(57)【要約】本発明は鳥類におけるアジュバントとしてＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）及び既知の類縁体を使用するための組成物及び方法に関する。本発明は更に、鳥類におけるワクチンとして植物産生のＬＴ、その既知類縁体、及び保護免疫原を使用するための組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類のワクチン接種のためのＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）及びＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素類縁体（ＬＴ類縁体）よりなる群から選択されるアジュバントを含む組成物。
【請求項２】
鳥類において有効な免疫保護抗原を更に含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記免疫保護抗原がウィルス性、細菌性又はカビ性の病原体よりなる群に由来する請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫保護抗原がニューカッスル病、トリインフルエンザ、伝染性ブルザ病、コクシジウム症、壊死性腸炎、気嚢炎、蜂巣炎、ニワトリ貧血症、喉頭鼻気管炎、伝染性気管支炎及びマレク病の既知の免疫保護抗原よりなる群から選択される請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫保護抗原がニューカッスル病ウィルス赤血球凝集素ノイラミニダーゼ蛋白及びトリインフルエンザ赤血球凝集素蛋白よりなる群から選択される請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記アジュバントがＥ．ｃｏｌｉ細菌により生産される請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記アジュバントがトランスジェニック植物により生産される請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記免疫保護抗原がトランスジェニック植物により生産される請求項２記載の組成物。
【請求項９】
前記アジュバント及び免疫保護抗原がトランスジェニック植物により生産される請求項２記載の組成物。
【請求項１０】
前記アジュバント及び免疫保護抗原が単一のトランスジェニック植物により生産される請求項２記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１の組成物の有効量を投与することを含む鳥類のワクチン接種のための方法。
【請求項１２】
請求項２の組成物の有効量を投与することを含む鳥類のワクチン接種のための方法。
【請求項１３】
請求項３の組成物の有効量を投与することを含む鳥類のワクチン接種のための方法。
【請求項１４】
請求項４の組成物の有効量を投与することを含む鳥類のワクチン接種のための方法。
【請求項１５】
請求項５の組成物の有効量を投与することを含む鳥類のワクチン接種のための方法。
【請求項１６】
鳥類において免疫応答を誘発することが知られている免疫保護抗原の有効量にネイティブＬＴの有効量を混合することを含む、トリの疾患に対抗して鳥類を保護するためのワクチンの製造方法。
【請求項１７】
鳥類において免疫応答を誘発することが知られている免疫保護抗原の有効量にＬＴ類縁体の有効量を混合することを含む、トリの疾患に対抗して鳥類を保護するためのワクチンの製造方法。
【請求項１８】
前記免疫保護抗原がニューカッスル病、トリインフルエンザ、伝染性ブルザ病、コクシジウム症、壊死性腸炎、気嚢炎、蜂巣炎、ニワトリ貧血症、喉頭鼻気管炎、伝染性気管支炎及びマレク病の既知の免疫保護抗原よりなる群から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫保護抗原がニューカッスル病ウィルス赤血球凝集素ノイラミニダーゼ蛋白及びトリインフルエンザ赤血球凝集素蛋白よりなる群から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫保護抗原がニューカッスル病ウィルス赤血球凝集素ノイラミニダーゼ蛋白である請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に免疫学の分野に関し、粘膜病原体に対抗して鳥類及び家禽類にワクチン接種するために有効なアジュバント組成物及び方法を提供する。本発明は特に免疫原性のペプチド、蛋白及びアジュバントを製造する遺伝子的に修飾された植物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
経口ワクチン接種は、ワクチンを投与するための簡便で非外傷性の方法として長く認識されてきた。食用ワクチンは、動物において確立された給餌慣行に医薬品投与の簡便性を理想的に組み合わせていることから、動物健康産業にとっては特に魅力的なものである。１９６０年代以来経口ポリオワクチンが功を奏してきたにもかかわらず、経口ワクチン、特に免疫応答を刺激するために非生存性抗原を利用したワクチンは極めて少数しか市販されていない。トランスジェニック植物は食用ワクチンのための抗原を経済的に生産するための手段を提供する。この分野で最初に報告された研究は米国特許５，６５４，１８４号；５，６７９，８８０号及び５，６８６，０７９号である。このようなトランスジェニック植物は、ワクチン接種において粘膜組織への経口抗原デリバリーの簡便性に動物の許容された給餌慣行の特徴を組み合わせる手段を提供する。
【０００３】
食用ワクチンが功を奏するためには、消化管の複雑な環境を理解しなければならない。脊椎動物の消化管、呼吸管及び生殖管に存在する粘膜関連リンパ様組織（ＭＡＬＴ）は、自然界において、最も多様であり、なお普遍的な免疫系の１つである。腸関連リンパ様組織（ＧＡＬＴ）を介した消化管における免疫応答を刺激することが可能ないかなる抗原も、消化管に進入した際に、複合的環境に遭遇する。口腔及び他の消化器官は広範な一連のｐＨ、酵素、界面活性剤及び食物の消化に寄与する共生微生物を含んでいる。
【０００４】
共生微生物は消化管自体を構成する細胞の数よりも多数である場合が多い。Savage,D.1999.Mucosal Microbiota.Mucosal Immunity,eds(P.Orga,J.Mestecky,M.Lamm,W.Strober,J.Biennenstock,J.McGhee)Academic Press,Inc.pp19-30。この事実にもかかわらず、これらの共生微生物は有用な機能を提供し、ＧＡＬＴの免疫系により一定の「寛容」状態にある。抗原は摂取され、消化の種々の段階にある食物成分及び他の環境要素との競合に直面する。免疫系は、免疫学的に寛容されるという意味において「自己」の特徴を有する食物抗原を含む自己抗原に対して外来性のものが無いかどうか、消化管並びに呼吸管及び生殖管を継続的に探索しなければならない。最終的に、受動輸送及び能動輸送の両方を有する粘膜で内張りされた絨毛性小胞性の上皮よりなる生来の免疫障壁は、栄養成分を収容し、粘膜表面への必要な分泌を可能にするための一定のフラックス内にある。
【０００５】
消化管の複雑な環境にも関わらず、極めて少量の生物学的活性（腸活性）物質のみが免疫応答を誘導できる。粘膜系の最も強力な免疫刺激剤の２種、即ちエシェリシア・コリ(E.coli)由来の熱不安定性毒素（ＬＴ）及びビブリオ・コレラ(V.cholera)由来のコレラ毒素（ＣＴ）は胃管栄養法により投与された場合に僅か数マイクログラムで血清学的応答を刺激することができる。Isaka,M.et al.,1998,Vaccine 16:1620-1626;Rappuoli,R et al.,1999;Immunol.Today.20:493-499;Isaka,M.et al.,2000,Vaccine 18:743-751。即ち、粘膜表面は良好に、ＬＴ及びＣＴのような生物活性蛋白少量により、露出することができる。しかしながら、その腸毒性誘発活性のため、ＬＴ及びＣＴはそのネイティブな形態ではヒト又は動物において安全に使用するための経口用アジュバントとしては提案されていなかった。
【０００６】
非生存性の抗原とは逆に、ＣＴ及びＬＴのような粘膜活性蛋白の主な特徴の１つは、ＣＴ及びＬＴが僅かの濃度においてこれらの毒素の進入（侵襲）を可能にする腸受容体（ＧＭ１−ガングリオシド）に対するリガンドであるという点である。このことは侵襲性の性質を有さず、希釈され、腸の消化性環境に付される非生存性抗原とは対照的である。非侵襲性抗原は腸粘膜表面を介した免疫応答を刺激するためには多数回投与により高用量（ミリグラム量）を要するという定説がある。しかしながら、高抗原用量及び複数回投与は恐らくは消化環境を飽和させるために必要である。抗原の大部分が分解されるか吸収されるため、移行して後天性の免疫応答を刺激する抗原の量は極めて僅かである。
【０００７】
