(57)【要約】本発明は、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）の３次元溶液構造と、ＩＬ−１３の種々の結合活性部位の同定および特徴付けとに関する。本発明により、ＩＬ−１３と相互作用する潜在的および選択的な物質の設計および選択のために、該３次元構造を利用する方法も備えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を含む溶液であって、ここでＩＬ−１３は図２のアミノ酸残基１〜１１３を含み、ＩＬ−１３はラベルされていないか、15Ｎに富むか、または15Ｎ、13Ｃに富み、ＩＬ−１３は４つのαへリックスαＡ、αＢ、αＣおよびαＤ、ならびに２つのβ鎖β１およびβ２を含み、αＡはＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｐ６〜Ｑ２２を含み、β１はＩＬ−１３のＭ３３〜Ｗ３５を含み、αＢはＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｍ４３〜Ｉ５２を含み、αＣはＩＬ−１３のアミノ酸残基Ａ５９〜Ｆ７０を含み、β２はＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｋ８９〜Ｅ９１を含み、αＤはＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｖ９２〜Ｒ１０８を含む溶液。
【請求項２】
ＩＬ−１３が、図８に記載の相対構造座標（±前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）により定義される構造を持つ請求項１に記載の溶液。
【請求項３】
ＩＬ−１３が、図８に記載の相対構造座標（±前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．０Å以下の２乗平均平方根偏差）により定義される構造を持つ請求項１に記載の溶液。
【請求項４】
ＩＬ−１３が、図８に記載の相対構造座標（±前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの０．５Å以下の２乗平均平方根偏差）により定義される構造を持つ請求項１に記載の溶液。
【請求項５】
ＩＬ−１３の図８または９に記載の相対構造座標（±アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含むＩＬ−１３の構造モデル。
【請求項６】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、１．０Å以下である請求項５に記載のモデル。
【請求項７】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、０．５Å以下である請求項５に記載のモデル。
【請求項８】
ＩＬ−１３の活性部位であって、ここで該活性部位が、図８または９に記載のＩＬ−１３のアミノ酸残基Ａ９、Ｅ１２、Ｅ１５、Ｅ１６およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む３次元構造により特徴付けられるＩＬ−１３の活性部位。
【請求項９】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、１．０Å以下である請求項８に記載の活性部位。
【請求項１０】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、０．５Å以下である請求項８に記載の活性部位。
【請求項１１】
ＩＬ−１３の活性部位であって、ここで該活性部位が、図８または９に記載のＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｉ５２、Ｑ６４、Ｒ６５およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む３次元構造により特徴付けられるＩＬ−１３の活性部位。
【請求項１２】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、１．０Å以下である請求項１１に記載の活性部位。
【請求項１３】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、０．５Å以下である請求項１１に記載の活性部位。
【請求項１４】
ＩＬ−１３と相互作用する物質を設計するための方法であって：
（ａ）図８または９のアミノ酸の相対構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を使用して、ＩＬ−１３の３次元モデルを生成する段階；および
（ｂ）該３次元モデルを、ＩＬ−１３と相互作用する物質を設計するために用いる段階
を含む方法。
【請求項１５】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、１．０Å以下である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、０．５Å以下である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記物質が、ＩＬ−１３の活性部位を使用して設計される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記活性部位が、図８または９に記載のＩＬ−１３のアミノ酸残基Ａ９、Ｅ１２、Ｅ１５、Ｅ１６およびＭ６６の相対構造座標（±前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、１．０Å以下である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、０．５Å以下である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記活性部位が、図８または９に記載のＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｉ５２、Ｑ６４、Ｒ６５およびＭ６６の相対構造座標（±前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、１．０Å以下である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アミノ酸の保存されている主鎖原子からの±２乗平均平方根偏差が、０．５Å以下である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１４に記載の方法であって、ここで物質を設計するために前記３次元構造を用いる前記段階が：
（ａ）ＩＬ−１３と会合可能な化学物質全体または断片を同定する段階；および
（ｂ）この同定された化学物質全体または断片を、該物質の構造を提供するために単独の分子中へ集める段階
を含む方法。
【請求項２５】
前記物質が、新規に設計される請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記物質が、既知の物質から設計される請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
前記物質を得るまたは合成する段階を更に含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
得られたかまたは合成された前記物質が、該物質がＩＬ−１３について持つ効果を決定するためにＩＬ−１３と接触させられる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１４に記載の方法により設計される物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
この出願は、２００１年６月７日に出願された米国仮出願第６０／２９６，６０７号の利益を請求する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、ヒトＩＬ−１３の３次元溶液構造に関する。この構造は、ＩＬ−１３と相互作用する潜在的および選択的な物質の設計および選択に関して重要である。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）は、アトピー、喘息、アレルギーおよび炎症応答における役割を有する多面的なサイトカインである（総説に関しては：Corry, 1999; De Vries, 1998; Finkelman et al., 1999; Shirakawa et al., 2000; Wills-Karp et al., 1998 参照）。ＩＬ−１３は、活性化Ｔ細胞により生産され、Ｂ細胞増殖を促進し、Ｂ細胞にＩｇＥを生産するように誘導し、原炎症サイトカインの生産をダウンレギュレーションし、上皮細胞上でのＶＣＡＭ−１の発現を増加させ、単球上でのクラスＩＩのＭＨＣ抗原および種々の接着分子の発現を増強する。ＩＬ−１３は、造血細胞および他の型の細胞上のその受容体との相互作用を通じてこれらの機能を仲介するが、現在のところ、機能的受容体は、Ｔ細胞上では同定されていない。このシグナル伝達ヒトＩＬ−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）は、インターロイキン−４受容体α鎖（ＩＬ−４Ｒα）およびＩＬ−１３結合鎖から構成されたヘテロ２量体である。２７％の相同性である２つのＩＬ−１３結合ドメインが、ＩＬ−１３Ｒα１およびＩＬ−１３Ｒα２として同定されている。ＩＬ−１３Ｒα２は、ＩＬ−４Ｒα非存在下でのＩＬ−１３Ｒα１に対して、ＩＬ−１３に関して約１００倍高い親和性を示すが、マウスの血清および尿中でのみ同定されている。ＩＬ−１３のその受容体との会合は、ＩＬ−４Ｒα鎖との結合相互作用を通じて、ＳＴＡＴ６（シグナル伝達物質および転写６の活性化）およびジャナス（Janus）−ファミリーキナーゼ（JAK1, JAK2, TYK2）の活性化を誘導する。
【０００４】
ＩＬ−１３は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＧＭ−ＣＳＦをコード化する染色体５上の遺伝子のクラスター中に位置されている。ＩＬ−１３は、それらの受容体における共通のＩＬ−４Ｒα成分の結果として、ＩＬ−４と多くの機能的特性を分かち合っている（Callard et al., 1996; Gessner および Rollinghoff, 2000）。ＩＬ−４は、ＩＬ−４Ｒα鎖に対して高い親和性を呈し（Ｋd＝２０〜３００ｐＭ）、ここでこの複合体は、ＩＬ−４Ｒの共通γ鎖（γc）を動員し、シグナル伝達複合体を形成する。同様にＩＬ−１３は、ＩＬ−４Ｒα鎖非存在下に、相対的に高い親和性（Ｋd〜４ｎＭ）でＩＬ−１３結合鎖（ＩＬ−１３Ｒα１）に結合し、ここでＩＬ−Ｒへの親和性の増加が、ＩＬ−４Ｒα存在下に起こる（Ｋd〜５０ｐＭ）。ＩＬ−１３は、ＩＬ−１３結合鎖の非存在下には、ＩＬ−４Ｒαと結合しない。結果としてＩＬ−４は、両方の受容体におけるＩＬ−４Ｒαの存在のために、ＩＬ−４ＲおよびＩＬ−１３Ｒの両方への結合を呈するが、ＩＬ−１３は、ＩＬ−１３結合鎖が存在しないために、ＩＬ−４Ｒとは結合しない（Callard et al., 1996）。ＩＬ−４ＲおよびＩＬ−１３Ｒ両方とのＩＬ−４の交差反応性は、ＩＬ−４Ｙ１２４Ｄ変異体のアンタゴニスト活性により更に促進される（De Vries, 1994）。ＩＬ−４Ｙ１２４Ｄ変異体は、ＩＬ−４Ｒαと結合する能力をなお維持しているが、γc鎖との相互作用を通じてシグナルを誘導するその能力に欠けている。該γc鎖はＩＬ−１３Ｒ中には存在しないので、ＩＬ−１３は、ＩＬ−４Ｒの該γc鎖と会合するＴ細胞の増殖および分化あるいはＪＡＫ−３キナーゼの活性化を誘導しない。
