(57)【要約】空気−液体界面で培養される、膣上皮細胞および免疫細胞からなる子宮頚−膣組織相当物が開示される。組織相当物は、ウイルス（例えばHIV）、バクテリア、寄生虫または真菌などの性感染病原体に感染することができる。組織相当物はまた、アレルギー型反応または刺激型反応を行うことができる。組織相当物は、有核基底層細胞および有核基底上層細胞を有し、さらに、漸次的にグリコーゲンの含有量を増加させ、かつ核の含量を減少させる基底上層の外側に、細胞層を有することにより特徴づけられる。組織相当物の免疫細胞は、最初に基底層および基底上層に位置している。また、組織相当物を作製するための方法が開示される。本方法は、膣上皮細胞および免疫細胞を提供すること、細胞を多孔性支持体上に播種すること、および、分化に適切な条件下、空気−液体界面で共培養することを含む。開示されるかかる方法の１つは、無血清培地における組織相当物の作製である。組織相当物が形成される特定の細胞、およびまた組織相当物が生成される培地の特定の好ましい成分が提供される。また、ここで開示される方法によりつくられた子宮頚−膣組織相当物も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膣上皮細胞および免疫細胞からなる、空気−液体界面で培養された、子宮頚−膣組織相当物。
【請求項２】
その上で子宮頚−膣組織相当物が培養される支持体をさらに含む、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項３】
ウイルス、バクテリア、寄生虫、および真菌からなる群から選択される性感染病原体に感染することができる、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項４】
性感染病原体がHIVである、請求項３に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項５】
アレルギー型反応または刺激型反応を惹起することができる、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項６】
無血清培地で生成する、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項７】
膣上皮細胞、免疫細胞、または両方がヒト由来である、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項８】
膣上皮細胞、免疫細胞、または両方が、初代細胞、継代された初代細胞、形質転換細胞、および不死化細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項９】
初代または継代された初代膣上皮細胞が、正常ヒト子宮頚部組織、正常ヒト子宮頚管組織、病態のヒト子宮頚部組織、および 病態のヒト子宮頚管組織からなる群から選択される組織由来である、請求項８に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１０】
免疫細胞が、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞（CD34+）、単球（CD14+）、未熟樹状細胞（CD1a+、CD4+）、成熟樹状細胞（CD86+、HLA-DR++）、T細胞（CD3+）、マクロファージ、またはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１１】
免疫細胞がランゲルハンス前駆細胞または単球からインビトロで産生される、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１２】
支持体が、人工膜、細胞外マトリックス成分、コラーゲン混合物、インビボ由来の結合組織、混合コラーゲン−線維芽細胞格子、混合細胞外マトリックス−線維芽細胞格子、およびプラスチックからなる群から選択される、請求項２に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１３】
混合コラーゲン−線維芽細胞格子が、膣線維芽細胞からなる、請求項１２に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１４】
混合コラーゲン−線維芽細胞格子が、さらにT細胞（CD3+）からなる、請求項１３に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１５】
免疫細胞がHLA-DRを発現している、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１６】
有核基底層細胞および有核基底上層細胞を有することを特徴とする、請求項１に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１７】
漸次的にグリコーゲンの含有量を増加させ、かつ核の含量を減少させる基底上層の外側に、細胞層を有することを特徴とする、請求項１６に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１８】
主に基底層および基底上層に存在する免疫細胞を有することを特徴とする、請求項１６に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【請求項１９】
ステップ：
膣上皮細胞および免疫細胞を提供すること；
細胞を播種すること；そして
分化に適切な条件下で、播種された細胞を空気−液体界面で共培養すること（co-culturing）、
を含む、子宮頚−膣組織相当物を製造する方法。
【請求項２０】
共培養するステップの前に、細胞の増殖に適切な条件下で、増殖培地中で、播種された細胞を共液中培養するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
共培養するステップが、無血清分化培地で行われる、請求項２０に記載の方法。  
【請求項２２】
共液中培養するステップの増殖培地が、無血清増殖培地である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
播種するステップの前に、細胞の増殖に適切な条件下で、増殖培地中にて膣上皮細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
共培養するステップの後に、共培養された播種細胞中に、追加の免疫細胞をさらに播種するステップ、および、分化に適切な条件下で空気−液体界面にて播種された細胞をさらに共培養するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
共培養するステップが、無血清分化培地で行われる、請求項１９に記載の方法。  
【請求項２６】
膣上皮細胞または免疫細胞あるいは両方が、初代細胞、継代された初代細胞、形質転換細胞、および不死化細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
提供するステップの初代または継代された初代膣上皮細胞が、正常ヒト子宮頚部組織、正常ヒト子宮頚管組織、病態のヒト子宮頚部組織、および病態のヒト子宮頚管組織からなる群から選択される組織由来である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫細胞が、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞（CD34+）、単球（CD14+）、未熟樹状細胞（CD1a+、CD4+）、成熟樹状細胞（CD86+、HLA-DR++）、T細胞（CD3+）、マクロファージ、またはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
提供するステップの前に、提供するステップのために、ハーベストされたCD34+細胞からインビトロで免疫細胞を産生するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
ハーベストされたCD34+細胞から免疫細胞を産生するステップが、ステップ：
CD34+細胞をヒト臍帯血、末梢血または骨髄からハーベストすること；
最初に、CD34+細胞を、幹細胞因子25ng/ml、GM-CSF約200U/ml、およびTNF-α約2.5ng/mlを含む培地中で、約１〜約１０日の期間培養すること；そして
CD34+細胞を、幹細胞因子約25ng/ml、GM-CSF約200U/ml、IL-4約40ng/ml、およびTGF-β1約0.5ng/mlを含む培地中で、約１〜約１７日の期間培養し続けること；
を含み、それにより免疫細胞を産生する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
最初に培養するステップの期間が約７〜約９日である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
最初に培養し続けるステップの期間が約５〜約１０日である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ハーベストされたCD34+細胞から免疫細胞を産生するステップが、ステップ：
CD34+細胞をヒト臍帯血、末梢血または骨髄からハーベストすること；
最初に、CD34+細胞を、幹細胞因子約20ng/ml、GM-CSF約500U/ml、およびTNF-α約2.5ng/mlを含む無血清培地中で、少なくとも約４日の期間培養すること；
CD34+細胞を、幹細胞因子約20ng/ml、GM-CSF約500U/ml、TNF-α約2.5ng/ml、FLT-3約20ng/ml、およびTGF-β1約0.5ng/mlを含む無血清培地中で、少なくとも約５日の期間培養し続けること；そして
CD34+細胞を、幹細胞因子約20ng/ml、GM-CSF約500U/ml、IL-4約40ng/ml、FLT-3約20ng/ml、およびTGF-β1約0.5ng/mlを含む無血清培地中で、少なくとも約３日の期間さらに培養すること；
を含み、それにより免疫細胞を産生する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
播種するステップが、人工膜、細胞外マトリックス成分、コラーゲン混合物、インビボ由来の結合組織、混合コラーゲン−線維芽細胞格子、混合細胞外マトリックス−線維芽細胞格子、およびプラスチックからなる群から選択される、下にある支持体上で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
混合コラーゲン−線維芽細胞格子が、膣線維芽細胞からなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
混合コラーゲン−線維芽細胞格子が、さらにT細胞（CD3+）からなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
提供するステップの膣上皮細胞または免疫細胞、あるいは両方が、ヒト由来である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３８】
提供するステップの免疫細胞が、ランゲルハンス前駆細胞または単球から産生される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３９】
提供するステップの前に、提供するステップのために、未熟または成熟樹状細胞として免疫細胞を単離することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項４０】
共培養するステップが、レチノイドを含む分化培地中で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項４１】
分化培地が、約10-5M〜約10-13Mのレチノイドを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
レチノイドがレチノイン酸である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
レチノイン酸の濃度が約5×10-10Mである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
分化培地が、
a)約3：1の比のDMEM：F12；および
b)レチノイン酸 約5×10-10M
を含む無血清培地である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
無血清分化培地が、ケラチノサイト成長因子約0.3ng/ml、EGF約5ng/ml、ヒドロコルチゾン約0.4μg/ml、およびインスリン約5μg/ml をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
共培養するステップが、アデニン、α−メラノサイト刺激ホルモン、アラキドン酸、β−線維芽細胞成長因子、ウシ下垂体抽出物、ウシ血清アルブミン、塩化カルシウム、仔牛血清、カルニチン、コレラ毒素、ジブチルサイクリックアデノシンモノホスフェート、エンドセリン−１、表皮成長因子、エピネフリン、エストラジオール、エストロゲン、エタノールアミン、ウシ胎児血清、FLT-3、グルカゴン、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子、肝細胞成長因子、ウマ血清、ヒト血清、ヒドロコルチゾン、インスリン、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２、インターロイキン−１β、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターロイキン−１８、イソブチルメチルキサンチン、イソプロテレノール、ケラチノサイト成長因子、リノール酸、MIP-1α、MIP-3α、ウシ新生仔血清、ノルエピネフリン、オレイン酸、パルミチン酸、ホスホエタノールアミン、プロゲステロン、幹細胞成長因子、トランスフェリン、形質転換成長因子−β１、トリヨードチロニン、腫瘍壊死因子α、ビタミンA、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンDおよびビタミンEからなる群より選択される、少なくとも１種の成分を含む分化培地中で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項４７】
播種するステップにおいて、各細胞種が、約1×103〜約1×107細胞／cm2で播種される、請求項１９に記載の方法。
【請求項４８】
播種するステップにおいて、各細胞種が、約1×105〜約1×106細胞／cm2で播種される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
播種するステップが、免疫細胞に対して膣上皮細胞が約1：1の比で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項５０】
播種するステップが、免疫細胞に対して膣上皮細胞が約1：1〜10000：1の比で行われ、そして、共培養するステップが、免疫細胞の生存を増加するかまたは増殖を惹起する添加剤が補充された無血清培地中で行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項５１】
比が、免疫細胞に対して膣上皮細胞が約20：1〜50：1 である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ステップ：
膣上皮細胞および免疫細胞を提供すること；
細胞を播種すること；そして
分化に適切な条件下で、播種された細胞を空気−液体界面で共培養すること、
を含む方法により産生される、子宮頚−膣組織相当物。
【請求項５３】
方法が、共培養するステップの前に、細胞の増殖に適切な条件下で、播種された細胞を増殖培地中で、共液中培養するステップをさらに含む、請求項５２に記載の子宮頚−膣組織相当物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連する出願
本出願は、2002年６月７日に出願された米国仮出願10/165,267号に係る優先権を主張し、その内容は、本明細書に参照により組み込まれる。
