(57)【要約】カルボキシシリル基でコーティングされたガラスをフッ化アシルで活性化する方法が説明される。前記方法は、カルボキシル基を含む、少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで処理された表面を有するガラス基質を提供し、該カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することによって、前記ガラス表面を、腐食を伴わずに活性化することを含む。１つの実施態様では、前記ガラス表面は、フッ化剤と、３級アミン基と、フッ化水素を結合することができる溶媒とに前記表面を接触させることによって活性化される。求核剤を含む分子種を共有結合で固定化するための基質も提供される。前記基質は、フッ化アシルで活性化された側鎖カルボキシシリルリンカーを用いて、腐食を伴わずに、処理された表面を有するガラスを含む。また本発明は、フッ化アシルで、腐食を伴わずに活性化されたガラス表面上に形成されたバイオアレイを提供する。
2005520134.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基でコーティングされたガラスをフッ化アシルで活性化する方法であって、
（ａ）カルボキシル基を含む、少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで処理された表面を有するガラス基質を用意するステップと、
（ｂ）前記カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することによって、前記ガラス基質の表面を活性化するステップと、
（ｃ）前記（ｂ）の活性化するステップのフッ化水素副産物を中和して、前記ガラス表面の腐食を防ぐステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記（ａ）のステップは、
（ｄ）塩共役型の側鎖カルボキシル基を含む、少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで処理された表面を有するガラス基質を用意するステップと、
（ｅ）前記共役型の側鎖カルボキシル基を中和して、前記カルボキシル基を露出させるステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｆ）表面を有するガラス基質を用意するステップと、
（ｇ）前記ガラス基質の表面をカルボキシシリル試薬で、前記表面上に前記側鎖カルボキシシリルリンカーを形成するのに十分な条件下で反応させるステップとを含み、
前記（ｆ）および（ｇ）のステップは前記（ｄ）のステップの前に実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記カルボキシシリル試薬は、１または２個以上のカルボキシル基を含むシランである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カルボキシシリル試薬はＮ−［（３−トリメトキシシリル）プロピル］エチレン・ジアミン三酢酸三ナトリウム塩で、形成された共役三酢酸三ナトリウム塩は過剰の酢酸の水溶液で中和される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｂ）および（ｃ）のステップは同時に実行され、前記ガラス表面は、フッ化剤と、３級アミン試薬と、フッ化水素を結合できる溶媒とに該表面を接触させることによって活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フッ化剤は、ジエチルアミノ硫黄トリフルオリド（ＤＡＳＴ）、シアヌル酸フルオリド、ヘキサフルオロリン酸テトラメチルフルオロホルマジニウムおよびトリスヒドロフルオリド３級アミンからなるグループから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アミン試薬は、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジメチルアミン、ジメチルブチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）からなるグループから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒は、水素を中和することができる溶媒からなるグループから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記フッ化剤はＤＡＳＴで、前記３級アミンはＤＩＥＡで、前記溶媒はアセトニトリルである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
求核剤を含む分子種を共有結合で固定化するための基質であって、フッ化アシルによって活性化された側鎖カルボキシシリルリンカーで腐食を伴わずに処理された表面を有するガラスを含む、基質。
【請求項１２】
前記ガラスは、スライド、シートまたはビーズの形状である、請求項１１に記載の基質。
【請求項１３】
前記カルボキシシリルリンカーは、１または２個以上のカルボキシル基を含むシランである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
求核剤を含む分子種を共有結合で固定化する方法であって、
（ａ）求核剤を含む分子種を用意するステップと、
（ｂ）カルボキシル基を含む、少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで処理された表面を有するガラス基質を用意するステップと、
（ｃ）前記カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することによって前記ガラス表面を活性化するステップと、
（ｄ）前記（ｃ）の活性化するステップのフッ化水素副産物を中和して、前記ガラス表面の腐食を防ぐステップと、
（ｅ）前記求核剤を含む分子種と前記フッ化アシル基との共有結合を可能にする条件下で、前記求核剤を含む分子種を前記活性化スライドに接触させるステップとを含む、方法。
【請求項１５】
