(57)【要約】従来法と比較して簡便かつ迅速な形質転換方法を確立することが、本発明の課題である。上記課題は、ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；およびｂ）該細胞と該核酸とを、エレクトロポーレーションが起き得る条件下に配置する工程を包含する方法によって解決され得る。本発明によれば、遺伝子導入操作後に通常必要な培養過程が必要とされない。従って、本発明は、従来法では形質転換体を得ることが不可能であるか、または極めて困難であった種の形質転換体を得ることを可能にする。簡便な本発明の方法はこの分野の開発研究において重要な大量処理・大量解析を容易にせしめ、ひいては飛躍的な研究の進歩を誘発し、画期的な組換え体の開発につながる。
2005534299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を細胞内に導入する方法であって、以下の工程：
ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；および
ｂ）該細胞と該核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程
を包含する方法。
【請求項２】
前記細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程が、前記細胞を減圧処理する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程が、前記細胞を加圧処理する工程である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程が、該細胞と前記核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程の前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記減圧処理する工程が、大気圧よりも０．０９６ＭＰａ低い減圧下で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記ｂ）工程が、少なくとも二種類の方向で、前記細胞と前記核酸とに電圧パルスをかけることを含む、方法。
【請求項７】
前記細胞が植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記植物細胞が、植物の休眠組織の細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記植物の休眠組織が種子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物が、単子葉植物である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記単子葉植物がイネ科植物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記イネ科植物がコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イネ科植物がイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記イネ科植物がトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物が、双子葉植物である請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記双子葉植物がアブラナ科植物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アブラナ科植物がハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．）である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記アブラナ科植物がナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｌ．）である、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記双子葉植物がマメ科植物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記マメ科植物がダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｍｅｒｒ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記双子葉植物がナス科植物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ナス科植物がトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｍｉｌｌ）である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記双子葉植物がウリ科植物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウリ科植物がマクワウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ  Ｌ．）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記双子葉植物がヒルガオ科植物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヒルガオ科植物がアサガオ（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ  ｎｉｌ  Ｃｈｏｉｓｙ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
核酸を細胞内に導入した植物を作製する方法であって、以下の工程：
ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；および
ｂ）該細胞と該核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程
を包含する方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記細胞を、分化、成長および／または増殖させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２７または２８に記載の方法であって、前記ａ）工程が、前記細胞を含む種子を大気圧と異なる圧力下に維持する工程を含み、かつ、前記ｂ）工程が、該細胞を含む該種子と該核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程を含む、方法。
【請求項３０】
前記種子が、単子葉植物の種子である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記単子葉植物の種子がイネ科の種子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記イネ科種子がコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）種子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記イネ科種子がイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）種子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記イネ科種子がトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）種子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記種子が、双子葉植物の種子である請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記双子葉植物の種子がアブラナ科種子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アブラナ科種子がハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．）種子である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記アブラナ科種子がナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｌ．）種子である、請求項３６の方法。
【請求項３９】
前記双子葉植物の種子がマメ科種子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記マメ科種子がダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｍｅｒｒ）種子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記双子葉植物の種子がナス科種子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記ナス科種子がトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｍｉｌｌ）種子である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記双子葉植物の種子がウリ科種子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記ウリ科種子がマクワウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ  Ｌ．）種子である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記双子葉植物の種子がヒルガオ科種子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記ヒルガオ科種子がアサガオ（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ  ｎｉｌ  Ｃｈｏｉｓｙ）種子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項２７〜４６のいずれか１項に記載の方法によって作製された、植物。
【請求項４８】
培養変異を含まない、請求項４７に記載の植物。
【請求項４９】
核酸を細胞内に導入するための装置であって、以下：
ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する手段；および
ｂ）エレクトロポーレーション手段、
を備えた、装置。
【請求項５０】
細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する前記手段は、大気圧より低い圧力に維持する能力を含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項５１】
前記細胞が植物細胞である、請求項４９に記載の装置。
【請求項５２】
請求項４９に記載の装置であって、前記ｂ）のエレクトロポーレーション手段は、アノードとして作用する第一電極およびカソードとして作用する第二電極を備え、ここで該第一電極と該第二電極との間の距離が、植物種子を収容し得る距離である、装置。
【請求項５３】
前記第一電極と前記第二電極との間の距離が、少なくとも約５ｍｍである、請求項５２に記載の装置。
【請求項５４】
前記第一電極と前記第二電極との間の距離が、約１ｃｍよりも長い、請求項５２に記載の装置。
【請求項５５】
前記第一電極および前記第二電極が白金電極である、請求項５２に記載の装置。
【請求項５６】
請求項４９に記載の装置であって、前記ｂ）のエレクトロポーレーション手段は、アノードとして作用する第一電極およびカソードとして作用する第二電極を備え、ここで該第一電極と該第二電極との間の距離は、該第一電極と該第二電極との間の距離が植物種子を収容し得る距離となるように変動可能である、装置。
【請求項５７】
前記第一電極および前記第二電極が白金電極である、請求項５６に記載の装置。
【請求項５８】
細胞を大気圧と異なる圧力下に維持することと組み合わせて、核酸を該細胞内に導入するためのエレクトロポーレーション装置であって、該装置は、アノードとして作用する第一電極およびカソードとして作用する第二電極を備え、ここで該第一電極と該第二電極との間の距離が、植物種子を収容し得る距離である、装置。
【請求項５９】
前記第一電極と前記第二電極との間の距離が、少なくとも約５ｍｍである、請求項５８に記載の装置。
【請求項６０】
前記第一電極と前記第二電極との間の距離が、約１ｃｍよりも長い、請求項５８に記載の装置。
【請求項６１】
前記第一電極および前記第二電極が白金電極である、請求項５８に記載の装置。
【請求項６２】
細胞を大気圧と異なる圧力下に維持することと組み合わせて、核酸を該細胞内に導入するためのエレクトロポーレーション装置であって、該装置は、アノードとして作用する第一電極およびカソードとして作用する第二電極を備え、ここで該第一電極と該第二電極との間の距離は、該第一電極と該第二電極との間の距離が植物種子を収容し得る距離となるように変動可能である、装置。
【請求項６３】
前記第一電極および前記第二電極が白金電極である、請求項６２に記載の装置。
【請求項６４】
大気圧と異なる圧力に耐える能力を有し、かつ植物種子を収容し得る大きさを有する、エレクトロポーレーションチャンバー。
【請求項６５】
前記エレクトロポーレーションチャンバーの内面の少なくとも３点に接する最大の内接円の直径が、少なくとも約５ｍｍである、請求項６４に記載のエレクトロポーレーションチャンバー。
【請求項６６】
前記エレクトロポーレーションチャンバーの内面の少なくとも３点に接する最大の内接円の直径が、約１ｃｍよりも大きい、請求項６４に記載のエレクトロポーレーションチャンバー。
【請求項６７】
前記チャンバーが四角形の横断面を有し、該チャンバーの内寸が、約１ｃｍ×２ｃｍ×２ｃｍである、請求項６４に記載のエレクトロポーレーションチャンバー。
【請求項６８】
前記チャンバーが円形の横断面を有し、該チャンバーの内寸が約１ｃｍ×４ｃｍである、請求項６４に記載のエレクトロポーレーションチャンバー。
【請求項６９】
大気圧と異なる圧力に耐える能力を有し、かつ植物種子を収容し得る大きさに変動可能である、エレクトロポーレーションチャンバー。
【請求項７０】
自動化してエレクトロポーレーションを実行する装置であって、該装置は、以下：
ａ）核酸と細胞とを含む混合液を入れる容器；
ｂ）該ａ）の容器中に核酸を入れる手段；
ｃ）該ａ）の容器中に細胞を入れる手段；
ｄ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する容器であって、大気圧と異なる圧力に耐える能力を有する、容器；
ｅ）該細胞を、該ｄ）の容器中に配置する手段；
ｆ）該ｄ）の容器中を、大気圧と異なる圧力に維持する手段；
ｇ）該核酸と該細胞とを含む混合液に電圧パルスをかける容器；
ｈ）該核酸と該細胞とを含む混合液を、該ｇ）の容器中に配置する手段；
ｉ）該ｇ）の容器中において、該核酸と該細胞とを含む混合液に対して電圧パルスをかける手段；および
ｊ）該ｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）およびｉ）の手段を自動化して実行する手段
を備え、ここで該ｂ）の手段および該ｃ）の手段は、互いに同一であるかまたは異なり、そして該ｅ）の手段および該ｈ）の手段は、互いに同一であるかまたは異なり、そして該ａ）の容器、該ｄ）の容器および該ｇ）の容器は、互いに同一であるかまたは異なる、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、減圧処理または加圧処理と、エレクトロポーレーションを用いて、所望の核酸を細胞または組織（植物組織を含む）へ導入し、核酸導入体（形質転換体を含む）を作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズなどの主要穀物は人類の生存にとって必須のものであるが、世界的な人口増加に見合った食料生産の増加をするためには、従来の作物より収量の多い作物を開発していく必要がある。収率を上げる品種改良の一つとして、組換えＤＮＡ技術を用いた形質転換作物の開発が行われている。
【０００３】
また、例えば、ハクサイ、トマト、キュウリなどの野菜類は食生活を豊かにし、栄養面でも必須の作物である。しかしながら、これらの野菜は様々な病虫害に弱く、遺伝子組換え技術の利用により耐病虫害性を付与することができるならば、収穫量を安定させることが可能となる。そのため、有用な遺伝子の単離と共にこれらの遺伝子を用いる形質転換方法が開発されてきた。
【０００４】
形質転換を行うためには、植物の場合、一般に、以下の２つの方法がある：植物に対して直接的に遺伝子導入を行う方法（直接的遺伝子導入法）；および植物に対して間接的に遺伝子導入を行う方法（間接的遺伝子導入法）が行われる。
【０００５】
現在までに、間接的な遺伝子導入法として、アグロバクテリウムを利用した方法が広く利用されている。例えばイネの完熟種子を培養して３週間後に得られたカルスに対してアグロバクテリウムを感染させる方法（Ｈｉｅｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６：２７１−２８２，１９９４を参照）あるいは、発芽後４−５日の種子に対してアグロバクテリウムを感染させて形質転換体を迅速に得ることができる方法（田中ら、特許第３１４１０８４号を参照）を挙げることができる。
【０００６】
直接的遺伝子導入方法の例として、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  Ｐ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７−９６２，１９９１を参照）、ポリエチレングリコール法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７３６−７４０，１９９０を参照）、およびエレクトロポーレーション法（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２７４−２７６，１９８９を参照）などが挙げられ、形質転換体の作出に利用されている。エレクトロポーレーション法は、所望のＤＮＡを含む溶液に細胞（例えば、植物細胞）を入れ、電気的刺激により遺伝子を細胞内に取り込むことによって、遺伝子導入を行うものである。
【０００７】
この直接的遺伝子導入方法は、間接的遺伝子導入方法と比較して、組織培養およびアグロバクテリウムの調製が不要であるなどの利点を有する。しかし、直接的遺伝子導入方法であるパーティクルガン法の場合には、形質転換組織から形質転換体（例えば、形質転換植物体）を再生する効率が依然として低いという欠点がある（Ｈａｇｉｏ，ＪＡＲＱ，３２（４）：２３９−２４７，１９９８）。エレクトロポーレーション法の場合には、適用可能な細胞および組織が限定されるという欠点がある。そのため、直接的遺伝子導入方法は、制限された適用を有していた。
【０００８】
