(57)【要約】本発明は、未成熟樹状細胞（ＤＣ）の成熟を誘導するため、ならびにこれらの細胞に１型免疫応答を誘導することをプライミングするための組成物および方法を提供する。本発明はまた、１型サイトカインおよび／または１型応答の産生に向かって極性化したＴ細胞を活性化および調製するために有用な樹状細胞集団を提供する。同様に、活性化され極性化したＴ細胞集団、およびこれらを作製する方法が提供される。本発明の方法はまた、未成熟樹状細胞を提供する工程；ならびに該未成熟樹状細胞を、該未成熟樹状細胞の成熟に適切な培養条件下で、有効量のＢＣＧおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）と接触させて、成熟樹状細胞集団を形成させる工程を包含する、成熟樹状細胞集団を産生するための方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟樹状細胞集団を産生するための方法であって、該方法は、以下：
未成熟樹状細胞を提供する工程；ならびに
該未成熟樹状細胞を、該未成熟樹状細胞の成熟に適切な培養条件下で、有効量のＢＣＧおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）と接触させて、成熟樹状細胞集団を形成させる工程；
を包含し、ここで、該成熟樹状細胞集団は、成熟の間にＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させなかった未成熟樹状細胞集団よりも上昇したインターロイキン１２対インターロイキン１０比を生じる、方法。
【請求項２】
ＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させる前に、前記未成熟樹状細胞を所定の抗原と接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記未成熟樹状細胞を所定の抗原、ＢＣＧおよびＩＦＮγと同時に接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の抗原が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍細胞、細菌細胞、細胞溶解産物、膜調製物、組換え産生抗原、ペプチド抗原、または単離抗原である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
単球性樹状細胞前駆体を単離する工程；および該前駆体を分化因子の存在下で培養して前記未成熟樹状細胞を形成させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分化因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン４との組み合わせ、またはインターロイキン１３である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記単球性樹状細胞前駆体が、ヒト被験体から単離される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記成熟樹状細胞が、少なくとも約１：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１００：１のＩＬ−１２対ＩＬ−１０の比を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
成熟樹状細胞集団を産生するための方法であって、該方法は、以下：
未成熟樹状細胞を提供する工程；ならびに
該未成熟樹状細胞を、該未成熟樹状細胞の成熟に適切な培養条件下で、有効量のＢＣＧおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）と接触させて、成熟樹状細胞集団を形成させる工程；
を包含し、ここで、該成熟樹状細胞集団が、１型免疫応答を生じる、方法。
【請求項１０】
ＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させる前に、前記未成熟樹状細胞を所定の抗原と接触させる工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記未成熟樹状細胞を所定の抗原、ＢＣＧおよびＩＦＮγと同時に接触させる工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記所定の抗原が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍細胞、細菌細胞、抗原を発現する組換え細胞、細胞溶解産物、膜調製物、組換え産生抗原、ペプチド抗原、または単離抗原である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
単球性樹状細胞前駆体を単離する工程；および該前駆体を分化因子の存在下で培養して前記未成熟樹状細胞を形成させる工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記分化因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン４との組み合わせ、またはインターロイキン１３である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記単球性樹状細胞前駆体が、ヒト被験体から単離される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記成熟樹状細胞が、少なくとも約１：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１００：１のＩＬ−１２対ＩＬ−１０の比を生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞を活性化するための組成物であって、該組成物は、以下：
成熟に適切な条件下で有効濃度のＢＣＧおよびＩＦＮγを用いて成熟させた樹状細胞集団；ならびに
所定の抗原；
を含み、ここで、前記樹状細胞集団が、成熟の間にＩＦＮγを伴わずにＢＣＧと接触させた成熟樹状細胞集団よりも上昇したインターロイキン１２（ＩＬ−１２）対インターロイキン１０（ＩＬ−１０）比を生じる、組成物。
【請求項１８】
前記樹状細胞集団が、少なくとも約１０：１の比のＩＬ−１２対ＩＬ−１０を生じる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記樹状細胞集団が、少なくとも約１００：１の比のＩＬ−１２対ＩＬ−１０を生じる、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
単離された未成熟樹状細胞集団であって、該細胞集団は、以下：
単離された未成熟単球性樹状細胞、ならびに該未成熟樹状細胞の成熟を誘導する有効濃度のＢＣＧおよびＩＦＮγ
を含み；ここで、得られる成熟樹状細胞が、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）よりも多くのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を産生する、細胞集団。
【請求項２１】
所定の抗原をさらに含む、請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項２２】
単離されたＴ細胞をさらに含む、請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞である、請求項２２に記載の細胞集団。
【請求項２４】
単離されたリンパ球をさらに含む、請求項２０に記載の細胞集団。
【請求項２５】
Ｔ細胞を産生するための方法であって、該方法は、以下：
未成熟樹状細胞を提供する工程；
該未成熟樹状細胞を所定の抗原と接触させる工程；
該未成熟樹状細胞を、該未成熟樹状細胞の成熟に適切な培養条件下で、有効濃度のＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させて、成熟樹状細胞を形成させる工程；ならびに
該成熟樹状細胞をナイーブＴ細胞と接触させて、ＩＦＮγを産生する活性化Ｔ細胞を形成させる工程
を包含する、方法。
【請求項２６】
前記所定の抗原が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍細胞、細菌細胞、抗原を発現する組換え細胞、細胞溶解産物、膜調製物、組換え産生抗原、ペプチド抗原、または単離抗原である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記未成熟樹状細胞が所定の抗原、ＢＣＧおよびＩＦＮγと同時に接触される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
単球性樹状細胞前駆体を単離する工程；および該前駆体を分化因子の存在下で培養して前記未成熟樹状細胞を形成させる工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記分化因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン４との組み合わせ、またはインターロイキン１３である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記単球性樹状細胞前駆体が、ヒト被験体から単離される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記未成熟樹状細胞およびＴ細胞が、互いに対して自己である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
インターロイキン１０（ＩＬ−１０）より多くのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を産生する、単離された成熟樹状細胞であって、該樹状細胞の成熟に適切な条件下で、有効濃度のＢＣＧおよびＩＦＮγを含む組成物を用いた未成熟樹状細胞の成熟によって調製された、単離された成熟樹状細胞。
【請求項３３】
所定の抗原をさらに包含する、請求項３２に記載の単離された成熟樹状細胞。
【請求項３４】
所定の抗原がローディングされた単離された成熟樹状細胞であって、該樹状細胞は、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）よりも多くのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を産生する、単離された成熟樹状細胞。
【請求項３５】
前記細胞が、ＩＬ−１０よりも少なくとも１０倍多くのＩＬ−１２を産生する、請求項３４に記載の単離された成熟樹状細胞。
【請求項３６】
動物内で１型免疫応答を生じるための方法であって、該方法は、以下：
未成熟樹状細胞を提供する工程；
該未成熟樹状細胞を、該未成熟樹状細胞の成熟に適切な培養条件下で、有効量のＢＣＧおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）および所定の抗原と接触させて、成熟樹状細胞を形成させる工程；
