(57)【要約】本発明は、牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体及びコード配列を含む発現カセットをウイルスゲノム中に含む、組換え変異ワクシニアウイルスアンカラであって、そのコード配列の発現が前記プロモーターによって調節されていることを特徴とする、上記ウイルスアンカラに関する。該ウイルスはワクチンとして、または薬学的調合物の一部として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体及びコード配列を含む発現カセットをウイルスゲノム中に含む、組換え変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、そのコード配列の発現が前記プロモーターによって調節されていることを特徴とする、上記組換え変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項２】
ＡＴＩプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を有する、請求項１記載の組換えＭＶＡ。
【請求項３】
ＡＴＩプロモーターの誘導体が、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による配列のサブ配列及び 、
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による配列またはそのサブ配列に対して、１つ以上のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失及び(又は)ヌクレオチド挿入を有する配列から選択され、その際当該サブ配列および配列それぞれがＭＶＡ中でプロモーターとして依然として活性である、請求項１記載の組換えＭＶＡ。
【請求項４】
ＭＶＡが、ヨーロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ−ＢＮ株またはその誘導体、およびＥＣＡＣＣに番号Ｖ００１２０７０７として寄託されているＭＶＡ５７５株から選択される、請求項１〜３のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡ。
【請求項５】
発現カセットが、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のゲノムに対してＭＶＡゲノムの天然に欠失している部位、またはＭＶＡゲノムの遺伝子間領域に挿入されている、請求項１〜４のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡ。
【請求項６】
コード配列が少なくとも１つの抗原、抗原エピトープ及び(又は)治療化合物をコードする、請求項１〜５のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡ。
【請求項７】
ワクチンまたは医薬としての、請求項１〜６のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡ。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡを含むワクチンまたは薬学的調合物。
【請求項９】
ワクチンまたは医薬の製造のために、請求項１〜６のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡを使用する方法。
【請求項１０】
標的細胞中にコード配列を導入する方法であって、標的細胞に請求項１〜６のいずれか1つに記載のウイルスを感染させることを含む、上記導入する方法。
【請求項１１】
ペプチド、タンパク質及び(又は)ウイルスの製造方法であって、
ａ）宿主細胞に請求項１〜６のいずれか1つに記載のウイルスを感染させる工程と、
ｂ）感染した宿主細胞を適当な条件下で培養する工程と、
ｃ）この宿主細胞が産生したペプチド及び(又は)タンパク質及び(又は)ウイルスを単離及び(又は)濃縮する工程と、
を含む、上記製造方法。
【請求項１２】
ヒトを含む動物生体における免疫応答に影響を与える、好ましくは免疫応答を誘発する方法であって、処置すべき動物またはヒトに、請求項１〜６のいずれか1つに記載のウイルス、または請求項８に記載の調合物もしくはワクチンを投与する工程を含む、上記方法。
【請求項１３】
少なくとも１０２  ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のウイルスを投与する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１接種（「初回免疫接種」）および第２接種（「追加免疫接種」）において、治療上有効な量でウイルス、調合物またはワクチンが投与される、請求項１２又は１３記載の方法または請求項９記載の使用する方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか1つに記載のウイルスを含む細胞。
【請求項１６】
ＭＶＡ中のコード配列を発現させるために、請求項２又は３に定義した牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体を使用する方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡの製造方法であって、ＭＶＡのゲノムに発現カセットを挿入する工程を含む、上記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体及びコード配列を含む発現カセットをウイルスゲノム中に含む、組換え変異ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ）であって、そのコード配列の発現が前記プロモーターによって調節されていることを特徴とする、上記組換え変異ワクシニアウイルスアンカラに関する。該ウイルスはワクチンまたは薬学的調合物の一部として有用である。
【背景技術】
【０００２】
組換えポックスウイルスは、感染細胞中で外来抗原を発現させるために、広く使用されている。また、組換えポックスウイルスは、ポックスウイルスベクターから発現される外来抗原に対する免疫応答を誘発するための極めて有望なワクチンとして、現在、試験されている。最も一般的なものに、ポックスウイルスや、ワクシニアウイルスがある。特許文献１および特許文献２には、ＨＩＶ抗原およびＨＩＶタンパク質を発現させる組換えワクシニアウイルスワイエス（Ｗｙｅｔｈ）株が開示されている。特許文献３には、レンチウイルス遺伝子を発現させる組換えワクシニアウイルスＮＹＣＢＨ株が開示されている。特許文献４には、ヒトレトロウイルス遺伝子を発現させる組換えワクシニアウイルスウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）株が開示されている。
