(57)【要約】本発明は、疾患（例えば、白血病および癌）の診断および治療のための組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、ネイティブのＷＴ１の免疫原性部分またはその改変体（これは、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なる）を含むポリペプチドを提供する。本発明の特定の実施形態において、このポリペプチドは、ＷＴ１ポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を含み、その免疫原性部分は、ＷＴ−１のアミノ酸２〜２８１内に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、配列番号４１４〜４５０、４７８および５０２またはそれらの改変体からなる群から選択される、Ｗｉｌｍｓ腫瘍抗原の免疫原性部分を含み、該改変体は、ＷＴ１特異的抗血清および／もしくはＴ細胞株またはクローンと反応する該改変体の能力が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入が異なる、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドであって、前記免疫原性部分が、ＭＨＣ分子に結合する前記免疫原性部分の能力が該免疫原性部分の能力よりも増加されるように、改変されている、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載の単離されたポリペプチドであって、前記免疫原性部分が、ＨＬＡ−Ａ２に結合する前記免疫原性部分の能力が改変されていない免疫原性部分の能力よりも増加されるように、改変されている、単離されたポリペプチド。
【請求項４】
プロリンリッチ領域の欠失を有するＷｉｌｍｓ腫瘍抗原を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記プロリンリッチ領域が、前記Ｗｉｌｍｓ腫瘍抗原のアミノ酸位置約５４〜６８である、請求項４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号４７８および５０２の任意の１つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
請求項１、２または４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載の融合タンパク質であって、前記融合パートナーが、Ｒａ１２、プロテインＤ、ＬＹＴＡ、ＨＩＳタグ、エンドソーム／リソソーム画分にポリペプチドを方向付け得る標的化シグナル、ツインアルギニントランスロケータ、および短縮型ツインアルギニントランスロケータからなる群から選択される、融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、ツインアルギニントランスロケータシグナルペプチドを含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合パートナーが、配列番号５０４および５０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記融合タンパク質が、配列番号４５３、４５５、４７０、４７９〜４８３および４９９の任意の１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項７、９および１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化されたコドンである、請求項１２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４５２、４５４、４６９、４７１および４７２〜４７７ならびに５０３、５０５の任意の１つの配列を含む、請求項１２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、請求項１、４、６または１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ワクチン。
【請求項１６】
非特異的免疫応答エンハンサーと組み合わせて、請求項１、４、６または１１のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１７】
前記非特異的免疫応答エンハンサーが、患者におけるＴ細胞応答を優先的に増大する、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１８】
請求項１５に記載のワクチンであって、前記免疫応答エンハンサーが、３ｄ−ＭＰＬ、ＭＰＬ、ＲＣ−５２９、ＡＧＰ、Ｍａｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５０、Ｓｅｐｐｉｃ  Ｍａｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０、サイトカイン、マイクロスフェア、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）ベースのアジュバント、ＡＳ−１、ＡＳ−２、Ｒｉｂｉアジュバント系ベースのアジュバント、ＱＳ２１、サポニンベースのアジュバント、微小流体形態のＳｙｎｔｅｘアジュバント、ＭＶ、ｄｄＭＶ、免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）ベースのアジュバントおよび不活性化毒素からなる群から選択される、ワクチン。
【請求項１９】
発現制御配列に作動可能に連結された請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２１】
Ｗｉｌｍｓ腫瘍抗原の免疫原性部分を含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２に結合する該ポリペプチドの能力が増加されるように改変されており、そしてここで該ポリペプチドの免疫原性が、配列番号２４１の免疫原性よりも増加されている、単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載の単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号４１４〜４５０のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
前記改変が、配列番号２４１の１〜９位の任意の１つにおける１つ以上の置換を含む、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
前記改変が、配列番号２４１の６位（Ｐ６）における置換を含む、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、配列番号４４５に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
前記改変が、配列番号２４１の９位（Ｐ９）における置換を含む、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、配列番号４２６に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
動物における免疫応答を誘導する方法であって、以下：
（ａ）該動物に、第１のウイルスベクターを含有する第１の組成物を投与する工程であって、該第１のウイルスベクターが、発現制御配列に作動可能に連結されたＷＴ１ポリヌクレオチドの少なくとも免疫原性部分を含む、工程；
（ｂ）該動物に、第２のウイルスベクターを含有する第２の組成物を投与する工程であって、該第２のウイルスベクターが、発現制御配列に作動可能に連結されたＷＴ１ポリヌクレオチドの少なくとも免疫原性部分を含む、工程；および
それによって、該動物における免疫応答を誘導する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記第１および第２のウイルスベクターが、ワクシニアベクター、鶏痘ベクターおよびアデノウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のウイルスベクターが、組換えワクシニアベクターを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のウイルスベクターが、ｒＶ−ＷＴ／ＴＲＩＣＯＭを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２のウイルスベクターが、組換え鶏痘ベクターを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のウイルスベクターが、ｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１および第２のウイルスベクターが、同時刺激性分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記同時刺激性分子が、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の組成物が、第１の時点で投与され、引き続いて、前記第２の組成物が、第２および第３の時点で投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
患者において免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、該患者に、４１４〜４５０、４５３、４５５、４７０、４７８、４７９〜４８３、４９９および５０２の任意の１つに記載されるアミノ酸配列を含む第１の成分、ならびに薬学的に受容可能なキャリアまたは免疫刺激剤のいずれか１つまたは両方から選択される第２の成分を含有する組成物を投与する工程、を包含する、方法。
【請求項３８】
患者において免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、該患者に、４１４〜４５０、４５３、４５５、４７０、４７８、４７９〜４８３、４９９および５０２のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む第１の成分、ならびに４１４〜４５０、４５３、４５５、４７０、４７８、４７９〜４８３、４９９および５０２のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む第２の成分を含有する組成物を投与する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府の助成による研究または開発に関する陳述）
本発明は、部分的に、ＮＩＨ  ＳＢＩＲ  第Ｉ期助成金番号ＩＲ４３  ＣＡ８１７５２−０１Ａ１の下で、政府支援によってなされた。連邦政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は、一般に悪性疾患（例えば、白血病および癌）の免疫療法に関する。より詳細には、本発明は、ＷＴ１に対する免疫応答を生じるかまたは増強するための組成物、ならびに悪性疾患を予防および／または処置するためのそのような組成物の使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
癌および白血病は、米国内および世界中で重大な健康問題である。そのような疾患の検出および処置における前進がなされてきたが、ワクチンまたは癌および白血病の予防または処置のための他の普遍的に首尾良い方法は、現在のところ利用可能ではない。これらの疾患の管理は、現在のところ、早期診断および積極的な処置の組合せに依存し、これは、種々の処置（例えば、手術、放射線治療、化学療法およびホルモン療法）のうちの１つ以上を含み得る。特定の癌のための処置方針は、特定の腫瘍マーカーの分析を含む種々の予後変数に基づいて頻繁に、選択される。しかし、確立されたマーカーの使用は、頻繁に、解釈するのが困難な結果を導き、そして多くの癌患者において高い致死率が観察され続けている。
【０００４】
免疫療法は、癌および白血病の処置および生存率を実質的に改善する能力を有する。最近のデータによって、白血病は、骨髄移植の関連で免疫療法（例えば、ドナーリンパ球注入）によって治癒され得ることが実証される。そのような治療は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する免疫応答の生成または増強を含み得る。しかし、現在までのところ、比較的わずかなＴＡＡしか既知ではなく、そしてそのような抗原に対する免疫応答の生成は、まれに例外が存在するが、治療的に有益であるとは示されていない。
【０００５】
従って、白血病および癌の予防および治療のための改善された方法についての当該分野における必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
簡潔に述べると、本発明は、疾患（例えば、白血病および癌）の診断および治療のための組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、ネイティブのＷＴ１の免疫原性部分またはその改変体（これは、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なる）を含むポリペプチドを提供する。本発明の特定の実施形態において、このポリペプチドは、ＷＴ１ポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を含み、その免疫原性部分は、ＷＴ−１のアミノ酸２〜２８１内に含まれる。特定の実施形態において、このポリペプチドは、ネイティブＷＴ１ポリペプチドのうちの１６個を超えない連続するアミノ酸残基を含む。他の実施形態において、このポリペプチドは、ネイティブのＷＴ１ポリペプチドのアミノ酸残基１〜１７４の免疫原性部分またはその改変体を含み、ここでこのポリペプチドは、このネイティブのＷＴ１ポリペプチドのアミノ酸１７５〜４４９内に存在する１６個を超えない連続するアミノ酸残基を含む。この免疫原性部分は、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。特定の実施形態において、このポリペプチドは、以下からなる群から選択される配列を含む：（ａ）表ＩＩ〜ＸＬＶＩのうちの任意の１つ以上において示される配列、（ｂ）前述の配列の改変体（これは、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なる）、および（ｃ）上記のポリペプチドの模倣物（抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその模倣物の能力が実質的に減少されないような模倣物）。
【０００７】
他の実施形態において、このポリペプチドは、以下からなる群から選択される配列を含む：（ａ）ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．）３４）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（配列番号８８）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号４９および配列番号２５８）、ＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（配列番号１９９および配列番号２９６）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（配列番号１９８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（配列番号１４７および配列番号２８４）、ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（配列番号３５および配列番号２５５）、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１８５および配列番号２９３）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（配列番号２４１）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳ（配列番号４１１）、配列番号４１４〜４５０、ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号４５１）、（ｂ）前述の配列の改変体（これは、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なる）、ならびに（ｃ）上記のポリペプチドの模倣物（抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその模倣物の能力が実質的に減少されないような模倣物）。模倣物は、１つ以上のアミノ酸模倣物と組み合わせてアミノ酸を含み得るか、または完全に非ペプチド模倣物であり得る。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、ＷＴ１タンパク質の免疫原性部分の改変体を含むポリペプチドを提供し、ここでこの改変体は、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力がネイティブのＷＴ１タンパク質と比較して実質的には減少されないかまたは増強されるようなその免疫原性部分内の１位と３位との間のアミノ酸位置での置換に起因して、その免疫原性部分が異なる。
【０００９】
本発明は上記のＷＴ１ポリペプチドをコードするＷＴ１ポリヌクレオチドをさらに提供する。
【００１０】
他の局面において、本発明は、薬学的組成物およびワクチンを提供する。薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、上記のポリペプチドもしくは模倣物および／または以下のうちの１つ以上を含み得る：（ｉ）ＷＴ１ポリヌクレオチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合するその抗体またはその抗原結合フラグメント；（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞、あるいは（ｉｖ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞。ワクチンは、上記のポリペプチドおよび／または以下のうちの１つ以上を含む：（ｉ）ＷＴ１ポリヌクレオチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、または（ｉｉｉ）抗イディオタイプ抗体、および非特異的免疫応答エンハンサー。特定の実施形態において、ネイティブのＷＴ１ポリペプチドの２３未満の連続するアミノ酸残基、好ましくは１７個未満のアミノ酸残基が、そのような薬学的組成物およびワクチン内に使用されるＷＴ１ポリペプチド内に存在する。免疫応答エンハンサーは、アジュバントであり得る。好ましくは、免疫応答エンハンサーは、Ｔ細胞応答を増強する。
【００１１】
本発明はさらに、患者に上記の薬学的組成物またはワクチンを投与することを包含する、患者において免疫応答を増強または誘導するための方法を提供する。特定の実施形態において、患者はヒトである。
【００１２】
本発明はさらに、患者に上記の薬学的組成物またはワクチンを投与することを包含する、患者において悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供する。悪性疾患としては、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病）および癌（例えば、乳癌、肺癌、甲状腺癌もしくは胃腸癌、または黒色腫）が挙げられるがそれらに限定されない。この患者は、悪性疾患に罹患していてもよいが、罹患している必要はなく、そしてこの薬学的組成物またはワクチンの投与は、そのような疾患の発病を阻害し得るか、または既存の疾患の進行および／もしくは転移を阻害し得る。
【００１３】
本発明はさらに、他の局面において、骨髄および／もしくは末梢血またはその画分からＷＴ１を発現する細胞を除去するための方法を提供する。この方法は、骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分と、ＷＴ１ポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞とを接触させる工程を含み、ここでこの接触させる工程は、骨髄、末梢血または画分中の骨髄性細胞またはリンパ性細胞の数の１０％未満、好ましくは５％未満およびより好ましくは１％未満までのＷＴ１陽性細胞の除去を可能にするに十分な条件および時間で行われる。骨髄、末梢血および画分は、ＷＴ１発現と関連する疾患に罹患している患者から得られ得るか、またはそのような疾患に罹患していないヒトもしくは非ヒト哺乳動物から得られ得る。
【００１４】
関連する局面において、本発明は、上記のように調製された骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分を患者に投与する工程を含む、患者における悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供する。そのような骨髄、末梢血または画分は、自己由来であり得るか、または関連するかもしくは関連しないヒトもしくは非ヒト動物（例えば、同系または同種異系）に由来し得る。
【００１５】
他の局面において、本発明は、Ｔ細胞の刺激（または、初回免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ））および／または拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を可能にするに十分な条件下および時間でＷＴ１ポリペプチドとＴ細胞とを接触させることを含む、Ｔ細胞刺激および／または拡大のための方法を提供する。そのようなＴ細胞は、自己由来のＷＴ１特異的細胞、同種異系のＷＴ１特異的細胞、同系のＷＴ１特異的細胞または関連しないＷＴ１特異的細胞であり得、そしてインビトロまたはインビボで刺激され得る。特定の実施形態において、拡大されたＴ細胞は、骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分内に存在し得、そしてクローン性（ｃｌｏｎａｌ）であり得る（が、その必要はない）。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、刺激および／または拡大の間に哺乳動物中に存在し得る。ＷＴ１特異的Ｔ細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入において使用され得る。
【００１６】
関連する局面において、上記で調製されたＴ細胞を患者に投与する工程を含む、患者における悪性疾患の発達を阻害するための方法が提供される。そのようなＴ細胞は、特定の実施形態において、自己由来、同系または同種異系であり得る。
【００１７】
本発明はさらに、他の局面において、患者におけるＷＴ１発現と関連する悪性疾患のための免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法を提供する。そのような方法は、患者における抗体、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答をモニタリングすることに基づく。特定のそのような局面において、方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）以下、（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの１つ以上とともに第１の生物学的サンプルをインキュベートする工程であって、ここでこの第１の生物学的サンプルは、治療または免疫の前に患者から得られ、そしてここでこのインキュベーションは、免疫複合体が形成するのを可能にするのに十分な条件下および時間で行われる、工程；（ｂ）ＷＴ１ポリペプチドと、ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する生物学的サンプルにおける抗体との間に形成される免疫複合体を検出する工程；（ｃ）治療または免疫の後に、同じ患者から得られる第２の生物学的サンプルを用いて、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）第１および第２の生物学的サンプルにおいて検出される免疫複合体の数を比較する工程、およびそれから、この患者におけるこの治療または免疫の有効性をモニタリングする工程。
【００１８】
上記の方法の特定の実施形態において、この検出する工程は以下を含む：（ａ）この免疫複合体に結合し得る検出試薬とともにこの免疫複合体をインキュベートする工程であって、ここでこの検出試薬はレポーター基を含む、工程、（ｂ）非結合検出試薬を除去する工程、および（ｃ）このレポーター基の存在または非存在を検出する工程。この検出試薬は、例えば、ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合し得る、第２の抗体またはその抗原結合フラグメントあるいはプロテインＡのような分子を含み得る。他の実施形態において、レポーター基は、ＷＴ１ポリペプチドに結合し、そして検出する工程は、非結合ＷＴ１ポリペプチドを除去する工程、およびその後にこのレポーター基の存在または非存在を検出する工程を包含する。
【００１９】
さらなる局面において、患者におけるＷＴ１発現と関連する悪性疾患のための免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）以下（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの１つ以上とともに第１の生物学的サンプルをインキュベートする工程であって、ここでこの生物学的サンプルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、そして治療または免疫の前に患者から得られ、そしてここでこのインキュベーションは、Ｔ細胞の、特異的な活性化、増殖および／または溶解を可能にするに十分な条件下および時間で行われる、工程；（ｂ）Ｔ細胞の活性化、増殖および／または溶解の量を検出する工程；（ｃ）ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む第２の生物学的サンプルを用いて、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程であって、ここでこの第２の生物学的サンプルは、治療または免疫後に同じ患者から得られる、工程；ならびに（ｄ）第１および第２の生物学的サンプル中のＴ細胞の活性化、増殖および／または溶解の量を比較する工程、およびそれによってこの患者におけるこの治療または免疫の有効性をモニタリングする工程。
【００２０】
本発明はさらに、患者におけるＷＴ１発現と関連する悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの１つ以上とともに、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、そのＴ細胞が増殖するようにインキュベートする工程；ならびに（ｂ）増殖されたＴ細胞の有効量をこの患者に投与する工程、およびそれからこの患者における悪性疾患の発達を阻害する工程。特定の実施形態において、Ｔ細胞をインキュベートする工程は、１回以上反復され得る。
【００２１】
他の局面においては、本発明は、患者内におけるＷＴ１発現に関連する悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、このＴ細胞が増殖するように、以下：（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの、１つ以上とともにインキュベートする工程；（ｂ）増殖した一つ以上の細胞をクローニングする工程；および（ｃ）患者に、クローン化したＴ細胞の有効量を投与する工程。
【００２２】
他の局面においては、患者におけるＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定するための方法が提供され、これは以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下：（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの１つ以上とともにインキュベートする工程；および（ｂ）Ｔ細胞の特異的な活性化の存在または非存在を検出し、それによってＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定する工程。特定の実施形態においては、検出の工程は、Ｔ細胞の増殖の存在または非存在を検出する工程を包含する。
【００２３】
さらなる局面においては、本発明は、患者におけるＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定するための方法を提供し、これは以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的なサンプルを、以下：（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの１以上とともにインキュベートする工程であって、ここで、このインキュベーションは、免疫複合体が形成されるのを可能にするに十分な条件かつ時間で行われる、工程；および（ｂ）ＷＴ１ポリペプチドとＷＴ１ポリペプチドと特異的に結合する生物学的なサンプル中の抗体との間に形成される免疫複合体を検出し、それによってＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定する工程。
【００２４】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付する図面を参照すれば明白になる。本明細書中に開示されたすべての参考文献は、各々が個々に援用されたかのようにその全体が参考として本明細書中に援用される。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本明細書に参照され、そして／または出願データシートに列挙される、米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。
【００２６】
上述のように、本発明は、一般に、悪性疾患の免疫療法および診断のための組成物および方法に関する。本明細書中に記載される組成物としては、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば、樹状細胞）、薬剤（例えば、ＷＴ１ポリペプチドに結合する抗体）および／またはＷＴ１に特異的な免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられ得る。本発明のＷＴ１ポリペプチドは、一般に、ウィルムス腫瘍遺伝子産物（ＷＴ１）またはその改変体の少なくとも一部を含む。本発明の核酸配列は、一般に、このようなポリペプチドの全てもしくは一部をコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、あるいはこのような配列に相補的であるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含む。抗体は、一般に、免疫系タンパク質またはその抗原結合フラグメントであり、これは、ＷＴ１ポリペプチドの一部に結合し得る。このような組成物内で使用され得るＴ細胞は、一般に、ＷＴ１ポリペプチドに特異的であるＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）である。本明細書中に記載される特定の方法は、さらに、本明細書中に提供されるようなＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞を使用する。
【００２７】
本発明は、ウィルムス腫瘍（ＷＴ）遺伝子産物（例えば、ＷＴ１）に対して惹起される免疫応答が、ＷＴ１遺伝子の発現の増加によって特徴付けられる悪性疾患を患う患者に、予防的利益および／または治療的利益を提供し得るという知見に基づく。このような疾患としては、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および小児期ＡＬＬ）、ならびに多くの癌（例えば、肺、乳房、甲状腺および胃腸の癌、ならびに黒色腫）が挙げられるが、これらに限定されない。ＷＴ１遺伝子は、元々、ウィルムス腫瘍を有する患者の染色体１１ｐ１３における細胞性欠失に基づいて同定および単離された（Ｃａｌｌら、米国特許第５，３５０，８４０号を参照のこと）。この遺伝子は１０のエキソンからなり、そしてジンクフィンガー転写因子をコードし、そしてマウスＷＴ１タンパク質およびヒトＷＴ１タンパク質の配列は、図１ならびに配列番号３１９および３２０に提供される。
【００２８】
（ＷＴ１ポリペプチド）
本発明の文脈において、ＷＴ１ポリペプチドは、本明細書に記載される場合、ネイティブＷＴ１（すなわち、遺伝的に改変されていない生物によって発現されるＷＴ１タンパク質）またはその改変体の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドである。ＷＴ１ポリペプチドは、任意の長さであり得るが、但し、ネイティブタンパク質またはその改変体の少なくとも免疫原性部分を含む。言い換えると、ＷＴ１ポリペプチドは、オリゴペプチド（すなわち、ペプチド結合によって連結される比較的少数のアミノ酸残基（例えば、８〜１０残基）からなる）、全長ＷＴ１タンパク質（例えば、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、マウス）内に存在する）あるいは中間のサイズのポリペプチドであり得る。特定の実施形態において、ネイティブＷＴ１ポリペプチドの少数の連続するアミノ酸残基を含むＷＴ１ポリペプチドの使用が、好ましい。このようなポリペプチドは、Ｔ細胞応答の生成が所望される特定の使用のために好ましい。例えば、このようなＷＴ１ポリペプチドは、ネイティブＷＴ１ポリペプチドの、２３未満の連続するアミノ酸残基、好ましくは１８以下の連続するアミノ酸残基、そしてより好ましくは１５以下の連続するアミノ酸残基を含み得る。ネイティブＷＴ１ポリペプチドの９つの連続するアミノ酸残基を含むポリペプチドは、一般に、このような目的のために適切である。ネイティブタンパク質由来のさらなる配列および／または異種配列は、任意のＷＴ１ポリペプチド内に存在し得、そしてこのような配列は、（必要ではないが）さらなる免疫原性特性または抗原性特性を保有し得る。本明細書中に提供されるようなポリペプチドは、さらに、他のポリペプチドまたは非ポリペプチド化合物と（共有結合的にかまたは非共有結合的に）会合され得る。
【００２９】
「免疫原性部分」は、本明細書中で使用される場合、Ｂ細胞表面抗原レセプターおよび／またはＴ細胞表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合される）ポリペプチドの部分である。特定の好ましい免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。本明細書中で使用される場合、免疫原性部分は、このような結合が当該分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能である場合、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子「に結合する」といわれる。例えば、ポリペプチドがＭＨＣクラスＩに結合する能力は、１２５Ｉで標識されたβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）のＭＨＣクラスＩ／β２ｍ／ペプチドヘテロ三量体複合体への取り込みを促進する能力をモニターすることによって間接的に評価され得る（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９４を参照のこと）。あるいは、当該分野で公知の機能的ペプチド競合アッセイが、使用され得る。特定の免疫原性部分は、表ＩＩ〜ＸＩＶの１つ以上に列挙される１つ以上の配列を有する。代表的な免疫原性部分には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＤＬＮＡＬＬＰＡＶＰＳＬＧＧＧＧ（ヒトＷＴ１残基６〜２２；配列番号１）、ＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ（ヒトおよびマウスＷＴ１残基１１７〜１３９；それぞれ、配列番号２および３）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡＧＳＳＳＳＶＫＷＴＥ（ヒトＷＴ１残基２４４〜２６２；配列番号４）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（ヒトＷＴ１残基２４４〜２５２；配列番号８８）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基２３５〜２４３；それぞれ、配列番号４９および２５８）、ＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（マウスＷＴ１残基１３６〜１４４；配列番号２９６）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（ヒトＷＴ１残基１３６〜１４４；配列番号１９８）；ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基２２５〜２３３；それぞれ、配列番号１４７および２８４）；ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（マウスＷＴ１残基１０〜１８；配列番号２５５）；ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基１２６〜１３４；それぞれ、配列番号１８５および配列番号２９３）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（ヒトＷＴ１残基３７〜４５；配列番号２４１）、またはＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳ（ヒトＷＴの残基３７〜４６；配列番号４１１）。さらなる免疫原性部分は、配列番号４１４〜４５１に提供される。さらなる免疫原性部分は、本明細書中に提供され、そしてその他は、一般に、周知の技術（例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、２４３〜２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびその中に引用される参考文献において要約される技術）を使用して同定され得る。免疫原性部分を同定するための代表的な技術としては、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力についてのポリペプチドのスクリーニングが挙げられる。ネイティブＷＴ１ポリペプチドの免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）実質的に全長ＷＴ１の反応性以上であるレベルで、このような抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。言い換える��、免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応性に類似するかまたはそれよりも大きなレベルで、このようなアッセイにおいて反応し得る。このようなスクリーニングは、一般に、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９９８に記載されるような、当業者に周知の方法を使用して実施され得る。
【００３０】
あるいは、免疫原性部分は、Ｔｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｏｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：９３〜１００、１９８８；Ｄｅａｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５〜１５５、１９９６を参照のこと）のようなコンピュータ分析を使用して同定され得、このコンピュータ分析は、Ｔｈ応答を誘発する可能性を有するペプチドモチーフについて検索する。マウスクラスＩ  ＭＨＣまたはマウスクラスＩＩ  ＭＨＣおよびヒトクラスＩ  ＭＨＣまたはヒトクラスＩＩ  ＭＨＣへの結合について適切なモチーフを有するＣＴＬペプチドは、ＢＩＭＡＳ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３、１９９４）および他のＨＬＡペプチド結合予測分析に従って同定され得る。あるいは、特定のＭＨＣ分子に結合する免疫原性部分は、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１７８−２２８，１９９５に記載されるような規定されたペプチド結合モチーフを使用することによって同定され得る。マウスクラスＩ  ＭＨＣ分子またはマウスクラスＩＩ  ＭＨＣ分子およびヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子またはヒトクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合するペプチドを確認するために、当該分野で公知のペプチド結合アッセイを使用し得る。免疫原性を確認するために、ペプチドは、ＨＬＡ  Ａ２トランスジェニックマウスモデルまたは他のトランスジェニックマウスモデル、および／または樹状細胞、線維芽細胞もしくは末梢血細胞を使用するインビトロ刺激アッセイを使用して、試験され得る。
【００３１】
上述のように、組成物は、ネイティブＷＴ１タンパク質の改変体を含み得る。ポリペプチド「改変体」は、本明細書中で使用される場合、そのポリペプチドの免疫原性が保持されるように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入においてネイティブポリペプチドと異なる（すなわち、この改変体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力は、ネイティブポリペプチドに対して実質的に減少されない）、ポリペプチドである。言い換えると、改変体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力は、ネイティブポリペプチドに対して増強され得るかまたは不変であり得るか、あるいはネイティブポリペプチドに対して５０％未満、そして好ましくは２０％未満減少され得る。１つの実施形態において、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞もしくはクローンと反応するような改変体の能力は、ネイティブポリペプチドと対して、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満または０．５％未満減少され得る。このような改変体は、一般に、本明細書中に記載されるように、上記のポリペプチド配列の１つを改変すること、および改変されたポリペプチドと抗血清および／またはＴ細胞との反応性を評価することによって、同定され得る。本発明の１つの実施形態において、改変体は、ヒトＨＬＡ分子またはネズミ（ｍｕｒｉｎｇ）のＨＬＡ分子に結合するその能力を評価することによって同定され得る。１つの好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、以下のクラスＩ  ＭＨＣ分子またはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合する改変体ポリペプチドの能力が、野生型（未改変）ＷＴ１ポリペプチドの能力に対して増加されるような改変を有する：例えば、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−Ｂ６２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５０１、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−ＣＷ０３、ＨＬＡ−ＣＷ０４、ＨＬＡ−ＣＷ０６またはＨＬＡ−ＣＷ０７。さらなる実施形態において、アミノ酸１〜２８１由来のＮ末端部分は、以下に結合し得るそれらのうちのかなり多数のポリペプチドの能力が、野生型（未改変）ＷＴ１ポリペプチド配列の能力に対して増加されるように改変される：ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−Ｂ６２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５０１、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−ＣＷ０３、ＨＬＡ−ＣＷ０４、ＨＬＡ−ＣＷ０６またはＨＬＡ−ＣＷ０７。さらなる実施形態において、少なくとも１つの免疫原性タンパク質（エピトープ）を含むポリペプチドは、以下のようなＭＨＣ分子に結合するその能力が増加されるよう��改変される：ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ６８、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ３３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂ６０、ＨＬＡ−Ｂ６２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５０１、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ５１、ＨＬＡ−Ｂ５２、ＨＬＡ−Ｂ５８、ＨＬＡ−ＣＷ０３、ＨＬＡ−ＣＷ０４、ＨＬＡ−ＣＷ０６またはＨＬＡ−ＣＷ０７。実施例３０は、生産され得る例示的な改変体を記載する。当業者は、これらが例示的な改変体であり、そして他の改変体がＨＬＡ−Ａ２以外のＨＬＡ分子に結合するペプチドに対して類似の様式で生産され得ることを容易に理解する。さらなる実施形態において、ＨＬＡ分子に結合する改変体ポリペプチドの能力は、ネイティブなＷＴ１ポリペプチドの能力と比較して、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、少なくとも４倍または少なくとも５倍増加される。本発明の関連において、ＷＴ１ポリペプチドの免疫原性部分内の比較的少数の置換（例えば、１〜３）は、ポリペプチドが免疫応答を誘発する能力を増強するように作用し得ることが、見出されている。適切な置換は、一般に、上記のようにコンピュータプログラムを使用することによって同定され得、そしてその効果は、本明細書中に記載されるように、改変されたポリペプチドと抗血清および／またはＴ細胞との反応性に基づいて確認される。従って、特定の好ましい実施形態において、ＷＴ１ポリペプチドは、免疫原性部分内の１〜３アミノ酸残基が置換され、その結果、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が、未改変のポリペプチドに対するその能力よりも統計学的に大きい、改変体を含む。このような置換は、好ましくは、このポリペプチドのＭＨＣ結合部位内に位置され、これは、上記の通りに同定され得る。好ましい置換は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を増加させる。
【００３２】
特定の改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸に置換される置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、そのポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的に変化していないことを予測する。アミノ酸置換は、一般に、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の親水性値を有する荷電していない極性ヘッド（ｈｅａｄ）基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他の基としては、以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた（または、あるいは改変体は）非保存的変化を含む。改変体はまた（または、あるいは改変体は）、例えば、このポリペプチドの免疫原性、二次構造およびヒドロパシー性質に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。
【００３３】
好ましい実施形態において、ＷＴ１のＮ末端（アミノ酸１〜２４９）の改変体ペプチドが構築され、ここで、この改変体ポリペプチドは、全長ＷＴ１および／またはＷＴ１のＮ末端ポリペプチドを認識する抗体に結合し得る。抗体の非限定的な例は、抗ＷＴ１抗体ＷＴ１８０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）である。
【００３４】
上述のように、ＷＴ１ポリペプチドは、翻訳と同時（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）にタンパク質の移行を指向するタンパク質のＮ末端において、シグナル（またはリーダー）配列に結合体化され得る。ポリペプチドはまた（または、あるいはポリペプチドは）、このポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製または同定の容易さのために、あるいはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカーもしくは他の配列に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合体化され得る。
【００３５】
ＷＴ１ポリペプチドは、任意の種々の周知技術を使用して調製され得る。本明細書中に記載されるようなＷＴ１ポリヌクレオチドによってコードされる組換えポリペプチドは、このポリヌクレオチドから容易に調製され得る。一般に、当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを使用して、組換えＷＴ１ポリペプチドを発現し得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターを用いて形質転換されたか、またはこの発現ベクターを用いてトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞および高等真核生物細胞が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株、酵母細胞株または哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳもしくはＣＨＯ）である。組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培養培地へ分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清は、まず、市販のフィルターを使用して濃縮され得る。次いで、この濃縮物は、適切な精製マトリクス（例えば、アフィニティーマトリクスまたはイオン交換樹脂）に適用され得る。最終的に、１つ以上の逆相ＨＰＬＣ工程を使用して、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。このような技術を使用して、ネイティブポリペプチドまたはその改変体を調製し得る。例えば、ネイティブポリペプチドの改変体をコードするポリヌクレオチドは、一般に、標準的な変異誘発技術（例えば、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発）を使用して調製され得、そしてＤＮＡ配列の切片は、短縮型ポリペプチドの調製を許容するように除去され得る。
【００３６】
特定の部分および他の改変体はまた、当業者に周知の技術を使用する合成手段によって生成され得る。例えば、約５００未満のアミノ酸、好ましくは約１００未満のアミノ酸、そしてより好ましくは約５０未満のアミノ酸を有するポリペプチドが、合成され得る。ポリペプチドは、メリーフィールド固相合成法（アミノ酸が、成長するアミノ酸鎖に連続的に付加される）のような任意の商業的に利用可能な固相技術を使用して合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動化合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給業者から市販されており、そして製造業者の指示書に従って操作され得る。
