(57)【要約】本発明は、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルの活性を調節し得る化合物をスクリーニングする方法に関する（なお、該化合物は、ある実施形態においては、抗体またはアンチセンスヌクレオチド配列である）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）組換え細胞を試験化合物と接触させるステップ（該組換え細胞は、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなる少なくとも一つのＮ型電位依存性カルシウムチャネルを発現する。ただし、該細胞は機能的カルシウムチャネルを発現しないものとする。）；および
ｂ）該化合物の、該細胞へのカルシウム流を調節する能力を判定するステップ
を含む、化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
組換え細胞が、また、カリウムチャネルも発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験化合物の能力が、さらに、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルを含まない細胞へのカルシウム流を調節する試験化合物の能力と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
慢性神経痛の処置に有用な化合物を同定する方法であって、ａ）Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのリガンドを、試験化合物の存在下および不存在下で、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルと接触させること；およびｂ）試験化合物が、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのリガンドと、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルとの結合を変化させるかどうかを判定することを含む方法。
【請求項５】
方法がさらに、ｃ）ステップ（ｂ）においてＣａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのリガンドと、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルとの結合を変化させることが確認された化合物を加えるステップ；ｄ）その化合物が慢性神経痛を軽減するかどうかを判定するステップ：およびｅ）ステップ（ｄ）において慢性神経痛を軽減する化合物を慢性神経痛の処置に有用な化合物として同定するステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットが、
ａ）配列番号８もしくは９、または配列番号８もしくは９と８０％の配列同一性を有するその変異体（Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）に関して）；
ｂ）配列番号６もしくは７、または配列番号６もしくは７と８０％の配列同一性を有するその変異体（α２δ１に関して）；
ｃ）配列番号１もしくは２、または配列番号１もしくは２と８０％の配列同一性を有するその変異体（β１に関して）；および
ｄ）配列番号３、４もしくは５、または配列番号３、４もしくは５と８０％の配列同一性を有するその変異体（γ４に関して）
からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試験化合物がアンチセンスヌクレオチド配列である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｐａｉｎ電位依存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）（該ＶＤＣＣは、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなる。）と特異的に結合する、精製抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットが、
ａ）配列番号８もしくは９、または配列番号８もしくは９と８０％の配列同一性を有するその変異体（Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）に関して）；
ｂ）配列番号６もしくは７、または配列番号６もしくは７と８０％の配列同一性を有するその変異体（α２δ１に関して）；
ｃ）配列番号１もしくは２、または配列番号１もしくは２と８０％の配列同一性を有するその変異体（β１に関して）；および
ｄ）配列番号３、４もしくは５、または配列番号３、４もしくは５と８０％の配列同一性を有するその変異体（γ４に関して）
からなる、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項８に記載の抗体フラグメント。
【請求項１１】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体または単鎖抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１２】
試験化合物が請求項６の抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
医療における請求項８〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１４】
慢性神経痛の処置用薬剤の製造のための請求項８〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１５】
慢性神経痛の処置用薬剤の製造のための、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのβ１およびγ４サブユニットに結合する化合物の使用。
【請求項１６】
慢性神経痛の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのβ１およびγ４サブユニットに結合する有効量の化合物を投与することを含む方法。
【請求項１７】
Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのβ１およびγ４サブユニットに結合する化合物、および医薬上許容される担体または希釈剤を含む、慢性神経痛の処置のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）の活性および／または発現を調節する候補化合物の能力をスクリーニングすることにより、哺乳類、特にヒトの慢性神経痛の抑制に有用な薬剤を同定する方法を提供する。本発明は、また、核酸、リボザイムおよび抗体である該薬剤を提供する。
【０００２】
背景技術
Ｎ型ＶＤＣＣ活性を調節するか、またはＮ型ＶＤＣＣの特異的阻害剤である化合物が知られている。これらのものとして、ω−コノトキシンＧＶＩＡ、ＳＮＸ−１１１（ジンコノチド）、ＳＮＸ−１５９、ＳＮＸ  ２３９、ＳＮＸ−１２４（Ｐｒａｄｏ  ＷＡ  （２００１）  Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ３４：  ４４９−４６１；Ｖａｎｅｇａｓ  Ｈ，  Ｓｃｈａｉｂｌｅ  Ｈ  （２０００）  Ｐａｉｎ  ８５：  ９−１８）がある。ギャバペンチンはα２δ１およびα２δ２サブユニットに高い親和性で結合し、ＶＤＣＣ電流調節を介してその鎮痛／抗痙攣作用を発揮するが、これは議論中である（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｅｍｂ  Ｂｉｏｌ  １８４（１）  ３５−４３  （２００１）；Ｓｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３５：  ２５７−２６５  （２００２））。
【０００３】
発明の開示
「アンチセンス」とは、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列をさす。「アンチセンス鎖」とは、「センス鎖」に相補的な核酸鎖をさす場合に用いる。アンチセンス分子は、目的の遺伝子を逆向きに、相補鎖を合成し得るウイルスプロモーターに連結することによる合成を含む、いずれの方法で作製してもよい。細胞内に導入されると、これは、細胞が産生した天然配列と結合して二重らせんを形成する。そして、これらの二重らせんはさらなる転写または翻訳のいずれかをブロックする。「ネガティブ」とは、アンチセンス鎖をさして用いられ、「ポジティブ」はセンス鎖をさして用いられる場合がある。
【０００４】
「変異体」とはリファレンスポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その必須特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドをさす。典型的なポリヌクレオチド変異体はリファレンスポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化はリファレンスポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても変更しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は以下に論じられるように、リファレンス配列によってコードされるポリペプチドにアミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断を生じさせる。典型的なポリペプチド変異体はリファレンスポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、この変更は、リファレンスポリペプチドと変異体の配列が全体としてよく似ており、多くの領域が同一であるという場合に限られる。変異体とリファレンスポリペプチドはいずれの組合せであってもよいが１以上の置換、挿入、欠失によりアミノ酸配列が異なる。置換または挿入されるアミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるものであってもなくてもよい。典型的な保存的置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ−Ｉ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ：およびＰｈｅ、Ｔｙｒが挙げられる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は対立遺伝子などの天然に存在するものであってもよいし、あるいは天然に存在するとは知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの非天然変異体は突然変異誘発技術または直接合成によって作出し得る。また変異体としては、１以上の翻訳後修飾、たとえばグリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＩＰリボシル化などを有するポリペプチドも含まれる。具体例としては、Ｎ末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびトレオニンのリン酸化、およびＣ末端グリシンの修飾が挙げられる。また変異体としては、ＳＮＰ（下記参照）を有し、１以上のアミノ酸交換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。また変異体には、いわゆるスプライス変異体（下記参照）、従って異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【０００５】
「多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」とは、ある集団内のゲノムの特定の位置におけるヌクレオチド配列（関連があれば、コードされるポリペプチド配列）のバリエーションをさす。
【０００６】
「一塩基多型」（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，  ＳＮＰ）とは、ある集団内のゲノムの単一のヌクレオチド位置におけるヌクレオチドバリエーションが存在することをいう。ＳＮＰはある遺伝子内、またはゲノムの遺伝子間領域内に存在し得る。ＳＮＰは対立遺伝子特異的増幅（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ＡＳＡ）を用いてアッセイできる。この目的では少なくとも３つのプライマーが必要である。共通プライマーとしてはアッセイする多型と逆の相補性があるものを用いる。この共通プライマーは多型塩基に由来する５０〜１５００ｂｐｓの間であり得る。他の２つ（またはそれ以上）のプライマーは、多型を構成している２つ（またはそれ以上）の対立遺伝子のうちの１つと対合するように最後の３’塩基にゆらぎを持っていること以外は互いに同一である。次に、サンプルＤＮＡに対して２種類（またはそれ以上）のＰＣＲ反応を、それぞれ共通プライマーと対立遺伝子特異的プライマーの１つを用いて行う。
【０００７】
本明細書において「スプライス変異体」とは、選択的ＲＮＡスプライシングを受けた同じゲノムＤＮＡ配列から最初に転写されたＲＮＡ分子から作製されたｃＤＮＡ分子をさす。選択的ＲＮＡスプライシングは、ＲＮＡの一次転写物が、通常はイントロンの除去のためにスプライシングを受ける際に起こり、その結果、各々異なるアミノ酸配列をコードし得る１を超えるｍＲＮＡ分子が生じる。スプライス変異体とはまた、上記のｃＤＮＡ分子によってコードされる他もさす。
【０００８】
「同一性」とは、配列を比較することによって求められる、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の関係をいう。一般に、同一性とは、比較する配列の長さにわたってそれぞれ２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチド、またはアミノ酸対アミノ酸の一致をさす。
【０００９】
「同一性％」−正確に一致しない配列については、同一性％を求めることができる。一般に、比較する２つの配列を、その配列間に最大の相関が得られるようにアラインする。これには、アラインメントの程度を高めるために配列の一方または双方への「ギャップ」の挿入を含んでもよい。同一性％は比較する各配列の全長にわたって求めてもよく（いわゆるグローバル・アラインメント）、これは長さが同じか、よく似た配列に特に適しており、あるいは、より短い、所定の長さにわたって求めてもよく（いわゆるローカル・アラインメント）、これは長さの異なる配列に適している。
【００１０】
「類似性」とは、２つのポリペプチド配列間の関係の尺度をさらにより精緻にしたものである。一般に、「類似性」とは、（同一性に関して）比較する配列からのそれぞれ１つの残基対間の正確な一致だけでなく、正確な一致がなかった場合に、進化に基づき、ある残基が他の残基に代わる可能性の高い置換かどうかを考慮して、２つのポリペプチド鎖のアミノ酸間の残基対残基に基づく比較を意味する。この見込みは関連の「スコア」を持ち、次にこのスコアから２つの配列の「類似性％」を求めることができる。
【００１１】
２以上の配列の同一性または類似性を比較する方法は当技術分野では周知である。よってたとえば、ウイスコンシン・シーケンス・アナリシス・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １２，  ３８７−３９５，  １９８４，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡから入手可能）で利用できるプログラム、たとえば、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰプログラムを用いて２つのポリヌクレオチド間の同一性％、ならびに２つのポリペプチド配列間の同一性％および類似性％を求めればよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、スミスおよびウオーターマン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １４７，１９５−１９７，  １９８１，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，  ２，  ４８２−４８９，  １９８１）の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを用い、２つの配列間の類似性の最も高い１つの領域を見つけ出す。ＢＥＳＴＦＩＴは長さの異なる２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列を比較するのに適しており、このプログラムでは短い配列は長い配列の一部に当たると仮定する。これに対して、ＧＡＰは２つの配列をアラインして、ネッデルマンおよびブンシュ（Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ４８，  ４４３−４５３，  １９７０）のアルゴリズムに従って「最大類似性」を見つけ出す。ＧＡＰは長さのほぼ同じ配列を比較するのに適しており、アラインメントは全長にわたると期待される。
【００１２】
好ましくは、各プログラムで用いるパラメーター「Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ」および「Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ」はポリヌクレオチド配列に関してはそれぞれ５０および３であり、ポリペプチド配列に関しては１２および４である。同一性％および類似性％は比較する２つの配列が最適にアラインされた際に求めるのが好ましい。
【００１３】
配列間の同一性および／または類似性を求めるその他のプログラムも当技術分野で知られており、たとえばＢＬＡＳＴ系のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２１５，  ４０３−４１０，  １９９０，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：３８９−３４０２，  １９９７，  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ），  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  ＵＳＡから入手可能、また、ＮＣＢＩのホームページｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからアクセスできる）、およびＦＡＳＴＡ  （Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ  Ｒ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８３，  ６３−９９，  １９９０；Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ  Ｒ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ  Ｊ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８５，  ２４４４−２４４８，１９８８，  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅの一部として入手可能）が挙げられる。
【００１４】
ヌクレオチド配列が、比較の前にまずアミノ酸配列に翻訳される場合を含み、ポリペプチド配列の比較にはＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｊ  Ｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９，  １０９１５−１０９１９，  １９９２）を用いるのが好ましい。
【００１５】
リファレンスポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対してクエリーポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一性％を求めるにはＢＥＳＴＦＩＴプラグラムを用いるのが好ましく、上述のようにクエリー配列およびリファレンス配列は最適にアラインし、プログラムのパラメーターはデフォルト値を示す。
【００１６】
「同一性指数」とは、候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）とリファレンス配列を比較するのに使用できる配列の関係性の指標である。よって、たとえば、リファレンスポリヌクレオチド配列と比較した場合に０．９５の同一性指数を有する候補ポリヌクレオチド配列は、その候補ポリヌクレオチド配列がリファレンス配列の１００ヌクレオチドごとに平均５までの違いを含み得ること以外はリファレンス配列と同一である。このような違いは少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、置換（転移およびトランスバージョンを含む）、または挿入からなる群から選択される。これらの違いはリファレンスポリヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端の位置に存在してもよいし、あるいはこれらの末端位置の間のどこかに、リファレンス配列のヌクレオチドの間に独立して、またはリファレンス配列の中に１以上の連続する群として散在してもよい。言い換えれば、リファレンスポリヌクレオチド配列と比較した場合に０．９５の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を得るためには、上述のように、リファレンス配列の１００ヌクレオチドごとに平均５〜２５までを欠失させるか、置換するか、または挿入するか、あるいはそのいずれかの組合せを行えばよい。同じことが必要な変更を加えた上で、たとえば０．９６、０．９７、０．９８および０．９９などのその他の値の同一性指数についても当てはまる。
