(57)【要約】プローブ部分を有する微粒子を含むアレイを、試料中の標的を検出するために用いる。微粒子(104)は、高分子マトリックス(106)中に固定化され、基板(102)の少なくとも一部の上にクラスター化された配列(108)を形成している。クラスター化された配列(108)のプローブに結合することができる標的と会合したマーカーを検出するために、検出方式を行う。
2005505762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレイ製造法であり：
a)i)マトリックス-形成材料、及びii)複数の微粒子を含有する、少なくとも1種のスラリーを調製する工程であり、ここで複数の各微粒子は、微粒子に連結されたプローブを含み、ここでこのプローブは標的に特異的に結合するように立体配置及び配列されている工程；
b)少なくとも1種のスラリーを基板上に配置させ、微粒子の少なくとも1種のクラスター化された配列を形成する工程；並びに、
c) マトリックス-形成材料がマトリックスを形成するようにスラリーを処理する工程であり、ここでこの微粒子は、基板上にクラスター化された配列のマトリックス中に固定化され始める工程を含む、方法。
【請求項２】
マトリックス-形成材料が、ポリマーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリマーが、反応性ポリマーを含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
反応性ポリマーが、少なくとも1個の光反応性基を有する光反応性ポリマーを含んで成り、且つこの光反応性基が、アリールケトン、アリールアジド、アシルアジド、スルホニルアジド、ホスホリルアジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾ酢酸エステル及びケテンからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
反応性ポリマーが、官能基化されたポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ(HEMA)、それらのコポリマー、並びにそれらの組合せからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項3記載の方法。
【請求項６】
反応性ポリマーが、ビニルピロリドン及びN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド(BBA-APMA)；並びに、アクリルアミド及びBBA-APMAからなる光反応性コポリマーの群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項７】
反応性ポリマーが、官能基化された多糖、グリコサミノグリカン、ポリペプチド及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項3記載の方法。
【請求項８】
処理する工程において、微粒子がマトリックス内への捕獲により固定化され始め、ここで微粒子の捕獲は、微粒子とマトリックス形成材料の間のイオン結合又は共有結合の形成に左右されない、請求項1記載の方法。
【請求項９】
処理する工程が、スラリーを電磁エネルギーで照射することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
微粒子の各クラスター化された配列が、独自のプローブを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
配置する工程が、少なくとも1種のスラリーを基板上にスポットすることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
プローブが、核酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
プローブが、ポリペプチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが、抗体又はそれらの断片を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
配置する工程が、スラリーを基板へ、ピンプリンティング又はジェットプリンティングにより塗布することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
a)基板；及び
b)基板上のマトリックス内に固定化された複数の微粒子を含む、微粒子の少なくとも1種のクラスター化された配列、を含むアレイであり、ここで複数の各微粒子が、この微粒子に連結されたプローブを含み、ここでこのプローブが標的に特異的に結合するように立体配置及び配列されるものを備える、アレイ。
【請求項１７】
マトリックス-形成材料がポリマーを含む、請求項16記載のアレイ。
【請求項１８】
ポリマーが、反応性ポリマーを含む、請求項17記載のアレイ。
【請求項１９】
反応性ポリマーが、少なくとも1個の光反応性基を有する光反応性ポリマーを含み、且つ光反応性基が、アリールケトン、アリールアジド、アシルアジド、スルホニルアジド、ホスホリルアジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾ酢酸エステル及びケテンからなる群より選択される、請求項18記載のアレイ。
【請求項２０】
反応性ポリマーが、官能基化されたポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ(HEMA)、それらのコポリマー、並びにそれらの組合せからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項18記載のアレイ。
【請求項２１】
反応性ポリマーが、ビニルピロリドン及びN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド(BBA-APMA)；並びに、アクリルアミド及びBBA-APMAからなる光反応性コポリマーの群より選択される、請求項18記載のアレイ。
【請求項２２】
反応性ポリマーが、官能基化された多糖、グリコサミノグリカン、ポリペプチド及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項18記載のアレイ。
【請求項２３】
微粒子の固定化が、マトリックス内の微粒子の捕獲を含み、ここで微粒子の捕獲は、微粒子とマトリックス形成材料の間のイオン結合又は共有結合の形成に左右されない、請求項16記載のアレイ。
【請求項２４】
微粒子の各クラスター化された配列が、独自のプローブを含む、請求項16記載のアレイ。
【請求項２５】
プローブが、核酸を含む、請求項16記載のアレイ。
【請求項２６】
プローブが、ポリペプチドを含む、請求項16記載のアレイ。
【請求項２７】
ポリペプチドが、抗体又はそれらの断片を含む、請求項26記載のアレイ。
【請求項２８】
試料中の標的を検出する方法であり：
a)i)基板；及び、
ii)基板上のマトリックス中に固定化された複数の微粒子を含む、微粒子の少なくとも1種のクラスター化された配列を含むアレイを提供する工程であり、ここで複数の各微粒子は、この微粒子に連結されたプローブを含み、ここでプローブは、標的に特異的に結合するように立体配置及び配列されている工程；
b)標的を含むことが疑われる試料をアレイへ塗布する工程；
c)試料及びアレイを、標的のプローブへの結合を可能にする条件下で、維持する工程；並びに
d)1)標的に連結され及びクラスター化された配列で会合された標的マーカー、並びに2)クラスター化された配列の位置を検出し、これにより試料中の標的の存在又は量を決定する工程を含む、方法。
【請求項２９】
マトリックス-形成材料が、ポリマーを含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ポリマーが、反応性ポリマーを含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
反応性ポリマーが、少なくとも1個の光反応性基を有する光反応性ポリマーであり、且つ光反応性基が、アリールケトン、アリールアジド、アシルアジド、スルホニルアジド、ホスホリルアジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾ酢酸エステル及びケテンからなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
反応性ポリマーが、官能基化されたポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ(HEMA)、それらのコポリマー、並びにそれらの組合せからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
反応性ポリマーが、ビニルピロリドン及びN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド(BBA-APMA)；並びに、アクリルアミド及びBBA-APMAからなる光反応性コポリマーの群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
反応性ポリマーが、官能基化された多糖、グリコサミノグリカン、ポリペプチド及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
固定化が、マトリックス内の捕獲を含み、ここで微粒子の捕獲は、微粒子とマトリックス形成材料の間のイオン結合又は共有結合の形成に左右されない、請求項28記載の方法。
【請求項３６】
微粒子の各クラスター化された配列が、独自のプローブを含む、請求項28記載の方法。
【請求項３７】
プローブが、核酸を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３８】
プローブが、ポリペプチドを含む、請求項28記載の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドが、抗体又はそれらの断片を含む、請求項38記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年10月4日に、米国国内企業であるSurmodics社の名称で、米国以外の全ての国を指定し、PCT国際特許出願として出願されている。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、試料中に存在することが疑われる標的の検出に使用するためのアレイの技術分野に関する。より詳細に述べると、本発明は、基板上に固定化された微粒子のクラスター化された配列を有するアレイに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
過去数年間にわたり、DNAアレイと称される新規技術が生物学者の間で関心を引いている。この技術は、1個のチップ上で生物のゲノムの一部又は全てをモニタリングすることが確実視されており、その結果研究者らは、同時に数百個又は数千個の遺伝子間の相互作用のより優れた写真を現像することができる。この技術は、バイオチップ、DNAチップ、DNAマイクロアレイ、遺伝子アレイ、及びゲノムチップと称されている。一般に、DNAアレイは、特定の相補的核酸配列の存在又は配列を分析するために、Watson及びCrickにより発見された標準の塩基対則に頼っている。
【０００４】
より最近になって、タンパク質又はペプチドアレイの製造が注目されており、この分野は通常「プロテオミクス」と称される。この方法の一例において、ペプチドライブラリーを、薬物をスクリーニングするためのプローブとして使用することができる。このペプチドは、受容体に曝され、この受容体に結合するそれらのプローブが同定され得る。ある適用において、10,000種よりも多いタンパク質スポットが、ガラス製スライド上にプリンティングされる。このチップを使用し、タンパク質−タンパク質及びタンパク質−薬物相互作用が同定される。(G. MacBeath及びS.L. Schreiber、Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination、Science、189:1760-1763 (2000))。
【０００５】
更に近年になって、複雑な混合物の高処理能及び費用効果の良い分析が要求され、これが小型の高密度アレイ装置の製造に対する技術を推進している。これらのアレイは、インクジェットプリンティング、スクリーンプリンティング、ホトリソグラフィー、及び光蒸着などの常法を用いて製造され、ここでは、検出化学(sensing chemistry)が、センサー表面に直接適用される。典型的には、核酸又はペプチドを直接基板へ付着することによりアレイが製造される。典型的には、労働集約的及びある程度の可変性をもたらす複数の製造工程が必要である。
