(57)【要約】本発明は、内皮細胞の増殖を誘導し、また内皮細胞の生存を亢進するためにＢｖ８ポリペプチドを使用する方法を提供する。Ｂｖ８活性のモジュレーターをスクリーニングする方法もまたここで提供される。更に、Ｂｖ８ポリペプチドを使用する治療方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞の増殖を誘導する方法であって、上記細胞を、上記細胞の増殖を誘導するのに有効な量のＢｖ８に接触させることを含んでなる方法。
【請求項２】
上記細胞が血管内皮細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記内皮細胞がステロイド産生内皮細胞である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記内皮細胞がステロイド産生腺の細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記Ｂｖ８が天然配列Ｂｖ８ポリペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記Ｂｖ８が天然ヒトＢｖ８ポリペプチドである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記Ｂｖ８が配列番号：２のアミノ酸配列を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記Ｂｖ８が配列番号：４のアミノ酸配列を含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上記Ｂｖ８が配列番号：６のアミノ酸配列を含む請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
上記Ｂｖ８がヘパリン結合性である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記Ｂｖ８がＢｖ８イムノアドヘシンである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記Ｂｖ８がキメラＢｖ８である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記細胞をＶＥＧＦに接触させることを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
内皮細胞の増殖を誘導する方法であって、Ｂｖ８をコードする核酸を、細胞増殖を誘導するのに有効な量で上記細胞中に導入することを含んでなる方法。
【請求項１５】
上記Ｂｖ８がヘパリン結合性である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記Ｂｖ８が天然配列Ｂｖ８ポリペプチドである請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
上記細胞が血管内皮細胞である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
上記内皮細胞がステロイド産生内皮細胞である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記内皮細胞がステロイド産生腺の細胞である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＶＥＧＦをコードする核酸を上記細胞に導入することを更に含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
細胞生存を亢進する方法であって、上記細胞を、生存を亢進するのに有効な量のＢｖ８に接触させることを含んでなる方法。
【請求項２２】
上記Ｂｖ８がヘパリン結合性である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記Ｂｖ８が天然配列Ｂｖ８ポリペプチドである請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
上記Ｂｖ８が天然ヒトＢｖ８ポリペプチドである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記Ｂｖ８が配列番号：２のアミノ酸配列を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記Ｂｖ８が配列番号：４のアミノ酸配列を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
上記Ｂｖ８が配列番号：６のアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
上記細胞が血管内皮細胞である請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
上記内皮細胞がステロイド産生内皮細胞である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記内皮細胞がステロイド産生腺の細胞である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
上記細胞をＶＥＧＦに接触させることを更に含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
細胞の生存を亢進する方法であって、Ｂｖ８をコードする核酸を、生存を亢進するのに有効な量で上記細胞中に導入することを含んでなる方法。
【請求項３３】
上記Ｂｖ８がヘパリン結合性である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記Ｂｖ８が天然配列Ｂｖ８ポリペプチドである請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
上記細胞が内皮細胞である請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
上記内皮細胞がステロイド産生内皮細胞である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
上記内皮細胞がステロイド産生腺の細胞である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＶＥＧＦをコードする核酸を上記細胞に導入することを更に含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
内皮細胞の増殖を阻害する方法であって、上記細胞を、細胞増殖を阻害するのに有効な量のＢｖ８アンタゴニストに接触させることを含んでなる方法。
【請求項４０】
哺乳動物の癌を治療する方法において、Ｂｖ８アンタゴニストを、癌を治療するのに有効な量で上記哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項４１】
上記哺乳動物がヒトである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
上記癌がホルモン依存性癌である請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
上記癌が生殖器官のものである請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
上記癌が睾丸癌である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物のホルモン産生組織に関連する症状を治療する方法において、上記症状を治療するのに有効な量でＢｖ８を投与することを含んでなる方法。
【請求項４６】
ホルモン産生組織に関連する上記症状が、リポイド先天性副腎皮質過形成、不妊症、性的成熟、アンドロゲン依存性腫瘍、性的早熟、マッククーネ-アルブライト症候群、先天性副腎発育不全、及び低ゴナドトロピン性性機能低下症からなる群から選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
上記哺乳動物がヒトである請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
容器；
Ｂｖ８アンタゴニスト；
癌を治療するためにＢｖ８アンタゴニストを使用する指示書
を含んでなる製造物品。
【請求項４９】
上記癌が睾丸癌である請求項４８に記載の製造物品。
【請求項５０】
容器；
Ｂｖ８；
ホルモン産生組織に関連する症状を治療するためにＢｖ８を使用する指示書
を含んでなる製造物品。
【請求項５１】
上記組織が精巣組織である請求項５０に記載の製造物品。
【請求項５２】
容器；
Ｂｖ８アンタゴニスト；
受精率を調節するためにＢｖ８アンタゴニストを使用する指示書
を含んでなる製造物品。
【請求項５３】
Ｂｖ８アンタゴニストを同定する方法であって、
ａ）候補化合物をＢｖ８に接触させ；
ｂ）内皮細胞増殖を刺激するＢｖ８の能力を決定し；
ｃ）内皮細胞増殖を刺激するＢｖ８の能力が阻害されるアンタゴニストとして化合物を同定する、
工程を含んでなる方法。
【請求項５４】
Ｂｖ８アンタゴニストを同定する方法であって、
ａ）候補化合物をＢｖ８に接触させ；
ｂ）内皮細胞生存を促進するＢｖ８の能力を決定し；
ｃ）内皮細胞生存を促進するＢｖ８の能力が阻害されるアンタゴニストとして化合物を同定する、
工程を含んでなる方法。
【請求項５５】
血管形成を誘導する方法において、細胞を、血管形成を誘導するのに有効な量でＢｖ８に接触させることを含んでなる方法。
【請求項５６】
哺乳動物の患者における過剰な、望まれない又は調節されない血管形成に関連した疾患又は症状を治療する方法であって、上記疾患を治療するのに有効な量で患者にＢｖ８アンタゴニストを投与することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
一般に本発明は分裂促進活性を持つタンパク質Ｂｖ８を使用する方法、組成物及びアッセイに関する。
【０００２】
（発明の背景）
内皮細胞
局所的微小環境は血管内皮細胞のフェノタイプ及び成長特性に組織又は器官特異的な形で大いに影響を及ぼすが、局所的指令シグナルの性質は大部分が未知である。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び内皮細胞特異的成長因子のアンジオポエチンファミリーは様々な生理学的及び病理的環境における胚発達及び脈管形成に対して不可欠であるという有力な証拠がある（Ferrara及びAlitalo, Nature Medicine, 5:1359-1364 (1999)；Carmeliet, Nature Medicine, 6:389-395 (2000)）。内皮細胞フェノタイプ及び成長の局所的な組織特異的調節には強力な証拠がある（Aird等, J Cell Biol., 138:1117-1124 (1997); Stewart及びWiley, Dev. Biol., 84:183-192 (1981)）。内皮細胞の形態学的及び機能的特性は器官が異なると広範囲に変わる（Simionescu及びSimionescu, Cell and Tissue Biology, Urban and Schwarzemberg, Baltimore, (1988) pp.355-398）。更に、適用部位は、試験された血管形成因子のタイプよりも更に大なる度合いで新しい血管の性質を決定する（Dellian等, Am. J. Pathology, 149:59-71 (1996)；Roberts等, Am. J. Pathology, 153:1239-1248 (1998)）。脈管構造の性質に対する局所的微小環境のこの影響に対する分子的根拠は未知であるが、特化した間質が主要な役割を担っていると考えられている（上掲のDellian）。おそらくは、刺激の統合ネットワークは、細胞性及び細胞外マトリックス成分に加えて組織特異的分泌タンパク質を含みうるが、常在性内皮の構造と機能を決定しまた成長を調節するように機能する。
【０００３】
よって、内皮細胞の成長及び／又は分化に影響を及ぼす因子を同定し特徴付ける必要性が今もある。脈管構造の発達の知識を増大させるのに加えて、そのような化合物は血管組織を伴う症状の診断と治療において有用であろう。
【０００４】
ホルモン分泌細胞
科学と医療の向上には進歩があるが、社会の内科的病気(medical ailments)の新しい治療法がなお必要とされている。新しい治療法を見出す一つのアプローチ法は如何に器官が働くかを研究することであった。特に、興味はシグナル伝達細胞が生物の行動を如何に制御するかにある。例えば、内分泌細胞はホルモンと呼ばれるシグナル伝達分子を分泌し、これらホルモンの分泌が機能障害に陥ると様々な疾患を生じうる。
ホルモンの分泌のために特化した細胞には、生殖腺、分泌性テストステロン（精巣のライディッヒ細胞）、エストロゲン（卵胞の卵胞膜内細胞）及びプロゲステロン（破裂した卵胞の黄体細胞）の細胞が含まれる。テストステロン、エストロゲン及びプロゲステロンの外因的投与を利用する様々な治療法が医療分野にはあるが、これらのホルモンを産生する細胞を調節する必要性が残っている。
【０００５】
ホルモン分泌のために特化された他の細胞には、副腎細胞と消化器系細胞が含まれる。例えば、副腎細胞はエピネフリン、ノルエピネフリン及びステロイドホルモン、例えば鉱質コルチコイド及び糖質コルチコイドを分泌する。特に興味があるものは副腎皮質において産生され、多くの細胞型の代謝に影響を及ぼすコルチゾールである。消化器系細胞にはインスリンを分泌する膵臓のものが含まれる。インスリンはランゲルハンス島によって分泌され炭水化物の代謝に不可欠である。インスリンは真性糖尿病の治療と調節に使用されるが、糖尿病のような疾患の効果的な治療法がなお必要とされている。腸及び気道の興味のある他のホルモンには、セロトニン、エンドルフィン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、グルカゴン及びボンベシンが含まれる。
ホルモン分泌細胞、特に内分泌腺中のステロイド産生内皮細胞に関連する多くの疾病及び疾患がある。従って、そのような内皮細胞に特異的に影響を及ぼす成長因子を同定することが望ましい。そのような内皮細胞特異的成長因子はそのような細胞型に関連する疾患を診断・治療し、そのような疾病の診断及び治療に有用な更なる候補薬剤を同定するための貴重なツールである。
【０００６】
Ｂｖ８
Ｂｖ８はカエルのキバラスズガエル(Bombina variegata)の皮膚分泌物から元々は単離された小タンパク質である（Mollay等, Eur. J. Pharmacol. 374:189-196 (1999)）。Ｂｖ８は腸管収縮の誘導が非常に強力なことが示されているコブラ科マンバ(black mamba)の毒由来の小タンパク質ＭＩＴ-１と４０％を越える同一性を示す（Schweitz等, FEBS Lett. 461:183-188 (1999)）。Ｂｖ８の幾つかの哺乳動物ホモログはマウス及びヒトからクローニングされ、同一のアミノ末端配列を有していることが分かっている（Wechselberger等, FEBS Lett. 462:177-181 (1999)）。ＭＩＴ-１と同様に、ヒトＢｖ８は、サブナノモル範囲のＥＣ５０をもって、胃腸平滑筋を強力に収縮させることが示されている（Li等 Mol. Pharm. 59:692-698 (2001) ）。二つの型のＢｖ８がヒトにおいて同定されており、長い型は選択的スプライスエキソンの存在を反映している。ヒトＢｖ８の長い型は、米国特許出願第０９／８８６２４２号に記載されているように、ＶＲＰＡとおよそ７８％相同性と５８％の同一性を有する。
【０００７】
（発明の概要）
本発明はＢｖ８の新規な活性の同定に基づいている。特に、Ｂｖ８は内皮細胞において増殖を誘導し、内皮細胞の生存を促進し、血管形成を促進することが見出された。ここに詳細に記載されるように、Ｂｖ８核酸及びポリペプチドは多くのアッセイにおいて及び内皮細胞に関連する症状の診断及び治療において使用することができる。
一側面では、本発明は細胞増殖を誘導する方法を提供する。一実施態様では、本方法は細胞の増殖を誘導するのに有効な量のＢｖ８に細胞を接触させることを含む。該方法は細胞をＶＥＧＦに接触させることを更に含む。他の実施態様では、本発明は細胞の増殖を誘導するのに有効な量のＢｖ８コード化核酸を細胞中に導入することを含む。この方法はＶＥＧＦコード化核酸を細胞中に導入することを更に含みうる。
【０００８】
一実施態様では、Ｂｖ８は天然配列Ｂｖ８ポリペプチドである。好ましくは、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドは天然ヒトＢｖ８ポリペプチドである。天然ヒトＢｖ８ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：４のアミノ酸配列を含みうる。他の実施態様では、天然配列Ｂｖ８は配列番号：６のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、Ｂｖ８はヘパリンを結合可能である。更に他の実施態様ではＢｖ８はＢｖ８イムノアドヘシンである。更なる実施態様ではＢｖ８はキメラＢｖ８である。
一実施態様では、細胞は内皮細胞、より好ましくはステロイド産生内皮細胞、例えばステロイド産生腺の細胞である。
【０００９】
更なる側面では、本発明は細胞生存を亢進する方法を提供する。一実施態様では、この方法は生存を亢進するのに有効な量で細胞をＢｖ８に接触させることを含む。該方法は更にＶＥＧＦに細胞を接触させることを含みうる。他の実施態様では、この方法はＢｖ８をコードする核酸を、細胞生存を亢進するのに有効な量で細胞中に導入することを含む。この方法はＶＥＧＦをコードする核酸を細胞に導入することを更に含みうる。
一実施態様では、Ｂｖ８は天然配列Ｂｖ８ポリペプチドである。好ましくは、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドは天然ヒトＢｖ８ポリペプチドである。天然ヒトＢｖ８ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：４のアミノ酸配列を含みうる。他の実施態様では、天然配列Ｂｖ８は配列番号：６のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、Ｂｖ８はヘパリン結合性である。
細胞は好ましくは内皮細胞、より好ましくはステロイド産生内皮細胞、例えばステロイド産生腺の細胞である。
【００１０】
更なる側面では、本発明はホルモン産生組織に関連した症状について哺乳動物を治療する方法を提供する。一実施態様では、本方法は、好ましくは、Ｂｖ８又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを含有する組成物をその症状を治療するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。他の実施態様では、本方法は更に哺乳動物にＶＥＧＦ又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与することを含む。哺乳動物は好ましくはヒトである。
一実施態様では、Ｂｖ８はヘパリン結合性である。他の実施態様では、Ｂｖ８は天然配列Ｂｖ８ポリペプチドである。好ましくは、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドは天然ヒトＢｖ８ポリペプチドである。天然ヒトＢｖ８ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：４のアミノ酸配列を含みうる。他の実施態様では、天然配列Ｂｖ８は配列番号：６のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
また更なる側面では、本発明は内皮細胞増殖を阻害する方法を提供する。一実施態様では、本方法は内皮細胞を、細胞増殖を阻害するのに有効な量のＢｖ８アンタゴニストに接触させることを含む。
また更なる側面では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトのＢｖ８に応答性の細胞における癌を治療する方法を提供する。該方法は好ましくはＢｖ８アンタゴニストを、癌を治療するのに有効な量で投与することを含む。一実施態様では、癌はホルモン依存性癌である。他の実施態様では、癌は睾丸癌である。
他の側面では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの生殖器官の癌を治療する方法を提供する。一実施態様では、該方法はＢｖ８アンタゴニストを、癌を治療するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。癌は好ましくは睾丸癌である。
【００１２】
他の側面では、本発明は血管形成を誘導する方法を提供する。一実施態様では、この方法は血管形成を誘導するのに有効な量のＢｖ８に細胞を接触させることを含む。他の実施態様では、この方法はＢｖ８をコードする核酸を血管形成を誘導するのに有効な量で細胞中に導入することを含む。
更なる側面では、過剰の望ましくない又は調節できない血管形成を伴う症状について哺乳動物を治療する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、好ましくは、Ｂｖ８又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを、その疾病を治療するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。哺乳動物は好ましくはヒトである。
また更なる側面では、本発明は哺乳動物において受精を調節する方法を提供する。一実施態様では哺乳動物はヒトである。該方法は好ましくはＢｖ８アンタゴニストを、受精を調節するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。
【００１３】
また更なる側面では、本発明は、容器、Ｂｖ８及びＢｖ８を使用する指示書を含む製造品を提供する。一実施態様では、指示書はホルモン産生内皮組織、好ましくは精巣組織に関連する症状を治療するためにＢｖ８を使用するためのものである。
他の側面では、本発明は哺乳動物におけるステロイドホルモン依存性疾患を治療する方法を提供する。一実施態様では、該方法はＢｖ８又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを、ステロイドホルモン依存性疾患を治療するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。好ましくは哺乳動物はヒトである。ステロイドホルモン依存性疾患は、好ましくは、リポイド先天性副腎皮質過形成、不妊症、性的成熟、アンドロゲン依存性腫瘍、性的早熟、マッククーネ-アルブライト症候群、先天性副腎発育不全、及び低ゴナドトロピン性性機能低下症からなる群から選択される。
【００１４】
他の側面では、本発明は、容器、Ｂｖ８アンタゴニスト及びＢｖ８アンタゴニストを使用する指示書を含む製造品を提供する。一実施態様では、指示書は癌、好ましくは睾丸癌を治療するためにＢｖ８アンタゴニストを使用するためのものである。他の実施態様では、指示書は受精を調節するためにＢｖ８アンタゴニストを使用するためのものである。
本発明の他の側面は、Ｂｖ８アンタゴニストを同定するための方法であって、候補化合物をＢｖ８に接触させ、Ｂｖ８の生物活性に対する化合物の効果を決定し、Ｂｖ８生物活性が阻害されるアンタゴニストを同定することによる方法を提供する。一実施態様では、Ｂｖ８アンタゴニストは内皮細胞増殖を刺激するＢｖ８の能力を阻害することによって同定される。他の実施態様では、Ｂｖ８アンタゴニストは内皮細胞の生存を促進するＢｖ８の能力を阻害することによって同定される。
【００１５】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
特に他の定義をしない限り、ここで使用される技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野の当業者が通常理解するところと同じ意味を持つ。例えば、Singleton等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology ２版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989 )。本発明のために、次の用語を下記のように定義する。
ここで用いられる場合、「Ｂｖ８」及び「Ｂｖ８ポリペプチド」は、互いに交換可能に使用され、天然配列Ｂｖ８；Ｂｖ８変異体；及びキメラＢｖ８を意味し、そそれぞれをここで定義する。場合によっては、Ｂｖ８は天然のグリコシル化を伴わない。「天然のグリコシル化」とは、哺乳動物細胞、特に天然に産生された細胞において産生されるときにＢｖ８に共有結合的に結合している糖質部分を言う。したがって、非ヒト細胞において産生されたヒトＢｖ８は、「天然のグリコシル化を伴わない」であろうＢｖ８の例である。しばしば、Ｂｖ８は、例えば大腸菌のような原核生物において産生される場合のように、全くグリコシル化されていない場合がある。
【００１６】
Ｂｖ８核酸は上述したようなＢｖ８ポリペプチドをコードするＲＮＡ又はＤＮＡであるか、あるいはこのようなＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれに安定に結合したままであって約１０ヌクレオチド長より長い。ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．１５ＭのＮａＣｌ／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム(ＮａＤｏｄＳＯ４)を用いるもの、又は（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファーを７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に用いるものである。
【００１７】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに作用可能に結合している。Ｂｖ８核酸は特定の宿主生物において発現されうるようにベクター中において他の核酸配列と作用可能に結合されうる。これは当該分野においてよく知られた方法によってなされうる。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるならば、コード化配列と作用可能に結合している。一般に、「作用可能に結合している」とは、結合しているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、常法に従って、合成のオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００１８】
