(57)【要約】オリゴヌクレオチド媒介性核酸配列を改変するための改良された方法、組成物およびキットが示される。オリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変効率を高める方法は、細胞性修復蛋白の存在のもとで、標的核酸を配列改変ターゲティングオリゴヌクレオチドと組み合わせ、前記組み合わせたものにラムダベータ蛋白を追加的に加えるか、または最初に前記細胞性修復蛋白を有する細胞をＨＤＡＣインヒビターまたはヒドロキシウレアと接触させる工程を含む。標的核酸と配列改変オリゴヌクレオチド類とはｅｘ  ｖｉｖｏ（生体外）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）で組合わせることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド媒介性標的核酸配列改変法であって、
標的核酸を細胞修復蛋白の存在のもとで配列改変ターゲティング・オリゴヌクレオチドと組み合わせる工程；および
ラムダベータ蛋白を追加的に前記組み合わせに加えるか、または前記細胞修復蛋白を含む細胞とＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアとをまず接触させる工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞修復蛋白が精製されている請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞修復蛋白が無細胞蛋白抽出物中に存在する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記細胞修復蛋白が完全無傷細胞内に存在する請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で培養される請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が生きている生物内に存在する請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記細胞修復蛋白が原核細胞および真核細胞からなる群から選択される細胞である請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が原核細胞である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記原核細胞が細菌細胞である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌細胞が大腸菌細胞である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が真核細胞である請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記真核細胞が酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞またはヒト細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記真核細胞が酵母細胞である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記真核細胞が植物細胞である請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記真核細胞がヒト細胞である請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒト細胞が肝細胞、肺細胞、結腸細胞、子宮頸部細胞、腎細胞、上皮細胞、癌細胞、幹細胞、造血幹細胞、造血系前駆細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がマウス、ハムスター、ラットおよびサルからなる群から選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドの配列が、前記オリゴヌクレオチドの配列と標的核酸第一ストランド上のその相補体との間の１つ以上のミスマッチを除いて、前記核酸標的の第一ストランドの配列に完全に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドが少なくも１つの末端修飾を有する請求項１ないし１９のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくも１つの末端修飾が、少なくも１つの固定核酸（ＬＮＡ）、少なくも１つの末端２’−Ｏ−Ｍｅ塩基類似体、および少なくも１つの末端ホスホロチオエート結合からなる群より選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが１７−１２１ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、少なくも８個の隣接デオキシリボヌクレオチドの内部非重複ドメインを有し、前記１つ以上のミスマッチが専ら前記オリゴヌクレオチドＤＮＡドメインおよび、前記オリゴヌクレオチドの５’および３’末端からの少なくも８個のヌクレオチドに位置する請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドが少なくも１つの末端固定核酸（ＬＮＡ）を有する請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドが少なくも２５ヌクレオチド長である請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドが７４以下のヌクレオチド長である請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが１２１以下のヌクレオチド長である請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記標的核酸がＤＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記二本鎖ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記ゲノムＤＮＡが染色体にある請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記染色体が人工染色体である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ゲノムＤＮＡがエピソームである請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
前記標的核酸が二本鎖ゲノムＤＮＡの非転写ストランドである請求項１記載の方法。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチド媒介性標的核酸配列の改変を高めるための組成物であって：
細胞性修復蛋白の存在のもとで実質的に相補的な標的核酸と組み合わせると、標的配列の改変を起こすことができるオリゴヌクレオチドと：
ＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアと予備接触させた細胞から誘導される細胞性修復蛋白、またはラムダベータ蛋白のいずれか、
を含んでなる前記組成物。
【請求項３５】
前記細胞性修復蛋白が精製されている請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
前記細胞性修復蛋白が無細胞蛋白抽出物中に存在する請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞性修復蛋白が無傷細胞内に存在する請求項３４記載の組成物。
【請求項３８】
前記細胞が原核細胞および真核細胞からなる群から選択される請求項３４ないし請求項３７のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記細胞が原核細胞である請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
前記原核細胞が細菌細胞である請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
前記細菌細胞が大腸菌細胞である請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
前記細胞が真核細胞である請求項３８記載の組成物。
【請求項４３】
前記真核細胞が酵母細胞、植物細胞、ヒト細胞または哺乳動物細胞である請求項４２記載の組成物。
【請求項４４】
前記真核細胞が酵母細胞である請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
前記真核細胞が植物細胞である請求項４３記載の組成物。
【請求項４７】
前記真核細胞がヒト細胞である請求項４３記載の組成物。
【請求項４８】
前記ヒト細胞が肝細胞、肺細胞、結腸細胞、子宮頸部細胞、腎細胞、上皮細胞、癌細胞、幹細胞、造血幹細胞、造血系前駆細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択される請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である請求項４３記載の組成物。
【請求項５０】
前記哺乳動物がマウス、ハムスター、ラットおよびサルからなる群から選択される請求項４９記載の組成物。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチドが少なくも１つの末端修飾を有する請求項３４ないし請求項５０のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記少なくも１つの末端修飾が、少なくも１つの末端固定核酸（ＬＮＡ）、少なくも１つの末端２’−Ｏ−Ｍｅ塩基類似体、および少なくも１つの末端ホスホロチオエート結合からなる群から選択される請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
前記オリゴヌクレオチドが少なくも１つの固定核酸（ＬＮＡ）を有する請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
前記オリゴヌクレオチドが１７−１２１ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、少なくも８個の隣接デオキシリボヌクレオチドの内部非重複ドメインを有する請求項３４ないし請求項５３のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドが少なくも２５ヌクレオチド長である請求項３４ないし請求項５４のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドが１２１以下のヌクレオチド長である請求項３４ないし請求項５５のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記オリゴヌクレオチドが７４以下のヌクレオチド長である請求項３４ないし請求項５６のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項５８】
さらにトリコスタチンＡ、蛋白抽出物、またはヒドロキシウレアを含む請求項３４ないし請求項５７のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項５９】
オリゴヌクレオチドと；
トリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白またはヒドロキシウレアと
を含むキット。
【請求項６０】
オリゴヌクレオチドと；
細胞性修復蛋白であって、ＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアと予備接触させた細胞から誘導される前記細胞蛋白と
を含むキット。
【請求項６１】
オリゴヌクレオチドと；
細胞性修復蛋白と；
ラムダベータ蛋白と
を含むキット。
【請求項６２】
ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群からの少なくも１つの蛋白と；
トリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白、またはヒドロキシウレア
を含むキット。
【請求項６３】
さらに、核酸配列改変活性を有するオリゴヌクレオチドを含む請求項６２記載のキット。
【請求項６４】
鋳型非依存性一本鎖ポリメラーゼと；
５’−トリホスフェート類を有するＬＮＡモノマー類と；
トリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白またはヒドロキシウレアと
を含むキット。
【請求項６５】
前記ポリメラーゼが子ウシ胸腺末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼである請求項６４記載のキット。
【請求項６６】
水溶性カルボジイミド組成物と；
イミダゾール組成物と；
求核基を有するＬＮＡモノマー類と；
トリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白、またはヒドロキシウレアと
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２００２年３月７日出願の米国仮特許出願第６０／３６３，３４１；２００２年３月７日出願の米国仮特許出願第６０／３６３，０５３号；２００２年３月７日出願の米国仮特許出願第６０／３６３，０５４号および２００２年１０月７日出願の米国仮特許出願第６０／４１６，９８３号からの優先権を主張する。これらの開示は参考としてその全体を本明細書に援用する。
発明分野
本発明は遺伝情報のオリゴヌクレオチド関連性修復または改変、およびこのような改変の効率を高めるための方法、組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ＤＮＡの標的配列改変に使用するための多数の異なるタイプのオリゴヌクレオチド（合理的に短いポリヌクレオチ類）が記載されている；例えば（ｉ）二本鎖、二重ヘアピン  コンフォメーションに折り畳まれた内部二重キメラＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド類、（ｉｉ）修復ドメインに繋がるトリプレックス形成ドメインを含む二官能価オリゴヌクレオチド類、および（ｉｉｉ）内部非重複ＤＮＡ修復ドメインを有し、ヘアピンもトリプレックス形成ドメインも欠ける化学的に修飾された一本鎖オリゴヌクレオチド類など。これら種々のオリゴヌクレオチドは、単一塩基対の標的化改変を起こし、並びに細菌、真菌、植物および動物などの種々の宿主生物からの細胞および非細胞抽出物においてフレームシフト変化をもたらすことが知られている。
【０００３】
増殖期、発育段階、細胞周期の位置などの要因の影響、および細胞または無細胞抽出物におけるオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変に与える特定の細胞性蛋白の関与は十分には理解されていない。幾つかの細胞性経路および遺伝子群が、照射または化学突然変異（蛋白類のＲＡＤ５２エピスタシス群、蛋白のミスマッチ修復群および蛋白のヌクレオチド切除修復群など）に起因するＤＮＡ損傷のｉｎ  ｖｉｖｏ修復の仲介に関係していることは公知であるとはいえ、そして相同組換えおよびゲノム一体性維持におけるこれら蛋白の役割は広く研究されているとはいえ（ヘイヤー（Ｈｅｙｅｒ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ  ５０巻（３号）、２２３−２３３ページ（１９９４）；タッカー（Ｔｈａｃｋｅｒ）、トレンド・オブ・ゲネティックス（Ｔｒｅｎｄ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１５巻（５号）、１６６−１６８ページ（１９９９）；ペイク（Ｐａｑｕｅｓ）＆ハーバー（Ｈａｂｅｒ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．  ６３巻（２号）、３４９−４０４ページ（１９９９）；およびトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）＆シルド（Ｓｃｈｉｌｄ）、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．  ４７７巻、１３１−１５３ページ（２００１））、オリゴヌクレオチドｄｉｒｅｃｔｅｄ核酸配列改変におけるこれら蛋白および関連蛋白の特殊な機能は十分には理解されていない。
【０００４】
ヒストン  デアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）のインヒビター類は培養腫瘍細胞において、成長停止、分化および／またはアポトーシスを誘発する。マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．  ９２巻（１５号）、１２１０−１２１６ページ（２０００）。例えば、ストレプトマイセス属の抗生物質であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）による処理は部分精製ＨＤＡＣの酵素活性を阻止し、種々の細胞型においてアセチル化ヒストンの蓄積を起こし、非常に低濃度で、Ｇ１およびＧ２相の正常ラット線維芽細胞において、フレンド細胞分化の誘発および細胞周期の特異的阻害を起こし得る。ヨシダら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １６５巻、１７１７４−１７１７９（１９９０）。
【０００５】
ＨＤＡＣインヒビターは遺伝子治療薬に影響を与えることも示唆されている。ＷＯ／００／２３５６７は、幹細胞集団、特に造血幹細胞集団を有効量のＨＤＡＣインヒビター、特にトリコスタチンＡ、トラポキシンまたはクラマイドシンにさらすことを含む、幹細胞自己再生（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）促進法を開示している。一実施形態において、レシピエントＤＮＡの起源に相同であるかまたは非相同である少なくも一つの導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を、レトロウィルス媒介性トランスファーによって、ＨＤＡＣインヒビター処理細胞内に挿入する。また別の実施形態において、ポリヌクレオチドと、ＨＤＡＣインヒビター処理とを用いて幹細胞を遺伝的に変化させる。
【０００６】
ＷＯ００／５１４２４は、遺伝子改変動物をつくるために、核ドナーとして使用する培養非胚性幹細胞における相同組換え法を開示している。この方法により、染色体の挿入遺伝子座のフランキング領域に１．８〜１２ｋｂの相同性を含む５’および３’領域を用いて、例えばマーカー遺伝子および導入遺伝子などの遺伝子を異なる遺伝子座に挿入した。ヒストンデアセチル化を阻止する作用物質、またはそれ以外に標的遺伝子座の転写を刺激する因子はこの相同組換え過程を高めることが示唆されている。
【０００７】
ＷＯ００／２４９１７は、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）に基づくベクターなどのパルボウィルスベクターを使用し、予備選択された部位における相同ペアリングにより、脊椎動物の細胞性ＤＮＡを修飾することを開示している。この方法のベクター類（その全ては少なくも２．７ｋｂ長である）は標的遺伝子座と実質的に同一のＤＮＡ配列、および少なくも１個のパルボウィルス逆末端反復（ＩＴＲ）配列または同等物の全部または一部を含む。標的細胞を処理するために開示された作用物質のなかには、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、例えば酪酸ナトリウムおよびトリコスタチンＡなどがある。
【０００８】
しかしＨＤＡＣインヒビターがオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の効率を高めることは示唆されていないし、開示されてもいない。
【０００９】
ラムダ溶菌サイクル中の大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｂａｃｔｅｒｉａ）におけるバクテリオファージラムダによる組換えは、２つの遺伝子を含むいわゆる“レッド（Ｒｅｄ）”組換え経路によって仲介される。Ｒｅｄαはエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏ）をコードする；このエキソヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡの破壊された末端部に結合してそれら鎖の一つを５’から３’方向に分解し、３’一本鎖オーバーハングを残す。Ｒｅｄβは一本鎖ＤＮＡ結合蛋白（ｂｅｔ）をコードする；この蛋白（ｂｅｔ）は細菌性ＲｅｃＡ蛋白と一緒になって、露出した３’末端に相補的な配列を含む部位で二重ＤＮＡを溶解し、一本鎖オーバーハングのストランド・インバージョンとアニーリングとを促進して相補的二本鎖にする。レッド組換えは、細菌性ＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼ（露出末端を有する二本鎖ＤＮＡを分解する酵素）を阻害する“Ｇａｍ”と呼ばれるラムダ蛋白によって容易になる。
【００１０】
種々の参考文献の記載によると、大腸菌におけるノンλファージ由来の線状二本鎖ＤＮＡの相同組換えを仲介しまたは容易にするためにＲｅｄ組換え系が使用される。マーフィー（Ｋ．Ｃ．Ｍｕｒｐｈｙ）、“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける遺伝子置換を促進するためにバクテリオファージλ組換え機能の使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  λ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｕｒｏｍｏｔｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）”Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０巻（８号）：２０６３−２０７１ページ（１９９８年、４月）；ユー（Ｙｕ）ら、“エシェリキア・コリにおける染色体工学のための効率的組換えシステム（Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７巻（１１号）：５９７８−５９８３ページ（２０００）；エリス（Ｅｌｌｉｓ）ら、“一本鎖オリゴヌクレオチドを用いる染色体ＤＮＡの高効率突然変異、修復およびエンジニアリング（Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻（１２号）：６７４２−６７４６ページ（２００１）。
【００１１】
ＷＯ０２／１４４９５は抑制可能（ｄｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）プロモータの制御下で、β蛋白をコードするＤＮＡを有する細胞中でＤＮＡ分子をクローン化し、真核生物遺伝子を改変する方法を開示している。誘発されたβ蛋白は細胞中の核酸類（この核酸類は染色体内核酸でも染色体外核酸でもよい）間の相同組換えを促進する。この特許公報は一本鎖ＤＮＡ分子を使用し、相同組換えを受け得る細胞ＤＮＡおよびβ蛋白に挿入することによって相同組換えを誘発する方法も開示する。この出願はさらに、効率的相同組換えを促進する細菌性細胞を開示しており、その細菌は欠損λファージからの一つ以上の遺伝子を含む。しかしこの公報は、本発明を説明するために使用した実験の少なくも一つが機能しなかったと述べている。
【００１２】
まとめて言うと、参考文献および国際特許公報は、ラムダＲｅｄ遺伝子産物および特にベータ蛋白を細菌に使用して、二本鎖および一本鎖オリゴヌクレオチドを用いる相同組換えによってＤＮＡを効率的に改変し得ることを証明している。しかし、前記参考文献は、ＤＮＡ相同組換え以外のメカニズムによって一本または二本鎖オリゴヌクレオチドを効率的に改変し得ることを証明も示唆もしていないし、ラムダファージ蛋白を用いて非細菌性細胞における核酸配列改変効率を何らかのメカニズムによって増加させ得ることは示唆していない。
【００１３】
ヒドロキシウレア（ＨＵ）はリボヌクレオチド還元酵素のＭ２サブユニットを阻害し、ｄＮＴＰプールを欠失させ、ＤＮＡ複製を阻害し（ゾウ（Ｚｈｏｕ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５巻：１３２８−１３３３ページ（１９９５））、この結果、細胞を細胞周期のＧ１／Ｓ境界で停止させることは知られている。ＨＵがＤＮＡ複製を阻害する能力をもつことは、抗レトロウィルス剤として、および抗腫瘍剤としてのＨＵの使用に通ずる。ハンフト（Ｈａｎｆｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ  ９５巻：３５８９−３５９３ページ（２０００）；アルビサー（Ａｒｂｉｓｅｒ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８巻：９７２−９７８ページ（１９９１）；タムラら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｍｅｄ．  ４５巻：１６０−１６７ページ（１９９７）；リスチーウィツ（Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ）、米国特許第６，１３０，０８９号。ＨＵの、Ｇ１／Ｓチェックポイントにおける細胞停止能力を利用して、遺伝子操作前に細胞培養物を同期化する。ハドラツキー（Ｈａｄｌａｃｚｋｙ）ら、ＷＯ９７／４０１８３。ＨＵは胎児ヘモグロビンの発現を刺激することが判明し、鎌状赤血球症の治療に使用されている。スタインベルグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ）＆ロジャース（Ｒｏｄｇｅｒｓ）、メディスン（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（バルチモア）８０巻：３２８−３４４ページ（２００１）。
【００１４】
ＨＵは、造血幹細胞へのレトロウィルス媒介性遺伝子トランスファーの効率を高めるために使用される。レトロウィルス  インテグレーションは、活発にサイクリングする細胞において非常に効率的である。このレトロウィルスの形質導入効率は、標的細胞の調製に使用する増殖培地にＨＵが存在と高まる。ウチダら、米国特許第５，９２８，６３８号などを参照されたい。ＨＵの効果は、静止したＧ０相の細胞をより活発なＧ１／Ｓ／Ｇ２およびＭ相にスイッチし、活発にサイクリングする細胞に富む集団を与える能力によるものである。
【００１５】
ＨＵはアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターと共に用いられることがある。アレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら、米国特許第５，８３４，１８２号。レトロウィルスのように、ＡＡＶベクターは標的細胞の染色体に安定的に組み込まれることによって作用する。タル（Ｔａｌ，Ｊ．）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．  ７巻：２７９−２９１ページ（２０００）。レトロウィルス形質導入の適用時と同様に、ＡＡＶ形質導入は、標的細胞をＨＵで予備処理した際により効率的であることが報告されている。
【００１６】
ＨＵは、培養細胞を先ず最初に相同組換えによって標的化し、改変した核をその後トランスファーする、という遺伝子導入アプローチにおける核トランスファー効率を高めるために使用される。ＨＵを使用してドナー核の分離前に細胞類を同期化し、核トランスファー操作の効率を高める。コルマン（Ｃｏｌｍａｎ）ら、ＷＯ００／５１４２４。
【００１７】
しかしＨＵがオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の効率を高めるために有用であることはこれまで示唆も開示もされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
当業者には、オリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の効率、特に相同組換え以外によって起きる核酸配列改変の効率を高める方法、組成物およびキットが必要である。特に、当業者には真核細胞、例えば酵母および哺乳動物細胞、特にヒト細胞などにおけるオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変効率を高めるために使用できる方法、組成物およびキットが必要である
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の概要
本発明は第一の局面において、オリゴヌクレオチド媒介性標的核酸配列改変の改良法を提供することによって、当業者のこれらのおよびその他の要求を解決する。オリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変効率を高める方法は、細胞性修復蛋白の存在のもとで、標的核酸を配列改変ターゲティングオリゴヌクレオチドと組み合わせ、前記組み合わせたものにラムダベータ蛋白を追加的に加えるか、または最初に前記細胞性修復蛋白を有する細胞をＨＤＡＣインヒビターまたはヒドロキシウレアと接触させる工程を含む。
【００２０】
標的核酸と配列改変オリゴヌクレオチド類とはｅｘ  ｖｉｖｏ（生体外）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）で組合わせることができる。
【００２１】
幾つかのｅｘ  ｖｉｖｏ実施形態において、細胞性修復蛋白の一つ以上が精製蛋白であり、その際精製蛋白とは、非修復蛋白に対して、その蛋白が、それが由来する細胞中に天然に見いだされるよりも高濃度であることを意味する。このような精製された細胞修復蛋白類は別々に精製しても、まとめて精製してもよい。その他のｅｘ  ｖｉｖｏ実施形態においては、細胞性修復蛋白は無細胞蛋白抽出物中に存在する。
【００２２】
その他の実施形態において、細胞性修復蛋白は、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養された完全無傷細胞内か、または生体内の完全無傷細胞内に存在する。
【００２３】
細胞性修復蛋白は原核または真核細胞に由来する；例えば大腸菌細胞、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、または動物細胞、例えばマウス、ハムスター、ラット、およびサル細胞そしてヒト細胞も含む哺乳動物細胞類など。ヒト細胞は非制限的に、例えば肝細胞、肺細胞、結腸細胞、子宮頸部細胞、腎細胞、上皮細胞、癌細胞、幹細胞、造血幹細胞、造血系前駆細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択できる。
【００２４】
実施形態の一系列において、配列改変オリゴヌクレオチドは、化学的に修飾された、非ヘアピン状の、内部に重複のないオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
オリゴヌクレオチドは例えば、そのオリゴヌクレオチド配列と標的核酸第一ストランド上のその相補体との間の一つ以上のミスマッチを除いて、核酸標的の第一ストランドの配列に完全に相補的な配列であり、少なくも一つの末端修飾を有する。特に有用な実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくも８個の隣接デオキシリボヌクレオチドの内部非重複ドメインを有し、一つ以上のミスマッチは専らオリゴヌクレオチドＤＮＡドメインおよびオリゴヌクレオチドの５’および３’末端から少なくも８ヌクレオチドに位置する。
【００２６】
末端修飾が少なくも一つの末端ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、少なくも一つの末端２’−Ｏ−Ｍｅ塩基類似体、および少なくも１つ、２つ、３つまたはそれ以上の末端ホスホロチオエート結合からなる群から選択され、オリゴヌクレオチドは１７−１２１ヌクレオチド長さであり、７４ヌクレオチド以上の長さにもなることがあるのが都合がよい。
【００２７】
標的は二本鎖ＤＮＡであり、例えば染色体中のゲノムＤＮＡなど、ゲノムＤＮＡである。染色体は天然または合成染色体でよい。その他の実施形態において、ＤＮＡ標的はエピソーム性である。
【００２８】
本発明の方法の幾つかの実施形態において、標的核酸は二本鎖ゲノムＤＮＡの非転写型ストランドである。他方、標的核酸は転写ストランドである。
【００２９】
第二の局面において、本発明はオリゴヌクレオチド媒介性標的核酸配列改変のための組成物を提供する。
【００３０】
前記組成物は、細胞性修復蛋白の存在下で実質的に相補的な標的核酸と組み合う際に、そこに標的配列改変を起こすことができる配列改変オリゴヌクレオチドと；
（ｉ）細胞性修復蛋白、ＨＤＡインヒビタまたはヒドロキシウレアとあらかじめ接触させた細胞から誘導される細胞性蛋白類、または（ｉｉ）ラムダベータ蛋白のどちらか、
とを含む。
【００３１】
上記の方法において、前記組成物の細胞性修復蛋白は精製されて無細胞蛋白抽出物中に存在するかまたは完全無傷細胞内に存在する。いずれの細胞も培養物中または完全無傷動物内に存在する。
【００３２】
その他の実施形態において、前記組成物は追加的にまたは代替的に、トリコスタチンＡ、細胞性修復蛋白、またはヒドロキシウレアを含むことができる。
【００３３】
もう一つの局面において、本発明はキットを提供する。
【００３４】
キットはオリゴヌクレオチド、特に化学的に修飾された内部非重複のノンヘアピン  オリゴヌクレオチドなどの配列改変オリゴヌクレオチド、およびトリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白またはヒドロキシウレアの一つ以上を別々にパッケージングして含む。
【００３５】
キットはオリゴヌクレオチド、特に化学的に修飾された内部非重複のノンヘアピン  オリゴヌクレオチドなどの配列改変オリゴヌクレオチド、および細胞性修復蛋白を含み、この細胞性蛋白はＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアとあらかじめ接触させた細胞から誘導され、分離してパッケージされる。このようなキットはさらにラムダベータ蛋白も含むことができる。
【００３６】
キット類はＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド除去修復群からの少なくも１つの蛋白を含み、追加的にトリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白、またはヒドロキシウレアを、任意に配列改変活性を有するオリゴヌクレオチドと共に含んでもよい。
【００３７】
１つ以上の固定核酸（ＬＮＡ）残基を有する配列改変オリゴヌクレオチドの作成に特に適したまた別の実施形態において、本発明のキットは子ウシ胸腺末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼなどの鋳型−非依存性一本鎖ポリメラーゼ；５’トリホスフェートを有するＬＮＡモノマー類；およびトリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白またはヒドロキシウレアを含むことができる。その他の実施形態において、キットは水溶性カルボジイミド組成物；イミダゾール組成物；求核基を有するＬＮＡモノマー類；およびトリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白、またはヒドロキシウレアを含むことができる。
【００３８】
本発明のその他の局面および実施形態を次のナンバーの項目にまとめる：
１．オリゴヌクレオチド媒介性標的核酸配列を改変する方法であって、
標的核酸を細胞性修復蛋白の存在下で配列改変標的オリゴヌクレオチドと組み合わせ；ラムダベータ蛋白を追加的に前記組み合わせに加えるか、または、先ず始めに、前記細胞性修復蛋白を含む細胞をＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアと接触させる
前記方法。
２．前記細胞性修復蛋白が精製されている第１項記載の方法。
３．前記細胞性修復蛋白が無細胞蛋白抽出物中に存在する第１項記載の方法。
４．前記細胞性修復蛋白が完全無傷細胞内に存在する第１項記載の方法。
５．前記細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで培養される第４項記載の方法
６．前記細胞が生体内にある第４項記載の方法。
７．前記細胞性修復蛋白が原核細胞および真核細胞からなる群から選択される細胞のものである第１項記載の方法。
８．前記細胞が原核細胞である第７項記載の方法。
９．前記原核細胞が細菌細胞である第８項記載の方法。
１０．前記細菌細胞が大腸菌細胞である第９項記載の方法。
１１．前記細胞が真核細胞である第７項記載の方法。
１２．前記真核細胞が酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞またはヒト細胞である第１１項記載の方法。
１３．前記真核細胞が酵母細胞である第１２項記載の方法。