【００１７】
同様に、ポリペプチドについても、たとえばリファレンスポリペプチド配列と比較した場合に０．９５の同一性指数を有する候補ポリペプチド配列は、そのポリヌクレオチド配列がリファレンス配列の１００アミノ酸ごとに平均５までの違いを含み得ること以外はリファレンス配列と同一である。このような違いは少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）、または挿入からなる群から選択される。これらの違いはリファレンスポリペプチド配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置に存在してもよいし、あるいはこれらの末端位置の間のどこかに、リファレンス配列のアミノ酸の間に独立して、またはリファレンス配列の中に１以上の連続する群として散在してもよい。言い換えれば、リファレンスポリペプチド配列と比較した場合に０．９５の同一性指数を有するポリペプチド配列を得るためには、上述のように、リファレンス配列の１００アミノ酸ごとに平均５までを欠失させるか、置換するか、または挿入するか、あるいはそのいずれかの組合せを行えばよい。同じことが必要な変更を加えた上で、たとえば０．９６、０．９７、０．９８および０．９９などのその他の値の同一性指数についても当てはまる。
【００１８】
ヌクレオチドまたはアミノ酸の違いの数と同一性指数との間の関係は以下の方程式：
【数１】
2005520522.tif 000002
［式中、
ｎａはヌクレオチドまたはアミノ酸の違いの数であり、
ｘａは与えられた任意の配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の総数であり（たとえば配列番号１では５９６）、
Ｉは同一性指数であり、
・は掛け算の記号であり、ｘａ・Ｉの積が整数でなければ、ｘａから引く前に最も近い整数に丸める］
で表すことができる。
【００１９】
「ホモログ」とは、リファレンス配列と高い程度の配列の関係性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列をさすために当技術分野で用いられる一般的な用語である。このような関係性は上記に定義されたような２つの配列間の同一性および／または類似性の程度を求めることにより定量し得る。「オルトログ」および「パラログ」という用語もこの一般用語の範囲内にある。「オルトログ」とは、別の種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的同等物であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをさす。「パラログ」とは、機能的に類似の同じ種内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをさす。
【００２０】
「融合タンパク質」とは、２つの関連のない融合遺伝子によりコードされるタンパク質またはその断片をさす。例としては、米国特許第５５４１０８７号、同第５７２６０４４号に開示されている。治療に用いる場合にこのような融合タンパク質の薬物動態特性を向上させるため、また、二量体融合タンパク質を作出するために目的タンパク質の機能的発現を行うには、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用いるのが有利である。この融合タンパク質ＤＮＡ構築物は、５’から３’方向へ、分泌カセット、すなわち哺乳類細胞からの輸出を誘発するシグナル配列、融合相手としての免疫グロブリンＦｃ領域フラグメントをコードするＤＮＡ、および目的のタンパク質またはその断片をコードするＤＮＡを含んでよい。用途によっては、内在する機能的特性（補体結合、Ｆｃ受容体結合）を、機能的Ｆｃ側を融合タンパク質の残りの部分を触らないように変異させるか、または発現後にＦｃ部分を完全に欠失させるかによって変更できることが望ましい場合もある。
【００２１】
本発明は１以上のＰａｉｎ  ＶＤＣＣを阻害、調節、ダウンレギュレートまたは不動化する（細胞内で）化合物をスクリーニングする方法を提供する。慢性神経痛の動物モデルにおいて（たとえば、Ｓｅｌｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐａｉｎ  ４３：  ２０５−２１８，  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｍｏｄｅｌ  （Ｇ．Ｊ  ａｎｄ  Ｘｉｅ，  Ｙ．Ｋ．  Ｐａｉｎ  （１９８８）  ３３：  ８７−１０７）、またチュン（Ｃｈｕｎｇ）のモデル（Ｋｉｍ，  Ｓ．Ｏ．  ａｎｄ  Ｃｈｕｎｇ，  Ｊ．Ｍ．  Ｐａｉｎ  （１９９２）  ５０：３５５−３６３））、ＶＤＣＣのＣａｖ２．２（α１Ｂ）およびα２δ１サブユニットだけでなく、β１およびγ４サブユニットもアップレギュレートすることが見出されており、たとえば、そのメッセンジャーＲＮＡはこれらの動物のＤＲＧで発現することがわかっている（種々の神経痛モデルにおける種々のサブユニットのアップレギュレーションを比較した表２を参照）。
【００２２】
Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニット、またはＶＤＣＣの該サブユニットの変異体（たとえば、スプライス変異体、ＳＮＰを含む）からなるＰａｉｎ  ＶＤＣＣは、限定されるものではないが、骨関節炎、慢性関節リウマチ、癌、糖尿病、機械的神経損傷、帯状疱疹後神経痛、慢性腰痛、腹痛、および脊柱管狭窄症をはじめとする疾病に関連する慢性神経痛状態の処置のための薬剤をスクリーニングするのに使用できる。このような変異体は８０％を超える同一性、より好ましくは８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超える同一性を有する。Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣまたはそのサブユニットの発現レベルは生体サンプル、たとえば組織（たとえば、背根神経節（Ｄｏｒｓａｌ  Ｒｏｏｔ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ，  ＤＲＧ））切片、細胞溶解液、または白血球溶解液から、インシツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション、定量的ＰＣＲ、免疫アッセイおよび電気泳動アッセイをはじめとする公知のいずれかの方法でアッセイすることができる（実施例１も参照）。
【００２３】
本発明において使用できる試験化合物は、生体ライブラリー、空間的にアドレス可能な（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）パラレル固相または液相ライブラリー、デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法をはじめ、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法の多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生体ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，  Ｋ．Ｓ．  （１９９７）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １２：１４５）。
【００２４】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：  ６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．    （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．    ３７：  ２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：  １３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．    Ｅｎｇｌ．  ３３：  ２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：  １２３３など、当技術分野に見出すことができる。化合物ライブラリーは液相中（たとえば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  （１９９２）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ  （１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ５，２２３，４０９）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒ  ＵＳＰ  ’４０９）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ  （１９９１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：３０１−３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ、前掲）に存在してもよい。現在利用できるＶＤＣＣブロッカーは、少なくとも一つには非特異的なチャネルブロッキング（他のイオンチャネル、他のＶＤＣＣ）によるものである許容できない副作用を有する。
【００２５】
Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣは極めて限定された数の組織に存在すると見込まれ、これはスプライス変異体が全面的な組織の特異性を作り出しているケースである可能性がある。Ｃａｖ２．２サブユニットは神経組織でのみ発現し、スプライス変異体が脳と末梢のチャネルを識別している。α２δ１サブユニットは広範囲に発現するが、少なくとも５つの選択的スプライス変異体が確認されている。β１サブユニットは主として骨格筋で発現するが、２つの脳特異的なイソ型が存在する。γ４サブユニットは神経組織のみで発現する。副作用を軽減すべきＤＲＧ神経部分集団以外のところには同じ組合せのスプライス変異体は存在しないと考えられるが、これは処置効果がたとえば採血によりモニタリングできないことを意味する。一つの実施形態では、スクリーニングアッセイは、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣを発現する組換え細胞を、たとえば上述のライブラリーに由来する試験化合物と接触させることを含む。その後、試験化合物の、ＶＤＣＣ活性を調節する（たとえば、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣを刺激もしくは阻害することによる、またはＰａｉｎ  ＶＤＣＣの発現のアップ／ダウンレギュレーションによる、またはＰａｉｎ  ＶＤＣＣの、細胞内プールからの不動化もしくは可動化による）能力をさらに判定する。上記の方法によって同定された化合物をさらに用い、その活性を適当な動物モデル、たとえば上記の動物モデル（Ｓｅｌｔｚｅｒのモデル、慢性痙攣傷害モデル、またはＣｈｕｎｇのモデル）で確認することができる。
