(57)【要約】本発明は、細胞内の25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を増加させ、それによって、カルシトリオール（活性ビタミンD）レベルを増加させる生物学的活性を有することを特徴とするペプチドを提供する。本ペプチドは、天然に存在するマトリックス細胞外リン糖タンパク質（PHEX）の残基242〜264位によって画定された連続配列に関連した配列を有する。本発明のペプチドを使用して25-ヒドロキシビタミン 1α-水酸化酵素遺伝子発現及びカルシトリオールレベルを調整する方法も、提供される。本発明の方法を実施するためのキットも、提供される。本発明の組成物及び方法は、パジェット病、くる病、骨粗鬆症、腎性骨形成異常、及び乾癬のようなビタミンD関連障害の治療を含む多様な適用において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を誘導する生物学的活性を特徴とする、デントニンを含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
デントニンが、配列番号：1〜18のうちのいずれか一つの15個の連続アミノ酸と少なくとも50％同一である、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
デントニンが、以下の配列：
2005525104.tif 000016
（式中、X1〜X7は任意の単一のアミノ酸である）を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：1〜18のうちのいずれか一つの少なくとも15個の連続アミノ酸を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号：1のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
ビタミンD 24-水酸化酵素活性を有意に誘導しない生物学的活性をさらに特徴とする、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
カルシトリオール量を増加させる生物学的活性をさらに特徴とする、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
請求項1記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項９】
細胞を請求項1記載の単離されたポリペプチドと接触させる段階を含む、細胞における25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を増加させるための方法であって、
該細胞において、25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性が、請求項1記載の単離されたポリペプチドと接触させられていない細胞と比較して増加する、方法。
【請求項１０】
ビタミンD 24-水酸化酵素活性が細胞において有意に誘導されない、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
細胞が哺乳動物宿主の細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
治療的有効量の請求項1記載のポリペプチドを含む製剤。
【請求項１３】
担体をさらに含む、請求項12記載の製剤。
【請求項１４】
担体が生理食塩水溶液であり、かつ製剤が注射可能である、請求項13記載の製剤。
【請求項１５】
対象におけるカルシトリオールのレベルを増加させるための方法であって、該カルシトリオールのレベルを増加させるため、治療的有効量の請求項12記載の製剤を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１６】
治療を必要とする対象を治療するための方法であって、該対象を治療するため、治療的有効量の請求項12記載の製剤を該対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１７】
対象がビタミンD関連状態を有している、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
状態が、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症、パジェット病、骨減少症、骨硬化症又は腎性骨形成異常、乾癬、髄様癌、アルツハイマー病、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症、偽性上皮小体機能不全、二次性上皮小体機能不全、糖尿病、肝硬変、閉塞性黄疸又は薬物誘導性代謝、グルココルチコイド拮抗、高カルシウム血症、吸収不良症候群、脂肪便、慢性腎疾患、低リン酸血症性ビタミンD抵抗性くる病、ビタミンD依存性くる病、I型くる病、II型くる病、サルコイドーシス、白血病、前立腺癌、乳癌、結腸癌、臓器移植、骨折、非脱灰歯、又は免疫障害である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨軟化症、くる病、腎性骨形成異常、上皮小体機能亢進症、高カルシウム血症、I型くる病、II型くる病、及び骨折である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
（a）単離されたデントニンポリペプチド；及び
（b）標的核酸へ機能的に連結された25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素プロモーター
を含む、細胞における標的核酸発現を増加させるための系であって、該デントニンが、該1α-水酸化酵素プロモーターの活性を誘導して該標的核酸の発現を増加させる系。
【請求項２１】
細胞における標的核酸の発現を増加させる方法であって、
標的核酸を1α-水酸化酵素プロモーターへ機能的に連結して発現カセットを形成する段階；
該発現カセットを細胞に移入する段階；及び
細胞を請求項1記載の単離されたポリペプチドと接触させて、該標的核酸の発現を増加させる段階
を含む方法。
【請求項２２】
細胞が腎細胞である、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序論
技術分野
本発明は、ビタミンD代謝を操作するために使用され得るペプチドに関する。より具体的には、本発明は、ビタミンDの活性型であるカルシトリオールを生成させる25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を刺激し増加させるデントニンペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ビタミンDは、カルシウムとリン酸とのバランスの維持、及び骨鉱化作用において大きな役割を果たしているホルモンである。ビタミンD欠乏は、成人においても子供においても、くる病及び骨軟化症を引き起こす。いずれの状態も、弱い骨及び骨の奇形へと至る、骨基質である類骨の石灰化の失敗を特徴とする。ビタミンDの活性型、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3（カルシトリオールとしても知られる）は、分子の炭素鎖の1α位にヒドロキシル基を置く1α-水酸化酵素（1α-OHase）によって達成される水酸化反応を通して、不活性の25-モノヒドロキシビタミンD3から作成される。24-水酸化酵素（24-OHase）による前駆物質25-モノヒドロキシビタミンD3の水酸化は、活性型の化合物を「迂回」する経路を引き起こす。24-水酸化酵素によるカルシトリオールの水酸化は、カルシトリオールを不活化し、そのさらなる代謝を開始させる。
【０００３】
多数の疾患が、ビタミンD代謝の改変と関連付けられている。ビタミンD代謝の障害をもたらす家族性疾患が、X連鎖ビタミンD抵抗性低リン酸血症性くる病（XLH又はHYP）、低リン酸血症性くる病を伴う遺伝性高カルシウム尿症（HHRH）、ある種の型の腎性ファンコーニ（Fanconi）症候群を含むデント（Dent's）病、腎臓1α-水酸化酵素欠損（VDDR I）、1,25-ジヒドロキシビタミンD3受容体の欠陥（終末器抵抗、VDDR II）、常染色体優性くる病（ADR）、及びマックキューン-オールブライト（McCune-Albright）症候群（MAS）を含む、くる病の原因として同定されている。腫瘍形成性低リン酸血症性骨軟化症（OHO）のような、くる病様症状を示す疾患も、知られている。ビタミンD代謝の障害に起因する古典的疾患に加え、乾癬及び癌（Abeら、P.N.A.S.（1981）,78,4990-4994）、免疫学的障害（Mullerら、Immunol.Lett.（1988）17,361-366）、高血圧（Lindら、Acta Med Scand.（1987）222,423-427）、糖尿病（Inomataら、Bone Miner.（1986）1,187-192）、脱毛（Editorial、Lancet（1989）i,p.478）、座瘡（Malloy,V.L.ら、Tricontinental Meeting for Investigative Dermatology,Washington,1989）、骨粗鬆症（Bikle Endocr.Rev.Monogr.（1995）4,77-83）、神経変性性障害（Carswell Exp.Neurol.（1993）,124,36-42）、及びその他のいくつかの疾患（一般には、米国特許第6,329,357号を参照のこと）のような、その他のいくつかの疾患が、ビタミンD代謝を操作し、カルシトリオールレベルを増加させることにより治療され得ると考えられている。
【０００４】
現在、ビタミンD代謝の障害の効果的な治療の必要、並びに増加が治療的であろう疾患のため細胞内及び循環血中のカルシトリオールレベルを増加させる必要が、存在する。骨粗鬆症のような骨減少性疾患に関して、エストロゲン、カルシトリオール、ビタミンD、フッ化物、イプリフラボン、ビスホスホネート、副甲状腺ホルモン等のような治療剤は、充分な治療手段を提供することができていない（Gennariら、Drug Saf.（1994）11（3）：179-95；Martinら、Am J Kidney Dis（2001）38（6）：1430-6）。例えば、外因的に投与されたビタミンDアナログのようなこれらの治療に関する重要な問題は、それらが、腸のカルシウム吸収及び腎臓のカルシウム再吸収を増加させ、高カルシウム血症をもたらすという点である。注射可能な副甲状腺ホルモンが、最近、新規の骨格同化剤として開発された。しかしながら、薬物の連続的な曝露は骨吸収を加速させるため、それは、ある程度の間隔を置いて患者に投与される必要がある。従って、この薬物の使用は、医療専門家による特別な注意を必要とする。前記の薬剤に関するもう一つの重要な問題は、それらが、大部分の場合、経口投与に適しておらず、従って、非経口的に与えられなければならないという点である。骨障害は、しばしば、慢性であり、長期の療法を必要とするため、治療剤が経口投与に適したものであることは、重要である。
【０００５】
ビタミンD代謝の制御は、理解され始めている。最近、X連鎖低リン酸血症性くる病を有する患者に欠損している遺伝子Phexが、クローニングされ特徴決定された（Rowe,Hum.Mol.Genet.6（1997）,539-549）。Phex遺伝子は、PHEXと命名されたZnメタロエンドペプチダーゼのファミリー（M13）のメンバーであるII型糖タンパク質をコードする。PHEXは、リン酸ホメオスタシス及び骨格鉱化作用において役割を果たす因子のプロセシングにより機能すると提唱されている（Rowe、Exp.Nephrol.5（1997）,355-363）。家族性くる病のような疾患状態において、欠陥PHEXは、ナトリウム依存性リン酸共輸送体のダウンレギュレーション、1α-水酸化酵素（1α-OHase）のダウンレギュレーション、及び腎臓ミトコンドリア24-水酸化酵素（24-OHase）のアップレギュレーションをもたらすであろう未切断のホスファトニン（phosphatonin）をもたらす。ビタミンD代謝の遺伝子の発現に対するPHEXの効果は、理解されていない。
【０００６】
ビタミンD代謝を改変させることにより疾患を予防又は治療することができる治療剤が、大いに必要とされている。特に、24-OHaseと比べて選択的に1α-OHaseの発現を増加させ得る薬剤は、炭素鎖の24位にヒドロキシ基を含有している不活性型と比べて選択的に内因性の活性1,25-ジヒドロキシビタミンD3のレベルを増加させるであろうため、効果的な薬剤として重要である。そのような薬剤は、パジェット病、くる病、骨粗鬆症、腎性骨形成異常、乾癬等のような、ビタミンD関連疾患のための治療として使用され得る。
【０００７】