該成熟樹状細胞をナイーブＴ細胞と接触させて、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）よりも多くのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を産生する活性化Ｔ細胞を産生させる工程；ならびに
該活性化Ｔ細胞を該動物に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記所定の抗原が、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍細胞、細菌細胞、抗原を発現する組換え細胞、細胞溶解産物、膜調製物、組換え産生抗原、ペプチド抗原、または単離抗原である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記未成熟樹状細胞を所定の抗原、ＢＣＧおよびＩＦＮγと同時に接触させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させる前に、前記未成熟樹状細胞を前記所定の抗原と接触させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記動物から単球性樹状細胞前駆体を単離する工程；および該前駆体を分化因子の存在下で培養して前記未成熟樹状細胞を形成させる工程をさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記分化因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン４との組み合わせ、またはインターロイキン１３である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記未成熟樹状細胞およびＴ細胞が、前記動物に対して自己である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記未成熟樹状細胞およびＴ細胞が、前記動物に対して同種異系である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記未成熟樹状細胞およびＴ細胞が、前記動物と同じＭＨＣハプロタイプを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、有効な免疫応答を惹起する際に重要である。これは、抗原特異的Ｔ細胞レセプターを有するＴ細胞に対して抗原を提示するだけでなく、Ｔ細胞活性化に必要なシグナルも提供する。これらのシグナルは、完全に規定されていないままであるが、種々の細胞表面分子ならびにサイトカインまたは増殖因子を含む。ナイーブＴ細胞または非極性化Ｔ細胞の活性化に必要な因子は、記憶Ｔ細胞の再活性化に必要とされる因子とは異なり得る。ＡＰＣが抗原を提示する能力およびＴ細胞活性化シグナルを送達する能力は両方とも、通常、補助細胞機能といわれる。単球およびＢ細胞はコンピテントＡＰＣであることが示されているが、それらのインビトロでの抗原提示能力は、以前に感作されたＴ細胞の再活性化に制限されているようである。それゆえ、これらは、機能的にナイーブなＴ細胞集団も、プライミングされていないＴ細胞集団も直接的に活性化することができない。
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、ナイーブＴ細胞および記憶Ｔ細胞の両方を活性化し得ると考えられる、免疫系のプロフェッショナル抗原提示細胞である。樹状細胞は、免疫治療（特に、癌の免疫治療）における使用のために、ますますエキソビボで調製されている。最適な免疫刺激特性を有する樹状細胞の調製は、エキソビボでの培養のために、これらの細胞の生物学の理解および活用を必要とする。各プロトコルに起因する種々の利点を有する、これらの細胞の培養のための種々のプロトコルが記載されている。近年のプロトコルとしては、無血清培地の使用、ならびに所望の免疫刺激特性を培養細胞に付与する成熟条件の使用が挙げられる。
【０００３】
樹状細胞の成熟は、未成熟ＤＣ（これは、皮膚ランゲルハンス細胞に表現型的に類似する）を、リンパ節へと移動し得る成熟した抗原提示細胞へと転換するプロセスである。このプロセスは、この未成熟樹状細胞を特徴付ける強力な抗原取り込み能力の喪失、ならびに補助刺激細胞表面分子および種々のサイトカインの発現のアップレギュレーションをもたらす。公知の成熟プロトコルは、ＤＣが抗原への曝露の間またはその後に遭遇すると考えられるインビボでの環境に基づく。このアプローチの最良の例は、細胞培養培地としての、単球馴化培地（ＭＣＭ）の使用である。ＭＣＭは、単球を培養することによってインビトロで生成され、そして成熟因子の供給源として用いられる。成熟の原因となる、ＭＣＭ中の主な成分は、炎症（誘発）性サイトカインインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン６（ＩＬ−６）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）であると報告されている。他の成熟因子としては、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ポリ−ｄＩｄＣ、血管作用性（ｖａｓｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）ペプチド（ＶＩＰ）、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、ならびにマイコバクテリアまたはマイコバクテリア成分（例えば、特定の細胞壁成分）が挙げられる。
【０００４】
充分に成熟した樹状細胞は、未成熟ＤＣとは定性的および定量的に異なる。充分に成熟したＤＣは、より高レベルのＭＨＣクラスＩ抗原およびＭＨＣクラスＩＩ抗原、ならびにより高レベルのＴ細胞補助刺激分子（すなわち、ＣＤ８０およびＣＤ８６）を発現する。これらの変化は、樹状細胞がＴ細胞を活性化する能力を増大させる。なぜなら、これらは、細胞表面の抗原密度、ならびにＴ細胞上の補助刺激分子の対応物（例えば、ＣＤ２８など）を通るＴ細胞活性化シグナルの大きさを増大させるからである。さらに、成熟ＤＣは、多量のサイトカインを産生し、このサイトカインは、Ｔ細胞応答を刺激して導く。これらのサイトカインのうちの２つは、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）およびインターロイキン（ＩＬ−１２）である。これらのサイトカインは、誘導されるＴ細胞応答の方向に対して反対の効果を有する。ＩＬ−１０産生は、Ｔｈ−２型応答の誘導をもたらし、一方、ＩＬ−１２産生は、Ｔｈ−１型応答をもたらす。後者の応答は、細胞免疫応答が所望される場合（例えば、癌免疫治療において）、特に望ましい。Ｔｈ−１型応答は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（これは、細胞性免疫系のエフェクターアームである）の誘導および分化をもたらす。このエフェクターアームは、腫瘍増殖と戦う際に最も有効である。ＩＬ−１２はまた、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を誘導し、そして抗脈管形成活性を有する。これらは両方とも、有効な抗腫瘍防御手段である。従って、ＩＬ−１２を産生する樹状細胞の使用は、理論的に、免疫刺激における使用に最も適している。
【０００５】
特定の樹状細胞成熟因子（例えば、細菌性リポ多糖、細菌性ＣｐＧ  ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびＣＤ４０リガンド）は、未成熟ＤＣを誘導して、ＩＬ−１２を産生させ、未成熟ＤＣにＴｈ−１応答をプライミングすると報告されている。対照的に、抗炎症分子（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＰＧＥ−２およびコルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｉｏｄ））はＩＬ−１２産生を阻害し、そして細胞にＴｈ−２応答をプライミングし得る。
【０００６】
近年、樹状細胞によるＩＬ−１２産生の増強は、インターフェロンγと特定の樹状細胞成熟因子（例えば、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）およびＣＤ４０）とを合わせることによって報告されている。しかし、ＬＰＳおよびＣＤ４０は両方とも、成熟の間に少量のＩＬ−１２を誘導する既知の能力を有する。従って、ＩＦＮγの添加は、その産生を増強するにすぎないことが可能である。インターフェロンγシグナル伝達は、Ｊａｋ２−Ｓｔａｔ１経路を使用し、これは、核へのその移動の前のＳｔａｔ１の７０１位のチロシン残基のチロシンリン酸化、およびその後のインターフェロンγ応答遺伝子の転写増強を含む。しかし、ヒト単球由来樹状細胞におけるシグナル伝達経路についてはごくわずかしか公知でない。これらの細胞におけるインターフェロンγ作用についての機構は、確立されていない。
【０００７】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの弱毒化ウシ株（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）（現在、カルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）として公知）は、癌免疫治療において用いられている。１例では、生ＢＣＧの膀胱内投与は、膀胱癌の処置に有効であることが証明されているが、この処置についての機構は、公知ではない。ＢＣＧ投与の効果は、例えば、癌細胞を攻撃する免疫応答の誘導によって媒介されると仮定されている。この応答におけるＢＣＧの特定の役割は、免疫反応性の一般化された誘導因子のものであり、免疫系に対する腫瘍抗原の提示においてアジュバント機能を有すると考えられる。
【０００８】