「天然配列Ｂｖ８」は、その調製態様にかかわらず、天然由来のＢｖ８と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。しかして、天然配列Ｂｖ８は、天然に生じるヒトＢｖ８、マウスＢｖ８、あるいは他の哺乳動物種由来のＢｖ８のアミノ酸配列を有し得る。例えば、完全長天然配列ヒトＢｖ８アミノ酸配列は図２（配列番号：２）に示されている。第二の完全長天然配列ヒトＢｖ８は図４（配列番号：４）に示されている。これらの二つの配列は限界(canonical)ヘパリン結合ドメインをコードするエキソンの選択的スプライシングの結果である。よって、アミノ酸配列が図２（配列番号：２）に示されている天然配列ヒトＢｖ８はヘパリン結合ドメインを含む一方、図４（配列番号：４）に示された天然配列Ｂｖ８は含まない。天然配列マウスＢｖ８アミノ酸配列は図６（配列番号：６）に示される。ヒト及びマウスＢｖ８配列はまた例えばWechselberger等（FEBS Lett. 462:177-181 (1999)）及びLi等（Mol. Pharm. 59:692-698 (2001)）に開示されている。そのような天然配列Ｂｖ８は天然から単離することができるか又は組換え及び／又は合成手段によって生産することができる。「天然配列Ｂｖ８」なる用語は、Ｂｖ８の天然に生じるプレプロ、プロ及び成熟型及び切断型、天然に生じる変異体型（例えば選択的スプライシング型、例えば図４（配列番号：４）に示されるもの）、及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。好ましい天然配列Ｂｖ８は図２（配列番号：２）に示されるような完全長天然配列ヒトＢｖ８である。
【００１９】
「Ｂｖ８変異体」とは、天然配列中の一又は複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾及び／又は置換によって、ヒト及びマウスＢｖ８に対して図２、４及び６（配列番号：２、４及び６）に示されるもののように、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドの配列とは異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なＢｖ８ポリペプチドである。Ｂｖ８変異体は一般には図２（配列番号：２）のヒトＢｖ８のような、天然配列Ｂｖ８と１００％より少ない配列同一性を有する。しかしながら、通常は、生物学的に活性なＢｖ８変異体は、図２（配列番号：２）のヒトＢｖ８のような天然に生じるＢｖ８のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、更により好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有し、少なくとも約９５％から少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性まで１％の増加率で好適度が増大するアミノ酸配列を有する。Ｂｖ８変異体には、対応する天然配列Ｂｖ８ポリペプチドの生物学的活性を保持する少なくとも５のアミノ酸のペプチド断片が含まれる。Ｂｖ８変異体にはまた天然Ｂｖ８配列のＮ末端又はＣ末端に、あるいは配列の内部に一又は複数のアミノ酸残基が付加されたＢｖ８ポリペプチドが含まれる。Ｂｖ８変異体には、多くの(a number of)アミノ酸残基が欠失され、場合によっては一又は複数のアミノ酸残基によって置換されたＢｖ８ポリペプチドが含まれる。Ｂｖ８変異体はまた例えば天然に生じるアミノ酸以外の部分との置換によって、又はアミノ酸を改変して天然に生じるものではないアミノ酸をつくり出すことによって、共有結合によって修飾されていてもよい。Ｂｖ８変異体はヘパリン結合ドメインを含みうる。
【００２０】
Ｂｖ８配列に関する「パーセントアミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じて間隙を導入し、配列同一性の一部として如何なる保存的な置換も考慮しない状態での、Ｂｖ８配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとしてここに定義される。候補Ｂｖ８配列に対するＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部の伸長、欠失、又は挿入は何れも、配列の同一性あるいは相同性に影響を与えるとはみなされないであろう。配列比較のための方法とコンピュータプログラムは当該分野においてよく知られている。一つのそのようなコンピュータプログラムは、ジェネンテク社によって著作され、米国著作権庁, Washington D.C., 20559にユーザー用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている「ＡＬＩＧＮ−２」である。
【００２１】
「キメラＢｖ８」分子は、完全長Ｂｖ８を含むかその一又は複数のドメインが異種ポリペプチドに融合あるいは結合したポリペプチドである。キメラＢｖ８分子は、一般に、天然に生じるＢｖ８と共通する少なくとも一つの生物学的性質を共有している。キメラＢｖ８分子の例は精製の目的のためにエピトープタグを付加したものである。他のキメラＢｖ８分子はＢｖ８イムノアドヘシンである。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、Ｂｖ８が「タグポリペプチド」に融合したキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、その長さはＢｖ８の生物学的活性を阻害しないように充分に短いものである。タグポリペプチドは、好ましくは、該タグポリペプチドに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。好適なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８−５０のアミノ酸残基（好ましくは約９−３０の残基）を有する。好ましいものは、ニッケルに結合し、タグタンパク質を、例えば記載されているように（Lindsay等 Neuron 17:571-574 (1996)）、Ｎｉ-ＮＴＡクロマトグラフィーで分離することを可能にするポリ-ヒスチジン配列である。
【００２２】
「単離されたＢｖ８」は、Ｂｖ８源から精製されたか、あるいは組換えもしくは合成法によって調製され、精製されたＢｖ８を意味する。精製Ｂｖ８は実質的に他のポリペプチド又はペプチドを含んでいない。ここで「実質的に含んでいない」とは、他の供給源タンパク質の汚染が約５％未満、好ましくは約２％未満、より好ましくは約１％未満、更により好ましくは約０．５％未満、最も好ましくは約０．１％未満であることを意味する。
「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の全重量基準で少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％、更により好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含む組成物(composition：構成物)を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、構成物の全重量に対して少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。
Ｂｖ８「アゴニスト」は、天然配列Ｂｖ８の生物学的活性の一又は複数を有する分子又は化合物である。これらには、限定されるものではないが、小有機分子、ペプチド、及びアゴニスト抗Ｂｖ８抗体が含まれうる。
【００２３】
「アンタゴニスト」という用語は最も広義で使用され、天然Ｂｖ８ポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全にブロックし、阻害し、もしくは中和するあらゆる分子を含む。好適なアンタゴニスト分子には特にアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然Ｂｖ８ポリペプチド、ペプチド、小有機分子等々の断片又はアミノ酸配列変異体が含まれる。Ｂｖ８ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法はＢｖ８ポリペプチドを候補アゴニストもしくはアンタゴニスト分子に接触させ、Ｂｖ８ポリペプチドに通常伴う一又は複数の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含みうる。
ここでの目的において「活性な」又は「活性」とは、天然又は自然に生じるＢｖ８の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持しているＢｖ８の形態を意味し、ここで「生物学的」活性とは、天然又は自然に生じるＢｖ８によって引き起こされる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は自然に生じるＢｖ８が有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は自然に生じるＢｖ８が有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を意味する。
【００２４】
よって、「生物学的に活性」とは、これが「Ｂｖ８」あるいは「単離されたＢｖ８」あるいはＢｖ８のアゴニストについて用いられる場合、天然配列Ｂｖ８のエフェクター機能を示し又は共有するＢｖ８ポリペプチドを意味する。Ｂｖ８の主要なエフェクター機能は、内皮細胞の増殖を刺激するその能力である。更により好ましくは、生物学的活性は、内分泌腺中での、毛細血管内皮細胞、好ましくはステロイド産生細胞の増殖を誘導する能力である。Ｂｖ８の更なるエフェクター機能は血管形成を誘導するその能力である。
「生物学的性質」は、これが「Ｂｖ８」あるいは「単離されたＢｖ８」あるいはＢｖ８の「アゴニスト」について用いられる場合、（天然か変性されたコンフォメーションかにかかわらず）天然配列Ｂｖ８によって直接又は間接に引き起こされ又はなされるエフェクターあるいは抗原機能又は活性を有することを意味する。エフェクター機能には、内皮細胞の増殖及び／又は血管形成の誘導の向上が含まれる。
【００２５】
「Ｂｖ８レセプター」はＢｖ８が結合し、Ｂｖ８の生物学的性質を媒介する分子である。
ここでの「抗体」という用語は最も広義で使用され、ヒト、非ヒト（例えばマウス）及びヒト化モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示す限りは抗体断片を特に包含する。
「抗体」(Ａｂｓ)と「免疫グロブリン」(Ｉｇｓ)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンには、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。
【００２６】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変わる。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００２７】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性と特異性に使用されていることを意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲｓ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲｓによって近接して互いに保持され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991), p647-669を参照のこと)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
【００２８】
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk, J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２９】
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化するその能力を表す、残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシンでの処理により、２つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るＦ(ａｂ')２断片が得られる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの高頻度可変領域が相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成するのはこの構造においてである。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低いが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００３０】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表すものである。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、最初は、間にヒンジシステインを有しているＦａｂ'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる二つの明確に異なる型の一方に分類される。
【００３１】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
【００３２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは例えば組換えＤＮＡ法によって作製することができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３３】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号; Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型とは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体に又はドナー抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものをまた含む。更なる詳細について、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
【００３４】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。ｓＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して、二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に十分に記載されている。
【００３５】
「直鎖状抗体」という表現は、この出願において使用される場合、Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を意味する。簡単に言えば、これらの抗体は抗原結合領域の対を形成する直列のＦｄセグメント（ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は二重特異的でも単一特異的でもよい。
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の（モノクローナル又はポリクローナル）抗体との結合部位を指すために使用される。
「アゴニスト抗体」とは、Ｂｖ８アゴニストである抗体を意味し、よって天然配列Ｂｖ８の生物学的性質の一又は複数を有する。
「Ｂｖ８イムノアドヘシン」なる用語は、「Ｂｖ８免疫グロブリンキメラ」なる用語と交換可能に用いられ、Ｂｖ８分子（天然又は変異体）の少なくとも一部を免疫グロブリン配列と組合わせるキメラ分子を意味する。免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうでなければならないものではない。イムノアドヘシンはヒト抗体の多くの貴重な化学的及び生物学的性質を有しうる。イムノアドヘシンは適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に結合した所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築することができるので、対象の結合特異性は完全にヒトの成分を使用して達成することができる。かかるイムノアドヘシンは患者には最小に免疫原性であり、慢性的な又は繰り返しの使用に対して安全である。
【００３６】
治療用途として記載されているホモ多量体イムノアドヘシンの例には、ＨＩＶの細胞表面ＣＤ４への結合を阻止するＣＤ４-ＩｇＧイムノアドヘシンが含まれる。ＣＤ４-ＩｇＧを妊娠中の女性に分娩直前に投与したPhase Iの臨床治験から得られたデータは、このイムノアドヘシンがＨＩＶの母子移行の防止において有用であることを示唆している（Ashkenazi等, Intern. Rev. Immunol. 10: 219-227 (1993)）。また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合するイムノアドへシンも開発されている。ＴＮＦは、敗血性ショックの主要なメディエータであることが分かっている炎症誘発性サイトカインである。敗血性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプターイムノアドヘシンは、敗血性ショックの治療において臨床的に用いるための候補として有望であることが示されている（Ashkenazi, A.等 (1991) PNAS USA 88:10535-10539）。ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合したＴＮＦレセプター配列を含んでなるイムノアドヘシンであるＥＮＢＲＥＬ(登録商標)(エタネルセプト)は、慢性関節リウマチの治療に対して１９９８年１１月２日に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。慢性関節リウマチの治療におけるＥＮＢＲＥＬ(登録商標)の新しく拡大した用途が２０００年６月６日にＦＤＡによって承認された。ＥＮＢＲＥＬ(登録商標)を含む、ＴＮＦ阻害薬に関する最近の情報については、Lovell等, N. Engl. J. Med. 342: 763-169 (2000)、及び８１０−８１１頁の添付の論説；及びWeinblatt等, N. Engl. J. Med. 340: 253-259 (1999)；Maini及びTaylor, Annu. Rev. Med. 51: 207-229 (2000)の概説を参照のこと。
【００３７】
イムノアドヘシン構造の二つの腕が異なる特異性を持つ場合、このイムノアドヘシンは二重特異的抗体に倣って「二重特異的イムノアドヘシン」と呼ばれる。Dietsch等, J. Immunol. Methods 162:123 (1993)は、アドヘシン分子の細胞外ドメイン、Ｅ-セレクチン及びＰ-セレクチンを組み合わせた、このような二重特異的イムノアドヘシンを記載しており、そのセレクチンの各々は天然では異なる細胞型中で発現される。結合実験により、そのように形成された二重特異的免疫グロブリン融合タンパク質が、それを誘導した単一特異的イムノアドヘシンと比較して骨髄細胞株に結合する向上した能力を有していることが示された。
【００３８】
「ヘテロアドヘシン」なる用語は「キメラヘテロ多量体アドヘシン」なる表現と交換可能に使用され、各キメラ分子がヘテロ多量体レセプターモノマーの各々の細胞外ドメインのような生物学的に活性な部分を多量体化ドメインと組み合わせているキメラ分子（アミノ酸配列）の複合体を意味する。「多量体化ドメイン」はヘテロ多量体複合体内のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、又はキメラヘテロ多量体のキメラ分子間に細胞間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して作用しうる。多量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域を含みうる。また、多量体化領域は、立体的相互作用が安定な相互作用を促進するばかりでなく、モノマー混合物からホモ二量体よりもヘテロ二量体の生成を更に促進するように、操作されうる。「隆起(protuberances)」は、第一のポリペプチドの界面からの小アミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えることにより構築される。隆起に対する同一又は類似のサイズの相補的「空洞(cavities)」は、場合によっては、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第二のポリペプチドの界面につくり出される。免疫グロブリン部分は、必ずではないが好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラの免疫グロブリン部分はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができるが、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得ることができる。
【００３９】
ここで使用される場合、「治療」とは、有益な又は所望される臨床結果を得るためのアプローチ法である。この発明の目的において、有益な又は所望される臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能か検出不可能かにかかわらず、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾病の安定した（つまり、悪くならない）状態、病気進行の遅延又は減速、疾病状態の回復又は緩和、及び沈静化（部分的又は全体的にかかわらず）が含まれる。「治療」はまた治療を受けない場合に予測される生存性に比較した延命を意味し得る。「治療」は、疾患の病状の進行又は変化を防止する意図で実施される介入である。従って、「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を意味する。治療が必要な者には、既に疾患を有する者並びに疾患が防止されるべき者が含まれる。すなわち、治療は、細胞変性又は損傷の病理状態、例えば癌治療における腫瘍細胞の病理状態を直接的に防止し、遅延させ又は減少等させうるか、あるいは他の療法剤による治療に細胞をより感受性にしうる。
【００４０】
「ステロイド産生」は、細胞貯蔵からミトコンドリア外膜へのコレステロールの可動化とコレステロールのプレグネノロンへの転換が生じる内膜へのその転位によって特徴付けられる「ステロイド産生細胞」中でのステロイドホルモン生合成の、ホルモンにより誘導されたＣＡＭＰ媒介の急性調節である。
「ステロイド産生組織」はステロイド産生過程によってステロイドホルモンを生産する組織を意味する。その例には、副腎、生殖器官、腸及び気道組織の組織が含まれる。
「慢性」投与とは、急性態様とは異なり、初期の治療効果（活性）を長時間にわたって維持するようにする、連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断なく連続的になされるのではなく、むしろ周期的になされる性質の治療である。
治療目的たる「哺乳動物」は、ヒト、他の高等霊長類、家庭及び酪農用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等々を含む哺乳類に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４１】
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。ここで特に興味がある癌の例には、生殖器官の癌、例えば卵巣癌、睾丸癌、子宮癌、子宮頸癌；前立腺癌；副腎皮質（例えば副腎皮質癌腫）及び副腎髄質の癌を含む副腎の癌；甲状腺癌；副甲状腺癌；膵癌；及び子宮内膜癌が含まれる。
疾患の「病理状態」には、患者の健康を損なうあらゆる現象が含まれる。癌の場合には、これに限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化等々が含まれる。
一又は複数の更なる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
【００４２】
ここで用いられる「担体」には、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤が含まれ、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭが含まれる。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞体であり、哺乳動物への薬物（Ｂｖ８ポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質構造に類似する二層形成体として配される。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つものと定義される。
【００４３】
ここで用いられる「血管内皮成長因子」、「ＶＥＧＦ」、「ＶＥＧＦポリペプチド」及び「ＶＥＧＦタンパク質」という用語は、天然配列ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ変異体（ここでさらに定義される）を包含する。ＶＥＧＦポリペプチドは、種々の供給源、例えばヒト組織型又はその他の供給源から単離されるか、又は組み換え及び／又は合成方法によって調製される。
「天然配列ＶＥＧＦ」には、天然に由来するＶＥＧＦと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。そのような天然配列ＶＥＧＦは自然界から単離することができるか、又は組換え及び／又は合成法によって生産される。「天然配列ＶＥＧＦ」という用語には、特にＶＥＧＦの天然に生じる切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様では、天然配列ＶＥＧＦは、例えば、米国特許第５３３２６７１号及び第５２４０８４８号；ＰＣＴ公報国際公開第９８／１００７１号；Leung等, Science 246: 1306-1309(1989)；及びKeck等, Science 246: 1309-1312(1989)に記載の、それぞれ１２１、１４５、１６５、１８９、２０６のアミノ酸残基からなる５つの既知のアイソフォームの一つである。
