(57)【要約】本発明は、金属アフィニティクロマトグラフィを用い、生物学的に活性な顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)を、不正確にホールドされた、生物学的に不活性の単量体、オリゴマー、もしくはポリマー、および凝集分子のG-CSFから単離する方法に関する。本発明の方法、所望により全方法を天然条件下で好都合に行うことができる。このようにして純度95%以上の生物学的に活性なG-CSFが得られる。次に、さらに2つのクロマトグラフィ工程、陽イオン交換クロマトグラフィおよびゲルろ過を微量の不純物を除去するのに適用するのが好ましい。方法全体で高収量の純度99%以上のG-CSFの生成をもたらす。記載の方法はG-CSFの産業的製造に特に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法であって、不純物存在下の生物学的に活性な形のG-CSFを含む混合物を得、次いで該混合物をIMACにかけることを含む方法。
【請求項２】
不純物存在下の生物学的に活性なG-CSFを含む混合物をIMAC支持体にロードし、
該生物学的に活性なG-CSFをIMAC支持体に選択的に結合させ、
次いで該生物学的に活性なG-CSFをIMAC支持体から溶出して生物学的に活性なG-CSFを得る工程を含む請求項1記載の生物学的に活性なG-CSFの単離方法。
【請求項３】
該混合物が、生物学的に不活性な単量体形および不正確にホールドされた分子のG-CSF、オリゴマーおよびポリマー形のG-CSF、変性形のG-CSF、宿主細胞タンパク質、および他の宿主細胞不純物(成分)からなる群の内の少なくとも1の物質である不純物を含み、
該IMACが、該不純物がIMAC支持体に実質的に結合せずにIMACカラムから溶出し、次いで生物学的に活性な形のG-CSFが溶出するように実施される請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
生物学的に活性なG-CSFがグリコシル化されていない請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
生物学的に活性なG-CSFがグリコシル化されている請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
生物学的に活性なG-CSFがメチオニルG-CSF、G-CSF類似体、酵素的または化学的修飾形のG-CSF、およびG-CSFを含む融合タンパク質からなる群から選ばれる少なくとも1のそれである請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該G-CSF含有混合物が、変性、次いで再生後に得られる混合物、媒質、または溶液、
天然条件下の封入体の溶液もしくは懸濁液、
分泌系における発現後の上清、または発現系の培養液から得られる混合物もしくは溶液、および
IMACカラムもしくはあらゆる他のクロマトグラフィカラムからG-CSFを先に溶出することにより得られた溶出液、からなる群から選ばれる先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該混合物が天然条件下で封入体溶液または懸濁液を含む請求項1または7に記載の方法。
【請求項９】
IMAC支持体結合キレート化金属イオンを用いるIMACを実施し、該金属イオンがHgでない先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
IMAC支持体結合キレート化金属イオンがM(II)-イミノジアセテート、M(II)-ニトリロ3酢酸、およびM(II)-カルボキシメチルアスパルテートからなる群から選ばれ、MがZn、Cu、Co、およびNiからなる群から選ばれる請求項9記載の方法。
【請求項１１】
IMAC支持体結合キレート化金属イオンがZn(II)-イミノジアセテート、Ni(II)-イミノジアセテート、およびNi(II)-ニトリロ3酢酸からなる群から選ばれる請求項10記載の方法。
【請求項１２】
IMAC支持体がZn(II)-イミノジアセテートを含む請求項10記載の方法。
【請求項１３】
生物学的に活性な形のG-CSFを含むIMAC用のローディング混合物または溶液がpH6.5〜9.0の範囲の緩衝溶液である先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該ローディング混合物または溶液がpH7.0〜8.5、好ましくは7.8〜8.2の範囲である請求項13記載の方法。
【請求項１５】
生物学的に活性な形のG-CSFを含む緩衝ローディング混合物または溶液を調製するための緩衝液が、酢酸、リン酸、クエン酸、Tris/HCl、およびTris/酢酸緩衝液からなる群から選ばれる請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
該緩衝液がTris/HCl緩衝液である請求項15記載の方法。
【請求項１７】
緩衝液の濃度が5〜50mMの範囲である請求項15または16記載の方法。
【請求項１８】
IMAC支持体から生物学的に活性な形のG-CSFを溶出させる工程が不連続段階勾配、pH下降直線勾配、および高pHの競合溶出からなる方法の群から選ばれる溶出方法により行われる先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
IMAC支持体から生物学的に活性な形のG-CSFを溶出する工程を不連続段階勾配を用いて行う請求項18記載の方法。
【請求項２０】
IMAC用溶出溶液がpH3.0〜5.0の範囲の緩衝溶液である先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
該溶出溶液のpHが3.5〜4.5である請求項20記載の方法。
【請求項２２】
IMAC用の溶出溶液を調製するための緩衝液が酢酸、Tris/酢酸、リン酸、およびクエン酸緩衝液からなる群から選ばれる先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
該溶出用緩衝液が酢酸緩衝液である請求項22記載の方法。
【請求項２４】
IMAC実施後に得られる生物学的に活性なG-CSFの純度が少なくとも95%である先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
さらに陽イオン交換クロマトグラフィおよびゲルろ過クロマトグラフィの工程を含む先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
該交換クロマトグラフィ工程後に得られる生物学的に活性なG-CSFの純度が少なくとも99%である請求項25記載の方法。
【請求項２７】
天然条件下の不純物を含むG-CSF含有混合物を、IMACのみ、および所望によりイオン交換およびゲルろ過技術から選ばれる少なくとも1の精製方法からなるクロマトグラフィ工程にかける生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法。
【請求項２８】
G-CSF含有混合物が本質的に界面活性剤または可溶化剤を含まないか、またはG-CSFが天然条件下で存在する濃度の界面活性剤または可溶化剤を含む請求項27記載の方法。
【請求項２９】