ＬＴ及びＣＴは高病原性であるため、アジュバント活性を温存しつつ病原特性を低減又は排除することを目標とした多くの生化学的及び遺伝的な研究の目的であった。ＬＴ及びＣＴは、これらが共にＧ１ガングリオシド受容体に特異的であるオリゴマー「Ｂ」サブユニット（それぞれＬＴ−Ｂ及びＣＴ−Ｂ）及びＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を有する単一の「Ａ」サブユニット（それぞれＬＴ−Ａ及びＣＴ−Ａ）よりなる点において、類似の蛋白３次構造を示す。ＬＴに関わる研究では多くの類縁体が作成され、それらの免疫原性及びアジュバント特性が哺乳類において検討されている。ＬＴ毒素の数種の類縁体は毒素のアジュバント特性を低減することなく腸疾患活性を減衰するために「Ａ」サブユニットにおけるアミノ酸の置換及び欠失により作成されている(Ghiara et al.,1997,Infect.Immun.,65:4996-5002)。しかしながら、鳥類におけるこのような毒素のアジュバントや免疫原としての使用については殆どデータが存在しない。
【０００８】
Hoshi.et al.,1995.Vaccine,13:245-252及びMeinersmann.et al.,1993.Avian Dis.,37:427-432はトリ動物種におけるＣＴの経口投与では経口投与された破傷風トキソイド又は不活性化された伝染性ブルザ病ウィルスへの全身性及び根粘膜の体液性応答を増強することができなかったと報告している。T.Takeda.et al.,1996. Vet.Microbiol.,50:17-25はＣＴ−Ｂの鼻内及び皮下投与によりニューカッスル病ウィルスに対する体液性応答が増強されたことを示している。更にまた、Vervelde.et al.,、1998.Vet.Immunol.Immunopath.,62:261-272はニワトリにおけるＣＴの腸内外科的適用によりアイメリア抗原の腸内外科的適用に対する体液性応答を増強したと報告している。従って、腸へのＣＴの外科的投与は腸上皮への結合を明らかにしたものの、鳥類における経口投与ではＣＴはアジュバント作用をもたらし得なかったと結論された。
【０００９】
広範な種類の哺乳類におけるＬＴ及びＣＴの腸疾患及びアジュバント作用に関する大量の文献に基づけば、同様の作用が鳥類においても観察されると予測される。家畜のニワトリが下痢や他の腸疾患性の作用の症状を示さなかったが精製された毒素からインサイチュの植物産生毒素に渡る種々のフォーマットにおいて提示されたネイティブのＬＴ及びＣＴ毒素の経口投与ではなお免疫学的応答をもたらしたことを発見したことは、極めて意外であった。
【００１０】
熱不安定性毒素を発現する腸疾患性のＥ．ｃｏｌｉ発現は家禽に関して記載はなく、また粘膜の免疫原又はアジュバントとしてのＬＴの使用の記載もない。家禽は孵化前に活性であるＢ細胞分化臓器（ファブリーキウス嚢）により部分的には幼若時に免疫化される能力を有する。Dibner,J.J.et al.,1998.Applied Poultry Research 7:427-436。即ち、１日齢で免疫化された鳥類は非生存性の抗原に競合するかこれを分解するための、腸内の食物、微生物及び消化酵素の負荷が少ない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に記載した試験はネイティブのＬＴ及びＬＴ−Ｂが鼻内（ＩＮ）、皮下、卵内、又は経口経由の何れかによる毒素の接種後僅か２１日内に血清ＩｇＧ中に検出される免疫応答を誘導することを明らかにするものである。同様の方法において、ネイティブ配列のＬＴ−Ｂ及び減衰されたＬＴ−Ａ類縁体を発現するトランスジェニックタバコＮＴ−１細胞は、毒素又は植物性物質により誘発される悪影響を伴うことなく経口及びＩＮの経路の両方により血清額的応答を誘導する。更にまた、経口又は皮下の経路により投与された場合、ネイティブのＬＴは意外にも、マウスでは致死量、ヒトでは腸疾患性と報告されている用量より高用量で投与した場合にブロイラーニワトリに対して非病原性であることがわかった。
【００１２】
本発明は鳥類にワクチン接種する際にアジュバントとして使用するためのＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）及びＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素類縁体（ＬＴ類縁体）よりなる群から選択される蛋白のアジュバント量を含む組成物として要約できる。本発明は更に、鳥類に請求項記載の組成物の何れかのアジュバント量を投与することを含む鳥類のワクチン接種のための方法よりなるものであり、特にそのような組成物がトランスジェニック植物により生産され、及び／又は、加工又は未加工のトランスジェニック植物性材料の形態で投与される場合の上記方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書において、鳥類とは羽に改変された前肢、鱗状の脚部、くちばしを有し、硬殻の卵中に子を出生するＡｖｅｓ種の何れかの温血脊椎動物メンバーとして定義される。本明細書の目的のためには、鳥類の好ましい群は家畜化されたニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、アヒル、ガチョウ及びコーニッシュ種のニワトリである。より好ましい群は家畜化されたニワトリ及びシチメンチョウである。本発明の目的のための最も好ましい鳥類は家畜化されたニワトリ、例えばブロイラー及び産卵鶏である。
【００１４】
免疫原は健常動物において体液性及び／又は細胞性の免疫応答を誘発し、これにより動物を免疫原へのそれ以上の曝露から保護するような非自己物質である。免疫原は典型的には何らかの形態で非病原性としてよいウィルス、細菌及びカビのような病原体である。免疫原はまた、細胞壁成分、ウィルス被覆蛋白及び毒素や酵素のような分泌された蛋白などを含む病原体の抗原性部分であってもよい。免疫原はまた植物細胞のような組み換え細胞及び免疫保護性の抗原を発現して提示するように操作されている細胞の抽出液も包含する。
【００１５】
ワクチン接種(vaccination, vaccinating)とは病原性物質又はその有毒な形態又は部分の免疫原性調製物を宿主に接種して宿主の免疫系を刺激し、病原性物質の後の曝露に対するその後の宿主の反応を防止又は減衰することにより病原体に対抗して保護を与えるための手段として定義される。
【００１６】
投与(administration, administer)とは動物の身体内への物質の導入として定義され、経口、鼻内、眼内、卵内、及び非経口（静脈内、筋肉内、又は皮下）の経路を包含する。本発明に合致する投与のより好ましい経路は共に腸粘膜に到達する経口及び／又は経鼻投与、及び、卵内投与である。経口投与がより好ましい。
【００１７】
有効量又は免疫保護量とは、疾患の攻撃に対抗した保護の所望の帰結を生じさせる物質の量又は嵩として定義される。有効量は本明細書に記載するデータ及び情報に基づいて当業者が容易に判り得るものである。
【００１８】
本明細書の目的のためには、アジュバントは免疫原又は抗原への免疫応答を強化、増大又は増強する物質である。アジュバントは典型的には体液性及び細胞性の応答の両方を増強するが、一方の非存在下における他方への増強された応答がアジュバントの定義に適している。更にまた、アジュバント及びその使用は免疫学者にはよく知られており、典型的には、免疫原の用量が制限されている場合、又は、免疫原の免疫原性が乏しいか、又は、投与経路が至適に至らない場合に、免疫応答を増強するために用いられる。即ち、「アジュバント量」という用語は所定の免疫原又は抗原への免疫応答を増強することができるアジュバントの量である。アジュバント量に等しい嵩とは変動し、種々の要因、例えば免疫原の性質、投与する免疫原の量、宿主の種、投与経路、及び、免疫原を投与するためのプロトコルに依存している。アジュバント量は状況の特定のセットが示されれば日常的実験により容易に求めることができる。これは当業者のよく知るものであり、典型的には種々の量の投与される免疫原及びアジュバントに対する通常の用量応答測定を使用する。応答は酵素結合免疫吸着試験、ラジオイムノアッセイ、赤血球凝集素試験等を用いて免疫原に応答して上昇した血清抗体価を測定することにより求める。
【００１９】
ＬＴの場合、多くの哺乳類における研究でキログラム当たりマイクログラム未満の量が強力な免疫応答を誘発するのみならず、病原性ももたらしていることが明らかになっている。最も意外な点は、これは、経口投与されたネイティブＬＴは１０ｍｇ／ｋｇまでいかなる病原性の徴候ももたらさなかったがなお、高い血清中ＩｇＧ力価の形態で実質的な免疫応答をもたらしたニワトリの場合には当てはまらなかった。このことは外科的に移植されたＣＴ及び抗原は病原性非存在下で免疫応答を増大させた(Vervelde et al.,1998,前出)のに対しＣＴ−Ｂは免疫応答をもたらすことはできたが病原性は示さなかった(Takeda et al.,1996,前出)ことを示した試験とは対照的である。
【００２０】
Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）はＸ線結晶分析により十分解明されており、多量体の蛋白よりなる。ホロ毒素は小腸内のプロテアーゼによりＬＴ−Ａ１及びＬＴ−Ａ２に分解される分子量２７０００ダルトンの「Ａ」サブユニット（ＬＴ−Ａ）１個を含む。ホロ毒素はまた、各々が非共有結合的に連結して極めて安定なドーナツ様の５量体構造となっている分子量１１，６００ダルトンの「Ｂ」サブユニット（ＬＴ−Ｂ）５個も含んでいる。何れかの原料に由来するネイティブのＬＴが好ましい。
