(57)【要約】本発明は、第一のモノクローナル抗体、および第二のモノクローナル抗体を含有する混合物を含み、当該抗体の両方がネコ血液グループ特異的A抗原を認識する抗体であることを特徴とする、ネコの血液型を判定するためのキットに関する。本発明はまた、ネコ血液グループ特異的Ａ抗原を認識する２種類の異なったモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ネコの血液型を判定するための方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含むことを特徴とする、ネコの血液型を判定するためのキット：
(a)  少なくとも１種類のモノクローナル抗体とネコの血液サンプルとの接触を促進するための基体部材；及び
(b)  該基体部材と接触して置かれている第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体の混合物であって、各抗体が少なくとも１つのネコの血液グループの特異的A抗原を認識することを特徴とする、混合物。
【請求項２】
前記混合物中のモノクローナル抗体の一つが糖脂質A抗原(NeuGc)2GD3を認識することを特徴とする請求の範囲１記載のキット。
【請求項３】
前記混合物中のモノクローナル抗体の一つが、 (NeuGc)2GT3を含む糖脂質A抗原、またはガングリオシドを含有する(NeuGc)を認識することを特徴とする請求の範囲１記載のキット。
【請求項４】
前記第１のモノクローナル抗体が13G3抗体であることを特徴とする請求の範囲１記載のキット。
【請求項５】
前記第２のモノクローナル抗体が4E10抗体であることを特徴とする請求の範囲１記載のキット。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が34 μg/mlと136 μg/mlの間に等しい濃度で溶液中に存在することを特徴とする請求の範囲３記載のキット。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が64 μg/mlと256 μg/mlの間に等しい濃度で溶液中に存在することを特徴とする請求の範囲２記載のキット。
【請求項８】
前記抗体混合物が凍結乾燥されていることを特徴とする請求の範囲１記載のキット。
【請求項９】
前記基体部材がカード部材と試験管から成る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲１記載のキット。
【請求項１０】
血液型Bと凝集反応を起こす物質を包括することを特徴とする請求の範囲１記載のキット。
【請求項１１】
前記物質がTriticum vulgarisから得られたレクチンであることを特徴とする請求の範囲１１記載のキット。
【請求項１２】
下記工程を含むことを特徴とする、ネコの血液サンプルを血液型判定するための方法：
(a)  血液サンプルを被検ネコから採取する工程；
(b)  当該血液サンプルのある量を基体部材に施す工程であって、それにより第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体との混合物と当該基体部材との間の接触が促進されること、かつ各抗体がネコの血液グループA特異的抗原を認識することを特徴とする、工程；及び
(c)  当該サンプルが凝集反応を起こしたか否かを判定するために、当該血液サンプル及び当該抗体混合物を検査する工程。
【請求項１３】
血液型を判定すべき各ネコから得られた、EDTA中に集められた５０μｌから１００μｌの間の血液サンプルを、前記基体部材に加えることを特徴とする請求の範囲１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合物中のモノクローナル抗体の一つが糖脂質A抗原(NeuGc)2GD3を認識することを特徴とする請求の範囲１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記１３G３抗体が34 μg/mlから136 μg/mlの間に等しい濃度で存在することを特徴とする請求の範囲１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記4E10抗体が64 μg/mlから256 μg/mlの間に等しい濃度で存在することを特徴とする請求の範囲１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記血液サンプルが、凝集の観察に十分な量の前記抗体混合物と混合されることを特徴とする請求の範囲１２に記載の方法。
【請求項１８】
ネコの血液型判定のためにモノクローナル抗体を用いる方法であって、ネズミのモノクローナル抗体の混合物とネコの血液サンプルを接触する工程を含み、ここで、当該抗体の一つが糖脂質A抗原(NeuGc)2GD3を認識し、他の当該モノクローナル抗体が、糖脂質A抗原(NeuGc)2GT3、またはガングリオシドを含む(NeuGc)を認識する、方法。
【請求項１９】
ネコのA型血液を特徴づける赤血球糖脂質抗原上にある受容体と特異的に結合し、かつネコのB型血液を特徴づける抗原上のいかなる受容体とも結合しないことを特徴とする、単離されたネズミモノクローナル抗体。
【請求項２０】
糖脂質A抗原(NeuGc)2GD3を認識することを特徴とする請求の範囲１９に記載の抗体。
【請求項２１】
糖脂質A抗原(NeuGc)2GT3、またはガングリオシドを含む(NeuGc)を認識することを特徴とする請求の範囲１９に記載の抗体。
【請求項２２】
二つの別個のモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体混合物とネコ血液サンプルとの間の接触を促進するための基体部材を含み、当該混合物は糖脂質A抗原 (NeuGc)2GD3を認識する第１モノクローナル抗体、及び糖脂質A抗原(NeuGc)2GT3またはガングリオシドを含む(NeuGc) を認識する第２モノクローナル抗体を含み、当該第１の抗体が64 μg/ml から256 μl/mlの間に等しい濃度で存在し、当該第２の抗体が34 μg/mlから136 μg/mlの間に等しい濃度で存在することを特徴とする、ネコの血液型を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコの血液型を判定する方法とキットに関する。特に本発明は、ネコの赤血球におけるネコの特異的A抗原を認識する二つのモノクローナル抗体の混合物を有するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
