(57)【要約】キトサンとイミノチオラクトン、例えば、2−イミノチオランとの反応により、チオール基をポリマーに共有結合的に固定化可能である。得られたキトサン誘導体は、分子間および分子内ジスルフィド結合の形成が可能なチオール基を有する。この架橋プロセスのために、ポリマー溶液の粘度が大きく改善される。さらに、ポリマーのカチオン性が大きく改善される。これらの新規キトサン誘導体の好ましい用途は化粧的および薬学的使用である。
2005505644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全体構造内に以下の式で表される下部構造を含む高分子化合物；
【化１】
2005505644.tif 000003
［式中、X=-CR1R2-CR1R2-CR1R2-CR1R2-CR1R2-CR1R2-、-CR1R2-CR1R2-CR1R2-CR1R2-CR1R2-、-CR1R2-CR1R2-CR1R2-CR1R2-、-CR1R2-CR1R2-CR1R2-、-CR1R2-CR1R2-または-CR1R2-（R1およびR2はそれぞれ独立してまたは同時に水素、-OH、-SH、-O-CH3、-O-CH2-CH3、-O-CH(CH3)2、-O-CH2-CH2-CH3、-OOC-CH3、-OOC-CH2-CH3、-OOC-CH2-CH2-CH3、=O、-Cl、-Br、-I、アルキル、アリールおよびO-アリールから選択される置換基である）である］。
【請求項２】
X=-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-、-CH2-CRH-CH2-（R=アルキル-、アリールまたはO-アリール-残基）、または-CH2-CO-CH2-である請求項1に記載の高分子化合物。
【請求項３】
全化学構造内に請求項1または2に記載の下部構造を1個または数個有するキトサン誘導体。
【請求項４】
共有結合されたチオール基の濃度が高分子複合体1グラムあたり10〜4200μmol、特に50〜2000μmolである請求項1〜3のいずれかに記載の高分子化合物。
【請求項５】
高分子化合物の1％水溶液が酸化により5倍以上、特に50倍以上の粘度増加を示す請求項1〜4のいずれかに記載の高分子化合物。
【請求項６】
キトサンを以下の一般構造式；
【化２】
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（式中、Xは上記と同様に定義される）で表されるイミノチオラクトンと反応させるステップを含む請求項1〜5のいずれかに記載の高分子化合物を製造する方法。
【請求項７】
イミノチオラクトンが2-イミノチオラン（トラウツ試薬）である請求項6に記載の方法。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物の化粧製品のための使用。
【請求項９】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物の整髪用ゲルでの使用。
【請求項１０】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物のメーキャップ用品での使用。
【請求項１１】
薬学的使用のための請求項1〜5のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物の点眼薬調製のための使用。
【請求項１３】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物のガラス体代用品としての使用。
【請求項１４】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物のステント用被覆材料としての使用。
【請求項１５】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物の組織工学での使用。
【請求項１６】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物の細胞培養のための使用。
【請求項１７】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物および生物細胞または組織を含む足場。
【請求項１８】
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物または請求項17に記載の足場のインプラント調製のための使用。
【請求項１９】