１４．前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである第１３項記載の方法。
１５．前記真核細胞が植物細胞である第１２項記載の方法。
１６．前記真核細胞がヒト細胞である第１２項記載の方法。
１７．前記ヒト細胞が肝細胞、肺細胞、結腸細胞、子宮頸部細胞、腎細胞、上皮細胞、癌細胞、幹細胞、造血幹細胞、造血系前駆細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択される第１６項記載の方法。
１８．前記真核細胞が哺乳動物細胞である第１２項記載の方法。
１９．前記哺乳動物細胞がマウス、ハムスター、ラットおよびサルからなる群から選択される第１８項記載の方法。
２０．前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの配列と標的核酸第一ストランド上のその相補体との間にある一つ以上のミスマッチを除いて、前記核酸標的の第一ストランドの配列に完全に相補的な配列であり、その際前記オリゴヌクレオチドが少なくも１つの末端修飾を有する第１項ないし第１９項のいずれかの項に記載の方法。
２１．前記少なくも１つの末端修飾が、少なくも１つの末端固定核酸（ＬＮＡ）、少なくも１つの末端２’−Ｏ−Ｍｅ塩基類似体、および少なくも１つの末端ホスホロチオエート結合からなる群から選択される第２０項記載の方法。
２２．前記オリゴヌクレオチドが１７−１２１ヌクレオチド長さを有する一本鎖オリゴヌクレオチドで、少なくも８つの隣接デオキシリボヌクレオチドの内部非重複のドメインを有し、前記一つ以上のミスマッチが専ら前記オリゴヌクレオチドＤＮＡドメインおよび前記オリゴヌクレオチドの５’および３’末端から少なくも８ヌクレオチドに位置する第２１項記載の方法。
２３．前記オリゴヌクレオチドが少なくも一つの末端固定核酸（ＬＮＡ）を有する第２１項記載の方法。
２４．前記オリゴヌクレオチドが少なくも２５ヌクレオチド長さである第１項記載の方法。
２５．前記オリゴヌクレオチドが７４以下のヌクレオチド長さである第１項記載の方法。
２６．前記オリゴヌクレオチドが１２１以下のヌクレオチド長さである第１項記載の方法。
２７．前記標的核酸がＤＮＡである第１項記載の方法。
２８．前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡである第２７項記載の方法。
２９．前記二本鎖ＤＮＡがゲノムＤＮＡである第２８項記載の方法。
３０．前記ゲノムＤＮＡが染色体内にある第２９項記載の方法。
３１．前記染色体が人工染色体である第３０項記載の方法。
３２．前記ゲノムＤＮＡがエピソーム性である第２９項記載の方法。
３３．前記標的核酸が二本鎖ゲノムＤＮＡの非転写ストランドである第１項記載の方法。
３４．オリゴヌクレオチド媒介性標的核酸配列改変を高めるための組成物であって：  オリゴヌクレオチドにおいて、細胞性修復蛋白の存在下で実質的に相補的な標的核酸と組み合わせた際に、標的配列改変を起こすことができる前記オリゴヌクレオチドと；
細胞性修復蛋白において、ＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアまたはラムダベータ蛋白とあらかじめ接触させた細胞から誘導される前記細胞性蛋白
とを含んでなる組成物。
３５．前記細胞性修復蛋白が精製されている第３４項記載の組成物。
３６．前記細胞性修復蛋白が無細胞蛋白抽出物中に存在する第３４項記載の組成物。
３７．前記細胞性修復蛋白が完全無傷細胞内に存在する第３４項記載の組成物。
３８．前記細胞が原核細胞および真核細胞からなる群から選択される第３４項ないし第３７項のいずれかの項に記載の組成物。
３９．前記細胞が原核細胞である第３８項記載の組成物。
４０．前記原核細胞が細菌細胞である第３９項記載の組成物。
４１．前記細菌細胞が大腸菌細胞である第４０項記載の組成物。
４２．前記細胞が真核細胞である第３８項記載の組成物。
４３．前記真核細胞が酵母細胞、植物細胞、ヒト細胞または哺乳動物細胞である第４２項記載の組成物。
４４．前記真核細胞が酵母細胞である第４３項記載の組成物。
４５．前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである第４４項記載の組成物。
４６．前記真核細胞が植物細胞である第４３項記載の組成物。
４７．前記真核細胞がヒト細胞である第４３項記載の組成物。
４８．前記ヒト細胞が肝細胞、肺細胞、結腸細胞、子宮頸部細胞、腎細胞、上皮細胞、癌細胞、幹細胞、造血幹細胞、造血系前駆細胞および胚性幹細胞からなる群から選択される第４７項記載の組成物。
４９．前記真核細胞が哺乳動物細胞である第４３項記載の組成物。
５０．前記哺乳動物がマウス、ハムスター、ラットおよびサルからなる群から選択される第４９号記載の組成物。
５１．前記オリゴヌクレオチドが少なくも１つの末端修飾を有する第３４項ないし第５０項のいずれかの項に記載の組成物。
５２．前記少なくも１つの末端修飾が少なくも１つの末端固定核酸（ＬＮＡ）、少なくも１つの末端２’−Ｏ−Ｍｅ塩基類似体、および少なくも１つの末端ホスホロチオエート結合からなる群から選択される第５１項記載の組成物。
５３．前記オリゴヌクレオチドが少なくも１つの末端固定核酸（ＬＮＡ）を有する第５２項記載の組成物。
５４．前記オリゴヌクレオチドが１７−１２１ヌクレオチド長さの一本鎖オリゴヌクレオチドであり、少なくも８つの隣接デオキシリボヌクレオチドの内部非重複ドメインを有する第３４項ないし第５３項記載の組成物。
５５．前記オリゴヌクレオチドが少なくも２５ヌクレオチド長さである第３４項ないし第５４項記載の組成物。
５６．前記オリゴヌクレオチドが１２１以下のヌクレオチド長さである第３４項ないし第５５項記載の組成物。
５７．前記オリゴヌクレオチドが７４以下のヌクレオチド長さである第３４項ないし第５５項記載の組成物。
５８．さらにトリコスタチンＡ、蛋白抽出物またはヒドロキシウレアを含む第３４項ないし第５７項記載の組成物。
５９．オリゴヌクレオチドと；
トリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白またはヒドロキシウレア、
を含むキット。
６０．オリゴヌクレオチドと；
細胞性修復蛋白であって、ＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアとあらかじめ接触させた細胞から誘導される前記細胞性修復蛋白、
とを含むキット。
６１．オリゴヌクレオチドと；
細胞性修復蛋白と；
ラムダベータ蛋白、
とを含むキット。
６２．ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド除去修復群からの少なくも１つの蛋白と；
トリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白、またはヒドロキシウレア、
とを含むキット。
６３．さらに核酸配列改変活性を有するオリゴヌクレオチドを含む第６２項記載のキット。
６４．鋳型−非依存性一本鎖ポリメラーゼと；
５’−トリホスフェートを有するＬＮＡモノマー類と；
トリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白、またはヒドロキシウレア、
とを含むキット。
６５．前記ポリメラーゼが子ウシ胸腺末端デオキシヌクレオチジル  トランスフェラーゼである第６４項記載のキット。
６６．水溶性カルボジイミド組成物と；
イミダゾール組成物と；
求核基を有するＬＮＡモノマー類と；
トリコスタチンＡ、ラムダベータ蛋白またはヒドロキシウレア、
とを含むキット。
発明の詳細な説明
本発明はオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の効率を高めるための方法、組成物、およびキットを提供する。
【００３９】
この方法は細菌、真菌、植物または、哺乳動物などの動物に、ＨＤＡＣインヒビタ、ベータ蛋白を含む組成物、またはヒドロキシウレアのような１種類または複数種類の作用物質を加え、それと同時に、またはその後しばらく経ってから、前記処理した細胞または組織に核酸配列改変活性を有するオリゴヌクレオチドを与える諸工程を含む。
【００４０】
相同組換えおよびウィルス媒介性トランスファーを容易にするためにＨＤＡＣインヒビタが使用されているとはいえ、そしてラムダベータ蛋白が大腸菌細胞において核酸（この核酸は染色体内核酸でも染色体外核酸でもよい）間の相同組換えを容易にすることが示されたとはいえ、そして本明細書に記載の発明の前にすでにＨＵを使用してウィルス形質導入および核トランスファーによる遺伝子標的効果が高められているとはいえ、これらの作用物質を使用してオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変効率を高めることができるかどうかは未知であり、予測することができなかった。
【００４１】
オリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変は相同組換えを仲介するものとは異なる細胞性蛋白によって仲介される。オリゴヌクレオチド媒介性遺伝子改変のために使用されるオリゴヌクレオチド類には、相同組換えに必要な、標的に相補的な配列の、長いストレッチが欠けているのが一般的である。そしてオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変はウィルス蛋白の仲介を含まない。
【００４２】
オリゴヌクレオチド媒介性配列改変によって生ずる遺伝子産物は、相同組換えまたはウィルス媒介性形質導入から生ずる産物とは異なる。
【００４３】
標的細胞の相同組換え機構を利用して必要な二本鎖の破壊および再結合を起こす相同組換えは、標的細胞の染色体ＤＮＡの大きいストレッチを、エピソーム性ＤＮＡ上に供給された導入遺伝子からの配列で置換させる。この標的挿入部位にフランクする配列に合うように設計された前記導入遺伝子の３’および５’領域上のフランキング配列は、通常は長く、例えば約１．５ないし１５ｋｂである。
【００４４】
レトロウィルスおよびアデノ随伴ウィルスの形質導入は標的細胞の組換えウィルスベクターによる感染を含み、ウィルスを宿主染色体に組み込むために、ウィルスによってコーディングされる蛋白に頼ることが多い。ロビン（Ｒｏｂｂｉｎ）＆ギビザニ（Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．  ８０巻：３５−４７ページ（１９９８）。その上、そのようなウィルス形質導入後の標的細胞の染色体は、ウィルスベクター配列を含む組換えウィルスの全体または実質的に一部分の挿入を含む。ウィルス組込みは、組み込まれたウィルスのタンデムまたはマルチコピーで増加する。組込みは、宿主染色体のランダムスポット、または既知の所定のウィルス組込み部位に起こる。挿入部位および挿入数の変動により、導入遺伝子の発現は多種多様になる。染色体に挿入されたウィルスくずは、発現されたウィルス蛋白に対して不都合な免疫反応を起こす可能性があり、それらの改変部位に応じて悪性腫瘍性変化を起こすこともある。
【００４５】
これに対して、オリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変は種々の試薬を使用し、相同組換えおよびウィルス形質導入に使用したものとは異なる結果をもたらす。オリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変は、外来遺伝子またはウィルスベクターに比べて相対的に短いオリゴヌクレオチドの使用を含み、標的細胞内の遺伝子を修飾する。宿主染色体ＤＮＡ配列は、標的遺伝子内の正確に定まった場所のたった一つの塩基か少数の塩基で改変される。ウィルス配列またはエピソームくずは宿主染色体に導入されず、ウィルスによってコードされる蛋白は必要ない。このため、相同組換えによる遺伝子ターゲティングには必要となるような、遺伝子全体（または少なくも遺伝子の長い部分）を含むエピソーム性ベクターを導入する必要がない。
【００４６】
オリゴヌクレオチド媒介性遺伝子改変は相同組換えおよびウィルス形質導入とは機構的にも異なる。オリゴヌクレオチド媒介性遺伝子改変は細胞性ＤＮＡミスマッチ修復メカニズムに依存する。このメカニズムは分離された遺伝子および遺伝子生成物と関係する相同組換えおよびウィルス形質導入とは異なる細胞経路である。ランゾフ（Ｌａｎｚｏｖ）、分子遺伝学および代謝（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、６８巻：２７６−２８２ページ（１９９９）。例えば、相同組換えはＲＡＤ５２遺伝子産物を必要とするが（クズミノフ（Ｋｕｚｍｉｎｏｖ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８巻（１５号）：８４６１−８４６８ページ（２００１））、オリゴヌクレオチド媒介性遺伝子改変はＲＡＤ５２が存在しない場合の方がより効率的である。
【００４７】
ラムダベータ蛋白を使用してラムダファージの天然宿主以外の細胞におけるオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変効率を高めることができるかどうかは詳しくは知られていないし、推測もできない。
【００４８】
驚いたことに、本発明者らはここで、オリゴヌクレオチド媒介性配列改変と、相同組換えおよびウィルス形質導入との間にメカニズムの差があるにもかかわらず、細胞をＨＤＡＣインヒビタトリコスタチンＡまたはヒドロキシウレアで前処理または同時処理すると、オリゴヌクレオチド媒介性配列改変の効率が高まることを発見した。さらに、オリゴヌクレオチド媒介性配列の改変と、相同組換えとの間にメカニズムの差があるにもかかわらず、また大腸菌と、真核細胞との間にあるような、蛋白および細胞内媒体の差があるにもかかわらず、ラムダ  ベータ蛋白が全ての被検細胞においてオリゴヌクレオチド媒介性配列改変の効率を驚くべく高めることも発見した。
【００４９】
よって、本発明はオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の効率を高めるための方法、組成物およびキットを提供する。この方法は細菌、真菌、植物または動物からの細胞および組織をＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアで処理し、その後処理ずみ細胞または組織に核酸配列改変活性を有するオリゴヌクレオチドを加えること、または、細菌、真菌、植物または動物からの細胞または組織をラムダベータ蛋白と核酸配列改変活性を有するオリゴヌクレオチドとで同時に処理することを含む。
【００５０】
本発明の方法、組成物およびキットは、核酸配列改変活性を有するあらゆるオリゴヌクレオチドで使用できる。このようなオリゴヌクレオチドは全て、核酸配列改変に導くように設計された非相補的塩基類を除いて、配列が核酸標的の一部の配列に完全に相補的である少なくも一部分を含む。このため、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチドは標的遺伝子の配列とは異なる少なくも１つの塩基対を有するか、または標的遺伝子のＤＮＡ配列の相補体とは異なる少なくも一つの塩基対を有する。
【００５１】
例えば、本発明の方法、組成物、およびキットは、クルバー（Ｃｕｌｖｅｒ）らの、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９９年１０月、１７巻（１０号）：９８９−９３ページに記載のように、トリプレックス形成ドメインおよび修復ドメイン両方を有する二官能価オリゴヌクレオチド類でも、米国特許第６，３０３，３７６号、第５，９６２，４２６号、および第５，７７６，７４４号に記載されるようなその他のタイプの配列改変トリプレクシング  オリゴヌクレオチド類でも使用できる。これらの開示は参考としてその全体が本明細書中に援用される。クノアート（Ｋｎａｕｅｒｔ）ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２００１年１０月１日；１０巻（２０号）：２２４３−５１ページも参照されたい。この開示は参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【００５２】
トリプレクシング  オリゴヌクレオチド類は、ワトソン−クリック塩基対の法則よりもフーグシュタイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）または逆フーグシュタイン塩基対の法則を利用してＤＮＡに結合するから、オリゴヌクレオチド媒介性配列改変のために使用するトリプレクシングオリゴヌクレオチドは、一般的には、改変が所望される標的に対して、オリゴヌクレオチドの一端または両端の８ヌクレオチド以内に、むしろ７、６、５、４、３、２または１以内に、一つ以上のワトソン−クリックミスマッチを含む。
【００５３】
本発明の方法、組成物、およびキットは、特に米国特許第５，９４５，３３９号、第５，８８８，９８３号、第５，８７１，９８４号、第５，７９５，９７２号、第５，７８０，２９６号、第５，７６０，０１２号、第５，７５６，３２５号、第５，７３１，１８１号および第５，５６５，３５０号に記載されているように、キメラＲＮＡ−ＤＮＡ二重ヘアピンオリゴヌクレオチド類でも使用できる。上記の開示は参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。イェ（Ｙｅ）ら、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  １９９８年１０月；４巻（１０号）：４３１−７ページおよびリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００１年８月；３巻（４号）：３２７−３７ページも再調査のために参照されたい。
【００５４】
配列改変キメラ  オリゴヌクレオチド内の内部配列の相補性は、一本鎖オリゴヌクレオチドの折り畳みを起こし、その結果２つのヘアピンを含む内部自己重複化型が形成される。標的に対するミスマッチは重複領域にある。配列改変キメラオリゴヌクレオチドはデオキシリボースおよびリボース含有塩基を両方含み、したがってＤＮＡおよびＲＮＡ両方の領域を含む；上記オリゴヌクレオチドの上記リボヌクレオチドの２’−ヒドロキシルはメチル化されてもよい。
【００５５】
非天然ヌクレオ塩基類がこのようなキメラオリゴヌクレオチド内に存在することがある（また、以下により詳細に記載される一本鎖、化学的に修飾された、内部非重複オリゴヌクレオチドにも存在する）。これに関連して、用語“ヌクレオ塩基”は天然発生性ヌクレオ塩基並びに非天然発生性ヌクレオ塩基を網羅する。これまで“非天然的に発生する”と考えられていた種々のヌクレオ塩基がその後自然界に見いだされたのは明らかである。こうして“ヌクレオ塩基”は公知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環式類似体およびそれらの互変異性体も含む。ヌクレオ塩基類の典型的例はアデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキミルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−Ｓ−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよび米国特許第５，４３２，２７２号に記載されている“非天然発生性”ヌクレオ塩基類である。用語“ヌクレオ塩基”はこれらの例およびその類似体および互変異性体の各々を網羅するものとする。
【００５６】
本発明の方法、組成物およびキットを使用して、化学的改変、一本鎖、内部非重複化オリゴヌクレオチド類を用いてオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の頻度および効率を高めることもできる。これについては特に米国特許第６，２７１，３６０号；国際特許出願第ＷＯ０１／７３００２、ＷＯ０１／９２５１２、およびＷＯ０２／１０３６４；ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０巻（１号）：２４−３３ページ（２００３）；パレク−オルメド（Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏ）ら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ９巻（１０号）：１０７３−８４ページ（２００２）；リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０巻（１３号）：２７４２−５０ページ（２００２）：およびガンパー（Ｇａｍｐｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８巻（２１号）：４３３２−９ページ（２０００）に記載されており、これらの開示は参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【００５７】
特に有用な一本鎖、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、１７−１２１ヌクレオチド長さを有し、内部非重複デオキシリボヌクレオチド“改変”ドメインを有するものである。このドメインは必ずというわけではないが、一般的に少なくも８ヌクレオチド長さである。このヌクレオチドの配列と、その標的とのミスマッチはこの内部非重複ＤＮＡドメイン内に位置し、必ずではないが、一般的に、オリゴヌクレオチドの５’および３’末端から少なくも８個のヌクレオチドである。デオキシリボヌクレオチド改変ドメインの配列と、標的核酸第一ストランド上のその相補体との間の１つ以上のミスマッチを除けば、上記オリゴヌクレオチドの配列は核酸標的の第一ストランドの配列に完全に相補的である。さらに、上記オリゴヌクレオチドは、少なくも１つの末端固定核酸（ＬＮＡ）、少なくも１つの末端２’−Ｏ−Ｍｅ塩基類似体および少なくも１つの末端ホスホロチオエート結合からなる群から選択される少なくも１つの末端修飾を有する。前記少なくも１つの修飾の少なくも１つは、上記オリゴヌクレオチドの末端部に位置するのが一般的である。このような修飾の複数、例えば２、３、４またはそれ以上のホスホロチオエート結合が一端または両端に存在する。
【００５８】
２’−Ｏ−メチル残基がリボ核酸であるとはいえ、上記本鎖の化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド類は、標的に対するミスマッチが内部非重複ＤＮＡドメイン内に位置することによって、上記“キメラ”オリゴヌクレオチドとは異なる。さらに、一本鎖キメラ修飾オリゴヌクレオチドには、上記の配列改変キメラオリゴヌクレオチドに見いだされるヘアピン構造がない（すなわちそれらは“ノンヘアピン”分子である）。
一本鎖の、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドによる配列改変の頻度を高めまたは増やすために本発明の方法、組成物およびキットを使用する際に含まれる特に有用な化学的修飾は、固定核酸（ＬＮＡ）として公知の合成分子群からの１つ以上のモノマーが含まれることである。ＬＮＡは、二環式または三環式ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体および、このような類似体を含むオリゴヌクレオチド類である。ＬＮＡｓおよび関連類似体の塩基構造および機能的特徴はＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／３９３５２、米国特許第６０４３０６０号および米国特許第６２６８４９０号など種々の出版物および特許に開示されている。これらは全て参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。
【００５９】
一般的ＬＮＡ構造は下記の式によって記載される：
【００６０】
【化１】
2005518817.tif 000002
上記式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−、−Ｏ−Ｃ（Ｒ７Ｒ７＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（Ｒ７Ｒ７＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ＊）−Ｃ（Ｒ７Ｒ７＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−Ｎ（ＲＮ＊）−および−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−Ｃ（Ｒ７Ｒ７＊）−から選択される；Ｂは水素、ヒドロキシ、任意に置換されたＣ１−４アルコキシ、任意に置換されたＣ１−４−アルキル、任意に置換されたＣ１−４−アシロキシ、およびヌクレオ塩基類から選択される；Ｐは隣接モノマーへのヌクレオシド間結合、または５’−末端基、例えばヌクレオシド間結合または任意に置換基Ｒ５を含む５’末端基などである；置換基Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３およびＲ３＊の一つは、隣接モノマーへのヌクレオシド間結合をあらわす基Ｐ＊、または３’−末端基である；Ｒ１＊、Ｒ４＊、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６、Ｒ６＊、Ｒ７、Ｒ７＊、ＲＮ＊の置換基から選択されるノン−ジェミナル置換基の１対または２対、およびＰ＊とあらわされていないＲ２、Ｒ２＊、Ｒ３、およびＲ３＊の１つは、それぞれ下記の置換基の１つ以上からなる共有結合部分である：−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（ＲａＲｂ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−および＞Ｃ＝Ｚ、ここでＺは−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｒａ）−から選択され、ＲａおよびＲｂは各々独立的に水素、任意に置換されたＣ１−１２−アルキル、任意に置換されたＣ２−１２−アルケニル、任意に置換されたＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ−（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ−（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル、モノ−およびジ−（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アチド、スルファニル、Ｃ１−６アルキルチオ、およびハロゲン類から選択される。ここでアリールおよびヘテロアリールは任意に置換され、２個のジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは一緒になって任意に置換されたメチレン（＝ＣＨ２）をあらわすことができ、Ｒａ、Ｒｂから選択される２個のノン−ジェミナルまたはジェミナル置換基、および、存在はするがＰ、Ｐ＊または１つまたは複数の共有結合部分には含まれない任意の置換基Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、Ｒ３＊、Ｒ４＊、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６およびＲ６＊、Ｒ７、およびＲ７＊は、前に定義した同じ種類の置換基から選択される関連架橋結合部分を形成できる；それによってノン−ジェミナル置換基の１対または複数対が、（ｉ）そのノン−ジェミナル置換基が結合している原子および（ｉｉ）任意の介在原子と一緒になって、単環式または二環式構造体を形成する；そして存在するがＰ、Ｐ＊、または１つまたは複数の共有架橋結合部分には含まれない置換基Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ２＊、Ｒ３、Ｒ４＊、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６およびＲ６＊、Ｒ７、およびＲ７＊の各々は、水素、任意に置換されたＣ１−１２−アルキル、任意に置換されたＣ２−１２−アルケニル、任意に置換されたＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノカルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキルアミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アチド、スルファニル、Ｃ１−６アルキルチオ、およびハロゲン類から独立的に選択される、この際アリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、その際２個のジェミナル置換基が一緒に、オキソ、チオキソ、イミノ、または任意に置換されたメチレンをあらわし、または一緒に、−Ｏ−、−Ｓ−、および−（ＮＲＮ）から選択される１つ以上の置換基によって任意に阻止されおよび／または打ち切られる１−５炭素原子のアルキレン鎖からなるスピロ架橋結合部分を形成してもよい。ここでＲＮは水素およびＣ１−４−アルキルから選択され、２つの隣接（ノン−ジェミナル）置換基は、二重結合を生ずる付加的結合を示す；そしてＲＮ＊は、存在はするが共有架橋結合部分には含まれない場合、水素およびＣ１−４−アルキル；これらの塩基性塩およびその酸付加塩から選択される。
【００６１】
上の一般式およびこれに関連する定義から明らかなように、置換基および可能な共有架橋結合部分の性質によって、オリゴマーには１個または数個の不斉炭素原子が存在する。本発明に使用するオリゴマーは個々のモノマー断片並びにそれらの混合物（ラセミ混合物を含む）の任意のおよび全ての異性体の存在から生ずる立体異性体をすべて含むものとする。Ｂがα−構造である一般式の変形体も本発明の範囲内に含まれる。
【００６２】
これらの定義および公知のヌクレオシド（天然発生性および非天然性）およびヌクレオシド類似体（公知の二−および三環式類似体を含む）を考慮する際に、オリゴマーは一つ以上のＬＮＡｓ（それらは置換基の選択に関しても共有架橋部分に関しても、互いに同一でも異なっていてもよい）および一つ以上のヌクレオシドおよび／またはヌクレオシド類似体を含むことは明らかである。これに関連して、“オリゴヌクレオチド”はヌクレオシド間結合によって結合したヌクレオシドの連続鎖を意味するが、オリゴマー（オリゴヌクレオチド）の１つ以上のヌクレオチド単位（モノマー）中のヌクレオ塩基は上に定義したように置換基Ｂで修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシ末端に少なくも１つのＬＮＡ類似体を含むのが好ましい。
【００６３】
上記のように、オリゴマーの単量体ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体はヌクレオシド間結合によってその他のモノマー類と結合する。これに関連して、用語“ヌクレオシド間結合”とは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ”）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ”）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択される２ないし４、好ましくは３個の置換基からなる結合を意味する、ここでＲＨは、水素、Ｃ１−４アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６アルキルおよびフェニルから選択される。ある場合には、ヌクレオシド間結合はキラルである。本発明に使用するオリゴマー類は個々のヌクレオシド間結合の任意のまたは全ての異性体の存在から生ずる全ての立体異性体並びにそれらの混合物（ラセミ混合物を含む）を含むものとする。
【００６４】
ＷＯ９９／１４２２６および米国特許第６，２６８，４９０号に開示される一連の有用な実施形態において、ＬＮＡは、下記の式に示されるようにリボースの２’−酸素を４’炭素と結合させるメチレン架橋を含む：
【００６５】
【化２】
2005518817.tif 000003
上記式中、Ｂはヌクレオ塩基であり、ＸおよびＹはヌクレオシド間結合である。理論によって束縛されるものではないが、これらの類似体の共有架橋部分は、リボース環の３’−末端コンフォメーションをロックすることによってそのリボース環の構造的柔軟性を減らし、それによって燐酸主鎖の局所的構造を強化すると考えられる。
【００６６】
この構造のその他の有用な実施形態において、２’−酸素位置は下記の構造に示すように窒素または硫黄で置換される：
【００６７】
【化３】
2005518817.tif 000004
上記式中、Ｂはヌクレオ塩基であり、ＸおよびＹはヌクレオシド間結合である。
【００６８】
ＷＯ９９／１４２２６に開示された基礎的ＬＮＡ構造のその他の有用な実施形態において、共有架橋部分は１つ以上の炭素原子を含むことができ、下記の構造によりリボース環内のその他の位置を繋げることができる：
【００６９】
【化４】
2005518817.tif 000005
上記式中、Ｂはヌクレオ塩基であり、ＸおよびＹはヌクレオシド間結合である。
【００７０】
或いは、本発明の方法、組成物およびキットにおける配列改変に使用するオリゴヌクレオチド類はＷＯ００／５６７４８に開示されるようなキシロ−ＬＮＡ構造を有する少なくも１つのヌクレオシドを含み、下記の一般式を有するオリゴマー類などである：
【００７１】
【化５】
2005518817.tif 000006
上記式中、ヌクレオシド間結合はＰおよびＰ＊であらわされ、その他の基はＷＯ００／５６７４８に開示される置換基である。この類似体の特殊の例は下記の構造的枠組と共にＷＯ００／５０７４８に開示されている：
【００７２】
【化６】
2005518817.tif 000007
上記式中、Ｂはヌクレオ塩基であり、ＸおよびＹはヌクレオシド間結合である。リボース環の２’および５’炭素間の結合を含むヌクレオシド類似体もＷＯ００／５６７４８に開示され、本発明の範囲内と考えられる：
【００７３】
【化７】
2005518817.tif 000008
上記式中、Ｂはヌクレオ塩基であり、ＸおよびＹはヌクレオシド間結合である。
【００７４】
本発明のその他の実施形態はＷＯ００／６６６０４に開示されるＬ−リボ−ＬＮＡ構造を有する少なくも１つのヌクレオシドを含むオリゴマーを含み、次の一般式を有する：
【００７５】
【化８】
2005518817.tif 000009
上記式中、ヌクレオシド間結合はＰおよびＰ＊によってあらわされ、その他の基はＷＯ００／６６６０４に開示される置換基でよい。この類似体の特殊な例は下記の構造的枠組と共にＷＯ００／６６６０４に開示されている：
【００７６】
【化９】
2005518817.tif 000010
上記式中、Ｂはヌクレオ塩基でありＸおよびＹはヌクレオシド間結合である。
【００７７】
本発明の範囲内と考えられるその他の実施形態は、米国特許第６，０４３，０６０号に開示されるヌクレオシド類似体を含むオリゴヌクレオチドを含む。これらの類似体は次の一般式のモノマー単位によってあらわされる：
【００７８】
【化１０】
2005518817.tif 000011
上記式中、Ｂはピリミジンまたはプリン核酸塩基、またはその誘導体であり、１オリゴマー内で複数のＢ置換基が同一でも互いに異なっていてもよい。
【００７９】
本発明の実施において有用なヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体、およびこれらを含むオリゴマー類の合成は、ＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／３９３５２、米国特許第６，０４３，０６０号、および米国特許第６，２６８，４９０号に開示されているように行うことができる。上記類似体の幾つかおよび合成用一式は市販されている（プロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）、ブルダー、ＣＯ、ＵＳＡ）。
【００８０】
第一の局面において、本発明はオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の改良法を提供する。その方法において、配列改変は、標的核酸を細胞性修復蛋白の存在下で配列改変ターゲティング・オリゴヌクレオチドと組み合わせることによって行われる。改良点は、上記組み合わせにラムダベータ蛋白を追加的に加えるか、または先ず最初に細胞性修復蛋白を有する細胞をＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアと接触させることを含む。こうしてこの方法は標的核酸を細胞性修復蛋白の存在下で配列改変ターゲティング・オリゴヌクレオチドと組み合わせ、この組み合わせに追加的にラムダベータ蛋白を加えるかまたは最初に細胞性蛋白類を有する細胞をＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアと接触させることを含む。
【００８１】
配列改変オリゴヌクレオチドおよび標的と、選択的に富化した細胞、培養細胞または無細胞抽出物中に存在する細胞性修復蛋白とをｅｘ  ｖｉｖｏで合一する。或いはその代わりに配列改変オリゴヌクレオチドと標的とをｉｎ  ｖｉｖｏで合一してもよい。この場合は細胞性修復蛋白は、体内に存在する細胞内に存在する。
【００８２】