ＢＣＧはまた、成熟マーカーＣＤ８３をアップレギュレートする能力を有する、樹状細胞に対する強力な成熟因子であることが見出されている。ＢＣＧはまた、エンドサイトーシス能力の低減を伴って、ＭＨＣ分子ならびに補助刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をアップレギュレートし得る。さらに、ＩＬ−１２の産生が特異的に阻害されることが見出された、他のＤＣ成熟因子について見出された結果とは対照的に、ＢＣＧまたはＢＣＧ由来リポアラビドマンナンは、サイトカイン産生を増大させることが報告されている。この前者の特性（ＩＬ−１２産生の阻害）は、強力な細胞媒介性細胞傷害性応答（Ｔｈ−１応答）が所望される免疫治療用の樹状細胞の成熟のためにＢＣＧを用いることの魅力を低減する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、能動免疫治療におけるＢＣＧの使用は、樹状細胞成熟を誘導する可能性を有する。しかし、樹状細胞のこのような成熟を誘導し、広範な免疫刺激を同時に提供し、そしてこれらの樹状細胞に、強固な細胞傷害性Ｔ細胞応答を有する１型（Ｔｈ−１）免疫応答をプライミングさせる、組成物およびこのような組成物を用いる方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、広範な免疫刺激を同時に提供する薬剤（すなわち、ＢＣＧ）を用いて未成熟樹状細胞（ＤＣ）の成熟を誘導するための方法および組成物、ならびにこれらの細胞に抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答をプライミングさせるための方法および組成物を提供する。１つの局面では、成熟樹状細胞集団を産生するための方法が提供され、この方法は、未成熟樹状細胞を提供する工程；ならびにこの未成熟樹状細胞を、この未成熟樹状細胞の成熟に適切な培養条件下で、有効濃度のＢＣＧおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）と接触させて、成熟樹状細胞集団を形成させる工程を包含する。この成熟樹状細胞集団は、成熟の間にＢＣＧおよびＩＦＮγ単独に接触させなかった未成熟樹状細胞集団よりも上昇したインターロイキン１２対インターロイキン１０比を生じる。この未成熟樹状細胞は、ＢＣＧおよびＩＦＮγとの接触の前または接触の間に所定の抗原と接触され得る。この所定の抗原は、例えば、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍細胞、細菌細胞、抗原を発現する組換え細胞、細胞溶解産物、膜調製物、組換え産生抗原、ペプチド抗原（例えば、合成ペプチド抗原）、または単離抗原であり得る。
【００１１】
特定の実施形態では、この方法は、単球性樹状細胞前駆体を単離する工程；およびこの前駆体を分化因子の存在下で培養して未成熟樹状細胞集団を形成する工程を必要に応じてさらに包含し得る。適切な分化因子としては、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン４との組み合わせ、またはインターロイキン１３が挙げられる。この単球性樹状細胞前駆体は、ヒト被験体から単離され得る。特定の実施形態では、この成熟樹状細胞は、少なくとも１：１のＩＬ−１２対ＩＬ−１０の比を生じる。
【００１２】
別の局面では、成熟樹状細胞集団を産生するための方法が提供される。この方法は一般に、未成熟樹状細胞を提供する工程；ならびにこの未成熟樹状細胞を、この未成熟樹状細胞の成熟に適切な培養条件下で、有効量のＢＣＧおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）と接触させて、成熟樹状細胞集団を形成させる工程を包含する。得られる成熟樹状細胞集団は、１型免疫応答を生じる。この未成熟樹状細胞を、ＢＣＧおよびＩＦＮγとの接触の前または接触の間に、所定の抗原と接触させ得る。この所定の抗原は、例えば、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍細胞、細菌細胞、抗原を発現する組換え細胞、細胞溶解産物、膜調製物、組換え産生抗原、ペプチド抗原（すなわち、合成ペプチド）、または単離抗原であり得る。
【００１３】
特定の実施形態では、この方法は、単球性樹状細胞前駆体を単離する工程；およびこの前駆体を分化因子の存在下で培養して、この未成熟樹状細胞を形成させる工程を必要に応じてさらに包含し得る。適切な分化因子としては、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン４との組み合わせ、またはインターロイキン１３が挙げられる。この単球性樹状細胞前駆体は、ヒト被験体から単離される。特定の実施形態では、この成熟樹状細胞は、少なくとも約１：１のＩＬ−１２対ＩＬ−１０の比を生じる。
【００１４】
なお別の局面では、Ｔ細胞を活性化するための組成物が提供される。この組成物は、成熟について適切な条件下で有効濃度のＢＣＧおよびＩＦＮγを用いて成熟された樹状細胞集団；および所定の抗原を含み得る。この樹状細胞集団は、成熟の間にＩＦＮγを伴わずにＢＣＧと接触させた成熟樹状細胞集団よりも上昇したインターロイキン１２（ＩＬ−１２）対インターロイキン１０（ＩＬ−１０）比を生じ得る。特定の実施形態では、この樹状細胞集団は、少なくとも約１０：１の比のＩＬ−１２対ＩＬ−１０を生じ得る。他の実施形態では、この樹状細胞集団は、成熟の間にＩＦＮγを伴わずにＢＣＧの存在下で培養した同様の未成熟樹状細胞集団よりも少なくとも約１：１００の比のＩＬ−１２対ＩＬ−１０を生じ得る。
【００１５】
別の局面では、単離された未成熟樹状細胞集団が提供される。この細胞集団は、未成熟単球性樹状細胞、ならびにこの未成熟樹状細胞の成熟を誘導する有効濃度のＢＣＧおよびＩＦＮγを含む。得られる成熟樹状細胞は、成熟の間にＩＦＮγを伴わずにＢＣＧの存在下で培養した同様の未成熟樹状細胞集団よりも高いインターロイキン１２（ＩＬ−１２）対インターロイキン１０（ＩＬ−１０）を生じる。この細胞集団は、所定の抗原および／または単離されたＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）を必要に応じて含み得る。このＴ細胞は、単離されたリンパ球の調製物中に必要に応じて存在し得る。
【００１６】
活性化Ｔ細胞を産生するための方法もまた提供される。この方法は一般に、未成熟樹状細胞を提供する工程；この未成熟樹状細胞を所定の抗原と接触させる工程；ならびにこの未成熟樹状細胞を、この未成熟樹状細胞の成熟に適切な培養条件下で、有効濃度のＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させて、成熟樹状細胞を形成させる工程を包含する。この成熟樹状細胞を、ナイーブＴ細胞と接触させて、ＩＦＮγを産生するか、および／または１型（Ｔｈ−１）応答に極性化した活性化Ｔ細胞を形成させ得る。適切な抗原としては、例えば、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍細胞、細菌細胞、抗原を発現する組換え細胞、細胞溶解産物、膜調製物、組換え産生抗原、ペプチド抗原（例えば、合成ペプチド抗原）、または単離抗原が挙げられる。
【００１７】
この未成熟樹状細胞を所定の抗原、ＢＣＧおよびＩＦＮγと同時に接触させ得るか、またはこの細胞を、ＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させる前にこの所定の抗原と接触させ得る。特定の実施形態では、この方法は、単球性樹状細胞前駆体を単離する工程；および分化因子の存在下でこの前駆体を培養して、この未成熟樹状細胞の形成を誘導する工程をさらに包含し得る。適切な分化因子としては、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン４との組み合わせ、またはインターロイキン１３が挙げられる。この単球性樹状細胞前駆体は、ヒト被験体から必要に応じて単離され得る。特定の実施形態では、この未成熟樹状細胞およびＴ細胞は、互いに自己である。
【００１８】
インターロイキン１０（ＩＬ−１０）よりも多くのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）を産生する単離された成熟樹状細胞もまた提供される。この成熟樹状細胞は、この樹状細胞の成熟に適切な条件下で有効濃度のＢＣＧおよびＩＦＮγを含む組成物を用いた未成熟樹状細胞の成熟によって提供され得る。所定の抗原が、この単離された成熟樹状細胞に必要に応じて含まれ得る。所定の抗原がローディングされた、単離された成熟樹状細胞もまた提供される。この樹状細胞は、成熟の間にＩＦＮγを伴わずにＢＣＧの存在下で培養した同様の未成熟樹状細胞集団よりも多くの、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）よりも多くのインターロイキン１２（ＩＬ−１２）（例えば、ＩＬ−１０よりも少なくとも１０倍多くのＩＬ−１２）を産生し得る。
【００１９】
動物において１型（Ｔｈ−１）免疫応答を産生するための方法もまた提供される。この方法は一般に、未成熟樹状細胞を提供する工程；この未成熟樹状細胞を、この未成熟樹状細胞の成熟に適切な培養条件下で、有効量のＢＣＧおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）、ならびに所定の抗原とを接触させて、成熟樹状細胞を形成させる工程を包含する。この成熟樹状細胞を動物に投与するかまたはナイーブＴ細胞と接触させるかのいずれかによって、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）および／または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の産生によって特徴付けられる活性化Ｔ細胞を形成させ得る。この活性化Ｔ細胞は、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答の刺激の必要のある動物に投与され得る。適切な抗原としては、例えば、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍細胞、細菌細胞、抗原を発現する組換え細胞、細胞溶解産物、膜調製物、組換え産生抗原、ペプチド抗原（例えば、合成ペプチド抗原）、または単離抗原が挙げられる。この未成熟樹状細胞を、この所定の抗原、ＢＣＧおよびＩＦＮγと必要に応じて同時に接触させ得るか、またはＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させる前に、この未成熟樹状細胞をこの所定の抗原と接触させ得る。
【００２０】
特定の実施形態では、この方法は、単球性樹状細胞前駆体をこの動物から単離する工程；およびこの前駆体を分化因子の存在下で培養して、この未成熟樹状細胞を形成させる工程をさらに包含し得る。この分化因子は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン４、ＧＭ−ＣＳＦとインターロイキン４との組み合わせ、またはインターロイキン１３であり得る。
【００２１】