前記（ｃ）および（ｄ）のステップは同時に実行され、前記ガラス表面は、フッ化剤と、３級アミン試薬と、フッ化水素を結合できる溶媒とに該表面を接触させることによって活性化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記３級アミン試薬はＤＩＥＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶媒は、フッ化水素を中和できる溶媒からなるグループから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記フッ化剤はＤＡＳＴで、前記３級アミン試薬はＤＩＥＡで、前記溶媒はアセトニトリルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記求核剤を含む分子種は、アミノ基と、１級または２級アミン基と、ヒドロキシル基とを含む分子種からなるグループから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記求核剤を含む分子種は、核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの類似体からなるグループから選択される生体分子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
複数の生体分子が用意され、前記接触させるステップは、離散した場所の前記活性化ガラス表面に該生体分子を接触させることを含み、これにより、バイオアレイが形成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）複数の生体分子を用意するステップと、
（ｂ）カルボキシル基を含む、少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで処理された表面を有するガラス基質を用意するステップと、
（ｃ）前記カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することによって、前記ガラス表面を活性化するステップと、
（ｄ）前記（ｃ）の活性化するステップのフッ化水素副産物を中和して、前記ガラス表面の腐食を防ぐステップと、
（ｅ）前記生体分子とフッ化アシル基との共有結合を可能にする条件下で、該生体分子を離散した場所の前記活性化ガラス表面に接触させて、バイオアレイを形成するステップとを含む方法によって調製された、バイオアレイ。
【請求項２３】
前記ガラス基質は、スライド、シートまたはビーズの形状である、請求項２２に記載のバイオアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、分子の固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）用のガラス基質の製作方法に関し、具体的には、フッ化アシルで活性化されたカルボキシシリル基で、腐食を伴わずに、コーティングされたガラス基質に関する。また本発明は、かかる活性化ガラス基質を用いて製作されたバイオアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオアッセイは、生体分子を固相支持体に付着する必要がしばしばある。吸着、紫外線クロス・リンキングおよび共有結合による付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を含む、かかる固定化に利用可能なさまざまな方法がある。表面への生体分子の吸着は、イオン結合、疎水結合またはファンデルワールス力により駆動される比較的単純な方法である。しかし、この方法は、前記表面に生体分子および細胞を十分に安定的に固定化することを提供しない。また、前記方法は、バイオアレイの構築に望ましい、生体分子および細胞の正確な付着をもたらすことができない。
【０００３】
紫外線クロス・リンキングは、光化学的な分子種を用いる基質の誘導体化を伴うが、該分子種は、紫外線照射により活性化されるとき、標的生体分子を結合することができる。しかし、この方法は、正確なアレイ構築を許さないランダムな家庭である。さらに、光化学的な分子種で誘導体化された基質は紫外光に対して敏感であるので、貯蔵および使用をするうえで難問が生じる。
【０００４】
生体分子の固定化のより安定的で正確な手段は、表面への共有結合である。しかし、天然の生体分子と未修飾の基質との間の相互作用は弱いため、生体分子とその基質の化学的修飾が、効率的な結合を促進するために必要となることがしばしばある。以下の特許文献１は、核酸を１級アミンで修飾し、その後、修飾された前記核酸を、還元剤の存在下で、遊離のアルデヒド基を有する固相基質と反応させることを開示する。水酸基、カルボキシル基、アミン基、ヒドラジン基、エポキシド基、ブロモアセチル基、マレイミド基およびチオール基を含む、さまざまな官能基を含むように修飾された基質に生体分子を固定化することはその他多数の報告がある（例えば、以下の特許文献２の背景技術の項と、Ａ．Ｓ．ＢｔａｗｓおよびＷ．Ｍ．Ｒｅｉｃｈｅｒｔによる以下の非特許文献１とを参照せよ。）
【特許文献１】米国特許第５，２１５，８８２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０１３，７８９号明細書
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９巻、５９５−６０９頁、１９９８年
【０００５】
他の研究者は、生体分子の固定化用にシランのような二官能性クロス・リンキンカーを使用してきた（特許文献３）。最近、未修飾生体高分子のフッ化アシルで活性化された基質への固定化が、本発明の米国出願承継人によって報告された（特許文献４）。
【特許文献３】米国特許第５，５５６，９５９号明細書
【特許文献４】米国特許第６，２６８，１４１号明細書
【０００６】
ガラスは、安価で、かつ、高品位の光学特性を提供するので、汎用される固体基質である。例えば、ガラスの顕微鏡スライドはマイクロアレイ器具の業界標準になっている。ポリ−Ｌ−リジンまたはアミノプロピルシランでコーティングされた顕微鏡スライドまたは露出されたアルデヒド官能基を有するガラススライドを含む、さまざまなタイプの誘導体化処理済みガラス基質が商業的に入手可能である。しかし、商業的に入手可能なガラス基質は、用いられる付着のための化学反応が劣り、生体分子結合選択性が限定され、そして、貯蔵寿命が限られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ガラス基質に生体分子を付着するためのより効果的な方法を開発することが望ましい。また、ガラス基質、特に、ガラス顕微鏡スライドの活性化のための、便利で、迅速で、安価で、かつ、信頼性のある方法を開発することが望ましい。
【０００８】
発明の概要