本発明の方法、組成物、およびキットを使用して、標的配列中の１、２または３個のヌクレオチドの決失、挿入または置換などを含むあらゆる種類の改変に導くオリゴヌクレオチドによって仲介される改変を高めることができる。これらの改変されたヌクレオチドは互いに隣接していても隣接していなくてもよい。さらに１、２、または３つのマルチ配列改変に導くオリゴヌクレオチドによる核酸配列改変も、本発明のキットおよび方法を使用して高めることができる。このような多発突然変異の各々は、標的配列の１、２または３個のヌクレオチドの例えば決失、挿入または置換を含むことができる。これらの変化したヌクレオチド類は互いに隣接しても隣接しなくともよい。複数の配列標的の核酸配列改変が高まる場合、単一のオリゴヌクレオチドによって、または１、２または３個の別々のオリゴヌクレオチドによって多重改変が起こり得る。多重改変は単一のオリゴヌクレオチドによって起こるのが有益であり、多重改変は１ないし１０ヌクレオチドにおいて相互に起きる。
【００８３】
本発明の方法、組成物およびキットを使用して、二本鎖標的核酸のいずれかの鎖を標的にするオリゴヌクレオチドによって導かれる核酸配列改変の効率を高めることができる。特に有用な実施形態において、これらの方法を用いて、標的配列の非転写ストランドを標的にするオリゴヌクレオチドの効率を高めることができる。また別の有用な実施形態において、これらの方法を使用して標的配列の非転写ストランドを標的とするオリゴヌクレオチドの効率を高めることができる。
【００８４】
本発明の方法、組成物およびキットを使用して、核−および細胞小器官染色体、および人工染色体ＤＮＡ、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、植物人工染色体（ＰｌＡＣ）、バイナリー細菌人工染色体（ＢｉＢＡＣＳ）、およびヒト人工染色体（ＨＡＣ）などを含むゲノムＤＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドによって指示される核酸配列改変の効率を高めることができる。本発明の方法、組成物およびキットを使用して、その他の種類の標的、例えばプラスミド、コスミド、ファージミド、および組み込まれていないウィルスなどの分離されたエピソーム性標的のオリゴヌクレオチド媒介性配列改変の効率を高めることができる。
【００８５】
本発明の方法、組成物およびキットを使用して、エキソン、イントロン、プロモータ、エンハンサまたは３’−または５’−未翻訳領域などを含む遺伝子の任意の部分を標的にしたオリゴヌクレオチド媒介性標的配列改変の効率を高めることができる。さらに、本発明の方法、組成物、およびキットを使用して、遺伝子内または遺伝子間のオリゴヌクレオチド媒介性標的配列改変の効率を高めることができる。
【００８６】
本発明の方法、組成物、およびキットを使用して、広範囲にわたる細胞型における、または原核生物種および真核生物種を含む種々様々の種に由来する細胞型から誘導される蛋白抽出物内の、オリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変効率を高めることができる。
【００８７】
例えば、本発明の方法、組成物およびキットを使用して、下等真核生物から取り出される細胞内、例えば酵母細胞などの真菌細胞内で、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａのようなＰｉｃｈｉａ種、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓなどのＣａｎｄｉｄａ種；昆虫細胞またはその抽出物、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ種からの細胞（または抽出物）など；およびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓなどの線形動物類を含むこの種の細胞からの抽出物内における核酸配列改変効率を高めることができる。
【００８８】
本発明の方法、組成物およびキットを使用して、植物など、より高等な真核生物からの細胞、例えばＣｈｌａｍｉｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｌ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａなどの実験モデル植物から取り出される細胞（またはその抽出物）、その他にカリフラワー（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、アーチチョーク（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）などの農作物、りんご（Ｍｕｌｓ、ｅ．ｇ．ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）、マンゴ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ、ｅ．ｇ．ｉｎｄｉｃａ）、バナナ（Ｍｕｓａ、ｅ．ｇ．ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ベリー類（干しぶどうなど、Ｒｉｂｅｓ、ｅ．ｇ．ｒｕｂｒｕｍ）、キーウイ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ、ｅ．ｇ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ぶどう類（Ｖｉｔｉｓ、ｅ．ｇ．ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ピーマン（Ｃａｐｓｉｃｕｍ、ｅ．ｇ．ａｎｎｕｕｍ）、チェリー（スィートチェリーなど、Ｐｒｕｎｕｓ、ｅ．ｇ．ａｖｉｕｍ）、キューリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ、ｅ．ｇ．ｓａｔｉｖｕｓ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ、ｅ．ｇ．ｍｅｌｏ）、ナッツ（クルミなど、Ｊｕｇｌａｎｓ、ｅ．ｇ．ｒｅｇｉａ；ピーナッツ、Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇｅａｅ）、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ、ｅ．ｇ．ｍａｘｉｍａ）、ピーチ（Ｐｒｕｎｕｓ、ｅ．ｇ．ｐｅｒｓｉｃａ）、ナシ（Ｐｙｒａ、ｅ．ｇ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、プラム（Ｐｒｕｎｕｓ、ｅ．ｇ．ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ストロベリー（Ｆｒａｇａｒｉａ、ｅ．ｇ．ｍｏｓｃｈａｔａ  またはｖｅｓｃａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、ｅ．ｇ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）などの果物；アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ、ｅ．ｇ．ｓａｔｉｖｅ  またはｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、キャベツ（ｅ．ｇ．Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、キクヂシャ（Ｃｉｃｈｏｒｅｕｍ、ｅ．ｇ．ばｅｎｄｅｖｉａ）、ニラネギ（Ａｌｌｉｕｍ、ｅ．ｇ．ｐｏｒｒｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ、ｅ．ｇ．ｓａｔｉｖａ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ、ｅ．ｇ．ｏｌｅｒａｃｅａｅ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、ｅ．ｇ．ｔａｂａｃｕｍ）などの葉類およびフォーレージ；クズウコン（Ｍａｒａｎｔａ、ｅ．ｇ．ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）、ビート（Ｂｅｔａ、ｅ．ｇ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ、ｅ．ｇ．ｃａｒｏｔａ）、タピオカ（Ｍａｎｉｈｏｔ、ｅ．ｇ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、サツマイモ（ｌｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔａｓ）などの根類、；  ビーンズ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、ｅ．ｇ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ピー（Ｐｉｓｕｍ、ｅ．ｇ．ｓａｔｉｖｕｍ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｅ．ｇ．ｍａｘ）、ササゲ（Ｖｉｇｎａ  ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）、モスビーン（Ｖｉｇｎａ  ａｃｏｎｉｔｉｆｏｌｉａ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、ｅ．ｇ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｅ．ｇ．ｂｉｃｏｌｏｒ）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ、ｅ．ｇ．ｖｕｌｇａｒｅ）、コーン（Ｚｅａ、ｅ．ｇ．ｍａｙｓ）、米（Ｏｒｙｚａ、ｅ．ｇ．ｓａｔｉｖａ）、菜種（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｓｐ．）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、エンバク（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ、ｅ．ｇ．ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）などの種子油を含む種子類；コールラビ（Ｂｒａｓｓｉｃａ、ｅ．ｇ．ｏｌｅｒａｃｅａｅ）、ポテト（Ｓｏｌａｎｕｍ、ｅ．ｇ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）などの塊茎類；フラックス（Ｌｉｎｕｍ  ｅ．ｇ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、コットン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｅ．ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、パイン（Ｐｉｎｕｓ  ｓｐ．）、オーク（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｐ．）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐ．）などの繊維および木材植物；芝生（Ｌｏｌｉｕｍ，ｅ．ｇ．ｒｉｇｉｄｕｍ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ，ｅ．ｇ．ｘｈｙｂｒｉｄａ）、ヒアシンス（Ｈｙａｃｉｎｔｙｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｅ．ｇ．ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）、デルフィニューム（Ｄｅｌｐｈｙｎｉｕｍ，ｅ．ｇ．ａｊａｃｉｓ）、ジュズダマ（Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、ポピー（Ｐａｐａｖｅｒ，ｅ．ｇ．ｎｕｄｉｃａｕｌｅ）、ライラック（Ｓｙｒｉｎｇａ、ｅ．ｇ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アジサイ（ＨＹｄｒａｇｅａ  ｅ．ｇ．ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、バラ（ガリカス、アルバス、ダマスクス、ダマスク・  ペルペツアルス、センチホリアス、キナス、ティーズおよびハイブリッド・ティーズを含む）およびオマメンタル・ゴールデンロッズ（ｏｍａｍｅｎｔａｌ  ｇｏｌｄｅｎｒｏｄｓ）（ｅ．ｇ．Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｓｐｐ．）などの観賞植物類から取り出される細胞（またはその抽出物）における核酸配列改変効率を高めることができる。一般に、分離された植物細胞は本発明の組成物によって、および／または本発明の方法によって処理され、その後それらを使用して当業者に公知の方法によって植物全体を再生することができる。
【００８９】
本発明の方法、組成物、およびキットを使用して、動物、例えばヒナドリ、ガチョウ、アヒル、七面鳥、キジ、ダチョウ、およびハトなどの家畜および野生鳥；ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヤギュウなどの哺乳動物；サケ、テラピア、ナマズ、マスおよびバスなどの魚類；マウス、ラット、モルモットおよびウサギなどのモデル実験動物類；イヌやネコのような家庭用ペット；および人間；から取り出される細胞（またはその抽出物）の核酸配列改変効率を高めることができる。
【００９０】
本発明の方法、組成物、およびキットを使用して種々様々の組織および細胞型、例えば肝臓、肺、結腸、子宮頸部、腎臓および上皮、胚細胞、各系統多能性幹−または前駆細胞、例えばＣＤ３４＋造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞）および胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などから取り出した細胞（またはその抽出物）の核酸配列改変効率を高めることができる。
【００９１】
現在、ある司法管轄区域ではヒト幹細胞の培養および／または遺伝的増幅が禁止されている。このため、本発明の方法、組成物およびキットを使用してヒトＥＳ細胞（またはその抽出物）内の核酸配列改変効率を高めることができるとはいえ、本発明はある場合にはヒト胚性幹細胞を除く全ての細胞型で実施される。このような禁止は現在、ネズミ胚性幹細胞またはその他の動物からの幹細胞の培養および／または遺伝的増幅には該当せず、そのため本発明は人間以外の種、例えばマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ヤギ、サル、チンパンジー、および家畜などからの胚性幹細胞における配列改変効率を高めるために無制限に使用できる。
【００９２】
本発明の方法、組成物およびキットの各々を本発明のその他の方法、組成物およびキットの１つ以上と組み合わせて使用し、配列改変効率をさらに高めることができる。
【００９３】
その上、本発明の方法、組成物およびキットはオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変効率を高めるためのその他の方法と同時に使用することができる。
【００９４】
例えば、本発明の方法、組成物およびキットを使用して、ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群からの少なくも１つの蛋白の濃度または活性の増加または減少によって核酸配列改変効率が変化した細胞内に、配列改変を導入することができる。これらの群のメンバーとしては：ＲＡＤ５２エピスタシス群においてはＲＡＤ５０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５７、ＲＡＤ５９、ＭＲＥ１１およびＸＲＳ１；ミスマッチ修復群においてはＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６およびＰＭＳ１；ヌクレオチド除去修復群においてはＲＡＤ１、ＲＡＤ２、ＲＡＤ１０、ＲＡＤ２３およびＥＸ０１がある。名称“ＲＡＤ５２エピスタシス群”は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の名称に由来するが、細菌、植物、動物およびその他の菌類を含むその他の生物からのホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）、およびパラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ）が本発明の方法に使用できることは当然である。
【００９５】
特に、本発明の方法、組成物およびキットを使用して、ＲＡＤ１、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５７およびＰＭＳ１のホモログ、オルソログまたはパラログからなる群から選択される少なくも一つの蛋白の濃度または活性が低下している細胞に、配列改変を導入することができる。ＷＯ０２／１０３６４として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２３７７０および同一所有者の同時係属米国特許出願第１０／３５１，６６２号（２００３年１月２４日出願）などを参照されたい。これらの開示は参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【００９６】
或いは、または追加的に、本発明の方法、組成物およびキットを使用して、正常な対立遺伝子性ＲＡＤ１０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＭＲＥ１１、ＰＭＳ１またはＸＲＳ２蛋白の少なくも１つのレベル上昇に基づく、またはこれら蛋白の１つの活性上昇に基づいて核酸配列改変効率が変化した細胞（またはそれらの抽出物）に配列改変を導入することができる。２００２年９月２７日に出願された同一所有者の同時係属出願米国特許出願第１０／２６０，３７５号を参照されたい。この開示は参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【００９７】
本発明の方法、組成物およびキットは、オリゴヌクレオチド標的核酸配列改変を高める諸方法と共に使用してオリゴヌクレオチドによって指示される標的核酸配列改変中のスクリーニングに必要な核酸分子の数を減らすこともできる。
【００９８】
本明細書中で以下の実施例に詳細に記載され、説明されるように、このような方法は少なくも第一および第二のオリゴヌクレオチドの使用を含む：これらオリゴヌクレオチドの各々は少なくも第一および第二核酸標的それぞれを改変に導くことができる。少なくも第二オリゴヌクレオチドは、その後に選択される選択可能の表現型を生成する改変を指示する。第一オリゴヌクレオチドは選択可能の表現型を生成する改変を指示するとはいえ、第一オリゴヌクレオチドは、スクリーニング、例えば対応する核酸配列を決定するとかまたは改変事象によって作られる選択不可能の表現型を分析試験するなどによって確認しなければならない改変を指示するのが一般的である。
【００９９】
二重ターゲティング・アプローチは、スクリーニングに必要な核酸分子数を、選択可能の表現型をもたらすオリゴヌクレオチド標的核酸配列改変のためにこれまでは選択されなかった、組成物中のスクリーニングすべき数に比較して少なくも約２分の１に減らす。その減少は少なくも約２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１２分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１および５０分の１またはそれ以上の減少にもなる。
【０１００】
第二のオリゴヌクレオチドによる配列改変は当業者に公知の選択可能の表現型を与えることができる。その選択は、一部には選択される宿主細胞に依存し、またはその選択がｉｎ  ｖｉｔｒｏで起きるかｉｎ  ｖｉｖｏで起きるかによる。例示的な選択可能表現型は、例えば抗生物質またはその他の化学的耐性、栄養源の使用可能性、蛍光蛋白の発現、エピトープの存在、またはアポトーシス信号に対する耐性などを含む。
【０１０１】
また別の変法において、本発明の方法、組成物およびキットを上記のように、ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド除去修復群中の少なくも１つの精製蛋白の投与をさらに含んでなる二重ターゲティング法に使用することができる。ある実施形態において、この方法は、２つの明確な蛋白が操作される細胞に、上記２つのオリゴヌクレオチドを与えることを含む−例えば、１つの染色体遺伝子のノックアウト、および第二の遺伝子産物の補体化（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）または補充によって、第二蛋白のレベルを高めまたは変化させる。このような実施形態において、標的細胞は染色体ＲＡＤ５２遺伝子にノックアウト突然変異を有し、その細胞は、構成的プロモータなどのプロモータの制御下で途中に発現するＲＡＤ５１遺伝子産物で補体化されるか補充される。
【０１０２】
また別の実施形態において、本発明の方法、組成物およびキットは、変化した核酸配列改変効率をあらわす成長サイクル、発育状態または細胞周期ポジションの特定相にある細胞（またはその抽出物）と組み合わせて使用される。核酸配列改変に特に好ましい発育の特定相を容易に決定するには、例えば成長過程全体にわたって成長周期中の複数時点で細胞をサンプリングし、本明細書に記載の分析試験（ａｓｓａｙ）を使用してこれら細胞における配列改変をモニターする。核酸配列改変に特に好ましい成長周期相は、例えば誘導期、初期対数期、対数期、後期対数期、対数期と定常期との移行期、初期定常期および後期定常期などである。言い換えれば、これらは細胞サイクルのＳ期、Ｍ期、Ｇ１期またはＧ２期またはこれらフェーズ間の移行点でもある。特に発達するフェーズは、例えばホルモン処理またはその他の処理によって分化が誘発された細胞、または特定組織から分離した分化細胞において同様に分析できる。
【０１０３】
本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチド類（オリゴヌクレオチド含有組成物を含む）を当業者に公知の技術によって細胞または組織に導入することができる。このような技術には、例えばエレクトロポレーション、リポソーム  トランスファー、裸の核酸導入法、パーティクル・ボンバードメント、燐酸カルシウム沈殿法などがある。一実施形態において、トランスフェクションはリポソーム性トランスファー化合物、例えばＤＯＴＡＰ（Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム  メチルスルフェート、ベーリンガー・マンハイム社）またはリポフェクチン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）のような同等物などで行われる。もう一つの実施形態において、トランスフェクション技術はカチオン性脂質を使用する。好ましい一実施形態において、トランスフェクションはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）２０００（インヴィトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて行われる。本発明の方法は広範囲の濃度のオリゴヌクレオチドで使用できる。例えば１０ｎＭ／１０５細胞で良い結果が得られる。１０５細胞あたりＤＯＴＡＰ３μｇ中約５００ｎｇのオリゴヌクレオチドの割合を使用することができる。トランスフェクトされた細胞は例えば無血清培地、ヒト血清アルブミンまたはヒト血清を補充した培地など、種々の培地に培養できる。
【０１０４】
トリコスタチンＡのようなＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵどちらかを含む本発明の方法、組成物およびキットでは、ＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵを含まない場合の同法に比較して核酸配列改変効率がそれぞれ２倍高まるのが普通である。核酸配列改変効率の増加は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０、および５０倍またはそれ以上にもなることがある。ベータ蛋白を含む本発明の方法、組成物およびキットはＤＮＡ配列の改変効率を、ベータ蛋白に欠ける同法に比較して少なくも２倍高めるのが一般的であり、その効率を５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍またはそれ以上に高めることもできる；ある実施形態において、ベータ蛋白を含む本発明の方法、組成物およびキットは、ベータ蛋白に欠ける同じ方法に比較して効率を、２倍未満、例えば１．９倍、１．５倍または１０％、２０％、３０％、４０％だけ高める。
【０１０５】
ＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵを使用する本発明の方法の実施形態において、細胞を先ず始めにＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアと接触させ、その後オリゴヌクレオチドを細胞性修復蛋白の存在下で標的と一緒にする。或いは、上記オリゴヌクレオチドと上記標的とを組み合わせると同時にＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアを上記細胞に接触させてもよい。また別の実施形態において、オリゴヌクレオチドを標的と組み合わせた後でＨＤＡＣインヒビタまたはヒドロキシウレアと上記細胞とを接触させてもよい。
【０１０６】
ＨＤＡＣインヒビタはトリコスタチンＡでよい。しかし、その他のＨＤＡＣインヒビタもこれらの目的に適することは当業者には当然である。例えば、参考としてそのまま本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００２／０１４３０５２号は、亜鉛結合部分の存在によってＨＤＡＣインヒビタ活性を有する化合物を開示している。本発明の目的に適するＨＤＡＣインヒビタのその他の例は、酪酸、ＭＳ−２７−２７５、スベロイルアニリド  ヒドロキサミン酸（ＳＡＨＡ）、オキサムフラン、トラポキシンＡ、デプデシン、ＦＲ９０１２２８（デプシペプチドとしても公知である）、アピシジン、ｍ−カルボキシ−ケイヒ酸ビスヒドロキサミン酸（ＣＢＨＡ）、スベリン  ビスヒドロキサミン酸（ＳＢＨＡ）およびピロキサミドなどである。マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓ．  ９２巻（１５号）、１２１０−１２１６ページ（２０００）を参照されたい。この開示は参考としてその全体が本明細書中に援用される。適切なＨＤＡＣインヒビタの別の例は、ＷＯ００／２３５６７に開示されるクラミドシン、ＨＣ−トキシン、Ｃｙｌ−２、ＷＦ−３１６１、およびラディシコルである。この開示は参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【０１０７】
ＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵを細胞または細胞抽出物に与える際、投与量および投与時機は細胞型を含む種々の要因に依存する。
【０１０８】
ＴＳＡの場合、投与量は１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μｇ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭまたはそれ以上でもよいし、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、またはそれ以下でもよい。ＨＵの場合、投与量は１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、１Ｍまたはそれ以上でもよいし、１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭまたはそれ以下でもよい。
【０１０９】
ＨＵの場合、処理は１００ｍＭ、７５ｍＭ、５０ｍＭ、４０ｍＭ、２０ｍＭ、１０ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭまたはそれ以下で行うことができる。投与量は酵母細胞では約４ｍＭないし１００ｍＭが好ましく、哺乳動物細胞では約０．０５ｍＭないし３ｍＭが好ましい。投与量は少なくも０．０５ｍＭ、０．１０ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．２０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．３０ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．４０ｍＭ、０．５０ｍＭまたはそれ以上でよく、少なくも０．５５ｍＭ、０．６０ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．７０ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．８０ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．９０ｍＭ、０．９５ｍＭ、または１ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭまたはそれ以上を含む。哺乳動物細胞の場合の用量は一般的には約３．０ｍＭ未満であり、２．５ｍＭ、２．０ｍＭ、１．５ｍＭ、１．０ｍＭ未満、０．９０ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．８０ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．７０ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．６０ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．５０ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．４０ｍＭ未満、そして約０．３５ｍＭまたは０．３０ｍＭ未満でもよい。
【０１１０】
配列改変オリゴヌクレオチドと一緒にする前の種々の時点に細胞をＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵの存在下で増殖させることができ、細胞抽出物はＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵで処理することができる。増殖または処理は１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２０時間または、より長く２８日、１４日、７日などでもよいし、より短かく、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間またはそれより短くてもよい。或いは、ＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵおよび配列改変オリゴヌクレオチドによる細胞または細胞抽出物の処理が同時に起きてもよいし、オリゴヌクレオチド添加後にＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵをそれぞれ加えてもよい。
【０１１１】
さらに、配列改変オリゴヌクレオチド処理の前の種々の時点に、ＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵが存在しない条件下で細胞を増殖させることによって、それら細胞をＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵ処理から回復させることができる。回復は１０分、２０分、４０分、６０分、９０分、２時間、４時間またはそれ以上長くてもよいし、９０分、６０分、４０分、２０分、１０分またはそれより短くてもよい。細胞はそれらを配列改変オリゴヌクレオチドで処理した後に回復させてもよい。この回復期間は１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間またはそれ以上でもよく、または８時間、６時間、４時間、２時間、１時間またはそれより短い時間でもよい。ＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵはこの回復期間中、細胞培地に存在していても、存在していなくともよい。
【０１１２】
ＨＤＡＣインヒビタおよびＨＵの細胞または細胞抽出物への最適用量および時機および投与期間は日常的実験によって決定できる。
【０１１３】
例えば、ＴＳＡのようなＨＤＡＣインヒビタによる処理の最適用量および時期は以下の実施例６に記載のアッセイ系を使用して決定できる。培養細胞（酵母細胞など）は、配列改変オリゴヌクレオチドのエレクトロポレーション前の種々の時間、種々濃度のＨＤＡＣインヒビタで処理される。種々の時間回復させた後、それら細胞を培養し、配列改変効率を試験する。修正の最高効率をもたらすパラメーター類を選択する。この方法を必要に応じてその後繰り返し、前処理の用量、時間、回復期間（もしあれば）の長さなどをさらに最適化する。
【０１１４】
ＨＵについて同様なアプローチを、以下の実施例８に示すアッセイ系を使用して決定することができる。
【０１１５】
このようなアッセイ、またはその明らかな変法を実施して選択したあらゆる細胞型のための条件を最適化することができる。
【０１１６】
ベータ蛋白を使用する本発明の第一の局面の実施形態において、配列改変オリゴヌクレオチドと標的核酸との組み合わせにラムダベータ蛋白を加える。ここに用いる用語“ベータ蛋白”はバクテリオファージラムダのあらゆる菌株からのＲｅｄ組換え系のｂｅｔ遺伝子から発現する蛋白を言う。この用語は付加的に、相同組換え、遺伝子修復メカニズム、またはオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変によってＤＮＡ配列を改変する効率をなお高めることができる、天然の完全遺伝子産物から誘導されるベータ蛋白の改変体も包含する。ベータ蛋白のこのような改変体は、非制限的に、ベータ蛋白とその他の蛋白類またはペプチド類との融合物；ベータ蛋白の断片類；一次アミノ酸配列に変化を含むベータ蛋白を含む。当業者には明らかなように、遺伝暗号の縮退により、多くの異なる遺伝子配列がベータ蛋白をコードすることができる。例えば、当業者の知識によると、ベータ蛋白をコードする一つ以上の合成遺伝子を作ることができる。しかしその合成遺伝子は、その遺伝子が発現される細胞に都合のよい、天然ベータ遺伝子に見いだされるコドンとは異なるコドンを含む。
【０１１７】
本発明の方法の実施形態によると、ベータ蛋白は、改変が望まれる標的ＤＮＡ配列を含む細胞中に導入され、やはり細胞中に存在する標的核酸配列改変オリゴヌクレオチドによる標的遺伝子修復効率を高める。理論によって束縛されるものではないが、ベータ蛋白は、相同組換えメカニズムにではなく、標的遺伝子修復メカニズムに関与することによって、このような細胞中の標的ＤＮＡ配列を改変する効率を高めると考えられる。本発明の方法によって所望通りに改変されたＤＮＡ配列は、細胞の天然染色体内に、または染色体外の要素内の残遺物（非制限的に、ＤＮＡ断片、プラスミド、ファージミド、ウィルスゲノム、原核細胞ゲノム、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはヒト人工染色体など）に含まれ得る。
【０１１８】
ベータ蛋白はＤＮＡのオリゴヌクレオチド媒介性標的配列改変効率を、ベータ蛋白欠乏時の同じ方法に比較して、２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍以上も高めることができ、またはたった５００倍、２５０倍、１００倍、９０倍、８０倍、７０倍、６０倍、５０倍、４０倍、３０倍、２５倍、２０倍、１５倍、１０倍、５倍、２倍、１．５倍それ以下にもできる。
【０１１９】
次に記すような種々の細胞型において標的核酸配列改変オリゴヌクレオチドを使用するＤＮＡ配列の改変効率を高めるためにベータ蛋白を使用することができる：すなわち非制限的に、細菌細胞のような原核細胞；並びに酵母およびその他の真菌細胞を含む真核細胞；双子葉植物細胞および単子葉植物細胞を含む植物細胞；および昆虫細胞などの無脊椎動物細胞を含む動物細胞；ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物細胞などの脊椎動物細胞、等々。
【０１２０】
ベータ蛋白が遺伝子修復メカニズムによるＤＮＡ配列改変効率を高めるように前記ベータ蛋白を細胞内に導入する、当業者に公知の種々の方法が提供されている。ベータ蛋白は蛋白として直接細胞内に導入することができ、または細胞の転写および翻訳メカニズムによって働く際には、ベータ蛋白をコードするベータ蛋白発現構成物を細胞内に導入するという様態で間接的に導入することもできる。このような構成物は予備転写されたｍＲＮＡの形であるか、または転写され得るＤＮＡ発現ベクターの形である。
【０１２１】
ベータ蛋白を細胞内に導入するための蛋白固有の技術には、非制限的に、アクティブ・モティフ（Ａｃｔｉｖ  Ｍｏｔｉｆ）社（カールスバッド、ＣＡ）から提供されるシャリオット（Ｃｈａｒｉｏｔ）（登録商標）蛋白トランスフェクション試薬；ベータ蛋白とペネトラチン１（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ蛋白の断片）との間の化学結合；ベータ蛋白と、ＨＩＶ−１  ＴＡＴ蛋白または単純ヘルペスウィルス−１蛋白ＶＰ２２との蛋白融合などがある。