この未成熟樹状細胞およびＴ細胞は、この動物に対して自己であってもよく、またはこの動物に対して同種異系であってもよい。あるいは、この未成熟樹状細胞およびＴ細胞は、この動物と同じＭＨＣハプロタイプを有してもよく、またはＭＨＣマーカーを共有してもよい。特定の実施形態では、この動物は、ヒトであっても非ヒト動物であってもよい。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、未成熟樹状細胞（ＤＣ）の成熟を誘導するための方法およびこれらの細胞に抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答（Ｔｈ−１応答）をプライミングさせるための方法を提供する。本発明はまた、１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、および／またはＩＬ−２）の産生に極性化したＴ細胞集団を活性化および調製するために有用な樹状細胞集団を提供する。このような樹状細胞集団としては、適切な成熟条件下でＢＣＧ、ＩＦＮγおよび所定の抗原と接触させた未成熟単球性樹状細胞が挙げられる。この未成熟樹状細胞を、成熟の間または成熟前にこの抗原と接触させ得る。あるいは、抗原に（例えば、インビボで）既に曝露した未成熟単球性樹状細胞を、適切な成熟条件下でＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させ得る。得られる成熟樹状細胞は、Ｔ細胞を活性化して１型応答に対してＴ細胞を極性化することがプライミングされる。１型応答としては、１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、および／またはＩＬ−２）の産生、ＩＬ−１０よりも多くのＩＬ−１２の産生、細胞傷害性Ｔ細胞応答、Ｔｈ−１細胞の産生、および特定の型の抗体の産生が挙げられる。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）もまたアップレギュレートされ得る。対照的に、２型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の産生、ＩＬ−１２よりも多いＩＬ−１０の産生、Ｔｈ２細胞の産生、ならびにＣＴＬ応答の誘導欠如によって特徴付けられる。
【００２３】
関連の局面では、未成熟樹状細胞（例えば、単球性樹状細胞前駆体）についての成熟因子（これは、これらの樹状細胞に１型応答をもプライミングさせ得る）を含む組成物が提供される。成熟し、プライミングされたこのような単球性樹状細胞は、所定の抗原（すなわち、所定の外因性抗原）の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラス−Ｉ提示を増加させ得る。抗原のＭＨＣクラスＩ提示は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の分化および標的細胞の抗原特異的ＣＴＬ媒介溶解の刺激を誘導するために所望される。このような組成物は、未成熟樹状細胞を含む細胞集団と混合され得、未成熟樹状細胞を成熟させるため、ならびにこの未成熟樹状細胞とＢＣＧとの接触によって誘導されるＩＬ−１２の阻害を転換または克服するための、ＢＣＧおよびＩＦＮγを含む。このような組成物を接触させた未成熟樹状細胞は、成熟を経て、そして代表的には、ＢＣＧ単独と接触させた未成熟樹状細胞集団と比較して、ＩＬ−１０よりも多量のＩＬ−１２を産生する。
【００２４】
別の局面では、被験体またはドナーから得た単球性樹状細胞前駆体を、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）と接触させて、未成熟樹状細胞を獲得し得る。次いで、この未成熟樹状細胞を、ＢＣＧおよびＩＦＮγのみと組み合わせたかまたはサイトカインと組み合わせた所定の抗原と接触させて、この樹状細胞を成熟させ得、そしてこの細胞がＴ細胞における１型免疫応答を誘導することをプライミングさせ得る。特定の実施形態では、ＭＨＣクラス−Ｉ抗原プロセシングが刺激され、このことは、所定の抗原を提示する細胞に対してＣＴＬ応答を惹起するために有用である。
【００２５】
樹状細胞は、種々のリンパ組織および非リンパ組織に見出される抗原提示細胞の多様な集団である（Ｌｉｕ，Ｃｅｌｌ  １０６：２５９−６２（２００１）；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−９６（１９９１）を参照のこと）。樹状細胞としては、脾臓のリンパ樹状細胞、表皮のランゲルハンス細胞、および血液循環中のベール細胞が挙げられる。集合的に、樹状細胞は、それらの形態、高レベルの表面ＭＨＣ−クラスＩＩ発現、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、単球、およびナチュラルキラー細胞上に発現される特定の他の表面マーカーが存在しないことに基づいて、１群として分類される。特に、単球由来樹状細胞（単球性樹状細胞ともいう）は通常、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６を発現し、そしてＨＬＡ−ＤＲ＋であるが、ＣＤ１４−である。
【００２６】
対照的に、単球性樹状細胞前駆体（代表的に、単球）は通常、ＣＤ１４＋である。単球性樹状細胞前駆体は、これらが存在する任意の組織（特に、リンパ組織（例えば、脾臓、骨髄、リンパ節および胸腺））から入手され得る。単球性樹状細胞前駆体はまた、循環系から単離され得る。末梢血は、単球性樹状細胞前駆体の容易に利用可能な供給源である。臍帯血は、単球性樹状細胞前駆体の別の供給源である。単球性樹状細胞前駆体は、免疫応答が惹起され得る種々の生物から単離され得る。このような生物としては、動物（例えば、ヒトおよび非ヒト動物（例えば、霊長類、哺乳動物（イヌ、ネコ、マウスおよびラットが挙げられる）、鳥類（ニワトリが挙げられる）、ならびにそれらのトランスジェニック種が挙げられる）が挙げられる。
【００２７】
特定の実施形態では、この単球性樹状細胞前駆体および／または未成熟樹状細胞は、健常な被験体、または免疫刺激の必要のある被験体（例えば、前立腺癌患者）、または細胞性免疫刺激が有利であり得るかもしくは所望され得る他の被験体（すなわち、細菌感染もしくはウイルス感染を有する被験体など）から単離され得る。樹状細胞前駆体および／または未成熟樹状細胞はまた、免疫刺激の必要がある、ＨＬＡが一致した被験体への投与のために、ＨＬＡが一致した健常個体から入手され得る。
【００２８】
（樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞）
樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞が富化された細胞集団を、種々の供給源（血液および骨髄を含む）から単離するための方法が当該分野で公知である。例えば、樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞は、ヘパリン処理した血液を収集することによって、アフェレーシスもしくは白血球搬出によって、バフィコートの調製、ロゼット形成、遠心分離、密度勾配遠心分離（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（例えば、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（登録商標））、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）（透析可能ではないポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）でコーティングしたコロイド状シリカ粒子（直径１５〜３０ｍｍ））、スクロースなどを用いる）、細胞の示差的溶解、濾過などによって単離され得る。特定の実施形態では、白血球集団は、例えば、被験体からの血液の収集、血小板を除去するためのフィブリン除去（ｄｅｆｒｉｂｒｉｎａｔｉｎｇ）および赤血球の溶解によって調製され得る。樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配を通しての遠心分離によって、単球性樹状細胞前駆体について必要に応じて富化され得る。
【００２９】
樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞は、閉じた無菌系において必要に応じて調製され得る。本明細書中で用いられる場合、用語「閉じた無菌系」または「閉じた系」とは、非滅菌空気、周囲の空気、もしくは循環空気、または他の非無菌条件への曝露が最小であるか排除されている系をいう。樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞を単離するための閉じた系は、一般に、頂部が開いたチューブにおける密度勾配遠心分離、細胞の開放空気下での移植、組織培養プレートまたはシールしていないフラスコにおける細胞培養などを除外する。代表的な実施形態では、この閉じた系は、無菌でない空気への曝露を伴わずに、最初の収集容器からシール可能な組織培養容器への、樹状細胞前駆体および未成熟樹状細胞の無菌移植を可能にする。
【００３０】
特定の実施形態では、単球性樹状細胞前駆体は、米国特許出願第６０／３０７，９７８号（２００１年７月２５日出願（代理人文書番号０２００９３−００２６００ＵＳ）（この開示は、本明細書中に参考として援用される））に開示されるように、単球結合基材への接着によって単離される。例えば、白血球集団（例えば、白血球搬出によって単離される）を、単球性樹状細胞前駆体接着基材と接触させ得る。この白血球集団をこの基材と接触させる場合、この白血球集団中の単球性樹状細胞前駆体は優先的にこの基材に接着する。他の白血球（他の潜在的樹状細胞前駆体を含む）は、基質に対する低減した結合親和性を示し、それゆえ、この単球性樹状細胞前駆体がこの基材表面に優先的に富化されるのを可能にする。
【００３１】
適切な基材としては、例えば、大きな表面積対容積比を有する基材が挙げられる。このような基材は、例えば、粒子状基材または繊維状基材であり得る。適切な粒子状基材としては、例えば、ガラス粒子、プラスチック粒子、ガラスでコーティングしたプラスチック粒子、ガラスでコーティングしたポリスチレン粒子、およびタンパク質吸収に適切な他のビーズが挙げられる。適切な繊維状基材としては、マイクロキャピラリーチューブおよび微絨毛膜が挙げられる。この粒子状基材または繊維状基材は通常、付着した単球性樹状細胞前駆体が、接着した細胞の生存率を実質的に低下させることなく、溶出されるのを可能にする。粒子状基材または繊維状基材は、この基材からの単球性樹状細胞前駆体または樹状細胞の溶出を容易にするために実質的に非多孔質であり得る。「実質的に非多孔質」の基材は、その基材中に存在する少なくとも大部分の孔が、この基材中に捕捉される細胞を最小にするために、この細胞よりも小さい基材である。
【００３２】
この基材に対するこの単球性樹状細胞前駆体の付着は、結合培地の添加によって、必要に応じて増強され得る。適切な結合培地としては、例えば、サイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、またはインターロイキン１３（ＩＬ−１３））、血漿、血清（例えば、ヒト血清（例えば、自己血清もしくは同種異系血清））、精製タンパク質（例えば、血清アルブミン、二価カチオン（例えば、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオン））ならびにこの基材に対する単球性樹状細胞前駆体の特異的付着を補助するかまたはこの基材への非単球性樹状細胞前駆体の付着を妨害する、他の分子が個々にまたは任意の組み合わせで補充された、単球性樹状細胞前駆体培養培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）など）が挙げられる。特定の実施形態では、血漿または血清は、熱不活化され得る。熱不活化血漿は、白血球に対して自己または異種であり得る。
【００３３】