従来のエレクトロポーレーション法は、細胞壁が遺伝的に存在しない細胞および細胞壁を人工的に取り去った細胞（例えば、プロトプラスト）に対してのみ可能であった。これに対して、細胞壁を有する細胞（例えば、植物（例えば、種子などの休眠組織が挙げられる））に対しては、エレクトロポーレーションを行うことが、不可能であると考えられている。実際に、種子にエレクトロポーレーションによって核酸導入する方法は報告されていない。従って、従来のエレクトロポーレーション法を用いて核酸導入体（特に、形質転換植物体）を得るためには、プロトプラストなどの組織に対して核酸導入をした後に、プロトプラスト培養、組織培養（例えば、再分化）または他の操作が必須である。そのため、エレクトロポレーションは、必ずしも簡便な方法ではなく、費用、時間および労力を必要とした。
【０００９】
一方、コムギへ遺伝子導入する場合には、未熟胚が用いられていた（Ｊ．Ｔ．Ｗｅｅｋｓら，Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０２：１０７７−１０８４，１９９３を参照）。しかし、未熟胚を入手するためには、圃場や温室で植物を育成しなければならず、圃場では６−７ヶ月、温室では３−５ヶ月を要する。
【００１０】
したがって、アグロバクテリウムなどの培養・調製を必要とせず、核酸導入する試料の調製が容易であり、かつ、核酸導入の後の核酸導入体（特に、形質転換体）を容易に得ることができる、簡便かつ迅速な核酸導入法（特に、形質転換法）は存在していない。
【００１１】
本発明の目的は、簡便かつ迅速な核酸導入方法（特に、植物の形質転換方法）が確立されていないという上記現状に鑑み、当該分野において、（１）アグロバクテリウムなどの培養・調製を必要とせず、（２）核酸導入する試料の調製が容易であり、かつ、（３）核酸導入の後の核酸導入体を容易に得ることができる、簡便かつ迅速な核酸導入方法（特に、植物の形質転換方法）を提供することである。
【００１２】
簡便かつ迅速な本発明の方法を用いることによって、核酸導入体（特に、形質転換植物体）を、迅速かつ大量に得ることが可能になる。従って、本発明は、植物形質転換体を得ることが必要な産業分野のみならず、植物を用いる開発研究においても利用され得、大量処理・大量解析を容易にし得る。さらに、本発明は、飛躍的な研究の進歩を誘発し、画期的な組換え作物の開発につながる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の上記課題は、
ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；および
ｂ）該細胞と該核酸とを、エレクトロポーレーションを導入し得る条件下に配置する工程を包含する、核酸を細胞内に導入する方法によって達成された。
【００１４】
一つの実施形態では、本発明の方法は、
１）植物組織を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；および
２）エレクトロポーレーションを用いて、所望の遺伝子を植物へ導入する工程、
によって実施される。
【００１５】
具体的には、本願明細書において発明者らは、植物において首尾よくエレクトロポーレーションを行うために、核酸が細胞内に取り込まれやすいように細胞を処理するための種々の方法を試みた。その結果、（１）植物を真空状態に保ち、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いる核酸導入法は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ以外の植物には効果的でなく、そしておよび（２）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いる核酸導入のためには、植物を真空状態に保つ必要がない（Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１２４：１５４０−１５４７，２０００年１２月）と考えられていた。対照的に、以下の実施例に示すように、本発明者らは、エレクトロポーレーションを用いる植物核酸導入は、植物組織を大気圧と異なる圧力下に維持する工程によって最適化されることを見出した。この本発明の方法は、植物細胞のみならず任意の細胞に対して適用され得、そしてエレクトロポーレーションの核酸導入効率を顕著に改善し得る。
【００１６】
本方法は極めて簡便である。さらに、本発明の方法は、核酸導入操作後に従来必要な培養過程を必要としない。従って、本発明は、形質導入体が培養変異を含まないという利点も有する。従来の核酸導入操作後に必要とされた培養過程では、必然的に、培養変異が起こることが知られている。培養変異とは、当業者が通常理解し得る通り、培養過程で生じる遺伝学的変異を意味し、すなわち、培養過程の間に、核酸導入される細胞がもともと有していた核酸配列および／または導入する核酸配列において生じる任意の配列改変（例えば、置換、欠失、挿入、転座、逆位、重複など）をいう。意図されない培養変異は、核酸導入した核酸導入体に望ましくない形質を付与することが多い。従って、この培養変異のない所望の核酸導入体を得ることができるため、本発明の方法は、非常に有益である。
【００１７】
本発明は、従来法の遺伝子導入技術によって形質転換体を得ることが不可能であるか、または極めて困難であった植物種に対する形質転換を可能にするという利点をさらに提供する。具体的には、以下の実施例において用いたコムギ品種農林６１号は、日本におけるコムギ主要品種の１つであるが、組織培養における植物体の再生が不可能であり、すなわち、従来技術によって形質転換体を得ることが非常に困難であった（Ｍａｃｈｉｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，５３：６７−７４，１９９８）。また、例えば、本明細書中で、実施例４で用られたダイズも、いまだ再分化技術が十分に確立されていない。ダイズは、形質転換体を得ることが非常に困難であった。しかし、本明細書の実施例に記載するように、本発明は、従来形質転換体を得ることが不可能であるか、または極めて困難であった植物種を形質転換することを可能にした。本発明の方法は、従来、形質転換体を得ることが不可能であるか、または極めて困難であった任意の他の種に対して適用され得る。
【００１８】
従って、本発明は以下を提供する。
１．核酸を細胞内に導入する方法であって、以下の工程：
ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；および
ｂ）該細胞と該核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程
を包含する方法。
２．前記細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程が、前記細胞を減圧処理する工程である、項目１に記載の方法。
３．前記細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程が、前記細胞を加圧処理する工程である、項目１に記載の方法。
４．前記細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程が、該細胞と前記核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程の前に行われる、項目１に記載の方法。
５．前記減圧処理する工程が、大気圧よりも０．０９６ＭＰａ低い減圧下で行われる、項目２に記載の方法。
６．項目１に記載の方法であって、前記ｂ）工程が、少なくとも二種類の方向で、前記細胞と前記核酸とに電圧パルスをかけることを含む、方法。
７．前記細胞が植物細胞である、項目１に記載の方法。
８．前記植物細胞が、植物の休眠組織の細胞である、項目７に記載の方法。
９．前記植物の休眠組織が種子である、項目８に記載の方法。
１０．前記植物が、単子葉植物である項目７に記載の方法。
１１．前記単子葉植物がイネ科植物である、項目１０に記載の方法。
１２．前記イネ科植物がコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）である、項目１１に記載の方法。
１３．前記イネ科植物がイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）である、項目１１に記載の方法。
１４．前記イネ科植物がトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）である、項目１１に記載の方法。
１５．前記植物が、双子葉植物である項目７に記載の方法。
１６．前記双子葉植物がアブラナ科植物である、項目１５に記載の方法。
１７．前記アブラナ科植物がハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．）である、項目１６の方法。
１８．前記アブラナ科植物がナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｌ．）である、項目１６の方法。
１９．前記双子葉植物がマメ科植物である、項目１５に記載の方法。
２０．前記マメ科植物がダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｍｅｒｒ）である、項目１９に記載の方法。
２１．前記双子葉植物がナス科植物である、項目１５に記載の方法。
２２．前記ナス科植物がトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｍｉｌｌ）である、項目２１に記載の方法。
２３．前記双子葉植物がウリ科植物である、項目１５に記載の方法。
２４．前記ウリ科植物がマクワウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ  Ｌ．）である、項目２３に記載の方法。
２５．前記双子葉植物がヒルガオ科植物である、項目１５に記載の方法。
２６．前記ヒルガオ科植物がアサガオ（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ  ｎｉｌ  Ｃｈｏｉｓｙ）である、項目２５に記載の方法。
２７．核酸を細胞内に導入した植物を作製する方法であって、以下の工程：
ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する工程；および
ｂ）該細胞と該核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程
を包含する方法。
２８．項目２７に記載の方法であって、前記細胞を、分化、成長および／または増殖させる工程をさらに包含する、方法。
２９．項目２７または２８に記載の方法であって、前記ａ）工程が、前記細胞を含む種子を大気圧と異なる圧力下に維持する工程を含み、かつ、前記ｂ）工程が、該細胞を含む該種子と該核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する工程を含む、方法。
３０．前記種子が、単子葉植物の種子である項目２９に記載の方法。
３１．前記単子葉植物の種子がイネ科の種子である、項目３０に記載の方法。
３２．前記イネ科種子がコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）種子である、項目３１に記載の方法。
３３．前記イネ科種子がイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）種子である、項目３１に記載の方法。
３４．前記イネ科種子がトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）種子である、項目３１に記載の方法。
３５．前記種子が、双子葉植物の種子である項目２９に記載の方法。
３６．前記双子葉植物の種子がアブラナ科種子である、項目３５に記載の方法。
３７．前記アブラナ科種子がハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  Ｌ．）種子である、項目３６の方法。
３８．前記アブラナ科種子がナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  Ｌ．）種子である、項目３６の方法。
３９．前記双子葉植物の種子がマメ科種子である、項目３５に記載の方法。
４０．前記マメ科種子がダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｍｅｒｒ）種子である、項目３９に記載の方法。
４１．前記双子葉植物の種子がナス科種子である、項目３５に記載の方法。
４２．前記ナス科種子がトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｍｉｌｌ）種子である、項目４１に記載の方法。
４３．前記双子葉植物の種子がウリ科種子である、項目３５に記載の方法。
４４．前記ウリ科種子がマクワウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ  Ｌ．）種子である、項目４３に記載の方法。
４５．前記双子葉植物の種子がヒルガオ科種子である、項目３５に記載の方法。
４６．前記ヒルガオ科種子がアサガオ（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ  ｎｉｌ  Ｃｈｏｉｓｙ）種子である、項目４５に記載の方法。
４７．項目２７〜４６のいずれか１項に記載の方法によって作製された、植物。
４８．培養変異を含まない、項目４７に記載の植物。
４９．核酸を細胞内に導入するための装置であって、以下：
ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する手段；および
ｂ）エレクトロポーレーション手段、
を備えた、装置。
５０．細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する前記手段は、大気圧より低い圧力に維持する能力を含む、項目４９に記載の装置。
５１．前記細胞が植物細胞である、項目４９に記載の装置。
５２．項目４９に記載の装置であって、前記ｂ）のエレクトロポーレーション手段は、アノードとして作用する第一電極およびカソードとして作用する第二電極を備え、ここで該第一電極と該第二電極との間の距離が、植物種子を収容し得る距離である、装置。
５３．前記第一電極と前記第二電極との間の距離が、少なくとも約５ｍｍである、項目５２に記載の装置。
５４．前記第一電極と前記第二電極との間の距離が、約１ｃｍよりも長い、項目５２に記載の装置。
５５．前記第一電極および前記第二電極が白金電極である、項目５２に記載の装置。
５６．項目４９に記載の装置であって、前記ｂ）のエレクトロポーレーション手段は、アノードとして作用する第一電極およびカソードとして作用する第二電極を備え、ここで該第一電極と該第二電極との間の距離は、該第一電極と該第二電極との間の距離が植物種子を収容し得る距離となるように変動可能である、装置。
５７．前記第一電極および前記第二電極が白金電極である、項目５６に記載の装置。
５８．細胞を大気圧と異なる圧力下に維持することと組み合わせて、核酸を該細胞内に導入するためのエレクトロポーレーション装置であって、該装置は、アノードとして作用する第一電極およびカソードとして作用する第二電極を備え、ここで該第一電極と該第二電極との間の距離が、植物種子を収容し得る距離である、装置。
５９．前記第一電極と前記第二電極との間の距離が、少なくとも約５ｍｍである、項目５８に記載の装置。
６０．前記第一電極と前記第二電極との間の距離が、約１ｃｍよりも長い、項目５８に記載の装置。
６１．前記第一電極および前記第二電極が白金電極である、項目５８に記載の装置。
６２．細胞を大気圧と異なる圧力下に維持することと組み合わせて、核酸を該細胞内に導入するためのエレクトロポーレーション装置であって、該装置は、アノードとして作用する第一電極およびカソードとして作用する第二電極を備え、ここで該第一電極と該第二電極との間の距離は、該第一電極と該第二電極との間の距離が植物種子を収容し得る距離となるように変動可能である、装置。
６３．前記第一電極および前記第二電極が白金電極である、項目６２に記載の装置。
６４．大気圧と異なる圧力に耐える能力を有し、かつ植物種子を収容し得る大きさを有する、エレクトロポーレーションチャンバー。
６５．前記エレクトロポーレーションチャンバーの内面の少なくとも３点に接する最大の内接円の直径が、少なくとも約５ｍｍである、項目６４に記載のエレクトロポーレーションチャンバー。
６６．前記エレクトロポーレーションチャンバーの内面の少なくとも３点に接する最大の内接円の直径が、約１ｃｍよりも大きい、項目６４に記載のエレクトロポーレーションチャンバー。
６７．前記チャンバーが四角形の横断面を有し、該チャンバーの内寸が、約１ｃｍ×２ｃｍ×２ｃｍである、項目６４に記載のエレクトロポーレーションチャンバー。
６８．前記チャンバーが円形の横断面を有し、該チャンバーの内寸が約１ｃｍ×４ｃｍである、項目６４に記載のエレクトロポーレーションチャンバー。
６９．大気圧と異なる圧力に耐える能力を有し、かつ植物種子を収容し得る大きさに変動可能である、エレクトロポーレーションチャンバー。
７０．自動化してエレクトロポーレーションを実行する装置であって、該装置は、以下：
ａ）核酸と細胞とを含む混合液を入れる容器；
ｂ）該ａ）の容器中に核酸を入れる手段；
ｃ）該ａ）の容器中に細胞を入れる手段；
ｄ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する容器であって、大気圧と異なる圧力に耐える能力を有する、容器；
ｅ）該細胞を、該ｄ）の容器中に配置する手段；
ｆ）該ｄ）の容器中を、大気圧と異なる圧力に維持する手段；
ｇ）該核酸と該細胞とを含む混合液に電圧パルスをかける容器；
ｈ）該核酸と該細胞とを含む混合液を、該ｇ）の容器中に配置する手段；
ｉ）該ｇ）の容器中において、該核酸と該細胞とを含む混合液に対して電圧パルスをかける手段；および
ｊ）該ｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）およびｉ）の手段を自動化して実行する手段
を備え、ここで該ｂ）の手段および該ｃ）の手段は、互いに同一であるかまたは異なり、そして該ｅ）の手段および該ｈ）の手段は、互いに同一であるかまたは異なり、そして該ａ）の容器、該ｄ）の容器および該ｇ）の容器は、互いに同一であるかまたは異なる、装置。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、添付の図面を参照して、例を挙げて本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２０】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２１】
本明細書において、用語「核酸導入」とは、人為的に核酸を細胞内または組織内に導入することを意味する。「核酸導入」によって核酸を導入した細胞または組織の表現型は、変化しても変化しなくても良い。本明細書において、用語「遺伝子導入」とは、遺伝形質を規定する因子である遺伝子を含む核酸を、人為的に細胞内または組織内に導入することを意味する。「遺伝子導入」によって遺伝子を含む核酸を導入した細胞または組織の表現型は、変化しても変化しなくても良い。本明細書において、用語「形質転換」とは、細胞内または組織内に、遺伝子を含む核酸を導入することによって、その細胞またはその組織の表現型に変化を生じることを意味する。ただし本明細書では、特定の局面において、用語「核酸導入」と「遺伝子導入」と「形質転換」とが互換可能に使用される場合がある。本明細書中において、これらの用語が指す意味は、その用語が含まれる文脈から明らかである。
【００２２】
用語「核酸導入体」、「遺伝子導入体」および「形質転換体」とは、それぞれ、核酸導入、遺伝子導入、および形質転換された細胞または組織から発生する生命体の全部または一部をいう。ただし本明細書では、特定の局面において、用語「核酸導入体」と「遺伝子導入体」と「形質転換体」とが互換可能に使用される場合がある。本明細書中において、これらの用語が指す意味は、その用語が含まれる文脈から明らかである。核酸導入体、遺伝子導入体、および形質転換体は、任意の生命体であり得、例えば、原核細胞、および真核細胞（例えば、植物細胞等）または組織から発生する生命体が挙げられる。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。同様のことが、用語「核酸導入体」および用語「遺伝子導入体」においても当てはまる。