【００２１】
Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素類縁体（ＬＴ類縁体）は１又はそれ以上のアミノ酸が置換された何れかの既知のネイティブＬＴとして定義され、文献に記載されている。数種のよく知られたＬＴ類縁体はαサブユニットの６３位、７２位及び１９２位に天然に存在する残基がリジン、アルギニン及びグリシンによりそれぞれ置換されている（Ｋ６３、Ｒ７２及びＧ１９２）ものである。Rappuoli et al.,1999,Immunol.Today.20,493-500。生物学的に活性なＬＴ及びＬＴ類縁体はＥＬＩＳＡフォーマットにおいてＧＭ１ガングリオシドに結合し、インビトロ細胞毒性試験のＹ１副腎細胞に対して毒性である。
【００２２】
鳥類は本発明者等が保護ワクチン接種を供する対象である広範な種類の疾患に対して感受性である。原因物質が本発明に適合する免疫原となる商業上より重要なトリ疾患の一部を以下に列挙する。これは本発明に適用されるトリ疾患の全てではない。ニューカッスル病、トリインフルエンザ、伝染性ブルザ病、コクシジウム症、壊死性腸炎、気嚢炎、蜂巣炎、ニワトリ貧血症、喉頭鼻気管炎、伝染性気管支炎及びマレク病。トリ疾患に対する保護を与え、本発明に合致している免疫原のより好ましい群はニューカッスル病ウィルスの抗原決定基、ニューカッスル病ウィルスの赤血球凝集素ノイラミニダーゼ蛋白、トリインフルエンザウィルスの抗原決定基、トリインフルエンザウィルスの赤血球凝集素蛋白である。
【００２３】
ＬＴ−Ａ、ＬＴ−Ｂ、ＬＴ及びＬＴ類縁体を含む比較的純粋なポリペプチド及び蛋白を大量に製造するための多くの方法が当該分野で知られている。組み換えポリペプチド及び蛋白を製造するための細菌及び酵母の系が過去数十年間実施されている。より最近では製造ビヒクルとしての昆虫、脊椎動物、哺乳類又は植物の細胞に依存したトランスジェニック蛋白製造系が開発されている。ＬＴのようなアジュバントの製造及び場合によりトランスジェニック植物内での選択された免疫原との同時発現は、トランスジェニック植物性物質が直接加工され、ワクチンとして鳥類に給餌されるか鼻内投与されることから、本発明に特に適している。
【００２４】
トランスジェニック植物とは本明細書においては、形質転換された植物細胞、組織又はプロトプラストに由来する、その植物細胞培養物、植物細胞系統、植物又はその子孫として定義され、その場合、形質転換された植物のゲノムは同じ系統のネイティブの非トランスジェニック植物には本来存在しない、実験室技術により導入された、外因性の外来ＤＮＡを含む。「トランスジェニック植物」及び「形質転換された植物」とは、場合により、当該分野においてはそのＤＮＡが外因性ＤＮＡ分子を含有する植物を定義するために同義的に使用されている。この定義に含まれるものは更に、組み込まれたトランスジェニックの事象をもたらさないウィルスベクター系を解して異種ＤＮＡで一過性に形質転換されている植物である。この技術は部分的に米国特許５，８４６，７９５号及び５，５００，３６０号に示されているとおり当該分野でよく知られている。
【００２５】
本発明の実施において使用する植物の好ましい群は植物細胞培養物、バレイショ、トマト、アルファルファ及びウキクサである。より好ましい群は植物細胞培養物及びトマトであり、植物細胞培養物が最も好ましい。好ましい植物細胞培養物は単子葉及び双子葉植物に由来する培養物の両方を包含する。特に好ましい植物細胞培養物は、Toshiyuki et al.,1992,Int'l Rev.of Cytology,132,1-30に記載されたＮＴ−１及びＢＹ−２と命名され
たタバコ細胞培養物である。
【００２６】
細胞内に形質転換ＤＮＡセグメントを導入するための多くの方法が当該分野で知られているが、全てが植物細胞にＤＮＡをデリバリーするために適しているわけではない。適当な方法は、アグロバクテリウム感染、例えばプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換(Omirulleh et al.,Plant Molecular Biology,21:415-428,1993)によるＤＮＡの直接のデリバリー、乾燥／抑制媒介のＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、シリコンカーバイド線維との同時攪拌、ＤＮＡコーティング粒子の加速等のような、ＤＮＡを細胞に導入できる実質的に如何なる方法も包含するものと考えられる。特定の実施形態においては加速方法が好ましく、例えばマイクロ噴出性衝突(microprojectile bombardment)等が含まれる。
【００２７】
細胞にＤＮＡを導入する技術は当該分野でよく知られている。外来性ＤＮＡを植物細胞にデリバリーするための４種の基本的方法が報告されている。即ち、化学的方法(Graham and van der Eb, Virology,54(02):536-539,1973;Zatloukal,Wagner,Cotten,Phillips,Plank,Steinlein,Curiel,Birnstiel,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:136-153,1992)；物理的方法、例えばマイクロインジェクション(Capecchi,Cell,22(2):479-488,1980)、エレクトロポレーション(Wong and Neumann,Biochim.Biophys.Res.Commun.107(2):584-587,1982;Fromn,Taylor,Walbot,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82(17):5824-5828,1985；米国特許５，３８４，２５３号）及び遺伝子銃(Johnston and Tang,Methods Cell.Biol.,43(A):353-365,1994;Fynan,Webster,Fuller,Haynes,Santoro,Robinson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(24):11478-11482,1993)；ウイルス法(Clapp,Clin.Peritnatol.,20(1):155-168,1993;Lu,Xiao,Clapp,Li,Broxmeyer,J.Exp.Med.178(6):2089-2096,1993;Eglitis and Anderson,Biotechniques,6(7):608-614,1988;Eglitis,Kantoff,Kohn,Karson,Moen,Lothrop,Blaese,Anderson,Avd.Exp.Med.Biol.,241:19-27,1988)；及び受容体媒介方法(Curiel,Agarwal,Wagner,Cotten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88(19):8850-8854,1991;Curiel,Wagner,Cotten,Bimstiel,Agarwal,Li,Loechel,Hu,Hum.Gen.Ther.,3(2):147-154,1992;Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(13):6099-6103,1992)である。
【００２８】
エレクトロポレーションによる植物細胞へのＤＮＡの導入は当該分野でよく知られている。植物細胞壁分解酵素、例えばペクチン分解酵素を用いてレシピエントの細胞を未処理細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換を受けやすくする。エレクトロポレーションにより形質転換を行うためには、細胞、又は胚形成カルス、又は未成熟の胚の懸濁培養物のような脆弱な組織、又は他の組織化された組織の何れかを使用してよい。一般的にはペクチン分解酵素に対する標的植物性物質の細胞壁を部分的に分解するか、又は制御された方法で機械的に創傷を与えることが必要である。このように処理された植物性物質はエレクトロポレーションにより外来性ＤＮＡを受容しやすくなる。
【００２９】
外来性形質転換ＤＮＡを植物細胞にデリバリーする別の方法はマイクロ噴出性衝突によるものである。この方法においては、微粒子を外来性ＤＮＡでコーティングし、推進力を用いて細胞内部にデリバリーする。このような微粒子は典型的にはタングステン、金、白金及び同様の金属よりなる。マイクロ噴出性衝突の利点はプロトプラストの単離(Cristou et al.,1988,Plant Physiol.,87:671-674)やアグロバクテリウム感染への感受性の何れも必要ない点である。加速によりトウモロコシ細胞内にＤＮＡをデリバリーするための方法の代表的な実施形態はバイオリスティックスパーティクルデリバリーシステムであり、これを用いてＤＮＡ又は細胞でコーティングされた粒子をスクリーンを通過して懸濁液中に培養されているトウモロコシ細胞に被覆されたフィルター表面上まで推進させる。スクリーンは粒子が大型凝集物の状態でレシピエント細胞にデリバリーされることがないようにこれらを分散させる。衝突のためには懸濁液中の細胞は好ましくはフィルター又は固体の培地上に濃縮されている。或は、未成熟の胚又は他の標的細胞を固体培地上に配列させる。衝突対象となる細胞はマイクロ噴出停止プレートの下方適切な距離に位置させる。衝突形質転換においては、所定の培養条件及び衝突パラメーターを至適化することにより、安定な形質転換体の最大数を得ることができる。衝突に関する物理的及び生物学的なパラメーターの両方がこの方法では重要である。物理的要因はＤＮＡ／マイクロ噴出性沈殿物の操作に関わるもの、又は、マイクロ噴出の飛行及び速度に影響するものである。生物学的要因は衝突の前及び直後の細胞の操作に関わる全工程、衝突に関わる外相を緩和する標的細胞の浸透圧調節、及び、線状化ＤＮＡ又は未損傷のスーパーコイルプラスミドのような形質転換ＤＮＡの性質を包含する。
