(57)【要約】  本発明は、センサー表面にカップリングするためのチオール基を含む変異結合タンパク質の組成物、これから得られる分析物バイオセンサーデバイス、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの分析物バイオセンサーとしてこれらを使用する方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの変異結合タンパク質およびこれに結合した少なくとも１つのチオール基と、
ｂ）前記チオール基を介して前記変異結合タンパク質がカップリングした少なくとも１つのセンサー表面と
を含み、前記センサー表面は、前記変異結合タンパク質が分析物に結合するときの屈折率の変化に起因する検出可能な信号を生成することを特徴とするバイオセンサー。
【請求項２】
前記変異結合タンパク質は、グルコース／ガラクトース結合タンパク質のなかから選択されることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記分析物はグルコースまたはガラクトースであることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも２つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記変異グルコース結合タンパク質は、位置１のシステイン、位置１のセリン、位置１１のシステイン、位置１４のシステイン、位置１９のシステイン、位置４３のシステイン、位置７４のシステイン、位置１０７のシステイン、位置１１０のシステイン、位置１１２のシステイン、位置１１３のシステイン、位置１４９のシステイン、位置２１３のシステイン、位置２１６のシステイン、位置２３８のシステイン、位置２８７のシステイン、位置２９２のシステイン、位置１５２のシステイン、位置１８２のシステイン、位置２３６のシステインおよび位置２９６のシステインからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項４に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記変異結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグを有することを特徴とする請求項４に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質は位置２１３に存在するシステインを含むことを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
前記変異グルコース結合タンパク質はヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
前記変異グルコース結合タンパク質は、位置１４９に位置する前記センサー表面にカップリングしたシステインを含むことを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
前記変異グルコース結合タンパク質はさらにヒスチジンタグを含むことを特徴とする請求項１０に記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記変異グルコース結合タンパク質は、位置１１２のシステインと位置２３８のセリン、位置１４９のシステインと位置２３８のセリン、位置１５２のシステインと位置１８２のシステイン、位置１５２のシステインと位置２１３のセリン、位置２１３のシステインと位置２３８のシステイン、位置１４９のシステインと位置２１３のアルギニン、位置１４９のシステインと位置２１３のシステイン、位置１４９のシステインと位置２１３のトレオニン、位置１４９のシステインと位置２１３のロイシン、位置１４９のシステインと位置２１３のチロシン、位置１４９のシステインと位置２２３のアスパラギン、位置１４９のシステインと位置２３８のシステイン、位置１４９のシステインと位置２５６のセリン、位置１４９のシステインと位置２５６のアルギニン、位置１５２のシステインと位置２１３のアルギニン、位置１５２のシステインと位置２２３のアスパラギン、および位置２１３のシステインと位置２５５のシステインからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
前記変異グルコース結合タンパク質は、位置１４９のシステインと位置２１３のセリンと位置２３８のセリン；位置１４９のシステインと位置２１３のアルギニンと位置２３８のセリン；位置１４９のシステインと位置２１３のシステインと位置２３８のシステイン；位置１４９のシステインと位置２１３のセリンと位置２２３のアスパラギン；位置１４９のシステインと位置２２３のアスパラギンと位置２５６のアルギニン；位置１のセリンと位置１４９のシステインと位置２１３のアルギニンと位置２３８のセリン；位置１のセリンと位置１４９のシステインと位置２１３のセリンと位置２３８のセリン；および位置１４９のシステインと位置１８２のシステインと位置２１３のシステインと位置２３８のセリンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換の組合せを含むことを特徴とする請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
前記変異グルコース結合タンパク質はヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
前記変異グルコース結合タンパク質はヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
ａ）少なくとも１つの変異結合タンパク質およびこれに結合した少なくとも１つのチオール基を提供する工程と、
ｂ）前記チオール基を介して前記変異結合タンパク質が結合した少なくとも１つのセンサー表面と、
ｃ）前記変異結合タンパク質を様々なグルコース濃度を含む生物学的溶液に曝す工程と、
ｄ）屈折率の変化に起因する検出可能で可逆的な信号を検出する工程と
を含み、前記検出可能で可逆的な信号は、前記様々な分析物濃度に対応する結合後の屈折率の変化に起因するものであることを特徴とする分析物検出方法。
【請求項１７】
前記検出は、連続的であるか、プログラムされているか、散発的であるか、またはこれらの組合せであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの変異結合タンパク質はグルコース／ガラクトース結合タンパク質であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
様々な分析物濃度の検出可能で可逆的な信号の前記検出は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの検出であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記分析物はグルコースまたはガラクトースであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質は、細菌ペリプラズムの結合タンパク質から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記リポーター基からの様々なグルコース濃度の検出可能で可逆的な信号の前記検出は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの検出であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも２つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記アミノ酸置換は、位置１のシステイン、位置１のセリン、位置１１のシステイン、位置１４のシステイン、位置１９のシステイン、位置４３のシステイン、位置７４のシステイン、位置１０７のシステイン、位置１１０のシステイン、位置１１２のシステイン、位置１１３のシステイン、位置１４９のシステイン、位置２１３のシステイン、位置２１６のシステイン、位置２３８のシステイン、位置２８７のシステイン、位置２９２のシステイン、位置１５２のシステイン、位置１８２のシステイン、位置２３６のシステインおよび位置２９６のシステインからなる群から選択されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記グルコース／ガラクトース結合タンパク質は、位置１１２のシステインと位置２３８のセリン、位置１４９のシステインと位置２３８のセリン、位置１５２のシステインと位置１８２のシステイン、位置１５２のシステインと位置２１３のセリン、位置２１３のシステインと位置２３８のシステイン、位置１４９のシステインと位置２１３のアルギニン、位置１４９のシステインと位置２１３のシステイン、位置１４９のシステインと位置２１３のトレオニン、位置１４９のシステインと位置２１３のロイシン、位置１４９のシステインと位置２１３のチロシン、位置１４９のシステインと位置２２３のアスパラギン、位置１４９のシステインと位置２３８のシステイン、位置１４９のシステインと位置２５６のセリン、位置１４９のシステインと位置２５６のアルギニン、位置１５２のシステインと位置２１３のアルギニン、位置１５２のシステインと位置２２３のアスパラギン、および位置２１３のシステインと位置２５５のシステインからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸置換の組合せを有することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記グルコース／ガラクトース結合タンパク質は、位置１４９のシステインと位置２１３のセリンと位置２３８のセリン；位置１４９のシステインと位置２１３のアルギニンと位置２３８のセリン；位置１４９のシステインと位置２１３のシステインと位置２３８のシステイン；位置１４９のシステインと位置２１３のセリンと位置２２３のアスパラギン；位置１４９のシステインと位置２２３のアスパラギンと位置２５６のアルギニン；位置１のセリンと位置１４９のシステインと位置２１３のアルギニンと位置２３８のセリン；位置１のセリンと位置１４９のシステインと位置２１３のセリンと位置２３８のセリン；および位置１４９のシステインと位置１８２のシステインと位置２１３のシステインと位置２３８のセリンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換の組合せを含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出可能で可逆的な信号は、表面プラズモン共鳴に基づく手段によって検出されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出可能で可逆的な信号は、長周期格子に基づく手段によって検出されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー分野に属する。詳細には、本発明は、センサー表面に結合するためのチオール基を含む変異結合タンパク質(mutated binding protein)、これから得られる分析物バイオセンサーデバイス、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ分析物バイオセンサーとしてのこれらの使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
グルコース濃度を監視して糖尿病患者の適切な代謝制御を容易にすることは望ましい目標であり、これによって多くの人の寿命は向上するであろう。現在、大部分の糖尿病患者は、血中グルコースレベルを監視するのに「指穿刺(finger stick)」法を使用しているが、頻繁な穿刺（日に数回）によって生じる痛みのため、患者が指示どおりにおこなっているかどうかは疑わしい。そのため、血中グルコースまたはグルコースを含む他の体液を頻繁および／または連続的に監視する非侵襲性またはできるだけ侵襲性の低いｉｎ  ｖｉｖｏ法、およびより効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を開発する努力が続けられてきた。これらのうち最も有望ないくつかの方法はバイオセンサーの使用を伴う。バイオセンサーは、トランスデューサ（検出）要素に結合した生物学的認識要素を使用して、特定の定量的または半定量的分析情報を提供することができるデバイスである。
【０００３】
バイオセンサーの生物学的認識要素は選択性を決定し、そのため測定される化合物だけが信号を引き起こす。この選択は、リガンド（例えばグルコース）の化学構造が変化しない場合のリガンドの生化学的認識に基づいてもよく、または要素が分析物の生化学反応を触媒する生体触媒作用に基づいてもよい。
【０００４】
トランスデューサ要素は、生物学的認識要素の認識結果を半定量的または定量的な信号に変換する。可能なトランスデューサ技術は、光学、電気化学、音響／機械または比色定量技術である。これまでに利用された光学特性は、吸光度、蛍光／りん光、生物発光／化学発光、反射率、光散乱および屈折率を含む。蛍光化合物などの慣用のリポーター基を使用してもよく、あるいはまた、標識の必要なしで光学的に直接に検出できる状況もある。
【０００５】
信号変換のための生物学的要素として使用される、グルコースを検出するために特に設計されるバイオセンサーは、典型的には、グルコースオキシダーゼ活性の電気化学検出または比色検出を使用する。この方法の使用は、特に酸素レベルの影響、血液中の阻害物質の存在および電極にまつわる問題に起因する難点を伴う。さらに、検出によって分析物が消費され、低いグルコース濃度を測定するときにはこのことが問題になる可能性がある。
【０００６】
バイオセンサーの開発が急速に進んでいる領域は、蛍光標識されたペリプラズム結合タンパク質（ＰＢＰ）の使用である。非特許文献１に報告されているように、標識されたマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、有用なマルトースセンサーであることが示された。この研究では、もともとシステイン残基を持たないＭＢＰを変異させて、位置３３７に単一のシステイン残基を有するタンパク質（Ｓ３３７Ｃ）を得た。この変異位置は、マルトース結合間隙(cleft)内にあり、マルトースが結合すると大きな環境変化を受けた。多数のフルオロフォアが調査され、そのうちのいくつかはリガンド結合をブロックし、またはタンパク質の立体配座の変化を妨害した。調査したフルオロフォアのうち、ＩＡＮＢＤでは、マルトース結合後、蛍光強度が大幅に増大した（１６０％）。この結果は、マルトース結合時のヒンジの閉鎖に関して理論的に予測されたように、親水性すなわち溶媒露出環境からより疎水性の高い環境へ変化するフルオロフォアの位置と一致する。しかし、この変異タンパク質および関連リポーター基は、哺乳動物の体液中の診断上重要な糖と結合しない。このタンパク質とＴｉＯ２表面との会合が開示されているが、この表面結合タンパク質には、時間とともに活性が低下し、定常的な水和が必要であるという欠点がある（非特許文献２）。
【０００７】
Hellinga他の特許文献１は、システイン残基を含むように変異させたガラクトース／グルコース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）に蛍光リポーターを導入することによって、グルコース結合時に生じる大規模な立体配座の変化を利用するグルコースバイオセンサーの設計を報告している。Hellinga他の特許文献１は、変異ＧＧＢＰの立体配座の変化の伝達を利用して、アロステリックカップリング機構を介してグルコース結合事象を蛍光の変化に変換する、統合された信号変換機能を構築することができることを開示している。この蛍光変換機能は、ＧＧＢＰの糖結合ポケットの固有の結合特性を最低限度しか妨害しないと報告されている。
【０００８】