政府の財政支援
本明細書において記載されている仕事は、国立衛生研究所により与えられたSBIR Grant 1R43 AI047792-01のもとに支援された。したがって、米国政府は本発明において一定の権利を有することができる。
【０００２】
発明の背景
膣組織における外在性および内在性の剤の効果を研究するために、数多くのインビトロモデルが用いられてきた。今日までに開発された各モデルは有用ではあるが、重大な欠点に苦しんできた。
単層培養における膣上皮細胞は、基礎の生化学研究のために、そしてホルモン、成長因子および外在性の剤の子宮頚部(cervical)および膣組織における効果を決定するために、用いられてきた。性感染症に関与する感染のメカニズムを調べるために、浮遊培養（suspension culture）における血液由来の樹状細胞およびT細胞と併せて、子宮頚部または膣細胞の単層培養が用いられてきた。しかし、単層培養の細胞は、正常組織に見出される分化能およびバリヤ特性を欠如している。よって、単層または浮遊細胞による結果は正常ヒト子宮頚−膣組織に適用できない場合がある。
【０００３】
培養された皮膚ケラチノサイトから作られた３次元組織もまた膣の殺菌剤の効果を研究するために用いられてきた。前記の組織は有用であるが、皮膚由来の細胞であるために、ンビボでの子宮頚部および膣組織を充分に表しておらず、したがって、膣組織としてのその使用は極めて限られている。
【０００４】
非悪性の膣組織がスライドグラス上で培養された１９７９年には早くも膣組織外植片（explant）の多層組織培養がSobelらにより報告された(Sobel, J.D., et al., In  vitro, 15, 993-1000 (1979))。他の研究は、インビボの組織の病態および感染を抑制する殺菌剤の効果を研究するために、子宮頚部および膣組織外植片からの上皮細胞の増殖物を用いてきた。しかしながら、正常（非癌性）ヒト膣および子宮頚部組織の利用性は限られており、かかる組織を長期間保存できないことにより、組織培養は小さな学問的研究環境においてしか用いることができない。また、組織外植片は扱いおよび操作が難しく、組織バイパスの問題は、避けることが難しい。例えば、適用された剤が組織の縁部周辺に拡散することにより組織を周回しないことを保証することは難しかった。
【０００５】
近年では、HIV感染の研究にとって膣および子宮頚部組織の実験的使用はさらに重要であるという高まっている認識がある。多くの研究が、CD4受容体および他の共受容体（
co-receptor）を発現している、膣上皮において発見されたランゲルハンス細胞が、HIV-1感染の最初の標的であり、感染したランゲルハンス細胞がHIVをCD4+T細胞に感染させることを示唆してきた(Cohen, M.S., Lancet, 351 (supp III), 5-7 (1998))。またランゲルハンス細胞は、インビボにおけるHIV/SIV複製のための重要な宿主（reservoir）であることも示されている(Hu, J., et al. , Lab. Invest., 78, 435-451 (1998)。しかし、HIVの複製がT細胞の存在下でのみ起こるということを示す研究(Granelli-Piperno, A., Steinman, R.M., et al., Curr. Biol., 14, 21-29 (1999))などの研究、およびCD4-である子宮頚部−膣細胞の直接的なHIV-1の感染の報告は、HIV感染におけるランゲルハンス細胞の役割について論議を持続させている。
【０００６】
インビボの子宮頚部および膣組織を高度に反映するインビトロモデルシステムの開発は、外在性および内在性の剤の膣組織における効果、ならびに性感染症の病態および抑制を正確に決定することを極めて容易にする。
【０００７】
発明の概要
１つの側面においては、本発明は、膣上皮細胞および免疫細胞からなる、空気−液体界面（air-liquid interface）で培養された、子宮頚−膣組織相当物（cervico-vaginal tissue equivalent）に関する。子宮頚−膣組織相当物は、任意に無血清培地中で生成されてもよい。膣上皮細胞、免疫細胞、または両方はヒト由来であってもよい。膣上皮細胞、免疫細胞、または両方は、初代細胞、継代された初代細胞、形質転換細胞、または不死化細胞であってもよい。子宮頚−膣組織相当物の初代または継代された初代膣上皮細胞は、正常ヒト子宮頚部組織、正常ヒト子宮頚管組織、病態のヒト子宮頚部組織、または病態のヒト子宮頚管組織由来であってもよい。子宮頚−膣組織相当物の免疫細胞は、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞（CD34+）、単球（CD14+）、未熟樹状細胞（CD1a+、CD4+）、成熟樹状細胞（CD86+、HLA-DR++）、T細胞（CD3+）、マクロファージ、またはこれらのいずれかの組合せであってもよい。子宮頚−膣組織相当物の免疫細胞はHLA-DRを発現している。免疫細胞は、例えばランゲルハンス前駆細胞または単球から、インビトロで産生されてもよい。
【０００８】
他の態様においては、子宮頚−膣組織相当物は、ウイルス（例えばHIV）、バクテリア、寄生虫、および真菌からなる群から選択される性感染病原体に感染することができる。また子宮頚−膣組織相当物は、アレルギー型反応または刺激型反応を惹起することができるてもよい。
【０００９】
子宮頚−膣組織相当物は、その上で子宮頚−膣組織相当物が培養される支持体をさらに含んでもよい。支持体は、例えば、人工膜、細胞外マトリックス成分、コラーゲン混合物、インビボ由来の結合組織、混合コラーゲン−線維芽細胞格子（mixed collagen-fibroblast lattice）、混合細胞外マトリックス−線維芽細胞格子（mixed extracellular matrix-fibroblast lattice）、またはプラスチックであってもよい。混合コラーゲン−線維芽細胞格子は、任意に膣線維芽細胞からなってもよく、さらに任意にT細胞（CD3+）からなってもよい。
【００１０】
子宮頚−膣組織相当物は、また有核基底層細胞および有核基底上層（suprabasal layer）細胞を有することを特徴としてもよい。子宮頚−膣組織相当物は、さらに、漸次的にグリコーゲンの含有量を増加させ、かつ漸次的に核の含量を減少させる基底上層の外側に、細胞層を有することを特徴としてもよい。子宮頚−膣組織相当物は、主に基底層および基底上層に存在する免疫細胞を有することを特徴としてもよい。
【００１１】
本発明の他の側面は、子宮頚−膣組織相当物を製造するための方法に関する。前記方法は、膣上皮細胞および免疫細胞を提供すること、細胞を播種すること、および、分化に適切な条件下で、播種された細胞を空気−液体界面で共培養すること（co-culturing）というステップを含む。共培養する（co-culturing）ステップは無血清分化培地で行われてもよい。前記の方法は、任意に、共培養するステップの前に、細胞の増殖に適切な条件下で、播種された細胞を増殖培地中にて共液中培養する（co-cultivating）ステップをさらに含む。共液中培養するステップの増殖培地は、無血清増殖培地であってもよい。
【００１２】
子宮頚−膣組織相当物を製造するための方法は、播種するステップの前に、細胞の増殖に適切な条件下で、増殖培地中にて膣上皮細胞を培養するステップをさらに含んでもよい。
または、あるいはさらに、前記の方法は、共培養するステップの後に、共培養された（co-cultured）播種細胞中に、追加の免疫細胞をさらに播種するステップ、および、分化に適切な条件下で、播種された細胞を空気−液体界面にてさらに共培養するステップをさらに含むこともできる。
【００１３】
上記方法において用いられる膣上皮細胞、免疫細胞、または両方は、初代細胞、継代された初代細胞、形質転換細胞、または不死化細胞であってもよい。上記方法において用いられる膣上皮細胞または免疫細胞、あるいは両方はまた、ヒト由来であってもよい。子宮頚−膣組織相当物の初代または継代された初代膣上皮細胞は、正常ヒト子宮頚部組織、正常ヒト子宮頚管組織、病態のヒト子宮頚部組織、または病態のヒト子宮頚管組織由来であってもよい。子宮頚−膣組織相当物の免疫細胞は、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞（CD34+）、単球（CD14+）、未熟樹状細胞（CD1a+、CD4+）、成熟樹状細胞（CD86+、HLA-DR++）、T細胞（CD3+）、マクロファージ、またはこれらのいずれかの組合せであってもよい。１つの態様においては、提供するステップの免疫細胞は、ランゲルハンス前駆細胞または単球から産生される。
【００１４】
他の態様においては、前記の方法の播種するステップは、人工膜、細胞外マトリックス成分、コラーゲン混合物、インビボ由来の結合組織、混合コラーゲン−線維芽細胞格子、混合細胞外マトリックス−線維芽細胞格子、またはプラスチックであってもよい、下にある支持体の上で行われる。混合コラーゲン−線維芽細胞格子は、膣線維芽細胞からなってもよく、さらにT細胞（CD3+）からなってもよい。
【００１５】
共培養するステップは、少なくとも１種の下記成分を含む分化培地中で行われてもよい：アデニン、α−メラノサイト刺激ホルモン、アラキドン酸、β−線維芽細胞成長因子、ウシ下垂体抽出物、ウシ血清アルブミン、塩化カルシウム、仔牛血清、カルニチン、コレラ毒素、ジブチルサイクリックアデノシンモノホスフェート、エンドセリン−１、表皮成長因子、エピネフリン、エストラジオール、エストロゲン、エタノールアミン、ウシ胎児血清、FLT-3、グルカゴン、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子、肝細胞成長因子、ウマ血清、ヒト血清、ヒドロコルチゾン、インスリン、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２、インターロイキン−１β、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターロイキン−１８、イソブチルメチルキサンチン、イソプロテレノール、ケラチノサイト成長因子、リノール酸、MIP-1α、MIP-3α、ウシ新生仔血清、ノルエピネフリン、オレイン酸、パルミチン酸、ホスホエタノールアミン、プロゲステロン、幹細胞成長因子、トランスフェリン、形質転換成長因子−β１、トリヨードチロニン、腫瘍壊死因子α、ビタミンA、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンDおよびビタミンE。
【００１６】
前記の方法の他の態様においては、共培養するステップがレチノイドを含む分化培地中で行われる。レチノイドの濃度は、例えば、約10-5M〜約10-13Mである。レチノイドはレチノイン酸であってもよい。レチノイン酸の濃度は、例えば約5×10-10Mであってもよい。関連する態様においては、分化培地は、約3：1の比のDMEM：F12およびレチノイン酸 約5×10-10Mを含む無血清培地である。無血清分化培地は、任意にケラチノサイト成長因子約0.3ng/ml、EGF約5ng/ml、ヒドロコルチゾン約0.4μg/ml、およびインスリン約5μg/ml をさらに含んでもよい。
【００１７】
前記の方法の好ましい態様においては、播種するステップが、免疫細胞に対して膣上皮細胞が約1：1の比で行われる。他の態様においては、播種するステップが、免疫細胞に対して膣上皮細胞が約1：1〜10000：1の比で行われ、そして、共培養するステップが、免疫細胞の生存を増加するかまたは増殖を惹起する添加剤が補充された無血清培地中で行われる。好ましい態様においては、比が、免疫細胞に対して膣上皮細胞が約20：1〜50：1 であって、共培養するステップが、免疫細胞の生存を増加するかまたは増殖を惹起する添加剤が補充された無血清培地中で行われる。
【００１８】
前記の方法の１つの態様においては、播種するステップにおいて各細胞種は、約1×103〜約1×107細胞／cm2で播種される。好ましくは、播種するステップにおいて各細胞種は、約1×105〜約1×106細胞／cm2で播種される。
子宮頚−膣組織相当物を製造するための方法において用いられる免疫細胞は、提供するステップの前に、未熟または成熟樹状細胞として単離されてもよい。
【００１９】
１つの態様において、子宮頚−膣組織相当物を製造するための方法は、提供するステップの前に、提供するステップのために、ハーベストされたCD34+細胞からインビトロで免疫細胞を産生するステップをさらに含む。ハーベストされたCD34+細胞から免疫細胞を産生するステップは、CD34+細胞をヒト臍帯血、末梢血または骨髄からハーベストすること、最初にCD34+細胞を、幹細胞因子約25ng/ml、GM-CSF約200U/ml、およびTNF-α約2.5ng/mlを含む培地中で、約１〜約１０日の期間培養すること、そしてCD34+細胞を、幹細胞因子約25ng/ml、GM-CSF約200U/ml、IL-4約40ng/ml、およびTGF-β1約0.5ng/mlを含む培地中で、約１〜約１７日の期間培養し続けることを含んでもよい。１つの態様においては、最初に培養するステップの期間は約５〜約１０日、好ましくは約７〜約９日である。
【００２０】
また、ハーベストされたCD34+細胞から免疫細胞を産生するステップは、CD34+細胞をヒト臍帯血、末梢血または骨髄からハーベストすること、最初にCD34+細胞を、幹細胞因子約20ng/ml、GM-CSF約500U/ml、およびTNF-α約2.5ng/mlを含む無血清培地中で、少なくとも約４日の期間培養すること、CD34+細胞を、幹細胞因子約20ng/ml、GM-CSF約500U/ml、TNF-α約2.5ng/ml、FLT-3約20ng/ml、およびTGF-β1約0.5ng/mlを含む無血清培地中で、少なくとも約５日の期間培養し続けること、そしてCD34+細胞を、幹細胞因子約20ng/ml、GM-CSF約500U/ml、IL-4約40ng/ml、FLT-3約20ng/ml、およびTGF-β1約0.5ng/mlを含む無血清培地中で、少なくとも約３日の期間さらに培養することというステップを含む。
【００２１】
本発明の他の側面は、本明細書において記載される方法により産生される子宮頚−膣組織相当物に関する。１つの態様においては、前記方法は、膣上皮細胞および免疫細胞を提供すること、細胞を播種すること、そして分化に適切な条件下で、播種された細胞を空気−液体界面で共培養することというステップを含む。前記の方法は、共培養するステップの前に、細胞の増殖に適切な条件下で、播種された細胞を増殖培地中にて共液中培養するというステップをさらに含んでもよい。
【００２２】
図面の簡単な説明
図１は、空気−液体界面で培養される子宮頚−膣組織の概略図である。栄養素および成長因子は、組織培養インサート（tissue culture insert）の底部で膜を介して浸透する、基本コンパートメントに配置された培地から組織に供給されている。頂端側の（apical）組織表面には培養培地が存在しないので、病原体や殺菌剤などの試験物質の局所適用が可能になる。
図２は、市販の殺精子剤ノノキシノール−９（nonoxynol-9）（２％）への暴露時間に対して、インビトロで産生された子宮頚−膣組織の組織生存率をプロットする用量作用曲線である。組織生存率を５０％まで減少させるのに必要な暴露時間（ET-50）のグラフによる決定が説明されている。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の側面は、本明細書に記載されている３次元子宮頚−膣組織相当物の開発に関する。子宮頚−膣組織相当物は、インビボの組織に由来する膣および／または子宮頚部上皮細胞を、インビボの組織の形態を強く反映する３次元細胞組織の状態で含む。インビボの組織と同様に、本発明の組織相当物はまた機能的に取り込まれた免疫細胞を含み、免疫応答性である。これらの性質を有する子宮頚−膣組織相当物は、当分野で現在利用できる他の既知のモデルよりも、インビボの膣組織の性質をより正確に反映するインビトロモデルシステムを供給する。そのようなものとして、子宮頚−膣組織相当物は、外来性の剤の膣組織における効果をより正確に決定するために、そして性感染症病原体の感染を研究するために、用いられてもよい。
