(57)【要約】癌検出用標識としてのPAX5αおよびPAX5βおよび他の遺伝子。PCRを基礎とする方法によりメチル化CpG島を増幅し、次に具象的な差額分析を行ってヒトの癌においてメチル化した遺伝子を同定する。遺伝子PAX5αおよびPAX5β、新規ループヘリックスループタンパク質、および新規遺伝子2、およびベータ３遺伝子は、メチル化されるとヒトの乳癌、結腸癌、および肺癌を検出し、モニタリングし、診断し、および経過予測するための標識として役立つ。メチル化に特異的なポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー配列を含む増幅方法が開示されている。
2005515787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの乳房、肺および結腸の癌化素因に随伴するプロモーターの異常なメチル化を検出する方法であって、PAX5α遺伝子のメチル化を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
ポリメラーゼ連鎖反応を利用してPAX5α遺伝子のコピー数を増大することによってプロモーターのメチル化が存在する遺伝子部分を増幅し、それによって増幅体を作成すること；および
第一のポリメラーゼ連鎖反応により作成した増幅体の一部をメチル化に特異的な第二のポリメラーゼ連鎖反応において利用することにより、メチル化によるPAX5α遺伝子の不活性化が存在することを検出すること、
の段階を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトの乳房、肺および結腸の癌化素因に随伴するプロモーターの異常なメチル化を検出する方法であって、PAX5β遺伝子のメチル化を検出することを特徴とする方法。
【請求項４】
ポリメラーゼ連鎖反応を利用してPAX5β遺伝子のコピー数を増大することによってプロモーターのメチル化が存在する遺伝子部分を増幅し、それによって増幅体を作成すること；および
第一のポリメラーゼ連鎖反応により作成した増幅体の一部をメチル化に特異的な第二のポリメラーゼ連鎖反応において利用することにより、メチル化によるPAX5β遺伝子の不活性化が存在していることを検出すること、
の段階を更に含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒトの癌をモニタリングする方法であって、遺伝子特異的なプロモーターのメチル化が生物学的液体の細胞中で存在していることを確認することにより、その生物学的液体中での遺伝子の不活性化を検出することを含み、および更に、
PAX5α遺伝子を含む生物学的液体サンプルを入手し、このサンプル入手の段階が血漿、粘液、大便および喀痰からなる群から選択する段階を含むこと；
ポリメラーゼ連鎖反応を利用してPAX5α遺伝子のコピー数を増大することによってプロモーターのメチル化が存在する遺伝子部分を増幅し、それによって増幅体を作成すること；および
第一のポリメラーゼ連鎖反応により作成した増幅体の一部を、第二の、メチル化に特異的なポリメラーゼ連鎖反応において利用することによりPAX5α遺伝子の不活性化が生物学的液体において存在していることを検出すること、
の段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
ヒトの癌をモニタリングする方法であって、遺伝子特異的なプロモーターのメチル化が生物学的液体の細胞中で存在していることを確認することにより、その生物学的液体中での遺伝子の不活性化を検出することを含み、および更に、
PAX5β遺伝子を含む生物学的液体サンプルを入手し、このサンプル入手の段階が血漿、粘液、大便および喀痰からなる群から選択する段階を含むこと；
ポリメラーゼ連鎖反応を利用してPAX5β遺伝子のコピー数を増大することによってプロモーターのメチル化が存在する遺伝子部分を増幅し、それによって増幅体を作成すること；および
第一のポリメラーゼ連鎖反応により作成した増幅体の一部を、第二の、メチル化に特異的なポリメラーゼ連鎖反応において利用することによりPAX5β遺伝子の不活性化が生物学的液体において存在していることを検出すること、
の段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
ヒトの癌をモニタリングする方法であって、遺伝子特異的なプロモーターのメチル化が生物学的液体の細胞中で存在していることを確認することにより、その生物学的液体中での遺伝子の不活性化を検出することを含み、および更に、
生物学的液体中のDNAを亜硫酸水素塩修飾すること；
亜硫酸水素塩修飾したDNAテンプレートを認識するが、メチル化アレル体と非メチル化アレル体を識別しないプライマー配列をポリメラーゼ連鎖反応において利用することにより該DNA中のPAX5α遺伝子のコピー数を増加してプロモーターのメチル化が存在するPAX5α遺伝子のCpGリッチな部分を増幅し、それによってPAX5α遺伝子の断片を含有する増幅体を作成すること；
第一のポリメラーゼ連鎖反応により作成した増幅体の一部を、メチル化DNAテンプレートに特異的なプライマー配列を使用する、第二の、メチル化に特異的なポリメラーゼ連鎖反応において利用することによりPAX5α遺伝子の不活性化が存在していることを検出すること、
の段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
