(57)【要約】本発明は、例えば本明細書中でＢ型肝炎により例示される病原体に対するワクチンが、脂質粒子を封入免疫刺激オリゴヌクレオチドと混合すること(ＬＮＡ)により、Ｔｈ-１型液性及び細胞性免疫応答を亢進するように剤形されうるという発見に基づく。ＬＮＡは、さらに病原体由来の抗原と会合される。ワクチンは、同一抗原又は病原体由来の異なる抗原からの２以上の異なるエピトープを使用しうる。そうしたワクチンは、抗原が脂質核酸粒子に結合され、かつ該核酸粒子がホスホロチオネート(ＰＳ)骨格を有するとき、Ｔｈ-１型液性応答を亢進する点でとくに有効である。亢進された液性応答は、例えばワクチン化の１時間の内に観測されるＩＦＮ-γの強い初期ピークにより、その後の、数日後に観測される、アイソタイプ転換と相関するＩＦＮ-γ生産２回目の強いピークにより示される。
2005525414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１の微生物抗原と共に脂質-核酸(ＬＮＡ)製剤を含む病原体ワクチンであって、ここで当該少なくとも１の微生物抗原が、上記ＬＮＡ製剤と混合されるか又は会合し、ここで当該ＬＮＡ製剤が、以下の：
ａ)  少なくとも１のカチオン性脂質を含む脂質成分；及び
ｂ)  少なくとも１のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分
を含み、ここで上記ワクチンが、上記少なくとも１の微生物抗原に対してＴｈ-１偏向免疫応答をin vivoで刺激することができる、前記ワクチン。
【請求項２】
前記少なくとも１の微生物抗原が、単一のエピトープを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記少なくとも１の微生物抗原が、ＨｂｓＡｇを含む、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記少なくとも１の微生物抗原が、同一抗原由来の複数のエピトープを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記少なくとも１の微生物抗原が、異なる抗原由来の複数のエピトープを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記少なくとも１の微生物抗原が、前記ＬＮＡ製剤と会合される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項７】
前記少なくとも１の微生物抗原が、前記ＬＮＡ製剤と混合される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項８】
前記少なくとも１のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項９】
前記少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドが、メチル化シトシンを含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、改変されたホスフェート骨格を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン。  
【請求項１１】
前記改変されたホスフェート骨格が、ホスホロチオエートである、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
複数の微生物抗原と共に脂質-核酸(ＬＮＡ)製剤を含むポリトープ病原体ワクチンであって、ここで、当該複数の微生物抗原が、上記ＬＮＡ製剤と会合し、ここで当該製剤が、以下の：
ａ)  少なくとも１のカチオン性脂質を含む脂質成分；及び
ｂ)  少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドを有する少なくとも１のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分
を含み、ここで、上記ワクチンが、当該複数の抗原を、上記ＣｐＧジヌクレオチドによるアジュバント免疫刺激と共に抗原提示細胞に同時にデリバリーして、Ｔｈ-１偏向免疫応答を誘導することができる、前記ワクチン。
【請求項１３】
前記少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドが、メチル化シトシンを含む、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、改変されたホスフェート骨格を含む、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記改変されたホスフェート骨格が、ホスホロチオエートである、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１６】
微生物抗原に対する亢進された宿主免疫応答を刺激する方法であって、少なくとも１の微生物抗原と共に脂質-核酸(ＬＮＡ)製剤を含む病原体ワクチンを、当該宿主に投与することを含み、ここで上記記少なくとも微生物抗原が、上記ＬＮＡ製剤と混合されるか又は会合し、当該ＬＮＡ製剤が以下の：
ａ)  少なくとも１のカチオン性脂質を含む脂質成分；及び
ｂ)  少なくとも１のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分；
を含み、ここで、上記ワクチンが、上記少なくとも１の微生物抗原に対する、Ｔｈ-１偏向免疫応答をin vivoで刺激することができる、前記方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１の微生物抗原が、単一のエピトープを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１の微生物が、ＨｂｓＡｇを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１の微生物抗原が、同一抗原由来の複数のエピトープを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１の微生物抗原が、異なる抗原由来の複数のエピトープを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１の微生物抗原が、前記ＬＮＡ製剤と会合される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。  
【請求項２２】
前記少なくとも１の微生物抗原が、前記ＬＮＡ製剤と混合される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドが、メチル化シトシンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドが、改変されたホスフェート骨格を含む、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
抗原提示細胞に抗原性及びアジュバント免疫刺激を同時に運搬する方法であって、標的抗原と会合した脂質-核酸(ＬＮＡ)製剤を投与することを含み、ここで上記ＬＮＡは以下の：
ａ)少なくとも１のカチオン性脂質を含む脂質成分；及び
ｂ)少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドを有する少なくとも１のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分；
を含み、ここで上記方法が亢進されたＴｈ-１偏向免疫応答をもたらす、前記方法
【請求項２７】
in vivoにおいて、抗原刺激に対する宿主免疫応答の液性成分を亢進する方法であって、改変されたホスフェート骨格を有する封入オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激組成物を上記宿主に投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
前記免疫刺激性組成物が、少なくとも１の標的抗原と会合される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記微生物抗原が、ＬＮＡの表面に対する化学結合、疎水的結合、又はイオン性結合の少なくとも１により、当該ＬＮＡと会合される、請求項２７に記載の方法
【請求項３０】
前記宿主に前記免疫刺激性組成物を投与することが、投与の２４時間のうちにin vivoにおけるＩＦＮ-γの第一ピーク量を誘導し、そして投与後の約２日〜７日の間に、in vivoにおいてＩＦＮ-γのより大きい第二ピーク量を誘導する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
in vivoにおいて、抗原刺激に対する宿主免疫応答の液性成分の成熟を改良する方法であって、改変されたホスフェート骨格を有する封入オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物を、上記宿主に投与することを含む、前記方法。
【請求項３２】
哺乳動物においてin vivoで、抗原刺激に応答する、抗原特異的抗体アイソタイプ転換を増大させる方法であって、当該哺乳動物に対して、改変されたホスフェート骨格を有する封入オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３３】
抗原刺激に応答して宿主で増大したＴｈ-１型サイトカイン分泌を誘導する方法であって、改変されたホスフェート骨格を有する封入オリゴヌクレオチドを含む免疫刺激組成物を、上記哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記サイトカインが、ＩＦＮ-γを含み、そして前記増大した分泌が、投与の２４時間内にin vivoにおけるＩＦＮ-γの第一ピーク量を誘導し、かつ投与後約２日〜７日の間で、in vivoにおけるより大きい第二ピーク量を誘導することにより特徴付けられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記改変されたホスフェート骨格が、ホスホロチオエートである、請求項２６〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
Ｂ型肝炎ウイルスに対する宿主免疫応答を刺激する改良されたワクチンであって、当該ワクチンが、少なくとも１のＢ型肝炎抗原と共に脂質-核酸(ＬＮＡ)製剤を含み、ここで、当該少なくとも１のＢ型肝炎抗原が上記ＬＮＡ製剤と混合され又は会合され、ここで当該ＬＮＡ製剤が以下の：
ａ)少なくとも１のカチオン性脂質を含む脂質成分；及び
ｂ)少なくとも１のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分；
を含み、ここで前記ワクチンは、in vivoにおいて増大したＴｈ-１型抗体タイターを誘導する点で効果的である、前記ワクチン。
【請求項３７】
前記少なくとも１のＢ型肝炎抗原が、Ｂ型肝炎表面抗原(ＨｂｓＡｇ)の少なくとも１のエピトープを含む、請求項３５に記載のワクチン。
【請求項３８】
前記Ｂ型肝炎表面抗原が、組み換えにより作製される、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]  本発明は、病原体に対するワクチンの分野に一般的に関し、より特異的に、Ｔｈ-１型液性免疫応答の刺激を高める脂質核酸粒子と会合される病原体由来の抗原エピトープを含むワクチン製剤に関する。
【０００２】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２００２年５月１０日に出願された米国仮特許出願第60/379,343号に対し、及び２００３年３月１２日に出願された米国仮特許出願第60/454,298号に対し、及び２００２年１１月７日に出願された米国特許第10/290,545号に対する優先権を主張する。該開示は、特に本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
[002]   免疫系は細胞及び組成物の非常に複雑な組み合わせであり、幅広い病原体から哺乳動物宿主を保護し、一方、有害な異常に対し体を監視する。免疫系の１つの部門は、免疫系機能を行う細胞を含み、(ａ)骨髄由来Ｂリンパ球、胸腺由来Ｔリンパ球、及びナチュラル・キラー(ＮＫ)細胞などのリンパ球、並びに(ｂ)単球及びマクロファージの両方を含む単核貪食細胞を含む。リンパ球は、その特異的に抗原決定因子を特異的に認識及び区別する能力のため、特異的免疫応答に最初に関わる。一方、単核貪食細胞は、貪食を介した外来微生物の一般的な除去、並びに微生物そのものにより誘導されるか又は抗原刺激Ｔリンパ球に反応して誘導されるサイトカインの生産及び分泌に関わる。リンパ球細胞及び単核貪食細胞の機能は、高度に相互連結されていてかつ適切な免疫系機能に必須である。
【０００４】
[003]  リンパ球細胞のある重要なサブセットは、Ｔリンパ球であり、その命名は、Ｔリンパ球が胸腺により作られるという事実から由来する。Ｔリンパ球は、細胞障害性を持ちうる細胞の複合群であり、細胞死誘導の多くのメカニズムを持ち、又は他の細胞を活性化するように機能する様々なサイトカインの分泌により活性化する。細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬｓ)は、特定の腫瘍組織適合複合体(ＭＨＣ)抗原に制限されることにより作用し、ＭＨＣの溝におけるペプチドに関わる特定のＭＨＣ複合体への特定の親和性を有する細胞表面Ｔ細胞受容体を発現する。ＭＨＣが外来であるか、又は溝中のペプチドが宿主にとって外来である場合、ＣＴＬｓはそうした細胞を攻撃し、殺す。しかしながら重要なことに、ＣＴＬｓは、胸腺発達の間に選別されて、溝内におけるペプチドが宿主にとって内在性である細胞に対して通常作用しない。
【０００５】
[004]  Ｂリンパ球及びＴリンパ球の組み合わせは、液性及び細胞性免疫応答の根底となる効力を確立し、該液性及び細胞性免疫は一緒になって、それぞれ病原体及びガン細胞に対する保護的ワクチンの創作の基礎を形成する。液性及び細胞性免疫応答は、抗原及びその結果の様々なサイトカインの分泌からの刺激に応答する細胞型の活性化により、各々進行する。未処置のＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に対する抗原ペプチドの提示は、細胞が、ヘルパー細胞の２つの異なるサブセット(Ｔｈ-１及びＴｈ-２)へ分化することをもたらす。Ｔｈ-１及びＴｈ-２は、その機能及びサイトカイン発現プロファイルにより区別されうる。Mosman et al., Annu. Rev. Immunol., 7: 145-173 (1989); Paul et al., Cell, 76: 241-251 (1994); O'Garra, Immunity, 8: 275-283 (1998).
【０００６】
[005]  ＣＤ４＋Ｔｈ細胞により分泌されるサイトカインの特定のパターンは、主に細胞性、つまり１型応答(ＩＦＮ-γ、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、及びＴＮＦ-α）、又は主に液性、つまり２型応答（ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、及びＩＬ-１３）を操作する。Glimcher and Murphy, Genes Dev. , 14: 1693-1711 (2000); Abbas et al., Nature, 383: 787-793 (1996). 該Ｔｈ-１サブセットは、ＣＴＬ及びＮＫ細胞の活性化を介した細胞媒介性免疫、並びに免疫グロブリン・クラスをＩｇＭから、人ではＩｇＧ及びＩｇＡ、マウスではＩｇＧ２ａに変換することにより特徴付けられる液性免疫を促進する。Ｔｈ-１応答は、遅発性過敏症及び自己免疫疾患に関連しうる。Ｔｈ-２サブセットは、液性免疫を誘導し、そしてマウスではＩｇＧ１、かつヒトではＩｇＥを導入する。Ｔｈ-１応答に関連する抗体のアイソタイプは、一般的に良好な中和及びオプソニン化能力を有し、一方Ｔｈ-２応答に関連する抗体のアイソタイプは、一般的にアレルギー反応に関連する。
【０００７】
[006]
ワクチンは、液性及び細胞性免疫応答を刺激し、そしてＢ細胞の産生を刺激する抗原及びアジュバントを導入することにより、病原体に対する保護免疫を提供するために剤形された。記憶Ｂ細胞は、分化したＢ細胞の一つの形態であり、液性免疫応答の構成成分として増殖する。記憶Ｂ細胞は、未活性化状態で留まり、記憶Ｂ細胞は、初期液性応答に必要とされる複数のサイトカインの急激な初期増殖を必要としないで、同一抗原(同族抗原)への結合に応答して即座に増殖する。記憶Ｂ細胞は、その同族抗原に結合すると、即座に抗体分泌細胞へと分化する。一方、記憶Ｔ細胞は、細胞性応答の構成成分として生産される。記憶Ｔ細胞及び記憶Ｂ細胞がヘルパーＴ細胞の抗原特異的活性化及び成熟の子孫であるという点では、記憶Ｔ細胞は、記憶Ｂ細胞と類似する。記憶Ｔ細胞は、記憶Ｂ細胞の抗体分泌細胞への分化を高める同族抗原に晒された際、ＩＦＮ-γを分泌する。強力なＴｈ-１型応答は、良好なワクチンの中枢である。
【０００８】
[007]  ワクチン製剤のゴールは、同族抗原を有する病原体による新たな暴露に対して即座に反応するために十分な数の記憶Ｔ細胞及びＢ細胞を導入することを目的として、十分強い液性及び細胞性免疫応答を作り出すことができる抗原及びアジュバントの組み合わせを提供することである。病原体に対するワクチンを製造する４つの基本的な戦略が存在する。
【０００９】
[008]  第一の戦略は、弱毒化及び／又は不活性化された細菌又はウイルス全体を使用する。これらは、幾つかの変性条件で処理して、病原体侵入を無効又は不十分にする。該戦略に基いたいくつかのワクチンは、とても有効であり、例えば、ポリオ、はしか黄熱インフルエンザ、狂犬病、及び日本脳炎ワクチンが例示される。他方、この戦略に基いたワクチンは、限定された保護、短い有効期間、毒性副作用、又は不十分な弱毒化若しくは不活性化を含む重大な問題を持ち、病原性感染に対する復帰が起こりうる。
【００１０】
[009]
第二の戦略は、精製された抗原を使うことである。該抗原は、典型的には、病原体の細胞培養又は病原体を含む組織サンプルから精製される天然抗原である。この戦略に基くワクチンの例は、ジフテリア、破傷風、肺炎球菌、及びヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)及びコレラ由来の抗原、並びにＢ型肝炎及びインフルエンザ・ウイルスのサブユニットを含む。抗原系を精製することの一つの欠点は、病原体の培養液から抗原を持ってくる必要性であり、これは他のウイルス病原体が精製物を汚染する危険性を伴う。別の欠点は、ある場合において、これらの型のワクチンが、記憶細胞の発達を刺激する際に不十分であるということである。
【００１１】
[0010]  ３番目の戦略は、部分的な抗原を、組換え操作された遺伝子由来の抗原エピトープを発現する遺伝子組換え操作生物から生産することである。典型的な抗原エピトープは、長さにして約８〜２０のアミノ酸の小さいポリペプチドである。この戦略に基く典型的なワクチンは、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペス・ウイルス、及び口蹄疫ウイルス(動物ワクチン)の種々の構成成分を含む。しかしながら、典型的には、小さい組換エピトープワクチンは、単独で免疫反応を刺激する十分な免疫原性ではなく、そしてイー・コリ(E. coli)エンドトキシンなどの免疫原性の高いタンパク質配列に架橋するか又は遺伝子上で結合することをしばしば必要とする。それ以上に、全長組換え発現タンパク質であっても、単独で、付加の刺激なしに関心の病原体に対する保護応答を提供するために十分な免疫原性ではないかもしれない。
【００１２】
[0011]  ４番目の戦略は、生きたウイルス運搬ベクターを使用して、対象の宿主細胞において病原体抗原を発現及び／又は分泌させる。これらの戦略は、ウイルスベクターを、非病原性かつ非毒性になるように遺伝子操作することに頼る。この目的のために使用されるウイルス運搬ベクターの例は、ワクチン・ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ライノウイルス、並びに、ヒトに感染するウイルス(例えば、ＨＩＶ)単独で又は他の種に感染するウイルス(例えばサル又はネコ・ウイルス)由来の配列を組み合わせて得られたの組換えウイルス・ゲノムを有する攻撃性をなくしたレトロウイルスの種々の型を含む。遺伝子治療戦略は、抗原提示細胞、Ｔ細胞などの特定の細胞型に対し、ウイルスベクターを標的化することに頼る。これらの戦略の全ては、標的細胞において発現し、そしてときには標的細胞から分泌するように、選択された抗原を遺伝子操作することを含む。しかし、残念ながら、生ウイルス・ワクチン・ベクターは、サイレンシングされているガン遺伝子を活性化する可能性、ウイルスを病原体形態に突然変異させる可能性、及び重篤又は致命的な結果を引き起こす過度に刺激されかつ制御できない免疫応答を引き起こす可能性を含む多くの危険性を有する。
【００１３】
[0012]  それゆえ、病原体に対する亢進されＴｈ-１偏向免疫応答を誘発することができる代わりのワクチン形成を開発する必要性が当該技術分野に存在する。種々の異なる病原体からの抗原に対する改良された液性応答を誘発することができるワクチンの開発の特別な必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１４】
発明の要約
[0013]  前述の必要性及び目的に一致して、本発明は、病原体に対する改良されたワクチン、並びに微生物抗原に対する免疫応答、好ましくは液性免疫応答を刺激する際のその使用方法を提供する。本明細書中に記述されるワクチン及び方法は、関心の抗原を有する脂質-核酸(ＬＮＡ)製剤を使用して、免疫刺激核酸の混合された運搬を介し、１以上の標的抗原の１以上のエピトープに応答する亢進されＴｈ-１偏向液性免疫応答を提供する。本発明は、抗原性刺激に対する免疫応答の液性構成成分を高め、液性応答の改良された成熟、並びにヒトにおけるＩｇＧ及びＩｇＡアイソタイプへ転換する抗体アイソタイプの増加を含む。
【００１５】
[0014]  ある態様において、本発明の病原体ワクチンは、免疫刺激性組成物を構成し、脂質、少なくとも１のオリゴヌクレオチド、及び好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド(ＯＤＮ)の核酸成分を有する。ここで、核酸成分は、関心の微生物抗原由来の１以上のエピトープと組み合わせて、脂質成分により封入される。そうした抗原のエピトープは、脂質-核酸製剤と混合されるか又は会合され、そしてより好ましくは、該製剤と会合される(例えばリポローム粒子と結合されるか又はリポソーム内に封入される)。特に好ましくは、１以上の微生物由来の複数の抗原性エピトープを含むポリトープワクチンである。
【００１６】
[0015]  別の態様において、本発明は、哺乳動物において、微生物抗原に対する亢進されたＴｈ-１偏向免疫応答を刺激する方法を提供する。該方法は、哺乳動物に対し、ＬＮＡ製剤を前記抗原由来の少なくとも１のエピトープと組み合わせて含む免疫刺激性組成物を投与することを含み、ここで、該ＬＮＡ製剤は、ａ)少なくとも１の脂質を含む脂質成分；及びｂ)少なくとも１のオリゴヌクレオチドを含む核酸成分；を含む。特に好ましい態様において、該ＬＮＡ製剤は、少なくとも１のエピトープと会合する。最も好ましい態様において、ＬＮＡ製剤は、１以上の関心の微生物抗原由来である複数のエピトープと会合する。
【００１７】
[0016]  本発明において有利な使用を見出す微生物抗原は、ウイルス、細菌、寄生虫、及び真菌類などの感染性微生物由来でありうるし、微生物及び天然単離物質、その断片及び誘導体、並びに合成及び組換え分子を含みうる。好ましい態様において、病原菌は、Ｂ型肝炎ウイルスを含む。さらに好ましい態様において、微生物抗原は、Ｂ型肝炎表面抗原(ＨＢｓＡｇ)を含む。代わりの特定の態様は、本明細書中に記述される。
【００１８】
[0017]  ある態様において、ＬＮＡ製剤の核酸成分は、少なくとも１のオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドはオリゴデオキシヌクレオチド(ＯＤＮ)である。好ましくは、該ＯＤＮは、少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドを含む。特定の好ましい態様において、核酸配列は、メチル化シトシンを有するＣｐＧジヌクレオチドを含む。特定の態様において、該核酸配列は、配列５’ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ  ３’(ＯＤＮ１ｍ)を含む。代わりの態様において、該核酸配列は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、ここでＣｐＧジヌクレオチドにおける少なくとも１のシトシンはメチル化される。さらなる態様において、配列中に存在するＣｐＧジヌクレオチドにおける各々のシトシンは、メチル化される。別の特定の態様において、核酸配列は、配列５’ＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ  ３’（ＯＤＮ２ｍ）を含む。特に好ましい態様において、ＯＤＮは、ＯＤＮ＃１、ＯＤＮ＃２、ＯＤＮ＃３、ＯＤＮ＃４、ＯＤＮ＃５、ＯＤＮ＃６、ＯＤＮ＃７、ＯＤＮ＃８、及びＯＤＮ＃９からなるＯＤＮ群から選ばれる。
【００１９】
[0018]  ある態様において、本発明から得られる亢進されたＴｈ-１偏向免疫応答は、免疫刺激組成物の投与後２４時間以内に、in vivoにおけるＩＦＮ-γの第一ピーク量を誘導することにより、並びに、免疫刺激組成物投与後２日と７日の間で、ＩＦＮ-γのより大きい第二ピーク量を誘導することにより特徴付けられる。好ましくは、改変されたホスフェート骨格を含むＬＮＡ製剤の使用は、ホスホジエステル骨格を含むＬＮＡ製剤の投与時に獲得される量の少なくとも２倍の量の第二ピークを提供する。
【００２０】
[0019]  別の態様において、本発明から得られる亢進されたＴｈ-１偏向免疫応答は、慣用のアジュバント又は遊離ＣｐＧ・ＯＤＮに比較して、in vivoにおけるＴｈ-１型抗原特異的抗体タイターの少なくとも３倍の増加によって特徴付けられる。より好ましくは、少なくとも４倍又は５倍の増加、さらに好ましくは６〜８倍の増加、最も好ましくは１０倍の増加、より一般的には少なくとも２倍の増加により特徴付けられる。
【００２１】
[0020]  代わりの態様において、関心の抗体に対する宿主免疫応答の液性成分を亢進する方法が提供され、該方法は対象ワクチンを宿主へと投与することを含み、ここで、ＬＮＡ製剤の核酸成分は、改変されたホスフェート骨格を有するオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、改変されたホスフェート骨格は、ホスホロチオエート骨格を含む。さらなる態様において、液性成分は、抗原をＬＮＡ製剤と結びつけることにより亢進されうる。
【００２２】
[0021]  ある態様において、液性応答は、免疫刺激組成物の投与の２４時間内にin vivoにおけるＩＦＮ-γの第一ピークの量を導入することにより、及び免疫刺激組成物の投与後約２日から約７日の間において、ＩＦＮ-γのより大きい第二ピークの量を導入することにより特徴付けられる。好ましくは、ホスホロチオエート骨格を含むＬＮＡ製剤の使用は、ホスホジエステル骨格を含むＬＮＡ製剤の投与の際獲得される量の少なくとも二倍である第二ピークを提供する。
【００２３】
[0022]  さらに、抗原刺激に応答する宿主液性免疫の成熟を改良する方法が提供され、該方法は、宿主への対象製剤を投与することを含み、ここで、ＬＮＡ製剤の核酸成分は、改変されるホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドを含む。ある態様では、宿主液性応答の改良された成熟は、in vivoにおいて、抗原性刺激に応答して転換する抗体アイソタイプの増加により特徴付けられる。好ましくは、ホスホロチオエート骨格を含むＬＮＡ製剤の使用は、宿主におけるＩｇＭからＩｇＧ及びＩｇＡアイソタイプへの抗原特異的アイソタイプの変換を引き起こす。
【００２４】
[0023]  ある態様において、核酸は、ホスホジエステル骨格から構成される。代わりの及び好ましい態様において、核酸は改変されたホスフェート骨格から構成される。上記で議論されたとくに好ましい態様において、改変されたホスフェート骨格は、ホスホロチオエート骨格であり、該骨格は本明細書中で示されるように、対象ＬＮＡ製剤内に封入されたとき、液性刺激を改良することができる。
【００２５】
[0024]  ある態様において、ＬＮＡ製剤の脂質成分は、カチオン性脂質を含む。さらなる態様において、カチオン性脂質は、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＤＭＡ、ＤＣ-Ｃｈｏｌ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＯＤＡＰからなるカチオン性脂質の群から選ばれる。更なる態様において、ＬＮＡ製剤の脂質成分は、中性脂質を含む。さらなる態様において、中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、コレステロール・スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、及びセレブロシドからなる中性脂質の群から選ばれる。
【００２６】
[0025]  別の態様において、脂質粒子はさらに、脂質粒子の表面上の立体障害脂質成分をさらに含む。ある態様において、立体障害脂質成分は、ＰＥＧ-ＤＭＧ、ＰＥＧ-ＰＥ、及びＰＥＧセラミドからなる群から選ばれる。ある態様において、ＰＥＧセラミドは、ＰＥＧ‐セラミドＣ‐１４である。別の態様では、ＰＥＧセラミドは、ＰＥＧセラミドＣ-２０である。好ましい態様において、ＬＮＡ製剤の脂質成分は、ＤＳＰＣ、ＤＯＤＭＡ、Ｃｈｏｌ、及びＰＥＧ‐ＤＭＧを含み、そしてＤＳＰＣ対ＤＯＤＭＡ対Ｃｈｏｌ対ＰＥＧ‐ＤＭＧの比率は、約２０：２５：４５：１０である。
【００２７】
[0026]  ある態様において、本発明の組成物及び方法のＬＮＡ製剤の核酸成分に対する脂質成分の割合は、約０.０１〜０.２５ｗｔ/ｗｔである。別の態様では、本発明の組成物及び方法におけるＬＮＡ製剤の脂質成分は、前記オリゴヌクレオチドを封入する脂質膜を含む。
【００２８】
[0027]  様々な態様において、脂質-核酸製剤は、医薬として許容される担体、緩衝液、又は希釈液をさらに含む。
【００２９】
