(57)【要約】61300+/-5000Daの分子量；コファクターとしてNADPHおよびNADH；pH7.4で55〜60℃の最適温度；4.5〜8.5の最適pH；α,β不飽和ケトンに対する基質特異性で特徴づけられる、単離されたエノン還元酵素；微生物から該還元酵素を産生するための方法；ならびにそのような還元酵素を使用してケトイソホロンからレボジオンを産生するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の物理化学的特性を有する単離されたエノン還元酵素：
a）分子量：61,300±5,000Da（45,000±5,000Daの分子量を有する1つのサブユニットからなる）、
b）コファクター：NADPHおよびNADH、
c）基質特異性：α,β不飽和ケトンに活性、
d）最適温度：pH7.4で55〜60℃、
e）最適pH：4.5〜8.5。
【請求項２】
請求項1で定義された特性を有するエノン還元酵素を産生することが可能な微生物に由来する、請求項1記載のエノン還元酵素。
【請求項３】
微生物が酵母である、請求項2記載のエノン還元酵素。
【請求項４】
微生物が、カンジダ・ケフィル (カンジダ・マセドニエンシス) IFO 0960、その機能的等価物、継代培養物、ミュータント、またはバリアントである、請求項2記載のエノン還元酵素。
【請求項５】
以下の物理化学的特性を有するエノン還元酵素を産生するための方法：
a）分子量：61,300±5,000Da（45,000±5,000Daの分子量を有する1つのサブユニットからなる）、
b）コファクター：NADPHおよびNADH、
c）基質特異性：α,β不飽和ケトンに活性、
d）最適温度：pH7.4で55〜60℃、
e）最適pH：4.5〜8.5
この方法は、上記特性を有するエノン還元酵素を産生することが可能な微生物を水性栄養培地中好気的条件下で培養する工程、微生物細胞を粉砕する工程、および該抽出物よりエノン還元酵素を単離・精製する工程を含む。
【請求項６】
微生物が酵母である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、ケトイソホロンからレボジオンを産生するための方法：
ケトイソホロンを、
(i)NADHもしくはNADPHの存在下、以下の物理化学的特性を有するエノン還元酵素
a）分子量：61,300±5,000Da（45,000±5,000Daの分子量を有する1つのサブユニットからなる）、
b）コファクター：NADPHおよびNADH、
c）基質特異性：α,β不飽和ケトンに活性、
d）最適温度：pH7.4で55〜60℃、
e）最適pH：4.5〜8.5
；または
(ii)(i)で定義された酵素を産生することが可能な微生物の細胞もしくは無細胞抽出物
と接触させる工程、
および生じたレボジオンを反応混合物から単離する工程。
【請求項８】
微生物が酵母である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
反応がpH4.5〜8.5の範囲内で行われる、請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
反応の温度が30〜60℃の範囲内である、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
実質的に本明細書に記載される、特に実施例に関する発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2,6,6-トリメチル-2-シクロヘキセン-1,4-ジオン（以後ケトイソホロンと呼ぶ）からの(6R)-2,2,6-トリメチルシクロヘキサン-1,4-ジオン（以後レボジオンと呼ぶ）の産生に関与する新規酵素と、その酵素を産生する方法（process）であって、その酵素がエノン還元酵素として作用する方法とに関する。レボジオン（levodione）は、カロテノイド（例えばゼアキサンチン）の合成における重要な中間体である。
【背景技術】
【０００２】
