(57)【要約】本発明はシトシン−メチル化の検出のためのオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー及び方法を提供するもので、これは特定の疾病について、遺伝的及び／または後天的パラメーターの組の解析による、疾病または疾病の発病素質の診断のために特に好適である。【解決手段】下記の段階からなることを特徴とする、シトシンのメチル化の解析により、進行状態の疾病または特定の疾病の発病素質の診断のために、遺伝的及び／または後天的パラメーターを調べる方法。ａ）一つのゲノムＤＮＡ−試料について、５−部位の非メチル化シトシン塩基を化学処理によって、ウラシルまたは他の、塩基対挙動がシトシンに類似していない塩基に変換する、b）化学的に前処理したゲノムＤＮＡを、プライマーオリゴヌクレオチッド及びポリメラーゼの組合わせ物によって増幅する、c）増幅産物をオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−ゾンデまたは一つのアレーの使用によってハイブリッド化する、ｄ）ハイブリッド化された増幅産物の存在を証明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２の一つに相当する、化学的に前処理されたＤＮＡの、少なくとも１８塩基長の配列断片を含む核酸。
【請求項２】
化学的に前処理されたＤＮＡ（配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２の）をハイブリッド化する、少なくとも９ヌクレオチッド長の塩基配列をその都度、少なくとも含む、化学的に前処理されたＤＮＡ中のシトシンのメチル化状態の検査用のオリゴマー[オリゴヌクレオチッドまたはペプチッド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマー]。
【請求項３】
塩基配列が、少なくとも一つのＣpＧジヌクレオチッドを含む請求項２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
ＣpＧジヌクレオチッドのシトシンがオリゴマーの約３分の一であることを特徴とする請求項３に記載のオリゴマー。
【請求項５】
配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２の一つの、少なくとも一つのＣpＧジヌクレオチッドあたり、少なくとも一つのオリゴマーを含む請求項３に記載のオリゴマーの組。
【請求項６】
配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２の一つの配列の、ＣpＧジヌクレオチッド毎に少なくとも一つのオリゴマーを含む請求項５に記載のオリゴマーの組。
【請求項７】
配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２の少なくとも一つに相当するＤＮＡ−配列または断片の増幅用にプライマーオリゴヌクレオチッドとして使用される、請求項２に記載の、少なくとも二つの核酸の組。
【請求項８】
少なくとも一つのオリゴヌクレオチッドが一つの固相に結合していることを特徴とする請求項７に記載のオリゴヌクレオチッドの組。
【請求項９】
請求項２〜４の何れか１項に記載のオリゴマーの少なくとも１０個を含む、配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２に相当する、化学的に前処理されたゲノムＤＮＡ中のシトシン−メチル化状態及び／または多形性、単一ヌクレオチッド（ＳＮＰs）の検出用のオリゴマーゾンデの組。
【請求項１０】
配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２のＣpＧジヌクレオチッドのメチル化状態と相関関係にある疾病解析用の異なるオリゴマー（アレー）の、担体上に固定される配置方法であって、請求項２〜４の何れか１項に記載の少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合されている方法。
【請求項１１】
請求項２〜４の何れか１項に記載の異なるオリゴマー（アレー）の固相上に結合した配置。
【請求項１２】
固相の平坦な平面上に四角形または六角形状格子形で、配置されていることを特徴とする請求項１１に記載の異なるオリゴヌクレオチッド−及び／またはＰＮＡ−オリゴマー配列のアレー。
【請求項１３】
固相表面がシリカ、ガラス、ポリスチロール、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることを特徴とする請求項１１または１２に記載のアレー。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の少なくとも一つの核酸を含む、遺伝子のメチル化状態と相関関係を有する疾病の解析用ＤＮＡ−アレー及び／またはＰＮＡ−アレー。
【請求項１５】
下記の段階からなることを特徴とする、シトシンのメチル化の解析により、進行状態の疾病または特定の疾病の発病素質の診断のために、遺伝的及び／または後天的パラメーターを調査する方法。
ａ）一つのゲノムＤＮＡ−試料について、５−部位の非メチル化シトシン塩基を化学処理によって、ウラシルまたは他の、塩基対挙動がシトシンに類似していない塩基に変換する；
b）この化学的に前処理されたゲノムＤＮＡから、断片が、請求項７または８に記載のプライマーオリゴヌクレオチッド及びポリメラーゼの組合わせの使用によって増幅され、その際、増幅産物が証明可能な標識を帯びている；
c）増幅産物は請求項２〜４の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−ゾンデまたは請求項１１〜１３の何れか１項に記載の一つのアレーの使用によってハイブリッド化される；
