(57)【要約】本発明は、Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドのインヒビターを検出または同定する方法、感染因子の病原性を阻害する方法、抗ウイルス治療、およびZ-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の複合体形成を阻害する化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）試験対象の薬剤、Z-DNAおよびZ-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントを含む組成物を、該Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントの該Z-DNAへの結合に適切な条件下で混合する工程；ならびに
ｂ）該Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントと該Z-DNAとの間での複合体の形成を検出する工程であって、ここで、適切な対照と比較した該薬剤による該複合体の形成の阻害が、該薬剤がインヒビターであることを示す、工程
を含む、Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドの結合のインヒビターを検出および／または同定する方法。
【請求項２】
前記Z-DNA結合リガンドがZ-DNA結合ドメインを含むタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記Z-DNA結合リガンドがE3L、ADAR1、DLM-1および前記いずれかのZ-DNA結合バリアントからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記Z-DNA結合リガンドがZ-DNA結合リガンドおよび検出可能な標識を含む融合タンパク質であり、ここで、前記複合体の形成が該検出可能な標識を検出することにより検出される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記Z-DNA結合リガンドがE3L、ADAR1、DLM-1および前記いずれかのZ-DNA結合バリアントからなる群より選択されるZ-DNA結合リガンドを含む融合タンパク質である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記融合タンパク質がZ-DNA結合リガンドおよび緑色蛍光タンパク質を含む、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記融合タンパク質がZ-DNA結合リガンドおよびグルタチオンS-トランスフェラーゼタンパク質を含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記Z-DNA結合リガンドが検出可能な標識で標識されている、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能な標識が放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティ標識、酵素、蛍光部分および化学発光基からなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、結合が１つ以上のZ-DNA結合リガンドの存在下で測定される競合アッセイである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
試験対象薬剤が有機低分子、ペプチド、タンパク質およびペプチド模倣物からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
試験対象薬剤が抗体またはその抗原結合断片である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体または抗原結合断片が前記リガンドに結合する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体または抗原結合断片がZ-DNAに結合する、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
Z-DNAに結合する前記抗体または抗原結合断片が抗体Z22またはその抗原結合断片のエピトープ特異性を有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記Z-DNAが本質的にオリゴヌクレオチドからなる、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記Z-DNAが本質的にプラスミドからなる、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が動物において実施される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
ａ）Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントおよびZ-DNAを含む細胞と試験対象の薬剤とを、該Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントの該Z-DNAへの結合に適切な条件下で接触させる工程；ならびに
ｂ）該Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントと該Z-DNAとの間での複合体の形成を検出する工程であって、ここで、適切な対照と比較した該薬剤による該複合体の形成の阻害が、該薬剤がインヒビターであることを示す、工程
を含む、Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドの結合のインヒビターを検出および／または同定する方法。
【請求項２１】
前記Z-DNA結合リガンドまたはバリアントのZ-DNAへの結合が細胞シグナル伝達および／または細胞応答を媒介し得、該結合が該結合に応答するシグナル伝達活性または細胞応答を検出することにより検出される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞がウイルスで感染され、前記細胞応答が該細胞からの補体結合タンパク質の分泌である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記Z-DNA結合リガンドまたはバリアントがZ-DNA結合ドメインを含むタンパク質である、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記融合タンパク質がZ-DNA結合リガンドおよび転写活性化ドメインを含み、ここで、該Z-DNAがレポーター遺伝子に動作可能に連結された遺伝子のプロモーター領域にあり、該Z-DNA結合リガンドと該Z-DNAとの間での複合体形成がレポーター遺伝子発現または活性を検出することにより検出される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１記載の方法により同定された、Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドの結合のインヒビター。
【請求項２７】
請求項２０記載の方法により同定された、Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドの結合のインヒビター。
【請求項２８】
前記インヒビターがZ-DNA結合リガンドのアンタゴニストである、請求項２６記載のインヒビター。
【請求項２９】
前記インヒビターがZ-DNA結合リガンドのアンタゴニストである、請求項２７記載のインヒビター。
【請求項３０】
請求項１記載の方法により同定されたインヒビターおよび生理的に許容され得る担体を含有してなる医薬組成物。
【請求項３１】
請求項２０記載の方法により同定されたインヒビターおよび生理的に許容され得る担体を含有してなる医薬組成物。
【請求項３２】
ａ）試験対象の薬剤、Z-DNAおよびZ-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントを含む組成物を、該Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントの該Z-DNAへの結合に適切な条件下で混合する工程；ならびに
ｂ）該Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントと該Z-DNAとの間での複合体の形成を検出する工程であって、ここで、適切な対照と比較した該薬剤による該複合体の形成の阻害が、該薬剤が抗感染剤であることを示す、工程
を含む、
抗感染剤を検出および／または同定するための方法。
【請求項３３】
適切なアッセイにおいて前記薬剤の抗感染活性を評価する工程をさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記抗感染剤が抗ウイルス剤である、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
請求項３２記載の方法により同定された抗感染剤および薬学的に許容され得る担体を含有してなる医薬組成物。
【請求項３６】
ａ）Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントおよびZ-DNAを含む細胞と試験対象の薬剤とを、該Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントの該Z-DNAへの結合に適切な条件下で接触させる工程；ならびに
ｂ）該Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントと該Z-DNAとの間での複合体の形成を検出する工程であって、ここで、適切な対照と比較した該薬剤による該複合体の形成の阻害が、該薬剤がインヒビターであることを示す、工程
を含む、抗感染剤を検出および／または同定する方法。
【請求項３７】
前記Z-DNA結合リガンドまたはバリアントのZ-DNAへの結合が細胞シグナル伝達および／または細胞応答を媒介し得、該結合が該結合に応答するシグナル伝達活性または細胞応答を検出することにより検出される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
適切なアッセイにおいて前記薬剤の抗感染活性を評価する工程をさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記抗感染剤が抗ウイルス剤である、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアント、核酸および適切なZ-DNA形成緩衝液を含有してなる、抗感染剤を検出または同定するためのキット。
【請求項４１】
Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントの結合を阻害する治療剤の治療有効量を被験体に投与することを含む、被験体における感染因子の病原性を阻害する方法。
【請求項４２】
前記感染因子がウイルスである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記ウイルスが痘瘡ウイルスである、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記感染因子が細菌である、請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
前記被験体が哺乳動物である、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
前記被験体がヒトである、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントの結合を阻害する薬剤の治療有効量を被験体に投与することを含む、感染性疾患を有する被験体を処置する方法。
【請求項４９】
感染性疾患がウイルス性感染である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ウイルス性感染がポックスウイルス感染である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ポックスウイルスが痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、オルフウイルス、マウスポックスウイルス、サル痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、ヤバ様疾患ウイルス、牛痘ウイルス、粘液腫、ウサギ線維腫ウイルスおよびランピースキン病ウイルスからなる群より選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントの結合を阻害する薬剤の治療有効量を、それが必要な被験体に投与することを含む、抗ウイルス治療方法。
【請求項５３】
ａ）ドッキング情報を含む候補化合物のデータベースから、１つ以上の候補化合物をサンプリングし、該候補化合物が標的Z-DNA結合リガンドまたはその機能的バリアントと複合体を形成し得るかどうかを評価する工程；ならびに
ｂ）該標的Z-DNAリガンドへのドッキングに適切な候補化合物の立体配座を同定する工程であって、ここで、該候補化合物の立体配座の同定が、該候補化合物が抗感染剤であることを示す、工程、
を含む、抗感染剤を検出および／または同定する方法。
【請求項５４】
前記化合物データベースが前記候補化合物と前記標的Z-DNA結合リガンドとの間の相互作用エネルギーを計算するための情報を含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記化合物データベースが該候補化合物の１つ以上の立体配座を生じるための情報を含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記工程ｂ）における同定工程が、前記標的Z-DNA結合リガンドに最適にドッキングする化合物を同定するための候補化合物の全ての可能性のある結合様式および立体配座の考察を含む、請求項５３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、2002年12月16日に提出された米国出願第10/ 号（代理人事件番号：0050.2037-001、Bertram L. JacobsとAlexander Richによる、表題「感染因子の病原性の阻害方法」）の係属出願であり、2001年12月20日に提出された米国仮出願第60/343,028号の利益を主張する。上記出願のすべての教示は、参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
政府援助
本明細書に記載された研究は、国立衛生研究所から認可番号5-R37-CA04186-43および認可番号1-R21-AI053320-01により、全体または一部が援助された。政府は、本発明においていくつかの権利を有する。
【０００３】
発明の背景
感染性疾患は、毎年、数百万人の人々の死亡の原因となっている。ワクチンおよび薬剤治療の使用は、先進国における感染性疾患による死亡率を低減させたが、感染性疾患は第三世界各国における主な死亡原因であり続けている。また、多くの感染性疾患が、毎年、先進国において発生したり、再発したりしている。
【０００４】
最近、公衆は、多くのさらなる理由から、感染因子について関心をもつようになっている。公衆が、テロリストの目的のため、病原生物または農業の有害生物などの生物学的薬剤に曝されるという生物テロ行為の危険性が、世界中に暴力と戦争の機会を増大させている。さらに、世界のさまざまな地域に旅行する人々の数が絶えず増加し続けていることで、明確な地理的区画に一度制限された感染性疾患が遠方の地域にまで蔓延しうる。要するに、感染性疾患は全住民全般の健康の悪化の不変の潜在的要因である。
【０００５】
いくつかの感染因子に対して多くの処置が現在のところ存在しているが、すべての感染因子に対してではない。いくつかの感染性疾患、例えば、水痘を含むウイルスに関して、制御についてのアプローチはウイルス性疾患の予防、たとえばワクチン接種に焦点をあわせている。残念ながら、人々または全住民はワクチン接種を受けてはおらず、ワクチンは開発されていないか、多くのウイルスおよび感染因子に対して容易に利用できない（たとえば、備蓄されていない）だろう。したがって、感染を処置するのに使用することができる薬剤が必要とされている。また、新たな標的に対する治療を開発することは、現在利用可能な治療に対して耐性をもつ感染因子、ならびに変異したまたは生物学的に変化した感染因子の形態の有害な作用を処置するために、有益である。
【０００６】
発明の要約
本発明は、Z-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合のインヒビターを検出および／または同定する方法に関する。本方法は、試験対象の薬剤、Z-DNAおよびZ-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントを含む組成物をZ-DNA結合リガンドまたはそのバリアントのZ-DNAへの結合に適切な条件下で混合すること、ならびにZ-DNA結合リガンドまたはそのバリアントとZ-DNAとの間の複合体の形成を検出することを含む。適切な対照と比較して前記薬剤により複合体の形成が阻害されることは、この薬剤がインヒビターであることを示す。
【０００７】
別の面において、本発明は、Z-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合のインヒビターを検出および／または同定する方法を特徴とする。本方法は、Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントおよびZ-DNAを含む細胞と試験対象の薬剤とを、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントのZ-DNAへの結合に適切な条件下で接触させること、ならびにZ-DNA結合リガンドまたはそのバリアントとZ-DNAとの間の複合体の形成を検出することを含む。適切な対照と比較して前記薬剤により複合体の形成が阻害されることは、この薬剤がインヒビターであることを示す。
【０００８】
別の面において、本発明は、前記方法にしたがって同定されるインヒビターと生理的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
【０００９】
また、別の面において、本発明は、抗感染剤を検出および／または同定する方法を特徴とする。本方法は、試験対象の薬剤、Z-DNAおよびZ-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントを含む組成物を、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントのZ-DNAへの結合に適切な条件下で混合すること、ならびにZ-DNA結合リガンドまたはそのバリアントとZ-DNAとの間の複合体の形成を検出することを含む。適切な対照と比較して前記薬剤により複合体の形成が阻害されることは、この薬剤が抗感染剤であることを示す。前記方法にしたがって同定された抗感染剤および生理的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。
【００１０】
また別の面において、本発明は、抗感染剤を検出および／または同定する方法を特徴とする。本方法は、Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントおよびZ-DNAを含む細胞と試験対象の薬剤とを、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントのZ-DNAへの結合に適切な条件下で接触させること、ならびにZ-DNA結合リガンドまたはそのバリアントとZ-DNAとの間の複合体の形成を検出することを含む。適切な対照と比較して前記薬剤により複合体の形成が阻害されることは、この薬剤が抗感染剤であることを示す。前記方法にしたがって同定された抗感染剤および生理的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。
【００１１】
別の面において、本発明は、ドッキング情報を含む候補化合物のデータベースから、１つ以上の候補化合物をサンプリングし、該候補化合物が標的Z-DNA結合リガンドまたはその機能的バリアントと複合体を形成することができるかどうかを評価し；かつ標的Z-DNA結合リガンドへのドッキングに適切な候補化合物の立体配座を同定する（ここで候補化合物の立体配座の同定は該候補化合物が抗感染剤であることを示す）ことを含む、抗感染剤を検出および／または同定する方法を特徴とする。一つの態様において、化合物データベースは、候補化合物と標的Z-DNA結合リガンドとの間の相互作用エネルギーを計算するための情報を含む。別の態様において、化合物データベースは、このデータベース中の候補化合物の１つ以上の立体配座を生み出す情報を含む。別の態様において、標的Z-DNA結合リガンドへのドッキングに適切な候補化合物の立体配座を同定することは、標的Z-DNA結合リガンドに最適にドッキングする化合物を同定するために、すべての可能な結合様式および候補化合物の立体配座を考察することを含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアント、核酸ならびに適切なZ-DNA形成緩衝液を含む抗感染剤を検出および／または同定するためのキットを特徴とする。
【００１３】
さらに本発明は、Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントのZ-DNAへの結合を阻害する治療剤の有効量を被験体に投与することを含む、被験体における感染因子の病原性を阻害する方法に関する。かかる方法は、ワクシニアウイルスおよび痘瘡ウイルスなどのウイルス、ならびに細菌、真菌、および寄生生物を含む、多くの因子による感染を治療するために使用され得る。
【００１４】
また、本発明は、Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントのZ-DNAへの結合を阻害する薬剤の有効量を被験体に投与することを含む、感染性疾患をもつ被験体を処置する方法に関する。本発明にしたがって処置することができる感染性疾患としては、ポックスウイルス感染などのウイルス感染、細菌感染、真菌感染、および寄生生物感染が挙げられる。
【００１５】
さらに、本発明は、それを必要とする被験体にZ-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントのZ-DNAへの結合を阻害する薬剤の治療有効量を投与することを含む、抗ウイルス治療方法に関する。
【００１６】
発明の詳細な説明
ウイルスは、生きているものの偏性細胞内寄生体であるが、非細胞性であり、典型的にはDNAまたはRNAおよびタンパク質性のコートを含む。ウイルスの大部分は、それらが感染した動物または植物で引き起こす疾患により認識される。住民に特に有害であり得るあるタイプのウイルスは、ポックスウイルスである。ポックスウイルスは、約300×200nm（小さな細菌の大きさ）の非常に大きな、レンガ形態のウイルスである。それらは、２つの側体と側面を接したコア内に包含された大きな二本鎖DNAゲノム（約200kbpの大きさ）の複雑な内部構造を有している。このウイルス粒子の表面は、繊維状のタンパク質成分で被覆される。すべての粒子は、宿主細胞膜由来のエンベロープに包含される。ポックスウイルスの実験室での診断は、ネガティブに染色した小胞体液または病変物質の電子顕微鏡検査で管理され得る。いくつかのポックスウイルスは、雛の胚の漿尿膜で培養され得、ここでポックスウイルスは痘を形成し、そのいくつかは細胞培養により単離され得る。
【００１７】
大部分のポックスウイルスは、宿主種特異的であるが、ワクシニアは例外である。ワクシニアウイルスは、原型的な、大きな二本鎖DNAウイルスであり、約190個の遺伝子をコードする。E3Lはワクシニアウイルスにおける重要なインターフェロン（IFN）耐性遺伝子の一つであり、E3Lは広範囲の宿主細胞におけるワクシニアウイルス複製に必要とされる。E3L遺伝子は、高度に保存されたカルボキシ末端二本鎖RNA結合ドメインをもつ190アミノ酸タンパク質をコードする（図１Ａ）。この二本鎖RNA結合ドメインは、インターフェロン耐性とワクシニアウイルスの広い宿主域表現型の両方に必要とされる。
【００１８】
ヒトに対して特に有害となりうるポックスウイルスの一つのタイプは、痘瘡である。痘瘡は、痘瘡ウイルスにより引き起こされる。痘瘡は、病人と向かい合わせに接触した感受性のあるヒトに曝露された感染唾液飛沫により、ある人から別の人に容易に拡散される。痘瘡は、感染した寝床や衣類を介しても拡散し得る。潜伏期間は、痘瘡ウイルスへの曝露後、約12日（範囲：7〜17日）である。痘瘡の初期症状としては、高熱、疲労、頭痛及び背痛が挙げられる。2〜3日した後で、特徴的な発疹が、顔、腕、および脚に顕著に表れる。発疹は、平滑な赤色の病変で始まり、同じ速度で徐々に変化する。病変は、膿で満たされ、第２週の初めにかさぶたを形成し始める。かさぶたは発展して、ついで約３〜４週後に剥がれ落ちる。痘瘡をもつ患者の大部分は回復するが、30％までの場合においては死に至る。
【００１９】
一度人が痘瘡に感染すれば、治療はない。痘瘡をもつ患者は、支持療法（熱または痛みなどを制御するための静脈内液、医薬）および発生する任意の二次細菌感染用の抗生物質から利益を得ることができる。痘瘡に対するワクチン接種は以前は日常的であったが、1972年に終息した。免疫レベルは、1972年の前にワクチン接種されたヒトの間であっても、はっきりとしない；したがって、これらの人々は、感受性であると仮定される。明らかなことには、効果的な治療を有することは、ポックスウイルス感染と診断された人だけでなく、痘瘡をもつ誰かと接触した可能性のある（たとえば、事務所、家、店舗、飛行機、教室、または公共の交通機関でポックスウイルスに感染した人と同じ空気または同じ所持品を共有する）人も処置するのに有益であるだろう。
【００２０】
本発明は、長年感じられてきた要求を解決して、感染性疾患、たとえば、ポックスウイルス感染を処置するための治療を同定し、公衆に提供する。本明細書に記載のように、感染因子の病原性に対する一つのメカニズムは、Z-DNAとZ-DNA結合リガンド、たとえば、ワクシニアウイルスおよび痘瘡ウイルスのE3Lとの間での複合体の形成である。それゆえ、かかる相互作用の阻害は、この複合体形成を妨げるのに使用して、感染因子の病原性を阻害し、かつ感染性疾患を治療することができる。
【００２１】
「Z-DNA」は、右旋性のB-DNAと立体配座的に区別されるヌクレオチドの左旋性の二重らせん立体配座を有するDNA分子を意味する。Z-DNAらせんは、反対の立体配座においてデオキシシチジンおよび通常でないsyn型においてデオキシグアノシンをもつジヌクレオチドリピートから構成され得る。Z-DNA分子は、B-DNAの小さな溝に相当する、一本の狭い溝を有し、大きな溝をもたない。Z-DNAは、DNAのより高エネルギーの型であり、ネガティブなスーパーコイル化、高塩、二価カチオン、および多価アニオンを含む条件下でのB-DNAからの異性化によりインビトロで安定化され得る。一つの態様において、Beheらに記載されるように、Z-DNAは、生理学的塩条件下でのB-DNAのZ-DNAへの異性化およびデオキシシチジンの5-メチル化によりインビトロで形成され得る（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1619-1623, 1981；この教示は参照により本明細書に援用される）。別の態様において、Z-DNAは、たとえば、インビトロでオリゴヌクレオチドの形態で、臭素化により安定化される（HerbertおよびRich, Nucleic Acids Research, 21:2669-2672, 1996；この教示は参照により本明細書に援用される）。
