(57)【要約】本発明はカルシウムシグナリング、インスリン分泌、及びグルコース恒常性に関与することが立証されているＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤を同定するための試薬と方法を提供する。本発明は被験体に効用を提供するようにＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの阻害剤を使用することを含む、糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及びグルコース恒常性障害の１種以上を有する被験体を治療するための治療薬と方法も提供する。
2005520520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子に作動可能に連絡した核酸制御配列を含む組換え発現ベクターでトランスフェクトされており、機能的β３サブユニット含有Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを有しない組換え宿主細胞。
【請求項２】
宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
ａ）請求項１に記載の組換え宿主細胞を提供する段階と；
ｂ）カルシウムの存在下で検出可能なシグナルを発生するカルシウム指示薬に前記組換え宿主細胞を接触させる段階と；
ｃ）前記宿主細胞をカルシウム指示薬に接触させる前、それと同時又はその後に該宿主細胞を１種以上の試験化合物で処理する段階と；
ｄ）対照細胞中の細胞内カルシウム濃度を増加させるのに有効量のＡＴＰで前記組換え宿主細胞を刺激する段階と；および
ｅ）前記組換え宿主細胞におけるカルシウム指示薬からのシグナルを検出し、該組換え宿主細胞におけるカルシウム指示薬からのシグナルが前記試験化合物により増加が誘導されている場合には該試験化合物がＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤であると判定する段階を含む、
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤の同定方法。
【請求項４】
方法が糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及びグルコース恒常性障害から構成される群から選択される１種以上の疾患の治療用化合物を同定するために使用される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組換え宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
被験体に効用を提供するようにＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの１種以上の阻害剤を被験体に投与することを含む、糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及びグルコース恒常性障害から構成される群から選択される１種以上の疾患を有する被験体の治療方法。
【請求項７】
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの１種以上の阻害剤が請求項３に記載の方法によって同定される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの１種以上の阻害剤がＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに特異的な抗体；Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニット遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド；及びＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニット遺伝子に対する小干渉性ＲＮＡから構成される群から選択される化合物を含む請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年３月２０日に出願された米国仮出願第６０／３６６１５２号、および２００３年１月２２日に出願された米国仮出願第６０／４４２１４２号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は分子生物学、細胞生物学、電圧ゲート型カルシウムチャネル、カルシウムシグナリング、薬剤発見、糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及びグルコース恒常性障害に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病（ＤＭ）はいずれも高血糖を特徴とする一連の疾患を含む。Ｉ型（「インスリン依存性」）ＤＭはインスリン欠乏を特徴とし、ＩＩ型（「インスリン非依存性」ないし「成人発症型」）ＤＭはインスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及び肝グルコース産生増加を特徴とする。ＤＭの慢性合併症は高血糖に起因し、網膜症、神経障害、腎症、及び心血管疾患が挙げられる。
【０００４】
膵臓β細胞では、膜脱分極と［Ｃａ２＋］ｉの振動増加がグルコースにより誘導されるインスリン分泌の主要な特徴である。［Ｃａ２＋］ｉの振動増加は栄養素、ホルモン及び神経伝達物質間の精巧な相互作用により制御され、電圧ゲート型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルによるＣａ２＋流入と小胞体（ＥＲ）等の細胞内貯蔵部からのＣａ２＋流動に起因する（Ｂｅｒｇｇｒｅｎ  ＆  Ｌａｒｓｓｏｎ  １９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔ．２２：１２−１８）。β細胞内でグルコースが代謝されるとＡＴＰが形成され、ＡＴＰにより制御される特定Ｋ＋チャネルが閉じ、原形質膜の脱分極の引き金となる。このような脱分極により電圧ゲート型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルが開き、Ｃａ２＋流入が生じ、［Ｃａ２＋］ｉが増加し、こうしてインスリンが放出される。このように、インスリンを分泌させるように膵臓β細胞を刺激するグルコース濃度レベルで電圧ゲート型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルが開く。
【０００５】
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルはα、β及びγサブユニットの組合せから構成される多重サブユニット蛋白質であり、各型のサブユニットは多重形で存在する。α１サブユニットはＬ型Ｃａ２＋チャネルの孔を形成し、βサブユニットはチャネル複合体のアセンブリ／発現に主要な役割を果たすと共にβ１サブユニットを介してＣａ２＋電流を調節すると考えられている（Ｓｉｎｇｅｒら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１５５３−１５５７；Ｈｕｌｌｉｎら，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：８８５−８９０；Ｔａｒｅｉｌｕｓら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１７０３−１７０８）。従来、インスリン分泌におけるＣａ２＋チャネルβサブユニットの役割は主に異種発現実験により研究されている（Ｉｈａｒａら，１９９５，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９：１２１−１３０）。膵臓β細胞はβ２サブユニットとβ３サブユニットの両者を発現する。
【０００６】
ＥＲ等の細胞内貯蔵部は電圧ゲート型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを介して細胞内カルシウム貯蔵部に流入するＣａ２＋の一部をイオン封鎖するか、又は付加的Ｃａ２＋を細胞質に放出することにより、脱分極により誘導されるＣａ２＋シグナリングを調節することができる。このようなＣａ２＋放出はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）のＣａ２＋仲介活性化とイノシトール１，４，５−三リン酸（Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３）の形成又は流入するＣａ２＋による細胞内Ｃａ２＋チャネルの直接ゲーティングにより生じ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
インスリン分泌を促進し、インスリン抵抗性を治療し、グルコース恒常性効率を増加するための薬剤を開発するために行われてきた大半の努力はＡＴＰにより制御されるＫ＋チャネルを標的としていた。しかし、このような薬剤は血中グルコース濃度と無関係に作用することが多いので、低血糖症等の重大な副作用を生じる恐れがある。従って、これらの欠点のない治療薬の標的を同定することが当分野で必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１側面において、本発明は活性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の発現を阻害するＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子に破壊を有する非ヒトトランスジェニック動物と、このようなトランスジェニック動物の作製方法を提供する。別の側面において、本発明はこのようなトランスジェニック動物を創製するための単離核酸配列とベクターを提供する。
【０００９】
別の側面において、本発明はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子に作動可能に連絡した核酸制御配列を含む組換え発現ベクターでトランスフェクトされており、機能的Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを有しない組換え宿主細胞を提供する。
【００１０】
別の側面において、本発明は本発明の組換え宿主細胞を提供する段階と、カルシウムの存在下で検出可能なシグナルを発生するカルシウム指示薬に前記組換え宿主細胞を接触させる段階と、前記組換え宿主細胞をカルシウム指示薬に接触させる前、それと同時又はその後に該組換え宿主細胞を１種以上の試験化合物で処理する段階と、対照細胞中の細胞内カルシウム濃度を増加させるのに有効量のＡＴＰで前記組換え宿主細胞を刺激する段階と、前記組換え宿主細胞におけるカルシウム指示薬からのシグナルを検出し、該組換え宿主細胞におけるカルシウム指示薬からのシグナルが前記試験化合物により増加が誘導されている場合には該試験化合物がＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤であると判定する段階を含む、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤の同定方法を提供する。
【００１１】
別の側面において、本発明は被験体に効用を提供するようにＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの１種以上の阻害剤を被験体に投与することを含む、糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及びグルコース恒常性障害から構成される群から選択される１種以上の疾患を有する被験体の治療方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及びグルコース恒常性障害を治療するための薬剤の標的としての電圧ゲート型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルのβ３サブユニットを同定することにより当分野の必要を満たすものである。本発明者らは電圧ゲート型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルのβ３サブユニット（以下、「Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質」又は「Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニット」と言う）を阻害すると、刺激グルコース濃度（即ち正常値即ち約１００ｍｇ／ｄＬを上回る血糖値）でのみインスリン分泌の増加が導かれることを発見した。
