(57)【要約】本発明は、真核及び原核細胞の寿命を調節したり、細胞を熱ショックなどの特定のストレスから保護するための方法及び組成物を提供するものである。方法の１つは、細胞内のNAD＋再利用経路を通る流れを、例えば、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択される１つ以上のタンパク質のレベル又は活性を調節するなどにより、調節するステップを含む。別の方法は、細胞内のニコチンアミドのレベルを調節するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する方法であって、前記細胞内のNAD＋再利用経路を通る流れを調節するステップを含む、方法。
【請求項２】
NAD＋再利用経路を調節する前記ステップが、NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質のレベル又は活性を調節するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
調節が増加させることであり、前記方法が、NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質のレベル又は活性を増加させるステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2 から成る群より選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、又は、細胞内の前記NAD＋再利用経路を通る流れを増加させるために充分な、少なくともその一部分、を細胞内に導入するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2 から成る群より選択される一種以上のタンパク質をコードする少なくとも５つのヌクレオチド配列、又は、細胞内の前記NAD＋再利用経路を通る流れを増加させるために充分な、少なくともその一部分、を細胞内に導入するステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
NPT1、PNC1、NMA1 及びNMA2 から成る群より選択される少なくとも１つのタンパク質、又は、細胞内の前記NAD＋再利用経路を通る流れを増加させるために充分な、少なくともその一部分、を細胞内に導入するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する方法であって、前記細胞内のニコチンアミドのレベルを調節するステップを含む、方法。
【請求項８】
調節が増加させることであり、前記方法が、細胞をニコチンアミド又はその類似体に接触させるステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞の寿命を、少なくとも約４０％、延ばす、請求項２又は７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がin vitroにある、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が真核細胞である、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１４】
ストレスが熱ショック浸透圧ストレス；DNA損傷性作用因子；不適切な塩レベル；不適切な窒素レベル、又は不適切な栄養レベルである、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１５】
NAD＋再利用経路を通る流れを調節するステップが、基本的にNAD＋及びNADHの定常状態レベルを変えずに行われる、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１６】
細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する化合物を特定する方法であって、
（ｉ）NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NNMT、NAMPRT、NMNAT-1、及びNMNAT-2 から成る群より選択されるタンパク質を、検査化合物に、前記タンパク質の活性に影響するのに充分であろう時間、接触させるステップと、
（ｉｉ） 前記酵素の活性を判定するステップであって、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下での前記酵素の活性の違いは、前記検査化合物が、細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する化合物であることを示す、ステップと
を含む方法。
【請求項１７】
細胞の寿命、又は、そのストレス耐性を調節する化合物を特定する方法であって、
（ｉ）NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NNMT、NAMPRT、NMNAT-1、及びNMNAT-2 から成る群より選択される遺伝子の転写調節核酸を、レポータ遺伝子に作動上連結させて含む細胞又はライセートを、検査化合物に、前記転写調節核酸に影響するのに充分であろう時間、接触させるステップと、（ｉｉ） 前記レポータ遺伝子のレベル又は活性を判定するステップであって、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下での前記レポータ遺伝子のレベル又は活性の違いは、前記検査化合物が、細胞の寿命、又は、そのストレス耐性を調節する化合物であることを示す、ステップと
を含む方法。
【請求項１８】
細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞の寿命又はそのストレス耐性が調節されたかどうかを判定するステップとを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項１９】
Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤を特定する方法であって、
（ｉ）コンピュータ・モデリング・アプリケーションに、分子又は分子複合体の一組の構造座標を提供するステップであって、前記分子又は分子複合体が、Ｃポケットを含むSir2ファミリ・メンバの少なくとも一部分を含む、ステップと、
（ｉｉ）前記コンピュータ・モデリング・アプリケーションに、ある化学的実体の一組の構造座標を提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記化学的実体が、前記分子又は分子複合体に結合する又は干渉すると予測される阻害剤であるかどうかを判定するステップであって、前記分子又は分子複合体に結合又は干渉することは、Sir2ファミリ・メンバの活性の潜在的阻害の指標である、ステップと
を含む方法。
【請求項２０】
前記化学的実体がニコチンアミドの類似体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤を特定する方法であって
（ｉ）少なくともＣポケットを含むSir2ファミリのタンパク質を、検査化合物に、前記検査化合物が前記Sir2ファミリのタンパク質のＣポケットにおそらくは結合するのに充分な時間、接触させるステップと、
（ｉｉ）タンパク質の活性を判定するステップであって、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比べたときに、前記検査化合物の存在下で、前記タンパク質の活性が低いことは、前記検査化合物が、Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤であることを示す、ステップと
を含む方法。
【請求項２２】
対象の細胞死又は老化に関連する障害を治療又は予防する方法であって、細胞死又は老化に易罹患性又は罹患性の細胞においてNAD＋再利用経路を通る流れを増加させる、又は、細胞内のニコチンアミドレベルを下げる作用薬を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
細胞の寿命を下げる、又は細胞をストレスに対してより感受性とすることが有益であるような障害を治療又は予防する方法であって、対象のNAD＋再利用経路を通る流れを減らす、又は、細胞内のニコチンアミドレベルを増加させる作用薬を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
生理学的研究や、より最近の遺伝子発現パターンのDNAアレイ解析により、老化は複雑な生物学的プロセスであることが裏付けられている。対照的に、モデル生物での遺伝子研究では、生物の環境又は遺伝子の構成に比較的小さな変化があっても、老化プロセスが劇的に遅くなることが実証されている。例えば、数多くの多様な生物の寿命は、単にカロリ制限と呼ばれる食餌療法でカロリ摂取を制限するだけで、大きく延ばすことができる（１−３）。
【０００２】
なぜ単純な変化が、このような深遠な効果を老化などの複雑なプロセスにもたらすのであろうか？すべての真核生物は、老化の速度を支配している驚くべき保存された調節系を持つという画が浮かびつつある。 このような調節系は、資源を、成長及び生殖から、ストレス耐性をもたらす経路へと方向修正することにより、生物が逆境を生き延びられるようにするために、進化の過程で生じたのかも知れない（４，６）。
【０００３】
老化の調節因子の解明で特に有用であることが判明したモデルの一つは、出芽酵母、Ｓ．セレビジエ（原語：S. cerevisiae）である。Ｓ．セレビジエの複製寿命は、典型的には、個々の「母細胞」が生ずる「娘細胞」の出芽の数であると定義されている（７）。母細胞は、大きさの増加、細胞周期の鈍化、仁の肥大、定常状態NAD＋レベルの増加、糖新生及びエネルギ貯蔵の増加、テロメア及び接合型遺伝子座におけるサイレント状態が失われることによる不稔性を含め、年齢依存的な変化を起こす（８−１３）。酵母寿命の別の尺度は、暦老化として知られ、非分裂細胞の集団が、栄養物質を絶たれたときに生存した状態に留まる時間の長さである（１４）。暦寿命の増加は、熱ショック及び酸化ストレスに対する耐性の高まりと相関関係にあり、細胞成分への損傷の累積が、この種類の老化の大きな原因であることが示唆されている（１４，１５）。複製老化及び暦老化の間の重複の程度は、現在のところ不明である。
【０００４】
酵母複製老化の原因の一つは、反復したリボゾームDNA（rDNA）遺伝子座の不安定性から生ずることが示されている（１６）。この不安定性のために、複製はするが分裂して娘細胞になることができないERCと呼ばれる環状の形のrDNAが生ずる。最終的には、ERCは1000コピーを越えるまで蓄積し、これが、必須な転写及び／又は複製因子を滴定してしまうことで、細胞を致死させると考えられている（１６−１８）。カロリ制限又はfob1 欠失など、DNA組換えを減らす療法が、複製寿命を延ばす。
【０００５】
酵母において老化の鍵となる調節物質は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD＋）依存的デアセチラーゼであるSir2サイレンシングタンパク質（１７）である（２１−２４）。Sir2は、テロメア及び２つのサイレント接合型遺伝子座において、サイレントなヘテロクロマチンの形成を触媒するヘテロ三量体型Sir2/3/4複合体の一成分である（２５）。Sir2はまた、rDNA遺伝子座でのサイレント状態や終期から出るのに必要なRENT複合体の一成分でもある。さらにこの複合体については、Pol IによるrRNAの転写を直接刺激したり、仁構造の調節に関与していることが最近示されている（２８）。
【０００６】
生化学的研究では、Sir2、はヒストンH3及びH4のアミノ末端のテイルを容易に脱アセチル化して、1-O-アセチル-ADP-リボース及びニコチンアミドを形成させることができることが示されている（２１−２３，２９）。SIR2 のコピーを付加的に持つ株は、rDNAサイレント状態の増加や（３０）、30%長い寿命を示す（１７）。最近では、Ｃ．エレガンス（原語：C. elegans）のSIR2相同体であるsir-2.1のコピーが付加的にあると、この生物の寿命が大きく延びることが示されている（３１）。このことは、老化のためのSIR依存的調節経路は進化の早い段階で生じ、よく保存されてきたことを意味している（４）。 酵母の寿命も、後生動物のそれと同様に、カロリ制限に似た介入により引き延ばされている（１９，３２）。グルコース応答性cAMP（アデノシン3,5-モノホスフェート）-依存的（PKA）経路の活性を減らす変異は、野生型細胞では寿命を延ばすが、変異sir2 株では延ばさないことから、SIR2 は、カロリ制限経路の下流にある鍵となる成分であることが分かる（１９）。
【０００７】
大半の生物では、２つのNAD＋生合成経路がある（図１を参照されたい）。NAD+は、トリプトファンからde novo合成されたり、また、ニコチンアミドからNAD＋再利用経路を通る４つの段階を経て再循環する場合がある。細菌 NAD＋再利用経路の一番目の段階では、ニコチンアミドのニコチン酸及びアンモニアへの加水分解が、pncA 遺伝子産物により触媒される（３３）。pncAに対して相同性のＳ．セレビジエの遺伝子 YGL037は最近、名称PNC1 (SGD)を与えられている（３４）。S.セレビジエではNPT1遺伝子にコードされているニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、この反応からのニコチン酸をニコチン酸モノヌクレオチド (NaMN)に転化させる（３５−３８）。この時点で、NAD＋再利用経路及びde novo NAD＋経路が一つになり、NaMNが、デスアミド-NAD＋（NaAD）に、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ(NaMNAT) により転化させられる。S.セレビジエでは、YLR328（３９）と、特徴付けがまだ済んでいないORFであるYGR010という、細菌 NaMNAT遺伝子に対して相同性を持つ２つの推定ORFがある（２３，３９）。我々はこれら２つのORFをそれぞれNMA1 及びNMA2と言及する。サルモネラでは、NAD＋の再生の最終段階は、NADシンセターゼにより触媒される（４０）。まだ特徴付けの済んでいないORFのQNS1は、NAD シンセターゼをコードしていると予測される（２３）。
【０００８】
酵母では、NPT1にヌル変異があると、定常状態のNAD＋レベルが、最高２分の１に減少して（２３）、カロリ制限によりもたらされる長寿が損なわれる（１９）。カロリ制限が複製寿命をどのように延ばすかを説明する現在の仮説の一つは、代謝活性の低下が、NAD＋レベルの増加を引き起こし、こうしてSir2 活性を刺激する、というものである （Campisi, 2000 及びGuarente, 2000にレビュー）。
【０００９】
転写のサイレント状態は、ゲノム中の異なる部位でのクロマチンの遺伝性の修飾に関係している。サイレント状態とは、それがプロモータ非特異的であり、しばしばゲノム遺伝子座全体を包含する場合に長距離リプレッションと呼ばれる(１’，２’）。酵母では、より高等な真核生物のヘテロクロマチンと同様に、DNAのこのようなサイレント領域には、幅広い修飾が起き易い（３’）。これらの修飾で最もよくなされた研究の中に、ヒストンの可逆的アセチル化がある（４，５にレビュー）。
【００１０】
ヒストンのアセチル化状態に影響する２つの種類の酵素がある：ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）及び対抗するヒストンデアセチラーゼ（HDAC）である。ゲノムのより転写活性な区域と比較すると、クロマチンのサイレント領域内にあるヒストンは、特にコア・ヒストンH3及びH4のNH2末端テイル上で、低アセチル化していることが知られている（６’）。３つのクラスのヒストンデアセチラーゼが解説されており、また、酵母タンパク質に対する相同性に基づいて分類されている。クラスＩ（Rpd3様）及びクラスＩＩ（Hda1様）のタンパク質は、阻害剤トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）へのそれらの感受性により特徴付けられている（７，８）。この阻害剤を用いた研究では、細胞周期、分化、及びアポトーシスの調節因子の発現へのこれらのタンパク質の関与を含め、これらの細胞内での働きに関して豊富な情報が得られた（９’にレビュー）。
【００１１】
酵母Sir2 は、クラスＩＩＩ HDACの始祖ファミリである。Sir2様デアセチラーゼはTSAによって阻害されず、NAD＋依存的であるという固有の特徴を有する（１０’−１３’）。このクラスのタンパク質は、細菌からヒトまで、幅広い種類の生物に見られる。酵母のHst2及びヒトのSIRT2という少なくとも２種のSir2相同体が細胞質に局在しており、ヒトSIRT1は最近、p53を脱アセチル化の標的とすることが示された（１１’１３’−１５’）。これらの結果は、このファミリのメンバのすべてが、ヒストン又は他の核内基質に特異的という訳ではないことを示している。
【００１２】
サイレント情報調節因子（SIR）というこの用語は、当初、Ｓ．セレビジエで接合型遺伝子座（HML及びHMR）の抑制に必要な一揃いの非必須遺伝子を言うために造語された（１６’）。酵母でのサイレント状態はまた、テロメア及びリボゾームDNA（rDNA）遺伝子座でも観察されている（２’，１７’）。接合型遺伝子座と、酵母テロメアのポリ（TG1-3）管でのヘテロクロマチンの形成は、Sir2、Sir3 及びSir4（１８，１９）のヘテロ三量体型複合体によって媒介される。rDNA遺伝子座においては、Sir2は、Net1及びCdc14を含むRENT（regulator of nuleolar
silencing and telophase exit）複合体の一部である。これらのタンパク質のうちで、Sir2は、これら３つのサイレント領域すべてで、サイレント状態にとって不可欠な唯一の因子である（２２’−２４’）。
【００１３】
酵母rDNA遺伝子座 (RDN1) は、100-200 回タンデムに反復した9 kbのユニットから成り、リボゾームRNAをコードしている。酵母の老化の主要な原因は、染色体外rDNA環（ERC）の切り出しにつながる、これらの反復間の組換えから生ずる（２５’−２７’）ことが示されている。ERCは複製はするが分離して娘細胞になることはできず、従って細胞分裂時には指数関数的に増幅される。ERCは、古い細胞の酵母ゲノム全体のそれよりも大きなDNA含有量になるまで蓄積することがあり、必須な転写及び／又は複製因子を滴定することにより、細胞を致死させると考えられている（２８’）。Sir2 は、rDNAに一体化されたPol II転写型遺伝子をサイレント状態にするが、この遺伝子座でのその主な働きは、組換えを抑制することであるとの証拠がある。SIR2 を欠失させるとrDNAサイレント状態が消え、マーカ遺伝子がrDNAの外で組換えられる頻度が１０倍に増加する（２９’）。その結果、ERCの形成が増し、寿命が劇的に短縮される（２９’，３０’）。
【００１４】
Sir2は酵母の長寿を制限する一要素である。SIR2遺伝子のコピーが余分に一つでもあると、組換えが抑制されて寿命が４０％延びる（２６’、３１’、３２’）。最近、SIR2が、検査された生物すべてで寿命を延ばす療法であるカロリ制限によりもたらされる寿命の延び（３１”）に必須であることが示された。さらに、Sir2相同体である sir2.1 を多量に投与すると、線虫Ｃ．エレガンスの寿命が延びることが示されており（３３’）、最も近いヒトの相同体SIRT1は、p53の脱アセチル化を通じてアポトーシスを阻害することが示されている（３４’，３５’）。これらの発見は、Sir2及びその相同体は、細胞及び生物レベルで生存を調節する保存された役割を有していることを示している。
【００１５】
最近、Sir2様デアセチラーゼの生化学的性質に大きな洞察が得られた（３６’にレビュー）。In vitroでは、Sir2 は、ヒストンH4のリジン16に、そしてヒストンH3のリジン9及び14に対して特異性を有する（１０’、１２’、１３’）。TSA感受性HDACはコファクタを要せずに脱アセチル化を触媒するが、Sir2反応にはNAD＋が必要である。これにより、この共基質の利用能の違いを通じて、Sir2の活性の調節が可能になっている（１０’−１３’）。Sir2の脱アセチル化は、NDA＋のADP-リボース成分をニコチンアミドに繋げている高エネルギグリコシド結合の切断に接続している。切断が起きると、Sir2は、アセチル基のADP-リボースへの移動を触媒する（１０’，１１’，１５’，３７’）。この移動反応の生成物はO-アセチル-ADP-リボースという、新規な代謝産物であり、これが、細胞周期での遅れ／遮断を引き起こしたり、胚の卵子成熟を引き起こすことが最近、示された（３８’）。
【００１６】
脱アセチル化の他方の産物は、ニコチン酸の前駆物質であり、ビタミンB3の一つの形であるニコチンアミドである（３９’）。高用量のニコチンアミド及びニコチン酸がしばしば、不安、変形性関節症、精神病を含むある範囲の状態を自己治療するために交換可能に用いられており、ニコチンアミドは現在、癌及びＩ型糖尿病の治療法として臨床治験中である（４０’）。これらの治療に用いられる高用量の長期安全性は疑問視されており（４１’）、これらの化合物の分子レベルでの効果の可能性は明らかではない。
【００１７】
発明の概要
ある実施態様では、本発明は、細胞内のNAD＋再利用経路を通る流れを調節するステップを含む、細胞の寿命やそのストレスへの耐性を調節する方法を提供するものである。本方法は、細胞内のNAD＋再利用経路を通る流れを増加させるステップを含む、細胞の寿命を増加又は延命させること、又は、そのストレスへの耐性を増すことを含むものであろう。NAD＋再利用経路を通る流れの調節は、NAD＋及びNADHの定常状態レベルを基本的に変えることなく、そして基本的には細胞内のNAD＋／NADH比を維持することにより、起こさせられよう。
【００１８】
NAD＋再利用経路を通る流れを増加させるステップは、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質のレベル又は活性を増加させるステップを含むであろう。該方法は、細胞内に、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、又は、ある遺伝子の少なくとも５個のコピーを含む核酸、を導入するステップを含むものでもよい。代替的には、該方法は、細胞内に、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択される少なくとも１つのタンパク質を導入するステップを含むものでもよい。該方法は、細胞を、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択される遺伝子の発現を上方調節する作用薬に接触させるステップを含んでもよい。該細胞は少なくとも約40%長く生きる場合、又は少なくとも約60%長く生きる場合もあるであろう。
【００１９】
さらに本発明は、細胞内のNAD＋再利用経路を通る流れを増加させるステップを含む、例えば熱ショック、浸透圧ストレス、DNA損傷性作用因子（例えば紫外線）、及び適切でない窒素レベルなどのストレスに対する細胞の耐性を増す方法も提供する。
【００２０】
ある実施態様では、細胞の寿命を調節するステップは、細胞内のサイレント状態を調節するステップを含む。サイレント状態には、テロメアのサイレント状態や、rDNAの組換えが含まれよう。
【００２１】
その寿命を延ばすことのできる、あるいは、それをストレスから保護することのできる細胞は、酵母細胞などの真核細胞、又は、細菌細胞などの原核細胞であってよい。当該細胞は in vitro にあっても、又はin vivoにあってもよい。
【００２２】
別の実施態様では、細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節するステップは、細胞内のニコチンアミドの量を調節するステップを含む。例えば、細胞の寿命を低下させるステップ、又は、細胞をストレスにより感受性にするステップは、細胞内のニコチンアミドのレベルを増加させるステップを含んでもよい。これは、細胞を、約１乃至２０ｍＭ、好ましくは約２乃至１０ｍＭの量のニコチンアミドに接触させるステップを含んでもよい。細胞内のニコチンアミドのレベルは、ニコチンアミドの生合成に関与する酵素のレベル又は活性を増したり、又は、ニコチンアミドを分解又は失活させる酵素のレベル又は活性を減らすことによっても、増加させられよう。ニコチンアミドを失活させる酵素には；PNC1；ニコチンアミド N-メチルトランスフェラーゼ（NNMT 及びNNT1）；ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（NAMPRT）；NPT1 及びそのヒト相同体；並びに選択的にニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ （NMNAT-1 及び2）；NMA1 及び2 並びにそのヒト相同体、がある。
【００２３】
反対に、細胞の寿命を増すステップ、又は、細胞をストレスにより耐性にする（即ち感受性を低くする）ステップは、細胞内のニコチンアミドのレベルを低下させるステップを含んでもよい。これは、ニコチンアミドの生合成に関与する酵素のレベル又は活性を減らしたり、又は、ニコチンアミドを分解又は失活させる酵素のレベル又は活性を増すことによって、達成されよう。従って、細胞の寿命又はストレス耐性を増すステップは、NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NNMT、NAMPRT、NMNAT-1、及びNMNAT-2から成る群より選択されるタンパク質の活性又は発現レベルを増すことによって、達成することができる。
【００２４】
さらに本発明は、細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する化合物を特定する方法を提供する。本方法は、NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NNMT、NAMPRT、NMNAT-1、及びNMNAT-2 から成る群より選択されるタンパク質を、検査化合物に、当該タンパク質の活性に影響するのに充分であろう時間、接触させるステップと、（ｉｉ） 前記酵素の活性を判定するステップであって、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下での前記酵素の活性の違いは、前記検査化合物が、細胞の寿命又はそのストレス耐性を調節する化合物であることを示す、ステップと、を含む。さらに本方法は、細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞の寿命が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。さらに本方法は、細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞のストレス耐性が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。
【００２５】
別の実施態様では、本発明は、細胞の寿命、又は、特定の種類のストレスに対するその耐性を調節する化合物を特定する方法を提供する。本方法は、NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NNMT、NAMPRT、NMNAT-1、及びNMNAT-2 から成る群より選択される遺伝子の転写調節核酸を、レポータ遺伝子に作動上連結させて含む細胞又はライセートを、検査化合物に、前記転写調節核酸に影響するのに充分であろう時間、接触させるステップと、（ｉｉ）前記レポータ遺伝子のレベル又は活性を判定するステップであって、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下での前記レポータ遺伝子のレベル又は活性の違いは、前記検査化合物が、細胞の寿命、又は、特定の種類のストレスに対するその耐性を調節する化合物であることを示す、ステップと、を含む。さらに本方法は、細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞の寿命が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。さらに本方法は、細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞のストレス耐性が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。
【００２６】
さらに、例えば細胞内のニコチンアミドレベルを調節する低分子などの作用薬を特定する方法も、ここで提供する。本方法は、（ｉ）細胞内のニコチンアミドのレベルに感受性のあるレポータ・コンストラクトを含む細胞又は細胞ライセートを提供するステップと、（ｉｉ）前記細胞を検査作用薬に接触させるステップと、（ｉｉｉ）前記検査作用薬に接触させた細胞内のニコチンアミドのレベルを判定するステップであって、前記検査作用薬で処理されていない細胞に比較したときの、前記検査作用薬で処理された細胞内のニコチンアミドのレベルの違いは、前記検査作用薬が細胞内のニコチンアミドのレベルを調節することを示す、ステップと、を含んでよい。当該細胞は、さらに、DNA結合因子に結合できる融合タンパク質をコードするベクタを、レポータ遺伝子に作動上連結させて含んでもよい。前記融合タンパク質は、例えばSir2ファミリ・メンバ及び異種ポリペプチドなど、ニコチンアミド感受性酵素の少なくともNAD＋結合ポケットを含んでよい。前記異種ポリペプチドは、転写因子の転写活性化ドメインであってよい。本方法はさらに、細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞の寿命又はそのストレス耐性が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。
【００２７】
さらに本発明の範囲には、Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤を特定するコンピュータ支援された方法も入る。本方法は、（ｉ）コンピュータ・モデリング・アプリケーションに、分子又は分子複合体の一組の構造座標を提供するステップであって、前記分子又は分子複合体が、Ｃポケットを含むSirファミリ・メンバの少なくとも一部分を含む、ステップと、（ｉｉ）前記コンピュータ・モデリング・アプリケーションに、ある化学的実体の一組の構造座標を提供するステップと、（ｉｉｉ）前記化学的実体が、前記分子又は分子複合体に結合する又は干渉すると予測される阻害剤であるかどうかを判定するステップであって、前記分子又は分子複合体に結合又は干渉することは、Sir2ファミリ・メンバの活性の潜在的阻害の指標である、ステップと、を含む。前記化学的実体は、ニコチンアミドの類似体であってもよい。Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤を特定するための別の方法は、（ｉ）少なくとも前記Ｃポケットを含むSir2ファミリのタンパク質を、検査化合物に、前記検査化合物が前記Sir2ファミリのタンパク質のＣポケットにおそらくは結合するのに充分な時間、接触させるステップと、（ｉｉ）タンパク質の活性を判定するステップと、を含み、但しこの場合、前記検査化合物の非存在下に比べたときに、前記検査化合物の存在下で、前記タンパク質の活性が低いことは、前記検査化合物が、Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤であることを示す。
【００２８】
加えて、本発明は、対象における細胞死（例えばアポトーシス）に関連する疾患を治療又は防止する方法を提供するものである。本方法は、NAD＋再利用経路を通る流れを増す、あるいは、細胞死に易罹患性の又は罹患性の細胞内のニコチンアミドレベルを減らす、作用薬を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。疾患は慢性でも又は急性でもよく、その中にはアルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中及び心筋梗塞がある。寿命を延ばす又はストレス耐性を増すための本発明の方法は、さらに、例えば美容目的など、老化を減らすためにも用いることができる。該作用薬は、局所又は全身投与することができる。寿命を延ばす又はストレス耐性を増す方法は、例えば移植前の臓器又は組織など、対象にとって外部の細胞、組織又は臓器に用いることもできる。
【００２９】
さらに本発明は、細胞の寿命を減らすこと、あるいは、細胞をストレス感受性にすることが有益であるような疾患を治療又は防止する方法も提供する。このような疾患には、例えば癌及び自己免疫疾患など、細胞が望ましくないものである場合が含まれる。
【００３０】
さらに本発明の方法は、哺乳動物以外の生物の寿命及びストレス耐性を調節するためにも用いることができる。例えば、本方法を微生物及び植物に用いることができる。具体的には、本発明の方法は、例えばニコチンアミドレベルを低下させる化学物質で植物を処理することにより、あるいは、NAD＋再利用経路又は細胞内のニコチンアミドレベルを調節する遺伝子を遺伝子修飾することにより、高い塩、干ばつ又は疾病に対するこれらの耐性を増すことを可能にする。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、酵母細胞の寿命は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）＋再利用経路（図１に示す）を通る流れを増すことにより、少なくとも約60%、延長できるという発見に少なくとも基づくものである。加えて、ここでは、NAD＋再利用経路を通る流れのこのような増加は、基本的にはNAD＋及びNADHレベルの増加なしに、また基本的には、NAD＋／NADH定数の比を維持することにより、起きることが示された。実施例で示すように、NAD＋再利用経路を通る流れを増し、またそれにより、細胞の寿命を増すには、例えばNPT1、PNC1、NMA1及びNMA2など、NAD＋再利用経路に関与する遺伝子の付加的なコピーを細胞に導入することにより、可能である。さらに実施例では、NAD＋再利用経路を通る流れを増すと、熱ショックなど特定の種類のストレスから酵母細胞が保護されることも示されている。加えて、PNC1を過剰発現させると、サイレント状態、寿命やストレス耐性が増し、例えば紫外線（Ｕ．Ｖ．）及び臭化エチジウム及び浸透圧ストレスにより引き起こされるDNA損傷から細胞が保護される。他方、PNC1を欠失させると寿命が延び、細胞がストレスに感受性となる。
【００３２】
さらに本発明は、ニコチンアミドは酵母においてサイレント状態を阻害し、またそれにより細胞の寿命を減少させるという発見にも、少なくとも基づく。ニコチンアミドは、細胞をストレスに対しより感受性にすることも示された。具体的には、細胞からのニコチンアミドの分泌に関与する酵素であるニコチンアミドメチルトランスフェラーゼ（NNMT）が過剰発現すると、サイレント状態が刺激され、こうして寿命が延び、ストレス（例えば放射線曝露）への耐性が増したが、この酵素を欠失させると、反対の効果があったことが示された。
【００３３】
NAD＋再利用経路及びサイレント事象が、原核生物から真核生物まで、強く保存されていることに少なくとも基づくと、本発明の方法は、酵母細胞に加え、真核細胞及び原核細胞まで応用可能であると期待される。
【００３４】
１．  定義
ここで用いられる以下の用語及び文言は、以下に記載する意味を有するものとする。他にそうでないと明示しない限り、ここで用いられた技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する当業の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００３５】
単数形「一つの（原語：a）」、「一つの（原語：an）」及び「その（原語：the）」は、ここでは、文脈が明らかにそうでないと明言しない限り、複数への言及も包含するものである。
【００３６】
DNA又はRNAなどの核酸に関してここで用いる場合の用語「単離された」は、巨大分子の天然源に存在する、それぞれ他のDNA又はRNAから分離された分子を言う。ここで用いる場合の単離されたという用語は、さらに、組換えDNA技術により作製された場合には細胞物質、ウィルス物質、又は培地を、あるいは、化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学物質を、実質的に含まないような核酸又はペプチドを言う。さらに、「単離された核酸」とは、天然では断片として生じず、また、天然状態では見られないであろう、核酸断片も包含するものと、意図されている。用語「単離された」はまた、ここでは、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを言うために用いられており、精製済み及び組換えのポリペプチドの両者を包含することを意図している。
【００３７】
「細胞のNAD＋再利用経路を通る流れを調節する」とは、例えば図１に示すように、NAD＋再利用経路により生ずるNAD＋分子の数を増加又は減少させるような作用を言う。
【００３８】
ここで用いられる用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（DNA）、及び適当な場合にはリボ核酸（RNA）などのポリヌクレオチドを言う。この用語は、さらに、均等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたRNA又はDNAの類似体や、解説中の実施態様に該当する場合、一本鎖（例えばセンス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドも包含するものと、理解されねばならない。EST、染色体、cDNA、mRNA、及びrRNAは、核酸と言及されることのある分子の代表例である。
【００３９】
文言「遺伝子に対応する核酸」とは、例えば、当該遺伝子に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸など、遺伝子を検出するために使用できる核酸を言う。
【００４０】
