(57)【要約】  本発明により、（ｉ）修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）酸化防止剤；および（ｖｉ）カルシウム塩、マグネシウム塩、またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬；を含有する液体水性組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）    修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド；
（ｉｉ）  ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；
（ｉｉｉ）酸化防止剤；および
（ｖｉ）  カルシウム塩、マグネシウム塩、またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬；
を含有する液体水性組成物。
【請求項２】
ｐＨが約４．０乃至約７．０の範囲に維持され、例えば、約４．５乃至約７．０、約５．０乃至約７．０、約５．５乃至約７．０、または約６．０乃至約７．０の範囲に維持される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
酸化防止剤（ｉｉｉ）がＬ−またはＤ−メチオニン、メチオニン類縁体、メチオニン含有ペプチド、メチオニン相同体、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン、およびシスタチオニンからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
酸化防止剤がＬ−メチオニンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
酸化防止剤が約０．１乃至約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において存在し、例えば、約０．１乃至約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１乃至約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１乃至約２ｍｇ／ｍｌ、または約０．５乃至約２ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
更に、（ｖ）張度調整剤を含有する、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
張度調整剤（ｖ）が中性塩；単糖、二糖、又は多糖；糖アルコール；アミノ酸；または小ペプチド、もしくはこれら調整剤の少なくとも２種の混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
張度調整剤がマニトールおよび／または中性塩であり、好ましくは塩化ナトリウムである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
張度調整剤（ｖ）が１ｍＭ乃至５００ｍＭの濃度において存在する、請求項６乃至８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
濃度が１０乃至２５０ｍＭである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
更に、（ｖｉ）非イオン性表面活性剤を含有する、請求項１乃至１０のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１２】
非イオン性表面活性剤が、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはポリオキシ２３ラウリルエーテル等のポリソルベートまたはポロキサマーまたはポリオキシエチレンアルキルエーテルである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するために好適な試薬（ｉｉ）が、くえん酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、リンゴ酸塩、リン酸塩、酒石酸、琥珀酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸塩、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、グリシン、または該試薬の少なくとも２種の混合物からなる酸および塩の群から選択される、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
試薬（ｉｉ）の濃度が約１ｍＭ乃至約５０ｍＭである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
試薬（ｉｉ）の濃度が約１０ｍＭである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
カルシウム塩および／またはマグネシウム塩（試薬（ｉｖ））が、約５ｍＭ乃至約１５０ｍＭの濃度において存在し、例えば、約５ｍＭ乃至約１００ｍＭ、約５ｍＭ乃至約５０ｍＭ、または約１０ｍＭ乃至約５０ｍＭの濃度において存在する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
カルシウム塩が、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、およびレブリン酸カルシウムからなる群から選択される、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
マグネシウム塩が、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、およびレブリン酸マグネシウムからなる群から選択される、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
更に、（ｖｉｉ）防腐薬（例えば、フェノール、ベンジルアルコール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、または塩化ベンゼトニウム等）を含有する、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
等張性である、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
薬剤投与のために調合される、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
２乃至８℃において少なくとも６ヶ月間安定である、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、野生型第ＶＩＩａ因子に関して、本明細書に記載されている凝固アッセイ、蛋白分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの１又はそれ以上において試験した場合に、野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、特に好ましくは約１％未満の生物学的活性を有する、請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、活性部位残基Ｓｅｒ３４４がＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、またはより好ましくはＡｌａで置換され、修飾されている、ヒトおよびウシ第ＶＩＩ因子；残基Ｌｙｓ３４１が置換されている、ヒト第ＶＩＩ因子；残基Ａｓｐ２４２が置換されている、ヒト第ＶＩＩ因子；残基Ｈｉｓ１９３が置換されている、ヒト第ＶＩＩ因子；ＦＶＩＩ−（Ｋ３４１Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｓ３４４Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｄ２４２Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｈ１９３Ａ）；ペプチドクロロメチルケトンまたはペプチジルクロロメタンからなる群から選択される試薬との反応により活性部位で修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド；アザペプチド；アシル化剤（例えば、種々のグアニジノベンゾアート誘導体および３−アルコキシ−４−クロロイソクマリン）；スルホニルフッ化物（例えば、フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ））；ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）；トシルプロピルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）；トシリシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）；ニトロフェニルスルホネート；ヘテロ環プロテアーゼ阻害因子（例えば、イソクマリンおよびクマリン）；Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、およびダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンからなる群から選択される試薬との反応により活性部位で修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド、からなる群から選択される、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、ＦＶＩＩ−（Ｓ３４４Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｈ１９３Ａ）；および、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、およびダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンからなる群から選択される試薬との反応により活性部位で修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド、からなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドが約０．１ｍｇ／ｍｌ乃至約１５ｍｇ／ｍｌの濃度において存在し、例えば、約０．５乃至約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５乃至約５．０ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍｌ乃至約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する、請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液体水性組成物の製造方法であって、（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）酸化防止剤；および（ｉｖ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬、を含有する溶液中に、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドを提供する工程を有する方法。