【０００５】
ＩＬ−１３およびＩＬ−４の両方は、短鎖４へリックス束を有するサイトカインファミリーの一員であり（Sprang および Bazan, 1993）、ここで溶液および結晶両方の構造が、ＩＬ−４に関しては以前に決定されている（Powers et al., 1992; Powers et al., 1993; Smith et al., 1992; Walter et al., 1992; Wlodaver et al., 1992）。ＩＬ−１３およびＩＬ−４間の相対的に低い（２５％）配列相同性にも関わらず、この２つのタンパク質間の全体のトポロジーにおける類似性が期待される。変異および速度論的解析の組み合わせが、結合しているＩＬ−４Ｒαと関連しているＩＬ−４の構造上の区別できる部位、および前記γc鎖を通じたシグナル伝達と関連している第２の部位を同定している（Kruse et al., 1993; Letzelter et al., 1998; Wang et al., 1997）。最近、ＩＬ−４Ｒαの外側ドメインと複合体化されたＩＬ−４のＸ線構造が決定され、ＩＬ−４−ＩＬ−４Ｒα界面を更に定義している（Hage et al., 1999）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
潤沢なＩＬ−４受容体系に関する構造情報にも関わらず、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒまたは該複合体に関する構造情報は、現在のところ不足している。本発明は、ヘテロ核多次元ＮＭＲによるヒトＩＬ−１３の高分解能溶液構造を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、ＩＬ−１３の３次元構造に関し、より特には、分光学および種々のコンピュータモデリング技術を使用して決定されるような、ＩＬ−１３の溶液構造に関する。
【０００８】
特に本発明は、ＩＬ−１３と相互作用する潜在的および選択的な物質の合理的な設計に関しての魅力的な標的を提供するＩＬ−１３の活性部位の同定、特徴付け、および３次元構造を更に指向するものである。
【０００９】
従って本発明は、ＩＬ−１３を含む溶液を提供する。ＩＬ−１３の３次元溶液構造は、分光学データから得られるような図８の相対原子構造座標により提供される。
【００１０】
本発明によりＩＬ−１３の活性部位も提供され、ここで該活性部位は、図８または９によるＩＬ−１３のアミノ酸残基Ａ９、Ｅ１２、Ｅ１５、Ｅ１６およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存された主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む３次元構造により特徴付けられる。
【００１１】
本発明によりＩＬ−１３の活性部位も提供され、ここで該活性部位は、図８または９によるＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｉ５２、Ｑ６４、Ｒ６５およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存された主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む３次元構造により特徴付けられる。
【００１２】
本発明により提供されるＩＬ−１３またはこの一部分（前記活性部位のような）の溶液座標は、３次元の形としての表示のために、あるいは、それらが定義する構造座標もしくは３次元構造のコンピュータ支援手技、またはそれらが定義する構造座標もしくは３次元構造に基づいた計算を含む他の使用のために、機械読み取り可能な保管媒体、例えばコンピュータハードドライブ、ディスケット、ＤＡＴテープ等の上に、機械読み取り可能な形態で保管されてもよい。例として、図８または９において以後設定されているようなＩＬ−１３の３次元構造を定義するデータは、該保管媒体からのこのようなデータからの表示を創出するための指示と共にプログラムされたデータを読み取ることが可能なコンピュータを典型的には使用して、機械読み取り可能な保管媒体中に保管されてもよく、関連構造座標の３次元グラフ表示として表示されてもよい。
【００１３】
従って本発明は、機械に接続されたディスプレイ上の構造座標の３次元グラフ表示へと座標を変換することが可能なプログラムと共に、ＩＬ−１３またはこの一部分の座標を伴ったメモリー中にプログラムされたコンピュータのような機械を提供する。この機械は、ＩＬ−１３に対しての構造または配列の相同性に関連付けられる化合物、タンパク質、複合体等のモデリングにおいてと同様、ＩＬ−１３の結合または活性の阻害剤の合理的な設計または選択におけるこのようなデータの補助を含有するメモリーを持ち、本明細書中で開示されるようなＩＬ−１３と好ましく会合する特別な化学物質全体の能力の評価を包含する。
【００１４】
本発明は、構造が未知の分子または分子複合体の３次元構造を決定する方法を追加的に指向するものであり、まずこの構造が未知の分子または分子複合体の結晶または溶液を得る段階、次いでこの結晶化された分子もしくは分子複合体からＸ線回折データを生成する段階、および／または該分子もしくは分子複合体の該溶液からＮＭＲデータを生成する段階を含む。該分子または分子複合体からのこの生成された回折または分光学データは、本明細書中で開示されるようなＩＬ−１３の溶液座標または３次元構造とその後比較され得、この未知の分子または分子複合体の３次元構造は、分子置換解析、２Ｄ、３Ｄおよび４Ｄアイソトープフィルタリング、編集および３重共鳴ＮＭＲ技術、ならびにコンピュータ相同性モデリングのような標準的な技術を使用して、ＩＬ−１３の構造に立体配座される。あるいは、この未知の分子の３次元モデルは、アミノ酸配列の同一性、２次構造エレメントまたは３次折りたたみのいずれかまたは全てに基づいて、ＩＬ−１３とこの未知の分子との間の配列アライメントを生成し、次いでコンピュータモデリングにより、ＩＬ−１３の３次元構造およびＩＬ−１３との配列アライメントを使用して、該分子に関する３次元構造を生成することにより生成されてもよい。
【００１５】
更に本発明は、ＩＬ−１３と相互作用する物質を同定する方法を提供し、該方法は、以下の段階：（ａ）図８または９のアミノ酸の相対構造座標（±該アミノ酸の保存された主鎖原子からの１．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を使用して、ＩＬ−１３の３次元モデルを生成する段階；（ｂ）ＩＬ−１３と相互作用する物質を設計するために、該３次元モデルを用いる段階を含む。
【００１６】
最後に本発明は、本明細書中で開示される方法を使用して設計または選択される物質を提供する。本発明の追加的な目的は、以下の記載から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書中で使用されるように、以下の用語および語句は、以後設定される以下の意味を持つようにされる。
【００１８】
違うように述べられていなければ、「ＩＬ−１３」は、図２のアミノ酸配列を包含し、その保存されている置換を包含する。
【００１９】
違うように述べられていなければ、「タンパク質」または「分子」は、タンパク質、タンパク質ドメイン、ポリペプチドまたはペプチドを包含するようにされる。
【００２０】
「構造座標」は、分子または分子複合体における、ある原子の他の原子との空間の関係に対応するデカルト座標である。構造座標は、Ｘ線結晶解析技術またはＮＭＲ技術を使用して得られてもよく、あるいは分子置換解析または相同性モデリングを使用して由来されてもよい。種々のソフトウェアプログラムが、分子または分子複合体の３次元表示を得るために、構造座標のセットのグラフ表示を考えて備えられている。本発明の構造座標は、逆数を取ったり、または整数を足したり引いたりすることによるような数学的な手技により、図８または９において提供される本来のセットから修飾されてもよい。このように、本発明の構造座標は相対的であり、図８または９の現実のｘ、ｙ、ｚ座標により特に限定される方式ではないことが認識される。
【００２１】
「物質」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する核酸、分子、化合物あるいは薬剤を包含するようにされる。
【００２２】
「２乗平均平方根偏差」は、中央値からの偏差の平方の算術平均の平方根であり、本明細書中で記載される構造座標からの偏差または変動を表現する方式である。本発明は、結果的に該２乗平均平方根偏差内の同じ構造座標になる、前記アミノ酸残基の保存されている置換を含む全ての実施形態を包含する。
【００２３】
「保存されている置換」は、同様の極性、立体的配置を持つことによるか、または置換された残基と同じクラスに属することによる（例えば、疎水性である、酸性である、または塩基性である）、この置換されたアミノ酸残基に機能的に等価なそれらのアミノ酸置換であり、分子置換解析に関しておよび／または相同性モデリングに関して、ＩＬ−１３と相互作用する物質の同定および設計用の該構造の使用に関する、ＩＬ−１３の３次元構造における些細な効果を持つ置換を包含する。
【００２４】
「活性部位」は、種々の共有および／または非共有結合力を介して、その形および電荷ポテンシャルの結果として、他方の物質（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する核酸、分子、化合物、抗生物質あるいは薬剤を包含するが、これらに限定しない）と好ましくは相互作用または会合する分子または分子複合体の領域に関する。このように、本発明の活性部位は、例えば、ＩＬ−１３に結合する受容体の現実の部位と、受容体結合の現実の部位での直接の妨害、またはＩＬ−１３の立体配座もしくは電荷ポテンシャルに非直接的に影響を及ぼし、これにより受容体結合の現実の部位でのＩＬ−１３への受容体結合を妨げもしくは抑制することにより、特別な物質との相互作用または会合の際に、それにも関わらずＩＬ−１３に影響を及ぼすことがある受容体結合の現実の部位に隣接する副結合部位とを包含してもよい。本明細書中で使用されるように、「活性部位」は、ＩＬ−１３上に存在する他の結合部位同様、自己会合の受容体部位をも包含する。
【００２５】
「ＩＬ−１３複合体」は、共有または非共有結合力により、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する核酸、小分子、化合物あるいは薬剤と結合会合しているＩＬ−１３を含む分子の共複合体に関する。ＩＬ−１３複合体の非限定的な例は、ＩＬ−１３に結合したＩＬ−４Ｒα受容体を包含する。
【００２６】
本発明は、ＩＬ−１３の３次元構造に関し、より特には、多次元ＮＭＲ分光学および種々のコンピュータモデリング技術を使用して決定されるようなＩＬ−１３の溶液構造に関する。その未結合立体配置（図８）または結合立体配置（図９）中のＩＬ−１３の構造座標は、数多くの適用に有用であり、ＩＬ−１３に結合している受容体の部位を包含するＩＬ−１３活性部位の視覚化、同定および特徴付けと同様、ＩＬ−１３の３次元構造の特徴付けを包含するが、これらに限定されるものではない。この活性部位の構造は、ＩＬ−１３と相互作用する設計または選択された物質あるいはＩＬ−１３複合体の、方向および結合活性を予測するのにその後使用されてもよい。従って、本発明は、受容体結合部位を包含するがこれに限定されないＩＬ−１３活性部位の３次元構造をも指向したものである。
【００２７】