【００４４】
「ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド」とは、天然配列ＶＥＧＦのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸同一性を有する、以下に定義したような活性ＶＥＧＦポリペプチドを意味する。このようなＶＥＧＦ変異体ポリペプチドには、例えば、天然配列の、Ｎ末端及び／又はＣ末端において、並びに一又は複数の内部ドメイン内において、一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失されているＶＥＧＦポリペプチドが含まれる。
ＶＥＧＦに関する配列同一性（アミノ酸又は核酸の何れか）は、特にＢｖ８に関して記載されているのと同じ手法を用いて決定される。同様に、Ｂｖ８のアゴニスト及びアンタゴニストのための定義は、限定されるものではないが抗体を含み、ＶＥＧＦアゴニスト及びアンタゴニストへ適用する。
【００４５】
Ｂ．本発明を実施するための方法
１．Ｂｖ８変異体の同定
ここに記載した完全長天然配列Ｂｖ８ポリペプチドに加えて、Ｂｖ８変異体を同定し、調製し、本発明において使用することができると考えられる。Ｂｖ８変異体は、Ｂｖ８ＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＢｖ８ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者であれば、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化のように、アミノ酸変化がＢｖ８の翻訳後過程を改変しうることを理解するであろう。Ｂｖ８変異体の生産方法は、好ましくは、以下に詳細に記載する天然配列Ｂｖ８についてのものと同じであり、唯一の違いは天然配列Ｂｖ８をコードしている核酸を、Ｂｖ８変異体をコードしている核酸に置き換えることである。
Ｂｖ８をコードする核酸分子が本発明の方法において使用される。ヒトＢｖ８の二つの完全長変異体をコードしているｃＤＮＡｓは図１及び２（配列番号：１及び２）に提供され、対応する推定アミノ酸配列は図２及び４（配列番号：２及び４）に提供されている。マウスＢｖ８をコードしているｃＤＮＡは図５（配列番号：５）に提供され、対応する推定アミノ酸配列は図６（配列番号：６）に提供されている。本発明において使用されるポリヌクレオチドは、例えばハイブリダイゼーションスクリーニング及びＰＣＲ法のような、当業者によく知られている標準的な方法を用いて得ることができる。
【００４６】
Ｂｖ８のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列を使用して、Ｂｖ８の発現を促す組換え分子を産生させることができる。また、本発明の方法はＢｖ８コード化配列と異種タンパク質の第二のコード化配列の融合ポリヌクレオチドを利用することもできる。
Ｂｖ８ｃＤＮＡ全体をコードしている任意の種からの完全長の相同ｃＤＮＡ配列をクローニングするために、あるいは対立遺伝子変異体のような変異体型又はファミリーメンバーをクローニングするために、ここで開示されたｃＤＮＡ配列の任意の部分に対応する断片から構築された標識ＤＮＡプローブを用いて、Ｂｖ８を発現すると思われる細胞又は組織型から誘導されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。より詳細には、コード化配列の５'又は３'末端の何れかに対応するオリゴヌクレオチドを用いて、より長いヌクレオチド配列を得ることができる。
【００４７】
完全長ｃＤＮＡを得るには異なった組織の複数のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが必要であろう。ｃＤＮＡクローニングにおいてよく遭遇する状況であるが、完全な５'末端コード領域をコードしているｃＤＮＡクローンを同定することが難しい場合には、ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends(ｃＤＮＡ末端の高速増幅)）法を使用することができる。ＲＡＣＥは不完全なｃＤＮＡｓの５'末端を増幅するための実績のあるＰＣＲベースの方策である。独特なアンカー配列を含むヒト胎盤から合成した５'-ＲＡＣＥ-Ｒｅａｄｙ ＲＮＡは市販されている（Clontech）。ｃＤＮＡの５'末端を得るために、提供されたアンカープライマーと３'プライマーを使用して５'-ＲＡＣＥ-Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡに対してＰＣＲを実施する。ついで、製造者の指示書に従って、アンカープライマーとネステッド３'プライマーを使用して二次のＰＣＲを実施する。ひとたび得られると、完全長ｃＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、翻訳開始及び終結部位に隣り合う連続のオープンリーディングフレーム、潜在的なシグナル配列のようなある種の目印及び最後にここに開示されたＢｖ８配列への全体的な構造類似性を調べる。
【００４８】
あるいは、標識されたプローブを用い、後記されるような適切なストリンジェントな条件を使用して対象の任意の生物から得られたゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。
Ｂｖ８コード化配列又は相同配列の単離は、ここに開示されるＢｖ８コード化配列を元にして構築された二つの変性オリゴヌクレオチドプライマープールを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施することができる。反応の鋳型は、例えばＢｖ８遺伝子の対立遺伝子を発現することが知られているか又は発現すると思われるヒト又は非ヒト細胞株又は組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）によって得られるｃＤＮＡでありうる。
ＰＣＲ産物は、増幅した配列がＢｖ８コード化配列の配列を表すようにサブクローニングされ配列決定されうる。ついで、ＰＣＲ産物は様々な方法により完全長ｃＤＮＡクローンを単離するために使用することができる。例えば、増幅断片は標識され、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用されうる。あるいは、標識された断片はゲノムライブラリーのスクリーニングを介してゲノムクローンを単離するために使用することができる。
【００４９】
ＰＣＲ法は完全長ｃＤＮＡ配列を単離するために使用することもできる。例えば、ＲＮＡは適切な細胞又は組織源から標準的な方法に従って単離することができる。ＲＴ反応は、第一鎖合成のプライミングのための増幅断片の大抵の５'末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡについて実施されうる。ついで、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、標準的な末端転移酵素反応を使用してグアニンを「尾部につけ(tailed)」、ＲＮＡアーゼＨでハイブリッドを消化させ、ついで第二鎖の合成を、ポリＣプライマーを用いてプライミングすることができる。このようにして、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列を容易に単離することができる。
Ｂｖ８遺伝子の対立遺伝子変異体又は突然変異体のｃＤＮＡクローンを、例えばＰＣＲを用いて単離することができる。この場合、第一ｃＤＮＡ鎖は変異体Ｂｖ８対立遺伝子を有していると推定される個体中でＢｖ８を発現することが知られているか発現すると思われる組織から単離されたｍＲＮＡにオリゴ-ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、逆転写酵素を用いて新しい鎖を伸長させることによって合成されうる。ついで、ｃＤＮＡの第二鎖は正常遺伝子の５'末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して合成される。ついで、これらの二つのプライマーを使用して、産物をＰＣＲを介して増幅させ、適切なベクターにクローニングし、当業者によく知られている方法によってＤＮＡ配列分析を行う。突然変異Ｂｖ８対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常なＢｖ８対立遺伝子のものと比較することによって、突然変異Ｂｖ８遺伝子産物の機能の喪失又は改変を生じる突然変異(群)を確実にすることができる。
【００５０】
あるいは、変異体Ｂｖ８対立遺伝子を有するものと思われるか有することが知られている個体から得られたＤＮＡを使用してゲノムライブラリーを構築することができ、あるいは変異体Ｂｖ８対立遺伝子を発現することが知られているか発現すると思われる組織からＲＮＡを使用しｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。ついで、機能を損なっていないＢｖ８遺伝子又はその任意の適切な変異体に標識を施し、そのようなライブラリーにおいて対応する変異体Ｂｖ８対立遺伝子を同定するためにプローブとして使用できる。ついで、当業者によく知られた方法によって、変異体Ｂｖ８遺伝子配列を含むクローンを精製し、配列解析を行うことができる。
また、変異体Ｂｖ８対立遺伝子を有するものと思われるか有することが知られている個体において変異体Ｂｖ８対立遺伝子を発現することが知られているか発現すると思われる組織から単離されたＲＮＡから例えば合成されたｃＤＮＡを使用して発現ライブラリーを構築することができる。このようにして、推定される変異体組織によって産生された遺伝子産物を発現させ、以下に記載するような、通常のＢｖ８遺伝子産物に対する抗体と組み合わせて、標準的な抗体スクリーニング法を使用してスクリーニングすることができる。
【００５１】
ここで使用されるところでは、核酸、ポリヌクレオチド及びヌクレオチドなる用語は交換可能であり、デオキシリボヌクレオシドからなるものであれ又はリボヌクレオシドからなるものであれ、またホスホジエステル結合からなるものであれ又は改変された結合、例えばホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート(acetamidate)、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート又はスルトン結合、及びそのような結合の組合せからなるものであれ、あらゆる核酸を意味する。
【００５２】
核酸、ポリヌクレオチド及びヌクレオチドなる用語はまた５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基からなる核酸を特に含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４-アセチルシトシン、５-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５-カルボキシメチルアミノメチル-ウラシル、ジヒドロウラシル、β-Ｄ-ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２,２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-アデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、β-Ｄ-マンオシルキュェオシン、５Ｎ-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキシウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、５-メチル-２-チオウラシル、３-(３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、及び２,６-ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも一の修飾塩基部分を含んでいるかもしれない。
【００５３】
更に、本発明において使用されるポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、アラビノース、２-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む群から選択される少なくとも一の修飾糖部分を含みうる。
本発明の方法はポリヌクレオチドの供給源によって制限されることは意図されていない。ポリヌクレオチドはヒト又は非ヒト哺乳動物由来であり、任意の組換え体供給源から誘導され、インビトロで又は化学合成によって合成され得る。ヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡであり得、二本鎖、単鎖又は部分的に二本鎖の形態で存在しうる。
本発明において有用な核酸には、限定することなく例示すると、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスＤＮＡｓ及び／又はＲＮＡｓ；リボザイム；遺伝子療法のためのＤＮＡ；ＤＮＡ及び／又はＲＮＡキメラ；単鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、高次コイルＤＮＡ及び／又は三重らせん体ＤＮＡ；Ｚ-ＤＮＡ等々が含まれる。核酸は多量に核酸を調製するために典型的に使用される任意の常套的手段によって調製することができる。例えば、ＤＮＡｓ及びＲＮＡｓは当該分野でよく知られた方法によって市販試薬及びシンセサイザーを使用して化学的に合成することができる（例えば、Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Englandを参照）。ＲＮＡｓはＳＰ６５のようなプラスミド（Promega Corporation, Madison, WI）を使用してインビトロ転写を介して高収量で産生させることができる。
【００５４】
ｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシング又はプロセシングから生じるｍＲＮＡ転写物を特に含む、Ｂｖ８核酸配列によってコードされている任意のｍＲＮＡ転写物を本発明の方法において使用することができる。
ヌクレアーゼ安定性の増加が望まれている場合のような、ある状況では、改変されたヌクレオシド間結合を有する核酸が好ましい。改変されたヌクレオシド間結合を含む核酸はまた当該分野においてよく知られた試薬と方法を使用して合成することができる。例えば、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、メトキシエチルホスホルアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン-スルフィド（-ＣＨ２-Ｓ-ＣＨ２）、ジメチレン-スルホキシド（-ＣＨ２-ＳＯ-ＣＨ２）、ジメチレン-スルホン（-ＣＨ２-ＳＯ２-ＣＨ２）、２'-Ｏ-アルキル、及び２'-デオキシ-２'-フルオロホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む核酸を合成する方法は当該分野でよく知られている（Uhlmann等, 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneider等, 1990, Tetrahedron Lett. 31:335及びそこで引用された文献）。
【００５５】
本発明のある実施態様では、使用されるヌクレオチドはα-アノマーヌクレオチドである。α-アノマーヌクレオチドは、通常のβユニットと異なり、鎖が互いに平行に走る、相補ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Gautier等, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641）。ヌクレオチドは２Ｎ-０-メチルリボヌクレオチドであり（Inoue等, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148）、又はキメラＲＮＡ-ＤＮＡアナログである（Inoue等, 1987, FEBS Lett. 215:327-330）。
核酸は当該分野においてよく知られているように任意の適切な手段によって精製することができる。例えば、核酸は逆相又はイオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー又はゲル電気泳動によって精製することができる。勿論、当業者であれば、精製方法は精製すべきＤＮＡのサイズに部分的に依存することは認識しているであろう。
【００５６】
Ｂｖ８コード化配列又はその相補鎖の少なくとも１０のヌクレオチド（つまりハイブリダイズ可能な部分）を有する単離又は精製されたポリヌクレオチドをまた本発明の方法において使用することができる。他の実施態様では、ポリヌクレオチドはＢｖ８コード化配列又は完全長Ｂｖ８コード化配列の少なくとも２５の（連続）ヌクレオチド、５０のヌクレオチド、１００のヌクレオチド、１５０のヌクレオチド、又は２００のヌクレオチドを含んでいる。核酸は一本鎖又は二本鎖でありうる。また、本発明は前記コード化配列の相補鎖に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。好適な実施態様では、ポリヌクレオチドはＢｖ８コード化配列の少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０又は２００ヌクレオチド又は全長を含む。
【００５７】
Ｂｖ８の突然変異体、Ｂｖ８のペプチド断片、Ｂｖ８の切断型及びＢｖ８融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列もまた本発明の方法において有用でありうる。融合タンパク質をコードしているヌクレオチドには、限定されるものではないが、無関係のタンパク質又はペプチドに融合した完全長Ｂｖ８配列、Ｂｖ８の切断型、又はＢｖ８のペプチド断片をコードするヌクレオチド、例えば血流中において生じる融合タンパク質（例えばＢｖ８-Ｉｇ）の安定性及び半減期を増大させるＩｇＦｃドメインに融合したドメイン；又はマーカーとして使用することができる蛍光タンパク質又は発光タンパク質のような酵素が含まれうる。
更に、米国特許第５６０５７９３号及び第５８３７４５８号に記載されている、遺伝子シャフリング及び／又は繰り返し配列組換えのような、ある形態の定方向進化によって、少なくとも部分的に産生されたＢｖ８ポリヌクレオチド変異体を本発明の方法において使用することができる。例えば、そのような技術を使用して、改変された機能及び／又は構造的特徴を有する機能的に及び／又は構造的に類似のタンパク質をコードしている新規配列の生成のための出発点としてＢｖ８コード化配列、又は複数のＢｖ８コード化配列を使用することができる。
【００５８】
上に記載されたＢｖ８コード化ポリヌクレオチド配列の高度に関連した遺伝子ホモログもまた本発明において有用であろう。高度に関連した遺伝子ホモログは、図２又は図４（配列番号：２及び４）の成熟ヒトＢｖ８のような、天然に生じるＢｖ８のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約８５％から少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性まで１％の増分で増加するタンパク質をコードしているポリヌクレオチドである。高度に関連したホモログはＢｖ８と機能的活性を共有するタンパク質をコードし得る。
本発明の方法はまた（ａ）前記のＢｖ８コード化配列及び／又はその相補鎖（すなわち、アンチセンス）の何れかを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード化配列の発現を指令する調節エレメントと作用可能に関連した前記Ｂｖ８コード化配列の何れかを含むＤＮＡ発現ベクター；（ｃ）宿主細胞中におけるコード化配列の発現を指令する調節エレメントと作用可能に関連した前記Ｂｖ８コード化配列の何れかを含む遺伝子操作した宿主細胞；及び（ｄ）外因的に導入された調節エレメント（すなわち、遺伝子活性化）の制御下で内因性Ｂｖ８遺伝子を発現する遺伝子操作された宿主細胞を使用することによって恩恵を受ける。
【００５９】
天然配列Ｂｖ８又はここに記載されたＢｖ８の様々なドメインの変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的及び非保存的突然変異のための技術と指針の任意のものを使用してなすことができる。変異は、天然配列Ｂｖ８と比較してＢｖ８のアミノ酸配列に変化を生じる一又は複数のＢｖ８コード化コドンの置換、欠失又は挿入でありうる。場合によっては、変異は、Ｂｖ８のドメインの一又は複数において少なくとも一のアミノ酸を任意の他のアミノ酸と置換することによる。所望の活性に悪影響を与えないで、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は欠失するかを決定するための指針は、Ｂｖ８の配列を既知の相同なタンパク質分子の配列と比較し、高い相同性の領域においてなされたアミノ酸配列の変化の数を最小にすることによって見出すことができる。アミノ酸置換は一つのアミノ酸を、類似の構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸と置き換えた結果であり得、例えばロイシンのセリンへの置換、つまり保存的アミノ酸置換でありうる。挿入又は欠失は場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲でありうる。許容される変異は、配列中にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的につくり出し、得られた変異体を、完全長又は成熟天然配列が示す活性について試験することによって決定することができる。
【００６０】
Ｂｖ８ポリペプチド断片がまた本発明の方法において有用である。そのような断片は、完全長天然タンパク質と比較した場合、例えばＮ末端又はＣ末端が切断され、又は内部の残基を欠いている可能性がある。ある種の断片はＢｖ８ポリペプチドの所望の生物学的活性には必須ではないアミノ酸残基を欠く。
Ｂｖ８断片は多くの従来の方法の任意のものによって調製することができる。所望のペプチド断片を化学的に合成してもよい。他のアプローチ法は、酵素消化により、例えば特定のアミノ酸残基により定まる部位でタンパク質を切断することが知られている酵素でタンパク質を処理するか、適当な制限酵素でＤＮＡを消化させることによりＢｖ８断片を産生し、所望の断片を単離することを含む。更に他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ)により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける５'及び３'プライマーに使用する。好ましくは、Ｂｖ８ポリペプチド断片は、天然Ｂｖ８ポリペプチドと少なくとも一つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【００６１】
特定の実施態様では、関心のある保存的置換を、好ましい置換と題して表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に置換例と表記され、又はアミノ酸分類を参照して以下に記載されるように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【表１】
2005504532.tif 000002
【００６２】
Ｂｖ８ポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリカルコンフォメーション、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、その影響が有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けできる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
【００６３】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類のものに交換することを必要とするであろう。また、そのような置換残基は、保存的置換部位に、あるいはより好ましくは残っている（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発（Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)）、カセット突然変異誘発（Wells等, Gene, 34: 315 (1985)）、制限的選択突然変異誘発（Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)）又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＢｖ８変異体ＤＮＡを作製することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析法を用いることもできる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である（Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)）。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的に好ましい。さらに、それは埋もれた位置と露出した位置の双方に見出されることが多い（Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)）。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリックな(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００６４】
２．Ｂｖ８及びＢｖ８変異体の生産
Ｂｖ８及びＢｖ８変異体の生産に適した技術は当該分野においてよく知られている。好適な技術はＢｖ８とＢｖ８変異体に対して同一であるので、以下に記載する技術はＢｖ８変異体並びに天然配列Ｂｖ８に適用される。
好適な生産方法には、ポリペプチドの内因性源からのＢｖ８の単離、（ペプチドシンセサイザーを用いた）ペプチド合成及び組換え技術（又はこれらの技術の任意の組み合わせ）が含まれる。
