(57)【要約】ポリケチドのための開始単位および伸長単位の生成を触媒する酵素の使用が記載される。さらに、改変したローディングモジュールが記載され、これは、置換ベンゾエートのような種々の開始単位を受容可能であり、そして天然生成物の置換誘導体を得るために使用され得る。これらの酵素は、ネイティブに生成されるポリケチドまたは合理的に設計されるポリケチドの収率を増大させるために使用され得る。これらの技術によって、完全なポリケチドはＥ．ｃｏｌｉにおいて達成されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのポリケチドの増大した合成のために、遺伝的に改変された微生物宿主細胞であって、該改変は、開始単位および／または伸長単位の生成を触媒するタンパク質を生成し、そして／あるいは開始単位および／または伸長単位の異化作用のための、少なくとも１つの内因性経路を無能にする、少なくとも１つの発現系の組込みを含む、微生物宿主細胞。
【請求項２】
前記ポリケチドが生成される条件下で、請求項１に記載の細胞を培養する工程を包含する、ポリケチドを生成する方法。
【請求項３】
改変した遺伝子混合物を生じる、ポリケチドシンターゼ遺伝子の改変をもたらす手順の結果を評価する方法であって、該方法は、以下の工程：
該改変した遺伝子混合物を、請求項１に記載の細胞培養物にトランスフェクトする工程であって、ここで、該細胞がＥ．ｃｏｌｉである工程、
該トランスフェクトされたＥ．ｃｏｌｉの個々のコロニーを培養する工程、および
ポリケチド生成について各コロニーを評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
置換ベンゾエートが、リファマイシンシンテターゼのアデニル化−チオール化（Ａ−Ｔ）ジドメインをプライムし得るか否かを決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
該Ａ−Ｔジドメインをプライムするのに適切な条件下で、ｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメインと共に置換ベンゾエートをインキュベートする工程；および
該Ａ−Ｔジドメインをプライムした置換ベンゾエートの量または存在を測定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
原核生物宿主細胞であって、該原核生物宿主細胞は、遺伝的改変の非存在下でポリケチドを生成せず、少なくとも１つのハイブリッドポリケチドの合成を増大するように遺伝的に改変され、ここで、該改変は、少なくとも１つの、Ａ−Ｔジドメインを含む発現系の組込みを含み、該発現系は、請求項４に記載される方法に従って、Ａ−Ｔジドメインをプライムする開始単位を組込む、原核生物細宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載される原核生物宿主細胞であって、ここで、前記開始単位が、改変ポリケチドを作製するために、以下：
２−アミノベンゾエート、３−アミノベンゾエート、４−アミノベンゾエート、３−アミノ−５−ヒドロキシベンゾエート、３−アミノ−４−ヒドロキシベンゾエート、４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾエート、３−ブロモベンゾエート、３−クロロベンゾエート、３，５−ジアミノベンゾエート、３，５−ジブロモベンゾエート、３，５−ジクロロベンゾエート、３，５−ジフルオロベンゾエート、２，３−ジヒドロキシベンゾエート、３，５−ジヒドロキシベンゾエート、３，５−ジニトロベンゾエート、３−フルオロベンゾエート、２−ヒドロキシベンゾエート、３−ヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシベンゾエート、３−メトキシベンゾエート、３−ニトロベンゾエートおよび３−スルホベンゾエートからなる群より選択される、原核生物宿主細胞。
【請求項７】
請求項５に記載される原核生物宿主細胞であって、ここで、前記開始単位が、改変ポリケチドを作製するために、以下：
２−アミノベンゾエート、３−アミノベンゾエート、４−アミノベンゾエート、３−アミノ−４−ヒドロキシベンゾエート、４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾエート、３−ブロモベンゾエート、３−クロロベンゾエート、３，５−ジアミノベンゾエート、３，５−ジブロモベンゾエート、３，５−ジクロロベンゾエート、３，５−ジフルオロベンゾエート、２，３−ジヒドロキシベンゾエート、３，５−ジニトロベンゾエート、３−フルオロベンゾエート、２−ヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシベンゾエート、３−メトキシベンゾエート、３−ニトロベンゾエートおよび３−スルホベンゾエートからなる群より選択される、原核生物宿主細胞。
【請求項８】
開始単位が組込まれたハイブリッドポリケチドであって、ここで、前記開始単位が、請求項４に記載の方法に従って、Ａ−Ｔジドメインをプライムする、ハイブリッドポリケチド。
【請求項９】
請求項８に記載のハイブリッドポリケチドであって、前記開始単位が、以下：
２−アミノベンゾエート、３−アミノベンゾエート、４−アミノベンゾエート、３−アミノ−５−ヒドロキシベンゾエート、３−アミノ−４−ヒドロキシベンゾエート、４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾエート、３−ブロモベンゾエート、３−クロロベンゾエート、３，５−ジアミノベンゾエート、３，５−ジブロモベンゾエート、３，５−ジクロロベンゾエート、３，５−ジフルオロベンゾエート、２，３−ジヒドロキシベンゾエート、３，５−ジヒドロキシベンゾエート、３，５−ジニトロベンゾエート、３−フルオロベンゾエート、２−ヒドロキシベンゾエート、３−ヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシベンゾエート、３−メトキシベンゾエート、３−ニトロベンゾエートおよび３−スルホベンゾエートからなる群より選択される、ハイブリッドポリケチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のハイブリッドポリケチドであって、前記開始単位が、以下：
２−アミノベンゾエート、３−アミノベンゾエート、４−アミノベンゾエート、３−アミノ−４−ヒドロキシベンゾエート、４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾエート、３−ブロモベンゾエート、３−クロロベンゾエート、３，５−ジアミノベンゾエート、３，５−ジブロモベンゾエート、３，５−ジクロロベンゾエート、３，５−ジフルオロベンゾエート、２，３−ジヒドロキシベンゾエート、３，５−ジニトロベンゾエート、３−フルオロベンゾエート、２−ヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシベンゾエート、３−メトキシベンゾエート、３−ニトロベンゾエートおよび３−スルホベンゾエートからなる群より選択される、ハイブリッドポリケチド。
【請求項１１】
前記ポリケチドが生成される条件下で、請求項５に記載の細胞を培養する工程を包含する、ポリケチドを生成する方法。
【請求項１２】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の細胞、またはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項１３】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、リファマイシン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、アンサトリエニン、ＦＫ５２０、ミクロシスチン、ピマリシン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、メガロマイシン、ピクロマイシン、スピノサド、アベルメクチン、チロシンまたはエポチロンに由来する、完全なポリケチドを生成する、請求項５に記載の細胞。
【請求項１５】
改変したリファマイシンを生成する、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
６−ｄＥＢアナログを生成する、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１７】
前記遺伝的改変がさらに、ポリケチドシンターゼタンパク質のための少なくとも１つの発現系の組込みを含む、請求項５に記載の細胞。
【請求項１８】
前記遺伝子的改変が、ホスホパンテチエニルトランスフェラーゼのための少なくとも１つの発現系の組込みを含む、請求項５に記載の細胞。
【請求項１９】
微生物宿主において、少なくとも１つのハイブリッドポリケチドの生成を増大する方法であって、該方法は、請求項４に記載の方法に従って、Ａ−Ｔジドメインをプライムする、外因性開始単位を組込むタンパク質を生成するための発現系を有する該宿主細胞を提供する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
微生物宿主細胞において、二次代謝産物の生成を増大する方法であって、該方法は、該微生物細胞が、培養中に高細胞密度に達した後に、該二次代謝産物の生成を誘導する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記二次代謝産物がポリケチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記誘導が、誘導性プロモーターを活性化する化合物を提供することによって誘導される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
微生物宿主において、二次代謝産物の生成を増大する方法であって、該方法は、該二次代謝産物の生成の間、比較的一定なレベルで、該微生物に与える栄養レベルを維持する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
前記二次代謝産物がポリケチドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
微生物においてポリケチドの生成を増大する方法であって、該方法は、チオエステラーゼＩＩ（ＴＥＩＩ）のための発現系を含むように、該微生物を改変する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリケチドの効率的な産生のために微生物宿主を適合させる方法に関する。１つの局面において、この宿主は、ポリケチドの合成においてポリケチドシンターゼにより使用される開始単位および／または伸長単位を合成するように改変される。別の局面において、宿主は、置換ベンゾエートを開始単位として受容するシンターゼを合成するように、改変される。他の宿主改変もまた、なされ得る。従って、本発明は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような多様な生物における、複合ポリケチドの産生のための方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（リファマイシンＢ）
リファマイシンシンテターゼは、非リボソーム性ペプチドシンテターゼのアデニル化（Ａ）ドメインおよびチオール化（Ｔ）ドメインと相同であるドメインを含む、ローディングモジュールによって、３−アミノ−５−ヒドロキシベンゾエート（ＡＨＢ）開始単位を用いて開始される。Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのリファマイシンシンテターゼは、抗生物質リファマイシンＢに対する前駆体であるプロサンサマイシンＸの生合成を担う（図１）。（リファマイシンＢ前駆体であるプロサンサマイシンＸの生合成を担うタンパク質複合体は、本明細書中で、リファマイシンシンテターゼと呼ばれる。なぜなら、本明細書中に記載される結果により、この複合体のローディングモジュールへのアリール開始単位の共有結合のために、ＡＴＰが必要であることが確立されるからである。）このリファマイシンシンテターゼは、一団の５つの多機能性タンパク質ＲｉｆＡ、ＲｉｆＢ、ＲｉｆＣ、ＲｉｆＤ、およびＲｉｆＥと、これに加えて、ＲｉｆＦ（分子内アミド形成を介してその他タンパク質の直鎖状産物を環化すると考えられるタンパク質）とからなる（Ｓｃｈｕｐｐ，Ｔ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９８）１５９：２０１−２０７；Ａｕｇｕｓｔ．Ｐ．Ｒ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）５：６９−７９；Ｔａｎｇ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９８）２１６：２５５−２６５；Ｆｌｏｓｓ，Ｈ．Ｇ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９）３：５９２−５９７）。この５つの多機能性タンパク質は、１つの非リボソーム性ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）様ローディングモジュールと、１０個のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）モジュールとに、他の系に対する配列相同性に基づいてさらに分割され得る。
【０００３】
ＲｉｆＡ（リファマイシンシンテターゼのＮ末端タンパク質成分）は、ＮＲＰＳ様モジュールであるアデニル化−チオール化（Ａ−Ｔ）ローディングジドメインを、第１の濃縮モジュールの上流に含む（図１）。最初のこのようなＡ−Ｔ型ローディングモジュールは、天然産物であるラパマイシンの遺伝子クラスターにおいて同定された（Ｓｃｈｗｅｃｋｅ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：７８３９−７８４３）。ハイブリッドモジュール型インターフェースを含む他のシンテターゼの完全遺伝子クラスターが、報告されている（Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）５：５７３−５８６；Ｑｕａｄｒｉ，Ｌ．Ｅ．Ｎ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）５：６３１−６４５；Ｓｉｌａｋｏｗｓｋｉ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：３７３９１−３７３９９；Ｊｕｌｉｅｎ，Ｂ．ら、Ｇｅｎｅ（２０００）２４９：１５３−１６０；Ｔｉｌｌｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０００）７：７５３−７６４；Ｗｕ，Ｋ．ら、Ｇｅｎｅ（２０００）２５１：８１−９０；Ｄｕ．Ｌ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０００）７：６２３−６４０）。そしてこれらのシンテターゼは、ケチド単位およびペプチド単位の両方から構成される、ハイブリッド天然産物を生成する。治療剤としての証明されたポリケチド天然産物およびペプチド天然産物の追跡記録は、ハイブリッド産物にて実現される組み合わせの多様性の増大が、薬物開発を進歩させることを示唆する。ハイブリッドシンテターゼの生化学的理解を、タンパク質工学を介してハイブリッドインターフェースを操作する能力とともに使用して、そのようなハイブリッド分子の能力を実現させることは、有利である。
【０００４】
ＲｉｆＡのＮＲＰＳ様Ａ−Ｔジドメインは、３−アミノ−５−ヒドロキシベンゾエート（ＡＨＢ）を用いてこのシンテターゼをおそらく開始させる。このＡＨＢは、リファマイシンＢのｍＣ７Ｎ構造エレメントの前駆体であることが示されている（図１）（Ｇｈｉｓａｌｂａ，Ｏ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８１）３４：６４−７１；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８９）３１１−３１３）。しかし、この開始機構は、確立されていない。２つの代替的モデルが、想定され得る。文献において普及している補酵素Ａ（ＣｏＡ）リガーゼモデル（Ｓｃｈｕｐｐ，Ｔ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９８）１５９：２０１−２０７；Ａｕｇｕｓｔ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）５：６９−７９；Ｇｈｉｓａｌｂａ，Ｏ．ら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８１）３４：６４−７１）において、このＡドメインの活性化ＡＨＢ−アデニレート産物は、ＣｏＡにより攻撃されて、ＡＨＢ−ＣｏＡ中間体を生成し、そしてこのアリールチオエステル酵素中間体は、そのＴドメインへのトランスチオール化から生じる（図２Ａ）。下記に詳述されるように確認されている、ＮＲＰＳモジュールを開始するために使用される機構と類似する代替的機構において、ＡＨＢが、そのＡドメインによってアリール−アデニレートとして活性化され、そしてそのＴドメインのホスホパンテテイン補因子のチオールが、ＡＨＢ−アデニレートを直接攻撃して、共有結合性アリールチオエステル酵素中間体を形成する（図２Ｂ）。
【０００５】
ＡＨＢは、Ａ−Ｔジドメインの天然の基質であるが、以前のインビボ研究によって、ＲｉｆＡが、代替基質である３−ヒドロキシベンゾエート（３−ＨＢ）および３，５−ジヒドロキシベンゾエートにより開始され得ることが、明らかにされている（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１０９２−１０９３）。非天然天然産物の産生のために関与することについてのこの本質的基質許容性を利用することは、有利である。１つの局面において、この開始モジュールの機構を確立するためおよびリファマイシンシンテターゼの基質許容性を系統的に調査するために、インビトロでリファマイシンシンテターゼのＡ−Ｔジドメインの活性を再構成することは、有利である。従って、本発明は、非天然天然産物の産生のための相同性置換基質を提供する。
【０００６】
（６−デオキシエリトロノリドＢ）
細菌Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａにより合成される広いスペクトルの抗生物質であるエリスロマイシンは、ポリケチドと呼ばれる複合天然産物の種類の原型である（Ｏ’Ｈａｇａｎ，Ｄ．，Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ（Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．，１９９１）。複合ポリケチド（例えば、抗生物質エリスロマイシンの大環状コアである６−デオキシエリスロノリドＢ（６−ｄＥＢ））は、天然産物の重要な種類を構成する。これらの生体分子は、単純な構築ブロック（例えば、アセチル−ＣｏＡ、プロピニル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、およびメチルマロニル−ＣｏＡ）から、放線菌類において一般的に見出される、ポリケチドシンターゼと呼ばれる大きなモジュール型メガシンターゼ（Ｃａｎｅ，Ｄ．Ｅ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８２：６３）の作用を介して合成される。例えば、６−ｄＥＢの合成を生じるポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）は、Ｓａｃｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｒｙｔｈｒａｅａにおいて産生される。これらの天然宿主において産生されるポリケチドは、一般的に、その後、グリコシル化、酸化、ヒドロキシル化、および他の改変反応によって調整されて、最終抗生物質が得られる。ポリケチドの構造的複雑性は、しばしば、実際の実験室合成経路の開発を不可能にし、発酵を、これらの薬学的および農学的に有用な薬剤の商業的生成のための唯一の実行可能な供給源とする。同時に、天然の生物学的供給源（主に、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ科の細菌）からポリケチドを産生するための拡張可能かつ経済的に実行可能な発酵プロセスを開発することに関連する試みは、膨大であり、そしてポリケチドの臨床前開発および臨床開発の間に最も深刻な隘路を示す。この実験室からの最近の研究によって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて機能的形態でポリケチドシンターゼモジュールを発現することが可能であることが、示された（Ｇｏｋｈａｌｅ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：４８２−４８５）。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉまたはこれらのモジュール酵素を天然には産生しない他の宿主におけるポリケチド生合成のためにこれらのモジュール型酵素を利用するために、これらのモジュール型酵素の適切な基質を、インビボにて制御された様式で産生することもまた、必要である。例えば、代謝産物（例えば、アセチル−ＣｏＡ、プロピニル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、およびメチルマロニル−ＣｏＡ）が、これらの酵素の最も一般的な基質である。Ｅ．ｃｏｌｉは、アセチル−ＣｏＡ、プロピニル−ＣｏＡ、およびマロニル−ＣｏＡを産生する能力を有するが、後者の２つの基質は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で少量にしか存在せず、これらの生合成は、きつく制御されている。Ｅ．ｃｏｌｉがメチルマロニル−ＣｏＡを合成する能力は、現在までに示されていない。
【０００７】
類似する条件が、他の微生物細胞（特に、天然ではポリケチドを産生しない微生物細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの種々の種））において有力である。従って、一般的に、必要な開始単位および／または伸長単位は、特定に任意の宿主において十分な量で産生されないかもしれない。さらに、問題のＰＫＳのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインの適切な選択によって、直前に記載した基質よりも複雑な基質が、使用され得る。例として、ＦＫ５０６の合成のためのＰＫＳは、マロニル−ＣｏＡまたはメチルマロニル−ＣｏＡに優先してプロピルマロニル−ＣｏＡのような基質を組み込む、アシルトランスフェラーゼドメインを含む。任意の自由に選択した宿主生物において適切なレベルでこの範囲の基質を提供する方法を利用可能にすることが、有用である。
【０００８】
原核生物宿主（特に、天然ではポリケチドを産生しない原核生物宿主）においてポリケチド産生をもたらす際に克服される必要があり得るさらなる問題としては、必要な開始単位および／または伸長単位を異化する酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｒｐオペロンによってコードされる酵素）の存在が挙げられる。このｐｒｐオペロンは、この生物における炭素およびエネルギー供給源としての外来性プロピオネートの異化を担う。プロピオニルＣｏＡを開始単位として利用し、そして／またはプロピオニルＣｏＡのカルボキシル化産物であるメチルマロニルＣｏＡを伸長単位として利用する、ポリケチドの産生を最適化するためには、プロピオニルＣｏＡシンテターゼをコードする部分（Ｅ遺伝子座）を以外の、このオペロンの機能を停止させなければならない。開始単位または伸長単位の異化酵素をコードするあらゆるさらなる遺伝子座もまた、有利なように機能停止される。
【０００９】
さらに、特定の原核生物宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ポリケチドシンターゼの活性化に必要なホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを欠損し得る。そのようなトランスフェラーゼを含むように宿主を改変することもまた、必要であり得る。
【００１０】
いくつかのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．における最近の研究によって、ポリケチド生産性に対するチオエステラーゼ様酵素の有益な影響が示された（Ｂｕｔｌｅｒ，Ａ．Ｒ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）６（５）；２８７−２９２；およびＴａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）６（８）５５３−５５８）が示されている。これらの酵素のホモログ（チオエステラーゼＩＩまたはＴＥＩＩと呼ばれる）が、多くのマクロライドの生合成遺伝子クラスター中にコードされる。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＴＥＩＩの機構は不明確であり、これらの酵素が、ポリケチド生合成において編集の役割を果すことが、提唱されている（Ｂｕｔｌｅｒ（前出）；およびＨｅａｔｈｃｏｔｅ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）８：２０７−２２０）。
【００１１】
まとめると、微生物（特に原核生物）宿主（概して天然ではポリケチドを産生しない宿主を含む）において、ポリケチドの産生をもたらすことが、有利である。これらの後者の宿主は、しばしば、形質転換の容易さ、培養中で迅速に増殖する能力等に関して、天然のポリケチド産生株（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を超える利点を有する。これらの利点は、ポリケチドシンターゼのランダム変異誘発または遺伝子シャッフリングの結果を評価するのに特に有用である。従って、本発明は、ポリケチド産生のために微生物宿主を適合させるための、複数のアプローチを提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の開示）