【００２３】
用語「細胞」は、任意の生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）、真菌類など）、単細胞生物（例えば、細菌（例えば、大腸菌）など）由来の細胞）を、言う。好ましくは、本発明において使用される細胞は、細胞壁を有する細胞であり、特に好ましくは、植物細胞である。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、同一の機能および／または形態を有するのであれば、異なる起源を持つ細胞集団であってもよい。通常、組織は、器官の一部である。植物では、組織は、例えば構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな様式で分類されている。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。
【００２５】
本明細書中において、用語「組織」は、任意の生物由来の任意の組織（たとえば、任意の種類の多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）、真菌類など）由来の組織）を言う。好ましくは、本発明において使用される組織は、細胞壁を含む組織であり、特に好ましくは、植物組織である。「植物組織」としては、休眠組織、生殖質、生長点、および花芽が挙げられるが、これに限定されない。好ましい休眠組織の例としては、完熟種子、未熟種子、冬芽、および塊茎が挙げられ、特に好ましくは完熟種子であるが、これに限定されない。
【００２６】
用語「器官」は、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物、真菌類）では器官は特定の空間的配置で形成され、組織は多数の細胞からなる。そのような植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられ、動物の例としては、皮膚、心臓、血管、角膜、網膜、腎臓、肝臓、膵臓、腸、胎盤、臍帯、肺、脳、神経、四肢末梢などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２７】
本願明細書において使用する場合、用語「選抜」とは、抗生物質に対する耐性検定および／または遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ、サザンブロット法、ノーザンブロット法など）によって、核酸導入された核酸導入体を、核酸導入されていないものと区別することを意味する。特定の場合では、用語「選抜」は、形質転換生物を薬物存在下で培養および／または育成することによって、薬物耐性遺伝子によって形質転換された形質転換体を、形質転換されていない生物とを区別する工程を意味する。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「エレクトロポーレーション」とは、直流の高電圧パルスを適用して物理的に細胞（例えば、植物細胞）に小孔をあけ、そこから核酸（例えば、遺伝子を含む核酸）を細胞内に導入する、細胞への核酸導入技術をいう。エレクトロポーレーションの条件は、使用する種、組織、細胞などに依存して、当業者が適宜選択し得る。代表的なエレクトロポーレーションの電圧の条件は、１０Ｖ／ｃｍ〜２００Ｖ／ｃｍ、好ましくは２０Ｖ／ｃｍ〜１５０Ｖ／ｃｍ、より好ましくは３０Ｖ／ｃｍ〜１２０Ｖ／ｃｍ、なおより好ましくは４０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍ、最も好ましくは５０Ｖ／ｃｍ〜１００Ｖ／ｃｍであるが、これらに限定されない。代表的なエレクトロポーレーションのパルス幅の条件は、１マイクロ秒〜９０マイクロ秒、好ましくは１０マイクロ秒〜９０マイクロ秒、なお好ましくは２０マイクロ秒〜８０マイクロ秒、なおより好ましくは３０マイクロ秒〜８０マイクロ秒、さらになおより好ましくは４０マイクロ秒〜７０マイクロ秒、最も好ましくは５０マイクロ秒〜６０マイクロ秒であるが、これらに限定されない。代表的なエレクトロポーレーションのパルスの回数は、１回〜２００回、好ましくは１０回〜１５０回、より好ましくは２０回〜１２０回、なおより好ましくは３０回〜１１０回、最も好ましくは４０回〜１００回であるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書において使用する場合、句「細胞（または組織）と核酸とを、エレクトロポーレーションが起きる条件下に配置する」とは、細胞（または組織）と核酸とを、それらの間でエレクトロポーレーション（すなわち、細胞（または組織）への核酸導入）が起きるために必須のすべての条件（電圧条件、パルス幅条件、パルス回数条件、細胞（または組織）と核酸との間の位置関係、エレクトロポーレーションの実行時間などを含む）を備えた状態に配置することを意味する。エレクトロポーレーションが起きるために必須の条件は、当業者に容易に明らかであり、当業者はその条件を適宜決定し得る。
【００３０】
本発明において、エレクトロポーレーションは、好ましくは、細胞（または組織）と核酸とに、少なくとも二種類の方向で高電圧パルスをかけることによって、実行される。最も簡単には、細胞（または組織）と核酸とに所定の時間高電圧パルスをかけた後で、アノード電極とカソード電極とを逆にして高電圧パルスをかけ直すことによって、この技術は達成され得る。この技術はまた、エレクトロポーレーションチャンバー内で別の位置に配置された電極対を使用しても達成され得る。少なくとも二種類の方向で高電圧パルスをかけることによって、核酸導入効率が顕著に高まる。例えば、アブラナ科の植物種子と核酸とに対して二種類の方向から高電圧パルスをかけた結果、その種子への核酸導入効率は、一種類の方向から高電圧パルスをかけた場合よりも約２倍以上改善されることが本発明者らによって見出された。
【００３１】
本発明においてエレクトロポーレーションを行う際に使用されるエレクトロポーレーションチャンバーは、核酸導入される細胞および／または組織を収容できるものであれば、どのような大きさであってもよい。特に好ましくは、エレクトロポーレーションチャンバーは、植物組織（例えば、植物種子）を収容し得る大きさを有する。本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、任意の形状であり得る。このような形状の例としては、立方体、直方体、円筒形、チューブ形（例えば、胴体が均一であるかまたは均一でない横断面を有し、かつ底が先細りしてもしなていなくてもよい形状）などが挙げられるが、これらに限定されない。植物種子を収容し得る大きさであるために、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーの内面の少なくとも３点に接する最大の内接円の直径は、例えば、以下の長さであり得る：少なくとも約５ｍｍであるかまたは約５ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約６ｍｍであるかまたは約６ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約７ｍｍであるかまたは約７ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約８ｍｍであるかまたは約８ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約９ｍｍであるかまたは約９ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１ｃｍであるかまたは約１ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約２ｃｍであるかまたは約２ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約３ｃｍであるかまたは約３ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約４ｃｍであるかまたは約４ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約５ｃｍであるかまたは約５ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約６ｃｍであるかまたは約６ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約７ｃｍであるかまたは約７ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約８ｃｍであるかまたは約８ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約９ｃｍであるかまたは約９ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１０ｃｍであるかまたは約１０ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１５ｃｍであるかまたは約１５ｃｍよりも長い、そして好ましくは、少なくとも約２０ｃｍであるかまたは約２０ｃｍよりも長い。本発明のエレクトロポーレーションチャンバーの内面の少なくとも３点に接する最大の内接円の直径の上限は、例えば、以下であり得るが、これらに限定されない：約２５ｃｍ、約２０ｃｍ、約１５ｃｍ、約１０ｃｍ、約９ｃｍ、約８ｃｍ、約７ｃｍ、約６ｃｍ、約５ｃｍ、約４ｃｍ、約３ｃｍ、約２ｃｍ、約１ｃｍ、約９ｍｍ、約８ｍｍ、約７ｍｍ、または約６ｍｍ。この長さは、上記に明示した数値の間の長さ（例えば、１．５ｃｍなど）であり得る。本明細書中において「内接円」とは、チャンバー容器の内面上における少なくとも３つの任意の点に接するように描かれる任意の円を指す。ここで、チャンバー内に配置された電極も容器の一部とみなされ、従って、チャンバー容器の内面は、電極表面も含む。代表的に、使用される電極の厚みは、無視できるほど非常に薄い（例えば、０．１ｍｍなど）。
【００３２】
本発明の一つの局面において、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、四角形の横断面を有し、かつ内寸（例えば、縦×横×高さ）が、１ｃｍ×２ｃｍ×２ｃｍである。本発明の別の局面に従い、エレクトロポーレーションチャンバーは、円形の横断面を有し、かつ内寸（例えば、直径×高さ）が、１ｃｍ×４ｃｍである。ここで、電極の占める領域は、チャンバーの内寸から除かれる。代表的に、使用される電極の厚みは、無視できるほど非常に薄い。本明細書中において横断面とは、チャンバーの長軸方向に直交する断面をいう。本明細書中において内寸とは、チャンバー容器内面上の任意の２点を結ぶ長さを指し、特に、四角形の横断面を有するチャンバーの場合には、その横断面の縦および横、ならびに高さを指し、そして円形の横断面を有するチャンバーの場合には、その横断面の直径、および高さを指す。
【００３３】
一つの実施形態では、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、植物種子を収容し得る大きさに変動可能である。大きさは、任意の手段によって変動され得る。例えば、チャンバーの大きさは、ネジなどの手段によって適切な大きさに調整され得る。
【００３４】
本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、任意の材料から作製され得る。エレクトロポーレーションチャンバーの材料としては、固体を形成し得る任意の材料が使用され得る。このような材料の例としては、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。チャンバーは、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリアミド、ポリカーボネート、（変性）ポリフェニレンオキサイド、ポリブチレンテレフタレート、強化ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリアリレート、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリスルホンなどの有機材料なども使用され得る。好ましくは、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、大気圧と異なる圧力に耐える能力（例えば、大気圧と異なる圧力にさらされても、破壊、亀裂および変形しない能力）を有し、特に好ましくは、減圧処理に耐える能力を有する。特に好ましくは、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、ポリプロピレン、シリコーン樹脂、およびガラスから作製され、そして白金製またはステンレス製の電極を備える。
【００３５】
好ましくは、本発明のエレクトロポーレーションチャンバーは、温度制御手段を備える。温度制御手段は、例えば、センサーなどで温度変化を感知し、手動または自動で、チャンバーの温度を制御し得る。温度制御手段は、代表的に、チャンバーの温度を冷却するように作用する冷却手段である。冷却手段は任意の手段であり得、例えば、氷、冷却ゲルなどを利用した手段であり得る。
【００３６】
本発明のエレクトロポーレーションチャンバーには、少なくとも一対（二個）の電極が備えられる。従って、特定の実施形態では、本発明のチャンバーは、一対（二個）より多い電極（例えば、二対（四個）の電極、三対（六個）の電極、四対（八個）の電極、五対（十個）の電極、またはより多い対の電極）を備え得る。例えば、四角形の横断面を有するチャンバーにおいて、向かい合う内面に沿って電極を配置すると、二対（四個）の電極を取り付けることが可能である。さらなる例として、六角形の横断面を有するチャンバーにおいて、向かい合う内面に沿って電極を配置すると、三対（六個）の電極を取り付けることが可能である。このように、本発明のチャンバー内に配置される電極対は、任意の数であり得、また、任意の空間的位置関係をとり得る。
【００３７】
本発明のエレクトロポーレーションチャンバー内に配置される電極の間の距離は任意の距離であり得、核酸導入される細胞および／または組織の大きさに応じて変動し得る。特に好ましくは、電極間の距離は、植物組織（例えば、植物種子）を収容するのに十分な距離である。植物種子を収容するのに十分な距離であるために、電極間の距離は、例えば、以下の長さであり得る：少なくとも約５ｍｍであるかまたは約５ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約６ｍｍであるかまたは約６ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約７ｍｍであるかまたは約７ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約８ｍｍであるかまたは約８ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約９ｍｍであるかまたは約９ｍｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１ｃｍであるかまたは約１ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約２ｃｍであるかまたは約２ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約３ｃｍであるかまたは約３ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約４ｃｍであるかまたは約４ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約５ｃｍであるかまたは約５ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約６ｃｍであるかまたは約６ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約７ｃｍであるかまたは約７ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約８ｃｍであるかまたは約８ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約９ｃｍであるかまたは約９ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１０ｃｍであるかまたは約１０ｃｍよりも長い、好ましくは、少なくとも約１５ｃｍであるかまたは約１５ｃｍよりも長い、そして好ましくは、少なくとも約２０ｃｍであるかまたは約２０ｃｍよりも長い。電極間の距離の上限は、例えば、以下であり得るが、これらに限定されない：約２５ｃｍ、約２０ｃｍ、約１５ｃｍ、約１０ｃｍ、約９ｃｍ、約８ｃｍ、約７ｃｍ、約６ｃｍ、約５ｃｍ、約４ｃｍ、約３ｃｍ、約２ｃｍ、約１ｃｍ、約９ｍｍ、約８ｍｍ、約７ｍｍ、または約６ｍｍ。電極間の距離は、上記に明示した数値の間の長さ（例えば、１．５ｃｍなど）であり得る。
【００３８】
一つの実施形態では、電極間の距離は、対になった電極間が植物種子を収容し得るように変動可能である。電極間の距離の変動は、任意の手段によって達成され得る。例えば、電極間の距離は、ネジなどを利用して適切な距離に調整され得る。
【００３９】
電極は、電流を流し得るという性質を有する限りにおいて任意の材料から作製され得る。電極の材料の例としては、例えば、白金、金、ステンレス、炭素、導電性ポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましくは、電極は白金電極である。
【００４０】
例示的なエレクトロポーレーションチャンバーは、白金電極を備える縦１ｃｍ×横２ｃｍ×高さ２ｃｍの直方形チャンバーであり、その白金電極間の距離は、約１ｃｍである。このエレクトロポーレーションチャンバーは、中程度の大きさ（約５〜１５ｍｍ程度）の植物種子（例えば、コムギ、イネ、トウモロコシなど）を処理する際に特に有用である。このチャンバーを使用することにより、中程度の大きさの植物種子を大量にまとめて（例えば、約１０〜３０粒）処理することが可能である。
【００４１】
別の例示的なエレクトロポーレーションチャンバーは、ステンレス電極を備える内径１ｃｍ×高さ４ｃｍのマイクロチューブ型チャンバーであり、ステンレス電極間の距離は、約１ｃｍである。このマイクロチューブ型チャンバーは、市販のマイクロチューブの内面に、ステンレス箔（例えば、約５×４０ｍｍ（厚さ約０．１ｍｍ））を接着剤などで貼り付けることによって、容易に作製され得る。このマイクロチューブ型チャンバーは、遠心分離にかけて、細胞、組織および／または種子を底に沈殿させることができるため、溶液の交換は、容易に行われ得る。このため、このマイクロチューブ型チャンバーは、微小な（約０．１〜５ｍｍ程度の）植物種子（例えば、シロイヌナズナなど）を処理する際に特に有用である。このチャンバーを使用することにより、微小な大きさの植物種子を大量にまとめて処理することが可能である。
【００４２】
本願明細書において使用する場合、細胞／組織（植物組織を含む）を、「大気圧と異なる圧力下に維持する」とは、細胞／組織（植物組織を含む）を、大気圧（通常は、１気圧＝１０１．３２５ｋＰａ＝約０．１ＭＰａ）よりも高い圧力下に維持する工程（加圧処理）、または低い圧力下に維持する工程（減圧処理）をいう。
【００４３】
