(57)【要約】本発明は、（ａ）配列番号１、又は（ｂ）血管形成因子をコードするヌクレオチド配列のうち少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になる単離又は精製された核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のイントロン５、６、７及びエキソン６、７、８を含むゲノムＤＮＡに連結した、ＶＥＧＦのエキソン１−５を含むｃＤＮＡを含み、且つエキソン５、６、７、８からなる群より選択されるエキソンに含まれるスプライスドナー、ブランチポイント、スプライスアクセプター領域の１つ以上に変異を更に含み、変異は、ＶＥＧＦの別のアイソ型と比較してＶＥＧＦの１つのアイソ型の産生を促進する、単離又は精製された核酸分子を提供する。このような核酸分子を含む、発現構築体、組成物、細胞もまた本発明によって提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１又は（ｂ）血管形成因子をコードするヌクレオチド配列のうち少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になる単離又は精製された核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、（ｉ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のエキソン１−５を含むｃＤＮＡを含み、該ｃＤＮＡは、（ｉｉ）ＶＥＧＦのイントロン５、６、７及びエキソン６、７、８を含むゲノムＤＮＡに連結しており、ヌクレオチド配列は、エキソン５、６、７、８からなる群より選択されるエキソンに含まれるスプライスドナー、ブランチポイント、スプライスアクセプター領域の１つ以上に変異を含み、変異は、ＶＥＧＦの別のアイソ型と比較してＶＥＧＦの１つのアイソ型の産生を促進する、単離又は精製された核酸分子。
【請求項２】
単離又は精製された核酸分子は、配列番号１のうち少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になる、請求項１記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項３】
血管形成因子をコードするヌクレオチド配列のうち少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になる単離又は精製された核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、（ｉ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のエキソン１−５を含むｃＤＮＡを含み、該ｃＤＮＡは、（ｉｉ）ＶＥＧＦのイントロン５、６、７及びエキソン６、７、８を含むゲノムＤＮＡに連結しており、ヌクレオチド配列は、エキソン５、６、７、８からなる群より選択されるエキソンに含まれるスプライスドナー、ブランチポイント、スプライスアクセプター領域の１つ以上に変異を含み、変異は、ＶＥＧＦの別のアイソ型と比較してＶＥＧＦの１つのアイソ型の産生を促進する、単離又は精製された核酸分子。
【請求項４】
単離又は精製された核酸分子は、血管形成因子をコードするヌクレオチド配列から本質的になり、ヌクレオチド配列は、（ｉ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のエキソン１−５を含むｃＤＮＡを含み、該ｃＤＮＡは、（ｉｉ）ＶＥＧＦのイントロン５、６、７及びエキソン６、７、８を含むゲノムＤＮＡに連結しており、ヌクレオチド配列は、エキソン５、６、７、８からなる群より選択されるエキソンに含まれるスプライスドナー、ブランチポイント、スプライスアクセプター領域の１つ以上に変異を含み、変異は、ＶＥＧＦの別のアイソ型と比較してＶＥＧＦの１つのアイソ型の産生を促進する、請求項３記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項５】
ＶＥＧＦはＶＥＧＦ−Ａである、請求項４記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項６】
ゲノムＤＮＡは、イントロン内に欠失を含み、変異は、スプライシング効率に影響を与えない、請求項４又は５記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項７】
ヌクレオチド配列は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）をコードする、請求項１〜６のいずれか１項記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の単離又は精製された核酸分子を含む発現構築体。
【請求項９】
ベクターはウイルスベクターである、請求項８記載の発現構築体。
【請求項１０】
ベクターはアデノウイルスベクターである、請求項９記載の発現構築体。
【請求項１１】
アデノウイルスベクターは、複製に必須な１つ以上の遺伝子機能が欠損している、請求項１０記載の発現構築体。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項記載の単離又は精製された核酸分子と担体とを含有する組成物。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか１項記載の発現構築体と担体とを含有する組成物。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれか１項記載の発現構築体を含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許出願の相互参照）
本特許出願は、米国仮特許出願No. 60/375,364（2002年4月25日出願）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡを含むヌクレオチド配列から本質的になる単離又は精製された核酸分子、及び遺伝子治療適用で使用される発現構築体にそれを含めることに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
遺伝子治療は、細胞への機能的遺伝子材料の導入により種々の疾患状態に取り組むことを目的とする治療の一般型として現れた。通常、遺伝子治療は、遺伝子送達ビヒクル（例えば、遺伝子導入ベクター）中に、ｃＤＮＡからなる導入遺伝子、又は普通ではないが、導入遺伝子のゲノム形状（エキソンとイントロンを含む）を含めることによって行う。典型的には、遺伝子治療ベクターにパッケージできるＤＮＡ又はＲＮＡ（即ち、導入遺伝子）の量に制限がある。導入遺伝子が占めるサイズを最小化するために、導入遺伝子を含む発現カセットは一般的に、ゲノムクローンよりもｃＤＮＡを含む。しかし、場合によっては、遺伝子治療ベクターは、イントロンを含むように構築されてきた。例えば嚢胞性線維症トランスメンブレンコンダクタンス制御（ＣＦＴＲ）遺伝子の１次転写体の５’末端にイントロン含有領域を含む嚢胞性線維症の治療に有用な遺伝子治療ベクターが報告された。このベクター中のイントロン含有領域は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期イントロンとヒト免疫グロブリン遺伝子からのイントロンとのハイブリッドである。１次転写体の５’末端でイントロンを使用する合理的理由は、２つの考えに基づく。第１に、インビトロトランスフェクション研究が示すところによれば、細胞に導入されるこのような遺伝子は、１次転写体がイントロンを含むとき、より効率的に発現される。第２に、１次転写体の５’末端のイントロンは、ｍＲＮＡ転写体からベクターＤＮＡを区別するためのＰＣＲ解析に便利である。ゲノムクローンは遺伝子治療に稀にしか使用されてこなかったが、比較的小さなゲノム（例えば、エリスロポエチン）又はヒトα１−アンチトリプシン遺伝子のゲノミッククローンが導入遺伝子として使用されたガットレス(gutless)アデノウイルスベクターは例外である。ガットレスベクターを用いるインビボデータは、導入遺伝子の長時間発現を示したが、この観察は、導入遺伝子の性質よりもガットレスベクターの性質を反映していると解釈された。ｃＤＮＡとは対照的に、ゲノムＤＮＡのプレｍＲＮＡスプライシングは、蛋白質産生に必須である。
【０００４】
ＲＮＡスプライシングは、ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鋳型の転写によって作出される１次転写体が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を作出するように再構成されるプロセスの一部である。大部分の哺乳動物遺伝子に関し、１次転写体に存在する１つ以上のイントロンが除去され、一緒にスプライスされたとき、成熟ｍＲＮＡを構成するエキソンのみを残す。イントロンの数と長さは、遺伝子毎に大きく異なる。
【０００５】
ＲＮＡスプライシングは、スプライセオソームによって媒介される。スプライセオソームは、２工程プロセスでイントロンの除去を担う大きな蛋白質／ＲＮＡ複合体である。第１に、５’−リン酸を露出しているスプライスドナー部位（イントロンの５’末端）で切断が起き、それは、イントロン内のスプライスアクセプターの近くに局在するブランチポイントの２’−ＯＨに直ちに連結する。第２に、上流エキソンの３’−ＯＨが下流エキソンの５’リン酸に連結すると同時に、スプライスアクセプター部位で切断が起きる。これらの２工程により、遊離３’−ＯＨ末端をもつ投げ輪（lariat）としてイントロンの放出が起こる。
【０００６】
構成型スプライシングのプロセスでは、イントロンの全てがプレｍＲＮＡから切り出され、独特のｍＲＮＡ種が生じる。しかし、１より多いｍＲＮＡ種が単一のプレｍＲＮＡ由来である多数の遺伝子が報告されている。このような事象は、オールターナティブ (alternative) スプライシングと呼ばれる。これが起きるとき、蛋白質の多数の異なるアイソ型 (isotype) が、１つのプレｍＲＮＡから産生されることができる。更に、これらのアイソ型の各々は、異なる生物活性を有し得る。オールターナティブスプライシングされたプレｍＲＮＡ転写体の例は、血管形成 (angiogenic) 因子ＶＥＧＦによって実証される。ＶＥＧＦ−Ａ（ときに、「ＶＥＧＦ−１」と言われる）遺伝子は、８個のエキソンと７個のイントロンを含み、オールターナティブスプライシングによって、該蛋白質の少なくとも６種のアイソ型を形成できる。
【０００７】
最長の蛋白質アイソ型はＶＥＧＦ２０６である。そのｍＲＮＡは、２３２個のアミノ酸のプレ蛋白質をコードする８個全てのエキソンの全体を含み、それは、２０６個のアミノ酸の成熟型へとプロセスされる。異なるアイソ型を産生するオールターナティブスプライシングは、エキソン６、７、８の周辺を中心とする。ＶＥＧＦ１２１アイソ型は、エキソン５の末端のスプライスドナーをエキソン８のスプライスアクセプターに直接連結し、それによりエキソン６と７が完全に除去されることから生じる。エキソン６は、エキソン７に連結でき、ＶＥＧＦ２０６、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１８３アイソ型をもたらす３つの異なる潜在的スプライスドナーを有するので特に複雑である。遺伝子の３’非翻訳末端は、虚血に応答してｍＲＮＡの半減期を増加する調節エレメントを含む。全てのアイソ型のｍＲＮＡは同一の５’と３’末端を共有するので、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、任意の組織で相対量を推定できる。大部分の正常組織では、ＶＥＧＦ１６５とＶＥＧＦ１８９は最も豊富であり、新生物の転換に関連する発現の変化を伴う(例えば、Jackson et al., J. Urol., 157, 2323-2328 (1997) 及びCheung et al., Hum. Pathol., 29, 910-914 (1998) 参照)。例えば、肺又は結腸起源の癌腫では、より短いＶＥＧＦ１２１アイソ型への転換が観察された（例えば、Cheung et al. (1998), 上記参照）。非小細胞肺癌では、ＶＥＧＦ１８９の増加が、疾患のより攻撃的な型を伴い、患者の予後不良を示す（例えば、Tokenaga et al., Br. J. Cancer., 77, 998-1002 (1998) 参照）。更に、ＶＥＧＦ１４５アイソ型は最初に、癌腫で発見されたが（例えば、Poltorak et al., J. Biol. Chem., 272, 7151-7158 (1997) 参照）、非形質転換組織では観察されなかった（例えば、Jackson et al. (1997), 上記, 及びCheung et al. (1998), 上記参照）。