【０１２２】
その他の方法が、ベータ蛋白およびベータ蛋白をコードする核酸を細胞内に導入するために使用できる。このような方法は、非制限的に、マイクロインジェクション；エレクトロポレーション；リポフェクチン、リポフェクタミンのような帯電脂肪親和性分子などの化学的試薬を用いるトランスフェクション；バイオリスティック・トランスフェクション；燐酸カルシウム共沈殿法；およびカチオン性リポソームを含むリポソーム類と細胞の細胞膜との融合、などを含む。
【０１２３】
さらに別の方法は、細胞に感染できるウィルスベクターの使用を含む、ベータ蛋白をコードする核酸の細胞内への導入に適する。
【０１２４】
ベータ蛋白の発現のためにベクターを使用しなければならない場合、当業者に公知の技術を使用して、ベクター蛋白コーディング配列を当業者が選択した適切なベクターにクローン化するのが一般的である。ベータ蛋白ベクターを含む細胞類は宿主細胞として公知である。宿主細胞はベータ蛋白を生産し、その後ベータ蛋白は当業者に公知の方法を使用して精製される、或いは、ある宿主細胞は、オリゴヌクレオチド媒介性配列改変効率を高める目的でその細胞中でベータ蛋白を発現させるという細胞であってもよい。
【０１２５】
理論によって束縛されるものではないが、細胞内に直接的または間接的に導入されるベータ蛋白の量を種々変えると、ＤＮＡ配列改変効率を調節できる程度の影響があらわれると考えられる。ベータ蛋白を細胞に直接導入する場合、ベータ蛋白の量を変えることによって用量を調節できる。宿主細胞に含まれるベクターから生成するベータ蛋白の量も、当業者に公知の方法によって変えることができる。このような方法には、各ベクター分子に存在するベクター蛋白コーディング配列の数を変えること；各細胞に含まれるベクター分子の平均数を変えること；そのベクターに存在する転写および翻訳調節要素の強度を変えること；ベクターから生成するｍＲＮＡの安定性を変えること；１つ以上の誘導可能の転写調節要素を介してベータ蛋白発現を誘発することができる環境変数の強度または程度を変えることなどが含まれる。細胞内に直接または間接に導入されるベータ蛋白の量を調節するその他の方法は当業者の知識の範囲内である。
【０１２６】
１細胞あたり導入されるベータ蛋白の平均量は１×１０−１９グラム、１×１０−１８グラム、１×１０−１７グラム、１×１０−１６グラム、１×１０−１５グラム、１×１０−１４グラム、１×１０−１３グラム、１×１０−１２グラム、１×１０−１１グラム、１×１０−１０グラム、１×１０−９グラム、１×１０−８グラムから１×１０−７グラム以上まで変動し得る。１細胞に導入されるベータ蛋白の平均量は１×１０−６グラム、１×１０−７グラム、１×１０−８グラム、１×１０−９グラム、１×１０−１０グラム、１×１０−１１グラム、１×１０−１２グラム、１×１０−１３グラム、１×１０−１４グラム、１×１０−１５グラム、１×１０−１６グラム、１×１０−１７グラムから、１×１０−１８グラム以下にまで変動し得る。
【０１２７】
これらのベクターは、特に、宿主細胞中のベータ蛋白コーディング配列を増殖させるために（クローニングベクター）、ベータ蛋白コーディング配列を、異種生物から誘導された宿主細胞間を行き来させるために（シャトルベクター）、ベータ蛋白コーディング配列を宿主細胞染色体に挿入するために（挿入ベクター）、ベータ蛋白を単独でまたは非相同ポリペプチドとの融合体としてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは宿主細胞内で発現させるために使用できる。
【０１２８】
ベクターは今や当業者には公知であり、特にジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら（編集）、ベクター：クローニング・アプリケーション：必須技術（必須技術シリーズ）（Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ））、ジョ  ン  ウィリー＆ソン社、１９９８（ＩＳＢＮ：０４７１９６２６６Ｘ）；ジョーンズら（編集）、ベクター：発現系：必須技術（必須技術シリーズ）（Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ））、ジョン  ウィリー＆ソン社、１９９８（ＩＳＢＮ：０４７１９６２６７８）；ガセサ（Ｇａｃｅｓａ）ら、ベクター：必須データ（Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄａｔａ）、ジョンウィリー＆ソンズ社、１９９５（ＩＳＢＮ：０４７１９４８４１１）；シド−アレグ（Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ）（編集）、ウィルスベクター：基礎科学および遺伝子治療（Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、イートン・パブリッシング社、２０００（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３５Ｘ）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（３版）、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、２００１（ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；アウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（編集）、分子生物学におけるショートプログラム：分子生物学における最新プロトコルによる方法概論（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（４版）、ジョンウィリー＆ソンズ、１９９９（ＩＳＢＮ：０４７３１３２９３８Ｘ）に記載されている、これらの開示は参考としてその全体が本明細書中に援用される。さらに、膨大な種類のベクターが市販されている。現存のベクター類の使用およびその変形は当業者には公知であるから、基礎的特徴だけをここに記載する。
【０１２９】
一般的にはベクター類はウィルス、プラスミド、原核または真核生物の染色体要素、またはそれらの組み合わせから誘導され、少なくも１つの複製起点、一般的には複数の密に凝集した単一切断制限部位を有するポリリンカーの形をした少なくとも１つの非相同核酸挿入部位、および少なくとも１つの選択マーカーを含む；ただしある組込みベクターには、宿主において染色体を改変するようにはたらく開始点がなく、あるベクターには選択マーカーがない。本発明のベクター類はさらに、そのベクターの少なくも１個所に挿入された少なくも１つのベータ蛋白コーディング配列を含む。
【０１３０】
存在する場合、複製起点および選択マーカーは所望宿主細胞または宿主細胞類に基づいて選ばれる；宿主細胞自体は所望の用途に基づいて選択される。
【０１３１】
原核細胞、一般的には大腸菌の場合、ベクターの複製は大腸菌感染ファージ、例えばファージラムダ、Ｍ１３、Ｔ７、Ｔ３およびＰ１など、の複製法で予測される、または自動的に複製するエピソーム類、特にＣｏｌＥ１プラスミドおよびその後の誘導体類、例えばｐＢＲ３２２およびｐＵＣシリーズプラスミド等の複製起点で予測される。大腸菌を宿主として使用する場合、選択マーカーもグラム陰性菌における選択性で選ばれる：例えば典型的マーカーはアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゼオシンなどの抗生物質に耐性を与える。栄養素要求マーカーも使用できる。
【０１３２】
酵母細胞、一般的にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合、酵母に使用する本発明のベクターは必ずというわけではないが、一般的に酵母に使用するのに適した複製起点と、酵母中で機能する選択マーカーを含む。
【０１３３】
組込み型ＹＩｐベクターは自動的には複製せず、一般的には単一コピーで低頻度で酵母ゲノムに合体し、宿主細胞染色体の一部として複製する；これらのベクターは細菌細胞中におけるベクターの増殖に適した複製起点を少なくも１つは有するのが普通であるとはいえ、これらのベクターには酵母中で機能する複製起点が欠けている。これに対してＹＥｐベクターは酵母の２ミクロンのプラスミド起点（２μｍ  ｏｒｉ）が存在するため、エピソームによって自律的に複製する。ＹＣｐ酵母動原体プラスミドベクターは動原体配列、ＣＥＮ、および自律的に複製する配列、ＡＲＳ、を含む自律的に複製するベクターである；ＡＲＳ配列は酵母染色体の天然の複製起点に対応すると考えられる。ＹＡＣｓはＹＬｐと呼ばれる酵母線状プラスミドを基礎にしており、このプラスミドはテロマー（ＴＥＬ）としてｉｎ  ｖｉｖｏで機能する相同または非相同ＤＮＡ配列を含み、酵母ＡＲＳ（複製起点）およびＣＥＮ（動原体）セグメントも含む。
【０１３４】
酵母ベクターの選択マーカーは種々の栄養素要求マーカーを含む；その最も一般的なものは（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の）ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２であり、これらはｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−Ｄ１、ｌｅｕ２−Ｄ１、ｔｒｐ１−Ｄ１およびｌｙｓ２−２０１など、特異的栄養素要求性変異を補完する。ＵＲＡ３およびＬＹＳ２酵母遺伝子はさらに固有のインヒビタ、５−フルオローオロチン酸（ＦＯＡ）およびα−アミノアジピン酸（αＡＡ）それぞれに基づく負の選択を可能にする。上記インヒビタはそれぞれ、原栄養体株の増殖は阻止するが、ｕｒａ３およびｌｙｓ２突然変異体を増殖させる。その他の選択マーカーは例えばゼオシンに対する耐性を与える。
【０１３５】
宿主細胞がＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のものである場合−例えばＳｆ９およびＳｆ２１細胞系、およびｅｘｐｒｅｓＳＦ（登録商標）細胞（プロテイン・サイエンシス社、メリデン、ＣＴ、ＵＳＡ）−、ベクター複製法はバキュロウィルス生活サイクルに基づくのが普通である。一般的にバキュロウィルス・トランスファーベクターは野生型ＡｃＭＮＰＶポリヘドリン遺伝子をベータ蛋白コーディング配列で置換するために使用される。野生型ゲノム中のポリヘドリン遺伝子にフランクする配列は上記トランスファーベクターの発現カセットの５’および３’末端にある。ＡｃＭＮＰＶ  ＤＮＡとの同時トランスフェクション後、相同組換え事象がこれらの配列間で起き、ベータ蛋白コーディング配列およびポリヘドリンまたはｐ１０プロモータを担持する組換えウィルスが生成する。選択はｌａｃ融合活性のビジュアル・スクリーニングに基づいて行うことができる。
【０１３６】
哺乳動物細胞の場合、自律的染色体外複製のためのベクター類は一般的にはＳＶ４０オリジンなどのウィルス・オリジン（大きいＴ−抗原を発現する細胞系、例えばＣＯＳ１およびＣＯＳ７細胞などにおける複製用）、パピローマウィルス・オリジン、または長期エピソーム複製のためのＥＢＶオリジン（ＥＢＶ  ＥＢＮＡ−１遺伝子産物を構成的に発現する例えば２９３−ＥＢＮＡなどに使用するため）を含む。組込みのためのベクター、したがって哺乳動物染色体の一部として複製するためのベクターは、（必須ではないが）哺乳動物細胞内で機能する複製起点、例えばＳＶ４０オリジンなどを含むことができる。アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ワクシニアウィルス、および種々の哺乳動物レトロウィルスなどのウィルスに基づくベクター類は一般的にウィルス複製戦略によって複製する。
【０１３７】
哺乳動物細胞に使用するための選択マーカー類には、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ブラスチジン、ハイグロマイシンおよびゼオシンに対する耐性が含まれ、ＨＡＴ培地を使用するプリンサルベージ経路に基づく選択が含まれる。
【０１３８】
植物細胞の場合、ベクターのレプリコンは、一般的には植物ウィルス（例えばカリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウィルス、ＴＭＶ）および植物に適するように選択された選択マーカーから誘導される。
【０１３９】
本発明はさらに、ベータ蛋白コーディング配列を含むベクターとして使用するための人工的染色体−ＢＡＣｓ、ＢｉＢＡＣｓ、ＹＡＣｓ、ＰＡＣｓ、およびＨＡＣｓ−を提供する。
【０１４０】
ＢＡＣ系は十分特徴づけられた大腸菌Ｆ−因子（宿主細胞のスーパーコイル・サーキュラーフォームに存在する低コピープラスミド）を基礎とする。Ｆ−因子は個々のヒトＤＮＡクローンのメンテナンスを安定化し、クローン化ＤＮＡの操作を容易にする。シズヤら、Ｋｅｉｏ  Ｊ．Ｍｅｄ．  ５０巻（１号）：２６−３０ページ（２００１）；シズヤら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻（１８号）：８７９４−７ページ（１９９２）を参照されたい。
【０１４１】
ＹＡＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏでテロマー（ＴＥＬ）として機能する相同または非相同ＤＮＡ配列並びに酵母ＡＲＳ（複製起点）およびＣＥＮ（セントロマー）セグメントを含むＹＬｐと呼ばれる酵母線状プラスミドを基礎としている。
【０１４２】
ＨＡＣはヒト人工染色体である。クロイワら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．  １８巻（１０号）：１０８６−９０ページ（２０００）；ヘニング（Ｈｅｎｎｉｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻（２号）：５９２−７ページ（１９９９）；ハリントン（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  １５巻（４号）：３４５−５５ページ（１９９７）。一変法において、アルファサテライトＤＮＡの長い合成アレーをテロマーＤＮＡおよびゲノムＤＮＡと組み合わせ、選択せずに細胞分裂的および細胞発生的に安定な線状ミクロ染色体を生成する。
【０１４３】
ＰＡＣはＰ１誘導性人工染色体である。ステンバーグ（Ｓｔｅｍｂｅｒｇ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻（１号）：１０３−７ページ（１９９０）；ステンバーグら、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ２巻（２号）：１５１−６２ページ（１９９０）；ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻（６号）：２０５６−６０ページ（１９９２）。
【０１４４】
本発明のベクター類は挿入された非相同核酸からのＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を可能とする要素も含むことが多い。このようなベクター類は核酸挿入物にフランクするＴ７、Ｔ３またはＳＰ６に由来するようなファージプロモータを含むのが一般的である。２種類のそのようなプロモータが挿入核酸にフランクし、センスおよびアンチセンス鎖両方のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成を分離することがよくある。
【０１４５】
本発明の発現ベクター−すなわちベータ蛋白コーディング配列の発現を推進するベクター類−はそのコーディング配列に操作可能に結合する種々のその他の遺伝要素、すなわち一般的にはプロモータおよびエンハンサ要素など、転写を促進する遺伝要素、転写ターミネータおよび／またはポリアデニレーション信号などの、ＲＮＡプロセッシングを容易にする遺伝要素、そしてリボソーム性コンセンサス配列などの翻訳を容易にする遺伝要素などを含むことがよくある。
【０１４６】
例えば、原核細胞、典型的には大腸菌、において本発明の蛋白を発現するベクターはプロモータを含む；ファージラムダｐＬプロモータなどのファージプロモータ、ｔｒｃプロモータ（ｔｒｐおよびｌａｃプロモータから誘導されるハイブリッド）、バクテリオファージＴ７プロモータ（大腸菌細胞内で操作され、Ｔ７ポリメラーゼを発現する）、またはａｒａＢＡＤオペロンが含まれることが多い。そのような原核細胞発現ベクターはさらにａｓｐＡターミネータなどの転写ターミネータ、およびコンセンサス・リボソーム結合部位、翻訳終止コドンなど翻訳を容易にする要素も含むことが多い。ショマー（Ｓｃｈｏｍｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻：８５０６−８５１０ページ（１９８６）。
【０１４７】
また別の実施例において、酵母細胞、典型的にはＳ．ＣＥＲＥＶＩＳＩＡＥにおいて本発明の蛋白を発現するベクター類は、ＣＹＣ１プロモータ、ＧＡＬ１プロモータ、ＡＤＨプロモータまたはＧＰＤプロモータなどの酵母プロモータを含み、一般的には、転写終結を容易にする要素類、例えばＣＹＣ１又はＡＤＨ１遺伝子からの転写終結シグナルなどを含む。
【０１４８】
また別の例において、哺乳動物細胞においてベータ蛋白コーディング配列を発現するベクター類は、哺乳動物細胞中で活性を有するプロモータを含む。そのようなプロモータは哺乳動物のウィルスに由来することが多く、例えばヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の即時初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ）からのエンハンサ−プロモータ配列、ラウス肉腫ウィルス末端反復配列（ＲＳＶＬＴＲ）からのエンハンサ−プロモータ、およびＳＶ４０からのエンハンサ−プロモータなどである。発現は、後期ＳＶ４０ポリアデニレーション部位およびポリアデニレーション信号などのポリアデニレーション部位およびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子からの転写終結配列、およびリボソーム結合部位の挿入によって高まることが多い。さらに、ベクター類は、ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩなどのイントロン、およびＳＶ４０スプライス要素を含むことができる。
【０１４９】
ベクター−駆動蛋白発現は構成的または誘導性でよい。
【０１５０】
誘発性ベクターには天然誘発性プロモータ類、例えばｌａｃオペロンによって調節されるｔｒｃプロモータ、およびトリプトファンによって調節されるｐＬプロモータ、デキサメサゾンによって誘発されるＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモータなどがあり、または隣接プロモータに誘導性コントロールを与える合成プロモータ類および／または付加的要素を含むことができる。誘導性合成プロモータの例はハイブリッドＰｌａｃ／ａｒａ−１プロモータおよびＰＬｔｅｔＯ−１プロモータである。ＰＬｔｅｔＯ−１プロモータはファージラムダのＰＬプロモータからの高い発現レベルを利用するが、ラムダリプレッサー部位をＴｎ１０テトラサイクリン耐性オペロンのオペロン２の２つのコピーで置換されると、このプロモータはＴｅｔリプレッサー蛋白によって強く抑制され、テトラサイクリン（Ｔｃ）および、アンヒドロテトラサイクリンなどのＴｃ誘導体に反応して誘発されるようになる。
【０１５１】
誘導性要素のその他の例として、グルココルチコイド反応要素（ＧＲＥ）およびエストロゲン反応要素（ＥＲＥ）などのホルモン反応要素は、対応スルホルモンレセプタを有する細胞に発現させるためにベクターを使用する際には、ホルモン誘発性を与えることができる。発現のバックグラウンドレベルを低下させるために、昆虫ホルモンであるエクジソンに反応する要素を代わりに使用して、エクジソンレセプタを同時発現させる。
【０１５２】
発現したベータ蛋白が、精製および／または可視化を容易にする小蛋白タグと融合するように、発現ベクターを設計することができる。
【０１５３】
例えば、ベータ蛋白をポリヒスチジンタグと共に発現させることができる；ポリヒスチジンタグは、ＮｉＮＴＡ樹脂（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（登録商標）社、バレンシア、ＣＡ、ＵＳＡ）またはＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂（コバルト固定アフィニティークロマトグラフィー培地、クロンテク・ラボ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ）、パロアルト、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用する固定金属アフィニティークロマトグラフィーによる融合蛋白の精製を容易にする。また別の例として、ベータ融合蛋白は、キチン結合タグおよび自己切採インテインを含むことができ、、融合タグの自己除去を伴うキチン−ベースの精製が可能である（ＩＭＰＡＣＴ（登録商標）システム、ニューイングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社、ビバリー、ＭＡ、ＵＳＡ）。或いは、ベータ融合蛋白はカルモジュリン結合ペプチド・タグを含み、カルモジュリン・アフィニティー樹脂（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ、ＣＡ、ＵＳＡ）による精製を可能とし、またはビオチンカルボキシラーゼ担体蛋白の固有の切採可能断片を含み、アビジン樹脂およびその後のタグ除去によるｉｎ  ｖｉｖｏビオチニル化蛋白の精製を可能にする（プロメガ、マジソン、ＷＩ、ＵＳＡ）。また別の有用な例として、ベータ蛋白をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合体として発現させることができる。グルタチオンとの結合の親和性および特異性により、グルタチオン・アフィニティー樹脂、例えばグルタチオン−スーパーフロー（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）樹脂（クロンテク・ラボラトリーズ、パロアルト、ＣＡ、ＵＳＡ）などを用い、その後遊離グルタチオンにより溶出するという方法による精製が可能である。
【０１５４】
その他のタグには、例えば抗−Ｘｐｒｅｓｓ抗体（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出できるエックスプレス（Ｘｐｒｅｓｓ）（登録商標）エピトープ、抗−ｍｙｃタグ抗体によって検出できるｍｙｃタグ、抗−Ｖ５抗体（インビトロゲン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出できるＶ５エピトープ、抗−ＦＬＡＧ（登録商標）抗体（ストラタジーン、ラジョラ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって検出できるＦＬＡＧ（登録商標）エピトープなどがある。
【０１５５】
発現したベータ蛋白の分泌のために、ベクターは、リーダーペプチドなどの分泌シグナルをコードする適切な配列を含むことができる。例えば、ｐＳｅｃＴａｇ２ベクター（インビトロゲン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）は、マウスｌｇカッパ鎖のＶ−Ｊ２−Ｃ領域からの分泌シグナルを担い、種々の哺乳動物細胞系からのベータ蛋白を効率的に分泌させる５．２ｋｂの哺乳動物発現ベクターである。
【０１５６】
本発明のベータ蛋白、ベータ蛋白融合体、およびベータ蛋白断片類の長期間の高収率組換え生産のためには、安定的発現が特に有用である。
【０１５７】
安定的発現は、選択マーカーを有するベクターを宿主細胞ゲノムに組み込み、その後インテグラントを選択することによって容易に実現する。
【０１５８】
広範囲の哺乳動物組織型および細胞系において異種蛋白を高水準で安定的に発現するために、例えばｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ  Ａ、Ｂ、およびＣベクター（インビトロゲン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）が設計されている。ｐＵＢ６／Ｖ５−ＨｉｓはヒトユビキチンＣ遺伝子からのプロモータ／エンハンサ配列を使用し、組換え蛋白の発現を促進する：２９３、ＣＨＯ、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞における発現レベルはＣＭＶおよびヒトＥＦ−１ａプロモータからのレベルに匹敵する。ｂｓｄ遺伝子は、強力な抗生物質ブラスチシジンを確実にトランスフェクトした哺乳動物細胞を速やかに選択することができる。
【０１５９】
一般にはモロニーマウス白血病ウィルスから誘導される複製インコンピテント・レトロウィルスベクターは、組込まれたプロウィルスを有する安定なトランスフェクタントを作るために特に有用であることが示された。レトロウィルスの高効率的形質導入機構は、種々のパッケージング細胞系（例えばＲｅｔｒｏＰａｃｋ（登録商標）ＰＴ６７、ＥｃｏＰａｃｋ２（登録商標）−２９３、ＡｍｐｈｏＰａｃｋ（登録商標）−２９３、ＧＰ２−２９３細胞系（全てクロンテク・ラボラトリーズ、パロアルト、ＣＡ、ＵＳＡから入手できる））が入手できることと相俟って、広範囲の宿主を高い効率で感染させることができる；感染多重度を種々変えることによって、組み込まれたプロウィルスのコピー数は容易に調節される。レトロウィルスベクターは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびプロマイシン耐性など種々の選択マーカーを与えられ、安定なインテグラントを容易に選択できる。
【０１６０】
本発明はさらに、細胞内にエピソームとして存在するか、または宿主細胞染色体中に全部または一部組み込まれて存在する本発明のベータ発現ベクターを含む宿主細胞も含む。
【０１６１】
その他の考察において（その幾つかは上に記載した）、ある宿主細胞株は、発現したベータ蛋白を所望の様態で操作できるという理由から選ばれる。ポリペプチドのそのような翻訳後修飾は、非制限的に、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、ホスフォリル化、脂質化、およびアシル化を含み、本発明の一局面は、このような翻訳後修飾を有するベータ蛋白を提供することである。
【０１６２】
上に述べたように、宿主細胞は原核細胞または真核細胞でよい。適切な宿主細胞の代表的例は、非制限的に、大腸菌、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｃｅｎｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどの細菌細胞；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなどの酵母細胞；  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからの細胞などの昆虫細胞系−例えばＳｆ９およびＳｆ２１細胞系、およびエクスプレスＳＦ（登録商標）（プロテイン・サイエンシス社、メリデン、ＣＴ、ＵＳＡ）−ドロソフィラＳ２細胞、およびトリコプルシア  ｎｉ  ハイ・ファイブ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）（登録商標）細胞（インビトロゲン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）；および哺乳動物細胞などである。典型的哺乳動物細胞には、ＣＯＳ１およびＣＯＳ７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ネズミＥＳ細胞系（例：１２９／ＳＶ、Ｃ５７／ＢＬ６、ＤＢＡ−１、１２９／ＳＶＪ株からのもの）、Ｋ５６２、ジュルカット（Ｊｕｌｋａｔ）細胞、およびＢＷ５１４７などがある。その他の哺乳動物細胞系が公知であり、米国培養コレクション（ＡＴＣＣ）（マナサス、ＶＡ、ＵＳＡ）およびコリエル・セル・レポジトリース（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）のナショナル・インスティチュート・オブ・ジェネラル・メディカル・サイエンシス（ＮＩＧＭＳ）ヒューマン・ジェネティック・セル・レポジトリース（Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（カムデン、ＮＪ、ＵＳＡ）から容易に入手できる。
【０１６３】
本発明のベクター類および核酸類を宿主細胞に導入する方法は当業者には公知である；方法の選択は主として導入される特異的ベクターおよび選択した宿主細胞によって決まる。
【０１６４】
例えば、ファージλベクターは一般的にはパッケージング抽出物（例えばギガパック（登録商標）、ストラタジーン、ラジョラ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してパッケージされ、パッケージされたウィルスが大腸菌感染に用いられる。プラスミドベクターは一般的には化学的コンピテントまたはエレクトロコンピテント細菌細胞に導入される。
【０１６５】
大腸菌は例えばＣａＣｌ２、またはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｒｂ＋またはＫ＋の溶液、ジメチルスルホキシド、ジチオスレイトール、およびヘキササミンコバルト（ＩＩＩ）（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １６６巻（４号：５５７−８０ページ（１９８３））などで処理することによって化学的にコンピテントにすることができ、ベクターは熱ショックによって導入できる。種々様々の化学的コンピテント株が市場からも入手できる（例えばエピキュリアン・コリ（登録商標）ＸＬ１０−ゴールド（登録商標）ウルトラコンピテント細胞（ストラタジーン、ラジョラ、ＣＡ、ＵＳＡ）；ＤＨ５αコンピテント細胞（クロンテク・ラボラトリーズ、パロアルト、ＣＡ、ＵＳＡ）；ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌キット（インビトロゲン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）など）。
【０１６６】
細菌細胞は種々の予備的パルス処理によってエレクトロコンピテントにすることができる−すなわち、エレクトロポレーションによって外来ＤＮＡを取り上げる能力をもたせる；ベクター類はエレクトロポレーションによって挿入され、その後選択培地中で成長させる。プロトコルの広範囲のシリーズが“エレクトロプロトコル・オンライン：遺伝子トランスファーのためのプロトコル集”（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｕｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｏｎｌｉｎｅ：Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）”にオンラインで提供されている（バイオラッド社、リッチモンド、ＣＡ、ＵＳＡ）（バイオラッド・ウェブサイトにあり）。
【０１６７】
ベクター類はスフェロプラスト処理、リチウム塩処理、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合法によって酵母細胞に導入することができる。
【０１６８】
スフェロプラストは加水分解酵素−一般にはグルスラーゼ（Ｇｌｕｓｕｌａｓｅ）と呼ばれるカタツムリ腸の抽出物、またはアルスロバクター・ルテウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｌｕｔｅｕｓ）からの酵素であるチモリアーゼ−（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）を作用させ、１Ｍソルビットなどの浸透圧安定剤の存在下で細胞壁の部分を除去することによって作られる。ＤＮＡをスフェロプラトに添加し、その混合物をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＣａ２＋の溶液で共沈殿させる。その後、細胞を溶融寒天と混合したソルビット溶液に再懸濁し、それからソルビットを含む選択プレートの表面に層状にする。リチウム媒介性形質転換のために、酵母細胞を酢酸リチウムで処理する。これは細胞壁を明らかに浸透性にする。ＤＮＡを加え、細胞をＰＥＧで共沈殿させる。細胞を短い熱処理にさらし、ＰＥＧおよび酢酸リチウムを洗浄によって除去し、その後通常の選択培地を含むプレート上に広げる。特別に作られた一本鎖担持ＤＮＡとある種の有機溶媒との使用によって形質転換の頻度は増加する。シーストル（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．  １６巻（５−６号）：３３９−４６ページ（１９８９）。エレクトロポレーションのために、新たに増殖した酵母培養菌を普通に洗い、ソルビットなどの浸透保護剤に懸濁し、ＤＮＡと混合し、その細胞懸濁液にエレクトロポレーション機器でパルスを与える。その後細胞を選択培地を含むプレートの表面に広げる。ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）ら、Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９４巻：１８２−７ページ（１９９１）。エレクトロポレーションによる形質転換効率は、ＰＥＧ、一本鎖担持ＤＮＡおよび後期対数期の成長期にある細胞を使用することによって１００倍以上になり得る。ＹＡＣｓなどのより大きい構成物はプロトプラスト融合法によって導入することができる。
【０１６９】
哺乳動物および昆虫の細胞はパッケージド  ウィルスベクターによって直接感染することも、化学的または電気的手段でトランスフェクトさせることもできる。
【０１７０】
化学的トランスフェクションのためには、ＤＮＡはＣａＰＯ４と共沈殿させるか、またはリポソーム性および非リポソーム性脂質ベースの作用物質を使用して導入することができる。市販のキットがＣａＰＯ４トランスフェクションのために提供され（カルフォス（登録商標）哺乳動物トランスフェクションキット、クロンテク・ラボラトリーズ、パロアルト、ＣＡ、ＵＳＡ）、脂質媒介性トランスフェクションは市販の試薬、例えばリポフェクタミン（登録商標）２０００、リポフェクタミン試薬、セルフェクチン（登録商標）試薬、およびリポフェクチン（登録商標）試薬（インビトロゲン、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）ＤＯＴＡＰリポソーマルトランスフェクション試薬、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２、ＤＯＤＰＥＲ（ロッシュ・モレキュラー・ビオケミカルス、インディアナポリス、ＩＮ、ＵＳＡ）、エフェクテン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）（登録商標）、ポリフェクト（Ｐｏｌｙｆｅｃｔ）（登録商標）、スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（登録商標）（キアゲン社、バレンシア、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施できる。哺乳動物細胞をエレクトロポレートするためのプロトコルは“エレクトロプロトコル  オンライン：遺伝子トランスファーのためのプロトコル集”にオンラインで見いだすことができる（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）・ウェブサイトにあり）。
【０１７１】
ノートン（Ｎｏｒｔｏｎ）ら（編集）の、遺伝子トランスファー法：生活細胞および生体へのＤＮＡ導入（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｂｓｆｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）、バイオテクニクス・ブックス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｃｓ  Ｂｏｏｋｓ）、イートン・パブリッシング社（２０００）（ＩＳＢＮ１−８８１２９９−３４−１）も参照されたい。これは参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【０１７２】
その他のトランスフェクション法には、パーティクル・ボンバードメントがある。例えばチェング（Ｃｈｅｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻（１０号）：４４５５−９ページ（１９９３）；ヤング（Ｙａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻（２４号）：９５６８−７２ページ（１９９０）を参照されたい。
【０１７３】
