(57)【要約】  新規なＧＡＶＥ７ポリペプチド、蛋白質および核酸分子を提供する。単離された完全長ＧＡＶＥ７蛋白質に加えて、単離されたＧＡＶＥ７融合蛋白質、抗原ペプチドおよび抗ＧＡＶＥ７抗体を教示する。ＧＡＶＥ７、組換え発現ベクター、前記発現ベクターを導入した宿主細胞およびＧＡＶＥ７遺伝子を導入したか、または破壊した非ヒトトランスジェニック動物を教示する。本発明の組成物を使用した診断方法、スクリーニング方法および治療方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＶＥ７（配列番号１）またはＧＡＶＥ７の変種のヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＧＡＶＥ７ポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸。
【請求項３】
ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびｃＤＮＡから成る群から選択された請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
ＧＡＶＥ７（配列番号１）のヌクレオチド配列の対立遺伝子変種を含む単離核酸。
【請求項５】
変種が付加、欠失または置換変異体をコードする請求項１に記載の単離核酸。
【請求項６】
配列内に機能が同等な少なくとも１個のアミノ酸残基をもたらす置換変異体をコードする請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
配列番号１に相補的であるか、または配列番号２をコードする核酸に相補的で、配列番号１の断片または配列番号２をコードする核酸の断片を含むハイブリダイゼーションプローブに厳密な条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸。
【請求項８】
アミノ酸配列が配列番号２と少なくとも３０％同一であるポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸。
【請求項９】
アミノ酸配列が配列番号２を含む精製ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２で示したような第３の細胞内ループを含む精製ポリペプチド。
【請求項１１】
発現調節領域に作動可能に結合した請求項１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１２】
発現調節領域が構成的、細胞特異的および誘導性調節配列から成る群から選択された請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項１４】
発現調節領域に作動可能に結合した請求項１に記載の核酸を含む培養細胞。
【請求項１５】
請求項１１に記載のベクターを構成する核酸によってコードされたポリペプチドを発現する、該ベクターで形質移入もしくは形質転換された培養細胞またはこの細胞の子孫。
【請求項１６】
真核細胞および原核細胞から成る群から選択された請求項１３に記載の培養細胞。
【請求項１７】
ベクターを構成する核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項１３に記載の細胞を培養することを含む蛋白質の産生方法。
【請求項１８】
ＧＡＶＥ７に特異的に結合する抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
患者にＧＡＶＥ７のアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストを投与することを含む、治療を必要とする患者のＧＡＶＥ７シグナル伝達活性またはシグナル伝達を調節する治療方法。
【請求項２１】
潜在的アゴニストをＧＡＶＥ７を発現する細胞と接触させること、および該潜在的アゴニストの存在下におけるＧＡＶＥ７のシグナル伝達活性が、該潜在的アゴニストの不在下におけるＧＡＶＥ７の活性に対して増加しているか否かを測定することを含むＧＡＶＥ７のアゴニストの同定方法。
【請求項２２】
潜在的逆アゴニストをＧＡＶＥ７を発現する細胞と接触させること、および該潜在的逆アゴニストの存在下におけるＧＡＶＥ７の活性が、該潜在的逆アゴニスト不在下におけるＧＡＶＥ７の活性に対して減少しているか否か、および内在性リガンドまたはアゴニストの存在下におけるＧＡＶＥ７の活性に対して減少しているか否かを測定することを含むＧＡＶＥ７の逆アゴニストの同定方法。
【請求項２３】
潜在的アンタゴニストをＧＡＶＥ７を発現する細胞と接触させること、および該潜在的アンタゴニストの存在下におけるＧＡＶＥ７のシグナル伝達活性が、内在性リガンドまたはアゴニストの存在下におけるＧＡＶＥ７の活性に対して減少しているか否かを測定することを含むＧＡＶＥ７のアンタゴニストの同定方法。
【請求項２４】
ＧＡＶＥ７シグナル伝達活性またはシグナル伝達を調節できるＧＡＶＥ７のアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストを含む治療組成物。
【請求項２５】
治療を必要とする患者に、ＧＡＶＥ７シグナル伝達活性またはシグナル伝達を調節できるＧＡＶＥ７のアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストを含む治療組成物を投与することを含む疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇ蛋白質結合受容体のＧＡＶＥ７に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇ蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞シグナル伝達に関与する膜内在性蛋白質の大きなファミリーである。ＧＰＣＲは、神経伝達物質、ホルモン、臭気物質および光を含めた様々な細胞外シグナルに応答して、細胞内で第２のメッセンジャー応答を開始するためにシグナルを伝達することができる。多くの治療薬がＧＰＣＲを標的とするのは、この受容体が炎症、血管拡張、心拍、気管支拡張、内分泌および蠕動運動を含めた多種多様な生理学応答を媒介するからである。
【０００３】
ＧＰＣＲは、細胞外ドメイン、７個の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを特徴としている。リガンドへの結合およびＧ蛋白質との相互反応などの受容体機能のいくつかは、重要な位置にある種のアミノ酸が存在することに関連する。ＧＰＣＲには、ロドプシンファミリー、セクレチン／グルカゴンファミリー、グルタミン酸ファミリーおよびフェロモンファミリーが含まれる。たとえば、様々な研究によって、ＧＰＣＲのアミノ酸配列の違いによって天然リガンドまたは小分子アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかへの親和性の違いが説明されることが示された。言い換えると、配列の小さな違いによって、結合親和性および活性の違いを説明することができる（たとえば、Ｍｅｎｇ他、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１（５０）：３２０１６〜２０、Ｂｕｒｄ他、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（５１）：３４４８８〜９５、およびＨｕｒｌｅｙ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９９）７２（１）：４１３〜２１を参照のこと）。特に、第３の細胞内ドメインのアミノ酸配列の違いによって活性の違いが生じ得ることが研究によって示された。Ｍｙｂｕｒｇｈ他は、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体の細胞内ループ３のアラニン２６１がＧ蛋白質結合および受容体内部移行に重要であることを発見した（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（１９９８）３３１（Ｐａｒｔ  ３）：８９３〜６）。Ｗｏｎｅｒｏｗ他は、チロトロピン受容体を研究して、第３の細胞内ループ内の欠失によって構成的受容体活性がもたらされることを示した（Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（１４）：７９００〜５）。
【０００４】
一般的に、内在性リガンドの受容体への結合作用によって受容体の細胞内ドメインの立体構造の変化がもたらされ、細胞内ドメインと細胞内成分、Ｇ蛋白質との結合が可能になる。Ｇq、Ｇs、Ｇi、ＧzおよびＧo（たとえば、Ｄｅｓｓａｕｅｒ他、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）（１９９６）９１（５）：５２７〜３７を参照のこと）などのいくつかのＧ蛋白質が存在する。受容体のＩＣ−３ループならびにカルボキシ末端がＧ蛋白質と相互作用する（Ｐａｕｗｅｌｓ他、Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ（１９９８）１７（１〜３）：１０９〜１３５およびＷｏｎｅｒｏｗ他、前記）。いくつかのＧＰＣＲは、Ｇ蛋白質に関しては「相手を選ばず」、すなわち、ＧＰＣＲは多数のＧ蛋白質と相互作用することができる（たとえば、Ｋｅｎａｋｉｎ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８８）４３：１０９５参照）。
【０００５】
Ｇ蛋白質と結合したリガンド活性化ＧＰＣＲは、シグナル伝達カスケードプロセス（「シグナル伝達」と称する）を開始する。このようなシグナル伝達は、最終的に細胞の活性化または細胞の阻害をもたらす。
【０００６】
ＧＣＰＲは、細胞膜内で、２種類の異なる構造、「不活性」状態と「活性」状態が平衡して存在している。不活性状態の受容体は、細胞内シグナル伝達経路に結合して、生物学
的応答を起こすことができない（シグナル伝達細胞における受容体の過剰発現中などの例外がある、たとえば、ｗｗｗ．ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ．ｅｄｕ／Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ／ｉｎｖｅｒｓｅ．ｈｔｍ．参照のこと）。活性状態へ立体配座を調節することによって、（Ｇ蛋白質を介した）伝達経路への結合が可能になり、生物学的応答が生じる。アゴニストが結合すると、活性な立体配座が極めて形成しやすくなる。しかし、ときどき、アゴニストがなくても既に相当な応答が生じている場合、このような受容体は構成的に活性であると言われる（すなわち、既に活性構造であるか、またはリガンドから独立しているか、または自発的活性状態である）。アゴニストをこのような系に付加すると、通常応答の増強が認められる。しかし、通常のアンタゴニストを付加すると、このような分子が結合しても何ら影響を及ぼさない。他方、いくつかのアンタゴニストは、受容体の構成的活性の阻害を引き起こすので、技術上後者の種類の薬剤はアンタゴニストではなく、負の固有活性を備えたアゴニストであることが示唆される。このような薬剤を、逆アゴニストと称する（ｗｗｗ．ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ．ｅｄｕ／Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ／ｉｎｖｅｒｓｅ．ｈｔｍ．）。
【０００７】
伝統的に受容体研究は、まず内在性リガンドを同定して、次にアンタゴニストおよびその他の受容体エフェクター分子を同定するための発見に進めるという想定から進められてきた。アンタゴニストが最初に発見されても、教義上の対応は内因性リガンドを同定することであった（ＷＯ００／２２１３１）。しかし、活性状態はアッセイスクリーニングに最も有用なので、このような構成的受容体、特にＧＰＣＲを得ることによって、内因性リガンドに関する情報がない場合に、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストを容易に単離することが可能になると思われる。さらに、受容体活性の障害から生じる疾患では、構成的活性の阻害を引き起こす、より具体的には有効に活性化した受容体の濃度を減少させる薬剤は、自発的活性化状態の受容体を使用したアッセイによってより容易に発見することができる。たとえば、疾患を治療するために患者に形質移入することができる受容体として、このような受容体の活性はこのようなアッセイによって発見された逆アゴニストで微調整することができる。
【０００８】
喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および関節リウマチ（ＲＡ）は一般的に、ヘルパーＴ細胞、単球−マクロファージおよび好酸球に関係した炎症が病因であると考えられる。コルチコステロイドによる現在の抗炎症治療は、喘息には効果的であるが、代謝および内分泌副作用と関係がある。肺または鼻粘膜から吸収され得る吸入製剤についても同様のことがおそらく当てはまるだろう。ＲＡまたはＣＯＰＤの満足のいく経口治療法は、現在のところ不十分である。
【０００９】
ＲＡは、病気に冒された滑膜に活性化マクロファージが蓄積することによって生じると考えられる。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、数多くの炎症誘発特性を備えた１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞由来サイトカインである。これは最も顕著なマクロファージ活性化サイトカインであり、クラスＩＩＭＨＣの遺伝子転写を誘導し、樹状細胞様表現型に寄与する。
【００１０】
リポ多糖類（ＬＰＳ）は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）放出を含めた炎症応答を生じさせるグラム陰性細菌の細胞壁の成分である。ＲＡにおける静脈内抗ＴＮＦα抗体治療の有効性は、臨床において示されてきた。ＣＯＰＤはまた、肺にマクロファージが蓄積することによって生じ、マクロファージは好中球化学誘因物質（たとえば、ＩＬ−８、ｄｅ  Ｂｏｅｒ他、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（２０００）１９０（５）：６１９〜６２６）を生じると考えられる。マクロファージおよび好中球はいずれも、肺胞壁の分解の原因となるカテプシンを放出させる。肺上皮組織は、炎症細胞化学誘因物質およびその他の炎症細胞活性化剤の重要な源であり得ると考えられる（たとえば、Ｔｈｏｍａｓ他、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０００）７４（１８）：８４２５〜８４３３、Ｌａｍｋｈｉｏｕｅｄ他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ（２０００）１６２（２  Ｐｔ．１）：７２３〜７３２、およびＳｅｋｉｙａ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１６５（４）：２２０５〜２２１３参照）。
【非特許文献１】Ｍｅｎｇ他、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１（５０）：３２０１６〜２０
【非特許文献２】Ｂｕｒｄ他、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（５１）：３４４８８〜９５
【非特許文献３】Ｈｕｒｌｅｙ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９９）７２（１）：４１３〜２１
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（１９９８）３３１（Ｐａｒｔ  ３）：８９３〜６
【非特許文献５】Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３（１４）：７９００〜５
【非特許文献６】Ｄｅｓｓａｕｅｒ他、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）（１９９６）９１（５）：５２７〜３７
【非特許文献７】Ｐａｕｗｅｌｓ他、Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ（１９９８）１７（１〜３）：１０９〜１３５
【非特許文献８】Ｋｅｎａｋｉｎ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８８）４３：１０９５
【非特許文献９】ｗｗｗ．ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ．ｅｄｕ／Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ／ｉｎｖｅｒｓｅ．ｈｔｍ
【特許文献１】ＷＯ００／２２１３１
【非特許文献１０】ｄｅ  Ｂｏｅｒ他、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（２０００）１９０（５）：６１９〜６２６
【非特許文献１１】Ｔｈｏｍａｓ他、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０００）７４（１８）：８４２５〜８４３３
【非特許文献１２】Ｌａｍｋｈｉｏｕｅｄ他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ（２０００）１６２（２  Ｐｔ．１）：７２３〜７３２
【非特許文献１３】Ｓｅｋｉｙａ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１６５（４）：２２０５〜２２１３参照
【特許文献２】欧州特許０１７１７０１号
【特許文献３】ＷＯ００／２２１２９
【特許文献４】米国特許第６１５０３９３号
【特許文献５】米国特許第６１４０５０９号
【非特許文献１４】Ｓａｍｂｒｏｏｋ他著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９
【非特許文献１５】「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６。３．１〜６．３．６
【非特許文献１６】Ｇａｕｌｔｉｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：６６２５〜６６４１
【非特許文献１７】Ｉｎｏｕｅ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：６１３１〜６１４８
【非特許文献１８】Ｉｎｏｕｅ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９８７）２１５：３２７〜３３０
【非特許文献１９】Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）  ３３４：５８５〜５９１
【特許文献６】米国特許第４９８７０７１号
【特許文献７】米国特許第５１１６７４２号
【非特許文献２０】Ｂａｒｔｅｌ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１４１１〜１４１８頁
【非特許文献２１】Ｈｅｌｅｎｅ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ（１９９１）６（６）：５６９
【非特許文献２２】Ｈｅｌｅｎｅ  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６０：２７
【非特許文献２３】Ｍａｈｅｒ、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  （１９９２）  １４  （１２）：  ８０７
【非特許文献２４】Ｈｙｒｕｐ他、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）４：５
【非特許文献２５】Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９６）９３：１４６７０
【非特許文献２６】Ｆｉｎｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９６）２４（１７）：３３５７〜６３
【非特許文献２７】Ｍａｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８９）１７：５９７３
【非特許文献２８】Ｐｅｔｅｒｓｅｒ他、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（１９７５）５：１１１９
【非特許文献２９】Ｋａｒｌｉｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４
【非特許文献３０】Ｋａｒｌｉｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３〜５８７７
【非特許文献３１】Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ（１９９０）２１５：４０３
【非特許文献３２】Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９
【非特許文献３３】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．
【非特許文献３４】Ｍｙｅｒｓ他、ＣＡＢＩＯＳ（１９８８）４：１１〜１７
【非特許文献３５】Ｌｅｅ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１（１９）：１１２７２〜１１２７９
【非特許文献３６】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ他著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２
【非特許文献３７】Ｎａｒａｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８３）３９：３
【非特許文献３８】Ｉｔａｋｕｒａ他、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８４）５３：３２３
【非特許文献３９】Ｉｔａｋｕｒａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）１９８：１０５６
【非特許文献４０】Ｉｋｅ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ（１９８３）１１：４７７
【非特許文献４１】Ａｒｋｉｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：７８１１〜７８１５
【非特許文献４２】Ｄｅｌｇｒａｖｅ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９３）６（３）：３２７〜３３１
【非特許文献４３】、Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜４９７
【非特許文献４４】Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２
【非特許文献４５】Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、（１９８５）、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁
【非特許文献４６】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｃｏｌｉｇａｎ他著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ
【非特許文献４７】Ｇａｌｆｒｅ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６：５５０〜５５２
【非特許文献４８】Ｋｅｎｎｅｔｈ、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０）
【非特許文献４９】Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（１９８１）５４：３８７〜４０２
【特許文献８】米国特許第５２２３４０９号
【特許文献９】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９
【特許文献１０】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１
【特許文献１１】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１
【特許文献１２】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９
【特許文献１３】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８
【特許文献１４】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７
【特許文献１５】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０
【特許文献１６】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９
【非特許文献５０】Ｆｕｃｈｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９：１３７０〜１３７２
【非特許文献５１】Ｈａｙ他、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９２）３：８１〜８５
【非特許文献５２】Ｈｕｓｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６：１２７５〜１２８１
【非特許文献５３】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９９３）２５（１２）：７２５〜７３４
【特許文献１７】ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０２６７１
【特許文献１８】欧州特許出願番号第１８４１８７号
【特許文献１９】欧州特許出願番号第１７１４９６号
【特許文献２０】欧州特許出願番号第１７３４９４号
【特許文献２１】ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０１５３３
【特許文献２２】米国特許第４８１６５６７号
【特許文献２３】欧州特許出願番号第１２５０２３号
【非特許文献５４】Ｂｅｔｔｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：１０４１〜１０４３
【非特許文献５５】Ｌｉｕ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７）８４：３４３９〜３４４３
【非特許文献５６】Ｌｉｎ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１３９：３５２１〜３５２６
【非特許文献５７】Ｓｕｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７）８４：２１４〜２１８
【非特許文献５８】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ他、Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ（１９８７）４７：９９９〜１００５
【非特許文献５９】Ｗｏｏｄ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４：４４６〜４４９
【非特許文献６０】Ｓｈａｗ他、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ（１９８８）８０：１５５３〜１５５９
【非特許文献６１】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：１２０２〜１２０７
【非特許文献６２】Ｏｉ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６）４：２１４
【特許文献２４】米国特許第５２２５５３９号
【非特許文献６３】Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５５２〜５２５
【非特許文献６４】Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４
【非特許文献６５】Ｂｅｉｄｌｅｒ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８）１４１：４０５３〜４０６０
【非特許文献６６】Ｊｅｓｐｅｒｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：８９９〜９０３
【非特許文献６７】Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）
【非特許文献６８】Ｓｍｉｔｈ他、Ｇｅｎｅ（１９８８）６７：３１〜４０
【非特許文献６９】Ａｍａｎｎ他、Ｇｅｎｅ（１９８８）６９：３０１〜３１５
【非特許文献７０】Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１８５：６０〜８９
【非特許文献７１】Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）  １８５：１１９〜１２８
【非特許文献７２】Ｗａｄａ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９２）２０：２１１１〜２１１８
【非特許文献７３】Ｂａｌｄａｒｉ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：２２９〜２３４
【非特許文献７４】Ｋｕｒｊａｎ他、Ｃｅｌｌ（１９８２）３０：９３３〜９４３
【非特許文献７５】Ｓｃｈｕｌｔｚ他、Ｇｅｎｅ（１９８７）５４：１１３〜１２３
【非特許文献７６】Ｓｍｉｔｈ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９８３）３：２１５６〜２１６５
【非特許文献７７】Ｌｕｃｋｌｏｗ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７０：３１〜３９
【非特許文献７８】Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０
【非特許文献７９】Ｋａｕｆｍａｎ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：１８７〜１９５
【非特許文献８０】Ｐｉｎｋｅｒｔ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９８７）１：２６８〜２７７
【非特許文献８１】Ｃａｌａｍｅ他、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８）４３：２３５〜２７５
【非特許文献８２】Ｗｉｎｏｔｏ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８９）８：７２９〜７３３
【非特許文献８３】Ｂａｎｅｒｊｉ他、Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：７２９〜７４０
【非特許文献８４】Ｑｕｅｅｎ他、Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：７４１〜７４８
【非特許文献８５】Ｂｙｒｎｅ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：５４７３〜５４７７
【非特許文献８６】Ｅｄｌｕｎｄ他Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：９１２〜９１６
【特許文献２５】米国特許第４８７３３１６号
【特許文献２６】欧州特許出願第２６４１６６号
【非特許文献８７】Ｋｅｓｓｅｌ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：３７４〜３７９
【非特許文献８８】Ｃａｍｐｅｓ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９８９）３：５３７〜５４６
【非特許文献８９】Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ他（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６）
【非特許文献９０】Ｍｉｔｃｈｅｌｌ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９（１９）：８９３３〜３７
【非特許文献９１】Ｋａｔａｄａ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９（６）：３５８６〜９５
【特許文献２７】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４８８２０
【特許文献２８】米国特許第６１６８９２７号Ｂ１
【特許文献２９】米国特許第５７３９０２９号
【特許文献３０】米国特許第５４８２８３５号
【特許文献３１】米国特許第４７３６８６６号
【特許文献３２】米国特許第４８７０００９号
【特許文献３３】米国特許第４８７３１９１号
【非特許文献９２】Ｈｏｇａｎ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８６）
【非特許文献９３】Ｔｈｏｍａｓ他、Ｃｅｌｌ（１９８７）５１：５０３を参照のこと）
【非特許文献９４】Ｌｉ他、Ｃｅｌｌ  （１９９２）６９：９１５
【非特許文献９５】Ｂｒａｄｌｅｙ  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ著、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、（１９８７）１１３〜１５２頁
【非特許文献９６】Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）２：８２３〜８２９
【特許文献３４】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１３５４
【特許文献３５】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０１１４０
【特許文献３６】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６８
【特許文献３７】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０４１６９
【非特許文献９７】Ｌａｋｓｏ他、、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：６２３２〜６２３６
【非特許文献９８】Ｏ’Ｇｏｒｒｎａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３５１〜１３５５
【非特許文献９９】Ｗｉｌｍｕｔ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８５：８１０〜８１３
【特許文献３８】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０７６６８
【特許文献３９】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０７６６９
【特許文献４０】米国特許第４５２２８１１号
【特許文献４１】ＷＯ９４／０４１８８
【特許文献４２】米国特許第５３２８４７０号
【非特許文献１００】Ｃｈｅｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：３０５４〜３０５７
【特許文献４３】米国特許第５５７１６９８号
【特許文献４４】米国特許第５４０３４８４号
【非特許文献１０１】Ｔｒａｙｎｏｒ他、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９５）４７（４）：８４８〜５４
【非特許文献１０２】Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ８章、ＮｅｕｒｏｎからＢｒａｉｎまで（３版）、Ｎｉｃｈｏｌｓ他著、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、１９９２
【非特許文献１０３】Ｌａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ（１９９７）１２：１４５
【非特許文献１０４】ＤｅＷｉｔｔ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：６９０９
【非特許文献１０５】Ｅｒｂ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：１１４２２