血液、間質液、眼溶液、または汗などのような生物学的溶液中のグルコース濃度を正確に決定するためには、対象の生物学的溶液の生理的および／または病理学的作働範囲と調和するようにバイオセンサーの感知分子の結合定数を調整することが望ましい。適切な結合定数を持たなければ、特定の生理的および／または病理学的濃度に関して、信号が範囲外となる可能性がある。さらに、Lakowiczの特許文献２に開示されているように、バイオセンサーは、それぞれが異なる結合定数を有する２種類以上のタンパク質を使用して、広い範囲のグルコース濃度にわたって正確な測定値を与えるように構成することができる。
【０００９】
変異ＧＧＢＰの有用性にもかかわらず、リポーター基の有無のいずれにおいても、これらのタンパク質のわずかのものが、設計および試験されたにすぎない。特定の部位の変異および／またはある種のリポーター基の結合は、予測不可能な方法で結合定数を変化させる働きをする。さらに、リポーター基を含むバイオセンサーは望ましい結合定数を有する可能性があるが、分析物の結合後に容易に検出可能な信号を生成しない。具体的な分析物の検出のために特定のタンパク質に結合させた特定のリポータープローブの感度を決定する最優先の因子の１つが、選択されるプローブとタンパク質のアミノ酸残基との間の具体的な相互作用の性質であることは従来技術から明らかである。タンパク質内のこれらの相互作用をコンピュータ計算法を使用して予測することは現在のところ不可能であり、および合理的な設計方法論を使用してリポータープローブの選択を最適化することも不可能である。さらに、タンパク質中のリポーター基の位置に基づいて結合定数に対する効果を予測すること（またはその逆）も不可能である。
【００１０】
無試薬で、自己充足的の、および／または埋込み可能な、および／または再使用可能なバイオセンサータンパク質を開発するためには、トランスデューサ要素が、トランスデューサ要素に対しておよび該トランスデューサ要素からの信号をインターロゲートする検出デバイスと連絡していなければならない。「インターロゲート」とは、試料に光を送り、および試料からの発光を測定するプロセスを意味する。典型的な方法は、光ファイバまたは平面導波路の内部または表面に、固定化法を使用してタンパク質を配置することを含む。このような固定化法は、半透膜、有機ポリマーマトリックスまたは無機ポリマーマトリックスの中にタンパク質を捕捉することを含むが、それらに限定されるものではない。使用する固定化法は、作動中のバイオセンサーの性能を最終的に決定する。従来技術は、生体分子の固定化に関連した数多くの問題を詳述している。例えば、多くのタンパク質は、立体配座の不可逆的な変化、変性および生化学的活性の損失を受ける。固定化されるタンパク質は、任意の特定の表面に可能な多数の配向で存在することができる。例えば、あるタンパク質は活性部位が露出するように配向し、他のタンパク質は活性部位が露出しないように配向し、したがって分析物との選択的な結合反応を経験することができない。また、固定化されるタンパク質は、時間に依存した変性、固定化中の変性、および固定化後に捕捉されたタンパク質の浸出にさらされる。これによって、例えば、検知装置の較正を維持できないこと、および信号のドリフトを含む問題点が生じる。一般的に、結合タンパク質は、その有効な使用を可能にするための配向制御を必要とし、したがって、文献に教示された物理的吸収およびランダムまたはバルク表面共有結合または固定化法は概して成功していない。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，２７７，６２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１９７，５３４号明細書
【非特許文献１】Cass, Anal Chem. 1994, 66, 3840-3847
【非特許文献２】Cass, Analytical Chemistry 1998, 70 (23), 5111-5113
【非特許文献３】N. K. Vyas, M. N. Vyas, F. A. Quiocho, Science 1988, 242, 1290-1295
【非特許文献４】S. L. Mowbray, R. D. Smith, L. B. Cole, Receptor 1990, 1, 41-54
【非特許文献５】Turcatti et al., J Bio. Chem. 1996 271, 33, 19991-19998
【非特許文献６】Greg T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1996, San Diego, pp. 4-16
【非特許文献７】Myszka et al., J. Mol. Recognit. 2001 14: 261-268
【非特許文献８】M. E. Jones et al., 2000, NSF Design and Manuf. Research conf., Vancouber, Poster Number SBIR-510
【非特許文献９】Guilbault, Biosensors & Bioclectronics 1999 14, 633-670
【非特許文献１０】Kunkel (1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、当技術分野では、バイオセンサーとして使用するための、分析物が結合すると検出可能で可逆的な信号を生成するさらなる有用な変異タンパク質および変異ＧＧＢＰタンパク質を設計することが求められており、さらに、バイオセンサーとして使用するために分析物またはグルコースが結合すると検出可能な信号を生成し、表面に結合するためのチオール基を含むさらなる有用な変異結合タンパク質および変異ＧＧＢＰ類を設計することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ａ）少なくとも１つの変異結合タンパク質およびこれに結合した少なくとも１つのチオール基と、ｂ）前記チオール基を介して前記変異結合タンパク質がカップリングした少なくとも１つのセンサー表面とを含み、前記センサー表面は、前記変異結合タンパク質が分析物に結合したときの屈折率の変化に起因する検出可能な信号を生成するバイオセンサーを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ａ）少なくとも１つの変異結合タンパク質およびこれに結合した少なくとも１つのチオール基を提供する工程と、ｂ）前記チオール基を介して前記変異結合タンパク質がカップリングした少なくとも１つのセンサー表面と、ｃ）前記変異結合タンパク質を様々なグルコース濃度を含む生物学的溶液に曝す工程と、ｄ）屈折率の変化に起因する検出可能で可逆的な信号を検出する工程とを含み、前記検出可能で可逆的な信号は、前記様々な分析物濃度に対応する結合後の屈折率の変化に起因する分析物検出方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
用語バイオセンサーは、一般に、単離された酵素、免疫系、組織、細胞小器官またはホールセル（細胞全体）によって媒介される特定の生化学反応を使用して、通常は電気、熱または光信号によって、化合物を検出するデバイスを指す。本明細書で使用するときには、「バイオセンサー」は、分析物（例えば、グルコースまたはガラクトース）に結合することができるタンパク質であって、本明細書に記載の検出手段によって分析物または分析物濃度の変化を検出する目的に使用することができるタンパク質を指す。
【００１６】
用語「結合タンパク質」は、記載される方法によって、分析物が存在しないとき、時間とともに分析物の濃度が変化するとき、または濃度に依存した方法で存在する時のいずれをも区別できる、検出可能および／または可逆的な信号を生成しまたは変換することができる方法で、特定の分析物と相互作用するタンパク質を指す。信号事象の検出は、１回だけの適用または再使用可能な用途を含む連続手段、プログラムされた手段および散発的(episodic)手段を含む。分析物の存在または濃度との相関が確立されている場合、可逆信号の生成または検出は、瞬時であってもよく、または時間依存であってもよい。このような信号がもたらされるように変異させた結合タンパク質が好ましい。