ケトイソホロン（ketoisophorone）からレボジオンを産生する微生物学的方法が知られている（例えば米国特許第4,156,100号を参照されたい）。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の酵素は、エノン還元酵素のクラスに属し、酵母（例えば、カンジダ・ケフィル（Candida kefyr）またはチゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii））から得ることができる。カンジダ・ケフィルから単離された酵素は、NADHにもNADPHにも依存し、ゲルろ過クロマトグラフィーで61.3kDaの分子量を持つ。この酵素は、変性電気泳動条件下45kDaの単一サブユニットからなり、278、376、および460nmにピークを持つUV可視吸収スペクトルを示す。
【０００４】
本発明は、以下の物理化学的特性を有する単離エノン還元酵素を提供することを目的とする：
a）分子量：61,300±5,000Da
（45,000±5,000Daの分子量を有する1つのサブユニットからなる）
b）コファクター：NADPHおよびNADH
c）基質特異性：α,β不飽和ケトンに活性
d）最適温度：pH7.4で55〜60℃
e）最適pH：4.5〜8.5。
【０００５】
本明細書に使用する、「エノン還元酵素（enone reductase）」という用語は、国際生化学・分子生物学連合命名委員会（Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology）（NC-IUBMB）により提供される酵素命名法（Enzyme Nomenclature）に従うカルボニル活性化二重結合の酵素的還元を触媒するタンパク質を包含する。この用語はまた、エノン還元酵素の上記活性を有するタンパク質であって、好ましくはケトイソホロンのレボジオンへの変換を触媒するタンパク質に関する。
【０００６】
より詳しくは、本発明は、上記物理化学的特性を有するタンパク質を産生することが可能な微生物に由来する、上記エノン還元酵素活性を有する単離タンパク質に関する。
【０００７】
本発明に使用される微生物は、上記で定義したエノン還元酵素を産生することが可能な、カンジダまたはチゴサッカロミセス属に属する微生物を含むがこれらに限定されない酵母から選択される。微生物の機能的等価物、継代培養物、ミュータント、およびバリアントもまた、本発明において使用できる。
【０００８】
本発明の1つの態様において、微生物は、酵母、好ましくはカンジダ、より好ましくはカンジダ・ケフィル、そして最も好ましくはカンジダ・ケフィル (カンジダ・マセドニエンシス（Candida macedoniensis)）IF0 0960、またはそれらの機能的等価物、継代培養物、ミュータント、およびバリアントである。カンジダ・ケフィル (カンジダ・マセドニエンシス) IFO 0960株は、発酵研究所（IFO）（〒532-8686大阪市淀川区十三本町2丁目17-85、日本）より、公的に利用可能である。
【０００９】
本明細書に使用する、微生物「カンジダ・ケフィル」または「チゴサッカロミセス・ルキシー」はまた、原核生物命名国際コード（International Code of Nomenclature of Prokaryotes）により定義される、同じ物理化学的特性を有するこのような種の類義語またはバソニム（basonym）を含む。
【００１０】
本発明により提供されるエノン還元酵素は、適切な微生物を水性栄養培地中好気的条件下で培養し、微生物細胞を粉砕し、そして粉砕微生物細胞の無細胞抽出物からエノン還元酵素を単離・精製することにより調製できる。
【００１１】
このように、本発明は、上記に定義された物理化学的特性を有するエノン還元酵素を産生するための方法であって、上記特性を有するエノン還元酵素を産生することが可能な微生物を水性栄養培地中好気的条件下で培養する工程、微生物細胞を粉砕する工程、および該細胞抽出物よりエノン還元酵素を単離・精製する工程を含む方法を提供することをもう1つの目的とする。
【００１２】
エノン還元酵素を産生する方法のために使用される微生物は、既に上記に定義されたものである。本発明の1つの態様において、エノン還元酵素の産生のために使用される微生物は、酵母、好ましくはカンジダ、より好ましくはカンジダ・ケフィル、そして最も好ましくはカンジダ・ケフィル (カンジダ・マセドニエンシス) IFO 0960、またはそれらの機能的等価物、継代培養物、ミュータント、およびバリアントである。
【００１３】