【非特許文献１０６】Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（１９９４）３７：２６７８
【非特許文献１０７】Ｃｈｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１３０３
【非特許文献１０８】Ｃａｒｒｅｌｌ他、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ（１９９４）３３：２０５９
【非特許文献１０９】Ｃａｒｅｌｌ他、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｉ（１９９４）３３：２０６１
【非特許文献１１０】Ｇａｌｌｏｐ他、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（１９９４）３７：１２３３
【非特許文献１１１】Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）１３：４１２〜４２１）
【非特許文献１１２】Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５４：８２〜８４
【非特許文献１１３】Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６４：５５５〜５５６
【非特許文献１１４】Ｃｕｌｌ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：１８６５〜１８６９
【非特許文献１１５】Ｓｃｏｔｔ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：３８６〜３９０
【非特許文献１１６】Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：４０４〜４０６
【非特許文献１１７】Ｃｗｉｒｌａ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：  ６３７８〜６３８２
【非特許文献１１８】Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９１）２２２：３０１〜３１０
【特許文献４５】米国特許第５９９８５７７号
【特許文献４６】米国特許第５２８３３１７号
【非特許文献１１９】Ｚｅｒｖｏｓ他、Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：２２３〜２３２
【非特許文献１２０】Ｍａｄｕｒａ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：１２０４６〜１２０５４
【非特許文献１２１】Ｂａｒｔｅｌ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３）１４：９２０〜９２４
【非特許文献１２２】Ｉｗａｂｕｃｈｉ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８：１６９３〜１６９６
【特許文献４７】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１０３００
【非特許文献１２３】Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２０：９１９〜９２４
【非特許文献１２４】Ｆａｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：６２２３〜２７
【非特許文献１２５】Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８
【非特許文献１２６】ＭｃＫｕｓｉｃｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ
【非特許文献１２７】Ｅｇｅｌａｎｄ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５：７８３〜７８７
【非特許文献１２８】Ｌａｎｄｅｇｒａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：  １０７７〜１０８０
【特許文献４８】米国特許第５２７２０５７号
【特許文献４９】米国特許第４６８３１９５号
【特許文献５０】米国特許第４６８３２０２号
【非特許文献１２９】Ｎａｋａｚａｗａ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：３６０〜３６４
【非特許文献１３０】Ａｂｒａｖａｙａ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９５）２３：６７５〜６８２
【非特許文献１３１】Ｇｕａｔｅｌｌｉ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：１８７４〜１８７８
【非特許文献１３２】Ｋｗｏｈ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：１１７３〜１１７７
【非特許文献１３３】Ｌｉｚａｒｄｉ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：１１９７
【特許文献５１】米国特許第５４９８５３１号
【非特許文献１３４】Ｃｒｏｎｉｎ他、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ（１９９６）７：２４４〜２５５
【非特許文献１３５】Ｋｏｚａｌ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９６）２：７５３〜７５９
【非特許文献１３６】Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５６０
【非特許文献１３７】Ｓａｎｇｅｒ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３
【非特許文献１３８】Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９５）１９：４４８
【特許文献５２】ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１６１０１
【非特許文献１３９】Ｃｏｈｅｎ他、Ａｄｖ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ（１９９６）３６：１２７〜１６２
【非特許文献１４０】Ｇｒｉｆｆｉｎ他、Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９３）３８：１４７〜１５９
【非特許文献１４１】Ｍｙｅｒｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２
【非特許文献１４２】Ｃｏｔｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８８）８５：４３９７
【非特許文献１４３】Ｓａｌｅｅｂａ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９２）２１７：２８６〜２９５
【非特許文献１４４】Ｈｓｕ他、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９９４）１５：１６５７〜１６６２
【特許文献５３】米国特許第５４５９０３９号
【非特許文献１４５】Ｏｒｉｔａ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：２７６６
【非特許文献１４６】Ｃｏｔｔｏｎ、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（１９９３）２８５：１２５〜１４４
【非特許文献１４７】Ｈａｙａｓｈｉ、Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ（１９９２）９：７３〜７９
【非特許文献１４８】Ｋｅｅｎ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ（１９９１）７：５
【非特許文献１４９】Ｍｙｅｒｓ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：４９５
【非特許文献１５０】Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ他、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ（１９８７）２６５：１２７５３
【非特許文献１５１】Ｓａｉｋｉ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４：１６３
【非特許文献１５２】Ｓａｉｋｉ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：６２３０
【非特許文献１５３】Ｇｉｂｂｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８９）１７：２４３７〜２４４８
【非特許文献１５４】Ｐｒｏｓｓｎｅｒ、Ｔｉｂｔｅｃｈ（１９９３）１１：２３８
【非特許文献１５５】Ｇａｓｐａｒｉｎｉ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２）６：１
【非特許文献１５６】Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：１８９
【非特許文献１５７】Ｌｉｎｄｅｒ、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ（１９９７）４３（２）：２５４〜２６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
疾患においてＧＰＣＲが果たす役割およびＧＰＣＲの活性を調節することによって疾患を治療する能力を考えれば、今まで未知であったＧＰＣＲを同定し、特徴づけることでＧＰＣＲの活性に関係する疾患状態を治療するための新規な組成物および方法を開発することができる。
【００１２】
本発明は、新規な構成的に活性なＧＰＣＲ、ＧＡＶＥ７の発現を同定し、特定し、関連疾患を同定し治療するためにこの発見を適用するための組成物および方法を提供する。たとえば、ＧＡＶＥ７はＴＨＰ−１細胞（単球白血病細胞系）においてＬＰＳによってダウンレギュレートされる。ＧＡＶＥ７は構成的に活性な受容体である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、本明細書でＧＡＶＥ７と称する新たに同定されたＧ蛋白質結合受容体に関する。一実施形態では、ＧＡＶＥ７は、配列番号２で示したようなアミノ酸約３７２個をコードするイントロンのない構造遺伝子から得られる。関連する態様では、配列番号１で示したようなポリヌクレオチドを意図する。
【００１４】
他の態様では、本発明は配列番号２で示したようなアミノ酸の脊椎動物蛋白質、変種、変異体およびＧＡＶＥ７活性を保持するそれらの断片をコードする単離核酸、ならびに配列番号１で示したようなヌクレオチド配列、変種、変異体およびＧＡＶＥ７活性を有するポリペプチドをコードするそれらの断片を含む単離核酸から成る群から選択した単離核酸に関する。さらに、本発明は、核酸配列番号１に結合するハイブリダイゼーションプローブおよび相補断片または配列番号２で示したようなアミノ酸配列をコードする核酸に結合するハイブリダイゼーションプローブおよび相補断片に関する。さらに、本発明は、配列番号１との同一性が約３０％から約９９％の核酸配列に関し、配列番号２で示したアミノ酸配列をコードする単離核酸との同一性が約３０％から約９９％の核酸が含まれる。関連態様では、オリゴヌクレオチドには、少なくとも８個のヌクレオチドが含まれ、ハイブリダイゼーション方法には、核酸と相補物のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、配列番号１で示したヌクレオチドを含む核酸またはそれらと実質的に同等なものと相補オリゴヌクレオチドとを接触させる段階を含めることを意図する。さらに、相補断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＡＶＥ７発現を阻害する方法のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとして役立つことができる。このような方法には、配列番号１で示したようなヌクレオチドの相補物から成るオリゴヌクレオチドを提供する段階、配列番号１で示したヌクレオチド配列と組み合わさるｍＲＮＡを含むヒト細胞を提供する段階、および該細胞に該オリゴヌクレオチドを導入する段階を含めることができ、ＧＡＶＥ７の発現を翻訳の阻害、３本鎖へリックス構造形成および／または細胞中のｍＲＮＡの分解を起こすヌクレアーゼの活性化を含む機構によって阻害する。
【００１５】
本発明はまた、配列番号２で示したようなアミノ酸配列の精製ポリペプチド、変種、変異体およびそれらの断片、ならびにＧＡＶＥ７の機能的特性をもたらす他のアミノ酸残基を有する精製ポリペプチドから成る群から選択された単離ポリペプチドに関する。
【００１６】
本発明はさらに、単離核酸を含むベクターを含めた、発現調節領域（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に作動可能に結合した核酸に関する。本発明はさらに、本発明の核酸を含めるために形質移入または形質転換した培養細胞に関する。本発明はさらに、本発明の核酸を含む形質転換細胞を増殖させる段階、発現調節領域の下で発現させる段階、および細胞または細胞を培養した培地からポリペプチドを精製する段階を含む、ポリペプチドの製造方法に関する。
【００１７】
本発明の他の態様には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含めた本発明のポリペプチドに結合する単離抗体が含まれる。さらに、関連態様では、抗体製造方法およびＧＡＶＥ７に結合する抗体でＧＡＶＥ７関連疾患を治療する方法を開示する。この抗体はまた、結合リガンドなしにＧＡＶＥ７を活性化する分子を同定するために使用することができる。
【００１８】
本発明の他の態様には、診断のため、生物学的試料および／または組織試料におけるＧＡＶＥ７の有無を確認する方法が含まれる。他の実施形態では、ＬＰＳへの曝露をモニターするか、または確認することができる。本発明の他の態様では、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニストおよび／または抗体をそれらを必要とする患者に投与することを含むＧＡＶＥ７シグナル伝達を調節するための治療方法を開示する。
【００１９】
本発明の他の態様では、化学的成分を提供する段階、ＧＡＶＥ７を発現する細胞を提供する段階、および該化学的成分がＧＡＶＥ７のシグナル伝達活性を調節するかどうかを、内因性リガンドの存在下でまたは不在下でこのような調節が生じるかどうかを含めて決定する段階を含む、ＧＡＶＥ７のモジュレーターの同定方法を開示する。関連態様では、この化学的成分にはペプチド、抗体、アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストが含めることができるがそれだけには限定されない。
【００２０】
他の態様では、本発明は候補化合物が逆アゴニストであるかどうかを決定する方法を特徴としており、前記候補を内因性リガンド、古典的アゴニストまたは古典的アンタゴニストの不在下で構成的受容体に曝露すると、このような構成的活性は前記逆アゴニストによって阻害される。
【００２１】
本発明の他の態様には、治療用組成物が含まれ、このような組成物には核酸、抗体、ポリペプチド、アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。さらに、本発明の方法にはまた、このような治療用組成物をそれらを必要とする患者に投与することによって疾患状態を処置し、ＧＡＶＥ７シグナル伝達活性を調節する方法が含まれる。
【００２２】
本発明のこれらの態様およびその他の態様は、以下の詳細な説明および添付した図面を参照にすれば明らかになるだろう。さらに、より詳細にある種の方法または組成物を記載した様々な参考文献を以下に示す。参考文献それぞれは、それぞれ独立して組み込むことを注記しているように本明細書に参照により組み込む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、Ｇ蛋白質結合受容体スーパーファミリーに属するヒトＧＡＶＥ７をコードするｃＤＮＡ分子の発見に基づいている。
【００２４】
本明細書では、「アゴニスト」という用語は、受容体に結合したとき細胞内応答を活性化するか、またはＧＴＰの膜への結合を促進する成分（たとえば、リガンドおよび候補化合物であるが、これだけには限定されない）を意味する。
【００２５】
本明細書では、「部分的アゴニスト」という用語は、受容体に結合したときアゴニストよりも少ない程度／範囲で細胞内応答を活性化するか、またはアゴニストよりも少ない程度／範囲でＧＴＰの膜への結合を促進する成分（たとえば、リガンドおよび候補化合物であるが、これだけには限定されない）を意味する。
【００２６】
本明細書では、「アンタゴニスト」という用語は、受容体にアゴニストと同様の部位で競合的に結合する成分（（たとえば、リガンドおよび候補化合物であるが、これだけには限定されない）を意味する。しかし、アンタゴニストは活性型受容体によって開始する細胞内応答を活性化せず、それによってアゴニストまたは部分的アゴニストによる細胞内応答を阻害することができる。関連態様では、アンタゴニストはアゴニストまたは部分的アゴニストがないときの細胞内基礎応答を減少させない。
【００２７】
本明細書では、「候補化合物」という用語は、スクリーニング技術に供することのできる成分（（たとえば、化学化合物であるが、これだけには限定されない）を意味する。一実施形態では、この用語にはアゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストから成る群から選択された化合物であることが公に知られた化合物は含まれない。これらの化合物は、受容体に特異的な内因性リガンドの同定を必要とする従来の薬剤開発方法および／または受容体に対する候補化合物のスクリーニングによって同定され、このようなスクリーニングには効果を評価するために競合アッセイが必要である。
【００２８】
本明細書で交換可能に使用された「構成的に活性化された受容体」または「自発的に活性のある受容体」は、リガンドがなくても活性化を受ける受容体を意味する。
【００２９】
関連態様では、このような構成的に活性化された受容体は、内因性（たとえば、ＧＡＶＥ７）の場合も非内因性の場合もある。すなわち、ＧＰＣＲを組換え手段によって変更して、野生型ＧＰＣＲの構成的変異型を製造することができる（たとえば、本明細書で参照により組み込んだ欧州特許０１７１７０１号、ＷＯ００／２２１２９、ＷＯ００／２２１３１、および米国特許第６１５０３９３号および第６１４０５０９号を参照のこと）。
【００３０】
本明細書では、「構成的な受容体活性化」という用語は、受容体を内因性リガンドまたはそれらの化学的同等物と結合させること以外の手段によって活性状態の受容体を安定化することを意味する。
【００３１】
本明細書では、「逆アゴニスト」という用語は、構成的に活性化された受容体に結合し、基礎細胞内応答を阻害する成分（たとえば、リガンドおよび候補化合物であるが、それだけには限定されない）を意味する。活性型受容体によって開始する基礎応答は、アゴニストまたは部分アゴニストなしで認められる活性の正常基礎レベルより小さいか、または膜へのＧＴＰ結合を減少させる。
【００３２】
本明細書では、「リガンド」という用語は、他の分子に結合する成分を意味し、前記成分は、たとえば、ホルモンまたは神経伝達物質であるがそれだけに限定されず、さらに前記成分は立体選択的に受容体に結合する。
【００３３】
ヒトＧＡＶＥ７蛋白質をコードするヌクレオチド配列を図１に示す（配列番号１）。ＧＡＶＥ７蛋白質のアミノ酸配列を図１に示す（配列番号２）。
【００３４】
図１のＧＡＶＥ７ｃＤＮＡのヌクレオチドの長さは約１．２ｋｂで、非翻訳領域を含み、アミノ酸の長さ約３７２個で分子量約４１ｋＤのイントロンを含まない蛋白質をコードする。
【００３５】
ノーザンブロットアッセイを使用して、約２．８ｋｂのＧＡＶＥ７ｍＲＮＡ転写物がある種の組織で発現している。ＧＡＶＥ７は、ＲＴ−ＰＣＲによると、ＬＰＳに曝露したＴＨＰ−１細胞ではダウンレギュレートされることが示された。形質移入したＨＥＫ２９３細胞の受容体はまた、アゴニストなしで構成的な活性化を示す。さらに、ノーザンブロットの結果によって、ＧＡＶＥ７発現は脳、心臓、結腸、胸腺、胎盤、脾臓および肺で検出されることが示された。ＧＡＶＥ７の骨格筋、腎臓および肝臓での発現は乏しかった。関連態様では、ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲ実験を実施して、さらにＧＡＶＥ７の発現を評価した。組織パネルの結果によって、ＧＡＶＥ７は脾臓、脳、胸腺および小腸で発現をすることが示された。本発明の蛋白質および核酸分子に関して、「ファミリー」という用語は、見かけ上共通の構造ドメインを有し、本明細書で定義した様な十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列同一性を有する２個以上の蛋白質または核酸分子を意味するものである。このようなファミリーの構成要素は、天然に生じることができ、同一または異なる種のいずれかから得ることができる。たとえば、ファミリーにはヒト由来の第１の蛋白質およびこの蛋白質のマウス由来の相同体、ならびにヒト由来の第２の異なる蛋白質および第２蛋白質のマウス相同体を含めることができる。ファミリーの構成要素はまた、共通の機能特性を備えることができる。
【００３６】
一実施形態では、ＧＡＶＥ７蛋白質には、配列番号２の第３細胞内ループドメインに対して少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは約８５％、９５％、９８％または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、ＧＡＶＥ７活性を有する第３の細胞内ループドメインが含まれる。
【００３７】
本明細書では、「同等のアミノ酸残基」という用語は、２個以上の配列を分析のために整列させたとき、アミノ酸が蛋白質配列内の実質的に同様の位置を占めることを意味する。本発明の好ましいＧＡＶＥ７ポリペプチドは、配列番号２の第３細胞内ループドメインアミノ酸配列と十分同一のアミノ酸配列を有する。本明細書では、「十分同一の」という用語は、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して同一または同等の（たとえば、類似の側鎖を有する）アミノ酸残基またはヌクレオチドを十分、または最小限含有する第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列のことである。第１および第２アミノ酸またはヌクレオチド配列は、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を備えている。たとえば、約５５％の同一性、好ましくは約６５％の同一性、より好ましくは７５％、８５％、９５％または９８％の同一性を有し、ＧＡＶＥ７活性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書では十分同一であると定義される。
【００３８】
関心のあるその他のドメインには、膜貫通（ＴＭ）ドメイン（配列番号２で示したように、アミノ酸残基約２４から約５２のＴＭ１、アミノ酸残基約５６から約７１のＴＭ２、アミノ酸残基約８３から約１１０のＴＭ３、アミノ酸残基約１３０から約１４７のＴＭ４、アミノ酸残基約１７８から約２０８のＴＭ５、アミノ酸残基約２２４から約２６０のＴＭ６、およびアミノ酸残基約２６８から約２９３のＴＭ７）、細胞質（細胞内）（ＩＣ）ドメイン（配列番号２に示したように、アミノ酸残基約５３から約５５のＩＣ１、アミノ酸残基約１１１から約１２９のＩＣ２、アミノ酸残基約２０９から約２２３のＩＣ３、およびアミノ酸残基約２８３から約３３０のＩＣ４）および細胞外（ＥＣ）ドメイン（配列番号２に示したように、アミノ酸残基約１から約２３のＥＣ１、アミノ酸残基約７２から約８２のＥＣ２、アミノ酸残基約１４８から約１７７のＥＣ３、アミノ酸残基約２６１から約２８７のＥＣ４、およびアミノ酸残基約２９４から末端までのＥＣ５）が含まれるが、それだけには限定されない。関連態様では、関心あるドメインにはまた、共通の糖鎖形成部位、脂質結合部位およびリン酸化部位が含まれるが、それだけには限定されない。アスパラギン残基は、たとえば、Ｎ末端に位置する。セリンなどのキナーゼリン酸化部位は、Ｃ末端に見いだされる。ＧＡＶＥ７はまた、ＴＭ３から下流にＤＲＹモチーフを有する。
【００３９】
本明細書で相互に入れ替えて使用する場合、「ＧＡＶＥ７活性」、「ＧＡＶＥ７の生物活性」または「ＧＡＶＥ７の機能活性」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標準的技術によって測定したとき、ＧＡＶＥ７応答性細胞にＧＡＶＥ７蛋白質、ポリペプチドまたは核酸分子が作用する活性のことである。ＧＡＶＥ７活性は、直接的活性、たとえば第２蛋白質との関連または第２蛋白質に対する酵素活性、または間接的活性、たとえばＧＡＶＥ７と第２蛋白質との相互作用によって媒介される細胞性シグナル伝達活性の場合もある。好ましい実施形態では、ＧＡＶＥ７活性には、少なくとも１種または複数の以下の活性、（ｉ）ＧＡＶＥ７シグナル伝達経路にいて蛋白質と相互作用する能力、（ｉｉ）ＧＡＶＥ７リガンドと相互作用する能力、および（ｉｉｉ）細胞内標的蛋白質と相互作用する能力が含まれる。
【００４０】
したがって、本発明の他の実施形態は、単離ＧＡＶＥ７蛋白質およびＧＡＶＥ７活性を有するポリペプチドを特徴とする。
【００４１】
本発明の様々な態様を以下の小区分でさらに詳細に説明する。
【００４２】
単離した核酸分子
本発明の一態様は、ＧＡＶＥ７蛋白質またはそれらの生物活性部分をコードする単離核酸分子に関連する。それらの核酸分子またはそれらの部分は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ＧＡＶＥ７をコードする核酸を同定するために十分である（たとえば、ＧＡＶＥ７  ｍＲＮＡ）。関係する核酸はまた、ＧＡＶＥ７核酸分子を増幅または変異させるためのＰＣＲプライマーとして使用することができる。本明細書では、「核酸分子」という用語には、ＤＮＡ分子（たとえば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（たとえば、ｍＲＮＡ）およびヌクレオチド類縁体を使用して生じたＤＮＡまたはＲＮＡの類縁体を含めるものとする。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることが可能であるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４３】
「単離した」核酸分子は、天然核酸源に存在するその他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離した」核酸には、核酸を取り出した生物のゲノムＤＮＡのＧＡＶＥ７をコードする核酸に天然に隣接した配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）は含まれない。たとえば、ＧＡＶＥ７は、ヒト染色体１２（すなわち、１４３メガ塩基）に位置するので、様々な実施形態では、単離されたＧＡＶＥ７核酸分子には、核酸を取り出した細胞のゲノムＤＮＡの該核酸に天然に隣接した約５ｋｂ未満、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂのヌクレオチド配列が含有され得る。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組換え技術によって生成するときはその他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないことが可能で、化学合成するときは化学物質前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないことが可能である。
【００４４】
本発明の核酸分子、たとえば、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはそのヌクレオチド配列のいずれかの断片または相補物は、標準的な分子生物学的技術および本明細書で提供した配列情報を使用して単離することができる。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１の核酸配列のすべてまたは一部を使用して、ＧＡＶＥ７核酸分子は（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されているように）標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離することができる。
【００４５】
本発明の核酸分子は、鋳型としてｃＤＮＡ，ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを使用し、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術によって増幅することができる。たとえば、このようなプライマーには、５’−ＣＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＴＧＣＧＡ−３’（配列番号３）および５’−ＧＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡＧＧＧＣＧＧ−３’（配列番号４）が含まれ得るが、それだけには限定されない。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングして、ＤＮＡ配列分析によって特徴づけることができる。さらに、ＧＡＶＥ７ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術によって、たとえば自動ＤＮＡ合成機を使用して調製することができる。
【００４６】
他の好ましい実施形態では、本発明の単離核酸分子には、配列番号１で示したヌクレオチド配列またはそれらのＧＡＶＥ７特異的部分の相補物である核酸分子が含まれる。所与のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、所与のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、それによって単離可能、または検出可能な二本鎖を形成する所与のヌクレオチド配列に対して十分相補的な核酸分子である。
【００４７】
さらに、本発明の核酸分子には、ＧＡＶＥ７をコードする核酸配列の一部、たとえば、プローブもしくはプライマーまたはＧＡＶＥ７の生物学的に活性のある部分をコードする断片として使用することができる断片のみを含めることができる。たとえば、このような断片には、配列番号２のアミノ酸残基約１から約１４までをコードする領域を含めることができるが、それだけには限定されない。ヒトＧＡＶＥ７遺伝子をクローニングすることによって決定されたヌクレオチド配列によって、その他の細胞種類、たとえば、その他の組織におけるＧＡＶＥ７相同体、ならびにその他の哺乳類からＧＡＶＥ７相同体を同定し、かつ／またはクローニングするためのプローブおよびプライマーを精製することが可能である。このプローブ／プライマーには、一般的に実質的に精製されたオリゴヌクレオチドが含まれる。このオリゴヌクレオチドには一般的に、厳密な条件下で、配列番号１または天然に生じる配列番号１の変異体のセンスまたはアンチセンス配列の少なくとも約１２個、好ましくは約２５個、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域が含まれる。ヒトＧＡＶＥ７ヌクレオチド配列をベースにしたプローブを使用して、同様または同一の蛋白質をコードする転写物またはゲノム配列を検出することができる。このプローブには、それに結合した標識群、たとえば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子を含めることができる。このようなプローブは、適切にＧＡＶＥ７蛋白質を発現しない細胞または組織を確認するための診断試験キットの一部として使用することができる。たとえば、これは、試験対象の細胞試料におけるＧＡＶＥ７をコードする核酸の濃度を測定することによって、たとえば、ＧＡＶＥ７  ｍＲＮＡ濃度を検出するか、またはゲノムＧＡＶＥ７遺伝子が変異したか、欠失したかを測定することによって実施することができる。
【００４８】
「ＧＡＶＥ７の生物学的に活性のある部分」をコードする核酸断片は、ＧＡＶＥ７の生物活性を有するポリペプチドをコードする配列番号１の部分を単離して、ＧＡＶＥ７蛋白質のコード部分を発現させて（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換え発現によって）、ＧＡＶＥ７のコード部分の活性を評価することによって調製することができる。たとえば、ＧＡＶＥ７の生物学的に活性のある部分をコードする核酸断片には、第３の細胞内ループドメイン、たとえば、配列番号２で示したようなアミノ酸残基約２０２から約２１９を含めることができる。本発明はさらに、遺伝子コードの縮重によって配列番号１のヌクレオチド配列と異なり、そして配列番号１で示したヌクレオチド配列によってコード化されたものと同一のＧＡＶＥ７蛋白質をコード化する核酸分子を包含する。
【００４９】
配列番号１で示したヒトＧＡＶＥ７ヌクレオチド配列に加えて、ＧＡＶＥ７のアミノ酸配列に変化もたらすＤＮＡ配列多形性が集団内（たとえば、ヒト集団内）に存在し得ることを当業者は理解するであろう。このようなＧＡＶＥ７遺伝子の遺伝子多形は、天然の対立遺伝子変異によって集団内の個体間に存在することが可能である。対立遺伝子は、所与の遺伝子座に代わりに生じる遺伝子群の１つである。本明細書では、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ＧＡＶＥ７蛋白質、好ましくは哺乳類のＧＡＶＥ７蛋白質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子のことである。本明細書では、「対立遺伝子変種」という表現は、ＧＡＶＥ７遺伝子座に生じるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのことである。他の対立遺伝子は、いくつかの異なる個体における関心のある遺伝子を配列決定することによって同定することができる。これは、様々な個体の同一遺伝子座を同定するハイブリダイゼーションプローブを使用することによって容易に実施することができる。ありとあらゆるこのようなヌクレオチド変異および天然の対立遺伝子変異の結果であり、ＧＡＶＥ７の機能活性を変更しない、得られたアミノ酸多形またはＧＡＶＥ７の変異は、本発明の範囲内とする。
【００５０】
さらに、ヒトＧＡＶＥ７とは異なるヌクレオチド配列を有するその他の種のＧＡＶＥ７蛋白質（ＧＡＶＥ７相同体）をコードする核酸分子は、本発明の範囲内とする。本発明のＧＡＶＥ７ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変種および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的ハイブリダイゼーション技術によるハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を使用して、本明細書で開示したヒトＧＡＶＥ７核酸との同一性に基づいて単離することができる。
【００５１】
したがって、他の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、長さが少なくとも３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００または１１００ヌクレオチドであり、厳密な条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列、好ましくはそのコード配列、またはその相補物を含む核酸分子にハイブリダイズする。
【００５２】
本明細書では、「厳密な条件下でハイブリダイズする」という用語は、一般的に少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％および好ましくは７５％またはそれ以上の相補性のヌクレオチド配列が通常は互いにハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を意味する。このような厳密な条件は当業者に公知で、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６に見いだすことができる。厳密なハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）において約４５℃でハイブリダイゼーションして、その後０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０〜６５℃で１回または複数回洗浄する。好ましくは、厳密な条件下で配列番号１の配列またはそれらの相補物にハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に生じる核酸分子に対応する。本明細書では、「天然に生じる」核酸分子とは、（たとえば、天然蛋白質をコードする）天然に生じるヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子のことである。当業者は、配列特異的変動（たとえば、長さ、Ｇ−Ｃ豊富さなど）に関して条件を変更することができることを理解するだろう。