キトサンをイミノチオランとの反応によって化学的に変性する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキトサン−チオ−アミジン複合体ならびにその化粧的および薬学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧的および薬学的配合物における高分子化合物の使用には長い伝統がある。その初期には、例えば、デンプンやゼラチンなどの天然源由来のポリマーしか使用されなかった。その後、有機化学の発達により、例えば、ポリアクリレートなどの合成ポリマーが生成されるようになった。さらに、天然ポリマーの化学的変性により、その特徴を大きく改善することもできた。例えば、セルロースエーテルの生成によって、化粧的および薬学的に使用される新規なポリマーであって、水溶液中で強いゲル化特性を示すものが得られた。別の発明は、カニの殻から単離可能なキチンの脱アセチル化に関するものである。脱アセチル化されたキチンまたは、いわゆるキトサンは、化粧用配合物［ナイドゥー・エヌ・ティー(Naidoo, N.T.)、「天然の化粧用成分：海草、キトサンおよび米」、エス・アフロ・ファーマ・ジェイ(S. Afr. Pharm. J.);59（1992）131〜132］および薬学的配合物［イルム・エル(Illum, L.)、「薬学的賦形剤としてのキトサンおよびその使用」、ファーマ・レス(Pharm. Res.)15（1998）1326〜1331］においてゲル化ポリマーとして使用される。キトサンの化学的変性によって、トリメチル化キトサン［サノウ・エム(Thanou, M.)、フローリア・ビー・アイ(Florea, B.I.)、ランジメーヤー・エム・ダブリュー(Langemeyer, M.W.)、ファーホフ・ジェイ・シー(Verhoef, J.C.)、ジャンギンガー・エッチ・イー(Junginger, H.E.)、「N-トリメチル化キトサンクロリド（TMC）はイン・ビトロ（Caco-2細胞）およびイン・ビボ（ラット）でのペプチド薬剤ブセレリンの腸の透過を改善する」、ファーマ・レス、17（2000）27〜31］、モノ−N−カルボキシメチルキトサン［サノウ・エム(Thanou, M.)、ニホット・エム・ティー(Nihot, M.T.)、ジャンセン・エム(Jansen, M.)、ファーホフ・ジェイ・シー、ジャンギンガー・エッチ・イー、「高分子両性キトサン誘導体であるモノ-N-カルボキシメチルキトサン（MCC）はイン・ビトロおよびイン・ビボにおいて腸の上皮を通して低分子量ヘパリンの腸の吸収を高める」、ジェイ・ファーマ・サイ(J. Pharm. Sci.)、90（2001）38〜46］、およびキトサン−EDTA複合体［酸性キレート錯体形成物質とのキトサン複合体；WO9831712A2；発明者：バーンコップ-シュナーチ・アンドレアス(Bernkop-Schnurch Andreas)およびペイクル・クリスティーナ(Paikl Christina)］が得られた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在の技術水準においてキトサンおよびキトサン誘導体は、一方で、粘弾性およびゲル化特性に関する欠点を有し、他方で、薬学的調製方法における特に工業的スケールでの取扱い特性に関する欠点を有する。従って、本発明は、より優れた特性を有するポリマー、特にキトサン誘導ポリマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、請求項1〜5のいずれかで定義された高分子化合物を提供する。そのようなポリマーは請求項6、7または19のいずれかに記載の方法によって好ましく製造される。当該ポリマーの好ましい使用は、請求項8〜18の内容によって特定される。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によるキトサンポリマーの化学的変性によって、好ましい特性と驚くべき優れた取扱い特性を有する高分子化合物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
ここで使用される用語「ポリマー」は、少なくとも1kDa、好ましくは少なくとも50 kDa、特に少なくとも200 kDaの分子量を有する分子であって、同定可能なモノマー、好ましくは炭水化物（糖）単量体（これによってポリサッカリドを定義している）、特にここで記載されようにC-2原子上にN−置換基を有するグルコース（グルコサミン）構造から誘導される単量体を少なくとも5個、好ましくは少なくとも20個、特に少なくとも100個含むと共に、請求項1で定義されるようなチオ−アミジンが複合化された糖構造を少なくとも2個、好ましくは少なくとも10個、特に少なくとも50個有する分子に関するものである。アルキルは好ましくは直線状または分枝状のC1−C10基であり、「アリール」は好ましくはヘテロ原子を有しない置換または無置換芳香族環である。