【０００８】
ＶＥＧＦアイソ型の意義は、それらの異なる生物活性にある。第１に、異なるアイソ型は、ＶＥＧＦレセプターに対する異なるアフィニティを有する。少なくとも３種のＶＥＧＦレセプター（ｆｌｔ１、ｆｌｋｌ／ＫＤＲ、及びニューロピリン）が知られており、異なる細胞型と発生中の異なる時期に見出される。Ｆｌｔｌは、細胞遊走を媒介し、ＫＤＲは、ＶＥＧＦの増殖効果に必要である（例えば、Barleon et al., Blood, 87, 3336-3343 (1996) 参照）。ＶＥＧＦ１６５は、ｆｌｋｌ／ＫＤＲレセプター、ｆｌｔ１レセプターにほぼ等しいアフィニティを有するが、ＶＥＧＦ１２１は、ｆｌｔ１に対しずっと低いアフィニティを有し、主にＫＤＲと結合する（例えば、Keyt et al., J. Biol. Chem, 271, 7788-7795 (1996) 参照）。従って、ＶＥＧＦ１２１は、ｆｌｔ１を欠く組織では生物不活性であることが予想される。同様に、ニューロピリンは、ＶＥＧＦ１６５とＫＤＲ（flt1ではない）との相互作用を増大すると考えられるが、ＶＥＧＦ１２１のＫＤＲへの結合に効果を有しない（例えば、Gitay-Goren et al., J. Biol. Chem., 271, 5519-5523 (1996) 及びPark et al., J. Biol. Chem., 269, 25646-25654 (1994) 参照）。第２に、異なるＶＥＧＦアイソ型は、ヘパリン及び負に荷電した他の細胞マトリックス成分との結合能力で異なる。ＶＥＧＦ１２１は、ヘパリンとの相互作用を決定するエキソン６と７に存在する塩基性ドメインを欠く。ヘパリンの存在は、レセプターに対するＶＥＧＦのアフィニティと組織での滞留時間の両方を改変できる（例えば、Keyt et al. (1996), 上記, 及びCohen et al. (1995), 上記参照）。ＶＥＧＦ１６５やＶＥＧＦ１８９などのヘパリン結合アイソ型は、細胞外マトリックスと強く結合し、プラスミンなどのプロテアーゼによって生物活性ペプチドとして放出され得る（例えば、Keyt et al. (1996), 上記, Athanassiades et al., Bio. Reprod., 59, 643-654 (1998), 及びTerman et al., Growth Factors, 11, 187-195 (1994)参照）。
【０００９】
ＶＥＧＦアイソ型の異なる性質の生物的意義は、ヘパリン結合アイソ型ＶＥＧＦ１６４／１８８を作ることができないマウスの表現型によって証明される（マウスＶＥＧＦアイソ型は、ヒト相同体より１アミノ酸短いことに注意）（例えば、Carmeliet et al., Nat. Med., 5, 495-502 (1999) 参照）。ＶＥＧＦ遺伝子のみの完全欠失は、２つのアレルの一方だけが欠失されているときでさえ、マウス胚に致死的である（例えば、Carmeliet et al., Nature, 380, 435-439 (1996) 参照）。しかし、エキソン６と７を含む小さなゲノム欠失を有し、それによりＶＥＧＦ１２０を、産生されることができる唯一のアイソ型とすることができるマウスを作出できる（例えば、Carmeliet et al. (1999), 上記参照）。ＶＥＧＦ１２０のホモ接合マウスは、新生児として致死性であり、心筋血管形成障害を有し、収縮性の減少と虚血性心筋障害が生じる。従って、ＶＥＧＦの発生的役割は、ＶＥＧＦ１２０によって与えられることができ、血管供給（特に、心筋への）の誕生後発達は、ＶＥＧＦ１６４／ＶＥＧＦ１８８アイソ型に依存する。この証拠は、遺伝子治療によって送達されるＶＥＧＦの異なるアイソ型又はアイソ型の混合物の産生から、異なる治療効果が期待され得るという内容を支持する。また、ＶＥＧＦ以外の遺伝子が同様に使用できることが考えられる。オールターナティブスプライシングは、特定の遺伝子の異なるアイソ型の産生を成就できるが、特定の遺伝子の他のアイソ型に対し１つのアイソ型の産生を促進するスプライス部位を含む核酸分子を構築することは利点がある。このような核酸分子は、スプライシングとアイソ型産生をより制御することを可能とし、治療適用において、並びに、哺乳動物でのこのような治療適用の有効性を測定する迅速・高感度且つ正確な方法において有用である。
【００１０】
本発明は、このような核酸分子、治療適用及び方法を提供する。本発明のこれらの目的や他の目的及び利点、並びに本発明の更なる性質は、本明細書で提供される本発明の説明から明らかとなろう。
【発明の開示】
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、（ａ）配列番号１、又は（ｂ）血管形成因子をコードするヌクレオチド配列のうち少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になる単離又は精製された核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のエキソン１−５を含むｃＤＮＡ（該ｃＤＮＡは、ＶＥＧＦのイントロン５、６、７及びエキソン６、７、８を含むゲノムＤＮＡに連結している）を含み、ヌクレオチド配列は、エキソン５、６、７、８からなる群より選択されるエキソンに含まれるスプライスドナー (splice donor)、ブランチポイント (branch point)、スプライスアクセプター (splice acceptor) 領域の１つ以上に変異を含み、変異は、ＶＥＧＦの別のアイソ型と比較してＶＥＧＦの１つのアイソ型の産生を促進する、単離又は精製された核酸分子を提供する。このような核酸分子を含む、発現構築体、組成物、細胞も本発明によって提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、同一遺伝子によってコードされ、且つオールターナティブスプライシングによって産生される異なる蛋白質アイソ型がしばしば、異なる機能を有するという知識、並びにオールターナティブスプライシングによって形成される異なるｍＲＮＡの相対量が、各エキソンに対して３’及び５’にあるイントロン配列におけるスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位の配列によって制御されるという知識に、少なくとも部分的に基づく。本発明は、配列番号１の少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になる、又はさらには、からなる単離又は精製された核酸分子を提供する。好ましくは、このような単離又は精製された核酸分子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの蛋白質の異なるアイソ型を産生できる遺伝子をコードするヌクレオチド配列から本質的になる。また好ましくは、核酸分子は、ゲノムＤＮＡに連結したｃＤＮＡを含むヌクレオチド配列から本質的になる。本発明はまた、ＶＥＧＦのイントロン５、６、７及びエキソン６、７、８を含むゲノムＤＮＡに連結したＶＥＧＦのエキソン１−５を含むｃＤＮＡを含む血管形成因子をコードするヌクレオチド配列から本質的になる単離又は精製された核酸分子であって、ヌクレオチド配列は、エキソン５、６、７、８からなる群より選択されるエキソンに含まれるスプライスドナー、ブランチポイント、スプライスアクセプター領域の１つ以上に変異を含み、変異は、ＶＥＧＦの別のアイソ型と比較してＶＥＧＦの１つのアイソ型の産生を促進する、単離又は精製された核酸分子を提供する。好ましくは、ヘパリンと結合するＶＥＧＦのアイソ型の産生は、ヘパリンと結合しないＶＥＧＦのアイソ型の産生に対し促進される。本発明は、ゲノムＤＮＡと連結したｃＤＮＡを含む血管形成因子をコードする上記ヌクレオチド配列のうち少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる単離又は精製された核酸分子を更に提供する。
【００１３】
「単離された」は、核酸分子がその天然環境から取り出されたことを意味する。「精製された」は、所定の核酸分子が、天然から取り出されたか、あるいは実験室条件下で合成及び／又は増幅されたかにかかわらず、純度（「純度」は相対的用語であって、「絶対的純度」ではない）において増大したことを意味する。「核酸分子」は、単一鎖又は二重鎖であり得、そして非天然又は改変ヌクレオチドを含み得る、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマー（即ち、ポリヌクレオチド）を含むことが意図される。
【００１４】
本発明の単離又は精製された核酸分子は、少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になるが、より大きな核酸分子も意図される。例えば、本発明の単離又は精製された核酸分子は、配列番号１、又はゲノムＤＮＡに連結したｃＤＮＡを含む血管形成因子をコードする上記ヌクレオチド配列のうち少なくとも１９００個連続するヌクレオチド、少なくとも１９１０個連続するヌクレオチド、少なくとも１９２０個連続するヌクレオチド、少なくとも１９３０個連続するヌクレオチド、少なくとも１９４０個連続するヌクレオチド、又はさらには、少なくとも１９５０個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になり得る。配列番号１、又はゲノムＤＮＡに連結したｃＤＮＡを含む血管形成因子をコードする上記ヌクレオチド配列のうち少なくとも２０００個連続するヌクレオチド、少なくとも２２２５個連続するヌクレオチド、少なくとも２５００個連続するヌクレオチド、又はさらには、少なくとも３０００個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になる単離又は精製された核酸分子などの更に大きな核酸分子も意図される。単離又は精製された核酸分子が、配列番号１、又はゲノムＤＮＡに連結したｃＤＮＡを含む血管形成因子をコードする上記ヌクレオチド配列のうち４４％以上、５０％以上、又はさらには、５５％以上に及ぶ連続するヌクレオチドから本質的になる限り、一般的には、任意のサイズの核酸分子が意図される。
【００１５】
本発明の核酸分子が、ｃＤＮＡ配列とゲノムＤＮＡ配列の両方を含むとき、これらのＤＮＡ配列は互いに連結される。この点に関し、ゲノムＤＮＡが核酸分子に含まれ、且つｃＤＮＡ配列に対し、直接的に５’又は３’のいずれかで該分子内で位置するとき、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡに「連結」されている。複数のゲノムＤＮＡが核酸分子中に含まれるとき、このような配列は、ｃＤＮＡ配列に対し５’及び／又は３’に位置し得る。特定の遺伝子の１つのアイソ型の産生が、別のアイソ型の代わりに促進されるように、核酸分子は構築される。このような場合において、スプライスドナー、ブランチポイント、及び／又はスプライスアクセプター部位を含むヌクレオチド配列が操作され（例えば、部位特異的変異誘発によって）、事実上、スプライシングによって除去されるべき核酸分子内の部位が決定される。これにより、特定のアイソ型がオールターナティブスプライシングによって産生されるように、より制御することが可能となる。
【００１６】