「パーセント、同一」とは、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を言う。同一性は、比較を目的としてアライメントしてもよい各配列中の一箇所を比較することにより、それぞれ決定することができる。比較された配列中で同等な位置が、同じ塩基又はアミノ酸で占められていた場合、それらの分子はその位置において同一であることになる。同等な部位が同じ又は類似のアミノ酸残基（例えば立体及び／又は電子上の性質で類似）で占められている場合、それらの分子を、その位置において相同（類似）であると言及することができる。相同性、類似性又は同一性のパーセンテージによる表現とは、比較された配列に共通の位置にある同一又は類似のアミノ酸の数の関数を言う。FASTA、BLAST、又はENTREZを含め、多様なアラインメント・アルゴリズム及び／又はプログラムを用いてよい。FASTA及びBLASTは、GCG配列解析パッケージ（ウィスコンシン州マジソン、ウィスコンシン大学）の一部として入手可能であり、デフォルトを設定するなどして用いることができる。ENTREZは、メリーランド州ベセズダ、米国国立保健研究所、ナショナル・ライブラリ・オブ・メディシン、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーションを通じて入手可能である。ある実施態様では、２つの配列の同一率は、例えば各アミノ酸のギャップを、それがあたかもこれら２つの配列間の単一のアミノ酸又はヌクレオチドミス対合であるかのように重みを付けて、ギャップ・ウェイトを１にしたＧＣＧプログラムにより決定することができる。アライメントの他の技術は、Methods in
Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis
(1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace &
Co., San Diego, California, USAに解説されている。好ましくは、配列中のギャップを許すアライメント・プログラムを用いて配列をアライメントするとよい。スミス・ウォーターマンは、配列アライメント時にギャップを許す種類のアルゴリズムの一つである。Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)を参照されたい。さらに、ニードルマン及びワンシュのアライメント法を用いたGAPプログラムを用いても、配列をアライメントすることができる。代替的な検索戦略は、MASPARコンピュータで作動するMPSRCHソフトウェアを用いるものである。MPSRCHはスミス・ウォーターマンのアルゴリズムを用いて配列を超並列コンピュータで採点する。このアプローチは、関係の遠い対合を探し出す能力が高く、特に小さなギャップ及びヌクレオチド配列エラーに寛容である。核酸にコードされたアミノ酸配列を用いると、タンパク質及びDNAの両方のデータベースを検索することができる。個々の配列を持つデータベースは、上記のMethods in
Enzymology, ed. Doolittleに解説されている。データベースには、Genbank、EMBL、及び日本のDNAデータベース(DDBJ)がある。
【００４１】
ここでは細胞の「寿命」又は「寿命」と交換可能に用いられている「複製寿命」とは、個々の「母細胞」が生む娘細胞の数を言う。他方、「暦老化」とは、非分裂細胞の集団が、栄養物質を絶たれたときに生存したまま留まる時間の長さを言う。細胞の寿命は、少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、又は20%乃至70%の間、30%乃至60%の間、40及び60% の間、又はそれ以上、本発明の方法により増すことができる。
【００４２】
「Sir2ファミリ・メンバ」又は「Sir2タンパク質ファミリ・メンバ」とは、Ｓ．セレビジエSir2 タンパク質や、例えばヒト相同体hSIRT1、gSIRT2、hSIRT3、hSIRT4、hSIRT5、hSIRT6及びhSIRT7など、Sir2及びSir-2.1に実質的な構造類似性を有するあらゆるヒストンデアセチラーゼを言う。
【００４３】
「低分子」とは、ここで用いる場合、約5kD未満、そして最も好ましくは約4kD未満の分子量を有する組成物を言うものと、意図されている。低分子は核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、糖、脂質又は他の有機（炭素を含有する）又は無機の分子であってよい。数多くの製薬業が、ここで解説する検定法のいずれかによりスクリーニングすることのできる、化学的及び／又は生物学的混合物、しばしば真菌、細菌、又は藻類抽出物の広汎なライブラリを有する。
【００４４】
テンプレート核酸の標的部位に対するプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーション・シグナルが明白に解釈できるように、プローブが主に標的にハイブリダイズすることを言う。ここでさらに解説するように、特異的なハイブリダイゼーションが起きるような条件は、相同領域の長さ、該領域のGC含有量、ハイブリッドの融解温度「Tm」に応じて様々である。従ってハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液及び洗浄液の塩含有量、酸性度、及び温度に応じて様々であろう。 
【００４５】
「ストレス」とは、成長、発生又は生殖にとって至適でないあらゆる条件を言う。
【００４６】
あるポリペプチドの「バリアント」とは、一つ以上のアミノ酸残基が異なるような、当該ポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドを言う。バリアントは、「保存的」変更を有していてもよく、この場合置換されたアミノ酸は、類似の構造上又は化学的性質（例えばロイシンのイソロイシンへの置換）を有するものである。バリアントは、「非保存的」変更（例えばグリシンのトリプトファンへの置換）を有していてもよい。同様な小さな変更には、アミノ酸の欠失又は挿入あるいは両者も含まれよう。生物学的又は免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入又は欠失させられるかを判断する上での指針は、当業で公知のコンピュータ・プログラム、例えばLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて見つけられよう。
【００４７】
ポリヌクレオチド配列の文脈で用いられる場合の用語「バリアント」は、ある特定の遺伝子又はそのコーディング配列のポリヌクレオチド配列に関係するそれを包含するものであろう。この定義には、さらに、例えば「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」又は「多型」バリアントも含まれよう。スプライス・バリアントは、基準分子に対して有意な同一性を有するだろうが、一般的には、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングが原因で、より多い又は少ない数のポリヌクレオチドを有することだろう。相当するポリペプチドは、付加的な機能ドメインを持っていたり、又は、ドメインを無くしているであろう。種バリアントとは、一つの種と別の種とで異なるポリヌクレオチド配列である。その結果できるポリペプチドは、一般に、相互に有意なアミノ酸同一性を有しているだろう。多型上のばらつきとは、ある種の個体間での特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列のばらつきである。多型バリアントは、ポリヌクレオチド配列が一個の塩基分、異なるような「単一塩基多型」（SNP）も包含するであろう。SNPの存在は、例えばある特定の集団、疾患状態、又は疾患状態への傾向の指標である場合がある。
【００４８】
用語「脂肪族の」は当業で公知であり、直線状、分枝状、環状のアルカン、アルケン、又はアルキンを言う。いくつかの実施態様では、本発明における脂肪族の基は直線状又は分枝状であり、１個乃至約２０個の炭素原子を有する。
【００４９】
用語「アルキル」は当業で公知であり、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基を含む、飽和脂肪族の基を包含する。いくつかの実施態様では、直鎖又は分枝鎖アルキルは、その主鎖に約３０個以下の炭素原子（例えば直鎖の場合はＣ１−Ｃ３０、分枝鎖の場合はＣ３−Ｃ３０）、そして代替的には約２０個以下の炭素原子、を有する。同様に、シクロアルキルは、その環構造内に約３から約１０個の炭素原子、そして代替的にはその環構造に約５、６又は７個の炭素を有するものである。用語「アルキル」はまた、ハロ置換アルキルも包含するものと、定義しておく。
【００５０】
用語「アラルキル」は当業で公知であり、アリール基（例えば芳香族又はヘテロ芳香族の基）で置換されたアルキル基を言う。
【００５１】
「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は当業で公知であり、上に説明したアルキルに対し、長さ及び可能な置換の点で類似であるが、それぞれ少なくとも一個の二重又は三重結合を含むような不飽和脂肪族の基を言う。
【００５２】
炭素数を他に特に明示していない場合、「低級アルキル」は、上に定義した通りの、しかし１個から約１０個の炭素、代替的には１個から約６個の炭素原子をその主鎖構造に有するようなアルキル基を言う。同様に、「低級アルケニル」及び「低級アルキニル」も同様な鎖の長さを有する。
【００５３】
用語「ヘテロ原子」は当業で公知であり、炭素又は水素以外のあらゆる元素の原子を言う。ヘテロ原子の例には、硼素、窒素、酸素、リン、硫黄及びセレンがある。
【００５４】
用語「アリール」は当業で公知であり、５−、６−及び７−員環の単一環芳香族の基を言い、この基にはゼロから４個のヘテロ原子が含まれていてもよく、例えばベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジン等である。環構造内にヘテロ原子を有するようなアリール基はさらに「アリールヘテロ環」又は「ヘテロ芳香族」と言及される場合もある。芳香族の環は、一つ又はそれ以上の環位で、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族の部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等、上述したような置換基で置換されていてもよい。「アリール」という用語には、さらに、二つ又はそれ以上の炭素が二つの隣り合った環に共通である（これらの環が「縮合している」）ような二つ又はそれ以上の環を有すると共に、環のうちの少なくとも一つが芳香族であり、例えばその他の環はシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、及び／又は、ヘテロシクリルであるような、多環式の系も含まれる。
【００５５】
オルト、メタ及びパラという用語は当業で公知であり、それぞれ1,2-、1,3-、及び1,4-二置換ベンゼンを言う。例えば1,2-ジメチルベンゼン及びオルト-ジメチルベンゼンという名称は同義である。
【００５６】
「ヘテロシクリル」又は「ヘテロ環式の基」という用語は、当業で公知であり、環構造が１個から４個のヘテロ原子を含むような、３員環から約１０員環構造、代替的には３員環から約７員環を言う。ヘテロ環はまた多環式であってもよい。ヘテロシクリル基には、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサンテン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、チノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノンなどのラクタム、スルタム、スルトン等が含まれる。ヘテロ環式の環は、一つ又はそれ以上の位置で、上述したような置換基、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、一個のヘテロシクリル、一個の芳香族又はヘテロ芳香族の部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等で置換されていてもよい。
【００５７】
「ポリシクリル」又は「多環式の基」という用語は当業で公知であり、複数の環が「縮合環である」など、二つ又はそれ以上の炭素が二つの隣り合った環に共通であるような二つ又はそれ以上の環（例えばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール及び／又はヘテロシクリル、など）を言う。隣り合っていない原子を通じて接合された環は「架橋」環と呼ばれる。多環の環のそれぞれは、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、一個のヘテロシクリル、一個の芳香族又はヘテロ芳香族の部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等といった上述したような置換基で置換されていてもよい。
【００５８】
ここで用いられる「炭素環」という用語は、当業で公知であり、環の各原子が炭素であるような芳香族又は非芳香族の環を言う。
【００５９】
「ニトロ」という用語は当業で公知であり、−ＮＯ２を言い、用語「ハロゲン」は当業で公知であり、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを言い、「スルフヒドリル」という用語は当業で公知であり、−ＳＨを言い、「ヒドロキシル」という用語は−ＯＨを意味し、そして「スルホニル」という用語は当業で公知であり、−ＳＯ２−を言う。「ハリド」はハロゲンの対応する陰イオンを指し、「プソイドハリド」は、コットン及びウィルキンソンによる「Advanced Inorganic Chemistry」 の５６０に記載された定義を有する。
【００６０】
「アミン」及び「アミノ」という用語は、当業で公知であり、置換されていない及び置換されたアミンの両方を言い、例えば、一般式：
【００６１】
【化１】
2005535342.tif 000002
【００６２】
（但し式中、Ｒ５０、Ｒ５１及びＲ５２はそれぞれ個別に一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表すか、又はＲ５０及びＲ５１は、これらが結合したＮ原子と一緒に捉えると、環構造内に４個から８個の原子を有するヘテロ環を完成するものであり、Ｒ６１は一個のアリール、一個のシクロアルキル、一個のシクロアルケニル、一個のヘテロ環、又は一個の多環を表し、そしてｍはゼロか、又は１から８までの間の一整数である）で表すことができる部分である。いくつかの実施態様では、Ｒ５０又はＲ５１の一方のみが、一個のカルボニルであってもよく、例えばＲ５０、Ｒ５１及びこの窒素が一緒になって一個のイミドを形成していない。他の実施態様では、Ｒ５０及びＲ５１（及び選択に応じてＲ５２）はそれぞれ個別に一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル、又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表す。このように、「アルキルアミン」という用語は、置換された又は置換されていない一個のアルキルをそれに結合させて有する、上に定義した通りの一個のアミン基を意味し、即ちＲ５０及びＲ５１の少なくとも一方は一個のアルキル基である。
【００６３】
用語「アシルアミノ」は当業で公知であり、一般式：
【００６４】
【化２】
2005535342.tif 000003
【００６５】
（但し式中、Ｒ５０は上に定義した通りであり、そしてＲ５４は一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル、又は、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１（但し式中、ｍ及びＲ６１は上に定義した通りである）を表す）で表すことのできる部分を言う。
【００６６】
「アミド」という用語はアミノ置換カルボニルとして当業で認識されており、一般式：
【００６７】
【化３】
2005535342.tif 000004
【００６８】
（但し式中、Ｒ５０及びＲ５１は上に定義した通りである）によって表すことのできる部分を包含する。本発明においてアミドのいくつかの実施例には不安定な可能性のあるイミドは含まれないであろう。
【００６９】
「アルキルチオ」という用語は、それに硫黄ラジカルを結合させて有した、上に定義した通りのアルキル基を言う。好適な実施例では、「アルキルチオ」部分は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、及び−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ８（但し式中、、ｍ及びＲ８は上に定義したとおりである）のうちの一つで表される。代表的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオ等がある。
【００７０】
「カルボニル」という用語は当業で公知であり、一般式：
【００７１】
【化４】
2005535342.tif 000005
【００７２】
（但し式中、Ｘ５０は一個の結合であるか、又は一個の酸素又は一個の硫黄を表し、そしてＲ５５及びＲ５６は一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１、又は薬学的に許容可能な塩を表し、Ｒ５６は一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１（但しこの式中、ｍ及びＲ６１は上に定義したとおりである）を表す）で表すことのできるような部分を含むものである。Ｘ５０が一個の酸素であり、そしてＲ５５又はＲ５６が水素でない場合、この式は一個の「エステル」を表すことになる。Ｘ５０が一個の酸素であり、Ｒ５５が上に定義した通りである場合、この部分はここではカルボキシル基と言及されており、特にＲ５５が一個の水素である場合、この式は「カルボン酸」を表すものである。Ｘ５０が一個の酸素であり、そしてＲ５６が水素である場合、この式は「ギ酸」を表すことになる。一般的には、上の式の酸素原子が硫黄に置換された場合、この式は「チオールカルボニル」基を表すことになる。Ｘ５０が一個の硫黄であり、Ｒ５５又はＲ５６が水素でない場合、この式は「チオールエステル」を表すものである。Ｘ５０が一個の硫黄であり、Ｒ５５が水素であれば、この式は「チオールカルボン酸」を表す。Ｘ５０が一個の硫黄であり、Ｒ５６が水素である場合、この式は「チオールギ酸」を表すことになる。他方、Ｘ５０が一個の結合であり、そしてＲ５５が水素でない場合、上の式は一個の「ケトン」基を表すものである。Ｘ５０が一個の結合であり、そしてＲ５５が水素である場合、上の式は「アルデヒド」基を表す。
【００７３】
「アルコキシル」又は「アルコキシ」という用語は当業で公知であり、一個の酸素ラジカルをそれに結合させて有する、上に定義した通りのアルキル基を言う。代表的なアルコキシル基には、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔ−ブトキシ等がある。「エーテル」は一個の酸素によって共有結合により連結された二つの炭化水素である。従って、アルキルをエーテルにするようなアルキルの置換基は、例えば、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１（但し式中、ｍ及びＲ６１は上に説明した通りである）で表すことができるものなど、アルコキシルであるか、又はアルコキシルに似ている。
【００７４】
いずれかの構造において２箇所以上あるような、例えばアルキル、m、n等の各表現の定義は、同じ構造の他の箇所でのその定義とは独立であることが意図されている。
【００７５】
トリフリル、トシル、メシル、及びノナフリルという用語は当業で公知であり、それぞれトリフルオロメタンスルホニル、p-トルエンスルホニル、メタンスルホニル、及びノナフルオロブタンスルホニル基を言う。トリフレート、トシレート、メシレート、及びノナフレートという用語は当業で公知であり、それぞれトリフルオロメタンスルホネートエステル、p-トルエンスルホネートエステル、メタンスルホネートエステル、及びノナフルオロブタンスルホネートエステル官能基、及びこれらの官能基を含有する分子を言う。
【００７６】
Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ、及びＭｓという略語は、それぞれメチル、エチル、フェニル、トリフルオロメタンスルホニル、ノナフルオロブタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、及びメタンスルホニルを表す。当業の有機化学者が用いる省略のより包括的なリストは、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリの各巻の第一版に見られるが、このリストは典型的には、スタンダード・リスト・オブ・アブリビエーションズという標題の表で提供されている。
【００７７】
本発明の組成物に含まれたいくつかの化合物は、特定の幾何学的もしくは立体異性学的形状で存在していてもよい。加えて、本発明のポリマは光学的に活性であってもよい。本発明は、cis-及びtrans-異性体、R-及びS-エナンチオマー、ジアステレオマー、(D)-異性体、（L)-異性体、これらのラセミ混合体、及びこれらの他の混合体を含め、あらゆるこのような化合物を、本発明の範囲に入るものと、考える。更なる非対称の炭素原子がアルキル基などの置換基に存在していてもよい。このような異性体や、それらの混合物はすべて、本発明に包含されるものと、意図されている。
【００７８】
例えば、本発明のある化合物の特定のエナンチオマーを欲しい場合、これは非対称合成又はキラル補助による誘導法で調製することができ、この場合、その結果得られたジアステレオマー混合物を分離し、補助基を開裂させて所望の純粋なエナンチオマーを得る。あるいは、分子がアミノなどの塩基性の官能基を含有する場合、又はカルボキシルなどの酸性の官能基を含有する場合、適した光学的に活性な酸又は塩基でジアステレオマーの塩を形成した後、このように形成されたジアステレオマーを、当業で公知の分別晶出又はクロマトグラフィーで分離した後、純粋なエナンチオマーを回収してもよい。
【００７９】
「置換」又は「で置換された」には、このような置換が、置換された原子及び置換基にとって可能な原子価に従ったものであり、その置換の結果、例えば、転位、環化、除去、、又は他の反応などの変換を自発的には行わない化合物など、安定した化合物ができるという、暗黙の前提が含まれるものと理解されよう。
【００８０】
「置換された」という用語は、さらに、有機化合物のあらゆる許容できる置換基を含むものとして考察されている。広い意味では、この許容可能な置換基には、有機化合物の非環式及び環式、枝分かれ式及び非枝分かれ式、炭素環式及びヘテロ環式、芳香族及び非芳香族の基が含まれる。置換基の例には、例えば、上に説明したものがある。許容可能な置換基は、適した有機化合物にとっては、一つ又はそれ以上であってもよく、同じ又は異なるものであってもよい。本発明の目的のためには、窒素などのヘテロ原子は水素置換基、及び／又は、そのヘテロ原子の原子価を満たす、ここに説明した有機化合物のいずれの許容可能な置換基を有していてもよい。本発明は、いかなる態様でも、有機化合物の許容可能な置換基によって限定されるとは意図されていない。
【００８１】
本発明の目的のために、化学元素は、ハンドブック・オブ・ケミストリー・アンド・フィジックス、第６７版、１９８６−８７、表紙内側のＣＡＳバージョンの元素周期表に基づいて表されている。さらに本発明の目的のために、「炭化水素」という用語は少なくとも一つの水素及び一個の炭素原子を有するあらゆる許容可能な化合物を含むものとして考察されている。広い態様では、この許容可能な炭化水素には、非環式及び環式、枝分かれ式及び非枝分かれ式、炭素環式及びヘテロ環式、芳香族及び非芳香族の、置換されていても、又は置換されていなくともよい有機化合物が含まれる。
【００８２】
いずれかの構造において２箇所以上あるような、例えばアルキル、m、n、p等の各表現の定義は、同じ構造の他の箇所でのその定義とは独立であることが意図されている。
【００８３】
「薬学的に許容可能な塩類」という用語は当業で公知であり、本発明の組成物中に含まれたものなどを含め、比較的に非毒性の無機及び有機酸添加塩類を言う。
【００８４】
「薬学的に許容可能な担体」という用語は当業で公知であり、当該組成物又はその成分を身体の一臓器又は一部分から、身体の別の臓器又は一部分に運ぶ又は輸送することに関与する、例えば液体又は固体の充填剤、希釈剤、医薬品添加物、溶媒又は封入剤などの薬学的に許容可能な材料、組成物又は賦形剤を言う。各担体は、当該組成物及びその成分に対して適合性があり、かつ、患者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として役立てることのできる材料のいくつかの例には、（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類、（２）コーンスターチ及びいもでんぷんなどのでんぷん、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びセルロースアセテートなど、セルロース及びその誘導体、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバター及び座薬用ろうなどの医薬品添加物、（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油脂類、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリル酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）無発熱源水、（１７）等張性生理食塩水、（１８）リンガー液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、及び（２１）薬剤調合に用いられるその他の非毒性の適合性物質、が含まれる。
【００８５】
「全身投与」、「全身的に投与する」、「末梢投与」及び「末梢的に投与する」という用語は当業で公知であり、患者の全身に入り、従って代謝及びその他の同様なプロセスを受けるような、例えば皮下投与など、中枢神経系に直接投与する以外の方法で当該の組成物、治療薬又は他の他の材料を投与することを言う。
【００８６】
用語「非経口投与」及び「非経口的に投与する」は当業で公知であり、多くの場合注射による、腸内及び局所投与以外の投与形態を言い、限定的な意味はないが、その中には、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内及び胸骨内注射及び輸注が含まれる。
【００８７】
２．  細胞の寿命を増す、又は、特定のストレスからそれを保護するための方法
ある実施態様では、NAD＋再利用経路を通る流れを増すことにより、細胞の寿命を増す、及び／又は、細胞を特定のストレスから保護する。これは、例えば、 NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質など、NAD＋再利用経路に関与する少なくとも１つのタンパク質のレベル又は活性を増すことにより、達成することができる。
【００８８】
タンパク質のレベルは、例えば、当該タンパク質の細胞内での発現を命令する転写調節配列に作動的に連結された、当該タンパク質をコードする核酸を細胞内に導入するなどにより、この細胞内で増加させることができる。細胞内で核酸を発現させる方法や、そのための適した転写調節配列は当業で公知である。代替的には、タンパク質を、通常はリポソームなどの細胞内への当該タンパク質の進入を容易にするベクタの存在下で、細胞内に導入することができる。さらにタンパク質を、その目的用の経細胞輸送ペプチドに連結することもできる。さらに他の方法では、内因性遺伝子の発現を刺激する作用薬を細胞に接触させる。このような作用薬は、ここでさらに解説するように同定することができる。
【００８９】
Ｓ．セレビジエのニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（NPT1）をコードするヌクレオチド配列や、それにコードされたタンパク質を、それぞれ配列番号１及び２に記載する。NPT1はまた「LSR2」としても知られる。Ｓ．セレビジエのNPT1の完全cDNAと、コードされたタンパク質はそれぞれ配列番号１及び２に記載されている通りに、GenBank登録番号NC 001147 及びAAB59317に提供されている。登録番号L11274 及びAAB59317はまた、それぞれＳ．セレビジエのヌクレオチド及びアミノ酸配列にも言及しているようである。細菌でのNPT1相同体はPncB（35、37及び38）である。E. coliの NPT1はGenBank登録番号J05568として提供されている。そのヒトヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank 登録番号 BC006284 及びAAH06284、並びにそれぞれ X71355 及びCAA50490、AAH32466 及びBC032466 に提供されており、Chong et al. (1993)
Genomics 18:355に解説されている。該ヒトヌクレオチド及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３及び１４にも記載しておく（並びにGenBank登録番号BC032466に相当する）。該ヒトタンパク質は、さらに、「腎リン酸ナトリウム輸送タンパク質」とも言及されている。マウスNPT1ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、GenBank 登録番号X77241 及びCAA54459に提供されており、Chong et al. (1995)
Am. J. Physiol. 268:1038に解説されている。マウスNPT1のプロモータ領域は GenBank登録番号 AF361762として提供されており、Soumounou et al. (2001)
Am J. Physiol. 281: F1082に解説されている。NPT1はまた、番号3957135でイメージ（原語：IMAGE）クローンとしても記載されている。NPT1相同体のアライメントを図１５に示す。
【００９０】
Ｓ．セレビジエのPNC1をコードするヌクレオチド配列と、それにコードされたタンパク質は、それぞれ配列番号３及び４に記載されているが、それぞれGenBank登録番号NC  001139 及びNP 011478に相当する。PNC1は、細菌タンパク質pncAの酵母相同体であり、ニコチンアミドのニコチン酸及びアンモニアへの加水分解を触媒する。Ｓ．セレビジエのPNC1は、解法読み取り枠（ORF） YGL037とも言及され、Ghislain et al. (2002)
Yeast 19:215に解説されている。ナンキンマメ（Arachis hypogaea）PNC1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、GenBank登録番号M37636及びAAB06183に提供されており、Buffard et al. (1990)
PNAS 87:8874に解説されている。ヒト相同体のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank登録番号BC017344及びAAH17344、それぞれAK027122 及びNP 078986；それぞれXM 041059及びXP 041059；並びにそれぞれNM 016048及び NP 057132に提供されている。ヒトPNC1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５及び１６に挙げてあるが、GenBank登録番号BC017344に相当する。ヒト、ハエ及びＳ．セレビジエのPNC1のアライメントを図１６に示す。
【００９１】
Ｓ．セレビジエNMA1をコードするヌクレオチド配列、及び、それにコードされたタンパク質は、それぞれGenBank 登録番号 NC 001144.2 及びNP 013432に相当する、それぞれ配列番号５及び６に記載されている。Ｓ．セレビジエNMA1は、Smith et al.
(2000) PNAS 97:6658に解説されたORF YLR328に相当する。NMA1は、細菌NaMNAT 遺伝子のＳ．セレビジエ相同体である。ヒト相同体のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank 登録番号NM 022787 及びNP 073624；それぞれAK026065及びBAB15345；それぞれAF459819 及びAAL76934；それぞれXM 087387 及びXP 087387；並びにそれぞれAF345564及びAAK52726、並びにNP 073624；AAL76934；NP 073624；及びAF314163に提供されている。ヒトNMA1のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７及び１８に記載されており、GenBank 登録番号 NM 022787に相当する。イメージ（原語：IMAGE）クローンは、番号4874147及びHRCクローンhrc08458に提供されている。細菌相同体は、例えばZhang et al.
(2002) Structure 10:69に解説されている。
【００９２】
Ｓ．セレビジエNMA2をコードするヌクレオチド配列、及び、それにコードされたタンパク質は、それぞれGenBank 登録番号NC 001139及びNP 011524に相当する、それぞれ配列番号７及び８に記載されている。Ｓ．セレビジエNMA2は、Emanuelli et al.
(1999) FEBS Lett. 455:13に解説されたORF YGR010に相当する。NMA2は、細菌NaMNAT遺伝子のＳ．セレビジエ相同体である。ヒト相同体のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank 登録番号NM 015039及びNP 055854に提供されている。ヒトNMA2のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９及び２０に記載されており、GenBank 登録番号 NM 015039に相当する。
【００９３】
完全長タンパク質や、このような完全長タンパク質又はその一部分をコードする核酸を、ここで解説された本方法に従って使用できることは、当業者には明白であろう。タンパク質の一部分は、好ましくはその生物学的に活性な部分であるとよい。生物学的に活性な部分は、当業で公知の方法に従うと共に、特定のタンパク質の活性を観察できる検定法を用いて、特定することができる。NPT1タンパク質の活性を判定するための検定法は、例えばPescanglini et
al. (1994) Clin. Chim. Acta 229: 15-25 及びSestini et al. (2000) Archives of Biochem. Biophys.
379:277に解説されている。PNC1タンパク質の活性を判定するための検定法は、例えばGhislain et al. Yeast
19:215に解説されている。NMA1及びNMA2タンパク質の活性を判定するための検定法は、例えば上記のSestini et al.に解説されている。代替的には、このようなタンパク質の活性を、細胞の寿命が判定されるような検定法で検査することができる。例えば、細胞に、NPT1、PNC1、NMA1又はNMA2タンパク質の一部分をコードする配列の一つ以上のコピーを含む核酸、又は、コントロール核酸、をトランスフェクトし、該細胞の寿命を比較する。前記タンパク質のうちの一つの一部分をトランスフェクトされた細胞の寿命の方が長いことは、前記タンパク質の当該部分が、生物学的に活性な部分であることの指標である。細胞の寿命を判定するための検定法は当業で公知であるが、ここでもさらに解説されている。具体的には、哺乳動物細胞の寿命を判定するための検定法は、例えばCell Growth,
Differentiation and Senescence: A Practical Approach.  George P. Studzinski （ed.）に解説された通りに行うことができる。寿命を測定する代わりに、あるタンパク質のある部分が生物学的に活性な部分であるかを判断するために、熱ショックなどの特定のストレスに対するトランスフェクト細胞の耐性を測定することもできる。特定のストレスに対する耐性を測定する方法は当業で公知であるが、ここでもさらに解説されている。具体的には、哺乳動物細胞の、熱ショックに対する耐性を判定する検定法は、例えば Bunelli et al. (1999)
Exp. Cell Res. 262: 20に解説された通りに行うことができる。
【００９４】
NPT1、PNC1、NMA1又はNMA2 タンパク質の部分に加え、一つ以上のアミノ酸の欠失、挿入又は追加を含有するタンパク質など、他のバリアントも、そのタンパク質が生物学的に活性であることを条件に、用いることができる。アミノ酸の変化の例には、保存的アミノ酸置換がある。他の変化には、非天然で生ずるアミノ酸への置換がある。NPT1、PNC1、NMA1又はNMA2をコードする核酸に、高い又は中程度のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸にコードされていると共に、生物学的に活性であるタンパク質も使用することができる。例えば、NPT1、PNC1、NMA1又はNMA2をコードする遺伝子に、６５℃の0.2 乃至1× SSCというストリンジェンシーの高い条件でハイブリダイズし、その後６５℃の0.2×SSCで洗浄される核酸を用いることができる。NPT1、PNC1、NMA1又はNMA2をコードする遺伝子に、室温の6×SSCというストリンジェンシーの低い条件下でハイブリダイズし、その後室温の2×SSCで洗浄される核酸を用いることもできる。他のハイブリダイゼーション条件には、４０又は５０℃の3×SSC、続いて２０、３０、４０、５０、６０、又は６５℃の1又は2×SSCでの洗浄 、がある。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのストリンジェント度をさらに高める、例えば１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％など、ホルムアルデヒドの存在下で行うことができる。核酸ハイブリダイゼーションの理論及び実際は、例えばS. Agrawal (ed.)