ゲノム用およびプロテオーム用のマイクロアレイおよびマクロアレイの研究に用いられる標準的な技術と完全に共同して使用できる、ガラス基質の活性化方法を提供することが本発明の目的である。さらに、適当な貯蔵寿命を有する活性化ガラス基質であって、常温常圧で安定で、安価で、光学的に透明で、かつ、物理的に丈夫なガラス基質を提供することも本発明の目的である。分子、特に、核酸、タンパク質および糖質か、これらの断片化産物または合成レプリカかのような、生体分子の共有結合による付着に適する表面を有する基質を提供することが本発明の別の目的である。
【０００９】
本発明のこれらおよびその他の目的は、フッ化水素による中和工程と組み合わせたフッ化アシル活性化化学反応を用いることによって達成される。本発明のフッ化水素による中和工程は、フッ化アシルによる活性化の際のガラス表面の腐食を防ぐという利点がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つの面は、カルボキシシリル基でコーティングされたガラスのフッ化アシルによる活性化と、これに付随する、フッ化水素副産物の中和とのための方法を提供する。前記方法は、
（ａ）側鎖中のカルボキシル基を含む少なくとも１つのカルボキシシリルリンカー処理された表面を有するガラス基質を提供するステップと、
（ｂ）前記カルボキシル基をフッ化アシル基に変換する（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）ことにより、前記ガラスの表面を活性化するステップと、
（ｃ）前記（ｂ）の活性化するステップのフッ化水素副産物を中和して、前記ガラスの腐食を防ぐステップとを含む。
【００１１】
前記ガラス基質の腐食を防ぐためにフッ化水素が速やかに中和される限り、前記方法の（ｂ）および（ｃ）のステップは、同時に実行されても、あるいは、逐次的に実行されてもかまわないことは当業者が了解するであろう。１つの実施態様では、前記ガラスの表面は、３級アミン試薬と、フッ化水素を中和できる溶媒との存在下で、フッ化反応剤に前記表面を接触させることによって、腐食を伴わずに、活性化される。
【００１２】
本発明の活性化方法は、カルボキシシリル基でコーティングされた、商業的に入手可能なガラス基質に適用される場合がある。代替的には、カルボキシシリル処理されたガラス基質は、カラスの表面に側鎖カルボキシシリルリンカーを形成するのに十分な条件下で、該ガラス基質をカルボキシシラン試薬に反応させることによって製作される場合がある。１つの実施態様では、前記カルボキシシラン試薬はＮ−［（３−トリメトキシシリル）プロピル］エチレン・ジアミン三酢酸三ナトリウム塩である。
【００１３】
本発明の別の面は、共有結合で固定化する求核剤を含む分子種（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｅｓ）のための基質に向けられる。前記基質は、フッ化アシルによって活性化された側鎖カルボキシシリルリンカーで、腐食を伴わずに、処理された表面を有するガラスを含む。
【００１４】
別の面では、本発明は、ガラス基質上に求核剤を含む分子種を共有結合で固定化する方法を提供する。前記方法は、
（ａ）求核剤を含む分子種を用意するステップと、
（ｂ）カルボキシル基を含む、少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで処理された表面を有するガラス基質を用意するステップと、
（ｃ）前記カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することによって前記ガラス表面を活性化するステップと、
（ｄ）前記（ｃ）の活性化するステップのフッ化水素副産物を中和して、前記ガラス表面の腐食を防ぐステップと、
（ｅ）前記求核剤を含む分子種と前記フッ化アシル基との共有結合を可能にする条件下で、該求核剤を含む分子種を前記活性化ガラス表面に接触させるステップとを含む。
【００１５】
１つの実施態様では、前記求核剤を含む分子種は、求核性の窒素および／または酸素を含む分子種である。
【００１６】
本発明のガラス基質は、腐食されることなく活性化されるため、光学的に透明で、マクロアレイおよびマイクロアレイの製作用に好適である。したがって、本発明のさらに別の面は、
（ａ）複数の生体分子を用意するステップと、
（ｂ）カルボキシル基を含む少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで処理された表面を有するガラスを用意するステップと、
（ｃ）前記カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することによって前記ガラス表面を活性化するステップと、
（ｄ）前記（ｃ）の活性化するステップのフッ化水素副産物を中和して、前記ガラス表面の腐食を防ぐステップと、
（ｅ）前記生体分子と前記フッ化アシル基とが共有結合してバイオアレイを形成することを可能にする条件下で、離散した位置の前記活性化ガラス表面に該生体分子を接触させるステップとを含む方法によって製作された、バイオアレイを提供する。
【００１７】
当業者は、本発明の活性化ガラス基質が、生体分子に加えて、いかなる求核剤を含む材料の共有結合による付着にも用いられる場合があることを認識するであろう。例えば、本発明の活性化ガラス基質は、アミノ基、１級または２級アミン基、または水酸基を含む官能基を有する、組織学的材料その他の生物学的材料の共有結合による付着に用いられる場合がある。
【００１８】
本発明の活性化ガラス基質上で製作されたバイオアレイは、市販および自家製のマイクロアレイプリンタと、共焦点レーザスキャナとともに使用可能である。前記活性化ガラス基質は、バイオアレイ構築用にエンドユーザに販売される場合がある。代替的には、本発明の活性化ガラス基質は、標的を絞ったアレイの製作用に自社内（ｉｎ  ｈｏｕｓｅ）で使用される場合がある。かかるアレイは、消費者が共焦点レーザに用いるためのキットに含まれることがある。
【００１９】
本発明は、従来の基質活性化の化学反応および従来のガラス基質に比べて多くに経済的および技術的な利点を提供する。当業者は、フッ化アシル基が水との反応に比較的耐性があるが、窒素および／または酸素の求核剤とは反応性が高いことを理解するであろう（“アミノ酸フッ化物を介するペプチド合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｖｉａ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅｓ）”、Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．、Ｂｅｙｅｒｍａｎ，Ｍ．、Ｗｅｎｓｃｈｕｈ，Ｈ．およびＢｉｅｎｅｒｔ，Ｍ．：Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９巻、２６８−７４頁、１９９６年）。フッ化アシル基の水に対する反応性が低いため、本発明の基質は、湿った条件であっても、長期の貯蔵寿命を有する。さらに、側鎖の前記シリル原子団をフッ化アシルで３重に置換すること（ｔｒｉ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、活性化された前記カルボキシシリル化ガラスの窒素および／または酸素求核剤の全体的な反応性をさらに増強させる。
