(57)【要約】  悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症にかかった患者を治療するためのPSP-94の使用を開示する。94アミノ酸からなる前立腺分泌蛋白質はホルモン依存前立腺の予後マーカーとして知られている。最近の研究で、前立腺癌増殖、骨転移及び悪性腫瘍を伴う高カルシウム血症におけるPSP-94の効果を調べた。一次腫瘍容積の顕著な投与量依存的な減少が、PSP-94を与えた実験動物で見られた。更に、放射線免疫測定法及び免疫組織化学法によって求めたところ、コントロール動物はPTHrP生成によって高カルシウム血症を進行させたが、PSP-94での治療によって血漿カルシウムがほとんど正常になり、PTHrP生成が顕著に減少した。得られた結果から、PSP-94が前立腺癌の効果的な治療能力が示された。更に、血漿PTHrP及びカルシウムレベルの減少は、新規の抗腫瘍剤の効果をモニターする有用な生化学マーカーとして働くことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症にかかっている患者を治療するためのPSP-94の使用。
【請求項２】
前記悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症が、前立腺癌、乳癌及び上皮性悪性腫瘍からなる群から選択される癌によって生じる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
必要としている患者のPTHrPレベルを減ずるためのPSP-94の使用。
【請求項４】
骨転移の進行を減ずるためのPSP-94の使用。
【請求項５】
悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療に用いる医薬組成物の製造におけるPSP-94の使用。
【請求項６】
骨転移の治療に用いる医薬組成物の製造におけるPSP-94の使用。
【請求項７】
腫瘍を有する患者におけるPSP-94の腫瘍治療効果を評価する方法であって、前記患者の血漿カルシウムレベルを測定することを含む方法。
【請求項８】
患者において、PSP-94の悪性腫瘍を伴う高カルシウム血症治療効果を評価する方法であって、前記患者の血漿カルシウムレベルを測定することを含む方法。
【請求項９】
a) PSP-94を用いた患者の治療の前に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿カルシウムを測定すること；
b) PSP-94を用いた患者の治療の後に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿カルシウムを測定すること；及び
c) a)工程で得られた値とb)工程で得られた値を比較すること；
を含む、患者のPSP-94の治療効果を評価する方法。
【請求項１０】
腫瘍を有する患者におけるPSP-94の腫瘍治療効果を評価する方法であって、前記患者の血漿PTHrPレベルを測定することを含む方法。
【請求項１１】
患者において、PSP-94の悪性腫瘍を伴う高カルシウム血症治療効果を評価する方法であって、前記患者の血漿PTHrPレベルを測定することを含む方法。
【請求項１２】
a) PSP-94を用いた患者の治療の前に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿PTHrPを測定すること；
b) PSP-94を用いた患者の治療の後に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿PTHrPを測定すること；及び
c) a)工程で得られた値とb)工程で得られた値を比較すること；
を含む、患者のPSP-94の治療効果を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
哺乳動物の雄にのみに見られる前立腺は、精液及び血液の複数の成分、並びに、複数の調節ペプチドを生成する。前立腺は間質細胞及び上皮細胞からなり、後者のグループは、分泌性の円柱細胞及び非分泌性の基底細胞からなる。間質細胞と同様に基底細胞の増殖により、一般的な前立腺の病気である、前立腺肥大症（BPH）が引き起こされる。他の一般的な前立腺の病気として、前立腺癌（CaP）がある。この癌は、最も一般的な、致死にいたる病態生理学的な前立腺の癌であり、前立腺の末梢領域に存在する上皮細胞の悪性形質転換を含む。前立腺癌及び前立腺肥大症は、二つの一般的な前立腺の病気であり、歳をとったヒト男性に、高い割合で症例が見られる。55歳以上の男性の約4人に1人が何らかの前立腺の病気を患っている。前立腺癌は、初老男性の癌の死亡原因の第二位であり、アメリカの報告では、年間、約96,000件診断され、約26,000人が死亡している。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌に独特な特徴は、ホルモン依存の悪性腫瘍であることと関連して、高い割合の罹患率及び死亡率をもたらす造骨性骨転移を引き起こす能力を有していることである。加えて、非常に多くの前立腺癌患者が、腫瘍細胞によるPTHrPの生成のために血漿カルシウムレベルの上昇を呈する。高カルシウム血症は、1920年から悪性腫瘍の合併症と考えらるようになり、前立腺癌を含む様々な癌患者の少なくとも15-20％に生じる。如何なる単一物質が悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症（HM）に特有の原因であるかわからなかったが、HMの原因となる主要な病原性の要素として、腫瘍細胞による副甲状腺関連ペプチド（PTHrP）の生成が増加することが見出された。このことは、骨転移に関連する前立腺癌及び乳癌にとっては特に重要な意味を示し、PTHrPの造血効果によって骨吸収が増加し、高カルシウム血症がもたらされる。
【０００３】
臨床での前立腺癌は、前立腺内に制限されている初期の段階では、うまく治療することができる。しかしながら、腫瘍細胞及び周囲の間質よって生成される、増殖因子、性ステロイド、血管新生因子及びプロテアーゼ、例えばウロキナーゼ（uPA）及びマトリックスメタロプロテアーゼ（MMPs）を含む多くの因子の生成量が増加することは、高い死亡率と関連している。手術及び放射線療法を含む、臓器に限定された前立腺癌の治療方法の最近の発達にも関わらず、ホルモン非依存性転移前立腺癌の治療においては限定的に成功しているにすぎない。
【０００４】
前立腺特異的抗原（PSA）及び94アミノ酸からなる前立腺分泌蛋白質（本出願では、PSP-94又はPSPという）が、病気の進展の予後マーカーとして働くことが知られている。PSAのように、血清中、尿中、及び前立腺癌を有する患者の前立腺組織中のPSP-94レベルは、腫瘍のグレードと反比例の関係にある。米国特許No. 5,428,011（参考文献としてここに挿入された完全な中身）に開示された以前の研究では、ネイティブなヒト精漿PSP-94の薬としての調製（すなわち組成物）により、in vitro及びin vivoで癌の前立腺、胃腸及び乳腺腫瘍を阻害していた。カナダ特許出願No:2,359,650（参考文献としてここに挿入された完全な中身）で開示された追加実験では、PSP-94フラグメント、例えばPCK3145の、腫瘍増殖の阻害能力及び更には、前立腺癌腫瘍の増殖阻害能力が示されていた。
【０００５】
本研究では、前立腺癌腫瘍増殖及び特に骨転移におけるPSP-94の効果を評価した。これらの研究のために、ラットPTHrPをコードする全長cDNAでトランスフェクトしたラット前立腺癌セルラインDunning R3277 Mat Ly Luを用いた、ラット前立腺癌の同系のin vivoモデルを用いた（Rabbani, S. A. et al., Int. J. Cancer, 80: 257-264, 1999）。Mat Ly Lu-PTHrPの皮下（S.C.）接種又は心臓内（I.C.）接種後の、投与量が異なるPSP-94又はPCK3145が、腫瘍増殖、転移、腫瘍のPTHrP生成を抑える能力を評価した。ヒトとラットPSPのアミノ酸配列ホモロジー、及び、非常に保存されたシステイン残基によって決定される三次構造の類似性によって、この研究にヒトPSP-94を使用することができた（Fernlund, P. et al., Arch. Biochem. Biophys. 334: 73-82, 1996）。高レベルのPTHrP生成により、これらの動物は、前立腺癌にかかった多くの患者に共通の合併症である、高カルシウム血症を常に発症した（Iwamura, M., et al., Urology, 43: 675-679, 1994; Iwamura, M. et al., Hum. Pathol. 26: 797-801, 1995）。前立腺癌の類似のモデルを用いることにより、ホストの環境並びに腫瘍細胞から分泌される増殖因子（EGE, TGF-β）（Helawell, G. O. et al., BJU Int. 89: 230-240, 2002）及びプロテアーゼ（uPA, MMPs）（Rabbani, S. A., et al., Int. J. Cancer, 87: 276-282, 2000, Rabbani, S.A., et al., In vivo, 12: 135-142, 1998）との間の完全な相互作用を可能である。前立腺癌の遅い段階でのPSP-94の効果の評価を考えれば、この前立腺癌細胞はホルモン非依存性である。
【特許文献１】米国特許No. 5,428,011
【特許文献２】カナダ特許出願No:2,359,650
【非特許文献１】Rabbani, S. A. et al., Int. J. Cancer, 80: 257-264, 1999
【非特許文献２】Fernlund, P. et al., Arch. Biochem. Biophys. 334: 73-82, 1996
【非特許文献３】Iwamura, M., et al., Urology, 43: 675-679, 1994
【非特許文献４】Iwamura, M. et al., Hum. Pathol. 26: 797-801, 1995
【非特許文献５】Helawell, G. O. et al., BJU Int. 89: 230-240, 2002
【非特許文献６】Rabbani, S. A., et al., Int. J. Cancer, 87: 276-282, 2000
【非特許文献７】Rabbani, S.A., et al., In vivo, 12: 135-142, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願で開示する本発明は、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症及び骨転移を有する患者を治療するのに用いる医薬組成物及び方法を提供する。PSP-94（native PSP-94（nPSP-94）（SEQ ID No.1））及びrHuPSP94（recombinant human PSP-94（SEQ ID No.2））、及び誘導体（フラグメント）例えばSEQ ID NO: 3に開示しているデカペプチド、SEQ ID NO: 4に開示しているポリペプチド（ポリペプチド7-21）、SEQ ID NO: 5に開示しているポリペプチド（PCK3145）、SEQ ID NO: 6に開示しているポリペプチド（ポリペプチド76-94）、及びポリペプチドアナログを、高カルシウム血症及び骨転移に関する病気を治療するために用いる。カルシウムはPSP-94の腫瘍治療効果の代理マーカーとしても用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の側面として、本発明は、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を患う（悪性腫瘍を有する）患者を治療するための（すなわち、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療のための）、PSP-94及びそのアナログの使用に関する。更には、本発明は、悪性腫瘍に伴う（に関する）高カルシウム血症を減少させるための（を有する患者を治療するための）、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。本発明のこの側面は、また、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を患う患者を治療する方法を包含し、PSP-94、本出願に記載のポリペプチド及びそのアナログを含む医薬組成物を患者に投与することを含む。本発明のこの側面は、また、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を患う患者のカルシウムレベルを減少する（下げる）ための、PSP-94の使用を包含する。