いかなる理論にも拘束されることを意図しないが、細胞／組織（植物組織を含む）を大気圧と異なる圧力下に維持することによって、細胞／組織が受ける環境中の圧力が変化し、ＤＮＡなどの核酸を含む緩衝液が組織間の腔・細胞間の腔に浸透しやすくなり、その結果、従来不可能と考えられていた細胞壁を有する細胞および組織（特に、植物細胞および植物組織）を標的とするエレクトロポーレーションによる核酸導入／形質転換を行うことが可能になったものと考えられる。
【００４４】
本明細書において使用する場合、用語「減圧処理」とは、核酸導入／形質転換のために、細胞／組織（植物組織（例えば、種子）を含む）を大気圧より低い気圧下に維持する工程をいう。本発明において、減圧処理は、大気圧よりも、０．０２ＭＰａ低い圧力、好ましくは０．０４ＭＰａ低い圧力、より好ましくは０．０６ＭＰａ低い圧力、さらにより好ましくは０．０８ＭＰａ低い圧力、最も好ましくは０．０９６ＭＰａ低い圧力で行われるが、これらに限定されない。減圧処理の時間は、１分〜１２０分、好ましくは１０分〜１００分、より好ましくは１５分〜９０分、さらにより好ましくは３０分〜７０分、最も好ましくは約６０分であるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書において使用する場合、用語「加圧処理」とは、核酸導入／形質転換のために、細胞／組織（植物組織（例えば、種子）を含む）を大気圧より高い気圧下に維持する処理をいう。
【００４６】
本発明の一つの局面において、エレクトロポーレーション装置を、提供する。本発明のエレクトロポーレーション装置は、顕著に高い効率で任意の細胞または組織に対して核酸導入し得、そして特に、これまでエレクトロポーレーションによる核酸導入が不可能であった、細胞壁を有する細胞または組織（例えば、植物細胞または植物組織）に核酸導入するために有用である。一つの実施形態では、本発明のエレクトロポーレーション装置は、ａ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する手段、および、ｂ）エレクトロポーレーション手段の両方の手段を備える。
【００４７】
細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する手段としては、減圧および／または加圧する能力を有する任意の手段が利用され得る。市販の減圧装置（例えば、真空デシケーターなど）および／または加圧装置もまた利用され得る。任意のエレクトロポーレーション手段が利用され得る。市販のエレクトロポーレーション手段（例えば、ＣＵＹ２１ＥＤＩＴ遺伝子導入装置、ネッパジーン社、日本国千葉県市川市）もまた利用され得る。好ましくは、エレクトロポーレーション手段に配置される２つの電極（第一電極および第二電極）の間の距離は、上記で定義付けられたような、植物種子を収容するのに十分な距離にある。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、本発明のエレクトロポーレーション装置は、植物種子を収容するのに十分な距離にある二つの電極を含み、そしてこのエレクトロポーレーション装置は、細胞／組織を大気圧と異なる圧力下に維持する手段と組み合わせて使用される。この実施形態では、このエレクトロポーレーション装置と、細胞／組織を大気圧と異なる圧力下に維持する手段とが、同一の機器の中に存在する必要はない。
【００４９】
従来のエレクトロポーレーション装置は、極めて小さい細胞に対して高電圧パルスをかけることを目的としていたため、チャンバーの内寸および電極間の距離をできるだけ小さくする必要があった。このため、従来のエレクトロポーレーション装置のチャンバーの内寸および電極間の距離は、代表的に、１ｍｍまたは２ｍｍ程度であり、長くてもせいぜい４ｍｍであった。従って、本発明のような、植物種子をも収容し得るほど大きなチャンバーおよび植物種子をも収容し得るほど長い距離で配置された電極を備えたエレクトロポーレーション装置は、これまで知られていない。
【００５０】
さらに、本発明のエレクトロポーレーション装置は、自動化して実行され得る。本発明の自動化エレクトロポーレーション装置において、緩衝液などの溶液の注入および／または交換は、自動分注機により行われ得る。自動分注機は、例えば、市販のｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７０  ワークステーション（エッペンドルフ株式会社  日本国東京都千代田区東神田３）などが利用され得るが、これに限定されない。特に、核酸と細胞とを含む混合液を入れる容器中に、核酸および／または細胞を入れる手段として、このような自動分注機が有利に使用され得る。
【００５１】
核酸と細胞とを含む混合液を入れる第一容器、細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する第二容器、および核酸と細胞とを含む混合液に高電圧パルスをかける第三容器は、任意の容器であり得る。これらの容器は、同一であっても異なってもよい。この容器の材質としては、固体を形成し得る任意の材質であり得る。例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。容器は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリアミド、ポリカーボネート、（変性）ポリフェニレンオキサイド、ポリブチレンテレフタレート、強化ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリアリレート、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリスルホンなどの有機材料なども使用され得る。
【００５２】
好ましくは、本発明の第一容器は、透明度が高く材料観察を容易にする材料（例えば、ポリスチレン）から作製される。好ましくは、本発明の第二容器は、大気圧と異なる圧力（特に、減圧）に耐える能力を有する材料（例えば、ポリアミド、ポリカーボネート、（変性）ポリフェニレンオキサイド、ポリブチレンテレフタレート、強化ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテルスルホン、ポリフェニレンスルフィド、ポリアリレート、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリイミドおよびエポキシ樹脂）から作製され、より好ましくは、透明度が高く材料観察を容易にする性質も備えた材料（例えば、アクリル樹脂）から作製される。好ましくは、本発明の第三容器は、細胞との親和性を示す材料（例えば、ポリプロピレン、シリコーン樹脂、およびガラス）から作製され、白金製、金製、ステンレス製、炭素製、または導電性ポリマー製の電極を備える。これらの材料は、所望の性質を付与するために（例えば、容器本体に絶縁性を付与するために、または電極の導電性を高めるために）、任意の適切な材料でコーティングされてもよい。
【００５３】
さらに、好ましくは、本発明の第一容器および第二容器は、大気圧と異なる圧力に耐える能力を有し、特に好ましくは、減圧処理に耐える能力を有する。例えば、上記の第一容器は、上記の第二容器内および／または上記の第三容器内に収容されてもよい。または、核酸と細胞とを含む混合液は、上記の第一容器から、上記の第二容器（または、その内部に収容される別の容器）内および／または上記の第三容器（または、その内部に収容される別の容器）内に注入されてもよい。
【００５４】
細胞を、上記の第二容器中に配置する手段、および核酸と細胞とを含む混合液を、上記の第三容器中に配置する手段には、ベルトコンベアなどが有利に使用され得るが、これに限定されず、任意の手段が利用され得る。自動ポンプなどを利用して、第一容器、第二容器および第三容器中に配置された液体を、吸引／排出することによって移動され得る。
【００５５】
本発明の自動化エレクトロポーレーション装置は、各操作手段を自動化する制御装置を含む。本発明のエレクトロポーレーション装置は、電源装置を含む。このような制御装置および電源装置は、エレクトロポーレーション装置と同一の機器内に配置されても、別々の機器としてコードで接続されてもよい。
【００５６】
種子に対してエレクトロポーレーションを行う場合、好ましくは、減圧処理または加圧処理をする種子を、処理前に、水（例えば、水道水）中に放置する。処理前の種子を水中に放置する場合、その放置時間は、６時間〜４８時間、好ましくは１２時間〜３６時間、より好ましくは１８時間〜３０時間、さらにより好ましくは２０時間〜２６時間、最も好ましくは約２４時間であるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明における例示的な核酸導入の条件は、種子を２５℃で一晩水道水中に放置し、翌日、真空装置の中に置き、大気圧より０．０９６ＭＰａ低い圧力にて１時間減圧処理を行い、その後、減圧処理した種子に対して、エレクトロポーレーションによる高電圧パルス（１００Ｖ、５０マイクロ秒、ただし、電極間の距離は１ｃｍ）を５０回程度かけ、核酸導入／遺伝子導入を行うという条件である。電圧およびパルス回数は作物によって変化し得、当業者は、必要に応じて、そのエレクトロポーレーション条件を適宜選択し得る。その後、抗生物質を含む培地において選抜し、その後鉢上げ（ポットでの育成）により通常の植物個体を得ることができる。
【００５８】
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、葉緑体、硬い細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。植物は、例えば、「原色牧野植物大図鑑」（北隆館（１９８２年）日本）などにおいて広範に分類されており、そこに記載されるすべての種類の植物が、本発明において使用され得る。代表的には、植物は、細胞壁の形成・葉緑体による同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。単子葉植物としては、イネ科植物が挙げられる。好ましい単子葉植物としては、トウモロコシ、コムギ、イネ、エンバク、オオムギ、ソルガム、ライムギ及びアワが挙げられ、さらに好ましくは、トウモロコシ、コムギ、イネが挙げられるが、これらに限定されない。コムギには、従来法では形質転換体を得ることが困難であったコムギ品種農林６１号も含まれる。双子葉植物としては、アブラナ科植物、マメ科植物、ナス科植物、ウリ科植物、ヒルガオ科植物が挙げられるが、これらに限定されない。アブラナ科植物としては、ハクサイ、ナタネ、キャベツ、カリフラワーが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアブラナ科植物は、ハクサイおよびナタネである。特に好ましいアブラナ科植物は、ナタネである。マメ科植物としては、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、ササゲが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいマメ科植物は、ダイズである。ナス科植物としては、トマト、ナス、バレイショが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいナス科植物は、トマトである。ウリ科植物としては、マクワウリ、キュウリ、メロン、スイカが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいウリ科植物は、マクワウリである。ヒルガオ科植物としては、アサガオ、カンショ、ヒルガオが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいヒルガオ科植物は、アサガオである。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。特定の実施形態では、植物は、植物体を意味し得る。
【００５９】
別の実施形態において、本発明において使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科、ヒルガオ科、キク科などの植物が挙げられる。さらに、本発明において使用され得る植物種の例としては、任意の樹木種、任意の果樹種、クワ科植物（例えば、ゴムの木）、およびアオイ科植物（例えば、綿花）が挙げられる。
【００６０】
簡便には、本発明の方法は、植物組織（休眠組織（完熟種子、未熟種子、冬芽、および塊茎を含む）、生殖質、生長点、および花芽を含む）に対してエレクトロポーレーションを行い、最も簡便には、種子に対してエレクトロポーレーションを行う。本発明のエレクトロポーレーション方法により核酸導入された種子はそのまま、例えば、土に植えて栽培することにより、容易に核酸導入体／形質転換体となり得る。種子は通常、胚、胚乳および種皮の三部分から構成される（野口弥吉・川田信一郎監修，該当部分は千坂英夫著，農学大事典，養賢堂，８９６頁，１９８７年を参照のこと）。胚は、植物のすべての遺伝情報を備え、そして植物体へと生育する部分である。すべての単子葉植物および双子葉植物は胚を有する。本発明のエレクトロポーレーション方法により核酸導入すると、胚の部分において、導入した核酸の発現が認められた。従って、胚を含む種子を有するあらゆる植物で、本発明のこの最も簡便な方法により、容易に核酸導入植物体／形質転換植物体を得ることができる。
【００６１】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ種子、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００６２】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、ソルガム、トウモロコシなどを含む。
【００６３】
本明細書において用いられる「動物」とは、動物界に属する生物の総称であり、酸素と有機性食物を必要とし，植物界や鉱物界と違って任意的に動くことができる生物により特徴付けられる。動物は、大きく脊椎動物と無脊椎動物とに分類される。脊椎動物としては、例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物などが用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞または器官などが用いられる。無脊椎動物としては、例えば、甲殻綱、ヤスデ綱、エダヒゲムシ綱、ムカデ綱、コムカデ綱、昆虫綱などが用いられる。より好ましくは、昆虫(例えば、チョウ目（カイコなどを含む）)が用いられる。
【００６４】
本明細書において、「トランスジェニック生物」とは、特定の遺伝子が組み込まれた生物をいう。「トランスジェニック植物」とは、特定の遺伝子が組み込まれた植物をいい、同様に「トランスジェニック動物」とは、特定の遺伝子が組み込まれた動物をいう。
【００６５】
本発明の方法により核酸導入／形質転換された細胞および組織は、当該分野において公知の任意の方法によって、分化、成長および／または増殖され得る。植物種の場合、細胞または組織を分化、成長および／または増殖させる工程は、例えば、その植物細胞もしくは植物組織またはそれらを含む植物体を栽培することによって達成され得る。本明細書では、植物の栽培は当該分野において公知の任意の方法により行うことができる。植物の栽培方法は、例えば、監修  島本功および岡田清，「モデル植物の実験プロトコール−イネ・シロイヌナズナ編−」：細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ４；イネの栽培法（奥野員敏）ｐｐ．２８−３２、ならびに、丹羽康夫著，シロイヌナズナの栽培法，ｐｐ．３３−４０に例示されており、当業者であれば容易に実施することができることから本明細書では詳述する必要はない。例えば、シロイヌナズナの栽培は土耕、ロックウール耕、水耕いずれでも行うことができる。白色蛍光灯（６０００ルクス程度）の下、恒明条件で栽培すれば播種後４週間程度で最初の花が咲き、開花後１６日程度で種子が完熟する。１さやで約４０〜５０粒の種子が得られ、播種後約２〜３ケ月で枯死するまでの間に１００００粒程度の種子が得られる。また、例えば、コムギの栽培においては、播種後に一定期間の低温短日条件にさらされなければ、出穂および開花しないことが周知である。従って、例えば、人工環境下（例えば、温室やグロスチャンバー）においてコムギを栽培する場合には、生育初期段階で、コムギ幼植物に低温短日処理（例えば、２０℃  明期８時間（約２０００ルクス）および８℃  暗期１６時間での処理など）を行う必要がある。この処理は春化処理（ｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれる。このような各植物種ごとに必要とされる栽培条件は、当該分野において一般に広く知られており、従って、本明細書中で詳述する必要はない。
【００６６】
植物以外の種（例えば、動物種）の場合においても、本発明の方法によって、核酸導入／形質転換された細胞および組織は、当該分野において公知の任意の方法によって、分化、成長および／または増殖され得る（例えば、泉美治ら編，生物化学実験のてびき  ４．動物・組織実験法，化学同人，１９８７年などを参照のこと）。例えば、エレクトロポーレーションにより核酸導入した細胞および／または組織は、市販の飼料を供給しながら常温下（約２５℃）で育成され得る。
【００６７】
本明細書において使用される場合、導入される遺伝子は、ポリヌクレオチドからなる。
【００６８】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）およびその相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５−２６０８，１９８５；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１−９８，１９９４）。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」と互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み通し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００６９】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を制御する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００７０】
本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００７１】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
【００７２】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるが、もとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００７４】
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８７などを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
【００７５】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を標的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、原核生物細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体等の宿主細胞、好ましくは植物細胞において自律複製が可能であるか、またはその染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００７６】