【００３７】
一般に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドが、単離される。「単離された」ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、その元々の環境から取り出されたものである。例えば、その天然系に共存するいくつかまたは全ての物質から分離される場合に、天然に存在するタンパク質が、単離される。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。例えば、天然の環境の一部でないベクター中にクローニングされる場合に、ポリヌクレオチドは、単離されたとみなされる。
【００３８】
さらなる局面において、本発明は、ＷＴ１ポリペプチドの模倣物を提供する。このような模倣物は、１つ以上のアミノ酸模倣物と連結したアミノ酸を含み得るか（すなわち、ＷＴ１タンパク質内の１つ以上のアミノ酸が、アミノ酸模倣物により置換され得る）または全体的に非ペプチド模倣物であり得る。アミノ酸模倣物はアミノ酸と立体配置的に類似する化合物であるが故に、そのアミノ酸模倣物は、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株あるいはクローンと反応する能力を実質的に減少させずにＷＴ１ポリペプチド内のアミノ酸と置換され得る。非ペプチド模倣物はアミノ酸を含まない化合物であり、そしてＷＴ１ポリペプチドと類似する全体的な配座を有するが故に、ＷＴ１特異的抗血清および／またはＴ細胞株あるいはクローンと反応する模倣物の能力は、ＷＴ１ポリペプチドの能力と比較して実質的に減少されない。このような模倣物は、ペプチド配列の三次元構造を評価する標準的な技術（例えば、核磁気共鳴技術および計算的技術）に基づき設計され得る。ＷＴ１ポリペプチドの１つ以上の側鎖官能基が、必ずしも同じサイズまたは容積を有しないが、類似の化学的特性および／または物理的特性（これは、類似する生物学的応答を生じる）を有する基により置換される場合に、模倣物が設計され得る。本明細書中に記載される実施形態において、模倣物が、ＷＴ１ポリペプチドに置換され得ることが理解されるべきである。
【００３９】
他の例示的な実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであり得るか、または本明細書中に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび無関係な配列（例えば、既知の腫瘍タンパク質）を含む融合ポリペプチドであり得る。融合パートナーは、例えば、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくは、ヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供することを補助し得るか、またはこの融合パートナーは、ネイティブな組換えタンパク質よりも高収量でこのタンパク質（発現エンハンサー）を発現させることを補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、このポリペプチドの溶解度を上昇させるか、またはこのポリペプチドが所望の細胞内画分に標的化されるように、選択され得る。なお、さらなる融合パートナーとしては、このポリペプチドの精製を容易にする親和性タグが挙げられる。
【００４０】
融合ポリペプチドは、一般に、化学的結合体化を含む標準的な技術を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、組換えポリペプチドとして発現され、発現系において、非融合性ポリペプチドに比べて、増大したレベルの産生を可能にする。簡潔には、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別々に構築され得、そして適切な発現ベクターに連結され得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを伴ってかまたはこれを伴わずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に連結され、その結果、この配列のリーディングフレームは、位相が同じである。このことによって、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへと翻訳されることを可能にする。
【００４１】
ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドの各々がその２次構造および３次構造にフォールドすることを確実にするのに十分な距離だけ、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分を分離するのに使用され得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野において周知の標準的な技術を使用して、融合ポリペプチドに組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基いて選択され得る：（１）可変性の延びたコンフォメーションを選定するこれらの能力；（２）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド上に機能的なエピトープと相互作用し得る２次構造を選定し得ない能力；および（３）このポリペプチド機能性エピトープと反応し得る、疎水性残基または荷電した残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基、およびＳｅｒ残基を含む。他のほぼ中性のアミノ酸（例えば、ＴｈｒおよびＡｌａ）はまた、このリンカー配列に使用され得る。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９〜４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８〜８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されたアミノ酸配列が挙げられる。このリンカー配列は、一般的に、１〜約５０のアミノ酸長であり得る。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、非必須のＮ末端アミノ酸領域を有し、このアミノ酸領域が機能的ドメインを分離し、空間的な干渉を阻止するのに使用され得る場合、リンカー配列は必要とされない。
【００４２】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に５’末端でのみ位置付けられる。同様に、翻訳を終止するために必要な終止コドンおよび転写終止シグナルは、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’にのみ存在する。
【００４３】
この融合ポリペプチドは、関連性のない免疫原性タンパク質（例えば、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起することが可能な免疫原性タンパク質）とともに、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質、および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１、１９９７を参照のこと）。
【００４４】
１つの好ましい実施形態において、この免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来である（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２フラグメント）。Ｒａ１２組成物および異種のポリヌクレオチド／ポリペプチドの配列の発現および／または免疫原性の増強におけるこれらの使用方法が、米国特許出願  ６０／１５８，５８５に記載され、この開示が、本明細書中で、全体が参考として援用される。簡潔には、Ｒａ１２とは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＭＴＢ３２Ａの核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性株および非毒性株の遺伝子によってコードされる分子量３２ＫＤのセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａの核酸配列およびアミノ酸配列は、（例えば、米国特許出願  ６０／１５８，５８５；Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８〜４００７（これらは、本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと）に記述されている。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは、高いレベルで発現し、そしてこの精製プロセスの全体を通して可溶性のポリペプチドのままである。さらに、Ｒａ１２は、これらが融合された異種の免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ＫＤのＣ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリペプチドは、一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの部分をコードする、少なくとも約１５の連続するヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部分をコードする内因性配列）を含み得るか、またはこのような配列の改変体を含み得る。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、１以上の、置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得、その結果、このコードされる融合ポリペプチドの生物学的活性は、ネイティブＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して実質的に減少しない。改変体は、好ましくは、ネイティブのＲａ１２ポリペプチドまたはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【００４５】
他の好ましい実施形態において、免疫学的融合バートナーは、プロテインＤ、グラム陰性細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質から誘導される（ＷＯ  ９１／１８９２６）。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、このタンパク質の約３分の１（例えば、始めのＮ末端の１００〜１１０のアミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基がＮ末端において含まれ、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供し得、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現レベルを増大し得る（従って、発現エンハンサーとして機能し得る）。この脂質テイルは、抗原提示細胞に対する最適な抗原の提示を確実にする。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質である、ＮＳ１（血球凝集素）が挙げられる。代表的には、このＮ末端の８１アミノ酸が使用されるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが使用され得る。
【００４６】
別の実施形態において、この免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして既知のタンパク質またはその部分（好ましくは、Ｃ末端部分）である。ＬＹＴＡは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来し、そしてこれは、アミダーゼＬＹＴＡ（これは、ＬｙｔＡ遺伝子にコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５〜２９２、１９８６）として既知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成する。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格において特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。このＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性を担う。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉのＣ−ＬＹＴＡの開発について活用されてきた。Ｃ−ＬＹＴＡフラグメントをアミノ末端に含むハイブリッドタンパク質の精製が記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５〜７９８、１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分が融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域において見出される。特定の好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を取り込む。
【００４７】
別の例示的な実施形態において、融合パートナーは、Ｎ末端でＥ．ｃｏｌｉ中のＴｏｒＡシグナルペプチド由来の二重アルギニン転座（ｔｗｉｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ：ＴＡＴ）シグナルペプチドを含む；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）２（２）：１７９−１８９；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ｊａｎ  ２００１  ｐ６０４−６１０  Ｖｏｌ  １８３，Ｎｏ  ２；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ  ２７６，２００１年３月１６日、８１５９−８１６４頁）（本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【００４８】
さらに別の例示的な実施例としては、融合ポリペプチド、およびこれらをコードするポリヌクレオチドが挙げられ、ここでこの融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載のように、エンドソーム画分／リソソーム画分にポリペプチドを指向し得る標的化シグナルを含む。本発明の免疫学的ポリペプチドは、この標的化シグナルと融合される場合に、ＭＨＣクラスＩＩ分子とより効率的に会合し、そして、それによって、このポリペプチドに対して特異的であるＣＤ４＋Ｔ細胞の増強されたインビボ刺激を提供する。
【００４９】
本発明は、融合パートナーの付加をすることなしにＥ．ｃｏｌｉにおいて組換え的に発現され得るＷＴ１ポリペプチドの短縮形態を提供する。これらの短縮形態の例は、配列番号３４２〜３４６に示され、そしてこれらは配列番号３３７〜３４１に示されるポリヌクレオチドによってコードされる。これらの短縮のバリーションにおいて、ＷＴ１の最初の７６アミノ酸は、このタンパク質のＣ末端に融合され得、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてより容易に発現する組換えタンパク質を生成し得る。Ｅ．ｃｏｌｉに加えて、例えば、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのような他の宿主もまた使用され得る。このタンパク質は、ヒスチジンタグを用いずにさらに調製され得る。
【００５０】
他の実施形態において、異なるサブユニットが作製され得、そしてネイティブＷＴ１の順番とは異なる順番で共に融合され得る。さらに、融合が例えば、Ｒａ１２と共になされ得る。例示的な融合タンパク質は、配列番号３３２〜３３６において示され、そしてこれらは配列番号３２７〜３３１に示されるポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００５１】
（ＷＴ１ポリヌクレオチド）
本明細書中に記載されるＷＴ１ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドは、本発明により含まれるＷＴ１ポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）あるいは二本鎖であり得、そしてＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）あるいはＲＮＡ分子であり得る。さらなるコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、存在する必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結され得るが、連結される必要はない。
【００５２】
ＷＴ１ポリヌクレオチドは、ネイティブなＷＴ１タンパク質をコードし得るか、または本明細書中に記載されるＷＴ１の改変体をコードし得る。ポリヌクレオチド改変体は、ネイティブなＷＴ１タンパク質と比較して、コードされるポリペプチドの免疫原性が減少されないような１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。コードされるポリペプチドの免疫原性に対する効果は、一般的に本明細書中に記載されるように評価され得る。好ましい改変体は、ネイティブなＷＴ１配列の免疫原性部分をコードするヌクレオチド位置の、２０％以下、好ましくは、１０％以下でヌクレオチド置換、欠失、挿入および／または付加を含む。特定の改変体は、ネイティブな遺伝子またはその一部と実質的に相同である。このようなポリヌクレオチド改変体は、ＷＴ１ポリペプチド（または相補配列）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列と、中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る。適切な中程度のストリンジェントな条件は以下を含む：５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液での前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣにおける一晩のハイブリダイゼーション；続いて、それぞれ０．１％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、および０．２×ＳＳＣを用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄。このようにハイブリダイズするＤＮＡ配列はまた、本発明の範囲内である。
【００５３】
遺伝コードの縮重の結果として、ＷＴ１ポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者に理解される。いくつかのこれらのポリヌクレオチドは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用法における差異に起因して変動するポリヌクレオチドが、特に本発明により意図される。
【００５４】
従って、本発明の別の局面に従い、本明細書中に示すポリヌクレオチド配列の一部または全て、本明細書中に示すポリヌクレオチド配列の相補体、および本明細書中に示すポリヌクレオチド配列の変性改変体を含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、本明細書中に示すポリヌクレオチド配列は、上記のように、免疫原性ポリヌクレオチドをコードする。
【００５５】
一旦、上記のようにＷＴ１の免疫原性部分が同定されると、ＷＴ１ポリヌクレオチドが、任意の種々の技術を使用して調製され得る。例えば、ＷＴ１ポリヌクレオチドが、ＷＴ１を発現する細胞から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーが、免疫原性部分の配列に基づいて設計され得、そして購入され得るか、または合成され得る。例えば、ヒトＷＴ１遺伝子のＰＣＲ増幅のための適切なプライマーには以下が挙げられる：第１工程−Ｐ１１８：１４３４−１４１４：５’ＧＡＧＡＧＴＣＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴ３’（配列番号５）およびＰ１３５：５’ＣＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣ３’（配列番号６）；第２工程−Ｐ１３６：５’ＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＧ３’（配列番号７）およびＰ１３７：５’ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＣＣＣＣＧＡ３’（配列番号８）。マウスＷＴ１遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーには以下が挙げられる：第１工程−Ｐ１３８：５’ＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧ３’（配列番号９）およびＰ１３９：５’ＧＣＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧ３’（配列番号１０）；第２工程−Ｐ１４０：５’ＧＡＧＣＡＴＧＣＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧ３’（配列番号１１）およびＰ１４１：５’ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴ３’（配列番号１２）。
【００５６】
次いで、増幅された部分を使用して、全長遺伝子が、周知の技術を使用してヒトゲノムＤＮＡライブラリーまたは適切なｃＤＮＡライブラリーから単離され得る。あるいは、全長遺伝子が、複数のＰＣＲフラグメントから構築され得る。ＷＴ１ポリヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチド成分を合成し、そして完全なポリヌクレオチドを産生するために共に成分を連結することにより調製され得る。
【００５７】
ＷＴ１ポリヌクレオチドはまた、当該分野において公知の任意の方法によって合成され得、その方法には化学合成が挙げられる（例えば、固相ホスホラミダイト化学合成）。ポリヌクレオチド配列における改変はまた、標準的な変異誘発技術（例えば、オリゴヌクレオチド指向性の、部位特異的変異誘発（Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ  ２：１８３、１９８３を参照のこと）、を使用して導入され得る。あるいは、ＤＮＡが適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）とともにベクターに組み込まれる場合、ＲＮＡ分子は、ＷＴ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボでの転写により産生され得る。特定の部分を使用して、本明細書中に記載されるような、コードされるポリペプチドを調製し得る。さらに、またはあるいは、コードされるポリペプチドがインビボで産生されるように、患者に対して一部が投与され得る（例えば、ＷＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ構築物を有する樹状細胞のような抗原提示細胞をトランスフェクトし、そしてそのトランスフェクトされた細胞を患者に投与することによる）。
【００５８】
ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは一般的に、インビトロまたはインビボにおいてそのポリペプチドを産生するために使用され得る。コード配列に相補的なＷＴ１ポリヌクレオチド（すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド）はまた、プローブとしてまたはＷＴ１発現を阻害するために使用され得る。アンチセンスＲＮＡに転写され得るｃＤＮＡ構築物もまた、組織の細胞に導入され、アンチセンスＲＮＡの産生を促進し得る。
【００５９】
任意のポリヌクレオチドがさらに改変され、インビボにおける安定性を増加し得る。可能な改変には以下が挙げられるが、これらに限定されない；５’末端および／または３’末端における隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合に代わるホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；および／または非伝統的な塩基（例えば、イノシン、キュエオシンおよびワイブトシン）、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル形態、メチル形態、チオ形態および他の改変形態の包含。
【００６０】
本明細書中に記載されるようなヌクレオチド配列が、確立された組換えＤＮＡ技術を使用して、種々の他のヌクレオチド配列に結合され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、任意の種々のクローニングベクターにクローン化され得る。そのようなベクターには、プラスミド、ファージミド、λファージ誘導体およびコスミドが挙げられる。特定の目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよび配列決定ベクターが挙げられる。一般的には、ベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位および１つ以上の選択マーカーを含む。他のエレメントは、所望される用途に依存し、そして当業者に明らかである。特に、本発明の１つの実施形態は、本発明の核酸分子を発現制御配列（プロモーター）に作動可能な結合で（すなわち、作動可能に結合して）組み込む、発現ベクターを含む。このようなベクターの構築物（例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスまたはワクシニアウイルス）あるいは弱毒化ウイルスベクター）は、細胞を形質転換またはトランスフェクトして、真核生物細胞株あるいは目的の分子をコードする原核生物細胞株を作製する場合、十分に当業者の技術の範囲内である。この様式に使用され得る宿主細胞の例は、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、酵母細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａまたはＳｆ−９細胞）、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞などである。原核生物細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌もまた、使用され得る。
【００６１】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の細胞に入り、そしてそこで発現することを可能にするように処方され得る。以下に記載されるように、このような処方物は、治療目的のために特に有用である。当業者は、標的細胞においてポリヌクレオチドの発現を達成するための多くの方法が存在すること、および任意の適切な方法が使用され得ることを理解する。例えば、ポリヌクレオチドが、ウイルスベクター（例えば、限定しないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスまたは他にポックスウイルス（例えば鳥類ポックスウイルス））に組み込まれ得る。ＤＮＡをこのようなべクターに組み込むための技術は、当業者において周知である。さらにレトロウイルスベクターは、選択マーカー（形質導入された細胞の同定または選択を援助するために）についての遺伝子および／またはベクターを標的特異的にするための標的部分（例えば、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子）を伝達または組み込み得る。標的化はまた、当業者において公知の方法により、抗体を使用して達成され得る。例えば、腫瘍防御および養子免疫療法実験（腫瘍あるいは白血病増殖阻害またはこのような細胞の溶解を実証するため）を実施するために使用され得るＷＴ１陽性腫瘍モデルを樹立する際の使用のために、そのようなベクター内のｃＤＮＡ構築物を使用して、ヒトまたは動物細胞株にトランスフェクトし得る。
【００６２】
ポリヌクレオチドについての他の治療的処方物は、コロイド分散系（例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ）および脂質ベースの系（Ｏ／Ｗエマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム）を含む。インビトロおよびインビボにおける送達ビヒクルとして使用するために好ましいコロイド系はリポソームである（すなわち、人工膜小胞）。このような系の調製および使用は、当該分野において周知である。
【００６３】
（抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子）
別の局面によると、本発明はさらに、本明細書中で開示されるＷＴ１ポリペプチドに対して、またはその一部、改変体もしくは誘導体に対して免疫学的結合を示す結合因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。抗体、またはその抗原結合フラグメントとは、本発明のＷＴ１ポリペプチドに対して、「特異的に結合する」こと、「免疫学的に結合する」ことを言い、そして／または、それが（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）検出可能なレベルでそのポリペプチドと反応し、かつ類似の条件下で非関連ポリペプチドと検出可能に反応しない場合、「免疫学的に反応性」であると言う。
【００６４】
この文脈で使用される場合、免疫学的結合は、一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有結合的な相互作用をいう。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表現され得、ここで、より小さいＫｄは、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して、定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定する工程を必要とし、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方の方向における速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。従って、両方の「オンレート定数（ｏｎ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｎ）および「オフレート定数（ｏｆｆ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋｏｆｆ）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しない全てのパラメータの排除を可能にし、そして従って、解離定数Ｋｄに等しい。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照のこと。
【００６５】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関係する免疫グロブリン分子の部分をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「超可変領域」といわれ、これは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域の間におよび、それに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、３次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。この抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」またたは「ＣＤＲ」といわれる。
【００６６】
結合因子は、本明細書中に提供される代表的なアッセイを使用して、ＷＴ１関連癌を有する患者と有さない患者との間をさらに区別し得る。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、好ましくは、この疾患を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において、癌の存在を示すシグナルを生成する。あるいは、または加えて、この抗体は、癌を有さない個体の少なくとも約９０％において、この疾患の非存在を示すネガティブシグナルを生成する。結合因子が、この要求を満たすか否かを決定するために、癌（標準的な臨床試験によって決定されるような）を有する患者および有さない患者からの生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿および／または腫瘍生検）が、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載されるようにアッセイされ得る。好ましくは、疾患を有するサンプルおよび有さないサンプルの統計的に有意な数が、アッセイされる。各結合因子は、上記の基準を満足すべきである；しかし、当業者は、結合因子が、組合せて使用されて、感度を改善し得ることを認識する。
【００６７】
上記の要求を満足する任意の薬剤は、結合因子であり得る。例えば、結合因子は、ペプチド成分を含むか含まないリボソーム、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術によって、調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、細胞培養技術（本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によって、または組換え抗体の生成を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を有さない免疫原として機能し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、優れた免疫応答が、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合される場合に、惹起され得る。この免疫原は、好ましくは、１回以上のブースト免疫を組み込む所定のスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこれらの動物が、定期的に採血される。このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、次いで、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
【００６８】
目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体が、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技術およびその改善物を使用して、調製され得る。簡潔には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死化細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られる脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞が、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫された動物と同系であるものとの融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤と組合され、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間の後、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてそれらの培養上清を、このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【００６９】
モノクローナル抗体は、増殖ハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術が、収量を増加させるために使用され得、この技術は、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入である。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。混入物が、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。
【００７０】
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多くの治療的に有効な分子が、当該分野で公知である。このタンパク質分解性酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかのフラグメントを生じさせ、これら（「Ｆ（ａｂ）フラグメント」）のうちの２つの各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメント（両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントを含む）を提供し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、および稀有な場合にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して、より一般的に誘導される。Ｆｖフラグメントは、非共有結合的なＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを含み、このへテロダイマーは、ネイティブな抗体分子の抗原認識および結合能力のほとんどを保持する抗原結合部位を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【００７１】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨをコードする遺伝子およびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域からの自然に凝集する（しかし、化学的には分離された）ポリペプチド軽鎖および重鎖を、ｓＦｖ分子に転換するための化学構造を識別するための多くの方法が記述され、このｓＦｖは、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造に折り畳まれる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎら）；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）を参照のこと。
【００７２】
上記分子の各々は、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、各々は、ＣＤＲＳへの支持を提供し、そして互いに対してＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖および軽鎖ＦＲセットの間に挿入される。本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域をいう。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、各々、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。従って、抗原結合部位は、６つのＣＤＲを含み、この６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを構成する。単一ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識ユニット」といわれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触を形成することが立証され、ここで、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３との接触である。従って、分子認識ユニットは、主に、抗原結合部位の特異性を担っている。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する、４つの隣接アミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触し得る；しかし、ＦＲは、主に、Ｖ領域を抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む原因である。ＦＲにおいて、特定のアミノ酸残基および特定の構造特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折り畳まれる場合、このＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして表示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関わらず、特定の「正準」構造に折り畳まれたＣＤＲループの形状に影響するＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関与することが知られている。
【００７４】
非ヒト免疫ブログリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が記載され、この抗体分子には、げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常領域に融合されたそれらの会合ＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持ＦＲにグラフトされたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５）、ならびに組換えベニアリングされた（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公開番号５１９，５９６（１９９２年１２月２３日公開）を有するキメラ抗体が挙げられる。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
【００７５】
本明細書中で使用される場合、用語「ベニアリングされたＦＲ」および「組換えベニアリングされたＦＲ」は、ネイティブのＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のＶ領域からのＦＲ残基のヒトＦＲ残基での選択的置換をいう。ベニアリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲセットの構造および相対的な配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、それらの互いとの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されるヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニアリング技術を使用することによって、外部（例えば、溶媒がアクセス可能な）ＦＲ残基（これは、免疫系に容易に遭遇する）は、ヒト残基と選択的に置換されて、弱い免疫原性ベニアリング表面または実質的に非免疫原性のベニアリング表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
【００７６】
ベニアリングのプロセスは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）において、Ｋａｂａｔらによって編集されたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データを使用し、Ｋａｂａｔデータベースに更新され、そして他の米国および海外のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を使用する。Ｖ領域アミノ酸の溶媒アクセス可能性は、ヒトおよびマウス抗体フラグメントについての既知の３次元構造から推定され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする際に２つの一般的な工程が存在する。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記の同定された供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同的なヒトＶ領域が、対応するマウスアミノ酸と、残基ごとに比較される。ヒト対応物とは異なるマウスＦＲにおける残基は、当該分野において周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基スイッチングは、少なくとも部分的に露出した（溶媒アクセス可能である）部分を用いて実施されるのみであり、そしてＶ領域ドメインの三次構造に対する有意な効果を有し得るアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸）の置換において、注意がなされる。
【００７７】
この様式において、得られた「ベニアリングされた」マウス抗原結合部位は、従って、マウスＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋没したかほとんど埋没した（溶媒のアクセスが不可能）として同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合的な（例えば、静電的および疎水的）接触に関係すると考えられる残基、およびＣＤＲループの「正準」三次構造に影響を与えると考えられるＦＲの保存された構造領域からの残基を保持するように設計される。次いで、これらの設計基準は、ヒト様ＦＲへのマウス抗原結合部位の軽鎖および重鎖の両方のＣＤＲを組合せる組換えヌクレオチド配列を調製するために使用され得、このヒト様ＦＲは、マウス抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得る。
【００７８】
本発明の別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１以上の治療剤に結合され得る。この点に関して適切な薬剤は、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびそれらの誘導体を含む。好ましい放射性核種は、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉを含む。好ましい薬物は、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログを含む。好ましい分化誘導剤は、ホルボールエステルおよび酪酸を含む。好ましい毒素は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む。
【００７９】
治療剤は、直接的または間接的（例えば、リンカー基を通じて）のいずれかで、適切なモノクローナル抗体に結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他方と反応し得る置換基を保有する場合に可能である。例えば、一方の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、無水物または酸ハライド）と、または良好な脱離基（例えば、ハライド）を含むアルキル基と反応することが可能であり得る。
【００８０】
あるいは、治療剤および抗体をリンカー基を通じて結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合能力を妨害することを回避するために、薬剤から抗体を離すスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性を増大させるように働き得、それにより結合効率を増大させる。化学反応性における増大はまた、薬剤、または薬剤上の官能基の使用を容易にし得るが、これは、そうでなければ可能ではない。
【００８１】
種々の二官能性試薬または多官能性試薬（ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方）（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのカタログに記載されるもの）が、リンカー基として用いられ得ることは、当業者に明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化した糖質残基を通じてもたらされ得る。このような方法論を記載している多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【００８２】
本発明の免疫結合体の抗体部分を含まないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインタナリゼーションの間またはその際に切断可能であるリンカー基を使用することが所望され得る。多くの異なる切断可能なリンカー基が、記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒに対する米国特許第４，４８９，７１０号）、光不安定結合の照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらに対する米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断（Ｋｏｈｎらに対する米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介加水分解による切断（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解による切断（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらに対する米国特許第４，５６９，７８９号）を含む。
【００８３】
１よりも多くの薬剤を抗体に結合させることが所望され得る。１つの実施形態では、薬剤の複数の分子が、１つの抗体分子に結合される。別の実施形態では、１よりも多い型の薬剤が、１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態にも関わらず、１よりも多い薬剤を有する免疫結合体が、種々の様式で調製され得る。例えば、１よりも多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のために複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【００８４】