本明細書中で使用されるように、溶液中のＩＬ−１３は、保存されている置換を包含する図２のアミノ酸１〜１１３を含む。好ましくは、溶液中のＩＬ−１３は、ラベルされていないか、15Ｎに富むかまたは15Ｎ、13Ｃに富み、および好ましくは生物学的に活性である。加えて、本発明の溶液中のＩＬ−１３の２次構造は、４つのαヘリックスαＡ、αＢ、αＣおよびαＤ、ならびに２つのβ鎖β１およびβ２を含み、ここでαＡは、ＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｐ６〜Ｑ２２を含み、β１は、ＩＬ−１３のＭ３３〜Ｗ３５を含み、αＢは、ＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｍ４３〜Ｉ５２を含み、αＣは、ＩＬ−１３のアミノ酸残基Ａ５９〜Ｆ７０を含み、β２は、ＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｋ８９〜Ｅ９１を含み、およびαＤは、ＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｖ９２〜Ｒ１０８を含む。最も好ましい実施形態では、本発明の溶液中のＩＬ−１３は、図８によるアミノ酸の完全な構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下（またはより好ましくは１．０Å以下、および最も好ましくは０．５Å以下）の２乗平均平方根偏差）を含む３次元構造により特徴付けられる。
【００２８】
当業界において既知の分子モデリング方法は、ＩＬ−１３のまたはＩＬ−１３複合体の活性部位または結合ポケットを同定するのに使用されてもよい。特に、本発明により提供される溶液構造座標は、ＩＬ−１３分子または分子複合体の３次元構造を特徴付けるのに使用されてもよい。このような構造から、推定活性部位が、該分子の表面構造、表面電荷、立体配置、反応性のアミノ酸の存在、疎水性または親水性の領域等に基づいて、コンピュータを用いて視覚化され、同定され、および特徴付けられる。このような推定活性部位は、種々のおよび区別できるＩＬ−１３複合体から生成されるスペクトルのケミカルシフトの摂動、拮抗および非拮抗阻害実験を使用して、および／または該活性部位の重要な残基または特徴を同定するための、ＩＬ−１３またはリガンドの変異の生成および特徴付けにより、更に洗練されてもよい。
【００２９】
分子または分子複合体の生物学的活性が、物質および該分子または分子複合体の１つ以上の活性部位間の相互作用から最も頻繁にもたらされるので、分子または分子複合体の推定活性部位の同定は大変重要である。従って、分子または分子複合体の推定活性部位は、該分子または分子複合体の活性に影響を及ぼす阻害剤の設計または選択において使用するに最もよい標的である。
【００３０】
本発明は、その形、反応性、電荷ポテンシャル等の結果として、もう１つ別の物質（限定なしに、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する核酸、分子、化合物、抗生物質あるいは薬剤を包含する）と好ましく相互作用または会合するＩＬ−１３または複合体の活性部位を指向したものである。好ましくは、本発明は、図８または９によるＩＬ−１３のアミノ酸残基Ａ９、Ｅ１２、Ｅ１５、Ｅ１６およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下、好ましくは１．０Å以下、および最も好ましくは０．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む３次元構造により特徴付けられるＩＬ−１３の活性部位を指向するものである。もう１つ別の実施形態においては、ＩＬ−１３の活性部位は、図８または９によるＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｉ５２、Ｑ６４、Ｒ６５およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下、好ましくは１．０Å以下、および最も好ましくは０．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む３次元構造により特徴付けられる。
【００３１】
図８または９において以後設定されるように、本発明の溶液構造に関して生成された構造座標の使用のために、関連座標を３次元の形もしくはグラフ表示として表示すること、または関連座標を３次元の形もしくはグラフ表示へと変換すること、あるいは関連座標をその他の方法で操作することがしばしば必要である。例えば、構造座標の３次元表示は、合理的な薬剤設計、分子置換解析、相同性モデリング、および変異解析においてしばしば使用される。これは、１セットの構造座標から、分子またはその部分の３次元グラフ表示を生成させることが可能な、幅広い種々の市販のソフトウェアプログラムのいずれかを使用して、典型的には達成される。この市販のソフトウェアプログラムの例は、限定なしに、以下：GRID(Oxford University, Oxford, UK); MCSS(Molecular Simulations, San Diego, CA); AUTODOCK(Scripps Research Institute, La Jolla, CA); DOCK(University of California, San Francisco, CA); Flo99(Thistlesoft, Morris Township, NJ); Ludi(Molecular Simulations, San Diego, CA); QUANTA(Molecular Simulations, San Diego, CA); Insight(Molecular Simulations, San Diego, CA); SYBYL(TRIPOS, Inc., St. Louis. MO); および LEAPFROG(TRIPOS, Inc., St. Louis, MO) を包含する。
【００３２】
このようなプログラムを用いた保管、移動および使用について、コンピュータのような機械は、ＩＬ−１３、その一部分（例えば、活性部位または結合部位）、またはＩＬ−１３複合体の３次元表示を生産することに備えられる。本発明の機械は、機械読み取り可能なデータと共にコード化されたデータ保管材料を含む、機械読み取り可能なデータ保管媒体を含む。データ保管材料を含む機械読み取り可能な保管媒体は、コンピュータを伴った使用に適応されてもよい従来のコンピュータハードドライブ、フロッピーディスク、ＤＡＴテープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ならびに他の磁気的、磁気光学的、光学的、フロッピーディスクの、および他の媒体を包含する。本発明の機械は、所望の３次元表示へと作業メモリーおよび機械読み取り可能なデータを加工する目的のための機械読み取り可能なデータに組み合わされた中央処理装置（ＣＰＵ）同様、機械読み取り可能なデータを加工するための指示を保管するための作業メモリーをも含む。最後に本発明の機械は、３次元表示がユーザーにより視覚化されてもよいように、該ＣＰＵに接続されたディスプレイを更に含む。従って、該データを使用するための指示と共にプログラムされた機械、例えば前に同定された種類の１つ以上のプログラムで装備されたコンピュータと共に使用される場合、本明細書中で備えられる機械は、本明細書中に記載される分子または分子複合体、あるいは分子複合体の分子の部分の３次元グラフ表示を表示可能である。
【００３３】
本発明の１つの実施形態において、この機械読み取り可能なデータは、図８または９によるＩＬ−１３のアミノ酸残基Ａ９、Ｅ１２、Ｅ１５、Ｅ１６およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下、好ましくは１．０Å以下、および最も好ましくは０．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む。代替の実施形態においては、この機械読み取り可能なデータは、図８または９によるＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｉ５２、Ｑ６４、Ｒ６５およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下、好ましくは１．０Å以下、および最も好ましくは０．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を更に含む。
【００３４】
本発明の構造座標は、（ｉ）関連分子、分子複合体またはＩＬ−１３の３次元構造を溶解し、（ｉｉ）ＩＬ−１３分子の活性部位と好ましく会合または相互作用することが可能な化学物質を設計、選択および合成するために、種々の分子設計および解析技術の使用を許可し、ここで該化学物質は、ＩＬ−１３の阻害剤、活性化剤、アゴニストまたはアンタゴニスト、あるいはＩＬ−４ＲαのようなＩＬ−１３の受容体を包含し、これには限定されないタンパク質に結合するＩＬ−１３として潜在的に作用する。
【００３５】
より特に本発明は、その構造が未知の分子または分子複合体の溶液を得る段階、その後該分子または分子複合体の溶液からＮＭＲデータを生成する段階を含む、その構造が未知の分子または分子複合体の分子構造を決定するための方法を提供する。その構造が未知の分子または分子複合体からの該ＮＭＲデータは、その後本発明のＩＬ−１３溶液から得られる溶液構造データと比較される。その後、２Ｄ、３Ｄおよび４Ｄアイソトープフィルタリング、編集ならびに３重共鳴ＮＭＲ技術が使用され、該溶液分子または分子複合体からの該ＮＭＲデータへ、本発明のＩＬ−１３溶液から決定された３次元構造を立体配座させる。あるいは、分子置換が、この未知の分子または分子複合体の結晶からのＸ線回折データへ、本発明のＩＬ−１３溶液構造を立体配座させるのに使用されてもよい。
【００３６】
分子置換は、未知の結晶性試料の構造をモデリングするための開始点として、既知の構造を持つ分子を使用する。この技術は、類似の構造、方向および位置を持つ２つの分子は同様にＸ線を回折するであろうという原理に基づいている。対応する分子置換へのアプローチは、ＮＭＲ技術を使用して、未知の溶液構造をモデリングするのに適用可能である。２つの類似の分子に関するＮＭＲスペクトルおよび該ＮＭＲデータの結果的に得られる解析は、構造的に保存されているタンパク質の領域に関しては本質的に同一であろう。ここで該ＮＭＲ解析は、水素結合、距離、２面角、結合定数、ケミカルシフトおよび双極結合定数の制約を含有してもよいＮＭＲ共鳴の帰属および構造の制約の帰属を得ることからなる。この２つの構造のＮＭＲスペクトルにおいて観測された違いは、この２つの構造間の違いを際立たせ、この構造の制約において対応する違いを同定するであろう。未知の構造に関しての構造決定過程は、既知の構造からのこのＮＭＲの制約の修飾にその後基づいて、該ＮＭＲスペクトル間に観測されたスペクトルの違いと一貫している。
【００３７】
従って、本発明の１つの非限定的な実施形態においては、ＩＬ−１３溶液に関する共鳴の帰属は、新しいＩＬ−１３：「溶解されていない物質」の複合体における、ＩＬ−１３の共鳴の帰属にとっての開始点を提供する。２次元15Ｎ／1Ｈスペクトルにおけるケミカルシフトの摂動は、このＩＬ−１３溶液およびこの新しいＩＬ−１３：物質複合体の間に観測され、比較され得る。このようにして、この影響を受けた残基は、図８または９の関連構造座標により提供されるような、ＩＬ−１３の３次元構造と関連付けられてもよい。これは、天然のＩＬ−１３構造に関した構造的な変化を起こした該ＩＬ−１３：物質複合体の領域を同定する。ＩＬ−１３の配列の主鎖および側鎖両方のアミノ酸の帰属に対応する1Ｈ、15Ｎ、13Ｃおよび13ＣＯのＮＭＲ共鳴の帰属がその後得られてもよく、この新しいＩＬ−１３：物質複合体の３次元構造が、対照としてＩＬ−１３溶液構造、共鳴の帰属および構造的な制約を使用する標準的な２Ｄ、３Ｄおよび４Ｄ３重共鳴ＮＭＲ技術ならびにＮＭＲ帰属の方法論を使用して生成されてもよい。ＩＬ−１３の３次元モデルを伴ったこの新しい物質の種々のコンピュータによる適合化解析が、ＩＬ−１３と複合体化されたこの新しい物質の初期の３次元モデルを生成させるために実行されてもよく、この結果得られる３次元モデルは、ＩＬ−１３の３次元構造と会合しているこの新しい物質を位置付け方向付けるために、標準的な実験条件およびエネルギー最小化技術を使用して洗練されてもよい。