ｄ）次いで、ハイブリッド化された増幅産物が証明される。
【請求項１６】
化学処理が重亜硫酸塩、酸性亜硫酸塩または亜硫酸水素塩の溶液によって行なわれることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
１０を超える異なる、１００〜２，０００の塩基対長の断片が増幅されることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
増幅が多くのＤＮＡ−断片によって、反応器中で行なわれることを特徴とする請求項１５〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡ−ポリメラーゼであることを特徴とする請求項１５〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行なわれることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
増幅産物の標識が蛍光標識であることを特徴とする請求項１５〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
増幅産物の標識が放射性核種であることを特徴とする請求項１５〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
増幅産物の標識が、質量分析計で証明可能であって、分離可能な、通常分子量の分子断片であることを特徴とする請求項１５〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
増幅産物または増幅産物の断片が質量分析計で証明されることを特徴とする請求項１５〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
質量分析計の検出能力を改善するために、検出対象の断片が各々陽荷電または陰荷電を帯びることを特徴とする請求項２３及び／または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
検出がマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）または電子噴射質量分析法（ＥＳＩ）によって行なわれ、映像化されることを特徴とする請求項２３〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ゲノムＤＮＡがＤＮＡを含む細胞または細胞構成物から得られ、その際、ＤＮＡの供給源が例えば、細胞列、生検、血液、喀痰、便、尿、脳−脊髄−液、パラフィン埋め込み組織、例えば、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓の組織、組織の顕微鏡スライドガラス標本及びこれらから得られる全ての可能な組み合わせを含むことを特徴とする請求項１５〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２〜４の何れか１項に記載の重亜硫酸塩（＝酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）及びオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマーを含むキット。
【請求項２９】
請求項１に記載の核酸、請求項２〜４の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチッドまたはＰＮＡオリゴマー、請求項２８に記載のキットまたは請求項１０〜１３の何れか１項に記載の、以下に列挙する各種疾病、障害等についてメチル化サンプルの解析による診断及び治療。薬剤の副作用；各種癌；ＣＮＳ−機能欠損；攻撃的徴候または挙動；脳傷害の結果、惹起される臨床的、心理的及び社会的マイナスの効果；精神錯乱及び人格錯乱；老人性痴呆及び／またはそれに附随する徴候；心筋症；胃腸系統の機能欠損、傷害または疾病；呼吸器系統の機能欠損、傷害または疾病；傷害、炎症、感染、免疫、及び／または、回復期、発育期の身体異常としての機能欠損、傷害または疾病；皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能欠損、傷害または疾病；内分泌及び代謝系の機能欠損；頭痛、性機能障害。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
近年、分子生物学において、方法的展開の後に、成功している研究分野は、遺伝子自体、ＲＮＡにおけるこの遺伝子の翻訳及びそれから生成する蛋白質である。個々の開発経過における何時、どの遺伝子が評価されたか、如何にして特定の細胞及び組織の、特定の遺伝子の活性化及び阻害が制御されるかは、遺伝子またはゲノムのメチル化の程度及び特性に相関する。その限りでは、個々の遺伝子またはゲノムの変化したメチル化サンプルにおける疾病状態が表現される。
【０００２】
本発明は核酸、オリゴヌクレオチッド、ＰＮＡ−オリゴマー及び進行中の疾病または特定の疾病の発病素質についての診断方法に関する。
【０００３】
（従来の技術）
ＣpＧ島のメチル化は、しばしば、転写不活性−性と同一視される。ＣpＧ島遺伝子のプロモーター中に見られる一義的な証明はされていないが、全てのＣpＧ島と既知のプロモーターが局在するメチル化位置とは同じではない。異なる、組織特異性の、刻印の遺伝子において、ＣpＧ島は転写出発部位から、見かけ上、下流方向に離れた部位に局在し、多くの遺伝子が複数のプロモーターを有している。疾病の多くがＣpＧジヌクレオチッドのメチル化と因果関係にあると実証されている。古典的突然変異に対して、ＤＮＡ−メチル化では、コード化された遺伝子の機能を変えることなく、塩基置換を行なうメカニズムが重要である。後天的変換と古典的突然変異との間の相互作用は腫瘍遺伝子では重要な役割を演じる。例えば、病巣についての過度のメチル化及び一般的なゲノムメチル化は多くの異なる腫瘍タイプの指標となる。腫瘍の発生及び腫瘍の進行は過度のメチル化によって、誘発された突然変異及び他の、遺伝子遮断、−これは細胞増殖及び／または遺伝子の、脱メチルを経て、誘導された、発生学的展開にのみ必要な、再活性化を制御するが−、が原因となる。