以下の検討の殆どは、Ｂｖ８核酸を含むベクターで形質転換された細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによりＢｖ８を組換え生産することに関する。しかし、当業者であれば、Ｂｖ８の製造には多くの方法があることは分かっているであろう。
【００６５】
簡単に述べると、この方法はＢｖ８をコードしている遺伝子を含むヒトの一次細胞を、（ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）又は以下に記載するそれ以外のもののような）増殖可能な遺伝子及びＢｖ８遺伝子の増幅を生じるＢｖ８遺伝子のコード化領域の遺伝子座におけるＤＮＡ配列が相同である少なくとも約１５０ｂｐの長さの少なくとも一のフランキング領域を含むコンストラクト（すなわち、ベクター）で形質転換することを含む。増殖可能な遺伝子はＢｖ８遺伝子の発現を阻害しない部位にあるものでなければならない。形質転換は、増殖可能な位置を定めるようにコンストラクトが一次細胞のゲノムに相同的に組込まれるような方法で行われる。
【００６６】
コンストラクトを有する一次細胞はついで増殖可能な遺伝子又はコンストラクト中に存在する他のマーカーによって選択される。マーカー遺伝子の存在はコンストラクトの存在及び宿主ゲノムへの組込みを可能にする。選択は第二の宿主で行われるため、一次細胞の更なる選択は必要とされない。所望されるならば、相同組換えの発生は、ＰＣＲを用いて、得られた増殖ＤＮＡ配列を配列決定するか、又は正確な相同組換え体のＤＮＡが存在する場合にはＰＣＲ断片の適切な長さを決定し、そのような断片を含む細胞のみを拡張することで、決定することができる。また所望されるならば、選択された細胞を、（増幅可能遺伝子がＤＨＦＲならメトトレキセートのような）適当な増幅化剤を用いて細胞にストレスを付与することによってこの時点で増幅させ、目的とする遺伝子の複数の複製を得ることができる。しかし、好ましくは、増幅工程は、以下に記載する第二の形質転換の後まで行われない。
【００６７】
選択工程の後に、全増幅可能領域を含むのに十分な大きさがあるゲノムのＤＮＡ部分を、選択された一次細胞から単離する。ついで、二次の哺乳動物発現宿主細胞をこれらのゲノムＤＮＡ部分で形質転換してクローニングし、増幅可能領域を含むクローンを選択する。ついで、増幅可能領域を、一次細胞で既に増幅されていなければ、増幅剤を用いて増幅させる。最後に、今はＢｖ８を含む増幅可能領域の複数の複製物を含む二次発現宿主細胞を増殖させ、遺伝子を発現しタンパク質を産生させる。
Ｂｖ８をコードしているＤＮＡは、Ｂｖ８ｍＲＮＡを有し、それを検出可能なレベルで発現すると思われる組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、Ｂｖ８のＤＮＡは、例えば複数のヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。Ｂｖ８をコードしている遺伝子はゲノムライブラリーあるいはオリゴヌクレオチド合成法によってもまた得ることができる。
【００６８】
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子からコードされるタンパク質を同定するために設計された（Ｂｖ８に対する抗体又は約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の）プローブを用いてスクリーニングされる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook等, Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)の１０−１２章に記載されている標準的な方法を使用して実施することができる。Ｂｖ８をコードしている遺伝子を単離する他の手段は、上掲のSambrook等のセクション１４に記載のＰＣＲ法を用いるものである。
Ｂｖ８のｃＤＮＡを単離する好ましい方法は、注意深く選択したオリゴヌクレオチド配列を使用して様々なヒト組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最小限に抑えられるように十分な長さを持ちかつ十分に明瞭でなければならない。好ましい配列はここに開示された天然に生じるＢｖ８から得ることができる。
【００６９】
オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡにハイブリダイズしたときに検出できるように標識されていなければならない。標識化の好ましい方法は、当該分野においてはよく知られているように、３２Ｐ標識ＡＴＰをポリヌクレオチドキナーゼと共に用いてオリゴヌクレオチドを放射標識することである。しかし、限定されることなく、ビオチン標識あるいは酵素標識を含む他の方法をオリゴヌクレオチドを標識するために使用することができる。
Ｂｖ８をコードしている核酸（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能ベクター中に挿入される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、限定されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
【００７０】
この発明のＢｖ８は、直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産される。一般には、シグナル配列はベクターの成分であり得、あるいはベクター中に挿入されるＢｖ８ＤＮＡの一部でありうる。好適に選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然Ｂｖ８シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーからなる群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は１９９１年４月２３日発行の米国特許第５０１０１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ３６２１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６号に記載されたシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、天然シグナル配列（例えばインビボにてヒト細胞からのＢｖ８の分泌を通常は指令するＢｖ８プレ配列）が満足できるが、例えば他の動物のＢｖ８ポリペプチド由来のシグナル配列、及び同一又は関連した種の分泌されたポリペプチド由来のシグナル配列、並びに例えば単純ヘルペスｇＤシグナルのようなウイルス分泌リーダーのような、他の哺乳動物シグナル配列も適している。
このような前駆体領域のＤＮＡは、成熟型Ｂｖ８又はその可溶型変異体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【００７１】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が初期プロモーターを有しているため典型的には用いられる)。
【００７２】
多くの発現ベクターは「シャトル」ベクターである。すなわち、それらは少なくとも一つのクラスの生物において複製可能であるが、発現のために他の生物に形質移入され得る。例えば、大腸菌中にベクターがクローニングされ、そのベクターが酵母あるいは哺乳動物細胞に形質移入され、宿主細胞染色体と独立して複製することはできないとしても、発現する。
またＤＮＡは宿主ゲノムに挿入することによって増幅され得る。これは、例えばベクターにバシラス(Bacillus)ゲノムＤＮＡに見られる配列と相補的なＤＮＡ配列を含めることにより、宿主としてバシラス種を用いて容易に達成される。このベクターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同組換え及びＢｖ８ ＤＮＡの挿入をもたらす。しかし、Ｂｖ８をコードするゲノムＤＮＡの回収は、Ｂｖ８ ＤＮＡを切除するのに制限酵素による消化を必要とするために、外来的に複製したベクターの場合よりも複雑である。
【００７３】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は選択培養培地中での形質転換宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードしている。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は培養培地中では生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物耐性を付与し、選択工程で生存するタンパク質を産生する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸又はハイグロマイシンが使用される。
【００７４】
哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、Ｂｖ８核酸を捕捉するのに適した細胞を同定することのできるものである。哺乳動物細胞の形質転換細胞は、マーカーを捕捉することによって当該形質転換細胞のみが生存できるように独特に適応化された淘汰圧下に置かれる。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が次第に変化する条件下で形質転換細胞を培養することにより課され、選択遺伝子とＢｖ８をコードするＤＮＡの双方を増幅させる。増幅は、成長に重要なタンパク質の生産に対する要求度が高い遺伝子が、組換え細胞の後の世代の染色体内にタンデムに反復されるプロセスである。増幅されたＤＮＡから増大した量のＢｖ８が合成される。増幅可能な遺伝子の他の例には、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々が含まれる。好適なベクター系は米国特許第５５６１０５３号に提供されている。
【００７５】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセート(Ｍｔｘ)を含む培養培地中で形質転換体の全てを培養することにより同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性が欠けるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。形質転換した細胞は次に濃度の高いメトトレキセートに接触させる。これによりＤＨＦＲ遺伝子の複数のコピーが合成され、同時に、Ｂｖ８をコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む他のＤＮＡの複数コピーが作られる。この増幅方法は、もし例えばＭｔｘに高度に耐性がある変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用されたような場合には内在性ＤＨＦＲの存在にかかわらず、任意の他の適切な宿主、例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１ＣＨＯ−Ｋ１を用いて使用することができる(ＥＰ１１７０６０)。
あるいは、Ｂｖ８をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照。
【００７６】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン中で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。Bianchi等, Curr. Genet., 12:185(1987)。より最近では、組換え子ウシキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Fleer等, Bio/Technology,9:968-975(1991)。
【００７７】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ｂｖ８核酸配列に作用可能に結合されたプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合されたＢｖ８核酸配列のような、特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは、典型的には、誘導性クラス及び構成的クラスの２つのクラスに属する。誘導性プロモーターは、養分の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを排除し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ｂｖ８をコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＢｖ８プロモーター配列及び多くの異種プロモーターを何れもＢｖ８ ＤＮＡの増幅及び／又は発現を指令するために用いることができる。しかしながら、異種プロモーターも、天然のＢｖ８プロモーターと比較してＢｖ８のより大なる転写と高い収量を一般に可能にするので、好適である。
【００７８】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Chang等, Nature, 275:615 (1978), Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); ＥＰ３６７７６）、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)。しかし、他の既知のバクテリアプロモーターも好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、よって当業者は、任意の所望の制限部位を提供するためにリンカーあるいはアダプターを使用することでＢｖ８をコードするＤＮＡ（Siebenlist等, Cell, 20:269 (1980)）にそれらを作用可能に結合させることが可能である。細菌系で使用されるプロモーターもまたＢｖ８をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｘが任意のヌクレオチドであるＣＸＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００７９】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ（Hitzeman等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)）又は他の糖分解酵素（Hess等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターである、他の酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００８０】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＢｖ８転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ２２１１５０４)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱衝撃プロモーター、そしてＢｖ８配列に通常付随するプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
【００８１】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をさらに含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。Fiers等, Nature, 273:113 (1978);Mulligan等, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。Greenaway等, Gene, 18:355-360 (1982)。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、サル細胞での免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現について、Gray等, Nature, 295：503-508(1982)を；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を；培養されたマウス及びウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現について、Canaani等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79：5166-5170(1982)を；プロモーターとしてラウス肉腫ウイルスの長い末端反復を用いたＣＶ-１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、及びマウスＮＩＨ-３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現について、Gorman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982)を参照のこと。
【００８２】
より高等の真核生物による本発明のＢｖ８をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向及び位置が独立しており、転写ユニットの５'（Laimins等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 (1981)）及び ３'（Lusky等, Mol. Cell Bio., 3:1108 (1983)）、イントロン内部（Banerji等, Cell, 33:729 (1983)）並びにコード化配列自身の内部（Osborne等, Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)）に見出されている。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強エレメントについては、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、Ｂｖ８コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００８３】
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、しばしば３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、Ｂｖ８をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又はMessing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法又はMaxam等, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)の方法によって配列決定する。
【００８４】
Ｂｖ８及びＢｖ８変異体の調製に特に有用なものは、Ｂｖ８をコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターである。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む。上掲のSambrook等、１６．１７−１６．２２頁。適切な発現ベクターと宿主細胞を含む一過性発現系は、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、生物学的に活性なＢｖ８であるＢｖ８変異体及びアナログを同定する目的のために特に有用である。
組換え脊椎動物細胞培養でのＢｖ８の合成に適合化させるのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); ＥＰ１１７０６０; 及びＥＰ１１７０５８に記載されている。Ｂｖ８の哺乳動物細胞での培養発現のための特に有用なプラスミドはｐＲＫ５（ＥＰ３０７２４７）又はｐＳＶＩ６Ｂである。１９９１年６月１３日に公開の国際公開９１／０８２９１。
【００８５】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適した宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物には、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリキアのような腸内細菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に開示されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスが含まれる。宿主のクローニングするための一つの好適な大腸菌は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のような他の株も適している。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物発酵に対して一般的な宿主株であるので、特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならない。例えば、株Ｗ３１１０は、タンパク質をコードする遺伝子に遺伝子突然変異をさせるように修飾してもよく、そのような宿主の例には、大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７が含まれる。２７Ｃ７の完全な遺伝子型は、ｔｏｎＡ ｐｔr３ ｐｈｏＡΔＥ１５ Δ(ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｏｍｐＴΔｄｅｇＰ４１ｋａｎｒである。株２７Ｃ７は１９９１年１０月３０日にアメリカンタイプカルチャーコレクションにＡＴＣＣ番号５５２４４として寄託された。あるいは、１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異体周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を用いることもできる。
【００８６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物が、Ｂｖ８コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、あるいは一般的にパン酵母は、下等真核生物宿主微生物として最も一般的に使用される。しかし、多くの他の属、種、系統が一般に入手でき、ここで有用である。例えば、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach等, Nature, 290: 140 (1981); １９８５年５月２日公開のＥＰ１３９３８３）；クルヴェロミセス(Kluveromyces)宿主（米国特許第４９４３５２９号; 上掲のFleer等）、例えばＫ．ラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 (1983)）、Ｋ．フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、ケー．ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、ケー．ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、ケー．ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、ケー．ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６; 上掲のVan den Berg等）、ケー．サーモトレランス(K. thermotolerans)及びケー．マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（ＥＰ４０２２２６）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（ＥＰ１８３０７０; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 (1988)）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（ＥＰ２４４２３４）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開のＥＰ３９４５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn等, Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)）及びＡ．ニガー(クロカビ)（Kelly等, EMBO J., 4: 475-479 (1985)）が含まれる。
【００８７】
グリコシル化Ｂｖ８の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能である。原則的には、脊椎動物であろうと無脊椎動物培養であろうと、任意のより高等の真核生物細胞培養が使用できる。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。例えば、Luckow等, Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller等, Genetic Engineering, Setlow等, eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.277-279; 及びMaeda等, Nature, 315:592-594 (1985)を参照のこと。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、それらのウイルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fugiperda)細胞の形質移入のために、本発明に係るウイルスとして使用できる。
【００８８】
