(57)【要約】本発明は、生体外で誘発され、次いで乾燥され、粉砕されそしてその組成物に分散された脱分化植物細胞により産生された代謝物に富む、局所用組成物、特に化粧用組成物に関する。本発明はさらに、フィトアレキシンの製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物が、少なくとも一種のフィトアレキシンを合成するために、培養物中で生体外で誘発された脱分化植物細胞の少なくとも一種の粉砕生成物を含有し、少なくとも一種のフィトアレキシンを合成するためのその誘発は、有利には、誘発を伴わない植物細胞培養の生体外での工程の後に行わることを特徴とする、脱分化植物細胞を含有する局所適用用の組成物、特に化粧用組成物であって、少なくとも一種のフィトアレキシンを含有するその粉砕生成物は生体外で誘発された脱分化粉砕植物細胞に由来する乾燥物の全体の少なくとも９５質量％、有利には少なくとも９７質量％、好ましくは少なくとも９９質量％を含んでなり、その粉砕生成物はその組成物に分散されているかあるいはその組成物に分散するのに好ましい形態にある、組成物。
【請求項２】
生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物が、小胞由来の粒子、細胞質由来の粒子およびペクト−セルロース膜由来の粒子を含んでなり、その粉砕生成物がフィトアレキシンを少なくとも０．１質量％含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
粉砕生成物が生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物であり、その細胞が少なくとも部分的に乾燥されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
粉砕生成物が生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物であり、その細胞が実質的に完全に乾燥され、好ましくは凍結乾燥され、次いで粉砕されていることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物を０．００５〜２５質量％、有利には０．００５〜５質量％含み、その重量は乾燥形態で計算されたものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
生体外で誘発された脱分化植物細胞の乾燥したまたは実質的に乾燥した粉砕生成物を含み、その乾燥したまたは実質的に乾燥した粉砕生成物が２５質量％未満、有利には１５質量％未満、好ましくは１０質量％未満の含水量を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
粉砕生成物の固体粒子の平均粒径が１００μｍ未満、有利には１０μｍ未満、好ましくは１μｍ未満であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
粉砕生成物の粒径分布が、粒子の９０質量％が平均粒径−２５％〜平均粒径＋２５％の範囲の粒径を有するものであることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物が、脱分化植物細胞の生体外誘発により合成された少なくとも一種のフィトアレキシンを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
脱分化され誘発された植物細胞のその粉砕生成物が、培地中の作用剤により生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物であって、誘発後のものには実質的に該作用剤を含まないことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
脱分化細胞が、揮発性作用剤により生体外で誘発されたものであることを特徴とする、前記請求項に記載の組成物。
【請求項１２】
生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物が、少なくとも一種のテルペン、タンニンまたはポリフェーノール化合物を含み、その化合物がそれらの培地中で脱分化植物細胞の生体外での誘発により合成されたものであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物が、粘性の懸濁物またはゲルまたは実質的に乾燥した粉末の形態で存在し、その懸濁物、ゲルまたは粉末が有利には組成物中で分散されるのに好適な形態にあることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
粉砕細胞材料が、生体外で誘発された脱分化ブドウ細胞の粉砕生成物であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
生体外培地で培養されそして誘発された脱分化細胞の粉砕生成物を含み、その粉砕生成物が有利には実質的に培養培地を含まないことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
生体外で誘発された脱分化細胞の粉砕生成物を含み、その粉砕生成物が、粉砕され、脱分化され、誘発された細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．１質量％、特に粉砕され、脱分化され、誘発された細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．２質量％、好ましくは粉砕され、脱分化され、誘発された細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．５質量％含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
脱分化され、誘発された細胞の粉砕生成物が、サルビア、コリウス、マンネンロウ、イチョウ、大麻、イヌサフラン、グロリオーサ、アスパラガス、アリガニィール（Ａｒｇａｎｉｅｒ）、フジ、ウマゴヤシ、マンゴー（Ｍｕｎｇｏ）、エリトリナ、マツヨイグサ、ケシ、アトローパ、チョウセンアサガオ、ナス科植物（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ボリジ、モクセイソウ、チョウジソウ、タマキビ、ピロカルパス、ジギタリス、コーヒーの木、テオブローマ、ジャスミン、トウガラシ、アイリス、ブドウ、イチイ、セコイヤ、オリズルラン、カカオ、オランダビユ、クマツヅラ、コミホラ・ウィギィー（commiphora wighii）、グレイガム、イングリッシュラベンダー、レモン、バニラ、ホワイトホアハウンド、ヤボランジ、バラ、カバノキ、茶およびそれらの種の細胞の混合物から選択される少なくとも一種の、誘発されそして乾燥された、脱分化植物細胞の培養物に由来することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
脱分化細胞は細胞増殖できるように培養培地中に入れられていること、その脱分化植物細胞は、十分な量の代謝物が合成されるのに十分な時間の間、それらの培養培地中で誘発されること、そして培養培地から誘発された植物細胞は化粧用組成物を調製するために１以上の賦形剤と混合され、細胞は１以上の賦形剤と混合する前および／または後、あるいは乾燥工程の前および／または後に粉砕されていることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載の局所使用のための組成物の製造方法。
【請求項１９】
生体外で誘発されるその細胞が乾燥されたのち、粉砕されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細胞の膜構造を保ちながら培養培地から誘発された細胞を抽出したのち、細胞が、誘発された細胞中で生起しない作用剤を用いてそれらの生体外培養培地中で誘発されることを特徴とする、請求項１８または１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
脱分化細胞が、生体外で培養物中に入れられ、生体外の培養培地中で誘発され、乾燥され、そして次いで、（任意に、１以上の洗浄／乾燥工程ののち）粉砕されそして人体の処置用の組成物中に分散される、方法。
【請求項２２】
粉砕に付される前に、細胞が凍結乾燥により乾燥されることを特徴とする、前請求項に記載の方法。
【請求項２３】
脱分化され誘発された細胞の乾燥粉砕生成物中で不純物が生成しない、作用剤または誘発手段が使用されることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
フィトアレキシンの取得方法であって、
−  脱分化植物細胞を培養培地に入れ、
−  培養の後におよび／またはその間に、脱分化細胞が培養培地中で誘発され、
−  脱分化され、誘発された細胞が培養培地から分離され、
−  脱分化され、誘発された細胞が、任意に１以上の洗浄工程に付され、