[0028]  ある態様において、病原体感染を被る宿主の治療方法が提供される。該方法は、対象ＬＮＡ製剤を、前記病原体由来の少なくとも１の微生物抗原と組み合わせて、前記宿主に投与することを含む。別の態様において、対象組成物及び方法を利用して、標的病原体に対して、宿主を予防的に免疫化する方法が提供される。好ましくは、対象組成物を投与することは、動物の免疫系における１以上の樹上細胞を刺激することができる。ある態様において、微生物抗原は、本明細書中で記述される脂質核酸製剤と組み合わせて、より好ましくはリポソーム粒子と組み合わせて投与される。特定の好ましい態様において、抗原は、リポソーム粒子に封入される。本明細書中に記述されるように、好ましい態様において、ワクチンは、１以上の微生物抗原由来の複数のエピトープを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
発明の簡単な詳細
[0079]  免疫グロブリンを発現及び分泌するＢ細胞の活性化及び増殖によって特徴付けられる、免疫応答の液性成分は、細菌及び寄生虫に対する防御応答原理であり、かつウイルスに対する防御応答の重要な成分である。ＣＴＬ及びＮＫ細胞の活性化及び増殖により特徴付けられる免疫応答の細胞成分は、ガン及び慢性ウイルス病などの内部病原と戦う防御応答原理である。免疫応答の両方の成分が、感染病原体に応答する宿主を助ける際に重要である一方で、液性応答は、侵入病原体を除去しそしてその再発に対して防御する際に、抗体及び記憶Ｂ細胞の特に重要な与えられた役割である。
【００３１】
[0080]  病原体ワクチン及び微生物抗原に対するＴｈ-１に偏向した強力な液性免疫応答を誘発することができるプロトコルは、将来の感染に対する効果的な予防的防御及び罹患中の感染の成功した治療に必要とされる。病原体刺激に対する免疫応答の液性成分を高め、かつ生ずる抗体応答の成熟を改良する能力は、重大な意味を持つ。本明細書中に示されるように、本発明刺激のワクチン組成物は、in vivoにおける微生物に対するＴｈ-１に偏向した強力な免疫応答を刺激し、そして、アイソタイプ変換を有意に増加し、それにより液性応答の成熟を改良することができる。以前の技術分野において記述された病原体ワクチンとは異なって、本明細書中で提供される独特なワクチン製剤は、in vivoにおいて、Ｔｈ-１偏向免疫刺激と組み合わせて、専門ＡＰＣｓに複数抗原決定因子を直接同時に提示することを可能にする。
【００３２】
[0081]  本発明は、少なくとも１の関心の微生物抗原の少なくとも１のエピトープと混合されるか又は該エピトープを会合する脂質-核酸(ＬＮＡ)製剤を提供する。好ましくは、ＬＮＡ製剤は、１以上の微生物抗原由来の複数のエピトープと混合されるか又は該エピトープと会合されて、ポリトープワクチンを形成する。さらにより好ましくは、複数のそうしたエピトープは、ＬＮＡ製剤と会合される。好ましい態様において、核酸は、免疫刺激配列(ＩＳＳ)を含み、そしてより好ましくは少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドを含む。
【００３３】
省略語と定義
[0082]  以下の省略は、本明細書中で使用される：ＲＢＣ、赤血球；ＤＤＡＢ、Ｎ,Ｎ-ジステアリル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニウム・ブロミド；ＤＯＤＡＣ、Ｎ,Ｎ-ジオレイル-Ｎ，Ｎ-ジメチルアンモニウム・クロリド；ＤＯＰＥ、１，２-ｓｎ-ジオレイルホスファチジル・エタノールアミン；ＤＯＳＰＡ、２，３-ジオレイルオキシ-Ｎ-(２(スペルミンカルボキサミド)エチル)-Ｎ，Ｎ-ジメチル-１-プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート((2, 3-dioleyloxy-N- (2 (sperminecarboxamido) ethyl)-N,N-dimethyl-1-propanaminiu m trifluoroacetate);ＤＯＴＡＰ、１,２-ジオレオイロキシ-３-(Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアミノ)プロパン・クロリド；ＤＯＴＭＡ、１，２-ジオレイロキシ-３-(Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアミノ)プロパンクロリド；ＯＳＤＡＣ、Ｎ-オレイル-Ｎ-ステアリル-Ｎ，Ｎ-ジメチルアンモニウム・クロリド；ＲＴ、室温；ＨＥＰＥＳ、４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸；ＦＢＳ、ウシ胎児血清；ＤＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培養液；ＰＥＧ-Ｃｅｒ-Ｃ.ｓｕｂ.１４、１-Ｏ-(２’-(ω-メトキシポリエチレングリコール)スクシノイル)-２-Ｎ-ミリストイル-スフィンゴシン；ＰＥＧ-Ｃｅｒ-Ｃ.Ｓｕｂ.２０、１-Ｏ-(２'-(ω-メトキシポリエチレングリコール)スクシノイル-２-Ｎ-アラキドイル-スフィンゴシン；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；ＥＧＴＡ、エチレンビス(オキシエチレンニトリロ)-四酢酸；ＳＦ-ＤＭＥＭ、血清なしＤＭＥＭ；ＮＰ４０、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、１，２-ジオレオイル３-ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）、パルミトイル・オレイル・ホスファチジル・コリン(ＰＯＰＣ)、及びジステアロイルホスファチジル・コリン(ＤＳＰＣ)。
【００３４】
[0083]  本明細書中で使用される技術用語及び化学用語は、他に定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者により、共通に理解される意味を有する。本明細書中で、当業者に知られる様々な方法論に参照が為される。参照される周知の方法論を示す前述の刊行物及び他の資料は、その全てを示すように本明細書中にその全てを援用される。組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を示す標準参考文献は、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning,: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N. Y. (1989); McPherson, M. J. , Ed. , Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991); Jones, J. , Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford (1992); Austen, B. M. and Westwood,O. M. R. , Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford (1991)を含む。当業者に周知の適切な材料及び/又は方法のいずれかは、本発明を行う際に利用されうる；しかしながら、好ましい材料及び/又は方法が記載される。以下の記載及び例に参照される材料、試薬などは、他に記載されない限り、市販される。当業者は、本明細書の記述に基き、本発明をその完全な程度まで利用することができる。本出願を通して引用される全ての参考文献(論文、交付特許、特許出願公開、及び共係属の特許出願を含む)の内容全ては、これにより明白に本明細書中に援用される。
【００３５】
[0084]  本発明の方法において使用される免疫刺激組成物は、脂質-治療用薬剤(ＬＴＡ)製剤と一般的に呼ばれ、少なくとも１の脂質成分と少なくとも１の治療薬剤を含み、in vivoにおいて治療用薬剤単独より高い免疫刺激性活性を有する。本明細書中で使用される「治療薬剤」又は「治療化合物」又は「薬剤」は、互換性を持って使用されかつ対象に医学における治療の有利な効果を提供する合成、組換え、天然分子のいずれかを指しうる。治療薬剤の例は、非限定的に核酸、ペプチド、及び化学物質を含む。
【００３６】
[0085]  本明細書中に記述される好ましい態様において、治療薬剤は、少なくとも１の核酸配列、より好ましくは少なくとも１のオリゴヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも１のオリゴデオキシヌクレオチド(ＯＤＮ)を含む。好ましい態様において、ＯＤＮは、少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチド・モチーフを含み、該モチーフは、メチル化又は非メチル化状態でありうる。特に好ましい態様において、ＯＤＮは、免疫刺激活性を有し、非メチル化形態における免疫刺激配列(ＩＳＳ)と名づけられるメチル化核酸配列を有する。
【００３７】
[0086]  本明細書中で使用される「対象」又は「宿主」は、オス又はメスの生物であって、免疫系を有する生物を指し、好ましくは動物、より好ましくは脊椎動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはげっ歯類、もっとも好ましくはヒトを指す。対象の更なる例は、非限定的に、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、及びラットを含む。本明細書中で使用される「患者」は、医療状態(例えば、疾患又は失調)を治療する必要のある対象のことを指す。
【００３８】
[0087]  本明細書中で使用される「in vivo」は、生物体を指し、好ましくは動物体内、より好ましくはげっ歯類体内、そして最も好ましくはヒト体内を指す。
【００３９】
[0088]  本明細書中で使用される、「免疫刺激」、「免疫刺激活性」、又は「免疫応答を刺激する」、並びに文法上のその同等物は、免疫応答を誘導、増大、亢進、又は調節することを指し、或いはそうでなければ免疫応答に関する有利な効果を提供することを指す。本明細書中に使用されるとき、「免疫応答」は、細胞性又は液性免疫応答の両方を指すが、液性免疫が最も好ましい。与えられた製剤及び核酸配列の免疫刺激活性は、本明細書中に記載されたとおりの適切なin vivoアッセイを使用することにより容易に決定されうる。
【００４０】
[0089]  本明細書中で使用される「標的抗原」は、免疫応答が仕向けられ又は刺激されうる関心の抗原のことを指す。標的抗原に対する免疫応答を刺激するための、本発明の組成物において使用される標的抗原は、合成、天然、又は単離分子或いはそれらの断片であり、そして単一又は複数のエピトープを含みうる。このように、本発明の組成物は、抗原の単一又は複数のエピトープに対する免疫応答を刺激しうる。好ましい態様において、標的抗原は、本発明の脂質粒子と会合される。本発明中で、抗原(又は標的抗原)に関して使用される「会合して」、「会合される」又はその文法的な同等物は、別の成分に結合するか又は別の成分により封入される抗原を指す。脂質粒子或いは本発明のリポソームに関して、抗原は、例えば、抗原は脂質粒子の内腔又は層内に封入されるか；脂質膜内又は部分的に脂質膜内に配置され又は結合されるか、或いは脂質粒子に結合(例えば共有結合的又はイオン結合的に)されうる。抗原は、脂質粒子の内側か又はより好ましくは、抗原は、脂質粒子の外部に結合される。好ましい態様において、抗原は、脂質粒子内に封入される。
【００４１】
[0090]  本発明の組成物及び方法において有用である抗原の例は、非限定的にペプチド又はタンパク質、細胞、細胞抽出液、多糖、多糖抱合体、脂質、糖脂質、糖ペプチド、及び炭水化物を含む。ある態様において、抗原は、ペプチド又はタンパク質抗原の形態である。別の態様において、抗原は、対象内で発現に適する形態及び対象の免疫系に対する提示に適する形態においてペプチド又はタンパク質をコードする核酸である。好ましい態様において、本発明の方法において使用される組成物は、哺乳動物において標的抗原に対する免疫応答を刺激するペプチド又はタンパク質標的抗原を含む。好ましくは、標的抗原は、哺乳動物に感染することができる微生物抗原（標的病原体)であり、例えば、細菌、ウイルス、真菌、酵母、寄生虫、及び哺乳動物種に感染できる他の微生物を含む。
【００４２】
[0091]  本明細書中で使用される「微生物抗原」は、微生物由来の抗原であり、非限定的に感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫、及び感染性真菌を含む。微生物抗原は、未処置の微生物でありうるし、及び天然単離体、断片、又はその誘導体、並びに対応する微生物(そこから天然微生物抗原が由来する)に特異的免疫応答を誘導する天然微生物抗原に同一又は類似の組換え又は合成化合物でありうる。天然微生物抗原に類似である化合物又は抗原は、当業者に周知である。好ましい態様において、化合物が天然微生物抗原に対する免疫応答(液性及び/又は細胞性)を誘導するなら、該化合物は、天然微生物抗原に類似である。天然微生物抗原に類似である化合物又は抗原の非制限的例は、当業者に周知である。化合物の非制限的な例は、多糖抗原のペプチド擬態物である。より特異的な態様は、本明細書中に提供される。
【００４３】
[0092]  「抗原」という用語は、上記の抗原などの周知又は野生型の抗原のペプチド・アナログ又はタンパク質アナログを包含することをさらに意図される。該アナログは、野生型の抗原より可溶性が高く、また安定であり、そして抗原をより免疫学的に活性にする変異又は修飾を含みうる。本発明の組成物及び方法において有用であることは、所望の抗原アミノ酸配列を有するアミノ酸配列ホモログを有するペプチド又はタンパク質であり、ここで該ホモログ抗原は、それぞれの病原体に対する免疫応答を誘導する。
【００４４】
[0093]  本明細書中に使用される「相同性」は、二つのポリマー製分子、例えば２つの核酸分子(例えば、２つのＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子)又は二つのポリペプチドの間のサブユニット配列の相同度を指す。両方の分子におけるサブユニットの位置が、同じ単量体サブユニット、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々における位置がアデニンであるなら、その位置においてそれらは相同である。配列間のホモロジーは、一致数又は相同位置の直接的な相関であり、例えば、二つの化合物配列における位置の半分(例えば長さにして１０個のサブユニット中の５個の位置)が相同であるなら、その二つの配列は５０％の相同性である。もし９０％の位置、例えば、１０中９が、一致又は相同であるなら、２つの配列は９０％のホモロジーを有する。本明細書中で使用される「実質的に相同」という用語は、所望の核酸に対して約５０％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、さらに好ましくは約８０％相同性、及び最も好ましくは約９０％の相同性のＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例として、ＤＮＡ配列５'-ＣＣＧＴＴＡ-３’及び５’-ＧＣＧＴＡＴ-３’は、５０％のホモロジーを有する。本明細書中で使用される「実質的に相同である」という用語は、所望の核酸に対し約５０％の相同性をであるＤＮＡ又はＲＮＡを意味し、より好ましくは、約７０％相同性、さらに好ましくは約８０％の相同性、そして最も好ましくは約９０％の相同性である。所望の抗原をコードする配列に相同である遺伝子は、それらが所望の抗原の生物活性に実質的に相同である生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする場合、本発明に含まれると解されるべきである。この脈絡において、タンパク質及び/又はＤＮＡ配列は、同一視された配列に対するホモロジー又は同一性の割合によって定義され、ホモロジーの割合又は同一性の割合を計算するために使用されるアルゴリズムは、以下の：スミス-ウォーターマン・アルゴリズム(the Smith-Waterman・algorithm(J. F. Collins et al., Comput. Appl. Biosci. , (1988) 4: 67-72; J. F. Collins et al., Molecular Sequence Comparison and Alignment, (M. J. Bishop et al., eds.) In Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, UK (1987) 417)、及び the BLAST and FASTA programs (E. G. Shpaer et al., 1996, Genomics, 38: 179-191)を含む。これらの参考文献は、本明細書中に援用される。
【００４５】
[0094]  本明細書中に記載される抗原のアナログは、保存されたアミノ酸配列における違いにより、又は配列に影響しない修飾により、又はその両方により、天然のタンパク質又はポリペプチドと異なりうる。例えば、タンパク質又はペプチドの一次配列を変化するが、通常その機能を変化させない保存的アミノ酸変化がされうる。修飾(通常一次配列を変化させない)は、in vivo又はin vitroにおいてポリペプチドを化学的に誘導体化、例えばアセチル化、又はカルボキシル化することを含む。抗原として考えられる物として、グリコシル化により修飾されるタンパク質がある。それらは、例えば、合成及びプロセッシング、又は更なるプロセッシング・ステップの間、例えばポリペプチドのグリコシル化に影響する酵素、例えば哺乳動物グリコシル化又は脱グリコシル化酵素にポリペプチドを晒すことによって、ポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することにより作られる。抗原として考えられる物として、リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホスレオニンを有するアミノ酸配列がある。抗原として考えられる物として、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されたポリペプチドがあり、その結果、タンパク質分解に対するその抵抗性を改良しまたは可溶性を最適化した。そうしたポリペプチドのアナログは、天然Ｌ-アミノ酸以外の残基、例えばＤ-アミノ酸、又は非天然合成アミノ酸を含むポリペプチドを含む。
【００４６】
[0095]  本発明の抗原は、本明細書中に掲載される特定の例示の過程のいずれかの産物に制限されない。実質的に、全長ポリペプチドに加えて、本発明において有用である抗原は、免疫的に活性なポリペプチド断片を含む。例えば、抗原は、少なくとも１のエピトープを含む完全な抗原の断片でありうる。本明細書中で使用される「エピトープ」は、抗体の抗原結合部位が結合できる抗原上の抗原決定因子のいずれかを指す。エピトープの決定因子は、通常、分子、例えばアミノ酸又は糖側鎖の化学的活性な表面基からなり、通常特異的な３次元構造特徴を有する。本発明の組成物及び方法の特に好ましい態様は、同一標的抗原由来の複数のエピトープを含む抗原の組み合わせを含むか、又は２以上の異なる標的抗原(つまり、ポリトープ・ワクチン)由来のエピトープを含む。例えば、抗原の組み合わせは、同じ又は異なるタイプ、例えばペプチド-ペプチド抗原、糖タンパク-ペプチド抗原、又は糖脂質-糖脂質抗原でありうる。
【００４７】
[0096]  ポリペプチド又は抗原は、それが標的抗原又は病原体に対して免疫応答を誘導する場合、「免疫的に活性」である。本明細書中で使用される「ワクチン」は、標的抗原に対する特異的免疫応答を刺激する標的抗原を含む組成物を指す。本明細書中で使用される「病原体ワクチン」は、該抗原に対する特異的免疫応答を刺激する少なくとも１の微生物抗原の少なくとも１のエピトープを含む組成物のことを指す。
【００４８】
[0097]  本明細書中で使用される「アジュバント」は、免疫応答の刺激を刺激又は亢進できるいずれの物質のことを指す。いくつかのアジュバントは、免疫系の細胞の活性化を引き起こすことができる。例えば、アジュバントにより、免疫細胞がサイトカインを生産及び誘導することができる。免疫系の細胞の活性化を引き起こすことができるアジュバントの例は、非限定的に、キュー.サポナリア・ツリー(Ｑ.saponaria tree)の樹皮から精製されたサポニン、例えば、ＱＳ２１(ＨＰＬＣ分画での２１番目のピークにおいて溶出する糖脂質;Aquila Biopharmaceuticals,Inc., Worcester, Mass.)；ポリ(ジ(カルボキシルアトフェノキシ)ホスファゼン(ＰＣＰＰポリマー；Virus Research Institute, USA)；リポポリサッカロイドの誘導体、例えばモノホスホリル・リピドＡ(ＭＰＬ；Ribi ImmunoChem Research,Inc., Hamilton, Mont.),ムラミル・ジペプチド(ＭＤＰ；Ribi)、及びスレオニル-ムラミル・ジペプチド(ｔ-ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ)；ＯＭ-１７４(リピドＡに関するグルコサミン・ジサッカロイド；OM Pharma SA, Meyrin,Switzerland);及びレーシュマニア伸張因子(精製されたレーシュマニア・タンパク質；Corixa Corporation, Seattle, Wash.)を含む。伝統的なアジュバントは、当該技術分野に周知であり、例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム塩(「ミョウバン」)を含む。
【００４９】
[0098]  周知のアジュバントと比較したとき、脂質及び核酸の組合せを含む改良されたアジュバントを提供する。該組み合わせは、亢進されたＴＨ-１偏向免疫応答を刺激することに相乗的に作用する。好ましい態様において、本発明のそうした組成物は、核酸成分及び脂質成分を含む。好ましくは、核酸成分は、少なくとも１のオリゴヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１のＯＤＮ、及び最も好ましくは少なくとも１のＣｐＧモチーフを含む少なくとも１のＯＤＮ、ここで該シトシンはメチル化又は非メチル化状態でありうる、を含む。
【００５０】
[0099]  好ましい態様において、本発明の方法において使用される免疫刺激組成物は、治療薬剤を封入する脂質膜を含む脂質成分を含む。本明細書中で使用されるとき、「リポソーム粒子」、「リポソーム」、「脂質小胞」、及び「リポソーム小胞」又は文法的なその同等物は、交換可能な状態で使用され、そして脂質-を含む膜を含む構造、粒子、複合体、又は製剤を指し、水性の内部を閉じこめ又は封入する。好ましい態様において、該リポソームは、治療薬剤、例えば核酸を閉じ込め又は封入する。リポソームは、１以上の脂質膜を有しうる。脂質を含む膜を一つ有するリポソームは、本明細書中で「単層」と呼ばれる。複数の脂質を含む膜を有するリポソームは、「多重膜」と呼ばれる。本明細書中で使用される「脂質二重層」は、２相を有する脂質を含む膜を指す。好ましい態様において、リポソームは多重膜である。
【００５１】
核酸
[00100]  本発明の組成物における使用に適する核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを含む。好ましくは核酸はオリゴヌクレオチドであり、より好ましくはＯＤＮであり、そして最も好ましくはＩＳＳ(「ＩＳＳ・ＯＤＮ」)及び少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドを含むＯＤＮである。
【００５２】
[00101]  本明細書中で使用される「核酸」は、複数のヌクレオチド(つまり、リン酸基及び交換可能な有機塩基に結合する糖(例えばリボース又はデオキシリボース)を含む分子である。ここで該有機塩基は、置換されたピリミジン(例えばシトシン(Ｃ)、チミン(Ｔ)、又はウラシル(Ｕ))又は置換されたプリン(アデニン(Ａ)又はグアニン(Ｇ))である)を指す。核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。好ましくは、核酸は、オリゴリボヌクレオチド及びより好ましくはＯＤＮｓである。核酸はまた、ポリヌクレオシド、つまり、ポリヌクレオチドからホスフェート引いた物、及びポリマーを含む他の有機塩基のいずれかでありうる。本発明の免疫刺激組成物は、核酸成分を含む。本発明の組成物に関して本明細書中で使用される「核酸成分」は、核酸を含む成分を指す。
【００５３】
[00102]  好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、一本鎖であり、及び長さにして５〜５０ヌクレオチド(ｎｔ)の範囲内である。しかしながら、５００〜５０，０００塩基対(ｂｐ)の範囲内の巨大な２本鎖プラスミドＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドのいずれかが使用されうる。
【００５４】
[00103]  本発明の組成物及び方法において有用である核酸は、周知の原料から獲得され又は当該技術分野に周知の方法を使用して単離されうる。該核酸は、組換え又は合成方法により調製されうる。該方法は当該技術分野に周知である。そうした核酸は、脂質粒子中に封入され、そして得られた組成物は、本明細書中に記述される本発明の方法を使用して免疫刺激活性をを試験された。
【００５５】
[00104]  in vivoにおける使用のために、核酸は、分解(例えばエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを介する分解)抵抗性でありうる。ステム・ループなどの２次構造は、分解に対して核酸を安定化できる。或いは、核酸安定化は、ホスフェート骨格改変を介して達成されうる。好ましい安定化核酸は、少なくとも部分的にホスホロチオエート(ＰＳ)改変骨格を有する。ホスホロチオエートは、ホスホルアミデート又はＨ-ホスホネート化学を用いた自動化技術を使用して合成されうる。アリール-及びアルキル-ホスホネートは、米国特許第4,469,863号に記述されるとおりに作られ、そしてアルキルホスホトリエステル(変換された酸素部分は米国特許第5,023,243号及び欧州特許第092,574号において記述されるとおりにアルキル化される)は、市販の試薬を使用する自動固層合成により調製されうる。他のＤＮＡ骨格改変及び置換を作る方法が、記述された(Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544,1990 ; Goodchild, J. , Bioconjugate Chem. 1: 165,1990)。しかしながら、本明細書中に記述されるように、本発明の方法及び組成物は、対象核酸に対しそうした改変を含む必要性を軽減する。
【００５６】
[00105]  こうして、本発明の組成物及び方法において有用なオリゴヌクレオチドは、改変されたホスフェート骨格、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスフォネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及び互いに及び/又はホスホジエステル(ＰＯ)オリゴヌクレオチドに関するそれらの組み合わせを有しうる。さらに、別の改変されたオリゴヌクレオチドは、非イオン性ＤＮＡアナログ、例えばアルキル及びアリール・ホスフェート(化合物中、荷電を有するホスホネート酸素は、アルキル又はアリール基により置き換えられる)、ホスホジエステル、及びアルキルホスホトリエステル(化合物中、荷電を有する酸素部位はアルキル化される)を含む。本明細書中に記されるように、細胞免疫応答が所望される場合、ＰＯ・ＯＤＮが好ましい。一方、液性応答が所望される場合、改変されたＯＤＮ、例えばＰＳ・ＯＤＮは、好ましい。
【００５７】
[00106]  塩基、糖、又は結合モチーフに対する多くの他の化学修飾もまた有用である。塩基はメチル化状態又は非メチル化状態でありうる。好ましい態様では、メチル又はヒドロキシメチル基は、少なくとも１のシトシンの炭素-４位(４-ｍＣ)又は炭素５位(５ｍＣ)に結合される。メチル化シトシンは、核酸配列におけるＣｐＧモチーフ内に好ましくは位置する。代わりに又はさらに、糖部位は、当該技術分野で記載されるようにメチル基で修飾されうる。
【００５８】
[00107]  本発明の組成物及び方法に有用である核酸配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのように、患者/対象ｍＲＮＡに相補的であるか、又はそれらは外来又は非相同(例えば、核酸配列は、患者/対象ゲノムに特異的にハイブリダイズしない)でありうる。核酸配列は、発現されうるし、得られた発現産物は、ＲＮＡ及び/又はタンパク質でありうる。さらに、そうした核酸配列は、適切なプロモーター及び発現エレメントに結合され、そして発現ベクター内に含まれうる。本発明の組成物及び方法に有用な核酸配列は、ＩＳＳ、例えばある回文配列であり、ヘアピン２次構造(Yamamoto S.,et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076を参照のこと)を誘導するか、或いはＣｐＧモチーフ、又は他の周知のＩＳＳの特徴(例えば、マルチＧドメイン、WO 96/11266を参照のこと)でありうる。特に好ましい態様において、核酸配列は、メチル化シトシンを有する少なくとも１のＣｐＧモチーフを含む。
【００５９】
[00108]  本発明の核酸は、当該技術分野に周知である多くの方法、例えば、ｂ-シアノエチル・ホスホルアミデート法 (Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H. , Tet. Let. 22: 1859,1981)；ヌクレオシドＨ-ホスホネート法(Garegg et al., Tet. Let. 27: 4051-4054,1986 ;Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14: 5399-5407,1986, ; Garegg et al., Tet. Let. 27: 4055-4058,1986, Gaffney et al., Tet. Let.29: 2619-2622,1988)のいずれかを使用することにより、新規に合成されうる。これらの化学反応は、市販の様々な自動化オリゴヌクレオチド合成機により行われる。ＣｐＧジヌクレオチドは、プラスミドにおいてラージスケールで製造されうる(Sambrook, T., et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989)を参照のこと。そうしたプラスミドは、発現される他の遺伝子、例えばＤＮＡワクチンの場合において抗原をコードする遺伝子をコードしうる。オリゴヌクレオチドは、周知の技術、例えば制限酵素、エキソヌクレアーゼ、又はエンドヌクレアーゼを用いる技術を用いて、現存の核酸配列(例えば、ゲノム又はｃＤＮＡ)から調製されうる。