【００２４】
Ｉ．子宮頚−膣組織相当物 
１つの側面においては、本発明は、インビボの膣および子宮頚部を表す３次元モデルを製造するために、空気−液体界面においてインビトロで培養された、膣上皮細胞および免疫細胞の両方からなる子宮頚−膣組織相当物に関する。子宮頚−膣組織相当物は、インビボの膣組織と同様の細胞組織、形態および組織像を有することを特徴とする。例えば、１つの態様においては、子宮頚−膣組織相当物の頂端側の表面には、微小隆線（microridge）が存在し、組織の頂端側の表面の近くに見出される組織の細胞は、ジッパー様のパターンで高度にかみ合っている。１つの態様においては、組織の下のほうの層に位置する細胞の間にデスモソームが存在する。
【００２５】
好ましい態様においては、本発明の子宮頚−膣組織相当物は、核およびオルガネラを欠如し、かつグリコーゲンで満たされているより頂端側の表面の層が続く、有核基底層細胞および多数の有核基底上層細胞を有することを特徴とする。これらの形態学的特徴は、顕微鏡写真（micrographic）解析により簡単に可視化される。
【００２６】
外側の細胞層におけるグリコーゲンの存在は、子宮頚−膣組織相当物の好ましい態様の重要な特徴である。これは、当分野において既知の他の現在のモデルシステムにおいては欠如していると理解されているインビボの組織の特徴である。インビボの組織での頂端側の層におけるグリコーゲンの存在は、膣内の正常な生理学的環境を維持するのに極めて重要であることが知られており、なぜなら前記の環境は、そこに自然に存在するいくつかの微生物に依存するからである。主要な膣の微生物は、これらの頂端側の細胞から放出されたグリコーゲンを発酵させて乳酸を産生することにより、膣のpHを4.5〜5.0の間に安定させる、デーデルライン乳酸桿菌（Doderlein's lactobacillus ）である (Melis, G.B., et al., Minerva Ginecol., 52 (4), 111-121 (2000)）。膣組織を研究するために用いられる他の既知のインビトロモデルシステムは、インビボのシステムおよび本発明の組織相当物のグリコーゲン含量を示していない。したがって、グリコーゲンの存在は、子宮頚−膣組織相当物が当分野において現在利用できる他のシステムよりも、より表現的なモデルシステムであることを示す。
【００２７】
子宮頚−膣組織相当物はまた、特徴的な細胞マーカーをインビボの組織と同様の位置に有するということにおいて、インビボの組織と組織学的に類似している。１つの態様においては、細胞マーカーであるサイトケラチン13（CK13）および14（CK14）は、組織相当物の免疫組織化学的解析によって、より分化した基底上層に存在するCK13および基底層に存在するCK14により簡単に識別される。
【００２８】
本発明の子宮頚−膣組織相当物の重要な側面は、インビボで膣組織において自然に存在する取り込まれた免疫細胞の存在である。組織相当物への免疫細胞の機能的取り込みは、従来技術の子宮頚−膣組織のモデルシステムを超える重要な革新である。免疫細胞の機能的な存在は、組織の免疫応答性という結果をもたらす。したがって、組織は免疫応答性に関連する天然のインビボの組織の機能的特徴を有する。そのような特徴のいくつかは、アレルギー型反応や刺激型反応を惹起する物質に暴露された場合に、アレルギー型反応を起こす能力および刺激型反応を起こす能力である。この能力は、インビボの膣組織のためのモデルシステムとしての組織相当物の価値に寄与する。
【００２９】
好ましい態様においては、免疫細胞は組織相当物の基底層および基底上層に主に存在する。１つの態様においては、機能する免疫細胞のうちの５０％を超えるものが基底層および基底上層に存在する。他の態様においては、機能する免疫細胞のうちの６０％、７０％、８０％または９０％を超えるものが基底層および基底上層に存在する。さらに、免疫細胞はさらに、いずれの存在する下にある結合組織にわたって分散されてもよい。これらはまた組織の他の層に位置していてもよく、その生成過程は人工的なものと考えられている。
【００３０】
組織相当物内の免疫細胞の存在は、当業者により容易に決定される。かかる免疫細胞は、例えば、ランゲルハンス細胞に対するHLA-DR (Human Leukocyte Antigen（ヒト白血球抗原）)などの特異的な細胞マーカーの存在により実験的に同定される。
【００３１】
当分野において既知であるように、アレルギー型反応は、組織に対するアレルギー物質の局所的な接触に起因する。アレルギー接触反応は、最初の暴露および抗原提示細胞（APC）による抗原のプロセシングを伴う。アレルギー反応を引き起こす抗原は、タンパク質、バクテリア、微生物または化学物質を含みうる。膣および子宮頚部組織における主要な抗原提示細胞はランゲルハンス細胞であるが、他の細胞も抗原をプロセシングしてもよく、また、アレルギー反応に関連する初期生化学的現象に関与してもよい。一度APCが抗原をプロセシングしてしまうと、APCは活性化され、引き続いて、特異的抗原に対して感作されるTリンパ球と相互作用する。インビボでは、この最初の暴露は、炎症、腫れ、発赤、かゆみ、痛み、疼痛、または異常膣臭または膣分泌物などの臨床症状を伴うアレルギー反応を起こす場合と起こさない場合がある感作をもたらす。インビトロおよびインビボでは、抗原への引き続く暴露において、感作されたT細胞はさらに活性化されて他の炎症細胞が集められ、これらの臨床症状のいくつかまたは全てを引き起こす。与えられた抗原に対するアレルギー型反応は、一般的に一部の個体に対して特異的であり、同様に、相当物が産生される細胞の起源に依存して、一部の組織相当物に対して特異的であると期待される。
【００３２】
インビトロ組織相当物により行われるアレルギー型反応は、インビボの反応に極めて類似する。最初のインビトロの効果は、組織の生存率の減少、アレルギー反応の最初の段階に関与するサイトカインの産生および／または放出、組織からのランゲルハンス細胞の遊走、T細胞の活性化、ならびに、組織の生化学の変化を含む。
【００３３】
当分野において知られているように、刺激型反応もまた組織への刺激物質の接触から生じる。刺激型反応は、アレルギー型反応よりも特異性が低く、より局所的な反応であり、刺激物質に接触した、全てでなくとも大抵の個体において起こる。臨床的には、刺激型反応は典型的に組織の上皮細胞に対して惹起された破壊や物理的損傷を伴って開始する。刺激物質は、発赤、かゆみ、痛み、疼痛、腫れまたは異常な膣臭もしくは分泌物により特徴づけられる炎症を惹起する。炎症細胞（Tリンパ球）は刺激反応の進行において役割を果たすが、アレルゲン特異的な免疫リンパ球は病態には関与せず、前の感作は必要でない。刺激物質に対する感受性は異なるものの、充分な暴露がなされれば、ほとんど全ての個体が刺激型反応を起こし得る。
【００３４】
インビトロ組織相当物により行われる刺激型反応は、インビボの反応に極めて類似する。最初のインビトロの効果は、組織の生存率の減少、アレルギー反応の最初の段階に関与するサイトカインの産生および／または放出、組織バリヤ機能の破壊、ならびに、組織の生化学の変化を含む。
【００３５】
インビボ組織を表す分化した細胞種の存在のために、本発明の組織相当物は、通常膣および／または子宮頚部組織に感染して性感染症を引き起こす種々の病原体（例えば、性および非性感染症病原体）による感染に対して感受性である。
【００３６】
「性感染症」の語は、数多くの性感染症を包含する。これらは、限定されることなく、後天性免疫不全症候群（AIDS）、急性尿道症候群（Acute Urethral Syndrome)または膀胱炎(Cystitis)、細菌性外陰膣炎（Bacterial Vaginosis Vulvovaginitis）、カンジダ症、子宮頚部上皮内癌（Cervical Intraepithelial Neoplasia)、軟性下疳（Chancroid）、クラミジア、サイトメガロウイルス感染、腸管感染症（Enteric infections）、陰部疣贅（Genital Warts）、 淋病（Gonorrhea）、鼠径部肉芽腫（Granuloma Inguinale）、B型肝炎（Hepatitis B）、陰部ヘルペス（Herpes Genitalis）、ヒトパピローマウイルス（Human Papillomavirus）(HPV)、鼠径リンパ肉芽腫（Lymphogranuloma venereum）(LGV)、伝染性軟属腫（Molluscum Contagiosum）、粘液膿性子宮頚部管炎（Mucopurulent Cervicitis）、非淋菌性尿道炎（Nongonococcal Urethritis）、ケジラミ寄生症（Pediculosis Pubis）、骨盤内炎症性疾患（Pelvic Inflammatory Disease）(PID)、梅毒（Syphilis）、トリコモナス症（Trichomoniasis）および 外陰膣炎を含む。性感染症は、性感染病原体により引き起こされる。これらの病原体は、ウイルス病原体、バクテリア病原体、真菌病原体および寄生虫病原体を含む。
【００３７】
多くの性感染ウイルス病原体が当分野において知られている。例えば、後天性免疫不全症候群は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）により引き起こされる。子宮頚部上皮内癌(CIN)はヒトパピローマウイルス(HPV) および単純ヘルペスウイルスに関連する。サイトメガロウイルス感染は、ヘルペスウイスル群のDNAウイルスにより引き起こされる。陰部疣贅は、パピローマウイルス群に属する小さなDNAウイルスであるヒトパピローマウイルス(HPV)により引き起こされる。陰部ヘルペスは単純ヘルペスウイルス２型（Herpes Simplex II virus）(HSV)により引き起こされる。B型肝炎は、複数の抗原性構成成分を有するDNAウイルスである、B型肝炎ウイルス(HBV)により引き起こされる。伝染性軟属腫は、ポックスウイルス（poxvirus）群で最も大きいDNAウイルスである、伝染性軟属腫ウイルスにより引き起こされる。
【００３８】
当分野において知られているバクテリア病原体は、限定されることなく、大腸菌、クラミジアトラコマチス（C. trachomatis）、淋菌（N. gonorrhea）および他のグラム陰性細菌により引き起こされる、急性尿道症候群を含む。軟性下疳は、ヘモフィルス  デュクレイイ（Hemophilus ducreyi）により引き起こされる。米国で最も一般的なSTD感染症のういちの１つであるクラミジアは、クラミジアトラコマチスにより引き起こされる。淋病は、グラム陰性双球菌である淋菌（Neisseria gonorrhea）により引き起こされる。鼠径部肉芽腫は、グラム陰性のカリマトバクテリウム属（calymmato-bacterium）肉芽腫菌（granulomatis）により引き起こされる。鼠径リンパ肉芽腫(LGV)は、免疫型L I、LIIまたはLIII のクラミジアトラコマチスにより引き起こされる。粘液膿性子宮頚部管炎は、クラミジアおよび淋菌により引き起こされる。非淋菌性尿道炎は、免疫型D〜Kのクラミジアにより引き起こされる。骨盤内炎症性疾患は、淋菌、クラミジア、および大腸菌やマイコプラズマ  ホミニス（Mycoplasma hominis）などの他の嫌気性細菌およびグラム陰性桿菌（rod）により引き起こされる。梅毒は、スピロへータである梅毒トレポネーマにより引き起こされる。
【００３９】
真菌病原体は、カンジダ  アルビカンス（Candida albicans）などの酵母を含む。寄生虫感染症は、膣トリコモナスまたは外陰膣炎を引き起こす膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）による原虫感染症を含む。
【００４０】
さらに、本発明の組織相当物は、また、性感染症に関係する腸管感染症に対しても感受性である。これは、胃腸管において運ばれる、多くの性感染性のバクテリア、ウイルス、および原虫により引き起こされる。
【００４１】
重要なことに、本発明の組織相当物は、病原体HIVによる感染に対しても感受性である。この感受性は、組織内の免疫細胞の存在による。本出願人の発見の前は、HIVは生殖器組織内に存在する免疫細胞に感染することにより侵入すると考えられていたが、この仮説にはかなりの論議が取り巻いていた。下記の例における詳細な実験の結果は、HIVは生殖器組織の免疫細胞に感染することにより侵入するという仮説を支持しており、HIV感染のメカニズムのさらなる研究における、組織相当物の有用性を明らかにしている。それはまた、感染の処置および抑制における効果的な中和物質の開発においても有用であることを明らかにしている。
【００４２】
本発明の子宮頚−膣組織相当物は、それが生育される支持体から種々の程度に分離されている組織を包含することが意図される。組織相当物を作製するためには、組織を構成する細胞は、空気−液体界面における培養を容易にする支持体上で培養される。かかる支持体の構成に依存して、支持体またはその構成成分は生育する組織に完全に取り込まれてもよい。１つの態様においては、本発明の組織相当物は、その上で生育する支持体、またはその１種もしくは２種以上の構成成分を、組織の完全な一部として含む。他の態様においては、組織相当物は、組織自体に対する回復不能な損傷を生じることなく、部分的にまたは完全にそれがその上で育成する支持体から分離できる。１つの態様においては、組織相当物は、部分的にまたは完全に支持体から分離されている。
【００４３】
空気−液体界面で細胞増殖を容易にする支持体はいずれも、本発明の組織相当物を作製するのに適している。種々のかかる支持体は、当分野において知られており、当業者により本発明に容易に適合させることができ、より詳細に下記で議論されているものを含む。
１つの態様においては、組織がその上で生育する支持体は、インビボの膣組織において天然に存在する細胞を含む（例えば、膣線維芽細胞または免疫細胞）。かかる支持体が用いられる場合には、支持体中に存在する細胞の一部は、育成している組織に機能的に取り込まれることが期待される。細胞の種類に依存して、ある細胞は基底層に残ってもよく、また、さらに頂端側の層に遊走してもよい。
【００４４】
本発明の好ましい態様は、無血清培地で作製される子宮頚−膣組織相当物である。血清の含量は規定されておらず、供給源およびロット間で変化するので、無血清培地を用いる明確なシステムにおいて作製される子宮頚−膣組織相当物は、はるかにより再現性のある生成物である。さらに、無血清培地で作製されて維持される子宮頚−膣組織相当物はまた、ある種のアッセイにおいてははるかにより有用でもある。例えば、受容体を特異的に標的とするかそうでなければ血清の成分により活性化される化合物の効果を調べるのにより有用である。これはまた、組織を特異的に標的とする、血清中に存在緒する特異的化学物質の効果を調べるのにも有用である。組織の作製および維持における血清の存在は、これら標的の存在を上方制御もしくは下方制御するように働くか、または、これら標的の活性化もしくは不活性化を引き起こし、良くてもデータの解釈を複雑にし、悪ければ不正確な結果を生み出す。したがって、多くの状況においては、無血清培地で作製され、任意に無血清培地で維持された子宮頚−膣組織相当物は、血清の存在により影響される組織相当物と比べて、インビボ組織のためのはるかに優れたモデルシステムとして役立つ。
【００４５】
無血清培地で子宮頚−膣組織相当物の作製を可能にする条件は以下に記載する。
【００４６】
II．子宮頚−膣組織相当物の作製 
本発明の他の側面は、本明細書において記載される子宮頚−膣組織相当物を作製する方法に関する。子宮頚−膣組織相当物の製造のために開発された本方法は、かなりの量の実験の結果である。
【００４７】
一般的に言えば、本方法は、最終的な組織生成物を構成する膣上皮細胞および免疫細胞を提供すること、および空気−液体界面での培養に適した条件下で細胞を一緒に播種することを含む。播種された細胞は、その後、本明細書において記載される子宮頚−膣組織相当物への分化に適切な条件下で、空気−液体界面にて共培養される。
【００４８】
Ａ．種および細胞の種類