【００２６】
本発明のもう一つの実施形態では、基本薬剤のスクリーニングおよび臨床試験の双方において処置を評価するために、臨床試験中の効果をモニタリングすることに関する。たとえば、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣ活性の阻害を目的として本明細書に記載するようなスクリーニングアッセイにより決定される化合物の有効性は、慢性神経痛を示す被験体の臨床試験においてモニタリングすることができる。ある好ましい実施形態では、本発明は被験体の化合物（たとえば、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または本発明に記載のスクリーニングアッセイにより同定されたその他の薬剤候補）による処置の有効性を評価、たとえばモニタリングする方法を提供し、その方法は、（ｉ）化合物の投与に先だって被験体のＰａｉｎ  ＶＤＣＣ活性の投与前レベルを、当技術分野で公知の検出方法を用いて評価するステップ、（ｉｉ）化合物を被験体に投与するステップ、（ｉｉｉ）化合物の投与後のＰａｉｎ  ＶＤＣＣ活性のレベルを評価するステップ、および（ｉｖ）化合物の投与前と投与後のレベルを比較するステップを含む。このような実施形態によれば、被験体のＰａｉｎ  ＶＤＣＣレベルは化合物の有効性の指標として用い得る。
【００２７】
本発明は、さらに、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣのβ１またはγ４サブユニットの発現を核酸レベルで阻害する物質を提供する。このような分子としては、β１またはγ４核酸の適当なヌクレオチド配列に対するリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよび／または二本鎖ＲＮＡが挙げられる。これらの阻害分子は当業者ならば過度な負担や実験もなく常法を用いて作出することができる。たとえば、遺伝子発現の修飾（たとえば阻害）は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域、すなわちプロモーター、エンハンサーおよびイントロンに対するアンチセンス分子ＤＮＡまたはＲＮＡをデザインすることで得ることができる。たとえば、転写開始部位、たとえば開始部位から−１０〜＋１０位の間に由来するオリゴヌクレオチドを用いてよい。しかしながら、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションを最大にするものを作出するためには、遺伝子の全領域を用いてアンチセンス分子をデザインしてもよく、このような安定なアンチセンスオリゴヌクレオチドは当業者に公知の標準的なアッセイ手順によって作製・同定することができる。
【００２８】
典型的には、約５〜５０ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドを用いる。より好ましくは、約５〜３５ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドを用いる。よりいっそう好ましくは、約２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを用いる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは当技術分野で公知の化学合成手順を用いて構築することができる。オリゴヌクレオチドは天然に存在するヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの生体安定性を高めるため、あるいはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二重らせんの物理的安定性を高めるためにデザインした種々の改変型ヌクレオチドを用いて化学的に合成することができる。たとえば、ホスホロチオエート、ホスホン酸メチルおよびエチルホスホトリエステルアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓｔｅｉｎ，  Ｃ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ  Ｙ−Ｃ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６１：１００４−１０１２）に総説）の使用も本発明の範囲内にある。さらに、アクリジン置換ヌクレオチドも本発明で用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。
【００２９】
本発明の好ましいアンチセンス核酸は、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣのサブユニット遺伝子（たとえば、β１またはγ４遺伝子）の一つのコード領域または調節領域に対してアンチセンスである。本明細書で意図されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイムおよび二本鎖ＲＮＡはβ１またはγ４の核酸配列に向けられたものであり、従って、選択されたβ１またはγ４のヌクレオチド配列はβ１またはγ４遺伝子発現の遺伝子特異的阻害をもたらす。たとえば、β１またはγ４ヌクレオチド配列の知識を用いてｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションを最大とするアンチセンス分子をデザインしてもよい。同様に、β１またはγ４の特異的ヌクレオチド配列を認識して、それを切断するようなリボザイムを合成することもできる（Ｃｅｃｈ．  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｍｅｄ  Ａｓｓｎ．  ２６０：３０３０  （１９８８））。遺伝子発現のターゲッティング阻害に使用するためのこのような分子をデザインする技術は当業者に周知のものである。遺伝子発現の遺伝子特異的阻害はまた、通常の二本鎖ＲＮＡ技術を用いて達成してもよい。このような技術は、出典明示によりその全開示内容を本明細書の一部とするＷＯ  ９９／３２６１９に見出せる。本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムは、核酸分子の合成のための当技術分野で公知のいずれかの方法により調製することができる。これらのものとしては、固相ホスホルアミダイト化学合成などのオリゴヌクレオチドの化学合成のための技術が挙げられる。あるいは、本明細書に記載のポリペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）転写によりＲＮＡ分子を作製してもよい。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて広範なベクターへ組み込むことができる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するｃＤＮＡ構築物を細胞系統、細胞または組織に導入することもできる。
【００３０】
ベクターは利用可能な多くの手段により細胞または組織へ導入することができ、インビボ、インビトロまたはエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で使用することができる。エクスビボ療法としては、患者から採取した幹細胞へベクターを導入し、クローン増殖させて、同じ患者へ自己移植片として戻せばよい。トランスフェクションおよびリポソーム注入による送達も、当技術分野で周知の方法を用いて達成することができる。本明細書では、たとえばこれらのタンパク質の抗体をデザインすること、かつ／または常法に従ってそのようなタンパク質の遺伝子へターゲッティングされた阻害型アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイムおよびＲＮＡアプタマーをデザインすることにより慢性の痛みを処置する方法として、関連の調節タンパク質、またはβ１もしくはγ４により修飾されたタンパク質の遺伝子の機能および／または発現を阻害できるということを意図している。このような慢性の痛みを処置するための阻害物質を含む医薬組成物も意図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス組換え発現ベクターは、当技術分野で公知のＰａｉｎ  ＶＤＣＣのサブユニットｃＤＮＡ（たとえば、β１またはγ４  ｃＤＮＡ）の一つの既知のヌクレオチド配列に基づいてデザインすることができる。ヒトβ１サブユニットｃＤＮＡはＧｅｎｂａｎｋ（商標）（受託番号ＮＭ＿０００７２３）から入手でき、ヒトγ４サブユニットｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋ（商標）（受託番号ＮＭ＿０１４４０５）から入手できる。さらに、ラットβ１サブユニットｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋ（商標）（受託番号ＮＭ＿０１７３４６）から入手でき、ラットγ４サブユニットｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋ（商標）（受託番号  ＡＦ３６１３４１）から入手できる。
【００３１】
別の種の細胞においてＰａｉｎ  ＶＤＣＣの活性を阻害するためには、種々の種の種々のサブユニット遺伝子の間で保存されているヌクレオチド配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインする（たとえば、ヒトおよびネズミ配列をはじめ、既知のサブユニット配列を比較することによる保存領域の同定に基づく）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子療法、および／またはＰａｉｎ  ＶＤＣＣのサブユニットの一つの遺伝子（たとえば、β１またはγ４遺伝子）の転写を阻害するのに十分な量および期間で被験体にそれらを外から投与すること、または細胞内におけるＰａｉｎ  ＶＤＣＣのサブユニットの一つ（たとえば、β１またはγ４遺伝子）のｍＲＮＡの翻訳により、細胞内でＰａｉｎ  ＶＤＣＣの活性を阻害するために使用できる。一つの実施形態では、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンス方向にサブクローニングした発現ベクター（すなわち、挿入された配列から転写された核酸は目的の標的核酸に対してアンチセンス方向になる）を用いて生物学的に生産することができる。このアンチセンス発現ベクターを、たとえば組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形で細胞へ導入し、そこでそのベクターの効率のよい調節領域の制御の下、アンチセンス核酸が生産され、その活性はベクターが導入された細胞のタイプにより測定することができる。好ましくは、この組換え発現ベクターはレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターである。