【００２２】
(dC-dG)配列を含む核酸分子は、Z-DNAを他の改変配列よりもさらに容易に形成する。Z-DNA配列は、たとえば、Kimらに記載のように、(dC-dG)n挿入物（式中、nは約2以上、たとえば2〜12である）を含むプラスミドを作製することにより、インビトロで形成され得る（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12875-12879, 1997；この教示は参照により本明細書に援用される）。かかるプラスミド中の(dC-dG)n挿入物は、細菌のスーパーヘリックス密度（δ＝-0.055）でネガティブにスーパーコイル化されたプラスミドにおいてZ-DNAを形成するが、このプラスミドが線形化されるか、トポイソメラーゼでゆるめられた場合にはB-DNA立体配座となる。プラスミド中の核酸試料におけるZ-DNAの存在は、たとえば、標準的な手法を用いて、プラスミドスーパーヘリックス密度を測定することにより検出され得る。
【００２３】
原核生物系、たとえば、生長している大腸菌細胞において、Jiangらに記載されるように、Z-DNAの存在は、過マンガン酸カリウムの使用を含む方法を介して検出することができる（Nucleic Acids Research, 19:6943-6948, 1991；この教示は参照により本明細書に援用される）。簡単には、過マンガン酸カリウムは、細胞中に潜在するスーパーコイル化プラスミドにおけるB-DNA／Z-DNAまたはZ-DNA／B-DNAの接合領域と選択的に反応する。これらの接合点に局在された制限酵素認識部位は、過マンガン酸カリウムでの修飾後に対応するエンドヌクレアーゼにより開裂されない。この開裂の阻害は、細胞内へのＢ型およびＺ型のクローン化された挿入物の相対量の決定を可能にしている。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「感染因子」または「感染力のある因子」は、有害な作用、たとえば、感染宿主に対する病原性を増大しかつ創出する因子または病原体である。感染因子の例としては、細菌、真菌、ウイルス、および寄生生物が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「病原」または「病原性」は、感染因子、たとえば、ウイルスにより引き起こされる任意の症状または病状である。感染因子により引き起こされる症状または病状の例としては、熱、疲労、痛み（たとえば、頭痛、背痛、筋肉痛または疼痛）、発疹、病変、および死亡が挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「抗感染剤」は、感染因子による感染および／または病原性を阻害（低減または予防）する、天然に存在する薬剤または人工的に得られる薬剤であり、たとえば、ペプチド、タンパク質、合成分子（たとえば、合成有機分子）、天然に存在する分子（たとえば、天然に存在する有機分子）、核酸分子、およびその構成成分を含む。抗感染剤の例としては、抗細菌剤、抗真菌剤、薬剤、抗ウイルス剤、および抗寄生生物剤が挙げられる。抗感染剤は単離または精製することができる。
【００２７】
Z-DNAに対するZ-DNA結合リガンドのインヒビターの同定
本明細書に使用される場合、「Z-DNA結合リガンド」は、Z-DNAに結合する物質であり、それによりZ-DNA結合リガンド−Z-DNA複合体を形成する。好ましい態様において、Z-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合は、高い親和性で生じる。Z-DNA結合リガンドという用語は、単離、精製、合成、および／または組み換えられた天然のリガンド、天然のリガンドのホモログ（たとえば、別の哺乳動物由来）、核酸、抗体、かかる分子の部分、およびZ-DNAを結合する他の物質を含む物質をいうが、これに限定されない。Z-DNAの天然のリガンドは、生理学的条件下でZ-DNAに結合することができる。
【００２８】
一つの態様において、Z-DNA結合リガンドは、Z-DNA結合ドメインを含むタンパク質である。本明細書で使用される場合、「Z-DNA結合ドメインを含むタンパク質」は、Z-DNA結合ドメイン（たとえば、Zαドメイン）、その多形または対立形質のバリアント、他のアイソフォーム（たとえば、かわりのスプライシングまたは他の細胞プロセスで作製される）、および修飾（たとえば、脂質化（lipidated）、グリコシル化、非グリコシル化）または上記の非修飾型を含む天然に存在するタンパク質をいう。また、同じアミノ酸配列を有するかかるタンパク質の型（たとえば、（合成有機化学の方法を用いて作製された）組み換えタンパク質、合成タンパク質）も含まれる。
【００２９】
Z-DNA結合ドメインを含むタンパク質の「機能的バリアント」としては、Z-DNAを結合する断片、変異タンパク質および／またはキメラ（融合）タンパク質（該タンパク質のZ-DNA結合活性を全部または一部保持する）が挙げられる。かかるバリアントは、適切な方法（たとえば、突然変異誘発（たとえば、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発）、組み換えDNA技術）を用いて作製され得る。一般的に、Z-DNA結合ドメインを含むタンパク質の断片または部分としては、タンパク質に関連するアミノ酸（すなわち、１以上のアミノ酸）の欠失（すなわち、１以上の欠失）を有するもの（N末端、C末端または内部の欠失など）が挙げられる。Z-DNA結合ドメインを含む選択したタンパク質に関して、隣接するアミノ酸が欠失されたおよび／または隣接しないアミノ酸が欠失された断片または部分が想像される。
【００３０】
Z-DNA結合ドメインを含有する変異タンパク質としては、１以上の隣接するおよび／または隣接しないアミノ酸残基の挿入（たとえば、融合）、置換、逆位、欠失および／または切端によりそのタンパク質と相違する天然または人工のバリアントが挙げられる。かかる変異は、たとえば、（Z-DNA結合ドメインを含む他のタンパク質と比べて）保存または非保存領域におけるタンパク質の１以上の部位で生じ得る。
【００３１】
キメラタンパク質または融合タンパク質も想像される。一つの態様において、第一の部分（たとえば、Z-DNA結合ドメインまたはそのバリアントを含むタンパク質）は、共有結合（たとえば、ペプチド結合）を介して、アミノ酸、オリゴペプチドまたはポリペプチドなどの第２の部分と連結される。第２の部分は、第１の部分と適切な位置、たとえば、N末端、C末端または内部で連結され得る。一つの態様において、融合タンパク質は、検出可能な標識（たとえば、酵素標識（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST））、蛍光タンパク質（たとえば、緑色蛍光タンパク質（GFP））、抗原またはエピトープタグ（たとえば、血液凝集素（HA）、FLAGペプチド）、結合ドメイン）を、（１以上の）リンカー配列を介して第１の部分に任意に結合される第２の部分として含む。さらなる（たとえば、第３の、第４の）部分は、適切な場合、存在し得る。
【００３２】
一つの態様において、Z-DNA結合ドメインを含むタンパク質の機能的バリアントは、Z-DNAを結合し、かつ該タンパク質に関して少なくとも約85％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは少なくとも約90％のアミノ酸配列の同一性、および該タンパク質に対してより好ましくは少なくとも約95％のアミノ酸配列の同一性を有する。別の態様において、機能的融合タンパク質は、Z-DNAを結合し、かつZ-DNA結合ドメインを含むタンパク質に関して少なくとも約85％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは少なくとも約90％の配列同一性、およびより好ましくは少なくとも約95％の配列同一性を有する第１の部分を含む（たとえば、図１Ａおよび１Ｂそれぞれに示すワクシニアまたは痘瘡E3L）。さらなる態様において、Z-DNA結合ドメインまたはその機能的バリアントを含むタンパク質は、ワクシニアウイルスE3LまたはE3LのZ-DNA結合ドメイン（ジーンバンクアクセション番号：S64006）または痘瘡ウイルスE3L（ジーンバンクアクセション番号：X69198.1）に関して少なくとも約85％のアミノ酸配列の同一性、好ましくは少なくとも約90％のアミノ酸配列の同一性、およびより好ましくは少なくとも約95％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【００３３】
ポリペプチドの比較について、比較のための配列の長さは、一般に少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは少なくとも15個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも20個のアミノ酸、および最も好ましくはポリペプチドのZ-DNA結合ドメインの全長または全ポリペプチドの全長であるだろう。
【００３４】
「Z-DNA結合ドメイン」は、ポリペプチドのZ-DNAへの結合を可能にする一次、二次および／または三次構造を有するポリペプチドを意味する。一つの態様において、Z-DNA結合ドメインは、コンセンサスなアミノ酸配列K〔K/R〕XXN〔R/K〕XXY〔X〕13〔T/I〕PPXW（配列番号：５）（式中、X(Xaa)は任意のアミノ酸である）に対して、少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
２つのタンパク質配列または２つの核酸配列の比較は、周知の方法により、たとえば、数学的アルゴリズムを用いて成される。かかる数学的アルゴリズムの好ましい、非限定の例は、Karlinらに記載される（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993；この教示は参照により本明細書に援用される）。かかるアルゴリズムは、Schafferらに記載のように、BLASTNおよびBLASTXプログラム（バージョン2.2）に組み込まれる（Nucleic Acids Res., 29:2994-3005, 2001；この教示は参照により本明細書に援用される）。BLASTおよびギャップドBLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（たとえば、BLASTN）の欠如したパラメータを使用することができる。たとえば、2001年12月17日に利用できる、バイオテクノロジー情報国立センターに関するインターネットのサイトを通してアクセスすることができるBLASTプログラムを参照のこと。一つの態様において、検索されたデータベースは、重複のない（non-redundant）（NR）データベースであり、配列比較のパラメータは次のように設定され得る；フィルターなし；期待値10；文字の大きさ3；マトリックスはBLOSUM62；およびギャップコストはイグジステンス11およびエクステンション1を有する。
【００３６】
配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の好ましい、非限定の例は、MyersおよびMillerのアルゴリズム、CABIOS(1989)である。かかるアルゴリズムは、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれ、これはGCG（Accelrys）シーケンス・アライメント・ソフトウェアパッケージの一部である。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを使用する場合、PAM120重量残基表、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティが使用され得る。配列分析のさらなるアルゴリズムは、当該分野に公知であり、TorellisおよびRobottiに記載のADVANCEおよびADAM（Comput. Appl. Biosci., 10:3-5, 1994；この教示は参照により本明細書に援用される）；ならびにPearsonおよびLipmanに記載のFASTA（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-8, 1988；この教示は参照により本明細書に援用される）を含む。
【００３７】
本発明は、また、同一性の程度がより低いが、Z-DNA結合ドメインの機能的バリアントとなる（即ち、たとえば、Z-DNAとの複合体を形成するZ-DNA結合リガンドにより行なわれる、１以上の同じ機能を行うことができる）ためには十分な相同性を有するZ-DNA結合ドメインを有するZ-DNA結合リガンドのバリアントを包含する。相同性は、たとえば、保存的アミノ酸置換により決定され得る。かかる置換は、ペプチド中の所定のアミノ酸が特性の似ている別のアミノ酸で置換されたものである。保存的置換は、表現型的にサイレントであることが適当である。典型的には、保存的置換としては、脂肪族アミノ酸であるAla、Val、Leu、およびIleの間でのあるものから別のものへの置換；水酸残基であるSerおよびThrの交換；酸性残基であるAspおよびGluの交換；アミド残基であるAsnとGlnとの間の置換；塩基性残基であるLysおよびArgの交換；ならびに芳香族残基であるPheおよびTyrの間の置換に見られる。アミノ酸の変化が表現型的にサイレントであることが適当であることに関連した概要は、Bowieらに見出すことができる（Science, 247:1306-1310, 1990)。
【００３８】
Z-DNA結合リガンドの例としては、E3L、DLM-1、およびADAR1、ならびにZ-DNAを結合するこれらのタンパク質の部分（たとえば、Kimら、J. Biol. Chem., 274:19081-19086, 1999に記載のような、ZαおよびZαβ）が挙げられる。また、Z-DNAを結合し、かつE3L、DLM-1、（ジーンバンクアクセション番号：AJ300575）、hADAR1（ジーンバンクアクセション番号：U18121）、hADAR1のZα（hADAR1のアミノ酸約129から約196）、またはhADAR1のZαβ（hADAR1のアミノ酸約129から約368）の任意の一つに対して、少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％のアミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドも、Z-DNA結合リガンドである。他のタンパク質、たとえば、ADAR1のZβドメインは該タンパク質がZ-DNAに結合するように変異され得る（たとえば、本明細書に記載されるように）。
【００３９】
Z-DNA結合リガンドを同定する方法は、当該分野で公知であり、たとえば、Kimら、J. Biol. Chem.,上記；Kimら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,上記；およびHerbertら、Nucleic Acids Research, 26:3486-3493, 1998に記載されている；これらの教示はそれぞれ参照により本明細書に援用される。Z-DNA結合リガンドまたはバリアントのZ-DNA結合活性を評価するために、ゲルシフトアッセイ、Z-DNA特異的ヌクレアーゼアッセイ、および円偏光二色性アッセイ、または他の適当なアッセイを含むこれらの方法を用いることができる。他のアッセイとしては、本明細書で記載するような、酵母ワンハイブリッドアッセイおよびB-Z中間点アッセイが挙げられる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「インヒビター」は、結合活性（複合体形成）、相互作用および／またはこの相互作用で媒介される細胞応答作用（たとえば、病原性）により引き起こされる細胞シグナル伝達などの、Z-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の相互作用の少なくとも１つの機能特徴を阻害（予防または低減）することにより作用する剤である。インヒビターという用語は、Z-DNA（Z-DNAアンタゴニスト）またはZ-DNA結合リガンド（Z-DNA結合リガンドアンタゴニスト）（たとえば、抗体、天然リガンドの変異体、ペプチド模倣体、およびリガンド結合の他の競争インヒビター）のいずれかを結合し、かつZ-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合リガンドバリアントとZ-DNAとの間での複合体形成により媒介される機能をそれに結合せずに阻害する物質に結合する剤（たとえば、抗イディオタイプ抗体）を含む。一つの態様において、インヒビターは、抗体や抗原結合断片ではない。別の態様において、インヒビターは、Z-DNAを結合する抗体またはその抗原結合断片以外の剤である。特定の態様において、インヒビターは、抗体Ｚ２２、Ｚ４４またはその抗原結合断片以外の剤である（Brigidoら、J. Immunol., 146:2005-2009, 1991）。好ましくは、インヒビターは、適切な対照（たとえば、インヒビターを受け取らないか、インヒビタービヒクルのみを受け取る試料）と比較して、少なくとも約10％、25％、50％、60％、70％、80％、90％または100％でZ-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の複合体形成を阻害する。
【００４１】
一つの態様において、本発明は、本明細書に記載のように、Z-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の相互作用の少なくとも一つの機能特徴を阻害するものを検出および／または同定するために候補インヒビターまたは試験因子（たとえば、候補化合物）をスクリーニングするためのアッセイ、ならびにこのアッセイにより同定可能な剤を提供する。本明細書で使用される場合、「候補インヒビター」または「試験因子」は、天然に存在するまたは人工的に得られた分子であり、たとえば、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、合成分子（たとえば、合成有機分子）、天然に存在する分子（たとえば、天然に存在する有機分子）、核酸分子、およびその成分を含む。
【００４２】
一般に、本発明での使用のための試験因子は、天然産物のライブラリーあるいは当該分野で公知の方法による合成（または半合成）抽出物または化学ライブラリーから同定され得る。薬剤発見および開発の分野の当業者は、試験抽出物または化合物の精密な供給源が本発明の一つまたは複数のスクリーニング手法にとって重要ではないことを理解するだろう。したがって、視覚的に任意の数の化学的な抽出物または化合物を、本明細書に記載の典型的な方法を用いてスクリーニングすることができる。かかる抽出物または化合物の例には、植物系、真菌系、原核生物系または動物系の抽出物、発酵肉汁、および合成化合物、ならびに存在する化合物の改変体が挙げられるが、これに限定されない。また、多くの方法が、限定されないが、糖系、脂質系、ペプチド系、および核酸系化合物を含む任意の数の化学的化合物のランダムなまたは直接的な合成（たとえば、半合成または全合成）を行うのに利用できる。合成低分子ライブラリーは、たとえば、Brandon Associates（Merrimack, NH）およびAldrich Chemical（Milwaukee, WI）から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、Biotics（Sussex, UK）、Xenova（Slough, UK）、Harbor Branch Oceangraphics Institute（Ft. Pierce, FL）、およびPharmaMar, U.S.A.（Cambridge, MA）を含む多くの供給源から市販されている。
【００４３】
また、天然でおよび合成で製造された分子またはライブラリーは、任意の適切な方法により（たとえば、標準的な抽出方法や分画方法により）生成され得る。たとえば、候補化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレスで呼び出すことができる平行固相または液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィ選択を用いる合成ライブラリー法を含む組み合わせライブラリー法における任意の多くのアプローチを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは、ポリペプチドライブラリーに限定され、一方、他の４つのアプローチは、ポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用できる（Lam,Anticancer Drug Des.,12:145,1997)。さらに、必要であれば、任意のライブラリーまたは化合物は標準的な化学的、物理学的、または生物学的方法を用いて容易に修飾され得る。
【００４４】
インヒビターが様々な程度でZ-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の相互作用の機能特徴を阻害しうることは理解される。たとえば、インヒビターは、Z-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の相互作用の機能特徴を、適切な対照と比較して少なくとも約10％、40％、50％、または75％まで、あるいは少なくとも約90％まで低減することができる。
【００４５】
粗抽出物がZ-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の相互作用の機能特徴を阻害することが見出されれば、観察された効果の原因となる化学的な構成成分を単離するために陽性の主要な抽出物のさらなる分画を行うことができる。化合物の混合物における活性の検出および／または同定について本明細書で記載されるアッセイは、活性成分を精製するためまたはその誘導体を試験するために使用することができる。必要であれば、処置に有用な剤であることが示された化合物は、当該分野に公知の方法にしたがって化学的に修飾され得る。治療価値があると同定された化合物は、次いで、Z-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の相互作用の機能特徴を改変することが望まれる疾患に関して動物モデルを用いて分析され得る。
【００４６】
結合阻害アッセイ
結合阻害アッセイは、任意の適切な方法を用いて行うことができる。かかるアッセイは、Z-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の相互作用の機能特徴のインヒビター（たとえば、抗感染剤）を同定するために、単独でまたはお互いにもしくは他の適切な方法と組み合わせて使用され得る。本発明の方法は、多くの試料が処理されるハイスループットスクリーニング（たとえば、96ウェルフォーマット）に適応され得る。
【００４７】
結合阻害アッセイは、Z-DNA結合リガンド、そのバリアントまたはZ-DNAに結合し、かつZ-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合を阻害するインヒビターを同定するのに使用され得る。たとえば、結合アッセイは、候補インヒビターの非存在下でのZ-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合が候補インヒビターの存在下でのZ-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合と比較される際に、行なわれ得る。Z-DNAは、Z-DNA結合リガンドおよび候補インヒビターと同時に、あるいは一つづつと、いずれかの順序で接触され得る。候補インヒビターの存在下でZ-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合の程度が低減することは、その候補がインヒビターであることを示す。
【００４８】
インヒビターの検出および／または同定のための一つの方法において、試験対象の薬剤（たとえば、１以上の候補インヒビターを含む組成物）、Z-DNAおよびZ-DNA結合リガンドまたはそのバリアントを含む組成物は、結合に適切な条件下で保持され得、Z-DNA結合リガンドまたはバリアントとZ-DNAとの間の複合体形成が検出または測定される。たとえば、複合体形成の程度は、適切な対照に関連して（たとえば、候補インヒビターの非存在下で決定されたバックグラウンドと比較して、または第２の剤（すなわち、標準品）との複合体形成と比較して）決定され得る。
【００４９】
Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントとZ-DNAとの間の複合体形成は、直接的または間接的に検出され得る。一つの態様において、Z-DNA、候補インヒビター、またはZ-DNA結合リガンドもしくはそのバリアントは、適切な標識（たとえば、蛍光部位、化学発光基、エピトープタグ、放射性同位体、酵素標識、またはアフィニティタグ）で標識され得、複合体形成は、この標識の検出により（直接的または間接的に）決定され得る。結合の特異性は、たとえば、未標識剤またはリガンド（たとえば、E3L、ADAR1、DLM-1、またはその部分）を競争者として使用する競合または置換により評価され得る。
【００５０】
たとえば、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントおよび検出可能な標識（たとえば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質）、または抗体（たとえば、標識した抗体）で検出することができるハプテン（グルタチオンS-トランスフェラーゼまたはビオチンなど）を含む融合タンパク質をZ-DNAと接触させる。Z-DNAは、固体支持体、たとえば、マイクロタイターウェルに固定することができる。好ましくは、Z-DNAおよび融合タンパク質は、本明細書に記載のように、Z-DNAとZ-DNA結合リガンドまたはバリアントとの間の複合体形成に適切な溶液中にある。融合タンパク質は、Z-DNAに結合する。結合していない融合タンパク質は、たとえば、固体支持体を洗浄することにより、またはZ-DNAと複合体を形成する結合融合タンパク質からの結合していない融合タンパク質の分離に適切な他の手段により取り除かれる。次いで、融合タンパク質とZ-DNAとの間に形成される複合体は、たとえば、結合蛍光タンパク質を検出することにより、または複合体と融合タンパク質のハプテン部分を結合する抗体とを接触させることにより、たとえば、ELIZAアッセイまたはラジオイムノアッセイを用いて検出される。このアッセイは、候補インヒビターの存在下で繰り返され得る。候補インヒビターが、Z-DNA結合融合タンパク質とZ-DNAとの間の複合体の形成を妨害する場合、融合タンパク質とZ-DNAとの間の複合体形成を低減するのにしたがって、シグナルの低減が検出され得る。かかる低減は、候補インヒビターがZ-DNA結合のインヒビターであることを示す。あるいは、DNA結合リガンドを固体支持体に固定することができ、Z-DNAと候補インヒビターを添加して複合体形成について評価する。
【００５１】