プレｍＲＮＡの複雑度と長さを考えれば、スプライス部位が選択される機構は必然的に複雑である。２つの戦略を用いてスプライシングの必須配列を評価した：（１）スプライシング効率及び位置を改変する天然の変異、及び誘導された変異の解析、並びに（２）スプライシングに関与する配列の統計的研究。これらの広範な研究は、スプライスドナー、ブランチポイント、及びスプライスアクセプター部位でのヌクレオチド頻度を示すものとして要約できる。プレｍＲＮＡがＶＥＧＦをコードする場合、図３に示すコンセンサススプライシング配列との一致は、効率的なスプライシングの指標となる。同様に、コンセンサス配列との不一致は、非効率的スプライシングの指標となる。他の遺伝子でのコンセンサススプライス部位は、慣用実験により決定できる。従って、ＶＥＧＦに関するスプライス部位の決定は、決して限定的ではない。
【００１７】
スプライス部位認識の解析において、Senapathyスコアなどの種々の数学的評価を行って、統計的コンセンサスに対するスプライス部位の一致性を評価できる（例えば、Senapathy et al., Methods Enzymol., 183, 252-278 (1990) 参照）。スプライシング効率に高いインパクトを有する変異は、Senapathyスコアで高いインパクトを有するが、多型（即ち、スプライシングに効果を有しない変異）は小さなインパクトを有する。Senapathyスコアの値、又は他のより複雑なスコア（例えば、Stephens et al., J. Mol. Biol., 228, 1124-1136 (1992) 参照）は、スプライシング効率に対する変異の効果の予測を可能とする。この情報は、所定のスプライス部位の利用をより効率的又は非効率的に促進又は抑制するように、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を設計するために使用できる。
【００１８】
本発明はまた、配列番号１の少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドから本質的になるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列から本質的になる核酸分子を提供する。このような相補的ヌクレオチド配列は、配列番号１の少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列から本質的になる核酸分子と、ストリンジェント条件下でハイブリダイズする。
【００１９】
句「〜とハイブリダイズする」とは、標的配列が不均質ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの調製物中に存在するとき、一本鎖核酸プローブが相補的配列の一本鎖標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列に対して選択的に結合することをいう。「ストリンジェント条件」は配列依存性であり、異なる環境下では異なる。一般的に、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度とｐＨにて、所定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）より約２０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度（規定のイオン強度とｐＨ下）である。
【００２０】
例えば、ストリンジェント条件下では、その用語から当業者に理解されるように、ハイブリダイゼーションは、約５０℃〜約７５℃、より一層好ましくは約６０℃〜約７０℃、最適には約６５℃〜約６８℃の範囲の温度で、標準ハイブリダイゼーション緩衝液を用いて、好ましくは行われる。あるいは、ホルムアミドをハイブリダイゼーション反応に含ませることができ、ハイブリダイゼーション温度は、好ましくは約３５℃〜約４５℃、より一層好ましくは約４０℃〜約４５℃、最適には約４２℃に下げることができる。望ましくは、ホルムアミドは、約３０％〜約５０％、好ましくは約３５％〜約４５％、最適には約４０％の濃度でハイブリダイゼーション反応に含まれる。更に、場合によっては、ハイブリダイズされた配列は、その用語から当業者に理解されるように、相対的に高いストリンジェント条件下で洗浄される（必要ならば、非特異的結合を減少させるために）。例えば、望ましくは、ハイブリダイズされた配列は、塩と界面活性剤を含有する溶液を用い、好ましくは約５０℃〜約７５℃、より一層好ましくは約６０℃〜約７０℃、最適には約６５℃〜約６８℃の温度で、１回以上洗浄される。好ましくは、塩（例えば、塩化ナトリウムなど）が、約０．０１Ｍ〜約１Ｍの濃度で洗浄溶液に含まれる。最適には、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウムなど）も、約０．０１％〜約１％の濃度で含まれる。
【００２１】
上記を考慮すれば、「高いストリンジェント条件」は好ましくは約２５％〜約５％、より好ましくは約１５％〜約５％、最適には約１０％〜約５％の不一致 (mismatch) を可能とする。「中程度 (moderately) ストリンジェント条件」は好ましくは約４０％〜約１５％、より好ましくは約３０％〜約１５％、最適には約２０％〜約１５％の不一致を可能とする。「低いストリンジェント条件」は好ましくは約６０％〜約３５％、より好ましくは約５０％〜約３５％、最適には約４０％〜約３５％の不一致を可能とする。不一致の上記範囲に関し、１％の不一致は、融点の１度減少に対応する。ハイブリダイゼーション反応でホルムアミド濃度を調整することによってストリンジェント条件を操作できることが一般的に理解される。例えば、漸増量のホルムアミドの添加によって、条件がよりストリンジェントとなり得る。
【００２２】
上記の単離又は精製された核酸分子に関し、核酸分子に挿入、欠失、逆位、及び／又は置換が無いことが好ましい。このような核酸分子は、「野生型」遺伝子産物（即ち、蛋白質）をコードする。しかし、上記の単離又は精製された核酸分子が、１つ以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むのが適切である。このような核酸分子は「変異体」遺伝子産物をコードする。
【００２３】
好ましくは、変異体核酸分子は、対応する野生型分子と機能的に異ならない。例えば、配列番号１のうち少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む核酸分子内に含まれる任意の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換は好ましくは、（１）フレームシフト変異の導入が起こらない、（２）プロモーター領域がヌクレオチド配列の転写を指向する能力を妨害しない、又は（３）蛋白質に翻訳される対応するＲＮＡ転写体の能力を妨害しない。１実施態様では、１つ以上の置換では、核酸分子によってコードされるアミノ酸の変化を生じない。別の実施態様では、１つ以上の置換により、ほぼ等価のサイズ、形態、及び／又は電荷の別のアミノ酸による、アミノ酸の置換が起こる。
【００２４】
また、上記に関し、「〜と機能的に異ならない」は、変異体核酸分子が、野生型分子に特徴的な活性を有することを意味すると意図される。しかし、変異体核酸分子は、所望される場合には、野生型分子よりも、活性が高く又は低くあり得る。
【００２５】
所望のとき、本発明の核酸分子は、発現構築体に挿入できる。上記核酸分子は、任意の適切な発現構築体にクローンでき、それを用いて、任意の適切な宿主を形質転換又はトランスフェクトできる。発現及びそれらの構築方法の選別は、当業者に通常公知であり、一般的技術的参考文献に記載されている（一般的には、「Recombinant DNA Part D」, Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987) 参照）。
【００２６】
適切な発現構築体としては、増殖又は発現あるいはその両方のために設計されたものが挙げられる。適切な発現構築体の例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルス、及びウイルスもしくは細菌源由来の他のビヒクルが挙げられる。これらの発現構築体の任意のものは、配列番号１のうち少なくとも１８７７個連続するヌクレオチドから本質的になる核酸配列を含むように操作でき、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、及び Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994) に記載の標準的組換えＤＮＡ技術を用いて製造できる。
【００２７】
プラスミドは、遺伝子的に操作された環状の二本鎖ＤＮＡ分子であり、本発明の核酸分子を含む発現カセットを含むようにデザインできる。プラスミドは、治療用核酸の投与のために記載された第１のベクターであるが、トランスフェクション効率のレベルは、他のベクターと比較して小さい。プラスミドをリポソームと複合体形成することによって、一般的に遺伝子導入の効率は改善される。プラスミド媒介遺伝子導入戦略のために使用されるリポソームは種々の組成を有するが、典型的には合成カチオン性脂質である。プラスミド−リポソーム複合体の利点としては、大きな核酸配列の導入能力、及び相対的に小さな免疫原性が挙げられる。プラスミドは、本発明での使用に適切であるが、好ましくは、発現構築体はウイルスベクターである。
【００２８】
ウイルスベクターは任意の適切なウイルスベクターであり得る。適切なウイルスベクターとしては、任意の適切な起源（好ましくは、動物起源（例えば、鳥類又は哺乳動物）及び望ましくはヒト起源）のレオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パポーバウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、エンテロウイルスが挙げられるがそれに限定されない。その他の適切なウイルスベクターは当業界公知であり、十分に特徴付けされている。このようなウイルスベクターの例は、例えば、Fields et al., Virology Lippincott-Raven (3rd ed. (1996) and 4th ed. (2000)); Encyclopedia of Virology, R.G. Webster et al., eds., Academic Press (2nd ed., 1999); Fundamental Virology, Fields et al., eds., Lippincott-Raven (3rd ed., 1995); Levine, 「Viruses」, Scientific American Library No. 37 (1992); Medical Virology, D.O. White et al., eds., Academic Press (2nd ed. 1994); 及び Introduction to Modern Virology, Dimock, N.J. et al., eds., Blackwell Scientific Publications, Ltd. (1994) に記載されている。好ましくは、ウイルスベクターは、哺乳動物（最適にはヒト）などの動物に通常感染するウイルス由来であるか、又はそれに基づく。ヒトアデノウイルスに基づくアデノウイルス（Ａｄ）ベクターは、好適なウイルスベクターである。
【００２９】