Methods in Molecular Biology, volume 20に解説されており、また、Tijssen (1993) Laboratory
Techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic
acid probesの例えば第１部第２章“Overview of
principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” Elsevier, New
York は、核酸ハイブリダイゼーションに対する基本的な指針を提供するものである。
【００９５】
例としてのタンパク質は、少なくとも約50%、70%、80%、90%、好ましくは少なくとも約95%、さらにより好ましくは少なくとも約98%、そして最も好ましくは少なくとも99% の相同性又は同一性を、野生型NPT1、PNC1、NMA1又はNMA2 タンパク質あるいはその一ドメイン、例えば触媒ドメイン、に対して有するものであってもよい。他の例としてのタンパク質は、例えばここに解説されたものなど、野生型NPT1、PNC1、NMA1又はNMA2核酸に対して少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約95%、さらにより好ましくは少なくとも約98%、そして最も好ましくは少なくとも99%、相同又は同一である核酸にコードされたものであってよい。
【００９６】
他の実施態様では、タンパク質は、例えば経細胞輸送ペプチドに融合したタンパク質など、融合タンパク質である。さらに融合タンパク質は、当該タンパク質の精製及び／又は検出に使用できる異種ペプチドを含んでもよい。
【００９７】
他の実施態様では、非天然で生じるタンパク質バリアントを用いる。このようなバリアントはペプチドミメティックであってよい。
【００９８】
さらに他の実施態様では、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択される一つ以上のタンパク質の活性を向上又は増加させる。これは例えば、これらのタンパク質のうちの一つの、酵素活性などの活性を増加させる化合物に細胞を接触させるなどにより、達成することができる。このような化合物を特定するための検定法については、ここでさらに解説されている。
【００９９】
好適な実施態様では、NAD＋再利用経路を通る流れを、細胞内のNAD＋、NADHのレベル、及びNAD/NADH比を実質的に変えることなく、増加させる。NAD＋及びNADHのレベルや、これら２つの分子間の比は、例えば実施例で解説する通りに、判定することができる。
【０１００】
ポリヌクレオチドを哺乳動物、ヒト又は非ヒトへ、あるいはこれらの細胞へ導入するためのいずれの手段も、本発明の多様なコンストラクトを目的のレシピエントに送達するために、本発明の実施に適合させてよい。本発明のある実施態様では、DNAコンストラクトを、トランスフェクションにより細胞に送達、即ち「裸の」DNAで送達するか、又は、コロイド状分散系との複合体に入れて細胞に送達する。コロイド状の系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに、水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースの系、がある。本発明の好適なコロイド状の系は、脂質と複合体形成した、又は、リポソームで調合された、DNAである。前者のアプローチでは、脂質などを用いたDNAの調合前に、まず所望のDNAコンストラクトを持つ導入遺伝子を含有するプラスミドを、発現に向けて実験的に最適化してもよい（例えば、5'側非翻訳領域にイントロンを含めて、不要な配列を削除するなど） (Felgner, et
al., Ann NY Acad Sci 126-139, 1995)。次に、多様な脂質又はリポソーム物質を用いたDNAの調合を、公知の方法及び材料を用いて行い、レシピエント哺乳動物に送達する。例えばCanonico et al,
Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29, 1994；Tsan et al, Am J Physiol 268； Alton et al.,
Nat Genet. 5:135-142, 1993 及びカーソンらによる米国特許第5,679,647号を参照されたい。
【０１０１】
リポソームのターゲティングを、解剖学的及び機械的因子に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、例えば器官特異的、細胞特異的、及びオルガネラ特異的など、選択性のレベルに基づくものである。機械的ターゲティングは、それが受動的であるか、又は、能動的であるかに基づき、区別することができる。受動的なターゲティングは、リポソームが、洞様毛細血管を含有する、器官内の細網内皮細胞（RES）の細胞に分散するという天然の傾向を利用する。他方、能動的ターゲティングは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、又はタンパク質などの特異的リガンドにリポソームを結合させたり、あるいは、天然で起きる局在部位以外の器官及び細胞種へのターゲティングを成功させるために、リポソームの組成又は大きさを変えることによる、リポソームの変更に関する。
【０１０２】
標的決定される送達系の表面を、多種の方法で修飾してもよい。リポソーム性の標的決定された送達系の場合、ターゲティング・リガンドが、リポソーム二重層との安定な結合を維持できるように、脂質の基をリポソームの脂質二重層に導入することができる。多種の連結基を用いて、脂質の鎖をターゲティング・リガンドに結び付けることができる。裸のDNAや、又は、リポソームなどの送達賦形剤に結合させたDNAを、対象の複数の部位に投与することができる（下を参照されたい）。
【０１０３】
本発明の好適な方法では、DNAコンストラクトをウィルス・ベクタを用いて送達する。導入遺伝子は、遺伝子治療で有用な多種のウィルスベクタ、例えば組換えレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（AAV）、及び単純疱疹ウィルス−１など、のいずれに導入しても、あるいは、組換え細菌又は真核細胞プラスミドに導入してもよい。多種のウィルスベクタを本発明の実施に用いてよいが、AAV-及びアデノウィルスをベースにしたアプローチが特に有利である。このようなベクタは、外因性遺伝子をin vivoで、特にヒトに輸送させるために選択される組換え遺伝子送達系であると、広く理解されている。ウィルスベクタの選択及び使用に関する以下の付加的な指針は、現場の医師にとって助けとなるであろう。以下に詳述するように、本発現コンストラクトのこのような実施態様は、多種のin vivo及びex vivoでの遺伝子治療プロトコルでの使用に向け、特に考察されたところである。
【０１０４】
本発明で有用なウィルス遺伝子送達系は、アデノウィルス由来ベクタを利用するものである。36 kBの直線状の二本鎖DNAウィルスであるアデノウィルスの遺伝子構造の知見により、アデノウィルスDNA中の大きな断片を、最大8 kBの外来配列に置換することが可能である。レトロウィルスとは対照的に、アデノウィルスDNAをホスト細胞内に感染させても、染色体への組込みは起きない。なぜなら、アデノウィルスDNAは、潜在的な遺伝毒性なしでエピソームとして複製することができるからである。さらに、アデノウィルスは構造上安定であり、また、広汎な増幅後でも、ゲノム再編成が検出されたことはない。アデノウィルスは、ほぼすべての上皮細胞に、それらの細胞周期段階に関係なく感染することができる。これまでのところ、アデノウィルス感染は、例えばヒトの急性呼吸器疾患など、関係があるのは軽度の疾患のみであるようである。
【０１０５】
アデノウィルスは、そのゲノムが中程度の大きさであること、操作が簡便であること、高力価であること、標的細胞範囲が広いこと、及び感染性が高いこと、のために、遺伝子輸送ベクタとしての使用に特に適している。このウィルス粒子は比較的に安定であり、精製及び濃縮に適合しており、そして上述したように、感染範囲を制限するために修飾することもできる。加えて、アデノウィルスは成長及び操作が容易であり、in vitro及びin vivoで幅広いホスト範囲を示す。このグループのウィルスは、例えば109乃至1011プラーク形成単位（PFU）/mlなど、高力価で得ることができ、またこれらは感染性が高い。アデノウィルスの生命周期には、ホスト細胞ゲノムへの組込みは必要ではない。アデノウィルス・ベクタにより送達される外来遺伝子はエピソーム性であるため、ホスト細胞への遺伝毒性が低い。野生型アデノウィルスのワクチン接種研究では、副作用が報告されたことはなく (Couch et al.,
1963; Top et al., 1971)、in vivo遺伝子輸送ベクタとしての安全性や、治療上の可能性が実証されている。さらに、外来DNAを運ぶアデノウィルスゲノムの能力は、他の遺伝子送達ベクタに比較して大きい（最高８キロベース）（上記のBerkner et al.；Haj-Ahmand and
Graham (1986) J. Virol. 57:267）。現在用いられており、従って本発明で好適な大半の複製欠陥アデノウィルスベクタは、ウィルスE1及びE3遺伝子の全部又は一部を欠失させてあるが、アデノウィルス遺伝物質の８０％もが残されたものである（例えば Jones et al.,
(1979) Cell 16:683; 上記のBerkner et al.；及びGraham et al., in Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana,
Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pp. 109-127を参照されたい）。本発明の挿入されたポリヌクレオチドの発現を、例えばE1A プロモータ、主要後期プロモータ (MLP)及び関連するリーダ配列、ウィルスE3プロモータ、又は外因的に加えられたプロモータ配列の制御下に置くことができる。
【０１０６】
アデノウィルスのゲノムは、目的の遺伝子産物をコードしているが、正常な溶解によるウィルス生命周期での複製能という点で不活性化させてあるように、操作することができる（例えばBerkner et al.,
(1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al., (1991) Science 252:431-434; and
Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155を参照されたい）。アデノウィルス株Ad型 5 dl324又は他のアデノウィルス株（例えばAd2、Ad3、Ad7等）を由来とする適したアデノウィルスベクタは当業者に公知である。組換えアデノウィルスは、非分裂細胞に感染できず、また気道上皮 (上記のRosenfeld et al.,
(1992) )、内皮細胞 (Lemarchand et
al., (1992) PNAS USA 89:6482-6486)、肝細胞 (Herz and Gerard, (1993) PNAS USA
90:2812-2816) 及び筋細胞 (Quantin et al.,
(1992) PNAS USA 89:2581-2584)を含め、幅広い細胞種を感染させるために用いることができるために、特定の状況で有利な場合がある。
【０１０７】
さらにアデノウィルスは細胞種特異的にすることができ、即ち、限られた種類の細胞しか感染せず、及び／又は、制限された種類の細胞でしか、導入遺伝子を発現しないようにすることができる。例えば、このウィルスは、１９９７年１２月１６日に発行されたヘンダーソン氏及びシュアー氏による米国特許第5,698,443号に解説されているように、標的ホスト細胞により特異的に調節される転写開始領域の転写制御下にある遺伝子を含む。このように、複製コンピテントアデノウィルスは、E1A又はE1Bなど、複製に必要なタンパク質の合成を調節するための細胞特異的応答配列を挿入するなどにより、特定の細胞に制限することができる。
【０１０８】
数多くのアデノウィルスタイプのDNA配列がGenbankから入手可能である。例えば、ヒトアデノウィルスタイプ5はGenBank登録番号M73260を有する。アデノウィルスDNA配列は、現在同定されている４２種のヒトアデノウィルス・タイプのいずれからも得られよう。多種のアデノウィルス株が、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから、又は数多くの商業的及び学術的ソースからの要請により、入手可能である。ここで解説する通りの導入遺伝子は、いずれのアデノウィルスベクタ及び送達プロトコルにも、制限消化、末端のリンカ連結又は充填、及び連結により、導入できよう。
【０１０９】
アデノウィルス産生細胞株には、例えばカダンらのPCT/US95/15947 (WO
96/18418)；コヴェスディらの PCT/US95/07341
(WO 95/346671)；イムラーらのPCT/FR94/00624
(WO94/28152)；ペロコーデットらのPCT/FR94/00851
(WO 95/02697)、ワンらのPCT/US95/14793
(WO96/14061) に解説されているように、アデノウィルス遺伝子E1、E2a、及びE4 DNA配列のうちの一つ以上を、これらの遺伝子のうちの一つ以上を変異又は欠失させてあるアデノウィルスベクタをパッケージするために、含めることができる。
【０１１０】
本ポリヌクレオチドの送達に有用なさらに別のウィルスベクタ系はアデノ随伴ウィルス（AAV）である。アデノ随伴ウィルスは、天然で生ずる欠陥ウィルスであり、アデノウィルス又は疱疹ウィルスなどの別のウィルスを、効率的な複製及び増殖生命周期のためのヘルパウィルスとして必要とする（レビューについては、Muzyczka et al.,
Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129を参照されたい）。
【０１１１】
ＡＡＶは、いずれの疾患の原因とも関連付けられていない。ＡＡＶは形質転換性でも、又は腫瘍発生性ウィルスでもない。ＡＡＶのヒト細胞系の染色体への組込みは、当該細胞の成長上の性質又は形態学的特徴に、何ら有意な変化も起こさせない。ＡＡＶのこれらの性質からも、潜在的に有用なヒト遺伝子治療ベクタとしてのその使用が推奨される。
【０１１２】
ＡＡＶはまた、そのDNAを肺上皮細胞などの非分裂細胞に組み込ませることができ、また高頻度で安定な組込みを示す数少ないウィルスの一つでもある（例えばFlotte et al., (1992)
Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al., (1989) J. Virol.
63:3822-3828; and McLaughlin et al., (1989) J. Virol. 62:1963-1973を参照されたい）。３００塩基対という小さなＡＡＶを含有するベクタをパッケージし、組み込ませることができる。外因性DNAのためのスペースは、約4.5kbに限られている。Tratschin et al.,
(1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260に解説されたものなどのＡＡＶベクタを、DNAを細胞内に導入するために用いることができる。多種の核酸が、様々な細胞種にＡＡＶベクタを用いて導入されてきた（例えばHermonat et al.,
(1984) PNAS USA 81:6466-6470; Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol.
4:2072-2081; Wondisford et al., (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et
al., (1984) J. Virol. 51:611-619; and Flotte et al., (1993) J. Biol. Chem.
268:3781-3790を参照されたい）。
【０１１３】
典型的に用いられているＡＡＶベースの発現ベクタは、制限部位をフランクする145 ヌクレオチドＡＡＶ反転末端反復配列（ＩＴＲ）を含有するが、該制限部位は、利用可能な該制限部位を直接用いるか、又は、制限酵素で当該導入遺伝子を切断し、両端を平滑末端にした後、 適したDNAリンカを連結し、制限消化し、該ＩＴＲ間の部位に連結するといった方法により、当該導入遺伝子のサブクローニングに用いることができる。ＡＡＶベクタの能力は約4.4kbである (Kotin, R.M.,
Human Gene Therapy 5:793-801, 1994 and Flotte, et al. J. Biol.Chem.
268:3781-3790, 1993)。
【０１１４】
ＡＡＶストックは、Samulski et al.
(1989) J. Virol. 63:3822が解説したようにpAAV/Adを用いることで改良したHermonat and
Muzyczka (1984) PNAS 81:6466に解説された通りに作製することができる。ウィルスの濃縮及び精製は、ＡＡＶベクタのin vivo発現の最初の報告（Flotte, et al. J.Biol.
Chem. 268:3781-3790, 1993）で用いられたように、塩化セシウム勾配でのバンディングや、又は、O'Riordan et al., WO97/08298に解説されたようなクロマトグラフィ精製など、報告された方法により、行うことができる。ＡＡＶベクタのin vitroパッケージングのための方法も利用でき、粒子内にパッケージされるDNAの大きさに制限がないという長所がある。（ツォウらの１９９７年１１月１８日発行の米国特許第5,688,676号を参照されたい）。この手法は、無細胞パッケージング抽出物の調製を含む。
【０１１５】
ハイブリッドアデノウィルス−ＡＡＶベクタの代表例は、アデノウィルスの一部分と、プロモータの制御下で所定の導入遺伝子をフランクするＡＡＶ由来の5'及び3'側ＩＴＲ配列とを含む核酸を含有するアデノウィルス・カプシドである。例えばウィルソンらの国際特許出願公報No. WO 96/13598を参照されたい。このハイブリッドベクタは、ホスト細胞への高力価の導入遺伝子送達と、rep遺伝子の存在下で導入遺伝子をホスト細胞染色体内へ安定に組み込ませる能力とを特徴とする。このウィルスは、ほとんどすべての細胞種に感染することができ（そのアデノウィルス配列により可能）、ホスト細胞ゲノムに、安定で長期に導入遺伝子を組み込ませる（ＡＡＶ配列により可能）ことができる。
【０１１６】
このベクタで用いられるアデノウィルス核酸配列は、ハイブリッドウィルス粒子を作製するためにヘルパウィルスの使用が必要になる最小限の配列量から、アデノウィルス遺伝子をごく選択された部分のみ欠失させたものまで幅広く、またこの欠失させた遺伝子産物は、パッケージング細胞によりハイブリッドウィルスプロセスで提供させることができる。例えば、ハイブリッドウィルスには、（複製開始点として機能する）アデノウィルスの5'側及び3'側反転末端反復（ITR）配列を含めることができる。使用できるAd5ゲノムの左側末端の配列（5'）配列は、通常のアデノウィルスゲノムの塩基対1から約36まで延び（さらに、マップ単位0-1と言及される）、5' 側ITR及びパッケージング／エンハンサドメインを含むものである。このハイブリッドウィルスの3' 側アデノウィルス配列は、約580ヌクレオチドの右側末端の3' 側ITR配列（アデノウィルスの約35,353塩基対から末端まで、約マップ単位98.4-100と言及される）を含む。
【０１１７】
ハイブリッドベクタの調製は、ウィルソンらの公開済みのＰＣＴ出願WO/96/13598、標題「Hybrid
Adenovirus-AAV Virus and Method of Use Thereof」にさらに詳述されている。本発明の実施にあたって有用であろうアデノウィルス及びハイブリッドアデノウィルス-ＡＡＶ技術に関する更なる詳細な指針については、導入遺伝子の導入のための方法や材料、当該導入遺伝子を含有する組換えウィルスの増殖及び精製、並びに細胞及び哺乳動物をトランスフェクトする際のその使用を含め、さらに、ウィルソンらのWO 94/28938、WO 96/13597 及びWO 96/26285、並びにそこで引用された文献を参照されたい。
【０１１８】
レトロウィルスベクタを作製するためには、目的の核酸をウィルスゲノム内に特定のウィルス配列の代わりに挿入することで、複製欠陥ウィルスを作製する。ビリオンを作製するには、gag、pol、及びenv遺伝子は含有するが、LTR及びpsi成分を持たないパッケージング細胞系を作製する（Mann et al. (1983)
Cell 33:153）。ヒトcDNAをレトロウィルスLTR及びpsi配列と一緒に含有する組換えプラスミドをこの細胞系に（リン酸カルシウム沈殿法などにより）導入すると、該psi配列により、当該組換えプラスミドのRNA転写産物をウィルス粒子内にパッケージさせ、その後、培地中に分泌させることができる（Nicolas and
Rubenstein (1988) “Retroviral
Vectors”, In: Rodriguez
and Denhardt ed. Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses.
Stoneham:Butterworth; Temin, (1986) “Retrovirus Vectors for Gene Transfer: Efficient
Integration into and Expression of Exogenous DNA in Vertebrate Cell Genome”, In:
Kucherlapati ed. Gene Transfer. New York: Plenum Press; 上記のMann et al., 1983）。次に、該組換えレトロウィルスを含有する培地を採集し、選択的には濃縮し、遺伝子輸送に用いる。レトロウィルス・ベクタは幅広い細胞種に感染することができる。組込み及び安定な発現には、ホスト細胞の分裂が必要である（Paskind et al. (1975)
Virology 67:242）。この局面は、PVRの治療に特に関係する。なぜなら、これらのベクタにより、増殖する細胞の選択的ターゲティングが可能となり、即ち、PVR対象の眼においてこれらは唯一増殖性のものであるため、網膜上皮の細胞の選択的ターゲティングが可能となるからである。
【０１１９】
レトロウィルスを用いる際の大きな必須事項は、特に細胞集団内で野生型ウィルスが拡がる可能性に関する、それらの使用上の安全性を確実にすることである。複製欠陥レトロウィルスしか産生しない特化細胞系（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発により、遺伝子治療用のレトロウィルスの実用性が増し、欠陥レトロウィルスは、遺伝子治療を目的とした遺伝子輸送での使用に関してよく特徴付けられている（レビューについてはMiller, A.D.
(1990) Blood 76:271を参照されたい）。このように、レトロウィルスコーディング配列（gag、pol、env）のうちの一部が、転写活性化因子など、本発明のタンパク質をコードする核酸に置換されたことで、当該レトロウィルスが複製欠陥になっているような組換えレトロウィルスを作製することができる。その後この複製欠陥レトロウィルスをビリオンにパッケージすると、このビリオンを用いて、標準的な技術によりヘルパウィルスの使用を通じて標的細胞を感染させることができる。組換えレトロウィルスを作製したり、in vitro又はin vivoの細胞をこのようなウィルスに感染させるためのプロトコルは、Current Protocols
in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., (eds.) Greene Publishing
Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 及び他の標準的な実験室用手引きに見ることができる。適したレトロウィルスの例には、当業者に公知のpLJ、pZIP、pWE 及び pEMがある。好適なレトロウィルスベクタはpSR MSVtkNeo
(Muller et al. (1991) Mol. Cell Biol. 11:1785 及びpSR MSV(XbaI) (Sawyers et
al. (1995) J. Exp. Med. 181:307) 及びその由来株である。例えば、クラックソンらによるPCT/US96/09948に解説されているように、これらのベクタの両方にある固有のBamHI部位は、ベクタをBamHIで消化することで取り除くことができ、Klenowで充填し、再連結すれば、それぞれpSMTN2 及びpSMTX2を生じさせることができる。環境栄養性及び両栄養性レトロウィルス系の両方を調製するために適したパッケージングウィルス系の例には、Crip、Cre、2 及びAmがある。
【０１２０】
レンチウィルスを含むレトロウィルスは、多種の遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、網膜細胞、内皮細胞、リンパ球、筋原細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む数多くの様々な細胞種に、in vitro 及び／又は in vivo で導入するために用いられてきた（例えばFederico (1999)
Curr. Opin. Biotechnol. 10:448; Eglitis et al., (1985) Science 230:1395-1398;
Danos and Mulligan, (1988) PNAS USA 85:6460-6464; Wilson et al., (1988) PNAS
USA 85:3014-3018; Armentano et al., (1990) PNAS USA 87:6141-6145; Huber et al.,
(1991) PNAS USA 88:8039-8043; Ferry et al., (1991) PNAS USA 88:8377-8381;
Chowdhury et al., (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al., (1992)
PNAS USA 89:7640-7644; Kay et al., (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et
al., (1992) PNAS USA 89:10892-10895; Hwu et al., (1993) J. Immunol. 150:4104-4115;
米国特許第4,868,116号；米国特許第4,980,286号；PCT出願WO 89/07136; PCT 出願WO 89/02468；PCT出願 WO 89/05345；及びPCT出願 WO 92/07573によるレビューを参照されたい）。
【０１２１】
さらに、ウィルス粒子の表面上のウィルスパッケージングタンパク質を修飾することにより、レトロウィルスの感染範囲、ひいてはレトロウィルスベースのベクタの感染範囲を制限することが可能であることが示されている（例えばPCT公報WO93/25234、WO94/06920、及びWO94/11524を参照されたい）。例えば、レトロウィルスベクタの感染範囲の改変のための戦略には：細胞表面抗原に特異的な抗体をウィルスenvタンパク質に結合させる (Roux et al.,
(1989) PNAS USA 86:9079-9083; 
Julan et al., (1992) J. Gen Virol 73:3251-3255; and Goud et al., (1983)
Virology 163:251-254)；あるいは細胞表面リガンドをウィルスenvタンパク質に結合させる (Neda et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:14143-14146)方法がある。結合は、タンパク質又は他の多様体との化学的架橋の形（例えばenvタンパク質をアシアロ糖タンパク質に転化させるラクトースなど）や、融合タンパク質（例えば一本鎖抗体／env融合タンパク質）を作製することによってもよい。この技術は、特定の組織種に感染を制限又は方向付けるために有用であるが、環境栄養性ベクタを両栄養性ベクタに変換するためにも用いることができる。
【０１２２】
本発明のポリヌクレオチドを送達するために使用できる他のウィルスベクタ系は、例えば単純疱疹ウィルス（１９９７年５月２０日に発行されたウーらの米国特許第5,631,236号、及びニューロベックス社によるWO 00/08191）などの疱疹ウィルス、ワクシニアウィルス（Ridgeway (1988)
Ridgeway, “Mammalian
expression vectors,” In: Rodriguez R L, Denhardt D T, ed. Vectors: A survey of molecular
cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth,; Baichwal and Sugden
(1986) “Vectors for gene
transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of
transferred genes,” In: Kucherlapati
R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press; Coupar et al. (1988) Gene,
68:1-10）、及びいくつかのRNAウィルスから得られてきた。好適なウィルスには、アルファウィルス、ポックスウィルス、アレナウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオウィルス等がある。これらは、多種の哺乳動物細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を持つ（Friedmann (1989)
Science, 244:1275-1281 ; 上記のRidgeway, 1988；上記のBaichwal and Sugden, 1986；Coupar et al., 1988; Horwich et al.(1990) J.Virol.,
64:642-650）。
【０１２３】
例えばNPT1、PNC1、NMA1及びNMA2又はその生物学的に活性なバリアントから成る群より選択されるタンパク質など、あるタンパク質の、本タンパク質をコードする核酸などが投与された対象の細胞における発現は、例えばこの患者から細胞試料を得、コントロール試料に比較したときの該試料中のタンパク質のレベルを判定することなどにより、判定することができる。
【０１２４】
別の実施態様では、タンパク質又はその生物学的に活性なバリアントを、それが標的細胞に到達し、その細胞膜を透過するように対象に投与する。ポリペプチドは原核生物又は真核生物あるいはこれらの細胞で合成させ、当業で公知の方法に従って精製することができる。例えば組換えポリペプチドはヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及び植物細胞で合成させることができる。さらにポリペプチドは、例えば網状赤血球ライセート又は麦芽抽出物など、無細胞抽出物中で合成することもできる。タンパク質の精製は、例えばクロマトグラフィ法など、多種の方法で行うことができる（例えばRobert K Scopes “Protein
Purification: Principles and Practice” Third Ed. Springer-Verlag, N.Y. 1994を参照されたい）。ある実施態様では、本ポリペプチドを、約６個の連続したヒスチジン残基から成るエピトープ・タグを含む融合ポリペプチドとして作製する。こうして、この融合ポリペプチドを、Ni＋＋カラム上で精製することができる。前記タグと当該ポリペプチドとの間にプロテアーゼ部位を挿入することにより、本ペプチドをNi＋＋カラム上で精製後に前記タグを取り外すことができる。これらの方法は当業で公知であり、市販のベクタ及びアフィニティ・マトリックスは市販のものを入手することができる。
【０１２５】
ポリペプチドの投与は、それらを上述したようにリポソームと混合することにより、行うことができる。リポソームの表面を、当該リポソームを、所望の生理学的位置に標的決定する分子を加えることで修飾することもできる。
【０１２６】
ある実施態様では、細胞膜をタンパク質が透過する速度が高められるように、それを修飾する。例えば、本ポリペプチドを、細胞による本ペプチドの取り込みなどの「経細胞輸送」を促進する第二のペプチドに融合させることができる。ある実施態様では、本ペプチドは、例えばin vitroで細胞に急速に取り込まれる部分である、HIVトランスアクチベータ（TAT）タンパク質の残基37-62又は48-60に相当するフラグメントなど、TATの一部分である（Green and
Loewenstein, (1989) Cell 55:1179-1188）。別の実施態様では、前記内部移行ペプチドはドゥロソフィラ-アンテナペディア（原語：Drosophila
antennapedia）タンパク質又はその相同体を由来とする。このホメオタンパク質アンテナペディアの60個のアミノ酸長のホメオドメインは、生体膜を通って転位し、それが結合した相手の異種ポリペプチドを転位させるのに便利であることが実証されている。このように、経細胞輸送のために、ポリペプチドを、ドゥロソフィラ-アンテナペディアの約アミノ酸42-58から成るペプチド又はそれより短いフラグメントに融合させることができる。例えばDerossi et al.