【００３２】
組換えレトロウイルスベクターを製造し、このようなウイルスをインビトロまたはインビボで細胞に感染させるプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  （１９８９），  Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４およびその他標準的な実験マニュアルに見出せる。好適なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられ、これらは当業者に周知のものである。好適なパッケージングウイルス系統の例としては、ＷＣｒｉｐ、ｙＣｒｅ、ｙ２およびｙＡｍが挙げられる。アデノウイルスベクターは、Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５に記載されている。アデノウイルス株Ａｄ  ５型  ｄ１３２４またはその他のアデノウイルス株（たとえば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄｚなど）に由来する好適なアデノウイルスベクターが当業者に周知である。アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）についてはＭｕｚｙｃｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９９２）  １５８：９７−１２９）に総説がある。好適なＡＡＶベクターの例は、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３２５１−  ３２６０に記載されている。
【００３３】
アンチセンス方向に核酸を含む組換え発現ベクターを細胞に導入すると細胞内でアンチセンス核酸が生じ、これにより細胞内でＰａｉｎ  ＶＤＣＣの活性が阻害される。このベクターは、細胞内に核酸を導入するための常法により細胞内へ導入することができる。ウイルスベクターを用いる場合は、この細胞を標準的な技術によりベクターに感染させることができる。細胞はインビトロまたはインビボにおいて感染させることができる。非ウイルスベクター、たとえばプラスミドを用いる場合は、たとえばリン酸カルシウム沈降法、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、エレクトロポレーションまたは細胞トランスフェクションのためのその他好適な方法によってベクターを細胞に導入することができる。
【００３４】
さらに、本発明は、慢性神経痛の処置のために有用な化合物を同定する方法に関し、その方法は、ａ）Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのリガンドを、試験化合物の存在下および不存在下で、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルと接触させること；およびｂ）試験化合物が、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのリガンドと、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルとの結合を変化させるかどうかを判定することを含む。所望により、該方法はさらに、ｃ）ステップ（ｂ）においてＣａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのリガンドと、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルとの結合を変化させることが確認された化合物を加えるステップ；ｄ）その化合物が慢性神経痛を軽減するかどうかを判定するステップ：およびｅ）ステップ（ｄ）において慢性神経痛を軽減する化合物を慢性神経痛の処置に有用な化合物として同定するステップを含む。
【００３５】
さらにもう一つの実施形態では、細胞においてＰａｉｎ  ＶＤＣＣ活性を阻害するために用いる核酸は、ｍＲＮＡ転写物など、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣのサブユニットの一つをコードする一本鎖核酸を切断し得るリボザイムである。リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ（リボザイム）は、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣのサブユニットの一つをコードするｍＲＮＡに対して特異性を有するようにデザインすることができる。たとえば、活性部位の塩基配列が、ｐａｉｎ  ＶＤＣＣ  ｍＲＮＡ中で切断される塩基配列と相補的であるようなテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築することができる。リボザイムのデザインについての記載はたとえば、チェクら（Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）米国特許第４，９８７，０７１号；チェクら（Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）米国特許第５，１１６，７４２号を参照。あるいは、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣのサブユニットの一つ（たとえば、β１またはγ１サブユニット）のＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールからＰａｉｎ  ＶＤＣＣのサブユニットの一つのＲＮＡに対して特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することもできる。リボザイムの選択についての記載はたとえば、Ｂａｒｔｅｌ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，  Ｊ．Ｗ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８  （１９９３）  を参照。リボザイムは、転写された際にリボザイムを産生する核酸を含む組換え発現ベクター（たとえば、上記のようなウイルスベクター）を構築することにより細胞に導入することができる（すなわち、リボザイムをコードするＤＮＡを常法により組換え発現ベクター中へクローニングする）。
【００３６】
本発明のあるさらなる好ましい実施形態では、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣに、またはγ４サブユニットに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。抗体は、サブユニットＣａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１に対するものが商品として入手可能である。本発明には、示差的に発現される１以上のＰａｉｎ  ＶＤＣＣの遺伝子エピトープを特異的に認識し得る抗体を生産する方法が記載されている。このような抗体としては、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生産されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。このような抗体は、たとえば、生体サンプル中のフィンガープリントとしてのＰａｉｎ  ＶＤＣＣ遺伝子の検出において、あるいはまた異常なＰａｉｎ  ＶＤＣＣ活性の阻害のための方法としても用いることができる。
【００３７】
よって、このような抗体はヒトおよび獣医学上の患者の慢性神経痛を抑制するために利用し得る。慢性神経痛は外傷による、または糖尿病、帯状疱疹もしくは後期癌などの疾病による、または化学的傷害（たとえば、数種の抗ＨＩＶ薬）による神経の損傷からくるものである。また、慢性神経痛は切断術（乳房切除術を含む）後に発症する場合もあり、何らかの腰痛にも関係がある（Ｐｏｒｔｅｎｏｙ  ＲＫ．  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ  ｐａｉｎ．  Ｉｎ：  Ｐｏｒｔｅｎｏｙ  ＲＫ，  Ｋａｎｎｅｒ  ＲＭ，  （Ｅｄｓ）  Ｐａｉｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  ＦＡ  Ｄａｖｉｓ，  １９９６，  ｐｐ  ８３−１２５）。示差的発現遺伝子に対する抗体を生産するためには、示差的発現遺伝子タンパク質またはその一部を注射することにより、種々の宿主動物を免疫化すればよい。このような宿主動物としては、限定されるものではないが、いくつか挙げるとウサギ、マウス、およびラットである。宿主種に応じて免疫応答を増強するために、限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）のような有用である可能性のあるヒトアジュバントをはじめとする種々のアジュバントを用いてもよい。
【００３８】
ポリクローナル抗体とは、標的遺伝子産物のような抗原、またはその抗原的に機能性のある誘導体で免疫化した動物の血清に由来する抗体遺伝子のヘテロな集団である。ポリクローナル抗体を生産するには、上記のような宿主動物を、上記のようなアジュバントを添加した示差的発現遺伝子産物を注射することで免疫化すればよい。モノクローナル抗体とは、特定の抗原に対する抗体のホモな集団であり、連続的培養細胞系統による抗体分子の生産を提供するいずれの技術によって得てもよい。これらのものとしては、限定されるものではないが、コーラーおよびミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）のハイブリドーマ技術（たとえば、米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（たとえば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（たとえば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６）が挙げられる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれかのサブクラスをはじめ、いずれの免疫グロブリン種のものであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで増殖させることができる。インビボにおいて高力価のｍＡｂが生産できれば、これはこれまでのところ好ましい生産方法となる。さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子に由来する遺伝子を適当な生物活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とともにスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８１：６８５１−６８５５）も使用できる。キメラ抗体とは、ネズミｍＡｂに由来する可変領域または超可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