アデノウイルスは、３６ｋｂの二重鎖ＤＮＡウイルスであって、種々の異なる標的細胞型にインビボで効率的にＤＮＡを導入する。Ａｄベクターは高力価で製造でき、複製及び非複製細胞に効率的にＤＮＡを導入できる。Ａｄベクターゲノムは、ベクターＤＮＡの源として、任意の種、株、亜型、種、株もしくは亜型の混合物、又はキメラアデノウイルスを用いて製造できる。アデノウイルスの源として使用できるアデノウイルスストックは、アデノウイルス血清型１〜５１（それらは、American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) から現在入手できる）から、又は任意の他の源から入手できるアデノウイルスの任意の他の血清型から増幅できる。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８、３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５、６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２−３０、３２、３３、３６−３９、４２−４７）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４０、４１）、又は任意の他のアデノウイルス血清型であり得る。ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ゲノムが完全に配列決定されたことを考えれば、Ａｄ５血清型に関するアデノウイルスベクターが本明細書では記載される。Ａｄベクターは、細胞で増殖できる任意のアデノウイルスベクターであり得、それは、かなりの部分（必ずしもほぼではない）、アデノウイルスのゲノム由来であるか、又はそれに基づく。Ａｄベクターは、任意の適切な野生型アデノウイルスのゲノムに基づき得る。好ましくは、Ａｄベクターは、グループＣ、特に血清型２又は５の野生型アデノウイルスのゲノム由来である。Ａｄベクターは当該分野において周知であり、例えば、米国特許第5,559,099号、同第5,712,136号、同第5,731,190号、同第5,837,511号、同第5,846,782号、同第5,851,806号、同第5,962,311号、同第5,965,541号、同第5,981,225号、同第5,994,106号、同第6,020,191号、及び同第6,113,913号、国際特許出願WO95/34671、WO97/21826及びWO00/00628、並びにVirology, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996) 中のそれぞれ67章、68章のThomas Shenk, 「Adenoviridae and their Replication」及び M. S. Horwitz, 「Adenoviruses」に記載されている。
【００３０】
好ましくは、Ａｄベクターは複製欠損である。「複製欠損」は、Ａｄベクターが、複製に必須な少なくとも１つの遺伝子機能を欠くゲノムを含むことを意味する。本明細書で使用するとき、遺伝子、遺伝子機能、又は遺伝子もしくはゲノム領域の欠損は、遺伝子の核酸配列が全体として欠失した、又は一部欠失したその遺伝子の機能を損なう又は破壊するのに十分なウイルスゲノムの遺伝子材料の欠失として定義される。複製に必須な遺伝子機能は、複製欠損Ａｄベクターの複製（即ち、増殖）に必要な遺伝子機能である。複製に必須な遺伝子機能は、例えば、アデノウイルス初期領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１−Ｌ５領域）、ウイルスパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、及びウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ−ＲＮＡＩ及び／又はＶＡ−ＲＮＡＩＩ）によってコードされる。好ましくは、複製欠損Ａｄベクターは、ウイルス複製に必要な２つ以上の遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含む。アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域は好ましくは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４領域からなる群より選択される。より好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の複製に必須な少なくとも１つの遺伝子機能での欠損を含む（Ｅ１欠損アデノウイルスベクターと表される）。アデノウイルスゲノムのＥ１領域は、Ｅ１Ａ領域とＥ１Ｂ領域を含む。Ｅ１Ａ領域とＥ１Ｂ領域は、ＲＮＡスプライシングのために、複数のペプチドをコードする核酸配列を含む。アデノウイルスゲノムのＥ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域のいずれか又は両方によってコードされる遺伝子機能（例えば、複製に必要な機能を行うペプチド）の欠損は、本発明の文脈では、Ｅ１領域の遺伝子機能の欠損とみなされる。Ｅ１領域でのこのような欠損に加えて、組換えアデノウイルスはまた、国際特許出願WO00/00628で考察されたように、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に変異を有し得る。より好ましくは、ベクターは、Ｅ１領域の複製に必須な少なくとも１つの遺伝子機能及び非必須Ｅ３領域の少なくとも一部（例えば、Ｅ３領域のＸｂａ Ｉ欠失）を欠損する（Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表される）。
【００３１】
好ましくは、アデノウイルスベクターは「多重欠損」である。これは、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域の各々でウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子機能を欠損することを意味する。例えば、上記のＥ１欠損又はＥ１／Ｅ３欠損Ａｄベクターは、Ｅ４領域の複製に必須な少なくとも１つの遺伝子機能を更に欠損し得る（Ｅ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターと表される）。全Ｅ４領域を欠失したアデノウイルスベクターは、より小さな宿主免疫応答を発揮し得る。
【００３２】
あるいは、Ａｄベクターは、Ｅ１領域の全部又は一部及びＥ２領域の全部又は一部で複製に必須な遺伝子機能を欠く（Ｅ１／Ｅ２欠損アデノウイルスベクターと表される）。Ｅ１領域の全部又は一部、Ｅ２領域の全部又は一部、及びＥ３領域の全部又は一部で複製に必須な遺伝子機能を欠くＡｄベクターも本明細書で意図される。Ａｄベクターが、Ｅ２Ａ領域の複製に必須な遺伝子機能を欠損するならば、好ましくは、ベクターは、Ｅ２Ａ領域の完全欠失を含まず、それは、長さで約２３０塩基対未満である。一般的に、アデノウイルスのＥ２Ａ領域は、ＤＮＡ複製に必要なポリペプチドであるＤＢＰ（ＤＮＡ結合蛋白質）をコードする。ＤＢＰは、ウイルス血清型に依存して４７３〜５２９個のアミノ酸からなる。ＤＢＰは、延びたＮｔドメインを有する球状Ｃｔからなる長形の楕円体として存在する非対称蛋白質であると考えられている。研究の示すところによると、Ｃｔドメインは、核酸と結合し、亜鉛と結合し、ＤＮＡ鎖伸長のレベルでＤＮＡ合成で機能するＤＢＰの能力を担う。しかし、Ｎｔドメインは、転写レベルと転写後レベルの両方で後期遺伝子発現で機能すると考えられ、該蛋白質の効率的な核局在を担い、また、それ自身の発現の増大に関与し得る。アミノ酸２〜３８の間のＮｔドメインでの欠失は、この領域がＤＢＰ機能に重要であることを示した（Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993)）。ＤＢＰのＣｔ領域をコードするＥ２Ａ領域での欠失は、ウイルス複製に影響を有しないが、ＤＢＰのＮｔドメインのアミノ酸２〜３８をコードするＥ２Ａ領域での欠失は、ウイルス複製を損なう。多重複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のこの部分を含むのが好ましい。特に、例えば、保持されるべきＥ２Ａ領域の所望部分は、Ｅ２Ａ領域の５’末端によって規定されるアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域のその部分、特に、血清型Ａｄ５のアデノウイルスゲノムのＥ２Ａ領域の位置Ad5 (23816) 〜 Ad5 (24032) である。
【００３３】
Ａｄベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域のみ、及びアデノウイルスゲノムの初期と後期領域の両方の、複製に必須な遺伝子機能を欠損し得る。アデノウイルスベクターはまた、アデノウイルスゲノム全体が本質的に除去されることもあり得る。その場合、少なくともウイルス（即ち、アデノウイルス）のインバーテッドターミナルリピート（Ａｄ ＩＴＲｓ）と１つ以上のプロモーター、又はＡｄ ＩＴＲｓとパッケージングシグナルは無傷のままであることが好ましい（即ち、アデノウイルスアンプリコン）。除去されるアデノウイルスゲノムの領域が大きい程、ゲノムに挿入できる外来核酸配列断片は大きくなる。例えば、アデノウイルスゲノムが３６ｋｂであることを考え、Ａｄ ＩＴＲｓと１つ以上のプロモーターを無傷のままにしておけば、アデノウイルスの外来挿入体の容量 (capacity) は約３５ｋｂである。あるいは、Ａｄ ＩＴＲとパッケージングシグナルのみを含む多重欠損Ａｄベクターは、約３７−３８ｋｂの外来核酸配列の挿入を効率的に可能とする。もちろん、任意又は全ての欠損アデノウイルス領域にスペーサーエレメントを含めることは、大きな挿入体のためのアデノウイルスベクターの容量を減少する。多重欠損Ａｄベクターを含む適切な複製欠損Ａｄベクターは、米国特許第5,851,806号、同第5,994,106号、並びに国際特許出願WO95/34671及びWO97/21826に開示されている。本発明で使用される特に好適なアデノウイルスベクターは、国際特許出願WO02/00906に記載されているものである。
【００３４】
Ａｄベクターの異なる領域の欠失は、Ａｄベクターに曝される哺乳動物の免疫応答を変更し得ることを理解すべきである。特に、異なる領域の欠失は、Ａｄベクターによって生じる炎症応答を減少し得る。更に、国際特許出願WO 98/40509に記載のように、野生型コート蛋白質に対する中和抗体によって認識されるＡｄベクターの能力又は無能力を減少するように、Ａｄベクターのコート蛋白質を改変できる。
【００３５】
多重複製欠損（特にＥ１とＥ４領域の複製に必須な遺伝子機能において）のアデノウイルスベクターは好ましくは、単一複製欠損Ａｄベクター（特に、Ｅ４領域での欠損を含むＡｄベクター）によって達成されるものと同様の相補細胞株でのウイルス増殖を可能とするスペーサーエレメントを含む。スペーサーエレメントは、Ａｄベクターがウイルス粒子に効率的にパッケージされるように、野生型アデノウイルスゲノムのサイズとほぼ同じにアデノウイルスゲノムのサイズを回復するための十分な長さの任意の配列として本発明では定義される。スペーサーエレメントは、所望の長さの任意の配列を含み得る。スペーサーエレメント配列は、コーディング又は非コーディングであり得、アデノウイルスゲノムに関し天然又は非天然であり得るが、複製に必須な機能を欠損領域に回復させない。スペーサーは任意の適切なサイズであり得、望ましくは少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５〜約１２，０００塩基対）、好ましくは約１００〜約１０，０００塩基対、より好ましくは約５００〜約８，０００塩基対、より一層好ましくは約１，５００〜約６，０００塩基対、最も好ましくは約２，０００〜約３，０００塩基対であり得る。スペーサーのサイズは、Ａｄベクターが収容する挿入体のサイズによってのみ限定される（例えば、約３８ｋｂ）。スペーサーの非存在下、多重複製欠損Ａｄベクターのファイバー (fiber) 蛋白質の産生及び/又はウイルス増殖は、単一複製欠損Ａｄベクターのそれと比較して減少する。しかし、欠損アデノウイルス領域の少なくとも１つ（好ましくはＥ４領域）にスペーサーを含めることにより、ファイバー蛋白質産生とウイルス増殖の減少に対抗し得る。Ａｄベクターでのスペーサーの使用は、米国特許第5,851,806号に記載されている。
【００３６】