−  脱分化され、誘発された細胞が、有利には乾燥、好ましくは凍結乾燥され、
−  脱分化され、誘発された細胞が、粉砕生成物を形成するために粉砕され、そして
−  粉砕された細胞を培地、特に水性および／またはアルコール性培地に導入する工程の後に、粉砕生成物が抽出されて、粉砕生成物から１以上のフィトアレキシンを抽出する、
方法。
【請求項２５】
その脱分化植物細胞をそれらの生体外培養培地中で誘発する工程が、脱分化され、誘発された植物細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．１質量％、特に細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．２質量％、好ましくは細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．５質量％含む培地が得られるために調節されることを特徴とする、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
粉砕生成物が、種サルビア、コリウス、マンネンロウ、イチョウ、大麻、イヌサフラン、グロリオーサ、アスパラガス、アリガニィール（Ａｒｇａｎｉｅｒ）、フジ、ウマゴヤシ、マンゴー（Ｍｕｎｇｏ）、エリトリナ、マツヨイグサ、ケシ、アトローパ、チョウセンアサガオ、ナス科植物（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ボリジ、モクセイソウ、チョウジソウ、タマキビ、ピロカルパス、ジギタリス、コーヒーの木、テオブローマ、ジャスミン、トウガラシ、アイリス、ブドウ、イチイ、セコイヤ、オリズルラン、カカオ、オランダビユ、クマツヅラ、コミホラ・ウィギィー（commiphora wighii）、グレイガム、イングリッシュラベンダー、レモン、バニラ、ホワイトホアハウンド、ヤボランジ、バラ、カバノキ、茶およびそれらの混合物の、誘発されそして乾燥された、脱分化植物細胞の培養物に由来することを特徴とする、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
生体外培養培地中で誘発されその後乾燥された脱分化植物細胞の粉砕生成物であって、その粉砕生成物は生体外で誘発された粉砕脱分化植物細胞に由来する乾燥物の全体の少なくとも９５質量％、有利には少なくとも９７質量％、好ましくは少なくとも９９質量％を含んでなり、その粉砕生成物は化粧用組成物および／または医薬組成物に分散されるのに好ましい形態にある、粉砕生成物。
【請求項２８】
誘発剤および／または培養培地を含まないことを特徴とする、請求項２７に記載の粉砕生成物。
【請求項２９】
１０μｍ未満の平均粒径を有することを特徴とする、請求項２７または２８に記載の粉砕生成物。
【請求項３０】
細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．１質量％、特に細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．２質量％、好ましくは細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．５質量％含むことを特徴とする、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の粉砕生成物。
【請求項３１】
組成物が、少なくとも一種のフィトアレキシンを含む少なくとも一種の粉砕生成物を含有し、その粉砕生成物は生体外で誘発された粉砕脱分化植物細胞に由来する乾燥物の全体の少なくとも９５質量％、有利には少なくとも９７質量％、好ましくは少なくとも９９質量％を含むことを特徴とする、脱分化植物細胞を含有する局所適用用の組成物、特に化粧用組成物であって、粉砕生成物は細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．１質量％、特に細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．２質量％、好ましくは細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．５質量％含む、組成物。
【請求項３２】
粉砕生成物が、以下の種：サルビア、コリウス、マンネンロウ、イチョウ、大麻、イヌサフラン、グロリオーサ、アスパラガス、アリガニィール（Ａｒｇａｎｉｅｒ）、フジ、ウマゴヤシ、マンゴー（Ｍｕｎｇｏ）、エリトリナ、マツヨイグサ、ケシ、アトローパ、チョウセンアサガオ、ナス科植物（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ボリジ、モクセイソウ、チョウジソウ、タマキビ、ピロカルパス、ジギタリス、コーヒーの木、テオブローマ、ジャスミン、トウガラシ、アイリス、ブドウ、イチイ、セコイヤ、オリズルラン、カカオ、オランダビユ、クマツヅラ、コミホラ・ウィギィー（commiphora wighii）、グレイガム、イングリッシュラベンダー、レモン、バニラ、ホワイトホアハウンド、ヤボランジ、バラ、カバノキ、茶およびそれらの混合物を含んでなる群から選択され、誘発されそして乾燥された、脱分化植物細胞の粉砕生成物であることを特徴とする、請求項３１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱分化植物細胞により産生された代謝物に富む、局所使用のための組成物、特に化粧用組成物に関する。本発明は、特に、誘発されそして部分的にまたは完全に乾燥、好ましくは凍結乾燥され、そして粉末化され、さらにその組成物中に分散された、脱分化植物細胞を含有する組成物に関する。
【０００２】
用語「脱分化植物細胞」は、特定の特殊化された細胞分類の特徴を全く示さず、そして他の細胞に依存しないで、それ自体で生存可能である植物細胞を意味するものと理解されたい。
【０００３】
脱分化植物細胞は、植物全体または葉、茎、花、花弁、根、果実、皮、それらを保護する外皮、種、葯、樹液、トゲ、芽、剥離皮、液果およびそれらの混合物等の、植物の部分に由来する植物材料から得ることができる。
【０００４】
脱分化植物細胞は、好ましくは剥離皮、葉、芽から、および果皮から、特に果実のクチクラである。
本発明に従って使用することができる脱分化植物細胞は、生体内培養により得られるあるいは生体内培養に由来する植物から得ることができる。
【０００５】
用語「生体内培養」は、任意の古典的な形態の培養、つまり、土壌中、新鮮空気中、グリーンハウス内、または無土壌もしくは水耕環境中での培養を意味するものと理解されたい。
【０００６】
用語「生体外培養」は、植物または植物の一部を人工的に得ることができる当業者に公知の全ての技術を意味するものと理解されたい。生体外で植物細胞の増殖中に物理化学的条件によって課せられる選択圧は、生体内で栽培された植物に比べて、夾雑物がなくそして一年中入手しうる標準化された植物材料を得ることを可能とする。
【背景技術】
【０００７】
本発明によれば、脱分化植物細胞は、好ましくは生体外での培養に由来するものが用いられる。
本発明にしたがって用いることができる脱分化植物細胞は、従来技術で公知である任意の方法により得ることができる。この点で言及することができる方法として、E.F. George and P.D. Sherrington, "Plantation Propagation by Tissue Culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories" (Exegetics Ltd. 1984)が挙げられる。本発明にしたがって用いることができる培養培地は、一般に当業者に公知のものである。言及することができる例として、Gamborg, MurashigeおよびSkoogs, Heller, Whiteらの培地が挙げられる。これらの培地の完全な記述は、E.F. George, D.J.M. Puttock and H.J. George, "Plantation Culture Media: Formulations and Users" (Exegetics Ltd. 1987, Volumes.1&2)に示されている。
【０００８】
本発明によれば、栽培され、脱分化された植物細胞は、好ましくは、MurashigeおよびSkoogの培地上で製造される。
【０００９】
従来技術