【００５３】
本発明は、同様の特性を有するＧＡＶＥ７様分子の診断薬としてのＧＡＶＥ７の核酸断片を含有することを意図する。診断用断片は、隣接配列を含むＧＡＶＥ７のいかなる部分からも生じることができる。この断片をライブラリーのプローブとして使用して、公知の方法を実施してすることができる。この断片は公知の方法で作製することができる。
【００５４】
集団内に存在可能な天然に生じるＧＡＶＥ７配列の対立遺伝子変種に加えて、当業者であればさらに、配列番号１のヌクレオチド配列に変異によって変更を導入して、それによってＧＡＶＥ７蛋白質の生物活性を実質的に変更することなくコードされたＧＡＶＥ７蛋白質のアミノ酸配列の変更をもたらすことができることを理解するだろう。たとえば、「必須ではない」アミノ酸残基にアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。「必須ではない」アミノ酸残基とは、実質的に生物活性を調節することなくＧＡＶＥ７の野生型配列（たとえば、配列番号２の配列）から変更できる残基のことである。「必須の」アミノ酸残基とは、実質的な生物活性に必要な残基である。たとえば、様々な種のＧＡＶＥ７において保存されていないか、または半保存されているだけのアミノ酸残基は、活性に必須ではなく、したがって、変更の標的となりやすい。反対に、様々な種のＧＡＶＥ７において保存されているアミノ酸残基は、活性に必須で、したがって変更の標的となりにくい。
【００５５】
したがって、本発明の他の態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変更を含むＧＡＶＥ７蛋白質をコードする核酸分子に関する。このようなＧＡＶＥ７蛋白質は、配列番号２とはアミノ酸配列が異なるが、まだ生物活性を保持している。一実施形態では、単離された核酸分子には、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約５５％同一であり、６５％、７５％、８５％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００５６】
配列番号２とは異なる配列を有するＧＡＶＥ７蛋白質をコードする単離核酸分子は、１個または複数のアミノ酸置換、付加または欠失をコード化蛋白質に導入するように、１個または複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を配列番号１のヌクレオチド配列に導入することによって生成することができる。
【００５７】
変異は、標準的技術、たとえば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲによる突然変異誘発によって導入することができる。好ましくは、１個または複数の予測された非必須アミノ酸残基に保存的なアミノ酸置換を行う。「保存的なアミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置換する置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されている。このファミリーには、塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、極性非電荷側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンおよびシステイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン）、ベータ分枝側鎖（たとえば、トレオニン、バリンおよびイソロイシン）および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、ＧＡＶＥ７における予測された非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換することが好ましい。あるいは、変異は、たとえば飽和突然変異誘発によって、ＧＡＶＥ７コード配列の全体または一部に無作為に導入することができ、得られた変異体のＧＡＶＥ７生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされた蛋白質を組換えによって発現することができ、蛋白質の活性を測定することができる。
【００５８】
好ましい実施形態では、変異ＧＡＶＥ７蛋白質は、（１）ＧＡＶＥ７シグナル伝達経路
において蛋白質との蛋白質：蛋白質相互作用を形成する能力、（２）ＧＡＶＥ７リガンドを結合する能力、または（３）細胞内標的蛋白質に結合する能力についてアッセイすることができる。さらに他の好ましい実施形態では、ＧＡＶＥ７変異体は、細胞増殖または細胞分化を調節する能力についてアッセイすることができる。
【００５９】
本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち蛋白質をコードするセンス核酸に相補的な、たとえば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖の相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な分子を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、完全なＧＡＶＥ７コード鎖またはそれらの一部のみ、たとえば、蛋白質コード領域（またはオープンリーディングフレーム）の全体または一部に対して相補的であることができる。アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ７をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域に対してアンチセンスであることができる。この非コード領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、コード領域に隣接したアミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。
【００６０】
本明細書で開示したＧＡＶＥ７をコードするコード鎖配列（たとえば、配列番号１）があれば、本発明のアンチセンス核酸は、Ｗａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対の法則にしたがって設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であることができるが、より好ましくは、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域に対して相補的であることができる。たとえば、配列５’−ＧＧＣＴＡＡＣＡＴＣＧＴＧＣＣ−３’（配列番号５）を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、たとえば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであることができる。本発明のアンチセンス核酸は、当業界で公知の方法を用いて化学的合成および酵素的連結反応を使用して構築することができる。たとえば、アンチセンス核酸（たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させるため、またはアンチセンスとセンス核酸との間に形成された二本鎖の物理的安定性を増大させるために様々に改変したヌクレオチド、たとえば、チオリン酸誘導体、ホスホン酸誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用して化学合成することができる。
【００６１】
アンチセンス核酸を生成するために使用することができる改変ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキルシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ6−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６−ジアミノプリンが含まれる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンス方向にサブクローニングした発現ベクターを使用して（すなわち、挿入核酸から転写されたＲＮＡは、関心のある標的核酸に対してアンチセンス方向である）生物学的に生成することができる。
【００６２】
本発明のアンチセンス核酸分子は一般的に、ＧＡＶＥ７蛋白質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または結合し、それによって、たとえば転写および／または翻訳を阻害することによって蛋白質の発現を阻害するために、対象に投与するか、またはその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で生じさせる。ハイブリダイゼーションは、通常のヌクレオチドの相補性によって、安定な二本鎖を形成することができ、または、たとえば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんの主溝との特異的な相互作用によって、またはＧＡＶＥ７の制御領域に対してできる。
【００６３】
本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位への直接注射が含まれる。あるいは、アンチセンス核酸分子は選択細胞を標的とするために改変して、全身に投与することができる。たとえば、全身投与の場合、たとえば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体にアンチセンス核酸分子が結合することによって、この分子が選択した細胞表面上に発現した受容体または抗原に特異的に結合するように、アンチセンス分子を改変することができる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書で説明したベクターを使用して細胞に輸送することができる。十分なアンチセンス分子細胞内濃度を実現するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの下に置いたベクター構築物が好ましい。
【００６４】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子であることができる。α−アノマー核酸分子は、鎖が互いに平行に並んだ相補的ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子にはまた、メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Ｉｎｏｕｅ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９８７）２１５：３２７〜３３０）を含めることができる。
【００６５】
本発明はまた、リボザイムを包含する。リボザイムは、リボザイムがハイブリダイズする一本酸核酸、たとえばｍＲＮＡを切断することができるリボヌクレアーゼ活性を備えた触媒性ＲＮＡ分子である。したがって、（たとえば、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３４：５８５〜５９１に記載されている）リボザイムを使用して、触媒的にＧＡＶＥ７ｍＲＮＡ転写物を切断して、それによってＧＡＶＥ７ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＧＡＶＥ７をコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書で開示したＧＡＶＥ７ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（たとえば、配列番号１）をベースにして設計することができる。たとえば、活性部位のヌクレオチド配列がＧＡＶＥ７をコードするｍＲＮＡにおいて切断すべきヌクレオチド配列に相補的なテトラヒメナＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築することができる。たとえば、米国特許第４９８７０７１号および第５１１６７４２号を参照のこと。あるいは、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子の集団から特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。たとえば、Ｂａｒｔｅｌ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１４１１〜１４１８参照のこと。
【００６６】
本発明はまた、３重らせん構造を形成する核酸分子を包含する。たとえば、ＧＡＶＥ７の調節領域（たとえば、ＧＡＶＥ７プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的として標的細胞内におけるＧＡＶＥ７遺伝子の転写を阻害する３本鎖らせん構造を形成することによって、ＧＡＶＥ７遺伝子の発現を阻害することができる。一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ（１９９１）６（６）：５６９、Ｈｅｌｅｎｅ  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６０：２７、およびＭａｈｅｒ、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ（１９９２）１４（１２）：８０７を参照のこと。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖で改変して、たとえば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改善することができる。たとえば、核酸のデオキシリボースリン酸主鎖を改変してペプチド核酸を創出することができる（Ｈｙｒｕｐ他、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）４：５）。本明細書では、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、模倣核酸、たとえば、模倣ＤＮＡのことで、デオキシリボースリン酸主鎖がシュードペプチド主鎖によって置換されており、天然の核酸塩基は４個のみ保持されている。中性のＰＮＡ主鎖は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡと特異的にハイブリダイズできることが示された。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ他、（１９９６）前述、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９６）９３：１４６７０で記載されたような標準的固相ペプチド合成方法を使用して実施することができる。
【００６８】
ＧＡＶＥ７のＰＮＡは、治療適用および診断適用に使用することができる。たとえば、ＰＮＡは、たとえば、転写停止もしくは翻訳停止を誘導することによって、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節用のアンチセンスまたはアンチジーン剤として使用することができる。ＧＡＶＥ７のＰＮＡもまた使用することができる。たとえば、ＰＮＡは、たとえば、ＰＮＡ指示性ＰＣＲクランピングによる遺伝子内の一塩基対変異の分析において、その他の酵素、たとえば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ他、（１９９６）前述）と組み合わせて使用したときは人工的制限酵素として、またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーション用のプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ他、（１９９６）前述、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ他、（１９９６）前述）使用することができる。
【００６９】
他の実施形態では、ＧＡＶＥ７のＰＮＡを改変して、たとえば、親油性基またはその他のヘルパー基をＰＮＡに結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成することによって、またはリポソームまたはその他の当業界で公知の薬剤送達技術を使用することによって、安定性、特異性または細胞摂取を促進することができる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ他、（１９９６）、前述、Ｆｉｎｎ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９６）２４（１７）：３３５７〜６３、Ｍａｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８９）１７：５９７３およびＰｅｔｅｒｓｅｒ他、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ（１９７５）５：１１１９に記載されたように実施することができる。
【００７０】
単離ＧＡＶＥ７蛋白質および抗ＧＡＶＥ７抗体
本発明の一態様は、単離ＧＡＶＥ７蛋白質およびそれらの生物学的に活性のある部分、ならびに抗ＧＡＶＥ７抗体を生じるために免疫原として使用するために適したポリペプチド断片に関する。一実施形態では、天然ＧＡＶＥ７蛋白質は、標準的蛋白質精製技術を使用した適切な精製方法によって細胞または組織源から単離することができる。他の実施形態では、ＧＡＶＥ７蛋白質は組換えＤＮＡ技術によって製造する。組換え発現の代わりに、ＧＡＶＥ７蛋白質またはポリペプチドは、標準的ペプチド合成技術を使用して化学的に合成することができる。
【００７１】
「単離された」または「精製された」蛋白質またはそれらの生物学的に活性のある部分には、ＧＡＶＥ７蛋白質を取り出す細胞または組織源の細胞物質もしくはその他の混入蛋白質が実質的に含まれていないか、または化学的に合成した場合は化学的前駆体またはその他の化学物質が実質的に含まれていない。「実質的に細胞物質が含まれていない」という用語には、蛋白質を単離した、または組換えによって産生した細胞の細胞成分から蛋白質が分離されているＧＡＶＥ７蛋白質の調製物が含まれる。したがって、実質的に細胞物
質が含まれていないＧＡＶＥ７蛋白質には、（本明細書ではまた、「混入蛋白質」と称される）非ＧＡＶＥ７蛋白質が（乾燥重量で）約３０％未満、２０％、１０％または５％以下のＧＡＶＥ７蛋白質の調製物である。ＧＡＶＥ７蛋白質またはそれらの生物学的に活性のある部分を組換えによって生成するとき、実質的に培養培地を含まないこと、すなわち、培養培地が蛋白質調製物量の約２０％未満、１０％または５％以下を示すこともまた好ましい。ＧＡＶＥ７蛋白質を化学合成によって生成するとき、実質的に化学物質前駆体またはその他の化学物質を含まないこと、すなわち、蛋白質の合成に関与する化学物質前駆体またはその他の化学物質から分離されていることもまた好ましい。したがって、このようなＧＡＶＥ７蛋白質調製物は、化学物質前駆体または非ＧＡＶＥ７化学物質を（乾燥重量で）約３０％未満、２０％、１０％または５％以下有する。
【００７２】
ＧＡＶＥ７蛋白質の生物学的に活性のある部分には、ＧＡＶＥ７蛋白質のアミノ酸配列（たとえば、配列番号２に示したアミノ酸配列）と十分に同一であるか、またはそれから得られた、完全長ＧＡＶＥ７蛋白質よりも少ないアミノ酸を含み、ＧＡＶＥ７蛋白質の少なくとも１つの活性を示すアミノ酸配列を表すペプチドを含む。一般的に、生物学的に活性のある部分には、ＧＡＶＥ７蛋白質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフが含まれる。ＧＡＶＥ７蛋白質の生物学的に活性のある部分は、たとえば、アミノ酸の長さが１０個、２５個、５０個、１００個またはそれ以上であるポリペプチドであることができる。好ましい生物学的に活性のあるポリペプチドには、１個または複数の同定されたＧＡＶＥ７構造ドメイン、たとえば、第３細胞内ループドメイン（たとえば、配列番号２）が含まれる。
【００７３】
さらに、その他の生物学的に活性のある部分はその他の蛋白質領域が除去されており、組換え技術によって調製することができ、天然ＧＡＶＥ７蛋白質の１種または複数の機能的活性を評価することができる。
【００７４】
好ましいＧＡＶＥ７蛋白質は、配列番号２に示したアミノ酸配列を有する。その他の有用なＧＡＶＥ７蛋白質は、配列番号２と実質的に同一であり、天然の対立遺伝子変異または突然変異誘発によってアミノ酸配列が異なっていても配列番号２の蛋白質の機能的活性を保持している。たとえば、このようなＧＡＶＥ７蛋白質およびポリペプチドは、本明細書で説明した生物活性を少なくとも１つ備えている。
【００７５】
したがって、有用なＧＡＶＥ７蛋白質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも４５％、好ましくは５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含み、配列番号２のＧＡＶＥ７蛋白質の機能的活性を保持した蛋白質である。その他の場合、ＧＡＶＥ７蛋白質はＧＡＶＥ７第３細胞内ループドメイン（配列番号２）と５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％または１００％同一なアミノ酸配列を有する蛋白質である。好ましい実施形態では、ＧＡＶＥ７蛋白質は配列番号２のＧＡＶＥ７蛋白質の機能的活性を保持している。
【００７６】
２種類のアミノ酸配列または２種類の核酸のパーセント同一性を測定するために、最適な比較を行うために配列を整列させる（たとえば、第２のアミノ酸または核酸配列との整列を最適にするために第１のアミノ酸の配列または核酸配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されているとき、この分子はその位置において同一であると見なされる。２種類の配列の間のパーセント同一性は、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、パーセント同一性＝同一の位置の数／位置の総数（たとえば、重複する位置）×１００）。一実施形態では、２種類の配列は同じ長さである。
【００７７】
２種類の配列の間のパーセント同一性の測定は、数学的アルゴリズムを使用して実施することができる。２種類の配列を比較するために使用する数学アルゴリズムの好ましい、非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４、Ｋａｒｌｉｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３〜５８７７の改変アルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ（１９９０）２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、たとえば、スコア＝１００、ワード数＝１２で実施して、本発明のＧＡＶＥ７核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴ蛋白質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、ワード数＝３で実施して、本発明のＧＡＶＥ７蛋白質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較用のギャップアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９で記載されたように使用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）前記。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用するとき、それぞれのプログラムの初期設定変数を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【００７８】
配列を比較するために利用する数学的アルゴリズム他に好ましい、非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ他、ＣＡＢＩＯＳ（１９８８）４：１１〜１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを使用するとき、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップレングスペナルティは１２、ギャップペナルティは４を使用することができる。
【００７９】
２種類の配列の間のパーセント同一性は、前述と同様の技術を使用して、ギャップを入れて、また入れないで決定することができる。パーセント同一性を計算する場合は、正確な一致のみを計数する。
【００８０】
本発明はまた、ＧＡＶＥ７キメラまたは融合蛋白質を提供する。本明細書では、ＧＡＶＥ７「キメラ蛋白質」または「融合蛋白質」には、非ＧＡＶＥ７ポリペプチドに作動可能に結合したＧＡＶＥ７ポリペプチドが含まれる。「ＧＡＶＥ７ポリペプチド」とは、ＧＡＶＥ７に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。「非ＧＡＶＥ７ポリペプチド」とは、ＧＡＶＥ７蛋白質と実質的に同一ではない蛋白質、たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質とは異なり、同一または異なる生物から得られた蛋白質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。ＧＡＶＥ７融合蛋白質内で、ＧＡＶＥ７ポリペプチドはＧＡＶＥ７蛋白質のすべてまたは一部、好ましくはＧＡＶＥ７蛋白質の少なくとも１つの生物学的に活性のある部分に対応することができる。融合蛋白質内では、「作動可能に結合した」という用語は、ＧＡＶＥ７ポリペプチドおよび非ＧＡＶＥ７ポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すものである。非ＧＡＶＥ７ポリペプチドは、ＧＡＶＥ７ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。有用な一融合蛋白質は、ＧＡＶＥ７配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端に融合したＧＳＴ−ＧＡＶＥ７である。このような融合蛋白質によって、組換えＧＡＶＥ７を容易に精製することができる。好ましい実施形態では、本発明の第３細胞内ループ（ＩＣ３またはＩＬ３）（すなわち、配列番号２で示したようにアミノ酸約２０２から約２１０まで）をＩＬ３のＰＣＲ増幅によってＧＳＴに融合し、ベクター、たとえば、ｐＧＥＸ−２Ｔに生成物をサブクローニングする。得られた構築物を宿主細胞（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入することができ、前記構築物の発現は適切な小分子（たとえば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）によって誘導して、その後精製することができる（Ｌｅｅ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１（１９）：１１２７２〜１１２７９参照）。
【００８１】
ある種の宿主細胞（たとえば、哺乳類宿主細胞）では、ＧＡＶＥ７の発現および／または分泌は、異種シグナル配列を使用することによって増加させることができる。たとえば、バキュロウイルス外被蛋白質のｇｐ６分泌配列は、異種シグナル配列として使用することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ他著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２）。真核細胞異種シグナル配列のその他の例には、メリチンの分泌配列およびヒト胎盤アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれる。さらに他の例では、有用な原核細胞異種シグナル配列には、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、前述）およびプロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が含まれる。
【００８２】
さらに他の実施形態では、融合蛋白質はＧＡＶＥ７のすべてまたは一部がイムノグロブリン蛋白質ファミリーのメンバーから得られた配列と融合したＧＡＶＥ７−イムノグロブリン融合蛋白質である。本発明のＧＡＶＥ７−イムノグロブリン融合蛋白質は、医薬組成物に組み入れて、対象に投与し、ＧＡＶＥ７リガンドと細胞表面上のＧＡＶＥ７蛋白質との間の相互作用を阻害し、それによってｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＡＶＥ７媒介シグナル伝達を抑制することができる。ＧＡＶＥ７−イムノグロブリン融合蛋白質を使用してＧＡＶＥ７と同起源のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼすことができる。ＧＡＶＥ７リガンド−ＧＡＶＥ７相互作用を阻害すると、増殖および分化の障害を治療し、細胞生存性の調節（たとえば、促進または阻害）するために、治療上有用であり得る。さらに、本発明のＧＡＶＥ７−イムノグロブリン融合蛋白質は、免疫原として使用して、対象において抗ＧＡＶＥ７抗体を産生させたり、ＧＡＶＥ７リガンドを精製したり、ＧＡＶＥ７とＧＡＶＥ７リガンドとの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイで使用したりすることができる。
【００８３】
好ましくは、本発明のＧＡＶＥ７キメラ蛋白質または融合蛋白質は、標準的組換えＤＮＡ技術によって製造する。たとえば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来技術によって、たとえば、連結用に平滑末端または付着末端を使用し、適切な末端をもたらすために制限酵素で消化し、必要ならば付着末端を充填し、望ましくない結合および酵素連結を回避するためにアルカリホスファターゼ処理して、インフレームで一緒に連結する。他の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含めた従来技術によって合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、後でアニーリングして、再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる２種類の連続した遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実施することができる（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ他、前述）。さらに、融合部分（たとえば、ＧＳＴポリペプチド）を既にコードした多くの発現ベクターは市販されている。ＧＡＶＥ７をコードする核酸は、融合部分がＧＡＶＥ７蛋白質にインフレームで結合するように、このような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００８４】
本発明はまた、ＧＡＶＥ７蛋白質の変種（すなわち、ＧＡＶＥ７アミノ酸配列とは異なる配列を有する蛋白質）に関する。このような変種は、ＧＡＶＥ７のアゴニスト（模倣物）またはＧＡＶＥ７のアンタゴニストのいずれかとして機能することができる。ＧＡＶＥ７蛋白質の変種は、突然変異誘発、たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質の別々の点突然変異または切断によって生成することができる。ＧＡＶＥ７蛋白質のアゴニストは、天然に生じるＧＡＶＥ７蛋白質の生物活性と実質的に同一のまたはサブセットを保持することができる。ＧＡＶＥ７蛋白質のアンタゴニストは、たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流要素に競合的に結合することによって、天然型のＧＡＶＥ７蛋白質の１種または複数の活性を阻害することができる。したがって、特異的生物学的効果は、機能の限定された変種で処理することによって引き起こすことができる。天然型の蛋白質の生物活性のサブセットを有する変種で対象を処理すると、天然型のＧＡＶＥ７蛋白質による処理と比較して対象における副作用を少なくすることができる。
【００８５】
ＧＡＶＥ７アゴニスト（模倣物）またはＧＡＶＥ７アンタゴニストのいずれかとして機能するＧＡＶＥ７蛋白質の変種は、ＧＡＶＥ７アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてのＧＡＶＥ７の変異体、たとえば、切断変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。一実施形態では、ＧＡＶＥ７変種の多様なライブラリーは核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成し、多様な遺伝子ライブラリーによってコードされている。可能性のあるＧＡＶＥ７配列の縮重型が別個のポリペプチドとして、あるいは一連のＧＡＶＥ７配列を含有する一連の大きな融合蛋白質（たとえば、ファージディスプレイ用）として発現するように、ＧＡＶＥ７変種の多様なライブラリーは、たとえば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することによって生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＧＡＶＥ７変種のライブラリーを生成するために使用できる方法は様々である。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で実施することができ、次に合成遺伝子は適切な発現ベクターに連結する。一連の縮重遺伝子を使用して、１つの混合物で、可能性のあるＧＡＶＥ７配列の望ましい組合せをコードする配列すべてを供給することが可能である。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業界では公知である（たとえば、Ｎａｒａｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８３）３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ他、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８４）５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）１９８：１０５６、Ｉｋｅ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ（１９８３）１１：４７７を参照のこと）。
【００８６】
さらに、ＧＡＶＥ７蛋白質コード配列の断片のライブラリーを使用して、スクリーニングしてその後ＧＡＶＥ蛋白質変種を選択するためのＧＡＶＥ７断片の多様な集団を作製することができる。一実施形態では、コード配列断片のライブラリーは、ＧＡＶＥ７コード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をニッキングが１モル当たり約１回のみ生じる条件下においてヌクレアーゼで処理して、二本鎖ＤＮＡを変性させて、ＤＮＡを復元して切れ目の異なる生成物からセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成して、Ｓ１ヌクレアーゼ処理によって復元した二本鎖から一本鎖部分を除去して、得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結することによって作製することができる。この方法によって、様々な大きさのＧＡＶＥ７蛋白質のＮ末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを生成することができる。
【００８７】
点突然変異または切断によって作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子生成物をスクリーニングするため、および選択した特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法が当業界では公知である。このような技法は、ＧＡＶＥ７蛋白質のコンビナトリアル突然変異誘発によって作製した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合している。ハイスループット分析に使いやすく、大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技法には一般的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適切な細胞を得られたベクターライブラリーで形質転換すること、および所望する活性を検出することによって検出した生成物の遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現することが含まれる。ＲＥＭ（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）というライブラリー内の機能的変異の頻度を増強する技術をスクリーニングアッセイと組み合わせてＧＡＶＥ７変種を同定することができる（Ａｒｋｉｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：７８１１〜７８１５、Ｄｅｌｇｒａｖｅ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（