【０００７】
キトサンとイミノチオラクトン、例えば、2−イミノチオランとの反応によって、チオール下部構造はポリマーに共有結合的に固定化され、ポリマーのカチオン性が大きく改善される。好ましい変性キトサンの化学構造を図1に示す。キトサン−チオ−アミジン複合体の精製は、好ましくは、溶液からのポリマーの透析または沈殿によって行うことができる。驚くべきことに、キトサンの粘弾性的特徴はこの化学的変性によって大きく改善された。このキトサン誘導体の水性ゲルは不活性条件下で低粘度を示したが、空気の存在下では粘度が500倍以上増大した。この効果の原因は、ポリマー鎖の架橋をもたらすポリマー内でのジスルフィド結合の形成である。さらに、変性キトサンは、該ポリマーのチオール基と表面タンパク質のシステインサブユニット(cysteine subunits)との間でのジスルフィド結合の形成に起因して、皮膚および毛髪に非常に良好に付着する。これらの特性のために、チオール化キトサンは、適用後において汚したり、分離したりすることを回避しつつ、それ自身安定化すべき整髪用ゲルまたはメーキャップ用品のための化合物となる。薬学的観点から本発明のポリマーは、例えば、点眼薬用の現場ゲル化賦形剤(in situ gelling excipients)としての利点を提供する。そのような点眼薬は低粘度で容易に点眼可能であり、その後、空気中での酸化プロセスに起因して眼の表面上で高粘性になる。眼の表面上での、この改善された粘度のために、該ポリマーは混合されている薬剤とともに標的組織上で長時間とどまり、治療効果を大きく改善する。さらに、組織工学の場合には、ここで記載されている本発明に基づくポリマーは大きな利益をもたらす。細胞はそのようなキトサン誘導体の水溶液と共に生体外(ex vivo)で低粘度で均一化可能である。体内への注入後、またはその懸濁液をモールド(moulds)に注いだ後、ポリマー／細胞混合物は酸素（または他の適切な酸化剤）の作用によって固形になり、細胞増殖のための安定な足場(scaffold)を提供する。さらに、キトサン−チオ−アミジン複合体はその優れた現場ゲル化特性(in situ gelling properties)のために、ガラス体代用品(vitreous substitutes)として使用可能であり、該複合体は水溶液の形態で注入され、眼の中で酸化により固形になる。さらにまた、ここで記載のポリマーはステント(stent)の被覆材料として有用であり、包埋された薬剤の制御された放出を可能にする。
【０００８】
従って、本発明は、本発明のポリマーを有するか、または該ポリマーから形成されるインプラント(implants)、足場、ステント、被膜および他の製品、特に医薬品または化粧製品も包含する。
【０００９】
本発明を以下の実施例および図面でさらに説明するが、本発明はそれらに制限されるものではない。
【実施例】
【００１０】
実施例１：
キトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体の合成
分子量約150kDaおよび脱アセチル化度85％のキトサンを最終濃度が0.2％（m/v）になるように1％酢酸に溶解した。2-イミノチオラン(2-iminothiolane)HCl（トラウツ試薬(Traut's reagent)）を最終濃度が0.7mg/mlになるように添加した後、窒素を2時間通気することにより溶液中の酸素を除去する。pHを1M NaOHで6.5に調整し、反応を室温で不活性条件下で8時間進行させた。得られたキトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体（図1参照）を、2mM HClとその後の脱塩水による透析により単離する。単離されたポリマーを凍結乾燥する。この方法によって製造された複合体はポリマー1グラムあたり0.5±0.2mMolの固定化チオール基を有する。
【００１１】
実施例２：
キトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体の誘導体の合成
分子量約150kDaおよび脱アセチル化度85％のキトサンを最終濃度が0.2％（m/v）になるように1％酢酸に溶解した。この溶液中へ5-メチル-2-イミノチオランHCl、5,5-ジメチル-2-イミノチオランHCl、5-フェニル-2-イミノチオランHClまたは4-メトキシ-2-イミノチオランHClを最終濃度が1mg/mlになるように添加した後、窒素を2時間通気することにより溶液中の酸素を除去する。pHを1M NaOHで6.0に調整し、反応を室温で不活性条件下で8時間進行させた。得られたキトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体の誘導体を、2mM HClとその後の脱塩水による透析により単離する。単離されたポリマーを凍結乾燥する。この方法によって製造された複合体はポリマー1グラムあたり0.02〜0.6mMolの固定化チオール基を有する。