(1996) J Biol Chem 271:18188-18193; Derossi et al. (1994) J Biol Chem
269:10444-10450; and Perez et al. (1992) J Cell Sci 102:717-722を参照されたい。
【０１２７】
別の実施態様では、ニコチンアミドの細胞内での量を減少させる。これは、例えばNAD＋再利用経路、又は、ニコチンアミドを生成する他の経路の遺伝子の発現を阻害するなどにより、達成することができる。遺伝子の阻害は、例えばここでさらに解説するように、ニコチンアミドを生成するNAD＋再利用経路遺伝子に対してRNAiを行うなどにより、実施することができる。また、ニコチンアミドのde novo合成に関与する遺伝子を阻害することもできる。例えば、細胞内のニコチンアミドレベルは、ポリ（アデノシンジホスフェート-リボース）ポリメラーゼ-1 (PARP)のレベル又は活性を調節することにより、調節することができる。具体的には、PARPはニコチンアミドを生成するため、この酵素のレベル又は活性を低下させることにより、ニコチンアミドレベルを低下させることができる。細胞内のニコチンアミドレベルはまた、NADを切断してニコチンアミドにするグリコヒドロラーゼ（例えばヒトCD38、好中球などの免疫細胞の表面上で発現する細胞外酵素；gi:4502665 及びGenBank登録番号NP 001766）のレベル又は活性を低下させることでも、減らすことができよう。
【０１２８】
さらに、de novoニコチンアミド合成経路を阻害することでも、ニコチンアミドレベルを下げられよう。この経路に関与する遺伝子には、Ｓ．セレビジエのBNA遺伝子（BNA1-6）がある。代替的には、ポリ（アデノシンジホスフェート-リボース）ポリメラーゼ（PARP）ファミリ・メンバ、例えばPARP-1及びPARPv 並びにタンキラーゼ（原語：tankyrase）を阻害しても、ニコチンアミドレベルを下げることができる。
【０１２９】
また、ニコチンアミド・トランスポータのレベル又は活性を下げても、細胞内に輸入されるニコチンアミドのレベルを下げることができる。例えば酵母では、ニコチン酸はTna1 （ニコチン酸／ニコチンアミド モノヌクレオチド輸送）タンパク質により輸送される。酵母TNA1のヒト相同体は、以下のGenBank登録番号を有する：gi:9719374及びAAF97769；gi:6912666及びNP 036566；gi:18676562及びAB84933；gi:12718201及びCAC28600；gi:19263934 及びAAH25312；gi:9966811及びNP 065079；及びgi:22761334 及びBAC11546。調節可能な他のヌクレオチドトランスポータには、細菌及びハエのヌクレオチドトランスポータや、それに対して相同な以下のヒト遺伝子がある：gi:8923160 及びNP 060164；gi:14336678 及びAAK61212；gi: 22749231及びNP 0689812；及びgi: 18603939 及びXP 091525。
【０１３０】
代替的には、例えばニコチンアミドメチルトランスフェラーゼとも言及されるニコチンアミド N-メチルトランスフェラーゼ（NNMT；EC 2.1.1.1；CAS 登録番号9029-74-7）など、ニコチンアミドを代謝、分解又は阻害する酵素の活性を刺激したり、又はレベルを増加させるなどしても、ニコチンアミドレベルを低下させたり、あるいはニコチンアミドを失活させることができる。この酵素は、反応S-アデノシル-L-メチオニン＋ニコチンアミド＝S-アデノシル-L-ホモシステイン＋1-メチルニコチンアミドを触媒して、細胞からのニコチンアミドの排出を促進する（さらにCantoni (1951) J.
Biol. Chem. 203-216を参照されたい）。このヒト酵素はNNMTと呼ばれ、その完全な配列は、GenBank 登録番号 U08021に、そしてヌクレオチド配列の場合は配列番号９に、そしてタンパク質の場合は配列番号１０に、見ることができる（Aksoy et al. (1994)
J. Biol. Chem. 269:14835 ）。この酵素の酵母のものはNNT1（YLR258wとも言及）と言及されている。
【０１３１】
ニコチンアミドを代謝することで、ニコチンアミドのレベルを下げるさらに別の酵素は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（NAMPRT; E.C.2.4.2.12）である。 そのヒト遺伝子はさらにプレ-B-細胞コロニ促進因子（PBEF）とも呼ばれ、その配列はGenBank 登録番号NP 005737；NM 005746；AAH20691；及びBC020691で入手することができる。ヒトNAMPRT (BC020691)
のヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１及び１２として提供する。酵母及びヒトの細胞では、それぞれNPT1又はそのヒト相同体のレベルを増加させると、ニコチンアミドレベルを下げることができる。
【０１３２】
ニコチンアミドを代謝し、そしてそれによりニコチンアミドのレベルを例えば下げるなど調節するであろう別の酵素は、ヒト細胞中のニコチンアミドモノヌクレオチド (NMN) アデニリルトランスフェラーゼである。このヒト酵素は、NMNAT-1(E.C.2.7.7.18)と言及されている。以下のGenBank 登録番号がこのヒト酵素に提供されている：NP 073624；NM 022787；AAL76934；AF459819；及びNP 073624；AF314163。この遺伝子のバリアントは、NMNAT-2 (KIAA0479)であり、そのヒト型はGenBank 登録番号NP 055854 及びNM 015039に見ることができる（Raffaelli et al. (2002)
Biochem Biophys Res Commun 297:835）。酵母細胞において、NAD＋再利用経路で均等な酵素はニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ１及び２（それぞれNMA1及びNMA2）(E.C. 2.7.7.1)である。
【０１３３】
増加させるとニコチンアミドレベルが低下するであろうさらに別の酵素は、リボース-5-ホスフェートを転化してNPT1の基質であるPRPPにするホスホリボシルピロホスフェート（PRPP）シンターゼ（PRPS）である。以下のGenBank 登録番号：gi:4506127 及びNP 002755（Prps1）；gi:4506129 及びNP 002756 （Prps2）；gi:20539448；gi:4506133 及びNP 002758 （Prps 関連タンパク質２）；gi:24418495 及び Q14558（Prps関連タンパク質１）；gi:17644236 及びCAD18892；gi:2160401 及びBAA05675（Prpsアイソフォーム１）；並びにgi:2160402及びBAA05676 （Prpsアイソフォーム２）を有するいくつかの関連する酵素がある。
【０１３４】
細胞内のニコチンアミドレベルを下げると、DNA損傷修復が刺激されるなど、他の利点もあるようである。実際、PARP はニコチンアミドにより調節されている（ニコチンアミドはPARPの負の調節をする）。このように、例えばさらにここで解説するように、細胞内のニコチンアミドのレベルを調節すると、PARPの活性が調節されるであろう。従って、PARPは、DNAの損傷修復、テロメアの長さの調節、及びヒストン修飾など、数多くの細胞機能に関与しているため、ニコチンアミドレベルを調節すると、これらの活性を調節することになるであろう。例えば細胞内のニコチンアミドレベルを低下させると、PARPの活性が上昇して、細胞のDNA損傷修復機序がさらに亢進するであろう。
【０１３５】
本発明の方法を哺乳動物細胞及び酵母細胞などの真核細胞に応用することに加え、本方法は、Sir2ファミリ・メンバが植物中にも存在するという事実に少なくとも基づき、植物細胞にも応用することができる。従って、本発明は、植物及び植物細胞の寿命を延ばしたり、過剰な塩条件などのストレスに対し植物及び植物細胞をより耐性にする方法も提供するものである。これは、例えば酵母及び哺乳動物系中の、ここで細胞の寿命及び／又はストレス耐性を増すとして解説されたタンパク質に実質的に相同な植物細胞中のタンパク質のレベル又は活性を調節するなどにより、達成することができる。代替的には、植物細胞中のニコチンアミドのレベルを、具体的には他の真核細胞でのそれらのレベルの調節に関してここで解説されたように、低下させることができる。核酸は当業で公知の方法に従って植物細胞内に導入することができる。
【０１３６】
例えば、以下は、細胞内のNAD＋再利用経路を通る流れ又はニコチンアミドレベルを調節するために調節することのできる、上述した遺伝子に相同なシロイヌナズナ（Arabidopsis
thalainia ）由来の遺伝子である。酵母PNC1の相同体：gi 18401044 NP 566539.1（推定上のヒドロラーゼ）；gi 15237256 NP 1977131；及びgi 15237258 NP 197714.1。酵母NPT1の相同体：gi 2026021
AAM13003.；gi 15234571 NP 195412.1; gi 25054896 AAN71931.1；及びgi 15227832 NP 179923.1。酵母NMA1/2の相同体：gi 22327861 NP 200392.2 及びgi 9758615
BAB09248.1。酵母NNT1 (YL285W)の相同体；gi 20197178
AAC14529；gi 22325900 NP 565619.2；gi 15219438 NP 177475.1 （腫瘍関連タンパク質）；gi 12324311
AA652120.1；gi:22330409 NP 683465；gi:15240506 NP 199767; gi 8778835 AAF79834.1；及びgi 15231011 NP 188637。ヒトNNMTの相同体：gi 15238203 NP 196623。酵母QNS1 （NAD＋再利用経路ではNMA1/2の下流の遺伝子）の相同体：gi:15221990 NP 175906。酵母BNA6の相同体：gi:18379203 NP 565259 及びgi:21555686
AAM63914。
【０１３７】
本発明の方法は、Sir2ファミリ・メンバがこれらの原核生物にも存在するという事実に基づき、原核生物などの微生物の寿命やストレス耐性を増すためにも用いることができる。      
【０１３８】
３．  細胞の寿命を減らす、又は、特定のストレスに対してそれをより感受性とする方法
ある実施態様では、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質の発現レベル又は活性を細胞内で減少させる。これは、対応する遺伝子の発現を阻害する作用薬を細胞に導入することにより、達成することができる。作用薬は、対応する遺伝子のプロモータに直接又は間接的に作用して、その転写を減少又は阻害するような低分子であってもよい。さらに作用薬は、当該タンパク質の生物学的活性を阻害する化合物であってもよい。さらに作用薬は、アンチセンス分子、三重分子又はsiRNAであってもよい。さらに他の作用薬は、例えばドミナント・ネガティブ変異体、又は、細胞内抗体、又は、当該タンパク質の生物学的活性に干渉する他のタンパク質など、をコードする核酸である。このような方法は当業で公知である。方法の例を以下に紹介する。
【０１３９】
細胞内の遺伝子の発現レベルを減少させる方法の一つは、細胞内に、標的遺伝子又はRNAの少なくとも一部分に相補的なアンチセンス分子を導入する方法である。ここで用いられる「アンチセンス」核酸とは、標的RNAのうちで、例えばその翻訳開始領域などの配列特異的（例えば非poly A）な部分に、コーディング及び／又は非コーディング領域の何らかの配列相補性のために、ハイブリダイズすることのできる核酸を言う。本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖又は一本鎖の、RNA又はDNAあるいはその修飾又は誘導体であるオリゴヌクレオチドであってよく、このオリゴヌクレオチドは、細胞に制御可能な態様で直接投与することも、あるいは、標的RNAの翻訳を混乱させるために充分な制御可能な量、導入された外因性の配列を転写させることにより、細胞内で産生させることもできる。
【０１４０】
好ましくは、アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチドであるとよく、そして好ましくは（６乃至約２００個のオリゴヌクレオチドの範囲の）オリゴヌクレオチドであるとよい。具体的な局面では、該オリゴヌクレオチド は、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、又は少なくとも２００ヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドはDNAでも、又はRNAでも、あるいはそのキメラ混合物又は誘導体又は修飾された形であっても、一本鎖でも、又は二本鎖でもよい。該オリゴヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾することができる。該オリゴヌクレオチドには、ペプチドなどの他の付属基や、又は、細胞膜を横切った輸送を促す作用薬（例えばLetsinger et al.,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc.
Natl. Acad. Sci. 84: 648-652: PCT Publication No. WO 88/09810, published Dec.
15, 1988を参照されたい）、ハイブリダイゼーションで惹起される切断剤（例えばKrol et al., 1988,
BioTechniques 6: 958-976を参照されたい）又はインターカレート剤（例えばZon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549を参照されたい）を含めてもよい。
【０１４１】
本発明のある好適な局面では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、好ましくは一本鎖DNAとして提供する。該オリゴヌクレオチドは、その構造上のいずれの位置でも、当業で公知の構成成分で修飾してよい。例えば、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定はしないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、及び2,6-ジアミノプリンから成る群より選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでよい。
【０１４２】
別の実施態様では、該オリゴヌクレオチドは、限定はしないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースから成る群より選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含む。
【０１４３】
さらに別の実施態様では、該オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホールアミドチオエート、ホスホールアミデート、ホスホールジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタール又はこれらの類似体から成る群より選択される少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含む。
【０１４４】
さらに別の実施態様では、該オリゴヌクレオチドは2-α-アノメリックオリゴヌクレオチドである。α-アノメリックオリゴヌクレオチドは、相補的なRNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するが、この場合、通常のβ-ユニットとは対照的に、ストランド同士は互いに並行に延びる（Gautier et al.,
1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641）。
【０１４５】
該オリゴヌクレオチドを、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションで惹起される架橋剤輸送剤、ハイブリダイゼーションで惹起される切断剤等の別の分子に結合させてもよい。アンチセンス分子は「ペプチド核酸（PNA）」であってよい。PNAとは、少なくとも約5ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを、リジンが末端に来たアミノ酸残基のペプチド骨格に連結させて含むアンチセンス分子又は抗遺伝子作用薬を言う。該末端のリジンは、当該組成物に可溶性をもたらす。PNAは、相補的な一本鎖DNA又はRNAに優先的に結合して転写産物の伸長を停止させるものだが、PEG化してそれらの細胞内での寿命を延ばしてもよい。
【０１４６】
本発明のアンチセンス核酸は、標的RNA種の少なくとも一部分に対して相補的な配列を含む。しかしながら、絶対的な相補性は、好ましいながらも必要ではない。ここで言う場合の、あるRNAの少なくとも一部分に対して「相補的な」配列とは、当該RNAとハイブリダイズできて安定な二本鎖を形成することができるように充分な相補性を有する配列を意味する。こうして、二本鎖アンチセンス核酸の場合には、二本鎖DNAの一本の鎖を検査しても、あるいは三本鎖形成を検定してもよい。ハイブリダイズ能は、アンチセンス核酸の相補性の程度及び長さの両方に依存するであろう。一般的には、ハイブリダイズする核酸が長いほど、標的RNAに対してより多くの塩基対ミス対合を含有する可能性があり、それでも尚、安定な二本鎖（又は、状況に応じては三本鎖）を形成するであろう。当業者であれば、標準的な手法を用いてハイブリダイズ後の複合体の融解点を判定することにより、許容可能なミス対合の程度を確認することができる。標的RNAの翻訳を阻害する上で有効であろうアンチセンス核酸の量は、標準的な検定技術により、判定することができる。
【０１４７】
次に、合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、制御された態様で細胞に投与することができる。例えば、当該のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、それらが細胞に取り込まれるであろう制御されたレベルで、細胞の成長環境に配置することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの取り込みは、当業で公知の方法を用いて支援することができる。
【０１４８】
ある代替的な実施態様では、本発明のアンチセンス核酸を、外因性配列からの転写により、細胞内で制御可能に発現させる。例えば、ベクタが細胞に取り込まれるようにそれをin vivoに導入することができ、この細胞内でベクタ又はその一部分が転写されると、本発明のアンチセンス核酸（RNA）が生じる。このようなベクタは、アンチセンス核酸をコードする配列を含有するであろう。このようなベクタは、それが転写されて所望のアンチセンスRNAを生じることができる限り、エピソーム性のままでも、あるいは、染色体に組み込ませることもできる。このようなベクタは、当業で標準的な組換えDNA技術により、作製することができる。ベクタは、哺乳動物細胞での複製及び発現に用いられる、プラスミドでも、ウィルスでも、又は当業で公知の他のものであってもよい。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、目的の細胞で作用することが当業で公知のいずれのプロモータによるものでもよい。このようなプロモータは誘導性でも、あるいは構成的でもよい。最も好ましくは、プロモータは、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドの制御された発現を達成するために、外因性の成分を投与することで制御可能又は誘導可能であるとよい。このような制御可能なプロモータには、Tet プロモータがある。哺乳動物細胞に利用できる他のプロモータには、限定はしないが：SV40初期プロモータ領域（Bernoist and
Chambon, 1981, Nature 290: 304-310）、ラウス肉腫ウィルスの3'側の長い末端反復配列に含まれたプロモータ（Yamamoto et al.,
1980, Cell 22: 787-797）、疱疹チミジンキナーゼプロモータ（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
78: 1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al.,
1982, Nature 296: 39-42）等がある。
【０１４９】
多種の癌のためのアンチセンス治療が臨床段階にあり、文献で広汎に論じられてきた。リード氏は、腫瘍におけるBcl-2遺伝子を狙ったアンチセンス治療：腫瘍細胞系で遺伝子輸送を媒介としてBcl-2を過剰発現させると、数多くの種類の癌薬に対する抵抗性がもたらされたことをレビューしている（Reed, J.C., N.C.I.
(1997) 89:988-990）。rasのアンチセンス阻害剤の臨床開発の可能性は、Cowsert, L.M., Anti-Cancer
Drug Design (1997) 12:359-371に論じられている。その他にも、重要なアンチセンス・ターゲットには、白血病（Geurtz, A.M., Anti-Cancer
Drug Design (1997) 12:341-358）；ヒトC-refキナーゼ（Monia, B.P., Anti-Cancer Drug Design
(1997) 12:327-339）；及びプロテインキナーゼＣ（McGraw et al., Anti-Cancer Drug Design (1997)
12:315-326がある。
【０１５０】
別の実施態様では、細胞内の特定のmRNA又はポリペプチドのレベルを、リボザイム、又は、リボザイムをコードする核酸を導入することにより、低下させる。mRNA転写産物を触媒作用により切断するようにデザインされたリボザイム分子を細胞に導入するか、又は細胞で発現させるようにしても、遺伝子の発現を阻害することができる（例えばSarver et al.,
1990, Science 247:1222-1225 及び米国特許第5,093,246号を参照されたい）。良く用いられているリボザイム・モチーフの一つはハンマーヘッドであり、このハンマーヘッドに対しては、基質配列の要件は小さい。ハンマーヘッド・リボザイムのデザインは、Usman et al.,
Current Opin. Struct. Biol. (1996) 6:527-533に開示されている。ウスマン氏はまた、リボザイムの治療的用途も論じている。リボザイムはさらに、 Long et al.,
FASEB J. (1993) 7:25; Symons, Ann. Rev. Biochem. (1992) 61:641;
Perrotta et al., Biochem. (1992) 31:16-17; Ojwang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) (1992) 89:10802-10806；及び米国特許第5,254,678号に解説された通りに調製及び使用することもできる。HIV-I RNAのリボザイムによる切断は、米国特許第5,144,019号に解説されている。リボザイムを用いてRNAを切断する方法は米国特許第5,116,742号に解説されており、そしてリボザイムの特異性を増す方法は、米国特許第5,225,337号及びKoizumi et al.,
Nucleic Acid Res. (1989) 17:7059-7071に解説されている。ハンマーヘッド構造中のリボザイム断片の調製及び使用も、Koizumi et
al., Nucleic Acids Res. (1989) 17:7059-7071に解説されている。ヘアピン構造中のリボザイム断片の調製及び使用は、Chowrira and
Burke, Nucleic Acids Res. (1992) 20:2835に解説されている。リボザイムはさらに、Daubendiek and
Kool, Nat. Biotechnol. (1997) 15(3):273-277に解説されているように、ローリング転写（原語：rolling
transcription）でも作製することができる。
【０１５１】
遺伝子発現を減少させる又は阻害する別の方法は、配列特異的mRNA分解を媒介する二本鎖小干渉RNA（siRNA）を導入する方法である。RNA干渉（RNAi）は、動物及び植物における配列特異的な転写後遺伝子のサイレント状態のプロセスであり、サイレントになる遺伝子に対して配列上相同な二本鎖RNA（dsRNA）により惹起される。in vivoでは、長いdsRNAがリボヌクレアーゼＩＩＩにより切断されて21及び22ヌクレオチドのsiRNAが生じる。21-ヌクレオチドのsiRNA二本鎖は、ヒトの胚性腎（２９３）及びHeLa細胞を含め、様々な哺乳動物細胞系で内因性及び異種の遺伝子の発現を特異的に抑制することが示されている（Elbashir et al. Nature
2001 ;411(6836):494-8）。従って、細胞中の遺伝子の翻訳は、その細胞を、約15乃至30ヌクレオチド、好ましくは約18乃至21ヌクレオチド、そして最も好ましくは19乃至21ヌクレオチドの長さを有する短い二本鎖RNAに接触させることにより、阻害することができる。代替的には、このようなsiRNA、又は、代謝されてsiRNAになるヘアピンRNAをコードするベクタを標的細胞に導入することができる（例えばMcManus et al. (2002)
RNA 8:842; Xia et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1006; 及びBrummelkamp et
al. (2002) Science 296:550を参照されたい。使用可能なベクタは、例えば OligoEngine社の名称pSuper RNAi システムTMなど、市販のものを入手可能である。
【０１５２】
さらに遺伝子発現は、標的遺伝子の調節領域（即ち遺伝子プロモータ及び／又はエンハンサ）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングして、身体内の標的細胞中の遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることでも、減少させることができる（概略的には Helene, C. 1991,
Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C., et al., 1992, Ann, N.Y. Accad. Sci.,
660:27-36; and Maher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807-15を参照されたい）。
【０１５３】
更なる実施態様では、RNAアプタマ（原語：aptamer）を細胞内に導入又は細胞内で発現させることができる。RNAアプタマは、Tat 及びRev RNA (Good et
al., 1997, Gene Therapy 4: 45-54) などのタンパク質の翻訳を特異的に阻害することができる、それらに対する特異的RNAリガンドである。
【０１５４】
ポリペプチドの生物学的活性を減少させるさらに別の方法は、細胞内にドミナント・ネガティブ変異体を導入する方法である。ドミナント・ネガティブ変異ポリペプチドは、このポリペプチドが通常相互作用する相手である分子と相互作用することで、その分子をめぐって競合するが、それは生物学的に不活性であるため、当該ポリペプチドの生物学的活性を阻害するであろう。あるタンパク質のドミナント・ネガティブ変異体は、例えば当該ポリペプチドの基質結合ドメイン、触媒ドメイン、又は細胞局在化ドメインを変異させるなどにより、作製することができる。好ましくは、変異ポリペプチドを過剰産生させるとよい。このような効果を有する点変異が作製されている。加えて、多様な長さの様々なポリペプチドを、あるタンパク質の末端に融合させると、ドミナント・ネガティブ変異体を生じさせることができる。ドミナント・ネガティブ変異体を作製するために一般的戦略を利用することができる。Herskowitz, Nature
(1987) 329:219-222を参照されたい。
【０１５５】
別の実施態様では、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択される一種以上のタンパク質の活性を低下させる。これは、例えば、これらのタンパク質のうちの一つの酵素活性などの活性を阻害する化合物に細胞を接触させるなどにより、達成することができる。このような化合物を特定するための検定法は、さらにここで解説されている。
【０１５６】
別の実施態様では、ニコチンアミドか、又は、実質的に同じ生物学的活性を有するそのバリアントに細胞を接触させることにより、細胞内のNAD＋再利用経路を通る流れを減少させる。ある好適な実施態様では、細胞を、約0.1 mM 乃至約100 mM、好ましくは約1 mM 乃至約20mM、さらにより好ましくは2 mM 乃至約10 mM、そして最も好ましくは約5 mMの量のニコチンアミドに接触させる。ニコチンアミドは市販のものを入手可能である（例えば実施例で提供した供給源を参照されたい）。細胞をニコチンアミドに、所望の効果を果たさせるために充分な時間、接触させる。 例えば、細胞を少なくとも約６０分間又は少なくとも約２４時間、ニコチンアミドに接触させることができる。さらに細胞をニコチンアミドに継続的に接触させてもよい。
【０１５７】
ニコチンアミドに加え、細胞をその類似体に接触させることもできる。類似体の例には、抗結核剤として販売されているピラジンアミドがある。類似体は、所望の活性を有するものについて、類似体のコンビナトリアル・ライブラリをスクリーニングするなどにより、同定することができる。例えば、寿命を測定するための検定法を用いることができる。代替的には、ニコチンアミドの類似体や、又は、Sir2ファミリ・メンバのＣポケットと相互作用する作用薬 を、さらにここで解説するように、合理的な薬物デザインにより同定することができる。
【０１５８】
ニコチンアミドの類似体又は誘導体の例には、式Ｉ：
【０１５９】
【化５】
2005535342.tif 000006
【０１６０】
の化合物があり、但し式中、
LはO、NR、又はSであり；
Rはアルキル又はフェニルであり；
R1は-NH2 、-O-アルキル、-N(R)2、又は-NH(R)であり；そして
Hetはヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルである。
【０１６１】
使用してもよい具体的な類似体には、式Ｉ及び付属の定義の化合物（但し式中、LはOである）；式Ｉ及び付属の定義の化合物（但し式中、R1は-NH2である）；式Ｉ及び付属の定義の化合物（但し式中、Het は、ピリジン、フラン、オキサゾール、イミダゾール、チアゾール、イソキサゾール、ピラゾール、イソチアゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピロール、テトラヒドロフラン、1:4 ジオキサン、1,3,5-トリオキサン、ピロリジン、ピペリジン、及びピペラジンから成る群より選択される）；式Ｉ及び付属の定義の化合物（但し式中、Hetはピリジンである）；式Ｉ及び付属の定義の化合物（但し式中、LはOであり、そしてR1は-NH2である）；式Ｉ及び付属の定義の化合物（但し式中、LはOであり、Hetはピリジンである）；式Ｉ及び付属の定義の化合物（但し式中、R1は-NH2であり、そしてHetはピリジンである）；並びに式Ｉ及び付属の定義の化合物（但し式中、LはOであり、R1は-NH2であり、そしてHetはピリジンである）、がある。
【０１６２】
使用できるニコチンアミドの他の類似体又は誘導体の例には、式ＩＩ：
【０１６３】
【化６】
2005535342.tif 000007
【０１６４】
の化合物があり、但し式中、
L はO、NR、又はSであり；
R はアルキル又はフェニルであり；
R1は-NH2、-O-アルキル、-N(R)2、又は-NH(R)であり；
X はH、アルキル、-O-アルキル、OH、ハロゲン化物、又はNH2であり；そして
n は１以上４以下の整数である。
【０１６５】
用いてよい具体的な類似体には、式ＩＩ及び付属の定義の化合物（但し式中、LはOである）；式ＩＩ及び付属の定義の化合物（但し式中、R1は-NH2である）；式ＩＩ及び付属の定義の化合物（但し式中、XはHであり、nは４である）；式ＩＩ及び付属の定義の化合物（但し式中、L はOであり、そしてR1は-NH2である）；式ＩＩ及び付属の定義の化合物（但し式中、LはOであり、X はHであり、そしてnは４である）；式ＩＩ及び付属の定義の化合物（但し式中、R1は-NH2であり、XはHであり、そしてnは４である）；並びに式ＩＩ及び付属の定義の化合物（但し式中、LはOであり、R1 は-NH2であり、XはHであり、そしてnは４である）がある。。
【０１６６】
さらに、ここで解説された化合物の薬学的に許容可能な塩及びプロドラッグを用いてもよい。
【０１６７】
一般的には、Sir2ファミリ・メンバのいずれの阻害剤も、細胞の寿命を減らすために用いることができる。好適な阻害剤は、例えばニコチンアミド又はその類似体など、Sir2ファミリ・メンバのＣポケットに結合する分子である。
【０１６８】
代替的には、細胞の寿命を減らしたり、あるいは、細胞をストレスにより感受性とすることが望ましいような細胞で、ニコチンアミドを産生する酵素のレベル又は活性を増加させることができる。例えば、NAD＋再利用経路中又はde novo合成経路中のニコチンアミドの生合成に関与する酵素のレベル又は活性を増加させることができる。代表的な酵素は前の項で上に記載されている。細胞内のニコチンアミドのレベルを増加させるさらに別の方法には、ニコチンアミドを失活又は分解する酵素、例えば酵母及びヒトのニコチンアミドメチルトランスフェラーゼ；ヒト細胞のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（上に論じた）、及び、酵母NPT1 又はそのヒト相同体（やはり上に解説した）、を阻害する方法がある。遺伝子発現レベル又はタンパク質活性を調節する方法は、さらにここで解説されており、また当業で公知でもある。