１９９３）６（３）：３２７〜３３１）。
【００８８】
単離したＧＡＶＥ７蛋白質またはその一部または断片を免疫原として使用して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製の標準的技術によってＧＡＶＥ７に結合する抗体を生じさせることができる。完全長ＧＡＶＥ７蛋白質を使用することができるか、あるいは、本発明は免疫原として使用するためのＧＡＶＥ７の抗原性ペプチド断片を提供する。ＧＡＶＥ７の抗原性ペプチドには、配列番号２に示したアミノ酸配列の少なくとも８個の（好ましくは１０、１５、２０、３０個またはそれ以上）アミノ酸残基が含まれ、ペプチドに対して生じた抗体がＧＡＶＥ７との特異的免疫複合体を形成するように、ＧＡＶＥ７のエピトープが含まれる。
【００８９】
関連態様では、抗原性ペプチドに含まれるエピトープは、蛋白質の表面に位置するＧＡＶＥ７の領域、たとえば親水性領域である。ヒトＧＡＶＥ７蛋白質配列の疎水性分析によって、配列番号２のアミノ酸約１と約１４との間の領域、アミノ酸約７２と約８３との間の領域、アミノ酸約１４５と約１５８との間の領域およびアミノ酸約２５１と約２５８との間の領域が特に親水性で、したがって標的化抗体産生に有用な表面残基をコードしやすいことが示唆される。
【００９０】
ＧＡＶＥ７免疫原は一般的に、適切な対象（たとえば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳類）をその免疫原で免疫することによって抗体を調製するために使用する。適切な免疫原調製には、たとえば、組換えによって発現したＧＡＶＥ７蛋白質または化学合成したＧＡＶＥ７ポリペプチドを含めることができる。この調製物にはさらに、アジュバント、たとえばフロインド完全もしくは不完全アジュバントまたは同様の免疫誘発剤を含めることができる。適切な対象を免疫原ＧＡＶＥ７調製物で免疫すると、抗ＧＡＶＥ７ポリクローナル抗体応答が誘導される。
【００９１】
したがって、本発明の他の態様には抗ＧＡＶＥ抗体に関する。本明細書では、「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、ＧＡＶＥ７などの抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子のことである。ＧＡＶＥ７に特異的に結合する分子は、ＧＥＶＥ７に結合するが、試料、たとえば天然にＧＡＶＥ７を含有する生物学的試料のその他の分子に実質的に結合しない分子である。イムノグロブリン分子の免疫学的に活性のある部分の例には、抗体をペプシンなどの酵素で処理することによって生成することができるＦ(ab)およびＦ(ab')2断片が含まれる。本発明は、ＧＡＶＥ７に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。本明細書では、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、ＧＡＶＥ７特有のエピトープと免疫反応を起こすことができる抗原結合部位の１種のみを含有する抗体分子の集団のことである。したがって、モノクローナル抗体組成物は一般的に、特有のＧＡＶＥ７蛋白質エピトープに単一の結合親和性を示す。
【００９２】
抗ＧＡＶＥ７ポリクローナル抗体は、適切な対象をＧＡＶＥ７免疫原で免疫することによって前述のように調製することができる。免疫した対象における抗ＧＡＶＥ７抗体の力価は、標準的技術によって、たとえば、固定化ＧＡＶＥ７を使用した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で、期間中ずっとモニターすることができる。所望するならば、ＧＡＶＥ７に特異的な抗体分子は、哺乳類（たとえば、血液）から単離して、さらに周知の技術、たとえばプロテインＡクロマトグラフィーによって精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫後適切な時点で、たとえば、抗ＧＡＶＥ７抗体の力価が最高のときに、抗体産生細胞を対象から採取して、標準的技術、たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜４９７によって最初に報告されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、（１９８５）、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）またはトリオーマ技術によってモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。ハイブリドーマを作製する技術は周知である（全般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｃｏｌｉｇａｎ他著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照のこと）。簡単に説明すると、不死細胞株（一般的に骨髄腫）を前述のようにＧＡＶＥ７免疫原で免疫した哺乳類のリンパ球（一般的に脾細胞）と融合して、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングしてＧＡＶＥ７に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００９３】
リンパ球と不死細胞株の融合に使用する多くの周知の方法のいずれかを抗ＧＡＶＥ７モノクローナル抗体の作製のために適用することができる（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前述、Ｇａｌｆｒｅ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６：５５０〜５５２、Ｋｅｎｎｅｔｈ、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８０）、およびＬｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（１９８１）５４：３８７〜４０２を参照のこと）。さらに、当業者であれば、同様に有用なこのような方法の変種がたくさんあることを理解するだろう。一般的に、不死細胞株（たとえば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同一の哺乳類種から得る。たとえば、マウスのハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫したマウスのリンパ球を不死化したマウス細胞株、たとえばヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性の骨髄腫細胞と融合することによって作製することができる。いくつかの骨髄腫細胞株のいずれか、たとえば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞株を標準的技術の融合相手として使用することができる。骨髄腫細胞株はＡＴＣＣから入手できる。一般的に、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞はポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞と融合する。次に、融合によって得られたハイブリドーマ細胞は、融合していない骨髄腫細胞および再生能力のない融合骨髄腫細胞（非融合脾細胞は、形質転換されていないので数日後に死滅する）を死滅させるＨＡＴ培地を使用して選択する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、たとえば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＧＡＶＥ７に結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出する。
【００９４】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代わりに、抗ＧＡＶＥ７モノクローナル抗体は、ＧＡＶＥ７で組換えコンビナトリアルイムノグロブリンライブラリー（たとえば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングして、それによってＧＡＶＥ７に結合するイムノグロブリンライブラリーメンバーを単離することによって、同定し単離することができる。ファージディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングキットは市販されている（たとえば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（登録商標）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。
【００９５】
さらに、抗体ディスプレイライブラリーの作製およびスクリーニングに特に使用しやすい方法および試薬の例は、たとえば、米国特許第５２２３４０９号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９、Ｆｕｃｈｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９：１３７０〜１３７２、Ｈａｙ他、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９２）３：８１〜８５、Ｈｕｓｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４６：１２７５〜１２８１、およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９９３）２５（１２）：７２５〜７３４に見いだすことができる。
【００９６】
さらに、組換え抗ＧＡＶＥ７抗体、たとえば、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体はヒトおよび非ヒト部分の両方を含んでいるが、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当業界で公知の組換えＤＮＡ技術を使用技術、たとえば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０２６７１、欧州特許出願番号第１８４１８７号、欧州特許出願番号第１７１４９６号、欧州特許出願番号第１７３４９４号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０１５３３、米国特許第４８１６５６７号、欧州特許出願番号第１２５０２３号、Ｂｅｔｔｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０：１０４１〜１０４３、Ｌｉｕ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７）８４：３４３９〜３４４３、Ｌｉｎ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）１３９：３５２１〜３５２６、Ｓｕｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８７）８４：２１４〜２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ他、Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ（１９８７）４７：９９９〜１００５、Ｗｏｏｄ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４：４４６〜４４９、Ｓｈａｗ他、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ（１９８８）８０：１５５３〜１５５９、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：１２０２〜１２０７、Ｏｉ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６）４：２１４、米国特許第５２２５５３９号、Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５５２〜５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４、およびＢｅｉｄｌｅｒ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８）１４１：４０５３〜４０６０によって作製することができる。
【００９７】
完全なヒト抗体は、特にヒト患者の治療に望ましい。このような抗体は、内在性イムノグロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用して生成することができる。トランスジェニックマウスを、選択した抗原、たとえばＧＡＶＥ７すべてまたは一部で通常の様式で免疫する。この抗原に対して特異的なモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して得ることができる。トランスジェニックマウスが有するヒトイムノグロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成し、その後型変換および体細胞変異を受ける。したがって、このようなエピトープを使用して、たとえば、ＧＡＶＥ７活性を阻害する抗体を同定する。非ヒト抗体の重鎖および軽鎖をクローニングして、ファージディスプレイＦab断片を生成するために使用する。たとえば、細菌が重鎖を分泌できるように重鎖遺伝子をプラスミドベクターにクローニングすることができる。軽鎖をファージ表面上に発現できるように、軽鎖遺伝子をファージコート蛋白質遺伝子にクローニングすることができる。ファージに融合したヒト軽鎖レパートリー（無作為集団）を使用して非ヒト重鎖を発現する細菌に感染させる。得られた子孫ファージはハイブリッド抗体（ヒト軽鎖／非ヒト重鎖）を表す。この選択抗原をパンニングスクリーニングで使用して、選択抗原に結合するファージを選択する。このようなファージの同定には、数回の選択が必要とされる可能性がある。
【００９８】
ヒト軽鎖遺伝子は、選択抗原に結合する選択ファージから単離する。次に、選択したヒト軽鎖遺伝子を使用して以下のようにヒト重鎖遺伝子の選択を導く。選択したヒト軽鎖遺伝子を細菌で発現させるためにベクターに挿入する。選択したヒト軽鎖を発現する細菌にファージに融合したヒト重鎖レパートリーを感染させる。得られた子孫ファージはヒト抗体（ヒト軽鎖／ヒト重鎖）を表す。
【００９９】
次に、選択抗原をパンニングスクリーニングで使用して、選択抗原に結合するファージを選択する。選択したファージは、最初に選択した、非ヒトモノクローナル抗体によって認識されるのと同様のエピトープを認識する完全なヒト抗体を表す。重鎖と軽鎖の両方をコードする遺伝子を単離して、ヒト抗体の産生のためにさらに操作することができる。その技術はＪｅｓｐｅｒｓ他（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２：８９９〜９０３）に記載されている。
【０１００】
抗ＧＡＶＥ７抗体（たとえば、モノクローナル抗体）を使用して、標準的技術、たとえばアフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降によってＧＡＶＥ７を単離することができる。抗ＧＡＶＥ７抗体によって、容易に、細胞からの天然ＧＡＶＥ７、および、宿主細胞において発現する組換えによって生成したＧＡＶＥ７を精製することができる。さらに、抗ＧＡＶＥ７抗体を（たとえば、細胞溶解物または細胞上清の）ＧＡＶＥ７蛋白質の検出に使用して、ＧＡＶＥ７蛋白質発現の存在量およびパターンを評価することができる。抗ＧＡＶＥ７抗体は、臨床試験方法の一部として、組織内の蛋白質濃度をモニターするために、たとえば、所与の治療計画の有効性を測定するために診断的に使用することができる。検出は、検出可能な物質に抗体を結合することによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、ルミノールが含まれる。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれる。適切な放射性物質の例には、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが含まれる。
【０１０１】
組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の他の態様は、ＧＡＶＥ７（またはその一部）をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書では、「ベクター」という用語は、他の核酸を結合して輸送することができる核酸分子のことである。ベクターの１種は「プラスミド」で、他のＤＮＡ部分を連結できる環状二本鎖ＤＮＡループのことである。他の種類のベクターは、ウイルスベクターで、他のＤＮＡ部分をウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、宿主細胞で自律増殖することができる（たとえば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（たとえば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入して宿主細胞のゲノムに組み込んで、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクター、発現ベクターは、それに作動可能に結合した遺伝子の発現を目的とすることができる。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態であることが多い。しかし、本発明は、このようなその他の発現ベクター形態、たとえば同等の機能を果たすウイルスベクター（たとえば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を含むものとする。
【０１０２】
本発明の組換え発現ベクターには、宿主での核酸の発現に適した形態の本発明の核酸が含まれる。このことは、組換え発現ベクターには、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した、発現する核酸に作動可能に結合した１種または複数の調節配列が含まれることを意味する。組換え発現ベクター内では、「作動可能に結合した」とは、（たとえば、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターを宿主細胞に導入するときは宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で関心のあるヌクレオチド配列が制御配列に結合することを意味するものである。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現調節領域（たとえば、ポリアデニル化シグナル）
が含まれるものとする。このような調節配列は、たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くの種類の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を目的とするもの（たとえば、組織特異的調節配列）が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計は形質転換する宿主細胞の選択、所望する蛋白質の発現濃度などの要素に左右され得ることを理解するだろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、本明細書で説明したような核酸によってコードされる蛋白質またはペプチド（たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質、ＧＡＶＥ７の変異型、融合蛋白質など）を生成することができる。
【０１０３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）昆虫細胞、酵母細胞または哺乳類細胞でＧＡＶＥ７を発現するために設計することができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、前述にさらに記載されている。あるいは、組換え発現ベクターは、たとえば、ファージ調節要素および蛋白質、たとえば、Ｔ７プロモーターおよび／またはＴ７ポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、翻訳することができる。
【０１０４】
原核細胞における蛋白質の発現は、融合または非融合蛋白質のいずれかの発現を目的とした構成性または誘導性プロモーターを含有するベクターを有するＥ．ｃｏｌｉにおいて実施することが最も多い。融合ベクターは、コードする蛋白質に、通常組換え蛋白質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、一般的に３つの目的、１）組換え蛋白質の発現を増加させること、２）組換え蛋白質の溶解性を高めること、および３）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することによって組換え蛋白質の精製を助けること、にかなう。しばしば、融合発現ベクターでは、蛋白質分解による切断部位を融合部分と組換え蛋白質の結合部分に導入し、融合蛋白質の精製の後、融合部分からの組換え蛋白質の分離を可能にする。このような酵素および同種の認識配列には、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。一般的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｓｍｉｔｈ他、Ｇｅｎｅ（１９８８）６７：３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびｐＲＩＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれ、それぞれグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白質またはプロテインＡを標的組換え蛋白質に融合する。
【０１０５】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ他、Ｇｅｎｅ（１９８８）６９：３０１〜３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１８５：６０〜８９）が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依拠する。
【０１０６】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換え蛋白質発現を最大限にする一戦略は、組換え蛋白質を蛋白質分解によって切断する能力が弱い宿主において蛋白質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１８５：１１９〜１２８）。他の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉで選択的に利用されるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９２）２０：２１１１〜２１１８）。このような本発明の核酸配列の改変は、標準
的ＤＮＡ合成技術によって実施することができる。
【０１０７】
他の実施形態では、ＧＡＶＥ７発現ベクターは酵母発現ベクターである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母における発現ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ他、Ｃｅｌｌ（１９８２）３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ他、Ｇｅｎｅ（１９８７）５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。
【０１０８】
あるいは、ＧＡＶＥ７は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞で発現することができる。培養した昆虫細胞（たとえば、Ｓｆ９細胞）での蛋白質の発現に有用なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９８３）３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７０：３１〜３９）が含まれる。
【０１０９】
さらに他の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞で発現する。哺乳類ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：１８７〜１９５）が含まれる。哺乳類細胞で使用するとき、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節要素によってもたらされることが多い。たとえば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から得られる。原核細胞と真核細胞の両方に適したその他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、前述の１６章および１７章を参照されたい。
【０１１０】
他の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞種における選択的な核酸の発現を目的とすることができる（たとえば、組織特異的調節要素を使用して核酸を発現する）。組織特異的調節要素は、当業界では公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９８７）１：２６８〜２７７）、リンパ系細胞特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ他、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８８）４３：２３５〜２７５）特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８９）８：７２９〜７３３）およびイムノグロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ他、Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：７２９〜７４０、Ｑｕｅｅｎ他、Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：７４１〜７４８）、神経細胞特異的プロモーター（たとえば、神経細繊維プロモーター、Ｂｙｒｎｅ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：９１２〜９１６）および乳腺特異的プロモーター（たとえば、乳清プロモーター、米国特許第４８７３３１６号および欧州特許出願第２６４１６６号）が含まれる。発達調節プロモーターにはまた、たとえばマウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：３７４〜３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（１９８９）３：５３７〜５４６）が包含される。
【０１１１】
本発明はさらに、アンチセンス方向に発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、このＤＮＡ分子は、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を（ＤＮＡ分子の転写によって）可能にする方法で調節配列に作動可能に結合させる。様々な細胞種でアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を誘導する、アンチセンス方向にクローニングされた核酸に作動可能に結合した制御配列を選択することができる。たとえば、構成的、組織特異的または細胞種特異的なアンチセンスＲＮＡの発現を目的とするウイルスプロモーターおよび／またはエン
ハンサーまたは調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が効率の高い調節領域の制御下で生成され、その活性がベクターを導入する細胞種によって測定できる組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であることができる。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の調節についての記載は、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ他（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６）を参照すること。
【０１１２】
本発明の他の態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入した宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書では交換可能に使用する。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的子孫も意味する。変異または環境の影響のいずれかによって世代の継代にある種の改変が起きる可能性があるので、このような子孫は、実際に、親細胞と同一であることはできないが、それでも本明細書で使用した様な用語の範囲内に含められる。
【０１１３】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であることができる。たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、２９３細胞またはＣＯＳ細胞）で発現させることができる。その他の適切な宿主細胞は、当業界で公知である。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書では、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム法もしくは塩化カルシウム共沈殿法、形質導入、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含めた外来核酸（たとえば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入する様々な当業界で認識されている技術を意味するものである。
【０１１４】
哺乳類細胞を安定して形質移入するためには、発現ベクターおよび使用したトランスフェクション技術に応じて、細胞の小画分のみがゲノム内に外来ＤＮＡを組み込むことができることが知られている。組み込む要素を同定し、選択するために、一般的に選択マーカー（たとえば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を関心のある遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーには、薬剤、たとえば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメソトレキセートに対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＧＡＶＥ７をコードするものと同一のベクターで宿主細胞に導入することができるか、または別のベクターで導入することができる。導入した核酸で安定に形質移入した細胞は、薬剤選択によって同定することができる（たとえば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１１５】
本発明の宿主細胞、たとえば、培養した原核または真核宿主細胞を使用して、ＧＡＶＥ７蛋白質を生成（すなわち、発現）することができる。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してＧＡＶＥ７蛋白質を産生する方法を提供する。一実施形態では、この方法には、ＧＡＶＥ７蛋白質を産生するように、（ＧＡＶＥ７をコードする組換え発現ベクターを導入した）本発明の宿主細胞を適切な培地で培養することが含まれる。他の実施形態では、この方法にはさらに、培地または宿主細胞からＧＡＶＥ７を単離することが含まれる。
【０１１６】
他の実施形態では、ＧＡＶＥ７には改変発現ベクターでサブクローニングされたその他の蛋白質を組換え発現するための誘導発現系が含まれる。たとえば、変異したＧ蛋白質を含む宿主細胞（たとえば、酵母細胞、Ｙ２副腎皮質細胞およびｃｙｓ-Ｓ４９、米国特許第６１６８９２７号、第５７３９０２９号および第５４８２８３５号、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９（１９）：８９３３〜３７およびＫａｔａｄａ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９（６）：３５８６〜９５参照）は、ＧＡＶＥ７が宿主細胞中で機能的に発現する場合に、ＧＡＶＥ７をコードする核酸配列を含む第１の発現ベクターで形質導入される。発現したＧＡＶＥ７が構成的に活性であっても、変異によってシグナル伝達は可能にならず、すなわち、下流カスケードに向うＧ蛋白質の活性化（たとえば、アデニリルシクラーゼ活性化の不在）は生じない。その後、ＧＡＶＥ７含有宿主細胞を形質転換するために、第２の発現ベクターを使用する。第２ベクターには、誘導系によって発現する関心のある遺伝子に加えて、宿主細胞のＧ蛋白質変異を補完する構造遺伝子が含まれる（すなわち、機能性哺乳類もしくは酵母Ｇs、Ｇi、ＧoまたはＧq、たとえば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４８８２０、米国特許第６１６８９２７号、第５７３９０２９号および第５４８２８３５号を参照のこと）。第２ベクターの補完性構造遺伝子は誘導性で、すなわち、前記補完性構造遺伝子に作動可能に結合したプロモーターを活性化する（たとえば、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、小分子など、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、前述参照のこと）外部から付加された成分の制御下にある。誘導因子を付加すると、前記補完性構造遺伝子によってコードされる蛋白質は機能的に発現し、したがって構成的に活性のあるＧＡＶＥ７が適切な下流経路活性化（たとえば、第２メッセンジャー形成）を導く複合体を形成する。関心のある遺伝子を含む第２ベクターは、適切な第２メッセンジャー（たとえば、ＣＲＥＢ、ＡＰ１因子）によって活性化される作動可能に結合したプロモーターを有する。したがって、第２メッセンジャーが蓄積するにつれて、関心のある遺伝子から上流にあるプロモーターが活性化されて前記遺伝子の産物を発現する。誘導因子がないと、関心のある遺伝子の発現が消失する。
【０１１７】
好ましい実施形態では、誘導発現系用の宿主細胞には、Ｓ４９（ｃｙｃ-）細胞が含まれるが、それだけには限定されない。細胞株にはＧ蛋白質変異体が含まれることを意図するが、適切な変異体は人工的に生成／構築することができる（米国特許第６１６８９２７号Ｂ１、第５７３９０２９号および酵母細胞については第５４８２８３５号を参照のこと）。
【０１１８】
関連態様では、細胞は配列番号２に示したような蛋白質をコードする配列を含むｃＤＮＡに作動可能に結合したベクターで形質移入する。前記系を含む第１および第２ベクターは、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：１８７〜１９５）、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ他、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９８７）６：２２９〜２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ他、Ｃｅｌｌ（１９８２）３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ他、Ｇｅｎｅ（１９８７）５４：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含むことを意図するが、これだけには限定されない。
