(57)【要約】ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むアセンブリ単位の種を少なくとも１つ含むナノ構造が作製される。ＰＮＡアセンブリ単位は、１つまたは２つのＰＮＡ連結要素を有し得る。さらに、ＰＮＡアセンブリ単位は、構造的要素、および／または他の機能的要素もしくは連結要素を含み得る。このナノ構造は、標準的なアセンブリ法を使用して、適切に調製される。この方法において、少なくとも１つの未結合連結要素を有するナノ構造中間体が、複数の異なる連結要素を有するアセンブリ単位と接触される。アセンブリ単位の連結要素のうちのいずれも、それら自体とも、同じアセンブリ単位の別の連結要素とも相互作用し得ない。しかし、アセンブリ単位の連結要素のうちの１つは、ナノ構造中間体の未結合連結要素と相互作用し得、その結果、このアセンブリ単位は、ナノ構造中間体に非共有結合され、新たなナノ構造中間体を形成する。
2005518456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ構造の段階的アセンブリのための方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの未結合連結要素を含むナノ構造中間体を、複数の異なる連結要素を含むアセンブリ単位と接触させる工程であって、ここで：
（ｉ）該複数の異なる連結要素のうちの連結要素のいずれも、それ自体とも、該複数のものの別の連結要素とも相互作用し得ず；そして
（ｉｉ）該複数の単一の連結要素、および該ナノ構造中間体の単一の未結合連結要素が、相補的連結要素である、工程、
であって、ここで、該アセンブリ単位は、該ナノ構造中間体に非共有結合されて、引き続くサイクルにおいて使用するための新たなナノ構造中間体を形成する、工程；
（ｂ）未結合アセンブリ単位を除去する工程；ならびに
（ｃ）ナノ構造を形成するために十分なサイクル数にわたって、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、
を包含し、ここで、少なくとも１つのサイクルにおいて、該アセンブリ単位は、ペプチド核酸を含む、方法。
【請求項２】
前記ナノ構造中間体が、表面結合した開始アセンブリ単位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらなる工程：
（ｄ）前記ナノ構造を１つ以上のキャップ単位でキャップする工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのサイクルにおいて使用される第一のアセンブリ単位が、ペプチド核酸を含む第一の連結要素に共有結合した少なくとも１つの構造的要素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記構造的要素が、前記第一の連結要素および第二の連結要素に共有結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第二の連結要素が、ペプチド核酸を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一のアセンブリ単位が、第二の構造的要素に結合して安定な複合体を形成する第一の構造的要素を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記アセンブリ単位が、機能的要素をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶、ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能的要素が、ペプチド核酸を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのサイクルにおいて使用される第一のアセンブリ単位が、機能的要素およびペプチド核酸を含む結合要素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶、ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記機能的要素が、ペプチド核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
相補的連結要素の特異的な非共有結合相互作用の、共有結合へのアセンブリ後転換の工程をさらに包含し、これによって、該結合が安定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アセンブリ単位が、複数のサブアセンブリ単位を含み、該サブアセンブリ単位が互いに結合して、安定な複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
複数の異なる連結要素を含むアセンブリ単位の複数の種から形成された、ナノ構造であって、該アセンブリ単位は、ペプチド核酸を含む第一のアセンブリ単位を含む、ナノ構造。
【請求項１７】
前記第一のアセンブリ単位における前記ペプチド核酸が、連結要素として存在する、請求項１６に記載のナノ構造。
【請求項１８】
前記第一のアセンブリ単位が、機能的要素をさらに含む、請求項１７に記載のナノ構造。
【請求項１９】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶、ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項１８に記載のナノ構造。
【請求項２０】
前記機能的要素が、ペプチド核酸を含む、請求項１８に記載のナノ構造。
【請求項２１】
前記第一のアセンブリ単位における前記ペプチド核酸が、機能的要素として存在する、請求項１７に記載のナノ構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むナノ構造のアセンブリのための方法、このようなナノ構造の構築において使用するためのＰＮＡアセンブリ単位、およびＰＮＡアセンブリ単位を含むナノ構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ナノ構造は、ナノメートル範囲（約１〜１００ｎｍ）の１つ以上の特徴的な寸法を有する個々の成分を有する構造である。成分がナノメートル範囲の物理的寸法を有する構造をアセンブルする利点が、科学者によって４０年以上にわたって考察および熟考されてきた。これらの構造の利点は、Ｆｅｙｎｍａｎ（１９５９，Ｔｈｅｒｅ’ｓ  Ｐｌｅｎｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｏｍ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｏｔｔｏｍ，Ａｎ  Ｉｎｖｉｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｅｎｔｅｒ  ａ  Ｎｅｗ  Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ（講義）、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２９，１９５９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて再版，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９６０，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）によって最初に指摘され、そしてＤｒｅｘｌｅｒ（１９８６，Ｅｎｇｉｎｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ，Ｇａｒｄｅｎ  Ｃｉｔｙ，Ｎ．Ｙ．：Ａｎｃｈｏｒ  Ｐｒｅｓｓ／Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ）によって大きく展開された。これらの科学者は、非常に小さい特徴的寸法を有する構造の創出において、多大な有用性を想定した。ナノテクノロジーの潜在的な適用は、広がる傾向にあり、そして社会に対する予測された影響は大きい（例えば、２０００，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ：ＩＷＧＮ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  Ｒｅｐｏｒｔ；Ｖｉｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒ＆Ｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｄｅｃａｄｅ；Ｍ．Ｃ．Ｒｏｃｏ，Ｒ．Ｓ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰ．Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ編，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。非常に多数のナノスケールのデバイスおよび構造（電子部品および光部品；医療用センサ；新規材料；生体適合性デバイス；ナノエレクトロニクスおよびナノ回路；ならびにコンピュータ技術を含む）についての潜在的な適用が存在すことが予測される。
【０００３】
ナノ構造の物理的性質および化学的性質は、このナノ構造が作製される構築ブロックに依存する。例えば、これらの構築ブロックのサイズおよびこれらが連結する角度、ならびに機能的要素が配置され得る位置は、ナノ構造の特性を決定する際に重要な役割を果たす。当該分野は、ナノ構造において使用され得る異なる型の材料の多数の例を提供しており、これには、以下が挙げられる：ＤＮＡ（米国特許第５，４６８，８５１号、同第５，９４８，８９７号および同第６，０７２，０４４号；ＷＯ  ０１／００８７６）、バクテリオファージＴ−平坦（ｅｖｅｎ）テイル繊維（米国特許第５，８６４，０１３号および同第５，８７７，２７９号ならびにＷＯ  ００／７７１９６）、ヒトエラスチンおよび他の繊維状タンパク質でモデル化された自己整列ペプチド（米国特許第５，９６９，１０６号）、ならびに人工ペプチド認識配列（米国特許第５，７１２，３６６号）。それにもかかわらず、ナノ構造についての全ての潜在的適用を満たすために必要とされ得る多様性を提供するために、さらなる型の構築ブロックが継続して必要とされている。本願は、このクラスのみの構築ブロックを含む均質なナノ構造中、または他のクラスの構築ブロックと組み合わせて不均一ナノ構造中で使用され得る、構築ブロックのさらなるクラスを提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、複数の種のアセンブリ単位から形成されたナノ構造を提供する。いくつかの例外（例えば、キャップ単位）があるものの、これらのアセンブリ単位は、複数の異なる連結要素を含む。本発明のナノ構造において、このナノ構造は、少なくとも１つの連結要素または機能的要素がペプチド核酸を含む、少なくとも１種のアセンブリ単位を含む。ＰＮＡアセンブリ単位は、２つのＰＮＡ連結要素を有し得る。さらに、ＰＮＡアセンブリ要素は、他の構造的要素、機能的要素および連結要素を含み得る。
【０００５】
本発明のナノ構造は、段階的アセンブリ法を使用して適切に調製される。この方法において、少なくとも１つの未結合の連結要素を含むナノ構造中間体は、複数の異なる連結要素を含むアセンブリ単位と接触させられる。この方法において、
（ｉ）この複数の異なる連結要素の中には、それ自体または別の複数の連結要素と相互作用し得る連結要素はなく、そして
（ｉｉ）複数の連結要素の中の単一の連結要素と、ナノ構造中間体の単一の未結合の連結要素とは、相補的な連結要素である。
結果として、アセンブリ単位は、ナノ構造中間体と非共有結合して、引き続くサイクルにおいて使用するための新たなナノ構造中間体を形成する。次いで、未結合のアセンブリ単位が除去され、そしてこのプロセスが、ナノ構造を形成するのに十分な数のサイクルにわたって反復される。
【０００６】
本発明の方法において、少なくとも１つのサイクルにおける相補的連結要素は、ＰＮＡを含む。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本願における用語は、当該分野におけるその通常の意味と一致した様式で一般に使用される。しかし、明確さを提供するために、当該分野で一致しない事象においては、以下の定義が支配する。
【０００８】
（アセンブリ単位）アセンブリ単位は、構造的要素、連結要素および／または機能的要素を含む原子および／または分子の集合である。好ましくは、アセンブリ単位は、特異的非共有結合相互作用の形成を介して、単一の単位としてナノ構造に付加される。アセンブリ単位は、２つ以上のサブアセンブリ単位であり得る。アセンブリ単位は、１つ以上の構造的要素を含み得、そしてさらに、１つ以上の機能的要素および１つ以上の連結要素を含み得る。アセンブリ単位が機能的要素を含む場合、この機能的要素は、連結要素に結合され得るかもしくは連結要素内に組み込まれ得、または特定の実施形態においては構造的要素に結合され得るかもしくは構造的要素内に組み込まれ得る。１つの構造的要素および１つまたは複数の非相互作用連結要素を含み得るこのようなアセンブリ単位は、特定の実施形態において、構造的に剛性であり得、そして十分規定された認識特性および結合特性を有し得る。
【０００９】
（アセンブリ単位、開始剤）開始アセンブリ単位は、本発明の段階的アセンブリ法によって形成されるナノ構造に組み込まれ得る最初のアセンブリ単位である。これは、段階的アセンブリプロセスの第一工程として、共有結合相互作用または非共有結合相互作用によって、固体基板または他のマトリクスに結合され得る。開始アセンブリ単位はまた、「開始単位」としても公知である。
【００１０】
（下から上へ（ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ））構造（例えば、ナノ構造）の下から上へのアセンブリは、例えば、自己アセンブリまたは段階的アセンブリを使用してサブ構造を一緒に連結することによる、その構造の形成である。
【００１１】
（キャップ単位）キャップ単位は、最大で１つの連結要素を含むアセンブリ単位である。キャップ単位が一旦ナノ構造中に組み込まれると、キャップ単位との相互作用を介してさらなるアセンブリ単位がナノ構造中に組み込まれることはできない。
【００１２】
（機能的要素）機能的要素は、任意の所望の物理的特性、化学的特性または生物学的特性を示す部分であり、ナノ構造中の十分規定された部位において、特異的な共有結合相互作用または非共有結合相互作用によって構築、結合または配置され得る。あるいは、機能的要素は、所望の物理的特性、化学的特性または生物学的特性を有する部分についての結合部位を提供するために使用され得る。機能的要素の例としては、限定ではなく、ペプチド、タンパク質（例えば、酵素）、タンパク質ドメイン、低分子、無機ナノ粒子、原子、原子クラスター、磁性ナノ粒子、光ナノ粒子もしくは電子ナノ粒子、またはマーカー（例えば、放射性分子、発色団、発蛍光団、化学発光分子もしくは酵素マーカー）が挙げられる。このような機能的要素は、二次元ナノ構造および三次元ナノ構造を形成するために、線状の一次元ナノ構造を架橋するためにも使用され得る。
【００１３】
（連結要素）連結要素は、アセンブリ単位に結合特性を付与する、アセンブリ単位の一部であり、これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結合ドメイン、ハプテン、抗原、ペプチド、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、ポリマーもしくは他の部分、またはこれらの組み合わせ（これらは、特異的な非共有結合相互作用を介して、別の連結要素と相互作用し得る）。
【００１４】
（連結要素、相補的）相補的連結要素は、特異的な非共有結合相互作用を介して、互いに相互作用する２つの連結要素である。
【００１５】
（連結要素、非相補的）非相補的連結要素は、互いに特異的に相互作用せず、そして互いに特異的に相互作用する傾向を全く実証しない、２つの連結要素である。
【００１６】
（連結対）連結対は、２つの相補的連結要素である。
【００１７】
（ナノ材料）ナノ材料は、ナノ粒子の、結晶性集合から作製されるか、部分的に結晶性集合から作製されるか、または非結晶性集合から作製される、材料である。
【００１８】
（ナノ粒子）ナノ粒子は、一緒に結合してナノメートル範囲（１〜１０００ｎｍ）の寸法を有する構造を形成する、原子または分子の集合である。この粒子は、均質であっても不均質であってもよい。単一の結晶ドメインを含むナノ粒子は、ナノ結晶とも呼ばれる。
【００１９】
（ナノ構造またはナノデバイス）ナノ構造またはナノデバイスは、アセンブリ単位（すなわち、構造的要素、機能的要素および／または連結要素）を含む原子および／または分子の集合である。これらの要素は、ナノメートル範囲の少なくとも１つの特徴的長さ（寸法）を有し、ここで、互いに対するアセンブリ単位の位置は、規定された形状で確立される。ナノ構造またはナノデバイスはまた、これに結合した官能性置換基を有して、特定の官能性を提供し得る。
【００２０】
（ナノ構造中間体）ナノ構造中間体は、さらなるアセンブリ単位が付加され得る、ナノ構造のアセンブリ中に形成される中間体サブ構造である。最終工程において、この中間体とナノ構造とは同じである。
【００２１】
（非共有結合相互作用、特異的）特異的非共有結合相互作用は、例えば、アセンブリ単位とナノ構造中間体との間で生じる相互作用である。
【００２２】
（タンパク質）本願において、用語「タンパク質」は、複数のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質をいうように一般に使用され、そしてアミノ酸の最小数をいずれも示すことを意図しない。
【００２３】
（除去）未結合のアセンブリ単位の除去は、物理的に除去されるかされないかによらず、これらが、成長中のナノ構造とのさらなる反応に関与することができないようにされる場合に達成される。
【００２４】
（自己アセンブリ）自己アセンブリは、規則正しい構造への、成分の自発的組織化である。自律的アセンブリとしても知られる。
【００２５】
（ナノ構造の段階的アセンブリ）ナノ構造の段階的アセンブリは、ナノ構造のアセンブリのためのプロセスであり、ここで、一連のアセンブリ単位は、固体マトリクスまたは固体基板上に代表的には固定化された開始単位で始まる、予め指定された順番で付加される。各工程は、中間体サブ構造（ナノ構造中間体という）の形成を生じ、次いでこれに、さらなるアセンブリ単位が付加され得る。アセンブリ工程は、以下の工程を包含する：（ｉ）連結工程（ここで、アセンブリ単位は、付加されるべき次のアセンブリ単位を含む溶液中の結合した開始単位またはナノ構造中間体との、マトリクスまたは基板のインキュベーションによって、開始単位またはナノ構造中間体に連結される）；ならびに（ｉｉ）除去工程（例えば、洗浄工程（ここで、過剰なアセンブリ単位は、中間体構造または完成したナノ構造の近位から除去される））。段階的アセンブリは、ナノ構造の所望の設計に従って全てのアセンブリ単位がナノ構造に組み込まれるまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）を反復することによって継続される。アセンブリ単位は、特異的な非共有結合の形成を介して、開始単位またはナノ構造中間体に結合する。アセンブリ単位の連結要素は、ナノ構造中間体上の予め指定された部位にのみ結合するように、選択される。アセンブリ単位の形状、構造的要素、ならびに連結要素および機能的要素の相対的配置、そしてアセンブリ単位がナノ構造に付加される順序は、全て、機能的単位がこの構造において互いに対して予め指定された位置に配置され、それによって完全にアセンブリされたナノ構造に所望の機能を付与するように、設計される。
【００２６】
（ストリンジェンシー）：実験条件が、安定なハイブリダイゼーション相互作用を達成するために２つの核酸配列に対して高い程度の相補性を課す程度。高いまたは中程度のストリンジェントの条件は、当該分野において一般的に公知である。例示として制限ではなく、高いストリンジェンシーの例示的な条件は、以下の通りである：ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００  μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝液中で、６５℃で８時間〜一晩の間実施する。フィルターを、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中で、６５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ＢＳＡを含む溶液中で１時間、３７℃で行う。これに続いて、オートラジオグラフィーの前に、０．１×ＳＳＣ中で、５０℃で４５分間洗浄する。他の使用され得る高いストリンジェンシーの条件が、当該分野において周知である。さらなる例として制限ではなく、中程度のストリンジェンシーの例示的な条件は、以下の通りである：ＤＮＡを含むフィルターは、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、５５℃で６時間前処理する。ハイブリダイゼーションを、同じ溶液中で実施し、そして５〜２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で１８〜２０時間、５５℃でインキュベートし、次いで、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中で６０℃で３０分間２回洗浄する。フィルターをブロットして乾燥し、そしてオートラジオグラフィーに曝す。使用され得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野において周知である。使用され得る高いストリンジェンシーの他の条件は、一般的であり、１４〜７０の間のヌクレオチド長のプローブについて、融点（ＴＭ）は、以下の式を使用して計算される：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［一価カチオン（モル濃度）］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（５００／Ｎ）、ここで、Ｎは、プローブの長さである。ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含む溶液で実施される場合、融点は、次式を使用して計算される：Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［一価カチオン（モル濃度）］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（０．６１％ホルムアミド）−（５００／Ｎ）、ここで、Ｎは、プローブの長さである。一般的に、ハイブリダイゼーションは、Ｔｍより約２０〜２５℃下（ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて）またはＴｍより１０〜１５℃下（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて）で実施される。
