(57)【要約】Lactobacillus fermentum細菌の変異株、および、消化器障害、粘膜表面の障害または免疫系の障害または患者の状態の治療におけるその使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質：
(a)グラム陽性で、条件性桿菌であり、
(b)リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、L-アラビノースおよびマンニトール発酵性であり、
(c)pH1.5において、増殖の損失がlog 3以下で4時間に及んで生存し、
(d)37℃、0.5%胆汁酸塩の存在下において増殖し、その結果、光学密度0.5 から0.8に増加し、
(e)ゼラチンカプセル中25℃での貯蔵に関して安定であり、
(f)組織1mgあたりlog 5 cfu超でパイエル板に接着して、直接的な拮抗効果、および免疫制御誘発の双方によって病原体を阻害する、
を有するLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネント。
【請求項２】
VRI 003(受託番号NM02/31074)である請求項１に記載のLactobacillus fermentum変異株。
【請求項３】
当該コンポーネントが細胞画分、細胞抽出物、分泌物または精製成分である請求項１に記載のLactobacillus fermentum変異株のコンポーネント。
【請求項４】
請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株あるいは請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネントと、薬剤として許容される担体とを含む組成物。
【請求項５】
プレバイオティクス、非消化性食品成分、食物繊維または医薬活性成分をさらに含む請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
プレバイオティクスがイヌリン、難消化性澱粉、オリゴ糖、ガム質またはベータ-グルカンである請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記プレバイオティクスが、未変性高アミロース澱粉またはベータ-グルカンである請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記Lactobacillus fermentum変異株の生細胞を含む請求項４ないし７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記Lactobacillus fermentum変異株の死細胞を含む請求項４ないし７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
錠剤、カプセル、粉末、ペースト、ゲル、液状製剤、食品サプリメントまたは食品の形態である請求項４ないし９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
錠剤の形態である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
食品の形態である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記食品が乳製品または乳成分主体の食品である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
液状製剤の形態である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
食品サプリメントの形態である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
消化器障害またはその症状を予防および／または治療する方法であって、その治療を必要とする患者に、請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株、請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネント、あるいは請求項４ないし１５のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記組成物を経口的に投与する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記消化器障害が過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、下痢、鼓脹、膨満、腹部痙攣、腹痛、便秘またはクローン病である請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記消化器障害が病原体によって引き起こされる請求項１６ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記消化器障害が細菌、ウイルスまたは原生動物によって引き起こされる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌がサルモネラ、大腸菌、ヘリコバクター、ビブリオまたはシュードモナスである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスがノーウォークウイルスまたはロタウイルスである請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記原生動物がクリプトスポリジウム、エントアメーバ、ジアルジアまたはジエントアメーバである請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
粘膜表面の障害および／またはその症状を予防および／または治療する方法であって、その治療を必要とする患者に、請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株、請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネント、あるいは請求項４ないし１５のいずれか一項に記載の組成物の有効量を投与する工程を含む方法。
【請求項２５】
前記障害が湿疹、アトピー性皮膚炎またはしゅさである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
消化器障害、粘膜表面の障害またはこれらの症状を治療および／または予防する医薬を製造するための、請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株、請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネント、あるいは請求項４ないし１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２７】
被験者におけるIL-12産生を刺激する方法であって、その処理を必要とする被験者に、請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株、請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネント、あるいは請求項４ないし１５のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項２８】
IFN-γを亢進する方法であって、その処理を必要とする被験者に、請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株、請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネント、あるいは請求項４ないし１５のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
被験者におけるTh-1型応答を誘導する方法であって、その処理を必要とする被験者に、請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株、請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネント、あるいは請求項４ないし１５のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項３０】
病原体の増殖を阻害する方法であって、その処理を必要とする被験者に、請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株、請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネント、あるいは請求項４ないし１５のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項３１】
消化管の常在微生物を調節する方法であって、その処理を必要とする被験者に、請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株、請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネント、あるいは請求項４ないし１５のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項３２】
被験者におけるIL-12産生の刺激、IFN-γの亢進、Th-1型応答の誘導、病原体増殖の阻害、または消化管常在微生物の調節のための医薬を製造するための、請求項１または２に記載のLactobacillus fermentum変異株、請求項１または３に記載のLactobacillus fermentum変異株コンポーネント、あるいは請求項４ないし１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Lactobacillus fermentum変異株、該変異株の製剤およびその成分、ならびに、哺乳類の病気の予防および／または治療、および哺乳類の健康増進におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書を通して、先行技術に関するいかなる論述も、決して、このような先行技術が広く知られている、あるいは当該分野の一般的周知技術の一部を成していることの容認とみなされるべきでない。
【０００３】
特定の細菌性および真菌性疾患の予防において、常在細菌が主要な役割を果たしている。これらは、細菌拮抗プロセス、つまり他の微生物が体内に定着するのを防止することによって役割を果たす。この活動に関るメカニズムとしては、栄養源をめぐる直接の競合、ある領域の酸度を変化させて他の微生物にとって不適な領域となすこと、阻害作用を有する代謝産物や抗微生物化学物質を産生すること、および、他の微生物が宿主の表面に接着するのを防止することなどが挙げられる。
【０００４】
また、常在フローラは免疫系にも影響を及ぼす。無菌環境で飼育された動物は、未発達かつ比較的未分化のリンパ組織、低いレベルの免疫タンパク質、および感染に対して明白な2次反応ではなくて１次反応を、それぞれ呈する。
【０００５】
これらの微生物は、大腸細胞に必要な必須ビタミンおよび栄養素を産生すること、複雑な栄養源の分解を補助すること、病原体の侵入から宿主を防護すること、および 免疫系を刺激することによって、宿主の健康において重要な役割を果たす。さらには、腸内微生物は、この微生物が産生した短鎖脂肪酸による結果的なpH低下によって、ミネラル吸収と脂質分解に貢献すると提案されている。これらの短鎖脂肪酸は大腸の生理機能に対する制御因子であり、腸の正常な機能維持において重要な役割を果たす。
【０００６】
消化管の上流部には、唾液および食物と一緒に嚥下された細菌しか含まれない。胃液の酸度が高いために、正常な胃から培養され得る微生物、主としてラクトバチルスは、わずかしかない。小腸上部には比較的まばらな数のラクトバチルスおよびエンテロコッカスが含まれる。消化管フローラは徐々に変化して、大腸と同じになる。これは、主としてバクテロイド、ビフィドバクテリウム、フゾバクテリウム、ラクトバチルスおよびユーバクテリウムである。
【０００７】