【００２０】
フッ化アシルの化学反応は「ドーナッツ」問題を防ぐので、アレイ製作に用いるのに特に魅力的である。「ドーナッツ」問題は、従来の基質でプリントされたスポットが外周から内向きに乾くときに発生する。その結果、前記スポットの辺縁部で濃度が上昇し、これに伴ってアシル化反応速度も上昇するので、被検体結合パートナーが不均一に分布するドーナッツ状の結合ゾーンができる。しかし、フッ化アシルの付着化学反応が用いられるときには、ドーナッツ状の結合ゾーンができる前に、アミノ基を含む被検体がフッ化アシルの部位に迅速に結合する。
【００２１】
さらに本発明のガラス基質の活性化は、フッ化アシルの化学反応をフッ化水素の中和と同時に組み合わせるため、予想外なことに、この方法が前記活性化の際にガラス表面の腐食を防ぐ。かかる腐食を伴わない活性化によって、反応性はあるが、光学的に透明で、ゲノムおよびプロテオーム用アレイ研究に用いられる標準的な技術とともに使用可能な基質が生成される。最後に、本発明の簡単な２段階活性化方法は、便利で、迅速で、安価で、信頼性のあるガラス基質活性化法を提供するという目的に適う。
【００２２】
上記およびその他の本発明の特徴と、該特徴を実現する方法とは、添付する図面とともに以下の説明を参照することによってより明らかとなり、最もよく理解されるであろう。これらの図面は、本発明の典型的な実施態様を例示するだけであって、その範囲を限定するものではない。
【００２３】
発明の詳細な説明
エチレンアクリル酸共重合体、エチレンメタクリル酸共重合体または誘導体化ポリプロピレンから製造された高分子支持体のフッ化アシル活性化は、本出願と米国出願承継人が同じである米国特許第６，１１０，６６９および６，１４６，８３３号明細書に説明されており、これらの特許文献の関連する内容は、引用によりその全体がここに取り込まれる。かかるフッ化アシル活性化高分子基質は、アミン基修飾オリゴヌクレオチド（米国特許第６，１１０，６６９および６，１４６，８３３号明細書）、ｃＤＮＡ（米国特許第６，２６８，１４１号明細書）およびタンパク質試薬（“多機能他用途マイクロアレイの製作方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）”という名称の同時係属中の米国特許出願第１７９１−１８１号明細書）のような未修飾の生体高分子を付着させるために用いられて成功してきた。米国特許第６，２６８，１４１号明細書および米国特許出願第１７９１−１８１号明細書の関連する内容は、引用によりその全体がここに取り込まれる。
【００２４】
生体分子の付着用に基質活性化にフッ化アシルの化学反応を応用して成功したのは、フッ素のユニークな物理化学的特性のためであるといえる。フッ素は他のハロゲンとは明確に異なり、周期律表のハロゲン族の傾向からはずれる特性を有する。例えば、フッ素は、最も電気陰性度が高い元素であるが、電子親和力は塩素より低い。アシル基のような炭素を含む原子団にフッ素を取り込むことは、その化学活性および反応速度論的性質に著しい変化を引き起こす。
【００２５】
フッ素原子が炭素−フッ素結合で電子を共有する独特のやり方と、その相対的なサイズおよびイオン化エネルギーとのために、フッ化アシルは、他のハロゲン化アシルとは異なり、競合する分子種に比べて窒素の求核剤に対して選択性がある。フッ化アシルは、アルコールのような中性の酸素求核剤に対してはあまり反応性がなく、水とはほとんど反応しないので（Ｃａｒｐｉｎｏら、上記文献、２７１頁）、加水分解に比較的耐性がある。フッ化アシルは水との反応性が低いために、フッ化アシルで活性化された基質は、湿度のある条件下でも、貯蔵安定性が非常に高い。これに対し、他のハロゲン化アシルは空気長のわずかな量の水とも容易に反応するので、ハロゲン化アシルで活性化された高分子基質の長期保存の妨げとなる。
【００２６】
さらに、フッ素原子のサイズは小さいので、アミド結合が形成されるときの立体障害がなくなる。その反対に、他の一部のハロゲンを含む、他の官能基は、立体障害を起こすことがしばしばあるので、反応速度が遅くなる。標的に対するフッ化アシルの反応特異性と、水溶液条件下での安定性とのために、フッ化アシルの活性化化学反応は、活性化支持体への生体分子の共有結合による付着が必要な用途では非常に望ましいものになる。
【００２７】
顕微鏡スライドのような光学的に透明なガラス基質は、マクロアレイおよびマイクロアレイの製作用に選ばれることがしばしばある。ガラス基質に現在用いられる付着のための化学反応は前記のフッ化アシルの化学反応より劣る。しかし、本発明以前には、フッ化アシルによる活性化はガラス基質には応用されていなかった。
【００２８】
したがって、本発明の１つの面は、カルボキシシリル基でコーティングされたガラスのフッ化アシルによる活性化方法を提供する。前記方法は、
（ａ）カルボキシル基を含む少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで表面が処理されたガラス基質を用意するステップと、
（ｂ）前記カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することによって、前記ガラスの表面を活性化するステップと、
（ｃ）前記（ｃ）の活性化するステップのフッ化水素副産物を中和して、前記ガラスの腐食を防ぐステップとを含む。
【００２９】
本発明のカルボキシシリルリンカーは、少なくとも１個のカルボキシル基を含み、以下の一般式を有するシラン化合物である。
【００３０】
【化１】
2005520134.tif 000003
【００３１】
上記の式で、Ｓｉはケイ素原子であり、
Ｒ１は１または２個以上の側鎖カルボキシル基を有する直鎖または分岐鎖で、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立に選択されたアルコキシ基またはアルキル基である。
【００３２】
１つの実施態様では、前記カルボキシシリルリンカーは、Ｎ−［（３−トリメトキシシリル）プロピル］エチレン・ジアミン三酢酸三ナトリウム塩［（ＣＨ３Ｏ）３−Ｓｉ−（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ．Ｎａ）−（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ．Ｎａ）２］である。