【００１２】
実施例３：
ジスルフィド結合の形成
チオール化キトサン内のジスルフィド結合の形成を以下のようにして測定した。キトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体を最終濃度が0.5％（m/v）になるように80mMアセテート緩衝液（pH6.5）に溶解した。その後、ポリマー溶液のpH値を、1M NaOHの添加により6.5に再調整した。反応混合物を37℃でインキュベートし、アリコートを実験の始めとその後の毎時間に分取した。これらのサンプル中の残留チオール基の濃度をエールマン試薬(Ellman's reagent)（5,5'-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸））で測定した。この実験の結果を図2に示す。結果は、時間の関数として残留チオール基が減少していること、すなわち高分子ネットワーク内でジスルフィド結合が形成されていることを示している。4時間以内で全チオール基の約25％がジスルフィド結合に酸化された。
【００１３】
実施例４：
粘度の増加
ジスルフィド結合の形成による粘度増加を粘度計（円錐体/プレート(cone/plate)）を用いて測定した。キトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体を最終濃度が1.5％（m/v）になるように80mMホスフェート緩衝液（pH6.0）に溶解した。この溶液の粘度増加を、0、5時間および20時間の時点で流れ曲線により測定した。この実験の結果を図3に示す。結果は、ポリマー溶液の粘度が時間の関数として有意に増加することを示している。インキュベーションを20時間行った後、ポリマー溶液の粘度はスタート時点の粘度よりも約50倍以上高かった。これらの現場ゲル化特性の利点は、ポリマー溶液が液体形態で適用でき、適用後は固形になるところにある。化粧品の分野では、例えば、メーキャップ用品を液体状態で適用でき、該メーキャップ用品は数分後に皮膚上で安定になる。
【００１４】
実施例５：
整髪用ゲル配合物の調製
まず、キトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体2gを酸素不含脱塩水200mlに溶解する。溶液のpH値をNaOHの添加によって7.0に調整した。イソプロピルアルコールを80ml添加した後、得られた透明ゲルを不活性条件下で30mlの単一ユニット容器(single unit vessels)に充填する。
【００１５】
実施例６：
メーキャップ用配合物の調製
まず、キトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体4gを酸素不含脱塩水200mlに溶解した。その後、着色顔料溶液（30％懸濁液；バイオチック・ホセア(Biotic Phocea)、マルセイユ、フランス）60mlを添加する。残留酸素を減圧によって除去した後、脱塩水を添加して最終体積200mlを達成し、pH値を7.0に調整する。メーキャップ用配合物を不活性条件下で1mlの単一ユニット容器に充填する。
【００１６】
実施例７：
チモロール点眼薬用の医薬配合物の調製
チモロール(timolol)HCl（3-tert-ブチルアミノ-1-［（4-モルホリノ-1,2,5-チアジアゾール-3-イル）オキシ］-2-プロパノール）は緑内障の処置のためのベータ−ブロッカーである。この薬剤を最終濃度が0.5％（m/v）になるように20mMアセテート緩衝液（pH5.2）に溶解する。キトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体を最終濃度が0.1％（m/v）になるように添加すると共に、防腐剤を最終濃度が0.03％（m/v）になるように添加した後、pH値を5.2に再調整する。溶液中へ窒素を通気することにより残留酸素を除去する。得られた点眼薬を不活性条件下で10mlの多ユニット容器(multiple unit vessels)に充填する。その後、容器をアルミニウム箔で密封する。
【００１７】
実施例８：
クロトリマゾール(clotrimazole)含有錠剤の調製および特性