【０００３】
ポックスウイルス中の異種遺伝子を発現させるためのプロモーターは、例えば３０Ｋおよび４０Ｋプロモーター（例えば特許文献５参照）、強力な合成初期／後期プロモーター（例えば非特許文献１参照）、Ｐ７．５プロモーター（例えば非特許文献２参照）ならびに牛痘ウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ）遺伝子由来のプロモーター（非特許文献３）など、当業者にはいくつか知られている。これらのプロモーターはいずれも、異種遺伝子を発現させる目的で組換えワクシニアウイルス中に使用されており、当該遺伝子を極めて効率よく発現させて、その異種遺伝子がコードしているタンパク質を比較的大量にもたらすことが示されている。
【０００４】
多くの予防接種方法では、誘発しようとする免疫応答の標的である抗原を、大量に発現させることが、極めて望ましい。しかしこれが当てはまらない場合もある。免疫系は抗原の濃度に依存してタイプの異なる細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することが記載されている。高濃度の抗原では低親和性ＣＴＬが誘導されるのに対して、低濃度の抗原では高親和性ＣＴＬが誘導される。高親和性ＣＴＬは、動物試験系におけるチャレンジウイルスの除去に関して、低親和性ＣＴＬよりもはるかに有効であることが示されている。また、高濃度の抗原は高親和性ＣＴＬを阻害したり、さらには高親和性ＣＴＬを殺すことさえありうることが、実証されている。要約すると、より大量の高親和性ＣＴＬを誘導し、その結果として有効な免疫応答を誘発するには、むしろ少量の抗原を使用することが望ましい場合もあることが、示されている（非特許文献４）。
【特許文献１】米国特許第５，７３６，３６８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０５１，４１０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７４７，３２４号明細書
【特許文献４】欧州特許第０  ２４３  ０２９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，７４７，３２４号明細書
【非特許文献１】Ｓｕｔｔｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９４）１２，１０３２−４０
【非特許文献２】Ｅｎｄｏ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）７２，６９９−７０３
【非特許文献３】Ｌｉ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７９，６１３
【非特許文献４】Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９９）１７０，１５１−１７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒトを含む動物への投与後に、ワクシニアウイルスゲノムに含まれている異種遺伝子を比較的少量だけ発現させること（これは比較的大量の高親和性ＣＴＬを誘導するための必要条件でありうる）ができる、ワクシニアウイルスに基づく系を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的は、牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体及びコード配列を含む発現カセットをウイルスゲノム中に含む、組換え変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、そのコード配列の発現が前記プロモーターによって調節されていることを特徴とする、上記ウイルスアンカラを提供することによって解決された。ＡＴＩプロモーターがＭＶＡ中で比較的低い活性を有することは予想外だった。というのも、このプロモーターは他のポックスウイルス系では極めて活性であることが知られていたからである（例えばＬｉ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７９，６１３）。これに対して、本明細書の実施例では、ＭＶＡに基づく系におけるＡＴＩプロモーターの活性が、他のワクシニアウイルス株、例えばウェスタンリザーブ株、エルストリー（Ｅｌｓｔｒｅｅ）株またはコペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株などに基づく系における活性の２分の１〜４分の１であることを示す。したがって、ＭＶＡ中のＡＴＩプロモーターは、あるタンパク質に対して高親和性ＣＴＬを誘導しようとする場合に、そのタンパク質をコードする遺伝子を発現させるのに好適なプロモーターである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスは、ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属の一員であるワクシニアウイルスと類縁関係にある。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞で５１６代にわたって連続継代することによって作出された（概要については、Ｍａｙｒ，Ａ．等、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４［１９７５］を参照されたい）。この長期間にわたる継代の結果、得られたＭＶＡウイルスではそのゲノム配列のうち約３１キロ塩基が欠失しているので、宿主細胞は鳥類細胞に著しく制限されると記載されている（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８［１９９１］）。得られたＭＶＡは著しく非病原性であることが、さまざまな動物モデルで示されている（Ｍａｙｒ，Ａ．およびＤａｎｎｅｒ，Ｋ．［１９７８］Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−３４）。また、このＭＶＡ株は、ヒト痘瘡疾患に対する免疫を与えるためのワクチンとして、臨床試験でも試験されている（Ｍａｙｒら、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ  １６７，３７５−３９０［１９８７］、Ｓｔｉｃｋｌら、Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２［１９７４］）。
【０００８】