【００６０】
[00109]  in vivoにおける投与のために、組成物の成分、例えば脂質成分又は核酸成分を含む本発明の組成物は、標的細胞(例えば、Ｂ-細胞、単球細胞、及びナチュラル・キラー(ＮＫ)細胞)表面に高い親和性の結合をもたらす分子と会合しうる。組成物の成分を含む本発明の組成物は、当該技術分野に周知である技術を用いて所望分子とイオン又は共有結合しうる。様々なカップリング又は架橋材が使用されうる。例えばタンパク質Ａ、カルボジイミド、及びＮ-スクシニミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)。
【００６１】
[00110]  生物における核酸配列の免疫刺激活性は、例えば、単純な実験、例えば当該配列を他の免疫刺激薬剤、例えば他のアジュバント又はＩＳＳと比較することにより、或いは当該配列の免疫刺激活性を検出又は計測することにより、宿主防御メカニズム又は免疫系成分の活性化を検出又は計測することにより、決定されうる。そうしたアッセイは、当該技術分野に周知である。また、当業者は、本明細書中に記述される及び/又は当該技術分野に周知であるルーチン・アッセイを使用して、関心の特定の哺乳動物種に有用である最適なオリゴヌクレオチドの同定の仕方を知っている。
【００６２】
[00111]  本発明の組成物及び方法における使用に適したＯＤＮｓの特定の核酸配列は、米国特許第60/379,343号、米国特許第09/649,527号、国際公報ＷＯ02/069369、国際公報ＷＯ01/15726、米国特許第09/649,527号、国際公報ＷＯ02/069369、WO01/15726、米国特許第6,406,705号、及びRaney et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298: 1185-1192 (2001)において記述される。これらの全ては、本明細書中に援用される。ＯＤＮｓの例示の配列は、非限定的に、表１において示される。本発明の組成物及び方法において使用されるＯＤＮｓは、ホスホジエステル(ＰＯ)骨格又はホスホロチオエート(ＰＳ)骨格を有する。本明細書中に記載されるように、ＰＳ ＯＤＮは、免疫応答の液性成分を亢進するその能力として最も好ましい。別の好ましい態様において、ＯＤＮｓは、ＣｐＧモチーフにおける少なくとも１のメチル化シトシン残基を含む。
【００６３】
【表１】
2005525414.tif 000003
【表２】
2005525414.tif 000004
【表３】
2005525414.tif 000005
【００６４】
脂質及び他の成分
[00112]  脂質製剤及び運搬小胞としてリポソームを調製する方法は、当該技術分野に周知であり、そうした多くの製剤のいずれかは、本明細書中の有利な使用を見つけうる。該使用は、米国特許第6,465, 439号、米国特許第6,379,698号、米国特許第6,365,611号、及び米国特許第6,093,816号に記述される使用を含む。これらの開示は本明細書中に援用される。好ましい脂質製剤は、本明細書中及び例えば米国特許第号特許5,785,992号、米国特許第6,287,591号、米国特許第6,287,591B1号、共係属中の米国特許出願第60/379,343号、及び共係属中の米国特許出願第09/649,527号に記載される脂質粒子製剤であり、これらの文献は全て本明細書中に援用される。
[00113]  ある好ましい態様において、好ましい脂質製剤は、２０：２５：４５：１０ｍｏｌ/ｍｏｌの比率を有するＤＳＰＣ、ＤＯＤＭＡ、Ｃｈｏｌ、及びＰＥＧ-ＤＭＧである。本明細書中で使用されるとき、脂質製剤における各々の脂質のモル量は、脂質が記載される順番と同じ順番で与えられる(例えば、ＤＳＰＣ対ＤＯＤＭＡ対Ｃｈｏｌ対ＰＥＧ-ＤＭＧの比率は、２０ＤＳＰＣ：２５ＤＯＤＭＡ：４５Ｃｈｏｌ：１０ＰＥＧ-ＤＭＧ又は「２０：２５：４５：１０」である)。代わりの態様において、ＤＳＰＣはＰＯＰＣで、ＤＯＤＭＡはＤＯＤＡＰで、及びＰＥＧ-ＤＭＧはＰＥＧＣｅｒ１４又はＰＥＧＣｅｒ２０で置き換えられる。
【００６５】
[00114]  「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルである有機化合物、及び水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることにより特徴付けられる有機化合物の群を指す。それらは通常、少なくとも３のクラスに分けられる。(１)「単純脂質」は、脂肪及び油並びにワックスを含む；(２)「脂質化合物」は、リン脂質及び糖脂質を含む；及び(３)「誘導脂質」は、脂質操作から由来されるステロイド及び化合物などである。多様な脂質は、本発明に関して使用され、それらのいくつかは以下に記述される。
【００６６】
[00115]  「荷電された脂質」という用語は、正電荷又は負電荷を有する脂質種を指すか、或いは正味で中性に荷電されず、かつ脂質が見つかる溶液のｐＨとの関連を一般的に必要とする相性イオンである脂質種を指す。 
【００６７】
[00116]  生理的ｐＨで正荷電された脂質は、非限定的にＮ,Ｎ-ジオレイル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニウム・クロリド(ＤＯＤＡＣ)；Ｎ-(２,３-ジオレイルオキシ)プロピル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ-トリメチルアンモニウム・クロリド(ＤＯＴＭＡ)；Ｎ,Ｎ-ジステアリル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニウム・ブロミド(ＤＤＡＢ)；Ｎ-(２,３-ジオレイルオキシ)プロピル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ-トリメチルアンモニウム・クロリド(ＤＯＴＡＰ)；３ｂ-(Ｎ-(Ｎ',Ｎ'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(ＤＣ-Ｃｈｏｌ)、及びＮ-(１,２-ジミリスチルオキシプロプ-３-イル)-Ｎ,Ｎ-ジメチル-Ｎ-ヒドロキシエチルアンモニウム・ブロミド(ＤＭＲＩＥ)を含む。さらに、多くのカチオン性脂質の市販標品は、本発明に使用されうる。これらは、例えば、リポフェクチン(商標)(ＤＯＴＭＡ及び１,２-ジオレオイル-ｓｎ-３-ホスホエタノールアミン(ＤＯＰＥ)を含むGIBCO/BRL, Grand Island, New York, U. S. Aから市販されるカチオン性リポソーム)；及びリポフェクタミン(商標)(Ｎ-(１-(２,３-ジオレイルオキシ)プロピル)-Ｎ-(２-(スペルミンカルボキサミド)エチル)-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニウム・トリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)及びＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ/ＢＲＬから市販されるカチオン性リポソーム)を含む。
【００６８】
[00117]  幾つかの正荷電の脂質は滴定可能であり、つまり、該脂質は、生理的ｐＨで又はその付近でｐＫａを有し、弱酸性条件下で強くカチオン性であり、生理的ｐＨで弱く(又は非)カチオン性であるという本発明の意味ある結果を有する。そうした正荷電脂質は、非限定的にＮ-(２,３-ジオレイルオキシ)プロピル)-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニウム・クロリド(ＤＯＤＭＡ)、及び１,２-ジオレオイル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン(ＤＯＤＡＰ)を含む。ＤＭＤＭＡはまた、有用な滴定可能なカチオン性脂質である。
【００６９】
[00118]  生理条件ｐＨで負に荷電する脂質は、非限定的に、ホスファチジル・イノシトール、ホスファチジル・セリン、ホスファチジル・グリセロール、ホスファチジン酸、ジホスファチジル・グリセロール、ポリ(エチレン・グリコール)-ホスファチジル・エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジル・グリセロール、ジオレオイルホスファチジル・グリセロール、ジラウリロイルホスファチジル・グリセロール、ジパルミトイルホスファチジル・グリセロール、ジステアリルオイルホスファチジル・グリセロール(distearyloylphosphatidyl・glycerol)、ジミリストイル・リン酸、ジパルミトイル・リン酸、ジミリストイル・ホスファチジル・セリン、ジパルミトイル・ホスファチジル・セリン、脳ホスファチジル・セリンなどを含む。
【００７０】
[00119]  負電荷の脂質のいくつかは、滴定可能であり、つまり、それらは生理条件ｐＨで又はその付近でｐＫａを有し、弱塩基性条件で強くアニオン性であり、生理条件ｐＨで弱い(又は非)アニオン性であるという意味ある結果を有する。そうした負に荷電した脂質は、本明細書中に開示される原理に基いて当業者により同定されうる。
【００７１】
[00120]  「中性脂質」という用語は、生理条件ｐＨで、非荷電か又は中性双極性で存在する多くの脂質種のいずれかを指す。そうした脂質は、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールを含む。
【００７２】
[00121]  本発明において使用されるある好ましい脂質製剤は、ＰＥＧ-脂質又はポリアミド・オリゴマー-脂質(例えばＡＴＴＡ-脂質)などの凝集を防ぐ化合物、及び他の立体障壁又は「ステルス」脂質、界面活性剤、などを含む。そうした脂質は、ポリアミドオリゴマーに関する米国特許第4,320,121号、米国特許第5,820,873号、米国特許第5,885,613, 国際公開WO 98/51278、及びポリアミドオリゴマーに関する米国特許出願第09/218,988号に記述され、これら全ては本明細書中に援用される。これらの脂質及び界面活性剤化合物は、反対の荷電の脂質及び治療薬剤含む製剤の沈殿及び凝集を妨げる。これらの脂質は、in vivoにおける循環寿命を改良するために適用される(Klibanov et al.,(1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237)を参照のこと、又はin vivoにおいて製剤から即座に交換されるように選択されうる(米国特許第5,885,613号を参照のこと。これは、本明細書中に援用される)。
【００７３】
[00122]  本発明の好ましい態様は、交換可能な立体障壁脂質を適用する(米国特許第5,820,873号、米国特許第5,885,613、及び米国特許出願第09/094540号、及び米国特許第6,320,017号において記載されるとおりであり、これら全ては本明細書中に援用される)。立体-障壁脂質、例えばＰＥＧ２０００-ＣｅｒＣ１４及びＡＴＴＡ８-ＣｅｒＣ１４は、対象／患者への投与の際、脂質粒子の外側単層から即座に交換される立体障壁脂質である。そうした脂質各々は、特徴的な割合を有し、その割合で、アシル鎖長、飽和、立体障壁部分の大きさ、膜組成物、及び血清組成物などを含む様々な因子に依存して、粒子から交換される。そうした脂質は、粒子形成の間、凝集を防ぐ点で有用であり、そして投与の際粒子からの強められた解離は、上記出願特許中に記述されるように、プログラムされた融合性及び粒子不安定化活性などの利点を提供する。
【００７４】
[00123]  いくつかの脂質粒子製剤は、ある標的細胞又は標的組織で、リポソームの局所化を促すように設計される標的部分を適用しうる。標的部分は、製剤化の間、又は製剤化の後に、脂質粒子の外側二層と会合される(つまり、直接接合、疎水性相互作用、又はその他による)。該方法は、当該技術分野に周知である。さらに、幾つかの脂質粒子製剤は、膜融合ポリマー、例えばＰＥＡＡ、赤血球凝集素、他のリポ-ペプチド(米国特許第6,417,326,号及び米国特許出願第09/674,191号を参照のこと。これら全ては本明細書中に援用される)、及びin vivoにおいて及び/又は細胞内運搬に有用である別の特徴を適用する。
【００７５】
[00124]  別の好ましい態様において、本発明の脂質粒子脂質成分は、スフィンゴミエリン及びコレステロール(スフィンゴソーム)を含む。好ましい態様において、本発明の組成物及び方法において使用される脂質粒子は、スフィンゴミエリン及びコレステロールから構成され、リポソーム内部のｐＨは酸性である。スフィンゴミエリン及びコレステロールを含む脂質粒子は、他の剤形に比較した場合、幾つかの利点を有する。スフィンゴミエリン/コレステロールの組み合わせは、延長された循環寿命を有し、酸性加水分解に対しずっと安定であり、有意によい薬剤保持特性を有し、腫瘍などに対するするよりよい積載特性を有し、そして試験される他のリポソーム製剤よりよい抗腫瘍効力を示すリポソームを生産する。
【００７６】
[00125]  好ましい態様において、本発明の脂質粒子は、式１のカチオン性化合物及び少なくとも１の以下の(及び米国特許第出願第5,785,992号に十分に記載される、該出願は本明細書中に援用される)中性脂質を含む。好ましい態様において、本発明のＬＮＡ製剤は、式１のカチオン性化合物、及び以下の(及び米国特許第5,785,992号に十分に記載され、本明細書中に援用される)少なくとも１の中性脂質を含む。
【化１】
2005525414.tif 000006
【００７７】
[00126]  式１において、Ｒ1及びＲ2は、各々独立してＣ1〜Ｃ3；アルキルである。Ｙ及びＺは、アルキル又はアルケニル鎖であり、各々独立して:-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2-、-ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2-、-ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2-、-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2-、-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ-、-ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ2-、-ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ-、又は-ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ-である。ただし、Ｙ及びＺは両方とも-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2-ではない。ｎ及びｑの文字は、３〜７の整数を示し、ｍ及びｐが４〜９の整数を示す。但し、ｎ＋ｍ及びｑ＋ｐは各々１０〜１４の整数である。Ｘ‐は、医薬として許容されるアニオンを示す。上記の式において、２重結合の配向は、シス又はトランスのいずれかであり、しかしながら、シス異性体は一般的に好まれる。
【００７８】
[00127]  別の好ましい態様において、カチオン性の化合物は、式Ｉ(式中Ｒ1及びＲ2はメチルであり、かつＹ及びＺは各々独立して:-ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2-、-ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2-、-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2-又は-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ-である)に属する。好ましい態様において、Ｒ1及びＲ2はメチルであり；Ｙ及びＺは、各々-ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2-であり；ｎ及びｑは、共に７であり、並びにｍ及びｐは共に５である。別の好ましい態様において、カチオン性化合物は、ＤＯＤＡＣ(Ｎ‐ジオレイル-Ｎ,Ｎ‐ジメチルアンモニウム・クロリド)である。ＤＯＤＡＣは、当該技術分野に周知であり、界面活性剤及びシャンプーの添加剤として広く使用される化合物である。ＤＯＤＡは、リポソーム組成物中の共脂質として他の界面活性剤と共に使用される(Takahashi, et al., GB 2147243を参照のこと)。
【００７９】
[00128]  本発明のＬＮＡ製剤における中性脂質は、界面活性剤中に又はミセル若しくはリポソームの形成のために典型的に使用される様々な中性脂質のいずれかでありうる。本組生物において有用である中性脂質の例は、非限定的に、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、及びセレブロシドである。好ましい態様において、本組成物は、１以上の中性脂質を含み、該脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、又はスフィンゴミエリンである。これらの中性脂質におけるアシル基は、好ましくはＣ10〜Ｃ24の炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基である。より好ましくは、アシル基は、ラウロリル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。特に好ましい態様において、中性脂質は、１,２‐ｓｎ‐ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである。
【００８０】
[00129]  アニオンであるＸ‐は、様々な医薬として許容されるアニオンのいずれかでありうる。これらのアニオンは、有機性又は無機性であり、例えばＢｒ-、Ｃｌ-、Ｆ-、Ｉ‐、スルフェート、ホスフェート、アセテート、ニトレート、ベンゾエート、シトレート、グルタメート、及びラクテートを含む。好ましい態様において、Ｘ‐は、Ｃｌ‐又はＡｃＯ‐である。
【００８１】
[00130]  本明細書中に記述される別の成分に加えて、本発明の組成物は、医薬として許容される担体を含みうる。医薬として許容される担体は、当該技術分野に周知である。担体の選択は、投与される特定の組成物によって、並びに該組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。好ましくは、医薬担体は溶液中、水又は生理食塩水中に存在する。
【００８２】
[00131]  本発明の組成物において、カチオン性化合物対中性脂質の比率は、好ましくは約２５：７５(カチオン性化合物：中性脂質)〜７５：２５(カチオン性化合物：中性脂質)の範囲内であり、又は好ましくは約５０：５０である。
【００８３】
[00132]  本発明の組成物において使用されるカチオン性化合物は、標準の合成反応(March, Advanced Organic Chemistry, 4th Ed.,Wiley-lnterscience, NY, N. Y. (1992)を参照のこと、該文献は本明細書中に援用される)を使用して、当業者に周知の方法により調製されうる。例えばＯＳＤＡＣの合成は、アミンの還元的アルキル化をもたらす条件下で、最初にオレイルアミンを、ホルムアルデヒド及び水素化シアノホウ素ナトリウムで処理することにより行われうる。該試行は、ジメチル・オレイルアミンを提供し、該物質は、次にステアリル・ブロミドでアルキル化されて、対応するアンモニウム塩を形成する。アニオン交換は、ＯＳＤＡＣの形成をもたらす。ジメチルオレイルアミンは、オレイル・ブロミドを過度のジメチルアミンで処置することにより合成され、そしてさらに上記のとおりに誘導体化される。
【００８４】
[00133]  脂肪酸鎖の両方が不飽和であるカチオン性化合物(つまりＤＯＤＡＣ)では、以下の一般的な手順が使用されうる。不飽和酸(つまり、オレイン酸)は、オキサリル・クロリド、チオニル・クロリド、ＰＣＩ３、又はＰＣＩ５などの試薬で、対応するアシル・クロリドに変換されうる。アシル・クロリドは、不飽和アミン(つまり、オレイルアミン)で処理されて、対応するアミドを提供する。アミドを、例えば水素化リチウム・アルミニウムで還元することにより、両方のアルキル基が不飽和長鎖アルキル基である２級アミンを提供する。２級アミンは、次にメチル・ヨージドなどのアルキル・ハライドで処理されて、４級アンモニウム化合物を提供する。アニオン交換が次に行われて、所望の医薬として許容されるアニオンを有するカチオン性化合物を提供する。アルキルアミン前駆体が、同様の方式で合成されうる。例えば、アルキル・ハライドを過剰量のアンモニアのメタノール溶液で処理し、精製した後に、必要とされるアミンを提供する。或いは、適切なカルボン酸を、オキサリル・クロリドで処理することにより、作られたアシル・クロリドを、アンモニアと反応させて、アミドを提供する。該アミドをＬｉＡｌＨ4で還元することにより、必要とされるアルキルアミンを提供する。
【００８５】
[00134]  好ましい態様において、本発明の医薬として許容される組成物は、ミセル又はリポソームとして剤形される。本発明のカチオン性化合物及び中性脂質を含むミセルは、当該技術分野に周知である方法により提供されうる。本組成物のミセル製剤形態に加えて、本発明はさらに、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン-ポリオキシエチレン複合体、セラミド-ポリオキシエチレン複合体、又はホスファチジン酸-ポリオキシエチレン複合体などの他の種を含むミセル製剤を提供する。
【００８６】
[00135]  本発明の組成物中に使用されるポリオキシエチレン複合体は、複合体基(つまり、ホスファチジン酸又はホスファチジルエタノールアミン)を適切に官能性をもたせたポリオキシエチレン誘導体と混合することにより調製されうる。例えば、ホスファチジルエタノールアミンは、ω-メトキシポリエチレングリコール・スクシネートと混合されて、ホスファチジルエタノールアミン-ポリオキシエチレン複合体を提供しうる(例えば、Parr, et al., Biochim. Biophys. Acta 1195: 21-30 (1994)を参照のこと、該文献は本明細書中に援用される)。
【００８７】
[00136]  本発明の組成物及び方法において使用する中性脂質の選択は、一般的に、例えばリポソームの大きさ及び血流中でのリポソームの安定性などを考慮することにより導かれる。上記のように、リポソーム中の中性脂質成分は、２つのアシル基を有する脂質(つまり、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジル-エタノールアミン)である。様々な鎖長及び飽和度の様々なアシル鎖基を有する脂質が利用でき、又周知の技術により単離又は合成されうる。フィルター滅菌の目的のため、リポソームは、約０.３ミクロン以下に大きさを揃える場合、一般的にあまり飽和されていない脂質は、容易に大きさを揃えられる。態様のある群において、Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含む脂質が好ましい。態様の別の群において、Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有し、１又は２の未飽和部分を有する脂肪酸を有する脂質が使用されうる。さらに、飽和及び未飽和脂肪酸鎖の混合体を有する脂質が使用されうる。
【００８８】
[00137]  本発明の組成物及び方法において有用であるリポソームは、セリン及びイノシトールなどのほかの頭部群を有するスフィンゴミエリン又はリン脂質から構成されうる。本発明において有用であるほかのリポソームは、コレステロール、ジグリセリド、セラミド、ホスファチジルエタノールアミン-ポリオキシエチレン複合体、ホスファチジン酸-ポリオキシエチレン複合体、又はポリエチレングリコール-セラミド複合体(例えば、ＰＥＧ-Ｃｅｒ-Ｃ１４又はＰＥＧ-Ｃｅｒ-Ｃ２０)を含む。リポソームの大きさを揃える際及びリポソームをフィルター滅菌する際に使用される方法は、以下で記述される。
【００８９】
[00138]  様々な方法は、リポソームを調製する技術分野において周知である(例えば、Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), U. S. Pat. Nos. 4,235, 871,4, 501,728, 4,837, 028, the text Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1, and Hope, et al., Chem. Phys. Lip. 40: 89 (1986)を参照のこと。該文献の全ては、本明細書中に援用される)。ある周知の方法は、不均一の大きさの多重膜小胞を作る。この方法において、小胞を形成する脂質は、適切な有機溶媒又は溶媒系に溶解され、そして吸引下又は不活性ガス下で乾燥されて、薄い脂質膜を形成する。望まれるなら、該膜は、三級ブタノールなどの適切な溶媒中に再溶解され、そして次に凍結乾燥されて、より均一な脂質混合物を形成する。該混合物は、より簡単に水和される粉末様形態である。該膜を緩衝水溶液で覆い、そして典型的には１５〜６０分間攪拌しながら水和させる。得られた多層小胞の大きさの分布は、脂質をより強く攪拌する条件下で水和することにより、又はデオキシコレートなどの可溶化界面活性剤を添加することにより、小さい大きさへと移行しうる。
【００９０】
[00139]  リポソームの調製に続いて、所望の大きさ範囲及び比較的狭い分布のリポソームの大きさを達成するために、リポソームの大きさを揃えうる。約０.２〜０.４ミクロンの大きさの範囲は、慣用のフィルター、典型的には０.２２ミクロンのフィルターを通したろ過により、リポソーム懸濁液を滅菌することを可能にする。該フィルター滅菌方法は、約０.２〜０.４ミクロンの大きさに揃えられたなら、ハイスループット体制で行われうる。
【００９１】
[00140]  リポソームの大きさを所望の大きさに揃えるために、幾つかの技術が利用される。ある大きさを揃える方法は、米国特許第4,737,323号に記述され、該出願は、本明細書中に援用される。浴槽超音波処理又は触針超音波処理によりリポソーム懸濁液を超音波処理することは、約０.０５ミクロン未満の大きさの小さい単層小胞まで連続的に大きさを減じることを引き起こす。ホモジェナイズは、大きいリポソームを小さいリポソームへと裁断するせん断エネルギーに基く別の方法である。典型的なホモジェナイズの手順において、多重膜小胞は、標準乳濁液ホモジェナイザーを通して、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０.１と０.５ミクロンの間の大きさが観測されるまで、再循環される。両方の方法において、粒子サイズ分布は、慣用のレーザービーム粒子サイズ判別によりモニターされうる。
【００９２】
[00141]  小孔のポリカーボネート膜又は非対称セラミック膜を通してリポソームを突出することは、リポソームの大きさを、比較的よく規定された大きさの分布へと減じる有効な方法である。典型的には、懸濁液は、所望のリポソームの大きさ分布が達成されるまで、１回以上膜を通される。リポソームは、連続的に小孔膜を通して突出されて、リポソームの大きさの段階的な減少を達成しうる。本発明における使用では、約０.０５ミクロン〜約０.１５ミクロンの大きさを有するリポソームが好ましい。
【００９３】
[00142]  以下にさらに記述されるように、本発明の組成物は、投与の周知の経路により対象に投与されうる。一度細胞により吸着されると、リポソーム(前記の複合体を含む)は、細胞の一部によりエンドサイトーシスされ、脂質を細胞膜と交換し、又は細胞と融合しうる。複合体の多アニオン部位の移行又は取り込みは、１以上のこれらの経路を介して行われうる。特に、融合が行われる場合、リポソーム膜は、細胞膜へと組み込まれ、そしてリポソームの内容物は、細胞内液と混合されうる。
【００９４】
[00143]  以下に詳細に記載されるように、治療用化合物でありうる追加の成分は、脂質粒子を特定の細胞型に標的するために本発明の脂質粒子に加えられうる。例えば、リポソームは、特異的細胞型上にのみ存在するエピトープ、例えばガン関連抗原などに結合するモノクローナル抗体又はその結合断片に結合されて、全身投与の後リポソームを標的する手段を提供する。或いは、標的細胞型の表面受容体に結合するリガンドは、リポソームに結合しうる。リポソームを標的するための別の手段は、本発明に適用されうる。
【００９５】
[00144]  リポソームを含むメディウムから遊離薬剤を取り除くために必要とされうる分離ステップの後に、リポソーム懸濁液は、患者又は宿主細胞に対し投与するため、医薬として許容される担体中に所望の濃度でもたらされる。多くの医薬として許容される担体は、本発明の組成物及び方法において適用されうる。様々な水性担体、例えば、水、緩衝液、０.４％生理食塩水、０.３％グリシンなどが使用され、かつ亢進された安定性のため糖タンパク質、例えばアルブミン、糖タンパク、グロブリンなどを含みうる。一般的に通常の緩衝化生理食塩水(１３５〜１５０ｍＭのＮａｃｌ)は、医薬として許容される担体として適用されるだろうが、他の適切な担体でも十分である。これらの組成物は、慣用のリポソーム滅菌技術、例えばろ過によって滅菌されうる。組成物は、おおよその生理条件が必要とされるとき、ｐＨ調節及び緩衝剤、浸透圧調整剤などの医薬として許容される補助的な物質を含みうる。例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどである。これらの組成物は、上記の技術により滅菌されうるか又は滅菌条件下で製造される。得られた水溶液を、使用のために包装され、又は無菌条件下でろ過されて凍結乾燥される。該凍結乾燥された製剤は、投与のまえに滅菌水溶液と混合される。
【００９６】
[00145]  担体中のリポソーム濃度は変化しうる。好ましい態様において、リポソーム濃度は約０.１〜２００ｍｇ/ｍｌである。当業者は、異なるリポソーム成分での又は特定の患者に対する処置を最適化するためにこれらの濃度を変える方法を知るだろう。例えば濃度を高くし、処置に伴う液量を低くしうる。
【００９７】
[00146]  対象の細胞は、通常、in vivo又はex vivo投与により本発明の組成物に晒される。本発明に記載される好ましい態様では、本発明の組成物は、例えば静脈投与により全身投与される。筋肉内、皮下、及び局所投与も考慮される。或いは、鼻腔内、又は気管内投与も使用されうる。気管内投与は、液体として提供されうるし好ましくはエアロゾルとして提供されうる。例えば、直径７０〜１００μｍの液滴のエアロゾルを作るために、噴霧器は使用されうる。液滴の大きさは通常リポソームの大きさより大きくされるべきであることは理解されるだろう。