Ａｄベクターは好ましくは、パッケージングドメインを含む。パッケージングドメインは、アデノウイルスゲノムがアデノウイルス粒子にパッケージングされる限り、アデノウイルスゲノムの任意の位置に配置され得る。好ましくは、パッケージングドメインは、Ｅ１領域の下流に位置する。より好ましくは、パッケージングドメインは、Ｅ４領域の下流に位置する。特に好適な実施態様では、複製欠損Ａｄベクターは、Ｅ１領域とＥ４領域の全部又は一部を欠く。この好適な実施態様では、スペーサーはＥ４領域に挿入され、目的とする所望の外来核酸配列（例えば、ＴＮＦ−αをコードする核酸配列）はＥ１領域に位置し、パッケージングドメインはＥ４の下流に位置する。パッケージングドメインを再配置することによって、Ａｄベクターと、Ａｄベクターを増殖させるために使用される細胞／ヘルパーウイルスゲノムとの間の潜在性重複の量が減少し、複製能のあるＡｄベクターを得る確率が減少する。
【００３７】
生じるアデノウイルス粒子の結合特異性を変更するように、Ａｄベクターのコート蛋白質は操作できる。コート蛋白質への適切な修飾としては、アデノウイルスファイバー、ペントン (penton)、ｐＩＸ、ｐＩＩＩａ、ｐＶＩ、又はヘキソン（hexon）蛋白質での挿入、欠失、又は置換、又はそれらの任意の適切な組合せ（このようなコート蛋白質の部分に対する種々の天然又は非天然リガンドの挿入を含む）が挙げられるがそれらに限定されない。結合特異性が改変されたＡｄベクターの例は、米国特許第5,871,727号、同第5,885,808号、同第5,922,315号に記載されている。好適に改変されたＡｄベクター粒子としては、例えば、Wickham et al., J. Virol., 71(10), 7663-9 (1997)、Cripe et al., Cancer Res., 61(7), 2953-60 (2001)、van Deutekom et al., J. Gene Med., 1(6), 393-9 (1999)、McDonald et al., J. Gene Med., 1(2), 103-10 (1999)、Staba et al., Cancer Gene Ther., 7(1), 13-9 (2000)、Wickham, Gene Ther., 7(2), 110-4 (2000)、Kibbe et al., Arch. Surg., 135(2), 191-7 (2000)、Harari et al., Gene Ther., 6(5), 801-7 (2000)、Bouri et al., Hum Gene Ther., 10(10), 1633-40 (1999)、Wickham et al., Nat. Biotechnol., 14(11), 1570-3 (1996)、Wickham et al., Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4), 149-51 (1997) 及び Wickham et al., Gene Ther., 2(10), 750-6 (1995), 並びに米国特許第5,559,099号；同第5,712,136号；同第5,731,190号；同第5,770,442号；同第5,801,030号；同第5,846,782号；同第5,962,311号；同第5,965,541号；同第6,057,155号；同第6,127,525号；同第6,153,435号；並びに国際特許出願WO96/07734、WO96/26281、WO97/20051、WO98/07865、WO98/07877、WO98/40509、WO98/54346、WO00/15823、WO01/58940に記載されたものが挙げられる。
【００３８】
複製欠損Ａｄベクターは、高力価のウイルスベクターストックを生成するために、複製欠損Ａｄベクターには存在しないが、ウイルス増殖には必要とされる遺伝子機能を適切なレベルで供給する相補細胞株で典型的には産生される。好適な細胞株は、複製欠損アデノウイルスには存在しない、複製に必須である少なくとも１つ及び好ましくは全ての遺伝子機能を補う。相補細胞株は、全てのアデノウイルス機能を含む、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連ＲＮＡ領域、又はそれらの組合せによってコードされる複製に必須である少なくとも１つの遺伝子機能での欠損を補う（例えば、Ａｄ ＩＴＲｓとパッケージングシグナルのみ、又はＡｄ ＩＴＲｓとアデノウイルスプロモーターのみなどの最小アデノウイルス配列を含むアデノウイルスアンプリコンの増殖を可能とする）。最も好ましくは、相補細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の複製に必須な少なくとも１つの遺伝子機能（例えば、２つ以上の複製に必須な遺伝子機能）での欠損、特にＥ１Ａ領域とＥ１Ｂ領域の各々の複製に必須な遺伝子機能での欠損を補う。更に、相補細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ２領域の複製に必須な少なくとも１つの遺伝子機能（特にアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ及び末端蛋白質）及び／又はＥ４領域の複製に必須な少なくとも１つの遺伝子機能での欠損を補う。望ましくは、Ｅ４領域での欠損を相補する細胞は、Ｅ４−ＯＲＦ６遺伝子配列を含み、Ｅ４−ＯＲＦ６蛋白質を産生する。このような細胞は望ましくは、少なくともＯＲＦ６を含み、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の他のＯＲＦは含まない。細胞株は、好ましくは、該細胞株がアデノウイルスベクターと非重複様式で相補遺伝子を含み、それにより、ベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組換えを起こす可能性を最小にし、そして実質的に排除するという点で更に特徴付けられる。従って、複製能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）の存在は、ベクターストックで避けられないとしても最小化され、従ってそれは、ある治療目的、特に遺伝子治療目的に適切である。ベクターストックでのＲＣＡの欠如によって、非相補細胞でのＡｄベクターの複製が避けられる。相補細胞株の構築は、Sambrook et al. (1989)（上記）及びAusubel et al. (1984)（上記）に記載のものなどの標準的分子生物学及び細胞培養技術を含む。アデノウイルスベクターの産生用の相補細胞株としては、293細胞（例えば、Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72 (1977) に記載）、PER.C6細胞（例えば、国際特許出願WO97/00326及び米国特許第5,994,128号、同第6,033,908号に記載）、及び293-ORF6細胞（例えば、国際特許出願WO95/34671及びBrough et al., J. Virol., 71, 9206-9213 (1997) に記載）が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３９】
本発明で使用される発現構築体の選択は、例えば、宿主、発現構築体の免疫原性、蛋白質産生の所望の持続時間、標的細胞などの種々の因子に依存する。発現構築体の各型は異なる性質を有するので、研究者は、任意の特定の状況に本発明を合わせる自由を有する。更に、所望ならば、２以上の型の発現構築体を使用できる。
【００４０】
本発明によれば、本発明の核酸分子は、発現に必要な制御配列、特にプロモーターに機能可能に連結している。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指向し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。プロモーターが、核酸配列の転写を指向することができるとき、核酸配列は、プロモーターと「機能可能に連結している」。プロモーターは、機能可能に連結している核酸配列に天然又は非天然であり得る。
【００４１】
任意のプロモーター（即ち、天然から単離されようと、又は組換えＤＮＡもしくは合成技術によって産生されようと）が、特定の核酸配列の転写を提供するために、本発明に関し使用できる。プロモーターは好ましくは、真核（望ましくは哺乳動物）細胞で転写を指向できる。プロモーターの機能は、ベクター上に存在する１つ以上のエンハンサー及び／又はサイレンサーの存在によって変更され得る。「エンハンサー」は、隣接遺伝子の転写を刺激又は阻害するＤＮＡのシス作用性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーは、「サイレンサー」とも言われる。エンハンサーは、エンハンサーがどちらの方向でも機能でき、数キロ塩基対（ｋｂ）までの距離にわたって、転写領域の下流位置からでさえ機能できるという点で、プロモーターにのみ存在する配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質のＤＮＡ結合部位（「プロモーターエレメント」とも言われる）とは異なる。
【００４２】
本発明は優先的に、ウイルスプロモーターを用いる。適切なウイルスプロモーターは当業界公知であり、例えば、ＣＭＶ即時初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＩＶロングターミナルリピートプロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター、ＲＳＶロングターミナルリピートなどのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｌａｐ２プロモーターもしくはヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., PNAS, 78, 144-145 (1981))などのＨＳＶプロモーター、ＳＶ４０又はエプスタイン・バー・ウイルス由来のプロモーター、ｐ５プロモーターなどのアデノ随伴ウイルスプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ウイルスプロモーターは、Ａｄ２もしくはＡｄ５主要後期プロモーター及び３分節 (tripartite) リーダーなどのアデノウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーター、又はＲＳＶプロモーターである。
【００４３】
上記プロモーターの多くは構成型プロモーターである。構成型プロモーターである代わりに、プロモーターは誘導型プロモーター、即ち、適当なシグナルに応答してアップ及び／又はダウンレギュレートされるプロモーターであり得る。適切な誘導性プロモーターシステムの例としては、ＩＬ−８プロモーター、メタロチオネイン誘導型プロモーターシステム、細菌ｌａｃＺＹＡ発現システム、テトラサイクリン発現システム、Ｔ７ポリメラーゼシステムが挙げられるがそれらに限定されない。更に、異なる発生段階で選択的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は、胚と成人で、グロビン関連プロモーターから差示的に転写される）を使用できる。核酸配列の発現を制御するプロモーター配列は、外来の薬剤による制御に応答する少なくとも１つの異種の制御配列を含み得る。制御配列は好ましくは、薬剤、ホルモン、又は他の遺伝子産物などが挙げられるがそれらに限定されない外来薬剤に応答性である。例えば、制御配列、例えば、プロモーターは好ましくは、グルココルチコイドレセプター−ホルモン複合体に応答性であり、次いで、それは、治療用ペプチド又はその治療用フラグメントの転写のレベルを高める。
【００４４】