「膣上皮細胞」の語は、膣および子宮頚部の上皮細胞を含むことが意図される。「免疫細胞」の語は、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞（CD34+）、単球（CD14+）、未熟樹状細胞（CD1a+、CD4+）、成熟樹状細胞（CD86+、HLA-DR++）、T細胞（CD3+）、およびマクロファージを含む、膣および子宮頚部組織において天然に見出される免疫細胞、またはその前駆体の種類をいう。
【００４９】
組織相当物の作製に提供される膣上皮細胞および免疫細胞は、マウス、ヒトを含む霊長類、家畜などの人工的な繁殖プログラムにおける動物および絶滅危惧種を含む、いかなる数多くの哺乳類の種から由来してもよい。好ましくは、上皮細胞および免疫細胞は、同一の種から由来し、好ましくは組織相当物の作製において用いられる細胞は、モデルが表そうと意図するものと同じ種である。好ましい態様においては、細胞はヒト由来である。膣上皮細胞および免疫細胞は、種々の異なる細胞の供給源から作製されてもまたは由来してもよい。
【００５０】
１つの態様においては、細胞は、インビボの組織に直接由来し、これは本明細書中で初代細胞として言及される。細胞はまた、培養において継代された初代細胞であってもよく、これは本明細書中で継代された初代細胞として言及される。継代された初代細胞は、好ましくは最初に単離された初代細胞からまだ区別できないままであり、増殖抑制、生化学的応答、および培養における有限の寿命を含む、その元の性質を維持している。当業者は、悪性組織（malignant tissue）由来の初代細胞が、増殖抑制または有限の寿命という性質を有さないことを認識している。
【００５１】
好ましくは、初代上皮細胞が由来する組織は、子宮頚部（ectocervical）または子宮頚管（endocervical） 組織である。両方の細胞の種類は、層状の非角化（non-keratinized）上皮組織を形成する。子宮頚管細胞は、インビボの異なる組織を反映して、子宮頚部細胞からつくられる組織よりも薄い組織をつくる。
【００５２】
初代細胞は、正常組織または病態組織のいずれから得られてもよい。病態組織から由来する細胞から生成される組織相当物は、何らかの病態にある膣組織のためのモデルとして特に有用である。病態組織は、限定なく、１種または２種以上の存在する細胞種が病原体に感染しているか、正常細胞と比べて減少した増殖の制御を呈しているか、後天性もしくは遺伝性の遺伝子的欠損を有しているか、または、何らか罹患している組織を含む。
【００５３】
初代または継代された初代細胞の使用に代わるものは、不死化細胞または形質転換細胞の使用である。当分野において知られているように、不死化細胞は老化することなく細胞培養において多継代の能力があると特徴づけられる。形質転換細胞は不死化された性質を共有し、さらに接触阻害されない。当業者は不死化細胞が必ずしも形質転換細胞でないことを認識している。当分野において知られているように、非形質転換、非不死化細胞は、細胞培養において、有限回数だけ継代することができ、終わりには、生存能力の喪失により特徴づけられ、そして培養において細胞が増殖する能力を完全に失うことになる老化を受ける。初代細胞、継代された初代細胞、形質転換細胞および不死化細胞のいずれの組合せも、組織相当物を作製するのに用いることができる。
【００５４】
他の態様においては、提供される細胞は、初代細胞として初めに単離され、その後、播種の前に、望ましい表現型に培養において分化させられる。このアプローチは、特に組織相当物をつくるのにおける使用のための免疫細胞の作製において特に有用である。
【００５５】
組織相当物の作製のために提供される免疫細胞は、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞（CD34+）、単球（CD14+）、未熟樹状細胞（CD1a+、CD4+）、成熟樹状細胞（CD86+、HLA-DR++）、T細胞（CD3+）、マクロファージ、またはこれらのいずれかの組合せを含む。さらに、免疫細胞への前駆体であるいずれの細胞もまた使用に好適であり、但し、それらは必要な細胞の種類へ分化させるために処置される。かかる処置および分化は、組織相当物の作製におけるいかなる時点、例えば、播種前、播種後、または共培養中のいずれで行われてもよい。一定の割合の免疫細胞の分化はまた、組織相当物の寿命にわたって継続するプロセスであってもよい。免疫細胞またはそれらの前駆体は、当分野において既知の標準的方法を用いてインビボの供給源から単離されてもよい。
【００５６】
１つの態様においては、提供される免疫細胞は、単球（CD14+）またはランゲルハンス前駆細胞（CD34+）からインビトロで生成される。単球から免疫細胞を生成させるかかる方法の１つは、下記に例２において詳説される。CD34+細胞から免疫細胞を生成させる他のかかる方法は、下記に例１および例６において詳説される。
【００５７】
１つの態様においては、ランゲルハンス前駆細胞からインビトロにおいて提供される免疫細胞を生成させる方法は、臍帯血、末梢血または骨髄からCD34+細胞をハーベストすることを含む。ハーベストされた細胞は、最初に、幹細胞因子約25ng/ml、GM-CSF約200U/ml、およびTNF-α約2.5ng/mlを含む培地中で、少なくとも下記の１つ：細胞のCD1aもしくはHLA-DRの発現の増加、またはバーベック顆粒の存在、を引き起こすのに充分な期間培養される。１つの態様においては、培養期間は約１〜約１０日であり、好ましくは、約７〜約９日である。この培養期間に続いて、培地は、幹細胞因子約25ng/ml、GM-CSF約200U/ml、IL-4約40ng/ml、およびTGF-β1約0.5ng/mlを含む他の培地に交換される。１つの態様においては、この培養期間は約１〜約１７日であり、好ましくは約５〜約１０日であり、あるいは所望の量の免疫細胞が産生されるまでである。
【００５８】
他の態様においては、ランゲルハンス前駆細胞からインビトロにおいて提供される免疫細胞を生成させる方法は、臍帯血、末梢血または骨髄からCD34+細胞をハーベストすること、ならびに最初に、細胞を、幹細胞因子約20ng/ml、GM-CSF約500U/ml、およびTNF-α約2.5ng/mlを含む無血清培地中で、少なくとも下記の１つ：細胞のCD1aもしくはHLA-DRの発現の増加、またはバーベック顆粒の存在、を引き起こすのに充分な期間培養されることを含む。培養期間は、少なくとも約４日であってもよく、約１０日まで延長されてもよい。その後培養は、幹細胞因子約20ng/ml、GM-CSF約500U/ml、TNF-α約2.5ng/ml、Fms様チロシンキナーゼ２（FLT-3）約20ng/ml、およびTGF-β1約0.5ng/mlを含む無血清培地中で、少なくとも下記の１つ：細胞のCD1aもしくはHLA-DRの発現の増加、またはバーベック顆粒の存在、を引き起こすのに充分な期間継続される。
【００５９】
１つの態様においては、これは少なくとも約５日の期間である。他の態様においては、培養期間は約２０日未満である。次いで、培養は、幹細胞因子約20ng/ml、GM-CSF約500U/ml、IL-4約40ng/ml、FLT-3約20ng/ml、およびTGF-β1約0.5ng/mlを含む無血清培地中で、少なくとも下記の１つ：細胞のCD1aもしくはHLA-DRの発現の増加、またはバーベック顆粒の存在、を引き起こすのに充分な期間継続される。１つの態様においては、培養期間は約２０日未満である。            
【００６０】
他の態様においては、免疫細胞は育成している組織相当物内で分化させられる。これは、下記で詳細に記載される、免疫細胞の分化を惹起しまたは支える培地補充物質の添加により促進されうる。
【００６１】
Ｂ．播種
提供される膣上皮細胞および免疫細胞は、空気−液体界面における培養のために適した条件下で一緒に播種される。これは、空気−液体界面において細胞の増殖を誘導する支持体上に細胞を播種することを伴う。支持体に対する要求の１つは、培地が下から細胞に通り抜けることができるのに充分なほど多孔性であることである。適切な支持体は、下記で詳細に議論される。
【００６２】
空気−液体界面において培養前になされる播種は、標準的方法によりなされる。これは、一般的に液体培地中において所望の比および量の細胞を懸濁すること、および支持体上に細胞を含む培地を載せることを伴う。細胞が壁を有する容器のようなデイッシュに載せられた場合は、容器の底は培養のための所望の支持体である。細胞は支持体上に定着する。播種後の支持体上への細胞の定着は、典型的には重力により、いずれの場所においても数分から数時間かかる。当業者は、支持体上へ細胞を載せる他の数多くの方法を工夫することができ、それらの全ては本発明により包含されることが意図される。１つの態様においては、播種される細胞の量は、約1×103〜約1×107細胞／cm2の膣上皮細胞および免疫細胞である。他の態様においては、細胞の量は約1×105〜約1×106細胞／cm2である。播種される細胞の比は、免疫細胞に対して上皮細胞が約1：1〜10000：1である。好ましい態様においては、免疫細胞に対して上皮細胞が約1：1、10：1、20：1または50：1の比で播種される。
【００６３】
免疫細胞の生存率および／または細胞数を増加させる添加剤を有する培地を補充することにより免疫細胞をより少なく播種することができる。かかる添加剤は、限定することなく、プロゲステロン(Wieser, F., et al., Fertil Steril., 75, 1234-1235 (2001))、IL-12(Esche, C., et al., J. Invest. Dermatol., 113, 1028-1032 (1999); Suemoto, Y, et al, J. Dermatol. Sci., 18, 98 108 (1998))、GM-CSF (Caux, C., et al., Nature, 360, 258 (1992))およびTNF-α (Caux, C., et al., Nature, 360, 258 (1992))を含む。種々の異なる種類の免疫細胞が用いられる場合には、所望量の各種類の免疫細胞の機能的取り込みを確実にするために添加される、全体的な量の１種類または２種類以上の免疫細胞を増加させるのに有益であり得る。
【００６４】
１度細胞が載せられると、インサートは、培養デイッシュ中において懸濁されるかまたは支持され、空気−液体界面に播種された細胞を生育させる間、培養培地が培養物の下側に接近できるようにする。
【００６５】
必要であれば、培養に加えられるべき細胞を含む上記からの少量の培地を添加することにより、空気−液体界面において、培養または共培養中に追加の播種が行われてもよい。このような方法で培養に免疫細胞が添加される場合には、生育しているまたは充分に生育した組織中の免疫細胞の遊走を刺激するために、GM-CSFなどの化学誘引物質（chemoattractant）を、培養物に真下から供給される培地中に取り込むことが望ましい。
【００６６】
Ｃ．支持体
播種のための好ましい容器は、細胞培養インサートであり、種々のものが当業者に知られ、入手できる。当業者は、壁があるおよび壁がない両方のさらなる容器を思い描くことができ、それは本方法における使用に充分であり、その全てが本発明により包含されることが意図される。容器が壁を有する場合には、容器の壁は、細胞が接着し、生育するための支持体として働く多孔性の基剤を有する、ポリスチレン、ポリカーボネート、樹脂、ポリプロピレンまたは他の生体適合性プラスチックからなってもよい。多孔性の基剤または支持体は、生育している組織の真下から培地が通過できるようにしなければならない。多孔性基剤は、ポリカーボネートの膜状基剤であってもよく、細胞がその上で培養される、底に付着したコラーゲン、水和性（wettable）フッ素ポリマー、セルロース、グラスファイバーまたはナイロン製の膜などの、他の培養生体適合性多孔性膜であってもよい。
【００６７】
他の適切な支持体の例は、限定することなく、人工膜、細胞外マトリックス成分、コラーゲンゲル、混合物もしくは格子（lattice）、インビボ由来の結合組織（好ましくは膣／子宮頚部組織由来）、混合コラーゲン−線維芽細胞格子、混合細胞外マトリックス−線維芽細胞格子、プラスチック、およびコラーゲンスポンジ(Morotaら、(2000) 米国特許6,051, 425号)を含む。支持体の孔は、培地が通過できるのに充分なサイズでなければならず、当業者に簡単に決定されうる。１つの態様においては、孔は約0.2μm〜10μmである。多孔性の膜は、本明細書中で記載される他の支持体の１種と共に、重層されてもよい。
【００６８】
好ましくは、支持体の構成成分は細胞接着および組織の育成を促進する。好ましい支持体は、混合コラーゲン−線維芽細胞格子、混合細胞外マトリックス−線維芽細胞格子またはインビボ由来の結合組織（固有層（lamina propria））などの、生存できる線維芽細胞を含むものである。かかる好ましい支持体は、好ましくは膣組織において天然に見出される線維芽細胞を含み、本明細書ではこれは膣線維芽細胞として言及される。
【００６９】
支持体はまた、本明細書中で記載される、免疫細胞などのインビボの膣組織において天然に見出される他の種類の生存できる細胞を含んでもよい。１つの態様においては、支持体はT細胞（CD3+）を含む。
【００７０】
Ｄ．空気−液体界面における培養
１度支持体上に播種されると、細胞を上記の子宮頚−膣組織相当物への分化に適切な条件下での共培養のために空気−液体界面に上昇させる。便宜上、「共培養」の後およびその変化したものは、空気−液体界面での、互いに直接的または非直接的接触している２種類または３種類以上の細胞の増殖および／または分化を特定するのに用いられる。空気−液体界面での細胞の増殖および分化のための方法は、当分野において既知である。共培養は、例えば標準的組織培養インキュベーター中で、標準的条件下で、インキュベートされてよい。子宮頚−膣組織相当物への分化に適切な条件は、培養がインキュベートされる空気の温度および組成、培地の組成（下記で詳細に議論される）ならびに任意に生育している組織への追加の細胞のさらなる播種を含む。好ましい温度および空気は約５％CO2中で約３７℃であるが、軽微な変更は許容されうる。
【００７１】
空気−液体界面での共培養の期間は、約１〜約28日まで延長することができるが、いくつかの場合においてはより長い期間も許容されうる。空気−液体界面共培養の好ましい期間は、約4〜約11日である。
【００７２】
用いられる培地の量は、全く上限なく1cm2あたりわずか0.1mlであってもよい。好ましくは、1cm2あたり2.0〜10.0mlの培地が１日おきに生育している組織相当物に供給される。空気−液体界面における増殖のためにフロースルー（flow through）供給が用いられてもよい。フロースルー供給速度は、培養組織１日あたり1cm2あたりわずか0.05mlであってもよい。好ましいフロースルー供給速度は、培養組織１日あたり1cm2あたり1.0〜5.0mlである。
【００７３】
Ｅ．追加のステップ
本発明の子宮頚−膣組織相当物をつくるための方法は、任意に上記に対する追加のステップを含んでもよい。
好ましい態様においては、一度細胞が空気−液体界面における増殖のために、支持体上に播種されると、共培養のために空気−液体界面に上昇させる前に、細胞増殖に適切な条件下で、増殖培地中で共液中培養される（co-cultivated）。「共液中培養（co-cultivation）」およびその変化したものは、培地中で、互いに直接的または非直接的接触している２種類または３種類以上の細胞の増殖および／または分化を特定するのに用いられる。１つの態様においては、液体（submerged)共液中培養は、約１日〜約２１日の期間である。好ましい液体共液中培養期間は、２〜６日である。上記のようにフロースルー供給もまた液体増殖するのに用いられてもよい。
【００７４】
提供される細胞が多孔性支持体上に播種された後のいかなる間においても、上記方法により、支持体または既に支持体上に存在する増殖／分化している細胞に、追加の細胞がさらに播種されてもよい。
【００７５】
本発明の態様においては、免疫細胞および上皮細胞は、最初に支持体上に一定の量の培地とともに播種され、定着させられる。細胞が定着し、共培養のために細胞を空気−液体界面に上昇させた後、追加の免疫細胞は、継続される共培養および組織の生育のために、生育している組織の上に載せられる。
【００７６】