ベータ蛋白は当業者に公知の種々の技術によって作ることができる。例としては、非制限的に、適切な遺伝子構成物からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳、並びにｉｎ  ｖｉｖｏ宿主細胞発現系、例えば細菌細胞（例えば大腸菌）、酵母細胞（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、昆虫細胞（例えばＳｆ９など）または哺乳動物細胞（例えばＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＣＶ１、Ｌ９２９、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ）などからの生産がある；この際上記細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞は適切なベータ蛋白発現ベクターを含む。一般的には上記発現系から生産されたベータ蛋白は当業者に公知の方法を使用して精製される。
【０１７４】
本発明のベータ蛋白および配列改変オリゴヌクレオチド類は、当業者の必要に応じて、一緒にまたは別々に細胞内に導入することができる。例えば、ベータ蛋白およびベクター類を当業者が決めた比率で一緒に混合し、それからトランスフェクション試薬で、またはエレクトロポレーション法などによって、細胞内に同時に導入することができる。本発明の方法のその他の実施形態においては、ベータ蛋白が最初に細胞内に導入され、その後当業者が決めたある間隔をおいて、配列改変オリゴヌクレオチドが導入される。或いは、配列改変オリゴヌクレオチドをベータ蛋白の前に導入してもよい。ベータ蛋白が、細胞内に存在する誘導性ベータ蛋白遺伝子発現構成物からの発現によって細胞内に導入される場合は、そのベータ蛋白の発現はオリゴヌクレオチドの導入前または導入後に誘発される。一般的に、ベータ蛋白の発現は配列改変オリゴヌクレオチドの導入前に誘発される。
【０１７５】
ある遺伝子からベータ蛋白を発現することが望まれる場合、その遺伝子はエピソーム性要素として細胞内に存在していてもよいし、細胞染色体に組み込まれていてもよい。いずれの場合も、ベータ蛋白を発現する遺伝子の１コピーまたは複数コピーが存在し得る。本発明の目的に適したベータ蛋白発現構成物を構成する技術は当業者には公知であり、エピソーム性構成物を成長する細胞内に保存する技術、および細胞染色体内に組み込む構成物を作成する技術などである。構成物は構成性または誘発性プロモータ、並びにベータ蛋白のｍＲＮＡへの転写を刺激するエンハンサ要素を含むことが多い。プロモータおよびエンハンサ要素は、構成物を配置しようとしている細胞として、同じ有機体から誘導されても異なる有機体から誘導されてもよい。別の方法として、構成物には転写調節要素がなくてもよい。この場合にはその構成物は当業者に公知の知識によって、ベータ蛋白遺伝子の転写を刺激する天然の細胞転写調節要素の近くに挿入されることが多い。エピソーム性構成物は付加的に複製起点を含み、細胞が分裂した際にその構成物の複製が可能になることが多い。染色体に挿入しようとするエピソーム性構成物および構成物類は、その他に１つ以上の選択マーカーを含み、その構成物を含む細胞が当業者の知識によって特定の増殖特性に関して選択されるようにする。発現構成物はその他に、リボソーム翻訳の効率を高める翻訳調節領域（コザク（Ｋｏｚａｋ）配列など）を含み、ベータ蛋白ｍＲＮＡを安定化する。真核細胞に発現するために、ベータ蛋白遺伝子は核ローカリゼーション信号を含み、上記蛋白が核内に能動的に運び込まれるようにする。
【０１７６】
以下に記載の実施例はさらに、所望の標的核酸配列改変、例えばここに記載する挿入、欠失または置換変化などを含む所望の標的核酸改変を導入するオリゴヌクレオチド並びに複数の核酸配列改変を導入するオリゴヌクレオチドの核酸配列改変効率を高めるために使用するベータ蛋白の濃度を最適化する組成物、アッセイ系、および方法を明らかにする。当業者はあらゆる標的の修復を分析試験するためのこれらの系の一つを容易に変更して、この出願の教示を用いて所望核酸配列改変の導入のためのベータ蛋白の濃度を最適化することができる。
【０１７７】
第二の局面において、本発明はオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の効率を高める組成物を提供する。
【０１７８】
一実施形態において、この組成物は少なくも１つの配列改変オリゴヌクレオチド−例えばキメラオリゴヌクレオチド、二官能価オリゴヌクレオチド、または一本鎖、化学的修飾されたオリゴヌクレオチドなど−およびトリコスタチンなどのＨＤＡＣインヒビタを含む。また別の実施形態において、この組成物は少なくも１つの配列改変オリゴヌクレオチドおよびベータ蛋白を含む。
【０１７９】
本発明の組成物はｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ使用、例えば培養基中のバッチ処理細胞のために、培養基中の細胞へのマイクロインジェクションのために、または人間または動物への静脈内投与のために使用するのに適する医薬組成物として処方される。一般的に、動物に細胞内投与または静脈内投与するための組成物は無菌等張性緩衝水溶液である。必要ならば、組成物は可溶化剤およびリグノカインのような局所麻酔薬を含み、注射部位の痛みを緩和してもよい。概ね、これらの成分は個別に、または混合して、乾燥凍結粉末または無水コンセントレートなどの単位投与型にして供給される。組成物は活性薬剤の量を活性単位で記したアンプルまたは小袋などの密封容器に入れて保存される。組成物を注射によって投与する場合は、この組成物を滅菌医薬品グレードの“注射用水”または生理食塩液を含む注入びんに分配する。本発明の医薬組成物は配列改変オリゴヌクレオチド、ＨＤＡＣインヒビタ、ベータ蛋白、またはＨＵの任意の１種類以上、および薬物学的に容認されるこれらの塩類、および薬物学的に容認される成分、賦形薬、担体、アジュバントまたはビヒクルを含む。
【０１８０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用に適する本発明の医薬組成物は、好ましくは注射可能の組成物の形で対象に投与される。その組成物は好ましくは非経口的に、すなわち静脈内、動脈内、髄腔内、組織内、または腔内に投与される。本発明の医薬組成物はヒトを含む哺乳動物に、その他の診断薬または治療薬と同様の方法で投与することができる。投与すべき量および投与法は年齢、体重、性別、対象の状態および遺伝因子などの種々の要因に依存し、最終的には医療関係者が上記の種々の用量の実験的測定値にしたがって決定する。概して、修復効果および治療効果のために必要な用量は約０．００１ないし５０，０００μｇ／ｋｇ、より好ましくは１ないし２５０μｇ／ｋｇ宿主細胞またはボディマス、最も好ましくは３０ないし６０マイクロモル範囲内の濃度である。
【０１８１】
ＨＤＡＣインヒビタまたはＨＵを動物に投与する場合、投与すべき用量および投与法は年齢、体重、性別、その動物の状態、遺伝因子などの種々の要因に依存し、最終的には獣医がここに記載の種々の用量の実験的測定値にしたがって決定する。概して、修復効果および治療効果のために必要な用量は約０．００１ないし１０００ｍｇ／ｋｇ体質量の範囲、より好ましくは１０ないし２００ｍｇ／ｋｇの範囲、そして最も好ましくは５０ないし１００ｍｇ／ｋｇである。ＨＤＡＣインヒビタをｉｎ  ｖｉｔｒｏ投与する場合、用量はナノモルないしマイクロモル濃度であり、約１００−２００μＭであることが多い。
【０１８２】
また別の実施形態において、本発明の組成物（そして別の局面では本発明のキット）は細胞抽出物または無細胞抽出物と、ＨＤＡＣインヒビタ、ベータ蛋白またはＨＵを含む。
【０１８３】
本発明の組成物（またはキット）に使用される完全無傷細胞、または細胞修復蛋白を含む細胞抽出物の形の細胞は、細菌、真菌、植物および動物、例えばヒトまたはその他の哺乳動物を含む任意の生物からの細胞を含む。本発明のキットに使用する細胞は、例えばヒト肝臓、肺、結腸、子宮頸部、腎臓、上皮の培養細胞、ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞（アフリカグリーンモンキー）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、Ｈ１２９９細胞（ヒト上皮癌、非小細胞性肺癌）、Ｃ１２７（不死ネズミ乳上皮細胞）、ＭＥＦ（マウス胚線維芽細胞）、ＨＥＣ−１−Ａ（ヒト子宮癌）、ＨＣＴ１５（ヒト結腸癌）、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸癌腫）、ＬｏＶｏ（ヒト結腸腺癌）、およびＨｅＬａ（ヒト子宮頸部癌）癌細胞並びにＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫）および哺乳動物ＥＳ細胞（ヒト胚性幹細胞を含む）を含む。
【０１８４】
本発明の組成物およびキットに使用する細胞−完全無傷細胞または、細胞修復蛋白を含む抽出物としての細胞−は哺乳動物胚性幹（ＥＳ）細胞も含むことができる。特定の管轄区域における現行の禁止事項をふまえて、この組成物は非ヒト哺乳動物ＥＳ細胞などの非ヒトＥＳ細胞は含むことができる。その他の管轄領域では組成物はヒトＥＳ細胞を含むことができる。例えば、組成物は米国フェデラル・ファンディング規準に適合するヒト幹細胞系を含むことができる。ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルスは現在下記施設によって保管されているものを含む既存の幹細胞系（ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のリストを作成中である：ブレサゲン（ＢｒｅｓａＧｅｎ）社、アテンス、ジョージア（４ライン）；シテラ（ＣｙＴｈｅｒａ）社、サンジエゴ、カリホルニア（９ライン）；カロリンスカ（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ）社、ストックホルム、スウェーデン（５ライン）；モナシュ（Ｍｏｎａｓｈ）大学、メルボルン、オーストラリア（６ライン）；ナショナル・センター・フォア・バイオロジカル・サイエンシス、バンガロー、インド（３ライン）；リライアンス・ライフ・サイエンシス（Ｒｅｌｉａｎｃｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マムバイ、インド（７ライン）、テクニオン−イスラエル・インスティチュート・オブ・テクノロジー（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ハイファ、イスラエル（４ライン）；カリフォルニア大学、サンフランシスコ、カリフォルニア（２ライン）；ゴテボルグ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ）大学、ゴテボルグ、スウェーデン（１９ライン）；ウィスコンシン・アルムニ・リサーチ・ファウンデーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｍｕｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、マジソン、ウィスコンシン（５ライン）。
【０１８５】
その他の実施形態において、本発明の組成物およびキットに使用するための細胞は酵母またはその他の真菌細胞、または例えばトウモロコシ、米、小麦、大麦、大豆、綿、およびジャガイモなどの植物からの細胞でよい。その他の例示的植物は本明細書の他の箇所に記載されるものを含む。
【０１８６】
さらにまた別の実施形態において、本発明は標的配列を改変するためのキットを提供する。
【０１８７】
一実施形態において、キットは少なくも１つの配列改変オリゴヌクレオチド−キメラオリゴヌクレオチド、二官能価オリゴヌクレオチドまたは一本鎖、キメラ改変オリゴヌクレオチドなど−およびトリコスタチンＡなどのＨＤＡＣインヒビタ、ＨＵおよびベータ蛋白からなる群から選択される一つ以上の別々にパッケージされた試薬を含む。キットは任意に、使用説明書を含む。
【０１８８】
一実施形態において、キットはベータ蛋白をコードする核酸を含む。その核酸はベータ蛋白発現ベクターのようなＤＮＡまたはＲＮＡでよい。発現ベクターは細胞内のエピソームとして存在するものでも、細胞の一染色体または複数の染色体に組み込まれたものでもよい。発現ベクターは誘発性プロモータによって、またはその代わりに構成性活性プロモータによって調節できる。
【０１８９】
また別の実施形態において、本発明によるキットは配列改変オリゴヌクレオチドと、ベータ蛋白発現ベクターを含む宿主細胞とを含む。
【０１９０】
さらに有益なことに、本発明のキットは配列改変オリゴヌクレオチドを細胞内に導入する手段；ベータ蛋白をコードする核酸を細胞に導入するための手段；ベータ蛋白発現構成物を細胞に導入するための手段；配列改変オリゴヌクレオチドおよびベータ蛋白を導入することが所望される細胞；および／または当業者が本発明の方法の様態を理解するのに十分な説明書を含む。追加的キット構成成分が当業者の知識および必要性によって提供できる。
【０１９１】
実施形態のその他のシリーズにおいて、本発明のキットは追加的に、ＬＮＡをオリゴヌクレオチド（本発明の遺伝子修復法に適切に使用できるオリゴヌクレオチド）の５’および３’末端のどちらかまたは両方に付けるための試薬類を含む。
【０１９２】
これらキットは末端を修飾するためのオリゴヌクレオチドを含む。そのような実施形態においては、オリゴヌクレオチドの配列は一般的に、所望されることが多い核酸配列改変を起こすように選択される。しかし、より一般的にはこれらキットはそのようなオリゴヌクレオチドを含まない。これら後者の実施形態において、ユーザーが、ユーザー所望の核酸配列改変を起こすように設計された配列を含むオリゴヌクレオチドを用意する。実施形態のこの両系列において、キットは任意に、末端修飾反応をコントロールするのに役立つ、および／または任意にその後の核酸配列改変プロセスをコントロールするのに役立つオリゴヌクレオチドを一つ以上含むことができる。
【０１９３】
本発明の末端修飾キットは、少なくも１つのモノマーＬＮＡ、より一般的には２つ、３つまたはそれ以上のモノマーＬＮＡが、オリゴヌクレオチドの３’末端またはオリゴヌクレオチドの５’末端のどちらかまたは両方に十分付くだけの試薬類を含む。
【０１９４】
一般的にはこれらの試薬類には、別々にパッケージされた組成物として、Ａ、Ｇ、Ｔ、およびＣの各々に個別的に相補的なヌクレオ塩基類を有するＬＮＡモノマー類が含まれ、ユーザーが、標的に対して非相補的な塩基を導入することなく、一端または両端にオリゴヌクレオチドを延ばすことができ、生成したオリゴヌクレオチドが、遺伝子修復プロセスによる修飾が望まれる部位を除く全ての部位で標的核酸に確実に相補的であるようにする。５’および３’末端両方の修飾を可能にするキットにおいて、５’末端修飾のためのＬＮＡモノマーは、３’末端修飾のためのモノマーとは化学構造が異なっていてもよい；このような場合、５’および３’末端修飾のためのそれぞれのモノマーは一般には互いに別々にパッケ−ジされる。
【０１９５】
３’末端を修飾できるキットの実施形態は、子ウシ胸腺末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼのような鋳型非依存性一本鎖ポリメラーゼ、および５’−トリホスフェート類を有するＬＮＡモノマー類を含むのが一般的である。子ウシ胸腺末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは、３’末端における一本鎖ＤＮＡへのヌクレオシドトリホスフェート類の非特異的鋳型非依存性重合を触媒する。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．）、およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．）（２００１）、分子クローニング：実験室マニュアル、３版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、９．６０−９．６１ぺージ。２’，３’−ジデオキシヌクレオシド  トリホスフェート類をこの重合反応に使用する場合は単一のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端に付加する。このためこのキットは、その後の重合を可能にするＬＮＡモノマー類を排除し、またはそれらに追加して、このようなジデオキシＬＮＡモノマーを含むことが有用である。
【０１９６】
これらの実施形態のキットは任意に、反応緩衝液および上記酵素反応を実施するための使用説明書を含むことができる。任意に、キットは、停止緩衝組成物などの上記反応を打ち切る手段、および反応体を取り出してオリゴヌクレオチドを作り、その後さらに修飾するか、または本発明の核酸配列改変法に使用する手段、例えばサイズ選択性スピンカラムなどを含むことができる。
【０１９７】
５’修飾は、５’ホスフェートがあるオリゴヌクレオチド上で容易に行われる。例えば、５’修飾のためのキットはバクテリオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのようなキナーゼとアデノシン三燐酸とを有用に含み、５’ヒドロキシル基をあらわすオリゴヌクレオチドを燐酸化することができる。サムブルックおよびラッセル（２００１）分子クローニング：実験室マニュアル、３版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、９．６６−９．６９ぺージ。
【０１９８】
このような試薬類は分子生物学の研究室には一般的に見られ、オリゴヌクレオチドは、すでに５’ホスフェートを所有する業者または中央施設から注文できるため、他の実施形態においては本発明のキットはキナーゼおよびＡＴＰは含まない。
【０１９９】
５’燐酸化オリゴヌクレオチドはその後イミダゾールの存在下で水溶性カルボジイミドを使用して活性化され、５’−ホスフォルイミダゾリドを形成する。チュー（Ｃｈｕ）ら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．  １１巻（１８号）６５１３−６５２９ページ。このためキットは一般的には２つに分かれた組成物として、１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドのような水溶性カルボジイミドと、反応時に５’−燐酸化オリゴヌクレオチドと結合するためのイミダゾールとを含む。
【０２００】
５’−ホスフォルイミダゾリドオリゴヌクレオチドはその後さらに、アミンのような求核性基を有するＬＮＡモノマーと反応し、オリゴヌクレオチドの５’末端をＬＮＡモノマーで伸長することができる。５’修飾のためにこの化学を利用するキットはさらにアミノ−ＬＮＡモノマーのような求核性ＬＮＡモノマーを含むのが一般的である。
【０２０１】
別のアプローチにおいて、末端未修飾のオリゴヌクレオチドは、活性化されて５’ヒドロキシル基と反応するＬＮＡによって５’末端が直接修飾される。このような実施形態では、活性化ＬＮＡモノマー類がキットに含まれる。
【０２０２】
このような活性化型のＬＮＡモノマーの一例はＬＮＡホスフォルアミダイトである。ＬＮＡホスフォルアミダイトは、全てのヌクレオ塩基が“保護”されているオリゴヌクレオチドの５’末端と反応することができる。このようなオリゴヌクレオチドは標準固相合成法を使用して、ヌクレオ塩基を脱保護することなくそのオリゴヌクレオチドを合成支持体から分離するという様態で得られる。このようなオリゴヌクレオチドは業者または中央施設からそのように容易に注文できる。
【０２０３】
オリゴヌクレオチドと、ホスフォルアミダイトのように活性化されたＬＮＡモノマーとの反応後、伸長したオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子修復法に使用する前に酸化され、脱保護される。
【０２０４】
本発明のこの局面のキットのさらに別の実施形態において、不都合な副反応を回避し、付加的化学作用の利用を可能にするための保護基を有するＬＮＡモノマーが提供される。これらの目的に適する保護基は当業者には公知である。例えばオリゴヌクレオチドおよび類似体のためのプロトコル：合成および特性（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）２０巻（アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）ら）、ヒューマン・プレス、１９９３；トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９巻、６１２３ページ；ボーケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびライア（Ｌｙｅｒ）（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８巻、２２２３；およびウールマン（Ｕｈｌｍａｎｎ）およびペイマン（Ｐｅｙｍａｎ）（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．  ９０巻、５４３ページを参照されたい。ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドをさらに修飾する前に、またはＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを遺伝子修復に使用する前に、これらの保護基を除去することも必要な付加的工程である。このような除去を起こすための試薬はこのようなキットに含まれてもよいし、ユーザーが提供してもよい。
【０２０５】
実施形態のさらに別のシリーズにおいて、本発明のキットはさらに細胞または無細胞抽出物、ＨＤＡＣインヒビタ、ベータ蛋白、およびＨＵからなる群から選択される１つ以上の試薬、および任意に、配列改変オリゴヌクレオチドおよび／または使用説明書を含む。
【０２０６】
本発明のキットのための細胞または無細胞抽出物は、任意の生物から誘導でき、同じ生物または異なる生物からの蛋白またはプレパレーションを直接補充することもできる。そのような蛋白は例えばＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド除去修復群からのものでよい。特に有用な実施形態において、上記細胞または無細胞抽出物は真核細胞または組織、特に酵母細胞であり、またはこれらに由来するものである。別の実施形態において、キットは細胞または無細胞抽出物からパッケージされた、ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド除去修復群からの少なくも１つの蛋白と、ＨＤＡＣインヒビタ、ベータ蛋白、またはＨＵを含む。
【０２０７】
さらに別の局面において、本発明は、オリゴヌクレオチド媒介性配列改変の効率を高める追加的化学化合物を確認するアッセイ法を提供する。このようなアッセイ法は、核酸配列改変をもたらすことが判明している系においてサンプルを化学化合物および配列改変オリゴヌクレオチドと接触させ、その化学化合物が存在しない場合に比べて核酸配列改変の量がより少ないか、より多いか、または同じかを測定することを含む。抗生物質耐性（例えばテトラサイクリン、カナマイシンまたはハイグロマイシン耐性など）、ＧＦＰ、およびＦｌＡｓＨ（登録商標）系（本明細書およびＷＯ０１／７３００２として公開された国際特許出願に開示されている）を含む多くの適切なアッセイ系が当業者には明らかである。
【０２０８】
本発明の方法、組成物およびキットを使用して、非ヒト細胞のゲノム配列を改変することができる。その後このゲノム配列から非ヒト細胞および全ての非ヒト動物または植物が再生される。本発明のその他の局面は、これによって生成した非ヒト動物および植物である。
【０２０９】
以下に示す非制限的例は、核酸配列改変効率を高め、１つ以上の所望標的核酸配列改変を導き出すオリゴヌクレオチドによる核酸配列改変の効率を高めるために必要な濃度を選択および最適化する方法、組成物およびキットをさらに詳しく明らかにする。当業者はここに示す教示を利用して、任意の所望標的の修正を分析試験するためにこれらの系の１つを容易に変更し、所望核酸配列改変の導入条件を最適化することができる。
【実施例】
【０２１０】
実施例１：ＤＮＡ修復遺伝子はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける直接核酸配列改変能力に影響を与える
この実施例において、化学的に修飾された、ノンヘアピンの、内部が重複しない一本鎖オリゴヌクレオチドまたはキメラ二重ヘアピンのオリゴヌクレオチドを使用して、高いまたは低いＤＮＡ修復遺伝子発現を有する細胞から得た無細胞抽出物におけるエピソーム性標的配列の核酸配列改変を測定する。これらの標的配列は、例えばカナマイシン耐性遺伝子（ｐＫａｎＳｍ４０２１）、テトラサイクリン耐性遺伝子、そしてハイグロマイシン耐性遺伝子とｅＧＦＰとの融合をコードする。各場合に、上記標的遺伝子は、コーディング領域における少なくも１つの点突然変異により、非機能性（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）である。
【０２１１】
核酸配列改変実験のための無細胞抽出物の調製および使用。例えば酵母細胞を２ＬのＹＰＤ培地中で３０℃で対数期（ＯＤ６００＝０．５−０．８）にまで成長させる。それから培養物を５０００×ｇで遠心分離し、ペレットを１０％スクロース、５０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶菌溶液に再懸濁し、それらをドライアイス上で凍結させる。融解後、ＫＣｌ、スペルミジンおよびリチカーゼを加え、それぞれの最終濃度を０．２５ｍＭ、５ｍＭおよび０．１ｍｇ／ｍｌとする。その懸濁液を氷上で６０分間インキュベートし、ＰＭＳＦおよびトリトンＸ１００を、それぞれ最終濃度０．１ｍＭおよび０．１％になるように加え、氷上でインキュベートを２０分間続ける。溶解物を３０００×ｇで１０分間遠心分離して大きいくずを除去する。それから上澄液を取り、３００００×ｇで１５分間遠心分離することによって澄明にする。澄明な抽出液にグリセロールを濃度１０％（ｖ／ｖ）になるまで加え、一部づつ−８０℃で凍結する。その抽出液の蛋白濃度をブラッドフォードアッセイによって測定する。
【０２１２】
核酸配列改変活性を測定するために、野生型酵母株、またはＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド除去修復群からの遺伝子に突然変異を有する酵母株のいずれかから得た無細胞抽出物１０−３０μｇ蛋白を含む反応混合物５０μｌを使用する；約１．５μｇキメラ二重ヘアピンのオリゴヌクレオチド（ＫａｎＧＧ、図１参照）または０．５５μｇ一本鎖分子（ＫａｎＧＧと同じ改変に導く、それぞれ各末端に３または６ホスホロチオエート結合を有する３Ｓ／２５Ｇまたは６Ｓ／２５Ｇ、２５マーオリゴヌクレオチド）；および約１μｇのプラスミドＤＮＡ（図１参照）を、２０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ  ＤＴＴ、および１．０ｍＭ  ＡＴＰを含む反応緩衝液中に含む反応混合物５０μｌを使用する。無細胞抽出物を加え、３０℃で４５分間インキュベートすることによって反応を開始する。それらのチューブを氷上に置いて反応を停止し、その後直ちに２回のフェノール／クロロホルム（１：１）抽出によってそれらを蛋白除去する。その後サンプルをエタノール沈殿し、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で４℃で３０分間遠心して核酸をペレット化する；ペレットを７０％エタノールで洗う；核酸を５０μｌのＨ２Ｏに再懸濁し；それを−２０℃で保存する。
【０２１３】
無細胞抽出物における核酸配列改変に与えるオリゴヌクレオチドの影響を次のように測定する。２０ｍＭトリスｐＨ７．６；１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１ｍＭ  ＤＴＴ；０．２ｍＭスペルミジン；２．５ｍＭ  ＡＴＰ；０．１ｍＭ各ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ；０．０１ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；０．１ｍＭ  ＮＡＤ；および１０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含む反応混合物１００μｌ中、約１μｇのプラスミドｐＫＳ４０２１および種々の量のオリゴヌクレオチドを使用する。無細胞抽出物１０−８０μｇを加えることによって反応を開始し、その反応物を３０℃で３０分間インキュベートする。氷上で反応を停止し、２回のフェノール抽出および１回のクロロホルム抽出でプラスミドＤＮＡを分離し、その後ドライアイス上で１時間エタノール沈殿を行い、４℃で３０分間遠心分離する。ペレットを７０％エタノールで洗い、５０μｌＨ２Ｏに再懸濁し、−２０℃で保存する。
【０２１４】
核酸配列改変の定量。セル−ポレーター（Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ）装置（ライフ・テクノロジーズ）を用い、４００Ｖ、３００μＦ、４ｋΩの設定で再懸濁液からのプラスミド５μｌ（〜１００ｎｇ）を２０μｌのＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレートする。エレクトロポレーション後、細胞を、１または２ｍｌ  ＳＯＣを含む１４ｍｌのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）スナップ−キャップ・チューブに移し、３７℃で１時間振とうする。最終的カナマイシン耐性コロニー数を増やすために、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を加えるか、または３ｍｌＳＯＣを１０μｇ／ｍｌカナマイシンと共に加えることによって改変配列を有するプラスミドを増幅し、細胞懸濁液を２または３時間以上３７℃で振とうする。その後未希釈培養物１００μｌ部分を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上に、そして１０４希釈の１００μｌ部分を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に直接培養する。或いは、まず最初に細胞を３７５０×ｇで遠心分離し、そのペレットを５００μｌＳＯＣ中に再懸濁する。再懸濁液（未希釈）２００μｌをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）寒天プレートに加え、１０５希釈液２００μｌをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プレートに加える。一晩３７℃でインキュベーション後、アクカウント（ＡｃｃｕＣｏｕｎｔ）（登録商標）１０００（ビオロジックス（ＢｉｏＬｏｇｉｃｓ））を使用して細菌コロニーを数える。核酸配列改変効率は、希釈を補正したカナマイシン耐性コロニー対アンピシリン耐性コロニーの比として測定される。
【０２１５】
或いは、次の操作法を使用する。再懸濁した反応混合物（総量５０μｌ）の５μｌを、セル−ポレーター装置（ライフ・テクノロジーズ）を使用して、２０μｌ部分のエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌中で形質転換する。その混合物を１ｍｌ  ＳＯＣ中で３７℃で１時間回復させ、その時間中に５０μｇ／ｍｌカナマイシンか１２μｇ／ｍｌテトラサイクリン（それぞれカナマイシンまたはテトラサイクリンプラスミドのための）を加え、さらに３時間インキュベートする。プレートする前に、細菌をペレット化し、２００μｌのＳＯＣに再懸濁する。１００μｌ部分をカナマイシンまたはテトラサイクリン寒天プレート上で培養し、培養物の１０−４希釈物１００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む寒天プレート上で培養する。アクカウント（登録商標）１０００プレートリーダー（ビオロジックス）を用いてコロニー数を数える。
【０２１６】
両方の培養法共、２回ずつまたは３回ずつ培養するのが普通である。各プレートは２００−５００アンピシリン耐性コロニーまたは０−５００テトラサイクリンまたはカナマイシン耐性コロニーを含む。耐性コロニーを選択し、プラスミドを分離し、ＡＢＩキャピラリーシーケンサー（ＰＥビオシステムズ）でＡＢＩプリズム  キットを用いてＤＮＡ配列決定を行う。
【０２１７】
酵母からの無細胞抽出物における核酸配列改変。カナマイシンプラスミド・アッセイ系を使用して酵母ＬＳＹ６７８株からの無細胞抽出物を試験する。表１に示すように、反応は全ての反応成分に依存することが認められる。反応物中のオリゴヌクレオチド量または抽出物量の増加は相対的に修正効率を高めるのが一般的である。その後ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群からの少なくも１つの蛋白が欠けている酵母株における核酸配列改変効率を分析する。ｍｓｈ２突然変異酵母株（ＬＳＹ８１４）から生成した抽出物が、ＭＳＨ２ｐに欠ける哺乳動物細胞に見られる下部遺伝子（ｌｏｗｅｒ  ｇｅｎｅ）修復に類似した、修復活性の顕著な低下を示すことが判明した（表２）。ｒａｄ５７またはｒａｄ５９突然変異株からの無細胞抽出物は、これらの遺伝子の機能性コピーを有する株に比較して、核酸配列改変活性をほとんど変化させず、ｒａｄ２３またはｒａｄ５４突然変異株からの無細胞抽出物は核酸配列改変活性を若干増加させることが判明した。特に、△ｒａｄ５２（ＬＳＹ３８６）株は約５倍ないし約２５倍高い修復頻度を示すことが認められる。全てのサンプルにおいて、アンピシリン耐性コロニーは１プレートあたり５００−６００の範囲で、カナマイシンコロニーは１０ないし３００の範囲である。
【０２１８】
遺伝子修復は修復蛋白の量に依存する。ＲＡＤ５２に欠ける抽出物の活性をより詳細に検討する。第一に、ｐＫｓｍ４０２１の修復は３種類の成分：プラスミド、オリゴヌクレオチド、および抽出物、全ての添加に依存することが認められる（表３）。その修復は用量依存的であり、２種類の抽出物が混合している場合、反応物中に存在するＬＳＹ３８６（△ｒａｄ５２）抽出物の量に比例することも認められる（表３）。これらの抽出物中にＲＡＤ５２が存在することはウエスターンブロット法によって確認される。ＲＡＤ５２欠損ｒａｄ５２突然変異株を、ＬＳＹ６７８の代わりにｒａｄ２３突然変異株（ＹＥＬＯ３７Ｃ）と混合する際、無細胞抽出物における修復に同様な効果が認められる。
【０２１９】
最後に、ＲＡＤ５２を発現するプラスミドを含むＬＳＹ３８６またはＬＳＹ６７８からの無細胞抽出物の核酸配列改変効率を分析する。ＲＡＤ５２の発現は、ＬＳＹ３８６またはＬＳＹ６７８から作られた抽出物中の核酸配列改変活性レベルを低下させることが認められる。ＬＳＹ３８６では、修復レベルは野生型レベル近くにまで低下し、ＬＳＹ６７８では修復レベルは野生型の４分の１に低下する（表３）。これらの株でウエスターンブロット分析を行った。これらの株ではＲＡＤ５２蛋白発現レベルはほぼ等しい。これらの結果は、ＲＡＤ５２遺伝子の発現がオリゴヌクレオチド標的核酸配列改変を抑制することを示す。３つのコロニーからの標的プラスミドのＤＮＡ配列も分析し、抽出物が△ｒａｄ５１または△ｒａｄ２３に由来するサンプルにおいてさえ、標的塩基に精密な変化が起きることが認められる。したがって、突然変異および核酸配列改変頻度の差にもかかわらず標的特異性は保持される。
【０２２０】
【表１】
2005518817.tif 000012
種々の濃度のキメラオリゴヌクレオチドを、プラスミドｐＫｓｍ４０２１およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＬＳＹ６７８）からの無細胞抽出物の指示量と共に３０℃で４５分間インキュベートする。プラスミドを分離し、精製し、大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）にエレクトロポレートし、自動プレートリーダーを使用して耐性コロニーを定量する。相対的頻度は、カナマイシン耐性コロニー割るアンピシリン耐性コロニー（カナマイシン耐性コロニー／アンピシリン耐性コロニー）（×１０−５）として示される。オリゴヌクレオチドＫａｎＣＧは、ミスマッチがないことと、ＫａｎＣＧが突然変異を修正しないことを除けば、ＫａｎＣＧと同じ配列を有する。各データ点は５回の独立的実験の平均値として示される。
【０２２１】
【表２】
2005518817.tif 000013
１μｇプラスミドｐＫｓｍ４０２１および１μｇオリゴヌクレオチドＫａｎＣＧを含む反応混合物（２０μｌ）を指示された酵母株からの無細胞抽出物１０μｇと混合する。３０℃で４５分間インキュベーション後、プラスミドＤＮＡを分離し、大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）にエレクトロポレートする。５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む寒天プレート上のカナマイシン耐性コロニーを数える。二重の反応混合物からのプラスミドも大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）にエレクトロポレートし、アンピシリン含有プレート上で培養する。Ｋａｎｒコロニー数割るＡｍｐｒコロニー数によって相対的活性を決定する。これらの数値は５回の反応の平均をあらわす。
【０２２２】
【表３】
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反応混合物およびコロニーのプロセッシングは下記を除いて表１の説明と同様である。次のような突然変異を含む酵母株からの無細胞抽出物を使用する：ＬＳＹ６７８（野生型）、ＬＳＹ３８６（△ｒａｄ５２）、およびＹＥＬＯ３７Ｃ（△ｒａｄ２３）。抽出物１０μｇまたは指示量を使用する。ＬＳＹ３８６・ｐ５２として確認される反応物は、ＲＡＤ５２蛋白を発現するプラスミドを含む△ｒａｄ５２株（ＬＳＹ３８６）からの無細胞抽出物を含む。ＬＳＹ６７８・ｐ５２として確認される反応物はＲＡＤ５２蛋白を発現するプラスミドを含む野生型株（ＬＳＹ６７８）からの無細胞抽出物を含む。