【０１６９】
さらに他の実施態様では、NADを切断してニコチンアミドにするグリコヒドロラーゼのレベル又は活性を増加させることによっても、細胞内のニコチンアミドレベルを増加させることができる。さらに、ニコチンアミド・トランスポータのレベル又は活性を増加させても、細胞内のニコチンアミドのレベルを増すことができる。
【０１７０】
細胞の寿命又はストレスへのそれらの耐性は、植物細胞や微生物においても、上で解説された遺伝子に相当する植物遺伝子を調節することにより、低下させることができる。これらの遺伝子については、前の項で解説されている。
【０１７１】
４．  細胞内のNAD＋再利用経路を通る流れ又はニコチンアミドのレベルを調節する作用薬を特定する方法
作用薬には、低分子、例えば低有機分子、又はいずれかの生物学的巨大分子、一本鎖もしくは二本鎖の、DNAもしくはRNAなどの核酸；タンパク質又はペプチド；多糖；脂質；又はこれらの分子的組合せ、がある。
【０１７２】
ある実施態様では、細胞の寿命又は特定の種類のストレスに対するその耐性を調節する化合物を特定する方法は、（ｉ）NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択されるタンパク質を検査化合物に、前記タンパク質の活性に影響を与えるのに充分であろう時間、接触させるステップと、（ｉｉ）前記酵素の活性を判定するステップであって、この場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下での前記酵素の活性の違いは、前記検査化合物が、細胞の寿命を調節する化合物であることを示す、ステップと、を含む。本方法には、さらに、細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、細胞の寿命が調節されたかどうかを判定するステップと、を含めてもよい。代替的には、本方法はさらに、細胞を検査化合物に接触させるステップと、例えば熱ショック、浸透圧ストレス、高温、カロリ制限、DNA損傷作用因子（例えば紫外線及びミトコンドリア変異誘発源臭化エチジウム）、不適切な窒素条件などの特定のストレスに対する細胞の耐性が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。酵素の活性を判定するステップは、ここでさらに解説するように行うことができる。それにはさらに、細胞の寿命や、熱ショック、浸透圧ストレス等に対するその耐性に及ぼされる、検査化合物の影響を測定するステップを含めることもできる。
【０１７３】
当業者であれば理解されるように、さらに上記の検定法は、上に解説したものなど、上記のタンパク質のうちの一つの生物学的に活性な部分又はバリアントを用いて行うこともできる。例えば、タンパク質の一部分はその触媒部位から構成されたものでもよい。Ｓ．セレビジエ及びヒトNPT1の触媒部位は、約アミノ酸209位から240位の間に位置している。Ｓ．セレビジエPNC1の触媒部位は、約アミノ酸150乃至186位に位置している。ヒトNMNAT（NMA1及びNMA2の相同体）の触媒部位は、約アミノ酸100乃至110位と、280乃至310位とに位置している（両方の配列とも、活性部位に寄与する）。
【０１７４】
別の実施態様では、本発明は、細胞の寿命又は特定の種類のストレスに対するその耐性を調節する化合物を特定する方法を提供するものである。本方法は、（ｉ）レポータ遺伝子に作動的に連結された、NPT1、PNC1、NMA1及びNMA2から成る群より選択される遺伝子の転写調節核酸を含む細胞又はライセートを、検査化合物に、前記転写調節核酸に影響を与えるのに充分であろう時間、接触させるステップと、（ｉｉ）前記レポータ遺伝子のレベル又は活性を判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下での前記レポータ遺伝子のレベル又は活性の違いは、前記検査化合物が、細胞の寿命又は特定の種類のストレスに対するその耐性を調節する化合物であることを示す、ステップと、を含む。さらに本方法は、細胞を前記検査化合物に接触させるステップと、前記細胞の寿命が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。さらに本方法は、細胞を検査化合物に接触させるステップと、熱ショックなどの特定のストレスに対する前記細胞の耐性が調節されたかどうかを判定するステップとを含んでもよい。転写調節核酸は当業で公知であるか、あるいは、当業で公知の方法に従って、容易に単離することができる。前記のレポータ遺伝子は、その発現を蛍光活性化セル・ソーティングなどにより検出することのできるタンパク質をコードしていれば、いずれの遺伝子であってもよい。細胞は原核細胞でも、又は真核細胞でもよい。ライセートは、当業で公知の方法に従って調製された、細胞の完全ライセートでも、又は、それは、細胞ライセートの画分であっても、又は、数種の細胞ライセートの組合せでも、又は、細胞ライセートの画分の組合せであってもよい。ライセートには、さらに、一種以上の組換えタンパク質が含まれていてもよい。
【０１７５】
さらに本発明は、細胞内のニコチンアミドのレベルを調節する方法も提供するものである。このような方法は、細胞内の ニコチンアミドレベルを増加又は減少させる酵素を調節する作用薬を特定するステップを含んでもよい。酵素の例はここで解説されている。検定は、基本的には、NAD＋再利用経路を調節する作用薬の特定に関して上述した通りに行うことができる。
【０１７６】
５．  Sir2及びSir2ファミリ・メンバの阻害剤を特定する方法
ここで示すように、ニコチンアミドはSir2及びヒトSRT1を阻害する。また、ニコチンアミドはSir2のＣポケットに結合することにより、Sir2を非競合的に阻害することも示されている。従って、本発明は、合理的な薬物デザインなどに基づいて、Sir2や、Ｃポケットを含むSir2ファミリのタンパク質の他のメンバの阻害剤であるニコチンアミドの類似体も特定するための検定法を提供するものである。
【０１７７】
従って、本発明は、特定の細胞の寿命を減らすと有益であろう状態を治療するなどのために、細胞の寿命を減らすために使用できる作用薬を特定する方法を提供するものである。このような実施態様の一つは、Ｃポケットを含むSir2ファミリ・メンバの少なくとも一部分の三次元座標を含むデータ・セットを用い、Sir2ファミリ・メンバの阻害剤として用いられる作用薬を特定する方法を包含する。Sir2相同体の結晶構造はMin et al. (2001)
Cell 105 269に解説されており、その構造はProtein Data Bank
ID code 1ICIに提供されている。ＣポケットはヒトSIRT1の約アミノ酸70-90位及び127-167位に位置する。Sir2のＣポケットは、約アミノ酸250-270位及び310-350位に位置する。当該の座標は、さらに、ニコチンアミド又はその類似体の座標を含んでいてもよい。ある具体的な実施態様では、当該の三次元座標は、Sir2相同体のものである。他の実施態様では、検定法は、Ｃポケットを含むSir2ファミリ・メンバの少なくとも一部分をニコチンアミド類似体などの化合物と同時晶析させるステップを含む。同時晶析は、NAD＋の存在下であっても、又は非存在下であってもよい。
【０１７８】
ある実施態様では、潜在的な作用薬は、少なくともＣポケットを含むSir2ファミリ・メンバの一部分の三次元座標で合理的な薬物デザインを行うことにより、選択される。上述したように、選択は、コンピュータ・モデリングと連携して行われることが好ましい。こうして、潜在的作用薬をSir2ファミリ・メンバと接触させ、Sir2ファミリ・メンバの活性を判定する（例えば測定する）。潜在的作用薬は、Sir2ファミリ・メンバについて判定された活性に減少があるときに、Sir2ファミリを阻害する作用薬として、特定される。
【０１７９】
ある好適な実施態様では、本方法は、Ｃポケットを潜在的作用薬に結合させて含む、Sir2ファミリ・メンバの少なくとも一部分を含有する補足的結晶を調製するステップをさらに含む。好ましくは、該補足的結晶は、原子座標の決定のために、実質的に５．０オングストロームより良好な分解能に、より好ましくは３．５オングストロームと同等又はそれより良好な分解能に、さらにより好ましくは３．３オングストロームと同等又はそれより良好な分解能に、Ｘ線を効果的に回折させるとよい。こうして、補足的結晶の三次元座標は分子置換解析で決定され、第二世代作用薬は、この補足的結晶について決定された三次元座標による合理的薬物デザインを行うことにより、選択される。好ましくは、この選択をコンピュータ・モデリングと連携して行うとよい。第二世代作用薬はニコチンアミドの類似体であってもよい。
【０１８０】
容易に明白なはずだが、補足的結晶の三次元構造は、分子置換解析又は多重波長異常分散又は多重同型置換により、決定することができる。こうして、当該の補足的結晶について決定された三次元構造を用いた合理的薬物デザインを、好ましくはコンピュータ・モデリングと関連させて行うことにより、候補薬物を選択することができる。こうして、候補薬物を、数多くの薬物スクリーニング検定法で、ここに例示した標準的な生化学的方法を用いて、検査することができる。
【０１８１】
さらに本方法は、第二世代作用薬を、異なる種のSir2ファミリ・メンバ又はその部分に接触させるステップと、前記他の種のSir2ファミリ・メンバ又はその部分の活性を判定（例えば測定）するステップとを含むことができる。こうして、第一の種のSir2ファミリ・メンバで観察されたものに比較して、他の種のSir2ファミリ・メンバの活性に有意に少ない変化（２以上の因数）があったときに、前記第一の種のSir2ファミリ・メンバの基本的に特異的な阻害剤として用いられる作用薬として、潜在的作用薬が特定される。好ましくは、他の種の活性に全く変化が観察されないか、又は代替的にはごく僅かな（即ち１５％未満）変化が観察されるとよい。
【０１８２】
ある局面では、本発明は、Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤を特定するための、コンピュータ支援された方法を提供するものである。本方法は、Ｃポケットを含むSir2ファミリ・メンバの少なくとも一部分を含む分子又は分子複合体の一組の構造座標をコンピュータ・モデリング・アプリケーションに提供するステップと；ニコチンアミドの類似体などの化学的実体の一組の構造座標を前記コンピュータ・モデリング・アプリケーションに提供するステップと；前記化学的実体が、前記分子又は分子複合体に結合又は干渉すると予測される阻害剤であるかどうかを判定するステップであって、前記分子又は分子複合体に結合又は干渉することは、Sir2ファミリ・メンバの活性の潜在的阻害の指標である、ステップと、を含む。好ましくは、前記化学的実体が、当該の分子又は分子複合体に結合又は干渉すると予測される阻害剤であるかどうかを判定するステップが、前記化学的実体と当該分子又は分子複合体の結合ポケットとの間で嵌合操作を行った後に、該嵌合操作の結果をコンピュータ解析して、前記化学的実体と前記結合ポケットの間の結合を定量するステップを含むとよい。さらに本方法は、化学的実体のライブラリをスクリーニングするステップを含んでもよい。さらに本方法は、潜在的阻害剤を提供又は合成し、次にこの潜在的阻害剤を検定して、それがSir2ファミリ・メンバの活性を阻害するかどうかを判定するステップを含んでもよい。
【０１８３】
別の局面では、本発明は、Sir2ファミリ・メンバの阻害剤を作製する方法を提供するものであり、本方法は、ある化学的実体を化学的又は酵素的に合成して、Sir2ファミリ・メンバの活性の阻害剤を生成するステップを含み、但し前記化学的実体は、例えば上述したように、コンピュータで支援されたプロセスの間にデザインされたものである。
【０１８４】
さらに本発明は、Sir2ファミリ・メンバと、ニコチンアミド又はその類似体との間の複合体の表現を含む装置も提供するものである。このような装置の一つは、コンピュータ・メモリ内に該複合体の表示を含むコンピュータである。ある実施態様では、該コンピュータは、当該複合体の原子座標を含む機械読み取り可能なデータで符号化されたデータ記憶材料を含有する機械読み取り可能なデータ記憶媒体を含む。本コンピュータは、さらに、前記機械読み取り可能なデータを処理するための指示を記憶するためのワーキングメモリと、前記作業記憶及び機械読み取り可能なデータ記憶媒体の両方に接続して、前記機械読み取り可能なデータを処理して該複合体の三次元表現にする中央処理装置とを含んでもよい。ある好適な実施態様では、該コンピュータはさらに、前記中央処理装置に接続して前記三次元表現を表示する表示装置を含む。
【０１８５】
６．  発明の用途
ある実施態様では、NAD＋再利用経路を通る流れを増加させる、又は、ニコチンアミドレベルを減少させるステップを用いて、細胞の寿命を増し、細胞を少なくとも特定のin vitroでのストレスから保護する。例えば、培養細胞を、例えばより長時間増殖させるなどのために、ここで解説された通りに処理することができる。これは、培養ではごく限られた寿命しか持たないことが知られている初代細胞培養株（即ち、ヒトなどの生物から得られた細胞）に特に有用である。例えばNPT1、PNC1、NMA1、NMA2、ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ（NNMT及びNNT1）、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（NAMPRT）、及び選択的にはヒトニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（NMNAT、NMAT-1及び2）から成る群より選択される一つ以上の遺伝子の一つ以上の付加的なコピーを組み込むなどにより、本発明の方法に従ってこのような細胞を処理すると、培養で細胞が生きた状態に維持される時間量が増加するであろう。胚性幹（ＥＳ）細胞及び多能細胞や、それらから分化した細胞も、該細胞又はそれらの後代細胞をより長時間培養できるように、本発明の方法に従って改変することができる。細胞の初代培養物、ＥＳ細胞、多能細胞及びそれらの後代細胞は、例えば細胞に対して特定の生物学的効果を有する化合物を特定したり、あるいは、細胞に対して化合物の毒性を検査する（即ち細胞毒性検定）ために、用いることができる。
【０１８６】
他の実施態様では、長時間保存しようとする細胞を、ここで解説した通りに処理する。当該細胞は、例えば血球、又は組織又は器官などの懸濁液中の細胞であってもよい。例えば、ある個体に投与するために個体から採集された血液を、例えば血球を長時間保存するなどのために、本発明に従って処理することができる。寿命を延ばすため、及び／又は、それらを特定の種類のストレスから保護するために処理してもよい他の細胞には、例えば（肉など）非ヒト哺乳動物由来の細胞など、消費用の細胞や、又は（例えば野菜など）植物細胞がある。
【０１８７】
別の実施態様では、ヒト又は他の哺乳動物などの対象から得られた細胞を、本発明の方法に従って処理した後、同じ又は異なる対象に投与する。従って、移植片として用いるためにドナーから得られた細胞又は組織を、移植のレシピエントに投与する前に、ここで解説したように処理することができる。例えば、骨髄細胞を対象から得、ex vivo で処理してそれらの寿命を延ばし、細胞を特定の種類のストレスから保護してから、レシピエントに投与することができる。いくつかの実施態様では、骨髄などの移植片の細胞に、NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NMNAT、NNT1、NAMPRT、及び選択的にNMAT-1又は2から成る群より選択される一つ以上の遺伝子の一つ以上のコピーをトランスフェクトする。該移植片は、器官、組織又は疎性細胞であってよい。
【０１８８】
さらに他の実施態様では、細胞をin vivo で処理して、それらの寿命を増す、及び／又は、それらを特定の種類のストレスから保護する。例えば、上皮細胞などの皮膚を、ここで解説するように処理することにより、皮膚を皺の発生などの老化から保護することができる。ある例示的な実施態様では、NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NMNAT、NNT1、NAMPRT、及び選択的にNMAT-1又は2から成る群より選択される一つ以上の遺伝子の転写を増加させることのできる化合物を含む医薬又は美容組成物に、皮膚を接触させる。別の実施態様では、NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NMNAT、NNT1、NAMPRT及び選択的にNMAT-1 又は2から成る群より選択されるタンパク質、あるいは、このようなタンパク質をコードする核酸と、前記核酸又はタンパク質を当該細胞に送達するための賦形剤とを含む組成物に、皮膚細胞を接触させる。
【０１８９】
化合物、核酸及びタンパク質はまた、注射などにより対象の組織又は器官に、細胞の寿命を延ばす、又は、特定のストレスから細胞を保護するために、送達することもできる。
【０１９０】
さらに別の実施態様では、本発明の作用薬を、例えば概略的にはその細胞の寿命を増し、その細胞を特定の種類のストレスから保護するなどのために、対象に投与する。例えば、作用薬を食品添加物として対象に摂取させることができる。ある実施態様では、このような作用薬は、複合ビタミン剤の成分である。
【０１９１】
細胞の寿命を延ばし、それらをストレスから保護する作用薬は、細胞死に関連する慢性疾患などや、神経細胞死又は筋細胞死に関連する疾患など、細胞死から細胞を保護するためなど、疾患の治療のために対象に投与することもできる。疾患の例にはパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、羊水栄養性側索硬化症、及び筋ジストロフィがある。このような場合、本作用薬を、細胞死が起きそうな組織又は器官に投与してもよい。
【０１９２】
このような作用薬を、さらに、例えば脳卒中又は心筋梗塞に罹患した対象や、又は、脊髄損傷を被った対象など、器官又は組織に急性の損傷を被った対象に投与することもできる。作用薬はまた、アルコール性肝臓を修復するためにも使用することができる。
【０１９３】
DNAの修復も、ニコチンアミドによって阻害されるため、細胞内のニコチンアミドレベルを下げる作用薬を用いて、細胞内のDNA修復を促進することができる。従って、例えば紫外線及び臭化エチジウムなど、DNA損傷を惹起しかねない条件に曝される細胞を、それらを、このDNA損傷作用因子への曝露前、曝露中及び／又は曝露後に、細胞内のニコチンアミドレベルを下げる作用薬に接触させることで、保護できよう。
【０１９４】
他の実施態様では、本発明の方法を酵母細胞に応用する。酵母細胞の寿命を延ばし、それらを特定の種類のストレスから保護することが好ましいであろう状況には、酵母を用いて、例えばビール、ヨーグルトを作製したり、パンを作製する製パンなどの加工がある。寿命の長い酵母を用いると、用いる酵母量を減らせたり、あるいは、酵母をより長時間、活性に保つことができる。
【０１９５】
さらに本発明は、細胞の寿命を減らしたり、あるいは、熱ショック、放射性活性、浸透圧ストレス、紫外線などによるDNA損傷などの特定のストレスに対してそれをより感受性とする方法も提供する。このような方法は、細胞の寿命を減らすことが好ましい場合なら、いつでも用いることができる。方法の例には、NPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NMNAT、NNT1、NAMPRT、及び選択的にNMAT-1又は2から成る群より選択されるタンパク質のレベル又は活性を下げるステップが含まれる。
【０１９６】
別の方法は、例えばニコチンアミドに細胞を接触させる、あるいは、例えばNPT1、PNC1、NMA1、NMA2、NMNAT、NNT1、NAMPRT、及び選択的にNMAT-1又は2のレベル又は活性を減少させるなど、ニコチンアミド生合成を刺激する酵素のレベル又は活性を増加させる、又は、ニコチンアミドを阻害又は分解する酵素のレベル又は活性を減少させることにより、細胞内のニコチンアミドのレベルを増加させるステップを含む。細胞の寿命を減らしたり、あるいは特定のストレスにそれをより感受性としたいような状況の例には、癌、自己免疫疾患、又は、対象の細胞を消失させることが好ましいような他のいずれかの状況、の治療がある。ニコチンアミド、又は、本発明の他の化合物もしくは作用薬を、腫瘍など、望ましくない細胞を含有する領域に直接投与することができる。さらにこれらの方法は、例えばいぼ、ほくろ又は及び線維腫など、非悪性腫瘍の細胞を消失させたり、あるいは望ましくない細胞をそれ以上増殖させないようにするためにも、用いることができる。例えば、ニコチンアミドをいぼに注射することができ、あるいは代替的には、いぼに塗る医薬組成物中に含めることもできる。
【０１９７】
細胞の寿命を減らしたり、あるいは、特定のストレスに対するそれらの感受性を増す方法は、酵母感染性対象など、酵母に応用することができる。従って、ニコチンアミドなどの作用薬を含む組成物を、酵母感染の位置に応用することができる。
【０１９８】
ここで解説するように治療してもよい対象には、真核生物、例えばヒト、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、マウス、及びラットなどの哺乳動物、が含まれる。治療してよい細胞には、真核細胞、例えば上に解説した対象由来のもの、又は、植物細胞、酵母細胞、及び細菌細胞などの原核細胞、がある。
【０１９９】
７．  医薬組成物及び方法
化合物、核酸、タンパク質、細胞及び他の組成物を、当業で公知の方法に従って対象に投与することができる。例えば、タンパク質をコードする核酸、又は、アンチセンス分子は、ウィルスベクタを用いるなどして、上に解説した通りに対象に投与することができる。細胞は、シクロスポリンＡなどの免疫抑制剤の投与など、付随する方法を伴ってもよい、対象に移植片を投与する方法に従って、投与することができる。医学的処方の一般的原則については、Cell Therapy:
Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G.
Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; and
Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill
Livingstone, 2000を参照されたい。
【０２００】
さらに本発明を、以下の実施例により描出するが、以下の実施例を何ら限定的なものと捉えられてはならない。（本出願全体を通じて引用された参考文献、発行済み特許、公開済み特許出願を含む）全引用文献の内容を、引用をもってここに援用することを明示しておく。
【０２０１】
本発明の実施にあたっては、そうでないと明示しない限り、当業の平均的技術水準である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の常法を用いることになるであろう。このような技術は、文献に十二分に説明されている。例えばMolecular Cloning
A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis
(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.
N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis
et al. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames &
S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S.
J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss,
Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A
Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In
Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian
Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);
Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical
Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press,
London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir
and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【０２０２】
実施例
実施例１：  核内NAD＋再利用経路を操作して老化を遅らせる
栄養を枯渇させた酵母は、NAD＋依存的ヒストンデアセチラーゼであるSir2pの活性を必要とする著しい寿命の伸長を示す。そこで我々は、NAD＋再利用経路にとって重要なニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするNPT1を増量投与すると、Sir2依存的サイレント状態が増し、そのrDNA遺伝子座が安定化して、酵母の複製寿命が最高６０％延びることを示す。NPT1及びSIR2は両者とも、熱ショックに対する耐性を提供するが、このことは、これらの遺伝子が、細胞生存を促進するためにより一般的な態様で作用することを示すものである。我々は、Npt1や、まだ特徴付けられていない再利用経路酵素であるNma2は両者とも、核内に濃縮されていることを示し、かなりの量のNAD＋がこのオルガネラ内で再生されていることを示唆する。再利用経路遺伝子のPNC1、NMA1及びNMA2 のコピーが増すと、テロメア及びrDNAサイレント状態も増すことから、多段階のステップがこの経路の速度に影響を与えていることが分かる。SIR2-依存的プロセスは付加的なNPT1により高められるが、定常状態NAD＋レベル及びNAD＋／NADH 比は変化しないままである。この発見から、酵母寿命の延びは、Sir2にとってのNAD＋利用能が高まると、定常状態レベルが単純に増すことが原因ではないが、促進されるのではないかと思われる。そこで我々は、NAD＋再利用経路を通る流れの増加が、寿命のSir2依存的延びを担っているとのモデルを提案する。
【０２０３】
実験の手法
プラスミド及び株  −  この研究で用いられる株を表２に挙げる。W303AR5 sir3::URA3（１６）、W303AR5
sir4::HIS3、W303AR5
sir2::TRP1 及びPSY316ATが解説されている（４１）。PSY316ATでのSIRの欠失を、ScaI/PvuIIで直線化させたpC369を用いて行った（４１）。JS209、JS241、JS237 及びJS218はＪ．スミス氏から提供された（４２）。NPT1のコーディング領域及び1.1kbの上流配列をPCRで増幅し（４３）、2.4 kbの産物断片を、pRS306ベースのベクタpSP400のNotI とSacI （M.I.T.大のＬ．ガランテ氏により提供）の間と、 2μベースのベクタpDB20とにサブクローニングして（４４）、それぞれpSPNPT1及びpDBNPT1 を生じさせた。
【０２０４】
【表２】
2005535342.tif 000008
2005535342.tif 000009
2005535342.tif 000010
2005535342.tif 000011
【０２０５】
NPT1 の更なるコピーをURA3 遺伝子座に、StuIで直線化させたプラスミドpSPNPT1を用いて組み込んだ。組込み体をまずPCRで特定した。次に、NPT1 コピー数を、NPT1 及び ACT1 DNAをサザン・ブロットでプローブして判定した。NPT1 バンドの濃度を、ACT1 バンドに、ImageQuant ソフトウェア（カリフォルニア州サニーベール、モラキュラー・ダイナミックス社）を用いて比較した。SIR2の付加的なコピーを持つ株を、XcmIで直線化させたプラスミドp306SIR2 又はp305SIR2（１７）を組み込むことにより、作製した。高コピーのSIR2 を2μベースのプラスミドp2μSIR2 （ＵＣＳＤ大、Ｌ．ピルス氏より提供）に導入した。それぞれ StuI 及びXcmIで直線化させたpRS306 又はpRS305（４５）を組み込むことにより、W303AR5をUra＋及びLeu＋原栄養性に形質転換させた。ADE2消失事象の起きたコロニを選抜することにより、YDS1595をW303AR5から作製した。YDS1595を、StuIで切断されたpRS402 （ADE2 遺伝子を持つ）で形質転換させてYDS1596を作製した。W303cdc25-10 はＳ．リン氏（M.I.T）からの提供だった（１９）。NPT1欠失株であるYDS1580を、この野生型遺伝子をkanr マーカに、解説された通りに置換することで作製した（４６）。PNC1/YGL037 のコーディング領域及び650bp上流をPCRによりゲノムDNAから増幅した。1350 bp のSacI/NotI断片をベクタpSR400内にクローニングしてpSPYGL037を作製した。NMA2/YGR010 のコーディング領域及び500bp上流をPCRによりゲノム・テンプレートから増幅し、1730 bpのSacI/NotI断片をpSP400内にサブクローニングしてpSPYGR010を作製した。NMA1/YLR328 のコーディング領域及び450 bpの上流をゲノム・テンプレートからPCRにより増幅し、2150 bp の断片をpRS306中にクローニングしてp306YLR328を作製した。QNS1/YHR074 のコーディング領域及び600bp上流をPCRにより増幅し、2.8 kbのSacI/NotI 断片をpSP400中にクローニングしてpSPYHR074を作製した。PNC1/YGL037、NMA1/YLR328、NMA2/YGR010、及びQNS1/YHR074 の付加的なコピーを、W303AR5 及びPSY316AT のURA3遺伝子座に形質転換により組み込んだ。増幅された全てのDNAに変異がないことを配列決定で確認した。
【０２０６】
HAタグ付きNPT1を、tag-kanr組込み法（４７）を株W303AR5及びW303cdc25-10で用いて作製した（１９）。緑色蛍光タンパク質（GFP）カセットを、Npt1、Nma1及びNma2のカルボキシ末端に、解説された通りに導入した（４８）。タグ付けされたタンパク質の機能性をrDNAサイレント状態を検定することで確認した。
【０２０７】
寿命の判定  −  複製寿命の判定を解説された通りに行った（１６）。細胞を、他に明示しない限りYPD 培地（1% 酵母抽出物、2% バクトペプトン、2% グルコース w/v）上で、１実験当たり最低４０個の細胞を用いて行った。各実験を少なくとも個別に２回、行った。寿命の統計学的有意差は、ウィルコキソンの順位和検定を用いて判定された。差は、信頼度が９５％より高いときに差であるとして記載されている。
【０２０８】
mRNA 及びタンパク質の判定  −  ノーザン及びウェスタン・ブロットを常法を用いて行った。NPT1 転写産物を、NPT1 遺伝子の完全開放読み取り枠から得られたプローブを用いて検出した。ACT1 mRNA を完全長ACT1プローブ（Ｍ．Ｉ．Ｔ．大のＧ．フィンク氏から提供）を用いて検出した。HAエピトープ・タグを、モノクローナル抗体HA.11（カリフォルニア州リッチモンド、CRP社）を用いて検出した。アクチンはモノクローナル抗体 MAB1501R（カリフォルニア州テメキュラ、ケミコン社）で検出された。
【０２０９】
酵母検定及びGFP位置確認  −  酵母株を他に記載しない限り３０℃で成長させた。リボゾームDNA遺伝子座でのサイレント状態の程度を、２つの検定法を用いて判定した。ADE2 のサイレント状態に関する検定では、細胞を合成完全（SC）培地（1.67% 酵母窒素基剤、2% グルコース、40 mg/lのヒスチジン、ウリジン、トリプトファン、アデニン及びロイシン）で３日間、予備成長させた。細胞をSD培地に再懸濁させ、リン酸緩衝生理食塩水で１０倍に連続希釈した後、アデニンを欠くSC培地にスポットした。MET15 のサイレント状態に関する検定は、前に解説した通りにPb2＋含有プレートで行われた（４２）。テロメアのサイレント状態は、0.7 mg/l のアデニンを含有するSC培地上で検定された。細胞を３日間、成長させ、４℃で３日間置いて、着色を強めた。熱ショック検定は、基本的には解説された通りに行われた（１４）。染色を、ヒスチジンを制限（20mg/ml）したSC完全培地上で一晩、予備成長させ、1×105細胞/mlになるように3mlの同じ培地で希釈し、５日間、成長させた。培養物を、換気した培地で１０倍に希釈し、５５℃で１時間、インキュベートし、SCプレートにスポットした。リボゾームDNA組換え率を前に解説された通りに判定した（４９）。少なくとも10,000個のコロニを各株毎に調べ、各実験は三重にして行われた。
【０２１０】
NAD＋及びNADH の判定は、他の箇所で解説した通りに測定された（５０）。GFP融合体を発現する細胞を中対数期までYPD培地又はYPD低グルコース（0.5% w/v）で成長させた後に、20μMの Hoechst 33342
DNA株（シグマ社）を含有するPBSで５分間、インキュベートした。画像を１００倍の倍率でニコンE600蛍光顕微鏡で撮像し、フォトショップ6.0ソフトウェアを用いて解析した。
【０２１１】
結果
NPT1 を増量投与すると寿命は延びるが定常状態NAD＋レベルは上がらない  −  SIR2 は、酵母の寿命の制限要素であり、触媒にはNAD＋を必要とする。E. coli での研究では、PncB は、NAD＋を循環させる再利用経路中の律速段階を触媒する（３５、３７、３８）ことが示された。我々は、酵母 pncB 相同体である