【０００６】
現在の製造方式を考えると、アレイ表面上のプローブの正確な配置が、試料を検索する前に分かっていなければならない。従ってアレイの製造は、プローブのアレイ表面へのプリンティング又はスポッティングのような技術に頼っており、その結果各プローブのアドレス又は位置は、このアレイを使用する前に分かっている。一旦これらの複合体が検出されたならば、この複合体の位置は、マップ作製されたアレイ表面と比較され、標的の正体が決定される。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
一般に本発明は、基板上に、プローブに連結された微粒子を配置することにより製造されたアレイに関する。これらのアレイを用い、試料中の標的の存在を決定することができる。アレイは、少なくとも1種の複数の微粒子及びマトリックス-形成材料を含有するスラリーの調製、並びにこのスラリーの基板上への配置により形成される。ひとつの態様において、スラリーのマトリックス-形成材料は、光反応性ポリマーである。複数の各微粒子において、微粒子は、特定のプローブに結合されている。ある態様において、プローブは、核酸分子である。別の態様において、プローブはタンパク質分子、例えば、抗体、抗体断片、又は結合対の構成員である。スラリーは、基板上に配置され、その後その中に微粒子が固定化されるマトリックスを形成するために処理され、これにより基板上の望ましい位置に微粒子のクラスター化された配列を形成する。ある態様において、微粒子は、マトリックスにより捕獲され、ここで微粒子の捕獲は主にマトリックスの微粒子に対する物理的拘束に左右され、微粒子とマトリックスの間の共有結合又はイオン結合による相互作用には左右されない。典型的には、アレイは、基板上の異なる位置へのスラリーの配置により作成され、各スラリーは、独自のプローブへ付着された複数の微粒子を含む。試料中の標的の存在を決定するためのアッセイにおいて、標的は、典型的には検出可能なマーカーで標識され、そして試料及びアレイは、検出可能なマーカーで標識された標的のプローブへの特異的結合を可能にする条件下で維持され、これは特定のクラスターの微粒子に結合される。検出工程は、微粒子のクラスター化された配列に会合された検出可能なマーカーで標識された標的の存在を決定するために行われる。
【０００８】
好ましい態様の詳細な説明
本明細書において使用される「プローブ」は、アレイを形成するために基板上に固定化される部分である。典型的には本発明に従い、プローブは微粒子へ結合され、この微粒子は次に、基板上に固定化され、これによりアレイを形成する。プローブは、特定の標的と特異的に相互作用することができる分子、粒子、又は細胞であることができる。
【０００９】
本明細書において使用される「標的」は、試料中に存在することが疑われ且つ特定のプローブと特異的に相互作用することができる、分子、細胞、又は粒子を意味する。
【００１０】
用語「試料」は、その最も広範な意味で使用される。この用語は、標的を含むことが疑われる標本又は培養物を含む。
【００１１】
本明細書において使用される用語「マトリックス」は、本発明の微粒子を取り囲むことができ及び包含している連結した分子(本明細書において「マトリックス-形成材料」と称す)ネットワークの三次元ネットワークを意味する。
【００１２】
本明細書において使用される「連結」は、共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、もしくはVan der Waals結合を含む、少なくとも1種化学結合、又は非化学的相互作用の形成を介した、ある部分の別の部分への直接又は間接の付着を意味する。例えば、化合物「A」の化合物「D」への連結は、直接的であってもよく、そして「A」と「D」の間の共有結合の形成を包含することがあり、又は化合物「A」の化合物「D」への連結は、間接的であってもよく、そして化合物「B」及び「C」の存在を包含することがあり、ここで配位結合が「A」と「B」、及び「C」と「D」の間に存在し、及び共有結合が「B」と「C」の間に存在する。この説明に従い、ふたつの部分は様々な方法で共に連結することができることが理解される。このような連結は、特異的な非-共有のストレプトアビジン又はアビジンのビオチンとの相互作用及びハプテンの抗体との相互作用；疎水性相互作用；磁気的相互作用；極性相互作用、例えばふたつの極性表面間又はオリゴヌクレオチド／ポリエチレングリコール間の「湿潤(wetting)」会合；共有結合の形成、例えばアミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、エーテル結合、炭素-炭素結合、又は他の架橋剤によるもの；並びに、酸-不安定なリンカーを介するものを含むことができるが、これらに限定されるものではない。本明細書において使用される「結合」は、ふたつの部分の、典型的には共有結合又はイオン結合を介した直接の付着を意味する。
【００１３】
本明細書において使用される「クラスター」又は「クラスター化された配列」又は「微粒子のクラスター化された配列」は、基板の表面上の群をなして固定化されている複数の類似の微粒子を意味する。微粒子のクラスター化された配列は、基板上に配置されている高分子マトリックス中の微粒子の捕獲により形成される。アレイは、典型的には微粒子の複数のクラスター化された配列を含み、これらのクラスターは、アレイ上に互いに空間的に分離されている。個別のクラスター化された配列の微粒子は、典型的には同じプローブ部分に連結される。
【００１４】
本明細書において使用される「固定化」は、基板上にクラスター化された配列の微粒子の位置的固定を意味する。
【００１５】
ひとつの態様において、これらの微粒子は、高分子マトリックス中の捕獲により基板上に固定化される。本明細書において使用される「捕獲」、「捕獲された」又は「捕獲する」は、位置的固定が主にポリマー鎖のネットワークによる微粒子の物理的拘束によるものであり、及び微粒子と基板間もしくは微粒子とポリマー間の共有的又はイオン的化学結合の相互作用には左右されないような、基板上の高分子マトリックス内の微粒子の位置的固定を意味する。場合によって微粒子又は物質に連結された微粒子と高分子材料の間に形成された共有結合又はイオン結合が可能であることがあるが、捕獲は主に、微粒子を拘束し、それらをマトリックス内に保持するような、マトリックスの材料により確立された物理的因子によって左右される。
【００１６】
本明細書において使用される「スラリー」は、マトリックス-形成材料及び微粒子を含有する混合物を意味する。
【００１７】
本発明は、微粒子のクラスター化された配列を使用し、試料中の標的を検出する方法を提供する。少なくとも1種の微粒子のクラスター化された配列は、基板上に存在し、これによりアレイを形成し、及び特定のクラスター内の微粒子は、独自のプローブへ連結される。クラスター化された配列の微粒子は、典型的には基板上のマトリックス内に固定化される。基板上の微粒子のクラスター化された配列は、特定のプローブへ連結されている微粒子を、マトリックス形成材料、例えば架橋可能なポリマーに混合し、これらの微粒子を基板上へ、スポット又は同様の手法により配置し、並びにこの材料をマトリックスを形成するように処理し、これにより微粒子を基板上に固定化することにより形成することができる。標的が試料中に存在するならば、これは、標的マーカーへ連結することができ、且つクラスター化された配列内にある微粒子へ連結されたプローブへ特異的に結合することができる。このアレイは、微粒子の複数のクラスター化された配列を提供することができ、各クラスター化された配列の微粒子は、典型的には特定のプローブへ連結され、その結果このアレイは、複数の異なるプローブを含むことができる。一部の態様において、クラスター化された配列の微粒子は、微粒子マーカーに連結され得る。
【００１８】
標的を含むことが疑われる試料は、標的マーカーを標的へ連結するように処理することができる。その後この試料はアレイへ塗布され、その結果標的マーカーで標識された標的が試料中に存在するならば、これはアレイにより提供された特定のクラスター化された配列の微粒子へ連結されたプローブと特異的に相互作用するであろう。その後、検出方式が実行され、結合した標的マーカーで標識された標的が検出され；任意に、微粒子マーカーが存在しクラスター化された配列の微粒子へ連結される場合、これも検出される。微粒子のクラスター化された配列の位置の決定又は微粒子マーカーの検出は、そのプローブの決定を可能にする。
【００１９】
本発明は、微粒子のクラスター化された配列を含有するアレイの調製法、及びアレイそれ自身を企図している。本発明は、微粒子のクラスター化された配列を含むアレイを用いる、標的の検出も企図している。同じく試料中の標的を検出するキットも企図されている。
【００２０】
本発明に従い調製されたアレイは、本明細書においては基板とも称される、固形支持体上に製造される。一般に用語「固形支持体」又は「基板」は、その上に本発明の微粒子が固定化され得るような少なくとも二次元の表面を提供する材料を意味する。固形支持体の組成は、それに微粒子のクラスター化された配列が直接又は間接に固定化され得るような適当な材料の一種であることができる。基板の組成は、典型的には微粒子及び高分子材料を含むクラスターを調製するために使用された材料の組成に応じて、変更することができる。基板表面は、標的結合を妨害せず、及び高量の非特異的結合をもたらさないことが好ましい。基板に適した材料は、生物学的又は非生物学的、有機又は無機の材料を含む。適当な固形基板は、プラスチック、機能性セラミック、樹脂、多糖、機能性シリカ、又はシリカベースの材料、機能性ガラス、機能性金属、フィルム、ゲル、膜、ナイロン、絹、羊毛及び綿花のような天然繊維、並びにポリマーで製造されたものを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
好ましくは、基板は、微粒子のクラスター化された配列を固定化するための一体化された表面を有する。この基板は、「実質的に平ら」であることができ、これは、表面は実質的に平面であり及びほとんど又は全く表面構造(configulation)を有さないか、又は基板は浮きだし部分、表面突起、腐蝕された部分、ウェルなどの表面構造を有することができるかのいずれかを意味する。浮きだし部分は、試料中の標的を検出する工程の間に有用であることができる。基板の表面は、単独の基板により提供されることが好ましい。
【００２２】
任意に、この基板の一部は、化合物により予め処理し、例えば、疎水性又は親水性の異なる領域のような、様々な表面特性を有する領域を開発することができる。「親水性」及び「疎水性」は本明細書において、各々、水を吸引する及び水に反発する組成物を広く説明するために使用される。一般に親水性化合物は、比較的極性があり、及びイオン化可能であることが多い。このような化合物は、通常水分子と強力に結合する。疎水性化合物は、通常比較的非-極性であり及びイオン化されない。「疎水性」は、水への低親和性を有し、水と容易に混合されないもしくは水により湿潤されない、通常水-反発性である材料又は表面を意味する。疎水性及び親水性は、相対用語であり、本明細書において、様々な組成物、液体及び表面が、互いに対して疎水性又は親水性であることができるという意味で使用される。
【００２３】
この基板の寸法は、変更することができ、且つ望ましいアレイの寸法、及び望ましいプローブ多様性の程度のような要因により決定することができる。別の態様において、複数のアレイを、単独の基板上に提供することができ、この場合の基板の寸法は、基板上に提供されたアレイの多様性、及び基板上のアレイのサイズのような要因により影響を受け得る。
【００２４】
ひとつの態様において、基板は、オルガノシラン材料により予備コーティングされ得る。有機ケイ素材料による予備コーティングは、望ましいならば、マトリックス-形成材料と結合を形成することができる基板の表面を提供する上で有用であることができる。この態様において、基板は、微粒子の付着前に、クリーニングされるか、前処理されるか、又はクリーニング及び前処理される。基板(例えば、ソーダ石灰ガラス製顕微鏡用スライド)は、それのアセトン中1％p-トリル(toly)ジメチルクロロシラン(T-シラン)及び1％N-デシルジメチルクロロシラン(D-シラン、United Chemical Technologies社、ブリストル、PA)の混合物中への1分間浸漬により処理されたシランである。風乾後、これらのスライドは、120℃の炉で1時間硬化される。次にスライドは、アセトンで洗浄し、引き続き蒸留水に浸漬される。スライドは更に、炉内において、5〜10分間風乾される。別の前処理又は洗浄工程は、この開示を考慮し明らかであろう。任意に、基板の一部は、化合物により前処理され、例えば、疎水性又は親水性の異なる領域のような、異なる表面特性を有する領域を開発することができる。