【請求項２８】
血液凝固を阻害する薬剤の製造のための請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２９】
組織因子が介在する反応を阻害する薬剤の製造のための請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３０】
対象における血液凝固を阻害する方法であって、（ｉ）修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）酸化防止剤；および（ｉｖ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬を含有する水性液体組成物の有効量を、血液凝固の阻害を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３１】
対象における組織因子が介在する反応を阻害する方法であって、（ｉ）修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）酸化防止剤；および（ｉｖ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬を含有する水性液体組成物の有効量を、組織因子介在反応の阻害を必要とする対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾された第ＶII因子ポリペプチドを含有する液体水性組成物、および該組成物の製造方法並びに使用に関する。より詳細には、本発明は、化学的および／または物理的分解に対して安定した液体組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固過程に関わる種々の因子（第ＶII因子（ＦＶII）を含む。）が血漿糖蛋白質として同定されてきた。止血は、血管壁への損傷により循環する血管に曝露される組織因子（ＴＦ）と全ＦＶII蛋白質質量の約１％に相当する量において循環中に存在するＦＶIIａとの複合体の形成により開始される。ＦＶIIは、血漿中に主として一本鎖チモーゲンとして存在し、ＦＸａにより、活性形態である二本鎖ＦＶIIａに分離される。組換え活性化された第ＶII因子（ｒＦＶＩＩａ）は、プロ−止血剤として開発されてきた。
【０００３】
修飾された第ＶII因子分子は、活性形態（第ＶIIａ因子）の触媒的活性が減少するようにその分子（例えば、触媒的部位）が修飾されている一方、組織因子に結合する能力は維持されている、血液凝固第ＶII因子の誘導体である。このような修飾第ＶII因子分子がＷＯ９２／１５６８６、ＷＯ９４／２７６３１、ＷＯ９６／１２８００およびＷＯ９７／４７６５１に記載されている。従って、生来の第ＶＩＩａ因子分子と同様に、修飾第ＶIIａ因子は組織因子に結合し得るが、生来の第ＶＩＩａ因子とは逆に、修飾第ＶII因子は、凝固の外因性経路においてその後の工程を活性化し得ない。その結果、修飾第ＶII因子は、単にフィブリン凝塊の形成の阻害因子として作用するのみである。従って、修飾第ＶIIａ因子分子は、トロンビンの生成、および続いて起こるフィブリンの析出を妨げることにより、血管損傷の治療において示唆された（ＷＯ９７／４７６５１）。
【０００４】
修飾第ＶII因子分子は、蛋白として、二量体、オリゴマー又はポリマーの形態における溶解性または不溶性アグリゲートの形成のような変性および凝集を含む物理的分解、あるいは、例えば加水分解、アミド分解および酸化を含む化学的分解されやすい。総合的に重要なことは、修飾第ＶII因子分子の活性の損失、毒性および免疫原性の分解生成物の形成、
分解した修飾第ＶII因子分子の注入時に血栓症を持ち込む深刻な危険性、注射において使用される注射針の詰まり、および非均質性の危険性である。したがって、修飾第ＶII因子を含有する薬物の安全性および効能が修飾第ＶII因子の安定性に直接的に関係する。
【０００５】
このように、修飾第ＶII因子分子を含有する組成物は、安定化していることが必要である。特に、フリーザーを必要とすることなく、修飾第ＶII因子を含有する薬物を保管し（使用前に例えば少なくとも６ヶ月という延長された期間において保管され得る。）且つ処理する必要がある。
【０００６】
保管および配達の双方に好適である修飾第ＶＩＩａ因子の投与形態を有することが所望される。薬剤製品は液体として保管され投与されることが理想的である。あるいは、薬物製品を真空状態で凍結乾燥し、その後患者が使用する直前に好適な希釈剤を加えることにより元に戻す。薬剤製品は長期間（すなわち、６ヶ月以上）保存状態におかれることに対して安定性を有することが理想である。
【０００７】
完成した薬剤製品を液体として維持するか、あるいは凍結乾燥するか否かの決定は、これら形態における蛋白の安定性に基づく。蛋白安定性は、とりわけ、イオン強度、ｐＨ、温度、凍結／解凍の繰り返しサイクル、および剪断力に対するエクスポージャー等の因子による影響を受け得る。活性蛋白は、変性および凝集（溶解性および不溶性アグリゲート双方の形成）を含む物理的不安定性、並びに例えば、加水分解、アミド分解および酸化を含む化学的不安定性の結果として失われ得る。蛋白調合薬の安定性の一般的記事に関しては、例えば、マニング等、ファーマスーティカル・リサーチ６：９０３−９１８（１９８９）を参照のこと。
【０００８】
蛋白不安定性の発現し得る可能性については広く認識されているが、特定の蛋白に関する特定の不安定性に係る問題を予測することは不可能である。これら不安定性のいずれもが、活性が低く、毒性が増加し、および／または免疫原生の増加した蛋白副産物、または誘導体をもたらし得る。事実、蛋白の析出により、血栓症、投薬形態および量の非一様性、並びに注射器詰まりが生じ得る。更に、例えば、Ｎ−末端におけるあるグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化および炭水化物側鎖の付加等、翻訳後の変異により、保存時に変異しやすいポテンシャル部位が提供される。従って、すべての蛋白組成物の安全性および効能は、その安定性に直接的に関与する。液体形態における安全性を維持することは、凍結乾燥された形態における場合とは、分子運動のポテンシャルがかなり増加し、故に分子間相互作用の蓋然性が増加するため、概して異なる。濃縮された形態において安全性を維持することもまた、増加した蛋白濃度においてアグリゲート形態となる傾向のため、異なる。
【０００９】
液体組成物を開発する場合においては、多くの因子が考慮される。短期間（すなわち、６ヶ月未満）における液体安定性は、概して、肉眼的構造変化（例えば、変性および凝集等）を避けることに依存する。これらの過程については、蛋白質に関する多くの文献に記載されており、安定化剤の多くの例が存在する。一種類の蛋白の安定化に有効である試薬が現に他の蛋白を不安定化させる作用を有することは周知である。一旦蛋白が肉眼的構造変化に対して安定化されると、長期間安定性（例えば、６ヶ月以上）に係る液体組成物の開発は、該蛋白に特有の分解型から蛋白を更に安定化することに帰着する。より具体的な分解型には、ジスルフィド結合のスクランブリング、ある残基の酸化、アミド分解、環化等が含まれ得る。個々の分解種を正確に指摘することは常に可能ではないが、関心ある蛋白を独自に安定化させるための特定の賦形剤の性能をモニターするように、わずかな変化をモニターするアッセイが開発されている。
【００１０】
安定性に関する考慮に加えて、一般的に、様々な世界中の医薬規制機関により認可されている賦形剤が選択される。組成物はほぼ等張であることが望ましい場合があり、組成物のｐＨは、注射／注入時において生理学的に好適な範囲にあることが望ましい場合がある。そうでない場合には患者に痛みや不快感を与える場合がある。
【００１１】
蛋白組成物の一般的な記事に関しては、例えば、Cleland等：The development
of stable protein compositions: A closer look at protein aggregation, deamidation and oxidation, Critical Reviews  in Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10 (4): 307-377; およびWang等、Parenteral compositions of proteins and peptides: Stability and stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology1988 (増刊), 42 (25)を参照されたい。
【００１２】
蛋白の安定に関して興味ある他の出版物は以下の通りである。
【００１３】
U.S. 20010031721 A1 (American Home Products)は、高濃度に濃縮され、凍結乾燥された、液体第ＩＸ因子組成物に関する。
【００１４】
U.S. 5,770,700 (Genetics Institute)は、液体第ＩＸ因子組成物に関する。
【００１５】
WO 97/19687 (American Red Cross)は、血漿蛋白の液体組成物、特に第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子に関する。
【００１６】
U.S. 4,297,344は、選択されるグリシン、アラニン、ヒドロキシプロリン、グルタミン、およびアミノ酪酸等のアミノ酸、および単糖類、オリゴ糖、または糖アルコール等の炭水化物を添加することによる熱に対する凝固第ＩＩ因子および第ＶＩＩＩ因子、抗トロンビンＩＩＩ、およびプラスミノゲンの安定性について開示している。
【００１７】
修飾第ＶＩＩａ因子に関する水性組成物の開発により、水を加えてもとに戻す場合のミスが排除されるという利点がもたらされ、これにより調薬の精度が増加すると共に、臨床的に生成物の使用が簡易となり、ゆえに患者の従順さが増加する。理想的には、第ＶＩＩａ因子の組成物は幅広い蛋白濃度に亘って６ヶ月以上安定であり得る。これにより、投与方法に柔軟性が生ずる。概して、より高濃度化された形態により、より少ない容積での投与が可能となり、これは患者の立場からさらに望ましいことである。液体組成物は、投与および使用の容易さに関しては凍結乾燥された生成物に対し多くの利点を有する。
【００１８】