本発明では任意のＭＶＡ株を使用することができる。本発明で使用されるＭＶＡウイルス株の実例であって、ブダペスト条約の要件に従って寄託されているものに、英国ソールズベリーのヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ＥＣＡＣＣ）にそれぞれ受託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７およびＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７として寄託されているＭＶＡ  ５７２株および５７５株、ならびにＥＣＡＣＣ  Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ−ＢＮがある。
【０００９】
最も好ましいＭＶＡ株はＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である。ＭＶＡ−ＢＮの特徴、あるＭＶＡ株がＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体であるかどうかを調べることが可能な生物学的アッセイの説明、およびＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体の取得を可能にする方法は、国際公開第０２／４２４８０号明細書に開示されている。この特許出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００１０】
ＭＶＡを増殖させるには真核細胞をこのウイルスに感染させる。これらの真核細胞は、各ポックスウイルスに感染しやすく、感染性ウイルスの複製および産生を許容する細胞である。ＭＶＡの場合、このタイプの細胞の例は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）とＢＨＫ細胞である（Ｄｒｅｘｌｅｒ  Ｉ．，Ｈｅｌｌｅｒ  Ｋ．，Ｗａｈｒｅｎ  Ｂ．，Ｅｒｆｌｅ  Ｖ．およびＳｕｔｔｅｒ  Ｇ．「著しく弱毒化した変異ワクシニアアンカラはウイルス増殖用宿主候補であるベビーハムスター腎細胞では複製するが、さまざまなヒト形質転換細胞および初代細胞では複製しない（Ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ  ｉｎ  ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ，ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｈｏｓｔ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７９，３４７−３５２）。ＣＥＦ細胞は当業者に知られている条件で培養することができる。好ましくは、ＣＥＦ細胞を、静置フラスコまたはローラーボトル中、無血清培地で培養する。インキュベーションは好ましくは３７℃±２℃で４８〜９６時間行う。感染には、ＭＶＡを好ましくは０．０５〜１  ＴＣＩＤ５０の感染多重度（ＭＯＩ）で使用し、インキュベーションを好ましくは３７℃±２℃で４８〜７２時間行う。
【００１１】
牛痘ウイルスＡ型封入体タンパク質遺伝子のプロモーター（ＡＴＩプロモーター）の配列は当業者に知られている。これについては、Ｇｅｎｅｂａｎｋエントリー、アクセッション番号Ｄ００３１９を参照されたい。好ましいＡＴＩプロモーター配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すが、その配列は次のとおりである：
５’  ＧＴＴＴＴ  ＧＡＡＴＡ  ＡＡＡＴＴ  ＴＴＴＴＴ  ＡＴＡＡＴ  ＡＡＡＴ  ３’。
【００１２】
本発明によれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すＡＴＩプロモーターを使用するか、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による配列のサブ配列であってもよいＡＴＩプロモーターの誘導体を使用することができる。「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１による配列のサブ配列」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１より短いＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の断片であって、プロモーターとして（特にワクシニアウイルス後期プロモーターとして）まだ活性であるものを表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の典型的な断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列のうち、少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも２５ヌクレオチドの長さを有する。サブ配列は、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２５〜２９、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３’末端に位置する５’−ＴＡＡＡＴ−３’という配列を含みうる。また、サブ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２２〜２９、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の３’末端に位置する５’−ＴＡＡＴＡＡＡＴ−３’という配列も含みうる。
【００１３】
本プロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２８〜２９（上記の配列で下線を引いた部分）が５’  ＡＴＧ  ３’翻訳開始コドンの一部になるような形で、コード配列の上流に挿入することができる。もう１つの選択肢として、本プロモーターは、数ヌクレオチドによって、翻訳開始コドンから隔てられていてもよい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のプロモーターの３’末端と５’  ＡＴＧ  ３’開始コドン中のＡの間のスペーサーは、好ましくは１００ヌクレオチド未満、より好ましくは０ヌクレオチド未満、さらに好ましくは２５ヌクレオチド未満である。ただしスペーサーは、本プロモーターが本プロモーターの下流に位置するコード配列の発現を指示する能力を依然として持っている限り、さらに長くてもよい。
【００１４】