【００２５】
別の態様において、基板は、反応性化合物により官能基化され得る。その後マトリックス-形成材料及び微粒子を含有するスラリーを、この反応性化合物を提示している基板上に配置することができる。この基板及びスラリーを処理し、マトリックス-形成材料を基板へ反応性基を介して連結し、更にマトリックス-形成材料からマトリックスを形成することにより微粒子を固定化することができる。
【００２６】
クラスター化された配列の微粒子は、基板上に配置することができるマトリックス-形成材料のスラリー中に再懸濁され得る三次元構造を構成することができる。クラスター化された配列は、あらゆるサイズ又は形状の微粒子、又は異なるサイズ及び形状の微粒子の混合物を含むことができる。典型的にはこれらの微粒子は、球形の形状である。本明細書において使用される「球形」は、球面、回転楕円形、円形、小球の形状などを含む、三次元形状を意味する。好ましい微粒子のサイズは、直径が約100nm〜約100μmの範囲、より好ましくは1〜5μmの範囲である。
【００２７】
本発明に従い、微粒子は、いずれか適当な材料で製造することができる。適当な材料は、例えば、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)などのポリマー；コントロールド多孔質ガラス(CPG)及びシリカ(非孔質ガラス)を含む、ガラス；金、鉄、銀、アルミニウム、ケイ素、銅、酸化第二鉄結晶などの、金属；磁鉄鉱などを含む。有用な微粒子の例は、例えばBangs Laboratories社(フィッシャー、IN)の「Microparticle Detection Guide」に記されている。
【００２８】
一部の態様において、微粒子は、膨潤可能であり、及び例えば蛍光色素のような検出可能な化合物を組込むことができることが好ましい。本明細書において使用される「膨潤可能な」とは、微粒子が、適当な媒質内に配置された場合に膨張し且つより多孔性となり、そして膨潤した状態で化合物又は粒子を組込むことができる能力を意味する。このような膨潤可能な微粒子は、典型的にはポリスチレン又はポリスチレンのコポリマーで構成され、及び典型的には有機溶媒中において膨潤可能である。一部の態様において、微粒子は膨潤することができ、蛍光有機色素を微粒子に組込むことができる。別の態様において、微粒子は、様々な検出可能な材料、例えば磁気材料、又は検出可能な材料の組合せで、含浸することができる。
【００２９】
微粒子は、例えば、Bangs Laboratories社(フィッシャー、IN)、Polysciences社(独国)、Molecular Probes社(ユージーン、OR)、Duke Scientific社(パロアルト、CA)、Seradyn Particle Technology社(インディアナポリス、IN)、及びDynal Biotech社(オスロ、ノルウェー)から、商業的に得ることもできる。
【００３０】
本発明の微粒子は、取り扱いの容易さ、寸法安定性、光学特性、望ましい量のプローブの基板への適切な連結に十分なサイズなどの、1種又は複数の望ましい特性を有することができる。微粒子は、満足できる密度、例えば水もしくはアレイの製造に使用される他の溶媒よりも大きい密度、又は微粒子がプローブもしくは検出可能なマーカーへ連結することを可能にする特性のような、追加の望ましい属性を提供するように選択することができる。
【００３１】
これらの微粒子は、1種又は複数のプローブを微粒子へ連結するための反応性基を提供するように修飾することができる。別の態様において、反応性基は、これらの微粒子に検出可能なマーカーの微粒子への連結、微粒子の互いの連結、微粒子の基板上に配置されているマトリックスへの連結、微粒子の基板への連結、又はこれらのいずれかの組合せを可能にするように提供することができる。適当な反応性基は、微粒子に付着される部分の性質に応じて選択することができる。適当な反応性基の例は、カルボン酸、スルホン酸、リン酸、ホスホン酸、アルデヒド基、アミン基、チオール基、チオール-反応性基、エポキシド基などを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、カルボン酸エステルで官能基化された微粒子は、水溶性カルボジイミド試薬を使用する、タンパク質及び他のアミン-含有分子の共有結合に使用することができる。アルデヒドで官能基化された微粒子は、緩やかな条件下での、微粒子のタンパク質及び他のアミンへの連結に使用することができる。アミンで官能基化された微粒子は、微粒子の、様々なアミン-反応性部分、例えばハプテン及び薬物のスクシンイミジルエステル及びイソチオシアネート、又はタンパク質のカルボン酸などに連結するために使用することができる。一部の適用において、硫酸エステルで官能基化された微粒子を用い、ウシ血清アルブミン(BSA)、IgG、アビジン、ストレプトアビジンなどのタンパク質を、微粒子上へ受動的に吸着するために使用することができる。別の態様において、反応性基は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインAのような結合パートナー上に存在することができる。これら及び他の修飾された微粒子は、Molecular Probes社(ユージーン、OR)を含む、多くの商業的供給業者から市販されている。
【００３２】
本発明の部分を連結するための別の方法は、Chumuraらにより説明されたような(Proc. Natl. Acad. Sci.、98:8480 (2001))、本明細書においては「ケミ-アフィニティ」相互作用と称される、化学的及び親和性の相互作用の組合せによる。結合対は、この対の親和性結合部位の近傍で、共有結合を形成するように反応する基により、結合対の各構成員を官能基化することにより、高い結合特異性及び無視できる解離定数を有するように操作することができる。例えば、官能基化された各構成員の置換基は、例えばマイケル付加又は求核置換により反応することができ、例えばチオエーテル結合のような共有結合を形成する。抗原：抗-抗原抗体の対、相補的核酸、及び炭水化物：レクチンの対は、官能基化され、ケミ-アフィニティ結合対を形成することができる結合対の例である。
【００３３】
微粒子は、プローブ、検出可能なマーカー、又は他の種に、架橋剤を介して連結することもできる。商業的に入手可能な架橋剤は、例えば、Pierce Chemical社(ロックフォード、IL)から入手することができる。有用な架橋剤は、ホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋剤を含む。例えばタンパク質で被覆された微粒子に対し使用することができるふたつの架橋剤の限定的でない例は、スべリン酸ジ-スクシンイミジル及び1,4-ビスマレイミドブタンである。
【００３４】
一部の態様において、微粒子は、結合した標的の検出を可能にするか又は検出工程の感度を増大する化合物又は部分へ連結することもできる。例えば、クラスター化された配列の微粒子は、フルオレセイン及びプローブの両方に連結することができる。これらの微粒子上のプローブは、Alexa Fluor(商標)488-標識された(Molecular Probes社、ユージーン、OR)標的に特異的に結合することができる。Alexa Fluor(商標)488-標識された標的のプローブへの結合時に、同じ微粒子上のフルオレセイン及びAlexa Fluor(商標)488分子の両方の存在が、クラスター内の微粒子からの蛍光放出を相乗的に増大することができる。別の例において、チラミドシグナル増幅を、チロシン残基の微粒子への連結、標的のホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素(HRP)への標識もしくは連結、HPR-連結された標的のプローブへ結合、及び基板上への蛍光チラミド誘導体の配置により、微粒子のクラスター化された配列内で行うことができ、これによりクラスター内の微粒子上の活性化されたチラミド誘導体の配置を生じる。これらの方法は、アッセイを行う場合のアレイの感度を大きく増加することができる。
【００３５】
本発明のアレイは、基板、基板上のマトリックス内に固定化された微粒子の少なくとも1種のクラスター、及びクラスター化された配列の微粒子に連結されたプローブを含む。本明細書に説明されたように、プローブは、例えば核酸又はペプチドのような特定の標的により認識することができる部分を含む。プローブは、特定の標的と特異的に相互作用することができる分子、粒子、又は細胞であることができる。プローブは、天然又は人造の分子を含むことができ、かつこれはその変更されない状態又は他の種との凝集塊として使用することができる。典型的には、プローブと標的の特異的相互作用は、例えば抗体と抗原の間のような、プローブと標的の間の親和性相互作用を確立するような化学結合を基にするか、又は例えばオリゴヌクレオチドとその相補的オリゴヌクレオチドの間のような、繰返しの水素結合パターンの配置を基にした特異的相互作用を基にしている。ひとつの態様において、このプローブは、核酸のような生物学的分子を含む。しかしプローブは、標的へ特異的に結合するいずれか他の分子であることができる。プローブは、免疫グロブリンのようなタンパク質、レクチンのような細胞受容体、又はそれらの断片(例えば、Fab断片、Fab'断片など)であることができる。別の態様において、プローブは、細胞又はウイルス粒子のような粒子を含み、標的は、これらの細胞又は粒子と相互作用する分子、細胞、又は他の粒子であることができる。この態様において、細胞又は粒子プローブは、標的との複数の特異的相互作用を提示することができる。本明細書に示されたように、当業者はアレイ製造のために、望ましいプローブ、又は望ましいプローブのセットを選択することができる。
【００３６】
ひとつの態様において、このプローブは核酸であり、アレイは微粒子の複数のクラスター化された配列を含み、各個別の配置の微粒子は、独自の核酸へ連結されている。本明細書において使用される用語「核酸」は、プリン及びピリミジン由来の塩基を有するポリヌクレオチド化合物の群のいずれかを意味する。用語「核酸」を用い、個別の核酸塩基又はオリゴヌクレオチドを意味することができる。これらは例えば、典型的には約500個未満のヌクレオチド長、より典型的には約20〜100個のヌクレオチド長が互いに共有的に連結されている、少なくとも2個のヌクレオチド短鎖の核酸配列を含むことができる。用語「核酸」は、cDNA又はPCR産物において認められるもののような長い配列、例えば、数百又は数千個のヌクレオチド長の配列の核酸も意味することができる。本発明の核酸配列の正確なサイズは、多くの要因によって決定し、これは次に核酸の最終的機能又は用途により左右される。
【００３７】
核酸は、固相支持体核酸合成、DNA複製、逆転写などの、当該技術分野において現在利用可能な技術を用いて調製することができる。あるいは核酸は、天然の給源から単離することができる。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、又は核タンパク質のような、いずれか適当な形であることができる。核酸は一般に、ホスホジエステル結合を含むが、場合によってはヌクレオチドは、類似の骨格、例えばペプチド核酸(PNA)を有することができる。核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)(相補的DNA(cDNA)など)、リボ核酸(RNA)、及びペプチド核酸(PNA)を含む。核酸は、ゲノム及びcDNAの両方のDNA、RNA又は両方を含むことができ、ここで核酸は、デオキシリボ-及びリボ-ヌクレオチドの組合せを含む。更に核酸は、ウラシル、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、更には他の塩基、例えばイノシン、キサンテン、ヒポキサンチン及び他の標準でないもしくは人工の塩基の組合せを含むことができる。PNAは、未変性の糖・リン酸DNA骨格がポリペプチドで置き換えられているDNAミミックである。
【００３８】
本明細書で使用される用語「相補的」又は「相補性」は、核酸(すなわち、ヌクレオチドの配列、例えばプローブ核酸又は標的核酸など)に関して使用される場合、標準のWatson Crick塩基対を形成することができる、対のある核酸配列を意味する。例えば、配列「5'-T-G-A-3'」に関して、相補的配列は「3'-A-C-T-5'」である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが、塩基対形成則に合致しているように「部分的」であっても良い。あるいは、核酸間の「完全な」又は「全体的」相補性であることができる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に影響を及ぼす。