ＦＲ２７９５６３７号明細書は、臭いの問題を回避するために脱分化植物細胞の抽出物を含む化粧用組成物を開示している。この組成物は、脱分化されているが誘発されていない植物細胞の抽出物を含有しているため、この組成物は低含量の二次代謝物またはフィトアレキシンを有するかあるいは実質的にそのような化合物を有していない。また、この文献は、それらの培養培地中の細胞を粉砕後、懸濁液中の粒子を除去して得られる水性抽出物の使用を記載しており、懸濁液中の粒子に結合した代謝物の損失は避けられない。特にプロテアーゼおよびオキシダーゼを除去するために、この文献はまた、１００，０００ダルトンより大きい分子量の分子を保持するフィルターの使用を推奨しており、化粧産業にとって非常な関心がもたれていることが明らかな、この分子量より大きい分子量の全ての代謝物の最終抽出物を損失することをもたらす。さらに、酸化による問題を除くために、この文献は、安定剤、特にシステインおよび／またはイオウ含有誘導体の添加を勧めており、このことは必然的に、抽出物の純度をその後の濾過工程で低下させることをもたらす。この文献に記載された方法は、その純度（多数の添加剤）および（代謝物の）品質および濃度が最良ではない、抽出物を取得するための複雑な手段の使用を必要とする。また、この方法により抽出物を得るために必要な多くの工程は、コストの増加と、多くの操作と使用される添加物による夾雑物混入のリスクをもたらす。
【００１０】
脱分化細胞の培養は、これらの細胞の誘発メカニズムと同様に、公知であり、抽出工程、および種々の濾過が引き続き、抽出物を化粧用組成物または医薬組成物に添加するために、凍結乾燥が続く。そのような方法は、例えば、ＵＳ４，２４１，５３６号明細書、ＥＰ３７８９２１号明細書、ＷＯ８８／００９６８号明細書、ＥＰ１２０３８１１号明細書等に種々の植物種について記載されている。これらの文献の内容は、培養培地、植物種、可能な誘発因子等を説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００１１】
現在、植物抽出分野の産業の専門知識およびノウハウにもかかわらず、また有機化学の進歩にもかかわらず、植物原料を得るために、いくつかの抽出工程が必要である。
【００１２】
これらの抽出工程にはいくつかの欠点が付随する：
−  単離された分子の三次構造の欠損、
−  最終生成物中の種々の溶媒の存在、
−  毒性の強まる溶媒を使用する精製抽出を必要とする、基質不均一性、
−  抽出物の品質は、収穫されたときの植物の生理学的状態に依存すること、
−  抽出物の製造は季節により制限されること。
【００１３】
これらの制限因子および天然起源の全てのものに関心のある消費者の更新により、細胞を取得するいくつかの試みがなされている。これまでに、二つの主な方法が用いられている。
【００１４】
−  単細胞生物または微生物からの細胞の培養、これは正常な生活条件の再現に基づき、全く独創的な手法ではない。しかしながら、これらの生物は原始的であり、そして最も興味深い活性成分の源である、二次代謝物を一切産生しない。
−  酵素的消化の後、果実（新鮮細胞）から細胞を得ること。この方法の限界は、果実は無菌ではなく、農薬（殺菌剤、除草剤、殺虫剤等）の残渣を含みうる。また、植物壁を消化するためにそして壁のない細胞（プロトプラスト）を得るために有意な量（２％ｗ／ｗ）で使用される酵素（セルラーゼ、ペクチナーゼ等）が最終生成物中で見出される。使用された酵素はまた、代謝物の品質を変化させうる。最後に、この手法の使用は、単に、プロトプラスト（細胞壁のない細胞）を回収することを可能にし、これらは、それらの代謝を正しい方向に進めることができない、脆弱な構造である。
【００１５】
発明者らは、生成物の品質および信頼性を保証する、画期的で制御された手法を開発した。それは、脱分化した高級植物の細胞を培養物中に入れることを包含する。
事実、そして最初に、それらの遺伝的継承物の変性を一切回避し、細胞が生理的特徴を保持できる方法により、高級植物から細胞を得ることが可能な工業的な方法を提供する。
【００１６】
種々の種の保持が、培養の種々の条件を全体として制御して、通常の継代培養により保証される。
この方法の重要性は、産業のニーズ、特に、
−  分子の三次構造の保持、
−  溶媒および残渣の不存在、
−  基質均一性、
−  季節の周期に関係のない、連続的な処理、
−  保存料を添加することなく、生物学的かつ生理学的特性を保持すること、
−  汚染物の完全な不存在、
−  代謝物の品質および濃度に関して、標準化された再現可能な製造、
【００１７】
−  ３０℃未満の温度での直接凍結乾燥後のこれらの植物懸濁物の使用。この手法は、化粧用組成物（クリーム、軟膏、ローション等）での分散に好適な、極めて微細な粉末を得ることを可能にする。これらの細胞は、有機溶媒を用いる抽出工程を経ることなく、それらが含有する活性成分を直接放出することを可能にする（残渣のリスクの排除）。しかしながら、凍結乾燥の生成物は、粒子の凝集を防ぐために、好ましくは粉砕に付される。
【００１８】
−  単に、超音波処理および遠心分離後の細胞抽出物の使用、
に対応しつつ、大規模で行われる脱分化植物細胞の培養を可能にするということである。
【特許文献１】ＦＲ２７９５６３７号明細書
【特許文献２】ＵＳ４，２４１，５３６号明細書
【特許文献３】ＥＰ３７８９２１号明細書
【特許文献４】ＷＯ８８／００９６８号明細書
【特許文献５】ＥＰ１２０３８１１号明細書
【非特許文献１】E.F. George and P.D. Sherrington, "Plantation Propagation by Tissue Culture, Handbook and Directory of Commercial Laboratories" (Exegetics Ltd. 1984)
【非特許文献２】E.F. George, D.J.M. Puttock and H.J. George, "Plantation Culture Media: Formulations and Users" (Exegetics Ltd. 1987, Volumes.1&2)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
この技術は、従来の溶媒抽出法に対する、有用で、画期的な代替法を提供する。細胞の遺伝的完全性を損なうことなく、代謝物の合成を自然で正しい方向に進める（誘発により）可能性は、品質と信頼性を保証する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
非常に驚くことに、発明者らは、誘発、乾燥そして粉砕後に、細胞が、直接、化粧用組成物および／または医薬組成物に添加または分散され得ることを発見した。本発明に係る組成物は、細胞膜、細胞質有機的組織体および小胞材料を含む。特に、この方法は、添加物や化学品を添加することなく、酸化性酵素を不活性化するという長所を有する。本発明の他の態様は、抽出および濾過工程による定量的または定性的な損失なしに、濃縮および誘導すべきフィトアレキシンの製造を可能にする。本発明の特定の態様は、抽出および濾過工程を回避し、そして添加物、溶媒および残渣なしの粉砕された細胞材料を得ることを可能にし、その粉砕生成物は化粧用組成物に直接分散することが可能である。本発明に係る組成物は、少なくとも一種のフィトアレキシンを合成するために培養物中で生体外で誘発された、少なくとも一種の粉砕された脱分化植物細胞材料を含有し、少なくとも一種のフィトアレキシンを合成するためのその誘発は、有利には、誘発を伴わない植物細胞の生体外での培養の工程の後に行われるものであり、少なくとも一種のフィトアレキシンを含むその粉砕生成物は生体外で脱分化され誘発された粉砕植物細胞に由来する乾燥物の全体の少なくとも９５質量％、有利には少なくとも９７質量％、好ましくは少なくとも９９質量％を含んでなり、その粉砕生成物はその組成物に分散されているかあるいはその組成物に分散するのに好ましい形態にある。特に、粉砕生成物は、脱分化され、誘発された、粉砕植物細胞の実質的に全ての乾燥材料（細胞中に存在する水の抽出後）を含んでいる。しかしながら、誘発されていない細胞の内容物に対してフィトアレキシンに富む、このような粉砕生成物は、細胞中に存在する全ての天然物質を含んでいる。
【００２１】
その他の目標のうちで、本発明の目的は、得られた細胞の本来の特性を保持しつつ、添加剤および化学品を使用しない簡便な方法を提案することである。また、物理的な手段による誘発は、管理され濃縮されることが化粧品産業により求められている代謝物の製造を可能にする。得られた細胞の完全性を保持しそしてそれらを誘発することを含んでなる本発明の特定の態様は、第一に、濃縮と得られた代謝物の品質が最適化されることを可能にし、そして第二に、添加剤を添加せずにまた濾過による損失なしに簡単な乾燥操作（凍結乾燥）により酵素を不活性化することにより、酸化の問題を解決することを可能にし、そして最後に、得られた粉砕生成物を化粧用調製物中に直接分散することを可能にする。
【００２２】
用語「培養培地中で誘発」は、１以上の防護メカニズムを始動させるために、細胞をそれらの培養培地中でストレスまたは攻撃（生物学的、化学的および物理的）に暴露することを意味するものと理解されたい。
【００２３】
植物の生長の全体を通して、植物は、それらの環境による継続的な攻撃にさらされている。しかしながら、保護メカニズムの存在または活性化によって、それらはしばしばこれらの外的な攻撃に対して自然に抵抗することができるようである（Hammond-Kosack and Jones, 1996）。このように、これらのメカニズムのいくつかは生来のものであり、そして物理的および化学的なバリヤーを攻撃に対して供与するが、他のものは、有害な作用剤による攻撃の後にのみ誘起される。