ＡＴＩプロモーターの誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列に対して、１つ以上のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失及び(又は)ヌクレオチド挿入を有する配列であることもでき、この場合、その誘導体はプロモーターとして（特にワクシニアウイルス後期プロモーターとして）まだ活性である。１つ以上のヌクレオチド置換を有する配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列のうち１つ以上のヌクレオチドが、異なるヌクレオチドに置換されている配列である。１つ以上のヌクレオチド挿入を有する配列は、１つ以上のヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の１つ以上の位置に挿入されている配列である。１つ以上のヌクレオチド欠失を有する配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列のうち１つ以上のヌクレオチドが１つ以上の位置で欠失している配列である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の誘導体では、欠失、置換および挿入が１つの配列内で組み合わされていてもよい。
【００１５】
本誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列に対して、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。最も好ましい態様では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列中、６個以下のヌクレオチド、さらに好ましくは３個以下のヌクレオチドが、置換、欠失及び(又は)挿入を起こしている。
【００１６】
特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２５〜２９、すなわちプロモーター中の配列５’−ＴＡＡＡＴ−３’は、最大のプロモーター活性が得られるように、残しておくことが好ましいかもしれない。また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２２〜２９、すなわちプロモーター中の配列５’−ＴＡＡＴＡＡＡＴ−３’を残しておくことも好ましいかもしれない。
【００１７】
当業者は、さまざまな先行技術文献を利用して、ワクシニアウイルスプロモーター（特にワクシニアウイルス後期プロモーター）として活性であるという生物学的活性を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のどの誘導体がまだ持っているかを予測することができる。これについては、Ｃｈａｋｒａｒｂａｒｔｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９７）２３，１０９４−１０９７や、ＤａｖｉｓｏｎおよびＭｏｓｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８９）２１０，７７１−７８４を参照されたい。また、ある断片がワクシニアウイルスプロモーター、特に後期プロモーターとして依然として活性であるかどうかも、当業者は容易に確かめることができる。具体的には、配列誘導体をプラスミドコンストラクト中のレポーター遺伝子の上流にクローニングすることができる。そのコンストラクトを、ＭＶＡに感染している真核細胞または細胞株、例えばＣＥＦまたはＢＨＫ細胞にトランスフェクトすることができる。次に、レポーター遺伝子の発現を決定し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のプロモーターによって制御されるレポーター遺伝子の発現と比較する。この実験設定は本明細書に示す実施例に相当する。本発明の誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のプロモーター配列の活性と比較して、この試験系で少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％のプロモーター活性を有する誘導体である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１より高いプロモーター活性を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の誘導体も、本発明の範囲に包含される。
【００１８】
より概括的に述べると、本発明は、ＭＶＡ中のコード配列を発現させるために、上記に定義した牛痘ＡＴＩプロモーターまたはその誘導体の使用に関係する。
【００１９】
ＡＴＩプロモーターは、既にＭＶＡゲノムの一部である遺伝子を発現させるために使用することができる。そのような遺伝子は、もともとウイルスゲノムの一部である遺伝子であってもよいし、ＭＶＡゲノムに既に挿入されている外来遺伝子であってもよい。これらの場合、ＡＴＩプロモーターは、ＡＴＩプロモーターによって発現を制御しようとするＭＶＡゲノム中の遺伝子の上流に挿入されている。
【００２０】
ＡＴＩプロモーターは、まだＭＶＡゲノムの一部ではない遺伝子の発現を調節するためにも使用することができる。この場合は、ＡＴＩプロモーターと、ＡＴＩプロモーターによって発現を調節しようとするコード配列とを含む発現カセットを構築し、その発現カセットをＭＶＡゲノム中に挿入することが好ましい。好ましい挿入部位は、（ｉ）ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のゲノムに対してＭＶＡゲノムの天然に欠失している部位、または（ｉｉ）ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域から選択される。「遺伝子間領域」という用語は、好ましくは、ウイルスゲノムのうち、隣り合う２つの遺伝子間に位置する部分であって、コード配列も調節配列も含んでいない部分を表す。しかし、挿入部位はこれらの好ましい挿入部位に限るわけではない。というのも、本発明においては、少なくとも１つの細胞培養系（例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞））で増幅および増殖することが可能な組換え体を得ることができる限り、発現カセットはウイルスゲノムのどこに挿入してもよいからである。したがって挿入カセットは、例えば非必須遺伝子またはＭＶＡの増殖に使用する細胞系によって補われうる機能を有する遺伝子などに挿入することもできる。
【００２１】
組換えＭＶＡの構築に必要な方法は当業者に知られている。例えば、発現カセット及び(又は)ＡＴＩプロモーターもしくはその誘導体は、相同組換えによってＭＶＡのゲノムに挿入することができる。この目的を達成するには、発現カセット及び(又は)ＡＴＩプロモーターもしくはその誘導体を挿入しようとするＭＶＡゲノムの領域に相同なヌクレオチドストレッチが隣接している発現カセット及び(又は)ＡＴＩプロモーターもしくはその誘導体を含む核酸を、ＣＥＦまたはＢＨＫ細胞などの許容細胞株にトランスフェクトする。その細胞をＭＶＡに感染させると、感染した細胞では、上記の核酸とウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こる。もう１つの選択肢として、まず細胞にＭＶＡを感染させた後、その感染細胞に上記の核酸をトランスフェクトすることもできる。この場合も組換えが細胞内で起こる。次に、当技術分野で知られている方法によって、組換えＭＶＡを選択する。組換えＭＶＡの構築はこの特定方法に限定されるわけではなく、当業者に知られている適当な方法はどれでもこの目的に使用することができる。