【００９８】
[00147]  患者に対する複数回投与は、考慮される。治療の投与量計画は、疾患及び患者の条件により決定されるだろう。免疫刺激組成物を含む治療用化合物での標準治療は、当該技術分野に周知であり、治療化合物を含むリポソームで治療するためのガイドとして役に立つ。治療期間及び治療計画は、当業者に周知の方法により変わりうるが、循環時間の増大、及びリポソームの漏出は、投与量を以前適用された投与量から下方修正することを一般的に許容する。本発明のリポソームの投与量は、臨床条件及び治療を受ける動物の又は患者の大きさに依存して変わりうる。封入されない場合の治療用化合物の標準投与量は、リポソームに封入される化合物の投与量に対する指針として役に立ちうる。投与量は、典型的には治療過程に渡り一定であるが、いくつかの場合において、投与量は変わりうる。標準生理条件パラメーターは、治療のあいだ評価され、本発明のリポソームの投与量を変えるために使用されうる。
【００９９】
抗原
[00148]  本発明の病原体ワクチンは、病原体由来の少なくとも１の抗原の少なくとも１のエピトープをさらに含み、上記ＬＮＡ製剤と混合されるか又はＬＮＡ製剤と会合される。対象ワクチンにより標的されうる病原体は、非限定的に感染ウイルス、感染細菌、感染寄生虫、及び完成真菌を含む。最も好ましくは、ポリトープワクチンは、１以上のそうした抗原由来の複数のエピトープを含んで提供される。対象組成物及び方法における使用を見出す微生物抗原は、本質的に免疫原性、又は非免疫原性、或いはわずかに免疫原性でありうる。典型的な抗原は、非限定的に合成、組換え、外来、又は相同の抗原を含み、そして抗原性物質は、非限定的にタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、及びＤＮＡを含みうる。
【０１００】
[00149]  典型的なウイルス病原体は、非限定的に哺乳動物、及びより特異的にヒトに感染する感染性ウイルスを含む。感染性ウイルスの例は、非限定的に：レトロウイルス科(例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ-１(また、ＨＴＬＶ-ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ-ＩＩＩ/ＬＡＶ、又はＨＩＶ-ＩＩＩとも称される)；及び別の単離体、例えばＨＩＶ-ＬＰ)；ピコルナウイルス科(例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒト・コクサッキー・ウイルス、リノウイルス、エコウイルス)；カルシウイルス科(例えば、胃腸炎を引き起こす種)；トガウイルス科(例えばウマ・脳炎ウイルス、風疹ウイルス)；フラウイルス科(Flaviridae)(例えば、デング・ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス)；コロナウイルス科(例えば、コロナウイルス)；ラブドウイルス科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス)；フィロウイルス科(例えばエボラ・ウイルス)；パラミキソウイルス科(例えば、パラインフルエンザ・ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ハシカウイルス、呼吸器合胞体ウイルス)；オルソミクソウイルス科(例えば、インフルエンザ・ウイルス)；ブンヤウイルス科(Bungaviridae)(例えば、ハンタ・ウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロ・ウイルス)；アレナウイルス科(出血熱ウイルス)；レオウイルス科(レオウイルス；オービウイルス、及びロタウイルス)；ビルナウイルス科；肝炎ウイルス科(Ｂ型肝炎ウイルス)；パルボウイルス科(パルボウイルス)；パポバウイルス科(パピローマ・ウイルス、ポリオーマ・ウイルス)；アデノウイルス科(多くのアデノウイルス)；ヘルペスウイルス科(単純ヘルペス(ＨＳＶ)１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、ヘルペス・ウイルス)；ポックスウイルス科(痘瘡ウイルス、ワクシニア・ウイルス、ポックス・ウイルス)；及びイリドウイルス科(たとえば、アフリカ・ブタ・熱ウイルス)；および未分類ウイルス(例えば、海面上脳症の病理学的病原体、δ型肝炎の病原体(Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられる)、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原体(クラス１＝内部伝染；クラス２＝非傾向的に伝染する(つまり、Ｃ型肝炎)；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス)を含む。
【０１０１】
[00150]  また、グラム陰性及びグラム陽性の細菌は、脊椎動物における対象の組成物及び方法により標的されうる。そうしたグラム陽性細菌は、非限定的にパスツレラ属、ブドウ球菌属、及び連鎖球菌属を含む。グラム陰性細菌は、非限定的に大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス属、及びサルモネラ属を含む。感染性細菌の特定の例は、非限定的に、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pyloris)、ボレリア・ブルドルフェリ(Borelia burgdorferi)、レジオネラ・ニューモフィリア(Legionella pneumophilia)、ミコバクテリア・エスピーエス(Mycobacteria sps)(例えば、エム. ツベルクロシス(M. tuberculosis)、エム. アビウム(M. avium)、エム. イントラセルラー(M. intracellulare)、エム. カンサイ、(M. kansaii)、エム. ゴルドナエ(M. gordonae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ネイセリア・ゴノロエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、リステリア・モノサイトジーン(Listeria monocytogenes)、ストレプトコッカス・ピオゲン(Streptococcus pyogenes)(グループAストレプトコッカス(Group A Streptococcus))、ストレプトコッカス・アガラクチー(Streptococcus agalactie)(グループＢストレプトコッカス(Group B Streptococcus))、ストレプトコッカス(ビリダン・グループ)(Streptococcus (viridans group))、ストレプトコッカスファエカリス(Streptococcusfaecalis)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス(アナエロビック エスピーエス.)(Streptococcus (anaerobic sps.))、ストレプトコッカス・ニューモニア(Streptococcus pneumoniae)、病原性カンピロバクター・エスピー.,(Pathogenic Campylobacter sp.)、エンテロコッカス・エスピー.,(Enterococcus sp.)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus infuenzae)、バチルス・アントラシス(Bacillus antracis)、コリーネバクテリウム・ジフテリア(corynebacterium diphtheriae)、コリーネバクテリウム・エスピー.,(corynebacterium sp.)、エリシペロスリックス・ルーシオパチー(Erysipelothrix rhusiopathiae)、クロストリジウム・ペルフリンガー(Clostridium perfringers)、クロストリジウム・テンターニ(Clostridium tetani)、エンテロバクター・アエロゲン(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumoniae)、パスツレラ・マルトシーダ(Pasturella multocida)、バクテロイド・エスピー(Bacteroides sp.)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、ストレプトバシラス・モニリフォルミス(Streptobacillus moniliformis)、トレポネマ・パリダム(Treponema pallidum)、トレポネマ・ペルテヌー(Treponema pertenue)、レプトスピラ(Leptospira)、リッケットシア(Rickettsia)、及びアクチノミセス・イスラエリ(Actinomyces israelli)を含む。
【０１０２】
[00151]  対象組成物における微生物抗原の出所としての使用を見出しうる細菌性病原の病原体のポリペプチドは、非限定的に鉄調節外膜タンパク質(ＩＲＯＭＰ)、外膜タンパク質(ＯＭＰ)、及びフルンケルン症を引き起こすアエロモナス・サルモニシダ(Aeromonis salmonicida)のＡ-タンパク質、細菌性腎臓病(ＢＫＤ)を引き起こすレニバクテリウム・サルモニナラム(Renibacterium salmoninarum)のｐ５７タンパク質、主要表面付随抗原(ＭＳＡ)、表面発現サイトトキシン(ｍｐｒ)、表面発現ホモリジン(ｉｓｈ)、及びエルシニア症の鞭毛抗原；細胞外タンパク質(ＥＣＰ)、鉄調節外膜タンパク質(ＩＲＯＭＰ)、及びパスツレラ症の構造タンパク質；ビブリオ・アングイラルム(Vibrosisanguillarum)及び、ブイ.オルダリ(Ｖ.ordalii)のＯＭＰ及び鞭毛タンパク質；エドワードシエラ・イクタルリ症、及びイー・タルダ(Ｅ.tarda)の鞭毛タンパク質、OMPタンパク質、アロA；及びイクチオフチリウス(Ichthyophthirius)の表面抗原；及びサイトファガコルムナリ(Cytophagacolumnari)の構造タンパク質及び調節タンパク質；及びリッケチア(Rickettsia)の構造及び調節タンパク質を含む。そうした抗原は、組換え又は当該技術分野に周知である別の方法のいずれかにより単離又は調製されうる。
【０１０３】
[00152]  病原体の例はさらに、非限定的に哺乳動物、より好ましくはヒトに感染する感染性真菌を含む。感染性真菌の例は、非限定的に、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラスマ・カプスラタム(Histoplasma capsulatum)、コシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、ブラストミセス・デルマティティジス(Blastomyces dermatitidis)、クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を含む。感染性寄生虫の例は、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、及び三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)などのマラリア原虫を含む。他の感染性生物(つまり、原生生物)は、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii)を含む。寄生虫病原体のポリペプチドは、非限定的に、イクチオプチリウス(Ichthyophthirius)の表面抗原を含む。
【０１０４】
[00153]  哺乳動物、特にヒトにおける抗原として役に立つ他の医学に関連する微生物は、文献において広く記載される。例えば、C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983を参照のこと。該文献の全ては、本明細書中に援用される。感染性ヒト疾患及びヒト病原体の治療に加えて、本発明の組成物及び方法は、非ヒト哺乳動物の感染を治療するために有用である。非ヒト哺乳動物を治療するための多くのワクチンは、Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums,Inc., 1995に記載される。また、WO 02/069369を参照のこと。これらの開示は本明細書中に援用される。
【０１０５】
[00154]  典型的な非-ヒト病原体は、非限定的にマウス乳腺腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)、ラウス・サルコメア・ウイルス(ＲＳＶ)、トリ白血病ウイルス(ＡＬＶ)、トリ骨髄芽球症ウイルス(ＡＭＶ)、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、ネコ白血病ウイルス(ＦｅＬＶ)、マウス・肉腫・ウイルス(ＭＳＶ)、テナガザル白血病ウイルス(ＧＡＬＶ)、脾臓壊死ウイルス(ＳＮＶ)、 細胞内皮症ウイルス(ＲＶ）、サル肉腫ウイルス（ＳＳＶ），マソン-ファイザー・サル・ウイルス（Mason-Pfizer monkey virus)(ＭＰＭＶ)、サル・レトロウイルス・タイプ１（ＳＲＶ-１），レンチ・ウイルス、例えばＨＩＶ-１、ＨＩＶ-２、ＳＩＶ、ビスナ・ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、及びウマ感染性貧血症ウイルス（ＥＩＡＶ）、Ｔ細胞白血病ウイルス、例えば、ＨＴＬＶ-１、ＨＴＬＶ-ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）、及びウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、及び泡沫状ウイルス、例えばヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）、及びウシ泡沫状ウイルス（ＢＦＶ）を含む。
[00155]  好ましい態様では、本明細書中で、感染性病原体に関して使用される「処置」、「処置する」、「処置」は、対象の感染への抵抗性を、病原体で増加するか又は対象が病原体で感染始める可能性を減じる予防的処置のことを指す。及び/又は感染に対抗するため、例えば感染が悪化することを低減するか又は取り除くため、対象が感染されたのちの処置の事を指す。
【０１０６】
[00156]  微生物抗原は、当該技術分野に周知である方法により調製されうる。例えば、これらの抗原は、粗製の抽出液を調製することにより、抗原を部分的に精製することにより、又は変わりに組換え技術により、又は周知の抗原の新規合成により、ウイルス及び細菌細胞から直接的に調製されうる。抗原は、抗原ペプチドをコードする核酸の形態でありうるし、対象における発現に適する形態、免疫化対象の免疫系への提示でありうる。さらに、抗原は、完全な抗原でありうる。又は完全な抗原の断片であって、少なくとも１のエピトープを含む断片でありうる。
【０１０７】
[00157]  脂質製剤の抗原は、リポソーム又は脂質粒子に封入、会合、又は混合されうる。本発明のある態様において、抗原は、リポソーム又は脂質粒子内に封入される。別の態様において、抗原は、リポソーム又は脂質粒子と混合されうる。別の態様において、抗原は、リポソーム又は脂質粒子と会合される。ある側面では、リポソーム又は脂質粒子に吸着する。別の態様では、抗原は共有結合でリポソーム又は脂質粒子に結合する。抗原をリポソーム又は脂質粒子と共有結合で結合するために使用される方法は、当業者に周知の標準方法である。
【０１０８】
他の薬剤成分
[00158]  本発明の幾つかの好ましい態様は、さらに別の治療用薬剤、例えば薬剤又は生理活性薬剤を含む。これらの追加の成分は、直接付加的な治療利得又は付加的な免疫刺激利得を提供する。幅広い様々な化合物は、本発明の組成物及び方法により運搬されうる。治療用化合物の例は、非限定的に核酸、タンパク質、ペプチド、腫瘍退縮薬、抗感染薬、抗不安薬、向精神薬、免疫調節薬、向イオン性薬、ゲロニン等の毒素、及び真核生物タンパク質合成の阻害剤などを含む。本発明のリポソーム内における補足のための好ましい治療化合物は、親油性のカチオンである。それらの中には、リポソームの脂質２重層に分画することができ、それゆえ膜形態のリポソームと関連することができる親油性の分子のクラスに属する治療用薬剤が存在する。治療用化合物の更なる例は、非限定的にプロスタグランジン、アンホテリシンＢ、メトトレキセート、シスプラチン及びその誘導体、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、ドキソルビシン、エピルビシン、ベクロメタゾン及びそのエステル、ビタミンＥ、コルチゾン、デキサメタゾン及びそのエステル、βメタソン・バレレート(betamethasone valerete)、及び他のステロイド、フッ化キノロン、抗細菌シプロフロキサシン及びその誘導体、並びにアルカロイド化合物及びその誘導体を含む。アルカロイド誘導体の中には、スワンソニン及びビンカ・アルカロイドのメンバー並びに半合成誘導体、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、エトポシド・ホスフェート、及びテニポシドが存在する。この群の中では、ビンブラスチン及びビンクリスチン、並びにスワンソニン(swainsonine)は、特に好ましい。スワンソニン(Creaven and Mihich, Semin. Oncol. 4: 147 (1977))は、骨髄増殖を刺激する能力を有する(White and Olden, Cancer Commun. 3: 83 (1991))。スワンソニンは、また、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＴＮＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、及びインターフェロン(Newton, Cancer Commun. 1: 373 (1989); Olden, K. , J.Natl. Cancer Inst., 83: 1149 (1991))を含む複数のサイトカインの生産を刺激する。さらに、スワンソニンは、報告によるとＢ細胞及びＴ細胞免疫を誘導し、ナチュラル・キラーＴ細胞及びマクロファージに誘導されるin vitroでの腫瘍細胞の破壊を誘導する。そしてインターフェロンと混ぜたとき、スウェイソニンは、in vivoにおいて、大腸ガン及びメラノーマガンに対する直接的な抗腫瘍活性を有する(Dennis, J. , Cancer Res. , 50: 1867 (1990); Olden, K. , Pharm. Ther. 44: 85 (1989); White and Olden, Anticancer Res. , 10: 1515 (1990))。本発明の組成物及び方法において有用な別のアルカロイドは、非限定的にパクリタキセル(タキソール)及びその合成誘導体を含む。さらなる薬剤成分は、非限定的に、当該技術分野に周知である生理活性薬剤であって、脂質粒子に取り込まれうる薬剤を含む。 
【０１０９】
[00159]  これらの更なる薬剤成分は、本明細書中に記載される脂質粒子に封入されるか、又はそうでなければ、該粒子と会合される。或いは、本発明補組成物は、脂質核酸粒子と会合しない薬剤又は生理活性薬剤を含みうる。そうした薬剤又は生理活性薬剤は、分離した脂質担体中に存在するか、又は共投与されうる。
【０１１０】
組成物の製造
[00160]  本発明の組成物の製造は、いずれの技術によって達成されうるが、最も好ましくは、以下の刊行物、特許、及び特許出願に詳細に記載されるエタノール透析又は界面活性剤透析方法である。米国特許第5,705,385号;米国特許第5,976,567号；米国特許第09/140,476号;米国特許第5,981,501号;米国特許第6,287,591号;国際公開第WO96/40964号;及び国際公開第WO98/51278号、これらの開示は本明細書中に援用される。これらの製造方法は、脂質粒子、好ましくは脂質-核酸粒子中に封入される治療用薬剤を含む免疫刺激組成物の小規模及び大規模製造を提供する。該方法は、優れた医薬特徴を有するそうした粒子を作製する。
【０１１１】
[00161]  本発明の病原体ワクチンは、免疫応答が所望される１以上の微生物抗原を添加することにより調製されうる。抗原を取り込む手段は、当該技術分野に周知であり、例えば１)製造過程のあいだ、受動的に抗原を封入する手段(例えば、抗原はＯＤＮを含む溶液へと添加されうる)；２)糖脂質及び他の抗原性脂質をエタノール脂質混合液に添加し、そして本明細書中に記述されるエタノールに基くプロトコルを使用して剤形する手段；３)脂質小胞へ挿入する手段(例えば抗原-脂質は、小胞と抗原-脂質ミセルをインキュベーションすることにより形成された脂質小胞へと添加されうる)；４)抗原は、剤形後に加えられうる手段(例えば、カップリング、ここで、リンカー部位を有する脂質が、剤形される粒子へと含まれ、そしてリンカーは剤形後に活性化されて、所望の抗原と結合する)を含む。標準のカップリング及び架橋方法論は、当該技術分野に周知である。代わりの調製は、抗原を、核酸を含まない脂質―粒子に取り込み、そしてこれらの粒子は、対象への投与に先立って、脂質―核酸粒子と混合される。
【０１１２】
本発明の方法において使用される組成物の特徴
[00162]  本発明の方法において使用される組成物の好ましい特徴は以下の通りである。
【０１１３】
[00163]  本発明の好ましい脂質核酸粒子は、十分な内部空間を封入する脂質膜外皮(一般的にリン脂質二重層)を含む。該粒子は、本明細書中でときおり、脂質膜小胞と呼ばれ、平均直径５０〜２００ｎｍ、好ましくは６０〜１３０ｎｍを有する小粒子である。静脈投与に最も好まれるのは、比較的均一の大きさの粒子であり、ここで９５％の粒子が、平均３０ｎｍ内である。核酸及び他の生理活性薬剤が、内部空間に含まれるか、又は封入膜の内表面と会合される。
【０１１４】
[00164]  本明細書中で使用される「完全に封入される」は、粒子中の核酸が、血清にさらされた後又は有意に遊離ＤＮＡを分解するヌクレアーゼ・アッセイの後に、有意に分解されないということを意味する。完全に封入されるシステムでは、通常遊離核酸の１００％を分解する処置において、好ましくは２５％未満の粒子核酸が分解され、より好ましくは１０％未満及び最も好ましくは、５％未満の粒子核酸が分解される。代わりに、完全な封入は、「オリグリーン(商標)(Oligrren)」アッセイにより決定されうる。完全な封入はまた、粒子が血清安定であるということ、つまり、粒子が、in vivo投与された際、成分部分に即座に分解しないということを提案する。
【０１１５】
[00165]  本発明の組成物の特徴は、本発明の好ましい粒子を、脂質―核酸凝集体(カチオン性複合体又はリポプレックスとして知られる)、例えばＤＯＴＭＡ/ＤＯＰＥ(リポフェクチン(商標))製剤から区別する。これらの凝集体は、一般的にかなり大きい(＞２５０ｎＭ)直径であり、該凝集体は、完全にはヌクレアーゼ切断に抵抗しない。該凝集体は、一般的にはin vivo投与の際、徐々に分解する。脂質―核酸製剤は、上記のように弱い抗原を有するカチオン性脂質―核酸凝集体を含み、局所的及び領域的な適用、例えば筋肉内、腹腔内、及びくも膜下内投与、及びより好ましくは鼻腔内投与のための適切なワクチンを提供しうる。
【０１１６】
[00166]  本発明のリポソーム粒子は、薬剤：脂質の比率の広い範囲で剤形されうる。本明細書中で使用される「薬剤対脂質比率」は、製剤の規定された体積中の治療用核酸の量(つまり、封入される核酸の量であり、血液にさらされたとき即座に分解されない核酸の量)を、同じ体積中の脂質の量で割った比率を指す。該比率は、モル対モル又は重量対重量、或いは重量対モルに基いて定義される。薬剤対脂質比率は、核酸の与えられる投与量と会合される脂質投与量を決定する。好ましい態様において、本発明の組成物は、約０.０１〜０.２５(ｗｔ/ｗｔ)の範囲の薬剤：脂質比率を有する。
【０１１７】
本発明の組成物及び方法の使用
[00167]  本明細書中に示されるように、対象病原体ワクチンは、微生物抗原に対する強力な、Ｔｈ-１偏向免疫応答を刺激することができ、そして宿主免疫応答の液性成分を亢進できる。こうして、本明細書中で記述される病原体ワクチンは、微生物抗原に対するＴｈ-１偏向液性免疫を導入する方法における使用を見出す。液性応答の成熟を改良する方法、並びに抗原刺激に応答して抗体アイソタイプの転換を増大する方法も本明細書中に提供される。
【０１１８】
[00168]  これらの免疫応答は、非限定的に、免疫系細胞(例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、例えば樹上細胞又はマクロファージなどのＡＰＣｓ、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞など)の活性化
、増殖、又は分化；マーカーの上方制御又は下方制御された発現；サイトカイン分泌；ＩｇＡ、ＩｇＭ、又はＩｇＧタイターの増加又は刺激；アイソタイプ・クラスの転換、及び脾腫大(増大した脾臓細胞性を含む)を含む多くの方法において計測されうる。Ｔｈ-１偏向免疫応答の存在は、特に、Ｔｈ-１サイトカイン(例えばＩＦＮ-γ、ＩＬ-１２)、及び抗原特異的ＣＤ８+ＣＴＬの導入により直接決定されうる。こうして、Ｔｈ-１サイトカイン又はＣＴＬが誘導されるなら、Ｔｈ-１偏向免疫応答は、本発明に従って誘導される。同様に、亢進された液性応答及び液性応答の成熟における改良は、誘導される１型抗原特異的抗体(例えば、ＩｇＧ２ａ、マウスにおけるＩｇＧ１、人におけるＩｇＧ及びＩｇＡ)のアイソタイプを検出することにより、及び本明細書中に例示されるようにアイソタイプ転換(例えばＩｇＭからＩｇＧ又はＩｇＡへの転換)がおこっているかを検出することにより、示唆される。もし、代わりのアジュバントと比較して、アイソタイプ転換の増大が起こっているなら、液性免疫応答の亢進が本発明に従って、誘導される。
【０１１９】
[00169]  好ましい態様において、本発明の方法は、少なくとも１の微生物抗原を含む有効量の病原体ワクチンを、対象に投与することにより、対象の病原体に対するＴｈ-１偏向免疫応答を刺激することを含む。好ましくは、ワクチンは、封入されたＯＤＮを含むＬＮＡ粒子を含む。より好ましくは、抗原は、ＬＮＡ粒子と会合し、そして最も好ましくは、複数の抗原が適用される。特に好ましい態様において、ＯＤＮは、ＰＳ又は他の改変された、非ホスホジエステル骨格を含む。Ｔｈ-１応答を誘導する代わりのアジュバントは、非限定的にＭＰＬ、ＭＤＰ、ＩＳＣＯＭＳ、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-γ、及びＳＢ-ＡＳ２を含む。
【０１２０】
[00170]  そうした病原体の例は、非限定的にＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ-１、ＨＳＶ-２、ＨＢＶ、ＳＡＲＳ、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhea),クラミジア,及び、トレポネーマ・パリジウム(Treponema pallidum)であり、これらの病原体は、抗原又はＤＮＡ配列であって本発明の方法において使用する抗原をコードするＤＮＡ配列を提供する。こうして、本発明において使用するために適した更なる抗原は、非限定的に、特に、ＨＰＶのＬ１タンパク質、ＨＰＶのＬ２タンパク質、ＨＰＶのＥ６タンパク質、ＨＰＶのＥ７タンパク質、ＨＢＶの表面タンパク質、ＨＢＰの「ｅ」抗原、ＨＩＶのｇｐ４１タンパク質、ＨＩＶのｇａｇタンパク質、ＨＩＶのｔｅｔタンパク質、及び、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質を含む。本発明のそうしたワクチン及びワクチン・プロトコルが有用である別の病原体は、非限定的にトリコモナス症、カンジダ症、肝炎、疥癬、及び梅毒を引き起こす病原体を含む。さらに、粘膜を介して侵入する病原は、非限定的に、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、他の上記呼吸器障害を引き起こす病原体、並びに腸管感染を引き起こす薬剤を含む。本発明の方法は、そうした病原体に対する粘膜免疫を刺激する際に有用である。従って、本発明は、粘膜免疫が所望される広範なヒト病原体由来の抗原の発現を包含する。こうして、本発明は、特定の抗原の同一性に制限されない。
【０１２１】
[00171]  ＨＢＶ風土病地域で生まれた新生児及び幼児(幼児は、３ヶ月齢のヒトを含む。これ以降幼児と呼ばれる)は、若年齢感染からもたらされる高割合の慢性のため、強力なＨＢＶ特異的免疫の早期誘導を必要とする。免疫学的予防なしでは、ＨＢｓＡｇ及び「ｅ」抗原(ＨＢｅＡｇ)の両方に陽性である母親から生まれた幼児の７０〜９０％は、感染し、そしてほとんど全てが慢性的保因者になる(Stevens et al., 1987)。誕生した日から開始するＨＢＶサブユニットワクチンの４回の投与量計画でワクチン接種した場合でさえ、２０％のそうした幼児は慢性的に感染し、そしてＨＢＶ-特異的免疫グロブリンを与えられた場合でも、該割合は１５％に減少されるのみである(Chen et al., 1996)。慢性ＨＢＶは、感染される人の１０〜１５％は青年又は成人であり、(垂直又は水平)感染する人の９０〜９５％は幼児である。ＨＢｅ抗原で調製され、そして本発明の方法において使用される本発明の組成物は、抗ＨＢ抗体のより早い出現及びより高い抗ＨＢ抗体のタイターのため、並びにＨＢＶ特異的ＣＴＬの誘導のため、そうした慢性感染をさらに低減する。このことは、子宮内で感染した赤ん坊の肝臓からウイルスを取り除く手助けをする。ウイルスを取り除く過程は、乳児ワクチン接種での多くの失敗を説明するようである。
【０１２２】
[00172]  適応症、投与、及び投与量
本発明の組成物及び方法は、免疫系刺激を必要とする患者又は生物のいずれかにおける使用を指示する。そうした必要性は、非限定的に、多くの医学領域、例えば腫瘍学、炎症、関節炎、及びリュウマチ学、免疫不全疾患を包含する。当業者は、本明細書中の開示に基く効力を試験する適切な指示を選択しうる。好ましい態様では、本発明の組成物及び方法は、関心の病原体、例えば以下の例におけるＢ型肝炎ウイルスなどのいずれかを標的するために予防学的又は治療学的に使用される。
【０１２３】
[00173]  本発明の組成物の対象に対する投与は、in vivo又はｅｘ ｖｉｖｏ方法を含むいずれの方法による。in vivo方法は、局所性、局所性、又は全身性の適用を含みうる。好ましい態様において、組成物は静脈投与され、その結果粒子が患者におけるＢ細胞、マクロファージ、又は脾細胞に接近可能であり、及び/又は粒子は、リンパ球増殖を刺激可能であり、前記患者におけるＩＬ-６、ＩＬ-１２、ＩＦＮｇ、及び/又はＩｇＭの分泌をもたらす。