この基材への単球性樹状細胞前駆体の付着後、付着していない白血球は、単球性樹状細胞前駆体／基材複合体から分離される。任意の適切な手段を用いて、付着していない細胞を複合体から分離し得る。例えば、付着していない白血球と複合体との混合物を沈澱させ得、そして付着していない白血球および培地を傾瀉または排出し得る。あるいは、この混合物を遠心分離し得、そして付着していない白血球を含む上清を、ペレット化複合体から傾瀉または排出し得る。
【００３４】
単離された樹状細胞前駆体は、分化、成熟および／または拡大のためにエキソビボで培養され得る。（本明細書中で用いられる場合、単離された未成熟樹状細胞、樹状細胞前駆体、Ｔ細胞、および他の細胞とは、ヒトの手によって、それらのネイティブな環境とは離れて存在し、それゆえ、天然の産物ではない細胞をいう。単離された細胞は、純粋な形態、半ば精製された形態、またはネイティブではない環境に存在し得る。）手短に述べると、エキソビボでの分化は代表的に、樹状細胞前駆体、または樹状細胞前駆体を有する細胞集団を、１以上の分化薬剤の存在下で培養する工程を包含する。適切な分化因子は、例えば、細胞増殖因子（例えば、サイトカイン（例えば、（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、および／またはそれらの組み合わせ））であり得る。特定の実施形態では、この単球性樹状細胞前駆体を分化させて、単球由来未成熟樹状細胞を形成させる。
【００３５】
この樹状細胞前駆体は、適切な培養条件で培養および分化され得る。適切な組織培養培地としては、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）などが挙げられる。この組織培養培地には、細胞の分化を促進するために、血清、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−４）、二価カチオンなどが添加され得る。特定の実施形態では、この樹状細胞前駆体は、無血清培地中で培養され得る。このような培養条件は、必要に応じて任意の動物由来産物を排除し得る。代表的樹状細胞培養培地における代表的なサイトカインの組み合わせは、各々約５００単位／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４である。樹状細胞前駆体は、分化して未成熟樹状細胞を形成した場合、皮膚ランゲルハンス細胞に表現型的に類似する。未成熟樹状細胞は代表的に、ＣＤ１４−およびＣＤ１１ｃ＋であり、低レベルのＣＤ８６およびＣＤ８３を発現し、そして極性化されたエンドサイトーシスを介して可溶性抗原を捕捉し得る。
【００３６】
未成熟樹状細胞は成熟して成熟樹状細胞を形成する。成熟ＤＣは、抗原を取り込む能力を失い、発現がアップレギュレートされた補助刺激細胞表面分子および種々のサイトカインを提示する。特に、成熟ＤＣは、未成熟樹状細胞よりも高いレベルのＭＨＣクラスＩ抗原およびＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現し、そして成熟樹状細胞は、一般に、ＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋、およびＣＤ１４−であると同定される。より多くのＭＨＣ発現は、ＤＣ表面での抗原密度の増加をもたらし、一方、補助刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６のアップレギュレーションは、Ｔ細胞上の補助刺激分子（例えば、ＣＤ２８）の対応物を通して、Ｔ細胞活性化シグナルを強化する。
【００３７】
本発明の成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞を有効量または有効濃度のＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させることによって、調製（すなわち、成熟）され得る。有効量のＢＣＧは、代表的に、組織培養培地１ミリリットルあたり約１０５〜約１０７ｃｆｕの範囲に及ぶ。ＩＦＮγの有効量は代表的に、組織培養培地１ミリリットルあたり約１００〜約１０００Ｕの範囲に及ぶ。カルメットゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ；ＢＣＧ）は、Ｍ．ｂｏｖｉｓの無発病性株である。本明細書中で用いられる場合、ＢＣＧは、ＢＣＧ全体ならびに細胞壁構成成分、ＢＣＧ由来リポアラビドマンナン、および２型免疫応答の誘導に関連した他のＢＣＧ成分をいう。ＢＣＧは、必要に応じて不活化される（例えば、熱不活化ＢＣＧ、ホルマリン処理ＢＣＧなど）。
【００３８】
ＢＣＧは、ＩＬ−１２産生の阻害およびエンドサイトーシスによる抗原の排除に付随して、樹状細胞上の表面成熟マーカーＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を増大させる。何らかの特定の理論に束縛されることを意図しないが、ＢＣＧによる樹状細胞成熟はまた、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）のホモタイプな凝集および放出を含むと特徴付けられている（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｔｈｕｒｎｈｅｒら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７０：１２８−３４（１９９７）を参照のこと）。ＩＦＮγおよびＢＣＧを用いて未成熟樹状細胞を成熟させることは、ＩＬ−１２のＤＣ産生を促進し、そしてＩＬ−１０の産生を低減または阻害し、それによって、成熟樹状細胞に１型（Ｔｈ−１）応答をプライミングさせる。
【００３９】
この未成熟ＤＣを、代表的に、有効量のＢＣＧおよびＩＦＮγと、約１時間〜約２４時間にわたって接触させる。この未成熟樹状細胞は、適切な成熟培養条件において培養されて成熟し得る。適切な組織培養培地としては、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）などが挙げられる。これらの組織培養培地には、細胞の成熟を促進するために、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−４）、二価カチオンなどが補充され得る。代表的なサイトカインの組み合わせは、各々約５００単位／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４である。
【００４０】
樹状細胞の成熟は、当該分野で公知の方法によってモニタリングされ得る。細胞表面マーカーは、当該分野で通常のアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学など）において検出され得る。これらの細胞はまた、（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、または他の免疫アッセイによって）サイトカイン産生についてモニタリングされ得る。本発明に従って成熟したＤＣ集団では、ＩＬ−１２レベルは、ＩＬ−１０レベルよりも高く、１型（Ｔｈ−１）応答を促進する。例えば、このＤＣは、１：１より大きく、約１０：１または約１００：１までのＩＬ−１２／ＩＬ−１０比を生じ得る。成熟ＤＣはまた、飲細胞運動によって抗原を取り込む能力を失う。飲細胞運動は、当業者には通常の取り込みアッセイによって分析され得る。樹状細胞前駆体、未成熟樹状細胞、および成熟樹状細胞は、抗原を用いてプライミングされていようとプライミングされていなかろうと、後日の使用のために凍結保存され得る。凍結保存のための方法は、当該分野で周知である。例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，７８８，９６３号を参照のこと。
【００４１】
（抗原）
本発明による、成熟しプライミングされた樹状細胞は、抗原をＴ細胞に対して提示し得る。成熟しプライミングされた樹状細胞は、成熟の前または成熟の間のいずれかに、未成熟樹状細胞を所定の抗原と接触させることによって形成され得る。あるいは、（例えば、単離前にインビボで）抗原と既に接触した未成熟樹状細胞を、ＢＣＧおよびＩＦＮγを含む組成物と接触させて、１型（Ｔｈ−１）応答がプライミングされた成熟樹状細胞を形成し得る。
【００４２】
適切な所定の抗原は、Ｔ細胞活性化が所望される任意の抗原を含み得る。このような抗原は、例えば、細菌抗原、腫瘍特異性抗原または腫瘍関連抗原（例えば、細胞全体、腫瘍細胞溶解産物、腫瘍由来の単離抗原、融合タンパク質、リポソームなど）、ウイルス抗原、および任意の他の抗原または抗原（例えば、ペプチド抗原またはポリペプチド抗原）のフラグメントを包含し得る。特定の実施形態では、この抗原は、例えば、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、または前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）であり得るがこれらに限定されない（例えば、Ｐｅｐｓｉｄｅｒｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０：２４２８−３２（１９８０）；ＭｃＣｏｒｍａｃｋら，Ｕｒｏｌｏｇｙ  ４５：７２９−４４（１９９５）を参照のこと）。この抗原はまた、細菌細胞、細菌溶解産物、細胞溶解産物由来の膜フラグメント、または当該分野で公知の任意の他の供給源であり得る。この抗原は、組換えによって発現もしくは産生されてもよく、または化学的に合成されてすらよい。組換え抗原はまた、宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、脊椎動物細胞または哺乳動物細胞）の表面に発現されてもよく、溶解産物中に存在してもよく、またはこの溶解産物から精製されてもよい。
【００４３】
抗原はまた、被験体由来のサンプル中に存在し得る。例えば、被験体における過剰増殖状態または他の状態に由来する組織サンプルは、抗原供給源として用いられ得る。このようなサンプルは、例えば、生検または手術切開によって入手され得る。このような抗原は、溶解産物として、または単離された調製物として用いられ得る。あるいは、被験体（例えば、癌患者）の細胞または確立された細胞株の膜調製物はまた、抗原または抗原供給源として用いられ得る。
【００４４】
例示的な実施形態では、手術標本から収集された前立腺腫瘍細胞の溶解産物は、抗原供給源として用いられ得る。例えば、生検または手術切開によって得られた、癌患者自体の腫瘍のサンプルは、抗原を樹状細胞に提示するため、または抗原提示用細胞溶解産物を提供するために、直接的に用いられ得る。あるいは、癌患者の腫瘍細胞の膜調製物が用いられ得る。この腫瘍細胞は、前立腺の腫瘍細胞、肺の腫瘍細胞、卵巣の腫瘍細胞、結腸の腫瘍細胞、脳の腫瘍細胞、黒色腫、または任意の他の種類の腫瘍細胞であり得る。溶解産物および膜調製物は、当該分野で公知の方法によって、単離された腫瘍細胞から調製され得る。
【００４５】
