(57)【要約】単離された繊維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦＲ５）のポリペプチドと、かかるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドとが提供される。また、ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤と、ＦＧＦＲ５ポリペプチドと特異的に結合して、ＦＧＦＲ５ポリペプチドの機能のアゴニストまたはアンタゴニストの役割を果たす結合分子とが提供される。特異的な結合分子は、ＦＧＦＲ５と特異的に結合してＦＧＦＲ５の活性を変調させる抗体およびその機能的な断片とｓｃＦｖおよびラクダ重鎖ＩｇＧとを含み、全身性ループス・エリテマトーデスのようなオステオポンチンが仲介する自己免疫疾患と、骨粗鬆症および骨化石症を含む骨疾患と、肝細胞性癌腫のような細胞性癌腫を含むがんとのような疾患の治療に適する効果的な物質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）遺伝子発現の低分子阻害剤と、（ｂ）アンチセンス・オリゴヌクレオチドと、（ｃ）短鎖干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡｉ）とからなるグループから選択されるＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドと、（ｂ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの相補体と、（ｃ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの逆配列と、（ｄ）配列番号５−８および１３−１５から成るグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドと、（ｅ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの相補体と、（ｆ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの逆配列とからなるグループから選択されるポリヌクレオチドと特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、ＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触するとき、ＦＧＦＲ５遺伝子発現を減少させる効果がある、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、ＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触するとき、オステオポンチン遺伝子発現を減少させる効果がある、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドで、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、（ａ）アンチセンス発現ベクターと、（ｂ）アンチセンス・オリゴデオキシリボヌクレオチドと、（ｃ）アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴデオキシリボヌクレオチドと、（ｄ）アンチセンス・オリゴリボヌクレオチドと、（ｅ）アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴリボヌクレオチドとからなるグループから選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
結合剤を含む組成物であって、
前記結合剤はＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤であって、前記結合剤は、（ａ）低分子と、（ｂ）抗体またはその抗原結合断片と、（ｃ）短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、（ｄ）ラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）と、（ｅ）ＦＧＦＲ５リガンドまたはその抗原結合断片とからなるグループから選択される、組成物。
【請求項７】
前記結合剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドまたはその相補体にコード化されるポリペプチドと、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５からなうグループから選択される配列を含むポリペプチドとからなるグループから選択されるポリペプチドに特異的に結合する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記結合剤はＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアゴニストである、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアゴニストは、該アゴニストがＦＧＦＲ５ポリペプチドを発現する細胞集団に接触するとき、該細胞集団でのオステオポンチン遺伝子発現を増大させる効果がある、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記結合剤はＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアンタゴニストである、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアンタゴニストは、該アンタゴニストがＦＧＦＲ５ポリペプチドを発現する細胞集団に接触するとき、該細胞集団でのオステオポンチン遺伝子発現を減少させる効果がある、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞集団を請求項１に記載の組成物に接触させるステップを含む、細胞集団でのオステオポンチン発現を変調する方法。
【請求項１３】
前記ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドと、（ｂ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの相補体と、（ｃ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの逆配列と、（ｄ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドと、（ｅ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの相補体と、（ｆ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの逆配列とからなるグループから選択されるポリヌクレオチドと特異的に結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、ＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触するとき、ＦＧＦＲ５遺伝子発現を減少させる効果がある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、ＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触するとき、オステオポンチン遺伝子発現を減少させる効果がある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤はアンチセンス・オリゴヌクレオチドであり、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、（ａ）アンチセンス発現ベクターと、（ｂ）アンチセンス・オリゴデオキシリボヌクレオチドと、（ｃ）アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴデオキシリボヌクレオチドと、（ｄ）アンチセンス・オリゴリボヌクレオチドと、（ｅ）アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴリボヌクレオチドとからなるグループから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
細胞集団を請求項６に記載の組成物に接触させるステップを含む、細胞集団でのオステオポンチン発現を変調する方法。
【請求項１８】
前記結合剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドにコード化されるポリペプチドと、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドとからなるグループから選択されるポリペプチドと特異的に結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合剤はＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアゴニストで、該アゴニストが前記細胞集団に接触するとき、前記アゴニストの前記細胞集団との結合がオステオポンチン発現の増大をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合剤はＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアンタゴニストで、該アンタゴニストが前記細胞集団に接触するとき、前記アンタゴニストの前記細胞集団との結合がオステオポンチン発現の減少をもたらす、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
オステオポンチン発現の増大と関連する疾患の治療薬におけるＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤の使用。
【請求項２２】
前記変調剤は、（ａ）遺伝子発現の低分子阻害剤と、（ｂ）アンチセンス・ポリヌクレオチドと、（ｃ）短鎖干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）とからなるグループから選択される、請求項２１に記載のＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤の使用。
【請求項２３】
前記変調剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドと、（ｂ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの相補体と、（ｃ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの逆配列と、（ｄ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドと、（ｅ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの相補体と、（ｆ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの逆配列とからなるグループから選択されるポリヌクレオチドと特異的に結合する、請求項２１に記載のＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤の使用。
【請求項２４】
オステオポンチン発現の増大と関連する前記疾患は、がん、多発性硬化症、全身性ループス・エリテマトーデス、糖尿病、リウマトイド関節炎、サルコイドーシス、結核、腎結石、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、腎炎、関節炎および骨粗鬆症からなるグループから選択される、請求項２１に記載のＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤の使用。
【請求項２５】
オステオポンチン発現の増大と関連する疾患の治療薬における結合剤の使用であって、
前記結合剤はＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアンタゴニストであり、前記結合剤は、（ａ）低分子と、（ｂ）抗体またはその抗原結合断片と、（ｃ）短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、（ｄ）ラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）とからなるグループから選択される、オステオポンチン発現の増大と関連する疾患の治療薬における結合剤の使用。
【請求項２６】
前記結合剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択されるポリヌクレオチドにコード化されるポリペプチドと、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドとからなるグループから選択されるポリペプチドと特異的に結合する、請求項２５に記載の結合剤の使用。
【請求項２７】
前記オステオポンチン発現の増大と関連する疾患は、がん、多発性硬化症、全身性ループス・エリテマトーデス、糖尿病、リウマトイド関節炎、サルコイドーシス、結核、腎結石、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、腎炎、関節炎および骨粗鬆症からなるグループから選択される、請求項２５に記載の結合剤の使用。
【請求項２８】
オステオポンチン発現の減少と関連する疾患の治療薬における結合剤の使用であって、前記結合剤はＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアゴニストであって、前記結合剤は、（ａ）低分子と、（ｂ）抗体またはその抗原結合断片と、（ｃ）短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、（ｄ）ラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）と、（ｅ）ＦＧＦＲ５リガンドまたはそのＦＧＦＲ５結合断片とからなるグループから選択される、オステオポンチン発現の減少と関連する疾患の治療薬における結合剤の使用。
【請求項２９】
前記結合剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択されるポリヌクレオチドまたはその相補体にコード化されるポリペプチドと、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドとからなるグループから選択されるポリペプチドと特異的に結合する、請求項２８に記載の結合剤の使用。
【請求項３０】
前記オステオポンチン発現の減少と関連する疾患は、骨化石症からなるグループから選択される、請求項２８に記載の結合剤の使用。
【請求項３１】
請求項１または６に記載の組成物を患者に投与するステップを含む、オステオポンチン発現の増加と関連する疾患の治療方法。
【請求項３２】
患者に請求項１または６に記載の組成物を投与するステップを含む、乳癌、肝細胞性癌腫および大腸癌からなるグループから選択されるがんの治療方法。
【請求項３３】
患者に請求項１または６に記載の組成物を投与するステップを含む、骨粗鬆症と、骨化石症とからなるグループから選択される骨疾患の治療方法。
【請求項３４】
患者に請求項１または６に記載の組成物を投与するステップを含む、ＦＧＦＲ５と関連する疾患の治療方法。
【請求項３５】
細胞集団でのオステオポンチン発現を阻害する方法であって、該細胞でのポリペプチドの量を減少させるステップを含み、該ポリペプチドは、
（ａ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列と、
（ｂ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、
（ｃ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、
（ｄ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、細胞集団でのオステオポンチン発現を阻害する方法。
【請求項３６】
細胞集団でのオステオポンチン発現を阻害する方法であって、請求項６に組成物を投与することによって前記細胞集団でのポリペプチドの活性を阻害するステップを含み、前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列と、
（ｂ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、
（ｃ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、
（ｄ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、細胞集団でのオステオポンチン発現を阻害する方法。
【請求項３７】
オステオポンチンのレベルの上昇を特徴とする疾患の治療方法であって、請求項６に記載の組成物を投与するステップを含み、前記組成物は、
（ａ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列と、
（ｂ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、
（ｃ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、
（ｄ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する結合剤を含む、オステオポンチンのレベルの上昇を特徴とする疾患の治療方法。
【請求項３８】
オステオポンチンのレベルの上昇を特徴とする疾患の治療方法であって。請求項１に記載の組成物を投与するステップを含み、該組成物は、
（ａ）配列番号１−４および９に提供される配列と、
（ｂ）配列番号１−４および９に提供される配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、
（ｃ）配列番号１−４および９に提供される配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、
（ｄ）配列番号１−４および９に提供される配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とからなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドを特異的に結合するＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤を含む、オステオポンチンのレベルの上昇を特徴とする疾患の治療方法。
【請求項３９】
前記疾患は、がん、多発性硬化症、全身性ループス・エリテマトーデス、糖尿病、リウマトイド関節炎、サルコイドーシス、結核、腎結石、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、腎炎、関節炎および骨粗鬆症からなるグループから選択される、請求項３５ないし３８のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フレーキースキン（ｆｌａｋｙ  ｓｋｉｎ、ｆｓｎ−／−）マウス由来のリンパ節間質細胞で発現するポリヌクレオチドおよびポリペプチドと、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドのヒトのホモログと、抗体その他本発明のポリペプチドに特異的な結合分子と、かかるポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび結合分子の治療および診断の方法への利用とに関する。特異的な結合分子は、ＦＧＦＲ５に特異的に結合してＦＧＦＲ５活性を変調（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する、抗体、その機能的断片と、ｓｃＦｖおよびラクダ（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）の重鎖ＩｇＧを含む。したがって特異的結合分子は、全身性ループス・エリテマトーデスのようなオステオポンチンが介在する自己免疫疾患と、骨粗鬆症および骨化石症とを含む骨疾患と、肝細胞性癌のような癌腫を含むがんとのような疾病の治療に適する、ＦＧＦＲ５活性のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを含む。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００２年５月２８日付の米国特許出願第１０／１５７、４４４号に基づく優先権を主張する。前記出願は２００１年５月２８日付の米国特許出願第０９／８２３、０３８号の一部継続出願であり、該特許出願は、２０００年２月１８日付の国際出願第ＰＣＴ／ＮＺ００／０００１５号と、２０００年７月２５日付の米国仮出願第６０／２２１、２１６号とに基づく優先権を主張し、かつ、米国特許第６、４２４、４１９号として登録された１９９９年８月２６日付の米国特許出願第０９／３８３、５８６号の一部継続出願であるが、前記米国特許は、既に放棄された米国特許出願第０９／２７６、２６８号の一部継続出願である。
【０００３】
リンパ管とリンパ節は身体の免疫系の重要な構成成分である。リンパ節はリンパ管の経路に位置する小さなリンパ器官である。異物を含めて高分子と細胞はリンパ管に入り、リンパ管を循環する間にリンパ節を通過する。ここでいかなる異物であっても濃縮され、リンパ球に曝される。これが引き金となって、身体を感染および癌から守る免疫反応を構成する一連の出来事が発生する。
【０００４】
リンパ節は支持被膜を形成する結合組織の濃密なネットワークで取り囲まれている。このネットワークはリンパ節の本体の中に伸長し、さらなる支持体の枠組みを形成する。この器官の残りの部分には、細網繊維と該繊維を産生しこれに囲まれる細網細胞とを含む微細な網の目が同定できる。これらの特徴的な構造がＴおよびＢリンパ球というリンパ系の主要な機能を担う細胞の支持体を提供する。リンパ節にみられるその他のタイプの細胞には、マクロファージとろ胞樹状細胞とリンパ節につながる（ｓｅｒｖｉｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｏｄｅ）血管の壁を覆う内皮細胞とが含まれる。
【０００５】
リンパ節内の細胞は、異物に対する生体防御のため互いに連絡を交わしている。異物すなわち抗原が存在するときには、抗原を取り込み、処理し、その細胞表面に抗原の部分を提示するマクロファージとろ胞樹状細胞により検出される。これらの細胞表面抗原はＴおよびＢリンパ球に提示され、これらの細胞を増殖させ、それぞれ活性化されたＴリンパ球と形質細胞に分化させる。これらの細胞は、抗原を探知し破壊するために循環（ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）に放出される。ＴおよびＢリンパ球の一部はメモリー細胞にも分化する。これらの細胞が後日同一の抗原に出会うことがあると、免疫反応はより迅速に進行する。
【０００６】
ひとたび活性化されたＴおよびＢリンパ球が循環に放出されると、抗原の破壊に最終的につながるさまざまな機能を果たすことができる。活性化されたＴリンパ球は、細胞表面に外来抗原を有する他の細胞を認識し、該細胞を細胞溶解により殺す細胞障害性リンパ球（別名キラーＴ細胞）に分化できる。活性化されたＴリンパ球は、Ｂリンパ球および他のＴリンパ球を刺激して抗原に反応させるためにタンパク質を分泌する、ヘルパーＴ細胞にも分化できる。さらに、活性化Ｔリンパ球は、Ｂリンパ球の活動を抑制する因子を分泌する、サプレッサーＴ細胞に分化できる。活性化したＢリンパ球は、外来抗原と結合する抗体を産生し分泌する形質細胞に分化する。抗原抗体複合体は、マクロファージによりまたは補体として知られる血液の一群の構成成分により検出、破壊される。
【０００７】
リンパ節を解離することができ、リンパ節を解離して得られた細胞を培養下で増殖することができる。組織培養ディッシュに接着する細胞はしばらくの間維持可能で、間質細胞として知られている。これらの培養された細胞は不均一な集団で、細網細胞、ろ胞樹状細胞、マクロファージおよび内皮細胞のようなリンパ節内にいる大半の細胞からなる。骨髄の間質細胞が造血幹細胞のホーミング、増殖および分化に決定的な役割を果たすことは良く知られている。間質細胞により産生されるタンパク質は試験管内での形質細胞の維持に必要である。さらに、間質細胞はリンパ腫細胞の生存に必要な因子を分泌し膜結合レセプターを提示することが知られている。
【０００８】