【００３９】
あるいは、単鎖抗体の生産のために記載の技術（たとえば、米国特許第４，９４６，７７８号）を示差発現される遺伝子単鎖抗体を生産するために採用することができる。単鎖抗体はＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントをアミノ酸橋を介して結合することにより形成し、単鎖ポリペプチドとする。
【００４０】
最も好ましくは、「ヒト化」抗体の生産に有用な技術を、本明細書に開示するポリペプチド、フラグメント、誘導体および機能的同等物に対する抗体を生産するために採用することができる。このような技術は、たとえば出典明示によりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第５，７７０，４２９号に開示されている。
【００４１】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技術によって作製することができる。本発明の好ましい抗体はＰａｉｎ  ＶＤＣＣの少なくとも一つの活性を有する。
【００４２】
さらに、本発明は、医療における、特に慢性神経痛の処置用薬剤の製造のための、本明細書に開示するような抗体、またはＣａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのβ１およびγ４サブユニットに結合する化合物の使用に関する。
【００４３】
Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのβ１およびγ４サブユニットに結合する化合物はインビトロにて溶液、たとえば水溶液または懸濁液の形で、また、インビボにて、たとえば懸濁液もしくは水溶液として、もしくは固形のカプセル剤もしくは錠剤として腸内または非経口、有利には経口にて適用することができる。
【００４４】
ゆえに、本発明はさらに
（ａ）慢性神経痛の処置方法であって、そのような処置を必要とする患者に、Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのβ１およびγ４サブユニットに結合する有効量の化合物を投与することを含む方法、および
（ｂ）Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるＮ型電位依存性カルシウムチャネルのβ１およびγ４サブユニットに結合する化合物、および医薬上許容される担体または希釈剤を含む、慢性神経痛の処置のための医薬組成物
を提供する。
【００４５】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は例示を目的として示されるものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ナイーブおよび神経性痛覚過敏症動物モデルにおけるＶＤＣＣサブユニットの発現プロファイリング
（１）ナイーブラットＤＲＧにおけるＶＤＣＣサブユニットの遺伝子発現：まず、表１に記載の全てのプライマーセットを用いてナイーブＤＲＧ全ＲＮＡの遺伝子発現を試験する。全ＲＮＡサンプルは、Ｔｒｉ試薬（Ｓｉｇｍａ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、１０匹のナイーブラットからの摘出ＤＲＧ組織から調製する。２μｇの全ＲＮＡを３７℃で５分間、０．２単位のＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で処理し、ＲＮＡイージーカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いて精製する。ＲＮＡの濃度はＯＤにて測定する。ＤＮアーゼで処理したＲＮＡ  ２μｇを、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を製造の使用説明書に従い６６μｌ量（反応物の２倍）で用いてｃＤＮＡへと転写する。ｃＤＮＡサンプルを希釈して２５ｎｇ／μｌ  ＲＮＡ当量ｃＤＮＡとし、５０ｎｇを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた標準ＲＴ−ＰＣＲ反応に用いる（アニーリング温度は５０〜６０℃）。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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表１  ＶＤＣＣサブユニット遺伝子に対してデザインされたＰＣＲプライマー。Ｒ、ＭまたはＨで始まる受託番号はそれぞれラット、マウス、またはヒトｃＤＮＡ配列に相当する。これらの配列に対してＰＣＲプライマーがデザインされる。＊異なる配列を有するγ５サブユニットがＧｅｎｂａｎｋに寄託されている。Ｃａｖ１．１（α１Ｓ）遺伝子は、骨格筋特異的であると考えられるが、その後の報告でこの遺伝子の神経発現のレベルが低いことが報告されたことから分析しなかった。
【００４７】
もし、標準的なアガロースゲル電気泳動後に正確な大きさの産物が明瞭になれば、遺伝子はナイーブラットＤＲＧで発現されるとみなされる。次に、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のためにβ、γおよびα２δおよび  Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）サブユニットに対するプライマーを最適化する。ナイーブラットＤＲＧ  ｃＤＮＡはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて示唆された条件を用いて増幅する。アニーリング温度は実験的に決定する。最適化されたところで、それらの条件を用いて、以下に記載のように、神経痛モデルおよび対照に由来するｃＤＮＡのパネルをスクリーニングする。次のような４つの神経痛動物モデルを用いる。
【００４８】
１．）Ｓｅｌｔｚｅｒのモデル：Ｓｅｌｔｚｅｒのモデル（Ｓｅｌｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｐａｉｎ  ４３：  ２０５−２１８）では、ラットを麻酔し、片方の大腿（通常は左）の正中を上に向かって小さく切開して座骨神経を露出させる。この神経を、二頭筋後方に半腱様筋神経が総座骨神経に分岐する点の少し遠位の転子付近の部位の周囲の結合組織を丁寧に除去する。シルク７−０のシルク縫合糸を３／８のカーブしたリバーブカッティング（ｒｅｖｅｒｖｅｄ−ｃｕｔｔｉｎｇ）ミニニードルで神経の中へ通し、背側１／３〜神経の厚みの１／２が結紮内に保持されるようにしっかり結紮する。筋肉と皮膚を縫合糸とクリップで閉じ、傷口に抗生物質粉末を付けた。擬似手術動物では、座骨神経を露出させるが、結紮せずに、擬似手術でない動物と同様に傷口を閉じる。
【００４９】
２．）慢性痙攣傷害（ＣＣＩ）モデル：ＣＣＩモデル（Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｇ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｘｉｅ，  Ｙ．Ｋ．  Ｐａｉｎ  （１９８８）＿３３：８７−１０７）では、ラットを麻酔し、片方の大腿（通常は左）の中央を上に向かって小さく切開して座骨神経を露出させる。神経は周囲の結合組織を除去し、４／０クロムガットを４箇所、各およそ１ｍｍ間隔で、結紮が神経の表面をわずかに締め付けるように神経をゆるく縛る結紮を作る。上記のように縫合糸とクリップで傷口を閉じる。擬似手術動物では、座骨神経を露出させるが、結紮せずに、擬似手術でない動物と同様に傷口を閉じる。
【００５０】
３．）軸索切断術モデル：軸索切断術モデルは、座骨神経を完全に切断して、結紮することを含む。神経の末端は神経腫を形成するが、このモデルでは神経は再生されず、脚は永久的に麻痺するので行動相関はない（Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７９）  Ｐａｉｎ：  ７：１０３−１１３）。
【００５１】
４．）Ｃｈｕｎｇのモデル：末梢神経の損傷を含むＳｅｌｔｚｅｒのモデルおよびＣＣＩモデルとは対照的に、Ｃｈｕｎｇのモデルは脊椎神経の結紮を含む（Ｋｉｍ，  Ｓ．Ｏ．  ａｎｄ  Ｃｈｕｎｇ，  Ｊ．Ｍ．  Ｐａｉｎ  （１９９２）：  ５０：  ３５５−３６３）。このモデルでは、ラットを麻酔し、腹臥位に置き、脊椎の左をＬ４−Ｓ２レベルで切開する。座骨神経は分岐してＬ４、Ｌ５およびＬ６の脊椎神経を形成しているので、脊椎側部の筋肉を深く切開し、Ｌ４−Ｓ２レベルで脊椎突起から筋肉を分離すると、座骨神経の部分が現れる。Ｌ６横突起を骨鉗子で慎重に除去すると、これらの脊椎神経が見える。Ｌ５脊椎神経を単離し、７−０シルク縫合糸で強く結紮する。一重筋肉縫合糸（６−０）シルクと１個または２個の皮膚縫合クリップで傷口を閉じ、抗生物質粉末を付ける。擬似手術動物では、Ｌ５神経を上記のように露出させるが、結紮せずに、上記のように傷口を閉じる。
【００５２】
痛みのモデルのバリデーション：全ての慢性痛モデルにおいて、機械的痛覚過敏症を、Ａｎａｌｇｅｓｙｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ−Ｂａｉｌｅ，  Ｍｉｌａｎ）を用いて加圧刺激の上昇に対する両後脚の払いのけ閾値を測定することで評価する。機械的異痛症は、両後足の足底表面にｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒによって与えた無毒な機械的刺激に対する払いのけ閾値を測定することで評価する。熱性痛覚過敏症は、各後足の下側に与えた無毒な熱刺激に対する払いのけ待ち時間（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｌａｔｅｎｃｉｅｓ）を測定することで評価する。全てのモデルで機械的痛覚過敏症および胃痛症および熱性痛覚過敏症が外科術後１〜３日以内に発症し、少なくとも５０日持続する。本明細書に開示される実施例では、上記の痛みのモデルには雄のウイスターラットを用いる。ラットの体重は外科術時およそ１２０〜１４ｇであった。外科術は全て、エンフルラン／Ｏ２吸入麻酔下で行う。全ての場合、手術後傷を閉じ、動物を覚醒させた。軸索切断モデル以外は全て、顕著な機械的および熱性の痛覚過敏症を発症し、痛み閾値の低下と接触、熱刺激の圧力に対する後足の反射応答の上昇が見られる。外科術後、動物はまた外科術を施された足に特徴的な変化を示す。大多数の動物では外科術を施された後足の指が一緒に曲がり、足が若干片側にねじれ、中には足指が下へ丸まってしまったラットもあった。結紮したラットの歩行は様々であるが、跛行は全般的なものではなかった。ケージの床面から外科術を受けた後足を浮かせているラット、また、捕まえた時に通常見られないような後脚の剛直な引き延ばしを示すラットもいた。これらのラットは接触に極めて敏感であり、鳴き声を上げる傾向がある。その他、ラットの全般の健康状態および症状は良好であった。
【００５３】