クロマトグラフィ工程実施後に得られる生物学的に活性なG-CSFの純度が少なくとも95%、好ましくは少なくとも99%である請求項27または28記載の方法。
【請求項３０】
全方法を天然条件下で行う先の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
純度が99%以上である生物学的に活性なG-CSF。
【請求項３２】
請求項1〜30のいずれかに記載の方法により得られる請求項31記載の生物学的に活性なG-CSF。
【請求項３３】
医薬的有効量の、純度99%以上の生物学的に活性なG-CSFおよび医薬的に許容される補助物質を含む医薬組成物。
【請求項３４】
生物学的に活性なG-CSFが請求項1〜30のいずれかに記載の方法により得られる請求項33記載の医薬組成物。
【請求項３５】
好中球減少症および好中球減少症関連臨床的後遺症、化学療法後の熱性好中球減少症のための入院の減少、ドナー白血球注入に代わる造血前駆細胞の動員、慢性好中球減少症、好中球減少性および非好中球減少性感染症、移植レシピエント、慢性炎症性病状、敗血症および敗血性ショック、好中球減少性および非好中球減少性感染症におけるリスク、疾病率、死亡率、入院日数の減少、好中球減少症および非好中球減少症患者の感染症および感染症関連合併症の予防、院内感染の予防、および院内感染の死亡率および頻度率の低下、新生児における経腸投与、新生児における免疫系の増大、集中治療室の患者および危篤状態の患者の臨床転帰の改善、外傷/皮膚潰瘍/火傷の回復および治療、化学療法および/または放射線療法の強化、汎血球減少症、抗炎症性サイトカインの増加、フィルグラスチムの予防的使用による高用量化学療法の間隔の短縮、光線力学療法の抗腫瘍効果の増強作用、異なる脳機能不全による疾患の予防および治療、血栓性疾患およびその合併症の治療、および放射線照射後の赤血球形成の回復からなる群から選ばれる、適用のための医薬を製造するための請求項1〜30のいずれかに記載の方法により得られる生物学的に活性なG-CSFの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(IMAC)を用いる生物学的に活性な顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)の新規精製および/または単離方法に関する。
【０００２】
G-CSFは、造血前駆細胞の分化および増殖、および成熟好中球の活性化を調節するコロニー刺激因子群に属する。G-CSFは、血液学および腫瘍学の分野で医薬に用いられる。2タイプのG-CSFが臨床的に利用可能である：哺乳類細胞における発現を用いて製造するグリコシル化形(レノグラスチム)、および細菌のEscherichia coli(E.coli)における発現を用いて製造する非グリコシル化形(フィルグラスチム)。
【背景技術】
【０００３】
非グリコシル化形のG-CSF(フィルグラスチム)およびその製造はEP 237545に記載されているが、グリコシル化形のG-CSF(レノグラスチム)およびその製造はEP 169566に記載されている。
【０００４】
該特許および科学論文に記載のG-CSFの精製および/または単離方法は、イオンクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲルろ過、およびその他の方法の種々の組み合わせを含む。
【０００５】
一般に、G-CSFの精製および/または単離方法の第一工程はG-CSFのヘテロローガスな発現の宿主生物に依存する。E.coliにおける発現の場合、G-CSFは不溶性封入体中にみいだされる。したがって、常套的方法には、正しくホールドされた生物学的に活性な形を生じる、封入体からG-CSFを単離するためのさらなる工程が含まれる。通常、これら工程は、界面活性剤またはカオトロピック物質による洗浄、強変性剤(例えば塩酸グアニジン(GndHCl)、尿素)または高濃度の界面活性剤(例えば、N-ラウロイル-サルコシン(サルコシル)またはドデシル硫酸ナトリウム(SDS))による可溶化、ゲルろ過、逆相HPLC(RP-HPLC)を用いる可溶化変性タンパク質の部分精製、および変性剤の希釈を用いるかまたは透析を用いる再生を含む。酵母または哺乳類細胞におけるG-CSFの発現の場合は、封入体または同様の構造がみられることは希であり、これらの場合の精製および/または単離方法はG-CSFの分泌後に直接始まる。G-CSFの精製および/または単離方法は以下の特許出願および特許に記載されている：EP 169566、EP 237545、EP 215126、EP 243153、US 5055555、およびWO 0104154。G-CSFの精製および/または単離方法は、科学論文にも記載されている：Lu, H. S.ら、Protein Expr Purif 4, 465-472(1993)、Kang, S. H. ら、Biotechnol. Lett. 17,687-692(1995)、Wingfield, Pら、Biochem J 256, 213-218(1988)、Kang, S. H.ら、v Biotechnol. Lett. 17, 687-692(1995)、Yamasaki, M.ら、Biosci Biotechnol Biochem 62, 1528-1534(1998)、Wingfield, P.ら、Biochem J 256, 213-218(1988)、Bae, C. S.ら、Biotechnol. Bioeng. 57,600-609(1998)。
【０００６】
ある他のタンパク質の場合、IMACは部分精製および再生にも用いられてきた。IMACはPorathら、Nature 258, 598-599(1975)に最初に記載され、種々のIMAC支持体にキレートする固定化金属イオンへのタンパク質の結合に基づく。タンパク質のアミノ酸配列における電子ドナー群は、支持体、特にヒスチジン残基中のイミダゾール環に対する配位結合を担う。IMACを用いるタンパク質のNまたはC末端上の改変ヒスチジンアフィニティタグによる組換えタンパク質の単離は、Hochuli, E.ら、Biol Technology 1321-1325(1988)、Chaga, G.ら、Biotechnol Appl Biochem 29(part 1), 19-24(1999)、およびJeong, J. K.およびLee S. Y. Protein Expr. Purif, 23: 311-318(2001)に記載された。タンパク質分子間の小さなトポグラフィ的相違を観察するためのIMACの使用は、Sulkowski、Trends Biotechnol 3,1-7(1985)、およびHemdanら、Proc Natl Acad Sci U S A 86,1811-1815(1989)によって記載された。
【０００７】
ヒスチジン残基を含むいくつかの他のタンパク質のIMACを用いる精製方法はUS 5932102に記載された。
【０００８】
金属イオンに結合することができる表面アミノ酸を用いるタンパク質の精製方法はWO 9012803に記載されている。この方法では、IMACを、いくつかの他のクロマトグラフィ法を用いる部分タンパク質精製後のさらなる工程として用いる。IMACを用いる天然条件下のG-CSFの変性または生物学的不活性分子からG-CSFの非変性または生物学的に活性な分子の単離も分離も記載されていない。
【０００９】