【０１２４】
[00174]  本発明のワクチン組成物は、投与のいずれかの周知の経路により投与されうる。ある態様において、本発明の組成物は、静脈注射を介して投与される。別の態様では、筋肉内又は腹腔内注射は、使用され、そしてこの方式において、大きいサイズ(１５０〜３００ｎｍ)の脂質粒子が使用されうる。結果として、高価な突出ステップの必要性は、減らされ、又は取り除かれうる。そして粒子は、循環することを必要としないので、脂質成分の分泌は、高価でない材料を選ぶように偏移しうる。例えば、Ｃｈｏｌの量は低減され、ＤＳＰＣは、より硬くない物(例えばＰＯＰＣ又はＤＭＰＣ)で置換され、そしてＰＥＧ-脂質は、より高価でないＰＥＧ-アシル鎖で置換されうる。さらなる態様において、本発明の組成物は、呼吸器官を介して、例えば気管注入、又は鼻腔内吸入により投与される。
【０１２５】
[00175]  当業者は、製剤の毒性可能性を同定する方法を知っている。例えば、補体活性化、凝固、腎毒性、肝臓酵素アッセイなどである。そうした毒性は、生物間で異なりうる。
【０１２６】
[00176]  組成物の医薬製剤は、通常運搬様式を改良又は手助けするための追加の担体を使用する。典型的には、本発明の組成物は、医薬として許容される担体、例えば、通常の生理食塩水又は標準医薬慣用に一致して選択されるリン酸緩衝液中において投与される。別の適切な担体は、亢進された安定性のためにアルブミン、脂質タンパク質、グロブリンなどの糖タンパク質を含む水、０.９％生理食塩水、０.３％グリシンなどを含む。
【０１２７】
[00177]  脂質核酸製剤の投与量は、所望の脂質投与量、所望の核酸投与量、及び組成物の薬剤：脂質比率に依存する。当業者は、本明細書中に提供される情報に基く適切な投与量を選択しうる。
【０１２８】
[00178]  初回抗原刺激、追加免疫、及び免疫の維持の免疫治療又はワクチン接種プロトコルは、当業者に周知であり、そして以下にさらに記述される。特に、当業者は、本明細書中に記述される投与量に基いて、対象、特に哺乳動物、及びより特にヒトに対する投与量の計算方法を知るだろう。ある動物から別の動物への(例えば、マウスからヒトへの)投与量を変換するための特定変換因子は、当該技術分野に周知であり、かつ、例えば食料医薬品投与ウェブサイト：www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm(腫瘍学ツール部門において)で十分に記述される。該サイトは、本明細書中に援用される。遊離核酸を有する周知の免疫刺激組成物と比較して、本発明の免疫刺激組成物及び方法は、in vivoにおける免疫応答の亢進を刺激する低減された核酸量を利用しうる。
【０１２９】
[00179]  本発明の製剤中の核酸量は、一般的に、約０.００１〜６０ｍｇ/ｋｇ(投与量あたりの核酸ｍｇ/マウスの体重ｋｇ)の間で変化する。静脈(ｉ.ｖ.)投与の好ましい態様において、本発明の組成物及び方法は、約１〜５０ｍｇ/ｋｇ、より好ましくは約５〜２０ｍｇ/ｋｇを利用する。皮下(ｓ.ｃ.)投与の好ましい投与において、本発明の組成物及び方法は、約１〜１０ｍｇ/ｋｇ、より好ましくは約１〜５ｍｇ/ｋｇ、通常約３〜５ｍｇ/ｋｇを利用する。本発明脂質粒子と会合される抗原量は、好ましくは約０.０４〜４０ｍｇ/ｋｇであり、より好ましくは約０.０４-４ｍｇ/ｋｇである。上記の様に、当業者は、上記の周知変換因子及び経験的試験に基いて、本明細書中に記述される投与量を与えられた別の動物の適切な投与量を容易に決定しうる。
【０１３０】
[00180]  本発明の製剤は、医薬として許容される溶液中で投与されうる。該溶液は、医薬として許容される濃度の塩、緩衝材、保存剤、化学反応をおこさない担体、アジュバント、及び場合により他の治療成分を決まりきって含みうる。
【０１３１】
[00181]  治療における使用は、本発明の免疫刺激組成物の有効量は、適切な標的細胞による取り込みを可能にするいずれの方法により、対象に投与されうる。本発明の免疫刺激性組成物を「投与」することは、当業者に周知の方法により達成されうる。投与の好ましい経路は、非限定的に非経口注射(例えば、皮下、皮内、静脈、非経口、腹腔内、くも膜下腔内、など)、粘膜、鼻腔内、気管内、吸入、及び直腸内、膣内；又は経口、経皮(例えばパッチを介して)を含む。注射は、大量又は連続輸液の形態でありうる。
【０１３２】
[00182]  例えば、本発明の免疫刺激組成物は、筋肉内又は皮内注射により、又は他の非経口的手段、又は表皮に遺伝子銃を適用することにより、投与されうる。本発明の免疫刺激組成物は、例えば吸入、局所的に、静脈、経口、移植、経直腸、又は経膣により投与されうる。適切な液体又は固体医薬製剤形態は、例えば、注射のための又は吸入のための水性又は生理食塩水であり、エンコクレート(encochleated)され、顕微金粒子上に被膜され、そして噴霧される。薬運搬の本方法を簡単に概説するために、Langer, Science 249: 1527-1533,1990を参照のこと。該出願は、本明細書中に援用される。 
【０１３３】
[00183]  医薬組成物は、好ましくは投与量単位において調製され、かつ投与される。液体投与量単位は、注射又は他の非経口投与のためのバイアル又はアンプルである。固体投与量単位は錠剤、カプセル、及び坐薬である。患者の治療のために、化合物の活性、投与の方式、免疫化の目的(つまり、予防又は治療)、疾患の性質及び重篤度、患者の年齢及び体重に依存して、異なる投与量は必要とされうる。与えられた投与量の投与は、個々の投与量単位の形態における一回の投与によって、又は少ない投与量単位の形態における数回の投与によって行われうる。数週又は数月はなれた特定の間隔での用量の複数回投与は、通常抗原特異的応答を追加免疫するため通常行われる。
【０１３４】
[00184]  適切な緩衝剤は、酢酸及び塩(１〜２％ｗ/ｖ)；クエン酸及び塩(１〜３％ｗ/ｖ)；ホウ酸及び塩(０.５〜２.５％ｗ/ｖ)；及びリン酸及び塩(０.８〜２％ｗ/ｖ)を含む。適切な保存剤は、ベンザルコニウム・クロリド(０.００３〜０.０３％ｗ/ｖ)；クロロブタノール(０.３〜０.９％ｗ/ｖ)：パラベンス(parabens)(０.０１〜０.２５％w・ｖ)、及びチメロサール(０.００４〜０.０２％ｗ/ｖ)を含む。
【０１３５】
[00185]  好ましい態様において、本発明の免疫刺激組成物は、医薬として許容される担体内に場合により含まれるアジュバント及び抗原の組み合わせの有効量を含む。本明細書中で使用される「医薬として許容される担体」は、１以上の化学反応を起こさない固体若しくは液体賦形剤、希釈剤、又は封入物質であって、ヒト又は他の哺乳動物に投与するために適しているものである。本明細書中で使用される「担体」は、活性成分が混ぜられて、その適用を亢進する天然又は合成の有機又は無機成分である。本発明の免疫刺激組成物の成分は、所望の医薬効力を実質的に損なう相互作用が存在しないように、本発明の化合物と及び互いに混ぜられることができる。
【０１３６】
[00186]  非経口投与に適した組成物は、滅菌された水性調製品を都合よく含み、該調製品は、受取人の血液と等張でありうる。許容される溶媒及び溶剤は、水、リンゲル溶液、リン酸緩衝生理食塩水、及び等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌固定油(fixed  oil)は、溶媒又は懸濁メディウムとして慣用的に利用される。この目的のために、いずれのブランドの穏やかに固定化されたミネラルオイル又は非ミネラルオイルは、合成モノ-オージ-グリセリドを含んで使用されうる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製の際の使用を見出す。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などの投与に適した担体製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Paにおいて見出される。
【０１３７】
[00187]  本発明において有用であるアジュバント又は抗原は、２以上のアジュバント又は抗原の混合体中で運搬されうる。混合体は、本明細書中に記述されるＬＮＡ製剤に加えて、幾つかのアジュバントからなりうる。
【０１３８】
[00188]  様々な投与経路が利用できる。選択された特定の方式は、もちろん特定のアジュバント又は選択される抗原、対象の年齢及び全身の健康状態、治療される特定の条件、及び治療効力に必要とされる投与量に依存する。本発明の方法は、一般的に、医学的に許容される投与のいずれの形態、つまり、臨床上許容されない有害な効果を引き起こすことなく、免疫応答の有効レベルを生じるいずれの形態を使用して行われうる。好ましい投与形態は、上に記述される。
【０１３９】
[00189]  組成物は、単位投与量形態において慣用的に提供され、薬学分野に周知のいずれかの方法により調製されうる。全ての方法は、該化合物を、１以上の付属成分から構成される担体と関連させるステップを含む。一般的に、組成物は、均一かつ本質的に化合物を、液体担体、微細に分けられた個体担体、又はその両方と関連させることにより、そしてもし必要なら産物の形を整えることにより調製される。
【０１４０】
[00190]  他の運搬システムは、時間-放出、遅延放出、又は維持放出システムを含みうる。そうしたシステムは、化合物の繰り返しの投与を避けることができ、対象及び医師に対する利便性を増大させる。多くのタイプの放出運搬システムが利用でき、そして当業者に周知である。該システムは、ポリマーに基くシステム、例えばポリ(ラクチド-グリコリド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチル酸及びポリ酸無水物を含む。薬を含む前述ポリマーの微小カプセルは、例えば米国特許第5,075,109号に記述される。運搬システムは、コレステロール、コレステロール・エステルなどのステロール、及び脂肪酸又は中性脂肪、例えばモノ- ジ-及びトリグリセリドを含む脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスティック(Sylastic)システム；ペプチドに基くシステム；ワックスコーティング；慣用の結合剤及び賦形剤使用する加圧された錠剤；部分的に融合された移植錠などである非ポリマーシステムを含みうる。特定の例は、非限定的に、(ａ)本発明の薬剤が、米国特許第4,452,775号、第4,675,189号、及び第5,736,152号に記載されるシステムなどのマトリックス中の形態に含まれる基質システム、及び(ｂ)米国特許第3,854,480号、5,133,974号、及び5,407,686号中に記載されるように、活性成分が、制御された割合でポリマーから浸透する拡散システムを含む。さらに、ポンプに基くハードウェア運搬システムが、使用されうる。幾つかのシステムは移植に適用される。
【０１４１】
[00191]  本発明の特定の態様に目をむけると、ある態様は、封入ＰＳ・ＯＤＮが、抗原刺激に対する亢進されたＴｈ-１偏向液性免疫応答を刺激することができ、そして封入ＰＯ・ＯＤＮに比較して、液性応答の成熟を改良することができると言う認識から生じる。
【実施例】
【０１４２】
実験
実験の詳細
[00192]  マウス。  メス、Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７/ＢＬ６(Ｂ６)マウス(６〜８週齢)を、Harlan-Sprague Dawley (Indianapolis, IN)から購入した。全ての動物を使用前に１週間検疫した。全ての研究は、カナダ動物管理協会(ＣＣＡＣ)及び動物管理使用委員会(ＩＡＣＵＣ)により設立されたガイダンスに沿って行われた。
【０１４３】
[00193]  ペプチド。  ペプチドはCommonwealth Biotechnologiesから購入され、そしてＨＰＬＣで決定したとき９５％の純度であった。品質管理分析(ＱＣ分析)は各々のペプチドに関して得られた。
【０１４４】
[00194]  オリゴヌクレオチド製剤。  オリゴヌクレオチドをＡｖｅｃｉａ又はＰｒｏｌｉｇｏ又はＴｒｉｌｉｎｋから購入した。全てのＯＤＮを滅菌水で再水和し、そして滅菌ＤＰＢＳ、ｐＨ７.２で適切な濃度へ希釈した。
【０１４５】
[00195]  ＬＮＡ製剤。  ＬＮＡ製剤を以下の通りに調製した。初期ＯＤＮ：脂質比率は、０.２５ｗ/ｗであった。ホスホジエステル製剤のため、２０ｍＭクエン酸緩衝液を３００ｍＭクエン酸緩衝液の代わりに使用して、ＯＤＮを溶解した。この過程の失敗は、封入効率のかなりの減少をもたらす(つまり〜３％終効率)。
【０１４６】
[00196]  ワクチン接種。Ｂ６マウスを注射ごとに１００ｍｌで皮下(ＳＣ)ワクチン接種をした。投与計画は、ｑ７ｄ×２又はｑ４ｄ×４であり、そして個々の図の説明において示される。ＣＦＡ混合体は粘稠性であり、大きい目盛りのシリンジで与えらなければならない。液性研究では、初回抗原刺激(０日)及び追加免疫(１４日)戦略を使用し、そして尻尾に切れ目を入れることにより、様々な時間で血液試料を収集した。
【０１４７】
[00197]  効力研究。  研究の間、Ｅ.Ｇ７-ＯＶＡ又はＥＬ-４チモーマ細胞系列を使用した。これらの細胞を確立された方法に従ってin vitroで培養した。腫瘍研究では、１％ＦＣＳを含む５０ｍｌのＰＢＳ中の２.５×１０6Ｅ.Ｇ７-ＯＶＡ細胞を、皮下注射した。腫瘍寸法を垂直的に繰り返し計測し、以下の式：
体積(ｍｍ3)＝(Ｌ×Ｗ×Ｈ)ｐ/６
を使用することにより腫瘍計測を行った。
【０１４８】
[00198]  ＴＲＰ-２及びｇｐ１００研究を、Ｂ１６／ＢＬ６マウス・メラノーマ・モデルを使用して行った。Ｂ１６細胞(１.０×１０5)を２００ｍｌの体積で静脈注射した。典型的には、動物を毎週２〜３回の注射でワクチン接種し、そして次にＢ１６細胞を最終ワクチン接種後１〜２日後に投与した。動物をＢ１６注射後１４〜１８日の間で屠殺し、肺を取り除き、そして転移を立体顕微鏡を使用して計測した。
【０１４９】
[00199]  フローサイトメトリー分析。  ＭＨＣ四量体(Beckman Coulter)又はダイマーＸ試薬(Pharmingen)を使用して、抗原特異的Ｔ細胞を、ワクチン接種マウス中で決定した。ＣＤ８ａ、Ｂ２２０、及びＣＤ４に対する抗体を関心の細胞数を同定するため使用し、不所望の数を取り除いた。脾臓及びリンパ節の単一細胞懸濁液を、免疫学における現在のプロトコルに従って調製した。抗体染色を４℃を保った９６ウェル・プレート中の１×１０6細胞について行った。一般的に、０.２ｍｇの各々の抗体を、１×１０6細胞ごとに使用した。
【０１５０】
実施例１
in vitroとin vivoにおける、遊離又は封入オリゴヌクレオチドにさらす事による、全血液細胞中の白血球の活性化
[00200]  in vivo免疫刺激を予測するin vitroアッセイの有効性を示すために、ＣＤ６９発現比較を図１及び図２に示す。ＣＤ６９は、細胞活性化マーカーであり、該マーカーはＮＫ細胞、Ｂ細胞、及び単球の活性化を定量する。ＮＫ細胞上でのＣＤ６９の発現は、細胞の活性化及びＩＦＮ-ｇの産生を示す。該ＩＦＮ-ｇは、Ｔｈ-１免疫応答を誘導するために重要である。遊離及び封入ＯＤＮ１及び２をin vitro及びin vivoにおいて、ＣＤ６９を誘導するそれらの能力を試験した。ＯＤＮ２の０.１ｍｇ/ｍｌ及びＯＤＮ１の１０ｍｇ/ｍｌをin vitroで使用し、そして１０ｍｇ/ｋｇのＯＤＮ２及び２０ｍｇ/ｋｇのＯＤＮ１をin vivoで使用した。各々のオリゴヌクレオチドは、ＰＯＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧＤＭＧの比２０：４５：２５：１０から構成される脂質粒子中に封入された。
【０１５１】
[00201]  図１は、マウス全血を、遊離オリゴヌクレオチド及び封入オリゴヌクレオチド、特にＯＤＮ１及び２で処理することによる、活性化マーカーＣＤ６９を有する白血球のin vitro活性化を示す。マウス全血液が、in vitroで遊離オリゴヌクレオチドで処理された場合、処理後１５時間で使用され遊離オリゴヌクレオチドの量に従って、ＣＤ６９陽性Ｂ-細胞、単球、及びある程度までＮＫ細胞の量における投与量に応答する増加が存在した。このin vitroアッセイにおいて、遊離ＯＤＮ２は、遊離ＯＤＮ１より、かなり強い刺激を引き起こす。しかしながら、それらの同じオリゴヌクレオチドが脂質小胞に封入される場合、これらの同じ細胞型におけるＣＤ６９産生のin vitro刺激は、低減されるか又は全くなくなる。
【０１５２】
[00202]  同じオリゴヌクレオチドをin vivoで投与したとき、驚くべき結果が得られた。封入又は遊離オリゴヌクレオチドで注射することによってin vivoでＩＣＲマウスを治療することは、in vitroで得られた結果と逆の結果をもたらすということを図２は示す。該図は、該脂質封入オリゴヌクレオチドが、注射後１６及び２４時間で、同じ細胞型上のＣＤ６９マーカーを刺激する際に、遊離オリゴヌクレオチドより有効であるということを明らかに示す。in vitroデーターは、オリゴヌクレオチドがin vivoで免疫刺激性であるかを決定するためには不十分であるということを、この結果により示される。それ以上に、オリゴヌクレオチドがin vivoにおいて有効であるかを決定する際に、脂質封入は重要な因子であるということを、図１及び２は提案する。封入されたＯＤＮ１及びＯＤＮ２が、両方ともＮＫ細胞上のＣＤ６９の産生を刺激することができるということをin vivoの結果は示す。その一方で、in vitroの結果は、ＯＤＮ１及びＯＤＮ２の脂質封入は、ＮＫ細胞上のＣＤ６９の刺激をコントロール・レベル以下に低減したということを示した。
【０１５３】
[00203]  前述のin vivo結果は、in vivoにおいてＣＤ６９を有する細胞の刺激により計測されるとき、遊離オリゴヌクレオチドが脂質小胞に封入されない限り、遊離オリゴヌクレオチドは必ずしも免疫刺激性でないということを示す。例え、ＣＤ６９の刺激がin vitroにおいて遊離ＯＤＮにより観測されたとしても、このことは真実である。さらに該結果は、封入オリゴヌクレオチドが、例えin vitroにおいて有効性を示されなかったとしても、封入オリゴヌクレオチドが有効でありうるということを示す。
【０１５４】
実施例２
メチル化オリゴヌクレオチドによる、in vivoの樹上細胞の活性化
[00204]  上記背景部分において記述されるように、in vitro又はin vivoのいずれで計測されたとしても、免疫応答を刺激するという点において、メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドは一般的に有効でないか又は非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較して有効でないということを、先行技術は示す。米国特許第6,429,199号は、メチル化オリゴヌクレオチドが、ＮＫ細胞又はヒトＢ細胞上のＣＤ４０の発現を亢進せず、また、Ｔｈ-１応答における液性及び細胞性免疫に含まれる主要抗原提示細胞である樹上細胞の改良された生存度を示さないということを開示した。さらに、開示されたメチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、in vitroで生存度、分化、活性化、又は樹上細胞の成熟を改良する点で不活性であった。同様に、ＷＯ02/069369において開示されたin vitroのＰＢＭＣの結果は、樹上細胞に対するメチル化オリゴヌクレオチドの活性を全く示さない。
【０１５５】
[00205]  対照的に、メチル化オリゴヌクレオチドは、樹上細胞の増殖を誘導する際に、少なくとも有効であり、典型的には非メチル化オリゴヌクレオチドよりも有効であるということを本発明は示す。非メチル化ＯＤＮ１の対応物は、一つのＣｐＧジヌクレオチド配列のシトシン残基が、メチル化されるように作られ、そしてＯＤＮ１ｍと名づけられる。
【０１５６】
[00206]  メチル化されたオリゴヌクレオチドが樹上細胞を刺激することができるということを示すために、ＯＤＮ１及びＯＤＮ１ｍの各々を、ＰＯＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧＤＭＧの比２０：４５：２５：１０を含む脂質小胞中に封入した。ＰＢＳをコントロールとして使用した。この実験の結果を図３に示す。
【０１５７】
[00207]  図３は、封入ＯＤＮ１ｍが樹上細胞を活性化する能力を明らかに示す。さらに、脂質粒子に封入される場合、メチル化ＯＤＮ１ｍは、in vivoにおける樹上細胞の活性化を刺激する点において、非メチル化対応物のＯＤＮ１より活性であった。樹上細胞活性化をＩＦＮ-γを分泌する細胞の割合により計測した。これらの細胞は、抗体で標識されて、細胞型を示し、そして樹上細胞マーカーを有する細胞のみが該計測に含まれた。
【０１５８】
[00208]  脂質封入非メチル化及びメチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与からもたらされる樹上細胞の増殖を示すために、血液、脾臓、及びリンパ節由来の細胞を樹上細胞集合の活性化及び増殖を分析した。ＩＣＲマウスを、封入オリゴヌクレオチドの一回の静脈注射、投与量２０ｍｇ/ｋｇで免疫化し、そしてコントロールＩＣＲマウスにＰＢＳを注射した。図４及び図５において示されるように、脾臓、血液、及びリンパ球の各々の細胞を、様々な時間点で分離し、そして樹上細胞増殖及び活性化量を、樹上細胞マーカーであるＣＤ１１ｃ及びＤＥＣ２０５の使用を介して計測した。これらのマーカーの各々は、樹上細胞特異的であるが、異なる細胞の副集合をあらわしうる。図４及び図５の各々において、コントロールを１００％としてプロットし、そしてＯＤＮ１ｍの各々の骨格配置に対する効果を、コントロールに対するパーセントとしてプロットした。図4Ａは、各々のパネルにおいて、コントロールに対して計測したとき、メチル化ＯＤＮ１ｍが、脾臓細胞及び全血液細胞におけるＣＤ１１ｃ陽性樹上細胞の増殖を刺激したが、リンパ組織細胞におけるＣＤ１１ｃ陽性樹上細胞増殖は刺激しなかったということを示す。ＯＤＮ１ｍのＰＯ及びＰＳ骨格の両方は、樹上細胞増殖を示した。図４Ｂは、コントロールに対して計測されたとき、メチル化ＯＤＮ１ｍが、脾臓細胞及びリンパ組織におけるＤＥＣ２０５陽性樹上細胞の増殖を刺激したが、全血液細胞におけるＤＥＣ２０５陽性樹上細胞の増殖を刺激しないといことを示す。
[00209]  図５は、樹上細胞の活性化を示す。試料を収集する際に、細胞は、最初にフロー・サイトメトリーにより、細胞増殖を示すＣＤ８６及び樹上細胞表現形マーカーであるＣＤ１１ｃ及びＤＥＣ２０５の共発現を分析された。活性化樹上細胞の割合は、ＰＢＳコントロールを１００％としたものに対してプロットされた。オリゴヌクレオチドが脂質封入されるとき、メチル化ＯＤＮ１ｍが、ＣＤ１１ｃ陽性樹上細胞上でのＣＤ８６の発現を誘導したことを示す。類似の結果は、ＤＥＣ２０５陽性樹上細胞を計測するときに図５の各々のパネルにおいて示される。
【０１５９】
[00210]  図４及び５におけるデーターは、樹上細胞の生存、分化、活性化、又は成熟を改良する点で、メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドが不活性であると記載する米国特許第6,429,199号の記載に異議を唱える。
【０１６０】
実施例３
血漿サイトカイン・レベルに関するＰＳ及びＰＯ骨格の効果
[00211]  上記のように、非脂質封入オリゴヌクレオチドに関して、骨格は、核酸による分子分解を低減するために伝統的に改変される。しかしながら、封入される際では、分解を妨げるための改変は、もはや必要とされない。免疫刺激をするとき、異なる骨格の効果を設立するために、マウスは、ＰＯ及びＰＳ骨格を有するオリゴヌクレオチドで注射され、そしてサイトカイン刺激は、一連の時間点にわたって計測され(図６及び７Ｂにおいて示される)、そして図７Ａに示される投与量規模を変えて計測された。該実験において、ＩＣＲマウスをＯＤＮ２０ｍｇ/ｋｇの投与量の遊離ＰＯ-ＯＤＮ１、封入ＰＯ-ＯＤＮ１、及び封入ＰＳ-ＯＤＮ１で静脈注射した。Ｔｈ-１及びＴｈ-２に共通のサイトカイン(ＩＬ-１２、ＩＬ-６、及びＩＦＮ-γ)、及びＭＣＰ-1(マクロファージ・ケモカイン)を、投与に続く２４時間のタイムコースにわたって計測した。サイトカイン刺激は、ＭＣＰ-１におけるケモカイン応答を指し示すように、細胞性免疫応答を一般的に指し示す。オリゴヌクレオチドを、ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧ-ＣＥＲ１４の比２０：４５：２５：１０から構成される脂質粒子中に封入する。
【０１６１】
[00212]  遊離ＰＯ-ＯＤＮ１のin vivo投与は、ＩＬ-６、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-γ、又はＭＣＰ-1の刺激に関して影響を与えず、該オリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼにより分解されているようであるということを図６は示す。遊離オリゴヌクレオチドを投与する場合、ヌクレアーゼによる分解を避けるために、ＰＳ骨格が必要とされるということは当該技術分野に周知である。脂質封入ＰＯ及びＰＳ-ＯＤＮ１のin vivo投与は、これらのサイトカイン及びケモカイン各々の産生を刺激する。しかしながら、図６は、ＰＯ-ＯＤＮがサイトカイン及びケモカイン産生を誘導する際、より有効であるということを示す。
【０１６２】
[00213]  図７Ａは、投与量規模の変移に渡って、ＩＣＲマウスを封入ＰＯ又はＰＳ-ＯＤＮ１４で処理することにより誘導されるＩＬ１２が、遊離ＯＤＮ１４で処理することにより誘導されるＩＬ１２と比較して増大することを図示する。脂質封入が、ＩＬ１２誘導の増加により証拠付けられるサイトカイン刺激の有効性を増大すること及びＰＯ-ＯＤＮがＰＳ-ＯＤＮよりサイトカイン応答を誘導する点でより効果的であるということを示す。図６から導かれる結果を該図は支持する。図７Ａは、封入される場合、脂質粒子の非存在下で投与される遊離オリゴヌクレオチドと比較して、より少ない投与量のオリゴヌクレオチドが必要とされるということを示す。
【０１６３】
[00214]  ＰＯ-ＯＤＮ及びＰＳ-ＯＤＮにおける違いをさらに解明するために、図７Ｂは、ＰＳ骨格配置とＰＯ骨格配置との間のＩＦＮ-γサイトカイン刺激の違いを時間に渡って示す。封入ＰＯ-ＯＤＮ１４での処理は、ＩＦＮ-γの強力な初期誘導を刺激する。一方で、封入ＰＳ-ＯＤＮ１４での処理は、少量ではあるがそれでも有効なＩＦＮ-γの導入を刺激する。それ以上に、図７Ｂは、数日の期間にわたって、ＰＳ-ＯＤＮで刺激したとき、２回目の大きなＩＦＮ-γピークが起こることを示す。このことは、該免疫系が封入ＰＳ-ＯＤＮで処置することにより、初回免疫されて、おそらくは処置後にＮＫ細胞の増加を介して、より効果的にＩＬ１２の産生に応答するということを示しうる。
【０１６４】
[00215]  図２２は、実施例４においてさらに記述されるように、図７ＢのＰＳ-ＯＤＮにおいて見られる、同じオリゴヌクレオチドのＰＯ型と比較して、遅いＩＦＮ-γピークを同様に示す。
【０１６５】
[00216]  本発明に従った脂質封入の重要な特徴は、天然ＰＯ骨格を有するオリゴヌクレオチドが、免疫応答を刺激するために使用されうるということを発見することである。従来技術では、ＰＳ骨格は、in vivo活性における有効性に必要とされる。以下の実施例７に示されるように、抗腫瘍効力を評価するとき、特にオリゴヌクレオチドがメチル化される場合、封入ＰＯオリゴヌクレオチドは、ＰＳオリゴヌクレオチドより有効でありうる。
【０１６６】
実施例４
ＰＳ及びＰＯを有するＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫刺激性質の評価
[00217]  ＰＯ及びＰＳ骨格を有するＯＤＮに特と会合される応答レベルを区別するとき、更なる態様は、評価される応答の型を分析することであり、より特異的に、該応答が液性応答か又は細胞性応答であるかを分析することである。骨格の効果を評価するために、液性免疫応答の成熟(つまり、アイソタイプ転換の促進)を誘導及び開始するＰＳ-ＯＤＮ及びＰＯ-ＯＤＮの能力に注目するように、実験は行われた。封入ＰＯ-ＯＤＮ及びＰＳ-ＯＤＮを投与することにより誘発される液性免疫応答の規模及び動態は、比較された。ＰＯ-ＯＤＮ及びＰＳ-ＯＤＮを、ｑ１４×２初回抗原刺激-追加免疫セットを、０日と１４日において、１００μｇ/投与量で皮下投与し、そして３５日から６週間評価した。コントロールマウスは、同じ投与量で、ＯＶＡ-ＰＢＳ及びＯＶＡ-ミョウバンを使用して免疫化された。オリゴヌクレオチドは、ＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧ-ＤＭＧの比２０：４５：２５：１０から構成される脂質粒子中に封入される。
【０１６７】
[00218]  ＰＯ及びＰＳ-ＯＤＮｓは両方とも、液性免疫応答を導入することができるが、応答の性質が異なると結論できる。図８及び９は、吸光度の点における、様々なオリゴヌクレオチド及びコントロールに対する、６週間後のＩｇＭ及びＩｇＧ応答の規模を示す。図において明らかに示されるように、ＰＳ-ＯＤＮ１及びＰＳ-ＯＤＮ２は、弱いＩｇＭ応答を生じ、一方、ＰＯ-ＯＤＮ２は、強いＩｇＭ応答を生じる。逆に、生じたＩｇＧ応答は、ＰＯ骨格を有する同じオリゴヌクレオチドと比較して、試験されたＰＳ-ＯＤＮの各々は一貫して良かった。このことは、ＰＳ-ＯＤＮが、優れたＩｇＧ応答をもたらすということを提案する。これらのデーターは、ＰＯ及びＰＳ‐ＯＤＮの両者が液性免疫応答を開始することができるという一方で、ＰＯ応答は、アイソタイプ転換を欠如し、かつＩｇＭアイソタイプが優勢であることから示されるように成熟していない。他方、ＰＳ‐ＯＤＮは、液性免疫応答を開始することができかつＩｇＧアイソタイプ抗体が優勢になるアイソタイプ転換により示されるように応答の成熟を誘導することができる。
【０１６８】
[00219]  該減少は、ＰＯ対ＰＳ‐ＯＤＮにより誘導されるサイトカイン・プロファイルに関係しうる。図７Ｂ及び２２は、封入ＰＳオリゴヌクレオチドＯＤＮ１及びＯＤＮ２が、処理後６日目で封入ＰＯオリゴヌクレオチドでは生じない強いＩＦＮ-γピークを生じることを図示する。ＩＦＮ-γなどのサイトカインが様々なＩｇＧアイソタイプへの好ましいアイソタイプ転換をもたらすということが報告されている。それゆえＰＳ‐ＯＤＮに誘導される遅く大きなＩＦＮ-γピークは、ＩｇＭからＩｇＧへのアイソタイプ転換をもたらしうる。一方、ＰＯ‐ＯＤＮ処理されたマウスにおいてそうしたピークがないことは、アイソタイプ転換をもたらさないかもしれない。ＰＯ‐ＯＤＮに関する該低減された遅いＩＦＮ-γピークの根拠は明らかではないが、結果は、封入ＰＯオリゴヌクレオチドでの処置は、ＮＫ又はＴ細胞におけるＩＦＮ-γ発現を促進するために必要とされるＩＬ‐１２の発現を阻害する１型インターフェロンの優先誘導を引き起こすが、ＰＳオリゴヌクレオチドでの処理は該誘導を引き起こさないということを提案しうる。