体におけるこの正常フローラは、複雑な生態系であり、食餌、微生物の相互作用や、腸運動能および腸分泌のような宿主側の要因などによって制御される。ストレス、食餌の変化や投薬などの外来要因は、正常フローラに影響して存在する微生物のタイプやその代謝を変化させ得る。このバランスが崩れると、宿主にとって有害となり病気を引き起こし得る。
【０００８】
しかし、時としてこのバランスが失われて、侵入性病原体が、体の防御を突破して感染症を起こすこと、あるいは不適当な免疫応答の引き金となることに成功する。同様に、宿主と常在フローラの間でのバランスが損なわれれば、通常は休止状態の微生物による感染、例えば鵞口瘡(Candida albicans感染症)の発症や、抗生物質処理後のClostridium difcile感染を導き得る。
【０００９】
残念ながら、抗生物質が提供したらしい「魔法の弾丸」は、そのインパクトの一部を失ってしまった。過去30年間で、抗生物質耐性という常に増大し続けていた問題が、主要な公衆衛生問題となった。今日では、いくつかの抗生物質が特定の微生物に対してほとんど無効であり、一方、特定の細菌は知られているほぼ全ての抗生物質投薬に対して抵抗性である。
【００１０】
さらには、大腸の常在微生物の、過敏性腸症候群(IBS)への関与を示しうる証拠が集積している。IBSは、腸の性質の変化、排便障害および膨満により特徴付けられる状態である。
【００１１】
代替となり、できれば補完的な治療手法が必要とされていることは明らかである。
本発明の一目的は、先行技術の短所を克服または改良すること、あるいは有用な代替事物を提供することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
Lactobacillus fermentumの新規変異株であって、この種における既存の株および他のプロバイオティック微生物に対して、驚くべき有利な特徴を有する新規なプロバイオティック変異株が単離された。これは、消化管に対する優れたコロニー形成能を有することから、消化器障害の予防および／または治療において特に有用である。さらに、この変異株は、腸内で局所的に、および共通の粘膜免疫系を介して全身の粘膜部位においてという双方で発揮される優れた免疫制御効果を有する。粘膜系の共通性の結果として、この変異株は、粘膜表面の障害または免疫系における障害または患者の状態に起因する、粘膜表面の他の障害および状態の予防および／または治療にも用いられ得る。
【００１３】
第一の態様によれば、下記：
(a)グラム陽性で、条件性桿菌(facultative rod)であり、
(b)リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、L-アラビノースおよびマンニトール発酵性であり、
(c)pH1.5において、増殖の損失がlog 3以下で少なくとも4時間生存し、
(d)37℃、0.5%胆汁酸塩の存在下において増殖し、その結果、光学密度0.5 から0.8に増加し、
(e)ゼラチンカプセル中25℃での貯蔵に関して安定であり、
(f)組織1mgあたりlog 5 cfu超でパイエル板に接着して、直接的な拮抗効果、および免疫制御誘発の双方によって病原体を阻害する、
の性質を有する新規なLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネントが提供される。
【００１４】
好ましくは、前記Lactobacillus fermentum変異株はVRI 003(受託番号NM02/31074)である。
【００１５】
好ましくは、前記コンポーネントは細胞画分、細胞抽出物、分泌物または精製成分である
。
【００１６】
本発明の第二の態様によれば、第一の態様に係るLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネントと、薬剤として許容される担体とを含む組成物が提供される。
【００１７】
好ましくは、前記組成物は株VRI 003またはそのコンポーネントを含む。好ましい実施形態において、前記組成物は前記Lactobacillus fermentum変異株の生細胞を含む。しかし、当業の読者にとって、前記組成物が前記Lactobacillus変異株の死細胞を含んでいてもよいことは明らかであろう。一実施形態において、前記組成物は細胞画分、細胞抽出物、分泌物または精製成分であるコンポーネントを含む。
【００１８】
このような細胞画分、細胞抽出物、分泌物または精製成分を調製する手順はよく知られている。例えば、細胞を超音波処理すること、または細胞壁自体を物理的に粉砕することができ、および／または細胞内容物を採集することができる。全細胞を洗浄して細胞表面コンポーネントを抽出することができ、必要な場合はその後これらの抽出物を分画してもよい。
【００１９】
好ましくは、前記Lactobacillus fermentumはプレバイオティクス、非消化性食品成分、食物繊維または医薬活性成分などの他の成分と組み合わされる。さらに好ましくは、前記プレバイオティクスはイヌリン、難消化性澱粉、オリゴ糖、ガム質またはベータ-グルカンを含むあるいはこれらからなる。さらにより好ましくは、プレバイオティクスは未変性高アミロース澱粉またはベータ-グルカンである。
【００２０】
前記組成物は、錠剤、カプセル、粉末、ゲル、ペースト、液状製剤、食品サプリメントまたは食品などとして調製することができる。好ましくは、前記組成物は錠剤またはカプセルの形態で調製される。
【００２１】
第三の態様によれば、本発明は、消化器障害またはその症状を予防および／または治療する方法であって、その治療を必要とする患者に第一の態様に係るLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネント、あるいは第二の態様に係る組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２２】
好ましくは、前記Lactobacillus fermentumはVRI 003株である。
【００２３】
本明細書中、「患者(subject)」および「被験者(individual)」の各用語は、互いに交換可能に用いられ、本発明の文脈においては、消化器障害および／または粘膜表面の障害および／または粘膜表面の障害に起因する状態もしくはあらゆる原因による免疫系の障害を、発症し得るあるいは既に発症しているようないかなる哺乳類をもこれら用語の範囲内に包含する。本発明の治療における投与について好ましい患者はヒト、家庭愛玩動物および家畜である。
【００２４】
好ましくは、前記消化器障害は過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病および／またはこれらの症状、例えば下痢、 鼓脹(bloating)、膨満(flatulence)、腹部痙攣、腹痛もしくは便秘などである。  前記消化器障害は細菌、ウイルスまたは原生動物などであり得る病原生物によって引き起こされ得る。しかし、単に消化管に不適切な微生物がコロニー形成することまたは炎症および／または自己免疫機構によっても引き起こされ得る。
【００２５】
好ましくは、前記障害または疾病は、患者の消化管に病原体がコロニー形成した結果である。好ましくは、この障害または疾病は、ここで規定されるような病原体の高度負荷の結果である。さらに好ましくは、前記病原体は細菌、ウイルスまたは原生動物である。最も好ましくは、前記病原体はサルモネラ、大腸菌、ヘリコバクター、ビブリオ、シュードモナスで、クロストリジウム、バクテロイド；あるいはノーウォークウイルスまたはロタウイルスなどのウイルス；あるいはクリプトスポリジウム、エントアメーバ、ジアルジアおよびジエントアメーバなどの原生動物である。
【００２６】
本発明の文脈において、「病原体の高度負荷」は、被験者(subject)が(a)日常さらされている通常の範囲外の分量で病原体の攻撃を受けた場合;(b)毒性の病原体の攻撃を受けた場合;(c) 被験者の抵抗力が低下している時、例えば免疫系が消耗している時および／または被験者のその他自然免疫機構が正常に機能していない時に病原体の攻撃を受けた場合、に起こる。被験者の抵抗力は、例えばストレスまたは抗生物質処置によって低下し得る。
【００２７】
第四の態様において、本発明は、粘膜表面の障害および／またはその症状を予防および／または治療する方法であって、その治療を必要とする患者に、第一の態様に係るLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネント、あるいは第二の態様に係る組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、前記粘膜表面の障害は湿疹、しゅさまたはアトピー性皮膚炎である。
【００２９】
第五の態様において、本発明は、被験者におけるIL-12産生を刺激する方法であって、その処理を必要とする被験者に、第一の態様に係るLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネント、あるいは第二の態様に係る組成物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３０】
第六の態様において、本発明は、IFN-γを亢進する方法であって、その処理を必要とする被験者に、第一の態様に係るLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネント、あるいは第二の態様に係る組成物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３１】
第七の態様において、本発明は、被験者におけるTh-1型応答を誘導する方法であって、その処理を必要とする被験者に、第一の態様に係るLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネント、あるいは第二の態様に係る組成物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３２】
第八の態様において、本発明は、病原体の増殖を阻害する方法であって、その処理を必要とする被験者に、第一の態様に係るLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネント、あるいは第二の態様に係る組成物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３３】
第九の態様において、本発明は、消化管の常在微生物を調節する方法であって、その処理を必要とする被験者に、第一の態様に係るLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネント、あるいは第二の態様に係る組成物の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３４】
要求される投与量は、処理されるべき状態の重篤度、その状態の原因、患者の年齢、および、一定の手順により当業者の技量内で容易に決定され得る、その他の標準的な臨床パラメータによって異なるであろう。
【００３５】
上記のLactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネントあるいは前記変異株を含む組成物の投与は、知られているいかなる手段によって行ってもよいが、好ましくは経口的に投与する。
【００３６】
上記のLactobacillus fermentum変異株あるいは前記変異株を含む組成物あるいはそのコンポーネントは、一以上の他の医薬活性成分と組み合わせて投与され得る。前記変異株または前記変異株を含む組成物は、その他の処理剤と同時に投与（共投与）され得、あるいは、任意の順序で連続的に投与され得る。
【００３７】
前記Lactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネントあるいは前記変異株を含む組成物を、毎日投与することが好ましい。これを、問題としている状態の治療経過、原因および重症度に応じて、1日当たり数回投与することもできるし、あるいはたまに(例えば2日または3日ごとに)投与することもできる。それらのパラメーターもまた、当業者によって容易に決定され得る。
【００３８】
本発明の文脈において、「安定な(stable)」という用語は、その範囲内に、25℃で6ヶ月の貯蔵1回による生存度の損失が25%までであること、を包含する。