重要な参照には、Yoshidaら、J Am Soc Nephrol.2002 13：1455-63；Katoら、Horm Res.2002 57：73-8；Yoshidaら、Endocrinology.2002 143：683-9；Millerら、Best Pract Res Clin Endocrinol Metab.2001 15：95-109；Zehnderら、J Clin Endocrinol Metab.2001 86：888-94；Zoidisら、Mol Cell Endocrinol.2000 168（1-2）：41-51；Hewisonら、J Mol Endocrinol.2000 25：141-8；Kimmel-Jehanら、Biochim Biophys Acta.2000 1475：109-13；Etoら、Anal Biochem.1998 258：53-8；Brenzaら、Proc Natl Acad Sci U S A.1998 95：1387-91；及びTakeyamaら、Science.1997 277：1827-30が含まれる。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、細胞内の25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を増加させ、それによって、カルシトリオール（活性ビタミンD又は1α,25ジヒドロキシビタミンD3）レベルを増加させる生物学的活性を有していることを特徴とするペプチドを提供する。そのペプチドは、天然に存在するマトリックス細胞外リン糖タンパク質（PHEX）の残基242〜264位によって画定された連続配列に関連した配列を有する。本発明のペプチドを使用して25-ヒドロキシビタミン1α-水酸化酵素遺伝子発現及びカルシトリオールレベルを調整する方法も、提供される。本発明の方法を実施するためのキットも、提供される。本発明の組成物及び方法は、パジェット病、くる病、骨粗鬆症、腎性骨形成異常、及び乾癬のようなビタミンD関連障害の治療を含む多様な適用において使用可能である。
【０００９】
多くの態様において、本発明のペプチドは、アミノ酸配列
2005525104.tif 000002
又はその変種を含み、配列番号：2〜18のペプチドのうちのいずれかの配列を有し得る。本発明のポリペプチドは、配列番号：1の少なくとも15個の連続アミノ酸残基に少なくとも60％関連している配列を有していてもよく、又は式：
2005525104.tif 000003
（式中、X1〜X7は、独立に、任意のアミノ酸である）を有していてもよい。
【００１０】
配列番号：1〜18のペプチド及びそれらの変種は、1α-水酸化酵素遺伝子発現を有意に誘導する。1α-水酸化酵素遺伝子は、カルシトリオールの生合成経路の最終工程を触媒する酵素をコードするため、その発現の増加は、細胞内のカルシトリオールの合成の速度を増加させ、細胞内及び循環血中のカルシトリオールのレベルの増加をもたらす。細胞内及び循環血中のカルシトリオールの濃度を増加させることは、本発明の方法の特色である。本発明のペプチドの特色は、ビタミンD経路の流れを増加させ、それにより細胞内又は循環血中の利用可能なカルシトリオールの量を減少させる酵素である24-水酸化酵素の発現を有意に誘導しないという点である。さらに、本発明のペプチドは、副甲状腺ホルモンシグナル伝達経路と無関係なシグナル伝達経路において作用する。従って、本発明のペプチドは、ビタミンD関連障害を有する宿主を治療するため、宿主内のカルシトリオールレベルを増加させるために使用され得る。
【００１１】
さらに、本発明のペプチドは、1α-水酸化酵素遺伝子のプロモーターに機能的に連結された1個以上の標的遺伝子を、タイムリーに、かつ選択的にアップレギュレートするのに有用である。
【００１２】
ビタミンD関連状態を治療する又は治癒させるための治療的有効量のペプチドを含有している製剤も、提供される。これらの製剤は、好ましくは、注射可能製剤である。
【００１３】
本発明のその他の面は、配列
2005525104.tif 000004
と少なくとも約60％の同一性を有しているペプチド及びペプチドアナログである。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの面は、配列
2005525104.tif 000005
との少なくとも約60％を有しているペプチド又はペプチドアナログを含む製剤の投与によって実施される、ビタミンD代謝と関係があるか又はビタミンD欠損によって引き起こされた疾患の治療のための方法である。
【００１５】
さらに、サルへ皮下注射された配列番号：1のペプチドは、直ちに循環系に進入し、細胞レベルで1α-水酸化酵素を誘導する生物学的に活性なレベルを保持し、そしてカルシトリオールの血清レベルを用量依存的にかつ有意に上昇させた。
【００１６】
これら及びその他の目的、面、特色、及び利点は、この開示を参照することにより当業者に明白になるであろう。
【００１７】
定義
「治療する」、「治療すること」、及び「治療」等の用語は、本明細書において交換可能に使用され、所望の薬理学的及び／又は生理学的な効果を得ることを意味する。その効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に防止するという点で予防的であってもよいし、かつ／又はビタミンDの効果の増強のように、疾患及び／もしくは疾患に起因する有害な効果を部分的もしくは完全に治癒させるという点で治療的であってもよい。本明細書において使用されるように「治療すること」には、脊椎動物、特に哺乳動物、特にヒトにおける疾患の治療が内含され、（a）疾患の素因を有しているが、未だそれを有していると診断されていない対象において疾患が発生するのを防止すること；（b）疾患を阻害すること、即ちその進展を阻止すること；又は（c）疾患を軽減させること、即ち疾患の退行を引き起こすことが含まれる。
【００１８】
本発明は、特に、骨減少を経験した患者、又は骨格減少を経験することが予想される患者を治療することを可能にするペプチドに関し、従って、特に、骨格減少の効果の防止、阻害、又は軽減に関する。対象が、骨格組織に関連した疾患の治療に関して望ましいと当業者によって一般に理解される、増加した骨格成長、増加した骨格強度、又はその他の特徴を含む多様な異なる基準に基づき測定され得る、治療的に検出可能かつ有益な効果を経験することを条件として、対象は、「治療」される。
【００１９】
「ペプチド性化合物」という用語は、本明細書において使用されるように、排他的にでないが主として、ペプチド結合により、相互に連結された単位を含む化合物をさす。単位には、典型的には、コードされたアミノ酸残基、コードされないアミノ酸残基、及び／又はペプチドミメティクス（peptidomimetics）が含まれる。「ペプチド」という用語は、本明細書において使用されるように、あるアミノ酸のカルボキシル基ともう一つのアミノ酸のアミノ基との間のアミド形成によって生成した任意の化合物をさす。ペプチド性化合物は、（a）天然に存在する、コードされた又はコードされないアミノ酸残基のポリマー；（b）天然に存在しないアミノ酸残基、例えばN置換グリシン、アミノ酸代用物等のポリマー；又は（c）天然に存在するアミノ酸残基／代用物及び天然に存在しないアミノ酸残基／代用物両方のポリマーであり得る。その用語には合成ペプチドが含まれる。換言すると、本発明のペプチド性化合物は、ペプチド又はペプトイド（peptoids）であり得る。ペプトイド化合物及びそれらの調製のための方法は、国際公開公報第91/19735号（これの開示は、参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。アミノ酸は、時には、本明細書において、標準的な三文字記号によって言及される（例えば、「Biochemistry」第2版、Voet及びVoet編（1995）John Wiley＆Sons,Inc.58-59頁参照）。
【００２０】
「有効量」、「治療的な量」、「治療的有効量」等の用語は、本明細書において、治療、例えば有益な又は所望の臨床的結果を達成するために十分な量を記載するために交換可能に使用される。有効量は、1回以上の投与で投与され得る。
【００２１】
「骨格減少」という用語は、骨格の体積、実質、もしくはマトリックス、又はカルシウム及びリン酸のような骨格の任意の成分が減少しているか、又は例えば骨の破壊に対する抵抗能力が弱っている任意の状況をさす。
【００２２】
「骨格」という用語には、骨及び歯の両方が含まれる。同様に、「骨格の」という用語は、骨及び歯の両方を意味する。
【００２３】
「骨粗鬆症」という用語は、任意の原因に起因する、骨減少、即ち骨の体積又は実質の量の縮小を含む、任意の状態をさすものとする。その用語は、特に、骨の鉱質除去、閉経後もしくは閉経期前後のエストロゲン減少、又は神経傷害に起因する骨減少をもたらす。
【００２４】
「対象」という用語は、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、特にヒト対象をさす。
【００２５】
「単離された」という用語は、その天然の情況又は最初の環境（例えば、それが天然に存在している場合、天然の環境）から除去され、従って、その天然の状態から「人工的に」改変させられた材料をさす。例えば、単離されたポリペプチドは、構成物の一部であってもよいし、又は細胞内に含有されていてもよく、その場合であっても、その構成物、又は特定の細胞は、ポリペプチドの最初の環境でないため、それらは「単離」されている。
【００２６】
「ビタミンD関連状態」という用語は、本明細書において使用されるように、ビタミンDの欠損に関連した状態をさし、ビタミンDを増加させることにより治療可能な状態もさす。ビタミンD関連状態には、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症、パジェット病、骨減少症、骨硬化症又は腎性骨形成異常、急性骨硬化症、乾癬、髄様癌、アルツハイマー病、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症、偽性上皮小体機能不全（pseudoparathyroidism）、二次性上皮小体機能不全（secondary parathyroidism）、糖尿病、肝硬変、閉塞性黄疸又は薬物誘導性代謝、グルココルチコイド拮抗、高カルシウム血症、吸収不良症候群、脂肪便、慢性腎疾患、低リン酸血症性ビタミンD抵抗性くる病、ビタミンD依存性くる病、I型くる病、II型くる病、サルコイドーシス、白血病、前立腺癌、乳癌、結腸癌、臓器移植、又は免疫障害（immunodisorder）が含まれる。ビタミンD関連状態には、骨折及び様々な歯障害も含まれる。
【００２７】
「対象」、「宿主」、「患者」、及び「個体」という用語は、本明細書において、診断又は療法が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトをさすために交換可能に使用される。その他の対象には、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ等が含まれ得る。
【００２８】
特定の態様の詳細な説明
本発明は、細胞内の25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素活性を増加させ、それによって、カルシトリオール（活性ビタミンD）レベルを増加させる生物学的活性を有していることを特徴とするペプチドを提供する。そのペプチドは、天然に存在するマトリックス細胞外リン糖タンパク質（PHEX）の残基242〜264位によって画定された連続配列に関連した配列を有する。本発明のペプチドを使用して、25-ヒドロキシビタミン1α-水酸化酵素遺伝子発現及びカルシトリオールレベルを調整する方法も、提供される。本発明の方法を実施するためのキットも、提供される。本発明の組成物及び方法は、パジェット病、くる病、骨粗鬆症、腎性骨形成異常、及び乾癬のようなビタミンD関連障害の治療を含む多様な適用において使用可能である。
【００２９】
本発明のペプチド、アナログ、製剤、及び方法論を記載する前に、本発明が、記載された特定の態様に制限されず、当然、変動し得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語法は、特定の態様を記載することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を制限するものではないことも理解されたい。
【００３０】
ある範囲の値が提供される場合には、その範囲の上限と下限との間に入る各値（特記しない限り、下限の単位の10分の1まで）も、特に開示されることが理解される。記述された値又は記述された範囲の中に入る値と、他の記述された値又はその記述された範囲の中に入る値との間のより小さな各範囲が、本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立に、その範囲に内含又は排除され得、そのより小さな範囲に一方の限度が含まれていても、両方の限度が含まれていなくても、又は両方の限度が含まれていても、各範囲は、記述された範囲の中の特別に排除された限度を条件として、本発明に包含される。記述された範囲が、限度の一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限度の一方又は両方を排除した範囲も、本発明に含まれる。
【００３１】
他に定義しない限り、本明細書において使用された技術用語及び科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有している。本明細書に記載されたものと類似しているか又は等価である任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試行において使用され得るが、好ましい方法及び材料が以下に記載される。本明細書において言及された出版物は、全て、その出版物の引用に関連した方法及び／又は材料を開示し記載するために参照として本明細書に組み込まれる。