特異的色素-金属イオン複合体に対するアフィニティパーティショニングによるG-CSF、そのSer-17、および(His)6-標識形と金属イオンとの相互作用の比較試験が記載された(Zaveckas, M.ら、J Chromatogr A 904, 145-169(2000))。無金属およびHg(II)荷電IDA(イミノジアセテート)カラムを用いるブロメラインおよび純粋G-CSFのクロマトグラフィ的挙動の評価に基づいて、Gelunaite, L.ら、J Chromatogr A 904,131-143(2000)は、変性条件下で界面活性剤可溶化封入体からG-CSFを抽出するHg(II)荷電IMAC(Sepharose IDA)の能力の評価を試みた。
【００１０】
固定化Zn(II)またはNi(II)イオンを用いるIMACは、GndHCl変性インターロイキン-3、G-CSF、および顆粒球マクロファージコロニー因子(GM-CSF)の再生方法として用いた(Rozenaite, V.ら、Poster abstract,P-104., Cordoba, Spain, 19-22. April(1998))。変性タンパク質は変性条件下でIMAC支持体と結合した。
(発明の要約)
【００１１】
本発明の目的はG-CSFの精製および/または単離方法を改善し、高度に純粋で活性な形の生物学的に活性なG-CSF、およびそれを含む医薬組成物を提供することである。
【００１２】
本発明は、請求項1記載の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法を提供する。さらに本発明は、請求項27記載の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法、請求項31記載の生物学的に活性なG-CSF、請求項33記載の医薬組成物、および請求項35記載の生物学的に活性なG-CSFの使用を提供する。好ましい態様は従属項に記載している。
【００１３】
本発明では、驚くべきことに、正しくホールドされた生物学的に活性なG-CSF分子を、天然条件下でIMACを用い、不正確にホールドされるかまたは生物学的に不活性なG-CSF分子から分離することができることをみいだした。本発明の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法は、天然条件下でIMACを用い、正しくホールドされた生物学的に活性なG-CSF分子を、不正確にホールドされるかまたは生物学的に不活性なG-CSF分子から、そして大部分の宿主タンパク質からも分離することを含む。この方法により、正しくホールドされた生物学的に活性なG-CSF分子は、IMAC支持体と特異的に結合するが、不正確にホールドされるかまたは生物学的に不活性な形のG-CSFおよび大部分の不純物は溶出液中に残存する。本発明の精製および/または単離方法は、生物学的に活性な単量体形のG-CSFの、オリゴマー、ポリマー、および生物学的に不活性な単量体形のG-CSFからの分離も含む。生物学的に活性な単量体形のG-CSFは、特異的にIMAC支持体と結合するがオリゴマー、ポリマー、および生物学的に不活性な単量体形のG-CSFは実質的に溶出液中に残存する。
【００１４】
本発明の方法は、正しくホールドされた生物学的に活性な単量体形または分子のG-CSFの有効な精製及び濃縮工程を示し、G-CSFの全精製および/または単離方法における鍵となる工程として用いることができる。
【００１５】
本発明の精製および/または単離方法は、発現後にG-CSFが分泌経路を介して直接媒質(培地)に分泌されるか、またはG-CSFが細胞質、ペリプラズム、またはあらゆる他の細胞の細胞小器官中に封入体の形で形成される場合に用いることができる。該方法は、生物学的に活性なG-CSFを、可溶化封入体から直接、そしてG-CSFが予め変性し、次いで再生されているすべての場合に精製および/または単離するのにも使用可能である。本発明の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法は、該方法の初めからずっと天然条件下で維持することができる。
【００１６】
本発明の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法は、純度95%以上の生物学的に活性なG-CSFの生成をもたらす。本発明の好ましい態様において適用される、2つのさらなるクロマトグラフィ工程の、陽イオン交換クロマトグラフィおよびゲルろ過のみを、残存する微量の不純物の除去(ポリッシング)にさらに用いることができる。
【００１７】
したがって、本発明の全方法は、純度99%以上の生物学的に活性なG-CSFの生成をもたらす。該方法は大量の生物学的に活性なG-CSFの製造に適しており、生物学的に活性なG-CSFの産業的製造に適している。
【００１８】
天然条件下でIMACを用い、オリゴマー、ポリマー、および生物学的に不活性な単量体形または不正確にホールドされた分子のG-CSFから、生物学的に活性な単量体の正しくホールドされた分子のG-CSFの分離に関する記載は、科学論文や特許論文にはみられない。
【００１９】
天然条件下で正しくホールドされた生物学的に活性な単量体形のG-CSF(すなわち、溶液または混合物中に既にみられるそれら分子)のIMAC支持体との結合により、生物学的に活性なG-CSF分子および不純物を含む粗溶液または混合物から生物学的に活性なG-CSFを精製および/または単離することも先行技術には記載されていない。さらに、IMACを用いることによるその構造状態に従ったG-CSF分子の分離も記載されていない。
【００２０】
先行術にみられるG-CSFの精製および/または単離方法はすべていくつかの工程を含む。G-CSFをその生物活性および正しいホールディングに従って分離、および溶液または混合物中に存在する不純物から単離するためのただ1つのクロマトグラフィ工程の使用、および純度95%以上の生物学的に活性なG-CSFの製造およびG-CSFの濃縮に有効な方法(さらなるポリッシングのみが必要である)は、先行技術には記載されていなかった。
(発明の詳細な説明およびその好ましい態様)
【００２１】
本発明は、生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法において有効なクロマトグラフィ法としてのIMACの使用に関する。正しくホールドされた生物学的に活性な単量体形または分子のG-CSFは、天然条件下でIMAC支持体と選択的に結合するが、不正確にホールドされるかまたは凝集したG-CSF分子、およびほとんどの他の不純物、特に例えばE.coliから発現後の封入体由来の可溶化タンパク質は、実質的にこれら支持体には結合せず、保持されることなく溶出される。この特徴は天然ヒスチジン残基の特異的分布により生じるものと思われる。
【００２２】
本明細書で用いている用語「天然条件」は、分子(G-CSFタンパク質)が天然の構造および生物活性を維持する条件を表す。
【００２３】
用語「変性条件」は、G-CSFタンパク質の天然構造が維持されず、生物活性が変化し、維持されない条件を表す。
【００２４】
本明細書で用いている「凝集分子」は、疎水性またはいくつかの他の相互作用(例えば、ジスルフィド結合)により結合した分子のクラスターを形成する分子を表す。これら分子は生物学的に活性ではない。
【００２５】
本明細書で用いている用語「溶出」は、クロマトグラフィカラムからの吸着物質の抽出または洗浄を表す。