各プロモーターは、時間と産生蛋白質量に関し異なるように、転写、従って、蛋白質発現を駆動することを当業者は理解する。例えば、ＣＭＶプロモーターは、形質導入後間もなく、即ち、形質導入後約２４時間で、ピーク活性を有し、次いで急速に低減するものとして特徴付けられる。一方、ＲＳＶプロモーター活性は徐々に増加し、形質導入後数日でピーク活性に到達し、数週間高レベルの活性を維持する。実際、ＲＳＶプロモーターによって駆動される持続性発現は、例えば、肝細胞、肺細胞、脾細胞、横隔膜細胞、骨格筋細胞、心筋細胞を含む研究した全ての細胞型で観察された。従って、プロモーターは、活性の特定のパターンを、目的とする核酸配列の所望のパターン及び発現レベルと適合させることによって、本発明での使用のために選択される。あるいは、複数のプロモーターの望ましい曲面を組合せるハイブリッドプロモーターを構築できる。例えば、ＣＭＶプロモーターの活性の最初の急増とＲＳＶプロモーターの活性の高レベル維持を組合せるＣＭＶ−ＲＳＶハイブリッドプロモーターは、本発明の多くの実施態様での使用に特に好適である。研究者によって操作できる発現プロフィールを有するプロモーターを選択することも可能である。
【００４５】
緑色蛍光蛋白質又はルシフェラーゼなどのマーカー蛋白質をコードする核酸配列も発現構築体に存在し得る。このようなマーカー蛋白質は、発現構築体の構築、並びに、生物に投与されるならば、発現構築体移動の決定に有用である。所望ならば、マーカー蛋白質はまた、治療の広い領域を提供するために、発現構築体組成物の注射の間隔を効率的にあけるための注射点の決定に使用できる。あるいは、選択因子（それはまた、ベクター構築プロトコルにも有用である）をコードする核酸配列は、発現構築体の一部であり得る。
【００４６】
陰性選択遺伝子を、上記発現構築体の任意のものに導入できる。好適な実施態様は、Ｅ２プロモーターに機能可能に連結したＨＳＶ  ｔｋ遺伝子カセット（Zjilstra et al., Nature, 342, 435 (1989); Mansour et al., Nature, 336, 348 (1988); Johnson et al., Science, 245, 1234 (1989): Adair et al., PNAS, 86, 4574 (1989); Capecchi, Science,244, 1288 (1989)）である。ｔｋ発現カセット（又は他の陰性選択発現カセット）は、例えば、Ｅ３遺伝子の実質的な欠失の代わりとしてアデノウイルスゲノムに挿入される。他の陰性選択遺伝子は当業者に明白である。
【００４７】
本発明の発現構築体に位置するプロモーター、核酸配列、選択マーカーなどに関し、このようなエレメントは、独立又は連結してカセットの一部として存在し得る。本発明の文脈では、「カセット」は、サブクローニング、ヌクレオチド配列の回収（例えば、１つ以上の制限部位）、又は特定の核酸配列の発現（例えば、ポリアデニル化部位又はスプライス部位）を容易にする機能を有する特定の塩基配列である。
【００４８】
発現に必要な制御配列に機能可能に連結した核酸配列の構築は、当業界の技術の範囲内に十分にある（例えば、 Sambrook et al. (1989), 上記参照）。本発明の核酸配列の発現に関し、異なる遺伝子シグナルとプロセシング事象は、例えば、転写、ｍＲＮＡ翻訳、転写後プロセシングなどの、細胞での核酸及び蛋白質／ペプチドのレベルを制御することを当業者は知っている。ＤＮＡのＲＮＡへの転写は、本明細書記載のように、機能的プロモーターを必要とする。
【００４９】
蛋白質発現は、ＤＮＡシグナル及びＤＮＡ鋳型のレベルによって制御されるＲＮＡ転写のレベルに依存する。同様に、ｍＲＮＡの翻訳は、まさに少なくとも、メッセージの５’末端の１０〜１００ヌクレオチド内に通常位置するＡＵＧ開始コドンを必要とする。ＡＵＧ開始コドンに隣接する配列は、真核リボソームによるその認識に影響を与えることが示され、完全なKozakコンセンサス配列への一致により、最適翻訳が生じる(例えば、Kozak, J. Mol. Biol., 196, 947-950 (1987)参照)。また、細胞での外来核酸の発現に成功するには、生じる蛋白質の翻訳後修飾を必要とし得る。従って、蛋白質の産生は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）がｍＲＮＡに転写される効率、ｍＲＮＡが蛋白質に翻訳される効率、及び翻訳後修飾を行う細胞の能力によって影響され得る。これらは、当業者が把握し、且つ所望の最終結果を達成するために、標準的手段を用いて操作できる全ての因子である。
【００５０】
これらの線に沿って、蛋白質産生を最適化するために、好ましくは、本発明の核酸分子は、核酸配列のコーディング領域後にポリアデニル化部位を更に含む。また、全ての適切な転写シグナル（及び、適切な場合には、翻訳シグナル）は、核酸配列が導入される細胞でそれが適切に発現されるように、好ましくは、正確に配置される。更に、核酸配列が、プロセスされるもしくは分泌される蛋白質であるか、又は細胞内で作用する蛋白質又はペプチドをコードするならば、好ましくは、核酸配列は、プロセシング、分泌、細胞内局在などの適切な配列を更に含む。
【００５１】
発現構築体は、本発明の複数の核酸分子を含み得ることが理解される。例えば、発現構築体は、本発明の核酸分子の複数のコピーを含み得、各コピーは、異なるプロモーター又は同一のプロモーターに機能可能に連結している。更に、本明細書記載の任意の核酸分子は、所望の効果の増加又は減少（例えば、治療効果の増加）のために、天然型から改変され得る。例えば、核酸分子の細胞質型は、コードされた遺伝子産物中にシグナルペプチドを組み込むことによって、分泌型に変換できる。
【００５２】
本発明は、本明細書記載の単離又は精製された核酸分子あるいは発現構築体を含む細胞（即ち、宿主細胞）を更に提供する。宿主細胞の例としては、原核又は真核宿主細胞が挙げられるがそれらに限定されない。原核細胞としては、E. coli, B. subtilis, P. aerugenosa, S. cerevisiae, N. crassa由来のものが挙げられる。好ましくは、宿主細胞は、ヒトなどの哺乳動物由来である。
【００５３】
本発明の核酸分子、又は好ましくは発現構築体は、組成物に処方され、組成物で哺乳動物に投与される。このような組成物は典型的には、担体と共に、本発明の核酸分子又は発現構築体を含有する。好ましくは、担体は、医薬として（例えば、生理的に）許容できる担体であり、本発明の状況において使用できる。このような担体は当該分野で周知である。担体の選択は、組成物を投与する特定の部位及びアデノウイルスベクター組成物を投与するのに使用される特定の方法によって部分的には決定される。
【００５４】
適切な組成物としては、水性溶液及び非水性溶液、等張性滅菌溶液（それらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図された受容者の血液もしくは眼内液と製剤を等張にする溶質を含有し得る）、並びに水性及び非水性滅菌懸濁剤（それらは、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤を含有し得る）が挙げられる。製剤は、アンプルやバイアルなどの単位投与量又は複数投与量の密封容器で用意でき、使用直前に、滅菌液体担体（例えば水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存できる。即時調製溶液や懸濁剤は、上記種類の滅菌粉末、顆粒、錠剤から調製できる。組成物を投与するとき、好ましくは、医薬として許容できる担体は緩衝化生理食塩水である。より好ましくは、本発明で使用される組成物は、投与前にダメージから核酸分子又は発現構築体を防御するように製剤化された組成物で投与される。例えば、組成物は、組成物を調製、保存又は投与するのに使用されるデバイス（例えば、ガラス器具、注射器、又は針）での核酸分子又は発現構築体の損失を減少するために製剤化できる。組成物は、発現構築体それ自体の光感受性及び／又は温度感受性を減少するように製剤化できる。この目的のために、組成物は好ましくは、例えば上記のものなどの医薬として許容できる液体担体、及びポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、及びそれらの組合せからなる群より選択される安定化剤（例えば、米国特許6,225,289号参照）を含む。このような組成物の使用は、組成物の保存期間を延ばし、投与を容易にし、核酸分子又は発現構築体の有効性を増大させる。この点に関し、組成物はまた、形質導入効率を増大するために製剤化し得る。
【００５５】
更に、本発明の組成物は、他の治療剤又は生物活性薬剤を含み得、又はそれらと共投与できる。「共投与」は、例えば、上記組成物の投与前に、同時に（例えば、同一の製剤又は別々の製剤での組成物との組合せ）、又は投与後に投与することを意味する。例えば、特定の病的状態の治療に有用な核酸配列、蛋白質、及び／又は他の薬剤は、本発明の組成物と共投与できる。適切な生物活性薬剤としては、例えば、イブプロフェンやステロイドなどの炎症を制御する因子が挙げられ、それは、組成物の投与と関連した膨潤や炎症を減少するために共投与できる。免疫抑制剤は、疾患又は本発明の方法の実施に関連した不適切な免疫応答を減少するために共投与できる。可溶性成長因子レセプター、成長因子アンタゴニスト（例えば、アンジオテンシン）などの抗血管形成因子など、並びに神経栄養性因子もまた共投与できる。同様に、ビタミンやミネラル、抗酸化剤、微量栄養素も共投与できる。抗生物質、例えば、殺微生物剤や殺真菌剤が、特定の病的状態と関連した感染のリスクを減少するために共投与できる。
【００５６】
本発明の核酸分子、及び好ましくは本発明の発現構築体は、病的状態の哺乳動物を予防的又は治療的に処置するのに有用であり得る。このような処置は、哺乳動物への本発明の組成物の投与を含む。好ましくは、このような処置は、哺乳動物への本発明の発現構築体（例えば、発現構築体組成物）の投与を含む。このような場合、発現構築体中に存在するか否かにかかわらず、核酸分子は治療因子をコードする。好ましくは、治療因子は、ＶＥＧＦなどの血管形成因子である。他の適切な治療因子は当業者に明白であり、治療因子としては、例えば、線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子３、線維芽細胞成長因子８、ＶＥＧＦ Ｂ、ＶＥＧＦ Ｄ、低酸素誘導性因子１α、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子が挙げられる。投与すると、本発明の核酸分子は発現され、治療因子の次なる産生が起きる。本発明の状況では、治療因子のこのような発現及び引き続く産生は、他のアイソ型と比べて遺伝子の１つのアイソ型の産生を可能とする。この選択的アイソ型産生は、病的状態の哺乳動物の予防的又は治療的処置のために有用である。本発明の１局面では、上記のように、スプライスドナー、ブランチポイント、及び／又はスプライスアクセプター領域を操作することによって、核酸分子は構築できる。例えば、図１に記載の核酸分子は、発現構築体に含めることができ、哺乳動物への投与により、ＶＥＧＦ１６５の代わりにＶＥＧＦ１８９の産生を促進できる。ＶＥＧＦ１８９によって提供される血管形成シグナルが、ＶＥＧＦ１６５によって提供されるものよりも強力であるか、又はＶＥＧＦ１８９の安全性がＶＥＧＦ１６５によって提供されるものよりも大きい場合、このような効果は望ましい。ＶＥＧＦ１８９の産生はまた、ＶＥＧＦ１６５産生の減少に加えて、又はその減少とは代替的に、ＶＥＧＦ１２１の産生の代わりであり得る。
【００５７】
「予防的」は、病的状態に対する全体的又は部分的な防御を意味する。「治療的」は、病的状態それ自体の全体的又は部分的な改善、及び／又は疾患の更なる進行に対する全体的又は部分的な防御を意味する。病的状態からの防御の任意の程度又は病的状態の改善の任意の程度は、患者に利点があることを当業者は理解する。
【００５８】
治療目的に使用するとき、本発明の核酸分子又は発現構築体は、ＣｓＣｌ勾配又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）などの種々の通常の精製方法を用いて、宿主細胞から精製できる。このような精製技術は当該分野で周知であり、しばしば実施される。