【００１３】
従って、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤は糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及びグルコース恒常性障害に現在利用可能な治療薬よりも低血糖症又は他の重大な副作用を生じる可能性が著しく少ない。
【００１４】
１側面において、本発明は活性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の発現を阻害するＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子に破壊（即ち「ノックアウト」）を有する非ヒトトランスジェニック動物を提供するものであり、前記非ヒト動物は野生型動物に比較して（ａ）細胞内カルシウム貯蔵部からのカルシウム放出の増加、（ｂ）基線グルコース値ではなく刺激グルコース濃度でのインスリン放出の増加、及び（ｃ）血液からのより効率的なグルコース除去から構成される群から選択される１種以上の特徴を有する。
【００１５】
本発明のトランスジェニック動物はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の発現がノックアウトされた特定細胞型（例えば膵臓β細胞）の源としてのＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の機能を測定するためや、候補化合物がＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤として作用していることを確認するために使用するのに有用である（下記参照）。
【００１６】
「基線グルコース値ではなく刺激グルコース濃度でのインスリン放出の増加」とは、血中グルコース濃度が基線レベルにあるときではなく、血中グルコース濃度が刺激レベルまで上昇するときに本発明のトランスジェニック動物が野生型動物よりも多量のインスリンを分泌することを意味する。「血液からのより効率的なグルコース除去」とは経口又は腹腔内耐糖能試験に応答して本発明のトランスジェニック動物が野生型動物よりも高い効率で血流からグルコースを除去することを意味する。
【００１７】
本明細書で使用する「トランスジェニック動物」なる用語はその細胞の一部に染色体外エレメントとして存在するか又はその生殖細胞系ＤＮＡに（即ちその細胞の大部分又は全部のゲノム配列に）安定に組込まれた非内性（即ち異種）核酸配列を有する非ヒト動物（例えば単細胞生物（例えば酵母）、哺乳動物、又は非哺乳動物（例えば線虫又はショウジョウバエ））と、このような動物の子孫を意味する。１好適態様では、トランスジェニック動物は哺乳動物であり、異種核酸配列は安定に組込まれている。より好適な１態様では、トランスジェニック動物は齧歯動物である。「齧歯動物」なる用語はその全後続世代の全子孫を含めて系統分類の齧歯目Ｒｏｄｅｎｔｉａ（ラット及びマウスを含む）の全メンバーを意味する。
【００１８】
最も好適な１態様において、トランスジェニック動物はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子にヘテロ接合性又はホモ接合性破壊を有するトランスジェニックマウスである。好適な１態様において、トランスジェニックマウスはＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子にホモ接合性破壊を有する。最も好適な１態様において、本発明のトランスジェニックマウスは内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子のヌル突然変異をもたらすホモ接合性破壊を有する。
【００１９】
本発明のこの側面で使用する「Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子」及び「Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質」はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３ノックアウトが所望される任意の非ヒト動物に由来することができる。１好適態様において、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子はマウス又はラットに由来する。最も好適な１態様において、「ノックアウト」の標的はマウスＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子（［配列番号１］，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２０３７２）である。別の最も好適な態様において、「ノックアウト」の標的はラットＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子（［配列番号３］，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ８８７５１）である。
【００２０】
本明細書で使用するＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子の「ノックアウト」とは動物の単一細胞、選択細胞又は全細胞の内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子によりコードされるポリペプチドの少なくとも一部の発現の部分的又は完全な低下を意味する。本発明の「ノックアウト」トランスジェニックは、内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子の一方の対立遺伝子が破壊された「ヘテロ接合性ノックアウト」を有するトランスジェニック動物でもよいし、内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子の両方の対立遺伝子が破壊されたホモ接合性ノックアウトでもよい。「ノックアウト」は例えば標的遺伝子破壊を促進する物質に動物を暴したり、標的遺伝子部位（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系のＣｒｅ）の組換えを促進する酵素を導入したり、出生後に標的遺伝子変異を破壊する他の任意の方法により、標的遺伝子の変異を生じることができる条件付きノックアウトも含む。
【００２１】
「子孫」なる用語はトランスジェニック動物がノックアウト構築物に関してヘテロ接合性であるかホモ接合性であるかを問わずに、トランスジェニック動物から派生するか又はこれに由来する全て又は任意の後続世代を意味する。この用語には任意連続世代の子孫が含まれ、ノックアウト構築物を含む子孫、Ｆ１、Ｆ２、及びＦ３世代等が無制限にこの定義に含まれる。
【００２２】
別の側面では、本発明は本発明のトランスジェニック動物から単離されたものである単離膵島及び膵臓β細胞を提供する。このような単離膵臓β細胞はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子に破壊を有するので、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子が通常活性な特定細胞型内でＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子ノックアウトのモデルとして有用である。
【００２３】
膵島及びβ細胞の単離方法は当分野で公知である。例えば、米国特許第６，３６１，９９５号及びＲｏｓａｔｉら，２０００，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １４：２６０１−１０参照。
【００２４】
別の側面において、本発明は内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子に相同であるＤＮＡ配列を両側にもつ選択マーカー配列を含むＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子ノックアウト構築物を含む単離された核酸配列を提供する。１好適態様において、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子はマウス又はラットに由来する。最も好ましい１態様において、「ノックアウト」の標的はマウスＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子（［配列番号１］，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ２０３７２）である。別の最も好ましい１態様において、「ノックアウト」の標的はラットＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子（［配列番号３］，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ８８７５１）である。
【００２５】
「ノックアウト構築物」なる用語は動物の１個以上の細胞中で内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を低下ないし抑制するように設計されたヌクレオチド配列を意味する。ノックアウト構築物として使用されるヌクレオチド配列は（１）抑制すべき内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子の所定部分に由来するＤＮＡ（１個以上のエキソン配列、イントロン配列、及び／又はプロモーター配列）と、（２）細胞中でノックアウト構築物の存在を検出するために使用される選択マーカー配列から構成される。ノックアウトすべき内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子を含む細胞にノックアウト構築物を挿入する。その後、ノックアウト構築物は内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子以内に組込むことができ、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子ノックアウト構築物のこのような組込みは全長内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子の転写を防止又は妨害することができる。細胞内染色体ＤＮＡへのＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子ノックアウト構築物の組込みは一般に相同組換えにより実施される（即ち、内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子のＤＮＡ配列に相同又は相補的であるＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子ノックアウト構築物の領域はノックアウト構築物を細胞に挿入すると相互にハイブリダイズすることができ、これらの領域はその後、ノックアウト構築物が内性ＤＮＡの対応位置に組込まれるように組換えることができる）。
【００２６】
一般に、ノックアウト構築物は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）と呼ばれる未分化細胞に挿入される。ＥＳ細胞は通常、後述するように、導入することができる発生中の胚と同一種の胚又は胚盤胞に由来する。より好ましい態様では、ノックアウト構築物は齧歯動物ＥＳ細胞株、最も好ましくはマウスＥＳ細胞株（例えばマウスのＲ１  ＥＳ細胞）に配置する。
【００２７】
例えば、ヌクレオチド配列ノックアウト構築物は破壊すべきＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子を含む単離ヌクレオチド配列の一部に抗生物質耐性遺伝子を含むヌクレオチド配列を挿入することにより作製することができる。次にこのノックアウト構築物をＥＳ細胞に挿入すると、構築物は少なくとも一方のＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３対立遺伝子のゲノムＤＮＡに組込むことができる。こうして、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子の内性コーディング領域の少なくとも一部が抗生物質耐性遺伝子により破壊されてしまったので、細胞の多数の子孫は少なくとも幾つかの細胞でＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質を発現しなくなるか、又は低レベル及び／又は切断形で発現することになる。
【００２８】
「選択マーカー配列」なる用語はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子ノックアウト構築物をその染色体ＤＮＡに組込んだ細胞を表すために使用する。選択マーカー配列はこの目的に適した任意配列とすることができるが、一般には細胞に検出可能な形質を付与する蛋白質をコードする配列（例えば抗生物質耐性遺伝子、細胞に天然には存在しないアッセイ可能な酵素、又は蛍光シグナル（例えばグリーン蛍光蛋白質））である。マーカー配列は一般にその発現を制御する相同又は異種プロモーターも含む。
【００２９】
１側面では、本発明はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子に破壊を有するトランスジェニック動物の作製方法であって、胚性幹細胞を上記のような本発明のノックアウト構築物で形質転換することにより、形質転換された胚性幹細胞を生産する段階と；形質転換胚性幹細胞を胚盤胞に注入する段階と；形質転換胚性幹細胞を含む胚盤胞を擬似妊娠雌性動物に移植する段階と；胚盤胞を満期まで成長させる段階と；内性Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子のヘテロ接合性又はホモ接合性破壊をゲノムに含むトランスジェニック動物を同定する段階を含む方法を提供する。１好適態様において、動物はマウスである。最も好ましい１態様において、胚盤胞はマウスＣ５７ＢＬ／６胚盤胞である。
【００３０】
別の側面において、本発明はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３をコードする配列に作動可能に連絡した核酸制御配列を含む組換え発現ベクターをトランスフェクトされており、機能的β３サブユニットを含むＬ型Ｃａ２＋チャネルをもたない組換え宿主細胞と、前記組換え宿主細胞の使用方法を提供する。１好適態様において、このような宿主細胞は筋細胞、神経細胞、又は神経内分泌細胞に由来する。最も好ましい１態様において、本発明の宿主細胞はＩｎｓＰ３により誘導されるＣａ２＋放出を伴う。本発明のこの側面の組換え宿主細胞はβ３サブユニットを含まない機能的Ｌ型Ｃａ２＋チャネルを含むことができる。このような細胞が機能的β３サブユニットを含むＬ型Ｃａ２＋チャネルをもたないことを確認するにはパッチクランプ電気生理学的記録の測定等の当業者に公知の技術により実施することができる。
【００３１】
このような宿主細胞は例えばＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の発現又は活性を阻害する化合物を同定するための薬剤スクリーニングアッセイで有用である。
【００３２】
本明細書で使用する「Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３をコードする配列」とは任意動物、好ましくはラット、マウス、又はヒト、最も好ましくはヒトに由来するＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質をコードする核酸配列を意味する。別の好ましい態様では、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３をコードする配列はマウスＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質をコードする核酸配列（［配列番号２］，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３１６０７）、ラットＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質をコードする核酸配列（［配列番号４］，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６９６０）、及びヒトＬ型Ｃ２＋チャネルβ３蛋白質をコードする核酸配列（［配列番号６］，ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００７１６）から構成される群から選択される。
【００３３】
このような核酸配列はＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、２本鎖ＤＮＡ配列が好ましい。このような２本鎖核酸配列はゲノムＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３核酸配列でもよい（従って、イントロンを含むものでもよい）し、イントロン配列をもたないｃＤＮＡ配列でもよい。
【００３４】
「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」なる用語は本明細書では互換的に使用する。このような用語は特定対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味すると理解すべきである。突然変異又は環境的影響により後続世代に改変がある場合もあるので、このような子孫は実際に親細胞と一致しない場合もあるが、本明細書で使用する用語の範囲に尚含むものとする。
【００３５】
宿主細胞は組換え発現ベクターで一過性にトランスフェクトしてもよいし、安定的にトランスフェクトしてもよい。発現ベクターを真核細胞にこのようにトランスフェクトするには当分野で公知の任意技術を使用して実施することができ、限定されるものではないが、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、又はリポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、ポリカチオン、もしくはウイルスによるトランスフェクションが挙げられる。あるいは、宿主細胞に組換えウイルス発現ベクターを感染させてもよい（例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）参照）。宿主細胞は樹立細胞株でもよいし、初代細胞培養物でもよい。
【００３６】
１好適態様では、プロモーターは異種のもの（即ち、非天然Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３遺伝子プロモーター）である。プロモーターがＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３核酸配列の発現を駆動できるとき、プロモーターとＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３をコードする核酸配列は「作動可能に連絡」されている。本明細書で使用する「ベクター」なる用語は、連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。ベクターの１種は付加的ＤＮＡセグメントをクローニングすることができる環状２本鎖ＤＮＡを意味する「プラスミド」である。別種のベクターは付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにクローニングすることができるウイルスベクターである。特定のベクターは導入された宿主細胞中で自律複製することができる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターやエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに組込まれることにより、宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターはベクターが作動可能に連絡されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターを本明細書では「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と言う。
【００３７】
ベクターは更に付加的核酸配列をサブクローニングするためのポリリンカーや転写産物の適正なポリアデニル化を行うためのポリアデニル化シグナル等の追加的配列を含むことができる。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の実施の成功に重要であるとは考えられず、任意のそのような配列を使用することができ、限定されないが、ＳＶ４０やウシ成長ホルモンポリＡ部位が挙げられる。ベクターは更にメッセージレベルを強化すると共に構築物から他の配列への読取りを最小限にするように機能することができる終結配列を含むことができる。最後に、発現ベクターはこれらのベクターを有する細胞の選択を可能にする選択マーカーを、多くの場合には抗生物質耐性遺伝子の形態で含むことができる。
【００３８】
上述のように、ＡＴＰは細胞内貯蔵部からのカルシウム放出を刺激する。本発明者らはＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質がＡＴＰ刺激による細胞内貯蔵部からのカルシウム放出を阻害するように機能することを発見した。この阻害活性は細胞における機能的電圧ゲート型チャネルの存在に依存しない。従って、上記に開示した本発明の組換え細胞において、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の発現はＡＴＰ刺激による細胞内貯蔵部からのカルシウム放出を阻害するように機能する。Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤を本発明の組換え細胞に投与すると、ＡＴＰ刺激による細胞内貯蔵部からのカルシウム放出を回復するように機能する。
【００３９】
従って、１側面において本発明はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤の同定方法であって、本発明の組換え宿主細胞を提供する段階と；カルシウムの存在下で検出可能なシグナルを発生する検出可能なカルシウム指示薬に宿主細胞を接触させる段階と；宿主細胞をカルシウム指示薬と接触させる前、それと同時又はその後に１種以上のスクリーニングしようとする試験化合物で宿主細胞を処理する段階と；対照細胞の細胞内カルシウム濃度を増加させるために有効な量のＡＴＰで組換え宿主細胞を刺激する段階と；宿主細胞におけるカルシウム指示薬からのシグナルを検出し、シグナルを対照細胞から検出されたシグナルと比較する段階を含む方法を提供し、ここで前記シグナルを使用して宿主細胞と１種以上の試験化合物との接触により宿主細胞におけるＡＴＰ刺激によるシグナルの回復を検出し、試験化合物に応答したそのような回復は、試験化合物がＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤であることを示す。このような回復はＡＴＰ刺激によるシグナルの部分的回復でもよいし、対照細胞に認められるレベルまでの完全回復でもよい。
【００４０】
本明細書で使用するＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの「阻害剤」としてはＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３ＤＮＡからＲＮＡへの転写を阻害する化合物、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３ＲＮＡから蛋白質への翻訳を阻害する化合物、及びＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の機能を阻害する化合物が挙げられる。このような阻害は完全阻害でもよいし、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの発現及び／又は活性が低下して細胞内カルシウム貯蔵部からのカルシウム放出阻害能を低下するような部分阻害でもよい。