【００３０】
アグロバクテリウム媒介転移は、ＤＮＡを全植物組織に導入でき、未損傷の植物をプロトプラストから再生する必要がないため、植物細胞への外来性ＤＮＡの導入のために広範に適用されている系である。植物細胞にＤＮＡを導入するためのアグロバクテリウム媒介植物組み込みベクターの使用は当該分野でよく知られている。例えばFraley et al.,1985,Biotechnology,3:629;Rogers et al.,1987,Meth.in Enzymol.,153:253-277を参照できる。更にまた、Ｔｉ−ＤＮＡの組み込みも殆ど再配列をもたらさない比較的正確な方法である。転移させるべきＤＮＡの領域は境界配列により明確化され、介在ＤＮＡは通常はSpielmann et al.,1986,Mol.Gen.Genet.,205:34;Jorgensen et al.,1987,Mol.Gen.Genet.,207:471に記載のとおり植物ゲノム内に挿入する。
【００３１】
最新のアグロバクテリウム形質転換ベクターはＥ．ｃｏｌｉ並びにアグロバクテリウムの複製が可能であり、報告されている通りに重宝な操作を可能とする(Klee et al.,1985)。更にまた、アグロバクテリウム媒介遺伝子転移のためのベクターにおける最近の技術的進歩により遺伝子の配列及びベクター内の制限部位が改善され、種々の蛋白又はポリペプチドを発現できるベクターの構築が容易になった。記載されているベクター(Rogers et al.,1987)は挿入されたポリペプチドコーディング遺伝子の直接発現のためのプロモーター及びポリアデニル化部位がフランキングした好都合なマルチリンカー領域を有しており、本発明の目的に適している。更にまた、防御(armed)及び防御解除(disarmed)のＴｉ遺伝子の両方を含むアグロバクテリウムを形質転換のために使用できる。
【００３２】
植物プロトプラストの形質転換はリン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション及びこれらの処理の組み合わせに基づいた方法を用いて達成できる(例えばPotrykus et al.,1985,Mol.Gen.Genet.,199:183及びMarcotte et al.,1988,Nature,335:454を参照できる)。種々の植物へのこれらの系の適用はプロトプラストから特定の種を再生できる能力に依存している。
【実施例１】
【００３３】
材料
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｈ１０４０７のＬＴ−Ｂ遺伝子をコードする植物至適化配列は当該分野で知られている(Mason et al.,1998,Vaccine 16:1336-1343)。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｈ１０４０７のＬＴ−Ａ遺伝子をコードする植物至適化配列は米国仮出願６０／１１３，５０７号として原出願された国際公開公報第２０００／３７６０９号に記載されている。国際公開公報第２０００／３７６０９号は実施例２におけるニコチアナ・タバカムＮＴ−１細胞のアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介植物細胞形質転換のために使用された３種のバイナリＴ−ＤＮＡベクター（ｐＳＬＴ１０２、ｐＳＬＴ１０５、ｐＳＬＴ１０７）の構築を記載している。得られた形質転換ＮＴ−１細胞系統（ＳＬＴ１０２、ＳＬＴ１０５及びＳＬＴ１０７）は完全に組み立てられたＬＴ及びＬＴ−Ｂ及びＬＴ−Ａサブユニットの修飾された形態よりなるＬＴ類縁体を発現し、蓄積した。図１はＡｌａ７２がＡｒｇ７２で置き換えられている修飾ＬＴ−Ａ遺伝子を含むｐＳＬＴ１０７を説明している。ＳＬＴ１０２及びＳＬＴ１０５発現産物はそれらがＬＴ−Ａ遺伝子において異なる改変（ｐＳＬＴ１０２ではＳｅｒ６３からＬｙｓ６３；ｐＳＬＴ１０５ではＡｒｇ１９２からＧｌｙ１９２）を含むこと以外は同一である。これらの系統は核染色体ＤＮＡ内に安定に組み込まれたプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域のコピーを未確認数含んでいる。トランスジェニックＮＴ１細胞は、ガングリオシド依存性ＥＬＩＳＡにより測定したところ、全可溶性蛋白の０．４％までの濃度でガングリオシド結合５量体に組み立てられたＬＴ−Ｂサブユニットを蓄積した。トランスジェニックＮＴ１細胞はまた修飾ＬＴ−Ａサブユニットも蓄積しており、その一部は、ＬＴ−Ａ特異的抗体を用いたガングリオシド依存性ＥＬＩＳＡで測定したところＬＴ−Ｂ５量体と共に組み立てられていた。
【００３４】
更にまた、プラスミドｐＱＥＴＨＫ、ｐＣＪ２１７及びｐＣＳ９６も得た。ｐＱＥＴＨＫはＱｕｉａｇｅｎのｐＱＥ６０（登録商標）ベクターにクローニングされたＬＴＢの植物至適化コーディング配列であり、ｐＣＪ２１７(Cardenas et al.,1993,Inf.and Imm.61:4629-4636)はｐＵＣ８にクローニングされたＬＴＢのＥ．ｃｏｌｉ由来配列及びＬＴＡの非コーディング領域を含む。ｐＣＳ９６はＥ．ｃｏｌｉのＬＴＢ及びＬＴＡサブユニット遺伝子の両方を発現する。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ５α又はＪＭ８３宿主菌株内の各プラスミドを選択のためにアンピシリン５０ｕｇ／ｍｌを用いたＬＢ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中に生育させた。
【００３５】
５０ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地中で一晩ＤＨ５α中のｐＣＳ９６１〜２リットルを生育させることによりネイティブのＬＴを単離した。細胞をＨｅｒａｅｕｓＭｅｇａｆｕｇｅ（２０分、４０００ｒｐｍ）を用いてペレット化し、ＴＥ緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．２、１ｍＭＥＤＴＡ）２００ｍｌ中に再懸濁し、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、ＴＥ緩衝液１００ｍｌ中に再懸濁し、−８０℃で保存した。再懸濁したペレットを平板交換チップ付きのＢｒａｎｓｏｎ４５０超音波処理機を用いて、氷上１０分間、出力コントロール８、デューティーサイクル６０で破壊した。次に調製品をＪ２−２１Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機及びＪＡ−２０Ｂｅｃｋｍａｎローターを用いて２〜７℃で３０分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を新しい試験管に移し、２００００ｒｐｍで１時間遠心分離した。２００００ｒｐｍ上清を透析試験管（６０００−８０００  ＭＷＣＯ）に写し、２ＬのＴＥＮに対して、４日間透析した（ＴＥＮは毎日交換）。透析後、試料をＴＥＮ平衡化固定化ガラクトースアフィニティーカラムに流量〜１０ｍｌ／時で通した。カラムをカラムの数倍容量のＴＥＮ緩衝液で洗浄し、結合したＬＴを１ＭＤ（＋）ガラクトースで溶出させた。ＬＴを含有する画分は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認し、合わせ、−８０℃で保存した。
【実施例２】
【００３６】
ＬＴを発現するトランスジェニックニコチアナ・タバカムの調製
形質転換の３〜４日前に、４０ｍｌのＮＴ−１培地にＮＴ−１培養物２ｍｌを添加することにより、１週齢のＮＴ−１培養物を新しい培地に継代した。継代培養は１００ｒｐｍの振とう機上において２５±１℃暗所に維持した。
【００３７】
【表１】
2005539039.tif 000002
目的の発現ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスをグリセロール保存溶液から掻き取ってスペクチノマイシン５０ｍｇ／ｌを含有するＬＢ培地の平板上に移した。細菌培養物を２４〜４８時間３０℃暗所でインキュベートした。１個の十分形成されたコロニーを選択し、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含有するＹＭ培地３ｍｌに移した。液体培養物をＯＤ600が０．５〜０．６となるまで２５０ｒｐｍで振盪培養器上３０℃暗所にインキュベートした。これには約２４時間を要した。