【００２４】
植物が病原体を感知するとすぐに、最も効果的な自然保護システムの一つ：超過敏反応を使用する。病原体の侵入部位において、迅速で激しい、この反応は、最初に感染した細胞の死をもたらし、そして小さな壊死領域を出現させ、このようにして攻撃された細胞を植物の他の部分と隔離する（Dangi et al., 1996; Lamb and Dixon, 1997）。この反応の始動は、宿主植物による病原体の特定認識に依存する。事実、攻撃された植物は、病原体により産生され誘発因子と称されるタンパク質を、（受容体）タンパク質を介して認識する。植物において、受容体タンパク質をコードする遺伝子は、抵抗性遺伝子（Ｒ遺伝子）と呼ばれ、また、病原体において、誘発因子の分子をコードする遺伝子は無発病性遺伝子（Ａｖｒ遺伝子）と呼ばれる：ここで関与しているのは、遺伝子−対−遺伝子の関係あるいはＲ−Ａｖｒ関係（Hammond-Kosack, 1996）である。一般誘発因子に分類される、他の分子もまた、宿主植物のこの防護反応を開始できる（前記の誘発因子よりもより低い特異性で）。これらは、ほとんどの場合、病原体（外因性誘発因子）または植物細胞（内因性誘発因子）により放出されるオリゴ糖である（Scheel and Parker, 1996）。
【００２５】
この超過敏反応ののち、感染領域に隣り合う細胞において、強い防御反応の活性化が起こる；これは局所反応である。最後に、植物他の全ての器官に対して種々の警告シグナルが発生して、新しい攻撃に対してより迅速かつより有効に反応することが可能になる：これを全身性反応と称する。
【００２６】
これらの反応の間、防護システムの三つのカテゴリーが活性化され得る：
【００２７】
−  回復用表皮の生成と壁の強化（木質化等）（Dai et al., 1995）；
【００２８】
−  タバコ産業により、１９７０年に発見された防御タンパク質または「病原関連」（ＰＲ）タンパク質の合成。これらのＰＲとして、例えば、プロテアーゼ阻害剤（Ryan, 1992）、キチナーゼまたはβ−１，３−グルカナーゼ等の加水分解酵素（Derckel et al., 1966; Robinson et al., 1997, Kraevas et al., 1998; Salzman et al., 1998; Renault et al., 2000）が挙げられる；
【００２９】
−  そして、フィトアレキシンタイプの二次代謝物の合成。これらの二次代謝物のうち、３００より多いフィトアレキシンが既に同定されている。それらは、クマリン、ベンゾフラン、テルペン、アルカロイド、ある種のポリフェノール（Smith, 1996）等を包含する、広範囲の種々の化学種の一部を形成する。
【００３０】
植物の防御反応の完成には、防御遺伝子の発現の迅速な誘起をもたらす、全ての一続きの伝達シグナルが関与する。このように、宿主植物による病原体の認知は、タンパク質キナーゼによるタンパク質のリン酸化、イオン種（Ｃａ2+）の流れ、反応性酸素化種の生成（Cote and Hahn, 1994; Shibuya et al., 1996; Benhamou, 1996）等のような、攻撃された細胞における一連のシグナルを活性化する。
【００３１】
また、攻撃された細胞は、隣り合う細胞に（局所反応）、さらには植物全体に伝達される警告シグナルを産生することができ、そしてそれは、従って、前節で述べたような、全身性反応現象を引き起こす。
【００３２】
全身性抵抗性の最もよく研究されたメカニズムは、ＳＡＲまたは「全身性後天的抵抗性」の現象である。用語ＳＡＲは、１９６１年にＲｏｓｓにより定義された。それは、病原体による攻撃に続いて、植物の感染部分および健康な部分の双方において、植物の抵抗性が出現することを表す。一般に、接種部位の周りに壊死病変が出現した後に、生じる。この局所的な超過敏反応は、病原体を感染部位内およびその周辺に限定し、その植物を種々の生物による攻撃に対しより抵抗性にしているように思われる（Ryals et al., 1996）。感染部位から離れた植物部分が、いかにしてこの抵抗性を獲得することができるのか。１９６６年に、Ｒｏｓｓは、感染領域から離れた組織内で防御メカニズムを低濃度で活性化することができるシグナル分子の存在というアイデアを展開した。
【００３３】
三種の分子が、短い距離または長い距離にわたって植物中で、細胞内および細胞間警告シグナルとして作用できる：サリチル酸、エチレンおよびジャスモネート。
【００３４】
ＡＳＲの進展において、最もよく研究されそして最もよく知られている伝達メカニズムは、サリチル酸（ＳＡ）が関与するそれである（Delaney et al., 1994; Ryals et al., 1996）。
【００３５】
一方、いくつかの植物の抵抗性の獲得は、直接的に、ＳＡまたはその誘導体の内因性合成の増加を伴う（Malamy et al., 1990; Metraux et al., 1990; Rasmussen et al., 1991; Smith-Becker et al., 1998）。このタイプの反応において、ＳＡの合成が開始されたとき、シグナルの伝達は、ＳＡの直接的な移動（Shulaev et al., 1995）または後者の、感染植物の健康な組織およびまた隣接する植物において抵抗性の出現を開始することができる揮発性のシグナル分子である、サリチル酸メチル（ＭｅＳａ）への変換のいずれかにより（Shulaev et al., 1997）、長距離で起こる。また、ＡＳＲを始動する上でＳＡが果たす役割の証拠は、バクテリア遺伝子ＮａｈＧを発現する遺伝子組換えタバコ植物の使用とリンクされる。サリチレートヒドロキシラーゼをコードするこの遺伝子は、それをカテコールに変換することにより、ＳＡを不活性化し、このようにして、ＡＳＲを進展させることができない形質転換植物を提供する（Graffney et al., 1993）。
【００３６】
一方、ある研究は、内因性ＳＡの応用が、バクテリア、ウイルスまたは病原体により引き起こされる種々の病変に対して抵抗性を誘起することができることを示している。従って、タバコにおいて、その植物をＳＡで処理した後、タバコモザイク病ウイルスの接種に伴なう症状の軽減が認められる（White et al., 1983）。同じように、ＳＡは、ＡＳＲの場合に通常産生される種々のＰＲタンパク質の生合成を活性化することができる（Renault et al., 1996; Narusaka et al., 1999）。
【００３７】
種々の研究は、いくつかの防御反応は、ＳＡの存在のいかんにかかわらず活性化されることを示している。従って、他のタイプの分子がＡＳＲシグナル分子として認められた（Enyedi et al., 1992; Pieterse et al., 1999）。これらの反応は、全身性防御誘起シグナルとして、二つの植物生長調節剤、つまりエチレンとジャスモン酸（ＪＡ）の介入を主として包含する。事実、これら二つのタイプの分子は、植物が攻撃にさらされたとき、迅速にそして外因的に産生され、そしてこれによって、抵抗性の出現をもたらす。また、それらは、また、ある種のＰＲの発現および／またはフィトアレキシンの産生を誘起することができる。
【００３８】
エチレンは、植物の多くの生理学的プロセスに介在する揮発性フィトアレキシンである。植物防御現象におけるその役割は、いくつかのチームによって実証されている。研究は、病原体や草食動物により植物の攻撃が宿主植物において内因性エチレン合成の誘起または増加と関係しうる（O'Donnell et al., 1996; Popp et al., 1997; Lund et al., 1998）。また、ＳＡと全く同じように、内因性エチレンの適用は、また、ＰＲタンパク質の合成を活性化することができる（Ward et al., 1991; Penninckx et al., 1996; Yang et al., 1997）。最後に、病原体に応答して、シロイヌナズナでの防御タンパク質の活性化が、このシグナルの認識において不完全な変異体の場合にブロックすることができる（Penninckx et al., 1998）。
【００３９】
ジャスモン酸およびそのメチルエステル、ジャスモン酸メチル（ＭｅＪａ）は、それらの生合成およびそれらの機能に関して、動物のプロスタグランジンに類縁のシクロペンタノン型の天然化合物である（Creelman et al., 1992; Mason et al., 1993; Sadka et al., 1994）。それらは、脂肪酸に由来し、そしてリノレン酸のリポキシゲナーゼ依存性酸化により合成される。これは、オクタデカン酸経路と称される。
【００４０】
種々の生理的機能におけるそれらの役割（Stawick, 1992）とは別に、これらの化合物は、最近、生物的または非生物的ストレスに応答して合成され、植物における防御反応、例えばフィトアレキシンの生合成または防御タンパク質をもたらす、細胞内シグナル伝達分子として同定されている（Gundlach et al., 1992; Blechert et al., 1995; Creelman et al., 1995; Doares et al., 1995; Conconi et al., 1996aおよび1996b; Ignatov et al., 1996; Baldwin et al., 1997）。