提供される細胞は、多孔性の支持体上に播種される前に操作されてもよい。１つの態様においては、提供される細胞は、多孔性支持体上に播種される前に、細胞増殖に適切な条件下で、増殖培地中でさらに培養される。この培養期間中、それらは、分化に適切な条件下で任意に液体培養されてもよい。１つの態様においては、免疫細胞は前駆細胞の形成において、播種前に分化に適切な条件下で最初に培養される。
【００７７】
Ｆ．培地
本発明の組織相当物への細胞の増殖および分化のために用いられる培地は、最終的な組織相当物の生成物の性質に影響を及ぼす。他に記載がなければ、本明細書において用いられている「培地」の語は、血清を含む培地および無血清培地の両方を含むことを意味する。「無血清培地」は、血清またはその分画された部分を含まない培地をいう。その化学的組成に関しては、無血清培地の全ての成分および量は、定義され、当分野の組織培養標準により相対的に純粋である。
【００７８】
「分化培地」の語は、本明細書中、空気−液体界面における細胞の増殖のために使用される培地をいうのに用いられる。この培地の目的は、構造および機能においてインビボの組織を模倣するインビトロの組織に組織化するための細胞を誘導することである。分化培地はまた、延長された期間、組織を分化状態に維持するために用いられてもよい。
【００７９】
当分野において知られている種々の細胞培養培地は、空気−液体界面での上皮細胞および、免疫細胞の共培養のための分化培地としての用途に好適であり、その決定は当分野の平均的な者の能力を超えない。１つの態様においては、分化培地はレチノイン酸、レチノール、レチニルアセテート、13-シスレチノイン酸、または9-シスレチノイン酸などのレチノイドを含む。好ましい態様においては、培地は、約10-5M〜約10-13Mのレチノイド（例えば、約5×10-10Mのレチノイン酸などのレチノイド）を含む。１つの態様においては、レチノイドの濃度は、共培養の期間にわたってさらに減少させてもよい。例えば、レチノイン酸のレベルは空気−液体界面培養期間の経過にわたって、約5×10-9M〜約5×10-13Mに減少させてもよい。
【００８０】
好ましい態様においては、分化培地は、１種または２種以上の下記補充物質を含む：
アデニン、α−メラノサイト刺激ホルモン、アラキドン酸、β−線維芽細胞成長因子、ウシ下垂体抽出物、ウシ血清アルブミン、塩化カルシウム、仔牛血清、カルニチン、コレラ毒素、ジブチルサイクリックアデノシンモノホスフェート、エンドセリン−１、EGF（表皮成長因子）、エピネフリン、エストラジオール、エストロゲン、エタノールアミン、ウシ胎児血清、FLT-3（Fms様チロシンキナーゼ３）、グルカゴン、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子、肝細胞成長因子、ウマ血清、ヒト血清、ヒドロコルチゾン、インスリン、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２、インターロイキン−１β、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターロイキン−１８、イソブチルメチルキサンチン、イソプロテレノール、ケラチノサイト成長因子、リノール酸、MIP-1α（マクロファージ炎症性タンパク質−1α）、MIP-3α（マクロファージ炎症性タンパク質−３α）、ウシ新生仔血清、ノルエピネフリン、オレイン酸、パルミチン酸、ホスホエタノールアミン、プロゲステロン、幹細胞成長因子、トランスフェリン、形質転換成長因子−β１、トリヨードチロニン、腫瘍壊死因子α、ビタミンA、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンDおよびビタミンE。
【００８１】
１つの態様においては、分化培地は：約3：1の比のDMEM：ハムF12、約10％ウシ胎児血清、約10ng/ml表皮成長因子、約0.4μg/mlヒドロコルチゾン、約1×10-6Mイソプロテレノール、約5μg/mlトランスフェリン、約2×10-9Mトリヨードチロニン、約1.8×10-4Mアデニン、約5μg/mlインスリンおよび約1×10-6Mレチノイン酸を含む。
【００８２】
他の態様においては、分化培地は無血清である。無血清培地は、当分野において既知の基礎培地または成分を用いてつくってもよい（例えばDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))、PRGM (前立腺上皮細胞増殖培地（Prostate Epithelial Cell Growth Medium)Part # CC-3166, Biowhittaker, Inc. )、ハムF12培地(Ham's F12 medium)、MEM (改変必須培地)、マッコイ5A培地(McCoy's 5A medium)、MCDB 153(分子細胞および発生生物学153培地(Molecular Cell and Developmental Biology 153 medium))、KGM(ケラチノサイト増殖培地(Keratinocyte growth Medium)、Biowhittaker)、EpiLife (Cascade Biologics, Inc.)、または199培地（Medium 199））。１つの様態においては、無血清培地は、約３：１の比のDMEM:F12であり、レチノイン酸などの追加の定義された（無血清の）成分、または本明細書に記載の他の定義された成分が補充される。
【００８３】
好ましい態様においては、無血清分化培地は、約3：1の比のDMEM：F12、約5×10-10Mレチノイン酸、約0.3ng/mlケラチノサイト成長因子、約5ng/mlEGF、約0.4μg/mlヒドロコルチゾンおよび約5μg/mlインスリンを含む。好ましい態様においては、無血清分化培地は、レチノイン酸(RA)約5×10-9M、ケラチノサイト成長因子(KGF)約0.1nM、ヒドロコルチゾン約0.4μg/ml、インスリン約5μg/ml、SCF（約2.5ng/ml）、GM-CSF（約20U/ml）、TNF-α（約0.25ng/ml）およびFLT-3（約2ng/ml）を含むDMEM：F12（約3：1の比）である。
【００８４】
当分野において既知の種々の細胞培養培地は、液体培地における上皮細胞および免疫細胞の共液中培養のための増殖培地としての使用に適している。「増殖培地（propagation medium or growth medium)」の語は、本明細書中では、液体培養における細胞の増殖のために用いられる培地をいうのに用いられる。本明細書において用いられる語としては、増殖培地は液体培養における細胞の分化を惹起するか支持する補充物質を含んでもよく、含まなくてもよい。したがって、この語の使用は、細胞の分化のどのレベルも存在しない細胞増殖のために用いるのに限定されない。かかる培地の例は、限定なく、DMEM、PRGM、SFEM (無血清増殖培地（serum free expansion medium）)、MEM、199培地、KGM、EpiLife、MCDB 153、マッコイ5Aを含む。
【００８５】
１つの態様においては、液体培地における上皮細胞および免疫細胞の共液中培養のための増殖培地は、無血清である。用いられ得る無血清増殖培地の一例は、SCF（約25ng/ml）、GM-CSF(約200 U/ml)、TNF-α(約2.5 ng/ml)およびFLT-3 (約20 ng/ml)を含む（PRGM）である。
【００８６】
増殖培地もしくは分化培地としての使用のための、本明細書において記載されている明確な培地成分または補充物質の有用な濃度および組合せの決定は、追加の補充物質または培地成分の同定と同様に、せいぜい日常的な実験程度による当分野における平均的な技術の者の能力を超えない。
【００８７】
III．子宮頚−膣組織相当物の使用
本発明の別の側面は、子宮頚−膣組織相当物の使用方法に関する。本発明の子宮頚−膣組織相当物は、当分野における種々の異なる用途を有している。１つの側面においては、インビボの膣および子宮頸部組織のためのモデルシステムとして役に立つ。そのようなものとして、インビボ組織において用いられる物質（例えば殺精子剤、感染に対する医学的処置、および感染に対する予防薬）の起こり得る悪影響を決定するのに用いられてもよい。
【００８８】
下記の例においてより詳細に記載されているMTTアッセイは、子宮頚−膣組織相当物が、インビボでの子宮頚部−膣の刺激を予測するのに用いられ得るアッセイである。当分野において既知の他のこのようなアッセイは、子宮頚−膣組織相当物を用いた使用のために容易に用いられるかまたは適合されうる。例えば、組織学的に観察される構造的損傷または炎症誘発性サイトカインの放出などの刺激のマーカーを同定するアッセイを用いてもよい。刺激に加えて、アレルギー型反応の進行の可能性もまた本明細書に記載の組織相当物を用いて評価され得る。
【００８９】
子宮頚−膣組織相当物はまた、インビボの膣および子宮頸部組織に感染する病原体による感染に対して感受性であるので、病原体感染の処置または予防のために用いられる物質の効果を決定するのに用いられてもよい。処置に関しては、進行している感染を処置するために（例えば、病原体を壊滅させるまたは病原体のさらなる拡大を抑制するために）設計された物質の有効性を調べるのに用いられもよい。予防に関しては、感染を引き起こし得る微生物を膣管において殺すように設計された殺菌剤の有効性を調べるために用いられてもよく、また、感染を防ぐバリヤ方法の効率を調べるために用いられてもよい。組織相当物は、それが作製された細胞の種類に依存して、正常な健康の膣組織、または代わりに病態の膣組織のためのモデルとして役立ってもよい。
【００９０】
例10において示されるように、本明細書において記載の方法により作製された組織相当物は、完全にそれが生成している組織培養インサートの表面にわたって完全に拡がっており、組織バイパスの問題なしに、病原体または処置もしくは予防剤の局所的適用を可能にする。さらに、多数の高度に再生可能な組織が単一の子宮頚−膣組織外植片から培養され得る。
【００９１】
子宮頚−膣組織はまた、病原体の感染、適合性個体の手術もしくは傷害により損傷されたインビボの膣または子宮頚部組織を置き換えるための移植方法において用いられてもよい。かかる移植の方法は、一般的に当業者に知られているかまたは利用され得る。
【００９２】
本発明はさらに、限定として解釈されるべきでない下記例により説明される。本出願にわたって引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、その図と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
例
例１−子宮頚−膣組織相当物の作製および特徴
樹状細胞、ランゲルハンス細胞、前駆細胞などの免疫細胞と共に、子宮頚部、子宮頚管上皮細胞の両方、または膣上皮細胞の供給源が子宮頚−膣組織相当物をつくるのに必要である。この例においては、初代子宮頚部上皮細胞をヒト子宮頚部組織から得た。ランゲルハンス細胞(CD1a+細胞)は、サイトカインを用いて、ランゲルハンス前駆細胞（CD34+細胞）を分化させることにより得られた。ランゲルハンス前駆細胞は、臍帯血サンプルからハーベストした。
【００９４】
上皮細胞
上皮細胞は、子宮摘出（hysterectomy）を受けた女性から得られた子宮頚部組織および膣組織から得た。組織の手術による除去の後、組織をペニシリンストレプトマイシン(1 mg/ml)およびゲンタマイシン(0.5 mg/ml)の10×濃縮物を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)に入れ、組織を処理できるまで、４℃で保存した（２４時間以内）。初代培養を開始するために、下にある結合組織を上皮層から切除した。ある実験においては、下にある結合組織は、膣線維芽細胞をハーベストするために残しておいた。上皮組織は、メスを用いて厚さ約1〜2mmの薄い切片に切った。次いで、切片を縦方向に何度も切り、上皮組織の小さい立方体をつくった。立方体は約2mm×2mm以下であった。その後、組織立方体を0.025％ トリプシン／0.025％EDTAに入れて、１時間37℃および5％CO2でインキュベートした。組織およびトリプシン／EDTA混合物はこの間、時々穏やかに撹拌した。１時間後、培地を除き、600 X g で5 分間遠心し、子宮頚部および膣上皮細胞のペレットを得た。培地を遠心チューブから吸引除去し、細胞をLife Technologies (Rockville, MD)から市販されているリン酸緩衝生理食塩水(PBS)／大豆トリプシンインヒビター(STI) に再懸濁した。
【００９５】
その後、細胞を再遠心し、培地を除いて細胞をBiowhittaker, Inc (Walkersville, MD)から購入したPRGMに懸濁した。細胞／PRGM混合物を次いで細胞数の単層増殖のために組織培養処理されたペトリディッシュに加えた。500〜5000細胞／cm2で播種した。細胞を、約70〜80％コンフルエントに達するまで、低倍率光学顕微鏡で観察しながら、4〜10日間にわたり37℃および5％CO2で培養した。低倍率光学顕微鏡により判断しながらトリプシン／EDTAを5〜9分間加えて、細胞を剥がした。得られた細胞懸濁液を遠心して培地を吸引して捨て、細胞を新鮮なPRGMに懸濁した。細胞を計数して、層状組織の播種のためにすぐに使用し、または細胞数の単層増殖を継続するために新しいペトリディッシュに継代し、または将来の使用のために低温保存した。低温保存する場合は、細胞をPRGM/FBS/ジメチルスルホキシド(DMSO)、80/10/10中に、約1×106 細胞／ml に調整した。
【００９６】
ランゲルハンス細胞
精製されたCD34+細胞は、イムノマグネチックビーズ（immuno-magnetic bead)(Dynal Inc., Lake Success, NY)を用いて、臍帯血から単離した。細胞の生存率をトリパンブルー排除法を用いて確認された：生存率は受領した全てのサンプルにおいて＞95％であった(n=10)。単離された細胞(2.5×105細胞／ml) は、11日間、幹細胞因子(SCF；25ng/ml)、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子(GM-CSF；200 U/ml)および腫瘍壊死因子(TNF-α;(2.5ng/ml)ならびに抗生物質を補充したStemSpan（登録商標）無血清増殖培地(SFEM, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)中で培養した。4日後、培地にさらにTGF-β1(0.5 ng/ml)をさらに補充し、11日まで培養を続けた。その後、細胞を計数し、ランゲルハンス細胞の重要なマーカーであるCD1aの存在に対してFACSを用いて特徴づけた。４つの代表的な帯血サンプルから得られたランゲルハンス前駆細胞の数を表１に示す。40mlの帯血が平均して31×106 ランゲルハンス細胞を産生し、そのうち、41％がCD1a+であった(n = 3 の調製物)。この方法で調製されたランゲルハンス前駆細胞は、すぐに上皮細胞と共に播種されるか、またはStemSpan（登録商標）無血清増殖培地(SFEM, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)および10％DMSOからなる凍結培地中でmlあたり5×105細胞で低温保存された。
【００９７】
表１：例１の方法を用いて帯血由来のランゲルハンス前駆細胞（CD34+）から産生されたランゲルハンス細胞(LC)
【表１】
2005530500.tif 000002
＊培養の初日を０日としている。
【００９８】
分化した組織を産生するための細胞の培養
PRGMに懸濁された2.5×105 個の子宮頚部上皮細胞（EEC）および無血清増殖培地に懸濁された2.5×105 個のランゲルハンス細胞を、NalgeneNunc International (Naperville, IL)から市販されている、ポリカーボネートの組織培養処理されている微小孔性膜（microporous membrane）細胞培養インサートに加えた。細胞培養インサートは、３日間37℃かつ５％CO2のインキュベーターで、1.8mlの増殖培地(PRGM)中で維持された。３日に、増殖培地を除き、RA 5×10-9M、ケラチノサイト成長因子(KGF) 0.1nM、ヒドロコルチゾン0.4μg/ml、インスリン5μg/mlを含むDMEM：F12（3：1）からなる分化培地に換えた。増殖培地と比較して、分化培地は、細胞培養インサートの微小孔性膜を通って、培養物の基底側（basolateral）(底)表面のみに対して補充された；すなわち、培養物の先端側（頂端側）表面は乾燥しているようにした。組織を培養するこの方法は、空気−液体界面（ALI）での培養として一般に言及されている。空気−液体界面での組織の培養のための装置の説明図を図１において示す。次の７日にわたって、RAの濃度を5×10-9M〜5×10-13Mに減らした。培地は１日おきに交換した。生成した組織は下記のように特徴づけられた。