【００１７】
本明細書で使用する際に、用語「ガラクトース／グルコース結合タンパク質」すなわち「ＧＧＢＰ」は、細菌のペリプラズム区画において天然に見出されるタイプのタンパク質を指す。自然の状態において、これらのタンパク質は、走化性および小分子（例えば糖、アミノ酸および小ペプチド）の細胞質への輸送に関与する。ＧＧＢＰは、３本の鎖によって接続されてヒンジを形成している、２つの球状／ドメインからなる単鎖タンパク質である。結合部位は、２つのドメイン間の間隙に位置する。グルコースが結合部位に入ると、ＧＧＢＰは、ヒンジを中心とした立体配座の変化を受け、これによって２つのドメインが一緒になり、結合部位にグルコースが捕らえられる。E.coli（非特許文献５）およびS.Typhimurium（非特許文献６）のＧＧＢＰの閉鎖形態のＸ線結晶構造が決定された。これらのＸ線結晶構造は、Protein Data Bank（http://www.resb.org/pdb/）から、それぞれ、２ＧＢＰおよび３ＧＢＰとして入手可能である。野生型のE.coliのＧＧＢＰのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、www.ncbi.nim.nih.gov/entrez/に登録番号Ｄ９０８８５（ゲノムクローン）および登録番号２３０５２０（アミノ酸配列）として出ている。好ましいＧＧＢＰはE.coli由来である。
【００１８】
本明細書で使用する際に、用語「変異結合タンパク質」（例えば「変異ＧＧＢＰ」）は、天然に存在するタンパク質中に存在するアミノ酸を置換したアミノ酸、天然のタンパク質に存在するアミノ酸から欠落したアミノ酸、または天然のタンパク質に存在するアミノ酸に付加されたアミノ酸を含む、細菌由来の結合タンパク質を指す。結合タンパク質の例示的な変異には、システイン基（天然に存在しないアミノ酸）の付加または置換、および実質的に非反応性のアミノ酸を反応性のアミノ酸で置換して、電気化学または光反応性リポーター基の共有給合を提供することなどが含まれる。「反応性」アミノ酸とは、チオール反応染料を用いたシステインの標識化に類似して標識化剤で修飾することができるアミノ酸を意味する。非反応性アミノ酸には、ひとたびタンパク質に組み込まれたならば容易に修飾することができない側鎖を持つ、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンなどのアミノ酸が含まれる（アミノ酸側鎖の反応性の分類については非特許文献８を参照されたい）。
【００１９】
ＧＧＢＰタンパク質の例示的な変異には、位置１１のリシンを置換したシステイン（Ｋ１１Ｃ）；位置１４のアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ１４Ｃ）；位置１９のバリンを置換したシステイン（Ｖ１９Ｃ）；位置４３のアスパラギンを置換したシステイン（Ｎ４３Ｃ）；位置７４のグリシンを置換したシステイン（Ｇ７４Ｃ）；位置１０７のチロシンを置換したシステイン（Ｙ１０７Ｃ）；位置１１０のトレオニンを置換したシステイン（Ｔ１１０Ｃ）；位置１１２のセリンを置換したシステイン（Ｓ１１２Ｃ）；位置１１２のセリンを置換したシステインおよび位置２３８のロイシンを置換したセリン（Ｓ１１２Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）を含む２重変異；位置１１３のリシンを置換したシステイン（Ｋ１１３Ｃ）；位置１３７のリシンを置換したシステイン（Ｋ１３７Ｃ）；位置１４９のグルタミン酸を置換したシステイン（Ｅ１４９Ｃ）；位置１４９のグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２３８のロイシンを置換したセリンを含む２重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）；位置１５２のヒスチジンを置換したシステインおよび位置１８２のメチオニンを置換したシステインを含む２重変異（Ｈ１５２Ｃ／Ｍ１８２Ｃ）；位置２１３のアラニンを置換したセリンおよび位置１５２のヒスチジンを置換したシステインを含む２重変異（Ｈ１５２Ｃ／Ａ２１３Ｓ）；位置１８２のメチオニンを置換したシステイン（Ｍ１８２Ｃ）；位置２１３のアラニンを置換したシステイン（Ａ２１３Ｃ）；位置２１３のアラニンを置換したシステインおよび位置２３８のロイシンを置換したシステインを含む２重変異（Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ）；位置２１６のメチオニンを置換したシステイン（Ｍ２１６Ｃ）；位置２３６のアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ２３６Ｃ）；位置２３８のロイシンを置換したシステイン（Ｌ２３８Ｃ）；位置２８７のアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ２８７Ｃ）；位置２９２のアルギニンを置換したシステイン（Ｒ２９２Ｃ）；位置２９６のバリンを置換したシステイン（Ｖ２９６Ｃ）；位置１４９のグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２１３のアラニンを置換したアルギニンを含む２重変異（Ｅ１４９Ｃ、Ａ２１３Ｒ）；位置１４９のグルタミン酸を置換したシステイン、位置２１３のセリンを置換したアラニンおよび位置２３８のロイシンを置換したセリンを含む３重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｓ／Ｌ２３８Ｓ）；および位置１４９のグルタミン酸を置換したシステイン、位置２１３のアラニンを置換したアルギニンおよび位置２３８のロイシンを置換したセリンを含む３重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）が含まれる。さらなる例を後の第１表に示す。アミノ酸残基番号は、上記の３０９個の残基を有するE.coliの公表された配列を指し、または代替源（例えば、Citrobacter freundiiまたはSalmonella typhimuriumのグルコース／ガラクトース結合タンパク質。配列登録番号はそれぞれＰ２３９２５およびＰ２３９０５）由来の実質的に相同の任意の配列中の対応するアミノ酸残基を指す。
【００２０】
【表１】
2005515409.tif 000002
【００２１】
本発明の変異結合タンパク質または変異ＧＧＢＰ類は、例えば分析物またはグルコースが関与する生物学的反応の速度を追跡できるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ分析物アッセイ、ならびに臨床アッセイ、および食品または飲料の工業的試験で使用することができる。
【００２２】
変異は、１つまたは複数の目的を果たすことができる。例えば、タンパク質の長期安定度を変化させる目的で；特定の封入マトリックス、ポリマーまたは表面にタンパク質を接合、カップリング、連結または他の方法で結びつける目的で；または特定の分析物に関してその結合定数を調整する目的で、あるいはこれらの任意の組合せのために、天然タンパク質を変異させることができる。
【００２３】
本発明では、分析物と変異タンパク質が結合パートナーとして機能する。本明細書で使用する際に、用語「会合」または「結合」は、検出手段によってタンパク質に対する結合を検出することを可能にするほど十分に強い相対結合定数（Ｋｄ）を有する結合パートナーを指す。Ｋｄは、半数のタンパク質が結合したときの遊離の分析物の濃度またはその逆として計算することができる。対象の分析物がグルコースのときには、結合パートナーのＫｄ値が約０．０００１ｍＭから約３０ｍＭであることが好ましい。
【００２４】