【００４１】
一方、揮発性のジャスモン酸誘導体である、ＭｅＪａの適用は、そのうちのいくつかが防御化合物の役割を果たす、生体内または生体外での（細胞培養で）多数の二次代謝物の産生を誘起する。事実、このエステルは、セロリの葉においてフラノクマリン類（Miksch and Boland, 1996）、コメの細胞培養におけるモミラクトンＡ（Nojiri et al., 1996）、Catharanthus roseusの幼植物または細胞培養物のアルカロイド（Aerts et al., 1996; Gantet et al., 1997）、およびCinchona ledgerianaの幼植物（Aerts et al., 1994; 1996）の生合成を誘発することができる。１２−オキソ−フィトジエン酸等の、ＪＡの他の前駆体誘導体は、多数の二次代謝物の生合成に作用することができる。
【００４２】
これらの化合物の誘起効果には、しばしば、これらの種々の代謝物の生合成において介在する遺伝子の発現または酵素の合成の活性化が先行する。これらの酵素として、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼ（ＤＦＲ）、ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰｏ）、ベルカプトールメチルトランスフェラーゼ（ＢＭＴ）、チロシン／ドーパデカルボキシラーゼ（ＴＹＤＣ）などが挙げられる（Dittrich et al., 1992; Gundlach et al., 1992; Mizukami et al., 1993; Tamari et al., 1995; Ellard-Ivey et al., 1996; Facchini et al., 1996; Ignatov et al., 1996; Lee et al., 1997; Yasaki et al., 1997; Constanbel and Ryan, 1998）。
【００４３】
一方、植物をＭｅＪａ蒸気に暴露すると、昆虫、草食動物、創傷またはＵＶにより誘起されたものと同様に、防御メカニズムの誘発が可能である（Farmer and Ryan, 1990; Conconi et al., 1996b; Ozawa et al., 2000）。このように、ジャスモナート、特にＭｅＪａは、ＪＩＰ（ジャスモナート誘起タンパク質）と称される、防御およびストレスタンパク質の生合成を誘起することが可能である（Reinbothe et al., 1994）。
【００４４】
また、トマト、ジャガイモまたはアルファルファ植物をＭｅＪａで処理すると、プロテアーゼ阻害剤の発現（Farmer and Ryan, 1990, 1992; Hildmann et al., 1992; Pena-Cortes  et al., 1992; Lee et al., 1996）、大麦中でのチオニンの生合成（Reinbothe et al., 1997）、大豆のプロリンに富むタンパク質またはＶｓｐ（植物性貯蔵タンパク質）の生合成（Stawick et al., 1991; Creelman et al., 1992; Mason et al., 1992, 1993; Berger et al., 1995）が誘起される。
【００４５】
最後に、それはまた、例えばリポキシゲナーゼ（Saravitz and Siedow, 1996）あるいはシステミン（Reinbothe et al., 1994; Bergey et al., 1996）等の、ストレスに応答したシグナルの伝達に関与するタンパク質の生合成の制御に関与する。
【００４６】
したがって、いろんなチームが、ＭｅＪａ蒸気に関して植物を処理した後に、いくつかの病気の発生が減少したことを示していることは、驚くことではない（Cohen et al., 1993; Meir et al., 1998; Thomma et al., 1998; Vijayan et al., 1998; Thomma et al., 2000）。
【００４７】
また、Ｊ．Ｓ．Ｔｈａｌｅｒ（１９９９）は、多数の植物について、草食動物による攻撃に対する防御メカニズムが、オクタデカン酸経路を介して誘起され、そしてこのように天敵を誘引することに関与することを示している。例えば、このことは、ＪＡで植物を処理すると、害虫の毛虫の寄生が増加することを示す。
【００４８】
ブドウにおいては、防御反応の発現に関与するシグナル伝達メカニズムは依然としてよく知られていない。しかしながら、３種の防御分子（リグニン、防御タンパク質およびフィトアレキシン）の合成が生起する。特に、フィトアレキシンの役割は、元来の化合物の一群、つまりポリフェノール類により果たされる（Deloire et al., 2000）。
【００４９】
植物の全ての器官におおむね多量存在する、フィトアレキシンは、葉および液果中で誘起され得る。この種の誘起は、用語「誘発」で定義される。誘発因子（エリシター）は種々の起源を有し得る。誘発は：
−  例えば、ボトリチス・シネレア、灰色腐敗菌（Jeandet et al., 1995; Bavaresco et al., 1997）、プラスモパラ・ビチコラ、うどん粉病菌（Dercks and Creasy, 1089）またはエクスコリオシス（excoriosis）の原因であるフォモプシス・ビチコラ（Hoos and Blaich, 1990）等の病原体による攻撃での、生物的な誘発。
【００５０】
−  ＵＶ、温度、光、窒息、他の植物から抽出された天然剤（Jeandet et al., 1997; langcake and Pryce, 1997b; Douillet-Breuil et al., 1999）、塩化アルミニウム（Adrian et al., 1996）またはオゾン（Sarig et al., 1996）等の環境因子による、非生物的な誘発、
の形態を取り得る。
誘発に際して、ｔｒａｎｓ−レスベラトロール、ｔｒａｎｓ−ピセイド、ｅ−ビニフェリンおよびプテロスチルベン等のフィトアレキシンは、葉や液果中で誘起され得る（Soleas et al., 1997）。ストレスに応答して、特に病原体による攻撃の後に、フィトアレキシンが新規に生合成されるというこの性質は、これらの分子が植物防御の天然手段の役割を果たすことを示唆する。
【００５１】
防御分子のこの役割は、植物の天然抵抗性のレベルとこれらの分子を合成するその能力との間での密接な相互関係を示すと思われるある種の研究により、確認される。例えば、ＬａｎｇｃａｋｅとＭｃＣａｒｔｈｙ（１９７９）は、ある種のビチス（Ｖｉｔｉｓ）のボトリチス・シネレアやプラスモパラ・ビチコラに対する抵抗性とフィトアレキシン（レスベラトロールおよびビニフェリン）の生合成に対するそれらの能力との間の関係を示した。また、ＤｅｒｃｋｓおよびＣｒｅａｓｙ（１９８９）は、プラスモパラ・ビチコラに抵抗性の種は、感受性の種よりも５倍多いフィトアレキシンを産生することを示した。同様に、ビニフェラ種の中で、フィトアレキシン産生能に依存して、菌類による攻撃に多かれ少なかれ耐性があるいくつかのブドウ種が存在する。
【００５２】
細胞誘発は、作用剤により、あるいは種々のストレス、例えば圧力、除圧、真空、圧力変動、ガスの存在、変動する雰囲気、温度、寒さ、光、明るさの周期、放射、毒素、植物毒、攪拌、バクテリア、ウイルス、菌類、微生物、超音波、ＩＲ、ＵＶ、窒息等により、達成され得る。
【００５３】
当業者に公知の任意の誘発方法を、本発明に係る組成物中で使用しうる粉砕生成物を製造するために用いることができる。
【００５４】
このように、本発明に従って使用することができる粉砕生成物は、任意の公知の形態を取ることができる。水性粉砕生成物およびアルコール性粉砕生成物が特に挙げられ、特定的には、エタノール性または水性アルコール性粉砕生成物が挙げられる。
【００５５】
本発明によれば、粉砕生成物は、好ましくは水性粉砕生成物または乾燥したもしくは実質的に乾燥した粉砕生成物である。
【００５６】
粉砕生成物は、有利には、その後の工程で凍結乾燥され得る。一つの有利な実施態様によれば、粉砕生成物は、培養培地または培養培地の抽出物中の細胞の粉砕生成物であり、その粉砕生成物は有利にはその後、凍結乾燥される。
【００５７】