【００３２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形の「一つの（a）」、「及び（and）」、及び「その（the）」には、特記しない限り、複数の支持対象が含まれる。従って、例えば、「ペプチド（a peptide）」との言及には、複数個のそのようなペプチドが含まれ、「方法（the method）」との言及には、1個以上の方法及び当業者に既知のそれらの等価物に対する言及が含まれ、他も同様である。
【００３３】
本明細書に記された出版物は、本願の出願日より前の開示のためにのみ提供される。本明細書は、先行発明のためそのような出版物に本発明が先行する権利を有しないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供された出版物の日付は、実際の出版日とは異なる可能性があり、それらは、独立に確認される必要があるかもしれない。
【００３４】
ペプチド組成物
本発明は、活性ビタミンD生合成の最終工程を触媒する酵素である25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素の発現を調整する（即ち、増加又は減少させる）生物学的活性を特徴とするペプチドを提供する。そのようなポリペプチドは、「デントニン」ポリペプチドと名付けられ、一般に、NCBIアクセッション番号AAK70343によって定義されるような天然に存在するマトリックス細胞外リン糖タンパク質（PHEX）の残基242〜264位によって画定された連続アミノ酸配列に関連した配列を有する。そのため、デントニンペプチドは、配列
2005525104.tif 000006
を含むか、又は1α-水酸化酵素活性を調整する能力を保持している配列番号：1に関連した変種ペプチドである。1α-水酸化酵素活性を調整する能力が、「デントニン活性」であり、その増加は、通常、24-水酸化酵素活性を有意に増加させない。
【００３５】
配列番号：1の変種であるデントニンペプチドには、
2005525104.tif 000007
並びにこれらのペプチドのより小さい断片、例えば、
2005525104.tif 000008
が含まれる。
【００３６】
一般に、デントニンペプチドは、配列番号：1〜18のうちのいずれか、又は配列番号：1〜18のうちのいずれかの断片との、少なくとも50％の配列同一性、少なくとも55％の配列同一性、少なくとも60％の配列同一性、少なくとも65％の配列同一性、少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、又は100％の配列同一性を有する。配列番号：1〜18のうちのいずれかの断片は、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、又は22連続アミノ酸長であり得る。
【００３７】
デントニンペプチドは、約10アミノ酸、約12アミノ酸、約14アミノ酸、約16アミノ酸、約18アミノ酸、約20アミノ酸、約23アミノ酸、約25アミノ酸、約30アミノ酸、約35アミノ酸、約40アミノ酸、約45アミノ酸、約50アミノ酸であり得、当然、融合タンパク質を形成するために他のペプチドと融合又は共有結合していてもよい。そのため、デントニンポリペプチドは、デントニン活性を保持している限り、50アミノ酸長より長くてもよい。
【００３８】
活性デントニンペプチド配列は、クラスタル（CLUSTAL）分析に供され、得られた配列アラインメント及びコンセンサス式が、図5に示される。
【００３９】
多くの態様において、デントニンペプチドは、（標準的な一アミノ酸記号を使用して、図5に示される）式：
2005525104.tif 000009
（X1〜X7は任意のアミノ酸である）によって記載される。ある種の態様において、デントニンペプチドは、式：
2005525104.tif 000010
（X1〜X2は任意のアミノ酸であり、かつX3はM、L、I、又はVである）によって記載される。その他のある種の態様において、デントニンペプチドの式は、
2005525104.tif 000011
（X1はD又はGであり、X2はD又はGであり、X3はI、V、又はMであり、X4はP又はSであり、X5はG又はDであり、X6はD又はGであり、かつX7はD又はGである）である。上記の各式中、文字は標準的な一アミノ酸記号を使用したアミノ酸に対応し、Zm及びZnは各々任意のアミノ酸の連続系列であり、n又はmは、各々独立に、0（即ち、アミノ酸なし）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、約10超、約20超、約30超、約40超、約50超、約80超、又は約100超、又はそれ以上、最大約500又はそれ以上のアミノ酸である。
【００４０】
前記の特定のデントニンに加え、さらなる変種が、例えば、ラット（NCBIアクセッション番号NP_077056）、マウス（NCBIアクセッション番号NP_444402及びAAK70342）、マカクザル（NCBIアクセッション番号BAB01638）のマトリックス細胞外リン糖タンパク質のアミノ酸配列をデントニン断片に関して調査することにより、ヒト以外の種から見出され得る。さらなるデントニン変種は、異なる既知の変種（例えば、図5に示される変種）、又はラット、マウス、及びマカクザルのマトリックス細胞外リン糖タンパク質の記載された変種の間で、（例えば、配列アラインメント、例えば図5の配列アラインメントによって決定されるような）等しい位置においてアミノ酸を置換することにより生成させられ得る。
【００４１】
本発明のデントニンタンパク質は、一般的には、天然に存在しない環境に存在する、即ち、天然に存在する環境から分離されている。ある種の態様において、本発明のデントニンは、天然に存在する環境のデントニンと比較して、デントニンに関して精製されている組成物の中に存在する。そのため、精製されたデントニンが提供される。ここで、精製された、とは、デントニンが、非デントニンタンパク質を実質的に含まない組成物の中に存在することを意味し、実質的に含まない、とは、組成物の90％未満、一般的には60％未満、より一般的には50％未満が、非デントニンタンパク質からなることを意味する。デントニンタンパク質に関して濃縮された組成物に関して、そのような組成物は、デントニン活性を示すであろう。
【００４２】
ある種の重要な態様において、デントニンタンパク質は、天然に存在する環境に存在する要素を実質的に含まない組成物の中に存在する。例えば、この態様における本発明に係るデントニンを含む組成物は、天然の環境において共存しているタンパク質、炭水化物、脂質等のような他の生物学的要素を完全ではないにしても実質的に含まないであろう。そのため、これらの態様のタンパク質組成物は、必然的に、天然に存在する起源からタンパク質を精製することにより調製されたものとは異なるであろう（天然に存在する起源から調製された組成物の中には、少なくとも微量のタンパク質要素が依然として存在するであろう）。
【００４３】
本発明のデントニンは、単離物としても存在し得る。これは、デントニンが、非デントニンタンパク質、並びにオリゴ糖、ポリヌクレオチド、及びそれらの断片等のようなその他の天然に存在する生体分子の両方を実質的に含まないことを意味する。この場合の、実質的に含まない、とは、単離されたデントニンを含有している組成物の70％未満、一般的には60％未満、より一般的には50％未満が、デントニン以外の天然に存在する生物学的分子であることを意味する。ある種の態様において、デントニンは実質的に純粋な形態で存在する。ここで、実質的に純粋な形態、とは、少なくとも95％、一般的には少なくとも97％、より一般的には少なくとも99％の純度であることを意味する。
【００４４】
本発明の一つの態様において、デントニンは、配列番号：1〜18のうちのいずれかに示されたポリペプチド配列、又はそれらの変種から本質的になる。本明細書に記載されたポリペプチドに関して、「から本質的になる」とは、ポリペプチドが配列表に示された配列から構成されており、その配列に、ポリペプチドの基本的な（1個以上の）特徴に物質的に影響を与えない1個以上のアミノ酸又はその他の残基が隣接していてもよいことを意味する。
【００４５】
デントニンのアナログ、誘導体、及びミメティクス
当業者は、単一又は複数のアミノ酸の置換、付加、又は欠失を作成することにより、前記のペプチドの配列を修飾することにより、デントニン活性を有するペプチドを調製し得る。これらの変化は、一般的には、ペプチドの折り畳み又は活性に有意に影響を与えない保存的アミノ酸置換のような、重要性の低い性質の変化である。例えば、トレオニンのようなある極性アミノ酸は、セリンのようなもう一つの極性アミノ酸と置換され得；又は、アスパラギン酸のようなある酸性アミノ酸は、グルタミン酸のようなもう一つの酸性アミノ酸と置換され得；又は、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンのような塩基性アミノ酸は、もう一つの塩基性アミノ酸と置換され得；又は、アラニン、ロイシン、もしくはイソロイシンのような無極性アミノ酸は、もう一つの無極性のアミノ酸と置換され得る。いかなるアミノ酸変化が表現型的にサイレントであるかに関する案内は、Bowie,J.U.ら、「タンパク質配列内のメッセージの解読：アミノ酸置換に対する許容性（Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substitutions）」、Science 247：1306-1310（1990）に見出され得る。当然、当業者が作成するであろうアミノ酸置換の数は、多くの要因に依存する。さらに、機能にとって不可欠なデントニンのアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発のような当技術分野において既知の方法により同定され得る（Cunningham＆Wells,Science 244：1081-1085（1989））。後者の手順は、分子内のすべての残基に単一アラニン変異を導入する。次いで、得られた変異分子が、生物学的活性に関して試験される。
【００４６】
本発明は、例えば翻訳中又は翻訳後に、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解、抗体分子又はその他の細胞リガンドとの結合等により、差次的に修飾されたポリペプチドをさらに包含する。多数の化学的修飾のうちの任意のものが、以下に制限はされないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的化学的分解；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下における代謝的合成等を含む既知の技術によって実施され得る。
【００４７】
本発明に包含される付加的な修飾には、例えば、例えばN結合型又はO結合型の炭水化物鎖、N末端又はC末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学的成分の付着、N結合型又はO結合型の炭水化物鎖の化学的修飾、及び原核宿主細胞発現の結果としてのN末端メチオニン残基の付加又は欠失が含まれる。ポリペプチドは、タンパク質の検出及び単離を可能にする酵素標識、蛍光標識、同位体標識、又はアフィニティ標識のような検出可能標識によっても修飾され得る。
【００４８】
ポリペプチドの増加した可溶性、安定性、及び循環時間、又は減少した免疫原性のような付加的な利点を提供し得る本発明のポリペプチドの化学的に修飾された誘導体も、本発明によって提供される（米国特許第4,179,337号参照）。誘導体化のための化学的成分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等のような水溶性ポリマーより選択され得る。5個のポリペプチドは、分子内のランダムな位置又は分子内の予定された位置において修飾され得、1個、2個、3個、又はそれ以上の付着した化学的成分を含んでいてもよい。
【００４９】
ポリマーは、任意の分子量を有していてよく、分岐していてもよいし、又は分岐していなくてもよい。ポリエチレングリコールに関して、好ましい分子量は、取り扱い及び製造が容易であるため、約1kDa〜約100kDaである（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製物中に、記述された分子量より高分子量のもの、低分子量のものが存在するであろうことを意味する）。その他のサイズも、所望の治療プロファイル（例えば、所望の徐放の期間、存在するのであれば生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度又は欠如、及び治療用のタンパク質又はアナログに対するポリエチレングリコールのその他の既知の効果）に依って使用され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、約200；500；1000；1500；2000；2500；3000；3500；4000；4500；5000；5500；6000；6500；7000；7500；8000；8500；9000；9500；10,000；10,500；11,000；11,500；12,000；12,500；13,000；13,500；14,000；14,500；15,000；15,500；16,000；16,500；17,000；17,500；18,000；18,500；19,000；19,500；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；50,000；55,000；60,000；65,000；70,000；75,000；80,000；85,000；90,000；95,000；又は100,000kDaの平均分子量を有し得る。