１つの局面において、本発明は、普遍的に有用な宿主生物であるＥ．ｃｏｌｉにおける、完全な複合ポリケチド産物である６−ｄＥＢの産生を初めて達成した。この結果を達成するために使用した方法は、概して微生物宿主（特に原核生物）に適合可能である。天然ではポリケチドを産生しない微生物宿主をそのような産生に適合させるために、および通常ポリケチドを産生する宿主におけるポリケチドの産生を増強するために、本発明が使用され得る。選択した宿主に依存して、必要な改変としては、ポリケチドシンターゼ遺伝子自体の発現系を、その生物中に組み込むこと；開始単位および／または伸長単位の異化酵素をコードする内因性遺伝子の機能停止；そのシンターゼの翻訳後修飾に必要な酵素（例えば、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ）を発現系中に組み込むこと；ならびに、開始単位および／または伸長単位のレベルを増強する酵素の組み込みが挙げられ得る。その宿主を適合させるために必要な改変の特定の組み合わせは、所望されるポリケチドの性質および宿主自体の性質に応じて変動する。
【００１３】
従って、１つの局面では、本発明は、少なくとも１つのポリケチドの合成の増強のために遺伝子改変された、微生物宿主細胞に関する。ここで、この改変は、開始単位および／または伸長単位の産生を触媒するタンパク質を産生するため、ならびに／あるいは開始単位および／または伸長単位の少なくとも１つの内因性異化経路の機能停止のための、少なくとも１つの発現系の組み込みを包含する。特に好ましい実施形態において、これらの改変は、その宿主生物のゲノムにおいてなされる。なぜなら、このことは、ポリケチドの大規模産生のために有利であるからである。
【００１４】
別の局面において、本発明は、生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において改変ポリケチドを生成するために、リファマイシンシンテターゼのＡ−Ｔローディングジドメインのための開始単位基質として使用される置換ベンゾエートを含む、ポリケチド産物の産生に関する。なお別の局面において、本発明は、どの置換ベンゾエート誘導体がＡ−Ｔドメインの実行可能な基質であるかを決定するためのスクリーニング方法を包含する。
【００１５】
さらなる改変（例えば、少なくとも１つのポリケチドシンターゼタンパク質発現系の組み込み、および、そして必要に応じて、少なくとも１つのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ発現系の組み込み）もまた、なされ得る。必要な場合は、合成ポリケチドのさらなる改変（例えば、ヒドロキシル化、グリコシル化など）のためのさらなる発現系もまた、使用され得る。また、ＴＥＩＩの発現系が、使用され得る。また、必要というわけではないが、これらの発現系をその宿主のゲノム中に組み込むことが、しばしば有利である。
【００１６】
他の局面では、本発明は、本発明の改変細胞において、ポリケチド（完全ポリケチドを含む）を調製する方法に関する。好ましい実施態様は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて６−ｄＥＢ、６−ｄＥＢアナログ、または他の完全ポリケチドを合成する方法である。
【００１７】
さらに別の局面では、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉの高い形質転換効率を利用することにより、ポリケチドシンターゼ遺伝子の遺伝子シャッフリングまたはランダム変異誘発の結果を評価する方法に関する。ポリケチド産生についてのアッセイもまた、企図される。
【００１８】
（発明を実施する形態）
本発明の１つの例示的局面に関して、下記の例示的実施例において、エリスロマイシンのポリケチド前駆体である６−ｄＥＢの産生を行うように、Ｅ．ｃｏｌｉが改変される。この合成に必要な３つのタンパク質であるＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２およびＤＥＢＳ３は公知であり、そしてそれらをコードする遺伝子は、クローニングおよび配列決定されている。アベルメクチン、オレアンドマイシン、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、メガロマイシン（ｍｅｇａｌｏｍｙｃｉｎ）、ピクロマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ラパマイシン、タイロシン、スピノサド（ｓｐｉｎｏｓａｄ）などのポリケチド前駆体を産生する酵素をコードする遺伝子を含む、複数のさらなるＰＫＳ遺伝子も同様に、クローニングおよび配列決定されている。さらに、産生されるポリケチドの性質を変えるように、ネイティブのＰＫＳ遺伝子を改変する方法が、記載されている。ハイブリッドモジュール型ＰＫＳタンパク質の産生および合成系が、米国特許第５，９６２，２９０号において記載されそして特許請求されている。効率的なジケチドの組み込みを可能にするようにＰＫＳ酵素を改変する方法が、米国特許第６，０８０，５５５号に記載されている。個々のドメインまたはドメイン群を混合および整合化することによってＰＫＳ酵素を改変する方法が、米国特許出願番号０９／０７３，５３８に記載されている。特定の開始単位または伸長単位を組み込むために、モジュール型ＰＫＳのモジュールの特異性を変化させる方法が、現在特許化されている米国特許出願番号０９／３４６，８６０に記載されている。ポリケチドへの組み込みのためのジケチドを調製する改良方法が、米国特許出願番号０９／４９２，７３３に記載されている。モジュール間のポリケチド鎖合成を媒介する方法が、米国特許出願番号０９／５００，７４７に記載されている。前述の特許および特許出願の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【００１９】
従って、そのようなシンターゼに含まれるタンパク質に適切な発現系を選択された宿主に組み込むことによって、可能性のある多くのポリケチドシンターゼのいずれか１つを含むようにその選択された宿主を改変し得る。望ましい産物に依存して、完全なシンターゼまたは部分的なシンターゼのいずれかが供給され得る。その宿主がポリケチドシンターゼを天然で産生し、そして通常産生されるポリケチドとは異なるポリケチドが望まれる場合には、ネイティブのＰＫＳをコードする遺伝子を欠失させることが望ましくあり得る。そのような欠失の方法が、米国特許第５，８３０，７５０号に記載されており、この特許は本明細書中で参考として援用される。
【００２０】
天然ではポリケチドを産生しない宿主に関しては、ポリケチドシンターゼを調整する酵素が欠失または欠損しており得るので、ポリケチドシンターゼ自体の発現系を供給することに加えて、これら酵素の発現系を供給することが必要であり得る。ＰＫＳの活性に必須である１つの酵素は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼである。これらのトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、クローニングされており、そして入手可能である。これらは米国特許出願第０８／７２８，７４２号において記載されており、それは例えばカナダ出願２，２３２，２３０において現在公開されている。これら文書の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【００２１】
特定の選択された宿主は、所望の開始単位および／または伸長単位を異化するタンパク質を産生する遺伝子を天然に含み得る。そのような宿主が選択される場合、そのような異化作用を触媒するタンパク質の産生を無効にすることが有利であり得る。なぜなら、本発明の重要な局面は、必要な開始単位および／または伸長単位のレベルが増強されるように宿主を改変することだからである。異化作用系の１つの非限定的な例としては、ｐｒｐオペロンが挙げられ、ここで、サブユニットＡ〜Ｄによってコードされるこのタンパク質は、外因性プロピオネートを異化する。しかし、ｐｒｐＥによってコードされる酵素が望ましい。なぜなら、これは、プロピオニルＣｏＡシンテターゼであるからである。異化作用酵素をコードするオペロンの部分は、改変Ｅ．ｃｏｌｉ中で有利に無効にされる。他の宿主中の類似のオペロンが、必要である場合、無効にされ得る。
【００２２】
プロピオネート異化作用またはプロピオネート同化作用を実行し得ない細胞中で、標識されたプロピオネートを添加し、そしてそれを産生されたポリケチドから分離することによって、ポリケチド産生を決定するためのアッセイが、使用され得る。
【００２３】
本発明の１つの局面は、開始単位および／もしくは伸長単位の産生を増強または可能にする酵素、ならびにこれらの産生酵素の活性化に必要とされる任意の酵素を、これらのタンパク質のための発現系を含むように細胞を改変することによって、その細胞中に組込む。上記のように、これらの発現系は、染色体外の複製ベクターとして供給され得るが、好ましくは、宿主ゲノム中に組込まれる。ゲノムに組込まれた場合、選択圧に対する要求が緩和され、そして安定な産生生物が得られる。
【００２４】
この局面の１つの例示的な実施形態において、ｍａｔＡＢＣオペロン（これは、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉから近年クローニングされた（Ａｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１５：３９５−４０２））を利用する。このオペロンは、ポリケチドの合成に一般的に使用される伸長単位および開始単位の両方の産生を可能にする酵素を提供する。これは通常、マロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡの産生を生じるが、コードされる酵素の特異性は、厳密ではなく、ゆえに、例えば、ピロピオニル−ＣｏＡおよびメチルマロニル−ＣｏＡもまた、産生され得る。この特定のオペロンは、例示のためのみに使用され、そして匹敵する酵素をコードする遺伝子が、複数の他の生物中に見出され得る。当業者は、公に利用可能なデータベースにおける相同性検索を介して、このような酵素にアクセス可能である。従って、本発明のこの局面は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉ由来のｍａｔＡＢＣオペロンのみに限定されるとみなされるべきではなく、他の生物から利用可能な匹敵する系まで及ぶ。
【００２５】
このオペロンによってコードされる３つのタンパク質が存在する。
【００２６】
ＭａｔＡは、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードし、これは、通常、反応：
マロニル−ＣｏＡ→アセチル−ＣｏＡ＋ＣＯ２
を触媒する。
【００２７】
ＭａｔＢは、マロニル−ＣｏＡシンテターゼをコードし、これは、反応：
マロン酸＋ＣｏＡＳＨ→マロニル−ＣｏＡ（ＡＴＰ依存性反応）
を触媒する。
【００２８】
ＭａｔＣは、細胞膜を横切るマロン酸の輸送を担うと考えられるマロン酸輸送体をコードする。
【００２９】
これらの酵素は、示される反応を触媒するそれらの能力において、基質に関していくらか無差別的であることが、本明細書中で実証されている。従って、基質としてマロニル−ＣｏＡおよびマロン酸（それぞれ、ＭａｔＡおよびＭａｔＢに対して）に加えて、これらの酵素はまた、メチルマロニル−ＣｏＡおよびメチルマロン酸；エチルマロニル−ＣｏＡおよびエチルマロン酸；プロピルマロニル−ＣｏＡおよびプロピルマロン酸なども利用し得る。従って、これらの酵素を使用して、所望のポリケチドの合成のための種々の開始単位および伸長単位を提供し得る。
【００３０】
上記のように、このオペロンのホモログもまた、意図される。例えば、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１６３００３）由来のｍａｔＢおよびｍａｔＣのホモログを使用し得る。
【００３１】
プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子もまた、伸長単位の供給に有用である。この活性の１つの例において、カルボキシラーゼ酵素は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５：３１０９−３１１９によってＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３から特徴付けられた、ｐｃｃＢ遺伝子およびａｃｃＡ２遺伝子によってコードされるダイマーである。ａｃｃＡ２遺伝子およびｐｃｃＢ遺伝子のホモログを用いて２Ｓ−メチルマロニルＣｏＡを作製する方法もまた、意図される。この場合ａｃｃＡ１遺伝子によって天然にコードされるビオチンリガーゼが、これらのタンパク質の活性化に必要とされる。代替のビオチンリガーゼもまた、使用され得る。この酵素に対する代表的な基質は、メチルマロニル−ＣｏＡに転換されるプロピオニル−ＣｏＡである；
プロピオニル−ＣｏＡ＋ＣＯ２→メチルマロニル−ＣｏＡ（ＡＴＰ依存性反応）
として要約される反応。
【００３２】
他のアシル−ＣｏＡ基質もまた、この酵素およびそのホモログによって対応するマロニル−ＣｏＡ産物に転換され得る。また、これらの遺伝子のホモログは、公に利用可能なデータベースにおける標準的な検索技術を用いて、当業者によって容易に見出され得る。特に、ビオチンリガーゼは、必ずしもカルボキシラーゼ自体と同じ遺伝学的補体に由来する必要はない。
【００３３】
ポリケチドの産生に有効である改変宿主細胞を提供することに加えて、ポリケチド合成、その活性化酵素、ならびに開始単位および／または伸長単位を提供する酵素を、インビトロ系で使用して、所望のポリケチドを産生し得る。例えば、ｍａｔＡＢＣオペロンによってコードされるような酵素マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼおよび／もしくはマロニル−ＣｏＡシンテターゼ、ならびに／または、ｐｃｃＢ遺伝子およびａｃｃＡ２遺伝子によってコードされるようなプロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼを、インビトロ培養で使用して、所望のＰＫＳに対する適切な伸長単位および開始単位に前駆体を転換し、無細胞培養系またはインビトロ細胞培養系においてポリケチドを合成させ得る。精製ＭａｔＢは、ポリケチドの調製無細胞産生に対して特に有利に使用される。なぜなら、ＣｏＡチオエステルが、このような無細胞合成系において最も高価な成分だからである。あるいは、上記のように、これらの遺伝子は、（任意の適切な組合せにおいて）これらの基質の培養物における細胞による産生に関する一般的なストラテジーに使用される。ＭａｔＢおよびＭａｔＣは、任意のα−カルボキシル化ＣｏＡチオエステルの産生をもたらすために使用され得、ここで、対応する遊離酸は、ＭａｔＢによって基質として認識され得る。ＭａｔＡタンパク質はまた、開始単位（例えば、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡ）をインビトロレベルまたはインビボレベルで補充するために使用され得る。プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子もまた、インビボにおいて適切な伸長単位を合成するための酵素を提供するために使用され得る。
【００３４】
この宿主は、さらなる支持を与える他の酵素（例えば、ビオチンリガーゼｂｉｒＡ）のレパートリーを有し得る。
【００３５】
一般的に、本発明は、ポリケチド合成において有用な伸長単位および／または開始単位を含む微生物を提供することを意図し、ここで、この宿主は、効率的な合成には不十分な量のこれらの物質を産生するか、または検出可能な量のそれらを少しも産生しないかのいずれかである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、検出可能な量のＳ−メチルマロニルＣｏＡ（６ｄＥＢ生合成において必要とされる中間体）を産生しない。従って、本発明は、１つの局面において、特に、Ｓ−メチルマロニルＣｏＡを含むように改変されたＥ．ｃｏｌｉに関する。同様に、他の生物が、さらなるポリケチド中間体（例えば、ポリケチドへの組み込みのための適切な立体化学の、エチルマロニルＣｏＡ、メトキシマロニルＣｏＡまたはヒドロキシマロニルＣｏＡ）を含むように改変される。これらの宿主は、これらのポリケチドシンターゼ基質の存在か、またはこれらのポリケチドシンターゼ基質の増大したレベルのいずれかによって、その未改変形態から区別され、そして関連するポリケチドを合成するその能力の獲得によってか、または関連するポリケチドを増大したレベルで合成するその能力の獲得によってこれらの改変を含むことが評価され得る。
【００３６】
１つの一般的な局面において、本発明は、増強したレベルのＰＫＳ基質を含むか、または未改変宿主が検出可能なレベルを含まない場合はＰＫＳ基質自体を含む、改変宿主生物に関する。
【００３７】
本発明はまた、ポリケチド（微生物宿主における完全な複合体ポリケチドを含む）の産生を増強または可能にするための方法を含み、この方法は、そのポリケチドの構築において使用される開始単位および／または伸長単位の産生を増強または可能にする酵素についての少なくとも１つの発現系と共に提供される改変宿主を培養する工程を包含する。「完全な」ポリケチドは、抗生物質の基礎を形成するポリケチドであり、例えば、エリスロマイシン、メガロマイシンなどに対する前駆体であるポリケチドである。提供される酵素としては、他の生物中のｍａｔＡＢＣオペロンおよびそれらのホモログによってコードされる酵素、ならびに他の生物中のプロピオニルカルボキシラーゼをコードするｐｃｃＢ遺伝子およびａｃｃＡ２遺伝子（およびａｃｃＡ１）およびそのホモログによってコードされる酵素が挙げられるが、これらに限定されない。別の局面において、本発明は、無細胞系に対してこれらの酵素のうちの１つ以上を提供することによって、この無細胞系においてポリケチドの産生を増強または可能にする方法に関する。
【００３８】
本発明はまた、これらの酵素を産生するように改変された細胞、およびこれらの細胞を用いてポリケチドを産生する方法、ならびに無細胞系を用いてポリケチドを産生する方法に関する。
【００３９】
本発明はまた、内因性酵素（これは、その基質を開始単位または伸長単位に転換する）に対する基質で培地を補充することによって、微生物系におけるポリケチドの産生を増強または可能にするための方法を含む。
【００４０】
本発明はまた、ポリケチド産生を補助するための改変（例えば、必要とされる基質の異化作用のためのタンパク質をコードする内因性遺伝子の排除）を含む微生物宿主中でこれらの細胞に合成前駆体（例えば、ジケチド前駆体）を供給することによって、ポリケチドを産生するための方法を含む。
【００４１】
産生されるポリケチドは、ＰＫＳによって通常産生されるポリケチドであり得、そして天然に存在し得る；この場合、インビボにおいて開始／伸長産生増強酵素をコードする遺伝子の存在または無細胞系における酵素自体の存在は、単純に産生レベルを増強し得る。さらに、このＰＫＳは、新規ポリケチドを生成するように設計された改変ＰＫＳであり得、その産生は、類似の様式で増強され得る。広範囲の基質を受け入れる本明細書中に記載される酵素の能力に起因して、伸長単位および開始単位は、広範囲の容易に利用可能な試薬に基づいて提供され得る。上記のように、ジケチド開始材料もまた、供給され得る。
【００４２】
従って、本発明はまた、そのポリケチドの産生を可能または増強するための上記の微生物宿主の種々の他の改変、およびこのような宿主を用いてポリケチドを産生する方法を含む。
【００４３】
Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の原核生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のような宿主中でポリケチドの産生を可能にするようにそのような宿主を改変する能力は、非常に有利であり、これらのうちの多くは、Ｅ．ｃｏｌｉの固有の性質にある。１つの重要な利点は、天然にポリケチドを産生する他の微生物と比較して、Ｅ．ｃｏｌｉが形質転換され得る容易さにある。この形質転換の容易さの１つの重要な適用は、ポリケチドシンターゼの遺伝子シャッフリングの結果を評価する際にある。従って、本発明のさらなる局面は、ポリケチドシンターゼ遺伝子シャッフリングの結果を評価するための方法に関し、この方法は、本発明に従って改変されたＥ．ｃｏｌｉの培養物を、シャッフリングされたポリケチドシンターゼの混合物でトランスフェクトする工程、および個々のコロニーを培養する工程を包含する。ポリケチドを産生するこれらのコロニーは、好首尾にシャッフリングされた遺伝子を含む。
【００４４】
ポリケチドを産生するために微生物宿主（特に、原核生物宿主）を改変することに加えて、これらの宿主は、さらに改変されて、ポリケチドを「調整（ｔａｉｌｏｒ）」し、そしてそれらの抗生物質への転換をもたらす酵素を産生するように改変され得る。このような調整反応としては、グリコシル化、酸化、ヒドロキシル化などが挙げられる。１つ以上のポリケチド改変酵素（例えば、ｐ４５０、糖生合成および糖転移、ならびにメチルトランスフェラーゼに関するもの）を含むように改変された生物（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ）もまた意図される。
【００４５】
宿主の性質に関して、Ｅ．ｃｏｌｉが、重要な例示として使用される。しかし、種々の原核生物宿主もまた、有用であり得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに加えて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよび一般にグラム陰性細菌が、有用である。他の原核生物が使用され得、そして真核生物微生物（例えば、酵母）さえも使用され得る。例えば、産生生物としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用する利点は、周知である。さらに、ポリケチドを天然に産生するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような生物が、宿主として使用され得る。なぜなら、これらの生物におけるポリケチドの産生は、本発明の方法によって増強され得るからである。これは、特に、ポリケチドを天然に産生する宿主が、代替の伸長単位または代替の開始単位を組込むように改変された場合である。この場合、たとえ宿主が天然にポリケチドを産生するとしても、この宿主は、改変ＰＫＳに対してここで必要とされる検出可能なレベルの開始単位および／または伸長単位を有し得ない。
【００４６】
当業者に明らかなように、天然に産生されない開始単位および／または伸長単位のレベルを増強する様式の正確な性質あるいは天然に産生されない開始単位および／または伸長単位の使用可能な量を提供する様式の正確な性質は、必要とされる開始単位および／または伸長単位の性質に依存する。代表的に、最も複雑なポリケチドは、適切な立体化学の少なくともマロニルＣｏＡまたはメチルマロニルＣｏＡを必要とする。さらなる型の置換マロニルＣｏＡ誘導体が、特定の例において必要とされ得る。このような基質の産生に対して酵素を提供するための発現系の適切な選択または所望の基質を異化し得る内因性酵素の不活性化は、合成されるポリケチドの性質および宿主の性質に依存する。実際、いくつかの例において、代表的に、合成酵素に対して必要な発現系は、異種供給源から提供されるが、ネイティブな宿主は、それ自体、適切な酵素をコードする遺伝子（ここで、これらの遺伝子は発現されない）を含み得る。この１つの例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける「スリーピングビューティ（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ）」オペロンである。
【００４７】
微生物宿主中でポリケチドの産生を得るために、ポリケチドの合成をもたらす酵素を誘導する前に、培養物の実質的な増殖を可能にすることが好ましい。従って、天然にポリケチドを産生しない宿主において、ＰＫＳ遺伝子に対して必要とされる発現系は、誘導可能なプロモーター（例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導される、Ｔ７プロモーター）の制御下に配置される。種々のこのような微生物宿主中で誘導可能である適切なプロモーターが多量に存在する。ポリケチド産生と適合性である条件下で誘導性であり、かつ示唆される特定の宿主に対して適切であるプロモーターを、当業者は認識する。改変宿主の他の有利な特徴（例えば、開始因子または伸長因子を合成する能力）もまた、誘導性制御の下であり得る。最終的に、ポリケチドシンターゼのための出発材料に対する前駆体は、合成が所望されるまで使用され得ない。従って、例えば、出発材料がピロピオネートから誘導される場合、プロピオネートは、細胞培養の間の任意の所望の時点で供給され得る。ジケチド出発材料またはトリケチド出発材料が使用される場合、これもまた、適切な時間まで使用され得ない。前駆体の添加前、最少培地が使用され得、そして代替の炭素源が、増殖のためのエネルギーおよび材料を供給するために使用され得る。
【００４８】
物質（例えば、ポリケチド）の産生のタイミングを制御することの利点は、周知である。代表的に、そのような二次代謝物の合成のためのエネルギーおよび代謝産物の要求の増大は、急速に増殖するその生物の能力を減少させる。従って、二次代謝物の産生を誘導する前に生物に指数増殖を起こさせることが有利である。
【００４９】
ポリケチドシンターゼに対して有用なレベルの基質または増強されたレベルの基質を提供するために、本発明の方法を適用したことの成功は、産生されるポリケチドのレベルまたは速度によって好都合に測定され得る。従って、本発明の方法は、ポリケチドの産生レベルを、宿主が同じ条件下で改変されていない場合の産生と比較して、少なくとも５％、より好ましくは１０％、より好ましくは２５％、そしてより好ましくは少なくとも５０％増強する。
【００５０】
上記のように、本発明は、任意の自由裁量によって選択されたポリケチドのインビトロ合成およびインビボ合成の両方のための方法を提供し、ここで、インビボ合成は、任意の微生物宿主、特に原核生物宿主中で実行され得る。原核生物宿主は、代表的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、より代表的にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特に、Ｅ．ｃｏｌｉである。インビトロ合成またはインビボ合成が使用されるか否かにかかわらず、１つ以上の適切なポリケチドシンターゼ（これは、ネイティブであっても、改変されていてもよい）、開始単位および／または伸長単位を産生するための１つ以上の酵素（代表的に、遊離酸をＣｏＡ誘導体に転換することを含む）、そして上記の酵素が宿主中で産生される場合、それらを活性化するために酵素を調整することを提供することが必要であり得る。さらに、インビボ合成に関して、そうでなければ適切な出発材料を破壊してしまう異化酵素を無力にすることが必要であり得る。