輸血後の副作用を防止するためには、ネコの血液グループ抗原判定に関する知識は重要である。特にネコが輸血を受ける前に、ネコの血液型を判定することが必要である。もし間違った血液型が輸血された場合は、重篤な免疫反応が起こる。雌ネコの初乳中に抗赤血球抗体が自然に生じるので、生まれる子ネコの授乳にも危険がある。
【０００３】
対立する血液型に対して自然に発生する抗体が常在することは、この特質がないか又はその臨床的な意義が極小である他の広範囲にわたる動物種とネコとの違いである。特に重要なことは、大抵のB型血液のネコは、抗A抗体の高い力価を持っていることである。これらの自然の抗体のため、不適合輸血は初回であっても、ひどい溶血反応をもたらす。新生児同種溶血現象及び関連した子ネコの衰え症候群は、これらの潜在的抗A抗体の直接的結果である。これに対して、A型血液のネコのうち、自然に発生する抗B抗体を所有しているものは僅かであり、しかもこれらは低い力価である。AB型血液のネコは、AもしくはB型の抗原に対する自然の抗体を有していない。
【０００４】
ネコの血液型の一般的機構や遺伝形態の知識にかかわらず、正確な血液型の判定は依然として重要である。希少であるAB型においては、遺伝様式がわかっていないので、血液型の判定は特に重要である。国内短毛（DSH）種や国内長毛（DLH）種のネコにおいてはA、B、AB型の３タイプの内、A型が最も多い。血液型Bは、ある品種、特にペルシャネコ、アビシニアン、ビルマン、及び関連した最近の品種、たとえば、ヒマラヤンやブリティッシュショートヘアーにおいての方がずっと割合が高い。３つの血液型中、AB型は極めて少なく、また赤血球表面にAとBの両抗原が存在していることにより特徴付けられる。血液型は、遺伝的特徴からかなり高度の正確さで推測可能であるものの、個々の血液型は、両親の血液型がわかっている場合にしか推測できない。さらに、両親が異なった血液型である場合にしか、統計的な予測ができない。血液型を判定するためには被検動物の血液型を調べることが必須であり、これが血液型を正確に判定する唯一の方法である。
【０００５】
現在では、B型のネコから作られたネコ抗A抗血清が、A型血液の判定のための試薬として用いられている。抗A抗血清を作るには、B型のネコを長期間多数飼育しなければならない。ネコから定期的に採血し、血液型判定のための試薬とするために血清を分離しなければならない。抗体力価、または抗体濃度がネコ個体毎に異なっていることから、血液型判定用血清はバッチ間の能力差異を監視しなければならないので、これらの手法は面倒であり、結果的にコストが嵩みがちである。また、血液型判定血清作成を目的としてネコから定期的に採血を行うことは批判を受ける惧れがあり、動物愛護グループや世界の色々な地域の政府機関から禁止される惧れまである。
【０００６】
迅速なカードテストが使用可能となって、以前よりも獣医学技術者によるネコの血液型判定が定期的に行われるようになっている。現行の血液型判定の製品は、A型の判定にB型血液のネコから得た抗A抗血清を用い、B型の判定に小麦胚芽レクチン（WGL）を用いている。上述の通り、ネコの抗A型抗血清は、高価であり、また取得するのにかなりの労力を要しがちである。加えて、原料調達元と調製段階における変動が、その特異性と感度に影響を及ぼす。
【０００７】
上記状況を踏まえ、ネコの血液型判定用のより特異的で簡単に製造可能な試薬の開発が望まれている。ネコを飼育し定期的に採血しなくてもよい方法も、さらに望まれている。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、ネコの血液型を判定する方法とそのためのキットに関するものである。本発明は、ネコの血液A型を特徴づける抗原上の１ないしそれ以上の受容体と結合する少なくとも一つの単離されたネコの抗体にも関係している。キット、方法ともに、ネコの血液型特異的A抗原を認識する二つの異なるモノクローナル抗体の使用を含んでいる。抗体の一つは糖脂質A抗原(NeuGc)2GD3を認識する。もう一方の抗体は、(NeuGc)2GD3以外の第２の糖脂質をA抗原として認識する。ネコのA型血液が正確に認識され、その赤血球が凝集されるかぎり、いかなるモノクローナル抗体も使用可能である。特に本発明は、血液のサンプルにネコの糖脂質A抗原が含まれているかどうかを判定するのに使用される。
【０００９】
本キットは、血液サンプルと第１と第２モノクローナル抗体の混合物との接触を促通する、カードのような基体を選んで形成されている。カードを使用するのが望ましいが、血液サンプルと抗体混合物を接触させうるものであればどのようなシステムあるいは機器でも使用可能である。代替となるテストシステムとしては、試験管の使用が挙げられる。さらにまた、B型血液によって凝集する物質もキットに含め得る。前記抗体は、血液凝固が視認できるかぎり、いかなる濃度でも使用可能である。タンパク質の劣化を妨げる他の構成物質を前記抗体に混合することも好ましい。タンパク質を保存すべく、抗体混合物中の湿気が取り除かれれば、さらに好ましい。タンパク質保存のための方法の一つは、前記混合物を凍結乾燥することである。
【００１０】
この方法は、被検ネコから血液サンプルを収集し、前記抗体混合物とある量のサンプルとを接触させる工程を含む。当該血液サンプルは、B型血液を凝集させる薬剤と接触させても良い。そうして抗体と血液サンプルの混合物は、抗A抗体によって、またオプションとして抗B物質によって、血液凝集を生じるかどうか観察される。
【００１１】
ネコのA型血液と結合する受容体を持つものである限り、いかなる抗体も本発明で使用することができる。糖脂質A抗原(NeuGc)2GD3に対する受容体部位を有しているモノクローナル抗体が望ましい。第２モノクローナル抗体は、(NeuGc)2GT3に類似する糖脂質A抗原に対する受容体部位を有していることが望ましい。
【００１２】