【００３９】
本発明の文脈において、「コンポーネント」という用語は、本発明のL fermentumのコンポーネントに用いられるとき、この細菌に由来する細胞画分、細胞抽出物、細胞分泌物およびを精製剤を包含するが、これらに限定されない。
【００４０】
文脈において明白に他の意味が要求されていない限り、「含む(comprise)」、「含んでいる(comprising)」および同様の用語は、詳細な説明および特許請求の範囲を通して、排他的または消耗的な意味でなく包括的な意味で、すなわち、「に限定される」ではなく「を包含する」の意味で解釈されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
これまでに、多くの疾病の予防および治療においてプロバイオティクスを利用する様々な試みがなされているが、消化器障害の治療におけるプロバイオティクスの有用性の証拠は非常に一定しなかった。今回、以下の性質：
(a)グラム陽性で、条件性桿菌であり、
(b)リボース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、トレハロース、ラフィノース、L-アラビノースおよびマンニトール発酵性であり、
(c)pH1.5において、増殖の損失がlog 3以下で少なくとも4時間生存し、
(d)37℃、0.5%胆汁酸塩の存在下において増殖し、その結果、光学密度0.5 から0.8に増加し、
(e)ゼラチンカプセル中25℃での貯蔵に関して安定であり、
(f)組織1mgあたりlog 5 cfu超でパイエル板に接着して、直接的な拮抗効果、および免疫制御誘発の双方によって病原体を阻害する、
を有するLactobacillus fermentum変異株；またはそのコンポーネント（類）が、消化器障害および／またはその症状の予防および／または治療において非常に有効であることが見出された。好ましくは、前記変異株はLactobacillus fermeneum VRI 003である。本発明はさらに、消化器障害またはその症状を予防および／または治療する方法であって、Lactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネント、あるいは前記変異株を含む組成物を患者に投与する工程を含む方法を提供する。前記変異株を他の剤と、例えばプレバイオティクス、非消化性食品成分、食物繊維、またはアスピリンやスタチンなどの医薬活性成分と組み合わせることが可能である。
【００４２】
本発明の方法および組成物は、消化器障害の治療においてヒトおよび獣医適用のために開発されているが、粘膜系の共通性の結果として、この治療物は、粘膜表面の障害または免疫系における障害または被験者の状態に起因する粘膜表面の他の障害および粘膜表面の傷害に起因する状態、または免疫系の障害または患者の病状などのその他障害にも適用され得る。ヒトあるいは家畜のいずれの治療に用いられても、基礎となる原理は同じであり、有利なことに、本発明の治療は上述された原因や状態に関係なく用いることができる。
【００４３】
典型的には、普段の有効投与量は108-1012の範囲の細菌であり、投与頻度は毎日1回または2回である。長期間の摂取に関しては、分量を、例えば上記範囲よりも少なくしてもよい；また、その他の事情下で、上記範囲よりも多い分量で使用してもよい。 
【００４４】
前記Lactobacillus fermentum変異株を、通常薬剤として許容される担体、賦形剤、溶剤やアジュバントを用い、知られている手段で製剤することができる。このような手順および材料はよく知られており、標準的な教科書およびマニュアル、例えば “Remington : The Science and Practice of Pharmacy”, 1995, Mack Publishing Co. Easton, PA 18042, USA, において詳細に記述されており、これは参照として本明細書に取り込まれる。
【００４５】
前記Lactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネントはさらに、通常よく知られた手段によって食品中に調合されてもよい。
【００４６】
前記組成物に含まれる上記の細菌としては、生菌、湿細菌、乾燥細菌、または、細胞画分、抽出物、分泌物および精製成分を包含してこれらに限定されない細菌コンポーネント、が包含される。
【００４７】
本発明の食品または飲料製品は、上記細菌、これと同一物を含有する材料およびその処理済製品の少なくとも一を、有効成分として含有する。
【００４８】
組成物は、様々な手段により、例えば、錠剤、カプセル、液体、食品サプリメント、ペースト、ゲル、食品その他の形態で、経口投与に適するように調合することができる。当業者には、その他の調合についても容易に明らかとなるであろう。
【００４９】
上記の細菌は、食品または飲料製品に利用可能であり、あるいは通常の手法で他の食物材料および食品成分と組み合わせて適切に利用することができる。好ましくは、前記組成物は、乳製品または乳成分主体の食品として調製され、このような乳製品の製造においてごく普通に用いられる他の成分を含有または非含有であってよい。
【００５０】
本発明の組成物はさらに、知られている抗酸化剤、緩衝剤や、着色剤、付臭剤、ビタミン、ミネラルなどその他の剤を含んでいてよい。コーンスターチ、グアーガム、キサンタンガムその他などの増粘剤を前記組成物に添加してもよい。この発明の治療用組成物について好ましい添加成分は、イヌリンなどのプレバイオティクス、非消化性食品成分、食物繊維、医薬活性成分およびその他栄養分を包含し得る。ラクターゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、カタラーゼその他の酵素などの食品サプリメント酵素も包含され得る。好ましいプレバイオティクスには、未変性高アミロースコーンスターチまたはベータ-グルカンが包含される。
【００５１】
上記の細菌は、これを投与される種の消化管組織または粘膜表面に対して生理的に適合性の担体に結合される。担体は、錠剤、カプセルまたは粉末形態への製剤のために、固体ベースの乾燥材料を含んでなるものでよく；あるいは、液状またはゲル状形態への製剤のために、液体またはゲルをベースとした材料を含んでなるものでもよい。担体および最終製剤のタイプの特定は、部分的に、選択した投与経路に依存する。
【００５２】
乾燥製剤用の典型的な担体には、下記：トレハロース、マルトデキストリン、米粉、マイクロクリスタリンセルロース(MCC)ステアリン酸マグネシウム、イノシトール、FOS、GOS、デキストロース、スクロースその他の担体、が包含されるがこれらに限定はされない。乾燥製剤(例えば粉末)を添加して市販の食品(例えば液状調合乳、乳製品、または水)を補助することもできる。同様に、製剤のタイプの特定は投与経路に依存する。
【００５３】
適当な液体またはゲルベースの担体には、下記：水および生理食塩溶液;尿素;アルコールおよび誘導体(例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール) ;グリコール類(例えばエチレングリコール、プロピレングリコールなど)、が包含されるがこれらに限定はされない。好ましくは、水ベースの担体は中性のpH値(例えばpH 7.0)を有する。
【００５４】
上記の担体には保存料も包含され得、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコールおよびエチレンジアミン四酢酸塩などが挙げられる。担体の組成は、これが活性成分の薬理学的活性を著しく阻害しない範囲内で変更することができる。
【００５５】
本発明の方法は、消化器障害、または、粘膜表面の障害および粘膜表面の障害もしくは免疫系の障害または患者の状態に起因する病状、および／またはこのような疾病に伴う症状を、例えば過敏性腸症候群(IBS)、炎症性腸疾患および／またはその症状（例えば下痢、鼓脹、膨満、腹部痙攣、腹痛や、便秘、湿疹、しゅさなど）を治療および／または予防するために、ヒトまたは動物に、前記Lactobacillus fermentum変異株またはそのコンポーネントあるいは前記変異株またはそのコンポーネントを含む組成物を投与する工程を含む。この治療の結果、消化管における常在細菌が調節され得る。投与は、好ましくは錠剤、カプセル、ゲル、液状製剤、粉末、ペースト、食品サプリメントまたは食品などの調製品を用いて実施され、これらは全て、本技術分野で周知の手法を用いて、本発明の治療組成物を含有するように調合される。
【００５６】
ここから本発明の好ましい実施形態を、例示としてのみ説明する。
【実施例】
【００５７】
実施例１：起源および同定
VRI 003変異株は健常被験者から単離された。一連の実験室試験において、このVRI 003株は消化管上皮組織に接着することが見出された。さらに、これがヒト消化管病原体に対して明白な効果を有することと胆汁酸に抵抗性であることも見出された。さらに、このVRI 003株は低pH環境において生存した。また、ペプシンおよび栄養制限条件に対して抵抗性であった。
【００５８】
この細菌株VRI 003は、Rogosa寒天培地（Oxioid）上で培養可能である。プレートを、37℃、嫌気チャンバー内で24時間インキュベートした。引き続いて、MRS寒天(Oxoid)プレートに移植して37℃、嫌気チャンバー内、24時間インキュベートすることで、この株を精製した。そして、嫌気チャンバー内、37℃で24時間、MRSブロスで継代した後に培養ブロスにグリセロールを添加することで、最終培養物を20%グリセロール中-70℃で保存した。
【００５９】
変異株VRI 003は、カタラーゼ陰性、グラム陽性桿菌であり、グルコース含有脳心臓滲出ブロス(BHI)(Oxoid)で嫌気的に成育させるとガスを産生した。したがって、これは大まかにヘテロ発酵乳酸菌であると鑑別され、API炭水化物キットによってL.fermentum株であると確認された(50 CHLキット;Biomerieux;提供者データベース、データベースにて99. 9%の確実性)。とりわけ糖5,10,11,12,13,25,28,29,30,31,32および25が、VRI 003株によって資化された。その細胞は短桿状、グラム陽性であり、Lactobacillus fermentumの形態学的性質と一致する。
【００６０】
ラクトバチルスVRI 003株は、ブダペスト条約の規定に依って、2002年8月27日、Australian Government Analytical Laboratories(PO BOX 385 PYMBLE 2073, NSW, Australia)に寄託され、この寄託に受託番号NM02/31074が付与された。
【００６１】
実施例２：VRI 003株の特性および記述
(i)コロニーの形態学的性質
MRS(Oxoid)寒天培地上、嫌気チャンバー内、37℃で成育させた場合、コロニーは直径約1mm、光沢性、ドーム形、不透明であり、白金耳で触ると粘着性を示す。この粘着性は、細胞外高分子物質が存在するためであろう。同様のプレートにて好気条件、37℃でインキュベートすると、外観粗面かつ外縁不定形の幾つかのコロニーが生成する。これらの粗面コロニーをMRS寒天培地に継代して、嫌気チャンバー内、37℃でインキュベートすると、不透明ドーム形、不透明光沢性、触ると粘着性のコロニーが得られる。
【００６２】
(ii)ブロス中での成育
VRI 003株を、MRS(Oxoid)ブロスあるいは他の種々ブロス中で、嫌気条件37℃で培養すると、粘調のブロスが得られる。
【００６３】
(iii)胆汁酸への抵抗性
図１に示されるように、VRI 003株は、0.5%および0.15%胆汁酸の各存在下（酸をMRSブロス(Oxoid)に添加し、株を嫌気的に37℃で8時間インキュベートした）で成育する。
【００６４】
(iv) 低pH環境における生存
VRI 003グリセロールストックを、MRSブロスに2回継代してからアッセイに供した。アッセイ当日、4000×gの遠心処理によって培養物をMRSブロスから回収し、ペレットを、pH1.5および2.0に各々調整されたClark-Lubsバッファーに希釈して、光学濃度0.4(1×108 CFU/mLに相当する)とした。微生物の生存の測定は、１時間ごとに、4時間に渡って採取された一定分量を連続希釈し、各100マイクロリットルをMRS寒天培地プレートに広げ、その後プレートを37℃で嫌気的に24時間インキュベートして行った。図２に示されるように、pH 1.5において4時間で1ml当たりlog 8.75 cfuからlog 4.93 cfu/mlに減少したL fermentum VRI 002株に比して、L fermentum VRI 003株はより良好に生存した。