【００２２】
ＭＶＡ中のＡＴＩプロモーターは、任意のコード配列の発現を制御するために使用することができる。コード配列は、好ましくは、少なくとも１つの抗原エピトープまたは抗原をコードすることができる。この場合は、組換えＭＶＡを使って、生物（例えばヒトを含む哺乳動物）中の細胞を感染させた後、当該抗原を発現させることができる。この抗原／エピトープの提示により、その生物では、この抗原／エピトープが由来する因子に対する当該生物の予防接種につながりうる免疫応答が誘発されうる。より具体的に述べると、エピトープ／抗原は、より大きいアミノ酸配列、例えばポリエピトープ、ペプチドまたはタンパク質などの一部であることができる。そのようなポリエピトープ、ペプチドまたはタンパク質の例として、（ｉ）ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペスウイルス、デングウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、肝炎ウイルスなどのウイルス、（ｉｉ）細菌、（ｉｉｉ）真菌に由来するポリエピトープ、ペプチドまたはタンパク質を挙げることができる。
【００２３】
もう１つの選択肢として、コード配列は、インターロイキン、インターフェロン、リボザイムまたは酵素などの治療化合物をコードしてもよい。
【００２４】
組換えＭＶＡは、当業者の知識に従って、動物またはヒトの身体に投与することができる。したがって本発明の組換えＭＶＡは医薬（すなわち薬学的調合物）またはワクチンとして役立ちうる。
【００２５】
本薬学的調合物または本ワクチンは、組換えＭＶＡに加えて、一般に、１つ以上の医薬的に許容できるかつ／または承認された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤及び(又は)安定剤を含みうる。そのような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などでありうる。適当な担体は、典型的には、緩徐に代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体などである。
【００２６】
薬学的調合物またはワクチンを製造するには、組換えＭＶＡを生理学的に許容できる形態に変換する。これは、痘瘡の予防接種に用いられるポックスウイルスワクチン（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら［１９７４］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２に記載されているもの）を製造する際の経験に基づいて行うことができる。例えば、精製ウイルスは、５×１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で約１０ｍＭのトリスおよび１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に製剤化して、−８０℃で保存される。ワクチン注射剤を製造するには、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に入っている本発明の組換えウイルス粒子１０１〜１０９個を、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下に、アンプル（好ましくはガラスアンプル）中で凍結乾燥する。もう１つの選択肢として、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスの段階的凍結乾燥によって製造することもできる。この製剤は、さらに、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、乳糖もしくはポリビニルピロリドンなどの添加剤、または、生体内投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの他の添加剤も含むことができる。凍結乾燥に適した典型的なウイルス含有製剤は、１０ｍＭトリス緩衝液、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１８．９ｇ／ｌデキストラン（ＭＷ３６０００〜４００００）、４５ｇ／ｌショ糖、０．１０８ｇ／ｌ  Ｌ−グルタミン酸一カリウム塩一水和物を含む（ｐＨ７．４）。次に、ガラスアンプルを密封して、４℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。しかし、必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で保存することが好ましい。
【００２７】
予防接種または治療を行うには、上記の凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは水、生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、筋肉内投与、または当業者に知られている他の任意の投与経路によって、投与することができる。当業者であれば、投与様式、投与量および投与回数を、既知の方法で最適化することができる。
【００２８】
したがって、関連する一態様として、本発明は、ヒトを含む動物生体における免疫応答に影響を与える、好ましくは免疫応答を誘発する方法であって、処置すべき動物またはヒトに、本発明のウイルス、調合物またはワクチンを投与することを含む方法に関する。ワクチン注射剤は、典型的には、少なくとも１０２、好ましくは少なくとも１０４、より好ましくは少なくとも１０６、さらに好ましくは１０８  ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のウイルスを含む。
【００２９】
ウイルスをプライム−ブースト投与に使用できることが、本発明の組換えＭＶＡ、特に組換えＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体に特有の利点である。したがって、本発明はさらに、第１接種（「初回免疫接種」）および第２接種（「追加免疫接種」）において、治療有効量の本ウイルス、本調合物または本ワクチンを、それを必要とするヒトを含む動物に投与する方法に関する。
【００３０】