PAX5α遺伝子のヌクレオチド配列を決定するための、またはポリメラーゼ連鎖反応で使用するための単鎖DNAプライマーであって、該プライマーが(i) SEQ ID NO:１またはその補体、および(ii) SEQ ID NO:３またはその補体からなる群から選択される配列を含むことを特徴とするプライマー。
【請求項９】
PAX5α遺伝子のヌクレオチド配列を決定するための、またはポリメラーゼ連鎖反応で使用するための単鎖DNAプライマーであって、該プライマーが(i) SEQ ID NO:２またはその補体、および(ii) SEQ ID NO:４またはその補体からなる群から選択される配列を含むことを特徴とするプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロモーターの過剰メチル化を標識とすることにより、癌をスクリーニングし、診断および治療上のモニタリングをする分野に関し、具体的にはPAX5アルファおよびベータ遺伝子、および他の同定された遺伝子の不活性化のスクリーニング、モニタリングに関する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、米国仮出願番号60/348,407、発明の名称「癌におけるPAX5アルファおよびベータ遺伝子の不活性化」、出願日2001年10月18日の出願の利益を請求しており、その明細書を引用により本明細書に取り込む。
【０００３】
政府権限
米国政府は、本発明に所定の権限を有しており、また限定された状況において本特許所有者に対し、第三者に正当な条項での実施許諾を与えるべきことを請求する権限を有しており、ただしその条項は米国国防省が裁定する協定番号DAMD17-99-1-9258の条項によって規定される。
【背景技術】
【０００４】
癌患者の経過予測は主に臨床診断の時点での腫瘍の段階に依存している。ヒトの新生物形成は、癌原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子における遺伝子的変異が進行的に蓄積する過程で起こることが判っている。これらの遺伝子的変化は、腫瘍の成長と共に保持されているので、癌検出用の標識として役立てることができる。したがって、これら遺伝子標識の同定は有用であり、それらを初期検出に利用すれば、治療をモニタリングし、この疾患の発生を予測することができる。
【０００５】
Dr. James HermanおよびDr. Stephan Baylinは、メチル化に特異的なポリメラーゼ連鎖反応(MSP)として知られている技法を開発して、腫瘍細胞内でプロモーターメがチル化する遺伝子特異的変異を検出した。この技法は米国特許5,786,146および6,017,704に記載されており、これを利用して癌遺伝子(例えば、p16、Rb ER、およびMGMT)でのプロモーターの過剰メチル化が検出され、またこの技法により1,000個の非メチル化コピーの背景の中から1個のメチル化遺伝子のコピーの検出が可能である。
【０００６】
DNAメチル化機構の調節不全が腫瘍形成および腫瘍進行とリンクしている証拠がある。新生物形成において、多くの腫瘍抑制遺伝子のプロモーター内ではDNAのメチル化パターンが増加している。この変異が起こると遺伝子はサイレンシングし、それはコード領域の突然変異体に向かう別ルートとして機能する。最近、メチル化CpG島増幅法と呼ばれる技法がゲノムスクリーニングの手段として開発され、これにより癌細胞において特異なメチル化をする遺伝子が同定された。PCT出願PCT/US01/26452、出願日2001年8月24日、本発明の出願人に譲渡、この全体を引用により本明細書に取り込む、を参照。
【０００７】
プロモーターの過剰メチル化により不活性化した新規遺伝子を癌、例えばヒトの乳癌において同定し、他の固形腫瘍型における遺伝子不活性化との共通性を決定する必要が残されている。こうした背景にかんがみて本発明は開発された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
PAX5αおよびβ遺伝子等はヒト癌の検出、モニタリングおよび診断のための標識体であると同定されている。ポリメラーゼ連鎖反応を基礎とするメチル化CpG島を増幅する技法に続いてレプレゼンテーショナルディファレンスアナリシスを行うことにより、メチル化されたこれら遺伝子がヒトの癌において同定されている。
【０００９】
5’CpG島の異常なメチル化は、ヒトの多くの癌では重要な後成的事象である。CpG島は二つ同定されており、PAX5αおよびβ遺伝子の5’UTR領域へマップされている。これらの遺伝子は染色体9p13に存在しており、二つの異なるプロモーターから転写され、二つの選択的な第一エクソンを形成するが、続いてスプライスされると共通エクソン2〜10になる。この得られたスプライス変異体は、細胞分化および胎芽発育に重要な二つの異なる転写因子をコードしている。メチル化に特異的なPCRを利用して各遺伝子のメチル化状態を検討したところ、両遺伝子とも例えば乳房、肺および結腸の腫瘍において過剰メチル化していることが明らかになっている。亜硫酸水素塩制限分析と亜硫酸水素シーケンシングとの組み合わせによって、メチル化した細胞株および腫瘍を分析してみると、濃密なメチル化パターンが各5’CpG島に存在し転写のサイレンシングと強く関連していることが明らかとなっている。このように同定されたプロモーターの異常メチル化は、PAX5および本発明で同定された他の遺伝子が調節不全となるメカニズムである。
【００１０】