【００５１】
出発材料の産生に関して、ｍａｔＡＢＣオペロンの遺伝子およびプロピオニルカルボキシラーゼをコードする遺伝子を使用して、無細胞ポリケチド合成における使用のためにそれらにコードされるタンパク質を産生し得、そしてまた、細胞培養物中でポリケチドの産生のために組換え宿主を改変し得る。これらの遺伝子およびこれらの対応するコードされる産物は、そのような合成がもたらされるべきである任意の宿主においてポリケチドシンターゼに対する基質の最適なレベルを提供するのに有用である。この宿主は、ポリケチドおよびその対応する抗生物質を天然に産生する宿主であり得るか、またはこの宿主は、いかなるポリケチドも天然に産生しないかもしくは通常作製されないポリケチドを産生するように改変された、組換え改変された宿主であり得る。従って、ポリケチドの合成に有用である微生物宿主としては、種々の株のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（特に、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、種々の株のＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、産業的に望ましい宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、および酵母のような他の微生物が挙げられる。これらの遺伝子およびこれらの対応するタンパク質は、一般的にポリケチド合成に対する基質レベルを調整する際に、有用である。
【００５２】
本発明の方法を使用して、微生物による特定のポリケチドの産生を増強し得る。微生物が天然にポリケチドを産生しないが、開始単位および／または伸長単位を提供する本発明の方法を伴なわない組み換え操作によってのみ関連するＰＫＳ遺伝子を含む場合、ポリケチドの産生は、全く進行し得ない。従って、増強は、本質的に無限である（ただ単に基礎が０であるから）。しかし、検出可能なレベルのポリケチドが産生される場合（事前の改変によってか、またはその微生物がそれらを天然に産生し得るからのいずれか）、本発明の方法は、産生レベルを少なくとも５％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％、より好ましくは１００％、２００％、５倍、１０倍、１００倍または２００倍増強する。産生されるポリケチドのレベルにおける極度に広範なバリエーションが、開始点および作製される改変に依存して利用可能である。
【００５３】
（基質特異性およびポリケチド設計）
これらの遺伝子およびそれらの産物は、ある範囲の出発材料を利用する酵素の能力に起因して特に有用である。従って、一般的に、プロピオニルカルボキシラーゼは、式Ｒ２−ＣＨ−ＣＯ−ＳＣｏＡ（ここで、各Ｒは、Ｈまたは必要に応じて置換されるアルキルまたは必要に応じて置換される他のヒドロカルビル基である）のチオエステルを、式Ｒ２Ｃ（ＣＯＯＨ）ＣＯＳＣｏＡの対応するマロン酸チオエステルに転換する。天然の補酵素Ａチオエステルに加えた他のチオエステル（例えば、Ｎ−アシルシステアミンチオエステル）もまた、使用され得る。同様に、ｍａｔＢ遺伝子の産物は、式Ｒ２Ｃ（ＣＯＯＨ）２のマロン酸誘導体を対応するアシルチオエステルに転換し得る（ここで、各Ｒは、独立して、Ｈまたは必要に応じて置換されたヒドロカルビルである）。好ましい出発材料は、Ｒがアルキル（１〜４Ｃ）であり、好ましくはＲＣＨ（ＣＯＯＨ）２である。インビボ系において、出発マロン酸関連材料の膜輸送を確実にするためにｍａｔＣ遺伝子を含むことが有利であり得る。ｍａｔＡ遺伝子は、式Ｒ２Ｃ（ＣＯＯＨ）ＣＯＳＣｏＡのマロニルＣｏＡ基質を、開始単位としての使用のための式Ｒ２ＣＨＣＯＳＣｏＡの対応するアシル−ＣｏＡに転換するタンパク質をコードする（ここで、Ｒは、上記のように規定される）。
【００５４】
代表的に、上記で参照されるヒドロカルビル基は、１〜８Ｃ、好ましくは１〜６Ｃ、より好ましくは１〜４Ｃのアルキル基である。このアルキル基は、直鎖であっても分枝鎖であってもよいが、好ましくは直鎖である。ヒドロカルビル基はまた、不飽和を含み得、そしてさらに、ハロ、ヒドロキシル、メトキシルまたはアミノ、またはメチルアミノもしくはジメチルアミノなどの置換基を含み得る。従って、ヒドロカルビル基は、式ＣＨ３ＣＨＣＨＣＨ２；ＣＨ２ＣＨＣＨ２；ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２；ＣＨ３ＣＣＣＨ２；ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２；などのヒドロカルビル基であり得る。
【００５５】
本発明の方法および材料によってさらに調製されるのは、式
ＲＯＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＯＳＣｏＡ
（ここで、Ｒは、上記のように規定される）の伸長単位である。
【００５６】
置換アルキル基はまた、その骨格鎖が１〜８Ｃ、好ましくは１〜６Ｃであり、より好ましくは１〜４Ｃである。アルケニルヒドロカルビル基およびアルキニルヒドロカルビル基は、２〜８Ｃ，好ましくは２〜６Ｃ、より好ましくは２〜４Ｃを含み、そしてまた、分枝鎖であっても直鎖であってもよく、好ましくは直鎖である。
【００５７】
出発材料として適切なジケチドを供給することによって、さらなる変動性が得られ得る。ジケチドは、一般的に、米国出願番号０９／３１１，７５６（１９９９年５月１４日出願され、本明細書中に参考として援用される）に記載されるような式のものである。次いで、種々の置換基が導入され得る。従って、このジケチドは、一般式Ｒ’ＣＨ２ＣＨＯＨＣＲ２ＣＯＳＮＡｃ（ここで、Ｒは上記のように規定され、そしてＲ’はアルキル、１〜８Ｃ、アリール、アリールアルキルなどであり得る）のジケチドである。ＳＮＡｃは、Ｎ−アセチルシステアミンのチオエステルを表すが、代替のチオエステルもまた、使用され得る。
【００５８】
ポリケチドのインビボ産生またはインビトロ産生のいずれかに関して、所望の特異性を有するアシルトランスフェラーゼドメインは、関連するＰＫＳへと組み込まれ得る。ＡＴドメインの適切な特異性を保証する方法は、１９９９年７月２日に出願された米国特許出願番号第０９／３４６，８６０号（その内容は本明細書中で参考として援用される）に詳しく記載されており、所望の特異性を有するそのようなドメインをどのように作成および使用し得るかが記載されている。また、成長するポリケチド鎖の１つのモジュールから次のモジュールへの適切な移動を保証することによって、ポリケチドシンターゼモジュール有効性を媒介する方法も、インビトロにおけるこれら酵素の、またはインビボにおける遺伝子の使用に関連する。そのような方法は、２０００年２月９日に出願された米国特許出願番号第０９／５００，７４７号に詳しく記載されており、その内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００５９】
置換したベンゾエートが、開始単位として作用し得るかを決定する際の予備的な事として、ローディングモジュールのアデニル化活性およびチオール化活性は、インビトロで再構成され、そしてコエンザイムＡに依存しないことが示されており、このことは、このローディングモジュールが、実施例７に示されるコエンザイムＡリガーゼであるという文献の提唱に反する。ローディングモジュールの共有結合性のアリール化についての動力学的パラメーターは、実施例８に記載されるように、非天然の基質ベンゾエート（Ｂ）および３−ヒドロキシベンゾエート（３−ＨＢ）について直接測定された。この分析は、実施例９および１０に記載されるように、競合実験を介して拡張されて、一連の置換されたベンゾエートの取り込みの相対速度を決定する。この実験における結果は、ローディングモジュールが、種々の置換されたベンゾエートを受容し得るが、生物学的基質が最もよく似ている３−置換ベンゾエート、５−置換ベンゾエート、および３，５−二置換ベンゾエートについて優先度を示すことを示す。リファマイシンシンテターゼのローディングモジュールの顕著な基質耐性は、このモジュールが、天然の産物の置換された誘導体を生成するためのツールとして有用であることを示唆する。
【００６０】
置換されたベンゾエートは、任意の置換基を含むベンゾエート分子として規定される。ベンゾエート基質は、リファマイシンシンターゼのＡ−Ｔドメインをプライムするか、さもなければ、ローディングモジュールへの開始単位（ｓｔａｒｔｅｒ  ｕｎｉｔ）としてか、またはシンターゼもしくはシンテターゼのモジュールへの伸長単位（ｅｘｔｅｎｄｅｒ  ｕｎｉｔ）として、取り込まれ得る。好ましいベンゾエート基質としては、３−置換ベンゾエート、５−置換ベンゾエート、および３，５−二置換ベンゾエートが挙げられる。より好ましくは、このベンゾエートは、以下からなる群より選択される：２−アミノベンゾエート、３−アミノベンゾエート、４−アミノベンゾエート、３−アミノ−５−ヒドロキシベンゾエート、３−アミノ−４−ヒドロキシベンゾエート、４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾエート、３−ブロモベンゾエート、３−クロロベンゾエート、３，５−ジアミノベンゾエート、３，５−ジブロモベンゾエート、３，５−ジクロロベンゾエート、３，５−ジフルオロベンゾエート、２，３−ジヒドロキシベンゾエート、３，５−ジヒドロキシベンゾエート、３，５−ジニトロベンゾエート、３−フルオロベンゾエート、２−ヒドロキシベンゾエート、３−ヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシベンゾエート、３−メトキシベンゾエート、３−ニトロベンゾエート、および３−スルホベンゾエート。
【００６１】
ＣｏＡがＴドメインのアリール化に必要とされず、そしてベンゾイルＣｏＡが、このプロセスの中間の成分ではないという観察は、ＮＲＰＳ様Ａ−Ｔジドメインとして、リファマイシンシンテターゼのローディングモジュールを確立する（図２Ｂ）。
【００６２】
リファマイシンシンテターゼのローディングモジュールが、ＮＲＰＳ様Ａ−Ｔジドメインとして機能するという結論は、他の系に密接な関係を有する。ラパマイシン（Ｌｏｗｄｅｎ，Ｐ．Ａ．Ｓ．ら、Ａｎｇｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９６）３５：２２４９−２２５１）、ＦＫ５０６（Ｍｏｔａｍｅｄｉ，Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）２５６：５２８−５３４）、アンサトリエニン（ａｎｓａｔｒｉｅｎｉｎ）（Ｃｈｅｎ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６１：９８−１０７）、ＦＫ５２０（Ｗｕ，Ｋ．ら、Ｇｅｎｅ（２０００）２５１：８１−９０）、ミクロシスチン（ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｎ）（Ｔｉｌｌｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０００）７：７５３−７６４）、およびピマリシン（Ａｐａｒｉｃｉｏ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０００）７：８９５−９０５）についての生合成遺伝子クラスターの全ては、リファマイシンシンテターゼのＡ−Ｔジドメインに相同性を有するローディングモジュールをコードする。しかし、これらの系のいくつかは、活性化ＣｏＡ基質（恐らく、図２Ａに示される機構に類似するＣｏＡリガーゼ機構を介して生成される）により、プライムされることが提唱されている。（Ｓｃｈｗｅｃｋｅ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：７８３９−７８４３；Ｍｏｔａｍｅｄｉ，Ｈ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）２５６：５２８−５３４；Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．，Ｅ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９１）１１３：５０８３−５０８４）。これらの系のプライミングについてより可能性のある機構は、リファマイシンシンテターゼについて有効なアデニル化−チオール化機構である。
【００６３】
図２に示される機構は異なるが、関与する化学は、本質的に同じである。両方の場合、ＡＨＢの活性化は、アリール−アデニル化を介して生じ、そして唯一の差異は、Ｔドメインのアリール化の前に、ＡＨＢのＣｏＡへの中間の移動が存在するか否かである。Ｔドメインのホスホパンテチン補因子は、ＣｏＡに由来するので、ＴドメインおよびＣｏＡのチオールの求核試薬は、化学的に等価である。従って、酵素が、ホスホパンテチン補因子として、ＣｏＡの求核末端の共有結合的取り込みによって、単純に、ＣｏＡリガーゼからＡ−Ｔジドメインへと発展し得る方法を想像することは困難ではない。恐らく、アリール基質部分を、アリール−ＣｏＡとして非共有結合的に結合する代わりに、Ｔドメインを介してシンテターゼに対して、共有結合的につなぐことの利点が存在する。それにもかかわらず、アリール−ＣｏＡリガーゼは、植物界におけるポリケチド合成に関与することが知られており（例えば、Ｂｅｅｒｈｕｅｓ，Ｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９９６）３８３：２６４−２６６；Ｂａｒｉｌｌａｓ，Ｗ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）３８１：１５５−１６０を参照のこと）、そしてベンゾイル−ＣｏＡは、エンテロシン（ｅｎｔｅｒｏｃｉｎ）を生成する反復性のＩＩ型ＰＫＳの基質であるようである（Ｈｅｒｔｗｅｃｋ，Ｃ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２０００）５６：９１１５−９１２０）。
【００６４】
この研究の前に、ＡＨＢ、３−ＨＢ、および３，５−ジヒドロキシベンゾエートは、Ａ−Ｔジドメインの基質であることが知られていた（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１０９２−１０９３）。１１個のさらなる基質（ベンゾエート（Ｂ）を含む）は、本明細書中で同定された（表１）。以前の研究は、選択的に置換されたベンゾエートについてのリファマイシンシンテターゼのＡ−Ｔジドメインの基質耐性が、関連する細菌ベンゾイル−ＣｏＡリガーゼ（Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９８８）１７０：１７０９−１７１４；Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｕ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９９１）１７３：５４９４−５５０１）；およびＥｎｔＥ（Ｒｕｓｎａｋ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）２８：６８２７−６８３５）（腸内バクトリンシンテターゼの成分である単体のＡドメイン）により、ある程度まで共有されることを示唆する。これらのタンパク質は、それらの生物学的基質に加えて、いくつかの選択的に置換されたベンゾエートを受容し得る。
【００６５】
詳細な分子レベルでのＡ−Ｔジドメインについての基質特異性の結果の分析は、このローディングモジュールの結晶構造を待つが、いくつかの予備的な観察は、表１の基質スクリーニングの結果および相対的反応性データに基づいてなされ得る。２−アミノベンゾエートおよびＢを除いて、３−置換基、５−置換基、または３−および５−置換基を有するベンゾエートのみが、Ａ−Ｔジドメインについての基質である。生物学的基質ＡＨＢの３−アミノ置換基および５−ヒドロキシ置換基に適応する結合部位はまた、明らかに、これらの位置で代替の置換基に適応し得る。３−スルホベンゾエート、３−ニトロベンゾエート、および３，５−ジニトロベンゾエートは、立体的な理由から基質として拒否されるようであった（図７）。なぜならば、スルホ置換基およびニトロ置換基の両方は、ＡＨＢのアミノ置換基およびヒドロキシ置換基よりも有意に大きいからである。これに関して、３−メトキシベンゾエートが、弱い基質ではあるが、基質として受容されることは驚きである。なぜならば、メトキシ置換基もまた、ＡＨＢのいずれかの置換基よりも有意に大きいからである。３−フルオロベンゾエートおよび３，５−ジフルオロベンゾエートは、それらのクロル化対応物およびブロモ化対応物に関して５個および３０個の因子により、識別される（表１）。フッ化の際の芳香族環の電子特性の変化は、これらの差異を説明し得る。フェニルアセテートおよび３−ヒドロキシフェニルアセテートは、対応するベンゾエート、Ｂ、および３−ＨＢの反応性にもかかわらず、Ａ−Ｔジドメインにより、基質として利用されないようである（表１）。この結果は、カルボキシレートの登録が、その反応性の決定要因であることを示唆する。なぜならば、フェニルアセテートのカルボキシレートは、ベンゾエートに対して、１つのメチレン基によって置換されているからである。置換されたベンゾエートが、この研究において推定の基質として標的化されたことに注目すべきである；置換されたベンゾエートについてのＡ−Ｔジドメインの耐性が、他の型の芳香族置換基（例えば、ヘテロ環）に広がる可能性は、試験されるべきであるままである。
【００６６】
置換されたベンゾエートについてのリファマイシンシンターゼのローディングモジュールの顕著な基質耐性は、タンパク質工学を通じた非天然の天然物の産生に対して密接な関係を有する。６−デオキシエリスロノライド（ｄｅｏｘｙｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ）Ｂ  ＰＫＳの内因性ローディングモジュールは、最近、アベルメクチンＰＫＳのローディングモジュールにより置換され、そして得られたハイブリッドシンターゼは、アベルメクチンファミリーに特徴的な分枝した開始単位を組み込まれたエリスロマイシン誘導体を産生した（Ｍａｒｓｄｅｎ，Ａ．Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２７９；１９９−２０２）。同様に、本来の生成物の置換された誘導体を生成する目的として、他のシンターゼまたはシンテターゼにリファマイシンシンテターゼのＡ−Ｔジドメインを付加することにより、リファマイシンシンテターゼのＡ−Ｔジドメインの乱雑さのプライミングを開発することが本発明に従って意図される。
【００６７】
最終的に、ＮＲＰＳ様Ａ−Ｔジドメインとしてリファマイシンシンテターゼのローディングモジュールのこの初期の特徴付けは、この系におけるハイブリッドＮＲＰＳ／ＰＫＳインターフェースの研究のための準備を整える。リファマイシンシンテターゼのＮＲＰＳ様ローディングモジュールおよびＰＫＳモジュール１を（シスまたはトランスで）組合わせる、生化学的研究は、ＮＲＰＳ／ＰＫＳ生合成インターフェースに関する機能的問題および構造的問題を扱うことを可能にするべきである。
【００６８】
様々なＰＫＳをコードするヌクレオチド配列は、望ましいＰＫＳの産生、およびマクロライド後（ｐｏｓｔｍａｃｒｏｌｉｄｅ）変換に有用なタンパク質、およびその改変型を産生する組換え手順での、その使用を可能にする。例えば、エリスロマイシンの産生に関連する遺伝子のヌクレオチド配列が、米国特許第６，００４，７８７号および米国特許第５，９９８，１９４号に；アベルメクチンに関しては米国特許第５，２５２，４７４号に；ＦＫ５０６に関しては米国特許第５，６２２，８６６号に；リファマイシンに関してはＷＯ９８／７８６８に；スピラマイシンに関しては米国特許第５，０９８，８３７号に開示されている。これらは単なる例である。望ましいコード配列の一部、または全てを、Ｊａｙｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３３１で記載されたような、そして例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販の、標準的な固相合成法を用いて合成し得る。
【００６９】
特定の活性をコードするＰＫＳの部分を単離し、そして例えば異なるモジュール型ＰＫＳにおける対応する領域を置換するためにそれを使用することによって操作し得る。さらに、ＰＫＳの個々のモジュールを、適切な発現系にライゲーションして、そしてオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質の一部を産生するために使用し得る。次いで、タンパク質を単離および精製し得るか、またはポリケチド合成をもたらすためにインサイチュで使用し得る。モジュールもしくは全オープンリーディングフレーム、またはオープンリーディングフレームの組み合わせの組換え産生についての宿主に依存して、プロモーター、終止配列、エンハンサー等のような適切な制御配列を、望ましいタンパク質をコードするヌクレオチド配列にライゲーションする。様々な宿主に関して適切な制御配列が、当該分野で周知である。
【００７０】
これらのヌクレオチド配列の利用可能性が、適切な酵素についての適切な発現系を含むように改変された宿主細胞を用いた、新規ポリケチドおよびその対応する抗生物質の産生の可能性を拡大する。異なるＰＫＳの骨組みにそれらを置換することによって、またはそのような置換または他の変異誘発変化の代わりに、またはそれに加えてハイブリッドを形成することによって、ドナーＰＫＳの様々な活性コード領域を操作することによって、広範な種々のポリケチドおよび対応する抗生物質を得ることができる。これらの技術は、例えば１９９８年５月６日に出願され、そして本明細書中で参考として援用される、米国特許出願番号第０９／０７３，５３８号に記載されている。
【００７１】
例えば、天然シンターゼ遺伝子の全てまたは採用された一部によってコードされる骨組みを用いることによって、新規ポリケチドを産生するポリケチドシンターゼを得ることができる。シンターゼは、少なくとも１つの機能的なモジュール、好ましくは２または３つのモジュール、そしてより好ましくは４つ以上のモジュールを含み、そして生じたポリケチドの性質が変化するように、これら機能的モジュールの１つ以上の活性に変異、欠失、または置換を含む。この記述は、タンパク質および遺伝的レベルのどちらにもあてはまる。特に好ましい実施形態は、ＫＳ、ＡＴ、ＫＲ、ＤＨ、またはＥＲが欠失したか、またはＫＳ、ＡＴ、ＫＲ、ＤＨ、またはＥＲが異なるＰＫＳ、もしくは同じＰＫＳにおける別の位置由来の活性のバージョンで置換されたものを含む。少なくとも１つの非縮合サイクル酵素活性（ＫＲ、ＤＨ、またはＥＲ）が欠失したものか、またはこれら活性のいずれかが変異して合成される最終的なポリケチドが変化した誘導体も好ましい。
【００７２】
従って、天然に存在するＰＫＳの様々な誘導体をコードするヌクレオチド配列、および様々なポリケチドを得るために、酵素活性コード部分の「ミキシングおよびマッチング」によって、望ましい数の構築物を得ることができ、そして変異を、ネイティブな宿主ＰＫＳ遺伝子集団またはその一部に導入し得る。
【００７３】
慣用的な技術を用いて、ネイティブの配列に変異を作製し得る。変異の基質は、遺伝子の全集団またはそれらの１つまたは２つのみであり得る；変異の基質はまた、１つ以上のこれら遺伝子の一部であり得る。変異の技術は、変異を含む合成オリゴヌクレオチドを調製すること、および変異配列を、制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）５：７８６を参照のこと）、または他の当該分野で公知の様々な方法によって、ＰＫＳサブユニットをコードする遺伝子へ挿入することを含む。
【００７４】
酵素活性をコードするヌクレオチド配列の選択された部分の無作為変異誘発をまた、当該分野で公知のいくつかの異なる技術によって、例えばオリゴヌクレオチドリンカーをプラスミドに無作為に挿入することによって、Ｘ線または紫外線の照射によって、インビトロＤＮＡ合成の間に正しくないヌクレオチドを組み込むことによって、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ変異誘発によって、合成変異体を調製することによって、または化学物質によってインビトロでプラスミドＤＮＡに障害を与えることによって、達成し得る。
【００７５】
酵素活性をコードする領域の変異形態を提供することに加えて、異なるＰＫＳシンターゼ由来、または同じＰＫＳシンターゼの異なる位置由来の対応する活性をコードする領域を、例えば適切なプライマーを用いたＰＣＲ技術を使用して回収し得る。「対応する」活性をコードする領域によって、同じ一般的な型の活性をコードする領域を意味される−例えば、遺伝子集団の１つの位置におけるケトレダクターゼ活性は、その遺伝子集団の別の位置における、または異なる遺伝子集団におけるケトレダクターゼをコードする活性と「対応する」。同様に、完全なレダクターゼサイクルは、対応すると考えられ得る−例えばＫＲ／ＤＨ／ＥＲはＫＲ単独に対応する。
【００７６】
宿主ポリケチドシンターゼの特定の標的領域を置換する場合、この置換は、適当な制限酵素を用いてインビトロで行い得るか、またはドナープラスミド中の置換遺伝子およびレシピエントプラスミド中のレセプター領域の相同配列フレーミング（ｆｒａｍｉｎｇ）を含む、組換え技術を用いてインビボで行い得る。異なる温度感受性を有するプラスミドを有利に含む、このような系は、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／４０９６８に記載されている。
【００７７】
最後に、ポリケチドシンターゼ遺伝子は、一般的なＤＮＡ配列と同様に、上記で概略を述べた系統的な変更およびランダム変異誘発のための方法に加えて、Ｍａｘｙｇｅｎに譲渡された米国特許第５，８３４，４５８号、ならびにＡｆｆｙｍａｘに譲渡された米国特許第５，８３０，７２１号、同第５，８１１，２３８号および同第５，６０５，７９３号に記載されたような、「遺伝子シャッフリング」の技術によって改変され得る。この技術において、ｂＰＫＳをコードするＤＮＡ配列を、制限酵素によって切断し、増幅し、そして次いで、再度連結する。これは、再編成された遺伝子の混合物を生じ、この混合物は、そのポリケチドを産生する能力について評価され得る。容易に形質転換される宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における、ポリケチドを産生するその能力は、これを実用的なアプローチにする。
【００７８】