本発明は、ネコの血液型のテストを行うのに迅速で簡単な方法であるので、非常に有益である。さらに、本方法の方法とキットは、血液検査に使用するための血清を得るための多数のネコを飼育する必要性を多少とも解決する。本発明は、従来の方法よりも正確であるということも、また有益である。公知の遺伝的特徴に頼るよりもさらに正確でもある。本発明は、血液型Aを判定するために２つの異なるモノクローナル抗体を使用している点が重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、採血されたネコの血液型を判定する方法と、当該方法に用いられるキットに関する。具体的に、当該方法及びキットは、それぞれがネコの血液グループ特異的A抗原を認識する第１と第２のモノクローナル抗体の混合物を使用する。こうして当該キット及び方法は、ネコの血液を正確に分類するために使用できる。本発明はまた、ネコ血液型A型をの判定に使用可能な、少なくとも２種類のモノクローナル抗体にも関する。当該キットに含まれている抗体は、ネコのA抗原(NeuGc)2GD3そして少なくとも１つの他のネコのA抗原を認識する。
【００１４】
前記キットは、ネコの血液グループ特異的A抗原を認識するモノクローナル抗体を最初に形成することにより成る。当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞細胞系を作成することが望ましい。しかしながら、望ましい抗体を産生するものであれば、他のいかなる方法に従っても前記モノクローナル抗体は作成しうる。前記モノクローナル抗体とハイブリドーマ細胞系を作成するための望ましい方法は、実施例１において具体的に開示される。
【００１５】
前記方法は、血液型A型のネコから血液を採取することから始まることが好ましい。その後、赤血球を血清から分離し、続いて赤血球膜から脂質を抽出する。薄層クロマトグラフィーを使用することにより、糖脂質を脂質残余物から分離することが可能である。次に、分離された赤血球膜糖脂質と一緒になっているリポソーム類が準備される。その後、ネズミ又は他のホスト生物に、前記リポソームの懸濁液を腹腔内注射する。これで免疫グロブリンＭ抗体の産生が促進される。同じネコ抗原A受容体部位を有する他の血清タンパク質も用いることができると仮想される。リンパ球を前記ネズミから採取し、ネズミの骨髄腫細胞と融合する。得られたハイブリドーマ培養細胞を、ネコの特異的A抗原を認識する抗体についてスクリーニングする。望ましい抗体を生産する細胞を、さらに増殖するよう生育させる。
【００１６】
ネコの特異的A抗原を検出する二つの異なるモノクローナル抗体を産生する２種類のハイブリドーマ細胞系を有することが望ましい。一方の抗体が、ネコA型血液の糖脂質抗原の大部分を占める糖脂質A抗原(NeuGc)2GD3を認識することが好ましい。さらに、(NeuGc)2GT3に類似している第２の糖脂質抗原を他方の抗体が認識すれば、好ましいことである。２つの異なる糖脂質抗原を認識することにより、２つの異なる抗体を含むキットの結果の正確さは増す。異なる抗原受容体を有する故に、各抗体は具体的に異なっている。抗体が単独で使用された場合に、A型血液を常に認識するとは限らないので、２種の異なる抗体を含有することは重要である。特に、AB血液型は、(NeuGc)2GD、(NeuGc)2GT3、及び(NeuGc)2GT3類似抗原のうち、少なくとも一つのA抗原を有している。一方の抗体で検出される糖脂質は、たいていの場合(NeuGc)2GT3、もしくは他の(NeuGc)を含むガングリオシドである。そのようなガングリオシド類はA型赤血球細胞で見い出された。２つの異なる抗原に対する２つの異なる抗体が使用されれば、AB型の血液を正しく識別しやすくなる。血液型がABのネコは異種遺伝子型（heterogeneous）であるから、２つの異なる抗体を使用することが必要である。そのようなネコの血液型を正確に識別するために、明瞭にA抗原を認識する２つの異なった抗体が必要である。
【００１７】
前記ハイブリドーマ細胞系によって産生される望ましいモノクローナル抗体は、１３G3と４E10と標示される、ネズミの免疫グロブリンＭ抗体である。４E10は、A抗原(NeuGc)2GD3を認識する抗体に相当する。13G3抗体は、A抗原(NeuGc)2GT3もしくは関連した抗原に相当するA抗原を認識する。これら２つの抗体を組み合わせて、ネコの血液型判定に用いることができる。これら２種の抗体、または同類の抗体類が血液サンプルの血液型判定に用いることができるのであれば、どのような種類の異なる基体や検査過程も用いることができる。上述の糖脂質A抗原受容体部位に類する受容体部位を有する抗体なら、13G3や４E10と標示された抗体の代替として使用できよう。ただしその抗体は、ネコの血液グループAの血液サンプル型を正確に判定せねばならない。
【００１８】
現在許されている抗体使用による血液型判定のためのいかなる方法においても、前記２つの抗体が用いられ得る。また、診断への使用、研究への使用、そして治療への使用を含む将来の応用においても、前記２つの抗体が使用され得る。その応用には赤血球凝集法、中心体凝集法（microsphere agglutination）、酵素免疫測定法、蛍光抗体法、免疫沈降反応法、寒天ゲル免疫拡散法、免疫組織化学法、組織もしくは体液、及びその他から抗体により抗原精製する方法などを含むが、これらに限定されない。前記抗体は、現在まで現実化されていない療法へも適用しうる。
【００１９】
前記抗体は単独使用、あるいはキットの一部として包含されうる。当該キットを準備するには、少なくとも２つのウェルを有するカード部材を保有することが望ましい。さらに望ましいのは、カード部材が、２つの対照区と血液サンプルを試験するのに十分なウェルを有することである。結果の正確さを保証するために、付加的なウェルがあることが望ましい。モノクローナル抗体の混合物を予め上に置くことが出来さえするものならば、商業的に入手できるどんなカードであっても使用できる。望ましいカードの例としてはカリフォルニアのロサンジェルスにあるDiagnostic Products CorpのPathoDx カード（登録商標）が挙げられる。
【００２０】
上記に述べたモノクローナル抗体は、任意で、溶液に混合できる。溶液は、2％のウシ血清アルブミン（BSA）と0.02Mのリン酸緩衝食塩水を含むことが望ましい。Stabilicoat（登録商標） をこの段階で加えても良く、または、以下に述べるように後で混合物と接触させても良い。Stabilicoat（登録商標） は、劣化を防ぐため抗体混合物に添加される。Stabilicoat（登録商標） 以外の溶液であっても、抗体の劣化を防ぐものであれば使用できる。異なる量のPBS及びBSAもまた使用可能である。
【００２１】