本発明では、グルコースが結合時に検出可能な信号を生成するタンパク質を、チオール基を介してセンサー表面に付着させることによって、変異ＧＧＢＰを使用してグルコースの結合を検出できることが示された。本明細書で使用する際に、「検出可能な信号を生成する」とは、リガンド−タンパク質結合の検出を可能にする方法で、センサー表面／タンパク質の組合せの特性変化を認識する能力を指す。例えば、１実施形態では、変異ＧＧＢＰがセンサー表面に付着され、グルコース結合時に起こるタンパク質の配座の変化によってその検出可能な特性（例えば屈折率）が変化する。
【００２５】
変異ＧＧＢＰは、該タンパク質のＮ末端またはＣ末端あるいはその両方にヒスチジンタグを有するように設計されることができる。ヒスチジン融合タンパク質は、タンパク質の精製を補助するために分子生物学の分野で広く使用されている。例示的なタグ系は、約６個のヒスチジンを含むタグを有するタンパク質を生成し、好ましくはこのようなタグ付けは変異ＧＧＢＰの結合活性を損なわない。
【００２６】
本発明の１つの態様では、バイオセンサーを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで分析物を感知する。この態様では、バイオセンサーをマトリックス中に封入し、次いでこれを、埋込み可能なデバイスとして使用する。「マトリックス」は、分析物を透過させるものである限り、円板、円筒、パッチ、マイクロスフェア、多孔質ポリマー、連続気泡発泡体などを含む、任意の望ましい形態または形状をとることができる。マトリックスはさらにバイオセンサーの浸出を防ぐ。マトリックスは、光源からの光、あるいはタンパク質への、またはタンパク質からの他の任意のインターロゲート光がバイオセンサーを通過することを許す。ｉｎ  ｖｉｖｏ用途で使用するとき、バイオセンサーは、実質的に生理的範囲の分析物に曝され、分析物濃度の変化を決定または検出することが望ましい。この決定または検出は、連続検出手段、プログラムされた検出手段および散発的検出手段を含む。したがって、本発明の構想のｉｎ  ｖｉｖｏバイオセンサーは、分析物透過性の捕捉または封入マトリックスの中に、少なくとも１つの変異結合タンパク質およびセンサー表面に付着するための少なくとも１つのチオール基を含み、変異結合タンパク質は、様々な分析物濃度に曝されたときに検出可能で可逆的な信号の変化を引き起こし、およびその検出可能で可逆的な信号は分析物の濃度と関連づけることができるようなものである。
【００２７】
本発明の結合タンパク質バイオセンサーは、マイクロモル濃度（１０−６モル濃度）からモル濃度の分析物濃度を、試薬を消費することなく測定しまたは検出することができる。いくつかの実施形態では、分析物に対するそれらの感度が、バイオセンサーを使用して、とりわけ、低体積の間質液、眼液または汗試料中に存在することが知られている低分析物濃度を測定することを可能にする。いくつかの実施形態では、埋込み可能なバイオセンサーを、間質液、組織または他の体液と相互作用させるために、哺乳動物の表皮−真皮接合部の皮内または皮下に埋め込むことができる。本発明の結合タンパク質バイオセンサーは、使用者または症状の治療にとって適切であるように、分析物を連続的に、一時的に、または「オンデマンド」で監視する手段を提供する。
【００２８】
他の実施形態では、分析物（例えばグルコース）に対するバイオセンサーの感度が、バイオセンサーを使用して血中の分析物のレベルを検査できる感度である。
【００２９】
他の実施形態では、変異タンパク質を使用し、屈折率の変化を測定することによって分析物の結合を検出する。「屈折率」は、一般的な意味、すなわち特定の放射線の真空中での速度と所与の媒質中での速度の比、で使用される。１つの媒質から密度の異なる別の媒質へ移るとき、または密度が不均一な媒質の中を進むときに、光線の方向は変化する（すなわち光線は屈折する）。屈折率の適当な検出または測定装置は、反射分光光度計、ならびに屈折率ベースの他の検出手段、例えば表面プラズモン共鳴手段および長周期格子手段である。
【００３０】
本発明の１つの態様では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してこのような屈折を監視する。ＳＰＲを使用して、２つの分子間の結合特異性を判定し、所与の分子がどれくらい存在し活性であるかを評価し、結合の速度および親和力を定量的に規定することができる。ＳＰＲを使用し、結合および解離プロセス中にセンサー表面で起こる質量濃度の変化を明確にすることによって、時間の経過に伴う生体分子の結合の進行を視覚化することができる。
【００３１】
ＳＰＲは、相対的に屈折率の大きい媒質（例えばガラス）の中を進んでいる光が、相対的に屈折率の小さい媒質（例えば溶液）に十分な傾いた角で遭遇したときに全反射される全反射現象に基づく。ＳＰＲ検出では、このような２つの媒質の界面に金属面が存在することによって、反射光の強度が減衰される。強度の低下は、２つの媒質の屈折率によって決まる明確に規定された角度で起こり、この角度は「共鳴角」と呼ばれている。２つの媒質の界面にタンパク質が吸着すると、この界面の近傍の溶液の屈折率が変化し、反射光が減衰される角度が変化する（すなわち共鳴角が変化する）。
【００３２】
１つの実施形態では、ＳＰＲとともに使用される構成は、薄い金属フィルムでコーティングされたプリズムからなる。本発明の１つの態様では、この表面にＧＧＢＰまたは結合タンパク質を固定化する。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「センサー表面」は、屈折率を測定するために、少なくとも１つの結合パートナーが固定化される場所を指す。センサー表面は、ガラスまたはプラスチックからなる基板を含む。該基板の上には、適当な波長の光と共鳴することができる伝導帯電子を有する適当な金属層が層をなす。様々な金属元素がこの条件を満たす。これには、銀、金、銅、コバルト、アルミニウムなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。１つの実施形態では、センサー表面は取外し可能なマイクロチップである。このトランスデューサ要素構成を例えば、患者の組織に挿入されて、患者に対する散発的、連続的またはプログラムされた読取り、あるいはこれらの組合せを可能にするファイバまたは他の小サイズの最小限の侵襲性を有するプローブの遠位端に組み込むことができる。
【００３４】
例示的な場合において、カルボキシメチル化されたデキストランマトリックスで被覆したセンサー表面に、変異ＧＧＢＰを固定化する。このマトリックスはセンサー表面と共有結合しており、厚さ約１００〜２００ｎｍまたは厚さ２００〜４００ｎｍの柔軟なヒドロゲルを形成する。このデキストランマトリックスを誘導体化して、多数の異なる官能基を付与し、および様々な固定化化学を実現することができる。１つの実施形態では、この手順は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとＮ−エチル−Ｎ’（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとの混合物を用いたデキストランゲルのカルボキシ基の活性化を利用してＮＨＳエステルを形成する。これはタンパク質のアミノ基とのカップリングを可能にする。
【００３５】
別の実施形態では、センサー表面の組成が、チップの表面に配置されたカルボキシメチル層からなる。
【００３６】
本発明で使用することができるさらなる固定化法には、チオール／ジスルフィド交換によるカップリング、アルデヒドカップリング、ヒドラジド基カップリング、スルフヒドリル基カップリング、およびオリゴヒスチジンタグのキレート結合が含まれる。
【００３７】
好ましい実施形態では、変異結合タンパク質の固定化は、本明細書に記載される変異結合タンパク質の任意のシステイン残基とセンサー表面またはその隣接層とのチオールカップリング／ジスルフィド結合を形成することによって達成される。
【００３８】