【００３９】
用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対形成に関して使用される。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション強度、すなわち核酸間の会合の強度は、核酸間の相補性の程度、関連する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度(Tm)、及び核酸内のG:CのA:Tに対する比のような要因により影響を受ける。
【００４０】
従ってアレイは、複数の核酸プローブを提供することができ、各核酸プローブは、異なる核酸配列を有することで定義され、及び微粒子の個別のクラスター内のアレイ上で区別される。微粒子に連結された核酸プローブは、あらゆる長さであることができるが、好ましくは少なくとも8個のヌクレオチド長である。より好ましくは、核酸プローブは、8〜200個のヌクレオチド長である。最も好ましくは、核酸プローブは、12〜50個のヌクレオチド長である。
【００４１】
別の態様において、プローブは、タンパク質又はタンパク質複合体であることができ、及びアレイは、微粒子の複数のクラスター化された配列を含み、この各個別のクラスター化された配列の微粒子は、独自のタンパク質プローブ、又はプローブとして利用されるタンパク質複合体に連結されている。各タンパク質、又はタンパク質複合体は、試料中に存在し得る標的に対する親和性を有する。タンパク質プローブは、例えば、試料中に存在する場合には、標的又は標的の一部を特異的に認識する抗体、又は抗体の一部、例えば、Fab断片もしくはFab'断片であることができる。従ってアレイは、異なる抗体に連結された複数の微粒子を含むことができ、各抗体は、試料中に存在することができる特定の標的に対し異なる親和性を伴う。
【００４２】
別の態様において、プローブは、小分子、例えばタンパク質の一部、酵素結合ポケット又は活性部位のような部分に特異的に結合する分子であることができる。小分子プローブは、例えば、酵素インヒビター、酵素補因子、酵素基質を含むことができる。
【００４３】
本明細書に説明されたように、特定の微粒子のクラスター化された配列は、特異的プローブが割当てられ、その結果このクラスター化された配列は、微粒子に連結されたプローブの種類について特異的であろう。典型的には、特定のクラスターの各微粒子は、複数の同一プローブ分子と連結されている。単独の微粒子に同じプローブ分子の複数のコピーを提供し、そして1個のクラスターにつき複数の微粒子を提供することにより、アレイの感度が大きく増大される。これは、その後の標的のプローブへの結合で、より高いシグナル対ノイズ比を達成することができるので有用である。
【００４４】
クラスターの微粒子上に提供されたプローブ分子の数は、望ましい作用が実現するように、使用者が調節することができる。プローブ分子の密度、例えば微粒子に連結された核酸又はタンパク質プローブ分子の数は、直径1μmの微粒子1個につき、1〜260,000個のプローブ分子の範囲であることができる。典型的には、40,000〜50,000個のプローブ分子が、直径1μmの微粒子1個につき固定化される。しかし微粒子の給源及び調製物に応じて、微粒子に連結されたプローブ分子の量は変動してもよい。例えば、プローブがストレプトアビジンなどの連結部分を介して微粒子に連結されている場合、ストレプトアビジンで被覆された微粒子の市販の調製品におけるストレプトアビジン量は、微粒子に連結することができるプローブの量の要因となり得る。
【００４５】
本発明のプローブは、いずれか適当な方法で微粒子へ連結することができる。例えば微粒子は、前述のように、表面上に反応性基を伴い提供され、これはプローブ分子へ連結するために使用することができる。選択された反応性基及び望ましいプローブに応じて、プローブは微粒子への付着前に、修飾されてもされなくとも良い。
【００４６】
一部の態様において、プローブは、プローブを微粒子へ連結する前に修飾することができる。例えば、核酸は、結合対の構成員のひとつで誘導体化することができ、そして微粒子は、その結合対の他方の構成員で誘導体化することができる。適当な結合対は、アビジン：ビオチン、ストレプトアビジン：ビオチン、抗体：ハプテン、例えば抗-ジゴキシゲニンAb：ジゴキシゲニン又は抗-トリニトロフェニルAb：トリニトロフェニルを含むが、これらに限定されるものではない。例えば核酸プローブは、ビオチン化されたヌクレオチドの酵素による組込みを用いるか、又は当該技術分野において公知の方法を用いビオチンを核酸へ架橋することにより、ビオチン化することができる。次にビオチン化された核酸プローブは、微粒子の表面上に提供されたストレプトアビジンと連結される。
【００４７】
核酸は、微粒子への連結ができるように様々な方法で修飾することができる。例えば核酸を、3'又は5'末端に反応性部分を提供するように、修飾することができる。あるいは、核酸は、修飾された塩基により合成することができる。加えて、3'及び5'位置以外でのヌクレオチドの糖部分の修飾は、通常の方法により可能である。同じく核酸塩基は、例えばN7-又はN9-デアザプリンヌクレオシドを使用することにより、又は例えばF. Eckstein編集の「Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach」、IRL Press社(1991)に説明されているような、リンカーアームによるdTのC-5修飾により、修飾することができる。あるいは、ホスホロアミデートDNAのような骨格が修飾された核酸を使用し、反応性基を修飾されたリン酸骨格により提供された窒素中心へ結合することができる。
【００４８】
好ましくは、プローブ、例えば核酸又は抗体の修飾は、プローブのその標的へ特異的に結合する能力を実質的に損なわない。核酸プローブの場合、修飾は、標的核酸へのWatson-Crick塩基対形成に寄与する核酸の官能性の実質的修飾を避けることが好ましく、及び抗体の場合は、修飾は、抗体の相補性決定部(CDR)の実質的修飾を避けることが好ましい。
【００４９】
様々な試薬が、核酸修飾に使用するために利用可能である。一部の態様において、反応性基を有するヌクレオチドを、酵素的技術を用い、合成することができ及び核酸へ組込むことができる。例えば核酸をビオチン、フルオレセイン及びジゴキシゲニン(DIG)で標識するために使用することができる様々な試薬を利用することができる。核酸の3'末端に単独又は複数の反応性基のいずれかを提供するために、核酸は、末端トランスフェラーゼを用い、反応性ジデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドにより標識することができる。例えばDNAのDIG-11-UTPによる標識をランダムにプライミングするためのジゴキシゲニン-標識キット(DIG-High Prime；Boehringer-Mannheim社)が、ビオチン-標識キット(Biotin High Prime)及びフルオレセイン-標識キット(Fluorescein-High-Prime)同様、市販されている。DNAは、クレノウ酵素を用い、反応性デオキシリボヌクレオチドとランダム-プライミングすることもできる。
【００５０】
DNAポリメラーゼI酵素も、反応性ヌクレオチドの核酸への組込みに使用することができる。デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の混合物中に反応性デオキシリボヌクレオチドを含むことにより、得られる重合された産物は、1種又は複数の反応性基をその長さに沿って含むであろう。加えてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)時に、反応性デオキシリボヌクレオチドは、増幅産物を標識するためにdNTPの混合物中に含むことができる。例えば、SP6又はT7のようなRNAポリメラーゼ、及び標準の転写プロトコールの使用により、リボヌクレオチドをRNAへ組込むことも可能である。
【００５１】
あるいは、例えばタンパク質のようなポリペプチドを、微粒子上に受動的に吸着し、その後微粒子と任意に架橋することができる。ポリペプチドは、ポリペプチドの疎水性部分と微粒子の最大の相互作用を促進する条件下で、微粒子へ吸着されることが好ましい。
【００５２】
典型的には、微粒子を含有するスラリーの基板上への配置の前に、プローブが微粒子に連結される。プローブは、リン酸緩衝生理食塩水などの適当な液体媒質中で、微粒子へ連結することができる。微粒子の配置前の、プローブの微粒子への連結は、アレイ調製における恩恵を提供することができる。例えば平らな基板へのプローブ連結と比べ、基板の表面積当りのより高密度のプローブを、プローブの微粒子への最初の連結、及びその後の微粒子の表面上への配置により実現することができる。同じく溶液中でのプローブの微粒子への連結は、プローブの「通常の」平らな基板への連結よりも、一般により効率的であり、結果として連結工程時に少ないプローブの喪失をもたらす。加えて、溶液中でのプローブの微粒子への連結は、一般に連結プロセス時により多くの可変性をもたらす。例えば攪拌のような、連結溶液のかき混ぜを必要とする連結手法は、攪拌された溶液中の微粒子を用いて容易に実現することができる。加えて、1個の微粒子当りの連結されたプローブ量の決定は、プローブへの連結後の微粒子部分に対し、例えば免疫蛍光フローサイトメトリー又はBCAアッセイのようなタンパク質アッセイを行うことにより、容易に実現することができる。これは、アレイ調製及びアッセイ分析においてより大きい精度を提供することができる。一旦微粒子が望ましい量及び型のプローブと連結されたならば、これらのプローブ-連結された微粒子は、次に適当なマトリックス-形成材料を含有するスラリー中に含まれ得る。
【００５３】
ひとつの態様において、微粒子のクラスター化された配列は、マトリックス内の基板上に固定化される。本明細書において使用される「固定化」は、クラスター化された配列の微粒子が、基板の表面にあるマトリックス内に位置的に固定化され始めるプロセスを意味する。典型的には、固定化は、スラリーを作成するための微粒子のマトリックス-形成材料との混合、スラリーの基板上への配置、及びその後のスラリーがマトリックスを形成するためのスラリーの処理により実行される。
【００５４】
好ましい態様において、微粒子は、本明細書に説明されたような、高分子マトリックス中の捕獲により、基板上に固定化される。捕獲された微粒子の例を図1に示し、ここで高分子材料106が、基板102上に配置され、及び微粒子104を高分子材料106内に捕獲し、これにより微粒子のクラスター化された配列108を形成している。
【００５５】
この高分子マトリックスは、微粒子の捕獲を可能にする様々な材料で構成することができる。高分子マトリックスにとって好ましい材料は、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、及びポリ(HEMA)を含む合成ポリマー、それらのコポリマー、又はポリマー及びコポリマーの組合せであることができるが、これらに限定されるものではない。天然のポリマーも使用することができ、これは多糖、例えばポリデキストラン、グリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸、並びにポリペプチド、例えばアルブミン及びアビジンのような可溶性タンパク質、並びにこれらの天然のポリマーの組合せを含む。天然及び合成の化合物の組合せも使用することができる。説明されたようなポリマー及びコポリマーは、例えば、熱反応性基又は光反応性基のような反応性基で誘導体化することができる。
【００５６】
代わりの態様において、個別に架橋する化合物、例えば光反応性又は熱で活性化された架橋剤を、マトリックス形成材料に添加することができ、そしてマトリックスを形成するように処理することができる。架橋剤のような化合物の添加は、使用条件に対してより耐久性のあるマトリックスを製造するために利用することができ、同じくより小さい微粒子を捕獲することが可能なより小さい孔径のマトリックスを作成することもできる。
【００５７】
この高分子マトリックスは、典型的には、ポリマーが基板に結合し及びポリマーを架橋するための外部刺激を提供することにより形成される。ひとつの態様において、微粒子及びポリマーを含有するスラリーは、基板上に配置され、その後このポリマーが、例えばこのポリマーにより提供された反応性基の活性化により、ポリマーを架橋するように処理される。
【００５８】