【０００８】
本発明によると、前記悪性腫瘍はおそらくホルモン非依存性の悪性腫瘍である。悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症は、前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌等を含む様々な原因から起こりうる。それ故、PSP-94、本出願に記載のポリペプチド及びそのアナログを用いた悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療は前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌等の患者に必要である。悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症は悪性腫瘍のタイプに制限されない。
【０００９】
他の側面として、本発明は、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の発症を予防するため、及び、患者の高カルシウム血症の誘発（発症）をコントロールするための、PSP-94の使用に関する。 
【００１０】
他の側面として、本発明は、患者のPTHrPの増加を予防（コントロール）するための、PSP-94の使用に関する。
【００１１】
更なる側面として、本発明は、必要とする患者のPTHrPレベル（生合成、発現、転写、翻訳、生成、分泌）又は活性を減少（低下）するための、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。
【００１２】
更なる側面として、本発明は、PTHrPを含む、高カルシウム血症（高カルシウム血症状態）を進展させる原因となる物質の生成を減少するための、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。
【００１３】
更なる側面として、本発明は、骨移転の進展を減少（遅らせる）ための、PSP-94の使用に関する。更には、本発明は、骨転移の進展（進行）をブロック（減少、弱める、減少させる）ための、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。本発明のこの側面には、また、PSP-94、本出願に記載のポリペプチド及びそのアナログを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、骨転移を発症した患者の治療方法を包含する。
【００１４】
更なる側面として、本発明は、カルシウム生成に関係する分子のレベルをコントロールするための、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。ここで、上述の分子は、ビタミンB、カルシトニン及びその生物学的な等価物から選択する。
【００１５】
更なる側面として、本発明は、骨への生物的利用性を改良するための、ビスフォスフォネート、RGDペプチド（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸ペプチド）、造骨細胞及び破骨細胞特異的な蛋白質と結合した、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。
【００１６】
他の側面として、本発明は、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療のための又は骨転移の治療のための：
a)PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチド；及び
b)製薬上許容できる担体
を含む医薬組成物に関する。
【００１７】
更なる側面として、本発明は、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療のための医薬組成物の製造におけるPSP-94の使用に関する。更には、本発明は、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療のための医薬組成物の製造のための、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。
【００１８】
更なる態様として、本発明は、骨転移の治療のための医薬組成物の製造におけるPSP-94の使用に関する。更には、骨転移の治療のための医薬組成物の製造のための、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。
【００１９】
更なる態様として、本発明は、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチド、及び製薬上許容できる担体を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症に関連する症状を有する患者の治療方法に関する。
【００２０】
更なる態様として、本発明は、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチド、及び製薬上許容できる担体を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、骨転移を有する患者の治療方法に関する。
【００２１】
更なる態様として、本発明は、ホルモン療法、化学療法又は放射線療法と組み合わせての、PSP-94、PCK3145、ポリペプチド7-21、デカペプチド、ポリペプチド76-94及びそのアナログからなる群から選択されるポリペプチドの使用に関する。
【００２２】
本発明によれば、ネイティブのPSP-94（nPSP-94）及びrHuPSP94からなる群から、PSP-94を選択することができる。
【００２３】
本発明によれば、ポリペプチドは、例えばマイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロ-ウラシル、メトトレキセート、アドリアマイシン、ダウノマイシン、タキソール（すなわちパクリタキセル）、及びタキソール誘導体（例えばドセタキセル、タキサン）を含む（これらに限定するものではない）、抗体、ホルモン又は抗癌剤とともに使用することができる。
【００２４】
他の側面として、本発明は、患者の血漿カルシウムレベルの測定を含む、腫瘍を有する患者のPSP-94腫瘍治療効果を評価する方法に関する。
【００２５】
更なる側面として、本発明の適用は、患者の血漿カルシウムレベルの測定を含む、患者における悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症のPSP-94治療の効果を評価する方法に関する。
【００２６】
更なる側面として、本発明は、患者におけるPSP-94治療の効果を評価する方法に関するものであり、その方法は以下を含む。
a)PSP-94を用いた患者の治療の前に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿カルシウムを測定すること；
b)PSP-94を用いた患者の治療の後に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿カルシウムを測定すること；及び
c)a)工程で得られた値とb)工程で得られた値を比較すること。
【００２７】
他の側面として、本発明は、患者の血漿PTHrPレベルの測定を含む、腫瘍を有する患者における腫瘍のPSP-94治療の効果を評価する方法に関する。
【００２８】
更なる側面として、本発明は、患者の血漿PTHrPレベルの測定を含む、患者における悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症のPSP-94治療の効果を評価する方法に関する。
【００２９】
更なる側面として、本発明は、患者におけるPSP-94治療の効果を評価する方法に関するものであり、その方法は以下を含む。
a)    PSP-94を用いた患者の治療の前に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿PTHrP（レベル）を測定すること；
b)    PSP-94を用いた患者の治療の後に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿PTHrP（レベル）を測定すること；及び
c)    a)工程で得られた値とb)工程で得られた値を比較すること。
【００３０】
本出願で用いられる際、“ポリペプチド”とは、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドイソスター（peptide isosteres））によりお互いが結合した2以上のアミノ酸を含む、いかなるペプチド又は蛋白質も指す。“ポリペプチド”とは、ペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと一般的に言われている短い鎖、及び蛋白質と一般的に言われている長い鎖の両方を指す。前述したように、ポリペプチドは、20の遺伝子をコードしているアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。
【００３１】
本出願で用いられる際、“腫瘍”という言葉は、固体又は非固体腫瘍、転移性又は非転移性腫瘍、肝臓、肺、脳、リンパ節、骨髄、副腎、乳房、大腸、すい臓、前立腺、胃、又は生殖器（子宮頚部、卵巣、子宮内部等）を起源とする癌（これらに限定するものではない）を含む異なる組織由来の腫瘍を指す。本出願で用いられる“腫瘍”という言葉は、また、腫瘍細胞産出及び増殖、悪性又は良性を問わず、全ての癌化前及び癌化後の細胞及び組織を指す。    
【００３２】