今日において、修飾第ＶＩＩ因子は液体調製物において提供され得、−８０℃において凍結して保管される必要がある。
【００１９】
したがって、当該分野においては、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドの安定性を改良する方法、並びに２乃至８℃における６ヶ月以上の延長された保管に対して安定である液体組成物を提供することが必要とされている。このように、本発明は、分解生成物の満足できる調整を提供する水性修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドを提供することを目的とする。
【発明の開示】
【００２０】
発明の概要
本発明により、修飾された第ＶＩＩ因子またはその類延体（「修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド」）は、水性溶液中で、ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬、酸化防止剤およびカルシウム塩と共に調製された場合に、物理的にも化学的にも安定であることが見出された。
【００２１】
一態様において、本発明は、（ｉ）修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）酸化防止剤；および（ｖｉ）カルシウム塩、マグネシウム塩、またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬；を含有する液体水性組成物を提供する。
【００２２】
異なる態様において、前記ｐＨは約４．０乃至約７．０の範囲に維持され、例えば、約４．５乃至約７．０、約５．０乃至約７．０、約５．５乃至約７．０、または約６．０乃至約７．０の範囲に維持される。
【００２３】
一態様において、酸化防止剤（ｉｉｉ）は、Ｌ−またはＤ−メチオニン、メチオニン類縁体、メチオニン含有ペプチド、メチオニン相同体、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン、およびシスタチオニンからなる群から選択され、好ましくは、該酸化防止剤はＬ−メチオニンである。
【００２４】
異なる態様において、該酸化防止剤は、約０．１乃至約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において存在し、例えば、約０．１乃至約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１乃至約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１乃至約２ｍｇ／ｍｌ、または約０．５乃至約２ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する。
【００２５】
更なる態様において、本組成物は更に（ｖ）張度調整剤を含有する。その一態様において、張度調整剤（ｖ）は、中性塩；単糖、二糖、又は多糖；糖アルコール；アミノ酸；または小ペプチド、もしくはこれら調整剤の少なくとも２種の混合物からなる群から選択される。好ましい一態様において、張度調整剤はマニトールまたは中性塩であり、好ましくは塩化ナトリウムである。一態様において、張度調整剤（ｖ）は１ｍＭ乃至５００ｍＭの濃度において存在し、例えば、１０乃至２５０ｍＭの濃度において存在する。
【００２６】
他の態様において、本組成物は、更に（ｖｉ）非イオン性表面活性剤を含有する。その一態様において、非イオン性表面活性剤（ｖｉ）は、０．００５質量％乃至２質量％の量において存在する。一態様において、該非イオン性表面活性剤は、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはポリオキシ２３ラウリルエーテル等のポリソルベートまたはポロキサマー（poloxamer）またはポリオキシエチレンアルキルエーテルである。
【００２７】
本発明の一態様において、ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するために好適な試薬（ｉｉ）は、くえん酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、リンゴ酸塩、リン酸塩、酒石酸、琥珀酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸塩、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、グリシン、または該試薬の少なくとも２種の混合物からなる酸および塩の群から選択される。一態様において、試薬（ｉｉ）の濃度は約１ｍＭ乃至約５０ｍＭであり、例えば、約１０ｍＭである。
【００２８】
更なる態様において、カルシウム塩および／またはマグネシウム塩（試薬（ｉｖ））は、約５ｍＭ乃至約１５０ｍＭの濃度において存在し、例えば、約５ｍＭ乃至約１００ｍＭ、約５ｍＭ乃至約５０ｍＭ、または約１０ｍＭ乃至約５０ｍＭの濃度において存在する。
【００２９】
好ましい態様において、カルシウム塩は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、およびレブリン酸カルシウムからなる群から選択され、マグネシウム塩は、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、およびレブリン酸マグネシウムからなる群から選択される。
【００３０】
更なる態様において、本組成物は、更に（ｖｉｉ）防腐薬（例えば、フェノール、ベンジルアルコール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン（methyl paraben）、プロピルパラベン（propyl paraben）、塩化ベンザルコニウム、または塩化ベンゼトニウム等）を含有する。
【００３１】
一態様において、本組成物は等張性である。一態様において、本組成物は薬剤投与のために調合される。一態様において、本組成物は２乃至８℃において少なくとも６ヶ月間は安定であり、および／または安定化されている。
【００３２】
本発明の一態様において、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩａ因子に関して、本明細書に記載されている凝固アッセイ、蛋白分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの１又はそれ以上において試験した場合に、野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、特に好ましくは約１％未満の生物学的活性を有する。
【００３３】
一連の態様において、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、活性部位残基Ｓｅｒ３４４がＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、またはより好ましくはＡｌａで置換修飾されている、ヒトおよびウシ第ＶＩＩ因子；残基Ｌｙｓ３４１が置換されている、ヒト第ＶＩＩ因子；残基Ａｓｐ２４２が置換されている、ヒト第ＶＩＩ因子；残基Ｈｉｓ１９３が置換されている、ヒト第ＶＩＩ因子；ＦＶＩＩ−（Ｋ３４１Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｓ３４４Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｄ２４２Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｈ１９３Ａ）；ペプチドクロロメチルケトンまたはペプチジルクロロメタンからなる群から選択される試薬との反応により活性部位で修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド；アザペプチド；アシル化剤（例えば、種々のグアニジノベンゾアート誘導体および３−アルコキシ−４−クロロイソクマリン）；スルホニルフッ化物（例えば、フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ））；ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）；トシルプロピルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）；トシリシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）；ニトロフェニルスルホネート；ヘテロ環プロテアーゼ阻害因子（例えば、イソクマリンおよびクマリン）；Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、およびダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンからなる群から選択される試薬との反応により活性部位で修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド、からなる群から選択される。
【００３４】
好ましい態様において、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ＦＶＩＩ−（Ｓ３４４Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｈ１９３Ａ）；および、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、およびダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンからなる群から選択される試薬との反応により活性部位で修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド、からなる群から選択される。
【００３５】
一連の態様において、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、約０．１ｍｇ／ｍｌ乃至約１５ｍｇ／ｍｌの濃度において存在し、例えば、約０．５乃至約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５乃至約５．０ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍｌ乃至約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する。
【００３６】
他の態様において、本発明は、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液体水性組成物の製造方法であって、（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）酸化防止剤；および（ｉｖ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬、を含有する溶液中に、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドを提供することを有する方法を提供する。