【００２６】
本明細書で用いている用語「溶出液」は、クロマトグラフィカラムからの抽出および洗浄により得られる溶液を表す。
【００２７】
本明細書で用いている用語「封入体」は、不正確にホールドされるかまたは部分的に正しくホールドされたタンパク質の不溶性のコンパクトな凝集物を表す。
【００２８】
本明細書で用いている用語「封入体溶液」は、封入体を含む溶液を表す。
【００２９】
本明細書で用いている用語「生物学的に活性なG-CSF」は、造血前駆細胞の分化と増殖、および造血系の成熟細胞の活性化を促すことができるG-CSFを表す。
【００３０】
本明細書で用いている用語「生物学的に活性な形(または分子)のG-CSF」は、単量体および非変性状態であり、前記生物活性をもたらすことができる形または分子のG-CSFを表す。
【００３１】
本明細書で用いている用語「不純物」は、生物学的に活性な分子のG-CSFを純粋でなくする生物学的に活性な分子のG-CSFと異なる物質を表す。不純物は、生物学的に不活性な単量体形および不正確にホールドされた分子のG-CSF、オリゴマーおよびポリマー形のG-CSF、変性形のG-CSF、および宿主細胞タンパク質からなる群からの少なくとも1の物質を含んでよい。不純物は、さらに宿主細胞物質、例えばDNA、(リポ)ポリサッカライドなど、およびG-CSFの製造およびプロセシングに用いられている添加剤も含んでいてよい。
【００３２】
本明細書に記載の純度はHPLC純度を表す。
【００３３】
本発明の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法は、特に以下の工程を含むことにより定義される：
a)生物学的に活性な形のG-CSFおよび不純物を含む溶液または混合物をIMAC支持体にロードし、
b)生物学的に活性な形のG-CSFをIMAC支持体に選択的に結合させ、所望により該IMACカラムを洗浄し、
c)生物学的に活性な形のG-CSFを該カラムから溶出させる。
【００３４】
本発明の方法は天然条件下で好都合に行うことができる。
【００３５】
本発明の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法は、生物学的に活性なG-CSFのさらなる精製を含むことができ、好ましくはIMACによる生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離後に行う以下の工程を含む：
d)陽イオン交換クロマトグラフィ、および/または
e)ゲルろ過。
【００３６】
本発明の全方法は、医薬に臨床使用するのに適した生物学的に活性なG-CSFの製造をもたらす。
【００３７】
医薬に臨床使用するのに適した生物学的に活性なG-CSFは、天然条件下でG-CSFを含む純粋でない混合物をIMACのみからなるクロマトグラフィ工程、および所望によりイオン交換およびゲルろ過技術から選ばれる少なくとも1の精製方法にかける精製および/または単離方法を適用することにより、すでに効率的かつ好ましい方法で得ることができる。本発明の方法は、G-CSF誘導体、例えばメチオニルG-CSF(Met-G-CSF)、グリコシル化、酵素的または化学的に修飾した(例えばペギレート化)G-CSF、G-CSF類似体、およびG-CSFを含む融合タンパク質を精製および/または単離する場合にも使用できる。
【００３８】
本発明の精製および/または単離方法の有意な利点には、
1. 該G-CSF分子がその構造状態に従って、したがってその生物活性に従って分離される。
2. 該方法は、天然条件下で生物学的に活性な分子のG-CSFのIMAC支持体との結合、次いで天然条件下で生物学的に不活性な分子のG-CSFからの生物学的に活性な分子のG-CSFの分離を可能にする。
3. 該方法は、天然条件下で正しくホールドされた分子のG-CSFのIMAC支持体との結合、次いで天然条件下で不正確にホールドされた分子のG-CSFからの正しくホールドされた分子のG-CSFの分離を可能にする。
4. 該方法は、天然条件下で生物学的に活性な単量体形のG-CSFのIMAC支持体との結合、次いで生物学的に不活性な単量体形のG-CSFからの生物学的に活性な単量体形のG-CSFの分離を可能にする。
5. 該方法は、単量体形のG-CSFのIMAC支持体との結合、次いで天然条件下でオリゴおよびポリマー形のG-CSFからの単量体形のG-CSFの分離を可能にする。
6. 該方法は、天然条件下で、溶液、混合物または培地中に存在する他のタンパク質および不純物からの正しくホールドされた単量体の生物学的に活性な分子のG-CSFの分離を可能にする。
7. 本発明の方法を用いると、精製G-CSFの比活性を、例えば少なくとも比活性1x107IU/mgの範囲、より好ましくは比活性7-8x107IU/mgの範囲、最も好ましくは比活性約1x108IU/mgの範囲に有意に増加させることができる(ここで、比活性は実施例5に記載の細胞増殖の刺激に基づく方法により測定する。)。
8. 本発明の方法を用いると、少なくとも純度95%、または好ましい態様において陽イオン交換クロマトグラフィおよびゲルろ過による精製をさらに含むときはさらに少なくとも99%で高収量でG-CSFを製造することができるので、該方法は生物学的に活性なG-CSFの産業的生産に適している。
9. さらに陽イオン交換クロマトグラフィおよびゲルろ過による精製を含む生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法のための好ましい態様に従った全方法は、G-CSF精製のいかなるさらなる工程も必要とせず、初めからずっと天然条件下で好都合に維持することができる。
【００３９】
本発明の生物学的に活性なG-CSFを精製および/または単離するための全方法は、天然条件下で最も好ましく維持される。
【００４０】
本発明の方法は不正確にホールドされた分子のG-CSFの再生方法ではないが、非精製G-CSFを含む溶液、混合物、または培地中にすでに存在している非変性または正しくホールドされた生物学的に活性な単量体分子のG-CSFのIMAC支持体との特異的結合を含む方法である。
【００４１】
オリゴマーおよびポリマー形のG-CSFからの単量体形の分離は、生物学的に活性な単量体形のG-CSFがIMAC支持体と結合するが、凝集形にも生じ得るオリゴマーおよびポリマー形は実質的に溶出液中に残存するような方法で生じる。
【００４２】
IMACの代わりに、ゲルろ過が、オリゴマーおよびポリマー形のG-CSFから単量体形のG-CSFを分離するのに用いられるかもしれない。IMACのゲルろ過に対する利点は、その濃縮能力、より高い結合能力、および正しくホールドされた単量体形のG-CSFを不正確にホールドされた単量体形のG-CSFから分離する能力である。正しくホールドされた単量体形のG-CSFはゲルろ過では不正確にホールドされた単量体形のG-CSFから分離できない。すなわち、IMACを用いることでよりよい収量が得られる。
【００４３】
本発明の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法の、先行技術で知られている他の方法に対する別の利点は、(該方法が初めからずっと維持される天然条件下で)異なるタンパク質の混合物、および異なる構造状態で生じるG-CSF分子の混合物から正しくホールドされた分子のG-CSFを単離できることである。したがって、天然条件下で(好ましくは希釈された)培養液または特に封入体からG-CSFを直接単離することができる。