前記13G3モノクローナル抗体は、約34マイクログラム/ミリリットル（μg/ml）から約136μg/mlの間の範囲の量で溶液に加えられることが望ましい。約68μg/mlに等しい量の13G3抗体が加えられることがさらに望ましい。前記4E10は約64マイクログラム/ミリリットル（μg/ml）から約256μg/mlの間の範囲の量加えられる。約128μg/mlに等しい量の４E10が加えられることがさらに望ましい。量は異なっていてもよいのだが、前記量で最高の結果を得られることが観察されている。実際、血液サンプル中にある赤血球を凝集するのに十分な量の抗体があれば、いかなる量であっても使用できる。十分な凝集反応とは、裸眼で見えるということである。
【００２２】
随意で溶液に入れうる前記抗体混合物は、等量の血清Stabilicoat（登録商標）と混合することが望ましい。溶液中でStabilicoat（登録商標）と混合されている抗体は、カード部材上の、少なくとも１個、より好ましくは３個のウェルに添加される。抗体とStabilicoat（登録商標）との混合物は、絵筆を使って、判定する場所全体に塗布される。キットの基質上に作られる他のウェルには、小麦 Triticum vulgaris のような抗B試薬が添加される。他の抗B試薬も代替として使用可能である。抗体がStabilicoat（登録商標）と溶液に混合された後の抗B試薬及び抗A試薬は、ともに、50マイクロリットル（μl）と100 μlの間で等量加えられることが望ましいのであるが、その内でも添加量100μlが望ましい。100 μl と等しい組み合わせも用い得る。裸眼で観察可能な凝集反応を起こすのに十分な量であることから100 μl 量が選択されるが、別の量であってもよい。
【００２３】
その後、カードは−20℃で１時間凍結され、その後−１０℃で一夜凍結乾燥されることが望ましい。タンパク質混合の長期保存できる代替法が用いられても良い。得られたカードは、室温でも保存可能であるが、4℃以下で保存すれば、有効期限を１年より長くできる。
【００２４】
また、他の基体部材をカードの代わりに使用してもよい。たとえば、抗体を置いておくことができる試験管や類似の部材を用いることができる。抗体混合物と血液サンプル間の接触を促進することができるものであれば、いかなる基質機器や装置であっても使用可能である。典型的には、抗体混合物は基質にかかわりなく、同じ量において使用可能である。
【００２５】
検査されるべき血液サンプルは被検ネコから採取される。血液サンプルは、赤血球だけから構成されているか、血漿や血清、他の血液構成物質を含んでいてもよい。エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)のような抗凝固剤を加えても良い。凍結乾燥されたカードを使用する場合には、溶液を戻すために50μｌのPBSを各ウェルに加える。
【００２６】
50μｌから100μｌの間のネコのEDTA全血サンプルを抗Aのウェルに添加し、サンプル血を抗Bのウェルに添加する。Dispenstir（登録商標）の端が平らな部分、もしくは木の棒で、全楕円形を覆うように、全血とPBSを12回転攪拌する。カードを１分間揺り動かして、そして読み取る。抗Aモノクローナル混合物によって楕円形内に血液が凝集するならば、これは、そのネコの血液型がAであることを示している。もし、抗Aと抗Bの両方で血液が凝集するならば、それは、血液型がABであることを示す。
【００２７】
本キット及び方法によって、現時点で99.9％（99.9% of the time）ネコの血液型を正確に判定可能である。もちろん、正確さを保証するためには、正しい手順に従わねばならない。カード式のキットの代替もまた使用可能である。たとえば、カードキットの代わりに、試験管を使用可能である。上記で挙げられた抗体類が含まれている限り、各種のどんなタイプのキットも使用可能である。
【００２８】
以下の実施例は、説明を意図しただけのものであり、特許請求の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１
以下は、ネズミの免疫グロブリンM（IgM）モノクローナル抗体産生のための方法に関するものである。
【００３０】
ネコの血液サンプルは、カンサス州立大学の臨床病理研究所、及び商業獣医研究所（コロラド獣医研究所、Broomfield、CO）に委託して入手した。ハイブリドーマの検定と赤血球膜の準備に用いられた血液は、血液型Aのネコ、Bのネコ、ABのネコ、及びカンサス州立大学動物供給施設で飼っている6匹の羊から得た。羊の赤血球は、公知の膜糖脂質の供給源として用いた。商業研究所（Stormont Laboratories, Woodland, CA）及びその研究所の血液型判定カードによって、ネコからの血液の血液型を決めた。サンプル血は、頚静脈静脈穿刺によって得、EDTA抗凝固剤を用いた。
【００３１】
試験管凝集反応、または血液型判定厚紙基体カード(PathoDx（登録商標） cards, Diagnostic Products Corp., Los Angeles, CA)によって、各血液サンプルの血液型を判定した。カード上で血液型を判定する場合、50μｌの全血を基体部材の色々な決められた場所に置き、血液型Bのネコから自然に産生された抗A抗血清（未希釈）50μｌ、またはWGI (リン酸緩衝食塩水（PBS）、ｐH7.4の60 μg/ml) 50μｌと混合した。カードを2分間揺り動かし、それから肉眼で凝集反応を調べた。試験管凝集反応には、100μｌの抗A抗血清、または100μｌのWGL（60μｌをPBS（１％のBSAを含む）で１：8に希釈）を赤血球の100μｌの1％食塩懸濁液に加えた。試験管の内容物を混合し、15分間室温でインキュベートした後、遠心分離して肉眼で凝集を観察した。
【００３２】
ヘモグロビンを含まない赤血球膜の残骸を低浸透圧崩壊により24時間以内に収集して準備した（Dodge 他1962）。一夜保存する場合は、EDTAにより抗凝固化したサンプルを4℃にてクエン酸デキストロース中においた。いずれの試料でも、全血は3000rpmで10分間遠心分離し、血漿を取り除き、沈降した赤血球は、0.02MのPBSで3回洗浄した。1ミリ浸透圧のDIFPを含む10 ミリ浸透圧のリン酸ナトリウム緩衝液により、赤血球は即座に崩壊した。赤血球膜は続いて、10ミリ浸透圧のリン酸ナトリウム緩衝液で5ないし6回洗浄した。赤血球膜のタンパク質濃度は、標準ウシ血清アルブミンを用いてビシンコニン酸タンパク質分析により測定した。その後、膜は−70℃で使用時まで保管した。
【００３３】