本明細書において用いられる「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。選抜のための選択マーカーとしては、抗生物質カナマイシンに対して耐性を与える酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ遺伝子（Ｂｅｃｋら，Ｇｅｎｅ，１９：３２７，１９８２；抗生物質ハイグロマイシンに対して耐性を与える酵素ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｈｙｇ遺伝子（Ｇｒｉｔｚ及びＤａｖｉｅｓ，Ｇｅｎｅ，２５：１７９，１９８３）；及び除草剤ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対して耐性を与えるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子（ＥＰ  ２４２２３６）；ストレプトマイシンフォスフォトランスフェラーゼをコードするｓｐｔ遺伝子；ストレプトマイシン耐性遺伝子；スペクチノマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子（例えば、Ｈ．Ｓ．Ｃｈａｗｌａ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第２版：３６３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，単行本，２００２）；ならびにβ−グルクロニダーゼをコードするＧＵＳ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６：３９０１，１９８６）およびルシフェラーゼ遺伝子（Ｏｗら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：８５６，１９８６）、およびＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）コード遺伝子（例えば、フナコシ株式会社、東京都文京区本郷から入手可能）のようなスクリーニング可能な選択マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明において選抜に使用する薬剤としては、カナマイシン、ハイグロマイシン、ジェネティシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７８】
「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を標的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、植物細胞、および植物個体等の宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
【００７９】
植物細胞に対する「組換えベクター」としては、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター、ジェミニウイルスベクターなどが例示される。
【００８０】
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することができる。推定プロモーター領域は、通常構造遺伝子の上流にあるが、好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
【００８１】
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、生物（例えば、植物）の部位（例えば、植物の場合、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実など）におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、生物（例えば、植物）の発達段階（例えば、植物であれば生長段階（例えば、発芽後の芽生えの日数）に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。
【００８２】
本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件下でノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも１つのストレスが生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を「ストレス誘導性」といい、発現量が減少する性質を「ストレス抑制性」という。「ストレス抑制性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析でＲＮＡの発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。ストレス誘導性のプロモーターを目的のポリペプチドをコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された植物または植物の部分（特定の細胞、組織など）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での特定の遺伝子の発現を行うことができる。
【００８３】
本明細書において用いられる「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。植物において使用する場合、エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好ましい。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【００８４】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、プロモーターと構造遺伝子との間に介在する配列が存在してもよいため、プロモーターと構造遺伝子とは必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００８５】
導入した遺伝子の存在は、サザンブロット法またはＰＣＲ法によって確認し得る。導入した遺伝子の転写は、ノーザンブロット法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。
【００８６】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００８７】
（方法および材料）
（１）導入遺伝子
本発明においては、抗生物質耐性遺伝子および／あるいはＧＵＳ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを主に用いたが、これらに限定されない。実施例においては以下の３種のプラスミドを用いた。ｐＢＩ２２１はＣｌｏｎｔｅｃｈ社のもので、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）の３５Ｓプロモーター、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーターを含んでいる。主に導入遺伝子の発現をＧＵＳ活性でモニターする目的で用いた。ｐＷＩ−Ｈ５Ｋ（図１にその制限酵素マップを記載する）は、ｐＷＩ−ＧＵＳ（Ｍａｓａｓｈｉ  Ｕｇａｋｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３７１−３７７，１９９１）のＧＵＳ遺伝子を除去して、ＮＰＴ  II遺伝子を挿入することにより構築した。このｐＷＩ−Ｈ５Ｋは、ｈｐｔ（ハイグロマイシン耐性遺伝子）とＣＭＶのターミネーター並びにＮＰＴ  II（カナマイシン及びゲンタマイシン耐性遺伝子）、ＣＭＶの３５Ｓプロモーターとターミネーターを含んでいる。ｐＢＣ１は、米国・コーネル大学のフロム博士（現、モンサント社）が開発したものであるが、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーターとイントロンの一部、ＧＵＳ遺伝子、ＮＯＳのターミネーター並びにＣＭＶの３５Ｓプロモーター、ｈｐｔ（ハイグロマイシン耐性遺伝子）、ＮＯＳのターミネーターを含んでいる（Ｈａｇｉｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１４：３２９−３３４，１９９５）。プラスミドＤＮＡとして、ｐＷＩ−ＧＵＳのＧＵＳ遺伝子の部分をＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子に置き換えたもの、またはｐｉｇＡ３ＧＦＰプラスミド（Ｔａｍｕｒａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，６９：１−１２，２０００）なども用いられる。
【００８８】
（２）種子の前処理（１日目）
種子は当研究所で生育したもの、あるいは種・種苗会社から購入したものを用いた。目視により適当な完熟種子を約１０〜３０粒選択し（種子の大きさにより異なる）、水道水中にて２５℃で一晩吸水させた。好ましくは、吸水に使用される水道水は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含む（有効塩素濃度が約０．０１％となるように調整する）。コムギの形質転換植物体作出を目的とした実験においては、好ましくは、この吸水は１０℃で二晩にわたって行う。
【００８９】
（３）エレクトロポーレーションの装置
本発明に用いたエレクトロポーレーションの装置には、市販のエレクトロポーレーション手段（例えば、ＣＵＹ２１ＥＤＩＴ遺伝子導入装置、ネッパジーン社、千葉県市川市）を使用し得る。
【００９０】
本実施例においてエレクトロポーレーションを行う際に使用されるエレクトロポーレーションチャンバーは、形質転換の対象となる植物組織を収容できるものであれば、どのような大きさであってもよいが、冷却可能なチャンバーが好ましい。本実施例では、白金電極を備える縦１ｃｍ×横２ｃｍ×高さ２ｃｍの特注のエレクトロポーレーションチャンバーを使用した。
【００９１】
（４）緩衝液の調製（２日目）
１回の実験に、１．５ｍｌの以下の緩衝液と１５０マイクログラムのプラスミドＤＮＡを用いた。緩衝液の組成は、２５０ｍＭ塩化カルシウム、１２．５ｍＭスペルミジン、０．５％ポリビニルピロリドン、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０である。
【００９２】
（５）減圧処理
直径３５ｍｍ×深さ１０ｍｍシャーレに緩衝液と発芽を始めた種子を入れ、０．０９６ＭＰａまたは０．０６ＭＰａの減圧処理を１時間行った。
【００９３】
（６）エレクトロポーレーション
減圧処理の後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに移し、氷上に１分間静置した。そして、実施例に示すように、１００Ｖあるいは５０Ｖの電圧で（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒の矩形波（５０マイクロ秒の間、電圧を加え、７５マイクロ秒休む周期を繰り返す）、パルス回数５０回あるいは９９回行った。さらに氷上にチャンバーを２分間静置した後、緩衝液を捨て、元のシャーレに処理した種子を戻した。この種子を戻したシャーレに、２ｍｌの０．５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）水溶液を入れた。このＰＶＰ水溶液は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム水溶液を含んだ（有効塩素濃度が約０．０１％となるように調整した）。
シャーレを４℃で約１時間保存した後、２５℃で一晩静置した。
【００９４】
（７）種子の後処理（３日目）
翌日、緩衝液を捨て、次いで、同じ組成の新しい緩衝液を２ｍｌ加えて２５℃で一晩静置した。
【００９５】
（８）ＧＵＳ分析（４日目）
翌々日、緩衝液を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液（１００  ｍＭ  ｐＨ７．０  リン酸緩衝液、０．０５％  Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド  シクロヘキシルアンモニウム塩）、０．５ｍＭ  フェリシアン化カリウム、０．５ｍＭ  フェロシアン化カリウム、０．３％  トライントンＸ−１００、２０％  メタノール）を２ｍｌ加え、２５℃で一晩静置した。５日目以降の染色の程度からＧＵＳ遺伝子の発現を確認した。
【００９６】
（９）抗生物質培地による選抜（４日目以降）
ＧＵＳ分析を行わず、以下のように生育させた。
ａ）ろ紙を敷いた９ｃｍ×１５ｍｍのシャーレに、種子を移した。
ｂ）シャーレに蒸留水に溶かした抗生物質の水溶液を１０ｍｌ添加した。コムギの種子をジェネティシンで選抜する場合、この濃度は２０００ｐｐｍまたは１２００ｐｐｍであった。なお、イネの種子をジェネティシンで選抜するときの濃度は、２００ｐｐｍであった。
ｃ）培養室で、２５℃  明期１６時間（約２０００ルクス）  暗期８時間の条件下または２０℃  明期８時間（約２０００ルクス）および８℃  暗期１６時間の条件下にて、育成した。
【００９７】
（１０）形質転換体の育成（１１日目以降）
抗生物質含有培地による選抜の後、植物を、園芸用培土（ニューマジックソイル；株式会社サカタのタネ、横浜市都筑区）を入れた直径８．５ｃｍ、高さ５．５ｃｍのポット（植木鉢）を用いて、隔離型のグロスチャンバーで育成した（１５℃  明期８時間（ナトリウムランプ、約５００００ルクス）、暗期１６時間の条件または２０℃  明期８時間（約２０００ルクス）および８℃  暗期１６時間の条件）。
【００９８】
（１１）ＤＮＡの抽出
遺伝子導入を確認するＰＣＲを行うために、形質転換植物の葉および茎を採取して、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出には、任意の周知の方法を使用し得る。代表的なＤＮＡ抽出方法は、ＣＴＡＢ法である（内宮博文「植物遺伝子操作マニュアル  トランスジェニック植物の作り方」講談社サイエンティフィック，７１−７４頁，単行本，１９８９年）。
【００９９】
（１２）ＰＣＲ分析
エレクトロポーレーション後、１４日目の個体の葉からＤＮＡを抽出し、ＮＰＴ  II遺伝子を検出する一対のプライマー（５’−ｃｔｇｃｇｔｇｃａａｔｃｃａｔｃｔｔｇ−３’：配列番号１、５’−ａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇａｔａｇａａｇ−３’：配列番号２）を用いてＰＣＲを行った。また、さらなる一対のプライマー（５’−ｃａｔｇａｔｔｇａａｃａａｇａｔｇｇａｔｔｇｃａｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃ−３’：配列番号３、５’−ｃａｇａａｇａａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇａｔａｇａａｇｇｃｇａｔ−３’：配列番号４）もまた使用され得、このプライマー対は、より特異的にＮＰＴ  II遺伝子を検出し得るので、より好ましい。ポリメラーゼは、株式会社パーキンエルマージャパン（横浜市西区）のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）を、製造業者の指示に従って、使用した。増幅に使用したサーマルサイクラーの条件は：
（ａ）９５℃  １０分間を１サイクル；
（ｂ）９５℃  １分間、６４℃  ２分間、７２℃  ２分間を５０サイクル；
（ｃ）７２℃  ７分間を１サイクル；および
（ｄ）その後４℃にて保存
であった。
【０１００】
（１３）サザンブロット分析
エレクトロポーレーション後、上記（１２）のＰＣＲ分析により導入遺伝子の存在が確認された個体由来のＤＮＡを用いて、サザンブロット分析を行った。サザンブロット法は当該分野において周知であり、当業者は、その条件を必要に応じて適宜選択し得る。サザンブロット分析では、導入したＮＰＴ  II遺伝子に特異的な配列（配列表において、配列番号５として示される）を、プローブとして使用した。
【０１０１】
（１４）遺伝解析
サザンブロット分析により導入遺伝子が確認された植物については、さらに生育させ、自家受粉により多数の完熟種子を得た。その中からランダムに約１０個の種子を取り、土を詰めたポットで栽培した。幼植物の葉からＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをテンプレートとして上記（１２）ＰＣＲ分析に記載の条件下でＰＣＲを行った。
【０１０２】
（実施例１）
（コムギの形質転換）
コムギ農林６１号の完熟種子を供試した。２５℃で一晩吸水させ、発芽を始めた種子３０粒及びｐＷＩ−ＧＵＳ（ＧＵＳ分析用）あるいはｐＷＩ−Ｈ５Ｋ（生育用）のプラスミドＤＮＡ（２００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに移し、氷上に１分間静置後、電気パルスを印加した。その電気的条件は以下に記載するとおりである。パルス幅は５０マイクロ秒、パルス回数は５０回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃で約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。ＧＵＳ活性を指標にした遺伝子発現量の結果を以下の表１に示す：
（表１）
電圧（Ｖ／ｃｍ）      遺伝子発現量            備考          
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
０                      −
１０                      −
２０                      −
５０                      ±
７５                      ±
１００                      ＋
１５０                      −                種子は褐変・枯死
２００                      −                種子は褐変・枯死。
【０１０３】
上記の結果から、１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）の電圧条件において、最も効率よく形質転換が可能であることが示される。
【０１０４】
同様の結果を、図２に示す。図２は、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回、減圧条件０．０９６ＭＰａの条件下で、Ａ：１００Ｖ、Ｂ：５０Ｖ、Ｃ：２０Ｖ、Ｄ：０Ｖという電圧条件にてエレクトロポーレーションを行った結果を示す。１００Ｖの条件での形質転換効率が最も高かった。
【０１０５】
図３は、１：電圧１００Ｖ、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回、減圧条件０．０９６ＭＰａの条件下で、形質転換したコムギ種子、２：減圧処理を行わずに、電圧１００Ｖ、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回の条件下で、エレクトロポーレーションのみを行ったコムギ種子、３：コントロールのコムギ種子の写真である。図３に示すように、減圧処理とエレクトロポーレーションを組み合わせた場合にのみ、形質転換を行うことができた。
【０１０６】
生育用の種子はＧＵＳ活性の実験を行わず、減圧処理の後、ジェネティシン  ２０００ｐｐｍを含む蒸留水の上で生育させた（上記（７）種子の後処理、（９）抗生物質培地による選抜、および（１０）形質転換体の育成のとおりに行った）。その結果を図４に示す。幼苗からＤＮＡを抽出しＰＣＲ法で導入遺伝子の存在確認を行った（上記（１１）ＤＮＡの抽出、および（１２）ＰＣＲ分析のとおりに行った）。