【００６５】
(v)炭水化物資化能
API 50CHL炭水化物資化キットを用いて、どの炭水化物をL fermentum VRI 003が資化できるかを検討したところ、インキュベーション時間に関してL fermentum strain VRI 002との差異が注目された。6時間インキュベーション後には、VRI 003は下記の糖を資化することができた。これは、培地が黄色に変化することで判断された。
リボース
ガラクトース
グルコース
フルクトース
マンノース
マルトース
ラクトース
メリビオース
スクロース
トレハロース
ラフィノース
この時点でVRI 002は、マンノースを除く上記全ての物質を資化することができた。
6時間インキュベーション後には、いずれの株も、Gluco Na Teをわずかに資化した。
【００６６】
18時間のインキュベーションにより、試験片のマンノース含有領域において変化が観察され、これにより、VRI 002がマンノースを資化してはいるが、比較的ゆっくりとであることが推測された。
【００６７】
24時間のインキュベーションにより、VRI 003がL-アラビノースおよびマンニトールを資化することが明らかであった。VRI 002は、これら2種に加えてさらに別の糖、すなわち、ラムノースおよびN-アセチル-グルコサミンを資化し始めた。
【００６８】
48時間インキュベーション後、VRI-003株は、Gluco Na Teを全て資化し、一方、VRI-002株はごくわずかな資化能しか有さなかった。
【００６９】
(vi) L fermentum VRI 003の接着性
(a)パイエル板へのin vitro接着性
放射性標識されたL fermentum VRI 003を、in vitroでパイエル板と一緒に30分間インキュベートして、接着レベルを定量した。図３に示されるように、VRI 003は、研究室において発見された他の株(LA 1-L.acidophilus 1, LA 2-L.acidophilus 2, L.caseiおよびVRI-002)に比べて、パイエル板細胞に対する向上した結合性を示した。パイエル板は、腸管免疫系における取り込み部位として働くことから、L fermentum VRI 003株の、このパイエル板への向上した接着性は、この株による高い免疫賦活効果につながるであろう。
【００７０】
(b)L fermentum VRI 003の、パイエル板へのタンパク質制御性の付着。
パイエル板に付着するメカニズムを特徴付ける目的で、接着性アッセイの前にタンパク質分解酵素およびメタ過ヨウ素酸塩でL fermentum細胞を前処理し、タンパク質の多糖が接着に関与しているかを検討した。メタ過ヨウ素酸塩処理により接着性が向上することが示され、したがって、学説にとらわれずに言えば、細胞外多糖は接着性に関与せず、しかも実際には接着性を減少させていると結論付けることができる。L fermentum細胞をタンパク質分解酵素で処理すると、接着性が劇的に減少したことから、パイエル板への接着における細胞壁タンパク質の関与が示される。さらには、L fermentum細胞全体を添加する前に、細胞表面抽出物を組織に添加したところ、これによって細胞の結合がブロックされ得た。よって、パイエル板への親和性を有する部分はL fermentum VRI 003の細胞壁表面上に存在することが確認された。
【００７１】
表Ｉ：接着性に対する、L fermentum VRI 003およびパイエル板組織の化学および酵素処理の効果。
【００７２】
【表１】
2005537791.tif 000002
【００７３】
L fermentum VRI 003細胞から抽出された細胞壁タンパク質の2次元解析を行い、パイエル板に接着しないことが既に示されているL fermentum LMG細胞のそれと比較すると、VRI 003(図4)では、L fermentum LMG(図5)に比して2種の細胞壁タンパク質の発現が亢進し、他の数種の細胞壁タンパク質の発現が減少していることが示される。
【００７４】
(c)ヒト腸管粘膜への接着
L fermentumを、ゼラチンカプセル入り凍結乾燥粉末として摂取(1日当たりlog 10-11、14日間)した被験者を内視鏡観察し、小腸の壁から生検試料を採取した。この生検試料を洗浄し、ホモジナイズした後、接着するラクトバチルスを単離するために、連続希釈してMRS寒天培地に播いた。単離されたラクトバチルスは精製され、VRI 003特異的抗原を用いて、L fermentum VRI 003であることが証明された。
【００７５】
(vii)免疫パラメータに対するL fermentum VRI 003の影響
(a)マクロファージに対するL fermentum VRI 003の直接的影響
骨髄由来のマクロファージを発生させ各種濃度のL fermentum VRI 003で4時間刺激した。L fermentum VRI 003は、高濃度(多種感染濃度 (MOI-260; Conc. 1)でも、低濃度(MOI-26, Conc. 2)でも供給された。
【００７６】
図６から明らかとなるように、マクロファージによる、濃度応答依存的なサイトカイン放出がある。刺激後1日目に、高濃度のL fermentum VRI 002または高濃度のL fermentum VRI 003のいずれで刺激されたマクロファージも、低濃度にて刺激を受けたマクロファージと比べて著しく多量のIL-12を産生した。L fermentum VRI 003刺激に応答してマクロファージにより産生されたIL-10のレベルは、産生されたIL-12レベルに比べて非常に低かった。
【００７７】
このことは予測どおりである。というのも、マクロファージによって、IL-12とIL-10とは互いに排他的に産生されるからである。マクロファージにより産生されるIL-12のレベルは、免疫応答を対抗原応答に向かわせる決定において、重要な役割を果たすと考えられている。消化管樹状細胞の近傍にIL-12が存在することで、T細胞がTh1型応答に向かうよう促される。このデータにより、多い方の量のL fermentum VRI 003が、免疫系をTh1応答へ偏向させる能力を有し、また、このことをL fermentum VRI 002よりも効果的に達成することが示唆される。
【００７８】
(b)in vivo免疫パラメータに対するL fermentum VRI 003の影響
BALB/cマウスに、１×109 cfu/マウス/日のL fermettum VRI 003を5日間経口投与した。このマウスを各種異なる時点において屠殺した。脾臓およびパイエル板を摘出し、免疫パラメータを測定した。
【００７９】
BALB/cマウスに、１×109 CFU/マウス/日のL fermettum VRI 003を5日間経口投与した。対照マウスにはPBSを与えた。これらマウスを6日目に屠殺した。脾臓およびパイエル板を摘出し、免疫パラメータを測定した。
【００８０】
図７に示されるように、L fermettum VRI 003の5日間経口投与は、対照群および実験に使用された別の実験室株(l fermentum -LF 1とは異なるもの)と比べて顕著に亢進した、パイエル板によるIFN-γおよびIL-12を導く。図８により、L fermentum VRI-003の食餌投与は、脾臓におけるサイトカインレベルには影響しないと思われることが示される。L fermentum VRI-003を給餌されたマウスのIL-12およびIFN-γレベルは、（PBSを給餌された）対照マウスと同程度であった。したがって、正常マウスにおける、活動性の感染がない状態でのL fermentum VRI 003経口食餌投与は、粘膜免疫を刺激して、腸病原体に対抗する最適な応答を展開するよう促す。
【００８１】
(viii)L fermentum VRI 003凍結乾燥粉末の安定性
図９により、VRI 003は、低水分活性難消化性澱粉と組合わされて25℃および30℃で貯蔵された場合に、ゼラチンカプセル中で特に安定であることが示される。
【００８２】
(ix)接着
ヒト消化管にコロニー形成する能力は、消化管内でのプロバイオティック株の活性発揮にとって必須の条件ではないが、望ましい性質である。プロバイオティック株が消化管上皮組織に接着可能であれば、この株はコロニー形成することができ、すなわち消化管内に定着して成育することができ、有益な効果を制御し得るような代謝産物を継続的に産生することが可能である。変異株VRI 003は、一連のヒトに対して経口投与された場合において、ヒト消化管にコロニー形成する。
【００８３】
(x)拮抗効果
in vitroの病原体阻害試験により、本株が一連の潜在的病原体を阻害する代謝産物を産生することが明らかになった。潜在的病原体には、グラム陰性およびグラム陽性の双方の種があり、Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Candida albicansおよびStaphylococcus aureusの多数の株が含まれる。
【００８４】
ある特定の作用機序に拘束されることを望むのではないが、プロバイオティック株が個体を消化管病原体から有効に防護するためには、病原体の成育を阻害する何らかの代謝産物を産生する必要があるかもしれない。この成育阻害効果は、拮抗効果と称され、拮抗的代謝産物は、低分子量あるいは高分子量の化合物として分類され得る。一連のヒト病原体に対するVRI 003株の拮抗能力を評価するために、3種の異なる手法、すなわちプレート直接共培養アッセイ、ラクトバチルス不活化培養液中でのブロス培養および負荷動物モデルが用いられてきた。
【００８５】
多数の病原体についてスクリーニングするために直接プレート法を用いた。ラクトバチルスの点接種原を利用して、これらを病原体に覆いかぶせ、病原体の成育が阻害された領域の大きさを測定した。この手法を用いて検出された拮抗効果をさらに定量するために、液体培地中でVRI 003を病原体と一緒に共培養して、24時間後に病原体の生存細胞を数え上げた。上記領域の大きさは、阻害の程度を定量するために用いられた。
【００８６】
VRI 003株の阻害活性もまた試験して、このラクトバチルスによる低分子量および高分子量の代謝産物が、検出された成育阻害効果を制御しているかを検討した。VRI 003の細菌不活化培養液を収集し、一部を、分子量8,000超の物質のみが保留されるように透析した。透析残留物および未透析不活化培養液の各存在下および非存在下で、特定のヒト病原体の成育を検討した。フィルター滅菌した未透析不活化培養液が上記病原体の成育を阻止した一方で、透析液は静菌さらには殺菌効果を示した。
【００８７】
in vitro病原体阻害実験から、上記株が、一連の潜在的病原体（グラム陰性およびグラム陽性の双方の種）の成育を阻害する代謝産物を産生することが明らかになった。上記VRI 003株は、動物負荷試験において、病原体を阻害し防護にはたらくような、低分子量および高分子量双方の代謝産物を産生した。この株を、サルモネラ菌を負荷されたマウスに経口投与すると、サルモネラ菌のみを与えラクトバチルスを与えなかった対照マウスで認められたような体重減少が阻害された。
【００８８】
実施例３：培養および製剤
(i)培養物の成育
Lactobacillus fermentum VRI 003株を、発酵容器中37℃で成育させる。次いで、この容器を冷却し、発酵ブロスを、好ましくは遠心処理にて濃縮させる。収集された培養物を、好ましくは凍結乾燥法で乾燥し、引き続いて破砕する。その後、破砕された物を大部の賦形剤と混合して、乾燥物質1グラム当たり微生物量について所望のレベルを得る。用いるレベルは、適用に応じる(1グラム当たりlog 11までに渡る)。それから、標準化された物質を用い、全ての材料をブレンダー（好ましくはV-ブレンダー）中で混合して製剤する。
【００８９】
(ii)製剤
(a)処方Ａ：高アミラーゼメイズをベースとしたもの（シンバイオティクス製剤）。
Lactobacillus fermentum VRI 003  100mg
Hi-maize 958 (または1043)  170mg