それから、公知手法 (Irwin and Irwin 1979) の改変法により、赤血球膜から脂質を抽出した。膜を、試験管内でクロロホルム対メタノール（C：M）が2対1（体積比）の液5mlと混合し、水浴で60℃、5分間暖めた。そして3000rpmで15分間遠心分離して沈殿物を除去した。脂質を含む上澄を除去し、窒素気流中で乾燥した。乾燥した脂質を、C対Mが1対1(体積)の液に再懸濁し、薄層クロマトグラフィー（TLC）板に点状に置いた。
【００３４】
次に、脂質からA抗原及びB抗原を分離するために、薄層クロマトグラフィーを用いた。赤血球膜脂質抽出物のサンプル600μｌを水平帯の標本TLC薄層板に適用した。また、同抽出サンプル40μｌと市販標準(NeuGc)2GD3 8μｌを端上が穿孔された薄層板の細長い一片の分離した展開線上に用いた。薄層板を、C対M対2.5規定のNH4OHが、60対40対9（体積比）の展開溶媒を含むガラス容器中で展開した。濾紙を容器の内部壁に置き、下の部分を溶媒に浸し、溶媒蒸発の芯となるようにし、容器内気相を飽和状態に維持した。溶媒先端線が板の上端から1C：M以内に来るまで展開させた。この後、薄層板を室温で乾燥した。糖脂質のバンドを、前記穿孔された細長い一片上に、オルシン塩化鉄を噴霧し、100℃に熱することによって可視化した。残りの（染色されていない）予備の薄層板上のバンドを、一方のオルシン染色された細長い一片上のものとの比較によって確認し、予備の薄層板における、相当すると推測される領域を、削り取って25mlのネジ栓のガラス試験管に入れた。そしてC：Mが2：1の混合液で２度抽出し、3000rpmで10分間遠心分離した。それから、C：M：水（体積比50：50：15）液で２度抽出した。各サンプルのすべての抽出液からの上澄液は、鐘型フラスコに貯留し、C：M液を除去するため蒸留分離した。残った脂質残留物をC：Mが1：1の液1mlに懸濁した。分離された抗原の純度は、アルミニウムベースのシリカゲル60 高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）板上でのTLC、及びオルシン塩化鉄とその後100℃へ加熱することによる視覚化により評価した。
【００３５】
前記分離された赤血球膜糖脂質を包含しているリポソーム類を、公知の手法（Wataraiら、1987）の改変法により調製した。100μｌの塩化ジパルミトイルフォスファチジル（50 μmol/ml C：M 1:1）と20 μl のSalnionella Minnesota リポ多糖体(5 mg/ml C：M 1:1)、及び20μｌの前記分離された赤血球膜糖脂質を混合した後、残っている脂質が完全に乾燥するまで窒素気流中で有機溶媒を蒸発させた。 脂質を滅菌PBS5mlに再懸濁し、水浴中で1分間50℃で加熱し、懸濁液が濁るまで、80％出力で1-3秒間音波破砕（Ultrasonic Homogenizer, ColePanner Instrument Co., Chicago, IL）した。凝集検定に用いる目的で、免疫グロブリンM抗体の産生促進のために、雌Balb/ｃ ネズミに、リポソーム懸濁液0.5mlの腹腔内注射を一回行った（Wataraiら、1987）。
【００３６】
リポソーム免疫処置の3日後、ネズミは吸入麻酔を行ってから頚部脱臼により安楽死させた。脾臓のリンパ球を採集し、洗浄し、50％のポリエチレングリコールを用いてネズミの骨髄腫細胞AG8U.1（ATCC, Rockville, NW）と融合させた。熱により不活性化された胎児の脹脛部血清L-グルタミン酸を12.5％、MEM非必須アミノ酸、MEMビタミン溶液、及び硫酸ゲンタマイシンを補い、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを添加したDulbeccoのMEMを含む、96のウェルを有するプレートにおいて、ハイブリドーマを選択した。プレートは7.3% のCO2中で10-14日間37℃でインキュベートされた。そして細胞のコロニーが肉眼で観察可能になったときスクリーニングに供された。
【００３７】
ハイブリドーマ培養の上澄を、ネコの血液型AまたはB赤血球に対する抗体についてスクリーニングした。血液型Aのネコ、または血液型Bのネコ由来の赤血球を各ウェル中の100μｌのハイブリドーマ上澄に加えた。15分間室温でインキュベートした後、試験管を３０００ｒｐｍで15秒間遠心分離し、可視的凝集を評価した。A型もしくはB型ネコ赤血球特異的凝集を示すハイブリドーマを、限定希釈によりクローニングし、非選択培地に広げた。所望の抗体を産生する、選択的にクローン化されたハイブリドーマを、予めプリスタンを投与されたBalb/cネズミに腹腔内注射することによって、モノクローナル抗体を大量産生した。
【００３８】
モノクローナル抗体（MoAb）は、抗原特異的抗原決定基系を用いることにより抗原決定基となる。各MoAb（１％ウシ血清アルブミン（BSA）と0.1％Tween 20を含むPBSで2：1希釈）からのハイブリドーマ上澄を、HPTLCにより分離された赤血球ガングリオシドを含む二つのストリップと共に4時間温度を保った。洗浄後、各ストリップは、抗原決定基特異的試薬と、ウサギ抗ネズミ免疫グロブリンG１またはウサギ抗ネズミ免疫グロブリンM（BSAとTween20を含むPBSで１：１５希釈）と共に１時間インキュベートし、更にヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG西洋ワサビぺルオキシダーゼ結合体（Tween 20を含むPBSで１：4000希釈）と共に１時間インキュベートする。ストリップは、0.03%の過酸化水素を含んでいるｐH 56.0の80 mmol/1クエン酸―リン酸緩衝液中の400μg/ml のOPDからなる基体溶液で展開する。
【００３９】
以上により抗原特異性テストが可能なモノクローナル抗体が産生された。
実施例2
実施例１のモノクローナル抗体を、多数のネコの血液サンプルに対し、試験管凝集反応でテストした。各MoAbからハイブリドーマ培地のサンプル100μｌを各血液サンプルの赤血球の１％食塩水懸濁液100μｌと混合し、３７℃で15分間インキュベートした後、試験管を３０００ｒｐｍで15秒間遠心分離し、可視的凝集を観察した。凝集反応は、公知の手順（Walker 1990）に従って、０から４＋の尺度で評価した。
【００４０】