本出願で用いられる際、“医薬組成物”とは、製薬上許容できる希釈剤、保存剤、可溶家財、乳化剤、アジュバンド及び／又は担体とともに用いる、治療上効果的な量の薬剤を意味する。本出願で用いられる“治療上効果的な量”とは、一定の状態及び投与計画での治療効果を与える量を指す。このような組成物は、液体、又は、凍結乾燥による若しくは他の方法による製剤形態であり、様々なバッファー用の希釈剤（例えば、Tris-HCl、酢酸、リン酸）、pH及びイオン強度、表面への吸着を防ぐアルブミン又はゼラチン、界面活性剤（例えば、Tween20、Tween80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量剤又は浸透圧調整剤（例えば、ラクトース、マンニトール）等の添加剤を含み、蛋白質へのポリエチレングリコールのようなポリマーの共有結合、金属イオンとの複合化、又はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル等のようなポリマー性化合物の粒子状の調製物上又はその中へ物質を導入すること、又はリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層の又は複層の小胞、赤血球ゴースト、又はスフェロプラスト上に物質を導入することがある。このような組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、in vivo放出の割合、及びin vivoクリアランスの割合に影響を与えるであろう。放出制御又は放出持続組成物は、親油性の持続性薬剤中での製剤形態（例えば、脂肪酸、ワックス、オイル）を含む。本発明により、ポリマー（例えば、ポロキサマー又はポロキサミン）で被覆した粒子状組成物も含まれる。本発明の組成物の他の実施態様として、粒子形態には、非経口、肺、鼻及び口を含む様々なルートからの投与のための保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤又は透過促進剤が含まれる。一つの実施態様として、医薬組成物を、非経口的に、粘膜に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮内に、皮下に、腹腔内に、脳室内に、頭蓋内に、腫瘍内等に投与する。    
【００３３】
更には、本出願で用いられる“製薬上許容できる担体”又は“製薬上の担体”とは、この業界で知られており、0.01-0.1 M及び好ましくは0.05 Mリン酸バッファー又は0.8％生理食塩水を含む（これらに限定するものではない）。更に、このような製薬上許容できる担体は、水溶性又は非水溶性の溶液、懸濁液、エマルジョンとすることができる。非水溶性の溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、及びオレイン酸エチルのような注射用の有機エステルである。水溶性の担体には、生理食塩水及びバッファーを含む、水、アルコール性／水溶性溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む。非経口用の媒介物には、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液又は不揮発油を含む。静脈用の媒介物には、流体及び栄養補充剤、ブドウ糖リンゲル液に基づくような電解質補充剤等を含む。防腐剤及び他の添加剤として、例えば抗菌剤、抗酸化剤、照合剤、不活性ガス等を存在させることができる。
【００３４】
本発明に含まれる、変異体（variant、analog、derivative）ポリペプチドには、1以上の変異を有する変異体が含まれ、その変異とは、欠失（例えばトランケーション）、挿入（例えば付加変異）、又はアミノ酸残基の置換である。変異体は、自然に生じたもの（すなわち、天然体から精製又は単離された）又は合成されたもの（例えば、コードDNAの部位特異的変異の実施又は化学合成のような他の合成方法による）のどちらでも可能である。従って、本発明のポリペプチドは自然に生じたもの又はリコンビナント（すなわち、組み換えDNA技術によって調製される）のどちらでも可能であることが明らかである。本出願記載の生物活性（高カルシウム血症及び骨転移の効果）を有する、PSP-94（native PSP-94（nPSP-94）；SEQ ID NO.:1又はrHuPSP94（recombinant human PSP-94）：SEQ ID NO.:2）由来の変異体ポリペプチド、及び、本出願記載のポリペプチド（PCK3145（SEQ ID NO.:5）、デカペプチド（SEQ ID NO.:3）、ポリペプチド7-21（SEQ ID NO.4）、ポリペプチド76-94（SEQ ID NO.6））由来の変異体ポリペプチドが、本願に含まれる。
【００３５】
理解されているように、本発明のポリペプチド又はフラグメントの生物活性に影響を及ぼすことなく、多数の変性がポリペプチド及びフラグメントになされる。本発明のポリペプチドには、例えば、翻訳後プロセッシングのような天然の工程、又は、この分野でよく知られた化学的な修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。修飾は、ポリペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシ末端を含む、ポリペプチドのいずれの場所でも起こりえる。同じタイプの修飾が、ポリペプチドの複数の部位で、同じ頻度で又は異なる頻度でおこりうることは理解できるであろう。ポリペプチドによっては、多くのタイプの修飾を含むこともある。ポリペプチドはユビキチン化の結果として枝分かれすることができ、枝分かれするしないに関わらず、環状になりうる。環状ポリペプチド、枝分かれしたポリペプチド及び枝分かれした環状ポリペプチドは、翻訳後の天然の工程に由来するか、又は、合成方法によって作成される。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、アセトミドメチル（Acm）基の付加、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンとの結合、ヘム部位との結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体との結合、脂質又は脂質誘導体との結合、フォスファチジルイノシトールとの結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水素化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン化、硫酸化、アルギニン化及びユビキチン化のような転移RNAによる蛋白質へのアミノ酸付加を含み、これらに制限されるものではない（リファレンスとして、Protein-structure and molecular proterties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New-York, 1993）。
【００３６】
他のタイプのポリペプチド修飾として、例えば、ポリペプチド配列中に保存又は非保存（例えばDアミノ酸、デスアミノ酸）のいずれか一方による、アミノ酸挿入（すなわち付加）、欠失及び置換（すなわち交換）を含む。そして、このような変化によって、ポリペプチドの生物活性は実質的に変化しない。本発明のポリペプチドには、例えば、生物活性を有する変異体、バリアント、フラグメント、キメラ、及びアナログを含み；フラグメントには、1以上のアミノ酸をトランケーションしたアミノ酸配列を含み、このトランケーションはアミノ末端（N末端）、カルボキシ末端（C末端）、又は蛋白質の内部に由来する。本発明のアナログとして、1以上のアミノ酸の挿入又は置換を含む。バリアント、ミュータント、フラグメント、キメラ及びアナログには、前立腺癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌又は上皮分泌の他の癌、又は前立腺肥大症（BPH）の増殖を阻害する本発明のポリペプチドの生物活性を有している。      
【００３７】
置換の例として、保存的なものがある（すなわち、残基が同じ一般的なタイプの他のものによって置換される）。当然のことながら、天然に存在するアミノ酸は、酸性、塩基性、中性で極性、又は中性で非極性に細分類される。更に、コードアミノ酸のうち三つは芳香族である。本発明によるポリペプチドと異なるコードポリペプチドに、置換されるアミノ酸のグループと同じグループ由来のアミノ酸への置換コドンが含まれていることは利用できるであろう。それ故、いくつかの場合では、塩基性アミノ酸であるLys、Arg及びHisは互換性があり；酸性アミノ酸であるAspとGluは互換性があり；中性で極性アミノ酸であるSer、Thr、Cys、GlnとAsnは互換性があり；非極性の脂肪族アミノ酸であるGly、Ala、Val、IleとLeuは互換性があり、大きさによりGlyとAlaはより密接な関連性があり、Val、IleとLeuはお互いに密接な関連性がある。そして、芳香族アミノ酸であるPhe、TrpとTyrは互換性がある。  
【００３８】
更には、ポリペプチドを合成して調製するならば、DNAによってコードされておらず、天然に無いアミノ酸に置換できることに注目すべきである。例えば、代替残基として、化学式NH2(CH2)nCOOH（nは2−6）で表されるオメガアミノ酸が含まれる。これらは中性の非極性のアミノ酸であり、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、及びノルロイシンである。フェニルグリシンは、Trp、Tyr又はPheと置換できる；シトルリン及びメチオニンスルフォキシドは中性で非極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンはヒドロキシプロリンと置換でき、特性を与える構造を保持する。
【００３９】
ミュータント又はバリアントは置換変異で生じ、本発明のポリペプチドの生物活性を保持していることは、この分野でよく知られている。これらのバリアントは、蛋白質分子中で少なくても一のアミノ酸残基が取り除かれ、その場所に異なるアミノ酸残基が挿入されている。例えば、置換変異が生じた部位には、活性部位、又は免疫部位として同定された部位を含むことがあるが、それに限定されない。他の部位では、例えば、様々な種から得られる特定の部位が一致している。これらの部位は、生物活性にとって重要であると考えられる。“保存された置換（conservative substitutions）”として同定された置換の例を、表１に示す。このような置換が望まない変化になるならば、表１で“典型的な置換（exemplary substitutions）”と命名した、又はアミノ酸のクラスに関して本出願で更に記述したような置換の他のタイプが導入され、その生成物がスクリーニングされる。
【００４０】
いくつかの場合では、アミノ酸置換、挿入、又は欠失によってポリペプチドの生物活性が変わることは、興味あることである。例えば、ポリペプチドの修飾によって、ポリペプチドの生物活性を上げることができ、毒性を変えることができ、生物学的利用能又は安定性を変えることができ、又は、免疫活性若しくは免疫的な同一性を変えることができる。（a）置換領域でのポリペプチド主鎖の構造、例えばシート又はへリックス構造、（b）標的部位での分子の電荷又は疎水性、又は（c）側鎖の大きさを維持する効果という点で非常に異なる置換を選択することによって、機能又は免疫的な同一性における実質的な変更がなされる。天然に存在する残基は共通の側鎖の特性に基づいたグループに分けることができる：
(1)疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Met）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）
(2)中性で親水性：システイン（Cys）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）
(3)酸性：アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）
(4)塩基性：アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）
(5)鎖の配向に影響を与える残基：グリシン（Gly）、プロリン（Pro）；及び
(6)芳香族：トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）
【００４１】
非保存的置換は、これらのクラスの一つを他へ変更することを伴っているのであろう。
【００４２】
【表１】
2005513000.tif 000002
【００４３】
アミノ酸置換による良い例となるPCK3145（SEQ ID NO:5）のアナログの例を以下に示す。
【００４４】