【００３７】
他の態様において、本発明は、血液凝固を阻害する薬剤の製造のための本組成物の使用に関する。他の態様において、本発明は、組織因子が介在する反応を阻害する薬剤の製造のための本組成物の使用に関する。
【００３８】
他の態様において、本発明は、対象における血液凝固を阻害する方法であって、（ｉ）修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）酸化防止剤；および（ｉｖ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬を含有する水性液体組成物の有効量を、血液凝固の阻害を必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００３９】
他の態様において、本発明は、対象における組織因子が介在する反応を阻害する方法であって、（ｉ）修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）酸化防止剤；および（ｉｖ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬を含有する水性液体組成物の有効量を、組織因子介在反応の阻害を必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００４０】
異なる態様において、所望されない血液凝固は、血管形成、深い静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、組織内（例えば、グラム陰性の内毒血症に関連する肺および／または腎臓）におけるフィブリン沈着、および心筋梗塞からなる群から選択される症状と関連する。
【００４１】
異なる態様において、組織因子介在反応は、全身性炎症応答性症候群（Systemic Inflammatory Response Syndrome; ＳＩＲＳ）、急性呼吸疾患（ＡＲＤＳ）、多発性器官疾患（Multiple Organ Failure; ＭＯＦ）、ＨＵＳ、およびＴＴＰからなる群から選択される症状と関連する。
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明に係る組成物は、安定性において有用であり、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドの使用態様の組成物として好ましい。本組成物は、２乃至８℃の範囲の温度において保管された場合に、少なくとも６ヶ月間は安定であり、好ましくは３６ヶ月まで安定である。本組成物は、２乃至８℃において少なくとも６ヶ月間保管された場合に、化学的および／または物理的に安定であり、特に化学的に安定である。
【００４３】
「安定」とは、２乃至８℃における６ヶ月間の保管後、ＷＯ９２／１５６８６（例ＩＩＩ）に実質的に記載されている競合凝固アッセイにより、または本明細書に記載されたアッセイ５乃至８（以下に示す「アッセイ」部分を参照のこと。）の１またはそれ以上により測定したその当初の生物学的活性の少なくとも５０％が保たれていることを意味する。安定な組成物は、好ましくは、２乃至８℃における６ヶ月間の保管後において、その当初活性の少なくとも８０％を保つ。
【００４４】
「物理的に安定」という用語は、視覚的に透明性を維持する組成物を示すことが意図される。本組成物の物理的安定性は、様々な期間、異なる温度において組成物を保管した後における視覚検査および濁りを評価する手段により行われる。組成物は、視覚的に濁りが観察されると物理的に不安定であるとして分類される。
【００４５】
修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドの「物理的安定性」という用語は、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドの二量体、オリゴマーおよびポリマー形態、並びに分子の構造的変形および変性体すべての形態における不溶性および／または溶解性アグリゲートの形成に関する。
【００４６】
「化学的に安定」という用語は、２乃至８℃における６ヶ月間の保管後において、ＷＯ９２／１５６８６（例ＩＩＩ）に実質的に記載されている競合凝固アッセイにより、または本明細書に記載されたアッセイ５乃至８（以下に示す「アッセイ」部分を参照のこと。）の１またはそれ以上により測定したその当初の生物学的活性の少なくとも５０％が保たれていることを意味する。
【００４７】
「化学的安定性」という用語は、早められた条件下において、溶解した状態または固体状態での保管時に、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドにおけるすべての化学的変化の形成に関するものであることが意図される。例えば、加水分解、アミド分解、および酸化を挙げることができる。特に、硫黄含有アミノ酸は、対応するスルフォキシドの形成で酸化される傾向がある。
【００４８】
本組成物は、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド、酸化防止剤、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン、緩衝剤を含有し、任意に、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドを更に安定化させる張度調整剤を含む他の添加剤を含有する。修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドの濃度は、約０．１乃至約１５ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００４９】
ここで使用される「張度調整剤」という用語には、溶液の重量オスモル濃度の一因となる試薬が含まれる。張度調整剤には、限定するものではないが、アミノ酸；小ペプチド（例えば、２乃至５個のアミノ酸残基を有する。）；中性塩；単糖類または二糖類；多糖類；糖アルコール、またはこれら調整剤の少なくとも二種の混合物が含まれる。張度調整剤の例としては、限定するものではないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、スクロース、グルコース、グリシルグリシンおよびマニトールが挙げられる。存在する他の成分に依存するが、張度調整剤は、通常、約１乃至約５００ｍＭ、約１乃至約３００ｍＭ、約１０乃至約２００ｍＭ、または約２０乃至約１５０ｍＭの濃度において存在する。中性塩（例えば、塩化ナトリウム、または塩化カリウム等）が使用され得る。「中性塩」は、水溶液中に溶解した時に賛成も塩基性も示さない塩を意味する。
【００５０】
「ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬」という語句には、溶液のｐＨが約４．０乃至約８．０の範囲となることを満たすように維持する試薬が含まれ、例えば、約４．０乃至約７．０、約４．５乃至約７．０、約５．０乃至約７．０、約５．０乃至約６．５、約５．５乃至約７．０、約５．５乃至約６．５、約６．０乃至約７．０、約５．０乃至約６．０、約６．４乃至約６．６または６．５、約５．２乃至約５．７または約５．５の範囲を満たすよう維持する試薬が含まれる。かかる語句は、「緩衝剤」と互換的に使用され得る。これら試薬には、限定するものではないが、くえん酸塩（例えば、ナトリウムまたはカリウム）、酢酸塩（例えば、アンモニウム、ナトリウムまたはカルシウム）、ヒスチジン（Ｌ−ヒスチジン）、リンゴ酸塩、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、酒石酸、琥珀酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸塩、グルタミン酸塩、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、グリシン、または該緩衝剤の少なくとも２種の混合物からなる酸および塩を含み得る。緩衝剤の濃度範囲は、溶液のｐＨを好ましい範囲に維持するよう選択される。緩衝剤はまた、少なくとも２種の緩衝剤の混合物であり得、該混合物は特定範囲のｐＨを与えることができる。ある態様において、緩衝剤濃度は、約１ｍＭ乃至約１００ｍＭ、約１ｍＭ乃至約５０ｍＭ、約１ｍＭ乃至約２５ｍＭ、約２ｍＭ乃至約２０ｍＭ、または約１０ｍＭの範囲である。
【００５１】
本組成物はまた、任意に表面活性剤または洗剤を含有し得る。「表面活性剤」または「洗剤」には、一般的に、蛋白を空気／溶液界面誘発圧力および溶液／表面誘発圧力から保護する試薬が含まれる（例えば、蛋白凝集体が得られる。）。洗剤は、好ましくは、限定するものではないが、ポリソルベート２０または８０等のポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標））；ポロキサマー１８８または４０７等のポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポロキサマー（poloxamer）（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール）および他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマー、またはＰＥＧ８０００等のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む非イオン性洗剤である。表面活性剤は、約０．００５乃至約２．０％の範囲の量において存在する。
【００５２】
本組成物はまた、酸化防止剤を含有する。酸化防止剤には、限定するものではないが、アスコルビン酸、システイン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオン、およびシステインまたはメチオニンを含む他のペプチド（特に、２乃至５個のアミノ酸残基（少なくとも１個の残基はメチオニンまたはシステイン残基である）を有するペプチド）が含まれ、メチオニン（特にＬ−メチオニン）が好ましい。酸化防止剤は、０．１乃至５ｍｇ／ｍｌの濃度において存在し、例えば、０．１乃至４ｍｇ／ｍｌ、０．１乃至３ｍｇ／ｍｌ、０．１乃至２ｍｇ／ｍｌ、０．５乃至２ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する。
【００５３】
防腐薬もまた、微生物の増殖を阻止するために本組成物に含有され得、これにより第ＶＩＩ因子ポリペプチドの「複数回使用」包装が可能となる。防腐薬には、フェノール、ベンジルアルコール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン（methyl paraben）、プロピルパラベン（propyl paraben）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムが含まれる。ｐＨ範囲や防腐薬の種類にも依存するが、防腐薬は通常、０．１乃至２０ｍｇ／ｍｌの濃度において含まれる。組成物はまた、任意にアミド分解を阻止することができる試薬を含有し得る。