したがって、本発明は、少なくとも一つの脱分化植物細胞培地を含有する化粧用組成物であって、その培地が、生体外の培養培地中で栽培され、そして生体外の培養培地中で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物であり、その粉砕生成物はその組成物中に分散されているかあるいはその組成物中に分散するのに好ましい形態にあることを特徴とする組成物に関する。その植物細胞は、好ましくは、生体外の培養培地中で栽培され、そして好ましくは、少なくとも一種のフィトアレキシンを合成するために、生体外の培養培地中で誘発され、その誘発は、有利には、少なくとも一種のフィトアレキシンを合成するための誘発なしまたは実質的に誘発なしの、植物細胞の生体外培養工程の後に達成される。その組成物は、少なくとも一種のフィトアレキシンを合成するために生体外で培養物中で誘発された脱分化植物細胞の少なくとも一種の粉砕生成物を含有し、少なくとも一種のフィトアレキシンを合成するためのその誘発は、有利には、誘発を伴わない植物細胞培養の生体外での培養工程の後に行われ、少なくとも一種のフィトアレキシンを含有するその粉砕生成物は生体外で誘発された粉砕脱分化植物細胞に由来する乾燥物の全体の少なくとも９５質量％、有利には少なくとも９７質量％、好ましくは少なくとも９９質量％を含んでなり、その粉砕生成物はその組成物中に分散されているかあるいはその組成物中に分散するのに好ましい形態にある。
【００５８】
実質的に全ての、あるいは全体としての乾燥物は、生体外で誘発された粉砕脱分化植物細胞に由来する。
細胞が、存在する全ての培養培地を除去するために洗浄される場合、細胞の膜構造に影響を与えることなく、培養培地を含まない脱分化誘発細胞の粉砕生成物を得ることが可能である（例えば、粉砕細胞の重量に対して０．１質量％未満）。生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物は、有利には、小胞由来の粒子、細胞質由来の粒子およびペクト−セルロース膜由来の粒子を含んでなり、その粉砕生成物はフィトアレキシンを少なくとも０．１質量％含む。
【００５９】
例えば、組成物は、培地または脱分化植物細胞の粉砕生成物を０．００５〜２５質量％、有利には０．００５〜５質量％含み、その重量は乾燥形態で計算されたものである。
【００６０】
組成物は、有利には、生体外で誘発された脱分化植物細胞の乾燥したまたは実質的に乾燥した粉砕生成物を含む。その粉砕生成物は、好ましくは、生体外培養培地中で誘発された脱分化植物細胞の乾燥したまたは実質的に乾燥した粉砕生成物であり、その乾燥したまたは実質的に乾燥した粉砕生成物は２５質量％未満、有利には１５質量％未満、好ましくは１０質量％未満の含水量を有する。特に、その乾燥したまたは実質的に乾燥した粉砕生成物は、粉砕工程後に細胞膜の完全性を補償するのに十分な量の水を含む。
【００６１】
粉砕生成物の固体粒子の平均粒径は、有利には１００μｍ未満、より有利には１０μｍ未満、好ましくは１μｍ未満である。粉砕生成物の粒径分布は、有利には、粒子の９０質量％が平均粒径−２５％〜平均粒径＋２５％の範囲の粒径を有するものである。
一つの特定の実施態様によれば、生体外で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物は、脱分化植物細胞の生体外の培養培地中での誘発により合成された少なくとも一種のフィトアレキシンまたはこれらのようなフィトアレキシンの混合物を含む。
【００６２】
一態様の有利な特徴によれば、脱分化され誘発された植物細胞のその粉砕生成物は、生体外の培養培地中で作用剤により誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物であり、その粉砕生成物は、生体外の培養培地中での誘発の後、その作用剤を実質的に含まない。
【００６３】
一態様の他の有利な特徴によれば、脱分化され誘発された植物細胞のその粉砕生成物は、培養培地中で作用剤により誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物であり、その作用剤は、その存在が化粧用組成物中で好ましい作用剤、例えば界面活性剤、分散剤、酸などである。
【００６４】
一つの好ましい実施態様によれば、脱分化細胞は、生体外培養培地中で、揮発性の作用剤、特にＣＯ2のようなガスにより誘発される。
【００６５】
一つの好ましい実施態様によれば、脱分化細胞は、生体外培養培地中で、物理的な作用剤、特に、温度、光、電磁場、ＵＶ、圧力または窒息により誘発される。
【００６６】
一態様の詳細によれば、生体外の培養培地中で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物は、少なくとも一種のテルペン、タンニンまたはポリフェーノール化合物を含有し、その化合物はそれらの培養培地中で脱分化植物細胞の生体外での誘発により合成されたものである。
【００６７】
生体外培養培地中で誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物は、有利には、粘性の懸濁物またはゲルまたは実質的に乾燥した粉砕生成物の形態で存在し、その懸濁物、ゲルまたは粉砕生成物は、組成物中で分散可能な形態にある。
【００６８】
一つの特定の実施態様によれば、粉砕細胞物は、生体外培養培地中で誘発された脱分化ブドウ細胞の粉砕生成物である。
【００６９】
一つの好ましい実施態様の詳細によれば、それらの生体外培養培地で培養されそして誘発された脱分化細胞の粉砕生成物を含む。
【００７０】
一つの有利な実施態様によれば、組成物は、生体外培養培地中で誘発された脱分化細胞を含んでなる培地、特に、脱分化され、誘発された細胞の粉砕生成物を含み、その培地または粉砕生成物は、細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．１質量％、特に、細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．２質量％、好ましくは、細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．５質量％を含む。
【００７１】
本発明に係る組成物において、粉砕生成物は、サルビア、コリウス、マンネンロウ、イチョウ、大麻、イヌサフラン、グロリオーサ、アスパラガス、アリガニィール（Ａｒｇａｎｉｅｒ）、フジ、ウマゴヤシ、マンゴー（Ｍｕｎｇｏ）、エリトリナ、マツヨイグサ、ケシ、アトローパ、チョウセンアサガオ、ナス科植物（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ボリジ、モクセイソウ、チョウジソウ、タマキビ、ピロカルパス、ジギタリス、コーヒー、テオブローマ、ジャスミン、トウガラシ、アイリス、ブドウ、イチイ、セコイヤ、オリズルラン、カカオ、オランダビユ、クマツヅラ、コミホラ・ウィギィー（commiphora wighii）、グレイガム、イングリッシュラベンダー、レモン、バニラ、ホワイトホアハウンド、ヤボランジ、バラ、カバノキ、茶およびそれらの種の細胞の混合物を含んでなる種の、生体外培地中で誘発されそして乾燥された、脱分化植物細胞の培養物に由来する。
【００７２】
一つの可能な実施態様によれば、本発明に係る組成物は、粉砕された（例えば、粒径５μｍ未満に）、脱分化され、誘発された植物細胞、および粉砕されていないまたはより粗く粉砕された、脱分化され、誘発された植物細胞を含んでなり、その粉砕されていないまたはより粗く粉砕された、脱分化され、誘発された植物細胞は、粉砕され、誘発された細胞と同一であるかあるいは異なり、および／またはその粉砕され、誘発された細胞とは別個に誘発される。一つの特定の実施態様によれば、脱分化され、誘発された植物細胞は、二つの別個の画分に分けられ、第一のものは、細かい粉砕に付され、第二のものは、荒い粉砕に付されるかあるいは粉砕されない。
【００７３】
本発明はまた、本発明に係る局所使用のための組成物の製造方法に関する。この方法において、脱分化植物細胞は細胞増殖できるように培養培地中に入れられ、その脱分化植物細胞は、十分な量の代謝物、特に少なくとも１種の二次代謝物、好ましくは少なくとも１種のフィトアレキシンまたはフィトアレキシンの混合物が合成されるのに十分な時間の間、培養培地中で誘発され、そして少なくとも一つの培地または培養培地から誘発された植物細胞の粉砕生成物は局所使用のための、特に、化粧用途のための、例えば、皮膚、毛髪、レザー、爪などの処置のための化粧用組成物を調製するために１以上の賦形剤と混合される。誘発された細胞は、組成物の１以上の賦形剤と混合する前および／または後に粉砕される。生体外培養培地中で誘発された脱分化細胞を粉砕に付することは可能であるが、誘発された脱分化細胞を実質的に細胞膜に影響を与えずに培養培地から分離し、そしてその細胞を、実質的に細胞膜に影響を与えない１以上の洗浄工程の後および／または１以上の乾燥工程の後に粉砕に付することが有利である。
【００７４】
一つの特定の実施態様によれば、脱分化植物細胞は、次々と、誘発なしの生体外培養工程、誘発なしの生体外培養工程に付される。
【００７５】
誘発されたものは有利には生体外培養培地から分離され、そして抽出物は乾燥に付され、その後粉砕に付される。
【００７６】
分離され、洗浄され、脱分化され、誘発された細胞を細胞膜の構造に影響を与えることなく凍結乾燥し、その後、凍結乾燥物を粉砕することは可能であるが、細胞膜の構造に影響を与えることなく分離され洗浄された、脱分化され、誘発された細胞は、有利には、膜バリヤーに実質的に影響を与えないように、制御された乾燥に付され（乾燥温度は５０℃未満、細胞の含水量は少なくとも３％、例えば５〜１５％）、次いで、粉砕に付される。これにより、粉砕工程の間に細胞（膜、細胞質および小胞）の破壊が可能となり、この工程の間にフィトアレキシンの放出を確実にする。