【０００４】
遺伝性、非ポリープ性結腸直腸癌では、例えば、突然変異マイナスの大腸ガンの主要部は、以前は、hMLH1プロモーターの過度メチル化及びそれに続くhMLH1の非−発現、欠損対の修復に原因がある[Bevilacqua RA、Simpson AJ．ハイレベルミクロサテライト不安定性を有する散発性胃癌におけるhMLH1突然変異ではない、hMLH1プロモーターのメチル化。Int J Cancer．2000 Jul 15;87(2):200〜3]。肺癌の原因では、発現の減少がＲＡＳ効果−相同体のプロモーター配列におけるＣpＧ島のメチル化と関連する[Dammann R、Li C、Yoon JH、Chin PL、Bates S、Pfeifer GP、肺腫瘍抑制遺伝子坐3p21.3.からのRAS結合域同族蛋白質の後天的不活性化。Nat Genet 2000 Jul；25(3):315〜9]。プロモーターの過度のメチル化を含む、腫瘍抑制遺伝子ＬＫＢ１の後天的不活性化はPeutz−Jeghers症候と関連する[Esteller M、Avizienyte E、Conn PG、Lothe RA、Baylin SB、Aaltonen LA、Herman JG、一次腫瘍のＬＫＢ１の後天的不活性化はPeutz−Jeghers症候と関連する。Oncogene．2000 Jan 6;19(1):164〜8]。
【０００５】
メチル化と関連する疾病の多くが、その病因において、腫瘍抑制遺伝子p１６またはp１５遺伝子の間に、真菌症とp16(INK４a)遺伝子の間に認められるような密接な関係を示している[Navas IC、Ortiz-Romero PL、Villuendas R、Martinez P、Garcia C、Gomez E、Rodriguez JL、Garcia D、Vanaclocha F、Iglesias L、Piris MA、Algara P、p16(INK４a)遺伝子の変性はしばしば真菌症の原因になる。Am J Pathol．2000 May;156(5):1565〜72]。また、胃癌の転写遺伝子p１６の切断と若干の、特殊なＣpＧ部位の新たなメチル化の間には、ある強力な関係がある[Song SH、Jong HS、Choi HH、Kang SH、Ryu MH、Kim NK、Kim WH、Bang YJ、プロモーター領域の特殊なＣpＧ部位のメチル化は胃癌の、p16(INK４a)発現を強力に制御できる。Int J Cancer．2000 Jul 15;87(2):236〜40]。初期の胆管硬化症と関連する胆管癌の病因は、p１６プロモーターのメチル化に依存する、腫瘍抑制遺伝子p１６の不活性化、と相関関係にある[Ahrendt SA、Eisenberger CF、Yip L、Rashid A、Chow JT、Pitt HA、Sidransky D、染色体９p２１損失及び初期胆管硬化症に関連する胆管癌のp１６不活性化。J Surg Res．1999 Jun 1;84(1):88〜93]。白血病素因及び急性リンパ性白血病の進行において、p１６遺伝子の過度のメチル化による不活性化が、一つの役割を演じる [Nakamura M、Sugita K、Inukai T、Goi K、Iijima K、Tezuka T、Kojika S、Shiraishi K、Miyamoto N、Karakida N、Kagami K、O-Koyama T、Mori T、Nakazawa S、p１６／ＭＴＳ１／１ＮＫ４A遺伝子は１１q２３転移の幼児性、急性リンパ性白血病における過度のメチル化によってしばしば不活性化される。Leukemia．1999 Jun;13(6):884〜90]。更に、p１６遺伝子及びp1５遺伝子の過度メチル化が多くの骨髄癌の原因に決定的役割を演じていることが前提になる[Ng NH、Wong IH、Lo KW、ＤＮＡメチル化の変化及び多数の骨髄炎。リンパ性白血病。1999 Aug;34(5~6):463〜72]。腎臓癌の発病素質にはメチル化によって不活性化されたＶＨＬ−遺伝子が関与しているとみなされる[Glavac D、Ravnik−Glavac M、Ovcak Z、Masera A、腎細胞癌の源発と進行における遺伝子的変化。Pflugers Arch．1996；431（6 Suppl 2）:R193〜4]。５’ＣpＧ島の異常メチル化は鼻咽喉系癌におけるp１６遺伝子の転写不活性化に関与している可能性がある[Lo KW、Cheung ST、Leung SF、van Hasselt A、Tsang YS、Mak KF、Chung YF、Woo JK、Lee JC、Huang DP、鼻咽喉系癌におけるp１６遺伝子の過度メチル化。Cancer Res．1996 Jun 15;56(12):2721〜5]。肝細胞癌ではp１６蛋白の不活性化が証明されている。プロモーターの過度メチル化及び遺伝子の同型接合体の消去はここでは頻繁なメカニズムに属する[Jin M、Piao Z、Kim NG、Park C、Shin EC、Park JH、Jung HJ、Kim CG、Kim H、p１６は肝細胞癌における一つの大きな不活性化標的である。2000 Jul 1;89(1):60〜8]。ＤＮＡ−メチル化は乳癌のＢＲＣＡ―１遺伝子の遺伝子発現を制御することが証明された。 [Magdinier F、Billard LM、Wittmann G、Frappart L、Benchaib M、Lenoir GM、Guerin JF、 Dante R、ＢＲＣＡ―１のＣpＧ島５’末端の部分的メチル化はヒトの体細胞ＦＡＳＥＢの遺伝子発現を抑制することに関与する。]。メチル化と非ホジキンリンパ腫の間の関係も同様に認められている[Martinez−Delgado B、Richart A、Garcia MJ、Robledo M、Osorio A、Cebrian A、Rivas C、Benitez J、非ホジキンリンパ腫の追跡における病気の標識としてのＰ16ink4a及びＰ15ink4b遺伝子。Br J Haematol．2000 Apr;109(1):97〜103]。