別の例において、Z-DNA結合リガンド（またはそのバリアント）および酵素（たとえば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはアルカリホスファターゼ）を含む融合タンパク質を、Z-DNAと接触させる。Z-DNAは、固体支持体、たとえば、マイクロタイターウェルに固定することができる。好ましくは、Z-DNAおよび融合タンパク質は、本明細書に記載のように、Z-DNAとZ-DNA結合リガンドまたはバリアントとの間の複合体形成に適切な溶液中にある。融合タンパク質は、Z-DNAに結合するだろう。結合していない融合タンパク質は、たとえば、固体支持体を洗浄することによりまたはZ-DNAと複合体を形成する結合融合タンパク質からの結合していない融合タンパク質の分離に適切な他の手段により取り除かれ得る。融合タンパク質とZ-DNAとの間に形成される複合体は、たとえば、融合タンパク質中に存在する酵素に対して適切な基質を添加し、かつ、たとえば、ミクロプレートリーダーまたはルミノメーターを用いて酵素活性を検出することにより、検出され得る。このアッセイは、候補インヒビターの存在下で繰り返され得る。候補インヒビターが、融合タンパク質とZ-DNAとの間の複合体形成を妨害する場合、融合タンパク質とZ-DNAとの間の複合体形成を低減するのにしたがって、酵素活性の低減が検出され得る。かかる低減は、候補インヒビターがZ-DNA結合のインヒビターであることを示す。
【００５２】
Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントとZ-DNAとの間の複合体形成のインヒビターを同定するための別の方法は、ファージディスプレイ技術を介する。例えば、Z-DNA結合リガンドまたはバリアントは、ファージの表面上に（例えば、ファージコートタンパク質との融合タンパク質として）発現され得る。次いで、ファージは、Z-DNA（例えば、マイクロタイターウェルなどの固体支持体上に固定された）と接触され、ファージはZ-DNAに結合する。複合体は任意の適切な方法を使用して検出され得る。例えば、複合体は、ファージを認識する抗体と接触され得、抗体の結合は、例えば、ELISAアッセイまたはラジオイムノアッセイを使用して検出され得る。このアッセイは、候補インヒビターの存在下で繰り返され得る。候補インヒビターがファージ上に提示されたZ-DNA結合リガンドとの間の複合体形成を妨害する場合、次いでシグナル（例えば、抗体結合の量）の減少は、融合物とZ-DNAとの間の複合体形成の減少によって検出され得る。かかる減少は、候補インヒビターがZ-DNA結合のインヒビターであることを示す。
【００５３】
さらに、Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントの検出のための上記方法は、候補インヒビターを結合反応に添加し、Z-DNAとZ-DNA結合リガンドまたはバリアントとの間の複合体の形成を検出することによる、複合体形成のインヒビターの検出のために適用され得る。
【００５４】
細胞ベースアッセイをまた使用して、Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドの結合のインヒビターを検出および／または同定し得る。レポーターベースアッセイ、例えば、酵母ワンハイブリッドアッセイ（例えば、本明細書に記載されるような）を使用して、かかるインヒビターを検出し得る（LiおよびHerskowitz, Science, 262:1870-1874, 1993）。１つの例において、反応条件下で「Z」立体配座を形成するDNA（例えば、Z-DNA形成緩衝液における(dC-dG)n配列）を含む遺伝子のプロモーター領域は、レポーター遺伝子、例えば、LacZに動作可能に連結される。Z-DNAは、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントおよび転写活性化タンパク質またはその転写活性化ドメイン（例えば、Gal4またはVP16）を含む融合タンパク質と接触させられ得る。融合タンパク質とZ-DNAとの間の結合は、レポーター遺伝子の発現を誘導または増強する。候補インヒビターが添加され得る。候補インヒビターがZ-DNAへの融合タンパク質の結合を阻害する場合、次いでレポーター遺伝子の発現は同様に阻害され、これは、候補インヒビターがZ-DNA結合のインヒビターであることを示す。このアッセイは、任意の適切な細胞、例えば、真菌もしくは酵母細胞（Pichia pastoris、Aspergillus種、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Neurospora crassaが挙げられる）、または他の低級（lower）真核生物細胞、およびに高等（higher）真核生物の細胞（例えば、昆虫由来のもの（例えば、Sf9昆虫細胞）または哺乳動物由来のもの（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、COS細胞、293細胞））またはこのレポーターベースアッセイの適切な成分を含む任意の他の細胞において実施され得る。
【００５５】
別の細胞ベースアッセイは、感染因子で感染した細胞における分泌されたウイルスタンパク質の検出を含む。痘瘡またはワクシニアウイルスで感染した細胞は、通常、補体結合タンパク質と呼ばれるタンパク質を分泌する（UvarovaおよびShchelkunov, Virus Research, 81:39-45, 2001）。E3Lタンパク質のアミノ末端が欠損した痘瘡またはワクシニアウイルスで感染した細胞において、補体結合タンパク質の分泌は減少する。Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントのZ-DNAへの結合のインヒビターは、ワクシニアまたは痘瘡ウイルスで感染した細胞に候補インヒビターを投与し、細胞培養培地に分泌された補体結合因子のレベルを、例えば、標準的なタンパク質検出技術（例えば、ELISAまたはラジオイムノアッセイ）を使用して測定することにより検出され得る。適切な対照（例えば、候補インヒビターを受けていないか、または候補インヒビタービヒクルのみを受けている細胞試料）と比較した補体結合因子の分泌における減少は、候補インヒビターがZ-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合のインヒビターであることを示す。任意の適切な細胞を使用してこのスクリーニング方法を実施し得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。１つの例において、HeLa細胞が使用される。
【００５６】
特定の態様において、アッセイの非結合成分からの結合の分離を容易にするために、ならびにアッセイの自動化に適応させるために、アッセイの成分をマトリックスまたは他の個体支持体上に（直接的または間接的に）固定化することが所望され得る。上記アッセイは、反応物を混合するための任意の適切な様式で実行され得る。例えば、成分は、適切な容器（例えば、マイクロタイタープレート、試験管、またはマイクロ遠心分離チューブ）内で混合され得る。１つの態様において、アッセイの成分をマトリックスまたは他の固体支持体に結合させるドメインを付加する融合タンパク質（例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質）が、提供され得る。
【００５７】
Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントとZ-DNAとの間の複合体形成のインヒビターの検出および／または同定もまた、「インシリコ」スクリーニング方法の使用（候補インヒビターのドッキングを試験するためのコンピュータープログラムの使用を含む）を介して起こり得る。かかる方法は、Z-DNAとの複合体を形成するのに関連するZ-DNA結合リガンドまたはそのバリアントの機能的残基を決定する工程；前記工程において同定された機能的残基に基づいて１つ以上の３次元構造を任意の適切な方法を使用して開発する工程；１つ以上の３次元構造を計算可能な３次構造を有する１つ以上の試験薬剤と比較する工程；ならびにZ-DNA結合リガンドとの複合体の形成と一致した空間的配向およびZ-DNAとZ-DNA結合リガンドまたはバリアントとの間の複合体形成の阻害を有する薬剤を同定する工程を含む。この様式で同定された薬剤は、さらに活性について評価され、抗感染剤として使用され得る。
【００５８】
Z-DNAへの結合およびウイルス病原性の媒介に関連するZ-DNA結合タンパク質の機能的残基は、本明細書に記載のように同定されている。かかる残基は、好結果の試験薬剤との複合体形成の一助となる。これらの機能的残基を使用して、好結果の試験薬剤が接触する１つ以上の３次元構造を開発し得る。この３次元構造は、計算可能な３次構造を有する１つ以上の試験薬剤と比較されるか、またはそれらに対して試験される。例えば、１つ以上の試験薬剤が個々にドッキングされ、Z-DNA結合リガンドに関して適切な空間的配向について試験されるコンピュータープログラムを使用して、適切な試験薬剤について試験し得る。試験薬剤のドッキングおよび会合（associated）結合エネルギーを検出するために使用されるコンピュータソフトウェアのパラメータを使用して測定されるように、試験薬剤が好ましいエネルギーでZ-DNA結合リガンドまたはバリアントに結合する場合、試験薬剤は適切な空間的配向を有する。候補化合物のドッキングを試験するための方法は、本明細書においてより詳細に記載される。次いで、好結果の化合物、またはその誘導体は、例えば、本明細書に記載されるようなインビトロまたはインビボアッセイを使用して試験され得る。
【００５９】
本発明はさらに、上記スクリーニングアッセイにより同定された新規化合物に関する。従って、本明細書に記載のように同定された薬剤を適切な動物モデルにおいてさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定された化合物（例えば、Z-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の複合体形成のインヒビターである候補化合物、例えば、抗体、ポリペプチド、または低分子インヒビター）を動物モデルにおいて使用して、例えば、以下に記載のかかる化合物を用いる処置の効力、毒性、または副作用を測定し得る。
【００６０】
抗体
抗体または抗体の抗原結合断片を使用して、Z-DNAとZ-DNA結合リガンドまたはバリアントとの間の複合体形成を阻害し得る。本明細書に使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原を選択的に結合する抗原結合部位を含む分子（例えば、抗体の抗原結合断片）をいう。本発明の抗体は、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアント（例えば、その断片）にあるいはZ-DNAに選択的に結合する分子である。好ましい態様において、抗体は、試料中の他の分子を実質的に結合しない。好ましくは、抗体は、天然に結合したタンパク質および天然に存在する有機分子から少なくとも60重量％遊離している。より好ましくは、抗体調製物は、少なくとも75重量％または90重量％、より好ましくは99重量％抗体である。
【００６１】
本発明はさらに、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアント、あるいはZ-DNA自身と反応する抗体に関する。１つの態様において、抗体は、単離されたおよび／または組換えZ-DNA結合リガンドまたはそのバリアント（例えば、タンパク質またはペプチド）に対して惹起される。好ましい態様において、抗体は、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントを特異的に結合し、特に好ましい態様において、抗体は、天然リガンド（例えば、E3L、DLM-1、ADAR1またはZαもしくはZαβなどのZ-DNA結合ドメイン）とのZ-DNAの相互作用を阻害（減少または防止）し得る。
【００６２】
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、用語、抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を包含することが意図される。用語ポリクローナルおよびモノクローナルは、抗体調製物の均質性の程度をいい、特定の生成方法に限定されることが意図されない。
【００６３】
本発明の抗体は、適切な免疫原（本明細書に記載のZ-DNA結合リガンドのタンパク質またはポリペプチド（合成ペプチドなどの合成分子を含む）を含む）に対して惹起され得る。
【００６４】
免疫化抗原の調製、ならびにポリクローナルおよびモノクローナル抗体生成は、任意の適切な技術を使用して実施され得る。種々の方法が記載されている（例えば、Kohlerら, Nature, 256:495-497, 1975およびEur. J. Immunol. 6:511-519, 1976；Milsteinら, Nature 266:550-552, 1977；Koprowskiら,米国特許第4,172,124号；Harlow, E.およびD. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.)；およびCurrent Protocols In Molecular Biology, Vol. 2（補遺27,夏'94), Ausubel, F. M.ら編,（John Wiley & Sons: New York, N.Y., 11章, 1991)を参照のこと；それらのそれぞれの教示は参考により本明細書に援用される）。一般的に、ハイブリドーマは、適切な不死化細胞株（例えば、SP2/0などの骨髄腫細胞株）を抗体産生細胞と融合することにより生成される。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節の細胞は、目的の抗原で免疫された動物から得られ得る。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択培養条件を使用して単離され、限定希釈によりクローニングされ得る。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えば、ELISA）により選択され得る。
【００６５】
必要な特異性の抗体を産生または単離する他の適切な方法が使用され得る。方法としては、例えば、ライブラリーから組換え抗体を選択する方法、またはヒト抗体の全レパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫化に依存する方法が挙げられる（例えば、Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993；Jakobovitsら, Nature, 362:255-258, 1993；Lonbergら, 米国特許第5,545,806号；およびSuraniら, 米国特許第5,545,807号を参照のこと；これらの教示はそれぞれ参考により本明細書に援用される）。
【００６６】
単鎖抗体、およびキメラ、ヒト化または霊長類化（primatized）（CDR-移植））、またはベニア（veneered）抗体、ならびに異なる種由来の部分を含むキメラ、CDR-移植またはベニア単鎖抗体などはまた、本発明および用語「抗体」により包含される。これらの抗体の種々の部分は、従来技術により化学的に一緒に結合され得るか、または遺伝子工学技術を用いて隣接タンパク質として調製され得る。例えば、キメラまたはヒト化鎖をコードする核酸が、隣接タンパク質を生成するために発現され得る。例えば、Cabillyら, 米国特許第4,816,567号；Cabillyら, 欧州特許第0,125,023号B1；Bossら, 米国特許第4,816,397号；Bossら, 欧州特許第0,120,694号B1；Neuberger, M. S.ら, WO 86/01533；Neuberger, M. S.ら, 欧州特許第0,194,276号B1；Winter, 米国特許第5,225,539号；Winter, 欧州特許第0,239,400号B1；Queenら, 欧州特許第0 451 216号B1；およびPadlan, E. A.ら, 欧州特許第0 519 596号A1を参照のこと。Newman, R.ら, BioTechnology, 10:1455-1460, 1992, 霊長類化抗体に関する、ならびにLadnerら, 米国特許第4,946,778号およびBird, R. E.ら, Science, 242:423-426, 1988 単鎖抗体に関する、をまた参照のこと。
【００６７】
さらに、抗体の抗原結合断片（キメラ、ヒト化、霊長類化、ベニアまたは単鎖抗体の断片を含む）もまた、生成され得る。前述の抗体の抗原結合断片は、それらが由来する全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／または調節機能を保持する。例えば、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントに、あるいはZ-DNA自身に結合し得る抗原結合断片（Fv、Fab、Fab'およびF(ab')2断片が挙げられるが、これらに限定されない）は、本発明により包含される。かかる断片は、酵素切断によりまたは組換え技術により生成され得る。例えば、パパインまたはペプシン切断は、それぞれFabまたはF(ab')2断片を生じ得る。F(ab')2断片の重鎖間のジスルフィド結合の還元は、F(ab')断片を生じ得る。抗体はまた、１つ以上の停止コドンが天然の停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用して種々の切断（truncated）形態で生成され得る。例えば、F(ab')2重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のCH、ドメインおよびヒンジ領域をコードするDNA配列を含むように設計され得る。
【００６８】
本発明の抗体をまた、研究および治療適用に使用して、Z-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合を調節し得る。１つの態様において、抗Z-DNA抗体またはその抗原結合断片は、抗体Z22またはZ44のエピトープ特異性を有する。
【００６９】
抗イディオタイプ抗体もまた提供される。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体の抗原結合部位に関連する抗原決定基を認識する。抗イディオタイプ抗体は、同種の動物、好ましくは一次抗体を産生するために使用された動物と同じ株の動物を一次抗体で免疫化することによって一次抗体に対して調製され得る。例えば、米国特許第4,699,880号を参照のこと。
【００７０】
１つの態様において、抗体は、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントあるいはZ-DNAに対して惹起され、次いで、これらの抗体を免疫原として使用して、抗イディオタイプ抗体（抗Id）を産生する。それにより産生された抗Idは、Z-DNA結合リガンドまたはバリアントあるいはZ-DNAを模倣し、それらを結合する化合物を結合し得、免疫アッセイに使用して、かかる化合物を検出、同定または定量し得る。かかる抗イディオタイプ抗体は、Z-DNA結合リガンドまたはZ-DNA自身を結合しないが、かかる抗イディオタイプ抗体はまた、Z-DNA結合リガンド／Z-DNA機能のインヒビターであり得る。
【００７１】
抗イディオタイプ（すなわち、抗Id）抗体自身を使用して、抗イディオタイプ抗体（すなわち、抗−抗Id）を惹起し得る。かかる抗体は、特異性において最初の免疫化抗体と類似または同一であり得る。１つの態様において、Z-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合をブロックする抗体アンタゴニストを使用して、抗Idを惹起し得、抗Idを使用して、抗体アンタゴニストの特異性と類似または同一の特異性を有し得る抗−抗Idを惹起し得る。これらの抗−抗Id抗体を、Z-DNA結合リガンド／Z-DNA機能に対する阻害効果について評価して、それらがアンタゴニストであるかどうかを決定し得る。
【００７２】
単鎖、およびキメラ、ヒト化、霊長類化（CDR-移植）、ベニア、ならびにキメラ、CDR-移植、またはベニア単鎖抗イディオタイプ抗体が調製され得、用語、抗イディオタイプ抗体に包含される。かかる抗体の抗体断片もまた調製され得る。
【００７３】
本発明の抗体および断片は、例えば、検出可能な標識の組み込みまたは付着（直接的または間接的）により修飾され得る。検出可能な標識の例としては、種々のスピン標識、抗原またはエピトープタグ、ハプテン、酵素標識、補欠分子団、蛍光物質、化学発光物質、生物発光物質、および放射能物質が挙げられる。適切な酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルおよびフィコエリトリンが挙げられ；化学発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射能物質の例としては、125I、131I、35S、および3Hが挙げられる。
【００７４】
治療の方法
Z-DNA結合リガンドの少なくとも１つの機能特徴の阻害を介する、本発明によるZ-DNA結合リガンドとZ-DNAとの複合体形成の調節は、Z-DNA結合媒介機能を阻害または促進する有効な方法を提供する。E3Lがウイルスで感染した細胞において発現される場合、E3Lは、哺乳動物、例えば、ヒトにおいてウイルス性因子病原を選択的に妨げる標的を提供する。従って、Z-DNAとZ-DNA結合リガンドとの間の複合体形成またはZ-DNA結合機能を阻害する薬剤（リガンド、インヒビター、例えば、本明細書に記載のように同定されたものを含む）を、抗感染剤として使用して、感染性疾患を、例えば、治療目的のために処置し得る。
【００７５】
１つの局面において、本発明は、かかる治療を必要とする個体にZ-DNA結合リガンドとZ-DNAとの間の複合体形成を阻害する治療剤の有効量を投与することを含む、かかる治療を必要とする個体において感染因子の病原性を阻害する方法を提供する。１つの態様において、Z-DNA結合リガンドの１つ以上の機能を阻害する化合物は、病原を阻害（すなわち、減少または防止）するために投与される。結果として、感染因子病原性の１つ以上の症状、例えば、死亡、炎症、熱、皮膚上の損傷の形成、嘔吐、胃腸管の不快、下痢、発疹、出血、および体重損失が、本方法により阻害され得る。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「治療」および「処置」は、疾患に関連する症状の改善（疾患症状の開始の防止もしくは遅延、および／または疾患の症状の重篤度もしくは出現率の減少が挙げられる）をいう。用語「個体」は、哺乳動物（霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、すなわち、他ではウシ（bovine）、ヒツジ（ovine）、ウマ（equine）、イヌ（canine）、ネコ（feline）、齧歯類またはマウス（murine）種が挙げられるが、これらに限定されない）などの動物を含むと、本明細書において定義される。感染因子病原性に関連する疾患および状態は、本方法を使用して処置され得る。好ましい態様において、疾患または状態は、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントを生じる能力を含むまたは有する感染因子で感染した細胞の作用が治療（予防を含む）目的のために阻害されるものである。特に好ましい態様において、疾患または状態はウイルス性感染である。
【００７７】
Z-DNAへのZ-DNA結合リガンドまたはバリアントの結合のインヒビターで処置され得るヒトまたは他の哺乳動物または動物の疾患または状態（慢性疾患を含む）としては、
細菌性疾患、例えば、ブドウ球菌感染症（例えば、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermis、またはStaphylococcus saprophyticusにより引き起こされる）、連鎖球菌感染症（例えば、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pneumoniae、またはStreptococcus agalactiaeにより引き起こされる）、腸球菌感染症（例えば、Enterococcus faecalis、またはEnterococcus faeciumにより引き起こされる）、ジフテリア（例えば、Corynebacterium diptheriaeにより引き起こされる）、炭疽菌（例えば、Bacillus anthracisにより引き起こされる）、リステリア症（例えば、Listeria monocytogenesにより引き起こされる）、壊疽（例えば、Clostridium perfringensにより引き起こされる）、破傷風（例えば、Clostridium tetanusにより引き起こされる）、ボツリヌス中毒（例えば、Clostridium botulinumにより引き起こされる）、中毒性腸炎（例えば、Clostridium difficileにより引き起こされる）、細菌性髄膜炎（例えば、Neisseria meningitidisにより引き起こされる）、菌血症（例えば、Neisseria gonorrhoeaeにより引き起こされる）、大腸菌感染（尿路感染症および腸感染症が挙げられる）、細菌性赤痢（例えば、Shigella種により引き起こされる）、サルモネラ症（例えば、Salmonella種により引き起こされる）、エルジニア感染症（例えば、Yersinia pestis、Yersinia pseudotuberculosis、またはYersinia enterocoliticaにより引き起こされる）、コレラ（例えば、Vibrio choleraeにより引き起こされる）、キャンピロバクター症（例えば、Campylobacter jejuniまたはCampylobacter fetusにより引き起こされる）、胃炎（例えば、Helicobacter pyloriにより引き起こされる）、シュードモナス感染症（例えば、Pseudomonas aeruginosaまたはPseudomonas malleiにより引き起こされる）、B型ヘモフィルスインフルエンザ（HIB）髄膜炎、HIB急性咽頭蓋炎、またはHIB蜂巣炎（例えば、Haemophilus influenzaeにより引き起こされる）、百日咳（例えば、Bordetella pertussisにより引き起こされる）、マイコプラズマ肺炎（例えば、Mycoplasma pneumoniaeにより引き起こされる）、非淋菌性尿道炎（例えば、Ureaplasma urealyticumにより引き起こされる）、レジオネラ症（例えば、Legionella pneumophilaにより引き起こされる）、梅毒（例えば、Treponema pallidumにより引き起こされる）、レプトスピラ症（例えば、Leptospira interrogansにより引き起こされる）、ライムボレリア症（例えば、Borrelia burgdorferiにより引き起こされる）、結核（例えば、Mycobacterium tuberculosisにより引き起こされる）、らい病（例えば、Mycobacterium lepraeにより引き起こされる）、放線菌症（例えば、Actinomyces speciesにより引き起こされる）、ノカルジア症（例えば、Nocardia種により引き起こされる）、クラミジア症（例えば、Chlamydia psittaci、Chlamydia trachomatis、またはChlamydia pneumoniaeにより引き起こされる）、斑点熱（例えば、Rickettsia ricketsiiにより引き起こされる）およびリケッチア痘（例えば、Rickettsia akariにより引き起こされる）を含むリケッチア疾患、発疹チフス（例えば、Rickettsia prowazekiiにより引き起こされる）、ブルセラ症（例えば、Brucella abortus、Brucella melitensis、またはBrucella suisにより引き起こされる）、およびツラレミア（例えば、Francisella tularensisにより引き起こされる）;