さらに本発明は、標的細胞中にコード配列を導入する方法であって、標的細胞に本発明のウイルスを感染させることを含む方法に関する。標的細胞は、本ウイルスの複製が起こりうるＣＥＦまたはＢＨＫ細胞などの細胞であってもよいし、ＭＶＡに感染させることはできるが、本ウイルスの複製は起こらない細胞、例えばあらゆるタイプのヒト細胞などであってもよい。
【００３１】
さらに本発明は、ペプチド、タンパク質及び(又は)ウイルスを製造する方法であって、宿主細胞に本発明の組換えウイルスを感染させた後、感染した宿主細胞を適当な条件下で培養し、さらに続いて、その宿主細胞が産生したペプチド及び(又は)タンパク質及び(又は)ウイルスを単離及び(又は)濃縮することを含む方法に関する。本発明のウイルスを製造（すなわち増幅）したい場合、細胞は、本ウイルスの複製が起こりうるＣＥＦまたはＢＨＫ細胞などの細胞である必要がある。本ウイルスがコードしているペプチド／タンパク質（好ましくはＡＴＩプロモーターまたはその誘導体が発現を制御しているコード配列によってコードされているタンパク質／ペプチド）を製造したい場合は、細胞は、本組換えウイルスに感染させることができ、ＭＶＡがコードするタンパク質／ペプチドの発現を許容する細胞であれば、どの細胞でもよい。
【００３２】
さらに本発明は、本発明のウイルスに感染した細胞に関する。
【００３３】
図面の簡単な説明
図１：図１は、ＣＥＦ細胞の感染後に組換えＭＶＡ中のＡＴＩプロモーターから発現したＲＮＡの存在を検出するためのＰＣＲ反応の結果（実施例２を参照）を示す。
図２：図２は、さまざまな組換えＭＶＡに感染させた細胞から単離されるタンパク質によるウェスタンブロットの結果を示す。図２Ａは、非還元条件、非加熱タンパク質を示す。図２Ｂは、還元条件、非加熱タンパク質を示す。図２Ｃは、非還元条件、加熱タンパク質を示す。レーン１、３、４は、それぞれＭＶＡ−ＡＴＩ−ＮＳ１、ＭＶＡ−ＧＦＰに感染させた細胞および非感染細胞の細胞溶解物である。レーン５、７、８は、それぞれＭＶＡ−ＡＴＩ−ＮＳ１、ＭＶＡ−ＧＦＰに感染させた細胞の上清および細胞対照の上清である。レーン２および６は空のままにしておいた。
【００３４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら当業者は、これらの実施例が、決して本発明によって提供される技術の適用範囲を限定するものではないことを十分に理解している。
【実施例１】
【００３５】
（さまざまなワクシニアウイルス株における牛痘ＡＴＩプロモーターの活性）
この実施例の目的は、さまざまなワクシニアウイルス株における牛痘ＡＴＩプロモーターの強さを分析することであった。
（序論）
発現分析を行うために、牛痘ＡＴＩプロモーターをＧＵＳ（大腸菌β−グルクロニダーゼ）レポーター遺伝子に融合した。ＢＨＫ（ベビーハムスター腎）細胞をさまざまなワクシニアウイルス株に感染させ、ＧＵＳ遺伝子に融合したＡＴＩプロモーターを含むプラスミドでトランスフェクトした。分析したワクシニアウイルス株には、ＣＶＡ、コペンハーゲン、エルストリー、ＩＨＤ、ウェスタンリザーブおよびＭＶＡ−ＢＮが含まれた。プロモーターが機能すれば、ＧＵＳが発現され、それを酵素反応によって定量することができる。
（材料および装置）
-ＢＨＫ細胞（ＥＣＡＣＣ番号８４１００５０１）
-ワクシニアウイルスはすべて、１ｍｌあたり７．５×１０７  ＴＣＩＤ５０の力価で使用した。
【００３６】
-プラスミドｐＢＮＸ７３（ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ＋ＡＴＩプロモーター＋ＧＵＳ）
-エフェクテン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）トランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）
-ＤＭＥＭ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）
-ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）
-溶解緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％トリトン＋１ｍＭプロテアーゼ阻害剤）
-ＧＵＳ基質  １ｍＭ（ｐ−ニトロフェニル−β−（Ｄ）−グルクロニド；Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｎ１６２７）
-停止溶液  ２．５Ｍ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール；Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ａ９７５４）
（方法）
（細胞の播種）
６穴プレートのウェルで行われるトランスフェクション反応１つにつき５×１０５個のＢＨＫ細胞を播種し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中、３７℃および５％ＣＯ２で一晩維持した。
（感染／トランスフェクション）
１ウェルにつき０．５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で、細胞をさまざまなワクシニアウイルス株（ＭＯＩ  ０．１）に感染させ、振盪機上、室温で、１時間インキュベートした。トランスフェクションは製造者の実験計画案に記載されているとおりに行った。２μｇのプラスミドをＥＢ緩衝液に希釈した（総体積１００μｌ）。３．２μｌのエンハンサー溶液を添加した後、溶液を混合し、室温で５分間インキュベートした。次に、１０μｌのエフェクテン試薬を加え、懸濁液を混合し、室温で１０分間インキュベートした。ウイルス懸濁液を細胞から除去し、１．６ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを加えた。０．６ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳをＤＮＡエフェクテン混合物に加え、培養プレートを回転させながら細胞に滴下した。次に、細胞を４８時間インキュベートした。
（細胞の採取）
培地を細胞から除去し、０．５ｍｌの溶解緩衝液を加えた。室温で１５分間振とうした後、細胞を溶解緩衝液中でこすりとり、１．５ｍｌの反応チューブに移し、激しくボルテックスした。溶解した細胞を５００ｒｃｆ、４℃で１分間遠心分離し、清澄な上清を新しいバイアルに移し、使用時まで−２０℃で保存した。
（ＧＵＳ活性の測定）
１０μｌの細胞抽出物（＝２×１０４細胞から得られたタンパク質）を、前もって温めておいた１ｍｌの基質溶液（３７℃）に加え、黄色く発色するまで３７℃でインキュベートした。次に、試料を直ちに氷上に置き、０．４ｍｌの停止溶液を加えた。４１５ｎｍでの吸光度を測定し、これをＧＵＳ活性と同一視した。なぜなら０．０５〜２．０の吸光度値は直線範囲にあるからである。基質溶液を参照試料として使用し、非感染細胞の細胞抽出物を陰性対照として使用した。