まず、500mgのキトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体0.5％溶液を40mlの脱塩水中で水和し、次いで2mlのジオキサンに溶解したクロトリマトゾール(clotrimatzole)100mgと共に均一化した。混合物を-20℃で凍結し、凍結乾燥した。上記のように凍結乾燥したポリマー/クロトリマゾール混合物を圧縮して錠剤とした。この薬剤送給系(drug delivery system)からのイン・ビトロ薬剤放出(in vitro drug release)を分析した。該錠剤を、放出媒体（80mMアセテート緩衝液（pH6.0）／ジオキサン；7＋3）6mlを収容したビーカー（ショット・デュラン(Schott Duran)25ml、ドイツ）に入れた。密閉した該ビーカーを振動水浴中に置き、37℃でインキュベートした。実験中、該ビーカーは浸漬した状態に維持した。8時間の間、400μlのアリコートを1時間ごとに分取した。媒体を等体積の放出用媒体と取り替えた。256nmで吸光度を測定することにより、放出されたクロトリマゾールをアッセイした。濃度を標準曲線から補間により算出した。放出実験の結果を図4に示す。結果は、送給系からの制御され、かつ持続された薬剤放出が保証され得ることを示している。
【００１８】
実施例９：
組織工学
足場の調製（方法I）
凍結乾燥されたキトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体を脱塩水で再水和し、3％（m/v）ポリマーゲルを得た。得られたゲルをオートクレーブ処理（10分間、121℃）により滅菌し、その後の使用まで無菌条件下、室温で貯蔵した。
【００１９】
足場の調製（方法II）
凍結乾燥されたキトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体を以下の方法で滅菌した：凍結乾燥された少量のチオール化キトサンを96％（v/v）EtOHと共に1時間インキュベートした後、70％（v/v）イソプロピルアルコールと共に48時間インキュベートした。その後の貯蔵のために70％（v/v）EtOHを用いた。
【００２０】
細胞培養実験
細胞培養実験を24-ウェル培養プレートで行った。未処理の培養ウェルを対照として使用した。キトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体製シートを5×5mmの大きさの試験片にカットし、該試験片を培養容器中で空気乾燥した後、PBS（リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4；ライフ・テクノロジーサ(Life Technologiesa)社製）で3回濯ぐことによってpHを7.4に調整した。ゲルを液化し、液滴（直径約5mm）を培養プレートに移した。L-929細胞（マウス線維芽細胞）を10μl DMEM（ライフ・テクノロジーサ社製）＋10％FCS（ライフ・テクノロジーサ社製）混合液中へ再度懸濁し、1×104個の細胞を、キトサン-4-チオ-ブチル-アミジン複合体を収容する各容器および対照容器に接種した。2時間インキュベートした後、750μlの培地を加えた。この足場上での細胞生長を2日ごとに顕微鏡で調査した。結果は、新規な足場材料上での細胞生長が速く、かつ密なことを示した。
【００２１】
本発明のポリマーの特徴：
１．キトサン-チオ-アミジン複合体の酸性水溶液は透明なクリヤゲルをもたらす。
２．キトサン-チオ-アミジン複合体の水溶液は、酸素の存在下ではジスルフィド結合の形成によって固体になる。
３．キトサン-チオ-アミジン複合体の配合物は強い現場ゲル化特性を示す。
４．固定化チオール基はキトサン-チオ-アミジン複合体上において不活性条件下で安定なままである。
５．キトサン-チオ-アミジン複合体はチオール側鎖を有し、キトサンよりも強いカチオン性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の好ましいポリマーの化学構造を示す。
【図２】ジスルフィド結合形成後の残留チオール基の濃度を示す。
【図３】ジスルフィド結合の形成による粘度増加を示す。
【図４】本発明のポリマーを含む錠剤から放出されたクロトリマゾールの量を示す。
【図２】
2005505644.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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2005505644.tif 000021
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【国際調査報告】
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