【００４４】
本発明の方法の常套的方法に対するさらなる利点は、界面活性剤の使用を減らすかまたは省略する可能性、毒性があるかまたは環境的に好ましくない変性剤(例えばGndHClまたは尿素)の非存在下で作業する可能性、および緩衝液および他の溶液の使用を減らすかまたは省略する可能性もあることである。
【００４５】
本発明の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法の、強変性剤を用いる方法に対する利点は、ジチオスレイトールまたはβ-メルカプトエタノールのような活性還元剤を使用する必要がないことである。
【００４６】
培地中に直接G-CSFを分泌する場合、本発明の生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法では、生物学的に活性なG-CSFを希釈媒地から有効に直接濃縮することができる。IMACカラムからの溶出液中に高純度の生物学的に活性なG-CSFが得られる。
【００４７】
生物学的に不活性なG-CSF分子および他の不純物からの生物学的に活性なG-CSF分子の効果的な分離は、封入体からの生物学的に活性なG-CSF分子の単離、および/またはそれを含む溶液または混合物からの生物学的に活性なG-CSF分子の直接分離により得ることができるので、G-CSFの精製および/または単離の経済は他の方法と比べてはるかに改善される。
【００４８】
すなわち、95%以上のG-CSFの純度を1精製工程のみを用いて得ることができる。 
【００４９】
以下のクロマトグラフィ工程はIMACから溶出後の生物学的に活性なG-CSFの最終精製(ポリッシング)に特に適している。
・陽イオン交換クロマトグラフィおよび/または
・ゲルろ過
【００５０】
陽イオン交換クロマトグラフィは、宿主細胞由来の微量の核酸、リポ多糖、およびタンパク質の除去、およびpI値が変化した変化(損傷)形のG-CSF、およびG-CSFのイオン異性体の除去に特に有効である。ゲルろ過クロマトグラフィは微量の二量体および高凝集形のG-CSFの除去に特に有効である。
【００５１】
さらに2つの最終精製工程を用いるだけで純度99%以上の生物学的に活性なG-CSFが生じる。
【００５２】
さらに陽イオン交換クロマトグラフィおよびゲルろ過を含む本発明の好ましい態様の生物学的に活性なG-CSFの全精製および/または単離方法の利点は、適切なプレプロセシング工程、例えば可溶化および所望により次いで透析、イオン交換、限外ろ過、透析、または希釈などによる可溶化剤の除去に加え、該方法が上記の特定の3クロマトグラフィ工程のみを効率的に含んでいてよいことであり、該3クロマトグラフィ工程間に中間工程(例えば濃縮、透析、沈殿など)がないことが好ましく、また天然条件は精製および/または単離方法の初めからずっと維持されることが好ましい。
【００５３】
中間濃縮工程は、収量低下をもたらす二量体および他の形の凝集の形成を不都合なほどに生じるであろう。全精製および/または単離方法は産業規模および少なくとも純度99%の生物学的に活性なG-CSFの製造に移すことができる。
【００５４】
本発明の全精製および/または単離方法により得られる生物学的に活性なG-CSFは、治療的有効量の生物学的に活性なG-CSFを含む、臨床使用に適した医薬組成物の製造に適している。
【００５５】
簡潔な精製および単離方法において活性形のG-CSFを維持する可能性は、生物学的に活性なG-CSFの収量の改善のみならず純度および有効性の改善、およびそれを含む医薬組成物に寄与する。
【００５６】
本明細書で用いている用語「治療的有効量」は、生物学的に活性なG-CSFの治療効果を有する生物学的に活性なG-CSFの量を表す。
【００５７】
適切な医薬的に許容される補助物質には、G-CSF療法に有用な適切な希釈剤、アジュバント、および/または担体が含まれる。
【００５８】
本発明の方法を用いて得られる生物学的に活性なG-CSFは、特に陽イオン交換クロマトグラフィおよびゲルろ過のさらなる工程を実施するとき、好中球減少症および好中球減少症関連臨床的後遺症、化学療法後の熱性好中球減少症のための入院の減少、ドナー白血球注入に代わる造血前駆細胞の動員、慢性好中球減少症、好中球減少性および非好中球減少性感染症、移植レシピエント、慢性炎症性病状、敗血症および敗血性ショック、好中球減少性および非好中球減少性感染症におけるリスク、疾病率、死亡率、入院日数の減少、好中球減少症および非好中球減少症患者の感染症および感染症関連合併症の予防、院内感染の予防、および院内感染の死亡率および頻度率の低下、新生児における経腸投与、新生児における免疫系の増大、集中治療室の患者および危篤状態の患者の臨床転帰の改善、外傷/皮膚潰瘍/火傷の回復および治療、化学療法および/または放射線療法の強化、汎血球減少症、抗炎症性サイトカインの増加、フィルグラスチムの予防的使用による高用量化学療法の間隔の短縮、光線力学療法の抗腫瘍効果の増強作用、異なる脳機能不全による疾患の予防および治療、血栓性疾患およびその合併症の治療、および放射線照射後の赤血球形成の回復を含む群から選ばれる適用に必要な医薬の製造に用いることができる。
【００５９】
G-CSFが必要なすべての他の疾患の治療に用いることもできる。
【００６０】
すなわち、本発明の方法により得られる純粋で生物学的に活性なG-CSFを含む医薬組成物は、上記疾患を治療するのに有効な治療量を当業者に知られた方法で患者に投与することができる。
【００６１】
本発明の方法を用いてIMACを実施するための好ましい態様を以下に示す。
【００６２】
該方法は試料をローディングし、少なくとも生物学的に活性なG-CSFタンパク質をIMAC支持体に結合させることにより開始する。
【００６３】
IMAC支持体は、固相物質および該固相物質と結合した金属イオンキレートを含む。常套的固相物質、例えばSepharose(セファロース)、Fractogel(フラクトゲル)、および他のゲル支持体物質を適切に用いることができる。IMAC支持体に結合した金属イオンキレートは、好ましくは原子価2の金属イオン、特に遷移金属イオンから適切に選ばれる。Hgは、その毒性とIMACカラムから溶出される傾向により適正が低い。IMAC支持体に結合している金属イオンキレートの好ましい例には、M(II)-イミノジアセテート(IDA)、M(II)-ニトリロ3酢酸(NTA)、M(II)-カルボキシメチルアスパルテートなど(ここで、MはZn、Cu、Co、Niなどを表す。)が含まれる。Zn(II)-IDA、Ni(II)-IDA、およびNi(II)-NTAが特に有効である。
【００６４】
IMACカラムにロードする前に、封入体を溶液として、またはバッチもしくは拡大ベッド分離法の場合は低濃度の界面活性剤もしくは可溶化剤の存在下で懸濁液として提供することが好ましい。すなわち、G-CSFは、界面活性剤が溶液もしくは懸濁液中に残存するかまたは界面活性剤がイオン交換体、透析、沈殿などを用いて除去される場合は天然条件下に保つことができよう。界面活性剤もしくは可溶化剤は溶液または混合物をIMACカラムにロードする前に除去するのが好ましい。
【００６５】