別の例示的実施形態では、精製または半精製された前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ、ＰＳＭ抗原としても公知）は、モノクローナル抗体７Ｅ１１−Ｃ．５と特異的に反応し、抗原として用いられ得る（一般的に、Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３７：１１５−３２（１９８３）、米国特許第５，１６２，５０４号；米国特許第５，７８８，９６３号；Ｆｅｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３２：（Ａｂｓ．１４１８）２３８（１９９１）を参照のこと；これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）。なお別の例示的実施形態では、アミノ酸残基配列Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ（配列番号１）を有する抗原性ペプチド（ＰＳＭ−Ｐ１と称される）は、ＰＳＭＡのアミノ酸残基４〜１２に対応し、抗原として用いられ得る。あるいは、アミノ酸残基配列Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ（配列番号２）を有する抗原性ペプチド（ＰＳＭ−Ｐ２と称される）は、ＰＳＭＡのアミノ酸残基７１１〜７１９に対応し、抗原として用いられ得る。
【００４６】
特定の実施形態では、アミノ酸残基配列Ｘａａ  Ｌｅｕ（またはＭｅｔ）Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｖａｌ（またはＬｅｕ）（ＰＳＭ−ＰＸと称される）を有する抗原性ペプチド（ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す）は、抗原として用いられ得る。このペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０２０１結合モチーフ、すなわち、ＨＬＡ−Ａ２患者において見出される「アンカー残基」ロイシンおよびバリンを有する９〜１０アミノ酸残基の結合モチーフに似る（例えば、Ｇｒｅｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙｓ  ２２：３７−４９（１９９５）を参照のこと）。このペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２＋患者についての抗原として用いられ得る（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ「Ａｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ」，第６．３節，Ｔｓｕｊｉ，Ｋ．ら（編），Ｔｏｋｙｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１０６６−１０７７頁を参照のこと）。同様に、他のＨＬＡ結合モチーフに似るペプチドが用いられ得る。
【００４７】
代表的に、未成熟樹状細胞は、上記のように、適切な成熟条件下で、ＢＣＧ、ＩＦＮγおよび所定の抗原の存在下で培養される。必要に応じて、この未成熟樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４または成熟因子を含まない代表的樹状細胞培養培地中で、所定の抗原と混合され得る。この抗原との少なくとも約１０分間〜２日間の培養後、この抗原は除去され得、そしてＢＣＧおよびＩＦＮγが補充された培養培地が添加され得る。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）はまた、成熟培地に添加され得る。樹状細胞を接触させるための方法は、当該分野で一般に公知である（一般的に、ＳｔｅｅｌおよびＮｕｔｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３５１−６０（１９９８）；Ｔａｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４２３７−４４（１９９７）；ＤｏｚｍｏｒｏｖおよびＭｉｌｌｅｒ，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：１８７−９６（１９９７）；Ｉｎａｂａら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１６６：１８２−９４（１９８７）；Ｍａｃａｔｏｎｉａら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１６９：１２５５−６４（１９８９）；Ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３０１３−２０（１９９２）を参照のこと；これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）。
【００４８】
次いで、得られる成熟しプライミングされた樹状細胞は、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）と共存インキュベートされる。Ｔ細胞またはＴ細胞サブセットは、レスポンダー細胞として使用するために種々のリンパ組織から入手され得る。このような組織としては、脾臓、リンパ節、および／または末梢血が挙げられるがこれらに限定されない。これらの細胞は、成熟しプライミングされた樹状細胞とともに、混合Ｔ細胞集団として、または精製されたＴ細胞サブセットとして共存培養され得る。Ｔ細胞精製は、ＣＤ２に対する抗体、ＣＤ３に対する抗体、ＣＤ４に対する抗体、ＣＤ８に対する抗体などの使用を含むがこれらに限定されない、ポジティブ選択またはネガティブ選択によって達成され得る。
【００４９】
Ｔ細胞を、成熟しプライミングされた樹状細胞と接触させることによって、抗原反応性か活性化された、極性化Ｔ細胞または極性化Ｔリンパ球が提供される。本明細書中で用いられる場合、用語「極性化（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）」とは、高レベルのＩＦＮγを産生するか、さもなければ１型（Ｔｈ−１）応答を誘導するようにプライミングされているＴ細胞をいう。このような方法は、代表的に、未成熟樹状細胞をＢＣＧおよびＩＦＮγと接触させて、成熟しプライミングされた樹状細胞を調製する工程を包含する。この未成熟樹状細胞を、成熟の間または成熟前に所定の抗原と接触させ得る。この未成熟樹状細胞は、成熟の間、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）とともに共存培養されてもよく、または、成熟および１型応答を誘導するための樹状細胞のプライミングの後にＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）と共存培養されてもよい。この未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞は、成熟前に富化され得る。さらに、Ｔ細胞は、樹状細胞との接触前にリンパ球集団から富化され得る。特定の実施形態では、富化または精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団を、この樹状細胞と接触させる。成熟し、プライミングされた樹状細胞とＴ細胞との共存培養は、特異的Ｔ細胞の刺激をもたらし、この特異的Ｔ細胞は、成熟して、抗原反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞または抗原反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞になる。
【００５０】
別の局面では、Ｔ細胞を、１型（Ｔｈ−１）Ｔ細胞応答を誘導することに向けてプライミングされた成熟樹状細胞の存在下で培養することによる、インビトロでのＴ細胞の再刺激のための方法が提供される。このようなＴ細胞は、フィーダー細胞上で必要に応じて培養され得る。成熟しプライミングされた樹状細胞は、Ｔ細胞との接触前に必要に応じて照射され得る。適切な培養条件は、１以上のサイトカイン（例えば、精製されたＩＬ−２、コンカナバリンＡ刺激脾臓細胞上清、またはインターロイキン１５（ＩＬ−１５））を含み得る。未成熟樹状細胞、ＢＣＧ、ＩＦＮγおよび所定の抗原の添加による、インビトロでのＴ細胞再刺激は、Ｔ細胞集団の増大を促進するために用いられ得る。
【００５１】
安定な抗原特異的、極性化Ｔ細胞培養物またはＴ細胞株は、周期的再刺激によってインビトロで長期間にわたり維持され得る。このようにして作製されたＴ細胞培養物またはＴ細胞株は、保存され得、そして（例えば、凍結保存剤を用いた処方および凍結によって）貯蔵される場合、活性化された極性化Ｔ細胞を長期にわたって所望の間隔で再供給するために用いられ得る。
【００５２】
特定の実施形態では、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、本発明の方法に従って作製され得る。代表的に、抗原反応性の極性化Ｔ細胞を作製するために用いられる、成熟しプライミングされた樹状細胞は、投与されるべき被験体に対して同質遺伝子的である（例えば、この被験体から入手される）。あるいは、意図されるレシピエント被験体と同じＨＬＡハプロタイプを有する樹状細胞は、ＨＬＡが一致したドナー由来の非癌性細胞（例えば、正常細胞）を用いてインビトロで調製され得る。特定の実施形態では、抗原反応性Ｔ細胞（ＣＴＬ細胞およびＴｈ−１細胞を含む）は、免疫刺激のための細胞供給源としてインビトロで増大される。
【００５３】
（細胞集団のインビボでの投与）
本発明の別の局面では、成熟しプライミングされた樹状細胞もしくは活性化され極性化したＴ細胞、またはこのような細胞を含む細胞集団を、免疫刺激の必要がある被験体に投与するための方法が提供される。このような細胞集団は、成熟しプライミングされた樹状細胞集団および／または活性化され極性化したＴ細胞集団の両方を包含し得る。特定の実施形態では、このような方法は、樹状細胞前駆体または未成熟樹状細胞を入手し、これらの細胞を、ＢＣＧ、ＩＦＮγおよび所定の抗原の存在下で分化および成熟させて、Ｔｈ−１応答に対してプライミングされた成熟樹状細胞集団を形成させることによって実施される。この未成熟樹状細胞を、成熟前または成熟の間に抗原と接触させ得る。このような成熟しプライミングされた樹状細胞は、免疫刺激の必要がある被験体に直接的に投与され得る。
【００５４】
関連した実施形態では、この成熟しプライミングされた樹状細胞を、被験体由来のリンパ球と接触させて、このリンパ球集団内のＴ細胞を刺激し得る。この活性化され極性化されたリンパ球は、必要に応じて続いて抗原反応性のＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞培養物中でクローン増大が行われ、免疫刺激の必要がある被験体に投与され得る。特定の実施形態では、活性化され極性化されたＴ細胞は、この被験体に対して自己である。
【００５５】