【０００６】
ＣpＧ−メチル化はＴ−細胞白血病を進行させ、これはＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の発現低下と相関する[Nosaka K、Maeda M、Tamiya S、Sakai T、Mitsuya H、Matsuoka M、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のメチル化の増加は成人Ｔ−細胞白血病の進行と相関する。Cancer Res．2000 Feb 15;60(4):1043〜8]。膀胱癌では、ＣpＧ−島のメチル化度を上げることと関連する[Salem C、Liang G、Tsai YC、Coulter J、Knowles MA、Feng AC、Groshen S、Nichols PW、Jones PA、膀胱癌のＣpＧ島のメチル化度と進行速度の増加。Cancer Res．2000 May 1;60(9):2473〜6]。食道の扁平上皮細胞癌の転写非活性化は、病気の進行に関与するＦＨＩＴ遺伝子のメチル化と関連する[Shimada Y、Sato F、Watanabe G、Yamasaki S、Kato M、Maeda M、Imamura M、脆弱なヒスチジン三つ組み遺伝子発現の低下は食道の扁平上皮細胞癌の進行に関係があるが、患者の予兆及び喫煙歴には無関係である。Cancer．2000 Jul 1;89(1):5〜11]。中性エンドペプチダ−ゼ２４．１１（ＮＥＰ）は、男性ホルモン非依存性前立腺癌の生長に関与する、神経ペプチッドの成長を非活性化する。ＮＥＰ−プロモーターの過度のメチル化によるＮＥＰ発現の減少は、神経ペプチッド刺激性男性ホルモン非依存型前立腺癌の成長を助長する[Usmani BA、Shen R 、Janeczko M、Papandreou CN、Lee WH、Nelson WG、Nelson JB、Nanus DM、ヒト前立腺癌の中性エンドペプチダ−ゼ遺伝子プロモーターのメチル化。Clin Cancer Res．2000 May;6(5):1664〜70]。成人の副腎皮質腫瘍は腫瘍−ＤＮＡの構造的異常を示す。この異常は他のＩＧＦ２遺伝子の過発現下に、この遺伝子坐のＤＮＡの脱メチルと関連がある[Wilkin F、Gagne N、Paquette J、Oligny LL、Deal C、小児性副腎皮質腫瘍：分子内変異がインシュリン様成長因子ＩＩ遺伝子の過発現へと導く。J Clin Endocrinol Metab．2000 May;85(5):2048〜56．Review]。網膜芽腫遺伝子で、多くのポリヌクレオチッドにおけるＤＮＡ−メチル化がこの疾病に関与していることが認められている[Mancini D、Singh S、Ainsworth P、Rodenhiser D、網膜芽腫遺伝子（ＲＢ１）における、構成的に突然変異を起こし易いホットスポットとしてのメチル化ＣpＧジヌクレオチッド。Am J Hum Genet．1997 Jul;61(1):80〜7]。慢性骨髄白血病の進行に関して、p５３遺伝子の規制解除とメチル化対象の変更との間には、関連があると推測される[Guinn BA、Mills KI、慢性骨髄白血病の進行における、p５３突然変異、メチル化及びゲノムの不安定度。Leuk Lymphoma．1997 Jul;26(3〜4):211〜26]。また、急性骨髄白血病のメチル化との関連も証明されている[Melki JR、Vincent PC、Clark SJ．急性骨髄白血病の多数遺伝子の同時過度メチル化。Cancer Res．1999 Aug 1;59(15):3730〜40]。ウイルムス腫瘍の抑制遺伝子における腫瘍特異性メチル化部位が同定された[Kleymenova EV、Yuan X、LaBate ME、Walker CL、ウイルムス腫瘍の抑制遺伝子における腫瘍特異性メチル化部位の同定。Oncogene．1998 Feb 12;16(6):713〜20]。バーキットリンパ腫では、いくつかのプロモーターが完全なＣpＧ−メチル化を示している[Tao Q、Robertson KD、Manns A、 Hildesheim A、Ａmbinder RF、特定バーキットリンパ腫におけるエプステイン−バートウイールス（ＥＢＶ）：初期腫瘍組織の分子的解析。Blood．1998 Feb 15;91(4):1373〜81]。甲状腺腫瘍において、ＤＮＡ−メチル化が一つの役割を演じていることが認められている[Venkataraman GM、Yatin Ｍ、Marcinek R、Ain KB、脱分化甲状腺腫瘍における沃化物摂取の制限：Ｎa＋／Ｉ−シンポーター遺伝子のメチル化状態への関係。J Clin Endocrinol Metab．1999 Jul;84(7):2449〜57]。
【０００７】