【０１１９】
関連態様では、宿主細胞はこのような適切な手段によって形質移入することができ、トランスフェクションによって機能的ＧＡＶＥ７蛋白質の発現がもたらされる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、前述、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９０）。このような「機能的蛋白質」には、一度発現すると、第２メッセンジャー形成を調節するＧ蛋白質と複合体を形成する蛋白質が含まれるが、それだけには限定されない。
【０１２０】
さらに関連する態様では、関心のある遺伝子を企図するプロモーターには、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から得られたものが含まれるが、それだけには限定されない。その他の発現構築用の組合せも誘導系に適している（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、前述およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、前述参照）。
【０１２１】
本発明の宿主細胞はまた、ヒト以外のトランスジェニック動物を生成するために使用することができる。たとえば、一実施形態では、本発明の宿主細胞は、ＧＡＶＥ７コーディング配列を導入した受精卵細胞または胚性幹細胞である。次に、このような宿主細胞を使用して外来ＧＡＶＥ７配列をゲノムに導入したヒト以外のトランスジェニック動物または内在性ＧＡＶＥ７配列を改変した相同組換え動物を生成することができる。このような動物は、ＧＡＶＥ７の機能および／または活性を研究し、ＧＡＶＥ７活性の修飾因子の同定し、かつ／または評価するために有用である。本明細書では、「トランスジェニック動物」は非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはラットまたはマウスなどの齧歯類であり、１個または複数の動物細胞に導入遺伝子が含まれる。トランスジェニック動物のその他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが含まれる。
【０１２２】
トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）は、トランスジェニック動物を作り出すための細胞のゲノムに組み込まれ、成熟した動物のゲノムで維持されている外来ＤＮＡである。トランスジーンは、トランスジェニック動物の１個または複数の細胞種または組織においてコードされた遺伝子産物を発現することを目的とする。本明細書では、「相同組換え動物」は内在性ＧＡＶＥ７遺伝子が相同組換えによって改変された非ヒト動物で、好ましくは哺乳類で、より好ましくはマウスである。これは、動物が成長する前に、内在性遺伝子と動物細胞、たとえば、動物の胚細胞に導入された外来ＤＮＡ分子との間に実施する。
【０１２３】
本発明のトランスジェニック動物は、たとえば、マイクロインジェクションまたはレトロウイルス感染によって、受精卵細胞の雄前核にＧＡＶＥ７をコードする核酸を導入し、偽妊娠雌里親動物でこの卵細胞を成長させることによって作り出すことができる。ＧＡＶＥ７ｃＤＮＡ配列、たとえば、（配列番号１）の配列は、トランスジーンとして非ヒト動物のゲノムに導入することができる。あるいは、ヒトＧＡＶＥ７遺伝子の非ヒト相同体、たとえばマウスＧＡＶＥ７遺伝子は、ヒトＧＡＶＥ７ｃＤＮＡとのハイブリダイズに基づいて単離して、トランスジーンとして使用することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルはまた、トランスジーンに含めてトランスジーンの発現効率を高めることができる。組織特異的調節配列は、ＧＡＶＥ７に作動可能に結合して、特定の細胞においてＧＡＶＥ７蛋白質の発現を誘導することができる。胚操作およびマイクロインジェクションによってトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作り出す方法は当業界では一般的で、たとえば、米国特許第４７３６８６６号および第４８７０００９号、米国特許第４８７３１９１号およびＨｏｇａｎ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８６）に記載されている。同様の方法は、ゲノムにトランスジーンを有するその他のトランスジェニック動物の作りだし、かつ／またはその動物の組織または細胞においてＧＡＶＥ７ｍＲＮＡを発現させるために使用する。次に、初代のトランスジェニック動物をトランスジーンを有する追加の動物を繁殖させるために使用することができる。さらに、ＧＡＶＥ７をコードするトランスジーンを有するトランスジェニック動物はさらに、その他のトランスジーンを有するその他のトランスジェニック動物と交配することができる。
【０１２４】
相同組換え動物を作り出すために、欠失、付加または置換を導入し、それによってＧＡＶＥ７遺伝子を改変、たとえば機能的に破壊したＧＡＶＥ７遺伝子（たとえば、ＧＡＶＥ７遺伝子のヒトまたは非ヒト相同体、たとえば、マウスＧＡＶＥ７遺伝子）の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。好ましい実施形態では、相同組換えによって内在性ＧＡＶＥ７遺伝子を機能的に破壊させるように（すなわち、もはや機能的蛋白質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも称する）ベクターを設計する。
【０１２５】
あるいは、相同組換えによって内在性ＧＡＶＥ遺伝子を変異させるか、そうでなければ
改変するが、まだ機能的蛋白質をコードするようにベクターを設計する（たとえば、上流調節領域を改変して、それによって内在性ＧＡＶＥ７蛋白質の発現を変更することができる）。
【０１２６】
相同組換えベクターでは、ＧＡＶＥ７遺伝子の改変部分はＧＡＶＥ７遺伝子の付加の核酸を５’および３’末端に隣接させることで、ベクターの有する外来ＧＡＶＥ７と胚性幹細胞の内在性ＧＡＶＥ７遺伝子との間に相同組換えを起こさせる。付加の隣接したＧＡＶＥ７核酸は内在性遺伝子との相同組換えを成功させるために十分な長さである。一般的に、数キロ塩基の隣接ＤＮＡがベクター（の５’末端および３’末端の両方）に含まれる（相同組換えベクターの説明については、たとえば、Ｔｈｏｍａｓ他、Ｃｅｌｌ（１９８７）５１：５０３を参照のこと）。
【０１２７】
このベクターを（たとえば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入し、導入されたＧＡＶＥ７遺伝子が内在性ＧＡＶＥ７遺伝子と相同組換えした細胞を選択する（たとえば、Ｌｉ他、Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：９１５を参照のこと）。次に、選択した細胞を動物（たとえば、マウス）の胞胚に注射して、集団キメラを形成する（たとえば、Ｂｒａｄｌｅｙ  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ著、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、（１９８７）１１３〜１５２頁を参照のこと）。次に、キメラ胚を適切な偽妊娠雌里親動物に移植して、胚を分娩させる。相同組換えＤＮＡを生殖細胞に有する子孫を使用して、トランスジーンの生殖系列伝達によって動物の細胞すべてが相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖することができる。
【０１２８】
相同組換えベクターおよび相同組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）２：８２３〜８２９およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１３５４、ＷＯ９１／０１１４０、ＷＯ９２／０９６８およびＷＯ９３／０４１６９にさらに記載されている。
【０１２９】
他の実施形態では、トランスジーンの調節発現を可能にする選択系を含有するトランスジェニック非ヒト動物を作り出すことができる。このような系の１例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明は、たとえば、Ｌａｋｓｏ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：６２３２〜６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の他の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｒｎａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３５１〜１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用してトランスジーンの発現を調節する場合、ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択蛋白質の両方をコードするトランスジーンを含有する動物が必要である。このような動物は、たとえば、２種類、一方は選択蛋白質をコードするトランスジーンを含有し、他方はリコンビナーゼをコードするトランスジーンを含有するトランスジェニック動物を交配することによって、「２重」トランスジェニック動物を構築することによって提供することができる。
【０１３０】
本明細書で説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８５：８１０〜８１３およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９で記載された方法に従って生成することができる。簡単に説明すると、トランスジェニック動物の細胞、たとえば、体細胞を単離して、増殖周期を離れてＧ0期に移行するのを誘導することができる。次に、休止期の細胞を、たとえば、電気パルスを使用して、休止期の細胞を単離したのと同種の動物から得た除核卵母細胞と融合することができる。次に、桑実胚または芽細胞に成長させ、偽妊娠雌里親動物に移植するように再構築した卵母細胞を培養する。雌里親動物から産まれた子孫は、細胞、たとえば、体細胞を単離した動物のクローンである。
【０１３１】
医薬組成物
本発明のＧＡＶＥ７核酸分子、ＧＡＶＥ７蛋白質および抗ＧＡＶＥ７抗体（本明細書ではまた「活性化合物」と称する）は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物には一般的に、核酸分子、蛋白質または抗体、および薬剤として許容される担体が含まれる。本明細書では、「薬剤として許容される担体」という用語には、薬剤投与に適合したあらゆる溶媒、分散溶媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤ならびに吸収遅延剤などが含まれるものとする。薬剤として活性のある物質のためにこのような溶媒および薬剤を使用することは当業界では周知である。従来の溶媒または薬剤が活性化合物に不適合である場合を除いて、それらを組成物で使用することを意図する。補充活性化合物もまた、組成物に組み込むことができる。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、計画した投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例には、非経口、たとえば、静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が含まれる。非経口、皮内または皮下適用に使用する溶液または懸濁液には、以下の成分：注射用の水、生理食塩溶液、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調節剤を含めることができる。ｐＨは、酸または塩基、たとえば、ＨＣｌまたはＮａＯＨで調節することができる。非経口用調製物は、ガラスまたはプラスティック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多数投与用バイアルに封入することができる。
【０１３３】
注射使用に適した医薬組成物には、滅菌水性溶液（水混和性）または分散液および滅菌注射溶液または分散剤を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に適した担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いずれの場合においても、組成物を滅菌して、注入しやすい程度の流動性を備えていなければならない。この組成物は、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。この担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散溶媒であることができる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物作用の防御は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実施することができる。多くの場合、等張剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコールまたは塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０１３４】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物（たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質または抗ＧＡＶＥ７抗体）を前述の成分の１種または組合せと一緒に適切な溶媒に組み入れて、必要であれば濾過滅菌して調製することができる。一般的に、分散液は、基礎分散溶媒および前述のその他の必要な成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を組み入れることによって調製することができる。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、既に滅菌濾過した溶液から活性成分および他の所望する成分の粉末を生じさせる真空乾燥およ
び凍結乾燥である。
【０１３５】
経口組成物には、一般的に不活性希釈剤または食用担体が含まれる。組成物は、ゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療薬投与の目的のために、活性成分は賦形剤と共に取り入れて、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた、口内洗浄剤として使用するための流体担体を使用して調製することができ、流体担体に入れた化合物は経口的に、うがいしてはき出すか、または飲み込んで使用する。
【０１３６】
薬剤として適合する結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、トローチ剤などは、同様の性質の以下の成分または化合物：微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；澱粉またはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料などの矯臭剤、のいずれかを含有することができる。吸入によって投与する化合物は、圧縮容器または適切な圧縮不活性ガス、たとえば二酸化炭素を含有する分配容器または噴霧吸入器からエアゾール噴霧の形態で放出する。
【０１３７】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または経皮投与のためには、バリアーを透過するために適切な浸透剤を調剤に使用する。このような浸透剤は一般的に業界では公知で、たとえば、経粘膜投与には界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐薬を使用して実施することができる。経皮投与のためには、活性化合物は一般的に当業界で公知の軟膏、膏薬、ジェルまたはクリームに調合する。
【０１３８】
この化合物はまた、坐薬（たとえば、通常の坐薬基剤、たとえばカカオ脂およびその他のグリセリドを一緒に）または直腸放出用の保持浣腸の形態で調製することができる。
【０１３９】
一実施形態では、活性化合物は体からの迅速な排泄から化合物を保護する担体、たとえばインプラントおよびマイクロカプセル化放出系を含めた制御放出製剤として調製する。生物分解性、生体適合ポリマー、たとえば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。
【０１４０】
このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商品として入手することができる。（モノクローナル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを含めた）リポソーム懸濁液はまた、薬剤として許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法によって、たとえば、米国特許第４５２２８１１号に記載されたように調製することができる。
【０１４１】
投与しやすく、均一に製剤するために投与単位形態で経口用または非経口用組成物を製剤することが特に有利である。本明細書では投与単位形態とは、治療する対象への単位投与に適した物理的に分離された単位のことで、単位それぞれには必要な医薬担体と関連して所望する治療効果を生じるように計算された予備決定量の活性化合物が含まれる。疾患の種類および重症度に応じて、患者に投与する初回用量候補は、たとえば、１回または複数回に分けて投与するにせよ、連続的に注入するにせよ、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（たとえば、０．１から２０ｍｇ／ｋｇ）である。一般的な一日用量は、前述の要素に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上であってよい。数日以上かけて
反復投与する場合は、状態に応じて、所望する疾患症状の抑制が生じるまで治療を持続する。しかし、その他の投与計画も使用してよい。治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされる。投与計画の例は、ＷＯ９４／０４１８８に開示されている。本発明の投与単位形態の詳細は、活性化合物固有の特性および実現する特定の治療効果および一個人を治療するための活性化合物を調剤することの当業界固有の限界に影響を受け、そして直接決定される。
【０１４２】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５３２８４７０号）または定位注射（たとえば、Ｃｈｅｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：３０５４〜３０５７を参照）によって対象に送達させることができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物には、許容される希釈剤に溶かした遺伝子治療ベクターを含めることができ、または遺伝子送達媒体を組み込んだ遅延放出基質を含めることができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター、たとえばレトロウイルスベクターを組換え細胞からそのまま生成することができる場合、医薬調製物には遺伝子送達系を生成する１種または複数の細胞を含めることができる。
【０１４３】
医薬組成物は、容器、パックまたは注入容器に投与指示書と共に含めることができる。
【０１４４】
本発明の用途および方法
本明細書で説明した核酸分子、蛋白質、蛋白質相同体および抗体は、以下の方法：ａ）スクリーニングアッセイ；ｂ）検出アッセイ（たとえば、染色体マッピング、組織適合試験、法生物学；ｃ）予測医学（たとえば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験のモニターおよび薬理ゲノミクス）；およびｄ）治療方法（たとえば、治療および予防）の１種または複数で使用することができる。ＧＡＶＥ７蛋白質は、その他の細胞蛋白質と相互作用するので、（ｉ）細胞増殖の調節；（ｉｉ）細胞分化の調節；および（ｉｉｉ）細胞生存の調節に使用することができる。単離した本発明の核酸分子を使用して、（たとえば、遺伝子治療適用において宿主細胞の組換え発現ベクターによって）ＧＡＶＥ７蛋白質を発現したり、（たとえば、生物学的試料中の）ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡを検出したり、またはＧＡＶＥ７遺伝子の遺伝的損傷を検出したり、ＧＡＶＥ７活性を調節したりすることができる。さらに、ＧＡＶＥ７蛋白質を使用して、ＧＡＶＥ７活性または発現を調節する薬剤または化合物をスクリーニングしたり、ＧＡＶＥ７蛋白質の不十分な、または過剰な産生、または野生型ＧＡＶＥ７蛋白質と比較して活性の減少した、または異常なＧＡＶＥ７蛋白質型の産生を特徴とする疾患を治療したりすることができる。さらに、本発明の抗ＧＡＶＥ７抗体を使用して、ＧＡＶＥ７蛋白質を検出したり単離したり、ＧＡＶＥ７活性を調節したりすることができる。本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定した新規な薬剤およびそれらの本明細書で説明したような治療用の用途に関する。
【０１４５】
Ａ．スクリーニングアッセイ
内在性リガンドの存在下でＧ蛋白質受容体を活性化するとＧ蛋白質受容体複合体形成が可能になり、その結果ＧＴＰのＧ蛋白質への結合が導かれる。Ｇ蛋白質のＧＴＰ加水分解酵素ドメインは、通常の条件下で、ＧＴＰをゆっくりＧＤＰに加水分解して、受容体の不活性化を引き起こす。しかし、構成的に活性化した受容体は、ＧＤＰからＧＴＰへの加水分解を継続する。
【０１４６】
Ｇ蛋白質の非加水分解性基質、［35Ｓ］ＧＴＰγＳを使用して、構成的に活性化した受容体を発現する膜への結合促進をモニターすることができる。ＴｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉは、［35Ｓ］ＧＴＰγＳを使用して、リガンドの不在下および存在下でのＧ蛋白質の膜への結合をモニターすることができることを報告した（Ｔｒａｙｎｏｒ他、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９５）４７（４）：８４８〜５４）。このようなアッセ
イ系は、この系は一般的に受容体に結合する特定のＧ蛋白質に関わらずにＧ蛋白質結合受容体すべてに適用できるので、候補化合物の最初のスクリーニングで使用することが好ましい。
【０１４７】
Ｇs20は、酵素アデニリルシクラーゼを刺激するが、ＧiおよびＧ0はこの酵素を阻害する。当業界で周知なように、アデニリルシクラーゼはＡＴＰからｃＡＭＰへの変換を触媒する。したがって、Ｇs蛋白質を結合する構成的に活性化したＧＰＣＲはｃＡＭＰの細胞濃度増加に関係する。あるいは、Ｇi（またはＧ0）を結合できる構成的に活性化したＧＰＣＲはｃＡＭＰの細胞濃度減少に関係する。「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」８章、ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（３版）、Ｎｉｃｈｏｌｓ他著、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、１９９２を参照のこと。したがって、ｃＡＭＰを検出するアッセイを使用して、候補化合物が受容体の逆アゴニストであるかどうかを決定することができる。ｃＡＭＰを測定するための当業界で公知の様々な取り組みを使用することができる。一実施形態では、抗ｃＡＭＰ抗体はＥＬＩＳＡをベースとした方法で使用する。他の実施形態では、全細胞第２メッセンジャーレポーター系アッセイを意図する（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１３１参照）。
【０１４８】
関連態様では、環状ＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性ＤＮＡ結合蛋白質または転写因子（ＣＲＥＢ）（次にｃＡＭＰ応答要素と呼ばれる特異的部位でプロモーターと結合し、遺伝子を発現させる）の結合を促進することによって遺伝子を発現させる。したがって、レポーター遺伝子、たとえば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼの前に多数のｃＡＭＰ応答要素を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築することができる。さらに、構成的に活性化したＧs結合受容体はｃＡＭＰの蓄積を引き起こし、次にレポーター蛋白質の遺伝子および発現を活性化する。その後、β−ガラクトシダーゼまたまたはルシフェラーゼなどのレポーター蛋白質は、標準的生物化学アッセイを使用して検出することができる（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１３１）。
【０１４９】
その他のＧ蛋白質、たとえば、ＧoおよびＧqは、酵素、ホスホリパーゼＣの活性化に関係し、次にリン脂質、ＰＩＰ２を加水分解して、２種類の細胞内メッセンジャー、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−トリリン酸を放出させる。ＩＰ３の蓄積増加は、Ｇq結合受容体およびＧo結合受容体の活性化に関係する（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１３１）。ＩＰ３蓄積を検出するアッセイを使用して、候補化合物がＧq結合受容体またはＧo結合受容体の逆アゴニストであるかどうかを決定することができる。Ｇq結合受容体はまた、Ｇq依存性ホスホリパーゼＣがＡＰ１要素を含有する遺伝子の活性化を引き起こすかどうかを測定するＡＰ１レポーターアッセイを使用して調べることができる。したがって、活性化したＧq結合受容体はこのような遺伝子の発現増加を示し、それによって逆アゴニストはこのような発現減少を示す。
【０１５０】
本発明は、調節因子、すなわち、ＧＡＶＥ７蛋白質に結合し、たとえば、ＧＡＶＥ７発現またはＧＡＶＥ７活性に刺激または阻害効果を有する候補化合物または試験化合物または薬剤（たとえば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子またはその他の薬剤）を同定する方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供する。
【０１５１】
一実施形態では、本発明は膜結合形態のＧＡＶＥ７蛋白質、ポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性のある部分に結合するか、活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、分注（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法を含めた当業界で公知
のコンビナトリアルライブラリーにおいて、数多くの取り組みのいずれかを使用して得ることができる。生物学的ライブラリーによる取り組みはペプチドライブラリーに限定されるが、その他の４種類の取り組みは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用することができる（Ｌａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ（１９９７）１２：１４５）。
【０１５２】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当業界では、たとえば、ＤｅＷｉｔｔ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：６９０９、Ｅｒｂ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（１９９４）３７：２６７８、Ｃｈｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６１：１３０３、Ｃａｒｒｅｌｌ他、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ（１９９４）３３：２０５９、Ｃａｒｅｌｌ他、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｉ（１９９４）３３：２０６１およびＧａｌｌｏｐ他、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（１９９４）３７：１２３３に見いだすことができる。
【０１５３】
化合物のライブラリーは、溶液中（たとえば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）１３：４１２〜４２１）またはビーズ上（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５４：８２〜８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６４：５５５〜５５６）、細菌（米国特許第５２２３４０９号）、胞子（米国特許第５５７１６９８号、第５４０３４８４および第５２２３４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９：１８６５〜１８６９）またはファージ（Ｓｃｏｔｔ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：３８６〜３９０、Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：４０４〜４０６、Ｃｗｉｒｌａ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：６３７８〜６３８２、およびＦｅｌｉｃｉ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９１）２２２：３０１〜３１０）に存在することができる。
【０１５４】
一実施形態では、アッセイは細胞をベースとしたアッセイで、膜結合型のＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分を細胞上で発現する細胞を試験化合物と接触させて、試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質と結合する能力を測定する。たとえば、細胞は酵母細胞または哺乳類由来の細胞であることができる。試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質に結合する能力の測定は、たとえば、試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分への結合が複合体中の標識化合物を検出することによって測定できるように、放射性同位元素または酵素標識を有する試験化合物の結合によって実施することができる。たとえば、試験化合物は125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは3Ｈで直接的または間接的に標識することができ、放射性同位元素は放射能放出を直接計数したり、シンチレーションで計数したりする。あるいは、試験化合物は、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素標識することができ、酵素標識を適切な基質の生成物への変換を測定することによって検出する。好ましい実施形態では、このアッセイには、膜結合型のＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分を細胞表面上で発現する細胞をＧＡＶＥ７と結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成すること、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質と相互作用する能力を測定することが含まれ、試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質と相互作用する能力の測定には、試験化合物が公知の化合物と比較してＧＡＶＥ７またはその生物学的に活性のある部分と選択的に結合する能力を測定することが含まれる。
【０１５５】
他の実施形態では、アッセイは細胞をベースとしたアッセイで、膜結合型のＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分を細胞表面上で発現する細胞を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分の活性を調節する（たとえば、刺激または阻害する）能力を測定することが含まれる
。試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分の活性を調節する能力の測定は、たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質がＧＡＶＥ７標的分子と結合または相互作用する能力を測定することによって実施することができる。本明細書では、「標的分子」はＧＡＶＥ７蛋白質が天然に結合または相互作用する分子、たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質を発現する細胞の表面上の分子、第２の細胞の表面上の分子、細胞外環境における分子、細胞膜の内面に関連する分子または細胞質分子である。ＧＡＶＥ７標的分子は、本発明の非ＧＡＶＥ７分子またはＧＡＶＥ７蛋白質またはポリペプチドであることができる。一実施形態では、ＧＡＶＥ７標的分子は細胞膜を通過して細胞内への細胞外シグナル（たとえば、化合物が膜結合ＧＡＶＥ７分子に結合することによって発生するシグナル）の伝達を促進するシグナル伝達経路の成分である。標的は、たとえば、活性を触媒する第２の細胞間蛋白質または下流シグナル伝達分子とＧＡＶＥ７との結合を促進する蛋白質であることができる。
【０１５６】
ＧＡＶＥ７蛋白質がＧＡＶＥ７標的分子と結合または相互作用する能力の測定は、前述の直接結合の測定方法の１つによって実施することができる。好ましい実施形態では、ＧＡＶＥ７蛋白質がＧＡＶＥ７標的分子と結合または相互作用する能力の測定は、標的分子の活性を測定することによって実施することができる。たとえば、標的分子の活性は、標的の第２細胞メッセンジャー（たとえば、細胞内Ｃａ2+、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質上で標的の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（たとえば、検出可能なマーカー、たとえばルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に結合したＧＡＶＥ７応答性調節要素）の誘導を検出すること、または細胞応答、たとえば、細胞分化または細胞増殖を検出することによって測定することができる。
【０１５７】
さらに他の実施形態では、本発明のアッセイは細胞を含まないアッセイで、ＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分と試験化合物を接触させ、試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分に結合する能力を測定することが含まれる。試験化合物のＧＡＶＥ７蛋白質への結合は、前述のように直接的に、または間接的に測定することができる。好ましい実施形態では、このアッセイにはＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分をＧＡＶＥに結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成すること、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質と相互作用する能力を測定することが含まれ、試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質と相互作用する能力の測定には、試験化合物が公知の化合物と比較してＧＡＶＥ７またはその生物学的に活性のある部分に選択的に結合する能力を測定することが含まれる。
【０１５８】
他の実施形態では、アッセイは細胞を含まないアッセイで、ＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分を試験化合物と接触させ、試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分を調節（たとえば、刺激または阻害）する能力を測定することが含まれる。試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質の活性を調節する能力の測定は、たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質がＧＡＶＥ７標的分子と結合する能力を前述の直接結合を測定する方法の１つによって測定することによって実施することができる。他の実施形態では、試験化合物がＧＡＶＥ７の活性を調節する能力の測定は、ＧＡＶＥ７蛋白質がさらにＧＡＶＥ７標的分子を変更する能力を測定することによって実施することができる。たとえば、適切な基質上で標的分子の触媒／酵素活性を既に説明したように測定することができる。