産生されるポリケチドに関して、ポリケチドシンターゼを構築するために５つの自由度が存在する。第１に、ポリケチド鎖の長さは、ＰＫＳ中のモジュールの数によって決定される。第２に、ＰＫＳの炭素骨格の性質は、各位置での伸長単位（例えば、マロニル、メチルマロニルまたはエチルマロニルなど）の性質を決定する、アシルトランスフェラーゼの特異性によって決定される。第３に、ローディングドメイン（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）の特異性もまた、得られるポリケチドの炭素骨格に対して影響を及ぼす。従って、ローディングドメインは、アセチル、プロピオニル、ブチリルなどのような、異なる開始単位を使用し得る。第４に、ポリケチドの様々な位置における酸化状態は、そのモジュールのデヒドラターゼ部分およびレダクターゼ部分によって決定される。これは、ポリケチドにおけるケトン、アルコール、二重結合または単結合の存在および位置を決定する。最後に、得られたポリケチドの立体化学は、シンターゼの３つの局面の機能である。第１の局面は、伸長単位としての置換マロニル基と関連するＡＴ／ＫＳ特異性に関連し、この特異性は、還元サイクルが存在しない場合または還元サイクルがケトレダクターゼのみを含む場合にのみ、立体化学に影響を与える（なぜなら、デヒドラターゼがキラリティーを破壊するからである）。第２に、ケトレダクターゼの特異性が、任意のβ−ＯＨのキラリティーを決定する。最後に、伸長単位としての置換マロニル基に対するエノイルレダクターゼの特異性が、完全なＫＲ／ＤＨ／ＥＲが利用可能な場合に、結果に影響を与える。
【００７９】
１つ有用なアプローチは、モジュール１におけるＫＳ活性を改変することであり、代替的な開始単位およびモジュール１伸長単位を取り込む能力を生じる。このアプローチは、本明細書中で参考として援用されるＰＣＴ出願ＵＳ／９６／１１３１７に例示され、ここで、ＫＳ−Ｉ活性は、変異によって不活性化された。次いで、ポリケチド合成を、モジュール１ジケチド産物の化学的に合成したアナログを供給することによって開始させる。次いで、本発明の方法を使用して、伸長単位量を増大させる得る。
【００８０】
モジュール型ＰＫＳは、それらの開始単位に対して緩やかな特異性を有する（Ｋａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）、前出）。モジュール型ＰＫＳはまた、それぞれの縮合サイクルにおける伸長単位の選択において、かなりの多様性をも示す。縮合反応後のβ−ケト還元の程度もまた、遺伝子操作により変更されることが示されている（Ｄｏｎａｄｉｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）、前出；Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：７１１９−７１２３）。同様に、ポリケチド産物のサイズは、適切な数のモジュールを持つ変異体を設計することによって変更され得る（Ｋａｏ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：１１６１２−１１６１３）。最後に、これらの酵素は、高度に制御された様式でそれらの産物における重要な範囲の不斉中心を生成することについて、特に周知である。本発明の方法により産生されるポリケチドおよび抗生物質は、代表的に、単一の立体異性体形態である。本発明の化合物は、立体異性体の混合物として生じ得るが、このＰＫＳ系を用いることによって、個々の立体異性体を生成させることが、より実用的である。
【００８１】
ＰＫＳのポリケチド産物は、抗生物質活性を示すために、代表的には、ヒドロキシル化、酸化および／またはグリコシル化によって、さらに修飾され得る。
【００８２】
ポリケチドをグリコシル化するための方法は、当該分野において一般的に公知であり；グリコシル化は、適切なグリコシル化酵素を提供することによって細胞内でもたらされ得るか、または、化学合成手段（本明細書中で参考として援用される、米国出願番号第０９／０７３，５３８号に記載されるような）を使用することによってインビトロでもたらされ得る。
【００８３】
抗生物質モジュール型ポリケチドには、任意の多くの異なる糖が含まれ得るが、Ｄ−デソサミンまたはそれらの類似アナログが、最も一般的ではある。例えば、エリスロマイシン、ピクロマイシン、ナルボマイシンおよびメチマイシンは、デソサミンを含む。エリスロマイシンはまた、Ｌ−クラジノース（３−Ｏ−メチルミカロース）を含む。タイロシンには、ミカミノース（４−ヒドロキシデソサミン）、ミカロースおよび６−デオキシ−Ｄ−アロースが含まれる。２−アセチル−１−ブロモデソサミンは、ポリケチドをグリコシル化するためのドナーとして使用されている（Ｍａｓａｍｕｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９７５）９７：３５１２、３５１３）。他の、明らかにより安定的なドナーとしては、グリコシルフルオリド、チオグリコシドおよびトリクロロアセトイミデートが挙げられる（Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３２１５；Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｆ．ら、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９７）１１９：３１９３；Ｔｏｓｈｉｍａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９５）１１７：３７１７；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ（１９８８）２９：３５７５）。グリコシル化はまた、出発物質としてのマクロライドおよびＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの変異体を使用してもたらされ得、このＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａの変異体は、変換を行うためのこのマクロライドを合成することができない。
【００８４】
一般的に、グリコシル化をもたらすためのアプローチは、ヒドロキシル化に関しての上記アプローチを反映する。天然の供給源から単離したかまたは組み換え産生した精製酵素を、インビトロで使用し得る。あるいは、グリコシル化は、内因性または組換え産生された細胞内グリコシラーゼを用いて、細胞内でもたらされ得る。さらに、合成的化学法が使用され得る。
【００８５】
宿主が通常ポリケチドを産生する場合、これらの宿主による内因性ポリケチド産生を阻害するように、これらの宿主を改変することが望ましくあり得る。そのような宿主は、例えば、参考として本明細書中で援用される米国特許第５，６７２，４９１号に記載され、これは、以下の実施例において使用される、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９を記載する。このような宿主においては、組換え産生されたポリケチドシンターゼを構築する酵素の翻訳後修飾のための酵素的活性を与えることが必要とされないかもしれない。これらの宿主は、一般に、シンターゼの機能性に必要とされるパンテテイニル残基を提供するための、ホロ−ＡＣＰシンターゼと呼ばれる、適切な酵素を含む。しかし、通常ポリケチドを産生しない酵母、植物または哺乳類細胞のような宿主において、組換え産生されたＰＫＳを機能性に変換するための適切なホロ−ＡＣＰシンターゼを提供する（代表的には、組換え手段による）必要があり得る。そのような酵素の提供は、例えば、本明細書中で参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ９８／２７２０３に記載されている。
【００８６】
また、宿主および所望の産物の性質に依存して、「調整（仕立て）（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）酵素」またはそれらをコードする遺伝子を提供することが必要であり得る。ここで、これらの調整酵素は、酸化、ヒドロキシル化、グリコシル化などによって産生された、マクロライドを修飾する。
【００８７】
コードするヌクレオチド配列は、これらの配列に適合性である宿主細胞において、このコードするヌクレオチド配列の発現をもたらすように作動する、プロモーター、エンハンサーおよび／または終止配列に作動可能に連結され；宿主細胞は、染色体外エレメントもしくはベクターとしてか、または染色体中に組み込まれるかのいずれかとしてこれらの配列を含むように改変され、そしてＰＫＳおよびＰＫＳ後（ｐｏｓｔ−ＰＫＳ）の酵素、ならびにポリケチドおよび抗生物質を生成するための方法は、これらの改変された宿主細胞を使用する。Ｅ．ｃｏｌｉのような生物において使用するための多重ベクター系（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）が意図される。
【００８８】
宿主のＰＫＳ遺伝子における酵素活性を置き換えるため、または宿主ＰＫＳ遺伝子のこれらの領域において変異を支持するための種々の操作を実施するために使用されるベクターは、コード配列の発現が適切な宿主においてもたらされ得る様式で、得られたコード配列に作動可能に連結された制御配列を含むように選択され得る。しかし、単純なクローニングベクターも同様に使用され得る。
【００８９】
特に有用な制御配列は、それ自体が、栄養性菌糸体において増殖期から定常期への転移の間に発現を活性化するか、または適切な調節系を使用して、栄養性菌糸体において増殖期から定常期への転移の間に発現を活性化する制御配列である。例示的なプラスミドｐＲＭ５に含まれる系（すなわち、ａｃｔＩ／ａｃｔＩＩＩプロモーター対、およびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４、アクチベーター遺伝子）は、特に好ましい。特に好ましい宿主は、ポリケチドを生成するそれ自身の手段を欠損し、その結果、より明瞭な結果が得られる宿主である。この型の例示的な宿主細胞としては、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／４０９６８に記載された改変Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９培養物およびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓの類似の株が挙げられる。
【００９０】
本発明の組換えベクターを適切な宿主に導入するための方法は、当業者に公知であり、そして代表的には、ＣａＣｌ２または他の薬剤（例えば、二価カチオン）の使用、リポフェクション、ＤＭＳＯ、プロトプラスト形質転換、およびエレクトロポレーションが挙げられる。
【００９１】
１９９７年１２月１１日付けで出願された出願番号０８／９８９，３３２号（本明細書中で参考として援用される）において開示されたように、いくつかの宿主は、シンテターゼのアシルキャリアタンパク質を活性化する適切な翻訳後機構を生来的に含まないとはいえ、広範な種々の宿主が使用され得る。これらの宿主は、適切な組換え酵素で改変されて、これらの改変を果たし得る。
【００９２】
新しい異種系においてモジュール型（ｍｏｄｕｌａｒ）ポリケチドシンターゼを操作する能力を実証するために、本発明者らは、ＰＫＳモジュールを非リボソーム性ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）様モジュールに融合したＤＥＢＳの誘導体を構築することを試みた（Ｍｏｏｔｚ，Ｈ．Ｄ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１：５４３）。リファマイシンシンテターゼの第１モジュールは近年、２つのドメイン（アデニル化（Ａ）ドメインおよびチオール化（ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）（Ｔ）ドメイン）から構成されるＮＲＰＳ様モジュールであることが示された（Ａｄｍｉｒａａｌ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（投稿済））。Ａドメインは、ＡＴＰ依存的な反応において、３−アミノ−５−ヒドロキシベンゾエート（ならびに、ベンゾエートおよびいくつかのベンゾエート誘導体（Ａｄｍｉｒａａｌ（前出）））を活性化し、そしてアリールアデニレートを、Ｔドメインのホスホパンテテイン腕に転移させる（図７）。このＮＲＰＳ様モジュールを、ＤＥＢＳのローディングジドメイン（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｉｄｏｍａｉｎ）の代わりに、ＤＥＢＳの第１縮合モジュールの上流に融合した（ＤＥＢＳ１に融合されたリファマイシンローディングジドメインおよびｐｃｃＡＢ遺伝子を保有するプラスミドｐＢＰ１６５の構築を、実施例１１に記載する）。外因性プロピオネートおよびベンゾエートの存在下において、得られたＥ．ｃｏｌｉ株は、ＮＭＲおよび質量分析法によって確認されたように（図７）、予期された６ｄＥＢアナログ（化合物３）を生成した（１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ２１３．７６，１７７．４３，７９．７０，７６．６０，７１．２４，３７．７２（富化された炭素原子のみ）。質量分析法（ＡＰ−ＣＩ）期待値  １２Ｃ１９１３Ｃ６Ｈ３８Ｏ６Ｎａ：４６３．２７５７；観測値：４６３．２８４７）。
【００９３】
まとめると、本発明者らは、複雑なポリケチド天然産物を生成するようにＥ．ｃｏｌｉを操作する可能性を実証した。以下に挙げられる複数の変更を、関連する６ｄＥＢの生成のためにＥ．ｃｏｌｉゲノムに対して行った：Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ由来の３つのＤＥＢＳ遺伝子の導入、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓｆｐホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ遺伝子の導入、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のヘテロ二量体性プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子の導入、内因性ｐｒｐＲＢＣＤ遺伝子の欠失、および内因性ｐｒｐＥ遺伝子およびｂｉｒＡ遺伝子の過剰発現。遺伝子発現を低温で協調的に誘導した場合、プロピオネートは、優れた動的パラメーターを有するこの代謝的に操作された細胞性触媒によって、６ｄＥＢへと変換され得る。生体産物（ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ）を過剰生成するようにＥ．ｃｏｌｉを発酵することに関して十分に確立された拡張可能なプロトコールが利用可能であることを考慮すると、この異種宿主において複雑なポリケチドを合成する能力は、これらの生物活性天然産物の実用的な生成のために良い前兆である。同じく重要なことに、本明細書中で記載されたハイブリッドＰＫＳ−ＮＲＰＳによって示されるように、このことは、方向付けられたアプローチおよび無作為なアプローチを使用してモジュール型ポリケチドシンターゼを操作するために、Ｅ．ｃｏｌｉにおける分子生物学の莫大な能力を利用する道を開く。このように、ＮＲＰＳを含みかつ種々のベンゾエート基質を組み込んだもののようなハイブリッドモジュール型ポリケチドシンターゼを作製する生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）もまた意図される。
【００９４】
（出発物質の増強およびバリエーション）
従って、開始因子単位および／または伸長因子単位の生成を触媒するタンパク質（および、それらのコード配列）を使用して、従来生成されたよりも高いレベルでかなり多様なこれらの開始因子単位および伸長因子単位を提供することによってポリケチドの産生を増強し得る。上記に示したように、微生物宿主を改変するために使用される必要な酵素（開始因子単位および／または伸長因子単位の提供、生成、または生成の増強において有効な酵素を含む）は、染色体外複製エレメントとして供給され得るが、これらは好ましくは、例えば、相同組換え技術によって宿主ゲノム中に導入される。所望される発現系をゲノムに組み込むことによって、選択圧の必要性が回避され、そしてさらなる抗生物質を伴わない理想的な生成条件下で適切でありかつ使用され得る適切な生成株が得られる。さらに、宿主は、組換え技術によって活性化される、基質の生成において有用であるサイレントな遺伝子を含み得る。
【００９５】
タンパク質は、種々の基質を使用して、開始因子単位および／または伸長因子単位を得るための反応を触媒するので、タンパク質は、改変されているかまたは改変されていないかに関わらず広範な種々のＰＫＳについて、開始因子単位および伸長因子単位の利用可能性を増強するにおける汎用的なツールである。上記のように、ｍａｔＡＢＣオペロン（または、他の種における類似のオペロン）、ならびにａｃｃＡ１遺伝子と共にｐｃｃＢおよびａｃｃＡ２によってコードされるプロピオン酸カルボキシラーゼ（または、他の種におけるそれらのアナログ）の生成は、特に有用である。これらの酵素およびそれらのコード配列は、ｍａｔＡＢＣオペロンおよびプロピオン酸カルボキシラーゼコード遺伝子が、種々の基質に対して必要とされる反応を実行するのみならず、ポリケチド合成において使用するために必要とされる立体化学を有する生成物の生成をも共に実行する酵素を提供するという発見に照らして有用である。
【００９６】
本明細書中に記載される遺伝子が、適切な開始因子単位および伸長因子単位を提供する能力は、以下に記載のようにして確証付けられた。
【００９７】
（改善された培養条件）
上記の宿主の改変に加えて、微生物の培養条件を改変して、合成されるポリケチドの収率を改善し得る。これらの条件の成功は、少なくとも５％、好ましくは１０％、より好ましくは２５％、そして最も好ましくは少なくとも５０％生成されるポリケチドのレベルまたは速度によって測定され得る。２００％の生成レベル増強もまた達成され得る。これらの増強は、おそらく比較的緩やかであり、そして５倍、１０倍、２０倍、１００倍、２００倍、または５００倍のレベルに増強することは、宿主生物のゲノム補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を改変することによってか、もしくは培養条件を操作することによってか、またはその両方によって可能となった。生成レベルまたは生成速度は、変動されるパラメーター以外の他のすべてを一定にした条件設定下で測定される。
【００９８】
以下に示されるように、ポリケチドの収率は、（１）発酵全体を通して、比較的一定した栄養素レベルを維持すること；（２）補助的なチオエステラーゼを提供すること；（３）開始因子単位および／または伸長因子単位についてのさらなる前駆体を大量に給餌すること；ならびに（４）高い細胞密度まで増殖させること、によって著しく増加される。１つ以上のこれらのストラテジーを使用して、ポリケチドの収率は、少なくとも１．２５倍、好ましくは１．５倍、より好ましくは２倍、そして多くの場合、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍増強される。
【００９９】
実施例１２に示されるように、チオエステラーゼＩＩ（ＴＥＩＩ）についての発現系を提供する場合に、最初の濃度が枯渇した後に前駆体を添加することは有益である。ポリケチド合成過程の間、比較的一定の値に栄養素レベルを維持し、そして高い細胞密度まで細胞増殖を可能にすることは、特に有益である。
【０１００】
栄養素が「比較的一定の値」とは、栄養素を、低濃度に、代表的には、Ｅ．ｃｏｌｉの場合２ｇ／Ｌ未満に維持することを意味する。「高い細胞密度」とは、Ｅ．ｃｏｌｉについては、約４０〜８０、好ましくは５０〜７０のＯＤ６００値を意味する。
【０１０１】
（実施例１）
（ＣｏＡシンテターゼを使用した、マロニルＣｏＡおよび２Ｓ−メチルマロニルＣｏＡの生成）
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｌ８は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子において温度感受性変異を有し、その結果、マロニルＣｏＡを、３７℃でアセチルＣｏＡから生成し得ない。しかし、この遺伝子産物は、３０℃でこの変換を果たし得る。Ｈａｒｄｅｒ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７２）６９：３１０５−３１０９を参照のこと。アセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡへのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ変換は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるマロニルＣｏＡ生成について知られている唯一の経路であるので、そしてマロニルＣｏＡは脂肪酸生合成に必須であるので、Ｅ．ｃｏｌｉのこの変異株は、３０℃では増殖し得るが、３７℃では増殖し得ない。ｍａｔＡＢＣオペロンを有するＬ８の形質転換体は、ｍａｔＡ、ｍａｔＢおよびｍａｔＣ遺伝子を、それらのネイティブなプロモーターの制御下に含むプラスミドｐＭＡＴＯＰ２で形質転換することによって生成され、そしてＡｎ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）２５７：３９５−４０２に記載されている。この形質転換体は、マロン酸の不在下では、３７℃でなお増殖し得ない；しかし、培地に１〜５ｍＭのマロン酸を添加することによって、この形質転換体を、この温度で増殖させることが可能となる（このプラスミドの不在下では、マロン酸は、３７℃で増殖を支持し得ない）。しかし、細胞外のマロン酸の濃度は重要である。なぜなら、４０ｍＭまでその濃度を増加させると、利用可能な補酵素Ａの量と比較してマロニルＣｏＡの過剰生成によって引き起こされる代謝的不均衡におそらく起因して、増殖の欠如を生じさせるからである。致死もまた、ｍａｔＡＢＣオペロンを保有するプラスミドおよび高濃度のメチルマロン酸の存在下で、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｅ．ｃｏｌｉの野生型株）において誘導された。
【０１０２】
にもかかわらず、上記で示された結果は、ｍａｔＢによってコードされるタンパク質が、遊離マロン酸が利用可能である限りにおいて、生理的条件下でインビボにおいてマロニルＣｏＡを生成し；そして、ｍａｔＣによってコードされるタンパク質によって細胞に輸送されたことを実証する。従って、ｍａｔＢＣ遺伝子を使用して、複雑なポリケチドをマロン酸の給餌によって生成するＥ．ｃｏｌｉ細胞中においてマロニルＣｏＡの利用能を補充し得る。
【０１０３】
マロン酸をマロニルＣｏＡに変換することに加えて、ＭａｔＢはまた、メチルマロン酸をメチルマロニルＣｏＡに変換することが示された。しかし、得られた産物の立体化学は報告されていない。このことは重要である。なぜなら、モジュール型ポリケチドシンターゼは、メチルマロニルＣｏＡの１つの異性体（すなわち、２Ｓ−メチルマロニルＣｏＡ）のみを受容することが知られているからである（Ｍａｒｓｄｅｎ，Ａ．Ｆ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６３：３７８−３８０）。ＭａｔＢがメチルマロニルＣｏＡの正確な異性体を作製し得るか否かを研究するために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合物（ＧＳＴ−ＭａｔＢ）をコードする構築物を使用して、このタンパク質を生成した。Ａｎ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ（１９９９）３４４：１５９−１６６を参照のこと。このＧＳＴ−ＭａｔＢタンパク質を、記載されたような標準的なプロトコールに従って精製し、そしてエリスロマイシンポリケチドシンターゼの（モジュール６＋ＴＥ）と混合し、また、Ｇｏｋｈａｌｅ，Ｒ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：４８２−４８５に記載されたようにしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。
【０１０４】
初期の研究において、本出願人は、インビトロで以下の反応を触媒する（モジュール６＋ＴＥ）の能力を実証することによって、（モジュール６＋ＴＥ）の活性を確証付けた。
【０１０５】
（２Ｓ，３Ｒ）−２−メチル−３−ヒドロキシペンタン酸のＮ−アセチルシステアミンチオエステル  ＋  ２（ＲＳ）−メチルマロニルＣｏＡ  ＋  ＮＡＤＰＨ  →  （２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２，４−ジメチル−３，５−ジヒドロキシ−ｎ−ヘプタン酸δ−ラクトン  ＋  ＮＡＤＰ＋。
【０１０６】
ＧＳＴ−ＭａｔＢの基質としてメチルマロン酸を使用して得られるメチルマロン酸チオエステル生成物は、正確な立体化学を提供し、この反応において伸長因子単位の供給源として役立つ。より詳細には、インサイチュで上記のポリケチド合成の基質を生成するために、以下の反応混合液（６＋ＴＥおよびＧＳＴ−ＭａｔＢを含む）を、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）緩衝液、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２．５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）および２０％グリセロールの反応緩衝液中で調製した：
４０ｍＭ  メチルマロン酸（ｐＨ６）
１６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５ｍＭ  ＡＴＰ
５ｍＭ  ＣｏＡＳＨ
１３．３ｍＭ  ＮＡＤＰＨ
１ｍＭ  （２Ｓ，３Ｒ）−２−メチル−３−ヒドロキシペンタン酸のＮ−アセチルシステアミンチオエステル（放射性形態で調製）。
【０１０７】
４時間後に、この反応をクエンチし、そしてエチルアセテートで抽出した（反応容量の３倍で２回抽出した）。サンプルを真空化で乾燥し、そして薄層クロマトグラフィー分析に供した。
【０１０８】
ポジティブコントロールを、初期に記載された条件（すなわち、（ＲＳ）−メチルマロニルＣｏＡを、メチルマロン酸、ＭｇＣｌ２、ＡＴＰ、ＣｏＡ  ＳＨ、およびＧＳＴ−ＭａｔＢの組み合わせと置換した条件）と同じ条件下で実行した。ネガティブコントロールは、ＧＳＴ−ＭａｔＢ融合タンパク質を除いて、上記に列挙されたすべての成分を含んだ。この結果によって、上記の二酵素系は、ポジティブコントロール反応に匹敵する量で、期待される生成物を生成し得ることが実証された。このことによって、ＭａｔＢは、メチルマロニルＣｏＡの正確な異性体を合成することが確証付けられた。