【０１６９】
[00220]  同様に、図６は、オリゴヌクレオチドの封入が、前記のＴｈ-１応答を導くサイトカインの生産を刺激するために重要であるということを示すだけでなく、封入ＰＯオリゴヌクレオチドを使用することは、ＰＳオリゴヌクレオチドを使用するよりも多くのサイトカインを生産するということを示す。このことは、in vivoにおけるオリゴヌクレオチドの分解を阻止するために、ＰＳ骨格がＰＯオリゴヌクレオチドより好ましいということを示した先行技術で知られた遊離オリゴヌクレオチドの投与と対照的である。
【０１７０】
実施例５
サイトカイン誘導、四量体分析、及び細胞障害性アッセイ(ＣＴＬ)により計測したときの、オリゴヌクレオチドでの処理に対するin vivo免疫応答
[00221]  皮下注射に対する免疫応答を計測するために、液性免疫応答を血漿抗体レベルを計測することにより計測する間、抗原特異的免疫応答を、ＭＨＣクラス１-四量体分析、細胞障害性アッセイ、及びサイトカイン放出アッセイを使用して、計測した。細胞性及び液性応答を、Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／Ｃマウスそれぞれにおいて評価した(各群５匹づつ)。細胞性応答の分析のため、０、７、及び１４日目において、２０μｇの抗原と組み合わせた１００μｇの投与量で、ｑ７ｄ×３の投与計画に基いて、マウスを３回の皮下注射で免疫化した。脾臓、肝臓、リンパ節、及び血液組織を、２１日目で収集した。個体組織を機械的に分離し、細胞を処理して単核細胞を収集した。液性応答を分析するために、０日目及び１４日目のｑ１４ｄ×２に基いて動物を２回免疫化し、血漿の免疫グロブリン・レベルを分析するために、３５日目に血液を収集した。この一連の実験において、オリゴヌクレオチドは、２０：４５：２５：１０の比のＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧ-ＤＭＧ、又はＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧ-ＤＭＧから構成される脂質粒子において封入された。全ての比較は、脂質粒子様で行われた。
【０１７１】
[00222]  ＭＨＣ‐四量体分析は、ＣＤ８＋ｖｅ、細胞障害性Ｔ‐リンパ球を検出するように設計された。該リンパ球は、適切なＴ細胞受容体を有し、ＭＨＣクラス１複合体との関係において、標的抗原を有する標的細胞を認識し、かつ溶解することを許容した。免疫化動物由来の単離脾細胞を、免疫優先ＯＶＡＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド並びにＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８及びＣｙ‐クローム-標識抗ＴＣＲ抗体で複合体形成したＰＥ標識ＭＨＣ‐クラス１四量体(Ｈ2Ｋb)で染色し、そしてフローサイトメトリー分析に供した。ＣＤ８＋ｖｅ、ＴＣＲ＋ｖｅのＴリンパ球は、ＭＨＣクラス１分子との関係でＯＶＡを特異的に認識しかつ結合できるＴ細胞受容体を有する細胞数で評価された。
【０１７２】
[00223]  細胞障害性アッセイでは、抗原特異的様式において標的細胞を特異的に認識しかつ溶解する免疫化動物由来の脾細胞の能力は、４時間の51クロム放出アッセイを使用して評価された。標的細胞を、51クロムで標識し、そして免疫効果細胞により溶解された標的から上清中に放出された放射性核酸量により決定された。免疫化動物由来の単離脾細胞は、ＯＶＡを発現する標的細胞であるＥＧ７を、ＯＶＡ非発現細胞であるＥＬ４に比較して特異的に溶解できる能力を、即座に試験するか、又はＯＶＡパルス同質遺伝子抗原提示細胞でin vitro再刺激の５日後に試験された。
【０１７３】
[00224]  サイトカイン放出アッセイの狙いは、特定抗原での刺激に応答して、活性化されるサイトカイン、特にＩＦＮ-γの生産及び分泌を活性化される抗原特異的免疫効果細胞を検出することである。免疫化された動物の脾臓、肝臓、血液、及びリンパ節から細胞を単離し、そしてサイトカイン分泌アッセイ(Miltenyi・Biotec)を使用して分析した。ＯＶＡ‐パルスされた自己抗原提示細胞で一晩細胞を刺激し、そして捕捉剤(免疫細胞の表面上のＣＤ４５エピトープ及びＩＦＮ-γを認識する双方に特異的な抗体)で標識した。抗原刺激に対する認識できかつ応答できる細胞のいずれかは、サイトカインを合成し、かつ分泌した。該サイトカインは、細胞結合捕捉剤により捕捉されて、その表面にＩＦＮ-γ結合マーカーをもたらす。次にＩＦＮ-γに対する蛍光標識抗体で、及び様々なフェノタイプマーカーで細胞を標識し、そしてフローサイトメトリーにより分析することにより、活性化されてＩＦＮ-γを分泌する特定の細胞型の検出を許容した。
【０１７４】
[00225]  免疫化マウスの血漿における抗原特異的ＩｇＧのレベルを決定するように、液性応答の分析を設計した。血液を心臓穿刺により収集し、そして遠心して血漿を収集した。抗原特異的免疫グロブリン生産を、終点希釈ＥＬＩＳＡ法を使用して計測し、ＩｇＭ、ＩｇＧ、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａサブクラスの全タイターを計測した。貯蔵血漿試料を連続的に希釈し、そしてＯＶＡ被膜プレートに撒き、希釈試料中のＯＶＡ特異的抗体を補足した。ＯＶＡ特異的抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼ接合ウサギ-抗マウスＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａ抗体、及びＴＭＢ基質で検出した。比色反応の吸光度を、４５０ｎｍで、ＥＬＩＳＡプレート・リーダーで検出し、そして終点希釈タイターは、０.０５のカットオフ値で、未処理動物の吸光度より二倍高い吸光度をもたらす最も希釈度の高い血漿として定義された。このことは、血清転換及び応答程度を評価するために、並びに応答のＴｈ型を評価するために使用された。
【０１７５】
[00226]  図１０及び１１のいずれもが、ＯＤＮ１ｍのその非メチル化対応物ＯＤＮ１に対する標準化を図示する。それぞれの図の各々の棒が、メチル化ＯＤＮで処理されたある動物群(群ごとに５匹)と、非メチル化対応物で処理された第二の群と直接的な比較を表し、ここで各々のオリゴヌクレオチドは、同一の脂質粒子中に脂質封入された。各々の群において、非メチル化集合の結果を１００％に合わせ、そしてメチル化群をこの１００％の基準に対して計測した。棒が２００％に等しいとき、これはカットオフ値であり、実際は２００％の線は、２００％又はそれ以上の値を示す。
【０１７６】
[00227]  図１０は、上記のサイトカイン放出アッセイの結果を示す。該図は、一連のスクリーニングにわたって、メチル化及び非メチル化脂質封入オリゴヌクレオチドの両者が各々免疫応答を示すが、非メチル化ＯＤＮに対してメチル化ＯＤＮＡを比較したとき、図１０Ａ、Ｂ、及びＣそれぞれにおけるサイトカイン分泌により示される樹上細胞、ＮＫ細胞、及びＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を刺激する点において、メチル化オリゴヌクレオチドは、非メチル化オリゴヌクレオチドと同じであるか、しばしばそれ以上出あったということを図１０は示す。
【０１７７】
[00228]  処置の結果及びＣＴＬ分析を図１１Ａ〜Ｃにおいて示す。これらの図は、免疫応答を刺激する、メチル化及び非メチル化ＯＤＮの能力を再度示す。しかしながら、図１１Ａ及びＢがさらに、メチル化又は非メチル化封入ＯＤＮで処置される動物のスクリーニングにわたって、各々の四量体及びＣＴＬ分析において、メチル化オリゴヌクレオチドが、細胞障害性Ｔリンパ球及び４量体リンパ球細胞の増殖を刺激する点で、非メチル化ＯＤＮにくらべて一貫して優れているということを示した。さらに、図１１Ｃは、代表的な四量体研究からのデーターを示し、ここで全体の平均は、図１１Ｂにおいて示される。ＯＤＮ５、ＯＤＮ５ｍ、ＯＤＮ７、及びＯＤＮ７ｍの各々は、上記プロトコルごとに試験された。脂質封入されたＯＤＮ５ｍ及びＯＤＮ７ｍは、脂質封入非メチル化対応物と比較して、多数の抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を誘導することが図１１Ｃにおいて明らかに示される。
【０１７８】
[00229]  図１０及び１１の各々から、メチル化ＯＤＮ１ｍでの免疫化によりもたらされる免疫刺激は、その非メチル化オリゴヌクレオチド対応物での同じ処置より、一貫して少なくとも等しく、そして優れていることが多いということが示される。これは次の実施例においてさらに示される。
【０１７９】
実施例６
ＥＧ７-ＯＶＡ腫瘍モデルにおけるメチル化及び比メチル化オリゴヌクレオチドの抗腫瘍効果の比較
[00230]  本明細書中のいたるところで記述されるように、本発明のある態様は、抗原と会合して結合する脂質-メチル化核酸製剤の使用を含み、in vivoにおける抗原に対する免疫応答を刺激する。
【０１８０】
[00231]  皮下免疫化により誘導される抗腫瘍効力は、予防的免疫化モデルにおいて、Ｃ５７ＢＬ/６(群あたり５匹)で評価された。０、７、及び１４日目のｑ７ｄ×３の投与計画に基く、１００μｇのオリゴヌクレオチド、２０μｇのＯＶＡ抗原投与量の３回の皮下注射でマウスを免疫化した。動物を次に、２１日目において、２.５×１０6のＯＶＡ発現腫瘍細胞Ｅｇ.７の皮下注射に供した。マウスを週３回計測して、腫瘍成長及び重量増加を評価した。コントロールのマウスは、上記の同じ投与計画に基いて、ＰＢＳ又はＨＢＳのうちの１と２０μｇのＯＶＡ抗原で注射された。２５：４５：２０：１０の比のＰＯＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ１４又はＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ１４のうちの１の脂質組成を有する脂質粒子中に封入された。メチル化と非メチル化オリゴヌクレオチドとの全ての比較は、同様の脂質粒子を使用して行われた。これらの効力実験の結果を、図１２〜１５、１８〜２１、及び２５〜２８において詳述した。各々の図の０日目は、各々の動物が、腫瘍細胞を接種された日である。
【０１８１】
[00232]  図１２は、動物が、遊離ＯＤＮで免疫化されるときの効力傾向を示す。示される結果は、先行技術と一致し、つまり、実験動物が遊離オリゴヌクレオチドを投与されるとき、メチル化オリゴヌクレオチドは、腫瘍成長を低減するという点で、非メチル化オリゴヌクレオチドより、少ない治療効力を有するということを示す。特に、ヌクレアーゼ分解を避けるためにＰＳ骨格を有する遊離非メチル化ＯＤＮ１及びＯＤＮ２は、腫瘍成長の点において、メチル化対応物、ＯＤＮ１ｍ及びＯＤＮ２ｍよりかなりの低減を示した。このことは、メチル化オリゴヌクレオチドの腫瘍成長割合が、ＰＢＳ緩衝液でのみ処理されたコントロールの動物の腫瘍成長割合に達するとき、腫瘍接種の約２５日後で特に顕著であった。
【０１８２】
[00233]  図１３〜１５は、特にオリゴヌクレオチドが天然ホスホジエステル(ＰＯ)骨格を含む場合、オリゴヌクレオチドの封入が、非メチル化オリゴヌクレオチドに対するメチル化オリゴヌクレオチドの同等か又は優れた治療効力を提供することを示す。図１３は、腫瘍を移植した後、ＰＳ骨格を有する封入されたメチル化ＯＤＮで処置することは、非メチル化ＯＤＮ１での処置に比較して、治療効力において等しいということを示す。対照的に、図１４は、ＰＯ骨格を有する封入されたメチル化ＯＤＮ１ｍ及び非メチル化ＯＤＮ１オリゴヌクレオチドに関する効果を示し、ここで治療効力は、移植後３２日目のメチル化の場合最大であり、一方、非メチル化の場合は、その効力を失う。図１５は、メチル化ＯＤＮ２及びそのメチル化対応物ＯＤＮ２ｍが、実質的に腫瘍成長を低減する点で同一の効力を有したということを示す。従って、ある態様において、ＰＳ骨格で形成されるとき、メチル化オリゴヌクレオチドは、非メチル化対応物と少なくとも同じ程度の効力である。  
【０１８３】
[00234]  図１８、１９、２０、及び２１の各々は、さらに上記効力データーをさらに詳述する。メチル化ＰＳ-ＯＤＮ１ｍの脂質封入が、ＰＳ-ＯＤＮ１の脂質封入より、延長された期間にわたって腫瘍成長を低減する点で、より効果的である治療上の利得を提供したということを図１８は示す。この効力は、さらに、封入ＰＳ-ＯＤＮ１ｍで処置されたマウスの生存率が、ＰＳ-ＯＤＮ１での処置に比較して、図１９において記述される２種の研究で優れているということによりさらに支持された。図１９Ａは、一連の時間点で、腫瘍を有しない動物の割合を示し、そして１９Ｂは、同じ時間点での該研究における動物の生存数を示す。図１９Ｂにおいて明らかに示されるように、ＯＤＮ１及びＯＤＮ１ｍで処置された研究における動物の生存数は、該研究を通して実質的に同一である。しかしながら、メチル化ＯＤＮ１ｍで処置されたとき、腫瘍を持たない動物の割合は、非メチル化ＯＤＮ１での処置と比較して、高いということを図１９Ａは明らかに示す。
【０１８４】
[00235]  同様に、図２０は、２つのオリゴヌクレオチドで処置されたマウスにおける経時的な腫瘍体積を図示する。図２１は、経時的な動物の生存割合を示す。図２０は、動物が封入されたメチル化ＯＤＮ１ｍで処置されたとき、封入された非メチル化対応物であるＯＤＮ１に比較して改良された効力を示す。従って、図２１は、非メチル化ＯＤＮ１での処置と比較して、メチル化ＯＤＮ１ｍで処理されたマウスの生存割合が増加することを示す。
【０１８５】
[00236]  更なる効力試験を、異なる免疫化プロトコルを使用して同じ腫瘍モデル上で行った。この試験において、皮下免疫化により誘導される抗腫瘍効力を、予防免疫化モデルのＣ５７ＢＬ／６において評価した。１００μｇのオリゴヌクレオチド及び２０ｐｇの抗原の投与量で、０日目及び７日目にｑ７ｄ×２の投与計画に基いて、マウスを皮下注射で免疫化した。動物は次に、５×１０5ＥＧ.７の皮下注射を受けた。２１日目においてＯＶＡを発現する腫瘍細胞を週３回モニターし、腫瘍成長及び体重増加を評価した。コントロールのマウスは上記の同じ計画でＰＢＳを注射された。図２４(ｂ)におけるオリゴヌクレオチドを、２５：４５：２０：１０の比のＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ１４の脂質組成を有する脂質粒子中に封入した。メチル化及び非メチル化オリゴの全ての比較を、脂質粒子様を使用して行った。これらの効力実験の結果は、図２４に詳述される。図における０日目は、各々の動物が腫瘍を接種された日である。
【０１８６】
[00237]  図２４は、脂質封入非メチル化ＰＳ‐ＯＤＮ１、脂質封入非メチル化ＰＳ‐ＯＤＮ２、メチル化ＰＳ‐ＯＤＮ１ｍをＥ-G７ＯＶＡ腫瘍抗原と合わせて使用して、実験腫瘍Ｅ-Ｇ７を治療する例を示す。この場合、該腫瘍抗原は、脂質粒子表面に結合されることにより脂質粒子と会合した。オリゴヌクレオチドが、免疫刺激性脂質粒子の非存在下で投与されたとき、メチル化ＰＳ-ＯＤＮ１ｍが腫瘍成長にほとんど影響を与えないということを図２４Ａは示した。対応する非メチル化オリゴヌクレオチドＰＳ-ＯＤＮ１は、腫瘍体積を低減する点で有効であり、一方、非メチル化オリゴヌクレオチドＰＳ-ＯＤＮ２は、腫瘍体積を低減する点で部分的に有効であった。図２４Ｂは、脂質粒子中へのオリゴヌクレオチドの封入が、非メチル化ＰＳ-ＯＤＮ２の効力を、ＯＤＮ１と類似のレベルまで増大するばかりでなく、封入メチル化オリゴヌクレオチドＰＳ-ＯＤＮ１ｍは、封入非メチル化オリゴヌクレオチドよりも有効であることを示した。
【０１８７】
[00238]  図２５〜２８は、オリゴヌクレオチドの封入は、封入非メチル化オリゴヌクレオチドに対して、封入メチル化オリゴヌクレオチドの同等又は大きい治療効力を提供することをさらに示す。図２５は、メチル化ＰＳ-ＯＤＮ５ｍの脂質封入は、期間にわたり腫瘍成長を低減するという点で、非メチル化ＰＳ-ＯＤＮ５の同等物の脂質封入より、有効な治療効果を提供するということを示す。図２６に示されるように、該有効性は、さらに封入メチル化ＰＳ-ＯＤＮ５ｍで治療されたマウスが、非メチル化ＰＳ-ＯＤＮ５で治療に比較して、優れた生存率を有することにより支持された。遊離非メチル化ＰＳ-ＯＤＮ７が、いくつかの抗腫瘍の有利な点を提供する一方で、遊離非メチル化ＰＳ-ＯＤＮ７及びＰＯ-ＯＤＮ７、並びに遊離メチル化ＰＳ-ＯＤＮ７及びＰＯＯＤ７は、腫瘍成長を低減する点では比較的有効ではない。しかしながら、メチル化ＰＯ-ＯＤＮ７ｍの脂質封入は、腫瘍成長を低減する点で有効な治療効果を提供する。同様にこれらの傾向は、これらの同じＯＤＮで処置されたマウスの生存率の点について、図２７において示された。
【０１８８】
実施例７
Ｂ-１６メラノーマ腫瘍モデルにおけるメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの抗腫瘍効力の比較
[00239]  静脈内尻尾免疫化により誘導される抗-腫瘍効力は、治療免疫化モデルのＣ５７ＢＬ/６(各群あたり８匹)において評価された。実験動物を、０日において、３.０×１０5のＥＧ.７Ｂ１６/ＢＬ６マウス・メラノーマ発現腫瘍細胞を皮下注射で接種した。マウスは、４日目に開始し、１４日間１日おきにされる静脈投与であって、その投与量が２０ｍｇ/ｋｇＯＤＮである投与を受けた。マウスは、腫瘍成長及び体重増加を一日おきに計測された。コントロール・マウスは、上記と同じ予定でＨＢＳを注射された。オリゴヌクレオチドを２５：４５：２０：１０の比のＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ１４の脂質組成を有する脂質粒子中に封入した。該効力実験の結果は、図１６及び１７において詳述される。これらの図の一日目は、各々の動物が腫瘍を接種された日である。
【０１８９】
[00240]  図１６は、メチル化ＰＳ-ＯＤＮ１ｍをＢ１６メラノーマ腫瘍を接種された動物に投与する治療効力を、その非メチル化対応物ＰＳ-ＯＤＮ１の投与と比較して示す。脂質粒子中のＰＳ-ＯＤＮ１の封入は、腫瘍体積を、少なくとも封入非メチル化ＰＳ-ＯＤＮ１の腫瘍体積まで低減する点における効力を増大した。
【０１９０】
[00241]  図１７は、２２日目における各々のマウスの平均腫瘍重量を示す。遊離メチル化ＰＳ-ＯＤＮ１ｍで治療されるマウスの平均腫瘍サイズは、緩衝液コントロールで処置されたマウスにおける平均腫瘍サイズとほとんど同じであった。一方、遊離メチル化ＰＳ-ＯＤＮ１で治療されたマウスは、低減された腫瘍成長を示した。対照的に、脂質粒子中に封入されたメチル化ＰＳ-ＯＤＮ１で処置されたとき、腫瘍減少量は、脂質封入非メチル化ＰＳ-ＯＤＮ１で獲得された腫瘍減少量とほとんど同じであった。従って、メチル化オリゴヌクレオチドの脂質封入は、該遊離メチル化オリゴヌクレオチドが少ない又は全く効力をもたない場合であっても、in vivoにおいて腫瘍を治療する際の効力を生み出しうる。
【０１９１】
実施例８
封入オリゴヌクレオチドで治療されたときの、血液浄化レベル
【０１９２】
[00242]  有効な免疫刺激の重要な側面は、免疫系の能力が、特定の抗原に対する抗体の応答を上昇することである。そうした応答を開始する、脂質封入オリゴヌクレオチドと会合される抗原の能力の実証は、図２３に示されるデーターにより例示される。
【０１９３】
[00243]  ＯＤＮ１及びＯＤＮ１ｍの各々は、２種の脂質粒子中に封入された。脂質１(Ｌ１)は、ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ２０であり、そして脂質２(Ｌ２)は、同じであるが、ＰＥＧＣｅｒ２０の代わりにＰＥＧＣｅｒ１４を有する。リポソーム内のＰＥＧＣｅｒ２０の半減期は、ＰＥＧＣｅｒ１４の半減期よりずっと長いことが知られており、それゆえ、ＰＥＧＣｅｒ２０は、脂質粒子中に長い期間残存する。０日目に開始し、そして３週間、週あたり一回投与された。０日目に開始する、マウスを一連の４回の静脈内尻尾注射を行い、そして３週間のあいだ週に一度投与された。血液を、各週ごとの注射１時間後に収集し、そして封入ＯＤＮの存在を分析された。
【０１９４】
[00244]  図２３は、マウスにおける異なる脂質組成物の血液からの排除効果を図示する。該脂質組成物Ｌ１及びＬ２各々は、異なるＰＥＧ-セラミド立体被膜(それぞれＰＥＧ-セラミド-Ｃ-２０及びＰＥＧ-セラミドＣ-１４)を、メチル化又は非メチル化オリゴヌクレオチド、つまりＯＤＮｍ及びＯＤＮ１それぞれと組み合わせて有する。注射１の後、該結果は、組成物に関わらず、血液試料からの封入ＯＤＮｓの両方が循環期間を延長し/排除をゆるやかにすることを示す。しかしながら、各々の注射２，３、及び４では、結果は、長寿命のＰＥＧＣｅｒ２０を含むＬ１リポソーム(Ｌ１-ＯＤＮ１及びＬ１-ＯＤＮ１ｍ)は、短い循環期間/早い排除を有し、一方、短寿命のＰＥＧ-セラミドＣ-１４を含むＬ２-ＯＤＮ１及びＬ２ＯＤＮ１ｍは、ＰＥＧＣｅｒ２脂質を含む脂質粒子で封入されたものより長い循環期間/ゆっくりした排除を有する。
【０１９５】
[00245]  本明細書中に表されるデーターは、２つの特異的点を示す：(１)抗原特異的抗体の誘導；及び(２)非メチル化及びメチル化オリゴヌクレオチドの相対的免疫刺激性能力である。抗原特異的抗体の誘導の点では、初回注射は、ＰＥＧ-セラミド立体障害脂質のＰＥＧ成分に対する抗体の誘導をもたらした。注射された動物の血漿中のこれらの抗体の存在は、オプソニン作用をもたらし、そして引き続いて、ＰＥＧＣｅｒ２０を有するＬ１リポソームで見られる注射２，３、及び４の後、ＰＥＧを含むリポソームの循環からの早い排除をもたらした。しかしながら、ＰＥＧを有しないリポソーム、例えば循環中に即座に解離するＰＥＧＣｅｒ１４を有するＬ２リポソームを注射された動物は、オプソニン化されず、それゆえ比較的長い循環期間を有した。非メチル化対メチル化オリゴヌクレオチドの免疫刺激性の相対的強さの点では、非メチル化オリゴヌクレオチド又は対応するメチル化形態は、同じような割合で排除され、それゆえ、両者とも抗原特異的抗体を誘導することができるということを指し示した。
【０１９６】
実施例９
ＬＮＡ及びアジュバントと組み合わせたＨＢｓＡｇ
[00246]  以下のデーターは、市販のＢ型肝炎ワクチン(リコンビナクス-ＨＢ、Merck；及びエンジェリックスＢ、GlaxoSmith-Kline)及びＬＮＡ/ＯＤＮ１の組み合わせを含むワクチンの免疫効果を決定する。該ワクチンは、市販のワクチン担体に比較して、免疫原性を有意に亢進しかつＨＢｓＡＧ特異的抗体の高いレベルを産出する。初回免疫化の後の効力は注目すべきであり、そしてリコンビナクス-ＨＢ又はエンジェリックスＢで、初回-追加免疫投与計画により免疫化された動物に類似の抗体タイターをもたらした。免疫応答のＴｈ型は、Ｂ型肝炎特異的ＩｇＧ２ａ/ＩｇＧ１抗体の割合に基いて評価された。該ワクチンは、Ｔｈ-１に基く免疫応答を生じることが示され、しばしば細胞性免疫応答を指し示す。それ以上に、ＬＮＡ/ＯＤＮ１は、耐用性を示した。ＬＮＡ/ＯＤＮ１のＩＭ投与の際、局所的炎症又は壊死の徴候は観測されなかった。対照的に、ミョウバンの投与は、ある場合において、温和な局所的炎症反応をもたらした。
【０１９７】
[00247]  材料
市販のＢ型肝炎ワクチン、リコンビナクス-ＨＢ(Merck)及びエンジェリックス(Glaxo Smith-Kline)は、再構成された形態で獲得された。市販のワクチンにおけるＨＢｓＡｇ濃度は、以下のとおりである：リコンビナクス１０μｇ／ｍｌ、及びエンジェリックス-Ｂ２０μｇ/ｍｌ。市販ワクチンの両者は、アジュバントであるミョウバンを０.５ｍｇ/ｍｌで含む１ｍｌの体積中に存在した。
【０１９８】
[00248]  表４は、本研究中で使用される市販のＢ型肝炎ワクチンであるリコンビナクス-ＨＢ(Merck)及びエンジェリックス-B(Glaxo Smith-Kline)の臨床及び実験における組成物及び投与量を示す。
【０１９９】
【表４】
2005525414.tif 000007
【０２００】
[00249]  組換えＢ型肝炎表面抗原は、Aldevron社から購入された。該抗原は、酵母サッカロミセス・セルビシエ(Saccharomyces cerevisae)において産生され、該酵母は、０.０５Ｍリン酸、０.２ＭＮａＣｌ緩衝液(ｐＨ７.２)中に濃度０.６ｍｇ/ｍｌの発現プラスミドであるｐＣＧＡ７、サブタイプ「ａｙｗ」を含んだ。
【０２０１】
[00250]  ＤＳＰＣ及びＤＯＤＡＰをNorthern Lipids (Vancouver, BC)及びAvanti Polar Lipids (Alabaster, AL)からそれぞれ購入した。一方、ＰＥＧ-ＣｅｒＣ１４は、Ｄｒ. Zhao Wang(INEX Pharmaceuticals Corporation)により合成された。コレステロールをSigma(St.Louis, MO)から購入した。ＯＤＮｓ、ＯＤＮ１、ヒト／マウスｃ-Ｍｙｃ・プロト-ガン遺伝子ｍＲＮＡの開始コドン領域１６ｍｅｒのｃ-Ｍｙｃ  ＯＤＮ、及びＣｐＧ・ＯＤＮ２をＩＮＥＸ'ｓ一般的供給者から得た。使用されたポリクローナル抗ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ(Ｈ＆Ｌ)抗体をZymed(San Francisco, CA)から購入した。ＨＲＰの基質、つまり３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)液体基質システムをシグマから購入した。
【０２０２】
[00251]  マウス
メスのＢＡＬＢ/ｃ(６〜８週齢)をHarlan-SpragueDawley (Indianapolis, IN)から購入した。全ての実験動物を、使用前に２週間検疫した。全ての研究は、カナダ動物管理協会(ＣＣＡＣ)及び 動物管理使用委員会(ＩＡＣＵＣ)により設立されたガイダンスに沿って行われた。
【０２０３】
[00252]  ＬＮＡ/ＯＤＮ１の調製。
ＤＳＰＣ/コレステロール/ＤＯＤＭＡ/ＰＥＧ-Ｃｅｒ１４(２０：４５：２５：１０のモル比)から構成されるＬＮＡ及び封入ＯＤＮは、以前に記述された(Semple et al., 2000)とおりに調製された。ＯＤＮ１を含むＬＮＡ製剤は、０.１４(ｗｔ/ｗｔ)に決定されたＯＤＮ対脂質の終比を有した。脂質含量は、Bligh ＆ Dyer抽出に続き、ＤＳＰＣ含量のリン酸アッセイに基いて計算され、一方ＯＤＮは、ＯＤＮ１に対する３１.７Ｇ/ｍｌの吸光係数３１.７ｇ/ｍｌを使用してＡ２６０により定量化された。調製品は、使用前に０.２２μｍのフィルターを通してろ過される。
【０２０４】
[00253]  免疫化
初回-追加免疫モデルにおいて、ＨＢｓＡｇタンパク質を、遊離ＣｐＧ・ＯＤＮ又はＬＮＡ/ＣｐＧ・ＯＤＮ(研究用ワクチン)と一緒に、筋肉内投与した。生物製剤評価研究センター(ＣＢＥＲ)のアジュバントの評価に対する要求に従って、該研究は、抗原のみ又はアルミニウム化合物で免疫賦活された抗原を受けたコントロール群を含み、その結果、研究用アジュバントが、抗原に対する免疫応答を増強するという証拠を提供した。ＬＮＡ/ＣｐＧ・ＯＤＮ・アジュバントの抗原-特異的免疫刺激性質は、特定の免疫グロブリンの生産、及びミョウバン(慣用のワクチン)で誘導される免疫刺激と比較して免疫応答のＴｈ型を評価することに基いて、評価された。
【０２０５】
[00254]  組換えタンパク質では、各免疫化投与量は、１００μｇの遊離又は封入ＯＤＮ及び/又は２５μｇのＡｌ3+(ミョウバン)を伴うか又は伴わない２ｐｇの精製ＨＢｓＡｇタンパク質からなった。市販のＨＢワクチンでは、２５μｇのミョウバンを伴う０.５μｇの抗原は、１００μｇの遊離又は封入ＯＤＮを伴うか又は伴わずに投与された。免疫化は、ｑ１４ｄ×２投与計画に基いた初回-追加投与計画において投与された。ただし、一回のＩＭ注射を受ける群は除かれる。実験条件は、以下の表５において設定される。Ｔｈ型の免疫応答は、特定の型のアジュバントにより影響された。ミョウバンとＨＢｓＡｇとの共投与は、ＩｇＧ１抗体が優勢になるＴｈ-２型免疫応答をもたらす。遊離又は封入ＣｐＧ・ＯＤＮｓの添加は、免疫応答をＩｇＧ２ａ抗体を合成するＴｈ-１型に移行させる。
【０２０６】
[00255]  抗体タイターを初回免疫化の６週間後(ｑ１４ｄ×２の投与計画の初期-追加免疫を受けた動物においては、追加免疫化の４週間後)に決定した。
【０２０７】
【表５】
2005525414.tif 000008
【０２０８】
[00256]  全体の形態学及び注射部位の組織病理学
免疫化の際、局所組織の程度を判別するために、視覚による分類が適用された。
【０２０９】
[00257]  液性免疫原性研究
尻尾に切れ目を入れることにより、ネガティブコントロールの血清を得た。ギルソン製ピペットを使用して収集された血液(５０μｌ)は、ＥＤＴＡチューブに置かれ、そして続いて血漿を得るため遠心された(４℃、１,１４００ｒｐｍ、３０分間)。尻尾に切れ目を入れる方法により、４週、及び６週において血液を集めた。８週においてマウスを屠殺したとき、血液を心臓穿刺により収集し、そして上記のように加工した。各群の５匹のマウスで血漿を貯蔵し、そして２回アッセイした。全ての結果は、各群で計算された平均値と標準偏差として表された。
【０２１０】
[00258]  前記終点希釈ＥＬＩＳＡ法を使用して、抗原特異的免疫グロブリン産生を計測した。該アッセイは、ＩｇＧクラス、つまりＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＨＢｓＡｇ特異的マウスＩｇＧの末端タイターを効果的に計測するために開発された。
【０２１１】
[00259]  該試験は、ＨＢｓＡｇで被膜する固層を使用して、抗体を特異的に捕捉する能力を表す。個々の動物から合わせて貯蔵された血漿サンプルにおいて、ＨＢｓＡｇに特異的な抗体を終着点希釈ＥＬＩＳＡアッセイにより検出し、そして定量化した。簡潔にいうと、１％ＢＳＡ-ＰＢＳ(１時間、３７℃)でブロッキングされたＨＢｓＡｇ(１００μｌの１０μｇ/ｍｌ該溶液は、９６ウェル平底プレートのウェルごとに、４℃で一晩被膜された)の固層を、連続的に(１％ＢＳＡ-ＰＢＳ)で希釈される血漿試料で、ＨＢｓＡｇ特異的抗体を補足するために使用した(１時間、３７℃)。結合ＨＢｓＡｇ特異的抗体は、次に西洋わさびペルオキシダ―ゼ(ＨＲＰ)-結合ウサギ抗-マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ａ(１％ＢＳＡ-ＰＢＳ中に１：４０００：１００μｌ/ウェル)、続いてＴＭＢ液体基質システム(１００μｌ/ウェル、室温で３０分間、遮光)でインキュベーションを行った。反応を１００μｌ/ウェルの２Ｍ硫酸を添加することにより停止し、そしてＥＬＩＳＡプレートリーダー上で、４５０ｎｍで吸光度を計測した。終末希釈タイターを、血漿中で抗体が検出される最も高いＨＢｓＡｇ特異的抗体の希釈度として定義し、ここで該検出は、未処置の動物の血漿の吸光度より２倍高い吸光度(ＯＤ４５０)をもたらす(カットオフ値は０.０５である)。該方法は、免疫化により開始される、血清転換及び抗体応答の程度の評価に適応され、並びに免疫応答のＴｈ型の評価に適応される。