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの、既にＢｖ８コード化ＤＮＡを含むように操作された所定の菌株と共にインキュベートすることによってトランスフェクトされる。A. トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、Ｂｖ８をコードするＤＮＡが、植物細胞宿主にそれが形質移入されるよう移され、そして適切な条件下でＢｖ８をコードするＤＮＡが発現される。加えて、例えば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる。Depicker等, J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)。また、Ｔ-ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡを含む植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化又は増強しうる。１９８９年６月２１日公開のＥＰ３２１１９６。
【００８９】
しかしながら、関心は脊椎動物細胞の場合に最も高く、培養(組織培養)での脊椎動物細胞の増殖は常套手段になっている。例えば、Tissue Culture, Academic Press, Kruse及びPatterson編(1973)を参照のこと。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 (ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５); マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）;ＭＲＣ５細胞;及びＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
【００９０】
宿主細胞をトランスフェクトし、好ましくは上述のＢｖ８産生のための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地で培養する。
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数の形質移入の方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功した形質移入が一般に認められる。
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等のセクション１．８２に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に使用される。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開された国際公開９１／００３５８に記載されているように、超音波処理を用いて植物を形質移入することもできる。
【００９１】
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham等, Virology, 52:456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は、１９８３年８月１６日に発行の米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact. 130: 946(1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829(1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチンもまた用いることができる。形質転換哺乳動物細胞のための様々な技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537(1990)及びMansour等, Nature, 336:348-352(1988)を参照のこと。
Ｂｖ８ポリペプチドを産生するために使用される原核細胞は上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に一般的に記載されているようにして、好適な培地中で培養される。
【００９２】
本発明のＢｖ８を生成するために用いられる哺乳動物宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開９０／０３４３０；国際公開８７／００１９５；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンＴＭ薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
この明細書において言及される宿主細胞は培養中の細胞並びに宿主動物内にある細胞を包含する。
【００９３】
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドもまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性ヌクレオチド、蛍光剤又は酵素のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位として作用する。また、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【００９４】
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネサンス標識である。本発明において使用するのに適した特に感度のよい染色方法はHsu等, Am. J. Clin. Path., 75:734-738 (1980)に記載されている。
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、ここに記載されたようにして調製することができる。
【００９５】
Ｂｖ８は、好ましくは、培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、宿主細胞溶解液から回収することもできる。Ｂｖ８が膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から引き離すことができる。
Ｂｖ８がヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられるときは、Ｂｖ８はヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、Ｂｖ８に関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからＢｖ８を精製することが必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ｂｖ８を、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；免疫親和性；エピトープタグ結合樹脂；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
【００９６】
３．Ｂｖ８の修飾
Ｂｖ８及びＢｖ８変異体の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つの型は、Ｂｖ８ポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、Ｂｖ８のＮ末端又はＣ末端残基、又は選択された側鎖と反応できる有機誘導体化剤と反応させることである。二官能性試薬による誘導体形成は、例えば、抗Ｂｖ８抗体を精製する方法に使用する水不溶性支持体マトリックス又は表面へのＢｖ８の架橋に有用であり、またその逆も同様である。通常使用される架橋剤には、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４-アジドサリチル酸とのエステル、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを包含するホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタンのような二官能性マレイミド、及びメチル-３-［(ｐ-アジドフェニル)ジチオ］プロピオイミダートのような試薬が含まれる。
【００９７】
その他の修飾は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化［T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, PP.79-86 (1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＢｖ８ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、（化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化部位の除去又はグリコシル化の欠失の何れかによって）天然配列Ｂｖ８に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は天然配列Ｂｖ８に存在しない一又は複数のグリコシル化部位を付加することを意味することをここでは意図している。また、その語句には、性質の変化及び存在する様々な糖鎖部分の割合を含む、天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化が含まれる。
【００９８】
Ｂｖ８ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更によって達成されうる。この変更は、例えば、天然配列Ｂｖ８への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。場合によっては、Ｂｖ８アミノ酸はＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが産生されるように予め選んだ塩基でＢｖ８ポリペプチドをコードしているＤＮＡを突然変異することによって変更される。
Ｂｖ８ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際特許出願第ＷＯ８７／０５３３０号及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。
【００９９】
Ｂｖ８ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によりなされる。例えば、化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (1987)及びEdge等, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura等, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを使用して達成することができる。
Ｂｖ８の共有結合的修飾の他の型は、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載されているように、Ｂｖ８ポリペプチドを、種々の非タンパク性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに結合させることを含んでいる。
【０１００】
また、本発明のＢｖ８は、他の異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＢｖ８を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグポリペプチドとのＢｖ８の融合体を含む。エピトープタグは一般にＢｖ８のアミノ又はカルボキシル末端に位置させられる。Ｂｖ８のこのようなエピトープタグが付けられた形は、その存在をタグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供給すると、Ｂｖ８を抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティーマトリックスを用いたアフィニティー精製によって直ぐに精製することができる。様々なタグポリペプチドとその各抗体は従来から良く知られている。例には、ポリヒスチジン（poly-his)又はポリヒスチジングリシン(poly-his-gly)タグ；ｆｌｕＨＡタグポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５（Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165(1988)）；ｃ-ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ(ｇＤ)タグとその抗体（Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553(1990)）が含まれる。他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇペプチド（Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210(1988)）；ＫＴ３エピトープペプチド（Martin等, Science, 255:192-194(1992)）；αチューブリンエピトープペプチド（Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)）；及びＴ７遺伝子１０タンパクペプチドタグ（Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)）が含まれる。
【０１０１】
もう一つの実施態様では、キメラ分子はＢｖ８の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシンとも呼ぶ」）には、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、「アドヘシン」タンパク質の結合ドメインを免疫グロブリン重鎖のヒンジ及びＦｃ領域と組み合わせるものである。通常は、本発明における使用のためにＢｖ８-免疫グロブリンキメラを調製する場合、Ｂｖ８をコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端的に融合させるが、Ｎ末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。
【０１０２】
融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、Ｂｖ８-免疫グロブリンキメラの生物活性を最適化するために選択されうる。
ある実施態様では、Ｂｖ８-免疫グロブリンキメラは単量体として、又はヘテロ多量体もしくはホモ多量体として、特に国際公開第９１／０８２９８号に本質的に例証されているように二量体又は四量体として構築される。
好適な実施態様では、Ｂｖ８配列は、例えば免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のような免疫グロブリンのエフェクター機能を含む抗体のＣ末端部分（特にＦｃドメイン）のＮ末端に融合される。Ｂｖ８配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、（ＩｇＧのＦｃを化学的に定める；重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６、又は他の免疫グロブリンの類似部位)パパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列が融合において使用される。特に好適な実施態様では、Ｂｖ８アミノ酸配列はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３重鎖のヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。融合がなされる正確な部位は重要ではなく、最適な部位は日常的な実験により決定することができる。
【０１０３】
ある実施態様では、Ｂｖ８免疫グロブリンキメラは多量体として、特にホモ二量体又はホモ四量体として構築されている。一般に、これらの構築された免疫グロブリンは既知のユニット構造を有する。基本的な４つの鎖構造ユニットはＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する形態である。４つのユニットはより高分子量の免疫グロブリンでは繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって互いに結合された異本的な４つのユニットの五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンと、時折ＩｇＧグロブリンもまた血清中に多量体の形で存在しうる。多量体の場合には、各４つのユニットは同じでも異なっていてもよい。
あるいは、Ｂｖ８配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、Ｂｖ８配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３’末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【０１０４】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はＢｖ８-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、Ｂｖ８に直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはＢｖ８-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時にハイブリッド重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４８１６５６７号に開示されている。
【０１０５】
好適な実施態様では、本発明のイムノアドヘシンの構築に使用される免疫グロブリン配列はＩｇＧ免疫グロブリン重鎖定常ドメインからのものである。ヒトイムノアドヘシンに対しては、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用する主な利点は、ＩｇＧ１イムノアドヘシンを固定化プロテインＡ上で効率的に精製することができることにある。これに対して、ＩｇＧ３の精製には多目的性が顕著に欠ける培地であるプロテインＧが必要となる。しかし、特定のイムノアドヘシンの構築のためにはＩｇ融合対を選択する場合に免疫グロブリンの他の構造的及び機能的性質を考慮しなければならない。例えば、ＩｇＧ３のヒンジは長くより可撓性であるので、ＩｇＧ１に融合した場合には正しく折りたたまれない又は機能しない大きなアドヘシンドメインを収容することができる。他の考慮は結合価であろう；ＩｇＧイムノアドヘシンは二価のホモ二量体であるが、ＩｇＡ及びＩｇＭのようなＩｇサブタイプは基本的なＩｇホモ二量体ユニットの二量体又は五量体構造をそれぞれ生じうる。インビボ用途のために構築されるＢｖ８イムノアドヘシンでは、Ｆｃ領域によって特定されるエフェクター機能及び薬物動態学的性質がまた重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は全て２１日のインビボ半減期を持っているが、補体系を活性化させるその相対能力は異なっている。ＩｇＧ４は補体を活性化させず、ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりも補体活性化が有意に弱い。更に、ＩｇＧ１とは異なり、ＩｇＧ２は単核細胞又は好中球上のＦｃレセプターに結合しない。ＩｇＧ３は補体活性化には最適であるが、そのインビボ半減期は他のＩｇＧアイソタイプのおよそ１／３である。ヒトの治療薬として使用されるために構築されるイムノアドヘシンに対する他の重要な考慮事項は特定のアイソタイプのアロタイプ変異体の数である。一般に、血清学的に定義されるアロタイプが少ないＩｇＧアイソタイプが好ましい。例えば、ＩｇＧ１は４つのみの血清学的に定義されるアロタイプ部位を有し、その２つ（Ｇ１ｍ及び２）はＦｃ領域に位置している；そしてこれらの部位の一つＧ１ｍ１は非免疫原性である。これに対して、ＩｇＧ３には１２の血清学的に定義されるアロタイプがあり、その全てがＦｃ領域にある；これらの部位の３つのみ（Ｇ３ｍ５、１１及び２１）が非免疫原性である一つのアロタイプを有している。よって、γ３イムノアドヘシンの潜在的な免疫原性はγ１イムノアドヘシンのものよりも大きい。
【０１０６】
親免疫グロブリンに対しては、有用な接合点は２つの重鎖間にジスルフィド結合を形成するヒンジのシステインの直ぐ上流である。頻繁に使用される設計では、分子のＢｖ８部分のＣ末端残基のコドンがＩｇＧ１ヒンジ領域の配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰのコドンの直ぐ上流に置かれる。
イムノアドヘシンの構築と発現に適した一般的な方法はＢｖ８に関して上に開示したものと同じである。Ｂｖ８イムノアドヘシンは、最も簡便には、Ｂｖ８部分をコードするｃＤＮＡ配列をＩｇ ｃＤＮＡ配列にインフレームとなるように融合させることによって構築される。しかしながら、ゲノムＩｇ断片との融合体もまた使用することができる（例えばGascoigne等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987); Aruffo等, Cell, 61:1303-1313 (1990); Stamenkovic等, Cell, 66:1133-1144 (1991)を参照）。後者のタイプの融合には発現のためのＩｇ調節配列が存在する必要がある。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードしているｃＤＮＡｓは、ハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって、脾臓又は末梢血リンパ球由来のｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づいて単離することができる。イムノアドヘシンのＩｇ部分及びＢｖ８をコードしているｃＤＮＡｓを、選択された宿主細胞中での効率的な発現を指令するプラスミドベクター中にタンデムで挿入する。哺乳動物細胞での発現には、ｐＲＫ５ベースのベクター（Schall等, Cell, 61:361-370 (1990)）及びＣＤＭ８ベースのベクター（Seed, Nature, 329:840 (1989)）を使用することができる。正確な接合部はオリゴヌクレオチド特異的欠失突然変異誘発を使用して設計された接合コドン間の余分な配列を除去することによってつくることができる（Zoller等, Nucleic Acids Res., 10:6487 (1982); Capon等, Nature, 337:525-531 (1989)）。それぞれ半分が所望の接合部の各側の配列に相補的である合成オリゴヌクレオチドを使用することができ；これらは理想的には３６から４８量体である。あるいは、ＰＣＲ法を使用して、適切なベクターにインフレームになるように分子の二つの部分を接合することができる。
【０１０７】
Ｂｖ８イムノアドヘシンの発現のための宿主細胞株の選択は発現ベクターに主に依存する。他の考慮事項は必要とされるタンパク質の量である。ミリグラム量はしばしば一過性形質移入によって生産できる。例えば、アデノウイルスＥＩＡ形質転換２９３ヒト胎児由来腎臓細胞株に、リン酸カルシウム法の変形法によってｐＲＫ５ベースのベクターを用いて一過性に形質移入し、効率的なイムノアドヘシンの発現を可能にする。ＣＤＭ８ベースのベクターを用いて、ＤＥＡＥ-デキストラン法によってＣＯＳ細胞に形質移入することができる（Aruffo等, Cell, 61:1303-1313 (1990); Zettmeissl等, DNA Cell Biol. US, 9:347-353 (1990)）。多量のタンパク質が所望される場合には、宿主細胞株の安定な形質移入後にイムノアドヘシンを発現させることができる。例えば、ｐＲＫ５ベースベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードしＧ４１８耐性を付与する更なるプラスミドの存在下でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に導入することができる。Ｇ４１８に耐性のあるクローンを培養中に選択することができる；これらのクローンはＤＨＦＲインヒビターのメトトレキセートのレベルを増加させた状態で成長させる；ＤＨＦＲ及びイムノアドヘシン配列をコードする遺伝子コピーの数が同時に増幅されているクローンが選択される。イムノアドヘシンがそのＮ末端に疎水性リーダー配列を含んでいる場合には、それは形質移入細胞によってプロセッシングされ分泌される可能性が高い。より複雑な構造を持つイムノアドヘシンの発現には独特に適合された宿主細胞が必要となりうる；例えば、軽鎖又はＪ鎖のような成分がある種のミエローマ又はハイブリドーマ細胞宿主によって提供されうる（上掲のGascoigne等, 1987, Martin等, J. Virol., 67:3561-3568 (1993)）。
【０１０８】
イムノアドヘシンはアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製できる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性はキメラに使用される免疫グロブリンＦｃドメインのアイソタイプ及び種に依存する。プロテインＡはヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づくイムノアドヘシンを精製するために使用できる（Lindmark等, J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。プロテインＡ又はＧアフィニティーカラムへイムノアドヘシンを結合させるための条件はＦｃドメインの特性によって完全に支配される；つまり、その種及びアイソタイプである。一般に、適切なリガンドが選択されると、効率的な結合が無条件培地流体から直接生じる。イムノアドヘシンの一つの顕著な特徴は、ヒトγ１分子の場合、プロテインＡに対する結合能が同じＦｃタイプの抗体に対して若干消失していることである。結合したイムノアドヘシンは酸性ｐＨ（３．０かそれ以上）又は穏やかなカオトロピック塩を含む中性ｐＨバッファーの何れかで効率的に溶出させることができる。このアフィニティークロマトグラフィー工程により＞９５％の純度のイムノアドヘシンの調製物を得ることができる。
【０１０９】