【表２】
2005513000.tif 000003
【００４５】
例えば、X1はグルタミン酸（Glu）、アスパラギン酸（Asp）、又はアスパラギン（Asn）とすることができ、X2はスレオニン（Thr）又はセリン（Ser）とすることができ、X3はチロシン（Tyr）又はフェニルアラニン（Phe）とすることができる。
【００４６】
ポリペプチドは、例えば、：
SEQ ID NO:2の、SEQ ID NO:3の、SEQ ID NO:4の、SEQ ID NO:5の、又はSEQ ID NO:6の少なくとも五つの近接するアミノ酸のポリペプチドアナログ；
SEQ ID NO:2の、SEQ ID NO:3の、SEQ ID NO:4の、SEQ ID NO:5の、又はSEQ ID NO:6の少なくとも二つの近接するアミノ酸のポリペプチドアナログ；
アミノ酸配列X1WQX2DX1CX1X2CX2CX3X1X2からなるペプチドアナログであり、式中X1はグルタミン酸（Glu）、アスパラギン（Asn）又はアスパラギン酸（Asp）のいずれか、X2はスレオニン（Thr）又はセリン（Ser）のいずれか、X3はチロシン（Tyr）又はフェニルアラニン(Phe)のいずれかである；
SEQ ID NO:5を含むポリペプチドアナログであり、アミノ末端に少なくとも一つのアミノ酸を付加したポリペプチドアナログ；
SEQ ID NO:5を含むポリペプチドアナログであり、カルボキシ末端に少なくとも一つのアミノ酸を付加したポリペプチドアナログ；
2から10ユニットのSEQ ID NO:5を含むポリペプチドアナログ；
2から50ユニットのSEQ ID NO:5を含むポリペプチドアナログ；
2から14のアミノ酸ユニットの配列からなるポリペプチドアナログであり、アミノ酸ユニットは、グルタミン酸（Glu）、トリプトファン（Trp）、グルタミン（Gln）、スレオニン（Thr）、アスパラギン酸（Asp）、アスパラギン（Asn）、システイン（Cys）、又はチロシン（Tyr）からなるSEQ ID NO:5のアミノ酸ユニットの群から選択する；
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と少なくとも90％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドアナログ；
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と少なくとも70％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドアナログ；
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列と少なくとも50％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドアナログ；又は
本出願記載の生物活性（高カルシウム血症及び骨転移への効果）を有する、PSP-94（nPSP-94（SEQ ID NO.:1）又はrHuPSP94（SEQ ID NO.:2））、及び、本出願記載の誘導体（PCK3145（SEQ ID NO.:5）、デカペプチド（SEQ ID NO.:3）、ポリペプチド7-21（SEQ ID NO.4）、ポリペプチド76-94（SEQ ID NO.6））のポリペプチドアナログ；
を含むPSP-94（nPSP-94(SEQ ID NO.:1)又はrHuPSP94(SEQ ID NO.:2)）のポリペプチドアナログ及び／又はPCK3145（SEQ ID NO.:5）、デカペプチド（SEQ ID NO.:3）、ポリペプチド7-21（SEQ ID NO.:4）、ポリペプチド76-94（SEQ ID NO.6）のアナログである。
【００４７】
アミノ酸配列挿入（例えば、付加）には、一つの又は複数のアミノ酸残基の配列内部への挿入と同様に、一つのアミノ酸残基から百以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドの範囲にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端への融合が含まれる。他の挿入性のバリアントには、キメラを形成する、相同性の又は非相同性のポリペプチドへの蛋白質のN又はC末端の融合が含まれる。キメラポリペプチド（すなわち、キメラ、ポリペプチドアナログ）には、相同性の又は非相同性の配列と融合した本発明のポリペプチドの配列を含む。前述の相同性の又は非相同性の配列には、本発明のポリペプチドとキメラを形成したときに1以上の生物活性又は免疫活性を保持するものを含む。
【００４８】
この分野の当業者に知られた方法（例えば、Smith, T.F. and Waterman M.S. (1981) Ad. Appl. Math., 2:482-489、又はNeedoleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970) J.Mol.Biol., 48: 443-453に記載されている方法）で求めた、本発明のポリペプチドと少なくとも50％一致する蛋白質は、本発明に含むこととする。なぜならば、本発明の蛋白質と少なくとも70％又は80％、及び更に好ましくは少なくとも90％一致する蛋白質であるからである。これは、一般的には、少なくとも5の、好ましくは少なくとも20の近接するアミノ酸の領域を超えるであろう。
【００４９】
本出願では当然のことながら、物質（例えば、アミノ酸）又は置換基の“範囲”又は“群（グループ）”等が記載されていたり、他のタイプの特定の特性（例えば、温度、圧力、化学構造、時間等）が記載されている場合、本発明は、部分的な範囲又は部分的な群のありとあらゆる特定の構成物及び組み合わせを指すものであり、これを組み込むこととする。それ故、任意の特定の範囲又は群は、その個々の範囲又は群のありとあらゆる構成物、及び、そこに含まれるありとあらゆる可能性ある部分的な範囲又は部分的な群を指す簡潔な言い方として理解され、そして、これは部分的な範囲又は部分的な群に関しても同様である。それ故、例えば、
・100℃より高い温度に関しては、ありとあらゆる個々の温度と同様に、100℃より高い部分的な範囲、例えば、101℃、105℃以上、110℃以上、115℃以上、110℃から135℃、115℃から135℃、102℃から150℃、210℃まで等も明確に組み込まれると理解される；
・反応時間に関しては、1分間以上とは、ありとあらゆる個々の時間と同様に、1分間より長い部分的な範囲、例えば、1分間、3から15分間、1分間から20時間、1から3時間、16時間、3から20時間等も明確に組み込まれると理解される；
・ポリペプチドに関しては、少なくとも二つの近接するアミノ酸配列からなるアナログポリペプチドとは、ありとあらゆる個々の可能性、例えば、アミノ酸1及び2のアナログポリペプチド、アミノ酸2及び3のアナログポリペプチド、アミノ酸3及び4のアナログポリペプチド、アミノ酸6及び7のアナログポリペプチド、アミノ酸9及び10のアナログポリペプチド、アミノ酸36及び37のアナログポリペプチド、アミノ酸93及び94のアナログポリペプチド等が組み込まれると理解される。
そして、濃度、成分等の他のパラメーターに関しても同様である。
【００５０】
本出願では当然のことながら、“g”又は“gm”はグラム重単位を指し、“C”は摂氏温度単位を指している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
最近の研究では、我々は、前立腺癌の増殖及び骨への転移おける、PSP-94又はPCK3145の効果について研究してきた。この研究のために、Mat Ly Luラット前立腺癌細胞を副甲状腺関連蛋白質（PTHrP）コードする全長をcDNAでトランスフェクトした。Mat Ly Lu-PTHrP細胞を、シンジェニックな雄のコペンハーゲンラットの右横腹に皮下（S.C.）接種するか、左心室に心臓内（I.C.）接種した。Mat Ly Lu細胞の心臓内接種によって、決まって後肢麻痺をもたらす腰椎への腫瘍の転移がみられた。後肢麻痺の時間及び腫瘍容積を測定し、比較はPSP-94又はPCK3145を投与した動物と溶媒のみを与えたコントロール動物との間で行った。研究の最後に、動物を殺し、コントロール動物と実験動物における血清Ca2+（カルシウム、Ca++）及びPTHrPレベルを求めた。一次腫瘍及び腰椎への骨転移についても、免疫組織化学によってPTHrP生成を測定した。研究の最後に、放射線学及び組織学分析のために、影響を受けた腰椎を取り除いた。腫瘍細胞のアポトーシスを証明するために、組織標本をHoechst染色及びTUNELアッセイに供してモニターした。
【実施例】
【００５２】
PSP-94（native）を米国特許No.:5,428,011の記載に従って生成した。PCK3145ポリペプチドは、例えば、カナダ特許出願No.:2,359,650の記載に従って生成した。
【００５３】
動物プロトコール
体重が200-250 gである同系交配の雄のコペンハーゲンラットを、Harlan Sprague-Dawley（Indianapolis, IN）から得た。接種前に、血清含有培地で増殖したMat Ly Lu-PTHrP腫瘍細胞をHanksバッファーで洗い、トリプシン処理を行い、1500 rpmで5分間遠心分離することによって集めた（Achbarou, A. et al., Cancer Res., 54:2372-2377, 1994; Rabbani, S.A. et al., Int. J. Cancer, 80: 257-264, 1999; Rabbani, S. A. et al., Endocrinology, 136:5416-5422, 1995）。細胞のペレット（10×103細胞）を100μlの生理食塩水に溶かし、1 mlインシュリンシリンジを用いて、ケタミン／キシラジン反応混液で麻酔したラットの左心室に注入した。動物は溶媒（PBS：リン酸緩衝生理食塩水）のみを与えたコントロール群と実験群に分けた。実験群は、腫瘍細胞接種時に開始してから（0日）骨転移が発達するまで、異なる投与量のPSP-94（0.1-10.0μg/kg/day）をI.P.注入した。後肢麻痺（腰椎転移のための脊髄圧迫の指標）の発達に必要である、腫瘍細胞接種後の時間を求め、後肢麻痺を発達する動物の数の割合をプロットした。    
【００５４】
代わりに、細胞のペレット（5×105細胞）を100μlの生理食塩水に溶かし、1 mlインシュリンシリンジを用いて、本出願に記載するように、ラットの右横腹に注入した。腫瘍細胞接種時から、S.C.注入によって15日間連続で、実験動物に異なる量のPSP-94（0.1、1.0又は10.0μg/kg/day）を投与した。コントロール動物には、溶媒コントロールとしてPBSのみ与えた。全ての動物に番号をつけ、分けたまま、毎日腫瘍の発達をモニターした。腫瘍の大きさは、キャリパーを用いて二次元で測定し、腫瘍容積は方程式(lxw2)/2（l＝長さ、w＝幅）に従って計算した（Rabbani, S. A. et al., Int. J. Cancer, 80: 257-264, 1999; Rabbani, S. A. et al., Endocrinology, 136: 5416-5422, 1995）。PSP-94の副作用を求めるために、全てのコントロール動物及び実験動物の体重を一日おきに測定した。コントロール動物及び実験動物両方を、腫瘍細胞接種後16日で殺し、腫瘍を取り出して重さを測定した。加えて、この腫瘍を、本出願で記載する組織学的分析に用いた。血漿Ca2+及びPTHrPレベルを求めるために、16日目で、全てのコントロール動物及び実験動物由来の血液を集めた。
【００５５】
本出願で提示する結果は、いつも、少なくとも3回行った実験での平均値±SE（標準偏差）として表し、統計上の比較はStudentのt検定又は分散分析に基づいて行った。p値＜0.05を有意差があるとする（Glantz, S. A., Primer of biostatistics. McGraw-Hill, new-York, 1981）。