【００３８】
【表２】
2005539039.tif 000003
（或は、粉末形態のＹＭを購入することができる（ＧＩｂｃｏ  ＢＲＬ；カタログ番号１００９０−０１１）。液体培地の調製のためには、１１．１ｇを水１リットルに添加する。）
形質転換当日、ＮＴ−１培養物ｍｌ当たり２０ｍＭアセトシリンゴン１μｌを添加した。アセトシリンゴン保存溶液は形質転換当日、エタノール中に調製した。ＮＴ−１細胞に創傷を与えて形質転換効率を向上させた。創傷を与えるために、５ｍｌ孔径の滅菌ピペットを通して懸濁培養物の吸い込みと吐き出しを繰り返した（２０回）。懸濁液４ミリリットルを１０，６０ｘ１５ｍｍのペトリ皿各々に移した。１プレートを取って非形質転換対照として使用した。残りの９プレートの各々にはアグロバクテリウム懸濁液約５０〜１００μｌを添加した。プレートはパラフィルムで被覆し、次に３日間２５±１℃で１００ｒｐｍの振盪器上暗所でインキュベートした。
【００３９】
細胞を滅菌した５０ｍｌ容の三角遠沈管に移し、ＮＴＣ培地（オートクレーブ後に添加した５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有するＮＴ−１培地）で最終容量を４５ｍｌとした。これらを混合し、次にスイングバケットローター付き遠心分離機中１０分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去し、得られたペレットをＮＴＣ４５ｍｌ中に再懸濁した。洗浄を繰り返した。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを４０ｍｌＮＴＣに再懸濁した。５ｍｌづつをＮＴＣＢ１０培地（オートクレーブ後に添加した１０ｍｇ／ｌバイアラホスを添加した８ｇ／ｌ寒天／寒天で固化させたＮＴＣ培地）の入った各ペトリ皿（１５０ｘ１５ｍｍ）にプレーティングした。プレートをパラフィルムで被覆し、２５±１℃で暗所に維持した。培養室に移す前に、プレートを層流フード内で開放放置し、過剰な液体を蒸発させた。６〜８週間後、推定形質転換体が出現した。これらを選択し、新しいＮＴＣＢ５（オートクレーブ後に添加した５ｍｇ／ｌバイアラホスを添加した８ｇ／ｌ寒天／寒天で固化させたＮＴＣ培地）に移した。プレートをパラフィルムで被覆し、２５±１℃で暗所に培養した。
【００４０】
推定形質転換体は死滅した非形質転換細胞のバックグラウンド上のカルスの小型クラスターとして出現した。これらのカルスをＮＴＣＢ５倍地に移し、数週間生育させた。各推定形質転換体の一部を選択してＥＬＩＳＡに供した。少なくとも２回のＥＬＩＳＡ試行の後、最も高い抗原濃度を示した系統を選択した。次に優秀な系統の各々についてカルス物質の量を平板培養及び場合により液体培養において増幅させた。
【００４１】
得られた形質転換体ＮＴ−１細胞系統ＳＬＴ１０２、ＳＬＴ１０５及びＳＬＴ１０７はＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴ−Ｂ）及びＬＴ−Ａサブユニットの修飾型を発現し、蓄積した。ＳＬＴ１０２、ＳＬＴ１０５及びＳＬＴ１０７の発現産物はＬＴ−Ａ遺伝子内に異なる改変を含むこと以外は同様であった。別のＮＴ−１系統であるＳＬＴ１０１はネイティブのＬＴ−Ａ及びＬＴ−Ｂ遺伝子を発現し、Ｅ．ｃｏｌｉ誘導ＬＴと全ての点において等しかった。これらの系統は核核染色体ＤＮＡ内に安定に組み込まれたプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域のコピーを未確認数含んでいる。全トランスジェニックＮＴ１細胞は、ガングリオシド依存性ＥＬＩＳＡにより測定したところ、全可溶性蛋白の０．４％までの濃度でガングリオシド結合５量体に組み立てられたＬＴ−Ｂサブユニットを蓄積した。全トランスジェニックＮＴ１細胞はまたネイティブ（ＳＬＴ１０１）又は修飾ＬＴ−Ａ（ＳＬＴ１０２、ＳＬＴ１０５及びＳＬＴ１０７）サブユニットも蓄積しており、これらは、ＬＴ−Ａ特異的抗体を用いたガングリオシド依存性ＥＬＩＳＡで測定したところＬＴ−Ｂ５量体と共に組み立てられていた。
【実施例３】
【００４２】
接種物の調製
緩衝液及び試薬：アンピシリンはＳｉｇｍａ（ロット番号１４Ｈ００４１）から入手し、１００ｍｇ／ｍｌ保存溶液は滅菌水中に作成した。トリプトンはＦｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ロット番号１０９７５６ＪＥ）から入手した。酵母エキスはＤｉｆｃｏ（ロット番号１３２３８４ＪＤ）から入手した。塩化ナトリウム（ロット番号４９Ｈ０２６５）、Ｄ（＋）ガラクトース（ロット番号４６ＨＯ３５６１）、ＭＥＳ（２−［モルホリノ］エタンスルホン酸）（ロット番号２９Ｈ５４２８１）及び水酸化ナトリウム（ロット番号３０Ｋ０２２９）はＳｉｇｍａより入手した。クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０はＢｉｏ−Ｒａｄより入手した。メタノールはＶＷＲ（ロット番号３８２７４８４２）から、氷酢酸はＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ロット番号Ｋ２７２６０７００）から、エチルアルコール（ロット番号ＤＵＯ９７２３ＢＵ）はＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手した。リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）は、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、１．５ｍＭ１塩基性リン酸カリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム及び６ｍＭ２塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２（ＢＲＬ／Ｇｉｂｃｏ）として調製した。
【００４３】
形質転換されたＮＴ−１細胞を０．８％寒天含有ＮＴ−１培地から調製した寒天プレート上にカルスとして維持した。培地の成分は２．５ｍＭ  ＭＥＳ、１．２ｍＭ  リン酸水素二カリウム（ロット番号４７ＨＯ８１１）、０．１％（ｗ／ｖ）ミオイノシトール（ロット番号４９Ｈ０３９０２５）、０．００１％（ｗ／ｖ）チアミン塩酸塩（ロット番号１０７Ｈ０２７８５）。０．４％（ｗ／ｖ）ＭＳ塩（ロット番号４７０８０３）、３％（ｗ／ｖ）ショ糖（ロット番号４７Ｈ０８０３）、及び０．８％（ｗ／ｖ）寒天（ロット番号３９０９０６）、以上全てＳｉｇｍａ、及び、０．２２％（ｖ／ｖ）２，４−Ｄ（ロット番号１０７０９１）Ｇｉｂｃｏとした。懸濁細胞並びに寒天プレートはまたＮＴ−１形質転換組み換えＤＮＡの選択の評価に必要な５０ｕｇ／ｍｌカナマイシン（ロット番号２９ＨＯ８９４１）も含有した。カルスは滅菌ピペットにカルスを通過させることにより崩壊させ、少量のカルス（０．５ｃｍ3）を新しいプレートに移した。ＮＴ−１細胞の懸濁培養物を製造するために、カルスをピペットで崩壊し、カルスの数片を寒天を含まない三角フラスコ中のＮＴ−１培地に移し、２８〜３０℃の旋回インキュベーター中に入れた。継代後６〜１２日に数種の方法で細胞を回収した。シェーカーフラスコを定常状態に維持し、細胞を沈殿させ、培地を傾瀉することにより全湿潤細胞を得た。超音波処理した全湿潤細胞は、リン酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．２中に５０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＰＭＳＦ及び０．１％トリトンＸ−１００（全てＳｉｇｍａ）を含有する抽出緩衝液中に湿潤細胞を再懸濁することにより上記したとおり採取した。次に細胞を平板交換チップ付きのＢｒａｎｓｏｎ４５０超音波処理機を用いて、氷上１０分間、出力コントロール８、デューティーサイクル６０で破壊開放した。超音波処理した湿潤細胞の上清及びペレットは、ＢｅｃｋｍａｎＧＰＲ遠心分離機を用いて３４００ｒｐｍで２０〜３０分間超音波処理した調製品を遠心分離することにより調製した。全乾燥細胞はＳｐｅｃｔｒａｍｅｓｈをライニングされたブフナー漏斗を用いて全湿潤細胞を濾過することにより調製し；緻密化された細胞を浅型プラスチックトレイ中のＳｐｅｃｔｒａｍｅｓｈシート上に展開し、次に食品脱水機中に一晩静置した。
【００４４】
混餌投与として、あらかじめ標的抗原含量に対して定量されている全細胞、乾燥細胞又は超音波処理湿潤細胞を直接給餌ボウル内に入れた。しかしながら、全湿潤細胞、乾燥細胞又は超音波処理細胞をまず飼料に混合（１日齢のブロイラーニワトリに対して６グラム）し、「Ｘ」羽のトリのケージ当たり１個の給餌ボウル内に入れた場合に、ブロイラーニワトリによる標的抗原の消費がより効率的であった。鼻内（ＩＮ）接種については、トリの鼻腔内に２５ｕｌをピペットで投与できるような整合性が得られるまで、湿潤細胞、乾燥細胞又は超音波処理細胞をＰＢＳに懸濁した。典型的には、ＩＮ接種に必要な細胞の質量の容量に対する比は細胞１に対し抽出緩衝液２である。
【実施例４】
【００４５】
ワクチン投与及び治療