従来から知られている他の方法も、イムノアドヘシンの精製のために、プロテインＡ又はＧのアフィニティークロマトグラフィーの代わりに又はそれに加えて使用することができる。イムノアドヘシンは、硫黄親和性ゲルクロマトグラフィー（Hutchens等, Anal. Biochem., 159:217-226 (1986)）及び固定化金属キレートクロマトグラフィー（Al-Mashikhi等, J. Dairy Sci., 71:1756-1763 (1988)）では抗体と同様に挙動する。しかし、抗体とは異なり、イオン交換カラムにおけるその挙動はその等電点によってだけでなく、そのキメラの性質による分子中に存在しうる電荷双極子によっても支配される。
望まれるならば、イムノアドヘシンは二重特異的になされ得る。よって、本発明のイムノアドヘシンはＢｖ８ドメイン及び他の成長因子由来のドメインのようなドメインを組合せうる。二重特異的分子では、その抗体様構造の一方のアームがキメラ抗体重鎖で他方のアームがキメラ抗体重鎖-軽鎖対からなる三量体分子が、精製が簡単であるので有利である。１０の四量体の混合物をつくり出す、二重特異的イムノアドヘシンの産生に伝統的に使用されている抗体産生クアドローマと異なり、三量体イムノアドヘシン構造の３つの鎖をコードしている核酸を形質移入した細胞は、３つの分子のみの混合物を生産し、よってこの混合物からの所望される産物の精製は簡単である。
【０１１０】
４．Ｂｖ８活性のモジュレーターの調製と同定
本発明はまたＢｖ８の一又は複数の生物学的活性を模倣又は亢進し（アゴニスト）あるいはＢｖ８の効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するために化合物をスクリーニングする方法をも包含する。Ｂｖ８アゴニスト及びアンタゴニストはまたＢｖ８モジュレーターと呼ばれる。アンタゴニスト薬物候補のスクリーニングアッセイはＢｖ８ポリペプチドに結合し又はそれと複合体を形成し、あるいは他の細胞性タンパク質とのＢｖ８の相互作用に干渉等する化合物を同定するように設計される。
【０１１１】
ａ．小分子スクリーニング
小分子は、Ｂｖ８アゴニスト又はアンタゴニストとして作用しうる能力を持ち得、よって治療的に有用でありうる。かかる小分子には、天然に生じる小分子、合成の有機又は無機化合物及びペプチドが含まれうる。しかし、本発明の小分子はこれらの形態に限定されるものではない。小分子の広範なライブラリーが商業的に利用でき、所望の活性についてこれらの分子をスクリーニングするための様々なアッセイ法が当該分野でよく知られている。
候補Ｂｖ８アゴニスト又はアンタゴニスト小分子は、好ましくは、Ｂｖ８活性の潜在的なモジュレーターの迅速な同定を可能にするアッセイで最初に同定される。そのようなアッセイの例は、Ｂｖ８レセプターに候補分子が結合する能力が測定されるタンパク質-タンパク質結合アッセイである。他の例では、Ｂｖ８レセプターへのＢｖ８の結合を妨害する候補分子の能力が測定される。
【０１１２】
好適な実施態様では、小分子Ｂｖ８アゴニストはＢｖ８の一又は複数の生物学的活性を模倣するその能力によって同定される。例えば、内皮細胞の増殖を誘導し、以下の実施例２及び３に記載されているように内皮細胞生存を促進し、又は以下の実施例４に記載されているように血管形成を誘導するその能力について小分子はスクリーニングされる。
他の実施態様では、小分子Ｂｖ８アンタゴニストはＢｖ８の生物学的活性の一又は複数を阻害するその能力によって同定される。よって、候補化合物はＢｖ８と接触させられる。ついでＢｖ８の生物学的活性が評価される。一実施態様では、例えば実施例２に記載されているように、内皮細胞の増殖を刺激するＢｖ８の能力が決定される。他の実施態様では、例えば実施例３に記載されているように、内皮細胞の生存を促進するＢｖ８の能力が決定される。化合物は、Ｂｖ８の生物学的活性が阻害されるアンタゴニストとして同定される。
Ｂｖ８アゴニスト又はアンタゴニストとして同定される化合物は本発明の方法において使用することができる。例えばＢｖ８アンタゴニストは癌を治療するために使用できる。
【０１１３】
ｂ．アゴニスト抗体の調製と同定
Ｂｖ８の生物学的性質を模倣するアゴニストヒト及び非ヒトポリクローナル及びモノクローナル抗体（非ヒトモノクローナル抗体のヒト化型を含む）もまた本発明において考慮される。これらにはアミノ酸配列変異体、グリコシル化変異体及び抗体断片が含まれる。そのような抗体の生産とアゴニスト抗体の選択のための一般的な技術は当該分野において知られており、以下に簡単に説明する。
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を調製する方法は、当該分野で知られている。例えば、ポリクローナル抗体は、免疫剤の一又は複数回、そして所望するならばアジュバントの注入によって哺乳動物で産生することができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントが複数回の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物に注射されるであろう。免疫剤を免疫化した哺乳動物にとって免疫原性であることが知られているタンパク質、例えば血清アルブミン、又は大豆トリプシンインヒビターと結合させることが有益であり得る。用いられ得るアジュバントの例には、完全フロイントアジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭが含まれる。
【０１１４】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４，８１６，５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターもしくはマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０１１５】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰ-２１およびＭ．Ｃ．-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【０１１６】
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、該細胞を限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【０１１７】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。ＤＮＡはまた、例えば、相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常部のコード化配列を置換することによって（Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。そのように、「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体は、ここに記載したＢｖ８アゴニストモノクローナル抗体の結合特異性を有するように調製される。
【０１１８】
キメラ又はハイブリッド抗体は、また、架橋剤に関するものを含む、既知の合成タンパク質化学の方法を用いてインビトロで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的に関して適した試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミデートが含まれる。
抗体の組換え生産は以下に更に詳細に説明する。
【０１１９】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体には非ヒトを源にする一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は本質的にはWinterと共同研究者（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988)）の方法に従って、齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(Cabilly, 上掲)である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはある程度のＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１２０】
抗体が、抗原及び他の好ましい生物学的特性に対する高い親和性の保持をともなってヒト化されることは重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によって、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び概念上のヒト化産物の分析の工程によって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、広く入手可能であり、当該分野に熟練した者にとっては良く知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体配置構造を例示して表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これら表示の検討によって、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の可能性ある役割の分析が可能になる、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原へ結合する能力に影響を及ぼす残基の分析である。この方法では、標的抗原に対して増大した親和性のような所望される抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基がコンセンサス及び移入配列から選択されて組み合わされることが可能である。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに、直接的かつ最も実質的に関与している。更なる詳細については、１９９１年６月１４日に出願された米国出願第０７／７１５２７２号の一部継続出願である１９９２年８月２１日出願の米国出願第０７／９３４３７３号を参照のこと。
【０１２１】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は，例えば，Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984), 及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）によって記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
【０１２２】
Mendez等(Nature Genetics 15: 146-156[1997]）は、さらに技術を改良し、抗原の挑戦を受けた際に、高親和性の完全なヒト抗体を生成する「XenomouseII」と命名されたトランスジェニックマウスの系統を作製した。これは、上に記載したような内因性のＪＨセグメントへの欠損をともなうマウスへのメガベースヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の生殖細胞系組み込みによって達成された。XenomouseIIは、およそ６６ＶＨ遺伝子、完全なＤＨ及びＪＨ領域及び３つの異なる定常領域（μ，δ及びχ）を含む１０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を有し、そしてまた、３２Ｖκ遺伝子、Ｊκセグメント及びＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスで生産される抗体は、遺伝子再構成、構築及びレパートリーを含む全ての点でヒトにおいて見られるものと極めて類似している。ヒト抗体は、マウス遺伝子座での遺伝子再構成を防ぐ内因性のＪＨセグメントの欠損のために、内因性抗体より優先的に多く発現される。
【０１２３】
あるいは、ファージディスプレイ技術（MaCafferty等, Nature 348, 552-553[1990]）を、免疫化されていない供与体の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体断片をインビトロで生産することに用いることができる。この技術によると、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄのような糸状バクテリオファージの主要又は副コートタンパク質遺伝子のいずれかへインフレームでクローンされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として表示される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むことから、抗体の機能的特性に基づいた選択も、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をする結果となる。従って、ファージは、Ｂ細胞の幾つかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々のフォーマットでおこなうことができる；それらの概説として、例えば、Johnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571(1993)を参照せよ。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかのソースをファージディスプレイのために用いることができる。Clackson等, Nature 352, 624-628(1991)は、免疫化したマウスの脾臓から取り出したＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、多様な抗-オキサゾロン抗体を単離した。免疫化していないヒト供与体のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、基本的にMarks等, J. Mol. Biol. 222, 581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12, 725-734(1993)によって記載されている技術に従って単離することができる。天然免疫応答では、抗体遺伝子は高速度で変異を蓄積する（体細胞過剰変異）。導入された幾つかの変化は、より高い親和性を与え、そして高親和性表面免疫グロブリンを表示するＢ細胞は、後の抗原の挑戦の間に、優先的に複製されて分化する。この天然プロセスは、「鎖シャフリング」として知られている技術を用いて模倣することができる（Marks等, Bio/Technol. 10, 779-783[1992]）。この方法では、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を、重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫化していない供与体から得られたＶドメイン遺伝子の天然に生じる変異体（レパートリー）のレパートリーで経時的に置き換えることによって改良することができる。この技術は、ｎＭの程度での親和性で、抗体及び抗体断片の生産を可能にする。かなり大きなファージ抗体レパートリーを作製するための戦略（「全てのライブラリーのもと」としても知られている）は、Waterhouseら., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266(1993)によって記載され、そのような大きなファージライブラリーからの直接の高親和性ヒト抗体の単離は、印刷中のGriffith等, EMBO J. (1994)によって報告されている。ジーンシャッフリングは、また、げっ歯動物の抗体からヒト抗体を誘導するために用いられ、そのヒト抗体は、最初のげっ歯抗体に対して類似の親和性及び特異性を有する。「エピトープ・インプリンティング」とも呼ばれるこの方法によると、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯抗体の軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換されて、げっ歯-ヒトキメラを作成する。抗原での選択は、機能性抗原結合部位を使うことができるヒト可変部の単離を引き起こす結果となる、すなわ���エピトープは、パートナーの選択を支配（インプリント）する。残りのげっ歯Ｖドメインを置換するために工程が繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に発行のＰＣＴ特許出願国際公開９３／０６２１３を参照のこと）。ＣＤＲ移植によるげっ歯抗体の伝統的なヒト化とは違って、この技術によって、げっ歯起源のフレームワーク又はＣＤＲ残基を有しない完全なるヒト抗体を提供される。
【０１２４】
（ｖ）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によってなされるが、かなり面倒であり、産物の収率は低い。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際公開９３／０８８２９、及びTraunecker等, EMBO 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１２５】
異なる、より好ましい方法によって、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列へ融合することができる。この融合は、好ましくは、少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には、軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、そして望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主微生物へ同時形質移入する。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)ことからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、１９９４年３月３日公開の国際公開９４／０４６９０に開示されている。
二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
【０１２６】
（ｖｉ）ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４６７６９８０号）及びＨＩＶ感染の治療のために（ＰＣＴ出願国際公開９１／００３６０；国際公開９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を用いて作製することができる。適した架橋剤は当該分野でよく知られており、米国特許第４６７６９８０号に、多くの架橋方法と共に開示されている。
【０１２７】
（ｖｉｉ）抗体断片
ある実施態様では、Ｂｖ８アゴニスト抗体（マウス、ヒト及びヒト化抗体、及び抗体変異体を含む）は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導される(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167 (1992))。他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２分子の組立を促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用してＦ(ａｂ')２が形成される。他のアプローチ法では、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。
（ｖｉｉｉ）アゴニスト抗体の同定
Ｂｖ８アゴニスト抗体はその生物学的活性に基づいて同定される。一実施態様では、Ｂｖ８アゴニスト抗体は、実施例２に記載されているように、内皮細胞の増殖を誘導するその能力によって同定される。他の実施態様では、Ｂｖ８アゴニスト抗体は実施例４に記載されているように、血管形成を誘導するその能力によって同定される。
【０１２８】
５．Ｂｖ８と相互作用するタンパク質のスクリーニングアッセイ
タンパク質-タンパク質相互作用を検出するのに適した任意の方法を、Ｂｖ８と相互作用する、限定するものではないが膜貫通又は細胞内タンパク質を含む、タンパク質又は他の分子を同定するために使用することができる。使用することができる伝統的な方法としては、Ｂｖ８と相互作用するタンパク質を同定するための免疫共沈降、架橋及び勾配又はクロマトグラフィーカラムでの同時精製である。このようなアッセイにおいては、Ｂｖ８成分は完全長タンパク質、その可溶型誘導体、対象のドメインに対応するペプチド、又はＢｖ８のある領域を含む融合タンパク質でありうる。
Ｂｖ８と相互作用可能なタンパク質をコードする遺伝子の同時の同定を可能にする方法を用いることができる。これらの方法には、例えば、標識Ｂｖ８又はその変異体を使用して、８ｇｔ１１ライブラリーの抗体探索のよく知られた方法と同様な形で、発現ライブラリーを探索することが含まれる。
【０１２９】
インビボでのタンパク質相互作用を検出する方法、２ハイブリッド(two-hybrid)系を、例示のためのみで限定をしないで詳細に説明する。この系の一つのバージョンが開示され（Chien等, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582）、クローンテック（Palo Alto, CA）から市販されている。
簡単に述べると、このような系を使用して、一方のプラスミドが、Ｂｖ８、又はそれ由来のポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列に融合した転写活性化因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードしているヌクレオチドからなり、他方のプラスミドが、ｃＤＮＡライブラリーの一部としてこのプラスミド中に組み込まれた未知のタンパク質をコードしているｃＤＮＡに融合した転写活性化因子タンパク質のドメインをコードしているヌクレオチドからなる２ハイブリッドタンパク質をコードしているプラスミドが構築される。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドとｃＤＮＡライブラリーは、その調節領域が転写活性化因子の結合部位を含むレポーター遺伝子（例えばＨＢＳ又はｌａｃＺ）を含む酵母サッカロミセス・セレビシェの株に形質転換される。何れかのハイブリッドタンパク質だけではレポーター遺伝子の転写を活性化できない：ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは、活性化機能を提供しないので、活性化できず、活性化ドメインハイブリッドは、活性化因子の結合部位に局在化できないので、活性化できない。２ハイブリッドタンパク質の相互作用は機能的活性化因子タンパク質を再構成し、レポーター遺伝子の発現を生じ、該レポーター遺伝子はレポーター遺伝子産物のアッセイによって検出される。
【０１３０】
２ハイブリッド系又は関連方法は、「ベイト」遺伝子産物と相互作用するタンパク質の活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。例を挙げると、限定するものではないが、Ｂｖ８はベイト遺伝子産物として使用することができる。全ゲノム又はｃＤＮＡ配列が活性化ドメインをコードしているＤＮＡに融合される。このライブラリーとＤＮＡ結合ドメインに融合したベイトＢｖ８遺伝子産物のハイブリッドをコードしているプラスミドを酵母レポーター株中に同時形質転換し、得られた形質転換体を、レポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば、限定するものではないが、ベイトＢｖ８遺伝子配列、例えば遺伝子オープンリーディングフレームを、それがＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードしているＤＮＡに翻訳的に融合されるようにベクター中にクローニングすることができる。これらのコロニーを精製し、レポーター遺伝子の発現の生じるライブラリープラスミドを単離する。ついで、ＤＮＡ配列決定法を使用して、ライブラリープラスミドによってコードされているタンパク質を同定する。
【０１３１】
ベイトＢｖ８遺伝子産物と相互作用するタンパク質が検出されることになる細胞株のｃＤＮＡライブラリーは、当該分野において常套的に実施されている方法を用いて作製できる。ここに記載された特定の系によれば、例えば、ｃＤＮＡ断片を、それらがＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳的に融合されるようにベクター中に挿入することができる。このライブラリーを、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターによって作用されるｌａｃＺ遺伝子を含む酵母株中にベイトＢｖ８遺伝子-ＧＡＬ４融合プラスミドと共に同時形質転換できる。ベイトＢｖ８遺伝子産物と相互作用するＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合したｃＤＮＡコード化タンパク質が活性なＧＡＬ４タンパク質を再構成し、よって発現を駆動する。発現を駆動するコロニーは当該分野で常套的な方法によって検出することができる。ついで、ｃＤＮＡをこれらの株から精製し、使用して、当該分野で常套的に実施されている方法を用いてベイトＢｖ８遺伝子相互作用タンパク質を製造し単離することができる。
【０１３２】
ａ．Ｂｖ８発現又は活性を調節する化合物のアッセイ
次のアッセイは、Ｂｖ８と相互作用する（例えば結合する）化合物、その結合対、同族体又はレセプターとのＢｖ８の相互作用を妨害する化合物、及びＢｖ８遺伝子の発現の活性を調節する（つまりＢｖ８遺伝子の発現レベルを調節する）か又は体中のＢｖ８のレベルを調節する化合物を同定するように設計されている。Ｂｖ８遺伝子調節配列（例えばプロモーター配列）に結合し、従ってＢｖ８遺伝子の発現を調節しうる化合物を同定するアッセイもまた利用できる。例えばPlatt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. 269:28558-28562を参照のこと。
本発明によってスクリーニングすることができる化合物には、限定されるものではないが、ペプチド、抗体とその断片、及びＢｖ８又はＢｖ８レセプターに結合し天然リガンド（つまりアゴニスト）によって惹起された活性を模倣するか又は天然リガンド（つまりアンタゴニスト）によって惹起された活性を阻害する他の有機化合物（例えばペプチドミメティックス）が含まれる。