動物モデルから採取した背根神経節からのＲＮＡ発現：神経損傷と同側のＬ４およびＬ５背根神経節を、外科術後１４日、２１日、２８日および５０日目に神経痛のラットモデルから取り出す（上記）。対側のＬ４および  Ｌ５  ＤＲＧを、擬似手術動物からのＤＲＧと同様に対照サンプルに関して採取する。Ｔｒｉ試薬（Ｓｉｇｍａ）を製造業者の使用説明書に従って用いて分離したＤＲＧ組織から全ＲＮＡサンプルを調製する。２μｇの全ＲＮＡを３７℃で５分間、０．２単位のＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で処理し、ＲＮＡイージーカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って用いて精製する。ＲＮＡの濃度はＯＤにて測定する。ＤＮアーゼで処理したＲＮＡ  ２μｇを、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を製造の使用説明書に従い６６μｌ量（反応物の２倍）で用いてｃＤＮＡへと転写する。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒｍ分析のため、ｃＤＮＡサンプルを希釈して１２．５ｎｇ／μｌ  ＲＮＡ当量ｃＤＮＡとする。ナイーブラットＤＲＧ（５０〜１ｎｇ）からの既知濃度のＲＮＡ当量ｃＤＮＡの標準曲線をサンプルパネルに沿って作製する。増幅の直線範囲において相対的交点を求め、これを用いてサンプルのメッセージレベルの定量を行う。各３回試験を行い、全ての値の平均をとり、標準誤差を求める。ｂ−アクチンｍＲＮＡのレベルも市販のプライマー（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号１７２０）およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて求める。ＶＤＣＣサブユニットの遺伝子レベルを、ｃＤＮＡ合成の効率が異なることを考慮してｂ−アクチンに対してノーマライズする。標準誤差は誤差の伝播式（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ２０００；Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．    Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  （Ｈａｒｌｏｗ）  を用いて計算する。実験サンプルおよび対照サンプルからのデータは、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡをダンの試験後多元比較とともに用いて統計学的に比較する。
【００５４】
擬似手術と対照のｍＲＮＡレベルを各遺伝子の神経痛モデルｍＲＮＡレベルと比較する。Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットは擬似手術および対照と比較してＳｅｌｔｚｅｒ、軸索切断、およびＣＣＩサンプルで発現のレベルの上昇を示すことが明らかである（表２）。他のタイプのＶＤＣＣチャネルサブユニットをコードする他の遺伝子は低レベルの遺伝子調節しか示さない。Ｓｅｌｔｚｅｒ、ＣＣＩおよび軸索切断モデルにおいて一貫した調節を行うサブユニットをさらにＣｈｕｎｇモデルのサンプルで試験する。
表２は結果の要約を示す。
【表５】
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【００５５】
実施例２：スクリーニング法
Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣ活性を調節する化合物を、たとえば、４５Ｃａの取り込みを測定することにより細胞内カルシウムレベルの変化を測定するか、またはカルシウム感受性色素を用いて細胞内カルシウムの蛍光測定法（蛍光アッセイ）によりＰａｉｎ  ＶＤＣＣを通るカルシウム流を調節するそれらの能力に関してスクリーニングする。これをたとえば次の２つのスクリーニングアッセイを用いて証明する。
【００５６】
カルシウム取り込みアッセイ：Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるヒトＮ型電位依存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．，  Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，  Ｕ．Ｋ．）細胞（ここでは、組換え細胞と呼ぶ）の培養物を多重カセットをタンデムで用いて調製する。たとえば、ＩＲＥＳ（Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ，  ９７：  １５３６−１５４１）を用いてタンデムに２つのサブユニットのｃＤＮＡをクローニングし、他の２つのサブユニットのｃＤＮＡを用いて繰り返し、ｐＢｕｄＣＥ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｕ．Ｓ．）中の２つの多重クローニング部位を両対をクローニングし、細胞系統へトランスフェクトする。さらに、これらの細胞を、標準プロトコール［ＭｃＩｎｔｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １３２：１０８４−１０９４  （２００１）］を用いてカルシウムチャネル（たとえば、Ｋｉｒ２．１チャネル、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０１１９０４）でトランスフェクトする。以下のプライマーを用いてヒト血液好酸球から調製した全ＲＮＡサンプルからＲＴ−ＰＣＲによりヒトＫｉｒ  ２．１のコード配列を増幅する（ＤＤ１０フォワード：  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＣＧＡ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＣＧＣ  ＴＡＣ  （配列番号１０）；ＤＤ１０リバース：  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＧＣＣ  ＧＴＡ  （配列番号１１））。ＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中にクローニングし、常法に従って配列決定する。細胞を９６ウェルプレートの一ウェルにつき２５０００の密度でプレーティングし、ＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で一晩培養する。アッセイ当日、カルシウム／マグネシウムフリーＨＢＳＳ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４で細胞を４回洗浄する。全ての工程を室温で行う。洗浄後、ウェルに約５０μｌのバッファーを入れる。試験化合物を２５μｌのバッファー中に加える。カルシウムチャネルは、細胞外カリウム濃度を４５Ｃａ２＋／ｍｌの３７０ＫＢｑを含有するＣａ２＋／Ｍｇ２＋フリーバッファー中〜８０ｍＭまで引き上げて膜の脱分極を誘発することにより活性化させる。陰性対照では、カリウムが除かれている。サンプルを室温で１５分間インキュベートした後、ＨＢＳＳ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４で５回洗浄する。ウェルから残りのバッファーを除去し、２５μｌの０．３％  ＳＤＳに置き換える。約１０分後、２００μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ４０シンチラントを加え、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔでサンプルのカウントを行う。
【００５７】
対象化合物は１ｎＭ〜１０μＭの範囲でＣａ２＋の取り込みを効果的にブロックする（＝ＩＣ５０）。あるいは、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣを発現する細胞におけるこのＣａ２＋取り込みブロック能を、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣを発現しない細胞と比較する。
【００５８】
蛍光アッセイ：Ｃａｖ２．２（α１Ｂ）、α２δ１、β１およびγ４サブユニットからなるヒトＮ型電位依存性カルシウムチャネル（ＶＤＣＣ）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養物を多重カセットをタンデムで用いて調製する（他の方法は上記に同じ）。さらに、これらの細胞をカリウムチャネル（Ｋｉｒ２．１チャネル）でもトランスフェクトする。
【００５９】
試験化合物の活性を、［Ｃａ２＋］ｉの細胞内変化を測定するためのカルシウム感受性色素を用いる蛍光アッセイを用いて検討する。細胞を９６ウェルＣｏｓｔａｒ透明底のブラックプレートの一ウェルにつき２５，０００の密度でプレーティングし、ＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２下、３７℃で一晩培養する。アッセイ当日、０．０１％プルロニックＦ−１２７を含有するアッセイバッファー［１０ｍＭ  Ｎ−２−（ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．４を含有するハンクのバランス塩溶液（ＨＢＳＳ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］で構成した２μＭ  ｆｕｒａ−２／ＡＭまたは２μＭ  ｆｕｒａ−６Ｆ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のいずれかで、室温にて３０分間、細胞をインキュベートする。アッセイバッファーで２回洗浄した後、試験化合物（最終濃度１ｎＭ〜１０μＭの範囲）を含有するアッセイバッファーまたは必要な場合にアッセイバッファー単独１００μｌを各ウェルに加え、プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎに入れる。蛍光を、励起波長３４０および３８０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍを用い、４秒間隔で１分にわたって測定する。Ｎ型カルシウムチャネルは、ＨＢＳＳ中４８０ｍＭのＫＣｌ  ２０μｌを加えて細胞外カリウム濃度を引き上げ、膜の脱分極を誘発することにより活性化する。各時点での、３４０および３８０ｎｍでの励起の後の蛍光強度比を算出する。カリウムにより誘発された応答は（刺激後の４時点の平均比）−（基底比）として算出する。対象化合物は、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で、３４０および３８０ｎｍでの励起の後の蛍光強度比を効果的に低下させる（＝ＩＣ５０）。あるいは、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣを発現する細胞における蛍光強度比を低下させる能力を、Ｐａｉｎ  ＶＤＣＣを発現しない細胞の場合と比較することもできる。
【００６０】