【０２２３】
実施例２：ＤＮＡ修復遺伝子はｉｎ  ｖｉｖｏ核酸配列改変能力に影響を与える
この実施例において、本発明者らは化学的に修飾された、内部非重複の一本鎖オリゴヌクレオチドまたは二重ヘアピンのキメラオリゴヌクレオチド類を使用し、ＤＮＡ修復遺伝子発現が高められたまたは低められた細胞中の標的核酸配列の核酸配列改変を測定する。これらの標的核酸配列は、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子とｅＧＦＰ（これはコーディング領域における少なくも一つの点突然変異により、非機能性である）との融合をコードする。標的配列はエピソーム性でも染色体性でもよい（例えば核、ミトコンドリアまたはプラスチドを含む）。エピソーム標的の核酸配列改変は、一般に染色体標的の核酸配列改変よりもわずかにより効率的である（２倍未満）。オリゴヌクレオチド類の修飾および標的ベクター類の構成は、２００１年３月２７日出願のクミエク（Ｋｕｍｉｅｃ）らの“修飾一本鎖オリゴヌクレオチドによる標的染色体ゲノムの改変（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）”と題する同時係属国際特許出願ＷＯ０１／７３００２に開示されている。この開示は参考としてその全体が本明細書中に援用される。
【０２２４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ系。エピソーム標的の核酸配列改変をモニターするために、プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰ（これはハイグロマイシン耐性遺伝子中に点突然変異を含む）、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰ（これはハイグロマイシン耐性遺伝子に単一塩基挿入を含む）、およびｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰ（単一塩基欠失を有する）（図２に示される）を用いる酵母系を使用する。本発明者らはｐＡＵＲＨＹＧ（ｗｔ）ｅＧＦＰと呼ばれるハイグロマイシン−ｅＧＦＰ融合遺伝子の機能性コピーも対照として使用する。これらのプラスミドはひとまとめにしてｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰと表す。これらのプラスミドはアウレオバシジンＡ（ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ）耐性遺伝子も含む。ｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰにおいて、ハイグロマイシンＢコーディング配列のコドン４６の位置１３７のＧがＣに変換され、そのためハイグロマイシン耐性遺伝子コーディング領域の早期停止コドンが除去される場合にハイグロマイシン耐性遺伝子機能およびｅＧＦＰ蛋白からの緑色蛍光が回復する。ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰにおいて、ハイグロマイシンＢコーディング配列のコドン４６の位置１３６および１３７のヌクレオチド間に挿入されたＡが欠失し、位置１３７のＴがＣに置換され、それによってフレームシフト突然変異が修正され、ハイグロマイシン−ｅＧＦＰ融合遺伝子のリーディング−フレームが回復するとき、ハイグロマイシン耐性遺伝子機能およびｅＧＦＰ蛋白からの緑色蛍光が回復する。ｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰにおいて、単一ヌクレオチド欠失部位にＣが挿入される際にはハイグロマイシン耐性遺伝子機能およびｅＧＦＰからの緑色蛍光が回復する。
【０２２５】
ハイグロマイシン−Ｂコーディング配列のヌクレオチド１３７に次に示すような点突然変異を含む３種類の酵母発現構成物ｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰ、ｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰ、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰのセットを合成する：（ｒｅｐ）はＴ１３７→Ｇ置換を示し、（△）はＧ１３７の欠失を示し、（ｉｎｓ）はヌクレオチド１３６および１３７間へのＡの挿入を示す。本発明者らはｐＨｙｇ（ｘ）ｅＧＦＰからの制限消化およびｐＡＵＲ１２３（パンベラ（ＰａｎＶｅｒａ）（登録商標）、ＣＡ）への結合によって、それぞれの発現カセットを切り取るという様態でこのプラスミドセットを構成する。１０μｇのｐＡＵＲ１２３ベクターＤＮＡ並びに１０μｇの各ｐＨｙｇ（ｘ）ｅＧＦＰ構成物をＫｐｏｎＩおよびＳａｌＩ（ＮＥＢ）で消化する。ＤＮＡ断片の各々をゲル精製し、酵素的結合のために準備する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ロッシュ）を使用して各突然変異挿入物をｐＡＵＲ１２３ベクターに３：１のモル比で結合させる。クローン類を制限消化によってスクリーニングし、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシチェイン終結配列決定によって確認し、キアゲン（登録商標）マキシプレプ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）キットを使用してプラスミドＤＮＡを精製する。
【０２２６】
染色体標的の核酸配列改変をモニターするためには、ＣＹＣ１のような染色体遺伝子をモニターするための酵母系を使用するか、またはｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰと呼ばれるもののような組込み型プラスミドを使用するのが一般的である。これらのプラスミドは酵母中では複製しない。これらのプラスミドは、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰエピソームプラスミド系（図２に示される）に用いられるＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰ融合蛋白、およびアウレオバシジンＡ耐性遺伝子を含む。したがって、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰのように、これらの構成物は全てのタイプの核酸配列改変、すなわち置換、挿入および欠失をモニターするためにも使用できる。この構成物の他に、本発明者らは例えばＣＹＣ１を含む固有の酵母遺伝子の核酸配列改変をモニターする。
【０２２７】
図８に図式で示したように、ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰプラスミドを構成する。つまり、１０μｇのｐＡＵＲ１０１（パンベラ（登録商標）社）をＳａｌＩおよびＫｐｎｌで消化し、特異的ＢｃｌＩ制限部位を含むリンカーを結合する。その後精製したプラスミド（“ｐＡＵＲ１０１−リンカー”）１０μｇをＢｃｌＩで消化し、ｐＡＵＲ１２３からの１ｋｂ  ＢａｍＨＩ断片に結合させる。ｐＡＵＲ１２３からのＢａｍＨＩ断片はマルチプル−クローニング部位並びにＡＤＨ１プロモータおよびターミネータ領域を含む。本発明者らはその後１０μｇのこのプラスミド（“ｐＡＵＲ１０１−プロモータ”）をＳａｌＩおよびＫｐｎｌで消化し、ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰ融合蛋白を含む、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰからの１．８ｋｂ  ＳａｌＩ／Ｋｐｎｌ断片に結合させる。生成したプラスミドはｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰである。全てのＤＮＡ断片は制限酵素消化後にゲル精製し、酵素的結合のために準備する。全ての結合はＴ４ＤＮＡリガーゼ（ロッシュ）を使用して行われる。クローン類を制限消化によってスクリーニングし、サンガーのジデオキシチェイン終結配列決定によって確認する。
【０２２８】
本発明者らはこれらプラスミドを野生型酵母細胞、並びに種々の遺伝子、例えばＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、およびヌクレオチド除去修復群などの遺伝子に突然変異を有する酵母株のゲノムに組み込む。１０μｇのプラスミドをＳａｕＩ消化によって線状にし、その線状プラスミドを酵母細胞にエレクトロポレートすることによって、これらのプラスミドを酵母ゲノム内に組み込む。プラスミドは野生型ＡＵＲ−Ｃ（アウレオバシジンＡ）遺伝子座における相同組換えによって組み込まれる。その後アウレオバシジンＡ上で選択し、上記プラスミドが組み込まれたクローンを確認する。このプラスミドが組み込まれたことをＰＣＲ分析およびサザーンブロット法によって確認する。単一並びに複数のプラスミドコピーが組み込まれた酵母株が得られる。
【０２２９】
本発明者らはＲＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、およびヌクレオチド除去修復群からの遺伝子を発現する一組の酵母発現プラスミドも合成する。ＴＰＬ１遺伝子からのプロモータを有するプラスミドｐＹＮ１３２を使用する。これは下流がクローン化された遺伝子を高水準に構成的に発現させる（アルバー（Ａｌｂｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．  １巻：４１９−３４ページ（１９８２））。１０μｇのｐＹＮ１３２ＤＮＡ並びにＤＮＡ修復蛋白の一つを含むＰＣＲ産物１０μｇをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ（ＮＥＢ）で消化することによって発現プラスミドを構成する。各ＤＮＡ断片をゲル精製し、結合の準備をする。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ロッシュ）を使用してＰＣＲ産物をｐＹＮ１３２ベクターに３：１のモル比で結合する。制限消化によってクローン類をスクリーニングし、サンガーのジデオキシチェイン終結配列決定によってクローンを確認し、キアゲン（登録商標）マキシプレプ−キットを使用してプラスミドＤＮＡを精製する。
【０２３０】
本発明者らは修飾オリゴヌクレオチド（図３に示される）について、野生型、突然変異体および付加的遺伝子（類）を発現する細胞など、種々の宿主細胞環境における核酸配列改変を促進する能力を分析試験するためにこの系を利用する。これらのオリゴヌクレオチドはｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰにおける突然変異並びにｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰまたはｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰにおける突然変異の修正に導く。これらのオリゴヌクレオチドのなかで第一のオリゴヌクレオチド、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４、は核酸配列改変に導く配列を中心位置に有する７４塩基のオリゴヌクレオチドである。第二のオリゴヌクレオチド（ＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴと呼ばれる）はＨｙｇＥ３Ｔ／７４の相補体である。第三のオリゴヌクレオチド（Ｋａｎ７０Ｔと呼ばれる）は標的配列に相補的でない非特異的、対照オリゴヌクレオチドである。或いは、配列は確認されているが、標的に対するミスマッチがないオリゴヌクレオチド、または完全にホスホロチオエート修飾されたオリゴヌクレオチド、または完全に２−Ｏ−メチル化された修飾オリゴヌクレオチドまたは完全にＬＮＡ修飾されたオリゴヌクレオチドを対照として使用できる。本発明者らはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ二重ヘアピン  オリゴヌクレオチドでもこの系を使用する。
【０２３１】
オリゴヌクレオチド合成および細胞類。本発明者らは使用できるホスフォルアミダイトを使用し、調節される孔を有するガラス支持体上でオリゴヌクレオチドを合成し、精製する。脱保護し、固体支持体から脱離した後、各オリゴヌクレオチドを例えばガンパー（Ｇａｍｐｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３９巻：５８０８−５８１６ページ（２０００）に記載された方法などを使用してゲル精製する。オリゴヌクレオチドの濃度を分光光度法によって測定する（一本鎖またはヘアピンオリゴマーのＡ２６０単位あたり、それぞれ３３または４０μｇ／ｍｌ）。アッセイに使用されるプラスミドは、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＬＳＹ６７８（野生型）中でアウレオバシジン選択下で低コピー数に安定的に維持される。上記株ＬＳＹ６７８は任意に付加的遺伝子突然変異を含んでいてもよいし、付加的蛋白（類）を発現するように改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）してもよい。
【０２３２】
プラスミド類およびオリゴヌクレオチド類を酵母細胞に次に記すようにエレクトロポレーションによって導入し、エレクトロコンピテント酵母細胞を作る：単一コロニーをＹＰＤ培地１０ｍｌに接種し、３００ｒｐｍ、３００℃で一晩振とうして培養菌を増殖させる。その後、一晩培養した培養物に新鮮ＹＰＤ培地３０ｍｌを加え、ＯＤ６００が０．５ないし１．０になるまで（３−５時間）３０℃で振とうし続ける。３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、細胞を２５ｍｌ氷冷蒸留水中で２回再懸濁させることによって細胞を洗浄する。その後３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、１ｍｌの氷冷１Ｍソルビトールに再懸濁し、最後にそれら細胞を５０００ｒｐｍ、４℃で５０００遠心分離し、細胞を１２０μｌ１Ｍソルビトールに再懸濁する。エレクトロコンピテント細胞をプラスミドまたはオリゴヌクレオチドで形質転換するために、特に記載がない限り、細胞４０μｌを核酸５μｇと混合し、氷上で５分間インキュベートする。その後０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに混合物を移し、１．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωにセットされたバイオラッド・ジーン・パルサー装置で１回５秒のパルスでエレクトロポレートする。その後直ちに、１Ｍソルビトールを補充した１ｍｌＹＰＤに細胞を懸濁させ、その培養液を３００ｒｐｍの振とう下で３０℃で６時間インキュベートする。この培養液２００μｌを、３００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む選択プレート上に広げ、この培養液の１０５希釈液２００μｌを、５００ｎｇ／ｍｌアウレオバシジンａおよび／またはハイグロマイシンを含む選択プレート上に広げ、３０℃で３日間インキュベートして個々の酵母コロニーを増殖させる。プレート上のコロニー数を数え、１０５アウレオバシジンＡ耐性コロニーあたりのハイグロマイシン耐性コロニー数を決定することによって核酸配列改変効率を計算する。
【０２３３】
野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの種々の突然変異を修復する核酸配列改変。図３に示すオリゴヌクレオチド類について、３種類全てのプラスミドをｉｎ  ｖｉｖｏで改変する能力を野生型酵母株ＬＳＹ６７８を用いて試験する。これらの標的プラスミドは点突然変異（ｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰ）、欠失突然変異（ｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰ）または挿入突然変異（ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰ）を含む。標的ＤＮＡの対側ストランドを標的にするオリゴヌクレオチドを試験し、ストランド特異的効果を確認し、またそのオリゴヌクレオチドをある範囲の濃度で試験し、遺伝子修復のための最適濃度を決定する。
【０２３４】
表４（この実施例の終わりに示される）に示すように、どちらの鎖も標的にするオリゴヌクレオチドは、３種類全ての突然変異の修正を指向することが認められる。データは、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰにおける点突然変異はｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰの挿入突然変異より効率的に修正され、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰの挿入突然変異それ自体はｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰの欠失突然変異より効率的に修正されることを示す。さらに、３種類全てのアッセイプラスミドにおいて、この系における核酸配列改変に最適なオリゴヌクレオチド濃度は５μｇであることが認められる。しかしこれらオリゴヌクレオチドが広い濃度範囲にわたって修復をおこし得ることは注目される。最後に、標的ＤＮＡ、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴ、のセンスストランドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドは３種類全ての標的突然変異を、相補的オリゴヌクレオチド、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４より効率的に修復する。ＨｙｇＥ３Ｔ／７４の使用に比較してＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴを使用する場合の修復効率の倍数差（ｆｏｌｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を表４の最後のカラムに示す。
【０２３５】
組込み型ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰプラスミドを含む株において、図３に示すオリゴヌクレオチド類が３種類の標的突然変異全てを改変する能力も試験する。本発明者らは、ＤＮＡ二本鎖標的のどちらの鎖も標的にするオリゴヌクレオチドの複数の濃度を試験する。ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰプラスミドに置換突然変異を有するこれらのタイプの実験の結果は表１４に示され、最適オリゴヌクレオチド濃度の決定の仕方に関するデータを含む。どちらのストランドも標的にするオリゴヌクレオチド類が、組込み型ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰプラスミドにおける点突然変異の修正に向かうこと、およびこの染色体標的に関する核酸配列改変のための最適オリゴヌクレオチド濃度が７．５μｇであることが認められる。しかしここでも、オリゴヌクレオチドは広い濃度範囲にわたって修復を起こし得ることが認められる。標的ＤＮＡのセンスストランドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴは、全ての試験濃度で、相補的オリゴヌクレオチド、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴより効率的に染色体標的突然変異を修復することが認められる。ＨｙｇＥ３Ｔ／７４の使用に比較した、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴを使用した場合の修正効率の倍差を表１４の最後のカラムに示す。
【０２３６】
ＲＡＤ５２エピスタシス群の遺伝子（類）に突然変異（類）を有する株における核酸配列改変。ＲＡＤ５２エピスタシス群の遺伝子に追加的突然変異（類）を有する酵母株を使用した際に、図３に示すオリゴヌクレオチド類がｉｎ  ｖｉｖｏで核酸配列を改変する能力を試験する。これらの実験には、ＲＡＤ５２エピスタシス群の遺伝子の一つ以上に突然変異を有し、標的プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰ、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰまたはｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰを含むＬＳＹ６７８（野生型）の誘導体を使用する。これらの細胞に５μｇのＨｙｇＥ３Ｔ／７４をエレクトロポレートし、ハイグロマイシンおよびアウレオバシジンＡ上にプレートして核酸配列改変効率を得る。プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰ、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰまたはｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰに関するこれらの実験結果を表５、表６および表７にそれぞれ示す。ＲＡＤ５２エピスタシス群の遺伝子（類）における突然変異（類）を有する酵母株における、染色体標的に対する核酸配列改変効率もモニターする。
【０２３７】
これらのデータは、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＲＡＤ５９、ＲＡＤ５０、ＭＲＥ１１またはＸＲＳ２に突然変異を有する酵母株において核酸配列改変効率は低下するかまたは変化しないことを示す。これらの実験で、ＲＡＤ５７に突然変異がるか、ｒａｄ５１／５２に二重突然変異がある株に本発明者らが観察した核酸配列改変効率は、標的プラスミドとしてｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰまたはｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰを使用する際には低下するが、驚いたことに、標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰを使用する際にはこれらの株においては核酸配列改変効率の増加が認められる。標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰを使用する際の核酸配列改変は、ＲＡＤ５４またはＲＡＤ５５に突然変異を有する酵母株では低下することが認められる。プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｗｔ）ｅＧＦＰを含むＬＳＹ６７８酵母細胞で対照実験も行う。この株では、オリゴヌクレオチド類を付加しない場合でさえ、数え切れないほど多くのハイグロマイシン耐性コロニーがあることが認められる。本発明者らはＲＡＤエピスタシス群の単一遺伝子両方に突然変異を有する酵母株並びに二つ以上の遺伝子に突然変異がある酵母株を試験する。本発明者らはこれらの酵母株の、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰ突然変異の全てを修正する能力を試験する。
【０２３８】
ミスマッチ修復遺伝子（類）に突然変異（類）を有する株における核酸配列改変。プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰを含むミスマッチ修復遺伝子（類）に追加的突然変異（類）を有する酵母株を使用して、図３に示すオリゴヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｖｏで核酸配列を改変する能力を試験する。これらの細胞にＨｙｇＥ３Ｔ／７４の５μｇをエレクトロポレートし、ハイグロマイシンおよびアウレオバシジンＡ上にプレートし、核酸配列改変効率を得る。例えば、プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰ、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰおよびｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰの場合のこれらの実験結果は表５、表６および表７にそれぞれ示される。ＲＡＤ５２エピスタシス群の遺伝子（類）に突然変異（類）を有する酵母株における、染色体標的に対する核酸配列改変効率もモニターする。
【０２３９】
これらのデータは、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３またはＭＳＨ６に突然変異を有する株では核酸配列改変は低い効率で起こり、ＰＭＳ１に突然変異を有する株では高い効率で起きることを示す。標的としてプラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰ、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰまたはｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰのいずれかを使用する実験においても、相対的効率は異なるとはいえ、同じ一般的効果が認められる。プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｗｔ）ｅＧＦＰを含むＬＳＹ６７８酵母細胞を用いる対照実験においては、オリゴヌクレオチドの付加がない場合でさえ、数え切れないほど多くのハイグロマイシン耐性コロニーがあることが判明した。両方の単一ミスマッチ修復遺伝子に突然変異を有する酵母株、並びに２つ以上の遺伝子に突然変異を有する酵母株を試験する。これらの酵母株の、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰ突然変異の全てを修正する能力を試験する。
【０２４０】
ヌクレオチド除去修復遺伝子（類）に突然変異（類）を有する株にお核酸配列改変。プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰを含むヌクレオチド除去修復遺伝子（類）に追加的突然変異（類）がある酵母株を用いて、図３に示すオリゴヌクレオチド類のｉｎ  ｖｉｖｏ核酸配列改変能力を試験する。これらの細胞に５μｇのＨｙｇＥ３Ｔ／７４をエレクトロポレートし、ハイグロマイシンおよびアウレオバシジンＡ上にプレートして核酸配列改変効率を試験する。例えば、プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰ、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰおよびｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰに関するこれらの実験結果を表５、表６および表７にそれぞれに示す。本発明者らはＲＡＤ５２エピスタシス群の遺伝子に突然変異（類）を有する酵母株における染色体標的に対する核酸配列改変効率もモニターする。
【０２４１】
これらのデータは、ＲＡＤ１０、ＲＡＤ２０またはＲＡＤ２３に突然変異を有する株において、核酸配列改変が低効率で起きることを示す。これらの実験でＲＡＤ１に突然変異を有する株に認められた核酸配列改変効率は、標的プラスミドとしてｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰまたはｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰのどちらかを使用した場合には低下するが、標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰを使用した場合には増加する。標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰまたはｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰを用いた場合、ＥＸＯ０１に突然変異を有する酵母株における核酸配列改変は減少することが認められる。本発明者らはプラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｗｔ）ｅＧＦＰを含むＬＳＹ６７８酵母細胞を用いる対照実験も行った；それは数え切れないほど多くのハイグロマイシン耐性コロニーを与える。本発明者らは両方の単一ヌクレオチド除去修復遺伝子に突然変異を有する酵母株並びに２つ以上の遺伝子に突然変異を有する酵母株を試験する。本発明者らはこれらの酵母株の、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰ突然変異の全てを修正する能力を試験する。
【０２４２】
プラスミドからのＤＮＡ修復遺伝子（類）を発現する酵母株における核酸配列改変。ＲＡＤ５２エピスタシス群の遺伝子、ミスマッチ修復遺伝子およびヌクレオチド除去修復遺伝子などの、ＤＮＡ修復遺伝子の発現の増加が、核酸配列改変効率に与える影響を試験する。これらの遺伝子の発現効果を、個々に、並びに２つ以上のグループとして試験する。ＤＮＡ修復遺伝子の発現に導く誘発性プロモータを有するプラスミド、例えば図６に記載されるプラスミドを用いる。或いは、ＤＮＡ修復遺伝子の発現に導く構成性プロモータを有するプラスミド、例えば図１、２、および４に記載されるプラスミドを使用する。
【０２４３】
ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群の遺伝子（類）の追加的コピーを有する酵母株を使用して、図３に示すオリゴヌクレオチド類の、ｉｎ  ｖｉｖｏ核酸配列改変能力を試験する。これらの実験において、本発明者らはＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群からの遺伝子のクローン化コピーを含むプラスミドｐＹＮ１３２またはｐＹＮ１３２の誘導体を含む、ＬＳＹ６７８野生型の誘導体類を使用する。これらの株はさらに、プラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰ、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰおよびｐＡＵＲＨＹＧ（ｄｅｌ）ｅＧＦＰの１つを、核酸配列改変をモニターするレポータとして含む。或いはこれらの株は、組込み型プラスミドｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰの１つ以上のコピーを、核酸配列改変をモニターするためのレポータとして含む。これらの株におけるクローン化ＤＮＡ修復遺伝子の発現をノザーンブロットおよび／またはウエスターンブロット法により確認する。
【０２４４】
本発明者らはＲＡＤ１０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＭＲＥ１１、ＰＭＳ１、ＲＥＣ２またはＸＲＳ２を発現するプラスミドをＬＳＹ６７８（野生型）に導入し、一本鎖オリゴヌクレオチド  ベクター、Ｈｙｇ３Ｓ／７４ＮＴの、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰプラスミドにおける核酸配列改変を指示する能力をモニターする。表９および表１２に示すように、これらの実験から得られた結果は、ＲＡＤ１０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＭＲＥ１１、ＰＭＳ１、またはＸＲＳ２遺伝子のうちの任意の１つの遺伝子の追加的発現も、核酸配列改変効率を１．２倍（ＲＡＤ１０）から７．５倍（ＲＡＤ５１）の範囲で増加させることを示す。これらのデータは、特定のＤＮＡ修復蛋白の追加的コピーが核酸配列改変効率を高めることを明らかに示している。本発明者らはまた、複数の蛋白を発現するプラスミドをＬＳＹ６７８（野生型）に導入し、表１０に示すような核酸配列改変効率をモニターする。また、ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群からのその他の遺伝子も、核酸配列改変効率の上昇に関して試験する。
【０２４５】
ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群における突然変異（類）をさらに含む酵母株を用いて上記のように核酸配列改変効率を試験する。例えば、ＲＡＤ１０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５５、ＭＲＥ１１、ＰＭＳ１、ＲＥＣ２またはＸＲＳ２を発現するｐＹＮ１３２誘導性プラスミド類を、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＭＲＥ１１またはＰＭＳ１に突然変異を有するＬＳＹ６７８株に導入する。その後、一本鎖オリゴヌクレオチドベクターＨｙｇ３Ｓ／７４ＮＴの、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰプラスミドにおける核酸配列改変に向ける能力をモニターする。表１１、表１３および表１５に示すように、本発明者らはＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＭＲＥ１１またはＰＭＳ１含有ｐＹＮ１３２に突然変異を有する株が、表９に示されるようにｐＹＮ１３２を含む野生型に比較して低い修正効率を示すことが認められる。これらのデータは、表６に示される突然変異株からの結果と一致する。一般に、これらの酵母株にＲＡＤ１０、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＭＲＥ１１、またはＰＭＳ１を発現させると、空のｐＹＮ１３２ベクターを有する突然変異体に比較して核酸配列改変効率が高まることが認められる。これらのデータは、これらの遺伝子の追加的発現が上記突然変異体において、野生型の場合と同様に、核酸配列改変効率の上昇を起こすことを示している。あるプラスミドからのＲＡＤ５１を発現するＲＡＤ５２突然変異体は非常に高い修正効率を与えることが認められる。本発明者らの考察では、あるプラスミドからＲＡＤ５１を発現するＰＭＳ１突然変異体は、全ての被検株の最高修正効率を与える。突然変異酵母株における複数蛋白の発現効果も試験し、核酸配列改変効率をモニターする。
【０２４６】
ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド除去修復群の遺伝子（類）の追加的コピーを有する酵母株において染色体標的に与える核酸配列改変効率もモニターする。例えば、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５１＋ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５１＋ＲＡＤ５２、ＭＲＥ１１、ＸＲＳ２またはＭＲＥ１１＋ＸＲＳ２を発現するｐＹＮ１３２誘導性プラスミドを、ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰプラスミドの組込み型コピーに導入する。組込み型ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰを有する株を使用した実験から得られる結果を表１６に示す。これらの結果はエピソーム性標的実験で認められた結果と一致する。
【０２４７】
本発明者らはさらに、ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群に突然変異（類）を含む酵母株を使用して上記のように染色体標的配列に対する核酸配列改変効率を測定する。例えば、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＭＲＥ１１、ＰＭＳ１、ＲＥＣ２、またはＸＲＳ２を発現するｐＹＮ１３２誘導プラスミド（類）を、ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰの組込み型コピーを有し、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＭＲＥ１１、およびＰＭＳ１遺伝子の一つ以上に突然変異（類）を有するＬＳＹ６７８株に導入する。その後、一本鎖オリゴヌクレオチドベクター、Ｈｙｇ３Ｓ／７４ＮＴ、の、組込み型ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰプラスミドにおける核酸配列改変に導く能力をモニターする。
【０２４８】
本発明者らは、例えばその他の菌類、動物、植物および細菌などを含むその他の生物からのＤＮＡ修復遺伝子の異種発現の効果も試験する。
【０２４９】