【００９９】
培養物を10％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋して、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)により染色した。3〜5μm厚のミクロトーム（microtomed）断切片（cross-section）を観察して、Nikon Diaphot顕微鏡を用いて撮影した。インビトロ子宮頚部−膣組織の典型的組織学的H&E染色断切片の顕微鏡写真を、同様にして得られた正常ヒト子宮頚部−膣組織外植片の顕微鏡写真と比較した。
【０１００】
PAS染色 
インビトロで生成した組織およびインビボの子宮頚部−膣組織内のグリコーゲンの存在を、過ヨウ素酸シッフ（periodic acid Schiff) (PAS)試薬を用いて決定した。インビトロで作製された子宮頚部−膣組織および正常ヒト子宮頚部−膣組織のホルマリン固定断切片をPAS試薬と反応させ、標準的組織学的手法を用いてヘマトキシリンを用いてカウンター染色した（counter stained）(Carson, F. I., Histotechnology: Aself-instructional text, Amer. Soc. Clin. Pathologist Press, Chicago 112-117 (1997))。前記の２つを同様にして得られたものと比較した。
【０１０１】
免疫組織化学解析
組織のサイトケラチンの解析のために、3〜5μm厚のパラフィン包埋断切片をスライドグラスにマウントし、抗原の探索のためにクエン酸塩緩衝液(pH 6.0)中で20分間95〜99℃で加熱することにより処理した。20分後、標本を水浴から取り出し、さらに20分間室温(RT)にて、クエン酸塩緩衝液中に立たせておいた。全ての抗体は、室温で30分間1：30の濃度で適用した。CK13(Sigmaから購入)、CK14(Research Diagnostics, Inc.から購入)、CK16(Novacastraから購入)およびCK18(DAKO, Carpinteria, CAから購入)、または、樹状細胞マーカーHLA-DR (マウス抗ヒトHLA-DR、PharMingen, San Diego, CA)に特異的な抗体である。２次抗体(ヤギ、抗マウス)は１次抗体を識別するために用い、結合した抗体を陽性の細胞を赤く染める基質としてFast Red (DAKO, Carpinteria, CA)を用いてアルカリホスファターゼ検出システムにより可視化した。
【０１０２】
透過型電子顕微鏡(TEM)
透過型電子顕微鏡の手順は、以前に記載されたものに従った(Cook, J.R., et al.. J. Toxicol. ：Cutaneous and Ocular Toxic. 12：109-128 (1993))。簡単には、培養物をカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH7.2の5％グルタルアルデヒド溶液を用いて室温で２時間固定した。その後、サンプルを洗い、カコジル酸ナトリウム緩衝液の１％四酸化オスミウム溶液中で後固定し（postfixed）、段階的な一連のエタノール中で脱水し、スパー低粘度エポキシ樹脂(Spurr's low-viscosity epoxy resin )(Polysciences, Inc. , Warrington, PA)中に包埋した。超薄切片を炭素安定化(carbon-stabilized）フォムバー被膜グリッド(Formvar-coated grid)上にマウントし、Hitachi 7000 透過型電子顕微鏡で観察する前に、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。Harvard Medical School(Boston, MA)のTEM設備を用いた。インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物についてTEM顕微鏡写真を撮影し、正常ヒト子宮頚部−膣組織を示している。インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物に用いられた固定剤はK4Fe(CN)6を含んでいたが、摘出された正常ヒト子宮頚部−膣組織に用いられた固定剤はこれを含んでいなかったことに注意されたい。
【０１０３】
結果
免疫染色の結果を表２に要約する。インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物は、インビボの組織と類似の形態および組織像を呈していた。H&E組織断切片は、インビトロで作製された組織およびインビボの組織が同様に有核基底細胞および多くの有核基底上細胞層を有していることを示した。調べた両方の組織においては、インビボおよびインビトロの組織のPASを反応させた断切片の顕微鏡写真において見られたように、これらの層は核およびオルガネラを喪失して、細胞がグリコーゲンで満たされた層に続いていた。両方の組織において、グリコーゲン染色の強度は、頂端側の表面に近づくにつれて増加した。
【０１０４】
グリコーゲン含量をアッセイした場合には、インビトロで作製された子宮頚部−膣組織および正常ヒト子宮頚部−膣組織の両方の細胞が、同様に、漸次的にグリコーゲンで満たされており、頂端側の表面に向かってそのオルガネラを喪失していることが観察された。  インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物については、免疫組織化学解析により、インビボにおいて見出される細胞マーカーの存在を解析した。インビトロおよびインビボの組織で検出されたサイトケラチンの存在について、表２に要約する。インビトロで作製された子宮頚部組織および摘出された正常ヒト子宮頚部組織の両方において、CK14は基底層で観察され、CK13はより分化した基底上層で観察された。CK18の発現はいずれの組織においても観察されなかった。
【０１０５】
表２：インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物およびインビボの子宮頚部組織における、サイトケラチンの発現
【表２】
2005530500.tif 000003
【０１０６】
インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物はまた、ランゲルハンス細胞マーカーであるHLA-DRの存在に関して染色することにより、ランゲルハンス細胞の存在について特徴づけられた。HLA-DRを発現しているランゲルハンス細胞は、インビトロで作製された組織において、摘出された正常ヒト子宮頚部−膣組織において見られたのと同様の位置および密度で観察された。HLA-DR陽性の細胞は、インビボの組織と同様に、組織相当物の基底上層において存在していた。これは、インビトロで作製された組織が、正常ヒト組織と同様にランゲルハンス細胞を取り込んだことを示している。インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物は、透過型電子顕微鏡により形態学的にさらに特徴づけられた。この解析により、インビトロで作製された組織の頂端側の表面に近い細胞は、ジッパー様のパターンで高度にかみ合うようになるということにおいて、正常な子宮頚−膣上皮の形態学的な特徴的性質（Sargeant, P., et al., J. Submicrosc. Cytol. Pathol., 28, 161-170(1996))が明らかになった。さらに、頂端側表面における微小隆線も明らかであった。組織の下方の層に位置する細胞の間に数多くのデスモソームが観察された。
【０１０７】
例２−子宮頚−膣組織相当物を作製するための、単球由来のランゲルハンス細胞の使用
単球から単離されたランゲルハンス細胞は、インビトロの子宮頚−膣組織の作製において同様に良好に行った。単球から産生されたランゲルハンス細胞を含む、インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物において、例１で行われたのと同じ実験を行った。
【０１０８】
前駆細胞からのランゲルハンス細胞の作製
精製されたマクロファージは、製造者の推奨にしたがってイムノマグネチックビーズ (Dynal Inc., Lake Success, NY)を用いて、またはプラスチックへの接着により、帯血／成人血液由来の単核細胞（MNC）から消極的に単離された。MNC(1×107)は、0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、20μlのブロッキング試薬および20μlの抗体混合物（Dynalから提供されている単球キット）を添加した200μlのPBS中に再懸濁し、4℃で10分間インキュベートした。その後細胞を２回洗い、0.1％BSAを含むPBS中に再懸濁した。Depletion Dynalbeads (100μl／1×107細胞) を次いで加えて、細胞を4℃で15分間、穏やかに傾斜および回転させながらインキュベートした。細胞をピペッティングし、その後、Dynal Magnetic Particle Concentrator(MCP)-6を用いて、ビーズ−細胞ロゼット(bead-cell rosette)の磁性分離を2分間行った。消極的に単離されたマクロファージを含む上清を集めて遠心した。単離されたマクロファージを計数し、培養し、または使用するまで液体窒素中で低温保存した。単離された単球(5.0×105細胞／ml)は、GM-CSF (200 U/ml)、IL-4(200 U/ml)、5％ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を補充したOPTI-MEM培地(GIBCO BRL Life Technologies, Rockville, MD)中で８日間培養した。培養８日後、培養物からランゲルハンス細胞が産生された。
【０１０９】
ランゲルハンス細胞は子宮頚−膣細胞と組み合わせて、例１において記載されている通りに培養し、分化した組織を作製した。作製された組織は、例１におけるのと同じ方法により評価され、同じ結果を出した。
【０１１０】
例3−ランゲルハンス前駆細胞の使用 
この例は、ランゲルハンス細胞の代わりに、ランゲルハンス前駆細胞を用いた以外は、例１と同じである。増殖および分化培地にサイトカインを添加し、組織の育成と同様にそのまま（in situ）ランゲルハンス前駆細胞をランゲルハンス細胞に成熟させた。
【０１１１】
PRGMに懸濁された2.5×105 個の子宮頚部上皮細胞（EEC）およびSFEMに懸濁された2.5×105 個のランゲルハンス細胞を、NalgeneNunc International (Naperville, IL)から購入した、ポリカーボネートの組織培養処理されている微小孔性膜細胞培養インサートに加えた。細胞培養インサートは、7日間37℃かつ５％CO2のインキュベーターで、SCF(25 ng/ml)、GM-CSF(200 U/ml)、TNF-α(2.5 ng/ml)およびFLT-3 (20 ng/ml)を含む増殖培地(PRGM)1.8ml中で維持された。7日に、増殖培地を除き、レチノイン酸（RA)5×10-9M、ケラチノサイト成長因子(KGF) 0.1nM、ヒドロコルチゾン0.4μg/ml、インスリン5μg/ml、SCF(2.5 ng/ml)、GM-CSF(20 U/ml)、TNF-α(0.25 ng/ml)およびFLT-3 (2 ng/ml)を含むDMEM：F12（3：1）からなる分化培地に換えた。増殖培地と比較して、分化培地は、細胞培養インサートの微小孔性膜を通って、培養物の基底側(底)表面のみに対して補充された；すなわち、培養物の先端側（頂端側）表面は乾燥しているようにした。例１と同様に、次の７日にわたって、レチノイン酸の濃度を5×10-9M〜5×10-13Mに減らした。培地は１日おきに交換した。
これは、例１および２に記載の方法により解析したところ、例１および２においてランゲルハンス細胞により産生されたものと同様の組織相当物を形成していた。
【０１１２】
例４−コラーゲンゲル／線維芽細胞マトリックスの添加
この例は、上皮細胞およびランゲルハンス細胞を添加する前に、ポリカーボネートの組織培養微小孔性膜細胞培養インサートに、コラーゲンゲル／線維芽細胞マトリックスを処理した以外は、例１と同じである。線維芽細胞は、例１の子宮頚部上皮組織から採取された下にある結合組織からハーベストされた。上皮組織と同様に、メスを用いて厚さ約1〜2mmの薄い切片に切った。次いで、切片を縦方向に何度も切り、上皮組織の小さい立方体を得た。好ましくは立方体は約2mm×2mm以下であった。その後、組織立方体を、各立方体において2〜3滴のDMEM＋10％FCS＋抗生物質(0.25μg/ml ファンギゾン(fungizone）、0.5 mg/ml ゲンタマイシン、および1 mg/ml ペニシリン／ストレプトマイシン)と共に、100mmの組織培養処理されたペトリディッシュ中に入れた。次に、ペトリディッシュを37℃かつ5％CO2で３日間インキュベーターに入れた。
【０１１３】
３日後、接着していない組織片を滅菌された鉗子を用いて取り除き、10.0mlのDMEM＋10％FCS＋抗生物質を加えた。細胞をインキュベーターに戻して、27日間、１日おきに10.0mlのDMEM＋10％FCS＋抗生物質を供給した。低倍率光学顕微鏡により観察しながら、細胞が90〜95％コンフルエントになった27日に、培地を除き、ペトリディッシュを10mlのPBSを用いて洗った。次に、2mlの0.025％ トリプシン／0.025％EDTAで約30分間処理することにより、ペトリディッシュから細胞をはがした（続いて低倍率４倍対物の顕微鏡観察により、ペトリディッシュからの細胞の剥離が行われた）。
【０１１４】
トリプシン／EDTAを除き、Life Technologies (Rockville, MD)から購入した大豆トリプシンインヒビター(STI) 10mlの２つの分注物を加えた。に再懸濁した。STI細胞混合物をその後600×gで5分間遠心し、膣線維芽細胞のペレットを得た。培地を遠心チューブから吸引除去し、細胞をBiowhittaker, Inc(Walkersville, MD)から市販されている DMEM／10％FCS＋抗生物質に再懸濁し、細胞を計数した。この方法を用いて、単一の手術外植片から4.5×106個の線維芽細胞が得られた。線維芽細胞は、以下に記載のコラーゲンゲル／線維芽細胞マトリックスの形成に速やかに用い、または将来の使用のために低温保存した。低温保存する場合は、細胞をDMEM/FCS/ジメチルスルホキシド(DMSO)、80/10/10中に、1×106細胞／ml に調整した。
【０１１５】
コラーゲンゲル／線維芽細胞マトリックスは、0.1％酢酸1.6 mlを含む6.4 mlのタイプ1ラット尾コラーゲン (5.0 mg/ml)、1 mlの冷却されたフェノールレッドが添加されている10×ハンクス緩衝生理食塩水溶液(Hanks Buffered Saline solution)(HBSS)(pH 7.2)を混合することにより調製された。この溶液は中性pHに調整した。次に、6×105個の膣線維芽細胞を含む1mlのウシ胎児血清（FCS）をコラーゲン−線維芽細胞溶液に添加した。250μlのこの混合物を、培養インサートに加え、37℃で1時間インキュベートすることによりゲル化させた。その後、コラーゲンゲル／線維芽細胞／マトリックスを２mlの培地中にインサートを浸すことにより、PRGMを用いて平衡化し、続いて37℃で48時間インキュベートした。次いで、適切な量の上皮細胞および樹状細胞の懸濁液を、コラーゲンゲル／線維芽細胞マトリックスで覆われている細胞培養インサートの頂端側に加えた。培養条件は例１の通りに継続された。同じ方法は、例２のランゲルハンス細胞または、ランゲルハンス前駆細胞を用いる例３の方法を使用して行われてもよい。コラーゲンゲル−線維芽細胞マトリックスを用いてつくられた組織のH&E染色された組織断切片は、例１においてつくられた組織と同じにみえる組織を形成していた。