【００５６】
（実施例１）
Mat Ly Lu-PTHrP細胞増殖、形態及び浸潤におけるPSP-94の効果
細胞及び細胞培地
Dunning R3327 Mat Ly Lu細胞ライン（例えば、American Type Culture Collection No.:JHU-5で入手可能）を、以前の記載に従って、ラットPTHrPをコードする全長cDNAでトランスフェクトした（Rabbani, S. A. et al., Int. J. Cancer, 80: 257-264, 1999）。三つの良く特徴付けられたモノクローナル細胞ラインMat Ly Lu-PTHrp-8のうちの一つを研究に用いた。これらの実験に供する細胞の以前に構築した培養方法（Rabbani, S. A. et al., Int. J. Cancer, 80: 257-264, 1999）に従って、2 mMのL−グルタミン（Life Technologies, Inc. Grand Island, N. Y.）、10％のウシ胎児血清（FBS）、100 nuits/mlのペニシリン-ストレプトマイシン硫酸塩（Life Technologies, Inc.）、及び250 nMのデキサメタゾン及びG418（600 mg/ml）を補充したRPMI 1640中で、細胞をin vitroで維持した。    
【００５７】
細胞の形態
コントロールMat Ly Lu-PTHrP細胞及びPSP-94処理したMat Ly Lu-PTHrP細胞の形態学的分析は、10％FBS存在下で、6穴プレート（Falcon Plastics, Oxnard, CA）を用いて1ウェル当り5×104の細胞を入れることによって行った。毎日、細胞の形態的ないかなる変化も観察し、写真撮影した（Rabbani, S. A. et al., Endocrinology, 136:5416-5422, 1995）。
【００５８】
浸潤
Mat Ly Lu-PTHrP腫瘍細胞の浸潤能力におけるPSP-94の効果を、以前の記載（Liu, D. F. et al., Prostate, 27: 269-276, 1995）に従って、2-compartment Boyden Chamber(Transwell, Costar, Cambridge, MA)及び基底膜マトリゲル（Becton Dickinson Labware, Bedford MA）を用いて観察した。
【００５９】
増殖曲線
増殖曲線を求めるために、5×103の細胞／ウェルの接種濃度で、Mat Ly Lu-PTHrP細胞を6穴プレート（Falcon Plastics, Oxnard, CA）に入れた。0.1、1.0及び10.0μg/mlのPSP-94又は溶媒のみの存在下で、3日間までMat Ly Lu-PTHrP細胞を増殖させ、細胞の倍加時間を変化させるPSP-94の能力を、毎日評価した。培地は2日ごとに変えた。細胞数は、モデルZ Coulter counter(Coulter Elertronics, Beds, UK)で数えた。比較も、野生型のトランスフェクトしていないMat Ly Lu-PTHrP細胞の倍加時間を用いて比較した。
【００６０】
図１に提示する結果は、ベクター単独で又はPTHrP発現ベクターでトランスフェクトしたMat Ly Lu-PTHrP細胞を、6穴プレートに5×103の細胞／ウェルの濃度で接種した結果を示す。Mat Ly Lu-PTHrP細胞をPSP-94処理し、トリプシン処理を行い、本出願で記載したcoulter counterを用いて細胞数を数えた。72時間10.0μg/mlのPSP-94で処理後の細胞数の変化を示す。Mat Ly LuをPTHrP cDNAでトランスフェクションすることによって倍加時間が減り、PTHrPの増殖促進効果によって腫瘍細胞増殖は増加した。それ故、Mat Ly Lu-PTHrP細胞は、ベクター単独でトランスフェクトしたコントロールMat Ly Lu細胞と比較して、高い割合で細胞増殖が行われた。Mat Ly Lu-PTHrP細胞の増殖の有意な減少が、72時間10.0μg/mlのPSP-94で処理した後に観察された（図１）。より少ない投与量のPSP-94（0.1及び1.0μg/ml）では、腫瘍細胞増殖の有意な差が見られなかった（データは示さない）。Mat Ly Lu-PTHrP細胞を3日間10.0μg/mlのPSP-94で処理することによって、細胞の形態に顕著な変化が生じ、通常の紡錘体様の形から、より丸く凝縮した形態へと変化した（データは示さない）。Boyden Chamber Matrigel浸潤アッセイを用いたところ、全ての投与量のPSP-94でMat Ly Lu-PTHrP細胞の浸潤能力は変化しなかった（データは示さない）。
【００６１】
（実施例２）
Mat Ly Lu-PTHrP腫瘍増殖におけるPSP-94の効果
雄のコペンハーゲンラットに、前述したように右横腹にS.C.ルートによる注入でMat Ly Lu-PTHrP細胞を接種した。腫瘍細胞接種の日からはじめて、腫瘍細胞接種部位下部に、15日間まで異なる量のPSP-94（0.1-10.0μg/kg/day）を動物にS.C.で接種した。溶媒のみを与えた動物が有するコントロール腫瘍と比較して毎日腫瘍容積を求めることによって、腫瘍増殖の減少におけるPSP-94の効果を評価した。    
【００６２】
図２Aに提示する結果は、雄のコペンハーゲンラットを、1×106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞で右横腹にS.C.接種した結果を示す。腫瘍細胞接種時からはじめて、前述したように15日間連続で、異なる量のPSP-94（0.1-10.0μg/kg/day）を動物に毎日注入した。腫瘍容積を時間間隔で測定し、溶媒のみを与えた動物が有する腫瘍をコントロール（CTL）として比較した。図２Bの結果も、雄のコペンハーゲンラットを、106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞でS.C.接種した結果を示す。腫瘍細胞接種3日後、腫瘍細胞注入部位に、溶媒のみ（CTL）又は異なる量のPSP-94（nPSP）（0.1、1.0又は10.0μg/kg/day）で動物に注入した。腫瘍容積（立方センチメートル（cm3）で表す）を時間間隔で求めた。コントロール動物については、実験期間の間、腫瘍容積の連続的な増加を示した。これと対照的に、PSP-94を与えた実験動物は、実験を通して、投与量に依存した腫瘍容積の減少を顕著に示した（図２A、２B）。
【００６３】
この実験を通じて、コントロール動物及び実験動物の両方について、顕著な副作用や、体重減少につながる悪液質をモニターした。図３に提示する結果は、雄のコペンハーゲンラットを、1×106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞で右横腹にS.C.注入した結果を示す。腫瘍細胞接種時からはじめて、前述したように15日間連続で、異なる量のPSP-94を動物に注入した。全ての動物を時間間隔で体重を測定し、溶媒のみを与えた腫瘍を有する動物の体重をコントロール（CTL）として比較した。コントロールの体重には顕著な変化が見られず、実験動物の群にはPSP-94の潜在的な副作用も見られなかった（図３）。
【００６４】
（実施例３）
Mat Ly Lu-PTHrP腫瘍の重さにおけるPSP-94の効果
腫瘍の重さにおけるPSP-94の効果を求めるために、S.C.ルート注入でMat Ly Lu-PTHrPを接種した動物を、実験の最後に（16日）殺し、腫瘍を切り取って重さを量った。
【００６５】
図４に提示する結果は、雄のコペンハーゲンラットを、右横腹に皮下注入して1×106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞で接種した結果を示す。腫瘍細胞接種の日からはじめて、前述したように15日間連続で、異なる量のPSP-94を動物に投与した。実験の最後に、コントロール（CTL）である、溶媒を与えた動物及びPSP-94を与えた動物の腫瘍を切り取って、重さを量った。溶媒のみを与えたコントロール動物は大きな腫瘍を示す一方で、異なる量のPSP-94（0.1-10.0μg/kg/day）を投与することによって、投与量に依存した腫瘍の重さの減少を顕著に示した（図４）。
【００６６】
右横腹への皮下注入を通してMat Ly Lu-PTHrP細胞で雄のコペンハーゲンラットを接種することによって、一次腫瘍の発達がもたらされた。コントロールである、溶媒投与動物が大きな一次腫瘍を発達させるのに対して、異なる量のPSP-94を投与することによって、投与量に依存した腫瘍の大きさの減少を示した。この抗腫瘍効果は、顕著な副作用又は実験動物の体重の減少とは関連性がなかった。
【００６７】
（実施例４）
骨転移の発達におけるPSP-94及びPCK3145の効果
死亡に関連する前立腺癌の主要な原因は骨転移の発達であることから、左心室へのI.C.ルートを通じてMat Ly Lu-PTHrP細胞で雄のコペンハーゲンラットを接種することによって、骨転移の発達を遅らせるPSP-94の効果の評価を行った。左心室へMat Ly Lu細胞を決まった手段で注入することによって、後肢麻痺の原因となる脊髄圧迫をもたらす骨転移の発達が導かれた。
【００６８】
左心房へのI.C.注入を通じて雄のコペンハーゲンラットに、Mat Ly Lu-PTHrP細胞を接種した。腫瘍細胞接種の日からはじめて（0日）、I.P.（腹腔内）ルートを通じて異なる量のPSP-94（0.1-10.0μg/kg/day）を動物に投与した。動物の後肢麻痺の発達を毎日モニターすることによって、骨転移の発達を遅らせるPSP-94の効果を評価した。
【００６９】
図５Aに提示する結果は、雄のコペンハーゲンラットを、10×103 Mat Ly Lu-PTHrP細胞で左心室にI.C.ルートを通じて接種した結果を示す。腫瘍細胞接種時からはじめて（0日）、前述したように後肢麻痺が発達する日まで、異なる量のPSP-94（0.1-10.0μg/kg/day）を動物に注入した。コントロール（CTL）として溶媒のみ与えた動物又はPSP-94を与えた動物を後肢麻痺の発達を調べるために毎日モニターし、各群で異なった時間における麻痺を生じなかった動物の％を計算した。Mat Ly Lu-PTHrP細胞で接種して溶媒のみを与えたコントロール動物は全て（100％）、13日までに後肢麻痺を発達させた。0.1及び1.0μg/kg/dayのPSP-94が後肢麻痺の発生時間に顕著な効果をもたらさなかったのに対し（データは示さない）、10.0μg/kg/dayのPSP-94投与によって、後肢麻痺を発達させた動物の数を統計的に有意に遅らせることができた。PSP-94を与えて後肢麻痺を発達させなかった動物の全体数の異なる日での割合を、図５A及び５Bに示す。
【００７０】
もう一つのセットの実験を行った。図５Bに提示する結果も、雄のコペンハーゲンラットを、5×104 Mat Ly Lu-PTHrP細胞で心臓内（I.C.）ルートを通じて接種した結果を示す。腫瘍接種の3日後、溶媒のみ（Ctl）又は異なる量のPSP-94（nPSP）を腹腔内ルートによって動物に注入した。Ctl及び10.0μg/kg/dayのPSP-94を与えた動物の後肢麻痺の発達に要する時間を示す。
【００７１】
PCK3145を与えて後肢麻痺を発達させなかった動物の全体数の異なる日での割合を図１１に示す。図１１に提示する結果は、雄のコペンハーゲンラットを、10×103 Mat Ly Lu-PTHrP細胞でI.C.注入して接種した結果を示す。腫瘍細胞接種の日からはじめて（0日）、前述したように後肢麻痺が発達する日まで、異なる量のPSP-3145（1.0-100.0μg/kg/day）を動物に注入した。コントロール（CTL）として溶媒のみ与えた動物又はPSP-3145を与えた動物を後肢麻痺の発達を調べるために毎日モニターし、各群で異なった時間における麻痺を生じなかった動物の％を計算した。