【０１５９】
さらに他の実施形態では、細胞を含まないアッセイには、ＧＡＶＥ７蛋白質またはその生物学的に活性のある部分をＧＡＶＥ７と結合する公知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成すること、このアッセイ混合物を試験化合物と接触さること、および試験化合
物がＧＡＶＥ７蛋白質と相互作用する能力を測定することが含まれ、試験化合物がＧＡＶＥ７蛋白質と相互作用する能力の測定には、ＧＡＶＥ７蛋白質が選択的にＧＡＶＥ７標的分子に結合するか、その活性を調節する能力を測定することが含まれる。
【０１６０】
必ずしもリガンド結合を阻害しないが、受容体に構造的な変化を引き起こして活性化の原因となり得るＧ蛋白質結合を可能にするか、またはおそらく受容体凝集、２量体化またはクラスター形成を引き起こす非リガンド分子によって受容体を活性化することができる。
【０１６１】
したがって、抗体は細胞表面に曝露したＧＡＶＥ７の様々な部分に対して生じることができる。標準的アッセイ、たとえばｃＡＭＰ濃度または細胞内Ｃａ2+濃度のモニターによって測定したとき、Ｇ蛋白質カスケードを介して細胞を活性化する抗体を選択することができる。
【０１６２】
抗体は公知の技術を使用して作製することができる。分子マッピングおよび特定のエピトープマッピングが関係するので、おそらくモノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、細胞表面で発現した完全な受容体および細胞表面で形成することが知られているペプチドの両方に対して生成することができる。Ｇｅｙｓｅｎ他、米国特許第５９９８５７７号の方法を実施して、多数の関連ペプチドを得ることができる。
【０１６３】
ＧＡＶＥ７を活性化することが発見された抗体は、ＧＡＶＥ７活性化に関係のない活性、たとえば補体結合を最小限に抑えるために改変することができる。したがって、抗体分子は切断したり、変異させたりしてＧＡＶＥ７活性化以外の活性を最小限に抑えるか、または除去することができる。たとえば、ある種の抗体では、抗原結合部分のみが必要とされる。したがって、抗体のＦc部分を除去することができる。
【０１６４】
ＧＡＶＥ７を発現する細胞を抗体に曝露してＧＡＶＥ７を活性化する。次に、受容体活性を高活性レベルか、または低活性レベルのいずれかに改変する分子を同定するために、活性化した細胞を様々な分子に曝露する。次に、目的を実現する分子を抗体なしでＧＡＶＥ７を発現する細胞について試験して、非活性化細胞に対する効果を観察することができる。次に、標的分子をＧＡＶＥ７代謝の改変に関連する疾患を治療するための候補薬剤として、公知の技術を使用して試験して改変することができる。
【０１６５】
本発明の細胞を含まないアッセイは、可溶型および膜結合型両方のＧＡＶＥ７に使用しやすい。膜結合型のＧＡＶＥ７を含む、細胞を含まないアッセイの場合、膜結合型ＧＡＶＥ７が溶液中で維持されるように、可溶化剤を使用することが望ましい。このような可溶化剤の例には、非イオン性洗剤、たとえば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンミノ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートが含まれる。
【０１６６】
本発明の前記アッセイ方法の多数の実施形態では、ＧＡＶＥ７またはその標的分子のいずれかを固定して、１種または両方の蛋白質の未複合型から複合型を分離し、ならびにアッセイの自動化に対応することが望ましい。試験化合物のＧＡＶＥ７への結合または候補化合物の存在下および不在下でのＧＡＶＥ７と標的分子との相互作用は、反応物を入れるのに適した任意の容器で実施することができる。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心管が含まれる。一実施形態では、１種または両方の蛋白質を基質に結合させるドメインを付加する融合蛋白質を提供することができる。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＧＡＶＥ７融合蛋白質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合蛋白質をグルタチオンセファロース（登録商標）ビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に吸着させることができる。あるいは、グルタチオンを被覆したマイクロタイタープレートを使用して、次に試験化合物または試験化合物および非吸着性標的蛋白質もしくはＧＡＶＥ７蛋白質を一緒にして、複合体形成を促進する条件下（たとえば、生理学的な塩およびｐＨの条件）でこの混合物をインキュベートすることができる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄していかなる未結合成分も除去し、複合体形成は、たとえば、前述のように直接的に、または間接的に測定する。あるいは、複合体は基質から分離して、標準的技術を使用してＧＡＶＥ７結合または活性の程度を測定することができる。
【０１６７】
蛋白質を基質に固定するその他の方法もまた、本発明のスクリーニングアッセイで使用することができる。たとえば、ＧＡＶＥ７またはそれらの標的分子は、ビオチンおよびストレプトアビジンの複合体を利用して固定することができる。ビオチン化ＧＡＶＥ７または標的分子は、当業界で周知の技術（たとえば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製することができ、ストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェルに固定することができる。あるいは、ＧＡＶＥ７または標的分子と反応するが、ＧＡＶＥ７蛋白質と標的分子との結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに被覆して、抗体結合によって未結合標的またはＧＡＶＥ７をウェルに捕捉することができる。ＧＳＴ固定複合体について前述したものに加えて、このような複合体を検出する方法には、ＧＡＶＥ７または標的分子と反応する抗体を使用した複合体の免疫検出法、ならびにＧＡＶＥ７または標的分子と関連する酵素活性の検出に基づいた酵素結合アッセイが含まれる。
【０１６８】
他の実施形態では、ＧＡＶＥ７発現の調節因子は、細胞を候補化合物と接触させ、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたは蛋白質の細胞内発現を測定する方法で同定する。候補化合物存在下でのＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現濃度を、候補化合物の不在下でのＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現濃度と比較する。次に、候補化合物は比較に基づいてＧＡＶＥ７発現の調節因子として同定することができる。たとえば、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現が候補化合物存在下では不在下よりも多いとき（統計学的に有意に多いとき）、その候補化合物はＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたは蛋白質発現の刺激因子またはアゴニストとして同定する。あるいは、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現が候補化合物存在下では不在下よりも少ないとき（統計学的に有意に少ないとき）、その候補化合物はＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたは蛋白質発現の阻害因子またはアンタゴニストとして同定する。ＧＡＶＥ７活性がリガンドまたはアゴニストの存在下で、または構成的ＧＡＶＥ７において基準を下回って減少する場合、その候補化合物は逆アゴニストとして同定される。細胞におけるＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたは蛋白質の発現濃度は、本明細書でＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたは蛋白質を検出するために説明した方法によって測定することができる。
【０１６９】
さらに他の本発明の態様では、ＧＡＶＥ７蛋白質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおいて「ベイト蛋白質」として使用して（たとえば、米国特許第５２８３３１７号、Ｚｅｒｖｏｓ他、Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：２２３〜２３２、Ｍａｄｕｒａ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：１２０４６〜１２０５４、Ｂａｒｔｅｌ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３）１４：９２０〜９２４、Ｉｗａｂｕｃｈｉ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９３）８：１６９３〜１６９６およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＧＡＶＥ７と結合または相互作用し（「ＧＡＶＥ７結合蛋白質」または「ＧＡＶＥ７−ｂｐ」）、ＧＡＶＥ７活性を調節するその他の蛋白質を同定することができる。このようなＧＡＶＥ７結合蛋白質はまた、たとえばＧＡＶＥ７経路の上流または下流因子としてＧＡＶＥ７蛋白質によるシグナルの伝播に関連するようである。
【０１７０】
純粋なＧＡＶＥ７を大量に製造できるので、合理的な薬剤設計のために適切な機能領域の構造の物理的特性を確認することができる。たとえば、分子のＩＣ３領域およびＥＣドメインは、特に関心の持たれる領域である。領域の形状およびイオン配置が一旦認識されたら、その領域と相互作用する候補薬剤を設計して、次に完全な細胞、動物および患者で試験することができる。このような３−Ｄ構造情報を得ることができる方法には、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ分光学、分子モデル形成などが含まれる。３−Ｄ構造によってまた、その他のその部位で作用する公知の薬剤が存在する公知の蛋白質の類似構造部位を同定することができる。このような薬剤、またはその誘導体は、ＧＡＶＥ７との用途を見つけることができる。
【０１７１】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤および本明細書で説明したようなそれらの治療のための使用に関する。
【０１７２】
Ｂ．検出アッセイ
本明細書で同定したｃＤＮＡ配列の一部または断片（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として様々な方法で使用することができる。たとえば、この配列を使用して、（ｉ）それぞれの遺伝子を染色体に位置づけて、したがって遺伝的疾患に関係する遺伝領域を位置づけたり、（ｉｉ）微量な生物学的試料から個人を同定したり（組織タイピング）、（ｉｉｉ）生物学的試料の法医学的同定を助けたりすることができる。その適用については、以下の細項目で説明する。
【０１７３】
１．染色体マッピング
遺伝子配列（または配列の一部）を一旦単離したら、その配列を使用して染色体、たとえば染色体１２におけるＧＡＶＥ７遺伝子の位置を位置づけすることができる。したがって、本明細書で説明したＧＡＶＥ７核酸分子またはその断片を使用して、染色体１２におけるＧＡＶＥ７の位置を位置づけすることができた。ＧＡＶＥ７配列の染色体１２への位置づけは、疾患に関連した遺伝子と配列を関連づけるために重要な第１段階である。
【０１７４】
簡単に説明すると、ＧＡＶＥ７配列からＰＣＲプライマー（１５〜２５ｂｐの長さが好ましい）を調製することによってＧＡＶＥ７遺伝子を染色体１２に位置づけることができる。このプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用する。ＧＡＶＥ７配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが増幅断片を生じる。
【０１７５】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳類の体細胞（たとえば、ヒトとマウスの細胞）を融合することによって調製する。ヒトとマウスの細胞のハイブリッドが増殖して分割するにつれて、一般的にヒト染色体が無作為な順番で失われるが、マウス染色体は維持される。（特定の酵素が欠如しているので）マウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を使用することによって、必要な酵素をコードする遺伝子を含有する１つのヒト染色体が保持される。様々な培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルを確立する。パネル内の各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、およびマウス染色体全部を含有し、特定のヒト染色体に個々の遺伝子を容易にマッピングすることが可能である（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２２０：９１９〜９２４）。ヒト染色体の断片のみを含有する体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を有するヒト染色体を使用して生成することができる。
【０１７６】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるための迅速な方法である。３種またはそれ以上の配列を、１個のサーモサイクラーを使用して一日毎に位置づけることができる。ＧＡＶＥ７配列を使用してオリゴヌクレオチドプライマーを設計して、染色体１２の断片パネルまたは染色体１２に関係する転座のパネルで局在化を実施する。ＧＡＶＥ７配列を染色体１２に位置づけするために同様に使用することができるその他のマッピング方法には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆａｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：６２２３〜２７）、フローソーティングした標識染色体による予備スクリーニングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションによる予備選択が含まれる。
【０１７７】
ＤＮＡ配列の中期染色体伸展物に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による蛍光を使用して、１段階で正確な染色体位置をもたらすことができる。染色体伸展物は、有糸分裂紡錘体を破壊する化学物質、たとえば、コルセミドによって分割を中期で遮断した細胞を使用して作製することができる。染色体は、トリプシンで短時間処理して、次にギムザで染色することができる。染色体を独立して同定できるように、明暗のバンドパターンを各染色体について染色する。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基の短いＤＮＡ配列で使用することができる。しかし、１０００塩基より大きいクローンは、簡単な検出では十分なシグナル強度で固有の染色体位置に結合する可能性が高い。好ましくは１０００塩基、より好ましくは２０００塩基があれば、合理的な時間で良好な結果を得るために十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａ他を参照すること（Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）。染色体マッピングは、コンピュータ上で（in silico）、統計学的考察、たとえばロッド（ｌｏｄ）スコアまたは単なる近接性を使用して推測することができる。たとえば、ＧＡＶＥ７は、コンピュータ上でマッピングによって試験的に１２ｐ２４．２３に位置づけられる。
【０１７８】
染色体マッピング用の試薬は、染色体１２または染色体上の単一部位に印を付けるために、個別に使用することができ、または一連の試薬を多数の部位および／または多数の染色体に印を付けるために使用することができる。ＧＡＶＥ７遺伝子の隣接領域に対応する試薬は実際にマッピングのために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリーで保存されている可能性が大きく、したがって染色体マッピング中に交差ハイブリダイゼーションの生じる機会が増加する。
【０１７９】
配列が正確な染色体位置に位置づけされたら、染色体上での配列の物理的位置を遺伝子地図データと関連づけることができる（このようなデータは、たとえば、ジョンホプキンス大学、ウェールズ医学図書館からオンラインで入手できるＭｃＫｕｓｉｃｋ、Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎに見いだされる）。次に、同一の染色体領域に位置づけされた遺伝子と疾患の関係は、連鎖解析によって同定することができ（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝（ｃｏ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ））。たとえば、Ｅｇｅｌａｎｄ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５：７８３〜７８７に記載されている。
【０１８０】
さらに、ＧＡＶＥ７に関連する疾患に罹った患者と罹っていない患者の間のＤＮＡ配列の違いを測定することができる。罹患患者のいくらかまたはすべてに変異が認められ、罹患してない患者には認められないならば、その変異は特定の疾患の原因となるようである。罹患した患者と罹患していない患者の比較には一般的に、最初は伸展染色体で見ることができるか、またはＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを使用して検出できる欠失または転座などの染色体における構造的変化の探索が含まれる。最終的には、数人の個人の遺伝子を完全に配列決定して、変異の存在を確認し、多形から変異を区別することができる。
【０１８１】
２．組織タイピング
本発明のＧＡＶＥ７配列はまた、微量な生物学的試料から個人を同定するために使用することができる。たとえば、米国軍隊は個人の同定に制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を使用することに注目している。この技術では、個人のゲノムＤＮＡを１種または複数の制限酵素で消化して、サザンブロットで試験して、同定のために固有のバンドを生じさせる。この方法は、紛失したり、入れ替わったり、盗まれたりして完全な同定が困難な現在の「認識タグ（Ｄｏｇ  Ｔａｇ）」の限界を克服している。本発明の配列は、ＲＦＬＰ用の追加のＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５２７２０５７号に記載されている）。
【０１８２】
さらに、本発明の配列を使用して、個人のゲノムの選択された位置の実際の塩基毎のＤＮＡ配列を決定する他の技術を提供することができる。したがって、本明細書で説明したＧＡＶＥ７配列を使用して配列の５’から３’末端への２個のＰＣＲプライマーを調製することができる。次に、このプライマーを使用して個人のＤＮＡを増幅して、その後それらの配列を提供することができる。
【０１８３】
対立遺伝子の違いによって個人それぞれが固有のこのような一連のＤＮＡ配列を有するので、このように調製した個人の対応するＤＮＡ配列のパネルによって、個人を固有に同定することができる。本発明の配列を使用して、個人および組織からこのような同定配列を得ることができる。本発明のＧＡＶＥ７配列は、ヒトゲノムの一部を固有に表す。対立遺伝子の変動が、配列のコード領域ではある程度、非コード領域ではより大きな程度生じる。個々のヒトの間の対立遺伝子の変動は、５００塩基毎に約１回の頻度で生じる。本明細書で説明した配列それぞれはある程度まで、同定するために比較にすることができる個人のＤＮＡに対する標準物として使用することができる。非常の多くの多型が非コード領域で生じるので、個人を区別するためにはより少ない配列が必要である。配列番号１の非コード領域、およびそれぞれが１００塩基の非コード増殖配列を生じる、おそらく１０から１０００個のプライマーのパネルによって、明確に個人認識することができる。予測コード配列、たとえば配列番号１にあるものを使用する場合、明確に個人を認識するためにより適切なプライマーの数は５００〜２０００個である。
【０１８４】
本明細書で説明したＧＡＶＥ７配列の試薬パネルを使用して、個人を固有に認識するデータベースを作成する場合、同様の試薬を後で使用して個人から組織を同定することができる。固有の認識データベースを使用して、極めて小さな組織試料から個人を、生死にかかわらず、明確に同定することができる。
【０１８５】
３．法生物学におけるＧＡＶＥ７部分配列の使用
ＤＮＡをベースとした同定技術はまた、法生物学で使用することができる。法医生物学は、たとえば、犯罪の加害者を明確に同定するための手段として犯罪現場で発見された生物学的証拠の遺伝子鑑定を使用した科学的分野である。このような同定を行うために、ＰＣＲ技術を使用して犯罪現場で発見された非常に少量の組織などの生物学的試料、たとえば、髪または皮膚、または体液、たとえば、血液、唾液または精液から得られたＤＮＡ配列を増幅することができる。次に、増幅された配列を標準物と比較して、それによって生物学的試料の持ち主の同定が可能になる。
【０１８６】
本発明の配列を使用して、ヒトゲノムの特異的位置を標的とし、ＤＮＡをベースとした法医学的同定の信頼性を高めることができるポリヌクレオチド試薬、たとえば、ＰＣＲプライマーを提供することができる。たとえば、関心のある核酸は他の「同定マーカー」（すなわち、特定の個人に固有な他のＤＮＡ配列）を提供することができる。前述のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素によって生じる断片から形成されたパターンの正確な代替法として、同定のために使用することができる。配列番号１の非コード領域は、非コード領域ではより多くの多型が生じるので、このような用途のために適切で、この技術を使用して個人を区別する識別能を高めることができる。ポリヌクレオチド試薬の例には、ＧＡＶＥ７配列またはその一部、たとえば、少なくとも２０または３０塩基の長さの配列番号１の非コード領域から得られた断片が含まれる。
【０１８７】
本明細書で説明したＧＡＶＥ７配列を使用してさらに、たとえば、特定の組織、たとえば脳組織を同定するためのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術で使用することができるポリヌクレオチド試薬、たとえば、標識した、または標識可能なプローブを提供することができる。身元の分からない組織を法医病理学者に提出する場合、これは非常に有用である。このようなＧＡＶＥ７プローブのパネルを使用して、種および／または器官の種類によって組織を同定することができる。
【０１８８】
同様の方法で、試薬、たとえば、ＧＡＶＥ７プライマーまたはプローブを使用して組織培養物の混入物をスクリーニングすることができる（すなわち、培養物中の様々な種類の細胞の混合物の存在をスクリーニングすることができる）。
【０１８９】
Ｃ．予測医療
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクスおよび臨床試験のモニタリングを予後（予測）目的に使用して、個人を予防的に治療する予測医療の分野に関する。したがって、本発明の一態様は、生物学的試料（たとえば、血液、尿、糞、喀痰、血清、細胞および組織）に関して、ＧＡＶＥ７蛋白質および／または核酸の発現ならびにＧＡＶＥ７活性を測定する診断アッセイに関する。このアッセイを使用して、異常なＧＡＶＥ７発現または活性に関連して、個人が疾患または障害に罹患しているか、または疾患を生じる危険性があるかを決定することができる。
【０１９０】
本発明はまた、個人がＧＡＶＥ７蛋白質、核酸発現または活性に関連した疾患を生じる危険性があるかどうかを決定するための予後（または予測）アッセイを提供する。たとえば、ＧＡＶＥ７遺伝子の変異は生物学的試料でアッセイすることができる。このようなアッセイは予後または予測のために使用して、それによってＧＡＶＥ７蛋白質、核酸発現または活性を特徴とする、または関連した疾患が発症する前に個人を予防的に処置することができる。
【０１９１】
本発明の他の態様は、個人のＧＡＶＥ７蛋白質、核酸発現またはＧＡＶＥ７活性を測定し、それによってその個人に適切な治療剤または予防剤を選択する方法（本明細書では「薬理ゲノミクス」と称する）を提供する。薬理ゲノミクスによって、個人の遺伝子型（たとえば、特定の薬剤に応答する個人の能力を測定するために調べた個人の遺伝子型）に基づいて個人を治療的または予防的に処置するための薬剤（たとえば、薬物）を選択することが可能になる。
【０１９２】
本発明のさらに他の態様は、臨床試験でＧＡＶＥ７の発現または活性に対する薬剤（たとえば、薬物またはその他の化合物）の影響をモニターすること関する。
【０１９３】
このような薬剤およびその他の薬剤について、以下の項目でさらに詳細に説明する。
【０１９４】
１．診断アッセイ
生物学的試料におけるＧＡＶＥ７の有無を検出する方法の例には、被験者から生物学的試料を採取すること、およびＧＡＶＥ７の存在が生物学的試料で検出されるように、この生物学的試料をＧＡＶＥ７蛋白質またはＧＡＶＥ７蛋白質をコードする核酸（たとえば、
ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物または薬剤と接触させることが含まれる。ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するために好ましい薬剤は、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。核酸ブローブは、たとえば、完全長ＧＡＶＥ７核酸、たとえば、配列番号１の核酸またはその一部、たとえば、ヌクレオチドの長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００以上で、厳密な条件下でＧＡＶＥ７ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするために十分なオリゴヌクレオチドであることができる。その他の本発明の診断アッセイに使用するために適したプローブをここで説明する。
【０１９５】
ＧＡＶＥ７蛋白質を検出するために好ましい薬剤は、ＧＡＶＥ７蛋白質に結合できる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルまたはより好ましくはモノクローナルであることができる。完全な抗体またはその断片（たとえば、ＦabまたはＦ(ab')2）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して、「標識した」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体に結合することによって（すなわち、物理的に結合することによって）プローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに直接標識した他の試薬との反応性によってプローブまたは抗体を間接的に標識することを含めるものである。間接的標識の例には、蛍光標識した第２抗体で第１抗体を検出すること、および蛍光標識したストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが含まれる。「生物学的試料」という用語には、患者から単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに患者内部に存在する組織、細胞および液体を含めるものである。すなわち、本発明の検出方法を使用して、生物学的試料中のＧＡＶＥ７ｍＲＮＡ、蛋白質またはゲノムＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができる。たとえば、ＧＡＶＥ７ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。ＧＡＶＥ７蛋白質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出技術には、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法が含まれる。ＧＡＶＥ７ゲノムＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、ＧＡＶＥ７蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏ検出技術には、対象への標識抗ＧＡＶＥ７抗体の導入が含まれる。たとえば、標準的画像技術によって対象における存在および位置が検出できる放射活性マーカーで抗体を標識することができる。
【０１９６】
一実施形態では、生物学的試料には被験者の蛋白質分子が含まれる。あるいは、生物学的試料には、被験者のｍＲＮＡ分子または被験者のゲノムＤＮＡ分子を含めることができる。好ましい生物学的試料は、通常の手段で対象から単離された末梢血リンパ球試料である。
【０１９７】
したがって、疾患との関連および保因者または罹患者に特徴的な核酸または蛋白質多型の同定は、予後または診断アッセイの開発に有益であり得る。たとえば、慢性関節リウマチ、喘息、精神分裂症などの予後または診断アッセイに有益であろう。特に関心のあるのは、免疫系機能不全に関連した障害である。したがって、耐性、自己免疫現象、アナフィラキシー状態、低反応状態などが適応できる疾患状態である。したがって、ＧＡＶＥ７代謝の障害によって、慢性関節リウマチまたは炎症を診断することができる。さらに、慢性関節リウマチの分子機構を検出することが可能で、たとえば、組織試料、たとえば血液試料で検出できる診断用ＳＮＰ、ＲＦＬＰ、発現レベルの可変性、機能の可変性などがあり得る。
【０１９８】
他の実施形態では、この方法にはさらに、対照被験者から生物学的試料を得ること、ＧＡＶＥ７蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量が生物学的試料内で検出されるように、対照試料をＧＡＶＥ７蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出できる化合物または薬剤と接触させること、ならびに対照試料中のＧＡＶＥ７蛋白質、ｍＲＮＡま
たはゲノムＤＮＡの存在および量を試験試料中のＧＡＶＥ７蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在および量と比較することが必要である。
【０１９９】
本発明はまた、生物学的試料（試験試料）におけるＧＡＶＥ７の存在を検出するキットを包含する。このようなキットを使用して、対象がＧＡＶＥ７の異常発現に付随する障害（たとえば、免疫疾患）に罹患しているか否か、または発症する危険性が増加しているか否かを測定することができる。たとえば、このキットには、生物学的試料中でＧＡＶＥ７蛋白質またはｍＲＮＡを検出できる標識化合物または薬剤および試料中でＧＡＶＥ７の量を測定する手段（たとえば、抗ＧＡＶＥ７抗体またはＧＡＶＥ７をコードするＤＮＡ、たとえば配列番号１に結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含めることができる。キットはまた、ＧＡＶＥ７蛋白質またはｍＲＮＡの量が通常濃度を上回るか、下回る場合、被験者がＧＡＶＥ７の異常発現に関連した障害に罹患しているか、または発症する危険性が増加しているかを示す結果を得るために使用することができる。
【０２００】
抗体をベースとしたキットでは、たとえば、（１）ＧＡＶＥ７蛋白質に結合する第１抗体（たとえば、固相に結合させる）、および場合によっては（２）ＧＡＶＥ７蛋白質または第１抗体に結合し、検出可能な薬剤を複合した第２の、異なる抗体をキットに含めることができる。第２抗体が存在しない場合は、第１抗体に結合し、標識することができる他の分子を使用することができるか、第１抗体を標識する。いずれの場合でも、当業界で公知なように検出可能なレポーター分子として役立つ標識結合部分を含める。
【０２０１】
オリゴヌクレオチドをベースとしたキットでは、たとえば、（１）ＧＡＶＥ７核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、たとえば、検出可能に標識したオリゴヌクレオチド、または（２）ＧＡＶＥ７核酸分子を増幅するために有用な一組のプライマーをキットに含めることができる。
【０２０２】
このキットにはまた、たとえば、緩衝剤、保存剤または蛋白質安定化剤を含めることができる。このキットにはまた、検出可能な薬剤（たとえば、酵素または基質）を検出するために必要な成分を含めることができる。このキットにはまた、アッセイして、試験試料と比較することができる対照試料または対照試料群を含めることができる。キットの各成分は通常、個々の容器内に封入して、被験者が様々な容器はすべてＧＡＶＥ７の異常発現に関連した障害に罹患しているか、または発症する危険性があるかを観察するための指示書と共に単一の包装内に入れる。
【０２０３】
２．予後アッセイ
本明細書で説明した方法はさらに、ＧＡＶＥ７の異常な発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または発症する危険性がある対象を同定するための診断または予後アッセイとして使用することができる。たとえば、本明細書で説明したアッセイ、たとえば、前述の診断アッセイまたは以下のアッセイを使用して、ＧＡＶＥ７蛋白質、核酸発現または活性に関連した障害を有するか、発症する危険性がある対象を同定することができる。たとえば、最近の細菌との接触、または喘息に関連する炎症、慢性閉塞性肺疾患および慢性関節リウマチはアッセイで分析しやすい。あるいは、予後アッセイを使用して、このような疾患または障害を有するか、発症する危険性がある対象を同定することができる。
【０２０４】
したがって、本発明は、対象から試験試料を得て、ＧＡＶＥ７蛋白質または核酸（たとえば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出する方法を提供する。ＧＡＶＥ７蛋白質または核酸の存在は、ＧＡＶＥ７の異常な発現または活性に関連した疾患または障害を有するか、または発症する危険性がある対象の診断に用いる。本明細書では、「試験試料」とは、関心のある対象から得られた生物学的試料のことである。たとえば、試験試料は生物学的液体（たとえば、血清）、細胞試料または組織であることができる。
【０２０５】
さらに、本明細書で説明した予後アッセイを使用して、ＧＡＶＥ７の異常な発現または活性に関連した疾患または障害を治療するために、対象に薬剤（たとえば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、蛋白質、ペプチド、核酸、小分子またはその他の薬剤候補）を投与できるかどうかを決定することができる。たとえば、このような方法を使用して、対象を特定の薬剤または薬剤種類（たとえば、ＧＡＶＥ７活性を減少させる種類の薬剤）で効果的に治療できるかどうかを決定することができる。したがって、本発明は試験試料を得て、ＧＡＶＥ７蛋白質または核酸を検出する、ＧＡＶＥ７の異常な発現または活性に関連した障害のための薬剤で効果的に対象を治療できるかどうかを決定するための方法を提供する。（たとえば、ＧＡＶＥ７蛋白質または核酸の存在は、ＧＡＶＥ７の異常な発現または活性に関連した疾患を治療するための薬剤を投与することができる対象の診断に用いる）。
【０２０６】
本発明の方法を使用してまた、遺伝的病変またはＧＡＶＥ７遺伝子の変異を検出することができ、それによって病変遺伝子を有する対象が細胞増殖および／または分化の異常を特徴とする障害の危険性があるかどうかを決定することができる。好ましい実施形態では、この方法には、対象の細胞試料において、少なくとも１個のＧＡＶＥ７蛋白質をコードする遺伝子の完全さに影響を及ぼす変化を特徴とする遺伝的病変もしくは変異の有無またはＧＡＶＥ７遺伝子の不適切な発現を検出することが含まれる。たとえば、このような遺伝的病変または変異は、１）ＧＡＶＥ７遺伝子の１個または複数のヌクレオチドの欠失、２）ＧＡＶＥ７遺伝子への１個または複数のヌクレオチドの付加、３）ＧＡＶＥ７遺伝子の１個または複数のヌクレオチドの置換、４）ＧＡＶＥ７遺伝子に関係した染色体の再編成、５）ＧＡＶＥ７遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の程度の変化、６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンなどＧＡＶＥ７遺伝子の異常な修飾、７）ＧＡＶＥ７蛋白質の非野生型濃度、８）ＧＡＶＥ７遺伝子の対立遺伝子欠失、および９）ＧＡＶＥ７蛋白質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも１つの存在を確かめることによって検出することができる。本明細書で説明したように、ＧＡＶＥ７遺伝子の病変を検出するために使用できるアッセイ技術は、当業界でたくさん知られている。好ましい生物学的試料は従来の手段で対象から単離された末梢血リンパ球試料である。