キャリアは、種々の様式において薬剤を保有し得、この様式は、直接的かまたはリンカー基を通じてかのいずれかでの共有結合を含む。適切なキャリアは、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらに対する米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチドおよびアミノデキストランのようなポリサッカリド（Ｓｈｉｈらに対する米国特許第４，６９９，７８４号）を含む。キャリアはまた、非共有結合によってか、または例えば、リポソームビヒクル内でのようなカプセル化によって薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示している。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためにドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらに対する米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示している。
【００８５】
（Ｔ細胞）
免疫治療組成物はまた、またはあるいは、ＷＴ１に特異的なＴ細胞を含む。このような細胞は、一般に、標準的な手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離系（例えば、ＣｅｌｌＰｒｏ  Ｉｎｃ．Ｂｏｔｈｅｌｌ  ＷＡから入手可能なＣＥＰＲＡＴＥＴＭ系）を使用して、哺乳動物（例えば、患者）の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分内に存在し得る（またはそれらから単離され得る）（米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）。あるいは、Ｔ細胞は、関連しているかまたは関連していない、ヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物に由来し得る。
【００８６】
Ｔ細胞は、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激され得る。このような刺激は、ＷＴ１ポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を許容するに十分な条件下および時間で行われる。好ましくは、ＷＴ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、抗原特異的Ｔ細胞の生成を容易にするために、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）内に存在する。簡潔には、Ｔ細胞は、慣用的な技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって）、患者または関連しているかもしくは関連していないドナーから単離され得、ＷＴ１ポリペプチドとインキュベートされる。例えば、Ｔ細胞は、ＷＴ１ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）または匹敵する量のＷＴ１ポリペプチドを合成する細胞とともに、３７℃で２〜９日間（代表的には４日間）インビトロでインキュベートされ得る。コントロールとして働くＷＴ１ポリペプチドの非存在下で、Ｔ細胞サンプルの別々のアリコートをインキュベートすることが所望され得る。
【００８７】
Ｔ細胞は、このＴ細胞がＷＴ１ポリペプチドでコーティングされているか、またはこのようなポリペプチドをコードする遺伝子を発現している標的細胞を殺傷する場合に、ＷＴ１ポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞の特異性は、任意の種々の標準的な技術を使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいては、陰性コントロールと比較して、溶解および／または増殖における刺激指数の２倍を超える上昇は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５〜１０７０、１９９４に記載されるように行われ得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出が、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の上昇した速度を測定することによって（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡ中に取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）検出され得る。Ｔ細胞増殖を検出する他の様式は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生、Ｃａ２＋フラックス、または色素（例えば、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム）の取り込みにおける上昇を測定することを包含する。あるいは、リンホカイン（例えば、インターフェロン−γ）の合成が、測定され得るか、またはＷＴ１ポリペプチドに応答し得るＴ細胞の相対数が、定量され得る。サイトカイン放出（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）のレベルにおける２倍の上昇がＴ細胞活性化を示す標準的なサイトカインアッセイを使用して測定した場合に、ＷＴ１ポリペプチド（２００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との３〜７日間の接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の上昇を生じるはずであり、そして／または上記のような２〜３時間の接触は、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ  １９９８）を参照のこと）。ＷＴ１特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、このＴ細胞は、患者または関連しているか、もしくは関連していないドナーに由来し、そして刺激および拡大の後に患者に投与される。
【００８８】
ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、またはＷＴ１発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的活性化が、種々の様式で検出され得る。特異的Ｔ細胞活性化を検出するための方法は、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えば、リンホカイン）の産生、または細胞溶解活性の生成（すなわち、ＷＴ１に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の生成）を検出することを包含する。ＣＤ４＋Ｔ細胞については、特異的Ｔ細胞活性化を検出するために好ましい方法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８＋Ｔ細胞については、特異的Ｔ細胞活性化を検出するために好ましい方法は、細胞溶解性活性の生成の検出である。
【００８９】
治療目的のために、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、またはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで数の上では増殖され得る。インビトロでのこのようなＴ細胞の増殖は、種々の様式で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）、および／またはＷＴ１ポリペプチドを合成する刺激性細胞を添加してか、または添加することなく、ＷＴ１ポリペプチドに再び曝露され得る。刺激性細胞の添加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成する場合に好ましい。Ｔ細胞は、ＷＴ１ポリペプチドでの断続的な再刺激に応答する特異性を保持したまま、インビトロで多数に増殖され得る。簡潔には、一次的なインビトロ刺激（ＩＶＳ）については、多数のリンパ球（例えば、４×１０７よりも多い）が、ヒト血清を含む培地を有するフラスコ中に置かれ得る。ＷＴ１ポリペプチド（例えば、１０μｇ／ｍｌでのペプチド）が、破傷風毒素（例えば、５μｇ／ｍｌ）とともに、直接的に添加され得る。次いで、これらのフラスコが、インキュベートされ得る（例えば、３７℃で７日間）。第２のＩＶＳについては、次いで、Ｔ細胞が収集され、そして２〜３×１０７の照射された末梢血単核細胞を有する新しいフラスコ中に置かれる。ＷＴ１ポリペプチド（例えば、１０μｇ／ｍｌ）が、直接的に添加される。これらのフラスコが、３７℃で７日間インキュベートされる。第２のＩＶＳの２日後および４日後に、２〜５単位のインターロイキン−２（ＩＬ−２）が、添加され得る。第３のＩＶＳについては、Ｔ細胞は、ウェル中に置かれ得、そしてこのペプチドでコーティングされた、個体独自のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞で刺激され得る。ＩＬ−２が、各々の周期の２日目および４日目に添加され得る。これらの細胞が特異的な細胞傷害性Ｔ細胞であることが示されるとすぐに、これらは、２日目、４日目および６日目で、より多いＩＬ−２（２０単位）を用いて、１０日の刺激周期を使用して拡大され得る。
【００９０】
あるいは、ＷＴ１ポリペプチドの存在下で増殖する１以上のＴ細胞が、クローニングによって、数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野において周知であり、そして限界希釈を含む。応答性Ｔ細胞は、密度勾配遠心分離およびヒツジ赤血球細胞ロゼッティングにより感作された患者の末梢血から精製され得、そして照射された自己充填細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｆｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）の存在下で名目上の抗原で刺激することによって培養物中で樹立され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞株を生成するために、ＷＴ１ポリペプチドが、抗原性刺激として使用され、そしてエプスタイン−バーウイルスでの感染により不死化された自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）またはリンパ芽球腫細胞株（ＬＣＬ）は、抗原提示細胞として使用される。ＣＤ８＋Ｔ細胞株を生成するために、ＷＴ１ポリペプチドを産生する発現ベクターでトランスフェクトされた自己抗原提示細胞が、刺激性細胞として使用され得る。樹立されたＴ細胞株は、１×１０６の照射されたＰＢＬ細胞またはＬＣＬ細胞および組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（５０Ｕ／ｍｌ）を有する９６ウェル平底プレートに、１ウェルあたり０．５の細胞の頻度で、刺激されたＴ細胞をプレートすることによって抗原刺激の２〜４日後にクローニングされ得る。樹立されたクローン増殖を有するウェルは、最初のプレーティングのおよそ２〜３週間後に同定され、そして自己抗原提示細胞の存在下で適切な抗原で再刺激され、次いで、抗原刺激の２〜３日後での低用量のｒＩＬ２（１０Ｕ／ｍｌ）の添加によって拡大され得る。Ｔ細胞クローンは、およそ２週間毎の抗原およびｒＩＬ２での定期的な再刺激によって２４ウェルプレートにおいて維持され得る。
【００９１】
特定の実施形態では、同種異系Ｔ細胞が、インビボおよび／またはインビトロで初回免疫され得る（すなわち、ＷＴ１に感作される）。このような初回免疫は、ＷＴ１ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリペプチドを産生する細胞と、Ｔ細胞とを、Ｔ細胞を初回免疫することを許容する条件下かつ時間で、接触させることによって達成され得る。一般に、Ｔ細胞は、例えば、本明細書中に記載される標準的な増殖、クロム放出アッセイおよび／またはサイトカイン放出アッセイにより測定されるように、ＷＴ１ポリペプチドとの接触がＴ細胞の増殖および／または活性化を生じる場合に、初回免疫されるとみなされる。陰性コントロールと比較して、増殖または溶解における２倍よりも大きい上昇、およびサイトカインレベルにおける３倍よりも大きい上昇の刺激指数は、Ｔ細胞特異性を示す。インビトロで初回免疫された細胞は、例えば、骨髄移植において、またはドナーリンパ球注入として、用いられ得る。
【００９２】
ＷＴ１に特異的なＴ細胞は、ＷＴ１タンパク質を発現する細胞を殺傷する。ＷＴ１のためのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）鎖をコードする遺伝子の導入は、ＷＴ１を保有する、白血病細胞および癌細胞に対する応答を量的かつ質的に改善する手段として使用される。ＷＴ１陽性細胞と反応し得るＴ細胞の数を増加させるためのワクチンは、ＷＴ１を保有する細胞を標的化するための一つの方法である。ＷＴ１に特異的なＴ細胞を用いたＴ細胞療法は別の方法である。代替的な方法は、ＷＴ１に特異的なＴＣＲ鎖をＴ細胞または溶解能を有する他の細胞に導入することである。適切な実施形態において、このＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、ＷＯ９６／３０５１６（これは、本明細書中において、参考として援用される）に記載されるように、ＷＴ１特異的Ｔ細胞株からクローン化され、そして養子Ｔ細胞治療のために使用される。
【００９３】
（Ｔ細胞レセプター組成物）
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、ジスルフィド結合によって連結されている、２つの異なる、非常に可変性のポリペプチド鎖（Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖と呼ばれる）からなる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、１４８〜１５９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。このα／βヘテロダイマー（異種二量体）は、細胞膜で不変のＣＤ３鎖と複合体化する。この複合体は、ＭＨＣ分子に結合した特定の抗原性ペプチドを認識する。ＴＣＲ特異性の膨大な多様性は、体細胞遺伝子再配列により、まるで免疫グロブリンの多様性のように生成される。このβ鎖遺伝子は、５０を超える可変性領域（Ｖ）、２つの多様性領域（Ｄ）、１０を超える連結セグメント（Ｊ）、および２つの定常領域セグメント（Ｃ）を含む。α鎖遺伝子は、７０を超えるＶセグメント、および６０を超えるＪセグメントを含むが、Ｄセグメントを含まず、そして１つのＣセグメントを含む。胸腺におけるＴ細胞発達の間、β鎖のＤ〜Ｊ遺伝子再配列が生じ、続いて、Ｖ遺伝子セグメントのＤＪへの再配列が生じる。この機能的ＶＤＪβエキソンは、転写され、そしてスプライシングされてＣβに連結される。α鎖に関しては、Ｖα遺伝子セグメントは、Ｊα遺伝子セグメントに再配列して、機能的エキソンを形成し、これが次に転写され、Ｃαにスプライシングされる。多様性は、さらにβ鎖のＶセグメントと、Ｄセグメントと、Ｊセグメントとの間、そしてα鎖のＶセグメントと、Ｊセグメントとの間のＰおよびＮ−ヌクレオチドの無作為な付加によって、組み換えプロセスの間にさらに増大する（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、９８および１５０．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。
【００９４】
本発明は、別の局面において、本明細書に開示されるポリペプチド、またはその改変体もしくは誘導体に特異的なＴＣＲを提供する。本発明に従って、本明細書に記載の腫瘍ポリペプチドを認識する、Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖について、Ｖ−ＪもしくはＶ−Ｄ−Ｊ接合領域、またはその部分について、ポリヌクレオチドおよびアミノ酸の配列が提供される。一般に、本発明のこの局面は、ＭＨＣの文脈において提示される腫瘍ポリペプチドを認識するか、またはそれに結合するＴ細胞レセプターに関する。好ましい実施形態において、Ｔ細胞レセプターによって認識される腫瘍抗原は、本発明のポリペプチドを含む。例えば、ＷＴ１ペプチドに特異的なＴＣＲをコードするｃＤＮＡは、標準的な分子生物学技術および組み換えＤＮＡ技術を用いて、腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞から単離され得る。
【００９５】
本発明はさらに、腫瘍ポリペプチドを認識するか、または結合する、本発明のＴ細胞レセプターと実質的に同じ機能または活性を有する、Ｔ細胞レセプターまたはそれらのアナログを包含する。このようなレセプターとしては、レセプターのフラグメント、または本明細書中で提供されたＴ細胞レセプターの置換、付加、もしくは欠失変異体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、本明細書中に提供されたＴ細胞レセプターに対して実質的に相同であるか、または実質的に同じ活性を保持する、ポリペプチドまたはペプチドもまた包含する。用語「アナログ」は、本明細書中に提供されるＴ細胞レセプターに実質的に同一であるアミノ酸残基配列を有する任意のタンパク質またはポリペプチドを含み、ここで１つ以上の残基、好ましくは５残基以下、より好ましくは２５残基以下が、機能的に類似の残基と保存的に置換されており、そしてこれは、本明細書中に記載のＴ細胞レセプターの機能的局面を示す。
【００９６】
本発明はさらに、本明細書に記載のポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされている（これによって、この宿主細胞はこのポリペプチドに特異的にされる）適切な哺乳動物宿主細胞、例えば、非特異的Ｔ細胞を提供する。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、別々の発現ベクターに含まれ得るか、あるいは単一の発現ベクター（これはまた、リボソーム内侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流の遺伝子のｃａｐ依存性翻訳のためにＩＲＥＳを含む）に含まれ得る。このポリペプチドに特異的なＴＣＲを発現するこの宿主細胞は、例えば、以下にさらに考察されるようなＷＴ１関連癌の養子免疫療法のために、用いられ得る。
【００９７】
本発明のさらなる局面において、本明細書に挙げたポリペプチドに特異的なクローニングされたＴＣＲは、ＷＴ１関連癌の診断のためのキットに用いられ得る。例えば、腫瘍特異的ＴＣＲの核酸配列またはその一部は、生物学的サンプル中で、特定のＴＣＲをコードする再配列された遺伝子の発現を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る。従って、本発明はさらに、ポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするメッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡを検出するためのアッセイを提供する。
【００９８】
（ペプチド−ＭＨＣテトラマー複合体）
本発明は、別の局面において、本明細書中に開示されたポリペプチドを認識するＴ細胞、またはそれらの改変体もしくは誘導体に特異的なペプチド−ＭＨＣテトラマー複合体（テトラマー）を提供する。１つの実施形態では、テトラマーは、ＷＴ１特異的Ｔ細胞の検出において使用され得る。テトラマーは、ＷＴ１特異的免疫応答をモニタリングすることにおいて、ＷＴ１関連悪性疾患の早期検出において、および最小後遺症をモニタリングするために使用され得る。テトラマー染色は、代表的には、フローサイトメトリー分析を用いて実施され、そして再発または疾患進行の危険性がより高いＷＴ１関連疾患に罹患した患者集団内の群を同定するために使用され得る。
【００９９】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物への投与のための、単独でかまたは治療の１つ以上の他の様相と組合わせてかのいずれかでの、薬学的に受容可能なキャリア中の本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞、ＴＣＲ、および／または抗体組成物の処方物に関する。
【０１００】
所望される場合、本明細書中に開示される組成物が、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤など）と組合わせても同様に投与され得ることが、理解される。事実、さらなる薬剤が標的細胞または宿主組織と接触した際に有意な有害な影響をもたらさないとすれば、さらに含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、この組成物は、特定の例において必要とされる種々の他の薬剤と共に送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは、本明細書中に記載されるように化学的合成され得る。同様に、このような組成物はさらに、置換または誘導体化されたＲＮＡ組成物またはＤＮＡ組成物を含み得る。
【０１０１】
従って、本発明の別の局面において、生理学的に受容可能なキャリアと組合わせた、本明細書中に記載される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、ＴＣＲ、および／またはＴ細胞組成物を含む薬学的組成物が、提供される。特定の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、予防ワクチン適用および治療ワクチン適用における使用のための、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド組成物および／または免疫原性ポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ，１９９５）に記載される。一般的に、このような組成物は、１つ以上の免疫刺激剤と組合わせた、本発明のポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物の１つ以上を含む。
【０１０２】
本明細書中に記載される任意の薬学的組成物が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、例えば、薬学的に受容可能な非毒性の塩基（有機塩基（例えば、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明の例示的な免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）は、上記のようなポリペプチドの１つ以上をコードするＤＮＡを含み、その結果このポリペプチドは、インサイチュで生成される。上記のように、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系の内のいずれかで投与され得る。実際、多数の遺伝子送達技術（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３−１９８，１９９８およびこの中に引用される参考文献に記載される遺伝子送達技術）が、当該分野で周知である。当然、適切なポリヌクレオチド発現系は、患者における発現のための必要な調節性のＤＮＡ調節配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。あるいは、細菌送達系は、その細胞表面上にポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、またはエピトープなどを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含み得る。
【０１０４】
従って、特定の実施形態において、本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知のウイルスに基づく系のうちのいずれかを用いて、発現のための適切な哺乳動物宿主細胞に導入される。１つの例示的な実施形態において、レトロウイルスが、遺伝子送達系のための簡便かつ有効な基盤を提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが、単離され、そして被験体に送達され得る。多数の例示的なレトロウイルス系が、記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。
【０１０５】
さらに、多数の例示的なアデノウイルスに基づく系もまた、記載されている。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に残り、従って、挿入変異誘発に関連する危険性を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６）。
【０１０６】
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系もまた、ポリヌクレオチド送達に関して開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ  ９２／０１０７０およびＷＯ  ９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０１０７】
遺伝子移入による、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を送達するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、ポックスウイルスのファミリー（例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルス）から誘導されるものが挙げられる。例として、新規分子を発現するワクシニアウイルスの組換え体は、以下のように構築され得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡを最初に、ワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように、適切なベクターに挿入する。次いで、このベクターを使用して、ワクシニアで同時に感染させる細胞にトランスフェクトする。相同組換えによって、ワクシニアプロモーターおよび目的のポリペプチドをコードする遺伝子を、ウイルスゲノムに挿入する。生じるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体を、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でこの細胞を培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークをピックアップすることによって、選択し得る。
【０１０８】
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、生物の宿主細胞における、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドの誘導可能な一過性発現または同時発現を提供するために、好都合に使用され得る。この特定の系において、細胞を最初に、インビトロで、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルスの組換え体に感染させる。このポリメラーゼは、それがＴ７プロモーターを保有する鋳型のみを転写する点で、鋭敏な特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される目的のポリヌクレオチドでトランスフェクトする。ワクシニアウイルスの組換え体から細胞質中で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは次いで、宿主翻訳機構によってポリペプチドに翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルで一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
【０１０９】
あるいは、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）もまた使用されて、目的のコード配列を送達し得る。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に、防御免疫を与えることが公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ生産的に複製し得、故に、哺乳動物細胞において感染性ではないからである。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記に記載されるように、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ  ９１／１２８８２；ＷＯ  ８９／０３４２９；およびＷＯ  ９２／０３５４５を参照のこと。多数のポックスウイルスが、異種タンパク質の発現のための生存ウイルスベクターとして開発されている（Ｃｅｐｋｏら、Ｃｅｌｌ  ３７：１０５３−１０６２（１９８４）；Ｍｏｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４６２６−４６３０（１９８７）；Ｌｏｗｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３８９６−３９００（１９８７）；ＰａｎｉｃａｌｉおよびＰａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７−４９３１（１９８２）；Ｍａｃｈｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７４１５−７４１９（１９８２））。代表的な鶏痘ウイルスおよびブタ痘ウイルスは、それぞれ受託番号ＶＲ−２２９およびＶＲ−３６３で、ＡＴＣＣを通じて入手可能である。組換えワクシニア−−ＣＥＡは、受託番号ＶＲ２３２３でＡＴＣＣを通じて入手可能である。また、他の例示のウイルスベクターとしては、Ｔｈｅｒｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）により記載されたウイルス（例えば、米国特許第６，０５１，４１０号、同第５，８５８，７２６号、同第５，６５６，４６５号、同第５，８０４，１９６号、同第５，７４７，３２４号、同第６，３１９，４９６号、同第６，１６５，４６０号において）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
多数のアルファウイルスベクターのいずれかもまた、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達のために使用され得、これらとしては、米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６８６号；同第６，００８，０３５号および同第６，０１５，６９４号に記載されるベクターが挙げられる。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）に基づく特定のベクターもまた、使用され得、この例示的な例は、米国特許第５，５０５，９４７号および同第５，６４３，５７６号に見出され得る。
【０１１１】
さらに、分子結合体化ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクター）がまた、本発明における遺伝子送達に用いられ得る。
【０１１２】
これらおよび他の公知のウイルスベースの送達系に対するさらなる例示的情報は、例えば、以下に見出され得る：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ  ２，２００，６５１：ＥＰ  ０，３４５，２４２号；ＷＯ  ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。
【０１１３】
当業者に容易に理解されるように、任意の数のさらなる成分が、本明細書中に記載されるように、ＷＴ１ポリペプチドまたはその任意の部分を発現するＤＮＡまたはレトロウイルスベクター中に存在し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはペプチドの送達のための発現ベクターは、任意の数の種々の同時刺激分子（ＣＤ２８、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３が挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る。送達ベクターはまた、任意の多くのサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−２を含み得る。１つの例示の実施形態において、組換えベクターウイルスベクター（例えば、ワクシニアベクターまたは鶏痘ウイルスベクター）としては、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３が挙げられる。
【０１１４】
本発明はまた、ＷＴ１の発現に関連する悪性腫瘍の処置において使用するための、本明細書中に記載されるＤＮＡおよび／またはウイルスベクターの任意の組み合わせの使用を包含する。１つの例示の実施形態において、組換えワクシニアウイルスベクターは、ＷＴ１関連悪性腫瘍に罹患した動物患者またはヒト患者に投与され、その後、組換え鶏痘ウイルスベクターが投与される。本発明の別の実施形態において、組換え鶏痘ウイルスは、ワクシニアベクターの投与後に２度投与される（例えば、プライム／ブースト／ブーストワクチン接種レジメン）。
【０１１５】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込み得る。この組み込みは、相同組み換えを介して特定の位置および方向であり得る（遺伝子置換）か、または無作為な非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持され得る。このようなポリヌクレオチドセグメントすなわち「エピソーム」は、宿主細胞の周期に独立してまたは同調して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、そしてこの細胞中にこのポリヌクレオチドが残る様式は、使用される発現構築物のタイプに依存する。
【０１１６】
本発明の別の実施形態において、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載され、そしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１〜１６９２、１９９３によって概説されるように、ポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡとして投与／送達される。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【０１１７】
なお別の実施形態において、本発明の組成物は、微粒子銃アプローチ（その多くが記載されている）を介して送達され得る。１つの代表的な例において、ガス駆動粒子加速（ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって製造されたデバイスのようなデバイスで達成され得る。そのいくつかの例は、米国特許第５，８４６，７９６号；同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；および欧州特許番号第０５００７９９号に記載されている。このアプローチは、注射針のない（無注射針）（ニードルフリー）送達アプローチを提供する。ここでは、微視的な粒子（例えば、ポリヌクレオチド粒子、またはポリペプチド粒子）の乾燥粉末処方物を、手持ちデバイスによって生成されたヘリウムガスジェット内で高速に加速し、目的の標的組織内へ粒子を噴射する。
【０１１８】
関連の実施形態において、本発明の組成物のガス駆動注射針なし注入に有用であり得る他のデバイスおよび方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）によって提供されるものが挙げられ、そのいくつかの例は、米国特許第４，７９０，８２４号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３９９，１６３号；同第５，５２０，６３９号；および同第５，９９３，４１２号に記載されている。
【０１１９】
別の実施形態に従って、本明細書に記載される薬学的組成物は、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞、ＴＣＲおよび／またはＡＰＣ組成物に加えて、１つ以上の免疫賦活剤（免疫刺激因子）を含む。免疫賦活剤とは、本質的に、外因性抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞媒介）を増大または増強する任意の物質をいう。免疫賦活剤の１つの好ましい型は、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物質（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ誘導化タンパク質）を含む。特定のアジュバント、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム）；カルシウム，鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンの誘導化多糖またはアニオンの誘導化多糖；ポリフォスファーゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）；生分解性ミクロスフェア：モノホスホリルリピドＡおよびモノホスホリルクイル（ｑｕｉｌ）Ａとして、市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２および他の同様の成長因子）はまた、アジュバントとして使用され得る。
【０１２０】
本発明の特定の実施形態において、アジュバント組成物は、Ｔｈ１型の免疫応答を優勢に誘導するものが好ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０１２１】
Ｔｈ１型優勢の応答を誘発するための特定の好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、Ｔｈ１優勢の応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして例えばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載される。免疫賦活剤ＤＮＡ配列がまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２，１９９６によって記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）、またはその誘導体（ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を含む）；エスシン（Ｅｓｃｉｎ）；ジキトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａもしくはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバントの組み合わせ、例えば、ＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ  Ａ、β−エスシン、またはジギトニンを含む以下の群のうち少なくとも２つの組み合わせ、において１つより多いサポニンを含む。
【０１２２】
あるいは、このサポニン処方物は、キトサン、または他のポリカチオン性ポリマーからなるワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−コ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、ポリサッカライドまたは化学的に改変されたポリサッカライドからなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子、などと組み合わせられ得る。サポニンはまた、コレステロールの存在下で処方されて、リポソームまたはＩＳＣＯＭのような粒子構造を形成し得る。さらに、サポニンは、非粒子的溶液もしくは懸濁液、または少数層リポソームもしくはＩＳＣＯＭのような粒子状構造のいずれかで、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に処方され得る。サポニンはまた、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のような賦形剤と一緒に処方されて、粘度を増大され得るか、またはラクトースのような粉末賦形剤とともに乾燥粉末形態に処方され得る。
【０１２３】
１つの好ましい実施形態において、アジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントとの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）される、あまり反応発生的（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でない組成物）を含む。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを使用する、別の特に好ましいアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【０１２４】
別の強化されたアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１との組み合わせがＷＯ００／０９１５９に開示されている。好ましくは、この処方物は、さらに、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。
【０１２５】
本発明の薬学的組成物における使用のためのさらなる代表的アジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国特許出願番号０８／８５３，８２６および０９／０７４，７２０ならびに米国特許第６，３０３，３４７号（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるアジュバント）、ならびにポリオキシエチレンエーテルアジュバント（例えば、ＷＯ  ９９／５２５４９Ａ１）に記載ののようなアジュバントが挙げられる。本発明の薬学的組成物において使用するためのさらなる例示のアジュバントとしては、イソツセロゾル（ｉｓｏｔｕｃｅｒｏｓｏｌ）が挙げられる。
【０１２６】
他の好ましいアジュバントは、一般式（Ｉ）：
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
のアジュバント分子を含み、
ここで、ｎは、１〜５０であり、Ａは、結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
【０１２７】
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、ｎは、１と５０との間、好ましくは４〜２４、最も好もしくは９であり、このＲ成分は、Ｃ１〜５０、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、そして最も好ましくはＣ１２アルキルであり、そしてＡは、結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、好ましくは０．１〜１０％、そして最も好ましくは０．１〜１％の範囲にあるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版、７７１７項目）に記載される。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載される。
【０１２８】
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望の場合、別のアジュバントと組み合わせられ得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中の英国特許出願第ＧＢ９８２０９５６．２号に記載されるようなＣｐＧとの組み合わせである。
【０１２９】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書に記載される免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）を介して宿主に送達される。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、そして／あるいは受け手と免疫学的に適合性（すなわち、一致するＨＬＡハプロタイプ）であるように遺伝学的に改変されてもよいが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離されてもよいし、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞であってもよい。
【０１３０】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫を惹起するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質突起（樹状突起）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングし、そして提示するそれらの能力、および未刺激Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替物として、分泌小胞抗原ローディング樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【０１３１】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドならびに／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【０１３２】
樹状細胞は、「未成熟」細胞および「成熟」細胞として便宜的に分類され、このことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を単純な方法で区別することを可能にする。しかしこの命名は、分化のあらゆる可能な中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未成熟樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０１３３】
ＡＰＣは、一般に、本発明のポリヌクレオチド（またはその部分もしくは他の改変体）を用いてトランスフェクトされ得、その結果、このコードされたポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む薬学的組成物は、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、ＷＯ９７／２４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、牛痘、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞の補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存在下で、結合していない免疫学的パートナーでパルスされ得る。
【０１３４】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用され得るが、このタイプのキャリアは、代表的に投与様式に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、粘膜投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、および筋肉内投与を含む）のために処方され得る。
【０１３５】
このような薬学的組成物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得る。特定の実施形態において、好ましくは、この処方物は比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。しかし、他の実施形態において、投与直後のより迅速な放出速度が所望され得る。このような組成物の処方は十分に、公知の技術を使用する当業者のレベル内である。この点に関して有用な例示的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の例示的な遅延放出キャリアとしては、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）を含む超分子バイオベクター、ならびに必要に応じて、両親媒性化合物を含む外部層（例えば、リン脂質）（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）を含む超分子バイオベクターが挙げられる。徐放性処方物内に含まれる活性な化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予期される放出持続期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【０１３６】
別の例示的な実施形態において、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテートポリグリコレート）は、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変Ｂ型肝炎コアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ／９９  ４０９３４およびそこで引用される参考文献に記載されるような系）もまた、多くの適用に有用である。別の例示的なキャリア／送達系は、粒状物−タンパク質複合体含有キャリア（例えば、米国特許第５，９２８，６４７号に記載されるキャリア）を使用し、これは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０１３７】
別の例示的な実施形態では、リン酸カルシウムコア粒子が、本発明の組成物に関する、キャリア、ワクチンアジュバント、または制御放出マトリクスとして用いられる。例示的なリン酸カルシウム粒子は、例えば、公開された特許出願第ＷＯ／００４６１４７に開示される。
【０１３８】
本発明の薬学的組成物はしばしば、１つ以上の、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質、懸濁剤、増粘剤および／または保存剤をさらに含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。
【０１３９】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、単回用量容器または多回用量容器（例えば、シールしたアンプルまたはバイアル）中に存在し得る。このような容器は、代表的に、使用まで処方物の無菌性および安定性を維持するような様式で、シールされる。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、薬学的組成物は、使用の直前に無菌の液体キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存され得る。
【０１４０】
様々な処置レジメンにおいて本明細書中で記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメンおよび処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および処方を含む）の開発は、当該分野で周知であり、これらのいくつかは、一般的な例示目的のために以下で簡単に考察される。
【０１４１】
特定の適用において、本明細書中で開示される薬学的組成物は、経口投与によって動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤と共にかまたは同化可能食用キャリアと共に処方され得るか、あるいはこれらの組成物は、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入され得るか、あるいはこれらの組成物は圧縮されて錠剤とされ得るか、あるいはこれらの組成物は食餌の食品に直接組み込まれ得る。