【００３３】
フッ化アシルによる活性化は、カルボキシル基をフッ化剤で処理してフッ化アシル基に変換することを伴う。しかし、この反応は、副産物であるフッ化水素の生成につながる。フッ化水素の生成は、ガラス表面を腐食して光学特性を低下させ、光学的な測定器とともに使用するのに適さなくなるので、ガラス基質の活性化には望ましくない。本発明は、望ましくないガラスの腐食を伴わずに、カルボキシシリル基でコーティングされたガラスのフッ化アシル活性化法を提供することによってこの問題を解決する。
【００３４】
前記方法の活性化するステップおよび中和するステップは、フッ化水素がガラス基質を腐食する前に中和されることを条件として、同時に実行されても、順次実行されてもかまわないことを当業者は理解するであろう。例えば、本発明の１つの実施態様によると、ガラスの表面は、該表面を３級アミン試薬と、フッ化水素の結合・中和を可能にする溶媒との存在下でフッ化剤に接触させることによって活性化される。その結果、ガラスのフッ化アシルによる活性化は、ガラスの腐食をもたらさない。
【００３５】
カルボキシル基をフッ化アシル基に変換する適当な試薬は、カルボキシル反応性フッ化試薬を広く含む。最も好ましい試薬は、ジエチルアミノ硫黄トリフルオリド（ＤＡＳＴ）である。他の適当な試薬は、シアヌル酸フルオリド、ヘキサフルオロリン酸テトラメチルフルオロホルマジニウム（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｆｌｕｏｒｏｆｏｒｍａｄｉｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびトリスヒドロフルオリド３級アミン（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ａｍｉｎｅ  ｔｒｉｓｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅｓ）を含む。
【００３６】
３級アミン試薬は、フッ化水素副産物によるガラス表面の腐食を防ぐために、反応混合液に添加される。前記３級アミン試薬はフッ化水素と結合し、トリスヒドロフルオリド３級アミンを形成する。トリスヒドロフルオリド３級アミンは、ホウケイ酸ガラスを腐食しないことが知られている（Ｆｒａｎｚ，Ｒ．、「トリスヒドロフルオリド３級アミンとそのフッ化処理法への使用について（Ｕｅｂｅｒ  Ｔｒｉｓｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ  Ｔｅｒｔｉａｅｒｅｒ  Ａｍｉｎｅ  Ｕｎｄ  Ｉｈｒｅｎ  Ｅｉｎｓａｔｚ  Ａｌｓ  Ｆｌｕｏｒｉｅｒｕｎｇｓｍｉｔｔｅｌ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：１５巻、４２３−３４頁、１９８０年の要約の項を参照せよ。）さらに、生成されたトリスヒドロフルオリド３級アミンは、これ自体がフッ化剤である。好ましい実施態様では、前記３級アミン試薬は、立体障害のある３級アミンのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）である。
【００３７】
溶媒が、フッ化水素を更に中和してガラス表面を腐食できないようにするために、前記反応混合液に添加される。前記溶媒はフッ化水素を中和できるいかなる溶媒でもかまわないことを当業者は理解するであろう。好ましい実施態様では、前記溶媒はアセトニトリルであるが、それは、アセトニトリルが他のハロゲン酸に比べてフッ化水素との親和性がより高いためである（Ｆｒａｎｚ，Ｒ．、「トリスヒドロフルオリド３級アミンとそのフッ化処理法への使用について（Ｕｅｂｅｒ  Ｔｒｉｓｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ  Ｔｅｒｔｉａｅｒｅｒ  Ａｍｉｎｅ  Ｕｎｄ  Ｉｈｒｅｎ  Ｅｉｎｓａｔｚ  Ａｌｓ  Ｆｌｕｏｒｉｅｒｕｎｇｓｍｉｔｔｅｌ）」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：１５巻、４２３−３４頁、１９８０年の４３０頁の第１段落）。
【００３８】
カルボキシシリル処理ガラス基質のフッ化アシル活性化は、ガラス表面の腐食を伴わずに、カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することを可能にする条件下で実行される。１の実施態様では、ナトリウム塩の除去後、前記カルボキシシリル基でコーティングされたガラス基質は、（３Åの篩の上に貯蔵された）無水アセトニトリル中の過剰のＤＡＳＴおよびＤＩＥＡ溶液に２５分間浸漬する（ＤＡＳＴについて５体積％、ＤＩＥＡについて２．５体積％）ことによって活性化される。それから、スライドは（３Åの篩の上に貯蔵された）無水アセトニトリル中に３回浸漬することにより洗浄され、乾燥された。
【００３９】
カルボキシシリル処理ガラススライドは、ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．社（テキサス州ヒューストン）から購入可能である。代替的には、前記カルボキシシリル基でコーティングされたガラスは、
（ａ）表面を有するガラスを用意すること、および
（ｂ）前記ガラス表面にカルボキシシリルリンカーを形成するのに十分な条件下で、該表面をカルボキシシリル試薬に反応させることによって製作される場合がある。
【００４０】
本方法がいかなるタイプのガラスをコーティングするのにも適することを当業者は気づくであろう。例えば、ガラスの化学的特徴（主成分、副成分（ｍｉｎｏｒ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）および微量成分）と、その物理的特性とは本発明の用途については重要ではない。
【００４１】
いずれのカルボキシシリル試薬でも、ガラス表面への共有結合による付着ができる限り、使用される場合がある。例えば、１つの実施態様では、カルボキシシリル試薬は、Ｎ−［（３−トリメトキシシリル）プロピル］エチレン・ジアミン三酢酸三ナトリウム塩である。
【００４２】
ガラス表面とカルボキシシリル試薬との間の反応条件は、側鎖カルボキシシリルリンカーが該ガラス表面に形成することができれば十分である。例えば、１つの実施態様では、ガラス基質は室温でＮ−［（３−トリメトキシシリル）プロピル］エチレン・ジアミン三酢酸三ナトリウム塩の水溶液中に浸漬され、硬化（ｃｕｒｉｎｇ）の前に遠心して乾燥する。
【００４３】