本発明により提供されるエノン還元酵素は、ケトイソホロンからのレボジオンの産生のための触媒として有用である。このように、本発明は、ケトイソホロンからレボジオンを産生するための方法であって、ケトイソホロンを、(i)NADHまたはNADPHの存在下、上記に定義された物理化学的特性を有するエノン還元酵素、(ii)(i)に定義される酵素を産生することが可能な該微生物の細胞または無細胞抽出物、と接触させる工程、および各ケースにおいて生じたレボジオンを反応混合物から単離する工程を含む方法を提供することをさらなる目的とする。
【００１４】
1つの態様において、上記に定義された酵素を産生することが可能な、レボジオンの産生のために使用される微生物は、酵母、好ましくはカンジダ、より好ましくはカンジダ・ケフィル、そして最も好ましくはカンジダ・ケフィル (カンジダ・マセドニエンシス) IFO 0960、またはそれらの機能的等価物、継代培養物、ミュータント、およびバリアントである。
【００１５】
微生物は、炭素源として、グルコースもしくはスクロースなどのサッカライド、エタノールもしくはグリセロールなどのアルコール、オレイン酸、ステアリン酸、もしくはそれらのエステルなどの脂肪酸、またはナタネ油もしくはダイズ油などの油；窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、アミノ酸、コーンスティープリカー、ブラン、酵母抽出物など；無機塩源として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウムなど；および他の栄養源として、麦芽抽出物、肉抽出物などを含む栄養培地中で培養されうる。培養は、通常1〜7日の期間内、培地pH3〜9、培養温度10〜40℃で、好気的に実施できる。より好ましくは、培養期間は2〜4日間であり、培地pHは5〜8であり、そして培養温度は25〜35℃である。
【００１６】
以下に、培養後の微生物からのエノン還元酵素の単離・精製のための態様を簡単に述べる：
(1)細胞を遠心分離またはろ過により液体培養ブロスから回収し、
(2)回収した細胞を、水、生理食塩水、または適切なpHを有する緩衝液溶液で洗浄し；
(3)洗浄した細胞を緩衝液溶液に懸濁し、ホモジナイザー、ソニケーター、フレンチプレス、またはリゾチームによる処理などによって粉砕して粉砕細胞溶液を得；そして
(4)エノン還元酵素を粉砕細胞の無細胞抽出物から単離・精製する。
【００１７】
この反応は、Tris-HCl緩衝液、リン酸緩衝液などの溶媒中、pH値約4.5〜約8.5、NADHまたはNADPHの存在下で行うことができる。本発明の1つの態様は、上記に定義したようなエノン還元酵素または微生物を使用してケトイソホロンからレボジオンを産生するための方法であって、反応がpH4.5〜8.5の範囲、好ましくは5.0〜8.0の範囲で行われる方法に関する。
【００１８】
本発明のさらなる局面は、上記に定義したようなエノン還元酵素または微生物を使用してケトイソホロンからレボジオンを産生するための方法であって、反応温度が30〜60℃の範囲、好ましくは55〜60℃の範囲である方法に関する。
【００１９】
pHおよび温度をそれぞれ5.0〜8.0および45〜60℃に設定することにより、反応は通常、最良の結果を出す。好ましくは、pHは5.0〜8.0の範囲であり、温度は55〜60℃の範囲である。
【００２０】
溶媒中のケトイソホロンの濃度は、他の反応条件に依存して変わりうるが、一般的に、1mM〜2M、好ましくは10mM〜100mMである。
【００２１】
反応中、エノン還元酵素はまた、適切なキャリアーによって固定化状態で使用されうる。当技術分野で一般的に知られている、酵素を固定化する任意の手段を使用しうる。例えば、酵素は、1つ以上の官能基を有する樹脂の膜や顆粒などに直接結合させてもよく、あるいは1つ以上の官能基を有する架橋化合物（例えばグルタルアルデヒド）を介して樹脂に結合させてもよい。
【００２２】
本発明は、上記のようなエノン還元酵素活性を有する酵素の単離だけでなく、当技術分野において知られている方法を使用する、このような酵素をコードする対応遺伝子のクローニングにも関する。このようなクローン化遺伝子のcDNAは、適した発現ベクターへの導入、続いて宿主細胞（例えばE. coliまたは酵母など）に導入するために有用であろう。組み換えタンパク質は、アクチノール（actinol）またはゼアキサンチンなどのカロテノイドの産生における重要な中間段階である、ケトイソホロンのレボジオンへの変換のために有用である。