【００３８】
本発明は、本発明の構造座標が、分子または分子複合体の未知の３次元構造を決定するために、標準的な相同性モデリング技術と共に使用されてもよいことを更に提供する。相同性モデリングは、１つ以上の関連タンパク質分子、分子複合体、またはこれらの部分（例えば、活性部位）を使用して、未知の構造のモデルを構築することを含む。相同性モデリングは、特に本明細書中の図８または９により提供される関連（例えば相同な）構造座標を使用して、その構造が既知の分子中の相同的な構造エレメントの３次元構造へと溶解されるタンパク質の共通または相同的な部分を適合させることにより遂行されてもよい。相同性は、アミノ酸配列の同一性、相同的な２次構造エレメント、および／または相同的な３次の折りたたみを使用して決定されてもよい。相同性モデリングは、アミノ酸（または他の成分）の置換を有する３次元構造の一部または全部を、溶解されるべきその関連構造のそれにより再構築することを包含し得る。
【００３９】
従って、この未知の分子または分子複合体に関する３次元構造は、本発明のＩＬ−１３分子の３次元構造を使用して生成され、当業界においてよく知られた数多くの技術を使用して洗練され、その後本発明の構造座標として同じ様式において、例えば分子置換解析、相同性モデリング、および合理的な薬剤設計を含む適用において使用されてもよい。
【００４０】
ＩＬ−１３の３次元構造、受容体へのその結合部位、および他の結合部位の決定は、ＩＬ−１３の阻害剤、活性化剤、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用してもよい物質の合理的な同定および／または設計について重要である。このような物質を同定する唯一の方法が、標的化合物への所望の阻害効果を持つ物質が同定されるまで、何千もの試験化合物をスクリーニングすることである従来の薬剤アッセイ技術を凌駕して、これは有利である。必然的に、このような従来のスクリーニング方法は高価であり、時間を消費し、標的化合物上でのこの同定された物質の作用の方法を明らかにしない。
【００４１】
しかしながら、Ｘ線の、分光学の、およびコンピュータモデリングの進んだ技術は、研究者が、標的化合物（すなわちＩＬ−１３）の３次元構造を視覚化できるようにした。このような３次元構造を使用して、研究者は推定結合部位を同定し、その後これらの結合部位と相互作用する物質を同定または設計する。これらの物質は、該標的分子への阻害効果に関して、その後スクリーニングされる。このようにして、所望の活性に関してスクリーニングされる物質の数が大きく抑制されるだけでなく、標的化合物上での作用の機構が、よりよく理解される。
【００４２】
従って本発明は、図８または９の相対構造座標により定義されるようなＩＬ−１３の３次元構造を生成する段階、およびＩＬ−１３と相互作用する物質を同定、設計または選択するためにその３次元構造を使用する段階を含むＩＬ−１３と相互作用する物質を同定するための方法を更に提供する。前記阻害剤は、適切なデータベースをスクリーニングすることにより選択されてもよく、適切なソフトウェアプログラムと共に、空のＩＬ−１３またはＩＬ−１３複合体の活性部位の立体配置および電荷ポテンシャルを解析することにより新規に設計されてもよく、あるいは「ハイブリッド」物質を創出するために、既知の物質の特徴を使用して設計されてもよい。
【００４３】
ＩＬ−１３またはＩＬ−１３複合体の活性部位と相互作用または会合する物質は、ＩＬ−１３の３次元構造から活性部位を決定すること、および該活性部位と相互作用または会合する物質を同定するためにコンピュータによる適合化を実行することにより同定されてもよい。コンピュータによる適合化解析は、（ａ）結合部位の相同性モデリングまたは原子構造座標を使用して、分子または分子複合体の推定活性部位の３次元モデルを生成すること、および（ｂ）該推定活性部位およびこの同定された物質間の会合の度合いを決定することにより、該推定活性部位およびこの同定された物質間の「適合」を評価する、種々のコンピュータソフトウェアプログラムを利用する。この会合の度合いは、幾つかの市販のソフトウェアプログラムによりコンピュータを用いて決定されてもよく、標準的な結合アッセイを使用して実験的に決定されてもよい。
【００４４】
該推定活性部位の３次元モデルは、当業界において既知の数多くの方法のいずれか１つを使用して生成されてもよく、結晶学的または分光学的技術を使用して生成された生の構造座標データのコンピュータ解析同様、相同性モデリングを包含してもよいが、これらに限定されるものではない。このような３次元モデルを生成し、および／またはこの必要な適合化解析を実行するために使用されるコンピュータプログラムは、GRID(Oxford University, Oxford, UK); MCSS(Molecular Simulations, San Diego, CA); AUTODOCK(Scripps Research Institute, La Jolla, CA); DOCK(University of California, San Francisco, CA); Flo99(Thistlesoft, Morris Township, NJ); Ludi(Molecular Simulations, San Diego, CA); QUANTA(Molecular Simulations, San Diego, CA); Insight(Molecular Simulations, San Diego, CA); SYBYL(TRIPOS, Inc., St. Louis. MO); および LEAPFROG(TRIPOS, Inc., St. Louis, MO) を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、図８または９によるＩＬ−１３のアミノ酸残基Ａ９、Ｅ１２、Ｅ１５、Ｅ１６およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下、好ましくは１．０Å以下、および最も好ましくは０．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む３次元構造により特徴付けられる活性部位の使用を包含する。もう１つ別の実施形態においては、活性部位は、図８または９によるＩＬ−１３のアミノ酸残基Ｉ５２、Ｑ６４、Ｒ６５およびＭ６６の相対構造座標（±該アミノ酸の保存されている主鎖原子からの１．５Å以下、好ましくは１．０Å以下、および最も好ましくは０．５Å以下の２乗平均平方根偏差）を含む３次元構造により特徴付けられる。本発明の方法が、結果的に前述の２乗平均平方根偏差内の図８または９における対応する残基の同じ構造座標になる前述のアミノ酸の保存されている置換を含む、追加的な実施形態を包含することが理解される。
【００４６】
ＩＬ−１３またはＩＬ−１３複合体に関するコンピュータによる適合化解析により同定されるこのような物質の効果は、コンピュータを用いて、あるいは拮抗結合実験により、またはこの同定される物質をＩＬ−１３（またはＩＬ−１３複合体）と接触させることおよび標的の生物学的活性への該物質の効果を測定することにより、実験的に更に評価されてもよい。標準的なアッセイが実行され、この結果が、該物質がＩＬ−１３活性の活性化剤、阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニストであるかどうか決定するために解析されてもよい（例えば、該物質が、ＩＬ−１３および関連結合タンパク質間の結合親和性を抑制または妨げてもよい）。
【００４７】
ＩＬ−１３と相互作用するように設計または選択される物質は、好ましくは種々の共有および／または非共有分子相互作用を介して、物理的および構造的にＩＬ−１３と会合可能であり、ならびにＩＬ−１３の関連活性部位を補完する３次元立体配置および方向を仮定することが可能である。
【００４８】
従って、これらの基準、本明細書中で開示されているようなＩＬ−１３分子の構造座標、および／または分子置換もしくは相同性モデリングを使用してこれから派生される構造座標を使用して、既知の阻害剤の構造を修飾すること、またはＩＬ−１３の活性部位の３次元立体配置および静電ポテンシャルのコンピュータ検査を介して新しい物質を新規に設計することにより、既知の阻害剤の潜在能力および選択性のいずれかまたは両方を増加させるように、物質が設計されてもよい。
【００４９】
従って、本発明の１つの実施形態において、本発明の図８または９の構造座標、あるいはこれから前に議論されたような分子置換または相同性モデリング技術を使用して派生される構造座標が、ＩＬ−１３活性の潜在的な活性化剤、阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用してもよい物質に関するデータベースをスクリーニングするのに使用される。特に、本発明から得られた構造座標は、ソフトウェアのパッケージ中へ読み込まれ、該３次元構造がグラフを用いて解析される。数多くのコンピュータソフトウェアパッケージが、構造座標の解析用に使用されてもよく、Sybyl (Tripos Associates), QUANTA および XPLOR (Brunger, A. T., (1994) X-Plor 3.851: a system for X-ray Crystallography および NMR. Xplor Version 3.851 New Haven, Connecticut: Yale University Press) を包含するが、これらに限定されるものではない。追加的なソフトウェアプログラムが、結合および原子の型のような特徴に関して、該座標の修正に関してチェックを行う。必要な場合は、該３次元構造は修飾され、その後該構造パラメータの全てがそれらの平衡／最適値に来るまで、適切なソフトウェアを使用して、エネルギー最小化される。このエネルギー最小化された構造は、本来の座標およびエネルギー最小化された座標間の有意な偏差がないことを確実にするために、この本来の構造に対して重ね合わされる。
【００５０】
「溶解された」物質に結合するＩＬ−１３のエネルギー最小化座標がその後解析され、この溶解されたリガンドおよびＩＬ−１３間の相互作用が同定される。結合部位の空洞の解析のために、ＩＬ−１３およびこの溶解された物質の幾つかの残基のみが残されるようにこの溶解された物質をグラフ上で除去することにより、最終的なＩＬ−１３の構造が修飾される。ＱＳＡＲおよびＳＡＲ解析および／または立体配座解析は、どのように他の阻害剤がこの溶解された阻害剤に対応するかを決定するために行われてもよい。この溶解された物質は、占有体積および距離拘束クエリーを創出するソフトウェアを検索のために使用して、データベース検索するためのテンプレートとして使用される複合体化されていない構造の結合部位中へ結合されてもよい。ヒットとしての資格を取る構造は、当業界において既知の標準的なアッセイおよび他の方法を使用して、活性に関してその後スクリーニングされる。
【００５１】