本発明の目的、利点および新規な特徴、および更なる適用範囲について、その一部分は添付図面を引用しながら以下の詳細説明に記述するが、他の部分は以下の記述を検討すれば当業者には明白であり、あるいは本発明の実施によって教示される。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘した手段および組み合わせにより実現および達成されてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
乳癌は米国における癌関連死の主要原因の第二位であり、事例数は毎年増加している。癌の発生と進行に係る分子変異についての理解が向上すれば、この疾患に起因する死亡率は減少する筈である。多くの散発性癌におけるメカニズム、すなわちプロモーターの異常な過剰メチル化は、後成的な事象であって、例えば遺伝子のプロモーター領域内の正常な非メチル化シトシンがメチル化することである（Baylin および Herman, 2000； Jones および Laird, 1999）。メチル化パターンがこのように変化すると、転写のサイレンシングが起こり、それはコード領域の突然変異に向かう別ルートとして機能する（Baylin および Herman, 2000； Jones および Laird, 1999）。乳癌では、異常なメチル化により、重要な細胞経路で機能している多数の遺伝子が不活性化している（Yang et al., 2001； Zochbauer-Muller et al., 2001； Du et al., 2001； Burbee; et al., 2001； Toyooka et al., 2001）。
【００１２】
プロモーターの過剰メチル化によって不活性化した遺伝子を同定するために、癌ゲノムを広範にスクリーニングするアプローチが知られている。そうしたアプローチには、例えばメチル化感受性を任意にプライムされたPCR法(Gonzalgo et al., 1997； Huang et al., 1997)、制限ランドマークゲノムスキャンニング法(Costello et al., 2000)、CpGミクロアレイ法 (Yan et al., 2001)、メチルCpG結合性領域のクロマトグラフィー法(Brock et al., 2001)、およびレプレゼンテーショナルディファレンスアナリシス（RDA）法と結合したメチル化CpG島増幅法(MCA)(Toyota et al., 1999a)が挙げられる。このMCA／RDAアプローチを利用して、結腸直腸癌(Toyota et al., 1999b； Toyota et al., 1999c)および膵臓癌（Ueki et al., 2001）に関与するいくつかのメチル化遺伝子が同定されている。MCA／RDAは、PCR／差し引きハイブリダイゼイションを基礎とする測定法であって、これによりサイズが200bpから2kbの濃密にメチル化されたCpGリッチ領域の迅速な増幅と選択が可能である。
【００１３】
PAX5遺伝子の役割は細胞分化および胎芽発育に存し、染色体9p13に位置している。この遺伝子座は染色体の転座にしばしば関連しており、二つの異なるプロモーターを含有するので選択的に5’エクソンは二つ(αおよびβ)あるが、スプライスされると共通コード配列のエクソン2〜10になる。テスターとして乳癌細胞株MCF7由来アンプリコンを、またドライバーとして正常乳房組織由来アンプリコンを使用して、本出願人らは転写因子PAX5の領域5’UTRおよびエクソン１を同定した。
【００１４】
メチル化CpG島増幅法を使用して、本出願人らは一般的な癌、例えば乳癌、結腸癌および肺癌の場合にこれら二つの遺伝子PAX5αおよびβのプロモーターが過剰メチル化していることを同定した。これら遺伝子は染色体9p13に位置し、二つの異なるプロモーターから転写され、結果的には二つの選択的な5’エクソンが形成されるが、スプライスされると共通エクソン2〜10になる。得られるスプライス変異体は、細胞分化および胎芽発育に重要な二つの異なる転写因子をコードしている。これらの遺伝子の発現は数種の腫瘍型では調節されないとの証拠を示している記述も最近あるが、これらの遺伝子をサイレンシングする手段としてプロモーターの過剰メチル化を実施したものはない。
【００１５】
PAX5αおよびβ遺伝子は共に腫瘍細胞株ならびに乳房、肺および結腸由来原発性腫瘍においてしばしば異常な過剰メチル化の標的になるとの確定が本発明によりなされた。本発明には、以下のPAX5メチル化に特異的なポリメラーゼ連鎖反応(MSP)用プライマーが含まれており、これによってプロモーターのメチル化を測定する
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【００１６】
MSP測定法を利用して、本出願人らは乳癌、肺癌、結腸癌におけるPAX5αおよびβ遺伝子のメチル化状態を検討した。PAX5αは、乳房腫瘍および肺腫瘍のほぼ70％、また結腸腫瘍の13%においてメチル化しており、PAX5β遺伝子は、乳房腫瘍および肺腫瘍のほぼ60％、また結腸腫瘍の20%においてメチル化している。
【００１７】
したがって、本発明を米国特許6,017,704およびPCT出願PCT/US01/26452に開示の方法と組み合わせるならば、癌の初期検出、腫瘍の進行のモニタリング、放射および化学療法に対する応答のモニタリング、疾患結果の予測、および予防療法に対する応答のモニタリングにとって有益な用途が見出される。本発明によって公知の癌スクリーニング法のレベルは向上する。その理由は初期検出、療法モニタリングおよび疾患結果の予測のためのマーカーが本発明により追加されるからである。
【００１８】