【００２３】
下記の実施例に従って調製されるエノン還元酵素の精製試料の物理化学的特性は以下の通りである。
【００２４】
1）酵素活性
本発明の新規エノン還元酵素は、下記式に従ってコファクターの存在下ケトイソホロンのレボジオンへの還元を触媒する：
2005517442.tif 000002
【００２５】
標準的酵素アッセイを以下のように行った：総容量1mlの基礎反応混合物（200μlの1M Tris-HCl緩衝液pH7.5、100μlの80mM NADHまたはNADPH、100μlの0.658Mケトイソホロン、600μl H2O）に5μlの酵素溶液を加え、40℃でインキュベートした。酵素活性1ユニットを、1分あたり1μmolのケトイソホロンの酸化を触媒する酵素量と定義した。反応混合物を1mlの酢酸エチルで抽出し、レボジオンを酢酸エチル層に回収した。抽出物をガスクロマトグラフィーにより解析した［カラム：ULBON HR- 20M（Shinwa, Japan）0.25mmφx 30m、カラム温度：160℃（一定）、インジェクター温度：250℃、キャリアーガス：He (ca. 1ml/min)］。タンパク質濃度を、Bio-Radタンパク質アッセイキット（Bio-Rad, USA）を使用して決定した。
【００２６】
2）分子量
タンパク質の分子量（MW）を、ゲルろ過カラムスーパーデックス（Superdex）200（Amersham Biosciences AB, SE-751 84 Uppsala, Sweden）で測定した。酵素の見かけ上の分子量は、分子量マーカータンパク質（Boehringer Mannheim Biochemica; Germany）フェリチン（分子量：450,000Da）、カタラーゼ（分子量：240,000Da）、アルドラーゼ（分子量：158,000Da）、ウシ血清アルブミン（分子量：68,000Da）、オボアルブミン（分子量：45,000Da）、キモトリプシノーゲン（分子量：25,000Da）、およびシトクロムc（分子量：12,500Da）と比較して、61,300±5,000Daと計算された。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により、分子量マーカータンパク質（Amersham Biosciences AB）ホスホリラーゼb（分子量：97,000Da）、ウシ血清アルブミン（分子量：66,300Da）、オボアルブミン（分子量：42,400Da）、炭酸脱水酵素（分子量：30,000Da）、およびダイズトリプシンインヒビター（分子量：20,100Da）と比較して、分子量45,000±5,000Daを持つ単一バンドを得た。このことにより、酵素が1つのサブユニットから構成されていることが示された。
【００２７】
3）コファクター
ケトイソホロンをレボジオンに変換するための酵素のコファクター要件を調べた。その結果、NADHおよびNADPHが、この還元反応のためのコファクターとして働き得た。
【００２８】
3）基質特異性
ケトイソホロンの代わりに様々な基質溶液（反応混合物中0.05%終濃度）を使用して反応を30℃で行ったこと以外は、(1)において上記した同じ酵素アッセイ方法を使用して、酵素の基質特異性を決定した。種々の基質の相対活性（%）を表1において比較する（3-ブテン-2-オンによる最良の結果が示されている）。
【００２９】
【表１】
2005517442.tif 000003
【００３０】
5）最適温度
2-シクロヘキセン-1-オンを基質として使用したこと以外は、(1)において上記した同じ酵素アッセイ方法を使用して、酵素活性を温度20〜70℃で測定した。表2に要約されるように、酵素活性の最適温度は55〜60℃であった。
【００３１】
【表２】
2005517442.tif 000004
【００３２】
5）最適pH
様々なpHおよび緩衝液を使用し、0.05%（終濃度）2-シクロヘキセン-1-オンを基質として使用したこと以外は、(1)において上記した同じ酵素アッセイ方法を使用して、酵素活性と反応混合物のpH値との相関関係を決定した。酵素反応の最適pHは、表3に示されるように4.5〜8.5であった。