【０１０９】
従って、ＭａｔＢ／ＭａｔＣは、ポリケチド生合成について、インビボでマロニルＣｏＡおよび２Ｓ−メチルマロニルＣｏＡの両方を合成するために有用である。これは、生理的条件下で、インビボで２Ｓ−メチルマロニルＣｏＡを生成する能力を有するＥ．ｃｏｌｉを操作した最初の実例である。さらに、インビボでｍａｔＡを同時発現させることは、メチルマロニルＣｏＡのプロピオニルＣｏＡへの変換を可能にし、それにより、この開始因子単位の利用可能な供給源を補充する。
【０１１０】
（実施例２）
（プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼが、２Ｓ−メチルマロニルＣｏＡを生成する能力）
上記のＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のプロピオニルカルボキシラーゼ遺伝子を利用するために、Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主（ＢＬ−２１（ＤＥ３））を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｍ．ら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８９）１７１：４６１７−４６２２によって開発された方法を使用して調製した。この新たな株（ＢＡＰ  １）は、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｒｐオペロンに組み込まれた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のホスホパンテテイントランスフェラーゼ遺伝子（ｓｆｐ遺伝子）を含む。Ｔ７プロモーターは、ｓｆｐの発現を駆動する。組換え手順において、ｐｒｐＥ遺伝子をまた、このＴ７プロモーターの制御下に配置したが、残りのオペロンは取り除いた。この遺伝的変更は、理想的には、以下の３つの特徴を与える：１）ＤＥＢＳおよび潜在的に他のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）の翻訳後改変のために必要とされるｓｆｐタンパク質の発現；２）ＣｏＡＳＨをプロピオネートに理論上連結し得る、推定プロピオニルＣｏＡシンテターゼであるｐｒｐＥの発現；および３）炭素／エネルギー源としてプロピオニルＣｏＡをもはや代謝し得ない細胞環境。
【０１１１】
第１に、ＢＡＰ１株は、ｓｆｐ遺伝子生成物のその生成によって、これらの細胞において生成されるＰＫＳのホスホパンテテイニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ）をもたらし得ることが確証付けられた。ＢＡＰ１を、モジュール６＋ＴＥについての発現系を含むプラスミドでトランスフェクトし、そして、生成されたモジュールの活性を、ｓｆｐ遺伝子をプラスミド産生（ｐｌａｓｍｉｄ  ｂｏｒｎｅ）したＢＬ−２１（ＤＥ３）細胞において組換え生成されたモジュールの活性と比較した。これらのレベルは同等であった。対照的に、ＢＬ−２１（ＤＥ３）において単独で発現された場合に、モジュール６＋ＴＥは活性を示さなかった。さらに、ＢＡＰ１は、単独の炭素供給源としてのプロピオネート（ＢＬ２１（ＤＥ３）のようなＥ．ｃｏｌｉ株によって適切に発現される）上では、増殖する能力がないことを確証付けた。ＢＡＰ１は、ＭａｔＢＣおよびプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼのような酵素と組み合わせて、ポリケチドシンターゼを異種発現させるために好ましい宿主である。
【０１１２】
プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素を、Ｔ７プロモーターの下で、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。この生成物酵素は、インビトロでモジュール６＋ＴＥの基質を供給し得る。このことは、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素のメチルマロニルＣｏＡチオエステル生成物の、（２Ｓ，２Ｒ）２−メチル−３−ヒドロキシペンタン酸のＮ−アセチルシステアミンチオエステルへのカップリングを使用して実証された。プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼの成分をコードする上記のｐｃｃＢおよびａｃｃＡ２遺伝子を発現させ、そして標準的な手順に従って、その生成物を個々に精製した。まず、ｐｃｃＢおよびａｃｃＡ２のサブユニットを、１５０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）および３００μｇＢＳＡ中において、氷上で複合化させた。１時間後、以下の基質を１００μｌ容量に対して添加し、そして３０℃でさらに３０分間インキュベートした：
１ｍＭ  プロピオニルＣｏＡ
５０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム
３ｍＭ  ＡＴＰ
５ｍＭ  ＭｇＣｌ２。
【０１１３】
次いで、モジュール６＋ＴＥに、以下の最終的な試薬セットを添加して２００μｌにし、そして３０℃でさらに１時間反応させた：
１０％グリセロール
１．２５ｍＭ  ＤＴＴ
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
４ｍＭ  ＮＡＤＰＨ
２ｍＭ  （２Ｓ，２Ｒ）２−メチル−３−ヒドロキシペンタン酸のＮ−アセチルシステアミンチオエステル（放射性形態で調製）。
【０１１４】
この反応をクエンチし、そして上記のように抽出し、そして予期された生成物の形成を示した。ポジティブコントロールは、ラセミ体マロニルＣｏＡを含んだ。ＡＴＰまたは炭酸水素ナトリウムのいずれかをこの反応から取り除いた場合には、生成物は全く形成されなかった。従って、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼは、ポリケチドシンターゼ活性に適切な基質を生成する。これは、特に上記で言及した新しい発現宿主ＢＡＰ１との組み合わせにおいて、ポリケチド生成のために特に有用である。
【０１１５】
ＤＥＢＳタンパク質であるＤＥＢＳ１＋ＴＥは、ｐＲＳＧ３２によって生成される。ＤＥＢＳ１は、３つのＤＥＢＳタンパク質の中で最も弱い発現を示し、そして近年まで、この酵素のインビトロ活性は示されていなかった。しかし、Ｍ９最少培地においてｐＲＳＧ３２を含むＥ．ｃｏｌｉを増殖させ、そして２２℃でタンパク質発現を誘導することによって、ＤＥＢＳ１＋ＴＥ活性が、ここで再現可能に観察された。
【０１１６】
プラスミドｐＲＳＧ３２（ＤＥＢＳ１＋ＴＥ）およびｐ１３２（プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼのα成分およびβ成分を含むプラスミド）を、ＢＡＰ１に同時トランスフェクトした。１０ｍｌのＭ９最少培地の培養物を、中程度対数期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）のレベルまで増殖させ、そしてＩＰＴＧでの誘導および０．２６７ｍＭ  １４Ｃプロピオネートの添加のために、１ｍｌまで濃縮した。次いで、このサンプルを１２〜１５時間にわたって２２℃でインキュベートした。次いで、この培養物の上清を、分析用ＴＬＣのためにエチルアセテートで抽出した。予期されるポジティブコントロールとの生成物の泳動およびこの同一の生成物は、野生型ＢＬ−２１（ＤＥ３）を使用するかまたはｐ１３２を取り除くかのいずれかの場合に検出不可能であった。従って、このカルボキシラーゼは、正確な立体異性体を形成する。
【０１１７】
さらに、ｐＲＳＧ３２、ｐ１３２およびｐＣＹ２１４（プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼのαサブユニットへのビオチンの結合を補助するために、ビオチンリガーゼを含んだ）で形質転換されたＢＡＰ１を含むＭ９最少培地の１００ｍｌの培養物を、ＩＰＴＧでの誘導および１００ｍｇ／Ｌの  １３Ｃプロピオネートの添加のために、中程度対数期まで増殖させた。ビオチン化サブユニット（ｐｃｃＡ）の活性は、Ｅ．ｃｏｌｉのｂｉｒＡビオチンリガーゼ遺伝子の同時発現に際して、有意に増強され得た。この培養物上清の抽出およびこのサンプルの濃縮に際し、１３Ｃ−ＮＭＲによって、予期される富化された生成物のピークの位置を確認した。ＢＬ−２１（ＤＥ３）を使用した、引き続くネガティブコントロールは、同じスペクトルを生じなかった。Ｅ．ｃｏｌｉがインビボで複雑なポリケチドを作製する能力を実証したことに加えて、これらの結果はまた、ＢＡＰ１において発現するようにプログラムされたｐｒｐＥタンパク質が活性であることを示唆している。
【０１１８】
あるいは、形質転換細胞をＭ９の最小の培地培養により、３７℃で対数期中間まで増殖させ、続いて、２２℃で、０．５〜１ｍＭのＩＰＴＧ、２．５ｇ／Ｌのアラビノース、および、それぞれ、２６ｍｇ／Ｌまたは２５０ｍｇ／Ｌの［１−１４Ｃ］プロピオナートまたは［１−１３Ｃ］プロピオナートで誘導した。１４Ｃ−１−プロピオナート摂取に関しては、個々の形質転換株を、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、および１７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下で、グルコースを含むＭ９の最小の培地培養中（３７℃、２５０ｒｐｍ）に播種した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１９８２）。培養物を、対数期中間（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）（ＯＤ６００＝０．６〜０．８）まで増殖させ、２２℃で５分間冷却し、次いで遠心した。この細胞ペレットを、１ｍｌの残留上清に再懸濁し、そして１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．２５％のアラビノース（ｐＣＹ２１６について）によって誘導した。さらに、１４Ｃ−１−プロピオナート（５６ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を、０．２７ｍＭの最終濃度で加えた。次いで、この培養物をさらに１２〜１５時間２２℃で攪拌した。この時点で、培養物を遠心し、１００μｌの上清を、酢酸エチル（各回  ３００μｌ）で抽出した（２回）。抽出物を、真空下で乾燥し、ＴＬＣ分析に供した。ネガティブコントロールは、ＢＡＰ１／ｐＲＳＧ３２／ｐＣＹ２１６およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＧ３２／ｐＴＲ１３２／ｐＣＹ２１６を含んでいた。
【０１１９】
１３Ｃ−１−プロピオナート摂取に関しては、ＢＡＰ１／ｐＲＳＧ３２／ｐＴＲ１３２／ｐＣＹ２１６の単一の形質転換株を用いて、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、および３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む３ｍＬのＬＢ培養を、３７℃、２５０ｒｐｍで開始した。この開始因子培養を、上記と同じ抗生物質濃度で、グルコースを含む１００ｍＬのＭ９最小培地に播種するために使用した。これらの培養物を、２５０ｒｐｍかつ３７℃で、対数期中間（ＯＤ６００＝０．５〜０．７）まで増殖させ、２２℃の水浴中で１５分間冷却し、そして５００μＭのＩＰＴＧおよび０．２５％のアラビノースによって誘導した。１３Ｃ−１−プロピオナートを、１００ｍｇ／Ｌで加えて、この培養物を２２℃で１２〜１５時間インキュベートした。次いでこのサンプルを遠心し、その上清を、３００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。このサンプルを真空下で乾燥し、ＣＤＣｌ３に再懸濁し、そして１３Ｃ−ＮＭＲによって分析した。ネガティブコントロールは、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＧ３２／ｐＴＲ１３２／ｐＣＹ２１６を用いて行った。１２〜４８時間後、培養上清を抽出し、そして予想される、ＤＥＢＳ１＋ＴＥのトリケチドラクトン（図７、化合物２）産物形成について分析した。両方の摂取条件下でのトリケチドラクトンの形成は、ＢＡＰ１がポリケチドを産生する能力を支持した。
【０１２０】
プラスミド  ｐＲＳＧ３２、ｐＢＰ４９、ｐＲＳＧ５０の構築：ＤＥＢＳ１＋ＴＥ（ｐＲＳＧ３２）、ＤＥＢＳ２（ｐＢＰ４９）およびＤＥＢＳ３（ｐＲＳＧ５０）をコードする遺伝子を、ｐＥＴ２１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングした。ＤＥＢＳ１＋ＴＥ遺伝子を、ｐＣＫ１２（６）由来のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローニングした。ＤＥＢＳ３遺伝子を、ｐＪＲＪ１０由来のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローニングした（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｊ．Ｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：４９２８）。ＤＥＢＳ２遺伝子を発現させるために、ｐＲＳＧ３４（Ｇｏｋｈａｌｅ，Ｒ．Ｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：４８２）由来のＢｓｍＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（モジュール３＋ＴＥを発現させるために以前使用されていた）を、モジュール４をコードするＢｓｍＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと置換した。天然の配列を以下の配列：
ＣＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣ
に変更することにより、このＥｃｏＲＩ部位（下線）を、ＤＥＢＳ２遺伝子の終止コドンのすぐ上流に操作した。
【０１２１】
最初の試みは、３つのＤＥＢＳタンパク質の各々をコードする遺伝子を発現させ、続いてタンパク質活性のインビトロアッセイを行うためになされたことに留意するべきである。ＤＥＢＳ３、ＤＥＢＳ２、およびＤＥＢＳ１の改変体（ＤＥＢＳ１＋ＴＥ）を、個別に、ｐＥＴ２１ｃ発現ベクター（ｐＲＳＧ５６上にｓｆｐホスホパンテテイニル（ｓｆｐ  ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ）トランスフェラーゼ遺伝子を保持する）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換によって導入した（Ｋａｏ，Ｃ．Ｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ（１９９５）１１７：９１０５−９１０６，Ｃｏｒｔｅｓ，Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６８：１４８７−１４８９；Ｌａｍｂａｌｏｔ，Ｒ．Ｈら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）３：９２３−９３６；Ｇｏｋｈａｌｅ，Ｒ．Ｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４：４８２−４８５）。３つのＤＥＢＳ遺伝子の発現レベルを、初期に報告されたＳ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ（Ｃａｆｆｒｅｙ，Ｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９２）３０４：２２５−２２８）またはＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｐｉｅｐｅｒ，Ｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７８：２６３−２６６）由来のそれらの発現レベルに匹敵することが見出された。個々の形質転換株を使用して、２５０ｒｐｍでかつ３７℃で、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２５ｍｌのＬＢ播種培養を開始した。これらの培養物を用いて、１ＬのＬＢ培地に播種し、そしてその培養物を、同じ条件下で増殖させた。対数期中間（ＯＤ６００＝０．４〜０．８）で、細胞を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、そして３０℃のインキュベーターに移した。４〜６時間後、細胞を回収し、それらのタンパク質含量を、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。この３つのＤＥＢＳタンパク質を、約１％の細胞性タンパク質総量で発現させた。しかし、これらの溶解物において、ＤＥＢＳ３は活性であることが見出されたが、ＤＥＢＳ１＋ＴＥおよびＤＥＢＳ２は、どんな検出可能な活性（ＤＥＢＳ１＋ＴＥ（Ｐｉｅｐｅｒ，Ｒ．，前出）も欠いており、そしてＤＥＢＳ３を初期に記載されるようにアッセイした（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｊ．Ｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：４９２８）。完全なＤＥＢＳ２についてのアッセイはまだ開発されていないが、このタンパク質のモジュール３の活性は、初期に記載されるようにアッセイされ得る（Ｇｏｋｈａｌｅ，Ｒ．Ｓ．，前出）。これらの結果と一致して、組み換えＤＥＢＳ３を、初期に記載される手順を用いて、これらの溶解物から精製できた（Ｐｏｈｌ，Ｎ．Ｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１２０６−１１２０７）が、ＤＥＢＳ１＋ＴＥもＤＥＢＳ２も、検出可能な量では精製できなかった。インビトロ活性の検出ならびに続くＤＥＢＳ１＋ＴＥおよびＤＥＢＳ２の精製を容易にした重要なパラメータは、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）誘導後のインキュベーション温度であった。発現温度を３０℃から２２℃に下げると、活性なＤＥＢＳ１＋ＴＥタンパク質、ＤＥＢＳ２タンパク質およびＤＥＢＳ３タンパク質は組み換えＥ．ｃｏｌｉ溶解物中で検出できた。この後、低温誘導条件を、本研究の過程全体に渡って維持した。
【０１２２】
Ｅ．ｃｏｌｉでの巨大遺伝子およびタンパク質の良好な発現における低温の使用は、他の巨大遺伝子およびンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉならびに他の生物において、本明細書中に示されるような低温を有利に用いることによって発現し得ることを示唆する。
【０１２３】
（実施例３）
（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおける６−ｄＥＢの増強された産生）
ｍａｔＢ遺伝子およびｍａｔＣ遺伝子の存在（ベクターｐＣＫ７上へのＤＥＢＳ遺伝子複合体の挿入によって、このポリケチドを産生するように組み換え的に改変された）はまた、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒでの６−ｄＥＢの組み換え産生を増大し得た。ｍａｔＢ遺伝子およびｍａｔＣ遺伝子を、ＤＥＢＳ遺伝子を保持するプラスミドの効力によって、５０ｍｇ／Ｌの６−デオキシエリスロノリド（ｄｅｏｘｙｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ）Ｂを産生するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの組み換え株において発現させた。このｍａｔＢ遺伝子およびｍａｔＣ遺伝子を、ｐＣＫ７上のＤＥＢＳ遺伝子のすぐ下流に挿入した。
【０１２４】
より詳細には、ｍａｔＢＣ遺伝子の供給源は、ｍａｔＢＣ遺伝子を保持するｐＭＡ  ＴＯＰ２由来の５ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含むＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体である、ｐＦＬ４８２である。ｍａｔＢＣ遺伝子を含むｐＦＬ４８２のＮｓｉＩフラグメントを、ＤＥＢＳ遺伝子と同方向に、ｐＣＫ７の独特なＮｓｉＩ部位にクローニングして、ｐＦＬ４９４を得た。プラスミドｐＦＬ４９４をＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９中に形質転換する際に、マクロライド力価の１００〜３００％の増加を、外因性のメチルマロネート（ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎａｔｅ）（０．１〜１ｇ／Ｌ）の存在下で得た。
【０１２５】
プラスミドｐＣＫ７またはプラスミドｐＦＬ４９４を用いるかまたは用いない、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９の培養は、ビス−トリス  プロパン緩衝剤（２８．２ｇ／Ｌ）を補充したＲ６培地（１０３ｇ／Ｌのスクロース；０．２５ｇ／ＬのＫ２ＳＯ４；１０．１２ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．９６ｇ／Ｌのプロピオン酸ナトリウム；０．１ｇ／Ｌのカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）；２ｍＬ／Ｌの痕跡元素溶液；５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｆｉｓｈｅｒ）；ｐＨ７）を用いてフラスコで増殖した。痕跡元素溶液は、４０ｍｇ／ＬのＺｎＣｌ２；２００ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ／ＬのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；１０ｍｇ／ＬのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１ＯＨ２Ｏ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏを含んでいた。全ての培地に、５０ｍｇ／Ｌのチオストレプトン（ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加え、プラスミド含有細胞を選択し、そしてフォームのコントロールとして、５ｍＬ／ＬのＡｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）を加えた。チオストレプトンを培養物に添加する前にＤＭＳＯに溶解し、１Ｌの培地につき約１ｍＬの最終ＤＭＳＯ濃度を生じた。
【０１２６】
発酵のための種培養物を、５０ｍＬの培地の播種によって調製し、続いて、２４０ｒｐｍでかつ３０℃で、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ  ｆｌａｓｋ）（Ｂｅｌｌｃｏ）中で２日間増殖させた。次いで、これらの播種培養物を用いて、１ｇ／Ｌのメチルマロネートの存在または非存在下で、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ中で５％の最終容量で、５０ｍＬの培地に播種した。フラスコ培養全てを２つ組で行い、毎日サンプル採取した。実験全てを一度繰り返し、バッチ間の結果の再現性を確実にした。
【０１２７】
Ａｌｌｔｅｃ５００蒸発光散乱検出器を装備したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ１０９０ＨＰＬＣを用いて、６−ｄＥＢおよび８，８ａ−デオキシオレアンドリド（ｄｅｏｘｙｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）の定量化を行った。ＨＰＬＣサンプルを最初に５分間１２，０００×ｇで遠心し、不溶性物を除去した。上清（２０μＬ）を４．６×１０ｍｍカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ，Ｃ１８  ＯＤＳ３，５μｍ）にアプライし、水（１ｍｌ／分で２分間）で洗浄し、そして最後に主要カラム（４．６×５０ｍｍ、同じ固定層および同じ流速）上に、１００％の水で開始し１００％のアセトニトリル終わるように６分の勾配で溶出した。次いで、１００％のアセトニトリルを１分間維持した。これらの条件下で、６−ｄＥＢを６．２分で、そして８，８ａ−デオキシオレアンドリドを５．８分で溶出した。発酵ブロスから精製した６−ｄＥＢからスタンダードを調製した。定量化誤差を、±１０％に見積もった。
【０１２８】
上記のように、ｐＣＫ７またはｐＦＬ４９４のいずれかを含むＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９を、それらの６−ｄＥＢおよび８，８ａ−デオキシオレアンドリドの産生力について比較した。
【０１２９】
結果は以下に示す：
１．細胞密度は、両方の株について、実質的に同じであった。
【０１３０】
２．６−ｄＥＢおよび８，８ａ−デオキシオレアンドリドの両方の産生は、６日後の最終力価としてｍｇ／リットル／時間について測定しようと、またはｍｇ／リットルについて測定しようと、ＣＨ９９９／ｐＣＫ７と比較して、ＣＨ９９９／ｐＦＬ４９４において劇的に増大した。（プロピオニルＣｏＡではなくアセチルＣｏＡを開始単位として使用しているため、１２位のエチルの代わりにメチルを含む点を除いては、８，８ａ−デオキシオレアンドリドは、６−ｄＥＢと同じである。）より詳細には、６日後、ＣＨ９９９／ｐＦＬ４９４とメチルマロン酸は、１８０ｍｇ／ｌの６−ｄＥＢおよび約９０ｍｇ／ｌの８，８ａ−デオキシオレアンドリドを産生した。メチルマロン酸を培地に添加しなかった場合、６−ｄＥＢは、１３０ｍｇ／ｌのレベルで産生されたが、８，８ａ−デオキシオレアンドリドは、約４０ｍｇ／ｌで産生された。ｐＣＫ７を含むように改変されたＣＨ９９９について、培地中でのメチルマロン酸の存在下において、たった６０ｍｇ／ｌの６−ｄＥＢしか、約２０ｍｇ／ｌの８，８ａ−デオキシオレアンドリドと共に形成されなかった。メチルマロン酸なしでは、これらの細胞は、僅かに少しの、各々のこれらのマクロライドを産生した。