本発明の最初の段階はPAX5αおよびβの過剰メチル化の同定であった。Toyotaらが開発したMCA／RDA法を使用して乳癌におけるメチル化遺伝子を同定した（Toyota et al., 1999）。差引きライブラリーを構築し、100個のクローンをDNAシーケンシングにより分析した。これらのクローンを比較したところ、50個の特異な配列が明らかとなり、各クローンをBlast検査したところ、50クローン中の48クローンが高処理ゲノム配列データベースに置かれているGenbankの配列と同族であった。これらクローンの一つは転写因子PAX5（Genbank accession # AF074913）の5’フランキング領域およびエクソン１βに一致した。この遺伝子のゲノム構造を解析したところ、二つの異なるプロモーターの存在が明らかとなったが、これらは二つの選択的な5’エクソン（１αおよび１β）を形成し、それらはスプライスされると共通エクソン2〜10となるが、翻訳するとフレームがシフトするために二つの特異なタンパク質になる（Busslinger et al., 1996参照）。αおよびβプロモーターを分析すると、各領域とも典型的なCpG島であり（Gardiner-Garden および Fromme, 1987； Antequera および Bird, 1993参照）、GC含有量は0.68および0.69；CpG／GpC比は0.70および0.73；また520bpおよび1,780kbの領域にそれぞれCpG部位は全部で53および162個あることが明らかとなった。
【００１９】
次に、PAX5αおよびβ遺伝子のMSP分析を行った。まず、10種の乳房細胞株、5種の肺癌細胞株、および5種の正常リンパ球由来のDNAについて、組み合わせ亜硫酸水素塩制限分析(COBRA)を行い、PAX5αおよびβ遺伝子の異常なメチル化をスクリーニングした。亜硫酸水素塩修飾の後に、メチル化アレル体および非メチル化アレル体を識別しないステージ１プライマーを使用してPCR生産物を生産した。亜硫酸水素塩修飾後に残存するCGCG部位を特異的に開裂する制限酵素BSTU1で消化すると、メチル化CpGが存在するのでPAX5α(389bp)体およびβ(328bp)体にメチル化アレル体が検出された。7種の乳房細胞株および5種の肺癌細胞株では、PAX5α遺伝子のメチル化を暗示するPCR生産物の完全消化が観察された。2種の乳房細胞株および肺癌細胞株では、PAX5αPCR生産物は部分的に(10~80％)消化された。同様に、5種の乳房細胞株および3種の肺癌細胞株において、PAX5β遺伝子は完全に消化された。2種の乳房細胞株および1種の肺癌細胞株では、PAX5βPCR生産物も部分的に(10~80％)消化された。正常リンパ球に由来するPCR生産物は消化されずに残存したことから、メチル化がなかったことが示唆された（データは示してない）。
【００２０】
原発性腫瘍（乳房、肺、および結腸）をパネルにして本出願人の２ステージMSPアプローチ（PCT出願PCT/US01/26452、出願日2001年8月24日）を使用して、PAX5αおよびβのメチル化頻度を特性化した。結果は図１にまとめてある。PAX5α遺伝子およびPAX5β遺伝子に対する典型的なMSP分析結果を図２に示す。図２は、原発性乳房腫瘍をパネルにしたPAX5α遺伝子およびPAX5β遺伝子のMSP分析結果を示す。亜硫酸水素塩で修飾したDNAを、メチル化アレル体に特異的なステージ２プライマーで増幅した。MDA-MB-231およびH2009は、PAX5α遺伝子およびPAX5β遺伝子の両方のメチル化にそれぞれ陽性および陰性な細胞株を示す。乳房および肺の腫瘍の両方において、PAX5αのメチル化頻度は、ほぼ70％であり、PAX5β遺伝子で観察された頻度(54％)よりも大きくなる傾向であった。結腸腫瘍でのPAX5αおよびβのメチル化頻度は、肺腫瘍または乳房腫瘍での頻度よりも有意に小さかった（ｐ＜0.0001）が、肺腫瘍および細胞株ではβ遺伝子のメチル化はα遺伝子のメチル化に強く随伴（ｐ＝0.05）した(図１)。
【００２１】
細胞株でのメチル化に対するMSP分析により、COBRA測定法で見られた事項が実証された。総合すると、乳癌由来の細胞株の90%および60％はそれぞれPAX5αおよびβ遺伝子についてメチル化されていた。11種の肺腫瘍由来細胞株をMSPで分析したところ、82%および55％はそれぞれPAX5αおよびβ遺伝子についてメチル化されていた。また培養した非悪性気管支表皮細胞(BEC)および癌の危険性は高いが癌ではない対象者の喀痰で検出されたメチル化アレル体の発生率は低かった(3〜13％)。非喫煙者の血中リンパ球でもMSPで測定するとPAX遺伝子はメチル化されていなかった。
【００２２】
3種の乳癌細胞株(MCF7、MDA-MB231、およびT47D)および1種の肺癌細胞株(Calu6)由来のcDNAについて逆転写PCR(RT-PCR)を行い、PAX5αおよびβ遺伝子と転写の間の関係を決定した。COBRA分析の結果、MDA-MB231およびT47D細胞株ではPAX5α遺伝子の完全消化が、またMCF7(20％)およびCalu6(80％)では部分消化が示された。PAX5βに関しては、MCF7、MDA-MB231、およびCalu6細胞株では完全消化が見られたが、T47Dでは消化がなかった。乳癌細胞株および肺癌細胞株のMSP分析を示している図３Ａを参照する。亜硫酸水素塩修飾DNAは、メチル化アレル体に特異的なステージ２プライマーで増幅された。図３Bは、１μM DACの存在下（＋）および不存在下(−)に72時間増殖した乳癌細胞株および肺癌細胞株におけるPAX5αおよびβ遺伝子の発現に対するRT-PCR分析結果を示す。PAX5αおよびβ遺伝子の発現はDAC処理後の非発現性細胞株で回復した。βアクチン遺伝子の発現をRNA組み込みのコントロールとして測定した。図３Aに示すように、次いでこれらメチル化変化をMSPにより証明した。図３Bに見られるように、PAX5αの転写はMCF7では潤沢であり、Calu6では程度は少ないが存在したのに対して、MDA-MB231およびT47D細胞株では転写は存在しなかった。これら細胞株をDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤であるDACの１μMで処理すると、Calu6では発現が増加し、MDA-MB231およびT47Dでは発現が回復した。PAX5αの転写はT47Dでのみ検出されたが、DACで処理すると他の三つの細胞株においても発現は回復した。DACで処理してもハウスキーピング遺伝子βアクチンの発現には影響がなかった。