フレーキースキン（ｆｓｎ−／−）と命名された常染色体劣性突然変異が純系Ａ／Ｊマウス系統で記載されている（ジャクソン研究所、メイン州、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ）。このマウスはヒトの乾癬に類似する皮膚疾患を有する。乾癬は人口の２％が罹患するありふれた疾患で、皮膚の肥厚と鱗屑化を伴う慢性の炎症を特徴とする。皮膚の病変部の組織学所見は、皮膚の最上層である上皮細胞の増殖の増加と、上皮の下の皮膚の層である真皮でのリンパ球を含む炎症細胞の異常な存在とを示す。病因は不明だが、乾癬はＴリンパ球が関与する免疫系の障害を伴う。この疾患は家族性で、遺伝的要因が関与することが示された。前記ｆｓｎ遺伝子の突然変異マウスには、乾癬様皮膚疾患のみならず、免疫系および造血系の細胞が関与する他の異常もある。このマウスでは脾臓とリンパ節を含むリンパ器官の肥大を伴うリンパ球数の著しい増大が起こる。さらに、肝臓の肥大と貧血がみられる。したがって、ｆｓｎ−／−マウスの異常なリンパ節で発現する遺伝子とタンパク質は、免疫および造血系細胞の発生または機能と、これらの細胞の炎症疾患における反応と、炎症シグナルに対する皮膚その他の結合組織細胞の応答とに影響を与えている。
【０００９】
本技術分野には、免疫系の全細胞を調整する機能を有するタンパク質をエンコードする遺伝子を同定する必要性がある。正常または異常なリンパ節由来のこれらのタンパク質は、腫瘍細胞または細菌、ウイルス、原生動物および蠕虫のような感染因子に対する免疫応答を調整するうえで有用である。かかるタンパク質は、Ｉ型過敏性反応（枯草熱、湿疹、アレルギー性鼻炎、喘息等）とＩＩ型過敏性反応（輸血反応、新生児溶血症等）を含む、免疫系が身体に好ましくない反応を惹起する疾患の治療に有用である。他の好ましくない反応が、持続感染を起こした器官あるいはカビ、植物または動物由来の物質を繰り返し吸入した後の肺で形成される免疫複合体を原因とするＩＩＩ型反応と、らい病、住血虫症、皮膚炎等の疾患でのＩＶ型反応において惹起される。
【００１０】
免疫系の新規なタンパク質は、生体が自己を外来と認識する自己免疫疾患の治療にも有用である。かかる疾患の例には、関節リュウマチ、アジソン病、潰瘍性大腸炎、皮膚筋炎および狼瘡が含まれる。かかるタンパク質は生体が移植された組織を外来と認識して殺そうとすることがよく起こる組織移植と、移植された細胞が宿主細胞を攻撃して死に至ることがよく起こる骨髄移植の際にも有用である。
【００１１】
したがって、免疫系に関連する疾患を含む疾患の治癒のための治療薬の開発に利用する目的で、免疫系細胞で発現するタンパク質をエンコードする遺伝子を同定、単離することの必要性が本技術分野には存在する。
【００１２】
発明の概要
本発明は、ｆｓｎ−／−マウスのリンパ節間質細胞中に発現するＦＧＦＲ５ポリペプチドおよび該ポリペプチドの機能性のある部分と、かかるポリペプチドのヒトのホモログと、かかるポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドとの同定および単離に基づく。
【００１３】
したがって本発明は、ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を含む組成物を提供する。かかる変調剤は、（ａ）遺伝子発現の低分子阻害剤と、（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチドと、（ｃ）短鎖干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）とを含むがこれらに限定されない。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、（ａ）アンチセンス発現ベクターと、（ｂ）アンチセンス・オリゴデオキシリボヌクレオチドと、（ｃ）アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴデオキシリボヌクレオチドと、（ｄ）アンチセンス・オリゴリボヌクレオチドと、（ｅ）アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴリボヌクレオチドとを含む。
【００１４】
一部の実施態様では、ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、（ａ）  配列番号：  １−４  および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドと、（ｂ）配列番号：  １−４  および  ９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの相補体と、（ｃ）配列番号：  １−４  および  ９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの逆配列と、（ｄ）配列番号：  ５−８  および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドと、（ｅ）  配列番号：  ５−８  および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの相補体と、（ｆ）  配列番号：  ５−８  および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの逆配列とを含むポリヌクレオチドに特異的に結合する。
【００１５】
本発明の一部の実施態様では、ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、ＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触されるとき、ＦＧＦＲ５遺伝子発現を減少させるうえで効果的である。他の側面では、ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、ＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触されるとき、オステオポンチンの遺伝子発現を減少させるうえで効果的である。
【００１６】
本発明の他の実施態様はＦＧＦＲ５ポリペプチドの機能の変調剤である結合剤を含む組成物を提供し、該結合剤は、（ａ）低分子と、（ｂ）抗体またはその抗原結合断片と、（ｃ）短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、（ｄ）ラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）と、（ｅ）ＦＧＦＲ５リガンドまたはその抗原結合断片とを含む。
【００１７】
これらの実施態様では、前記結合剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドまたはその相補体によってコード化されるポリペプチドと、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドとを含むポリペプチドに特異的に結合する。
【００１８】
企画する正確な用途に応じて結合剤は、例えばＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触するとき該細胞集団でのオステオポンチン遺伝子発現を増大させる効果を有するＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアゴニストの場合がある。代替的に結合剤は、例えばＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触するとき該細胞集団でのオステオポンチン遺伝子発現を減少させる効果を有するＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアンタゴニストの場合がある。
【００１９】
本発明のさらに別の実施態様は、細胞集団でのオステオポンチン遺伝子発現を変調する方法を提供する。一部の側面ではこれらの方法は、上記列挙された組成物の１つに細胞集団を接触させるステップを含む。したがって一部の方法では、ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドと、（ｂ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの相補体と、（ｃ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの逆配列と、（ｄ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドと、（ｅ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの相補体と、（ｆ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの逆配列とを含むポリヌクレオチドに特異的に結合する。
【００２０】
これらの方法では前記ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、ＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触されるときＦＧＦＲ５遺伝子発現を減少させること、および／または、ＦＧＦＲ５を発現する細胞集団に接触されるときオステオポンチン遺伝子発現を減少させることに効果がある。適当なかかるＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、（ａ）アンチセンス発現ベクターと、（ｂ）アンチセンス・オリゴデオキシリボヌクレオチドと、（ｃ）アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴデオキシリボヌクレオチドと、（ｄ）アンチセンス・オリゴリボヌクレオチドと、（ｅ）アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴリボヌクレオチドとのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００２１】
他の側面では、本発明は細胞集団でのオステオポンチン発現を変調する方法を提供する。前記方法は、上記列挙された結合剤を含む組成物に前記細胞集団を接触させるステップを含む。例えばかかる方法は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドまたはその相補体がコードするポリペプチドと、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドとのようなポリペプチドに特異的に結合する結合剤を用いる。結合剤は、ＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアゴニストを含み、該アゴニストの前記細胞集団との結合は、前記アゴニストが前記細胞集団に接触するときオステオポンチン発現の増大につながる。代替的に結合剤は、ＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアンタゴニストを含み、該アンタゴニストの前記細胞集団との結合は、前記アンタゴニストが前記細胞集団に接触するときオステオポンチン発現の減少につながる。
【００２２】
本発明のさらに別の実施態様は、オステオポンチン発現の増大に関連する疾患の治療薬にＦＧＦＲ５変調剤を提供する。一部の側面では前記変調剤は、（ａ）低分子遺伝子発現阻害剤と、（ｂ）アンチセンス・オリゴヌクレオチドと、（ｃ）短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）とを含む。
【００２３】
ＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドと、（ｂ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの相補体と、（ｃ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドの逆配列と、（ｄ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドと、（ｅ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの相補体と、（ｆ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの逆配列とを含むポリヌクレオチドに特異的に結合する。
【００２４】
本発明のＦＧＦＲ５変調剤で適切に治療されるオステオポンチン遺伝子発現の増大に関連する代表的な疾患は、がん、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性ループス・エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、リウマトイド関節炎（ＲＡ）、サルコイドーシス、結核、腎結石、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、腎炎、関節炎および骨粗鬆症を含む。
【００２５】
本発明の他の関連する側面では、（ａ）低分子と、（ｂ）抗体またはその抗原結合断片と、（ｃ）短鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）と、（ｄ）ラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）とを含む、ＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアンタゴニストである結合剤のオステオポンチン発現の増大に関連する疾患の治療薬における使用方法が提供される。
【００２６】
ここで提供される代表的な結合剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドまたはその相補体にコード化されたポリペプチドと、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドとを含むポリペプチドと特異的に結合する。
【００２７】
ここに列挙されたような結合剤は、がん、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性ループス・エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、リウマトイド関節炎（ＲＡ）、サルコイドーシス、結核、腎結石、アテローム性動脈硬化症、脈管炎、腎炎、関節炎および骨粗鬆症を含む、オステオポンチン発現の増大と関連する疾患の治療に用いるのに適する場合がある。
【００２８】
本発明の他の実施態様は、（ａ）低分子と、（ｂ）抗体またはその抗原結合断片と、（ｃ）短鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）と、（ｄ）ラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）と、（ｅ）ＦＧＦＲ５リガンドまたはそのＦＧＦＲ５結合断片とを含む、ＦＧＦＲ５ポリペプチド機能のアゴニストである結合剤のオステオポンチン発現の減少に関連する疾患の治療薬における使用方法を提供する。
【００２９】
オステオポンチン発現の減少に関連する疾患の治療に適する結合剤は、（ａ）配列番号１−４および９からなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドまたはその相補体にコード化されたポリペプチドと、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５からなるグループから選択される配列を含むポリペプチドとを含むポリペプチドと特異的に結合する。オステオポンチン発現の減少と関連する代表的な疾患は骨化石症である。
【００３０】
本発明の他の実施態様は、ここに上記列挙の組成物の１つを患者に投与するステップを含む、オステオポンチン発現の増大と関連する疾患の治療方法を提供する。本発明の関連する側面は、患者の、乳癌、肝細胞性癌腫および大腸癌を含む、がんの治療方法と、骨粗鬆症および骨化石症を含む骨疾患の治療方法と、ＦＧＦＲ５関連疾患の治療方法とを提供する。これらの方法のそれぞれは、ここに提供される組成物の１つまたは２つ以上の投与を含む。
【００３１】
本発明のさらに別の実施態様は、（ａ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列と、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、（ｃ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、（ｄ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とを含むアミノ酸配列を含むポリペプチドの細胞内の量を減少させるステップを含む、細胞集団におけるオステオポンチン発現を阻害する方法を提供する。
【００３２】
細胞集団でのオステオポンチン発現を阻害する関連方法は、ここに提供される組成物を投与することによって、（ａ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列と、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、（ｃ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、（ｄ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とのようなアミノ酸配列を含むポリペプチドの前記細胞集団での活性を阻害するステップを含む。
【００３３】
（ａ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列と、（ｂ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、（ｃ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、（ｄ）配列番号５−８および１３−１５に提供される配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチと特異的に結合する結合剤を含む組成物を投与するステップを含む、オステオポンチン発現の増大によって特徴づけられる疾患を治療するためのその他の方法が、ここに提供される。
【００３４】
（ａ）配列番号１−４および９に提供される配列と、（ｂ）配列番号１−４および９に提供される配列との同一性が少なくとも７５％ある配列と、（ｃ）配列番号１−４および９に提供される配列との同一性が少なくとも９０％ある配列と、（ｄ）配列番号１−４および９に提供される配列との同一性が少なくとも９５％ある配列とからなるグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドと特異的に結合するＦＧＦＲ５遺伝子発現の変調剤を含む、ここに提供される組成物を投与するステップを含む、オステオポンチン発現の増大によって特徴づけられる疾患を治療するためのさらに別の方法がここに提供される。
【００３５】
以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の上記のおよびさらなる特長およびその入手法は明らかとなり、本発明は最も良く理解される。ここで開示された全ての参照文献は、引用によりそれらの全体がそれぞれ個別に取り込まれたかのように取り込まれる。
【００３６】
図面の簡単な説明
図１は、マウスのＦＧＦレセプターｍｕＦＧＦβ（配列番号６）のアミノ酸配列である。２量体形成、リガンド結合および前記レセプター活性に関与する複数の保存されたドメインが同定された。シグナルペプチドおよび膜貫通領域に下線が引かれ、ＦＧＦＲファミリーメンバー間で保存される６個のシステインは太字および下線で示される。４個の糖付加部位は二重下線で示される。３個の免疫グロブリンドメイン（Ｉｇループ、Ｉｇループ１：４０−１０２番残基、Ｉｇループ２：１６１−２２４番残基、Ｉｇループ３：２５７−３４１番残基）と、２個のチロシンキナーゼリン酸化部位（１９８−２０１番および３２５３３２番残基）、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存タンパク質キナーゼリン酸化部位（２０８−２１５番残基）および４個のプレニル基結合部位（ＣＡＡＸボックス）とが同定された。前記リン酸化部位およびＣＡＡＸボックスは箱囲みで示される。ヘパリン結合ドメイン（１５０−１６７番残基、太字および箱囲み）が同定され、これは部分的にＣＡＭ結合ドメイン（１４１−１６０番残基、斜字および下線）と重なる。
【００３７】
図２Ａは、ＳＲＥの制御下での遺伝子誘導を示す。ＮＩＨ−３Ｔ３  ＳＲＥ細胞が、１０ｍｇ／ｍＬのヘパリン存在下でＦＧＦ−２の希釈系列で６時間刺激された。黒丸は培地のみを、白四角はＦＧＦ−２の希釈系列を表す。図２Ｂは、異なる濃度のＦＧＦＲ２Ｆｃ（黒菱形）、ＦＧＦＲ５βＦｃ（黒三角）およびＦＧＦ−２のみ（星印）の存在下で、標準投与量のＦＧＦ−２およびヘパリンで処理されたＮＩＨ−３Ｔ３  ＳＲＥ細胞の競合解析を示す。両方の実験の平均およびＳＤは３個の別々のウェルから計算され、対照と比較してレポータ遺伝子の誘導が何倍であったかを表す。
【００３８】
図３はＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによるＲＡＷ２６４．１０細胞ｎ増殖刺激を示す。この刺激は、ＦＧＦ−２およびＦＧＦＲ２が対照として用いられたときには観察されなかった。この刺激は増殖培地によっても誘導されなかった。
【００３９】
図４はＰＨＡで誘導されたＰＢＭＣへのＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γの増殖増強効果を示す。ＦＧＦＲ２または精製ＩｇＧＦｃが用いられたときには増殖の増強は観察されなかった。
【００４０】
図５は、ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによる抗ＣＤ３で刺激されたＰＢＭＣの増殖の増強を示す。ＦＧＦＲ２または精製ＦＣが刺激剤として用いられたときには増殖の増強は観察されなかった。
【００４１】
図６は、ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γも、対照のＦＧＦＲ２もＩｇＧＦｃも、ＰＨＡ非存在下ではＰＢＭＣの増殖を刺激しなかったことを証明する。
【００４２】
図７は、ＰＢＭＣの接着の刺激がＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによって起こるが、ＦＧＦＲ２または精製ＩｇＧＦｃによっては起こらないことを示す。
【００４３】
図８は、接着したＰＨＡ刺激ＰＢＭＣの刺激がＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによって起こるが、精製ＩｇＧＦｃによっては起こらないことを示す。
【００４４】
図９は、ＮＫ細胞のマーカーである抗ＣＤ５６抗体の存在下で測定された、ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによるＮＫ細胞の接着の刺激を示す。黒いヒストグラムは、ＮＫ細胞のマーカーＣＤ５６で染色された接着性ＰＢＭＣを表し、白いヒストグラムは、アイソタイプが適合した対照抗体で染色された同じ細胞を表す。
【００４５】
図１０は、ヒトＦＧＦＲ５のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。２量体形成、リガンド結合およびレセプター活性に関与する、複数の保存されたドメインが同定された。シグナルペプチドは下線で示され、ＦＧＦＲファミリーメンバー間で保存される６個のシステインのうちの５個が太字および下線で示される。３個の免疫グロブリンドメイン（Ｉｇループ、Ｉｇループ１：４４−１０６番残基、Ｉｇループ２：１６５−２２８番残基、Ｉｇループ３：部分的）と、１個のチロシンキナーゼリン酸化部位（２１２−２１９番残基）、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存タンパク質キナーゼリン酸化部位（２０２−２０５番残基）および４個のプレニル基結合部位（ＣＡＡＸボックス）とが同定された。前記リン酸化部位およびＣＡＡＸボックスは箱囲みで示される。ヘパリン結合ドメイン（１５４−１７１番残基、太字および箱囲み）が同定され、これは部分的にＣＡＭ結合ドメイン（１４５−１６４番残基、斜字および下線）と重なる。
【００４６】
図１１Ａ−Ｃは、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ５、ＬＰＳまたは培地単独で２４時間刺激した後のＯＰＮタンパク質（図１１Ａ）、ＰＢＭＣ（図１１Ｂ）および接着性ＰＢＭＣ（単球が優占的、図１１Ｃ）の上向き調節を示す棒グラフである。上清がサイトカイン分析用に回収された。
【００４７】
発明の詳細な説明
１つの側面では、本発明は、ｆｓｎ−／−マウスのリンパ節間質細胞から単離されたポリヌクレオチドと、かかるポリヌクレオチドにコード化された単離ポリペプチドと、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドのヒトのホモログとを提供する。
【００４８】
ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基の１本鎖または２本鎖の重合体を意味し、ＤＮＡ分子およびこれと対応する、ＨｎＲＮＡとｍＲＮＡ分子を含めた、センス鎖とアンチセンス鎖の両方のＲＮＡ分子を含み、全合成または部分合成されたポリヌクレオチドとともに、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡと組み換えＤＮＡを含む。ＨｎＲＮＡ分子はイントロンを含み、ＤＮＡ分子と一般的に１対１に対応する。ｍＲＮＡ分子は、イントロンが切り出されたＨｎＲＮＡおよびＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチドは、遺伝子全体またはその部分からなる。操作可能なアンチセンスポリヌクレオチドは対応するポリヌクレオチドの断片を含み、それゆえに「ポリヌクレオチド」の定義は全てのかかる操作可能なアンチセンス断片を含む。アンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを伴う技術は本発明の技術分野において周知であり、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２５４巻、２３号、３６３−３７５頁、１９９５年およびＫａｗａｓａｋｉら、Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ、２０巻、８号、８３６−８４８頁、１９９６年に説明される。
【００４９】
特定の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１−４および９に提供された配列からなるグループから選択されたポリヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
かかる単離されたポリヌクレオチドの相補体と逆相補体と逆配列が、上記のポリヌクレオチドのいずれかの少なくとも特定された数の連続した残基（ｘ量体）と、上記のポリヌクレオチドのいずれかに対応する拡張された配列と、上記のポリヌクレオチドのいずれかに対応するアンチセンス配列と、本明細書に説明するとおりの上記のポリヌクレオチドのいずれかの変異体のグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドとともに提供される。
【００５１】
ここで使用された「相補体」、「逆相補体」、および「逆配列」という用語の定義は、以下の例で最も良く示されている。５’ＡＧＧＡＣＣ３’という配列に対して、相補体、逆相補体および逆配列は以下のとおりである。
【００５２】
相補体                ３’ＴＣＣＴＧＧ５’
逆相補体              ３’ＧＧＴＣＣＴ５’
逆配列                ５’ＣＣＡＧＧＡ３’
【００５３】
好ましくは、列挙された特定のポリヌクレオチド配列の相補体は、該特定のポリヌクレオチド配列の全長にわたって相補的である。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドの一部は、完全長ポリペプチドをコード化する完全長遺伝子を意味しないという点で、部分（ｐａｒｔｉａｌ）配列である。かかる部分配列は、プライマーおよび／またはプローブ、ならびに周知のハイブリダイゼーション技術および／またはＰＣＲ技術を用いて、さまざまなＤＮＡライブラリを分析し、配列決定することにより拡張することができる。部分配列は、ポリペプチドをコード化するオープン・リーディング・フレーム、完全長ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを発現可能な遺伝子あるいは別のゲノムの有用な部分が同定されるまで拡張できる。完全長ポリヌクレオチドおよび遺伝子を含むかかる拡張された配列は、この拡張されたポリヌクレオチドが、配列番号１−４および９の配列の１つとして同定された配列またはその変異体、あるいはその１つの連続した部分（ｘ量体）またはその変異体を含むとき、配列番号１−４および９の１つの配列またはその変異体あるいは配列番号１−４および９の１つの配列の部分またはその変異体に対応すると記載される。かかる拡張されたポリヌクレオチドは、約５０個ないし約４、０００個の核酸または塩基対の長さを有するものであってもよいが、約４、０００個以下の核酸または塩基対の長さを有するのが好ましく、約３、０００個の核酸または塩基対の長さを有するのがより好ましく、約２、０００個の核酸または塩基対の長さを有するのがさらに好ましい。ある状況の下では、本発明の拡張されたポリヌクレオチドは、約１、８００個未満の核酸または塩基対を有するものでもよいが、約１、６００個未満の核酸または塩基対を有するのが好ましく、約１、４００個未満の核酸または塩基対を有するのがより好ましく、約１、２００個未満の核酸または塩基対を有するのがさらに好ましく、約１、０００個未満の核酸または塩基対を有するのが最も好ましい。
【００５５】
同様に、本発明のポリヌクレオチドに対応するＲＮＡ配列、逆配列、相補配列、アンチセンス配列等は、配列番号１−４および９として同定されたｃＤＮＡ配列を用いて、ルーティン化した手順で確認し、取得することができる。
【００５６】
配列番号１−４および９として同定されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドまたはポリペプチドの機能性のある部分をコード化するオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）または部分的なオープン・リーディング・フレームを含む。オープン・リーディング・フレームは、当業者に周知の技術を用いて同定できる。これらの技術は、例えば既知の開始および終了コドンの位置の解析、コドン頻度にもとづく最も可能性の高い読み枠の同定等を含む。オープン・リーディング・フレームおよびオープン・リーディング・フレームの部分は、本発明のポリヌクレオチドの中に同定できる。ＯＲＦ解析用に適するツールおよびソフトウェアは、当業者に周知で、例えば、サンガーセンター（Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０  １ＳＡ、英国）から入手可能なＧｅｎｅＷｉｓｅと、ミネソタ大学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＵＭＨＧ  Ｂｏｘ  ４３  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ  ５５４５５）から入手可能なＤｉｏｇｅｎｅｓと、オークリッジ国立研究所（ｔｈｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ  ＴＮ）から入手可能なＧＲＡＩＬとを含む。ひとたび部分的なオープン・リーディング・フレームが同定されると、ポリヌクレオチドは、完全なオープン・リーディング・フレームのポリヌクレオチドが同定できるまで、当業者に周知の技術を用いて部分オープン・リーディング・フレームの領域において拡張することができる。よって、ポリペプチドおよび／またはポリペプチドの機能性のある部分をコード化するオープン・リーディング・フレームは、本発明のポリヌクレオチドを用いて同定できる。
【００５７】
ひとたびオープン・リーディング・フレームが本発明のポリヌクレオチドにおいて同定されると、該オープン・リーディング・フレームは、単離および／または合成できる。前記オープン・リーディング・フレームと、当業者に周知の適当なプロモーター、イニシエーター、ターミネーター等とを含む、発現可能な遺伝子コンストラクトが構築できる。かかる遺伝子コンストラクトは、前記オープン・リーディング・フレームにエンコードされたポリペプチドを発現するために宿主細胞に導入される。適当な宿主細胞は植物細胞、哺乳類細胞、細菌細胞、藻類等を含むさまざまな原核および真核細胞を含む。
【００５８】
別の側面では、本発明は、上記のポリヌクレオチドにエンコードされるか、または部分的にエンコードされる単離ポリペプチドを提供する。ここで使用された「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共有結合で連結された、完全長を含むいかなる長さのアミノ酸鎖をも含む。本発明のポリペプチドは、天然物から精製された産物であっても、組み換え技術を用いて部分的にあるいは全面的に生産されてもかまわない。ポリペプチドは、シグナルペプチド（またはリーダーペプチド）配列をタンパク質のＮ末端に含む場合があり、該シグナルペプチドは、翻訳と同時に、あるいは、翻訳後に、前記タンパク質の輸送を指示する。前記ポリペプチドは、該ポリペプチドの合成、精製または同定の便宜のため（例えばポリ−Ｈｉｓ）、あるいは、前記ポリペプチドの固体支持体への結合を増強するためのリンカーその他の配列にコンジュゲートされる場合もある。例えば、ポリペプチドは免疫グロブリンＦｃ領域にコンジュゲートされる場合がある。
【００５９】
ここで使用された「ポリヌクレオチドにコード化されたポリペプチド」という用語は、本発明の部分単離ＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列によりコード化されたポリペプチドを含む。特定の実施態様では、本発明のポリペプチドは配列番号５−８および１３−１５に提供された配列とかかる配列の変異体とからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドにコード化されたポリペプチドは、その生物活性を決定するために、発現され、さまざまなアッセイ法に使用される。かかるポリペプチドは、抗体作成と、相互作用する相手の蛋白質またはその他の化合物の単離と、相互作用する相手のタンパク質またはその他の化合物のレベルの定量的な測定とに用いることができる。
【００６１】
ここに記載されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、全て当業者に慣用される条件で単離精製される。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％純粋であることが好ましく、少なくとも９０％純粋であることがより好ましく、少なくとも９９％純粋であることが最も好ましい。
【００６２】
ここで用いられる「変異体」という用語は、具体的に同定された配列と異なるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含むものであって、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、欠失、置換または付加されたものをいう。変異体は、自然界に存在する対立遺伝子の変異体でも、自然界に存在しない変異体でもよい。変異体配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、本発明の配列に対し少なくとも７５％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、最もよく好ましくは少なくとも９５％または９８％の残基の同一性を示すものをいう。残基の同一性の百分率は周知の技術を用いて決定される場合がある。１つの実施態様では、残基の同一性の百分率は、比較する２つの配列のアライメントをとり、アライメントがとれた部分の同一残基数を決定し、該同一残基数を本発明の（クエリーの）配列中の全残基数で除算し、その結果を１００倍したものをいう。
【００６３】
配列番号１−９、１３−１５のうちの１つに同定されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドと特定の百分率の残基の同一性を有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、その一次構造に高度の類似性を共有する。本発明のポリヌクレオチドとの特定の百分率の残基の同一性に加えて、変異体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは本発明のポリヌクレオチドと追加の構造的および／または機能的な特徴を共有することが好ましい。本発明のポリヌクレオチドと特定の百分率の残基の同一性を有するか、あるいは、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションできるポリヌクレオチドは、（１）列挙された配列番号のポリヌクレオチドにコード化されるポリペプチドまたはその機能性がある部分と実質的に同一の機能特性を有するポリペプチドまたはポリペプチドの機能性がある部分をコード化するオープン・リーディング・フレームまたは部分的なオープン・リーディング・フレームを両者が含むこと、あるいは、（２）両者が同定可能なドメインを共通に含むことという特徴のうち少なくとも１つを追加的に有するこのが好ましい。
【００６４】
公開で入手可能なコンピューターアルゴリズムを用いて、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のアライメントをとることができ、特定の領域のヌクレオチドの同一性の百分率を別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して決定することができる。説明書に説明され、アルゴリズムとともに配布されるデフォールトのパラメータに設定されたＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムは、ポリヌクレオチド配列のアライメントおよび類似性同定とのための２つの代表的なアルゴリズムである。ポリペプチド配列のアライメントおよび類似性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べられる場合がある。ＢＬＡＳＴＸおよびＦＡＳＴＸアルゴリズムは、ヌクレオチドのクエリー配列の６つの読み枠の概念的な翻訳産物をポリペプチド配列に対して比較する。ＢＬＡＳＴＸおよびＦＡＳＴＸアルゴリズムは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、２４４４−２４４８頁、１９８８年と、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３巻、６３−９８頁、１９９０年とに説明されている。ＦＡＳＴＡソフトウェアパッケージは、「ｔｈｅ  Ａｓｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｒｏｖｏｓｔ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＰＯ  Ｂｏｘ  ９０２５、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ  ２２９０６−９０２５」に連絡することにより、バージニア大学から入手可能である。ＢＬＡＳＴＮソフトウェアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ、Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４から入手可能である。説明書に記載され、前記アルゴリズムとともに配布された、デフォルトのパラメーター値に設定したＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．１１（２０００年１月２０日）を、本発明による変異体の決定に用いるのが好ましい。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムの使用方法は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「ギャップ入りＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年という刊行物に説明されている。
【００６５】
以下のランニングパラメーターを、ポリヌクレオチドのＥ値（Ｅ  ｖａｌｕｅ）および同一性の百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＮを使うアライメントおよび類似性の決定に用いるのが好ましい。Ｕｎｉｘ（登録商標）のランニングコマンドは、「ｂｌａｓｔａｌｌ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ  −ｄ  ｅｍｂｌｄｂ  −ｅ  １０  −Ｇ  ０  −Ｅ  ０  −ｒ  １  −ｖ  ３０  −ｂ  ３０  −ｉ  ｑｕｅｒｙｓｅｑ  −ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ」で、パラメーターのデフォルト値は以下のとおりである。
−ｐ    プログラムの名称  ［文字列］；
−ｄ    データベース  ［文字列］；
−ｅ    期待値（Ｅ）  ［実数］；
−Ｇ    ギャップを空けるためのコスト（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）  ［整数］；
−Ｅ    ギャップを拡張するためのコスト（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）  ［整数］；
−ｒ    ヌクレオチドのマッチの報酬（ＢＬＡＳＴＮのみ）  ［整数］；
−ｖ    １行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数（Ｖ）  ［整数］；
−ｂ    表示するアライメントの数（Ｂ）  ［整数］；
−ｉ    クェリーファイル  ［Ｆｉｌｅ  Ｉｎ］；
−ｏ    ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル  ［Ｆｉｌｅ  Ｏｕｔ］    任意。
【００６６】
ポリペプチド配列のＥ値および同一性の百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＰを使うアライメントおよび類似性の決定には以下のランニングパラメーターを用いるのが好ましい。「ｂｌａｓｔａｌｌ  −ｐ  ｂｌａｓｔｐ  −ｄ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄｂ  −ｅ  １０  −Ｇ  ０  −Ｅ  ０  −ｖ  ３０  −ｂ  ３０  −ｉ  ｑｕｅｒｙｓｅｑ  −ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ」で、パラメーターは以下のとおりである。
−ｐ    プログラムの名称  ［文字列］；
−ｄ    データベース  ［文字列］；
−ｅ    期待値（Ｅ）  ［実数］；
−Ｇ    ギャップを空けるためのコスト（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）  ［整数］；
−Ｅ    ギャップを拡張するためのコスト（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）  ［整数］；
−ｖ    １行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数（Ｖ）  ［整数］；
−ｂ    表示するアライメントの数（Ｂ）  ［整数］；
−Ｉ    クェリーファイル  ［Ｆｉｌｅ  Ｉｎ］；
−ｏ    ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル  ［Ｆｉｌｅ  Ｏｕｔ］    任意。
【００６７】
ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡまたは同様のアルゴリズムにより作成された、クエリー配列による１以上のデータベース配列への「ヒット」は、配列の類似部分のアライメントをとって同定する。前記ヒットは、類似性の程度および配列重複の長さの順に並べられる。データベース配列へのヒットは、前記クエリー配列の配列長の一部としか重複しないことを意味するのが一般的である。
【００６８】
上記のとおり、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一性の百分率は、デフォールトのパラメータに設定されたＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰのような適当なアルゴリズムを用いてポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のアライメントをとること、アライメントのとれた部分のわたる同一の核酸またはアミノ酸の個数を同定すること、同一の核酸またはアミノ酸の個数を本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの核酸またはアミノ酸の全個数で除算すること、および、同一性の百分率を決定するために１００倍することによって決定される。例として、２２０個の核酸を有するクエリーのポリヌクレオチドが、デフォールトのパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムによって生成されたアライメントにおいて、ＥＭＢＬデータベース中のポリヌクレオチド配列に２３ヌクレオチドの長さにわたってヒットする。前記２３ヌクレオチドのヒットは２１個の同一のヌクレオチドと、１箇所のギャップと、１個の異なるヌクレオチドとを含む。前記ＥＭＢＬデータベース中のヒットに対する前記クエリーのポリヌクレオチドの同一性の百分率は、２１／２２０すなわち９．５％である。ポリペプチドの同一性の百分率も同様にして決定できる。
【００６９】
ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズムは、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのアライメントの「期待」（Ｅ）値をも算出する。Ｅ値は、一定の規模のデータベースを検索したときに偶然一定数の隣接した配列にわたって発見が「期待」できるヒットの数を示す。Ｅ値は、データベースへのヒットが真の類似性を表すかどうかを決定するための、有意性の閾値として用いられる。例えば、あるポリヌクレオチドのヒットに付与されたＥ値が０．１であることは、ＥＭＢＬデータベースの規模のデータベースにおいて、同様のスコアの配列のアライメントをとった部分にわたって、偶然０．１回マッチすることが期待できると解釈される。この判定基準により、前記ポリヌクレオチド配列のアライメントがとれてマッチした部分は、９０％が同一である確率を有することになる。アライメントがとれてマッチした部分にわたって０．０１未満のＥ値を有する配列については、アルゴリズムＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡを用いてＥＭＢＬデータベースで偶然マッチするものを見つける確率は、１％以下である。ポリペプチド配列についてのＥ値は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースのようなさまざまなポリペプチドのデータベースを用いて、同様にして決定できる。
【００７０】
１つの実施態様によると、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのそれぞれに関して、「変異体」のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのそれぞれよりも核酸の数が同じか少ない配列で、かつ本発明のポリヌクレオチドと比べて０．０１未満のＥ値となる配列を含むのが好ましい。すなわち、変異体のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である確率が９９％以上あり、上記のデフォールトのパラメータ設定でＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下となる、いかなる配列をもいう。好ましい実施態様によると、変異体ポリヌクレオチドとは、上記のデフォールトのパラメータ設定でＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いるとＥ値が０．０１以下となり、９９％以上の確率で本発明のポリヌクレオチドと同一となる、本発明のポリヌクレオチドの核酸の数以下の数の核酸を有する配列をいう。同様に、好ましい実施態様によると、変異体ポリペプチドとは、上記のデフォールトのパラメータ設定でＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いるとＥ値が０．０１以下となり、９９％以上の確率で本発明のポリヌクレオチドと同一となる、本発明のポリペプチドのアミノ酸の数以下の数のアミノ酸を有する配列をいう。
【００７１】