【００４１】
１好適態様では、細胞は哺乳動物細胞である。最も好ましい１態様では、細胞は齧歯動物及びヒト細胞から構成される群から選択される。
【００４２】
「１種以上の試験化合物」は任意性質のものとすることができ、限定されないが、化学及び生物学的化合物と環境試料が挙げられる。１種以上の試験化合物は更に複数の化合物を含むことができ、限定されないが、組合せ化学ライブラリーや天然化合物ライブラリーが挙げられる。宿主細胞と１種以上の試験化合物との接触はアッセイデザインの詳細に応じて宿主細胞を検出可能なカルシウム指示薬と接触させる前、後、及び／又は同時のいずれに行ってもよい。例えば、動的スクリーニングを実施するためには、多重時点で宿主細胞からのシグナルを検出する必要があり、使用者は細胞を試験化合物と接触させる前、それと同時、及びその後に検出可能なシグナルを獲得することができる。
【００４３】
本明細書で使用する「検出可能なカルシウム指示薬」なる用語はカルシウムと細胞内相互作用すると検出可能で測定可能なシグナルを発生する１又は複数の任意分子を意味する。指示薬とその使用は当分野で公知であり、限定されないが、カルシウム感受性生物発光蛋白質、蛍光蛋白質、及び合成プローブ（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販されているような蛍光カルシウム色素）が挙げられる。１好適態様では、カルシウム指示薬は蛍光カルシウム指示薬である。
【００４４】
本明細書で使用する所与細胞型に関する細胞内カルシウムシグナリングを増加するための刺激量のＡＴＰは当業者が常法により決定することができる。殆どのこのような用途では、０．２μＭ〜５００μＭ  ＡＴＰが有効であり、最も好ましいＡＴＰの量は１μＭ〜１００μＭである。
【００４５】
１種以上の試験化合物がＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３発現及び／又は活性を阻害する能力に関する最適情報を得るためには、組換え宿主細胞における検出可能なカルシウム指示薬からのシグナルを対照細胞からのシグナルと比較することが好ましい。このような対照細胞としては以下の１種以上が挙げられる：
１．１種以上の試験化合物と接触させない以外は同一方法で処理した同一組換え宿主細胞；
２．１種以上の試験化合物と種々の時点で接触させる以外は同一方法で処理した同一組換え宿主細胞（時間依存効果の分析用）；
３．種々の濃度の１種以上の試験化合物と接触させる以外は同一方法で処理した同一組換え宿主細胞（濃度依存効果の分析用）；
４．１種以上の試験化合物と接触させた組換え宿主細胞と同一型の非組換え細胞；及び
５．１種以上の試験化合物と接触させない組換え宿主細胞と同一型の非組換え細胞。
【００４６】
本発明の１好適態様では、対照細胞はＩｎｓＰ３により誘導されるＣａ２＋放出がＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の発現により低下又は阻害し、このようなＩｎｓＰ３により誘導されるＣａ２＋放出はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤により回復することができる。
【００４７】
１好適態様では、９６ウェル以上のマイクロプレートに細胞をプレートし、高スループットで方法を実施する。潜在的主要化合物を同定した後に、上記に開示した本発明のトランスジェニック動物又は単離膵島β細胞に及ぼす潜在的主要化合物の効果を試験するなどの種々の確認アッセイを実施することができる。化合物がＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの阻害剤として作用しているならば、トランスジェニック動物及び／又は膵島β細胞に及ぼす効果は少ないか又は無効であるので、主要化合物の細胞標的がＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットであることが確認される。
【００４８】
本発明のこの側面の種々の好適態様では、糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及びグルコース恒常性障害から構成される群から選択される１種以上の疾患の治療用化合物を同定するために本明細書に記載するスクリーニング方法を使用する。
【００４９】
更に別の側面では、本発明は上記方法により同定されたＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニット阻害剤を提供する。
【００５０】
別の側面では、本発明は被験体に効用を提供するようにＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの１種以上の阻害剤を被験体に投与することを含む、糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン分泌障害、及びグルコース恒常性障害から構成される群から選択される１種以上の疾患を有する被験体の治療方法を提供する。
【００５１】
本明細書で使用する「被験体」ないし「患者」なる用語は治療が所望される任意対象を意味し、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、昆虫、ウマ、ニワトリ等が挙げられる。被験体はヒトが最も好ましい。
【００５２】
本明細書で使用する「糖尿病」は膵臓によるインスリン産生不足又は無産生により高血糖値を生じることを特徴とする。１好適態様では、糖尿病はＩＩ型糖尿病である。このような患者には、「効用」としてはインスリン産生増加及び血糖値低下の１種以上が挙げられる。
【００５３】
本明細書で使用する「インスリン分泌障害」とは正常血糖値を維持するために十分なインスリンを分泌できないことを意味する。このような患者には、「効用」としてはインスリン産生増加及び血糖値低下又は正常化の１種が以上が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用する「インスリン抵抗性」とはグルコース取込みの刺激及び／又は肝グルコース産生の抑制におけるインスリン効力の低下を意味する。このような患者には、「効用」としては血糖値低下又は正常化が挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用する「グルコース恒常性障害」とは正常血中グルコース濃度を維持できないことを意味する。このような患者には、「効用」としてはインスリン産生増加、血糖値低下及び血糖値の経時的正常化の１種以上が挙げられる。
【００５６】
１態様では、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの阻害剤は上記のような本発明の方法により同定される。
【００５７】
本発明のこの側面の別の態様では、１種以上のＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニット阻害剤はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに選択的な抗体；Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド；及びＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに対する小干渉性ＲＮＡから構成される群から選択される。
【００５８】
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに選択的な抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、キメラ、１本鎖及びヒト化抗体とＦａｂフラグメント、又はＦａｂ発現ライブラリーの産物が挙げられる。１好適態様では、抗体は配列番号２、配列番号４、及び／又は配列番号６に開示するようなＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに選択的である。抗体はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットと実質的に相同でない他の蛋白質とも結合する場合でも、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットと選択的に結合すると考えられる。このような抗体はＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）に記載されているような当分野の標準方法により作製することができる。Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの全長蛋白質又は抗原性ペプチドフラグメントを免疫原として使用して標準ポリクローナル及びモノクローナル抗体作製に関する標準的技術を使用して抗体を作製することができる。
【００５９】
１例では、初回免疫前に免疫前血清を採取する。免疫応答を誘発するために十分な量と間隔でＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットのアミノ酸配列のペプチド部分を適当なアジュバントと共に動物に注入する。動物から定間隔、好ましくは週に一度採血して抗体力価を測定する。初回免疫後に動物にブースター注射を行ってもよいし、行わなくてもよい。各ブースター免疫から約７日後又は単一ブースター免疫後にほぼ週１回動物から採血し、血清を採取し、アリコートを約−２０℃で保存する。次に、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットを含まない同一発現系から作製した非抗原関連蛋白質を結合したカラムに動物から採取した血清を通すことにより、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに対するポリクローナル抗体を直接精製することができる。
【００６０】
モノクローナル抗体は動物から脾細胞を得ることにより作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５）参照）。１例では、目的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は近交系マウスにＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニット又はその部分を免疫することにより作製される。免疫応答を誘発するために十分な量と間隔でＩＰ又はＳＣ経路でマウスに免疫する。マウスに０日に初回免疫し、約３〜約３０週間安静にする。免疫したマウスに静脈内（ＩＶ）経路により１回以上ブースター免疫する。免疫したマウスから当分野で公知の標準技術により脾臓を摘出することにより抗体陽性マウスからのリンパ球を取得する。安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下で脾臓リンパ球を適当な融合パートナーと混合することによりハイブリドーマ細胞を生産する。抗体産生細胞と融合パートナー細胞を約３０％〜約５０％の濃度のポリエチレングリコール中で融合する。融合したハイブリドーマ細胞を当分野で公知の手順によりヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリン補足ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させて選択する。上清液を増殖陽性ウェルから採取し、固相イムノラジオアッセイ等のイムノアッセイにより抗体産生をスクリーニングする。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞をＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３の軟寒天法等の技術によりクローニングする。
【００６１】