粉砕工程および／または乾燥工程（特に、制御された乾燥工程）および／または洗浄工程および／または脱分化細胞分離工程は、細胞から（例えば、膜から）の１以上の化合物の酸化を防止または減少させるために、有利には、ビタミンＥ等の１以上の酸化防止剤の存在下に行われる。
【００７７】
細胞は、好ましくは、誘発された細胞の抽出後に、誘発された細胞の粉砕生成物中に存在することがない作用剤により、それらの生体外培養培地中で誘発される。
【００７８】
本発明の方法において、その脱分化植物細胞をそれらの生体外培養培地中で誘発する工程は、脱分化された細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．１質量％、特に細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．２質量％、好ましくは細胞の乾燥重量に対してスチルベンを少なくとも０．５質量％含む培地が得られるために調節される。
【００７９】
培地または粉砕生成物は、例えば、サルビア、コリウス、マンネンロウ、イチョウ、大麻、イヌサフラン、グロリオーサ、アスパラガス、アリガニィール（Ａｒｇａｎｉｅｒ）、フジ、ウマゴヤシ、マンゴー（Ｍｕｎｇｏ）、エリトリナ、マツヨイグサ、ケシ、アトローパ、チョウセンアサガオ、ナス科植物（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ボリジ、モクセイソウ、チョウジソウ、タマキビ、ピロカルパス、ジギタリス、コーヒーの木、テオブローマ、ジャスミン、トウガラシ、アイリス、ブドウ、イチイ、セコイヤ、オリズルラン、カカオ、オランダビユ、クマツヅラ、コミホラ・ウィギィー（commiphora wighii）、グレイガム、イングリッシュラベンダー、レモン、バニラ、ホワイトホアハウンド、ヤボランジ、バラ、カバノキ、茶およびそれらの混合物を含んでなる種の、生体外培養培地中で誘発されそして有利には乾燥された、脱分化植物細胞の培養物に由来する。
【００８０】
本発明に従って使用することができる粉砕生成物の製造例は、また、実施例に記載される。
【００８１】
本発明に係る組成物中に存在する粉砕生成物の量は、当然のことながら、求められる効果に依存し、したがって、大幅に変動し得る。大まかに言えば、先に示した粉砕生成物は、組成物の全重量の０．０１％〜２０％を構成する量で、好ましくは組成物の全重量の０．１％〜５％を構成する量で使用することができる。
【００８２】
特に１種以上のフィトアレキシンの産生を促進するために、生体外培養培地中で誘発された、脱分化植物細胞の粉砕生成物は、例えば、酸化防止剤として、ラジカル防止剤として、無痛化剤として、抗刺激剤として、またはフリーラジカルスカベンジャーとして使用することができる。
【００８３】
一つの特定の態様において、本発明の方法は、フラバノール類、アントシアン類、およびフラボノール類等のフラボノイドに富む粉砕生成物を得ることを可能にする。
【００８４】
他の特定の態様において、本発明の方法は、フェノール酸および安息香酸誘導体等の非フラボノイド化合物ならびにスチルベン、レスベラトロールのｔｒａｎｓ−およびｃｉｓ−異性体およびそれらのグルコシドならびにｔｒａｎｓ−およびｃｉｓ−ピセイド等の元来の化合物に富む粉砕生成物を得ることを可能にする。
【００８５】
他の特定の態様において、ポリフェノール、フィトアレキシンおよび二次代謝物に富む粉砕生成物は、それらの重要な薬理学的な効果を保持している。従って、本発明の粉砕生成物は、酸化防止、抗ラジカル、抗炎症、抗増殖、弛緩および血管への活性等から選択される１以上の活性を有する。
【００８６】
一次代謝物とは対照的に、ポリフェノール等の二次代謝物は、植物生体内に少量蓄積される。本発明の一つの態様において、これらの二次代謝物をかなりの量でしかも連続的に安定に得るために、標準化された細胞の培養において、それらの生合成を促進した。
【００８７】
本発明に係る組成物中で使用できる脱分化植物細胞は、植物の全ての公知の種に由来する。この点で、サルビア、コリウス、マンネンロウ、イチョウ、大麻、イヌサフラン、グロリオーサ、アスパラガス、フジ、ウマゴヤシ、マンゴー（Ｍｕｎｇｏ）、エリトリナ、マツヨイグサ、ケシ、アトローパ、チョウセンアサガオ、ナス科植物（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ボリジ、モクセイソウ、チョウジソウ、タマキビ、ピロカルパス、ジギタリス、コーヒー、テオブローマ、ジャスミン、トウガラシ、アイリス、ブドウ、イチイ、セコイヤ、オリズルラン、カカオ、オランダビユ、クマツヅラ、コミホラ・ウィギィー（commiphora wighii）、グレイガム、イングリッシュラベンダー、レモン、バニラ、ホワイトホアハウンド、ヤボランジ、バラ、カバノキ、茶等の植物種が挙げられる。
【００８８】
本発明によれば、特に、セコイヤ、ブドウ、アリガニィール（Ａｒｇａｎｉｅｒ）、カカオおよびオリズルラン、ならびにそれらの組合せに由来する、脱分化植物細胞が用いられる。
【００８９】
本発明に係る組成物中で使用することができる脱分化植物細胞の粉砕生成物は、当然のことながら、異なる植物属から得られたおよび／または異なる植物材料から得られた脱分化植物細胞の混合物に由来することができ、その細胞は同じ生体外培養培地中でまたは異なる生体外培養培地中で（例えば、異なる誘発を行うために）、誘発される。
【００９０】
用語「局所使用のための組成物」は、クリーム、軟膏、ローション、懸濁液、スティック、シャンプー、ゲル、溶液（例えば、スプレーで適用可能）を意味するものと理解されたい。例えば、局所使用のための組成物は、化粧用組成物、皮膚科学的組成物、皮膚衛生用組成物、香水などに使用できる。
【００９１】
本発明によれば、組成物は好ましくは、化粧用、特には、局所適用用の組成物である。
【００９２】
本発明はさらに、生体外培養培地中で誘発され、凍結乾燥され、化粧品の中に添加または分散された脱分化植物細胞の少なくとも１種の粉砕生成物を含んでなる。本発明に係る組成物を、皮膚、毛髪および／または粘膜に適用することを特徴とする、皮膚の化粧処置方法に関する。
【００９３】
特に、本発明の化粧処置方法は、これらの組成物の使用のための慣用法により、上記のように、化粧用組成物を適用することにより行うことができる。例えば、クリーム、ゲル、漿液、ローション、乳液、シャンプーまたは日光反射組成物の皮膚への適用。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９４】
本発明に係る組成物のそして本発明に係る粉砕生成物の必須な重要な特徴は、特許請求の範囲中に記載されている。組成物の以下の実施例は、本発明を一切限定することなく、本発明を例証する。組成物において、記載の比率は質量％である。
【００９５】
これらの実施例において、好ましい方法は、下記のまとめ中に記載されたように使用された。
【００９６】
粉砕生成物を取得する方法
工程１：生体外培養培地中で培養された脱分化細胞の製造
工程２：培養培地中での脱分化細胞の誘発
【００９７】
工程３：生体外培養培地中で誘発された脱分化細胞の誘発、例えば培養培地の濾過と、特に細胞膜の構造を破壊しないように行われる、その後の１回以上の洗浄工程。細胞は、有利には、培養培地の一切の痕跡を実質的に除去するために洗浄し、その洗浄は細胞膜の構造を破壊しないように行われる。
【００９８】
工程４：生体外培養培地中で誘発された、脱分化細胞を乾燥または凍結乾燥、この乾燥操作は、細胞膜の構造を破壊しないように行われる。
この工程は、有利には、６０℃未満、例えば−６０℃と５０℃の間の温度で行われる。
【００９９】
工程５：粉砕（工程５は、有利には行われ；しかしながら、ある場合には、この工程は必要ではない）。粉砕生成物は、こうして、細胞を形成する実質的に全ての乾燥成分、すなわち膜の、細胞質の、そして小胞の実質的に全ての成分を含んでいる。
【０１００】
工程６：局所使用のための組成物の製造のために、１以上の賦形剤および／または他の活性成分（特に、他の細胞／粉砕植物材料）の混合および／または添加。
【実施例１】
【０１０１】
生体外で誘発された脱分化ブドウ細胞の粉砕生成物の製造
植物細胞培養物の開発の第一工程は、求める物質を産生する植物を選択することからなる。現在では、同じ種の中で、所与の代謝物に対する産生能力に変動性があり、その変動性の一部は遺伝子起源であることが認められている。それが可能なときには、したがって、最良の遺伝子型、すなわち、求める代謝物について最も生産性のよいものを選択することにより、この変動性を活用することが必要である。一次増殖は、固体培地（ゲロース）上に生体外で置かれた選択された植物器官（葉、茎、根など）の殺菌フラグメントから成功裡に誘起することができる。このようにして、数週間の培養後、カルスと称される細胞の脱分化蓄積物が外植体中に生成する。これらのカルスの生育は、新しい栄養培地上での連続的な継代培養工程により維持される。これらの培養条件は、同じ植物または同じ外植体に由来するカルス間での形態的および代謝的な変動性の自発的な出現を誘起する。しかしながら、一定の環境条件を維持することは、この変動性を減少させがちである。このように、規則的な継代培養を１〜２年行った後、非常に異なる代謝物の増殖および産生を示す、安定株のコレクションが得られる。