【００２７】
（構造的要素）：構造的要素は、連結要素間に構造的連結または幾何学的連結を提供し、それによって隣接するアセンブリ単位間に幾何学的連結を提供するアセンブリ単位の部分である。構造的要素は、これらが一部分であるナノ構造についての構造的枠組みを提供する。
【００２８】
（サブアセンブリ）：サブアセンブリは、一緒に結合される複数のアセンブリ単位からなり、そしてアセンブリ中間体（例えば、ナノ構造中間体）に全体として加えられ得る原子または分子の集合である。本発明の多くの実施形態において、構造的要素はまた、アセンブリ単位の機能的要素を指示する。
【００２９】
（上から下へ）：構造（例えば、ナノ構造）の上から下へのアセンブリは、例えば、リソグラフィー技術を使用する、大きな最初の構造の処理を介する構造の形成である。
【００３０】
（ＰＮＡアセンブリ単位）
本発明は、ナノ構造の作製において使用され得る新たなクラスのアセンブリ単位を提供する。これらの「ＰＮＡアセンブリ単位」は、少なくとも１つの連結または機能的要素（ＰＮＡである）を含む。さらに、アセンブリ単位は、構造的要素ならびに／または他の連結および機能的要素を含み得る。
【００３１】
（ＰＮＡ連結要素）
本発明の特定の実施形態において、連結要素は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含み、そして多くの一般的な形態のいずれか（例えば、図１に示されるもの）を有し得る。ＰＮＡは、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００）によって最初に記載され、そして負に荷電された糖−リン酸骨格の代わりに中性ペプチドまたはペプチド様骨格を有するＤＮＡの構造相同体である（図１）。従って、ＰＮＡは、アミノ酸側鎖がＤＮＡのピリミジン塩基およびプリン塩基で置換されたタンパク質またはオリゴペプチドとして見なされ得る。同じ窒素塩基（すなわち、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン）を、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるようにＰＮＡにおいて使用する；ＰＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成規則に従って、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に結合する。ＰＮＡは、一般的に、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸結合タンパク質または他の酵素（プロテアーゼおよびヌクレアーゼを含む）によって基質として認識されるが、いくつがの例外が存在する（例えば、Ｌｕｔｚら、１９９７，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｃｈａｒｇｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：３１７７−７８を参照のこと）。ＰＮＡの生物学は、広範に考察されている（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９２，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）．ＤＮＡ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ，Ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  ＰＲＥＳＳ，ｐｐ．３６３−７２；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＰＮＡｓ）：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｇｅｎｅ  ａｇｅｎｔｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  ８（１）：５３−６３；Ｂｕｃｈａｒｄｔら、１９９３，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１（９）：３８４−８６；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９４，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）．Ａ  ＤＮＡ  ｍｉｍｉｃ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５（１）：３−７；Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９６，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）：Ａ  ｌｅａｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．４，Ｔｒａｉｎｏｒ，ｅｄ．，ＳＥＣＯＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ｌｅｉ���ｅｎ，ｐｐ．７６−８４；Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９５，ＤＮＡ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：１６７−８３；Ｈｙｒｕｐ  ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９６，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．４：５−２３；Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、１９９５，Ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３４３−５５；Ｄｕｅｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，Ｎｅｗ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．２１：１９−３１；Ｋｎｕｄｓｅｎ  ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９７，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＮＡ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  ８：１１３−１８；Ｎｉｅｌｓｅｎ，１９９７，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３：５０５−０８；Ｃｏｒｅｙ，１９９７，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｃｏｐｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（６）：２２４−２９；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｏｒｕｍ，  １９９５，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）ａｓ  ｎｅｗ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｐａｒｔ  ２，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．，ｅｄ．），Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＫ，ｐｐ．７３−８６；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈａａｉｍａ，１９９７，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）．Ａ  ＤＮＡ  Ｍｉｍｉｃ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．：７３−７８を参照のこと）。
【００３２】
ＰＮＡにおいて、図１に示されるように、ホスホリボース骨格は、例えば、アミド結合によって連結されるＮ−（２−アミノエチル）−グリシンの反復単位によって置換され得る（Ｅｇｈｏｌｍら，１９９２，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｃｈｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５−９７）。負に荷電された糖−リン酸骨格について中性ペプチドまたはペプチド様骨格のＰＮＡにおける他の置換は、当該分野において一般的に公知であり、当業者により容易に明らかである。改変ポリアミド骨格を有するＰＮＡは、例えば、以下に記載されている：Ｈｙｒｕｐら（１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１６：７９６４−７０）；Ｄｕｅｈｏｌｍら（１９９４，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈｉｒａｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｌａｎｉｎｅ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０７７−８０）；Ｐｅｙｍａｎら（１９９６，Ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  Ｅｓｔｅｒｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＨＯＮＡｓ）：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ａｃｈｉｒａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｓｔｅｒ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５：２６３６−３８）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎら（１９９６，Ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ−Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＮＡ  ａｎａｌｏｇｕｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７：７８５７−６０）；Ｊｏｒｄａｎら（１９９７，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８１−８６）；Ｇｏｏｄｎｏｗら（１９９７，Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ａｎａｌｏｇ：Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｍｉｄｅ（ＧＮＡ），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３８：３１９９−３２０２）；Ｚｈａｎｇら（１９９９，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎｅｗ  ＰＮＡ  ａｎａｌｏｇｓ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌ−  ａｎｄ  Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅｓ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２９０３−０８）；Ｓｔａｍｍｅｒｓら（１９９９，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ  ｐｕｒｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｌｋｙｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｔ−ＤｕＰＨＯＳ−Ｒｈ＋ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎａｍｉｄｏ  ｅｓｔｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４０，３３２５−３３２８）；Ｐｕｓｃｈｌら（２０００，Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ  ＰＮＡ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＰＮＡ  Ａｎａｌｏｇｕｅ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２：４１６１−６３）；Ｖｉｌａｉｖａｎら（２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｈｉｒａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｎ−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｐｒｏｌｉｎｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １０（２２）：２５４１−４５）；Ｙｕら、２００１，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ａｍｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｌｉｎｋａｇｅｓ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９（１）：１０７−１９）；Ｆａｄｅｒら（２００１，Ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＰＮＡ）ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：３３７２−７９）。
【００３３】
ＰＮＡの窒素塩基は、メチレンカルボニル連結によって中性骨格に結合される。ＰＮＡが高度に荷電された糖−リン酸骨格を有さないので、標的核酸に結合するＰＮＡは、従来の核酸よりも強力であり、一旦確立されると、その結合は、実質的に、塩濃度から独立する。これは、ＰＮＡを含む二重鎖の高い熱安定性によって、定量的に反映される。
【００３４】
ペプチド骨格が非荷電であるので、２つの相補的なＰＮＡ分子間、または例えば、ＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドのＤＮＡおよびＰＮＡ間の塩基対形成は、対応するＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドよりもかなり強力である。ＰＮＡとその相補的なＤＮＡ標的またはＲＮＡ標的との結合は、当量の核酸プローブの結合よりも迅速に生じる。ＰＮＡの親和性は、非常に高いので、二本鎖ＤＮＡにおける対応する鎖を置換し得る（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｎｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００）。
【００３５】
ＰＮＡは、一般的に、対応するＤＮＡ二重鎖よりも、中程度の塩条件（例えば、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）において塩基当たり約１℃だけ高い融点を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００；Ｐｅｆｆｅｒら、１９９３，Ｓｔｒａｎｄ−ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０６４８−５２；Ｄｅｍｉｄｏｖら、１９９５，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ（”ｐｅｐｔｉｄｅ”）ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：２６３７−４１）。ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖の熱安定性（Ｔｍによって示される）は、ＡＴ塩基対当たり２℃およびＧＣ塩基対当たり４℃の推定を使用して近似され、それによって、５０％ＧＣ含有量を有する１０ｂｐＤＮＡ二重鎖は、約３０℃の融点を有すると推定される。従って、対応するＰＮＡは、約４０℃の融点を有する。同様に、１８残基ＰＮＡ二重鎖（５０％ＧＣ）は、約７２℃の融点を有すると推定される。従って、本発明の特定の実施形態において、ＰＮＡ連結要素は、約８残基〜約２０残基、約１０残基〜約１８残基、または約１２残基〜約１６残基を有する。
【００３６】
他の実施形態において、より少ない残基を有するＰＮＡが設計され得、これは、３重らせんを形成するＰＮＡの能力を利用することによって、より高い融点を有する。特定の実施形態において、３つのＰＮＡ鎖（２つのポリピリミジン、１つのポリプリン）は、この非常に安定な構造を形成する。この構造は、２つのＰＮＡを使用することによってさらに安定化され得、その結果、１つは、グリシンスペーサーによって分離される２つのポリピリミジンＰＮＡを有し、ここで、このグリシンスペーサーは、一般的に、３〜５個のグリシン残基を含む。対応するポリプリンＰＮＡと混合する場合、２つのポリピリミジンＰＮＡセグメントは、グリシン空間の周りで折り畳まれて、この三重らせんを形成する。同じ分子上に「２」つのポリピリミジン鎖を有することは、有効濃度を上昇させ、従って、三重らせん形成の速度および強度を上昇させる。段階的アセンブリ結合対について、結合対の１つの連結要素は、ポリプリン鎖を含むが、一方、結合対の他の連結要素は、二倍の長さのポリピリミジンＰＮＡ連結要素である。
【００３７】
ＰＮＡは、核酸およびペプチドの合成のために使用される方法と類似の化学を使用して、当業者に周知の方法によって合成され得る。このような合成に使用されるＰＮＡモノマーは、ヌクレオシドおよびアミノ酸のハイブリッドである。ＰＮＡ産物、サービス（例えば、ＰＮＡ分子のカスタム合成）、および技術的サポートは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの一部，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から市販される。ＰＮＡは、市販の試薬および設備を使用して合成され得るか、またはＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のような契約製造業者から購入され得る。ＰＮＡオリゴマーはまた、標準的なペプチド化学プロトコルを使用して、Ｆｍｏｃ保護モノマーまたはｔ−Ｂｏｃ保護モノマーのいずれかを使用して手動で合成され得る。同様に、標準的なペプチド精製条件は、合成に続いてＰＮＡを精製するために使用され得る。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明の方法で使用されるＰＮＡは、キメラＰＮＡまたはその結合誘導体もしくは改変バージョンであり、そしてＰＮＡに対する参照は、ＰＮＳおよびこれらのバリエーションの両方を包含するように理解されるべきである。キメラＰＮＡは、塩基部分またはペプチド骨格で改変され、そして他の付属基または標識を含み得る分子である。キメラＰＮＡはまた、１つ以上のアミノ酸または２つ以上の連続するアミノ酸の配列への共有結合によって連結されるＰＮＡ配列を含む分子であり得る。
【００３９】
例えば、キメラＰＮＡまたは改変ＰＮＡは、以下を含むがこれらに限定されない基から選択される少なくとも１つの改変塩基部分を含み得る：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシルヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシルメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロキシウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシルプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【００４０】
特定の実施形態において、改変ＰＮＡまたはキメラＰＮＡは、「ユニバーサル塩基」３−ニトロピロール（Ｚｈａｎｇら、２００１，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ３−ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：１３２−４０）を含む。
【００４１】
一旦、所望のＰＮＡが合成されると、当該分野で公知の方法によって、それが合成されそして処理された固体支持体から切断されて、存在する任意の保護基を除去する。次いで、ＰＮＡは、当該分野で公知の任意の方法（抽出およびゲル精製を含む）によって精製され得る。ＰＮＡの濃度および純度は、アクリルアミドゲル上で分離されたＰＮＡを調べることによってかまたは分光光度計で光学密度を測定することによって、決定され得る。
【００４２】
本発明の特定の実施形態において、結合対は、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋおよび／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成を介して結合し得る相補的な対のＰＮＡ連結要素を含む。ＰＮＡ部分は、連結要素として役立ち得、一方、オリゴペプチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメントは、小さな構造的要素を提供し、特定の実施形態において、構造的要素は、図１９（Ａ−Ｂ）に図式的に示されるように、機能的要素をさらに備える。図１９（Ａ−Ｂ）に示されるように、２つのＰＮＡ／オリゴペプチド単位は、単一アセンブリ単位を形成するために二量化され得る。ＰＮＡ部分は、連結要素ＡおよびＢ’を提供し、一方、オリゴペプチド部分は、２つのコイルドコイル構造的要素を形成する。
【００４３】