【０１０７】
配列番号１および２を用いたＰＣＲの結果、ＮＰＴ  II遺伝子が植物体に導入されていることが確認された。
【０１０８】
上記の実験結果の再現性を調べるため、上記と実質的に同じ様式で実験を繰り返して、同様の結果が得られることを確認した。この反復実験で行った具体的な手順の詳細は、以下の通りである。まず、９０×１５ｍｍのシャーレ中に直径７ｃｍの濾紙を入れ、この濾紙の上にコムギ農林６１号の種子１５０粒を置いた。このシャーレに１０ｍｌの水を添加し、１０℃で暗黒下に２日間おいて種子に吸水させた。この添加した水は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム溶液を含んだ（有効塩素濃度が約０．０１％となるように調整）。２日目に、幼根および幼芽が種子を破り、種子の発芽の開始が認められた。この２日目に、この種子を水道水で十分に洗浄し、その直後、本発明の核酸導入処理を行った。このコムギ種子３０粒及びｐＷＩ−Ｈ５ＫのＤＮＡ（２００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに移し、氷上に１分間静置後、電気パルスを印加した。その電気的条件は以下に記載するとおりである。電圧条件は１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅は５０マイクロ秒、パルス回数は５０回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃で約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。この処理を、５回繰り返して、合計１５０粒のコムギ種子に本発明の核酸導入処理を行った。
【０１０９】
次いで、９０×１５ｍｍのシャーレに、褐変防止剤として１０ｍｌの０．５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）水溶液を入れ、そしてこのシャーレに、上記の核酸導入処理後のコムギ種子を置いた。このＰＶＰ水溶液は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム溶液を含んだ（有効塩素濃度が約０．０１％となるように調整）。このシャーレを、１０℃で暗黒下に２日間静置した。２日後、新たな９０×１５ｍｍのシャーレに、１２００ｐｐｍのジェネティシン水溶液１０ｍｌを入れ、そしてこのシャーレに上記のコムギ種子を移した。このジェネティシン水溶液は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム溶液を含んだ（有効塩素濃度が約０．０２％となるように調整）。次いで、このシャーレを、培養室で、２０℃  明期８時間（約２０００ルクス）および８℃  暗期１６時間の春化処理条件下において、種子を２週間育成した。
【０１１０】
さらに、上記のジェネティシン抗生物質による選抜において発芽を示した生存コムギ植物を、土をいれたポットに移植して約３〜４ヶ月間育成した。この育成は、上記と同じ培養室において、２０℃  明期８時間（約２０００ルクス）および８℃  暗期１６時間の条件下で行った。ポットへの移植から約１ヶ月後、育成したコムギ植物から葉を採取し、この採取した葉からＤＮＡを抽出した。この抽出ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行うことにより、導入遺伝子の存在を確認した。このＰＣＲ分析は、上記（１２）ＰＣＲ分析に記載のプライマー対および増幅条件を使用して行った。その結果を図５に示す。
【０１１１】
約５，０００個のコムギ種子を同様に処理した。その結果、ジェネティシン耐性を示す２０５個体の植物が得られ、そのうちの８７個体が、ＰＣＲ分析において導入遺伝子の存在を示した。このＰＣＲで導入遺伝子の存在を示した８７個体をさらに育成し、サザンブロット分析に供した。８７個体のなかで無作為に選択された８個体から抽出されたＤＮＡを用いて、サザンブロット分析を行った。その結果、８個体すべてにおいて、導入したＮＰＴ  II遺伝子の存在が確認された。この結果を図６に示す。
【０１１２】
このサザンブロット分析において導入遺伝子の存在が確認された８個体をさらに育成したところ、８個体すべてにおいて種子稔性のある個体が得られた。この種子稔性を有するコムギ形質転換植物体の写真を、図７に示す。このコムギ形質転換植物体（当世代：Ｔ０世代）から得られた種子（次世代：Ｔ１世代）を土に播種し、幼植物まで生長させた。この幼植物６個体の葉からＤＮＡを抽出し、この抽出ＤＮＡをＰＣＲ分析に供することにより、導入遺伝子の存在を確認した。このＰＣＲ分析も、上記（１２）ＰＣＲ分析に記載のプライマー対および増幅条件を使用した。その結果を図８に示す。図８に示されるように、６個体の幼植物すべてにおいて、導入したＮＰＴ  II遺伝子の存在が確認された。これにより、本発明の核酸導入法が、目的とする外来遺伝子を安定してゲノム中に組み込み、そして本発明の方法によって導入された外来遺伝子は、次世代にも安定して伝達され得ることが明らかとなった。
【０１１３】
（実施例２）
イネジャポニカ品種コシヒカリの完熟種子を材料に用いた。
【０１１４】
２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子３０粒及びｐＷＩ−ＧＵＳあるいはｐＷＩ−Ｈ５ＫのプラスミドＤＮＡ（２００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧５０Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数９９回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。ＧＵＳ活性を指標にした遺伝子発現量の結果を以下の表２に示す：
（表２）
電圧（Ｖ／ｃｍ）      遺伝子発現量            備考            
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
０                      −
１０                      −
２０                      ±
５０                      ＋
７５                      ±            種子は褐変・生育不良
１００                      −            種子は褐変・枯死
１５０                      −            種子は褐変・枯死
２００                      −            種子は褐変・枯死。
【０１１５】
上記の結果から、５０Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）の電圧条件において、最も効率よく形質転換が可能であることが示される。
【０１１６】
同様の結果を、図９に示す。図９は、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数９９回、減圧条件０．０９６ＭＰａの条件下で、Ａ：５０Ｖ、Ｂ：２０Ｖ、Ｃ：１０Ｖ、Ｄ：０Ｖという電圧条件にてエレクトロポーレーションを行った結果を示す。５０Ｖの条件での形質転換効率が最も高かった。
【０１１７】
図１０は、１：電圧５０Ｖ、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数９９回、減圧条件０．０９６ＭＰａの条件下で、形質転換したイネ種子、２：減圧処理を行わずに、電圧５０Ｖ、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数９９回の条件下で、エレクトロポーレーションのみを行ったイネ種子、３：コントロールのイネ種子の写真である。図１０に示すように、減圧処理とエレクトロポーレーションを組み合わせた場合にのみ、形質転換を行うことができた。
【０１１８】
生育用の種子はＧＵＳ活性の実験を行わず、減圧処理の後、ジェネティシン  ２００ｐｐｍを含む蒸留水の上で生育させた（上記（７）種子の後処理、（９）抗生物質培地による選抜、および（１０）形質転換体の育成のとおりに行った）。その結果を図１１に示す。
【０１１９】
上記の実験結果の再現性を調べるため、上記と実質的に同じ様式で実験を繰り返して、同様の結果が得られることを確認した。この反復実験で行った具体的な手順の詳細は、以下の通りである。まず、９０×１５ｍｍのシャーレ中に直径７ｃｍの濾紙を入れ、この濾紙の上にイネ種子（玄米）１００粒を置いた。このシャーレに１０ｍｌの水を添加し、２５℃で明期１６時間の条件下に１日間おいて種子に吸水させた。この添加した水は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム溶液を含んだ（有効塩素濃度が約０．０１％となるように調整）。翌日、この種子を水道水で十分に洗浄し、その直後、本発明の核酸導入処理を行った。このイネ種子２０粒及びｐＷＩ−Ｈ５ＫのＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液１ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧５０Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数９９回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。この処理を、５回繰り返して、合計１００粒のイネ種子に本発明の核酸導入処理を行った。
【０１２０】
次いで、９０×１５ｍｍのシャーレに、褐変防止剤として１０ｍｌの０．５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）水溶液を入れ、そしてこのシャーレに、上記の核酸導入処理後のイネ種子を置いた。このＰＶＰ水溶液は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム溶液を含んだ（有効塩素濃度が約０．０１％となるように調整）。このシャーレを、２５℃で明期１６時間の条件下に２日間静置した。２日後、新たな９０×１５ｍｍのシャーレに、２００ｐｐｍのジェネティシン水溶液１０ｍｌを入れ、そしてこのシャーレに上記のイネ種子を移した。このジェネティシン水溶液は、雑菌の繁殖を抑えるために次亜塩素酸ナトリウム溶液を含んだ（有効塩素濃度が約０．０２％となるように調整）。次いで、このシャーレ中の種子を、２５℃で明期１６時間の条件下において２週間育成した。
【０１２１】
さらに、上記のジェネティシン抗生物質による選抜において発芽を示した生存イネ植物を、土をいれたポットに移植して約３〜４ヶ月間育成した。この育成は、２５℃の閉鎖系温室内において通常の栽培条件下で行った。ポットへの移植から約１ヶ月後、育成したイネ植物から葉を採取し、この採取した葉からＤＮＡを抽出した。この抽出ＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行うことにより、導入遺伝子の存在を確認した。このＰＣＲ分析は、上記（１２）ＰＣＲ分析に記載のプライマー対および増幅条件を使用した。このＰＣＲ分析によって、ＮＰＴ  II遺伝子の存在が確認された。
【０１２２】
約２，０００個のイネ種子を同様に処理した。その結果、ジェネティシン耐性を示す５５個体の植物が得られ、そのうちの３３個体が、ＰＣＲ分析において導入遺伝子の存在を示した。このＰＣＲで導入遺伝子の存在を示した３３個体をさらに育成し、サザンブロット分析に供した。３３個体のなかで無作為に選択された６個体から抽出されたＤＮＡを用いて、サザンブロット分析を行った。その結果、２個体において、導入したＮＰＴ  II遺伝子の存在が確認された。この結果を図１２に示す。
【０１２３】
このサザンブロット分析において導入遺伝子の存在が確認されたイネ植物体をさらに育成したところ、種子稔性のあるイネ植物体が得られた。この種子稔性を有するイネ形質転換植物体の写真を、図１３に示す。このイネ形質転換植物体（当世代：Ｔ０世代）から得られた種子（次世代：Ｔ１世代）を土に播種し、幼植物まで生長させた。この幼植物８個体の葉からＤＮＡを抽出し、この抽出ＤＮＡをＰＣＲ分析に供して導入遺伝子の存在を確認した。このＰＣＲ分析も、上記（１２）ＰＣＲ分析に記載のプライマー対および増幅条件を使用して行った。その結果を図１４に示す。図１４に示されるように、８個体の幼植物すべてにおいて、導入したＮＰＴ  II遺伝子の存在が確認された。これにより、本発明の核酸導入法が、目的とする外来遺伝子を安定してゲノム中に組み込み、そして本発明の方法によって導入された外来遺伝子は、次世代にも安定して伝達され得ることがさらに確証付けられた。
【０１２４】
（実施例３）
イネインディカ品種（ＩＲ２４）の完熟種子を材料に用いた。
【０１２５】
２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子３０粒およびｐＷＩ−ＧＵＳのプラスミドＤＮＡ（２００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧５０Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数９９回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。その結果を図１５に示す。図１５に示すように、減圧処理とエレクトロポーレーションを組み合わせた場合にのみ、形質転換を行うことができた。
【０１２６】
また、減圧処理の後、ジェネティシン２００ｐｐｍを含む蒸留水の上で選抜する。
【０１２７】
（実施例４）
ダイズ品種オオスズの完熟種子を材料に用いた。２５℃で１晩吸水させた。
【０１２８】
発芽を始めた種子１０粒及びｐＢＣ１あるいはｐＷＩ−ＧＵＳのプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。形質転換が成功した結果を図１６に示す。
【０１２９】
（実施例５）
トウモロコシ（品種：ピーターコーン）の完熟種子を材料に用いた。２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子３粒及びプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回である。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻す。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置する。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置する。
【０１３０】
（実施例６）
ハクサイ（品種；無双）の完熟種子を材料に用いた。２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子３０粒及びプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。形質転換が成功した結果を図１７に示す。
【０１３１】
生育用の種子はＧＵＳ活性の実験を行わず、減圧処理の後、適量のジェネティシンを含む蒸留水の上で生育させる（上記（７）種子の後処理、（９）抗生物質培地による選抜、および（１０）形質転換体の育成のとおりに行う）。幼苗からＤＮＡを抽出しＰＣＲ法で導入遺伝子の存在確認を行う（上記（１１）ＤＮＡの抽出、および（１２）ＰＣＲ分析のとおりに行う）。さらに、ＰＣＲで導入遺伝子の存在を示した個体をさらに育成し、サザンブロット分析に供する。無作為に選択された育成個体から抽出されたＤＮＡを用いて、サザンブロット分析を行う。
【０１３２】
（実施例７）
トマト（品種ミニキャロル）の完熟種子を材料に用いた。２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子３０粒及びプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。形質転換が成功した結果を図１８に示す。
【０１３３】
（実施例８）
マクワウリ（品種：キンショーメロン）の完熟種子を材料に用いる。２５℃で１晩吸水させ、発芽を始める。
【０１３４】
種子４０粒及びプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れる。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加する。その電気的条件は電圧１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回である。
【０１３５】
さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻す。
【０１３６】
シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置する。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置する。
【０１３７】
（実施例９）
アサガオ（品種「サンスマイル」と「曜白大輪」）の完熟種子を材料に用いた。２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子１０粒及びプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。形質転換が成功した結果を図１９に示す。
【０１３８】
（実施例１０）
シロイヌナズナ（品種；Ｃｏｌ−０）の完熟種子を材料に用いた。２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子約１０００粒及びプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をマイクロチューブ型チャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。
【０１３９】
生育用の種子はＧＵＳ活性の実験を行わず、減圧処理の後、適量のジェネティシンを含む蒸留水の上で生育させる（上記（７）種子の後処理、（９）抗生物質培地による選抜、および（１０）形質転換体の育成のとおりに行う）。幼苗からＤＮＡを抽出しＰＣＲ法で導入遺伝子の存在確認を行う（上記（１１）ＤＮＡの抽出、および（１２）ＰＣＲ分析のとおりに行う）。ＰＣＲで導入遺伝子の存在を示した個体をさらに育成し、サザンブロット分析に供する。無作為に選択された育成個体から抽出されたＤＮＡを用いて、サザンブロット分析を行う。
【０１４０】
サザンブロット分析において導入遺伝子の存在が確認されたシロイヌナズナ個体をさらに育成して種子稔性のある個体を得る。このシロイヌナズナ形質転換植物体（当世代：Ｔ０世代）から得られた種子（次世代：Ｔ１世代）を土に播種し、幼植物まで生長させる。この幼植物の葉からＤＮＡを抽出し、この抽出ＤＮＡをＰＣＲ分析に供することにより、導入遺伝子の存在を確認する。このＰＣＲ分析も、上記（１２）ＰＣＲ分析に記載のプライマー対および増幅条件を使用する。
【０１４１】
（実施例１１）
マクワウリ（品種「キンショーメロン」）の完熟種子を材料に用いた。２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子３０粒及びプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。減圧なし、ならびに０．０６ＭＰａおよび０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。その結果は、以下の表３のとおりである：