【０１３１】
３．ＣＨ９９９／ｐＦＬ４９４は、６日目までに１ｇ／Ｌで供給されたメチルマロネートを完全に消費した。
【０１３２】
４．１ｇ／Ｌのメチルマロネートの消費は、結果として、２００ｍ／Ｌのマクロライドの蓄積的増加を生じ、メチルマロネートの産物への３５％の変換効率を示す。
【０１３３】
５．ＣＨ９９９／ｐＦＬ４９４は、外因性のメチルマロネートの非存在下でさえ、両方のマクロライドの改善された産生を示す（上記２を参照のこと）。
【０１３４】
６．ＣＨ９９９／ｐＣＫ７でさえ、外因性のメチルマロネートを加えた場合、６−ｄＥＢ産生において２０％の改善を示した（上記２を参照のこと）。
【０１３５】
天然および異種の宿主での既知のポリケチドの生産力の増大に加え、ＭａｔＢをまた使用して、新規のポリケチドを産生する。ポリケチド生合成のためのα−カルボキシル化ＣｏＡチオエステルビルディングブロックを産生する他の酵素（例えば、メチルマロニル−ＣｏＡムターゼ（スクシニル−ＣｏＡに対して高度の特異性を有する）、およびアセチル／プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（アセチル−ＣｏＡおよび／またはプロピオニル−ＣｏＡを好む））と対照的に、ＭａｔＢは、広範囲の基質に対して活性である。マロネートおよびメチルマロネートに加え、ＭａｔＢは、基質（例えば、エチルマロネート、ジメチルマロネート、イソプロピルマロネート、プロピルマロネート、アリルマロネート、シクロプロピルマロネート、およびシクロブチルマロネート）を、それらの対応するＣｏＡチオエステルに活性化し得る。
【０１３６】
これらの基質のポリケチド合成への取り込みは、非天然の基質を受容し得るように、ポリケチドシンターゼの適切なモジュールへと操作され得る適切なアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）を必要とする。ＣＨ９９９／ｐＦＬ４９４に与えられた場合、これらのいずれのジカルボン酸も、検出可能な量の新規化合物を生じないが、特定のＰＫＳ酵素は、天然に、オルソゴナルな基質特異性を有するＡＴドメインを有する。例えば、ＦＫ５０６ＰＫＳは、通常、マロニル−ＣｏＡまたはメチルマロニル−ＣｏＡの様な基質よりも、かさ高い基質（例えば、プロピルマロニル−ＣｏＡ）を取り込む、アシルトランスフェラーゼドメインを含み、従って、どんなＰＫＳも操作することなく、ＭａｔＢが生成した非天然ビルディングブロックを受容し得る。
【０１３７】
Ｌａｕ，Ｊら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）３８：１６４３−１６５１によって記載されるタンパク質操作戦略を用いて、ｐＦＬ４９４におけるＤＥＢＳのモジュール６のＡＴドメインを、エチルマロニル−ＣｏＡを取り込むニッダマイシン（ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）ＡＴ４ドメイン由来の特異性決定セグメントを含むように改変した。Ｋａｋａｖａｓ，Ｓ．Ｊら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９９７）１７９：７５１５−７５２２を参照のこと。この結果生じたｐＦＬ５０８をＣＨ９９９に形質転換した。この株にエチルマロネートを供給する際、質量分析により、６ｄＥＢの質量分析に匹敵するレベルで、２−エチル−６ｄＥＢに相当する産物を検出することができた。この新しい化合物は、エチルマロネートの非存在下またはｍａｔＢＣ遺伝子を欠くコントロール株においては検出不可能であった。
【０１３８】
（実施例４）
（Ｅ．ｃｏｌｉでの６−ｄＥＢの産生）
本発明者等は、機能性のＰＫＳ（パンテテイニルトランスフェラーゼ）を発現する能力、ならびに開始単位および伸長単位を生じるための１つより多くの経路をプログラムされた場合に、複雑で完全なポリケチドを産生するＥ．ｃｏｌｉの能力を実証した。Ｎｏｖａｇｅｎから入手したＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ−２１（ＤＥ）を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ遺伝子（ｓｆｐ遺伝子）をファージＴ７プロモーターの制御下で染色体中に挿入することにより、ｐｒｐオペロンのｐｒｐＡ〜Ｄ部分を欠失することにより、またそれによりＴ７プロモーターの制御下でｐｒｐＥ座位（プロピオニルＣｏＡシンテターゼをコードする）を配置することにより、遺伝的に改変した。次いで、この遺伝的に改変された株を、Ｔ７プロモーターの制御下でもＤＥＢＳ１タンパク質、ＤＥＢＳ２タンパク質、およびＤＥＢＳ３タンパク質をコードする３つの遺伝子についての発現系を、ならびにプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子およびビオチンリガーゼ（プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素の活性化に必須である）をコードする遺伝子を含むように改変した。生じたＥ．ｃｏｌｉは、６−ｄＥＢについての完全なシンターゼ、このＰＫＳの活性化に必須のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、プロピオニルＣｏＡからメチルマロニルＣｏＡを提供するプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素を含み、そして外因性のプロピオナートをプロピオニルＣｏＡに変換し得る内因性のプロピオニルＣｏＡシンターゼを産生するための誘導手段を含む。さらに、プロピオナートの異化作用に対する内因性の系を解除した。
【０１３９】
従って、Ｅ．ｃｏｌｉに、誘導性プロモーターの制御下で開始単位および伸長単位の両方の合成のための酵素を提供し、開始単位および伸長単位のプロピオナート前駆体の破壊についての内因性機構が解除され；そして発現系（誘導プロモーターの下でも）に、ＰＫＳタンパク質の活性化のための酵素の発現系と共に必須のＰＫＳタンパク質を提供された。
【０１４０】
より詳細には、遺伝的に改変されたＢＬ−２１（ＤＥ３）株を、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９８９）１７１：４６１７−４６２２（本明細書中で参考として援用される）に記載の手順に従って調製した。この刊行物中に記載されるｐＭＡＫ７０５の誘導体を調製した。誘導されたベクターにおいて、ｓｆｐ遺伝子に連結したＴ７プロモーターを、ｐｒｐオペロンのＡ座位の上流の配列に同一な１，０００塩基対配列およびこのオペロンのＥ座位の下流の配列に同一な１，０００塩基対配列によって挟んだ。ｓｆｐ遺伝子は、ｐＵＣ８−ｓｆｐ（Ｎａｋａｎｏら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９２）２３２：３１３−３２１によって記載されるプラスミド）から入手した。生じた統合された配列は、ｐｒｐ座位Ａ〜Ｄを欠失し、そしてその場所にｓｆｐ遺伝子を制御するＴ７プロモーターを挿入し、そしてさらにＴ７プロモータの制御下でのｐｒｐＥ座位の置換を生じた。本明細書中で示唆されるように、２つの理由でｓｆｐ遺伝子挿入のためにこの部位を選択した。第１に、ｐｒｐオペロンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、プロピオネート異化作用の原因であると推定される（Ｈｏｒｓｗｉｌｌ，Ａ．Ｒ．，およびＥｓｃａｌａｎｔｅ−Ｓｅｍｅｒｅｎａ，Ｊ．Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９９）１８１：５６１５−５６２３）。プロピオナートは、６ｄＥＢ生合成（以下を参照のこと）についての炭素ビルディングブロックの唯一の供給源であると意図され、同時に起こる、プロピオナートの異化作用および同化作用は好ましくないと考えられた。ｓｆｐ統合の過程においてｐｒｐＲＢＣＤを欠失させることによって、ＢＡＰ１がプロピオナートを炭素およびエネルギーの供給源として利用する能力を排除した。第２に、ｓｆｐ遺伝子と一緒にして、ＢＡＰ１中のｐｒｐＥ遺伝子をＩＰＴＧ誘導性プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）の制御下でまた配置した。ｐｒｐＥは、プロピオナートをプロピオニル−ＣｏＡに変換すると考えられ（Ｈｏｒｓｗｉｌｌ，Ａ．Ｒ．，およびＥｓｃａｌａｎｔｅ−Ｓｅｍｅｒｅｎａ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５：１３８１−１３８８）；従って、外因性プロピオナートの存在下で、ＤＥＢＳが活性化形態で発現されると同時に、プロピオニル−ＣｏＡが細胞内に蓄積されると予想され得る。しかし、産生株においてｐｒｐＲＢＣＤを欠くことは所望されないかもしれないことが認められる。あるいは、いくつかの株において、いくつかのｐｒｐＲＢＣＤ遺伝子のみを不活性化することが所望され得る。このＴ７プロモーターは、ＩＰＴＧによって誘導可能である。
【０１４１】
次いで、結果的に生じた遺伝的に変更された宿主（ＢＡＰ１と表わす）を、異なる抗生物質耐性についてそれぞれ選択可能な３つのプラスミドをトランスフェクトした。これらのプラスミドは、以下の通りである：
ｐＢＰ１３０は、Ｎｏｖａｇｅｎから入手したｐＥＴ２１（ｃａｒｂＲ）由来であり、Ｔ７プロモーターの制御下のＤＥＢＳ２遺伝子およびＤＥＢＳ３遺伝子を含むように改変される。
【０１４２】
ｐＢＰ１４４は、Ｎｏｖａｇｅｎからまた入手可能なｐＥＴ２８（ｋａｎＲ）の改変された形態であり、またＴ７プロモーターの制御下のｐｃｃおよびＤＥＢＳ１遺伝子を含む。
【０１４３】
ｐＣＹ２１４（ｃｍＲ）は、ａｒａプロモーター下のＥ．ｃｏｌｉ  ｂｉｒＡ（ビオチンリガーゼ）遺伝子を含み、そしてＣｈａｐｍａｎ−Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９４）３０２：８８１−８８７に記載される。このプラスミドは、Ｄｒ．Ｈｕｇｏ  Ｇｒａｍａｊｏからただで入手した。ＰＣＣタンパク質およびｐｃｃ遺伝子は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９９）１４５：３１０９−３１１９に記載される。
【０１４４】
プラスミドｐＢＰ１３０、プラスミドｐＢＰ１４４の構築：発現ベクターｐＥＴ２１ｃおよび発現ベクターｐＥＴ２８ａを、最初に、Ｂｐｕ１１０２Ｉ部位、ＮｓｉＩ部位、ＰｓｔＩ部位、ＰａｃＩ部位、およびＤｒａＩＩＩ部位を有するポリリンカーで、これらのベクターのＢｐｕ１１０２Ｉ−ＤｒａＩＩＩフラグメントを、置換することにより再操作した。ｐＢＰ４９由来のＤＥＢＳ２遺伝子およびｐＲＳＧ５０由来のＤＥＢＳ３遺伝子を、ｐＥＴ２１ｃ誘導体中のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位間およびＮｓｉＩ−ＰａｃＩ部位間にそれぞれクローニングし、ｐＢＰ１３０（２５．５ｋｂ）を生じた。従って、ｐＢＰ１３０は、ＤＥＢＳ２遺伝子およびＤＥＢＳ３遺伝子を同じＴ７プロモーターのの制御下で発現し得る。同様に、ｐＢＰ１４４（２０ｋｂ）を、ｐＴＲ１３２由来のｐｃｃＡＢ遺伝子（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅ．，およびＧｒａｍａｊｏ，Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５：３１０９−３１１９）およびＤＥＢＳ１遺伝子を、それぞれ、ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位およびＰｓｔＩ−ＰａｃＩ部位に挿入することによって、上記ｐＥＴ２８ａ誘導体から構築した。このＤＥＢＳ１遺伝子は、ＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを用いて天然のＤＥＢＳ１遺伝子の３’末端から増幅させたフラグメントと置換することにより、ｐＲＳＧ３２から誘導される：５’オリゴヌクレオチド：ＴＴＡＣＴＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＧＴＣＣＧＧＧＧ；３’オリゴヌクレオチド：ＴＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＣＧＡ。従って、ｐＢＰ１４４は、ｐｃｃＡＢ遺伝子およびＤＥＢＳ１遺伝子を、それぞれ、それ自身のｐＴ７プロモーターの制御下で発現する。
【０１４５】
６−ｄＥＢの産生について、ｐＢＰ１３０、ｐＢＰ１４４、およびｐＣＹ２１４で形質転換したＢＡＰ１細胞を、適切な抗生物質を含むＭ９の最小培地中で増殖させた。この培養物を、対数期中間まで増殖させ、続いてＩＰＴＧおよびアラビノースで誘導し、同時に２５０ｍｇ／Ｌの１３Ｃ−１−プロピオナートを加えた。誘導培養物を２２℃で１２〜２４時間増殖させた。（最小培地および低温の両方が、ＤＥＢＳ遺伝子発現に有益であることが見出された。このプロトコルは、６−ｄＥＢの増殖関連産生を可能にした。なぜなら、グルコースが、炭素およびエネルギーの供給源を全体的な代謝のために提供し、一方、プロピオナートが６−ｄＥＢに変換されるからである。）
１２〜２４時間後、培養上清を酢酸エチルで抽出した。その有機相を真空下で乾燥し、そして１３Ｃ−ＮＭＲ分析のためにＣＤＣｌ３に再溶解した。付随のスペクトルは、６−ｄＥＢが主要な１３Ｃ−標識産物であることを示した。１２０〜１４０ｐｐｍの範囲にピークを有する他の主要な１３Ｃ−標識化合物は、１３Ｃ−３−プロピオナートを１３Ｃ−１−プロピオナートの代わりに用いた別個の実験によって確認されるように、プロピオナート取り込み由来ではない。６−ｄＥＢに対応するピークの強度から、外因性プロピオナートの少なくとも７５％が、６−ｄＥＢに変換されたことが推測される。このことは、発酵の最後における培養培養物の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルからのプロピオナートのシグナルの消失と一致した。ネガティブコントロール株（ｐＢＰ１３０またはｐＢＰ１４４のいずれかを欠いている）は、検出可能な量の６−ｄＥＢを生じなかった。
【０１４６】
前述の実験を低い細胞密度（０．５〜２．５の範囲のＯＤ６００）で行った；Ｅ．ｃｏｌｉで組み換え産物を合成する主要な利点は、この細菌が、特定の触媒活性を大幅に減少することなく、非常に高い細胞密度（１００〜２００のＯＤ６００）まで増殖し得ることである。
【０１４７】
ネイティブでない発現系における、ｍａｔＢ遺伝子およびｍａｔＣ遺伝子または他の生物由来のそれらのホモログのいずれかの使用は、任意の微生物宿主中での任意のα−カルボキシル化ＣｏＡチオエステルのインビボ産生のための遺伝的戦略として有用である。このようなＣｏＡチオエステルのインビボ産生は、天然のポリケチドの生産性を増大するか、または新規のポリケチドを産生することを意図し得る。このｍａｔＡ遺伝子はまた、基質（例えば、アセチル−ＣｏＡおよびプロピオニル−ＣｏＡ）のインビボレベルを補足するために有用である。精製されたＭａｔＢはまた、ポリケチドの調整用インビトロ産生に使用される。なぜなら、このような無細胞合成系において、ＣｏＡチオエステルは、最も高価な成分であるからである。
【０１４８】
（実施例５）
（ジケチドの取り込み）
実施例４に記載されるＢＡＰ１  Ｅ．ｃｏｌｉ宿主生物を、ＰＣＣＡおよびＢサブユニットに関する発現系を含むｐ１３２およびＤＥＢＳ３のモジュール６＋ＴＥに関するｐＲＳＧ３６を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション培養物を、両方のプラスミドに対する最小選択培地で増殖し、次いで１４Ｃ標識ジケチドを与えた。プロピオネートで誘導されそして提供される場合、１４Ｃ標識ジケチドを得た。
【０１４９】
あるいは、３つのＤＥＢＳ遺伝子およびｐｃｃ遺伝子の全てを共発現するために、ベクターｐＥＴ２１ｃおよびｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、それぞれ２つおよび３つの遺伝子を発現するように改変した（プラスミドｐＢＰ１３０およびｐＢＰ１４４の構築を、実施例４に記載した）。個々に試験した場合、タンパク質生産を、両方のプラスミドに局在される各々の遺伝子について観察した。ＢＡＰ１を、ｂｉｒＡプラスミドと共に、これらのプラスミドを用いて形質転換した。個々の形質転換株を［１−１３Ｃ］−プロピオネートを用いてＤＥＢＳ１＋ＴＥ（上記）に対する実験と同様に、培養し、誘導し、そして分析した。粗有機抽出物のＮＭＲ分析は、これらの組換え細胞の主要なプロピオネート誘導代謝産物として６ｄＥＢを示した。この産物を、後にＨＰＬＣによって精製し、そして質量分析に供し、予測した質量の主要なピークを得た。プラスミドｐＢＰ１３０、ｐＢＰ１４４およびｐＣＹ２１６を、前記のようにＢＡＰ１へと形質転換した。培養条件は、上記実施例２に記載された２５０ｍｇ／Ｌでの１３Ｃ−１−プロピオネート供給に対して記載された条件と同一であった。培養物を、規則正しく３日間にわたってサンプリングした。サンプルを遠心分離し、この上清（２μＬまたは２０μＬのいずれか）を、初期４．６×１０ｍｍカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ，Ｃ１８  ＯＤＳ３，５μｍ）を用いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １０９０  ＨＰＬＣにロードし、水（１ｍｌ／分で２分間）で洗浄し、次いで主要４．６×５０ｍｍカラム（同一定常相および同一流速で）上にロードした。次いで、６分の勾配を適用した（１００％の水で開始し、そして１００％アセトニトリルで終了し、さらに１分間維持）。サンプルをＡｌｌｔｅｃｈ蒸発光散乱検出システム（ＥＬＳＤ５００）を用いて分析し、そして６．４分の保持時間におけるピークを、質量分析によってヘプタ−１３Ｃ標識６ｄＥＢとして確認した（ＭＷｏｂｓ＝３９３）。産物の濃度を、同一検出スキームを用いて標準６−ｄＥＢサンプルとの比較において測定した。インキュベーション期間の最後に、全体の培養上清を、以前に述べたように酢酸エチルを用いて抽出し、乾燥し、そして１３Ｃ−ＮＭＲによって分析した。さらに、最終細胞ペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析し、３つのＤＥＢＳタンパク質およびＰＣＣの存在を確認した。誘導して１２時間後および４８時間後における観察されたタンパク質の発現レベルの間に違いはなかった。ＢＡＰ１／ｐＢＰ１３０／ｐＢＰ１４４／ｐＣＹ２１６中のそれぞれのプラスミドの安定性をまた、誘導して１２時間後および３６時間後に試験した。ｐＢＰ１４４の損失を、いずれの時間点においても観察しなかったが、ｐＢＰ１３０およびｐＣＹ２１６は、それぞれ１２時間および３６時間においてコロニーの５０％および３５％を維持した。いずれのプラスミドの再配置も、複数再形質転換コロニーの制限分析基づいて、いずれの時間点においても検出しなかった。１３Ｃ−ＮＭＲ実験に対するネガティブなコントロールは、ＢＡＰ１／ｐＢＰ１３０／ｐＣＹ２１６、ＢＡＰ１／ｐＢＰ１４４／ｐＣＹ２１６およびＢＡＰ１／ｐＢＰ１３０／ｐＢＰ１６０／ｐＣＹ２１６を含んだ。（プ��スミドｐＢＰ１６０は、モジュール１においてＫＳドメインの活性部位におけるＣ−＞Ａヌル変異を有する）（Ｋａｏ，  Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）３５：１２３６３）。この新規のポリケチド細胞系の生産性を定量するために、培養サンプルを周期的に取り、６−ｄＥＢの濃度を測定した（図９）。このデータから、この細胞触媒の特定の生産性は、０．１ｍｍｏｌ  ６ｄＥＢ／ｇ細胞タンパク質／日であることが計算され得る。これは、野生型Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａよりかなり優れており、そしてランダムな変異誘発に基づく方向付けられた株改良の長年のプログラムの結果として、エリスロマイシンを過剰生産する産業上関連性株に十分に匹敵する（０．２ｍｍｏｌエリスロマイシン／ｇ細胞タンパク質／日）（Ｍｉｎａｓ，Ｗ．，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．（１９９８）１４：５６１）。
【０１５０】
（実施例６）
（Ａ−Ｔローディングジドメインの構成、発現および精製）
Ａ−Ｔローディングジドメインは、ＲｉｆＡのＮ−末端に天然に存在する。このジドメインを生化学的に研究するために、ＲｉｆＡタンパク質の前後から除去した。従って、単離されたＡ−Ｔジドメインをコードする配列を、以下により詳述されるように、ＲｉｆＡの転写性開始部位を操作したＮｄｅＩ制限部位、およびコンセンサスなＴドメインのＣ末端とモジュール１のコンセンサスなケトシンターゼドメインのＮ末端との間のリンカー領域に導入されたＮｏｔＩ制限部位を用いて、発現ベクター中にサブクローニングした。チオール化ドメインは、活性である保存されたセリンに対するＣｏＡの４’−ホスホパンテテイン部分の共有結合を必要とする（Ｗａｌｓｈ，Ｃ．Ｔ．，ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）１：３０９−３１５）。従って、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＳｆｐホスホパンテテニルトランスフェラーゼ（これは、多くの異種組換えタンパク質のａｐｏ形態をｈｏｌｏ形態に転換し得る）を、ｈｏｌｏ酵素調製物中でＡ−Ｔジドメインと共に共発現した（Ｌａｍｂａｌｏｔ，Ｒ．Ｈ．，ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）３：９２３−９３６；Ｑｕａｄｒｉ，Ｌ．Ｅ．Ｎ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：１５８５−１５９５）。Ａ−Ｔジドメインのａｐｏ形態およびｈｏｌｏ形態を、Ｃ−末端ヘキサヒスチジンタグ化融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中で生産し、そしてより完全に以下に記載されるようにニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって＞９８％均一になるまで精製した。精製した組換えａｐｏ  Ａ−Ｔジドメインおよびｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメイン（プラスミドｐＳＡ８にとってコードされる）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で過剰生産し、そしてタンパク質サンプルを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（４−１５％、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって分離し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色した。ａｐｏ  Ａ−Ｔジドメインおよびｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメインのそれぞれは、７５ｋＤの分子量マーカーよりも小さい分子量を有した。ｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメインは、ａｐｏ  Ａ−Ｔジドメインの分子量よりわずかに高い分子量を有した。
【０１５１】
（材料）
［７−１４Ｃ］−安息香酸（５７ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）および［７−１４Ｃ］−３−ヒドロキシ安息香酸（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た。全ての他の置換された安息香酸、フェニル酢酸、および３−ヒドロキシフェニル酢酸を、非ラベル形態でＡｌｄｒｉｃｈから得た。ＡＴＰ、ＣｏＡおよびベンゾイル−ＣｏＡを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手した。ＡＨＢを以前に公開されたプロトコルに従って合成した（Ｇｈｉｓａｌｂａ，Ｏ．，ら、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８１）３４：６４−７１）。制限酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ由来である。
【０１５２】
（ＤＮＡおよび株の操作）
ＤＮＡ操作を、標準培養条件を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ。ポリメラーゼ連鎖反応を、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、製造者によって推奨されるように行った。
【０１５３】
（Ａ−Ｔジドメインに対する発現ベクターの濃度）
ＮｄｅＩ制限部位を、プライマー（
【０１５４】
【化１】
2005506044.tif 000002
）を用いてｒｉｆＡ遺伝子の開始コドンにて操作した（変異された塩基を太字で示し、そして導入されたＮｄｅ  Ｉ制限部位に下線を引く）；増幅した２．５ｋｂのフラグメントを、直線化されたｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、ｐＨｕ２９を生産した。次いで、開始コドンに操作されたＮｄｅＩ制限部位を有するｒｉｆＡ遺伝子を、ｐＨｕ２９、ｐＨｕ３５、ｐＨｕ５０、およびｐＨｕ５１を介してｐＨｕ９０−１（ｐＲＭ５０の誘導体）（ＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｒ．，ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，１５４６−１５５０）中で再構築した。ＰａｃＩおよびＰｓｔＩに対するフランキング制限部位を使用して、ｐＨｕ９０−１からｐｕＣ１８誘導体中へ、ローディングジドメインおよびモジュール１の一部をコードする配列を転移し、ｐＳＡ２を生産した。ローディングジドメインおよびモジュール１を、約２０アミノ酸リンカー領域によって分割し、ローディングジドメインのコンセンサスなＴドメインのＣ−末端およびモジュール１（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号ＡＦ０４０５７０）のコンセンサスなケトシンターゼドメインのＮ−末端によって描写した。モジュール１からローディングジドメインを単離するために、ＮｏｔＩ制限部位をプライマー（