本発明者らはその他のオリゴヌクレオチド類を使用して、ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群および／またはヌクレオチド除去修復群の遺伝子（類）の発現または活性が変化している酵母株に含まれるｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰプラスミドの複数の突然変異を修正する、個々のオリゴヌクレオチド類の能力も分析する。これらには例えば、３ヌクレオチド離れた２つの塩基対を改変するもので、配列５’−ＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＧＴＡＣＧＴＣＣＴＧＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＡＴＧＧＴＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号：１７）を有する７４マー；１５ヌクレオチド離れた２つの塩基対を改変する、配列５’−ＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＣＧＴＣＣＴＧＣＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号：１８）を有する７４マー；
および２７ヌクレオチド離れた２塩基対を改変する、配列５’−ＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＣＧＴＣＣＴＧＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＡＣＧＧＴＴＴＣＴＡＣ（配列番号：１９）を有する７４マーがある。これらオリゴヌクレオチド中の、標的配列の改変に導くヌクレオチドには下線を引き、太字で記載する。これらのオリゴヌクレオチドはこれまでに記載したオリゴヌクレオチドと同じ方法で修飾される。
【０２５０】
プラスミドｐＡＵＲＮｅｏ（ｘ）ＦＩＡｓＨＴＭ（図４）を含み、ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群および／またはヌクレオチド除去修復群の遺伝子（類）の変化した発現または活性を有する酵母株を使用して、図１に示されるオリゴヌクレオチドの、ｉｎ  ｖｉｖｏ核酸配列改変効率も試験する。このプラスミドは、ネオマイシン−ホスフォトランスフェラーゼ（カナマイシン耐性）遺伝子とＦＩＡｓＨＴＭリガンドのためのレセプタをコードする伸長リーディングフレームとを含む合成発現カセットを、ｐＡＵＲ１２３シャトルベクターに挿入することによって構成される（パンベラ（登録商標）社、マジソン、ＷＩ）。本発明者らはｐＫｓｍ４０２１と同じ突然変異を有する構成物を作る。生成した構成物はＳ．ＣＥＲＥＶＩＳＩＡＥ中で低コピー数で複製し、アウレオバシジンＡ耐性を与え、ＡＤＨ１プロモータからのＮｅｏ（ｘ）ＦＩＡｓＨＴＭ融合産物を構成的に発現する。小さいリガンドを結合させて蛍光複合体を形成できる固有のペプチド配列をコードするこの遺伝子のリーデイングフレームを伸長することによって、停止コドンの修正による発現の回復が共焦点顕微鏡によって実時間で検出できる。短縮されたＮｅｏ（−）ＦＩＡｓＨＴＭ産物を修正し、Ｎｅｏ（＋）ＦＩＡｓＨＴＭ融合産物が生成すると、翻訳された融合蛋白はリガンド（ＦＩＡｓＨＴＭ−ＥＤＴ２）に結合し、細胞上に緑色蛍光を与える。ＦＩＡｓＨＴＭペプチドに融合する標的遺伝子を使用したその他の構成物をこのモデル系を使用して作り、付加的核酸配列改変事象を試験することができる。
【０２５１】
酵母細胞中のＮｅｏ（＋）ＦＩＡｓＨＴＭ融合産物の存在を検知するために、ＦＩＡｓＨＴＭリガンドを、１Ｍソルビトールおよび２０μＭジスパーゼ３を含むＹＰＤに混ぜ合わせることによって、ローディング緩衝液を作る。リガンド分子を、１μＭＦＩＡｓＨＴＭ−ＥＤＴ２および１０μＭ  １，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）のＹＰＤ（シグマ社）に混入する。それから細胞１００μｌを、ＨＢＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１０μＭ  ＥＤＴ、１Ｍソルビトールおよび２０μＭジスパーゼ３を含む等容量の洗浄緩衝液と混合する。適切な発光フィルタ（ＦＩＡｓＨＴＭ−ＥＤＴ２結合では５０５−５５０ｎｍバンドパス）を備えたオムニクローム  Ａｒ−Ｋｒレーザーの４８８／５６８ｎｍ励起線を使用するツァイス・アキシオバート（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ）１００ｍのツァイスＬＳＭ５１０レーザー操作顕微鏡で細胞を画像化する。同時に、４８８ｎｍ励起を用いて全ての蛍光画像でレーザー走査伝達画像または微分干渉コントラスト画像を得る。本発明者らはサンプルをラボテクＩＩチャンバード＃１．５カバーグラス  システム（Ｌａｂ−ｔｅｋＩＩ  ｃｈａｍｂｅｒｅｄ  ＃１．５  Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＩＬ）に担持させ、それらをツァイス６３ｘ  Ｃ−アポクロメト（Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍｅｔ）浸水レンズ（ＮＡ１．２）を使用して画像化する。陽性および陰性対照を含む全てのサンプルは所定の実験セットで同一条件（レーザーパワー、ピンホール、ＰＭＴギャップ  オフセットなど）のもとで組み込まれる。
【０２５２】
本発明者らはＦＩＡｓＨ−ＥＤＴ２モデル系を使用して、酵母株ＬＳＹ６７８に存在するネオマイシン−ホスフォトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）の突然変異の修正を観察する。核酸配列改変に導くＫａｎＧＧまたはその他のオリゴヌクレオチドを、ｐＡＵＲＮｅｏ（−）ＦＩＡｓＨＴＭプラスミドの安定コピーを含むＬＳＹ３８６およびＬＳＹ６７８にエレクトロポレートする。テキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）結合オリゴヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチドの取り込みを測定し、生存細胞の８０％以上がオリゴヌクレオチドを受け入れるように、エレクトロポレーション条件を最適化する。ＫａｎＧＧ、または核酸配列改変に導くその他のオリゴヌクレオチドがない場合は、ＬＳＹ６７８（図５Ａ）およびＬＳＹ３８６（図５Ｂ）両方にＦＩＡｓＨＴＭ−ＥＤＴ２を添加後、共焦点顕微鏡によって低レベルのオートフルオレッセンスだけが認められる。しかし、ＫａｎＧＧを細胞に導入すると、ＬＳＹ６７８およびＬＳＹ３７８にはそれぞれ図５Ｃおよび図５Ｄに見られるように、多くの修正された細胞が認められる。ＲＤＡ５２欠乏ＬＳＹ３７８（図５Ｄ）には、ＬＳＹ６７８株（図５Ｃ）に比較して、緑色蛍光を示す細胞数の顕著な増加が見られる。この結果は、ＲＡＤ５２遺伝子機能が欠乏している株における高度の遺伝子修復をあらわすものである。ｐＡＵＲＮｅｏ（−）ＦＩＡｓＨＴＭの修正も、酵母細胞におけるＧ４１８選択に対する耐性を与える。そのため、本発明者らは緑色蛍光あらわす典型的サンプルをＧ４１８を含む寒天プレート上で増殖させた。その後これら細胞中のプラスミドのＤＮＡ配列を決定する。配列分析の結果、Ｇ４１８選択後に分離されたプラスミドにおいて設計したように、標的塩基がＧからＣに変わっていることが判明した。ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群およびヌクレオチド除去修復群においてその他の蛋白の発現または活性レベルが変化した酵母株で同様な実験を行う。
【０２５３】
酵母突然変異体において、センスストランドを標的にするオリゴヌクレオチドは核酸配列をより効率的に改変する。一本鎖オリゴヌクレオチド類が、ＤＮＡ修復遺伝子の発現の増加、または減少を示すＬＳＹ６７８突然変異株に存在するｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰ、ｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰまたはｐＡＵＲＨＹＧ（△）ｅＧＦＰの標的配列の２つのストランドの各々を標的化する能力を比較する。例えば、ＲＡＤ１およびＲＡＤ１０に突然変異を有する酵母株で行った実験結果が表８に示される。この実験のデータは、標的配列のセンスストランド（すなわちｍＲＮＡと同一である標的配列のストランド）に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴが、ＲＮＡ合成のための鋳型として役立つストランドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４、に比べて約１０倍も効率的に遺伝子を容易に修正することを示す。しかし、ＤＮＡ修復遺伝子に突然変異を有する酵母株に認められる効率の低下にもかかわらず、なおそれらオリゴヌクレオチド類は標的配列のいずれのストランドも明らかに標的にすることができる。さらに標的遺伝子の転写の役割を、図６に記載したような誘発性プロモータを有するプラスミドを使用して研究する。
【０２５４】
その他の細胞におけるＤＮＡ修復遺伝子の影響。上記の酵母アッセイ系におけるＤＮＡ修復遺伝子の効果の試験に加えて、その他の細胞、例えばその他の菌類、動物、植物および細菌細胞などにおけるＤＮＡ修復遺伝子の発現または活性を改変する効果も試験する。正常なＤＮＡ修復遺伝子を有するその他の細胞並びにＤＮＡ修復遺伝子の改変されたレベルまたは活性を有する細胞、例えば相同遺伝子に突然変異を有するヒトおよび細菌細胞または相同遺伝子の追加的コピーを発現するヒトおよび細菌細胞などを使用する。例えば、本発明者らは、天然または非相同性（異種）ＤＮＡ修復遺伝子のどちらかを発現するベクターで一過性にまたは安定的に形質転換される細胞を使用する。これらの細胞における核酸配列改変をモニターするために、本発明者らはリポータ遺伝子アッセイ系、例えばカナマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性またはＧＦＰ発現などを用いる。或いは、あるオリゴヌクレオチドの、標的細胞のゲノムに存在する標的の核酸配列改変を指示する能力を分析する。例えば、β−グロビン遺伝子の鎌状赤血球Ｔ（βＳ）突然変異の、正常Ａ（βＡ）対立遺伝子への変換、またはその逆をモニターする。
【０２５５】
【表４】
2005518817.tif 000015
＊４実験から得られたヒグロマイシンプレート上の平均コロニー数
括弧内の数字はアウレオバシジン耐性コロニー１個あたりのヒグロマイシン耐性コロニー数をあらわす。
【０２５６】
【表５】
2005518817.tif 000016
＊各株は指示された突然変異以外は野性型である。これらの実験に使われた突然変異は概ねノックアウト突然変異である。
【０２５７】
【表６】
2005518817.tif 000017
＊各株は指示された突然変異以外は野生型である。これらの実験に使われた突然変異は概してノックアウト突然変異である。
【０２５８】
【表７】
2005518817.tif 000018
【０２５９】
【表８】
2005518817.tif 000019
＊括弧内の数字は、蛋白をコードするＤＮＡ二本鎖の非転写ストランドを標的とする効率が他の一つのストランドを標的とす効率に比較して何倍増加するかを示す。
＊＊各株は指示された突然変異体以外は野生型である。これらの実験に使われた突然変異は概ねノックアウト突然変異である。
【０２６０】
【表９】
2005518817.tif 000020
＊全ての株が修正標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰも含む。全ての酵母株は全てのＤＮＡ修復蛋白に関して野生型であり、示されているように、ＤＮＡ修復蛋白を発現するプラスミドを含む。
【０２６１】
【表１０】
2005518817.tif 000021
＊全ての株は修正標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰも含む。全ての酵母株は全てのＤＮＡ修復蛋白に関しては野生型であり、示されているようにＤＮＡ修復蛋白を発現するプラスミドを含む。
【０２６２】
【表１１】
2005518817.tif 000022
＊全ての株は修正標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰも含む。全ての酵母株は、指示されたＤＮＡ修復蛋白における単一突然変異以外は野生型であり、示されたように野生型ＤＮＡ修復蛋白を発現するプラスミドを含む。これらの実験に使われた突然変異は概ねノックアウト突然変異である。
【０２６３】
【表１２】
2005518817.tif 000023
＊全ての株は修正標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰも含む。全ての酵母株は全てのＤＮＡ修復蛋白では野生型であり、示されたようにＤＮＡ修復蛋白を発現するプラスミドを含む。
【０２６４】
【表１３】
2005518817.tif 000024
＊全ての株は修正標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰも含む。全ての酵母株は指示されたＤＮＡ修復蛋白における単一突然変異以外は野生型であり、示されたように野生型ＤＮＡ修復蛋白を発現するプラスミドを含む。これらの実験に使われた突然変異は概ねノックアウト突然変異である。
【０２６５】
【表１４】
2005518817.tif 000025
＊３実験から得られたハイグロマイシンプレート上の平均コロニー数が示される。括弧内の数字はアウレオバシジン耐性コロニーの数（／１０５）を示す。
【０２６６】
【表１５】
2005518817.tif 000026
＊全ての株は修正標的としてｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰも含む。全ての酵母株は指示されたＤＮＡ修復蛋白における単一突然変異以外は野生型であり、指示されたように野生型ＤＮＡ修復蛋白を発現するプラスミドを含む。これらの実験に使われた突然変異は概ねノックアウト突然変異である。
【０２６７】
【表１６】
2005518817.tif 000027
＊全ての株は修正標的としてｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰを含む。全ての酵母株は組込み型プラスミド以外は野生型であり、示されたように野生型ＤＮＡ修復蛋白を発現するプラスミドを含む。
【０２６８】
実施例３：培養細胞の操作
単核細胞を正常ドナーのヒト臍帯血、骨髄または末梢血から、フィコル・ペイク・プラス（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ）（アマーシャム・ビオサイエンシス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ピスカタウエイ、ＮＪ）密度遠心分離法を使用して分離する。ＣＤ３４細胞を単核細胞から、前駆体またはマルチソート・キット（Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔ  Ｋｉｔｓ）（ミルテニー・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ）、アーバーン、ＣＡ）のどちらかを使用して免疫磁気的に精製する。Ｌｉｎ−ＣＤ３８−細胞は、製造者のプロトコルによって、ステムセプ・システム（ＳｔｅｍＳｅｐ  ｓｙｓｔｅｍ）でネガティブ選択を使用して単核細胞から精製する。マイクロインジェクションに使用する細胞は新しく分離するか冷凍保存し、マイクロインジェクションの前の２ないし５日間ステム培地（Ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で培養する。Ｓ培地は、フェノールレッドを含まないイスコヴス（Ｉｓｃｏｖｅｓ）の改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を、１００μｇ／ｍｌグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５０μｇ／ｍｌウシ膵臓インスリン、１ｍｇ／ｍｌヒトトランスフェリンおよびＩＭＤＭ；ステム・セル・テクノロジー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４０μｇ／ｍｌ低密度リポ蛋白（ＬＤＬ；シグマ社、セントルイス、ＭＯ）、５０ｍＭ  ＨＥＰＥｓ緩衝液および５０μＭ２−メルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌの各トロンボポイエチン、ｆｉｔ３−リガンド、幹細胞因子、およびヒトＩＬ−６（ペプロ・テク（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ）社、ロッキーヒル、ＮＪ）と共に含む。マイクロインジェクション後、細胞を脱離し、４８ウェルプレートのウェルにまとめて移し、培養する。
【０２６９】
３５ｍｍ皿を、燐酸緩衝食塩液中５０μｇ／ｍｌフィブロネクチン（ＦＮ）断片ＣＨ−２９６（レトロネクチン；タカラ  バイオメディカルス（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、パンベラ（登録商標）、マジソン、ＷＩ）で４℃で一晩コーティングし、グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭで洗う。３００ないし２０００細胞をクローニングリングに加え、マイクロインジェクションの前に４５分間、３７℃でプレートに付着させる。インキュベーション後、クローニングリングを取り、Ｓ培地２ｍｌを各皿に加え、マイクロインジェクションを行う。インジェクション針を引き抜く；０．２２μないし０．３μの範囲のチップ外径を使用する。３７℃にセットされた温度調節ステージを備えた顕微鏡で細胞を可視化し、電子的に連動したエッペンドルフ・ミクロマニピュレータおよびトランスジェクタを使用して注入する。うまく注入された細胞は完全無傷で生きており、注入後プレートに付着したままである。蛍光標識をつけた分子によって、細胞に運搬されたオリゴヌクレオチドの量が決定できる。
【０２７０】
Ｌｉｎ−ＣＤ３８−細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで赤血球を生成するために、マリク（Ｍａｌｉｋ）の方法を使用できる（マリクら、Ｂｌｏｏｄ、９１巻：２６６４−７１ページ（１９９８））。細胞をＭＥ培地で４日間培養し、その後Ｅ培地で３週間培養する。赤血球生成は、グリコフォリンＡ発現、並びに培養細胞にヘモグロビンの存在を示す赤色の発生によって明らかになる。注入された細胞は、それらの増殖能力および骨髄系および赤血球系子孫の生成能力を保有する。ＣＤ３４＋細胞はβ−グロビン遺伝子における正常Ａ（βＡ）を鎌状赤血球Ｔ（βＳ）に突然変異で変えることができ、またはここに記載の本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかを使用して改変され、正常遺伝子を変異体遺伝子に修正または改変することができる。或いは、幹細胞を遺伝病突然変異を有するヒトの血液から分離することができ、本発明のオリゴヌクレオチドを使用してこれら細胞内の欠陥を修正し、または細胞内のゲノムを改変することができる。
【０２７１】
或いは培養細胞の非幹細胞集団を、当業者に公知の方法、例えばポリカチオン、カチオン性脂質、リポソーム、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、エレクトロポレーション、バイオリスティック、燐酸カルシウム沈殿または当業者に公知のその他の方法を使用して操作することができる。
【０２７２】
実施例４：血液疾患の治療
本発明のキットおよび方法は、例えば標的細胞が幹細胞である場合、治療的アプローチに使用できる。これらのアプローチは種々の多能性幹細胞、例えば本明細書の他の箇所に記載されているナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルスのリスト中のいずれかの幹細胞系、胚性幹細胞、および造血幹細胞などと共に使用できる。これらの細胞型のいずれかを使うこのようなアプローチが特に有益なのは、標的細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで操作でき、突然変異の修正、および所望の改変を有するクローンの選択が可能になるからである。これらの細胞はその後患者に再導入され、遺伝子的に修正された幹細胞からの子孫の再増殖が全体的にまたは一部起きる。造血幹細胞の場合、治療効果を得るためには宿主血液新生の完全な根絶は必要ないとは、患者の骨髄を除去した後に前記細胞を再導入する。（ブラウ（Ｂｌａｕ）、Ｂａｉｌｌｉｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ、１１巻、２７５−２５７ページ（１９９８）などを参照）。鎌状赤血球性貧血、タラセミア症候群、免疫学的疾患および凝血疾患などの血液疾患の多くは、本発明の組成物および方法を使用して造血幹細胞の染色体ＤＮＡの突然変異を修正し、これら細胞を患者に移植するという様態で治療することができる。
【０２７３】
幹細胞に対する大部分の治療的アプローチは、ウィルスベクター、例えばレトロウィルスベクター、アデノウイルス（Ａｄ）の部分またはアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）などを使用して特殊の蛋白の一部または完全部分をコードする核酸配列を運び込む。その蛋白が細胞に発現され、所望の表現型があらわれる。米国特許第５，７００，４７０号などを参照されたい。真核生物の生体におけるこのような導入遺伝子ベクターの使用は、ある遺伝子（宿主にとって異種でもよい）の一つ以上の外来コピーを通常はランダムな方法で、上記生体のゲノムの一つ以上の組み込み部位にある頻度で付加する。本来そのゲノムに存在する遺伝子（それは正常な対立変種、突然変異、欠損、および／または機能的遺伝子でよい）は宿主のゲノムに保有される。これとは異なり、ここに記載される本発明の方法は、標的ＤＮＡの、後遺症のない（ｌｅｇａｃｙ−ｆｒｅｅ）、精確な核酸配列改変をもたらし、ウィルスベクター遺伝子治療では起こえい得る免疫反応が起きない。
【０２７４】
鎌状赤血球性疾患の治療。本発明のキットおよび方法を用いる幹細胞の突然変異の修正のモデルとして、本発明者らは、それらが血液、骨髄、臍帯血またはその他のヒト造血幹細胞のソースから得たヒト細胞のヘモグロビン鎌状赤血球突然変異を修正する能力を試験する。或いは、培養細胞またはマウスモデルにおけるヘモグロビン鎌状赤血球突然変異修正能力を試験する。鎌状赤血球対立遺伝子を含むヒトグロビンを専ら発現する多数のトランスジェニックマウス株が開発されている。専らヒト鎌状ヘモグロビンを発現するマウスは、抗鎌状赤血球治療を試験するのに十分信頼できる顕著な鎌状赤血球形病変を示す。ブルイン（Ｂｌｏｕｉｎ）ら、Ｂｌｏｏｄ、９４巻：１４５１−１４５９ページ（１９９９）およびファブリ（Ｆａｂｒｙ）ら、Ｂｌｏｏｄ、９７巻：４１０−４１８ページ（２００１）などを参照されたい。さらに、造血幹細胞の精製法および培養法は当業者には公知である。スパングルド（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１４巻：５８−６２ページ（１９８８）および米国特許第６，２６１，８４１号を参照されたい。
【０２７５】
本発明者らはマウスの造血幹細胞を精製し、鎌状赤血球対立遺伝子を修正し、マウスに再挿入し、鎌状赤血球表現型をモニターする。
【０２７６】
エイズの治療。ＨＩＶ−１の標的細胞への侵入は、細胞表面ＣＤ４並びに付加的宿主細胞補因子を必要とすることは公知である。ＨＩＶ−１の主要な向マクロファージ株（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｔｒｏｐｉｃ  ｓｔｒａｉｎｓ）のエンベロープ糖蛋白を介する侵入のための主な補因子はＣＣ−ＣＫＲ５である。米国特許第６，０５７，１０２号などを参照されたい。ＣＫＲ５の発現を完全に抑制するＣＫＲ５レセプタ突然変異に関してホモ接合である個体は、ＨＩＶ感染に抵抗する。ＣＫＲ５突然変異に関してヘテロ接合である個体は、ＨＩＶ感染により強く抵抗し、ＣＫＲ５突然変異に関してホモ接合である個体はヘテロ接合の個体よりより強く抵抗する。
【０２７７】
ヒトＣＫＲ−５遺伝子の配列は公知であり、ＣＫＲ−５の突然変異に起因する明らかに不都合な効果はない。よってＨＩＶ−１に感染した個体は、造血幹細胞を除去し、ＣＫＲ−５に突然変異を導入することによって治療できる。
【０２７８】
実施例５：ヒト血液細胞をＨＤＡＣインヒビタで処理すると核酸配列改変効率は高まる
単核細胞を正常ドナーのヒト臍帯血から、フィコル  ペイク  プラス（アマーシャム・ビオサイエンシス）密度遠心分離法を使用して分離する。ＣＤ３４＋細胞は単核細胞から、前駆体またはマルチソート・キット（ミルテニー・バイオテク、アーバーン、ＣＡ）を使用して免疫磁気的に精製される。Ｌｉｎ−ＣＤ３８−細胞は単核細胞から、製造者のプロトコル（ステム・セル・テクノロジー社、バンクーバー、ＣＡ）によって、ステムセプ・システムを使用するネガティブ選択により精製する。マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションまたはリロポソーム・トランスフェクションに本発明のオリゴヌクレオチドと共に使用する細胞は、新しく分離するか冷凍保存し、治療前の２ないし５日間ステム培地（Ｓ培地）中で培養する。Ｓ培地は、フェノールレッドを含まないイスコヴスの改良ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を１００μｇ／ｍｌグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌウシ膵臓インスリン、１ｍｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、およびＩＭＤＭ、４０μｇ／ｍｌ低密度リポ蛋白（ＬＤＬ；シグマ社、セントルイス、ＭＯ）、５０ｍＭ  ＨＥＰＥｓ緩衝液および５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、２０ｎｇ／ｍｌの各トロンボポイエチン、ｆｉｔ３−リガンド、キットリガンドと共に含み、５０ｍｇ／ｍｌウシ胎児血清アルブミン、幹細胞因子およびヒトＩＬ−６（ペプロ・テク社、ロッキーヒル、ＮＪ）を含むことができる。無血清培地の一ソースはクォリティ・バイオテクノロジカル社（ガイサーバーク、マリーランド）からのＱＢＳ６０である。細胞は、本発明のオリゴヌクレオチドによる処理前に、１７０μＭトリコスタチンＡを含む培地に１６時間培養される。処理後、細胞を脱離し、４８ウェルプレートのウェルにまとめて移し、培養する。
【０２７９】
マイクロインジェクションのためには、３５ｍｍ皿を、燐酸緩衝食塩液中５０μｇ／ｍｌフィブロネクチン（ＦＮ）断片ＣＨ−２９６（レトロネクチン；タカラ  バイオメディカルス）、パンベラ（登録商標）、マジソン、ＷＩ）で、４℃で一晩コーティングし、グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭで洗う。３００ないし２０００の細胞をクローニングリングに加え、マイクロインジェクションの前に４５分間、３７℃でプレートに付着させる。インキュベーション後、クローニングリングを取り、Ｓ培地２ｍｌを各皿に加え、マイクロインジェクションを行う。インジェクション針を引き抜く；０．２２μないし０．３μの範囲のチップ外径を使用する。３７℃にセットされた温度調節ステージを備えた顕微鏡で細胞を可視化し、電子的に連動したエッペンドルフ・ミクロマニピュレータおよびトランスジェクタを使用して注入する。うまく注入された細胞は完全無傷で、生きており、注入後プレートに付着したままである。蛍光標識をつけた分子によって、細胞に運搬されたオリゴヌクレオチドの量を決定することができる。
【０２８０】
エレクトロポレーションのために、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、キットリガンドおよびＦＬＴ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清培地２５０μｌ中約２−４×１０６の細胞（同じサイトカイン類の存在下で７２時間培養したもの）に、スクエア・ウェーブ装置（Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）などのエレクトロポレーション装置において、ＶＴＸによってエレクトロポレートする。細胞には、１パルスに約２５−３０μｇのオリゴヌクレオチドが２２０ｍＶおよび９６０μＦでエレクトロポレートされる。エレクトロポレーション後、細胞を、１０％ＦＣＳおよびＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）、キット・リガンドおよびＦＬＴ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）を含むイスコヴス培地で２．５×１０５細胞／ｍｌに希釈し、フローサイトメトリーによって分析する。処置後約１２時間、細胞を回復させ、死んだ細胞を除去する。細胞はその後培地に保持される。核酸配列改変の頻度は、細胞サンプルで、種々の時間に、細胞ＤＮＡのＰＣＲサンプルの配列決定によって決められ、核酸配列改変効率が決定できる。造血幹細胞の核酸改変はエレクトロポレーション後少なくも４週間は保持された細胞集団における核酸配列改変によって示される。成熟細胞は時が経つと死に、分化可能の未成熟細胞の集団が残ると考えられる。
【０２８１】
Ｌｉｎ−ＣＤ３８−細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏ赤血球を生成するために、マリク（Ｎ｜Ｍａｌｉｋ）、１９９８、の方法を使用する。細胞をＭＥ培地に４日間培養し、その後３週間Ｅ培地に培養する。赤血球生成はグリコフォリンＡ発現並びに培養細胞にヘモグロビンの存在を示す赤色の存在によって明らかになる。注入された細胞はそれらの増殖能力、および骨髄性および赤血球性子孫を生成する能力を保持できる。ＣＤ３４＋細胞はβ−グロビン遺伝子内の正常Ａ（βＡ）を鎌状赤血球Ｔ（βＳ）に突然変異で変えることができ、或いは本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかによって改変され、正常遺伝子を突然変異体遺伝子に修正または改変し得る。或いは、幹細胞を遺伝病突然変異をを有するヒトの血液から分離し、本発明のオリゴヌクレオチドを使用してこれら細胞内の欠陥を修正し、ゲノムを変えることができる。
【０２８２】
或いは、培養細胞の非−幹細胞集団を当業者に公知の方法、例えばポリカチオン、カチオン性脂質、リポソーム、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、エレクトロポレーション、バイオリスティックス、燐酸カルシウム沈殿、または当業者に公知のその他の方法などを使用して操作することができる。
【０２８３】
実施例６：トリコスタチンＡ処理は、酵母細胞における核酸配列改変に導く能力に影響を与える。
【０２８４】
この実施例において、トリコスタチンＡを使用して、修飾主鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを使用する系においてオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変効率を高める。ｐＡＵＲＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰ（図２）のようなエピソーム性標的または同じ標的の組み込み型コピーを使用してこれらの実験を行い、染色体遺伝子改変をモニターする。これらのアッセイ系は実施例２に記載されている。
【０２８５】
実施例２に記載のように、エピソーム性プラスミドおよび組み込み型プラスミド共、アウレオバシジンＡ耐性遺伝子を含む。例えばｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ＧＦＰにおいて、ハイグロマイシン耐性遺伝子機能およびｅＧＦＰ蛋白からの緑色蛍光は、ハイグロマイシンＢコーディング配列のコドン４６の位置１３７のＧがＣに変換され、ハイグロマイシン耐性遺伝子コーディング領域の早期停止コドンが除去されたときに復活する。
【０２８６】
本発明者らはこの系を用いてトリコスタチンＡのようなＨＤＡＣインヒビタを含むおよび含まない、種々の条件下で、３オリゴヌクレオチド（図３に示される）の、修正を促進する能力を分析する。オリゴヌクレオチドＨｙｇ７４Ｔ（ＨｙｇＥ３Ｔ／７４Ｔ）は改変のための標的塩基を中心に有する７４塩基オリゴヌクレオチドである。Ｈｙｇ７４ＮＴ（ＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴ）と呼ばれる第二のオリゴヌクレオチドは、Ｈｙｇ７４Ｔの相補体である。Ｈｙｇ１０と呼ばれる第三のオリゴヌクレオチドは改変のための標的塩基を中心の位置に有する２４塩基オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド類の配列は図３に示される。Ｈｙｇ７４ＴおよびＨｙｇ７４ＮＴは各末端に３個のホスホロチオエートを有する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。Ｈｙｇ１０は各端に１個のＬＮＡを有する。標的配列に非相補的な、非特異的対照オリゴヌクレオチドを対照として使用できる。或いは、同一配列を有するが標的に対するミスマッチのないオリゴヌクレオチド、または完全にチオエート修飾されたオリゴヌクレオチド、または完全に２’−Ｏ−メチル化修飾されたオリゴヌクレオチドを対照として使用してもよい。
【０２８７】
オリゴヌクレオチド合成および細胞類。実施例２に記載のように、一本鎖オリゴヌクレオチド（記載された修飾を有するものを含む）を合成および精製する。アッセイのために使用するプラスミドは酵母（サッカロミセス・セレビシア）株ＬＳＹ６７８ＭＡＴに、アウレオバシジン選択下で低コピー数に安定的に維持される。プラスミドおよびオリゴヌクレオチドは酵母細胞に、次のようにエレクトロポレーションによって導入される：エレクトロコンピテント細胞を作るために、ＹＰＤ培地１０ｍｌ上で単一コロニーから培養し、培養物を一晩３００ｒｐｍで３０℃で振とうしながら増殖させる。それから上記一晩培養物に、５０μｇ／ｍＬトリコスタチンＡを含む、または含まない新鮮なＹＰＤ培地３０ｍｌを加え、ＯＤ６００が約０．５になるまで（４時間）３０℃で振とうし続ける。その後細胞を４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離によって洗浄し、それら細胞を２５ｍｌ氷冷蒸留水中で２回再懸濁させる。その後４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１ｍｌ氷冷１Ｍソルビトールに再懸濁し、最後に細胞を４℃、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を１２０ｍｌ１Ｍソルビトールに再懸濁する。
【０２８８】
エレクトロコンピテント細胞をプラスミドまたはオリゴヌクレオチドで形質転換するためには、特別に記載がない限り細胞４０μｌを５μｇの核酸と混合し、氷上で５分間インキュベートする。その後混合物を０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベットに移し、ＢＩＯ−ＲＡＤジーン・プラスター装置で、１．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ωで５秒のパルスでエレクトロポレートする。それから直ちに１Ｍソルビトールを補充した、５０μｇ／ｍＬトリコスタチン、例えばトリコスタチンＡなど、を含む、または含まない１ｍｌＹＰＤに細胞を再懸濁し、培養物を３０℃で３００ｒｐｍで振とうしながら６時間培養する。この培養物を３００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含む選択プレート上に広げ、この培養物の１０５希釈物の２００μｌを、アウレオバシジンＡを含む選択プレート上に広げ、３０℃で３日間インキュベートし、個々の酵母コロニーを増殖させる。その後プレート上のコロニーを計数し、１０５アウレオバシジンＡ耐性コロニーあたりのハイグロマイシン耐性コロニー数を決定することによって遺伝子変換効率を計算する。本発明者らはこのアッセイ系を用いて他のＨＤＡＣインヒビタも試験する。
【０２８９】
トリコスタチンＡはオリゴヌクレオチド媒介性遺伝子改変効率を高める。本発明者らは５０μｇ／ｍＬトリコスタチンＡで前処理した細胞におけるオリゴヌクレオチド媒介性遺伝子改変効率を、前処理をしなかった細胞におけるオリゴヌクレオチド媒介性遺伝子改変効率と比較する。表１７などを参照されたい。これらの実験は、エレクトロポレーション前４時間、５０μｇ／ｍｌトリコスタチンＡ中で細胞を増殖させると遺伝子改変効率が数倍まで高まり、回復期間中の５０μｇ／ｍｌトリコスタチンＡによる細胞処理も遺伝子改変効率を３倍以上高めることを示している。
【０２９０】
【表１７】
2005518817.tif 000028
Ｈｙｇ１０によるターゲティングと、トリコスタチンＡ処理の時間および温度との関係。５０μｇ／ｍＬトリコスタチンＡで処理した細胞において、回復期間中の時間、および遠心分離工程の温度がオリゴヌクレオチド媒介性遺伝子改変効率に与える影響を比較する。表１８などを参照されたい。酵母細胞の一晩培養物を５０μｇ／ｍＬトリコスタチンＡを含むまたは含まないＹＰＤ２００ｍＬ中に希釈し、ＯＤ６００が約０．５になるまで（４時間）３０℃で振とうしながら増殖させる。その細胞を４℃か室温で、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その細胞をあらかじめ温めた新鮮ＹＰＤ培地１００ｍｌｓに再懸濁する。それら細胞を２０または４０分間増殖させ、調製し、Ｈｙｇ１０オリゴヌクレオチド１．６２μｇで上記のようにエレクトロポレートする。細胞を回復させ、上記のようにプレートし、１０５細胞あたりの変換を測定する。