ＤＮＡ同様、ＰＮＡ／ＰＮＡ分子は、アンチパラレル様式で最も安定に結合する（Ｗｉｔｔｕｎｇら、１９９４，ＤＮＡ−ｌｉｋｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：５６１−６３）。ＰＮＡ分子について、アミノ末端は、対応するＤＮＡ配列の５’末端と等価である（図１）。ロイシンジッパー二量体は、通常、パラレル様式で結合する（アミノ末端は、アミノ末端に隣接する）（Ｈａｒｂｕｒｙら、１９９３，Ａ  ｓｗｉｔｃｈ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ−，ｔｈｒｅｅ−，ａｎｄ  ｆｏｕｒ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌｓ  ｉｎ  ＧＣＮ４  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｍｕｔａｎｔｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１−０７）。従って、図２に示されるアセンブリ単位中に示される全ての分子は、パラレル方向で示される（アミノ末端は、左側に５’末端であり、そしてカルボキシ末端は、右側に３’末端である）。
【００４４】
特定の実施形態において、このアセンブリ単位は、二量体の内部もしくは中心部分（図２Ａ）、または連結要素を含む末端と反対側のＰＮＡ分子の末端に、機能的要素Ｆを含むランダムコイルペプチドを有し得る。２つの機能的要素は、同じでも異なってもよい。連結要素は、このようなアセンブリ単位を使用した段階的アセンブリを可能にするために、制御されないアセンブリを防止するように設計される。この例示において、ＰＮＡ配列の少なくとも２つの相補的対が使用される。これらの連結対間に、非自己相補性または交差相補性が存在しなければならない。
【００４５】
図３は、図２Ａに示される段階的アセンブリサブユニットを形成する、上の合成タンパク質単量体の要素の順序を示す。対応する下の単位における要素の順序は、ＰＮＡ要素がＣ末端にあることを除いて、同一である。これは、２つの単位を整列させるロイシンジッパーのパラレル配置を反映する。機能性配列は、機能的要素がアセンブリサブユニットに付加され得る領域をコードする。グリシンは、要素間の立体構造による干渉を低減するために、各要素を分離する。線の下の数字は、各要素の代表的な残基長を示す。
【００４６】
ＰＮＡ／オリゴペプチドアセンブリ単位構造の形成は、タンパク質の折り畳みをモニタリングするために使用される、当該分野で一般に公知の同じ方法論を使用して、モニタリングされ得る。例えば、オリゴペプチド部分は、コイルドコイルの形成を予測するソフトウェアを用いてモデル化され得る（例えば、Ｍｕｌｔｉｃｏｉｌ（Ｗｏｌｆら、１９９７，ＭｕｌｔｉＣｏｉｌ：Ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｗｏ−ａｎｄ  ｔｈｒｅｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：１１７９−８９），Ｐａｉｒｃｏｉｌ（Ｂｅｒｇｅｒら、１９９５，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌｓ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：８２５９−６３）、ＣＯＩＬＳ（Ｌｕｐａｓら、１９９１，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６２−６４；Ｌｕｐａｓ，１９９６，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：５１３−２５）およびＭａｃｓｔｒｉｐｅ（Ｌｕｐａｓら、１９９１，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｃｏｉｌｅｄ  Ｃｏｉｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１１６２−６４）。円偏光二色性（ＣＤ）（例えば、ＣＤスペクトル）の測定のような標準的な技術もまた、オリゴペプチド折り畳みをモニタリングするために使用され得る。さらに、ＰＮＡ連結要素を含む連結対の形成のモデル化は、ＤＮＡ−ＤＮＡ相補的対合と同じ法則に従う。ＰＮＡ連結対は、好ましくは、任意の種々の市販のソフトウェアパッケージ（例えば、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）およびＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ））を使用して評価される。
【００４７】
ＰＮＡ／オリゴペプチドアセンブリ単位は、いくつかの局面において、（ピリンベースの免疫グロブリンベースのアセンブリ単位のような）他の型のアセンブリ単位とは異なる。ＰＮＡ／オリゴペプチドアセンブリ単位は、２つの異なるクラスの生物学的分子（ＰＮＡおよびオリゴペプチド）のハイブリッドであり、従って、生物学的に合成されるのではなく、化学的に合成される。従って、このようなＰＮＡ含有アセンブリ単位の各バッチについての品質制御および試験の厳格なレベルが必要とされる。これらの試験としては、例えば、タンパク質／タンパク質相互作用についてのサンドイッチＥＬＩＳＡおよび円偏光二色性の試験、ＰＮＡ連結要素についての温度評価、ならびに全長分子の割合を決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられる。
【００４８】
アセンブリ単位のαヘリックスオリゴペプチド部分は、例えば、ロイシンジッパータンパク質ドメインがアセンブリ単位の構築における構造的要素として使用される実施形態において、７価（ｈｅｐｔａｄ）リピート１つ当たり約１ｎｍの長さである（Ｈａｒｂｕｒｙら、１９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−ｚｉｐｐｅｒ  ｔｒｉｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：８０−８３）。アセンブリ単位が４〜６つの７価（２８〜４２アミノ酸）を有する実施形態において、この構造的要素は、約４〜６ｎｍの長さである。ＰＮＡ連結要素は、構造的にＤＮＡと類似であり、そして約０．３４ｎｍ／塩基の長さを有する。従って、特定の実施形態において、１０〜１８残基の連結要素は、３〜６ｎｍの長さであり、従って、このようなアセンブリ単位は、約７〜１２ｎｍの長さである。
【００４９】
ＰＮＡ／オリゴペプチドアセンブリ単位はまた、一般にあまり剛性でないという点で、本明細書中に開示される本発明の他の実施形態とは異なる。好ましい実施形態において、ＰＮＡ−ペプチドアセンブリ単位は、ロイシンジッパー構造を含む構造的要素を有する。このようなＰＮＡ−ペプチドアセンブリ単位は、いくらかの可撓性を有するαヘリックス部分を有するものの、特定の実施形態において、２つまたは３つのヘリックス束の存在は、単離されたαヘリックスコイルほど可撓性でない。このＰＮＡ部分は、比較的可撓性があり、その結果、本発明の段階的アセンブリ法に従ってこれらの単位からアセンブルされる構造は、剛性の棒よりも、軟質のビーズの紐に類似している。さらに、特定の実施形態において連結要素を構造的要素に連結する可撓性ドメイン（例えば、トリグリシン、テトラグリシンまたはペンタグリシン）は、このアセンブリ単位および高次構造に可撓性を付加する。これらの単位からなる二次元および三次元のナノ構造は、遊離単位としていくらか可撓性である。しかし、固体支持体またはマトリクスへの複数の点における結合の際に、このナノ構造は、張力の適用によって、ロープネットまたはクモの巣の硬化と類似の様式で、全体的構造に張力を適用することによって、剛性にされ得る。
【００５０】
コイルドコイル構造的要素はまた、アセンブリ単位およびこれらのアセンブリ単位から製造されるナノ構造の設計設計および構築における自由度を可能にする。一般に、上記に開示されるような単純なロイシンジッパー型のコイルドコイルは、アセンブリ単位をそれら自体で一緒に維持するのに十分に安定ではないが、ジスルフィド結合によって安定化される（上記を参照のこと）。例えば、Ｒｏｐタンパク質において見出される４つのヘリックス束は、一般に、通常の室温で十分安定であり、そして必要に応じて長くされて、アセンブリ単位の形成に必要な安定性を提供し得る。さらに、機能的要素間の距離は、コイルドコイルの長さを変化させること、そして例えば、連結要素と機能的要素との間に可撓性ペプチドセグメントを付加することによって、調整され得る。特定の実施形態において、これは、可撓性ナノ構造を、紐上のビーズ（ａ  ｂｅａｄｓ−ｏｎ−ａ−ｓｔｒｉｎｇ）型の構造により類似させる。
【００５１】
ＰＮＡ／タンパク質アセンブリ分子は、共通の骨格を共有するので、これは、単一の分子として合成され得る。これらが別々に合成されたあと、２つの構成要素が一緒に連結される必要はない。特注の短縮（ｃｏｎｔｒａｃｔ）ＰＮＡ／タンパク質合成が、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  ＭＡの部門）から市販される。
【００５２】
各ＰＮＡ連結要素の配列は、正確なアセンブリに重要である。相補的対を設計することは、当業者に比較的容易であるが、同じアセンブリ単位の一部であるＰＮＡ間に相補的塩基対合が存在しないことを確認することが重要である。当業者に公知の種々のＤＮＡソフトウェアパッケージが存在し、これらは、相補性についてヌクレオチド配列を分析するために使用され得る（例えば、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）およびＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ）。内部相補性を有するＰＮＡセグメントは、ヘアピンループを形成し得、そして好ましくは、本明細書中に開示される段階的アセンブリ法に従って回避される。
【００５３】
以下の表１は、ＰＮＡ／タンパク質アセンブリ単位中の連結要素に含まれ得る例示的ＰＮＡ配列を列挙し、そして使用可能な配列および使用に適さない配列の例を与える。好ましい実施形態において、ＰＮＡ連結対の１つのメンバーは、単一のアセンブリ単位に結合される。連結対の対応するメンバーは、直接的相補的配列であり、そして別のアセンブリ単位に結合される。表１中の配列は、アミノ→カルボキシ（５’→３’）方向で列挙される。
【００５４】
（表１：ＰＮＡ／タンパク質アセンブリ単位において連結要素として使用するためのＰＮＡ配列）
適合性の連結要素対（Ａ．．．Ｂ’およびＢ．．．Ａ’の一般形態を有する２つのアセンブリ単位について；＊は、そのアセンブリ単位の残りの部分を示す）
【００５５】
【表１−１】
2005518456.tif 000003
相補的結合対は、三重らせんを形成する。「ＯＯＯＯ」は、ＰＮＡがそれ自体で折り畳まって、三重らせんを形成することを可能にする塩基を有さない残基（本質的にグリシン）を示す。
【００５６】
【表１−２】
2005518456.tif 000004
（連結要素として不適切な配列）
交差相補性を有する配列（相補的配列に下線を付す）
【００５７】
【表１−３】
2005518456.tif 000005
図１９（Ａ〜Ｂ）は、本発明の段階的アセンブリ法に有用なアセンブリ単位の構築において使用され得る合成分子の２つの可能な実施形態の線図を含む。図１９（Ａ〜Ｂ）に示されるように、２つのＰＮＡ／オリゴペプチド単位は、二量体化して、単一のアセンブリ単位を形成する。２つの可能なアセンブリ単位は、図２Ａおよび２Ｂに示される。ＰＮＡ部分は、連結要素ＡおよびＢ’を提供し、一方オリゴペプチド部分は、いずれかの末端でジスルフィド結合によって安定化される２つのコイルドコイル構造的要素（Ｓ）を形成する。例えば、タンパク質セグメントから構成される）１つ以上の機能的単位（Ｆ）もまた、このアセンブリ単位に組み込まれ得る。特定の実施形態において、このアセンブリ単位は、二量体の内部もしくは中心部分（図２Ａ）、または連結要素を含む末端と反対側のＰＮＡ分子の末端（図２Ｂ）に、機能的要素Ｆを含むランダムコイルペプチドを有し得る。
【００５８】
この例において、対応する次のアセンブリ単位（すなわち、段階的アセンブリの間に次に付加されるアセンブリ単位）における要素（すなわち、連結要素、構造的要素および／または機能的要素）の順序は、ＰＮＡがＣ末端に存在すること以外、同一である。これは、２つの単位を整列させるロイシンジッパーのパラレル配置を反映する。グリシンは、要素間の立体構造による干渉を低減するために、各要素を分離する。線の下の数字は、各要素の代表的な残基長を示す。
【００５９】
（ＰＮＡ機能的要素）
別の実施形態において、ペプチド配列を含む機能的要素（「Ｆ」で示される）は、ロイシンジッパー二量体化によって形成されるアセンブリ単位中の２つの可能な位置に配置される。配列は、図２に示されるように、例えば、ＰＮＡから、このペプチドの反対側の末端に付加され得るか、または２つのより短いαへリックス間に挿入され得る。
【００６０】
表２は、機能的要素のいくつかの非限定的な例示的例を示す。
【００６１】
（表２：ペプチド／ＰＮＡにおいて機能的要素として使用され得るペプチド）
【００６２】
【表２】
2005518456.tif 000006
2005518456.tif 000007
2005518456.tif 000008
１実施形態において、この機能的要素は、ＰＮＡセグメントを含む。ＰＮＡは、連結要素として働くために、合成の間にモノマーの末端に配置され得るのと同時に、対合可能な残基を含むＰＮＡセグメントは、機能的要素として働くために、合成ペプチドサブユニットの中央部に配置され得る。このことは、適切に分枝したナノ構造、または塩基対合相互作用によって、構造的要素が埋め込まれたＰＮＡ機能的要素に適切に結合されるＰＮＡ結合体化連結要素を含むナノ構造の製造を可能にする。好ましい実施形態において、機能的要素および／または架橋システイン残基は、一般に、約２〜５つのグリシン残基のペプチドセグメントによって、隣接する構造的要素および／または連結要素から分離され、その結果、タンパク質／ペプチドドメインは、独立して形成し得る。
【００６３】
（他の要素）
本発明の特定の実施形態において、アセンブリ単位は、構造的要素を含む。上記のように、この構造的要素は、ロイシンジッパーであり得る。さらに一般には、この構造的要素は、一般に、剛性構造を有する（しかし、以下に記載される特定の実施形態において、この構造的要素は、非剛性であってもよい）。この構造的要素は、好ましくは、既知のサイズおよび構造の、少なくとも約５０アミノ酸、そして一般には２０００アミノ酸未満を含む、規定されたペプチド、タンパク質またはタンパク質フラグメントである。ペプチド、タンパク質およびタンパク質フラグメントが好ましい。なぜなら、天然に存在するペプチド、タンパク質およびタンパク質フラグメントは、十分規定された構造を有し、タンパク質の異なる面の間の安定な空間的関係を提供する構築されたコアを有するからである。この特性は、構造的要素が、アセンブリ単位の連結要素と機能的要素との間の、予め設計された形状関係、ならびにこれが結合されるアセンブリ単位の相対的な位置および化学量論を維持することを可能にする。
【００６４】
構造的要素としてのタンパク質の使用は、無機ナノ粒子のような他の選択肢を超える特定の利点を有する。無機ナノ粒子のほとんどの集団は、不均質であり、これらをナノ構造のアセンブリにとって魅力のない足場にしている。ほとんどの集団について、各無機ナノ粒子は、切子面と結晶面との間の異なる幾何学的関係、ならびに欠損および不純物を有する多数の異なる原子から作製される。対照的に、タンパク質の比較できるサイズの集団は、非常に均質であり、各タンパク質は同じ数のアミノ酸から構成され、それらの各々は、ほとんどの部分について、熱変動の効果のみによって、異なる配列でほぼ同じ方法で配列される。結果として、互いに相互作用するように設計された２つのタンパク質は、通常、同じ形状と相互作用して、予測可能な形状および化学量論の複合体の形成を生じる。この特性は、ナノ構造の大量の平行な「上から下への」アセンブリに必須である。
【００６５】
構造的要素は、ナノ構造の連結要素と機能的要素との間の幾何学的関係を維持するために使用され得る。このように、剛性な構造的要素は、一般に、本明細書中に記載される段階的アセンブリ法を使用するナノ構造の構築のために好ましい。この剛性は、多くのタンパク質に典型的であり、そしてタンパク質（例えば、αヘリックスおよびβシート）を作製する二次的な構造的要素の特性を介して、タンパク質に付与され得る。
【００６６】
構造的要素は、その三次元構造が最初から既知であるかまたは最初から設計され得る、タンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチドの構造に基づき得る。アセンブリ単位において構造的要素として利用され得るタンパク質またはタンパク質フラグメントの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体ドメイン、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単鎖抗体可変ドメインおよび細菌ピリン。
【００６７】
いくつかの実施形態において、構造的要素、連結要素および機能的要素は、例えば、グリシンリンカーによって分離された、十分規定された範囲のものであり得る。他の実施形態において、連結要素は、構造的要素の一体的な部分であるペプチドもしくはタンパク質セグメントを含み得るか、または例えば、抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）の場合、構造的要素の１つの末端にて複数のループを構成し得る（Ｋａｂａｔら、１９８３，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。ＣＤＲは、抗体の可変ドメインの一体的な部分である連結要素である。この可変ドメインは、構造的要素を示し、そして構造的要素と連結要素をなすＣＤＲとの境界（多くの抗体配列の比較の基礎についての文献において十分に規定されているが）は、常に構造的に完全に明白なわけではない。構造的要素と連結要素との間の十分規定された境界は常に存在するわけではなく、そのそれぞれの用途に基づいて十分規定されているものの、これらのドメイン間の境界は、不明瞭に分離され得る。
【００６８】
本発明の構造的要素は、例えば、天然に存在するタンパク質のコア構造的要素を含み、このコア構造的要素は、次いで、連結要素、機能的要素および／または可撓性ドメイン（例えば、トリグリシン、テトラグリシンまたはペンタグリシン）を組み込み、それによって、有用なアセンブリ単位を提供刷るように改変される。結果的に、特定の実施形態において、既存のタンパク質の構造は、タンパク質またはタンパク質部分の剛性構造に実質的に影響を与えることなしに改変され得る、タンパク質またはその一部の部分を同定するために分析される。
【００６９】
例えば、特定の実施形態において、タンパク質または構造的要素の表面ループ領域のアミノ酸配列は、タンパク質の全体的な折り畳みに対してほとんど影響を有さずに変更される。タンパク質の表面ループのアミノ酸配列は一般に、タンパク質構造をかき乱す可能性が最も低い、連結要素、機能的要素および／または可撓性ドメインのさらなるアミノ酸配列が挿入され得るアミノ酸位置と称される。タンパク質中の表面ループの位置を決定することは、三次元の原子座標が入手可能である場合、例えば、ＲＡＳＭＯＬ（Ｓａｙｌｅら、１９９５，ＲａｓＭｏｌ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  ａｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（ＴＩＢＳ）２０（９）：３７４−３７６；Ｓａｑｉら、１９９４，ＰｄｂＭｏｔｉｆ−ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０（５）：５４５−４６）のような公有のタンパク質可視化コンピュータプログラムを使用して、タンパク質またはそのホモログの三次元構造の試験によって実行される。この様式で、表面ループに含まれるアミノ酸およびこれらの表面ループの相対的な空間的位置が決定され得る。
【００７０】
操作されるタンパク質の三次元構造が未知であるが、近縁のホモログの三次元構造が既知である場合（例えば、本質的に全ての抗体分子についての場合など）、目的の分子のアミノ酸配列またはその一部は、その三次元構造が既知である分子のアミノ酸配列と整列され得る。この比較（例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７，Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）またはＬＡＬＩＧＮ（ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ，１９９１，Ａ  ｔｉｍｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｎｅａｒ−ｓｐａｃｅ  ｌｏｃａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１２：３３７−３５７）を使用して実行される）により、既知の三次元構造のタンパク質中の表面ループ（βターン）を構成するアミノ酸に対応する、目的のタンパク質中のアミノ酸全ての同定が可能となる。２つのタンパク質間に高い配列類似性が存在する領域において、この同定は、高レベルの確実性で実施される。一旦、本明細書中に開示される方法に従って推定ループが同定され、そして変更されると、得られた構築物は、期待された特性を有するか否かを決定するために試験される。この分析は、ループの同定が、高度に信頼性がある場合（例えば、そのような決定が、既知の三次元タンパク質構造に基づく場合）にさえ、実施される。
【００７１】
ロイシンジッパー型コイルドコイルを含む構造的要素は、本発明のナノ構造中のアセンブリ単位においても使用され得る。特定の実施形態において、本発明は、本発明の段階的アセンブリ法を使用するナノ構造の構築の際に使用するための、ロイシンジッパー型コイルドコイルを含む構造的要素を包含する。ロイシンジッパーは、ロイシンジッパータンパク質の正確な配列に依存して（Ｈａｒｂｕｒｙら、１９９３，Ａ  ｓｗｉｔｃｈ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ−，ｔｈｒｅｅ−，ａｎｄ  ｆｏｕｒ−  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌｓ  ｉｎ  ＧＣＮ４  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｍｕｔａｎｔｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１−０７）、タンパク質またはタンパク質単量体の、二量体、三量体および四量体構造へのオリゴマー化に関与する、周知のαヘリックスタンパク質構造である（Ｏａｓら、１９９４，Ｓｐｒｉｎｇｓ  ａｎｄ  ｈｉｎｇｅｓ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｉｔｉｅｓ，ＴＩＢＳ  １９：５１−５４；Ｂｒａｎｄｅｎら、１９９９，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。簡潔さのために、二量体のみが本明細書中に開示されているが、三量体ユニットおよび四量体ユニットもまた、本明細書中に開示される方法に従うナノ構造の段階的アセンブリにおいて使用するために、アセンブリ単位の構築のために使用され得ることが、当業者に明らかである。特定の実施形態において、三量体ユニットおよび四量体ユニットは、適切な活性（例えば、金粒子の結合のための２つのシステイン部分の組み込み）のための、２つ異常の化学的部分を必要とする、機能的要素の組み込みのために特に有用であり得る。ロイシンジッパードメインのいくつかの非限定的な例が、以下の表３に提供される。