一部の態様において、ポリマーに提供された反応性基は、光反応性基であることができ、そしてこの光反応性ポリマーは、照射により架橋することができる。微粒子は、ポリマーの架橋により形成される高分子マトリックスに捕獲され始める。これらの光反応性基は、光反応性基の活性化時に、ポリマーを、基板表面に結合するためにも利用することができる。異なる濃度のポリマーが、スラリー中に存在することができるが、一般にその濃度は、微粒子の捕獲が可能になるのに十分大きくなければならない。このポリマーの濃度も、使用される微粒子のサイズによって左右される。例えば、微粒子を高分子マトリックス内に安定して捕獲するためには、ポリマーの濃度は、1.0μmの微粒子について少なくとも0.625mg/mLである。
【００５９】
この態様に従い、光反応性基を、ポリマー上に提供することができる。本明細書において使用される「光反応性ポリマー」は、1個又は複数の「光反応性基」を含むことができる。「光反応性基」は、例えばナイトレン、カルベン及び励起されたケトン状態などの活性種を、隣接する標的化された化学構造と共有結合させるように、活性種を発生させるための照射のような、特異的に適用された外部エネルギー源に反応する1個又は複数の反応性部分を含む。このような光反応性基の例は、米国特許第5,002,582号(Guireら、本発明の譲受人により譲渡されている)に開示されており、その開示は全体が本明細書に組入れられている。光反応性基は、電磁スペクトルの様々な部分に、典型的にはスペクトルの紫外、可視又は赤外部分に反応するように選択することができる。「照射」は、表面への電磁照射の適用を意味する。
【００６０】
これらの光反応性基は、ポリマーのあらゆる位置に位置することができる。比較的小さい微粒子が固定化される場合は、ポリマー上に存在する光反応性基の数が増加することが好ましい。
【００６１】
光反応性アリールケトンが、光反応性ポリマー上の好ましい光反応性基であり、例えばアセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン、及びアントロン-様複素環(すなわち、アントロンの複素環式アナログ、例えば10-位にN、O又はSを有するもの)、又はそれらの置換された(例えば、環が置換された)誘導体であることができる。好ましいアリールケトンの例は、アントロンのヘテロ環式誘導体であり、これはアクリドン、キサントン及びチオキサトン、並びにそれらの環が置換された誘導体を含む。特に好ましいのは、チオキサントン、及び約360nmより大きい励起波長を有する、その誘導体である。
【００６２】
アジドも、この光反応性ポリマー上の適当な光反応性基の適当なクラスであり、アリールアジド(C6R5N3)、例えばフェニルアジド及び特に4-フルオロ-3-ニトロフェニルアジド、アシルアジド(-CO-N3)、例えばギ酸エチルアジド、ギ酸フェニルアジド、スルホニルアジド(-SO2-N3)、例えばベンゼンスルホニルアジド、並びにホスホリルアジド(RO)2PON3、例えばジフェニルホスホリルアジド及びジエチルホスホリルアジドを含む。
【００６３】
ジアゾ化合物は、光反応性ポリマー上の光反応性基の別の適当なクラスを構成し、これはジアゾアルカン(-CHN2)、例えばジアゾメタン及びジフェニルジアゾメタン、ジアゾケトン(-CO-CHN2)、例えばジアゾアセトフェノン及び1-トリフルオロメチル-1-ジアゾ-2-ペンタノン、ジアゾ酢酸エステル(-OCO-CHN2)、例えばt-ブチルジアゾ酢酸エステル及びフェニルジアゾ酢酸エステル、並びにβ-ケト-α-ジアゾ酢酸エステル(-CO-CN2-CO-O-)、例えば3-トリフルオロメチル-3-フェニルジアジリン、並びにケテン(-CH=C=O)、例えばケテン及びジフェニルケテンを含む。
【００６４】
光反応性基の例を以下に示す。
【表１】
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【００６５】
光反応性ポリマーは、一部の態様において、光反応性コポリマーを含む。このポリマー又はコポリマーは、例えばポリアクリルアミド骨格を有するか、又はポリエチレンオキシド-ベースのポリマーもしくはコポリマーであることができる。光反応性ポリマーの一例は、ビニルピロリドン及びN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド(BBA-APMA)のコポリマーを含み；別の例は、アクリルアミド及びBBA-APMAのコポリマーである。
【００６６】
光反応性ポリマーの光反応性基は、基板と光反応性ポリマーの間の共有結合の形成を可能にし、これによりこのポリマーは基板の表面に結合することができる。光反応性ポリマーの光反応性基は、隣接ポリマー鎖を共に架橋し、微粒子がその中に捕獲されるマトリックスとして利用する共有的に架橋されたポリマー鎖のネットワークの形成を可能にするために利用することもできる。一部の態様において、非-光反応性架橋剤を用い、架橋されたポリマー鎖の形成を促進することができる。例えばビス-アクリルアミドのような架橋剤の使用は、ポリマー鎖上に存在する光反応性基の位置及び数によって決まる。
【００６７】
この高分子マトリックスは、好ましくは本発明の微粒子を捕獲することを可能にする孔径を有する様々な材料で構成することができる。このマトリックスは、試料中の標的の検出に関連する工程時に、微粒子が多孔質材料から逃れないようにすることが好ましい。例えば、平均直径2.5μmの微粒子を捕獲する場合、孔径が50nm〜2.5μmの範囲、より好ましくは100nm〜1μmの範囲を有するものが有用である。
【００６８】
別の態様において、微粒子の固定化は、微粒子の高分子マトリックスへの及び高分子マトリックスの基板への化学結合により行うことができる。様々な結合を、微粒子とマトリックス材料の間及びマトリックス材料と基板の間に形成することができ、これは微粒子の固定化を可能にする。これらの結合は、例えば、イオン結合、共有結合、配位結合、水素結合又はVan der Waals結合を含む。この態様において、共有結合が形成されることが好ましい。
【００６９】
本発明に従い、アレイは、基板を提供し、マトリックス-形成材料及びプローブ-連結された微粒子を含有するスラリーを調製し、微粒子のクラスター化された配列を形成する方法でスラリーを基板上に配置し、及びスラリーをマトリックスを形成するように処理し、これにより微粒子をマトリックス内に固定化することにより製造される。
【００７０】
ひとつの態様において、マトリックス-形成材料及びプローブ連結された微粒子を含有するスラリーは、基板の表面にプリントされ、アレイを形成する。この態様に従い、プリンティング装置は、スラリーを基板表面上に物理的にスポットし、そしてこれはBioRobotics社(MicroGridアレイ作成ロボット、コンバートン、ケンブリッジ、英国)及びPackard Instrument社(BioChipアレイヤー、メリデン、CT)を含む様々な供給業者から入手可能である。あるいは、プローブは、圧電式ポンプを利用することにより、微粒子にジェットプリントを適用することができる。BioChip Arrayer (Packard BioChip Technologies社)を用い、スラリーを基板のスポット上にプリントすることができる。
【００７１】
プローブの微粒子への塗布にプリンティング又はスポット技術が使用される場合、典型的にはプローブ分子を含有する溶液のおよそ0.5〜1.0nLの容量が、各微粒子に塗布される。容量範囲1pL〜5μLが好ましい。接触プリンティングが使用される場合、基板に塗布される微粒子を含有するスラリー容量は、例えば、アレイ内で使用される微粒子のサイズ、基板上に提供されるプローブの望ましい量、利用されるプリンティングピンの種類、基板の表面エネルギー、例えば溶媒中のプローブ分子のような、微粒子含有するスラリー溶液の表面張力などの要因により左右される。インクジェットプリンティング技術が使用される場合、基板の特徴は、典型的には塗布されるプローブ溶液を含有する溶液の容量を決定しないであろう。典型的には、圧電式プリンティングは、約10〜100pLのスラリーの塗布に関連するであろう。
【００７２】
微粒子のクラスター化された配列は、基板表面の少なくとも一部を覆うことができる。微粒子のクラスター化された配列は、基板表面上の様々な位置にパターン化することができる。各微粒子のクラスター化された配列は、典型的には独自のプローブへ連結され、その結果基板表面上のプローブの位置は、基板上のクラスターの位置又はパターンにより決定される。各クラスターの高分子マトリックスの厚さは変更することができ、そして高分子マトリックス内に捕獲された微粒子のサイズによって決まり得る。好ましくは、基板上の高分子マトリックスの厚さは、基板上に配置されている最大微粒子の直径よりも大きい。
【００７３】
標的は、先に例証された相互作用を基に、特定のプローブと特異的に相互作用することができる、試料中に存在することが疑われる分子、細胞、又は粒子である。標的は、本明細書に説明した方法に従い検出及び／又は定量することができ、及びこれを実現するために「標的マーカー」に連結することができる。標的は、天然の又は人造の分子を含み、及びこれはその変更されない状態で又は他の種との凝集塊として使用することができる。標的の例は、抗体、核酸、受容体、ホルモン、薬物、代謝産物、補因子、ペプチド、酵素、ウイルス粒子、細胞などを含む。ひとつの態様において、標的は、試料内で検出されるべき核酸を含む。プローブ及び標的は、典型的には特異的結合対の構成員であり、ここでこの対の構成員は、互いに結合するが、他の非特異的物質にはほとんど又は全く結合しないことが分かっている。
【００７４】
ひとつの態様において、標的を含有することが疑われる試料は、標的を標的マーカーで標識するように処理される。本明細書において使用される「標的マーカー」は、標的を可視化するために使用される検出部分を意味する。本発明において企図されるように、標的マーカーは、当該技術分野において公知の標準技術を用い検出可能である部分を含む。適当なマーカーの例は、発蛍光団、蛍りん光体、及び放射性同位元素を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
検出されるべき標的がRNAを含む場合、RNA標的は、例えばT7、T3又はSP6 RNAポリメラーゼのようなRNAポリメラーゼを使用し標識されたRNA試料を作成するための、in vitroランオフ転写のような分子生物学的技術を用いて標識することができる。RNAを標識するキットは、例えば、Ambion社(オースチン、TX)のような様々な供給業者から入手できる。この技術は、例えば、RNAポリメラーゼ転写のための適当なプロモーターと共にベクターにクローニングされるcDNAライブラリーからの、標識されたRNAの作成において、特に有用である。例えば、ニックトランスレーション、PCR増幅、ランダムプライミング、又はプライマー伸張のような、標識されたDNAを作成する技術も使用することができる。これらの技術は、例えば、cDNAライブラリー又はゲノムDNAライブラリーから標識されたDNAを作成するために有用であることができる。標識物として使用するための修飾されたDNAヌクレオチドは、逆転写酵素反応から作成することもできる。例えば、ポリA-RNA試料のようなRNA試料は、標識されたcDNAを作成するための、逆転写酵素、ポリTオリゴヌクレオチドプライマー、及び修飾されたヌクレオチドを含む反応における鋳型として使用することができる。DNAを標識する技術は、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubelら編集、1990年、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience: John Wiley社、ニューヨーク)のような、様々な技術文献において認めることができる。
【００７６】
RNA及びDNA標的は、修飾されたヌクレオチドを用い標識することができ、DNA又はRNAの検出を可能にするためには、例えば、フルオレセイン-5[6]-カルボキシアミドカプロイル-[5-(3-アミノアリル)ウリジン-5'-三リン酸(Sigma社、セントルイス、MO)のような発蛍光団-連結されたヌクレオチド、(N6-[N-(ビオチニル-ε-アミノカプロイル)-6-アミノヘキシルカルバモイルメチル]アデノシン-5'-三リン酸)のようなビオチン-連結されたヌクレオチド、又は例えば、5-(3-アミノアリル)ウリジン5'-三リン酸(Sigma社、セントルイス、MO)のような他の修飾されたヌクレオチドである。二次的発蛍光団に連結された試薬、例えばストレプトアビジン-Cy3(Caltag社、バーリンガム、CA)を、修飾された核酸の間接的検出に使用することができる。放射性ヌクレオチド、例えば32P-、33P-、及び35S-標識されたリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドは、試料中に存在する標的DNA又はRNAに組込むことができる。これらの修飾されたヌクレオチドは、例えばポリヌクレオチドキナーゼ又は末端トランスフェラーゼのような酵素による5'又は3'末端-標識によるなど、別法で試料核酸を標識するために使用することもできる。任意に、修飾されたヌクレオチドを核酸試料へ連結するキット及び器具を、例えば、CALBIOCHEM社(サンディエゴ、CA)からのように、商業的に入手することができる。標識された標的は、ゲル濾過又は精製、スピンカラム、又は選択的沈殿などの方法により、任意に精製することができる。