【００７２】
コントロールである、溶媒を投与した動物は全て13日までに後肢麻痺を発達させたのに対して、腫瘍細胞接種時から最も多量のPSP-94を投与することによって、骨転移の中程度の遅れがもたらされた。このような結果は、PSP-94が骨に対して低い生物学的利用能であることを示し、骨転移の効果的な治療薬の開発に関連する共通の欠点であることを示す（Rabbani, S. A. et al., Cancer res., 58:3461-3465, 1998）。    
【００７３】
（実施例５）
血漿PTHrP及びカルシウムレベル及び腫瘍のPTHrP生成におけるPSP-94及びPCK3145の効果
血漿PTHrP及びカルシウムレベルにおけるPSP-94及びPCK3145の効果を求めるために、S.C.ルートを通じてMat Ly Lu-PTHrP細胞で接種した動物を実験の最後に殺し、血漿を集め、PTHrPレベルを放射線免疫測定法を用いて分析した。比較は、ノーマルであり腫瘍を有していない動物から集めた血漿、コントロールである溶媒のみを与えた腫瘍を有する動物から集めた血漿及び異なる量のPSP-94（0.1-10.0μg/kg/day）を与えた実験動物から集めた血漿との間で行った。血漿カルシウムレベルは、原子吸光分光光度計で求めた（model 703, Perkin-Elmer, Norwalk, CT）。血漿PTHrPを求めるために、全てのサンプルを、製品の取扱説明書に従ってPTHrP R.I.A.キット（Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA）で二倍希釈してテストした。
【００７４】
ノーマルであり腫瘍を有していない動物は血漿PTHrPが基礎レベルを示したが、Mat Ly Lu-PTHrP細胞で接種した動物又は溶媒のみを与えた動物は、免疫活性な血漿PTHrPレベルの顕著な上昇が見られた。腫瘍を有する動物にPSP-94を投与することによって、容量に依存した血漿PTHrPレベルの減少を示した（図６A）。ノーマルであり腫瘍を有していない動物から集めた血漿及び溶媒のみを与えた腫瘍を有する動物から集めた血漿を分析することによって、腫瘍細胞接種から16日経過後に殺す時にはコントロールである腫瘍を有する動物の血漿カルシウムが顕著に増加していることが明らかになった。対照的に、異なる量のPSP-94を与えた、実験動物の群は、血漿カルシウムレベルの顕著な減少を示した。最も多い投与量のPSP-94（10.0μg/kg/day）では、実験動物の群では血漿カルシウムがほとんど正常になっていることが示された（図６B）。図７A及び７Bで提示する結果も参照せよ。
【００７５】
図６A及び６Bの結果は、雄のコペンハーゲンラットを、1×106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞でS.C.接種した結果を示す。腫瘍細胞接種時からはじめて、前述したように15日間連続で、異なる量のPSP-94を動物に投与した。全ての動物を実験の終わりに（16日）殺し、コントロール（CTL）である溶媒投与動物及びPSP-94投与動物から血漿を集め、本出願で記載したように放射線免疫測定法を用いて、免疫活性な血漿PTHrP（iPTHrP）レベルを分析し（図６A）、又は、本出願で記載したように血漿カルシウムレベルを分析した（図６B）。ノーマルであり腫瘍を有していない動物の血漿PTHrPレベル（N）（図６A）及びノーマルであり腫瘍を有していない動物の血漿カルシウムも示す（N）（図６B）。
【００７６】
もう一つのセットの実験を行った。類似した結果を図７A及び７Bに提示する。図７Aの結果は、雄のコペンハーゲンラットを、106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞でs.c.接種した結果を示す。腫瘍細胞接種の3日後、溶媒のみ（Ctl）を又は異なる量（1.0又は10.0μg/kg/day）のPSP-94を18日間動物に投与した。動物は21日目に殺し、血漿PTHrPを求めた。腫瘍を有していない動物のPTHrPレベル（ピコモル当量／リットルで表す）も（N）で示す。図７Bの結果は、雄のコペンハーゲンラットを、106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞でs.c.接種した結果を示す。腫瘍細胞接種の3日後、溶媒のみ（Ctl）を又は異なる量（1.0又は10.0μg/kg/day）のPSP-94を18日間動物に投与した。動物は21日目に殺し、血漿カルシウム（ミリモル（mM）で表す）を求めた。腫瘍を有していない動物のPTHrPレベルも（N）で示す。
【００７７】
全ての動物を実験の終わりに殺した。溶媒のみを投与したコントロール群由来の腫瘍及び異なる量のPSP-94（0.1-10.0μg/kg/day）を投与した実験群由来の腫瘍を取り出し、パラフィン包埋し、切片化して、本出願に記載した方法を用いてPTHrPに特異的な免疫組織化学反応によって、腫瘍のPTHrP生成を分析した。図８の結果は、溶媒のみ与えた動物由来の腫瘍（CTL）又は異なる量のPSP-94を与えた動物由来の腫瘍の組織切片であり、本出願で記載したようにPTHrPに特異的な抗体で染色した組織切片を表す。各群は3匹の動物からなり、少なくとも10のランダムなフィールドの観察によって、各動物につき3の腫瘍切片を分析した。
【００７８】
組織学的分析
免疫組織学的分析のために、一次腫瘍サンプルについて、60℃で加熱することによってロウを除去し、段階的な一連のアルコール（100％-70％）で再水和させた。一次抗体として、PTHrPに対する抗ラット抗体を用いた。一晩4℃で腫瘍切片を反応させ、その後、45−60分間ビオチン化ユニバーサル抗体（Vector Laboratories, Burlingame, CA）と更に反応させた。切片をTBST（Tris buffered saline-Tween）でゆすぎ、その後、30分間Vectastain ABC-AP試薬（Vertor Laboratories, Burlingame, CA）で反応させた。この切片を再びTBSTで洗い、Napthol AS-Mix Phosphate/Fast Red solution(Sigma-Aldriche, Oakville, ON)で反応させた。最終的に、切片をメチルグリーン（Vector Laboratories, Burlingame, CA）で対比染色し、標本にした。
【００７９】
溶媒のみを与えた動物のコントロール群由来の腫瘍は、濃い色の染色が観察された。対照的に、異なる量のPSP-94を与えた動物由来の腫瘍においては、投与量に依存したPTHrP免疫染色の減少が見られた（図８）。
【００８０】
PCK3145で接種した腫瘍を有する動物から得られた類似した結果を図１０A及びBに示す。
【００８１】
図１０Aで提示する結果は、雄のコペンハーゲンラットを、1×106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞でS.C.接種した結果を示す。腫瘍細胞接種時からはじめて、前述したように15日間連続で、異なる量のPCK-3145を動物に投与した。全ての動物を実験の終わりに（16日）殺し、コントロール（CTL）である溶媒投与動物及びPSP-94投与動物から血漿を集め、本出願で記載したように放射線免疫測定法を用いて、免疫活性なPTHrP（iPTHrP）レベルを分析した。ノーマルであり腫瘍を有していない動物の血漿PTHrPレベルも（N）で示す。
【００８２】
図１０Bで提示する結果は、雄のコペンハーゲンラットを、1×106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞でS.C.接種した結果を示す。腫瘍細胞接種時からはじめて、前述したように15日間連続で、異なる量のPCK-3145を動物に投与した。全ての動物を実験の終わりに（16日）殺し、溶媒を投与したコントロール動物（CTL）及びPCK-3145を投与した動物から血漿を集め、本出願で記載したように血漿カルシウムレベルを分析した。腫瘍を有していない動物の血漿カルシウムも（N）で示す。
【００８３】
これまでで論じてきたように、動物の犠牲の上に、血漿を集めてPTHrP及びカルシウムレベルを分析した。ノーマルであり、腫瘍を有していない動物は検出できるレベルの血漿PTHrPを有していないにもかかわらず、Mat Ly Lu-PTHrP細胞で動物を接種することによって、血漿PTHrPの顕著な増加が示された。このことと対照的に、異なる量のPSP-94の投与によって、投与量に依存した血漿PTHrPレベルの減少がもたらされた。加えて、コントロール溶媒投与動物及びPSP-94投与動物を免疫組織化学的分析に供した際に、同じ投与量に依存した減少が腫瘍細胞のPTHrP生成で見られた。    
【００８４】
悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の主な病原要因であるように、血漿カルシウムレベルは血漿PTHrPレベルと密接に関連している（Iwamura, M., et al., Urology 43: 675-679, 1994; Iwamura, M., et al., Hum. Pathol. 26: 797-801, 1995; Suva, L. J., et al., Science, 237: 893-896, 1987）。動物へのMat Ly Lu-PTHrP細胞の接種によって、ノーマルであり、腫瘍を有していない動物由来の血清と比較して、血漿カルシウムレベルが顕著に増加することが示された。異なる量のPSP-94の投与によって、投与量に依存して血漿カルシウムレベルが減少し、最もPSP-94の投与量が多い場合には、血漿カルシウムレベルはほとんど正常になった。
【００８５】
このモデルを用いれば、腫瘍容積及び重さが減少することによってPSP-94の抗腫瘍効果を明らかにすることができるだけでなく、血漿カルシウム及びPTHrPレベルといった生化学的なパラメーターが治療後に顕著に減少することも示した。本研究の重要な知見は、腫瘍容積の減少が投与量依存的であるのに対して、10.0μg/kg/dayのPSP-94では、1.0μg/kg/dayに比較して顕著な腫瘍容積の減少を示さなかったことである。対照的に、PSP-94の血漿カルシウム、血漿PTHrP及び腫瘍のPTHrPを減少させる能力は、10.0μg/kg/dayのPSP-94まで投与量依存的に効果を示し続け、血漿カルシウム及びPTHrPレベルをほとんど正常に導くことができた。この知見から、我々は、PSP-94が腫瘍細胞によるPTHrPの生成を制御する能力又はカルシウムのホメオスタシスを変える能力のような新たな効果を有しているかもしれないということを推測した。実際、PSP-94は、細胞内カルシウムを制御することで知られている、卵胞刺激ホルモン（FSH）を抑制することが示されている（Touyz, R. M. et al., Biol. Reprod. 62: 1067-1074, 2000）。PSP-94によるFSHの抑制は、FSHが前立腺癌の増殖を促進する効果を有しているため、抗腫瘍効果をもたらす新たな機構として働いているかもしれない（Porter, A. T. et al., Urol. Oncol., 6: 131-138, 2001）。更に、推定されるPSP-94レセプターのクローニング及び性質決定がなされていないにもかかわらず、いくつかの研究では、PSP-94が結合する前立腺癌細胞の蛋白質が存在していることを示す証拠が示され、それによると、PSP-94結合によって、観察された抗腫瘍効果を導くシグナル伝達系が開始されるということであった（Yang, J. P. et al., J. Urol. 160:2240-2244, 1998; Yang, J. P. et al., Prostate, 35: 11-17, 1998）。