１つの実施態様では、カルボキシシリル試薬は塩共役型（ｓａｌｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒｍ）である。かかる試薬がガラス表面と反応するとき、該ガラス表面に形成される側鎖フッ化アシルリンカーも塩共役型であり、フッ化アシル基に変換するためには、中和してカルボキシル基を露出させなければならない（図１）。１つの実施態様では、塩共役型のカルボキシシリル試薬は、Ｎ−［（３−トリメトキシシリル）プロピル］エチレン・ジアミン三酢酸三ナトリウム塩である。前記ナトリウム塩は、本明細書の実施例１に詳細に説明されるとおり、水溶液中の過剰の酢酸で中和される（１０体積％、１０分間）場合がある。
【００４４】
基質に連結されたフッ化アシル基は求核剤との反応性がある。特に、基質に連結されたフッ化アシル基は、水との反応性は比較的弱いけれども、アミノ基、１級または２級アミン基および水酸基を含む求核剤分子種と選択的に反応して、共有結合を形成する。基質に連結されたフッ化アシルは、一部のエステル基を含む分子種と反応して、該基質に連結する場合がある。したがって、フッ化アシルで活性化されたガラススライドは、求核官能基、特に、窒素および／または酸素を含む求核剤を含む、広範囲の有機分子および生体分子の共有結合による固定化に利用される場合がある。
【００４５】
したがって別の面では、本発明は、求核剤を含む分子種の共有結合による固定化用の基質を提供する。前記基質は、フッ化剤との反応によって、腐食を伴わずに、活性化される、側鎖カルボキシシリルリンカーを有するガラス表面を含む。好ましい実施態様では、窒素および／または酸素の求核剤を含む分子種が、本発明のガラス基質の上に固定化される。
【００４６】
本発明の基質は、分子種の付着に利用可能な１つまたは２つ以上の表面を提供するいずれの形状であってもよい。前記基質の適当な形状の例は、スライド、シートおよびビーズを含むが、これらに限られない。本発明の基質は、生物活性の評価または同定のための生体分子のアレイの製作に特に有用である。したがって、１つの実施態様では、固体支持体は、少なくとも１つの平らな表面を有する器具の形状をしている。前記固体支持体のサイズはさまざまであるが、固定化された生体分子の最終的な用途に依存する。例えば、小型化された固体支持体上に固定化された生体高分子のアレイが多年にわたって開発中であることを当業者は了解するであろう。これらの固体支持体は、ｍｍ２のオーダーのサイズの面積を有し、前記小型化された固体支持体上の異なる部位特異的な位置に付着された、多数の異なる固定化生体高分子を有することがある。
【００４７】
ここで用いられるところの「生体分子」という用語は、核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、糖質、脂質、その他の生物学的に意義のある分子種と、これらの類似体とを指す。ここで用いられるところの「ポリヌクレオチド」とは、分離した断片の形状またはより大きな構造の成分としてのデオキシリボヌクレオチドか、リボヌクレオチドかの重合体を指す。ここで用いられるところの「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡか、ＲＮＡか、ＰＮＡ（ペプチド核酸）のようなＤＮＡの類似体か、合成オリゴヌクレオチドかの場合がある。前記ＤＮＡは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡか、ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡかの場合がある。前記ＲＮＡはｍＲＮＡの場合がある。前記ポリヌクレオチドの長さは、３ｂｐないし１０ｋｂの場合がある。本発明の１つの実施態様によると、ポリヌクレオチドの長さは、約５０ｂｐないし１０ｋｂの範囲内で、好ましくは、１００ｂｐないし１．５ｋｂの範囲内である。本発明の別の実施態様によると、合成オリゴヌクレオチドの長さは、約３ないし１００ヌクレオチドの範囲内である。
【００４８】
ここで用いられるところの「ポリペプチド」という用語は、１個のアミノ酸のα−カルボキシル基が別のアミノ酸のα−アミノ基とペプチド結合によって連結されている、アミノ酸の重合体を指す。タンパク質は、ジスルフィド結合か、他の非共有結合相互作用かによって連結された単数または複数のポリペプチドを含む場合がある。タンパク質の例は、抗体、抗原、酵素およびレセプターを含むが、これらに限られない。
【００４９】
本発明の基質は、求核剤を含む分子種の共有結合による付着に好適である。したがって本発明は、さらに別の面では、求核剤を含む分子種をガラス基質に共有結合で付着させる方法を提供する。前記方法は、
（ａ）求核剤を含む分子種を用意するステップと、
（ｂ）カルボキシル基を含む少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで処理された表面を有するガラス基質を用意するステップと、
（ｃ）前記カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することによって、前記ガラス表面を活性化するステップと、
（ｄ）前記（ｃ）の活性化するステップのフッ化水素副産物を中和して、前記ガラス表面の腐食を防ぐステップと、
（ｅ）前記求核剤を含む分子種と前記フッ化アシル基との共有結合を可能にする条件下で、該求核剤を含む分子種を前記活性化ガラス表面に接触させるステップとを含む。
【００５０】
前記求核剤を含む分子種は、該分子種の前記ガラス基質への付着を可能にするのに十分な条件下で、本発明の活性化ガラス基質に接触させることによって、共有結合で付着される。前記条件は、前記分子を前記リンカーの側鎖フッ化アシル基と反応して共有結合を形成できる場合に十分とされる。
【００５１】
本発明の１つの実施態様によると、コーティングされた基質にポリヌクレオチドを接触させるステップは、水溶性バッファー、好ましくは中性または塩基性のｐＨのバッファーの存在下で達成される。本発明の目的には、塩基性ｐＨ条件とは、８を超えるｐＨを有する条件をいう。塩基性ｐＨ条件は、ポリヌクレオチドが固体支持体に付着できれば十分である。本発明の１つの実施態様によると、本発明の塩基性ｐＨ条件は、約９ないし１２のｐＨを有する。前記塩基性ｐＨ条件は、用いる方法次第で変わる。当業者は、本発明の開示に基づいて特定の付着反応の塩基性ｐＨ条件を容易に突き止めることができる。
【００５２】