【０１４２】
活性化合物は、さらに賦形剤と共に組み込まれ得、そして経口摂取可能錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラートなどの形態で使用され得る（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７年３月２７日；３８６（６６２３）：４１０−４；Ｈｗａｎｇら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １９９８；１５（３）：２４３−８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと）。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下の種々のさらなる成分のいずれかを含み得る：例えば、結合剤（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）が添加され得る。投薬量単位形態がカプセル剤である場合、これは上記のタイプの材料に加えて液体キャリアを含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ投薬単位の物理的形態を改変し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、シェラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ用いられる量で実質的に無毒性でなければならない。さらに、活性化合物は、持続放出調製物および持続放出処方物に組み込まれ得る。
【０１４３】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含むが、活性成分の百分率は、もちろん、変化し得、そして好都合には、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％以上との間であり得る。当然、治療的に有用な組成物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、任意の所定の単位用量の化合物において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の貯蔵寿命のような要因、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、そしてそのようなものとして、種々の投薬量および処置レジメンが、所望され得る。
【０１４４】
経口投与について、あるいは、本発明の組成物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤とともに組み込まれ得る。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、結合剤、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る、錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０１４５】
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらには腹腔内送達することが望ましい。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのいくつかは、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止するために、保存剤を含む。
【０１４６】
注入用途のために適切な例示的な薬学的形態として、無菌水性液剤または無菌水性分散物および無菌注射用液剤または無菌注射用分散物の即時調製のための無菌散剤が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、無菌でなけらばならず、そして容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）汚染作用から保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが、好ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０１４７】
一実施形態において、水溶液の非経口投与のために、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被験体の状態に依存して必然的に生じる。さらに、ヒト投与について、調製物は、もちろん、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を好ましく満たす。
【０１４８】
本発明の別の実施形態において、本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。
【０１４９】
キャリアは、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生じない分子実体および組成物をいう。
【０１５０】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８  Ｍａｒ  ２；５２（１−２）：８１−７）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での例示的な経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される。
【０１５１】
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などを、適切な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために使用する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達するために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合され得る。
【０１５２】
潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の形成および使用は一般に、当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８  Ｊｕｌ；１６（７）：３０７−２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９８  Ｍａｒ；５６（３）：６９１−５；Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ａｕｇ；３５（８）：８０１−９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９９５；１２（２−３）：２３３−６１；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として詳細に援用される）を参照のこと）。
【０１５３】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションが通常困難である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０  Ｓｅｐ  ２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０  Ａｐｒ；９（３）：２２１−９）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターなどを、種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答にも受容不可能な毒性にも関連しないようである。
【０１５４】
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。
【０１５５】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは一般に、化合物を安定かつ再現可能な様式で捕獲し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ  Ｐｈａｒｍ．１９９８  Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３−２８を参照のこと）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計され得る。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９８８；５（１）：１−２０；Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９８  Ｍａｒ；４５（２）：１４９−５５；Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．１９９８  Ｊａｎ  ２；５０（１−３）：３１−４０；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されるようにして作製され得る。
【０１５６】
（悪性疾患の治療）
癌治療に対する免疫学的アプローチは、癌細胞がしばしば、異常または外来の細胞および分子に対する身体の防御を回避するという認識、およびこれらの防御が、失われた基礎を回復するために治療的に刺激され得るという認識に基づく（例えば、Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２の６２３−６４８頁）。種々の免疫エフェクターが、直接的または間接的に、腫瘍の増殖を阻害し得るという、多数の最近の観察は、癌治療に対するこのアプローチの新たにされた興味をもたらしている（例えば、Ｊａｇｅｒら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００１；６０（１）：１−７；Ｒｅｎｎｅｒら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ；７９（１２）：６５１−９）。
【０１５７】
機能が抗腫瘍細胞免疫および身体からの腫瘍細胞の排除に関連する、４つの基礎的な細胞型は、以下である：ｉ）Ｂリンパ球であって、これは、非自己侵入細胞の同定および標識のために、血漿中に免疫グロブリンを分泌する；ｉｉ）単球であって、これは、免疫グロブリンでコーティングされた標的侵入細胞を溶解およびプロセシングすることを担う、相補タンパク質を分泌する；ｉｉｉ）ナチュラルキラーリンパ球であって、腫瘍細胞の破壊、抗体依存性細胞傷害性、および自然の殺傷のための、２つの機構を有する；ならびにｉｖ）Ｔリンパ球であって、抗原特異的レセプターをプロセシングし、そして相補的マーカー分子を保有する腫瘍細胞を認識し得る（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｈ．，１９８９，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編）Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，９２３−９５５頁）。
【０１５８】
癌の免疫療法は、一般に、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはこれらの両方を誘導することに焦点を当てる。さらに、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞が、抗体または細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの二次的な誘導のために必要であることが、十分に確立されている。癌細胞（特に、ＷＴ１発現に関連する癌細胞）に選択的であるかまたは理想的には特異的な、ポリペプチド抗原は、ＷＴ１発現に関連する癌に対する免疫応答を誘導するための強力なアプローチを与え、そして本発明の重要な局面である。
【０１５９】
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載の組成物およびワクチンは、悪性疾患（例えば、進行性または転移性の疾患、あるいは小さい腫瘍負荷（例えば、最小の残留性疾患）によって特徴付けられる疾患）の発症を阻害するために使用され得る。一般的に、このような方法は、ＷＴ１発現に関連する疾患を予防、遅延または処置するために使用され得る。換言すると、本明細書中に提供される治療方法は、既存のＷＴ１関連疾患を処置するために使用され得るか、あるいは疾患を有さない患者において、またはＷＴ１発現に未だ関連付けられていない疾患に罹患している患者において、このような疾患の発症を予防または遅延させるために使用され得る。
【０１６０】
本明細書中で使用される場合、疾患の経過の間のいずれかの時点で疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）が、その同じ組織の正常細胞より検出可能に高レベルでＷＴ１ポリペプチドを生成する場合、その疾患は、「ＷＴ１発現に関連する」。ＷＴ１発現の悪性疾患との関連は、ＷＴ１が腫瘍上に存在することを必要としない。例えば、ＷＴ１の過剰発現は、腫瘍の開始に関連し得るが、そのタンパク質の発現は、その後消失し得る。あるいは、ＷＴ１発現の増加によって特徴付けられない悪性疾患は、後の時点で、ＷＴ１発現の増加によって特徴付けられる疾患に進行し得る。従って、疾患細胞が、増加レベルのＷＴ１を先に発現したか、現在発現するか、または後に発現することが予想される任意の悪性疾患は、「ＷＴ１発現に関連する」するとみなされる。
【０１６１】
免疫治療は、任意の種々の技術を使用して実行され得、ここで、本明細書中に提供される化合物または細胞は、患者からＷＴ１発現細胞を除去するように機能する。このような除去は、ＷＴ１またはＷＴ１を発現する細胞に特異的な免疫応答を患者において増強または誘導する結果として生じ得る。あるいは、ＷＴ１発現細胞は、エキソビボで除去され得る（例えば、自己骨髄、末梢血、あるいは骨髄または末梢血の画分の処置によって）。骨髄または末梢血の画分は、当該分野の任意の標準的技術を使用して得られ得る。
【０１６２】
このような方法において、薬学的組成物およびワクチンは、患者に投与され得る。本明細書中で使用される場合、「患者」とは、任意の温血動物（好ましくは、ヒト）をいう。患者は、悪性疾患に罹患していてもよいし、していなくてもよい。従って、上記の薬学的組成物およびワクチンは、疾患の発生を予防するために（すなわち、予防的に）使用され得るか、または疾患に罹患した患者を処置するために（例えば、既存の疾患の進行および／または転移を、予防または遅延させるために）使用され得る。疾患に罹患した患者は、最小の残留性疾患（例えば、完全または部分的寛解における白血病患者中の低い腫瘍負荷、あるいは外科的な放射線療法および／または化学療法後の腫瘍負荷の減少後の癌患者）を有し得る。このような患者は、再発を阻害するために免疫化され得る（すなわち、再発を予防または遅延させるか、あるいは再発の重篤度を低下させる）。特定の好ましい実施形態において、患者は、白血病（例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬまたは幼少期ＡＬＬ）、脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）または癌（例えば、胃腸癌、肺癌、甲状腺癌または乳癌、あるいは黒色腫）に罹患し、ここで、白血病の癌は、ＷＴ１陽性（すなわち、本明細書中に提供されるような、抗ＷＴ１抗体と検出可能に反応するか、または本明細書中に記載されるように、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能なレベルでＷＴ１  ｍＲＮＡを発現する）か、またはＷＴ１発現細胞に対する自己免疫疾患に罹患する。
【０１６３】
ＷＴ１の過剰発現に関連する他の疾患としては、Ｓａｔｏｈ  Ｆ．ら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．５０（６）：４５８〜７１（２０００）およびＣａｍｐｂｅｌｌ  Ｃ．Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７８（２）：１８２〜８（１９９８）に記載されるような腎臓癌（例えば、腎細胞癌腫またはウィルムス腫瘍）；およびＡｍｉｎ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６（２）：３４４〜５６（１９９５）に記載されるような中皮腫が挙げられる。Ｈａｒａｄａら（Ｍｏｌ．Ｕｒｏｌ．３（４）：３５７〜３６４（１９９９））は、ヒト精巣の生殖細胞腫瘍におけるＷＴ１遺伝子発現を記述している。Ｎｏｎｏｍｕｒａら、Ｈｉｎｙｏｋｉｋａ  Ｋｉｙｏ  ４５（８）：５９３〜７（１９９９）によって、精巣癌特異的遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応を使用して精巣癌の分子的な足場（ｓｔａｇｉｎｇ）が記載される。Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１９（２）：１５８〜６３（２０００）によって、上皮卵巣腫瘍におけるこのウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の免疫組織化学的検出が記載される。
【０１６４】
ＷＴ１過剰発現はまた、Ｂａｒｎｏｕｄ、Ｒ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２４（６）：８３０〜６（２０００）およびＰａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９４（１０）：６９３〜７００（１９９８）によって、繊維形成性小円形細胞腫瘍において記載されている。神経膠腫および他の癌におけるＷＴ１過剰発現が、Ｍｅｎｓｓｅｎ，Ｈ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２６（４）：２２６〜３２（２０００）”Ｗｉｌｍｓ’  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅ（ＷＴ１）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｆｒｅｓｈｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ”によって、記載されている。ＷＴ１過剰発現を示す他の疾患としては、ＥＢＶ関連疾患（例えば、バーキットリンパ腫および鼻咽腔癌）（Ｓｐｉｎｓａｎｔｉ  Ｐ．ら、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ３８（５〜６）：６１１〜９（２０００），”Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｈｙｐｈｏｃｙｔｅｓ”）が挙げられる。
【０１６５】
Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４（９）：１６３４〜４（２０００）において、Ｐａｎらは、白血病または脊髄形成異常症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を有する患者由来の末梢血単核細胞のインビトロＩＬ−１２処置を記載し、そして細胞傷害性の増加およびＷＴ１遺伝子発現における減少を報告した。Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３（６）：８９１〜９００（１９９９）において、Ｐａｔｍａｓｉｒｉｗａｔらは、脊髄形成異常症候群および急性白血病におけるＷＴ１およびＧＡＴＡ１の発現を報告した。Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３（３）：３９３〜９（１９９９）において、Ｔａｍａｋｉらは、ウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１が、脊髄形成異常症候群の疾患の進行の診断についての良好なマーカーであることを報告した。固形癌におけるウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１の発現、および腫瘍細胞増殖におけるその改善が、胃癌、結腸癌、肺癌、乳癌の細胞株、生殖細胞の腫瘍細胞株、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌細胞株の細胞、肝臓細胞癌腫の関連において、Ｏｊｉら  Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９０（２）：１９４〜２０４（１９９９）で議論されている。
【０１６６】
本明細書中に提供される組成物は、単独か、あるいは手術、照射、化学療法および／または骨髄移植（自己、同系、同種異系または無関係の）のような従来の治療レジメンと組み合わせて使用され得る。以下により詳細に議論されるように、本明細書中に提供される結合剤およびＴ細胞は、自己性の幹細胞をパージするために使用され得る。このようなパージング（ｐｕｒｇｉｎｇ）は、例えば、骨髄移植あるいは血液またはその成分の輸血の前に有益であり得る。本明細書中に提供される結合剤、Ｔ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および組成物は、さらに、インビトロおよび／またはインビボで、自己、同系、同種異系または無関係のＷＴ１特異的Ｔ細胞を、拡大および刺激（または初回刺激）するために使用され得る。このようなＷＴ１特異的Ｔ細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入において使用され得る。
【０１６７】
投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個体間で変化し、そして標準的な技術を使用して容易に確立され得る。一般的に、薬学的組成物およびワクチンは、注射によって（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）か、鼻内（例えば、吸入によって）にか、または経口的に投与され得る。いくつかの腫瘍において、薬学的組成物またはワクチンは、局所的に（例えば、直腸鏡検査（ｒｅｃｔｏｃｏｌｏｓｃｏｐｙ）、胃鏡検査、ビデオ内視鏡検査（ｖｉｄｅｏｅｎｄｏｓｃｏｐｙ）、血管造影または当該分野で公知の他の方法によって）投与され得る。好ましくは、１〜１０用量が、５２週の期間にわたって投与され得る。好ましくは、６用量が、１ヶ月間隔で投与され、そしてブースターワクチン接種が、その後定期的に与えられ得る。代替的プロトコルは、個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与される場合に、基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％大きい、抗腫瘍免疫応答を促進し得る化合物の量である。このような応答は、患者における抗腫瘍抗体を測定することによってか、またはインビトロで患者の腫瘍細胞を殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、非ワクチン接種患者と比較した場合に、ワクチン接種した患者において改善された臨床結果（例えば、より頻繁な完全または部分的寛解、あるいはより長い無疾患および／または全体的生存）を導く免疫応答を引き起こし得るべきである。一般的に、１以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、１用量に存在する各ポリペプチドの量は、約１００μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者のサイズに伴って変化するが、代表的には、約０．１ｍＬ〜５ｍＬの範囲である。
【０１６８】
一般的に、適切な用量および処置レジメンは、治療的利益および／または予防的利益を提供するための十分な量で、活性化合物を提供する。このような応答は、未処置患者と比較して、処置患者に関し改善された臨床上の結果（例えば、より頻繁な完全な寛解もしくは部分的な寛解、またはより長い疾患のない状態および／もしくは全般的な生存）を確立することによってモニターされ得る。ＷＴ１への予め存在する免疫応答の増加は、改善された臨床上の結果に一般的に関連する。このような免疫応答は、標準増殖アッセイ、細胞毒性アッセイ、またはサイトカインアッセイを使用して一般的に評価され得、そして処置前および処置後の患者から得られるサンプルを使用して実施され得る。
【０１６９】
特定の実施形態において、免疫治療は、処置が、免疫応答改変薬剤（例えば、本明細書中で提供されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投薬を用い、腫瘍に対して反応するための、内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する活動免疫治療であり得る。
【０１７０】
他の実施形態において、免疫治療は、処置が、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得る確立された腫瘍免疫反応性を有する薬剤（例えば、エフェクター細胞またはエフェクター抗体）の送達を包含し、そして無傷の宿主免疫系に依存することを必要をしない受動免疫治療であり得る。エフェクター細胞の例としては、上記に論じられるようなＴ細胞、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞ならびに本明細書中で提供されるポリペプチドを発現する抗原提示細胞（例えば、樹状突起細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中で引用されるポリペプチドについて特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫治療のために他のベクターまたはエフェクター細胞にクローン化され、発現され、そして転移され得る。本明細書中で提供されるポリペプチドはまた、受動免疫治療についての抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載されるような）を生じるために使用され得る。
【０１７１】
モノクローナル抗体は、検出アッセイ、診断アッセイまたは治療適用における所望の選択的用途について任意の様々な標識で標識化され得る（米国特許第６，０９０，３６５号；同第６，０１５，５４２号；同第５，８４３，３９８号；同第５，５９５，７２１号；および同第４，７０８，９３０号に記載される、各々が、個別に援用されるかのように、それらの全体が明細書ににおいて参考として援用される）。各々の場合において、抗原の決定基部位に対する標識化されたモノクローナル抗体の結合は、非正常細胞に関する抗原決定基への特定の治療的薬剤の検出または送達をシグナルする。本発明のさらなる目的は、このような所望の選択的なこれらの用途を達成するために適切に標識化された特異的なモノクローナル抗体を提供することである。
【０１７２】
エフェクター細胞は、本明細書中に記載されるように、インビトロにおける増殖によって養子免疫治療について十分な量で一般的に得られ得る。インビボでの抗原認識を維持しながら数を数十億に単一抗原特異的エフェクター細胞を拡大するための培養条件は、当該分野で周知である。このようなインビトロ培養条件は、代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および非分割培養細胞の存在下で、抗原を用いる間欠性刺激を使用する。上記されるように、本明細書中において提供されるような免疫反応ポリペプチドは、免疫治療について細胞の十分な数を生じるための抗原特異的Ｔ細胞培養を迅速に拡大するために使用され得る。特に、抗原提示細胞（例えば、樹状突起細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞および／またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準技術を使用して、免疫反応ポリペプチドとともにパルス化され得るか、または一つ以上のポリヌクレオチドとともにトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組み替えウイルスに関する発現または他の発現系を増殖するために適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドとともに導入され得る。治療に際し使用するための培養エフェクター細胞は、広く増殖および分配すること、そしてインビボで長い期間生存することが可能である必要がある。研究は、培養エフェクター細胞が、インビボで増殖することおよびＩＬ−２を補充された抗原を用いる刺激を繰り返すことによってかなりの数で長い期間生存することを誘発され得ることを示した（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０１７３】
あるいは、本明細書中で記載されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から取り出された抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に移植し戻すためにエキソビボでクローン的に生殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、好ましくは、静脈内投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与により、滅菌形態において、当該分野で公知の任意の手段を使用して患者の中に再導入され得る。
【０１７４】
さらなる局面において、ＷＴ１発現と関連する悪性疾患の発症を阻害するための方法は、上記のように、ＷＴ１ポリペプチドまたはＷＴ１発現ＡＰＣに応答して活性化された自系のＴ細胞の投与を包含する。このようなＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得、そして上記のように増殖され得る。Ｔ細胞は、悪性疾患の発症を阻害するに有効な量で個体に投与され得る。代表的には、約１×１０９〜１×１０１１Ｔ細胞／Ｍ２が、静脈内、腔内、または切除された腫瘍のベッド中で投与される。細胞の数および投与の頻度が患者の応答に依存することは、当業者に明白である。
【０１７５】
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、自系の骨髄移植の前に刺激され得る。このような刺激は、インビボまたはインビトロで行い得る。インビトロの刺激については、患者から得られた骨髄および／または末梢血（または骨髄もしくは末梢血の画分）は、上記のようなＴ細胞の刺激を可能にするに十分な条件下および時間の間、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣと接触され得る。次いで、骨髄、末梢血幹細胞、および／またはＷＴ１特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して患者に投与され得る。
【０１７６】
関連する実施形態において、関連するドナーまたは関連しないドナーのＴ細胞は、同系または同種異系の（関連するかまたは関連しない）骨髄移植の前に刺激され得る。このような刺激は、インビボまたはインビトロで行い得る。インビトロの刺激については、関連するドナーまたは関連しないドナーから得られた骨髄および／または末梢血（または骨髄もしくは末梢血の画分）は、上記のようなＴ細胞の刺激を可能にするに十分な条件下および時間の間、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣと接触され得る。次いで、骨髄、末梢血幹細胞、および／またはＷＴ１特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して患者に投与され得る。
【０１７７】
他の実施形態において、本明細書中に記載されるＷＴ１特異的Ｔ細胞は、自系の骨髄、末梢血、または骨髄もしくは末梢血の画分（例えば、患者への投与前のＣＤ３４＋富化末梢血（ＰＢ））からＷＴ１を発現する細胞を取り除くために使用され得る。このような方法は、ＷＴ１を発現する細胞を、骨髄または末梢血中での骨髄細胞またはリンパ細胞の総数に対して１０％未満まで、好ましくは５％未満まで、そしてより好ましくは１％未満までの減少させることを可能にするに十分な条件下で、かつそれを可能にするに十分な時間、骨髄またはＰＢをそのようなＴ細胞と接触させることによって実行され得る。このような細胞が取り除かれた程度は、例えば、定性的および定量的ＰＣＲ分析、形態学、免疫組織化学、およびＦＡＣＳ分析のような標準的な方法によって容易に決定され得る。次いで、骨髄またはＰＢ（またはそれらの画分）は、標準的な技術を使用して、患者に投与され得る。
【０１７８】
（癌の検出および診断の組成物、方法およびキット）
一般的に、ＷＴ１発現に関連する癌は、患者から得られる生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰尿および／または腫瘍生検）中のそのようなタンパク質をコードする一つ以上のＷＴ１タンパク質および／またはポリヌクレオチドの存在に基いて、患者において検出され得る。言い換えると、このようなＷＴ１タンパク質は、癌の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。本明細書中において提供される結合薬剤は、一般的に、生物学的サンプル中の薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。
【０１７９】
ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、ＷＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、また癌の存在または非存在の表示である。一般的に、ＷＴ１配列は、腫瘍が生じる同じ型の形態の正常組織中より腫瘍組織中で、少なくとも２倍、好ましくは３倍、そしてより好ましくは５倍またはそれ以上であるレベルで存在するべきである。腫瘍が生じる型とは異なる組織の型中のＷＴ１の発現レベルは、腫瘍細胞の存在が、同じ型の正常組織中での発現レベルに対する腫瘍組織中で予定される差次的な発現レベル（例えば、２倍、５倍など）の観察によって確認され得るので、特定の診断実施形態に関し無関係である。
【０１８０】
他の差次的発現パターンは、診断目的について有利に利用され得る。例えば、本発明の一局面において、ＷＴ１配列の過剰な発現は、腫瘍組織および同じ型の通常組織においては診断的に搾取され得るが、他の通常組織の型（例えば、ＰＢＭＣ）においては搾取され得ない。この場合において、転移性腫瘍細胞の存在（例えば、血行または腫瘍が生じる型と異なるいずれかの他の組織部位から取り出されるサンプル中の）は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、サンプル中の腫瘍配列の発現を検出することによって同定および／または確認され得る。多くの例において、細胞捕捉または他の同様の技術を使用して目的のサンプル中の腫瘍細胞（例えば、ＰＢＭＣ）について豊富であることが所望される。
【０１８１】
サンプル中でＷＴ１ポリペプチドマーカーを検出するために結合薬剤を使用するための、当業者に公知である様々なアッセイフォーマットがある。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。一般的に、患者中でのＷＴ１に関連する癌の存在または非存在は、以下（ａ）患者から得られる生物学的サンプルを結合薬剤と接触させる工程；（ｂ）結合薬剤に結合するＷＴ１ポリペプチドのレベルをサンプル中で検出する工程；および（ｃ）ＷＴ１ポリペプチドのレベルを予定されるカットオフ値と比較する工程によって決定され得る。
【０１８２】
好ましい実施形態において、アッセイは、サンプルの残りの部分からのＷＴ１ポリペプチドに結合するため、およびＷＴ１ポリペプチドを除去するための、固体支持上に固定された結合薬剤の使用を包含する。次いで、結合ＷＴ１ポリペプチドは、レポーター基を含み、そして結合薬剤／ＷＴ１ポリペプチド複合体に特異的に結合する、検出薬剤を使用して検出され得る。このような検出薬剤は、例えば、ＷＴ１ポリペプチドまたは抗体または結合薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡもしくはレクチン）に特異的に結合する他の薬剤に特異的に結合する結合薬剤を含み得る。あるいは、競合アッセイは、利用され得、ここで、ＷＴ１ポリペプチドは、レポーター基で標識化され、そしてサンプルとの結合薬剤のインキュベーション後、固定された結合薬剤に結合され得る。サンプルの成分が、標識化されたＷＴ１ポリペプチドの結合薬剤への結合を阻害する程度は、固定された結合薬剤とサンプルの反応性の指示である。このようなアッセイ中での使用について適切なポリペプチドとしては、ＷＴ１タンパク質の全長および上記されるような結合薬剤が結合するそのポリペプチド部分が挙げられる。
【０１８３】
この固体支持体は、ＷＴ１タンパク質が結合され得る、分野の当業者にとって公知の任意の物質であり得る。例えば、この固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切なメンブレンであり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックス、または、ポリスチレンもしくはポリビニルクロライドのようなプラスチック材料）であり得る。この支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるもののような）であり得る。結合剤は、特許文献および科学文献に十分に記載される、当業者に公知である種々の技術を用いて、固体支持体上に固定化され得る。本発明の文脈において、用語「固定化」とは、非共有結合的な結合（例えば、吸着）および共有結合的な結合（これは、薬剤と支持体上の官能基との間の直接的な連結であり得るか、または架橋剤による連結であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたはメンブレンへの吸着による固定化が好ましい。このような場合において、吸着は、適切な緩衝液中で、適切な時間の間、結合薬剤を固体支持体と接触させることによって達成され得る。接触時間は温度によって変動し得るが、代表的には、約１時間と約１日間との間である。一般的に、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロライド）のウェルを、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、および好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの量の範囲の量の結合薬剤と接触させることが、適切な量の結合薬剤を固定化するために十分である。
【０１８４】
固体支持体への結合薬剤の共有結合は、支持体および結合薬剤上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性反応剤と支持体と最初に反応させることによって一般的に達成され得る。例えば、結合薬剤は、ベンゾキノンを使用して、または結合パートナー上のアミンおよび活性水素と、支持体上のアルデヒドとの縮合によって適切なポリマーコーティングを有する支持体に共有結合され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
【０１８５】
特定の実施形態において、アッセイは、２つの抗体のサンドイッチアッセイである。このアッセイは、サンプルと、固体支持体、通常はマイクロタイタープレートのウェル上に固定された抗体とを最初に接触させることによって実施され得、その結果、サンプル中のＷＴ１ポリペプチドは、固定された抗体に結合される。次いで、非結合サンプルは、固定されたポリペプチド抗体複合体から除去され、そしてレポーター基を含む検出反応剤（好ましくは、ポリペプチド上の異なる部位に結合可能な第二抗体）は、加えられる。次いで、固体支持体に結合したままの残検出反応剤の量は、特定のレポーター基について適切な方法を使用して決定される。
【０１８６】
さらに特別には、いったん抗体が、上記されるように支持体上に固定されると、支持体上の残ったタンパク質結合部位は、代表的に、ブロックされる。当業者に公知である任意の適切なブロッキング剤（例えば、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。次いで、固定された抗体は、サンプルとともにインキュベートされ、そしてポリペプチドは、抗体に結合することを可能にされる。サンプルは、インキュベーションの前に、適切な希釈剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。一般的に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、少なくとも約９５％が結合した抗体と結合していない抗体との間の平衡において達成される、ＷＴ１に関連する癌を有する個体から得られたサンプル中のＷＴ１ポリペプチドの存在を検出するに十分である時間の間である。当業者は、平衡を達成するのに必要な時間が、時間の間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを理解する。室温においては、約３０分間のインキュベーション時間が、一般的に十分である。
【０１８７】
次いで、結合していないサンプルは、適切な緩衝液（例えば、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）で固体支持体を洗浄することによって除去され得る。次いで、レポーター基を含む第二抗体は、固体支持体に加えられ得る。好ましいレポーター基は、上記に記載される基を含む。
【０１８８】
次いで、検出試薬は、結合したポリペプチドを検出するに十分な時間量の間、固定化抗体−ポリペプチド複合体とともにインキュベートされる。適切な時間の長さは、一般的に、ある時間の間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、結合していない検出試薬が除去され、そして結合した検出試薬が、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために用いられる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基については、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー法が一般に適切である。分光学的な方法は、色素、発光基、および蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般に、放射活性基もしくは蛍光基、または酵素）に結合されたアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、（一般に、特定の時間にわたる）基質の添加と、その後の反応生成物の分光学的分析または他の分析によって検出され得る。
【０１８９】
ＷＴ１発現に関連する癌の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルは、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、ＷＴ１発現に関連する癌の検出のためのカットオフ値は、固定された抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。代替の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃｕｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
【０１９０】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合因子は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定された結合因子に結合する。次いで、第２の標識化された結合因子が、この第２の結合因子を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合因子−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合因子の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合因子が結合される膜の一端を、サンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合因子を含む領域を通って、そして固定された結合因子の領域まで移動する。固定された抗体の領域での第２の結合因子の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合因子の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合因子の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合因子は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０１９１】
もちろん、本発明のＷＴ１タンパク質または結合因子との使用に適する多数の他のアッセイプロトコールが存在する。上記の記載は、例示であることを意図するにすぎない。例えば、上記プロトコールが、腫瘍ポリペプチドを使用するために容易に改変され得て、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明らかである。このようなＷＴ１タンパク質特異的抗体の検出は、ＷＴ１発現に関連する癌の存在と相関し得る。
【０１９２】
ＷＴ１発現に関連する癌もまた、あるいはＷＴ１発現に関連する癌は、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、ＷＴ１ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にてポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、ＷＴ１ポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者におけるＷＴ１発現に関連する癌の存在を示す。
【０１９３】
上記のように、癌もまた、あるいは癌は、生物学的サンプル中のＷＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来するＷＴ１  ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、ＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。
【０１９４】
同様に、ＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中でこのＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０１９５】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、本発明のＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０１９６】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の増加が、癌のないサンプルの同一希釈の物と比較して２倍以上である場合、これは、代表的に、陽性とみなされる。
【０１９７】
本発明の別の局面において、細胞捕捉技術は、ＷＴ１抗原を発現する転移細胞の検出のためのより高感度のツールを提供するために、例えば、リアルタイムＰＣＲと組み合わせて使用され得る。生物学的サンプル（例えば、骨髄サンプル、末梢血および小針吸引サンプル）におけるＷＴ１関連癌細胞の検出は、ＷＴ１発現に関連する癌を有する患者における診断および予後のために所望され得る。
【０１９８】
表面細胞マーカーに特異的なモノクローナル抗体または四量体抗体複合体でコーティングされた免疫磁気ビーズは、サンプル中の癌細胞を最初に富化するか、またはポジティブに選択するために、使用され得る。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）、ＳｔｅｐＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む種々の市販のキットが、使用され得る。当業者は、他の方法論およびキットが、所望の細胞集団を富化またはポジティブに選択するために使用され得ることを認識する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈは、正常上皮組織および新生物上皮組織上で発現される２つの糖タンパク質膜抗原に特異的なｍＡｂでコーティングされた磁気ビーズを含む。コーティングされたビーズは、サンプルに添加され得、次いでサンプルは磁石に適用され、それによって、ビーズに結合した細胞を捕捉する。所望でない細胞を洗浄して除き、そして磁気により単離された細胞がビーズから溶出され、さらなる分析において使用される。
【０１９９】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、血液サンプルから細胞を直接富化するために使用され得、そして、所望でない種々の細胞を標的化し、それらをサンプル中に存在する赤血球（ＲＢＣ）上のグリコホリンＡに架橋してロゼットを形成する、四量体抗体のカクテルからなる。Ｆｉｃｏｌｌで遠心分離される場合、標的化された細胞は、遊離ＲＢＣと共にペレット化する。枯渇カクテルにおける抗体の組み合わせは、どの細胞が除去され、そして結果としてどの細胞が回収されるかを決定する。利用可能な抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥおよびＴＣＲαβ。
【０２００】
別の実施形態において、本明細書中に記載された組成物は、癌の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、ＷＴ１発現に関連する癌の診断について上記に記載されるようなアッセイは、経時的に実行され得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化を評価し得る。例えば、このアッセイは、６ケ月〜１年の期間、２４〜７２時間毎に実行され得、そしてその後、必要に応じて実行され得る。一般に、癌は、検出されるＷＴ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増大する患者において進行している。対照的に、癌は、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定のままであるか、または時間とともに減少するかのいずれかである場合、進行していない。
【０２０１】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍上で直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合因子と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合因子は、レポーター基によって直接的または間接的に検出され得る。このような結合因子はまた、組織学的な用途において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブは、このような用途において使用され得る。
【０２０２】
本発明はさらに、上記の診断方法のうちのいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。このようなキットは代表的に、診断アッセイを行うために必要な２つ以上の構成要素を備える。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または器具であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、ＷＴ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように、支持体材料に付着されて提供され得る。１つ以上のさらなる容器は、アッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を封入し得る。このようなキットもまた、あるいはこのようなキットは、抗体結合の直接的または間接的な検出に適切なレポーター基を含む上記のような検出試薬を備え得る。