ステアリン酸  4.5mgまでの残部
二酸化ケイ素  4.5mgまでの残部
(b)処方Ｂ：マイクロクリスタリンセルロース(MCC)をベースとしたもの。
Lactobacillus fermentum VRI 003  100mg
Avicell Ph 112 (または同等物)  170mg
ステアリン酸  4.5mgまでの残部
二酸化ケイ素  4.5mgまでの残部
(c)処方Ｃ：ＡおよびＢに述べた高アミラーゼメイズベースまたはMCCをベースとして、二酸化ケイ素の替わりにコロイドケイ酸(4.5mgまでの残部)を用い、または同様に二酸化ケイ素(4.5mgまでの残部)を用いたもの。
【００９０】
VRI 003に望まれる性質の一つは、投与後にヒト消化管内で生存し続け、成育能を有することである。以上で概括したように、この性質は望ましい株を選択する基準のひとつであるが、望まれる有益な効果にとって必ずしも必要ではない。
【００９１】
この点についてのさらなる重要なファクターは、株が消化管内の様々な条件に対して生き残る能力をたとえ有していても、この株は、ラージスケールで成育され製品形態に調剤された場合においても、生存能および株の望ましい特徴を保持していなければならないということである。以上で提示された結果は全て、活発に成育している実験室培養物から直接回収されたVRI 003細胞に基づいていた。以下は、ラージスケール培養および凍結乾燥後の、ならびにゼラチンカプセルへのカプセル封入後の、VRI 003の生存性および菌株特性の分析である。
【００９２】
(iii)凍結乾燥されたVRI 003の生存性
ラージスケール生産および凍結乾燥後におけるVRI 003の生存度測定は、乾燥物の1mLあたりコロニー形成単位(CFU/g)を分析することで行った。
乾燥粉末の評価は、ゼラチンカプセルへのカプセル封入前および後の両方に行った。各1gの粉末サンプル10個について生存細胞数を測定した。同様に、10個のカプセルの内容物をそれぞれ分析した。
【００９３】
VRI 003は生産およびカプセル封入を経ても高レベルの生存度を維持していた。乾燥粉末は5.6×1010 cfu/gを含有していた。また、カプセルの内容物は4.15×1010 CFU/gを含有していた。結果はn=10の場合における平均値で表されている。
【００９４】
上記カプセルをフォイル/フォイルパッケージ材に入れて30℃および25℃で6ヶ月間貯蔵した際に、生存の損失は1.5 logあるいはそれ以下と示された。
【００９５】
(iv)変異株の特性
乾燥粉末およびカプセル内容物を、リン酸緩衝生理食塩水(0, 1M, PH 7. 2)中に懸濁し、100倍希釈液を得た。この細菌懸濁物について、以上で概説されている種々の特性を試験した。全ての試験について、内部対照におけるVRI 003培養物の活発な成育が認められた。以下で詳細に示されるように、凍結乾燥粉末あるいはカプセル内容物のいずれについても、菌株特性の目立った損失は示されなかった。
【００９６】
さらには、上記粉末およびカプセル内容物は、実験室で成育された対照培養物と同様の接着特性を示した。
【００９７】
実施例４： Lactobacillus fermentum VRI、VRI 003投与（プレバイオティクス有りまたは無し条件）の、過敏性腸症候群(IBS)の症状および腸内フローラプロファイルに対する効果
(i)実験計画
・参加者
7名のIBS保持患者(男性2名女性5名)が、文書によるインフォームドコンセント(HREC 99264)を行った後に試験に参加した。患者は全員、試験開始の3か月前から抗生物質を摂取しなかった。治験に参加する前に、IBS診断基準が存在するか、および器質的疾病が存在しないかについて、患者全員が医師により検診された。試験の時点で、患者全員が症状を発現していた。
【００９８】
・治験計画
3週間のプラセボ処理、次に2週間のウォッシュアウト(処理なし)と続き、3週間のシンバイオティクス処理、すなわちVRI 003株およびプレバイオティクスを含有する製剤での処理で終わる過程からなる、継続して8週間に渡るシングルブラインド治験を行った。比較的少人数の患者グループに対して、VRI 003を単独で含有する製剤による処理を行った。
【００９９】
試験において患者の食事制限はしなかったが、患者には、発酵乳製品(例えばヨーグルトやサワークリーム)の摂取は避けるよう助言した。ベースラインを求めるため治験1日目に、その後は21,35および56日目(各処理期間の前および後)に、患者に新鮮糞便検体を提出させた。治験1日目に、患者に初回のアンケートを記入してもらい、その後は治験の各週において、1週間ごとに、患者にアンケートに記入してもらった。
【０１００】
典型的な処理プロトコルは以下の通りである（シンバイオティクス処理に関して規定したものだが、VRI 003単独条件の製剤についても同様のプロトコルを用いた）。
【０１０１】
・カプセルおよび炭水化物
空のカプセルに手動で充填を行った。カプセルの組み立てはラミナフローフード内で実施し、また材料は使用する前に15分間 UV下にて滅菌した。プラセボ用カプセルはマイクロクリスタリンセルロースNF XVIII(Mingtai Chemical Company Ltd, Taiwan)を含有し、一方プロバイオティクスカプセルは、凍結乾燥粉末のLactobacillus ferrnentum(VRI 003)(1.67×1010 cfu.gm-1, DSM Moorebank, Sydney)を含んでいた。組み立てられたカプセルを、シリカゲル2袋と一緒に120 mL容試料瓶に入れた。
【０１０２】
マルトデキストリン(FieldstarTM, Goodman Fielder, SYDNEY)と難消化性澱粉(Culture ProTM958, Penfold Australia)とを、プラセボおよびプレバイオティクス炭水化物としてそれぞれ利用した。炭水化物をラミナフローフード中でUV下に15分間置いた後、試料を計り分け(20 g)て70 mL容試料瓶に入れ、これをクリーンルーム内に貯蔵した。
【０１０３】
・アンケート
治験の開始前に患者の過去および現在の症状を確認するため、初回のアンケートが用いられた。患者は、自分の、下痢、便秘、下痢と便秘との交代性便通異常、膨満、鼓脹および急激な腹痛などの症状の重症度を0(なし)から10(極度)までのスケールで評価するよう求められた。腸障害の原因および軽減ならびに食物アレルギーに関するその他の質問も尋ねられた。
【０１０４】
患者は、治験の継続期間中、各週の終わりに1週間ごとのアンケートを記入するよう求められた。これは、再び自分の症状の重症度を、さらにあらゆる腸障害の性質を評価するよう求めるものであった。さらに、上記カプセルおよび炭水化物の摂取状況および自覚された効果に関する質問も尋ねられた。
【０１０５】
・糞便試料の準備
治験の開始前に、それまで3か月間抗生物質を摂取していなかったIBS患者から糞便接種材料を採集した。便を清潔なプラスチック容器中に採集し、到着後直ちに嫌気チャンバー内に移動した。皮製胃袋中で、便の一部を4分の3量の中力価Wilkin-Chalgrens(WC)ブロス(Oxoid, CM643)と一緒にホモジナイズした。
【０１０６】
・細菌の数え上げ
滅菌マイクロ遠心チューブ内で中力価Wilkin-Chalgrens(WC)ブロス(Oxoid, CM643)による10倍連続希釈を行った。その後、各10μＬずつを、糞便試料中に存在する主な微生物グループの数を評価するために種々の培地上に3連で滴下した(表1)。培地は、製造者の推奨に従って調製した。RCAプレート上に播かれた試料を、まず90℃で10分間加熱した。
【０１０７】
【表２】
2005537791.tif 000003
【０１０８】
(ii) L fermentum VRI 003の単独投与またはプレバイオティクスとの組み合わせ投与による効果-結果概括
表２：単独でまたはプレバイオティクス(高アミロースコーンスターチ) (難消化性澱粉=RS)と共に投与したL fermentum VRI 003株の、IBSの症状の重症度に対する効果。結果は、症状なしに対応する"-"、症状ありの"+"から"+++"まで（最も重症の場合を"+++"とする）で表されている。
【０１０９】
【表３】
2005537791.tif 000004
【０１１０】
VRI 003の投与は、単独で投与された場合であっても効果を上げた。しかし、VRI 003を高アミロースコーンスターチと組み合わせると、プロバイオティクス単独またはベータ-グルカン単独の場合と比べてVRI 003菌のレベルが上昇し、サルモネラおよびクロストリジウムなど特定の細菌のレベルが低下した。
【０１１１】
実施例５：被験期間中のIBS患者からの試料を用いた糞便中微生物プロファイルの変化
治験期間中、絶対好気性菌、腸内細菌、絶対嫌気性菌、グラム陰性嫌気性菌、ラクトバチルス、クロストリジウムおよびビフィドバクテリウムの変化について結果を得た。グラフに表示されている時点は、治験開始(ベースライン)、プラセボ処理の終わり、ウォッシュアウト期間の終わりおよびシンバイオティクス処理の終わりにおける糞便中微生物プロファイルの代表である。結果に関しては、患者は普段の症状体験にしたがって、主症状が下痢、便秘、下痢と便秘との交代性便通異常、というサブグループに分けられた。このサブグループ分類によって、症状を有する患者の体験する多種多様に渡る症状によって、患者を適切に評価することが可能となる(AkehurstおよびKaltenthaler, 2001)。しかし、一人の患者は上記三つのサブグループのいずれにも当てはまらず、そこで、主症状が膨満、鼓脹および急激な腹痛という別個のグループに位置づけられた。
【０１１２】
・下痢を主とする患者
下痢を主とする患者の糞便中微生物プロファイルの変化を、図10（患者4）、図11（患者5）および図12（患者9）に示す。
【０１１３】
患者４（図10）：絶対好気性菌は1×105 log cfu.mL-1の一定レベルに留まっていたが、ただしウォッシュアウト期間には、絶対好気性菌は1 log増加した。最初1×105 log cfu.mL-1と検出された腸内細菌の数は、シンバイオティクス処理期間の終わりまでに1.5 log減少した。しかし、ウォッシュアウト期間の終点において、腸内細菌は絶対好気性菌の数に対する格差の拡大を示し始めた。絶対嫌気性菌およびグラム陰性嫌気性菌はいずれも、初めは5×108 log cfu.mL-1であり、シンバイオティクス処理期間の終わりまでに1 logの増加を示した。ラクトバチルスは最初1×107 log cfu.mL-1と検出され、プラセボおよびシンバイオティクス処理期間の終点において2 logの減少を示し、これらの間、ウォッシュアウト期間に、今度はピークを呈している。クロストリジウムは治験中全期間を通して検出されないままであった。一方、ビフィドバクテリウムは、初め5×107 log cfu.mL-1であり、シンバイオティクス処理期間中に1 log増加した。
【０１１４】
患者５（図11）：絶対好気性菌は初め5×105 log cfu.mL-1で検出され、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理期間中に1 log増加した。腸内細菌はいずれの時点においても絶対好気性菌と同様のレベル（5×105 log cfu.mL-1）を保っていたが、ただしプラセボ処理期間の終点では腸内細菌の数は2 log減少していた。絶対嫌気性菌およびグラム陰性嫌気性菌の各数は、治験期間を通して、1×109 log cfu.mL-1の一定レベルを維持していたが、ただしプラセボ処理期間の終点には各々1 logおよび1.5 log減少した。ラクトバチルスは最初1×106 log cfu.mL-1で検出され、プラセボ処理期間の終点において1 log減少していたが、ウォッシュアウト期間の終点において3 log増加していた。しかし結局、シンバイオティクス処理期間の終点では1 log減少した。クロストリジウムは治験初めに1×103 log cfu.mL-1で検出され、治験の残りの期間を通して検出されないままであった。ビフィドバクテリウムは、初め5×108 log cfu.mL-1であり、シンバイオティクス処理期間中に1 log減少していたが、ウォッシュアウト期間中に1 log増加した。
【０１１５】