【００７８】
以下のウイルスのいずれかでの感染により引き起こされるウイルス性疾患または状態：インフルエンザウイルス（インフルエンザ）、パラインフルエンザ、RSウイルス（RSウイルス感染症）、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス（ムンプス）、麻疹ウイルス（麻疹）、風疹ウイルス（風疹感染症）、パルボウイルスB19、ポックスウイルス（オルソポックスウイルス（例えば、痘瘡ウイルス（痘瘡）、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、マウスポックスウイルス、サル痘ウイルス、およびバッファローポックスウイルス）および他のポックスウイルス（例えば、伝染性軟属腫ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘ウイルス）が挙げられる）、エンテロウイルス（ポリオウイルス（ポリオ）、コクサッキーウイルス、ECHOウイルスが挙げられる）、肝炎ウイルス（A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、およびE型肝炎が挙げられる）、ヘルペスウイルス（単純疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス（水痘）、帯状ヘルペス（帯状ヘルペス（Shingles））、エプスタイン‐バーウイルス（感染性単核細胞症）、およびヒトヘルペスウイルス6型（バラ疹）が挙げられる）、ロタウイルス（腸障害）、ノーウォークウイルス（腸障害）、トガウイルス、フラビウイルス、ブンヤウイルス、レオウイルス、アレナウイルス、アルボウイルス（西部ウマ脳脊髄炎、東部ウマ脳脊髄炎、セントルイス脳炎、カリフォルニアウイルス、黄熱、デング熱、日本脳炎、ポーワッサンウイルス、およびコロラドダニ熱）、フィロウイルス（Filiovirus）（エボラウイルスおよびマルブルクウイルス）、ハンタウイルス（ハンタウイルス出血熱）、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス（狂犬病）、レトロウイルス（HIVウイルスが挙げられる）、およびパポバウイルス（乳頭腫ウイルス、およびポリオーマウイルスが挙げられる）;
【００７９】
真菌性疾患、例えば、皮膚糸状菌症（例えば、種または属小胞子菌属、白癬菌属、または表皮糸状菌属により引き起こされる）、カンジダ症（例えば、Candida albicans、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、またはCandida guilliermondiiにより引き起こされる）、アスペルギルス症（例えば、Aspergillus種により引き起こされる）、接合真菌症（例えば、Absidia、Phizopus、およびMucor zygomycetesにより引き起こされる）、ブラストミセス症（例えば、Blastomyces dermatitidisにより引き起こされる）、クリプトコックス症（例えば、Cryptococcus neoformansにより引き起こされる）、ヒストプラスマ症（例えば、Histoplasma capsulatumにより引き起こされる）、コクシジオイデス真菌症（例えば、Coccidioides immitisにより引き起こされる）、スポロトリクス症（例えば、Sporothrix schenckiiにより引き起こされる）およびニューモシスティス症（例えば、Pneumocystis cariniにより引き起こされる）;ならびに
【００８０】
寄生虫性疾患、例えば、寄生虫性（helminthic）疾患（例えば、ぎょう虫症（例えば、Enterobius vermicularisにより引き起こされる）、鞭虫症（例えば、Trichuris trichuriaにより引き起こされる）、回虫症（例えば、Ascaris lumbricoidesにより引き起こされる）、鉤虫病（例えば、Necator americanusおよびNecator duodenaleにより引き起こされる）、クリプトスポリジウム症（例えば、Cryptosporidium parvumにより引き起こされる）、アメーバ症（例えば、Entamoeba histolyticaにより引き起こされる）、アメーバ性髄膜脳炎（例えば、ネグレリア属およびアカントアメーバ（Ancanthamoeba）属のアメーバにより引き起こされる）、トキソプラスマ症（例えば、Toxplasma gondiiにより引き起こされる）、マラリア（例えば、Plasmodium vivax、Plasmodium ovale、Plasmodium malariae、またはPlasmodium falciparumにより引き起こされる）、トリコモナス症（例えば、Trichomonas vaginalisにより引き起こされる）、ジアルジア鞭毛虫症（例えば、Giardia lambliaにより引き起こされる）、リーシュマニア症（例えば、Leishmania tropica、Leishmania mexicana、Leishmania braziliensis、Leishmania donovaniにより引き起こされる）、アフリカトリパノソーマ症（例えば、ツェツェバエ属のハエにより引き起こされる）、および南アメリカトリパノソーマ症（例えば、Trypanosoma cruziにより引き起こされる））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本発明はまた、Z-DNA結合リガンドをコードする遺伝子を含む感染因子の病原性を、前記Z-DNA結合タンパク質と比較して減少したZ-DNA結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のバリアントを含む感染因子の誘導体を生成することにより減少する工程、および前記誘導体を含むワクチン組成物を調製する工程を含むワクチン組成物を生成する方法を特徴とする。Z-DNA結合能力の減少および／またはインビボでの病原性の減少を示すかかるZ-DNA結合リガンドは、本明細書に記載され、これらのリガンドを含むウイルスは、ワクチン組成物に使用され得る。かかるワクチンは、治療的におよび／または研究目的のため（例えば、感染因子の病原性を減少し得る治療剤を同定するため）に使用され得る。
【００８２】
投与の様式
本方法により、（すなわち、１つ以上の）抗感染剤または治療剤は、適切な経路を介して単独でまたは別の薬物と組み合わせて宿主に投与され得る。抗感染剤または治療剤の有効量が投与される。有効量は、投与の条件下で、所望の治療または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントとZ-DNAとの間の複合体形成の阻害、それにより感染因子病原性を阻害するのに十分な量である。
【００８３】
薬剤および処置対象の疾患または状態に依存して、種々の経路の投与（経口、鼻腔内、眼内、規定食、局所、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下注射）および吸入（例えば、気管支内、鼻腔内または経口吸入、鼻腔内滴下）経路の投与が挙げられるが、これらに必ずしも限定されない）が可能である。
【００８４】
投与対象の抗感染剤または治療剤の製剤は、選択された投与の経路により変動するだろう（例えば、溶液、エマルジョン、カプセル）。投与対象の薬剤を含む適切な組成物は、生理的にまたは薬学的に許容され得るビヒクルまたは担体内で調製され得る。溶液またはエマルジョンについて、適切な担体としては、例えば、生理食塩水および緩衝化媒質を含む水溶液またはアルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。
【００８５】
治療使用のための抗感染剤または治療剤の製剤に使用されるべき正確な用量は、投与の経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、開業医の判断および各患者の情況により決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系由来の用量依存曲線から外挿され得る。
【００８６】
非経口ビヒクルとしては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガーまたは固定油が挙げられ得る。静脈内ビヒクルとしては、種々の添加剤、保存剤、または流体、養分または電解質補充液などが挙げられ得る（一般的に、RemingtonのPharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Co., Pa,, 1985参照のこと）。吸入について、薬剤は、可溶化され、投与用の適切なディスペンサー（例えば、アトマイザ、ネブライザまたは加圧エアロゾルディスペンサー）に装填され得る。
【００８７】
さらに、抗感染剤がタンパク質またはペプチドである場合、薬剤は、組換えタンパク質のインビボ発現を介して投与され得る。インビボ発現は、適切な方法（例えば、米国特許第5,399,346号を参照のこと；この教示は参考により本明細書に援用される）によって、体細胞発現を介して達成され得る。本態様において、タンパク質をコードする核酸は、送達用のレトロウイルス、アデノウイルスまたは他の適切なベクター（好ましくは、複製欠陥感染性ベクター）に組込まれ得るか、あるいは、送達用のタンパク質を発現し得るトランスフェクトまたは形質転換宿主細胞に導入され得る。後者の態様において、細胞は、治療有効量のタンパク質を発現するのに有効な量で移植（単独でまたはバリアデバイス内で）されるか、注射されるか、その他、導入され得る。
【００８８】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載のように同定された、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントとZ-DNAとの間の複合体形成のインヒビターを含む医薬組成物に関する。インヒビターは、医薬組成物を調製するために、生理的または薬学的に許容され得る担体または賦形剤と共に製剤化され得る。担体および組成物は無菌であり得る。製剤は、投与の様式にあわせるべきである。
【００８９】
適切な生理的および薬学的に許容され得る担体としては、水、塩溶液（例えば、NaCl）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。医薬調製物は、所望の場合、活性化合物と有害的に反応しない補助剤（例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色剤、香味剤および／または芳香物質など）と混合され得る。
【００９０】
医薬組成物はまた、所望の場合、少量の湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝化剤を含み得る。この組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または散剤であり得る。前記組成物は、伝統的な結合剤およびトリグリセリドなどの担体と共に坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。
【００９１】
これらの組成物の導入の方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口および鼻腔内が挙げられるが、これらに限定されない。他の導入の適切な方法としてはまた、遺伝子治療、再装填可能または生分解性デバイス、粒子加速デバイス（「遺伝子銃」）および低放出ポリマーデバイスが挙げられ得る。本発明の医薬組成物はまた、他の化合物との組み合わせ治療の一部として投与され得る。
【００９２】
前記組成物は、慣用的な手順により、ヒトへの投与に適合された医薬組成物として製剤化され得る。例えば、静脈内投与のための組成物は、典型的に、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、前記組成物はまた、可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔薬を含み得る。一般的に、成分は、例えば、密閉した密封容器内（例えば、活性化合物の量を示したアンプルまたはサシェット）の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、単位投薬形態で別個にまたは一緒に混合してのいずれかで供給される。前記組成物が点滴による投与対象である場合、滅菌医薬グレード水、生理食塩水またはデキストロース／水を含む点滴ボトルを用いて分配され得る。前記組成物が注射によって投与される場合、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得、その結果、成分は投与前に混合され得る。
【００９３】
局所適用のために、局所適用に適合性があり、好ましくは水よりも大きな粘性率を有する担体を含む噴霧不可能な形態、粘性から半固体または固体の形態が、使用され得る。適切な製剤としては、所望の場合、滅菌された、または補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または浸透圧に影響を及ぼす塩など）と混合された溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏剤（ointment）、粉末、浣腸剤、ローション、ゾル、リニメント剤、軟膏剤（salve）、エアロゾルなどが挙げられるが、これらに限定されない。前記化合物は、化粧品製剤に組込まれ得る。局所適用について、噴霧可能なエアロゾル調製物がまた適切であり、ここで、活性成分は、好ましくは固体または液体不活性担体物質と組み合わせて、中身をしぼり出せるプラスチック容器にまたは加圧揮発性物質、通常、ガス性推進剤、例えば、加圧空気と混合して包装される。
【００９４】
本明細書に記載の薬剤または治療剤は、中性または塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、アミノ基なしで形成されたもの（塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸由来のものなど）、およびカルボキシル基なしで形成されたもの（ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン由来のものなど）が挙げられる。
【００９５】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を管理する政府機関により規定された形態の通知（この通知はヒト投与のための製造、使用または販売の機関による承認を反映する）が、かかる容器に任意に付随される。パックまたはキットは、投与様式、薬物投与の順序（例えば、別個に、連続的にまたは同時に）などに関する情報が貼られ得る。パックまたはキットはまた、患者に治療を受けることを思い出させる手段を含み得る。パックまたはキットは、組み合わせ治療の単回単位投薬であり得るか、または複数の単位投薬であり得る。具体的には、化合物は、分離され、任意の組み合わせで混合され、単一バイアルまたは錠剤に存在し得る。ブリスターパックまたは他の分配手段に整理された組成物が好ましい。本発明の目的のため、単位投薬は、各化合物の個々の薬力学に依存し、標準的なタイムコースでFDAの許可した投薬量で投与される投薬を意味することが意図される。
【００９６】
キット
本発明はまた、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアント、核酸、およびZ-DNA形成緩衝液（溶液または凍結乾燥形態であり得る）を含む抗感染剤を検出および／または同定するためのキットを特徴とする。Z-DNA形成緩衝液は、溶液に含有されるZ-DNAの形成および、または安定化を促進する溶液を形成する任意の試薬を含み得る。Z-DNA形成緩衝液の例は、当該分野で公知であり、例えば、DNAの負のスーパーコイル化を生じる、および／または維持する溶液、例えば、75mM KCl、3mM DTT、5％グリセロール、200μg/ml E. coli tRNA、10mM MgCl2、および10mM Tris-HCl（pH8.0）が挙げられる。
【００９７】
本発明はまた、Z-DNA結合リガンドまたはそのZ-DNA結合バリアントをコードする遺伝子を感染因子に組込む工程を含む、該因子の病原性を増加する方法を特徴とする。さらに、本発明は、Z-DNA結合リガンドをコードする遺伝子を含む感染因子の病原性を増加する方法を特徴とし、該方法は、Z-DNA結合リガンドと比較してZ-DNA活性結合が向上したタンパク質をコードする該遺伝子の改変バージョンを含む感染因子の誘導体を生成する工程を含む。かかる方法は、感染因子の病原性を阻害するために使用され得る治療化合物および／またはZ-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合を阻害し得る化合物のスクリーニングに有効である。より危険なウイルス、例えば、ポックスウイルスを使用するのとは対照的に、病原性の増加した感染因子を生じるために、かかるこれらの方法を使用することが好ましい。
【実施例】
【００９８】
本発明はここで以下の実施例により例証され、何らかの限定も意図されない。
【００９９】
実施例１: Zαは、ワクシニアウイルスE3LのN末端ドメインの機能を置換し得る。
ウイルスの病原性は、ウイルスが宿主細胞のプログラムされた細胞死（アポトーシス）を阻害するという事実に由来する。この根拠は、マウスに致死であるワクシニアウイルスを用いた実験に由来する。ワクシニアウイルスゲノムは、病原性に不可欠であるE3Lタンパク質をコードする。E3Lタンパク質は2つのドメインを含む；1つのドメインは、配列を問わず二本鎖RNAに結合し、もう一方のドメイン（アミノ末端ドメイン）はタンパク質ドメインZαの配列に類似性を有する。Zαはヒト二本鎖RNAアデノシンデアミナーゼ（hADAR1）のアミノ末端領域由来のタンパク質ドメインであり、左旋性Z-DNAに対して特異的および選択的に結合することが示されている。Z-DNAに複合体化したZαの三次元結晶構造は決定されており（Schwartzら, Science, 284:1841-1845, 1999)、この構造から、Z-DNAと相互作用する残基が同定されている。
【０１００】
E3Lは、hADAR1のZαとアミノ酸配列において類似している。本研究において、E3Lの病原性がZ-DNA結合と関連するかどうかを決定するため、実験を実行した。
【０１０１】
ワクシニアウイルスE3LのN末端ドメインがZαのそれと類似した機能を有するかどうかを決定するために、以下のZ-DNA結合ドメインスワッピング研究を行った。67アミノ酸を含むワクシニアE3Lタンパク質（GenBankアクセッション番号: S64006）のアミノ末端ドメインを除去し、hADAR1由来のZαドメイン（Z-DNA結合ドメイン）(GenBank アクセッショ番号: U18121のhADAR1の残基129から196）で置換した。Zαアミノ末端ドメイン（hADAR1由来）を有するこのキメラ化E3Lタンパク質をコードする遺伝子を含んだワクシニアウイルスを作製した。以前に、E3Lのアミノ末端ドメインおよびカルボキシ末端二本鎖RNA結合ドメインの両方が病原性に不可欠であったことを示していた。キメラ化E3Lタンパク質をコードするワクシニアウイルスを、マウスを感染させるために使用した場合、ウイルスは100％致死性であった。この致死性は、キメラ化E3L分子における67アミノ酸の15のみがE3Lタンパク質のアミノ末端ドメインに関連して変化しない（E3Lの他の52のアミノ酸はドメイン変換により変化した）にもかかわらず起こった。これらの結果は、少数の特異的アミノ酸残基のみが、E3Lの病原性活性のために必要であったことを示した。
【０１０２】
E3LのE3Lアミノ末端ドメインおよびhADAR1のZαドメインの間で一定であった15アミノ酸の大部分を、Zαおよび左旋性Z-DNA間の特異的相互作用において使用する（Schwartzら, Science, 前出)。例えば、hADAR1のZαドメインのアミノ酸、169位のリシン、170位のリシン、173位のアスパラギン、174位のアルギニン、177位のチロシン、191位のスレオニン、192位のプロリン、193位のプロリン、および195位のトリプトファンがZ-DNAと接触すると示している。
【０１０３】
実施例２: ワクシニアウイルス病原性の原因であるE3L残基の同定
【０１０４】
材料および方法
プライマー設計およびベクターの構築
pMPADARZα-E3LおよびpMPADARZβ-E3Lの構築
ワクシニアウイルス（VV）E3L遺伝子のヌクレオチド（nt）61〜261（アミノ酸1〜67 をコードする）を、pMPE3L（Kiblerら, J.Virol., 71:1992-2003, 1997）において、ヒトADAR遺伝子のヌクレオチド554〜742（Zα）またはヌクレオチド1025〜1216（Zβ）いずれかと置換した。これは2段階PCRベースの突然変異誘発プロトコルを使用して行った。1次PCR反応はメガプライマーの構築を含み、これを続いて、組換えプラスミドを生成するため2次PCR反応において使用した。
【０１０５】
メガプライマーを合成するために、ヒトADAR（Genbankアクセッション番号 U10439）またはVV E3L（GenBankアクセッション番号 S64006）cDNA配列に基づく、以下のオリゴヌクレオチドをPCR増幅に使用した。下線領域はADAR ZαまたはZβ-E3Lメガプライマーを生成するためヒトADAR由来の配列に融合したVV E3L由来の配列を示す。
【０１０６】
ADARZα-E3Lメガプライマー合成のためのプライマー:
5'-AAAATGTCTATCTACCAAGATCAGGAACAAAGG-3'（配列番号: 16)(GenBankアクセッション番号 U10439, nt 554〜580)；および 5'-CCGGCTTATCCGCCTCCGTTGTCATTTTC
CACAAAGGGGGTGTTCCTGCCTCTTTC-3'（配列番号: 17)(GenBankアクセッション番号 S64006, nt 262-286（下線)；GenBankアクセッション番号 U10439, nt 711〜742)。
【０１０７】
ADARZβ-E3Lメガプライマー合成のためのプライマー:
5'-AAAATGTTGGAGTTTTTAGACATGGCCGAG- 3'（配列番号: 18)(GenBank アクセッション番号 U10439, nt 1025-1048)；および 5'-CCGGCTTATCCGCCTCCGTTGTCATATGCC
ATATGGGAGGGGTTGTCCCTTG-3'（配列番号: 19)(GenBankアクセッション番号 S64006, nt 262〜286（下線)；GenBank アクセッション番号 U10439, nt 1190〜1216).
【０１０８】
pGEXADARからメガプライマーを合成するために、製品使用説明書に従いTaq polymerase enzyme（Promega, Madison, WI）を使用してPCRを実行した。PCR増幅を以下のとおり実行した:（94℃１分間)、次いで25サイクルの増幅（94℃
1分間、50℃ 2分間、72℃ 3分間)。製品使用説明書に従いQIAquick PCR purification kit（Quiagen, Valencia, CA）を使用して、メガプライマーを精製した。
【０１０９】
全プラスミドPCRベースの突然変異誘発（FisherおよびPei, Biotechniques, 23:570-574, 1997）を、組換えプラスミドpMPADARZα-E3LおよびpMPADARZβ-E3Lの構築において使用した。この技術は、元の技術の修正である。端的に言えば、分岐プライマーを、変異される領域の横に位置するように設計した。プライマーの１つは、E3L遺伝子のすぐ上流のフランキング領域において鋳型pMPE3Lとアニールした。2番目のプライマーは、その5’末端に、E3L由来の配列（nt262〜286）と融合したADAR由来のZα（nt 554〜742）またはZβ（nt 1025〜1216）配列いずれかを含む、メガプライマーであった。両方のプライマーを、製品使用説明書に従いT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Gibco BRL, Rockville, MD）を使用して、その5’末端でリン酸化した。
【０１１０】
PCRを、10〜50ngのpMPE3L鋳型、50pmolのリン酸化プライマー、2.5mM dNTP、およびPFUポリメラーゼ（Stratagene, LaJolla, CA）を使用して実行した。以下のパラメータをPCR増幅に使用した。：94℃4分間、次いで16サイクルの（94℃1分間、50℃2分間、72℃15分間)。PCR産物を、製品使用説明書に従いQIAquick PCR purification kit（Quiagen, Valencia, CA）を使用して精製した。
【０１１１】
直鎖状PCR産物を、製品使用説明書に従い、T4 DNA Ligase（Gibco BRL, Rockville, MD）を使用してライゲートした。ライゲーション後、鋳型DNAを、製品使用説明書に従いDPNI制限酵素（Stratagene, La Jolla, CA）を使用して切断した。この産物をDH5α細菌細胞に形質転換した。pMPADARZα-E3LまたはpMPADARβ-E3Lのいずれかを含んだ細菌コロニーをPCRによりスクリーニングした。ADARZα-E3LまたはADARZβ-E3L遺伝子の存在を確認するため、このプラスミドを配列決定した。
【０１１２】
pMPDLM-1Zα-E3Lの構築
VV E3L遺伝子のヌクレオチド61〜261（アミノ酸1-67をコードする）を、pMPE3Lにおいて、マウスDLM-1遺伝子のヌクレオチド116〜316（Zα）と置換した。これは2段階プロトコルを使用して行った。第1段階で、それぞれ5’および3’末端に連結したBamHIおよびAatII部位を有するZαADAR1を増幅するため、PCRを実行した。第2段階で、ZαDLM1を、ZαDLM1およびpMPE3L両方のBamHIおよびAatII消化により、pMPE3Lにクローニングした。
【０１１３】
ZαDLM1配列を増幅するために、マウスDLM-1（AF136520）もしくはVVE3L（S64006）cDNA配列に基づく、またはベクターpMPE3LΔGPT（Kiblerら、前出）に基づく以下のオリゴヌクレオチドを、PCR増幅に使用した。下線領域は、DLM-1 Zαを生成するためにマウスDLM-1遺伝子由来の配列と融合された、VV E3L（下流プライマー）または pMPE3LΔGPT（上流プライマー）由来の配列を示す。
【０１１４】
上流プライマー
5'-TCTAAAAAGGATCCCCCGGGCTGCCTGAAAATGGCAGAAGCTCCTGTTGAC-3'（配列番号: 20）(pMPE3LΔGPT, nt 2207〜2181（番号付けは親プラスミド、pBluescriptと同じである）(下線)；GenBankアクセッション番号 AF136520, nt 116〜136).
【０１１５】
下流プライマー
5'ATCTATTATGACGTCAGCCATAGCATCAGCATCCGGCTTATCCGCCTCCGTTG TCATGCTCCATGTTGCAGGCTCTG-3'（配列番号: 21)(GenBankアクセッション番号 S64006, nt 1920〜1976（下線)；GenBankアクセッション番号 AF136520, nt（297〜316)).