【０１１６】
例５−コラーゲンゲル／線維芽細胞マトリックスのT細胞への添加
この例において続く手順は、T細胞が豊富な末梢血単核細胞（PBMC）をコラーゲンゲル／線維芽細胞マトリックスに添加する以外は、例４と同じであった。PBMCをHistopaque gradient(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)を用いて帯血細胞から分離した。40mlの帯血から、この方法を用いて平均1×108個のPBMCを得た。約1×107個のPBMCを0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、10％ウシ胎児血清、20μlの抗体混合物（Dynal Inc., Lake Success, NYから提供されているT細胞の消極的単離キット）を添加した200μlのPBS中に再懸濁し、4℃で10分間インキュベートした。その後細胞を２回洗い、0.1％BSAを含むPBS中に再懸濁した。Depletion Dynal beads (100μl／1×107PBMC) を次いで加えて、細胞を4℃で15分間、穏やかに傾斜および回転させながらインキュベートした。
【０１１７】
細胞をピペッティングし、その後、Dynal Magnetic Particle Concentrator(MCP)-6を用いて、ビーズ−細胞ロゼットの磁性分離を2分間行った。消極的に単離されたT細胞を含む上清を集めて遠心した。その後、単離されたT細胞を計数した。40mlの帯血から、平均25×106個のT細胞が単離された。これらの細胞の生存率をトリパンブルー排除により決定したところ、＞95％であり、これらの細胞の表現型の特徴は、T細胞マーカーであるCD3の高発現を示した(＞70％)。25000個のT細胞を、細胞培養インサートに添加された例４のコラーゲン／膣線維芽細胞混合物250μlに加えた。
【０１１８】
次に、適切な量の上皮細胞および樹状細胞を、コラーゲンゲル／線維芽細胞マトリックスに覆われている細胞培養インサートの頂端側に添加した。培養条件は例１の通り続けられた。例２の樹状細胞および／または例３のランゲルハンス前駆細胞は、これらの方法の適合によりコラーゲンゲル／線維芽細胞マトリックスに取り込まれてもよい。
【０１１９】
得られた組織の組織像は、例４の組織のものと同じであった。組織断切片の免疫染色により、分化した組織の下にあるコラーゲンマトリックス中において取り込まれて生存しているT細胞を確認した。T細胞は、CD3（T細胞マーカー）に対するモノクローナル抗体を用いて陽性に染まった。T細胞をコラーゲンマトリックスに添加していないコントロールの組織においては、染色は観察されなかった。
【０１２０】
例６−継代された上皮細胞の使用およびランゲルハンス細胞の改善された調整方法
例１において記載されているように、子宮頚部組織からハーベストされた初代上皮細胞を、0.5mlの低温バイアルにおいてPRGM/FBS/ジメチルスルホキシド(DMSO)中、1×106細胞／mlで低温保存した。低温バイアルの内容物を、３７℃の水浴中で融解し、30mlのPRGMを含む直径150mmの組織培養処理されたペトリディッシュ２つに加えた。上皮細胞は、70〜75％コンフルエントになる時点である７日まで、１日おきに上皮細胞に供給された。5mlの0.025％ トリプシン／0.025％EDTAで約1分間処理することにより、ペトリディッシュから細胞をはがした（続いて低倍率４倍対物の顕微鏡観察により、ペトリディッシュからの細胞の剥離が行われた）。１度細胞が剥がれたら、過剰のトリプシンを大豆トリプシンインヒビター(STI)を用いて中和し、PRGM培地中で懸濁し、ばらばらにした。これらの２次継代（second passaged）細胞は、例１において用いられた初代上皮細胞と同じ方法で、細胞培養インサートに添加された。
【０１２１】
精製されたCD34+細胞は、イムノマグネチックビーズ (Dynal Inc., Lake Success, NY)を用いて、臍帯血から単離された。細胞の生存率は、トリパンブルー排除法により確認した：受領した全てのサンプルについて、生存率は＞95％であった（n=10）。単離された細胞（2.5×105細胞／ml）は、幹細胞因子(SCF；20 ng/ml)、顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子(GM-CSF；500 U/ml)および腫瘍壊死因子(TNF-α；2.5 ng/ml)ならびに抗生物質が補充された無血清増殖培地中で、３日間培養した。４日に、0.5 ng/ml TGF-β1および20 ng/ml FLT-3をさらに補充して、培養を９日まで続けた。９日に、TNF-αを除いて、40 ng/mlのIL-4を加えた。
【０１２２】
12日に、細胞を計数し、ランゲルハンス細胞の重要な表面上物であるCD1aの存在についてFACSを用いて特徴づけした。５つの代表的な帯血サンプルから得られた、ランゲルハンス細胞の数およびランゲルハンス細胞のCD1aの発現を表３に示す。40mlの帯血から平均して128×106個のランゲルハンス細胞が得られ（調製物n=5）、そのうちの53％がCD1a+であった（調製物n=3）。この方法で調製されたランゲルハンス細胞は、いずれもすぐに上皮細胞と共に播種し、または、将来の使用のために、StemSpan（登録商標）無血清増殖培地(SFEM, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)および10％DMSOからなる凍結培地中に、5×105細胞／mlで低温保存した。
【０１２３】
分化した組織は、これらの細胞および例１に記載の方法を用いてつくられた。細胞は、５日間液中で維持され、７日間空気−液体界面で培養された。IL-12(1 ng/ml)およびレチノイン酸 (5 ×10-10 M)が、例１に記載の分化培地に添加された。これらの濃度は、培養期間にわたって維持された。全ての他の条件は、例１に記載されたものと同じである。２次継代細胞から構成される子宮頚部／ランゲルハンス細胞組織のH＆E染色断切片は、例１において産生された組織と同じであった。
【０１２４】
表３：例６の方法を用いて帯血由来の接着性単球（adherent monocyte）から産生されたLC
【表３】
2005530500.tif 000004
培養初日を０日としている。
n.m.= not measured(未測定)
【０１２５】
例７−ランゲルハンス細胞／子宮頚−膣組織相当物をつくるための無血清増殖培地
低温保存された、皮膚由来の、正常ヒト表皮ケラチノサイト（NHEK）をCascade Biologics (Portland, OR)から購入し、Human Keratinocyte Growth Supplement (Cascade Biologics)が補充された154培地(Medium 154)中で、Cascade Biologicsにより提供されている説明書の通りに単層培養で増殖させた。子宮頚部上皮細胞(EEC)は、例１に記載の通りに子宮頚部組織から単離した。さらに、ランゲルハンス細胞を例１に記載の通りに調製した。その後、Nuncの細胞培養インサートに、125000個のランゲルハンス細胞および250000個のa)正常ヒト表皮ケラチノサイトもしくはb)子宮頚部上皮細胞のいずれかを播種した。これらの組織は、４日間、１日おきに培地交換をしつつ、PRGM 2.0ml中で維持された。４日に、組織は空気−液体界面に上昇させ、さらに125000個のランゲルハンス細胞をインサートに播種した。空気−液体界面において、5.0mlの下記培地を用いた：DMEM：F12 (3：1)+ 5×10-10M RA、0.3 ng/ml KGF、5 ng/ml EGF、0.4μg/mlヒドロコルチゾンおよび 5μg/ml インスリン。
【０１２６】
形成されたインビトロで作製された子宮頚−膣組織およびインビボの子宮頚−膣組織のH&E組織断切片を分析し、同じ培養培地を用いて表皮ケラチノサイトを培養した場合に形成されたH&E組織断切片と比較した。子宮頚−膣細胞は、インビボの組織に極めて類似した組織を形成した。他方、表皮ケラチノサイトから形成された組織は、顆粒層および角質層の存在により証明される通り、皮膚に極めて類似していた。インビトロで作製された子宮頚−膣組織の他の特徴は、上記に議論されたものと等価であった。
【０１２７】
例８−血清含有培地の使用
この例は、組織を分化させるために用いた培地が、3：1 の比のDMEM：ハムF12、10%ウシ胎児血清、10 ng/ml表皮成長因子、0.4μg/ml ヒドロコルチゾン、1×10-6Mイソプロテレノール、5 ug/mlトランスフェリン、2×10-9 M トリヨードチロニン、1.8×10-4 Mアデニン、5μg/mlインスリンおよび1×10-6 Mレチノイン酸である以外は、例１と同じである。培養物は、１日おきに培地交換をしながら、2.0mlのこの培地を用いて、５日間液中で培養中で維持された。その後培養物を、イソプロテレノール、トランスフェリン、トリヨードチロニンおよびアデニンを除いた以外は同じ培地5.0mlを用いて、空気−液体界面に置いた。組織像が上記例において作製された組織のものと（これらの種類の培養物において観察される通常の多少のばらつきの範囲内で）等価な組織が得られた。上記の組織の特徴と等価な組織の特徴もまた観察された。
【０１２８】
例９−膣刺激を予測するための組織モデルの使用
上記例１において作製された子宮頚−膣組織培養物を、MTTアッセイを用いてインビボの刺激の結果と相関させるために用いた。
【０１２９】
MTT組織生存率アッセイ
MTT組織アッセイは、全体的な生存率(Mosmann, T., J. Immunol. Meth., 65, 55(1983)) および増殖性(Klausner, M., Kubilus, J., et al., in Advances in Animal Alternatives, eds. Salem, H. , Katz, S. A., Taylor & Francis, Washington, DC, 347-357 (1997))を定量する、容易かつ正確な手段を提供する。MTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)は、生存細胞に取り込まれ、紫のホルマザンを形成するミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより、減少する色素である。機能しているミトコンドリアを有する生存細胞のみがこの反応を行うので、産生された有色のホルマザンの量が生存細胞数に比例する(Mosmann, T., J. Immunol. Meth., 65, 55(1983))。
【０１３０】
アッセイでは、組織培養物は試験物質に暴露され、試験物質は種々の時間で培養物の頂端側表面に適用される。試験物質により引き起こされる細胞の損傷は、暴露された組織にMTTアッセイを行い、同様にアッセイされた暴露されていない組織の結果と比較することにより、定量される。一般的な殺精子剤である、ノノキシノール−９に暴露した、インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物についてのサンプルの用量作用曲線を図２に示す。組織生存率を５０％にまで減少させるのに必要な暴露時間（ET-50）のグラフによる決定が説明されている。数学的補間を用いてET-50の実際の計算がなされた。
【０１３１】
より刺激的な物質はより短いET-50を有し；より刺激的でない物質は、より長いET-50を有するか、または極めて長い暴露時間に対してさえも組織生存率について５０％未満の減少しか起こさない。このアッセイは、皮膚刺激(Perkins, M. A., Osborne, R., Rana, F. R., Ghassemi, A., and Robinson, M. K.,"Comparison Of In Vitro And In Vivo Human Skin Responses To Consumer Products And Ingredients With A Range Of Irritancy Potential,"Toxicological Sciences, 48, 218-229(1999);Genno, M., Yamamoto, R. Kojima, H., Konishi, H. and Klausner, M., "Evaluation of New Alternative to Primary Draize Skin Irritaion Testing Using The EpiDerm(TM) Skin Model,"Altern. Animal Test. Experiment. 5, 195-200(1998))および眼刺激を予測するために、非角化表皮組織モデルであるEpiOcular（登録商標）（Stern, M., et al, Toxicology In vitro, 12, 455-461,(1998)）を用いて、通常使用される。
【０１３２】
MTTアッセイにおける子宮頚−膣組織相当物の使用
例１の通りにつくられたインビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物およびEpiOcular（登録商標）眼組織（Stern, M., et al, Toxicology In vitro, 12, 455-461,(1998)）を、100mgの３つの試験物質に暴露した：１）KY Brand Jelly personal lubricant(KYブランドゼリー個人用潤滑剤)(Personal Products Company, Division of McNeil-PPC, Inc., Skillman, NJ, 08558)；２）KY Plus 2％ Nonoxynol-9 Lubricant Spermicide （KYプラス2％ノノキシノール−９潤滑殺精子剤）(Personal Products, Company)；および３）10％ノノキシノール−９（Nonoxynol-9）(JEECHEN NP-9, JEEN International Corporation, Fairfield, NJ)を、市販されているKY Plus  Nonoxynol-9 (2％)Lubricant Spermicideに加えて調製された、KY と12％ノノキシノール−９の実験用組成物。これらの各製品を１〜２４時間、重複組織に暴露した。高い粘性、すなわちKY Jellyのゲル様性質のために、100mgの組成物を、0.50cm2の円形領域を有する塗布ピンの平面末端に均一に拡げた。
【０１３３】
次いで、塗布ピンを逆にして、組織の頂端側表面に穏やかに接触させた。塗布ピンは暴露の間、置いておき、その間組織を３７℃および５％CO2でインキュベートした。各暴露時間が完了した後、組織培養インサートを少なくとも３回PBSを含むビーカーに浸して、その後デカントすることにより試験物質を洗い流した。試験物質が完全に除去されていない証拠がある場合には、さらなるPBS洗浄／デカントサイクルを行った。洗浄後、組織を12ウェルプレート中の5.0mlのアッセイ培地に10分間浸し、試験物質の完全な除去を確実にした。
【０１３４】
種々の暴露時間および、組織からの試験物質の洗浄の後、培養培地中、培養物に1mg/mlのMTT色素を「負荷」した。その後、紫のホルマザン色素を2.0mlのイソプロピルアルコールを用いて抽出し、ホルマザン抽出物を、E-MAX96ウェルプレートリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, CA)で570nmにおける吸光度（OD）を測定することにより定量した。
【０１３５】
組織の生存率は、MTTを負荷して同じ方法で抽出した、暴露していないコントロールの組織のパーセントとして標準化した。残っている生存細胞の％を、式：%生存率＝OD (処理した組織)／OD (コントロールの組織)を用いて決定した。用量作用曲線は、パーセント生存率対界面活性剤溶液に対する暴露時間をプロットすることにより作成した。生存率を５０％にまで減少させるのに必要な暴露時間(ET-50)を数学的に決定した。