多くの癌性疾病がメチル化と関連するだけでなく、多くの非癌性疾病もメチル化と関連している。関節炎の研究が、この病気がゲノムＤＮＡのメチル化と関連することを示している[Kim YI、Logan JW、Mason JB、Roubenoff R、関節炎におけるＤＮＡの低メチル化：抗悪性腫瘍薬による逆療法。Lab Clin Med．1996 Aug;128(2):165〜72]。ＩＣＦ−症候ではメチル化で規制された発現が実証された[Kond T、Bobek MP、Kuick R、Lamb B、Zhu X、Narayan A、Bourc'his D、Viegas−Pequignot E、Ehrlich M、Hanash SM、ＩＣＦ−症候における全−ゲノムのメチル化：非サテライトＤＮＡの低メチル化はＤ４Ｚ４ＮＢＬ２を反復する。]。システムルーパス紅斑症へのメチル化の関与が推定される[Vallin H、Perers A、Alm GV、Ronnblom L、システムルーパス紅斑症における内因性ＩＦＮ−α誘導物質のミミック組み合わせの、抗体の抗−二重−鎖ＤＮＡ及び免疫刺激性プラスミドＤＮＡ．J Immunol．1999 Dec1;163(11):6306〜13];同様に、デュシェンヌ型進行性筋ジストロフィー及びＣpＧ島の間の関連[Banerjee S、Singh PB、Rasberry C、Cattanach BM、マウス精子の書込みＨ１９領域のクロマチン体の初期遺伝継承。Mech Dev．2000 Feb;90(2):217〜26;Burmeister M、Lehrach H、デュシェンヌ型進行性筋ジストロフィー遺伝子の周辺図。Nature．1986 Dec11〜17;324(6097):582〜5]。アミロイド前駆蛋白の低メチル化に関与する後天的効果は、アルツハイマー病の発生に関与すると推定される[West RL、Lee JM、Maroun LE、アルツハイマー病患者の脳中のアミロイド前駆蛋白遺伝子の低メチル化。J Mol Neurosci．1995;6(2):141〜6]。染色体面でもメチル化状態は重要な役割を演じる。例えば、Ｘ−染色体の脆弱性と関係する精神的発育不全症候において、染色体の脆弱性の程度はメチル化によって決定される[de Muniain AL、Cobo AM、Poza JJ、Saenz A、（ＤＮＡの不安定性による病気）。Neurologia．1995 Dec;10 Suppl 1:12〜9]。
【０００８】
５−メチルシトシンは最も頻繁に現われる、真核細胞のＤＮＡの共有結合反応した塩基である。これは例えば、遺伝子書込み及び腫瘍発生の際、転写規制で或役割を演じる。遺伝情報の構成部分としての５―メチルシトシンの同定はそれ故非常に興味がある。５―メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対挙動を示すので、５―メチルシトシンの部位は配列によっては同定できない。更に、ＰＣＲ−増幅では５―メチルシトシンが有する後天的情報は完全に失われる。
【０００９】
ＤＮＡの５−メチルシトシンについての研究で、比較的新しく、頻繁に使用される方法は、重亜硫酸塩とシトシンとの特殊な反応である。これはその後に続くアルカリ加水分解で、その塩基対挙動がチミンに相当するところのウラシルに変化する。５−メチルシトシンはそれに対して、この条件下で変化しない。このようにして、元のＤＮＡは変換されて、もともと、その増幅挙動からではシトシンと区別され得なかったメチルシトシンは、今や、通常の分子生物学的技法で、僅かに残存するシトシンとして、例えば、増幅及びハイブリッド化または配列化によって証明される。感度に関する現技術水準は、調べるＤＮＡをアガロース−マトリックスに封じこめることによって、ＤＮＡの拡散と変性（重亜硫酸塩は単鎖ＤＮＡにのみ反応する）が防止され、全ての沈殿−及び精製過程が迅速な透析操作で置き換えられる[Olek、A．et al．、Nucl．Acids．Res．1996、24、5064〜5066]。ポテンシャルが具体的に説明できる方法によって、個々の細胞が研究される。ただし、今日まで、僅か３０００塩基対長までの個別領域が調べられたにすぎず、数千のメチル化解析を要する細胞研究は不可能である。また、この方法では、僅少量の試料からの非常に小さい断片から信頼性のある解析結果を得ることはできない。これら試料はマトリックスによる拡散の保護によってもロスされる。
【００１０】
５−メチルシトシンを証明する広範な公知の方法についての概観は、次ぎの概観−刊行物から読み取れる。：Rein、T．、DePamphilis、M．L．、Zorbas、H．、Nucleic Acids Res．1998、26、2255．
【００１１】
重亜硫酸塩−技法は今日まで、ほんの僅かの例外[Z．B．Zechnigk、M．et al．、Eur．J．Hum．Gen．1997、5、94〜98]として研究で使用されていた。常に既知の遺伝子の短い、特殊な断片が重亜流酸塩−処理後増幅されるか、完全に配列されているか[Olek、A．und Walter、J．、Nat．Genet．1997、17、275〜276]または個々のシトシン−位置が“プライマー−延長−反応“[Gonzalgo、M．L．und Jones、P．A．、Nucl．Acids Res．1997、25、2529〜2531、WO-Patent 9500669]または酵素断片[Xiong、Z．und Laird、P．W．、Nucl．Acids．Res．1997、25、2532〜2534]が証明された。これにはハイブリッド化による証明も記載されている[Olek et al．、WO99 28498]。
【００１２】
個々の遺伝子のメチル化の証明に重亜硫酸塩−技法を使用することを記載している他の刊行物は以下の通りである。Xiong、Z und Laird、P．W．(1 7)、Nucl．Acids Res．25、2532;Gonzalgo、M．L．und Jones、P．A．(1997)、Nucl．Acids Res．25、2529;Grigg、S．und Clark、S．(1994)、Bioassays 16、431;Zeschnik、M．et al．(1997)、Human Molecular Genetics 6、387;Teil、R．et al．(1994)、Nucl．Acids．Res．22、695;Martin、V．et al．(1995)、Gene 157、 261;WO 9746705、WO 9515373 und WO 45560．