別の実施形態では、この樹状細胞、Ｔ細胞、およびレシピエント被験体は、同じＭＨＣ（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する。被験体のＨＬＡハプロタイプを決定する方法は、当該分野で公知である。関連の実施形態では、この樹状細胞および／またはＴ細胞は、このレシピエント被験体に対して同種異系である。例えば、この樹状細胞は、このＴ細胞およびこのレシピエントに対して同種異系であり得、これは、同じＭＨＣ（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する。この同種異系細胞は代表的に、少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子が一致している（例えば、少なくとも１つだが全てではないＭＨＣ対立遺伝子を共有する）。それほど代表的でない実施形態では、この樹状細胞、Ｔ細胞およびレシピエント被験体は全て、互いに対して同種異系であるが、全て、少なくとも１つの共通のＭＨＣ対立遺伝子を共通に有する。
【００５６】
１つの実施形態によれば、このＴ細胞は、この未成熟樹状細胞を得たのと同じ被験体から得られる。インビトロでの成熟および極性化の後、この自己Ｔ細胞は、既存の免疫応答を誘発および／または増強するためにこの被験体に投与される。例えば、Ｔ細胞は、（例えば、体表面積１ｍ２あたり約１０８〜１０９細胞の用量での）静脈内注入によって投与され得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｒｉｄｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：２３８−４１（１９９２）を参照のこと）。注入は、所望の間隔で（例えば、毎月）繰り返され得る。レシピエントは、有害な影響の何らかの証拠について、Ｔ細胞注入の間およびその後、モニタリングされ得る。
【００５７】
別の実施形態によれば、本発明に従ってＢＣＧおよびＩＦＮγを用いて成熟させた樹状細胞は、腫瘍または標的抗原を含む他の組織中に直接的に注射され得る。このような成熟細胞は、抗原を取り込んでこの抗原をＴ細胞に対してインビボで提示し得る。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例を、本発明の種々の局面の単に例示として提供し、そして本発明を如何様にも限定すると解釈すべきでない。
【００５９】
（実施例１：異なる成熟条件下でのＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生：）
本実施例では、サイトカイン産生を、成熟因子ＢＣＧおよび／またはＩＦＮγと接触させた未成熟樹状細胞集団から決定した。未成熟ＤＣを、１％ヒト血漿を補充したＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の存在下で末梢血単球をプラスチックと接触させることによって調製した。未結合の単球を、洗浄によって除去した。結合した単球を、１ミリリットルあたり５００Ｕ  ＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ  ＩＬ−４の存在下で６日間にわたってＸ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）培地中で培養した。
【００６０】
第１研究では、未成熟樹状細胞を、不活化ＢＣＧの添加によって成熟させた。得られる成熟樹状細胞のサイトカイン産生を決定した。不活化ＢＣＧを、種々の濃度で、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）培地中の未成熟樹状細胞に添加し、続いて３７℃にて２４時間培養した。４．１×１０８ｃｆｕ／ｍｌストックから開始した、１ミリリットルあたりで添加したＢＣＧの希釈を、表に指定する。サイトカイン産生を、検出されるべきサイトカインに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。手短に述べると、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２またはＩＬ−１０）に対して特異的な抗体を用いて、固体表面のサイトカインを捕捉する。次いで、この固体表面を、このサイトカインに対する第２の標識抗体で処理して、捕捉されたサイトカインの存在を検出する。第２の抗体は、代表的に、酵素で標識されて、比色アッセイによる検出を容易にする。代表的な実験の結果を、以下の表１に下記に示す。サイトカインの量、すなわちサイトカイン産生を、ｐｇ／ｍｌとして示す。
【００６１】
【表１】
2005505270.tif 000002
表１を言及して、この結果は、ＢＣＧの添加が、サイトカインＩＬ−１２、ＩＬ−１０、またはそれらのサブユニットの産生を増大させ得るが、サイトカイン産生の相対レベルおよび絶対レベルの両方がドナー依存性であることを実証する。最大レベルの増加が、ＩＬ−１２  ｐ４０およびＩＬ−１０について見られ、このことは、ＩＬ−１２  ｐ４０のレベルと比較して低レベルの、観察されたＩＬ−１２  ｐ７０（ｐ３５サブユニットおよびｐ４０サブユニットから構成される）が、ＩＬ−１２  ｐ３５産生の欠除に起因することを示唆した。ＢＣＧが存在する１つの条件を除く全ての条件において、ＩＬ−１２  ｐ７０レベル：ＩＬ−１０レベルの比は、１以下である。このことは、ＢＣＧ単独の存在下での未成熟樹状細胞の成熟が、ナイーブＴ細胞をＴｈ−２  応答に向けて極性化させるようであることを示す。
【００６２】
同様の条件下でＩＦＮγを導入することの効果もまた決定した。これを、以下の表２に提示する。サイトカイン産生を上記の通りに測定した。表１と表２とを比較して、成熟因子（例えば、ＢＣＧ）の存在下でのＩＦＮγの添加が、ＩＬ−１２  ｐ７０の産生を増大させたことが明らかである。特に、成熟の間でのＢＣＧを伴うＩＦＮγの添加は、ＩＬ−１２  ｐ３５産生を増大させ、そしてＩＬ−１０産生を減少させた。その結果、ＩＬ−１２  ｐ７０：ＩＬ−１０の比は、ＢＣＧとともにＩＦＮγを添加すると、いつも１より大きかった。何人かのドナーでは、および特定の条件下では、ＩＬ−１２  ｐ７０産生：ＩＬ−１０産生の比は、ＢＣＧを伴うＩＦＮγの添加によって１００：１より大きく増大し得る。従って、これらの結果は、驚くことに、成熟因子ＢＣＧを伴うＩＦＮγの添加が、ＩＬ−１２  ｐ７０産生を劇的に増大させ得ることを実証する。
【００６３】
【表２】
2005505270.tif 000003
（実施例２：ＩＦＮγによるＩＬ−１０のダウンレギュレーションは、用量依存性である：）
本実施例では、ＢＣＧと組み合わせたＩＦＮγが、樹状細胞集団におけるＩＬ−１０産生をダウンレギュレートする能力を実証する。未成熟樹状細胞を、上記の通りに調製した。これらの未成熟樹状細胞を単独でインキュベートし、２つのうちの１つの濃度のＢＣＧ（１：１０００希釈または１：２５０希釈の４．１×１０８ｃｆｕ／ｍｌストック）の存在下で、または１ミリリットルあたり０Ｕ〜１０００Ｕの範囲の濃度のＩＦＮγ単独に曝露して、成熟させた。得られる樹状細胞によるＩＬ−１０産生を、市販の抗体（例えば、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ製）を用いたＥＬＩＳＡ（前出）によって測定し、そしてｐｇ／ｍｌで報告した。コントロールでは、単独で培養した未成熟ＤＣ（ＢＣＧもＩＦＮγも添加しない）は、検出可能なＩＬ−１０を産生しなかった。対照的に、ＩＦＮγ単独の存在下で培養したＤＣは、少量のＩＬ−１０（約２０〜３０ｐｇ／ｍｌ）を産生した。産生されたＩＬ−１０の量は、１ミリリットルあたり１０Ｕ〜１０００ＵのＩＦＮγの範囲にわたって用量依存性ではなかった。
【００６４】
対照的に、ＢＣＧ単独の存在下での成熟によって産生されたＤＣは、顕著な量のＩＬ−１０を産生した：１：１０００または１：２５０倍希釈のＢＣＧストックの存在下、それぞれ、約１５０ｐｇ／ｍｌまたは２５０ｐｇ／ｍｌを超えるＩＬ−１０。ＤＣ成熟の間のＢＣＧへのＩＦＮγの添加は、ＩＬ−１０産生のダウンレギュレーションを用量依存性様式でもたらした。１：１０００希釈のＢＣＧの存在下で培養したＤＣについては、ＩＬ−１０産生は、約１５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１０（ＩＦＮγなし）から約２０〜３０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１０（１０００Ｕ  ＩＦＮγ）へと減少した。１：２５０希釈のＢＣＧの存在下で培養したＤＣについては、ＩＬ−１０産生は、約２７０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１０（ＩＦＮγなし）から約５０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１０（１０００Ｕ  ＩＦＮγ）へと減少した。従って、ＢＣＧおよびＩＦＮγの存在下での未成熟ＤＣの成熟は、ＩＬ−１０産生をダウンレギュレーションし得、そしてＢＣＧ単独によって誘導されるＩＬ−１０産生の見かけの刺激を克服し得た。
【００６５】
（実施例３：ＩＦＮγによるＩＬ−１２のアップレギュレーションは、用量依存性である：）
本実施例では、ＩＦＮγがＩＬ−１２産生をアップレギュレートする能力が実証された。未成熟樹状細胞を、上記のように、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で増殖させた単球の６日間培養物から誘導した。これらの未成熟ＤＣを、種々の希釈のＢＣＧ単独を用いて、または種々の濃度のＩＦＮγと組み合わせたＢＣＧを用いてさらに２日間処理した。培養上清を、ＩＬ−１２  ｐ７０の存在について、上記の通りに、ＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。
【００６６】
代表的実験による結果を図１に示す。各培養物について、この結果を３連で決定した。増加する量のＢＣＧ単独に応答して、比較的低い（＜１０００ｐｇ／ｍｌの）平均濃度のＩＬ−１２  ｐ７０がこれらの成熟ＤＣによって産生された。ＩＬ−１２産生の量は、ＢＣＧの量が増加するにつれて用量依存様式で減少した。対照的に、ＢＣＧ（ストックの１：１０００希釈物）を有するＩＦＮγ（１０Ｕ／ｍｌ）の添加によって、ＩＬ−１２の量は、約５０００ｐｇ／ｍｌまで劇的に増加した。ＢＣＧ（ストックの１：１０００希釈物）を有するＩＦＮγ（１００Ｕ／ｍｌ）の添加によって、ＩＦＮγの量は、ほぼ２０，０００ｐｇ／ｍｌまで増加した。ＢＣＧを有する５００Ｕ／ｍｌまたは１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ（ストックの１：１０００希釈物）の添加は、それぞれ、約２１，０００ｐｇ／ｍｌおよび約２２，０００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１２レベルをもたらす。
【００６７】
まとめると、ＢＣＧは単独では、ＩＬ−１２産生を拮抗するようであるが、ＢＣＧおよびＩＦＮγの存在下での未成熟ＤＣの成熟は、ＩＬ−１２産生を劇的に増加させた。
【００６８】
（実施例４：抗原特異的Ｔ細胞の刺激：）