更に、一旦この溶解された物質間で特異的な相互作用が決定されると、異なる物質とのドッキングスタディが、ＩＬ−１３に結合される新しい物質の初期モデルの生成に備えられる。これらの新しいモデルの統合は、分子動力学的方法を使用する制約立体配座解析を包含する数多くの方法で評価されてもよい（例えば、ここでＩＬ−１３および結合された物質の両方が、最も好ましい状態が達せられるかまたは該タンパク質およびこの結合された物質間に存在することが見出されるまで、異なる３次元立体配座の状態を試料とするようにされる）。該モデルが、測定される結合親和性に基づいて、既知の実験的ＳＡＲに従うことを確実にするために、該分子動力学解析により提案されるようなこの最終的な構造が、視覚的に解析される。一旦モデルがＩＬ−１３に結合された本来の溶解された物質およびＩＬ−１３に結合された他の分子のコンピュータモデルから得られると、阻害剤の活性を改善および／または阻害剤の選択性を促進する阻害剤への修飾を設計するために、戦略が決定される。
【００５２】
一旦ＩＬ−１３結合物質が前記のように最適に選択または設計されてしまうと、その選択性および結合特性を改善または修飾するために、その原子または側鎖基の幾つかにおいて、その後置換がなされてもよい。一般的に、初期の置換は保存され、つまり該置換基は、本来の基とおおよそ同じ大きさ、形、疎水性および電荷を持つであろう。このような置換された化学的な化合物は、前に詳細に記載された同じコンピュータの方法により、ＩＬ−１３に適合する効率についてその後解析されてもよい。
【００５３】
アゴニスト／アンタゴニスト設計に関し、タンパク質のＮＭＲの構造解析のために使用されてもよい数多くのコンピュータソフトウェアパッケージがある。この場合、Tripos Associates からのソフトウェアパッケージ Sybyl v.6.4+ 〜 v.6.5+、MSI からの QUANTA97 (Version 97.1003)、XPLOR (Version 3.840) が使用されてもよい。一旦座標がＮＭＲにより決定されてしまうと、数多くの段階が、以下にリストアップされるように採用される。
【００５４】
１．本来の座標が該ソフトウェアパッケージ中へ読み込まれ、構造（３Ｄ）がグラフ上解析される。加えて、ＱＵＡＮＴＡ内のプログラムが、このような結合および原子の型のような特徴に関して、ＮＭＲ座標の修正に関してチェックを行う。
２．（必要な場合は）修飾された構造が、全ての構造パラメータがそれらの平衡／最適値に来るまで、該ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭｍを使用してエネルギー最小化される。
３．このエネルギー最小化構造は、本来の座標および最小化された座標間に有意な偏差がないことを確実にするために、本来のＮＭＲ構造に対して重ね合わされる。
４．天然タンパク質複合体が解析され、天然のリガンドおよび該タンパク質間の相互作用が同定される。この複合体化されていない構造の結合部位は、潜在的なアゴニスト／アンタゴニストにより使われてもよい面積に関して、この複合体化された構造の結合部位と比較される。
５．天然のリガンドに結合された最終的なタンパク質の構造は、該天然リガンドを除去することにより修飾され、それで、該タンパク質および該天然リガンドの幾つかの残基だけが、該結合部位の空洞の解析用に残される。該天然リガンドの残基は、SYBYL/UNITY データベース検索用のテンプレートとして使用される、この複合体化されていない構造の結合部位中へ結合される。
６．SYBYL/UNITY は、構造データベースを検索するための占有体積および距離拘束クエリーを創出するのに使用される。「ヒット」としての資格を取る構造が、活性に関してスクリーニングされる。
７．一旦新しいリガンドおよび該タンパク質の構造間で特異的なリガンド−タンパク質相互作用が決定されると、異なる一連のコンピュータ中のリガンドおよびＩＬ−１３の間で、ドッキングスタディが行われてもよい。この部分は、新しいリガンドのＩＬ−１３とのモデリングされた初期の複合体を我々に与える。
【００５５】
このモデリングされた新しいＩＬ−１３−リガンド複合体の統合に関してチェックを行うために、異なる手順が使用されてもよい。この場合、制約立体配座解析が、分子動力学的方法を使用して行われる。このモデリングの過程において、最も好ましい状態が達せられるかまたはタンパク質および阻害剤の間に存在することが見出されるまで、タンパク質およびこの複合体化されたリガンド両方が、異なる３Ｄ立体配座の状態を試料とするようにされる。測定される結合親和性に基づいて、このモデリングされた複合体が、既知の実験的ＳＡＲに従うことを確実にするために、該分子動力学的方法により提案されるような最終的な構造が、視覚的に解析される。
更に、アゴニスト／アンタゴニスト設計は、ＩＬ−１３結合鎖またはＩＬ−４Ｒα結合状態の利点を取ってもよい。加えて、ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒα界面の詳細は、この結合領域においてＩＬ−１３またはＩＬ−４Ｒαに効果的に結合するリガンドを設計するのに使用されてもよい。また、ＩＬ−４Ｒαを動員することが要求されるＩＬ−１３結合鎖を結合させる際のＩＬ−４における立体配座の変化は、固有のＩＬ−１３活性に影響を及ぼすこの構造的な変化を阻害または促進するリガンドを設計することにおいて利用されてもよい。ＩＬ−１３に結合される天然のリガンドおよび／または他のリガンドのコンピュータモデルが一旦決定されてしまうと、該モデルに基づいた結合および／または活性を改善するリガンドへの修飾が設計され得る。
【００５６】
種々の分子解析および合理的な薬剤設計技術が、その内容が本明細書中で援用される WO99/09148 として公開されたＰＣＴ出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６８７９同様、米国特許第５，８３４，２２８号、米国特許第５，９３９，５２８号、および米国特許第５，８６５，１１６号において、更に開示されている。
【００５７】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。この以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより充分に例示するために提示され、如何なる方法においても本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５８】
［実施例１］
［Ａ．方法および方法］
一様な15Ｎおよび13Ｃラベルされた１１３個のアミノ酸のＩＬ−１３が、以下のようにして得られた。大腸菌コドンの使用を最適化し、５’末端にてＡＴ含量を増加させたサイレントな変更により、ＩＬ−１３の成熟分泌部分をコード化するｃＤＮＡが再構築された。該遺伝子は Escherichia coli BL21 (DE3) における発現のために、T7-lac ベクター pRSET 中へサブクローニングされた。成長および発現は、３７℃にて、13Ｃ−グルコースおよび／または15Ｎ−硫酸アンモニウムで補われた最小培地を有する振とうフラスコ中で行われた。該タンパク質は、本質的に完全に不溶性であった。細胞はマイクロ流動化器で壊され、不溶性のＩＬ−１３が集められて、５０ｍＭのＣＨＥＳ（ｐＨ９）、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＤＴＴ中、約２ｍｇ／ｍｌにて溶解された。この溶液は、５０ｍＭのＣＨＥＳ（ｐＨ９）、３Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭの酸化グルタチオンへ２０倍に希釈され、５０ｍＭのＣＨＥＳ（ｐＨ９）、１００ｍＭのＮａＣｌの１０容量に対して２回、２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）の１０容量に対して１回透析された。遠心分離による清澄化後、ＩＬ−１３はＳＰ−セファロースへと吸着され、ＭＥＳ緩衝液中のＮａＣｌ勾配で溶出された。最終的な精製は、Superdex 75 上での４０ｍＭのリン酸ナトリウム、４０ｍＭのＮａＣｌ中でのゲルろ過クロマトグラフィーによった。
【００５９】
ＮＭＲ試料は、ｐＨ６．０にて、９０％Ｈ2Ｏ／１０％Ｄ2Ｏまたは１００％Ｄ2Ｏの中で、４０ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭのＮａＮ3、４０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中に、１ｍＭのＩＬ−１３を含有した。全てのＮＭＲスペクトルは、３重共鳴勾配プローブを装着された Bruker DRX 600 分光計において２５℃にて記録された。スペクトルは、NMRPipe ソフトウェアパッケージ (Delaglio et al., 1995) を使用して加工され、PIPP (Garrett et al., 1991) で解析された。
【００６０】
1Ｈ、15Ｎ、13ＣＯ、および13Ｃ共鳴の帰属は、以下の実験に基づいている：ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＣＢＣＡＮＨ、Ｃ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＨＢ、ＨＮＣＯ、ＨＮＨＡ、ＨＮＣＡおよびＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ（総説として Bax et al., 1994; Clore および Gronenborn 参照）。ＩＬ−１３のＮＭＲの帰属の精度は、構造計算の間15Ｎで編集されたＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣスペクトル中の連続ＮＯＥにより、13Ｃで編集されたＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣおよび15Ｎで編集されたＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣスペクトル中で観測されたβ鎖間のＮＯＥにより、更に確定された。
【００６１】
本構造は、以下の一連のスペクトルから決定される、実験的な距離およびねじれ角拘束に基づいている：ＨＮＨＡ（Vuister および Bax, 1993）、ＨＮＨＢ（Archer et al., 1991）、ＨＡＣＡＨＢ−ＣＯＳＹ（Grzesiek et al., 1995）、３Ｄ15Ｎ−（Marion et al., 1989; Zuiderweg および Fesik, 1989）および13Ｃ−編集ＮＯＥＳＹ（Ikura et al., 1990; Zuiderweg et al., 1990）。この15Ｎ−編集ＮＯＥＳＹおよび13Ｃ−編集ＮＯＥＳＹ実験は、それぞれ１００ｍｓおよび１２０ｍｓの混合時間で収集された。
【００６２】
β−メチレンの立体特異的帰属およびχ１ねじれ角拘束は、このＨＡＣＡＨＢ−ＣＯＳＹ実験からの3Ｊαβ結合定数（Grzesiek et al., 1995）およびこのＨＮＨＢ実験からの3ＪNβ結合定数（Archer et al., 1991）の大きさの定性推定値からまず得られた。バリンのγ−メチルの立体特異的帰属は、内部残基のＮＨ−ＣγＨおよびＣαＨ−ＣγＨのＮＯＥの相対強度からなされた（Zuiderweg et al., 1985）。ロイシンおよびイソロイシンのχ２ねじれ角拘束ならびにロイシンのδ−メチル立体特異的帰属は、13Ｃ−13Ｃ−ロングレンジ結合定数（Bax および Pochapsky, 1992）および分子内ＮＯＥの相対強度（Powers et al., 1993）からまず得られた。このφおよびψねじれ角拘束は、このＨＮＨＡ実験（Vuister および Bax, 1993）から、およびＴＡＬＯＳプログラム（Cornilescu et al., 1999）を使用するケミカルシフト解析から測定された3ＪNHα結合定数から得られた。このφ、ψおよびχねじれ角拘束に用いられた最小の範囲は、それぞれ±３０°、±５０°および±２０°であった。この３Ｄ15Ｎ−および13Ｃ−編集ＮＯＥＳＹ実験から帰属されたこのＮＯＥは、非立体特異的に帰属が中央に平均化するために適切に修正されていない場合の（Wuthrich et al., 1983）プロトン間の距離の拘束に対応して、強い、中庸、弱い、および非常に弱い、にクラス分けされた。