【００２３】
次に、MSPプライマーで増幅したPAX5αおよびβのプロモーター領域内でのメチル化密度を、MCF-7およびT47D細胞株および三つの原発性乳房腫瘍について測定した。COBRA分析で使用したPCRプライマーも使用して細胞株由来修飾DNAを増幅する一方、メチル化特異的プライマーを使用して原発性腫瘍でのメチル化配列を、基質細胞および起炎症細胞による汚染が存在する中で検出した。PAX5αおよびβ配列に対するMSPプライマーの間にある116および86bpの領域にそれぞれ展開している16個および13個のCpG部位を検討し、細胞株と腫瘍の間でのメチル化密度を比較した。図３Ａ，３Ｂ、４Ａ、および４Ｂを参照すると、シーケンシングの結果によって発現の検討がどの程度証明されたかが判り、T47D細胞株のPAX5αプロモーター内では78％の部位がメチル化され、またMCF-7細胞株のPAX5βプロモーター内では100％の部位がメチル化された。図４Aおよび４BではPAX5αおよびβ遺伝子のメチル化密度がグラフで示されている。乳癌細胞株T47DおよびMCF-7、および三つの原発性乳房腫瘍に由来するゲノムDNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理した。それぞれ16個および13個のCpG部位を含有するPAX5αおよびβPCR生産物を作成した。PCR生産物をクローン化し、5個の個別のクローン／サンプルを配列決定した。まとめのデータをメチル化されたCpG部位の百分率によって示してある。三つの原発性腫瘍では全てCpGメチル化密度は各遺伝子のメチル化細胞株で観察されたパターンに非常に類似しており、これはPAX5αおよびβ遺伝子のメチル化とサイレンシングにとってこれらの領域が重要であることと一致した(図4Aおよび4B参照)。
【００２４】
PAX遺伝子のファミリーは9個のメンバーから構成されており、その各々はペアードボックスと呼ばれる共通のモチーフを共有しており、このモチーフによりDNA結合性が顕現する（Stuart et al., 1995）。PAXタンパク質は細胞の分化、遊走、および増殖に重要な核転写因子として機能する（Schafer, 1998）。これらの遺伝子は強力な転写調節因子であるために、腫瘍形成の場合には破壊の標的になりやすい。この前提に呼応して、小リンパ球のリンパ腫および進行段階の神経膠芽腫の疾患原因にPAX5遺伝子の不適切な発現が関連している（Schafer, 1998）。本発明によれば、PAX5αおよびβ遺伝子は、肺、乳房、および(程度は小さいが)結腸直腸の腫瘍においてプロモーターが異常な過剰メチル化を受けて不活性化する共通の標的である。転写の欠落に関連して両遺伝子が示すメチル化のパターンは均質で濃密である。更に、本発明によれば、肺腫瘍の場合にはPAX5β遺伝子のメチル化はα遺伝子のメチル化に随伴しており、したがってこの癌のタイプでは両方の遺伝子とも不活性化の標的となる選択上の利点がある。
【００２５】
MCAおよびRDAを利用した過去の研究において、眼、鼻、膵臓および脳の成長に関連するPAX6遺伝子が加齢とともに結腸粘膜において起こる異常なメチル化の共通の標的であることが同定されている（Toyota et al., 1999a; Toyota et al., 1999b）。これらの研究で同定したCpG島はPAX6遺伝子の5’領域に存在するエンハンサー内に局在していた。PAX6遺伝子のエクソン5コード領域内にあるCpG島も膀胱腫瘍および結腸腫瘍において過剰メチル化された（Salem et al., 2000）。プロモーター領域およびエクソン５のメチル化は細胞株に共通であったが、原発性腫瘍でのメチル化は主にエクソン５に限定されていたので、遺伝子の転写には影響がなかった。これはPAX5αおよびβ遺伝子を使用する本発明とは著しく対照的な点である。本発明によれば、誘導細胞株および原発性の肺癌および乳癌の双方において濃密なメチル化が二つのプロモーター領域に見られ、これは転写の欠落と直接に関連していた。原発性腫瘍で見られたPAX5およびPAX6をサイレンシングする差は各組織におけるこれらの機能に関連すると思われる。正常な結腸粘膜ではPAX6遺伝子の発現は見られなかったので、メチル化のためにプロモーター領域を選択する利点は否定される。再び、これとは対照的に本発明によれば正常な肺組織ではPAX5の両方の転写物が潤沢に発現しているのが観察される。
【００２６】