【００３３】
【表３】
2005517442.tif 000005
【００３４】
7）金属イオンおよび他の化合物の効果
2-シクロヘキセン-1-オンを基質として使用し、様々な金属および他の化合物を反応混合物に加えて金属終濃度1mMとしたこと以外は、(1)において上記した同じ酵素アッセイ方法を使用して、酵素活性に対する金属イオンおよび他の化合物の効果を調べた。Pbイオンおよびトリパノフラビンが、酵素活性を強力に阻害した。Ag、Hg、Cu、Vのイオン、およびグアニジンが、酵素活性を中程度に阻害した。結果を表4に示す。
【００３５】
【表４】
2005517442.tif 000006
【００３６】
8）精製手順
エノン還元酵素の精製は原則的には、沈殿剤（例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールなど）を用いる分画、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ならびに塩析および透析などの、既知の精製方法の任意の組み合わせにより実行しうる。
【００３７】
以下の実施例により、本発明をさらに例証する。
【００３８】
実施例1：エノン還元酵素の調製
すべての操作は特記しない限り、20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.0）中4℃で行った。
【００３９】
(1)カンジダ・ケフィル (カンジダ・マセドニエンシス) IFO 0960の培養
アガープレート上で生育させたカンジダ・ケフィル (カンジダ・マセドニエンシス) IFO 0960を、チューブ中、D-グルコース（5%）、ペプトン（0.5%）、KH2PO4（0.2%）、K2HPO4（0.1%）、MgSO4・7H2O（0.02%）、および酵母抽出物（0.1%）からなる5mlの培地（pH6.0）に播種し、2日間28℃でインキュベートした。こうして調製された10mlの種培養物を、2l坂口フラスコ中500mlの上記と同じ培地に播種し、2日間28℃でインキュベートした。こうして調製された10個のフラスコからの5リットルの培養物を、8,000rpmで20分間4℃で遠心分離した。合計60.5gの湿潤細胞を得た。
【００４０】
(2)無細胞抽出物の調製
湿潤細胞（60.5g）を121mlの緩衝液に懸濁し、クボタインソネーター（Kubota Insonator）201ソニケーター（Kubota, Japan）を使用して電力190Wで2時間超音波処理した。超音波処理後、試料を10,000rpmで20分間遠心分離した。その結果、1,550mgのタンパク質を含む139mlの無細胞抽出物を得た。
【００４１】
(3)硫酸アンモニウム沈殿
前の段階で得られた無細胞抽出物（80ml）を、固体硫酸アンモニウムで分画した。40〜80%画分（78.5ml）を5lの緩衝液に対して4回透析し、91mlの透析溶液を得た。
【００４２】
(4)ジエチルアミノエチル-セファセル（Sephacel）カラムクロマトグラフィー
以上で調製された透析試料を、緩衝液で平衡化したジエチルアミノエチル（DEAE）-セファセルカラム（直径2.5cm、高さ14cm; Amersham Biosciences AB, Sweden）に加えた。同じ緩衝液200mlでカラムを洗浄した後、酵素を530mlのNaClの直線勾配（0〜0.6M）で溶出させた。酵素活性は0.1M NaClで溶出した。
【００４３】
(5)フェニル-スーパーロース（Superose）HR10/10カラムクロマトグラフィー
前の段階からの試料にNaClを追加し、終濃度4Mとした。カラム（直径1cm x長さ30cm; Amersham Biosciences AB, Sweden）を4M NaClを含む緩衝液で平衡化し、上記試料に使用した。酵素を160mlの緩衝液の直線勾配（4〜0M NaCl）により溶出させた。酵素活性はNaCl濃度2Mで溶出した。
【００４４】
(6)スーパーデックス200 HR10/30カラムクロマトグラフィー
前の段階からの試料を、スーパーデックス200 HR10/30カラム（直径1cm x長さ30cm; Amersham Biosciences AB, Sweden）クロマトグラフィーにかけた。カラムを2M NaClを含む緩衝液で平衡化し展開した。酵素活性を有する画分を回収した。酵素の精製段階の概要を表5に示す。