【００１３】
マトリックス−補助レーザー脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は非常に優れた分子生物学における解析手段である[Karas、M．und Hillenkamp、F．(1988)、分子量１００００ダルトンを超える蛋白質分子のレーザー脱離イオン化。Anal．Chem．60:2299〜2301]。或分析では光吸収性マトリックスが使用されている。短いレーザー照射でマトリックスが蒸発し、被分析分子は分解することなくガス化する、マトリックス分子の衝撃により、被分析分子のイオン化が達成される。一定の電圧により、イオンは飛行管へと加速される。イオンの質量に比例して、異なる強さで加速される。小さいイオンは大きいイオンより早く検出器に到達する。
【００１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析はペプチッド及び蛋白質の分析に優れており、且つ好適である。核酸の分析にはやや難点がある[Gut、I．G．und Beck、S．(1995)ＤＮＡ及びマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析。分子生物学：技術革新の現状と将来の傾向1:147〜157．]。核酸の分析時の感度は、ペプチッドの場合の感度に比較して約１００倍も悪く、断片の大きさが増加するに従がって、それに不釣合な程度に感度が低下する。核酸については、多量の負電荷を帯びた骨格を有するので、マトリックスによるイオン化過程が本質的に非効率的である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析では、マトリックスの選択が非常に重要である。ペプチッドの脱離用に、非常に細かい結晶になる、非常に有効な、いくつかのマトリックスが発見された。ＤＮＡヘの用途としては、感度にそれほど差のない、いくつかのマトリックスがある。ＤＮＡを化学処理してペプチッドに類似するものにすることによって、感度を低下させることができる。普通のホスフェート骨格がチオホスフェートで置換されるホスホロチオエイト核酸は簡単なアルキル化剤によって、中性電荷のＤＮＡに変換される[Gut、I．G．und Beck、S．(1995)、ＤＮＡの選択的アルキル化法と質量分析法による検出。Nucleic Acids Res．23:1367〜1373]。“charge tags“をこの化学変化されたＤＮＡに結合させると、ペプチッドにみられる感度と同程度に感度が上昇する。“charge tags“の、もう一つの利点は、変化しない物質の検出を困難にする不純物の分析安定性を高めることである。
【００１５】
ゲノムＤＮＡは細胞−試料、組織−試料または他の試験試料から、標準的方法により得られる。この標準的方法はFritsch und Maniatis eds．、分子クローン：実験マニュアルなどの参考文献に記載されている。
【００１６】
（課題の設定）
本発明はシトシン−メチル化の検出のためのオリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−オリゴマー及び方法を提供することにある。これは特定の疾病について、遺伝的及び／または後天的パラメーターの組の解析による、疾病または疾病の発病素質の診断のために、特に好適である。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は少なくとも、化学的に前処理されたゲノムＤＮＡ（配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２）におけるシトシン−メチル化状態の検出のために使用される、１０個のオリゴマーゾンデ（オリゴヌクレオチッド及びまたはＰＮＡ−オリゴマー）の組である。このゾンデによって、現在進行中の疾病または特定の疾病の発病素質の診断のための遺伝的及び／または後天的パラメーターの組の解析が可能になる。
【００１８】
本発明における遺伝的パラメーターは、請求項記載の核酸（配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２）の突然変異及び多形性及びその規制外の必要とする配列である。特に、突然変異としては、組込み、一部染色体の欠失、一部突然変異、遺伝子配列順の逆位及び多形性及び、中でも特に、ＳＮＰs（単一ヌクレオチッド多形性）を挙げることができる。多形性は上記の組込み、一部染色体の欠失または遺伝子配列順の逆位でもあり得る。
【００１９】
本発明における後天的パラメーターは、特に、請求項記載の核酸（配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２）のＤＮＡ−塩基のシトシン−メチル化及び更なる化学変化及びその規制外の必要とする配列である。その他の後天的パラメーターは、例えば、ヒストンのアセチル化があるが、これは本発明の方法では直接解析できず、再度のＤＮＡ−メチル化を要する。
前記化学的に前処理されたＤＮＡでは、少なくとも、１８塩基対長の、配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２の断片が診断用として使用される。この断片の検出には、少なくとも、９ヌクレオチッド長のオリゴマーが使用される。
【００２０】