PAX5の遺伝子は両方とも正常な肺で発現されるという事実から、それらのタンパク質も肺細胞において遺伝子の活性を調節しているらしいことが示唆される。染色体９の短腕は肺癌の場合にしばしばヘテロ接合性が失われている部位であり、非小細胞肺癌のほぼ50％において9p13から9p21まで欠落が拡がっている（Testa et al., 1994）。PAX5（9p13）およびp16(9p21)遺伝子は共にこの領域に局在しており、今や肺癌ではプロモーターの異常メチル化により頻繁に不活性化されるという共通性を共有している（Esteller et al., 2001； Belinsky et al., 1998）。また転写因子結合性タンパク質をコードする遺伝子がプロモーターの過剰メチル化により不活性化される前例がある。癌での過剰メチル化(HIC-1)はジンクフィンガー転写因子遺伝子であり、これは正常組織では普通に発現されるが、肺、乳房、結腸、および造血での腫瘍の場合にはプロモーターの過剰メチル化により不活性化される（Wale et al., 1995; Issa et al., 1997）。PAX5遺伝子と同様に、HIC1も発育において重要であり、ノックアウトマウスでは産周期に死亡し、また脳、口蓋裂、四肢に係わる大きな発育異常が現れる（Carter et al., 2000）。
【００２７】
遺伝子に特異的なメチル化が変化すれば、それは癌の検出、危険度の査定、および喀痰および血液での疾患のモニタリングのための中間的な生体標識として役立つと思われる（Palmisano et al., 2000; Esteller et al., 1999）。例えば、肺癌について言えば、p16および／またはO6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼプロモーターの異常メチル化が、臨床診断前三年までの扁平上皮癌(SCC)患者の喀痰に由来するDNAにおいて検出された（Palmisano et al., 2000）。
【００２８】
本発明によれば、PAX5αおよびβ遺伝子は新しい評価用中間標識を構成する。これらの遺伝子が不活性化するタイミングは精確に特定されていないが、危険性は高いが癌ではない対象者の気管支上皮および喀痰においてメチル化が低頻度ながら見られるならば、これら遺伝子のメチル化は開始というよりもむしろ目下進行中であると推定されることが判る。これはp16での本出願人の知見とは対照的であって、p16はSCCおよび腺癌(ADC)の最初期段階で不活性化されるので、この事実は現在および過去の喫煙者の気管支上皮および喀痰にはp16が普通に検出(35%)される原因であると推測される。PCT出願PCT/US01/26452、出願日 2001年8月24日、本発明の譲受人が譲受、を参照。血漿または血清を利用して、結腸直腸癌、頭頸癌、および乳癌の患者中に還流する異常メチル化DNAを検出することが知られている（Zou et al., 2002, Silva et al., 2002）。したがって、肺癌、乳癌、および結腸癌の分子標識パネルにPAX5遺伝子を本発明に従って編入すれば、危険度の高い対象者の喀痰および血液を分析してこれらの癌を検出するに当たって、その危険度進行モデルとしての感度と特異性が向上する。
【００２９】
以上から、プロモーターの過剰メチル化によって不活性化されたPAX5αおよびβ遺伝子は、癌の危険度を予測する生体標識としての有用性が証明される。プロモーターの過剰メチル化によって不活性化された遺伝子のパネルは、肺癌危険度の予測および初期検出のための生体標識であると同定されている。コロラド大学を通じて募集された対象者について行った集合型事例制御研究において同定が行われた。慢性の障害的肺疾患(COPD)および合計30年を超える喫煙歴を有する人を標的にして現在および過去の喫煙者の集団を最初に結成した。全ての登録対象者について長期に(最適には１年に1回)家庭での喀痰を集めた。この集団の登録者は現在3000人に達し、約120例の肺癌を観察した。
【００３０】
当初の調査では、33例の肺癌を選択し、臨床的に未だ癌ではない33人（コントロール）と年齢、性別、および最初の喀痰サンプルの日付を１対１に対応させた。対応例を癌と診断した後に、コントロールとして集めた喀痰サンプルを検査した。出願人の研究所で測定した喀痰検体中の遺伝子のうち二つは、PAX5αおよびβのメチル化によって特徴づけられた。品質管理のための複製物および全対象者のコード識別はブラインドにしたので、出願人の研究所は事例の振分け状態についてはブラインドされたままである。集めた喀痰サンプルの1人当たりの数は1〜5検体であった。喀痰におけるPAX5αおよびβのメチル化は、それぞれオッズ比2.0および2.4をもって関連していた。したがって、これらの知見から、PAX5遺伝子は肺癌危険度を予測する標識パネルの重要な成分であることが示唆される。
【００３１】
遺伝子解明プログラムを通して、CpGリッチなプロモーター領域を有する数種の他の候補が癌における遺伝子標的として出現してきた。三つのCpG島が同定され、そのうちの二つは遺伝子を予測させるが、他は特性が未だ明らかでない。各島の特性を以下に示す。
2005515787.tif 000004
【００３２】
最初の二つのCpG島は染色体領域20q13内に集束している。新規なヘリックスループヘリックス遺伝子は、マウス膵臓β細胞株から単離した遺伝子BHLHB4と同族である。このマウス遺伝子については、これによって膵臓および神経の細胞の分化および／または維持に必要な遺伝子の発現を調節することが提案されている。ベータ３遺伝子は単一のエクソン遺伝子であり、これも基本的なヘリックスループヘリックスタンパク質をコードする。本出願人の現在までの研究によれば、査定した乳癌細胞株(n=8〜10)の約80％において三つのCpG島はプロモーターの過剰メチル化により全て不活性化していることが解かる。対照的に、肺癌細胞株(11例中の8例)においてCpG島１は通常に不活性化するが、細胞株において他の二つのCpG島が不活性化する発生率は＜10％である。
【００３３】