【０１１６】
pGEM-T（Fuら, Gene, 240:157-163, 1999）におけるDLM1 cDNAからZαDLM1を増幅するために、製品使用説明書に従い、Platinum Pfx（Gibco BRL, Rockville, MD）を使用してPCRを実行した。PCR増幅を以下の通り実行した:（95℃ 1分間)、次いで35サイクルの増幅（95℃ 1分間、50℃ 1分間、68℃ 1分間)。
【０１１７】
PCR産物およびベクターpMPE3LΔGPTを、BamHIで消化し、次いでMicropure-EZ（Millipore, Bedford, MA）およびMicrocon（Millipore, Bedford, MA）を使用して精製した。精製された産物をAatIIで消化し、次いでゲル抽出した（QIAEXII, Qiagen, Valencia, CA)。製品使用説明書に従いT4 DNA Ligase（Promega, Madison, WI）を使用して、消化された挿入物およびベクターをライゲートした。ライゲーション後、この産物をTOP10 E.coli（Invitrogen, Carlsbad, CA）に形質転換した。pMPDLM-1Zα-E3Lをスクリーニングし、存在を確認するため、プラスミドDNAを抽出および配列決定した。
【０１１８】
pMPADARZα-E3L、pMPADARZβ-E3LおよびpMPE3Lにおける点突然変異の生成
重複プライマーを使用する全プラスミドPCRベースの突然変異誘発（Makarovaら, Biotechniques, 29:970-972, 2000）を、pMPADARZα-E3L、pMPADARZβ-E3LおよびpMPE3Lにおいて変異を生成するために使用した。端的に言えば、重複プライマー40〜45塩基長を、その5’末端において8〜10塩基突出を有するよう設計した。目的のコドンを、両方のプライマーにおける重複の領域において、おおよそプライマーの中央において、変異させた。
【０１１９】
100〜300ng鋳型、200nMの各プライマー、800μM dNTPおよび1.25ユニットPFUポリメラーゼ（Stratagene, LaJolla, CA）を使用してPCRを実行した。以下のパラメータをPCR増幅に使用した：95℃3分、次いで18サイクルの（95℃15秒間、50℃1分間、68℃12分間)。鋳型のバックグラウンドレベルを決定するため、プライマーまたはポリメラーゼいずれかを有さない対照を実行した。
【０１２０】
鋳型DNAを、製品使用説明書に従いDPNI restriction enzyme（Stratagene, LaJolla, CA）を使用して消化した。この産物をDH5α細菌細胞に形質転換した。プラスミドDNAを、pMPADARZα-E3LおよびpMPADARZβ-E3Lにおける点突然変異をスクリーニングし、存在を確認するため、プラスミドDNAを抽出および配列決定した。
【０１２１】
細胞培養
BHK21細胞を、10％ 胎仔ウシ血清（FBS)、50μg/mLゲンタマイシン、および0.1mM非必須アミノ酸溶液（MEM 5％, Gibco BRL, Rockville, MD）を含むMEM（Gibco BRL, Rockville, MD）中で培養した。細胞を、5％ CO2と37℃でインキュベートした。RK13細胞を5％FBS、50μg/mLゲンタマイシン、および0.1mM 非必須アミノ酸溶液（MEM 5％, Gibco BRL, Rockville, MD）を含むMEM（Gibco BRL, Rockville, MD）中で培養した。細胞を5％ CO2と37℃でインキュベートした。
【０１２２】
インビボ組換え
E3L遺伝子のVVを欠失したWR株（VVΔE3L）を、組換えのための親ウイルスとして使用した。VVΔE3Lにおいて、E3L遺伝子はLacZ遺伝子と置換されている。BHK細胞をRK-13細胞の代わりに使用し、10p.f.u./細胞の代わりに、0.05の感染多重度（MOI）で細胞を感染させたこと以外、前述（Kiblerら、前出）の通りインビボ組換えを実行した。ZαDLM1-E3LおよびE3Lにおける全ての突然変異を除く全てのウイルスを、前述（Kilberら、前出）の一過性優勢選択により得た。ZαDLM1-E3L、およびE3Lにおける全ての変異について、RK-13細胞におけるインターフェロン耐性の選択後に組換えウイルスを得た。端的に言えば、RK-13細胞のコンフルエントな単層を、1000 U/mlの組換えhuIFNαA/Dで処理し、標準的な感染/トランスフェクション反応から得られたウイルスで感染させた。インターフェロン処理細胞において形成されたプラークは、トランスフェクトされたプラスミドから機能的E3L遺伝子を拾っている。
【０１２３】
ウイルス増幅
BHK21細胞を、組換えウイルスを増幅するために使用した。細胞培養培地を単層から除去し、ウイルス感染を、2％ FBS、50μg/mL ゲンタマイシン、および0.1 mM 非必須アミノ酸溶液（MEM 5％, Gibco BRL, Rockville, MD）を含むMEM（Gibco BRL, Rockville, MD）中で実行した。細胞を、200μL容量中でウイルスを用いて感染させ、37℃、5％ CO2で1時間、毎10分ごとに振動させてインキュベートした。感染後、細胞培養培地を交換した。100％の細胞障害性で、感染したBHK21細胞を採取し、ウイルスを放出するために、3巡の凍結（-80℃）および融解（37℃)、次いで30秒の超音波処理に供した。細胞残屑を700×g で10分間、4℃で遠心分離することによりペレット化した。上清を新しいチューブに移し、-80℃で保存した。上清中のウイルスを、RK13細胞において滴定した。
【０１２４】
結果
上記のドメイン変換研究の結果に基づいて、2つのタンパク質間のアミノ酸残基の保存に基づき、Z-DNAに接触すると予想されるE3Lのアミノ酸残基が、ウイルスの病原性を含むかどうかを決定するため試験を行った。図２Ａおよび２Ｂは、本明細書中に記載された通り、hADAR1の相同ドメインZαの構造研究に基づき、Z-DNAに結合すると予想される痘瘡E3L残基（hADAR1アミノ酸番号付け系を使用する）を示す。例えば、hADAR1 169位のアミノ酸リシン（E3Lの40位のアスパラギンに対応する)、hADAR1 170位のアルギニン（E3Lの41位のアスパラギンに対応する)、hADAR1 173位のアスパラギン（E3Lの44位のアスパラギンに対応する)、hADAR1 174位のリシン（E3Lの45位のアスパラギンに対応する)、hADAR1 177位のチロシン（E3Lの48位のアスパラギンに対応する)、hADAR1 191位のイソロイシン（E3Lの62位のアスパラギンに対応する)、hADAR1の192位のプロリン（E3Lの63位のアスパラギンに対応する)、hADAR1 193位のプロリン（E3Lの64位のアスパラギンに対応する)、およびhADAR1 195位のトリプトファン（E3Lの66位のアスパラギンに対応する）がZ-DNAと接触し、ウイルスの病原性を媒介すると予想される。
【０１２５】
さらに、これらの結果はまた、K[K/R]XXN[R/K]XXY[X]13[T/I]PPXW（式中、X（Xaa）は任意のアミノ酸である）のZ-DNA結合モチーフが、ウイルスの病原性の媒介に重要であることを示す。アミノ配列 K[K/R]XXN[R/K]XXY[X]13[T/I]PPXW（式中、X（Xaa）は任意のアミノ酸である）と少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％同一であるポリペプチド、あるいは、アミノ酸配列K[K/R]XXN[R/K]XXY[X]13[T/I]PPXW（式中、X（Xaa）は任意のアミノ酸である)
と少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％または95％同一である配列を含むポリペプチドを作製し、本明細書中に記載した方法を使用して、Z-DNAおよびZ-DNA結合リガンドまたはバリアント間の複合体の形成の阻害を評価し得る。
【０１２６】
E3LのZ-DNAに対する結合がウイルスの病原性を媒介するかどうかをさらに調べるため、Z-DNAに結合すると予想されるワクシニアウイルスE3Lの残基（上記）を変異させる実験を行った。ZαドメインのZ-DNA結合残基の変異は、hADAR1のZ-DNA結合を減少させるまたは廃止させることが公知である。特に、以下のワクシニアE3Lのアミノ酸を変異させた: 44位のアスパラギン（Zαの173位に対応する）をアラニンに変異させた、66位のトリプトファン（Zαの195位に対応する）をロイシンに変異させた、変異体ウイルスを、BrandtおよびJacobs（J.Virol. 75:850-856, 2001；その教示は参考により援用される）により記載された通りに調製した。さらに、44位のアスパラギンおよび66位のトリプトファンの両方を変異させた二重変異体を作製した。E3Lにおけるこれらの変異のそれぞれは、このワクシニアウイルスをマウスに投与した場合、変異を受けていないウイルスと比較して、病原性の損失を生じた。単一変異は病原性の減少において二重変異とちょうど同様に効果的であった。これらの結果は、ワクシニアウイルスの病原性の重要な部分が左旋性Z-DNAに対するアミノ末端Z-DNA結合ドメインの相互作用に関連することを示す。
【０１２７】
第2のドメイン変換研究において、15アミノ酸を保存した一方で、E3LのN末端ドメインにおける48アミノ酸を変化させた。100プラーク形成単位（p.f.u.）の感染（頭蓋内接種（innoculation）を介する）において、キメラE3L分子を有するウイルスは、野生型ワクシニアウイルス（ZE3L)；E3Lタンパク質の83アミノ末端アミノ酸を欠失しているワクシニアウイルス（del83N)；E3LのN末端ドメインをZ-DNA結合ドメインZαADAR1で置換しているワクシニアウイルス（ZαADAR1)；またはZαADAR1構築物におけるアミノ酸192位のプロリンをアラニンに変異させているワクシニアウイルス（P192A)(図３Ａ）あるいはZαADAR1構築物におけるアミノ酸193位のプロリンをアラニンに変異させているワクシニアウイルス（P193A)(図３Ｂ)；を接種したマウスにおける、経時的（感染後日数）な致死率（生存百分率）のグラフである図３Ａおよび３Ｂ（ZαADAR1）に示される通り、100％病原性であった。
【０１２８】
Z-DNA結合に不可欠な残基のいくつかにおいて変異を作製した場合、それはウイルスの病原性を減少させたかまたは廃止させたかのいずれかであった。ADAR1を用いた先の実験において、サウスウエスタンアッセイ（Schadeら、EMBO J, 18:470-479, 1999）において示された通り、プロリン192のアラニンへの変異はZ-DNA結合を廃止すること、プロリン193のアラニンへの変異はより弱いZ-DNA結合を生じることを示した。100プラーク形成単位の野生型E3Lウイルスでの大脳内接種は、8日以内に全てのマウスの死亡を導いた（図３Ａおよび３Ｂ、ZE3L）。マウスにADAR1のZαをE3LのN末端ドメインに置換したキメラウイルスを接種した場合、同様な結果を観察し、9日以内に全てのマウスが死亡した（図３Ａおよび３Ｂ、ZαADAR1)。E3LのN末端を83位まで欠失したワクシニアウイルス（del83N）でのマウスの接種は、致死性を生じなかった。残基192位のプロリンをアラニン構築物に変異させたZαADAR1キメラウイルスでのマウスの接種は、同様に全ての致死性を廃止した（図３Ａ、P192A)。一方、残基193位のプロリンをアラニンに変異させたZαADAR1でのマウスの接種は、致死性の減少を導いた（図３Ｂ、P193A)。これらの結果は、減少したZ-DNA結合は致死性の減少を引き起こし、Z-DNA結合の損失は致死性の損失を引き起こすことを示唆する。
【０１２９】
円偏光二色性装置を使用して、poly(dG-dC）またはd(CG)6の生理的溶液をアッセイした場合、完全に右旋性B-DNAとして存在することが示されている。しかしながら、ADAR1のZαをこの溶液に滴定した場合、DNAは速やかに、タンパク質がそれに結合してZ-DNAに変わる（Herbertら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:8421-8426, 1997)。この変換は、4塩基対あたりおよそ1のZαADAR1残基の比率で完了する（Bergerら, Biochemistry, 37:13313-13321, 1998)。従って、円偏光二色性の変化はZαのZ-DNAへの結合の指標である。
【０１３０】
チロシンADAR1 177（ZαADAR1とE3Lのアミノ末端を変換したおよびチロシン残基がマウス病原性研究のためにZαADAR1タンパク質の177位に位置するキメラE3Lタンパク質、ならびに、インビトロZ-DNA結合研究のために、チロシン残基が177位に位置するZαADAR1タンパク質）およびその変異体を用いた用量-応答実験は、Z-DNA結合の病原性との相関を示す。ZαADAR1において、チロシン177はZ-DNAのsynグアニンとのファンデルワールス接触の安定に関連し、また、その水酸基を介して、リン酸基への結合によりZ-DNAを安定させる。円偏光二色性実験を、ZαADAR1、チロシン177タンパク質およびその変異（Y177FおよびY177A）を、CG塩基対を交換しながらオリゴヌクレオチドに加えることの影響のグラフである図４Ｂに示す。ADAR1の野生型Zα（ZαADAR1）をd(CG)6に加えた場合、急速なおよび完全なZ-DNAへの変換を観察した。しかしながら、フェニルアラニンに変化したチロシン177の変異体（Y177F）は、遅い、およびそれほど完全でない円偏光二色性スペクトル変化を引き起こし、アラニンへの変化（Y177A）は非常に少ないZ-DNA結合を引き起こした。
【０１３１】
Z-DNAと上記構築物の3つ全てとの相互作用の解離定数（Kd）もまた、表面プラスモン共鳴（Herbert, 1997, 前出）を使用して測定した。この測定について、poly(dG-dC)を、Z-DNA立体配座で安定させるため部分的に臭素化した。Z-DNAに対するZαADAR1タンパク質のKdを、40nMと決定した。チロシン177のフェニル化変異体（Y177F）はKdを350nMに減少させ、チロシンのアラニン変異体（Y177A）はKdをさらに700nMに減少させた。円偏光二色性アッセイおよびKd測定は異なるものを測定することに注意すべきである；Kd測定は、予め形成されたZ-DNAに対するZ-DNA結合タンパク質のアフィニティーを反映し、一方、円偏光二色性アッセイ測定は、結合前の、右旋性B-DNAの左旋性Z-DNAへの変換を含む。従って、これらのアッセイを必ずしも互いに量的に比較するべきではない。
【０１３２】
これらの結果は、図４Ａに示された、これらのキメラタンパク質で作製されたウイルスの脳内注射後のマウスの生存に反映され、この図は、野生型ワクシニアウイルス（WT(ZE3L)）；E3LのN末端ドメインをZ-DNA結合ドメインZαADAR1で置換しているワクシニアウイルス（ZαADAR1）；E3LのN末端ドメインをZ-DNA結合ドメインZαADAR1で置換し、ZαADAR1ドメインにおけるアミノ酸177位のチロシンをフェニルアラニンに変異させているワクシニアウイルス（Y177F）；またはE3LのN末端ドメインをZ-DNA結合ドメインZαADAR1で置換し、ZαADAR1構築物におけるアミノ酸177位のチロシンをアラニンに変異させているワクシニアウイルス（Y177A）；を接種したマウスにおける、経時的（感染後日数）な致死率（生存百分率）のグラフである。10プラーク形成単位（p.f.u.）の用量において、野生型E3LおよびE3Lのアミノ末端をADAR1のZαで置換したキメラは、9日目までに20〜40％の生存をもたらした。変異体Y177Fを接種したマウスにおける生存は80％であり、一方、変異体Y177Aを接種したマウスは完全な生存を有した。チロシン177をフェニルアラニンに変異させたキメラ（Y177F）でのマウスの感染は、102p.f.u.の用量で80％のマウスを殺し、このウイルスはZαADAR1を含む変異されていないウイルスよりもおよそ10倍少ない病原性であることを示した。変異体Y177Aは完全な致死性を引き起こすため、非常に多い用量を必要とした。注射用量を104p.f.u.に増加させたところ、変異体Y177Aを接種したマウスの生存は、102プラーク形成単位以上で野生型およびZαADAR1キメラを接種したマウスの生存と、同様のレベルに減少した。従って、Y177A変異を有するキメラウイルスは、変異されていないZαADAR1キメラE3Lを含むウイルスよりおよそ1000倍少ない病原性である。これらの研究は、Z-DNA結合の量、ならびに、野生型E3Lウイルスおよびそのキメラウイルスの病原性間は並行であることを示す。
【０１３３】
ウイルスの病原性についての1つの考察は、Z-DNAと相互作用するアミノ酸側鎖および相互作用しない側鎖の間の違いであり得る。この違いを探索するため以下の研究を行った。ZαADAR1の構造において、リシン169（K169）はリン酸基と水素結合を形成し、さらに、次のリン酸基に結合する水分子に対して水素結合を形成する。リシン170（K170）もまたZ-DNAと相互作用し、しかしながら、認識ヘリックスにおける次の残基、グルタミン酸171（E171）はZ-DNAと相互作用しない。さらに、グルタミン186（N186）もまたZ-DNAと相互作用しない。ZαADAR1のリシン169、グルタミン酸171、およびグルタミン186をそれぞれ個々にアラニンに変異させ、円偏光二色性を測定することによりZ-DNA結合を評価した。図５Ｂは、ZαADAR1(ZαADAR1)；アミノ酸186位におけるグルタミンをアラニンに変異させているZαADAR1（Q186A)；アミノ酸171位におけるグルタミン酸をアラニンに変異させているZαADAR1（E171A)；アミノ酸169位におけるリシンをアラニンに変異させているZαADAR1（K169A)；および E3L（WT(ZE3L))の、経時的な（秒）結合活性（B立体配座からZ立体配座へのDNAの変換により測定された）のグラフである。K169A変異体を含む試料におけるB-DNAのZ-DNAへの変換は、たった一部分であり遅い、一方、E171AおよびQ186A変異体ZαADAR1タンパク質両方の変換の割合は、変異されていないZαADAR1タンパク質で観察された割合に匹敵した。
【０１３４】
ウイルスを接種したマウスでの致死性における、これらの変異を含むワクシニアウイルスの影響をもまた調べた。図５Ａは、野生型ワクシニアウイルス（WT(ZE3L))；E3LのN末端ドメインをZ-DNA結合ドメインZαADAR1で置換したワクシニアウイルス（ZαADAR1)；E3LのN末端ドメインをZ-DNA結合ドメインZαADAR1で置換した、およびZαADAR1構築物のアミノ酸186位におけるグルタミンをアラニンに変異させたワクシニアウイルス（Q186A)；E3LのN末端ドメインをZ-DNA結合ドメインZαADAR1で置換している、およびZαADAR1構築物のアミノ酸171位におけるグルタミン酸をアラニンに変異させているワクシニアウイルス（E171A)；またはE3LのN末端ドメインをZ-DNA結合ドメインZαADAR1で置換している、およびZαADAR1のアミノ酸169位のリシンをアラニンに変異させているワクシニアウイルス（K169A)を接種したマウスにおける経時的な（感染後日数)致死率（生存百分率）のグラフである。図５Ａに示す通り、K169A変異を含むウイルスを接種したマウスにおいて、病原性の明確な損失があった。100p.f.u.の脳内接種後、75％の動物が12日の実験期間を生存した。しかしながら、野生型ウイルス、ZαADAR1キメラウイルス、Q186A変異キメラウイルス、およびE171A変異キメラウイルスを接種したマウスは、接種後8または9日目までに全て死亡した。
【０１３５】
Z-DNA結合部位に近いが、実際はZ-DNAと相互作用しない残基を含む試験を次いで実行した。従って、ZαADAR1構築物におけるグルタミン186をアラニンに変異させた（Q186A)。このグルタミンはβシートのβ2鎖に位置し、そのためZ-DNA結合領域に近いが実際はかみ合わない。図５Ｂに示される通り、ZαADAR1におけるQ186A変異は速やかにB-DNAをZ-DNAに変換した。この変異体をキメラワクシニアウイルスの形でマウスに接種した場合、図５Ａに示される通り、この変異体は9日目までに全ての動物が死亡し、野生型（WT(ZE3L）ウイルスおよびZαADAR（ZαADAR1）置換キメラウイルスと同様の病原性であった。これらの実験は、Z-DNA結合を弱める変異は病原性もまた弱めるが、Z-DNA結合に影響を与えない変異は病原性にも影響を与えないことを示す。
【０１３６】
Z-DNAを結合しないタンパク質を変異させ、結果Z-DNAを結合し得る、別のタイプの実験を企画した。ADAR1のZβタンパク質ドメインはADAR1のZαと多くの配列類似性を有するが、Z-DNAには結合しない。図6Ｂに、Zβの存在におけるd(CG)6の円偏光二色性は経時的に一定のままであることを示す。Zβは、ZαにおけるY177と類似した位置で、チロシン残基の代わりにイソロイシン残基を有する（ZβADAR1I335)。イソロイシンをチロシンに変化させた変異体Zβポリペプチド（ZβADAR1I335Y）を作製した場合、ZβADAR1I335Yの存在下でd(CG)6がZ立体配座に部分的に変化する円偏光二色性アッセイによってアッセイすると、Z-DNAに結合した（図６Ｂ)。これに関連して、106プラーク形成単位において、E3Lタンパク質のN末端をZβADAR1I335Yで置換した修飾E3Lキメラウイルスは80％致死性であり、一方、E3Lタンパク質のN末端をZβADAR1I335で置換した修飾E3Lキメラウイルスは非致死性であった（図６Ａ)。これらの研究において、非Z-DNA結合タンパク質の弱いZ-DNA結合タンパク質への変換は、致死性の開始に関連していた。
【０１３７】
さらに、E3LのN末端における67アミノ酸を、タンパク質DLM-1のマウスZ-DNA結合ドメイン（Zα）由来の67アミノ酸で置換させたドメイン交換研究も実行した。このドメイン交換は、ドメイン中の12残基のみが変化しないままであるという結果を生じた。キメラDLM-1-E3Lウイルスでのマウスの接種は、完全に病原性の表現型を引き起こした。図７に示される通り、アミノ末端をマウスDLMのZαドメインで置換したE3Lタンパク質を含むワクシニアウイルス（ZαDLM1）でのマウスの接種は、野生型ワクシニア（WT(ZE3L))、およびアミノ末端をヒトADAR1のZαドメインで置換したE3Lタンパク質を含むワクシニアウイルス（ZαADAR1）の致死率と類似した致死率を生じた。
【０１３８】
ワクシニアE3LにおけるヒトZαADARまたはマウスZαDLMのドメイン交換を比較すると、2つの構築物のそれぞれにおいて約50アミノ酸が変化をうけている。これらの50アミノ酸はZ-DNA結合または疎水性コアに関連していない。病原性に重要なものは、ADAR1のヒト Zα（配列番号: 6)、DLMのヒト Zα（配列番号: 7)、ワクシニアウイルスのE3L（配列番号: 8)、痘瘡ウイルスのE3L（配列番号: 9)、オルフウイルスのE3L（配列番号: 10)、ランピースキンウイルスのE3L（配列番号: 11)、豚痘ウイルス のE3L（配列番号: 12)、ヤバ様疾患ウイルスのE3L（配列番号: 13)、牛痘ウイルス（Cowpox virus）のE3L（配列番号: 14)、およびヒトZβ（配列番号:15)、ならびに折りたたみを維持する疎水性残基のアミノ酸アライメントである、図８Ａに記載された一般的なZ-DNA結合残基と思われる。
【０１３９】