上記オリゴマーは少なくとも一つのＣpＧジヌクレオチッドを含む。ＣpＧジヌクレオチッドのシトシンはオリゴマーの約３分の１存在する。オリゴマーの組においては、その都度、少なくとも各ＣpＧジヌクレオチッド毎に、配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２の、少なくとも一つのオリゴヌクレオチッドが存在する。オリゴマーは担体物質上に一定の配置で形成される。
【００２１】
この関係においては、更に、請求項記載の、配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２の核酸の遺伝的及び／または後天的パラメーターの診断のためには、個々のＣpＧジヌクレオチッドではなくて、配列中に存在する多数のＣpＧジヌクレオチッドが解析されねばならない。本発明の方法の特に好ましい変形においては、配列中に存在する全てのＣpＧジヌクレオチッドが研究されねばならない。
【００２２】
本発明の方法の好ましい変形においては、少なくとも一つのオリゴマーが、一つの固相に結合される。
【００２３】
本発明の方法の更に好ましい変形の一つにおいては、化学的に前処理されたゲノムＤＮＡにおける、シトシン−メチル化状態及び／またはＳＮＰs単一ヌクレオチッド多形性（ＳＮＰs）が使用される。
【００２４】
本発明におけるオリゴマーは、メチル化試料の解析によって、以下に列挙する各種疾病、障害等についての診断に使用される。薬剤の副作用；各種癌；ＣＮＳ−機能欠損、障害または疾病；攻撃的徴候または挙動；脳傷害の結果、惹起される臨床的、心理的及び社会的マイナスの効果；精神錯乱及び人格錯乱；老人性痴呆及び／またはそれに附随する徴候；心筋症；胃腸系統の機能欠損、傷害または疾病；呼吸器系統の機能欠損、傷害または疾病；傷害、炎症、感染、免疫、及び／または回復期、発育期の身体異常としての機能欠損、傷害または疾病；皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能欠損、傷害または疾病；内分泌及び代謝系の機能欠損；頭痛、性機能障害。
【００２５】
配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２の、補遺中にリストアップされている核酸の、少なくとも一つが、現在進行中の疾病または特定の疾病の発病素質の診断のための、遺伝的及び／または後天的パラメーターの組の解析用として使用される。
【００２６】
更に、本発明はゲノムＤＮＡ−試料におけるシトシン−メチル化及び多形性、単一ヌクレオチッドの検出用のオリゴマーゾンデの解析によって、現在進行中の疾病または特定の疾病の発病素質の診断のための、重要な遺伝的及び／または後天的パラメーターの調査方法であり、その方法は次の段階よりなる。
【００２７】
本発明の方法の最初の段階では、一つのゲノムＤＮＡ−試料について、５−位置の非メチル化シトシン塩基を化学処理によって、ウラシル、チミンまたは他の、塩基対挙動がシトシンに類似していない塩基に変換する。これは次ぎに、化学的前処理を施される。
【００２８】
通常の専門家にとっては、使用される配列中の、オリゴマーにおいて、チミンがウラシルと交換される際、同じ目的が達成されることが理解できるだろう。
【００２９】
解析されるゲノムＤＮＡが、好ましくは、ＤＮＡを含む通常のＤＮＡの供給源から得られ、それらは、例えば、細胞列、生検、血液、喀痰、便、尿、脳−脊髄−液、パラフィン埋め込み組織、例えば、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓の組織、組織の顕微鏡スライドガラス標本及びこれらから得られる全ての可能な組み合わせである。
【００３０】
好ましくは、上記ゲノムＤＮＡの処理は重亜硫酸塩（酸性亜硫酸塩または亜硫酸水素塩）によって行なわれ、次いで、アルカリ加水分解されて、非メチル化シトシン−核塩基がウラシルへ変化される。
【００３１】
本発明の方法の第二段階において、化学的に前処理されたゲノムＤＮＡ断片がプライマーオリゴヌクレオチッドによって増幅される。
【００３２】
好ましくは、異なる、１０を超える数の、１００〜２，０００の塩基対長の断片が増幅される。
【００３３】
本発明の、変形された、好ましい方法では増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われ、その際、耐熱性ＤＮＡ−ポリメラーゼが使用されることが好ましい。
【００３４】
本発明においては、増幅が多くのＤＮＡ−断片によって、反応器中で行なわれることが好ましい。
【００３５】
本発明の方法の好ましい変形においては、その配列がその都度、補遺（配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２）にリストアップされている塩基配列の少なくとも１８塩基対長の断片に、対相補的であるか、同一であり、少なくとも二つのオリゴヌクレオチッドであるプライマーオリゴヌクレオチッドの組を含む。このプライマーオリゴヌクレオチッドは、好ましくは、ＣpＧジヌクレオチッドを含まないことが特徴である。
【００３６】
本発明の好ましい形態は、更に、異なるオリゴマーが固相の平坦な平面上に四角形または六角形状格子形で、配置されていることである。
【００３７】
本発明の、変形された、好ましい方法は、増幅が、固相に結合する、プライマーオリゴヌクレオチッドの鎖延長によって行なわれる方法である。
【００３８】
固相表面がシリカ、ガラス、ポリスチロール、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなることが好ましい。
【００３９】
第二段階で得られた、増幅産物は、次いで、オリゴヌクレオチッド及び／またはＰＮＡ−ゾンデまたは一つのアレーの使用によってハイブリッド化される。ハイブリッド化の際、使用される組は好ましくは、少なくとも、１０オリゴマーゾンデからなるものである。増幅産物は固相に結合するオリゴヌクレオチッドをハイブリッド化するソンデとして働く。次いでハイブリッド化されなかった断片は除去される。