【００７２】
表３は、正統なロイシンジッパーおよび高安定性の二量体化配列を示す。上の行は、反復単位の登録を示す。ａおよびｄ位置中の残基は、一般に疎水性であり、そしてオリゴマー化を制御する。ｅおよびｇ位置の残基は、一般に、荷電し、そして塩橋を作成し、そしてオリゴマー化を安定化する。
【００７３】
【表３】
2005518456.tif 000009
多くの天然に存在するロイシンジッパーは、本発明の方法に従って用いられ得、酵母転写因子ＧＣＮ４において、そして哺乳動物Ｆｏｓ、ＪｕｎおよびＭｙｃ癌遺伝子中に見出されるものを含む。ロイシンジッパーおよび他のコイルドコイル形オリゴマー化配列を含むさらなるタンパク質は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＴｒＥＭＢＬ（ＢａｉｒｏｃｈおよびＡｐｗｅｉｌｅｒ、２０００、Ｔｈｅ  ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースおよび２０００、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：４５〜４８中のその相補ＴｒＥＭＢＬ）のような公開タンパク質データベースをサーチすることによって同定され得る。表４は、キーワード「コイルドコイル」および「二量体」を用いる、このようなサーチの結果を示す。
【００７４】
表４では、遺伝子の一般名、ならびにそれらのＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号、配列の説明および配列が列挙されている。このＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受託番号は、配列記録のための特有の識別子である。受託番号は、完全な記録に適用され、そして、通常、５つのアラビア数字が続く単一文字（例えば、Ｑ１２３４５）、または６文字とアラビア数字との組み合わせ（例えば、Ｑ１Ｚ２Ｆ３）のような、文字（単数または複数）と数字との組み合わせである。コイルドコイル配列に下線を引いてある。
【００７５】
【表４】
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2005518456.tif 000039
2005518456.tif 000040
高い安定性のロイシンジッパーは、当業者に公知の手順を用いて誘導され得る（例えば、Ｎｅｗｍａｎら、２０００、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからの相互作用するコイルドコイルを同定するコンピューター指向スクリーニング、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７、１３２０３〜０８を参照のこと）。ＰＡＩＲＣＯＩＬ（Ｂｅｒｇｅｒら、１９９５、ペア様残基相関関係の使用によりコイルドコイルを予測すること、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：８２５９〜６３）およびＭＵＬＴＩＣＯＩＬ（Ｗｏｌｆら、１９９７、ＭｕｌｔｉＣｏｉｌ：二本鎖および三本鎖コイルドコイルを予測するためのプログラム、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：１１７９〜８９）のようなコンピュータープログラムが、どのようにコイルドコイルが相互作用して二量体および／または三量体などを形成するかを予測するために使用され得る。
【００７６】
ロイシンジッパーは、７残基の反復単位として記載され得る。ロイシンジッパーに由来する各７つ揃いにおける７つのアミノ酸のうち、ａおよびｄ位置における残基は、一般に、疎水性アミノ酸（アラニン、バリン、フェルニアラニン、メチオニン、イソイシンおよびロイシン）であり、その一方、ｅおよびｇ位置におけるアミノ酸は、通常、荷電したアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンおよびアルギニン）である。疎水性のａおよびｄ残基の特定配列が、ペアの２つのメンバーが相互作用するか否かを決定する。従って、多くのコイルドコイルは、既に公知であり、そしてコンピューターソフトウェア分析を用いて、可能な新規のコイルドコイルを、同定、設計および試験し得る（Ｎｅｗｍａｎら、２０００、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからの相互作用するコイルドコイルを同定するコンピューター指向スクリーニング、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７、１３２０３〜０８）。
【００７７】
７つ揃いのｅおよびｇ位置における残基は、コイル間の結合を安定化する塩橋を形成することにより、互いにどのように強くコイルドコイルが結合するのかを決定する（例えば、Ｋｒｙｌｏｖら、１９９８、ロイシンジッパーコイルドコイル二量体のらせん間相互作用：荷電アミノ酸間の結合エネルギーのｐＨおよび塩依存性、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９：９５９〜７２を参照のこと）。ジッパー配列、特に、ｅおよびｇ位置に基づくロイシンジッパーのらせん間の結合強度の予測式が誘導されており、そして当業者に公知である。これらは、特定のアセンブリ単位の構築に必要なロイシンジッパーの長さを決定するために用いられ得る。ロイシンジッパー中の７つ揃いの数は、これらの７つ揃いを含む分子間の結合強度に影響し；一般に、約４の７つ揃いが通常温度で十分である。特定の実施形態では、より高い温度（＞４０℃）に曝されるナノ構造が、より長いコイルドコイル、または、制限されずに１つ以上の分子間ジスルフィド結合の導入のような別の様式で安定化されたコイルドコイルを含むアセンブリ単位を用いて構築される。
【００７８】
単離されたロイシンジッパーは、一般に、タンパク質環境の外側では安定な二量体を形成しない（ＢｒａｎｄｅｎおよびＴｏｏｚｅ  １９９９、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３７頁）。従って、ロイシンジッパーで形成される本発明のアンセブリ単位を安定化するために、好ましい実施形態では、隣接するシステインが挿入され、ジスルフィド橋を形成する。一旦、これらの結合が形成されると、設計されたアセンブリ単位は、還元剤に曝されなければ安定である。従って、特定の実施形態では、システインが、安定化ジスルフィド結合の形成のために、ロイシンジッパーの端部、またはロイシンジッパーのαヘリックスとＰＮＡ連結要素との間に付加される。
【００７９】
アンセブリ単位中のシステインの正確な位置は、ＳＩＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＲａｓＭｏｌ（Ｓａｙｌｅら、１９９５、ＲａｓＭｏｌ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  ａｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ（ＴＩＢＳ）２０（９）：３７４〜７６）、またはＰｄｂＭｏｔｉｆ（Ｓａｑｉら、１９９４、ＰｄｂＭｏｔｉｆ−−タンパク質構造におけるモチーフの自動化同定および表示のためのツール、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０（５）：５４５〜４６）のような分子モデリングソフトウェアを用いてアセンブリ単位またはアセンブリサブユニットをモデリングすることにより決定され得、そして次に実験的に試験する。２つのシステインのジスルフィド橋への変換は、当業者に周知であり、そして溶液の酸化還元ポテンシャルを改変することにより制御される。酸化条件下（例えば、酸素の存在下）では、イオウ原子は結合する。還元条件（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤の添加により）２つのイオウ原子は、一緒に結合しない。
【００８０】
一般に、２つのジスルフィド結合が、アセンブリ単位のコイルドコイルを一緒に保持するために十分である。好ましい実施形態では、これらシステイン残基は、ロイシンジッパーの端部に配置され、そしてこのアセンブリ単位を一緒に結合するために用いられる。しかし、その他の実施形態では、システイン残基は、アセンブリ単位内の任意のドメインの境界に配置される。特定の実施形態では、このような付加されたシステイン残基は、１つ以上の、好ましくは２〜５のグリシン残基によって隣接されるか、または囲まれる。
【００８１】
ロイシンジッパーによる二量体形成は、協働プロセスであり、そしてそれ故、ロイシンジッパーの長さは、２つのヘリックス間の結合の安定性に影響する（Ｓｕら、１９９４、合成αラセンコイルドコイルの形成および安定性に対する鎖長さの影響、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５５０１〜１０）。３〜４の間の７つ揃いには温度安定性における有意な増加があるが、より長いヘリックスには増加はより少ない。本発明の特定の実施形態では、４つの７つ揃が、単一の非中断単位二量体化領域に用いられ得、その一方、機能的配列がこの７つ揃いを中断するとき、２つの３−７つ揃い領域が必要である（以下を参照のこと）。
【００８２】
４つのヘリックス束を含む構造要素がまた、本発明のナノ構造中のアセンブリ単位で採用され得る。ロイシンジッパーの設計および構築は、アンセブリ単位の構造要素の構築に有用なコイルドコイルオリゴマー化ペプチドの１つのタイプを表す。別のタイプは、４−ヘリックス束であり、その非制限的な例は、図４に示される。アセンブリ単位を形成するために、ヘリックスを結合する１つ以上のループセグメント（すなわち、非ラセンセグメント）が存在するので、この構造はまた、「ヘリックス−ループ−ヘリックス」構造とも呼ばれる。このループセクションは、これらヘリックスを互いの近傍に維持することにより、そしてそれ故、機能的に高濃度で、全体構造の安定性を継続する。ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質の例は、制限されずに：細菌Ｒｏｐタンパク質（２つのヘリックス−ループ−ヘリックス分子を含むホモ二量体）（Ｌａｓｓａｌｌｅら、１９９８、二量体から三量体への変換：ループ切除は、ＲＯＰの４つのα−ヘリックス束タンパク質の構造および安定性を劇的に改変する、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９（４）：９８７〜１０００）；真核生物チトクロムｂ５６２（単一のヘリックス−ループ−ヘリックス−ループ−ヘリックス−ループ−ヘリックス構造から構成される単量体タンパク質）（Ｌｅｄｅｒｅｒら、１９８１、一次構造を再決定すること、および分子グラフックスを用いることによるチトクロムｂ５６２の２．５Å改造モデルの改良、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４８（４）：４２７〜４８）；Ｍａｘ（Ｌａｖｉｇｎｅら、１９９８、ｃ−Ｍｙｃ−Ｍａｘヘテロ二量体ロイシンジッパーの１Ｈ−ＮＭＲ溶液構造からのヘテロ二量体化の機構への洞察、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１（１）：１６５〜８１）；ＭｙｏＤ  ＤＮＡ結合ドメイン（Ｍａら、１９９４、ＭｙｏＤ  ｂＨＬＨドメイン−ＤＮＡ複合体の結晶構造：転写活性化のためのＤＮＡ認識および関連に関する見通し、Ｃｅｌｌ  ７７（３）：４５１〜５９）；ＵＳＦ１およびＵＳＦ２  ＤＮＡ結合ドメイン（Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅら、１９９４、ＵＳＦのｂ／ＨＬＨ／Ｚドメインの構造および機能、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（１）：１８０〜９；Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒら、１９９７、ＵＳＦ２／ＦＩＰは、そのｂＨＬＨドメインを経由して、ｂ−Ｚｉｐ転写因子、ｃ−Ｍａｆと会合し、そしてｃ−Ｍａｆ  ＤＮＡ結合活性を阻害する、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３１（２）：３３３〜３９）；およびＭｉｔ−ｆ転写因子ＤＮＡ−結合ドメイン（Ｒｅｈｌｉら、１９９９、ｂＨＬＨ−ＺＩＰ転写因子ＴＦＥＣおよびＴＦＥＢのマウス遺伝子のクローニングおよび特徴付けは、すべてのＭｉＴサブファミリーメンバーについて共通の遺伝子組織化を示す、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５６（１）：１１１〜２０）を含む。
【００８３】
Ｒｏｐタンパク質、またはそのフラグメントを示す特性を示す、Ｒｏｐタンパク質のらせん領域およびループ領域の両方は、本発明の段階的アセンブリ法中のアセンブリ単位の構築物中の構造要素として用いられ得る。１つの実施形態では、Ｍｕｎｓｏｎらの方法（１９９６、何がタンパク質をタンパク質にするのか？  安定性および構造性質を特定する疎水性コア設計、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１５８４〜９３）を用いて、Ｒｏｐタンパク質のらせん領域中のａおよびｄ残基を変異誘発し、増加および減少した熱安定性の両方を有する改変体ポリペプチドを生成する。
【００８４】
別の実施形態では、Ｂｅｔｚら（１９９７、ネイティブタンパク質のデノボ設計：アンチ平行のＲｏｐ様４−ヘリックス束に折り畳まれるよう意図されたタンパク質の特徴付け、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：２４５０〜５８）を用いて、Ｒｏｐタンパク質に基づき、しかも推定されるアンチ平行配置にある二量体を形成する、合成の５５残基タンパク質を設計する。
【００８５】
Ｒｏｐタンパク質様４−ヘリックス束に基づく段階的アセンブリのためのアセンブリ単位は、制限されないで、Ｂｅｔｚらのもの（１９９７、ネイティブタンパク質のデノボ設計：アンチ平行のＲｏｐ様４−ヘリックス束に折り畳まれるよう意図されたタンパク質の特徴付け、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：２４５０〜５８）を含む合成タンパク質およびオリゴペプチドで構築される。ＢｅｔｚおよびＤｅＧｒａｄｏ（１９９６、デノボ設計ペプチドの制御トポロジーおよびネイティブ様挙動：アンチ平行４−鎖コイルドコイルの設計および特徴付け、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：６９５５〜６２）およびＢｅｔｚら（１９９７、ネイティブタンパク質のデノボ設計：アンチ平行のＲｏｐ様４−ヘリックス束に折り畳まれるよう意図されたタンパク質の特徴付け、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：２４５０〜５８）に開示されるように、合成の４−ヘリックス束は、一般式：Ｎｃａｐ−（ＡａＺｂＺｃＬｄＹｅＺｆＹｇ）３−ターン−（ＸａＺｂＺｃＬｄＹｃＺｆＹｇ）３−Ｃｃａｐ−ＣＯＮＨ２を有する２つのペプチドから作製され得る。
ここで、ａ−ｇ下付は７つ揃え位置をいい、Ｘはアラニンまたはバリンのいずれかであり、Ｙはグルタミン酸、アルギニン、チロシンまたはリジンであり、Ｚは任意のアミノ酸であり、ＮｃａｐおよびＣｃａｐは、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９８８、αヘリックスの端部における特定的位置のアミノ酸優先、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１６４８〜５２）により規定されるようなα−ヘリックスで終わる残基であり、そしてターンは３〜５のグリシンである。
【００８６】
特定の実施形態では、ＰＮＡ配列が、一方のアセンブリ単位のアミノ末端、および他方のアセンブリ単位のカルボキシ末端に添加される。これは、１つ以上の機能的要素の挿入のために利用可能な、他の２つの分子の端部、およびループ領域を残す。このような４−ヘリックス束の適正な折り畳みは、ＣＤスペクトル分析、構築されたアセンブリ単位のＥＬＩＳＡ分析、およびアセンブルリ単位および／またはこのようなアセンブリ単位から製作されたナノ構造の電子顕微鏡分析によってモニターされ得る。
【００８７】
本発明のＰＮＡアセンブリ単位は、連結要素（ｊｏｉｎｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）または機能的要素としての少なくとも１つのＰＮＡを含む。ＰＮＡアセンブリ単位中のさらなる連結要素は、アセンブリ単位上の結合特性を与える任意の連結要素であり得、この要素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ピリン連結要素、ハプテン、抗原、ペプチド、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、ポリマーもしくは他の部分またはその組み合わせ。これらは、別の連結要素と特異的な非共有結合性相互作用を介して相互作用し得る。
【００８８】
特定の実施形態において、２より多い連結要素を有するアセンブリ単位を使用して、ナノ構造を構築する。さらなる連結要素が、例えば、以下として使用され得る：（ｉ）機能的要素もしくは機能的部分の付加または挿入のための結合点として；（ｉｉ）開始剤の固体の基体への結合点として；または（ｉｉｉ）サブアセンブリの結合点として。
【００８９】
本発明で使用されるＰＮＡアセンブリ単位はまた、機能的要素を組み込み得る。これらは、上記のように、ＰＮＡ機能的要素の形態であり得るか、またはこれらは非機能的ＰＮＡ要素であり得る。機能的要素は、アセンブリ単位に組み込まれ得、そして最終的には、機能的要素の間のおよびこれらの中の良く規定された空間的関係を提供するような様式で、一次元、二次元および三次元ナノ構造中に組み込まれ得る。機能的要素の間のおよびこれらの中の良く規定された空間的関係は、これらの要素が協同して作用して個別または構造化されていない混合物では得ることが出来ない活性および特性を提供することを可能にする。
【００９０】
本発明の１つの局面において、機能的要素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、低分子、無機ナノ粒子、原子、原子のクラスター、磁気ナノ粒子、光ナノ粒子または電気的ナノ粒子。特定の機能的要素（この要素は、一般的にこの要素が結合しているアセンブリ単位の構造的特質から独立している）に関連している特異的な活性または特性が、以下が挙げられるが、これに限定されない非常に大きな範囲の可能性のある機能のセットから選択され得る：タンパク質によって与えられるような生物学的特性（例えば、転写、翻訳、結合、改変または触媒的特性）。別の実施形態において、アセンブリ単位に化学的、有機的、物理電気的（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ）、光学的、構造的、機械的、計算機的、磁気的およびセンサー的な特性を与える官能基が、用いられ得る。
【００９１】
本発明の別の局面において、機能的要素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：金属ナノ粒子または金属酸化物ナノ粒子（Ａｒｇｏｎｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｆｏｒｄ，ＦＬ；ＮａｎｏＥｎｅｒｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｎｇｍｏｎｔ、ＣＯ；Ｎａｎｏｐｈａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｍｅｏｖｉｌｌｅ，ＩＬ；Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；ＴＡＬ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；金ナノ粒子または金でコーティングされたナノ粒子（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ；Ｎａｎｏｓｐｅｃｔｒａ  ＬＬＣ，Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）；免疫結合体（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ）、非金属ナノ粒子（Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、セラミックナノファイバー（Ａｒｇｏｎｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｆｏｒｄ，ＦＬ）；フラーレンまたはナノチューブ（例えば、カーボンナノチューブ）（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ；Ｎａｎｏｌａｂ，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  ＭＡ；Ｎａｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ；Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）；ナノ結晶（ＮａｎｏＧｒａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）；シリコンもしくはシリコンナノ結晶または粉末（ＭＴＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）；ナノワイヤ（Ｎａｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）；または量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ；Ｎａｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）。
【００９２】
機能的要素はまた、任意の当該分野で公知の検出可能なマーカーを含む。このマーカーとしては，以下が挙げられる：３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈなどの様な放射性標識；発色団；発蛍光団；化学発光分子；または酵素マーカー。
【００９３】
本発明の特定の実施形態において、機能的要素は、発蛍光団である。標識として選択され得る例示的な発蛍光団部分を、表５に示す。
【００９４】
（表５：機能的要素として使用され得る発蛍光団部分）
４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸
アクリジンおよび誘導体：
アクリジン
アクリジンイソチオシアネート
５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）
４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＶＳ）−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド
アントラニルアミド
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ
クマリンおよび誘導体：
クマリン
７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １２０）
７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １５１）
Ｃｙ３
Ｃｙ５
シアノシン（ｃｙａｎｏｓｉｎｅ）
４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）
７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン
ジエチレントリアミン  ペンタアセテート
４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸
４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸
５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，ダンシルクロリド）
４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゾイックアシッド（ＤＡＢＣＹＬ）
４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）
エオシンおよび誘導体：
エオシン
エオシンイソチオシアネート
エリトロシンおよび誘導体：
エリトロシンＢ
エリトロシンイソチオシアネート
エチジウム
フルオレセインおよび誘導体：
５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）
５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）
２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）
フルオレセイン
フルオレセインイソチオシアネート
ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）
フルオレスカミン
ＩＲ１４４
ＩＲ１４４６
Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎイソチオシアネート
４−メチルランベリフェロン
オルト  クレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラローザニリン
Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ
Ｂ−フィコエリトリン
ｏ−フタルジアルデヒド
ピレンおよび誘導体
ピレン
ピレンブチレート
スクシンイミジル  １−ピレン  ブチレート
Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）
ローダミンおよび誘導体：
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）
６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
リスアミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢスルホニルクロリド
ローダミン（Ｒｈｏｄ）
ローダミンＢ
ローダミン１１０
ローダミン１２３
ローダミンＸイソチオシアネート
スルホローダミンＢ
スルホローダミン１０１
スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）
テトラメチルローダミン
テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）
リボフラビン
ロゾール酸
テルビウムキレート誘導体
他の実施形態において、機能的要素は、ルミノール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＯＬＤＴＭ  ＡＰＢ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）、Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ（Ｌｕｍｉｇｅｎ）などのような化学発光基体である。
【００９５】
別の実施形態において、機能的要素は、酵素である。特定の実施形態において、酵素は、特定の化学反応が行なわれるとき、酵素アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどのような検出可能なシグナルを生成し得る。
【００９６】
別の１つの実施形態において、機能的要素は、ハプテンまたは抗原（例えば、ｒａｓ）である。さらに別の実施形態において、機能的要素は、ビオチン（これに対して、標識されたアビジン分子またはストレプトアビジンが結合し得る）またはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）（これに対して、標識された抗ジゴキシゲニン抗体が結合し得る）のような分子である。
【００９７】
別の実施形態において、機能的要素は、ピーナッツレクチンまたは大豆凝集素のようなレクチンである。さらに別の実施形態において、機能的要素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素のような毒素である（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９，Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（６２２３）：３９４−９７）。
【００９８】
ペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインは、当該分野で一般に公知の分子生物学の手段を用いてタンパク様のアセンブリ単位に加えられ、融合タンパク質（このタンパク質中で、機能的要素が、タンパク質のＮ末端、タンパク質のＣ末端またはタンパク質中のループ中にタンパク質のフォールディングを妨害しないような方法で導入される）を産生し得る。非ペプチド機能的要素が、前記機能的要素に対する特異性を示すペプチドまたはタンパク質部分のアセンブリ単位のタンパク様部分に組み込むことによってアセンブリ単位に加えられ得る。
【００９９】
特定の実施形態において、１つ以上の機能的要素が、以下であるとして同定される位置にてピリンタンパク質を含むアセンブリ単位に加えられる：（ｉ）単位の表面上；（ｉｉ）単位の他のピリン含有アセンブリ単位との相互作用に重要でない；および（ｉｉｉ）単位自体の安定性に対して重要でない。大きなループの挿入が許容され、安定で活性なタンパク質構造に首尾良くフォールディングし得る多くの組換えタンパク質が発現されてきた。いくつかの例において、このような組換えタンパク質が、さらなる遺伝子操作なしに設計され、産生されているが、他のアプローチが、最適な配列変化を同定するためにランダム化および選択の工程を組み込んできた（Ｒｅｇａｎ，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｄｅｓｉｇｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：４９４−９９）。例えば、再操作に従う１つのピリン領域は、配列ｇｌｙ１０７−ａｌａ１０８−ｇｌｙ１０９を含むｐａｐＡ上の表面ループである。このループは、異種ペプチドが挿入され得る位置のような全ての上記の基準を満たす。
【０１００】
別の実施形態において、完全抗体可変領域ドメイン（例えば、１本鎖可変ドメイン）が、機能的要素についてのアフィニティ標的として働くために、アセンブリ単位中に（例えば、連結要素またはその構造的要素中に）組み込まれる。この実施形態において、完全抗体可変ドメインが例えば、連結要素またはその構造的要素の表面ループ中に挿入される場合、可撓性のセグメント（例えば、ポリグリシンペプチド配列）が、好ましくは可変ドメイン配列の各々の側に加えられる。このポリグリシンリンカーは、組換え融合タンパク質の合成後の元のタンパク質のフォールディングを促進する可撓性のスペーサーとして働く。この抗体ドメインは、機能的要素に対する結合特異性について選択され、この機能的要素としては、以下があり得るが，これらに限定されない：タンパク質もしくはペプチドまたは無機材料。
【０１０１】
本発明の別の実施形態において、機能的要素は、所望の最適な特性を有する量子ドット（半導体ナノ粒子、例えば、ＱＤＯＴＴＭ、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）であり得る。量子ドットは、特定の種類の量子ドットに対して特異性を有するペプチドを介してナノ構造中に組み込まれ得る。当業者に明らかであるように，特定の型の量子ドットに必要とされる親和性を有するこのようなペプチドの同定が、当該分野で周知の方法を使用して実行される。例えば、このようなペプチドは、親和性精製方法を使用してファージディスプレイされたペプチドの大きなライブラリから選択される。適切な精製方法としては、例えば、バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）（Ｗｈａｌｅｙら、２０００，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（６７８７）：６６５−６８）および親和性カラムクロマトグラフィーが挙げられる。各々の場合において、標的の量子ドットは、固定化され、組換えファージディスプレイライブラリーは、固定された量子ドットに対してインキュベートされる。数回のバイオパニングが実行され、量子ドットに対して親和性を示すファージが、標準的方法によって同定され、その後ペプチドの特異性が標準ＥＬＩＳＡ方法を使用して試験される。
【０１０２】
代表的に、アフィニティー精製は、いくつかのアフィニティー精製工程を使用する反復性プロセスである。アフィニティー精製を使用して、特定の金属および半導体に対する親和性を有するペプチドを同定し得る（Ｂｅｌｃｈｅｒ，２００１，Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｍａｙ  １８−２０，２００１；Ｂｅｌｃｈｅｒら、２００１，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｐａｐｅｒｓ，２２２ｎｄ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ２６−３０，２００１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。
【０１０３】
代替の方法は、ファージディスプレイ単鎖可変ドメインのライブラリーの使用および同じ型の選択プロセスの実行に指向される。従って、特定の実施形態において、機能的要素は、所望の特性を有する非タンパク質ナノ粒子がナノ構造に結合される連結要素（相互作用部位）の使用を介してナノ構造に取り込まれる。２つの非限定的な例において、このような連結要素は、抗体可変ドメインの相補性決定領域または親和性選択ペプチドに由来する。
【０１０４】
ナノ結晶（単一のナノ粒子）の電子的特性とナノ粒子のアセンブリとを比較するのに一般的に使用される電子的な機能的要素およびフォトニクス機能的要素についての慣用的な試験（Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：５４５−６１０）は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して組み立てられたナノ構造の分析のために使用される。
【０１０５】
特定の実施形態において、半導体ナノ結晶の独特な調和した特性は、これらの半導体ナノ結晶を、ナノデバイス（光伝導性ナノデバイスおよび発光ダイオードを含む）における使用に好ましくする。個々のナノ構造の電気的特性は、測定するのが困難であり、従って、光伝導性は、これらのナノ構造の特性の測定として使用される。光伝導性は、半導体および有機固体の特性の分析について使用される周知の現象である。光伝導性は、他の点では、絶縁性の有機固体において弱い相互作用分子の間で電子を輸送するのに長く使用されている。
【０１０６】
光電流スペクトル応答をまた使用して、ナノ構造におけるナノ結晶の吸収スペクトルをマップし、そして個々のナノ結晶の光電流スペクトル応答と比較し得る（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：５４５−６１０を参照のこと）。さらに、光学スペクトルおよび発光スペクトルをまた使用して、ナノ構造の光学特性を研究し得る（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：５４５−６１０を参照のこと）。
【０１０７】
制御がナノ粒子のアレイの形成により影響すると、生成されるアレイの光学、電気的および磁性現象が広がる。ナノ粒子が三次元精度と共に取り込まれるナノ構造の段階的アセンブリから形成される固体の特性を三次元において制御することが可能であり、それによって、ナノデバイスの設計に有用な多くの異方性の特性を生じる。これらの集合の特性を特徴付けるための慣用的な試験および方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉ．３０：５４５−６１０を参照のこと）。
【０１０８】
例えば、タンパク質および量子ドットの組み合わせから作製されるバイオセンサーは、市販されている（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓら、１９９６，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ「ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：６０９−１１；Ｗｅｉｓｓら、米国特許第６，２０７，３９２号、表題「Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｃｈ  ｐｒｏｂｅｓ」（２００１年３月２７日に発行された））。高特異性生物学的分子（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは抗体分子）と量子ドットとを複合する能力は、分子の標的に対するスペクトルフィンガプリントを提供する。異なるサイズの量子ドット（各々非常に異なるスペクトル特性を有する）を使用して、異なる特異性を有する分子に複合体化された各々は、同時に構成成分の複数の検出を可能にする。
【０１０９】
無機構造（例えば、金属または半導体の量子ドットおよびナノ結晶）は、アセンブリされたナノ構造の分枝の末端としてナノ構造の段階的アセンブリに使用され得る。一旦、このような無機構造を添加すると、さらなる基はこれらに結合し得ない。なぜなら、無機構造は、ナノ構造へと操作される結合部位の任意のセットについての不確定な化学量論を有するからである。これは、アセンブリ単位が添加され、段階的アセンブリによって組み立てられたナノ構造を形成する配列に影響する。例えば、一旦特定のナノ結晶がナノ構造に添加されると、その型のナノ結晶を認識しそして結合する連結要素を有するさらなるアセンブリ単位を添加することは一般的に好ましくない。なぜなら、ナノ結晶に対するこのようなアセンブリ単位の位置決めを制御することは、一般的に可能でないからである。従って、ナノ結晶を最後または少なくともその特定の型のナノ結晶を結合するアセンブリ単位の全てを添加した後に添加する必要があり得る。好ましい実施形態において、ナノ結晶は、マトリクスになお結合され、そして十分に分離されるナノ構造に添加され、その結果各ナノ結晶は、単一のナノ構造にのみ結合し得、それによってナノ構造の複数架橋を防止する。
【０１１０】
１つの実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法に従って組み立てられた、強固なナノ構造は、ナノ構造レバーアームの末端に機能的な要素として結合した磁性ナノ粒子を含み、この磁性ナノ粒子は、局所的な磁場の非常に敏感なセンサーとして作用する。磁場の存在は、磁性ナノ粒子の位置を変えるのに作用し、ナノ構造レバーアームを結合した固体基板に対してナノ構造レバーアームを曲げる。特定の実施形態において、レバーアームの位置は、例えば、ナノ構造レバーアームに沿って他の位置（アセンブリ単位）に機能的要素として結合した光学ナノ粒子の位置の変化を通して検出され得る。レバーアームの移動の程度は較正され、磁場の測定を提供する。
【０１１１】
他の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法に従って組みたてられたナノ構造は、特定化された機能的要素の非存在において所望の特性を有する。このような実施形態において、段階的アセンブリプロセスは、例えば、微小液体システムの粒子を濾過するために使用され得る、小さな（ナノメートルスケール）、正確なサイズかつ十分に規定された孔を有する二次元ナノ構造または三次元構造を提供する。この実施形態のさらなる局面において、このように十分に規定された孔のみだけでなく、ナノ構造の分離特性を増強する機能的要素を含むナノ構造が、アセンブリされ、分離される分子のサイズだけでなく、電荷ならびに／または親水性特性および／または疎水性特性に基づいて分離可能にする。このようなナノ構造は、ＨＰＬＣ分離に使用され得、非常に均一な充填物質およびこれらの物質に基づく分離を提供する。このような機能的要素の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：所望のクロマトグラフィー分離に使用されるｐＨで正または負に荷電した１つ以上の側鎖を含むペプチド配列；および疎水性側鎖または親油性側鎖を有する１つ以上のアミノ酸を含むペプチド配列。
【０１１２】
結合は、シリコンベースの電子チップなどのようなミクロ電子工学の回路において「スウィッチポイント」として働き得る構築的な構造である。特定の実施形態において、多価の抗体あるいはその結合誘導体または結合フラグメントは、結合構造として使用され、そして本発明の方法を使用してナノ構造へと取り込まれる。これらのナノ構造結合を含む生物電子工学デバイスおよび生物コンピューター（ｂｉｏｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ）デバイスの１つの非限定的な例は、量子セルオートマトン（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｍａｔａ：ＱＣＡ）である。
【０１１３】
（ナノ構造の段階的アセンブリ）
ＰＮＡアセンブリ単位はアセンブリされ得、段階的アセンブリによってナノ構造を形成する。段階的アセンブリは、有機部分および無機部分が予め設計された三次元構築中に正確かつ精密に配置される、複合非断続性複数次元ナノ構造の超並列合成を可能にする。段階的アセンブリにおいて、一連のアセンブリ単位は、開始単位および／またはナノ構造中間体に、所定の予め設計された順番で添加される。多数の同一の開始が使用され、そしてサブユニットは、同時に全ての開始／中間体に添加されるので、段階的アセンブリは、超並行様式で複数の同一のナノ構造を組み立てる。好ましい実施形態において、開始単位は、固体基板、支持体またはマトリクスに結合される。さらなるアセンブリ単位は、連続的に、固相ポリマー合成に類似の手順で添加される。アセンブリされながら、開始単位上で形成された結合アセンブリ単位を含むナノ構造の中間段階は、ナノ構造中間体または単にナノ構造のいずれかとして一般的に記載される。各アセンブリ単位の、アセンブリ中のナノ構造中間体への添加は、先に添加されたアセンブリ単位によって提供される連結要素の性質に依存し、そして次いで添加されたアセンブリ単位に関係ない。従って、アセンブリ単位は、アセンブリ中のナノ構造中間体上に曝露された連結要素のみに結合し得る；すなわち、添加されたアセンブリ単位は、自己相互作用をせず、そして／または重合しない。
【０１１４】
単一アセンブリ単位の連結要素は非相補的であり、従って、互いと相互作用しないので、未結合アセンブリ単位は、二量体またはポリマーを形成しない。添加されるべきアセンブリ単位は、完了まで中間体とのその反応を駆動するために、好ましくは、開始単位またはナノ構造中間体に対してモル過剰で提供される。段階的アセンブリ中の未結合アセンブリ単位の除去は、未結合アセンブリ単位がアセンブリプロセスの各サイクルにおいて洗浄され得るように、固体−基板−結合開始を使用して、段階的アセンブリを実行することによって促進される。
【０１１５】
このスキームは、相対的に低い非交差反応性の、相補的な連結対を使用する複雑なナノ構造のアセンブリを提供する。限定された数の連結要素が、アセンブリプロセスにおける任意の１つの工程でアセンブリ中間体の表面上に曝露されるので、低い連結対のみが使用される必要がある。相補的な連結要素を有するアセンブリ単位が、添加され、そしてナノ構造中間体についてインキュベートされ、アセンブリサイクルの間に、さらなるアセンブリ単位をナノ構造中間体に結合させ得る。次いで、過剰のアセンブリ単位を洗浄し、アセンブリプロセスの引き続く工程の間、これらが他のアセンブリ単位と所望でない相互作用を形成することを防止し得る。ナノ構造の各位置は、段階的アセンブリのプリセスによって独自に規定され得、そして異なる機能的要素は、任意の所望の位置で添加され得る。本発明の段階的アセンブリ法は、複合性ナノ構造の大量の平行製造を可能にし、そして異なる複合体ナノ構造は、階層的な様式において、より高次の構築にさらに自己アセンブリされ得る。
【０１１６】
図５は、一次元における本発明の段階的アセンブリ法の実施形態を示す。工程１において、開始単位は、固体基板上に固定化される。工程２において、アセンブリ単位は、開始に添加され（すなわち、マトリクス結合開始単位）、２つの単位で構成されたナノ構造中間体を生じる。単一のアセンブリ単位のみが、この工程において付加される。なぜなら、第２のアセンブリ単位は、自己と相互作用（すなわち重合）し得ないからである。
【０１１７】
開始単位（すなわち、キャップ単位を含む段階的アセンブリの間に引き続いて添加される任意のアセンブリ単位）は、さらなる機能的要素を含み得、そして／または先に添加した単位と異なる長さの構造単位を含み得る。例えば、図５の工程３において、機能的要素を含む第３のアセンブリ単位が添加される。工程４および５において、それぞれ設計された官能基を有するさらなるアセンブリ単位を添加する。従って、図５に示される段階的アセンブリの実施形態において、第３、第４および第５のアセンブリ単位の各々は、独特の機能要素を保有する（図においてアセンブリ単位の上部から突き出す幾何学的形状によって示される）。
【０１１８】