このような抗体応答を生じるためには、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニット又はその抗原部分を一般に医薬的に許容可能な非経口投与用キャリヤーと処方する。このような許容可能なアジュバントとしては限定されないが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍとｔＲＮＡを加えたフロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿、油中水エマルションが挙げられる。ポリペプチドの濃度とビヒクル及び他の成分の選択を含めたこのような組成物の処方は当業者が容易に実施できる。
【００６２】
慣用技術により抗体を断片化し、完全抗体について上述したと同様にフラグメントの活用性をスクリーニングすることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを処理し、ジスルフィド結合を還元してＦａｂ’フラグメントを生産することができる。
【００６３】
別の好適態様では、本発明の方法で使用するＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニット阻害剤はオリゴマー化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドである。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドはＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットをコードする核酸分子の発現及び／又は機能を阻害し、こうして最終的にＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの産生量を抑制するために使用される。これはＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットをコードする１種以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することにより実施される。このような核酸としてはＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡとｍＲＮＡを含む）、及びこのようなＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡが挙げられる。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的ハイブリダイゼーションは核酸の正常機能を妨げる。標的核酸と特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調節を一般に「アンチセンス」と言う。妨害されるＤＮＡの機能としては複製と転写が挙げられる。妨害されるＲＮＡの機能としては全生命機能が挙げられ、例えば蛋白質翻訳部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからの蛋白質の翻訳、１種以上のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング、及びＲＮＡに関与するか又はＲＮＡにより助長され得る触媒活性が挙げられる。標的核酸機能のこのような妨害の総合効果はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの発現の阻害である。
【００６４】
標的はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットをコードする核酸分子であり、例えば配列番号２、４、及び／又は６の蛋白質をコードする核酸分子である。１好適態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号１、３、及び５から構成される群から選択される核酸又はその部分を標的とする。最も好ましい１態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒトＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニット遺伝子［配列番号５］（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ２７５８４）又はその部分を標的とする。
【００６５】
標的遺伝子における好適遺伝子間部位としては、翻訳開始コドン、終結コドン、コーディング領域、イントロン−エキソン接合部、及び非翻訳領域（５’及び３’の両者）を含む部位が挙げられる。
【００６６】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基間の水素結合を意味し、ワトソン−クリック型、フーグスティーン型又は逆フーグスティーン型のいずれでもよい。オリゴヌクレオチド及びＤＮＡ又はＲＮＡは各分子の十分な数の対応位置が相互に水素結合することができるヌクレオチドにより占有されている場合に相互に相補的である。当分野で認識されている通り、アンチセンス化合物の配列は特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。アンチセンス化合物が特異的にハイブリダイズ可能であるのは化合物と標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子との結合が標的ＤＮＡ又はＲＮＡの正常機能を妨害して活用性を低下させ、特異的結合が所望される条件下、即ちｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ又は治療処置の場合には生理的条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイを実施する条件下で、アンチセンスの化合物の非標的配列への非特異的結合を避けるために十分な相補度がある場合である。
【００６７】
本発明の関連で「オリゴヌクレオチド」なる用語はリボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はその模倣物のオリゴマー又はポリマーを意味する。この用語は天然ヌクレオ塩基、糖及び共有ヌクレオシド間（鎖状構造）結合から構成されるオリゴヌクレオチドと、同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは例えば細胞取込みの強化、核酸標的に対する親和性の強化及びヌクレアーゼの存在下の安定性の増加等の望ましい特性により天然形よりも好ましい場合が多い。
【００６８】
本発明のアンチセンス化合物は約８〜約５０ヌクレオシド又はヌクレオチドを含むことが好ましい。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、約１２〜約３０ヌクレオチド又はヌクレオシドを含むものがより好ましい。アンチセンス化合物としてはリボザイム、外部案内配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド（オリゴザイム）、及び標的核酸とハイブリダイズしてその発現を調節する他の短い触媒性ＲＮＡ又は触媒性オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好適形態であるが、本発明は他のオリゴマーアンチセンス化合物も含み、限定されないが、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣物が挙げられる。本発明で有用な好適アンチセンス化合物の具体例としては修飾鎖状構造又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書の定義によると、修飾鎖状構造を有するオリゴヌクレオチドとしては限定されないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェートが挙げられる。上記リン含有結合の作製を教示する代表的な米国特許としては限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；４，４６９，８６３号；４，４７６，３０１号；５，０２３，２４３号；５，１７７，１９６号；５，１８８，８９７号；５，２６４，４２３号；５，２７６，０１９号；５，２７８，３０２号；５，２８６，７１７号；５，３２１，１３１号；５，３９９，６７６号；５，４０５，９３９号；５，４５３，４９６号；５，４５５，２３３号；５，４６６，６７７号；５，４７６，９２５号；５，５１９，１２６号；５，５３６，８２１号；５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号；５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；５，５８７，３６１号；５，１９４，５９９号；５，５６５，５５５号；５，５２７，８９９号；５，７２１，２１８号；５，６７２，６９７号及び５，６２５，０５０号が挙げられる。
【００７０】
他の修飾オリゴヌクレオチド鎖状構造としては短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ接合性原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１個以上の短鎖ヘテロ接合性原子もしくは複素環状ヌクレオシド間結合が挙げられる。上記オリゴヌクレオチドの作製を教示する代表的な米国特許としては限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；５，１６６，３１５号；５，１８５，４４４号；５，２１４，１３４号；５，２１６，１４１号；５，２３５，０３３号；５，２６４，５６２号；５，２６４，５６４号；５，４０５，９３８号；５，４３４，２５７号；５，４６６，６７７号；５，４７０，９６７号；５，４８９，６７７号；５，５４１，３０７号；５，５６１，２２５号；５，５９６，０８６号；５，６０２，２４０号；５，６１０，２８９号；５，６０２，２４０号；５，６０８，０４６号；５，６１０，２８９号；５，６１８，７０４号；５，６２３，０７０号；５，６６３，３１２号；５，６３３，３６０号；５，６７７，４３７号；５，７９２，６０８号；５，６４６，２６９号及び５，６７７，４３９号が挙げられる。
【００７１】
使用可能なオリゴヌクレオチド模倣物の１例はペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖鎖状構造がアミド含有鎖状構造、特にアミノエチルグリシン鎖状構造で置換されている。上記ＰＮＡ化合物の作製を教示する代表的な米国特許としては限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；５，７１４，３３１号；及び５，７１９，２６２号が挙げられる。ＰＮＡ化合物の他の教示はＮｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００にも記載されている。
【００７２】
オリゴヌクレオチドは更に塩基修飾又は置換を含むことができ、限定されないが、５置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンが挙げられる。このような修飾塩基の作製を教示する代表的な米国特許としては限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；４，８４５，２０５号；５，１３０，３０２号；５，１３４，０６６号；５，１７５，２７３号；５，３６７，０６６号；５，４３２，２７２号；５，４５７，１８７号；５，４５９，２５５号；５，４８４，９０８号；５，５０２，１７７号；５，５２５，７１１号；５，５５２，５４０号；５，５８７，４６９号；５，５９４，１２１号，５，５９６，０９１号；５，６１４，６１７号；５，６４５，９８５号；５，８３０，６５３号；５，７６３，５８８号；６，００５，０９６号；及び５，６８１，９４１号が挙げられる。
【００７３】