ロードした試料が例えば希釈、透析、限外ろ過、または変性剤/界面活性剤の除去により予め再生されている場合、強変性剤、例えば8M尿素または6M GndHCl存在下の封入体溶液または懸濁液(または混合物)、および変性濃度の界面活性剤(例えば、1% サルコシル、2%サルコシル、または1%ドデシル硫酸ナトリウム)の存在下の溶液も出発試料として用いることができる。
【００６６】
分泌系、例えば酵母、真菌、または哺乳類細胞系における発現の場合、上清または濃縮上清、もしくは培養液(混合物は予めpH6.5〜9.0の範囲で処理していてもよい)をIMAC支持体にロードすることができる。
【００６７】
IMACカラムからの最初の溶出で得られた溶出液も、IMAC用のローディング溶液または混合物として用いることができる。該溶出液のpHは、NaOH溶液または高pH緩衝溶液を加えてpH6.5〜9.0の範囲に調製されているべきである。次に、溶出液は、同じIMAC支持体、例えばZn(II)-IDA、Ni(II)-IDA、Ni(ll)-NTAまたは異なるIMAC支持体に再ロードすることができる。他の固定化金属イオンとの組み合わせも可能であり(例えば、Zn(II)、Cu(II)、Co(II)、Ni(II)など)、特定の宿主タンパク質のよりよい分離および除去を可能にする。
【００６８】
ローディング溶液の調製物および起源に関わらず、ローディング溶液のpHは6.5〜9.0の範囲であるべきである。ローディング溶液の好ましいpHは7.0〜8.5であり、最も好ましいpHは7.8〜8.2である。
【００６９】
pHを6.5〜9.0の範囲に維持することができる種々の緩衝液を、IMAC支持体へのG-CSFのローディングおよび結合に用いることができる。リン酸、酢酸、ヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)/HCl、Tris/酢酸、クエン酸、およびpH6.5〜9.0をもたらす他の緩衝液が適している。Tris/HClを用いるのが好ましい。
【００７０】
該緩衝液、特にTris/HCl緩衝液は、好ましくは5〜50mM、最も好ましくは10〜40mMの範囲で使用する。
【００７１】
該支持体に結合後、カラムを洗浄し、カラムからタンパク質を溶出させることにより該方法を続ける。溶出は、不連続段階勾配またはpH下降直線勾配、または高pHでの競合(例えばイミダゾール、ヒスチジン、塩化アンモニウム、および同様のもの)を用いることにより行うことができる。
【００７２】
本明細書で用いている用語「直線勾配」は、ある緩衝液(または緩衝液のある成分)の割合が直線的に増加するように変化するが、その他の緩衝液(または緩衝液の別の成分)の割合は直線的に減少するように変化する溶液でクロマトグラフィカラムを洗浄することを表す。
【００７３】
本明細書で用いている用語「不連続段階勾配」は、ある割合のある緩衝液(または緩衝液のある成分)とある割合の別の緩衝液からなる溶液で決められた時間クロマトグラフィカラムを洗浄することを表す。両緩衝液の割合は急速(突然)に変化し、カラムを別の決められた時間洗浄する。該溶液の組成(緩衝液比または成分比の変化)は直線的に変化しない。
【００７４】
本明細書で用いている用語「競合溶出」は、溶出用緩衝液中の競合分子、例えばイミダゾール、ヒスチジン、塩化アンモニウムなどがそれ自身で金属キレート化マトリックスと結合し、タンパク質分子と置換する結合緩衝液のpHで溶出することを表す。
【００７５】
低pHでの溶出をもたらす不連続段階勾配を用いるのが好ましい。すなわち、高pHは、システイン残基の活性化と二量体の形成を生じるかもしれない。G-CSFの安定性も低pHで高い。
【００７６】
種々の溶出用緩衝液を不連続段階または直線洗浄および溶出に用いることができ、これらは酢酸、Tris/酢酸、リン酸、クエン酸、および他の適切な緩衝液からなる群から選ばれる。該溶出液のpH範囲は、3.0〜5.0、好ましくは3.5〜4.5であり得る。不連続段階勾配により、pHはローディングpHのオーダーから溶出pHのオーダー、例えば7.0から4.0に急速に変化し、等電点を飛び越えてタンパク質の沈殿を避ける。すなわち、タンパク質の等電点のpHを含む環境はその沈殿を生じ得る。
【００７７】
溶出液中に、単量体の生物学的に活性な正しくホールドされたG-CSFが95%以上の純度で得られる。
【００７８】
所望により、IMACカラムから得られた溶出液をいかなるさらなる中間工程も必要とせずに陽イオン交換クロマトグラフィカラムに直接ロードすることができる。種々の陽イオン交換クロマトグラフィ支持体を用いることができ、これらはSP Sepharose FF、SP Sepharose HP、CM Sepharose FF、TSKゲルSP-5PW、TSKゲルSP-5PW-HR、Toyopearl SP-650M、Toyopearl SP-650S、Toyopearl SP-650C、Toyopearl CM-650M、Toyopearl CM-650S、Macro-Prep High S支持体、Macro-Prep S支持体、Macro-Prep CM支持体などからなる群から選ぶことができよう。SP Sepharose FFまたはTSKゲルSP-5PWを用いるのが好ましい。
【００７９】
陽イオン交換クロマトグラフィ用のローディング溶液のpH範囲は、3.0〜5.8の範囲、好ましくは4.0〜5.0の範囲である。
【００８０】
陽イオン交換クロマトグラフィ用のローディング溶液の塩濃度は、結合できるように十分低くなければならず、これも溶液のpHに依存する。
【００８１】
pHの範囲が3.0〜5.8の種々の緩衝液を陽イオン交換クロマトグラフィ用の支持体へのローディングおよび結合に用いることができ、これらは酢酸、クエン酸、Tris/HCl、Tris/酢酸、リン酸、コハク酸、マロン酸、2-(N-モルホリノエタンスルホネート)(MES)、および他の緩衝液からなる群から選ぶことができよう。酢酸緩衝液を用いるのが好ましい。
【００８２】
酢酸緩衝液は、10〜60mMの濃度範囲、好ましくは10〜30mMの濃度範囲で用いることができる。
【００８３】
陽イオン交換クロマトグラフィでは、カラムローディングに次いでカラムの洗浄およびカラムからのタンパク質の溶出を行う。溶出は、緩衝溶液に高濃度の塩を添加後のイオン強度の増加により生じる。不連続段階勾配、直線勾配、および段階および直線勾配の適切な組み合わせを用いることができる。
【００８４】
洗浄および溶出に用いることができる溶出用緩衝液は、酢酸、クエン酸、Tris/HCl、Tris/酢酸、リン酸、コハク酸、マロン酸、MES、およびNaClまたはKClのような塩を加えた他の適切な緩衝液からなる群から選ぶことができよう。緩衝液のpHが高くなると、カラムからのタンパク質の溶出にはより低いイオン強度が必要である。
【００８５】
溶出液中には生物学的に活性な、正しくホールドされたG-CSFが98%以上の純度で得られる。
【００８６】
所望により、IMACから得られるか、または好ましくは連続する陽イオン交換クロマトグラフィカラム後の溶出液をいかなるさらなる中間工程も必要とせずにゲルろ過カラムに直接ロードすることができる。
【００８７】
種々のゲルろ過支持体を用いることができ、これらは、Sephacryl S-200HR、Sephacryl S-100HR、Superose 12、Superose 6、Superdex 75、TSKゲルG-2500PW、TSKゲルG-3000 PW、Bio-Gel P-60、Bio-Gel P-100などを含む群から選ばれる。Superdex 75を用いるのが好ましい。