【０２０３】
あるいは、キットは、生物学的サンプル中のＷＴ１タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するように設計され得る。このようなキットは一般に、ＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、上記のような、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを備える。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられ得る。このようなキット内に存在し得るさらなる構成要素としては、ＷＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にする、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬あるいは容器が挙げられる。
【０２０４】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるのではない。
【０２０５】
（実施例）
（実施例１）
（血液学的悪性疾患を有する患者における、ＷＴ１に対する免疫応答の同定）
本実施例は、血液学的悪性疾患を有する患者において存在する免疫応答の同定を例証する。
【０２０６】
患者において予め存在するＷＴ１特異的抗体応答の存在を評価するため、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および重篤な再生不良性貧血を有する患者の血清を、ウェスタンブロット分析を用いて分析した。ヒト白血病性細胞株Ｋ５６２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）由来のＷＴ１を免疫沈降する能力について、血清を試験した。各々の場合において、免疫沈降物をゲル電気泳動により分離し、メンブレンに転写し、そして抗ＷＴ１抗体であるＷＴ１８０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）でプローブした。このウェスタンブロット分析は、血液学的悪性疾患を有する患者において潜在的なＷＴ１特異的抗体を同定した。ＡＭＬを有する患者についての結果を示す代表的なウェスタンブロットを、図２に示す。この患者の血清を使用して生成された免疫沈降物中の５２ｋＤタンパク質は、ＷＴ１特異的抗体により認識された。５２ｋＤタンパク質は、ポジティブコントロールと同じサイズに移動した。
【０２０７】
さらなる研究によって、全長ＷＴ１タンパク質および切断されたＷＴ１タンパク質に対する抗体の存在について、ＡＭＬおよびＣＭＬを有する患者の血清を分析した。ヒトＷＴ１／全長（アミノ酸１〜４４９）、Ｎ末端（アミノ酸１〜２４９）（ＷＴ１／Ｎ末端）およびＣ末端（アミノ酸２６７〜４４９）（ＷＴ１／Ｃ末端）領域を表すｃＤＮＡ構築物を、改変されたｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングした。このＷＴ１／全長タンパク質およびＷＴ１／Ｎ末端タンパク質を、Ｒａｌ２融合タンパク質として発現した。Ｒａ１２は、分泌されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質（ＭＴＢ３２Ｂとして示される）のＣ末端フラグメントである（Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６７；３９９８、１９９９）。Ｒａ１２−ＷＴ１／全長融合領域を、ヒスチジンタグ改変ｐＥＴ２８におけるヒスチジンタグの３’側にクローニングした。ＷＴ１／Ｎ末端領域を、５’ヒスチジンタグを有し、その後にチオレドキシン（ＴＲＸ）−ＷＴ１／Ｎ末端融合領域が続きさらに３’ヒスチジンタグが後に続く改変されたｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングした。ＷＴ１／Ｃ末端コーディング領域を、融合パートナーを有さず、５’ヒスチジンタグおよび３’ヒスチジンタグのみを含有し、その後にトロンビンおよびＥＫ部位が続く、改変ｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングした。
【０２０８】
ＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を、３つのＷＴ１発現構築物を用いて形質転換し、一晩増殖させ、そしてイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した。ＷＴ１タンパク質を、以下のように精製した：細胞を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｔａｂｌｅｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）中、３７℃でインキュベーションおよびその後の繰り返しの音波破砕によって収集および溶解した。封入体を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いて２回洗浄した。次いでタンパク質を、ニッケルニトリロトリ酢酸樹脂（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ；Ｈｏｃｈｕｌｉら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：２１７、１９８９）での金属キレートアフィニティークロマトグラフィーおよびその後のＳｏｕｒｃｅ  Ｑアニオン交換樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）でのクロマトグラフィーによって精製した。ＷＴ１タンパク質の同一性を、Ｎ末端配列決定によって確認した。
【０２０９】
デノボ（ｄｅ  ｎｏｖａ）ＡＭＬまたはＣＭＬを有する成人患者からの血清を、ＷＴ１特異的Ａｂの存在について試験した。組換えタンパク質を、ＴＣマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた。プレートを、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて洗浄し、そして１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いてブロックした。洗浄後、血清希釈物を、添加し、そして４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてロバ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を添加し、そして室温にて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＡ）を用いてインキュベートし、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いてクエンチングし、そして直ちに計測した（Ｃｙｔｏ−Ｆｌｕｏｒ  ２３５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）。
【０２１０】
血清学的調査に関して、ヒト血清を、ＥＬＩＳＡによって１：５０〜１：２０，０００の範囲にわたる連続血清希釈物の試験した。正常なドナーからの血清（ｎ＝９６）の平均ＯＤ値を標準偏差３倍分（ＷＴ１／全長、ＷＴ１Ｃ末端）超える１：５００希釈血清のＯＤ値として、陽性反応を規定した。正常なドナーにおけるＷＴ１／Ｎ末端タンパク質に対するより高いバックグラウンドに起因して、ＷＴ１／Ｎ末端に対する陽性反応を、正常なドナーからの血清の平均ＯＤ値を標準偏差４倍分超える１：５００希釈血清のＯＤ値として規定した。患者のＡｂ応答が、ＷＴに対するものであり、かつ、このタンパク質の、Ｒａ１２融合部分に対してでも、またはＴＲＸ融合部分に対してでも可能性のあるＥ．ｃｏｌｉ夾雑タンパク質に対してでもないことを確認するために、コントロールは、類似の方法で精製したＲａ１２タンパク質およびＴＲＸタンパク質のみを含んだ。Ｒａ１２タンパク質および／またはＴＲＸタンパク質に対する反応性を示すサンプルを、この分析から排除した。
【０２１１】
ＷＴ１に対する免疫性の存在について評価するために、正常な個体および白血病を有する患者の血清中の全長ＷＴ１組換えタンパク質および切断されたＷＴ１組換えタンパク質に対するＡｂを決定した。抗体反応性を、ＷＴ１／全長タンパク質、ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質およびＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性によって分析した。
【０２１２】
９６人の正常なドナーのうち２人のみが、ＷＴ１／全長タンパク質に反応性の血清抗体を有していた（図１８）。これらの個体のうち１人は、ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質に対する抗体を有し、１人は、ＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する抗体を有していた。対照的に、６３人のＡＭＬを有する患者のうち１６人（２５％）は、血清抗体ＷＴ１／全長タンパク質に対して反応性の血清抗体を有していた。著しく対照的に、６３人の患者のうち２人（３％）のみが、ＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する反応性を有していた。８１人のＣＭＬを有する患者のうち１５人（１９％）は、ＷＴ１／全長タンパク質に反応性の血清抗体を有し、そして８１人の患者のうち１２人（１５％）は、ＷＴ１／Ｎ末端に反応性の血清抗体を有していた。８１人の患者のうち３人のみ（３％）が、ＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する反応性を有していた（図１６および図１７）。
【０２１３】
これらのデータは、ＷＴ１に対するＡｂ応答が、ＡＭＬを有する幾人かの患者およびＣＭＬを有する幾人かの患者において検出可能であることを示す。白血病患者における抗体のより高い発生率は、ＷＴ１を発現する悪性疾患、またはある場合には発現されたＷＴ１を患者が保有する結果として、ＷＴ１タンパク質に対する免疫が生じたことの強力な証拠を提供する。特定の理論に限定されること無く、ＷＴ１に対する観察された抗体応答はおそらく、自分自身の白血病細胞上のＷＴ１に対して免疫となる患者から生じ、そしてこの応答は、ＷＴ１が「自己」タンパク質であるにも関らず、ＷＴ１が免疫原性であり得ることの直接的な証拠を提供することが、考えられる。
【０２１４】
ＷＴ１に対する抗体の存在は、同時発生するヘルパーＴ細胞応答もまた、同じ患者に存在することを強く意味する。ＷＴ１は、内在性タンパク質である。従って、ＣＴＬ応答は、白血病治療に関して最も効果的であり、かつ免疫の最も毒性のアームであるようである。従って、これらのデータは、ＷＴ１に対する治療的なワクチンが、ＷＴ１に対する免疫応答を誘発し得ることの証拠を提供する。
【０２１５】
検出された抗体の多数は、Ｎ末端中のエピトープに反応性であったが、一方で患者の少数の部分群のみがＣ末端に対する弱い抗体応答を示した。これは、Ｃ末端由来の試験されたペプチドはいずれも、抗体応答も、Ｔ細胞応答も誘発しないが、Ｎ末端より誘導されたペプチドを用いる免疫が、抗体応答、ヘルパーＴ細胞応答およびＣＴＬ応答を誘発する、という動物モデルにおける観察と一致する（Ｇａｉｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ９６：１３３４、２０００）。
【０２１６】
（実施例２）
（ＷＴ１発現細胞株で免疫されたマウスにおけるＷＴ１に対する抗体の誘導）
この実施例は、インビボでのＷＴ１特異的抗体応答を誘導するためのＷＴ１発現細胞の使用を例示する。
【０２１７】
白血病を有する患者におけるＷＴ１に対して存在する抗体の検出は、ＷＴ１に対する免疫性を誘発するためにＷＴ１タンパク質に対する免疫し得ることを強く意味した。ＷＴ１に対する免疫性がワクチン接種によって生じたか否かを試験するために、マウスに、ＴＲＡＭＰ−Ｃ（Ｂ６起源のＷＴ１陽性腫瘍細胞株）を注入した。手短に述べると、雄性Ｂ６マウスを、皮下に５×１０６のＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞を用いて免疫し、そして３週間の間隔で５×１０６の細胞を２回追加免疫した。最後の免疫の３週間後、血清を得、そして脾臓の１細胞懸濁液を、２５μＭのβ−２−メルカプトエタノール、１ｍｌあたり２００単位のペニシリン、１０ｍＭのＬ−グルタミン酸、および１０％のウシ胎仔血清を有するＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に調製した。
【０２１８】
ＴＲＡＭＰ−Ｃに対する免疫後、免疫された動物におけるＷＴ１特異的抗体応答は、検出可能であった。代表的なウエスタンブロットを、図３に示す。これらの結果は、ＷＴ１タンパク質に対する免疫が、ＷＴ１タンパク質に対する免疫応答を誘発し得ることを示す。
【０２１９】
（実施例３）
（ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＴｈおよび抗体応答の誘導）
本実施例は、ＷＴ１に特異的な免疫応答を誘発するための、ＷＴ１ペプチドでの免疫の能力を例示する。
【０２２０】
Ａｂおよび増殖性Ｔ細胞応答を誘発するために適切なペプチドを、Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドモチーフについて検索するＴｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｏｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：９３−１００、１９８８；Ｄｅａｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５−１５５、１９９６）に従って同定した。表Ｉに示されるペプチドを、合成および配列決定した。
【０２２１】
（表Ｉ）
（ＷＴ１ペプチド）
【０２２２】
【表１】
2005518192.tif 000002
免疫のために、ペプチドを以下のようにグループ分けした：
群Ａ：ｐ６−２２ヒト：１ｍｌ中に１０．９ｍｇ（１０μｌ＝１００μｇ）
ｐ１１７−１３９ヒト／マウス：１ｍｌ中に７．６ｍｇ（１４μｌ＝１００μｇ）
ｐ２４４−２６２ヒト：１ｍｌ中に４．６ｍｇ（２２μｌ＝１００μｇ）
群Ｂ：ｐ２８７−３０１ヒト／マウス：１ｍｌ中に７．２ｍｇ（１４μｌ＝１００μｇ）
マウスｐ２９９−３１３；１ｍｌ中に６．６ｍｇ（１５μｌ＝１００μｇ）
ｐ４２１−４３５ヒト／マウス：１ｍｌ中に３．３ｍｇ（３０μｌ＝１００μｇ）
コントロール：（ＦＢＬペプチド  １００μｇ）＋ＣＦＡ／ＩＦＡ
コントロール：（ＣＤ４５ペプチド  １００μｇ）＋ＣＦＡ／ＩＦＡ。
【０２２３】
群Ａは、ＷＴ１のアミノ末端部分内に存在するペプチド（エキソン１）を含んだ。そして群Ｂは、他のＤＮＡ結合タンパク質に対する配列相同性を有する４つのジンクフィンガー領域を含むカルボキシ末端内に存在するペプチドを含んだ。群Ｂの中で、ｐ２８７−３０１およびｐ２９９−３１３は、エキソン７（ジンクフィンガー１）由来であり、そしてｐ４２１−４３５は、エキソン１０（ジンクフィンガーＩＶ）由来であった。
【０２２４】
Ｂ６マウスを、ＷＴ１ペプチドの群またはコントロールペプチドで免疫した。ペプチドを、注射のために１ｍｌの滅菌水中に溶解し、そしてＢ６マウスを３週間の間隔で３回免疫した。使用したアジュバントは、ＣＦＡ／ＩＦＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭｏｎｔｉｎｉｄｅであった。次いで、ＷＴ１に特異的な抗体の存在を、実施例１および２に記載のように決定し、そして増殖性Ｔ細胞応答を、標準的なチミジン取りこみアッセイを使用して評価した。このアッセイでは、細胞を抗原の存在下で培養し、そして取りこまれた放射能を測定することにより、増殖を評価した（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０、１９９４）。詳細には、リンパ球を、１ウェルあたり２×１０５細胞にて９６ウェルプレート中で培養し、このウェルは４×１０５の照射した（３０００ラド）同系脾臓細胞および明示されたペプチドを有した。
【０２２５】
群Ａとして明示されたペプチドの群によるマウスの免疫は、ＷＴ１に対する抗体応答を誘発した（図４）。ワクチンＢに対する免疫後に全く抗体は検出されず、これはワクチンＢでの免疫からのヘルパーＴ細胞応答の欠如と一致する。Ｐ１１７−１３９は、増殖性Ｔ細胞応答を誘発した（図５Ａ〜５Ｃ）。刺激指数（ＳＩ）は、８と７２との間を変動した。他のペプチド（Ｐ６−２２およびＰ２９９−３１３）もまた、増殖性Ｔ細胞応答を誘発することが示された。Ｐ６−２２での免疫は２．３の刺激指数（ＳＩ）を生じ、そしてＰ２９９−３１３での免疫は３．３のＳＩを生じた。陽性コントロールは、ＣｏｎＡ刺激したＴ細胞、ならびに既知の抗原（例えば、ＣＤ４５およびＦＢＬ）で刺激したＴ細胞、および同種異系Ｔ細胞株（ＤｅＢｒｕｉｊｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３−２９７０、１９９１）を含んだ。
【０２２６】
図６Ａおよび６Ｂは、ワクチンＡ（図６Ａ）およびワクチンＢ（図６Ｂ）において各３つのペプチドについて観察された増殖性応答を示す。ワクチンＡは、３と８との間（バルク線）を変動する刺激指数（ＳＩ）で、免疫ペプチドｐ６−２２およびｐ１１７−１３９に対する増殖性Ｔ細胞応答を誘発した。ｐ２４４−２６２に対する増殖応答は検出されなかった（図６Ａ）。
【０２２７】
引き続くインビトロ刺激を、ｐ６−２２およびｐ１１７−１３９のみを使用する単一ペプチド刺激として実施した。ｐ１１７−１３９でのワクチンＡ特異的Ｔ細胞株の刺激は、ｐ６−２２に対する応答を伴わずに、ｐ１１７−１３９に対する増殖を生じた（図７Ａ）。この株由来のクローンは、ｐ１１７−１３９に特異的であった（図７Ｂ）。対照的に、ｐ６−２２でのワクチンＡ特異的Ｔ細胞株の刺激は、ｐ１１７−１３９に対する応答を伴わずに、ｐ６−２２に対する増殖を生じた（図７Ｃ）。この株由来のクローンは、ｐ６−２２に特異的であった（図７Ｄ）。
【０２２８】
これらの結果は、ＷＴ１ペプチドでのワクチン接種が、ＷＴ１タンパク質に対する抗体応答および免疫ペプチドに対する増殖性Ｔ細胞応答を誘発し、ペプチドを免疫し得ることを示す。
【０２２９】
（実施例４：ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＣＴＬ応答の誘導）
本実施例は、ＷＴ１ペプチドのＣＴＬ免疫を誘発する能力を例示する。
【０２３０】
クラスＩ  ＭＨＣへの結合に適切なモチーフを有するペプチド（９マー）を、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９４）を用いて同定した。このような分析で同定したペプチドを、表ＩＩ〜ＸＬＩＶに示す。これらの表の各々において、スコアは、示したＭＨＣ分子に対するペプチドの理論的結合親和性（解離の半減期）を反映する。Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１７８−２２８，１９９５（その全体が本明細書中に記載される）により記載されるような、規定されたペプチド結合モチーフもまた、この表に示される。ＨＬＡ−Ｂ１４２についてのペプチド結合モチーフは、ＤｉＢｒｉｎｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３４２６−２３４３４，１９９４（その全体が本明細書中に記載される）により記載されている。ペプチド位置は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、およびＰ９として省略される。
【０２３１】
Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドモチーフを検索する、Ｔｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｏｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．  ７：９３−１００，１９８８；Ｄｅａｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５−１５５，１９９６）を用いて同定したペプチドを、図８Ａおよび８Ｂ、ならびに表ＸＬＶにさらに示す。
【０２３２】
（表ＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、３位（Ｐ３）のＤまたはＥ；Ｐ９のＹであり、補助的なアンカーは、Ｐ４のＰおよびＰ７のＬである）
【０２３３】
【表２−１】
2005518192.tif 000003
【０２３４】
【表２−２】
2005518192.tif 000004
（表ＩＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ  ０２０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ  ０２０１１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＬまたはＭ；Ｐ９のＶまたはＬであり、補助的なアンカーは、Ｐ６のＶである）
【０２３５】
【表３】
2005518192.tif 000005
（表ＩＶ：ヒトＨＬＡ  Ａ  ０２０５に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ  ０２０５ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＬであり、補助的なアンカーは、Ｐ２のＶ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＰ６のＩ、Ｖ、Ｌ、Ａである）
【０２３６】
【表４】
2005518192.tif 000006
（表Ｖ：ヒトＨＬＡ  Ａ２４に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ２４ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＹ；Ｐ９のＩ、Ｌ、またはＦであり、補助的なアンカーは、Ｐ５のＩまたはＶおよびＰ６のＦである）
【０２３７】
【表５−１】
2005518192.tif 000007
【０２３８】
【表５−２】
2005518192.tif 000008
（表ＶＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ３に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ３ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＬ、ＶまたはＭ；Ｐ９のＫ、ＹまたはＦであり、補助的なアンカーは、Ｐ３のＦまたはＹ、Ｐ６のＩ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、またはＬ；Ｐ７のＩ、Ｌ、Ｍ、Ｆである）
【０２３９】
【表６−１】
2005518192.tif 000009
【０２４０】
【表６−２】
2005518192.tif 000010
（表ＶＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ６８．１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ６８．１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＶまたはＴ；Ｐ９のＲまたはＫである）
【０２４１】
【表７】
2005518192.tif 000011
（表ＶＩＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ  １１０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ  １１０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＫであり；補助的なアンカー残基は、Ｐ２のＶ、Ｉ、Ｆ、Ｙ；Ｐ３のＭ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｉ、Ａ、Ｐ７のＬ、Ｉ、Ｙ、Ｖ、またはＦである）
【０２４２】
【表８】
2005518192.tif 000012
（表ＩＸ：ヒトＨＬＡ  Ａ  ３１０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ  ３１０１ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＲであり、補助的なアンカーは、Ｐ２のＬ、Ｖ、Ｙ、またはＦ；Ｐ３のＦ、Ｌ、Ｙ、Ｗ、Ｐ６のＬ、Ｆ、Ｖ、Ｉである）
【０２４３】
【表９−１】
2005518192.tif 000013
【０２４４】
【表９−２】
2005518192.tif 000014
（表Ｘ：ヒトＨＬＡ  Ａ  ３３０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ａ  ３３０２ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ９のＲであり、補助的なアンカーは、Ｐ２のＡ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、またはＶである）
【０２４５】
【表１０−１】
2005518192.tif 000015
【０２４６】
【表１０−２】
2005518192.tif 000016
（表ＸＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ１４に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
（ＨＬＡ−Ｂ１４ペプチド結合モチーフアンカー残基は、Ｐ２のＲ、Ｐ３のＹ、Ｐ５のＲ、Ｐ９のＬである。４つのアンカー残基のうちの３つは十分である）
【０２４７】
【表１１】
2005518192.tif 000017
【０２４８】
【表１２】
2005518192.tif 000018
【０２４９】
【表１３−１】
2005518192.tif 000019
【０２５０】
【表１３−２】
2005518192.tif 000020
【０２５１】
【表１４−１】
2005518192.tif 000021
【０２５２】
【表１４−２】
2005518192.tif 000022
【０２５３】
【表１５】
2005518192.tif 000023
【０２５４】
【表１６】
2005518192.tif 000024
【０２５５】
【表１７−１】
2005518192.tif 000025
【０２５６】
【表１７−２】
2005518192.tif 000026
【０２５７】
【表１８−１】
2005518192.tif 000027
【０２５８】
【表１８−２】
2005518192.tif 000028
【０２５９】
【表１９】
2005518192.tif 000029
【０２６０】
【表２０】
2005518192.tif 000030
【０２６１】
【表２１−１】
2005518192.tif 000031
【０２６２】
【表２１−２】
2005518192.tif 000032
【０２６３】
【表２２−１】
2005518192.tif 000033
【０２６４】
【表２２−２】
2005518192.tif 000034
【０２６５】
【表２３】
2005518192.tif 000035
【０２６６】
【表２４】
2005518192.tif 000036
【０２６７】
【表２５−１】
2005518192.tif 000037
【０２６８】
【表２５−２】
2005518192.tif 000038
【０２６９】
【表２６−１】
2005518192.tif 000039
【０２７０】
【表２６−２】
2005518192.tif 000040
【０２７１】
【表２７】
2005518192.tif 000041
【０２７２】
【表２８】
2005518192.tif 000042
【０２７３】
【表２９−１】
2005518192.tif 000043
【０２７４】
【表２９−２】
2005518192.tif 000044
【０２７５】
【表３０−１】
2005518192.tif 000045
【０２７６】
【表３０−２】
2005518192.tif 000046
【０２７７】
【表３１】
2005518192.tif 000047
【０２７８】
【表３２】
2005518192.tif 000048
【０２７９】
【表３３−１】
2005518192.tif 000049
【０２８０】
【表３３−２】
2005518192.tif 000050
【０２８１】
【表３４−１】
2005518192.tif 000051
【０２８２】
【表３４−２】
2005518192.tif 000052
【０２８３】
【表３５】
2005518192.tif 000053
【０２８４】
【表３６】
2005518192.tif 000054
【０２８５】
【表３７−１】
2005518192.tif 000055
【０２８６】
【表３７−２】
2005518192.tif 000056
【０２８７】
【表３８−１】
2005518192.tif 000057
【０２８８】
【表３８−２】
2005518192.tif 000058
【０２８９】
【表３９】
2005518192.tif 000059
（表ＸＬ：ウシＨＬＡ  Ａ２０に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０２９０】
【表４０】
2005518192.tif 000060
（表ＸＬＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ  ０２０１に対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０２９１】
【表４１−１】
2005518192.tif 000061
【０２９２】
【表４１−２】
2005518192.tif 000062
（表ＸＬＩＩ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｄｂに対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０２９３】
【表４２−１】
2005518192.tif 000063
【０２９４】
【表４２−２】
2005518192.tif 000064
（表ＸＬＩＩＩ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｋｂに対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０２９５】
【表４３】
2005518192.tif 000065
（表ＸＬＩＶ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｋｄに対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０２９６】
【表４４】
2005518192.tif 000066
（表ＸＬＶ：ヘルパーＴ細胞応答を誘発し得るヒトＷＴ１ペプチドについての、ＴＳｉｔｅｓペプチド結合予測分析の結果）
【０２９７】
【表４５−１】
2005518192.tif 000067
【０２９８】
【表４５−２】
2005518192.tif 000068
特定のＣＴＬペプチド（表ＸＬＶＩに示す）を、さらなる研究のために選択した。表ＸＬＶＩ中に各ペプチドについて、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析を用いて得られたスコアを、提供する。
【０２９９】
（表ＸＬＶＩ：ＷＴ１ペプチド配列およびＨＬＡペプチド結合予測）
【０３００】
【表４６】
2005518192.tif 000069
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスＭＨＣに結合するペプチドを、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：４７６−４８０，１９９０に記載されるように、白血病細胞株ＲＭＡ−Ｓを用いて確認した。簡単には、ＲＭＡ−Ｓ細胞を、１％ＦＣＳを補充した完全培地中で２６℃にて７時間培養した。合計１０６のＲＭＡ−Ｓ細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、そして単独か、または指定したペプチド（２５μｇ／ｍｌ）と共にのいずれかで２６℃にて１６時間インキュベートし、そして完全培地中で３７℃にてさらに３時間インキュベートした。次いで、細胞を３度洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート結合体化抗Ｄｂ抗体または抗Ｋｂ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。標識した細胞を２度洗浄し、再懸濁し、そして１％パラホルムアルデヒドを有する５００μｌのＰＢＳ中で固定し、そしてフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標））において蛍光強度について分析した。ＲＭＡ−Ｓ細胞の表面上でのＤｂ分子またはＫｂ分子の増加の割合を、培地単独でインキュベートした細胞の蛍光強度と比較した、ペプチドと共にインキュベートした細胞の平均蛍光強度の増加により測定した。
【０３０１】
マウスをマウスクラスＩ  ＭＨＣに結合し得るペプチドで免疫した。免疫の後、脾臓細胞をインビトロで刺激し、そしてＷＴ１ペプチドと共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。ＣＴＬを、標準的なクロム放出アッセイ（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４）で評価した。１０６個の標的細胞を３７℃にて１５０μＣｉのナトリウム５１Ｃｒと共に９０分間、特定のペプチドの存在下または非存在下でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、そして５％ウシ胎仔血清を有するＲＰＭＩ中に再懸濁した。このアッセイのために、１０４個の５１Ｃｒ標識化標的細胞を、Ｕ底９６ウェルプレートにおいて２００μｌの最終容量で異なる濃度のエフェクター細胞と共にインキュベートした。上清を、３７℃にて４〜７時間後に取り除き、そして比溶解の％を、以下の式により決定した：
比溶解の割合＝１００×（実験の放出−自発的放出）／（最大の放出−自発的放出）。
【０３０２】
表ＸＬＶＩＩに示される結果は、いくつかのＷＴ１ペプチドが、ＣＴＬを生成するために不可欠であるクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合し得ることを示す。さらに、このペプチドのいくつかは、クロム放出アッセイを用いて決定されるように、ペプチド特異的ＣＴＬ（図９Ａおよび９Ｂ）を誘発し得た。ＣＴＬペプチドである、ｐ１０−１８ヒト、ｐ１３６−１４４ヒト、ｐ１３６−１４４マウスおよびｐ２３５−２４３に対する免疫の後、ペプチド特異的ＣＴＬ株を産生し、そしてクローンを樹立した。これらの結果は、ペプチド特異的ＣＴＬがＷＴ１を発現する悪性細胞を死滅させ得ることを示す。
【０３０３】
（表ＸＬＶＩＩ：マウスＢ６クラスＩ抗原に対するＷＴ１  ＣＴＬペプチドの結合）
【０３０４】
【表４７】
2005518192.tif 000070
（実施例５：マウスにおいてＷＴ１特異的ＣＴＬを誘発するためのＷＴ１ポリペプチドの使用）
本実施例は、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を死滅させ得るＣＴＬ免疫を誘発するための、代表的なＷＴ１ポリペプチドの能力を例示する。
【０３０５】
クラスＩ  ＭＨＣおよびクラスＩＩ  ＭＨＣへの結合に適切なモチーフを有するペプチドである、ｐ１１７−１３９を、ＴＳＩＴＥＳおよびＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析を用いて上記のように同定した。マウスを、実施例３に記載されるように免疫した。免疫の後、脾臓細胞をインビトロで刺激し、そしてＷＴ１ペプチド、ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞および陰性腫瘍細胞と共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。ＣＴＬを、標準的なクロム放出アッセイで評価した。図１０Ａ〜１０Ｄに示されるこの結果は、Ｐ１１７が、ＷＴ１陽性腫瘍細胞を死滅させ得るＷＴ１特異的ＣＴＬを誘発し得るが、ＷＴ１陰性細胞の死滅は観察されなかったことを示す。これらの結果は、ペプチド特異的ＣＴＬが、実際にＷＴ１を発現する悪性細胞を死滅させること、およびワクチンおよびＴ細胞治療が、ＷＴ１を発現する悪性腫瘍に対して有効であることを実証する。
【０３０６】
類似の免疫を、９マーのクラスＩ  ＭＨＣ結合ペプチドである、ｐ１３６−１４４、ｐ２２５−２３３、ｐ２３５−２４３、ならびに２３マーペプチドである、ｐ１１７−１３９を用いて行った。免疫の後、脾臓細胞をインビトロで４つのペプチドの各々を用いて刺激し、そしてＷＴ１ペプチドと共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。ＣＴＬは、ｐ１３６−１４４、ｐ２３５−２４３、およびｐ１１７−１３９に特異的に生成されたが、ｐ２２５−２３３については生成されなかった。ｐ２３５−２４３およびｐ１１７−１３９についてのＣＴＬデータを、図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ペプチドｐ１３６−１４４およびｐ２２５−２３３についてのデータは示さない。
【０３０７】
ＣＴＬ溶解は、標的ＷＴ１ペプチドが、腫瘍細胞クラスＩ  ＭＨＣ分子に関連して、内因的にプロセシングおよび提示されることを要求する。上記のＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬを、ＷＴ１陰性腫瘍細胞株と対比してＷＴ１陽性腫瘍細胞株を溶解する能力について試験した。ｐ２３５−２４３に特異的なＣＴＬは、ｐ２３５−２４３ペプチドともにインキュベートした標的を溶解したが、ＷＴ１タンパク質を発現した細胞株を溶解することに失敗した（図１１Ａ）。著しく対照的に、ｐ１１７−１３９に特異的なＣＴＬは、ｐ１１７−１３９ペプチドと共にインキュベートした標的を溶解し、そしてＷＴ１を発現する悪性細胞もまた溶解した（図１１Ｂ）。陰性コントロールとして、ｐ１１７−１３９に特異的なＣＴＬは、ＷＴ１陰性ＥＬ−４（本明細書中でＥ１０ともいわれる）を溶解しなかった。
【０３０８】
ＷＴ１特異的溶解の特異性を、非放射性標的阻害によって確認した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。エフェクター細胞を、種々のエフェクター：標的比で、９６ウェルＵ底プレートにプレートした。１０倍過剰（放射性標的と比べて）の５１Ｃｒ標識を有さない示されたペプチドをコートした標的を、添加した。最終的に、１ウェルあたり１０４個の５１Ｃｒ標識化標的細胞を添加し、そしてプレートを３７℃にて４時間インキュベートした。１ウェルあたりの総容量は、２００μｌであった。
【０３０９】
ｐ１１７−１３９特異的ＣＴＬによるＴＲＡＭＰ−Ｃの溶解を、関連性のあるペプチドｐ１１７−１３９と共にインキュベートしたＥＬ−４によって、５８％〜３６％をブロックしたが、無関係なペプチドと共にインキュベートしたＥＬ−４ではブロックしなかった（図１２Ａ）。同様に、ＢＬＫ−ＳＶ４０の溶解は、関連性のあるペプチドｐ１１７−１３９と共にインキュベートしたＥＬ−４によって、１８％〜０％をブロックした（図１２Ｂ）。結果は、ＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬが、プロセスしたＷＴ１の認識により、悪性の細胞を特異的に死滅させることを確認する。
【０３１０】
推定のＣＴＬモチーフを有するいくつかのセグメントは、ｐ１１７−１３９内に含まれる。ＣＴＬエピトープの正確な配列を決定するために、ｐ１１７−１３９内の全ての潜在的な９マーペプチドを合成した（表ＸＬＶＩＩＩ）。これらのペプチドの２つ（ｐ１２６−１３４およびｐ１３０−１３８）は、Ｈ−２ｂクラスＩ分子に結合することを示した（表ＸＬＶＩＩＩ）。ｐ１１７−１３９での免疫により生成したＣＴＬは、ｐ１２６−１３４およびｐ１３０−１３８と共にインキュベートした標的を溶解したが、ｐ１１７−１３９内の他の９マーペプチドでは溶解しなかった（図１３Ａ）。
【０３１１】
ｐ１１７−１３９特異的ＣＴＬ株を、ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８のいずれかで再刺激した。ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８で再刺激した後、両方のＴ細胞株は、ペプチド比溶解を実証したが、ｐ１３０−１３８特異的ＣＴＬのみが、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を示した（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。従って、ｐ１３０−１３８は、天然でプロセスされるエピトープであるように思われる。
【０３１２】
（表ＸＬＶＩＩＩ：ｐ１１７−１３９内のＷＴ１  ＣＴＬ  ９マーペプチドのマウスＢ６クラスＩ抗原に対する結合）
【０３１３】
【表４８】
2005518192.tif 000071
（実施例６：マウス腫瘍細胞株におけるＷＴ１特異的ｍＲＮＡの同定）
本実施例は、細胞および細胞株においてＷＴ１特異的ｍＲＮＡを検出するための、ＲＴ−ＰＣＲの使用を例示する。
【０３１４】
単核細胞を、密度勾配遠心分離により単離し、そして直ちに凍結し、そしてＷＴ１特異的ｍＲＮＡの存在についてＲＴ−ＰＣＲにより分析するまで、−８０℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲを、一般に、Ｆｒａｉｚｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８６：４７０４−４７０６，１９９５に記載されるように行った。総ＲＮＡを、標準的な手順に従って１０７の細胞から抽出した。ＲＮＡペレットを、２５μＬジエチルピロカルボネート処理した水に再懸濁し、そして逆転写に直接用いた。ジンクフィンガー領域（エキソン７〜１０）を、３３０ｂｐのマウスｃＤＮＡとしてＰＣＲにより増幅した。増幅を、サーマルサイクラーにおいて、ＰＣＲの１回、または、必要な場合、連続した２回の間、行った。５０μｌの総反応容量において、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および２０ｐｍｏｌの各プライマーを用いた。ＰＣＲ産物の２０μＬのアリコートを、臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲル上で電気泳動した。このゲルを、Ｐｏｌａｒｏｉｄフィルム（Ｐｏｌａｒｏｉｄ  ６６７，Ｐｏｌａｒｏｉｄ  Ｌｔｄ．Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で写真撮影した。ＫｗｏｋおよびＨｉｇｕｃｈｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：２３７−２３８，１９８９の推奨に従って、相互汚染に対する予防策を取った。陰性コントロールは、各実験において、ｃＤＮＡの代わりに水を含有するｃＤＮＡ試薬およびＰＣＲ試薬混合物を含んだ。偽陰性を避けるために、インタクトなＲＮＡおよび適切なｃＤＮＡ産生の存在を、各サンプルについて、β−アクチンプライマーを用いるコントロールＰＣＲによって評価した。これらのプライマーで増幅されなかったサンプルを、分析から除いた。
【０３１５】
マウス細胞株における、ＷＴ１の増幅のためのプライマーは、以下であった：Ｐ１１５：１４５８−１４７８：５’  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＧＡＧ  ＡＴＡ  ３’（順方向プライマー；配列番号２１）；およびＰ１１６：１７６７−１７８７：５’  ＡＴＧ  ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ３’（逆方向プライマー；配列番号２２）（Ｉｎｏｕｅら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：２２６７−２２７８，１９９６；Ｆｒａｉｚｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８６：４７０４−４７０６，１９９５を参照のこと）。
【０３１６】
コントロール反応に用いたβアクチンプライマーは、以下であった：５’  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡ  ３’（センスプライマー；配列番号２３）；および５’  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＡＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ３’（アンチセンスプライマー；配列番号２４）。
【０３１７】
ヒトＷＴ１を増幅するのに使用するためのプライマーは、以下を含む：Ｐ１１７：９５４−９７４：５’  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ３’（配列番号２５）；およびＰ１１８：１４３４−１４１４：５’  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＣＡＧＴ  ３’（配列番号５）。ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲについて、プライマーは、以下であり得る：Ｐ１１９：１０２３−１０４３：５’  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ３’（配列番号２６）；およびＰ１２０：１３４５−１３６５：５’  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ３’（配列番号２７）。
【０３１８】
表ＸＬＶＩＩＩは、マウス腫瘍細胞株のＷＴ１  ＰＣＲ分析の結果を示す。表ＩＶにおいて、（＋＋＋）は、ＲＴ−ＰＣＲの第１工程における、強いＷＴ１  ＰＣＲ増幅産物を示し、（＋＋）は、ＷＴ１  ＲＴ−ＰＣＲの第１工程により検出可能であるＷＴ１増幅産物を示し、（＋）は、ＷＴ１  ＲＴ  ＰＣＲの第２工程においてのみ検出可能である、産物を示し、そして（−）は、ＷＴ１  ＰＣＲ陰性を示す。
【０３１９】
（表ＸＬＩＸ：マウス腫瘍細胞株におけるＷＴ１  ｍＲＮＡの検出）
【０３２０】
【表４９−１】
2005518192.tif 000072
【０３２１】
【表４９−２】
2005518192.tif 000073
（実施例７）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１  ＴＲＸ融合構築物の発現）
短縮された、ＷＴ１のオープンリーディングフレーム（ＷＴ１Ｂ）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２から始まる順方向プライマー
Ｐ−３７（配列番号３４２）  ５’  ｇｇｃｔｃｃｇａｃｇｔｇｃｇｇｇａｃｃｔｇ  ３’  Ｔｍ  ６４℃
終止コドンの後にＥｃｏＲＩ部位を作製する逆方向プライマー
Ｐ−２３（配列番号３４３）  ５’  ｇａａｔｔｃｔｃａａａｇｃｇｃｃａｇｃｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｔ  ３’  Ｔｍ  ６３℃
このＰＣＲは、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μｌ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃３分×４０サイクル
７２℃４分
このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでｐＴｒｘ  ２Ｈベクター（Ｎ末端上のＴｒｘ融合およびＴｒｘ融合周辺の２つのＨｉｓタグによって改変されたｐＥＴ２８ベクター。Ｔｒｘ融合の後にトロンビンおよびエンテロキナーゼについてのプロテーアーゼ開裂部位が存在する）にクローニングした。このｐＴｒｘ２Ｈ構築物を、ＳｔｕＩ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化した。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞に形質転換した。
【０３２２】
（実施例８）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１  Ａ  Ｈｉｓタグ融合構築物の発現）
ＷＴ１のＮ末端オープンリーディングフレーム（ＷＴ１Ａ）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２から始まる順方向プライマー
Ｐ−３７（配列番号３４４）  ５’  ｇｇｃｔｃｃｇａｃｇｔｇｃｇｇｇａｃｃｔｇ  ３’  Ｔｍ  ６４℃
アミノ酸２４９の後に配置された人工的終止コドンの後にＥｃｏＲＩ部位を作製する逆方向プライマー
ＰＤＭ−３３５（配列番号３４５）  ５’  ｇａａｔｔｃｔｃａａａｇｃｇｃｃａｇｃｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｔ  ３’  Ｔｍ  ６４℃
このＰＣＲは、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μｌ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃１分２０秒×４０サイクル
７２℃４分。
【０３２３】
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されている、ｐＰＤＭ（インフレームでＨｉｓタグを有する改変されたｐＥＴ２８ベクター）へとクローニングした。このＰＣＲ産物をまた、ｐＴｒｘ  ２Ｈベクターにも形質転換した。このｐＴｒｘ２Ｈ構築物を、ＳｔｕＩ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化した。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞へと形質転換した。
【０３２４】
（実施例９）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１  Ｂ  Ｈｉｓタグ融合構築物の発現）
ＷＴ１の切断されたオープンリーディングフレーム（ＷＴ１Ａ）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２５０から始まる順方向プライマー
ＰＤＭ−３４６（配列番号３４６）  ５’  ｃａｃａｇｃａｃａｇｇｇｔａｃｇａｇａｇｃ  ３’  Ｔｍ  ５８℃
終止コドンの後にＥｃｏＲＩ部位を作製する逆方向プライマー
Ｐ−２３（配列番号３４７）  ５’  ｇａａｔｔｃｔｃａａａｇｃｇｃｃａｇｃｔｇｇａｇｔｔｔｇｇｔ  ３’  Ｔｍ  ６３℃
このＰＣＲは、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μｌ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃１分３０秒×４０サイクル
７２℃４分。
【０３２５】
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されている、ｐＰＤＭ（インフレームでＨｉｓタグを有する改変されたｐＥＴ２８ベクター）へとクローニングした。このＰＣＲ産物をまた、ｐＴｒｘ  ２Ｈベクターにも形質転換した。このｐＴｒｘ  ２Ｈ構築物を、ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化した。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞へと形質転換した。
【０３２６】
実施例７〜９について、以下の配列番号を開示する：
配列番号３２７は、Ｔｒｘ＿ＷＴ１＿Ｂについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２８は、Ｔｒｘ＿ＷＴ１＿Ａについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２９は、Ｔｒｘ＿ＷＴ１について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３０は、ＷＴ１＿Ａについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３１は、ＷＴ１＿Ｂについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３２は、配列番号３２７によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３３は、配列番号３２８によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３４は、配列番号３２９によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３５は、配列番号３３０によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３６は、配列番号３３１によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
【０３２７】
（実施例１０）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されたＷＴ１の短縮された形態）
ＷＴ１の３つのリーディングフレームを、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：
ＷＴ１  Ｔｒ２について：
ＰＤＭ−４４１（配列番号３４８）  ５’  ｃａｃｇａａｇａａｃａｇｔｇｃｃｔｇａｇｃｇｃａｔｔｃａｃ  ３’  Ｔｍ  ６３℃
ＰＤＭ−４４２（配列番号３４９）  ５’  ｃｃｇｇｃｇａａｔｔｃａｔｃａｇｔａｔａａａｔｔｇｔｃａｃｔｇｃ  ３’  Ｔｍ  ６２℃
ＷＴ１  Ｔｒ３について：
ＰＤＭ−４４３（配列番号３５０）  ５’  ｃａｇｇｃｔｔｔｇｃｔｇｃｔｇａｇｇａｃｇｃｃｃ  ３’  Ｔｍ  ６４℃
ＰＤＭ−４４４（配列番号３５１）  ５’  ｃａｃｇｇａｇａａｔｔｃａｔｃａｃｔｇｇｔａｔｇｇｔｔｔｃｔｃａｃｃ  ３’  Ｔｍ  ６４℃
ＷＴ１  Ｔｒ４について：
ＰＤＭ−４４５（配列番号３５２）  ５’  ｃａｃａｇｃａｇｇａａｇｃａｃａｃｔｇｇｔｇａｇａａａｃ  ３’  Ｔｍ  ６３℃
ＰＤＭ−４４６（配列番号３５３）  ５’  ｇｇａｔａｔｃｔｇｃａｇａａｔｔｃｔｃａａａｇｃｇｃｃａｇｃ  ３’  Ｔｍ  ６３℃
このＰＣＲは、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μＬ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃３０秒×４０サイクル
７２℃４分。
【０３２８】
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓ（インフレームで５’末端にて、Ｈｉｓタグで改変されたｐＥＴ２８ベクター）へとクローニングした。この構築物が正しいことを、配列分析を通じて確認し、そしてＢＬ２１  ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ細胞、またはＢＬＲ  ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬＲ  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ細胞へと形質転換した。
【０３２９】
（実施例１１）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１  Ｃ（アミノ酸７６〜４３７）およびＷＴ１  Ｄ（アミノ酸９１〜４３７）の発現）
ＷＴ１  Ｃリーディングフレームを、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：
【０３３０】
【化１】
2005518192.tif 000074
このＰＣＲを、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μＬ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃２分×４０サイクル
７２℃４分
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓへとクローニングした。この配列を、配列分析を通じて確認し、次いでＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＰを用いて同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）されたＢＬＲ  ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬＲへと形質転換した。
【０３３１】
（実施例１２）
（重複オリゴのアニーリングによるＷＴ１  ＴＲ−１の合成的産生）
本実施例を、発現におけるプロリンコドン使用頻度を変化する効果を決定するために実施した。
【０３３２】
以下のオリゴの対をアニーリングした：
【０３３３】
【化２】
2005518192.tif 000075
【０３３４】
【化３】
2005518192.tif 000076
各々のオリゴの対を、別々に組み合わせ、次いでアニーリングした。次いでこの対を、一緒にライゲーションし、そして１μｌのライゲーション混合物を以下のＰＣＲ条件で用いた：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μＬ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃３０秒×４０サイクル
７２℃４分。
【０３３５】
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓへとクローニングした。この配列を、確認し、次いでＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＰを用いて同時形質転換されたＢＬＲ  ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬＲへと形質転換した。
【０３３６】
実施例１０〜１２について、以下の配列番号を開示する：
配列番号３３７は、ＷＴ１＿Ｔｒ１について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３８は、ＷＴ１＿Ｔｒ２について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３９は、ＷＴ１＿Ｔｒ３について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４０は、ＷＴ１＿Ｔｒ４について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４１は、ＷＴ１＿Ｃについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４２は、配列番号３３７によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３４３は、配列番号３３８によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３４４は、配列番号３３９によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３４５は、配列番号３４０によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３４６は、配列番号３４１によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
【０３３７】
このＷＴ１  Ｃ配列は、ＴＲ２、ＴＲ３およびＴＲ４のコード領域を有するポリヌクレオチドを表わす。
【０３３８】
このＷＴ１  ＴＲ−１合成配列は、そこでプロリンの代替的なコドンがネイティブのコドンに代わり置換され、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＷＴ１  ＴＲ−１を発現し得るポリヌクレオチドを産生する、ポリヌクレオチドを表す。
【０３３９】
（実施例１３）
（マウスにおけるＷＴ１免疫の全身性の組織病理学的および毒物学的効果の評価）
本実施例の目的は、ＷＴ１タンパク質免疫の免疫原性および潜在的な全身性の組織病理学的および毒物学的効果を、マウスにおける複数投与の滴定において分析することである。
【０３４０】
ＷＴ１タンパク質を用いたマウスの免疫についての実験の設計を、表Ｌに略説する。
【０３４１】
（表Ｌ）
（マウスにおけるＷＴ１免疫の実験的設計）
【０３４２】
【表５０−１】
2005518192.tif 000077
【０３４３】
【表５０−２】
2005518192.tif 000078
雌性Ｃ５７／Ｂ６マウスにおける複数投与滴定の研究（投与量は、ＷＴ１タンパク質、２５μｇ、１００μｇから１０００μｇで変化する）において、ＭＰＬ−ＳＥをアジュバントとして用いたＷＴ１タンパク質に対するワクチン接種は、強いＷＴ１特異的抗体応答（図１９）および細胞性のＴ細胞応答（図２０）を誘発した。
【０３４４】
ＷＴ１タンパク質を用いた免疫の全身性の組織病理学的および毒物学的効果は、全く観察されなかった。以下の組織において、毒性についての組織学的な証拠は、全く見られなかった：副腎腺、脳、盲腸、結腸、十二指腸、眼、大腿骨および大腿骨骨髄、胆嚢、心臓、回腸、空腸、腎臓、喉頭、涙腺、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、食道、卵巣、膵臓、上皮小体、唾液腺、胸骨および胸骨骨髄、脾臓、胃、胸腺、気管、甲状腺、膀胱ならびに子宮。
【０３４５】
潜在的な造血毒性の評価に、特別重きを置いた。胸骨および大腿骨における骨髄／赤血球の比率は、正常であった。全ての評価可能な血液細胞数および血液化学（ＢＵＮ、クレアチニン、ビリルビン、アルブミン、グロブリン）は、通常の範囲内であった（表ＬＩ）。
【０３４６】
ＷＴ１に対して存在する免疫性が、何人かの白血病を有する患者において存在しそしてＷＴ１タンパク質に対するワクチン接種が、マウスにおいて、正常な組織に対する毒性を有することなくＷＴ１特異的Ａｂ応答および細胞性Ｔ細胞応答を誘発し得る場合、これらの実験は、腫瘍／白血病ワクチンとしてＷＴ１を確認した。
【０３４７】
（表ＬＩ）
（臨床化学的および血液学的分析）
（表ＬＩ：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０３４８】
【表５１】
2005518192.tif 000079
（表ＬＩ：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０３４９】
【表５２】
2005518192.tif 000080
（表ＬＩ：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０３５０】
【表５３】
2005518192.tif 000081
（表ＬＩ（続き）：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０３５１】
【表５４】
2005518192.tif 000082
（表ＬＩ（続き）：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０３５２】
【表５５】
2005518192.tif 000083
（表ＬＩ（続き）：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０３５３】
【表５６】
2005518192.tif 000084
（略語）
ＷＢＣ：白血球；ＲＢＣ：赤血球；Ｈｇ．：血色素（ヘモグロビン）；ＨＣＴ：ヘマトクリット；ＭＣＶ：平均赤血球容積（ｍｅａｎ  ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  ｖｏｌｕｍｅ）；ＭＣＨ：平均赤血球血色素量（ｍｅａｎ  ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）；ＭＣＨＣ：平均赤血球血色素濃度（ｍｅａｎ  ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）；Ｐｌｔ：血小板；Ａｂｓ：純粋な；Ｂａｓｏ：好塩基球；Ｅｏｓ：好酸球；Ａｂｓ．Ｂａｎｄｓ：未熟好中球；Ｐｏｌｙｓ：多核型細胞；Ｌｙｍｐｈ：リンパ球；Ｍｏｎｏ：単球；ＢＵＮ：血液尿素窒素。
【０３５４】
（実施例１４）
（インビトロでの全遺伝子の初回免疫によるヒトＷＴ１特異的Ｔ細胞応答の誘発）
本実施例は、ＷＴ１特異的Ｔ細胞応答が、正常な個体の血液より惹起され得ることを実証する。
【０３５５】
樹状細胞（ＤＣ）を、１０％のヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地中での４〜１０日間の増殖によって正常なドナーのＰＢＭＣ由来の単球培養物より分化した。培養の後、ＤＣを、組換えＷＴ１発現ワクシニアウイルスを５のＭ．Ｏ．Ｉ．で用いて１６時間か、または組換えＷＴ１発現アデノウイルスを１０のＭ．Ｏ．Ｉ．で用いて３日間感染させた（図２１および２２）。ワクシニアウイルスを、Ｕ．Ｖ．照射によって不活性化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズを用いた陽性選択によって単離し、そして培養物の初回免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ）を、９６ウェルプレートにおいて開始した。培養物を、ＷＴ１を発現するようにアデノウイルスまたはワクシニアルスで感染させた自己の樹状細胞を用いて、７〜１０日間毎に再刺激した。３〜６回の刺激の周期の後、自己のＷＴ１発現樹状細胞または線維芽細胞を用いて刺激された場合にインターフェロン−γを特異的に産生するＣＤ８＋株を、同定し得た。これらの株のＷＴ１特異的活性を、さらなる刺激の周期の間、維持し得た。これらの株が、アデノＷＴ１またはワクシニアＷＴ１で感染された自己の樹状細胞を特異的に認識するが、アデノＥＧＦＰまたはワクシニアＥＧＦＰで感染された自己の樹状細胞を認識しないことを、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって実証した（図２３）。
【０３５６】
（実施例１５）
（注射のためのＲＡ１２−ＷＴ１の処方：凍結乾燥した産生物を安定化するための賦形剤の使用）
本実施例は、凍結乾燥したＲａ１２−ＷＴ１の完全な可溶化を可能とする処方を記載する。
【０３５７】
以下の処方は、組換えタンパク質Ｒａ１２−ＷＴ１を、凍結乾燥により乾燥された後に、水性培地に溶解させ得た。
【０３５８】
組換えＲａ１２−ＷＴ１濃度：０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ；緩衝液：１０〜２０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ１０．０）；１．０〜５．０ｍＭシステイン；０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０）；糖：１０％トレハロース（Ｔ５２５１、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）  １０％マルトース（Ｍ９１７１、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）  １０％スクロース（Ｓ７９０３，Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）  １０％フルクトース（Ｆ２５４３、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）  １０％グルコース（Ｇ７５２８、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）。
【０３５９】
糖賦形剤と共に凍結乾燥したタンパク質が、その糖賦形剤を伴わないものより十分に多く溶解し得ることを見出した。クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって、この溶解されたこの物質中に残存する固体の徴候は示されなかった。
【０３６０】
（実施例１６）
（ＷＴ１タンパク質ワクチンの処方）
本実施例は、ＷＴ１タンパク質および２つの異なるアジュバントの処方物による免疫後のＷＴ１特異的応答の誘導を記載する。
【０３６１】
本実施例に従って、ＭＰＬ−ＳＥと組み合わせたＷＴ１タンパク質は、ＷＴ１に対する、強いＡｂ応答およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）応答を誘導する。以下に詳述されるのは、Ｃ５７／Ｂ６マウスにおいてアジュバントとしてＭＰＬ−ＳＥまたはＥｎｈａｎｚｙｎを用いた、ＷＴ１タンパク質免疫後にＷＴ特異的な免疫応答を誘導するために用いる方法である。
【０３６２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＰＬ−ＳＥまたはＥｎｈａｎｚｙｎアジュバントのいずれかを組み合わせた２０μｇのｒＲａ１２−ＷＴ１を用いて免疫した。３回の筋肉内（ＩＭ）免疫を、３週間間隔で与えた。一群のコントロールマウスを、アジュバントを伴わずにｒＲＡｌ１２−ＷＴ１を用いて免疫し、そして一群を、生理食塩水のみを用いて免疫した。３回の筋肉内（ＩＭ）免疫化を３週間空けて与えた。脾臓および血清を、最後の免疫後２週間に収集した。血清を、Ｒａ１２−ＷＴ１融合、Ｒａｌ１２またはＷＴ１ＴＲＸでコートしたプレート上で、ＥＬＩＳＡによって、抗体応答について分析した。同様のレベルのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１抗体力価を、Ｒａ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥおよびＲａ１２−ＷＴ＋Ｅｎｈａｎｚｙｎを用いて免疫したマウスにおいて、観察した。アジュバントを伴わずにｒＲａ１２−ＷＴ１を用いて免疫したマウスは、低レベルのＩｇＧ２ａ抗体を示した。
【０３６３】
ＣＤ４応答を、インビトロでｒＲａ１２−ＷＴ１、ｒＲａ１２またはｐ６、ｐ１１７、およびｐ２８７のＷＴ１ペプチドを用いた脾細胞の刺激後のインターフェロン−γ産生を測定することによって評価した。両方のアジュバントは、ｒＲＡ１２−ＷＴ１を単独で用いて免疫したマウスよりもＣＤ４応答を改善した。さらに、この結果は、ｒＲＡ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥがｒＲＡ１２−ＷＴ１＋Ｅｎｈａｎｚｙｎが誘導するよりも強いＣＤ応答を誘導することを示した。ＩＦＮ−γ  ＯＤの読み値は、ｒＲＡ１２−ＷＴ１＋Ｅｎｈａｎｚｙｎを用いて免疫したマウスにおいて１〜１．２であるのに対し、ｒＲＡ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥを用いて免疫したマウスにおいては１．４〜１．６で変化する。ペプチド応答は、ｐ１１７に対してのみ観察され、そしてそれはｒＲＡ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥを用いて免疫したマウスにおいてのみであった。陽性コントロール（ＣｏｎＡ）に対する強いＩＦＮ−γ応答を、全てのマウスにおいて観察した。生理食塩水を用いて免疫した陰性コントロールマウスにおいては、ＣｏｎＡに対してのみ応答を、観察し、これはこの応答がｒＲＡ１２−ＷＴ１に特異的であることを示した。
【０３６４】
（実施例１７）
（ランダム変異ＷＴ１ライブラリーの構築）
ヒトＷＴ１の核酸配列を、８−ｏｘｏ  ｄＧＴＰおよびｄＰＴＰの存在下でポリメラ−ゼ連鎖反応を用いて、ランダムに変異させた（ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９６；２５５：５８９−６０３）。スプライシングされていない完全なヒトＷＴ１遺伝子を配列番号３８０に開示し、対応するタンパク質配列を配列番号４０４に開示する。ＷＴ１のスプライス改変体を、ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして用い、そして配列番号３８１（ＤＮＡ）および配列番号４０８（タンパク質）に開示する。条件を、核酸の変化の頻度が、アミノ酸配列の標的とする変化を導くように（通常はＰＣＲ産物の５〜３０％）、選択した。次いでこの変異ＰＣＲ産物を、ヌクレオチドアナログの非存在下で、４つの正常なｄＮＴＰを用いて増幅した。このＰＣＲ産物を、免疫のための哺乳動物の発現ベクターおよびウイルスベクターへとサブクローニングした。従って、このライブラリーは、ランダムに変異したＷＴ１クローンの混合された集団を含有する。いくつかのクローンを、選択および配列決定した。この変異ＷＴ１改変体ＤＮＡ配列を、配列番号３７７〜３７９に開示し、この改変体の予測されるアミノ酸配列を、配列番号４０５〜４０７に示す。これらの変化した配列（およびライブラリーからの他の配列）を、癌細胞におけるＷＴ１タンパク質に対する強いＴ細胞応答を誘導するための免疫原として用い得る。
【０３６５】
（実施例１８）
（ＷＴ１−ＬＡＭＰ融合物の構築）
３つの部分からなる融合物を、ポリメラーゼ連鎖反応ならびにヒトリソソーム関連膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１）配列およびヒトＷＴ１配列スプライス改変体の所望の結合部を含有する合成オリゴヌクレオチドを用いて構築した。これらの融合物に用いたＷＴ１のスプライス改変体およびＬＡＭＰ−１配列を、配列番号３８１および３８３に開示する。詳細には、ＬＡＭＰ−１のシグナルペプチド（ＬＡＭＰの塩基対１〜８７）を、ヒトＷＴ１オープンリーディングフレーム（１，２９０塩基対長）の５’末端に融合し、次いでＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（ＬＡＭＰの塩基対１１６１〜１２８１）をＷＴ１配列の３’末端に融合した。得られたＷＴ１−ＬＡＭＰ構築物の配列を、配列番号３８２（ＤＮＡ）および配列番号４０９（タンパク質）に開示する。この構築物を、それが真核生物細胞中で発現された場合に、シグナルペプチドが、このタンパク質を小胞体（ＥＲ）に指向し、ここで、ＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン中の局在化シグナルが、リソソーム位置へのこの融合タンパク質の輸送を指向し、ここで、ペプチドが、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子に充填されるように設計した。
【０３６６】
（実施例１９）
（増強されたＭＨＣクラスＩ提示のためのＷＴ１ユビキチン融合物の構築）
ヒトユビキチンオープンリーディングフレーム（配列番号３８４）を、最後のアミノ酸をコードするヌクレオチドがグリシンの代わりにアラニンをコードするように変異させた。この変異オープンリーディングフレームを、ヒトＷＴ１（配列番号３８１および４０８（各々ＤＮＡおよびタンパク質））スプライス改変体の最初のコドンの直前に、インフレームでクローニングした。Ｇ−＞Ａ変異は、翻訳の間に通常ポリユビキチンをプロセシングするプロテアーゼによるなり始めのタンパク質の同時翻訳開裂を除去する。この得られる構築物のＤＮＡ配列および予想されるアミノ酸配列を、各々配列番号３８５および４１０に示す。得られたタンパク質は、ヒト細胞中で発現された場合に、減少された細胞性細胞傷害性を示した。ネイティブのＷＴ１を発現する安定株を産生することは、不可能だが、融合タンパク質を発現する細胞株は、容易に得られた。得られたタンパク質が、付加されたユビキチン分子によってプロテオソームの標的とされることが予想される。これが、ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるタンパク質のより効率的な認識を生じるのは当然である。
【０３６７】
（実施例２０）
（ヒトＷＴ１発現アデノウイルスベクターの構築）
全長ヒトＷＴ１遺伝子（配列番号３８１）のスプライス改変体を、Ｅ１およびＥ３欠失アデノウイルス血清型５ベクターへとクローニングした。ＷＴ１遺伝子の発現は、高レベルのＷＴ１タンパク質発現を媒介するＣＭＶプロモータによって制御される。この試薬でのヒト細胞の感染は、高レベルのＷＴ１タンパク質の発現を導く。宿主細胞へと導入され、そして感染に続いて低レベルで産生されたアデノウイルスタンパク質の抗原性の性質は、免疫学的標的としてのＷＴ１の免疫学的監視および免疫学的認識を増加するように作用し得る。このベクターもまた、ヒト被験者に接種された場合、ＷＴ１タンパク質に対する免疫応答を惹起するために用いられ得る。これらの被験者が、ＷＴ１発現腫瘍細胞について陽性である場合、この免疫応答は、疾患の過程において治療的効果または治癒的効果を有し得る。
【０３６８】
（実施例２１）
（ヒトＷＴ１発現ワクシニアウイルスベクターの構築）
全長ヒトＷＴ１遺伝子（配列番号３８１）のスプライス改変体を、ｐＳＣ１１シャトルベクターを用いて、ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株のチミジンキナーゼ位置へとクローニングした。ＷＴ１遺伝子は、ワクシニアウイルス感染の過程を通じて遺伝子発現を媒介するハイブリッドワクシニアウイルスプロモーターの制御下にある。この試薬は、インビボまたはインビトロで、ヒト細胞におけるＷＴ１タンパク質を発現するために用いられ得る。ＷＴ１は、いくつかのヒト腫瘍細胞上で過剰発現される自己のタンパク質である。従って、タンパク質として送達されたＷＴ１に対する免疫応答は、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）を媒介するＷＴ１の認識を導く傾向にはない。しかし、ワクシニアウイルスベクターによる細胞内部分におけるタンパク質の発現は、高レベルのＭＨＣクラスＩ提示およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＷＴ１タンパク質の認識を可能とし得る。ワクシニアウイルスベクターによるＷＴ１タンパク質発現はまた、ＭＨＣクラスＩＩと関連するＷＴ１ペプチドの提示も導き、従ってＣＤ４＋Ｔ細胞による認識も導き得る。
【０３６９】
本発明の使用は、癌ワクチンとしてのその使用を含む。ＷＴ１陽性腫瘍を保有しているヒト被験者の免疫は、治療的または治癒的な応答を導き得る。細胞内でのＷＴ１の発現は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方によるタンパク質の認識を導き得る。
【０３７０】
（実施例２２）
（遺伝子全体の初回免疫を用いたＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの産生）
樹状細胞（ＤＣ）を、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｇ  ＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地中で４〜６日間増殖することによって正常な患者のＰＢＭＣ由来の単球培養物より分化した。培養後、ＤＣを、組換えＷＴ１発現ワクシニアウイルス（実施例２１に記載）を５の感染多重度（ＭＯＩ）で用いて１６時間か、または組換えＷＴ１発現アデノウイルスを１０のＭＯＩで用いて３日間、感染した。ワクシニアウイルスをＵ．Ｖ．照射によって不活性化した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、磁気ビーズを用いた陰性除去によって単離し、そして培養物の初回免疫を、９６ウェルプレートにおいて開始した。培養物を、ＷＴ１を発現するように操作されたアデノウイルスまたはワクシニアルスで感染した自己の樹状細胞を用いて、７〜１０日間毎に再刺激した。４〜５回の刺激の周期の後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞株が、自己のＷＴ１を発現する樹状細胞または線維芽細胞を用いて刺激された場合にインターフェロン−γを特異的に産生することを同定し得た。これらの株をクローニングし、そしてこれらの株が、ＥＧＦＰ形質導入された線維芽細胞ではなく、ＷＴ１形質導入された自己の線維芽細胞を特異的に認識することをＥｌｉｓｐｏｔアッセイによって実証した。
【０３７１】
ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）遺伝子は、白血病誘発物に関与し、そしてほとんどのヒト白血病および複数の固形腫瘍において過剰発現される。ヒトに関する以前の研究は、研究されたＡＭＬ患者の１６／６３（２５％）およびＣＭＬ患者の１５／８１（１９％）においてＷＴ１特異的な抗体（Ａｂ）応答の存在を実証した。マウスに関する以前の研究は、ＷＴ１ペプチドに基づくワクチンが、ＷＴ１特異的な、Ａｂ、ＴｈおよびＣＴＬ応答を誘発することを示した。ヒトにおけるワクチンとしてのペプチドの使用は、それらのＨＬＡ制限、およびペプチド特異的応答を誘発しかつ少数の患者においてのみＣＴＬを誘発する傾向によって制限される。全遺伝子免疫の利点は、いくつかのヘルパーおよびＣＴＬエピトープが単一のワクチン中に含まれ、従って特定のＨＬＡ型に対するワクチンを制限し得ないことである。明細書中に開示されるデータは、インビトロでの全遺伝子の初回免疫を用いたＷＴ１特異的免疫応答の誘導、そしてＷＴ１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンを産生し得たこと、を実証する。ＷＴ１に対して存在する免疫性が、白血病を有する何人かの患者において存在すること、ならびにマウスおよびヒトのＷＴ１が、アミノ酸レベルで９６％同一でありそしてＷＴ１タンパク質、ＷＴ１  ＤＮＡまたはＷＴ１ペプチドに対するワクチン接種が、マウスにおける正常な組織に対する毒性を有すること無くＷＴ１特異的Ａｂ、および細胞性Ｔ細胞応答を誘発し得ることから、これらのインビトロでのヒト初回免疫実験は、腫瘍／白血病ワクチンとしてのＷＴ１のさらなる確認を提供する。さらに、ＷＴ１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンを産生する能力は、遺伝子的に操作したＴ細胞を用いた、ＷＴ１過剰発現に関連する悪性疾患の処置を導き得る。
【０３７２】
（実施例２３）
（ＷＴ１の臨床的製造のための組換え構築物）
５つの構築物を、以下に詳述するように、臨床的グレードのＷＴ１の産生のために作製した。
【０３７３】
Ｒａ１２／ＷＴ−Ｅ（配列番号３８８（ｃＤＮＡ）および３９１（タンパク質））およびＨｉｓタグを有さないＷＴ−１Ｅ（配列番号３８６（ｃＤＮＡ）および３９５（タンパク質））の設計：
ＷＴ１  Ｅリーディングフレームを、非Ｈｉｓ非融合構築物のための以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【０３７４】
【化４】
2005518192.tif 000085
以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：１μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌの１０μＭ各オリゴ、８３μＬ滅菌水  １．５μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、５０ｎｇのＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２  ＷＴ−１  非Ｈｉｓ）。反応を、最初９６℃で２分間変性し、その後９６℃で２０秒間、６２℃で１５秒間および７２℃で１分４０秒間を４０サイクル続けた。この後７２℃で４分間の最後の伸長を続けた。このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、次いでＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓ（改変されたｐＥＴ２８ベクター）へとクローニングした。この構築物を、配列分析を通して確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞およびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞へと形質転換した。次いでこの構築物−ｐＰＤＭ  ＷＴ−１を、ＮｃｏＩおよびＸｂａｌを用いて消化し、そしてｐＰＤＭ  Ｒａ１２  ＷＴ−１  Ｆ（以下を参照のこと）からのＮｃｏＩおよびＸｂａＩ挿入のためのベクターの基幹部として用いた。この構築物を、配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬＹｓ  ＳおよびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞へと形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端タンパク質配列分析によって確認した。
【０３７５】
Ｈｉｓタグを有さないＲａ１２−ＷＴ−１−Ｆ（ａ．ａ．１〜２８１）（配列番号３８９（ｃＤＮＡ）および３９３（タンパク質））の設計：
Ｒａ１２  ＷＴ１リーディングフレームを、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【０３７６】
【化５】
2005518192.tif 000086
以下のＰＣＲサイクル条件を、使用した：１μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌ  各１μＭオリゴ、８３μｌ滅菌水、１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、５０ηｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２  ＷＴ−１  Ｎｏ  Ｈｉｓ）。反応物を、まず、９６℃で２分間変性し、続いて、９６℃にて２０分間、５８℃にて１５秒間、および７２℃にて３分間の４０サイクルを行う。この次に、７２℃にて４分間の最後の伸長を行った。ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩで消化し、そしてＮｄｅＩおよびＥｃｏ７２Ｉで消化されたｐＰＤＭ  Ｈｉｓにクローン化した。この配列を、配列分析によって確認し、次いで、ＢＲＬ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞およびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ−末端タンパク質配列分析によって確認した。
【０３７７】
Ｈｉｓタグを有さないＲａ−１２−ＷＴ−１の設計（配列番号３９０（ｃＤＮＡ）および配列番号３９２（タンパク質））：
Ｒａ１２  ＷＴ−１リーディングフレームを、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−７７７（配列番号４００）  ５’ｃｇａｔａａｇｃａｔａｔｇａｃｇｇｃｃｇｃｇｔｃｃｇａｔａａｃ  ３’  Ｔｍ  ６６℃
ＰＤＭ−７７８（配列番号４０１）  ５’ｇｔｃｔｇｃａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａａａｇｃｇｃｃａｇｃ  ３’  Ｔｍ  ７〜℃。
【０３７８】
以下のＰＣＲサイクル条件を使用した：１μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌ  各１μＭオリゴ、８３μｌ滅菌水、１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、５０ηｇ  ＤＮＡ（Ｈｉｓを有さないｐＰＤＭＲａ１２  ＷＴ−１）。反応物を、まず、９６℃で２分間変性し、続いて、９６℃２０秒間、６８℃１５秒間、および７２℃２分３０秒間の４０サイクルを行った。この次に、７２℃４分間の最後の伸長を行った。ＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩおよびＮｄｅＩで消化し、そしてＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化されたｐＰＤＭ  Ｈｉｓにクローン化した。この配列を、配列分析によって確認し、次いで、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞およびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ−末端タンパク質配列分析によって確認した。
【０３７９】
（Ｈｉｓタグを有さないＥ．ｃｏｌｉ中でのＷＴ−１  Ｃ（ａ．ａ．６９−４３０）の設計（配列番号３８７（ｃＤＮＡ）および３９４（タンパク質）））
ＷＴ−１  Ｃリーディングフレームを、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−７８０（配列番号４０２）  ５’ｇａｃｇａａａｇｃａｔａｔｇｃａｃｔｃｃｔｔｃａｔｃａａａｃ  ３’  Ｔｍ  ６〜℃
ＰＤＭ−７７８（配列番号４０３）  ５’ｇｔｃｔｇｃａｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａａａｇｃｇｃｃａｇｃ  ３’  Ｔｍ  ７〜℃。
【０３８０】
以下のＰＣＲサイクル条件を使用した：１μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌ  各１μＭオリゴ、８３μｌ滅菌水、１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、５０ηｇ  ＤＮＡ（Ｈｉｓを有さないｐＰＤＭＲａ１２  ＷＴ−１）。反応物を、まず、９６℃で２分間変性し、続いて、９６℃２０秒間、６２℃１５秒間、および７２℃２分の４０サイクルを行った。この次に、７２℃４分間の最後の伸長を行った。ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩで消化し、そしてＮｄｅＩおよびＥｃｏ７２Ｉで消化されたｐＰＤＭ  Ｈｉｓにクローン化した。この配列を、配列分析によって確認し、次いで、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞およびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ−末端タンパク質配列分析によって確認した。
【０３８１】
（実施例２４）
（全遺伝子初回免疫を使用するＷＴ１−特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンの同定およびＨＬＡ−Ａ２−制限ＷＴ１エピトープの同定）
この実施例において、アデノウイルス送達ビヒクルおよびワクシニアウイルス送達ビヒクルを使用し、ＷＴ１特異的Ｔ細胞株を生成した。細胞株由来のＴ細胞クローンは、ＷＴ１に対して特異的であることが示され、さらに、このクローンによって認識されるエピトープを同定した。
【０３８２】
樹状細胞（ＤＣ）を、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地中で４〜６日間の増殖によって、正常なドナーのＰＢＭＣに由来する単球培養物から分化した。培養後、ＤＣに、５の多重感染度（ＭＯＩ）で組換えＷＴ１発現ワクシニアウイルスを１６時間感染させたか、または３〜１０のＭＯＩで組換えＷＴ１発現アデノウイルスを２〜３日感染させた。ワクシニアウイルスを、Ｕ．Ｖ．照射によって不活性化した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ５６＋細胞に対する抗体を使用するネガティブ枯渇、続いてのこれらのＡｂのＦｃ部分に対して特異的な磁気ビーズによって単離した。
【０３８３】
培養物を初回免疫することを、９６ウェルプレート中で開始した。培養物を、ＷＴ１を発現するように操作されたアデノウイルスまたはワクシニアウイルスで感染された自己樹状細胞を使用して、７〜１４日毎に再刺激した。４〜５刺激サイクル後に、自己−ＷＴ１発現樹状細胞または自己−ＷＴ１発現線維芽細胞で再刺激された場合に、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を特異的に産生するＣＤ８＋細胞株を、同定し得る。これらの株を、クローン化し、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって、ＷＴ１導入自己線維芽細胞を特異的に認識するが、形質導入された線維芽細胞を制御することを示した。
【０３８４】
これらのＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのＨＬＡ制限をさらに分析するために、さらなるドナー由来の繊維芽細胞（Ｄ４７５）（Ｔ細胞クローンを確立したドナー（Ｄ３４９）を有するＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子のみを共有する）に、ＷＴ１を形質導入した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、Ｔ細胞クローンによるこれらのＤ４７５標的細胞の認識を示した。ＨＬＡ  Ａ２認識をさらに示すために、そしてこのエピトープがＷＴ１を（これらの悪性形質転換の部分として）「天然に」過剰発現する腫瘍細胞によって発現されることをさらに示すために、白血球細胞株Ｋ５６２を試験した。Ｋ５６２を、ＨＬＡ  Ａ２分子で形質転換し、そしてＨＬＡ−Ａ２ネガティブＫ５６２細胞を、非特異的ＩＦＮ−γ放出のためのコントロールとして使用した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、Ｔ細胞が、Ａ２ポジティブなＫ５６２細胞株を認識したが、Ａ２ネガティブＫ５６２細胞を認識しなかったことを示した。認識の特異性およびＨＬＡ−Ａ２制限の認識のさらなる証拠は、ＨＬＡ−Ａ２抗体ブロッキング実験によって示された。
【０３８５】
ＷＴ１エピトープをさらに規定するために、４の短縮されたＷＴ１レトロウイルス構築物を、生成した。次いで、ドナー４７５繊維芽細胞を、これらの構築物で形質転換した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＷＴ１  Ｔｒ１構築物（ａａ２−ａａ９２）で形質転換されたＤ４７５繊維芽細胞を示し、それによって、ＷＴ１エピトープが、ＷＴ１タンパク質の最初の９１のＮ−末端アミノ酸内に局在化されることを示した。エピトープを細かくマップするために、１１アミノ酸重複するＷＴ１タンパク質の１５マーペプチドを、合成した。ＷＴ１特異的Ｔ細胞クローンは、２つの重複する１５マーペプチド（ペプチド９（ＱＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡ）（配列番号４１２）およびペプチド１０（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ）（配列番号４１３））を認識した。認識される最小のエピトープをさらに特徴付けるために１５マーのうち剪断された９マーのペプチドおよび１０マーのペプチドを、クローンの特異性を分析するために使用した。クローンは特異的に９マー（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（配列番号２４１））および１０マー（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳ  （配列番号４１１））を認識した。
【０３８６】
（実施例２５）
（ＷＴ１に対して特異的なＣＤ８  Ｔ細胞に由来するＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のクローニングおよび配列決定）
ＷＴ１に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するＴ細胞レセプターα鎖およびＴ細胞レセプターβ鎖を、クローン化した。配列分析は、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖のファミリーの複製起点を示した。さらに、特有の多様性および結合配列（応答の特異性に寄与する）を同定する。
【０３８７】
ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン由来の２×１０６細胞からの全ｍＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用して単離し、ｃＤＮＡを、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して合成する。クローン中のＶαおよびＶβを決定するために、Ｖαサブタイプ特異的プライマーおよびＶβのパネルを（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡによって生成されたプライマー配列に基づいて）合成し、そして各クローンから生成されたｃＤＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応において使用する。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＶβおよびＶα配列が各クローンによって発現されることを示す。
【０３８８】
クローンからの全長ＴＣＲα鎖およびβ鎖をクローン化するために、イニシエーターコードＴＣＲヌクレオチドおよびターミネーターコードＴＣＲヌクレオチドにまたがるプライマーを、設計する。標準的な３５サイクルＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＣＴＬクローンおよび上記プライマーから合成されたｃＤＮＡを使用して、プルーフリーディング熱安定性ポリメラーゼＰＷＯ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して確立する。得られた特異的なバンド（αについて約８５０ｂｐおよびβについて約９５０ｂｐ）を、ＰＣＲブラントベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換する。全長α鎖およびβ鎖を含むプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを同定し、対応するプラスミドの大スケール調製物を生成した。次いで、全長α鎖およびβ鎖を含むプラスミドを、標準的方法を使用して配列決定する。従って、ＴＣＲの特異性に寄与する組み合わせ結合（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｊｏｉｎｉｎｇ）（ＤＪ）領域を、決定する。
【０３８９】
（実施例２６）
（ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンはＷＴ１発現白血病芽細胞を溶解する）
ペプチド配列（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（ヒトＷＴ１残基３７−４５；配列番号２４１））を認識する実施例２４において最初に開示されたＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを、ＨＬＡ  Ａ２制限様式において、ＷＴ１発現白血病標的細胞を殺傷（溶解）する能力についてさらに試験した。ＨＬＡ  Ａ２分子（ＧＦＰ、Ａ２Ｋｂ）で形質導入されたＫ５６２標的細胞または形質導入されないＫ５６２標的細胞を、２５：１および５：１のエフェクター  対  標的細胞（Ｅ：Ｔ）比を用いて、標準的４．５時間の５１クロム放出アッセイにおいて使用した。２５：１の比において、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、Ｋ５６２／Ａ２細胞およびＫ５６２／Ａ２Ｋｂ細胞を溶解し（それぞれ、４０％および４９％の比溶解）、その一方で、コントロールＧＦＰを形質導入し、そしてＫ５６２を溶解しなかった。５：１のＥ：Ｔにおいて、Ｋ５６２／Ａ２細胞およびＫ５６２／Ａ２Ｋｂ細胞の比溶解は、それぞれ、２１％および２４％であった。従って、このＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ−Ａ２−制限様式において、ＷＴ１を発現する白血病細胞を認識し、そして溶解する。ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを産生する能力は、遺伝的に操作されたＴ細胞を使用して過剰発現するＷＴ１と関連する悪性腫瘍の処置において有用性を有する。
【０３９０】
（実施例２７）
（ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド−ＭＨＣテトラマー複合体の構築）
この実施例は、昆虫細胞における可溶性ＨＬＡ−Ａ２のクローニングおよび発現、ならびに抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の検出および単離のための、ＨＬＡ−Ａ２の精製およびＨＬＡ−Ａ２の蛍光多価ペプチド−ＭＨＣテトラマー複合体へのアセンブリを記載する。
【０３９１】
この系は、Ａｌｔｍａｎら（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６  ２７４（５２８４）：９４−６）によって開発され、そして記載された系と類似しており、ここで、可溶性ＨＬＡ−Ａ２を、ｂｉｒＡ認識配列で単一のビオチン化し、続いて、フィコエリスリン−結合ストレプトアビジン骨組みに対してマルチマーにてアセンブルした。本明細書中で記載される物質は、昆虫細胞からグリコシル化された可溶性形態で発現するという点で異なり、ヘテロダイマーを、抗−ヒトクラスＩ  ＭＨＣ抗体アフィニティーカラムを使用して精製した。
【０３９２】
ＨＬＡ−Ａ２重鎖遺伝子（ｂｉｒＡビオチン化配列に付加される）およびヒトβ−２−マイクログロブリン遺伝子を、バキュロウイルス発現ベクター（ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｄｕａｌ）にクローン化した。昆虫細胞の感染の際に、遺伝子を、分岐プロモーターから同時に転写し、そして完全にアセンブルし、グリコシル化された可溶性ＨＬＡ−Ａ２ヘテロダイマーを、増殖培地中に分泌した。感染昆虫細胞を、細胞ファクトリー中で、２１℃で４日間培養し、その後、上清を回収した。ＨＬＡ−Ａ２産生を、Ｗ６／３２およびビオチン化されたＢ９．１２．１抗体を使用する捕捉ＥＬＩＳＡによってモニターした。ＨＬＡ−Ａ２を、一工程で培養物上清から９０％を超える純度まで精製した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに連結された２の抗−ヒトクラスＩ  ＭＨＣモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって９０％を超えるまで、精製した。使用される抗体は、ＰＡ２．１およびＷ６／３２であった。精製されたＨＬＡ−Ａ２を、市販のｂｉｒＡ酵素を使用して、重鎖のＣ−末端でｂｉｒＡ認識配列上に、単一のビオチン化した。ビオチン化の効率を、本質的に記載されるように（Ｃｒａｗｆｏｒｄら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｊｕｎｅ；８（６）：６７５−８２）評価し、物質を、サイズ排出クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製した。フィコエリスリン−結合ストレプトアビジンを、ｂｉｏ−ＨＬＡ−Ａ２で飽和し、そして多価染色試薬を、ＳＥＣによって遊離ＨＬＡ−Ａ２から精製した。ＨＬＡ−Ａ２テトラマーを、１０倍モル過剰のＨｅｒ−２／ｎｅｕ  Ｅ７５ペプチドまたはＩｎｆｌｕｅｎｚａマトリクスＭＩペプチドと共に、室温で４８時間培養し、特定のＴ細胞クローンを、ペプチド搭載テトラマーおよび抗−ＣＤ８抗体の存在下で、４℃で３０分間染色した。結果は、モル過剰量のＭ１  ５８−６６  Ｍ１  インフルエンザペプチドの存在下においてインキュベートされたテトラマーが、インフルエンザ特異的Ｔ細胞クローンを染色し、過剰のＨｅｒ−２／ｎｅｕ  Ｅ７５ペプチド共にインキュベートされたテトラマーが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｗ  特異的Ｔ細胞クローンを染色することを示した。