【０１３３】
そのような化合物には、限定されるものではないが、ペプチド、例えば、限定されるものではないがランダムペプチドライブラリーのメンバーを含む可溶型ペプチド；（例えばLam, K.S.等, 1991, Nature 354:82-84; Houghten, R等, 1991, Nature 354:84-86を参照）、及びＤ形及び／又はＬ形アミノ酸からなるコンビナトリアル化学誘導分子ライブラリー、ホスホペプチド（限定するものではないが、ランダムな又は部分的に縮重した定方向ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む；例えばSongyang, Z等, 1993, Cell 72:767-778を参照）、抗体（限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ又は単鎖抗体、ＦＡｂ、Ｆ(ａｂＮ)２及びＦＡｂ発現ライブラリー断片、及びそのエピトープ結合断片を含む）、及び小有機又は無機分子が含まれうる。
本発明によってスクリーニングできる他の化合物には、限定されるものではないが、適切な細胞（例えば内皮細胞）中に進入し得、Ｂｖ８遺伝子又はＢｖ８媒介経路に関与するある種の他の遺伝子に（例えば遺伝子発現に関与する転写因子又は調節領域との相互作用によって）影響を及ぼす小有機分子；又はＢｖ８の活性又はＢｖ８シグナル伝達、異化、又は代謝経路に関与するある種の他の細胞内因子の活性に影響を及ぼし又はそれに代わる化合物が含まれる。
【０１３４】
コンピュータモデル化及び検索技術によって、Ｂｖ８発現又は活性を調節可能な化合物の同定、又は既に同定された化合物の改良が可能になる。そのような化合物又は組成物を同定すれば、活性な部位又は領域が同定される。そのような活性部位は典型的にはリガンド結合部位であるかも知れない。例えばペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、又はその天然リガンドとの関連化合物又は組成物の複合体の研究から、当該分野で知られている方法を使用して活性部位を同定することができる。後者の場合、化学的又はＸ線結晶学的方法を用いて、因子のどこに複合体化リガンドが見出されるかを見出すことにより活性な部位を見出すことができる。
次に、活性な部位の３次元幾何構造が決定される。これは、完全な分子構造を決定することができる、Ｘ線結晶構造解析を含む既知の方法によってなすことができる。他方、固相又は液相ＮＭＲを用いて、ある分子内距離を決定することができる。構造決定の任意の他の実験的方法を使用して、部分的な又は完全な幾何構造を得ることができる。幾何構造は、天然又は人工の複合体化リガンドを用いて測定することができ、これは決定される活性部位構造の精度を増大しうる。
【０１３５】
不完全な又は不十分に精確な構造が決定される場合、コンピュータベースの数値モデリング方法を用いて、構造を完全にし又はその精度を改善することができる。タンパク質又は核酸のような特定の生体高分子に特異的なパラメータ化モデル、分子の動きの計算に基づく分子動力学モデル、熱アンサンブルに基づく統計的力学モデル、又は組合せモデルを含む、任意の認識されたモデリング方法を用いることができる。殆どのタイプのモデルに対して、構成原子及び基間の力を表す標準的な分子力場が必要であり、物理化学において知られている力場から選択することができる。不完全な又は精度が悪い実験的な構造は、これらのモデリング法によって計算される完全でより精確な構造に対する制約となり得る。
最後に、実験的であれ、モデリングによってであれ、又は組合せによってであれ、活性な部位（又は結合部位）の構造を決定すると、その分子構造に関する情報に沿って化合物を含むデータベースを検索することによって候補の調節化合物を同定することができる。そのような検索は、決定された活性な部位の構造に一致し、活性な部位を定める基と相互作用する構造を持つ化合物を探す。そのような検索はマニュアルであってもよいが、好ましくはコンピュータ支援のものである。この検索から見出されたこれらの化合物はＢｖ８活性の潜在的なモジュレーターである。
【０１３６】
あるいは、これらの方法を用いて、既に知られている調節化合物又はリガンドから改善された調節化合物を同定することができる。既知の化合物の組成(composition)は修飾でき、修飾の構造的効果は、新しい組成に適用される上述の実験的及びコンピュータモデリング方法を使用して決定することができる。ついで、変更された構造が、改善された一致又は相互作用を生じるかを決定するために化合物の活性部位構造と比較される。このようにして、例えば側方基を変えることによる組成の系統的な変動を、改善された特異性又は活性のリガンド又は改変された調節化合物を得るために速やかに評価することができる。
Ｂｖ８の活性部位（又は結合部位）の同定に基づいて調節化合物、及び関連した伝達及び転写因子を同定するのに有用な更なる実験的及びコンピュータモデリング法は当業者には明らかであろう。
分子モデリング系の例はＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation, Waltham, MA）である。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化及び分子力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフモデリング及び解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは相互作用構造、修飾、可視化及び分子の互いの挙動の解析を可能にする。
【０１３７】
多くの文献が特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングについて総説しており、例えばRotivinen等, 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (1988年6月16日); McKinaly及びRossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122; Perry及びDavies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp.189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis及びDean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236:125-140及び141-162であり;また核酸成分のためのモデルレセプターに対しては、Askew等, 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090である。化学物質をスクリーニングし画像で示す他のコンピュータプログラムは、BioDesign社（Pasadena, CA）、Allelix社（Mississauga, Ontario, Canada）、及びHypercube社（Cambridge, Ontatio）のような会社から入手できる。これらのものは特定のタンパク質に特異的な薬物へ利用するために主として設計されているが、ＤＮＡ又はＲＮＡの領域に特異的な薬物の設計に、その領域が特定された場合には、適合化させることができる。
【０１３８】
結合性を改変しうる化合物の設計と製造について上述したが、インヒビター又はアクチベーター化合物に対して、天然の生成物又は合成化学物質、及びタンパク質を含む生物学的に活性な物質を含む、既知の化合物のライブラリーをスクリーニングすることもできる。
ここに記載されるもののようなアッセイによって同定される化合物は、例えばＢｖ８遺伝子産物の生物学的機能を解明するのに有用であろう。そのような化合物は様々な生理学的疾患の何れかを治療するために治療的に有効な用量で患者に投与することができる。治療的に有効な用量とは、何れかの生物学的徴候のあらゆる改善、障害、防止又は改変を生じるのに十分な化合物の量を意味する。
【０１３９】
ｂ．Ｂｖ８に結合する化合物のアッセイ
Ｂｖ８と相互作用し（例えば結合し）又はＢｖ８を模倣することができ、あるいは同族体レセプター、結合対又は基質へのＢｖ８の結合を妨害することができる化合物を同定するシステムが設計できる。同定される化合物は、例えば野生型及び／又は変異体Ｂｖ８遺伝子産物の活性を調節するのに有用であり得；Ｂｖ８の生物学的機能を詳しく調べるのに有用であり得；正常なＢｖ８の相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングに使用し得、あるいはそのような相互作用をそれ自身が破壊し又は活性化させうる。
Ｂｖ８又はＢｖ８同族体レセプター又は基質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、Ｂｖ８と試験化合物の反応混合物を、二つの化合物が相互作用し結合し、よって除去され及び／又は反応混合物において検出され得る複合体を形成する条件と時間で、調製することを含む。使用されるＢｖ８種はスクリーニングアッセイの目標に応じて変わりうる。例えば、天然レセプターのアゴニストが所望される場合は、完全長Ｂｖ８、又は可溶型切断Ｂｖ８、ペプチド、又はアッセイ系において利点を生じるタンパク質又はポリペプチド（例えば標識、得られた複合体の単離等々）に融合した一又は複数のＢｖ８ドメインを含む融合タンパク質を用いることができる。Ｂｖ８と直接相互作用する化合物が探索されている場合は、Ｂｖ８に対応するペプチド及びＢｖ８を含む融合タンパク質を用いることができる。
【０１４０】
スクリーニングアッセイは様々な方法で実施することができる。例えば、そのようなアッセイを実施する一方法は、Ｂｖ８、ポリペプチド、ペプチド、又はそれからの融合タンパク質、又は試験物質を固相に固着させ、反応の終わりに固相に固着したＢｖ８／試験化合物複合体を検出することを含むであろう。そのような方法の一実施態様では、Ｂｖ８反応物が固相に固着させられ、固着しない試験化合物が、直接的か間接的に、標識されうる。
実際には、マイクロタイタープレートを固相として簡便に利用することができる。固着成分は非共有又は共有結合によって固定されうる。非共有結合は固体表面にタンパク質の液を単に被覆し乾燥させることによって達成できる。あるいは、固定化されるタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体は固体表面にタンパク質を固着させるために使用できる。表面は前もって準備し保存できる。
【０１４１】
アッセイを実施するために、非固定化成分を、固着成分を含む被覆表面に加える。反応が完了した後、未反応の成分を、形成されたあらゆる複合体が固体表面上に固定化されたままになる条件下で（例えば洗浄により）除去する。固体表面に固着した複合体の検出は多くの方法で達成することができる。前の非固定化成分が事前に標識されている場合は、表面に固定化された標識の検出が、複合体が形成されたことを示す。前の非固定化成分が事前に標識されていない場合は、間接的な標識を用いて、例えば前の非固定化成分に特異的な標識抗体（該抗体はついで直接的に標識され又は間接的に標識抗Ｉｇ抗体で標識されうる）を使用して、表面上に固着された複合体を検出することができる。
あるいは、反応を液相中で実施することができ、反応産物は未反応成分から分離され、複合体が、例えば溶液中に形成されたあらゆる複合体を固着させるためにＢｖ８タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質又は試験化合物に特異的な固定化抗体を、固着した複合体を検出するために可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して、検出される。
【０１４２】
ｃ．Ｂｖ８相互作用を妨害する化合物のアッセイ
Ｂｖ８と相互作用する巨大分子は、この検討の目的では「結合対」と称する。これらの結合対はＢｖ８媒介生物学的経路に関与している可能性が高い。従って、体内におけるＢｖ８活性を調節し又は増大させ、及び／又はこの活性（又はその欠乏）に関連する疾患を制御するのに有用でありうるそのような結合対の相互作用に干渉し又はこれを破壊する化合物を同定することが望ましい。
Ｂｖ８と結合対又は結合対類間の相互作用を妨害する化合物を同定するために使用されるアッセイ系の基本的原理は、Ｂｖ８又はそのある種の変異体と、その結合対の反応混合物を、二つが相互作用し結合し、よって複合体を形成する条件と時間で、調製することを含む。阻害活性について化合物を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下及び非存在下で調製する。試験化合物は反応混合物中に最初から含められるか、又はＢｖ８とその結合対の添加に続いて添加されうる。コントロール反応混合物は試験化合物を含めないで又はプラシーボと共にインキュベートされる。ついでＢｖ８と結合対の間のあらゆる複合体の形成を検出する。試験化合物を含む反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、化合物がＢｖ８と相互作用結合対の相互作用を妨害することを示している。また、試験化合物と通常のＢｖ８タンパク質を含む反応混合物内における複合体の形成は、また試験化合物と変異体Ｂｖ８を含む反応混合物内の複合体形成と比較されうる。この比較は、通常のタンパク質ではなく変異体、又は変異されたＢｖ８の相互作用を特異的に破壊する化合物を同定することが望まれる場合に重要でありうる。
【０１４３】
Ｂｖ８と結合対間の相互作用を妨害する化合物のアッセイは不均一又は均一な様式で実施することができる。不均一アッセイはＢｖ８又は結合対の何れかを固相に固着させ、反応の終わりに固相上に固着した複合体を検出することを含む。均一アッセイでは、全反応が液相中で実施される。何れのアプローチでも、反応物の添加順序は試験されている化合物に関して異なった情報を得るために変化させることができる。例えば、競合によって相互作用を妨害する化合物は、試験物質の存在下で反応を行わしめることにより、すなわち、試験物質を、Ｂｖ８及び相互作用性結合対に先だって又はそれらと同時に反応混合物に加えることにより、同定することができる。あるいは、前もって形成された複合体を破壊する化合物、例えば複合体から成分の一つを分離させる高い結合定数を持つ化合物を、複合体の形成後に試験化合物を反応混合物に添加することによって試験することができる。様々な様式を以下に簡単に説明する。
不均一アッセイ系では、Ｂｖ８又は相互作用性結合対の何れかが固体表面に固着される一方、非固着種が直接的にか間接的に標識される。実際には、マイクロタイタープレートを簡便に利用することができる。固着種は非共有又は共有結合によって固定されうる。非共有結合は固体表面にＢｖ８又は結合対の液を単に被覆し乾燥させることによって達成できる。あるいは、固定化される種に特異的な固定化抗体を、固体表面に種を固着させるために使用できる。表面は前もって準備し保存できる。
アッセイを実施するために、固定化種の対を、試験化合物を被覆した又は被覆していない表面に暴露する。反応が完了した後、未反応の成分を（例えば洗浄により）除去し、形成されたあらゆる複合体が固体表面上に固定化されたまま残る。固体表面に固着した複合体の検出は多くの方法で達成することができる。非固定化種が事前に標識されている場合は、表面に固定化された標識の検出が、複合体が形成されたことを示す。非固定化種が事前に標識されていない場合は、間接的な標識を用いて、例えば最初の非固定化種に特異的な標識抗体（該抗体はついで直接的に標識され又は間接的に標識抗Ｉｇ抗体で標識されうる）を使用して、表面上に固着された複合体を検出することができる。反応成分の添加順序に応じて、複合体形成を阻害し又は前もって形成された複合体を破壊する試験化合物を検出することができる。
【０１４４】
あるいは、反応を試験化合物の存在下又は非存在下で液相中で実施することができ、反応産物は未反応成分から分離され、複合体が、例えば溶液中に形成されたあらゆる複合体を固着させるために結合成分の一つに特異的な固定化抗体を、固着した複合体を検出するために他の結合対に特異的な標識抗体を使用して、検出される。再び、液相への反応物の添加順序に応じて、複合体形成を阻害し又は前もって形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することができる。
本発明の他の実施態様では、均一アッセイを用いることができる。このアプローチ法では、Ｂｖ８と相互作用結合対の前もって形成された複合体で、Ｂｖ８又はその結合対の何れかが標識されているが、標識によって生じるシグナルが複合体の形成のためにクエンチされるものが調製される（例えばイムノアッセイにこの方法を利用しているRubensteinの米国特許第４１０９４９６号を参照のこと）。前もって形成された複合体と競合し、それから種の一つを置換する試験物質の付加により、バックグラウンドを超えるシグナルが生成される。このようにして、相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。
【０１４５】
特定の実施態様では、Ｂｖ８融合体を固定化のために調製することができる。例えば、Ｂｖ８又はそのペプチド断片を、その結合活性が、得られる融合タンパク質中に維持されるように、ｐＧＥＸ-５Ｘ-１のような融合ベクターを使用してグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させることができる。当該分野で常套的に実施され上述された方法を使用して、相互作用結合対を精製し、モノクローナル抗体を得るために使用することができる。この抗体は、当該分野で常套的に実施されている方法によって、例えば放射性同位元素１２５Ｉで標識することができる。不均一アッセイでは、融合タンパク質をグルタチオン-アガロースビーズに固着させることができる。ついで、相互作用性結合対を、相互作用と結合を生じせしめる形で試験化合物の存在下又は不存在下で加えることができる。反応期間の終わりに、未結合物質を洗い去ることができ、標識されたモノクローナル抗体を系に添加して複合体成分に結合させることができる。Ｂｖ８と相互作用性結合対の間の相互作用は、グルタチオン-アガロースビーズに付随して残る放射能の量を測定することによって検出することができる。試験化合物による相互作用の阻害が成功すると、測定放射能は減少することになる。
あるいは、ＧＳＴ融合タンパク質と相互作用性結合対は固体グルタチオン-アガロースビーズの不存在下で液体中で互いに混合することができる。試験化合物は種が相互作用させられる間又はその後に加えることができる。ついで、この混合物をグルタチオン-アガロースビーズに加えることができ、未結合物質を洗い流す。再び、Ｂｖ８と結合対間の相互作用の阻害度は、標識抗体を加え、ビーズに付随する放射能を測定することによって検出することができる。
【０１４６】
本発明の他の実施態様では、これらの同じ方法を、完全長タンパク質の一つ又は双方の代わりに、Bv8及び／又は相互作用性又は結合対（結合対がタンパク質である場合）の結合ドメインに対応するペプチド断片を使用して用いることができる。当該分野で常套的に実施される任意の数の方法を使用して、結合部位を特定し分離することができる。これらの方法には、限定するものではないが、タンパク質の一つをコードする遺伝子の突然変異誘発及び免疫共沈降アッセイでの結合破壊のスクリーニングが含まれる。ついで、複合体中の第二の種をコードしている遺伝子の代償性突然変異体を選択することができる。各タンパク質をコードしている遺伝子の配列解析は、相互作用性結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異を明らかにする。あるいは、一つのタンパク質を、上述の方法を使用して固体表面に固着させ、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で処理されたその標識された結合対と相互作用させ結合させることができる。洗浄後に、結合ドメインを有する比較的短い標識されたペプチドは固体物質に付随したままであり得、これを単離してアミノ酸配列決定によって同定することができる。また、細胞内結合対をコードする遺伝子がひとたび取得されると、短い遺伝子セグメントを遺伝子操作してタンパク質のペプチド断片を発現させ、ついでその結合活性を試験し、精製又は合成することができる。
例えば、限定するものではないが、Ｂｖ８は、ＧＳＴ融合タンパク質を作製し、それをグルタチオンアガロースビーズに結合させることにより、上述のような固形物質に固着させることができる。相互作用性結合対は３５Ｓのような放射性同位元素で標識し、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で開裂させることができる。ついで、開裂産物を固着融合タンパク質に加え、結合させることができる。未結合ペプチドを洗って除去した後、細胞内結合対結合ドメインを表す標識された結合物質を、よく知られた方法によって溶離させ、精製し、そのアミノ酸配列を分析することができる。このようにして同定されたペプチドは、合成的に製造し又は組換えＤＮＡ法を使用して適切な有益な(facilitative)タンパク質に融合させることができる。
【０１４７】
６．製薬組成物
ここに記載したＢｖ８ポリペプチド及びそのモジュレーターは治療剤として用いることができる。本発明のＢｖ８ポリペプチド及びＢｖ８モジュレーターは、製薬的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って処方することができ、ここでのＢｖ８産物は製薬的に許容可能な担体ビヒクルと混合されて組み合わされる。Ｂｖ８の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ、好ましくは本質的に純粋なＢｖ８を、凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で、任意成分の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製される（上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で暴露される細胞又は哺乳動物に非毒性である。例としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はトゥイーン(TWEEN)、プルロニクス(Pluronics)、又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１４８】
インビボ投与に使用されるＢｖ８は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過等、当該分野に置いて知られている任意の方法により容易に達成される。Ｂｖ８は凍結乾燥形態で保存してもよい。治療用Ｂｖ８組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
Ｂｖ８は場合によっては他の成長因子と組み合わされ、又はそれと併せて投与される。例えばＥＧ-ＥＣＧＦ又はＶＥＧＦと組み合わされうる。
Ｂｖ８は癌治療の他の一般的な治療法と共に使用してもよい。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変わりうる。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できる指針を提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W.「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【０１４９】
Ｂｖ８ポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＢｖ８ポリペプチド又はモジュレーターを持続放出投与することが望まれる場合、Ｂｖ８ポリペプチド又はモジュレーターのマイクロカプセル化が考えられる。例えば、精製形態のＢｖ８は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）中に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルション中に捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, 1980（A.Osol編）に開示されている。
Ｂｖ８は治療用に使用するために徐放性調製物中に導入してもよい。徐放性調製物の適切な例には、マイクロカプセル又はフィルム等の、成形品の形態である半透性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)に記載されたようなヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１)、Ｌ-グルタミン酸とエチル-γ-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman等, Biopolymers 22:547 (1983)）、非分解性エチレン酢酸ビニル（上掲のLanger等）又は分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron DepotＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８）が含まれる。
【０１５０】
エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日にわたって分子を放出できるが、所定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化タンパク質は、長時間体内に残存すると、３７℃の水分に曝される結果、変性又は凝集し、生物学的活性の喪失や免疫原性の変化のおそれがある。関連するメカニズムに応じてタンパク質の安定化のために合理的な処置が案出できる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合であることが分かったら、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、安定化を達成することができる。
また、持続放出Ｂｖ８組成物はリポソーム的に封入されたＢｖ８を含む。Ｂｖ８を含有するリポソームは、それ自体周知である方法（Epstein等, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688; Hwang等, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030；独国特許出願公開第３２１８１２１号；欧州特許出願公開第５２３２２号；同第３６６７６号；同第８８０４６号；同第１４３９４９号；同第１４２６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４４８５０４５号及び同第４５４４５４５号；及び欧州特許出願公開第１０２３２４号）によって調製される。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％以上コレステロールであり、選択される割合が最適なＢｖ８治療法に対して調節された微小(約２００-８００オングストローム)な単ラメラ状のものである。