【００７７】
別の態様において、試料は、タンパク質標的を含有することが疑われた複数のタンパク質を含む。このタンパク質試料は、生検標本のような組織試料、又は例えば血液もしくは骨髄のような、細胞を含有する液体試料、又は例えば血漿、汗、唾液もしくは尿のような他の体液から得ることができる。タンパク質試料は、例えば、沈殿、濾過、又は透析などの、様々な技術により、体液から回収することができる。組織又は体液に関する、細胞からのタンパク質試料を、任意に音波処理又はホモジネーションのような方法を使用し、界面活性剤中での細胞の溶解又は可溶化により調製することができる。例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、Triton X-100、デオキシコール酸ナトリウム及びCHAPSのような、イオン系又は非イオン系界面活性剤を使用することができる。細胞は、尿素及びグアニジン塩のようなカオトロピック試薬の存在下で破壊することもできる。例えば、Tris又はHEPESのような緩衝液、及び例えばKCl又はNaClなどの塩類のような、その他の試薬を、界面活性剤又はカオトロピック試薬に添加することもできる。タンパク質試料を安定化する他の化合物、例えば、PMSF、ペプスタチン又はEDTAなどのプロテアーゼインヒビターを、利用することができる。しかし、様々な方法及び緩衝剤組成物を、タンパク質抽出のための細胞の溶解又は破壊に利用することができ、及びこれらは当該技術分野において一般に公知である。この情報は、例えば「Current Protocols in Protein Science」(Coliganら編集、1996、John Wiley & Sons社、ニューヨーク、NY)のような、様々な文献において認めることができる。
【００７８】
タンパク質試料は、タンパク質標的の検出を可能にしかつタンパク質標的の微粒子に連結されたプローブとの相互作用する能力を維持する方法で、標識されることが好ましい。発蛍光団の、タンパク質標的上のアミノ酸残基との連結を可能にする試薬が、利用可能である。アミン-反応性基、例えばスルホスクシンイミジルエステルを含むスクシンイミジルエステル、イソチオシアナート及びスルホニルクロリド又はジクロロトリアジン、ハロゲン化アリール及びアシルアジドが、発蛍光団プローブとして利用可能であり、並びにタンパク質標的の標識に使用することができる。様々なこれらのアミン-反応性発蛍光団プローブは市販されており、例えばAlexa F1uor(商標)350カルボン酸、スクシンイミジルエステル；4,4-ジフルオロ-5-(2-チエニル)-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸、スクシンイミジルエステル(BODIPY(商標)558/568、SE)；並びに、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル(6-JOE、SE)(Molecular Probes社、ユージーン、OR)がある。別の状況においては、例えば、N,N'-ジダンシル-L-シスチン(Molecular Probes社、ユージーン、OR)などの、タンパク質標的を蛍光チオール-反応性誘導体で標識することが望ましい。あるいは、他の試薬、例えばヒドラジン基、芳香族ジアゾニウム塩、又はアミン基を含む蛍光色素を使用し、タンパク質試料を標識することができる。
【００７９】
タンパク質標的は、例えば、NHS-ASA (Pierce Chemical社、ロックフォード、IL)のような市販の二官能基反応性架橋剤を用い、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)のように、蛍光タンパク質へ連結することもできる。アミン、スルフヒドリル、カルボハイドレート、カルボキシル及びヒドロキシル基に対し反応性である別の二官能基反応性架橋剤が市販されており(例えば、Pierce Chemical社、ロックフォード、IL)、及びタンパク質標的に関心のあるタンパク質を連結するために使用することができる。タンパク質標的は、二次発蛍光団検出のために、一次試薬へ連結することもできる。一部の態様において、タンパク質は、例えばスルホ-NHS-ビオチンにより修飾され、次に例えばストレプトアビジン-Cy3のような二次発蛍光団試薬へ連結される。
【００８０】
検出のために、別のタンパク質試料標識法が利用できる。このような方法は、例えば、125Iを使用するタンパク質ヨウ素化、及び32P又は33Pを利用するタンパク質リン酸化を含み、並びにプロテインキナーゼを使用することができる。
【００８１】
場合によっては、標的は、例えばウイルス粒子のような粒子、細胞、又は細胞の一部を含む。これらの標的は、アレイ内に存在し得る特定のプローブへのそれらの結合を可能にするそれらの表面上に分子を提示することができる。このプローブと、ウイルス粒子、細胞又は細胞の一部上に存在する分子との結合は、試料中に存在し得る特定のウイルス粒子、細胞、又は細胞の一部を同定及び定量する際に有用であることができる。例えば、アレイは、試料中に存在するリンパ球の異なる亜型の存在及び量を決定する際に有用であることができる。ウイルス粒子、細胞、又は細胞の一部は、例えば、発蛍光団に連結された抗体で標識することなどの、様々な手段により標識することができる。この標識された抗体は、試料の亜集団と特異的に又は試料と非特異的に反応するように、選択することができる。あるいは、ウイルス粒子、細胞、又は細胞の一部を、これらの可能性のある標的の構成員に蛍光色素を組込むことにより、標識することができる。このような色素、例えばPKH-67 GL(Sigma社、セントルイス、MO)又は蛍光親油性プローブ、CM-DiI (Molecular Probes社、ユージーン、OR)は、市販されており、細胞を標識するために使用することができる。
【００８２】
タンパク質標識に利用可能な多種多様な技術があること、及び選択された技術は標識のために標的化された試料中に利用可能な単独又は複数のタンパク質によって決まることは、当業者に理解される。
【００８３】
代わりの態様において、標的検出は、微粒子上での発蛍光団：消光物質の対を用いて行うことができる。この態様において、プローブに連結された微粒子は更に、蛍光分子のような検出可能な部分に連結され、並びに標的は、微粒子上の検出可能な部分のシグナルを消光する化合物へ連結される。消光物質に連結された標的の発蛍光団に連結された微粒子上のプローブへの結合は、微粒子のクラスター化された配列からのシグナル喪失をもたらすであろう。例えば、プローブ-及びフルオレセイン-連結された微粒子のクラスター化された配列において、プローブに特異的で消光分子6-(N-4'-カルボキシ-4-(ジメチルアミノ)アゾベンゼン)-アミノヘキシル-1-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト(Dabcyl；Glen Research社、スターリング、VA)に連結された標的は、プローブへ特異的に結合し、フルオレセインの蛍光放出を効果的に消光することができる。蛍光シグナルの消光は、消光分子を発蛍光団に隣接するように配置することにより実現することができる。
【００８４】
本明細書に説明されたように、当業者は、検出される標的に応じて望ましい標識方式を選択することができる。核酸及びタンパク質が特に説明されているが、本明細書の内容は、小分子などを含むがこれらに限定されるものではない他の種類の標的を含有することが疑われる試料の標識に適用することができることは明らかであろう。
【００８５】
微粒子の複数のクラスター化された配列を含むことができるアレイが一旦形成されたならば、独自のプローブに会合された微粒子(micropshere)のクラスター化された配列の各々を用い、試料中に含まれることが疑われる標的を検出することができる。使用に際して、試料は、本明細書に説明されたように、標識された標的を提供するように修飾される。修飾された試料は、その後アレイに塗布され、このアレイ及び試料は、試料中に標的が存在する場合は、それのプローブへの特異的結合に適した条件下で維持される。このような特異的結合条件は、検出されるべき標的に応じて、当該技術分野において公知の技術により決定することができる。例えば核酸がプローブとして使用される場合は、特異的結合条件、又はハイブリダイゼーション条件が、プローブ核酸と標的核酸の間に形成されるヌクレオチド塩基対の数を基にして調節される。
【００８６】
標的のプローブへの特異的結合後、過剰な試料を、例えば洗浄により除去することができ、そして残留しているハイブリダイズされた標的を、検討することができる。本発明のアレイを用い、試料中に存在することが疑われる標的を検出することができる。試料の検討には、標的検出に使用されるマーカー(標的マーカー)の種類に応じて決まる1種又は複数の可視化工程、並びにアレイ内に含まれる微粒子プローブが存在するならば、任意に微粒子検出が関与し得る。
【００８７】
試料中の1種又はそれよりも多い標的(複数)の存在及び量の決定は、典型的には、基板上の微粒子の1種又は複数のクラスター化された配列に関連した検出可能なシグナルの存在又は非存在の可視化により行われる。基板上の微粒子の特定のクラスター化された配列に関連したプローブ、及び微粒子の特定のクラスター化された配列に関連したシグナルを知ることにより、試料中の特定の標的の存在及び量を決定することができる。
【００８８】
検出可能なマーカーの可視化は、当該技術分野において公知の適当な可視化技術を用いて実現することができる。蛍光作像は、改良された落射(epi)蛍光顕微鏡又は共焦点蛍光顕微鏡を用い行うことができる。適当な顕微鏡は、例えばOlympus BX60(東京、日本)又は他の同様の顕微鏡である。顕微鏡像からの蛍光像は、コンピュータソフトウェアを用い、蛍光強度について分析することができる。市販の顕微鏡分析ソフトウェア、例えばImage-Pro Plus(4.0版)(Media Cybernetics, L.P.社、シルバースプリング、MD)を用い、光学検出システムにより、蛍光シグナルを自動的に定義及び計測することができる。あるいは蛍光走査法を用い、粒子を可視化することができる。およそ5μmの解像度を有する、Scan Array 5000 (GSI Lumonics社、ビレリカ、MA)又はAxon GenePix 4000A(フォスターシティ、CA)のような蛍光スキャナーを用い、可視化することができる。
【００８９】
実施例
実施例1
本実施例に示されるように、アレイを、マトリックス-形成材料中にプローブ-連結された微粒子を含有するスラリーを配置することにより製造した。微粒子は、プローブの微粒子への連結、それに続く光反応性ポリマー及びプローブで連結された微粒子を含有するスラリーの調製により、調製した。次にこのように調製した微粒子を、基板に塗布し、アレイを作成した。
【００９０】
磁気、ポリスチレンで被包した微粒子で、蛍光青色色素(最大励起／発光490／515nm)及びストレプトアビジンに連結したものを、Bangs Laboratories社(製品番号CM01F；フィッシャー、IN)から得た。ストレプトアビジン濃度は、ビオチン-複合体結合により測定し、及び製造業者の1回の測定につき、9.86μgビオチン-アルカリホスファターゼ／mgミクロビーズ及び0.77μgビオチン-FITC／mgミクロビーズであると決定された。これらの微粒子は、直径0.96μm、及び密度1.7g/cm3 (1.305x1012微粒子/g)を有した。これらの微粒子を、脱イオン水で2回洗浄し、25mMリン酸緩衝生理食塩水(pH8)中に、10mg/mLで再懸濁した。
【００９１】