本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドの他の修飾としてはオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取込みを強化する１個以上の部分又は複合体のオリゴヌクレオチドへの化学的結合が挙げられ、限定されないが、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を強化する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を強化する基が挙げられる。このようなオリゴヌクレオチド複合体の作製を教示する代表的な米国特許としては限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号；４，９４８，８８２号；５，２１８，１０５号；５，５２５，４６５号；５，５４１，３１３号；５，５４５，７３０号；５，５５２，５３８号；５，５７８，７１７，５，５８０，７３１号；５，５８０，７３１号；５，５９１，５８４号；５，１０９，１２４号；５，１１８，８０２号；５，１３８，０４５号；５，４１４，０７７号；５，４８６，６０３号；５，５１２，４３９号；５，５７８，７１８号；５，６０８，０４６号；４，５８７，０４４号；４，６０５，７３５号；４，６６７，０２５号；４，７６２，７７９号；４，７８９，７３７号；４，８２４，９４１号；４，８３５，２６３号；４，８７６，３３５号；４，９０４，５８２号；４，９５８，０１３号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，０８２，８３０号；５，１１２，９６３号；５，２１４，１３６号；５，２４５，０２２号；５，２５４，４６９号；５，２５８，５０６号；５，２６２，５３６号；５，２７２，２５０号；５，２９２，８７３号；５，３１７，０９８号；５，３７１，２４１号，５，３９１，７２３号；５，４１６，２０３号，５，４５１，４６３号；５，５１０，４７５号；５，５１２，６６７号；５，５１４，７８５号；５，５６５，５５２号；５，５６７，８１０号；５，５７４，１４２号；５，５８５，４８１号；５，５８７，３７１号；５，５９５，７２６号；５，５９７，６９６号；５，５９９，９２３号；５，５９９，９２８号及び５，６８８，９４１号が挙げられる。
【００７４】
オリゴヌクレオチドがこのような修飾を含む場合には、所与オリゴヌクレオチドの全位置が均質に修飾されている必要はなく、実際に上記修飾の２種以上を単一オリゴヌクレオチドに組込んでもよいし、オリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシド又はヌクレオチドに組込んでもよい。
【００７５】
本発明により使用されるアンチセンス化合物は周知固相合成の技術により常法で作製することができる。このような合成用装置は数件のメーカーから販売されており、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。このような合成に用いられる当分野で公知の他の手段を追加又は代替使用してもよい。ホスホロチオエートやアルキル化誘導体等のオリゴヌクレオチドを作製するための同様の技術を使用することは周知である。本発明の化合物は取込み、分布及び／又は吸収を補助するために他の分子、分子構造又は化合物の混合物と混合、カプセル封入、共役又は他の方法で結合してもよく、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所又は他の製剤が挙げられる。このような取込み、分布及び／又は吸収補助製剤の製造を教示する代表的米国特許としては限定されないが、米国特許第５，１０８，９２１号：５，３５４，８４４号：５，４１６，０１６号：５，４５９，１２７号：５，５２１，２９１号：５，５４３，１５８号：５，５４７，９３２号：５，５８３，０２０号：５，５９１，７２１号：４，４２６，３３０号：４，５３４，８９９号：５，０１３，５５６号：５，１０８，９２１号：５，２１３，８０４号：５，２２７，１７０号：５，２６４，２２１号：５，３５６，６３３号：５，３９５，６１９号：５，４１６，０１６号：５，４１７，９７８号：５，４６２，８５４号：５，４６９，８５４号：５，５１２，２９５号：５，５２７，５２８号：５，５３４，２５９号：５，５４３，１５２号：５，５５６，９４８号：５，５８０，５７５号：及び５，５９５，７５６号が挙げられる。
【００７６】
別の態様では、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３蛋白質の阻害剤はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３核酸に対する小妨害性ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）配列である。２本鎖（ｄｓＲＮＡ）はＲＮＡ妨害（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを介してｍＲＮＡの配列特異的分解を指示する（米国出願第２００２００８６３５６号）。Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３発現を阻害するためにはＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３から誘導される２１〜２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡフラグメントを使用することが好ましいが、これ以上又はこれ以下の長さのｄｓＲＮＡ配列も使用できる。１好適態様では、ｄｓＲＮＡフラグメントは配列番号１、配列番号３、及び配列番号５から構成される群から選択される配列又はそのフラグメントに指向性である。分子は平滑末端でもよいし、１〜６ヌクレオチドの突出末端（例えば５’，３’）を含んでもよい。このようなｓｉＲＮＡ配列は化学合成又は組換え生産等の標準技術を使用して作製することができる。
【００７７】
本発明の治療方法の投薬は治療する疾患状態の重度と応答に依存し、治療期間は数日間から数カ月であり、あるいは治癒が得られるまで又は疾患状態もしくはその症状が緩和されるまでとする。最適投薬計画は患者の体内の薬剤蓄積の測定から計算することができる。当業者は最適用量、投薬法及び反復頻度を容易に決定することができる。最適用量は個々の阻害剤の相対力価によって変動し、一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルで有効であると判定されたＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に用量は０．０１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、１日、毎週１回以上、又は他の方法で投与することができる。当業者は体液又は体組織中の薬剤の滞留時間と濃度の測定に基づいて投薬反復頻度を容易に推定することができる。治療の成功後、疾病状態の再発を予防するために患者に維持療法を行い、上記と同様の維持用量の阻害剤を投与することが望ましいと思われる。
【００７８】
別の側面では、本発明はＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの１種以上の阻害剤と医薬的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物にも関する。１好適態様では、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットの１種以上の阻害剤は上記のようにＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに選択的な抗体；Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド；及びＬ型Ｃａ２＋チャネルβ３サブユニットに対する小干渉性ＲＮＡから構成される群から選択される。他の態様では、阻害剤は本発明の薬剤発見法により同定された阻害剤である。
【００７９】
阻害剤に滅菌等の慣用的な製薬処理を施してもよいし、及び／又は防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液等の慣用的なアジュバントを加えてもよい。別の好適態様では、阻害剤は本発明の方法により同定される。
【００８０】
投与のために、阻害剤を指定投与経路に適した１種以上のアジュバントと常法により混合する。阻害剤はラクトース、スクロース、澱粉粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム及びカルシウム塩、アラビアガム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及び／又はポリビニルアルコールと混合し、慣用的投与用に錠剤化又はカプセル封入することができる。あるいは、阻害剤を食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、落花生油、綿実油、ゴマ油、トラガカントガム、及び／又は種々の緩衝液に溶かしてもよい。他のアジュバント及び投与方法も製薬分野で周知である。キャリヤー又は希釈剤としてはモノステアリン酸グリセリルやジステアリン酸グリセリル単独又は蝋との併用等の時間遅延材料や、当分野で周知の他の材料が挙げられる。阻害剤は固体形態（顆粒剤、散剤又は座剤を含む）で処方してもよいし、液体形態（例えば溶液、懸濁液、又はエマルション）で処方してもよい。本発明により使用するのに適した溶液は無菌であり、十分な量のポリペプチドを溶かし、提案用途に無害である。
【００８１】
本発明は以下の実施例により更によく理解することができる。以下の実施例は本発明の所定の好適態様を更に例証することを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００８２】
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３ノックアウトマウスの作製
そのエキソン３の一部と完全エキソン４をネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）で置換することによりβ３遺伝子（Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍ．ら，１９９６  Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：１３８−１４３  １９９６）をノックアウトした（β３−／−）。ｐＭＣ１  ｎｅｏＰｏｌｙＡベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から出発し、マウスβ３遺伝子のエキソン３の一部とエキソン４と後続イントロンの一部を含む１ｋｂ  ＨｉｎｃＩＩ（Ｈ）フラグメントをネオマイシン耐性カセット（ｎｅｏｒ）で置換することによりターゲティングベクターＩＩＭＢを作製した（図１参照）。
【００８３】
β３−／−マウスを作製するために、直鎖化したターゲティング構築物をＲ１胚性幹（ＥＳ）細胞（Ｎａｇｙ，Ａ．ら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８４２４−８４２８）にエレクトロポレーションし、組換えクローンをＧ４１８とガンシクロビルで選択した。ターゲティングベクターＩＩＭＢの予想ゲノム構造を有する４７０個のＥＳ細胞クローンから３個を同定し、選択した。選択したＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６胚盤胞にマイクロインジェクションし、擬似妊娠レシピエント雌の子宮に移植した。３個の相同組換えクローンのうちの２個をＣ５７ＢＬ／６マウス胚盤胞に注入した。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌と交配した。
【００８４】
仔のβ３突然変異をサザンブロット分析によりタイピングした。ＥＳ細胞又はマウス尾からのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレンに移した。３２Ｐ標識プローブ（〜５００ｂｐ  ＳｍａＩ／ＡｐａＩフラグメント）とハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後にブロットを洗浄し、Ｘ線フィルムに露光した。プライマー対５’−ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＣＡＴ  ＴＴＧ−３’（ネズミβ３遺伝子のエキソン２及び３のヌクレオチド１６７〜１８７に相当）［配列番号７］及び５’−ＴＣＧ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＣＡＧ−３’（ネズミβ３遺伝子のエキソン５のヌクレオチド４３０〜４５０に相当）［配列番号８］とマウス尾ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して迅速マウス仔ゲノタイピングのためにポリメラーゼ連鎖反応によるアッセイを実施した。