図５に示される段階的アセンブリの実施形態は、２つの非交差反応性の相補的な連結対のみを必要とする。工程５の最終で構造の自己アセンブリが停止する場合、構造の自己アセンブリは、４つの非交差反応の相補的な連結対を必要とする。必要とされる連結対の数のこの相対的に適度な増加は、構造のサイズが増大するにつれてさらに大きくなる。例えば、図５に図示される５つの工程の伸長によって組み立てられたＮ単位の線形構造について、段階的アセンブリは、なお、２つの非交差反応の相補的な連結対のみを必要とするのに対し、自己アセンブリは、（Ｎ−１）個の非交差反応の相補的な連結対を必要とする。
【０１１９】
組み立てられたナノ構造の数は、マトリクスに結合される開始単位の数によって決定されるが、一次元ナノ構造の各々の長さは、実行されるアセンブリサイクルの数の関数である。１つ以上の異なる機能的要素を有するアセンブリ単位を使用する場合、組み立ての順番は、他の機能的要素に対して各機能的要素の相対的な空間的配向を規定する。
【０１２０】
本発明の段階的アセンブリの方法における各工程の後、過剰の未結合アセンブリ単位を、除去工程（例えば、洗浄工程）によって、結合したナノ構造中間体から除去する。基板結合ナノ構造中間体は、適切な溶媒（例えば、水溶液または緩衝液）で洗浄され得る。溶媒は、相補的な連結要素の特異的な相互作用）を破壊することなく非特異的相互作用によって維持されるサブユニットを除去し得なくてはならない。適切な溶媒は、使用されるアセンブリ単位によって必要とされる場合、ｐＨ、塩濃度、化学組成物などによって変更し得る。
【０１２１】
ナノ構造中間体を洗浄するための緩衝液は、例えば、ＥＬＩＳＡプロトコルにおいて実行される洗浄工程に使用される緩衝液（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２章，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，２．１節「Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００１，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｅｄｉｔｏｒ：Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃｏｉｃｏを参照のこと）に記載される緩衝液）であり得る。
【０１２２】
特定の実施形において、アセンブリされたナノ構造は、「キャップ単位（ｃａｐｐｉｎｇ  ｕｎｉｔ）」の添加によって「キャップ」され、このキャップ単位は、単一の連結要素のみを保有するアセンブリ単位である。さらに、開始単位が、切断可能結合を介して固体基板に結合される場合、ナノ構造は、固体基板から除去され、そして単離され得る。しかし、いくつかの実施形態おいて、完全なナノデバイスは、固体基板に結合される間、機能的であり、そして除去される必要がなくなる。
【０１２３】
アセンブリ単位を添加する上記の工程は、完全なナノ構造がアセンブリされるまで、反復性の様式で繰り返され得、この後、完全なナノ構造は、開始単位内で設計された放出部分（例えば、プロテアーゼ部分）でマトリクスから第１のアセンブリ単位を固定化した結合を破壊することによってか、または放出について予め設計されたプロセス（例えば、ｐＨの低下）を使用することによって放出し得る。図２および３に図示されるように、段階的アセンブリのプロセスは、段階的アセンブリに企図される最も単純な実施形態の１つである。他の実施形態において、さらなる連結要素を有するアセンブリ単位を使用して、より複雑なアセンブリを作製し得る。アセンブリ単位は、個々に添加され得るか、特定の実施形態において、サブアセンブリとして添加され得る（図６）。結果は、所望の設計パラメータを満足するために、互いに関連して空間的に分散される機能的要素を有する完全に規定されたナノ構造である。本明細書中に開示される組成物および方法は、これらの複合性の設計されたナノ構造のアセンブリ手段、および大きな構造の１つまたは複数のナノ構造の段階的アセンブリによって形成されたより複合性のナノデバイスのアセンブリ手段を提供する。多次元的なナノ構造の組みたては、例えば、個々の一次元ナノ構造にさらなる連結要素（これらのさらなる連結要素は、個々のナノ構造を一緒に結合する適切な交差連結試薬によって認識され、そして結合され得る）を含む正確に間隔を空けられたアセンブリ単位を取り込むことによって達成され得る。特定の好ましい実施形態において、このような交差連結は、例えば、抗体またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントであり得る。
【０１２４】
本発明の段階的アセンブリ法のいくつかの実施形態において、開始単位が固体支持体に係留される。このような係留は、ランダムではなく（すなわち、アセンブリ単位の可塑性のビオチン化またはランダムなビオチン化に対するタンパク質の非特異的結合（その後、固定化ストレプトアビジンの結合が続く）ではなく）、マトリックスまたは基板への開始単位の特定の元素の結合を伴う。この段階的アセンブリプロセスは、方向性のプロセスであって、次のアセンブリ単位の結合のために、開始単位上に妨害されていない連結要素を必要とする。基板への開始単位のランダムな結合は、ある場合には、次のアセンブリ単位の結合に必要とされる連結要素の妨害をもたらし、従って、ナノ構造が組み立てられる際における開始単位の数を低減させる。
【０１２５】
本発明の段階的アセンブリ法の他の実施形態において、開始単位は、固体基板に固定されない。この場合、除去工程（例えば、洗浄工程）が、以下：
（１）磁性ナノ粒子を開始単位に結合させること、および磁場をかけることによって非結合性のアセンブリ単位からナノ構造中間体を分離すること；
２）より大きいナノ構造中間体を、非結合性のアセンブリ単位から、遠心分離、沈殿または濾過によって分離すること；あるいは
３）ナノ構造中間体またはアセンブリナノ構造が、破壊的な処理（例えば、プロテアーゼ処理もしくは化学的分解）に対してより耐性であるような場合には、非結合性のアセンブリ単位が選択的に破壊されること；
によって、非固定化または係留されていない開始単位上に構築されたナノ構造上で実施され得る。
【０１２６】
タンパク質は、明確な結合特性を有し、そしてタンパク質の分子間の相互作用を操作するための技術は、当該分野で周知である（Ｈａｙａｓｈｉら、１９９５、Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｇｅｎｅ  １６０（１）：１２９〜３０；Ｈａｙｄｅｎら、１９９７、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（２）：２０１〜１２；Ｊｕｎｇら、１９９９、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４（１）：１６３−８０；Ｖｉｔｉら、２０００、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４８０〜５０５；Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４、Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜５５）。しかし、企図されたナノ構造の段階的アセンブリは、特異的な認識特性を有する生物学的分子（例えば、タンパク質および核酸）から主に構成される成分に限定される必要は無い。無機元素または無機分子の光学的特性、磁性特性または電気的特性は、段階的アセンブリによって組み立てられたナノ構造のいくつかの実施形態に必要とされる。
【０１２７】
タンパク質で構成されていない成分が有利に利用される、本発明の多くの実施形態が存在する。他の実施形態において、有機物質と無機物質の両方から構成されるナノ構造を構築するためにタンパク質または核酸の分子相互作用特性を利用することが可能であり得る。
【０１２８】
ある実施形態において、無機ナノ粒子が、本発明の段階的アセンブリ法を用いて、ナノ構造中に組み立てられる成分に付加される。これは、無機粒子への結合のために特異的に選択された連結要素を用いて行われ得る。例えば、Ｗｈａｌｅｙおよび共同研究者は、半導体結合表面に特異的に結合するペプチドを同定した（Ｗｈａｌｅｙら、２０００、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：６６５〜６８）。１つの実施形態において、これらのペプチドは、本明細書中に記載されたタンパク質成分中に、標準的なクローニング技術を用いて挿入される。タンパク質の段階的アセンブリは、本明細書中に開示されるように構築され、強固で明確な三次元アレイ中に、これらの結合部位を分配する手段を提供する。
【０１２９】
一旦、無機ナノ粒子の特定の型についての結合部位が全て配置されると、これらの無機ナノ粒子は、タンパク性のアセンブリ単位を付加するのに使用されるサイクルに類似した段階的アセンブリのサイクルを用いて付加され得る。これを達成するために、ある実施形態において、無機ナノ粒子の溶解性を提供するために、ナノ構造中間体がインキュベートされる溶液条件を調整することが必要であり得る。一旦、無機ナノ粒子がナノ構造中間体に付加されると、この無機ナノ粒子に、さらなる単位を管理された方法で付加することは不可能である。なぜなら、任意の集団の無機ナノ粒子に固有の微小不均一性のためである。これらの不均一性は、さらなる相互作用の幾何学および化学量論が制御不可能であることを示す。
【０１３０】
図７は、本発明の段階的アセンブリ法に従うナノ構造へのタンパク質単位および無機元素の付加を示す図である。工程１において、開始単位を固体基板に結合させる。工程２において、アセンブリ単位を開始単位に特異的に結合させる。工程３において、さらなるアセンブリ単位を組み立てられたナノ構造に結合させる。このアセンブリ単位は、特定の無機元素に特異的な、操作された結合部位を構成する。工程４において、無機元素（クロスハッチされた楕円（ｃｒｏｓｓ−ｈａｔｃｈｅｄ  ｏｖａｌ）として示す）をこの構造に付加し、そして操作された結合部位に結合させる。工程５は、第２の型の無機元素に特異的に操作された結合部位を有する別のアセンブリ単位を付加し、そして第２の無機元素（長菱形（ｈａｔｃｈｅｄ  ｄｉａｍｏｎｄ）として示す）を工程６において付加させる。
【０１３１】
アセンブリ単位が付加される順序は、所望の構造および／または活性（アセンブリプロセスに用いられる生成物ナノ構造、および交差反応する連結要素対の数を最小化する必要性）によって決定される。従って、アセンブリの順序の決定は、段階的アセンブリによって組み立てられるべきナノ構造の設計の不可欠な部分である。連結要素が設計によって選択され、所望のナノ構造の段階的アセンブリを可能にする。連結要素の選択は、ナノ構造中に組み込まれるべき機能要素と一般的に無関係であり、これらの連結要素は、必須の機能要素および連結要素（所望の空間的位置に機能要素の配置を規定する）を有するアセンブリ単位を組み立てるのに必要とされるように混合されそしてマッチングされる。
【０１３２】
例えば、２つの連結要素（３つの連結対を作る６つの連結要素を用いて設計された）を構成するアセンブリ単位は、相互作用しない任意の１８対の連結要素を含み得る。連結要素の２１対の可能な対が存在するが、これらの対のうちの３対は相互作用し（例えば、Ａ−Ａ’）、そしてアセンブリ単位におけるこれらの対の使用により、互いに同一のアセンブリ単位の自己会合を引き起こす。以下に示した実施例において、連結要素は、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、ＣおよびＣ’として示され、ここで、ＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’、ならびにＣおよびＣ’は、連結要素の相補的対（連結対）（すなわち、互いに特異的に結合するが、示された他の４つの連結要素のいずれにも結合しない）である。６つの代表的なアセンブリ単位（各々が２つの連結要素を含み、ここで各々の連結要素は、非同一な非相補的な連結要素を含む）が、以下に示される。この描写において、各々のアセンブリ単位は、固有の機能要素（６つのセットの１つ）をさらに含み、Ｆ１〜Ｆ６として表される。これらの慣習に従って、６つの可能なアセンブリ単位が、以下のように設計され得る：
【０１３３】
【化１】
2005518456.tif 000041
本明細書中に開示される方法に従う段階的アセンブリは、以下に例証される線形の一次元ナノ構造を組み立てるために使用され得、各々のアセンブリ単位の順序および相対的なベクトル方向は、機能要素（記号
【０１３４】
【化２】
2005518456.tif 000042
は、開始剤が付加される固体基板を表して使用され、そしてダブルコロンは、アセンブリ単位間の特異的相互作用を表す）の順序と無関係である：
【０１３５】
【化３】
2005518456.tif 000043
。
【０１３６】
この図から明らかなように、多数の固有のアセンブリ単位が少数の相補的な連結要素を用いて構築され得る。さらに、アセンブリ単位の１つの型のみが、各々の段階的アセンブリサイクルに付加されるので、少数の相補的な連結要素のみが、多数の固有の複雑なナノ構造のアセンブリに必要である。従って、連結要素が、完成したナノ構造内部のアセンブリ単位の位置に両義性を付与することなく繰り返し使用され得る。
【０１３７】
上記の場合の各々において、２つまたは３つの連結対のみが使用される。これらの構造の任意の自己アセンブリは、７つの非交差反応連結対の使用を必要とする。これらの線形構造がＮ単位の大きさであって、段階的アセンブリを用いて組み立てられる場合、２つまたは３つの連結対が依然として必要とされるのみであるが、自己アセンブリのためには、これらの線形構造は、（Ｎ−１）非交差反応する相補的連結対を必要とする。
【０１３８】
本発明の別の局面において、上に示したアセンブリ単位の２つの連結要素の位置を交換することによって、付加された機能要素の空間的位置および配向が、組み立てられたナノ構造の全体的な構造内で変更される。本発明のこの局面は、本明細書中に開示されるように、ナノ構造の段階的アセンブリによって付与される設計柔軟性のさらに別の局面を明らかにする。
【０１３９】
開始剤またはナノ構造中間体への各アセンブリ単位の付加は、開始剤またはナノ構造中間体によって運ばれるアセンブリ単位の１つの連結要素と１つ以上の非結合相補的連結要素との間の特異的連結対相互作用の形成によって、媒介される。多数の実施形態において、単一の非結合相補的連結要素のみが、開始剤またはナノ構造中間体上に存在する。しかし、他の実施形態において、複数の同一のアセンブリ単位を、同一の連結要素を含むアセンブリ中間体上の複数の部位に付加することは、有利であり得る。これらの実施形態において、段階的アセンブリは、アセンブリ単位の並列加算によって進行するが、単一単位のみが中間体上の任意の１部位に付加され、そして関連する全ての部位でのアセンブリは、予め設計されたベクトル様式で生じる。
【０１４０】
ナノ構造の構造完全性は、段階的アセンブリのプロセスにわたって決定的な重要性があり、そしてこれらのアセンブリ単位は、好ましくは非共有結合性の相互作用によって連結される。特異的非共有結合性の相互作用は、例えば、アセンブリ単位とナノ構造中間体との間に生じる相互作用である。特異的相互作用は、アセンブリ単位とナノ構造中間体との間の複合体に、段階的アセンブリプロセス全体に渡って安定な相互作用を維持するのに十分な安定性を与えるために、適切な親和性を示すべきである。非共有結合性の特異的相互作用は、付加されたアセンブリ単位が、そのアセンブリ単位と相互作用するように設計された連結要素とのみ安定な相互作用を形成するように、適切な特異性を示すべきである。本明細書中に開示された段階的アセンブリプロセスの間、要素間に生じる相互作用は、好ましくは、操作可能には「逆転できない（不可逆である）」。この要求を満たす結合定数は、明確には定義され得ない。なぜなら、「不可逆性」は動力学的概念であり、結合定数が平衡特性に基づくためである。それにもかかわらず、１０−７以下の桁（すなわち、より高い親和性および典型的なダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）−エピトープ複合体のＫｄに類似）のＫｄ’での相互作用は、目的のタイムスケールで（すなわち、ナノ構造の段階的アセンブリの間）、代表的に「不可逆的に」作用する。
【０１４１】
しかし、分子間の相互作用は、ナノ構造の利用のタイムスケール（すなわち、その有効期限予測値または可使時間予測値）に「不可逆的に」作用する必要はない。ある実施形態において、本明細書中に開示される段階的アセンブリ法に従って組み立てられたナノ構造は、続いて、化学固定（例えば、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを用いた固定）によって安定化されるか、または架橋結合によって安定化される。２つのタンパク質を架橋結合するための最も一般的なスキームは、１つのアセンブリ単位上のアミノ基の第２アセンブリ単位上のチオール基に対する間接的なカップリングを含む（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第８版、２章、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｌｏｓｔｅｒら、１９９７、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．６９９（１〜２）：４３９−６１；Ｐｈｉｚｉｃｋｙら、１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９（１）：９４〜１２３を参照のこと）。
【０１４２】
本発明のある実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法によるナノ構造のアセンブリは、アセンブリ単位間の非共有結合性の相互作用を用いて、比較的強固な連結および安定なアセンブリ単位に関与する。それにもかかわらず、有用なアセンブリ単位に組み込まれる連結要素は、むしろ混乱し（つまり、安定でも強固でもない）、その後、第２の連結要素と相互作用して、安定な、好ましくは強固な連結対を形成し得る。したがって、本発明のある実施形態において、個々のアセンブリ単位は、アセンブリ前に、不安定な可撓性のドメイン含み得、これは、アセンブリ後には、より強固である。好ましい実施形態において、本明細書中に開示された組成物および方法を用いて組み立てられたナノ構造は、強固な構造である。
【０１４３】
本発明の方法に従って、ナノ構造の剛性の分析、ならびに任意の構造的不備または欠陥の同定が、当該分野で周知の方法（例えば、電子顕微鏡検査法）を用いて実施される。
【０１４４】
別の実施形態において、構造的剛性は、固体表面に完成したナノ構造の一端を直接的に付着させることによって（すなわち、可撓性係留を用いることなく）、試験され得る。次いで、ナノ構造の他端（または、多分岐構造である場合、ナノ構造の末端分岐）は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）チップに接着され、可動である。チップを動かす目的で、チップに力がに適用される。ナノ構造が可撓性である場合、適用された力とナノ構造の偏向によって認められたチップ移動との間には、おおよその比例関係が存在する。対照的に、ナノ構造が強固である場合、ナノ構造偏向およびチップ移動はほとんど無いかまたは全くない。なぜなら、適用される力のレベルが、強固なナノ構造が破壊される点まで増加するためである。その時点では、これ以上の力は適用されないにもかかわらず、ＡＦＭチップの大きな移動がある。２つの末端の接着点がナノ構造よりも強い限りは、この方法は、剛性の有用な測定値を提供する。
【０１４５】
本発明によると、ナノ構造中の各位置は、全ての他の位置と区別可能である。なぜなら、各アセンブリ単位が、その隣接単位と密に、かつ特異的に、かつ固有に相互作用するように設計され得るからである。各アセンブリ単位は、このナノ構造内の位置とは異なる活性および／または特性を有し得る。このナノ構造中の各位置は、段階的アセンブリプロセスによって、ならびに各アセンブリ単位および／または所望の位置で加えられる機能的要素の特性によって、固有に規定される。さらに、本明細書中に開示される段階的アセンブリ法およびアセンブリ単位は、十分に規定されたサイズ、形状および機能の複雑なナノ構造を構築するための大規模な大量並列自動化製造プロセスに供することができる。
【０１４６】
本発明の方法および組成物は、本明細書中で用いられるアセンブリ単位の構築において使用されるタンパク質が可能である正確な寸法、均一性、および空間形状の多様性を利用する。さらに、本明細書中以下に記載されるように、本発明の方法は有利である。なぜなら、遺伝子操作技術が、本明細書中に開示される本発明の方法において使用される生物学的材料の特性を改変および変更するため、ならびに微生物中で多量のこのような材料を合成するために使用され得るからである。
【０１４７】
（開始アセンブリ単位）
開始アセンブリ単位は、本発明の段階的アセンブリ法によって形成されるナノ構造に組み込まれた第１のアセンブリ単位である。開始アセンブリ単位は、特定の実施形態において、共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用によって、固体基板または他のマトリクスに結合され得る。開始アセンブリ単位は、「開始単位」としても公知である。
【０１４８】
ナノ構造の段階的アセンブリは、選択されたアセンブリ単位の開始単位への非共有結合的な方向性付加によって始まる。本発明の方法によると、アセンブリ単位が、（ｉ）開始単位のインキュベーションによって、開始単位に付加され、この開始単位は、いくつかの実施形態において、付加されるべき次のアセンブリ単位を含む溶液中で、マトリクスまたは基板に固定される。このインキュベーション工程の後に、（ｉｉ）除去工程（例えば、洗浄工程）が続き、ここで過剰のアセンブリ単位が、開始単位の付近から除去される。
【０１４９】
アセンブリ単位は、特異的な非共有結合の形成によって、開始単位に結合する。次のアセンブリ単位の連結要素は、これらの連結要素が開始単位上の予め指定された部位のみに結合するように選択される。１つのアセンブリ単位のみが、第１の段階的アセンブリサイクルの間に、開始単位上の標的連結要素に付加され得、そしてこのアセンブリ単位の標的開始単位への結合は、方向性である。所望のアセンブリ単位の全てがナノ構造の所望の設計に従ってナノ構造に組み込まれるまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことによって、段階的アセンブリが続く。
【０１５０】
本発明の段階的アセンブリ法の好ましい実施形態において、開始単位が、基板に固定され、そしてさらなる単位が、固相ポリマー合成と類似の手順で、連続的に付加される。
【０１５１】
開始単位は、アセンブリ単位のカテゴリーであり、従って、本発明のアセンブリ単位で含まれると本明細書中以下に記載される構造的連結要素および／または機能的要素のいずれかを含み得る。従って、開始単位は、以下の分子、またはそれらの結合誘導体もしくは結合フラグメントのいずれかを含み得る：モノクローナル抗体；多重特異的抗体、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）；二重特異的、キメラまたは二重特異的なヘテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディまたは多量体ｓｃＦｖフラグメント；細菌ピリンタンパク質、ロイシンジッパー型コイルドコイル、４へリックス束、ペプチドエピトープまたはＰＮＡ、あるいは本明細書中に開示される任意の他の型のアセンブリ単位。