ブロイラーニワトリをＳｔｏｖｅｒＨａｔｃｈｅｒｙ，ＳｔｏｖｅｒＭＯより入手した。これらのニワトリは小規模のブロイラー業務の接種用に孵化された副産物の雄性動物又は雌雄混合のニワトリである。ニワトリは一晩の速達便で到着し、直ちに養鶏用のＰｅｔｅｒｓｉｍｅケージ（ケージ当たり７羽）に入れられた。治療群当たりのニワトリの数は反復測定を用いた完全に無作為化された設計に基づいた。過剰なニワトリがあった場合は個々のケージに無作為に入れ、出荷又は設置のストレスから死亡したニワトリの交換用とした。ケージのトリの接種直後に水を自由摂取させた。絶食トリに対しては飼料は一晩取り下げ、翌朝に接種を行うか、又は、飼料を一晩自由接種させ、その後午前中５時間絶食させた後、午後に接種を行った。混餌接種の場合は、植物誘導抗原を最小量の水でスラリーとし、次に飼料に混合して塊状の混合物とした。飼料をボウルに入れ、ボウルをケージに入れて全トリが接触できるようにした。胃管投与については、シリンジに固定した１インチの胃管針を用いて食道又はそ嚢に直接接種した。鼻内経路投与は鼻腔に直接２５μｌを接種することにより行った。ニワトリは一般的に接種時には１８時間〜３０時間齢であり、即ち、全ての臨床試験は試験第０日に１日齢のニワトリにより開始した。
【実施例５】
【００４６】
定量的ＥＬＩＳＡ
ＮｕｎｃのＭａｘｉｓｏｒｐ９６穴マイクロＥＬＩＳＡプレートにウェル当たり１００ｕｌを用いて０．０１Ｍホウ酸塩緩衝液中混合ＧＭ１ガングリオシド５ｕｇ／ｍｌをコーティングし；プレートを室温で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（１回、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有、Ｓｉｇｍａロット番号１２０Ｋ０２４８）で３回洗浄した。次に各ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中５％（ｗ／ｖ）無脂肪乾燥乳を含有するブロッキング緩衝液２００ｕｌと共に３７℃で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０を用いて２５０ｕｌ／ウェルで１回洗浄した。比較対象抗原及び試料抗原をブロッキング緩衝液と混合した後にプレートに添加した。ＬＴ比較対象抗原及びＬＴ−Ｂ比較対象抗原を第１のウェル中５０ｎｇ／ｍｌに稀釈し、試料は数種の異なる初期希釈度となるように予備希釈した。Ａ列に試料２００ｕｌを適用することにより試料をプレートに添加し、残りの列にはブロッキング緩衝液１００ｕｌを添加した。混合及びウェル当たり１００ｕｌを混合及び移行させることにより、２倍連続希釈を行った。次にプレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中の希釈抗血清１００ｕｌをウェル当たり添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次に抗体コンジュゲート１００ｕｌを添加し３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＴＭＢ基質５０ｕｌを各プレートに添加し、ＴＭＢ停止溶液を基質添加２０分後に添加した。波長４５０ｎｍにおける光学密度をＴｅｃａｎＳｕｎｒｉｓｅプレートリーダーを用いて測定した。データはＴｅｃａｎＭａｇｅｌｌａｎソフトウエアを用いて転送し、表示した。直線回帰及び定量分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０００バージョン９．０．３８２１ＳＲ−１を用いて行った。
【実施例６】
【００４７】
血清ＥＬＩＳＡ
血液を断首（０〜７日齢のトリ）又は羽弁部の静脈又は頸静脈の静脈穿刺により採取した。断首前１〜５分に頸部切断又はＣＯ2曝露によりトリを安楽死させた。血液を動物施設から実験室に移送し、４５分間２〜７℃において血液凝固を進行させ、濃縮した。血液試料を３７℃のウォーターバスに１０分間移し、次に２〜７℃でＢｅｃｋｍａｎＧＰＲ遠心分離機を用いて２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。各試験管から血清を無菌的に採取し、０．５〜１．５ｍｌづつ低温試験管（Ｎｕｎｃ）に分注し、使用時まで−１８℃で保存した。血清ＥＬＩＳＡ用に、ガングリオシド吸着段階では２〜７℃で一晩インキュベートしながら１．５ｕｇ／ｍｌを使用した。
【００４８】
プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中３％脱脂粉乳２００ｕｌ／ｍｌでブロッキングした。血清試料当りの抗体の力価測定するために、ガングリオシド吸着後、ブロッキング緩衝液中２．５ｕｇ／ｍｌのＬＴ−Ｂ又はＬＴ１００ｕｌをウェルあたり添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中に希釈した血清試料２００ｕｌをＡ列に添加し、ブロッキング緩衝液１００ｕｌを残りの列に添加した。血清の初期希釈は特段の記載が無い限りブロッキング緩衝液中１：１０とした。血清試料の連続２倍希釈の後、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。至適結合について予備力価測定されたヤギ抗ニワトリ抗体、及びクロマゲンを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ１００ｕｌを添加し、陽性対照の初期希釈がＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ（ＴＭ）プレートリーダーを用いて二重波長４０５／４９２における吸光度が０．７〜１．０となるまでインキュベートした。
【００４９】
データは転送し、ＴｅｃａｎＭａｇｅｌｌａｎソフトウエアを用いて表示した。直線回帰及び定量分析はＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０００バージョン９．０．３８２１ＳＲ−１を用いて行った。血清相乗平均力価（ＧＭＴ）を各投与群につきＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０００バージョン９．０．３８２１ＳＲ−１を用いて求めた。これらの計算のためにバックグラウンドＥＬＩＳＡ力価＜１０を数値１とした。投与トリに関する最小自乗平均の対照との差は最小自乗法により求めた。投与群と非ワクチン接種非攻撃対照群との間に有意差があった場合に投与を有効とみなした。
【実施例７】
【００５０】
Ｙ１副腎細胞試験
マウス由来のＹ１副腎細胞をＡＴＣＣ（ＣＣＬ−７９、ロット番号１３５３４００）から購入した。細胞バイアルを３７℃で解凍し、Ｆ−１２Ｋ培地（ＧｉｂｃｏＬ＃１０８９７１６）中１５％ドナーウマ血清（Ｑｕａｄ−５＃２２１２）、２．５％ウシ胎児血清（ＪＲＨＬ＃７Ｎ２３２６）、１％グルタマックス−１（ＧｉｂｃｏＬ＃１０８０３２３）よりなる生育培地１０ｍｌのはいった２５ｃｍ3のＴフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にいれた。細胞を５％ＣＯ2中３７℃でインキュベートした。各継代に付き細胞をこの生育培地中に維持し、ＬＴ及びＣＴ細胞毒性試験に付した。試験に際しては細胞を９６穴の細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ）に写し、８０％コンフルエントとした。ＬＴ又はＣＴ毒素をＦ−１２Ｋ生育培地中１ｕｇ／ｍｌに希釈した。プレートのＡ列に予備希釈した試料１００ｕｌを添加することにより９６ウェルのマイクロプレート上で連続２倍希釈することにより毒素を更に希釈した。次にＡ列の試料５０ｕｌを次のウェル中の生育培地５０ｕｌに移すことにより連続２倍希釈を行った。試料の各希釈物を試料又は細胞の入手容易性に応じてＹ１副腎細胞の１〜４ウェルに移した。ＣＴ及びＬＴ毒素のエンドポイント力価は５０％細胞毒性（細胞死）を得るために必要なｕｇ／ｍｌとする。Ｇｕｉｄｒｙ，Ｊ．Ｊ．，Ｃａｒｄｅｎａｓ，Ｌ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｅ．ａｎｄＪ．Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，１９９３。エシェリシア・コリ熱不安定性エンテロトキシンの毒性、免疫原性及びアジュバント性における受容体結合の役割。Ｉｎｆ．ａｎｄ  Ｉｍｍ．６５：４９４３−４９５０。
【実施例８】
【００５１】
ブロイラートリのネイティブＬＴによる攻撃
ブロイラーニワトリを１０〜２１日齢となるまでケージ当たり５〜６羽で飼育した。パイロット試験においては１６羽の１０日齢のニワトリを３群（未接種群５羽、１００ｕｇ／羽投与群５羽、２００ｕｇ／羽投与群５羽）に分割し、Ｅ．ｃｏｌｉネイティブＬＴを皮下接種した。上記したとおり、ＬＴ毒素はあらかじめマウスＹ１−副腎細胞に対する力価測定により活性型であることがわかっていた。トリは臨床徴候について接種後８時間に渡り毎時観察した。接種後１、２、４、８、２４及び２６時間後、トリを屠殺し、全体的な剖検を行った。腸、肝臓、腎臓、脾臓及び副腎を含む重要な臓器の重量及び病変、並びに体重を記録した。
【００５２】