患者９（図12）：絶対好気性菌および腸内細菌はベースラインにおいて1×107 log cfu.mL-1で検出され、シンバイオティクス処理期間の終点までに、緩やかに減少し続けて1.5 log減少した。絶対嫌気性菌およびグラム陰性嫌気性菌はベースラインにおいて5×108 log cfu.mL-1であり、プラセボ処理期間の終点には1 log増加していて、試験の残りの期間、定常レベルにとどまっていた。ラクトバチルスはベースラインにおいて5×105 log cfu.mL-1で検出されたが、プラセボ処理期間で検出不能となった。ラクトバチルスはウォッシュアウト期間の終わりに5×103 log cfu.mL-1で再び検出され、シンバイオティクス処理期間の終わりに1 log増加していた。クロストリジウムは治験継続期間中に確認されなかった。ビフィドバクテリウムは初め5×107 log cfu.mL-1であり、プラセボ処理期間の終点で1.5 log減少していたが、ウォッシュアウト期間の終点までに今度は増加して5×108 log cfu.mL-1となり、シンバイオティクス処理期間の終わりまでこのレベルを維持していた。
【０１１６】
・便秘を主とする患者
便秘を主とする患者の糞便中微生物プロファイルの変化を、図13（患者2）および図14（患者3）に示す。
【０１１７】
患者２（図13）：絶対好気性菌および腸内細菌は初め1×107 log cfu.mL-1で検出され、治験期間を通して同程度のレベルを維持していたが、ただしプラセボ処理期間の終点では腸内細菌は1 log増加していた。絶対嫌気性菌およびグラム陰性嫌気性菌の各数は治験期間を通して1×108 log cfu.mL-1という同程度のレベルを維持しており、プラセボ処理期間の終点に1 log増加していて、シンバイオティクス処理期間の終わりまでに0.5 log減少した。ラクトバチルスは初め1×103 log cfu.mL-1であり、プラセボ処理期間の終点には1 log増加していたが、ウォッシュアウト期間の終点においては検出されず、そしてシンバイオティクス処理期間の終わりに3 log再び増加していた。クロストリジウムは1×103 log cfu.mL-1で治験初めにのみ検出され、治験の残りの期間を通して検出されないままであった。ビフィドバクテリウムは初め1×107 log cfu.mL-1で検出され、プラセボ処理期間の終点で1.5 log減少し、治験の残りの期間には検出されなくなった。
【０１１８】
患者３（図14）：絶対好気性菌および腸内細菌は治験継続期間中5×104 log cfu.mL-1で検出され、プラセボ処理期間の終点に2 log増加していたが、シンバイオティクス処理期間の終点までに1 log減少した。絶対嫌気性菌およびグラム陰性嫌気性菌は初め1×107 log cfu.mL-1であり、プラセボ処理期間の終点までに2 logの一定した増加を続けた。ウォッシュアウト期間の終点においては検出されず、そしてに3 log再び増加していた。ラクトバチルスは治験初めに1×104 log cfu.mL-1で検出されたが、その後、プラセボ処理期間の終点に検出されなくなった。しかし、ラクトバチルスはウォッシュアウト期間の終点において4.5 log増加していることが示され、そしてシンバイオティクス処理期間の終わりに今度は0.5 log減少していた。クロストリジウムは1×104 log cfu.mL-1でプラセボ処理期間の終点にのみ検出され、治験中その他の期間には検出されないままであった。ビフィドバクテリウムは初め1×107 log cfu.mL-1であり、プラセボ処理期間には検出不能であったが、ウォッシュアウト期間の終点までに検出されるようになり、シンバイオティクス処理期間の終わりまでに4.5 log増加した。
【０１１９】
・下痢と便秘との交代性便通異常を主とする患者
下痢と便秘との交代性便通異常を主とする患者の糞便中微生物プロファイルの変化を、図15（患者7）に示す。
【０１２０】
患者７（図15）：絶対好気性菌および腸内細菌は初め5×105 log cfu.mL-1で検出され、ウォッシュアウト期間の終わりまでに2 log増加していたが、シンバイオティクス処理期間の終点に1 log減少していた。絶対嫌気性菌およびグラム陰性嫌気性菌は初め5×108 log cfu.mL-1であり、試験期間を通して定常レベルを維持した後、シンバイオティクス処理期間に絶対嫌気性菌が1 log減少、またグラム陰性嫌気性菌が2 log減少した。ラクトバチルスは試験中ほとんど検出されなかったが、ただしシンバイオティクス処理期間の終点では5×103 log cfu.mL-1で検出された。これに対し、クロストリジウムは1×103 log cfu.mL-1で治験開始時にのみ検出された。ビフィドバクテリウムは初め5×106 log cfu.mL-1で検出されたが、プラセボ処理期間中に検出不能となり、ウォッシュアウト期間中にやっと再び5×107 log cfu.mL-1で検出され、シンバイオティクス処理期間の終点に0.5 log増加していた。
【０１２１】
・その他；膨満、鼓脹および急激な腹痛を主とする患者
膨満、鼓脹および急激な腹痛を主とする患者の糞便中微生物プロファイルの変化を、図16（患者6）に示す。
【０１２２】
患者６（図16）：絶対好気性菌および腸内細菌は初め5×105 log cfu.mL-1で検出され、シンバイオティクス処理期間までレベルを維持しており、ここで絶対好気性菌および腸内細菌は、2 log増加した。絶対嫌気性菌およびグラム陰性嫌気性菌はベースラインで1×108 log cfu.mL-1検出され、プラセボ処理期間の終点までに1 log増加し、その後、残りの試験期間はこのレベルにとどまっていた。ラクトバチルスは治験の継続期間中、1×104 log cfu.mL-1という比較的安定したレベルを維持していた。クロストリジウムは試験の間検出されなかったが、ただしシンバイオティクス処理期間の終点においては5×103 log cfu.mL-1で検出された。ビフィドバクテリウムは初め1×107 log cfu.mL-1であり、プラセボ処理期間の終点までで3 log減少し、ウォッシュアウト期間中に再び1×107 log cfu.mL-1で検出されただけで、最終的に、シンバイオティクス処理期間の終点に3 log減少していた。
【０１２３】
実施例６：被験期間中の、IBS患者における症状の重症度の変化
治験期間中、下痢、便秘、下痢と便秘との交代性便通異常、膨満、鼓脹および急激な腹痛を含む症状の重症度の変化について結果を得た。各症状は0から10までのスケールで評価付けされ、0は症状なしを示し、10は症状が極度に重篤であることを示す。結果は1から5のスケールで表示されており、1は比較的軽度の症状を、5は極度に重篤な症状を示す。症状の重症度の変化は全ての患者において毎週観察されたが、結果には、ベースライン（治験の開始）、プラセボ処理期間、ウォッシュアウト期間およびシンバイオティクス処理期間を代表する時点のみを示す。上記と同様に、患者は普段の症状体験にしたがって、主症状が下痢、下痢と便秘との交代性便通異常、便秘、というサブグループに分類された。
【０１２４】
・下痢を主とする患者
下痢を主とする患者の症状の重症度の変化を、表３（患者4）、表４（患者5）および表５（患者9）に示す。
【０１２５】
患者４（表３）：ベースラインにおける下痢の重症度は極度に高かったが、プラセボ処理期間の終わりまでに半分の重症度にまで減少し、さらにシンバイオティクス処理期間の終わりまでに軽度にまで低下した。膨満および鼓脹はベースラインにおいて重症度中度(3)であり、結局、シンバイオティクス処理期間の終わりまでに重症度軽度(1)にまで軽減された。急激な腹痛も、ベースライン開始時点において重症度軽度(2)でシンバイオティクス処理期間の終わりまでに重症度1までさらに軽減された。
・表３：8週間治験中の、患者#4における症状の重症度の変化。
ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中、症状の重症度をモニターした。結果は、+(軽度)から+++++(極度の重症)で表されている。
【０１２６】
【表４】
2005537791.tif 000005
【０１２７】
患者５（表４）：ベースラインにおける下痢の重症度は極度に高く、プラセボ処理期間によっては4までしか減少せず、その後も高い重症度に留まった。膨満のレベルはベースラインにおいて低く、プラセボ処理期間中は無しであったが、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中にそれぞれ1および2の増加があった。急激な腹痛の重症度は、治験中を通してレベル3という一定であり続けたが、ウォッシュアウト期間中に1レベルという多少の低減があった。膨満および鼓脹の症状は、治験の継続期間を通して非存在であり続けた。
・表４：8週間治験中の、患者#5における症状の重症度の変化。
ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中、症状の重症度をモニターした。結果は、+(軽度)から+++++(極度の重症)で表されている。
【０１２８】
【表５】
2005537791.tif 000006
【０１２９】
患者９（表５）：下痢はベースラインにおいて中度(3)に始まり、プラセボ処理期間までこの重症度が継続し、ここで2レベル低下して軽度となった。便秘は治験中に認められなかったが、ただしプラセボ処理期間ではレベル1まで上昇した。膨満も同じく治験中に認められなかったが、ウォッシュアウト期間中に3レベル増加した。鼓脹はベースラインにおいて重症度中度(3)であり、プラセボ処理期間に1レベル減少した。しかし、これはウォッシュアウト期間中に今度は1レベル増加し、その後プロバイオティクス処理期間に軽度(1)まで落ち込んだ。急激な腹痛は、治験の継続期間を通して非存在であった。
・表５：8週間治験中の、患者#9における症状の重症度の変化。
ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中、症状の重症度をモニターした。結果は、+(軽度)から+++++(極度の重症)で表されている。
【０１３０】
【表６】
2005537791.tif 000007
【０１３１】
・便秘を主とする患者
便秘を主とする患者の症状の重症度の変化を、表６（患者2）および表７（患者3）に示す。
【０１３２】
患者２（表６）：下痢は、ベースラインおよび治験中の大部分では認められず、シンバイオティクス処理期間に1レベル上昇した。便秘、膨満および鼓脹はベースライン、プラセボおよびウォッシュアウトの間、重症度高度(5)であり続けたが、シンバイオティクス処理期間に1レベル低下した。急激な腹痛は、ベースラインおよびプラセボ処理期間中において高度(4)であったが、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理期間に3レベル低下して軽度となった。
・表６：8週間治験中の、患者#2における症状の重症度の変化。
ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中、症状の重症度をモニターした。結果は、+(軽度)から+++++(極度の重症)で表されている。
【０１３３】
【表７】
2005537791.tif 000008
【０１３４】
患者３（表７）：便秘はベースラインで軽度(2)に始まり、プラセボ処理期間中はこのレベルを維持していたが、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間には非存在となった。膨満はベースラインで重症度高度(5)に始まり、プラセボ処理期間でレベル3まで低減し、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間に更に減少して軽度(2)にまでなった。鼓脹もベースラインにおいて非常に高度に始まり、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間にそれぞれ4,3および3レベルへの軽減ができた。急激な腹痛は、ベースラインで重症度高度(4)に始まり、プラセボ処理期間中に軽度(1)まで低減し、その後、治験の残りの期間は認められなくなった。下痢は治験の継続期間中に非存在であった。
・表７：8週間治験中の、患者#3における症状の重症度の変化。
ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中、症状の重症度をモニターした。結果は、+(軽度)から+++++(極度の重症)で表されている。