NPT1のコピーが付加的にあると、Sir2に対するNAD＋産生が増し、ひいては酵母寿命が延びるかどうかを疑問にした。NPT1 を、URA3 遺伝子座にその天然プロモータの制御下に置いて組み込んだ。次に、NPT1の１つ又は４つのタンデム・コピーを持つ株をサザン・ブロット法で特定した。我々はその結果得られた遺伝子型をそれぞれ2xNPT1 及び5xNPT1 と言及する。
【０２１２】
複製寿命検定については、細胞を少なくとも２日間、新鮮な酵母抽出物／ペプトン／グルコース（YPD）培地で成長させることで、これらが検定前にカロリ制限条件から確実に充分に回復しているようにした。次に、前に発芽していない母細胞から萌芽した娘細胞を顕微操作して取り出し、採点した。図１Ａに示すように、2xNPT1 株は、野生型株よりも平均最高４０％長く生存し、そして5xNPT1 株は、驚くべきことに最高６０％、長く生存した。NPT1で誘導された寿命の延びは、sir2を欠失させると完全に失われ、SIR2の付加的なコピーがあっても有意には向上しなかった（図１Ｂ）ことから、NPT1 によりもたらされた寿命の延びはSir2により媒介されていることが分かる。
【０２１３】
最近、低グルコース培地（0.5% w/v）で成長させた野生型細胞は、標準的（2%）グルコース培地で成長させたものよりも、有意に長い平均寿命を有することが示されている（１９、３２）。図１Ｃに示すように、低グルコース培地上では、5xNPT1 株の寿命は、野生型株よりも有意には長くなかった。NPT1 及び低グルコースの影響が相加的でないという事実は、２つの養生法は同じ経路を通じて作用していることを示している。
【０２１４】
生化学的研究では、Sir2はNAD＋をコファクタとして要することが示されている。このことから、複製寿命はNAD＋レベルが上がると延びるのではないかとの仮説が導かれた。この考えと一致するように、NAD＋レベルは、老化した細胞では著しく上昇しており、おそらくは、老化に対する防御としてか、あるいは、代謝活性の低下が原因である（５０）。今日までのところ、長寿株のNAD＋の細胞内レベルが報告されたことはない。我々は、2×NPT1株での定常状態NAD＋レベル 及びNAD＋／NADH比は、野生型と有意に異ならないことを見出した（表１）。さらに我々は、Dsir2 及び2xNPT1 Dsir2 株も調べたが、やはり、野生型から何の違いも見出さず、NAD＋レベルの増加を検出できなかったことは、Sir2の活性が原因ではないことが分かった。
【０２１５】
【表１】
2005535342.tif 000012
【０２１６】
NPT1 及びSIR2は熱ショックに対する耐性を増すが他のストレスに対する耐性は増さない  −   Ｃ．エレガンス及びドゥロソフィラのインシュリン／IGF-1経路の成分に変異があると、動物はコントロールの最高２倍も長く生きることができる（５）。Ｃ．エレガンスでは、この長寿はストレス耐性に関係している（４）。対照的に、ホモ接合型では最高５０％、寿命が延びるドゥロソフィラでのchico変異は、熱ショックからも、酸化ストレスからも保護しない（５１）。Ｃ．エレガンスでのsir2.1 の寿命の延びとストレス耐性との関係が調べられたことはないが、Sir2/3/4 複合体がこのような応答に関与しているのでないかという証拠が酵母で上がっている。酵母sir4-42変異があると、複製寿命が延びるだけでなく、飢餓及び熱ショックへの耐性も増す（５２）。このことから、SIR2長寿経路がストレス耐性にも影響を与えている可能性が浮かび上がる。
【０２１７】
これを明らかにするために、我々は、NPT1及びSIR2のコピーが余分にあると、熱ショック、飢餓及びメチルメタンスルホネート（MMS）又はパラコートへの曝露を含む多種のストレスに対する耐性がもたらされるかどうかを調べた。MMSは、多種のDNA病変を引き起こすDNA損傷物質であり、他方パラコートは、反応性の酸素種を生じることにより酸化ストレスを誘導する。NPT1、SIR2、又は両者のコピーが付加的にあっても、パラコートに対しても、MMSに対しても耐性がもたらされず、また、これらが静止期での生存能を高めることもなかった。
【０２１８】
熱ショック耐性を検定するために、NPT1又はSIR2 の付加的なコピーを持つ株を、SC培地で静止期まで成長させ、１時間５５℃で熱ショックを与えた後、１０倍連続希釈液にしてSCプレート上にスポットした。図２Ａに示すように、NPT1 又は SIR2 の付加的なコピーを１つ持つ株は、他の点で同質遺伝子型の野生型コントロール株よりも、熱ショックに対して、著しく耐性であった。NPT1及びSIR2の相加的効果は見られず、これら２つの遺伝子が同じ経路で作用することと合致した。この表現型のより定量的な測定値を出すために、株に１時間、熱ショックを与え、コロニ一個ずつになるようにプレートし、２４時間後のコロニの数を、未処理の試料のパーセンテージとして採点した。図２Ｂに示すように、NPT1 及びSIR2、又は両者の付加的なコピーにより、野生型の最高６倍の生存率が提供され、我々の先の発見と一致した。
【０２１９】
NPT1 が付加的にあると、サイレント状態及びrDNA安定性が高まる  −  我々は、付加的なNPT1によりもたらされるSIR2依存的寿命の延びの分子基盤を判定したいと思った。単純なモデルで、NPT1を増量投与すると、NAD＋再利用経路が刺激され、ひいてはSir2活性が増すことが予測される。従って我々は、NPT1の付加的なコピーがあったときに、サイレント状態や、rDNA遺伝子座での安定性のSIR2依存的プロセスに対して及ぼされる影響を調べた。
【０２２０】
NPT1 がrDNAサイレント状態に及ぼす影響を調べるために、我々は、ADE2 又はMET15 マーカをrDNA遺伝子座（RDN1）に組み込んである株を用いた。我々は、我々が観察した影響が、単にアデニン又はメチオニンの生合成の変化を原因としないことを確認するために、２つのマーカ遺伝子を用いた。ADE2がサイレント状態になると、アデニンを欠く培地上では細胞成長が鈍化し、アデニンを制限したプレート上では赤色の色素が蓄積する。MET15がサイレント状態になると、Pb2＋含有培地上で茶色の色素が生じる。SIR2の付加的なコピーを持つ株が、比較のために含まれた。2xNPT1株は、ADE2検定（図３Ａ、アデニン上での成長を、アデニンなしでの成長と比較されたい）及びMET15検定（図３Ｂ）で野生型よりも高いレベルのrDNAサイレント状態を示した。付加的なNPT1のコピーを2xSIR2株に導入しても、サイレント状態はそれ以上増加せず、やはり、これら２つの遺伝子が同じ経路上にあることと一致した。SIR2 及び NPT1 を高コピー数の2μベースのプラスミド上に持つ株も、高いレベルのrDNAサイレント状態を示した（図３Ｂ及びＣ）。NPT1 の付加的なコピーがあると、sir3 及びsir4 ヌル株でもサイレント状態が増した（図３Ｃ）。高コピーのNPT1 はrDNAサイレント状態に対して sir3 株では破壊的効果を有していたが、この効果は、sir4 株では観察されなかった。これは、sir4 変異体がSir2をrDNAに再局在させるという事実で説明でき、これが高レベルのNpt1に対抗するのかも知れない。sir2 変異体ではNPT1の付加的なコピーがあることで、SIR2依存的サイレント状態よりも相当に弱いrDNAサイレント状態に僅かな増加が起きた。この見かけの増加の基礎は不明である。これがサイレント状態に対する全体的な影響であるかどうかを判断するために、我々はテロメア遺伝子座でのサイレント状態を調べた。５番染色体のサブテロメア領域にADE2マーカが挿入されたPSY316ATに、NPT1の付加的なコピーを導入した（５３）。図３Ｄに示すように、NPT1 の付加的なコピーがあることで、テロメアのサイレント状態がSIR2依存的な態様で増加した。
【０２２１】
rDNAの不安定性が、酵母複製老化の主な原因であることが示されている。NPT1 が、この遺伝子座での安定性を増すことにより寿命を延ばすかどうかを検査するために、我々は、2xNPT1 及び2xSIR2 株でrDNA組換え率を判定した。これは、rDNAに挿入されたADE2マーカの消失率を測定することにより行われた。図３Ｅに示すように、NPT1 のコピーが付加的にあると、rDNA組換えが、2xSIR2 及び2xNPT1 2xSIR2
株と同様に２分の１に減少した。sir2 を2xNPT1 株から欠失させると、rDNA 組換えは劇的に増加してsir2 ヌル株のレベルになった（図３Ｆ）。これらの結果は、NPT1が、Sir2のrDNA組換え阻害能を増すことにより複製寿命を延ばすというモデルと一致している。
【０２２２】
NPT1のコピーが付加的にあるとrDNAサイレント状態が増す理由を説明する可能な解釈の１つは、これらの株ではテロメアのSir2がrDNAに再局在し、その結果テロメアのサイレント状態が失われるのではないか、というものである。我々は、NPT1のコピーが付加的にあると、テロメアのサイレント状態がSIR2依存的な態様で増すことを示し、テロメアからのSir2の再局在が、寿命の延びの機序であるとの説に異論を述べる。もう一つの可能性ある解釈は、付加的なNPT1はSir2の発現を上方調節するというものである。我々は、ウェスタン・ブロット法により、Sir2の定常状態レベルは付加的なNPT1に応答して変化しないことを見出した。rDNAサイレント状態の増加に関する三番目の可能性は、付加的な NPT1 が全体的Sir2活性を刺激するというものである。現在ではこの活性をin vivoで測定することはできないが、この考えは、付加的なNPT1 はこれまで調べられたSIR2依存的プロセスのそれぞれを亢進させるという我々の発見と合致する。
【０２２３】
カロリ制限はNPT1 発現も局在化も変化させない  −  付加的なNPT1及びカロリ制限があると同じ経路を通じて寿命が延びるようであると考えられることから、我々は、カロリ制限がNPT1の発現を増すことにより作用するのかどうかを検査した。3×HA-カナマイシン耐性カセットを天然NPT1遺伝子座に組み込むことにより、三重のヘマグルチニン・エピトープ（3xHA）・タグをNpt1のカルボキシ末端に加えた。我々はこの融合タンパク質が機能的であることを、野生型レベルのrDNAサイレント状態を維持する上でのその能力を検定することにより、確認した。次にNPT1 レベルを、(0.5%）グルコース培地上で成長させた株と、カロリ制限の遺伝学的ミミックと考えられる長寿cdc25-10株とで判定した（１９）。図４Ａ及びＢに示すように、NPT1の発現にはmRNAレベルでも、又はタンパク質レベルでも、増加は検出されなかった。 実際、低グルコース条件下では、例外なく最高２分の１の減少が NPT1 の発現で観察された。熱ショック又はMMSもしくはパラコートへの曝露後、NPT1発現に有意な変化は検出されなかった（図４Ｃ及びＤ）。そこで我々は、カロリ制限はNPT1発現を上方調節することにより寿命を増すのではないと結論する。
【０２２４】
NPT1 の発現がカロリ制限に応答して高められなかったことから、我々はこのタンパク質の活性が他の手段の調節を受けている可能性を調べた。具体的には、我々は、完全又は低グルコース培地で成長させた生存細胞におけるGFPタグ付きNpt1の細胞レベル下局在を調べた。驚いたことに、Npt1は細胞全体に観察され、このタンパク質の明白な濃縮が大半の細胞の核内にあった（図４Ｅ）。排除されていた大きな領域は液胞に相当する。これらの発見から、NAD＋の大部分が核内で再生されているという興味深い可能性が浮かび上がる。低グルコース培地では、Npt1-GFPの局在パターンに変化はなく、カロリ制限に応答したNpt1の相対的再局在化はないことが分かる。
【０２２５】
全NAD＋再利用経路が核内の区画に存在すると仮定すると、この経路の他の酵素も、Npt1と同様の局在パターンを示すであろうと予測できる。細菌の再利用経路に基づくと、NPT1 のすぐ下流のステップは、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（NaMAT）により触媒されていると予測される。他の種由来のNaMATに類似の相同性を持つ２つの酵母ORF、YLR0328 及びYGR010があり、我々はそれぞれをNMA1及びNMA2と名付けた。これら２つのタンパク質の位置確認をするために、GFPカセットを各ORFの停止コドンの前にフレーム内で組み込んで、C末端融合体を作製した。図４Ｆに示すように、Nma2-GFPは、大半の細胞の核内に、Npt1-GFPのそれと同一のパターンで濃縮していた。さらにこの発見は、NAD＋は、完全に核内でニコチンアミドから再循環するという我々の仮説を裏付けるものである。Nma1の局在パターンは、発現レベルが低いために判定できなかった。
【０２２６】
NAD＋再利用経路中の他の推定寿命遺伝子の同定  −  Nma2 がNpt1と同様の局在を示すという発見に促されて、我々は、NAD＋再利用経路中の他の遺伝子も、過剰発現したときにNpt1と同様な効果を有するかどうかを検査した。NAD＋再利用経路にある細菌遺伝子は詳細に研究されているが、Ｓ．セレビジエでは、この経路で鍵となる遺伝子のいくつかは特徴付けが済んでいない。最近同定された遺伝子であるPNC1は、NPT1のすぐ上流のステップである、ニコチンアミドのニコチン酸への転化を触媒するニコチンアミダーゼをコードしている。上に論じたように、２つの遺伝子NMA1 及びNMA2 が、NPT1のすぐ下流のステップを触媒するNaMNATをコードしている。細菌では、この経路の次のステップであるNAD＋の生成は、NADシンセターゼにより触媒されている。特徴付けの済んでいないORFであるQNS1/YHR074はNADシンセターゼに高い相同性を示す。これらの再利用経路の遺伝子のそれぞれが、単一のコピーとしてW303AR5 及びPSY316AT のURA3遺伝子座に組み込まれ、前に解説したようにサイレント状態について検定された。PNC1、NMA1又はNMA2のいずれかの付加的なコピーがあると、rDNA及びテロメアのサイレント状態が増加して、2xNPT1株のそれと同様なレベルになった（図５Ｂ及びＣ）。対照的に、QNS1 の付加的なコピーがあっても、rDNA（図５Ｂ）のサイレント状態にもテロメアのサイレント状態にも、何の影響もなかった。下に論じるように、これらの結果は、この経路の速度に影響する複数のステップがあること、そして、２つの相同体NMA1及び NMA2 が重複する機能を有する可能性があること、を示唆している。
【０２２７】
議論
NPT1 は、Sir2のコファクタであるNAD＋を再循環させる酵母再利用経路の鍵となる成分をコードしている。 我々は、NPT1 の付加的なコピーがあると、寿命が最高60%、SIR2依存的な態様で増すことを示した。酵母の寿命は高いNAD＋レベルと関係がある可能性が提案されている。しかしながら、我々は、NPT1 の付加的なコピーを持つ株では、定常状態のNAD＋レベルは変化がないことを示した。さらに、NAD＋／NADH比も、野生型細胞に同様であることから、全細胞レドックス状態は劇的には変化していないことが分かる。
【０２２８】
さらに我々は、sir2 変異体は野生型のNAD＋レベルを有するため、Sir2はNAD＋の主要な消費物質ではないことが分かることを示した。にも係わらず、NAD＋をニコチンアミドに転化するその能力があるため、Sir2は再利用経路を通る流れの増加に対して応答性であるはずである（図６）。このように、NAD＋の定常状態レベルは一定のままであるが、この分子のターンオーバーが上昇するのかも知れない。GFPで標識された酵素の局在から、NAD＋再利用経路中の酵素のうちの少なくとも２つが、核内に濃縮していることが分かった。これと一致して、Nma1 及びNma2 は、高スループットの２種ハイブリッド・スクリーニング法により、核内局在配列（NLS）の受容体として作用するタンパク質であるSrp1と相互作用することが示されている（５４）。同じ２種ハイブリッド・スクリーニングで、Nma1及びNma2はそれら同士の間でも、また相互の間でも相互作用することができることも見出されている。おそらくNmaタンパク質は、バシラス-サチリス（Bacillus subtilis
）NaMNAT （５５）の場合と同様に二量体として存在するか、メタノコッカス-ジャナスチイ（Methanococcus
jannaschii）（５６）及び メタノバクテリウム-テルモオートトロフィカム（Methanobacterium Thermoautotrophicum
）（５７）NaMNATの場合と同様に六量体として存在する。NMA1 又はNMA2 のいずれかを破壊した株は生存しており（５８）、これらは機能的に重複していることが論じられることに注目されたい。
【０２２９】
脊椎動物においては、NaMNAT/NMNAT活性は主に、肝細胞抽出物の核画分に観察され（５９）、当該経路の核内区画化は、真核細胞全般の性質であろうことが示唆されている。この再利用経路がクロマチンの近傍にあることにより、サイレント状態にするタンパク質のためにNAD＋を急速に再生できるのかも知れない。あるいは、核内のNAD＋プールを変更することにより、多種の核内活性を調和可能にしているのかも知れない。これらの仮説を検証することは簡単な作業ではないであろうが、細胞内NAD＋に関する分子プローブが開発されれば、大きく助けとなるであろう。
【０２３０】
酵母及び数多くの後生動物では、多くの長命な変異体がストレス耐性の増加を示している。しかしながら、寿命は延ばすがストレスからの保護は小さくなるような変異の例が数多くあり、この関係が単純ではないことを示している（４）。例えば、酵母では、cdc25-10 の変異によりもたらされる寿命の延びには、熱ショック耐性は伴わない（１９）。我々は、NPT1 又はSIR2 のコピーが付加的にあると寿命は延びるが、MMS、パラコート又は飢餓からの保護は提供しないことを示した。このように、Ｓ．セレビジエでは、寿命はストレス耐性の全体的増加には関係していない。寿命に相関すると我々が見出した唯一のストレス関連表現型は熱ショック耐性である。sir2D 株での遺伝子発現のゲノム・ワイド解析に基づき、Sir2は、３つのサイレント遺伝子座にあるもの以外の遺伝子を調節していると提案されている（６０）が、この解釈は論議を呼んでいる（６１）。この解釈が正しいとすると、我々が 2xNPT1 及び2xSIR2株で観察した熱ショック耐性は、熱ショック耐性を抑制する遺伝子の、Sir2を媒介としたサイレント状態が原因であると考えるのが妥当である。
【０２３１】
細菌では、Npt1相同体PncB は、NAD＋再利用経路の律速段階を触媒している（３５、３７、３８）。この研究では、我々は、 PNC1、NPT1、NMA1 又はNMA2 すべての付加的なコピーがrDNA及びテロメアのサイレント状態を増加させることを示す。それが意味するものは、酵母においては複数の段階プが経路の速度に影響を与えることができるということである。このような提案は、大半の代謝経路を通る流れは、単一の律速段階ではなく、複数の酵素により制御されているという観察に基づく理論である代謝制御分析と一致する（６２）。当該の再利用経路中のすべての遺伝子の中でも、QNS1 だけは、サイレント状態に対して何の影響もなかったことから、それが当該経路中で、基質利用能の制限を受ける唯一の酵素であることが分かる。これはおそらく、デスアミド-NAD＋であるQns1にとって予測される基質は、 この再利用経路の外の供給源からは供給できない唯一の中間体であるという事実が原因であろう（図６を参照されたい）。
【０２３２】
酵母及び後生生物では、Sir2ファミリには複数のメンバがあるが、その多くは、NAD＋依存的デアセチラーゼであることが示されている（又は予測されている）（２４、６３）。この発見を、いくつかのSir2ファミリ・メンバは細胞質内にある（６４、６５）という事実と組み合わせると、可逆的なアセチル化が、以前に考えられたよりも遙かにより支配的な調節機序であろうということが分かる（６６）。こう考えると、NAD＋再利用経路は、細胞のエネルギ状態に応答するこのグループのエフェクタタンパク質の活性を調和させる中枢位置に来るであろう。
【０２３３】
今や、寿命の調節のための保存された経路があることが広く受け容れられている（４、５）。この保存の程度は、Ｃ．エレガンスsir-2.1の付加的なコピーがあっても、その生物の寿命が延びるという発見で例示される（３１）。我々の発見は、酵母において、いくつかのSIR2依存的プロセスはNAD＋再利用経路を操作することで向上させることができることを示すが、このことは、より高等な生物にとっても真実であろう。我々は、我々が調べた全てのゲノムでNPT1 相同体を同定したが、そのいずれも、ヒスチジン残基の周りに保存度の高い領域を持ち、この領域は、サルモネラでは、リン酸化したときに触媒作用を大きく刺激するものである（６７）。この形態の調節により、Npt1活性を増すような変異又は低分子のデザインが可能であろう。まとめると、我々の発見では、Npt1及び当該再利用経路の他のメンバは、カロリ制限の有益な効果を模倣するであろう低分子のための魅力的なターゲットであることを示すものである。
【０２３４】
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【０２３５】
実施例２：  ニコチンアミドによるゲノム不安定性の増加及び老化の促進
サッカロミセス-セレビジエ（Saccharomyces
cerevisiae）Sir2 タンパク質は、転写のサイレント状態、ゲノム安定性及び寿命において重要な役割を果たすNAD＋依存的ヒストンデアセチラーゼである。 Sir2のヒト相同体SIRT1は、p53腫瘍抑制因子の活性を調節し、アポトーシスを阻害する。Sir2脱アセチル化反応は２つの生成物を生じる：O-アセチル-ADP-リボースと、ニコチン酸の前駆体であり、ナイアシン／ビタミンB3の１つの形であるニコチンアミドである。我々は、ここで、ニコチンアミドは酵母のサイレント状態を完全に損ない、複製寿命をsir2変異体のそれまで縮めることを示す。ニコチンアミドは、酵母のテロメア、rDNA及び接合型遺伝子座でサイレント状態を強く阻害するが、ニコチン酸はしない。ニコチンアミドはまた、rDNA遺伝子座の不安定性を高め、酵母の寿命をsir2 変異体のそれまで縮める。さらにニコチンアミドは、G1期停止細胞でサイレント状態を損なうことから、継続的なSir2 活性がサイレント状態の維持には必要であることが分かる。ニコチンアミドの存在下では、Sir2はもはやテロメアとも、接合型遺伝子座とも結び付かず、rDNAとは結び付いたままである。Sir2は、ニコチンアミドの存在下では、もはやテロメア及び接合型遺伝子座で、クロマチンと同時免疫沈降しないが、Sir2局在パターンは変わらない。我々は、in vitroで生理濃度のニコチンアミドがSir2及びSIRT1の両方を阻害することを示す。ニコチンアミド(IC50＜50μM）によるSIRT1 の阻害の程度は、このクラスのタンパク質の大半の有効な既知の阻害剤と等しいか、又はより良好である。我々は、ニコチンアミド及びNAD＋はSir2に同時に結合して触媒作用を防ぐことができることを提案し、ニコチンアミドによるSir2の阻害は生理学的に適切である可能性を論じる。
【０２３６】
我々は、核内ニコチンアミドがin vivoでSir2活性の負の調節をしている可能性を論じる。我々の発見は、ニコチンアミドの臨床上の使用には慎重な配慮をせねばならないと示唆するものである。
【０２３７】
実験の手法
酵母検定  −  この研究で用いた全ての酵母株を表３に挙げる。細胞は、他に記載しない限り、３０℃でYPD培地（1% 酵母抽出物、2% バクトペプトン、2% グルコース w/v）上で成長させた。リボゾームDNA遺伝子座でのサイレント状態の程度は、RDN1::MET15 株をPb２＋含有培地（0.3% ペプトン、0.5% 酵母抽出物、4% グルコース、0.02% (w/v) 酢酸アンモニウム、0.07% Pb(NO3）2及び2%  寒天）上で成長させることにより判定された。ADE2ベースのテロメア及びHM 遺伝子座のサイレント状態の検定は、前に解説された通りに行われた（実施例１を参照されたい）。リボゾームDNA組換え頻度は前に解説された通りに判定された（４４’）。
【０２３８】
【表３】
2005535342.tif 000013
2005535342.tif 000014
2005535342.tif 000015
【０２３９】
複製寿命の判定は、解説した通りにマイクロ操作により行われた（２５’）。最小４０個の細胞が１回の実験で調べられ、各実験は個別に少なくとも２回、行われた。 寿命の統計学的有意差は、ウィルコキソンの順位和検定を用いて判定された。差は、信頼度が９５％より高いときに差として記載されている。
【０２４０】
FACSCalibur フロー・サイトメータ（カリフォルニア州、ベクトン・ディッキンソン社）を解説された（４５’）通りに用いた蛍光活性化セル・ソーティング法（FACS）によりGFP蛍光を定量した。G1期停止実験に際しては、細胞を10μg/mlのα因子で３時間、処理した。DNA含有量を、解説された通り（４５’）にヨウ化プロピジウム（シグマ社）で染色された固定細胞のFACS分析により判定した。典型的には１試料当たり、20,000個の細胞を分析した。データの獲得及び解析は、CELLQuest ソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて行われた。
【０２４１】
蛍光顕微鏡法及びクロマチン免疫沈降  −  GFP蛍光を、合成培地（SC）（1.67% 酵母窒素基剤、2% グルコース、それぞれ40 mg/リットルのヒスチジン、ウリジン、トリプトファン、アデニン及びロイシン）で対数期まで成長させた生存細胞で観察した。画像をニコン・エクリプスE600顕微鏡を倍率１０００×にして用いて撮像し、Scionイメージ・ソフトウェアで解析した。クロマチン免疫沈降法（ChIP）を、解説された通り（４５’）に、表２に挙げたプライマ対を用いて行った（４６’）。ＰＣＲ反応を予め清澄させた全細胞抽出物由来の入力DNAの1/5000又は1/12500希釈液と、免疫沈降させたDNAの1/50希釈液とを用いた50μlの体積で行わせた。ＰＣＲパラメータは以下の通りだった。CUP1 及び5S rDNAプライマ対の場合、２６サイクルのＰＣＲを、５５℃のアニーリング温度で行った。Tel 0.6、Tel 1.4 及びHM プライマ対の場合、５０℃のアニーリング温度での３２サイクルを用いた。ＰＣＲ産物を、2.3%アガロース・ゲルによるゲル電気泳動法で分離し、臭化エチジウム染色で観察した。
【０２４２】
【表４】
2005535342.tif 000016
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【０２４３】
In vitro 脱アセチル化検定  −   組換えGSTタグ付き酵母Sir2p（Ｄ．モアゼッド氏より提供）及び組換えヒトSIRT1（４７’）を、デアセチラーゼ活性について、HDAC蛍光活性検定／薬物発見キット（AK-500、BIOMOLリサーチ・ラボラトリーズ社）を用いて検定した。この検定系により、展開剤で処理したときに出るヒストン基質の脱アセチル化による蛍光シグナルの検出が可能になる。蛍光は、蛍光分析リーダ（Cytofluor II 400 シリーズ、PerSeptive バイオシステムズ社）を励起を360nmに設定し、発光検出を460nmに設定して測定された。反応液を、5μgのGST-Sir2 又は2.5μgのSIRT1のいずれかから構成し、250μMのアセチル化ヒストン基質、1mM のDTT 、及び、解説された通りの一定の範囲のNAD＋濃度を50μl検定緩衝液に溶かしたものと一緒にインキュベートした。酵母及びヒトタンパク質との反応を、それぞれ３０℃及び３７℃で３０分間、行わせた。
【０２４４】
阻害剤検定の場合、反応を、200μM NAD＋と、ニコチンアミド（0、50、150 又は300μM）（シグマ社）又は50μMの以下の阻害剤；ニコチン酸（シグマ社）、シルチノール（原語：sirtinol）、M15（ケンブリッジ大）、スプリトマイシン（４７）、TSA（BIOMOL社）のいずれかとの存在下で行わせた。
【０２４５】
結果
ニコチンアミドはrDNA、テロメア及び接合型遺伝子座でのサイレント状態を損なう。
ニコチンアミドはSir2脱アセチル化の生成物であり、NAD＋再利用経路の鍵となる基質である。NAD＋生合成を操作すると、Sir2依存的活性に影響を与えることができるという我々の前の観察に基づき（実施例１を参照されたい）、我々は、どのような効果をNAD＋前駆体がサイレント状態に対して有するかを調べたいと考えた。ADE2 又はMET15 マーカをrDNA遺伝子座（RDN1）に組み込ませた形で持つ株を調べた。ADE2 がサイレント状態になと、アデニンを制限したプレート上では赤色の色素が蓄積するが、MET15 がサイレント状態になると、Pb2＋含有培地上で茶色の色素が生じる。我々は２つのマーカ遺伝子を用いて、我々が観察した効果が、単にアデニン又はメチオニン生合成の変化の結果ではないことを確認した。SIR2  のコピーを１つ余分に持つ株（2X SIR2）、又は、SIR2を欠く株（sir2::TRP1）を、それぞれサイレント状態の増加及びサイレント状態の消失に関するコントロールとして含めた。図８Ａに示すように、5 mM ニコチンアミドの存在下で成長させたとき、サイレント状態は完全に失われる。この遺伝子座にあるADE2 マーカのサイレント状態も、ニコチンアミドの添加により同様に失われた。
【０２４６】
ニコチンアミドの効果がrDNAに特異的なものか、あるいは、それは他の異質染色性領域にも影響するのかを検査するために、我々はテロメアでのサイレント状態を調べた。テロメアのサイレント状態を観察するために、我々は、ADE2 遺伝子が５番染色体右腕のサブテロメア（Y'）領域に組み込まれた株を用いた（２２’）。アデニンを制限したプレート上では、コロニは、ADE2マーカのふ入りの発現のために、赤／白の部分を有する。5 mM ニコチンアミド の存在下では、コロニは白色であり、抑制の完全な消失が実証された（図８Ｂ）。さらに我々は、接合型遺伝子のサイレント状態も観察し、ニコチンアミドは、この遺伝子座でもサイレント状態を完全に失わせることを見出した。
【０２４７】
NAD＋再利用経路中の中間体であるニコチン酸は、ニコチンアミドに構造上似ている（図９Ｂを参照されたい）。ニコチン酸は酵母細胞に効率的に取り込まれるが、この化合物の特異的トランスポータTna1が最近、同定された（４８’、４９）。上記の検定のそれぞれにおいて、我々は、5mMのニコチン酸がSir2依存的サイレント状態に及ぼす効果を調べたが、いずれの場合でも、ニコチン酸は何の効果も有さないことを見出した。
【０２４８】
ニコチン酸はゲノムの不安定性を高め、酵母寿命を縮める。我々は、上記のサイレント状態の消失がSir2活性の阻害が原因であるかどうかを判断したいと考えた。もしそうであれば、ニコチンアミドで処理された細胞は、sir2D 株を模倣するはずである。機能的Sir2を欠く酵母は、rDNA組換え頻度の増加を示す。rDNA遺伝子座のADE2マーカの消失を野生型、2X SIR2 及びsir2 株で、ニコチンアミドの存在下及び非存在下で観察した。図９Ａに示すように、野生型及び2X SIR2 細胞をニコチンアミド で処理したところ、sir2 変異体のそれと同様に、マーカ消失の頻度が最高７倍まで増加した。重要なことに、 sir2 株を処理しても、それ以上組換えは増加せず、観察されたマーカの消失は、Sir2の阻害が原因であることを示した。
【０２４９】
rDNA遺伝子座の不安定性は、酵母複製老化の主要な原因であることが示されている（２５’、２６’）。従って我々は、ニコチンアミドが酵母寿命に及ぼす効果を調べた。 細胞を２日間、新鮮な酵母YPD培地上で成長させて、それらが検定前に確実にカロリ制限条件から完全に回復しているようにした。その後、前に萌芽していない母細胞から萌芽した娘細胞をマイクロ操作で取り出し、採点した。図９Ｃは、野生型（三角）及び短命のsir2 変異体（丸）の両方の代表的な寿命曲線を示す。5mMのニコチンアミドを含有する培地上で成長させた細胞（塗りつぶしたダイヤモンド）は、野生型のそれの平均で最高４５％の寿命を有し、sir2 変異体のそれと同等だった。該sir2 株をニコチンアミドで処理しても、寿命はそれ以上、縮まなかった（四角）。これらの結果とは対照的に、我々は、5 又は50 mM のニコチン酸の存在下では、複製寿命に何の有害な効果も観察しなかった（図９Ｄ、それぞれ塗りつぶしたダイアモンド及び開放したダイアモンド）。
【０２５０】
ニコチンアミドは非分裂細胞でサイレント状態を阻害する。サイレントなクロマチン・ドメインを再度確立するには、Ｓ期を通過させることが必要（５０’）だが、それを惹起するのはDNA複製ではないようである（５１’、５２’）。温度感受性SIR3 対立遺伝子を用いた実験では、Sir2/3/4 複合体が存在することが、細胞周期全体を通じてサイレントな状態を維持するのに必要であることが分かる（５０’）。我々は、ニコチンアミドが、周期循環中の細胞のサイレント・ドメインを抑制解除して複製寿命を縮めることを示した。我々は、ニコチンアミド処理で、非周期循環中のG1期停止細胞でもサイレント状態に同様な効果があるかと考えた。我々は、HMR 遺伝子座にGFPレポータを組み込んで含有する株を用いることで、単個細胞におけるHMサイレント状態に対するニコチンアミドの効果を定量することができた。我々はまず、周期循環中の細胞でこの系をバリデートした。図１０Ａに示すように、GFPは、この遺伝子座でのサイレント状態の程度が高いために、未処理細胞では発現しなかった。しかしながら、5 mM のニコチンアミド中の６０分後では、我々は、発現レベルの劇的な増加を観察し、これは９０分後ではさらに著明となった（図１０Ａ、それぞれ２番目及び３番目のパネル）。
【０２５１】
サイレント状態のより定量的な測定値を得るために、細胞を蛍光活性化セル・ソーティング法（FACS）で分析した。図１０Ｂの上側２つのパネルはsir4 及び野生型株の異時培養物のGFP発現プロファイルを示す。SIR4 を欠失させると、テロメア及び接合型遺伝子座のSIR複合体が破壊されて、これらの部位から離れてrDNAへとSir2が再分配された。このように、sir4 株のプロファイルは、HMR 遺伝子座の完全な抑制解除を表すものである。図１０Ｂは、5 mM のニコチンアミド中での野生型細胞の成長が、この遺伝子座の完全な抑制解除（３番目のパネル）へとつながり、sir4 変異体とは対照的であることを示す。5 mM のニコチン酸又は構造上関連するキノリン酸（de novo NAD＋合成経路での基質）で処理された細胞では、GFP発現に何の増加も見られなかった（図１０Ｂ、下側２つのパネル）ことから、この脱サイレント効果はニコチンアミドに特異的であることが実証された。