代替的な実施態様では、変異体ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする配列である。相補性を決定するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約１Ｍ未満、より通常は約５００ｍＭ未満、そして好ましくは約２００ｍＭ未満の塩条件を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５°Ｃの低温でもよいが、一般的には約２２°Ｃより高く、より好ましくは約３０°Ｃより高く、最も好ましくは約３７°Ｃより高い場合がある。ＤＮＡ断片が長いほど特異的なハイブリダイゼーションのためにより高温のハイブリダイゼーション温度を必要とする。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブ組成、有機溶媒の存在および塩基のミスマッチングのような他の因子によって影響される場合があるため、パラメータの組み合わせがいずれか１つのパラメータのみの絶対的な基準より重要である。「ストリンジェントな条件」の１つの例は、６Ｘ  ＳＳＣと０．２％  ＳＤＳの溶液で前洗浄し、６Ｘ  ＳＳＣと０．２％  ＳＤＳの溶液中で６５°Ｃ、終夜（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）ハイブリダイゼーションさせ、その後１Ｘ  ＳＳＣと０．１％  ＳＤＳで６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２Ｘ  ＳＳＣと０．１％  ＳＤＳで６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄することである。
【００７２】
本発明は、開示された配列とは相違するが、遺伝暗号の食い違い（ｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙ）の結果、本発明のポリヌクレオチドにコード化されるポリペプチドと類似の酵素活性を有するポリペプチドを含む。したがって、保存的置換の結果、配列番号１−４に列挙されたポリヌクレオチド配列またはこれらの配列の相補体、逆配列または逆相補体と相違する配列を含むポリヌクレオチドは、本発明により意図されたものであり、本発明に含まれる。さらに、合計が前配列長の１０％未満の欠失および／または挿入の結果として、配列番号１−４に列挙されたポリヌクレオチド配列、またはこれらの配列の相補体、逆配列または逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオチドも、本発明により意図されたものであり、かつ本発明に含まれる。同様に、合計が全配列長の１０％未満のアミノ酸置換、挿入および／または欠失の結果として、配列番号５−８および１３−１５に列挙されたポリペプチド配列と異なる配列を含むポリペプチドは、配列番号５−８および１３−１５の配列を含むポリペプチドの機能特性と実質的に同一か、あるいは、実質的に類似する機能特性を前記変異体のポリペプチドが有する場合には、本発明により意図されたものであり、かつ本発明に含まれる。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−４および９として同定されたポリヌクレオチドと、かかる配列の相補体と、逆配列と、逆相補体と、それらの変異体とのうちのいずれかの、少なくとも特定の数の連続した残基を含むポリヌクレオチド（ｘ量体）を含むポリヌクレオチドを含む。同様に、本発明のポリペプチドは、配列番号５−８および１３−１５として同定されたポリペプチドとそれらの変異体とのうちのいずれかの、少なくとも特定の数の連続した残基を含むポリペプチド（ｘ量体）を含むポリペプチドを含む。ここで用いられる「ｘ量体」という用語は、「ｘ」という特定の値に関して、配列番号１−４および９として同定されたポリヌクレオチドまたは配列番号５−８および１３−１５として同定されたポリペプチドのいずれかの、少なくとも特定された数「ｘ」の連続した残基を含む配列を指す。好ましい実施態様によると、ｘの値は少なくとも２０が好ましく、少なくとも４０がより好ましく、少なくとも６０がさらに好ましく、少なくとも８０が最も好ましい。よって、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、配列番号１−９、１３−１５として同定されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびそれらの変異体の２０量体、４０量体、６０量体、８０量体、１００量体、１２０量体、１５０量体、１８０量体、２２０量体、２５０量体、３００量体、４００量体、５００量体または６００量体を含む。
【００７４】
本発明のポリヌクレオチドは、以下の実施例１に記載のとおり、ｆｓｎ−／−マウスのリンパ節間質細胞由来のｃＤＮＡライブラリのハイスループット配列決定により単離されてもよい。代替的には、配列番号１−４および９に提供された配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブが合成され、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、ｆｓｎ−／−マウスのリンパ節間質細胞由来のｃＤＮＡライブラリまたはゲノムＤＮＡライブラリのいずれかの陽性クローンを同定するのに用いることもできる。プローブはここで提供された配列より短くてもよいが、少なくとも約１０個、好ましくは少なくとも約１５個、最も好ましくは約２０個の長さとすべきである。かかるオリゴヌクレオチドプローブで用いられるのに適するハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ法は本発明の技術分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５１巻、２６３頁、１９８７年；Ｅｒｌｉｃｈ編、「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年を参照せよ。陽性クローンは制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定等により解析できる。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドは当業者に周知の技術を用いて合成してもよいとするのが代替策である。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、５０個以上の核酸のポリヌクレオチドセグメントを得るために、自動オリゴヌクレオチド合成機（例えば、ベックマン社オリゴ１０００Ｍ  ＤＮＡシンセサイザー）を使用して合成してもよい。複数のかかるポリヌクレオチドセグメントは、分子生物学の分野で周知の標準的なＤＮＡ操作技術を用いて連結することができる。１つの代表的な従来のポリヌクレオチド合成技術は、例えば８０個の核酸を有する１本鎖ポリヌクレオチドセグメントを合成すること、該セグメントを相補的な８５個の核酸セグメントとハイブリダイゼーションしてヌクレオチド５個のオーバーハングを作り出すことを伴う。次のセグメントも同様の手法で反対側の鎖にヌクレオチド５個のオーバーハングを持つように合成される。この「粘着」末端が、前記の２つの部分がハイブリダイゼーションしたときに適切に連結することを保証する。このようにして、本発明の完全なポリヌクレオチドは、試験管内で全合成できる。
【００７６】
本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入し、適当な宿主で前記ポリペプチドを発現させることにより、遺伝子組み換え法で生産することができる。当業者に周知のさまざまな発現ベクターのいずれを用いてもかまわない。組み換えポリペプチドをコード化するＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされたいかなる適当な宿主細胞においても発現は達成できる。適当な宿主細胞には、原核生物、酵母および高等な真核細胞が含まれる。用いられた宿主細胞は大腸菌、昆虫、酵母またはＣＯＳあるいはＣＨＯのような哺乳類株細胞であることが好ましい。このやり方で発現されたＤＮＡ配列は、自然界に存在するポリペプチド、自然界に存在するポリペプチドの部分またはこれらの他の変異体をコード化できる。
【００７７】
関連する実施態様では、配列番号５−８および１３−１５に提供された配列からなるグループから選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも機能性のある部分を含むポリペプチドが提供される。ここで使用されたポリペプチドの「機能性のある部分」とは、該ポリペプチドの機能に影響を与えるために必須の活性部位を含む部分、例えば、１以上の反応物と結合することが可能な分子の部分をいう。前記活性部位は１以上のポリペプチド鎖上に存在する分離された部分からなる場合もあり、一般的に高い結合親和性を示す。一般に、かかる機能性のある部分は少なくとも約５個のアミノ酸残基を含むことが好ましく、少なくとも約１０個がより好ましく、少なくとも約２０個のアミノ酸残基を含むことが最も好ましい。本発明のポリペプチドの機能性のある部分は、まず、化学的または酵素的に該ポリペプチドを消化するか、あるいは前記ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの突然変異解析をするかのいずれかにより、前記ポリペプチドの断片を用意すること、つぎに、得られた突然変異ポリペプチドを発現させることにより同定できる。前記ポリペプチド断片または突然変異ポリペプチドは、どの部分が完全長ポリペプチドの生物活性を保持しているかを決定するためにテストされる。
【００７８】
本発明のポリペプチドの部分その他の変異体は、人工合成法または組み換え法により生成される。約１００個未満のアミノ酸であって、一般には約５０個未満のアミノ酸を有する合成ポリペプチドは、本発明の技術分野の通常の技量を有する者に周知の技術を用いて生成できる。例えば、かかるポリペプチドは、アミノ酸が次々に伸長中のアミノ酸鎖に付加されていくＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法のような、いずれかの商業的に利用可能な固相技術を用いて合成することが可能である（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５巻、２１４９−２１４６頁、１９６３年）。ポリペプチド自動合成装置は、パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ））のような供給者から入手可能であり、製造者の指示書に従って操作することができる。天然のポリペプチドの変異体は、オリゴヌクレオチド指令型（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）部位特異的突然変異生成のような標準的な突然変異生成技術を用いて調製される（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、４８８−４９２頁、１９８５年）。ＤＮＡ配列のセクションは、トランケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ポリペプチドの調製を可能にするため標準的な技術を用いて切除される。
【００７９】
本発明は、本発明の第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質か、あるいは代替的に、本発明のポリペプチドと既知のポリペプチドとを含む融合タンパク質を、かかる融合タンパク質の変異体とともに提供する。本発明の融合タンパク質は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間にリンカーポリペプチドを含む場合がある。
【００８０】
本発明の融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、第１および第２のポリペプチドをコード化する別々のポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込むように既知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築される。第１のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの３’末端が、ペプチドリンカーとともに、あるいは、ペプチドリンカーなしで、第２のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列ポリヌクレオチドの５’末端に連結され、前記配列の読み枠が適合して、前記２個のポリヌクレオチドのｍＲＮＡ翻訳が第１および第２の両方のポリペプチドの生物活性を保持する単一の融合タンパク質になる。
【００８１】
ペプチドリンカー配列が、第１および第２のポリペプチドのそれぞれがその二次構造および三次構造を形成することを確保するのに十分な距離で両ポリペプチドを隔離するのに用いられる場合がある。かかるペプチドリンカー配列は、当業者に周知の標準的な技術を用いて前記融合タンパク質に取り込まれる。適当なペプチドリンカー配列は、（１）柔軟で拡張したコンフォメーションをとることができること、（２）第１および第２のポリペプチドの機能的なエピトープと相互作用二次構造をとることができないこと、および、（３）前記ポリペプチドの機能的なエピトープと反応する可能性がある疎水性または荷電した残基がないことという因子に基づいて選択される場合がある。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒの残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような他のほぼ中性のアミノ酸を前記リンカー配列に用いてもよい。リンカーとして有用性のあるアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ、４０巻、３９−４６頁、１９８５年、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３巻、８２５８−８２６２頁、１９８６年、米国特許第４、９３５、２３３号および第４、７５１、１８０号明細書に説明されるものを含む。前記リンカー配列は、１個から約５０個のアミノ酸までの長さの場合がある。ペプチドリンカー配列は、第１および第２のポリペプチドが前記機能的なドメインを隔離して立体的な干渉を防ぐ非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有するときには、必要がない。
【００８２】
前記融合タンパク質をコード化する前記連結されたポリヌクレオチドは、当業者に知られた技術を用いて適当な発現システムにクローニングされる。
【００８３】
本発明のポリヌクレオチド配列は、免疫系の成長および発生と免疫系の組織損傷、炎症その他の疾患状態に対する応答とにおいて重要な役割を果たすポリペプチドをコード化する。前記ポリヌクレオチドの一部は、シグナル配列または膜貫通ドメインをコードする配列を含み、これらの配列からこのタンパク質産物が分泌分子またはレセプターと同定される。配列番号５−８のポリペプチドは繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプターファミリーのタンパク質のメンバーと２５％をこえる同一性がある。本発明のポリペプチドは、免疫応答の調整、免疫前駆細胞の特殊な細胞タイプへの分化、細胞移動、細胞増殖および細胞−細胞間相互作用のような過程で重要な役割を有する。前記ポリペプチドは感染因子に対する生体防御にとって重要であり、病気のない環境を維持するうえで重要である。これらのポリペプチドは、皮膚細胞の調整役（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）として働く。さらにこれらのポリペプチドは免疫学的に活性があり、広範囲の病状においてこれらのタンパク質が重要な治療の標的になる。
【００８４】
１つの側面では本発明は、１つまたは２つ以上の本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを患者の疾患を治療するために用いる方法を提供する。ここで用いられるところの「患者」は、いかなる温血動物をも指し、好ましくはヒトを指す。
【００８５】
この側面では、前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、一般に、医薬品組成物または免疫原組成物のような、組成物のなかに存在する。医薬品組成物は１つまたは２つ以上のポリペプチドを含み、そのそれぞれが１つまたは２つ以上の上記の配列（またはその変異体）と、生理的に許容される担体とを含む場合がある。免疫原組成物は、１つまたは２つ以上上記のポリペプチドと、該ポリペプチドを取り込むアジュバントまたはリポソームのような免疫刺激剤とを含む場合がある。
【００８６】
本発明の組成物は、上記の１個または２個以上のポリペプチドがその場で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）生成されるように、該ポリペプチドをコード化するＤＮＡを含むとするのが代替策である。かかる組成物では、ＤＮＡは、核酸発現システムと細菌およびウイルスの発現システムとを含む、本発明の技術分野の通常の技量を有する者に知られたさまざまな送達システムのいずれかの中に存在する場合がある。適当な核酸発現システムは（適切なプロモーターとターミネーターシグナルのような）患者の体内で発現するために必要なＤＮＡ配列を含む。細菌の送達システムは、ポリペプチドの免疫原性のある部分を菌体表面に発現する（カルメット−ゲラン菌のような）細菌の投与を伴う。好ましい実施態様では、ＤＮＡは、非病原性、すなわち非感染性だが複製能を有するウイルスを利用することを伴う発現システム（例えば、ワクシニアその他のポックスウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルス）を用いて導入される。ＤＮＡをかかる発現システムに取り込むための技術は本発明の技術分野で周知である。例えばＵｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９巻、１７４５−１７４９頁、１９９３年に記載され、Ｃｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９巻、１６９１−１６９２頁、１９９３年に総説されたとおり、ＤＮＡは「裸」であってもよい。  裸のＤＮＡの取り込みは、該ＤＮＡを細胞内に効率的に輸送される生分解性のビーズにコーティングすることによって増大する場合がある。
【００８７】
投薬の経路と頻度および投与量は、個人ごとに異なる。一般に本発明の組成物は、注射（例えば皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻内（例えば吸入）または経口で投与されてもよい。一回の投与量に存在する（または１回の投与量のＤＮＡでその場で産生される）ポリペプチドの量は、宿主の体重１ｋｇあたり約１ｐｇから約１００ｍｇまでの範囲であるのが一般的であり、宿主の体重１ｋｇあたり約１０ｐｇから約１ｍｇの範囲であるのが典型的であり、宿主の体重１ｋｇあたり約１００ｐｇから約１μｇの範囲であるのが好ましい。適当な投与サイズは患者のサイズに応じて異なるが、約０．１ｍｌから約２ｍｌまでの範囲であるのが典型的である。
【００８８】
当業者に知られたいかなる適当な担体でも本発明の医薬品組成物に用いることができるが、担体のタイプは投与モードに応じて異なる。皮下注射のような非経口的な投与のためには、前記担体は水、生理食塩水、アルコール、脂質、ワックスまたは緩衝液を含むのが好ましい。経口投与のためには、上記のいずれかの担体あるいはマニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロースおよび炭酸マグネシウムのような固体の担体が用いられる。（例えばポリ酪酸ガラクチド（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ｇａｌａｃｔｉｄｅ）のような）生分解性ミクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）も本発明の医薬品組成物の担体として用いることができる。適当な生分解性のミクロスフェアは、例えば米国特許明細書第４、８９７、２６８号明細書および第５、０７５、１０９号明細書に開示されている。
【００８９】
さまざまなアジュバントのどれでも、免疫応答を非特異的に増強するため本発明の免疫原組成物に用いることができる。大抵のアジュバントは、抗原を迅速な異化作用から保護するための水酸化アルミニウムまたは鉱物油のような物質と、リピドＡ、百日咳菌または結核菌のような非特異的な免疫応答刺激剤とを含む。適当なアジュバントは、例えばフロイントの不完全アジュバントおよびフロイントの完全アジュバント（ディフコラボラトリ（ミシガン州、デトロイト）およびメルクアジュバント６５（メルク社、ニュージャージー州、Ｒａｈｗａｙ）のように商業的に入手可能である。その他の適当なアジュバントは、ミョウバン、生分解性ミクロスフェア、モノリン酸化リピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）およびＱｕｉｌ  Ａを含む。
【００９０】
本発明のポリヌクレオチドは、組織のマーカーとして、染色体マーカーまたはタグとして、遺伝病の同定において、アフィメトリクス（カリフォルニア州、サンタクララ）から入手可能なマイクロアレイ技術のような当業者に周知の技術を用いる発現パターンの検査のためのオリゴヌクレオチドの設計のために利用することができる。ここで開示された部分的なオリゴヌクレオチド配列は、例えばＤＮＡ発現ライブラリのスクリーニングにより完全長遺伝子を得るため、および本発明の配列にもとづくハイブリダイゼーション用プローブまたはＰＣＲプライマーを用いて他の生物種由来の相同ＤＮＡ配列を単離するために用いることができる。
【００９１】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、ゲノムマッピング、物理地図マッピングおよび遺伝子のポジショナルクローニングに有用である。さらに、以下に詳しく説明するとおり、配列番号１−４として同定されたポリヌクレオチドおよびその変異体は、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを設計するのに利用可能である。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、スロットブロットＤＮＡハイブリダイゼーション技術のような本発明の技術分野における周知技術を用いて、細胞内に十分に類似性のあるＤＮＡおよびＲＮＡ配列を有するいかなる生物においても、遺伝子の存在を検出し、遺伝子発現パターンを調べるために用いることができる。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーはＰＣＲ増幅に利用できる。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、アフィメトリクス（カリフォルニア州、サンタクララ）のマイクロアレイ技術を含むさまざまなマイクロアレイ技術との関連でも利用できる。
【００９２】
ここで用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド配列の比較的短いセグメントであって、一般的には６個と６０個の間のヌクレオチドを含むセグメントを指し、ハイブリダイゼーションアッセイ法に使用するプローブとポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅に使用するプライマーとの両方を含む。あるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが、配列番号１−４および９として提示された１の配列を含む本発明のポリヌクレオチドまたは変異体に「対応する」と記載されるのは、前記オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、あるいはその相補体が、配列番号１−４および９として提示された１の配列か、または前記配列番号で特定された配列の１の変異体かに含まれるときである。本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、ここに開示されるポリヌクレオチドと実質的に相補的である。
【００９３】
２つの１本鎖配列に実質的な相補性があると言えるのは、最適なアライメントをとって比較すると、適当なヌクレオチド挿入および／または欠失を有する一方の鎖のヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％ないし９５％、そしてより好ましくは少なくとも９８％ないし１００％対合するときである。実質的な相補性が存在するのは、第１のＤＮＡ鎖がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で第２のＤＮＡ鎖と選択的にハイブリダイゼーションするときであるとするのが代替策である。相補性を決定するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、塩類の条件が約１Ｍ未満で、より通常的なのは約５００ｍＭ未満で、好ましくは約２００ｍＭ未満である。ハイブリダイゼーションの温度は、５°Ｃでもよいが、一般的には約２２°Ｃより高く、より好ましいのは約３０°Ｃより高く、最も好ましいのは約３７°Ｃより高い。長いＤＮＡ断片ほど、特異的なハイブリダイゼーションには高いハイブリダイゼーション温度が必要である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブ組成、有機溶媒の存在および塩基のミスマッチングの程度のような他の要因の影響を受けるため、パラメーターの組み合わせは、どれか１のパラメーターだけの絶対的な基準よりも重要である。