ストレプトアビジンで被覆した微粒子を、オリゴヌクレオチドBN30に連結した。BN30は、5'ビオチン修飾及び3'アミンを持つ30-merである(Integrated DNA Technologies社、コーラルビル、IA)。連結は、25mM PBS(pH8)中で、5nmole/mlのBN30及び1mg/mlの微粒子(供給業者が示したビオチン結合能を基に、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドの5倍過剰量)を用い、行った。被覆された微粒子及びオリゴヌクレオチドは、穏やかに攪拌しながら、室温で30分間インキュベーションした。インキュベーション後、微粒子を、脱イオン水で洗浄し、及び脱イオン水中に20mg/mlで再懸濁した。
【００９２】
水中の光反応性ポリ(ビニルピロリドン)(PV01；SurModics社、エデンプレイリー、MN)の37mg/mlのスラリーを、微粒子溶液と、9:1の比で一緒にした(PV01中に微粒子溶液を10x希釈)。スラリーを、Microgrid IIアレイヤー(Biorobotics社、ケンブリッジ、英国)を用い、アクリル表面(Cadillac Plastics社、ミネアポリス、MNから入手)に、平均スポットサイズ100μm及び中心間の間隔250μmでプリントし、およそ16スポット/mm2を提供した。被覆したスライドを風乾し、代表出力2mW/cm2であるDymax LightWelder PC-2 (Dymax Engineering Adhesives社、トリントン、CT)を用い、広いスペクトルの紫外線(320〜390nm)を2分間照射した。このランプは、PV01溶液のゲル化の間に、可能性のある核酸損傷を避けるために、カットオフフィルター(315nm)の下側に同じく配置したスライドから約10cmの位置に置いた。照射後、この基板を、1X PBS、0.1％ Tween20ですすいだ。
前述の方法で調製したアレイは、洗浄及び接触に対して安定していたが、照射されなかった試料は、安定していなかった。蛍光走査及び光学顕微鏡を用い、微粒子の存在及び位置を決定した。
【００９３】
標的核酸を含有する試料をアレイに塗布し、カバースリップとアレイ表面の間に配置さ
れた1cm2(アレイ面積)当り、ハイブリダイゼーション緩衝液(5xSSC、0.1％SDS、0.1mg/mlサケ精子DNA)中の発蛍光団-連結した標的核酸33fMの溶液2.5μLと共にインキュベーションした。その後スライドを、ハイブリダイゼーションチャンバー内に配置し、水浴で45℃で2時間加熱した。次にカバースリップを、4xSSC緩衝液の流れで取り除き、次にスライドを、2xSSC／0.1％SDSで5分間45℃で洗浄し、引き続き0.2xSSCで1分間室温で洗浄し、最後に0.1xSSCで1分間室温で洗浄した。次にこれらのスライドを回転乾燥し、標的オリゴヌクレオチドを下記の方法で検出した。
標的は、ScanAxray 5000蛍光スキャナー(Packard Bioscience社、ビレリカ、MA)で、アレイ上で検出した。
【００９４】
実施例2
高分子マトリックス中の微粒子の捕獲により、アレイを形成した。高分子マトリックス中の微粒子の捕獲は、基板と微粒子の間の共有結合又はイオン結合の形成には左右されなかった。本実施例において、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)により形成されたマトリックスを用い、微粒子を捕獲した。アレイは、光反応性PVP及び誘導体化していないシリカ微粒子の混合物を調製し、この混合物を基板上に配置し、次に光反応性PVPをPVPマトリックスへと重合することにより製造した。
【００９５】
アレイ製造における基板の調製において、シラン化されたガラススライド(1x3 in.x1mm(2.5x7.5cmx1mm))を用いた。ガラス製顕微鏡用スライドは、Erie Scientific社(ポートスミス、NH)(カタログ番号2950-W)から得た。これらのソーダ石灰ガラス製顕微鏡用スライドは、アセトン中の1容量％p-トリルジメチルクロロシラン(T-シラン)及び1容量％n-デシルジメチルクロロシラン(D-シラン、United Chemical Technologies社、ブリストル、PA)の混合物中に1分間浸漬することにより、処理したシランであった。風乾後、これらのスライドを、120℃の炉で1時間硬化した。その後これらのスライドを、アセトンで洗浄し、引き続きDI水に浸漬した。スライドは更に、炉で5〜10分間乾燥した。シラン化したガラス又はポリプロピレン製スライドを、その後アセトン又はイソプロパノールで洗浄した。
【００９６】
脱イオン水中の10mg/ml光反応性ポリ(ビニルピロリドン)(PV01；SurModics社、エデンプレイリー、MN)及び2.5mg/mlの5μm-直径のシリカ微粒子(製品番号SSO5N、Bangs Laboratories社、フィッシャー、IN)の溶液を、25ゲージの使い捨て針(PrecisionGlide Needles、Becton Dickinson社、フランクリンレーク、NJ)及びx-yプログラム可能なステージを用い、前述のように調製したガラス製顕微鏡用スライドにプリンティングした。その後このスライドに、320〜390nmの範囲にわたる広幅の紫外線を2分間照射した(Dymax Engineering Adhesives、Dymax LightWelder PC-2、トリントン、CT)。この後スライドを、0.05％Tween-20を含む1xPBSで5回洗浄し、その後0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を補充したブロック液DB02(50mMエタノールアミン、0.1M Tris(pH9)；SurModics社、エデンプレイリー、MN)中、45℃で15分間インキュベーションした。このスライドを更に、脱イオン水ですすぎ、及び4xSSC(0.6M NaCl、0.06M クエン酸ナトリウム／0.1％SDS)中で、45℃で1時間インキュベーションした。仕上げのすすぎは、2xSSCで45℃で5分間、次に0.2xSSCで室温で1分間行い、その後乾燥した。
【００９７】
微粒子は、PVPヒドロゲルアレイ内に残留し、蛍光顕微鏡(Olympus BX60、東京、日本)及び共焦点蛍光スキャナー(ScanArray 5000、GSI Lumonics社、ビレリカ、MA)により、可視化された。
【００９８】
微粒子及び光反応性PVPが、照射工程を伴わずにガラススライド上に沈積された場合、これらの微粒子は、ゲル内に保持されなかった。照射を行わないと、高分子マトリックスを形成するために架橋することができず、これにより高分子マトリックスは微粒子を物理的に捕獲することができなかった。
【００９９】
微粒子の高分子マトリックス内の固定化の性質を定義するために、直径5μmの微粒子(カタログ番号SSO5N、Bangs Laboratories社、フィッシャー、IN)を4級アミン基で官能基化されたベンゾフェノン二量体溶液中で照射した。PR03(エチレン(4-ベンゾイルベンジルジメチルアンモニウム)ジブロミド；SurModics社、エデンプレイリー、MN)の溶液は、米国特許第5,714,360号(Swanら、1998年2月3日に発行、本発明の譲受人に譲渡され、その開示は全体が本明細書に参照として組入れられている。)に開示されており、これを10容量％DMF/水中に、2.5mg/ml直径5μm-シリカ微粒子(製品番号SSO5N、Bangs Laboratories社、フィッシャー、IN)を含有する濃度5mg/mlで、25ゲージの使い捨て針(PrecisionGlide Needles、Becton Dickinson社、フランクリンレーク、NJ)及びx-yプログラム可能なステージを用い、実施例1で行ったように、疎水性ガラススライドを用いプリンティングした。プリンティングしたアレイは、紫外線を2分間照射し(Dymax Engineering Adhesives、Dymax Light Welder PC-2、トリントン、CT)、及び脱イオン水で、0.05％Tween-20を添加した1xPBSですすぎ、その後0.1％SDSを添加したDB02(SurModics社、エデンプレイリー、MN)中で、45℃で15分間インキュベーションした。その後このスライドを、脱イオン水ですすぎ、更に4xSSC／0.1％SDS中で45℃で1時間、インキュベーションした。仕上げのすすぎは、2xSSCで45℃で5分間、その後の0.2xSSCで室温で1分間、その後0.1xSSCで室温で1分間行い、その後乾燥した。
【０１００】
この時点で作像した場合、PR03溶液でプリンティングした領域に微粒子は残存していなかった。微粒子を効果的に捕獲したPV01ポリマーとは対照的に、高濃度のPR03は、微粒子の固定化には不充分であることが証明された。
【０１０１】
実施例3
高分子マトリックス中への微粒子の捕獲により、微粒子を基板表面上に固定化した。この固定化法は、微粒子と高分子マトリックスの間に化学結合は形成されなかったので、微粒子表面の機能性を妨害しなかった。従って、微粒子上の表面化学は、変更されなかった。ポリマー分子間の共有結合は、微粒子及び高分子材料を含有するスラリーでこの装置を被覆した後に形成された。微粒子は、活性化されたベンゾフェノンがそれと反応し得る炭素-水素結合を示さないので、ポリマーと微粒子の間に共有結合は形成されなかった。フォトポリマーの照射は、ポリマーをそれ自身架橋し、微粒子を包み込んだが、微粒子に付着された生体分子は変更しなかった。
【０１０２】
この固定化法を明らかにするために、4種の異なる直径(0.4μm、0.9μm、5.0μm、及び9.9μm)のプレーンシリカ微粒子を、異なる濃度のフォトポリマーマトリクス内に固定化した。最低濃度のフォトポリマーで、形成された高分子マトリックスは、試験したサイズの微粒子の物理的固定化に十分ではなかった。追加の対照として、一部のフォトポリマーコーティングは照射せず、これは微粒子の周りに不充分な架橋を生じ、コーティングからの微粒子の喪失につながった。界面活性剤及び高塩溶液中、高温でのストリンジェントなすすぎを、フォトポリマーコーティングが強固であることを確実にするために使用した。
【０１０３】
400nm、970nm、5μm、及び9.9μmシリカ微粒子の各溶液(各々、カタログ番号SSO2N、SSO3N、SSO5N、及びSSO6N；Bangs Laboratories社、フィッシャー、IN)の100mg/mlアリコートの20μlを、遠心によりペレット化した。これらのペレットを、光反応性ポリ(ビニルピロリドン)(PV01；SurModics社、エデンプレイリー、MN)の100μl連続希釈液中に、個別に再懸濁した。一連の希釈液は、PV01の10、5、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15、0.08、0.04及び0.02mg/mlの濃度試料からなった。微粒子の最終濃度は、全てのサイズについて20mg/mlであった。従って、400nmの微粒子溶液は、9.9μm微粒子溶液よりも、有意に多い微粒子を含有したが；しかし、全ての微粒子溶液は、同じ割合の固形物を含有していた。
【０１０４】
実施例1に説明したように、アセトン中のn-デシルジメチルクロロシラン及びトルイルジメチルクロロシランの1容量％溶液で被覆されたガラス製顕微鏡用スライドを、コーティングのための基板として使用した。各微粒子-PV01溶液の5μlを、ガラススライド上およそ10mmx2mmの領域に置き、風乾させた。一旦乾燥させ、これらのコーティングを、実施例1に説明したように、紫外線ランプ(Dymax Lightwelder PC-2、Dymax Engineering Adhesives社、トリントン、CT)で2分間照射した。試料の第二のセットは、フォトポリマー高分子マトリックスの架橋が、微粒子を含むために必要であるかどうかを決定するために、対照として利用するために照射しなかった。
【０１０５】
微粒子がポリマーコーティング中に良好に捕獲されたかどうかを決定するために、被覆されたスライドを、1xPBS-0.1％ Tween-20溶液で、1時間穏やかに振盪しながら洗浄し、引き続き2回脱イオン水ですすいだ。その後コーティングを、顕微鏡で再試験し、及び微粒子の喪失を評価した。次により高塩でより高温の第二の洗浄条件で行った。微粒子被覆された小片を、0.1％SDSを含む4xSSC緩衝液中で、45分間45℃でインキュベーション及び振盪し、その後2回脱イオン水ですすぎ、微粒子コーティング中の変化を顕微鏡により試験した。最後により長期間高塩で洗浄する工程を行い、スライドを、0.1％SDSを含む5xSSC緩衝液中で、45℃で2時間インキュベーションし、引き続き漸減濃度のSSCで、4回すすいだ。
【０１０６】
微粒子コーティングは、倍率50Xでの、定性的顕微鏡試験(Olympus BX60、東京、日本)により試験し、及び変化を表とした。結果は図2及び図3に示している。
図2a-2dは、最終洗浄後の微粒子の存在を示している。図2aは、400nm微粒子を有するコーティングを示し；図2bは、970nm微粒子を有するコーティングを示し；図2cは、5μm微粒子を有するコーティングを示し；及び、図2dは、9.9μm微粒子を有するコーティングを示している。