【００５９】
病的状態は任意の病的状態であり得る。例えば、病的状態は、特定の遺伝子産物のレベルの増加又は減少によって引き起こされる疾患であり得る。「レベルの増加」は、正常と考えられるレベルを超えたレベルを意味する。同様に、「レベルの減少」は、正常と考えられるレベル未満のレベルを意味する。多くの血管形成関連疾患は、ある遺伝子の特定のアイソ型のレベルの増加又は減少から起きる。従って、病的状態は好ましくは、血管形成関連疾患であり、核酸配列は好ましくは、新規血管の産生を促進する血管形成因子をコードする。
【００６０】
病的状態は、新規血管の成長から利益を受け取ることができる疾患の任意の型であり得る。例えば、病的状態は、アテローム性動脈硬化（例えば、冠動脈疾患）、末梢血管疾患及び広汎性動脈硬化、創傷治癒、組織修復、手術後再編、うっ血性心不全の全ての型であり得る。
【００６１】
他の病的状態もまた本発明の状況では意図される。例えば、病的状態は、炎症性疾患（例えば、関節炎）、神経変性疾患、特定のアイソ型のレベルの増加又は減少の存在に起因する器官の疾患、又は病的状態と関連した遺伝子の異なるアイソ型の調節がその病的状態を治療又は予防する任意の他の病的状態であり得る。
【００６２】
組成物を直接的に投与する侵襲的及び非侵襲的方法の両方の適切な方法が利用できる。２つ以上の経路が投与のために使用できるが、特定の経路は、別の経路よりもより迅速な、そしてより有効な反応を提供できる。本発明の方法は、所望の効果を達成するために、哺乳動物、好ましくはヒトへの組成物の投与様式に依存しない。従って、核酸分子が、本明細書記載のように、ＲＮＡスプライシングによりプロセシングされる限り、投与の任意の経路が適切である。組成物は適切に製剤化でき、局所注射、ローション、軟膏、インプラントなどの形態で投与できる。組成物は、例えば局所的に適用できる。組成物は、細胞を組成物に十分に曝すことを担保するために、複数適用及び／又は複数経路により投与できる。
【００６３】
核酸分子又は核酸分子を含む発現構築体は好ましくは、投与前に組成物に製剤化され、哺乳動物、特にヒトなどの動物が、特定の病的状態の危険性がある（予防的処置）又は病的状態を発症した（治療的処置）と決定された後できるだけ早く投与される。処置は、核酸配列から発現される特定の治療因子、投与経路、並びにもしあれば、病的状態の原因と程度に部分的に依存する。
【００６４】
組成物は、例えば、標的組織への局所注射（例えば、筋肉内注射）などの侵襲的方法を用いて投与できる。局所注射は典型的には、遺伝子導入が実質的に標的器官もしくは組織の細胞へのみ起こるように、器官もしくは組織に供給する動脈の基部に十分に深く挿入されたカテーテルもしくは同様のデバイスによる組成物の投与を含む。注射用組成物のための医薬として許容できる担体は当業者に周知である (Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), 及び ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986) 参照)。
【００６５】
組成物は、哺乳動物に非侵襲的に投与できる。例えば、複数の手術が行われたならば、哺乳動物は麻酔薬に低耐性を示し、又は他の疾患が存在するならば、組成物の局所投与が最適であり得る。局所用製剤は当業者に周知である。組成物はまた、Bioject, Inc.から入手できるBiojector 2000 Needle-Free Injection Management System（登録商標）などの針無し注射デバイスを用いて、非侵襲的に投与できる。
【００６６】
組成物は好ましくは、生体適合性ポリマーマトリックス、網（meshwork）、機械的リザーバー、又は機械的インプラントなどの制御性放出又は持続性放出を可能とするデバイス中又は上に存在する。移植用デバイスなどのインプラント（例えば、米国特許第5,443,505号、同第4,853,224号、同第4,997,652号参照）及びデバイス（例えば、米国特許第5,554,187号、同第4,863,457号、同第5,098,443号、同第5,725,493号参照）、例えばポリマー組成物からなる機械的リザーバーもしくはインプラントもしくはデバイスは、組成物の投与に特に有用である。組成物はまた、例えば、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴ）などのポリホスホエーテル、又はポリ乳酸−グリコール酸を含む持続性放出組成物（例えば、米国特許第5,378,475号参照）の形態で投与できる。
【００６７】
組成物を投与するとき、宿主の免疫系に起因する核酸分子又は発現構築体の損失又は不活化を最小とするように、適切な投与量と投与経路を選択できる。例えば、インビボ投与に関し、本発明の方法を行う前に、治療する哺乳動物に、免疫抑制剤（例えば、シクロホスファミド又はＦＫ５０６）又はＴ細胞レセプターをブロックできるモノクローナル抗体を投与することは利点があり得る。免疫抑制剤又はモノクローナル抗体の前投与は、哺乳動物の免疫系によって排除される組成物の量を減少するのに役立ち得る。
【００６８】
インビボで実施されるとき、任意の適切な器官もしくは組織もしくは成分細胞が送達の標的となり得る。好ましくは、使用される器官／組織／細胞は、循環器系（即ち、心臓、血管又は血液）、呼吸器系（即ち、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺）、胃腸器系（即ち、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢）、泌尿器系（即ち、腎臓、尿管、膀胱、尿道）、神経系（即ち、脳、脊髄、及び眼などの特別の感覚器官）、及び外皮系（即ち、皮膚）である。より一層好ましくは、標的細胞は、心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、膀胱及び眼細胞からなる群より選択される。
【００６９】
本発明により哺乳動物、特にヒトに投与される組成物の投与量は、病的状態の哺乳動物を予防的又は治療的に処置するのに十分な量であるべきである。投与量は、年齢、種別、問題の病理、状態もしくは疾患状態を含む種々の因子に依存する。投与量はまた、発現構築体に含まれる核酸配列、並びに疾患によって冒されるであろう、もしくは実際に冒された組織の量に依存する。投与量のサイズはまた、投与の経路、タイミング、頻度、並びに特定の組成物の投与に伴い得る有害な副作用の存在、性質、程度及び所望の生理効果によって決定される。種々の状態もしくは疾患状態、特に慢性状態もしくは疾患状態は、複数投与を含む長期間の処置を必要とし得ることが当業者に理解される。
【００７０】
適切な投与量及び投与計画は、当業者に公知の従来見出される範囲の技術によって決定できる。ウイルスベクターなどの発現構築体を投与するとき、好ましくは、約１０６〜約１０１２ウイルス粒子が、疾患組織に送達される。換言すれば、約１０６〜約１０１２粒子／ｍｌ（約１０６〜約１０１２粒子／ｍｌの範囲内の全ての整数を含む）、好ましくは、約１０１０〜約１０１２粒子／ｍｌの発現構築体濃度を含む発現構築体組成物を投与できる。典型的には、約０．１〜約１００μｌのこのような発現構築体組成物が各々の冒された組織に投与できる。もちろん、投与の他の経路は、治療効果を達成するために、より小さな又はより大きな投与量を必要とし得る。投与量と投与経路における任意の必要なバリエーションは、当業界公知の慣用技術を用いて、当業者により決定できる。
【００７１】
幾つかの実施態様では、２以上（即ち、複数）の投与量の組成物の投与が利点がある。本発明は、十分な組み込みを達成するために、組成物の複数適用を提供し、それによって、特定の疾患状態を予防的又は治療的に処置する。例えば、組成物の少なくとも２回の適用が、同一組織に投与できる。好ましくは、標的細胞は、約３０日以内、またはそれ以上にわたる所望の組織への直接的投与により、２回以上の適用の組成物と接触される。より好ましくは、２回以上の適用は、約９０日以内、またはそれ以上にわたり同一組織の細胞に投与される。所望の予防的又は治療的効果が達成される限り、３回、４回、５回、６回以上の投与量が、任意の時間枠（例えば、投与間が２、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８５日以上）で投与できる。
【００７２】
組成物は、哺乳動物、特にヒトから予め取り出され、組成物に曝された細胞にエキソビボで導入できるが、これはあまり好ましくない。哺乳動物（例えば、ヒト）に再導入されたこのような形質導入された自己又は同種宿主細胞は、ＤＮＡ複製の開始後、インビボでそれに含まれる核酸配列を直接的に発現する。１つのエキソビボ治療オプションは、生体適合性カプセル中への感染細胞のカプセル化を含み、それを、特定の組織に移植できる。このような細胞は、患者から単離される必要はなく、その代わりに、別の個体から単離し、患者に移植できる。
【００７３】
本発明の組成物の投与は望ましくは、別のアイソ型の代わりに特定の遺伝子の１つのアイソ型の産生を促進する。次いで、産生レベルのこのような変化は、上記のように病的状態の処置を担う。この点に関し、本発明はまた、特定遺伝子の所望のアイソ型が病的状態のマーカーである、哺乳動物での病的状態の治療の有効性の評価方法を提供する。このような方法は、哺乳動物から得られた試験サンプル中のアイソ型のレベル（試験サンプル中の該アイソ型のレベルが、哺乳動物での癌の処置の有効性の指標となる）を測定することを含む。試験サンプル中のアイソ型のレベルは、試験サンプル中のアイソ型のレベルを、哺乳動物から得られた別の試験サンプル中のアイソ型のレベルと経時的に比較することによって測定できる。アイソ型がどの遺伝子から産生されるか、及びどの病的状態が評価されるかに依存して、サンプル毎のアイソ型のレベルの増加、減少又は未変化が、処置が有効であるか無効であるかの指標となる。特定のアイソ型の適切なレベルを決定すること、及びアイソ型のレベルの増加、減少又は未変化が検出され、特定の病的状態に対する処置の有効性の指標となるかどうかは、当業者に明白であり、一般的に、アイソ型が由来する遺伝子及びそれが関連する病的状態に依存する。例えば、ＶＥＧＦ１８９、又はＶＥＧＦ１６５及び／又はＶＥＧＦ１２１のレベルが経時的に測定できる。ＶＥＧＦ１８９のレベルの増加、又はＶＥＧＦ１６５及び／又はＶＥＧＦ１２１のレベルの減少は、本発明の核酸分子又は発現構築体による治療が有効であることの指標となる。あるいは、ＶＥＧＦ１８９のレベルの減少、又はＶＥＧＦ１６５及び／又はＶＥＧＦ１２１のレベルの増加は、治療が無効であることの指標となる。
【００７４】
本明細書で使用するとき、用語「レベルの減少」は、正常と考えられるレベル未満のレベルにおいて、哺乳動物から得られた試験サンプル中の所望のアイソ型を検出することとして定義できる。例えば、アイソ型をコードするｍＲＮＡ又はアイソ型をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が、正常と考えられるレベル未満で検出されるとき、試験サンプル中のアイソ型のレベルは減少している。逆に、用語「レベルの増加」は、正常と考えられるレベルよりも上のレベルにおいて、哺乳動物から得られた試験サンプル中の所望のアイソ型を検出することととして定義できる。例えば、アイソ型をコードするｍＲＮＡ又はアイソ型をコードするアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が、正常と考えられるレベルよりも上のレベルで検出されるとき、試験サンプル中のアイソ型のレベルは増加している。「正常レベル」は、同一種の病的状態ではない哺乳動物から確立され、当業界で一般的に受け入れられ、且つ認識されている、アイソ型の既に決定されている範囲に関連する。
【００７５】
本発明に関連して使用される試験サンプルは、当業界で典型的に使用されるものの任意のものであり得、哺乳動物の状態（例えば、病的状態が哺乳動物で発症したかどうか）に依存して異なる。例えば、試験サンプルは、体細胞を含む組織であり得る。しかし、好ましくは、試験サンプルは、血液又は血清サンプルなどの、哺乳動物に関し最小の侵襲的様式で得ることができるものである。