【００５０】
本発明のタンパク質のPEG化（pegylation）は、多数の任意の手段によって達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接、又は介在するリンカーによって、タンパク質に付着させられ得る。タンパク質にポリエチレングリコールを付着させるためのリンカーレスの系は、Delgadoら、Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sys.9：249-304（1992）；Francisら、Intern.J.of Hematol.65：1-18（1998）；米国特許第4,002,531号；米国特許第5,349,052号；国際公開公報第95/06058号；国際公開公報第98/32466号（各々の開示は、参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００５１】
介在するリンカーなしに直接ポリエチレングリコールを5個のタンパク質のアミノ酸残基に付着させるための一つの系は、塩化トレシル（tresylchloride）（ClSO2CH2CFl）を使用したモノメトキシポリエチレングリコール（MPEG）の修飾によって生成するトレシル化（tresylated）MPEGを利用する。タンパク質のトレシル化MPEGとの反応により、ポリエチレングリコールは、タンパク質のアミン基に直接付着させられる。従って、本発明は、2,2,2-トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と本発明のタンパク質を反応させることにより生成したタンパク質-ポリエチレングリコール複合体を含む。
【００５２】
さらに、本発明のポリペプチドの選択された側鎖又はN末端もしくはC末端の残基と反応することができる有機誘導体化剤による本発明のポリペプチドのアミノ酸の標的修飾も、企図される。そのような薬剤には、例えば1,1-ビス（ジアゾアセチル）-2-ペニルエタン（penylethane）、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシサクシニビド（hydroxysaccinibide）エステル等が含まれる。
【００５３】
その他の修飾は、PCT公開広報第00/55173号に見出され得る。
【００５４】
核酸、ベクター、及び宿主細胞
本発明は、デントニンをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、並びにそれを含有しているベクター及び宿主細胞をさらに提供する。多くの態様において、本発明の核酸は、デントニンのコーディング配列を含む。遺伝暗号が既知であり、デントニンの配列が本明細書に記載されているため、これらの核酸の設計及び作製は、十分に当業者の技術の範囲内である（参照、例えばAusubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Wiley＆Sons、1995；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、（1989）Cold Spring Harbor、N.Y.）。
【００５５】
本発明は、本発明の核酸を含むベクター（「構築物」とも呼ばれる）をさらに提供する。本発明の多くの態様において、デントニンをコードする核酸配列は、例えばプロモーターを含む発現調節配列に配列が機能的に連結された後、宿主内で発現されるであろう。本発明の核酸は、典型的に、エピソームとして又は宿主染色体DNAの必須部分として宿主生物内で複製することができる発現ベクターの中に置かれてもよい。通常、発現ベクターは、所望のDNA配列により形質転換された細胞の検出を許容する選択マーカー、例えばテトラサイクリン、ネオマイシン等を含有しているであろう（例えば、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第4,704,362号を参照のこと）。単一及び二重の発現カセットベクターを含むベクターは、当技術分野において周知である（Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Wiley＆Sons、1995；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、（1989）Cold Spring Harbor、N.Y.）。適当なベクターには、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体（ヒト人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体等）、ミニ染色体等が含まれる。
【００５６】
発現ベクターは、一般的に、誘導可能又は構成性であり得る転写及び翻訳の開始領域（コーディング領域が、転写開始領域の転写調節下で機能的に連結される）、並びに転写及び翻訳の終結領域を提供するであろう。これらの調節領域は、本発明のペプチドをコードする遺伝子に固有のものであってもよいし、又は外因的な起源に由来してもよい。
【００５７】
発現ベクターは、一般に、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するための、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主において機能性である選択可能マーカーが存在してもよい。発現ベクターは、外因的な融合ペプチドが、付加的な機能性、即ち増加したタンパク質合成、安定性、定義された抗血清との反応性、酵素マーカー、例えばβ-ガラクトシダーゼ等を提供する融合タンパク質の作製に使用されてもよい。
【００５８】
本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む、単離されたインビトロ宿主細胞及びインビボ宿主細胞を含む宿主細胞をさらに提供する。細菌、酵母、昆虫、及び哺乳動物の宿主細胞を含む適当な宿主細胞は、PCT公開広報第00/55173号に見出され得る。
【００５９】
作製の方法
デントニンは、当技術分野において周知の方法を使用して、単離又は合成され得る。そのような方法には、ペプチドの作製のための組み換えDNA法及び化学合成法が含まれる。適当な宿主細胞におけるペプチドをコードする核酸配列の発現によってペプチドを作製する組み換え法は、当技術分野において周知であり、例えば、参照として本明細書に組み込まれるサンブルック（Sambrook）ら（Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（1989））に記載されている。
【００６０】
特定の重要な発現系には、細菌、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞に由来する発現系が含まれる。これらの各カテゴリーからの代表的な系を、以下に挙げる。
【００６１】
組み換え法
細菌
細菌における発現系には、Changら、Nature（1978）275：615；Goeddelら、Nature（1979）281：544；Goeddelら、Nucleic Acids Res.（1980）8：4057；欧州特許第0 036,776号；米国特許第4,551,433号；DeBoerら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1983）80：21-25；及びSiebenlistら、Cell（1980）20：269に記載されたものが含まれる。
【００６２】
酵母
酵母における発現系には、Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1978）75：1929；Itoら、J.Bacteriol.（1983）153：163；Kurtzら、Mol.Cell.Biol.（1986）6：142；Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25：141；Gleesonら、J.Gen.Microbiol.（1986）132：3459；Roggenkampら、Mol.Gen.Genet.（1986）202：302；Dasら、J.Bacteriol.（1984）158：1165；De Louvencourtら、J.Bacteriol.（1983）154：737；Van den Bergら、Bio/Technology（1990）8：135；Kunzeら、J.Basic Microbiol.（1985）25：141；Creggら、Mol.Cell.Biol.（1985）5：3376；米国特許第4,837,148号及び第4,929,555号；Beach及びNurse、Nature（1981）300：706；Davidowら、Curr.Genet.（1985）10：380；Gaillardinら、Curr.Genet.（1985）10：49；Ballanceら、Biochem.Biophys.Res.Commun.（1983）112：284-289；Tilburnら、Gene（1983）26：205-221；Yeltonら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1984）81：1470-1474；Kelly及びHynes,EMBO J.（1985）4：475479；欧州特許第0 244,234号；及び国際公開公報第91/00357号に記載されたものが含まれる。
【００６３】
昆虫細胞
昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第4,745,051号；The Molecular Biology Of Baculoviruses（1986）（W.Doerfler編）の中のFriesenら、「バキュロウイルス遺伝子発現の制御（The Regulation of Baculovirus Gene Expression）」；欧州特許第0 127,839号；欧州特許第0 155,476号；及びVlakら、J.Gen.Virol.（1988）69：765-776；Millerら、Ann.Rev.Microbiol.（1988）42：177；Carbonellら、Gene（1988）73：409；Maedaら、Nature（1985）315：592-594；Lebacq-Verheydenら、Mol.Cell.Biol.（1988）8：3129；Smithら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1985）82：8844；Miyajimaら、Gene（1987）58：273；及びMartinら、DNA（1988）7：99に記載されたようにして達成される。多数のバキュロウイルス株及び異型、並びに宿主由来の対応する許容性昆虫宿主細胞が、Luckowら、Bio/Technology（1988）6：47-55、Millerら、Generic Engineering（1986）8：277-279、及びMaedaら、Nature（1985）315：592-594に記載されている。
【００６４】
哺乳動物細胞
哺乳動物発現は、Dijkemaら、EMBO J.（1985）4：761、Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1982）79：6777、Boshartら、Cell（1985）41：521、及び米国特許第4,399,216号に記載されたようにして達成される。哺乳動物発現のその他の特色は、Ham及びWallace、Meth.Enz.（1979）58：44、Barnes及びSato、Anal.Biochem.（1980）102：255、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、国際公開公報第90/103430号、国際公開公報第87/00195号、米国再発行特許第30,985号に記載されたようにして助長される。
【００６５】
化学合成
デントニンは、化学合成により、例えば、参照として本明細書に組み込まれるメリフィールド（Merrifield）ら（J.Am.Chem.Soc.85：2149（1964））の固相ペプチド合成法により、作製され得る。当技術分野において周知の標準的な溶液法も、本発明において有用なペプチドを合成するために使用され得る（例えば、各々参照として本明細書に組み込まれるBodanszky、Principles of Peptide Synthesis、Springer-Verlag、Berlin（1984）及びBodanszky、Peptide Chemistry、Springer-Verlag、Berlin（1993）を参照のこと）。新たに合成されたペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィ（HPLC）により精製され得、例えば質量分析又はアミノ酸配列分析を使用して特徴決定され得る。