抗A MoAb（13G3、23G5、4E10、4G2のクローンを作る）を産生する4つのIgM細胞系、及び抗B MoAb（9D10及び17G7のクローンを作る）を産生する２つのIgM細胞系を作った。これらのMoAbによる、血液型がわかっているネコの血液からの赤血球の凝集反応テスト結果の概要を下記の表１に示す。
【００４１】
【表１】
2005505755.tif 000002
【００４２】
MoAb及びネコの血液型判定試薬との凝集反応は、概して３＋または４＋のスコアであった。4E10を除いたすべての抗A MoAbは、すべてのA型サンプルを凝集させた。MoAb 4E10は、A型血液型2075サンプル中１個を検出しなかった。このサンプルを他の抗A MoAbではテストしなかったが、抗B MoAbでテストした際には凝集反応を起こさなかった。３１のB型サンプル中の１個を１＋凝集スコアで凝集したMoAb 4g2を除き、上記抗A MoAbは、B型血液サンプルをまったく検出しなかった。すべての抗A MoAbはまた、10匹のAB型ネコからの血液に対してもテストされた。MoAb 13G3及び4G2はそれぞれ、AB型サンプル10個中同じ7個に凝集反応を起こした。MoAb 13G3及び4G2により検出された7個のサンプルの一部を構成する10個のAB型サンプル中同じ4個に対して、MoAb 23G5と4E10のそれぞれは凝集反応を起こした。残りの3個のAB型サンプルは、ネコの血液判定試薬で３〜４＋のスコアの凝集を示したが、どの上記抗AMoAbによっても凝集しなかった。各抗A MoAbは、羊の赤血球に対しても試験管凝集反応によりテストされた。MoAb 13G3及び4G2は、すべての羊からの赤血球を示２〜３＋のスコアで凝集させ、MoAb 4E10及び23G5は、いかなる羊血液サンプルでも凝集反応を示さなかった（データは示していない）。これらの羊の1匹からの赤血球膜は、続いてTLC免疫染色のために使用された。
【００４３】
抗B MoAb である9D10及び17G7はそれぞれ、B型血液55サンプル中54個、及びA型サンプル1428サンプル中3個を検出した。これらのMoAbによって検出されなかったB型サンプルの一つは両抗体に対して異なっていた。MoAb 17G7は、9D10によって凝集しなかったB型血液サンプルを強力に凝集させたが、MoAb 9D10は、17G7によって検出されなかったB型サンプルと示した凝集反応は１+であった。3個のA型サンプル中2個が誤って検出されたことは、両抗B MoAbに対しても同様であった。これらの血液サンプルの内一つは、各抗B MoAbと痕跡程度から１＋の凝集反応を示した。第二の血液サンプルは、MoAb 9D10によって溶血し、また17G7によって２＋の凝集、そしてネコの血液型判定試薬（抗B MoAbと示す凝集は１＋に過ぎない）と変則的に反応し２＋の凝集を示した。モノクローナル抗体9D10は10個のサンプルのうち9個のAB型サンプルを検出し、MoAb 17G7は10個のサンプルのうち8個のAB型サンプルを検出した（表１）。
【００４４】
モノクローナル抗体類がネコの血液サンプルの血液型を正確に判定することが判明した。抗体産生と抗体選択に関する本件の主要な出願内容は、直接血液細胞凝集工程によるネコの赤血球細胞型判定である。
実施例3
以下の実施例は、本発明のモノクローナル抗体の抗原特異性を示すものである。
【００４５】
HPTLCプレートの各展開線に、糖脂質抽出物を約25〜35μｌ置いた。C：Mが1：1の1ml中で再構成することによって準備したガングリオシド標準(NeuGc)2GD3を、6〜8μｌずつ展開線に置いた。上記記載と同様にC：M：NH4OH溶媒（60：４０：9容積比）中で薄層板を展開した。ストリップの一つは、糖脂質バンドを可視化するため、オルシノールで処理し100℃で熱した。残りのストリップは、公知の方法（BuehlerとMacher 1986）の改変法を用いて免疫染色した。乾燥後、ストリップをヘキサンに溶解した0.3％ポリ（イソブチルメタクリル酸）で均一にプラスチックコーティングし、乾燥した。ストリップを1％のBSAと0.1％のTween 20とを含むPBS中で１時間ブロッキングし、Tween 20を含有するPBSで3回洗浄した。そして、抗Aまたは抗B MoAbハイブリドーマ上澄液（2：1希釈）、MoAb 32〜27（1：20希釈）またはMoAb R-24（10μg/ml）と共に4時間インキュベートした。ストリップは、Tween 20を含有するPBS中で3回洗浄し、ビオチン化したヤギ抗ヒトIｇM、またはビオチン化したヤギ抗ネズミIｇM中でインキュベートされた。すべてのMoAbとビオチン化した抗体はPBS−BSA−Tween 20中で希釈した。ストリップは、Tween 20を含むPBS中で洗浄し、1時間Tween 20を含むPBS中でABC試薬と保温し、そしてPBSで3回洗浄した。ストリップは、0.03%の過酸化水素を含んでいるｐH 5.0 の80 mmol/1クエン酸―リン酸緩衝液中400μg/mlの OPDからなる基体溶液で展開させる。
【００４６】
抗A MoAbの結合特異性は、ヒトMoAb 32〜27（抗(NeuGc)2GD3）との比較において、A型ネコ、B型ネコ、もしくは市販標準(NeuGc)2GD3 及び羊から得た赤血球膜糖脂質のTLC免疫染色によって評価した。MoAb 23G5と4E10はそれぞれ、(NeuGc)2GD3と共に移動する、A型サンプルにおける共通のバンドを染めた。MoAb 13G3と4G2もまた、わずかに(NeuGc)2GD3.の後に移動する、A型糖脂質における特定の単一のバンドを検出した。MoAb 32〜27は、A型サンプルにおいて3つのバンドを強く染色する。その中で最も大きなバンドは(NeuGc)2GD3 と共に移動するものであり、他のものはMoAb 13G3と4G2によって検出されるバンドと共に移動する。MoAb 32〜27によって羊の糖脂質において検出されるバンドは、これらのA型サンプルのものとは異なっている。4つの抗A MoAbのいずれも、B型糖脂質も市販標準(NeuGc)2GD3 も検出しなかった。同様に、MoAb 32〜27は、B型糖脂質とは反応しなかった。追加した38匹のA型のネコからの赤血球膜糖脂質のTCL免疫染色を、MoAb 4E10と13G3で実施した。38匹のネコすべてにおいて、4E10はバンドを検出した。
【００４７】