【０２１２】
初回刺激の６週後における血清転換及び抗体応答
[00260]  抗体タイターをＯＤＮ１を含むＬＮＡの伴うか又は伴わないリコンビナクス-ＨＢで免疫化後評価した(図２９)。終末希釈ＥＬＩＳＡ法により、全ＩｇＧタイターを初回刺激の６週後に計測した。全ての調べられた群において、血清転換を初回刺激後６週間で完了した。ＬＮＡ/ＯＤＮ１+ミョウバンの免疫賦活活性は、ミョウバンのみの免疫賦活活性より有意に高いようだ。リコンビナクス-ＨＢをＬＮＡ/ＯＤＮ１と合わせて一回投与することは、リコンビナクスＨＢのみで初回-追加免疫化した免疫応答と類似の免疫応答を産生する。初回-追加免疫投与計画で、ＬＮＡ/ＯＤＮをリコンビナクス-ＨＢを共投与することは、同一の投与計画でリコンビナクス-ＨＢで免疫化した後より、１０倍高い抗Ｂ型肝炎特異抗体タイターをもたらした。
【０２１３】
[00261]  結果を確認するために、ミョウバン又はＬＮＡ/ＯＤＮ１を伴う２Ａｇ/投与量の組換えＨＢｓＡｇでマウスを免疫化した。ＬＮＡ/ＯＤＮ１に対する特定のＩｇＧタイターが、ミョウバンに比較して、１０倍増加することが観測された。(図３０)
【０２１４】
[00262]   これらの結果は図３１においてにおいて支持され、該図３１は、ＬＮＡ/ＯＤＮ１と共投与されるリコンビナクス-ＨＢワクチン一回の免疫化が、初回-追加免疫、ｑ１４ｄ×２の投与計画において投与されたＢ型肝炎ワクチンエンジェリックス-Ｂ、つまり別のミョウバンに基くワクチンと類似の抗ＨＢｓＡｇ抗体タイターを誘導するということを示す。さらに、同一の初回-追加免疫投与計画で与えられたリコンビナクス-ＨＢからの抗体タイターは、同等であるということが示される。筋肉内一回投与免疫化の６週間後に獲得された血漿は、エンジェリックスＢ又はリコンビナクス-ＨＢで初回抗原刺激の６週間後(追加免疫の４週間後)のマウスから獲得された血漿と比較された。抗-ＨＢｓＡｇ・ＩｇＧレベルは、終末点希釈ＥＬＩＳＡにより計測された。
【０２１５】
[00263]  さらに、図３２において示されるデーターは、ＬＮＡ/ＯＤＮ１を、ミョウバンに基くワクチン、例えばリコンビナクス-ＨＢ又はエンジェリックス-Ｂを共投与することが、ワクチンのみの投与と比較して亢進された抗体タイターをもたらすということを図３２に示されるデーターは、さらに確かにする。０.５μｇ/免疫化の抗原投与量でこれらのワクチンを、１００μｇのオリゴヌクレオチド/免疫化と組合わせて注射することは、ワクチンのみの投与と比較して、少なくとも１０倍増加した抗-ＨＢｓＡｇ抗体タイターをもたらす。血漿は、エンジェリックス又はリコンビナクスＨＢでの初回免疫刺激の６週後(追加免疫の４週後)に獲得された。抗-ＨＢｓＡｇ・ＩｇＧレベルを、終末希釈ＥＬＩＳＡにより計測した。
【０２１６】
[00264]  ＬＮＡ/ＯＤＮ１をミョウバンに基くワクチンと混合する研究に基くこれらの結論は、精製組換えＨＢｓＡｇと混合する研究(図３３)でさらに確かにされる。これらのデーターは、ＬＮＡ/ＯＤＮ１及びミョウバンアジュバントの、ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ生産の相乗的効果を示す。ミョウバンアジュバントを、ＨＢｓＡｇに添加することは、抗体のみに比較して抗体産生を亢進する。しかしながら、ＬＮＡ/ＩＯＤＮ１は、より効果的なアジュバントであり、１０倍高いタイターをもたらし、そしてミョウバン及びＬＮＡ/ＯＤＮ１の両者の組み合わせは、抗体タイターのさらなる増加をもたらす。実験動物は、初回-追加免疫実験計画において免疫化された。血漿は、エンジェリックスＢ又はリコンビナクスＨＢで初回抗原刺激した６週後(追加免疫の４週後)に獲得された。
【０２１７】
[00265]  循環期間及び/又は免疫細胞に対する生理活性の増加のため、ＣｐＧ・ＯＤＮのＬＮＡ封入は、アジュバントと同様に、ＣｐＧ・ＯＤＮの免疫刺激の性質を改良する。このことは、ＬＮＡ/ＯＤＮ１と比較して、遊離ＯＤＮ１で免疫化されるとき、誘導される抗原特異的ＩｇＧタイターの比較研究から獲得されるデーターにより確証された。
【０２１８】
[00266]  リコンビナクス―ＨＢ又はエンジェリックスＢワクチン単独で免疫化する、又はＬＮＡ/ＯＤＮ１の組合せで免疫することにより獲得される抗体タイターを評価することは、ＬＮＡ/ＯＤＮ１と共投与されるリコンビナクスＨＢワクチンでの一回投与免疫化が、慣用のワクチンで初回―追加免疫するのと同じ程度高い抗体タイターを誘導するということを示す。ＬＮＡ/ＯＤＮ１を、リコンビナクスＨＢ又はエンジェリックスＢと共投与することは、特定の抗Ｂ型肝炎抗体タイターをもたらし、該タイターは、リコンビナクス―ＨＢ又はエンジェリックス単体で免疫化した後より有意に高い。ＬＮＡ/ＯＤＮ１は、２μｇ/投与量のＨｂｓＡｇで免疫化されたマウスにおいて、ミョウバンの免疫賦活活性より高い免疫賦活活性を示し、そしてＬＮＡ/ＯＤＮ１は、ミョウバンと相乗的に作用した。
【０２１９】
[00267]  免疫応答のＴｈ型は、アジュバントの特定の型により影響された。ＨＢｓＡｇをミョウバンと共投与することは、ＩｇＧ１抗体が優勢になるＴｈ-２型の免疫をもたらす。遊離又は封入ＣｐＧＯＤＮｓの添加は、免疫応答を、ＩｇＧ２ａ抗体を好ましく優勢に合成するＴｈ-１型へと移行させる。獲得される免疫応答の型は、表７に示される。
【０２２０】
【表６】
2005525414.tif 000009
【０２２１】
改変ワクチン対慣用のワクチンで免疫化するときの、免疫のＴｈ型の評価
[00268]  Ｔｈ-１型又はＴｈ-２型を変えて誘導することは、ある感染性疾患に対する保護的免疫に必要とされる。ワクチンにより誘導される応答の型は、その効力に対し致命的でありうる。Ｔｈ-１型応答は、Ｂ型肝炎ウイルス感染を制御する為に必須でありうる。使用されるアジュバントの型は、作られるＴｈ応答の型を、投与された抗原に方向付けることができる。ミョウバンは、強力なＴｈ-２アジュバントであり、現在のＢ型肝炎ワクチン全ての成分である。研究は、ＬＮＡ/ＣｐＧ・ＯＤＮアジュバントが、Ｔｈ-１応答を促進する能力を評価した。ＩｇＧ２ａ/ＩｇＧ１の比率は、Ｔｈ-１優勢(ＩｇＧ２ａ＞＞ＩｇＧ１)、Ｔｈ-２優勢(ＩｇＧ１＜＜ＩｇＧ２ａ)又は混合型Ｔｈ-１/Ｔｈ-２(ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａがほぼ等しい)(比率が０.５〜２.０)応答の主要な指標として使用されうる。ＣｐＧ・ＯＤＮを、ＨＢｓＡｇと共投与することは、抗原特異的ＩｇＧ生産を有意に増加するだけでなく、免疫応答をＴｈ-１応答側に移行した。該効果は、ＬＮＡ剤形においてさらに議論された。
【０２２２】
[00269]  ＣｐＧ・ＯＤＮ/ＬＮＡアジュバントの該特徴は、我々のモデル動物であるＢａｌｂ/ｃマウスが、遺伝的にＴｈ-２型応答を発現しやすいということを考慮に入れると、より顕著である。
【０２２３】
[00270]  全体の形態部位及び注射部位の組織病理学の点において、ＬＮＡ/ＯＤＮ１は、耐用性をよく示す。ＬＮＡ/ＯＤＮ１を筋肉内投与した際、局所的炎症又は壊死の徴候は認められない。対照的に、ミョウバン投与は、ある場合において、穏やかな炎症性反応を示し、そしてある場合、肉芽種の発達を引き起こす。
【０２２４】
実施例１０
該実施例は、液性免疫応答を示す。
１.  ＬＮＡ及びタンパク質抗原に対する液性応答
[00271]  １回の静脈投与に従ったＬＮＡにより誘導されるサイトカイン・プロファイルは、Ｔｈ-１に偏向した状態を指し示す。該状態は、マウス抗体アイソタイプＩｇＧ２ａの刺激により特徴付けられる。ＩｇＧ２ａは、ＬＮＡがウシ胎児血清などのタンパク質抗原と共混合され、かつマウスに皮下投与されたときに観測される。ＤＮＡコアが、ＣｐＧモチーフを含まない場合、強力なＩｇＧ１応答が観測されるが、ＣｐＧを含む粒子は、免疫系を高いタイターのＩｇＧ２ａアイソタイプを生産するように方向付ける(図３４)。１回の静脈投与の後のＬＮＡのみにより誘導されるサイトカイン・プロファイルは、Ｔｈ-１への偏向を示し、該偏向はマウス抗体アイソタイプＩｇＧ２ａの刺激により特徴付けられる。これは、ＬＮＡが、タンパク質抗原、例えばウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)と共混合され、そしてマウスに皮下投与されたとき、観測される。ＤＮＡコアが、ＣｐＧモチーフを含まない場合、強力なＩｇＧ１応答が観測されるが、ＣｐＧを含む粒子は免疫系をＩｇＧ２ａアイソタイプの高いタイターを生産するように方向付けられる(図３４)。
【０２２５】
２.  抗原をＬＮＡプラットホームに結合することは、液性応答を高める。 
[00272]  他の粒子性アジュバントに対するＬＮＡプラットホームの利点は、疾患に関連する抗体が、疎水性アンカーを使用して形成前の粒子に直接結合されうるということである。抗原及びアジュバントが結合され、その結果それらが同時にＡＰＣｓに運搬されるとき、免疫応答の性質の有意な亢進は、認識されうる。例えば、ＬＮＡ(マウス免疫系を活性化するように最適化されたＩＳＳを含む)は、アルブミン(ＯＶＡ)タンパク質と結合され、ＬＮＡは、マウス中で全ＯＶＡ特異的ＩｇＧのタイターを誘導し、該タイターは、ＯＤＮ２及びＯＶＡが単純に混合されるときに観測されるレベルより、又は標準アジュバントに比較して１００倍高いタイターである(図３６)。現在、非ヒト適用の最も活性の高い市販のアジュバントの組み合わせは、イムノイージー(ImmunoEasy)(CpGオリゴと混合されたミョウバン)であり、該薬は、高いＩｇＧタイター及び早い血清転換を注目される。しかしながら、我々のデーターは、オリゴバックス(OligoVax)-ＯＶＡ粒子が、一回の投与の２週間後に生じるＯＶＡ特異的ＩｇＧのレベルの点でイムノイージー並びに他の多くのアジュバントを有意に上回る(図３６)。
【０２２６】
３.  粘膜免疫応答のＬＮＡ誘導
[00273]  多くのワクチンが全身免疫を誘導するように設計される一方で、粘膜表面は、感染性疾患の侵入及び伝染の最初の部位である。それゆえ、強力な粘膜応答を誘導するワクチン戦略は、多くの予防効果を示すことを期待される。しかしながら、ＩｇＡ抗体(優勢粘膜免疫グロブリン)の誘導は、難しいと証明されてきた。周知の最も強力なアジュバントは、コレラトキシン(ＣＴ)であるが、ヒトに適用するにはあまりに毒性が高い。注目すべきことに、以下の３回の毎週鼻腔内の投与の後に、ＬＮＡ-ＯＶＡ粒子は、ＯＶＡと混合されたＣＴを使用して獲得されるよりずっと大きいＩｇＡ応答を導いた(図３５)。亢進されたＩｇＡタイターは、血清中並びに肺及び膣洗浄液中に見つかる。
【０２２７】
実施例１１
ＬＮＡ製剤を使用した抗原特異的粘膜免疫応答の刺激
[00274]  該実施例は、標的抗原、ニワトリ卵白アルブミン(ＯＶＡ)を含む脂質核酸(ＬＮＡ)製剤に対するＩｇＡ及びＩｇＧ免疫応答の刺激を記す。
オリゴヌクレオチド
[00275]  本研究で使用されるオリゴヌクレオチド(ＯＤＮｓ)は、ホスホロチオエート(ＰＳ)骨格で合成された。各々ＯＤＮの配列は以下のとおりである。
ＯＤＮ＃２ＰＳ  配列番号１  ５'-ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ-３'  
ＯＤＮ＃１ＰＳ  配列番号２  ５'-ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ-３'  
ＯＤＮ＃３ＰＳ  配列番号３  ５'-ＴＡＡＧＣＡＴＡＣＧＧＧＧＴＧＴ-３'  
【０２２８】
ＬＮＡ製剤の調製
[00276]  ＬＮＡは、ＯＤＮ＃１ＰＳ，ＯＤＮ＃２ＰＳ、又はＯＤＮ＃３ＰＳ、及びＯＶＡを標的抗原として使用して調製される。特に、ＬＮＡ製剤は、脂質混合体  ＤＳＰＣ：ＣＨ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧ-Ｃ１４(２０：４５：２５：１０  ｍｏｌ％)を伴うＯＤＮｓを、米国特許第6,287,591号に開示されるエタノールに基く手法を使用して、剤形することにより調製された。該開示は、本明細書中に援用される。それにより、ＯＤＮ＃１ＰＳ又はＯＤＮ＃２ＰＳ、又はＯＤＮ＃３ＰＳは調製された。得られたリポソームの粒子サイズは、１００〜１４０ｎｍであった。
【０２２９】
[00277]  オリゴヌクレオチドＯＤＮ＃１ＰＳ、ＯＤＮ＃２ＰＳ、及びＯＤＮ＃３ＰＳは、以前に記述されるエタノール透析手法及びイオン化アミノ脂質(例えばSemple et al., Methods Enzymol. (2000) 313: 322-341 ; Semple et al., Biochem. Biophys. Acta. (2001) 1510 (1-2): 152-166)を参照のこと)を使用して脂質粒子中に封入された。ＯＤＮｓを次に３００ｍＭクエン酸緩衝液(ｐＨ４.０)中に水和し、そして８０℃で５分間前もって温めて、次にモノマーＯＤＮｓの存在を保証するように剤形した。脂質製剤は、２０/４５/２５/１０のモル比のＤＳＰＣ/ＣＨ/ＤＯＤＡＰ/ＰＥＧ-Ｃｅｒ１４からなった。各々のＯＤＮは、エタノール中に溶解した脂質混合体をＯＤＮのクエン酸溶液にゆっくり加えて、エタノールの終濃度４０％(ｖｏｌ/ｖｏｌ)を与えることにより、分離して封入された。最初のＯＤＮ対脂質比(ｗｔＯＤＮ対ｗｔ脂質総量)は０.２５であった。ＯＤＮ脂質混合体は、約６５℃で維持されたサーモバレル突出機(Lipex Biomembranes, Vancouver, BC Canada)を使用して、２層の１００ｎｍポリカーボネート・フィルター(Osmonics, Livermore, CA)を１０回通された。非封入ＯＤＮは、最初に３００ｎＭクエン酸緩衝液、ｐＨ４.０で１時間透析し、次にＨＢＳ(１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.５)で一晩透析し、続いてＤＥＡＥ-セファロースＣＬ-６Ｂアニオン交換クロマトグラフィーを行うことにより、製剤から取り除かれた。製剤のＯＤＮ濃度は、分光光度計において２６０ｎｍで分析することにより決定された。ＬＮＡ粒子の平均直径及びサイズ分布は、ＮＩＣＯＭＰ・Ｍｏｄｅｌ３７０サブミクロン粒子サイザーを使用して決定され、そして、典型的には１００+/-３０ｎｍであった。
【０２３０】
免疫化及びサンプル分離
[00278]  Ｃ５７ＢＬ／６マウス(６週齢)を、２０μｌの以下の試験製剤で、０日目(初回免疫化)、及び初回免疫化後７日目、１４日目に、鼻腔内投与により免疫化した。
【０２３１】
[00279]  図３７〜３９では、
ＯＶＡのみ  
１０ｍｇのＣＴ（ＯＶＡ＋ＣＴ）と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃２（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃２)と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃１（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃１)と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃３（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃３)と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃２を含むＬＮＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ-ＯＤＮ＃２)と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１)と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃３を含むＬＮＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ-ＯＤＮ＃３)と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ (ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１)
【０２３２】
[00280]  マウスは、免疫化につき７５μｇの投与量でＯＶＡタンパク質を受けた。遊離又は封入ＯＤＮを１、１０、及び１００μｇの投与量で投与した。
[00281]  図４２及び図４３では：
ＰＢＳのみ
１０ｍｇのＣＴ（ＯＶＡ＋ＣＴ）と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃１（ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１）を含むＬＮＡ
ＯＤＮ＃２（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃２）と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃２を含むＬＮＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ-ＯＤＮ＃２）と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃１（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃１）と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１）と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃３（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃３）と共投与されるＯＶＡ
ＯＤＮ＃３を含むＬＮＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ-ＯＤＮ＃３）と共投与されるＯＶＡ
【０２３３】
[00282]  マウスは、各免疫化毎に７５μｇの投与量でＯＶＡタンパク質を受けた。遊離又は封入ＯＤＮは、１００μｇの投与量で投与された。
【０２３４】
[00283]  各々の処置群(ｎ＝５)をハロタンで麻酔し、ワクチンの液滴を完全に吸入されるよう外鼻に適用した。初回免疫化後２８日目に、血漿は、麻酔されたマウスから心臓穿刺により収集され、そして血清チューブに置かれた。膣洗浄液は、５０μｌのＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水)を、各々のマウスの膣内にピペットで出し入れすることにより獲得された。この方法は、３回繰り返され、その結果全体で１５０μｌの洗浄液を収集した。マウスは続いて頚椎脱臼により屠殺し、そして気管にチューブを挿入し、そして次に１ｍｌのＰＢＳをピペットで肺に出し入れすることにより肺洗浄は行われた。この手順で回収された体積は通常７０〜８０％であった。血清チューブは、室温で３０分間放置して、凝固させ、次に４℃１０,０００ｒｐｍ(分あたりの回転数)で５分間遠心し、そして得られた一定分量の血清を収集して-２０℃で分析まで貯蔵した。血清の一定分量もまた、分析まで-２０℃で貯蔵した。
【０２３５】
免疫応答のＥＬＩＳＡ評価
[00285]   血清、肺洗浄液、及び膣洗浄液中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体を、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着測定法)により計測した。マイクロタイター・プレート(９６ウェル)を、４℃で一晩、ＰＢＳ(５０μｌ)中に希釈された５μｌ/ｍｌＯＶＡで被膜した。マイクロタイター・プレートを、０.５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(ＰＢＳＴ)で洗浄し、そして、ＢＳＡ-ＰＢＳＴで希釈されたＨＲＰ(西洋わさびペルオキシダーゼ)結合やぎ抗マウスＩｇＧ(１：４０００)又はＨＲＰ結合やぎ抗-マウスＩｇＡ(１：１０)を伴って、ＰＢＳＴ中の１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)２００μｌで３７度で１時間ブロッキングした。プレートをＴＭＢ(３，３'，５，５'-テトラメチルベンジジン)(１００μｌ)と室温で３０分間インキュベーションし、次に該反応を５０μｌの０.５Ｍ Ｈ2ＳＯ3で反応をとめることにより完成させた。光学的密度は、４５０から５７０ｍｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを利用して読まれた。
【０２３６】
結果
[00286]  結果は、図３７〜３９において示されて、血清、肺洗浄、及び膣洗浄液中の抗体タイターを示す。
【０２３７】
[00287]  ＬＮＡ製剤と共投与されるＯＶＡを使用する試験製剤では、ＯＤＮと共投与されたＯＶＡ、ＣＴと共投与されたＯＶＡ、ＯＶＡのみ、又はＬＮＡ-ＯＤＮ＃１のみでの投与に対し数桁の大きさで、抗-ＯＶＡ-特異的ＩｇＡレベルが局所粘膜部位及び遠位粘膜部位の両部位において増大した、ということを図３７〜３９(ｂ)は示す。ＬＮＡ製剤と共投与されるＯＶＡを使用する試験製剤では、ＯＤＮと共投与されたＯＶＡ、ＣＴと共投与されたＯＶＡ、ＯＶＡのみ、又はＬＮＡ-ＯＤＮ＃１のみに対し数桁大きさで、抗ＯＶＡ-特異的ＩｇＧレベルが局所粘膜部位及び遠位粘膜部位の両部位において増大した、ということを図３７〜３９(ａ)は示した。本発明のＬＮＡ製剤中のＯＤＮｓのリポソーム封入が、ＯＤＮと共投与されるＯＶＡ、ＣＴと共投与されるＯＶＡ、ＯＶＡのみ、又はＬＮＡ-ＯＤＮ＃１で共投与されるＯＶＡに対して、数桁の大きさで抗ＯＶＡＩｇＭタイターを増大した。該応答は、投与量依存的であった。
【０２３８】
[00288]  図４２及び４３は、膣洗浄液及び肺洗浄液における抗体タイターを示す。
【０２３９】
[00289]  ＯＤＮ＃１、ＯＤＮ＃２、及びＯＤＮ＃３を含むＬＮＡ製剤と共投与されるＯＶＡを使用する試験製剤では、ＯＤＮ＃１、ＯＤＮ＃２、及びＯＤＮ＃３で共投与されたＯＶＡ、ＬＮＡ-ＯＮＤ＃１のみ、ＣＴで共投与されるＯＶＡ、及びＰＢＳのみに対し数桁大きさで、抗ＯＶＡ-特異的ＩｇＡレベルが局所粘膜部位及び遠位粘膜部位の両部位において増大した、ということをこれらの図は示す。
【０２４０】
実施例１２
ＯＶＡ結合ＬＮＡ製剤を使用して、抗原-特異的粘膜免疫応答の刺激
[00290]  免疫刺激性ＣｐＧモチーフを有する合成オリゴデオキシヌクレオチド(ＩＳＳ・ＯＤＮｓ)を含む脂質核酸(ＬＮＡ)製剤を使用し、そしてオブアルブミン(ＯＶＡ)を標的抗原として共投与することにより、該実施例は、標的抗原に対する粘膜免疫応答を刺激することを示す。
オリゴヌクレオチド
[00291]  １つのＣｐＧモチーフを有するＩＳＳ・ＯＤＮ、ＯＤＮ＃１及びＯＤＮ＃２は、該実施例において使用され、そしてホスホロチオエート(ＰＳ)骨格で合成した(ＯＤＮ＃２ＰＳ、及びＯＤＮ＃１ＰＳ)。各ＯＤＮの配列は、上記実施例１１中に提供される。
【０２４１】
ＬＮＡ製剤の調製
[00292]  ＯＤＮ＃１ＰＳ又はＯＤＮ＃２ＰＳを含むＬＮＡ製剤は、米国特許第6,287,591号において十分に記述されるエタノールに基く手順を使用して、ＯＤＮｓを、脂質混合体ＤＳＰＣ:ＣＨ:ＤＯＤＡＰ:ＰＥＧ-Ｃ１４(モル比で２０：４５：２５：１０)と製剤化することにより調製された。それにより、ＯＤＮ＃１(ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１ＰＳ)又はＯＤＮ＃２(ＬＮＡ-ＯＤＮ＃２ＰＳ)を調製した。ＯＤＮ各々の異なる２つの量、１０μｇ及び１００μｇは、ＬＮＡ製剤を調整するために使用された。得られたリポソームの粒子サイズは、１００〜１４０ｎｍであった。ＣＴと共投与されるＯＶＡは、コントロールとして使用された。
【０２４２】
ＯＶＡが結合するＬＮＡ製剤の調製
[00293]  製剤を調整するために２つの方法が使用された。両方法は、チオレーション手法により活性化されるＯＶＡタンパク質に頼る。活性化タンパク質は、標準のフルファヒドリル化学で、活性化脂質種、例えばＤＳＰＥ-ＰＥＧ-ＭＰＢに化学的に直接結合した(例えば、Harasym et al., Bioconjugate Chemistry (1995) 6: 187; Hermanson et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996) 230-232; Ansell et al., Antibody conjugation methods for active targeting of liposomes pages 51-68 in Drug targeting: strategies, principles and applications, Methods in Molecular Medicine, Vol 25, Francis, GE.及びDelgado C.著 , Human PressInc., Totwa, New Jerseyを参照のこと)。 
【０２４３】
[00294]  反応性脂質をＬＮＡ製剤へ挿入する２つの方法が存在する。
1)  ＬＮＡ製剤のほかの脂質成分全てが、上記エタノール手順の間混合されるとき、該反応性脂質を添加する。脂質が製剤中に存在した後、ＯＶＡを次に脂質に結合した。これは、活性化結合と呼ばれ、以下に詳述される。
２)  第二の方法は、まず、脂質をＯＶＡタンパク質と混合することを必要とする。該混合構成は、次に前もって形成されたＬＮＡ製剤へと挿入される。これは、受動結合と呼ばれ、そして以下に詳細に記載される。
【０２４４】
ＯＶＡタンパク質のＳＰＤＰでのチオレーション
[00295]  ＯＶＡ(４０ｍｇ)を、ＨＢＳ(１ｍｏｌ；２５ｍＭ・Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、ｐＨ７.４)中に溶解した。ＳＰＤＰ(３-(２-ピリジルジチオ)プロピオン酸Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド・エステル)のストック溶液を、エタノール中(28.8：１、ＥｔＯＨ/ＳＰＤＰ・ｍｇ)に調製し、そして一定分量(４０：１)は、ＯＶＡ溶液をボルテックスしながらＯＶＡ溶液へと添加した。該溶液を、室温で３０分間攪拌し、そしてセファデックス(Sephadex)Ｇ-５０カラム(１５ｍｉｌ、ＳＡＳ(酢酸ナトリウム生理食塩水)ｐｈ４.４)を通した。分画は、１６滴が落ちた後に採集し、そして２８０ｎｍで分光光度計で分析し、そしてＡ２８０(２８０ｎｍでの吸光度)で１より大きいの分画が、混合された。典型的には、２.５〜３ｍｌの保護チオレートタンパク質は、この方法を使用して生産される。ＤＴＴ(ジチオスレイトール、３.８ｍｇ/ｍｌ溶液)は、次に直接固体として添加され、そして溶液は１５分間攪拌した。溶液は、セファデックスＧ-５０カラム(ＨＢＳ中５０ｍｌ、ｐＨ７.４)を通過し、２０〜２４の滴分画を収集した。該分画は、分光光度計の２８０ｎｍで分析し、そして、Ａ２８０で１より大きい分画は混合された。混合分画の一定分量を、ＨＢＳ(Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水)で１０倍に希釈し、そしてＨＢＳをコントロール・サンプルとして使用した。タンパク質愛用量を、１.８の係数を適用することにより、吸光度を濃度(ｍｇ/ｍｌ)へと変換した。
【０２４５】
活性結合を使用したＬＮＡタンパク質接合体の調製
[00296]活性化結合技術は、活性タンパク質が化学的に、脂質粒子中に取り込まれた反応性脂質へ直接結合させるプロトコルを指す。
【０２４６】
[00297]  エタノール(１.２ｍｌ)中のＤＳＰＣ/Ｃｈｏｌ/ＭｅＰｅｇｓ-２０００-ＤＭ/ＤＯＤＡＰ/ＤＳＰＥ-ＡＴＴＡ２-ＭＰＡ(３２：４５：２：２０：１、ｍｏｌ/ｍｏｌ)は、６０℃まで熱せられ、そしてＯＤＮ＃１(1.8ｍｌの３００ｎＭクエン酸塩ｐＨ4.0中１２ｍｇ)の溶液をゆっくり加えた。該溶液は、前もって６０度に熱せられてあった。添加の間、溶液を勢いよく攪拌した。粗製ＬＮＡは、６５℃に設定された突出装置を使用して、２つの１００ｎｍフィルターを１０回通した。得られた大きさを整えられた粗製ＬＮＡは、セファデックスＧ-５０カラム(５０ｍｌ；ＨＢＳ)を通して、即座に使用された。おおよその脂質濃度は、脂質のほとんどが、カラムから回収されたと想定して見積もられた。
【０２４７】
[00298]  
次にチオール化ＯＶＡを、初期タンパク質対脂質比率、１５０ｇ/ｍｏｌで、活性化ＬＮＡ粒子に添加し、そして室温で１６時間攪拌した。得られたＬＮＡ-タンパク質(又はＬＮＡ-ＯＶＡ)接合体をセファロースＣｌ-４Ｂカラム(２５ｍｌ；ＨＢＳ、カラムあたりサンプル量１ｍｌまで)で、未反応のタンパク質から分離した。
【０２４８】
受動的カップリングを使用したＬＮＡ-タンパク質複合体の調製
[00299]  受動的カップリング技術は、活性化タンパク質を最終反応性脂質から離れた反応性脂質と結合し、そして同じ方法、つまり前もって形成された粒子内に交換されることにより、又は粒子形成段階の間に取り込むことにより、粒子内へ取り込まれるプロトコルを指す。
【０２４９】
[00300]  ＬＮＡ粒子を上記の通りに調製した。ＤＳＰＥ-ＡＴＴＡ２-ＭＰＡ/ＤＳＰＥ-ＡＴＴＡ４-ＮＢＯＣ(１：４)のミセル溶液を、最少量のエタノール膣中に脂質を溶解し、そしてゆっくりＨＢＳを添加し、脂質集濃度を１０ｍＭにすることにより、調製した。該溶液の一定分量を、ＯＶＡ(ｇ)/脂質(ｍｏｌ)の比率３０００で上記チオール化ＯＶＡに添加し、そして室温で一晩攪拌させた。ＬＮＡにおける１５０ＯＶＡ(ｇ)/脂質(ｍｏｌ)に一致する該溶液の一定分量をＬＮＡの試料に添加し、水浴中に６０℃で１時間インキュベーションした。該溶液を、セファロースＣＬ-４Ｂカラム(２５ｍｌ、ＨＢＳ、１カラムにつき１ｍｌまでのサンプル)を通過させた。
【０２５０】
免疫化及び試料の単離
[00301]  ０日目(初回免疫化)、初回免疫化の７日後、及び１４日後で、鼻腔内投与により、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を２０μｌの以下の試験製剤で免疫化した。
[00302]  図４０及び図４１では、
投与量１０μｇのＯＤＮ＃１ＰＳと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃１ＰＳ）
投与量１００μｇのＯＤＮ＃１ＰＳと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃１ＰＳ）
投与量１０μｇのＯＤＮ＃１ＰＳを含むＬＮＡと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１ＰＳ）
投与量１００μｇのＯＤＮ＃１ＰＳを含むＬＮＡと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ＃１ＰＳ）