１つの実施形態では、センサー表面への変異ＧＧＢＰの固定化に成功した後に、速度論的分析を実施することができる。典型的には、いくつかの異なる濃度の分析物をセンサー表面に２回または３回にわたって注入する。例えば、グルコースを定濃度においてセンサー表面の上の緩衝液流に導入し、センサー表面での複合体の形成の進行を監視する。この手順に引き続いて解離段階を実施してもよい。この段階において、緩衝液中に遊離のグルコースは存在せず、複合体解離の時間経過を記録する。最後に、残りの複合体を除去するために、（例えば低ｐＨ緩衝液に短時間暴露することによって）センサー表面を再生することができる。この会合実験、解離実験および再生のサイクルを、異なる濃度のグルコースを使用して繰り返すことができる。光はセンサー表面の裏側に照射され、金属フィルムの表面で生じる電子電荷密度波現象を伝搬させる。これは、センサー表面を越えて延びるエバネセント波の形態をとり、センサー表面の質量変化を検出する。相互作用の化学的速度定数および熱力学的平衡定数に関する情報を含む、一連の結合進行曲線を得ることができる。
【００３９】
ＢＩＡＣＯＲＥ（Uppsala, Sweden）装置を使用する１つの実施形態では、結合進行曲線をセンサーグラムとも呼ぶ。この実施形態では、結合モデルの範囲にデータをフィッティングさせるのに使用することができ、およびＫｄを計算することができるソフトウェアがこの系とともに使用可能である。
【００４０】
結合時の表面の近傍における屈折率の時間依存の変化は、一般にＲＵ（共鳴単位）単位で測定される。１ＲＵはタンパク質約１ｐｇ／ｍｍ２に相当する。
【００４１】
他の実施形態では、生物学的溶液または他の溶液中の分析物の濃度をＳＰＲを使用して求めることができる。本明細書で使用する「生物学的溶液」には、血液、汗、眼液または間質液およびこれらの組合せが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４２】
ＳＰＲを使用して結合パートナー間の結合を評価する市販の装置が、いまや入手可能であるBiacore（Uppsala, Sweden）(BIACORE)、Intersens Instruments BV（Amersfoort, Netherlands）(IBIS)、Texas Instrumentsによって製造されている装置、および実験室で組み立てられたいくつかのＳＰＲ機器）。このような装置の最近のレビューが非特許文献７に見出される。
【００４３】
代替の実施形態では、変異ＧＧＢＰタンパク質を含むアフィニティコーティングをセンサー表面を含むファイバに付着することによって分析物と本発明の変異ＧＧＢＰとの間の結合を検出する光ファイバ長周期格子（ＬＰＧ）を使用して、屈折率を測定することができる（例えばLuna Innovations, Inc.（Blacksburg, VA）の市販機器。非特許文献８も参照されたい）。ＬＰＧは、格子周期、ファイバの屈折率および周囲の媒質の屈折率に基づき特定の波長の光を散乱させる。アフィニティコーティングが標的分子を吸収すると、屈折率が変化し、これによって散乱光の波長が変化し、ＬＰＧがこれを検出する。ＬＰＧファイバセンサーの監視は、Lunascanシステム（Luna Innovations,Inc.）によって実施することができる。このシステムは、分光計、検出器、コントローラ、ラップトップコンピュータからなり、ラップトップコンピュータは、複数のＬＰＧセンサーにインターロゲートするためのインタフェースおよびスイッチング機構を備えている。遠位端あるいはその長手方向に沿った１つまたは複数の位置に対する、上記の技法による、１つまたは複数の変異結合タンパク質のＬＰＧファイバの付着または表面固定化は、本発明の他の実施形態として理解される。
【００４４】
他の実施形態では、検出装置を、変異タンパク質のチオール結合のために適当な層をその上に含む水晶発振子微量天秤（ＱＣＭ）とすることができる。適当なＱＣＭ装置は例えば非特許文献９に記載の装置である。
【実施例】
【００４５】
以下の実施例は、本発明の好ましいいくつかの実施形態を説明する。ただしこれらは、すべての実施形態を説明することを意図したものではない。
【００４６】
（実施例１）  ヒスチジンタグのない変異タンパク質の発現および精製方法
ＧＧＢＰは、E.coliのＭｇ１Ｂ−１遺伝子によってコードされている。Ｍｇ１Ｂ−１遺伝子の部位特異的変異誘発によりアミノ酸であるシステインを様々な位置に導入することによって、このタンパク質を変化させた。次いで、E.coli中でこれらのタンパク質を発現させ、そして精製した。
【００４７】
Ｍｇ１Ｂ−１のカセット式変異誘発は以下のように実施した。野生型Ｍｇ１Ｂ−１遺伝子を、ｐＴＺ１８Ｒベクタ（Dr.Anthony Cass, Imperial College, London, England）の中でクローン化した。非特許文献１７に記載の方法に本質的に従ったランダムなアミノ酸配列を生成するカセット式変異誘発を使用して、この親プラスミドから変異プラスミドを生成し、E.coli JM109（Promega Life Science, Madison, WI）の中でクローン化した。塩基配列決定によって変異プラスミドを同定した。以下のようにJM109の中で変異タンパク質を誘導し、および精製した。変異プラスミドを含むE.coli JM109コロニーを、アンピシリン（Ａｍｐ）５０μｇ／ｍＬを含む３７℃のＬＢブロス（ＬＢ／Ａｍｐ）中で振盪（２２０ｒｐｍ）しながら一晩増殖させた。この一晩増殖物を、新鮮なＬＢ／Ａｍｐ  １Ｌで１００倍に希釈し、培地のＯＤ６００が０．３〜０．５になるまで振盪しながら３７℃で培養した。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を添加し、培養および振盪を３７℃で４〜６時間継続することによって、変異の発現を誘導した。遠心法（１０，０００ｇ、１０分、４０℃）によって細胞を回収した。
【００４８】
浸透圧性衝撃によって変異タンパク質を回収し、カラムクロマトグラフィによって精製した。細胞ペレットをスクロース緩衝液（３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁させ、室温で１０分間培養し、次いで遠心処理した（４０００ｇ、１５分、４℃）。上澄みを流出させ、氷上に保持した。細胞ペレットを再懸濁させ、氷温の無菌脱イオン水１０ｍＬを繰り返し、懸濁液を氷上で培養し遠心処理した。残った上澄みを、別に集めた他の上澄みと一緒にし、再び遠心処理した（１２，０００ｇ、１０分、４℃）。一緒にした衝撃液(shockate)を０．８μｍフィルタ、次いで０．４５μｍフィルタでろ過した。５％ｗ／ｖの硫酸ストレプトマイシン（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を衝撃液に加え、３０分攪拌し、次いで遠心処理した（１２，０００ｇ、１０分、４℃）。次いで、Amicon Centriprep 10（10,000 MWCO）フィルタ（Charlotte, NC）を使用して衝撃液を濃縮し、５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２に対して一晩透析した。透析した衝撃液を遠心処理した（１２，０００ｇ、３０分、４℃）。得られた上澄みを、予め平衡化させたDEAE Fast Flow Sepharoseカラム（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）に０．５ｍＬ／分の速度で加えた。このカラムを、５〜１０カラム容積の洗浄液で洗浄した。このカラムに０〜０．２Ｍ  ＮａＣｌの直線的勾配を適用し、フラクションを集めた。変異タンパク質を含むフラクションを、クーマシーブリリアントブルー染色（ｍｗ約３２ｋＤａ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定した。フラクションを集めて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．４）に対して終夜で透析し（４℃）、Amicon Centriprep 10フィルタを使用して濃縮し、４℃、またはグリセロールを用いて−２０℃で貯蔵した。この重炭酸アンモニウムで透析されたタンパク質を凍結乾燥させた。