ZαADAR1-E3Lキメラウイルスおよび野生型ワクシニアウイルスE3L（ZE3L）の類似した位置における変異のインビボ影響を比較するため、実験を次に行った。ZαADAR1のチロシン177（Y177）と類似するE3Lのチロシン48（Y48）変異の影響をモニターするため、実験の第1セットを行った。キメラZαADAR1-E3Lを、チロシン177においてフェニルアラニンに次いでアラニンに変異させる用量応答実験は、チロシン48での野生型ZE3Lの変異における類似データと比較され得る（図９Ａ)。Y48F変異を含むワクシニアウイルスは、野生型ウイルスよりおよそ1ログ（log）少ない病原性であり、Y48A変異を含むウイルスはおよそ3ログ少ない病原性であり、キメラZαADAR-E3Lを含むウイルスにおけるチロシン177変異で得た結果と類似していた。従って、ZαADAR1-E3LおよびZE3Lを有する野生型E3Lにおけるチロシン変異について、インビボの生物学的影響は類似している。
【０１４０】
ワクシニアウイルスE3LのN末端ドメインにおける変異の影響を調べるため、またこれらの変異をE3L N末端ドメインをヒトZαADARで置換したキメラウイルスにおける変異と比較するために、追加実験を行った。これらの分子の両方は、β3鎖において2つのプロリン残基を有する。E3Lにおいて変異P63AおよびP64Aを作製し、ウイルスの頭蓋内接種後、その病原性を測定した。結果は図３Ａおよび３Ｂに示されているのと同様である。変異P63Aは、ADAR1キメラウイルスにおける変異P192Aで見出されたのと類似した、病原性の完全な損失を生じた（図９Ｂおよび９Ｃ)。一方、E3L変異P64Aは、P193A変異キメラウイルスで観察されるのと並行に、減少した病原性を生じるが、廃止は生じなかった（図９Ｂおよび９Ｃ)。
【０１４１】
他の2つのタイプの比較変異もまた行った。ZαADARにおけるアスパラギン N173は、Z-DNAとのいくつかの水素結合相互作用に関連している。ZαADAR-E3LキメラウイルスにおいてN173をアデニンに変異させた場合、マウスに接種した場合病原性の著しい損失があった。同様に、E3Lウイルスにおいて変異N44Aを作製した場合、病原性のさらに大きい損失があった。これらの機能的結果は、ヒトZαADARで見られるのと類似の様式で、ワクシニアウイルスE3LのN末端ドメインが幾折りたたまれるという解釈を補強する。E3Lウイルスにおける選択された変異は、Z-DNA結合に影響を与え、ZαADARキメラE3Lウイルスで見られるのに匹敵する病原性の損失を引き起こす。
【０１４２】
上記の追加実験は、Z-DNAへのワクシニアウイルスE3Lの結合は、ウイルス感染における病原性機構の不可欠な特徴であるという解釈を強める。本明細書中に記載された結果、ならびに図８Ａに示された痘瘡ウイルスおよびワクシニアウイルスのE3L N末端ドメインの近い同一性を考慮すると、痘瘡E3LのZ-DNAへの結合を阻害する低分子は、おそらくウイルスの病原性に干渉する。
【０１４３】
核におけるE3Lの役割は公知でないが、核において一旦、E3L分子は活発に転写している遺伝子の転写開始部位近辺を形成するZ-DNAセグメントに結合し得る。C末端ドメインは次いで、その遺伝子のpre-mRNAにおいて形成された一過性ヘアピンまたは二本鎖セグメントを結合し得る。mRNAおよびDNA両方の結合は、おそらく遺伝子の転写を阻害する。従ってインターフェロン誘導遺伝子を上昇調節することによって感染に応答するための、細胞の能力の欠陥があり得る。
【０１４４】
従って、Z-DNA結合リガンドまたはバリアント、およびZ-DNA間の相互作用または複合体形成を阻害する因子は、Z-DNA結合リガンドまたはバリアントのZ-DNAへの結合により生じる病原性効力の阻害に有用である。このようなインヒビターは、感染性因子、例えばウイルス、に感染している患者を治療するために使用され得る。
【０１４５】
実施例３: 酵母ワンハイブリッドシステムを使用したZ-DNA結合タンパク質の検出
酵母ワンハイブリッドシステム は、特異的なDNA配列に結合するタンパク質を同定するための手段として使用されている（Allenら, Trends Biochem. Sci., 20:511-6, 1995；Liuら, Methods, 5:125-37, 1993)。レポーター遺伝子の上流活性化配列（UAS）をベイト（bait）配列で置換し、DNA結合タンパク質を次いで、転写活性化ドメインとの融合タンパク質として酵母細胞内で発現させる。従って、活性化ドメインに融合したDNA結合タンパク質がベイトDNA配列と相互作用する場合、転写は活性化される。このシステムはZ-DNA形状とのDNA立体配座特異性を含むよう拡張されている。このアッセイは、インビボでのZ-DNA特異的結合タンパク質の同定および特徴づけ、ならびに転写活性におけるZ-DNA形状の影響の研究を可能にする。
【０１４６】
本明細書中に記載された通り、二重d(CGCGCG）の単結晶X線解析において明らかにされた通り、Z-DNAはダブルヘリックスの左旋性形状である（Wangら, Nature, 282:680-686, 1979)。Z-DNAにおけるワトソン−クリック塩基対はB-DNAにおけるその配向と比較して「ひっくり返って」おり、syn立体配座をとるグアニン残基を生じ、一方シトシン残基はアンチ立体配座のままである。プリンはピリミジンより、容易にsyn立体配座をとることから、Z-DNAはプリンおよびピリミジンを交互に有する配列が好ましい。多くの他の配列もまたZ立体配座をとり得るが、最も好ましい配列は(dC-dG)nからなる（Richら、Annu. Rev. Biochem, 53:791-846, 1984)。
【０１４７】
Z-DNAは右旋性のB-DNAよりも高いエネルギー立体配座であり、Z-DNAが負のスーパーコイルにより安定化されることが発見された時、この型の変換はインビボで起こり得ることが理解された（Peckら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4560-4564, 1982)。Z-DNAの形成は負のスーパーコイルを除去し、スーパーコイルのエネルギーはZ立体配座を安定させる。RNAポリメラーゼの動きが、その後の負のねじれ鎖を生成すること（LiuおよびWang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7024-7027, 1987）、およびプロモーター領域に近いZ-DNA配列は遺伝子が活発に転写される範囲内で哺乳動物核において左旋性立体配座に維持される（Wittigら, EMBO J., 11:4653-4663, 1992）ことが示されている。さらに、Z-DNAを容易に形成する配列は転写開始部位の近くにおいて高い頻度で存在する（Schrothら, J. Biol. Chem., 267:11846-11855, 1992)。酵母ワンハイブリッドシステム が組織され、そのためプロモーターに近いZ-DNA形成の転写における影響を測定し得る。Z-DNAはまた、特異的なZ-DNA結合タンパク質により安定化され得、いくつかは本明細書中に記載された研究に含まれている。本明細書中に記載された通り、編集酵素二本鎖RNAアデノシンデアミナーゼ（ADAR1）由来のタンパク質ドメインhZαADARは同定されており、Z-DNAに結合することが見出されている。hZαADARが、中心にZ-DNA形成配列を有するDNAに加えられる場合、それがB-DNAに囲まれている場合においても、配列に結合する（Kimら, J. Biol. Chem., 275:26828-26833, 2000)。マウス腫瘍関連タンパク質DLMもまた、Zαドメインを介してZ-DNAに結合することが公知であり、このようなZ-DNA結合タンパク質のファミリーがあることを示している。このファミリーの別のメンバーは、本明細書中に記載された通り、ワクシニアウイルスE3L（vZE3L）のN末端ドメインである。hZαADARおよびmZαDLMはZ-DNAに堅くおよび特異的に結合することが公知であるが、vZE3Lはインビトロでより少ない活性である。しかしながら、本明細書中に記載された立体配座特異的な酵母ワンハイブリッドシステムにおいてインビボで使用した場合、これら3つ全てのタンパク質はZ-DNAに結合する。これらのZ-DNA結合タンパク質に加えて多数の遺伝子工学で作製したバリアントを研究することにより、これらのタンパク質が転写を増大するのに関連することが実証され得る。
【０１４８】
材料および方法
酵母株およびレポータープラスミドの構築
酵母株YM4271をClontech（Palo Alto, CA）から購入し（Wilsonら、Science, 252;1296-1300, 1991)、本明細書中に記載された全ての酵母実験のために使用した。ベクター構築物を、MATCHMAKER酵母ハイブリッドシステム（Clontech, Palo Alto, CA）において使用されたベクターから修正した。レポーターベクターを、鋳型としてpLacZiベクターを使用して構築し、発現ベクターをpACT2またはpGAD-GH（Clontech, Palo Alto, CA）のいずれかを使用して構築した。
【０１４９】
標的配列を、二本鎖DNAオリゴマーを使用してレポーターベクターに挿入した。オリゴヌクレオチド配列は、5'-CCGAATTCGTCGGT(CG)nACCGACCTCGAGTCTAGAGC-3'（配列番号:22〜26）および5'-GCTCTAGACTCGAGGTCGGT(CG)nACCGACGAATTCGG -3'（配列番号: 27〜31)、(式中、nは対照については0、またはn=4、5、9もしくは12である）であった。オリゴヌクレオチドの各対を、二本鎖DNAを形成するためにアニールし、次いでpLacZiベースのベクターについて、適切な制限酵素、EcoRIおよびXhoIで消化した。DNAを精製し、類似の制限酵素の対を用いて消化したレポーターベクターDNAに連結した。
【０１５０】
pLacZcOp-対照またはpLacZcOp-(dC-dG)n（式中、nは4、5、9、および12である）と呼ばれるLacZ遺伝子レポーターベクターは、酵母における自己増殖のためのセントロメアエレメントを有する。これは、pLacZiベクターのURA3遺伝子およびAmpr遺伝子の間に、pRS313由来のDNA断片を含むPCR増幅CEN6/ARSH4を挿入することによって作製された。最終的に、それぞれの標的配列（対照、または（dC-dG)n）をLacZレポーター遺伝子の上流EcoRIおよびXhoI部位に挿入した。結果生じた、標的配列挿入物を有するpLacZcOpベクターを、pLacZcOp-対照およびpLacZcOp-(dC-dG)nと命名した。挿入標的配列を、ジデオキシ配列決定により確認した。
【０１５１】
pLacZcSmベクターを構築するため、プロモーターおよびターミネーターを含む完全なURA3転写ユニットを、プライマー5'-CGGAATTCAGCACGCCATAGTGACTGG-3'（配列番号: 32）および5'-GACTAGCTAGCTCAAGCTTTTCAATTCATCATTT-3'（配列番号: 33）を用いてpLacZcOpからPCR増幅した。増幅したDNAを次いで、存在するURA3遺伝子を置換させるため、pLacZcOpにクローン化させた。生じたプラスミド、pLacZcSm、はURA3遺伝子およびLacZ遺伝子の両方において転写の同方向性を有した。標的配列を次いで、pLacZcOp-対照または（dC-dG)nに由来する断片と共に、pLacZcSmに導入した。
【０１５２】
活性化ドメイン（AD）融合を有するまたは有さないZ-DNA結合タンパク質のための酵母発現ベクターの構築
Zαモチーフタンパク質の遺伝子断片を、pET28a（Novagen, Madison, WI）細菌性発現ベクター構築物より調製した。使用した断片は、Schwartzら（J.Biol. Chem., 274:2899-28906, 1999）により記載された通り、ヒトADAR1（GenBankアクセッション番号: U18121）由来のhZαADAR（aa 133〜209）およびhZabADAR（aa 133〜368）であった。遺伝子工学により作製されたZαモチーフ、hZaaADAR、および変異体、hZa'bADAR（hZabADARにおけるI172FおよびN173A)、は先に記載された通り（Kimら, J. Biol. Chem., 275:26828-26833, 2000, およびKimら, J. Biol. Chem., 274:19081-19086, 1999）であった。mZDLM（aa 8〜70）はSchwartzら（Nat. Struct. Biol., 8:761-765, 2001）により先に記載されたマウスDLM-1（GenBankアクセッション番号: AF136520）由来であった。さらに、以下の構築物をこの研究のために作製した: hZβADAR（aa 294〜368）および変異体、hZαN173A（hZαADARにおけるN173A）はヒトADAR1由来であり、vZE3L（aa 1〜78）はワクシニアウイルスE3L（GenBankアクセッション番号: S64006）由来であった。NcoIおよびXhoI消化断片を、NcoIおよびXhoI部位においてpACT2に挿入した。生じたベクターは、酵母においてN末端にGal4活性化ドメイン（AD）を有する融合タンパク質を産生した。N末端SV40 T抗原核局在シグナル（NLS）がADのN末端に位置するため、この融合タンパク質は核に入り得る。
【０１５３】
酵母においてAD無しにタンパク質を産生するベクターを構築するため、pGAD-GH（Clontech, Palo Alto, CA）から、KpnI消化によりGal4活性化ドメインを欠失させた。しかしながら生じたベクターはなお、核に入るためのNLSを含んだ。KpnI部位にNcoIおよびXhoI部位を含むリンカーを挿入することにより、酵母において所望のタンパク質遺伝子をクローニングするため、pGNAと呼ばれるベクターを創造した。
【０１５４】
定量的および定性的β-ガラクトシダーゼ活性アッセイを有する酵母ワンハイブリッド分析
酵母株YM4271を、他に記載された（Gietzら, Yeast, 11:355-360, 1995）リチウム酢酸ポリエチレングリコール方法を使用して、LacZレポーターベクター（pLacZcOpまたはpLacZcSmのいずれか）で形質転換させた。o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトース（ONPG）アッセイを、製品使用説明書（Clontech, Palo Alto, CA）に従い、β-ガラクトシダーゼ活性の定量的アッセイのために使用した。平均および標準偏差を、1ユニットが1細胞あたり1分間に1μmolのo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ（ONPG）を加水分解する、Miller β-ガラクトシダーゼユニットにおける3つのものより計算した。
【０１５５】
X-galを有するプレートを使用したβ-ガラクトシダーゼの比色分析アッセイについて、選択プレート上の新たに形質転換された酵母細胞を採取し、80μg/ml X-galならびにウラシルおよびロイシンを欠く選択培養液を含む新しいプレート上に画線した。30℃でインキュベート後、LacZレポーター遺伝子からβ-ガラクトシダーゼが産生された場合は、青色が発生した。pGNAベースのベクターで形質転換された細胞は、pACT2ベースのベクター細胞（1〜2日）よりも色を発生するのに時間がかかる（2〜3日)。
【０１５６】
B-Z中間点アッセイ
poly(dG-dC)(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を購入し、トリスバッファー（10 mM Tris-Cl, pH 7.4, および50 mM NaCl）で再水和し、使用する前に-20℃で保存した。NaCl（PohlおよびJovin, J. Mol. Biol., 67:375-396, 1972）およびコバルトヘキサアミン（Co(NH3)63+)(BeheおよびFelsenfeld, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1619-23, 1981）を含む種々の塩を用いて円偏光二色性（CD）によりモニターしながら、poly(dG-dC）をZ立体配座に推進し得る。水溶液中で大部分をZ-DNAに変換するためには、NaClは高い濃度（2Mより高い）を必要とする。従って、B-Z平衡の中間点を生成するため高い濃度のNaCl（2.5 M）を使用し、これは挿入する低分子の立体配座結合特異性を試験するためにも使用している（Quら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12032-12037, 2000)。しかしながら、この水溶液はタンパク質のDNA結合を試験するために適切ではなかった。コバルトヘキサアミンは非常に低い濃度でのZ-DNAの安定化においてより強力であるため、この目的のためより適切である。従って、poly(dG-dC）におけるB-Z平衡混合物を創造するため、コバルトヘキサアミンを使用した。端的に言えば、40μg/mlの濃度のDNAを、70〜80μMコバルトヘキサアミン（Sigma, St.Louis, MO）と25℃で一晩インキュベートした。CDスペクトルによって測定されたB-Z平衡における約1:1の割合は感度のよいアッセイのために所望された。これは塩濃度の小さい変化に非常に感受性があったため、コバルトヘキサアミンの異なる濃度を有する複数試料を通常調製し、所望のB-Z平衡を有する試料をこのアッセイのために次いで使用した。AVIVモデル202 CD 機器 を使用して25℃でCDスペクトルを得た。40μg/mlまたは60μM（塩基対）のDNAを使用し、2 mm石英セルにおいて25℃で測定を行った。波長走査についてのスペクトルを、3秒にわたり平均した1 nm間隔で記録した。60μM のタンパク質を次いで濃縮ストック溶液から試料に加えた。試料に加えられたタンパク質の最大容量は、全容量の5％を超えなかった。反応速度測定のために、292 nmにおけるCDシグナル変化を1秒間隔で記録した。
【０１５７】
結果
負のスーパーコイルにより安定化されたZ-DNAを含むように設計されたレポーターベクター構築物
Z-DNA形成およびその結合タンパク質の役割を研究するために酵母ワンハイブリッドシステムを修正する目的で、交互のdC-dG伸張を含むレポーターベクターを構築した（図１０Ａおよび１０Ｂ)。交互のdC-dGはZ-DNAを形成する最も高い傾向を有する配列であり、短い反復でも、スーパーコイルプラスミド内のZ立体配座において安定である（Kimら. J. Biol. Chem., 271:9340-9346, 1996)。DNA鋳型からのRNAの転写は、移動するRNAポリメラーゼの後に負のスーパーコイルを生成することが示されている（LiuおよびWang, 前出)。負のスーパーコイルは適切な配列においてZ-DNAを安定化させ（Peckら, 前出)、従って活性化プロモーターの上流の（dC-dG）セグメントはZ立体配座に変換される。このメカニズムは、(dC-dG）配列を、上流のCYC1最小プロモーターを有するレポーター遺伝子LacZ遺伝子、およびそのプロモーターの逆の方向性を有する構造的発現URA3遺伝子の間に置くことによって利用される（図１０Ａ, pLacZcOp-(dC-dG)n(Op))。URA3の安定した転写は、従って（dC-dG)n のZ-DNAへの変換を生じる。図１０Ａに図式的に示された通り、ヒトADAR1（hZαADAR）のZαドメインまたは活性化ドメイン（AD）に融合した他のZ-DNA結合タンパク質の結合は、LacZの転写の活性化を生じるはずである。βガラクトシダーゼ、LacZ遺伝子産物の産生は、ONPGアッセイにより定量され得る。LacZ遺伝子の発現もまたURA3およびLacZ間の領域の負の超らせん性を増大させ、それによりZ-DNA形成が増すため、このシステムの感受性は増大するようである。
【０１５８】
図１０Ｂに示された更なるプラスミド、pLAcZcSm-(dC-dG)n(Sm）を、結合のZ-DNA特異性を評価するため対照として構築した。RNAポリメラーゼによるURA3遺伝子の転写から生成された正のスーパーコイルは（dC-dG)n 配列におけるZ-DNA形成のために好ましくない環境を産む。(dC-dG)n 配列のB立体配座に特異的なタンパク質は、Z-DNA形成がそれらの配列特異的結合を抑制するかどうかに依存して、Opと同様にまたはよりよくSmを結合する。対照的に、Z-DNA結合タンパク質は、独立してZ-DNAを安定化するZ-DNA結合タンパク質の能力に依存してSmに結合し、Op配向において優先的に結合する。
【０１５９】
交互のdC-dG配列の長さは、これらの実験の結果に影響し得る。Z-DNA形成およびタンパク質結合の両方について最適のサイズがある。Opプラスミドを、（a）単独で、または(b）活性化ドメインのみを発現するプラスミド（pACT2）と共に、または（c）hZαADARに付着した活性化ドメインを発現するプラスミドと共に、酵母にトランスフェクトした。図１１Ａは、活性化ドメインに付着したZαの存在下で、dC-dG反復の数の増加と共にβ-ガラクトシダーゼ活性の量がほぼ直線的に増加したことを示す。hZαADARの非存在において、pACT2有または無しのいずれかで反復の数が5未満であった場合、最小の酵素活性しかなかった。より高い反復数では、活性化ドメインの非存在下でも、わずかな活性の増加があった。これはプロモーターに近いZ-DNAの形成はそれ自体がエンハンサーとして機能し得ることを示唆する。この所見を更に調査し、後に検討する。
【０１６０】
Opと同様Smプラスミドにおいて、hZαADARの存在下でβ-ガラクトシダーゼを誘導した（図11B)。Smにおけるこの誘導は、高いアフィニティーhZαADARはB-DNA環境内でもdC-dG反復においてZ立体配座を安定化させるために充分であるという事実を反映すると思われる（Kimら, J. Biol. Chem., 275:26828-26833, 2000)。誘導は高い反復数においておよそ類似したが、短い長さにおいて顕著な差があった。Opは、プラスミドを含む（dC-dG)4 における劇的な誘導を示し、一方Smは（dC-dG)9 より穏やかな酵素活性のみを有した。(dC-dG)4および(dC-dG)5を含むプラスミドは、hZαADAR: DNAの結晶構造に基づくと、各鎖あたり単一のhZαADAR結合部位のみを含んだ（Schwartzら, Science, 284:1841-1845, 1999)。これはスーパーコイルの非存在下でZ-DNAを安定化させるために充分ではあり得ない。より長い反復は、スーパーコイルの非存在下においてでも、Z-DNAを安定化させるために共に作用し得る複数の結合部位を含む。同様の現象を、過剰のhZαADARの存在下で、複数のZβ結合部位を含む配列におけるZ-DNA特異的ヌクレアーゼによる切断の増大によって、インビトロで実証した（Kimら, J. Biol. Chem., 275;26828-26833, 2000)。
【０１６１】
hZβADARはZ-DNAを結合しない
hZαADARはそれ自体で安定なタンパク質ドメインであるが、ヒトADAR1のN末端の部分的タンパク質分解は、それがhZabADARと呼ばれる、より大きなドメインに含まれることを示す（Schwartzら, 1999a)。このドメインは、hZαADAR、ならびに配列について密接に関連した第2の領域、hZβADARからなる。さらに、ヒトにおいて縦列に2重化された介在リンカーが存在する。hZabADARによるZ-DNAのインビトロ結合は、hZαADARのものと類似しているが、同一ではない（Schwartzら, J. Biol. Chem., 274:2899-2906, 1999)。hZβADARは配列においてhZαADARに非常に類似しているが、インビトロでhZβADARによるZ-DNAの結合を示すことは可能ではない。