【００８５】
夫々１２ｋｂ及び８ｋｂ  ＥｃｏＲＩフラグメントの存在により野生型と突然変異体の対立遺伝子が示された。脳抽出物のノーザンブロット分析とイムノブロッティングによりβ３遺伝子の欠失を確認した。ヘテロ接合性マウスの交配によりメンデル頻度から予測される頻度でβ３−／−マウスが産まれた（１１８＋／＋，２１２＋／−，９９−／−）。生存ホモ接合性マウスは正常に成長し、１年以上生存し、繁殖性であり、明白な症状がなかった。
【実施例２】
【００８６】
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３ノックアウトマウスの耐糖能
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３ノックアウトマウスで腹腔内及び経口耐糖能試験を実施した。．腹腔内耐糖能試験では、Ｄ−グルコース２ｇ／ｋｇ体重を腹腔内注射した。経口耐糖能試験では、マウスにグルコース１．２ｇ／ｋｇ体重を投与した。両方の耐糖能試験とも尾採血により血液試料を採取した。
【００８７】
空腹時血糖値に有意差はなかったが、β３−／−マウスは野生型マウスと比較して有効なグルコース除去を示したことから、より効率的なグルコース恒常性を示すことが判明した（図２参照）。
【実施例３】
【００８８】
単離β３サブユニット欠損性単離膵島におけるインスリン放出
コラゲナーゼ消化とＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，英国）に一晩維持することによりランゲルハンス島を単離した。ランゲルハンス島を無Ｃａ２＋培地で振盪することにより得られた単一細胞をプラスチック皿に播種した。インスリン放出を測定するために、ランゲルハンス島をクレブス−リンゲル重炭酸緩衝液（ＫＲＢＢ）で３０分間３７℃にてプレインキュベートした。ＫＲＢＢ０．３ｍｌと試験物質を加えた試験管にランゲルハンス島３個の各群を移して更に３０分間３７℃でインキュベートした。試料を氷冷することによりインキュベーションを終了した。インスリンを分析するまで試料を−２０℃で保存した。基線グルコース濃度（３．３ｍＭグルコース）ではインスリン分泌に差はなかったが、刺激濃度の糖（１６．７ｍＭグルコース）ではβ３−／−マウスからのランゲルハンス島は野生型マウスからのランゲルハンス島に比較して約２００％の有意に高いインスリン放出を示した。
【００８９】
β３サブユニットがエキソサイトーシス機構に直接影響するか否かを解明するために、電気浸透処理したランゲルハンス島からのインスリン放出を基線及び高Ｃａ２＋濃度で試験した。浸透処理したランゲルハンス島からのインスリン放出を測定するために、ランゲルハンス島を冷浸透緩衝液で洗浄した。次に、ランゲルハンス島をこの緩衝液中で３ｋＶ／ｃｍ電場６パルスにより電気浸透処理した。浸透処理したランゲルハンス島３個の各群を選択し、２ｍＭ  ＭｇＡＴＰ，２ｍＭクレアチンリン酸，１０Ｕ／ｍｌ  クレアチンホスホキナーゼ及び遊離Ｃａ２＋濃度３０ｎＭ又は１０μＭの改変浸透緩衝液０．３ｍｌを加えた試験管に移した。ランゲルハンス島を２０分間３７℃でインキュベートした。ラットインスリンを標準（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，デンマーク）として使用してラジオイムノアッセイによりインスリンを測定した。これらの条件下のいずれでもβ３−／−及び野生型マウスに由来するランゲルハンス島間にインスリン分泌の差は観察されなかった。
【００９０】
野生型及びβ３−／−マウスに由来する膵島にβ３サブユニットを欠失するＧＦＰ又はβ３−ＣＦＰをコードするアデノウイルスベクターをトランスフェクトした。形質導入から２４時間後に１６．７ｍＭグルコースに応答するインスリン分泌を測定した。β３をコードするアデノウイルス発現構築物をβ３サブユニット欠損ランゲルハンス島に逆形質導入すると、グルコースによるインスリン放出のパターンは野生型ランゲルハンス島で観察されるパターンに変化した。
【００９１】
従って、β３−／−マウスで観察されたより効率的なグルコース恒常性はインスリン放出の増加により説明される。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ蛍光の測定によると、野生型ランゲルハンス島とβ３−／−マウスに由来するランゲルハンス島のグルコース代謝に差はなかった。
【実施例４】
【００９２】
パッチクランプ測定
１１０ｍＭ  ＢａＣｌ２，１０ｍＭ  ＴＥＡ−Ｃｌ及び５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｂａ（ＯＨ）２（ｐＨ７．４）を加えたピペットを使用して野生型及びβ３サブユニットノックアウトマウスに由来するβ細胞で細胞付着単一チャネル記録を行った。電圧パルス（−７０〜０ｍＶ，２００ｍｓ，０．５Ｈｚ）による電流を１ｋＨｚでフィルターにかけ、５ｋＨｚでディジタル化し、記録した。全細胞パッチクランプ記録技術の穿孔パッチ変形を使用することにより野生型及びβ３サブユニットノックアウトマウスに由来するβ細胞で全細胞Ｃａ２＋電流を記録した。７６ｍＭ  Ｃｓ２ＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＮａＣｌ，及び５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３５）と、アンホテリシンＢ（０．２４ｍｇ／ｍｌ）を電極に充填した。１３８ｍＭ塩化コリン，１０ｍＭ塩化テトラエチルアンモニウム，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，５．６ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び３ｍＭグルコース（ｐＨ７．４）を含有する溶液に細胞を浸漬させた。電圧パルス（−７０ｍＶの保持電位から１０ｍＶずつ増加して−６０〜５０ｍＶの数種のクランプ電位まで，１００ｍｓ，０．５Ｈｚ）により誘導される全細胞電流を１ｋＨｚでフィルターにかけ、記録した。全記録はＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で室温（約２２℃）にて実施した。ソフトウェアプログラムｐＣＬＡＭＰ６（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してデータの獲得と分析を行った。
【００９３】
パッチクランプ技術の全細胞コンフィギレーションは次のように実施した。ホウ珪酸ガラスからピペットを引き、先端付近をＳｙｌｇａｒｄでコーティングし、火炎研磨した。１５０ｍＭ  Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン，１２５ｍＭ  ＨＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＥＧＴＡ，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び３ｍＭ  ＭｇＡＴＰを含有する溶液をピペット（２〜５ｍΩ）に充填した。ｐＨはＫＯＨで７．１５に調整した。浴緩衝液は１３８ｍＭ  ＮａＣｌ，５．６ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及びｐＨ７．４とした。ランゲルハンス島又は単離細胞にＫＲＢＢ中２μＭ  ｆｕｒａ  ２／ＡＭを３０分間ロードした。無Ｃａ２＋培地におけるＣＣｈ（カルバミルコリン）効果を測定するために、Ｃａ２＋を含まず、１００μＭ  ＥＧＴＡを加えたＫＲＢＢを使用した。ローディング後に、カバースリップに付着した単一ランゲルハンス島又は細胞を開放潅流チャンバーに移し、３７℃に維持した。［Ｃａ２＋］ｉを反映する３４０／３８０ｎｍ蛍光比の測定を文献に記載されているように実施した（Ｚａｉｔｓｅｖ，Ｓ．Ｖ．ら，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９７１２−９７１６）。準ニュートンアルゴリズム（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ，ｖ．５．０，ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．，米国）を使用して二重指数減衰式により［Ｃａ２＋］ｉ減衰の時定数を計算した。［Ｃａ２＋］ＥＲを測定するために、低親和性Ｃａ２＋感受性蛍光色素Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した。色素のＫＤ（３５０μＭ）は記録される蛍光変化が主に［Ｃａ２＋］ＥＲの変化を反映するようにした。単一β細胞を５μＭ  Ｘ−Ｒｈｏｄ−  ５Ｎ／ＡＭと共に１時間４℃でインキュベートし、細胞内区画への色素ローディングを確実にした。ローディング後に細胞を無色素緩衝液で洗浄し、更に２時間３７℃でインキュベートして細胞質ゾルから色素を除去した。Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｎを５７０ｎｍで励起し、６００ｎＭ長波長透過発光フィルターでシグナルを集めた。
【００９４】
穿孔パッチ全細胞コンフィギレーションを使用して、細胞膜キャパシタンスの変化として単一β細胞におけるエキソサイトーシスをモニターした。細胞キャパシタンスの変化を−７０ｍＶの保持電位で測定し、Ａｘｏｂａｓｉｃ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ．，米国）に記載されているソフトウェアを使用して検出した。実験中、０．４ｍｌ容積実験チャンバーに入れた細胞を１．５ｍｌ／分の速度で連続的にスーパーヒューズし、温度を３３℃に維持した。２分間隔で２回連続脱分極して同一振幅（∀１０％）のエキソサイトーシス応答が誘発されたら実験を開始し、観察される変化が単に分泌容量の自然長期変化によるものではないようにした。ピペット溶液は７６ｍＭ  Ｃｓ２ＳＯ４，１０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＣｓＯＨでｐＨ７．３５に調整）とした。０．２４ｍｇ／ｍｌアンホテリシンＢをピペット溶液に加えることにより細胞内部との電気的接触を確立した。穿孔には数分間を要し、直列コンダクタンス（Ｇｓｅｒｉｅｓ）が一定で＞３５〜４０ｎＳになったら電圧クランプが十分であるとみなした。細胞外培地は１１８ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  テトラエチルアンモニウム−Ｃｌ（ＴＥＡ−Ｃｌ），５．６ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２．６ｍＭ  ＣａＣｌ２，５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨを使用してｐＨ７．４０）及び５ｍＭ  Ｄ−グルコースから構成した。ｆｕｒａ−２／ＡＭと蛍光イメージングＩｏｎｏｐｔｉｘ（Ｍｉｌｔｏｎ，ＭＡ，米国）を使用して［Ｃａ２＋］ｉの平行測定を行った。蛍光比の校正はＣａ２＋と既知［Ｃａ２＋］ｉを有するＥＧＴＡの各種混合物をｆｕｒａ−２に浸出するように標準的な全細胞コンフィギレーションを使用して実施した。
【実施例５】
【００９５】
Ｌ型Ｃａ２＋チャネルβ３ノックアウトにおけるグルコース応答性インスリン放出の増加の基礎となる分子メカニズム