【０２５２】
この検定系を用いて、我々は、非周期循環細胞におけるニコチンアミドの異種クロマチンに対する効果を観察できた。GFP導入遺伝子を含有するMATa 株を、HMLα遺伝子座について欠失させて、これらの細胞が、a及びα遺伝子の同時発現のために、G1期停止を確実に出ないようにした。α因子での処理によるG1での停止後、細胞を5 mMのニコチンアミドに曝露し、FACSで３０分毎に調べた。図１０Ｃは、ニコチンアミドの存在下及び非存在下における、停止細胞の発現プロファイルを示す。驚くべきことに、Ｇ１で停止した細胞は、ニコチンアミドで処理したときに、サイレント状態の消失を見せた。FACSでDNA含有量を測定すると、この実験の間中、細胞がG1期に留まったことが確認できた（図１０Ｃ、右側コラム）。これらの結果は、外因性ニコチンアミドが、非分裂細胞においてすらサイレントクロマチンを抑制解除することを実証するものであり、異種クロマチンは不安定であり、動的な構造であることを示唆している。またこれは、ヒストンが継続的に脱アセチル化していることが、サイレント状態の維持にとって必須であることも示している。
【０２５３】
ニコチンアミドは、Sir2にテロメア及び接合型遺伝子座から解離させるが、rDNAからは解離させない。我々は、ニコチンアミドが異種クロマチンを３つのサイレントな遺伝子座すべてで抑制解除することを酵母で示した。我々の観察を説明する最も可能性のある解釈は、Sir2 はニコチンアミドにより触媒として失活するというものだが、この説は、Sir2が非局在化する、あるいは、その発現が下方調節される、という説も可能である。後者の可能性を検討するために、我々は、ニコチンアミド（1-5mM）の存在下でのSir2タンパク質レベルを判定し、これらに変化はないことを見出した。次に我々は、ニコチンアミドがGFPタグ付きSir2の局在化に及ぼす効果を調べた。同一な対数期培養株を5mMにニコチンアミドの存在下又は非存在下で２時間成長させ、その間、GFP-Sir2の局在を、蛍光顕微鏡法で観察した。通常の条件下では、Sir2は、核周縁近傍の顕著な焦点距離に観察することができ、各焦点は、複数のテロメアのクラスタを表す（５３’）。sir2 変異体のバックグラウンドでは、Sir3 はテロメアから遊離して、拡散した核内パターンを示す（図１１Ａ）。この株を、Sirの非局在化の基準として役立てた。ニコチンアミド中での成長中、我々は、処理された細胞がサイレントな遺伝子座の最大の抑制解除を示す時点である２時間後ですら、Sir2-GFPパターンに何の変化も観察しなかった（図１１Ｃ及びＤ）。さらに我々は、Sir3及びSir4という他の２つのSirサイレント状態複合体のメンバを調べた。図５Ｅ及びＧは、非処理細胞におけるそれぞれSir3-GFP及びGFP-Sir4の局在パターンを示す。 5 mMのニコチンアミドで２時間処理しても、これらのタンパク質のいずれでも、GFP蛍光のパターンに変化は起きなかった（図１１Ｆ及びＨ）。これらの結果は、Sir2を阻害しても、SIR複合体の全体的な再局在は起きないことを初めて示すものである。
【０２５４】
ニコチンアミドの存在下におけるSir2とサイレント遺伝子座との間の関係をより詳細に調べるために、我々は処理細胞及び未処理細胞の両方に、クロマチン免疫沈降（ChIP）を行った。sir2 変異株及びサイレントになっていないCUP1 遺伝子をコントロールとして役立てた。図１２は、入力され、免疫沈降させたDNAの、5S rDNA特異的プライマ対を用いたPCR産物を示す。細胞を5 mMのニコチンアミドで処理しても、これらのプライマを用いて得られたPCR産物の量は変わらなかった（レーン５及び６を比較されたい）ことから、Sir2 は、この化合物の存在下ではrDNAと結合したままであることが実証された。
【０２５５】
次に我々は、Sir2と、６番染色体のサイレントHMRα遺伝子座並びに 右側テロメアのDNA 0.6 及び 1.4 kb との結合を調べた。ニコチンアミドの存在下では、HMRに特異的なプライマを用いては、何のPCR産物も得られなかった。同様に、サブ-テロメアDNAに特異的なプライマを用いても、ニコチンアミド処理細胞から得られる産物量は、バックグラウンドに等しかった。これらの結果は、Sir2は、ニコチンアミドで処理された細胞では、HMRにも、又はサブテロメアDNAにも結合していないことを実証している。これはおそらくは、Sir2が、rDNAのRENT複合体で果たす役割と、テロメア及び接合型遺伝子座のヘテロ三量体型SIR複合体で果たす役割との基本的な違いを反映しているのであろう。
【０２５６】
ニコチンアミドは、in vitroで酵母Sir2及びヒトSIRT1の両方の強力な非競合的阻害剤である。Sir2は、ニコチンアミドに応答して非局在化もせず、また下方調節もされなかったため、我々の結果を説明する最も可能性のある解釈は、この化合物が、Sir2デアセチラーゼ活性の直接的な阻害剤として作用したというものである。これをさらに解明し、ニコチンアミドにより誘導されるサイレント解除機序の見識をより深めるために、我々は、様々な量のこの化合物の存在下で、Sir2活性をin vitroで直接、測定した。我々は、ヒストン基質が脱アセチル化すると蛍光シグナルを生じる新規なクラスＩＩＩHDAC 活性検定法を利用した。アセチル化した基質及びNAD＋と一緒にインキュベートすると、組換えGSTタグ付きSir2は、酵素なし及びNAD＋なしのコントロールの１０倍大きな強力な蛍光シグナルを発する。この検定法を用いて、我々は、ニコチンアミドの、多様な濃度のNAD＋の存在下での脱アセチル化阻害能を調べた。データの二重逆数ラインウィーバー ・バーク・プロット（図１３Ａ）は、ニコチンアミドがこの反応の強力な非競合的阻害剤であることを示している。同様な結果は、細胞質Sir2相同体である Hst2についても最近、得られている（５４’）。我々は、ニコチンアミドの阻害効果が、より高等な真核生物のSir2相同体にも延長できるかどうかを調べたいと考えた。従って我々は、ニコチンアミドがヒトSIRT1も in vitroで阻害できるかどうかを調べた。我々は、組換えSIRT1を用い、多様な濃度のニコチンアミド及びNAD＋の存在下で基質の脱アセチル化を観察した。Sir2と同様に、データのラインウィーバー・バーク・プロットは、ニコチンアミドはSIRT1も非競合的な態様で阻害することを示している（図１３Ｂ）。これらの結果は、ニコチンアミドは、Sir2/SIRT1への結合をめぐってNAD＋と競合することにより脱アセチル化を阻害するのではないこと、そして、ニコチンアミド及びNAD＋はこの酵素に同時に結合できること、を示している。
【０２５７】
最近、いくつかのグループが、Sir2様タンパク質をin vitro及びin vivoの両方で阻害する化合物を単離した（５５’、５６’）。これらの中にシルチノール、M15及びスプリトマイシンがある。これらの化合物は、サイレント状態の阻害剤として、低分子ライブラリの高スループット表現型スクリーニングで単離されたが、いずれもこれまでのところ、SIRT1活性の阻害能については調べられていない。これらの化合物の阻害の効験を、ニコチンアミドのそれと比較するために、我々は、組換えSIRT1活性を50μMのこれらの各阻害剤の存在下で測定した。さらに我々は、クラスI/II HDAC阻害剤TSA を陰性コントロールとして含めた。図１３Ｃに示すように、ニコチンアミド はIC50＜50μMでSIRT1を阻害し、この値は、検査された他の全ての阻害剤のそれと同等であるか、又は低かった。我々の in vivo での結果をさらに裏付けるものとして、我々は、構造上関連する化合物であるニコチン酸が、SIRT1の活性に対してin vitroで何の効果も持たないことを示した（図１３Ｃ）。
【０２５８】
議論
我々は、Sir2の脱アセチル化反応の生成物であるニコチンアミドが、in vivo及びin vitroの両方でSir2活性の強力な阻害剤であることを示した。外因性ニコチンアミドを酵母細胞に加えると、３つのサイレントな遺伝子座すべてが抑制解除され、リボゾームDNA遺伝子座での不安定性が高まり、酵母寿命がsir2 変異体のそれまで縮まる。ニコチンアミドで処理された細胞の、rDNAの不安定性及び短い寿命という表現型は、sir2 変異でも強まらないことは、これらの表現型がSir2阻害の結果であることを示している。重要なことに、これらの結果はさらに、rDNAの不安定性及び寿命は、もう一方の酵母Sir2ファミリ・メンバであるHstタンパク質の影響を受けていないことを示している。
【０２５９】
我々は最近、NAD＋再利用経路遺伝子のコピーを余分に持つ株は、サイレント状態の増加を示し、長命ではあるが、これらの有する定常状態NAD＋又はNADHレベルは増えていないことを示した（実施例１を参照されたい）。我々は、寿命の延びは、NAD＋利用能の局部的な増加か、又は、当該再利用経路を通る流れの増加により媒介されていると仮設した。後者のモデルは、 Sir2 ファミリ・メンバ及び／又はNMNアデニリルトランスフェラーゼを通じて、NAD＋からニコチンアミドへの継続的な再循環がある可能性を意味する。我々はニコチンアミド が、G1期停止細胞においてサイレント状態を失わせることを示し、Sir2活性がヘテロクロマチンの維持のために構成的に必要であること、そして、Sir2がNAD＋を、非周期循環細胞においても消費することを立証した。これは、サイレントなHML遺伝子座にあるMATα遺伝子は、スプリトマイシンで処理されたG1期細胞で発現するという、ベデロフ氏らによる最近の発見と合致する（５６’）。
【０２６０】
細胞にニコチンアミドを添加しても、我々が調べたSir-GFP融合タンパク質のいずれの局在パターンも変わらない（図１１）。これは、Sir2の局在化を、その活性とは独立に維持する相互作用があることを示唆している。ChIPを用いた、より詳細な調査では、Sir2がまだrDNAに結合したままでも、それは、この化合物の存在下では、テロメアにも、又は接合型遺伝子座にも結合していないことが分かる（図１２）。以前に、RENT複合体のDNA結合サブユニットであるNet1は、Sir2とは独立にクロマチンに結合できることが示されている（５７’）。これらの発見は、この複合体が、Sir2デアセチラーゼ活性の非存在下でリボゾームDNA上で集合できることを示すものである。対照的に、我々は、ヘテロ三量体Sir2/3/4複合体は、Sir2触媒活性の非存在下ではクロマチン上で集合できないことを示す。これらの結果は、触媒として不活性なSir2変異体を用いた他の２つのグループから出た最近のデータと一致する（４６’、５８’）。両方のグループとも、触媒ドメイン中の保存されたヒスチジン（His-364）に変異があると、in vivoにおいて、Sir2の、テロメア及び接合型遺伝子座との相互作用が妨げられることを見出している。しかしながら、これらの変異が、Sir2の他のタンパク質との相互作用能にも影響する可能性が残っている。我々の結果は、結論的には、Sir2のデアセチラーゼ活性が、テロメア及び接合型遺伝子座とのその適正な結合には必要であることを示すものである。
【０２６１】
我々は、ニコチンアミドが、酵母Sir2及びヒトの相同体SIRT1の両方のデアセチラーゼ活性をin vitroで強く阻害することを示した。ニコチンアミドが非競合的に作用してSir2を阻害するという事実は、この化合物が結合をめぐってNAD＋と競合しないことを示唆している。Sir2脱アセチル化の反応機序や、始生代Sir2相同体の結晶構造を調べると、考えられる阻害機序の鍵が得られる。Sir2を触媒とする脱アセチル化は２つの加水分解段階から成るが、これらの段階はつながっていると考えられる。ニコチンアミドをNAD＋のADP-リボース部分に接続しているグリコシド結合の切断に続き、アセチル基とリジンとの間のC-N結合が切断される。最近の構造解析では、Sir2酵素が２つの空間的に別個のNAD＋結合部位（Ｂ部位及びＣ部位）を含有し、その両方が触媒作用に関与していることが示されている（５９’）。本著者は、アセチルリジンの存在下では、該Ｂ部位に結合したNAD＋は、それが切断されるＣ部位近傍にニコチンアミド基を来させるようなコンホメーション変化を起こすことができることを提案する。こうしてこの反応のADP-リボース産物はＢ部位に戻り、そこでアセチルリジンの脱アセチル化が起きるのである。我々は、高濃度ではニコチンアミドは内側のＣ部位に結合すると共にこのＣ部位を遮断するために、コンホメーション変化が妨げられ、こうしてNAD＋の切断も妨げられるのだと提案する。これが、この化合物の阻害形態の非競合的な性質を説明するものであろう。
【０２６２】
我々は、ニコチンアミドの効力は、我々の検定で用いられた大半の有効なライブラリから単離された化合物のそれに匹敵することを示した。SIRT1がこのような低濃度のニコチンアミドによりin vitroで阻害されるという事実から、この形態の阻害が生理学的に関連している可能性が浮かび上がる。哺乳動物組織中のニコチンアミドのレベルは、11乃至400μMの範囲内であることが報告されている（３０’、６０’−６２’）。最近、脳脊髄液中のニコチンアミドのレベルが、高い精度で54.2μMという、ここで報告されたニコチンアミドに関するIC50と同様な数値であることが判定された（６３’）。我々は、細胞内ニコチンアミドレベルの変動が、in vivoではSir2タンパク質の活性を直接コントロールしているのではないかと提案する。これらの変動は、翻っては、ニコチンアミド代謝に関与する酵素の調節を受けているであろう。
【０２６３】
酵母PNC1 遺伝子は、NAD＋依存的デアセチラーゼを調節するために鍵となる配置にあるニコチンアミダーゼをコードしている。ニコチンアミドをニコチン酸に転化させることにより、Pnc1は、この阻害剤のレベルを下げて、NAD＋が再生される速度を刺激しているようである（図７を参照されたい）。興味深いことに、PNC1 は、ストレスやカロリ制限に似た条件に応答する最も誘導性の高い遺伝子の１つである（６４’、６５’）。さらに、PNC1 は、その転写産物が細胞周期依存的に変動する唯一の再利用経路酵素をコードしている（６６’）。PNC1 のレベルは、M/G1期で最も高く、Ｓ期で鋭く低下する。興味深いことに、これは、Sir依存的サイレント状態の確立と一致する（５１’、５２’、６７’）。これらの事実から、Ｓ期後や、又は、ストレス及びカロリ制限条件下では、高レベルのPnc1が、ニコチンアミドの阻害効果を外すことにより、サイレント状態を誘導している可能性が浮かび上がる。PNC1 のコピーが余分に１つでもあるとSir2依存的サイレント状態が増加するという我々の以前の発見（実施例１を参照されたい）は、このモデルの更なる裏付けとなる。細胞内ニコチンアミドレベルが、細胞周期、ストレス又はカロリ制限の間に変わるのかどうかを判定することが興味深いであろう。
【０２６４】
ニコチンアミド及びニコチン酸は高用量（最高10g／日）で多様な状態を自己治療するために用いられている（４１’）。両者ともビタミンB3の形であると考えられ、しばしば交換可能に用いられているが、ニコチンアミドは、副作用が見かけ上ないために、多くの場合で好まれるようになった。加えて、ニコチンアミドは現在、癌の再発やインシュリン依存性（１型）糖尿病の治療法として治験中である。ニコチンアミドが、たとえ非周期循環細胞においてもヘテロクロマチンを破壊できることを明確に実証する我々の結果からは、ヒトにおいて長期にニコチンアミド治療を続けることには有害な結果があるかも知れないという懸念が浮かび上がる。
【０２６５】
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【０２６６】
実施例３：  ニコチンアミドはSir2のＣポケットに結合するがニコチン酸は結合しない
ニコチンアミドを、NAD＋に結合したアルカエグロブス-フルギダス（Archaeoglobus
fulgidus）由来のSir2（Sir2-Af1）の結晶構造（タンパク質データバンク ID コード 1ICI, Min et al.
(2001). Crystal structure of a SIR2 homolog-NAD complex. Cell 105,
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(1983) J. Comput. Chem. 4, 187-217）により、Sir2-Af1及びNAD＋（F = 2.4 Kcal/molÅ2）の調和定数を用いて行った。図１４Ａ−ＣをPYMOL（DeLano, W.L.  The PyMOL Molecular Graphics System
(2002) DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA）を用いて作製した。
【０２６７】
これらの研究は、ニコチンアミドがSir2を阻害すること（図１４Ａ−Ｃを参照されたい）、そしてニコチン酸は、残基D101（即ち酸性）が存在するためにニコチン酸がSir2のＣポケットに嵌め合うことができないために、Sir2を阻害しないことを示している。
【０２６８】
実施例４：  PNC1は寿命の延びを媒介する
図１７Ａに示すように、PNC1 はアミドの加水分解を触媒し、ニコチンアミドをニコチン酸にNAD＋再利用経路で転化させる（図１７Ｂ）。大半の野生型酵母株は２１乃至２３回の分裂という平均寿命を有し、最大寿命は４０回の分裂である。カロリ制限（0.5%グルコース）又は熱ストレス（３７℃）を与えた野生型株は、未処理のコントロール（それぞれ2.0% グルコース又は３０℃）に比較して長い寿命を示した（図１７Ｃ及びＤ）。sir2D 株は、前の報告と一致して短い寿命を有し１２，１３、カロリ制限も熱も、この株の寿命を延ばさなかった（図１７Ｃ及びＤ）。pnc1D 株は、これらの条件下のいずれでも、寿命の延びを示さず、PNC1 が寿命の延びに必要であることが実証された。
【０２６９】
驚くべきことに、非ストレス条件（2% グルコース、３０℃）下では、 PNC1 の付加的なコピーを持つ株（5×PNC1）は、野生型よりも７０％長く生き、いくつかの細胞は、この生物で報告された最長の寿命の延びである７０回を越える分裂回数を生きた（図１７Ｅ）。カロリ制限も熱ストレスも、5×PNC1株の寿命をそれ以上、増加させなかった。5×PNC1バックグラウンドでSIR2を欠失させると、寿命がsir2D 株のそれまで縮んだ（図１７Ｅ）。 pnc1D
sir2D
二重変異体も、sir2D 変異体と同様な寿命を有しており（図１７Ｅ）、その寿命はグルコース制限の影響を受けなかった。このことは、PNC1 及びSIR2 は同じ経路で機能し、PNC1 は寿命をSIR2を通じて延ばすことを示すものである。
【０２７０】
このように、これらの結果は、PNC1が、カロリ制限及び熱ストレスの両方による寿命の延びに必要であり、付加的なPNC1 があれば、これらの刺激を模倣するのに充分であることを実証している。我々のモデルによると、PNC1 の付加的なコピーがあると、ニコチンアミドを枯渇させてSir2の阻害を緩和させることにより、寿命が延びるのである。
【０２７１】
実施例５：  PNC1の発現は、ストレス条件に応答して増加する
Ｓ．セレビジエを様々なストレス条件でインキュベートし、PNC1の発現レベルを、ウェスタン・ブロットを行って測定した。2.0%グルコース完全培地（YPD）中で成長させた酵母細胞で測定されたPNC1の量を１に設定した。下の表及び図１８は、この基準発現レベルに比較したときの様々な成長条件でのフォールド（原語：fold）誘導を示す：
【０２７２】
【表５】
2005535342.tif 000018
【０２７３】
さらに、窒素制限により、PNC1発現が大きく誘導されたことも示された。上記の「ストレス条件」、即ち2.0% グルコース完全培地 (YPD) 以外の条件、はすべて、Ｓ．セレビジエ（カロリ制限）の寿命を延ばしたため、PNC1の増加は、アミノ酸制限、塩ストレス及び熱ストレスを含め、酵母寿命を延ばすことが公知の検査されたすべての条件で寿命の延びと相関する（図１８Ｃ）。ストレス応答のゲノム・ワイドmRNAプロファイルの解析（Gash）では、PNC1が、この生物でストレス及び飢餓に応答する応答性の最も高い遺伝子の１つであることが示された。さらにPNC1レベルは、cAMPを下げることによりカロリ制限を模倣するcdc25-10 対立遺伝子を持つ細胞でも大きく誘導された（図１８Ｂ）。
【０２７４】
この応答が環境ストレスに特異的であったかどうかを検査するために、我々は、NAD＋のde novo合成には必要であるが、カロリ制限による寿命の延びには必要でないBNA6/QPT1を欠失させた株でPnc1レベルを調べた１２。この変異体において、Pnc1レベルは変わらなかった（図１８Ｂ）。処理された細胞からの抽出物中のPnc1活性はウェスタン・ブロットのPnc1レベルと相関した（図１８Ｄ）ことから、これらの細胞のニコチンアミド加水分解速度が増していることが実証された。このように、PNC1 は、その発現が寿命を延ばす刺激により調節される一番目の酵母寿命遺伝子である。
【０２７５】
従って、PNC1のレベルを増加させて細胞の寿命を延ばす、又は、それらをストレスから保護する方法は、ここでさらに解説するように、細胞内の天然の事象を模倣するものである。
【０２７６】
実施例６：  PNC1が付加的にあると急性ストレスに対する耐性がもたらされる
他の種での寿命とストレス耐性との間の強い関係に基づき、我々は、PNC1が付加的にあるとある範囲のストレスへの耐性ももたらされるかどうかを検査した。酵母においてよく特徴付けられたストレス耐性検査は、細胞の高塩濃度に対する耐性である２６。我々は、5×PNC1株が高いレベルのNaCl（600mM）及びLiCl（200mM）の両方に対して、野生型よりも劇的に耐性が高かったことを見出した（図１９Ａ）。さらに我々は、紫外線照射（5mJ／cm2）によるDNA損傷後の生存率も調べ、やはり、PNC1 が付加的にあると耐性がもたらされたことを見出した（図１９Ｂ）。ミトコンドリアDNAの損傷が哺乳動物の老化に関係があるとされているため２７、さらに我々は、付加的なPNC1のこの種類のストレスからの保護能力も調べた。強制換気条件（3% グリセロールを炭素供給源とする）下では、5×PNC1 細胞は、野生型よりも、臭化エチジウムによるミトコンドリア変異誘発に対してより耐性だった（図１９Ｃ）。5×PNC1 株のLiClに対する耐性増加はSIR2依存的だった。驚くべきことに、この株のNaCl、紫外線及び臭化エチジウムに対する耐性は、SIR2 からは独立だった（図１９Ａ−Ｃ）。これらの結果は、PNC1 が長寿及びストレス耐性の両方を促進することを実証しており、SIR2 が、この遺伝子の唯一の下流エフェクタではないことを示唆している。このように、ニコチンアミド はSir2以外のタンパク質も調節している可能性が高い。
【０２７７】
実施例７：  多種のストレス条件下でのPNC1の細胞内局在化
我々は前に、NAD＋再利用経路中の２つの酵素Npt1（ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ）及びNma2（ニコチン酸モノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）が核内に濃縮していることを示した２３。我々は、別の再利用経路酵素であるPnc1が同様な細胞内分布を有するかどうかを調査した。驚いたことに、完全2% グルコース培地上ではPnc1-GFPは細胞質、核、及び細胞一個当たり3乃至6箇所の離散した細胞質内焦点距離に観察された（図２０Ａ）。カロリ制限した又はストレスを与えた細胞は、ウェスタン・データと一致して、蛍光輝度の劇的な増加を示した。興味深いことに、アミノ酸制限又は塩ストレスの条件下では、このパターンは変化しており、蛍光は主に焦点距離に局在していた（図２０Ｂ）。このことは、Pnc1の局在は、異なるストレスにより異なる方法で調節されていることを示すものである。
【０２７８】
この焦点距離の正体を判定するために、我々は、Pnc1-GFPと同時局在する細胞内マーカを探した。我々は、ペルオキシソームを標的とする赤色蛍光タンパク質(RFP）で大きな重複を観察した（図２０Ｃ）。さらに、Pnc1-GFPの焦点距離は、ペルオキシソームを形成することができない pex6D
変異体ではもはや観察されなかった（図２０Ｄ）。我々のストレス研究では、ペルオキソソームへのPnc1の局在が調節可能かも知れないことが示されていたため、我々は、このオルガネラへのその輸入を担うトランスポータを特定しようと試みた。Pex5 はペルオキシソーム性タンパク質の大半を輸入するが、Pnc1のペルオキシソームへの局在には、より利用頻度の低いトランスポータPex7 が必要だった（図２０Ｄ）。Pnc1の、核より外側の部位への局在は、ニコチンアミドがSir2以外のタンパク質を調節することを実証した我々のストレス結果と一致している。ペルオキシソームへの局在は、これらのオルガネラは反応性酸素種の主要な供給源であり、哺乳動物の老化への関与が指摘されている２８、２９ために、特に興味深い。加えて、脂質代謝の数多くの重要なステップがペルオキシソーム内で行われ、脂質シグナル伝達は最近、塩耐性にも関連付けられている２６。付加的なPNC1 の耐塩性は、Pnc1のペルオキシソーム機能の結果かも知れない。
【０２７９】
実施例８：  寿命及びストレス耐性は、細胞内ニコチンアミドによる負の調節を受ける
我々の予測モデルの１つは、細胞内ニコチンアミドレベルを何らかの方法で操作すると、Sir2活性を変えるには充分なはずであるというものである。Sir2活性の通常の指標は、rDNA（RDN1） に挿入されたレポータ遺伝子がサイレントになる程度である。NAD＋レベルがいずれかのサイレント効果を担っている可能性を除外するために、我々は、NAD＋再利用経路の外にある遺伝子を用いて細胞内ニコチンアミドレベルを操作することを試みた。ヒトでは、ニコチンアミド代謝の主要な経路は、ニコチンアミド N-メチルトランスフェラーゼ（NNMT）を通る３０。NNMTはニコチンアミドをN’-メチルニコチンアミドに転化させ、このN'-メチルニコチンアミドが腎臓を通じて排出される３１。我々は、相同性により、Ｓ．セレビジエNNMT遺伝子を同定し、この遺伝子をNNT1と命名した。Nnt1 は哺乳動物NNMTコア・ドメインに対して23%同一であり３０、S-アデノシルメチオニン（SAM）依存的メチルトランスフェラーゼの４つのシグナチャ・モチーフを含有する３２。
【０２８０】
NNT1 を欠失させると、PNC1 の欠失と同様なサイレント解除表現型が起きた３３（図２１Ａ）。これらの結果は、rDNA サイレント状態が外因性ニコチンアミド の存在下で失われるという我々の発見と一致する（実施例２）。予測通り、付加的なNNT1 を持つ株は、付加的なPNC1を持つ株と同様に、サイレント状態の増加を示した２３。我々は、寿命、ストレス耐性及びSir2活性は、細胞内ニコチンアミド及びNNT1のレベルの変更により調節することができると結論する。NNT1 はPNC1 表現型を模倣できるが、PNC1とは異なり、その発現は、寿命を延ばす刺激では見かけ上、調節されないことは注目に値する２５。
【０２８１】
我々はPNC1 を、細胞内ニコチンアミドを枯渇させることにより、細胞の寿命及びストレス耐性を延ばす、カロリ制限及びストレス応答性遺伝子であると特定した（図２１Ｂ）。我々は、カロリ制限による寿命の延びは、特異的調節遺伝子により調和させられた能動的な細胞による防御的応答の結果であることを示す。この機序の魅力的な特徴は、それが細胞恒常性に関与する必須コファクタであるNAD＋の調節には基づかないことである。
【０２８２】
我々には、ニコチンアミド代謝に関与する遺伝子がどのようにして数多くの急性ストレスに対する耐性をもたらすのかは、まだ不明である。おそらくは、Pnc1増加という利益は進化上の代価として生じたのであるが、我々はまだ、淘汰上の不利益は特定していない。我々のストレス及び局在結果の両者で、複数のニコチンアミド調節性エフェクタが存在することが示されている。ニコチンアミド によるSir2阻害の酵素学に基づき（実施例２及び３４）、NAD＋を２段階の反応で切断するタンパク質が考えられる候補である。例には、Sir2 （Hst1-4）及びTpt1の相同体、タンパク質の変性応答を促進するNAD＋依存的2'-ホスホトランスフェラーゼがある３５。ニコチンアミド代謝が変化した細胞の発現プロファイリングをすれば、これらのエフェクタや、ストレス耐性の下流経路を特定する助けになるはずである。
【０２８３】
哺乳動物では、ニコチンアミド代謝とストレス耐性との間の関係の証拠がある。ポリ（アデノシンジホスフェート-リボース）ポリメラーゼ-1 （PARP）は、ポリ（ADP-リボース）をアクセプタタンパク質に共有結合させるためにNAD＋を切断する核内酵素である。この２段階の反応はニコチンアミドを生じるが、このニコチンアミドが、PARP-1に対して阻害効果を発揮し、自己調節を可能にしている３６。PARP酵素については、DNAの損傷修復、テロメア長の調節、ヒストン修飾、及び、ICAM-1及び酸化窒素シンターゼを含む主要なタンパク質の転写レベルでの調節を含め、数多くの細胞機能との関連が示唆されてきた３６。我々の結果は、PARP酵素が、一般的なストレス応答の一部としてニコチンアミド代謝により調節されている可能性を示唆している。ニコチンアミドはさらに、in vitro （実施例２）及び in vivo １７の両方でヒトSIRT1を阻害する。SIRT1 はp53活性を負に制御することから、ニコチンアミドレベルがアポトーシス及びDNA修復を調節している１７，１８可能性が分かる。これと一致して、ヒト細胞及び組織でのNNMTの発現は、腫瘍発生３７及び放射線抵抗性３８と相関している。 
【０２８４】
実施例９：  実施例４−８の材料及び方法
培地及び株：  全ての株を、他に記載しない限り、３０℃の完全2.0% (w/v) グルコース（YPD）培地で成長させた。実験のすべてで、我々は、空のベクタを組み込むことにより、確実に株同士の間で栄養要求性マーカが一致しているようにした。欠失はすべて、kanMX6 PCRベースの技術３９を用いて作製され、PCRで確認された。PNC1 の付加的なコピーは、前に解説した通りに組み込まれた２３。NNT1 (YLR285w)
の開放読み取り枠全体及び700塩基の上流配列を、ゲノムDNAからPCRによりpSP400中にクローニングし４０、配列決定し、酵母ゲノムに前に解説した通りに組み込んだ２３。組み込まれた遺伝子のコピー数は、サザン・ブロット法で判定された。GFP カセットを、天然PNC1 遺伝子の３’側にインフレームで前に解説した通りに導入した３９。RFP-PTS1プラスミド（pSG421）はＳ．Ｊ．グールド氏（ジョンズ・ホプキンス大）から提供された。PSY316AT由来株を寿命の分析及びストレス耐性検定に用いた。PSY316ATを由来とする株（MATα、ura3-53
leu2-3,112 his3-D200 ade2-1,01 can1-100
ADE2-TEL V-R): pnc1D (YDS1741）、sir2D (YDS1750)、5xPNC1 (YDS1853)、5xPNC1 sir2D (YDS1851)、pnc1D sir2D (YDS1853)。W303由来株をウェスタン・ブロット分析、蛍光顕微鏡法及びSIR2 依存的サイレント状態検定法に用いた。W303 (MATa,
ade2-1, leu2-3,112, can1-100, trp1-1, ura3-52, his3-11,15, RDN1::ADE2, RAD5)
を由来とする株には：PNC1-GFP (YDS1742)、pnc1D (YDS1911)、nnt1D (YDS1747)、2xPNC1 (YDS1588)、2xNNT1 (YDS1926)、ADE2 (YDS1596)が含まれた。以下の株をPNC1-GFP (YDS1742)から得た： bna6D (YDS1857),
pSG421 (YDS1916), pex6D (YDS1869), pex5D (YDS1870) 及びpex7D (YDS1871)。cdc25-10 株はＬ・ギャランテ氏（Ｍ．Ｉ．Ｔ．大）から提供された。
【０２８５】
酵母検定法を以下の通りに行った。寿命測定を前に解説した通りに行った２３が、例外として、熱ストレス実験では、株を各剥離後に３７℃でインキュベートした。ストレス耐性検定は、対数期中期細胞を用いて行われた。サイレント状態は前に解説した通りに検定された２３。
【０２８６】
タンパク質発現分析を以下の通りに行った。株を記載した条件下で予備処理し、対数期中期まで成長させた。ウェスタン・ブロット法は、解説した通りに２３全細胞抽出物（７５μｇ）を用いて行われた。タンパク質は抗GFP抗体（サンタクルズ社）又は抗アクチン抗体（ケミコン社）を用いて検出された。蛍光顕微鏡画像を、ハママツ Orca100 CCD カメラで倍率を１００×にして同じ露出（1s）で撮像し、Openlabソフトウェアで処理した。
【０２８７】
ニコチンアミド活性検定は以下の通りに行われた。予備処理された対数期中期培養株から得られた抽出物中のPnc1の活性は前に解説した通りに判定された４１。簡単に説明すると、0.16 mg のタンパク質を0 もしくは8 mMのニコチンアミドと一緒に４５分間、３０℃で、10 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl 及び1 mM MgCl2から成る最終体積400μlにしてインキュベートした。Pnc1活性は、反応生成物であるアンモニアの最終濃度を、シグマ・アンモニア・ダイアグノスティック・キットを用いて測定することで判定された。ニコチンアミドなしのコントロールを減算することで、基礎アンモニアを斟酌した。ニコチンアミド活性を、生じたアンモニアnmol ／分／総タンパク質mg で表した。Pnc1活性は、pnc1D 株（0.06±0.004 nmol／分／mg）のバックグラウンド値を減算することで得られた。
【０２８８】
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【０２８９】
実施例１０：  ヒトニコチンアミドメチルトランスフェラーゼ (NMNAT) はヒト細胞の放射線抵抗性をもたらす
NMNAT（EC 2.1.1.1; CAS 登録番号 9029-74-7）は、ニコチンアミド N-メチルトランスフェラーゼとも呼ばれ、反応S-アデノシル-L-メチオニン＋ニコチンアミド＝S-アデノシル-L-ホモシステイン＋1-メチルニコチンアミドを触媒する酵素である（さらにCantoni (1951) J.