【００４９】
（実施例２）  ヒスチジンタグを含む変異ＧＧＢＰの発現および精製
部位特異的変異誘発またはカセット式変異誘発によってＧＧＢＰ変異を設計した。部位特異的変異誘発（QuikChange, Stratagene, La Jolla, CA）を実行し、１つのアミノ酸を別のアミノ酸（特に選択した他のアミノ酸）で置換することによって、ｐＱＥ７０ベクタの個々のアミノ酸を変更した。カセット式変異誘発法（非特許文献１７）を実行して、ＧＧＢＰ遺伝子の指定された領域のアミノ酸をランダム化した。次いでこれらの変異したカセットをｐＱＥ７０発現ベクタの中でサブクローン化した。
【００５０】
ｐＧＧＢＰ−Ｈｉｓプラスミドは、ｐＱＥ７０発現ベクタ（Qiagen, Valencia, CA）の中へとクローン化されたＧＧＢＰ遺伝子を含む。この構成は、ＧＧＢＰ遺伝子のＣ末端に６個のヒスチジン残基を配置する。E.coli SG13009株を使用して、変異ＧＧＢＰ−Ｈｉｓを標準手順（Qiagen）に従って過剰発現させた。２５０ｍＬ培地の過剰発現の後、遠心法（６０００ｒｐｍ）によって細胞を集め、２５ｍＬのBugBusterバッファー（Novagen, Madison, WI）の中で再懸濁させた。リゾチーム（２５ｍｇ）をこの溶解産物に加え、この混合物を、室温で３０分間にわたって静かに混合した。遠心法（６０００ｒｐｍ）によって透明な溶解産物を得て、これに、イミジゾール（１Ｍ）０．５ｍｌおよびＮｉ−ＮＴＡビーズ（Qiagen）３ｍｌを加えた。室温で静かに３０分混合した後、混合物を遠心処理し（６０００ｒｐｍ）、溶解産物を除去した。ビーズを溶液２５ｍｌ（１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で洗浄し、再び遠心処理した。溶液（１６０ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、１５分混合することによって、ビーズから変異ＧＧＢＰ−Ｈｉｓを溶離した。直ちにCentriplus YM-100フィルタ（Amicon, Charlotte, NC）を使用してタンパク質溶液をろ過し、次いで、Centriplus YM-10フィルタを使用して１〜３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。このタンパク質を、貯蔵溶液（１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ８．０）２Ｌに対して一晩透析した。
【００５１】
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％BIACORE界面活性剤Ｐ２０（BIAcore）（HBS-P）流動緩衝液中、流量５μｌ／分で標準的チオールカップリング反応を使用したチオール結合によって、カルボキシメチルデキストラン（CM5）センサー表面（BlAcore）にタンパク質を固定化した。エタノールアミン（EDC/NHS）の２分間のパルス、引き続いて８０ｍＭ  ２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン（ＰＤＥＡ）、０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）の４分のパルスを用いてセンサー表面を活性化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中、１：５０希釈のＥ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ（１．８ｍｇ／ｍｌ）を様々な回数注入した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中の１：１０希釈の炭酸脱水酵素II（５ｍｇ／ｍｌ）を２０分間注入した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中の１．５０希釈のＧ７４Ｃ  ＧＧＢＰ（２．６ｍｇ／ｍｌ）を１２分間注入した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中の１：２０希釈のＡ２１３Ｃ  ＧＧＢＰ（０．６ｍｇ／ｍｌ）を２４分間注入した。５０ｍＭシステイン、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍギ酸ナトリウム、ｐＨ４．３の４分のパルスを使用して反応をクエンチし、非特異的に結合したタンパク質をセンサー表面から除去した。固定化に続いて、プロトコルDESORB（０．５％ＳＤＳ、５０ｍＭグリシン、ｐＨ９．５）を実行して、系からタンパク質凝集体を除去した。実験には、３０００ＲＵ（Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ）、４５００ＲＵ（炭酸脱水酵素）、２０００ＲＵ（Ａ２１３Ｃ  ＧＧＢＰ）および４０００ＲＵ（Ｇ７４Ｃ  ＧＧＢＰ）の表面を使用した。
【００５２】
ＨＢＳ−Ｐ流動緩衝液中、流量５μｌ／分で標準的アミンカップリング反応を用いたアミンカップリングによって、カルボキシメチルデキストラン（CM5）センサー表面（BlAcore）にタンパク質を固定化した。ＥＤＣ／ＮＨＳの７分のパルスでセンサー表面を活性化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中の１：５０希釈のタンパク質（ＷＴ  ＧＧＢＰ、２ｍｇ／ｍｌ；Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ、１．８ｍｇ／ｍｌ）を２０分間注入した。１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）パルスを注入して反応をクエンチし、非特異的に結合したタンパク質を除去した。実験には、４８００ＲＵ（Ｅ１４９Ｃ）および２４００ＲＵ（野生型ＧＧＢＰ）の表面を使用した。
【００５３】
Ｃ１表面へのＥ１４９Ｃ  ＧＧＢＰのチオールカップリングを以下のように実施した。ＨＢＳ−Ｐ流動緩衝液中、流量５μ／分で標準チオールカップリング反応を使用して、カルボキシメチル（C1）チップ上にＥ１４９Ｃ  ＧＧＢＰを固定化した。ＥＤＣ／ＮＨＳの４分のパルス、これに続く０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）の８０ｍＭ  ＰＤＥＡの４分のパルスによってＣｌ表面を活性化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中、１：２希釈のＥ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ（１．８ｍｇ／ｍｌ）を流量１μｌ／分で５０分間注入した。５０ｍＭシステイン、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍギ酸ナトリウム、ｐＨ４．３の７分のパルスを使用して反応をクエンチし、非特異的に結合したタンパク質をセンサー表面から除去した。実験には９０００ＲＵの表面を使用した。
【００５４】
Ｃ１表面へのＥ１４９Ｃ  ＧＧＢＰのアミンカップリング。ＨＢＳ−Ｐ流動緩衝液中、流量５μｌ／分の標準アミンカップリング反応を使用してＣ１チップ上にＥ１４９Ｃ  ＧＧＢＰを固定化した。ＥＤＣ／ＮＨＳの７分のパルスでこの表面を活性化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中、１：２希釈のＥ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ（１．８ｍｇ／ｍｌ）を、流量１μｌ／分で５０分間注入した。１Ｍ  エタノールアミン（ｐＨ８．０）パルスを使用して反応をクエンチし、特異的に結合したタンパク質を除去した。
【００５５】