【０１０７】
合計3回の洗浄の前後の微粒子の顕微鏡図は、図3に示した。図3aは、洗浄前の0.3mg/mlのPV01マトリックス中の9.9μm微粒子を示し、及び図3bは、洗浄後の0.3mg/mlのPV01マトリックス中の9.9μm微粒子を示している。これらの結果は、表2及び表3に示した。表1及び2の表示は以下である：N＝喪失なし、S＝わずかに喪失、M＝中等度の喪失、H＝重度に喪失、C＝完全な喪失；PBST＝1時間室温での、1xPBS-0.1％ Tween-20洗浄；4xSSC＝45℃45分間の、4xSSC-0.1％SDS洗浄；Final＝45℃で2時間の、5xSSC-0.1％ SDS洗浄。
【０１０８】
【表２】
2005505762.tif 000004
【表３】
2005505762.tif 000005
【０１０９】
表2及び3に示されるように、微粒子喪失は、照射しなかった試料において、有意に増大した。同じく先の表2及び3に示されたように、微粒子喪失は、ポリマー濃度が低下した場合に増加した。微粒子喪失は、より小さいサイズの微粒子が高分子マトリックスにおいて使用された場合に増加した。このデータは、照射が、微粒子の周りを包み込む高分子ネットワークの形成を促進したことを示している。このデータは同じく、微粒子が、化学結合によるよりもむしろ、高分子マトリックスの物理的拘束により固定化されたことを示している。
【０１１０】
基板上にプリンティングする場合、より小さい微粒子を有するスラリーは、微粒子の複数の層内に密に充填されているコーティングを生じたのに対し、より大きい微粒子を有するスラリーは、数十ミリメーター毎(every few tenths of a millimeter)に微粒子が緩く配列されたコーティングを生じた。より低い密度の微粒子を示すコーティングは、洗浄条件に対して、濃い濃度のものと同じくらい安定していた。
【０１１１】
実施例4
固定化された微粒子のクラスター化された配列のアレイを、光反応性ポリマー中に懸濁された微粒子のスラリーを作成し、及びこのスラリーをガラススライド上に接触プリンティングすることにより調製した。微粒子は、核酸に連結され、これにより試料中の標的核酸の存在の検出に使用される微粒子のクラスター化された配列のアレイを作成した。
【０１１２】
オリゴヌクレオチドに連結された微粒子のクラスター化された配列のアレイを製造するために、1μmストレプトアビジンで被覆したシリカ微粒子(CS01N；Bangs Laboratories社、フィッシャー、IN)を、ビオチン化したCy3-標識された30-merオリゴヌクレオチド(Integrated DNA Technologies社、コーラルビル、IA)に、1.25μMオリゴヌクレオチド溶液20μlを、PBS(pH7.5)中の微粒子の4mg/ml溶液100μlに添加し、ビオチンをストレプトアビジンに室温で30分間連結させることにより、連結した。
【０１１３】
その後このオリゴヌクレオチドに連結された微粒子を、遠心によりペレット化し、上清を除去し、新たな脱イオン水を添加し、かつその後オリゴヌクレオチドに連結された微粒子溶液を激しく攪拌し、オリゴヌクレオチドに連結された微粒子を再懸濁した。この洗浄法を、2回繰返し、連結していないビオチン化されたオリゴヌクレオチドを除去した。
【０１１４】
オリゴヌクレオチドに連結された微粒子を、脱イオン水中PV01(Surmodics社、エデンプレイリー、MN)の2.25mg/mL溶液へと導入し、4.0mg/mL微粒子を含有するスラリーを形成した。このスラリーを、実施例1に示したように、n-デシルジメチルクロロシラン及びトリルジメチルクロロシランの混合物により誘導体化されたガラススライド上に、Microgrid IIアレイヤー(Biorobotics社、ケンブリッジ、英国)により、接触プリンティングした。3x3スポットのパターンを、その表面上に繰返し、これらのスポットは乾燥前に、平均直径100μm及び容量約0.5〜1pLを有した。プリンティング後、スライドを、実施例1に詳述したような紫外線源(Dymax LightWelder PC2、Dymax Engineering Adhesives社、トリントン、CT)で、315nmカットオフフィルター(Electro-Lite社、ダンバリー、CT)を通して、2分間照射した。この時点で、マイクロアレイを、蛍光スキャナー(Packard Biosciences社、ScanArray 5000、ビレリカ、MN)で作像し、かつ代表的スポットを、蛍光顕微鏡(Olympus BX 60、東京、日本)で作像した。100μmスポット当り約100〜500個の5μm微粒子が存在した。
【０１１５】
プリンティング後、アレイを洗浄し、緩く結合した微粒子を除去した。このアレイを、0.1容量％Tween-20を含む1xPBS(pH7.4)で3回洗浄し、脱イオン水ですすぎ、DB02洗浄緩衝液(Surmodics社、エデンプレイリー、MN)の溶液中で50℃で1時間インキュベーションし、引き続き脱イオン水で2回すすいだ。その後このマイクロアレイを、4x SSC／0.1％SDSの溶液中で、50℃で2時間インキュベーションし、脱イオン水ですすいだ。
【０１１６】
標的ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、アレイ上に、5xSSC及び0.1％SDS中にCy5-標識された相補的オリゴヌクレオチドを500fmole含有する溶液を置くことにより達成した。ハイブリダイゼーションを、45℃で2時間行った。ハイブリダイゼーション後、このマイクロアレイを、2xSSCで50℃で5分間、0.2xSSCで室温で1分間、及び最後に0.1xSSCで室温で1分間洗浄した。この時点で、マイクロアレイを、Cy3及びCy5チャンネルを用い及び蛍光顕微鏡で、蛍光スキャナーで作像した。蛍光スキャナ及び顕微鏡の画像も、マイクロアレイ上のスポットは明確に視認できかつ有意な数の微粒子を含むことに加え、アレイ上のオリゴヌクレオチドは相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを示した。図4は、スライド上の微粒子のクラスター化された配列及びハイブリダイズした標的の蛍光画像を示している。図4aは、プリンティング直後の微粒子クラスターを示し；図4bは、標的のハイブリダイゼーション後の、Cy3チャンネル(60％レーザー)における微粒子のクラスターの蛍光を示し；図4cは、Cy5チャンネル(50％レーザー)におけるハイブリダイズしたCy5-標識された標的オリゴヌクレオチドの蛍光を示している。
【０１１７】
実施例5
本実施例において、アレイは、光反応性ポリマーの濃度を低下した以外は、実施例3の手法を用いて作成した。低濃度の光反応性ポリマーでは、高分子マトリックスは、穏やかにすすいだ後、最早微粒子を保持しなかった。
【０１１８】
5mg/mL PV01(SurModics社、エデンプレイリー、MN)のスラリーを、脱イオン水の中に5、2.5、1.25、0.625、0.313mg/mLとなるよう連続希釈し、各連続希釈したPV01溶液の45μlを、脱イオン水中の40mg/ml微粒子の5μlに添加し、スラリーを作成し、これは総量50μlの各スラリー混合物中の微粒子の最終濃度が4mg/mlであった。
【０１１９】
これらのスラリーを、Microgrid IIアレイヤー(Biorobotics社、ケンブリッジ、英国)上に全て接触プリントし、その後実施例1に詳述されているように、紫外線(Dymax LightWelder PC2、Dymax Engineering Adhesives社、トリントン、CT)を、315nmカットオフフィルター(Electro-Lite社、ダンバリー、CT)を通して、2分間照射した。次にこれらのアレイを、0.1％Tween-20を含む1xPBSで3回及び脱イオン水ですすいだ。得られたスポットを、蛍光顕微鏡(Olympus BX 60、東京、日本)により、倍率100Xを用い、作像した。図5に示されたように、PV01高分子マトリックスは、濃度が0.625mg/mL未満(図5d)に低下するまで、微粒子を固定化し、この時微粒子は高分子マトリックスから洗浄除去された(rinsed free)。図5aは、5mg/mL PV01中に固定化された微粒子を示し；図5bは、2.5mg/mL PV01中に固定化された微粒子を示し、図5cは、1.25mg/mL PV01中に固定化された微粒子を示し、図5dは、0.625mg/mL PV01中に固定化された微粒子を示し、図5eは、0.313mg/mL mg/mL PV01中に固定化された微粒子を示している。
【０１２０】
実施例6
様々なマトリックス-形成材料を、別法で使用し、微粒子を基板上に固定化した。各々異なるポリマー及び微粒子を含有するスラリーを調製した。その後これらのスラリーを、基板上に配置し、その中に微粒子が固定化されたマトリックスを形成するように処理した。4種の異なる光反応性ポリマーを用い、直径9.9μmシリカ微粒子を基板上に固定化した。これらの光反応性ポリマーPA04、PA05、PV01及びPV05は全て、SurModics社(エデンプレイリー、MN)から市販されている。PA04及びPA05は、アクリルアミド(AA)及びN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド(BBA-APMA)のコポリマーであり、BBA-APMA:AAの比が異なっている。同様に、PV01及びPV05は、ビニルピロリドン(VP)及びN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド(BBA-APMA)のコポリマーであり、BBA-APMA:VPの比が異なっている。PR03(実施例4に説明された)は、高分子でない光反応性材料であり、これも本実施例において使用した。
【０１２１】
PA04、PA05、PV01、PV05及びPR03は、濃度2.5mg/mlで脱イオン水に溶解した。光反応性化合物を含有する各溶液100μlを、脱イオン水で3回洗浄した直径9.9μmシリカ微粒子(SSO6N、Bangs Laboratories社、フィッシャー、IN)のペレット2mgに添加し、スラリーを作成した。各スラリーの最終濃度は、光反応性化合物2.5mg/ml及び微粒子20mg/mlであった。各スラリーを、実施例1に詳述したように、25ゲージの使い捨て針(PrecisionGlide Needles、Becton Dickinson社、フランクリンレーク、NJ)及びx-yプログラム可能なステージ(CAMM-3、Roland Digital Group社、アービン、CA)を用い、シランにより機能性ガラス製顕微鏡用スライド上、及びアクリル製スライド(Cadillac Plastics社、ミネアポリス、MN)上にプリンティングした。このプリンティングは、基板上に直径約300〜400μmのスポットのパターンを形成した。
【０１２２】
被覆した基板を、実施例1に詳述したように、紫外線を2分間照射した。その後被覆した基板を、蛍光顕微鏡(Olympus BX 60、東京、日本)で作像し、パターン化がうまくいったことを確認した。
【０１２３】
その後、被覆された基板を洗浄し、緩く結合した微粒子を除去した。被覆した基板を、0.1容量％Tween-20を含む1xPBS(pH7.4)で3回洗浄し、脱イオン水ですすいだ。この時点で、各々を蛍光顕微鏡で再度作像し、様々な光反応性ポリマーマトリックス中での微粒子の喪失を決定した。作像後、被覆した基板を、DB02洗浄緩衝液(Surmodics社、エデンプレイリー、MN)の溶液中で、1時間50℃でインキュベーションし、引き続き脱イオン水で2回すすいだ。被覆した基板は、その後4xSSC／0.1％SDS溶液中で2時間50℃でインキュベーションし、脱イオン水ですすいだ。洗浄工程前後の微粒子の存在を、表4にまとめた。
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図1は、基板上に固定化されたマトリックス中の微粒子のコーティングの概略図である。
【図２】図2a−2dは、基板上のマトリックス内に固定化された微粒子の顕微鏡試験である。
【図３】図3a及び3bは、基板上のマトリックス内に固定化された微粒子の顕微鏡写真である。
【図４】図4a−4cは、基板上のマトリックス内に固定化された微粒子の顕微鏡写真である。図4cは、微粒子上の標識された標的のハイブリダイゼーションを示している。
【図５】図5a−5eは、基板上のマトリックス内に固定化された微粒子の顕微鏡写真である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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