【０１６２】
多数の構築物が、hZabADARのDNAへの結合、および2つの関連サブドメインの役割を調べるために設計されている。hZa'bADARにおいて、hZabADARにおける二重変異体（I172FおよびN173A)(Kimら, 2000）は、Z-DNAを結合するためのその能力を実質的に廃止する。従って、hZa'bADARはインビトロで検出可能にZ-DNAを結合しない（Kimら, J. Biol. Chem., 275:26828-26833, 2000)。hZaaADARはhZabADARにおいてhZβADARを置換する第2のhZαADARモチーフを含む構築物である（Kimら, J. Biol. Chem., 274:19081-19086, 1999)。hZaaADARはhZαADARまたはhZabADARのいずれかより高いアフィニティーでZ-DNAを結合する。
【０１６３】
これらの様々なペプチドによるZ-DNAのインビボ結合の試験は、インビトロの結果とよく一致した（図１２)。図１２は、交互の（dC-dG）長の変化の存在下で、様々なペプチドによるLacZ遺伝子の活性化を示す。hZαADARおよびhZa'bADARは、pACT2対照を超える活性化の顕著な増加を示さなかった、一方hZαADAR、hZabADAR、およびhZaaADARは全てLacZ遺伝子の活性化を引き起こした。レポーター構築物が、(dC-dG）の4または5のみの反復を含んだ場合、これらのタンパク質の3つ全ては同様にふるまった。より長い反復では、hZabADARはhZαADARと類似した様式でLacZを活性化させ、一方hZaaADARは劇的に向上した。hZaaADARにおいて、hZαADARの2つのコピーが互いに隣に位置した場合、協力的に作用し、活性化の高いレベルを生じると思われる。
【０１６４】
dC-dGの4つの反復を含むレポーターベクターOpおよびSmをX-galプレート上で比較した場合、分岐プロモーター（Op）を有するZ-DNA結合ドメイン、hZαADARまたはhZaaADARいずれかの存在が、大部分のβ-ガラクトシダーゼ活性を産生することが明らかであった。先に図１１Ｂにおいて示した通り、安定した負の超らせん性（Sm）の非存在においてでも、hZαADARおよびhZabADARはいくらかの刺激効果を有した。hZβADARの存在は効果が無く、hZβADARはプロモーター領域に結合しないことを示した。hZβADARの存在下でのβ-ガラクトシダーゼ活性のレベルは、活性化ドメイン単独と同じであった。これはインビトロの結果と一致して、hZβADARはインビボでZ-DNAを結合しないことを示す。
【０１６５】
mZαDLMおよびvZE3LはインビボでZ-DNAを結合する
hZαADARに顕著な類似性を有する配列が、多数の脊椎動物タンパク質において見出されている（Herbertら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:8421-8426, 1997；Schwartzら, Nat. Struct. Biol., 8:761-65, 2001)。これらの2つ、mZαDLMおよびvZE3Lは、インビトロにおけるZ-DNA結合のために研究されている。mZαDLMは、初めに腫瘍関連インターフェロン誘導性タンパク質として同定されたマウスDLM-1のN末端に位置する（Fuら, Gene, 240:157-163, 1999)。DLM-1はADAR1に類似する2つのモチーフ、ZαおよびZβを有する（Schwartzら, 2001, 前出)。mZαDLMはインビトロで、Z-DNAを堅くおよび特異的に結合する。Z-DNAとのその結晶構造は解明されており、hZαADAR-Z-DNA複合体に非常に類似である（Schwartzら, 2001, 前出)。ZE3Lはワクシニアウイルス由来のEL3タンパク質のN末端に位置し、インビトロでのZ-DNA結合において非常に少ない効力を有する。しかしながら、これらのペプチドを酵母ワンハイブリッドアッセイにおいて試験した場合、両方がZ-DNA結合において効果的である（図１３)。vZE3LおよびmZαDLMは、定量的（図１３）および定性的アッセイの両方において、インビボでhZαADARとほぼ同一にふるまった。これは、同じアフィニティーを有する、hZαADARおよびmZαDLMはZ-DNAを結合した一方、vZE3Lは不充分に結合したインビトロでの研究（Schwartzら, 2001, 前出）と対照的であった。インビボおよびインビトロでの異なる結果は、これらのドメインの安定性または折りたたみを変更し得る他のタンパク質の結合または存在の局所環境における差異を反映すると考え得る。
【０１６６】
遺伝子工学により作製されたバリアントにおいて、hZαADARおよびZ-DNA間の1つの直接接触および2つの水媒介接触を除去した変異（N173A）を有するhZαN173Aを作製した（Schwartzら, J. Biol. Chem., 274:2899-2906, 1999)。この変異（hZαN173A）は、図１３に示す通り、インビトロ（Schadeら, EMBO J., 18:470-479, 1999）およびインビボでのZ-DNA結合を抑制した。vZE3Lを除外して、定量的アッセイ（図１３）およびX-galプレート上の両方において示された結果は、インビボでのZ-DNA結合活性がインビトロで実証されたものと平行であることを確認する。
【０１６７】
実施例４: 平衡中間点アッセイにおける、インビトロでのZ-DNAへのvZE3L結合の検出
vZE3LがZ-DNA結合タンパク質であったという初期のインビトロ証拠は弱くなっている。配列については、それはhZαADARおよびmZαDLMに非常に類似している。しかしながら、hZαADARおよびmZαDLMとは異なり、vZE3Lは（dC-dG)6 のCDスペクトルをB-形状からZ-形状に変換せず、ゲル移動度シフトにおいて、弱い結合およびスミアを引き起こす。同様に、hZβADARは（dC-dG)6 をBからZ立体配座に変動させることによりCDスペクトルを変化せず、ゲル移動度シフトアッセイにおいてZ-DNA結合活性を示さない。しかしながら、本明細書中に記載された酵母ワンハイブリッドアッセイにより提供されたインビボでのvZE3LのZ-DNA結合活性についての強い証拠は、Z-DNA結合のための新しい、およびより感度の良いインビトロアッセイの発展を促す。このアッセイにおいて、コバルトヘキサアミン（BeheおよびFelsenfeld, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1619-1623, 1981）は、円偏光二色性（CD）により評価した場合、DNAがおよそ1:1の割合においてB-形状およびZ-形状の混合物である濃度で（dC-dG)6 に加えられる。タンパク質の添加は、(a）影響がない、または（b）平衡をB立体配座に向って推進する、もしくは（c）Z立体配座に向って推進する。タンパク質がZ-DNAに優先的に結合する場合、Z-DNAはタンパク質およびコバルトヘキサアミンの両方により安定化されるため、水溶液中のDNAの全体の平衡は、Z-DNAに向って推進される。B-DNA結合タンパク質については、平衡は逆の方向に推進される。図１４はこれらの影響のそれぞれの例を示す。インビボ結果の確証において、vZE3Lは平衡をZ立体配座に向って推進する。上記の通り、hZβADARはインビボではZ-DNA結合タンパク質ではない。従来のCDアッセイにおいては、B-Z平衡は移動せず、ゲル移動度シフトアッセイにおいてもまたZ-DNA結合活性を示さない。平衡中間点アッセイにおいては、しかしながらhZβADARは平衡をB立体配座に向って推進し、これはZ-DNA結合タンパク質ではなく、むしろ弱いB-DNA結合タンパク質であることを示唆している。hZβADARおよびvZE3Lに加えて、ヒトヒストン1（hH1）およびヒトPbxホメオドメインを含むいくつかの周知B-DNA結合タンパク質を試験した。結果は、予測された通り、このアッセイにおいてそれらがB-DNA結合タンパク質であることを示した。hH1（ヘリックス3前のN末端半分）の一部およびhZαADAR（認識ヘリックス3からのC末端半分）の一部を含むキメラタンパク質は、スペクトルにおいてZまたはB立体配座いずれに向う移動も示さず、CD実験においてZ-DNA結合を示さないという事実と一致する。従ってインビボおよびこれらのインビトロ結果の間には完全な一致がある。これらの方法は共に、立体配座特異的結合の研究のためのアッセイを提供する。
【０１６８】
プロモーター領域に近いZαにより安定化されたZ-DNA形成はエンハンサーエレメントとして作用する
Liuら（Cell, 106:309-318, 2001）は、プロモーターの近くに存在するZ-DNAは、プロモーターにおける調節効果を有し得ることを示唆している。さらに、Z-DNA形成配列は、転写開始部位の近くによくある（Schrothら, J. Biol. Chem., 267:11846-11855, 1992)。上記の結果は、本明細書中に記載したシステムが、この効果を検出するために修正され得ることを示唆する。hZαADARはインビボでZ-DNAの形成を刺激するための手段として利用されている。活性化ドメインを有さないhZαADARを、本明細書中に記載されたOpまたはSmレポーター構築物を含む酵母細胞において発現させた。Z-DNA自体の存在がすぐ近くのプロモーターの転写において効果を有する場合を除き、活性化ドメインの非存在下において、hZαADARはプロモーターとの相互作用によりβ-ガラクトシダーゼ発現を活性化し得ない。hZαADARまたはhZaaADARのいずれかを発現する異なるレポーター構築物からの結果の比較は、Z-DNA形成の増加がレポーター遺伝子発現に比例することを示した（図１５)。hZαADAR発現の非存在下で、(dC-dG）のより長い反復は、本明細書中に示された通り、わずかに多いβ-ガラクトシダーゼ発現をもたらした。しかしながら、(dC-dG）のより長い反復に伴うこの増加した転写のレベルは、Z-DNA形成を促進させることが公知であるhZαADARの発現により大きく増幅された（図１５)。この効果は、組換えpGNA、pGNA-Zβ、pGNA-Zα、およびpGNA-ZaaならびにpLacZcOp-(dC-dG)n またはpLacZcSm-(dC-dG)n（式中、n=5）で酵母細胞を形質転換し、X-gal、β-ガラクトシダーゼ基質を含む選択培養液上に細胞をプレーティングすることにより評価する場合、Z-DNA形成に好ましくない環境においてさらに劇的である。(dC-dG)5 については、Z-DNA形成がOp鋳型におけるhZαADARまたはhZaaADARにより誘導された場合のみ、LacZレポーター遺伝子の活性化を示した。しかしながら、この実験を（dC-dG）のより長い伸長で反復した（ws）場合、(dC-dG)9 はより多くのhZαADARの結合部位を提供し、その結果正のスーパーコイルがSmプラスミドにおけるURA3プロモーターから産生された場合でさえ、Z-DNAは容易に形成された。従って、hZαADARによるZ-DNAの誘導はレポーター遺伝子転写の活性化の原因である。同様の効果がhZabADARについて見られた。
【０１６９】
実施例５: Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントおよびZ-DNA間の複合体形成のインヒビターを使用する他の疾患の治療
天然痘を引き起こす因子である痘瘡ウイルスは、ワクシニアウイルスのE3Lと高いアミノ酸配列同一性を有し、ワクシニアE3Lとはアミノ末端ドメイン（Z-DNA結合ドメイン）における限られた数のアミノ酸（比較においてどの株が使用されるかに依存し、そのどれもZ-DNA結合において関係していない)、例えば約3〜5アミノ酸について相違する、E3Lタンパク質を有する。特に、Z-DNAに接触するワクシニアウイルスE3Lのアミノ末端ドメイン（Z-DNA結合ドメイン）におけるアミノ酸残基は、密接に関連した痘瘡ウイルスE3Lのそれらと同一である。例えば、痘瘡ウイルスのZ-DNA結合ドメインは、ワクシニアにおいてZ-DNA結合のために重要であることが公知な9アミノ酸残基全てを共有する。さらに、オルフウイルス（図１Ｃ)、エクトロメリアウイルス（GenBankアクセッション番号: AJ312294.1)、マウス痘ウイルス、ヤバ様疾患ウイルス（図1Ｄ)、牛痘ウイルス（GenBankアクセッション番号: AJ312293.1)、粘液腫ウイルス（GenBankアクセッション番号: NC001132)、ランピースキン疾患ウイルス（GenBankアクセッション番号: NC003027.1)、猿痘ウイルス（GenBankアクセッション番号: AF380138.1）およびウサギ線維腫ウイルス（GenBankアクセッション番号: NC001266）もまた、E3LまたはZ-DNA結合ドメインとの高い配列同一性を含む、ワクシニアE3Lと高いアミノ酸配列同一性を有するE3L様タンパク質を含む。ADAR1のヒトZα、DLMのヒトZα、ワクシニアウイルスのE3L、痘瘡ウイルスのE3L、オルフウイルスのE3L、およびヤバ様疾患ウイルスのE3Lのアミノ酸配列アライメントを図８Ａに示す。これらのアミノ酸配列はタンパク質の翼のある（winged）ヘリックス立体配座を安定化させるために必要である疎水性残基（図８Ａ中、三角で示す）ならびにZ-DNA認識のために重要であると見出された特異的残基（図８Ａ中、円で示す）を有する。さらに図８Ａに示された通り、Z-DNA結合部位から除去される2つのタンパク質間で異なるアミノ酸残基はほとんど無く、ワクシニアウイルスおよび痘瘡ウイルスのE3L配列は高く相同である。
【０１７０】
これらのアミノ酸-Z-DNA相互作用をまた、図８Ｂに示す。図８ＢはZ-DNAに結合したADAR1のZαサブユニットの共結晶構造の図解説明である。この分子の図は、左方にある認識ヘリックスを見下ろして示される。Z-DNAに結合したDLMのZαサブユニットの共結晶構造は解明されており、Z-DNAと相互作用するDLMの領域は同定されている。
【０１７１】
実施例６: Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントおよびZ-DNA間の複合体の形成のインヒビターの同定
Zα（編集酵素ADAR1由来）またはDLM（両方Z-DNAに結合される）いずれかに対するZ-DNAの結合の近年のX線回折研究は、互いに2つの構造の類似性を説明する（Schwartzら, Science, 前出；およびSchwartzら, Nature Structural Biology, 8:761-765, 2001)。ポックスウイルス由来のE3L分子の配列の比較は、これがタンパク質の同じファミリーにあることを示す。これらのタンパク質全ては、それらの構造および活性に不可欠である2つの一定の特徴を有する。折りたたみモチーフはβ-シート翼が付着したヘリックス-ターン-ヘリックスである。ヘリックス-ターン-ヘリックスドメインの折りたたみは、それらの相互作用を介して折りたたみ立体配座において分子を支える疎水性アミノ酸のコアにより維持される。これらの残基はZ-DNA結合タンパク質のこのクラスの全てのメンバーにおいて相同であり、分子の全体の形状を提供する。
【０１７２】
分子の表面上の残基の第2のクラスは、Z-DNAを認識および結合するために不可欠である。これらの残基は通常同一であるが、いくつかの場合において、それらは類似した残基である。(「類似した」残基は、例えば、アルギニン残基を置換しているリシン残基またはその逆を含み得る。これらの残基の両方は、やや類似した側鎖を有し、正に荷電している。）ワクシニア（もしくは痘瘡、または他のE3L）についてのE3L分子のモデルを作製するために、E3Lにおけるアミノ酸で、ADAR1のZαにおける類似の残基を置換した。同一残基を同一に維持し、類似残基を同じ立体配座に置いた。隣接した側鎖とのファンデルワールス接触を最小限にし、その方法において分子の最も低いエネルギー立体配座を得るため、側鎖の小さい動きを可能にさせるエネルギー最小化の周知技術を行うことによって、最終的な立体配座を得た。分子の立体配座におけるこの変化は、Zαを有するE3Lと比較する場合、さほど大きくない。
【０１７３】
図２Ａは全ての残基のアウトラインを示す分子のファンデルワールス表面を示し、その上に重ね合わせたものは複合体の結晶構造に見られるようなZ-DNAの球棒ダイアグラムである。Z-DNA認識に関連するそれらの残基は、関連した側鎖の立体配座を示す棒ダイアグラムで、黒で縁取られている。Z-DNA結合残基と関連したダークグレーの領域は、それから伸びている2つのブロック間のライトグレーの細長い部分を有する別の狭いブロックと共に、1つの大きなブロックを形成することを理解し得る。これは表面下に押し下げられる分子のセグメントであり、そのためダークグレーの残基はZ-DNAに結合し得る高いレベルにあり、それに対して、この中心領域におけるライトグレーの残基は、さらに表面より離れ、わずかな裂け目を作っている。
【０１７４】
Z-DNAの非存在下での、水溶液におけるADAR1のZαの構造の水溶液NMR研究を行った（Schadeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:12465-12470, 1999)。この研究における特有の目的は、Z-DNA認識に関連する側鎖の立体配座を決定することであった。発見されたことは、水溶液中で側鎖は、それらが複合体の結晶構造中にあるのと同様の立体配座で、Z-DNAの認識のため前もって配置されることである。この観察の唯一の例外は、いくらかの環のゆらぎ回旋を示すチロシン残基（Y177）である。しかしながら、大部分の残基が前もって配置されるという事実は、低分子などのインヒビターがE3L分子の活性を阻害する目的で付着し得る結合表面の良い評価を生じ得ることを示唆する。これは認識残基の側鎖が共に見出される、棒状形式で描かれた図２Bに示される。結合部位、オングストロームでの距離数を、電子陰性原子について示す。総距離は、この部位に結合するために低分子などのインヒビターの標的として使用され得る200平方Åを越す領域であることを知り得る。例えば、この構造は、E3LのZ-DNAへの結合を阻害するであろう低分子を探すためのハイスループットスクリーニングを行うために使用され得る。
【０１７５】
本明細書中に記載された結果およびオルトポックスウイルスのE3L N末端ドメイン間のアミノ酸配列類似性、ならびに、特にワクシニアおよび痘瘡E3L分子の近い同一性を考慮すれば、Z-DNAへの結合からE3L分子を妨げる抗感染性薬剤（たとえば、低分子）を開発することが可能である。E3LのZ-DNA結合部位へのこの薬剤の結合は、Z-DNAへのE3L結合を妨害し、従ってウイルスの病原性を減少または廃止させるだろう。かかるインヒビターは、ワクシニアの場合、マウスにおいて直接的に試験され得る。これらのインヒビターはまた、痘瘡感染の霊長類モデルにおいても試験され得る（EnserinkおよびStone, Science 295:2001-2005, 2002)。Z-DNA結合のインヒビターを同定するための方法を、より詳細に本明細書中に記載する。
【０１７６】
オルトポックスウイルスE3L分子に結合し得る薬剤（たとえば、低分子）を見出すことは薬物発見の工程であり、様々なステージにおいて起こると考え得る: 
1.E3LのN末端ドメインまたはADAR1のZαなどのZ-DNA結合リガンドまたはそのバリアントに結合する薬剤（たとえば、低分子先導化合物）の、計算法またはハイスループットスクリーニングを介した同定；
2. 任意に、その結合がZ-DNA結合分子のZ-DNA結合部位に対してであることの確認；および
3. 任意に、低分子結合のアフィニティーを増大するための1つ以上の先導化合物の最適化。
【０１７７】
オルトポックスウイルスの病原性効果の阻害における、低分子の活性を評価するための動物実験を実行し得る。
【０１７８】
本明細書中に記載されたものを含む任意の適切なアッセイを、Z-DNA結合リガンドまたはそのバリアントに結合する薬剤または先導化合物を同定するために使用し得る。次いで、1つの態様において、適切なハイスループット・スクリーニングアッセイを化合物の1つ以上のライブラリーを検索するために使用し得る。
【０１７９】
低分子結合特性を得るための1つのアプローチは、Z-DNA結合リガンド、例えばE3LまたはE3Lに配列類似性を有するタンパク質、例えばADAR1、が蛍光標識されている場合、蛍光シグナルをZ-DNAへの結合を示すため使用し得、低分子によるそのシグナルの崩壊を特異的インヒビターを単離するため使用し得ることである。上記の方法に従って先導化合物を見出すためのハイスループットスクリーニングに適したかかるアッセイの例は、以下の通りである。poly(dG-dC）を96ウェルタイタープレートの底に固定する。Zα（ADAR1）などの分子を修飾し、その結果蛍光タグがそれに付加される。poly(dG-dC）の水溶液への蛍光標識Zαの添加は、続く洗浄によって除去されないように固定されたDNAへの結合を生じる。結合タンパク質の存在は蛍光により検出され得、結合を妨げる試験薬剤の存在は蛍光の損失により示される。
【０１８０】
インヒビターのハイスループットスクリーニングのための別の方法は、そのメモリーに 100〜200万の低分子を含むコンピュータープログラムを使用する「インシリコ」スクリーニングの工程を含み、任意の適切なコンピュータープログラム、例えばCNS（Crystallographic NMR System）を使用して、低分子を結合部位にドッキングさせエネルギー最小化を捜すため四方に移動させる操作を実行する。次いで分子のライブラリーについて結合エネルギーを連続的に計算し、これから候補分子を同定し得る。これらの分子および構造バリアントはスクリーニングされ得る（たとえばハイスループットスクリーニングによって)。
【０１８１】
新たに合理的なドラッグデザイン、リガンド最適化、ファーマコフォア（pharmacophor）技術、およびリガンド/低分子ドッキング方法を含む「インシリコ」スクリーニングのための方法は、当該分野で公知であり、例えば米国特許出願第；5,854,992号および5,712,171号、ならびに米国特許公報第2002/0055536 A1号、に記載され、その全教示は参考により本明細書中に援用される。
【０１８２】
「インシリコ」スクリーニング由来の最も有望な候補は化学的に合成され得、そのためZ-DNA結合を阻害するためのそれらの能力は実験的に測定され得る。
【０１８３】
一旦先導化合物が同定されると、どこでどのように化合物がZ-DNA結合部位に結合するのかを確認することが有用である。これは、多くの方法において実行され得、最も単純なのは本明細書中に記載された通りZαの添加におけるd(CG)nの円偏光二色性を測定することである。化合物がZ-DNAへの変換を阻害する場合、おそらくその結合はタンパク質のZ-DNA結合部位において、またはその近くにおいてである。任意に、低分子結合部位の詳細な位置を決定するため、Zαドメインとの共結晶化により有望な化合物をさらに研究し得る。Zαドメインの構造は公知であるため、結晶構造はかなり容易に解明され得る。
【０１８４】
解離定数（Kd）を低くする目的で、結合の最適化を実行し得る。この工程は様々な初期先導化合物の誘導体を作製し得る有機化学を含む。
【０１８５】
異なる位置に基を付加することによる先導化合物の誘導に加えて、ドメインへの化合物の三次元構造の知識は、結合を増大しやすい位置における残基の付加の指針として、合理的なドラッグデザインを使用することを可能にし得る。
【０１８６】