投与量１０μｇのＯＤＮ＃１を含むＬＮＡに結合するＯＶＡ（ＯＶＡ／ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１ＰＳ）
投与量１００μｇのＯＤＮ＃１を含むＬＮＡに結合するＯＶＡ（ＯＶＡ／ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１ＰＳ）
投与量１０μｇのＣＴと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＣＴ）
投与量１０μｇのＯＤＮ＃２を含むＬＮＡと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ／ＬＮＡ-ＯＤＮ＃２ＰＳ）
【０２５１】
[00303]  マウスは、１回の免疫化あたり７５μｇの投与量でＯＶＡタンパク質を受けた。
【０２５２】
[00304]  図４４〜４６では、
投与量１００μｇのＯＤＮ＃１を含むＬＮＡに結合するＯＶＡ（ＯＶＡ／ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１ＰＳ）
投与量１０μｇのＯＤＮ＃１を含むＬＮＡに結合するＯＶＡ（ＯＶＡ／ＬＮＡ-ＯＤＮ＃１ＰＳ）
投与量１００μｇのＯＤＮ＃１ＰＳを含むＬＮＡと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ＃１ＰＳ）
投与量１０μｇのＯＤＮ＃１ＰＳを含むＬＮＡと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＬＮＡ＃１ＰＳ）
投与量１００μｇのＯＤＮ＃１ＰＳと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃１ＰＳ）
投与量１０μｇのＯＤＮ＃１ＰＳと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＯＤＮ＃１ＰＳ）
１０μｇのＣＴと共投与されるＯＶＡ（ＯＶＡ＋ＣＴ）
ＰＢＳのみ
【０２５３】
[00305]  マウスは、１免疫化ごとに７５μｇの投与量のＯＶＡタンパク質を受けた。
【０２５４】
[00306]  各々の処置群(ｎ＝５)は、ハロタンで麻酔され、ワクチンの液滴を完全に吸入されるよう外鼻に適用された。初回免疫化後２８日目に、血漿は、麻酔されたマウスから心臓穿刺により収集され、そして血清チューブに置かれた。膣洗浄液は、５０μｌのＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水)を、各々のマウスの膣内にピペットで出し入れすることにより獲得された。この方法は、３回繰り返され、その結果全体で１５０μｌの洗浄液を収集した。続いてマウスを頚椎脱臼により屠殺し、そして気管にチューブを挿入し、そして次に１ｍｌのＰＢＳをピペットで肺に出し入れすることにより、肺洗浄を行った。この手順で回収された体積は通常７０〜８０％であった。血清チューブは、室温で３０分間放置して、凝固させ、次に４℃１０,０００ｒｐｍ(一分間の回転数)で５分間遠心し、そして得られた一定分量の血清を収集して-２０℃で分析までのあいだ貯蔵した。
【０２５５】
免疫応答のＥＬＩＳＡ評価
[00307]  血清、肺洗浄液、及び膣洗浄液中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体を、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着測定法)により計測した。マイクロタイター・プレート(９６ウェル)を、４℃で一晩、ＰＢＳ(５０μｌ)中に希釈された５μｌ/ｍｌＯＶＡで被膜した。マイクロタイター・プレートを、０.５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(ＰＢＳＴ)で洗浄し、そして、ＢＳＡ-ＰＢＳＴで希釈されたＨＲＰ(西洋わさびペルオキシダーゼ)結合やぎ抗マウスＩｇＧ(１：４０００)又はＨＲＰ結合やぎ抗-マウスＩｇＡ(１：１０)を伴って、ＰＢＳＴ中の１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)２００μｌで３７度で１時間ブロッキングした。プレートは、ＴＭＢ (１００μｌ)と室温で３０分間インキュベーションし、次に該反応を５０μｌの０.５Ｍ Ｈ2ＳＯ3で反応をとめることにより完成させた。光学的密度は、４５０から５７０ｍｍで、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを利用して読まれた。
【０２５６】
結果
[00308]  図４０及び４１は、血清、肺洗浄液、及び膣洗浄液中の抗体タイターを図示する結果を示し、図４４及び４５は、膣洗浄液及び肺洗浄液中の抗体タイターを図示する結果を示し、そして図４６は、血清中の抗体タイターを図示する結果を示す。
【０２５７】
[00309]  ＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ製剤に結合するＯＶＡを使用する試験製剤において、ＯＤＮ＃２又は＃１を含むＬＮＡ製剤と共投与されるＯＶＡ、ＯＤＮ＃１と共投与されるＯＶＡ、及びＣＴと共投与されるＯＶＡに対して、抗ＯＶＡ特異的ＩｇＡレベルは、数桁の大きさで、局所及び遠位の両部位で増加したことを図４１は示す。
【０２５８】
[00310]   ＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ製剤に結合するＯＶＡを使用する試験製剤において、ＯＤＮ＃２又は＃１を含むＬＮＡ製剤と共投与されるＯＶＡ、ＯＤＮ＃１と共投与されるＯＶＡ、及びＣＴと共投与されるＯＶＡに対して、抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧレベルは、数桁の大きさで、局所及び遠位の両部位で増加したことを図４０は示す。
【０２５９】
[00311]  ＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ製剤に結合するＯＶＡを使用する試験製剤において、ＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ製剤と共投与されるＯＶＡ、ＯＤＮ＃１と共投与されるＯＶＡ、ＣＴと共投与されるＯＶＡ、及びＰＢＳ単体に対して、抗ＯＶＡ特異的ＩｇＡレベルは、数桁の大きさで、局所及び遠位の両部位で増加したことを図４４は示す。
【０２６０】
[00312]   ＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ製剤に結合するＯＶＡを使用する試験製剤において、ＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ製剤と共投与されるＯＶＡ、ＯＤＮ＃１と共投与されるＯＶＡ、ＣＴと共投与されるＯＶＡ、及びＰＢＳ単体に対して、抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧレベルは、数桁の大きさで、局所及び遠位の両部位で増加したことを図４５及び４６は示す。
【０２６１】
[00313]  要約すると、該データーは、ＯＶＡがＬＮＡ製剤に結合する場合、ＩｇＡ及びＩｇＧ応答が強く亢進されることをこのデーターは示す。例えば、本発明のＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ製剤に結合するＯＶＡで免疫化されたマウスは、遊離又は封入ＯＤＮ＃１と混合されたＯＶＡで免疫化されたマウスと比較したとき、分析された体液の全てにおいてより大きいＩｇＡタイターを示す(図４１及び４４)。投与量応答は、ＬＮＡ製剤に結合したＯＶＡに関して観測され、マウスに投与されたＯＤＮ量が多いほど、より多いＩｇＡ抗体産生をもたらした。ＯＶＡがＬＮＡ製剤に結合することにより、粘膜免疫に重要な意味を有するＩｇＡ抗体を産生するＬＮＡ粒子の能力を増大することができることを該データーは示す。さらに、本発明のＯＤＮ＃１を含むＬＮＡ製剤に結合するＯＶＡで免疫化されるマウスは、遊離又は封入ＯＤＮ＃１で混合されるＯＶＡで免疫化されたマウスと比較するとき、分析される全ての体液で高いＩｇＧを示した(図４０、４５、及び４６を参照のこと)。投与量応答は、ＬＮＡ製剤に結合するＯＶＡに関して観測されて、マウスに投与されるＯＤＮ量が大きいほど、ＩｇＧ抗体の大きい産生量をもたらす。該データーは、ＯＶＡをＬＮＡ製剤に結合することが、ＩｇＧ抗体の産生するＬＮＡ粒子の能力を増大しうる。
【０２６２】
実施例１３
複数の腫瘍付随抗原に関するポリトープ・アプローチを使用したＣＴＬ応答の誘導
[00314]  一つのエピトープに基くアプローチは、ＭＨＣ-制御ＣＴＬ応答が、一つの抗原のみに対して上昇するという欠点を有する。さらに、多くのガン抗原は、非突然変異分化抗原、例えば、上で例示されるＴＲＰ-２であり、そしてそれゆえ宿主中の自己反応性Ｔ細胞は、胸腺教育の間優先的に消去される。ポリトープ・アプローチは、複数の抗原が同時に標的されることを許容し、そしてそうした自己抗原に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答の範囲を増大する。複数の抗原に特異的であり、かつ複数のＭＨＣ対立遺伝子により制御されるＣＴＬ応答は、広い免疫反応性を明白に所望され、腫瘍抗原及び異なる悪性度のＭＨＣ対立遺伝子の可変性発現をあたえられる。特定の悪性度に関する複数の抗原を標的することは、抗原の発現低下又はエピトープの変移により腫瘍エスケープの機会を最小限にする。
【０２６３】
[00315]  複数の抗原及びＭＨＣ対立遺伝子の標的化は、合成ペプチド・エピトープの複数の組換え抗原混合体を使用することによって達成されうる。これらの複数エピトープ抗原に対する免疫応答を改良するために、いくつかのアジュバントがアッセイされている。この実験は、ＰＯＰＣ：ＣＨＬ：ＤＯＤＭＡ：ＤＭＧ(２５：４５：２０：１０、モル比)中に、２種のマウス・メラノーマ抗原、つまりＴＲＰ２(Ｈ２Ｋｂ、ＶＹＤＦＦＶＷＬ)及びＧｐ１００(Ｈ２Ｄｂ、ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ)を封入ＰＳ-ＯＤＮ１ｍと組み合わせて使用した。Ｃ５７ＢＬ/６マウスを、封入ＰＳ-ＯＤＮ１ｍの存在下で、各々の抗原、又は両方で３回注射した。ポジティブ・コントロールとして、ＣＴＬ応答を強力に誘導するとしられる樹上細胞を使用した。複数のエピトープを含むＢ１６ライセートを、ＯＤＮ１ｍ又はＤＣに関して、複数エピトープ免疫化を誘導する能力をアッセイした。免疫応答は、抗原特異的様式でＢ１６腫瘍細胞に対する細胞毒性を仲介するＣＤ８+Ｔ細胞の能力により評価された。
【０２６４】
[00316]  結果：
封入ＯＤＮ１ｍ一緒に注射されるとき、ＣＴＬ応答は、両方の抗原に対して上昇した(図４７)。ＰＳ-ＯＤＮ１ｍは、一緒に運搬された両方の抗原に対するＣＴＬ応答を作る点で、ＤＣと同じくらい優れていた(図４８)。Ｂ１６ライセートをＰＳ-ＯＤＮ１ｍと注射することは、Ｂ１６ライセートとインキュベーションされたＤＣを注射するより、ＣＴＬを誘導する点でより強力であった(図４９)。
【０２６５】
[00317]  提供される実施例は、本発明のある態様を示す。より広い意味で、本発明は、組成物、並びにそうした組成物を使用して、哺乳動物対象(ヒトを含む)に対する治療上の利点を提供する方法を提供する。本発明の組成物は、脂質膜小胞の形態であり、そして前記小胞中に完全に封入される核酸の形態である。特定抗原に対する応答を刺激する場合、組成物は、例えば小胞の外表面に対する化学的共役、疎水結合、又はイオン結合を介して抗原を小胞と会合しうるか、又は小胞中に封入されうる。
【０２６６】
[00318]  好ましい組成物は、核酸が組成物の重量で約４％を占める組成物である。
【０２６７】
[00319]  本発明の組成物中の核酸は、処置された動物のゲノムに相補的でなく、かつ、外哺乳動物の核酸と相補的塩基対形成に依存しないメカニズムを介した免疫化を提供する核酸でありうる。そうした核酸は、ＣｐＧモチーフ又は免疫刺激パリンドロームなどの免疫刺激配列を頻繁に含む。
【０２６８】
[00320]  本発明の組成物中に使用される核酸は、未処置の哺乳動物に遊離形態で投与されたとき、免疫応答を誘導しない核酸であるか、又は未処置の哺乳動物に遊離形態で投与されたとき、ヌクレオチドの免疫刺激配列に対する免疫応答を抑制する核酸でありうる。
【０２６９】
[00321]  核酸は、ホスホジエステルのヌクレオチド間結合のみを有しうるし、又は改変されたヌクレオチド間の結合と組み合わせた複数のホスホジエステルのヌクレオチド間の結合を有する様式に改変されうる。核酸はまた、改変された結合のみを含みうるし、又は複数の改変された結合を含みうる。例えば、核酸は、ホスホロチオエートのヌクレオチド間結合のみを含みうるし、又は複数のホスホロチオエートのヌクレオチド間の結合を複数有しうる。
【０２７０】
[00322]  組成物を剤形する際に使用されるカチオン性脂質は、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ-Ｃｈｏｌ、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＭＲＩＥ、及びＤＯＳＰＡから適切に選ばれうる。さらに、脂質製剤は、好ましくは化合物、例えばＰＥＧ-脂質、ＰＡＯ-脂質、又はガングリオシドなどの凝集阻害剤を含む。
【０２７１】
[00323]  抗原に加えて、又は抗原の代わりに、本発明の組成物は、共封入されたドキソルビシンなどの細胞毒性の薬剤を含みうる。脂質膜小胞は、核酸及び細胞毒性の薬剤の両方を完全に封入する。このタイプの組成物は、本発明の更なる態様である方法により調製されうる。該方法では、治療組成物は、脂質をエタノール中で調製し；水性緩衝液中で脂質をオリゴヌクレオチドと混合してオリゴヌクレオチドを搭載した脂質粒子を形成し；そして該オリゴヌクレオチドを搭載した脂質小胞を細胞毒性薬剤にさらし、その結果該細胞毒性薬剤が前記小胞の内空間に集積することにより調製される。
【０２７２】
[00324]  本発明の組成物は、様々な方法において使用されて、薬剤製品中のカチオン性脂質を含む脂質製剤中に十分に封入される核酸を含む脂質-核酸粒子の使用を介して、治療効果をヒトを含む哺乳動物に提供する。こうして、該組成物は、哺乳動物の免疫応答を誘導するため、哺乳動物においてＣＴＬ又はＢ細胞を活性化するため、又は腫瘍症を有する哺乳動物において腫瘍症を治療するために、脂質-核酸粒子を調製し、そして該脂質-核酸粒子を哺乳動物に投与するステップを含む方法により使用されうる。ここで、該脂質-核酸粒子は、カチオン性脂質を含む脂質製剤中に完全に封入される核酸を含む。
【０２７３】
[00325]  抗原が組成物中に含まれるとき、本発明は、抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、脂質膜小胞を含む粒子を調製する工程、ここで該小胞は、該小胞中に完全に封入された核酸及び免疫応答が所望される抗原であって該小胞の表面と会合される抗原を含む、並びに該粒子を治療される哺乳動物対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【０２７４】
[00326]  上記の実施例中に示されるように、本発明に従って組成物中に脂質担体を使用することは、免疫系の所望の刺激を達成するために必要とされるオリゴヌクレオチド量を実質的に低減することを許容する。ある場合において、遊離形態において明白な活性を有しないオリゴヌクレオチドが、脂質-封入形態で提供された場合、免疫応答を刺激するのに有用であるという事実に反映される。別の場合、応答の同じレベルを達成するために必要とされるＯＤＮ量が、低いＯＤＮ投与量でもたらされるという事実に反映される。
こうして、哺乳動物において免疫応答を刺激するオリゴヌクレオチドの有効量を用いる方法を行う際に、本発明は、オリゴヌクレオチドを脂質粒子中に完全に封入すること、及び哺乳動物対象に前記オリゴヌクレオチドの有効量の２０％未満を投与し、それにより前記哺乳動物対象において所望の免疫応答を獲得することを含む改良を提供する。
【０２７５】
[00327]  完全性及び一貫性のために提供される本発明のある例示の態様を使用して、本明細書中に記されるデーターがin vivoにおける免疫刺激活性及び治療効力を示す一方で、本発明はこれらの例示の態様に制限されないということは理解される。当業者は、本明細書中に提供される教示と一致して、本発明の別の特定の態様を作り及び使用することが容易にできるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】[0031]  図１は、活性化マーカーＣＤ６９を有する白血球のin vitroにおける刺激が、全血液を遊離オリゴヌクレオチドで処理することによりもたらされることを示す。マウス全血液を、本明細書中でＯＤＮ１と名づけられる遊離オリゴヌクレオチド又はＯＤＮ２と名づけられるオリゴヌクレオチドで処理される。
【図２】[0030]  図２は、封入又は遊離ＯＤＮ１及びＯＤＮ２オリゴヌクレオチドを注射することによるマウスのin vivoでの治療が、in vitroで得られた結果と反対である結果になることを示す。
【図３】[0031]  図３は、脂質小胞に封入されたとき、メチル化ＯＤＮ１ｍは、in vivoにおける樹上細胞の活性化を刺激する点において、メチル化されていない対応物ＯＤＮ１より活性であることを示す。
【図４Ａ】[0032]  図４Ａは、メチル化ＯＤＮ１ｍ及び非メチル化ＯＤＮ１の両者が、脾臓及び全血液におけるＣＤ１１ｃ陽性細胞の増大を刺激したことを示す。
【図４Ｂ】[0033]  図４Ｂは、ＯＤＮ１及びＯＤＮ１ｍの両者が、脾臓、全血液、及びリンパ節中のＤｅｃ２０５陽性細胞を増大を刺激することを示す。
【図５】[0034]  図５は、ＯＤＮのどちらも脂質に封入されるとき、ＣＤ８６発現を刺激する際において、メチル化ＯＤＮ１ｍが非メチル化対応物ＯＤＮ１より活性であったことを示す。
【図６】[0035]  図６は、遊離オリゴヌクレオチドのin vivo投与が、ＩＬ-６、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-γ、又はＭＣＰ-１の刺激に影響を与えないということを示す。対照的に、脂質封入オリゴヌクレオチドのin vivo投与は、これらのサイトカイン各々の産生を刺激した。
【図７Ａ】[0036]  図７Ａは、オリゴヌクレオチド投与量規模に渡って計測される遊離オリゴヌクレオチドＯＤＮ１と比較して、封入ＰＯ又はＰＳオリゴヌクレオチドＯＤＮ１でマウスを処置することにより、増大するＩＬ-１２誘導を例示する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、封入ＰＯオリゴヌクレオチドで治療することが、ＩＦＮ-γの初期誘導を強く刺激することを示す。一方、封入ＰＳオリゴヌクレオチドは、ＩＦＮ-γを、少ないが、有効性をもって導入を刺激する。
【図８】[0037]  図８は、遊離ＰＳ又はＰＯオリゴヌクレオチドの投与に基くＴｈ-１応答を示すＩｇＭタイターの比較を示す。
【図９】[0038]  図９は、メチル化オリゴヌクレオチドを含む遊離ＰＳ又はＰＯオリゴヌクレオチドの投与に基く、Ｔｈ-２応答を示すＩｇＧ産生の比較を示す。
【図１０】[0039]  図１０は、脂質封入メチル化又は非メチル化オリゴヌクレオチドで処置された動物をスクリーニングする系に渡って、メチル化オリゴヌクレオチドが、樹上細胞、ＮＫ細胞、及びＣＤ８+Ｔ-細胞の増殖を刺激する点で、非メチル化オリゴヌクレオチドと大体同じであるか、又は優れているということを示す。
【図１１】[0040]  図１１Ａ及び図１１Ｂは、脂質封入メチル化又は非メチル化オリゴヌクレオチドで処理される動物のスクリーニングの系に渡って、メチル化オリゴヌクレオチドが、細胞障害性Ｔリンパ球及びＡｇ特異的リンパ球の増殖を刺激する際に非メチル化オリゴヌクレオチドより優れるということを示す。    [0041]  図１１Ｃは、図１１Ａ及び図１１Ｂにおいて示される全体スクリーニングに含まれた、代表的な四量体の研究からのデーターを示す。
【図１２】[0042]  図１２は、動物に遊離オリゴヌクレオチドとして投与されたとき、メチル化されたものは、腫瘍成長の低減において、メチル化核酸より治療効力が少なかったということを示す。
【図１３】[0043]  図１３は、オリゴヌクレオチドの封入は、特にオリゴヌクレオチドが天然ホスホロチオエート(ＰＳ)骨格を含むとき、遊離のＯＤＮに対してメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの改良された効力を提供することを示す。
【図１４】[0044]  図１４は、オリゴヌクレオチドがホスホジエステル(ＰＯ)骨格含むとき、オリゴヌクレオチドの封入が、遊離ＯＤＮに対してメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの改良された効力を提供することを示す。
【図１５】図１５は、ＰＳオリゴヌクレオチドＯＤＮ２及びＯＤＮ２ｍを封入する脂質が各々治療効力を発揮することを示す。
【図１６】[0045]  図１６は、Ｂ１６メラノーマ腫瘍を接種された動物に対して、メチル化ＯＤＮ１ｍを投与するアジュバント効果及び治療効率を例示する。脂質粒子中のＯＤＮオリゴヌクレオチドの封入は、その腫瘍体積を低減する効力を増大させた。
【図１７】[0046]  図１７は、Ｂ１６メラノーマを接種され、そして続いて２０ｍｇ/ｋｇの投与量のオリゴヌクレオチドの投与で処理されたマウスの系列において、封入された遊離オリゴヌクレオチドＯＤＮ１及びＯＤＮ１ｍで治療されたマウスの平均腫瘍サイズを示す。
【図１８】[0047]  図１８は、マウスがメチル化ＯＤＮ１ｍ及び非メチル化対応物であるＯＤＮ１の封入物で処理されたとき、腫瘍体積が減少することを示す。
【図１９】[0048]  図１９は、2回の異なる研究において、封入されたメチル化ＯＤＮ１ｍで処理されたマウスの生存率を、封入された非メチル化ＯＤＮ１で処理された生存率と比較して示す。
【図２０】[0049]  図２０は、メチル化ＯＤＮ１ｍ及び非メチル化対応物であるＯＤＮ１が、脂質粒子に封入されるとき、腫瘍体積の点から効力を示す。
【図２１】[0050]  図２１は、封入されたメチル化ＯＤＮ１ｍで処理されたマウスの生存率を、封入された非メチル化ＯＤＮ１で処理されたマウスの生存率に対して示す。
【図２２】[0051]  図２２は、封入されたＰＳオリゴヌクレオチドＯＤＮ１及びＯＤＮ２が、封入されたＰＯオリゴヌクレオチド処理後６日によっては生産されないＩＦＮ-γのピークを生ずることを示す。
【図２３】[0052]  図２３は、異なるＰＥＧ-セラミド・立体被膜を有する脂質粒子内に封入されるメチル化又は非メチル化オリゴヌクレオチドの血液排除に関する影響を示す。
【図２４】[0053]  図２４は、組成物を腫瘍を有する動物に投与することにより、腫瘍を治療する際における、非メチル化又はメチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドを封入するリポソーム粒子の治療効力を示す。
【図２５】[0054]  図２５は、メチル化されるＰＳ-ＯＤＮ５ｍの脂質封入が、時間に渡って腫瘍成長を低減する際、同等物である非メチル化ＰＳ-ＯＤＮ５の封入より有効に治療効力を提供することを示す。
【図２６】[0055]  図２６は、遊離の及び封入されたメチル化ＯＤＮ５ｍで処理されたマウスの生存率は、遊離の及び封入された非メチル化ＯＤＮ５での処理されたマウスの生存率に対して示される。
【図２７】[0056]  図２７は、遊離非メチル化及びメチル化ＰＳ及びＰＯ・ＯＤＮ７及び封入されたＰＯ-ＯＤＮ７ｍで処置されたとき、腫瘍体積の点から効力を示す。
【図２８】[0057]  図２８は、封入ＰＯ-ＯＤＮ７ｍでの処理に比較して、遊離非メチル化及びメチル化ＰＳ及びＰＯ  ＯＤＮ７で処理されたマウスの生存割合を示す。
【図２９】[0058]  図２９は、ミョウバン-に基くワクチンを、ＬＮＡ/ＯＤＮ１と共に共投与することに基いてＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧのタイターの増加を示す。血漿ＩｇＧレベルは、６週間後に、ＩＭ初期追加免疫化に基いて獲得され、そして終末点希釈ＥＬＩＳＡにより計測された。
【図３０】[0059]  図３０は、図２９における結果を確証する。マウスは、ミョウバン又はＬＮＡ/ＯＤＮ１を有する２ｗｇ/投与量の組換えＨＢｓＡｇで免疫化された。特定ＩｇＧタイターにおける１０倍増加は、ミョウバンと比較して、ＬＮＡ/ＯＤＮ１を観測した(図３４Ａ)。
【図３１】[0060]  図３１は、初回免疫化セットにおいて、リコンビナクス-ＨＢ(Recombivax-HB)ワクチンを、ＬＮＡ／ＯＤＮ１と共投与する効果を例示する。IMの初回投与免疫化後６週間で得られた血漿は、エンジェリックスＢ(EngerixB)又はリコンビナクス-HBで初回-追加免疫投与計画において免疫化されたマウスから獲得された血漿と比較される。
【図３２】[0061]  図３２は、リコンビナクス-ＨＢ又はエンジェリックス-Ｂ(投与量あたり０.５ｐｇのＨＢｓＡｇ、２５ｐｇのミョウバン)で単独で又はＬＮＡ/ＯＤＮ１(１００ｐｇＯＤＮ)との混合をアジュバントとして、ｑ１４ｄ×２の初回-追加投与計画にもとづいてＩＭ免疫化の後における抗-ＨＢｓＡｇ血漿抗体タイターを例示する。
【図３３】[0062]  図３３は、組換えＨＢｓＡｇ(２のＨＢｓＡｇ、２５)単独又はミョウバン(投与量あたり２５μｇ)、封入(ＬＮＡ/ＯＤＮ１)ＩＳＳ ＯＤＮ(１００μｇ)と混合して、或いはミョウバンと封入ＯＤＮ(ＬＮＡ/ＯＤＮ１)とを組み合わせて、ｑ１４ｄ×２初回-追加投与計画においてＩＭ免疫化した後の抗-ＨＢｓＡｇ血漿プラズマ抗体タイター示す。
【図３４】[0063]  図３４は、ＢＳＡと共投与されるＬＮＡの免疫賦活在校かを例示する。ＢＳＡ単独で又はＬＮＡ+ＢＳＡは、マウスに初回投与として静脈投与された。血清における抗体のタイターは、５週間後に計測された。強いＩｇＧ１応答が、どちらのケースでも観測される。しかしながら、グラフの右手がわ上の棒グラフにおいて見られるように、ＣｐＧを含む粒子により、免疫系がより高いタイターのＩｇＧ２ａアイソタイプを産出することを仕向けられる。
【図３５】[0064]  図３５は、Ｉが生産に基くＬＮＡの免疫刺激効果を示す。ＯＶＡ+ＬＮＡ/ＯＤＮ１ＰＳ、ＯＶＡ+ＯＤＮ１ＰＳ、又はＯＶＡと混合されるＣＴは、マウスに週一回、３週間鼻腔内投与された。ＩｇＡタイターは、血清中及び肺内で計測された。どちらの場合でも、ＩｇＡレベルは、ＯＶＡ+ＬＮＡ/ＯＤＮ１ ＰＳが使用されるときより高かった。
【図３６】[0065]  図３６は、ＬＮＡの免疫刺激性の効果を示す。ミョウバン、ＣＦＡ/ＩＦＡ、タイターマックス(TitreMax)(商標)、イムノ・イージー(ImmuneEasy)(商標)(CpG１８２６+ミョウバン)、ＬＮＡ(ＣｐＧ１８２６)、及びＯＶＡ-結合ＬＮＡ(ＣｐＧ１８２６)は、マウスに静脈内投与され、ＩｇＧレベルは、２週間後に計測された。ＬＮＡ-ＯＶＡ粒子(黒四角)は、初回投与の２週間後に、最も高いレベルのＯＶＡ-特異的ＩｇＧを誘導した。
【図３７】[0066]  図３７は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与による２０μｌの試験薬剤で初期免疫した２８日後の血清における抗-ＯＶＡ・ＩｇＧ(図３７Ａ)、抗-ＯＶＡ・ＩｇＡ(図３７Ｂ)、及び抗-ＯＶＡ・ＩｇＭ(図３７Ｃ)のタイターを記す。
【図３８】[0067]   図３８は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与による２０μｌの試験薬剤で初期免疫した２８日後の肺洗浄における抗-ＯＶＡ・ＩｇＧ(図３８Ａ)、抗-ＯＶＡ・ＩｇＡ(図３８Ｂ)、及び抗-ＯＶＡ・ＩｇＭ(図３８Ｃ)のタイターを記す。
【図３９】[0068]  図３９は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与による２０μｌの試験薬剤で初期免疫した２８日後の膣洗浄における抗-ＯＶＡ・ＩｇＧ(図３９Ａ)、及び抗-ＯＶＡ・ＩｇＡ(図３９Ｂ)のタイターを記す。
【図４０】[0069]  図４０は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与による２０μｌの試験薬剤で初期免疫した２８日後の血清中の抗ＯＶＡ-ＩｇＧのタイター(図４０Ａ)、肺洗浄のタイター(図４０Ｃ)、及び膣洗浄(図４０Ａ)のタイターにより示される液性免疫を記す。
【図４１】[0070]  図４１は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与による２０μｌの試験薬剤で初期免疫した２８日後の血清中(図４１Ａ)、肺洗浄(図４１Ｂ)、及び膣洗浄(図４０Ｃ)の抗ＯＶＡ・ＩｇＡのタイターにより示される液性免疫を記す。
【図４２】[0071]  図４２は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与により２０μｌの試験薬剤で初期免疫した２８日後の肺洗浄液中の抗ＯＶＡ・ＩｇＡタイターを記す。
【図４３】[0072]  図４３は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与により２０μｌの試験薬剤で初期免疫した２８日後の膣洗浄液中の抗ＯＶＡ・ＩｇＡタイターを記す。
【図４４】[0073]  図４４はＣ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与により２０μｌの試験薬剤で初期免疫した２８日後の肺洗浄(図４４Ａ)及び膣洗浄(図４４Ｂ)中の抗ＯＶＡ・ＩｇＡのタイターを記す。
【図４５】[0074]  図４５は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与によい２０μｌの試験薬剤で初期免疫した２８日後の肺洗浄液(図４４Ａ)及び膣洗浄液(図４４Ｂ)中の抗ＯＶＡ・ＩｇＧのタイターを記す。
【図４６】[0075]  図４６は、Ｃ５７ＢＬ/６マウス(６週齢)を、鼻腔内投与により２０μｌの試験薬剤で初期免疫した後の日における血漿中の抗-ＯＶＡ・ＩｇＧのタイターを記す。
【図４７】[0076]  図４７は、封入ＯＤＮ１ｍを使用して、複数のエピトープ・ガン・ワクチンで免疫化した後のＢ１６細胞標的に対するＣＴＬ応答を示す。
【図４８】[0077]  図４８は、ペプチド・パルスされた樹上細胞を使用して、複数のエピトープ・ガン・ワクチンで免疫化した後のＢ１６細胞標的に対するＣＴＬ応答を示す。
【図４９】[0078]  図４９は、封入ＯＤＮ１ｍ又は樹上細胞と組み合わせて腫瘍細胞ライセートで免疫化した後のＢ１６細胞標的に対するＣＴＬ応答を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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