【００９４】
特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーは、本発明のポリヌクレオチド配列に相補的な、少なくとも約６個の連続した残基を含み、より好ましくは少なくとも約１０個の連続した残基を含み、最も好ましくは少なくとも約２０個の連続した残基を含む。本発明のプローブおよびプライマーは約８個から１００個までの塩基対の長さであってもよいが、約１０個から５０個の塩基対の長さが好ましく、約１５個から４０個の長さがより好ましい。前記プローブは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと、アニーリングおよび融解の温度と、ループ形成の可能性と、本発明の技術分野において周知のその他の要因とを考慮して、本発明の技術分野で周知の手順を用いて容易に選択できる。プローブおよびＰＣＲプライマーの設計に適するツールおよびソフトウェアは、Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、３７８６  Ｃｏｒｉｎａ  Ｗａｙ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ  ９４３０３−４５０４から入手可能である。ＰＣＲプライマーの設計のための好ましい技術は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、ＣＷおよびＤｙｋｓｌｅｒ、ＧＳ、「ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー、１９９５年にも開示されている。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドに対応する複数のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、キットの形で提供される場合がある。かかるキットは、一般的には複数のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドプローブを含み、それぞれのプローブは、あるポリヌクレオチド配列に特異的である。本発明のキットは、配列番号１−４および９に同定されたポリヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチドに対応する１以上のプローブまたはプライマーを含む場合がある。
【００９６】
ハイスループットアッセイ法に有用な１つの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブキットは、固体基質の表面上の予め定義され、番地により空間的な位置指定ができる（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｒｅｓｓａｂｌｅ）場所に各プローブが固定化された、アレイ状フォーマットの複数のプローブを含む。本発明で有効に用いられるアレイ状フォーマットは、例えば米国特許明細書第５、４１２、０８７号明細書、第５、５４５、４５１号明細書および国際公開パンフレットＷＯ第９５／００４５０号に開示されており、その開示内容は、引用によりここに取り込まれている。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチドは、生物またはその繁殖材料のタグづけをし、同定するためにも用いられる場合がある。かかるタグづけは、例えば非破壊的で機能のない異種由来のポリヌクレオチド識別子であって、本発明の１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、生物に安定的に導入することにより達成できる。
【００９８】
本発明で提供されたポリペプチドは、生物活性を測定するため、抗体を作成するため、対応するリガンドまたはレセプターを単離するためのアッセイ法に用いることも、タンパク質またはコグネイトな対応するリガンドまたはレセプターのレベルを定量するためのアッセイ法に用いることも、抗炎症剤として用いることも、免疫系疾患の治療のための組成物に用いることもできる。
【００９９】
本発明は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変調用および／または活性の阻害用の方法および組成物を提供する。ここで用いられるところの「変調」または「変調する」という用語は、ポリヌクレオチド発現の増減および／またはポリペプチド機能の増減を含む。したがって、「変調」という用語は、ポリペプチド機能の文脈で用いられ、「変調剤」はタンパク質機能のアゴニストおよびアンタゴニストの両方を広く含む意味であり、ここで「アゴニスト」という用語は、例えば、ポリペプチド機能を増大する変調剤分子、化合物および／または組成物を指し、「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチド機能を減少させる変調剤を指す。
【０１００】
本発明の変調剤を用いる方法は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体、その抗原結合断片、短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）および／またはラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）と、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの低分子阻害剤と、本発明のポリヌクレオチドに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに特異的な短鎖干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）と、本発明のポリペプチドのリガンドと結合するがシグナル伝達を刺激しない加工された可溶性ポリペプチド分子とからなるグループから選択される分子、化合物および／または組成物を投与するステップを含む。
【０１０１】
ここに説明するポリペプチドの活性を変調することは、該ポリペプチドの発現を減少または阻害することによって達成される場合があり、これは、対応するポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に干渉することによって達成できる。ポリペプチド発現は、例えば、アンチセンス発現ベクターの導入か、アンチセンス・オリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンス・オリゴリボヌクレオチドまたはアンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴリボヌクレオチドの導入か、当業者に周知の他の手段かによって阻害される場合がある。全てのかかるアンチセンス・ポリヌクレオチドは、ここではまとめて「アンチセンス・オリゴヌクレオチド」という。
【０１０２】
ここで開示されるアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドに特異的に結合するのに十分な、前記ポリヌクレオチドに対する相補性がある。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの配列は、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドが本発明の方法で有効であるためには、前記ポリヌクレオチドの配列と１００％相補的である必要はない。むしろ、アンチセンス・オリゴヌクレオチドが十分に相補的であるのは、前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドの前記ポリヌクレオチドとの結合が前記ポリヌクレオチドの正常な機能と干渉して、有用性を失わせるとき、および、前記オリゴヌクレオチドの他の標的でない配列への非特異的結合が避けられるときである。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドの翻訳を阻害するアンチセンス配向のポリヌクレオチドを含む。適当なアンチセンス・オリゴヌクレオチドの設計は当業者に周知である。メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドが翻訳を阻害するのに最も効率的に作用するはずである。しかし、標的ポリヌクレオチドの５’か３’かのいずれかの非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドが使用可能である。
【０１０３】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの細胞透過および活性は、フェノキサジン置換Ｃ−５プロピニルウラシルオリゴヌクレオチド（Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：４８−５２（１９９９））または２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−ＭＯＥ）オリゴヌクレオチド（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：８６２−８６７（２０００））のような適当な化学的修飾によって増強できる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドを伴う技術の使用は当業者に周知で、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：３６３−３７５（１９９５）およびＫａｗａｓａｋｉら、Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ  ２０：８３６−８４８（１９９６）に説明されている。
【０１０４】
本発明のポリペプチドの発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のような方法によって特異的に抑制される場合がある。この技術の総説は、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：１３７０−１３７２、２０００に掲載されている。簡潔に、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを用いる従来の遺伝子抑制方法は、関心のある遺伝子の逆配列との結合がその後の細胞の諸過程と干渉して、対応するタンパク質の合成をブロックするような、結合によって作用する。ＲＮＡｉも翻訳後のレベルで作用し、配列特異的だが、はるかに効率的に遺伝子発現を抑制する。遺伝子発現の制御または改変の代表的な方法は、国際公開第ＷＯ９９／４９０２９号、第ＷＯ９９／５３０５０号およびＷＯ０１／７５１６４号公報に提供され、この開示内容は引用によりここに取り込まれる。これらの方法では翻訳後の遺伝子サイレンシングは、配列に関連する遺伝子の転写産物の迅速な分解を起こす配列特異的なＲＮＡ分解過程によってもたらされる。複数の研究は、２本鎖ＲＮＡが配列特異的な遺伝子サイレンシングのメディエーターとしてはたらいているかもしれないということを示している（例えば、ＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙおよびＦｉｒｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４：２５５−２５８、１９９８参照）。自己相補的な領域を有する転写産物を生成する遺伝子コンストラクトは遺伝子サイレンシングの効率が特によい。
【０１０５】
１または２以上のリボヌクレアーゼが２本鎖ＲＮＡと特異的に結合し切断して短い断片にすることが証明されている。前記リボヌクレアーゼは、これらの断片に会合したままで今度はこれらの断片が相補的なｍＲＮＡに特異的に結合する、すなわち、関心のある遺伝子の転写されたｍＲＮＡ鎖に特異的に結合する。前記遺伝子のｍＲＮＡも前記リボヌクレアーゼによって短い断片に分解され、前記遺伝子の翻訳および発現を未然に防ぐ。さらにＲＮＡポリメラーゼが前記短い断片の多数のコピーの合成を促進するように作用し、前記短い断片はシステムの効率を指数関数的に増大させる。ＲＮＡｉのユニークな特徴は、サイレンシングが、最初に始まった細胞に限定されないことである。遺伝子サイレンシング効果は個体の他の部分に広がる場合がある。
【０１０６】
したがって本発明のポリヌクレオチドは、当業者に知られた従来の方法で送達可能な、遺伝子サイレンシングコンストラクトおよび／または遺伝子特異的な自己相補的２本鎖ＲＮＡ配列を生成するために用いられる場合がある。遺伝子コンストラクトは、前記自己相補的ＲＮＡ配列を発現するために用いられる場合がある。代替的には、遺伝子特異的２本鎖ＲＮＡ分子が細胞の細胞質の中へ取り込まれて遺伝子サイレンシング効果を奏するように、前記ＲＮＡ分子に細胞が接触する。前記２本鎖ＲＮＡは、標的でない遺伝子の発現に影響を与えないでＲＮＡｉに介在するのに十分な相同性を前記標的遺伝子に対して有するのでなければならない。前記２本鎖ＤＮＡは、少なくとも２０ヌクレオチドの長さで、好ましくは２１−２３ヌクレオチドの長さである。好ましくは、前記２本鎖ＲＮＡは本発明のポリヌクレオチドに特異的に対応する。ほ乳類細胞での遺伝子発現を抑制するために２１−２３ヌクレオチドの長さの短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を使用することは、国際公開第ＷＯ０１／７５１６４号公報に記載されている。最適な阻害ｓｉＲＮＡを設計するためのツールは、ＤＮＡｅｎｇｉｎｅ社（ワシントン州、シアトル）から入手可能なものを含む。
【０１０７】
１つのＲＮＡｉ技術は、センスおよびアンチセンス配列が、ドナーおよびアクセプターのスプライシング部位との適正なスプライシング配向状態にあるイントロン配列の側の領域に配置される遺伝子コンストラクトを用いる。代替的には、さまざまな長さのスペーサ配列が前記コンストラクト中の配列の自己相補的な領域を隔離するために用いられる場合がある。前記遺伝子コンストラクトの転写産物のプロセッシングの際、イントロン配列がスプライシングで切り出されて、センス配列およびアンチセンス配列と、スプライシングジャンクション配列とが結合して２本鎖ＲＮＡを形成できる。選択されたリボヌクレアーゼがそれから前記２本鎖ＲＮＡに結合して切断し、特異的ｍＲＮＡ遺伝子配列の分解につながる出来事のカスケードを開始して、特異的遺伝子のサイレンシングをする。
【０１０８】
ここで用いられるところの「遺伝子コンストラクト、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ分子に細胞集団を接触させる」という文言は、細胞の生存能力に適合可能で当業者に知られたいずれかの方法によって、核酸分子を１個または２個以上の細胞のいずれかの部分に導入する、いかなる手段をも含む。単数または複数の前記細胞は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはこれらのいずれかの組み合わせで接触される場合がある。
【０１０９】
生体内での使用のためには、遺伝子コンストラクト、アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ分子は、さまざまな当業者に認知された手順で投与される場合がある。例えばＲｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３−１９８（１９９８）とこれに引用された文献を参照せよ。ウイルス送達方法および非ウイルス送達方法の両方が遺伝子治療に用いられてきた。有用なウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含む。アデノウイルスベクターで遺伝子を腫瘍細胞にターゲティングする効率の改良は、例えば、アデノウイルスをＤＮＡ−ポリリジン複合体に連結すること、および、レセプター仲介エンドサイトーシスを利用する戦略とによって行われてきた。例えばＣｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１４７−１５４（１９９２）と、ＣｒｉｓｔｉａｎｏおよびＣｕｒｉｅｌ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：４９−５７（１９９６）を参照せよ。ポリヌクレオチドを送達する非ウイルス的な方法は、ＣｈａｎｇおよびＳｅｙｍｏｕｒ（編）  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２巻、（２０００）に総説されている。これらの方法は、裸のＤＮＡか、陰イオンリポソームか、ポリヌクレオチドと陰イオンポリマーおよび全身投与用デンドリマーとの多重複合体（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）に細胞を接触させることを含む（ＣｈａｎｇおよびＳｅｙｍｏｕｒ、前出）。リポソームは、細胞表面レセプターを認識するリガンドの取り込みによって改変され、レセプター仲介エンドサイトーシスによる取り込みのために特異的レセプターにターゲティングを可能にする。例えばＸｕら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．、６４：１９３−１９７（１９９８）と、Ｘｕら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１０：２９４１−２９５２（１９９９）とを参照せよ。
【０１１０】
サルモネラ菌のような腫瘍を標的とする細菌は、全身投与後遺伝子を腫瘍に送達するために使える可能性がある（Ｌｏｗら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３７−４１（１９９９））。細菌は、生体内および試験管内でほ乳類上皮細胞内に侵入して高い効率でＤＮＡを送達するように生体外で操作できる。例えばＧｒｉｌｌｏｔ−Ｃｏｕｒｖａｌｉｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：８６２−８６６（１９９８）を参照せよ。分解で安定化されたオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に封入され、静脈注射または標的部位内への直接注射によって患者に送達される場合がある。代替的には、本発明のポリペプチド用のアンチセンスＲＮＡを発現するレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターか、裸のＤＮＡかが、適当な経路で、試験管内で患者の細胞内に送達するか、あるいは、直接患者に生体内で送達するかされる場合がある。かかる方法に用いられる適当な技術は当業者に周知である。
【０１１１】
本発明は、ここに開示されたポリペプチドか、その部分または変異体かと特異的に結合する抗体、その抗原結合断片、短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）および／またはラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）のような結合剤を提供する。結合剤は、該結合剤が本発明のポリペプチドと検出可能なレベルで反応するが、類似の条件下で無関係のポリペプチドとは検出可能な反応をしない場合に、本発明のポリペプチドと「特異的に結合する」といわれる。この要件を満たすいかなる薬剤でも結合剤の場合がある。例えば結合剤は、ペプチド成分、ＲＮＡ分子またはポリペプチドを有するか、有しないリボソームの場合がある。好ましい実施態様では結合剤は、ポリペプチドと特異的に結合する抗体、その抗原結合断片、短鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）および／またはラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＨ）である。結合剤がポリペプチドに特異的に結合できる能力は、例えば、当業者に周知の技術を用いるＥＬＩＳＡアッセイで決定できる。
【０１１２】
抗体の「抗原結合部位」または「抗原結合断片」は、抗原結合に参加する抗体の部分を指す。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３カ所の非常に多様な短いペプチド配列（ｓｔｒｅｔｃｈ）が、「フレームワーク領域」または「ＦＲｓ」として知られる、より保存された短いペプチド配列の間に間挿された「超可変領域」とよばれる。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間と、超可変領域の隣とに自然にみられるアミノ酸配列を指す。抗体分子では、軽鎖の３カ所の超可変領域と、重鎖の３カ所の超可変領域とは、互いに三次元空間で抗原結合表面を形成するように配置される。前記抗原結合表面は、結合された抗原の三次元的な表面と相補的で、重鎖および軽鎖のそれぞれの３カ所の超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とよばれる。
【０１１３】
抗体は、当業者に知られたさまざまな技術によって調製される場合がある。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照せよ。一般に抗体は、ここに説明されるモノクローナル抗体の作成か、組換え抗体の産生を可能にするための適当な細菌またはほ乳類細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションかを含む細胞培養グループから選択されるによって製造できる。１つの技術では、本発明のポリペプチドを含む免疫原が最初に非常に多様なほ乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。本発明のポリペプチドは修飾なしで免疫原としての役割を果たす。代替的に、特に比較的短いポリペプチドについては、前記ポリペプチドがウシ血清アルブミンまたはスカシ貝ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）のような担体タンパク質と連結される場合に優れた免疫応答が誘発される場合がある。前記免疫原は、１回または２回以上のブースター免疫を取り込んだ予め定められたスケジュールに従って、前記動物宿主に注射されることが好ましい。本発明のポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体はかかる抗血清から、例えば適当な固体支持体に結合された前記ポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製される場合がある。
【０１１４】
本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術と、その改良技術を用いて調製される場合がある。これらの方法は、所望の特異性を有する抗体を産生できる不死性細胞株の調製を伴う。かかる細胞株は上記のとおり免疫された動物から得られる脾臓細胞から作成される場合がある。前記脾臓細胞は、例えば、前記免疫された動物と同遺伝子型であることが好ましい、ミエローマ細胞の融合パートナーとの融合によって不死化される。当業者に周知のさまざまな融合技術を用いる場合がある。例えば、前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは非イオン性界面活性剤と数分間混合され、それからハイブリッド細胞の増殖は支持するがミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度でプレートされる。好ましい選択技術はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。通常約１ないし２週間の十分な時間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、その培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。反応性および特異性が高いハイブリドーマが好ましい。
【０１１５】
モノクローナル抗体は増殖中のハイブリドーマコロニーの上清から単離される場合がある。さらに、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマ細胞株を注射するような、収率を向上させるためのさまざまな技術が用いられる場合がある。モノクローナル抗体は腹水または血液から回収される場合がある。汚染物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿および抽出のような従来技術によって前記抗体から除去される場合がある。本発明のポリペプチドは、精製工程、例えばアフィニティクロマトグラフィーのステップで用いられる場合がある。
【０１１６】