抗B MoAbのTLC免疫染色による特徴判定は、同じ血液型であるA型とB型ネコから得られた赤血球膜糖脂質によってなされた。MoAb 9D10と17G7の両方とも、オルシノール染色によって視覚化された、市販標準(NeuGc)2GD3 と共に移動する、B型血液糖脂質における同じバンドを確認した。ネズミのMoAb R-24（抗(NeuGc)2GD3）は、B型サンプルと同じ位置にバンドを検出した。抗BmoAb及びMoAb R-24のいずれでも、A型糖脂質からバンドは検出されなかった。
【００４８】
ネコの血液A型の判定におけるモノクローナル抗体の正確さは、さらに立証された。
実施例4
赤血球膜タンパク質は、SDSドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（（SDS―PAGE）／免疫ブロット法）におけるポリアクリルアミド厚板状ゲル（7.5％）上で、不連続緩衝液系を使用して、分離される。参照のために、ビオチン化された高分子量標準を使用した。分離されたタンパク質は電気泳動的にPVDF膜に移送され、PBSで20分間洗浄される。ブロットは、４℃で一晩、0.2％のBSAを含むPBS中でブロッキングされ、その後、0.05％のTween 20を含むPBSで3回洗浄される。ブロットは、PBS-BSA-Tween 20液で2：1に希釈された抗A、または抗B MoAbと共に4時間37℃にインキュベートされ、洗浄される。そして更にビオチン化ヤギ抗ネズミIgGまたはIgM（PBS-BSA-Tween 20液による1：200 希釈）と共に1時間インキュベートされる。ブロットはTween 20を含むPBS中で3回洗浄され、ABC試薬と共に１時間インキュベートされる。Tween 20を含むPBS中で最後の洗浄を行った後、ブロットは製造所の使用法に従って、４−CN−DAB（４−クロロナフトールージアミノベンジジン（Pierce Chemical Co., Rockford, IL））基体液によって展開される。
【００４９】
上記血液型A及びB型のネコから得られた赤血球膜タンパク質のSDS-PAGE調製物の免疫ブロッティングを、各抗A及び抗B MoAｂについて実施した（データは示していない）。抗体間ではバンドのパターンにはわずかな違いが認められるが、どのような抗体に関してもA型とB型ネコの糖脂質間には違いが現れない。A及びBの両サンプルにおいて、6種のMoAbすべてが約74ｋDaにバンドを検出した。またMoAb 4G２は、45ｋDaに更なるバンドを検出する。ネガティブ対象区（ハイブリドーマ培地）は、A型赤血球膜におけるタンパク質であってもB型赤血球膜におけるタンパク質であっても、いかなるバンドも染色しない。
実施例5
以下のテストは、テストに使用される各抗体の正確な量を決定するために行われた。カード式の凝集反応テストを行った。全血を使用した。特異的抗体及びテストされた濃度を下記の表２に示す。凝集反応テストのために、2％のBSAを含むPBSで、抗体を下記に示す望ましい希釈まで希釈した。当該抗体混合物を、長方形のカード上のウェルに置いた。そこで、抗体サンプル50μｌを全血サンプル50μｌと混合した。凝集反応は、公知の手順（Walker 1990）に従って、０から４＋の尺度で評価した。このカードテストは正しい抗体量を決定するために行われた。カードテスト法は、試験管凝集反応テストよりも感度が低い。
【００５０】
【表２】
2005505755.tif 000003
【００５１】
以下は表2に列挙した希釈度のリストである。
3.2 mg/mlの 4E10 = 3,200 μg/ml
10倍希釈 = 320 μg/ml
20倍希釈 = 160 μg/ml
40倍希釈 = 80 μg/ml
4.2 mg/mlの13G3 = 4,200 μg/ml
25倍希釈 = 168 μg/ml
50倍希釈 = 84 μg/ml
100倍希釈 = 42 μg/ml
表2に示されるように、320μg/mlの４E10は、AB血液型と適切な凝集反応を起こす十分な量ではなかった。320μg/mlの4E10は、Agata血液と凝集反応を起こすには十分な量であった。168μg/mlの13G3は、AB及びAの両血液型と適切な凝集反応を起こすのに十分な量であることを示した。これら２つの抗体を組み合わせた混合物は、AB及びAの両血液型と適切な凝集反応を起こした。
実施例6
実施例５の過程は、抗体個々又はその混合物について異なる量を用いて行われた。
3.2 mg/mlの4E10 = 3,200 μg/ml
10倍希釈 = 320 μg/ml
4.2 mg/mlの13G3 = 4,200 μg/ml
25倍希釈 = 168 μg/ml
50倍希釈 = 84 μg/ml
100倍希釈 = 42 μg/ml
200倍希釈 = 21 μg/ml
400倍希釈 = 10.5 μg/ml
800倍希釈 = 5.25 μg/ml
諸結果は、下記の表3に示される。
【００５２】
2％BSAを含むPBSで希釈された50μｌの抗体を、50μｌの全血と混合した。
【００５３】
【表３】
2005505755.tif 000004
【００５４】
【表４】
2005505755.tif 000005
【００５５】
表4は、13G3抗体が凝集反応に影響を与えずに著しく希釈されうることを示す。21μg/ml（13G3の200倍希釈）と同等量の13G3抗体は、適切な凝集反応を起こす。また4E10のみの場合、AB血液型では直ちに凝集を起こさないが、血液型Aでは凝集を起こした。
実施例7
ネコの血液型判定カードを下記のように準備した。
【００５６】
実施例１の方法で作成した13G3と4E10の２つの抗Aモノクローナル抗体を、2％のウシ血清アルブミンを含む0.02Mのリン酸緩衝食塩水（PBS）中に混合した。ネズミIｇMモノクローナル抗体13G3と4E10の濃度は、それぞれ68μg/ｍｌと128μg/mlであった。等量のStabilCoat（登録商標）免疫アッセイ安定剤(SurModics, Inc. 9924 West 74th Street, Eden Prairie, MN 553443523)を当該モノクローナル抗体混合物に添加した。血液型判定カードは、8つのウェルを有していた。モノクローナル抗体混合物の100μｌをそれぞれ4つのウェル中に置き、♯５の絵筆でウェルの中に塗り広げた。
【００５７】
抗B試薬は、1％DMSO及び0.0036g/ｍｌブドウ糖を含む、小麦Triticum vulgaris (小麦胚芽)由来のレクチンである。当該レクチン(6mg)を100mlのリン酸緩衝食塩水に溶解した。レクチン100μｌをそれぞれ4つのウェル中に置き、♯５の絵筆でウェルの中に塗り広げた。
【００５８】