【００４５】
【表５】
2005517442.tif 000007
【００４６】
(7)反応産物の同定
50mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液中、10mg/mlケトイソホロン、0.6mg/ml NADP+、0.2mg/mlグルコースデヒドロゲナーゼ（Amano Enzyme, Japan）、および50mg/ml D-グルコースからなる反応混合物（1ml）に、表5のスーパーデックス200の画分からの酵素50ミリユニットを加えた。28℃で24時間インキュベーション後、混合物を1ml酢酸エチルで抽出した。抽出物をガスクロマトグラフィーにより解析した。レボジオンの標準的試料と比較して、産物はレボジオンであると同定された。
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月24日(2004.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の物理化学的特性を有する単離されたエノン還元酵素：
a）分子量：61,300±5,000Da（45,000±5,000Daの分子量を有する1つのサブユニットからなる）、
b）コファクター：NADPHおよびNADH、
c）基質特異性：α,β不飽和ケトンに活性、
d）最適温度：pH7.4で55〜60℃、
e）最適pH：4.5〜8.5。
【請求項２】
請求項1で定義された特性を有するエノン還元酵素を産生することが可能な微生物に由来する、請求項1記載のエノン還元酵素。
【請求項３】
微生物が酵母である、請求項2記載のエノン還元酵素。
【請求項４】
微生物が、カンジダ・ケフィル (カンジダ・マセドニエンシス) IFO 0960、その機能的等価物、継代培養物、ミュータント、またはバリアントである、請求項2記載のエノン還元酵素。
【請求項５】
以下の物理化学的特性を有するエノン還元酵素を産生するための方法：
a）分子量：61,300±5,000Da（45,000±5,000Daの分子量を有する1つのサブユニットからなる）、
b）コファクター：NADPHおよびNADH、
c）基質特異性：α,β不飽和ケトンに活性、
d）最適温度：pH7.4で55〜60℃、
e）最適pH：4.5〜8.5
この方法は、上記特性を有するエノン還元酵素を産生することが可能な微生物を水性栄養培地中好気的条件下で培養する工程、微生物細胞を粉砕する工程、および該抽出物よりエノン還元酵素を単離・精製する工程を含む。
【請求項６】
微生物が酵母である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、ケトイソホロンからレボジオンを産生するための方法：
ケトイソホロンを、
(i)NADHもしくはNADPHの存在下、以下の物理化学的特性を有するエノン還元酵素
a）分子量：61,300±5,000Da（45,000±5,000Daの分子量を有する1つのサブユニットからなる）、
b）コファクター：NADPHおよびNADH、
c）基質特異性：α,β不飽和ケトンに活性、
d）最適温度：pH7.4で55〜60℃、
e）最適pH：4.5〜8.5
；または
(ii)(i)で定義された酵素を産生することが可能な、カンジダ属に属する微生物の細胞もしくは無細胞抽出物
と接触させる工程、
および生じたレボジオンを反応混合物から単離する工程。
【請求項８】
微生物が酵母である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
反応がpH4.5〜8.5の範囲内で行われる、請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
反応の温度が30〜60℃の範囲内である、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
【国際調査報告】
2005517442.tif 000008
2005517442.tif 000009
2005517442.tif 000010
2005517442.tif 000011
2005517442.tif 000012