異なるタイプの分子の共有結合による付着に適する条件の例は以下に提供される（実施例２−４）。要約すると、１つの実施態様では、活性化ガラススライドは、ビオチン化オリゴヌクレオチド水溶液（中性ｐＨで〜２０ｎＭ）を手作業でスポットされ、室温で乾燥される。別の実施態様では、３つの異なるバッファー中のウサギ抗マウスＩｇＧの０．０２ｍｇ／ｍＬ溶液がＢｉｏＤＯｔインクジェットプリンタを用いて３枚の活性化スライドにプリントされ、室温で乾燥される。前記バッファーは、５０ｍＭＣＨＥＳ  ｐＨ９．０と、５０ｍＭＣＡＰＳ  ｐＨ１０．５と、０．１Ｍ炭酸バッファー  ｐＨ１０．０とである。さらに別の実施態様では、５０ｍＭ炭酸バッファーｐＨ１０中の１：５００希釈のビオチンアミドペンチルアミン（ＢＡＰＡ）がＢｉｏｄｏｔインクジェットプリンタを用いて２枚の活性化スライドにプリントされる。
【００５３】
本発明の活性化ガラス基質は、当業者に知られた方法によって求核剤を含む分子種と接触される場合がある。例えば、前記接触させるステップは、インクジェットプリント法と、固相または開放毛管装置接触プリント法と、微小流体力学的チャンネルプリント法と、電気化学的または電磁的な力に基づくプリント装置を用いる技術とによって実行される場合がある。例えば、商業的に入手可能なインクジェットプリンタを含むサーマルインクジェットプリント技術と、米国特許第４，８７７，７４５号明細書に説明される圧電微小ジェットプリント技術とが、未修飾ポリヌクレオチドを固体支持体にスポットするのに用いられることがある。代替的に、前記接触させるステップは、ピペッタまたはＢｉｏｍｅｋのピン・ツールを用いて、前記生体分子または細胞を活性化ガラス基質の上に手作業によってスポットすることによって実行される場合がある。
【００５４】
本発明のコーティングされた基質は、生体分子がガラス基質と接触状態に置かれるいかなる方法によって、前記分子を含む求核剤を含む分子種に接触されてもかまわない。ここでは明示的に記載されない他の水性バッファーシステムも、該バッファーシステムが分子のガラス基質への付着を可能にするのに十分な条件を提供する限り、本発明に利用されてもかまわないことは理解されるべきである。
【００５５】
本発明の実施態様によると、水溶液中に含まれる分子の濃度は、該分子のタイプ、サイズ、構造その他の前記分子の溶解度に影響を与えることのある要因次第で変わる場合がある。一般に、基質表面のフッ化アシル基の上にプリントされる求核剤を含む分子種の過剰なモル数が必要である。例えば、付着した高分子がポリヌクレオチドのときには、プリントされる溶液中の濃度は約５ｎＭから約４０ｐＭまでの範囲内であることが好ましい。
【００５６】
１つの実施態様では、未反応の側鎖フッ化アシル基は、望ましくない反応を起こさないように「ブロック」される。前記側鎖フッ化アシル基は、不活性化できるいずれの化学薬品によってブロックされてもかまわない。例えば、未反応のフッ化アシル官能基は、水酸化アンモニウムと反応してカルボキサミドを形成し、あるいは、エタノールと反応してエステルを形成する場合がある。しかし、その他のブロッキング反応が想定できることを当業者は認めるであろう。
【００５７】
上述のとおり、固定化された生体分子を利用する多くの用途では、該生体分子が固体支持体の表面の部位特異的な位置に固定化されることを必要とする。それぞれの生体分子が部位特異的に配置された、固定化生体分子のグリッドおよびアレイを含む、生体分子の規則正しく配置されたアレイを製作するためには、コーティングされた基質表面の予め選択された部位が所望の生体分子または細胞の溶液に曝される。これは、手作業か、あるいは、上記のさまざまなプリント技術かを利用することによって達成できる。
【００５８】
その結果、本発明の別の面は、
（ａ）複数の生体分子を用意するステップと、
（ｂ）カルボキシル基を含む、少なくとも１個の側鎖カルボキシシリルリンカーで処理された表面を含むガラス基質を用意するステップと、
（ｃ）前記カルボキシル基をフッ化アシル基に変換することによって、前記ガラス表面を活性化するステップと、
（ｄ）前記（ｃ）の活性化するステップのフッ化水素副産物を中和して、前記ガラス表面の腐食を防ぐステップと、
（ｅ）前記生体分子とフッ化アシル基とが共有結合してバイオアレイを形成することを可能にする条件下で、離散した位置の前記活性化ガラス表面に該生体分子を接触させるステップとを含む方法によって製作された、バイオアレイを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
以下の実施例は、本発明の範囲を例示することが目的であって、限定することは目的ではない。かかる実施例は、利用される場合がある実施例の典型的なものではあるが、当業者に知られた他の手順が代替的に利用される場合がある。実際、当業者は、ここの記載に基づいて、過度の実験を行うことなく、更なる実施態様を案出し製作することが容易にできる。
【実施例１】
【００６０】
カルボキシシリル処理ガラスの活性化
カルボキシシリル処理ガラススライドは、ホウケイ酸ガラス顕微鏡スライドをＮ−［（３−トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン三酢酸三ナトリウム塩（ペンシルバニア州、ＢｒｉｓｔｏｌのＵｎｉｔｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎc．）の２％水溶液中で２ないし３分間室温で撹拌しながら浸漬し、その後、室温で２４時間乾燥および硬化を行うことによって、製作される。代替的に、製作済みのカルボキシシリル処理ガラススライドがＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（テキサス州ヒューストン）その他の供給業者から購入される場合がある。残存するナトリウム塩は、前記カルボキシル基を除去するために過剰の酢酸水溶液（１０体積％、１０分間）で中和され、水中に３回浸漬して洗浄される。前記スライドは、強力なアルゴンガス気流（〜９０ｐｓｉ）の下で乾燥されるが、低速遠心がより効果的に利用される場合がある。乾燥され、中和された前記スライドは、その後、無水アセトニトリル（３Å篩の上に貯蔵）中の過剰のＤＡＳＴおよびＤＩＥＡ溶液（ＤＡＳＴについて５体積％、ＤＩＥＡについて２．５体積％）中で２５分間浸漬することによって活性化された。
【００６１】
前記スライドは、無水アセトニトリル（３Å篩の上に貯蔵）中で３回浸漬することによって洗浄され、強力なアルゴンガス気流（〜９０ｐｓｉ）の下で乾燥されるが、低速遠心がより効果的に利用される場合がある。活性化された前記スライドは、アルゴン雰囲気下で４°Ｃ以下で保存された。
【実施例２】
【００６２】
オリゴヌクレオチドおよびｃＤＮＡの本発明の活性化スライドへの共有結合による付着