【００８８】
広いpH範囲のゲルろ過用ローディング溶液が使用でき、IMAC、および好ましくは続く陽イオン交換クロマトグラフィからの直接溶出液がローディング溶液として適している。溶液のローディング、ゲルろ過支持体へのタンパク質の結合、およびタンパク質の溶出は、同じ緩衝液を用いるて行うことができる。種々の緩衝液を使用でき、これらはクエン酸、酢酸、Tris、リン酸、およびpHを3.5〜8.0の範囲に維持できる他の適切な緩衝液からなる群から選ぶことができよう。pH6.0〜7.0のリン酸緩衝液を用いるのが好ましい。
【００８９】
リン酸緩衝液(ローディング用)は2〜100mMの濃度範囲、好ましくは3〜10mMの濃度範囲で使用できることが好ましい。
【００９０】
ゲルろ過用緩衝液の塩濃度は、30〜100mMの範囲、好ましくは約50mMであり得る。
【００９１】
溶出液中に、単量体の生物学的に活性な正しくホールドされたG-CSFが99%以上の純度および1X108U/mgの生物活性で得られる。
【００９２】
以下の実施例は、本発明の種々の態様を例示する目的で示すものであり、何ら本発明の限定を意味するものではない。
(図面の説明)
【００９３】
図1は、IMAC支持体：Zn(II)-lDA Chelating Sepharose Fast Flow(キレーティングセファロースファーストフロー)(Pharmacia)を用いる可溶化封入体からのタンパク質のクロマトグラフィ分離を示す。
クロマトグラムは、時間(min(分))に基づく280nm(A280)における吸光度変化(−)および緩衝液P3の割合(---)を示す。ピークA−E.coliタンパク質および凝集G-CSF； ピークB−単量体の正しくホールドされた生物学的に活性なG-CSFおよび微量のE.coliタンパク質。
【００９４】
図2は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS-PAGE)存在下における出発試料および図1のZn-IDA Cheating Sepharose Fast Flow(Pharmacia)を用いた分離後のクロマトグラフィのピークで示した試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
凡例：
1、分子量標準(Bio-Rad)およびG-CSF(Neupogen)(矢印で示す)。
2、クロマトグラフィ分離前の出発試料。
3、図1のピークA中のタンパク質(凝集G-CSFおよびE.coliタンパク質)。
4、図1のピークB中のタンパク質(単量体の正しくホールドされた生物学的に活性なG-CSFおよび微量E.coliタンパク質)。
【００９５】
図3は、IMAC支持体Zn-IDA Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia)およびカラムXK50/20を用いるクロマトグラフィ分離を示す。クロマトグラムは、時間(分)に基づく280nm(A280)における吸光度変化(−)および緩衝液P6の割合(---)を示す。ピークA−E.coliタンパク質および凝集G-CSF； ピークB−単量体の正しくホールドされた生物学的に活性なG-CSFおよび微量のE.coliタンパク質。
【００９６】
図4は、陽イオンクロマトグラフィ支持体TSKゲルSP-5PW(TosoHaas)を充填したカラムXK16/20を用いるクロマトグラフィ分離を示す。クロマトグラムは、時間(分)に基づく280nm(A280)における吸光度変化(−)および緩衝液P8の割合(---)を示す。主要ピーク−単量体の正しくホールドされた生物学的に活性なG-CSF；小ピーク−G-CSFアイソフォームおよび微量のE.coliタンパク質。
【００９７】
図5：ゲルろ過支持体 Superdex(登録商標)75プレプグレード(Pharmacia)を充填したカラムXK26/70を用いるクロマトグラフィ分離。クロマトグラムは、(分)に基づく280nm(A280)における吸光度変化を示す。主要ピーク−単量体の正しくホールドされた生物学的に活性なG-CSF。
【実施例】
【００９８】
実施例1：  IMAC:Zn-IDA(Chelating Sepharose Fast Flow)を用いる生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離
【００９９】
クロマトグラフィカラム(h=10cm、d=10mm)に、Zn2+イオンが結合したCheating Sepharose Fast Flow(Pharmacia)支持体を充填し、次いでカラムを5カラム容量の緩衝液P2で2ml/minの一定流速にて平衡化した。封入体を緩衝液P1(0.2%サルコシル、40mM Tris/HCl、pH8.0)に可溶化し、サルコシルをイオン交換体を用いて除去した。カラムに生物学的に活性なG-CSFを含むローディング溶液(総タンパク質17mg)10mlを1ml/minの一定流速でロードした。分離は、緩衝液3Pの不連続段階勾配を用い、2ml/minの一定流速で行った(図1)。第一クロマトグラフィピーク(ピークA)において、E.coliタンパク質およびほとんどの不正確にホールドされた凝集G-CSFがみられた。100% 緩衝液P3(0% 緩衝液P2)で実質的に純粋な単量体の生物学的に活性なG-CSFが95%以上の純度で溶出された(7mg)(図2)。
【０１００】
ピークAからの試料の生物活性は、下記実施例5に記載のごとく測定し、約1x106IU/mgタンパク質であり、ピークBからの試料の生物活性測定値は0.8-1.0x108IU/mgタンパク質であり、標準品の生物活性は1x108lU/mgタンパク質であった。出発封入体溶液を用いる1ステップIMACは、純度95%以上、標準品に匹敵する生物活性の単量体形のG-CSFの単離をもたらした。
実施例2：  IMAC:Zn-IDA(Fractogel EMD Chelate)を用いる生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離
【０１０１】
クロマトグラフィカラム(h=2cm、d=10mm)に、Zn2+イオンが結合したFractogel EMD Chelate(Merck)支持体を充填した。カラムを水で洗浄し、次いで5カラム容量の緩衝液P2で1ml/min(分)の一定流速にて平衡化した。封入体を緩衝液P1に可溶化し、サルコシルをイオン交換体を用いて除去した。カラムに総量4mgの可溶化封入体3.3mlをロードした。分離は、緩衝液P3の不連続段階勾配を用い、1ml/minの一定流速で行った(勾配: 0% 緩衝液P3(100% 緩衝液P2)13min、25% 緩衝液P3(75% 緩衝液P2)12min、100% 緩衝液P3(0% 緩衝液P2)14min、0% 緩衝液P3(100% 緩衝液P2)11min)。100%の緩衝液P3で単量体の生物学的に活性なG-CSF(0.7mg)が溶出された。
実施例3： IMAC:Ni-NTA(Superflow)を用いる生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離。
【０１０２】