カードを−20℃で１時間凍結し、−10℃で凍結乾燥した。カードは乾燥剤の包み１つと一緒にポリエチレン袋に封入した。カードは4℃で保存し、すぐに使用可能な状態とした。
実施例8
実施例７の手順は、本実施例のテストカードで行われた。テストカードの等量抗体：
200倍希釈した 13G3 (4.3 mg/ml) 22 μg/ml = 55 μl + 10 ml
10倍希釈した 4E10 (3.2 mg/ml) 320 μg/ml = 1 ml + 9 ml
このカードは1匹以上のネコをテストするようにデザインされている。１４匹のネコのうちの１匹から得た50μｌの全血をテストカードに置き、ネコの血液型を判定した。血液サンプルの添加に先立ち、抗体溶液を再構成するために50μｌのPBSを各ウェルに加えた。総計14のサンプルのテストが実施された。AB型血液のネコにおける結果は、
アビーABネコの全血50μｌに
13 G3 を 22 μg/ml添加             陽性
4E10を320 μg/ml添加  陽性
13GBと4E10を混合し添加（11μg/ml の13G3 及び 160 μg/mlの 4E10）陽性
結果を表4に示す。表4に示されるように、13G3/4E10抗体混合物は、血液型Aであるネコをすべて識別することに成功した。13G3/4E10抗体混合もまた、血液型ABであるネコ4匹中3匹を識別することに成功した。モリーABネコのみAに対して陰性であった。
【００５９】
【表５】
2005505755.tif 000006
【００６０】
モリーABネコについては、全血25μｌのみを用いてテストカード上で再試行した。この結果は、Aに対し陽性であった。
【００６１】
【表６】
2005505755.tif 000007
【００６２】
モリーABネコについて、更に10μｌの全血のみを用いて（一滴のPBSに一滴の全血を加える）再試行し、2倍希釈液の一滴を混合した。これらの結果は、表5に示される。
【００６３】
表４と表5からわかるように、抗体の組み合わせにより容易にA型とAB型が判定される。
実施例9
実施例5の手順を以下に示す。これらの結果は、表6に示される。
【００６４】
13G3 1.7 mg/ml 25倍希釈＝    68 μg/ml
4E10 3.2 mg/ml 25倍希釈＝    128 μg/ml
【００６５】
【表７】
2005505755.tif 000008
【００６６】
4E10抗体単独では、AB型血液で凝集を生ずる結果にはならない。4E10抗体と13G3を混合すると、AB型血液の識別を明確にする結果を生じる。
実施例10
実施例１の抗体と実施例７の手順で使用した抗体を用いる血液型判定カードについて、上記のような標準方法と比較し、正確さを評価した。
【００６７】
再び、前記２つのモノクローナル抗体の混合物をA型血液検出に使用した。血液型判定カードは、B型サンプルをまったく検出することなく（16検体中０例）、正しく225例中225例のA型サンプルを識別し、そして、AB型サンプル5例中5例を識別した。
【００６８】
このカードテストに用いられたモノクローナル抗体がネコの血液サンプルの血液型を正確に判定することが確定された。抗体産生と抗体選択に関する本件の主要な出願内容は、直接血液細胞凝集工程によるネコの赤血球細胞型判定である。
【００６９】
以上で、すべての目的及び求められる利点を満たす、ネコの血液型を判定する方法とキットについて示した。しかしながら、当該技術分野の熟練者には、多数の変更、変形物、改変、及び他の使用法、及び、ネコの血液型判定のための本発明の方法及びキットに他の適用方法の可能性があることが、明瞭に理解される。そのような発明の意図と範囲から離れていない変更、変形物、改変、及び他の使用法、及び他の適用方法は、本発明に含まれているとみなすものであり、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【００７０】
参考文献は下記の通りである。
Buehler J, Macher BA (1989) Glycosphingolipid inununostaining: detection of antibody binding with an avidinbiotin enzyme system. Anal Biochem 158:283287
Dodge J. Mitchel C, Hanahan D (1962) The preparation and chemical characteristics of hemoglobinfree ghosts of human erythrocytes. Arch Biochem Biophys 100: 119130
Hoogenraad N, Helman T, Hoogenraad J (1983) The effect of preinjection of mice with pristane on ascites formation and monoclonal antibody production. J Immunol Meth 61:317320
Irwin CC, Irwin LN (1979) A simple rapid method for ganglioside isolation from small amounts of tissue. Anal Biochem 94:333339
Walker RH (ed) (1990) In: Technical manual. American Association of Blood Banks, Arlington, VA, pp 528529
Watarai S, Handa S, Tadakuma T et al. (1987) Application of liposomes to generation of monoclonal antibody to glycosphingolipid: production of monoclonal antibody to GgOsedCer. J Biochem 102:5967
Comparative Haemotology (1991) 1:196199
Blood. Vol. 79 No. 9 (May 1992), pp 24852491
Comparative Haematology (1991) 1:217219
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2005505755.tif 000042