【０１３５】
【表８】
2005537791.tif 000009
【０１３６】
・下痢と便秘との交代性便通異常を主とする患者
下痢と便秘との交代性便通異常を主とする患者の症状の重症度の変化を、表８（患者7）に示す。
【０１３７】
患者７（表８）：下痢はベースラインで軽度(1)に始まったが、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間に2レベル上昇した。便秘はベースラインで軽度(2)であり、プラセボおよびウォッシュアウトの期間に1レベル低下したが、シンバイオティクス処理の期間に3レベル上昇した。膨満はベースラインで軽度(1)に始まり、治験中の大部分では軽度にとどまったが、シンバイオティクス処理の期間に3レベル上昇した。鼓脹はベースラインにおいて軽度(2)に始まり、プラセボ処理期間に1にまで低下したが、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の各期間にそれぞれ3および4レベルと上昇し続けた。急激な腹痛は治験期間中に非存在であったが、ただしシンバイオティクス処理期間には中度(3)まで上昇した。
・表８：8週間治験中の、患者#7における症状の重症度の変化。
ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中、症状の重症度をモニターした。結果は、+(軽度)から+++++(極度の重症)で表されている。
【０１３８】
【表９】
2005537791.tif 000010
【０１３９】
・その他；膨満、鼓脹および急激な腹痛を主とする患者
膨満、鼓脹および急激な腹痛を主とする患者の症状の重症度の変化を、表９（患者6）に示す。
【０１４０】
患者６（表９）：下痢は治験中の大部分で非存在であったが、ただしシンバイオティクス処理期間に、1レベル上昇して軽度となった。膨満はベースラインで中度(3)に始まり、プラセボおよびウォッシュアウト期間で軽度(1)まで軽減したが、シンバイオティクス処理期間に上昇して再び中度(3)になった。鼓脹もベースラインで中度(3)に始まり、そしてプラセボ処理期間に非存在となったが、これもまたウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の各期間にそれぞれ1および3レベル上昇した。急激な腹痛はベースラインで軽度(2)に始まり、プラセボ処理期間には非存在であったが、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の各期間にそれぞれ1および3レベル上昇した。便秘はは治験の継続期間中に非存在であった。
・表９：8週間治験中の、患者#6における症状の重症度の変化。
ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中、症状の重症度をモニターした。結果は、+(軽度)から+++++(極度の重症)で表されている。
【０１４１】
【表１０】
2005537791.tif 000011
【０１４２】
考察
IBS患者からの試料を用いた糞便中微生物プロファイルの変化と治験期間中の症状の重症度との関係
臨床治験は全8週間に渡って継続され、最初の3週間はマルトデキストリンカプセルおよびセルロースによるプラセボ処理であった。引き続いては、処理を施さない2週間のウォッシュアウト期間であった。最後の3週間は、VRI 003カプセルおよびRSからなるシンバイオティクス処理であった。ベースラインを求めるため治験の初めに、その後さらに各処理の前および後に、糞便検体を採集した。さらには、症状の重症度を観察するために、0から10（0は症状なしであり、10は最も重篤である）に渡るスコア付けシステムを用いて、各患者が毎週のアンケートに記入した。その後、便宜のために結果を1から5のスケールに変換して、ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理期間について示した。
【０１４３】
AkehurstらおよびWestonらによって示されているように(AkehurstおよびKaltenthaler, 2001 ; Westonら, 1993)、症状のうち優勢な症状にしたがって、患者を3種類のサブグループに分類した。主症状が下痢、便秘、または下痢と便秘との交代性便通異常のサブグループいずれかに分類することで、普段の症状体験における症状の患者間での幅広い変動性によって、各症状における変化を然るべく評価することが可能となる。一人の患者(#6)は特に、上記三つのサブグループの患者の誰が体験した症状とも異なる症状群を示し、それゆえ主症状が膨満、鼓脹および急激な腹痛という別個のグループに分類された。
【０１４４】
・下痢を主とする患者
患者４は、シンバイオティクス処理期間の終点までに全ての症状について全般的な重症度低減を示し（表３）、特に下痢に関して示した。ベースラインにおいて重度で始まった下痢症状が、その後シンバイオティクス処理期間の終点まで、軽度の状態を持続した。この症状に相関し得ることは、ベースラインにおける1×105 log cfu.mL-1から、シンバイオティクス処理期間の終点における5×103 log cfu.mL-1への、腸内細菌の緩やかな減少（図10）に関連して考えられるであろう。ラクトバチルスの菌数は患者４に見られた症状のいずれとも相関しないように見受けられるが、ビフィドバクテリウムではシンバイオティクス処理期間に1 logの増加が観察されていて、このことは、ビフィドバクテリウムがRSを利用可能であるという先の論述と対応する。しかしながら、この症状の重症度低減はプラセボ期間中に始まっていたことから、ビフィドバクテリウムのこの増加の結果で下痢が軽減したとは考えにくい。よって、この患者では腸内細菌が下痢の重症度に対して一つに留まらない効果を有していたとみてよいだろう。
【０１４５】
患者５は、治験中、いかなる症状についても全般的な軽減を示さないように思われた（表４）。しかし、プラセボ処理期間に膨満が観察されなかったこと、これが腸内細菌数の2 logの減少と関連し得ることに注目してよいだろう（図11）。この患者について全体的に俯瞰すると、上記シンバイオティクス処理はこの人に対していかなる有益な効果を促進することもなく、むしろプラセボ処理が症状の重症度に対して何らかの有益な効果を示し得るように見えるということが示されるだろう。ラクトバチルスの菌数はウォッシュアウト期間に3 log上昇したが、シンバイオティクス処理の終点までに1 log減少した。ウォッシュアウト期間中のラクトバチルスのこの大幅な増加は、患者に示された急激な腹痛がこの時間に軽減したこと、その後シンバイオティクス処理の終点までに重症度が上昇し、同時にこの期間にラクトバチルスがやや減少していたことともまた関連しているだろう。急激な腹痛の軽減と関係してラクトバチルス増加が観察されたことは、Lactobacillus plantarumの投与でIBSを伴う患者の急激な腹痛が軽減されることを観察したNobaekらの発見(Nobaekら, 2000)とも関係する。ウォッシュアウト期間にビフィドバクテリウムの1 logの増加もまた認められ、このこともラクトバチルスの増加と対応している。これは、ビフィドバクテリウムがラクトバチルスの成育を間接的に促進するとの仮説による。この患者ではシンバイオティクス処理期間に症状が改善されたようには見えないが、毎週のアンケートにおけるコメントからは、この処理の間、症状は重症度を増したというよりも、同じ状態に留まっていたと示される。
【０１４６】
患者９は、治験の終わりまでに全ての症状について全般的な重症度改善を示し（表５）、特に下痢および鼓脹について示した。これらはシンバイオティクス処理期間の終点までに重症度中度から軽度へと低減した。これらの症における低減は、ベースラインからシンバイオティクス処理期間終点までにおける腸内細菌の2 logの減少と関連し得る。プラセボ処理期間の後には、ビフィドバクテリウムの3 log増加も観察された。しかし、この増加はウォッシュアウト期間中に始まり、この時症状は依然として中度に留まっていた。よって、ビフィドバクテリウムの菌数は、シンバイオティクス処理期間の症状軽減に関して影響を及ぼしていなかったであろう。シンバイオティクス処理期間終点にラクトバチルス菌数の増加(1 log)も観察され、これは症状の重症度低減と関連しているであろう。ビフィドバクテリウムおよびラクトバチルスの増加は、ビフィドバクテリウムの成育を、したがってラクトバチルスの成育を促進すると示されているRS(Brownら,2000)の投与とも関連するだろう。
【０１４７】
・便秘を主とする患者
患者２はほとんどの症状についても改善を示さないように思われた（表６）が、ただし急激な腹痛は別で、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理期間中に重症度が大幅に低減した。糞便微生物プロファイルによる結果(図13)により、シンバイオティクス処理期間中、ビフィドバクテリウムは検出不能であったことと、この期間中に絶対好気性菌および腸内細菌の減少(1 log)が認められたことが示される。このことにより、腸内細菌の減少が急激な腹痛の症状を軽減し得ることが示されるであろう。しかし、ビフィドバクテリウムの不在が症状軽減とも関連しているとは推測され得るに過ぎず、これは、ビフィドバクテリウムはヒトの腸において有益であると考えられているからである。患者２の糞便微生物プロファイルはさらに、シンバイオティクス処理期間中にラクトバチルス菌数はより多数に上昇しなかったことを示している。このことは、この患者の腸におけるラクトバチルスの初めの菌数が少なく、多数となる刺激まで比較的長い時間が必要であったためであろう。この患者は症状の全般的な改善を本当に示したが、毎週のアンケートからは、治験中に体験された症状は一定であって、重症度が改善されてはいないことが示される。
【０１４８】
患者３は、症状について全般的に重症度の概ね改善を示し（表７）、特に便秘および急激な腹痛について示した。これらはウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理期間の終わりまでに鎮静化された。これらの症状の改善は、シンバイオティクス処理期間の終点におけるビフィドバクテリウム菌数の大幅増加（4 log）(図5)と関連しているだろう。ビフィドバクテリウムの増加は、シンバイオティクス処理期間のRS投与がビフィドバクテリウムの成育を刺激したことを示す。さらに、食物繊維（例えばRS）の投与は、便の嵩を増やすことで便秘症状を軽減することが示されている(Lambertら, 1991 ; Philipsら, 1995)。治験期間中にラクトバチルス菌数はビフィドバクテリウムと比べて低レベルに留まっていたが、もし治験がさらに長期に渡れば、ラクトバチルス菌数がより大規模にまで増加する可能性がある。シンバイオティクス処理期間の終点までに腸内細菌も減少し(1 log)、微小な減少にすぎないが、このこともまた、これら症状の重症度低減に貢献していたであろう。
【０１４９】
・下痢と便秘との交代性便通異常を主とする患者
患者７は、プラセボ処理期間中に全ての症状について全般的な重症度改善を示し（表６）、一方で、シンバイオティクス処理期間中には重症度の増加を呈した。治験中に腸内細菌数の緩やかな増加(図15)が認められており、このことは、腸内細菌の増加が、鼓脹および下痢などの症状の増強に関係し得ることを示唆する。しかし、考慮すべき重要な注意点は、RSなどのプレバイオティクスの投与が、鼓脹および膨満の症状を、たとえ健常な個体においても増強するらしいということ(Cummingsら, 2001 ; Munsterら, 1994)、よって、IBS患者の体験したこれらの症状の増強はあり得ないことではないということである。 ビフィドバクテリウムもウォッシュアウト期間に菌数の増加が観察されたが、プラセボ処理期間に検出不能であった。このことは、ビフィドバクテリウムの増加がもしかするとこれらの症状の重症度上昇に関係しているかもしれないことを示す。ビフィドバクテリウムはRB培地上で非常に多数で検出されるということがさらに観察されており、ビフィドバクテリウム以外の他のバクテリアの種、例えばラクトバチルス種などがこのプレート上で検出され得る(Harteminkら, 1996)ということである。したがって、これらがすべてビフィドバクテリウム種であったかを確認するためには、RB培地上で成育しているコロニーに対して、生化学的試験を実施しなければならないであろう。シンバイオティクス処理期間に症状の重症度が増加したように見えたが、毎週のアンケートでのコメントは、これら症状の体験はベースラインに対して通常であったと示している。