【０１５５】
【化２】
2005506044.tif 000003
）を用いてリンカー配列に導入した（変異された塩基を太字で示し、そして導入されたＮｏｔ  Ｉ制限部位に下線を引く）；得られた０．９４ｋｂのフラグメントは、リンカー領域中のローディングジドメイン内でコードする。この増幅されたフラグメントを、直線化されたｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、ｐＳＡ４を生産し、次いで、これはＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを用いて消化され、そして同じ酵素で消化されたｐＳＡ２に連結し、ｐＳＡ６を生産した。ｐＳＡ６から誘導された１．９ｋｂ  ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩ消化されたｐＥＣ２１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結し、ｐＳＡ８（Ｃ末端に付加されたヘキサヒスチジンを有するローディングジドメインに対する発現ベクター）を生産した。
【０１５６】
（Ａ−Ｔジドメインの発現および精製）
プラスミドｐＳＡ８を、ａｐｏＡ−Ｔジドメインの発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）への形質転換を介して導入した。ＢＬ２１／ｐＳＡ８の１リットルの培養物を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを追加したＬＢ培地を含む２Ｌフラスコ中で３７℃にて増殖した。Ａ−Ｔジドメインの発現を、６００ｎｍの光学密度０．７にて１００μＭＩＰＴＧを用いて誘導した。誘導後、インキュベーションを３０℃にて６時間続けた。次いで、細胞を、２５００×ｇの遠心分離によって回収し、そして崩壊緩衝液［２００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭベンズアミジン（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）、ペプスタチン（２ｍｇ／Ｌ）、ロイペプチン（２ｍｇ／Ｌ）および３０％ｖ／ｖグリセロール］に再懸濁した。
【０１５７】
全ての精製手順を、４℃にて行った。再懸濁細胞を、１３，０００ｐｓｉにてフレンチプレスに、２回の通して破壊し、この溶解物を４０，０００×ｇで遠心分離によって回収した。核酸を、ポリエチレンイミン（０．１５％）を用いて沈殿し、そして遠心分離を介して除去した。この上清を、硫酸アンモニウムで４５％（ｗ／ｖ）飽和にし、そして一晩沈殿した。遠心分離後、タンパク質を含むペレットを５０ｍＭトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ８）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾールおよび１０％ｖ／ｖグリセロール中に再溶解した。この溶液を、先に平衡化したニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）カラム（２ｍＬ、Ｑｉａｇｅｎ）にロードした。このカラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、３００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０％ｖ／ｖグリセロール中の２０ｍＭイミダゾールで洗浄し、そしてＡ−Ｔジドメインを同じ溶液中の１００ｍＭイミダゾールで溶出した。Ａ−Ｔジドメインを含むプールした画分を、ゲル濾過（ＰＤ−１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって１００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２０％ｖ／ｖグリセロールへと緩衝液交換し、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−５０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。この精製されたタンパク質を、液体窒素中で瞬間凍結し、そして−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度を、２８０ｎｍ：４９５００Ｍ−１ｃｍ−１にて計算された吸光係数を用いて測定した（Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｃ．，ら（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２，３１９−３２６）。代表的に１Ｌ培養物は、約３０ｍｇの精製されたタンパク質を生産した。
【０１５８】
ｈｏｌｏＡ−Ｔジドメインの発現について、プラスミドｐＳＡ８を、プラスミドｐＲＳＧ５６を含むＢＬ２１に形質転換し（Ｇｏｋｈａｌｅ，Ｒ．Ｓ．，ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，４８２−４８５）、このプラスミドｐＲＳＧ５６は、カナマイシン耐性遺伝子およびｓｆｐ遺伝子を保有した。ｓｆｐ遺伝子は、Ｓｆｐ（これは、ｈｏｌｏタンパク質へとａｐｏタンパク質を変換するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の非特異的ホスホパンテテニルトランスフェラーゼである）を発現する（Ｌａｍｂａｌｏｔ，Ｒ．Ｈ．，ら（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３，９２３−９３６；Ｑｕａｄｒｉ，Ｌ．Ｅ．Ｎ．，ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１５８５−１５９５）。この組換えＥ．ｃｏｌｉ株の１リットルの培養物を、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび５０μｇ／ｍＬカナマイシンを追加したＬＢ培地を含む２Ｌフラスコ中で３７℃で増殖した。ｈｏｌｏＡ−Ｔジドメインについての発現工程および精製工程を、ａｐｏＡ−Ｔジドメインに関して上記のように行った。
【０１５９】
（実施例７）
（Ａ−Ｔジドメインの機構を決定するためのＡ−Ｔジドメインの放射活性標識）
Ａ−Ｔジドメイン中へのＢまたは３−ＨＢの取り込みを定性的に評価するために、反応系は、５μＭのａｐｏＡ−ＴジドメインまたはｈｏｌｏＡ−Ｔジドメイン、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロールおよび１００μＭ［７−１４Ｃ］−Ｂまたは［７−１４Ｃ］ＨＢを含んだ。ＡＴＰを含めた反応系において、５ｍＭが存在した。３０℃３０分間のインキュベーション後、反応系を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液でクエンチし、そして４％〜１５％勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で電気泳動した。このゲルを、クマシーブルーを用いて単時間染色し、脱色し（ｄｅｓｔｉｎ）、乾燥し、そしてオートラジオグラフにかけた。
【０１６０】
図２中で描写されるように、Ａ−Ｔジドメインの機構に対する両方のモデルは、Ａドメインによってアリール−アデニレートとしてＡＨＢの活性化、次いで、Ｔドメインのホスホパンテテインコファクターのチオール求核基によって、アリール−ＣｏＡ（図２Ａ）またはアリール−アデニレート（図２Ｂ）のいずれかの攻撃からの共有結合アリールチオエステル酵素中間体の最終的な形成に関する。これらの可能な機構を研究するために、本発明者らはＡ−Ｔジドメインの共有結合性ロードを研究した。ＡＨＢは放射標識形態において利用可能でなかったが、インビボでの供給実験は、ＲｉｆＡがまた３−ＨＢによって刺激され得ることを示している（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，Ｄ．，ら、Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１０９２−１０９３）。［１４Ｃ］−３−ＨＢまたは推定基質［１４Ｃ］−ベンゾエート（Ｂ）、およびａｐｏＡ−ＴジドメインまたはｈｏｌｏＡ−Ｔジドメインを含む反応系を、Ｍｇ・ＡＴＰの存在下または非存在下でインキュベートし、引き続いて以下に詳細に記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィー（図４）によって分析した。ホスホパンテテインコファクターを欠損していると、ａｐｏＡ−Ｔジドメインは、共有結合的にロードされ得ない（レーン１）。しかしｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメインは、Ｍｇ・ＡＴＰを必要とする反応系（レーン２〜５）において、Ｂおよび３−ＨＢの両方と共に共有結合的にロードされる。
【０１６１】
ＣｏＡは、上記の標識反応系において含まれず、これはｈｏｌｏＡ−Ｔジドメインの共有結合性ロードを必要としないことを示唆する。ローディングジドメインは、ＣｏＡリガーゼ（図２Ａ）であると提唱されている（Ｓｃｈｕｐｐ，Ｔ．，ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９８）１５９：２０１−２０７；Ａｕｇｕｓｔ，Ｐ．Ｒ．，ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）５：６９−７９；Ｇｈｉｓａｌｂａ，Ｏ．，ら、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（１９８１）３４：６４−７１）ので、本発明者らは、やはりＣｏＡの可能な関与を直試験した。
【０１６２】
ＨＰＬＣを使用して、以下の手順に従って可能なベンゾイル−ＣｏＡ形成を検出した。反応系は、１０μＭ  ａｐｏＡ−Ｔジドメイン、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＡＴＰ、１０％グリセロール１ｍＭ  ＣｏＡおよび１ｍＭ  Ｂを含んだ。ベンゾイルＣｏＡが含まれる反応系において、１００μＭが存在する。３０℃で示された時間のインキュベート後、２０μＬのサンプルを、Ｃ１８逆相カラム（ＶＹＤＡＣ、２５０×５ｍｍ）、２５４ｎｍでモニタリングする検出器を備えたＨＰＬＣに注入した。緩衝液Ａ（２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ５．４）と緩衝液Ｂ（１００％アセトニトリル）との間で０％から５０％Ｂまで直線勾配を、１４分にわたって行った（１ｍＬ／分の流速）。この基質および推定の生産物ピークを、標準物質を用いた共注入によって同定した。
【０１６３】
図２Ａにおいて示される機構が作用する場合、ａｐｏＡ−Ｔジドメインはベンゾイル−ＣｏＡを生産し得るはずである。しかし、ａｐｏＡ−ＴジドメインをＡＴＰ、ＢおよびＣｏＡと共にインキュベートした場合、ベンゾイル−ＣｏＡ形成を、検出することができなかった（図４、−ベンゾイル−ＣｏＡ追跡）。ベンゾイル−ＣｏＡが、形成される場合は、これらの反応条件において維持されることを確認するために、ベンゾイル−ＣｏＡを他の同一反応に添加した（図４、＋ベンゾイル−ＣｏＡ追跡）。ベンゾイル−ＣｏＡは、約０．００２／分の観察された速度定数で分解され、そして同じ観察された速度定数がａｐｏＡ−Ｔジドメインを除外する反応系に関して得られる（データは示さない）ので、この分解は酵素依存性である；この遅い非酵素的分解を、以下のｋｃａｔ分析に考慮した。
【０１６４】
５μＭベンゾイル−ＣｏＡの蓄積は、このＨＰＬＣ分析を用いて容易に検出可能である。この保存的検出限界は、以下のように、ａｐｏＡ−Ｔジドメインによって、ベンゾイル−ＣｏＡの形成についてのｋｃａｔの上限がに計算されることを可能にする。５μＭのベンゾイル−ＣｏＡの蓄積は、最大１０μＭベンゾイル−ＣｏＡが３００分の反応の間に形成されることを示す（ベンゾイルＣｏＡの半減期はこれらの条件下で約３００分である（ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｂｓ；ｋｏｂｓ約０．００２／分）。従って、ベンゾイルＣｏＡ形成の速度は、最も速くて０．０３μＭ／分（１０μＭ／３００分）である。これは、これらの反応におけるａｐｏＡ−Ｔジドメインの濃度は、である（ｋｃａｔ＝ｖ／［Ｅ］ｔ）ので、１０μＭでｋｃａｔ＜０．００３／分に一致する。以下に記載するように、ｈｏｌｏＡ−ＴジドメインのＢでの共有結合ローディングについてのｋｃａｔは、０．１４／分である。従ってベンゾイル−ＣｏＡは、その形成に対する速度定数が、Ｅ−Ｂの形成についての速度定数よりも少なくとも５０倍小さいので、アリール化反応おいて適切な中間物質ではない。これらの結果は、図２Ａに描写されるＣｏＡリガーゼモデルが、リファマイシンシンテターゼのＡ−Ｔジドメインに対して利用可能でないことを示す。
【０１６５】
（実施例８）
（ｈｏｌｏＡ−Ｔジドメインの速度論パラメーターの直接測定）
代表的な反応系は、１〜１０μＭ  ｈｏｌｏＡ−Ｔジドメイン、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＡＴＰ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、０．５〜５μＣｉ／ｍＬ［７−１４Ｃ］−Ｂまたは［７−１４Ｃ］ＨＢおよび可変濃度の非標識Ｂまたは非標識３−ＨＢを含んだ。非標識Ｂおよび非標識３−ＨＢのストックを、添加の前に反応ｐＨに調整した。反応物を、３０℃でインキュベートし、そして所望の時点で２０μＬアリコートを１ｍＬの氷冷５％トリクロロ酢酸でクエンチし、そして２００μｇのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）をこの混合物に添加し、タンパク質の沈殿を援助した。この沈殿を、遠心分離によってペレット化し、０．５ｍＬの５％トリクロロ酢酸で洗浄し、そして０．５ｍＬの１００ｍＭリン酸（ｐＨ  ８）、２％ＳＤＳ溶液中に溶解した。この溶液を４．５ｍＬの液体シンチレーション流体（Ｆｏｒｍｕｌａ  ９８９、Ｐａｃｋａｒｄ）と合わせ、そしてＥ−ＢまたはＥ−３−ＨＢに対応する取り込まれた１４Ｃを、液体シンチレーション計数によって定量した。反応速度は、直線的に酵素濃度に依存した。データ分析を、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行い、そして代表的にＲ≧０．９９を与えたデータに指数関数的に一致した。
【０１６６】
Ｂまたは３−ＨＢは、図３に定性的に示されるように、ｈｏｌｏＡ−Ｔジドメインについての基質である。アリール−アデニレート形成のための基質としてこれらのベンゾエート、次いで、Ｔドメインのホスホパンテテインコファクターのチオールのアリール化を定量的に評価するために、本発明者らは、上記のタンパク質沈殿アッセイを使用した。上記で議論されるように、ｈｏｌｏＡ−Ｔジドメイン、０．５〜５μＣｉ／ｍＬ［７−１４Ｃ］−Ｂまたは［７−１４Ｃ］−３−ＨＢ、および可変濃度の非標識Ｂまたは非標識３−ＨＢを含む反応物からのアリコートを、トリクロロ酢酸でクエンチし、そしてそれぞれの洗浄したタンパク質ペレット中の放射標識タンパク質の量を、液体シンチレーション計数によって測定した。Ｂ濃度または３−ＨＢ濃度の関数としてのＥ−Ｂ形成またはＥ−３−ＨＢ形成の初期速度を、この方法を用いて得、そしてこれを使用して図５に示される飽和曲線を作成した。飽和モデルに対するデータの最良の適合は、３−ＨＢについて１．９／分のｋｃａｔおよび１８０μＭのＫＭ、ならびにＢについては０．１４／分のｋｃａｔおよび１７０μＭのＫＭを得た。２つの基質についてのｋｃａｔ／ＫＭ値の比は、Ａ−ＴジドメインによってＢより、３−ＨＢに関して１２倍優先されることを示した。これらの反応系へのＣｏＡの添加は、効果的でなく（データは示さない）、Ａ−ＴジドメインはＣｏＡリガーゼでないという結論に一貫する。
【０１６７】
（実施例９）
（Ａ−Ｔジドメインの基質特異性についてスクリーニングするための追跡実験）
反応を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＡＴＰ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０％グリセロール中で行った。それぞれの反応系は、２０μＭ  ｈｏｌｏＡ−Ｔジドメインおよび０．５ｍＭの推定基質、０．５ｍＭの非標識Ｂを含むか、または基質を添加しなかった。３０分間３０℃のインキュベーション後、１００μＬの反応アリコートを、反応緩衝液で前平衡化されているＧ−２５マイクロスピン（ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ）ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に個々に適用した。適用されたサンプルのタンパク質成分を、製造者の指示に従って遠心分離によって定容量でマイクロスピンカラムから溶出した。それぞれの溶出したタンパク質サンプルの１０μＬのアリコートを、２００μＭの最終Ｂ濃度のために２μＬの［７−１４Ｃ］−Ｂ溶液で希釈した。これらの追跡反応物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィーにより分析の前に１５分間、３０℃でインキュベートした。
【０１６８】
以前のインビボでの供給実験（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，Ｄ．，ら、Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１０９２−１０９３）および先ほど記載されたインビボでの結果に基づき、ＡＨＢ、３−ＨＢ、Ｂ、および３，５−ジヒドロキシベンゾエートを、Ａ−Ｔジドメインによって基質として受容する。
【０１６９】
Ａ−Ｔジドメインを刺激し得るさらなる基質についてスクリーニングするために、単純な追跡実験を、上記のように考案した。ｈｏｌｏＡ−Ｔジドメインを、まず、標準反応条件下で、推定基質と共にインキュベートした。次いで、この反応混合物を、マイクロスピンゲル濾過カラムに通し、推定未反応基質からタンパク質成分を分離した。放射標識Ｂを、タンパク質画分に最後に添加し、そしてこの混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィーの前に単時間インキュベートした。基質と共に本来インキュベートされたタンパク質サンプルは、共有結合的にロードされた酵素−置換ベンゾエート（Ｅ−ＸＢ）を含み、共有結合的にロードされた酵素−置換ベンゾエート（Ｅ−ＸＢ）は、追跡の間、放射標識Ｂと反応せず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィーによる検出可能な酵素−ベンゾエート（Ｅ−Ｂ）をわずかに生じるか、または全く生じなかった。対照的に、乏しい基質または非基質と共に本来インキュイベートタンパク質サンプルは、主にを遊離酵素（Ｅ）含み、この遊離酵素（Ｅ）は、Ｅ−Ｂ形成のための追跡の間、放射標識ベンゾエート（Ｂ）と容易に反応し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフィーによって検出可能な放射活性バンドを生じた。
【０１７０】
一連の置換ベンゾエートについてのこのスクリーニング実験の結果を、以下に議論した。Ａ−Ｔジドメインサンプルを含むゲル（４〜１５％、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のオートラジオグラフによって、基質なしでインキュベーションした後か；または以下と共にインキュベーションした後で、放射線標識Ｂで追跡した：非標識Ｂ；２−アミノベンゾエート；３−アミノベンゾエート；４−アミノベンゾエート；ＡＨＢ；３−アミノ−４−ヒドロキシベンゾエート；４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾエート；３−ブロモベンゾエート；３−クロロベンゾエート；３，５−ジアミノベンゾエート；３，５−ジブロモベンゾエート；３，５−ジクロロベンゾエート；３，５−ジフルオロベンゾエート；２，３−ジヒドロキシベンゾエート；３，５−ジヒドロキシベンゾエート；３，５−ジニトロベンゾエート；３−フルオロベンゾエート；２−ヒドロキシベンゾエート；３−ＨＢ；４−ヒドロキシベンゾエート；３−メトキシベンゾエート；３−ニトロベンゾエート；３−スルホベンゾエート。
【０１７１】
最初の２つのレーンは、コントロール反応物を含み、ここで、基質がないもの（レーン１）または非標識Ｂ（レーン２）が、最初のインキュベーションにおいて存在し、期待したように、放射線標識されたＡ−Ｔジドメインが、基質のないコントロール反応物中で形成されたが、非標識Ｂコントロール反応物の中において形成されなかった。既知の基質である、ＡＨＢ（レーン６）、３，５−ジヒドロキシベンゾエート（レーン１６）、および３−ＨＢ（レーン２０）は、初期段階のインキュベーションで存在していた反応物においても、放射線標識Ａ−Ｔジドメインは、存在しなかった。これらの３つの基質に加えて、レーン１のコントロール反応物と比較したときの、放射線標識Ａ−Ｔジドメインの非存在または減少に基づいたさらなる研究のために、１０を超える類似の基質を同定した。これらの１０の基質は、以下である：２−アミノベンゾエート；３−アミノベンゾエート；３−ブロモベンゾエート；３−クロロベンゾエート；３，５−ジアミノベンゾエート；３，５−ジブロモベンゾエート；３，５−ジクロロベンゾエート；３，５−ジフルオロベンゾエート；３−フルオロベンゾエート；および３−メトキシベンゾエート。所定の反応における、放射線標識Ａ−Ｔジドメインの非存在についての最も簡単なモデルは、問題としている置換ベンゾエートがＡ−Ｔジドメインにロードされ、そして、追跡の間、この酵素を放射線標識Ｂとの反応から遮断するというものであるが、この実験は、これが、代りに、緊密な結合をする競合インヒビターであるという可能性を除外しない。しかし、これらの置換ベンゾエートと基質Ｂとの間の競合が時間に依存しないという以下に記述した観察によって、起こりそうもない阻害モデルを与える。放射線標識Ａ−Ｔジドメインは、以下の基質を有する反応において形成された：４−アミノベンゾエート；３−アミノ−４−ヒドロキシベンゾエート；４−アミノ−２−ヒドロキシベンゾエート；２，３−ジヒドロキシベンゾエート；３，５−ジニトロベンゾエート；２−ヒドロキシベンゾエート；４−ヒドロキシベンゾエート；３−ニトロベンゾエート；および３−スルホベンゾエート。
【０１７２】
（実施例１０）
（Ａ−Ｔジドメインのアリール化についての相対速度定数を使用する、相対的特異性決定）
追跡実験（実施例９）におけて記載したスクリーニングにおいて見出された類似の基質のセットを準備して、アリールアデニレート形成、その後の、Ｔドメインにおけるホスホパンテテイン補因子（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ）のチオールのアリール化についてのＡ−Ｔジドメインの相対的特異性を決定した。放射線標識ベンゾエート（Ｂ）およびｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメインを含む反応混合物に置換ベンゾエートを添加することによって、置換ベンゾエート（ＸＢ）との反応と、それに続くＢとの反応との間を分割することを可能にした。反応を、上述（実施例８  速度論的測定）のように実施したが、５０μＭ〜５ｍＭの一連の置換ベンゾエートの存在下で実施した。置換ベンゾエートストックを、添加前に、この反応ｐＨに対して調整した。Ｂの反応に関して、所定の置換ベンゾエートの反応について、ベンゾエートとの類似の反応と比較した速度定数ｋｒｅｌを、以下のスキーム１における式に従って、もとの反応物におけるＢおよび置換ベンゾエートの濃度（［Ｂ］，［ＸＢ］）、ならびにＥ−ＢおよびＥ−ＸＢとして存在する生成物量から決定した（Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．Ｒ．（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６−１１７頁，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１７３】
【化３】
2005506044.tif 000004
所定の時点での各反応におけるＥ−ＸＢ生成物の量を、競合物を欠く同一の反応物の同時刻において得られた放射線標識Ｅ−Ｂの量から、競合する置換ベンゾエートの存在下の放射線標識Ｅ−Ｂの量を差し引くことによって決定した。Ｅ−ＸＢに対するＥ−Ｂの比は、特定の時間経過を通して一定であって、これは、この反応生成物に関わる２次的な反応が生じなかったことを示している。この一定の比はまた、置換ベンゾエートが真の基質であって、かつ高親和性の競合的インヒビターではないという見解を支持しており、これは、Ｅ−Ｂが競合インヒビターの存在下で蓄積し続け、時間の関数として増加し得る見かけのＥ−ＸＢに対するＥ−Ｂの比を生じるためである。置換ベンゾエートの各々について、同じｋｒｅｌ値を、誤差範囲で、異なった置換ベンゾエート濃度において実施された反応について得た。この反応を、Ｂの代わりに放射線標識３−ＨＢを使用して、選択された置換ベンゾエートについて反復し、そして、（Ｂに関しての）ｋｒｅｌ値を、誤差範囲で、得た。表１中の各ｋｒｅｌ値は、少なくとも４つの別個の測定の平均を表す。Ａ−Ｔジドメインとの反応に対する、酢酸フェニルおよび酢酸３−ヒドロキシフェニルによる、Ｂとの競合を検出し得ず、そして、これらの化合物についての、ｋｒｅｌについての極限値を表１において報告した。
【０１７４】
表１におけるｋｒｅｌ値は、所定の置換ベンゾエートおよびＢについてのｋｃａｔ／Ｋｍ比を表しており、そして、このような値は、各基質に対するＡ−Ｔジドメインの特異性の指標を提供する（Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．Ｒ．（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６〜１１７頁、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。このアプローチの妥当性を、３−ＨＢについて得られる１２のｋｒｅｌ値と、３−ＨＢおよびＢについての１２のｋｃａｔ／ＫＭの直接測定から得られた同じ１２のｋｃａｔ／ＫＭ比を比較することによって実証した（図４）。Ａ−Ｔジドメインは、全てのほかの基質よりも、ＡＨＢ、その生物学的基質に対する１０〜１０００倍の選択性を提示する。
【０１７５】
（実施例１１）
（プラスミドｐＢＰ１６５の構築）