実施例１に記載の活性化ガラススライドは、手作業によって、ビオチンアミドペンチルアミン（ＢＡＰＡ）の塩基性の炭酸バッファー溶液（ｐＨ９）、２種類のビオチン化ポリヌクレオチドの水溶液（中性ｐＨ）、ｃＤＮＡ製作物の水溶液（中性ｐＨ）をスポットされた。室温で５分間未満乾燥した後、前記スライド上に残存する活性化部位は、エタノールで１時間処理して失活された（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）。前記スポットが彗星状に尾を引いていることから判断すると、使用されたエタノールは、おそらく完全には無水状態ではなかった。前記スライドは、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼで（ｉ）時間常温処理して現像された。前記スライドは、その後、信号の現像のため酵素結合蛍光（ＥＬＦ）試薬（アルカリフォスファターゼ用蛍光基質、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン）中に３０分間入れられた。アレイの信号は、ＣＣＤカメラシステムを用いて読みとられた。
【００６３】
図２に示される結果は、フッ化アシルの化学反応を介して、腐食を伴わずに、ガラス表面に付着されたオリゴヌクレオチドおよび核酸は、レポータ分子と生化学的な相互作用を起こして検出可能な信号を生成することができる。より低分子の有機分子（ビオチンアミドペンチルアミン−ＢＡＰＡ）も結合したが、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼおよびＥＬＦ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン）との反応では信号の強度は弱かった。
【実施例３】
【００６４】
抗体の本発明の活性化スライドへの共有結合による付着
ウサギ抗マウスＩｇＧの３つの異なるバッファー中の０．０２ｍｇ／ｍＬ溶液が、ＢｉｏＤｏｔインクジェットプリンタを用いて３枚の活性化スライド上にプリントされた。前記バッファーは、５０ｍＭ  ＣＨＥＳ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＣＡＰＳ（ｐＨ１０．５）および０．１Ｍ  炭酸バッファー（ｐＨ１０．０）であった。乾燥後、前記スライド上に残存する活性化部位は、１ｍｇ／ｍＬカゼインの５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９）溶液中で失活された。その後、標的のビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧが固定化された前記抗マウスＩｇＧに結合された。前記スライドは、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼで１時間常温処理して現像された。その後、前記スライドは、信号の現像のため、前記ＥＬＦ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）中に３０分間入れられた。アレイ信号は、ＣＣＤカメラシステムを用いて読みとられた。
【００６５】
図３に示した結果は、さまざまなバッファーを用いるフッ化アシルの化学反応を介して、複合体の４重ＩｇＧタンパク質が、腐食を伴わずに、ガラス表面に付着していることを証明する。付着した前記タンパク質は、次々と、別のビオチン化特異抗体に免疫反応で結合でき、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼとＥＬＦ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）とからなる生化学的レポータシステムによって検出できた。
【実施例４】
【００６６】
ビオチンアミドペンチルアミン（ＢＡＰＡ）の本発明の活性化スライドへの共有結合による付着
ビオチンアミドペンチルアミン（ＢＡＰＡ）は１個のアミノ基を有する低分子の分子種なので、基質に共有結合で連結されない限り、競合する塩基によって該基質から容易に脱離（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ）される。５０ｍＭ炭酸バッファーｐＨ１０．０中に１：５００希釈したＢＡＰＡがＢｉｏｄｏｔインクジェットプリンタを用いて２枚の活性化スライド上にプリントされた。１枚のスライドは、強塩基性の３０％アンモニア水中で９０分間インキュベーションされ、もう１枚のスライドは、エタノール中で９０分間インキュベーションされた。両方のインキュベーションとも常温で行われた。前記スライドはストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼで常温１時間処理して現像された。その後、前記スライドは信号の現像のために３０分間ＥＬＦ試薬中に入れられた。アレイの信号はＣＣＤカメラシステムを用いて読みとられた。
【００６７】
アンモニアとエタノールの両方の試薬とも、前記スライド上の未反応のフッ化アシル部位を失活させると予想される。さらに、前記アンモニア水は、ＢＡＰＡが共有結合のアミド結合で前記表面に連結されていない場合には、図５ｂに示すとおり、ＢＡＰＡと競合して洗い流す（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｏｆｆ）ことができる。ＢＡＰＡはアンモニアによって置換されないため、ＢＡＰＡは前記シリルリンカーと共有結合で連結すると結論されるので（図４）、フッ化アシルの付着機構の正しさが立証される。
【００６８】
上記の内容はかなり詳細に好ましい実施態様について説明されたが、本明細書の開示内容または請求の範囲の限定として解釈されるべきではない。当業者の理解しえる範囲内の改変および変更は、添付する請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明のカルボキシシリル基でコーティングされたガラスのフッ化アシルによる活性化方法を示す反応工程図。
【図２】本発明の活性化スライドへのオリゴヌクレオチドおよびｃＤＮＡの付着状態を示す図。
【図３】本発明の活性化スライドへの抗体の付着状態を示す図。
【図４】本発明の活性化スライドへのビオチンアミドペンチルアミン（ＢＡＰＡ）の共有結合による付着状態を示す図。
【図５】ＢＡＰＡが本発明の活性化スライドに共有結合で付着していない場合には、ＢＡＰＡは競合するアンモニア水によって脱離されることを示す反応工程図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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