実施例３：β１またはγ４に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成：β１またはγ４の発現をはじめ、遺伝子発現を阻害するのに有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は常法に従って作製することができる。たとえば、β１またはγ４に対するＡＳＯは完全にまたは部分的にホスホロチオエート化されていてもよいし、あるいは、両末端がＭＯＥ（メトキシエトキシ）基で修飾されたヌクレオチドを有する完全または部分的ホスホジエステル１８マーであってもよい。これらは常法に従い、ホスホルアミダイト化学法を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、エレクトロスプレー質量分析法およびキャピラリーゲル電気泳動法により同定することができる。それぞれ３８〜７２％の間のＧＣ含量を有するＡＳＯを選択し、たとえばラットまたはヒトβ１またはγ４のコード領域の部分と相補的となるよう合成すればよい。誤対合を含む対照オリゴヌクレオチドについては、対合するオリゴヌクレオチドのおよその塩基組成を保持し得る。さらに、たとえば一方はラットＧＡＰＤＨコード領域に対するもの、もう一つはランダム合成ＡＳＯというように２つの対照ＡＳＯを選択してもよい。抗ラットＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドの形式は抗β１またはγ４オリゴヌクレオチドの場合と同様であってもよく、合成オリゴヌクレオチドは、その配列の両末端において、中央のホスホロチオエートまたはホスホロジエステルＤＮＡ残基により、そのＭＯＥリボヌクレオチドに修飾を有してもよい。
【００６１】
β１またはγ４  ＡＳＯのインビトロ選択：当業者に公知の方法を用いて、その後の分析（たとえば、インビボ標的バリデーション）のために最も有効なＡＳＯを同定するために、インビトロにおいてＡＳＯ候補のコレクションから最適なＡＳＯを選択してもよい。このようなＡＳＯ候補は、誤対合ＡＳＯ（すなわち、不活性な保存的突然変異を有すること以外は同一のＡＳＯ）、ビヒクル、および／または非処理対照と比較試験を行ってもよい。最適な候補ＡＳＯ配列がアンチセンスとして同定されれば、インビボ適用により適合し、かつ、同じ最適標的配列に基づく化学誘導体および形式が合成でき、さらにはインビボ投与できる。
【００６２】
トランスフェクションプロトコール：ＡＳＯのトランスフェクションは当業者に公知の方法に従って行うことができる。たとえば、トランスフェクション２４時間前に２×１０５の細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．，  Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，  Ｕ．Ｋ．）を６ウェルプレートに一ウェルにつき２ｍｌの量（Ｆ１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘ  （ＤＭＥＭ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ））を入れ、５％ＣＯ２下で７０〜８０％密集となるまで培養すればよい。トランスフェクションの当日、リポフェクチン（商標）を血清フリーＯｐｔｉＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）に希釈する（１ｍｌ  ＯｐｔｉＭＥＭ中へ、目的最終オリゴヌクレオチド濃度１００ｎＭにつき３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））ことでトランスフェクション２倍原液を調製し、室温で１５分間インキュベートする。次にこの溶液を、ＯｐｔｉＭＥＭ中に目的最終濃度の２倍量のＡＳＯを含有する２倍ＡＳＯ溶液と１：１混合する。このトランスフェクション混合物を室温で１５分間インキュベーションしてトランスフェクション複合体を形成させた後、事前に吸引したウェルの各細胞に２ｍｌを添加し得る。リポフェクチン（商標）試薬のみの対照と通常細胞の対照（非処理）も含み得る。３７℃で４時間インキュベーションした後、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中５０％のＦＢＳ  ５００μｌを各ウェルに加え、最終ＦＢＳ濃度１０％とする。次にこれらの培養物を、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター内、３７℃にて、ｍＲＮＡの回収のためには２４時間、タンパク質の回収および電気生理学のためには４８時間インキュベートすればよい。
【００６３】
リアルタイム定量的ＰＣＲ  ｍＲＮＡ分析は当技術分野で標準的な方法に従って行ってよい。たとえば、ＲＮイージー９６キット（Ｑｉａｇｅｎ，  ＧｍＢＨ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者のプロトコールに従って用いて全ＲＮＡを単離してもよい。このＲＮＡサンプルをそれぞれ１ｎｇ／Ｌに希釈する。次に、各サンプルのＲＮＡ  ５ｎｇを遺伝子特異的検出プライマー（当業者ならば容易に決定できる）、また、リアルタイム定量的ＰＣＲ反応キットＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ（商標）  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）からの適当な試薬と混合し、製造業者のプロトコールに従って行う。適当な配列を有するラットβ１またはγ４プライマーはＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）から購入してもよい。比較のための対照遺伝子としてＧＡＰＤＨを選択してもよい。同じこれらのＲＮＡサンプルをＴａｑＭａｎＲ  Ｒｏｄｅｎｔ  ＧＡＰＤＨ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）からのラットＧＡＰＤＨプライマーとともに実施してもよい。配列特異的な蛍光発光シグナルは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて検出し得る。これらのサンプルとともに、純粋な鋳型ｍＲＮＡの希釈物の標品を試験して、全ＲＮＡの挿入量についての絶対濃度を得てもよい。
【００６４】
インビトロβ１またはγ４  ＲＮＡ分析：用量応答対、誤対合：β１またはγ４特異的ＡＳＯを、元の対合ＡＳＯと比較した場合にそれぞれ突然変異を有する誤対合対照とともに合成してもよい。要するに、たとえば、３’および５’末端において２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）基で修飾された５個のヌクレオチドを有する完全ホスホジエステル１８マーをホスホルアミダイト化学法（Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐ  ａｎｄ  Ｎａｔｔ，  Ｆ．  ＥＰ  ９９−１１９７６８，  ＵＳ  ９８−１６８４４７，  ＣＡＮ  １３２：２７９４７７，  ＡＮ  ２０００：２４０７３４）を用いて合成し、ＨＰＬＣ精製し、エレクトロスプレー質量分析法およびキャピラリーゲル電気泳動法により同定することができる。次に、比較的高レベルの内在β１またはγ４  ｍＲＮＡを発現する細胞系統で実施したインビトロアッセイにおいてリアルタイム定量的ＰＣＲによって判定した場合に、β１またはγ４  ｍＲＮＡレベルの阻害において最も効率的なＡＳＯを決定すればよい。その後、これらを、再びこれらの細胞系統に対する用量応答実験で適当な誤対合対照に対して試験してもよい。
【００６５】
インビボアッセイ：インビトロで作製された用量応答データに基づき、たとえば、ＡＳＯの完全または部分的ホスホジエステル型、および３’および５’末端において２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）基で修飾された５個のヌクレオチドを有するミスセンスオリゴヌクレオチド（ＭＳＯ）１８マーをインビボで用いてもよい。次に、ＡＳＯ、ＭＳＯまたはビヒクルを最大７日間、所望の濃度でラット（たとえば、ウイスター）に送達し、脊髄および背根神経節内の細胞体にこのオリゴヌクレオチドまたはビヒクルを取り込ませてもよい。ＡＳＯおよびＭＳＯは、座骨神経結紮２４時間前または１４日後、またはＣＦＡ注射の２４時間前に挿入した留置カニューレを通じて髄腔内投与してもよい。ラットを麻酔し、正中のすぐ側方で、腹側腸骨棘の約１０ｍｍ尾側の背の皮膚を切開する。滅菌カテーテル（ポリエチレンＰＥ１０管）を、ガイドカニューレ（２０ゲージニードル）を通じて挿入し、髄腔内空間内を頭蓋側へ３ｃｍほぼＬ１レベルまで進めればよい。次にこのカテーテルを、ＡＳＯ、ＭＳＯまたは生理食塩水（１μｌ／時、７日を送達する）オスモティックミニポンプ（Ａｌｚａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）と接続し、これを左または右側腹部に皮下挿入すればよい。その後、傷口を創傷クリップで閉じ、抗生物質粉末をつければよい。次に、最大許容量を確定するため、予備実験を行う。機械的痛覚過敏症、異痛症は、痛覚過敏症の逆転におけるβ１またはγ４アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を評価するための下記の方法で測定すればよい。機械的痛覚過敏症は、Ａｎａｌｇｅｓｙｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ−Ｂａｓｉｌｅ，  Ｍｉｌａｎ）を用いて加圧刺激の上昇に対する両後足の払いのけ閾値を測定することにより評価できる。カットオフは２５０ｇに設定し、終了点は払いのけ、発声、または明確な苦痛とする。外科術後には６５ｇより低い加圧刺激での足の払いのけは見られない。機械的異痛症は、両後足の足底表面に、カスタムメードのｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒｓで与えた無毒な機械的刺激に対する払いのけ閾値を測定することにより評価できる。動物を個々に金網底のケージに入れ、同時に６個体の群を試験し、約３０分間順化させる。次に、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒｓ試験を、１回６秒までで、力のオーダーを段階的に高めながら、払いのけ応答が起こるまで行えばよい。なお、２０．６ｇをカットオフとする。これを、もう一度最小の力では応答しないことを試験することで払いのけ閾値であることを確認すればよい。各動物は無作為な順番で一度だけ試験する。機械的痛覚過敏症および異痛症データの統計学的有意性は、ＡＮＯＶＡ、次にＴｕｋｅｙのＨＳＤ検定を用い、アッセイした種々の実験動物群から得ればよい。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月15日(2004.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005520522000001.app
【国際調査報告】
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