【００７６】
以下の実施例は、本発明を説明するのに役立つが、その範囲を制限することは決して意図されない。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
本実施例は、本発明の核酸分子の構築を示す。
【００７８】
ヒトＶＥＧＦ遺伝子は、エキソン６、７、８（イントロン５、６、７を含む）のゲノム形状に連結したエキソン１−５のｃＤＮＡを用いてハイブリッドとして再構築した。エキソン５を、ＳａｃＩ制限部位を含むように変異させ、エキソン６を、ＸｂａＩ制限部位を含むように変異させ、エキソン７を、ＸｈｏＩ制限部位を含むように変異させた。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、エキソン８の停止コドン直後に作出した。イントロンのクローニングと配列決定により、これらのイントロンのスプライシングシグナルの同定が可能となった。
【００７９】
ＶＥＧＦの１８９アミノ酸のアイソ型は、１６５アミノ酸型から除かれたエキソン６によってコードされるアミノ酸を含む。従って、ＶＥＧＦ１６５の代わりにＶＥＧＦ１８９の産生を増加するために、エキソン６のスプライスアクセプター、ブランチポイント、スプライスドナー部位の各々で変異を作製した。部位特異的変異誘発によって適当な変異を作製することによって、エキソン６の認識効率は増大した。
【００８０】
これらの変異を以下の表に示す。スプライスアクセプター配列中の「／」は、スプライスアクセプター配列の末端とエキソン６の開始点を示す。同様に、スプライスドナー配列中の「／」は、エキソン６の末端とスプライスドナー配列の開始点を示す。変異は太字で示す。
【００８１】
【表１】
2005530495.tif 000002
【００８２】
本発明の核酸分子を使用して、ＶＥＧＦ１６５の代わりにＶＥＧＦ１８９の量を増加させることができる。
（実施例２）
本実施例は、本発明の核酸分子の構築を示す。
【００８３】
ヒトＶＥＧＦ遺伝子は、エキソン６、７、８（イントロン５、６、７を含む）のゲノム形状に連結したエキソン１−５のｃＤＮＡを用いるハイブリッドとして再構築した。エキソン５を、ＳａｃＩ制限部位を含むように変異させ、エキソン６を、ＸｂａＩ制限部位を含むように変異させ、エキソン７を、ＸｈｏＩ制限部位を含むように変異させた。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を、エキソン８の停止コドン直後に作出した。イントロンのクローニングと配列決定により、これらのイントロンのスプライシングシグナルの同定が可能となった。
【００８４】
エキソン６Ａのスプライスアクセプター、ブランチポイント、スプライスドナーの各々に変異を作製し、２種の核酸配列を産生した。２種の核酸配列は、発現されたとき、野生型ヒトＶＥＧＦ遺伝子中のスプライシングシグナルと比較して、ＶＥＧＦ１２１の代わりにＶＥＧＦ１８９の産生を促進する。
【００８５】
【表２】
2005530495.tif 000003
【００８６】
ＶＥＧＦ-ＡＬＬ核酸は、オールターナティブスプライシングによってＶＥＧＦの全てのアイソ型の産生を促進する天然スプライシングシグナルを含むＶＥＧＦ ｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡハイブリッドを含む。ＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋核酸配列は、エキソン６Ａを含むメッセンジャーＲＮＡを促進するスプライシングシグナルを含む。ＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋核酸配列は、ウエスタンブロットによって測定したところ、ＶＥＧＦ-ＡＬＬ核酸配列と比較して、より多くの量のＶＥＧＦ１８９及び減少した量のＶＥＧＦ１２１を産生した。
【００８７】
ＶＥＧＦ-ＡＬＬ核酸配列とＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋核酸配列の産物の活性を試験した。Ｃ５８Ｂｌ／６マウスの大腿動脈を縛り、後肢に虚血を誘導した（例えば、米国特許第6,518,255号参照）。アデノウイルスゲノムのＥ１とＥ３領域での欠失を含み、ＶＥＧＦ-ＡＬＬ核酸配列（ＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬ）又はＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋核酸配列（ＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋）を含む複製欠損アデノウイルスベクターの投与量（１×１０５粒子ユニット（ｐｕ））を後肢に注射した。後肢の血流回復を、アデノウイルスベクターの投与後、３、７、１４、２１、２８日にDopplerフローメーターで定量した。ＶＥＧＦ-ＡＬＬ核酸配列とＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋核酸配列は、等価でないにしろ、各時点で同様の血流回復を媒介した。
【００８８】
ＶＥＧＦアイソ型の発現は、浮腫と宿主の死亡を引き起こすことができる。従って、各々のＶＥＧＦをコードする核酸配列の安全性パラメーターを研究した。Ｃ５８Ｂｌ／６マウスに、５×１０１０ｐｕのＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬ又はＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋を気管内に投与した。５日後、マウスを屠殺し、肺の浮腫を、肺組織の湿重量／乾重量の比によって測定して評価した。肺浮腫のレベルの増加が、ＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋核酸配列を投与したマウスと比べて、ＶＥＧＦ-ＡＬＬ核酸配列を投与したマウスで観察された。
【００８９】
ＶＥＧＦ-ＡＬＬ核酸配列とＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋核酸配列を投与したマウスの全体の生存も測定した。Ｃ５８Ｂｌ／６マウスに、５×１０１０ｐｕのＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬ、ＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋、又は導入遺伝子を欠くＥ１，Ｅ３欠損アデノウイルスベクター（ＡｄＮｕｌｌ）を静脈内に投与した。アデノウイルスベクターの投与後１０日にわたって、マウスの生存率を測定した。ＡｄＮｕｌｌを投与した全てのマウスは、投与後１０日間生存した。ＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬを投与したマウスの生存率は、３日で１００％から２０％に減少した。４日にマウスの全ては死亡した。ＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋を投与したマウスは、ＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬを投与したマウスよりかなり長く生存した。ＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋を投与したマウスの生存率は、６日で１００％から８０％に減少した。８日までにマウスの２０％が生存した。ＡｄＶＥＧＦ-ＡＬＬ６Ａ＋を投与したマウスはどれも、９日を超えて生存しなかった。
【００９０】
本実施例は、ＶＥＧＦ核酸配列の操作により、遺伝子産物の活性を保持し、且つＶＥＧＦ産生が原因となる所望されない特徴を最小にしつつ、ＶＥＧＦ１２１の代わりにＶＥＧＦ１８９の産生を増加できることを実証する。
【００９１】
本明細書で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が引用により含まれるように個々に、及び具体的に示され、本明細書にその全体が記載されているかのような程度まで、引用により本明細書に含まれるものである。
【００９２】
本発明の説明の文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本明細書で異なるように記載されるか、文脈によって明確に否定されなければ、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。用語「含む (comprising)」、「有する (having)」、「含む (including)」及び「含む (containing)」は、異なるように記載されていなければ、許容範囲が制約のない用語（即ち、「・・を含むが、・・に限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の記載は、本明細書で異なるように記載されていなければ、その範囲内の各々の分離した値へ個々に言及することの略記方法として役立つことが単に意図され、各々の分離した値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に含まれるものである。本明細書で記載される方法の全ては、本明細書で異なるように記載されるか、文脈によって明確に否定されなければ、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供される任意及び全ての例、又は例示的言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、異なるように特許請求の範囲に記されていなければ、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして特許請求の範囲にない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００９３】
本発明を実施するのに本発明者らが把握する最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様が本明細書で記載される。勿論、上記説明を読むと、それらの好適な実施態様のバリエーションが当業者に明白となり得る。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予期し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは異なるように実施されることを意図する。それ故、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載の主題の全ての改変及び均等物を含むものである。更に、本明細書中に異なるように記載されていないか、文脈によって異なるように明瞭に否定されていなければ、その全ての可能なバリエーション中の上記要素の任意の組合せも本発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ＶＥＧＦ１６５の代わりにＶＥＧＦ１８９の産生を促進する、ＶＥＧＦのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むヌクレオチド配列を示す［配列番号１］。
【図２】図２は、図１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる蛋白質に対応するアミノ酸配列を示す［配列番号２］。
【図３】図３は、ＶＥＧＦをコードするヌクレオチド配列のスプライスドナー、ブランチポイント、スプライスアクセプター部位のコンセンサスヌクレオチド配列を示す［配列番号３〜５］。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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