【０２９１】
【表１８】
2005518817.tif 000029
実施例７：λファージβ蛋白は酵母における標的配列改変効率を高める
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて修飾された一本鎖遺伝子修復ターゲティングベクターによる遺伝子修正効率に与えるベータ蛋白発現の効果を研究する。
【０２９２】
遺伝子修復、および遺伝子修復効率に対するベータ蛋白の影響を研究するために酵母中のＣＹＣ１遺伝子を選ぶ。２倍体の酵母株ＹＭＨ５１はＣＹＣ１の野生型コピーを含み、２倍体酵母株ＹＭＨ５２、ＹＭＨ５３、ＹＭＨ５４、およびＹＭＨ５５はＣＹＣ１遺伝子の突然変異体を半接合状態で含む。これらの株は酵母株ＭＡＴα  ｃｙｃ１−７０６：：ＣＹＨ２ｃｙｃ７−６７ｕｒａ３−５２ｌｅｕ２−３  １１２ｃｙｈ２に由来する。ＹＭＨ５１において、ＣＹＣ１のコドン２２は野生型ＴＧＣ（Ｃｙｓ）配列である；ＹＭＨ５２において、コドン２２はＣＧＣ（Ａｒｇ）である；ＹＭＨ５３において、コドン２２はＡＧＣ（Ｓｅｒ）である；ＹＭＨ５４において、コドン２２はＧＧＣ（Ｇｌｙ）である；そしてＹＭＨ５５において、コドン２２はＴＣＣ（Ｓｅｒ）である。各場合に、突然変異遺伝子の遺伝子産物は本来の配列の位置２２にシステイン残基の代わりに異なるアミノ酸を有する。この突然変異と関係する表現型は、グリセロールを唯一の蛋白源として増殖することができない。ＣＹＣ１遺伝子突然変異を逆転して（例えば配列改変オリゴヌクレオチドにより仲介される方法など）野生型配列にすると、その酵母はグリセロールだけで増殖できるようになる。
【０２９３】
Ｃｙｃ１／７０Ｔ（７０Ｔ）およびＣｙｃ１／７０ＮＴ（７０ＮＴ）はこれらの実験に用いられる修飾一本鎖遺伝子修復ターゲティングベクターである。７０Ｔベクターは突然変異ＣＹＣ１遺伝子の転写ストランドに相補的であり、したがってこれを標的とし、他方７０ＮＴベクターは非転写ストランドに相補的であり、したがってこれを標的とする。ターゲティングベクターは、例えばターゲティングベクターと突然変異ＣＹＣ１遺伝子配列との間に単一塩基ミスマッチが存在するというような、野生型配列を含む。７０Ｔベクターも７０ＮＴベクターもそれらの５’および３’末端の各々に３ホスホロチオエート結合を含む（下表１９に記号“＊”によって示される）。Ｈｙｇ３Ｓ／７４Ｔ（７４Ｔ）と呼ばれるベクターは陰性対照として役立ち、ＣＹＣ１遺伝子のいずれのストランドの配列にも相補的でない。これらのベクターの配列は表１９に明らかにされる。これらのオリゴヌクレオチドベクターの全てはこの領域では標準的な技術、または本明細書の別の箇所で述べられるような技術によって合成され、精製される。
【０２９４】
【表１９】
2005518817.tif 000030
ＣＹＣ１遺伝子に突然変異を有する酵母株、例えばＹＭＨ５２、ＹＭＨ５３、ＹＭＨ５４およびＹＭＨ５５、およびＹＭＨ５１  ２倍体野生型株などに、各ＣＹＣ１オリゴヌクレオチド５μｇを当業者に公知の方法によってエレクトロポレートする。核酸配列改変のための選択は、酵母細胞１ｍｇを希釈せずにＹＰＤプレート上に広げることによって行われる（１％酵母抽出物、２％ペプトン、３％グリセロール、２％寒天）。選択をしない増殖は、別の、１×１０−４に希釈した酵母細胞０．１ｍｌを、炭素源としてグリセロールよりもむしろデキストロースを含むＹＰＤプレート上に広げることによって分析する。ＹＰＧプレートは３０℃で７日間インキュベートし、ＹＰＤプレートは３０℃で３日間インキュベートする。選択された酵母（ＹＰＧ上で増殖）および非選択酵母（ＹＰＤ上で増殖）のコロニー数をアキュカウント（登録商標）（バイオロジックス社）を使用して測定する。修正効率（Ｃ．Ｅ．）は、ＹＰＧコロニー数をＹＰＤコロニー数で割ることによって計算される；この数値を、形質転換頻度および生存率の変数に関して標準化する。ＹＰＧプレート上で選択されたＹＭＨ５２、ＹＭＨ５３、ＹＭＨ５４またはＹＭＨ５５酵母に野生型ＣＹＣ１遺伝子配列が存在することは、コドン２２を含むＣＹＣ１遺伝子のエキソンのＰＣＲ増幅およびその後の遺伝子産物の配列決定によって確認される。選択されたコロニーをＹＰＧプレートからランダムに拾い上げ、蒸留水５０μｌ中に希釈する。酵母細胞溶液１マイクロリットルを、１ｘＰＣＲ増幅緩衝液、３００μＭ  ｄＮＴＰ、ＯＪＷ−２４プライマー、ＯＲＢ−２７プライマー、およびＴａｑポリメラーゼを含むＰＣＲ反応混合液に加える。ハンプシー（Ｈａｍｐｓｙ）の、“イソ−１−チトクロームｃの必須システインを選択することによってＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の６塩基対置換の各々を検出するためのテスター系（Ａ  ｔｅｓｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｅａｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｘ  ｂａｓｅ−ｐａｉｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｎ  ｉｓｏ−１−ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ）”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２８巻：５９−６７ページ（１９９１）などに、ＯＪＷ−２４プライマーおよびＯＲＢ−２７プライマーの配列が見いだされる。サンプルを９２℃で４分間予備加熱し、その後９２℃１０秒間、５２℃３０秒、６０℃１分間の３５サイクルを行い、６８℃８分間の１回の最終伸長工程を行った後、２４℃でインキュベーションを行う。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルを通すゲル電気泳動法によって分析し、４２２塩基対ＣＹＣ１エキソンバンドの存在を確認する。ＰＣＲ産物の配列はＡＢＩ３７３シーケンサーを使用する自動配列決定によって確認される。
【０２９５】
これらの種類の実験から得られた結果を下の表２０に示す。野生型株ＹＭＨ５１はＹＰＧ上でよく増殖する。なぜならば野生型ＣＹＣ１遺伝子はグリセロールを代謝できるからである。それに対して、半接合突然変異ＣＹＣ１遺伝子を含む突然変異株は、ＣＹＣ１遺伝子を標的としない陰性対照７４Ｔベクターをエレクトロポレートされた場合はＹＰＧプレート上で増殖できない。オリゴヌクレオチド、７０Ｔまたは７０ＮＴどちらかを有する突然変異株のエレクトロポレーションはＣＹＣ１遺伝子の突然変異を逆転させて野生型配列にする。このことは、処理細胞がＹＰＧプレート上で増殖してコロニーを作ることができることによって証明される。遺伝子修復頻度は、ＣＹＣ１遺伝子に結合し、ＣＹＣ１の非鋳型ストランドである７０ＮＴの方が、７０Ｔより遥かに高い。
【０２９６】
【表２０】
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ベータ蛋白およびＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド除去修復群のその他蛋白の発現を、酵母におけるＣＹＣ１遺伝子の遺伝子修復効率に与えるそれらの影響について試験する。本明細書の別の箇所に記載したように、ＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群の遺伝子を過剰発現するベクターを作る。酵母ベータ発現ベクターを次のように作る。ベータ蛋白のコーディング配列をその遺伝子を含むプラスミドからＰＣＲによって増幅し、その後ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、酵母発現ベクターｐＹＮ１３２（これは構成的活性酵母プロモータＴＰＩを含む）に結合する。結合反応物のサンプルを用いてＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換し、その後形質転換した細胞を選択し、当業者に公知の標準的方法を用いて、ｐＹＮＴβと呼ばれる発現構成物の存在に関して陽性コロニーを分析する。ＹＭＨ５１、ＹＭＨ５２、ＹＭＨ５３、ＹＭＨ５４およびＹＭＨ５５細胞を、５μｇのｐＹＮＴβ構成物またはＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群またはヌクレオチド除去修復群からの遺伝子を過剰発現するプラスミドまたはｐＹＮ１３２（陰性対照として）と共にエレクトロポレートする。その後形質転換した細胞を、ＳＣ  ＵＲＡ３−プレート（ウラシルに欠け、全アミノ酸を補充した最小培地）上３日間の増殖によって選択する。これらのプラスミドを含むこれら酵母株を５μｇの７０ＮＴオリゴヌクレオチドと共にエレクトロポレートし、遺伝子修復活性を、上記のようにＹＰＧおよびＹＰＤプレート上のコロニー増殖を試験することによって評価する。
【０２９７】
ＹＭＨ５５を使用したこのような実験の結果は下の表２１に示される。ＹＭＨ５５酵母はグリセロールの存在下で増殖し、遺伝子修復が行われたことを証明する。ただし、空のｐＹＮ１３２ベクター（陰性対照）を含む酵母の増殖はｐＹＮ１３２を含まないＹＭＨ５５に比較して非常に減少した（多分グリセロール中の二重選択およびウラシル欠損増殖培地に帰せられる効果と考えられる）。しかし驚くことに、二重選択の阻止的効果にもかかわらず、ＹＭＨ５５におけるベータ蛋白の発現、またはＲＡＤ５２エピスタシス群、ミスマッチ修復群、またはヌクレオチド除去修復群の発現は、表２１に示すように、７０ＮＴオリゴヌクレオチドによる突然変異ＣＹＣ１遺伝子の標的遺伝子修復の頻度を実質的に増加させる。
【０２９８】
【表２１】
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ＣＹＣ１遺伝子修復に与えるベータ蛋白発現の効果を試験するその他の実験において、１０５トランスフォーマントあたりの修正効率は０．３２６で、遺伝子修復効率の５ないし１８倍の増加に相当する。
【０２９９】
複数の蛋白を過剰発現するＹＭＨ５３に関するこの種の実験の結果を表２２に示す。ＹＭＨ５３酵母はグリセロールの存在下で増殖し、遺伝子修復が起きたことを示唆する。ＹＭＨ５３株におけるＭＲＥ１１およびＸＲＳ２蛋白両方の発現、またはＲＡＤ５２およびＲＡＤ５４蛋白両方の発現は、７０Ｔおよび７０ＮＴオリゴヌクレオチド両方による、突然変異ＣＹＣ１遺伝子の標的遺伝子修復の頻度を実質的に高める。
【０３００】
【表２２】
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実施例８：ヒドロキシウレアは酵母細胞における標的配列改変を高める
この実施例において、ＨＵを使用して、修飾主鎖を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを使用する系における遺伝子修復効率を高め、実施例２に記載のようにプラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｗｔ）ｅＧＦＰを対照としてプラスミドｐＡＵＲＨＹＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰを使用する遺伝子修復を測定する。この系を使用して、種々の条件下における３種類のオリゴヌクレオチド（図３に示す）の、修正促進能力を分析する。オリゴヌクレオチドＨｙｇＥ３Ｔ／７４およびＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴ、および対照オリゴヌクレオチドは実施例２に記載されている。Ｈｙｇ１０と呼ばれる第三のオリゴヌクレオチドは、改変を標的とする塩基を中心にもつ、配列５’−ＡＣＣ  ＣＧＣ  ＡＧＧ  ＡＣＧ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ３’を有する２４塩基オリゴヌクレオチドである。Ｈｙｇ１０オリゴヌクレオチドは各末端にＬＮＡ修飾を有する。オリゴヌクレオチドは実施例２に記載のように合成される。
【０３０１】
アッセイに使用するプラスミドは酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＬＳＹ６７８ＭＡＴにアウレオバシジン選択のもとで低コピー数で安定的に保持される。プラスミドおよびオリゴヌクレオチドは下記のようにエレクトロポレーションによって酵母細胞内に導入される：エレクトロコンピテント酵母細胞をつくるために、ＹＰＤ培地１０ｍｌに単一コロニーを接種し、培養物を３０℃、３００ｒｐｍで振とうしながら一晩増殖させる。その後ＨＵ２０ｍｌを含む、または含まない新鮮ＹＰＤ培地３０ｍｌを上記一晩培養物に加え、ＯＤ６００が約０．５になるまで（４時間）３０℃で振とうし続ける。その後４℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を新鮮ＹＰＤ培地に再懸濁することによって細胞を洗浄する。再懸濁後１０、２０、４０、６０および９０分に培養物４０ｍｌをとる。エレクトロコンピテント細胞をプラスミドまたはオリゴヌクレオチドで形質転換するために、特に記載がない限り細胞４０μｌを核酸５μｇと混合し、氷上で５分間インキュベートする。エレクトロポレーションおよび改変（“変換”）効率測定を実施例２に記載のように行う。
【０３０２】
ヒドロキシウレアはオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変効率を高める。本発明者らは２０ｍＭ  ＨＵで前処理した細胞におけるオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の効率を、前処理なしの細胞におけるオリゴヌクレオチド媒介性核酸配列改変の効率と比較する。表２３に示すこれらの実験は、エレクトロポレーション前４時間、２０ｍＭ  ＨＵ中で細胞を増殖させると、核酸配列改変の効率は少なくも２５−４０倍増加することを示唆する。表２３に示されるように、ＨＵ後の増殖時間が９０分間であるときに、核酸改変効率の最大効率が認められるとはいえ、ＨＵは１０、２０、４０、および６０分の処理でも核酸配列改変効率を高める。表２３は、被検オリゴヌクレオチドがセンス（非転写）ストランド（ＨｙｇＥ３Ｔ７４ＮＴ；配列番号９）を標的にしようと転写ストランド（ＨｙｇＥ３Ｔ／７４Ｔ；配列番号８）を標的にしようと、そしてそれらオリゴヌクレオチドが７４塩基長さ（ＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴ）であろうと２４塩基長さ（Ｈｙｇ１０；配列番号２０）であろうと、全ての被検オリゴヌクレオチドでＨＵ前処理が核酸配列改変効率を高めることを示す。
【０３０３】
【表２３】
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記載のように酵母培養物を２０ｍＭ  ＨＵの存在下、または不在下で４時間増殖させる。細胞を洗い、新鮮ＹＰＤ培地に再懸濁し、指示されたＯＤ６００になるまで、１０、２０、４０、６０、９０分間増殖させ、その後５μｇのオリゴヌクレオチドＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴまたはＨｙｇＥ３Ｔ／７４または１．６２μｇのＨｙｇ１０でエレクトロポレーションを行う。その後細胞を、ハイグロマイシンまたはアウレオバシジンＡを含む選択培地にプレートする。遺伝子修正効率は“修正効率”として報告され、それは１０５アウレオバシジンＡ耐性コロニーあたりのハイグロマイシン耐性コロニー数を示す。
【０３０４】
実施例９：二重ターゲティング実験におけるＨＵおよびＴＳＡの使用
二重ターゲティング実験において少なくも２種類の、関連性のないオリゴヌクレオチドを同時に使用することによって、標的改変の効率を高め、コストを減らすことができる。このアプローチにおいて、第一オリゴヌクレオチドによる改変は、選択される選択可能表現型を与える。第二オリゴヌクレオチドによって導かれる改変が、この選択集団内からスクリーニングされる。２００２年１０月７日に出願された同一所有者の同時係属米国特許出願第６０／４１６，９８３号“オリゴヌクレオチド標的核酸配列改変におけるスクリーニングを減らす方法および組成物（Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）”などを参照されたい。これは参考として本明細書にそのまま組み込まれる。選択性圧力（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）によって確認される集団は、非選択部位に編集された塩基を担う細胞に富むから、このアプローチは、修飾一本鎖オリゴヌクレオチドを使用してすぐれた単一ヌクレオチド多型性をほとんど全ての遺伝子の所望部位に速やかにかつ効率的に導入するための方法（遺伝子編集と呼ばれる）として有用である。
【０３０５】
二重ターゲティング戦略は図９Ａに図示される。ＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）β株（表２４）は、２４０ｋｂのヒトβｓ−グロビンＹＡＣおよび、単一塩基突然変異によって不活性化された染色体ハイグロマイシン耐性遺伝子と機能性アウレオバシジン耐性遺伝子とを含むカセットを含む。リウら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１巻：２７４２−２７５０ページ（２００２）；パレクーオルメド（Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．  ９巻：１０７３−１０８４ページ（２００２）；およびリウら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２２巻：３８５２−３８６３ページ（２００２）を参照されたい。図９Ｂは染色体ハイグロマイシン突然変異体遺伝子の編集に導くために使用されるオリゴヌクレオチドを示す。ＨｙｇＥ３Ｓ／７４ＮＴ（配列番号９）は、非転写ストランドに特異的に結合し、３個の末端ホスホロチオエート結合を含む７４マー（７４量体）である。ｌｄ．ＴＡＧ停止コドンを含む、突然変異体の標的配列も示される。図９Ｃは、β−グロビンＹＡＣの構造を示し、編集を標的とするヌクレオチド類が明記されている。別々の実験において、２つの非選択的変化が、異なるオリゴヌクレオチド、βＴｈａｌ１（配列番号２７）およびβＴｈａｌ２（配列番号２８）によって導かれる。ＹＡＣはヒト染色体１１からの約２３０ｋｂゲノムＤＮＡを含む（陰をつけた領域によって示される）。陰をつけない（ｕｎｓｈａｄｅｄ）領域はＹＡＣのどちらかの末端にある酵母配列を示す（実物大でない）。ユー（Ｙｕ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９７巻：５９７８−５９８３ページ（２０００）。β−グロビン配列の一部（開始コドンで始まる）が示される。βＴｈａｌ１はＧからＡへの変化を導き、βＴｈａｌ２はＴからＣへの変化を導く。核酸配列改変活性を有するオリゴヌクレオチド類の配列が示され、βグロビン遺伝子座のヒト転写に対して、非転写ストランドに結合するように設計される。両変化共、ヒトにβ−サラセミア症を起こすことがわかっている単一塩基置換を起こす。
【０３０６】
編集実験のために、ＹＡＣ含有ＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）β細胞（表２４）をＨＵの存在下で増殖させ、選択可能および選択不可能オリゴヌクレオチドと共にエレクトロポレートし、ＴＳＡの存在下で回復させる（図９Ａ）。ヒトβ−グロビン遺伝子は酵母においては転写的に不活性であると考えられるから、ＨＵおよびＴＳＡが標的アクセスを高めるために特に重要である。二重ターゲティング実験の結果を図１０Ａに示す。オリゴヌクレオチドＨｙｇＥ３Ｓ／７４ＮＴを使用する際にハイグロマイシン耐性コロニーが認められる。ハイグロマイシン−耐性コロニー  対  アウレオバシジン耐性コロニーの比が修正効率（Ｃ．Ｅ．）とされる。ＨＵおよびＴＳＡの存在はハイグロマイシン突然変異のＣ．Ｅ．の増加、ここでは約４ないし６倍、につながる。この実験において、ハイグロマイシン耐性コロニーは３０００のアウレオバシジン耐性コロニーあたり大体１個であることが判明する。ハイグロマイシン耐性コロニーをその後ＹＡＣβ−グロビン遺伝子における第二部位の編集について分析する。βＴｈａｌ１オリゴヌクレオチドはエキソン１のＴＧＧコドン１６のＧをＡで置換し、停止コドンＴＧＡを与える（図９Ｃ）。図１０ＢはＡＢＩ  ＳＮａＰショット（真ん中のパネル）、およびこの実験から得られる修正コロニーにおけるβグロビン遺伝子のある領域の直接ＤＮＡ配列（下のパネル）を示す：両パネルにおいて、ＧからＡへの変化が明らかである。ハイグロマイシン突然変異において修正されるこれらコロニーのなかで、３２５中１個がＹＡＣβ−グロビン配列の第二変化も含む。したがって修正されたハイグロマイシン耐性遺伝子を有する細胞の約１０％が編集β−グロビン遺伝子も含む。
【０３０７】
上の種々の実験に示されるように、ＲＡＤ５１の過剰発現は一貫して染色体遺伝子編集の頻度を高める。よって本発明者らは酵母ＲＡＤ５１遺伝子を含む発現プラスミドをＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）β細胞に導入する（表２４）。図１１はこの株における二重ターゲティングの結果を示す。期待通り、ＲＡＤ５１の発現はオリゴヌクレオチドＨｙｇＥ３Ｓ／７４ＮＴのハイグロマイシンＣ．Ｅ．をたかめる（図１０と比較）。これらの編集実験では、ＹＡＣ含有ＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）β細胞（表２４）をＨＵの存在下で増殖させ、選択可能および選択不可能オリゴヌクレオチドと共にエレクトロポレートし、ＴＳＡの存在下で回復させる（図９Ａ）。ここでもまた、第二オリゴヌクレオチド、βＴｈａｌ２の添加は修正効率を８００アウレオバシジン耐性コロニーあたり大体１ハイグロマイシン耐性コロニーにまで、さらに高める。
【０３０８】
βＴｈａｌ２オリゴヌクレオチドはエキソン１のイニシエータＡＴＧコドンのＴのＣによる置換を導き、非イニシエータコドンＡＣＧを与えるように設計される（図９）。図１１ＢはＡＢＩ  ＳＮａＰショット（真ん中のパネル）および修正ずみＨｙｇｒコロニーからのβ−グロビン遺伝子の直接ＤＮＡ配列を示す；ＴからＣへの変化が両分析パネルにおいて明らかである。重要なことは、ハイグロマイシン突然変異において修正されたコロニーのなかで、７０中１がＹＡＣβ−グロビン配列に第二の単一塩基変化も含むことである。したがって、二重ターゲティングアプローチはここでも成功である；修正されたハイグロマイシンを担う細胞の約１０％が編集β−グロビン遺伝子も含む。さらに、高濃度のＲＡＤ５１の存在下において遺伝子編集がより高レベルで起き、ＨＵ、ＴＳＡおよびＲＡＤ５１過剰発現の存在が全体的プロセスに共力効果をあらわすことを示唆する。
【０３０９】
【表２４】
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株。これらの研究に使用される酵母株を表２４に挙げる。ＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）株の詳細はリウら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２２巻：３８５２−３８６３ページ（２００２）に発表されている。
【０３１０】
ＹＡＣ操作。β−グロビンＹＡＣはグリンク（Ｇｒｉｎｋｅ）らのゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）１５巻：６５９−６６７ページ（１９９３）に記載されるように、標準的パルスド−フィールド  ゲルから分離する。つまり、βＳ−ＹＡＣ株（ＡＢ１３８０バックグラウンド、チャングら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５巻：１４８８６−１４８９０ページ（１９９８）を参照）から濃縮染色体ＤＮＡを調製し、１％低溶融アガロース・パルスド−フィールド・ゲル上で２００Ｖ、１４℃、２０−５０ｓ、３３時間溶解する。ＹＡＣを分離し、改良アガロース緩衝液（１０ｍＭ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化し、β−アガロース（ニュー・イングランド・ビオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理し、最終容量〜２００μｌまで濃縮する。精製ＹＡＣ３０μｌを、スフェロプラスト形質転換およびトリプトファン欠損  寒天／ソルビトール  プレートによる選択によって、コンピテントＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）細胞に導入する。トランスフォーマントを再画線培養し、パルスド−フィールド・ゲル電気泳動法、ＰＣＲ、およびヒトβ−グロビン遺伝子の断片の配列分析によって確認する。
【０３１１】
ｐＹＮＡＲａｄ５１エピソーム発現プラスミドは、ｐＹＮＡ５１のＴＲＰ１遺伝子（リウら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１巻、２７４２−２７５０ページ（２００２）を参照）をＡＤＥ２遺伝子に置換することによって構成される。ｐＹＮＡＲａｄ５１はエレクトロポレーションおよびアデニン欠損寒天プレート上の選択によって、ＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）βに導入される。
【０３１２】
オリゴヌクレオチド類。Ｈｙｇ３Ｓ／７４ＮＴ（配列番号９）、βＴｈａｌ１（配列番号２７）、およびβＴｈａｌ１２（配列番号２８）は、ＩＤＴから、ＨＰＬＣ精製によって整列させる。Ｈｙｇ３Ｓ／７４ＮＴは７４ｍｅｒであり、βＴｈａｌ１およびβＴｈａｌ２は両方共７１ｍｅｒである；これら３種類のオリゴヌクレオチドは全て５’および３’末端に３つのホスホロチオエート結合を有する（図９）。
【０３１３】
二重ターゲティング。二重ターゲティングプロトコルは図９Ａに概略示される。
ＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）β細胞を１０ｍｌＹＰＤ培地に３０℃で一晩増殖させる。培養物を４０ｍｌＹＰＤ培地に０Ｄ６００が０．１５−０．２０になるまで希釈し、１倍加時間増殖させＯＤ６００を０．３〜０．４にする。１００ｍＭ  ＨＵを培養物に加え、細胞を１倍加時間増殖させてＯＤ６００を０．６〜０．８にする。細胞を採集し、２５μｌの１Ｍ  ＤＴＴを含む１ｍｌのＹＰＤに再懸濁し、さらに２０分間３０℃で増殖させる。細胞を２５ｍｌ冷ｄＨ２０で２回洗い、２５ｍｌ冷１Ｍソルビトールで１回洗う。細胞をしずかに１Ｍ冷１Ｍソルビトールに再懸濁し、ミクロ遠心分離器で５０００ｒｅｐで５分間回転し、１Ｍソルビトール  １２０μｌに再懸濁する。バイオラッド・ジーン・パルサー装置（リッチモンド、ＣＡ）を使用し、２ｍｍギャップキュベット中で、細胞４０マイクロリットルに各オリゴヌクレオチド３０μｇを、１．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ω、１パルス、５ｓ／パルスド長さでエレクトロポレートする。その細胞を直ちに０．８μｇ／ｍｌアウレオバシジンＡおよび５０μｇ／ｍｌＴＳＡを含む３ｍｌＹＰＤに再懸濁し、３０℃で一晩回復させる。細胞をスピンダウンし、１ｍｌ新鮮ＹＰＤに再懸濁する。希釈液を、ハイグロマイシン（３００μｇ／ｍｌ）かアウレオバシジンＡ（０．５μｇ／ｍｌ）かどちらかを含むＹＰＤプレート上に培養する。Ｃ．Ｅ．はアウレオバシジン耐性コロニー１個あたりのハイグロマイシン耐性コロニー数に基づいて決定される。
【０３１４】
個々のコロニーをハイグロマイシン寒天プレートから拾い上げ、１５０μｌＹＰＤを含む９６ウェルプレート（コーニング）に入れ、振とうしながら３０℃で一晩増殖させる。ヒトβ−グロビン座に特異的な３４５ｂｐＰＣＲ産物を、プライマーＰＣＯ２（５’−ＴＣＣＴＡＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２９））およびＰＣＯ５（５’−ＣＴＡＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＧ−３’（配列番号３０））を使用して各ウェルの各々から増幅し、βＴｈａｌ１またはβＴｈａｌ２変換をスクリーニングする。ＰＣＲ反応は、８ｐｍｏｌｓの各プライマーおよび２．５μｌ酵母細胞培養液を、等分する前のＰＣＲ反応ミックスに加えることによって行われる（マーシュ／アブジーン（Ｍａｒｓｈ／Ａｂｇｅｎｅ））。ＰＣＲ反応はアニーリング温度４５．８℃で、３５サイクルで１分の伸長時間を用いる。ＰＣＲ反応物はキアクィック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ９６−ウェル精製キット（キアゲン社）を使用して精製され、容量８０μｌに溶出される。精製ＰＣＲ産物の１マイクロリットルをＡＢＩＳＮａＰショット反応のための鋳型として使用する。βＴｈａｌ１変換をスクリーニングするために使用するＳＮａＰｓｈｏｔプライマーの配列は：５’−ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号３１）である。βＴｈａｌ２変換をスクリーニングするために使用するＳＮａＰｓｈｏｔプライマーの配列は：５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣ−３’（配列番号３２）である。ＳＮａＰショット反応はメーカーによって指示されるように、ＡＢＩプリズムＳＮａＰショット・マルチプレックス・キットを使用して行われ、ＡＢＩ３１００遺伝子分析器（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）で分析される。
【０３１５】
配列分析。ＳＮａＰショット反応物から得られる任意の潜在的変換クローンは配列分析によって確認される。ＰＣＲ産物の両ストランド共、プリズムＰＣＯ２およびＰＣＯ５を用い、メーカーによって指示されるようにＡＢＩプリズムキットを使用するサンガー・ジデオキシ配列決定法によって、自動ＡＢＩ３１００遺伝子分析器で配列決定される。
【０３１６】
多数の実施形態および特徴を記載したが、本発明の精神または添付のパラグラフの範囲を逸脱することなく、記載の実施形態および特徴の改良および変更が行われ得ることは当業者には理解できる。本明細書中に記載の全ての刊行物および特許は参考として本明細書にその全体が援用される。
【０３１７】
本発明の上記のまたはその他の目的および利点は下記の詳細な説明を添付の図面と共に考慮することによって明らかになる。それらの図では全体を通じて同様な文字は同様な部分を指す。
【図面の簡単な説明】
【０３１８】
【図１】プラスミドｐＫｓｍ４０２１における点突然変異の修正のための遺伝子読み出し系。プラスミド中のｐＫｓｍ４０２１突然変異体カナマイシン遺伝子は、オリゴヌクレオチドによる修正の標的である。突然変異体ＧはそのオリゴヌクレオチドによってＣに変換される。修正されたプラスミドは、エレクトロポレーション後、大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）にカナマイシン耐性を与え、遺伝的読み出しおよびコロニー計数が可能となる。キメラ、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重ヘアピン  オリゴヌクレオチド  ＫａｎＣＧの配列が示される（配列番号１）。
【図２】ハイグロマイシン−ｅＧＦＰ標的プラスミド。プラスミドｐＡＵＲＨＧ（ｘ）ｅＧＦＰの図。プラスミドｐＡＵＲＨＧ（ｒｅｐ）ｅＧＦＰはハイグロマイシンＢコーディング配列（ｃｄｓ）のコドン４６のヌクレオチド１３７にＧを挿入する塩基置換突然変異を含む。プラスミドｐＡＵＲＨＧ（ｉｎｓ）ｅＧＦＰは、構成的ＡＤＨ１プロモータから転写されるハイグロマイシンＢコーディング配列（ｃｄｓ）のコドン４６のヌクレオチド１３６と１３７との間の単一塩基挿入突然変異を含む。プロモータｐＡＵＲＨＧ（△）ｅＧＦＰはハイグロマイシンＢコーディング配列（ｃｄｓ）のコドン４６の単一ヌクレオチドを除去する欠失突然変異を含む。正常対立遺伝子、標的（既存突然変異）、および所望の改変が３プラスミドの各々について示される。
【図３】ハイグロマイシン耐性遺伝子の修正のためのオリゴヌクレオチド。ハイグロマイシン耐性の修正を分析試験（ａｓｓｅｙ）する実験に使用するオリゴヌクレオチドの配列を示す。ＤＮＡ残基は大文字で示され、ＲＮＡ残基は小文字で示され、ホスホロチオエート主鎖を有するヌクレオチドは大文字であらわして下線を引いた。図３において、ＨｙｇＥ３Ｔ／２５の配列は配列番号７に対応し、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４Ｔ（ＨｙｇＥ３Ｔ／７４およびＨｙｇ３Ｓ／７４Ｔとしても知られている）は配列番号８に対応し、ＨｙｇＥ３Ｔ／７４ＮＴ（ＨｙｇＥ３Ｔ／７４αおよびＨｙｇＥ３Ｓ７４ＮＴとしても知られている）の配列は配列番号９に対応し、ＨｙｇＧＣ／Ｒｅｖの配列は配列番号１０に対応し、Ｋａｎ７０Ｔの配列は配列番号１１に対応し、Ｈｙｇ１０の配列は配列番号２０に対応する。
【図４】ｐＡＵＲＮｅｏ（−）ＦＬＡｓＨ（登録商標）プラスミド。この図は、プラスミド構造、標的配列、オリゴヌクレオチド類、および蛍光によって核酸配列改変事象を検知するための塩基を示す。Ｎｅｏ／Ｋａｎ標的突然変異体およびその相補体の配列は配列番号１２および配列番号１３に対応し、変換した配列およびその相補体は配列番号１４および配列番号１５に対応し、ＦＬＡｓＨ（登録商標）ペプチド配列は配列番号１６に対応する。
【図５】ＦＬＡｓＨ（登録商標）系の蛍光顕微鏡検査。この図は、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチド  ｋａｎＧＧｒｖによるトランスフェクションの前と後の酵母株の共焦点顕微鏡検査を示す。変換された酵母細胞は明るい緑色蛍光によって示される。（Ａ）上左：野生型、非標的。上右：△ｒａｄ５２、非標的。（Ｃ）下左：野生型、標的。（Ｄ）下右：△ｒａｄ５２、標的。
【図６】ｐＹＥＳＨｙｇ（ｘ）ｅＧＦＰプラスミド。このプラスミドは、プロモータが誘発性ＧＡＬ１プロモータであることを除けば、図７に示されるｐＡＵＲＨｙｇ（ｘ）ｅＧＦＰ構成物と同様の構成物である。このプロモータはガラクトースで誘発され、ラフィノースの存在下では漏出し、デキスロースの存在下では抑制される。
【図７】ｐＹＮ１３２プラスミド。この図は、ＴＰＬ１からの構成的プロモータを含むプラスミド構造を示す。これは下流でクローン化されるｃＤＮＡの発現に導く。
【図８Ａ】ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰプラスミドの構成。図８Ａおよび８ＢはｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰ組み込み型プラスミドのための構成図式である。
【図８Ｂ】ｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰプラスミドの構成。図８Ａおよび８ＢはｐＡＵＲ１０１−ＨＹＧ（ｘ）ｅＧＦＰ組み込み型プラスミドのための構成図式である。
【図９】二重ターゲティングプロトコル。（Ａ）二重ターゲティングのための一般的戦略の図式図。（Ｂ）ハイグロマイシン耐性遺伝子およびその突然変異の配列。野生型（“ｗｔ”）（配列番号２３）、突然変異体（配列番号２４）、および変換された配列（配列番号２５）を、その変換（配列番号９）を生起するために使用する配列改変オリゴヌクレオチド（“Ｈｙｇ３Ｓ／７４ＮＴ”）と共に示す。（Ｃ）ヒトβ−グロビン遺伝子座、改変されるβグロビン遺伝子のセグメント（配列番号２６）および非選択性改変を生起するために使用するオリゴヌクレオチド類：“βＴｈａｌ１”（配列番号２７）および“βＴｈａｌ２”（配列番号２８）を含むＹＡＣの図式。
【図１０】二重ターゲティングの結果。（Ａ）二重ターゲティングプロトコルを使用したハイグロマイシン突然変異の遺伝子編集（ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ）効率。これらの実験では、ＹＡＣ含有ＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）β細胞を、選択性および非選択性オリゴヌクレオチドと共にエレクトロポレートされたＨＵの存在下で増殖させ、ＴＳＡの存在下で回復させる。（Ｂ）変換前（配列番号２９）および変換後（配列番号３０）の改変セグメントの配列を含む、βＴｈａｌ１オリゴヌクレオチドによって指示されるヒトβグロビン遺伝子の遺伝子編集。
【図１１】二重ターゲティングおよびＲａｄ５１。（Ａ）二重ターゲティングプロトコルと酵母Ｒａｄ５１の過剰発現とを組み合わせて使用する、ハイグロマイシン突然変異の遺伝子編集の効率。これらの実験では、ＹＡＣ含有ＬＳＹ６７８ｌｎｔＨｙｇ（ｒｅｐ）β細胞をＨＵの存在のもとで増殖させ、選択および非選択オリゴヌクレオチドと共にエレクトロポレートし、ＴＳＡの存在のもとで回復させる。（Ｂ）変換前（配列番号３１）および変換後（配列番号３２）の改変セグメントを含む、βＴｈａｌ１２オリゴヌクレオチドが標的とするヒトβグロビン遺伝子の遺伝子編集。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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