本実施例では、ＢＣＧおよびＩＦＮγの存在下で成熟させた未成熟ＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を刺激することが示された。インフルエンザＡに特異的なＴ細胞株を、２×１０６細胞／ｍｌの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を５％ヒト血清を補充したＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地中で５μｇ／ｍｌのインフルエンザＭ１ペプチド（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；配列番号３）とともにインキュベートすることによって作製した。これらの培養条件は、インフルエンザＭ１ペプチドに特異的なＴ細胞の選択的増大をもたらした。２日間の培養後、２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２および５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５をこれらの培養物に添加した。約７〜１４日間の培養後、これらのＴ細胞株を、サイトカインを含まない培地中に一晩配置した。
【００６９】
次いで、抗原特異的Ｔ細胞を、未成熟ＤＣとともに、ＢＣＧ単独を用いて成熟させたＤＣとともに、またはＢＣＧおよびＩＦＮγを用いて成熟させたＤＣとともに、共存培養した。抗原特異的Ｔ細胞：ＤＣの比は、１：１であった。Ｔ細胞およびＤＣを、３７℃にて２４時間インキュベートした。これらのＤＣは、インフルエンザＭ１ペプチドが直接的にローディングされるかまたは浸透圧的にローディングされるかのいずれかであった。手短に述べると、未成熟ＤＣを培養フラスコから収集し、そして遠心分離によって濃縮した。浸透圧ローディングについては、これらの細胞を、小容量の高浸透圧培地中に再懸濁し、続いてＰＢＳ中の等容量のインフルエンザＭ１ペプチドを添加した。氷上での１０分間のインキュベーションの後、これらの細胞を徹底的に洗浄した。直接的ローディングについては、これらの細胞を、等容量のＸ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）培地およびＰＢＳ中のインフルエンザＭ１ペプチド中に再懸濁し、３７℃で１時間にわたってインキュベートした。これらの細胞を、３７℃にて２時間にわたってインキュベートして、抗原プロセシングを可能にした。
【００７０】
Ｔ細胞およびＤＣの共存培養後、Ｔ細胞応答を、培養上清の１００μｌサンプルからのＩＦＮγのＥＬＩＳＡ定量によって測定した。この結果は、ＣＤローディングの方法にかかわらず、ＢＣＧおよびＩＦＮγで刺激したＤＣが、抗原特異的Ｔ細胞の優れた刺激因子であることを示す。未成熟ＤＣとともに共存培養したＴ細胞は、極めてわずかなＩＦＮγ（＜２，０００ｐｇ／ｍｌ）を産生し、一方、ＢＣＧ単独を用いて成熟させたＤＣとともに共存培養したＴ細胞は、ＩＦＮγの中程度の生産者であった（＞５，０００ｐｇ／ｍｌ）。ＢＣＧおよびＩＦＮγを用いて成熟させたＤＣとともに共存培養したＴ細胞は、高レベルのＩＦＮγ（浸透圧によってローディングしたＤＣについて＞２０，０００ｐｇ／ｍｌ、または直接的にローディングしたＤＣについて＞２５，０００ｐｇ／ｍｌ）を産生した。
【００７１】
従って、ＢＣＧおよびＩＦＮγを用いて成熟させたＤＣは、ＤＣに抗原をローディングする方法とは独立して、抗原特異的Ｔ細胞のより良好な刺激因子であった。
【００７２】
（実施例５：インビトロでの抗原特異的Ｔ細胞応答のデノボ作製：）
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に特異的なＴ細胞株を、ＢＣＧ、またはＢＣＧおよびＩＦＮγのいずれかを用いて成熟させたＤＣを用いて、ＰＢＭＣを刺激することによって作製し、ＫＬＨまたはコントロールタンパク質を、１０：１のＴ細胞：ＤＣ比でローディングした。Ｔ細胞および成熟させたＤＣに、新鮮な培地（５％ヒトＡＢ血清、２０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２、および５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１５を補充したＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地）を３〜４日毎に提供した。これらの細胞を、必要に応じて、より大きなフラスコへと増大させた。特定の抗原に対する前駆体頻度全体が低く、ナイーブ細胞は応答するために強力な刺激を必要とするので、刺激を、１０〜２１日間の間隔で３〜４回繰り返した。細胞をサイトカインを含まない培地中で一晩回復させた後に再刺激した。
【００７３】
標準的な３日間のチミジン取り込みアッセイを用いて、刺激Ｔ細胞株をＫＬＨ特異的細胞増殖について試験した。刺激されたＴ細胞を、ＫＬＨパルス未成熟樹状細胞を用いて、種々のＤＣ：Ｔ細胞比でインキュベートした。Ｔ細胞増殖を、１分間あたりのカウント（ＣＰＭ）として測定した。刺激に応答した、細胞増殖またはサイトカインの産生を、抗原特異的応答の証拠と解釈した。抗原特異性について制御するために、ネガティブコントロールの抗原（インフルエンザＡウイルス）もまたこのアッセイに含めた。
【００７４】
ＢＣＧ単独によって成熟させたＤＣを用いてＴ細胞を刺激する場合、Ｔ細胞増殖は一貫して低かった（＜５，０００ＣＰＭ）。この低レベルの増殖は、ＤＣをＫＬＨと接触させようがインフルエンザＡウイルスと接触させようが、低かった。低レベルの増殖もまた、未成熟ＤＣを用いたインキュベーションに応答して観察された。５０：１、２５：１、または１２．５：１の応答者：刺激者（Ｔ細胞：ＤＣ）の比で用いた３つの群のＤＣの間に顕著な差は観察されなかった。対照的に、ＢＣＧおよびＩＦＮγを用いて成熟させた樹状細胞を用いてＴ細胞を刺激し、ＫＬＨパルスＤＣは、インフルエンザＡでパルスした未成熟ＤＣまたは成熟ＤＣが誘導するよりも一貫してさらに多いＴ細胞増殖を誘導した（約１０，０００〜３３，０００ＣＰＭ）。ＫＬＨ抗原でパルスした成熟ＤＣについては、Ｔ細胞増殖は、応答者：刺激者の比の増大に比例して増加した。
【００７５】
Ｔ細胞エフェクター機能もまた、サイトカイン分泌によってモニタリングされた。ＫＬＨ特異的Ｔ細胞株（上記の通りに作製された）を、ＢＣＧ単独またはＢＣＧおよびＩＦＮγのいずれかを用いて成熟させたＤＣを用いて刺激した。刺激されたＴ細胞株を抗ＣＤ３抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）を用いて非特異的に刺激した後、これらの細胞を、細胞内サイトカイン染色によってサイトカイン産生について試験した。サイトカイン産生を、特定のサイトカインを産生する細胞の百分率として測定した。極めて低い百分率から検出不可能な百分率（＜＜５％）のサンプリング細胞は、細胞内ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、またはＩＬ−１０を産生した。ＩＬ−５およびＩＬ−１０は、ＢＣＧおよびＩＦＮγを用いて成熟させたＤＣによって刺激されたＴ細胞において検出されなかった。ＢＣＧ単独によって成熟させたＤＣによって刺激されたＴ細胞は、低レベルのＩＦＮγ（＜１０％）およびＴＮＦ−α（＜１５％）を産生した。対照的に、ＩＦＮγおよびＢＣＧを用いて成熟させたＤＣを用いて刺激された有意な比率のＴ細胞は、ＩＦＮγ（約３５％）およびＴＮＦα（＞４５％）を産生した。ＩＦＮγは、ＩＬ−１２産生の公知の刺激因子である。従って、ＢＣＧおよびＩＦＮγを用いて成熟させたＤＣを用いてＴ細胞を刺激することによって、これらのＴ細胞は、１型（Ｔｈ−１）応答に向けて極性化される。
【００７６】
（実施例６：Ｔｈ−１サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の誘導：）
本実施例では、ＢＣＧおよびＩＦＮγの組み合わせが１型サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）をアップレギュレートする能力が実証された。手短に述べると、未成熟樹状細胞を上記の通りに誘導し、そしてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で増殖させた（ｐｒｏｗｎ）。これらの未成熟ＤＣを、約２４時間にわたってＢＣＧ単独またはＩＦＮγとの組み合わせのいずれかとともに培養した。続いて、タンパク質輸送インヒビター（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇＴＭ，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を添加して、ゴルジ複合体から産生されたサイトカインの輸送をブロックし、そしてこれらの細胞を一晩インキュベートした。次いで、これらの細胞を、当該分野で周知の方法を用いて、収集し、透過性にし、そしてＴＮＦαについて特異的な蛍光標識抗体またはアイソタイプコントロール抗体を用いて内部染色した。ＴＮＦαについてＤＣポジティブの頻度およびこれらの細胞の蛍光強度を、ＦＡＣＳ分析によって決定した（表３）。ＩＦＮγの存在下でＢＣＧを用いてＤＣの成熟は、ＤＣがＴｈ−１サイトカインＴＮＦαを産生する能力を増強することが見出された。
【００７７】
【表３】
2005505270.tif 000004
（実施例７：細胞関連抗原に対する応答の誘導：）
本実施例では、ＢＣＧおよびＩＦＮγの存在下で成熟させたＤＣは、ＢＣＧ単独を用いて成熟させたＤＣと比較して、有意に高い腫瘍特異性Ｔ細胞ＩＮＦγ放出および類似のレベルの抗原特異的細胞傷害性を惹起することが実証された。未成熟樹状細胞を上記の通りに単離し、そしてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で培養した。次いで、これらのＤＣに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはインフルエンザＡウイルスのＭ１タンパク質のいずれかを発現する組換えアデノウイルスで予め感染させた腫瘍細胞（Ａ５４９）全体のいずれかをローディングした。これらのＤＣを、ＢＣＧまたはＩＦＮγと組み合わせたＢＣＧのいずれかを用いて２４時間後に成熟させた。腫瘍をローディングしたＤＣもしくはＧＦＰまたはＭ１発現腫瘍細胞を用いて、自己Ｍ１特異的Ｔ細胞株を刺激した。２４時間後、細胞培養上清を収集し、そして標準的ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡを行った。Ｍ１発現腫瘍細胞をローディングしたＤＣのみがＩＦＮγ放出を刺激し得、そしてＢＣＧ＋ＩＦＮγにおいて成熟させたＤＣは、この応答を誘導する際に、未成熟ＤＣまたはＢＣＧ成熟ＤＣのいずれかよりも有意により強力であった。
【００７８】
【表４】
2005505270.tif 000005
上記の実施例は、本願発明の範囲を例示するために提供されるが、本願発明の範囲を限定しない。本発明の他の改変体は、当業者に容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の参考文献は、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】記載なし。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505270.tif 000043
【国際調査報告】
2005505270.tif 000044