【０１５１】
局所適用される場合、Ｂｖ８は好適には他の成分、例えば担体及び／又はアジュバントと組み合わされる。そのような他の成分の性質には、それらの意図している投与について製薬的に許容可能でかつ有効であり、組成物の活性成分の活性を低下させ得ないこと以外に制限はない。適当なビヒクルの例には、軟膏、クリーム、ゲル、又は懸濁液を含み、精製コラーゲンを含んでも含まなくてもよい。また、組成物は経皮パッチ、プラスター、及び包帯に、好ましくは液体又は半液体形態で含浸させてもよい。
ゲル製剤を得るためには、液体組成物に製剤したＢｖ８を、有効量の水溶性多糖類又はＰＥＧなどの合成ポリマーと混合して、局所投与するのに適した粘度のゲルを形成してもよい。用いられる多糖類は、例えば、セルロース誘導体、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、及びアルキルヒドロキシアルキルセルロースを含むエーテル化セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロース；デンプン及び分留デンプン；寒天；アルギン酸及びアルギン酸塩；アラビアゴム；プルラン；アガロース；カラゲナン；デキストラン；デキストリン；フルクタン；イヌリン；マンナン；キシラン；アラビナン；キトサン；グリコーゲン；グルカン；及び合成バイオポリマー；並びにガム、例えばキサンタンガム；グアーガム；イナゴマメガム；アラビアゴム；トラガカントガム；及びカラヤガム；及びそれらの誘導体及び混合物である。ここで好ましいゲル化剤は、生物学系に不活性で、非毒性で、調製が簡単で、なおかつ流動性がありすぎず粘性すぎず、そこに保持されるＢｖ８を不安定にさせないものである。
【０１５２】
好ましくは、多糖類はエーテル化セルロース誘導体、より好ましくは良好に定義され、精製され、米国特許に列挙されたものであり、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース誘導体である。ここで最も好ましいのはメチルセルロースである。
ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、典型的には適切な粘度を得るための低分子量及び高分子量のＰＥＧｓの混合物である。例えば、分子量４００−６００のＰＥＧと分子量１５００のものとの混合物は、ペーストを得るのに適した比率で混合した場合にこの目的に有効となるであろう。
多糖類及びＰＥＧｓに適用される「水溶性」という用語は、コロイド溶液及び分散物を含むことを意味する。一般に、セルロース誘導体の溶解度はエーテル基の置換度によって決まり、ここで有用な安定化誘導体は、そのようなエーテル基をセルロース鎖の無水グルコース単位当りに誘導体を水溶性とするのに十分な量有していなければならない。無水グルコース単位当りに少なくとも０．３５のエーテル基というエーテル置換度が一般に十分である。また、セルロース誘導体はアルカリ金属塩、例えばＬｉ、Ｎａ、Ｋ、又はＣｓ塩の形態であってもよい。
ゲルにメチルセルロースが用いられる場合、好ましくはゲルの約２−５％、より好ましくは約３％を含み、Ｂｖ８はゲル１ｍｌ当たりに約３００−１０００ｍｇの量で存在する。
【０１５３】
ある状況では、インプラント可能な半透膜デバイスは薬剤送達手段として有用である。例えば、Ｂｖ８、Ｂｖ８変異体、Ｂｖ８キメラ又はＢｖ８アゴニスト又はアンタゴニストを分泌する細胞をカプセル化し、そのようなデバイスを患者の体内にインプラントすることができる。従って、特定の条件によってそれを必要とする患者の体内にＢｖ８、そのアゴニスト又はアンタゴニストを分泌する細胞をインプラントすることを含む、癌を防止し又は治療する方法も含まれる。最後に、本発明は、半透膜と、その膜内にカプセル化されるＢｖ８（又は特定の条件に対して要求されうるそのアゴニストもしくはアンタゴニスト）を分泌する細胞を含むインプラントの患者への移植によって、癌を防止又は治療するデバイスを含み、該膜はＢｖ８（又はそのアゴニストもしくはアンタゴニスト）に対して透過性であり、細胞に有害な患者からの因子に対して不透過性である。Ｂｖ８を生成するように生体外で形質転換された患者自身の細胞を、場合によってはそのようなカプセル化をしないで、患者に直接移植することができる。生存している細胞の膜カプセル化方法は当業者には周知であり、カプセル化細胞の準備や患者内へのその移植は過度の実験を行わなくとも実施できる。
Ｂｖ８又はＢｖ８アゴニスト又はアンタゴニストを含む製薬的組成物は好ましくは適切な容器中に配される。容器には好ましくは製薬組成物の適切な使用法と用量を詳細に記載した指示書が添付される。当業者には、これらの指示書は治療方法に応じて変わることが分かるであろう。
【０１５４】
７．治療方法
ここで提供される治療剤は多くの治療に使用することができる。その治療は、ホルモン産生組織又は内分泌腺に関連する症状及び／又は過剰な望まれない又は調節されない血管形成を伴う症状を持つ哺乳動物、好ましくはヒトを治療することを含む。一側面では、Ｂｖ８又はＢｖ８アゴニストは症状を治療するのに有効な量が、それを必要とする哺乳動物に投与される。Ｂｖ８は、ポリペプチド又は核酸の形態で投与することができる。好ましくは、Ｂｖ８又はＢｖ８アゴニストは、症状が特定のホルモンを産生する細胞の生存又は数の増加を必要とするものである場合に使用される。そのような症状の例には糖尿病が含まれる。他の症状には、精巣の細胞のような生殖器官の細胞の数を増加させ、又は細胞の生存を亢進することが望まれるものが含まれる。他の症状には、新しい血管の形成を減じることが望まれるものが含まれる。そのような症状の例には、腫瘍、例えば睾丸癌が含まれる。
Ｂｖ８は他の化合物又は組成物と共に投与してもよい。一実施態様では、その化合物はＶＥＧＦ又はそのアゴニスト又はアンタゴニストである。場合によっては、化合物はＶＥＧＦのようなポリペプチドをコードする核酸であってもよい。
【０１５５】
一実施態様では、上のセクション４及び５のスクリーニングアッセイによって同定されたもののような化合物を、Ｂｖ８活性又は発現のレベルを調節するために使用することができる。すなわち、Ｂｖ８アゴニストであるか、又はレセプターに対するＢｖ８の結合を刺激可能な同定化合物は、Ｂｖ８活性のレベルの増加が望まれる治療に有用でありうる。同様に、Ｂｖ８遺伝子発現を増加させることができる同定化合物がこの種の治療に有用であろう。
好ましくは、Ｂｖ８又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、ホルモン産生組織又は内分泌腺に関連した症状、好ましくは特定のホルモンを生産する細胞の数の減少を、細胞増殖の減少又は血管形成の減少を必要とする症状を持つ個体に投与される。例えば、受精率を調節するのに有効な量でＢｖ８アンタゴニストを個体に投与することを含む、個体における受精率を調節する方法がここで提供される。Ｂｖ８アンタゴニストは嚢胞及びホルモン産生組織における過剰増殖に関連する他の症状を治療するために投与することもできる。
ステロイドホルモン依存性疾患もまた本発明の組成物及び方法を使用して対処できる。そのような疾患には、リポイド先天性副腎皮質過形成、不妊症、性的成熟、アンドロゲン依存性腫瘍、性的早熟、マッククーネ-アルブライト症候群、先天性副腎発育不全、又は低ゴナドトロピン性性機能低下症が含まれる。
【０１５６】
ここで提供される薬剤及び組成物によって治療することができる特定の症状は、癌、特にステロイド、例えばアンドロゲン依存性癌である。ここで提供される癌の好適な治療方法は、癌を有するか癌を有しているリスクのある個体に、癌を治療するのに有効な量でＢｖ８アンタゴニストを投与することを含む。一実施態様では、癌は精巣のものである。
更なる実施態様では、Ｂｖ８アンタゴニストは、例えば癌の治療において、一又は複数の化学療法剤と組み合わせて患者に投与される。治療効果が増大するように、化学療法剤での治療の前、治療の間、又は治療の後にＢｖ８を投与することができる。好適な化学療法剤には、限定されるものではないが、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、３'-アジド-３'-デオキシチミジン、タキサン類（例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France））及び／又はアントラサイクリン系抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製物及び投与計画を決定する際には製造者の指示書に従ってもよいし、又は熟練した医療専門家が経験的に決定してもよい。そのような化学療法のための調製物と投与計画はまたChemotherapy Service編, M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。
細胞増殖を増加させ細胞増殖を阻害する方法はインビボ又はインビトロで実施することができると理解される。ある場合には、インビトロで細胞試料にＢｖ８を加え、特定の細胞タイプの増殖を刺激することが望ましいであろう。ついで、Ｂｖ８処置試料をスクリーニングアッセイで使用し、又は治療を必要とする個体又は動物モデル中に移植することができる。
【０１５７】
治療的に使用されるＢｖ８又はＢｖ８アゴニスト又はアンタゴニストの有効量は、例えば、治療目的、投与経路、及び患者の状態に依存する。従って、治療士は用量を定め、必要とされる投与経路を変更して最適な治療効果を得ることが必要であろう。典型的には、臨床医が、所望の効果を達成する用量に到達するまでＢｖ８を投与する。全身治療のための典型的な毎日の用量は、投与経路に依存して、約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ哺乳動物体重／日あるいはそれ以上、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であろう。異なった処方が異なった治療化合物及び異なった疾患に有効であり、例えばある器官又は組織を標的とする投与が、他の器官又は組織への投与とは異なる形で送達することを必要としうると予想される。
別の一般的な計画として、Ｂｖ８は、効果的であるが過度に毒性ではないＢｖ８レベルを組織に形成することができる用量で標的部位又は組織に処方され送達される。この組織内濃度は、可能ならば連続注入、持続放出、局所適用、Ｂｖ８発現細胞移植、又は経験的に決定した頻度で注射により維持されなければならない。この治療法の経過は一般的なアッセイによって容易にモニターされる。
【０１５８】
投薬計画は個人の状況に基づいて決定されなければならない。しかし、好適な実施態様では、Ｂｖ８又はＢｖ８アゴニスト又はアンタゴニストは、毎日、より好ましくは一日おきに、更により好ましくは毎週少なくとも２回、投与される。治療は、好ましくは６ヶ月、より好ましくは１ヶ月、更により好ましくは少なくとも２週間、継続される。当業者には、正確な投薬計画は個人の状況に基づいて診療士によって決定されなければならないことが分かるであろう。
Ｂｖ８ポリペプチドをコードしている核酸をまた遺伝子治療法において使用することもできる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞内に導入される。「遺伝子治療」には、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は繰り返しの投与の、遺伝子治療剤の投与とが含まれる。アンチセンスＲＮＡｓ及びＤＮＡｓを、ある種の遺伝子のインビボでの発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それがインヒビターとして作用する細胞中に移入できることは既に示されている。（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって、その取込みを促進するように修飾してもよい。
【０１５９】
生存可能な細胞に核酸を導入するために利用できる様々な技術がある。その技術は、核酸が培養細胞にインビトロで移入されるか、あるいは意図する宿主の細胞にインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等々を含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzau等, Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)）。ある状況では、核酸供給源に、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の、標的細胞を標的にする薬剤を提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
Ｂｖ８配列もまた診断方法において使用することができる。Ｂｖ８の過剰発現は生殖器官の嚢胞又は癌の徴候である。更に、変異型又は機能障害Ｂｖ８について、患者からの試料を分析することができる。一般に、そのような方法は患者からの試料中のＢｖ８の発現をコントロールの発現と比較することを含む。
【０１６０】
８．製造物品
他の側面では、本発明は、疾病又は疾患の治療又は予防のため、あるいは受精率を調節するために有用な物質を含む製造物品を考える。製造物品は好ましくは容器及び容器上の又は容器に付随したラベル又はパッケージ挿入物を含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器はガラス及びプラスチックのような様々な材料から形成することができる。容器はＢｖ８又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを含有する組成物を収容し、ラベル又はパッケージ挿入物は好ましくはＢｖ８又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用するための指示書を提供する。一実施態様では、製造物品はＢｖ８アンタゴニストと、そのＢｖ８アンタゴニストを癌の治療又は予防のために使用するための指示書を含んでいる。他の実施態様では、製造物品はＢｖ８と、ホルモン産生内皮組織に関連する症状を治療又は予防するためにＢｖ８を使用するための指示書を含んでいる。更に他の実施態様では、製造物品はＢｖ８アンタゴニストと、受精率を調節するためにＢｖ８アンタゴニストを使用するための指示書を含んでいる。パッケージ挿入物はまた適切な投薬計画を示していてもよい。一実施態様では、挿入物は、組成物が約０．０１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与されるべきであることを示す。
【０１６１】
実施例
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従って使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書を通して特定された細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。
【０１６２】
実施例１
ノーザンブロット分析
Ｂｖ８の発現パターンを解明するために、様々なヒト、マウス及びラット組織からのＲＮＡを使用してノーザンブロット分析を実施した。ヒトＲＮＡブロットは、ヒトＢｖ８ ｃＤＮＡをベースにした３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせ、マウス及びラットＲＮＡブロットを、マウスＢｖ８ ｃＤＮＡをベースにした３２Ｐ標識ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。
ノーザンブロット分析を、当該分野でよく知られている方法に従って実施した。例えば、ｃＤＮＡプローブは、３２Ｐ-ｄＣＴＰ３０００μＣｉ／mmol（Amersham）を使用して、Redi-Prime IIキット（Amersham）で、３０−５０ｎｇのヒト又はマウスｃＤＮＡ断片を用いてｃＤＮＡプローブを調製した。プローブはセファデックスＧ５０スピンカラム（Pharmacia）で精製し、ハイブリダイゼーションをExpressHybハイブリダイゼーション液（Stratagene）中で６８℃にて実施した。他の実施例では、ブロットを、ハイブリダイゼーションバッファー（５ＸのＳＳＰＥ；２Ｘのデンハート液；１００ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡ；５０％のホルムアミド；２％のＳＤＳ）中でプローブと共に４２℃で６０時間インキュベートした。ブロットを２ＸのＳＳＣ；０．０５％のＳＤＳ中で室温にて１時間、数回洗浄し、続いて０．１ＸのＳＳＣ；０．１％のＳＤＳ中で５０℃にて３０分洗浄した。ブロットをホスフォイメージャー分析（Fuji）によって一晩露出させた後に現像した。等価なＲＮＡ充填物を、コントロールアクチンプローブを用いたハイブリダイゼーションによって評価した。
Ｂｖ８ ｍＲＮＡ転写物を検出した。図９は、１．８ｋｂの単一ｍＲＮＡ種がヒトＢｖ８プローブを用いてヒト精巣中で検出されたことを示している。分析された他のヒト組織の何れにも発現は検出されなかった。図１０Ａは、単一ｍＲＮＡ種がマウス精巣及び心臓中で検出されたことを示している。図１０Ｂは、１．８ｋｂ及び０．８ｋｂの転写物がラットの精巣中に存在しているが、他のラットの組織中には存在していないことを示している。総じると、これらの知見は、精巣がＢｖ８のｍＲＮＡの発現の主要な部位であることを示している。
【０１６３】
実施例２
細胞増殖アッセイ
Ｂｖ８に対する特定の細胞タイプの応答性を決定するために、ウシ副腎皮質毛細血管内皮細胞（ＡＣＥ）及びウシ脳毛細血管内皮細胞（ＢＢＣ）を増殖応答性についてアッセイした。
簡単に述べると、ＡＣＥ（副腎皮質毛細血管内皮細胞）及びＢＢＣ（ウシ脳毛細血管）を、１０％仔ウシ血清を補填した低グルコースＤＭＥＭ中で培養した。細胞増殖アッセイのために、６０００の細胞を上記培地の１２ウェルプレートの各ウェルに蒔いたが、コントロールでは添加をせず（図１１の「Ｃ」）、他は１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（図１１の「Ｖ」）、５０、１０又は１ｎＭのＢｖ８（Ｆｃタグ組換えタンパク質）である。Coulterカウンターを用いて１週間後に全細胞カウント数を得た。細胞数の増加倍数は１の値に任意に設定されたコントロール条件に対するものである。培地及び他の細胞培養試薬はLife Technologies, Inc.から得た。アッセイの性能については、Aravind及びKoonin, Curr. Biol. 8:477-478(1998)をまた参照のこと。
予備結果は図１１Ａ及び１１Ｂに示されており、これはコントロールに対する細胞数の増加を示している。Ｂｖ８は試験した全ての濃度において細胞増殖の増加をつくり出し、観察された最大の効果は５０ｎＭの濃度においてであった。正のコントロールであるＶＥＧＦは未処理コントロールと比較してＡＣＥ及びＢＣＣ細胞の双方の増殖においてほぼ三倍の増加を誘導した。
【０１６４】
実施例３
細胞生存アッセイ
内皮細胞の生存に対するＢｖ８の効果を測定した。およそ２ｘ１０５のウシ脳毛細血管（ＢＢＣ）細胞を、完全培地（上の実施例２に記載）を含む６ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。次の日に、完全培地を吸引し、細胞を、何も添加していない培地中又は次の成分の一つを含有する培地中で培養した：２％のＦＣＳ、１０％のＦＣＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（図１２の「Ｖ」）、５ｎＭのＢｖ８、２５ｎＭのＢｖ８、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ＋２５ｎＭのＢｖ８（図１２の「Ｖ＋Ｂｖ８」）、又は２５ｎＭのＥＧ-ＶＥＧＦ。４８時間のインキュベーションの後、トリプシン処理によって細胞を取り除き、冷７０％エタノール中で数時間、固定した。ついで、細胞を、ＰＢＳ中の２０ｎｇ／ｍｌのＲＮＡ分解酵素及び５μｇ／ｍｌのプロピジウムヨウ素を用いて２−４時間、室温にて染色した。細胞のサブ-Ｇ１プロフィールをＦＡＣＳ分析によって決定した。細胞集団のこのパーセントを図１２のグラフの縦軸にアポトーシス細胞パーセントとしてプロットした。
図１２から分かるように、Ｂｖ８はＢＢＣ内皮細胞の生存を向上させた。特に、培養物中に可視できたアポトーシス細胞は、２％のＦＣＳ又は２５ｎＭのＥＧ-ＶＥＧＦの存在下でよりも何れかの濃度のＢｖ８の存在下で少なかった。Ｂｖ８とＶＥＧＦは相乗効果を示し、２つの化合物の併用は、成長因子をそれだけか１０％のＦＣＳの何れよりも大なる程度に細胞生存を増大させた。
【０１６５】
実施例４
血管形成のインビボでの誘導
血管形成応答を誘導するＢｖ８の能力を測定した。一連の実験で、ベージュヌード雄マウスの精巣中の精巣内血管増殖に対するＢｖ８の効果を定量した。
ＬａｃＺ、ＶＥＧＦ及びＥＧ-ＶＥＧＦをコードするアデノウイルスは過去に記載されている（LeCouter, Nature, 412: 877-84, 2001）。Ｂｖ８をコードしているアデノウイルスの生産のために、ヒトＢｖ８の８１アミノ酸アイソフォームをコードしているｃＤＮＡをＣＭＶシャトルベクター（Stratagene）中にクローニングし、製造者の指示書に従って、組換えアデノウイルスベクター及び組換えウイルスを製造した。ウイルスを、Virapur(Carlsbad, CA)の大規模なキットを使用して精製し、力価を決めた。
インビボ実験に対して、アデノウイルスベクター（ＬａｃＺ、ＶＥＧＦ、ＥＧ-ＶＥＧＦ及びＢｖ８）を、１０７−１０８ｐｆｕ（ｎ＝５）でベージュヌードマウスの精巣中に注入した。７日後に、動物を殺し、精巣を固定し組織観察のために加工した。
図１３から分かるように、Ｂｖ８は、ＶＥＧＦ及びＥＧ-ＶＥＧＦと同様に、ヌードマウスの精巣細胞中でインビボでの間質毛細血管形成を増大させた。ＰＢＳ又はＬａｃＺアデノウイルスコントロール群の何れにも間質毛細血管生成又は血管形成の増加は観察されなかった。多くの処理した動物において、管状萎縮がまた観察された。管状萎縮は血管形成応答の誘導から生じる間質圧力の増加から生じうる。
【０１６６】
上記の明細書文書は当業者が本発明を実施するには十分であると考えられる。しかしながら、ここに示され記載されたものに加えて本発明の様々な変更は、上の説明から当業者には明らかであり、特許請求の範囲内のものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】ヒトＢｖ８ホモログをコードしているｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。太線フォント及び下線で表されているものは各開始コドン及び停止コドンの位置である。
【図２】配列番号：１のコード化配列から誘導されたヒトＢｖ８ホモログポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。推定シグナル配列はアミノ酸１から２１からなる。
【図３】ヒトＢｖ８ホモログの選択的スプライシング型をコードしているｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す。太線フォント及び下線で表されているものはまた各開始コドン及び停止コドンの位置である。
【図４】配列番号：３のコード化配列から誘導されたヒトＢｖ８ホモログポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【図５】マウスＢｖ８ホモログのヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す。太線フォント及び下線で表されているものはまた各開始コドン及び停止コドンの位置である。
【図６】配列番号：５のコード化配列から誘導されたマウスＢｖ８ホモログポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図７】マウス及びヒトＢｖ８ホモログのアラインメントを示す。可能なヘパリン結合ドメインはボックスで囲んでいる。示されているように、このドメインは選択的スプライシングがなされた転写物には存在していない。マウス及びヒトＢｖ８ホモログはおよそ９６％の同一性である。
【図８】ヒトＢｖ８及びＥＧ-ＶＥＧＦのアミノ酸配列のアラインメントを示す。ヒトＢｖ８はヒトＥＧ-ＶＥＧＦに対しておよそ６０％の同一性である。
【図９】ヒトＲＮＡ試料のノーザンブロット分析を示し、約１．８ｋｂの単一転写物を明らかにした。発現は精巣で可視できた。レーンの内容はブロットの上に示し、サイズ（ｋｂ）は右に示している。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂはマウス及びラットにおけるＢｖ８の発現のノーザンブロット分析を示す。マウスでは、Ｂｖ８の発現は心臓と精巣に見ることができる（図１０Ａ）。ラットでは、Ｂｖ８の発現は精巣においてのみ可視できる（図１０Ｂ）。また、０．８ｋｂのより小さなバンドもまたラットの精巣に可視できる。
【図１１】図１１Ａ及び１１ＢはＢｖ８が内皮細胞の増殖を誘導することを示している。図１１Ａは、１、１０及び５０ｎＭの濃度のＢｖ８の投与により、未処置コントロール（「Ｃ」）と比較してウシ副腎皮質毛細血管内皮（ＡＣＥ）細胞の増殖が増大することを示している。同様に、図１１Ｂは、３通り全ての濃度でＢｖ８はウシ脳毛細血管細胞の増殖を増大させることを示している。双方の場合において、Ｂｖ８によって誘導された増殖はＶＥＧＦによって誘導されたもの（「Ｖ」）よりも少ない。
【図１２】Ｂｖ８が内皮細胞の生存を促進することを示す。５又は２５ｎＭのＢｖ８を含む培地中でのインキュベーション後では、２％のＦＣＳ又はＥＧ-ＶＥＧＦ中でのインキュベーション後よりもアポトーシスを示すウシ脳毛細血管細胞は少なかった。Ｂｖ８とＶＥＧＦは相乗効果を示し、Ｂｖ８とＶＥＧＦ双方と共にインキュベーションした後の培養物には何れか個々のものと共にインキュベーションした後のものよりもアポトーシスを示す細胞は少なかった。
【図１３】Ｂｖ８がヌードマウスの精巣中において間質毛細血管形成を増大させたことを示す。ＬａｃＺ、ＶＥＧＦ、ＥＧ-ＶＥＧＦ、又はＢｖ８の何れかを発現するアデノウイルスベクターのマウス精巣への注入後に、Ｂｖ８処置動物では精巣内血管増殖の増加が観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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