本出願人らは、CpG島１の研究を肺の原発性扁平上皮癌に拡大し、評価した腫瘍の60％においてメチル化による不活性化を見出している。したがって、これら三つの遺伝子は乳癌および／または肺癌の進行に関連している可能性があり、初期検出、経過予測、および予防処置効果のモニタリングのための生体標識として評価することができると思われる。更にこれら遺伝子も他の固形腫瘍および液状腫瘍(例えば白血病)の場合に不活性化されることが今後の研究で明らかになれば、他の癌の生体標識として同等に評価されるようになると推測される。以下は、新規なヘリックスループヘリックス結合性タンパク質、新規遺伝子２、およびベータ３遺伝子のためのプライマーの配列およびアニーリング温度である。
2005515787.tif 000005
【００３４】
図５は、腫瘍細胞株、原発性腫瘍および非悪性腫瘍検体における新規なヘリックスループヘリックス結合性タンパク質、新規遺伝子２、およびベータ３遺伝子のメチル化頻度を表にしたものである。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明を以下の非制限的実施例によって更に説明する。
組織サンプルおよび細胞株
肺SCCは、St. Mary’s Hospital, Grand Junction, Coloradoを通してLung Cancer Surveillance Studyに登録済みの患者から入手した。肺ADCは、Johns Hopkins Lung Spore Repository, Baltimore, Marylandから入手した。乳房腫瘍は、ニューメキシコ大学でのEpidemiology and Cancer Control Program内で実施中のNew Mexico Women’s Health Studyに登録されている女性から集めた。結腸直腸癌は、それぞれ、スペインのバルセロナおよびカタロニアのHospital de Sant PauおよびHospital de Bellvitgeで手術中の患者から集めた。喀痰、非悪性腫瘍BEC、および血液リンパ球は、初期介護にMultispecialty Chest Clinic at the New Mexico Veterans Health Care Systemを利用している経験者から入手した。喀痰の細胞分析は、個別の対象者における癌診断ではなく、この集団の正常者から顕著な異常形成者までの範囲について分析した。対象者からは全て施設のガイドラインに従ってインフォームドコンセントを得た。腫瘍由来細胞株はAmerican Type Culture Collectionから入手し、それぞれの条件に従って培養した。
【００３６】
MCA／RDA
MCA／RDA は、Toyotaらの記載通りに実施した（Toyota et al., 1999a）。概要を示すと、細胞株MCF7由来DNAの5μgをテスターとして使用した。また5人の女性の正常な乳房組織(各１μg)から得たDNAの混合物をドライバーとして使用した。MCAアンプリコンは、RMCAアダプターを使用して生産し、競合的ハイブリダイゼーションを２ラウンド実施した。得られたRDA生産物を制限エンドヌクレアーゼXmal（New England Biolabs）で消化し、次にpBluescript KS+の中にクローン化した。
【００３７】
DNA配列決定および分析
RDA生産物を含有するプラスミドDNAは、QIAprep Spin Miniprepを使用し、その製造者（Qiagen）の指示書に従って調製した。配列は、自動化DNAシーケンサー（Applied Biosystems）を使用しVirco (Cambridge, UK)により分析した。配列の相同性は、National Center for Biotechnology InformationのBlastプログラムを使用して決定した。()
【００３８】
MSPおよび亜硫酸水素塩による配列決定
DNAは、標準的なフェノール−クロロフォルム抽出およびエタノール析出により単離した。ゲノムDNAは、非メチル化シトシンのみをウラシルに変換する亜硫酸水素ナトリウムで処理することにより修飾した。PAX5αおよびβ遺伝子のメチル化状態は、既述の集合型二段階法を使用して決定した（Palmisano et al., 2000）。各遺伝子のステージ1増幅で使用したプライマーの配列は以下の通りである。
α正方向  (5’-gggt ttgtatatggagatgttatagg-3’)；
α逆方向  (5’-caacatcacaaaatatccccaaacac-3’)；
β正方向  (5’-agtttgtgggttgtttagttaatgg-3’)；および
β逆方向  (5’-caaaaaatcccaaccaccaaaacc-3’)。
【００３９】
PCR増幅は全て、Biometra T3テルモサイクラーおよびTaq Gold ポリメラーゼ (Perkin-Elmer).を使用して実施した。ステージ１αのサイクルパラメータは次のごとくであった。94℃ 10分間；次に94℃ 1分間、60℃ 1分間、および72℃ 1分間を40サイクル;および最後に72℃で延長5分。ステージ１βは、アニーリング温度を54℃に落とし、サイクル時間は全て30秒間にした以外は同じ条件で実施された。ステージ１αおよびβのPCR生産物のサイズは、それぞれ389および328bpであった。各遺伝子のステージ２増幅において使用したプライマー配列は以下の通りである。
α-BSM1  (5’-ataaaagtttggggcggcgc-3’)；
α-BSM2  (5’-gcgcccccaacgcgccg-3’)；