【０１５２】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの連結要素を含む開始アセンブリ単位を提供する。他の実施形態において、本発明は、２つ以上の連結要素を有する開始アセンブリ単位を提供する。
【０１５３】
開始単位は、種々の方法でマトリクスに連結され得る。連結方法の選択は、いくつかの設計要素（開始単位のタイプ、最終のナノ構造がマトリクスから除去されるべきか否か、最終のナノ構造の化学などが挙げられるが、これらに限定されない）によって決定される。可能な連結方法としては、開始エピトープへの抗体の結合、Ｈｉｓタグ化開始剤、マトリクス結合ドメイン（例えば、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン）を含む開始単位、抗体または抗体由来開始単位については、抗体結合タンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）、ビオチン化開始剤のストレプトアビジン結合、ＰＮＡ係留、および開始剤のマトリクスへの特異的な共有結合的連結が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
特定の実施形態において、開始単位は、固体基板に固定される。開始単位は、抗体または抗原の固定のための当該分野で一般的に使用される方法を使用して、固体基板に固定され得る。抗体または抗原の固定のための当該分野で周知の多数の方法がある。これらの方法としては、プラスチックＥＬＩＳＡプレートへの非特異的吸着；タンパク質のビオチン化、その後の、プラスチック基板にすでに吸着されたストレプトアビジンまたはアビジンに結合することによる固定（例えば、Ｓｐａｒｋｓら、１９９６、Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｂ．Ｋ．Ｋａｙ，Ｊ．ＷｉｎｔｅｒおよびＪ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２２７−５３を参照のこと）が挙げられる。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに加えて、タンパク質は、多数の他の固体支持体（例えば、セファロース（Ｄｅｄｍａｎら、１９９３，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８；２３０２５−３０）、または常磁性ビーズ（Ｓｐａｒｋｓら、１９９６，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｂ．Ｋ．Ｋａｙ，Ｊ．ＷｉｎｔｅｒおよびＪ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２２７−５３））に固定され得る。使用され得るさらなる方法としては、アミンを含有する生物学的分子の、アルデヒドを含有する固体支持体上での還元的アミノ化（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐ．１８６）、ジメチルピメリミデート（ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）（ＤＭＰ）の使用、およびいずれかの末端にイミドエステル基を有するホモ二官能性架橋剤の使用（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２０５−０６）が挙げられる。この試薬は、結合プロテインＡを含む不溶性支持体に抗体分子を固定する際の使用が見出されている（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９８２，Ａ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｍｍｕｎｏｍａｔｒｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，１０７６６−６９）。
【０１５５】
特定の実施形態において、開始単位は、係留化ドメイン（Ｔ）（これは固定された抗原／ハプテンを認識し、そしてこれらに結合する）および対向するドメイン（Ａ）（続いて、このドメインに、段階的アセンブリ中にさらなるアセンブリ単位が付加する）を含む二重特異的抗体である。抗体８Ｆ５（これは、抗原性ペプチドＶＫＡＥＴＲＬＮＰＤＬＱＰＴＥ（配列番号１５９）に由来するヒトライノウイルス（血清型２）ウイルスキャプシドタンパク質Ｖｐ２に対して指向される）は、Ｔドメインとして使用される（Ｔｏｒｍｏら、１９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒａｌ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ２，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（１０）：２２４７−５６）。Ａドメインは、二重特異的抗体単位１について先に記載された同じリゾチーム抗イデオトープ抗体（Ｅ５．２）である。従って、完全開始アセンブリ単位は、８Ｆ５×７３０．１．４（Ｔ×Ａ）を対向するＣＤＲとして含む。開始単位が、構築され、そして二重特異的抗体を含む連結要素および／または構造的要素を特徴付けるための本明細書中で記載された方法を使用して機能的に特徴付けされる。
【０１５６】
開始単位を固体支持体マトリクスに固定するために、ライノウイルス抗原性ペプチドが、第Ｘａ因子の配列ＩＥＧＲのＮ末端（ＮａｇａｉおよびＴｈｏｇｅｒｓｅｎ，１９８４，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９（５９７１）：８１０−１２）で、ならびに第Ｘａ因子の配列と抗原性ペプチド配列との間で、スプライシングされた短い可撓性リンカーを介して、プロテアーゼ認識ペプチド第Ｘａ因子に融合され得る。この融合ペプチドは、ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（６炭素長のスペーサーアームを有し、１級アミンを介するカップリングを許容するセファロース誘導体）に共有結合され得る。（あるいは、カルボキシル基を介する共有結合のためのセファロース誘導体が使用され得る）。共有結合された融合タンパク質は、開始単位（Ｔ×Ａ）中の係留化ドメイン「８Ｆ５」の認識エピトープとして働く。
【０１５７】
一旦、開始剤が固定されると、続いて、さらなる二重特異的抗体単位（二重特異的抗体アセンブリ単位１および２）が、結合ドメインＡ’から一方向で、段階的アセンブリに付加され得る。段階的アセンブリが完了すると、ナノ構造は、支持体マトリクスに架橋され得るか、またはプロテアーゼ第Ｘａ因子の付加の際に、このマトリクスから放出され得る。このプロテアーゼは、共有結合された抗原性／第Ｘａ因子の融合ペプチドを切断し、支持体マトリクスからインタクトなナノ構造を放出する。なぜなら、設計によって、設計されたタンパク質アセンブリ単位のいずれにも、第Ｘａ因子認識部位が含まれないからである。
【０１５８】
第Ｘａ因子の付加を必要としない固体支持体マトリクスからのペプチド融合物の切断の代替方法もまた、実行され得る。この方法は、セファロースマトリクスに結合した切断可能なスペーサーアームを使用する。抗原ペプチドは、フェニルエステル結合を介してマトリクスに共有結合される。一旦、固定された抗体が開始アセンブリ単位に結合すると、この開始アセンブリ単位は、ｐＨ７．４（開始単位／抗原複合体（および関連のナノ構造）が支持体マトリクスから放出される点）におけるイミダゾールグリシン緩衝液を用いるスペーサーアームの化学的切断まで、この支持体マトリクスに連結されたままである。
【０１５９】
（連結要素を特徴付けする方法）
（抗体ファージディスプレイ技術による、連結要素の相互作用を同定する方法）
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法における使用に適切な連結要素が、スクリーニングされ、そしてその相互作用が、抗体ファージディスプレイ技術を使用して同定される。組換え抗体、またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントの産生のためのファージディスプレイ技術は、広範な多種多様な抗原（有機と無機の両方）（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、および半導体表面など）に結合し得るタンパク質を生成するために使用され得る。ファージディスプレイ技術のための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｍａｒｋｓら、１９９１，Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｐｈａｇｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７；Ｎｉｓｓｉｍら，１９９４，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ「ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｔ」ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：６９２−９８；Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら，１９９６，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｕ１  ＲＮＡ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｖ  ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６２９−３９；ＤＥ  Ｗｉｌｄｔら，１９９７，Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０７：６１−６７；Ｗｉｌｌｅｍｓら，１９９８，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １２：１２９５−１３０２；ｖａｎ  Ｋｕｐｐｅｖｅｌｔら，１９９８，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｆｕｒｔｈｅｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｋｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２９６０−６６；Ｈｏｅｔら，１９９８，Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｕ１ｓｎＲＮＰ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｕ１Ｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａ��ｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖ−ｇｅｎｅ  ｕｓａｇｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１０４５−５５を参照のこと）。
【０１６０】
組換え抗体技術は、ハイブリドーマ細胞からの既知の特異性を有する抗体の単離を可能にするが、この技術は、特定のｍＡｂを迅速に作製し得ない。別個の免疫、続く、ハイブリドーマを作製するための細胞融合は、目的の各ｍＡｂを作製するために必要である。これは、時間がかかりかつ面倒である。
【０１６１】
好ましい実施形態において、抗体ファージディスプレイ技術は、これらの制限を克服するために使用され、その結果、目的の特定の抗原を認識するｍＡｂが、より効率的に作製され得る（方法については、Ｗｉｎｔｅｒら，１９９４，Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５；Ｈａｙａｓｈｉら，１９９５，Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇｅｎｅ  １６０（１）：１２９−３０；ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓら，１９９６，Ｐｈａｇｅ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（９）：１１４９−５４；Ｊｕｎｇら，１９９９，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４（１）：１６３−８０；Ｖｉｔｉら，２０００，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎｚｙｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４８０−５０５を参照のこと）。一般に、抗体ファージディスプレイ技術において、ＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子のＦｖ抗原結合部分またはＦａｂ抗原結合部分は、適切なプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、ヒト脾臓またはヒト末梢血リンパ球細胞由来のｃＤＮＡから「レスキュー」される。このレスキューされたＶＬおよびＶＨ遺伝子レパートリー（ＤＮＡ配列）は、一緒にスプライシングされ、そしてバクテリオファージのマイナーコートタンパク質（例えば、Ｍ１３またはｆｄ、あるいはそれらの結合誘導体）に挿入されて、融合バクテリオファージコートタンパク質を形成する（Ｃｈａｎｇら，１９９１，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｂ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１０）：３６１０−１４；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  およびＬｉｔｔｌｅ，１９９９，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（２）：１７３−２０１）。得られたバクテリオファージは、ファージタンパク質コートの外面に融合された機能的抗体、およびファージゲノムに組み込まれた抗体ＶＬおよびＶＨをコードする１コピーの遺伝子フラグメントを含む。
【０１６２】
これらの方法を使用して、特定の目的の抗原に対して親和性を有するバクテリオファージディスプレイ抗体が、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによって、ディスプレイ抗体を有する組換えバクテリオファージの集団の、標的エピトープまたは抗原（これは固体表面またはマトリクスに固定されている）への結合を介して単離され得る。結合、結合していないかまたは弱く結合したファージ粒子の除去、およびファージの複製の反復サイクルにより、所望のＶＬ遺伝子フラグメントおよびＶＨ遺伝子フラグメントを有するバクテリオファージの濃縮された集団が得られる。
【０１６３】
目的の抗原としては、ペプチド、タンパク質、免疫グロブリン定常領域、ＣＤＲ（抗イディオタイプ抗体産生のための）、他の高分子、ハプテン、低分子、無機粒子および無機表面が挙げられ得る。
【０１６４】
一度、精製されると、結合されたＶＬ遺伝子フラグメントおよびＶＨ遺伝子フラグメントは、当該分野で公知の標準的ＤＮＡ分子技術により、バクテリオファージゲノムからレスキューされ得、クローニングされ得、そして発現され得る。この方法によって生成される抗体の数は、遺伝子レパートリーのサイズおよび多様性に直接的に相関し、実際の任意の標的分子に対する抗原性についてスクリーニングされ得る多様な抗体ライブラリを生成するための最適な方法を提供する。抗体−ファージディスプレイ技術により生成されたｍＡｂは、しばしば、ピコモル〜ナノモルの範囲で抗原に対する特異的結合を示す（Ｓｈｅｅｔｓら，１９９８，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ  ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｙ：ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｇｉｇｅｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１１）：６１５７−６２）。
【０１６５】
本発明の方法において有用である、抗体、またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントは、上述のように構築および特徴付けされた抗体またはフラグメントファージディスプレイライブラリを使用して選択され得る。このようなアプローチは、高複合性（例えば、１０９）を有するライブラリを効率的にスクリーニングするための方法を提供するという利点を有し、本発明の方法における使用に適切な抗体またはフラグメントの同定を劇的に増加させる。
【０１６６】
特定の実施形態において、免疫グロブリンレパートリーをクローニングするための方法（「レパートリークローニング」）を使用して、本発明の段階的アセンブリ法における使用のための抗体を産生する。レパートリークローニングは、抗体産生動物を含めずに、実質的に任意の種類の抗体の産生に使用され得る。免疫グロブリンレパートリーをクローニングするための方法（「レパートリークローニング」）は、当該分野で周知であり、全体的にインビトロで実施され得る。一般的に、レパートリークローニングを実施するために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、末梢血から得られるＢリンパ球から抽出される。ｍＲＮＡは、逆転写および標準プロトコルを使用するｃＤＮＡ合成についてのテンプレートとして役立つ（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｔｏｏｌｓ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ，Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ＩＡ，ＩＣ，ＩＩＡ，ＩＩＢ，ＩＩＣおよびＩＩＩＡ，編者Ｊａｎｕｓｚ  Ａ．Ｚ．Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｊｕｌｉａ  Ｍ．Ｐｏｌａｋ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ７，１１，１４および１８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３，４，１１，１５および２４，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。免疫グロブリンｃＤＮＡは、適切なプライマーを使用するＰＣＲにより、ｃＤＮＡのこの複雑な混合物から特異的に増幅される。所望の結合特性を有する免疫グロブリンフラグメントを構築するために、抗体軽鎖（Ｌ）および抗体重鎖（Ｈ）をコードする遺伝子由来のＰＣＲ産物が得られる。次いで、この産物は、ファージミドベクターに導入される。ファージコートタンパク質との融合物として、バクテリオファージゲノムに組み込まれたクローニングされた遺伝子または遺伝子フラグメントは、適切な細菌宿主において発現され、これにより、バクテリオファージの表面上に保持されるハイブリッドｓｃＦｖ免疫グロブリン分子の合成が導かれる。それゆえに、バクテリオファージ集団は、そのレパートリーに含まれる全ての特異性を有する免疫グロブリンの混合物に相当する。
【０１６７】
抗原特異的免疫グロブリンは、抗原免疫吸着の反復プロセス、続くファージ増殖によりこの集団から選択される。目的の抗原に対してのみ特異的であるバクテリオファージは、複数回の選択後に残っており、そしてさらなる操作のため、または可溶性形態でかつ多量でファージコードタンパク質を発現するための、新たなベクターおよび／または宿主に導入され得る。
【０１６８】
従って、抗体ファージディスプレイライブラリは、上述のように、抗体のエピトープ結合領域の単離、精製、および改善のために使用され得、この抗体は、本明細書に開示される、ナノ構造の段階的アセンブリに使用するためのアセンブリ単位の構築における連結要素として使用され得る。
【０１６９】
（Ｘ線結晶学を用いる、連結要素相互作用を特徴付けるための方法）
多くの場合、タンパク質間またはタンパク質とペプチドとの間の分子認識は、実験的に決定され得る。本発明の１つの局面において、連結要素相互作用を規定するタンパク質−タンパク質相互作用は、結合対の形成に重要であり、当該分野で一般的に公知のＸ線結晶学的方法によって特徴付けおよび同定される。このような特徴付けにより、当業者は、本発明の組成物および方法において有用であり得る結合対相互作用を認識することができる。
【０１７０】
（連結要素の特異性および親和性を特徴付けるための方法）
２つの相補的連結要素が特異的に相互作用するという検証は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、分析的限外濾過、またはＢＩＡｃｏｒｅ方法論（Ａｂｒａｈａｍら，１９９６，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．９（５−６）：４５６−６１；Ａｔｗｅｌｌら，１９９６，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ｄｉｍｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｒｉｎ  ａｎｄ  Ｎ９  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（１７−１８）：１３０１−１２；Ｍｕｌｌｅｒら（１９９８），Ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｖｉｄｉｔｙ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３２（１−２）：４５−４９）、または当該分野で周知の他の類似の方法を使用して確立され得、これらは、分子間結合相互作用の強度を実証および／または定量するのに適している。
【０１７１】
（構造的要素、連結要素および機能的要素の設計および操作）
規定された結晶構造、または高度に相同性の物質の既知の結晶構造に基づく相同性モデリングにより明らかにされるように、本発明の構造的要素、連結要素および機能的要素の設計、ならびにこれらを含むアセンブリ単位の設計は、所望の結合相互作用におけるそれらの構造の分析および決定によって容易にされる。１つ以上の機能的要素を含む有用なアセンブリ単位の設計は、好ましくは、以下の工程の幾つかまたは全部を含み得るが、これらに限定されない、一連の決定および分析を包含する：