【０１５０】
・その他；膨満、鼓脹および急激な腹痛を主とする患者
患者６において認められた症状の重症度の変化(表９)は、この患者がプラセボ処理期間に症状の軽減を感じたこと、一方シンバイオティクス処理期間は症状に対して有害な影響を与えたように思われたということを示している。プラセボ処理期間には、ビフィドバクテリウムの、およびそれより少ない程度でラクトバチルスの、菌数が減少することが観察された(図16)。ビフィドバクテリウムはプラセボ処理期間に3 log減少し、これは膨満の軽減と、鼓脹および急激な腹痛の非存在とに対応している。しかし、ビフィドバクテリウムは善玉菌と考えられており、ビフィドバクテリウムがこれらの症状の増強に関連し得ることは示唆されるにすぎない。プレバイオティクス、特にRSの投与が、鼓脹および膨満の症状を増強すると示されている(Cummingsら, 2001 ; Munsterら, 1994)こと、これらの症状はシンバイオティクス処理期間においてRSが投与された期間に患者６の示した症状であることも考慮に入れるべきである。各症状の重症度のプラセボ処理期間における全体的な改善も、セルロースによる潜在的な嵩増し効果およびこれによる便通改善作用に帰属され得る。毎週のアンケートでも、患者はウォッシュアウト期間に少量のアルコール飲料を飲んだことが示され、これが症状の増強を悪化させたとみられる。さらには、この患者がシンバイオティクス処理期間中にストレスを感じていたことも注目され、これもまた、他で観察されているように(LidbeckおよびNord, 1994; LongstrethおよびWolde-Tsadik, 1993)、症状の重症度を上昇させたのであろう。
【０１５１】
糞便微生物プロファイルによる治験結果により、腸内細菌の菌数の全般的な減少が症状の重症度の低減と関連すると示される。ラクトバチルス菌数の増加も、特定の症状の改善、例えば膨満の軽減に関連付けられた(患者#5)。しかし、ラクトバチルスは症状の改善に関して顕著な効果を発揮したとは思われない。これに対し、ビフィドバクテリウムの増加は、種々混成ではあろうが重症度と関連性を有するように見えた。ビフィドバクテリウムの増加は、便秘および急激な腹痛の軽減と関連していると観察できる（患者#3）。しかし、ビフィドバクテリウムの増加は、膨満および急激な腹痛の増強とも関連付けられ得る(患者#7)。おそらく、様々な種のビフィドバクテリウムが重症度の増強または軽減に関与し得て、あるいは患者が異なれば、消化管内でのビフィドバクテリウムのレベルに影響する腸内微生物のコロニー形成状態が異なり、患者に影響するということかもしれない。
【０１５２】
治験により、VRI 003およびRSを含有するシンバイオティクス製剤、またはVRI 003単独を投与した場合の、IBS患者における糞便微生物プロファイルおよび症状の重症度のそれぞれ好ましい変化を示している予備的な結果が提供された。
【０１５３】
実施例７：湿疹の治療 
医学的診断で重度の湿疹を呈する21歳の女性患者。全身に広く現れた発疹および頬に毛毛細血管の拡張を呈する。肌は非常に乾燥しており、乾燥のためさらさらした（light）感触である。コルチゾンクリームおよび湿潤剤による毎日の処置を指示されている。
【０１５４】
L. fermentum VRI-003による処置を、朝食時に3カプセル、夕食時に3カプセルを毎日、で始めた。各カプセルは4.2×1010 cfu.を含有している。湿潤剤およびコルチゾンクリームは通常通り適用した。2週間のL fermentum経口投与後、湿疹の重症度は、視認アナログスケール(VAS;スケール1-10であり、1 = 軽度および10=重度)において2単位減少した。肌の赤みは軽減され、アレルギーはVASにおいて2単位減少し、肌の感触はわずかに改善された。かゆみも軽減し、観察されるフレーキングが減少した。全体として、この患者のQOLは向上した。
【０１５５】
実施例８：腸障害を伴う湿疹患者
医学的診断による湿疹を呈する33歳男性患者。湿疹は炎症性の形態であり、かゆみ、肌乾燥および露出びらんを伴う。これまでの処置には、ステロイド軟こうが含まれる。虫垂切除術の後に、この患者も腸障害を示した。
【０１５６】
L. fermentum VRI 003による処置を、朝食時に3カプセル、夕食時に3カプセルを毎日、を基本として始めた。各カプセルは4.2×1010 cfu.を含有している。2週間のL. fermentum VRI 003摂取後、患者は湿疹に伴うかゆみの軽減を報告した。彼は同様に、消化管の健康状態の改善、すなわち、トイレに行く回数がかなり減ったことを体感した。
【０１５７】
実施例９：慢性疲労感ならびにミネラルおよびビタミンの吸収／利用能欠乏を伴うクローン病
10年以上クローン病に罹患している35-40歳の女性患者は、毎朝毎晩に、食時と一緒に3カプセル(各カプセルは4×1010 cfuのL fermentum VRI 003を含有していた)を摂取し、1週間後に、下痢痙攣、腹痛、慢性疲労感、うっ滞の症状が、劇的に減少した。大便が形状を有するものになった。イオンおよびビタミンB12レベルは非常に良く、したがって、腸内のL fermentum 003が、イオンおよびビタミンB12の吸収／利用能を向上させたことが確認された。
【０１５８】
実施例10：プロバイオティクスL. fermentum VRI-003の、過敏性腸症候群(IBS)患者に対する効果
IBSにみられる胃腸障害の重症度低減における、プロバイオティクスL. fermentum VRI 003の効果を明らかにするために、IBS患者に対して、無作為の、複数機関にまたがった交差治験が行われた。試験は全18週間にわたって実施し (試験の完了後、2週間のフォローアップあり) 、被験者に活性およびプラセボ処理を施した。プロバイオティクス処理の詳細な日程は以下の通りである: 
【０１５９】
【表１１】
2005537791.tif 000012
【０１６０】
この試験では、立会い医の検証によりIBS 症候群診断基準を満たした年齢17-74歳のグループに属する患者を対象とした。しかし試験では、消化管への感染を受けている、および他の何らかのタイプの器質的疾病(例えば肝臓病など)をもっている状態の患者を除外した。ボランティア被験者も、試験参加中は他のいかなる種類のプロバイオティクスも摂取しないよう、厳しく指示された。
・患者罹患歴：54歳白人女性、年齢10代からIBSを罹患している。活動状態のIBS症状として、特に夕方に下痢および鼓脹を呈する。患者1の症状は、ケーキ、ペストリー、チョコレートなどの糖分の多い食物を食べた場合に悪化する。
・処理：1カプセルのL. fermentum VRI 003を朝および晩に食事と一緒に摂取させた。各カプセルは1カプセル当たり3×1010のVRI-003を含む。
・症状の評価：1カプセルのL. fermentum VRI-003を朝および晩に摂取した結果は、正常な腸運動であった。大便はより固くしっかりしたものとなり、鼓脹の強度は低減した。しかし、食餌中で糖分の多い食物が摂取された場合には、L. fermentum VRI-003は症状の重症度を最小限とすることはできなかったが、症状を重くすることもなかった。
【０１６１】
実施例11. L fermentum VRI 003の、しゅさ症状に対する効用
活動状態のIBSおよび顔にしゅさを呈する45-55歳の男性。主治皮膚医により、何年もの間、しゅさ症状の特徴的発現である赤みおよび病変部位に対する処置を受けている。IBSに対してL fermentum VRI 003(ゼラチンカプセル中、1日当たりlog 10-11 cfu)による処置を受けている間、患者は、しゅさによる顔の赤みおよび病変の著しい軽減を体験し、抗生物質クリームおよびステロイドクリーム使用を全てやめることができた。彼の顔の状態は、L fermentum 003を摂取している間、寛解状態に維持された。
【０１６２】
本発明はこれら特定の実施例を参照して説明されてきたが、本発明が他の多数の形態で具現化され得るということは、当業者により認められるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】L fermentum VRI 003の成育および生存に対する各種濃度の胆汁酸塩の影響を示すグラフである。
【図２】in vitro培養VRI 003の生存度に対する低pH値の影響を示すグラフである。
【図３】Lactobacillus種の、マウスパイエル板への接着性を示すグラフである。
【図４】図４は、L fermentum VRI 003細胞から抽出された細胞壁タンパク質の2次元解析図である。
【図５】図５は、パイエル板に接着しないことが既に示されているL fermentum LMG細胞から抽出された細胞壁タンパク質の2次元解析図である。図４および図５により、VRI 003では、L fermentum LMGに比して2種の細胞壁タンパク質の発現が亢進され、他の数種の細胞壁タンパク質発現が抑制されていることが示される。
【図６】L fermentum VRI 003刺激の、マクロファージによるサイトカイン産生に対する効果を示すグラフである。
【図７】L fermentum VRI 003経口投与後の、パイエル板におけるサイトカインレベルの増強を示すグラフである。
【図８】L fermentum VRI 003経口投与後の脾臓におけるサイトカインレベルについて、L fermentum VRI 003経口投与の効果を示すグラフである。
【図９】低水分活性難消化性澱粉と組合わせてサイズ1-ゼラチンカプセル中に入れ、フォイル-フォイルブリスターパック内で4℃、25℃および30℃で貯蔵時の、L fermentum VRI 003の安定性を示すグラフである。
【図１０】8週間治験中の、IBS患者#4の糞便中細菌の変化を示すグラフである。ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中に観察された微生物プロファイルを示す。結果は1mLあたりコロニー形成単位(cfu)で表されている。
【図１１】8週間治験中の、IBS患者#5の糞便中細菌の変化を示すグラフである。ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中に観察された微生物プロファイルを示す。結果は1mLあたりコロニー形成単位(cfu)で表されている。
【図１２】8週間治験中の、IBS患者#9の糞便中細菌の変化を示すグラフである。ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中に観察された微生物プロファイルを示す。結果は1mLあたりコロニー形成単位(cfu)で表されている。
【図１３】8週間治験中の、IBS患者#2の糞便中細菌の変化を示すグラフである。ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中に観察された微生物プロファイルを示す。結果は1mLあたりコロニー形成単位(cfu)で表されている。
【図１４】8週間治験中の、IBS患者#3の糞便中細菌の変化を示すグラフである。ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中に観察された微生物プロファイルを示す。結果は1mLあたりコロニー形成単位(cfu)で表されている。
【図１５】8週間治験中の、IBS患者#7の糞便中細菌の変化を示すグラフである。ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中に観察された微生物プロファイルを示す。結果は1mLあたりコロニー形成単位(cfu)で表されている。
【図１６】8週間治験中の、IBS患者#6の糞便中細菌の変化を示すグラフである。ベースライン、プラセボ、ウォッシュアウトおよびシンバイオティクス処理の期間中に観察された微生物プロファイルを示す。結果は1mLあたりコロニー形成単位(cfu)で表されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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