【００５４】
ここで特定される量は、±約１０％であることが理解される。例えば、約５０ｍＭは５０ｍＭ±５ｍＭを含み、また、４％は４％±０．４％を含む。
【００５５】
百分率は、溶液に溶解する固体および溶液中で混合される液体をいう場合の双方について、（質量／質量）を表す。例えば、Ｔｗｅｅｎについては、溶液の１００％ストック／質量の質量である。
【００５６】
「等張」なる用語は、「血清（serum）に関する等張」、すなわち、約３０００±５０ミリオスモル／ｋｇにおいてである。等張は、投与前の溶液の重量オスモル濃度の測定であることを意味する。
【００５７】
「薬学的に有効な量」または「有効量」なる用語は、資格を有する専門家により決定される有効な投薬量であり、該専門家は所望される反応を得るために投与量を滴定し得る。投薬量を検討するための因子には、効能、バイオアベイラビリティ、所望される薬物動力学的／薬力学的プロフィル、治療条件、患者関連因子（例えば、体重、健康、年齢等）、同時に投与される薬物（例えば、他の抗凝固剤）、投与時間、または医薬専門家に公知の他の因子が含まれる。
【００５８】
「治療」なる用語は、疾患、体調不良、または障害に立ち向かう目的をもって対象（例えば哺乳類であり、特にヒトである。）を管理および介護することとして定義され、症候または合併症の攻撃を防止するため、または症候または合併症を軽くするため、もしくは疾患、体調不良または障害を除去するために修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドを投与することを含む。修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する本発明に係る薬学的組成物は、その治療が必要な対象に非経口的に投与され得る。非経口的投与は、注射器（任意にペン様注射器であり得る。）を用い、皮下注射、筋肉注射、または静脈注射により行われ得る。あるいは、注入ポンプにより行われ得る。
【００５９】
使用方法：
野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に生物学的活性が減少している、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する本発明に係る調製物は、例えば、再狭窄において生ずるような血管の血栓症または閉塞の危険性を増加させ得る、例えば血管形成または他の外科的処置を経験している患者において抗血液凝固薬として使用され得る。抗血液凝固薬が処方される他の医学的適応症には、限定するものではないが、深い静脈血栓症、肺塞栓症、発作、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、組織内（例えば、グラム陰性の内毒血症に関連する肺および／または腎臓）におけるフィブリン沈着、心筋梗塞；急性呼吸疾患（Acute Respiratory Distress Syndrome; ＡＲＤＳ）、全身性炎症応答性症候群（Systemic Inflammatory Response Syndrome; ＳＩＲＳ）、溶血性尿毒症症候群(ＨＵＳ)、ＭＯＦおよびＴＴＰが含まれる。
【００６０】
本発明に従い調製される第ＶＩＩ因子ポリペプチド：
「ヒト第ＶＩＩ因子」または「ＦＶＩＩ」なる用語は、天然源抽出および精製を含む方法により製造されるヒト第ＶＩＩ因子、また組換え細胞培養システムにより製造されるヒト第ＶＩＩ因子を示す。その配列および特性は、例えば、ＵＳ特許第４，７８４，９５０号明細書に記載されている。用語「第ＶＩＩ因子」とは、切断されていない（チモーゲン）形態での第ＶＩＩ因子ポリペプチド、及び第ＶＩＩａ因子と称される場合があるそれらのそれぞれの生物活性形態を生成するよう、蛋白分解的に処理されている第ＶＩＩ因子ペプチドを包含することを意図される。典型的には、第ＶＩＩ因子は、第ＶＩＩａ因子を生成するために、残基１５２と１５３との間で切断される。用語「第ＶＩＩ因子」とはまた、限定するものではないが、野生型ヒト第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列１−４０６を有するポリペプチド（Ｕ．Ｓ．特許第４，７８４，９５０号明細書に記載されている。）、および他の種（例えば、ウシ、ブタ、イヌ、ネズミ、サケ第ＶＩＩ因子）に由来する野生型第ＶＩＩ因子を包含することを意図される。更に、第ＶＩＩ因子は、一個体から他の個体へ存在し且つ発現し得る第ＶＩＩ因子の天然対立因子変異体をも包含する。また、糖化または他の翻訳後の修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞及び宿主細胞環境の性質に依存し変化し得る。
【００６１】
ここで使用される「修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド」には、限定するものではないが、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子の活性に対して第ＶＩＩａ因子生物学的活性が実質的に修飾されているか、または減少されているポリペプチドが包含される。これらのポリペプチドには、限定するものではないが、化学的に修飾された第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子、およびポリペプチドの生物活性を修飾しまたは破壊する、１又は２以上の特定のアミノ酸配列変更が導入されている第ＶＩＩ因子変異体が包含される。該用語は、第ＶＩＩ因子の置換、欠失、および挿入アミノ酸変異体または翻訳後の変異を包含するものであることが意図される。野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に修飾された、または減少した生物活性を示す修飾第ＶＩＩ因子は、限定するものではないが、ヒト第ＶＩＩ因子に対して化学的に修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド、および／または、ヒト第ＶＩＩ因子に関して１または複数のアミノ酸配列変更を含む第ＶＩＩ因子ポリペプチド（すなわち、第ＶＩＩ因子変異体）、および／または、ヒト第ＶＩＩ因子に関して切断されたアミノ酸配列を含む第ＶＩＩ因子ポリペプチド（すなわち、第ＶＩＩ因子フラグメント）を包含する。
【００６２】
修飾第ＶＩＩ因子は更に、Ｎ−末端アミノ酸欠失又は付加を含む修飾されたＮ−末端を有するポリペプチドを包含する。
【００６３】
変異体を包含し、野生型第ＶＩＩａ因子に関して実質的に減少した生物学的活性を有する修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、アッセイ１乃至４（以下に示す「アッセイ」を参照のこと。）に記載されている凝固アッセイ、蛋白分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの１または複数において試験される場合、同じ細胞型において生成された野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、特に好ましくは約１％未満を示すポリペプチドである。
【００６４】
ここで使用される用語「修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド」は、少なくとも１つの修飾を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを意味することが意図され、ここでの修飾は、修飾第ＶＩＩ因子が血漿第Ｘ因子または第ＩＸ因子を活性化する能力を実質的に阻害する。これは、限定するものではないが、触媒的活性が実質的に減少した第ＶＩＩ因子ポリペプチドおよびそのフラグメントを含む。不活性第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、高い親和力および特異性をもって組織因子と結合するが、血液凝固を起こすものではない。「触媒的に不活性な第ＶＩＩ因子ポリペプチド」、「不活性第ＶＩＩ因子ポリペプチド」、または「ＦＶＩＩａｉ」なる用語は、「修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチド」または「修飾第ＶＩＩ因子」と互換性をもって使用され得る。
【００６５】
本発明の一態様において、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、本明細書に記載されている１または複数のＴＦ結合アッセイにおいて試験される場合、野生型第ＶＩＩａ因子の特異的なＴＦ結合親和力の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、または少なくとも約１３０％を示すポリペプチドを包含する。好ましい態様において、ＴＦアンタゴニストは、野生型第ＶＩＩａ因子の結合親和力の少なくとも約７５％を示す。ここで使用される用語「ＴＦ結合活性」は、ＦＶＩＩａポリペプチドまたはＴＦアンタゴニストの、組換えヒト１２５Ｉ−ＦＶＩＩａが細胞表面ヒトＴＦに結合することを阻害する能力を意味する。ＴＦ結合活性は、アッセイ３（本明細書）に開示されているように測定され得る。
【００６６】
他の態様において、修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、本明細書のアッセイ１乃至４に開示された凝固アッセイまたは蛋白分解アッセイの１またはそれ以上において試験される場合、野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％未満、より好ましくは約１０％未満、または５％。または３％、または２％、特に好ましくは約１％未満を示すポリペプチドを包含する。
【００６７】