抗体分子の結合特性を示すことができる抗原結合部位を含む多数の分子が当業者に知られている。例えばタンパク質分解酵素のパパインは、ＩｇＧを優占的に切断して複数の断片にし、該断片のうちの２つ（いわゆるＦ（ａｂ）”断片）は、無傷の抗原結合部位を含む共有結合されたヘテロ２量体をそれぞれが含む。酵素のペプシンはＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含む複数の断片を提供することができる。Ｆｖ断片が、ＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡの免疫グロブリン分子の優占的なタンパク質分解酵素切断によって作成できるが、当業者に知られた組換え技術を用いて得られることがより一般的である。Ｆｖ断片は、天然抗体分子の抗原認識能および結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶＨ：：ＶＬヘテロ２量体を含む（Ｉｎｂａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２（１９７２）；Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０（１９７６）；およびＥｈｒｌｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６（１９８０））。
【０１１７】
本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合するヒト化抗体も含む。ヒト以外の免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む多数のヒト化抗体が記載されており、齧歯類のＶ領域および付随するＣＤＲｓがヒトの定常ドメインに融合されたキメラ抗体（Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９（１９９１）；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４（１９８９）；Ｓｈａｗら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８（１９８７）；およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３（１９８７））、齧歯類ＣＤＲｓがヒトの支持ＦＲに移植された後適当なヒト抗体の定常ドメインに融合されたキメラ抗体（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））、齧歯類のＣＤＲｓが組換えによって貼り合わされた齧歯類ＦＲｓで支持されたキメラ抗体（１９９２年１２月２３日発行の欧州特許第５１９、５９６号公報）を含む。これらの「ヒト化」分子は、齧歯類の抗ヒト抗体分子に向けた、ヒトの被移植者における治療用途の持続性および有効性を限定する望ましくない免疫応答を最小限にするために設計される。
【０１１８】
同様に本発明の実施に適するのは、配列番号５−８および１３−１５として提供されるＦＧＦＲ５ポリペプチドとこれらのポリペプチドの変異体とのうちの１つに特異的に結合する、ｓｃＦｖおよびラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）を含む単一鎖抗体断片である。ここに提供されるｓｃＦｖは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、いっしょに、あるいは、それぞれ個別に、ここに提供されるＦＧＦＲ５ポリペプチドを特異的に結合する結合部位を形成する。ｓｃＦｖは、アミノ末端のＶＨ領域と、カルボキシル末端のＶＬ領域とを含む場合がある。同様に適するのが、アミノ末端のＶＬ領域と、カルボキシル末端のＶＨ領域とを含むｓｃＦｖである。
【０１１９】
ここに開示されたｓｃＦｖは、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に操作可能に連結されたポリペプチドリンカーを任意的に含む場合がある。本発明のポリペプチドリンカーは一般的に１ないし５０基のアミノ酸を含む。より好ましいのは少なくとも２個のアミノ酸のポリペプチドリンカーである。しかし、他の実施態様では、ポリペプチドリンカーは３ないし１２個のアミノ酸であるのが好ましい。ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の間に取り込まれる代表的なリンカーポリペプチドは、５個のアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを含む。代替的な代表的なリンカーポリペプチドは、前記配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの１回または２回以上の縦列繰り返しを含み、例えば、配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒおよび  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを含むリンカーを生成する。
【０１２０】
本発明の他の実施態様は、配列番号５−８および１３−１５に提供されるポリペプチドおよびその変異体を特異的に結合するラクダ（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）の重鎖抗体（ＨＣＡｂ）を提供する。これらの重鎖抗体は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスである（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３））。ＨＣＡｂは、従来のＩｇＧ抗体の分子量〜１６０ｋＤａのかわりの分子量〜９５ｋＤａである。これらの結合ドメインは重鎖可変ドメインのみで、従来のＶＨと区別するためにＶＨＨとよばれる（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２：１３１−１４０（１９９９））。第１の定常ドメイン（ＣＨ１）が存在しないため（スプライシングのコンセンサスシグナルの欠失のためにｍＲＮＡプロセシングの際にスプライシングで除去される）、前記可変ドメイン（ＶＨＨ）の後に直接ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインが続く（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：５１５−５２４（１９９９）；Ｗｏｏｌｖｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０：９８−１０１（１９９９））。前記ＨＣＡｂは軽鎖がないが、本物の抗原結合レパートリーを有する。ＨＣＡｂの遺伝的な生成機構にカンする最新知識は、Ｎｇｕｙｅｎら（Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７９：２６１−２９６（２００１）  ）およびＮｇｕｙｅｎら（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５４：３９−４７（２００２））によって総説されている。同様に、コモリザメ（ｎｕｒｓｅ  ｓｈａｒｋ）  を含むサメは抗原レセプターを含む単一の単量体のＶドメインを示す（Ｉｒｖｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１−４５（２００１）；Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１１８０４（１９９８））。
【０１２１】
ＶＨＨは入手可能な最小の抗原結合断片（〜１５ｋＤａ、１１８−１３６残基）を構成する。ＶＨＨのアフィニティはナノモルの範囲で、ＦａｂおよびｓｃＦｖ断片に匹敵する。さらに、ＶＨＨは非常に可溶性が高く、対応するｓｃＦｖおよびＦａｂ断片の誘導体よりも安定である。ＶＨＨは、より親水性にしてＢｉＰ（免疫グロブリン重鎖結合タンパク質）との相互作用を長期化するアミノ酸置換を有するが、前記ＢｉＰは、正常ではフォールディングおよびアッセンブリの際に小胞体（ＥＲ）内でＨ鎖に結合し、その後Ｌ鎖に置き換えられる。ＶＨＨは親水性が高いため、ＥＲからの分泌が増大する。
【０１２２】
一部の実施態様では、機能的なＶＨＨは免疫したラクダおＨＣＡｂのタンパク分解産物から得る場合か、免疫したラクダのＢ細胞からＶＨＨを直接クローニングして組換えＶＨＨを得る場合か、ナイーブ（非免疫）ライブラリまたは合成ライブラリから得る場合がある。所望の抗原特異性を有するＶＨＨは、ファージディスプレイ法で得られる場合もある。ファージディスプレイ法にＶＨＨを用いるのは、機能的な抗原結合断片を得るためにたった１つのドメインしかクローニングして発現する必要がないため、ＦａｂまたはｓｃＦｖに比べて非常に簡単でより効率的である（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２（２００１）；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４：５２１−５２６（１９９７）；およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８０：２６１−２７０（２０００））。
【０１２３】
代替的に、リボソームディスプレイ法が、所望の結合活性およびアフィニティを有するｓｃＦｖおよび／またはＶＨＨの分子の同定および単離に用いるのに適する（ＩｒｖｉｎｇらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１−４５（２００１））。リボソームの提示および選択は、ナイーブなレパートリーの理論的最大量（１０１４）を代表する大規模ライブラリを作成し提示するための可能性を有する。
【０１２４】
その他の実施態様は、溶解性を増大させ、非特異的結合を防止するために、ヒトのＶＨようなラクダ以外のＶＨを改変することによって、すなわち、ＶＨのＶＬ側の残基をＶＨＨ様の残基に置換して、より溶解性の高い断片をまねることによってラクダ化の工程を経て作成されたＶＨＨ様分子を提供する。ラクダ化ＶＨ断片、特にヒトのフレームワークに基づくものは患者に生体内で投与されるときの免疫応答が非常に低減することが期待され、そのため、治療目的には著しく有利であると期待される（Ｄａｖｉｅｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３３９：２８５−２９０（１９９４）；Ｄａｖｉｅｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：５３１−５３７（１９９６）；Ｔａｎｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２４７７４−２４７８０（２００１）；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８（１９９９）．）。
【０１２５】
Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖおよびＶＨＨを含む非常にさまざまな発現システムが本発明の技術分野で利用可能である。例えば抗体断片および抗体融合タンパク質の大規模生産に適するのは、原核および真核生物の両方に由来する発現システムである。特に有利なのは、大量の抗体断片を培地に分泌できる発現システムである。
【０１２６】
ほ乳類細胞、昆虫細胞、植物、トランスジェニック動物および下等真核生物に基づく抗体断片および抗体融合タンパク質の大規模生産用の真核生物の発現システム記載されている。例えば、抗体断片のコスト効果のある大規模生産は、酵母発酵システムで達成できる。これらの生物の大規模発酵は、当業者に周知で、複数の組換えタンパク質のバルク生産に現在用いられている。酵母および糸状菌類は遺伝的改変が可能で、関心のあるタンパク質が培地に分泌される場合がある。さらに、産物の一部は、ＧＲＡＳ（一般に安全とみなされる）基準に従う、すなわち、発熱物質、毒素およびウイルス封入体を含まない。
【０１２７】
Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのようなメタノール資化性その他の酵母は、異種タンパク質の生産用の周知のシステムである。ミリグラムないしグラムの量の高レベルのタンパク質を得ることができ、産業用発酵への規模拡大も可能である。
【０１２８】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの系は、産業的規模の複数の生産工程に用いられる。例えば、ｓｃＦｖ断片と、組み合え抗体およびその断片との発現にＰｉｃｈｉａ菌を使用することが記載されている（Ｒｉｄｄｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：２５５−２６０（１９９５）；Ａｎａｄｒａｄｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）  １２８：８９１−８９５（２０００）；Ｐｅｎｎｅｌｌら、Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：５９９−６０３（１９９８））。振盪フラスコ培養では、２５０ｍｇ／Ｌないし１ｇ／Ｌを超えるレベルのｓｃＦｖおよびＶＨＨの生産が達成できる（Ｅｌｄｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１：６７−７５（１９９７）；Ｆｒｅｙｒｅら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：１５７−１６３（２０００））。
【０１２９】
ｓｃＦｖ用の同様の発現システムがＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓについて記載されている（Ｈｏｒｗｉｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８６７８−８６８２（１９８８）；Ｄａｖｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１６５−１６９（１９９１）；およびＳｗｅｎｎｅｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４８：４１−５０（２００２））。ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのような糸状菌は、大量のタンパク質を分泌する能力を有する。この特性は、ｓｃＦｖおよびのＶＨＨ発現に利用できる場合がある（Ｒａｄｚｉｏら、Ｐｒｏｃｅｓｓ−ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：５２９−５３９（１９９７）；Ｐｕｎｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２００−２０６（２００２）；Ｖｅｒｄｏｅｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４３：１９５−２０５（１９９５）；Ｇｏｕｋａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７：１−１１（１９９７）；Ｗａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４３５−４４０（１９９０）；Ａｒｃｈｅｒら、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｖｅｎｈｏｅｋ  ６５：２４５−２５０（１９９４）；Ｄｕｒａｎｄら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：３４１−３４６（１９８８）；Ｋｅｒａｎｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５３４−５３７（１９９５）；Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：１９３−２００（１９９４）；Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：５９１−５９５（１９９３）；およびＮｙｙｓｓｏｎｅｎら、国際公開第ＷＯ  ９２／０１７９７号公報（１９９２））。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３０】
以下の実施例は例示のために提供されるのであって、限定のためではない。
【実施例１】
【０１３１】
マウスリンパ節間質細胞発現ライブラリ由来ｃＤＮＡ配列の単離
本発明のｃＤＮＡ配列は、以下に説明するとおり、マウスｆｓｎ−／−リンパ節間質細胞由来のｃＤＮＡ発現ライブラリのハイスループット配列決定によって得られた。
【０１３２】
リンパ節間質細胞由来ｃＤＮＡライブラリ（ＭＬＳＡおよびＭＬＳＥ）
リンパ節がフレーキースキンｆｓｎ−／−マウスから摘出され、細胞が解離されて、得られた単離細胞懸濁液が培養された。４代の継代培養の後、細胞が回収された。製造者の仕様書に従い、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＢＲＬライフテクノロジー、メリーランド州、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いて単離された全ＲＮＡが、ポリＡＱｕｉｋｍＲＮＡ単離キット（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラホヤ）を用いてｍＲＮＡを得るのに使われた。ｃＤＮＡ発現ライブラリ（ＭＬＳＡライブラリという）が前記ｍＲＮＡからラムダＺＡＰエキスプレスｃＤＮＡライブラリ合成キット（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラホヤ）を用いて逆転写酵素により調製された。ＭＬＳＥライブラリという、第２のｃＤＮＡ発現ライブラリはｃＤＮＡが哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン、カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）に挿入された点を除いて正確に上記のとおり調製された。
【０１３３】
ＭＬＳＡライブラリから単離されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は配列番号１に示され、対応するアミノ酸配列は配列番号５に提供される。
【実施例２】
【０１３４】
単離されたｃＤＮＡ配列の解析
単離されたｃＤＮＡ配列は、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いてＥＭＢＬＤＮＡデータベース中の配列に対して比較され、（６つの読み枠のそれぞれでＤＮＡがタンパク質に翻訳された）対応する予測ポリペプチド配列は、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＰを用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中の配列に対して比較された。具体的には、配列番号１−４に提供されたＤＮＡ配列のＥＭＢＬデータベース（リリース６０、１９９９年９月）中の配列に対する比較と配列番号５−８に提供されたアミノ酸配列のＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＴｒＥＭＢＬデータベース（１９９９年１０月２０日まで）中の配列に対する比較は１９９９年１２月３１日現在で行われた。配列番号１−４のｃＤＮＡ配列とこれらに対応する予測アミノ酸配列（それぞれ配列番号５−８）は、それぞれコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを用いて前記ＥＭＢＬおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中の配列に対し（上記のとおり決定された）同一性が７５％未満であると決定された。
【０１３５】
治療および／または診断の利用性があると報告された既知分子をコードする配列に対してスクリーニングするための自動検索プログラムを用いて、配列番号１−４の単離ポリヌクレオチド配列は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプターファミリーのポリペプチド配列（配列番号５−８）をコード化することが決定された。ファミリーメンバーとは、既知のタンパク質またはタンパク質ファミリーのメンバーに対し翻訳されたポリペプチド中のアミノ酸残基が少なくとも２０％同一性を有するものをいうとここでは定義される。
【０１３６】
繊維芽細胞増殖因子は４つの１回膜貫通型チロシンキナーゼ（ＦＧＦＲ１ないし４）のファミリーに属する。これらのレセプターは２３の増殖因子（ＦＧＦ１ないし２３）に対する高親和性レセプターとしての役割を果たす。ＦＧＦレセプターは、中胚葉誘導とパターン形成、細胞の増殖と移動、器官形成および骨の成長を含む多数の生物学的な過程において重要な役割を有する（Ｘｕ、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、２９６巻、３３−４３頁、１９９９年）。前記配列のさらなる解析から他のＦＧＦレセプターと同様に膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと思われるものが存在することが明らかになった。
【実施例３】
【０１３７】
マウス繊維芽細胞増殖因子受容体ホモログの完全長ｃＤＮＡ配列の単離
マウス繊維芽細胞増殖因子受容体ホモログの完全長ｃＤＮＡ配列は以下のとおり単離された。
【０１３８】
前記ＭＬＳＡ細胞ｃＤＮＡライブラリ（実施例１に記載）は配列番号１のなかのコーディング領域のヌクレオチド１−４５１に対応する［α３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識されたｃＤＮＡプローブでスクリーニングされた。プラークの写し取り（ｐｌａｑｕｅ  ｌｉｆｔ）、雑種形成およびスクリーニングは、標準的な分子生物学的な技術を用いて行われた。完全長マウスＦＧＦＲ遺伝子（ｍｕＦＧＦＲ５βという）の決定されたポリヌクレオチド配列は配列番号２に提供され、対応するポリペプチド配列は配列番号６に提供される。
【０１３９】
配列番号２のポリヌクレオチド配列の解析から、ヌクレオチド１３１１ないし１３７０にコード化される膜貫通ドメインと思われるものが存在することが明らかになった。そのポリペプチドの配列（配列番号６、図１）は繊維芽細胞増殖因子受容体ファミリーの細胞外ドメインと類似する領域を有する。ｍｕＦＧＦＲ５βの細胞外ドメインのアミノ酸配列は配列番号１３に提供され、細胞内ドメインのアミノ酸配列は配列番号１４に提供される。
【０１４０】
配列番号２のスプライシング変異体も実施例１に記載のＭＬＳＡｃＤＮＡライブラリから単離された。前記スプライシング変異体（ＦＧＦＲ５γという）の決定されたポリヌクレオチド配列は配列番号３に提供され、対応するポリペプチド配列は配列番号７に提供される。このスプライシング領域は過去に記載されたＦＧＦ受容体についてのスプライシング部位と等価の位置にあり（Ｏｒｎｉｔｚ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２９６：１５２９２−１５２９７、（１９９６）；Ｗｉｌｋｉｅ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：５００−５０７、（１９９５）；Ｍｉｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２４６−２５０、（１９９２））、この分子（本明細書では「ＦＧＦＲ５」という。）がＦＧＦ受容体ホモログであることが確立された。２つのＦＧＦＲ５のスプライシング変異体の間の主な相違点は、ｍｕＦＧＦＲ５βが３個の細胞外Ｉｇドメインを含むのに対し、ＦＧＦＲ５γは２個しかかかるドメインを含まないことである。
【０１４１】
ＦＧＦＲ５γと、ＦＧＦレセプターファミリーのＦＧＦＲ５βその他のメンバーとの間の構造的な類似性を調べるために、３Ｄ  Ｓｗｉｓｓモデラー（Ｐｅｔｉｓｃｈ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：６５８−６６０（１９９５）；Ｐｅｉｔｓｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２４：２７４−２７９（１９９６）；およびＧｕｅｘおよびＰｅｉｔｓｃｈ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８：２７１４−２７２３（１９９７））がＦＧＦＲ５γの細胞外ドメインの予測結晶構造を作成するのに用いられた。これらの研究は、配列番号７（配列番号１５）の１８８番ないし２１９番の残基の間のＦＧＦＲ５の結晶構造が既知のＦＧＦＲ１の結晶構造から逸脱していることを示した。これらの残基は、ＦＧＦＲ５と、ＦＧＦレセプターファミリーの他のメンバーとの間での相同性が低い、リガンド特異性を定めるうえで重要な役割を果たすかもしれない領域に対応する。
【０１４２】