【００６３】
この構造は、3ＪNHα結合定数についての偽のポテンシャル（Garrett et al., 1994）、２次13Ｃα／13Ｃβケミカルシフト拘束（Kuszewski et al., 1995）、回転の半径（Kuszewski et al., 1999）および立体配座データベースポテンシャル（Kuszewski et al., 1996; Kuszewski et al., 1997）を取り込むように適応され、プログラムＸＰＬＯＲ（Brunger, 1993）を使用する小さい修飾（Clore et al., 1990）を伴った Nilges et al., (1988c) の距離幾何学−動力学ハイブリッドシミュレーションアニール化方法を使用して計算された。拘束最小化およびシミュレーションアニール化の間最小化される標的の機能は、共有幾何学、3ＪNHα結合定数および２次13Ｃα／13Ｃβケミカルシフト拘束に関する２次調和項、実験的距離、回転の半径およびねじれ角拘束に関する４角い窪みの２次ポテンシャル、ならびに非結合接触に関する４次のファンデルワールス項のみを含む。全てのペプチド結合は、平面状およびトランス状に制約された。この標的機能には、水素結合性、静電的、または６〜１２のレナード−ジョーンズの経験的なポテンシャルエネルギー項はなかった。この回転の半径は、高分解能ｘ線構造解析から経験的に決定された（Kuszewski et al., 1996）関係を使用し、残基の数に基づいて合理的な精度で予測可能である。立体配座データベースに関しての力の定数および回転ポテンシャルの半径は、このシミュレーションを通して相対的に低く保たれ、この実験的距離およびねじれ角拘束が、結果的に得られる構造上優占的な影響であるようにされた。ＮＯＥおよび２面拘束に関する力の定数は、立体配座データベースおよび半径の回転ポテンシャルに関して使用された力の定数よりも、それぞれ３０倍および１０倍強かった。
【００６４】
自由なＩＬ−４、およびＩＬ−４／ＩＬ４Ｒα複合体中のＩＬ−４を用いたＩＬ−３の溶液構造の重ね合わせは、Ｑｕａｎｔａ（Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA）を用いて達成された。立体的な衝突を除くためのＩＬ−３側鎖の最小化は、ＣＨＡＲＭＭ（Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA）を用いて達成された。ＩＬ−１３およびＩＬ−４の構造中のへリックス間の角および軸距離の測定は、ＩＮＴＥＲＨＬＸを使用して決定された。
【００６５】
シミュレーションされた３０の最終的なアニール化構造および拘束最小化平均構造に関する原子座標、ならびにＩＬ−１３のＮＭＲのケミカルシフトの帰属は、それぞれ RCSB Protein Data Bank (PDB ID: 1ijz および liko) および BioMagResBank (BMRB-5004) に寄託されている。
【００６６】
［Ｂ．結果および議論］
［１．ＩＬ−１３のＮＭＲ構造］
ＮＭＲにより該タンパク質に関する高分解能溶液構造の決定を可能にした殆ど完全な主鎖および側鎖の1Ｈ、15Ｎ、13Ｃおよび13ＣＯの帰属が、ＩＬ−１３に関して得られた（図１）。このＩＬ−１３の構造は、該ＮＭＲデータによりよく定義され、ここで合計２８４８の制約が、該構造を洗練するのに使用された（図２）。これは、図３において示されるような主鎖原子の最も適合した重複像により明らかであり、ここで、残基１〜１１３に関する平均座標位置についての３０のシミュレーションされたアニール化構造の原子ｒ．ｍ．ｓ．分布は、主鎖原子に関して０．４３（±０．０４）Åである（表１）。非グリシン残基に関する全ての主鎖ねじれ角は、ラマチャンドランプロットの期待される領域内にあり、ここで８９．９％の残基は、ラマチャンドランφ、ψプロットの最も好ましい領域内にあり、９．１％は追加的に許される領域中にあり、および１．０％は寛容的には許される領域中にある。ＩＬ−１３のＮＭＲ構造の高い質は、ＰＲＯＣＨＥＣＫ解析の結果によっても明らかであり、ここで１００残基につき０．１５の全体のＧ−因子、０．９０の水素結合エネルギー、および１．８のみの悪い接触が決定された。ＩＬ−１３に関して計算されたこのＰＲＯＣＨＥＣＫパラメータは、〜１ÅのＸ線構造と共に得られる値と比較可能であり、該構造に関して相対的に高い質を示すが、固有の分解能は示さない（Laskowski et al., 1996）。
【００６７】
ＩＬ−１３タンパク質は、以前にＩＬ−４および類似のサイトカインに関して観測された、上−上−下−下の接続を伴った、期待された左巻きの４つのへリックスの束を採用している。この４つのへリックス領域は、残基６〜２２（αA）；４３〜５２（αB）；５９〜７０（αC）および９２〜１０８（αD）に対応する。この４つの逆平行なへリックスの対、αA−αC、αC−αB、αB−αDおよびαD−αA間で観測された角および軸の解離は、それぞれ−１６１．７°および１１．３Å、−１４７．７°および９．２Å、−１６５．１°および１２．７Å、ならびに−１５０．３°および９．８Åである。この２つの平行なへリックスの対、αA−αBおよびαC−αD間の対応する値は、それぞれ３７．０°および１６．４Å、ならびに３３．４°および１４．２Åである。加えて、短いβシート領域が、残基３３〜３５（β1）および８９〜９１（β2）に対応するＩＬ−１３構造中に観測された。加えて、３つのシステイン残基に関する明確なＣβケミカルシフト（〜４２ｐｐｍ）が、ＩＬ−１３構造中の２つのジスルフィド結合の存在を確定した。Ｃ２９に関するＣβケミカルシフトは異常であり、ここでこのケミカルシフト（３４ｐｐｍ）は、酸化および還元形態の両方について、典型的な値の中−間にあった。このＣ２９〜Ｃ５７およびＣ４５〜Ｃ７１ジスルフィド結合の更なる同定が、ＩＬ−１３構造計算の間に同定された明確な分子間ＮＯＥにより決定された。特に、Ｃ２９Ｈα〜Ｃ５７Ｈβ、Ｃ２９Ｈβ〜Ｃ５７ＨβＮＯＥ、およびＣ４５Ｈα〜Ｃ７１Ｈβ、Ｃ４５Ｈβ〜Ｃ７１ＨβＮＯＥは、それぞれＣ２９〜Ｃ５７およびＣ４５〜Ｃ７１ジスルフィド結合を定義付けた。
【００６８】
ＩＬ−１３の構造に関する興味深い観測は、Ｃ２９の構造的近傍における残基に関する２Ｄ1Ｈ−15ＮのＨＳＱＣスペクトルにおけるケミカルシフトの不均一性の存在である。Ｃ２９およびＣ５７に引き続く残基に加えて、Ａ９３およびＡ９３に引き続く残基も、複雑な1Ｈ−15ＮのＨＳＱＣピークを呈した。主鎖のＮＨ共鳴の帰属以外は、これらの残基に関するスピン系ケミカルシフトの帰属の残りは、本質的に同一であった。より重要なことには、３Ｄ15Ｎ−編集ＮＯＥＳＹスペクトルは、この主鎖ＮＨの対角線上の複雑なピークに関して、同一のＮＯＥパターンおよび相対強度を呈した。これ故に、この２Ｄ1Ｈ−15ＮのＨＳＱＣスペクトルにおいて観測されたケミカルシフトの複雑さは、Ｃ２９の近傍における局所の立体配座の不均一性を示唆し、ここでＩＬ−１３の構造的な変化は、該構造の分解能およびＮＯＥ強度の変化に関する検出の限界内である。構造的な不均一性のあり得そうな源は、Ｃ２９〜Ｃ５７ジスルフィド結合を含む側鎖の２面角に関する複雑な立体配座の存在である。ジスルフィド結合に含まれる２つのシステインに関するＣα−Ｃα距離の解離は、直接的にこの側鎖の２面角に依存している（Richardson, 1981）。Ｃα−Ｃα解離に関する４．４〜６．８Åの距離の範囲は、ジスルフィド結合中で観測される２面角の典型的な値に関して観測されるが、０．１〜０．２Åのみの距離の変化は、側鎖の立体配座の対の間で共通である。最もあり得そうなのは、小さな距離の変化が、異なる側鎖の立体配座が結果的に僅かにＣ５７またはＡ９３により近くなったＣ２９をもたらすＩＬ−１３中に存在する不均一性の源である。Ｃ２９上に集まったこの立体配座の不均一性は、この残基に関する異常なＣβケミカルシフトを説明するかも知れない。
【００６９】
ＩＬ−１３の構造のもう１つ別の特徴は、この４つのへリックスに接続する３つの長いループの存在である。最も短いループは、へリックスαBおよびαCに接続し、残基Ｎ５３〜Ｓ５８を含む。この手を上から当てた２つの長い接続は、へリックスαAをαBと接続する残基Ｎ２３〜Ｇ４２、およびαCをαDと接続する残基Ｃ７１〜Ｅ９１に含まれる。これらのループは、近くで接触するようになって短いβ−シートを形成する。加えて、Ｃ２９〜Ｃ５７ジスルフィド結合は、ＡＢループをＢＣループに接続させる。この短いβ−シートおよびこのジスルフィド結合の組み合わせは、相対的によく定義されるこれらのループの領域を結果的にもたらす。この長いループの更なる安定性は、へリックスの束に対して該ループの一部の詰め込みを結果的にもたらすロングレンジの分子間ＮＯＥから生じる。
【００７０】
ＩＬ−１３の構造のもう１つ別の興味深い特徴は、αBのＮ−末端をαCのＣ−末端と効果的に接続するＣ４５〜Ｃ７１ジスルフィド結合の位置である。このＣ２９〜Ｃ５７ジスルフィド結合により更に安定化されるこの短いＢＣループによりαBおよびαCへリックスも接続されるので、このαBおよびαCへリックスの方向は、共有接続性により広く定義される。最終的な結果は、αBおよびαCへリックスを接続する閉じたループである。
【００７１】
［２．ＩＬ−１３およびＩＬ−４の溶液構造の比較］
潤沢なＩＬ−４に関する構造情報は、ＩＬ−４の構造に関する合理的な共通認識が得られた（Smith et al., 1994）ＮＭＲおよびＸ線結晶構造解析の両方により、以前に決定されている。これ故に、ＩＬ−４（ＰＤＢ ＩＤ：１ＢＢＮ）の単一溶液構造が、ＩＬ−１３のＩＬ−４との溶液構造間の比較を単純化するのに使用された（Powers et al., 1992; Powers et al., 1993）。ＩＬ−１３およびＩＬ−４両方の拘束最小化溶液構造に関するリボン図が、図４において示される。この２つのタンパク質の全体の折りたたみのトポロジーが大変似ている一方、この２つの構造間には明らかな区別がある。最初の区別は、この２つのタンパク質間の全体の大きさの違いである。ＩＬ−１３に関しての１１３に比較して、ＩＬ−４は合計１２９残基を含有する。これは、ＩＬ−１３に対して相対的に、長軸に沿って〜１２ÅのＩＬ−４構造の延長をもたらす。ＩＬ−４およびＩＬ−１３の構造間でのへリックスの長さにおける変動は、全体の大きさの違いと一貫している。ＩＬ−４における４つのへリックスの長さは、それぞれへリックスαA、αB、αCおよびαDについて１７、２３、２６および１６残基に対応する。逆にＩＬ−１３においては、へリックスαA、αB、αCおよびαDは、それぞれ１７、１０、１２および１７残基の長さを持つ。明らかに、最も断言される区別は、へリックスαBおよびαCの間にあり、ここでＩＬ−４のへリックスは、ＩＬ−１３の長さの２倍より長い。興味深いことに、これらのへリックス間のループ領域における同様の違いは見られなかった。ＩＬ−４およびＩＬ−１３の間のＡＢ、ＢＣおよびＣＤループの長さは、同一または殆ど同一であり、ここでＩＬ−１３中のループは、１〜２残基長い。同様に、ループＡＢおよびＣＤの一部を含む短いβ−シートの長さは、本質的に同一である。この２つのタンパク質構造間のもう１つ別の区別は、ジスルフィド結合の数および位置である。ＩＬ−４は、Ｎ−およびＣ−末端（Ｃ３〜Ｃ１２７）、ＡＢおよびＢＣループ（Ｃ２４〜Ｃ６４）、ならびにへリックスαB〜ループＣＤ（Ｃ４６〜Ｃ９９）を接続する合計３つのジスルフィド結合を持つ。逆にＩＬ−１３は、ＡＢおよびＢＣループ（Ｃ２９〜Ｃ５７）ならびにへリックスαB〜へリックスαC（Ｃ４５〜Ｃ７１）を接続する２つのジスルフィド結合しか含有しない。