【００８６】
（実施例６）
in vitro及びin vivoでのPSP-94 Mat Ly Lu-PTHrP腫瘍細胞アポトーシス効果
TUNELアッセイにおいては、組織切片について、60℃で加熱することによってロウを除去して再水和し、キシレンで洗ってから、段階的な一連のアルコール及び水で再水和させた。組織は、30分間37℃でプロテイナーゼKで反応させ、固定化し、ブロック及び透過処理を行った。アポトーシス細胞を、製品の取扱説明書に従って、TUNEL assay in situ cell death detection kit(Roche Molecular Biochemicals, Laval, QC)を用いて検出した。陽性のTUNEL染色は、蛍光顕微鏡で視覚化した。
【００８７】
TUNELアッセイに続く他の実験として、組織切片をHoechst 33258（Sigma-Aldrich, Oakville, Canada）で対比染色した。Hoechst stainingを、PBS中終濃度24μg/mlで組織に加え、15分間室温で反応させた。組織切片を洗い、ブルースクリーンを用いて蛍光顕微鏡で視覚化した（Rabbani, S. A., et al., Int. J. Cancer, 87: 276-282, 2000）。免疫組織化学的なアッセイ及びTUNELアッセイから得られた全ての結果は、二人の別の研究者によって評価し解釈した。
【００８８】
腫瘍増殖の減少におけるPSP-94がもたらす作用の基本的な分子機構を調べるために、PSP-94（10.0μg/ml）の存在下又は溶媒のみの存在下、異なる時間間隔でMat Ly Lu-PTHrP細胞を培養した。溶媒のみ又はPSP-94の存在下で培養した細胞からゲノムDNAを集めた。簡潔に言うと、DNA断片化のために、6穴プレート（Falcon Plastics, Oxnard, CA）にMat Ly Lu-PTHrP細胞を入れた。72時間、PSP-94（10.0μg/ml）で細胞を処理した。PSP-94と培養した処理細胞由来のDNA及び溶媒のみで処理した細胞由来のDNAを、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液（50：48：2）を用いて集めた。当量のDNAを、2％アガロースゲル電気泳動に供した。DNAの断片化は、トランスイルミネーターを用いてUVによって視覚化した。より具体的には、図９Aに提示する結果は、Mat Ly Lu-PTHrP細胞を96時間まで溶媒のみ又はPSP-94（10.0μg/ml）の存在下で培養した結果を示す。前述したように、DNAを単離し、アガロースゲルに供した。この結果により、溶媒のみで培養したコントロールMat Ly Lu-PTHrP細胞が全くDNAの断片化を示さないことがわかった。しかしながら、実験に供した、PSP-94（10.0μg/ml）存在下で培養したMat Ly Lu-PTHrP細胞では、72時間の処理後、顕著なDNAの断片化を示した（図９A）。
【００８９】
DNAの断片化の程度は、アポトーシスのマーカーとして機能するTUNELアッセイを用いてin vivoでも分析した。より具体的には、図９Bに提示する結果は、本出願で記載したように、1×106 Mat Ly Lu-PTHrP細胞で接種し、15日間連続で異なる量のPSP-94を注入した雄のコペンハーゲンラットから集めた組織に由来する。全ての動物を実験の終わりに殺し、一次腫瘍を取り出してパラフィン包埋し、切片化して、本出願で記載のTUNELアッセイに供した（上のパネル）。TUNELアッセイに続き、Hoescht試薬で対比染色した（下のパネル）。PSP-94（10.0μg/kg/day）で処理した腫瘍切片は、溶媒で処理したコントロール腫瘍に比べて、顕著なTUNEL陽性となった（図９B）。Hoechst試薬を用いた対比染色によって、PSP-94で処理した動物由来の組織切片にアポトーシスを起こした細胞が存在していることが明らかになった。更に、アポトーシス細胞に特徴的である、凝縮クロマチンがPSP-94処理腫瘍で観察された。コントロールである、溶媒処理腫瘍は、ノーマルなDNA染色パターンを示した（図９B）。これらのin vitro及びin vivoでの知見によって、実際に、PSP-94処理後の腫瘍容積の減少が、腫瘍細胞アポトーシスを促進する能力に由来していることを明らかになった。
【００９０】
上述の指摘のとおり、コントロール動物及び実験動物由来の腫瘍切片で行ったTUNELアッセイによって、PSP-94を投与した腫瘍では、コントロールの腫瘍よりも著しいTUNEL陽性となり、PSP-94を投与した動物においては高い頻度でアポトーシスが生じていることを明らかにした。これに加えて、Hoechst試薬を用いた対比染色によって、PSP-94を投与した腫瘍では凝縮しアポトーシスを起こしたクロマチンとなり、コントロールの腫瘍ではノーマルなDNA染色を示すことを明らかにした。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
まとめると、本研究の結果によって、PSP-94及びPCK3145が、いかなる細胞毒性も示さずに、ホルモン非依存性の末期前立腺癌の増殖及びそれに関連する悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の効果的な阻害剤であることがわかる。ポリペプチド、そのポリペプチド類似のアナログ単独又は現在利用できる化学療法薬との組み合わせを用いることによって、薬に関連するいかなる副作用も示さない、長期間にわたって投与できる非常に効果的で毒性の無い生物治療薬を伴った前立腺癌の進行を妨げる独特な機会を提供するであろう。このアプローチは、前立腺癌に関する罹患率及び死亡率の減少に大いに役立つであろう。    
【００９２】
本明細書に引用された全ての刊行物及び特許物願は、それぞれの刊行物又は特許出願が具体的及び単独に組み込まれたものとして、本明細書に組み込まれる。いかなる出版物の引用も出願日以前の開示内容を示すためのものであり、先行技術によってそのような刊行物に先行できないと自認するものと解釈すべきではない。
【００９３】
理解を明確にする目的で、前述の発明を図面及び実施例をとおして詳細に説明したが、本願の特許請求の範囲の精神から外れない限りにおいて、幾つかの変更又は修正が行いうることは、本願の教示内容に照らして当業者にとっては言うまでもなく明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、Mat Ly Lu-PTHrP細胞増殖におけるPSP-94の効果を示す。各点は、3回行った異なる実験の平均値を表す。PSP-94非存在下でのコントロール細胞（Mat Ly Lu-CMV）とPTHrPトランスフェクト細胞との有意な差はアスタリスクで表している（p<0.05）。
【図２Ａ】図２Aは、Mat Ly Lu-PTHrP腫瘍容積（cm3）におけるPSP-94の効果を示す。結果は、3回行った異なる実験での、各群における5匹の動物の平均値±SEMを表す。溶媒のみを与えた動物のコントロール腫瘍（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。
【図２Ｂ】図２Bも、Mat Ly Lu-PTHrP腫瘍容積（cm3）におけるPSP-94の効果を示す。結果は、各群における6匹の動物の平均値±SEMを表す。腫瘍容積の有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。
【図３】図３は、動物の体重におけるPSP-94の効果を示す。結果は、3回行った異なる実験での、各群における5匹の動物の平均値±SEMを表す。
【図４】図４は、Mat Ly Lu-PTHrP腫瘍の重さにおけるPSP-94の効果を示す。結果は、3回行った異なる実験での、各群における5匹の動物の平均値±SEMを表す。溶媒のみを与えた動物のコントロール腫瘍（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。
【図５Ａ】図５Aは、後肢麻痺をもたらす脊髄転移におけるPSP-94の効果を示す。結果は、3回行った異なる実験での、各群における5匹の動物の平均値±SEMを表す。麻痺が起こらない動物の％によって表した、溶媒のみを与えた動物のコントロール腫瘍（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。
【図５Ｂ】図５Bも、後肢麻痺をもたらす脊髄転移におけるPSP-94の効果を示す。
【図６Ａ】図６Aは、腫瘍を有する動物の血漿PTHrPにおけるPSP-94の効果を示す。結果は、3回行った異なる実験での、各群における5匹の動物の平均値±SEMを表す。溶媒のみを与えた動物のコントロール腫瘍（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。腫瘍を有していない動物から得られる結果（N）も示す。
【図６Ｂ】図６Bは、腫瘍を有する動物の血漿カルシウムにおけるPSP-94の効果を示す。結果は、3回行った異なる実験での、各群における5匹の動物の平均値±SEMを表す。溶媒のみを与えた動物のコントロール腫瘍（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。腫瘍を有していない動物から得られる結果（N）も示す。
【図７Ａ】図７Aも、腫瘍を有する動物の血漿PTHrPにおけるPSP-94の効果を示す。結果は、各群における6匹の動物の±SEMを表す。コントロール（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。腫瘍を有していない動物から得られる結果（N）も示す。
【図７Ｂ】図７Bも、腫瘍を有する動物の血漿カルシウムにおけるPSP-94の効果を示す。結果は、各群における6匹の動物の±SEMを表す。コントロール（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。腫瘍を有していない動物から得られる結果（N）も示す。
【図８】図８は、Mat Ly Lu-PTHrP腫瘍によるPTHrP生成におけるPSP-94の効果を示す。3つのこの実験の代表的な顕微鏡写真を200Xの拡大率で表す。
【図９Ａ】図９Aは、in vitroでのMat Ly Lu-PTHrP細胞のDNA断片化におけるPSP-94の効果を示す。3つのこの実験の代表的な写真を表す。
【図９Ｂ】図９Bは、in vivoでのMat Ly Lu-PTHrP細胞のDNA断片化におけるPSP-94の効果を示す。全ての動物を研究の終わりに殺し、一次腫瘍を取り出し、パラフィン包埋し、切片化して本出願に記載したTUNELアッセイに供し（上のパネル）、又は、Hoescht試薬で対比染色を行った（下のパネル）。各群は3匹の動物からなり、各動物につき3つの切片を分析した。少なくとも10のランダムなフィールドの観察により評価した。各群における3つのこの実験の代表的な顕微鏡写真を200Xの拡大率で表す。
【図１０Ａ】図１０Aは、放射線免疫測定法を用いた、腫瘍を有する動物の血漿PTHrPレベルにおけるPCK-3145の効果を示す。結果は、3回行った異なる実験での、各群における5匹の動物の平均値±SEMを表す。溶媒のみを与えた動物のコントロール腫瘍（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。腫瘍を有していない動物から得られる結果（N）も示す。
【図１０Ｂ】図１０Bは、腫瘍を有する動物の血漿カルシウムレベルにおけるPCK-3145の効果を示す。結果は、3回行った異なる実験での、各群における5匹の動物の平均値±SEMを表す。溶媒のみを与えた動物のコントロール腫瘍（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。腫瘍を有していない動物から得られる結果（N）も示す。