β３−／−マウスでグルコース応答性のより顕著なインスリン放出の基礎となると考えられる分子メカニズムを検討した。細胞付着単一チャネル記録を行い、β３−／−マウスにおけるβ細胞電圧ゲート型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルの生体物理学的性質を野生型マウスのものと比較した。β３サブユニットを欠失するβ細胞に付着したパッチから記録された単一Ｃａ２＋チャネルを流れるＢａ２＋電流は野生型β細胞で得られたものと著しい差がなかった。単一チャネルパラメーター分析によると、野生型とβ３−／−マウスの間で平均開放時間、開放確率及び利用率に顕著な差はなかった。単一チャネル記録に関するデータによると、β３サブユニットを除去してもβ細胞で電圧ゲート型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルの生体物理学的性質に影響しないことが分かった。
【００９６】
以上の結果はβ３サブユニットを除去すると原形質膜におけるＬ型Ｃａ２＋チャネル数が変化するという可能性を排除するものではない。従って、電圧ゲート型Ｌ型Ｃａ２＋チャネルの活性の穿孔全細胞記録を実施した（Ｈａｍｉｌｌ，Ｏ．Ｐ．ら，１９８１，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．３９１：８５−１００）。β３−／−と野生型のβ細胞とでＣａ２＋電流密度に有意差はなかった。これらの結果から、β３サブユニットを欠くβ細胞は原形質膜で野生型β細胞と類似数のＬ型Ｃａ２＋チャネルを発現することが判明した。従って、β細胞原形質膜のＬ型Ｃａ２＋チャネルの数と機能を維持するのにβ３サブユニットを他のβサブユニットで置換することができる。更に、β３−／−マウスでグルコースに応答するより顕著なインスリン放出はＬ型Ｃａ２＋チャネル活性の増加により説明することができない。
【００９７】
次に［Ｃａ２＋］ｉの変化を検討した。高グルコースで刺激後にβ３−／−及び野生型マウスに由来するβ細胞間で［Ｃａ２＋］ｉの振幅又は初期増加の時間経過に差はなかった。初期増加後の［Ｃａ２＋］の変化を低速振動（約１６０秒）、高速振動（約１０秒）及び無振動の３群に分類した。野生型マウスでは、４３回（ランゲルハンス島４３個）の記録を行った。これらのランゲルハンス島の１９％で高速振動が観察され、３５％で低速振動が観察された。残りの４６％のランゲルハンス島は振動を示さなかった。β３−／−マウスでは、４２回の記録のうちの７１％が高速振動を示し、１４％が低速振動を示し、残りの１５％は振動パターンを示さなかった。曲線の下の面積として測定した［Ｃａ２＋］ｉの合計増加はβ３−／−及び野生型マウスに由来するランゲルハンス島で差がなかった。従って、グルコースにより誘導される［Ｃａ２＋］ｉの変化については、β３−／−及び対照マウスから得られるランゲルハンス島間で相違する唯一のパラメーターは高周波数［Ｃａ２＋］ｉ振動を示すランゲルハンス島の数であった。
【００９８】
膵臓β細胞において、［Ｃａ２＋］ｉ振動は原形質膜及びＥＲチャネルのＣａ２＋及びＫ＋コンダクタンス間の複雑な相互作用に依存する（Ｂｅｒｇｇｒｅｎ  ＆  Ｌａｒｓｓｏｎ  １９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔ．２２：１２−１８；Ｒｏｅら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９９５３−９９５６）。イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩｎｓＰ３）のレベルはホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）系の刺激後に増加し、その結果、ＥＲからＣａ２＋が流動する。小胞体（ＥＲ）Ｃ２＋−ＡＴＰａｓｅの阻害剤であるタプシガーギンでβ細胞を処理すると、［Ｃａ２＋］ｉ振動が［Ｃａ２＋］ｉの単相増加に変換されることは知られている（Ｒｏｅら，１９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７３：１０４０２−１０４１０）。従って、野生型とβ３−／−マウスの両者に由来するランゲルハンス島を１μＭタプシガーギンと共に３０分間プレインキュベートし、グルコースにより誘導される［Ｃａ２＋］ｉ振動を阻止した。ＩｎｓＰ３受容体を２−アミノエトキシジフェニルボラン（２−ＡＰＢ）でブロックすると、β３−／−マウス由来β細胞では［Ｃａ２＋］ｉ振動は高速から低速に変換した。従って、β３−／−β細胞における［Ｃａ２＋］ｉの振動はＩｎｓＰ３感受性ＥＲのＣａ２＋貯蔵部を介するＣａ２＋流にも依存する。
【００９９】
タプシガーギンで処理したランゲルハンス島でグルコースに応答するインスリン放出が対照マウスとβ３−／−マウスで差がないことは、グルコースにより誘導されるインスリン分泌とβ３−／−マウスからのランゲルハンス島で認められる［Ｃａ２＋］ｉ振動パターンのより高い周波数との間に直接関係があることを示唆している。この認識を更に確認するために、［Ｃａ２＋］ｉの振動対単相増加を模倣する脱分極パルスプロトコルを適用し、［Ｃａ２＋］ｉとインスリンエキソサイトーシスの変化を同時に測定した。
【０１００】
［Ｃａ２＋］ｉとインスリンエキソサイトーシスの測度としての細胞キャパシタンス（Ｃｍ）の変化の同時測定は１分間−７０ｍＶ〜−４０ｍＶの膜脱分極の前、その間及びその後に単一電圧クランプ化β細胞で実施した。５回の実験系列で−４０ｍＶまで脱分極すると、［Ｃａ２＋］ｉは１１６∀２１ｎＭの基線値から５７５∀４３ｎＭまで増加し（Ｐ＜０．０１）、−７０ｍＶの保持電位まで戻すと１３３∀３７ｎＭ（Ｐ＜０．０１）まで減衰した。この［Ｃａ２＋］ｉの増加はそれ自体で分泌を誘発するには十分でないが、β細胞のエキソサイトーシス容量を一過的に増加し、０ｍＶまでの電圧クランプ脱分極により誘発されるキャパシタンス増加の振幅は−４０ｍＶまで、１分間脱分極前に見られるよりも７１∀１２％（Ｐ＜０．０５；ｎ＝５）増加した。細胞キャパシタンスのこれらの増加は１分間０ｍＶまでの一連の電圧クランプ脱分極（時間１００ｍｓ；１０Ｈｚ）後に観察されるものよりも比較的小さかった。これらの条件下で［Ｃａ２＋］ｉは１３８∀２７ｎＭから４３８∀４７ｎＭ（Ｐ＜０．０１）まで増加し、−７０ｍＶの保持電位まで戻すと１５６∀３９ｎＭ（Ｐ＜０．０１）まで減衰した。この場合も、［Ｃａ２＋］ｉのこの増加は細胞キャパシタンスの変化に関連付けられなかったが、β細胞のエキソサイトーシス容量は脱分極前に見られたよりも３０９∀２７％（Ｐ＜０．００５；ｎ＝５）増加した。エキソサイトーシス容量の変化は０ｍＶまで５００ｍｓ脱分極に応答する積分Ｃａ２＋電流の変化に関連付けられなかった。
【０１０１】
β３−／−β細胞における［Ｃａ２＋］ｉ振動周波数の増加の基礎となる分子メカニズムを解明するために、ＩｎｓＰ３により放出可能な細胞内Ｃａ２＋プールの役割を検討した。細胞の外側からＣａ２＋を除去するか又は細胞外Ｃａ２＋の不在下に細胞をタプシガーギンで処理することによりＣａ２＋プールを枯渇させ、２．５ｍＭ細胞外Ｃａ２＋の添加後の［Ｃａ２＋］ｉの増加を調べた。
【０１０２】
これらの実験条件下で、［Ｃａ２＋］ｉの増加はＩｎｓＰ３とＣａ２＋の順次結合によるＩｎｓＰ３受容体の協調的活性化によるＥＲ  Ｃａ２＋放出をある程度反映している。枯渇プロトコールに関係なく野生型マウスに比較してβ３−／−マウスからのランゲルハンス島で観察されるより顕著な［Ｃａ２＋］ｉの増加はβ３サブユニットを欠くβ細胞ではＩｎｓＰ３感受性プールに放出性のより高いＣａ２＋が存在することを反映している。２μＭガドリニウムを加えてもこの［Ｃａ２＋］ｉの増加に影響はなく、伝統的な容量性Ｃａ２＋流入（Ｈｏｔｈ，Ｍ．ら，１９９３，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４６５：３５９−８６）によっては説明されないことを示唆している。
【０１０３】
カルバミルコリン（ＣＣｈ）により誘導されるＰＬＣの活性化はβ３−／−及び野生型マウスの両者に由来するランゲルハンス島で［Ｃａ２＋］ｉの一過性増加を生じた。野生型マウスに比較してβ３−／−に由来するランゲルハンス島のほうが［Ｃａ２＋］ｉ増加のピークが高く、初期ピーク後の［Ｃａ２＋］ｉの低下が迅速であった。この［Ｃａ２＋］ｉピークの細胞外Ｃａ２＋依存性を解明するために、Ｃａ２＋を含まない培地でインキュベートしたランゲルハンス島でＣＣｈの効果を試験した。これらの条件下でＣＣｈにより誘導される［Ｃａ２＋］ｉの増加に有意差はなかった。
【０１０４】
ＥＲ  Ｃａ２＋（［Ｃａ２＋］ＥＲ）の操作に関して野生型及びβ３−／−マウスから得られるβ細胞間に予想される差を検討するために、低親和性蛍光Ｃａ２＋色素であるＸ−Ｒｈｏｄ−５Ｎを使用して［Ｃａ２＋］ＥＲを測定した。ＣＣｈで刺激後に野生型マウスに比較してβ３−／−マウスから得られたβ細胞では［Ｃａ２＋］ＥＲの枯渇が遅かった。従って、ＩｎｓＰ３により放出可能な細胞内Ｃａ２＋プールは野生型β細胞に比較してβ３−／−のほうが大きいという認識は実験により十分に裏付けられる。
【０１０５】
β細胞がＩｎｓＰ３に媒介される［Ｃａ２＋］ｉの周期的増加を示すことは公知であり（Ａｍｍａｌａ，Ｃ．ら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８４９−８５２）、このメカニズムはグルコースにより誘導される振動的［Ｃａ２＋］ｉ応答の調節に関与していると思われる。β３サブユニットはＩｎｓＰ３受容体と関連づけられ、ＩｎｓＰ３により誘導されるＣａ２＋放出を負に調節することが今回判明した。β３サブユニットの除去はＩｎｓＰ３により放出可能なＣａ２＋プールの増加と［Ｃａ２＋］ｉ振動周波数の増加が観察されることに一致する。これは、β３−／−マウスでグルコースにより誘導されるインスリン放出の増加を分子レベルで説明するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１Ａ】β３遺伝子（Ａ）および、β３遺伝子のノックアウトを作製するために使用したターゲティングベクター（ＩＩＭＢ）（Ｂ）の構成を示す。エキソンを黒四角で示し、イントロンを縦線で示す。相同組換え産物の構造を（Ｃ）に示す。略語はＥ，ＥｃｏＲＩ；Ｈ，ＨｉｎｃＩＩ；Ｐ，プローブ；ｔｋ，単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を表す。
【図１Ｂ】β３遺伝子（Ａ）および、β３遺伝子のノックアウトを作製するために使用したターゲティングベクター（ＩＩＭＢ）（Ｂ）の構成を示す。エキソンを黒四角で示し、イントロンを縦線で示す。相同組換え産物の構造を（Ｃ）に示す。略語はＥ，ＥｃｏＲＩ；Ｈ，ＨｉｎｃＩＩ；Ｐ，プローブ；ｔｋ，単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を表す。
【図１Ｃ】β３遺伝子（Ａ）および、β３遺伝子のノックアウトを作製するために使用したターゲティングベクター（ＩＩＭＢ）（Ｂ）の構成を示す。エキソンを黒四角で示し、イントロンを縦線で示す。相同組換え産物の構造を（Ｃ）に示す。略語はＥ，ＥｃｏＲＩ；Ｈ，ＨｉｎｃＩＩ；Ｐ，プローブ；ｔｋ，単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を表す。
【図２Ａ】野生型（○）及びβ３−／−（●）マウスの（Ａ）腹腔内耐糖能試験と（Ｂ）経口耐糖能試験の結果を示す。
【図２Ｂ】野生型（○）及びβ３−／−（●）マウスの（Ａ）腹腔内耐糖能試験と（Ｂ）経口耐糖能試験の結果を示す。
【配列表】
2005520520.tif 000003
2005520520.tif 000004
2005520520.tif 000005
2005520520.tif 000006
2005520520.tif 000007
2005520520.tif 000008
2005520520.tif 000009
2005520520.tif 000010
2005520520.tif 000011
2005520520.tif 000012
2005520520.tif 000013
2005520520.tif 000014
【図１Ａ】
2005520520.tif 000015
【図１Ｂ】
2005520520.tif 000016
【図１Ｃ】
2005520520.tif 000017
【図２Ａ】
2005520520.tif 000018
【図２Ｂ】
2005520520.tif 000019
【国際調査報告】
2005520520.tif 000020
2005520520.tif 000021
2005520520.tif 000022
2005520520.tif 000023
2005520520.tif 000024
2005520520.tif 000025
2005520520.tif 000026