第２の試験については、８４羽の２０日齢のトリを各々１６羽の６群に分割し、トリ当たりネイティブＬＴホロ毒素０、１０、５０、１００、２００又は４００ｕｇを皮下接種した。接種後１０、２４及び４８時間後、各群の５羽の体重、全体的な病態、糞の整合性及び全身状態を評価した。試験期間中を通じて全てのトリに飼料及び水を自由接種させた。
【実施例９】
【００５３】
ブロイラーニワトリにおける経口投与されたＣＴ−Ｂへの血清学的応答
コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴ−Ｂ）を種々のフォーマットを用いてニワトリに混餌投与するか直接接種した。この試験のために、３回の接種を１、１４及び２８日齢において行い；１、１４、２８及び３５日齢において抗体分析用に採決した。データによればニワトリでは報告されていないが哺乳類において報告されている数種の観察結果が明らかになった。測定可能な血清学的応答は２８日齢即ち１４日齢時の２回目の接種の２週間後に容易に検出できた。即ち、検出可能な応答を誘導するためには僅か２回の投与が必要であるのみであった。しかしながら、２８日齢で３回目の投与を行ったところ応答は増強された。鼻内（ＩＮ）及び混餌（ＯＦ）接種は共に、血清学的応答を誘導し；最高力価（５４０７）はトリの各鼻腔に２５ｕｌ水溶液としてデリバリーされたＣＴ−Ｂ２０ｕｇの接種により起こった。ＣＴ−Ｂの経口デリバリーもまた、胃管栄養法による２０ｕｇ用量（力価１７９０）又は飼料に直接噴霧（上方散布）した４０ｕｇ（力価３６５）としてデリバリーした場合の何れも良好な応答をもたらした。哺乳類で観察されている通り、ＣＴ−Ｂを用いたＩＮ経路は良好な血清学的応答をもたらしている。(Verweij, et al.,1998,Vaccine 16:2069-2076及びIsaka, et al.,1998,Vaccine 16:1620-1626)。しかしながら、鼻腔内を経由した進入を可能とするためには投与容量は少量である必要がある。この場合、精製されたＣＴ−Ｂ毒素は２ｍｇ／ｍｌの保存溶液として製造できた、これにより２０ｕｇの適切な用量を２５ｕｌでデリバリーすることができた。飼料６グラム中２０ｕｇを用いた噴霧適用、即ち約０．３ｐｐｍでは良好な力価が得られた。飼料上のＣＴ−Ｂの希釈及びその後の応答を考慮すると、経口投与は、食道への直接接種又は６グラムの接種物の任意の消費による何れも、ＧＡＬＴの良好な刺激をもたらすと考えられる。比較として、ＩＮ投与されたＣＴ−Ｂ２０ｕｇ用量又はニワトリ飼料中経口投与された４０ｕｇはマウスの粘膜応答を刺激する用量と極めて近似している。本試験においてＣＴ−Ｂに関して有効であったことがわかった用量はまた筋肉内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ）によりデリバリーされる動物に対する従来のワクチンにおいて使用されている抗原の量に匹敵するものであった。更にまた、これらのトリにおいてはＣＴ−Ｂに起因する副反応は観察されず；体重増加及び摂餌量は正常であり、これは、経口ワクチンとしてのトランスジェニック由来植物抗原の安全な使用を裏付けるものである。
【実施例１０】
【００５４】
ニワトリにおけるタバコ由来のＬＴへの血清学的応答
ＣＴ−Ｂに対して有効であると判明した用量範囲を利用して、第２の試験を行うことにより、ネイティブのＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）又はＬＴ−Ｂ並びに遺伝子修飾熱不安定性毒素が同様の応答をもたらすかどうか評価した。本試験においては、ＬＴ−Ｂ定量的ＥＬＩＳＡで測定した場合に毒素４０ｕｇとなる量を上記したＣＴ−Ｂ試験の場合と同様の時間枠において３回投薬により投与した。表１は混餌投与法又は経口ワクチン接種により投与されたタバコ由来ＬＴ（ＳＬＴ）及びネイティブの毒素の結果を示す。全投与群はＳＬＴ上清をのぞいて応答した。「ＳＬＴ全体」試料（力価８４４）及び「ＳＬＴ超音波処理」（力価５５７）は本試験において最高応答を示した。
【００５５】
【表３】
2005539039.tif 000004
「ＳＬＴ全体」は単にＮＴ−１生産フラスコを沈殿させ、培地を傾瀉し、飼料に混合される残存全湿潤細胞及び残留培地を使用することにより単離された全湿潤細胞であった。「ＳＬＴ超音波処理」はまず超音波処理して細胞壁を破壊し、次に飼料に混合された全湿潤細胞であった。タバコ由来ＳＬＴ試料は共に飼料に直接適用した場合はネイティブのＬＴやＣＴ−Ｂよりも良好な血清学的応答を誘導した。これらの結果はタバコ細胞由来ＬＴ（ＳＬＴ）及びネイティブＬＴがニワトリにおける良好な粘膜抗原であることを裏付けている。更にまた、表２はタバコ由来ＳＬＴが体重増加を尺度とした場合に有害な副作用をもたらさなかったことを示しており、これは植物又はネイティブのＬＴを用いた経口投与経路によるニワトリの安全なワクチン接種を裏付けるデータである。更に、１、１４及び２８日齢で与えられたネイティブＬＴ毒素は何れの齢においても投与トリの目視可能な腸病原性作用（下痢、不快感、脱水）をもたらさなかった。ｋｇ体重当たりのＬＴの質量は０．６ｍｇＬＴ／ｋｇ体重と推定され、これはマウスで観察された致死量（Ｇｉｌｌ，Ｍ．Ｄ．１９８２，細菌毒素：致死量表、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ．４６：８６−９４）より十分に高値であり、ネイティブのＬＴがニワトリにおいて安全に使用できるという概念を支持している。
【００５６】
【表４】
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【実施例１１】
【００５７】
ＳＬＴに対する血清学的応答の開始及び血清学的応答の持続時間
前の２試験はネイティブのＥ．ｃｏｌｉ又はタバコ由来の熱不安定性毒素がブロイラーニワトリにおいて強力な血清学的応答を誘導したことを示していた。ブロイラーニワトリにおいて応答が測定できる最も早い日及び応答の持続時間を調べるための試験を実施した。本試験では、用量とトリの齢の組み合わせを用いてＳＬＴへの応答を調べた。表３は投与群、投薬時のトリの齢、及び、本試験の各投薬時において使用した抗原の量を示す。２回目の用量は抗原の収量が少量であったため低値となり、これは群間で分散した場合のより低値の抗原用量と解釈された。ＩＮ用量は約１００ｎｇであり；低用量はＳＬＴ抗原がタバコ細胞塊により希釈されたという事実、及び、ＳＬＴ細胞の再懸濁は１日齢のトリの鼻腔への適用を可能とするためには十分均質としなければならないという事実によるものである。ピペットによる移行を可能とするのに十分希釈されたＮＴ−１細胞の懸濁液は初回用量としては極めて少量の接種物を与えたのみであった。この事実にも関わらず、飼料上の第２の投薬によりブーストした場合、これらのトリは応答し、少量の用量でもトリをＩＮ経路によるＬＴ抗原に対して感作するには十分であることが示されていた。
【００５８】
【表５】
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表３Ａは血清学的応答を示す。血清学的応答を検出する最も早い齢は０日齢、７日齢又は１４日齢に投薬したか否かに関わらず、第２１日であった。第３群、７群及び１１群においては、第３回目の投薬は２８日齢に行ったが、検出可能な力価を示すために必要ではなかった。２１日齢に検出された応答は４２日齢まで持続し、ブロイラートリの市販時の齢（３５〜６５日齢）と合致していた。
【００５９】
最高の血清学的応答は僅か２回の投薬をトリに対して行った時点で観察され、両方の場合において、初回の接種は１日齢で行い、２回目の接種は７日齢で行っている。ニワトリは典型的には孵化前３日に卵内接種されるか人工孵化場において１日齢に接種されるため、１日齢においてトリを感作する能力はブロイラー産業のワクチン接種慣行に適合可能である。
【００６０】
【表６】
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【実施例１２】
【００６１】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のネイティブＬＴのブロイラートリへの投与
表４及び５はネイティブのＬＴを皮下投与された１０日齢及び２１日齢のブロイラートリにおける２種の試験の結果を示す。皮下接種は、それがマウスにおける致死的攻撃の方法よりは強力ではないとしても強力であることが報告されていることから使用した(Isaka,et al.,1998)。１６羽及び３投与群を用いたが未投与と投与群のトリとの間には明らかな相違点はなかった。数羽が僅かな下痢及び僅かな出血を示したが、組織学的切片では投与群と未投与対照群のトリの間に差はなかった。下痢感受性動物の１つの特徴は、総体重当たりの腸内の水分保持量である。しかしながら、本試験においては、体重当たりの腸の平均重量は１００ｕｇ投与群の数値よりも対照において実際は低値であった。これらの結果に基づけば本方法においてＬＴを投与した場合にはトリにおける強度の病理学的応答はなかった。第２の試験においては、パイロット試験と同じ孵化機から得た８４羽の２１日齢ブロイラートリをネイティブＬＴのより広範な範囲を用いて投与した。パイロット試験においては組織化学的レベル、又は全体的な病理検査及び総トリ重量において試料間で差はなかったため、第２の試験では全体的な病理検査及び全身状態の観察のみを実施した。表５に示すデータは投与群に関わらず、ＬＴ濃度又は観察時期に関わらず、トリの全身状態には病理学的又は全般的な変化はなかったことを示している。投与群試料の一部には一部に出血性病変が観察されたが、それらは対照群においても観察され、即ち、投与とは関係ないとみなされた。パイロット試験において調べたトリ当たりの平均体重は１６２ｇであったのに対し、攻撃試験のトリ当たりの平均体重は６３６ｇであった。従って、両方の試験に関するトリの体重に対するＬＴの質量は０．２ｍｇ／ｋｇ〜１．２ｍｇ／ｋｇの範囲であった。マウスにおいて致死量であると報告された質量の体重に対する比はＣＴ（ＩＮ投与）で１ｍｇ／ｋｇ体重〜ＬＴ（ＩＶ投与）で０．２ｍｇ／ｋｇである。Glenn,et al.,1998,J.Immunol.161:3211-3214及びGill,1983。ヒトにおいては、僅か０．１ｍｇ／ｋｇで数リットルの体液損失を誘発するのに十分である。ＬＴに関する攻撃の許容されている高感度の方法により今回試験した比は、対照と比較して如何なる下痢の徴候も誘発しなかった。