結合する化合物の毒性および用量応答を評価するため（たとえば、マウスに投与したポックスウイルスの致死性を防ぐため）の動物実験を実行し得る。本明細書中に記載されたようなアッセイまたは毒性を評価するための他の方法を、化合物の毒性を決定するために使用し得る。
【０１８７】
タンパク質のZ-DNA結合表面に結合するインヒビターの探索において多くのタンパク質を使用し得る。これらのタンパク質は、例えばADAR1、DLM1およびワクシニアのE3LのZ-DNA結合ドメインを含む。これらのタンパク質はアミノ酸配列において大きく異なるにもかかわらず、Z-DNA結合部位において見出されたアミノ酸残基の共通点を有する。従って、これら3つのサブユニットに結合するインヒビターをアッセイし得る。タンパク質のZ-DNA結合表面は、3つの分子全てにおいて類似であり、一方他の表面は異なる。研究されているこれらの分子に加えて、オルフウイルスおよびヤバ様ウイルスからの他のE3L N末端ドメイン（図８Ａ）を使用し得る。これらの分子の両方はそれらをコードするDNAを使用して研究室で合成されている。
【０１８８】
実施例７: ウイルスで感染させたマウスの治療
1つの例として、BrandおよびJacobs（前出；その教示は参考により援用される）により記載された通り、マウス（たとえば、C57BL/6血統）をワクシニアウイルスで感染させ、Z-DNA結合リガンドとZ-DNA間の複合体形成の候補インヒビターを、以下の通り病原性を阻害または減少させる能力について試験した。マウスにまず麻酔薬、例えば1μl/体重グラムのキシラジン（7.5 mg/ml)、マレイン酸アセプロマジン（2.5 mg/ml)、およびケタミン（37.5 mg/kg）を含むカクテルを筋肉内に投与した。麻酔に続き、ウイルスを、例えばゲルローディングチップを装填したマイクロピペットを使用して、死亡をもたらすために充分な（例えば、実験の所望の持続期間に依存し、103、104、105、106、または107 p.f.u）10μl用量で鼻腔内に投与した。逆立った毛および活動の欠乏を含む病気の徴候、ならびに死亡についてマウスを毎日観察した。さらに、体重減少は動物のポックスウイルス感染における発熱と直接的に関連するため、体重減少を病原性の測定のため使用し得る（Bloomら, J.Virol., 65:1530-1542, 1991；その教示は参考により援用される)。あるいはウイルスを、例えば10μlのウイルス、ならびに27ゲージ皮下注射針および1 mlシリンジを使用して、麻酔されたマウスに頭蓋内注射を介して投与し得る。
【０１８９】
インヒビターを、ウイルス感染の前に、同時に、または後のいずれかにマウスに投与した。投与は任意の適切な経路に従い得る。好ましくは、投与の様式は全身性送達を提供する。かかる研究についての可能な対照は、ウイルスで感染されるがインヒビターは受けないマウス、ならびにウイルスで感染され、インヒビタービヒクルのみを投与されるマウスの集合を含む。
【０１９０】
ウイルスで感染させたマウスの病原性（例えば、死亡、体重減少、外毛荒れ）を減少させる化合物は、Z-DNA結合リガンドのZ-DNAへの結合のインヒビターである。このようなインヒビターは、ウイルスで感染された個体を治療するために使用され得る。
【０１９１】
ワクシニアウイルスの病原性を減少させる1つの方法を、以下の通り実行した。臭素化され、その結果化学的に安定化されたZ-DNAを形成するpoly(dG-dC)(2 mM（塩基対)）を含むリポソームの組成物を当該分野で公知の方法に従い作製した。一般的に、およそ50％のpoly(dG-dC）はDNA-リポソーム組成物において残存する。5匹のマウスの1つの群に、ワクシニアウイルス単独を頭蓋内接種し、5匹のマウスの第2群に、ワクシニアウイルスおよび10μLのZ-DNA-リポソーム組成物を摂取し、一方、第3群のマウスに、ワクシニアウイルスおよび10倍に希釈した10μLのZ-DNA-リポソーム組成物を加えて接種した。研究を結論付けると、ウイルス単独を受けたマウスはおよそ1週間で死亡し、一方ウイルスおよびリポソームに含まれたZ-DNAを投与したマウスは少なくとも2週間生存した。
【０１９２】
本発明はその好ましい態様を参照して詳しく示され、記述されているが、添付された特許請求の範囲に包含された発明の範囲から逸脱することなく、形式および詳細において様々な変化がその中でなされ得ることが当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】図１Ａは、ワクシニアウイルスの単離物由来のE3Lのアミノ酸配列（配列番号：１）を示し（ジーンバンクアクセション番号：S64006、Yuwenら、J. Virol., 195(2):732-744,1993)、この教示は参照により本明細書に援用される。図１Ｂは、痘瘡ウイルスの単離物由来のE3Lのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す（ジーンバンクアクセション番号：X69198.1、この教示は参照により本明細書に援用される）。図１Ｃは、オルフウイルスの単離物由来のE3Lのアミノ酸配列（配列番号：３）を示す（ジーンバンクアクセション番号：CAA10952、この教示は参照により本明細書に援用される）。図１Ｄは、ヤバ様疾患ウイルスの単離物由来のE3Lのアミノ酸配列（配列番号：４）を示す（ジーンバンクアクセション番号：AJ293568、またジーンバンクアクセション番号：NC002642.1にも見られる、この教示は参照により本明細書に援用される）。
【図２Ａ】図２Ａは、スティックフォーマットで表現されたE3Lの側鎖（黒色）、およびボールおよびスティックフォーマットで示されるTrp195（Z-DNAを間接的に接触する）を有する、Z-DNA（淡灰色）に接触した痘瘡E3L（暗灰色）の表面観察の概略説明図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、スティックフォーマットで表現されたE3Lの側鎖を有し、帯電した基について強調されている、（Angstroms において）示された接触残基の間の距離がある、Z-DNAと接触する残基を示す、痘瘡またはワクシニアE3Lの概略説明図である。
【図３】図３Ａは、時間（感染後の日数）に関して、野生型ワクシニアウイルス（ＺE3L）；E3Lタンパク質の83個のアミノ末端アミノ酸が欠失したワクシニアウイルス（del83N）；Z-DNA結合ドメインZαADAR1がE3LのN末端ドメインについて置換されたワクシニアウイルス（ZαADAR1）；またはZαADAR1構築物における192位のアミノ酸であるプロリンがアラニンに変異されたワクシニアウイルス（P192A)を接種したマウスにおけるワクシニアウイルスまたはバリアントの致死率（生存率）のグラフである。図３Ｂは、時間（感染後の日数）に関して、野生型ワクシニアウイルス（ＺE3L）；E3Lタンパク質の83個のアミノ末端アミノ酸が欠失したワクシニアウイルス（del83N）；Z-DNA結合ドメインZαADAR1がE3LのN末端ドメインについて置換されたワクシニアウイルス（ZαADAR1）；またはZαADAR1構築物における193位のアミノ酸であるプロリンがアラニンに変異されたワクシニアウイルス（P193A）を接種したマウスにおけるワクシニアウイルスまたはバリアントの致死率（生存率）のグラフである。
【図４】図４Ａは、時間（感染後の日数）に関して、Z-DNA結合ドメインZADAR1がE3LのN末端ドメインについて置換されたワクシニアウイルス（ZADAR1）；ZADAR1構築物における177位のアミノ酸であるチロシンがフェニルアラニンに変異されたワクシニアウイルス（Y177F）；またはADAR1構築物における177位のアミノ酸であるチロシンがアラニンに変異されたワクシニアウイルス（Y177A）を接種したマウスにおけるワクシニアウイルスまたはバリアントの致死率（生存率）のグラフである。10μl中、提示した数のプラーク形成単位（p.f.u.）のワクシニアウイルス構築物での頭蓋内注射を経て、提示された変異を含む、ZαADAR1−E3Lキメラ遺伝子を含有するワクシニアウイルスをマウスに感染させた。2週間、死亡率についてマウスをモニターした。図４Ｂは、円偏光二色性で評価した場合、時間（秒）に関して、ZαADAR1タンパク質；177位のアミノ酸であるチロシンがフェニルアラニンに変異されたZαADAR1タンパク質（Y177F）；177位のアミノ酸であるチロシンがアラニンに変異されたZαADAR1タンパク質（Y177A）により、Ｂ立体配座からＺ立体配座へのd(CG)6DNAの転換（255nmでの楕円率(mdeg)）で測定された、結合活性のグラフである。Ｂ立体配座からＺ立体配座へのDNAの転換は、負の楕円率がより小さくなる際に生じ、タンパク質のZ-DNAへの結合を示す。255nmでの楕円率は、90μM（塩基対）のd(CG)6および30μMのタンパク質を用いて、時間の関数としてモニターされる。
【図５】図５Ａは、時間（感染後の日数）に関して、野生型ワクシニアウイルス（WT(ZE3L)）；Z-DNA結合ドメインZαADAR1がE3LのN末端ドメインについて置換されたワクシニアウイルス（ZαADAR1）；ZαADAR1構築物における186位のアミノ酸であるグルタミンがアラニンに変異されたワクシニアウイルス（Q186A）；ZαADAR1構築物における171位のアミノ酸であるグルタミン酸がアラニンに変異されたワクシニアウイルス（E171A）；またはZαADAR1構築物における169位のアミノ酸であるリジンがアラニンに変異されたワクシニアウイルス（K169A）を接種したマウスにおけるワクシニアウイルスまたはバリアントの致死率（生存率）のグラフである。10μl中100プラーク形成単位（p.f.u.）のワクシニアウイルス構築物での頭蓋内注射を経て、提示されたウイルスをマウスに感染させた。１２日間、死亡率についてマウスをモニターした。図５Ｂは、円偏光二色性で評価した場合、時間（秒）に関して、ZαADAR1；186位のアミノ酸であるグルタミンがアラニンに変異されたZαADAR1（Q186A）；171位のアミノ酸であるグルタミン酸がアラニンに変異されたZαADAR1（E171A）；または169位のアミノ酸であるリジンがアラニンに変異されたZαADAR1（K169A）のB立体配座からZ立体配座へのDNAの転換（255nmでの楕円率(mdeg)）で測定された、結合活性のグラフである。B立体配座からZ立体配座へのDNAの転換は、負の楕円率がより小さくなる際に生じ、タンパク質のZ-DNAへの結合を示す。
【図６】図６Ａは、種々の用量のウイルス接種(p.f.u.)で、E3Lのアミノ末端ドメインがADAR1のZβドメインで置換されたワクシニアウイルス（ZβADAR1）；またはE3Lのアミノ末端ドメインがADAR1のZβドメインで置換され、かつZαにおける177位と類似した位置のイソロイシンがチロシンに変換されたワクシニアウイルス（ZβADAR1I335Y）を接種したマウスにおけるワクシニアウイルスおよびバリアントの致死率（生存率）のグラフである。マウスを、106p.f.u.のZβADAR1−E3Lキメラウイルス、またはI335Y変異を有する該キメラウイルスのいずれかで頭蓋内感染させ、生存について経時的にモニターした。図６Ｂは、円偏光二色性で評価した場合、時間（秒）に関して、E3Lのアミノ末端ドメインがADAR1のZβドメインで置換されたワクシニアウイルスE3L（ZβADAR1）；またはE3Lのアミノ末端ドメインがADAR1のZβドメインで置換され、かつZαにおける177位と類似した位置のイソロイシンがチロシンに変換されたワクシニアウイルスE3L（（ZβADAR1I335Y））のＢ立体配座からＺ立体配座へのDNAの転換（255nmでの楕円率(mdeg)）で測定された、結合活性のグラフである。B立体配座からZ立体配座へのDNAの転換は、負の楕円率がより小さくなる際に生じ、タンパク質のZ-DNAへの結合を示す。
【図７】図７は、時間（感染後の日数）に関して、野生型ワクシニアウイルス（WT(ZE3L)））；E3Lタンパク質の83個のアミノ末端アミノ酸が欠失したワクシニアウイルス（E3LΔ83N）；ヒトZ-DNA結合ドメインZαADARがE3LのN末端ドメインについて置換されたワクシニアウイルス（ZαADAR1）；またはDLMタンパク質のマウスZ-DNA結合ドメインがE3LのN末端ドメインについて置換されたワクシニアウイルス（ZαDLM1）を接種したマウスにおけるワクシニアウイルスまたはバリアントの致死率（生存率）のグラフである。4〜6匹のC57BL/6マウス（4〜6週齢）の群を10μl中、提示された数のプラーク形成単位（p.f.u.）のワクシニアウイルス構築物で頭蓋内感染させた。100プラーク形成単位をこの実験に使用し、マウスを２週間死亡率についてモニターした。野生型ワクシニアウイルスについてのデータは、４つの異なる実験からなり、それぞれ４匹のマウスを用いる。生存率を感染後の日数に対してプロットしている。
【図８Ａ】図８Ａは、ADAR1のヒトZα（配列番号：６）、DLMのマウスZα（配列番号：７）、ワクシニアウイルスのE3L（配列番号：８）、痘瘡ウイルスのE3L（配列番号：９）、オルフウイルスのE3L（配列番号：１０）、ランピースキンウイルスのE3L（配列番号：１１）、豚痘ウイルスのE3L（配列番号：１２）、ヤバ様疾患ウイルスのE3L（配列番号：１３）、牛痘ウイルスのE3L（配列番号：１４）、およびADAR1のヒトZβ（配列番号：１５）の部分のアミノ酸配列アライメントである。この配列のいずれかの末端の数字は、それぞれのタンパク質におけるアミノ酸残基の番号付けを表わす。疎水性のコアを有するアミノ酸残基は三角形で示され、核酸（Z-DNA）に接触している残基は円で示される。下線を引いた残基は、タンパク質の折り目（fold）およびZ-DNA認識について重要な残基を示す。配列の先端の二次構造ダイアグラム（ADAR1のヒトZαの番号付けを有する）は、これらのタンパク質の予想される二次構造を示す。種々の配列についてのジーンバンクアクセション番号は以下のとおり：二本鎖RNAアデノシンデアミナーゼ〔ホモ・サピエンス〕AAB06697.1；腫瘍ストローマおよび活性化マクロファージタンパク質DLM-1 〔ムス・ムスクラス(Mus musculus)〕NP067369；およびE3Lタンパク質〔ワクシニアウイルス〕AAA02759；〔痘瘡ウイルス〕NP042088；〔オルフウイルス〕AAC08018；〔ランピースキン疾患ウイルス〕AAK84995；〔豚痘〕NP570192；〔ヤバ様疾患ウイルス〕NP073419；および〔牛痘ウイルス〕CAC42100。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Z-DNAに結合したADAR1のZαサブユニットの共結晶構造の概略図である。この図は、タンパク質の認識ヘリックスの下方にあり（左側）、静電気的相互作用およびファンデルワールス相互作用により安定化された左旋性のZ-DNAと相互作用する多くのアミノ酸が示される。グアニン４とチロシン177との間に、端部から表面へのファンデルワールス相互作用がある。プロリン192、193とZ-DNA骨格との間のファンデルワールス相互作用に注意すべきである。
【図９Ａ】図９Ａはマウスにおけるワクシニアウイルスまたはバリアントの致死率（生存率）のグラフである。図４Ａに記載したものに類似する実験を、野生型ワクシニアウイルスのE3L遺伝子について行った。異なる用量のウイルスについて２週間モニターした頭蓋内接種後の致死率の用量応答曲線が示される。結果は、野生型E3Lを含有するウイルス並びにY48F変異およびY48A変異を含むウイルスの両方に関して示される。
【図９Ｂ】図９Ｂは、P63AまたはP64A変異を含むヒトZ-DNA結合ドメインZαADARがE3LのN末端ドメインについて置換されたワクシニアウイルス（P64AまたはP63A）または野生型E3Lウイルスを接種したマウスにおけるワクシニアウイルスまたはバリアントの致死率（生存率）のグラフである。マウスを提示された用量の野生型ワクシニアウイルス（WT(ZE3L)）で、あるいはP63AまたはP64A変異を含むキメラウイルスで頭蓋内感染させ、生存を評価した。
【図９Ｃ】図９Ｃは、P193AまたはP192A変異を含むヒトZ-DNA結合ドメインZαADARがE3LのN末端ドメインについて置換されたワクシニアウイルス（P193AまたはP192A）あるいはヒトZ-DNA結合ドメインZαADARがE3LのN末端ドメインについて置換されたワクシニアウイルス（ZαADAR1）を接種したマウスにおけるワクシニアウイルスまたはバリアントの致死率（生存率）のグラフである。マウスは、提示された用量のキメラウイルス（ZαADAR1）、またはP192AもしくはP193A変異を含むキメラウイルスで頭蓋内感染させた。
【図１０】図１０Ａは、本明細書に記載する酵母ワンハイブリッドアッセイを行うために使用されるレポーターベクターの概略説明図である。レポーターベクター構築物に関して、(dC-dG)の種々のリピートのベイト配列をレポーター遺伝子（LacZ）とURA3遺伝子との間に挿入した。選択マーカー遺伝子、URA3の配向は、Z-DNA形成について有利な（正反対またはOp）条件を作り出した。pLacZcOpベクターにおいて、URA3転写の配向は、LacZレポーター遺伝子のものと正反対であった。pLacZcOpについて図示するように、LacZレポーター遺伝子の転写は、活性化ドメイン（AD）を伴うhZαADAR1がZ-DNAに結合した場合、活性化した。Zα-ADハイブリッド融合は、独立したベクター、pACT2-Zαから発現された。図１０Ｂは、本明細書に記載する酵母ワンハイブリッドアッセイを行うために使用されるレポーターベクターの概略説明図である。レポーターベクター構築物に関して、(dC-dG)の種々のリピートのベイト配列をレポーター遺伝子（LacZ）とURA3遺伝子との間に挿入した。選択マーカー遺伝子、URA3の配向は、Z-DNA形成について不利な（同じまたはSm）条件を作り出した。URA3とLacZの両方からの転写産物は、pLacZcSmベクターで同じ配向を有した。Zα-ADハイブリッド融合は、独立したベクター、pACT2-Zαから発現された。
【図１１Ａ】図１１Ａは、hZαADARを含むZα-ADハイブリッド融合タンパク質をコードするpACT2またはpACT2-Zα発現ベクターでトランスフェクトされたpLacZcOp、またはZαタンパク質を含まない対照（なし）を用いた、本明細書に記載する酵母ワンハイブリッドアッセイで使用される(dC-dG)リピートの数の関数として、β−ガラクトシダーゼ活性で評価された、転写活性を示すグラフである。Zα-AD融合タンパク質は、ベイト配列を形成する上流のZ-DNAに結合することにより、LacZレポーター遺伝子の転写を活性化した。hZαADAR1を含有するpACT2またはpACT2-Zα発現ベクターをもたない（ない）またはもついずれかの酵母にpLacZcOpベクターがトランスフェクトされた。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、本明細書に記載の酵母ワンハイブリッドアッセイにおける種々の長さの(dC-dG)リピートを用いる、異なるレポーターベクター、pLacZcOpおよびpLacZcSm中のZα-AD融合タンパク質によるLacZ遺伝子の活性化の比較を示すヒストグラムである。バーの上の数字は、pLacZcSmと比較した、pLacZcOpの酵素活性の倍増加を示す。
【図１２】図１２は、LacZレポーター遺伝子活性化および種々の長さの(dC-dG)リピートを用いるZα、Zβ、Za'b、ZabおよびZaaのZ-DNA結合活性のヒストグラムである。Zα、ZβおよびZabは、すべてヒトADAR1由来であった。Zaaにおいて、ZabのZβドメインが除去され、Zαがそれと置換した。Za'bは、ZabのZαに変異があった。（pACT2）のないまたはヒトADAR1由来の種々のヒトZα、ZβまたはZab構築物（pACT2-Zβ、-Zα、-Zab、-Za'bおよび-Zaa）に融合した活性化ドメインを含むベクターは、pLacZcOp-(dCdG)n（式中、ｎ＝4、5、9および12）をもつ酵母に同時トランスフェクト(co-transfect)された。β−ガラクトシダーゼ活性を、定量o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトース（ONPG）アッセイにより決定した。
【図１３】図１３は、ヒトADAR1由来のヒトZβまたはZα構築物に融合した活性化ドメインを含む種々のベクターを含有する酵母中のβ−ガラクトシダーゼレポーター活性を測定することで評価される場合、インビボのZβまたはZαのホモログのZ-DNA特異的結合を示すヒストグラムである。pACT2ベクターにおいてZαまたはそのホモログについてコードするベクターを、レポーターベクター、placZcOp-(dC-dG)9を有する酵母細胞にトランスフェクトした。すべての構築物が、ある活性化ドメインのみを有したpACT2を除く活性化ドメインに融合された。β−ガラクトシダーゼ活性を、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトース（ONPG）アッセイにより定量的に決定した。ZE3LおよびZαDLMは、ワクシニアウイルスE3Lタンパク質およびマウスDLM-1それぞれ由来のN末端Zαホモログドメインであった。ZαN173Aは、hZαADARのAsn173からAlaへの変換における変化のため、有意に低減されたZ-DNA結合活性を持つ変異体であった。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本明細書に記載のように、中間点でのB-Z平衡を用いるZ-DNA結合特異性についての感度の高い円偏光二色性（CD）アッセイの結果を示すグラフである。ポリ(dC-dG)のB-Z平衡のCD中間点は、コバルトヘキサアミンを添加することにより達成された。タンパク質がB立体配座よりもDNAのZ立体配座に特異的に結合した場合、B立体配座とZ立体配座との間の平衡は、Z-DNAの方に変化した。同様に、B立体配座特異的結合タンパク質は、B-DNAの方に変化した。60μMのタンパク質を60μM（塩基対）のポリ(dC-dG)DNAにB-Z平衡の中間点で添加した。B-Z平衡のシフトを、292nmのCDで3000秒間モニターした。vZE3L（暗い線）は、CD信号をZ立体配座に変えることにより、明確なZ-DNA特異性を示し、一方、hZβADAR（淡い線）は正反対のものであった。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａに記載するアッセイにおいてタンパク質が添加された20時間後に計測した240nmと320nmとの間のCDスペクトルを示す。約75μMのコバルトヘキサミンを添加することでB-Z中間点スペクトル（----）を達成した。vZE3L（暗い線）およびhZ(3ADAR)（淡い線）の立体配座特異性の特性を示す。ポリ(dC-dG)のB-DNA（中抜きの丸）スペクトルおよび塩誘導（4M NaCl）Z-DNA（塗りつぶした丸）スペクトルを比較のために示した。
【図１５】図１５は、β−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより評価される場合、Zαによるレポーター遺伝子LacZの転写の活性化のグラフである。Gal4活性化ドメインをもたないZα単独の発現を試験した。pGNA-Zαは、（本明細書に記載される）N末端にSV40 T抗原核局在シグナルを有するZαを発現した。異なるpLacZcOp-(dC-dG)nレポーターを用いて実験を行った。dC-dGの伸長が長くなるにつれて、hZαADAR発現はβ−ガラクトシダーゼ活性を有意に増加させた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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