β-BSM1  (5’-gagttgagtttcgggcggc-3’)；および
β-BSM3  (5’-gccgccgccgccgtcg-3’)。
【００４０】
ステージ２αのサイクルパラメータは次のごとくであった。94℃ 10分間；次に94℃ 15秒間、66℃ 15秒間、および72℃ 15秒間を40サイクル;および最後に72℃で延長5分。ステージ２βの条件は、アニーリング温度を64℃に落とした以外は同じであった。ステージ２αおよびβのPCR生産物のサイズは、それぞれ166および124bpであった。
【００４１】
細胞株MDA-MB-231およびNIH-2009から単離したDNAは、それぞれ両遺伝子に対する陽性および陰性のコントロールとして役立った。測定は全て少なくとも2回実施し、またメチル化陽性はBstUIでの制限消化によって、またはDNAシーケンシングによって確認した。
【００４２】
T47DおよびMCF-7由来の亜硫酸水素塩で修飾したDNAは、PAX5αおよびβ遺伝子に対するステージ１プライマーを使用して増幅した。αまたはβ遺伝子がメチル化されることが判っている三つの乳房腫瘍から、ステージ１プライマーおよびメチル化特異的ステージ２プライマーを使用して、修飾DNAを増幅した。TAクローニング用キット（Invitrogen, San Diego, California）を使用して、PCR生産物をPCRIIベクター中に結合した。各サンプル5個のクローンの配列を決定した。
【００４３】
5-アザ-2’-デオキシシチジン処理およびRT-PCR
三つの乳癌細胞株（MCF7、MDA-MB-231、およびT47D）および一つの肺癌細胞株（Calu6）を使用して再発現の検討を行った。細胞株を培地中で3日間１μM DAC（Sigma Chemical Co.）で処理した。Trizol（Life Technologies, Inc.）を使用して全RNAを調製し、その一部3μgを、Superscript kit（Life Technologies, Inc.）を使用して逆転写した。PAX5αおよびβ転写物の発現は、エクソン1α正方向プライマー(5’- cctgtccattccatcaagtcctg-3’)およびエクソン１β正方向プライマー（5’-cccgatggaaatacactgtaagcac-3’）をエクソン２逆方向プライマー（5’-ttttgctgacacaaccatggctgac-3’）と共に使用する逆転写(RT)-PCRによって決定した。βアクチンもRNA組み込み用コントロールとして増幅した。
【００４４】
PCR増幅は、94℃ 10分間；次に94℃ 30秒間、64℃ 30秒間、および72℃ 30秒間を35サイクル;および最後に72℃で延長5分にて実施した。PCR生産物を臭化エチジウム含有3％アガロースゲル上で分析し、UV照射で可視化した。
【００４５】
各種癌タイプの中でのPAX5αおよびβのメチル化陽性腫瘍の比率をフィッシャーの直接確率検定をもって比較した。また、各癌タイプについてPAX5αおよびβの間の関連もフィッシャーの直接確率検定によって評価した。
【００４６】
上記実施例で使用した反応物および／または条件を包括的または具体的に記述した反応物および／または本発明の操作条件にて置換して上記実施例を繰り返しても同様な成果が得られる。
【００４７】
以上の好ましい実施態様を特別に参照することにより本発明を詳細に説明したが、他の実施態様によっても同じ結果が達成可能である。本発明の改変例および改修例は当業者に自明であろうが、そうした改修例および均等例は全て添付の特許請求の範囲に包含されることを意図している。以上で引用した参照文献、出願文書、特許文書、および刊行物全ての全開示事項は引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
添付図面は、本明細書の一部に編入されて本明細書を形成するものであり、本発明のいくつかの実施態様を図示し、記述と一体となって本発明の原理の説明に資する。これら図面の目的は、本発明の好ましい実施態様の単なる図示であって、本発明を限定するものと解釈されてはならない。
【図１】腫瘍細胞株の原発性腫瘍および非悪性腫瘍検体においてPAX5αおよびPAX5βがメチル化する頻度を示す表である。
【図２】本発明による、代表的なメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応の分析を図示する。
【図３】３Aおよび３Bは、PAX5遺伝子の不活性化を示すメチル化変化をメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応分析により確認したところ、ある細胞株ではPAX5α転写が潤沢または存在したが（図３A）、他の細胞株では転写が存在しなかった(図３B) ことを図示する。
【図４】４Aおよび４Bは、腫瘍細胞株の原発性腫瘍および非悪性腫瘍検体におけるメチル化密度を本発明によってサマライズした棒グラフであり、密度はPAX5α遺伝子およびPAX5β遺伝子の中でそれぞれメチル化されたCpG部位のパーセントで示され、これによってPAX5α遺伝子およびPAX5β遺伝子がメチル化されサイレンシングすることが標示される。
【図５】腫瘍細胞株の原発性腫瘍および非悪性腫瘍検体において新規ヘリックスループヘリックス結合性タンパク質、新規遺伝子２、およびベータ３遺伝子がメチル化する頻度を本発明により示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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