リガンド結合に重要な残基はＦＧＦ−２と結合したＦＧＦＲ１の共結晶化の研究で既に同定されている（Ｐｌｏｔｎｉｋｏｖら、Ｃｅｌｌ  ９８：６４１−６５０（１９９９））。ＦＧＦＲ５γのＦＧＦＲ１とのアライメントは、これらの残基の多くが保存されているか、保存的な置換であることを示した。２つのレセプターの間で保存されているリガンド結合残基は、配列番号７の６６、６８、１４６、１７８、１８１、１８３  および２１６番であり、リガンド結合の可能性がある残基の保存的置換は、配列番号７の６４、１８０および２２６番である。ＦＧＦＲ５γの予測結晶構造に視覚化するとき、これらの残基はリガンド結合ドメインの溝に並ぶ。したがってＦＧＦＲ５と他のＦＧＦレセプター（すなわちＦＧＦＲ１−４）との間の全体としての類似性の程度は比較的低いが、ＦＧＦＲ５のスプライシング変異体の細胞外ドメインはリガンド結合に重要な全ての保存された残基を有する。
【０１４３】
ＦＧＦＲ５と他のファミリーメンバーとの間の主な相違点は、細胞内チロシンキナーゼドメインがないことである。既に同定された４種類のＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ１−４）では、シグナル伝達は、リガンド結合およびレセプター２量体化によって仲介され、細胞内ＲＴＫドメイン内のチロシン残基の自己リン酸化と、複数のシグナル伝達カスケードを開始させる多数の細胞内基質のリン酸化とをもたらす。ここに記載されるＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γのスプライシング変異体は両方とも、チロシン残基を細胞内ドメインにを含み、ＳＨＰ結合モチーフ（配列番号６の４５８−４６３番と、配列番号７の３６７−３７７番）との類似性を示す。ＳＨＰは、細胞のシグナル伝達に参加し、広範囲の活性を誘発する多数のレセプターの細胞質ドメインに既に同定されてきたタンパク質チロシンホスファターゼである。したがってＦＧＦＲ５の細胞質ドメインにかかるモチーフが存在することは、シグナル伝達を示し、これらのモチーフの改変がリガンドがＦＧＦＲ５に結合することによって開始されるシグナル伝達を変調するために用いられる場合がある。これらのモチーフは、マウスのＦＧＦＲ５と、以下（実施例４）に説明するヒトのホモログとの間では保存されている。ＦＧＦＲ５のこれらのシグナル伝達モチーフおよび／または細胞質ドメインの除去または改変は、シグナル伝達を刺激しないでＦＧＦＲ５リガンドに結合する可溶性ＦＧＦＲ５様分子を加工するために用いられる場合がある。かかる分子はＦＧＦＲ５の結合および活性
を変調するために有用である場合がある。
【実施例４】
【０１４４】
ヒトＦＧＦ受容体ホモログの単離
マウスＦＧＦ受容体の部分をコード化するｃＤＮＡ（配列番号１）が、ヒトＥＳＴホモログを同定するためにＥＭＢＬデータベース（リリース５８、１９９９年３月）を検索するのに用いられた。同定されたＥＳＴ（アクセッション番号ＡＩ２４５７０１）はＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムクローンＩＤ番号１８７０５９３としてリサーチ  ジェネティクス社（アラバマ州、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）から入手した。クローン１８７０５９３のインサート全体の配列決定の結果、５２０個の追加のヌクレオチドが同定された。このクローンの前記インサートは完全長遺伝子を表してはいない。ヒトＦＧＦレセプターホモログの細胞外ドメインを表すクローン１８７０５９３のインサート全体の決定されたヌクレオチド配列は配列番号４に示され、細胞外ドメインのポリペプチド配列は配列番号８に示される。２量体化、リガンド結合およびレセプター活性に関与する複数の保存されたドメインが配列番号８に同定された。これらは図１０に示される。
【０１４５】
マウスおよびヒトのＦＧＦＲ５の両方とも他のＦＧＦレセプターファミリーのメンバーであるＦＧＦＲ１−４と構造的に類似する。細胞外ドメインでは、保存されたシステイン残基の側にある３個の免疫グロブリン様モチーフが存在する。Ｉｇ−１ループは３個のＩｇループの中で最も保存されておらず、リガンド結合には必要ないが、結合アフィニティを調節する（Ｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：３９０７−３９１８（１９９３））。Ｉｇ−３ループはリガンド選択性に関与する（Ｏｒｎｉｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：４３２−４３６（１９９６））。
【０１４６】
酸性ボックスはＦＧＦＲ１−４に特徴的で、銅およびカルシウムを含む２価陰イオンを結合するのに関与する。酸性ボックスは細胞接着分子、細胞外マトリクスおよびヘパリンとの相互作用に重要である（ＰａｔｓｔｏｎｅおよびＭａｈｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３３４３−３３４６（１９９６））。ＦＧＦＲ５の酸性ボックスは他の４つのレセプターより小さいか、存在しない。
【０１４７】
細胞接着分子（ＣＡＭ）の相同性と、ヘパリン結合ドメインとは細胞外ドメインの特徴である（ＳｚｅｂｅｎｙｉおよびＦａｌｌｏｎ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１８５：４５−１０６（１９９９））。前記ＣＡＭ相同性領域は、Ｌ１、Ｎ−ＣＡＭおよびＮ−カドヘリンとの結合部位である（Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｄｅｖ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．４（２−３）：１５７−６８（１９９６））。
【０１４８】
ＦＧＦＲ５ヘパリン結合ドメインは、他のＦＧＦＲのヘパリン結合ドメインの典型で、Ｌｙｓ残基の横にある塩基性および疎水性の残基のクラスターからなる（Ｋａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１９１８−１９２１（１９９３））。ヘパリンまたはヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ＦＧＦとＦＧＦＲとの相互作用の必須のコファクターで、ヘパリンはっＦＧＦＲ４の増殖因子非依存リガンドである（ＧａｏおよびＧｏｌｄｆａｒｂ、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：２１８３−２１９０（１９９５））。
【実施例５】
【０１４９】
マウスＦＧＦレセプターホモログの特徴付け
可溶性型のマウスＦＧＦレセプターホモログＦＧＦＲ５βとスプライシング変異体ＦＧＦＲ５γ（それぞれ配列番号２および３）がほ乳類細胞で発現され、精製されたタンパク質が、前記レセプター分子のリガンド結合特異性を決定するために用いられた。
【０１５０】
ｍｕＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γはプライマーＭＳ１５８およびＭＳ１５９（それぞれ配列番号１０および１１）を用いてＰＣＲにより増幅され、ヒトＩｇＧ１由来Ｆｃ断片を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３にクローニングされた。ＦＧＦＲ５βＦｃおよびＦＧＦＲ５γＦｃというこれらの可溶性組換え蛋白質は、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、バージニア州、Ｍａｎａｓｓａｓ）で発現され、ＡｆｆｉｐｒｅｐプロテインＡカラム（バイオラッド、カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて精製された。
【０１５１】
ＦＧＦ−２（塩基性繊維芽細胞増殖因子）は、ある範囲のアフィニティで全てのＦＧＦレセプターと結合することが既に示されている。ｍｕＦＧＦＲ５βのＦＧＦ−２との結合が、プロテインＧセファロース（アマーシャムファルマシア、スウェーデン、ウプサラ）存在下で精製されたタンパク質とＦＧＦ−２をコインキュベートし、形成された複合体を変性ポリアクリルアミドゲルで分析することにより証明された。ＦＧＦ−２（２μｇ）が、５μｇのＦＧＦＲ５βＦｃ、ＦＧＦ受容体２（ＦＧＦＲ２Ｆｃ）または無関係なタンパク質（ＭＬＳＡ８７９０Ｆｃ）と、５μｌプロテインＧファーストフロー（Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）ビーズ（ファルマシア、スウェーデン、ウプサラ）、ＰＢＳおよび０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で６０分間４°Ｃでインキュベートされた。前記ビーズは、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで３回洗浄され、２０μｌのローディングバッファー（０．１Ｍ  ＤＴＴ、１０％  スクロース、６０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ６．８、５％  ＳＤＳおよび０．０１％ブロモフェノールブルー）中に再懸濁された。このサンプルは１２％ポリアクリルアミドゲルで分析された。ＦＧＦ−２、ＦＧＦＲ２Ｆｃ、ＦＧＦＲ５βＦｃおよびＭＬＳＡ８７９０Ｆｃ（それぞれ１μｇ）が比較のため前記ゲルにロードされた。前記ゲルをクーマジーブルーで染色した後、ＦＧＦＲ５βＦｃを含むレーンでは２本のバンドが視認でき、ＦＧＦ−２とマウスＦＧＦ受容体ホモログＦＧＦＲ５βＦｃとの間で複合体が形成されたことと、ＦＧＦ−２がこの新規ＦＧＦ受容体ホモログのリガンドであることとが示された。２本のバンドは、陽性の対照実験である、ＦＧＦＲ２Ｆｃを含むレーンでも観察された。ＭＬＳＡ８７９０Ｆｃタンパク質を含む陰性の対照実験のレーンでは２本のバンドは観察されなかった。
【０１５２】
マウスＦＧＦ受容体ホモログＦＧＦＲ５βＦｃの結合特異性は、ＦＧＦ−２を別の既知の増殖因子である上皮増殖因子（ＥＧＦ）に置き換えて上記の実験を繰り返すことによりさらに調べられた。この実験では、ＥＧＦはＦＧＦＲ２Ｆｃ、ＦＧＦＲ５βＦｃまたはＭＬＳＡ８７９０Ｆｃとは結合しなかったので、マウスＦＧＦ受容体ホモログＦＧＦＲ５βＦｃとＦＧＦ−２の結合は特異的であることが示された。同様にＦＧＦ−７を用いる以下の実験では、ＦＧＦＲ２Ｆｃ、ＦＧＦＲ５βＦｃまたはＭＬＳＡ８７９０Ｆｃとの結合は観察されなかった。
【０１５３】
ＦＧＦＲ５とＦＧＦＲ２との間の結合アフィニティの違いを決定するために、ＦＧＦに応答するＮＩＨ３Ｔ３ＳＲＥレセプター細胞におけるＦＧＦＲ５βＦｃおよびＦＧＦＲ５γＦｃのＦＧＦシグナル伝達阻害能が調べられた。繊維芽細胞増殖因子はＭＡＰキナーゼ経路を刺激するレセプターのチロシンキナーゼドメインのリン酸化を介してシグナルを伝達するのが典型的である。これは結局は血清応答エレメント（ＳＲＥ）の制御の下での遺伝子活性化につながる。ルシフェラーゼレポータの上流にコンカテマー化したＳＲＥ配列を含むレポータコンストラクトがＮＩＨ３Ｔ３細胞に安定的にトランスフェクションされた。レポータ活性はルシフェラーゼレベルの測定によって計測された。図２Ａに示すとおり、ＦＧＦ−２に対するＮＩＨ３Ｔ３  ＳＲＥ細胞の容量依存応答がヘパリン存在下でみられた。ヘパリン存在下でのＦＧＦ−２の標準用量を用いて、ＦＧＦＲ２Ｆｃ、ＦＧＦＲ５βＦｃまたはＦＧＦＲ５γＦｃの異なる濃度が前記ＮＩＨ３Ｔ３  ＳＲＥ細胞に滴定され、ルシフェラーゼ活性が測定された。陽性対照であるＦＧＦＲ２Ｆｃの濃度が上昇すると、ＦＧＦ−２で刺激された細胞でのルシフェラーゼシグナルは低下した（図２Ｂ）。しかし、ＦＧＦＲ５βＦｃおよびＦＧＦＲ５γＦｃを滴定してもＦＧＦを仲介するＮＩＨ３Ｔ３  ＳＲＥ細胞からのルシフェラーゼシグナルは阻害されなかった。これらの結果は、ＦＧＦ−２はＦＧＦＲ２よりもＦＧＦＲ５βＦｃまたはＦＧＦＲ５γのほうがアフィニティが低いことを示し、ＦＧＦＲ５のリガンド特異性はＦＧＦレセプターファミリーの他のメンバーのリガンド特異性とは異なることを表している。
【実施例６】
【０１５４】
マウスＦＧＦＲ５βゲノムＤＮＡを含むポリヌクレオチド断片の配列決定
上記のとおり、２つのスプライシング変異体ｍｕＦＧＦＲ５βＦｃおよびｍｕＦＧＦＲ５γは、他の既知のＦＧＦレセプターに存在する古典的なレセプターチロシンキナーゼドメインを含まない。古典的なレセプターチロシンキナーゼドメイン（ＲＴＫ）を含むＦＧＦＲ５のスプライシング変異体の存在を調べるために、ＦＧＦＲ５のゲノムＤＮＡが以下のとおりクローニングされ、配列決定された。
【０１５５】
マウスのゲノムＤＮＡはＬ９２９細胞から標準的な技術を用いて単離された。マウスＦＧＦＲ５βを含むゲノムＤＮＡのポリヌクレオチド断片は、ＭＳ１５７およびＭＳ１６６（それぞれ配列番号１１および１２）を用いてＰＣＲ増幅された。この１．４ｋｂのポリヌクレオチド断片は、Ｔテーリングされた（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ２＋ベクターにクローニングされた。このプラスミドのインサートの配列は、標準的なプライマーウオーキング法の配列決定技術を用いて決定された。マウスＦＧＦＲ５βを含むゲノムＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号９に示される。この配列は、３’非翻訳領域からシグナル配列を除く成熟ＦＧＦＲ５レセプターの５’末端をコード化する配列まで伸びる。ＲＴＫドメインを発現する代替的なエクソンは同定されなかった。
【実施例７】
【０１５６】
マウスＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによる細胞増殖の刺激
ＲＡＷ２６４．１０細胞はＢａｌｂ／ｃマウスで作成されたマウスマクロファージ細胞株に由来し、マクロファージおよび骨芽細胞の前駆体である。マウスＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γ（それぞれ「ＦＧＦＲβ」および「ＦＧＦＲγ」ともいう。）存在下でのＲＡＷ２６４．１０細胞および抹消血単核球（ＰＢＭＣ）の刺激（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：８１１−８１６（１９７８））が以下に示された。
【０１５７】
上記のとおり、マウスＦＧＦレセプターホモログのｍｕＦＧＦＲ５βとそのスプライシング変異体ＦＧＦＲ５γ（それぞれ配列番号２および３）がほ乳類細胞で発現され、マウスＦＧＦＲ５β−ＦｃまたはＦＧＦＲ５γ−Ｆｃ融合タンパク質として精製された。ＦＧＦＲ５β−ＦｃおよびＦＧＦＲ５γ−Ｆｃ融合タンパク質は、９６穴平底マイクロタイタープレートで０、０５ｍＬの培養液０．０５  ｍｌ  ｍｅｄｉａ（５％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）、１  ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  ＭＤ）、０．７７  ｍＭ  Ｌ−アスパラギン（Ｓｉｇｍａ）、０．２  ｍＭ  ａｒｇｉｎｉｎｅ（シグマ）、１６０  ｍＭ  ペニシリンＧ（シグマ）および  ７０  ｍＭ  硫酸ジヒドロストレプトマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スイス、バーゼル）  添加ＤＭＥＭ）中で１０ｎＭから滴定された。精製ヒトＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質が対照として用いられ、１０ｎＭから滴定された。
【０１５８】
ＲＡＷ２６４．１０細胞は、各ウェルに２  ｘ  １０４個／ｍＬの濃度で０．０５ｍＬ添加された。前記プレートは、３７°Ｃ、１０％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で４日間インキュベーションされた。細胞の増殖はＭＴＳ色素の変換によって測定され、ＥＬＩＳＡリーダを用いて定量化された。図３に示すとおり、マウスのＦＧＦＲ５β−ＦｃおよびＦＧＦＲ５γ−Ｆｃ融合タンパク質の両方とも、１００ｐＭおよびこれ以上のＦｃ融合タンパク質の濃度でＲＡＷ２６４．１０細胞の増殖を刺激した。
【０１５９】
これらの結果は、ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γが、直接マクロファージ細胞株を活性化する免疫刺激性の分子であることを証明した。これらのアッセイに用いたマクロファージ細胞克（ＲＡＷ２６４．１０）は、さまざまな既知の骨形態形成剤で刺激されるとき骨芽細胞に分化することが既に示されている。これらの細胞へのＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γの効果は、これらの分子も骨芽細胞の分化および活性化を刺激するかもしれないことを示唆する。ＷｅｉｄｅｍａｎｎおよびＴｒｕｅｂ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６９：２７５−２７９（２０００））は、ＦＧＦＲ５が軟骨組織で発現する
ことを示した。上記に提供されたデータの文脈でみるとき、これはＦＧＦＲ５が骨形成に役割をはたし、骨折の修復と、骨粗鬆症および骨化石症のような骨疾患とに用途があるかもしれないことを示唆する。
【実施例８】
【０１６０】
マウスＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖および接着の刺激
マウスＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γのＦｃ融合タンパク質によるＰＢＭＣのプラスチックへの接着の刺激は以下のとおり証明された。
【０１６１】
精製されたＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γのＦｃ融合タンパク質は、９６穴マイクロタイタープレートのウェルあたり０．１ｍＬの培養液に２０ｎＭから滴定された。精製されたヒトＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質と、ヒトＩｇＧＦｃが対照として用いられた。ＰＢＭＣは密度勾配遠心法によって血液から回収され、２  ｘ  １０６個／ｍＬの濃度で培養液中に再懸濁された。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）、抗ＣＤ３抗体または培養液が、ＰＢＭＣに添加され、０．１ｍＬの細胞が各ウェルに分注された。前記プレートは空気中に５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７°Ｃ３日間インキュベーションされた。細胞増殖は、前記プレートをトリチウム化（３Ｈ）−チミジンで培養の最後の１６時間パルス処理することによって定量された。前記細胞は、回収され、３Ｈ−チミジンの取り込みが標準的な液体シンチレーション・カウンター法で定量された。図４−６はマウスＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γ融合タンパク質が、ＰＨＡまたは抗ＣＤ３で活性化されたＰＢＭＣの増殖を増強するが、前記融合タンパク質だけではＰＢＭＣの増殖を誘導しなかったことを示す。増殖はヒトＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質またはヒトＩｇＧＦｃでは刺激されなかった。
【０１６２】
ｍｕＦＧＦＲ５βおよびｍｕＦＧＦＲ５γ（それぞれ配列番号２および３）は、上記のとおり、ほ乳類細胞で発現されＦｃ融合タンパク質として精製された。ｍｕＦＧＦＲ５β−ＦｃおよびｍｕＦＧＦＲ５γ−Ｆｃ融合タンパク質は、９６穴マイクロタイタープレートのウェルあたり０．１ｍＬの培養液に１０ｎＭから滴定された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心法によって血液から回収され、２  ｘ  １０６個／ｍＬの濃度で培養液中に再懸濁された。ＰＨＡまたは培養液（５％  ＦＢＳ、２  ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１６０  ｍＭペニシリンＧ（Ｓｉｇｍａ）および  ７０ｍＭ  硫酸ジヒドロストレプトマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）  を添加したＲＰＭＩ  １６４０）がＰＢＭＣに添加され、０．１ｍＬの細胞が各ウェルに分注された。前記プレートは３日間３７°Ｃで空気中に５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気中でインキュベーションされた。非接着性細胞は３回の培養液での洗浄で除去された。ＭＴＤ／ＰＥＳ溶液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、プロメガ、ウィスコンシン州、マジソン）を含む培養液（０、０５ｍＬ）が各ウェルに分注され、前記プレートは４時間インキュベーションされた後、色素の変換が９６穴ＥＬＩＳＡプレートリーダを用いて定量された。図７および８は、ｍｕＦＧＦＲ５βおよびｍｕＦＧＦＲ５γのＦｃ融合タンパク質が、用量依存的なやり方で、ＰＢＭＣの接着と接着したＰＢＭＣの増殖とを刺激したことを示す。これらの結果は、ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γはヒト造血細胞、主にＰＢＭＣの混合集団に対する既知の免疫刺激分子の増殖効果を増強することができることを証明する。
【実施例９】
【０１６３】
マウスＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによるナチュラルキラー細胞に活性化
この実施例は、ｍｕＦＧＦＲ５β−ＦｃおよびｍｕＦＧＦＲ５γ−Ｆｃ融合タンパク質によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を開示する。
【０１６４】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心法によって血液から回収され、２  ｘ  １０６個／ｍＬの濃度で培養液（５％  ＦＢＳ、２  ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１６０  ｍＭペニシリンＧ（Ｓｉｇｍａ）および  ７０ｍＭ  硫酸ジヒドロストレプトマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）  を添加したＲＰＭＩ  １６４０）中に再懸濁された。ｍｕＦＧＦＲ５β−ＦｃおよびｍｕＦＧＦＲ５γ−Ｆｃ融合タンパク質が１０ｎＭの濃度でぇ細胞に添加され、該細胞が６穴プレート（３ｍＬ／ウェル）で３日間３７°Ｃで空気中に５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で培養された。精製ヒトＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質が対照として用いられた。非接着性細胞は３回の培養液による洗浄で除去された。接着性細胞が軽いトリプシン処理およびスクレーパで掻き取ることによって回収された。細胞は洗浄して染色バッファーに移され、その表現型がＮＫ細胞のマーカーであるＣＤ５６と、対照のアイソタイプ抗体とを用いて標準的なフロー・サイトメトリー法で測定された。
【０１６５】
図９に示すとおり、ｍｕＦＧＦＲ５β−ＦｃおよびｍｕＦＧＦＲ５γ−Ｆｃ融合タンパク質は、約５０％がＮＫ細胞である、ヒトＰＢＭＣ由来の接着細胞の接着および／または増殖を刺激した。黒く塗りつぶしたヒストグラムはＮＫ細胞マーカーＣＤ５６で染めた接着性のＰＢＭＣを表し、白いヒストグラムはアイソタイプが適合した対照抗体で染めた同じ細胞を表す。ＦＧＦＲ２はＰＢＭＣの接着性を刺激しなかったので、これらの培養からは分析する細胞がなかった。これらの結果は、ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γはＮＫ細胞を直接活性化する免疫刺激的分子であることを証明する。これらの結果と、実施例８で提供された結果とは、ＦＧＦＲ５が免疫応答を増強でき、ワクチン応答および抗がん療法に結うようであるかもしれないことを証明した。
【実施例１０】
【０１６６】
ｍｕＦＧＦＲ５β−Ｆｃ融合タンパク質によるヒト単球における遺伝子発現の刺激
本実施例は、マウスＦＧＦＲ５β−Ｆｃ融合タンパク質で刺激されたヒト単球において過剰発現した遺伝子を開示する。
【０１６７】
単球は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から２時間３７°Ｃの接着によって精製された。細胞は１００ｎＭの可溶性ＦＧＦＲ５β−Ｆｃ融合タンパク質またはＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質で刺激された。０および１２時間後、接着性の単球は回収され、全ＲＮＡがこの細胞からＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を製造者の指示書に従って用いて抽出された。前記ＲＮＡは増幅され、アンビオンのＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ  ａＲＮＡ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ、テキサス州、オースチン）を製造者の指示書に従って用いてアミノアリルＵＴＰが取り込まれた。
【０１６８】
ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ２で処理された細胞から抽出され増幅されたＲＮＡは、間接アミノアリルｄＵＴＰ標識法によってそれぞれＣｙ３またはＣｙ５色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ  、英国）のいずれかで標識され、２枚のＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｔｌａｓ  Ｇｌａｓｓ  ３．８  遺伝子マイクロアレイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  クロンテク、カリフォルニア州、パロアルト）にハイブリダイゼーションされた。スライドは、洗浄され、Ａｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘスキャナおよびソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ）を用いてスキャニングおよび解析をされた。明示されたところでは、定量的ＰＣＲがマイクロアレイのデータを確認し、前記アレイに存在しない遺伝子についてｍＲＮＡを定量するために用いられた。プライマーおよびプローブのセットはパーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）およびＭＷＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ドイツ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）から購入され、全てのＰＣＲ反応は、製造者の指示書に従ってパーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ７７００で行った。
【０１６９】
ＦＧＦＲ５β−Ｆｃでの単球の処理は以下の表１に列挙する２６個の遺伝子発現を上向き調節した。前記遺伝子のうち３個の上向き調節は定量的ＰＣＲで確認された。さらに、８個のヒトサイトカインの発現が定量的ＰＣＲで分析され、、この分析結果は表１に示される。
【０１７０】
ＦＧＦＲ５−Ｆｃは、オステオポンチン（ＯＰＮ）およびＴＧＦβのレベルの劇的な上向き調節を刺激したが、他のサイトカインには少ししか効果がなかった。この遺伝子発現のプロフィールは、ＬＰＳ、結核菌、ＧＭ−ＣＳＦ  およびＭ−ＣＳＦのような単球の他の刺激剤について記載されたプロフィールと非常に異なるが、前記他の刺激剤は、少ししかＯＰＮ発現を刺激しないが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８  ＩＬ−１０、ＩＬ−１２  およびＴＮＦαのような向炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの発現を著しく刺激したＲｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５８９４−９０４（２０００）；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｂｌｏｏｄ  ９６：２５８４−２５９１（２０００）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ  ９４：８３７−８４４（１９９９）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ  ９４：８４５−８５２（１９９９）；Ｂｏｌｄｒｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：９７２−９７７（２００２）；Ｒａｇｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０４：９９−１０８（２００１））。
【０１７１】
【表１】
2005537786.tif 000002
2005537786.tif 000003
2005537786.tif 000004
2005537786.tif 000005
【０１７２】
ＯＰＮｍＲＮＡの証明可能な上向き調節に加えて、ＰＢＭＣおよび接着性ＰＢＭＣ（単球が優占的）がＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ５、ＬＰＳまたは培養液単独で２４時間刺激され、上清がサイトカイン分析のために回収された。ＬＰＳはＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦβのような予測された向炎症性サイトカインの産生を誘導したが、ＦＧＦＲ５はしなかった。これに対し、ＦＧＦＲ５は、ＰＢＭＣおよび接着性ＰＢＭＣの両方を刺激してそれぞれ９０および１３０ｎｇ／ｍＬのオステオポンチンを産生させた。ＬＰＳは、２０および５０ｎｇ／ｍＬのオステオポンチンを刺激し、ＦＧＦＲ２および培養液の対照培養は２０ｎｇ／ｍＬ未満のオステオポンチンしか含まなかった。図１１Ａ−Ｃを参照せよ。これらの結果は、表１に提供された前記マイクロアレイおよびリアルタイムＰＣＲの結果と矛盾せず、ＦＧＦＲ５が選択的にＰＢＭＣによるオステオポンチン産生を刺激したことを証明する。
【０１７３】
全体として、ここで提供された結果は、ＦＧＦＲ５が強力でほぼ特異的なオステオポンチン発現の刺激剤であることを証明する。オステオポンチン（ＯＰＮ）は、活性化マクロファージによって分泌される多機能タンパク質で、ここでＦＧＦＲ５について説明した機能の大部分を共有する。より具体的には、ＯＰＮは、マクロファージの接着、活性化、サイトカイン分泌および増殖を刺激する、強力な免疫刺激分子（Ｏ’Ｒｅｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：４７５−４７８（２０００））である。ＯＰＮは、ＣＤ３で誘導される増殖、ＩＮＦγ産生およびＣＤ４０リガンド発現を増大させる点でＴ細胞応答の調節剤である。ＯＰＮはＴｈ１サイトカイン発現を増強し、Ｔｈ２サイトカイン発現を阻害する。ＯＰＮはマクロファージを直接誘導してＩＬ−１２を産生させ、ＬＰＳで刺激されたマクロファージによるＩＬ−１０発現を阻害する（Ａｓｈｋａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８６０−８６４（２０００））。ＯＰＮはＢ細胞増殖と自己反応性抗体の産生を誘導することが示されており、ＯＰＮは優先的にＣＤ５＋サブセットのＢ細胞を活性化し、自己抗体の産生を誘導するようである。
【０１７４】
オステオポンチンはさまざまな腫瘍、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性ループス・エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病およびリウマトイド関節炎のような自己免疫疾患、サルコイドーシスおよび結核のような肉芽種様炎症、腎結石およびアテローム性動脈硬化症のような病理的石灰化を含む多数の病理生理学的状態に関連づけられてきた（ＧｉａｃｈｅｌｌｉおよびＳｔｅｉｔｚ、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．１９：６１５−６２２（２０００））。ＯＰＮレベルの上昇は、ＳＬＥ患者および自己免疫疾患を起こしやすいＭＲＬマウスの血清で見られる。細菌２つのグループが多発性硬化症におけるＯＰＮの中心的な役割を記載した（Ｃｈａｂａｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：１７３１−１７３５（２００１）およびＪａｎｓｓｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：２０９６−２０９９（２００２））。ＯＰＮはＭＳ患者のプラークに優勢で、その免疫刺激的特性のため、ＯＰＮはＭＳの進行において役割を果たすことが提唱されている。この効果は、ＭＳのマウスのモデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において証明されている。ＯＰＮ遺伝子を欠失したマウスは進行性ＥＡＥに耐性があり、ＯＰＮを発現する野生型マウスに比べるとき、頻繁に寛解した。
【０１７５】
ＳＬＥは米国で１００、０００人あたり２４人が発症する自己免疫疾患である。罹患者通常は、腎炎、関節炎および皮膚炎を発症する。自己抗体産生、補体活性化、免疫複合体の沈着、Ｆｃレセプター連結および白血球の標的器官への浸潤が、免疫発病学的な事象の一部である。ＦＧＦＲ５の染色体位置は４ｐ１６である。多数のＳＬＥ患者の遺伝的スクリーニングは、この位置の突然変異が病気と関連することを示す。したがってＦＧＦＲ５配列の解析は、突然変異が存在するかどうか決定することによってＳＬＥのリスクがある個人を同定するために用いられるかもしれない。
【０１７６】
ＯＰＮは石灰化を阻害することによって骨再建に機能することも示されている。ＦＧＦＲ５のレベルまたは結合を低減することによるＯＰＮ発現の阻害は、骨粗鬆症または骨折の治療に有用かもしれない。逆にＦＧＦＲ５か、ＦＧＦＲ５レベルまたは活性を上昇させる物質かが、骨化石症のような過剰な骨形成を起こす行状に苦しむ患者の利益になるかもしれない。
【０１７７】
多数の最近の研究は、ＯＰＮが、乳癌、肝細胞性癌腫および大腸癌を含む多くの種類のがんで過剰発現することを示している（Ｆｕｒｇｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：６２１−６３２（２００１）；ＴｕｃｋおよびＣｈａｍｂｅｒｓ、Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ６：４１９−４２９（２００１）；ＹｅａｔｍａｎおよびＣｈａｍｂｅｒｓ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２０：８５−９０（２００３）、Ｙｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：４１６−４２３（２００３））。ＯＰＮ発現は、細胞の遊走性および浸潤の誘導と、悪性の行動に寄与する遺伝子の発現の変化を介してがんの悪性の表現型と関係づけられるようである。ＦＧＦＲ５は、腫瘍においてＯＰＮを発現させるかもしれず、したがって、ＦＧＦＲ５発現の阻害剤またはＦＧＦＲ５の機能および／または活性のアンタゴニストはがんの治療薬として作用しうる。
【０１７８】
ＦＧＦＲ５について記載された効果の多くは、ＦＧＦＲ５が高レベルのオステオポンチン発現を誘導できることによって仲介されているかもしれない。オステオポンチンは、明らかに多数の疾患の過程の進行における鍵となる分子であり、したがって、ＦＧＦＲ５のようなオステオポンチン発現の調節剤は、ＳＬＥ、脈管炎、アテローム性動脈硬化症、腎炎および関節炎を含む、オステオポンチンが仲介する疾患用の治療薬の標的である。
【実施例１１】
【０１７９】
ＦＧＦＲ５特異的抗体を用いるＦＧＦＲ５発現の解析
本実施例は、ウサギ抗ＦＧＦＲ５ポリクローナル抗血清の調製と、さまざまなヒト由来の正常および病気の組織におけるＦＧＦＲ５タンパク質の発現検出のおける有用性を開示する。
【０１８０】
ＦＧＦＲ５β細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体が、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片と融合されたマウスＦＧＦＲ５β細胞外ドメインを完全フロイントアジュバントに乳化してウサギを免疫することによって作成された。ＦＧＦＲ５特異的な免疫応答は、同じタンパク質で隔週３回、精製マウスＦＧＦＲ５β細胞外ドメインタンパク質で２回の皮下注射によってブーストされた。抗血清は前記ウサギから回収され、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー法によってＩｇＧが精製された。
【０１８１】
免疫原のヒトＩｇＧＦｃ部分に対する抗体は、ヒトＩｇＧでコーティングされたセファデックスビーズへの吸着により除去された。得られたポリクローナル抗体はヒトおよびマウスのＦＧＦＲ５に特異的に反応したが、ＥＬＩＳＡ法またはウェスタンブロット法ではヒトＦＧＦＲ１、２、３または４のＦｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮから購入）を認識しなかった。
【０１８２】
正常および病気のヒト組織アレイ（ＳｕｐｅｒＢｉｏＣｈｉｐｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）は、ＦＧＦＲ５が脾臓の赤脾髄領域の顆粒球の少数の集団で発現していることを明らかにした。これらの細胞は顆粒球の可能性がある。ＦＧＦＲ５を発現する顆粒球は、胃、肺および小腸を含む多数の組織でもみつかった。ＦＧＦＲ５発現は骨格筋、皮膚および腎臓でも検出された。さらに、ＦＧＦＲ５の発現は、肝細胞性癌腫および扁平上皮癌由来の生検組織で見られた。
【０１８３】
サルコイドーシスは非乾酪化無菌性肉芽種の形成を特徴とする自己免疫疾患である。肉芽種は、大きい上皮様細胞、組織球および巨細胞に分化するマクロファージの慢性局部刺激のため形成される節状病変である。
【０１８４】
ヒトのサルコイドーシス患者２名の生検試料が薄切され、ＦＧＦＲ５発現について染色された。第１の生検試料は、リンパ組織に包囲された無数の小さい肉芽種が充満したリンパ節であった。全てではないが多くのリンパ細胞がさまざまな程度でＦＧＦＲ５を発現していた。脈管構造に関連するリンパ細胞は強いＦＧＦＲ５＋であったが、他の細胞はより低レベルのＦＧＦＲ５タンパク質を発現することがわかった。前記肉芽種内部の細胞も非常に低レベルのＦＧＦＲ５タンパク質を発現するようであった。
【０１８５】
第２の生検は、肝由来で、第１の生検試料で観察された標準的な肉芽種とは異なる構造を示す多数の小型炎症病巣を含んでいた。これらの病巣は肉芽種病変の代表的なもののようであった。第２の生検試料中の肝細胞はＦＧＦＲ５タンパク質を発現した。前記リンパ節の試料と異なり、より少数の白血球が高レベルのＦＧＦＲ５を発現したが、小型のおそらく形成中の病変に存在する白血球は非常に高レベルのＦＧＦＲ５を発現した。
【０１８６】
前記サルコイドーシス患者の生検試料は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｄｅｘｔｒａｎ複合体を利用するキット（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）でさらに分析された。リンパ節の肉芽種は、中程度から発現なしまでさまざまな程度でＦＧＦＲ５を発現した。より成熟した肉芽種に存在する巨細胞の一部はＦＧＦＲ５について非常に強く染色したが、その他の組織球は弱く染色した。リンパ小節および顆粒球の残渣が肉芽種に散在した。前記顆粒球は前記抗体で強く染色されたが、リンパ細胞のポケットはより低レベルのＦＧＦＲ５を発現した。これらの実験は、ＦＧＦＲ５が肉芽種および顆粒球で発現し、一部のリンパ球によって発現される可能性があることを証明した。前記肝臓の生検中の肉芽種はＦＧＦＲ５を発現せず、切片全体に広く散在するＦＧＦＲ５＋顆粒球だけがあった。強陽性のＦＧＦＲ５＋細胞は顆粒球と同定された。肉芽種内の組織球および巨細胞もＦＧＦＲ５を発現した。
【０１８７】
全体では、これら２つの生検試料で得られた結果は、サルコイド病変におけるＦＧＦＲ５発現を証明し、ＦＧＦＲ５がこの疾患過程の促進に参加している可能性を示唆する。
【実施例１２】
【０１８８】
ＦＧＦＲ５生体内投与の効果
本実施例はＦＧＦＲ５βタンパク質のマウス生体内投与の効果を開示する。
【０１８９】
実験１はＢａｌｂ／ｃＢｙＪマウスを、実験２はＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを用いた。両方のセットのマウスは５μｇ（０．１ｍＬ  ＰＢＳ中５５ｎＭ）のマウスＦＧＦＲ５β細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−マウスＩｇＧ３Ｆｃ融合タンパク質を５日間朝夕同量（すなわちマウス１日あたり１０μｇ投与）皮下注射された。対照マウスはＰＢＳだけを投与された６日目に、前記マウスは屠殺され、排膿している（腋下または側腋下（ｌａｔｅｒａｌ  ａｘｉｌｌａｒｙ）リンパ節が除去された。単離細胞懸濁液が各マウスのリンパ節から作成され、各マウスから回収された細胞数がトリパンブルー生存性計測法によって血球計算器で測定された。ＦＧＦＲ５処理マウスから回収されたリンパ節細胞がプールされた。ＰＢＳ処理マウスから回収されたリンパ節細胞は別のプールの細胞にまとめられた。ＦＧＦＲ５処理およびＰＢＳ処理の両方のマウスからの細胞が表３に列挙した細胞表面抗原について染色され、フロー・サイトメトリー法で分析された。
【０１９０】
第３の実験では、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスが１０μｇ（０．１ｍＬＰＢＳ中１１０ｎＭ）のマウスＦＧＦＲ５βＥＣＤ−ヒトＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質を５日間１日１回皮下注射された。処置方式が実験１および２で用いられたものと異なるが、マウスに投与されたタンパク質の総量は変えなかった。対照マウスはヒトＩｇＧ１断片だけを投与された。６日目に、マウスは屠殺され、排膿している（腋下または側腋下）リンパ節が除去された。各マウスから回収された細胞数と、細胞表面抗原の有無が上記のとおり測定された。
【０１９１】
表２に示すとおり、ＦＧＦＲ５の生体内投与はリンパ節症、あるいは、リンパ節肥大を刺激することがわかった。Ｆｃタンパク質で処理されたマウスと比べると、ＦＧＦＲ５処理マウスの排膿リンパ節中のＢ細胞頻度は倍増した。フロー・サイトメトリー法による前記Ｂ細胞の細胞周期状態の分析は、前記Ｂ細胞が増殖しておらず、選択的に遊走したか、あるいは、リンパ節に留まっていたかのいずれかであることを明らかにした。これは、ＦＧＦＲ５が培養でマクロファージの増殖を起こすがＴ細胞またはＢ細胞の増殖を起こさないということを示す上記のデータと矛盾しない。しかし、極初期の活性抗原ＣＤ６９を発現する細胞数が増加したため、前記細胞は活性化されていた。
【０１９２】
【表２】
2005537786.tif 000006
【実施例１３】
【０１９３】
マウスＦＧＦＲ５に対するモノクローナル抗体の作成
本実施例は、マウスＦＧＦＲ５細胞外ドメインのエピトープに特異的なマウスモノクローナル抗体の調製を開示する。
【０１９４】
マウス４頭が、マウスＩｇＧ３と融合されたＦｃマウスＦＧＦＲ５細胞外ドメイン（上記のとおり調製）で免疫された。前記マウスから回収された血清試料がマウスＦＧＦＲ５に反応する抗体についてテストされた。４頭のうち２頭が抗ＦＧＦＲ５抗体を産生することが確認された。ＦＧＦＲ５抗体のタイターが最も高い１頭のマウスが前記ＦＧＦＲ５−Ｆｃ融合タンパク質で再免疫された。脾臓細胞がこのマウスから単離され、標準的な方法が前記脾臓細胞をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作成するために用いられた。融合後、前記細胞は１８枚の９６穴プレートに分注してハイブリドーマ選択培地で培養された。
【０１９５】
７００個の独立のハイブリドーマ株が、ヒトＩｇＧＦｃと融合されたマウスＦＧＦＲ５βＥＣＤを用いるＥＬＩＳＡアッセイでＦＧＦＲ５反応性抗体についてスクリーニングされた。３個の独立な陽性ハイブリドーマが同定され、さらにＦＧＦＲ５特異的な抗体についてマウスＦＧＦＲ１−４とヒトＩｇＧＦｃ融合タンパク質（市販）を用いてスクリーニングされた。ＦＧＦＲ５特異的ハイブリドーマはサブクローニングされ、上清が作成され、以下のアッセイでテストされた。
【０１９６】
３個のモノクローナル抗体がここに記載された前記ウサギポリクローナル抗血清によって明らかにされたＦＧＦＲ５の発現プロフィールを確認するのに用いられた。一連のアッセイは、３個の抗体全てが類似のエピトープを認識し、組換えＦＧＦＲ５タンパク質との結合について競合した。これら３個のモノクローナル抗体のうち１つが以下のアッセイで用いられた。
【０１９７】
一連の免疫組織化学実験が、細胞遠心（ｃｙｔｏｃｅｎｔｏｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）でスライドに固定された細胞で実施された。これらの実験は、ＦＧＦＲ５が多形核（ＰＭＮ）白血球および単球の顆粒球で発現しているが、全てのＰＭＮがＦＧＦＲ５を発現するのではなく、〜１０％はほとんどまたはまったくＦＧＦＲ５を発現しておらず、〜２０％は中レベル発現しており、残りが高レベルの前記タンパク質を発現する。この染色パターンは、ＦＧＦＲ５がＰＭＮ活性化および成熟の際に調節される可能性を示唆する。
【０１９８】
ＰＭＮおよび単球の顆粒でのＦＧＦＲ５の発現は、ＦＧＦＲ５がこれらの細胞の活性化の際に放出されることを示唆する。ＰＭＮおよび単球は、炎症の鍵を握る推進物質であり、ＰＭＮおよび単球が活性化され顆粒の中身を放出するさまざまな疾患状況でみつかる。前記顆粒は多くの重要な炎症の仲介物質を含むので、前記顆粒でのＦＧＦＲ５の発現は、ここで提供した、このタンパク質の免疫調整効果のデータを支持する。したがって、前記顆粒におけるＦＧＦＲ５の発現は、ＦＧＦＲ５が炎症組織で放出され、例えば、全身性ループス・エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマトイド関節炎（ＲＡ）および多発性硬化症（ＭＳ）のようなさまざまな疾病における疾患病理を推進することに参加する可能性を示唆する。
【０１９９】
配列番号１−１５は添付する配列表に提示される。添付する配列表で用いられるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９８８）の付属文書２に従う。
【０２００】
特許文献および非特許文献を含むここで引用された全ての文献は、引用によりそれらの全体が取り込まれる。
【０２０１】
本発明は具体的な実施態様との関係で説明されたが、変更および改変は本発明の範囲を逸脱することなく実行可能であり、本発明の範囲は添付する請求の範囲のみによって限定されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】マウスのＦＧＦレセプターｍｕＦＧＦβ（配列番号６）のアミノ酸配列。
【図２Ａ】ＳＲＥの制御下での遺伝子誘導を示すグラフ。
【図２Ｂ】ＮＩＨ−３Ｔ３  ＳＲＥ細胞の競合解析を示すグラフ。
【図３】ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによるＲＡＷ２６４．１０細胞ｎ増殖刺激を示すグラフ。
【図４】ＰＨＡで誘導されたＰＢＭＣへのＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γの増殖増強効果を示すグラフ。
【図５】ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによる抗ＣＤ３で刺激されたＰＢＭＣの増殖の増強を示すグラフ。
【図６】ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γも、対照のＦＧＦＲ２もＩｇＧＦｃも、ＰＨＡ非存在下ではＰＢＭＣの増殖を刺激しなかったことを証明するグラフ。
【図７】ＰＢＭＣの接着の刺激がＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによって起こるが、ＦＧＦＲ２または精製ＩｇＧＦｃによっては起こらないことを示すグラフ。
【図８】接着したＰＨＡ刺激ＰＢＭＣの刺激がＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによって起こるが、精製ＩｇＧＦｃによっては起こらないことを示すグラフ。
【図９】ＮＫ細胞のマーカーである抗ＣＤ５６抗体の存在下で測定された、ＦＧＦＲ５βおよびＦＧＦＲ５γによるＮＫ細胞の接着の刺激を示すグラフ。
【図１０】ヒトＦＧＦＲ５のアミノ酸配列。
【図１１】ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ５、ＬＰＳまたは培地単独で２４時間刺激した後のＯＰＮタンパク質（図１１Ａ）、ＰＢＭＣ（図１１Ｂ）および接着性ＰＢＭＣ（単球が優占的、図１１Ｃ）の上向き調節を示す棒グラフ。
【図１】
2005537786.tif 000007
【図２Ａ】
2005537786.tif 000008
【図２Ｂ】
2005537786.tif 000009
【図３】
2005537786.tif 000010
【図４】
2005537786.tif 000011
【図５】
2005537786.tif 000012
【図６】
2005537786.tif 000013
【図７】
2005537786.tif 000014
【図８】
2005537786.tif 000015
【図９】
2005537786.tif 000016
【図１０】
2005537786.tif 000017
【図１１】
2005537786.tif 000018
【配列表】
2005537786000001.app
【国際調査報告】
2005537786.tif 000019
2005537786.tif 000020
2005537786.tif 000021
2005537786.tif 000022