（結果）
さまざまなワクシニアウイルス株に感染させたＢＨＫ細胞中でＡＴＩプロモーター−ＧＵＳ遺伝子コンストラクトから発現したＧＵＳ活性を定量することにより、以下の結果を得た。
【００３７】
【表１】
2005525821.tif 000002
【実施例２】
【００３８】
（ＭＶＡゲノムに挿入され牛痘ＡＴＩプロモーターによって制御される外来遺伝子の発現）
この実施例の目的は、ＭＶＡのゲノムに挿入した場合に、ＡＴＩプロモーターが遺伝子を調節し、発現させる能力を有することを実証することであった。
（序論）
牛痘ＡＴＩプロモーターをデングウイルスの非構造（ＮＳ）１遺伝子に融合した。この発現カセットを、ＭＶＡゲノムに相同な配列を含む組換えベクターに挿入した。得られた組換えプラスミドでは、発現カセットを挿入しようとするＭＶＡゲノム中の配列に相同な配列が、発現カセットに隣接している。ＣＥＦ細胞をＭＶＡ−ＢＮに感染させ、ＡＴＩプロモーターＮＳ１発現カセットを含む組換えベクターでトランスフェクトした。この細胞では、ＭＶＡゲノムと組換えプラスミドとの間で相同組換えが起こって、組換えＭＶＡゲノムが生じた。精製を数回行った後、組換えＭＶＡ中のＮＳ１タンパク質がＡＴＩプロモーターから発現するかどうかを分析した。並行実験では、ＨＩＶポリトープをコードする配列をＡＴＩプロモーターの制御下に含んでいる発現カセットをＭＶＡゲノムに挿入し、ＡＴＩプロモーターがＭＶＡ中で活性であってＨＩＶポリトープを発現させるかどうかを、ここでも調べた。
（材料および装置）
-初代ＣＥＦ細胞
-ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ：ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズの寄託物８５０１１４３３）
-１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を有するＭＶＡ−ＢＮ
-プラスミドｐＢＮ７４およびｐＢＮ８４：ｐＢＮ７４は、ＨＩＶポリトープをコードする配列をＡＴＩプロモーターの制御下に含み、ｐＢＮ８４は、ＡＴＩプロモーターの制御を受けるデングウイルスＮＳ１タンパク質のコード配列を含んでいる。それぞれデングウイルスコード配列およびＨＩＶポリトープコード配列を含んでいる発現カセットの他に、どちらのプラスミドも、Ｇ４１８耐性遺伝子と、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、マーカー遺伝子として含んでいる。マーカー遺伝子ならびにデングウイルスＮＳ１およびＨＩＶポリトープの各発現カセットには、それらの異種遺伝子を挿入しようとしているＭＶＡゲノムの領域に相同なＭＶＡ配列が隣接している。
【００３９】
-エフェクテントランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）
-ＶＰ−ＳＦＭ細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）
-ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）
-ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）
-ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）
-Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）
-ＲＮアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
-以下のオリゴヌクレオチドをＭＷＧ（ドイツ）から購入した：逆転写酵素反応用のプライマーｏＢＮ４６５  ｇｇｔｃｔｇａｔｔｔｃｃａｔｃｃｃｇｔａｃ（２１ヌクレオチド）；ＰＣＲ用のプライマーｏＢＮ４６３  ｇａａｃｔｇａａｇｔｇｔｇｇｃａｇｔ（１８ヌクレオチド）；ＰＣＲ用のプライマーｏＢＮ４６４  ｃｇｇｔｇｇｔａａｔｇｔｇｃａａｇａｔｃ（２０ヌクレオチド）。
（方法）
（相同組換えによるＭＶＡゲノムへの組込み）
上述のプラスミドｐＢＮ７４またはｐＢＮ８４を使って、それぞれＨＩＶポリトープコード配列およびデングＮＳ１発現カセットを、ｐＢＮ７４またはｐＢＮ８４中の発現カセットに隣接するＭＶＡ配列と、ＭＶＡゲノム内の相同標的配列との相同組換えにより、ＭＶＡゲノムに組み込んだ。これは、線状化したプラスミドｐＢＮ７４またはｐＢＮ８４を、前もってＭＶＡに低い感染多重度で感染させておいたニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞にトランスフェクトすることによって達成した。より具体的に述べると、ＣＥＦ細胞を６穴プレートに播種し、ＶＰ−ＳＦＭ中、３７℃および５％ＣＯ２で一晩維持した。その細胞を、１ウェルあたり０．５ｍｌのＶＰ−ＳＦＭ中のＭＶＡ−ＢＮ（ＭＯＩ  １．０）に感染させ、振盪機上、室温で１時間インキュベートした。細胞へのｐＢＮ７４またはｐＢＮ８４のトランスフェクションは、製造者の実験計画案に記載されているとおりに行った。感染の４８時間後または感染がコンフルエントになってから、ウイルス抽出物を調製し、所望の組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）を選択およびクローン精製する準備が整った状態で−２０℃に保存する。
（組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）の選択およびクローン精製）
非組換えＭＶＡ（空ベクターウイルス）の除去およびｒＭＶＡの増幅は、コンフルエントなニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞を、Ｇ４１８の存在下に、低いＭＯＩで感染させることによって達成される（Ｇ４１８の量はＣＥＦ細胞を殺さない最高量を決定するために最適化する必要がある）。ＮＰＴＩＩ遺伝子が組み込まれていないウイルスはいずれも、細胞維持培地に添加されたＧ４１８が存在する状態では複製しないだろう。Ｇ４１８はＤＮＡ複製を阻害するが、ＣＥＦ細胞は定常非複製状態にあるだろうから、Ｇ４１８の作用による影響は受けないだろう。ｒＭＶＡに感染したＣＥＦ細胞は、強化緑色蛍光タンパク質の発現により、蛍光顕微鏡下で可視化することができる。
【００４０】
相同組換え工程で得たウイルス抽出物を段階希釈し、それを使って新鮮ＣＥＦ細胞をＧ４１８の存在下で感染させる。感染した細胞に低融点アガロースを重層する。感染の２日後に、プレートを緑色感染細胞の単一フォーカスについて蛍光顕微鏡下で観察する。これらの細胞に印を付け、細胞の感染フォーカスを含むアガロースプラグを採取し、滅菌細胞維持培地が入っている１．５ｍｌの微量遠心管に入れる。その遠心管を−２０℃で３回凍結融解することにより、アガロースプラグからウイルスを遊離させる。