【００４０】
前記オリゴマーは、少なくとも一つのＣpＧジヌクレオチッドを含む、少なくとも９ヌクレオチッド長の塩基配列を含むものである。そして、ＣpＧジヌクレオチッドのシトシンはオリゴマーの約３分の一である。ＣpＧジヌクレオチッド毎に一つのオリゴヌクレオチッドが存在する。
【００４１】
本発明の方法の第四段階ではハイブリッド化されなかった増幅産物が除去される。
【００４２】
本発明の方法の最終段階では、ハイブリッド化された増幅産物が検出される。
【００４３】
本発明においては、オリゴヌクレオチッド配列が存在する、固相の部位毎に、増幅産物に付加された標識が同定可能であることが好ましい。
【００４４】
本発明においては、増幅産物に付加された標識が蛍光物質標識であることが好ましい。
【００４５】
本発明においては、増幅産物に付加された標識が放射性核種であることが好ましい。
【００４６】
本発明においては、増幅産物に付加された標識が、分離可能な、質量分析計で証明可能であって、通常分子量の分子断片であることが好ましい。
【００４７】
本発明においては、増幅産物、増幅産物の断片または増幅産物に相補的なゾンデが、質量分析計で証明可能であることが好ましい。
【００４８】
本発明においては、質量分析計の検出能力を改善するために、検出対象の断片が各々陽荷電または陰荷電を帯びることが好ましい。
【００４９】
本発明においては、検出がマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）または電子噴射質量分析法（ＥＳＩ）によって行なわれ、映像化されることが好ましい。
【００５０】
更に、本発明においては、患者または健常者個人の好ましくない徴候の診断及び／または予備診断において、この好ましくない徴候が重要な遺伝的及び／または後天的パラメーターと関係があることが好ましい。
【００５１】
本発明においては、進行中の病気または、ある特定の疾病の発病素質の診断に、遺伝的及びまたは／後天的パラメーターの組の解析による方法が使用されることが好ましい。
【００５２】
本発明の対象は、重亜硫酸塩含有反応剤；配列がその都度、少なくとも、１８塩基対長の、補遺としてリストアップされている塩基配列（配列ＩＤ１〜配列ＩＤ４０７１２）の断片に対応するか、または、それに相補的であり、増幅産物製造用であって、少なくとも、二つのオリゴヌクレオチッドを含む、プライマーオリゴヌクレオチッド；オリゴヌクレオチッド；及び／または、ＰＮＡ−オリゴマーの組；及び、本発明の方法の実施及び評価用手引き；からなるキットである。
【００５３】
次ぎの実施例は、特定のＣＧ−部位のメチル化が調べられているところの、遺伝的非ポリープ性結腸直腸癌に関与するhＨＭＬ１遺伝子断片についてのものである。
【００５４】
第１段階では、ゲノム配列が、塩基の５−部位がメチル化されない、全ての、シトシンが変化して、塩基対挙動が異なる塩基を生成し、それに対して、塩基の５−部位がメチル化されたシトシンが変化しないように、重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）により処理される。反応が重亜硫酸塩の濃度が０．１〜６モルで行なわれると、非メチル化シトシン塩基に付加が起こる。これには、変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤の使用が必要である。次いで、アルカリ加水分解により、非メチル化シトシン−核塩基がウラシルに変換される。この変換されたＤＮＡはメチル化シトシンの証明に使用される。反応の第二段階で、ＤＮＡ−試料が水または水性溶剤で希釈される。続いてＤＮＡの脱スルフォン（１０〜３０分、９０〜１００℃）がアルカリpＨ域の値で行なわれる。本発明の方法の第三段階でＤＮＡ−試料が好ましくは、耐熱性ＤＮＡ−ポリメラーゼの使用下、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。本実施例では、１５５１bp５’側鎖領域のhＨＭＬ１遺伝子のシトシンが調べられる。ここでは、特殊なプライマーオリゴヌクレオチッドであるＡＧＣＡＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧ及びＴＴＧＡＴＴＧＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＡＴＧＣによって、７１９bp長の断片が増幅される。この増幅産物は固相に結合するオリゴヌクレオチッドを増幅する試料として使用され、二重鎖構造、例えば、ＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧが形成される。このとき、証明されるシトシンは増幅産物の５８８部位に存在する。ハイブリッド化産物の証明はＣy３及びＣy５の部位が蛍光標識され、増幅に使用された、プライマーオリゴヌクレオチッドにより証明される。亜硫酸塩で処理されたＤＮＡのこの位置に、メチル化シトシンが存在するならば、増幅されたＤＮＡのハイブリッド化反応はオリゴヌクレオチッドによって起こる。このようにして、その都度、調べられるシトシンのメチル化状態はハイブリッド化産物を経て決定される。
【配列表】
2005512499000001.app
2005512499000002.app
2005512499000003.app
2005512499000004.app
2005512499000005.app
【国際調査報告】
2005512499.tif 000002
2005512499.tif 000003
2005512499.tif 000004
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