【００７２】
２５％の配列相同性が、ＩＬ−１３およびＩＬ−４の間に存在する；しかしながら、この２つのタンパク質の最適な重複像は、分けられた２次構造エレメントのアライメントにより主に決定される。共通の２次構造エレメントおよびシステイン残基に基づいた、ＩＬ−１３およびＩＬ−４の溶液構造の重ね合わせは、１．４４Åの主鎖ｒ．ｍ．ｓ．を与える。ＩＬ−１３に関するＩＬ−４との主鎖原子の重ね合わせに沿った、分けられた２次構造エレメントおよびシステイン残基に基づいた配列アライメントが、図５において例示される。一般的に、前記ループ領域を包含するＩＬ−１３およびＩＬ−４間の重複像において、良い一致がある。にも関わらず、４つのへリックスの束の相対的な方向および詰め込みにおいて、この２つのタンパク質間に幾つかの明確な違いが存在し、ここでαBおよびαDは最大の変化を呈する。これは、へリックスαB−αD間のへリックス間の角において観測された２０°の違い、およびへリックスαA−αBおよびαC−αDに関しての軸の解離における反対方向への変化により例示される。このαA−αBの軸の解離は、それぞれＩＬ−１３およびＩＬ−４の間で、１６．４Åから１２．６Åへと減少する。逆に、このαC−αDの軸の解離は、ＩＬ−１３およびＩＬ−４の間で、１４．２Åから１６．７Åへと増加する。ＩＬ−１３におけるαBは最短のへリックスであり、ＩＬ−４中のαBの半分の長さなので、この観測された構造変化は、へリックスの長さにおけるこの変化によるものかも知れない。更に、ＩＬ−１３中のαBの相対的な方向は、このへリックスのＮ−末端およびＣ−末端両方において、ジスルフィド結合によっても定義される。ＩＬ−１３のＩＬ−４との比較は、αBにおける摂動に更に寄与しながら、保存されているシステインの部分的な空間アライメントのみが生じることを指し示している。ＩＬ−１３からのＣ５７の、ＩＬ−４からのＣ４６との相対的な方向との良い一致がある。より小さな程度まで、ＩＬ−１３からのＣ２９の位置取りは、ＩＬ−４からのＣ２４と一致する。しかし、ジスルフィドの対の他の一員の間には、相関は本質的にない。この違いは、ＩＬ−１３中のより短いαBおよびαCへリックスからもたらされ、そのＣ９９は、ＩＬ−１３に関してへリックスＣ中に位置されるＣ７１に比較されるＩＬ−４中のＣＤループ内に存在する。ＩＬ−１３およびＩＬ−４間の際立たされた違いにも関わらず、この２つのタンパク質に関しての該タンパク質の折りたたみの重なりが大変似ていることを強調することは、重要である。
【００７３】
［３．ＩＬ−１３受容体結合に関しての意味］
ＩＬ−４受容体α鎖に複合体化されたＩＬ−４の最近のＸ線結晶構造は、サイトカイン−受容体相互作用中への洞察を提供して来た。更に、潤沢な先行の変異作業は、該サイトカイン−受容体相互作用の特徴に属する追加的な情報を提供する。機能における強い重なりは、両方の受容体が同じＩＬ−４鎖を含有するという事実により更に例示されるＩＬ−１３およびＩＬ−４両方に関して存在する。これ故に、このタンパク質の折りたたみ、変異データ、およびＩＬ−４受容体／複合体中で観測された類似性の組み合わせは、ＩＬ−１３のその受容体との相互作用を調べるための枠組みを提供する。
【００７４】
変異および速度論的解析の組み合わせは、ＩＬ−４Ｒαの結合と関連するＩＬ−４の構造上の区別できる部位、およびγｃ鎖を介したシグナル伝達と関連する第２の部位を同定した（Wang et al., 1997, Kruse et al., 1993, Letzelter et al., 1998）。ＩＬ−４上のＩＬ−４Ｒα結合部位は、へリックスＡ（Ｉ５、Ｅ９、Ｔ１３）およびＣ（Ｋ７７、Ｒ８１、Ｋ８４、Ｒ８５、Ｒ８８、Ｎ８９、Ｗ９１）により形成される表面を含むアミノ酸と会合している。γｃ鎖を介したシグナル伝達と関連する第２の部位は、へリックスＡ（Ｉ１１、Ｎ１５）およびＤ（Ｒ１２１、Ｙ１２４、Ｓ１２５）中の残基に対応する。その反応性をＩＬ−１３Ｒに代替するＩＬ−１３上の同様の変異作業は、ＩＬ−１３に関して予測された２次構造に基づいて、へリックスＡ（Ｅ１２、Ｅ１５）、Ｃ（Ｒ６５、Ｓ６８）およびＤ（Ｒ１０８、Ｆ１１２）中のアミノ酸をも同定した（Thompson et al., 1999, Oshima et al., 2000）。この変異解析の結果は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３両方に関して、ＧＲＡＳＰ表面上へマッピングされた（図６ａおよび６ｃ）。この解析は、ＩＬ−４の結合部位と一致する潜在的なＩＬ−１３結合鎖およびＩＬ−１３上のＩＬ−４Ｒα結合部位を同定する。
【００７５】
ＩＬ−４Ｒαへ複合体化されたＩＬ−４のＸ線構造は、該タンパク質−受容体相互作用の特異性を更に説明する一方、ＩＬ−４上のα−鎖結合部位を同定することにおける以前の変異データを確定した（Hage at al., 1999）。ＩＬ−４からのへリックスαAおよびαCの表面は、ＩＬ−４ＲαのＬ−形構造に殆ど直角である。相補的な受容体のエピトープが、疎水性残基により囲まれた極性残基のクラスターから構成される一方、ＩＬ−４からの接触残基は、優占的に極性および荷電された残基である。残基の３つの区別できるクラスターが記載され、ここでＩＬ−４からのＥ９およびＲ８８が、それぞれクラスターＩおよびＩＩにおける焦点であり、ここでこれらの残基は、数多くのＩＬ−４Ｒα残基との水素結合およびイオン性結合中に含まれる。Ｅ９およびＲ８８の隣の数多くの追加的なＩＬ−４残基が、ＩＬ−４−受容体界面を完成させる。３番目のクラスターは、結合親和性に有意に寄与しない静電的相互作用としてまず記載されるが、複合体形成を容易にする。２次構造エレメントの相関にまず基づいた、ＩＬ−１３のＩＬ−４との主鎖原子の重なりは、構造に基づいた配列アライメントを確立する機構を提供した。ＩＬ−１３のＩＬ−４とのこの構造に基づいた配列アライメントは図４において示され、ここで前記変異データおよびＩＬ−４／受容体Ｘ線構造からの鍵となる接触残基両方がまとめられている。再び、ＩＬ−４の変異および構造接触データの間には明らかな一貫性があり、ここでＩＬ−１３の変異データは、この情報とよく相関している。ＩＬ−１３の構造のＩＬ−４との重なりは、ＩＬ−４Ｒαと複合体化されたＩＬ−１３のモデルを創出するために、同様の様式にてその後使用されてもよい。
【００７６】
このＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα複合体において、ＩＬ−１３のＩＬ−４との最もよく適合された重複像を創出することにより、ＩＬ−４Ｒαと複合体化されたＩＬ−１３の単純なモデルが得られる。共通の２次構造エレメントおよびシステイン残基に基づいた、ＩＬ−４／受容体Ｘ線構造からのＩＬ−１３のＮＭＲ構造のＩＬ−４との重なりは、１．５５Åの主鎖ｒ．ｍ．ｓを与えた。ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒα複合体の追加的な洗練は、ＩＬ−１３およびＩＬ−４Ｒα間の明らかな立体的衝突を除くための、ＩＬ−１３側鎖の立体配座の最小化に限定された。
【００７７】
ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒαモデルは、図７において例示される。ＩＬ−１３の一般的な相互作用がＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα複合体を近似することが、容易に明らかである。特に、へリックスαAおよびαCは、ＩＬ−４Ｒαに対しておおよそ直角に詰め込まれる（図７Ａ）。更に、ＩＬ−１３側鎖の枠組みのＩＬ−４Ｒαとの相互作用は、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα複合体中観測された相互作用のネットワークを真似ている。特に、ＩＬ−１３からのＥ１２は、ＩＬ−４からのＥ９の、ＩＬ−４ＲαからのＹ１３、Ｙ１８３およびＳ７０との結合ネットワークを真似るように位置される（図７Ｂ）。同様に、ＩＬ−１３からのＲ６５は、ＩＬ−４ＲからのＤ７２との潜在的な塩の架橋を形成するように、合理的に位置される（図７Ｃ）。この相互作用は、ＩＬ−４からのＲ８８の、ＩＬ−４ＲαからのＤ７２との相互作用と比較できる。ＩＬ−４／ＩＬ−４ＲαのＸ線構造と相対的なＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒαモデル間の区別は、Ｅ１２およびＲ６５のＩＬ−４Ｒαとの相互作用を補完する結合ネットワークの比較がなされる場合に明らかになる。ＩＬ−４を対照とすることにより、ＩＬ−４Ｒαと相互作用すると予測されるＥ１２の隣の残基は、ＩＬ−１３の残基Ａ９、Ｅ１５、Ｅ１６およびＭ６６からなる。これらの残基は、それぞれＩＬ−４からのＴ６、Ｋ１２、Ｔ１３およびＮ８９と相関し、Ｓ７０、Ｙ１８３、Ｙ１２７およびＡ７１と相互作用するであろう（図７Ｂ）。対応して、ＩＬ−４Ｒαに結合すると予測されるＲ６５の近くの残基は、ＩＬ−４の残基Ｒ５３、Ｎ８９およびＷ９１と相関するＩＬ−１３の残基Ｉ５２、Ｑ６４およびＭ６６を含む。これらのＩＬ−４残基は、ＩＬ−４ＲからのＦ４１およびＶ６９と相互作用することが示された（図７Ｃ）。幾つかの比較可能な相互作用が、ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒαモデル中に潜在的に存在する一方、これらの相互作用は、明らかに最適ではない。また、ＩＬ−１３のＩＬ−４Ｒαとの親和性に障害性の影響を持つと予測されるであろう幾つかの極性または電荷の変化が存在する。これは、静電ポテンシャルにより着色された（示されていない）ＩＬ−４およびＩＬ−１３に関するＧＲＡＳＰ表面の比較によっても明らかである。区別できる表面は、この２つのタンパク質によりＩＬ−４Ｒαに対して提示され、ここでＩＬ−４は、ＩＬ−１３に比較して相対的により高くマイナスに荷電された表面を提示している。逆に、ＩＬ−１３の表面は、幾つかのプラスの電荷の特徴を有するＩＬ−４に比較してより疎水的である。この解析は、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒ複合体と一貫している幾つかの鍵となる相互作用が存在している一方、ＩＬ−４ＲαとのＩＬ−１３の相互作用の幾つかの再配置が、２次相互作用を最適化し、ＩＬ−１３およびＩＬ−４間の残基の置換を調節するのに要求されるということを、ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒαモデルが予測することを示している。
【００７８】
ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒ複合体に基づいた、ＩＬ−１３およびＩＬ−４Ｒα間の明らかな副最適界面は、ＩＬ−４ＲαとのＩＬ−１３の実験的親和性およびＩＬ−４ＲとのＩＬ−４の集合機構の両方と一貫しているように思われる。ＩＬ−４ＲへのＩＬ−４の結合の順番は、以前に提案されている（Kondo et al., 1993, Russell et al., 1993）。第１に、ＩＬ−４は、高い親和性で（Ｋd＝２０〜３００ｐＭ）ＩＬ−４Ｒα鎖に結合する。この結果として得られる複合体は、共通のγＣ鎖をその後動員して、シグナル伝達ヘテロ２量体を形成する。ＩＬ−４Ｒα鎖との複合体形成の際、ＩＬ−４は、推定のγＣ鎖結合部位に局在化されている立体配座の変化を受ける（Wang et al., Kruse et al., Letzelter et al., Hage et al.）。仮定上、この観測されたＩＬ−４の立体配座の変化は、γＣ鎖結合に結合するために要求される。同様の機構が、ＩＬ−１３のその受容体との相互作用と一貫しているように思われる。