野生型第ＶＩＩ因子に関して実質的に減少された、または修飾された生物学的活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非制限的例示には、Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ（Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ ２９：３４１３−３４２０、１９９０）、Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ（Ｋａｚａｍａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６６−７２、１９９５）、ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ（Ｈｏｌｓｔ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１５：５１５−５２０、１９９８）、およびＧｌａドメイン欠失第ＶＩＩａ因子（Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎ等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．３１７：２４５−２４９、１９９３）が包含される。非制限的例示にはまた、３４１位において他のアミノ酸残基により置換されたリシン残基を有するヒトＦＶＩＩａ；３４４位において他のアミノ酸残基により置換されたセリン残基を有するヒトＦＶＩＩａ；２４２位において他のアミノ酸残基により置換されたアスパラギン酸残基を有するヒトＦＶＩＩａ；１９３位において他のアミノ酸残基により置換されたヒスチジン残基を有するヒトＦＶＩＩａ；ＦＶＩＩ−（Ｋ３４１Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｓ３４４Ａ）；ＦＶＩＩ−（Ｄ２４２Ａ）；およびＦＶＩＩ−（Ｈ１９３Ａ）が含まれる。化学的に修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチドおよび配列変異体の非制限的な例が、例えばＵ．Ｓ．特許第５，９９７，８６４号明細書に記載されている。
【００６８】
第ＶＩＩａ因子の触媒活性は、触媒中心またはトライアッドの化学的誘導により阻害され得る。誘導は、第ＶＩＩ因子を有機リン化合物、スルホニルフッ化物、ペプチドハロメチルケトンまたはアザペプチド等の不可逆阻害因子と反応させることにより、あるいは、アシル化（例えば、ペプチドクロロメチルケトンまたはペプチジルクロロメタン；アザペプチド；種々のグアニジノベンゾアート誘導体および３−アルコキシ−４−クロロイソクマリン等のアシル化剤；フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）等のスルホニルフッ化物；ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）；トシルプロピルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）；トシリシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）；ニトロフェニルスルホネート；イソクマリンおよびクマリン等のヘテロ環プロテアーゼ阻害因子）によりなされ得る。
【００６９】
好ましいペプチドハロメチルケトンには、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ＡｒｇクロロメチルケトンＰｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン、ダンシル−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン、およびダンシル−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトンが含まれる。
【００７０】
好ましい態様において、アミノ酸置換は、因子触媒部位に貢献するアミノ酸を含む領域として規定される第ＶＩＩ因子触媒トライアッドのアミノ酸配列においてなされる。触媒トライアッドにおける置換、挿入または欠失は、一般には、触媒部位を形成するアミノ酸においてまたは該アミノ酸隣接部においてなされる。ヒトおよびウシ第ＶＩＩ因子蛋白において、触媒「トライアッド」を形成するアミノ酸はＳｅｒ３４４、Ａｓｐ２４２およびＨｉｓ１９３である（ヒト野生型第ＶＩＩ因子において位置を示す下付き番号）。他の哺乳類種に由来する第ＶＩＩ因子における触媒部位は、その他の中から、蛋白分離およびアミノ酸配列分析を含む現在利用可能な技術を用いて決定され得る。触媒部位はまた、他のセリンプロテアーゼ、特にキモトリプシンの配列を用い、配列のアラインメントにより決定され得る。ここで、その活性部位はあらかじめ決定されており（Ｓｉｇｌｅｒ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５：１４３−１６４（１９６８）；参照によりその内容がここに含まれる。）、前記アラインメントから類似活性部位残基を決定する。
【００７１】
アミノ酸置換、挿入または欠失は、第ＶＩＩａ因子による第Ｘ因子および／または第ＩＸ因子の活性化を防止し、あるいは阻止するためになされる。しかしながら、そのように修飾された第ＶＩＩ因子はまた、凝固カスケードにおいて組織因子と結合するために第ＶＩＩ因子および／または第ＶＩＩａ因子と競合する能力を保持すべきである。そのような競合は、例えば、本明細書に記載された凝固アッセイにより、あるいは、例えば、ヒト膀胱癌腫細胞系Ｊ８２（Ｓａｋａｉ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：９９８０−９９８８（１９８９））のような細胞表面組織因子を有する細胞系を用いた競合結合アッセイにより容易に決定され得る。
【００７２】
第ＶＩＩ因子において触媒部位を形成するアミノ酸（例えば、ヒトおよびウシ第ＶＩＩ因子におけるＳｅｒ３４４、Ａｓｐ２４２、およびＨｉｓ１９３）は、置換または欠失され得る。単一のアミノ酸のみを変質させることが、その結果、分子の抗原性が増加する可能性を最小限にすることができ、あるいは組織因子に結合する能力を阻止できるため好ましいが、２またはそれ以上のアミノ酸の変質（置換、付加、欠失）がなされ得、置換、付加、および欠失の組み合わせもなされ得る。ヒトおよびウシ第ＶＩＩ因子の好ましい態様において、Ｓｅｒ３４４は好ましくはＡｌａで置換されるが、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒまたは他のアミノ酸が置換されてもよい。ＡｓｐをＧｌｕで置換すること、またＨＩｓをＬｙｓまたはＡｒｇで置換することが好ましい。概して、置換は蛋白の３次元構造を破壊することがなるべく少なくなるように選択される。ヒト、ウシまたは他の種の適切な第ＶＩＩ因子配列の触媒部位において上述したような残基変質を導入し得、得られる蛋白を触媒活性阻害の所望されるレベルに関して試験し、ここで述べた抗凝固活性を試験し得る。
【００７３】
ヒトおよびウシ第ＶＩＩ因子の好ましい態様において、活性部位残基Ｓｅｒ３４４がＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、またはより好ましくはＡｌａで置換修飾される。このような置換は、別々になされてもよいし、触媒トライアッドにおいて、Ｈｉｓ１９３およびＡｓｐ２４２を含む他の部位における置換と組み合わせてなされてもよい。
【００７４】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性：
血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）に結合し、（ｉｉ）活性化された第ＩＸ又はＸ因子（それぞれ、第ＩＸａ又はＸａ因子）を生成するために第ＩＸは第Ｘ因子の蛋白分解的切断を触媒するその能力に由来する。
【００７５】
本発明の目的のために、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性（「第ＶＩＩ因子生物学的活性」）は、例えば、Ｕ．Ｓ．特許第５，９９７，８６４号明細書またはＷＯ９２／１５６８６に記載されているように、第ＶＩＩ因子欠失血漿及びトロンボプラスチンを用いて、血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって定量化され得る。このアッセイにおいては、生物学的活性は、対照サンプルに関して凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの第ＶＩＩ因子活性を含むプールされたヒト血清標準との比較により“第ＶＩＩ因子単位”に転換される。
【００７６】
あるいは、第ＶＩＩａ因子生物学的活性は、
−  脂質膜に埋封されたＴＦ及び第Ｘ因子を含んで成るシステムにおける活性化された第Ｘ因子（第Ｘａ因子）を生成する第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子相当物の能力を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １９９１９−１９９２４， １９９７）；
−  水性システムにおける第Ｘ因子加水分解を測定すること（以下に示す「インビトロ蛋白分解アッセイ」を参照のこと。）；
−  表面プラスチン共鳴に基づく装置を用いて第ＶＩＩａ因子又は第ＩＩ因子相当物のＴＦへの物理的結合を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ４１３−３５９−３６３， １９９７）；
−  第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＶＩＩ因子相当物により合成基質の加水分解を測定すること（以下に示す「インビトロ加水分解アッセイ」を参照のこと。）；
−  ＴＦ−独立インビトロシステムにおけるトロンビンの生成を測定すること、
によって定量化され得る。
【００７７】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性の決定に好適なアッセイ：
本発明に従い有用な第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、簡便な予備的インヴィトロ試験として行われ得る好適なアッセイにより選択され得る。従って、本明細書では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性に関し、簡便な試験（表題の「インヴィトロ加水分解アッセイ」）を開示する。
【００７８】
インヴィトロ加水分解アッセイ（アッセイ１）
生来（野生型）の第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子変異体（以下において、双方を「第ＶＩＩａ因子」と称する。）が、比活性についてアッセイされ得る。それらはまた、その比活性を直接的に比較するために並行してアッセイされ得る。アッセイは、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）において行われる。色原体基質Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２８８、Ｃｈｒａｍｏｇｅｎｉｘ， Ｓｗｅｄｅｎ；最終濃度１ｍＭ）が、０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）の溶液中、第ＶＩＩａ因子（最終濃度１００ｎＭ）に添加される。４０５ｎｍでの吸光度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＵＳＡ）により連続して測定される。酵素を含まないブランクウェルにおける吸光度の控除の後、２０分間のインキュベーションの間に進行する吸光度が、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と野生型第ＶＩＩａ因子の活性との間の比を計算するために使用される：