（表３）
減圧（ＭＰａ）        遺伝子発現量          
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
０                      −１
０．０６                −１
０．０９６              ＋２
１−；形質転換した全ての種子において、Ｘ−Ｇｌｕｃによる染色が確認されなかった。
２＋；形質転換した３０個の種子中、１５個以上の種子において、Ｘ−Ｇｌｕｃによる染色が確認された。
【０１４２】
この表３では、Ｘ−Ｇｌｕｃ液での染色の程度を、遺伝子発現量の指標とした。この結果に示されるとおり、マクワウリの場合は、０．０９６ＭＰａ程度の減圧条件が好ましい条件であった。
【０１４３】
次に、マクワウリの形質転換に好ましい電圧条件を検討した。０．０９６ＭＰａの減圧条件を用い、そして以下の表に示される電圧条件を用いた以外は、上記の条件で、マクワウリの形質転換を行った。その結果を以下の表４に示す：
（表４）
電圧（Ｖ／ｃｍ）      遺伝子発現量        
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
０                      −１
１０                      −１
２０                      −１
５０                      ±２
７５                      ±２
１００                      ＋３
１５０                      ±２
２００                      ±２
１−；形質転換した全ての種子において、Ｘ−Ｇｌｕｃによる染色が確認されなかった。
２±；形質転換した３０個の種子中、１〜１４個の種子において、Ｘ−Ｇｌｕｃによる弱い染色が確認された。
３＋；形質転換した３０個の種子中、１５個以上の種子において、Ｘ−Ｇｌｕｃによる染色が確認された。
【０１４４】
上記の結果から、１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）の電圧条件において、最も効率よく形質転換が可能であることが示された。
【０１４５】
（実施例１２）
コムギ品種農林６１号の完熟種子を材料に用いて、減圧条件について比較検討した。２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子３０粒及びプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。プラスミドＤＮＡを含まないエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌ中の発芽種子を、コントロールとした。減圧なし、ならびに０．０６ＭＰａまたは０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後（ただし、コントロールの種子には、減圧処理を行わなかった）、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧１００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃で約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。その結果を、図２０に示す。Ｘ−Ｇｌｕｃ液での染色の程度を、遺伝子発現量の指標とすると、図２０に示されるように、コムギの場合は０．０９６ＭＰａ程度の減圧条件が好ましい条件であった。また、０．０６ＭＰａ程度の減圧を行ったコムギ種子においても、Ｘ−Ｇｌｕｃ液での染色が確認された。
【０１４６】
（実施例１３）
イネジャポニカ品種コシヒカリの完熟種子を材料に用いて、減圧条件について比較検討した。２５℃で１晩吸水させ、発芽を始めた種子３０粒及びプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れた。プラスミドＤＮＡを含まないエレクトロポーレーション緩衝液２ｍｌ中の発芽種子を、コントロールとした。減圧なし、ならびに０．０６ＭＰａまたは０．０９６ＭＰａで１時間減圧処理を行った後（ただし、コントロールの種子には、減圧処理を行わなかった）、シャーレの中の種子と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポーレーションにより電気パルスを印加した。その電気的条件は電圧５０Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数９９回であった。さらに氷上にチャンバーを２分間静置後、元のシャーレに種子と緩衝液を共に戻した。シャーレを４℃で約１時間保存した後、２５℃で１晩静置した。翌日、緩衝液を捨て、蒸留水を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。さらに翌々日、蒸留水を捨て、Ｘ−Ｇｌｕｃ液を２ｍｌ加えて２５℃で１晩静置した。その結果を、図２１に示す。Ｘ−Ｇｌｕｃ液での染色の程度を、遺伝子発現量の指標とすると、図２１に示されるように、イネの場合は０．０９６ＭＰａ程度の減圧条件が好ましい条件であった。また、０．０６ＭＰａ程度の減圧を行ったイネ種子においても、Ｘ−Ｇｌｕｃ液での染色が確認された。
【０１４７】
（実施例１４）
（カイコの形質転換）
節足動物であるカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｌｉｎｎａｅｕｓ）の卵を用いる。冷蔵庫で保存中の休眠卵から任意に５０粒、もしくは産卵直後から産卵後１０日目の範囲の非休眠卵から任意に５０粒のカイコ卵、及びプラスミドＤＮＡ（２００μｇ／２ｍｌ）を添加したエレクトロポレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れる。プラスミドＤＮＡとして、ｐＷＩ−ＧＵＳのＧＵＳ遺伝子の部分をＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子に置き換えたものを用いる。または、ｐｉｇＡ３ＧＦＰプラスミド（Ｔａｍｕｒａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，６９：１−１２，２０００）を用いる。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子は市販品（フナコシ株式会社、東京都文京区本郷）を用いる。０．０９６ＭＰａで５分間減圧処理を行った後、シャーレの中の卵と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポレーションにより電気パルスを印加する。その電気的条件は電圧５０Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５回である。さらに氷上にチャンバーを２分間静置する。
【０１４８】
ろ紙を敷いたシャーレにエレクトロポレーションを行った卵のみを移し、２５℃で２〜３週間育成する。飼料は市販の人工飼料（片倉工業株式会社、埼玉県狭山市奥富）などを用いる。孵化した幼虫に紫外光や青色光を照射し、核酸導入体が発する緑色蛍光を確認する。
【０１４９】
緑色の蛍光を確認した幼虫についてはさらに成体まで育成し、同種類の核酸を導入した他の個体などと交配し、導入した核酸の次世代個体への伝達を、紫外光や青色光を照射したときに発生する緑色蛍光で確認する。
【０１５０】
（実施例１５）
（大腸菌の形質転換）
原核生物である大腸菌を用いる。大腸菌約１０６〜１０８細胞／ｍｌ及びｐＢＣ１プラスミドＤＮＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したエレクトロポレーション緩衝液２ｍｌをシャーレに入れる。０．０９６ＭＰａで１分間減圧処理を行った後、シャーレの中の大腸菌と緩衝液をチャンバーに入れ、氷上に１分間静置後、エレクトロポレーションにより電気パルスを印加する。その電気的条件は電圧２００Ｖ（ただし、電極間の距離は１ｃｍ）、パルス幅２マイクロ秒、パルス回数１回である。さらに氷上にチャンバーを２分間静置する。
【０１５１】
エレクトロポーレーションを行った大腸菌を、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ（市販の実験書、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２版を参照のこと）寒天培地に移植し、３７℃で１晩培養する。この大腸菌よりプラスミドＤＮＡとゲノムＤＮＡを各々抽出し、ＰＣＲ法などによりアンピシリン耐性遺伝子の存在を確認する。
【０１５２】
（実施例１６）エレクトロポーレーション装置およびチャンバー
ここで本発明のエレクトロポーレーション装置およびエレクトロポーレーションチャンバーを、添付の例示的な図面を参照して説明する。ここで説明するそれぞれの図面は、本発明の一実施形態を示すに過ぎず、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【０１５３】
図２２は、本発明のエレクトロポーレーション装置の一実施形態を示す。この装置は、細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する手段とエレクトロポーレーション手段とを備える。容器（１０６）の内側には、対向する少なくとも一対の電極（１０４、１０５）が配置される。なお、図２２では、一対（二個）の電極（１０４、１０５）として描かれているが、この容器（１０６）内に配置される電極対は、一対より多い電極対であってもよい。この容器（１０６）は、必要に応じて、温度制御手段（１２８）を備える。核酸導入の対象となる細胞（１０９）および導入される核酸（１１０）は、必要に応じて緩衝液（１１１）と共に、この容器（１０６）中に配置される。この容器（１０６）は、一つの実施形態では、別の容器（１０８）の内部に配置される。この容器（１０８）の内部は、大気圧と異なる圧力に維持されることが可能である。容器（１０８）の内部の圧力の変更は、容器内部を大気圧と異なる圧力に維持する手段（１２６）を作動させて通気口（１０７）を通して空気を導入すること（加圧処理の場合）または空気を排出すること（減圧処理の場合）によって、達成され得る。容器（１０６）が、密閉可能な蓋をさらに備えることによって、容器（１０６）と容器（１０８）とは同一の容器であり得る（すなわち、容器（１０６）が容器（１０８）を代替し得る）。この装置はさらに、高電圧パルスを発生する手段（１０１）を含み、この高電圧パルス発生手段（１０１）に接続した２本のコード（１０２、１０３）は、それぞれ、一対となった２つの電極（１０４、１０５）に接続される。高電圧パルス発生手段（１０１）をオンにして高電圧パルスを発生させると、接続された電極（１０４）と電極（１０５）は、それぞれ、アノードとカソードまたはカソードとアノードとして作用し得る。必要ではないが、好ましくは、この高電圧パルス発生手段（１０１）は、電流の流れを逆転させる極性切替手段（１２７）を備える。極性切替手段（１２７）を、オン／オフに作動することにより、細胞（１０９）と核酸（１１０）とに二種類の方向から電圧パルスをかけることが可能となる。
【０１５４】
図２３は、本発明のエレクトロポーレーション装置の他の実施形態を示す。この装置は、一つの容器（２１２）の内部で、細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する手段とエレクトロポーレーション手段とが別々に配置されている装置を示す。この装置において、細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する手段は、容器（２０６−ａ）を含む。容器（２０６−ａ）中には、核酸導入の対象となる細胞（２０９）が配置される。必要に応じて、この容器（２０６−ａ）中には、細胞（２０９）と共に、導入される核酸および／または緩衝液も配置される。容器（２０６−ａ）は、一つの実施形態では、別の容器（２０８）の内部に配置される。この容器（２０８）の内部は、大気圧と異なる圧力に維持されることが可能である。容器（２０８）の内部の圧力の変更は、容器内部を大気圧と異なる圧力に維持する手段（２２６）を作動させて、通気口（２０７）を通して空気を導入すること（加圧処理の場合）または空気を排出すること（減圧処理の場合）によって、達成され得る。容器（２０６−ａ）が、密閉可能な蓋をさらに備えることによって、容器（２０６−ａ）と容器（２０８）とは同一の容器であり得る（すなわち、容器（２０６−ａ）が容器（２０８）を代替し得る）。
【０１５５】
上記手段によって減圧および／または加圧処理された細胞は、次いで、エレクトロポーレーション手段によって処理される。エレクトロポーレーション手段は、容器（２０６−ｂ）を含む。容器（２０６−ｂ）は、容器（２０６−ａ）と異なっても同一であってもよく、すなわち、加圧および／または減圧処理に使用された容器（２０６−ａ）がそのまま容器（２０６−ｂ）として使用されてもよい。必要に応じて、この容器（２０６−ａ、２０６−ｂ）は、温度制御手段（２２８−ａ、２２８−ｂ）を備える。容器（２０６−ｂ）の内側には、対向する少なくとも一対の電極（２０４、２０５）が配置される。なお、図２３では、一対（二個）の電極（２０４、２０５）として描かれているが、この容器（２０６−ｂ）内に配置される電極対は、一対より多い電極対であってもよい。核酸導入の対象となる細胞（２０９）および導入される核酸分子（２１０）は、必要に応じて緩衝液（２１１）と共に、この容器（２０６−ｂ）中に配置される。このエレクトロポーレーション手段はさらに、高電圧パルスを発生する手段（２０１）を含み、この高電圧パルス発生手段（２０１）に接続した２本のコード（２０２、２０３）は、それぞれ、２つの電極（２０４、２０５）に接続される。高電圧パルス発生手段（２０１）をオンにして高電圧パルスを発生させると、接続された電極（２０４）と電極（２０５）は、それぞれ、アノードとカソードまたはカソードとアノードとして作用し得る。必要ではないが、好ましくは、この高電圧パルス発生手段（２０１）は、電流の流れを逆転させる極性切替手段（２２７）を備える。極性切替手段（２２７）を、オン／オフに作動することにより、細胞（２０９）と核酸（２１０）とに二種類の方向から電圧パルスをかけることが可能となる。
【０１５６】
図２４は、本発明のエレクトロポーレーション装置の他の実施形態を示す。この装置は、細胞を大気圧と異なる圧力下に維持することと組み合わせて、核酸を細胞内に導入するためのエレクトロポーレーション装置を示す。この装置は、エレクトロポーレーション手段のみを含む。この装置は、容器（３０６）を含む。容器（３０６）の内側には、対向する少なくとも一対の電極（３０４、３０５）が配置される。なお、図２４では、一対（二個）の電極（３０４、３０５）として描かれているが、この容器（３０６）内に配置される電極対は、一対より多い電極対であってもよい。この容器（３０６）は、必要に応じて、温度制御手段（３２８）を備える。核酸導入の対象となる細胞（３０９）および導入される核酸分子（３１０）は、必要に応じて緩衝液（３１１）と共に、この容器（３０６）中に配置される。この細胞（３０９）は、任意の他の手段によって、大気圧と異なる圧力下に配置されて加圧および／または減圧処理を受けた細胞である。この装置はさらに、高電圧パルスを発生する手段（３０１）を含み、この高電圧パルス発生手段（３０１）に接続した２本のコード（３０２、３０３）は、それぞれ、一対となった２つの電極（３０４、３０５）に接続される。高電圧パルス発生手段（３０１）をオンにして高電圧パルスを発生させると、接続された電極（３０４）と電極（３０５）は、それぞれ、アノードとカソードまたはカソードとアノードとして作用し得る。必要ではないが、好ましくは、この高電圧パルス発生手段（３０１）は、電流の流れを逆転させる極性切替手段（３２７）を備える。極性切替手段（３２７）を、オン／オフに作動することにより、細胞（３０９）と核酸（３１０）とに二種類の方向から電圧パルスをかけることが可能となる。この装置において、電極（３０４）と電極（３０５）との間の距離（α）は、植物種子を収容し得る距離である。植物種子を収容し得る距離は、本明細書中の上記において定義されている。
【０１５７】
図２５は、本発明の直方形エレクトロポーレーションチャンバーの一実施形態を示す。このチャンバーは、大気圧と異なる圧力に耐える能力を有する材料（例えば、ポリプロピレンなど）から作製される。このエレクトロポーレーションチャンバー（４０６）の内側には、内壁に密着して、対向する少なくとも一対の電極（４１３、４１４）が配置される。なお、図２５では、一対（二個）の電極（４１３、４１４）として描かれているが、この容器（４０６）内に配置される電極対は、一対より多い電極対であってもよい。電極（４１３、４１４）は好ましくは、対向する二面に沿って配置される板状の形態である。必要に応じて、この電極（４１３）および電極（４１４）からはそれぞれ、電極（４１３、４１４）と同じかまたは異なる金属で作製された線（４０４）および線（４０５）が伸長する。この線（４０４）および線（４０５）に対して、高電圧パルス発生手段（４０１）に接続したコード（４０２）およびコード（４０３）が、それぞれ接続される。線（４０４）および線（４０５）は存在しなくてもよく、存在しない場合には、高電圧パルス発生手段（４０１）に接続したコード（４０２）およびコード（４０３）は、電極（４１３）および電極（４１４）に直接的に接続され得る。高電圧パルス発生手段（４０１）をオンにして高電圧パルスを発生させると、接続された電極（４１３）と電極（４１４）は、それぞれ、アノードとカソードまたはカソードとアノードとして作用し得る。このチャンバーは、植物種子を収容し得る大きさを有する。このチャンバーの大きさは、横断面の縦ａ×横断面の横ｂ×高さｃの内寸によって表される。植物種子を収容し得る大きさは、本明細書中の上記において定義されている。好ましくは、植物種子を収容し得るこのチャンバーの大きさは、縦１ｃｍ×横２ｃｍ×高さ２ｃｍである。核酸導入の対象となる細胞および導入される核酸分子は、必要に応じて緩衝液と共に、この容器（４０６）中に配置される。この容器（４０６）は、必要に応じて、温度制御手段（４２８）を備える。
【０１５８】
図２６は、本発明のマイクロチューブ形エレクトロポーレーションチャンバーの一実施形態を示す。このチャンバー（５０６−ａ）は、大気圧と異なる圧力に耐える能力を有する材料（例えば、ポリプロピレンなど）から作製される。このチャンバー（５０６−ａ）の内側には、内壁に密着して、対向する少なくとも一対の電極（５０４、５０５）が配置される。なお、図２６では、一対（二個）の電極（５０４、５０５）として描かれているが、この容器（５０６−ａ）内に配置される電極対は、一対より多い電極対であってもよい。電極（５０４、５０５）は、好ましくは、例えば、マイクロチューブの内面に、ステンレス箔（例えば、約５×４０ｍｍ（厚さ約０．１ｍｍ））を接着剤などで貼り付けることによって作製され得る。特定の実施形態では、この電極（５０４）および電極（５０５）の末端は、このマイクロチューブ（５０６−ａ）からはみ出るように配置される。これらの電極（５０４）および電極（５０５）の末端に対して、高電圧パルス発生手段（５０１）に接続したコード（５０２）およびコード（５０３）が、それぞれ接続される。高電圧パルス発生手段（５０１）をオンにして高電圧パルスを発生させると、接続された電極（５０４）と電極（５０５）は、それぞれ、アノードとカソードまたはカソードとアノードとして作用し得る。このチャンバーは、植物種子を収容し得る大きさを有する。このチャンバーの大きさは、横断面の直径ｅ×高さｄの内寸によって表される。植物種子を収容し得る大きさは、本明細書中の上記において定義されている。好ましくは、植物種子を収容し得るこのチャンバーの大きさは、直径１ｃｍ×高さ４ｃｍである。核酸導入の対象となる細胞および導入される核酸分子は、必要に応じて緩衝液と共に、この容器（５０６−ａ）中に配置される。必要に応じて、このマイクロチューブ（５０６−ａ）は、マイクロチューブを密封するための蓋（５１５）を備える。この容器（５０６−ａ）は、必要に応じて、温度制御手段（５２８）を備える。