【図１１】図１１は、後肢麻痺をもたらす実験的骨転移におけるPCK-3145の効果を示す。結果は、3回行った異なる実験での、各群における5匹の動物の平均値±SEMを表す。麻痺が起こらない動物の％によって表した、溶媒のみを与えた動物のコントロール腫瘍（CTL）との有意な差は、アスタリスクで表している（p<0.05）。
【図１】
2005513000.tif 000004
【図２Ａ】
2005513000.tif 000005
【図２Ｂ】
2005513000.tif 000006
【図３】
2005513000.tif 000007
【図４】
2005513000.tif 000008
【図５Ａ】
2005513000.tif 000009
【図５Ｂ】
2005513000.tif 000010
【図６Ａ】
2005513000.tif 000011
【図６Ｂ】
2005513000.tif 000012
【図７Ａ】
2005513000.tif 000013
【図７Ｂ】
2005513000.tif 000014
【図８】
2005513000.tif 000015
【図９Ａ】
2005513000.tif 000016
【図９Ｂ】
2005513000.tif 000017
【図１０Ａ】
2005513000.tif 000018
【図１０Ｂ】
2005513000.tif 000019
【図１１】
2005513000.tif 000020
【配列表】
2005513000000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月8日(2004.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症にかかっている患者を治療するためのPSP-94の使用。
【請求項２】
前記悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症が、前立腺癌、乳癌及び上皮性悪性腫瘍からなる群から選択される癌によって生じる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
必要としている患者のPTHrPレベルを減ずるためのPSP-94の使用。
【請求項４】
骨転移の進行を減ずるためのPSP-94の使用。
【請求項５】
悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症の治療に用いる医薬組成物の製造におけるPSP-94の使用。
【請求項６】
骨転移の治療に用いる医薬組成物の製造におけるPSP-94の使用。
【請求項７】
腫瘍を有する患者におけるPSP-94の腫瘍治療効果を評価する方法であって、前記患者の血漿カルシウムレベルを測定することを含む方法。
【請求項８】
患者において、PSP-94の悪性腫瘍を伴う高カルシウム血症治療効果を評価する方法であって、前記患者の血漿カルシウムレベルを測定することを含む方法。
【請求項９】
a) PSP-94を用いた患者の治療の前に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿カルシウムを測定すること；
b) PSP-94を用いた患者の治療の後に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿カルシウムを測定すること；及び
c) a)工程で得られた値とb)工程で得られた値を比較すること；
を含む、患者のPSP-94の治療効果を評価する方法。
【請求項１０】
腫瘍を有する患者におけるPSP-94の腫瘍治療効果を評価する方法であって、前記患者の血漿PTHrPレベルを測定することを含む方法。
【請求項１１】
患者において、PSP-94の悪性腫瘍を伴う高カルシウム血症治療効果を評価する方法であって、前記患者の血漿PTHrPレベルを測定することを含む方法。
【請求項１２】
a) PSP-94を用いた患者の治療の前に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿PTHrPを測定すること；
b) PSP-94を用いた患者の治療の後に、腫瘍又は悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を有する患者の血漿PTHrPを測定すること；及び
c) a)工程で得られた値とb)工程で得られた値を比較すること；
を含む、患者のPSP-94の治療効果を評価する方法。
【請求項１３】
SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2及びSEQ ID NO.:5からなる群から選択される化合物及び製薬上許容される担体を含む医薬組成物であり、転移、ホルモン非依存性の後期段階の前立腺癌、副甲状腺ホルモン関連蛋白質レベルの上昇に関連する状態、PTHrP誘導骨吸収及び悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症からなる群から選択される状態の治療に用いる医薬組成物。
【請求項１４】
前記転移が骨転移である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ホルモン非依存性の後期段階の前立腺癌が、ホルモン非依存性の後期段階の転移性の前立腺癌である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記化合物がSEQ ID NO.:5で定義されたものである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
転移、ホルモン非依存性の後期段階の前立腺癌、副甲状腺ホルモン関連蛋白質レベルの上昇に関連する状態、PTHrP誘導骨吸収及び悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症からなる群から選択される状態を有する患者の治療のための医薬組成物の製造における、SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2及びSEQ ID NO.:5からなる群から選択される化合物の使用。
【請求項１８】
前記転移が骨転移である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ホルモン非依存性の後期段階の前立腺癌が、ホルモン非依存性の後期段階の転移性の前立腺癌である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記化合物がSEQ ID NO.:5である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
腫瘍に関連する状態、骨転移、副甲状腺ホルモン関連蛋白質レベルの上昇に関連する状態、PTHrP誘導骨吸収及び悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症からなる群から選択される状態を有する患者の治療効果を評価する方法であって、前記治療が、SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2及びSEQ ID NO.:5からなる群から選択される化合物による治療であり、患者の血漿サンプルにおける血漿カルシウムレベルを測定することを含む治療効果の評価方法。
【請求項２２】
患者の治療後の血漿カルシウムレベルを患者の治療前の血漿カルシウムレベルと比較する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
転移性の癌細胞の増殖を減ずる方法であって、SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2及びSEQ ID NO.:5からなる群から選択される化合物を転移性の癌細胞に供給することを含む方法。
【請求項２４】
前記転移性の癌細胞が骨の転移性の癌細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記骨の転移性の癌細胞が、転移性の前立腺癌、転移性の乳癌、転移性の肺癌、転移性の肝臓癌及び転移性の骨髄腫からなる群から選択される癌由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記転移性の癌細胞がPTHrPを発現している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
転移性の癌細胞の増殖を減ずるためのSEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2及びSEQ ID NO.:5からなる群から選択される化合物の使用。
【請求項２８】
前記転移性の癌細胞が骨の転移性の癌細胞である、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
前記骨の転移性の癌細胞が、転移性の前立腺癌、転移性の乳癌、転移性の肺癌、転移性の肝臓癌及び転移性の骨髄腫からなる群から選択される癌由来である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記転移性の癌細胞がPTHrPを発現している、請求項２７に記載の使用。
【請求項３１】
SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2及びSEQ ID NO.:5からなる群から選択される化合物及び製薬上許容される担体を含む、転移性の癌細胞の増殖を阻害するための医薬組成物。
【請求項３２】
前記転移性の癌細胞が骨の転移性の癌細胞である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記骨の転移性の癌細胞が、ホルモン非依存性の後期段階の前立腺癌細胞由来である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記転移性の癌細胞がPTHrPを発現している、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2及びSEQ ID NO.:5からなる群から選択される化合物及び製薬上許容される担体を含む、転移の進行を減らすのに用いる医薬組成物。
【請求項３６】
前記転移が骨転移である、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記化合物がSEQ ID NO.:5である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2及びSEQ ID NO.:5からなる群から選択される化合物を転移性の癌細胞に供給することを含む、転移の進行を減ずる方法。
【請求項３９】
前記化合物がSEQ ID NO.:5である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
必要としている患者の転移の進行を減ずるための医薬組成物の製造における、SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2及びSEQ ID NO.:5からなる群から選択される化合物の使用。
【請求項４１】
前記転移が骨転移である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記化合物がSEQ ID NO.:5で定義されたものである、請求項４１に記載の使用。
【国際調査報告】
2005513000.tif 000021
2005513000.tif 000022
2005513000.tif 000023
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