【０３９３】
（実施例２８）  
（ＷＴ１  ＭＨＣ−ペプチドテトラマーを使用するＷＴ１特異的Ｔ細胞の検出）
実施例２７に記載されるＨＬＡ−Ａ２テトラマーを、ＨＬＡ−Ａ２によって制限されることが実施例２４において前記されるモル過剰のＷＴ１  ｐ３７−４５ペプチド（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ）（ヒトＷＴ１残基３７−４５；配列番号２４１）と共にインキュベートした。個のテトラマーを使用して、実施例２４に記載されるＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを染色した。このクローンは、ｐ３７−４５エピトープを特異的に認識することが示された。テトラマーを、過剰のｐ３７−４５ペプチドと共にインキュベートした場合、これらは、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを特異的に染色し、その一方で、これらのテトラマーを、過剰の関連のないＨＬＡ−Ａ２ペプチド（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ，ＷＴ１  ｐ３８−４６，ＷＴ１  ｐ３９−４７）と共にインキュベートし、このテトラマーは、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを染色しなかった。従って、ＷＴ１ｐ３７−４５特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２−ｐ３７−４５ペプチドＭＨＣテトラマーによって特異的に認識する。
【０３９４】
次いで、実施例２４において記載されるように生成されたＷＴ１特異的Ｔ細胞株を、ＨＬＡ−Ａ２−ｐ３７−４５、関連のないＨｅｒ２／ｎｅｕまたはＷＴ１ｐ３７−４６テトラマーで染色した。ＨＬＡ−Ａ２−ｐ３７−４５テトラマーは、このＷＴ１特異的Ｔ細胞株の全集団の１％を、およびゲートされたＣＤ８＋集団の７％を染色し、その一方で、コントロールＨＬＡ−Ａ２−ｐ３７−４６テトラマーは、コントロールＨＬＡ−Ａ２−Ｈｅｒ２／ｎｅｕテトラマーと同じバックグラウンドレベルで染色した。
【０３９５】
これらの結果は、ＭＨＣ−ペプチドテトラマーが、ＷＴ１特異的免疫応答を検出することについて、高度に感受性であり、そしてこの検出について特異的なツールである。ペプチド−ＭＨＣテトラマーは、ＷＴ１特異的応答をモニタリングするＷＴ１関連悪性疾患の初期検出のために使用され、そして、最小の残存疾患をモニタリングし得る。テトラマー染色によるＷＴ１特異的Ｔ細胞の検出はまた、再発または疾患進行のより高い危険性を有してＷＴ１関連疾患に罹患する、患者集団内の群を同定するための有用なツールである。
【０３９６】
（実施例２９）
（遺伝子全体のプライミングを用いたＨＬＡ−Ａ２４−ポジティブドナーからのＷＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株の生成）
この実施例において、アデノウイルスおよびワクシニアウイルス送達ビヒクルを使用してＨＬＡ−Ａ２４ポジティブドナーからＷＴ−１特異的Ｔ細胞を生成した。このＴ細胞株は、限定されたＭＨＣクラスＩであることを示した。これらの実験はさらに、ＷＴ１タンパク質の免疫原性を確認し、そしてワクチンおよび／または他の免疫治療アプローチに対する標的としての用途を支持する。
【０３９７】
樹状細胞（ＤＣ）を、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｇ  ＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地中で４〜６日間増殖することによって正常なＨＬＡ−Ａ２４−ポジティブドナーＰＢＭＣ由来の単球培養物より分化した。培養後、ＤＣを、組換えＷＴ１発現ワクシニアウイルスを５の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（ＭＯＩ）で用いて１６時間か、または組換えＷＴ１発現アデノウイルスを３〜１０のＭＯＩで用いて２〜３日間、感染させた。ワクシニアウイルスをＵ．Ｖ．照射によって不活性化した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ５６＋細胞に対する抗体、次にこれらのＡｂｓのＦｃ部分に特異的な磁気ビーズを用いた陰性除去によって単離した。
【０３９８】
培養物のプライミングを、９６ウェルプレートにおいて開始した。培養物を、ＷＴ１を発現するように操作されたアデノウイルスまたはワクシニアルスで感染した自己の樹状細胞を用いて、７〜１４日間毎に再刺激した。４〜５回の刺激の周期の後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞株が、自己のＷＴ１発現樹状細胞または線維芽細胞を用いて刺激された場合にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を特異的に産生することを同定し得た。これらの株をクローニングし、そしてこれらの株が、ＭＨＣクラスＩ拘束様式において、コントロール形質導入された線維芽細胞ではなく、ＷＴ１形質導入された自己の線維芽細胞を特異的に認識することをＥｌｉｓｐｏｔアッセイによって実証した。
【０３９９】
これらの実験は、ＷＴ１タンパク質がＴ細胞応答を生成させるために使用され得、従って、ＷＴ１抗原の免疫原性をさらに確認し得ることを示し、このことは、ワクチンおよび他の免疫療法アプローチのための標的としてのその用途を支持する。
【０４００】
（実施例３０）
（ＨＬＡ−Ａ２高親和性ＷＴ１エピトープの同定）
この実験は、天然でプロセスされた（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）エピトープよりも高親和性を有してＨＬＡ−Ａ２に結合することが予測されるＷＴ１エピトープのインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）同定を記載する。本明細書中で同定されたエピトープは、ＷＴ１発現に関連する癌の処置のためのワクチンおよび／または免疫学的ストラテジーにおいて有用性を有する。
【０４０１】
天然でプロセスされたペプチドよりも高い親和性でＨＬＡ−Ａ２．１を結合するためのモチーフを有する、天然でプロセスされたＨＬＡ−Ａ２拘束ＷＴ１エピトープｐ３７−４５のペプチドアナログ（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ；ヒトＷＴ１残基３７−４５；配列番号２４１；ＨＬＡ−Ａ２によって限定されることを実施例２４で以前に示した）を、以下にさらに詳細に記載されるように構築した。
【０４０２】
Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら（Ｈａｎｓ−Ｇｅｏｒｇ  Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ，Ｊｕｔｔａ  Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｎｉｅｌｓ  Ｎｉｋｏｌａｕｓ  Ｅｍｍｅｒｉｃｈ，Ｏｓｋａｒ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｂａｃｈｏｒ，Ｓｔｅｆａｎ  Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ：ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｏｔｉｆｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）５０：２１３−２１９）およびＰａｒｋｅｒら（Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．，Ｍ．Ａ．Ｂｅｄｎａｒｅｋ，およびＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ．１９９４．Ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｒａｎｋｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＨＬＡ−Ａ２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３）によって開発されたアルゴリズムに基づくペプチドモチーフ検索プログラムを使用して、天然のｐ３７−４５ペプチドよりも高親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合することが予測されるＷＴ１  ｐ３７−４５ペプチドエピトープのアナログを同定した。表ＬＩＩに示されるペプチドは、天然でプロセスされたｐ３７−４５ペプチド以上の推定ペプチド結合スコアを有する。この結合スコアは、ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子への解離の推定半減期に由来する。この分析は、Ｄｒ．Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｐａｒｋｅｒ  ｋｐａｒｋｅｒ＠；ａｔｌａｓ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨによる刊行物から推定される係数表に基づく。
【０４０３】
【表５７−１】
2005518192.tif 000087
【０４０４】
【表５７−２】
2005518192.tif 000088
別個の分析において、コンピューターモデリングを使用して、ｐ３７−４５ＷＴ１エピトープのペプチドエピトープアナログを同定した。ＨＬＡ−Ａ２のネイティブ構造の座標を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  タンパク質データベースからダウンロードした（ｐｄｂ  Ｉ．Ｄ．：３ＨＬＡ）（Ｌ．Ｌ．Ｗａｌｓｈ，「Ａｎｎｏｔａｔｅｄ  ＰＤＢ  Ｆｉｌｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：５，Ｄｉｓｋｅｔｔｅ  Ａｐｐｅｎｄｉｘ（１９９２）。このファイルを、Ｅｘｐａｓｙウェブサイト（Ａｐｐｅｌ  Ｒ．Ｄ．，Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ．，Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ  Ｄ．Ｆ．Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ：  ｔｈｅ  ｅｘａｍｐｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  ＷＷＷ  ｓｅｒｖｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：２５８−２６０（１９９４））を介して利用可能なＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ（Ｐｅｉｔｓｃｈ  ＭＣ（１９９６）ＰｒｏＭｏｄ  ａｎｄ  Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌ：Ｉｎｔｅｒｎｅｔ−ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２４：２７４−２７９．）プログラムを用いて操作するためのテンプレートとして使用した。タンパク質に結合したペプチドを手動で変異させて結合型ＷＴｐ３７−４５ペプチドを得た。新規の構造を、Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒのＧＲＯＭＯＳ９６の実施によるエネルギー最小化に３ラウンド供した；２回のエネルギー最小化を、構造全体に実施し、次に選択された好ましくない残基を用いて１ラウンド実施した。最終の評価は、このモデルについての全般的に好ましいエネルギー状態を示した。Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｐｌｏｔｔｉｎｇは、１つの非グリシニル残基のみが禁制領域から離れて存在することを示した。本明細書中に記載されたモデリング方法を使用して同定されたペプチドを、以下の表ＬＩＩＩに記載する。
【０４０５】
【表５８】
2005518192.tif 000089
次いで、上記の２つの方法を用いて同定したいくつかのペプチドを、ｐ３７−４５特異的ＣＴＬクローンによって認識される能力について試験した（実施例２４を参照のこと）。ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、ペプチドｐ３７−１（配列番号４２６）およびｍｏｄｅｌ−１（配列番号４４５）が、ｐ３７−４５ＣＴＬクローンによって認識されることを示した。これらの結果は、これらの２つのペプチドアナログが、天然でプロセスされたエピトープよりも高い親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合され、なおネイティブＴ細胞レセプターによって認識されることを予測する。
【０４０６】
従って、この実験は、天然でプロセスされたエピトープよりも高い親和性でＨＬＡ−Ａ２に結合されることが予測されるＷＴ１エピトープのインシリコでの同定を記載する。同定された２つのエピトープを試験した。このことは、これらのエピトープが、ネイティブＷＴ１ｐ３７−４５エピトープを用いて生成したＣＴＬクローンによって認識されることを示した。本明細書中で同定されたエピトープは、ＷＴ１発現に関連する癌の処置のためのワクチンストラテジーおよび／または免疫療法ストラテジーにおける有用性を有する。
【０４０７】
（実施例３１）
（ＷＴ１抗原のインビボ免疫原性）
この実施例は、マウスにおいて、ＷＴ１を用いるワクチン化ストラテジーを評価するための３つのインビボ免疫原性研究を記載する。３つのストラテジーには、以下が含まれる：１）裸のＤＮＡワクチンのプライムおよびブースト；２）弱毒化したアデノウイルスプライム、引き続く弱毒化したアデノウイルスブースト；または３）裸のＤＮＡプライム、引き続くアデノウイルスブースト。これらの研究において使用されるＷＴ１のスプライス改変体の全長ｃＤＮＡを、配列番号３８１に記載する。本明細書中に記載される結果は、ＷＴ１発現に関連する癌を処置するためのワクチンストラテジーとしての、ＷＴ１  ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／アデノウイルスまたはアデノウイルス／アルファウイルスのプライム／ブーストレジメンの使用を支持する。
【０４０８】
第１の研究において、Ｃ５７／ＢＩ６マウスを、ＷＴ１をコードする裸のＤＮＡ（１００μｇ）を用いて２週間間隔で３回免疫した。最後の免疫の２〜３週間後にマウスを屠殺し、ＣＴＬを標準的なクロム放出アッセイによって評価した。この第１の研究は、ＷＴ１  ＤＮＡの免疫が、これらのマウスにおいて、ＷＴ１特異的細胞障害性Ｔ細胞応答を、２５：１  Ｅ：Ｔ比（４０％の分解を示す）で誘発することを証明した。
【０４０９】
第２の研究において、ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを、ＷＴ１をコードする弱毒化したアデノウイルス（５×１０８ＰＦＵ）で１回免疫し（実施例２０に記載するように）、４週間後にＷＴ１をコードするアルファウイルス（ＡｌｐｈａＶａｘ）（５×１０６ＰＦＵ）で１回ブーストした。最後の免疫の２〜３週間後にマウスを屠殺し、ＣＴＬを標準的なクロム放出アッセイによって評価した。この結果は、ＨＬＡ−Ａ２／ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＷＴ１特異的ＣＴＬが、ＷＴ１発現ウイルス構築物を形質導入した樹状細胞（ＤＣ）およびＷＴ１ペプチドでパルスしたＤＣを特異的に分解することを示した。従って、この免疫ストラテジーはまた、インビボでのＷＴ１特異的ＣＴＬを効率的に誘発する。
【０４１０】
第３の研究において、Ｃ５７／ＢＩ６およびＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを、裸のＷＴ１  ＤＮＡ（１００μｇ）で２週間の間隔を空けて２回免疫し、３週間後にＷＴ１をコードするアデノウイルス（７×１０８ＰＦＵ）でブーストした。最後の免疫の２〜３週間後にマウスを屠殺し、ＣＴＬをＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。これらの結果は、ＷＴ１  ＤＮＡおよびアデノウイルスのプライム−ブーストが、ＨＬＡ−Ａ２／ＫｂトランスジェニックマウスにおいてＷＴ１特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を生成することを示した。ＣＤ８ポジティブ細胞の約４２％を、ＷＴ−１を形質導入されたＤＣで刺激した７日後に、ＩＦＮ−γについてポジティブ染色した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスからの結果は、この免疫ストラテジーが、新鮮な脾細胞において検出可能なＣＤ８応答を生じることを示した。脾細胞を、ＷＴ１タンパク質全体にわたる１１個のアミノ酸まで重複する１０〜１５マーペプチドのプールで６時間刺激した。ｐ１２１−１７１で刺激した細胞のみがＩＦＮ−γ染色を示した。これらのＣＤ８  Ｔ細胞の約１．１％を、ＩＦＮ−γについてポジティブに染色されたｐ１２１−１７１ペプチドのプールで刺激した。このペプチドは、ｐ１１７−１３９ペプチド（配列番号２）（実施例３において示される）を含み、マウスにおいてＣＴＬ、Ｔヘルパー細胞および抗体応答を誘発する。
【０４１１】
まとめると、これらの結果は、本明細書中で試験された３つの免疫ストラテジーが、インビボでＴ細胞応答を生じることを示す。従って、これらの研究はさらに、ＷＴ１タンパク質の免疫原性を確認し、ＷＴ１発現に関連する癌を処置するためのワクチンストラテジーとしての、ＷＴ１  ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／アデノウイルスまたはアデノウイルス／アルファウイルスのプライム／ブーストレジメンの使用を支持する。
【０４１２】
（実施例３２：ＷＴ１タンパク質で免疫したＨＬＡ−Ａ２／ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＷＴ１＋主要増殖の減少）
この実施例は、ＷＴ１ワクチンで免疫したトランスジェニックマウスにおけるＷＴ１＋腫瘍の減少を記載する。これらの結果は、ワクチン標的としてのＷＴ１をさらに立証し、ＷＴ１発現に関連する癌を処置するためのワクチンストラテジーにおけるＷＴ１の使用についての支持を提供する。
【０４１３】
マウス樹状細胞（ＤＣ）株ＤＣ２．４．を、ＷＴ１−ＬＡＭＰ構築物（実施例１８を参照のこと。配列番号３８２および４０９それぞれに示されるｃＤＮＡおよびタンパク質配列）で安定に形質導入した。次いで、マウスに、皮下（ｓ．ｃ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）のいずれかで２×１０６細胞を接種した。このことにより、マウスの８０〜１００％において腫瘍増殖を生じた。インビボでマウスにおいて確立した腫瘍は、それらのＷＴ１発現を維持した。従って、このモデルは、ＷＴ１ワクチンストラテジーの有効性の立証を提供する。
【０４１４】
次いで、３つの群のＡ２／Ｋｂマウスを、以下のように、２週間間隔を空けて３回免疫した：
群１：生理食塩水単独ｓ．ｃ．（コントロール、ｎ＝１０マウス）
群２：ＭＰＬ−ＳＥ  １０μｇ単独ｓ．ｃ．（コントロール、ｎ＝１０マウス）
群３：Ｒａ１２／ＷＴ１タンパク質１００μｇ＋１０μｇＭＰＬ−ＳＥ  ｓ．ｃ．（ｎ＝９マウス）
最後のＷＴ１免疫から２〜３週間後、マウスに、ＷＴ１を過剰発現する２×１０６  Ａ２／Ｋｂ  ＤＣ２．４腫瘍細胞を接種した。腫瘍チャレンジ後、マウスをモニターし、腫瘍チャレンジから４週間後まで、１週間に２回腫瘍サイズを測定した。
【０４１５】
結果により、ＷＴ１タンパク質ワクチンを与えた群において腫瘍増殖を有するマウスの割合は、約１００％（生理食塩水コントロール）または９０％（ＭＰＬ−ＳＥアジュバントコントロール）から４５％（ＷＴ１タンパク質免疫群）へと減少することが示された。さらに、平均腫瘍容積は、ＷＴ１タンパク質免疫群において、コントロール群において観察される平均腫瘍サイズ１２３３ｃｍｍ（生理食塩水コントロール）または７５３ｃｍｍ（ＭＰＬ−ＳＥアジュバントコントロール）からＷＴ１タンパク質免疫群における２２６ｃｍｍへと減少した。組織病理学的分析により、ワクチン接種した動物における腫瘍境界が、組織球、好塩基球、リンパ球、肥満細胞およびプラスマ細胞を含む、宿主免疫学的反応と調和していることが示された。まとめると、この結果は、ＷＴ１タンパク質免疫が、ＷＴ１で免疫した動物におけるＷＴ１陽性腫瘍の増殖から防御するかまたはそのような増殖を遅延させることを示す。従って、これらの結果は、ＷＴ１発現と関連する悪性度についてワクチンとしてのＷＴ１タンパク質の使用を支持する。
【０４１６】
（実施例３３：天然にプロセシングされたＷＴ１細胞傷害性Ｔ細胞エピトープの同定）
この実施例は、細胞傷害性Ｔ細胞によって認識されるＷＴ１タンパク質の天然にプロセシングされたエピトープの同定を記載する。この実験はさらに、ＷＴ１タンパク質の免疫原性を確認し、ワクチンおよび／または他の免疫治療アプローチについての標的としてのその使用の支持を提供する。さらに、この実験は、これらの適用において使用され得るＷＴ１タンパク質のエピトープを同定する。
【０４１７】
ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを、１００μｇの裸のＷＴ１  ＤＮＡで２週間間隔を空けて２回免疫し、続いて、３週間後に、１０７  ＰＦＵのＷＴ１をコードするアデノウイルスを追加免疫した。マウスを、最後の免疫から２〜３週間後に屠殺し、標準的なクロム放出アッセイにより、ＣＴＬを評価した。先の実験において観察されるように、ＷＴ１  ＤＮＡでの免疫、続いてアデノウイルス追加免疫は、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいてＷＴ１特異的ＣＴＬ応答を誘発した。どのエピトープがＴ細胞によって認識されるかを同定するために、ＣＴＬ株を作製し、標準的なプロトコルを使用して、限界希釈によってクローニングした。次いで、陽性クローンを、上から２０個の推定ＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬエピトープに対応するペプチドでパルスした標的細胞ＤＣ２．４  Ａ２／Ｋｂ細胞を使用して試験した。この結果により、ＷＴ１  ｐ１０−１８  ９マーペプチド（アミノ酸：ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ、配列番号４５１に記載される）が、このＣＴＬクローンによって認識されることが示された。このエピトープは、表ＸＬＶＩ、配列番号３４において記載されるように、以前に、エピトープであると推定された。さらなる実験において、ｐ１０ペプチドに対するＣＴＬ応答は、試験した５匹のＷＴ１免疫した動物のうちの４匹において観察された。従って、この実験は、推定ｐ１０−１８  ＷＴ１エピトープが、天然にプロセシングされ、ＣＴＬによって認識されることを実証する。さらに、この実験は、ＷＴ１タンパク質の免疫原性を確認し、ＷＴ１過剰発現と関連する悪性疾患の処置についてのワクチンおよび免疫治療ストラテジーにおいて使用され得る天然にプロセシングされたＨＬＡ−Ａ２拘束ＣＴＬエピトープをさらに規定する。
【０４１８】
（実施例３４）
（二重アルギニン輸送体（ＴＡＴ）シグナルペプチドを用いたＷＴ１発現構築物）
この実施例は、ＷＴ１−ＴＡＴベクターの構築およびこれらのベクターからＷＴ１−ＴＡＴ分子の発現を記載する。これらの構築物は、ワクチンストラテジーに使用するためのＷＴ１−ＴＡＴ分子の発現において有用性を有する。
【０４１９】
ＷＴ１−Ｆ（ＷＴ１タンパク質のアミノ酸２〜２８１；ＷＴ１のｃＤＮＡ配列および２〜２８１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４６０および配列番号４６１に示す）および全長ＷＴ１を、下記で示すように、ＨｉｓタグなしのｐＴＡＴ融合タンパク質として構築した。得られた融合タンパク質のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４５２および配列番号４５３
ならびに配列番号４５４および配列番号４５５に示す。
【０４２０】
ＷＴ−１Ｆオープンリーディングフレームは、下記のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−４３９（配列番号４５６）：
５’ＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣ３’Ｔｍ６６℃
ＰＤＭ−７７９（配列番号４５７）
５’ＣＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧ３’Ｔｍ６３℃。
【０４２１】
ＷＴ１全長オープンリーディングフレームを、下記のプライマーで増幅した：
ｐ３７（配列番号４５８）：５’ＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧ３’
ｐ２３（配列番号４５９）：
５’ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＴ３’
ＰＣＲ条件は下記の通りであった：１μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌ  １μＭ  各オリゴ、８３μｌの滅菌水、１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬＡ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）、５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ−１）。反応は、変性を９６℃で２分、つづいて９６℃で２０秒、６４℃で１５秒、および７２℃で２分、３０秒を４０サイクル、および１回の、最終伸長を７２℃で４分行った。
【０４２２】
ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ１で消化し、Ｅｃｏ７２１部位およびＥｃｏＲ１部位で、ｐＴＡＴ（Ｎ末端のＥ．ｃｏｌｉにおけるＴｏｒＡシグナルペプチド由来の二重アルギニン輸送体（ＴＡＴ）シグナルペプチドを用いた改変ｐＥＴ２８ベクター）に、クローン化した。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．（２０００）２（２）：１７９〜１８９；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｊａｎ  ２００１  ｐ６０４〜６１０  Ｖｏｌ  １８３，Ｎｏ２；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ  ２７６，Ｍａｒｃｈ  １６  ２００１  ｐｐ  ８１５９〜８１６４を参照のこと。）配列を、配列解析によって確認し、さらに、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。ＷＴ１−ＴＡＴタンパク質の発現を、ウェスタン解析で確認した。
【０４２３】
（実施例３５）
（ＷＴ１のＮ末端は、タンパク質のインビボでの支配的な免疫原性部分である）
この実施例において、マウスをＭＰＬ−ＳＥアジュバントにより処方したＷＴ−１（実施例３４に記載されるような、Ｆ画分（２−２８１）および全長（２−４３０））の異なるタンパク質構築物により免疫した。改善されたＣＤ４応答を、全長タンパク質に対する短縮型構築物によって誘発した。従って、この実施例は、アミノ酸２〜２８１にわたるＷＴ１タンパク質のＮ末端部分が、インビボにおいてＷＴ１タンパク質の支配的な免疫原性部分であることを実証する。
【０４２４】
４つのＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、２０μｇ  ＷＴ１タンパク質：ＷＴ−１−ＦまたはＷＴ−１全長（ＦＬ）、Ｒａ１２，ＨＩＳまたはＴＡＴ融合物を用いて皮下に免疫した。第０週、第３週および第９週において免疫を実施し、そして脾臓を第１１週において回収した。次いで、脾細胞を、１５マーのペプチド「ｐ３２」（ＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ、ＷＴ−１のアミノ酸１２５−１３９；これは、配列番号２に示されるｐ１１７−１３９ペプチド内に見出される）、ＤＣ２．４−ＷＴ−１／ＬＡＭＰ細胞株、またはｒＲａｌ２を用いて、培地単独により６時間インビトロで刺激した。次いで、ＣＤ４細胞を細胞内インターフェロンγについて染色し、ＦＡＣＳ分析により定量した。次いで、これらの脾細胞の一部を、ＣＤ４＋  ＩＦＮ＋細胞を数えた後に、８日間インビトロで刺激した。ｐ３２によって６時間刺激した後では、０．３３％のＣＤ４ポジティブ細胞は、短縮型Ｎ末端構築物ｒＷＴ１−Ｆ−ＴＡＴにより免疫したマウスにおける細胞内ＩＦＮ−γ染色について陽性であった。対照的に、染色された０．１０％のＣＤ４ポジティブ細胞のみが、ｒＷＴ１−ＦＬ−ＴＡＴにより免疫したマウスにおける細胞内ＩＦＮ−γについて陽性であった。８日間刺激した後、ｒＷＴ１−Ｆ−ＴＡＴ構築物により免疫したマウスは、１０．７２％のＣＤ４＋細胞のＩＦＮ−γ染色を示した。対照的に、染色された全長ＷＴ１−ＴＡＴ構築物により免疫したマウス由来のＣＤ４ポジティブ細胞の０．２４％は、細胞内ＩＦＮ−γについて陽性であった。これらのデータは、改善されたＣＤ４応答が、全長ｒＷＴ１−ＴＡＴ構築物に対する短縮型ｒＷＴ１−ＴＡＴ構築物によって誘発されたことを示す。
【０４２５】
第２のアッセイにおいて、脾細胞を、インビトロで２３マーペプチドｐ１１７−１３９（配列番号２；ＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ、既知のＣＤ４エピトープを含み、「ｐ３２」を含む）で３日間刺激した。その後、上清を、分泌型ＩＦＮ−γについてＥＬＩＳＡによってアッセイした。全長ＷＴ１構築物で免疫したマウス由来の脾細胞からの検出可能なＩＦＮ−γ分泌は存在しなかった。対照的に、平均２４７７ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γが、ｒＷＴ１−ＦありでＨＩＳタグなしで免疫したマウス由来の脾細胞から検出された。平均４６５８ｐｇ／ｍｌ  ＩＦＮ−γを、ｒＷＴ１−Ｆ−ＴＡＴで免疫したマウス由来の脾細胞から検出した。これらのデータは、改善されたＣＤ４応答が、全長タンパク質に対して、短縮されたＮ末端ＷＴ１構築物により誘発されたという観察をさらに支持する。
【０４２６】
ＷＴ１タンパク質は、２つの機能的ドメイン：Ｎ末端のプロリン−グルタミンリッチドメイン、および転写因子のＥＧＲ１／Ｓｐ１ファミリーに対する相同性を有するＣ末端の４つのジンクフィンガーから構成されるジンクフィンガードメインから構成される転写因子である。ＷＴ１は、セルフタンパク質である。そのＣ末端は、他のセルフタンパク質に対して相同であり、従って免疫原性が低い（すなわち、免疫学的寛容性のより大きな程度の問題）。留意すべきは、この４つのＣ末端内ジンクフィンガードメインは、ＥＧＲファミリーメンバーに対して相同性を有することである。この実施例において記載されるこれらの結果は、寛容性が、おそらく、配列相同性および機能的ドメインに依存して、タンパク質の異なる部分の間で変化することを示す。
【０４２７】
まとめると、この実施例において記載されるデータは、最も有効なＷＴ１ワクチンは、組換えタンパク質または遺伝子ベースの構築物のいずれかとして、ＷＴ１  Ｎ末端を含むという考えを支持する。
【０４２８】
（実施例３６：ＷＴ１のＮ末端フラグメント（ＷＴ−１−Ｆ：アミノ酸１〜２８１）のバキュロウイルス発現構築物および昆虫細胞を使用するタンパク質の大規模生成）
Ｋｏｚａｋコンセンサス配列とともに、ＷＴ−１のＮ末端フラグメントのｃＤＮＡを、テンプレートとしてＷＴ１−Ｆプラスミドを使用するＰＣＲによって得た。（ＷＴ−１−Ｆ：開始メチオニンの下流でクローニングされたＷＴ１タンパク質のアミノ酸２〜２８１；ＷＴ１の２−２８１のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４６０および４６１に示す。）本明細書中で記載される実験においてテンプレートとして使用されるｐＴＡＴ融合構築物を、実施例３４に記載する。この構築物のｃＤＮＡは、配列番号４５２に記載される。以下のプライマーを、増幅のために使用した：
ＷＴ１Ｆ１（配列番号４６６）：
５’ＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧ
ＷＴ１ＲＶ４（配列番号４６７）
５’ＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＧＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＴＧ
同じＯＲＦ＋Ｃ末端の１０残基のＨｉｓタグについてのｃＤＮＡを、逆方向プライマーとしてＷＴ１  ＲＶ３  （配列番号４６８）を使用したこと以外は、上記と同様に、ＰＣＲによって得た：５’ＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＴＧ。
【０４２９】
精製されたＰＣＲ産物を、ドナープラスミドであるｐＦａｓｔＢａｃ１のＸｂａｌ  Ｉ部位にクローニングした。組換えドナープラスミドｐＦＢＷＴ１−Ｆ（それぞれ配列番号４６３および４６５に示されるｃＤＮＡおよびアミノ酸配列）ならびにｐＦＢＷＴ１−ＦＨ（１０×Ｈｉｓタグを有する：それぞれ配列番号４６２および４６４に示されるｃＤＮＡおよびアミノ酸配列）を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換して、部位特異的転移によりＥ．ｃｏｌｉにおいて組換えバクミド（ｂａｃｍｉｄ）を作製した。この組換えバクミドを、ＰＣＲ分析により確認し、次いで、Ｓｆ−９昆虫細胞にトランスフェクトして、組換えバキュロウイルスＢＵＷＴ１−ＦおよびＢＶＷＴ１−ＦＨを作製した。この組換えウイルスを、Ｓｆ−９細胞において高力価ウイルスストックまで増幅した。
【０４３０】
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞を使用して、タンパク質発現および組換えタンパク質の大規模生成についての条件を最適化した。タンパク質発現についての条件を最適化するために、Ｈｉｇｈ５昆虫細胞単層を、組換えバキュロウイルスＢＵＷＴ１−ＦおよびＢＶＷＴ１−ＦＨにより、異なる感染多重度（ＭＯＩ）で感染し、そして異なる期間で形質導入された細胞を収集した。タンパク質の同定を、ウサギ抗ＷＴ１ポリクローナル抗体［＃９４２−３２（７９９Ｌ）］を用いて、ウェスタンブロット分析により確認した。ＷＴ１−Ｆ組換えタンパク質およびＷＴ１−ＦＨ組換えタンパク質の両方は、Ｈｉｇｈ５細胞が、ＭＯＩ  １．０または２．０で組換えウイルスによって感染された場合に、感染後４８時間または５４時間のいずれかで良好に発現された。
【０４３１】
組換えバキュロウイルスの増幅ならびに組換え体ＷＴ１−Ｆタンパク質および組換え体ＷＴ１−ＦＨタンパク質の発現を、次いで、最適化した。ＢＶＷＴ１−ＦおよびＢＶＷＴ１−ＦＨの両方を、Ｓｆ９昆虫細胞株中、２％雌仔牛血清および０．５×ＰＳＦを含むＥＳＦ９２１中で増幅した。この増幅を、ＭＯＩ  ０．０５とし２８℃で４日間実施した。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞を使用して、タンパク質発現についての条件を最適化した。Ｈｉｇｈ５昆虫細胞を、０．５、１または２のＭＯＩで、３０時間、４８時間、５４時間または７２時間収集前に組換えバキュロウイルスによって感染した。組換えタンパク質の同定を、ＷＴ１に対して特異的なウサギポリクローナル抗体（抗体＃９４２−３２）を用いるウェスタンブロット分析、そしてキャピラリーＬＣ−ＥＳＩタンデム質量分析によって確認した。これらの実験は、ＷＴ１−ＦおよびＷＴ１−ＦＨの大規模生成についての最適なタンパク質発現は、Ｈｉｇｈ５が、ＭＯＩ  ０．５〜１．０で組換えウイルスによって感染された場合に、感染後４３時間に生じることを示す。
【０４３２】
まとめると、上記ＷＴ１バキュロウイルスは、ＷＴ１発現に関連する悪性腫瘍の処置についての種々のワクチンストラテジーにおける用途のために、ＷＴ１のＮ末端部分の大規模タンパク質生成に使用され得る。
【０４３３】
（実施例３７）
（組換えＴＲＩＣＯＭワクシニアベクターおよび鶏痘ベクターを使用する、マウスにおけるインビボでのＣＤ４細胞応答およびＣＤ８Ｔ細胞応答の誘導）
この実施例は、マウスにおけるＷＴ１によるワクチン化ストラテジーを評価するためのインビボでの免疫原性試験を記載する。これらの実験の目的は、ｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭおよびｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭが、ＷＴ１に対して、免疫性、特にＴ細胞免疫性を誘導する能力を試験することであった。本明細書に記載される結果は、ＷＴ１発現に関連する癌を処置するワクチンストラテジーにおいて、ＷＴ１を発現し、そして三つ組の同時刺激分子（Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３）を含むＴＲＩＣＯＭワクシニアベクターおよび鶏痘ベクターの使用についての支持を提供する。
【０４３４】
第１の研究において、Ｃ５７ＢＩ／６マウス（１群あたり１２匹のマウス）を、表１に示されるように、１次、２次および３次免疫の間の１４日間で、２回または３回免疫した。マウスを、２次および３次免疫後の２１日目に収集した。ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞応答を、以下により詳細に記載されるように、ＷＴ１ペプチド活性化脾臓細胞のＩＦＮ−γ細胞内サイトカイン染色によってアッセイした。ＣＤ４  Ｔ細胞を、ｒＷＴ１タンパク質刺激脾臓細胞からのＩＦＮ−γ放出によってさらにアッセイした。血清ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ応答を、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。Ｔ細胞応答を、プールした脾細胞培養物（４マウス／群／時点）を用いて評価した。抗体力価を、個々のマウスについて決定した（４マウス／群／時点）。
【０４３５】
【表５９】
2005518192.tif 000090
これらの研究において使用されたＷＴ１のスプライス改変体の全長ｃＤＮＡが、配列番号３８１に示される。本明細書中で使用されるＷＴ１−アデノウイルスは、実施例２０において記載されるとおりである。ｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ組換え鶏痘ベクターおよびｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ組換えワクシニアベクターの両方ともが、ＷＴ１を発現しかつ３つ組みの同時刺激分子（Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３）を含み、Ｔｈｅｒｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって製造されている。
【０４３６】
Ｔ細胞応答を評価するために、脾臓細胞を、ＷＴ１ペプチド「ｐ３２」（ＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ，ＷＴ−１の１２５〜１３９アミノ酸；配列番号２に示されるｐ１１７−１３９ペプチド中に見出される）を用いてインビトロで刺激した。この「ｐ３２」は、ＣＴＬおよびヘルパーＴ細胞エピトープを含むことが知られている。二次免後２１日でｐ１２５−１３９で活性化した脾臓細胞のＩＦＮ−γについての細胞内サイトカイン染色は、ｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（初回免疫）およびｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（追加免疫）で免疫したマウスにおいて、有意なパーセンテージのＷＴ１応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を示したが、他方、他の群は、有意なＷＴ１特異的Ｔ細胞免疫応答を示さなかった。そのＤＮＡ群が、ＤＮＡのみを用いて初回免疫および追加免疫されたことに留意のこと。同一の群が、その後、ｒＷＴ１−Ａｄｖ三次免疫を受けた。
【０４３７】
三次免疫の後に、単ペプチド番号３２に対する応答よりもオーバーラップ１５マーペプチドのプールに対する応答を評価した。ペプチドプール番号３２〜３６に特異なＷＴ１ペプチドＣＤ８＋Ｔ細胞およびＷＴ１ペプチドＣＤ４＋Ｔ細胞が、γＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（初回免疫）およびｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（追加免疫×２）でワクチン接種したマウスにおける二次免疫後の応答と類似のレベルで応答することが見出された。さらに、これらのマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、ペプチド番号３２によりもずっと低いレベルであるにもかかわらず、２つのオーバーラップ１５マーペプチド番号５７〜５８（ペプチド  ５７：ＤＮＬＹＱＭＴＳＱＬＥＣＭＴＷＮ（アミノ酸２２４−２３９）；ペプチド  ５８：ＭＴＳＱＬＥＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（アミノ酸２２９−２４３）；オーバーラップは、ＷＴ１のアミノ酸残基２２４〜２４３に対応する）に含まれる第２のＷＴ１エピトープに応答することが見出された。
【０４３８】
抗体応答を、標準ＥＬＩＳＡを使用して評価した。ＷＴ１に対する血清ＩｇＧ２ｂ抗体の低いレベルは、ｒＷＴ１  ＋ＭＰＬ−ＳＥで免疫したマウスにおける、二次免疫（力価１：１３５０）の２１日後および三次免疫（力価１：３３２５）の２１日後の８匹全てのマウスにおいて測定可能であった。対照的に、他の全ての群において、血清ＩｇＧ２ｂ抗体力価は、１：１００より小さかった（表２）。
【０４３９】
（表２：ＷＴ１免疫マウスにおける抗体応答）
【０４４０】
【表６０】
2005518192.tif 000091
＊血清力価は、１群あたり４マウスの平均である。＜５０、＜７５、または＜１００のように記載された力価はまた、平均値であるが、全ての例において、４マウス未満が、検出可能な力価を有していた。ＮＤは、これらのマウスのうちのいずれにおいても抗体が、検出されなかったことを示す。
【０４４１】
要約すると、ｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（初回免疫）後のｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ（追加免疫）、またはＷＴ１−ＤＮＡ（初回免疫）後のＷＴ１−Ａｄｅｎｏ（追加免疫）での、Ｃ５７ＢＩ／６マウスの免疫は、ＷＴ１に対するＣＤ８Ｔ細胞応答およびＣＤ４Ｔ細胞応答の両方を惹起した。ｒＶ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭの後のｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭに対するＴ細胞応答と、ＷＴ１−ＤＮＡの後のＷＴ１−Ａｄｅｎｏに対するＴ細胞応答は、実験的設計の検出力内で等しかった。理論によって束縛されることなく、ｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭの主要な利点は、複数の追加免疫が、免疫のレベルを増大させ続けることができるということである。従って、これらの研究によって、ＷＴ１タンパク質の免疫原性が確認され、そして、ＷＴ１発現と関連する癌を処置するためのワクチンストラテジーにおける、ＷＴ１  ＤＮＡ／アデノウイルスまたはｒｖ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ／ｒＦ−ＷＴ１／ＴＲＩＣＯＭ免疫レジメンの使用に対する支持が提供される。
【０４４２】
（実施例３８）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１−Ｆの発現のためのＳＴＵＭＰＹ−ＷＴ１−Ｆベクターの構築）
この実施例は、ＷＴ１−Ｆリーディングフレーム（ＷＴ１タンパク質の２〜２８１  Ｎ末端部分）に融合された短縮型ツインアルギニントランスロケーター（ＴＡＴ）シグナルペプチドを含む発現ベクターの構築を記載する。このベクターは、ＷＴ１の発現に関する悪性腫瘍の処置のための免疫学的ストラテジーにおける用途のための単一種（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｅｐｅｃｉｅｓ）短縮型ＴＡＴ−ＷＴ１−Ｆタンパク質を産生するために使用され得る。
【０４４３】
実施例３４において上述されるように、ＴＡＴシグナル配列を、多様なＷＴ１ベクターを製作するために使用した。これらのＴＡＴベクターを発現において使用したとき、そのタンパク質の複数の形態を観察した。これらの形態のＮ末端配列決定によって、発現されている３つの別個のタンパク質の各々が、ＴＡＴペプチドの短縮体であることを示した。これらの切断は、ツインアルギニン部位の各々において生じた。従って、短縮型ＴＡＴベクターを、発現の間にそれらの切断が生じることを避けるために、３９アミノ酸〜１２アミノ酸のＴＡＴシグナルペプチドを短くするように構築した。ＴＡＴ「Ｓｔｕｍｐｙ」ベクターを、第１のツインアルギニンまでのＴＡＴペプチドの最初の１２残基を保存することで生成した。このベクターは、以下のように構築した：
オリゴヌクレオチドの以下のペアを組み合わせ、次いで、アニーリングさせた。
【０４４４】
ペア１：
Ｓｔｕｍｐｙ  １（配列番号４８６）：５’ｔａｔｇａａｃａａｔａａｃｇａｔｃｔｇｔｔｔｃａｇｇｃ  ３’
Ｓｔｕｍｐｙ  ３（配列番号４８７）：５’ＣＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＣＧＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡ３’
ペア２：
Ｓｔｕｍｐｙ  ４（配列番号４８８）：５’ａａｔｔｃｔｔｇｇｔｃａｔｔｃａｃｇｔｇｇｃｇｇｃｔｃｇｃ  ３’
Ｓｔｕｍｐｙ  ２（配列番号４８９）：５’ｇａｇｃｃｇｃｃａｃｇｔｇａａｔｇａｃｃａａｇ  ３’。
【０４４５】
次いで、これらのペアを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＰＤＭ、改変型ｐＥＴ２８ベクターと共に連結した。この得られたプラスミド、ｐＳｔｕｍｐｙを、配列番号４７１として示す。短縮型ＴＡＴタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号５０６で示す。全長ＴＡＴポリヌクレオチドを、配列番号５０３で示し、これは、配列番号５０４で示されるＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列をコードする。
【０４４６】
次いで、このｐＳｔｕｍｐｙベクターを、Ｓｔｕｍｐｙ−ＷＴ１−Ｆベクターを構築して切断産物なしでＷＴ１のＮ末端部分を発現するために使用した。このＳｔｕｍｐｙ−ＷＴ１−Ｆベクターを以下のように構築した：
ＷＴ１−Ｒのコード領域を、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−１００５（配列番号４８４）：５’ＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＧＣＡＣＴＧ  ３’
ＰＤＭ−１００４（配列番号４８５）：５’ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＣＴＧＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＡＡＧ  ３’。
【０４４７】
この増幅反応物は、１０μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、それぞれ２μｌの１０μＭプライマー、８３μｌ滅菌水、ならびに１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含んだ。この反応物を、はじめに、９６℃で２分間変性させて、その後、２０秒間に亘って９６℃、１５秒間に亘って６３℃、および３０秒間に亘って７２℃を４０サイクル続けた。次いで、
最終的な伸長のために７２℃で伸長させた。
【０４４８】
次いで、このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩで消化して、そして、Ｅｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲ１で消化したｐＳｔｕｍｐｙベクターにクローニングした。この構築物を、配列分析によって確認して、次いで、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞に移入した。この得られた短縮型ＴＡＴ  ＷＴ１−Ｆ融合タンパク質が、単一種として発現した。ｐＳｔｕｍｐｙ  ＷＴ１−Ｆのコード領域のポリヌクレオチド配列は、配列番号４６９に示され、これは、配列番号４７０に示されるアミノ酸配列をコードする。
【０４４９】
（実施例３９）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現するためのＷＴ１−Ｆ  ＧＭＰベクター、ＷＴ１−Ｇベクター、およびＷＴ１−ΔＧベクターの構築）
この実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質産生に対して最適化された、ＷＴ１−Ｆベクター、ＷＴ１−ＧベクターおよびＷＴ１−ΔＧベクターの構築を記載する。
【０４５０】
ＴＡＴ  ＷＴ−１  Ｆ  ＤＮＡ配列を、コドン最適化して、そして、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｏｔｈｅｌ，ＷＡ）で合成的に操作して、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現について最適化した。ＷＴ１−Ｆのコドン最適化したｃＤＮＡ配列を、配列番号４７７に示し、これは、配列番号４７９に示されたアミノ酸配列をコードする。次いで、この配列を含むプラスミドを、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化した改変型ｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングした。この構築物を、ＤＮＡ分析によって正しいことを確認し、次いで、発現のためにＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞に移入した。この構築物は、ＴＡＴ  ＷＴ１−ＦテンプレートＤＮＡの完全合成の追跡可能な供給源である。
【０４５１】
次いで、コドン最適化した配列を、ＰＣＲのテンプレートとして使用して、Ｎ末端領域から１４アミノ酸のプロリンリッチ領域の除去（全長ＷＴ１のアミノ酸５５〜６８に対応する、配列番号４６１に示されたＷＴ−１  Ｆ配列のアミノ酸５４〜６７の除去）を行い、配列番号４７８に示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号４７３に示されるＷＴ−１  ＧｃＤＮＡ配列を生成した。これを、以下のようにｐＴＡＴ−ＷＴ−１  Ｇ構築物をはじめに構築することによって行った：
ＷＴ−１  Ｇの５’コード領域を、以下のプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−１００７（配列番号４９０）５’ｃａａｇｃｇｃｔｃａｔｇａｇｃｃｃｇａａｇｔｇｇｃｇａｇｃｃｃ  ３’  Ｔｍ７６℃
ＰＤＭ−１００６（配列番号４９１）５’ｃａｔａａａｔｔｔｇｃｃｃｇｇｇｃｃｃｇｃｃｃａｇａｇａｇｃｃｇ  ３’  Ｔｍ７６℃
ＷＴ−１  Ｇ領域の３’コード領域を、以下のプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅した：