【００６６】
例えば、本発明のポリペプチドは、例えばクレイトン（Creighton）（1983、Proteins：Structures and Molecular Principles、W.H.Freeman＆Co.、N.Y.）又はハンカピラー（Hunkapiller）ら（Nature,310：105-111（1984））の方法によって化学的に合成され得る。多くの態様において、ポリペプチドの断片に相当するポリペプチドは、ペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems（Foster City、CA）のペプチド合成装置）の使用により合成され得る。さらに、所望により、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸アナログが、置換又は付加としてポリペプチド配列へ導入され得る。非古典的アミノ酸には、以下に制限はされないが、通常のアミノ酸のD-異性体、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、5ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、b-アラニン、フルオロ-アミノ酸、b-メチルアミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-メチルアミノ酸、及びアミノ酸アナログ一般のようなデザイナー（designer）アミノ酸が含まれる。さらに、アミノ酸は、D（右旋性）又はL（左旋性）であり得る。ペプチド合成のためのさらなる方法及びアミノ酸アナログは、チャン（Chan）ら（Fmoc solid phase peptide synthesis：A Practical Approach、Oxford University Press、2000）及びボダンスキ（Bodanszky）（Principles of Peptide Synthesis、Springer Verlag、第2版、1993）に見出され得る。
【００６７】
カルシトリオールを調整する方法
本発明は、細胞内の25-ヒドロキシビタミンD3 1α-水酸化酵素（「1α-水酸化酵素」）活性及び／又はカルシトリオールレベルを増加させる方法を提供する。多くの態様において、その方法は、細胞内又は宿主内のカルシトリオール量を調整するため、細胞内の1α-水酸化酵素活性を調整する有効量の1個以上の活性薬剤と、細胞を接触させることを含む。ある種の態様において、1個以上の活性薬剤は、デントニンを含む。いくつかの態様において、所望の増加は、1α-水酸化酵素mRNAレベル、1α-水酸化酵素タンパク質レベル、又は1α-水酸化酵素酵素活性の増加である。
【００６８】
「1α-水酸化酵素活性」とは、1α-水酸化酵素タンパク質の活性を意味し、代表的な1α-水酸化酵素タンパク質は、GenBankアクセッション番号NP_000776、NP_446215、又はO35084に開示されており、フー（Fu）ら（DNA Cell Biol.16：1499-507,1997）及びキタナカ（Kitanaka）ら（N.Engl J Med.338：653-61,1998）に記されている。1α-水酸化酵素の活性を決定するためのアッセイには、ナカムラ（Nakamura）（FEBS Lett.419：45-8,1997）及びエトウ（Eto）（Anal Biochem.258：53-8,1998）のものが含まれ、当技術分野において既知であり（例えば、Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Wiley＆Sons、1995；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、（1989）Cold Spring Harbor、N.Y.）、後にさらに記載されるような、1α-水酸化酵素遺伝子発現を決定するための方法、例えば、RT-PCR、RNA又はタンパク質のゲルブロッティング、RNAハイブリダイゼーション等も含まれる。
【００６９】
ある種の態様において、1α-水酸化酵素活性及び／又はカルシトリオール量は、基線1α-水酸化酵素活性レベル、例えばデントニンとの接触前に細胞内又は宿主内に観察されたものと比較して、少なくとも約10％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約70％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、少なくとも約250％、少なくとも約300％、少なくとも約400％、少なくとも約500％、少なくとも約700％、少なくとも約1000％、少なくとも約2000％、少なくとも約5000％、又はそれ以上、増加させられる。
【００７０】
多くの態様において、1α-水酸化酵素活性及び／又はカルシトリオール量は、適当なカルシトリオール前駆分子が利用可能である任意の部位、例えば腎細胞において増加させられる。
【００７１】
ある種の態様において、活性薬剤は、ビタミンD 24-水酸化酵素の活性（「25水酸化酵素」、例えば、NCBIアクセッション番号NP_000773、AAB03776、CAB91829、又はCAB91829によって記載されたタンパク質の活性）を増加させるよりも大きな程度で、1α-水酸化酵素活性を増加させる。そのため、大部分の態様において、活性薬剤が細胞と接触させられた場合、それは、1α-水酸化酵素活性のレベル（例えば、1α-水酸化酵素mRNAのレベル）を、ある程度の量、増加させ、25水酸化酵素の活性（例えば、25水酸化酵素mRNAのレベル）を、検出不可能なレベル、細胞内又は宿主内の基線活性レベルと比較して約1％未満、約5％未満、約10％未満、約20％未満、約30％未満、約40％未満、又は約50％未満、増加させるであろう。例えば、1α-水酸化酵素mRNAレベルが500％増加させられる場合、25水酸化酵素mRNAのレベルは、その量の5％（25％）誘導され得る。ある種の態様において、細胞が、活性薬剤（例えば、デントニン）と接触されられた場合、25水酸化酵素活性の検出可能な増加は存在しない。
【００７２】
多くの態様において、その方法は、宿主内の1α-水酸化酵素活性又は宿主内のカルシトリオールレベルを調整する有効量の1個以上の活性薬剤を宿主に投与することを含む。活性薬剤は、ポリヌクレオチド組成物（例えば、デントニンのコーディング配列等）、ポリペプチド組成物（例えば、デントニンポリペプチド等）、及び天然に存在する又は合成の低分子化合物等を含む、多様な異なる化合物であり得る。
【００７３】
ある種の態様において、宿主へ投与される活性薬剤は、ポリヌクレオチド組成物又は核酸組成物である。核酸は、デントニンのコーディング配列、例えば、遺伝子、遺伝子断片等であってよく、それは、発現ベクター内に存在してもよく、そのようなベクターは、一般に、核酸配列の挿入を提供するためのプロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。転写開始領域、標的遺伝子又はその断片、及び転写終結領域を含む転写カセットが調製され得る。転写カセットは、デントニンを発現するため、一般的には少なくとも約1日、より一般的には少なくとも約数日〜数週の期間にわたって、細胞内に一過性に又は安定的に維持され得る多様なベクター、例えば、プラスミド；レトロウイルス、例えば、レンチウイルス；アデノウイルス等へ導入され得る。
【００７４】
製剤
本発明の方法の実施においては、有効量の活性薬剤が宿主へ投与される。ここで、「有効量」という用語は、所望の結果を生じるのに十分な投薬量を意味し、所望の結果とは、1α-水酸化酵素活性及び／又はカルシトリオールレベルの所望の調整、例えば、増強、縮小である。
【００７５】
本発明の方法の実施において、1個以上の活性薬剤は、典型的には、生理学的に許容される送達媒体に含まれて、例えば、薬学的調製物として、宿主へ投与される。多様な代表的な製剤、投薬量、候補薬剤の投与経路、核酸送達媒体、及び核酸送達用の核酸製剤を、以下に記載する。
【００７６】
製剤、投薬量、及び投与経路
本発明は、宿主内の1α-水酸化酵素活性及び／又はカルシトリオールレベルを調整する薬剤を含む、薬学的製剤を含む製剤を提供する。一般に、製剤は、宿主内の1α-水酸化酵素活性を調整する薬剤を有効量含む。「有効量」とは、所望の結果、例えば、1α-水酸化酵素活性発現のレベルの増加及び／又はカルシトリオールの増加等を生じるのに十分な量をさす。多くの態様において、所望の結果は、少なくとも、表現型がより正常に近づくような、対照と比較した表現型の縮小又は増加である。
【００７７】
製剤
本発明の方法において、1個以上の活性薬剤は、宿主内の1α-水酸化酵素活性及び／又はカルシトリオールレベルの所望の増加をもたらし得る任意の便利な手段を使用して、宿主へ投与され得る。
【００７８】
従って、薬剤は、治療的投与のための多様な製剤に組み込まれ得る。より具体的には、本発明の薬剤は、適切な、薬学的に許容される担体又は希釈剤との組み合わせによって薬学的組成物へと製剤化され得、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、及びエアロゾル剤のような、固形、半固形、液状又はガス状の調製物へと製剤化され得る。
【００７９】
薬学的剤形において、薬剤は、薬学的に許容される塩の形態で投与されてもよく、又は単独で使用されてもよいし、もしくは他の薬学的に活性な化合物と適切に会合させられて、また、組み合わせられて使用されてもよい。下記の方法及び賦形剤は、例示に過ぎず、決して制限的なものではない。
【００８０】
経口調製物の場合、薬剤は、単独で使用されてもよいし、又は錠剤、散剤、顆粒剤、もしくはカプセル剤を作成するための適切な添加剤、例えば、乳糖、マンニトール、コーンスターチ、もしくはジャガイモデンプンのような従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチ、もしくはゼラチンのような結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、もしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤；タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；そして所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、及び風味剤と組み合わせられて使用されてもよい。
【００８１】
薬剤は、所望により、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、及び保存剤のような従来の添加剤を用いて、水性溶媒、又は植物油もしくはその他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、もしくはプロピレングリコールのような非水性溶媒に、それらを溶解させるか、懸濁させるか、又は乳化することにより、注射用の調製物へと製剤化され得る。
【００８２】
薬剤は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤で利用され得る。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような加圧された許容される噴霧剤へと製剤化され得る。
【００８３】
さらに、薬剤は、乳化基剤又は水溶性基剤のような多様な基剤と混合することにより坐剤へと加工され得る。本発明の化合物は、坐剤を介して直腸投与され得る。坐剤は、体温では融解するが室温では固体である、カカオ脂、カーボワックス（carbowaxes）、及びポリエチレングリコールのような媒体を含み得る。
【００８４】
各投薬単位、例えば小さじ1杯、大さじ1杯、錠剤、又は坐剤が、1個以上の阻害剤を含有している組成物を、予定された量、含有している、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤のような経口投与又は直腸投与のための単位剤形が提供され得る。同様に、注射又は静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、普通の生理食塩水、又はもう一つの薬学的に許容される担体の溶液として組成物中に（1個以上の）阻害剤を含み得る。
【００８５】
「単位剤形」という用語は、本明細書において使用されるように、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は媒体と会合した、所望の効果を生じるのに十分な量の計算された予定された量の本発明の化合物を各々含有している、ヒト及び動物対象のための単位投薬量として適当な物理的に別個の単位をさす。本発明の新規の単位剤形に関する明細は、利用される特定の化合物及び達成すべき効果、並びに宿主における各化合物に関連した薬力学に依存する。
【００８６】
その他の投与様式も、本発明において使用可能であろう。例えば、本発明の薬剤は、坐剤へと製剤化され得、いくつかの場合にはエアロゾル剤及び鼻腔内組成物へと製剤化され得る。坐剤の場合、媒体組成物は、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドのような伝統的な結合剤及び担体を含むであろう。そのような坐剤は、約0.5％〜約10％（w/w）、好ましくは約1％〜約2％の範囲で活性成分を含有している混合物から形成され得る。