【００４１】
本発明に記載のデングウイルスＮＳ１発現カセットを挿入した組換えＭＶＡをＭＶＡ−ＡＴＩ−ＮＳ１と名付けた。
（組換えＭＶＡ中のＡＴＩプロモーターから発現されるＲＮＡの検出）
組換えＭＶＡに感染させた細胞中でＡＴＩプロモーターから発現されるＲＮＡを検出するために、製造者の実験計画案（「動物細胞から全ＲＮＡを単離するためのＲＮｅａｓｙミニプロトコール（ＲＮｅａｓｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｆｒｏｍ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）」）に記載されているとおりに、ＲＮＡ抽出を行った。ＤＮアーゼ消化反応は、水で調節した３０μｌの体積中で、ＲＮＡ  ５μｇに３μｌのＲＮアーゼフリーＤＮアーゼ（＝３０Ｕ；Ｒｏｃｈｅ）、３μｌの１０×緩衝液Ａ（通常は制限酵素消化用；Ｒｏｃｈｅ）を加えることによって行った。その混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。製造者の実験計画案に従ってＲＮｅａｓｙカラムを使用することにより、ＲＮＡを精製した。逆転写を行うために、２μｇのＲＮＡを１μｇの逆転写用プライマーｏＢＮ４６５と混合し、水を加えることによって総体積を１０μｌに調節した。７０℃で５分間インキュベートした後、チューブを氷上に移した。次に、５μｌの５×緩衝液、５μｌのｄＮＴＰミックス（１０μＭ）、０．５μｌのＲＮａｓｉｎ、２μｌのＭ−ＭＬＶ  ＲＴ（２００Ｕ）および２．５のＨ２Ｏを加え、その混合物を４２℃で６０分間インキュベートした。
【００４２】
ＰＣＲ増幅を行うために、５μｌのＲＴ反応液を３６μｌのＨ２Ｏ、５μｌの１０×緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ類、２μｌの各プライマーｏＢＮ４６３およびｏＢＮ４６４（１０μＭ）ならびに１μｌのＴａｑポリメラーゼと混合した。ＤＮＡを２５サイクル（伸長１分間、アニーリング温度５５℃）で増幅し、ゲル電気泳動によって分析した。
（ＭＶＡ−ＡＴＩ−ＮＳ１に感染させた細胞中で発現したデングウイルスＮＳ１タンパク質の検出）
約８０％コンフルエントなＢＨＫ細胞の単層を含んでいる２５ｃｍ２フラスコに、１％ＦＣＳを含むＭＥＭαで１×１０７に希釈したＭＶＡ−ＡＴＩ−ＮＳ１ウイルスストック１００μｌを接種し、室温で３０分間振とうした。３％ＦＣＳを含むＭＥＭα  ５ｍｌを各フラスコに加え、ＣＯ２培養器中、３０℃でインキュベートした。４８時間後にフラスコを回収した。上清をフラスコから取り出し、２６０ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。上清を小分けして−８０℃で保存した。ペレットを５ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した後、１％ＴＸ１００を含む低張ホモジナイズ緩衝液（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｄｏｕｎｃｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）１ｍｌに再懸濁した。細胞溶解物を採取し、１６，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を微量遠心管に入れて−８０℃で保存した。
【００４３】
対照ウイルスを接種したフラスコおよび非感染フラスコも、上記と同じ方法で処理した。
【００４４】
細胞／ウイルス溶解物および上清を、非還元試料緩衝液または還元試料緩衝液中、非加熱条件下または加熱条件下で処理した。タンパク質を１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。そのブロットを、希釈率１：５００の回復期患者から得たプール血清（ＰＰＣＳ）、すなわちデングウイルス感染を患った患者から得た血清で、一晩プローブした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロットを抗ヒトＩｇＧ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＤＡＫＯ）と共に室温で２時間インキュベートした。ブロットを上述のように洗浄した後、４−クロロ−１−ナフトールを使って発色させた。結果を図２に示す。
（結果）
ＮＳ１遺伝子およびＨＩＶポリトープは、牛痘ＡＴＩプロモーターで調節した場合、発現することが明らかになった（図１）。対応するｍＲＮＡを明瞭に検出できた。より具体的には、予想される９２６ｂｐのシグナルが、ＲＮＡ試料のＲＴ−ＰＣＲ後に明瞭に検出できた（図１のレーン２）。試料をＰＣＲだけに使用すると、シグナルは検出できなかった（図１のレーン３）。したがって、ＤＮＡ汚染によって起こる偽陽性シグナルの可能性は排除することができる。図１のレーン４は、プラスミド陽性対照を使ったＰＣＲの結果を示している。予想どおり、ＰＣＲ産物のサイズは、ＲＮＡ試料のＲＴ−ＰＣＲ後のＰＣＲ産物のサイズと一致した。図１のレーン５は、陰性対照（水）を使ったＲＴ−ＰＣＲの結果を示している。図１のレーン１とレーン６は分子量マーカーである（１００ｂｐラダー）。
【００４５】
ウェスタンブロットの結果から、ＮＳ１は、ＭＶＡ−ＡＴＩ−ＮＳ１に感染させた細胞中で発現することが明らかになった。図２Ａおよび図２Ｂのレーン１に示すように、非加熱条件下ではＮＳ１は正しいコンフォメーションで、二量体として発現した。試料を加熱すると、図２Ｃに示すように、ＮＳ１単量体を認めることができる。
【００４６】
また、この実験の結果から、ＭＶＡ−ＡＴＩ−ＮＳ１に感染させた細胞中で発現したＮＳ１は抗原性を持ち、回復期患者のプール血清によって認識されることも明らかになった。
【００４７】
結論として、これらの実験は、ＮＳ１がＭＶＡ−ＡＴＩ−ＮＳ１に感染させたＢＨＫ細胞中で正しいコンフォメーションで発現することを示している。二量体と単量体はどちらも抗原性であり、回復期患者のプール血清によって認識される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ＣＥＦ細胞の感染後に組換えＭＶＡ中のＡＴＩプロモーターから発現したＲＮＡの存在を検出するためのＰＣＲ反応の結果（実施例２を参照）を示す。
【図２】さまざまな組換えＭＶＡに感染させた細胞から単離されるタンパク質によるウェスタンブロットの結果を示す。
【配列表】
2005525821.tif 000003
【図１】
2005525821.tif 000004
【図２】
2005525821.tif 000005
【国際調査報告】
2005525821.tif 000006
2005525821.tif 000007
2005525821.tif 000008