リファマイシンシンターゼ由来のＡ−Ｔロード（ｌｏａｄｉｎｇ）ジドメインとＤＥＢＳの第１のモジュールとの間の機能的融合を操作するために、ＤＥＢＳモジュール１の中にＫＳドメインの直ぐ上流にあるＤＮＡ配列を、以下のように読み出されるように改変した：
【０１７６】
【化４】
2005506044.tif 000005
操作されたＢｓａＢＩ部位（太字）を、このリファマイシンシンターゼのＡ−Ｔロードドメインと第１のＰＫＳモジュールとの間の対応する天然に存在するＢｓａＢＩ部位に融合した（図６）。得られた融合物を、ＤＥＢＳ１の代りにｐＢＰ１４４に移入し、ｐＢＰ１６５を生成した。
【０１７７】
（表１）
（置換ベンゾエートａによるＴ−Ａジドメインの共有結合的ローディング（Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｌｏａｄｉｎｇ）についての相対速度定数）
【０１７８】
【表１】
2005506044.tif 000006
ａ  ３０℃，５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＡＴＰ、１０％  グリセロール。
【０１７９】
ｂ  ベンゾエートによるＴドメインアリール化と比較した、Ｔドメインアリール化についての速度定数（スキーム１）。
【０１８０】
（実施例１２）
（分析方法）
吸光度測定を、ＰＢＳを用いた希釈液を必要とするＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６５０分光光度計を使用して、６００ｎｍで実施した。グルコース濃度を、酵素ヘキソキナーゼ検出キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して測定した。アセテートおよびプロピオネートの濃度を、５ｍＭのＨ２ＳＯ４を用いるｉｓｏｃｒａｔｉｃ  ＨＰＬＣ法（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシリーズ）を使用して分析した。使用するカラムは、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＨＰＬＣ有機酸分析カラム（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ）（屈折率を利用して５５℃で維持される）、このカラムを使用して、浄化した発酵培養液サンプルからアセテートおよびプロピオネートを検出した（２０μＬ注入）。分離ＨＰＬＣアッセイを使用して、以前に記載したように（Ｌｏｍｂｏ，Ｆら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２００１）１７（４）：６１２〜６１７）６ｄＥＢを検出した。タンパク質レベルを、細胞破砕（２ｍｌのサンプルを使用した超音波処理）、浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）染色を介した検出の後、モニターした。
【０１８１】
（予備の最適化）
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰｌを、宿主細胞（Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−  ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）  ΔｐｒｐＲＢＣＤ（ｓｆｐ））として使用した。６ｄＥＢを、ＢＡＰｌ／ｐＢＰ１３０（ＣａｒｂＲ）／ｐＢＰ１４４（ＫａｎＲ）により生成した。Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｂ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９１：１７９０−１７９２（本明細書中に参考として援用される）。この菌株は、６ｄＥＢの合成のために必要なＰＫＳおよび補助遺伝子を有する。２つをゲノム中に組込み、５つをプラスミド上に組み込んだ。
【０１８２】
細胞ストックを、カルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を補充したＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）中で、３７℃かつ２５０ｒｐｍで、ＢＡＰ１／ｐＢＰ１３０／ｐＢＰ１４４の培養物を増殖させることで調製した。培養液が、０．５と１の間のＯＤ６００に達した後、これらの細胞を遠心分離し、そして、８％のグリセロールを含むＦ１培地を使用して、初発培養液容積の半分に再懸濁した。Ｆ１培地は以下を含む：ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４、６．６２ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４，１０５．５ｍｇ／Ｌ；Ｇｌｕｃｏｓｅ、５ｇ／Ｌ；微量金属（Ｔｒａｃｅ  Ｍｅｔａｌ）溶液、１．２５ｍｌ／Ｌ；およびビタミン溶液、１．２５ｍｌ／Ｌ。（この微量金属溶液は、以下を含む：ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２７ｇ／Ｌ；ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．９ｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３、０．５ｇ／Ｌ；濃ＨＣｌ、１００ｍｌ／Ｌ；以下を含むビタミン溶液：リボフラビン、０．４２ｇ／Ｌ；パントテン酸、５．４ｇ／Ｌ；ナイアシン、６ｇ／Ｌ；ピリドキシン、１．４ｇ／Ｌ；ビオチン、０．０６ｇ／Ｌ；葉酸、０．０４ｇ／Ｌ）。再懸濁した細胞をアリコートし、そして、−８０℃で凍結した。
【０１８３】
スモールスケールの実験のために、２５０ｍＬのフラスコ中の２５ｍＬのＦ１培地に、０．５ｍＬの凍結前のグリセロール細胞ストックを接種し、そして、適切なＯＤ６００（以下で明記するように、０．２〜１の間）まで、３７℃および２５０ｒｐｍで増殖させた（各々、カルベニシリン濃度１００ｍｇ／Ｌおよびカナマイシン濃度５０ｍｇ／Ｌを含む）。この時点で、培養液を２２℃まで冷却し、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド、ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ、以下で明記するように、１０μＭと１０ｍＭの間）で誘導し、そして、プロピオン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、以下に明記するように、１０ｍｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの間の最終濃度まで）を補充した。次いで、この培養液を、生成物のさらなる増加が観察されなくなるまで、２００ｒｐｍかつ、２２℃または２５℃でインキュベートした。
【０１８４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１／ｐＢＰ１３０／ｐＢＰ１４４の培養液中の６ｄＥＢの生産性および力価に対する、様々な増殖パラメーターおよび様々なプロセスパラメーターの効果を、これらの条件下で研究した。最初に、Ｅ．ｃｏｌｉの流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養に適合する３つの培地を試験した（データは示さず）。これらの中で、発酵培地Ｆ１は、最高の収率（１９時間にわたり約１ｍｇ／Ｌ）を与えた。ＩＰＴＧおよびプロピオネートの濃度、誘導後の温度ならびに誘導時間の効果を、この培地を使用して研究した。これらの実験に基づいて見出された最適な条件を、表２に示す。
【０１８５】
【表２】
2005506044.tif 000007
最高の条件として、６ｄＥＢ力価は、１９時間にわたり一貫して１ｍｇ／Ｌ〜３ｍｇ／Ｌであると見出された。
【０１８６】
（栄養ストリーム、誘導時間およびプロピオネート供給の効果）
流加曝気（ａｅｒａｔｅｄ）発酵を、Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ３Ｌ  Ｂｉｏｂｕｎｄｌｅシステム（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して実施した。スターターカルチャーを、１．５ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン）中で増殖させた。３７℃および２５０ｒｐｍで対数増殖期後期に達した後、この培養液を遠心分離し、そして、５０ｍＬのＬＢ（１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン）中に再懸濁した。３０℃および２００ｒｐｍで一晩、定常期まで増殖させた培養液を、遠心分離し、そして、２ＬのＦ１培地を含む３Ｌの容器に接種するために、２０ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。この２ＬのＦ１培地は、以下を含む：ＫＨ２ＰＯ４、１．５ｇ／Ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４、４．３４ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．４ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４、１５０．５ｍｇ／Ｌ；グルコース、５ｇ／Ｌ；微量金属溶液、１．２５ｍｌ／Ｌ；およびビタミン溶液、１．２５ｍｌ／Ｌ。増殖は、実験を通して、１ＭのＨ２ＳＯ４および濃ＮＨ４ＯＨでｐＨを７．１に維持して、３７℃で行った。曝気を、６００ｒｐｍ〜９００ｒｐｍで制御した撹拌で、２．８Ｌ／分で維持し、５０％の空気飽和を超える溶存酸素を維持した。塩溶液（ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、および（ＮＨ４）２ＳＯ４）を含む発酵装置をオートクレーブしたのに対して、さらなる供給成分（ＭｇＳＯ４、グルコース、微量金属およびビタミン）を濾過滅菌し、そして、接種する前に、１５０ｍｇ／Ｌのカルベニシリンおよび７５ｍＬ／Ｌのカナマイシンとともに無菌的に添加した。この供給物をまた、濾過滅菌した。いったん、グルコースが開始培地から枯渇すると（培養液の酸素要求の突然の減少により示されるように）、温度を２２℃まで下げ、そして、ＩＰＴＧ（１００μＭ）およびプロピオン酸ナトリウム（２ｇ／Ｌ）を添加した。この時点で、蠕動ポンプが０．１ｍｌ／ｍｍの供給培地の送達を開始し、この供給培地は以下：（ＮＨ４）２ＳＯ４、１１０ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４、３．９ｇ／Ｌ；グルコース、４３０ｇ／Ｌ；微量金属溶液、１０ｍｌ／Ｌ；およびビタミン溶液、１０ｍｌ／Ｌを含み、そして、サンプルを、その後、代表的には１日に２回取った。約４８時間毎にさらなるプロピオン酸ナトリウムを添加し（プロピオネートが残存しないと推定する場合、２ｇ／Ｌまで）、ポリケチド生合成のためのこの前駆物質の欠失を回避した。
【０１８７】
図１０Ａ中に示されるように、細胞増殖を、実験の経過を通じてグルコース濃度およびアセテート濃度を１ｇ／Ｌ以下に維持する栄養供給ストリームの制御された添加により、５０と７０の間の最終ＯＤ６００（２４ｇ（乾燥菌体重量）／Ｌおよび３３ｇ（乾燥菌体重量）／Ｌ）まで伸ばした。ポリケチド生合成を、１００μＭのＩＰＴＧと２ｇ／Ｌのプロピオネートを２２℃で添加することによって、５と１０の間のＯＤ６００で誘導した。細胞内タンパク質を、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して定期的に分析し、そして、可溶性ＰＫＳタンパク質の発現されたレベルが、実験の期間（誘導の約４時間後から開始する）を通して比較的一定にとどまることを見出した。この培養手順により、１１０時間にわたり７０ｍｇ／Ｌの最終６ｄＥＢ力価を産出した。前駆物質および生成物の分析は、全ての外因性のプロピオネートが消費された後に力価がプラトーに達したことを示した。図１０Ｂ中に示すように、発酵培地中のプロピオネート補充は、１００ｍｇ／Ｌの６ｄＥＢを超える再現性のある力価増加を生じた。６ｄＥＢへのプロピオネートの最大変換は、６％であった。発酵槽および振盪フラスコに特異的な生産性は類似した；しかし、発酵槽の容量生産性は、振盪フラスコの値よりも１７倍高かった。
【０１８８】
（ＴＥＩＩの効果）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ中のエリスロマイシン生合成遺伝子クラスター由来のｅｒｙＨ遺伝子は、チオエステラーゼ遺伝子のホモログ（チオエステラーゼＩＩまたはＴＥＩＩとも命名される）をコードする（Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９０）１７２：２３７２〜２３８３）。ＴＥＩＩは、未知の機構により、アクチノミセス宿主中でポリケチド生合成を増強することが示されている（Ｈｕ，Ｚ．，公開されていないデータ）。このｅｒｙＨ遺伝子を、クロラムフェニコール耐性プラスミドである、ｐＧＺ１１９ＥＨ上のＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの制御下でクローニングした（Ｌｅｓｓｌ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９２）１７４：２４９３〜２５００）。このプラスミドは、プラスミドｐＢＰ１３０およびプラスミドｐＢＰ１４４に適合可能である。得られたプラスミドである、ｐＢＰ１９０を、ｐＢＰ１３０およびｐＢＰ１４４とともに、ＢＡＰ１中に同時に形質転換し、上記で概略を説明した発酵プロトコル（スターターカルチャー中に３４ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールおよび発酵槽中に２０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む）を使用して研究した。
【０１８９】
この組換え菌株の増殖特性を、以前の実験の特性と類似したが、６ｄＥＢの力価は、２倍（約１８０ｍｇ／Ｌ）であった（図１１）。これらの実験は、ＴＥＩＩ共発現が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．中のポリケチド生産性効果に類似するＥ．ｃｏｌｉのポリケチド生産性を増加することを示唆する。（ここで、６ｄＥＢ生成物はまた、ＴＥＩＩなしの培養物と比較して２倍であった［Ｈｕ，Ｚ．，公開されていない結果］。）
上記で記載されたＴＥＩＩ共発現は、ＢＡＰ１のプラスミド安定特性を有意に改善せず、そして、発酵遺伝子発現プロフィールは、ＴＥＩＩを発現しない発酵物と比較した場合、質的差異を示さなかった。ＤＥＢＳ特性およびＰＣＣ特性とは異なり、ＴＥＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介して容易に目視できなかったが、発酵槽条件と類似するように意図した振盪フラスコ条件を使用した単離物中で発現された場合、ＴＥＩＩ（約３０ｋＤ）は、Ｎ末端６ヒスチジンタグを使用して容易に精製し得た。これは、いったんＴＥＩＩが発現すると、このＴＥＩＩは、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞骨格内に存在することを示唆する。スモールスケールのインビボでの放射性実験（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ（２００１）前出）はまた、力価増加がＴＥＩＩ共発現に起因するという概念を支持する。上記で記載したように、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＢＡＰ１、ｐＢＰ１３０、ｐＢＰ１４４、およびｐＢＰ１９０を、ＢＡＰ１／ｐＢＰ１３０／ｐＢＰ１４４／ｐＧＺ１１９ＥＨと比較した。さらに、これらの２つの菌株を、ＢＡＰ１／ｐＢＰ１３０／ｐＢＰ１４４と比較した。各々の比較は、ＴＥＩＩ共発現した方が、６ｄＥＢ力価が約２倍増加することを示した。
【０１９０】
初期の研究において、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１が、この組換え菌株から、プロピオネート異化のための既知の経路のみが欠失しているので、増殖を支持するための唯一の炭素供給源としてプロピオネートを利用し得ないことを確認していた。しかし、約１０％の外因性プロピオネートが６ｄＥＢに変換されるので、プロピオネートは、未知でかつ潜在的に所望されない副生成物に異化されると思われる。プロピオネートをプロピニル−ＣｏＡとして活性化するＥ．ｃｏｌｉの能力は、ＢＡＰ１中に保持されている（そして、意図的に増幅されている）ので、奇数鎖の脂肪酸合成の生合成は、外因性のプロピオネートの利用のための１つの経路を提供する可能性がある。放射標識したプロピオネートを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰｌ／ｐＢＰ１３０／ｐＢＰ１４４に供給した場合、６ｄＥＢよりもなお親油性である（放射−ＴＬＣ分析により判断した；データは示さず）放射標識した生成物を観察した。別の可能性は、アセチル−ＣｏＡ（インビボで最も一般的なアシル供与体）の代わりにプロピオニル−ＣｏＡを利用し得る非特異的アシル基転移機構を介した、プロピオネートの潜在的利用である。このような「行き詰まった（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）」生成物の同定は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主からのこのような非生産的経路の遺伝子的または代謝的な減衰または排除を導き得、これによって、ポリケチド生合成についてのその能力をさらに増強する。
【０１９１】
本発明者らの結果は、Ｅ．ｃｏｌｉ中の６ｄＥＢの生産性を増強するための、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ中に存在するアクセサリーチオエステラーゼ、ＴＥＩＩの有用性を実証した。ＴＥＩＩの正確な機構は、現在のところ明らかではなく、そして、この酵素は、多機能ＰＫＳの不正確にプロセッシングされた中間体を加水分解することによる、編集する役割を担うと思われる。あるいは、ＴＥＩＩは、不適切なホスホパンテテイン供与体で翻訳後修飾されたアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメインを一掃することにより、ＰＫＳ酵素の細胞内活性を増大し得る。通常、ＰＫＳ上のＡＣＰドメインは、活性部位のセリンでホスホパンテテインアームの付着により、翻訳後修飾される。この反応は、ホスホパンテテイントランスフェラーゼによって触媒される。ＢＡＰ１において、異種酵素であるＳｆｐ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来）は、この反応を触媒する。Ｓｆｐを使用する主要な利点は、このＳｆｐが実質的な任意のアシルキャリアタンパク質ドメインに対して、広範な基質特異性を有することである；しかし、Ｓｆｐは、ＣｏＡＳＨに対する匹敵する特異性を有するアシル−ＣｏＡ供与体を利用し得るので、このＳｆｐは、アセチル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡのような基質を誤って利用し得る。もしそうならば、アセチル化されたホスホパンテテインは、チオエステル結合が加水分解されるまで、ミスプライム（ｍｉｓｐｒｉｍｅ）されたＡＣＰドメインを過ぎてプロセスされることから、ポリケチド中間体を効果的にブロックする。ＴＥドメインが、対応するＣｏＡチオエステルよりもむしろアセチルＡＣＰ−またはプロピオニルＡＣＰドメインを選択的に加水分解し得る範囲で、ＴＥドメインは、インビボでの新規な合成ＰＫＳ活性のエンハンサーとして作用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１は、リファマイシンＢの前駆体であるプロサンサマイシンＸの提唱される生合成スキームである。このリファマイシンシンテターゼは、一団の５つの多機能性タンパク質ＲｉｆＡ、ＲｉｆＢ、ＲｉｆＣ、ＲｉｆＤ、およびＲｉｆＥ（各々、１つ以上のＰＫＳモジュールを含む）からなる。各ＰＫＳモジュールは、プロサンサマイシンＸの生合成のための鎖伸長および関連するβ−ケト還元という１サイクルを触媒する。ＲｉｆＡのＮ末端Ａ−Ｔローディングジドメインは、ＡＨＢを用いてこのシンテターゼを開始する。このジドメインは、最小ＮＲＰＳモジュールを暗示する。ＡＨＢに由来するｍＣ７Ｎ単位の位置が、プロサンサマイシンＸ構造中に太く示される。この活性部位は、アデニル化（Ａ）ドメイン、チオール化（Ｔ）ドメイン、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン、ケトシンターゼ（ＫＳ）ドメイン、β−ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン、またはデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインを示す。示されるように、ＲｉｆＦは、分子間アミド形成を介して環化を触媒すると考えられる。
【図２】図２は、Ａ−Ｔローディングジドメインに関する可能な機構を示す。（Ａ）ＣｏＡリガーゼモデルにおいて、Ａドメインの活性化ＡＨＢ−アデニル化産物が、ＣｏＡにより攻撃されて、ＡＨＢ−ＣｏＡ中間体が生成され、そしてこのアリールチオエステル酵素中間体は、Ｔドメインへのトランスチオール化から生じる。（Ｂ）ＮＲＰＳ様機構において、ＡＨＢは、ＡドメインによりＡＨＢ−アデニレートとして活性化され、そしてＴドメインのホスホパンテテイン補因子のチオールが、ＡＨＢ−アデニレートを直接攻撃して、共有結合アリールチオエステル酵素中間体を形成する。
【図３】図３は、ａｐｏ  Ａ−Ｔジドメインもしくはｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメイン、ＡＴＰ、および［１４Ｃ］−Ｂもしくは［１４Ｃ］−３−ＨＢの、存在または非存在を示す図であり、この存在または非存在は、ｈｏｌｏ  Ａ−ＴジドメインとＢとのＡＴＰ依存性共有結合ローディングまたはｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメインと３ＨＢとのＡＴＰ依存性共有結合ローディングの結果に基づき、この結果は、これらの反応混合物のクーマシー染色ゲル（４〜１５％勾配）およびこのゲルのオートラジオグラフ（示さず）に基づいて示される。
【図４】ａｐｏ  Ａ−Ｔジドメインを含む反応の時間経過の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）追跡をグラフ化している。正味のベンゾイル−ＣｏＡ形成は観察されない。標識ピークが、ＣｏＡ、Ｂ、およびベンゾイル−ＣｏＡの真正標準物と同時注入によって同定された。このＨＰＬＣ追跡は、０．１５分だけ前進的にシフトした。
【図５】３−ＨＢによるｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメインの共有結合ローディングの飽和曲線（白四角）またはＢによるｈｏｌｏ  Ａ−Ｔジドメインの共有結合ローディングの飽和曲線（白丸）をグラフ化している。図５Ａは、このデータの直線表示である。図５Ｂは、両方のデータセットの同時評価を容易にするための、データの対数表示である。その線は、単純飽和モデルへのこのデータの最適線であり、３−ＨＢに関してｋｃａｔ＝１．９分−１およびＫＭ＝１８０μＭを生じ、Ｂに関してｋｃａｔ＝０．１４分−１およびＫＭ＝１７０μＭを生じる。
【図６】図６は、ＤＥＢＳ遺伝子およびｐｃｃ遺伝子の発現を容易にするための合成オペロンアプローチにて使用された２つのプラスミドを示す。制限部位が、以下のように短縮されている：Ｘ（ＸｂａＩ）；Ｎ（ＮｄｅＩ）；Ｅ（ＥｃｏＲＩ）；Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）；Ｂ（Ｂｐｕ１１０２Ｉ）；Ｎｓ（ＮｓｉＩ）；Ｐｓ（ＰｓｔＩ）；Ｐ（ＰａｃＩ）；Ｄ（ＤｒａＩＩＩ）。
【図７】図７Ａは、６−デオキシエリスロノリドＢシンターゼ（ＤＥＢＳ）の模式図である。その触媒ドメインは以下である：ＫＳ（ケトシンターゼ）；ＡＴ（アシルトランスフェラーゼ）；ＡＣＰ（アシルキャリアタンパク質）；ＫＲ（ケトレダクターゼ）；ＥＲ（エノイルレダクターゼ）；ＤＨ（デヒドラターゼ）；ＴＥ（チオエステラーゼ）。ＤＥＢＳは、１モルのプロピニル−ＣｏＡおよび６モルの（２Ｓ）−メチルマロニル−ＣｏＡを使用して、１モルの６−デオキシエリスロノリドＢ（６ｄＥＢ（化合物１））を合成する。図７Ｂは、短縮型ＤＥＢＳ１＋ＴＥが、トリケチドラクトン（化合物２）を生成することを示す。図７Ｃは、このリファマイシンシンテターゼが、非リボソーム性ペプチドシンテターゼローディングモジュールにより天然で開始されるポリケチドシンターゼであることを示し、この非リボソーム性ペプチドシンテターゼローディングモジュールは、２つのドメイン−ＡＴＰ依存性アデニル化ドメイン（Ａ）およびチオール化ドメイン（Ｔ）から構成される。ＤＥＢＳのローディングドメインに代えてこのＡ−Ｔジドメインで置換すると、外因性酸（例えば、安息香酸）を使用して置換大環状分子（例えば、化合物３）を操作されたＥ．ｃｏｌｉ株において合成するように操作された「ハイブリッド」シンターゼが生じる。
【図８】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１の遺伝子設計の模式図である。
【図９】図９は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける６ｄＥＢの産生を示す。細胞タンパク質含量および６ｄＥＢ濃度が、時間に対してプロットされている。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉの流加培養発酵実験を示す。図１０Ａは、経時的にさらなるプロピオネートを添加しなかったことを示す。図１０Ｂは、材料および方法の節において特定されるようなさらなるプロピオネート供給を行ったことを示す。
【図１１】図１１は、ＴＥＩＩ遺伝子発現を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ  ６ｄＥＢ流加培養発酵を示す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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