割合＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩ因子ポリペプチド）／（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子野生型）。
【００７９】
これに基づけば、例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と生来の第ＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性との間の比が、約１．０を超える第ＶＩＩ因子ポリペプチドというように、生来の第ＶＩＩａ因子よりも低いか、相当するか、あるいはそれよりも高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを同定することができる。
【００８０】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性はまた、適切には１００−１０００ｎＭの濃度で、生理学的基質、例えば第Ｘ因子を用いて測定され得（「インヴィトロ蛋白分解アッセイ」）、ここで生成される第Ｘａ因子は、適切な色原体基質（例えば、Ｓ−２７６５）の添加の後、測定される。さらに、活性アッセイは、生理学的温度で行われ得る。
【００８１】
インヴィトロ蛋白分解アッセイ（アッセイ２）
生来（野生型）の第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド（以下において、双方とも「第ＶＩＩａ因子」と称する。）が、その比活性を直接的に比較するために並行してアッセイされる。アッセイは、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ， Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）において行われる。０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）の１００μＬ溶液中、第ＶＩＩａ因子（１０ｎＭ）および第Ｘ因子（０．８μＭ）が１５分間インキュベートされる。生成する第Ｘ因子の量を、色原体基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２７６５， Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ， Ｓｗｅｄｅｎ）（最終濃度０．５ｍＭ）を添加して測定する。４０５ｎｍでの吸光度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＵＳＡ）により連続して測定される。ＦＶＩＩａを含まないブランクウェルにおける吸光度の控除の後、１０分間のインキュベーションの間に進行する吸光度が、第ＶＩＩ因子ポリペプチドと野生型第ＶＩＩａ因子との間の蛋白分解活性の比を計算するために使用される：
割合＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩ因子ポリペプチド）／（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子野生型）。
【００８２】
これに基づけば、例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と生来の第ＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性との間の比が、約１．０を超える第ＶＩＩ因子ポリペプチドというように、生来の第ＶＩＩａ因子よりも低いか、相当するか、あるいはそれよりも高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを同定することができる。
【００８３】
トロンビンを生成する第ＶＩＩａ因子または第ＶＩＩ因子ポリペプチドの能力はまた、すべての適切な凝固因子及び生理学的濃度でのインヒビター（血友病Ａ症状を擬態する場合のマイナス因子ＶＩＩＩ）、及び活性化された血小板を含有するアッセイ（アッセイ３）において測定され得る（参照によりその全内容が本明細書に組込まれる、Ｍｏｎｒｏｅ等，（１９９７） Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ９９： ５４２−５４７の５４３ページに記載される）。
【００８４】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性はまた、ＷＯ９２／１５６８６またはＵＳ５，９９７，８６４号明細書に本質的に記載されている１段階凝固アッセイ（アッセイ４）を用いて測定され得る。手短に言及すれば、測定されるサンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１％ＢＳＡ中に希釈し、１００μｌを、１００μｌの第ＶＩＩ因子欠失血漿および１０ｍＭのＣａ２＋を含有する２００μｌのトロンボプラスチンを用いてインキュベートする。凝固時間を測定し、参照標準または連続希釈物中のクエン酸塩正常ヒト血漿のプールを用いた標準曲線と比較する。
【００８５】
競合アッセイ：
ＦＶＩＩａ／ｓＴＦアミドーリティック活性の阻害（アッセイ５）
修飾第ＶＩＩ因子によるＦＶＩＩａ−ＴＦ触媒アミドーリティック活性の阻害が、ヒトＴＦ（１０ｎＭ）、組換えヒトＦＶＩＩａ（１０ｎＭ）および濃度が増加する修飾第ＶＩＩ因子の溶液を使用して試験される。修飾第ＶＩＩ因子の変化する濃度は、基質Ｓ２２８８（１．２ｍＭ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）の添加前に、室温において６０分間、１０ｎＭｓのＴＦおよび１０ｎＭのＦＶＩＩａのＢＳＡバッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を用いてあらかじめインキュベートされる。色変化が、４０５ｎｍにおいて３０分間連続的に測定される。アミドーリティック活性は、ｍＯＤ／分として示される。修飾第ＶＩＩ因子によるＦＶＩＩａ／ＴＦアミドーリティック活性の阻害に関するＩＣ５０値が計算され得る。
【００８６】
ＦＸａ発現の阻害（アッセイ６）
ＦＸ（５０ｎＭ）が添加される前に、室温において６０分間、ＢＳＡバッファー（アッセイ４を参照のこと。）中の脂質（lipidated）ＴＦ（１０ｐＭ）、ＦＶＩＩａ（１００ｐＭ）および修飾第ＶＩＩ因子（０−５０ｎＭ）がインキュベートされる。反応は１／２体積のバッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）の添加により更なる１０分後に停止される。生成するＦＸａの量が基質Ｓ２７６５（０．６ｍＭ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）の添加により決定され、１０分間、４０５ｎｍにおいて吸光度が連続的に測定される。ＦＸのＦＶＩＩａ／脂質ＴＦ−媒介活性の修飾第ＶＩＩ因子阻害に関するＩＣ５０値が計算され得る。
【００８７】
ＴＦ−依存性凝固アッセイ（アッセイ７）
アッセイは、ＡＣＬ３００リサーチ凝固装置（ＩＬＳラボラトリーズ）において行われる。イミダゾール中の修飾第ＶＩＩ因子５０ｍＭの希釈液、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡが、２５ｍＭのＣａＣｌ２と２対５の割合において混合され、凝固装置中のサンプル容器に加えられる。イミダゾールバッファーで希釈され、修飾第ＶＩＩ因子の存在しないサンプル中で約３０秒間の凝固時間を与えられたヒト、ネズミ、ウサギ、ヒヒまたはブタからのトロンボプラスチンが、試薬貯蔵庫２に置かれ、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヒヒまたはブタ血漿が試薬貯蔵庫３に置かれる。分析の間、７０μｌの修飾第ＶＩＩ因子およびＣａＣｌ２の混合物が２５μｌのトロンボプラスチン試薬に移され、６０μｌの血漿を添加する前に予めインキュベートされ、凝固時間を測定する。最大凝固時間は４００秒に設定する。トロンボプラスチンの希釈液が凝固時間を修飾ＦＶＩＩ無添加調整に対するＴＦ活性に転換するための標準曲線として使用される。
【００８８】
修飾第ＶＩＩ因子によるＦＸのＦＶＩＩａ／細胞表面ＴＦ触媒活性の阻害（アッセイ８）
細胞表出ヒトＴＦの単層（例えば、ヒト肺繊維芽細胞ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−７５）、ヒト膀胱癌細胞系Ｊ８２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＴＢ−１）、ヒトケラチノサイト細胞系ＣＣＤ１１０２ＫｅｒＴｒ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−２３１０）、ヒト神経膠芽腫細胞系Ｕ８７、またはヒト胸部癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ２３１）が、ＦＸのＦＶＩＩａ／ＴＦ触媒活性におけるＴＦ源として使用される。２４−、４８−、または９６−ウェルプレートにおける融合性細胞単層がバッファーＡ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、および１１ｍＭ グルコース）中で一度洗浄され、バッファーＢ（バッファーＡに１ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび５ｍＭ Ｃａ２＋が補充された。）中で一度洗浄される。ＦＶＩＩａ(１ｎＭ)、ＦＸ（１３５ｎＭ）およびバッファーＢ中で濃度が変化する修飾第ＶＩＩ因子が細胞に同時に加えられる。あるいは、細胞はｒＦＶＩＩａおよびＦＸの添加前に、修飾第ＶＩＩ因子で１５分間予めインキュベートされる。３７℃、１５分においてＦＸａが形成され得る。各ウェルから５０μｌ等量が取り出され、５０μｌの阻止バッファー（バッファーＡに１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡが補充されたもの。）が加えられる。生成するＦＸａが、５０μｌの上記混合物をマイクロタイタープレートウェルに移し、２５μｌのＣｈｒｏｍｏｚｙｍＸをウェルに添加することにより決定される（最終濃度０．６ｍＭ）。４０５ｎｍにおける吸光度が連続的に測定され、色変化の初期割合がＦＸａ標準曲線を使用し、ＦＸａ濃度に転換される。
【００８９】
修飾第ＶＩＩ因子ポリペプチドの調製および精製：
本発明に従い調製されるのに好適な修飾第ＶＩＩ因子分子およびそのマニュファクチュアが、ＷＯ９２／１５６８６、ＷＯ９４／２７６３１、ＷＯ９６／１２８００およびＷＯ９７／４７６５１に開示されている。
【００９０】