Biol. Chem. 203-216も参照されたい）。放射線感受性ヒト細胞中でヒトNMNATが過剰発現すると、この細胞の放射線抵抗性が増すことが見出された。
【０２９０】
均等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】図１は、NPT1を増量投与すると、カロリ制限を模倣することにより老化が遅れることを示す。寿命は、細胞分裂停止前に各母細胞が生じる娘細胞の数を採点することにより、判定された（７，１０）。細胞は完全グルコース培地上で最低４８時間、予め成長させた。Ａは、野生型 (PSY316AT、丸）、2xNPT1（YDS1544、ダイヤモンド）及び5xNPT1 （YDS1548、三角）の2% グルコースを加えた培地上での死亡曲線を示す。平均寿命はそれぞれ21.9、30.8 及び35.1世代だった。Ｂは、野生型（PSY316AT、丸）、sir2::TRP1 （YDS1594、下向き三角）、2xNPT1 （YDS1544、四角）、sir2::TRP1 2xNPT1 （YDS1573、ダイヤモンド）及び 5xNPT1 2xSIR2（YDS1577、上向き三角）の2% グルコース培地上での死亡曲線を示す。平均寿命はそれぞれ23.7、14.4、13.9、31.0 及び31.9 世代だった。Ｃは、2% グルコース（PSY316AT、丸）及び0.5% グルコース培地（PSY316AT、四角）上の野生型、及び0.5% グルコース 培地（YDS1544、三角）上の2xNPT1 の死亡曲線を示す。平均寿命はそれぞれ21.9、31.7 及び34.5 世代である。
【図２】図２は、NPT1 及びSIR2 が熱ショックに対する耐性を提供することを示す。Ａでは、株を、ディオーキシー移相後３日間ＳＣ培地で成長させ、５５℃で１時間、インキュベートしてから、１０倍希釈にしてＳＣプレート上にプレートした。Ｂでは、株をＡの通りに処理し、ＳＣプレート上に低密度になるようにプレートした。２４時間後に生じたコロニを採点し、未処理試料から生じたコロニのパーセンテージで表した。数値は、３つの個別の実験の平均を表す（＋／−s.d.）。株：W303AR URA3(YDS1568)、W303AR URA3LEU2 (YDS1563) 並びにW303AR、2xNPT1-URA3 (YDS1503)、2xSIR2-URA3 (YDS1572)及び2xNPT1-URA32xSIR2-LEU2 (YDS1561)の同質遺伝子型由来体。
【図３】図３は、付加的なNPT1 があるとサイレント状態及びrDNA安定性が増すことを示す。Ａでは、rDNAにADE2 マーカを持つ株をＳＣプレート上で予備成長させ、１０倍連続希釈液にしてＳＣプレート上にスポットした。アデニンを欠く培地では成長の遅延によりサイレント状態の増加が示されている。株：W303-1A ADE2(YDS1596)、W303-1A RDN1::ADE2(W303AR5) 並びにW303AR5 由来体 2xNPT1(YDS1503)、2xSIR2 (YDS1572)及び2xNPT1 2xSIR2(YDS1561)。Ｂでは、rDNA遺伝子座にある MET15 のサイレント状態を、JS237の同質遺伝子型由来体を、0.07% PbNO3を含有する栄養培地に画線し、５日間３０℃でインキュベートすることにより、検定した。茶色の色素の蓄積により、サイレント状態の増加が示されている。関連する遺伝子型：met15D (JS209)、MET15 (JS241)、 RND1::MET15 (JS237)、sir2::TRP1 (JS218)、2xSIR2 (YDS1583)、2mSIR2 (YDS1522)、npt1D::kanr (YDS1580)、2xNPT1(YDS1581) 及び 2mNPT1 (YDS1493)。Ｃでは、rDNA遺伝子座にあるADE2 マーカのサイレント状態を、1xNPT1、2xNPT1、及び２μNPT1 を以下のバックグランドで持つ株で判定した：野生型 （W303AR5、YDS1503、YDS1496)、 sir2::TRP1 (YDS878、YDS1504、YDS1494)、sir3::HIS3 (YDS924、YDS1505、YDS1587)、及び sir4::HIS3 (YDS882、YDS1506、YDS1495)。Ｄでは、ADE2 マーカをテロメアに持つ株を制限量のアデニンを含有するＳＣ培地上に画線した。赤色の色素の蓄積によりサイレント状態の増加が示されている。関連する遺伝子型： (PSY316AT)、2xNPT1(YDS1544)、5xNPT1(YDS1548)、5xNPT1 2xSIR2(YDS1577) 及び5xNPT1 SIR2::TRP1(YDS1573). sir2::TRP1 (YDS1594)。Ｅでは、Ａの株を、rDNA遺伝子座に組み込まれたADE2マーカの消失率を調べることにより、rDNA安定性について検定した。細胞をYPD培地上にプレートし、一回目の細胞分裂でのマーカ消失事象を反映した半円弧型のコロニの頻度を測定した。10,000個を越えるコロニを各株について調べ、各実験を三重にして行った。細胞分裂一回当たりの平均組換え頻度（＋／−s.d.）を示す。Ｆは、野生型 (W303AR)、sir2::TRP1 (YDS878) 及び 2xNPT1sir2::TRP1  (YDS1504) 株のリボゾームDNA組換え率を示す。検定は（Ｅ）の通りに行われた。
【図４】図４は、カロリ制限及びストレスに応答したNPT1 の発現を示す。Ａでは、3xHA タグ配列を、W303AR5 （YDS1531） 及び W303cdc10-25（YDS1537）の天然NPT1 ORFの3'側末端にインフレームで挿入した。細胞を３０℃のYPD 培地で成長させ、解説された通りに処理した。NPT1 mRNA のレベルを、YPD（0.5% 及び2.0% グルコース）で成長させたW303AR5 と、YPD（2% グルコース）で成長させたW303cdc25-10で調べた。1.8 kbの NPT1 転写産物を検出し、レベルをアクチン (ACT1) コントロールに正規化した。同様な結果をPSY316 株バックグラウンド（図示せず）で得た。Ｂでは、Ａの培養株からのタンパク質抽出物をウェスタン・ブロット法で分析して、HAタグ付きNpt1をα-HA 抗体を用いて検出した。53 kD 及び40 kD の２つのバンドがNpt1-HA 株でに検出され、タグのついていないコントロール株にはバンドは検出されなかった（図示せず）。アクチンレベルを充填コントロールとして役立てた。同様な結果をPSY316株バックグラウンドで得た（図示せず）。Ｃでは、NPT1 mRNA のレベルを、野生型 W303AR5(YDS1531) 対数期培養株で、以下：MMS  (0.02% v/v)、パラコート (5mM)、又は熱ショック（55°C）への曝露後１時間で調べた。Ｄでは、Ｃの培養株のタンパク質抽出物をＢの通りに分析した。Ｅ及びＦでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）配列を、W303AR5（それぞれYDS1611 及びYDS1624）の天然NPT1 及びNMA2 ORFの3'側末端にインフレームで挿入した。細胞を３０℃のYPD培地で対数期中期まで成長させ、生きた状態で撮影した。GFP（緑色）及びHoechst DNA 染料（偽性赤色）の重複領域は、組合せ画像では黄色に見える。
【図５】図５は、NAD＋再利用経路の複数の制限成分を示す。Ａは、サルモネラで公知のステップに基づく、Ｓ．セレビジエでのNAD＋生合成の推定ステップを示す。各ステップを媒介していると考えられる酵母遺伝子をイタリックで示す。NaMN、ニコチン酸モノヌクレオチド；NaAD、デスアミド-NAD+；NaM、ニコチンアミド；Na、ニコチン酸。Smith et al.(2000)から適合。Ｂは、株ADE2 (YDS1596)、野生型 (W303AR5)、2xNPT1(YDS1503)、2xPNC1(YDS1588)、2xNMA2(YDS1589)、2xNMA1(YDS1590)、及び2xQNS1(YDS1614)でのrDNA遺伝子座でのADE2のサイレント状態を示す。サイレント状態の増加は、アデニンを欠く培地上で成長遅延により示されている。Ｃでは、テロメアにADE2 マーカを持つ株を、制限量のアデニンを含有するＳＣ培地上に画線した。サイレント状態は赤色色素の蓄積で示されている。検査された株：野生型 (PSY316AT)、2xNPT1(YDS1544)、5xNPT1(YDS1548)、sir2::TRP1 (YDS1594)、2xPNC1(YDS1591)、2xNMA2(YDS1592) 及び 2xNMA1(YDS1593)。
【図６】図６は、NAD＋再利用経路を通る流れの増加による寿命の延びのモデルを示す。Sir2 及びHst1-4 などのタイプＩＩＩヒストンデアセチラーゼは、NAD＋をニコチンアミドに転化することにより、この再利用経路で重要なステップを触媒する。PNC1、NPT1、NMA1及びNMA2 のコピーが付加的にあると、NAD＋再利用経路を通る流れが増加し、それによりSir2活性が刺激されて寿命が増す。QNS1 の付加的なコピーがあってもサイレント状態は増加しない。なぜなら、この経路の他のステップとは異なり、その基質はこの再利用経路の外にある供給源からは提供されず、従ってこの反応に限界があるからである。略語：NAD＋、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；NaMN、ニコチン酸モノヌクレオチド；NaAD、デスアミド-NAD＋。
【図７】図７はNAD＋再利用経路を示す。Sir2により生じるニコチンアミドはPnc1によりニコチン酸に転化され、次にNAD＋に、と３段階で戻される。 略語：NAD＋、 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；NaMN、ニコチン酸モノヌクレオチド；NaAD、デスアミド-NAD＋。
【図８】図８は、ニコチンアミドがテロメア及びrDNAのサイレント状態を阻害することを示す。Ａでは、rDNA遺伝子座でのサイレント状態を、JS237 (RDN1::MET15)の同質遺伝子型由来株を、0.07% PbNO3及び0、1、もしくは5 mMのニコチンアミドを含有する栄養培地上に画線することで検定した。MET15 マーカのサイレント状態が、茶色の色素の蓄積で示されている。RDN1::MET15 株の一個の暗褐色のコロニはマーカ消失事象を表すものである。関連する遺伝子型： met15D (JS209)、MET15 (JS241)、RDN1::MET15 (JS237)、sir2::TRP1 (JS218)、2xSIR2(YDS1583)。Ｂでは、テロメアにADE2 マーカを持つ株を、制限量のアデニンと、0 もしくは5 mM のニコチンアミドを含有するＳＣ培地上に画線した。 ADE2 マーカがサイレント状態になると、赤色の色素が蓄積する。関連する遺伝子型：(PSY316AT)、W303-1A ADE2(YDS1596) 及びW303-1A ade2(YDS1595)。
【図９】図９は、ニコチンアミドがrDNA組換えを増加させ、酵母寿命を縮めることを示す。Ａでは、rDNA遺伝子座に組み込まれたADE2マーカの消失率を調べることにより、rDNA安定性について株を検定した。細胞を5 mMのニコチンアミド（NAM）を加えた、又は加えない2% グルコース YPD培地にプレートし、一回目の細胞分裂時のマーカ消失事象を反映する半円弧型のコロニの頻度を測定した。10,000 個を越えるコロニを各株について調べ、各実験を三重にして行った。一回の細胞分裂毎の平均組換え頻度（＋／−s.d.）を示す。関連する株：W303-1A RDN1::ADE2(W303AR5) 並びにW303AR5 由来体 2xSIR2 (YDS1572)及びsir2::TRP1 (YDS878)。Ｂでは、ニコチンアミド（NAM）及びニコチン酸（NA）の構造の比較を示す。Ｃ及びＤでは、細胞分裂停止前の各母細胞から生じた娘細胞の数を採点することにより、寿命を判定した（６８’６９）。細胞を最低４８時間、完全グルコース培地上で予備成長させた。Ｃは、野生型 (PSY316AT) 及びsir2::TRP1 (YDS1594) 株の0 又は5 mM ニコチンアミド（NAM）中での死亡曲線を示す。平均寿命はそれぞれ wt: 22.4、12.1 及び sir2: 12.1、11.7 だった。Ｄは、Ｃの野生型及びsir2株の0、5 mM 又は50 mM のニコチン酸（NA）の存在下での死亡曲線を示す。平均寿命はwt: 22.4、26、25 及びsir2: 12.1、12.2だった。
【図１０】図１０は、ニコチンアミドが、周期循環中及びG1期停止細胞の両方においてサイレントな接合型遺伝子座（HMR）を抑制解除することを示す。Ａでは、HMR遺伝子座（YDS970）にADH作動性GFP転写産物を含有するPSY316 細胞を、３０℃のYPD培地で対数期中期まで成長させ、5 mMのニコチンアミド (NAM) で提示した時間、処理した。細胞を生きた状態で撮影した。Ｂでは、株YDS970 又は同質遺伝子型 sir4D 変異体(YDS1499) を5 mM のニコチンアミド (NAM)、5 mMのニコチン酸 (NA) 又は5 mM のキノリン酸 (QA)のいずれかで処理した。細胞を蛍光活性化セル・ソーティング (FACS) で分析して、ADH-GFP 発現の程度を判定した。Ｃでは、株YDS970の  MATa由来体 (YDS1005)を HMLについて欠失させ、10μg/ml α因子で３時間、処理した。次に細胞を5 mM のニコチンアミドの存在下で提示した時間、成長させ、FACSで上記の通りに調べた。細胞周期の進行を、各時点で、ヨウ化プロピジウム染色された細胞のFACS分析により観察した。
【図１１】図１１は、ニコチンアミドがSirタンパク質の局在を変化させないことを示す。SIR2-GFP (YDS1078) (C 及び D)、SIR3-GFP (YDS1099) (E 及び F)、又はGFP-SIR4 (YDS1097) (G 及び H) のいずれかを含有する野生型株と、SIR3-GFP (YDS1109) (A 及びB)を発現する同質遺伝子型sir2由来体を２時間、5 mM のニコチンアミドの存在下で成長させた。GFP蛍光を生存細胞で検出した。
【図１２】図１２は、Sir2が、ニコチンアミドの存在下では、テロメア由来のDNAとも、接合型遺伝子座由来のDNAとも結合しないことを示す。Ａ及びＢでは、ポリクローナルα-Sir2 抗体を用いたクロマチン免疫沈降を、sir2 (YDS878) (A)又は野生型 (W303AR5) (B)株からの抽出物に対し、5 mM ニコチンアミド (NAM)の存在下で行った。全細胞抽出物と、免疫沈降後のクロマチンの両方を由来とする入力DNAのＰＣＲ増幅を示す。PCR は、CUP1 遺伝子（一番上のパネル）、5S rDNA （２番目のパネル）、HMR 遺伝子座（３番目のパネル）、又はテロメアのうちのサブテロメア DNA 1.4 及び 0.6 kb （一番下のパネル）に特異的なプライマ対を用いて行われた。プライマの配列を表４に挙げる。
【図１３】図１３は、ニコチンアミドは、in vitroにおいて酵母Sir2及びヒトSIRT1の強力な非競合的阻害剤であることを示す。Ａでは、組換えGSTタグ付きSir2を、アセチル化基質と一緒に３０分間、３０℃で、 1 mM のDTT、200、350、500 もしくは750μMのNAD＋及び提示した濃度のニコチンアミドの存在下でインキュベートした。展開剤を添加することで反応を停止させ、試料を蛍光分析法（励起は 360 nm に設定し、発光は460 nm）で分析した。実験は三重にして行った。データは、任意蛍光単位（AFU）分-1、対、NAD＋（μM）のラインウィーバー・バーク二重逆数プロットとして示されている。Ｂでは、実験をＡの通りに行ったが、例外として、組換えヒトSIRT1を用い、反応は３７℃で行われた。Ｃでは、脱アセチル化反応を三重にして、2.5μgのSIRT1、1 mM DTT、200μM NAD＋と、 50μMの水空試験、DMSO空試験、ニコチン酸、シルチノール、M15、スプリトマイシン又はニコチンアミドのいずれかとで行った。反応を３７℃で３０分間、行わせ、蛍光をＡの通りに測定した。
【図１４】図１４Ａ−Ｃは、Sir2-Af1の保存されたＣポケットに嵌め合わせたニコチンアミドを示す。（Ａ）左側のパネルは、結合したNAD＋を紫色にし、アセチル-リジン結合トンネルを赤色の矢印で指し示した、Sir2-Af1の表面図の前面図を示す。Ｃ部位は、破線の緑がかった青の曲線で描かれている。右側のパネルは、破線を通って切断し、その垂直軸に沿って９０度回転させた該タンパク質を示す。Ｃ部位の保存された残基の表面は緑がかった青に着色されている。（Ｂ）Ａの右側のパネルで描かれた黒い矩形の近接図であり、Sir2-Af1のＣポケットに深く嵌め合わされたニコチンアミドを示す。（Ｃ）Ｃポケットの保存された残基に取り囲まれた、嵌め合わされたニコチンアミド（緑色）の立体図を示す。推定上の相互作用を破線で示し、水素結合（青色）、静電的（マゼンタ）及びファンデルワールス（黄色）が含まれている。
【図１５】図１５は、NPT1相同体のアライメントを示す。
【図１６】図１６は、PNC1相同体のアライメントを示す。
【図１７】図１７Ａ−Ｅは、カロリ制限及び熱ストレスが、PNC1-依存的な態様で寿命を延ばすことを示す。（Ａ）は、Pnc1がニコチンアミドのニコチン酸への転化を触媒することを示す。（Ｂ）は、酵母では、NAD＋は、トリプトファンからde novo 合成され、ニコチンアミドからNAD＋再利用経路を通じて再循環することを示す。（Ｃ）は、グルコース制限による寿命の延びには、PNC1が必要であることを示す。2.0% (w/v) グルコースを含有する完全培地上の平均寿命は：野生型、(21.6); pnc1D, (19.1); sir2D, (14.2)だった。 0.5% グルコース上の平均寿命は：野生型、(32.7); pnc1D, (18.1); sir2D, (14.7)だった。（Ｄ）は、穏やかな熱ストレスへの曝露による寿命の延びを示す。３０℃のときの平均寿命は：野生型、(19.4); pnc1D, (18.5); sir2D, (12.0)だった。３７℃のときの平均寿命は：野生型、(23.4); pnc1D, (17.5); sir2D, (10.6)だった。（Ｅ）付加的な PNC1 があると寿命がSIR2依存的な態様で延びることを示す。2.0% グルコース/30°C上の平均寿命は：野生型、(19.7); 5xPNC1,(36.1); sir2D, (14.2); 5xPNC1 sir2D, (15.1); pnc1D?sir2D, (14.4)だった。
【図１８】図１８Ａ−Ｄは、Pnc1 レベル及び活性はカロリ制限及びストレスに応答して上昇することを示す。（Ａ）は、抗GFP抗体を用いた、酵母全細胞抽出物中のPnc1-GFPの検出を示す。アクチンレベルが充填コントロールとして含まれている。抽出物は、2.0%、0.5% 又は 0.1% グルコース (w/v)を加えた完全培地で成長させた対数期中期野生型培養株から作製された。（Ｂ）は、対数期中期野生型、cdc25-10 又は bna6D 培養株からの抽出物で、上述した通りに検出されたPnc-1GFPレベルを示す。（Ｃ）は、対数期中期野生型培養株からの抽出物、で上述した通りに検出されたPnc-1GFPを示す。培養株を以下の条件で成長させた：完全培地（処理なし）、合成培地（SD）、アミノ酸（a.a.）制限 （非必須アミノ酸を欠くSD）、塩ストレス（NaCl, 300 mM)、熱ストレス（３７℃）、ソルビトール（1M）。（Ｄ）は、提示した条件下で成長させた対数期中期野生型培養株の細胞抽出物からのPnc1によるニコチンアミド脱アミン化の測定を示す。示した数値は、３つの個別の実験の平均である。活性は、生じたアンモニアnmol／分／総タンパク質のmg、±s.d: 2.0% グルコース 0.90±0.26、0.1% グルコース 4.38±0.43、３７℃ 3.28±0.32、ソルビトール (1 M) 3.75±0.65。
【図１９】図１９Ａ−Ｃは、PNC1 が急性ストレスに対する耐性をもたらすことを示す。（Ａ）は、付加的なPNC1 が塩ストレスに対する耐性をもたらすことを示す。対数期中期コロニからの細胞を600 mM NaCl 又は200 mM LiCl を含有する完全培地上に塗り、４日間、２５℃でインキュベートした。標準酵母培地（2% グルコース、２５℃）には、野生型、5xPNC1、又は 5xPNC1 sir2D 株間で成長速度に検出可能な違いはなかった。（Ｂ）は、付加的なPNC1 が紫外線で誘導される損傷からSIR2 独立な態様で保護することを示す。対数期中期培養株からの細胞を低密度で完全培地にプレートし、紫外線（5 mJ/cm2、254nm）に曝露した。暗室で３０℃で３日間成長させた後にコロニを形成する能力により、生命力を判定した。数値は、生命力有りのパーセント±s.e. で表されている。（Ｃ）は、PNC1 が、ミトコンドリアDNA損傷からのSIR2独立な保護を提供することを示す。完全3% (v/v) グリセロール培地及び10μg/ml 臭化エチジウム（EtBr）上に画線した対数期細胞のミクロコロニ分析。少なくとも100個のミクロコロニを２つの別個の実験で３日後に採点した。コロニ一個当たりの細胞数±s.e.は：野生型6.92±0.06、5xPNC1 18.72±0.53、及び5xPNC1 sir2D 16.15±2.82だった。EtBrを加えた、完全2% (w/v) グルコース培地上のこれらの株の間に成長の違いは検出されなかった。
【図２０】図２０Ａ−Ｄは、Pnc1-GFPが細胞質及び核内に局在しており、ペルオキシソームに濃縮していることを示す。（Ａ）では、Pnc1-GFP 蛍光を、2.0% グルコース （制限なし）、又は0.5% もしくは0.1% グルコース (Glu)を含有する完全培地で成長させた対数期中期野生型培養株から採取した細胞で検出した。（Ｂ）では、以下の条件下で成長させた野生型培養株からの細胞中のPnc1-GFPの検出を示す：アミノ酸（a.a.）制限（非必須アミノ酸を欠くSD）、塩ストレス（300 mM NaCl）、熱ストレス（３７℃）。（Ｃ）では、対数期中期野生型培養株からの細胞中のPnc1-GFP（緑色）及びRFP-PTS1（Peroxisomal TargetingSignal 1）（赤色）の同時局在を示す。黄色は重複を示す。培養株を0.5% グルコースを含有する完全培地で成長させて、蛍光の観察を容易にできるようにした。（Ｄ）では、ペルオキシソーム変異株、pex6D、pex5D 及び pex7Dの対数期中期培養株からの細胞中のPnc1-GFPの局在を示す。培養株を、0.5% グルコースを含有する完全培地中で成長させて、蛍光の観察を向上させるようにした。画像はすべて、１秒という同じ露出で撮影された。
【図２１】図２１Ａ−Ｂは、ニコチンアミド代謝を操作すると、SIR2 依存的サイレント状態に影響があることを示す。（Ａ）では、サイレント状態を測定するために、ADE2 レポータを、リボゾームDNA（rDNA）遺伝子座に組み込んだ。この系では、アデニンを欠く培地上での成長増加が、ADE2 サイレント状態の低下の指標となる。株を１０倍連続希釈液にして、アデニンを加えた、又は加えないプレート上にスポットした。Ade＋株をコントロールとして役立てた。（Ｂ）は、ニコチンアミドによる寿命及びストレス耐性の調節のモデルを示す。カロリ制限、熱及び浸透圧ストレスを含む異種の環境刺激は、寿命及びストレス耐性の共通の経路への入力として働く。細胞は、ニコチンアミドをニコチン酸に転化する酵素をコードするPNC1の転写を誘導することにより、これらの入力への応答を調和させる。ニコチンアミドを枯渇させると、Sir2の阻害を緩和し、寿命を促進するだけでなく、ストレス耐性及びおそらくは他の細胞内プロセスに関与する数多くの更なる標的タンパク質が活性化する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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