【０１５９】
上記の例では、図２６に示されるように、胴体が均一である横断面を有し、かつ底が先細りしている形状のマイクロチューブ（５０６−ａ）を用いて例示されたが、本発明のマイクロチューブ型エレクトロポーレーションチャンバーの形状は、他の任意の形状であり得る。例えば、このチャンバーは、胴体の横断面が均一でなく、底に向かって徐々に先細りしていく形状のマイクロチューブ（５０６−ｂ）であり得る。他の実施形態では、このチャンバーは、胴体の横断面が頂部から底部まで均一であり、従って、底が先細りしていない形状のマイクロチューブ（５０６−ｃ）であり得る。さらに他の実施形態では、このチャンバーは、胴体の横断面が均一でない、５０６−ｄに示されされるような形状でもあり得る。
【０１６０】
本発明のチャンバーは、植物種子を収容し得る大きさを有する限り、任意の形状であり得る。チャンバーが、植物種子を収容し得る大きさであるか否かは、チャンバーの内面に接する内接円の直径を測定することによって確認され得る。この内接円は、チャンバー内面上における少なくとも３つの任意の点に接する。例えば、図２７に示されるように、三角柱のような形状のチャンバー（６０６）である場合、図２７に示されるように３点で接する最大の内接円（６１６）の大きさ（直径（ｆ））が、植物種子を収容し得る大きさである。そしてこの三角柱形状のチャンバー内には、例えば、図２７に示されるように、少なくとも一対の電極（６０４−ａ、６０５−ａ）が配置される。なお、図２７に示される三角柱形状のチャンバーでは、一対（二個）の電極（６０４−ａ、６０５−ａ）として描かれているが、この容器（６０６）内に配置される電極対は、一対より多い電極対であってもよい。同じく図２７に示されるように、五角柱のような形状のチャンバー（６０７）である場合、図２７に示されるように５点で接する最大の内接円（６１７）の大きさ（直径（ｇ））が、植物種子を収容し得る大きさである。そしてこの五角柱形状のチャンバー内には、例えば、図２７に示されるように、少なくとも一対の電極（６０４−ｂ、６０５−ｂ）が配置される。なお、図２７に示される五角柱形状のチャンバーでは、一対（二個）の電極（６０４−ｂ、６０５−ｂ）として描かれているが、この容器（６０７）内に配置される電極対は、一対より多い電極対であってもよい。他の形状のチャンバーの場合でも、同様にして描かれる最大の内接円の大きさ（直径）が、植物種子を収容し得る大きさである。
【０１６１】
図２８は、本発明の自動化エレクトロポーレーション装置の簡略化した模式図を示す。この装置は、以下を含む：
ａ）核酸分子と細胞とを含む混合液を入れる容器（７０６−ａ）；
ｂ）該ａ）の容器中に核酸分子を入れる手段（７２４）；
ｃ）該ａ）の容器中に細胞を入れる手段（７２５）；
ｄ）細胞を大気圧と異なる圧力下に維持する容器であって、大気圧と異なる圧力に耐える能力を有する、容器（７０８）；
ｅ）該細胞を、該ｄ）の容器中に配置する手段（７１８−ａ）；
ｆ）該ｄ）の容器中を、大気圧と異なる圧力に維持する手段（７２６）；
ｇ）該核酸分子と該細胞とを含む混合液に電圧パルスをかける容器（７２０）；
ｈ）該核酸分子と該細胞とを含む混合液を、該ｇ）の容器中に配置する手段（７１８−ｂ）；
ｉ）該ｇ）の容器中において、該核酸分子と該細胞とを含む混合液に対して電圧パルスをかける手段（７０１）；および
ｊ）該ｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）およびｉ）の手段を自動化して実行する手段（７１９）。
【０１６２】
まず容器（７０６−ａ）が準備される。この容器（７０６−ａ）に対して、手段（７２５）から細胞が注入される。必要に応じて、この細胞注入の前か、この細胞注入と同時にかまたはこの細胞注入後に、手段（７２４）から核酸分子が、同じ容器（７０６−ａ）中に注入されてもよい。上記細胞（および、必要に応じて、上記核酸分子）またはそれを注入された容器（７０６−ａ）は、配置手段（７１８−ａ）の作用によって、容器（７０８）中に配置される。容器（７０８）は、大気圧と異なる圧力に耐える能力を有する材質（例えば、ポリプロピレンなど）から作製される。この容器（７０８）中に配置された、細胞（および、必要に応じて、核酸分子）を注入された容器を７０６−ｂとして示す。いくつかの場合においては、容器（７０８）と容器（７０６−ｂ）とは同一の容器であり得る。このようにして細胞が容器（７０８）中に配置されると、次いで、手段（７２６）が作動する。この手段（７２６）の作用によって、容器（７０８）中の圧力は大気圧と異なる圧力に維持され、従って、容器（７０８）中に配置された細胞（および、必要に応じて、核酸分子）は、加圧および／または減圧処理を受ける。このようにして加圧および／または減圧処理を受けた細胞またはそれが入った容器は、配置手段（７１８−ｂ）の作用によって、容器（７０８）から出て容器（７２０）中へと配置される（容器（７２０）中に配置される細胞を含む容器を７０６−ｃとして示す（ここで、容器（７２０）と容器（７０６−ｃ）とが同一の容器であってもよい））。容器（７０６−ｂ／７０６−ｃ）中に核酸分子が入っていない場合には、配置手段（７１８−ｂ）が作動する前または後で、手段（７２４）から容器（７０６−ｂ／７０６−ｃ）に核酸分子を注入する。必要に応じて、緩衝液も核酸分子と一緒にまたは核酸分子と別々ではあるが連続して、容器（７０６−ｂ／７０６−ｃ）中に注入され得る。このようにして細胞と核酸分子とを含む混合液が容器（７２０）中に配置されると、次いで、手段（７０１）が作動する。この手段（７０１）の作用によって、容器（７２０）中に配置された細胞と核酸分子とを含む混合液は、電圧パルスを受け、それによりその細胞と核酸分子との間でエレクトロポーレーションが起こる。本発明のエレクトロポーレーション装置は、さらに、上記の各手段（具体的には、７２４、７２５、７１８−ａ、７２６、７１８−ｂ、および７０１として示される手段）を自動化して実行する制御手段（７１９）を備える。制御手段７１９と各手段７２４、７２５、７１８−ａ、７２６、７１８−ｂ、および７０１との間は、図２８に示されるように、それぞれコード（７２１−ａ、７２１−ｂ、７２１−ｃ、７２１−ｄ、７２１−ｅ、および７２１−ｆ）で接続されており、これらのコードの内部を通って制御信号が伝達される。この本発明の自動化エレクトロポーレーション装置において、手段（７２４）および手段（７２５）は、互いに同一であっても異なっても良く、そして手段（７１８−ａ）および手段（７１８−ｂ）は、互いに同一であっても異なっても良く、そして容器（７０６−ａ）、容器（７０６−ｂ）および容器（７０６−ｃ）は、互いに同一であっても異なっても良い。さらに、本発明のエレクトロポーレーション装置において、容器（７０８）中における加圧および／または減圧処理と、容器（７２０）中におけるエレクトロポーレーション処理とは任意の順序で実行され得る。好ましくは、容器（７０８）中における加圧および／または減圧処理の後に、容器（７２０）中におけるエレクトロポーレーション処理が実行され得る。
【０１６３】
図２９では、より具体的に、本発明の自動化エレクトロポーレーション装置の一実施形態を示す。図２９に示される実施形態では、まず、細胞を入れる手段（８２５）から、容器（８０６−ａ）中に細胞が注入される。必要に応じて、この細胞注入の時点で、核酸分子を入れる手段（８２４）から、核酸分子もまた容器（８０６−ａ）中に注入され得る。必要に応じて、容器（８０６−ａ）は、電極（８０４−ａ、８０５−ａ）も含む。このようにして細胞（および、必要に応じて、核酸分子）を注入された容器（８０６−ａ）は、ベルトコンベアなどのような手段（８１８−ａ）によって、容器（８０８）の入口（８２２−ａ）を通って、容器（８０８）中に配置される。容器（８０８）中に配置された、細胞（および、必要に応じて、核酸分子）を注入された容器を８０６−ｂとして示す（および、容器（８０６−ｂ）中に配置された電極を、８０４−ｂ、８０５−ｂとして示す）。容器（８０８）中に細胞が配置されると、容器（８０８）の入口（８２２−ａ）および出口（８２２−ｂ）が閉鎖された状態となり、容器（８０８）内は密封される。密封状態となった容器（８０８）において、手段（８２６）が作動し、容器（８０８）中は大気圧と異なる圧力に維持される。この大気圧と異なる圧力への変更は、手段（８２６）が作動して、通気口（８０７）を通して空気を導入すること（加圧処理の場合）または空気を排出すること（減圧処理の場合）によって、達成され得る。この操作により加圧および／または減圧処理された細胞（および、必要に応じて、核酸分子）を注入された容器（８０６−ｂ）は、ベルトコンベアなどのような手段（８１８−ｂ）によって、容器（８０８）の出口（８２２−ｂ）を通って、容器（８０８）から出され、容器（８２０）へと移動される。この時点で容器（８０６−ｂ／８０６−ｃ）中に核酸分子が注入されていない場合には、この移動工程の間に、核酸分子を容器（８０６−ｂ／８０６−ｃ）中に注入する。このように移動して容器（８２０）中に配置された、細胞および核酸分子を注入された容器を、８０６−ｃとして示す（および、容器（８０６−ｃ）中に配置された電極を、８０４−ｃ、８０５−ｃとして示す）。このようにして容器（８２０）中に細胞および核酸分子が配置されると、好ましくは、容器（８２０）の入口（８２３−ａ）および出口（８２３−ｂ）が閉鎖された状態となる。この容器（８２０）は、高電圧パルスを発生する手段（８０１）を含み、この高電圧パルス発生手段（８０１）に接続した２本のコード（８０２、８０３）は、それぞれ、電極（８０４−ｃ）および電極（８０５−ｃ）に接続される。高電圧パルス発生手段（８０１）をオンにして高電圧パルスを発生させると、接続された電極（８０４−ｃ）と電極（８０５−ｃ）は、それぞれ、アノードとカソードまたはカソードとアノードとして作用し得る。必要ではないが、好ましくは、この高電圧パルス発生手段（８０１）は、電流の流れを逆転させる極性切替手段（８２７）を備える。極性切替手段（８２７）を、オン／オフに作動することにより、細胞（８０９）と核酸分子（８１０）とに二種類の方向から電圧パルスをかけることが可能となる。さらに、本発明の自動化エレクトロポーレーション装置は、上記の各手段（具体的には、８２４、８２５、８１８−ａ、８２６、８１８−ｂ、８０１として示される手段）を自動化して実行する制御手段（８１９）を備える。制御手段８１９と各手段８２４、８２５、８１８−ａ、８２６、８１８−ｂ、および８０１との間は、図２９に示されるように、それぞれコード８２１−ａ、８２１−ｂ、８２１−ｃ、８２１−ｄ、８２１−ｅ、および８２１−ｆで接続されており、これらのコードの内部を通って制御信号が伝達される。なお、図２９では、容器（８０６−ａ）中に核酸分子を入れる手段（８２４）と、容器（８０６−ａ）中に細胞を入れる手段（８２５）が、別個の手段として描かれているが、これらの手段８２４と８２５は、同一の手段であってもよい（すなわち、容器（８０６−ａ）中に、細胞と核酸分子とを入れる単一の手段であってもよい）。また、図２９では、電極は一対（二個）の電極（８０４−ａ、８０５−ａ；８０４−ｂ、８０５−ｂ；８０４−ｃ、８０５−ｃ）として描かれているが、この容器（それぞれ、８０６−ａ；８０６−ｂ；８０６−ｃ）内に配置される電極対は、一対より多い電極対であってもよい。さらに図２９では、配置手段（８１８−ａおよび８１８−ｂ）が単一のベルトコンベアとして描かれているが、これらの配置手段８１８−ａおよび８１８−ｂは、連続していない別々の手段であってもよい。また、核酸分子および／または細胞が注入された容器（８０６−ａ、８０６−ｂ、８０６−ｃ）がベルトコンベアにより移動されるのと同時にかまたはその代わりに、圧力を変更する処理に使用される容器（８０８）および／またはエレクトロポーレーション処理に使用される容器（８２０）がベルトコンベアにより移動されてもよい。あるいは、配置手段は、ベルトコンベアなどに拠らずに、自動ポンプなどを利用して、容器（８０６−ａ）、容器（８０６−ｂ）および容器（８０６−ｃ）中に配置された材料／懸濁物を、吸引／排出することによって移動させてもよい。さらに、容器（８０６−ａ）、容器（８０６−ｂ）および容器（８０６−ｃ）は、同じ容器であっても異なる容器であってもよい。異なる容器である場合には、容器（８０６−ａ）から容器（８０６−ｂ）へと、および／または容器（８０６−ｂ）から容器（８０６−ｃ）へと、などのように各容器間で内容物（すなわち、細胞および／または核酸分子）が移し替えられる。この移し替えは、例えば、単に容器を傾けることによってか、または、自動分注機／自動ピペット／自動ポンプなどによって吸引／排出されることによって実施され得る。これらの容器（８０６−ａ、８０６−ｂ、８０６−ｃ）は、必要に応じて、温度制御手段（８２８−ａ、８２８−ｂ、８２８−ｃ）を備える。
【０１６４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１６５】
簡便かつ迅速な核酸導入方法が提供される。
【０１６６】
簡便な本発明の核酸導入方法はこの分野の開発研究において重要な大量処理・大量解析を容易にせしめ、ひいては飛躍的な研究の進歩を誘発し、画期的な組換え作物の開発につながる。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】図１は、ｐＷＩ−Ｈ５Ｋの制限酵素地図である。
【図２】図２は、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回、大気圧より低い（減圧の）０．０９６ＭＰａの条件下でエレクトロポレーションしたコムギ（農林６１号）を示し、そして適用した電圧は、Ａ：１００Ｖ、Ｂ：５０Ｖ、Ｃ：２０Ｖ、Ｄ：０Ｖであった。
【図３】図３は、以下をＧＵＳ染色した結果を示す：（１）減圧処理＋エレクトロポーレーションしたコムギ種子（２）エレクトロポーレーションのみを行ったコムギ種子（３）コントロールのコムギ種子。
【図４】図４は、形質転換したコムギをジェネティシン  ２０００ｐｐｍで選抜した結果を示す。Ａ：プラスミドを用いたサンプル、Ｂ：プラスミドを用いないコントロール。
【図５】図５は、形質転換したコムギのＤＮＡを用いたＰＣＲ分析の結果を示す。レーン１〜８：形質転換したコムギのＤＮＡサンプル、Ｍ：マーカー、Ｐ：ポジティブコントロール、Ｎ：ネガティブコントロール。右の矢印は、目的産物（約０．７５ｋｂ）の位置を示す。
【図６】図６は、形質転換したコムギのＤＮＡを用いたサザンブロット分析の結果を示す。レーン１〜８：形質転換したコムギのＤＮＡサンプル、Ｐ１：ポジティブコントロール１、Ｐ２：ポジティブコントロール２、Ｎ：ネガティブコントロール。右の矢印は、上から順に、約４．０ｋｂ、約２．０ｋｂ、約１．５ｋｂ、および約１．０ｋｂの位置を示す。
【図７】図７は、種子稔性を有するコムギ形質転換植物体の写真を示す。この写真の植物は、図６に示されるサザンブロット分析においてポジティブであった、レーン１およびレーン２の植物に対応する。
【図８】図８は、形質転換したコムギの次世代個体（Ｔ１）のＤＮＡを用いたＰＣＲ分析の結果を示す。レーン１〜６：形質転換したコムギの次世代個体（Ｔ１）のＤＮＡサンプル、Ｍ：マーカー、Ｐ：ポジティブコントロール、Ｎ：ネガティブコントロール。右の矢印は、目的産物（約０．７５ｋｂ）の位置を示す。
【図９】図９は、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数９９回、大気圧より低い（減圧の）０．０９６ＭＰａの条件下でエレクトロポレーションしたイネ種子（ジャポニカ）を示し、そして適用した電圧は、Ａ：５０Ｖ、Ｂ：２０Ｖ、Ｃ：１０Ｖ、Ｄ：０Ｖであった。
【図１０】図１０は、以下をＧＵＳ染色した結果を示す：（１）減圧処理＋エレクトロポーレーションしたジャポニカイネ種子（２）エレクトロポーレーションのみを行ったジャポニカイネ種子（３）コントロールのジャポニカイネ種子。
【図１１】図１１は、形質転換したジャポニカイネのジェネティシン  ２００ｐｐｍでの選抜の結果を示す。Ａ：プラスミドを用いたサンプル、Ｂ：プラスミドを用いないコントロール。
【図１２】図１２は、形質転換したジャポニカイネのＤＮＡを用いたサザンブロット分析の結果を示す。レーン１〜６：形質転換したジャポニカイネのＤＮＡサンプル、Ｐ：ポジティブコントロール（約５コピーに相当）、Ｎ：ネガティブコントロール。右の矢印は、目的産物（約０．８ｋｂ）の位置を示す。
【図１３】図１３は、種子稔性を有するジャポニカイネ形質転換植物体の写真を示す。この写真の植物は、図１２に示されるサザンブロット分析においてポジティブであった、レーン５の植物に対応する。
【図１４】図１４は、形質転換したジャポニカイネの次世代個体（Ｔ１）のＤＮＡを用いたＰＣＲ分析の結果を示す。レーン１〜８：形質転換したジャポニカイネの次世代個体（Ｔ１）のＤＮＡサンプル、Ｍ：マーカー、Ｐ：ポジティブコントロール、Ｎ：ネガティブコントロール。右の矢印は、目的産物（約０．７５ｋｂ）の位置を示す。
【図１５】図１５は、以下をＧＵＳ染色した結果を示す：（Ａ）減圧処理＋エレクトロポーレーションしたインディカイネ種子（Ｂ）エレクトロポーレーションのみを行ったインディカイネ種子（Ｃ）コントロールのインディカイネ種子。
【図１６】図１６は、１：減圧処理＋エレクトロポーレーションしたダイズ種子、２：コントロールのダイズ種子をＧＵＳ染色した結果である。
【図１７】図１７は、Ａ：減圧処理＋エレクトロポーレーションしたハクサイ種子、Ｂ：コントロールのハクサイ種子をＧＵＳ染色した結果である。
【図１８】図１８は、以下をＧＵＳ染色した結果を示す：（Ａ）減圧処理＋エレクトロポーレーションしたトマト種子（Ｂ）エレクトロポーレーションのみを行ったトマト種子（Ｃ）コントロールのトマト種子。
【図１９】図１９は、以下をＧＵＳ染色した結果を示す：（Ａ）減圧処理＋エレクトロポーレーションしたアサガオ種子（Ｂ）コントロールのアサガオ種子。
【図２０】図２０は、電圧１００Ｖ、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数５０回の条件下で、Ａ：大気圧より０．０９６ＭＰａ下、Ｂ：大気圧より０．０６ＭＰａ下、Ｃ：減圧せず、Ｄ：コントロール（ＤＮＡなし、減圧せず）エレクトロポレーションしたコムギを示す。
【図２１】図２１は、電圧５０Ｖ、パルス幅５０マイクロ秒、パルス回数９９回の条件下で、Ａ：大気圧より０．０９６ＭＰａ下、Ｂ：大気圧より０．０６ＭＰａ下、Ｃ：減圧せず、Ｄ：コントロール（ＤＮＡなし、減圧せず）という減圧条件にてエレクトロポレーションしたジャポニカイネ種子を示す。
【図２２】図２２は、本発明のエレクトロポーレーション装置の一実施形態を示す。
【図２３】図２３は、本発明のエレクトロポーレーション装置の他の実施形態を示す。
【図２４】図２４は、本発明のエレクトロポーレーション装置の他の実施形態を示す。
【図２５】図２５は、本発明の直方形エレクトロポーレーションチャンバーの一実施形態を示す。
【図２６】図２６は、本発明のマイクロチューブ型エレクトロポーレーションチャンバーの一実施形態を示す。
【図２７】図２７は、本発明の例示的エレクトロポーレーションチャンバーの内面の少なくとも３点に接する最大の内接円の例を示す。
【図２８】図２８は、本発明の自動化エレクトロポーレーション装置の概略図を示す。
【図２９】図２９は、本発明の自動化エレクトロポーレーション装置の一実施形態を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月12日(2005.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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