【００８７】
鼻腔内製剤は、一般的に、鼻粘膜に対する刺激を引き起こさず、繊毛機能を有意に妨害しない媒体を含むであろう。水、水性生理食塩水、又はその他の既知の物質のような希釈剤が、本発明において使用され得る。鼻製剤は、以下に制限はされないが、クロロブタノール及び塩化ベンザルコニウムのような保存剤を含有していてもよい。鼻粘膜による本発明のタンパク質の吸収を増強するため、界面活性剤が存在してもよい。
【００８８】
本発明の薬剤は、注射可能剤として投与され得る。典型的には、注射可能組成物は、液状の液剤又は懸濁剤として調製され；注射前の液状媒体への溶解又は懸濁に適している固体が調製されてもよい。調製物は、乳化されていてもよく、又はリポソーム媒体に封入された活性成分であってもよい。
【００８９】
適当な賦形媒体は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組み合わせである。さらに、所望により、媒体は、湿潤剤、乳化剤、又はpH緩衝剤のような微量の補助物質を含有していてもよい。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者には既知であるか又は明白であろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania、第17版、1985；Remington：The Science and Practice of Pharmacy、A.R.Gennaro、（2000）Lippincott、Williams＆Wilkinsを参照のこと。投与される組成物又は製剤は、いずれにせよ、治療を受ける対象において所望の状態を達成するのに充分な量の薬剤を含有しているであろう。
【００９０】
媒体、佐剤、担体、又は希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、公に容易に入手可能である。さらに、pH調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、安定剤、湿潤剤等のような薬学的に許容される補助物質は、公に容易に入手可能である。
【００９１】
投薬量
使用される投薬量は、達成すべき臨床目標に依って変動するであろうが、適当な投薬量範囲は、対象動物におけるビタミンD関連障害の症状を縮小させる薬剤を最大1μg〜1,000μg又は約10,000μg提供するものである。
【００９２】
当業者は、特定の化合物、症状の重度、及び副作用に対する対象の感受性の関数として用量レベルが変動し得ることを容易に認識するであろう。所定の化合物についての好ましい投薬量は、多様な手段によって当業者により容易に決定され得る。
【００９３】
投与経路
従来の、薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、腫瘍内、皮下、皮内、局所適用、静脈内、直腸、鼻、経口、及びその他の非経口の投与経路が含まれる。投与経路は、所望により組み合わせられ得、又は薬剤及び／もしくは所望の効果に依って調整され得る。組成物は、単回投与されてもよいし、又は複数回投与されてもよい。ある種の態様において、製剤は、例えば、直接注射、又は腎動脈への注射を通して、宿主の腎臓へ投与される。
【００９４】
薬剤は、全身経路又は局部経路を含む、従来の薬物の送達に適している任意の利用可能な従来の方法及び経路を使用して、宿主へ投与され得る。一般に、本発明によって企図される投与経路には、必ずしも以下に制限はされないが、腸経路、非経口経路、又は吸入経路が含まれる。
【００９５】
吸入投与以外の非経口投与経路には、必ずしも以下に制限はされないが、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、関節内、脊髄内、胸骨内、及び静脈内の経路、即ち消化管を通らない任意の投与経路が含まれる。非経口投与は、薬剤の全身送達又は局所送達を達成するために実施され得る。全身送達が望まれる場合、投与には、典型的には、浸潤性の、又は全身に吸収される、医薬調製物の局所投与又は粘膜投与が含まれる。
【００９６】
薬剤は、腸投与によっても対象へ送達され得る。腸投与経路には、必ずしも以下に制限はされないが、経口送達、及び（例えば、坐剤を使用した）直腸送達が含まれる。
【００９７】
皮膚又は粘膜を通した薬剤の投与の方法には、必ずしも以下に制限はされないが、適当な薬学的調製物の局所適用、経皮伝達、注射、及び表皮投与が含まれる。経皮伝達の場合、吸収促進剤又はイオントフォレシスが適当な方法である。イオントフォレシスによる伝達は、数日又はそれ以上の期間にわたって、無傷の皮膚を通して電気パルスを介して継続的に生成物を送達する、商業的に入手可能な「パッチ」を使用して達成され得る。
【００９８】
治療とは、少なくとも、宿主が罹患している病理学的状態に関連した症状の緩解を意味し、ここで、緩解とは、ビタミンD関連障害及びそれに関連した心理学的外傷のような、治療されている病理学的状態に関連したパラメータ、例えば症状の大きさの縮小を少なくともさすために広義に使用される。そのため、治療には、宿主が病理学的状態又は少なくとも病理学的状態を特徴づける症状にもはや罹患しないよう、病理学的状態又は少なくともそれに関連した症状が、完全に阻害される、例えば発生が防止されるか、又は中止される、例えば終了される状況も含まれる。
【００９９】
本発明のポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして送達されてもよいし、又は送達媒体と会合して（複合体化されて）送達されてもよい。「会合した」又は「複合体化された」とは、いずれも、ポリヌクレオチドの所定の送達媒体との共有結合性及び非共有結合性の相互作用を包含する。
【０１００】
核酸送達媒体
ある種の態様において、薬剤は核酸である。核酸は、ウイルス性及び非ウイルス性の送達媒体を含むいくつかの異なる媒体を使用して送達され得る。
【０１０１】
ウイルス性送達媒体
本発明のポリヌクレオチドは、ウイルス性送達媒体と会合させられ得る。本明細書において使用されるように、「ウイルス性送達媒体」とは、送達すべきポリヌクレオチドが、ウイルス粒子内のキャプシドに包囲されていることをさす。
【０１０２】
インビボ形質転換及び遺伝子治療において有用な多数のウイルスゲノムが、当技術分野において既知であるか、又は技術分野における技術及び知識があれば容易に構築され得る。含まれるのは、複製可能ウイルス、複製欠損ウイルス、及び条件付き複製ウイルスである。ウイルスベクターには、アデノウイルス、ムンプスウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、サイトメガロウイルス（CMV）、ワクシニアウイルス、及びポリオウイルス、並びにこれらの非複製性変異体／変種が含まれる。気道は、徐々に複製する細胞及び／又は最終分化細胞から主として構成されているため、いくつかの態様において、複製欠損ウイルスは、これらの細胞型に感染することができる。例えば、アデノウイルスは、徐々に複製する細胞及び／又は最終分化細胞に効率的に感染する。いくつかの態様において、ウイルスゲノム自体又はウイルス表面のタンパク質は、標的細胞の細胞に対して特異的であるか、又は実質的に特異的である。ウイルスゲノムは、ウイルス複製にとって不可欠な（1個以上の）遺伝子に機能的に連結された細胞型特異的なプロモーター及び／又はエンハンサーを含めることにより、標的細胞特異的であるよう設計され得る。
【０１０３】
複製欠損ウイルスがウイルスゲノムとして使用される場合、目的のポリヌクレオチドに相当するDNA又はRNAのいずれかを含有しているウイルス粒子の作製は、ウイルスの複製及び／又は産生にとって不可欠な欠けている成分を提供する組換え細胞系へウイルス構築物を導入することにより作製され得る。好ましくは、組換えウイルスゲノムによる組換え細胞系の形質転換は、例えば、組換え細胞系のウイルス配列の、導入されたウイルスゲノムとの相同的組み換えにより、複製可能ウイルスの産生をもたらさないであろう。目的の核酸を含有している複製欠損ウイルス粒子の作製のための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Rosenfeldら、Science 252：431-434,1991及びRosenfeldら、Cell 68：143-155,1992（アデノウイルス）；米国特許第5,139,941号（アデノ随伴ウイルス）；米国特許第4,861,719号（レトロウイルス）；並びに米国特許第5,356,806号（ワクシニアウイルス）に記載されている。ムンプスウイルスゲノムの操作のための方法及び材料、ウイルス融合及びウイルス複製を担うムンプスウイルス遺伝子の特徴決定、並びにムンプスウイルスゲノムの構造及び配列は、Tanabayashiら、J.Virol.67：2928-2931,1993；Takeuchiら、Archiv.Virol.,128：177-183,1993；Tanabayashiら、Virol.187：801-804,1992；Kawanoら、Virol,179：857-861,1990；Elangoら、J.Gen.Virol.69：2893-28900,1988に記載されている。
【０１０４】
非ウイルス性送達媒体
本発明のポリヌクレオチドは、非ウイルス性送達媒体を使用して投与され得る。「非ウイルス性送達媒体」（本明細書において「非ウイルスベクター」とも呼ばれる）とは、本明細書において使用されるように、裸のポリヌクレオチド又は凝縮したポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドとカチオン性化合物（例えば、デキストラン硫酸）との製剤）、及びウイルス粒子のような佐剤と混合された裸のポリヌクレオチド又は凝縮したポリヌクレオチド（即ち、目的のポリヌクレオチドはウイルス粒子内に含有されていないが、形質転換製剤は、裸のポリヌクレオチドとウイルス粒子（例えば、アデノウイルス粒子）との両方から構成されている）を含有している化学的製剤を含むものとする（例えば、Curielら、1992 Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.6：247-52参照）。従って、「非ウイルス性送達媒体」には、ウイルス粒子が目的ポリヌクレオチドを含有していない、ポリヌクレオチド＋ウイルス粒子から構成されたベクターが含まれ得る。「非ウイルス性送達媒体」には、送達すべきポリヌクレオチドが、ウイルス粒子内のキャプシドに包囲されていない、又はウイルス粒子内に含有されていない、細菌プラスミド、ウイルスゲノム又はその一部が含まれ、構築物には、ウイルスゲノムの一部と、細菌プラスミド及び／又はバクテリオファージの一部とが含まれる。その用語には、天然及び合成のポリマー及びコポリマーも包含される。その用語には、さらに、脂質に基づく媒体が包含される。脂質に基づく媒体には、フェルグナー（Felgner）ら（米国特許第5,264,618号及び第5,459,127号；PNAS 84：7413-7417,1987；Annals N.Y.Acad.Sci.772：126-139,1995）によって開示されたようなカチオン性リポソームが含まれ；それらは、シュレイアー（Schreier）ら（米国特許第5,252,348号及び第5,766,625号）によって開示されたような人工ウイルスエンベロープを含む、中性もしくは負の電荷を有するリン脂質又はそれらの混合物からなっていてもよい。
【０１０５】
非ウイルス性送達媒体には、ポリマーに基づく担体が含まれる。ポリマーに基づく担体には、天然及び合成のポリマー及びコポリマーが含まれ得る。好ましくは、ポリマーは、生分解性であるか、又は対象から容易に排除され得る。天然に存在するポリマーには、ポリペプチド及び多糖が含まれる。合成ポリマーには、以下に制限はされないが、分子が凝縮剤としても機能することができるポリリシン及びポリエチレンイミン（PEI；Boussifら、PNAS 92：7297-7301,1995）が含まれる。これらの担体は、水、エタノール、生理食塩水溶液、及びそれらの混合物のような分散液中に溶解、分散、又は懸濁させられ得る。多様な合成ポリマーが、当技術分野において既知であり、使用され得る。
【０１０６】
「非ウイルス性送達媒体」には、さらに細菌が含まれる。ポリヌクレオチドの送達媒体としての様々な細菌の使用が記載されている。以下に制限はされないが、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、サルモネラ（Salmonella）等の非病原性株を含む、任意の既知の細菌が、送達媒体として使用され得る。
【０１０７】
核酸送達用の製剤