（ｉ）ナノ構造の所望の全体的な機能に基づく、組み込まれるべき機能的要素の選択；
（ｉｉ）標的機能に基づく所望の形状の選択、特に、機能的要素の相対的位置の決定；
（ｉｉｉ）これらのペプチドまたはタンパク質の決定、同定または選択を介する連結要素の選択（例えば、コンビナトリアルライブラリから）であり、これらのペプチドまたはタンパク質は、所望のナノ構造に組み込まれるべき機能的ナノ粒子に対する特異性を有する、選択；
（ｉｖ）例えば、量子ドットなどのようなナノ粒子を含む、機能的要素間の必要とされる分離に基づく、正確な寸法を有する適切に剛性の構造を提供しかつ正確な形状および化学量論を有する連結要素の組み込みのための位置を有する構造的要素の選択；
（ｖ）工程（ｉｉｉ）からの、ペプチドまたはタンパク質連結要素および工程（ｉｖ）において選択された構造的要素を組み込む融合タンパク質の設計であって、それにより、アセンブリ単位の構造的要素および連結要素の折り畳みが、破壊されない（例えば、βターンにおける組み込みを介する）、設計；
（ｖｉ）ナノ構造の全体的な設計の状況において生じる融合タンパク質のコンピューターモデリングおよび機能的仕様によって必要とされる場合に構造的寸法を最適化するための設計の精錬；または
（ｖｉｉ）段階的アセンブリのためのアセンブリ配列の設計。
【０１７２】
構造的要素タンパク質の改変は、通常、例えば、問題のタンパク質のアミノ酸配列の挿入、欠失、または改変を含む。多くの場合、改変は、ネイティブのタンパク質において現存しない連結要素を加えるための挿入または置換を含む。挿入変異の成功を決定するための慣習的な試験の非限定的な例は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルである。生じる融合変異体タンパク質のＣＤスペクトルが、ネイティブのタンパク質のＣＤと比較され得る。
【０１７３】
挿入が小さい場合（例えば、短いペプチド）、適切に折り畳まれた挿入変異体のスペクトルは、ネイティブのタンパク質のスペクトルに非常に類似する。挿入がタンパク質ドメイン全体である場合（例えば、単鎖可変ドメイン）、融合タンパク質のＣＤスペクトルは、個々の成分（すなわち、ネイティブのタンパク質ならびにネイティブのタンパク質および機能的要素を含む融合タンパク質の成分）のＣＤスペクトルの合計に対応するはずである。この対応は、融合タンパク質の２つの成分の正確な折り畳みについての慣習的な試験を提供する。
【０１７４】
好ましくは、融合タンパク質の首尾よい操作の更なる試験がなされる。例えば、融合タンパク質がその標的の全てに結合し、それゆえに、全ての結合対と首尾よく相互作用する能力の分析がなされ得る。これは、多くの適切なＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施され得る；少なくとも１つのＥＬＩＳＡを実施して、ナノ構造を形成するのに必要とされる各々の結合対に対する、改変されたタンパク質の親和性および特異性を試験する。
【０１７５】
（段階的アセンブリ法の使用およびそれにより構築されたナノ構造の使用）
本発明の段階的アセンブリ法およびアセンブリ単位は、無数のナノ構造の構築における用途を有する。このようなナノ構造の使用は、容易に明らかとなり、この使用としては、一次元、二次元、および三次元の構造（例えば、繊維、ケージ、または固体）の高度に規則正しい十分に規定されたアレイを必要とする適用が挙げられ、これらの構造は、それらが他の物質と会合できるようにする特定の結合部位を含み得る。
【０１７６】
特定の実施形態において、これらのナノ構造は、本発明の段階的アセンブリ法により製造されたナノ構造は、一次元構造である。例えば、段階的アセンブリにより製造されたナノ構造は、他の物質（例えば、エアロゲル、紙、プラスチック、セメントなど）の構造的補強剤のために使用され得る。特定の実施形態において、長い一次元繊維の形態を取るように段階的アセンブリにより製造されるナノ構造は、例えば、製造の間、紙、セメントまたはプラスチックに組み込まれて、加えられた湿度および乾燥引張り強度を提供する。
【０１７７】
別の実施形態において、ナノ構造は、同定または認識の目的のために使用され得るパターン化またはマーキングされた繊維である。このような実施形態において、ナノ構造は、例えば、蛍光色素、量子ドット、または酵素などのような機能的要素を含み得る。
【０１７８】
さらなる実施形態において、特定のナノ構造は、偽造に対するマーカーとして紙および織物に含浸される。この場合、（例えば、キットで市販される）単一の色が関連する抗体反応を使用して、物質の起源を検証する。あるいは、このようなナノ構造は、組み込みの前または後のいずれかに色素、インクもしくは他の物質と結合して、紙もしくは織物を染色し得るか、または、他の方法でそれらの外観もしくは特性を改変し得る。
【０１７９】
別の実施形態において、ナノ構造は、例えば、製造の間にインクまたは色素に組み込まれて、可溶性または混和性を増大させる。
【０１８０】
別の実施形態において、一次元構造のナノ構造（例えば、繊維）は、所望の位置に１つ以上の酵素機能的要素または触媒機能的要素を保有する。このナノ構造は、酵素反応または触媒反応のための支持構造または足場として機能し、その効率を増大させる。このような実施形態において、ナノ構造を使用して、所望の反応における酵素または他の触媒を「取り付ける」か、または位置付けし、反応「アセンブリライン」を提供し得る。
【０１８１】
別の実施形態において、一次元のナノ構造（例えば、繊維）は、アセンブリジグとして使用される。２つ以上の成分（例えば、機能的単位）がナノ構造に結合され、それにより、空間的配向を提供する。これらの成分は、結合または融合され、次いで、生じた融合生成物は、ナノ構造から放出される。
【０１８２】
別の実施形態において、ナノ構造は、一次元、二次元または三次元の構造であり、この構造は、ナノ粒子（例えば、熱特性、電気的特性または磁気特性を有する金属粒子または他の粒子）を規定された間隔で取り付けるための支持体または枠組みとして使用され、そして、この構造は、ナノワイヤまたはナノ回路を構築するために使用される。
【０１８３】
別の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法を使用して、一次元ナノ構造（繊維）と金属との電極のないプレーティングを達成し、規定されたサイズおよび／または形状を有するナノワイヤを構築する。例えば、機能的要素として金属粒子を含むナノ構造が構築され得る。
【０１８４】
別の実施形態において、機能的要素として磁気粒子を含む一次元ナノ構造（例えば、繊維）は、外部磁場により整列されて、ナノ構造を通って流れる流体を制御する。別の実施形態において、外部磁場を使用して、ＬＣＤ型ディスプレイにおいて使用するために、機能的要素として光学部分を含むナノ構造（例えば、繊維）を整列または脱整列させる。
【０１８５】
別の実施形態において、ナノ構造は、電子顕微鏡のためのサイズ標準物質または正確な寸法のマーカーとして使用される。
【０１８６】
他の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法により製造されたナノ構造は、二次元または三次元構造である。例えば、１つの実施形態において、ナノ構造は、規定された孔サイズを有するメッシュであり、二次元ふるいまたはフィルターとして機能し得る。
【０１８７】
別の実施形態において、ナノ構造は、アセンブリ単位の三次元六角形アレイであり、この単位は、分子ふるいまたはフィルターとして使用され、サイズによって粒子を選択的に分離するための、正確な直径の規則的な垂直孔を提供する。このようなフィルターは、溶液の滅菌（すなわち、微生物またはウイルスを除去するため）に使用され得るか、または一連の分子量カットオフフィルターとして使用され得る。この実施形態において、孔のタンパク質成分（例えば、構造的要素または機能的要素）は、特定の表面特性（すなわち、親水性または疎水性、特定のリガンドを結合する能力など）を提供するように改変され得る。とりわけ、この型の濾過デバイスの利点は、孔の均質性および直線性であり、そしてマトリクスに対する孔の高い比率である。
【０１８８】
本明細書に開示される方法およびアセンブリ単位を使用して、種々の二次元および三次元構造（例えば、多角形構造（例えば、八角形））ならびに開放固体（例えば、三角形から形成される四面体、二十面体）、ならびに正方形および矩形から形成される箱型または立方体（例えば、節１１、実施例６に開示される立方体）を構築し得ることは、当業者に対して明らかである。この構造の範囲は、構造要素の異なる軸上で操作され得る連結要素および機能的要素の型によってのみ限定される。
【０１８９】
別の実施形態において、二次元または三次元の構造を使用して、機能的単位として光学的部分、電気的部分、磁気的部分、触媒性部分、または酵素的部分を含む表面コーティングを構築し得る。このようなコーティングは、例えば、光学的コーティングとして使用され得る。このような光学的コーティングを使用して、コーティングされた物質の吸着特性または反射特性を変更し得る。
【０１９０】
本発明のナノ構造を使用して構築された表面コーティングはまた、電気的コーティングとして（例えば、静的遮蔽表面または（コーティングが光学的に透明である場合は）レンズ用の自己ダスティング表面として）使用され得る。この表面コーティングはまた、磁気コーティング（例えば、コンピュータハードドライブの表面のコーティング）として使用され得る。
【０１９１】
このような表面コーティングはまた、触媒コーティングまたは酵素コーティングとして（例えば、表面保護として）使用され得る。特定の実施形態において、このコーティングは、抗酸化剤コーティングである。
【０１９２】
別の実施形態において、このナノ構造は、機能的要素として光学的部分、電気的部分、磁性部分、触媒性部分、酵素部分を有する、開いた枠組みまたは足場を構築するために使用され得る。このような足場は、上記のような光学的部分、電気的部分、磁性部分、触媒性部分、または酵素部分のための支持体として使用され得る。特定の実施形態において、このような足場は、より厚いかまたはより密集した分子のコーティングを形成するために、あるいは所望の光学的特性、電気的特性、磁気的特性、触媒特性、または酵素特性を有する可溶性のミクロンサイズの粒子を支持するために配列される、機能的要素を構成し得る。
【０１９３】
別の実施形態において、ナノ構造は、酵素結合ドメインまたは抗体結合ドメインが結合して高密度の多価プロセシング部位を提供し得る、枠組みまたは足場として働く。この多価プロセシング部位は、結合しなければ不溶性である酵素を結合して可溶化するか、または種々の分子種をトラップし、保護し、そして送達する。
【０１９４】
別の実施形態において、ナノ構造は、アドレス可能な位置を有する高密度コンピュータメモリを構築するために使用され得る。
【０１９５】
別の実施形態において、ナノ構造は、人工ゼオライト（すなわち、水からイオンを吸収し得る天然鉱物（含水ケイ酸塩）を構築するために使用され得、ここで、このナノ構造の設計は、開いた枠組みを通って流れる反応物の高効率のプロセシングを促進する。
【０１９６】
別の実施形態において、このナノ構造は、新素材のための基礎として働き得る開いた枠組みまたは足場を構築するために使用され得る。例えば、この枠組みは、特性（例えば、強度、密度、確定粒子充填および／または種々の環境中での安定性）の独特の調和性を保有し得る。
【０１９７】
特定の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法はまた、コンピュータアーキテクチャ（例えば、量子ドットの空間的に組織化されたアレイからなる量子セルラーオートマトン（ＱＣＡ））を構築するために使用され得る。ＱＣＡ技術において、論理状態は、電圧レベルによってではなく、空間的に配置された量子ドットからなるＱＣＡセルに含まれる個々の電子の位置によって符号化される。段階的アセンブリは、バイナリー情報の格納のために必要な幾何学的配置に従って、量子ドット粒子を空間的に組織化する順序で実施され得る。量子ドットセルラーオートマトンのためのＱＣＡセルの空間的配置および構築のための段階的アセンブリを使用して作製され得る、論理デバイスの例としては、ＱＣＡワイヤ、ＱＣＡインバータ、多数決ゲートおよび全加算器（Ａｍｌａｎｉら、１９９９、Ｄｉｇｉｔａｌ  ｌｏｇｉｃ  ｇａｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ｑｕａｎｔｕｍ−ｄｏｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｍａｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４１２）；２８９−９１；ＣｏｗｂｕｒｎおよびＷｅｌｌａｎｄ，２０００、Ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｍａｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７（５４５７）：１４６６−６８；Ｏｒｌｏｖら、１９９７、Ｒｅａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｕｍ−Ｄｏｔ  Ａｕｔｏｍａｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９２８−３２）が挙げられる。
【０１９８】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、ここでさらに記載される。
【実施例】
【０１９９】
（実施例１：段階的アセンブリのためのプロトコル）
段階的アセンブリの以下の工程は、図８に示される。得られるナノ構造は、図８の工程１１に示される。
【０２００】
【表５】
2005518456.tif 000044
（実施例２：高分子ナノ構造の作製）
高分子アセンブリを構築するために、２つのアセンブリられたナノ構造中間体が、本発明の段階的アセンブリ法を使用して、互いに連結され得る。この実施例は、２つのナノ構造中間体からの高分子ナノ構造の作製を記載する。
【０２０１】
図９は、図８に示される段階的アセンブリプロトコルから作製された、２つのナノ構造中間体の段階的アセンブリを示す。ナノ構造中間体１は、図８において、工程１１として示される。ナノ構造中間体２は、図８において、工程８として示される。以下のプロトコルは、図９に示されるような、相補的な連結対の会合による、２つのナノ構造中間体の付加を記載する。得られる高分子ナノ構造は、図９の工程５に示される。
【０２０２】
【表６】
2005518456.tif 000045
（実施例３：光散乱による重合の分析）
高分子モノマー（例えば、この実施例において使用されるダイアボディ）の広範な重合は、光散乱によって分析され得る。光散乱光度計（例えば、ＤＡＷＮ−ＤＳＰ光度計（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ））からの光散乱測定は、重量平均分子量の決定、粒子のサイズ、形状および粒子−粒子対の相関の決定のための情報を提供する。
【０２０３】
（実施例４：スクロース勾配沈降による分子量決定（重合度））
異なる長さの結合したダイアボディ単位は、ゾーン超遠心分離において、スクロース勾配中で異なる速度で沈降する。次いで、重合度と、スヴェードベリ単位での沈降との間の量的関係が、計算される。この方法は、一般的には自己アセンブリの効率、および新たなダイアボディ単位の付加の各工程における、段階的アセンブリのプロセスを特徴付けるために有用である。
【０２０４】
（実施例５：電子顕微鏡検査による棒の形態および長さ）
スクロース勾配沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後に、棒を含む部分的に精製した画分が出現する。これらの形態を決定するために、適切な画分のサンプルをＥＭ格子に配置し、そして染色または影付けをして、電子顕微鏡検査を使用して、大きい構造を探す。
【０２０５】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって、範囲を限定されない。実際に、本発明の種々の改変が、本明細書中に記載されたものに加えて、上記説明から、当業者に明らかになる。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０２０６】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、その全体が全ての目的で参考として援用されることが具体的にかつ個々に示されると同程度まで、その全体が、全ての目的で本明細書中に参考として援用される。
【０２０７】
任意の刊行物の引用は、出願日より前のその開示についてであり、そして本発明は、先行技術の発明によって、このような刊行物より前日である権利がないという承認として、解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】ＰＮＡ（ペプチド核酸、左）構造とＤＮＡ（右）構造との比較。ＰＮＡは、負に荷電した糖−リン酸骨格の代わりに、中性のペプチドまたはペプチド様の骨格を有することに留意のこと。
【図２】図２（Ａ−Ｂ）。２つのＰＮＡ／オリゴペプチド単位が二量体化して、単一のアセンブリ単位を形成し得る。アセンブリ単位についての２つの可能な構成が、この図において示される（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。ＰＮＡ部分は、連結要素ＡおよびＢ’を提供するが、オリゴペプチド部分は、そのいずれかの末端においてジスルフィド結合によって安定化された、２つのコイルドコイル構造的要素（Ｓ）を形成する。例えば、タンパク質セグメントから構成される１つ以上の機能的要素（Ｆ）もまた、このアセンブリ単位へと組み込まれ得る。特定の実施形態において、このアセンブリ単位は、機能的要素（Ｆ）を含むランダムにコイル化したペプチドを、二量体の内部部分もしくは中央部分（図１９Ａ）または連結要素を含む末端と対向するＰＮＡ分子の末端（図１９Ｂ）において、有し得る。これらの図の各々において、ＰＮＡ／オリゴペプチド単位のＮ末端は、図の左側に向き、そしてそのＣ末端は、右側に向いている。
【図３】図１９Ａに示される段階的アセンブリサブユニットを形成する上側の合成タンパク質単量体の要素の順序を示す線画。対応する下側単位中の要素の順序は、ＰＮＡ要素がＣ末端にあること以外、同一である。これは、２つの単位を整列させるロイシンジッパーのパラレル配置を反映する。機能性配列は、機能的要素がアセンブリサブユニットに付加され得る領域をコードする。グリシンは、各要素を分離して、要素間の立体干渉を減少させている。線の下の数字は、各要素の代表的残基長を示す。
【図４】ＲＯＰタンパク質の４ヘリックス束の図。
【図５】アセンブリ単位の段階的アセンブリ。実際には、段階的アセンブリの各段階は、大規模にパラレルな様式で実行される。工程１において、開始単位は、固体基板上に固定化される。本明細書中に例示される本発明の実施形態において、この開始単位は、単一の連結要素を有する。工程２において、第二のアセンブリ単位が付加される。この第二の単位は、２つの非相補的連結要素を有し、その結果、これらの単位は、溶液中で自己会合しない。第二のアセンブリ単位上の連結要素の１つは、開始単位上の連結要素と相補的である。未結合のアセンブリ単位は、各工程の間に洗浄して除去される（示さず）。インキュベーション後、第二のアセンブリ単位は、開始単位に結合し、２つのアセンブリ単位から作製されたナノ構造中間体の形成を生じる。工程３において、第三のアセンブリ単位が付加される。この単位は、２つの非相補的連結要素を有し、このうち１つは、ナノ構造中間体上の非対合連結要素に対してのみ、相補的である。この単位はまた、機能的単位（「Ｆ３」）を有する。機能的要素「Ｆ４」を有する第四のアセンブリ単位および機能的要素「Ｆ５」を有する第五のアセンブリ単位が、それぞれ、工程４および５において、工程２および３と正確に類似する様式で付加される。各々の場合において、連結要素の選択は、１つより多い単位が一度に付加されるのを防ぎ、そして予め指定された位置における機能的単位の厳密に制御されたアセンブリを導く。
【図６】サブアセンブリからのナノ構造の生成。ナノ構造は、図２において上記されたような、個々のアセンブリ単位の付加のために使用されるのと類似の工程を使用して、サブアセンブリの連続的付加によって生成され得る。矢印は、成長中のナノ構造へのサブアセンブリの付加を示す。
【図７】本発明の段階的アセンブリ法に従う、ナノ構造へのタンパク質単位および無機元素の付加を示す図。工程１において、開始単位は、固体基板に結合される。工程２において、アセンブリ単位は、開始単位に特異的に結合される。工程３において、さらなるアセンブリ単位が、アセンブリを受けているナノ構造に結合される。このアセンブリ単位は、特定の無機元素に対して特異的な操作された結合部位を含む。工程４において、無機元素（網がけした丸として示される）が、この構造に付加され、そして操作された結合部位によって結合される。工程５は、第二の型の無機元素に対して特異的なように操作された結合部位を有する別のアセンブリ単位を付加し、そして第二の無機元素（網がけした菱形として示される）が、工程６において付加される。
【図８】二次元ナノ構造を作製するために、４つの二重特異的アセンブリ単位および１つの四重特異的アセンブリ単位を利用する、段階的アセンブリの１１の工程の図。
【図９Ａ】サブアセンブリとしてナノ構造中間体を利用する段階的アセンブリの図。工程１〜３において、ナノ構造中間体が構築され、２つの連結要素がキャップされ、そしてナノ構造中間体が固体基板から放出される。工程５において、工程３からのナノ構造中間体が、インタクトなサブアセンブリとして、アセンブリ中間体（工程４において固体基板に結合して示される）に付加される。
【図９Ｂ】サブアセンブリとしてナノ構造中間体を利用する段階的アセンブリの図。工程１〜３において、ナノ構造中間体が構築され、２つの連結要素がキャップされ、そしてナノ構造中間体が固体基板から放出される。工程５において、工程３からのナノ構造中間体が、インタクトなサブアセンブリとして、アセンブリ中間体（工程４において固体基板に結合して示される）に付加される。
【図１】
2005518456.tif 000046
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2005518456.tif 000048
【図３】
2005518456.tif 000049
【図４】
2005518456.tif 000050
【図５】
2005518456.tif 000051
【図６】
2005518456.tif 000052
【図７】
2005518456.tif 000053
【図８】
2005518456.tif 000054
【図９Ａ】
2005518456.tif 000055
【図９Ｂ】
2005518456.tif 000056
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月24日(2005.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005518456000001.app
【国際調査報告】
2005518456.tif 000057
2005518456.tif 000058