ＰＤＭ−１００８（配列番号４９２）５’ｃａｔｔｃａｔｔｃａｔｃａａａｃａｇｇａｇｃｃ３’  Ｔｍ６１℃
ＰＤＭ−１００９（配列番号４９３）５’ｃｃａｔｔａａｇａａｔｔｃａｔｃａｃｔｇａａｔａｃｃ３’Ｔｍ６０℃
ＷＴ１−Ｇの増幅のためのＰＣＲ反応物は、１０μｌ  １０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、それぞれ２μｌの１０μＭのプライマー、８３μｌ滅菌水、ならびに１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および５０μｇＤＮＡテンプレート（配列番号４７７に記載されるようにコドン最適化されたｐＴＡＴ  ＷＴ１−Ｆ）を含む。この反応物を、はじめに、９６℃で２分間変性させて、その後、２０秒間に亘って９６℃、１５秒間に亘って６３℃、および３０秒間に亘って７２℃を４０サイクル続けた。次いで、この反応物を、７２℃で４分間に亘る採取的な伸長のために伸長させた。
【０４５２】
次いで、この第１のＰＣＲ産物を、ＸｂａＩで消化して、そして、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化したＰＤＭ（改変型ｐＥＴ２８ベクター）にクローニングした。次いで、この得られた構築物（ｐＴＡＴ  ＷＴ１−ＧＡ）を、ＳｒｆＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。この第２のＰＣＲ構築物を、ＥｃｏＲＩで消化して、ｐＴＡＴ  ＷＴ１−ＧＡプラスミド構築物にクローニングした。同時に、スリーウェイライゲーションを、ＸｂａＩおよびＳｒｆＩで第１のＰＣＲ構築物を消化し、そして第２のＰＣＲ構築物をＥｃｏＲＩで消化して、そして、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＰＤＭにクローニングすることによって実施した。この得られたｐＴＡＴ−ＷＴ１−Ｇ構築物を、配列分析を介して正しいことを確認し、ついで、発現宿主に移入した。このｐＴＡＴ−ＷＴ１−ＧのｃＤＮＡを、配列番号４７５に示し、そして、このｃＤＮＡは、配列番号４８２のアミノ酸配列をコードする。
【０４５３】
上記の第２の方法の間の不完全なＳｒｆＩ消化に起因して、１４アミノ酸（ＷＴ−１  Ｆの５５〜６８）が除去されかつさらなる３アミノ酸が追加されたＷＴ−１  Ｇの予想外の形態（ＷＴ−１  ΔＧ）が生成された（配列番号５０２に示されるポリペプチド配列をコードする配列番号５０５において示されるＷＴ−１ΔＧ  ポリヌクレオチド配列）。このＴＡＴ  ＷＴ−１ΔＧ構築物は、ＴＡＴ  ＷＴ−１  Ｆ構築物と比較して予想外に５倍もの過剰発現を生じた。ｐＴＡＴ−ＷＴ１ΔＧ構築物のｃＤＮＡを、配列番号４７６に示し、そして、このｃＤＮＡは、配列番号４８１に示すアミノ酸配列をコードする。
【０４５４】
Ｈｉｓタグを伴うかまたは伴わない、ｐＴＡＴ−ＷＴ−１  Ｇ、ｐＳｔｕｍｐｙ−ＷＴ１  ＧおよびＷＴ１−Ｇの以下のような生成物を、以下に記載のＰＣＲ反応中でのｐＴＡＴ−ＷＴ１  Ｇをテンプレートとして使用して、構築した。
【０４５５】
ＷＴ１−Ｇ領域のコード領域は、以下のプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅された：
ＰＣＲ  １  ：
ＰＤＭ−１０１０（配列番号４９４）５’ｇｇｔｔｃｇｇａｔｇｔａｃｇｃｇａｔｃｔｇａａｃｇ  ３’  Ｔｍ  ６８℃
ＰＤＭ−１０１１（配列番号４９５）５’ｃａａａｇａａｔｔｃａｔｃａｃｔｇａａｔａｃｃｇｃｇ  ３’  Ｔｍ６３℃
ＰＣＲ  ２：
ＰＤＭ−１０２３（配列番号４９６）５’ｇｃｔｔｔｔｇｇｃａｔａｔｇｇｇｔｔｃｇｇａｔｇｔａｃｇｃｇａｔｃ  ３’  Ｔｍ７１℃
ＰＤＭ−１０１１（配列番号４９７）５’ｃａａａｇａａｔｔｃａｔｃａｃｔｇａａｔａｃｃｇｃｇ  ３’  Ｔｍ  ６３℃。
【０４５６】
配列番号４７５に記載されるｐＴＡＴ−ＷＴ１をテンプレートとして使用するＰＣＲ反応および増幅の条件は、上記の通りであった。第１のＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＰＤＭ（インフレームでｈｉｓタグを有する改変ｐＥＴ２８ベクター）およびｐＳＴＵＭＰＹ（インフレームで配列番号４７１に記載される１２アミノ酸短縮型ＴＡＴリーダーペプチドを有する改変ｐＥＴ２８ベクター）（これらは、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏ７２１で消化された）で消化した。第２のＰＣＲ産物を、ＮｄｅｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてＮｄｅｌおよびＥｃｏＲＩで消化した改変ｐＥＴ２８ベクター（ｐＰＤＭ）にクローニングした。これらの構築物を、配列分析によって正確であることを確認し、次いで、発現宿主に形質転換した。得られた構築物は、以下のとおりである：Ｈｉｓタグを有するＷＴ１−Ｇのポリヌクレオチドは、配列番号４７２に記載され、そして配列番号４８０に記載されるアミノ酸配列をコードする。Ｈｉｓタグを有さないＷＴ１−Ｇのポリヌクレオチドは、配列番号４７３に記載され、これは配列番号４７８に記載されるアミノ酸配列をコードする。ｐＳｔｕｍｐｙ−ＷＴ１−Ｇポリヌクレオチド配列は、配列番号４７４に記載され、そして配列番号４８３に記載されるアミノ酸配列をコードする。
【０４５７】
関連の実験において、ｐＳｔｕｍｐｙ  ＷＴ−１Ｆ  ＧＭＰ（最適化されたコドン）ベクターを、以下のようにして構築した。
【０４５８】
ＷＴ−１Ｆ領域のコード領域を、以下のプライマーを使用して増幅した：
ＰＤＭ−１０１０（配列番号５００）５’ｇｇｔｔｃｇｇａｔｇｔａｃｇｃｇａｔｃｔｇａａｃｇ３’（Ｔｍ  ６８℃）；
ＰＤＭ−１０１１（配列番号５０１）５’ｃａａａｇａａｔｔｃａｔｃａｃｔｇａａｔａｃｃｇｃｇ３’（Ｔｍ  ６３℃）。
【０４５９】
ｐＴＡＴ  ＷＴ−ＡＦ  ＧＭＰをテンプレートとして使用するＰＣＲ反応および増幅の条件は、以下のとおりであった。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩで消化し、そして実施例３８に記載のｐＳｔｕｍｐｙベクター（これは、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏ７２１で消化されている）にクローニングした。この構築物を、配列分析によって、正確であることを確認し、そして発現宿主に形質転換した。ｐＳｔｕｍｐｙ  ＷＴ−１Ｆ  ＧＭＰのポリヌクレオチド配列を、配列番号４９８に示し、これは、配列番号４９９のアミノ酸配列をコードする。
【０４６０】
要約すると、本明細書中に記載される発現ベクターは、ＷＴ１の発現に関連する悪性腫瘍の処置のためのワクチンストラテジーにおいて使用するための、ＷＴ１、短縮型ＷＴ１およびＷＴ１融合タンパク質の最適な発現および産生のために使用され得る。
【０４６１】
上記から、本発明の特定の実施形態は、例示のために本明細書に記載されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって制限される以外は制限されない。
【図面の簡単な説明】
【０４６２】
【図１】図１は、マウス（ＭＯ）およびヒト（ＨＵ）のＷＴ１タンパク質配列（それぞれ配列番号３２０および３１９）の比較を示す。
【図２】図２は、血液学的な悪性疾患（ＡＭＬ）を有する患者におけるＷＴ１特異的抗体の検出を示すウェスタンブロットである。レーン１は、分子量マーカーを示す；レーン２は、陽性コントロール（ＷＴ１特異的抗体を用いて免疫沈降されたＷＴ１陽性ヒト白血病細胞株）を示す；レーン３は、陰性コントロール（マウス血清を用いて免疫沈降されたＷＴ１陽性細胞株）を示す；そしてレーン４は、ＡＭＬを有する患者の血清を用いて免疫沈降されたＷＴ１陽性細胞株を示す。レーン２〜４に関して、免疫沈降物は、ゲル電気泳動によって分離し、そしてＷＴ１特異的抗体によってプローブされた。
【図３】図３は、ＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＷＴ１陽性腫瘍細胞株）を用いて免疫されたＢ６マウスにおけるＷＴ１特異的抗体応答の検出を示すウェスタンブロットである。レーン１、３および５は、分子量マーカーを示し、そしてレーン２、４および６は、ＷＴ１特異的陽性コントロール（Ｎ１８０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。ＷＴ１タンパク質のＮ末端領域の１８０アミノ酸におよぶポリペプチド。ウェスタンブロット上で５２ｋＤにて移動する）を示す。用いた一次抗体は、レーン２においてはＷＴ１８０であり、レーン４においては非免疫化Ｂ６マウスの血清であり、そしてレーン６においては免疫化Ｂ６マウスの血清であった。
【図４】図４は、代表的なＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおけるＷＴ１特異的抗体の検出を示すウェスタンブロットである。レーン１、３および５は、分子量マーカーを示し、そしてレーン２、４および６は、ＷＴ１特異的陽性コントロール（Ｎ１８０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。ＷＴ１タンパク質のＮ末端領域の１８０アミノ酸におよぶポリペプチド。ウェスタンブロット上で５２ｋＤにて移動する）を示す。用いた一次抗体は、レーン２においてはＷＴ１８０であり、レーン４においては非免疫化Ｂ６マウスの血清であり、そしてレーン６においては免疫化Ｂ６マウスの血清であった。
【図５Ａ】図５Ａは、代表的なＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の刺激を示すグラフである。チミジン取り込みアッセイを、表示されたように一つのＴ細胞株および二つの異なるクローンを用いて実施し、そして結果を、ｃｐｍとして表現した。Ｘ軸上に示されるコントロールは、抗原なし（Ａｇなし）およびＢ６／培地であり；用いられた抗原はヒトのｐ６−２２（ｐ１）、ヒトのｐ１１７−１３９（ｐ２）またはヒトのｐ２４４−２６２（ｐ３）であった。
【図５Ｂ】図５Ｂは、代表的なＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の刺激を示すグラフである。チミジン取り込みアッセイを、表示されたように一つのＴ細胞株および二つの異なるクローンを用いて実施し、そして結果を、ｃｐｍとして表現した。Ｘ軸上に示されるコントロールは、抗原なし（Ａｇなし）およびＢ６／培地であり；用いられた抗原はヒトのｐ６−２２（ｐ１）、ヒトのｐ１１７−１３９（ｐ２）またはヒトのｐ２４４−２６２（ｐ３）であった。
【図５Ｃ】図５Ｃは、代表的なＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の刺激を示すグラフである。チミジン取り込みアッセイを、表示されたように一つのＴ細胞株および二つの異なるクローンを用いて実施し、そして結果を、ｃｐｍとして表現した。Ｘ軸上に示されるコントロールは、抗原なし（Ａｇなし）およびＢ６／培地であり；用いられた抗原はヒトのｐ６−２２（ｐ１）、ヒトのｐ１１７−１３９（ｐ２）またはヒトのｐ２４４−２６２（ｐ３）であった。
【図６Ａ】図６Ａは、代表的なＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の刺激を図示するヒストグラムである。三回目の免疫の三週間後に、ワクチンＡまたはワクチンＢを接種したマウスの脾臓細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、ペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）、ｐ２４４−２６２（ｐ２４４）（ワクチンＡ；図６Ａ）またはｐ２８７−３０１（ｐ２８７）、ｐ２９９−３１３（ｐ２９９）、ｐ４２１−４３５（ｐ４２１）（ワクチンＢ；図６Ｂ）でパルスしたＢ６脾臓細胞、および２５μｇ／ｍｌの無関係のコントロールペプチド（無関係のペプチド）でパルスした脾臓細胞とともに培養し、そして（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均値によって除算した実験ウェルの平均値として計算された刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、代表的なＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の刺激を図示するヒストグラムである。三回目の免疫の三週間後に、ワクチンＡまたはワクチンＢを接種したマウスの脾臓細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、ペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）、ｐ２４４−２６２（ｐ２４４）（ワクチンＡ；図６Ａ）またはｐ２８７−３０１（ｐ２８７）、ｐ２９９−３１３（ｐ２９９）、ｐ４２１−４３５（ｐ４２１）（ワクチンＢ；図６Ｂ）でパルスしたＢ６脾臓細胞、および２５μｇ／ｍｌの無関係のコントロールペプチド（無関係のペプチド）でパルスした脾臓細胞とともに培養し、そして（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均値によって除算した実験ウェルの平均値として計算された刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性Ｔ細胞株およびクローンの産生を図示すヒストグラムである。インビボの免疫に続いて、最初の３回のインビトロでの刺激（ＩＶＳ）を、それぞれワクチンＡまたはＢの３つのペプチドすべてを用いて実施した。引き続くＩＶＳを、二つの関連したペプチドｐ１１７−１３９およびｐ６−２２のみを用いた単一ペプチド刺激として実施した。クローンを、示されるようにｐ６−２２特異的Ｔ細胞株およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方から誘導した。Ｔ細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）または無関係のコントロールペプチド（無関係のペプチド）でパルスしたＢ６脾臓細胞と共に培養し、そして（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール（抗原なしの、Ｂ６脾臓細胞）の平均値によって除算された実験ウェルの平均値として計算された刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性Ｔ細胞株およびクローンの産生を図示すヒストグラムである。インビボの免疫に続いて、最初の３回のインビトロでの刺激（ＩＶＳ）を、それぞれワクチンＡまたはＢの３つのペプチドすべてを用いて実施した。引き続くＩＶＳを、二つの関連したペプチドｐ１１７−１３９およびｐ６−２２のみを用いた単一ペプチド刺激として実施した。クローンを、示されるようにｐ６−２２特異的Ｔ細胞株およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方から誘導した。Ｔ細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）または無関係のコントロールペプチド（無関係のペプチド）でパルスしたＢ６脾臓細胞と共に培養し、そして（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール（抗原なしの、Ｂ６脾臓細胞）の平均値によって除算された実験ウェルの平均値として計算された刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性Ｔ細胞株およびクローンの産生を図示すヒストグラムである。インビボの免疫に続いて、最初の３回のインビトロでの刺激（ＩＶＳ）を、それぞれワクチンＡまたはＢの３つのペプチドすべてを用いて実施した。引き続くＩＶＳを、二つの関連したペプチドｐ１１７−１３９およびｐ６−２２のみを用いた単一ペプチド刺激として実施した。クローンを、示されるようにｐ６−２２特異的Ｔ細胞株およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方から誘導した。Ｔ細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）または無関係のコントロールペプチド（無関係のペプチド）でパルスしたＢ６脾臓細胞と共に培養し、そして（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール（抗原なしの、Ｂ６脾臓細胞）の平均値によって除算された実験ウェルの平均値として計算された刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性Ｔ細胞株およびクローンの産生を図示すヒストグラムである。インビボの免疫に続いて、最初の３回のインビトロでの刺激（ＩＶＳ）を、それぞれワクチンＡまたはＢの３つのペプチドすべてを用いて実施した。引き続くＩＶＳを、二つの関連したペプチドｐ１１７−１３９およびｐ６−２２のみを用いた単一ペプチド刺激として実施した。クローンを、示されるようにｐ６−２２特異的Ｔ細胞株およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方から誘導した。Ｔ細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）または無関係のコントロールペプチド（無関係のペプチド）でパルスしたＢ６脾臓細胞と共に培養し、そして（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール（抗原なしの、Ｂ６脾臓細胞）の平均値によって除算された実験ウェルの平均値として計算された刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドについてヒトＷＴ１（配列番号３１９）のＴＳＩＴＥＳ分析の結果を示す。「Ａ」と示された領域は、ブロックのＡＭＰＨＩ中間点であり、「Ｒ」は、Ｒｏｔｈｂａｒｄ／Ｔａｙｌｏｒモチーフと一致する残基を示し、「Ｄ」は、ＩＡｄモチーフと一致する残基を示し、そして「ｄ」は、ＩＥｄモチーフと一致する残基を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドについてヒトＷＴ１（配列番号３１９）のＴＳＩＴＥＳ分析の結果を示す。「Ａ」と示された領域は、ブロックのＡＭＰＨＩ中間点であり、「Ｒ」は、Ｒｏｔｈｂａｒｄ／Ｔａｙｌｏｒモチーフと一致する残基を示し、「Ｄ」は、ＩＡｄモチーフと一致する残基を示し、そして「ｄ」は、ＩＥｄモチーフと一致する残基を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおけるＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を示すグラフである。図９Ａは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を示し、そして図９Ｂは、ペプチドでコートされた細胞株の溶解を示す。各々の場合において、溶解％（標準的クロム放出アッセイによって決定される）は、３つの示したエフェクター：標的比で示される。結果は、リンパ腫細胞（ＬＳＴＲＡおよびＥ１０）ならびにＥ１０＋ｐ２３５−２４３（Ｅ１０＋Ｐ２３５）について提供される。Ｅ１０細胞はまた、本明細書中でＥＬ−４細胞とも呼ばれる。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおけるＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を示すグラフである。図９Ａは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を示し、そして図９Ｂは、ペプチドでコートされた細胞株の溶解を示す。各々の場合において、溶解％（標準的クロム放出アッセイによって決定される）は、３つの示したエフェクター：標的比で示される。結果は、リンパ腫細胞（ＬＳＴＲＡおよびＥ１０）ならびにＥ１０＋ｐ２３５−２４３（Ｅ１０＋Ｐ２３５）について提供される。Ｅ１０細胞はまた、本明細書中でＥＬ−４細胞とも呼ばれる。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７を用いたＢ６マウスのワクチン接種後に、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するがＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を示すグラフである。図１０Ａは、非免疫化Ｂ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷しないことを示す。溶解％（溶標準的クロム放出アッセイによって決定される）は、三つの示したエフェクター：標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された繊維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）ならびにＥ１０＋Ｐ１１７について提供される。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７を用いたＢ６マウスのワクチン接種に引き続き、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するがＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ｂは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を図示する。溶解％（溶標準的クロム放出アッセイによって決定される）は、三つの示したエフェクター：標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された繊維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）ならびにＥ１０＋Ｐ１１７について提供される。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７を用いたＢ６マウスのワクチン接種に引き続き、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するがＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、異なる二つの実験におけるＷＴ１陰性細胞株と比べたＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図１０Ｃは、ペプチドにてコートされた細胞株（関連したＷＴ１ペプチドＰ１１７によってコートされたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）の溶解を示す。溶解％（溶標準的クロム放出アッセイによって決定される）は、三つの示したエフェクター：標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された繊維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）ならびにＥ１０＋Ｐ１１７について提供される。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７を用いたＢ６マウスのワクチン接種に引き続き、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するがＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、異なる二つの実験におけるＷＴ１陰性細胞株と比べたＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図１０Ｄは、ペプチドにてコートされた細胞株（関連したＷＴ１ペプチドＰ１１７によってコートされたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）の溶解を示す。溶解％（溶標準的クロム放出アッセイによって決定される）は、三つの示したエフェクター：標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された繊維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）ならびにＥ１０＋Ｐ１１７について提供される。
【図１１Ａ】図１１Ａは、代表的なペプチドＰ１１７−１３９特異的ＣＴＬがＷＴ１陽性腫瘍細胞を溶解する能力を示すヒストグラムである。３回目の免疫の３週間後に、ペプチドｐ２３５−２４３またはｐ１１７−１３９を接種したマウスの脾臓細胞を、関連するペプチドを用いてインビトロにおいて刺激し、そしてＷＴ１ペプチドならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞およびＷＴ１陰性腫瘍細胞と共にインキュベートされた標的を溶解する能力について試験した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比にて三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均特異的溶解％を示す。図１１Ａは、示されるように、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；関連する（免疫ならびに再刺激のために用いた）ペプチドｐ２３５−２４３でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ２３５）；無関連のペプチドｐ１１７−１３９でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）またはｐ１３０−１３８でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１３０）ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞ＢＬＫ−ＳＶ４０（ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１陽性）およびＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）に対する、ｐ２３５−２４３特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、代表的なペプチドＰ１１７−１３９特異的ＣＴＬがＷＴ１陽性腫瘍細胞を溶解する能力を示すヒストグラムである。３回目の免疫の３週間後に、ペプチドｐ２３５−２４３またはｐ１１７−１３９を接種したマウスの脾臓細胞を、関連するペプチドを用いてインビトロにおいて刺激し、そしてＷＴ１ペプチドならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞およびＷＴ１陰性腫瘍細胞と共にインキュベートされた標的を溶解する能力について試験した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比にて三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均特異的溶解％を示す。図１１Ｂは、示されるように、ＥＬ−４；関連するペプチドＰ１１７−１３９でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１１７）および無関連のペプチドｐ１２３−１３１でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１２３）、またはｐ１２８−１３６でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１２８）；ＢＬＫ−ＳＶ４０およびＴＲＡＭＰ−Ｃに対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、非放射性標的阻害によって実証される、ＷＴ１陽性腫瘍細胞の溶解の特異性を示すヒストグラムである。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比にて三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均特異的溶解％を示す。図１２Ａは、示されるように、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）；５１Ｃｒ標識なしの関連するペプチドｐ１１７−１３９でパルスした（放射性標的と比べて）１０倍過剰のＥＬ−４細胞とともにインキュベートされたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ＋ｐ１１７非放射性標的）および５１Ｃｒ標識なしの無関連のペプチドでパルスしたＥＬ−４細胞とともにインキュベートされたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ＋無関係の非放射性標的）に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、非放射性標的阻害によって実証される、ＷＴ１陽性腫瘍細胞の溶解の特異性を示すヒストグラムである。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比にて三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均特異的溶解％を示す。図１２Ｂは、示されるように、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＢＬＫ−ＳＶ４０（ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１陽性）；関連する非放射性標的とともにインキュベートされたＢＬＫ−ＳＶ４０細胞（ＢＬＫ−ＳＶ４０＋ｐ１１７非放射性標的）および無関連の非放射性標的とともにインキュベートされたＢＬＫ−ＳＶ４０細胞（ＢＬＫ−ＳＶ４０＋無関係の非放射性標的）に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ｐ１１７−１３９内の９マーのＣＴＬエピトープの評価を示すヒストグラムである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株を、適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは欠如するアミノ酸１１７〜１３９内のペプチドに対して、ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８を用いて再刺激した後に試験した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比にて三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均特異的溶解％を示す。図１３Ａは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）およびペプチドｐ１１７−１３９でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ペプチドｐ１１９−１２７でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１１９）、ペプチドｐ１２０−１２８でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２０）、ペプチドｐ１２３−１３１でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２３）、ペプチドｐ１２６−１３４でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２６）、ペプチドｐ１２８−１３６でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２８）およびペプチドｐ１３０−１３８でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１３０）に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ｐ１１７−１３９内の９マーのＣＴＬエピトープの評価を示すヒストグラムである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株を、適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは欠如するアミノ酸１１７−１３９内のペプチドに対して、ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８を用いて再刺激した後に試験した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比にて三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均特異的溶解％を示す。図１３Ｂは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４、ｐ１１７−１３９でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２６）およびＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃに対する、ｐ１２６−１３４を用いた再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害性活性を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ｐ１１７−１３９内の９マーのＣＴＬエピトープの評価を示すヒストグラムである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株を、適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは欠如するアミノ酸１１７−１３９内のペプチドに対して、ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８を用いて再刺激した後に試験した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比にて三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均特異的溶解％を示す。図１３Ｃは、ＥＬ−４、ｐ１１７−１３９でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１３０−１３８でパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１３０）およびＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃに対する、ｐ１３０−１３８を用いた再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害性活性を示す。
【図１４】図１４は、ＡＭＬを有する６３人の患者における、ＷＴ１に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質に対する血清抗体の反応性は、ＡＭＬを有する患者においてＥＬＩＳＡによって評価された。第１のレーンおよび第１および第２のレーンは、それぞれ、陽性コントロールおよび陰性コントロールを表す。第１のレーンおよび第１および第２のレーンは、それぞれ、陽性コントロールおよび陰性コントロールを表す。市販されているＷＴ１特異的抗体ＷＴ１８０を陽性コントロールについて使用した。次の６３レーンは、各々の個々の患者由来の血清を使用した結果を表す。示されたＯＤ値は、１：５００の血清希釈を使用するＥＬＩＳＡから得た。この図は、３つの別個の実験からの累積データを含む。
【図１５】図１５は、ＡＭＬを有する２人の患者におけるＷＴ１タンパク質およびコントロールタンパク質に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／全長、ＷＴ１Ｎ末端、ＴＲＸタンパク質およびＲａ１２タンパク質に対する、血清抗体の反応性が、ＡＭＬを有する２人の患者においてＥＬＩＳＡによって評価された。示されたＯＤ値は、１：５００の血清希釈を使用するＥＬＩＳＡによった。ＡＭＬ−１およびＡＭＬ−２は、ＷＴ１全長に対する実証された抗体反応性を有する、図１における患者個体のうちの２人に由来する血清を示す。このＷＴ１全長タンパク質が、Ｒａ１２との融合タンパク質として発現された。このＷＴ１／Ｎ末端タンパク質は、ＴＲＸとの融合タンパク質として発現された。このコントロールＲａ１２タンパク質およびＴＲＸタンパク質は、類似の様式で精製される。この結果によって、ＷＴ１融合タンパク質に対する血清抗体反応性は、このタンパク質のＷＴ１部分に対することが確認される。
【図１６】図１６は、ＣＭＬを有する８１人の患者におけるＷＴ１に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／全長タンパク質に対する血清抗体の反応性は、ＡＭＬを有する患者においてＥＬＩＳＡによって評価された。この第１のレーンおよび第２のレーンは、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールを示す。市販されるＷＴ１特異的抗体ＷＴ１８０を陽性コントロールのために使用した。次の８１個のレーンは、患者個体各々に由来する血清を使用した結果を表す。示されるＯＤ値は、１：５００の血清希釈を使用するＥＬＩＳＡから得た。この図は、３つの別個の実験からの累積データを含む。
【図１７】図１７は、ＣＭＬを有する２人の患者におけるＷＴ１タンパク質およびコントロールタンパク質に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／全長タンパク質、ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質、ＴＲＸタンパク質およびＲａ１２タンパク質に対する血清抗体反応性が、ＣＭＬを有する２人の患者においてＥＬＩＳＡによって評価された。示されたＯＤ値は、１：５００で血清希釈を使用するＥＬＩＳＡから得た。ＣＭＬ−１およびＣＭＬ−２は、ＷＴ１／全長に対する実証された抗体反応性を有する図３における患者個体のうちの２人の血清を示す。このＷＴ１／全長タンパク質は、Ｒａ１２との融合タンパク質として発現された。このＷＴ１／Ｎ末端タンパク質は、ＴＲＸとの融合タンパク質として発現された。このコントロールのＲａ１２タンパク質およびＴＲＸタンパク質を類似の様式において精製した。この結果によって、ＷＴ１融合タンパク質に対する血清抗体反応性がこのタンパク質ＷＴ１部分に対することが確認される。
【図１８】図１８は、血清学的分析に使用される組換えＷＴ１タンパク質の特徴を提供する。
【図１９Ａ１】図１９Ａ１は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ａ２】図１９Ａ２は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ａ３】図１９Ａ３は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｂ１】図１９Ｂ１は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｂ２】図１９Ｂ２は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｂ３】図１９Ｂ３は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｃ１】図１９Ｃ１は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｃ２】図１９Ｃ２は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｃ３】図１９Ｃ３は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｄ１】図１９Ｄ１は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｄ２】図１９Ｄ２は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｄ３】図１９Ｄ３は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｅ１】図１９Ｅ１は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｅ２】図１９Ｅ２は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｅ３】図１９Ｅ３は、異なった用量のＷＴ１タンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＷＴ１タンパク質で免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の棒グラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＷＴ１タンパク質で免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の棒グラフである。
【図２１】図２１は、蛍光顕微鏡によって検査されたヒトＤＣの写真であり、このヒトＤＣは、アデノＷＴ１感染およびワクシニア感染の後にＷＴ１を発現する。
【図２２】図２２は、ヒトＤＣにおけるＷＴ１発現が、アデノＷＴ１感染の後に再現可能であり、かつコントロールアデノ感染によって誘導されないことを実証する写真である。
【図２３】図２３は、ＷＴ１全遺伝子のインビトロでの初回免疫によって、ＷＴ１特異的Ｔ細胞応答が誘発されることを示す、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのグラフである。
【図２４】図２４は、ＷＴ１タンパク質のアミノ酸２−２８１（配列番号４６１）およびこれらのアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ（配列番号４６０）を表わす。この短縮型ＷＴ１タンパク質は、ＷＴ１−Ｆと呼ばれる。
【配列表】
2005518192.tif 000092
2005518192.tif 000093
2005518192.tif 000094
2005518192.tif 000095
2005518192.tif 000096
2005518192.tif 000097
2005518192.tif 000098
2005518192.tif 000099
2005518192.tif 000100
2005518192.tif 000101
2005518192.tif 000102
2005518192.tif 000103
2005518192.tif 000104
2005518192.tif 000105
2005518192.tif 000106
2005518192.tif 000107
2005518192.tif 000108
2005518192.tif 000109
2005518192.tif 000110
2005518192.tif 000111
2005518192.tif 000112
2005518192.tif 000113
2005518192.tif 000114
2005518192.tif 000115
2005518192.tif 000116
2005518192.tif 000117
2005518192.tif 000118
2005518192.tif 000119
2005518192.tif 000120
2005518192.tif 000121
2005518192.tif 000122
2005518192.tif 000123
2005518192.tif 000124
2005518192.tif 000125
2005518192.tif 000126
2005518192.tif 000127
2005518192.tif 000128
2005518192.tif 000129
2005518192.tif 000130
2005518192.tif 000131
2005518192.tif 000132
2005518192.tif 000133
2005518192.tif 000134
2005518192.tif 000135
2005518192.tif 000136
2005518192.tif 000137
2005518192.tif 000138
2005518192.tif 000139
2005518192.tif 000140
2005518192.tif 000141
2005518192.tif 000142
2005518192.tif 000143
2005518192.tif 000144
2005518192.tif 000145
2005518192.tif 000146
2005518192.tif 000147
2005518192.tif 000148
2005518192.tif 000149
2005518192.tif 000150
2005518192.tif 000151
2005518192.tif 000152
2005518192.tif 000153
2005518192.tif 000154
2005518192.tif 000155
2005518192.tif 000156
2005518192.tif 000157
2005518192.tif 000158
2005518192.tif 000159
2005518192.tif 000160
2005518192.tif 000161
2005518192.tif 000162
2005518192.tif 000163
2005518192.tif 000164
2005518192.tif 000165
2005518192.tif 000166
2005518192.tif 000167
2005518192.tif 000168
2005518192.tif 000169
2005518192.tif 000170
2005518192.tif 000171
2005518192.tif 000172
2005518192.tif 000173
2005518192.tif 000174
2005518192.tif 000175
2005518192.tif 000176
2005518192.tif 000177
2005518192.tif 000178
2005518192.tif 000179
2005518192.tif 000180
2005518192.tif 000181
2005518192.tif 000182
2005518192.tif 000183
2005518192.tif 000184
2005518192.tif 000185
2005518192.tif 000186
2005518192.tif 000187
2005518192.tif 000188
2005518192.tif 000189
2005518192.tif 000190
2005518192.tif 000191
2005518192.tif 000192
2005518192.tif 000193
2005518192.tif 000194
2005518192.tif 000195
2005518192.tif 000196
2005518192.tif 000197
2005518192.tif 000198
2005518192.tif 000199
2005518192.tif 000200
2005518192.tif 000201
2005518192.tif 000202
2005518192.tif 000203
2005518192.tif 000204
2005518192.tif 000205
2005518192.tif 000206
2005518192.tif 000207
2005518192.tif 000208
2005518192.tif 000209
2005518192.tif 000210
2005518192.tif 000211
2005518192.tif 000212
2005518192.tif 000213
2005518192.tif 000214
2005518192.tif 000215
2005518192.tif 000216
2005518192.tif 000217
2005518192.tif 000218
2005518192.tif 000219
2005518192.tif 000220
2005518192.tif 000221
2005518192.tif 000222
2005518192.tif 000223
【図１】
2005518192.tif 000224
【図２】
2005518192.tif 000225
【図３】
2005518192.tif 000226
【図４】
2005518192.tif 000227
【図５Ａ】
2005518192.tif 000228
【図５Ｂ】
2005518192.tif 000229
【図５Ｃ】
2005518192.tif 000230
【図６Ａ】
2005518192.tif 000231
【図６Ｂ】
2005518192.tif 000232
【図７Ａ】
2005518192.tif 000233
【図７Ｂ】
2005518192.tif 000234
【図７Ｃ】
2005518192.tif 000235
【図７Ｄ】
2005518192.tif 000236
【図８Ａ】
2005518192.tif 000237
【図８Ｂ】
2005518192.tif 000238
【図９Ａ】
2005518192.tif 000239
【図９Ｂ】
2005518192.tif 000240
【図１０Ａ】
2005518192.tif 000241
【図１０Ｂ】
2005518192.tif 000242
【図１０Ｃ】
2005518192.tif 000243
【図１０Ｄ】
2005518192.tif 000244
【図１１Ａ】
2005518192.tif 000245
【図１１Ｂ】
2005518192.tif 000246
【図１２Ａ】
2005518192.tif 000247
【図１２Ｂ】
2005518192.tif 000248
【図１３Ａ】
2005518192.tif 000249
【図１３Ｂ】
2005518192.tif 000250
【図１３Ｃ】
2005518192.tif 000251
【図１４】
2005518192.tif 000252
【図１５】
2005518192.tif 000253
【図１６】
2005518192.tif 000254
【図１７】
2005518192.tif 000255
【図１８】
2005518192.tif 000256
【図１９Ａ１】
2005518192.tif 000257
【図１９Ａ２】
2005518192.tif 000258
【図１９Ａ３】
2005518192.tif 000259
【図１９Ｂ１】
2005518192.tif 000260
【図１９Ｂ２】
2005518192.tif 000261
【図１９Ｂ３】
2005518192.tif 000262
【図１９Ｃ１】
2005518192.tif 000263
【図１９Ｃ２】
2005518192.tif 000264
【図１９Ｃ３】
2005518192.tif 000265
【図１９Ｄ１】
2005518192.tif 000266
【図１９Ｄ２】
2005518192.tif 000267
【図１９Ｄ３】
2005518192.tif 000268
【図１９Ｅ１】
2005518192.tif 000269
【図１９Ｅ２】
2005518192.tif 000270
【図１９Ｅ３】
2005518192.tif 000271
【図２０Ａ】
2005518192.tif 000272
【図２０Ｂ】
2005518192.tif 000273
【図２１】
2005518192.tif 000274
【図２２】
2005518192.tif 000275
【図２３】
2005518192.tif 000276
【図２４】
2005518192.tif 000277
【国際調査報告】
2005518192.tif 000278
2005518192.tif 000279
2005518192.tif 000280