送達すべきポリヌクレオチドは、DNA-リポソーム又はRNA-リポソーム複合体製剤として製剤化され得る。そのような複合体は、正電荷（静電的相互作用）によって遺伝材料（DNA又はRNA）と結合する脂質の混合物を含む。本発明において使用され得るカチオン性リポソームには、3β-(N-(N',N'-ジメチル-アミノエタン)-カルバモイル)-コレステロール（DC-Chol）、1,2-ビス(オレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニオ-プロパン（DOTAP）（例えば、国際公開公報第98/07408号参照）、リジニルホスファチジルエタノールアミン（L-PE）、リポスペルミンのようなリポポリアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1-プロパナミニウム（propanaminium）ブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、N(1,2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル-N,N,N-トリエチルアンモニウム（DOTMA）、DOSPA、DMRIE、GL-67、GL-89、リポフェクチン、及びリポフェクタミン（Thieryら（1997）Gene Ther.4：226-237；Felgnerら、Annals N.Y.Acad.Sci.772：126-139,1995；Eastmanら、Hum.Gene Ther.8：765-773,1997）が含まれる。米国特許第5,858,784号に記載されたポリヌクレオチド／脂質製剤も、本明細書に記載された方法において使用され得る。これらの脂質の多くは、例えば、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer-Mannheim）及びアバンティ・ポーラー・リピッヅ（Avanti Polar Lipids）（Birmingham,AL）より商業的に入手可能である。米国特許第5,264,618号、第5,223,263号、及び第5,459,127号に見出されるカチオン性リン脂質も、包含される。使用され得るその他の適当なリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルイノシトール等が含まれる。コレステロールも含まれ得る。
【０１０８】
宿主細胞内の遺伝子発現を調整する方法
本発明は、宿主細胞内の核酸発現を調整する方法をさらに提供する。一般に、これらの方法は、細胞内の1α-水酸化酵素プロモーター（プロモーターの例は、Shinkiら、PNAS 1999 96：6988-6993；Yoshidaら、J Am Soc Nephrol.2002；Brenzaら、Proc Natl Acad Sci U S A.1998 95：1387-91、及び配列番号：19に記載されている）に機能的に連結された1個以上の標的核酸の発現を調整することを含む。ある種の態様において、1α-水酸化酵素プロモーターへ機能的に連結された標的核酸を含むベクター構築物が、発現カセットが形成されるよう調製され、ベクターが、細胞、特に腎細胞へ移入される。次いで、核酸の発現を達成するために、細胞はデントニンと接触させられる。ある種の態様において、核酸はポリペプチドをコードし、そのため、そのような方法は、宿主細胞における1個以上のポリペプチドの作製において有用である。発現カセットを含有しているベクターを作成するための方法、及びそのようなベクターのための発現系は、当技術分野において一般に周知である（例えば、Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology、第3版、Wiley＆Sons、1995；Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、（1989）Cold Spring Harbor、N.Y.参照）。
【０１０９】
大部分の態様において、細胞内の1α-水酸化酵素プロモーターへ機能的に連結された核酸は、細胞のデントニンとの接触により誘導されるであろう。多くの態様において、核酸の産生は、デントニンの非存在下での細胞内の同じ発現カセットと比較して、少なくとも約20％、少なくとも約20％、少なくとも約40％、少なくとも約80％、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、少なくとも約300％、少なくとも約400％、少なくとも約500％、少なくとも約1000％〜少なくとも約10,000％、増加するであろう。ある種の態様において、細胞は動物宿主内に含まれ、その方法は、宿主内の核酸の発現を誘導するために使用され得る。
【０１１０】
そのような方法は、細胞内でポリペプチドを産生させるために使用され得る。そのため、いくつかの態様において、本発明は、遺伝子治療の方法を提供する。一般に、これらの態様は、カセットを形成させるため、標的遺伝子配列を1α-水酸化酵素遺伝子のプロモーターへ機能的に連結すること、そのカセットを哺乳動物対象へ移入すること、及び治療的に有効な標的遺伝子の発現を誘導するデントニン製剤を対象へ投与することを含む。ある種の態様において、カセットは哺乳動物対象の腎細胞に移入される。
【０１１１】
利用可能性
宿主内の1α-水酸化酵素活性及び／又はカルシトリオールレベルを増加させる本発明の組成物及び方法は、多様な治療プロトコルにおいて使用可能である。一般に、これらのプロトコルは、宿主内のカルシトリオールを増加させ、宿主を治療するため、1α-水酸化酵素活性を調整する有効量の1個以上の活性薬剤を、そのような治療を必要とする宿主（例えば、ビタミンD関連状態に罹患している宿主、又はビタミンDレベルの増加により治療可能な状態を有する宿主）へ投与することを含む。
【０１１２】
いくつかの態様において、本発明の組成物及び方法は、宿主内のカルシトリオールレベルを増加させるために使用され得る。一般に、これらの態様は、宿主が、カルシトリオール、特に血清カルシトリオールのレベルを、デントニンを投与されていない宿主と比較して少なくとも約20％、少なくとも約20％、少なくとも約40％、少なくとも約80％、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、少なくとも約300％、少なくとも約400％、少なくとも約500％、少なくとも約1000％、増加させるよう、デントニンペプチドを宿主へ投与することを含む。
【０１１３】
治療とは、少なくとも、宿主が罹患している病理学的状態に関連した症状の緩解を意味し、緩解とは、遅い骨治癒、弱い骨等のような、治療されている病理学的状態に関連したパラメータ、例えば症状の大きさの縮小を少なくともさすため広義に使用される。そのため、治療には、宿主が病理学的状態又は少なくとも病理学的状態を特徴づける症状にもはや罹患しないよう、病理学的状態又は少なくともそれに関連した症状が、完全に阻害される、例えば発生が防止されるか、又は中止される、例えば終了される状況も含まれる。例えば、疾患状態が脆弱な骨を特徴とする場合、治療には、正常な骨強度の回復を含む、観察された骨の脆弱さの縮小が少なくとも含まれる。
【０１１４】
多様な宿主が、本発明の方法に従い治療可能である。一般に、そのような宿主は、哺乳類又は哺乳動物（これらの用語は、肉食類（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯類（例えば、マウス、モルモット、及びラット）、並びに霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、及びサル）を含む哺乳綱に含まれる生物を記載するために広く使用される）である。多くの態様において、宿主はヒトであろう。
【０１１５】
特定に重要であるのは、例えば、縮小したカルシトリオール合成、増加したカルシトリオール流動等により引き起こされた縮小したカルシトリオールレベルを含む、望ましくないカルシトリオールレベルに関連した障害の治療及び予防である。そのような障害の例には、以下に制限はされないが、くる病、骨軟化症、骨粗鬆症、パジェット病、骨減少症、骨硬化症又は腎性骨形成異常、急性骨硬化症、乾癬、髄様癌、アルツハイマー病、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症、偽性上皮小体機能不全（pseudoparathyroidism）、二次性上皮小体機能不全（secondary parathyroidism）、糖尿病、肝硬変、閉塞性黄疸又は薬物誘導性代謝、グルココルチコイド拮抗、高カルシウム血症、吸収不良症候群、脂肪便、慢性腎疾患、低リン酸血症性ビタミンD抵抗性くる病、ビタミンD依存性くる病、I型くる病、II型くる病、サルコイドーシス、白血病、前立腺癌、乳癌、結腸癌、臓器移植、又は免疫障害（immunodisorder）が含まれる。ビタミンD関連状態は、骨折治癒及び様々な歯障害にも関する。本発明の方法は、特定のビタミンD関連障害に罹患していないが、カルシトリオールレベルの調整が望まれる宿主において、カルシトリオールレベルを増加させるための方法においても使用可能である。例えば、本発明の方法は、そのようなビタミンD関連障害を来すことを回避することを望む宿主に対して実施され得る。特定に重要な対象には、例えば、それぞれ1型又は2型骨粗鬆症に罹患している50〜70歳の年齢群の女性及び70〜90歳の年齢群の女性のような、ビタミンD関連状態を発症しやすい対象が含まれる。
【０１１６】
キット
前記のような本発明の方法を実施するためのキットも、本発明によって提供される。本発明のキットは、前記のようなデントニンを少なくとも含む薬学的調製物を1個以上少なくとも含む。その他の場合により含まれ得るキットの成分には、注射器又はその他の投与装置が含まれる。キットの様々な成分は、所望により、別々のコンテナの中に存在してもよいし、又はある種の適合性の成分が単一のコンテナへ予め組み合わせられていてもよい。多くの態様において、活性薬剤の単位用量、例えば経口用量又は注射可能用量を含むキットが提供される。多くの態様において、本発明の組成物は、リン酸緩衝生理食塩水、トリス、グリセロール等のような媒体内に含有されている。
【０１１７】
前記成分に加え、本発明のキットは、典型的には、宿主内のカルシトリオールレベルを調整し、宿主を治療するため、宿主内の1α-水酸化酵素活性を増加させる有効量の1個以上の活性薬剤を宿主へ投与することにより、そのような治療を必要とする宿主を治療する本発明の方法を実施するため、キットの成分を使用するための指示をさらに含む。本発明の方法を実施するための指示は、一般に、適当な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙又はプラスチック等のような基質に印刷され得る。そのため、指示は、例えば、添付文書として、キットのコンテナ又はその部材のラベリングに含まれて（即ち、パッケージング又はサブパッケージングに添付されて）、キット内に存在し得る。その他の態様において、指示は、適当なコンピュータ読取り可能記憶媒体、例えばCD-ROM、ディスク等に存在する電子的記憶データファイルとして存在する。さらに他の態様において、実際の指示はキット内に存在せず、遠隔の供給元から、例えばインターネットを介して、指示を得るための手段が提供される。この態様の例は、指示が閲覧され得、かつ／又は指示がダウンロードされ得るウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を得るためのこの手段は、適当な基質に記録される。
【０１１８】
実施例
以下の実施例は、本発明を作成し使用するための方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために示され、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を制限するためのものではなく、また、以下の実施例が実施された全ての又は唯一の実験であることを表すものでもない。使用された数値（例えば、量、温度等）に関しては正確さを保証するよう努力がなされたが、いくつかの実験誤差及び偏差は斟酌されるべきである。特記しない限り、割合は重量の割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
【０１１９】
材料及び方法
細胞培養、RNA調製、及びcDNA合成：CL-8細胞（1.6×106個）を60mm培養皿に置き、5％FCS D-MEM/HamF-12（1：1）培地中で48時間培養した。この培地を、FCSを含まない0.5mM Ca定義培地（D-MEM/HamF-12（13：87）、インスリン5μg/ml、トランスフェリン5μg/ml、Na2SeO3 5ng/ml、T3 0.37nM、EGF 2.5ng/ml、ヒドロコルチゾン1nM）に交換した。24時間後、配列番号：1のペプチド（100ng/ml又は500ng/ml）又はPTH 100nMを添加し、5時間培養した。処理後、各ウェルの全細胞内容物をRNA抽出及び逆転写（RT）に使用した。RNAは、製造業者のプロトコルに従い、ISOGEN（Nippon Gene、Japan）を使用して単離した。精製されたRNAを、10μlのRNaseを含まない水に再溶解させ、RTによるcDNA合成に使用した。RTは、10mMトリス緩衝液（pH8.3）、50mMのKCl、5mMのMgCl2、各1mMのdATP、dGTP、dCTP、及びdTTP、20UのRNase阻害剤、1μMの逆方向プライマー、及び5UのAMV逆転写酵素を含有している、20μlの反応混合物において実施した。反応混合物は、30℃で10分、55℃で15分、95℃で5分、その後5℃で5分インキュベートした。
【０１２０】