【０２０７】
ある実施形態では、病変の検出には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（たとえば、米国特許第４６８３１９５号および第４６８３２０２号参照）、たとえば、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ  ＰＣＲ、または、代りに、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（たとえば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：１０７７〜１０８０、およびＮａｋａｚａｗａ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：３６０〜３６４参照）においてプローブ／プライマーを使用することが必要で、後者はＧＡＶＥ７遺伝子の点突然変異を検出するために特に有用であることができる（たとえば、Ａｂｒａｖａｙａ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９５）２３：６７５〜６８２を参照）。この方法には、患者から細胞試料を収集する段階、試料の細胞から核酸（たとえば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）を単離する段階、（存在するならば）ＧＡＶＥ７遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下でＧＡＶＥ７遺伝子と特異的にハイブリダイズする１種または複数のプライマーと核酸試料を接触させる段階、ならびに増幅した生成物の有無を検出するか、または増幅した生成物の大きさを検出し対照試料と長さを比較する段階が含まれる。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書で説明した変異の検出のために使用した技術のいずれかと一緒に予備増幅段階として使用することが望ましいと予想される。
【０２０８】
他の増幅方法には、自己持続性配列複製法（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃ
ａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：１８７４〜１８７８）、転写増幅法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｋｗｏｈ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：１１７３〜１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ法（Ｌｉｚａｒｄｉ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：１１９７）または、その他の任意の核酸増幅方法が含まれ、その後当業者に周知の技術を使用して増幅した分子を検出する。この検出計画は、このような分子が非常に小数存在する場合に、核酸分子の検出に特に有用である。
【０２０９】
他の実施形態では、試料細胞のＧＡＶＥ７遺伝子の変異は、制限酵素切断パターンの変化によって同定することができる。たとえば、試料および対照ＤＮＡは、単離して、増幅して（場合によって）、１種または複数の制限エンドヌクレアーゼで消化して、断片の長さをゲル電気泳動によって測定し、比較する。試料と対照ＤＮＡの間の断片の長さの違いは、試料ＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（たとえば、米国特許第５４９８５３１号参照）を使用して、リボザイム切断部位の発生または欠失によって特異的変異の存在を採点することができる。
【０２１０】
その他の実施形態では、ＧＡＶＥ７における遺伝子変異は、試料と対照核酸、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎ他、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ（１９９６）７：２４４〜２５５；Ｋｏｚａｌ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９６）２：７５３〜７５９）。たとえば、ＧＡＶＥ７における遺伝子変異は、前記のＣｒｏｎｉｎ他で記載された光発生ＤＮＡプローブを含有する２次元アレイで同定することができる。簡単に説明すると、プローブの第１ハイブリダイゼーションアレイを使用して、試料および対照の長い範囲のＤＮＡを調べて、連続重複プローブの直線アレイを作製することによって配列間の塩基変化を同定することができる。この段階によって、点突然変異の同定が可能になる。この段階の後、検出された変種または変異のすべてに相補的な、より小さな特化したプローブアレイを使用した特定の変異の特定を可能にする第２ハイブリダイゼーションを行う。各変異アレイは、一組の平行プローブセットから成り、１つは野生型遺伝子に対して相補的で、もう１つは変異遺伝子に対して相補的である。
【０２１１】
さらに他の実施形態では、当業界で公知の様々な配列決定反応のいずれかを使用して、ＧＡＶＥ７遺伝子を直接配列決定して、試料ＧＡＶＥ７の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することによって変異を検出することができる。配列決定反応の例には、Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３）によって開発された技術をベースにしたものが含まれる。診断アッセイ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９５）１９：４４８）を実施するとき、様々な自動化配列決定方法のいずれかを使用できることもまた意図し、質量分析による配列決定（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１６１０１、Ｃｏｈｅｎ他、Ａｄｖ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ（１９９６）３６：１２７〜１６２およびＧｒｉｆｆｉｎ他、Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９３）３８：１４７〜１５９）が含まれる。
【０２１２】
ＧＡＶＥ７遺伝子における変異を検出するその他の方法には、切断剤からの保護を使用してＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖のミスマッチ塩基を検出する方法が含まれる（Ｍｙｅｒｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２）。一般的に、「ミスマッチ切断」の技術には、野生型ＧＡＶＥ７配列を含有する（標識）ＲＮＡまたはＤＮＡと組織試料から得られた変異した可能性があるＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供することが必要である。二本鎖の二重鎖は、対照鎖と試料鎖との間の塩基対ミスマッチによって存在する、二重鎖中の一本鎖領域を切断する薬剤で処理する。ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はＲＮＡ分解酵素で処理してミスマッチ領域を切断することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を切断することができる。その他の実施形態では、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のいずれかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理して、ミスマッチ領域を切断することができる。ミスマッチ領域を切断した後、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲルで大きさによって分離し、変異部位を決定する。たとえば、Ｃｏｔｔｏｎ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８８）８５：４３９７、Ｓａｌｅｅｂａ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９２）２１７：２８６〜２９５を参照のこと。好ましい実施形態では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検出のために標識することができる。
【０２１３】
さらに他の実施形態では、ミスマッチ切断反応は、細胞試料から得られたＧＡＶＥ７ｃＤＮＡの点突然変異を検出しマッピングする定義された系において、二本鎖ＤＮＡのミスマッチ塩基対を認識する１個または複数の蛋白質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕ他、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（１９９４）１５：１６５７〜１６６２）。例示的実施形態によれば、ＧＡＶＥ７配列、たとえば野生型ＧＡＶＥ７配列に基づいたプローブは、試験細胞（複数）のｃＤＮＡまたはその他のＤＮＡ生成物にハイブリダイズする。二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、もしあるならば切断生成物を電気泳動方法などで検出することができる。米国特許第５４５９０３９号参照。
【０２１４】
その他の実施形態では、電気泳動での移動の変化を使用してＧＡＶＥ７遺伝子の変異を同定する。たとえば、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異型と野生型核酸との間の電気泳動の移動度の違いを検出することができる（Ｏｒｉｔａ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ（１９９３）２８５：１２５〜１４４、Ｈａｙａｓｈｉ、Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ（１９９２）９：７３〜７９を参照のこと）。試料および対照ＧＡＶＥ７核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性して、復元させる。一本鎖核酸の第二構造は配列によって変化し、得られた電気泳動の移動度の変化によって１個の塩基変化さえも検出することができる。ＤＮＡ断片を標識するか標識プローブで検出することができる。アッセイの感度は、ＲＮＡの第２構造は配列の変化により敏感なので、（ＤＮＡよりも）ＲＮＡを使用することによって高めることが可能である。好ましい実施形態では、対象となる方法はヘテロ二重鎖分析を使用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロ二重鎖の分子を分離する（Ｋｅｅｎ他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ（１９９１）７：５）。
【０２１５】
さらに他の実施形態では、変性剤勾配を含有するポリアクリルアミドゲルでの変異型または野生型断片の移動度は、変性剤勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイする（Ｍｙｅｒｓ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析方法として使用するとき、ＤＮＡを修飾して、たとえばＰＣＲによって高融点ＧＣの多い約４０ｂｐのＤＮＡであるＧＣクランプを付加することによって、完全には変性しないことを保証する。さらに他の実施形態では、変性勾配の代わりに温度勾配を使用して、対照および試料ＤＮＡの移動度の違いを同定する（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ他、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ（１９８７）２６５：１２７５３）。
【０２１６】
点突然変異を検出するその他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、選択的増幅または選択的プライマー伸長が含まれるが、それだけには限定されない。たとえば、公知の変異が中心にあり、次に完全な一致が見いだされた場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができる（Ｓａｉｋｉ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９８
６）３２４：１６３、Ｓａｉｋｉ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成膜に結合されたとき、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡまたはいくつかの様々な変異体にハイブリダイズし、標識した標的ＤＮＡにハイブリダイズする。
【０２１７】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に応じた対立遺伝子特異的増幅技術は本発明と一緒に使用することができる。特異的増幅でプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、分子の中心（したがって、増幅はディファレンシャルハイブリダイゼーションに左右される）（Ｇｉｂｂｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８９）１７：２４３７〜２４４８）または一個のプライマーの３’先端（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ、Ｔｉｂｔｅｃｈ（１９９３）１１：２３８）に関心のある変異を有することが可能で、適切な条件下でミスマッチはポリメラーゼ伸長を妨害するか、または抑制することができる。さらに、新規な制限部位を変異の領域に導入して、切断をベースとした検出を行うことが望ましい可能性がある（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ（１９９２）６：１）。ある実施形態では、増幅はまた増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施できることが予測される（Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：１８９）。このような場合、連結は、５’配列の３’末端に完全な一致がある場合にのみ生じ、増幅の有無を探索することによって特定の部位における公知の変異の存在の検出が可能になる。
【０２１８】
本明細書で説明した方法は、たとえば、少なくとも１個のプローブ核酸または本明細書で説明した抗体試薬を含むあらかじめ包装された診断キットを使用して実施することができる。この方法およびキットは、たとえば臨床現場で、ＧＡＶＥ７遺伝子に関連した疾患または疾病の徴候または家族歴を示す患者を診断するために、便利に使用することができる。
【０２１９】
さらに、ＧＡＶＥ７を発現するどのような細胞の種類または組織であっても本明細書で説明した予後アッセイで使用することができる。
【０２２０】
３．薬理ゲノミクス
本明細書で説明したスクリーニングアッセイによって同定したようなＧＡＶＥ７活性（たとえば、ＧＡＶＥ７遺伝子発現）に刺激または阻害効果を有する薬剤または調節物質を、ＧＡＶＥ７活性に関連した疾患（たとえば、喘息に関連した炎症、慢性閉塞性肺疾患および慢性関節リウマチ）を（予防的にまたは治療的に）処置するために個人に投与することができる。このような処置と相まって、個人の薬理ゲノミクス（すなわち、個人の遺伝子型と個人の外来化合物または薬剤に対する応答との間の関係の研究）を考慮することができる。治療薬の代謝の違いによって、薬理学的に活性のある薬剤の用量と血液濃度との間の関係が変化して重篤な毒性または治療の失敗がもたらされ得る。したがって、個人の薬理ゲノミクスによって、個人の遺伝子型の考察に基づいた予防的または治療的処置に有効な薬剤（たとえば、薬物）の選択が可能になる。このような薬理ゲノミクスはさらに、適切な用量および治療計画の決定に使用することができる。したがって、個人におけるＧＡＶＥ７蛋白質の活性、ＧＡＶＥ７核酸の発現またはＧＡＶＥ７遺伝子の変異含量を測定して、それによって個人を治療的または予防的に処置するのに適した薬剤を選択することができる。
【０２２１】
薬理ゲノミクスは、罹患した人間における薬物動態の変更および異常作用によって薬物応答の臨床的に重要な遺伝的変異を扱う。たとえば、Ｌｉｎｄｅｒ、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ（１９９７）４３（２）：２５４〜２６６を参照のこと。一般的に、薬理ゲノミクスの２種類の状態を区別することができる。薬剤が体に作用する方法を変更する１因子として遺
伝する遺伝的状態は、「薬剤作用の変更」と称する。体が薬剤に作用する方法を変更する１因子として遺伝する遺伝的状態は、「薬剤代謝の変更」と称する。薬理ゲノミクス状態は、希な欠如または多型のいずれかとして生じることが可能である。たとえば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損（Ｇ６ＰＤ）は、通常遺伝する酵素欠損症で、主な臨床的合併症は酸化剤（抗マラリヤ薬、スルホンアミド、鎮痛剤またはニトロフラン）摂取後およびソラマメ摂取後の溶血である。
【０２２２】
例示的実施形態として、薬剤代謝酵素の活性は、薬剤作用の強度および有効期間両方の主要な決定要素である。薬剤代謝酵素（たとえば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびチトクロームＰ４５０酵素、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２ＣＩ９）の遺伝子多型の発見によって、なぜ何人かの患者は予期された薬剤効果が得られないか、または標準的で安全な薬剤用量を投与した後に過大な薬剤応答および重篤な毒性が示されるのかについて説明することができた。この多型は集団内の２種類の表現型、代謝能が高い人（ＥＭ）および代謝能が低い人（ＰＭ）として現れる。ＰＭの出現率は異なる集団では異なる。たとえば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は多型が高く、いくつかの変異がＰＭで同定されており、いずれも機能性ＣＹＰ２Ｄ６の欠如を導いている。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２ＣＩ９の代謝能が低い人は、標準的な用量を投与されたとき、過大な薬剤応答および副作用を経験することが非常に多い。代謝産物が活性のある治療成分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６が形成した代謝産物、モルヒネによって媒介されたコデインの鎮痛効果で示されたように、治療的応答を示さない。その他極端なのは、標準的用量に応答しないいわゆる極めて代謝能の速い人（ｕｌｔｒａ−ｒａｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）である。近年、極めて速い代謝の分子的基礎研究によって、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の増幅によることが確認された。
【０２２３】
こうして、個人のＧＡＶＥ７蛋白質の活性、ＧＡＶＥ７核酸の発現またはＧＡＶＥ７遺伝子の変異含量を測定して、それによって個人の治療的または予防的処置に適した薬剤を選択することができる。さらに、薬理遺伝学研究は、薬剤代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を個人の薬剤応答表現型の同定に当てはめるために使用できる。投与または薬剤の選択に適用するとき、この知識によって副作用および治療不足を回避することができ、したがって対象をＧＡＶＥ７調節物質、たとえば、本明細書で説明した例示的スクリーニングアッセイの１つによって同定した調節物質で治療するとき、治療効果または予防効果を高めることができる。
【０２２４】
４．臨床試験中の効果のモニター
ＧＡＶＥ７発現または活性（たとえば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する薬剤（たとえば、薬物または化合物）の影響のモニタリングは、基本的な薬剤スクリーニングだけでなく、臨床試験に適用することができる。たとえば、本明細書で説明したスクリーニングアッセイで測定したような薬剤がＧＡＶＥ７遺伝子発現、蛋白質濃度または蛋白質活性を増加させる効果は、ＧＡＶＥ７遺伝子発現、蛋白質濃度または蛋白質活性の減少を示す対象の臨床試験でモニターすることができる。あるいは、スクリーニングアッセイで測定したような薬剤がＧＡＶＥ７遺伝子発現、蛋白質濃度または蛋白質活性を減少させる効果は、ＧＡＶＥ７遺伝子発現、蛋白質濃度または蛋白質活性の増加を示す対象の臨床試験でモニターすることができる。このような臨床試験では、ＧＡＶＥ７発現または活性および、好ましくは、たとえば細胞増殖障害に関わったその他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答のマーカーとして使用することができる。
【０２２５】
たとえば、限定するつもりではないが、（たとえば、本明細書で説明したスクリーニングアッセイで同定したような）ＧＡＶＥ７活性を調節する薬剤（たとえば、化合物、薬物または小分子）で処理することによって細胞内で調節されるＧＡＶＥ７を含めた遺伝子を同定することができる。したがって、たとえば臨床試験において、細胞増殖障害に対する
薬剤の効果を研究するために、細胞を単離して、ＲＮＡを調製して、ＧＡＶＥ７および疾患に関係するその他の遺伝子の発現レベルを分析することができる。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書で説明したようにノーザンブロットもしくはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは、本明細書で説明したような方法の１つによって生成した蛋白質の量を測定することによって、またはＧＡＶＥ７もしくはその他の遺伝子の活性レベルを測定することによって定量することができる。このように、遺伝子発現パターンは細胞の薬剤に対する生理学的応答を示すマーカーとして役立つことができる。したがって、応答状態は、個人を薬剤で処理する前、および処理中の様々な時点で測定することができる。
【０２２６】
好ましい実施形態では、本発明は、（ｉ）薬剤を投与する前に対象から投与前試料を採取する段階、（ｉｉ）投与前試料におけるＧＡＶＥ７蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する段階、（ｉｉｉ）対象から１個または複数の投与後試料を採取する段階、（ｉｖ）投与後試料におけるＧＡＶＥ７蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性を検出する段階、（ｖ）投与前試料におけるＧＡＶＥ７蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性を投与後試料におけるＧＡＶＥ７蛋白質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性と比較する段階、および（ｖｉ）それに応じて薬剤投与を変更する段階、が含まれる対象の薬剤（たとえば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、蛋白質、ペプチド、核酸、小分子または本明細書で記載したスクリーニングアッセイで同定されたその他の薬剤候補）による処置の効果をモニターする方法を提供する。たとえば、薬剤の投与増加は、ＧＡＶＥ７の発現または活性を検出されるよりも高い濃度まで増加させるために、すなわち薬剤の効果を増加させるために望ましい可能性がある。あるいは、薬剤の投与減少は、ＧＡＶＥ７の発現または活性を検出されるよりも低くまで減少させるために、すなわち薬剤の効果を減少させるために望ましい可能性がある。
【０２２７】
Ｄ．治療方法
本発明は、異常なＧＡＶＥ７発現または活性に関連した障害の危険性がある（罹患しやすい）、または障害を有する対象を治療する予防的および治療的方法の両方を提供する。このような障害には、たとえば、喘息などの炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患および慢性関節リウマチが含まれるが、それだけには限定されない。
【０２２８】
１．予防方法
一態様では、本発明はＧＡＶＥ７発現または少なくとも１種のＧＡＶＥ７活性を調節する薬剤を患者に投与することによって、異常なＧＡＶＥ７発現または活性に関連した疾患または状態を患者において予防する方法を提供する。異常なＧＡＶＥ７発現または活性によって引き起こされるか、または原因となる疾患の危険性がある対象は、たとえば、本明細書で説明した診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組合せによって同定することができる。予防剤の投与は、疾患または障害を予防するか、あるいは進行を遅らせるように、ＧＡＶＥ７異常を特徴とする徴候が現れる前に行うことができる。ＧＡＶＥ７異常の種類に応じて、たとえば、ＧＡＶＥ７アゴニストまたはＧＡＶＥ７アンタゴニスト剤を患者の治療のために使用することができる。適切な薬剤は、本明細書で説明したスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
【０２２９】
２．治療方法
本発明の他の態様は、治療目的のためにＧＡＶＥ７発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法には、細胞に関連したＧＡＶＥ７蛋白質活性の１種または複数の活性を調節する薬剤と細胞を接触させることを含む。ＧＡＶＥ７蛋白質活性を調節する薬剤は、本明細書で説明した薬剤、たとえば核酸または蛋白質、ＧＡＶＥ７蛋白質の天然に生じる同種由来のリガンド、ペプチド、ＧＡＶＥ７ペプチド模倣物またはその他の小分子
であることができる。一実施形態では、薬剤はＧＡＶＥ７蛋白質の生物活性の１種または複数を促進する。このような促進剤の例には、活性ＧＡＶＥ７蛋白質および細胞に導入したＧＡＶＥ７をコードする核酸分子が含まれる。他の実施形態では、薬剤はＧＡＶＥ７蛋白質の生物活性の１種または複数を阻害する。このような阻害剤の例には、アンチセンスＧＡＶＥ７核酸分子および抗ＧＡＶＥ７抗体が含まれる。調節方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（たとえば、細胞を薬剤と共に培養することによって）あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ（たとえば、薬剤を患者に投与することによって）で実施することができる。そのようなものとして、本発明はＧＡＶＥ７蛋白質または核酸分子の異常発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、この方法には薬剤（たとえば、本明細書で説明したスクリーニングアッセイによって同定した薬剤）またはＧＡＶＥ７発現または活性を調節する（たとえば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤の組合せを投与することを含む。他の実施形態では、この方法には治療としてＧＡＶＥ７蛋白質または核酸分子を投与して、減少した、または異常なＧＡＶＥ７発現または活性を補うことを含む。
【０２３０】
ＧＡＶＥ７活性の促進は、ＧＡＶＥ７が異常にダウンレギュレートされている、かつ／または増加したＧＡＶＥ７活性が有益な効果を有するようである状況で望ましい。反対に、ＧＡＶＥ７活性の阻害は、ＧＡＶＥ７が異常にアップレギュレートされている、かつ／または減少したＧＡＶＥ７活性が有益な効果を有するようである状況で望ましい。
【０２３１】
本発明はさらに、限定を意味するのではない以下の実施例によってさらに例示される。出願を通して引用した参考文献、特許および公開された特許出願すべての内容は参照により組み込む。
【０２３２】
〔実施例１〕
ｈＧＡＶＥ７ｃＤＮＡのクローニング
ヒトゲノムバンクのＧＰＣＲモチーフを調べた。ヒトゲノムＤＮＡ、ＡＣ００６０８７、ｇｉ４５８９９３７を選択した。ゲノムＤＮＡ、およびその断片をノーザンブロットのプローブとして使用することができた。
【０２３３】
ＰＣＲスクリーニングをヒト腎臓、脾臓および胎盤ｃＤＮＡライブラリーのプールについて実施する。ＰＣＲ用のプライマーは以下の配列
順向き：５’−ＣＧＣＧＴＧＣＡＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＡ−３’（配列番号６）
逆向き：５’−ＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧ−３’（配列番号７）
を使用して設計する。
【０２３４】
以下のサイクルをサーモサイクラーで使用した。９４℃で３０秒間変性し、その後５５℃で３０秒間アニーリングして、７２℃で１分間伸長する。このサイクルを３５回繰り返して、その後７２℃で５分間伸長する。
【０２３５】
ＰＣＲ後、ｄＮＴＰ（各ヌクレオチド１０ｍＭ）Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号７４０４−ｉ  ３μｌおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２０１２２３）１μｌ（５単位）をＰＣＲ生成物に付加して、混合物を７２℃で１０分間インキュベートする。次にＰＣＲ生成物を１％アガロースゲルで泳動する。所望する断片を含有する約２．８キロ塩基のバンドをゲルから切り取って、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットで製造者によって提供された方法を使用して精製する（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）。次に、精製したＰＣＲ生成物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングする（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ２０００−０１／４０／Ｊ１０およびＫ２０３０−０１／４０／Ｊ１０）。ＰＣＲ生成物をベクターにサブクローニングするために、連結反応物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＡクローニングベクターキットを使用して調製する。連結反応には、滅菌水５μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ２Ｘ連結反応用緩衝液１μｌ、ｐＣＲ２．１ベクター２μｌ（２５ｎｇ／μｌ）、ＰＣＲ生成物ＤＮＡ４μｌ（１０ｎｇ）、（５×）希釈緩衝液４μｌ、およびＴ４  ＤＮＡリガーゼ１μｌ（５単位）が含まれる。反応物を１４℃で１８時間インキュベートする。連結反応混合物２μｌをＩＮＶαＦ’コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｃ６５８−００）と混合し、氷上で３０分間インキュベートし、３７℃で４５秒間熱ショックを与え、氷上で２分間インキュベートした後ＬＢ８００μｌを付加することによって、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を連結反応物で形質転換する。次に、細胞を細菌振盪機／インキュベーター（空気を再循環する）で３７℃で一晩撹拌しながらインキュベートする。一晩インキュベートした後、形質転換反応混合物２００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天プレートに入れて、３７℃で一晩インキュベートする。
【０２３６】
インキュベート後、コロニーを採取し、それぞれのコロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ５００μｌを入れた別々の試験管に入れて振盪機／インキュベーター内で一晩増殖させる。ＰＣＲによってコロニーをスクリーニングするために、以下の反応物を使用する。ＬＢに溶かしたコロニー４１．５μｌ、Ｔａｑ緩衝液（１０×）５μｌ、ｄＮＴＰ１．０μｌ（各ヌクレオチド１０ｍＭ）、順向きプライマー１．０μｌ（１０ｍＭ）、逆向きプライマー１．０μｌ（１０ｍＭ）、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（５単位／μｌ）。
【０２３７】
反応物をサーモサイクラーで以下のサイクルを使用してインキュベートする。９４℃で２分間、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間および７２℃で１０分間、その後４℃で冷却。
【０２３８】
ＰＣＲ反応の結果を調べるために、ＰＣＲ反応物５μｌを１％ＴＡＢアガロースゲルで泳動する。陽性クローンには約２．８ｋｂの挿入物が示された。陽性クローンをＬＢ５ｍｌ＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌで３７℃で一晩、細菌振盪機／インキュベーター内で増殖させる。プラスミドはＱｉａｇｅｎＤＮＡ精製カラムを使用して製造者の方法の指示通りに精製する（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２１４３）。次に、陽性クローンは、Ｔ７順向きプライマー（５’−ＧＧＣＴＣＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＴＴＣ−３’）（配列番号８）およびＭ１３逆向きプライマー（５’−ＧＧＧＣＡＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧＣ−３’）（配列番号９）を使用して配列決定する。ＤＮＡ配列決定によって、図１に示したＤＮＡ配列（配列番号１）を有するｃＤＮＡおよび図２に示したアミノ酸配列（配列番号２）の単離物を同定した。
【０２３９】
〔実施例２〕
ｈＧＡＶＥ７を過剰発現する哺乳類細胞の創出
さらなる実験のために大量のｈＧＡＶＥ７を提供するために、ｈＧＡＶＥ７をコードするｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングして、２９３細胞などの哺乳類細胞に形質移入する。
【０２４０】
ｈＧＡＶＥ７を過剰発現する哺乳類細胞を創出するために、牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１６００−０４４）１０％が存在するＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１１７６５−０５４）２ｍｌを入れた６ウェル３５ｍｍ組織培養プレート（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１５７３）に哺乳類細胞を播種する（１ウェル当たり３×１０5哺乳類細胞）。
【０２４１】
次に、細胞が５０〜８０％集密になるまで、細胞をＣＯ2インキュベーターで３７℃でインキュベートする。クローニングしたｈＧＡＶＥ７のｃＤＮＡ核酸配列を前述の方法を使用してｐｃＤＮＡ３．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号
Ｖ７９０−２０）に挿入する。ＤＮＡ２μｇを血清を含まないＦ１２ＨＡＭ培地１００μｌで希釈する。別に、リポフェクタミン試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１８３２４−０２０）２５μｌを血清を含まないＦ１２ＨＡＭ培地１００μｌで希釈する。次に、ＤＮＡ溶液およびリポフェクタミン溶液をゆっくり混合して、室温で４５分間インキュベートして、ＤＮＡ−脂質複合体を形成させる。
【０２４２】
血清を含まないＦ１２ＨＡＭ培地２ｍｌで細胞を１回洗浄する。それぞれのトランスフェクションのために（６ウェルプレートに６個のトランスフェクション）、血清を含まないＦ１２ＨＡＭ培地０．８ｍｌをＤＮＡ−脂質複合体を含有する溶液に付加し（全量０．２ｍｌ）、ゆっくり混合する。次に、得られた混合物（以後「トランスフェクション混合物」）を洗浄細胞に被せる（０．８ｍｌ＋０．２ｍｌ）。抗細菌試薬は付加しない。次に、細胞を脂質−ＤＮＡ複合体と共に３７℃で１６時間ＣＯ2インキュベーターでインキュベートして、トランスフェクションさせる。
【０２４３】
インキュベーション期間完了後、牛胎児血清１０％を含有するＦ１２ＨＡＭ培地１ｍｌを最初にトランスフェクション混合物を除去しないで細胞に被せる。トランスフェクションして１８時間後、細胞に被せた培地を吸引する。次に細胞をＰＢＳ、ｐＨ２〜４（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬカタログ番号１００１０−０２３）で洗浄して、ＰＢＳを５％血清を含有するＦ１２ＨＡＭ培地（「選択培地」）と置換する。トランスフェクションして７２時間後、細胞を抗菌剤ジェネテシン４００μｇ／ｍｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１８１１）を含有する選択培地で１０倍に希釈する。
【０２４４】
〔実施例３〕