【０１３６】
結果
例１においてつくられたインビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物、および非角化上皮組織モデルであるEpiOcular（登録商標）を用いて、KY jellyおよび種々の濃度のN-9を含むKY jelleyについて、MTTアッセイを行った。種々の試験物質について決定されたET-50を表４に示す。
【０１３７】
表４：EpiOcular(OCL-200)およびインビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物で試験されたノノキシノール−９(N9)を含む３つの殺精子剤製品についてのET-50
【表４】
2005530500.tif 000005
【０１３８】
インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物および眼組織は、KY jellyおよび試験された種々のN-9の濃度に対して異なる感受性を有することが示された。予想されたように、より高いN-9濃度に対しては、より低いET-50が得られ、すなわち、より高いN-9の濃度はより組織の細胞毒性を惹起し、したがって、より刺激性であることが予測された。事実、N-9は、米国で用いられる最も一般に使用されている殺精子剤の避妊薬であるが(D'Cruz, O. J., et al, AAPS PharmSciTech, 2(1), article 6(2001))、N-9は集団の限定的部分において子宮頚部−膣刺激を引き起こすことが示されている(Reckart, M. L., J. AIDS, 5, 425-427 (1992))。HIV抗生剤としてのN-9の使用を評価した研究では、２５％のボランティアが子宮頚部−膣刺激を経験した(Stafford, MK., et al., J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol., 17, 327-331(1998))。
【０１３９】
例１０：HIVウイルスは子宮頚部−膣組織相当物を通過しない
本発明のインビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物は、HIV感染および透過のメカニズムを研究するために用いられてもよく、抗生剤を試験するインビボ様手段または他のウイルスの透過を防止する予防手段を提供する。HIV感染および透過に関する１つの答えが出ていない疑問は、HIVは子宮頚部組織または膣組織を透過しうるかどうかということである。この例では、子宮頚−膣組織相当物を、HIVビリオン(virion)が子宮頚部−膣組織を通過する能力を決定するために用いた。
【０１４０】
ウイルスストック
HIV-1ウイスルのストックは、293T細胞にpNL4-3(T細胞トロピック(tropic）ウイルスであるNL4-3のプラスミド)またはpAD8 (マクロファージトロピックウイルスであるADAのプラスミド)プラスミドDNAのいずれか15μgをトランスフェクトすることにより、作製された。トランスフェクションから１２時間後、細胞を洗い、10％ウシ胎児血清 (FCS)および抗生物質を補充したRPMI中で培養した。24時間後、全長ウイルスを含む培養上清をハーベストし、孔サイズ0.45μmのフィルターを用いてろ過し、逆転写酵素（RT）アッセイを用いて解析した。
【０１４１】
HIVについての逆転写酵素（RT）アッセイ
逆転写酵素（RT）アッセイは、HIV透過および感染実験後の上清に存在するHIVの相対的な量を決定するために用いられた。1mlの上清を集めて12000rpmで30分間遠心した。上清を捨て、ウイルスのペレットを50 mM Trisバッファー−HCl pH 7.5、1 mMジチオスレイトール(DTT)、20％グリセロール、0.25 M KCl、および0.25％ triton X-100を含むRT懸濁バッファー10μlに再懸濁した。３回の凍結／融解サイクル(37℃／-78℃)を用いて上清中のウイルスを溶解させた。
【０１４２】
次に、RTアッセイバッファー(250 mM Tris バッファー、pH 7.5、37.5 mM MgCI2、および0.25％triton X-100)ならびにDTT、Oligo-dT-poly(A)、[3H]dTTPを含む40μlのRTアッセイ混合物をウイルス溶解物に加えた。サンプルをボルテックスして３７℃で１時間インキュベートした。このアッセイでは、Oligo(dT-15)がpoly(A)テンプレート(Boeringer Mannheim, Indianapolis, IN)でのRTによる[3H]dTTPの取り込みのためのプライマーとして働く。次いで、ラベル反応生成物をニトロセルロース膜に結合させ、2×SSCバッファー(Sigma Chemical Co.)中に３回浸すことにより洗った(10分／洗浄)。膜をさらに95％エタノールで２回洗い(10秒／洗浄)、加熱ランプを用いて乾燥させた。相対的なウイルス量の定量的結果は、シンチレーションカウンターを用いて得られた。
【０１４３】
組織を介したウイルスの通過
ウイルスは、子宮頚−膣組織相当物に局所的に適用されるかまたは直接（その上で組織が培養されている）下にある0.4μmの微小孔性膜に直接適用された。子宮頚−膣組織相当物を有するかまたは有さない組織培養インサートを2.0mlの培養培地と一緒に6ウェルプレートに入れ、108μlのADAウイルス（RTアッセイで測定したところでは50000CPM）を局所的に適用した。インサートの真下にある培地を、ウイルス適用後２、５および２４時間でアッセイした。２４時間後、インサートの頂端側表面を洗浄し、空の（bare）インサートおよび組織含有インサートをさらに48時間インキュベーターにもどした（全部で72時間）。培地サンプルは、RTアッセイを用いてHIVについてアッセイした。結果を表５に示す。
結果
解析結果を表５に要約する。
【０１４４】
表５：A)組織培養膜のみまたはB)膜上で培養された子宮頚部組織、の下の培地中におけるNL4-3ウイルスの蓄積。０時間でウイルスが局所的に適用された（50000CPM）。組織培養インサートの下の培地の一部を示した時間に回収し、逆転写酵素アッセイを用いて組織を介したウイルスの通過について解析した。
【表５】
2005530500.tif 000006
【０１４５】
空のインサートを用いて得られた結果と子宮頚−膣組織相当物（表４）を用いて得られた結果の比較は、HIVビリオンは子宮頚部−膣組織を透過できないことを示した。２時間以内に、44％のウイルスが空の細胞培養インサートの0.4μmの膜を通過した。５時間後には、組織を通過するウイルスのほとんど大部分（60.1％のうちの57％）がすでに通過していた。調べた72時間にわたって、子宮頚−膣組織相当物を通過したウイルスは検出されなかった。全72時間の実験にわたって、適用されたウイルスの60％が空のインサートの下の培地中で回復した。残りの40％は分解したようであった（表６参照）。しかしながら、子宮頚−膣組織相当物を通過したウイルスは、培地中には検出されなかった（注：表５の低い値は、RTアッセイについてのベースラインの数値である−すなわち組織を通過したウイルスは検出され得ない）。
【０１４６】
例１１：HIVウイルスは子宮頚−膣組織相当物に感染する
HIV感染および透過をモニターする能力を、例１０で記載された逆転写酵素およびポリメーラーゼ連鎖反応（PCR）を利用して、インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物においてモニターし、子宮頚−膣組織相当物のDNAの中にHIV転写物を検出した。
【０１４７】
HIV転写物に対するポリメーラーゼ連鎖反応（PCR）
PCR解析のためのDNA溶解物の調製において、組織サンプルは遠心によりPBSを用いて２回洗った。次いで、Qiagen DNeasy（登録商標）Tissue Kit (Qiagen Inc., Valencia Inc, CA)を使用して製造者のプロトコールを用い、細胞のDNA抽出を行った。このアッセイにおいては、組織サンプルをプロテアーゼK(15μl／組織)の添加および55℃１時間のインキュベーションにより溶解し、その後70℃で10分間インキュベートした。その後、溶解物をDNeasy（登録商標）ミニメンブレンカラム上にロードした。DNAが選択的にこの膜に結合するので、混入物は２回の洗浄により除かれる。次いで、DNAを50μlの溶出バッファーを（２回）加えることにより溶出した。DNAは分光光度計により定量した（260/280の吸光度比が1.81〜1.97の範囲にある）。全DNA（0.6μg）を、HIVのDNAについてポリメーラーゼ連鎖反応（PCR）により調べた。
【０１４８】
ADAのgag遺伝子に特異的なプライマーを、ワールドワイドウェブ（world wide web）上でWhitehead Institute (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA)から提供されているPrimer 3 ゲノムソフトウェアを用いて設計した。プライマーセットは：フォワードプライマー、5'CAGCATGTCAGGGAGTAGGG-3' (SEQ ID NO：1)；およびリバースプライマー、5'TTGTCTATCGGCTCCTGCTT-3 (SEQ ID NO：2) であり、Great American Gene Company (Ramona, CA)から購入した。
【０１４９】
DNA-PCRは、プライマー最終濃度各0.4μMの遺伝子特異的プライマー、全DNA（600ng）、Taqポリメラーゼ1.0ユニット、バッファー(5μl)、各dNTP 200ｍMおよびdH2O（最終用量を50μlにする）を加えることにより行った。サンプルを下記プロトコールを用いてサーモサイクラー(thermocycler)(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)にかけた。DNA変性ステップを94℃で5分間加熱することにより行った。その後、サンプルを変性(94℃30秒)、プライマーアニーリング(60℃30秒)、および鎖伸展(72℃1分)の35PCRサイクルを行い、そして最終伸展時間は７分間伸展させた。PCR産物はアガロースゲル状での可視化により確認した。電気泳動は、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含む1.5％アガロースゲルで増幅させたDNA20μlを用いて行った。 
【０１５０】
感染／透過実験
インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物におけるHIVの感染／透過を評価するために、図１で概略的に描いたように、組織を空気−液体界面条件下、24時間37℃でADA（マクロファージトロピック）もしくはNL4-3（T細胞トロピック）HIV-1単離物に局所的に暴露した（50000CPM／組織）。
【０１５１】
２４時間後、組織の表面に残っているウイルスをPBSで10回洗い、組織を下記のように培養し続けた：
a)空気−液体界面（ALI）：ウイルスが暴露された組織は、基底側のEC組織表面の下の細胞培養インサートの膜を介して供給された。培地中には、T細胞は存在しなかった。
b)空気−液体界面＋ジャーカット（Jurkat）細胞（ALI+J）：1×106個のジャーカット細胞を細胞培養インサートの下の培地に加え、a)と同様にした。細胞培養インサートの膜は、組織とジャーカット細胞の間のいかなる直接的接触をも防止していた。
c)液中(submerged)(SUB)：ウイルスが暴露された組織は細胞培養インサートを剥がして、1×106個のジャーカット細胞を含む培地中に浸した。
培養培地サンプルは、ウイルスを除去するための局所的な洗浄の後、3、７および10日に回収し、ウイルスの存在を決定するために逆転写酵素アッセイに用いた。
結果
結果を表６に示す。
【０１５２】
表６．ランゲルハンス細胞を含む子宮頚−膣組織相当物への、マクロファージトロピック(ADA)およびT細胞トロピック(NL4-3)HIV-1単離物の感染。50000CPMのウイルスを組織に局所的に適用した。24時間後、組織をPBSで１０回洗い（０日）、培養を上記のようにALI、ALI+JまたはSUB条件下で続けた。37℃でのウイルスの分解をまた、試験チューブ中３７℃で細胞を含まないウイルス（50000CPM）をインキュベートすることにより決定した。
【表６】
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【０１５３】
ALI培養の培地中にはウイルスは検出されなかった。ALI+J培養の培地中にはウイルスは検出されず、組織の下の培地に加えられたT細胞に対しては、マクロファージトロピックウイルス（ADA）によるウイルス産生／感染は起こらないことを示唆している。マクロファージトロピックウイルスは産生的にはT細胞に感染しないので、これは予想されていた。しかしながら、T細胞トロピックウイルスであるNL4-3が用いられた場合には、ウイルスはALI+J培養の培地中に検出された。これは、ウイルスが膣組織によりT細胞に感染することを示している。細胞培養インサートの膜の存在は、組織にわたるウイルス感染を遅くしたが、抑制しなかった。
【０１５４】
これらの結果は２つの可能なメカニズムを示唆する。１つ目の可能なメカニズムは、組織が感染し、感染に続いてウイルスがＴ細胞に伝播したというものである。他のメカニズムは、NL4-3ウイルスが組織に透過して、そこに結合したというものである。この結合はウイルスを保護し、その分解を抑制した（表５）。究極的には、少量の生きたウイルスが放出されるかまたは組織を透過するが（RTによる検出のレベルより低い）、T細胞が感染し、大量のウイルスがT細胞により産生される。この２つの可能性のうちどちらが実際に起こっているかを決定するために、ランゲルハンス細胞を有する子宮頚−膣組織相当物およびランゲルハンス細胞を有さない子宮頚−膣組織相当物を（表５の結果を出すのに用いられたのと同じプロトコールを用いて）感染させ、DNAを抽出してPCRを用いて解析した。増幅反応の産物をゲルでサイズ分画し、HIV転写物の有無を決定した。
【０１５５】
転写物（サイズで約400bp）は、ランゲルハンス細胞を含む組織(LC+)およびランゲルハンス細胞を含まない組織(LC-)の両方において、ADA(MT)およびNL3-4（TCT）ウイルスの両者に関して観察された。予想されたように、NL3-4よりもADAに暴露された組織においてより多くのHIV転写物が存在しており、LC-組織よりもLC+培養のほうが、より多くのHIV転写物が存在していた。これらの結果は、最終的に、プロウイルス(pro-virol)HIV DNAが組織のゲノムに取り込まれたことを証明しており、組織の感染が実際に起こったことを示している。これは、子宮頚−膣組織相当物がHIVなどの病原体に感染可能であり、かかる病原体の感染を研究するため、そしてその処置または予防の効果を解析するために用いることができることを示している。
【０１５６】
当分野の平均的技術の者は、この開示において特に言及されていない、初代培養技術における多くのさらなる変更が、本発明の子宮頚−膣組織相当物の成功する作製において可能であることを認識するであろう。
【０１５７】
均等
当業者は、本明細書において記載された本発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、または、日常的実験を超えないものを用いて、確認することができるであろう。かかる均等物は、請求項により包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】空気−液体界面で培養される子宮頚−膣組織の概略図である。
【図２】殺精子剤ノノキシノール−９（nonoxynol-9）（２％）への暴露時間に対して、インビトロで産生された子宮頚−膣組織の組織生存率をプロットした用量作用曲線。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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