クロマトグラフィカラム(h=10cm、d=10mm)に、Ni-NTA Superflow(Qiagen)支持体を充填し、次いで5カラム容量の緩衝液P4で2ml/minの一定流速にて平衡化した。封入体を緩衝液P1に可溶化し、サルコシルをイオン交換体を用いて除去した。カラムに可溶化封入体(総タンパク質10mg)10mlを1ml/minの一定流速でロードした。分離は、緩衝液P5の不連続段階勾配を用い、2ml/minの一定流速で行った(図1に記載のZn-IDA Cheating Sepharose Fast Flowを用いる分離と同じ勾配)。100% 緩衝液P5(0% 緩衝液P4)で純度95%以上の単量体の生物学的に活性なG-CSF(3.6mg)が溶出された。第一クロマトグラフィピークでは、E.coliタンパク質に加えて不正確にホールドされた凝集G-CSFのみがみられた。Ni-NTA Superflowを用いるいくつかのクロマトグラフィ分離後の第二ピークからの単量体形のG-CSFをプールし、最終精製物(ポリッシング)を陽イオン交換クロマトグラフィおよびゲルろ過を用いて行った。
実施例4：  生物学的に活性なG-CSFを製造するためのさらなるクロマトグラフィ工程を含む精製および/または単離方法
【０１０３】
生物学的に活性なG-CSFの精製および/または単離方法を、E.coli中にG-CSFを発現後に得られた封入体溶液から出発した。4.5gの洗浄封入体を225mlの緩衝液P1に再懸濁させ、20℃で18時間、リニア振盪器を用いて静かに(軽く)振盪させて可溶化した。15分間遠心後、サルコシルをイオン交換体を用いて除去した。試料を水で容量が2倍になるまで希釈し、タンパク質濃度〜1.4mg/mlの封入体溶液(標準としてG-CSFによるBradford後)〜430mlを得た。タンパク質溶液を、Zn2+イオンが結合したCheating Sepharose Fast Flow(45-165μm、Pharmacia)支持体を高さ10cm(h=10cm、d=5cm、V=200ml)に充填したクロマトグラフィカラムXK50/20(Pharmacia)に2等量をロードした。試料のローディングおよび溶出は7ml/minの一定流速で行った。ローディング後、カラムを不連続工程勾配で洗浄した(図3)：緩衝液P2で15min、次いで緩衝液P2およびP6の混合物(容量比75:25)で45min、および緩衝液P6で86min。単量体形の生物学的に活性なG-CSFを100% 緩衝液P6で溶出した。単量体の生物学的に活性なG-CSFを含む分画すべて(2分離物)をプールし、タンパク質濃度〜0.7mg/mlの溶液271mlを得た。この溶液にEDTAを最終濃度2mMで加えた。該溶液を20mM CH3COOH、pH4.0で3回希釈し、陽イオン交換クロマトグラフィ用のローディング溶液として用いた。
【０１０４】
IMAC溶出液の2部分標本を、クロマトグラフィ支持体SP-5PW(30μm：TosoHaas)を高さ16cm(h=16cm、d=1.6cm、V=32ml)に充填したクロマトグラフィカラムXK16/20(Pharmacia)にロードした。試料のローディングおよびカラムからの溶出は5ml/minの一定流速で行った。試料のローディング後、カラムを緩衝液P7で11min洗浄し、30minで0%〜25%緩衝液P8(100%〜75%緩衝液P7)の緩衝液P8の直線勾配で溶出した。カラムを再度緩衝液P7およびP8の混合物(容量比75：25)、次いで緩衝液P8で22min洗浄した(図4)。〜18%の緩衝液P8の直線勾配の直線部分に溶出され、正しくホールドされたG-CSF(純度98%以上)に属する主クロマトグラフィピークの分画をプールし、ゲルろ過カラム用のローディング溶液として直接用いた。
【０１０５】
陽イオン交換クロマトグラフィ(V=46ml、タンパク質濃度〜2.4mg/ml)からの溶出液の5部分標本を、ゲルろ過支持体Superdex 75(プレプグレード、34μm)(Pharmacia)を高さ57cm(h=57cm、d=2.6cm、V=300ml)に充填したクロマトグラフィカラムXK26/70(Pharmacia)にロードした。分離は緩衝液P9を用い2.5ml/minの一定流速で行った。タンパク質二量体を示すピークが単量体タンパク質を表す主ピークから明らかに分離される(図5)。主クロマトグラフィピーク分画をプールし、緩衝液を交換し、標準品の生物活性に相当する生物活性が1x108IU/mgで純度99%以上の純粋な単量体形のG-CSF 100mgを得た。
実施例5： In vitro G-CSF生物活性アッセイ
【０１０６】
G-CSFの生物活性を、国際標準ヒト組換えG-CSF(88/502、酵母細胞由来;NIBSC Potters Bar, Hertfordshire, UK; Mire-Sluis, A. R.ら、v J Immunol Methods 179,117-126(1995)参照)を用い、既知の方法(Hammerling, U.ら、J Pharm Biomed Anal 13, 9-20(1995))を用いる細胞増殖刺激(NFS-60細胞)に基づく方法により測定した。
【０１０７】
緩衝液組成：
P1：0.2%サルコシル、40mM Tris/HCl、pH8.0
P2：20mM Tris/HCl、150mM NaCl pH8.0
P3：20mM酢酸、150mM NaCl(1M NaOHでpHを4.5に調製)
P4：10mMTris/HCl、200mM NaCl(pH8.0)
P5：20mM酢酸、200mM NaCl(1M NaOHを加えてpHを4.0に調整)
P6：20mM CH3COOH、150mM NaCl(pH4.0)
P7：20mM CH3COOH(pH5.5)
P8：20mM CH3COOH、500mM NaCl(pH5.5)
P9：5mM リン酸Na、50mM NaCl(pH7.0)
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】IMAC支持体：Zn(II)-lDA Chelating Sepharose Fast Flow(キレーティングセファロースファーストフロー)(Pharmacia)を用いる可溶化封入体からのタンパク質のクロマトグラフィ分離を示す。
【図２】ドデシル硫酸ナトリウム(SDS-PAGE)存在下における出発試料および図1のZn-IDA Cheating Sepharose Fast Flow(Pharmacia)を用いた分離後のクロマトグラフィのピークで示した試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図３】IMAC支持体Zn-IDA Chelating Sepharose Fast Flow(Pharmacia)およびカラムXK50/20を用いるクロマトグラフィ分離を示す。
【図４】陽イオンクロマトグラフィ支持体TSKゲルSP-5PW(TosoHaas)を充填したカラムXK16/20を用いるクロマトグラフィ分離を示す。
【図５】ゲルろ過支持体 Superdex(登録商標)75プレプグレード(Pharmacia)を充填したカラムXK26/70を用いるクロマトグラフィ分離を示す。
【図１】
2005525304.tif 000002
【図２】
2005525304.tif 000003
【図３】
2005525304.tif 000004
【図４】
2005525304.tif 000005
【図５】
2005525304.tif 000006
【国際調査報告】
2005525304.tif 000007
2005525304.tif 000008