アゴニストアッセイ
ヒトＧＡＶＥ７のアゴニストをスクリーニングするために、ｈＧＡＶＥ７を人工的にＧq機構に結合させる。Ｇq機構の活性化によって、細胞内の筋小胞体からのＣａ2+の放出が促進される。Ｃａ2+は、細胞質に放出され、Ｃａ2+キレート色素を使用して検出できる。Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  ＲｅａｄｅｒまたはＦＬＩＰＲ（登録商標）装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して得られたどのような蛍光変化をもモニターする。アゴニストの活性は、蛍光の増加によって示される。
【０２４５】
ｈＧＡＶＥ７を発現するＣＨＯ−ＫＩ細胞を予め操作して、無差別型Ｇq蛋白質（Ｇα16）を発現する。このような細胞を調製するために、Ｇα16−結合ＣＨＯ細胞を購入して（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＩＶＥＷＡＲＥTM細胞、カタログ番号ＲＤ−ＨＧＡ１６）、実施例２の方法を行い、それらの細胞におけるｈＧＡＶＥ７の発現を促進する。
【０２４６】
細胞は牛胎児血清１０％、ペニシリン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１５１４０−１４８）１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０−１４８、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）１００μｇ／ｍｌ、ジェネテシン（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１０１３１−０３５）４００μｇ／ｍｌおよびゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ２５０−０５）２００μｇ／ｍｌを含有するＦ１２  Ｈａｍ’ｓ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１１７６５−０５４）で、３７℃で５％ＣＯ2で対数増殖期に維持した。アッセイ１日前に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞１２５００細胞／ウェルを９６／３８４Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ器具（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｙｐｅ８３２）を使用してウェル量５０μｌの３８４ウェル透明底アッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ／Ｍａｒｓｈ、カタログ番号Ｎ５８１０２）に入れる。細胞を加湿した５％ＣＯ2インキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＣＯ2水ジャケット付きインキュベーターモデル３１１０）で３７℃でインキュベートする。
【０２４７】
以下の保存溶液：Ｈｅｐｅｓ１Ｍ保存溶液（ｐＨ７．５）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１５６３０−０８０）；１Ｎ  ＮａＯＨに溶かして作製したプロベニシド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８７６１）２５０ｍＭ保存溶液；ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ２６５０）に溶かして作製したＦｌｕｏ４−ＡＭ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号ＦＩ４２０２）の１ｍＭ保存溶液を調製する。反応緩衝液は、ハンクス平衡塩溶液（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ２１０２３）１０００ｍｌ、Ｈｅｐｅｓ１Ｍ保存溶液２０ｍｌおよびプロベニシド２５０ｍＭ保存溶液１０ｍｌで調製する。付加緩衝液を調製するために、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ  Ｄｙｅ  １ｍＭ保存溶液１．６ｍｌをプルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｐ６８６６）０．３２ｍｌと混合して、次に前記反応緩衝液４００ｍｌおよび牛胎児血清４ｍｌと混合する。
【０２４８】
アッセイ１時間前に、新たに調製した付加緩衝液５０μｌを９６／３８４Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ器具を使用して３８４ウェルプレートの各ウェルに付加する。細胞を加湿したインキュベーターで３７℃でインキュベートして、染料の取り込みを最大にする。アッセイ直前に、３８４ＥＭＢＬＡ細胞洗浄器（Ｓｋａｔｒｏｎ、モデル番号１２３８６）を使用して、吸引ヘッドをプレートの底から少なくとも１０ｍｍのところに設定して細胞を反応緩衝液９０μｌで２回洗浄し、１ウェル当たり緩衝液４５μｌを残す。
【０２４９】
ＦＬＩＰＲ（登録商標）ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）装置のＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をｆストップ２．０、露出０．４秒に設定する。このカメラを使用して細胞プレートの染料付加精度をモニターする。
【０２５０】
可能性のあるアゴニストを含有する化合物ライブラリーは、生理学的塩緩衝液中で１０μＭの濃度で試験する。蛍光の変化は、化合物付加前に１０秒間測定する。化合物付加後、蛍光は最初の１分間は毎秒測定し、その後全３分間の実験分析の間、６秒毎に露出する。１０回目の走査の後に１００μＭ保存化合物の一部分５μｌを添加し、細胞に対する最終的な化合物濃度を１０μＭにする。最初の８０回の走査の最大蛍光変化をアゴニスト活性の測定値として記録し、ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａ９０６２）１０μＭによって誘導される最大蛍光変化と比較する。
【０２５１】
〔実施例４〕
アンタゴニストアッセイ
ヒトＧＡＶＥ７のアンタゴニストをスクリーニングするために、ｈＧＡＶＥ７を人工的にＧq機構に結合させる。実施例３に示したように、ＦＬＩＰＲ（登録商標）装置を使用して得られるいかなる蛍光変化もモニターする。アンタゴニストの活性は蛍光の減少によって示される。
【０２５２】
ｈＧＡＶＥ７を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を予め操作して、実施例３に説明したように無差別型Ｇq蛋白質（Ｇα16）を発現させる。この細胞を牛胎児血清１０％、ペニシリン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１５１４０−１４８）１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン（カタログ番号１５１４０−１４８、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）１００μｇ／ｍｌ、ジェネテシン（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１０１３１−０３５）４００μｇ／ｍｌおよびゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ２５０−０５）２００μｇ／ｍｌを含有するＦ１２  ＨＡＭ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１１７６５−０５４）で、３７℃で５％ＣＯ2で対数増殖期に維持する。アッセイ１日前に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞１２５００細胞／ウェルを９６／３８４Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ器具を使用してウェル量５０μｌの３８４ウェル透明底アッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ／Ｍａｒｓｈ、カタログ番号Ｎ５８１０２）に入れる。細胞を加湿した５％ＣＯ2インキュベーターで３７℃でインキュベートした。
【０２５３】
以下の保存溶液：Ｈｅｐｅｓ１Ｍ保存溶液（ｐＨ７．５）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、カタログ番号１５６３０−０８０）；１Ｎ  ＮａＯＨで作製したプロベニシド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８７６１）２５０ｍＭ保存溶液；ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ２６５０）で作製したＦｌｕｏ４−ＡＭ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号ＦＩ４２０２）の１ｍＭ保存溶液；およびリガンドまたはアンタゴニストの保存溶液を調製する。反応緩衝液は、ハンクス平衡塩溶液（Ｆｉｓｈｅｒ／Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号ＭＴ２１０２３）１０００ｍｌ、Ｈｅｐｅｓ１Ｍ保存溶液２０ｍｌ、プロベニシド２５０ｍＭ保存溶液およびＣａＣｌ2１ｍＭ  １０ｍｌで調製する。付加緩衝液を調製するために、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ  Ｄｙｅ  １ｍＭ保存溶液８０μｌをプルロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｐ６８６６）１６μｌと混合して、次に前記反応緩衝液２０ｍｌおよび牛胎児血清０．２ｍｌと混合する。
【０２５４】
アッセイ３０分前に、新たに調製した付加緩衝液３０μｌを９６／３８４Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ器具を使用して３８４ウェルプレートの各ウェルに付加する。細胞を加湿したＣＯ2インキュベーターで３７℃で染料の取り込みが最大になるまでインキュベートする。アッセイ直前に、３８４ＥＭＢＬＡ細胞洗浄器を使用して、吸引ヘッドをプレートの底から少なくとも４０ｍｍのところに設定して細胞を反応緩衝液１００μｌで３回洗浄し、１ウェル当たり緩衝液４５μｌを残す。
【０２５５】
保存アンタゴニスト化合物１００μＭの５μｌをＰｌａｔｅｍａｔｅ−３８４ピペッター（Ｍａｔｒｉｘ）を使用して細胞に添加する。インキュベーション段階中の化合物濃度は、約１０μＭである。細胞をＦＬＩＰＲ（登録商標）ＩＩに入れ、プレートの蛍光は最初の１分間は毎秒測定し、その後全３分間の実験分析の間６秒毎に露出する。アンタゴニストまたはリガンド（１０μＭ）を１０回目の走査後に添加する。添加それぞれの後に、３８４チップをＤＭＳＯ０．０１％水溶液２０μｌで１０回洗浄する。
【０２５６】
〔実施例５〕
受容体結合アッセイ
ｈＧＡＶＥ７受容体を含有する膜画分を調製するために、ｈＧＡＶＥ７を過剰発現するＣＨＯ細胞株をＥＤＴＡ１ｍＭを含有するリン酸緩衝生理食塩水（１０ｍｌ）でインキュベートすることによって収集する。この細胞を緩衝液Ａ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ（ｐＨ７．８）（Ｓｉｇｍａ  Ｔ６７９１）、ＭｇＣｌ2  ５ｍＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ８２６６）およびＥＧＴＡ  １ｍＭ（Ｓｉｇｍａ  ０３６９））に再懸濁する前に、ＥＤＴＡ１ｍＭを含有するリン酸緩衝液生理食塩水（１０ｍｌ）でさらに３回洗浄する。
【０２５７】
次に、細胞を組織ホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ、Ｋｉｎｅｍｅｔｉｃａ、モデルＰＴ１０／３５）で１分間粉砕する。得られたホモジネートをＳｏｒｖａｌｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＲＣ３Ｂ冷却遠心器で４９０００×ｇで４℃で２０分間遠心する。得られたペレットを緩衝液Ａ  ２５ｍｌに再懸濁して、遠心段階を３回反復する。最終遠心後、ペレットを再度緩衝液Ａ５ｍｌに再懸濁して、小分けして−７０℃で保存する。
【０２５８】
膜画分およびトレーサーとしての放射標識リガンドまたはアゴニストを使用した受容体結合アッセイを実施する。このアッセイは９６ウェルプレート（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で実施する。結合反応液は、放射活性リガンドまたはアゴニスト（０．０１ｎＭ〜２５ｎＭ）を存在させて、牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３４２８７）０．１％を含有する緩衝液Ａ最終量０．２ｍｌに溶かしたＣＨＯ細胞調製物１８μｇから成る（Ｉｍ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２０００）２７５（１９）：１４２８１〜１４２８６参照）。反応は室温で１時間インキュベートする。反応は、ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ３１４３）０．３％および牛血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１％で１時間前処理した、マルチチャンネルハーベスター（Ｂｒａｎｄｅｌｌ）上のＷｈａｔｍａｎＧＦ／Ｃ濾紙で濾過することによって停止する。この混合物を濾紙に付加し、１時間インキュベートする。濾紙を氷冷したＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ、ｐＨ７．６  １ｍｌで６回洗浄する。特異的結合は、放射活性を測定することによって、各トレーサー濃度の全結合量と非特異的結合量（バックグラウンド）との間の差に基づいて計算する。８から１６個の濃度データ点を得て、リガンドと受容体の平衡状態で達成される受容体に対するリガンドの結合（平衡結合変数）、および受容体上への放射活性リガンドまたはアゴニストの結合と競合するために必要な非放射活性リガンドまたはアゴニストの量（競合結合値）を測定する。阻害曲線を作成して、５０％結合阻害を達成するために必要な濃度（ＩＣ50）を決定する。
【０２５９】
〔実施例６〕
ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、いくつかのヒト組織試料から得られた全ＲＮＡまたはポリＡ+ＲＮＡについて、その組織がｈＧＡＶＥ７を発現するかどうかを決定するために実施する。使用したプローブは、ランダムプライムしたＰ32標識ｈＧＡＶＥ  ｃＤＮＡまたはその一部である。
【０２６０】
プローブの調製
Ｐ32標識ｈＧＡＶＥ７  ｃＤＮＡは以下の通りに調製する。前述のように調製したｈＧＡＶＥ７  ｃＤＮＡ２５ｎｇを微量遠心管内でＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＥＤＴＡ  １ｍＭ  ４５μｌに再懸濁して、９５℃で５分間加熱する。次に、この試験管を氷上でさらに５分間冷却する。冷却後、試験管内に含有される混合物をＧＡＶＥ７  ｃＤＮＡ４５μｌおよび前述のような緩衝液で再懸濁して、（ＲＴＳ  Ｒａｄ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識系を備えた）ＲＴＳ  Ｒａｄ  Ｐｒｉｍｅ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０３８７−０１７）と混合する。Ｐ32標識α−ｄＣＴＰ５μｌ、比活性３０００Ｃｉ／ｍＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＡＡ０００５）をゆっくり、しかし十分に混合しながら添加する。得られた混合物を３７℃で１０分間インキュベートする。ＥＤＴＡ  ０．２Ｍ、ｐＨ８．０  ５μｌを付加することによってインキュベーションを停止する。放射活性α−ｄＣＴＰのｈＧＡＶＥ７  ｃＤＮＡへの取り込みは、混合物から少量５μｌを採取し、放射活性を計数することによって評価する。プローブ約１０6ｃｐｍを使用する。
【０２６１】
ＲＮＡ抽出
関心のある細胞にトリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５５９６）１ｍｌを付加することによって、培養皿内で直接溶解する。次に、細胞溶解物をピペットで数回出し入れして、溶解物を均一化する（細胞溶解物はその後試験管に移す）。均一化の後、溶解物を５分間３０℃でインキュベートして、核蛋白質複合体を完全に分離させる。インキュベーション後、トリゾール試薬１ｍｌ当たりクロロホルム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ５３１２）０．２ｍｌを溶解物に添加して、試験管を１５秒間激しく振盪する。次に溶解物を３０℃で３分間インキュベートする。インキュベーション後、溶解物を１２０００×ｇで４℃で１５分間遠心する。得られた水相を新しい試験管に移し、トリゾール試薬１ｍｌ当たりイソプロピルアルコール０．５ｍｌを添加する。次に、水相試料を３０℃で１０分間インキュベートして、１２０００×ｇで４℃で１０分間遠心する。遠心後、上清を除去して、残存するＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄する。次に、洗浄した試料を７５００×ｇで４℃で１０分間遠心して、得られた上清を除去する。次に、残存するＲＮＡペレットを乾燥して、ＲＮＡ分解酵素を含まない水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０９９７−０１５）に再懸濁する。全ＲＮＡ、たとえば末梢組織の試料、またはポリＡ+ＲＮＡ、たとえば様々な脳領域の試料のいずれかをノーザンまたはＴａｑｍａｎ（以下に説明する）実験に使用することができる。公知の標準物、たとえばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒのヒト脳アクチンは購入できる。
【０２６２】
ゲル電気泳動
アガロースゲルは、アガロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ０１６９）を水、５×ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液（以下の説明参照）および２．２Ｍホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８２０３１）に溶融することによって調製する。
【０２６３】
ゲル電気泳動用の試料は以下の通りに調製する。
ＲＮＡ                                              ４．５μｌ（全体で５μｇ）
５×ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液                  ２．０μｌ
ホルムアルデヒド                                    ３．５μｌ
ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ９０３７）  １０．０μｌ
【０２６４】
ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液（５×）は、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．０）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ５１６２））０．１Ｍ；酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ７６７０）４０ｍＭ；およびＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ７８８９）５ｍＭである。
【０２６５】
試料を６５℃で１５分間インキュベートして、次に氷上で冷却する。冷却後、試料を５秒間遠心する。次に、ホルムアルデヒドゲル付加緩衝液２μｌ；グリセロール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ５５１６）５０％；ＥＤＴＡ１ｍＭ（ｐＨ８．０）；ブロモフェノールブルー０．２５％（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１８０４６）；キシレンシアノールＦＦ
０．２５％（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３３５９４０）を試料に添加する。
【０２６６】
表１に、いくつかの実験で使用したいくつかのＲＮＡの原料を挙げる。
〔表１〕
表１  
ヒト全RNA   Clontechカタログ番号
ヒト脳、全体              64020-1
ヒト心臓                  64025-1
ヒト腎臓                  64030-1
ヒト肝臓                  64022-1
ヒト肺                    64023-1
ヒト膵臓                  64031-1
ヒト骨格筋                64033-1
ヒト小腸                  64039-1
ヒト脾臓                  64034-1
ヒト胃                    64090-1
ヒト胸腺                  64028-1
【０２６７】
ゲルに５Ｖ／ｃｍを５分間予備泳動する。予備泳動後、試料をゲルに付加する。次に、ゲルをＩＸホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液に浸して４Ｖ／ｃｍで泳動する。緩衝液は泳動して２時間で交換する。
【０２６８】
ゲルからニトロセルロースへのＲＮＡの移し取り
ゲルをエチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＥＩ３８５）（酢酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号０９６８９）０．１Ｍに０．５μｇ／ｍｌで溶かす）で３０分間染色して、ＲＮＡが分解していないことを保証する。次に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他著（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｖｏｌｕｍｅ１、７．４６〜７．５１頁、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載された方法を使用して、ＲＮＡをアガロースゲルからニトロセルロースフィルタ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号７４３３０−０２６）へ移す。
【０２６９】
Ｐ32標識ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号８０１５−１）を６８℃で２時間インキュベートする。インキュベーション後、加温したハイブリダイゼーション溶液１５ｍｌを多数組織試料ノーザン（ＭＴＮ）膜に注ぐ。ＭＴＮ膜を振盪しながら６８℃でハイブリダイゼーション溶液に浸漬したままにする。１時間経過後、９５℃で５分間煮沸することによって既に変性させたｈＧＡＶＥ７  ｃＤＮＡプローブを１０6カウント／ｍｌの濃度で付加する。ゲルをハイブリダイゼーション溶液で覆って、６８℃で２時間から一晩まで振盪しながらインキュベーションをつづける。
【０２７０】
次に、ＭＴＮ膜をＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液から取り出し、２×ＳＳＰＥ；ＳＤＳ０．０１％で５０℃で３０分間、０．１×ＳＳＰＥ；ＳＤＳ０．１％で６０℃で１時間洗浄する。
【０２７１】
現像
膜をＫｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲ（Ｋｏｄａｋ、カタログ番号１６５１５７９）フィルムに−７０℃で一晩曝露して、標準的方法で現像する。異なるいくつかの組織をスクリーニングしたところ、固有の約２．３ｋｂのｍＲＮＡが選択した組織、たとえば、脾臓および肺で認められた。
【０２７２】
〔実施例７〕
ＰＣＲアッセイ
ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって試料中のメッセンジャーＲＮＡを検出する。このアッセイでは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用してＰＣＲ中にＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを切断する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブには、レポーター色素、たとえば、プローブの５’−末端の６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）およびプローブの３’末端のクエンチャー色素、たとえば、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）が含まれる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、順向きプライマー部位と逆向きプライマー部位との間の関心のある標的ｃＤＮＡとハイブリダイズするように特異的に設計する。プローブが完全なとき、３’末端クエンチャー色素は５’末端リポーター色素の蛍光発光を抑制する。ＰＣＲ中、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’活性によって５’末端リポーター色素と３’末端クエンチャー色素との間のプローブの切断が生じ、リポーター色素の移動が生じる。１回移動すると、リポーター色素の蛍光はもはやクエンチャー色素によって抑制されない。したがって、標的ｃＤＮＡ鋳型から形成されたＰＣＲ産物の蓄積はリポーター色素の蛍光の増加をモニターすることによって検出される。
【０２７３】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ配列検出系（モデル番号ＡＢＩ７７００）を使用してＰＣＲ中のリポーター蛍光の増加をモニターする。リポーター・シグナルは、受動対照の放出に対して正規化する。
【０２７４】
ｃＤＮＡ鋳型の調製
いくつかの組織の全ＲＮＡおよびポリＡ+ＲＮＡは、たとえばＣｌｏｎｔｅｃｈから商用に購入することができる（前記の表１および以下の表２参照）。
〔表２〕
表２  
RNA試料    Clontechカタログ番号
ヒト脳、全体              6516-1
ヒト脳、扁桃体            6574-1
ヒト脳、尾状核            6575-1
ヒト脳、小脳              6543-1
ヒト脳、脳梁              6577-1
ヒト脳、海馬              6578-1
ヒト脳、黒質              6580-1
ヒト脳、視床              6582-1
ヒト胎児脳                6525-1
【０２７５】
全ＲＮＡ５μｇをランダムヘキサマープライマー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１８０９０）２μｌ（５０ｎｇ／μｌ）と混合して全反応量を７μｌにする。得られた混合物を７０℃で１０分間加熱して、氷上で素早く冷却する。次に、以下の、５×第一鎖緩衝液４μｌ、ＤＴＴ  ０．１ｍＭ  ２μｌ、ｄＮＴＰ  １０ｍＭ  １μｌおよび水１μｌを混合物に添加する。この混合物をゆっくり混合して、３７℃で２分間インキュベートする。インキュベーション後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１８０９０）５μｌを付加する。次に、混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。ＥＤＴＡ  ２．５ｍＭ  １μｌを付加することによって反応を停止する。次に、この混合物を６５℃で１０分間インキュベートする。
【０２７６】
ＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ
ＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは９６ウェルプレートＭｉｃｒｏＡｍｐ光学試験管（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号Ｎ８０１−０９３３）で実施する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ混合物（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号Ｎ８０８−０２３０）２５μｌ、順向きプライマー（５’−ＡＧＣＧＡＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＣＣＣ−３’）（配列番号１０）１μｌ、逆向きプライマー（５’−ＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＴＧＣＧＴＡＧＴ−３’）（配列番号１１）１μｌ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（５’−ＦＡＭ−ＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＧＴＴＣＧＴＣＴＣＴＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’）（配列番号１２）１μｌ、ｃＤＮＡ１μｌおよび水２１μｌを各ウェルに入れる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）試料を、各組織試料を２個ずつ以下のｃＤＮＡ鋳型濃度；５、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５ｎｇ／μｌ（この鋳型ｃＤＮＡ濃度は最終濃度である）で作製する。次に、プレートをＭｉｃｒｏＡｍｐ光学８ストリップキャップ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号Ｎ８０１−０９３５）で密封する。
【０２７７】
標準曲線は、ヒトβアクチン遺伝子（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号４０１８４６）を使用して２個ずつ実施する。標準曲線の各ｃＤＮＡ鋳型濃度について、いくつかの増幅分子を得た。公知の遺伝子の標準曲線を増幅することによって、未知の標的遺伝子それぞれを増幅したｃＤＮＡ分子の定量および内部対照による正規化が可能になる。
【０２７８】
前記ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応の結果は、調節倍率（fold regulation）として任意に選択した組織に対して表す。あるいは、反応性が公知の異なる組織、たとえばβアクチンを参照フレームとして使用することができる。高濃度のＧＡＶＥ７ｍＲＮＡが認められた。
【０２７９】
〔実施例７〕
［35Ｓ］ＧＴＰγＳを使用した逆アゴニストおよびアゴニストの同定
構成的に活性化された受容体を含む膜は、まずＧＡＶＥ７を発現する真核細胞のコンフルエントな単層から培地を吸引して（細胞はフラスコまたはマルチウェルプレートに入れてよい）、次に冷却ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄し、さらに吸引することによって調製する。ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭおよびＥＤＴＡ  １０ｍＭを含有する緩衝液、ｐＨ７．４  ５ｍｌを添加して、基板から細胞をこすり取る。細胞物質を５０ｍｌ遠心管に移す（２００００ｒｐｍで４℃で１７分間遠心する）。その後、上清を吸引して、得られたペレットをＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭおよびＥＤＴＡ  ０．１ｍＭを含有する緩衝液、ｐＨ７．４  ３０ｍｌに再懸濁して、その後前記のように遠心する。次に、上清を吸引して、得られたペレットをＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭおよびＭｇＣｌ2  １０ｍＭを含有する緩衝液（結合緩衝液）に再懸濁する。次に、懸濁液をＢｒｉｎｋｍａｎ  ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザーを使用して均一化し（物質すべてが均一な懸濁液になるまで１５〜２０秒間粉砕する）、膜蛋白質調製物を生成する。蛋白質の濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定する（ＷＯ００／２２１３１参照）。
【０２８０】
候補化合物は９６ウェルプレート様式を使用してスクリーニングすることが好ましい。膜蛋白質調製物は、結合緩衝液で０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈して、最終濃度１２．５μｇ／ウェルで５０μｌ量とする。ＧＤＰ緩衝液１００μｌ（結合緩衝液３７．５ｍｌおよびＧＤＰ  ２ｍｇ、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ−７１２７）を各ウェルに付加して、次にＷａｌｌａｃ  ＳｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐTM（Ｗａｌｌａｃ）を添加する。候補化合物５μｌを各ウェルに移す（すなわち、候補化合物の最終濃度が１０μＭになるように、全アッセイ量２００μｌ中５μｌとして、１：４０の比が得られる）。膜蛋白質５０μｌを（受容体を含有しない膜対照を含めた）各ウェルに添加して、予備インキュベーションを室温で５〜１０分間実施する。その後、結合緩衝液にとかした［35Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）５０μｌを各ウェルに添加して、その後振盪機で室温で６０分間インキュベートする。プレートを４０００ｒｐｍで２２℃で１５分間回転させてアッセイを停止させる。次に、プレートを８チャンネルマニホールドで吸引して、プレートカバーで密封して、Ｗａｌｌａｃ  １４５０TMで（製造者指示書により）設定「Ｐｒｏｔ．＃３７」を使用して読み取る。細片に結合した物質量の変化によって、候補化合物が逆アゴニスト（基準線に対して減少）か、アゴニスト（基準線に対して増加）かを決定する。
【０２８１】
〔実施例８〕
免疫細胞制御
ＴＨＰ−１細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、ＲＰＭＩ培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０、ペニシリン−ストレプトマイシン１００ＩＵ／ｍｌ、熱不活性化牛胎児血清１０％）で３７℃で加湿した９５％空気／５％ＣＯ2組織培養インキュベーター内に維持した。ＴＨＰ−１細胞は、フォルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）１０ｎＭで処理して、一晩インキュベートして、単球を付着マクロファージ型細胞に分化させた。分化した細胞は付着し、増殖を停止し、高濃度のＣＤ１４を発現する。ＬＰＳはマクロファージを活性化し、炎症応答を生じる。この細胞を培養培地で１回洗浄して、ＰＭＡなしでさらに４８時間増殖させた。ＰＭＡ分化細胞は、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）を入れて、または入れないで４時間および２４時間誘発した。
【０２８２】
次にこの細胞のＧＡＶＥ７発現をノーザンブロットまたはＴａｑＭａｎアッセイでアッセイした。細胞は、対照として使用したアクチンに曝露した。ＬＰＳはＧＡＶＥ７発現をダウンレギュレートした。
【０２８３】
本発明は前記の実施例を参照にして詳細に説明したが、本発明の精神を逸脱することなく様々な変更が可能であることが理解される。したがって、本発明は、以下のクレームによってのみ制限される。引用したすべての特許および出版物は、本出願に取り入れ、全体
を参照により組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１Ａ】ｈＧＡＶＥ７のＤＮＡ配列（配列番号１）ならびにｈＧＡＶＥ７のアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図２】ＴＨＰ１細胞における発現実験の結果を示した図で、ＬＰＳの存在下でダウンレギュレートを示す。アクチンは対照である。
【図３】ＧＡＶＥ７の構成的活性を示す実験を示した図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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