一般に、本発明における使用に好適なヒト精製第ＶＩＩａ因子は、好ましくは、例えばＨａｇｅｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ２４１２−２４１６， １９８６， 又はヨーロッパ特許第２００，４２１号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）に記載のようにして、ＤＮＡ組換え技法により製造される。
【００９１】
第ＶＩＩ因子はまた、Ｂｒｏｚｅ及びＭａｊｅｒｕｓ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５ （４）： １２４２−１２４７， １９８０、および Ｈｅｄｎｅｒ及びＫｉｓｉｅｌ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： １８３６−１８４１， １９８３により開示された方法により製造され得る。これらの方法は、検出可能な量の他の血液凝固因子を伴うことなく第ＶＩＩ因子を生成する。さらに精製された第ＶＩＩ因子調製物であっても、最終精製段階として追加のゲル濾過を包含することによって得ることができ、次いで、第ＶＩＩ因子は既知の手段、例えばいくつかの異なった血漿蛋白（例えば、第ＸＩＩａ因子、ＩＸ因子、又はＸａ因子）により、活性化された第ＶＩＩａ因子に転換される。あるいは、Ｂｊｏｅｒｎ等，（リサーチ・ディスクロージャー、２６９、 １９８６年９月， ｐｐ．５６４−５６５） に開示されるように、第ＶＩＩ因子は、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばＭｏｎｏ Ｑ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）等に通すこと、もしくは溶液中での自動活性化によって活性化され得る。
【００９２】
第ＶＩＩ因子ポリペプチド（分離され、あるいは組換え的に製造された）は、次いで、例えば以下に開示されているようにして化学的に修飾され得る。
【００９３】
ＷＯ９２／１５６８６、ＷＯ９４／２７６３１、ＷＯ９６／１２８００およびＷＯ９７／４７６５１、またはＳｏｒｅｎｓｅｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１１８６３−１１８６８，１９９７（ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａ：Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトンを用い活性部位においてブロックされたＦＶＩＩａ）。
【００９４】
第ＶＩＩ因子変異体は、野生型第ＶＩＩ因子の修飾により、または組換え技術により製造され得る。野生型第ＶＩＩ因子との比較において、変質されたアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子相同物は、公知の手段（例えば、特定部位の突然変異誘発）を用い、アミノ酸コドンを変異させることにより、あるいは天然第ＶＩＩ因子をコードする拡散においてアミノ酸コドンのいくつかを除去することにより、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を修飾して製造され得る（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ および Ｗｅｌｌｓ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５を参照のこと。）。
【００９５】
ポリペプチドの、その起源細胞からの分離は、当該分野において知られているいずれかの方法により達成され得、例えば、限定するものではないが、付着細胞培養物からの所望する生成物を含む細胞培養培地の除去；非付着細胞を除去するための遠心分離又は濾過等が含まれる。
【００９６】
任意には、第ＶＩＩ因子ポリペプチドはさらに精製され得る。精製は当該分野において知られているいずれかの方法を用いて行うことができ、該方法には、限定するものではないが、例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、抗−第ＶＩＩ因子抗体カラム上（例えば、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１： １１０９７， １９８６； 及びＴｈｉｍ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７： ７７８５， １９８８を参照のこと。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動（ＩＥＦ））、示差的溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出等が含まれる。一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２； 及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｃ． Ｊａｎｓｏｎ および Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， ｅｄｉｔｏｒｓ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照のこと。精製後において、調製物は、好ましくは約１０質量％未満、より好ましくは約５質量％未満及び特に好ましくは約１質量％未満の宿主細胞由来の非ＶＩＩ因ポリペプチドを含む。
【００９７】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＸＩＩａ因子、又はトリプトシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子及びトロンビンを用いて、蛋白分解的切断により二本鎖形態にされ得る。例えば、Ｏｓｔｅｒｕｄ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１： ２８５３（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ、Ｕ．Ｓ．特許第４，４５６，５１１号明細書；及びＨｅｄｎｅｒ等， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： １８３６ （１９８３）を参照のこと。あるいは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｍｏｎｏ Ｑ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等に通すことによって、もしくは溶液中における自動活性化により活性化され得る。次いで、得られた活性化第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、本願に記載されたようにして配合され、投与され得る。
【実施例】
【００９８】
以下に本発明の実施例を示す。これら実施例は例証としての目的のためのみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００９９】
実験例
例１
Ａ．アッセイ法
アグリゲートの含有量は、非変性のサイズ排除ＨＰＬＣにより決定する。酸化形態の含有量は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定する。酵素的分解形態の含有量は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定する。
【０１００】
非変性のサイズ排除クロマトグラフィーは、移動相として０．２Ｍ硫酸アンモニウム、５％２−プロパノール（ｐＨ７．０）を用い、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ３００ ＳＷ カラム（７．５×３００ｍｍ）上で行った。流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、ディテクション：２１５ｎｍ、負荷：２５μｇＦＶＩＩａ。
【０１０１】
逆相ＨＰＬＣを、５μｍの粒子サイズおよび３００Ａの孔サイズを有する、登録商標権に係る４．５×２５０ｍｍブチル結合シリカカラム上で行った。カラム温度：７０℃。Ａ−緩衝剤：０．１％ ｖ／ｖトリフルオロ酢酸。Ｂ−緩衝剤：０．０９％ ｖ／ｖトリフルオロ酢酸、８０％ ｖ／ｖ アセトニトリル。カラムは３０分で線形勾配Ｘ−（Ｘ＋１３）％Ｂで溶離された。ＸはＦＶＩＩａを約２６分間の保持時間で溶離するために調整される。流速度：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、ディテクション：２１４ｎｍ、負荷：２５μｇＦＶＩＩａ。
【０１０２】
例２
酸化防止剤としてメチオニンを含有する水性Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロロメチルケトン−不活性第ＶＩＩ因子（ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａ）調製物の化学的安定性
２種類の異なる組成物を調製した。該組成物は以下の通りである。
【０１０３】
ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａ        ２ｍｇ／ｍｌ
ＮａＣｌ                    ２．８−２．９ｍｇ／ｍｌ
ＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ          １．４−１．５ｍｇ／ｍｌ
グリシルグリシン            １．３ｍｇ／ｍｌ
メチオニン                  ０または１ｍｇ／ｍｌ
ｐＨ                        ７．０。
【０１０４】
調製物は、ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、およびグリシルグリシンを含有するＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａの液体バルク溶液から調製した。メチオニンは水に溶解した。ＦＦＲ−ｒＦＶＩＩａバルク体とメチオニン溶液を混合し、溶液のｐＨを７．０に調整した。調製物を濾過し（０．２μｍ）、ガラス瓶に注入した（ガラス瓶１個当たり溶液２．２ｍｌ）。ガラス瓶は３５℃において保管した。サンプルを取り出し、下表に示した時間ポイントにおいて酸化形態の含有量を分析した（ＲＰ−ＨＰＬＣ）。酸化形態の含有量（％）を下表に示す。
【表１】
2005530682.tif 000002
【０１０５】
該結果より、メチオニンの添加により調製物中の酸化率が低下することがわかる。
【国際調査報告】
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2005530682.tif 000004
2005530682.tif 000005