リアルタイム定量的PCR：mRNAを、ヒト1α-OHase遺伝子及びβ-アクチンについて定量した。これら遺伝子を、オリゴ合成DNA（Takara、Japan）のプライマーを使用して増幅した。ヒト1α-OHase遺伝子プライマーは、115bpの産物（ヒトシトクロムP450、サブファミリーXXVIIB（25-ヒドロキシビタミンD-1-α-水酸化酵素）、ポリペプチド1（CYP27B1）、核遺伝子によってコードされたミトコンドリアタンパク質、mRNA配列、アクセッション番号：NM000785の塩基1197-1311位に位置する）を増幅する。β-アクチンプライマーは、77bpの産物（マウス筋肉黒色腫X-アクチン（Actx）、mRNA配列、アクセッション番号：NM007393の塩基250-326位に位置する）を増幅する。mRNAの定量は、SYBRグリーン（Green）法によりアプライド・バイオシステムズ・ジーンアンプ（Applied Biosystems GeneAmp）5700配列検出システムを使用して実施した。
【０１２１】
使用されたプライマーセットは：ヒト1α-OHase順方向：
2005525104.tif 000012
、ヒト1α-OHase逆方向：
2005525104.tif 000013
、β-アクチン順方向：
2005525104.tif 000014
、β-アクチン逆方向：
2005525104.tif 000015
であった。
【０１２２】
実施例1
デントニンペプチドによる1α-水酸化酵素mRNA発現の制御
1α-水酸化酵素mRNA発現の制御に対する配列番号：1のペプチドの効果を研究するため、CL-8細胞を、配列番号：1のペプチドの存在下及び非存在下で増殖させ、1α-水酸化酵素に対するペプチドの効果を定量した。図1a及び1bは、これらの実験のグラフ化された結果を示す。図1aは、PTHなしで増殖させられた細胞への100ng/mlの配列番号：1のペプチドの添加が、1α-水酸化酵素mRNAのレベルをおよそ200％増加させることを示している。PTHなしで増殖させられた細胞への500ng/mlの配列番号：1のペプチドの添加は、1α-水酸化酵素mRNAのレベルをおよそ500％増加させる（p＜0.05）。図1bは、配列番号：1のペプチドが、細胞が100nM PTHの存在下で増殖させられた場合、1α-水酸化酵素mRNAのレベルをさらには増加させないことを示している。従って、配列番号：1のペプチドは、1α-水酸化酵素遺伝子発現の強力な誘導剤である。1α-水酸化酵素遺伝子はカルシトリオールの生合成経路の最終工程をコードするため、その発現の増加は、1α-水酸化酵素の量を増加させ、カルシトリオールの合成の速度を増加させ、細胞内及び循環血中のカルシトリオールのレベルの増加をもたらすであろうと予想されよう。
【０１２３】
実施例2
1α-水酸化酵素mRNA発現を制御するためにプロテインキナーゼAを必要としないデントニン
PTH及び配列番号：1のペプチドは、1α-水酸化酵素mRNAの発現を誘導する。CL-8細胞を、プロテインキナーゼA阻害剤である化合物H-89の存在下又は非存在下で、配列番号：1のペプチドの存在下又は非存在下で、又はPTHと共に増殖させ、PTHの配列番号：1のペプチドによる1α-水酸化酵素の誘導に対するH-89の効果を調査した。実施例1と同じ実験系において、細胞が分裂した時点で、第1の実験においては、H-89を細胞に添加せず、100nmolの濃度のPTH、又は100もしくは500ng/mlいずれかの濃度の配列番号：1のペプチドを、細胞に添加した。平行の第2の実験においては、10uMの濃度のH-89を、100nmolの濃度のPTH、又は100もしくは500ng/mlいずれかの濃度の配列番号：1のペプチドと共に細胞に添加した。細胞を、さらに5時間増殖させ、RNAを採集し、1α-水酸化酵素の発現レベルを、標準的なノーザンブロッティング又はRT-PCRの手法を使用して、各試料において決定した。
【０１２４】
図2は、これらの実験のグラフ化された結果を示す。図2は、100ng/ml又は500ng/mlいずれかの濃度の配列番号：1のペプチドが、100nmの濃度のPTHより有意に高いレベルに、1α-水酸化酵素mRNAの発現レベルを誘導したことを示している。図2は、H-89が1α-水酸化酵素mRNA発現に対するPTHの誘導効果を阻害したことも示している。H-89はプロテインキナーゼA（PKA）に対する強力かつ特異的な阻害剤であるため、従って、それは、PKA依存経路によるPTHによる1α-水酸化酵素mRNA発現の誘導を阻害することができた。
【０１２５】
この実験において、H-89は、1α-水酸化酵素mRNA発現に対する配列番号：1のペプチドの刺激効果を阻害しなかった。従って、配列番号：1のペプチドは、PKA非依存性の経路により1α-水酸化酵素を誘導する。従って、配列番号：1のペプチドは、PTHとは異なるシグナル伝達経路で働く。PTHは、骨細胞又は腎細尿管細胞の細胞膜上のPTH受容体（PTHR）に結合し、PKA依存性の経路を介して特定の遺伝子の発現を達成するためのシグナルが伝達される。PTH及びPTHのアナログは、骨粗鬆症のようなビタミンD代謝関連障害の治療のための薬剤として頻繁に提唱されている（例えば、米国特許第6,316,410号、第6,147,186号、及び第5,969,095号）。PTH及びそのアナログは、1α-水酸化酵素mRNAの発現を誘導し、それにより、腎細尿管細胞における活性ビタミンD合成を増加させるが、それは、同時に、高カルシウム血症をもたらす腎細尿管細胞におけるカルシウム再吸収を促進する。従って、PTH及びそのアナログの有効性は、高カルシウム血症を引き起こすその効果によって損なわれている。配列番号：1のペプチドは、PKA非依存性の経路により1α-水酸化酵素mRNA発現を誘導することが見出されたため、ビタミンD関連疾患の治療としてのPTH及びそのアナログの負の副作用を有しないかもしれない。
【０１２６】
実施例3
24-水酸化酵素mRNA発現を誘導しないデントニン
24-水酸化酵素は、カルシトリオールの直前の前駆物質である25-モノヒドロキシビタミンD3、又はカルシトリオール自体を水酸化する酵素である。前駆物質の場合、24位における水酸化は、活性型の化合物を「迂回」する経路を引き起こす。活性カルシトリオールの水酸化は、その化合物を不活化する。
【０１２７】
CL-8細胞を前記のように増殖させ、配列番号：1のペプチドを、細胞に添加しないか、又は100もしくは500ng/mlいずれかの濃度で、細胞に添加した。細胞をさらに5時間増殖させ、RNAを前記の方法を使用して採集し、24-水酸化酵素の発現レベルを、前記の方法を使用して、各試料において決定した。
【０１２８】
図3は、この実験のグラフ化された結果を示す。100又は500ng/mlいずれかの配列番号：1のペプチドによる、24-水酸化酵素の有意な誘導は、観察されなかった。従って、配列番号：1のペプチドは、24-水酸化酵素の発現を誘導しなかった。配列番号：1のペプチドは、24-水酸化酵素の発現を増加させることなく、1α-水酸化酵素の発現を増加させ、それによって、細胞内及び循環血中のカルシトリオールの全体濃度を増加させることができるため、この結果は重要である。
【０１２９】
実施例4
1α,25-ジヒドロキシビタミンD3と組み合わせられた場合、24-水酸化酵素mRNA発現を誘導しないデントニン
カルシトリオール（1α,25-ジヒドロキシビタミンD3）は24-水酸化酵素mRNA発現の既知の誘導剤である。カルシトリオールの24-水酸化酵素mRNA誘導効果に対する配列番号：1のペプチドの効果を決定するため、CL-8細胞を前記のように増殖させ、10-9Mの濃度の1α,25-ジヒドロキシビタミンD3を細胞に添加し、配列番号：1のペプチドを、細胞に添加しないか、又は100もしくは500ng/mlいずれかの濃度で細胞に添加した。細胞をさらに5時間増殖させ、RNAを前記の方法を使用して採集し、24-水酸化酵素mRNAの発現レベルを、前記の方法を使用して、各試料において決定した。図4に示されるように、24-水酸化酵素mRNAのレベルの有意な増加が、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の添加によって観察された。しかしながら、その後の100又は500ng/mlいずれかの配列番号：1のペプチドの添加は、24-水酸化酵素mRNAの発現レベルに対し効果を及ぼさなかった。これらの結果は、その他のメカニズムによる誘導がある場合にも、又はない場合にも、配列番号：1のペプチドが24-水酸化酵素mRNA発現に全く影響を与えないことを示唆している。
【０１３０】
さらに、配列番号：1の生物学的に活性なホモログ、欠失変種、及び置換変種が同定されており、その配列は配列番号：2〜18に示される。
【０１３１】
実施例5
デントニンペプチドのインビボ効果
配列番号：1のデントニンペプチドのインビボ効果を研究するため、異なる用量のペプチドを霊長類に皮下注射した後、血清1α,25-ジヒドロキシビタミンD3レベルを研究した。注射されたペプチドの血清レベルも調べた。
【０１３２】
1mg/kg及び50mg/kgの用量の投与を容易にするための濃度で、配列番号：1のペプチドを担体（0.9％塩化ナトリウム）中に可溶化した。およそ2歳、体重およそ1.5〜2.5kgのカニクイザルに、皮下注射によって、配列番号：1のペプチドを投与した。異なる濃度の配列番号：1のペプチドを、1ml/kgという一定の体積で投与した。対照として用いるため、同時に、類似の体積で媒体単独（0.9％塩化ナトリウム）を投与した。
【０１３３】
血液試料を注射後2及び24時間目に収集し、血清を調製し、さらなる分析のため-70℃で等分して保管した。血清を、有効な（validated）ラジオイムノアッセイ（Quest Diagnostics）を使用して、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3に関してアッセイした。このアッセイのLOQは、およそ3pg/mlと決定された。
【０１３４】
データは、血清1ml当たりの25-ジヒドロキシビタミンD3（pg）として図6に示される。データは、各投薬群についての8匹（雄4匹及び雌4匹）の平均及び標準偏差を表している。
【０１３５】
図6が示すように、皮下投与された配列番号：1のペプチドによるこれらの動物の処理は、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の血清レベルを増加させ、用量依存的に1α,25-ジヒドロキシビタミンD3の血清レベルを上昇させた。例えば、50mg/kg群は、Omg/kg（媒体）群と比較して有意に高い値を示した（p＜0.05）。
【０１３６】
試料50mg/kgをサルへ皮下注射した場合の、配列番号：1のペプチドの血清濃度を測定した。図7に示されるように、投与後の配列番号：1のペプチドの血清濃度は、インビトロ実験において示された生物学的に活性な濃度より有意に高かった（実施例1参照）。
【０１３７】
試験ペプチド注射を受けたサルに、有害な事象は全く観察されなかった。
【０１３８】
本発明を、特定の態様に関して記載したが、本発明の真の本旨又は範囲から逸脱することなく、様々な変化がなされ得、等価物が置換され得ることが、当業者には理解されよう。さらに、特定の状況、材料、構成物、方法、一つ又は複数の段階を、本発明の目的、本旨、及び範囲に適合させるため、多くの修飾がなされ得る。そのような修飾は、全て、ここに添付された特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１Ａ】100nmolの副甲状腺ホルモン（PTH）を含まない培養物において増殖させられたCL-8細胞における1α-水酸化酵素mRNAの発現レベルに対する、0ng/ml、100ng/ml、又は500ng/mlの配列番号：1のペプチドの効果を比較している棒グラフである。
【図１Ｂ】100nmolの副甲状腺ホルモン（PTH）を含む培養物において増殖させられたCL-8細胞における1α-水酸化酵素mRNAの発現レベルに対する、0ng/ml、100ng/ml、又は500ng/mlの配列番号：1のペプチドの効果を比較している棒グラフである。
【図２】100nmolのPTH、100ng/mlの配列番号：1のペプチド、又は500ng/mlの配列番号：1のペプチドを含む培養物において増殖させられたCL-8細胞における1α-水酸化酵素mRNAの誘導に対する、プロテインキナーゼA（PKA）阻害剤であるH-89の効果を比較している棒グラフを示す。
【図３】培養物中で増殖させられたCL-8細胞における24-水酸化酵素mRNAの発現レベルに対する、0ng/ml、100ng/ml、又は500ng/mlの配列番号：1のペプチドの効果を比較している棒グラフを示す。
【図４】配列番号：1のペプチドを含まない培養物、又は100ng/mlもしくは500ng/mlの配列番号：1のペプチドを含む培養物において増殖させられたCL-8細胞における24-水酸化酵素mRNAの発現レベルに対する1,25-ジヒドロキシビタミンD3の効果を比較している棒グラフを示す。
【図５】本発明のペプチド配列の多重配列アラインメントである。
【図６】0mg/kg、1mg/kg、又は50mg/kgでサルへ皮下注射された場合の、1,25ジヒドロキシビタミンD3の血清レベルに対する異なる用量の配列番号：1のペプチドの効果を比較している棒グラフである。
【図７】50mg/kgでサルへ皮下注射された場合の、配列番号：1のペプチドの血中レベルを示す線グラフである。
【図１】
2005525104.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2005525104000001.app
【国際調査報告】
2005525104.tif 000024