すべてのグルコース注入は、具体的実験に対して適当な流動緩衝液中で２５℃で実施した。グルコース注入は流量１０μｌ／分で１０μｌであった（接触時間１分）。異なるグルコース濃度の注入を３回繰り返し、タンパク質表面とブランク表面との間で交互に実施した。流動緩衝液を用いた流路の洗浄、および続く流動緩衝液の注入によってタンパク質表面を再生させた。センサーグラムは、ブランク表面を差し引くか、または最初にブランク表面上のグルコース注入をタンパク質表面の対応するグルコース注入からに差し引くことによって二重対照するかのいずれかであった。次いで、ブランク表面上の緩衝液注入をタンパク質表面の緩衝液注入から差し引いた。規格化した緩衝液注入を規格化したグルコース注入から差し引くことによって最終的なセンサーグラムを得た。
【００５６】
１ＭグアニジンＨＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いた一晩の連続フローによって、活性Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ表面（３０００ＲＵ）を変性させた。タンパク質の変性の後、ＨＢＳ−ＥＰ中でグルコース注入を実行した。流動緩衝液をＨＢＳ−Ｐ、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２に変更し、連続フローを一晩実行することによって、グルコース信号を回復させた。
【００５７】
図１に、グルコース検出に対するカップリング法の効果を示す。図１では、括弧内のカップリング方法を用いて固定化したタンパク質が示されている。指示された表面の上に１分間にわたり、流動緩衝液および１００μＭグルコースを注入した。注入中の１０秒から５０秒に対応する時間枠の間で、二重対照センサーグラムを平均した。注入はそれぞれ３回実施した。この図から明らかなように、変異ＧＧＢＰ  Ｅ１４９Ｃにおけるチオール−カップリングによって、アミノカップリングまたは緩衝液だけに比べて著しく増強されたグルコース結合後の信号が得られた。
【００５８】
図２に、グルコースと優先的に結合するＥ１４９Ｃ変異ＧＧＢＰの特異性を示す。３０００ＲＵのチオールカップリングしたＥ１４９Ｃ表面に、指示された糖を濃度１００μＭで注入した。注入中の１０秒から５０秒に対応する時間枠の間で、二重対照センサーグラムを平均した。注入はそれぞれ３回実施した。この図から明らかなように、グルコースは、他の糖よりも容易にチオールカップリングした変異体に結合し、この変異体の選択性が維持されていることを示している。
【００５９】
図３に、ＧＧＢＰのＥ１４９Ｃ変異体の、変性後および再生後のグルコース検出の結果を示す。活性のチオールカップリングしたＥ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ表面を、先に概要を示したプロトコルに従って変性させた。ＨＢＳ−ＥＰ注入を実行し、続いて１ＭグアニジンＨＣｌを用いて一晩変性させた。この方法ではグルコース信号は生じなかった。ＨＢＳ−Ｐおよび１．５ｍＭＣａＣｌ２を注入し、続いて緩衝流液中での一晩の連続フローを実施した後に、グルコース信号が回復した。注入中の１０秒から５０秒に対応する時間枠の間で、二重対照センサーグラムを平均した。注入はそれぞれ３回実施した。
【００６０】
図４および５に、チオールカップリングしたＥ１４９Ｃ  ＧＧ１３Ｐ表面上でのグルコース滴定を示す。図４に、濃度０、０．１μＭ、１．０μＭ、１０μＭおよび１０００μＭのグルコース注入に由来するセンサーグラムを示す。センサーグラムは、対応するブランク表面注入をタンパク質表面注入から差し引くことによって規格化した。図５に、グルコース濃度とその応答（ＲＵ）とのプロットを示す。注入中の１０秒から５０秒に対応する時間枠の間で、ブランクを差し引いたセンサーグラムを平均した。注入はそれぞれ３回実施した。
【００６１】
図６および７に、固定化されたＥ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ  Ｃ１表面上でのグルコース検出を示す。図６のセンサーグラムは、９０００ＲＵのチオールカップリングしたタンパク質表面上の流動緩衝液および１００μＭグルコース注入に由来する。このチオールカップリングした表面のグルコース検出は明らかである。２０００ＲＵのアミンカップリングしたタンパク質表面上の流動緩衝液および１００μＭグルコース注入の結果を示す図７のセンサーグラムでは、グルコースの結合は見られない。センサーグラムは二重対照した。
【００６２】
図８に、Ｅ１４９Ｃ以外のチオールカップリングした変異体を使用したＳＰＲによるグルコース検出を示す。Ｇ７４ＣおよびＡ２１３Ｃ変異体の両方とも、信号が増強されたグルコース検出を示した。指示されたチオールカップリングした表面の上に、０．１ｍＭおよび１ｍＭグルコースを含む流動緩衝液を１分間注入した。注入中の１０秒から５０秒に対応する時間枠の間で、二重対照センサーグラムを平均した。注入はそれぞれ３回実施した。チオール変異体およびそれらの性能の概要を第２表に示す。チオールを含まないＷＴ  ＧＧＢＰおよび変性Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰタンパク質は、代表的な陰性の対照標準である（それぞれ表のエントリー３および７）。この表に示すとおり、野生型およびアミンカップリング試料に比べて、本発明のチオールカップリングした変異タンパク質は、バックグラウンドを超える信号の向上を示している。さらに、これらのデータは、様々なセンサー表面に対する幅広い適用可能性を指示した（ＣＭ５およびＣ１表面へチオールカップリングしたタンパク質を示すエントリー１および９を参照されたい）。
【００６３】
【表２】
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【００６４】
ＳＰＲ信号は、ブランクを差し引いたものか、または二重対照したものである。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】チオール結合Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ、アミン結合Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰおよびアミン結合野生型（ＷＴ）ＧＧＢＰを利用したＳＰＲを使用する、グルコース検出を示す図である。
【図２】糖のパネルに結合させたときのチオール結合Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ変異タンパク質のＳＰＲ応答を示す図である。
【図３】変性後および塩化カルシウムが存在する緩衝液を用いた再生後のグルコースに対するチオール結合Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ変異タンパク質のＳＰＲ応答を示す図である。
【図４】チオール結合Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰの表面に、ある範囲のグルコース濃度を注入したときの時間の経過に伴うＳＰＲ応答を示す図である。
【図５】図４に示したデータセットのグルコース濃度範囲の滴定曲線を示す図である。
【図６】チオール結合Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ変異タンパク質の、カルボキシメチル表面（Ｃ１チップ）上でのグルコースに対するＳＰＲ応答を示す図である。
【図７】アミン結合Ｅ１４９Ｃ  ＧＧＢＰ変異タンパク質の、カルボキシメチル表面（Ｃ１チップ）上でのグルコースに対するＳＰＲ応答を示す図である。
【図８】チオール結合Ｇ７４Ｃ  ＧＧＢＰおよびチオール結合Ａ２１３Ｃ  ＧＧＢＰ変異タンパク質のＳＰＲを使用するグルコース検出を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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