【００６２】
【表７】
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【００６３】
【表８】
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【実施例１３】
【００６４】
鼻内／眼内接種による応答をアジュバントするためのＳＬＴ及びＬＴの使用
本試験は鼻内／眼内の経路により別の抗原をアジュバントするために必要なＬＴの用量を調べるために設計された。本試験においては、標的抗原は米国特許５，３１０，６７８号に記載のニューカッスル病ウィルスの赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）蛋白とした。ネイティブのＨＮ遺伝子を発現する形質転換ＮＴ−１系統（ＣＨＮ１８）を生産する形質転換ベクターとしてｐＣＨＮ１８を用いながら、実施例２に実質的に従ってＮＴ−１細胞を形質転換した。
【００６５】
免疫原は個別に、以下に記載するとおり、形質転換細胞を破砕し、ＳＬＴ、ＨＮ又はゼロ対照を発現するＮＴ−１細胞のエキスを凍結乾燥することにより調製した。濾過細胞約１ｇを緩衝液（ＤＰＢＳ及び１ｍＭＥＤＴＡ）２ｍｌ中に入れ、次に氷上で１５〜２０秒間超音波処理した。超音波処理は交換マイクロチップ付きのＢｒａｎｓｏｎ４５０超音波処理機を用いて、出力コントロール８、デューティーサイクル６０で２０秒間実施した。次に超音波処理物を１０分間１６，０００ｇで遠心分離し、細胞破砕片を除去し、上清を傾瀉した。エキスをガラス製の血清バイアルに分注し、凍結乾燥し、必要時まで２〜７℃で保存した。凍結乾燥した細胞抽出液を植物由来物治療のための接種物として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬＴホロ毒素（５．９２ｍｇ／ｍｌ、ＤＰＢＳ中に懸濁）を陽性対照として使用した。
【００６６】
使用したワクチンの接種は試験の第０日及び１４日に実施した。ＣＨＮ１８の抽出液は第０日に７ｕｇ、第１４日に１８ｕｇを投与した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＬＴは第０日に８ｕｇ、第１４日に２０ｕｇを用いてＣＨＮ１８抽出液と混合し、植物由来熱不安定性毒素（ＳＬＴ１０２）は第０日に０．５ｕｇ、第１４日に１．５ｕｇを投与した。ＬＴ又はＳＬＴを投与した試料は、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０と共にＤＰＢＳ中０．１６５％Ｓｐａｎ８０を含有する２．５％Ｄｒａｋｅｏｌオイルの終濃度中に凍結乾燥抗原調製品を再懸濁することにより調製したより従来型の油中水アジュバントを与えた投与群と比較した。試料はシリンジ２本及び３方向ストップコックを用いて混合し、水と油の混合物中の抗原の懸濁液を得た。
【００６７】
鼻内／眼内接種のために、１０日齢より幼若なトリの各鼻腔及び各眼部には２５ｕｌ、１０日齢より高齢のトリの各鼻腔及び各眼部には５０ｕｌを添加した。血液は第２１日、３５日及び４２日に採取した。第３５日に、不活性化したネイティブのウィルスをトリに皮下接種して攻撃用量を模倣し、模倣攻撃の７日後（第４２日）に血液を採取して血清学的分析に付した。表６に示す結果はＬＴ及びＳＬＴに対する血清学的応答は試験２１日目即ち２回目のワクチン接種の７日後には共に容易に検出できたことを示している。ＥＬＩＳＡによるＬＴの血清学的応答は植物由来ＳＬＴに対するものよりもはるかに高値であったが、感作投薬に使用した用量はＬＴよりもＳＬＴで１０倍低値であった。第３５日及び４２日までに、ＬＴ及びＳＬＴに対する血清学的応答は究めて高くなり、鼻内及び眼内の投与経路による粘膜応答は、０．５ｕｇもの低い感作用量を投与した場合も効果的であることを示している。一方、ＣＨＮ１８トランスジェニックＮＴ１細胞系統由来のＨＮ蛋白に対する応答はＥＬＩＳＡによってもＨＡＩによっても、第２１日において検出可能な力価を示さなかった。しかしながら、ネイティブＮＤＶによる模倣攻撃後７日である第４２日においては、投与群１及び２は共に、他の投与群では観察されなかった有意なＨＡＩ血清学的応答を示した。他の投与群では、油及び水中に乳化したこと以外は投与群１及び２と同様の用量でデリバリーされたＬＴ及びＳＬＴ（投与群７及び８）を用いた。これらの結果は、ＨＮへの記憶応答が模倣攻撃用量におけるネイティブの抗原への曝露後に増幅されたことを示唆している。典型的には、ＨＮに対する血清学的応答は抗原への曝露後７日以内に検出できない。更にまた、ＨＮ抗原単独又は他の混合物と組み合わせたものは、他の投与群の何れにおいても応答を誘導しておらず、即ち、投与群１及び２について示されたＨＮの力価はＨＮ及びＬＴ／ＳＬＴの曝露の結果として現れた。
【００６８】
【表９】
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表７に示す結果はＨＮと組み合わせてＬＴを皮下（ＳＱ）接種することにより得たものである。ワクチン調製品は表６に示すとおりとした。ワクチンは本試験においては試験の第０日及び１４日の２回接種により大腿羽弁部に接種することにより投与した。
【００６９】
不活性化ＮＤＶによる模倣攻撃用量は第３５日に投与した。表７に示す結果によれば、ＬＴへの血清学的応答もまたＳＱ接種物の投与によるものであり、ＨＮ血清学的応答の増強は同時投与時に観察されている。
【００７０】
【表１０】
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ＬＴは卵内接種による応答も刺激した。表８において、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬＴは気嚢を通し羊膜腔内に接種することにより投与した。受精卵をインキュベートの第１８日に透かして観察し、健康な胚のみを識別して接種に付した。注射部位は、卵の気泡上部を直接アルコールで拭いた。穿孔部は卵パンチを用いて穏やかに穿刺し、長さ１1／2インチの２２ゲージ針を穿孔部を通して挿入した。接種物０．３ｍｌまでの量を気嚢膜真下の羊膜腔内に付着させた。次に卵を第１８日〜２１日の間、孵卵機に移した。孵化後１４日にトリにＬＴをブーストし、第２１日に血清学的応答により分析した。血清学的応答は感作用量を予め投与しなかった場合には７日以内の単回の接種では観察されなかった。結果は卵内接種されたＬＴは１８日齢の胚を効果的に感作したことを示している。
【００７１】
【表１１】
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本明細書、従来技術又は単なる日常的実験に基づいて、本明細書に記載し、説明した本発明の特定の実施形態の多くの同等形態を当業者は容易に認識し確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】ＮＴ−１細胞の形質転換のために使用したｐＳＬＴ１０７の地図。左右境界のＴ−ＤＮＡは植物細胞に移行されるべきＤＮＡの範囲を示しており、二重エンハンスＣａｍＶ３５Ｓプロモーターにより駆動され、バレイショｐｉｎ２３’領域により停止される転写によるＬＴ−Ａ−Ｒ７２；二重エンハンスＣａｍＶ３５Ｓプロモーターにより駆動され、ダイズｖｓｐ３’領域により停止される転写によるＬＴ−Ｂ；及びカナマイシン耐性植物の選択用のｎｐｔ２に関わる発現カセットに隣接している。実施例に記載するＮＴ−１細胞を形質転換するために使用されるｐＳＬＴ１０１，ｐＳＬＴ１０２及びｐＳＬＴ１０５はＬＴ−Ａコーディング領域意外は全ての点においてｐＳＬＴ１０７と同一である。ｐＳＬＴ１０２ベクターはＫ６３ＬＴ−Ａ突然変異体をコードしており、ｐＳＬＴ０１５ベクターはＧ１９２ＬＴ−Ａ突然変異体をコードしており、ｐＳＬＴ１０７ベクターはRappouli, et al.,1999.Immunol.Today.20,493-500に記載されているＲ７２ＬＴ−Ａ突然変異体をコードしていた。ｐＳＬＴ１０１ベクターはＥ．ｃｏｌｉ由来ＬＴに生物学的に等価な完全ネイティブのＬＴをコードしていた。
【図１】
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【国際調査報告】
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