【００７９】
ＩＬ−１３は、ＩＬ−１３結合鎖の非存在下では、ＩＬ−４ＲまたはＩＬ−４Ｒα鎖に結合しないが（Zurawski et al., 1993）、相対的に高い親和性で（Ｋｄ〜４ｎＭ）ＩＬ−１３結合鎖（ＩＬ−１３Ｒα１）に結合する。ＩＬ−４に関して提案された引き続いての結合機構の後、ＩＬ−１３は、該ＩＬ−１３結合鎖にまず結合するように思われるであろう。この結果得られる複合体は、その後ＩＬ−４Ｒα鎖を動員し、シグナル伝達ヘテロ２量体を形成する。該ＩＬ−１３結合鎖との複合体形成の際、ＩＬ−１３は仮定上、それがＩＬ−４Ｒαに結合するようにするであろう立体配座の変化を受けるであろう。再び、この立体配座の変化は、ＩＬ−４と共に観測された変化におそらく似ていて、ＩＬ−１３のへリックスαAおよびαCにおける微妙な再配置をもたらす。ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒαモデルが、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒαと一貫した基礎的な相互作用のネットワークが存在していることを解き明かすので、おそらくへリックスの詰め込みにおける控え目な修飾のみが、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα複合体との比較可能な結合界面を確立し、ＩＬ−１３のＩＬ−４Ｒαとの親和性を改善するであろう。
【００８０】
【表１】
2005506960.tif 000002
【００８１】
これらの構造の表記は、以下の通りである：＜ＳＡ＞は、最終的な３０のシミュレーションされたアニール化構造であり；ＳＡの平均は、各々に最もよく適合された個々のＳＡ構造の座標を平均化することにより得られた平均の構造であり；（ＳＡの平均）rは、該平均構造のＳＡの平均の拘束最小化により得られた拘束最小化平均構造である（Nilges et al., 1988）。種々の拘束についての項の数は、括弧中で与えられる。
aいずれの構造も、０．２Åより大きい距離の違反、または１°より大きい２面角の違反を呈さなかった。
b主鎖ＮＨ−ＣＯの水素結合に関して、２つの拘束がある：ｒNH-O＝１．５〜２．３ÅおよびｒN-O＝２．５〜３．３Å。全ての水素結合は、ＮＨプロトンをゆっくり交換することを含む。
cねじれ角拘束は、１０４φ、１０５ψ、６６χ１、および２４χ２拘束を含む。
d４角い窪みのＮＯＥ（ＦNOE）およびねじれ角（Ｆtor）ポテンシャルの値は［Clore et al., (1986) 中の式２および３参照］、それぞれ５０ kcal mol-1Å-2および２００ kcal mol-1rad-2の力の定数を用いて計算される。４次のファンデルワールス斥力の項（Ｆrep）の値は［Nilges et al., (1988) 中の式５参照］、ＣＨＡＲＭＭ（Brooks et al., 1983）の経験的なエネルギー関数（Nilges et al., 1988, Nilges et al., 1988, Nilges et al., 1988）において使用される標準的な値の０．８倍に設定された剛体の球体のファンデルワールス半径を伴った４ kcal mol-1Å-4の力の定数を用いて計算される。
eＥL-Jは、ＣＨＡＲＭＭの経験的なエネルギー関数を用いて計算されるレナード−ジョーンズ−ファンデルワールスエネルギーであり、シミュレーションされたアニール化または拘束最小化に関する標的機能中には包含されない。
f残りのねじれ拘束は、平面性および不斉を維持するために働く。
gこれらは、ＰＲＯＣＨＥＣＫプログラム（Laskowski et al., 1996）を使用して計算された。
h正規の２次構造中の残基は：６〜２２（αA）、４３〜５２（αB）、５９〜７０（αC）、９２〜１０８（αD）、３３〜３５（βI）および８９〜９１（βII）である。
【００８２】
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【００８９】
以上のように本明細書中で述べられた全ての刊行物は、発効された特許、係続出願、出版物、タンパク質構造寄託、またはその他であるかどうかに関わらず、それらの全部を援用して本明細書の一部とする。明確にするおよび理解する目的のためにある程度詳細に前記発明が記載されているが、添付された請求の範囲中の本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細において種々の変更がなされ得るということが、この開示を読むことから当業者により理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、ＩＬ−１３のＥ６１〜Ｆ７０残基のアミドに関するＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨおよびＣＢＣＡＮＨスペクトルから取られた帯状プロットを表す。各アミドは、該ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨスペクトル中の該残基のＣαおよびＣβに関係し、その内部残基のＣαおよびＣβならびに該ＣＢＣＡＮＨスペクトル中の該残基のＣαおよびＣβの両方に関係する。残基間（ｉ−１）の関係は、実線によりマークされた観測された残基間の接続と共に指し示される。マイナスの等高線は、破線により指し示される。
【図２】図２は、このデータから演繹された２次構造を伴った、ＩＬ−１３に関して観測されたＮＨ、ＨαおよびＨβプロトンを含む配列およびミドルレンジのＮＯＥ、アミド交換および3ＪHNα結合定数データ、ならびに13Ｃαおよび13Ｃβ２次ケミカルシフトの概要である。線の太さは、該ＮＯＥの強さを反映している。Ｄ2Ｏへの交換後になお存在するアミドプロトンは、閉じた円により指し示される。Ｈα（ｉ）−ＮＨ（ｉ＋１）ＮＯＥとしての同線上の中が空の４角は、残基ｉのＨαプロトンおよびｉ＋１プロリンのＣδＨプロトン間の順続するＮＯＥを表し、トランスプロリンを指し示している。
【図３】図３は、１〜１１３残基に関する、ＩＬ−１３に関して決定された３０の最良の構造の、主鎖原子（Ｎ、Ｃ、Ｃ’）の最良に適合した重複像である。へリックスは、暗灰色として示されている。２つのジスルフィド結合が、それぞれＣ２９およびＣ５７、ならびにＣ４５およびＣ７１残基間に示されている。
【図４】図４（ａ）は、２次構造により着色されたＩＬ−１３のＮＭＲ構造のリボン図である（図２と同じ眺め）。図４（ｃ）は、ＩＬ−４（１ＢＢＮ）のＮＭＲ構造のリボン図である（Powers et al., 1992; Powers et al., 1993）。この眺めは、共通の２次構造エレメントおよびジスルフィド結合のアライメントに基づいたＩＬ−１３と同じである。図４（ｂ）および４（ｄ）は、それぞれＩＬ−１３およびＩＬ−４のＮＭＲのリボン図の上からの眺めを表し、へリックスの詰め込みおよび方向を例示している。この２次構造エレメントおよびジスルフィド結合に含まれるシステインは、ラベルされており図２と同様である。
【図５】図５（ａ）は、ＩＬ−１３およびＩＬ−４の拘束最小化平均ＮＭＲ構造の、主鎖原子（Ｎ、Ｃ、Ｃ’）の最良に適合した重複像である（Powers et al., 1992; Powers et al., 1993）。図５（ｂ）は、共通の２次構造エレメントおよびジスルフィド結合に基づいた、ＩＬ−１３のＩＬ−４との配列アライメントである。ＩＬ−４／ＩＬ４ＲαのＸ線構造（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＩＡＲ）（Hage et al., 1999）に基づいた、ＩＬ−４Ｒα結合部位中に含まれるＩＬ−４変異データおよび残基は、該配列の頂上部に指し示されている。該ＩＬ−１３変異データは、該配列の底部に指し示されている。ＩＬ−４Ｒα中に含まれるＩＬ−４残基、および変異解析により同定されたγC結合部位は、（*）および（＋）でそれぞれラベルされている。対応する変異データなしに、該Ｘ線構造からＩＬ−４Ｒα結合部位の一部として同定されるＩＬ−４残基は、（−）でラベルされている。ＩＬ−４Ｒα中に含まれるＩＬ−１３残基、および変異解析により同定されたＩＬ−１３結合鎖結合部位は、（＃）および（＆）でそれぞれラベルされている。該ＩＬ−４配列番号は頂上部にあり、該ＩＬ−１３配列番号は底部にある。
【図６】図６（ａ）および６（ｂ）は、それぞれＩＬ−４およびＩＬ−１３のＮＭＲ構造のＧＲＡＳＰ分子表面を表しており、ここにＩＬ−４Ｒαの親和性と関係する変異解析から同定される残基が示されている。前記γCまたはＩＬ−１３結合鎖（ＢＣ）と相互作用すると提案されている残基も示されている。変異したＩＬ−４Ｒα結合部位中の残基が、ラベルされている。
【図７】図７（ａ）は、ＩＬ−４／ＩＬ−４ＲαのＸ線構造（Hage et al., 1999）に基づいた、ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒαモデルを表している。共通の２次構造エレメントおよびシステインに基づいて、ＩＬ−１３をＩＬ−４上へ重ねることにより、ＩＬ−１３は、ＩＬ−４／ＩＬ−４ＲαのＸ線構造中のＩＬ−４と置き換わっている（図４参照）。ＩＬ−４Ｒαは分子表面として示され、ＩＬ−１３はリボン図として示されており、ここでへリックスは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとしてラベルされている。ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒα界面のみが例示されている。前記２次構造エレメントが、ラベルされている。図７（ｂ）は、ＩＬ−１３からのへリックスαAとの相互作用を指し示す、ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒα結合部位の拡大された眺めである。図７（ｃ）は、ＩＬ−１３からのへリックスαCとの相互作用を例示する、ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒα結合部位の拡大された眺めである。ＩＬ−４／ＩＬ−４ＲαのＸ線構造および変異データに基づいた、重要な残基に関する側鎖が示され、ラベルされている。ＩＬ−４Ｒαからの残基は、接頭辞「ｒ」でラベルされている。
【図８】図８は、多次元ＮＭＲ分光学により由来されるような、ＩＬ−１３の拘束最小化平均構造に関する原子構造座標を表にしている。「原子の型」は、その座標が測定されている原子に関する。「残基」は、その測定された各原子が、一部、つまり、アミノ酸、補助因子、リガンドまたは溶媒である残基の型に関する。「ｘ、ｙおよびｚ」座標は、測定された各原子の位置のデカルト座標を指し示している（Å）。
【図９】図９は、ＩＬ−１３／ＩＬ−４Ｒα受容体モデルの座標を提供している。「原子の型」は、その座標が測定されている原子に関する。「残基」は、その測定された各原子が、一部、つまり、アミノ酸、補助因子、リガンドまたは溶媒である残基の型に関する。「ｘ、ｙおよびｚ」座標は、測定された各原子の位置のデカルト座標を指し示している（Å）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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