【０１０２】
この工程において、次に、確立された試験の助けにより、有意な量の対象化合物を産生する１または２以上の株を選択することが可能である。次いで、これらのカルスを液体環境に入れると、最初は２５０ｍｌの薬瓶中、そしてその後バイオリアクター（２０リットル以上）中と、より大きい生産容積へ移動する進歩が可能となる。凝集物と単離細胞から生成された、このように得られた細胞懸濁物は、再び、異質性（ソマクロナール（somaclonal）変動性）を示すことができる。その後、非常に生産性のよい細胞株を取得するために、付加的な選択が行われる。このクローニング操作に加えて、対象の代謝物の産生は、培養条件を修正することによっても最適化することができる。この培地は、２倍にされたスクロース濃度を除いて、細胞の継代培養培地と同一である。産生培地中でのそれらの培養の間に、非常に生産性のよいカベルネ・ソービニヨン（Cabernet Sauvignon）ブドウ細胞株は、１ｍの距離に置かれたウイルバー−ロウマー（Wilber-Lourmat）Ｔ−３０ランプ（６００μＷ／ｃｍ2）からの２５４ｎｍＵＶ光により、細胞に１０分間直接照射をもたらすように、接種後１０日間誘発されて、細胞中にポリフェノール、特にスチルベンの相当量の蓄積を誘起する。この誘発手段は、明らかに、一切の不純物を細胞培養中に生成しない。培養工程の終わり、つまり誘発後３日目に、植物細胞は濾過されて、残っている培養培地が除去され、そして冷水（４℃）中でリンスされる。１リットルの培養培地あたり、約３５０ｇの新鮮な生物体がこのようにして得られる。抽出された細胞は、次いで、乾燥され、そして粉砕される。乾燥は、生体外で誘発された、脱分化ブドウ細胞の粉砕生成物を粘性の懸濁物もしくはゲルとしてまたは実質的に乾燥した粉末として得るために、多かれ少なかれ相当程度に行われる。乾燥速度および細胞の含水量（有利には３〜１０％の間である）を調節することにより、粉砕工程の前に細胞膜を破壊しないことが可能であり、これにより、細胞中、特に細胞の小胞中および／または膜中に含まれるフィトアレキシンを粉砕工程の間に放出させることが可能となる。実質的に乾燥した細胞の場合、ビルチス（Ｖｉｒｔｉｓ）装置（Uni-Trap 10-100）中で凍結乾燥後に、培養物１リットルあたり乾燥生物体約２０ｇが得られる。モルチエ（Mortier）型ミル中で粉砕後に得られる粉末は、軽く、超微細で（粒径１０μｍ未満）、色がベージュで、そして透明である。
【０１０３】
誘発され、乾燥された細胞は、粉砕されて、１〜１０μｍの間の平均粒径（重量で）を有する粒子を形成する。必要に応じて、粉砕生成物を、所与の粒径、例えば５〜１０μｍ、１〜５μｍ、３μｍ未満などの範囲内の粒子のみを保持するように、粒径分離（篩など）に付することが可能である。
【０１０４】
脱分化細胞は、種々の材料から製造され、そして種々の作用剤を用いて誘発された。データは以下の表にまとめた。
【表１】
2005530708.tif 000002
【０１０５】
脱分化され、誘発された細胞の粉砕は、化粧用組成物の少なくともいくつかの薬剤中にフィトアレキシンが放出されることを確実にするために、化粧用組成物の１以上の薬剤または賦形剤の存在下に行われることを同じく特記したい。
【実施例２】
【０１０６】
誘発された（実施例１Ａ）および非誘発ブドウ細胞のスチルベン含量のＨＰＬＣによる定量
材料と方法：
−  ビッショッフ（Bischoff）モデル２，２００ポンプ
−  自動インジェクター（Alcoot モデル７８８自動サンプラー）
−  ウルトラセップ（Ultrasep）Ｃ１８カラム（３０ｘｃｍ０．１８ｃｍ）；空孔度６ｍｍ
−  ジャスコ（Jasco）８２１−ＦＩ蛍光検出器。
蛍光は、３００ｎｍで励起しそして３９０ｎｍで放出して検知された。使用された溶離液は、メタノール：水、４０：６０（ｖ／ｖ）であり、そのｐＨは、１Ｍ ＫＯＨで８．３に調整された。
【０１０７】
結果：
スチルベン含量は、生体外で誘発されたブドウ細胞の乾燥分の重量に基づいて約１％であった。フィトアレキシン含量は、非誘発細胞において０．０５％未満残っていた。この増大したスチルベン含量（２０倍）は、誘発工程の、そしてしたがって、本発明に係る粉砕生成物の製造方法の手段である。本発明に係る粉砕生成物においてはスチルベンが高濃度であるため、抽出、蒸留、または結晶化操作等により、スチルベンまたはフィトアレキシンがさらにまた濃縮されている培地を製造することあるいは実質的に純粋なフィトアレキシンを製造することさえも可能である。
【０１０８】
本発明に係る組成物は、したがって、非誘発のまたは天然の植物細胞におけるフィトアレキシン含量と粉砕された細胞膜含量との比率に比べて、フィトアレキシン含量は粉砕された細胞膜含量に対して高比率で含んでなる。
【実施例３】
【０１０９】
粉砕されたブドウの薬理学的活性：酸化防止剤
実施例１Ａに従って得られた生成物の抗ラジカル活性は、生体外で調べられた。再生モデル表皮、ＳＫＩＮＥＴＨＩＣ（登録商標）が使用され、それは、紫外線Ｂ放射によるそれの誘起後、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の定量によって、この活性を明らかにすることを可能とした。
【０１１０】
表皮分布
生成物（実施例１Ａからの粉砕生成物）を表皮と２４時間接触させた後、試験を３回行った。ヒト起源のケラチン生成細胞は、確定培地（変性ＭＣＤＢ１５３）中で０．６３ｃｍ2ポリカーボネートフィルター上に接種され、そして栄養補足された。細胞は空気／液体界面で１４日間培養し、培養培地は一日おきに取り替えた。
【０１１１】
このようにして生成された表皮は、培養の１７日目から調査を行うために使用された。
ＳＫＩＮＥＴＨＩＣ（登録商標）再生表皮バッチ：
−  バッチ１：生成物または放射を受けていない３つの対照表皮
−  バッチ２：ＵＶＢ（１５０ｍＪ／ｃｍ2）に暴露した３つの表皮
−  バッチ３：ＳＯＤ＋カタラーゼ＋ＵＶＢ（１５０ｍＪ／ｃｍ2）で処理した３つの表皮
−  バッチ４：粉砕生成物（０．１％）で処理した３つの表皮
−  バッチ５：粉砕生成物（０．５％）で処理した３つの表皮
−  バッチ６：粉砕生成物（１％）で処理した３つの表皮
−  バッチ７：粉砕生成物（０．１％）＋ＵＶＢ（１５０ｍＪ／ｃｍ2）で処理した３つの表皮
−  バッチ７：粉砕生成物（０．５％）＋ＵＶＢ（１５０ｍＪ／ｃｍ2）で処理した３つの表皮
−  バッチ７：粉砕生成物（１％）＋ＵＶＢ（１５０ｍＪ／ｃｍ2）で処理した３つの表皮
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の定量：リポペルオキシデーションの指標
【０１１２】
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の抽出
ＳＫＩＮＥＴＨＩＣ（登録商標）再生表皮の処理後２４時間で、細胞を懸濁物中に入れた：
−  ０．１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリス緩衝液２５０μｌ、５０ｍＭ、ｐＨ８
−  ７％ＳＤＳ２５μｌ
−  ＨＣｌ（０．１Ｎ）３００μｌ
−  水中のホスホタングステン酸３８μｌ
−  水中の０．６７％チオバルビツール酸３００μｌ
【０１１３】
暗所５０℃での１時間のインキュベーションおよび氷水中での冷却の後、ｎ−ブタノール３００μｌをそれぞれのチューブに加えた。これらは１０，０００ｇ、０℃で１０分間遠心分離された。上清層は、ＭＤＡ定量のために、回収された。
【０１１４】
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の定量
ＭＤＡは、ＨＰＬＣによりＭＤＡ−ＴＢＡ錯体の分離後に、蛍光を測定することにより定量した。
−  ビッショッフ（Bischoff）モデル２，２００ポンプ
−  自動インジェクター（Alcoot モデル７８８自動サンプラー）
−  ウルトラセップ（Ultrasep）Ｃ１８カラム（３０ｘｃｍ０．１８ｃｍ）；空孔度６ｍｍ
−  ジャスコ（Jasco）８２１−ＦＩ蛍光検出器。
蛍光は、５１５ｎｍで励起しそして５５３ｎｍで放出して検知された。使用された溶離液は、メタノール：水、４０：６０（ｖ／ｖ）からなり、そのｐＨは、１Ｍ ＫＯＨで８．３に調整された。
定量化は、ＩＣＳ（Instrumentation Consommation Service）データ処理ソフトを用いて、試料（０．１２５；０．２５；０．５および１μＭ）と同様に処理された標準物と比較することにより行われた。
【０１１５】
タンパク質の定量
タンパク質は、ＢＲＡＤＦＯＲＤの方法で定量された。５９５ｎｍでの吸収の増加は、タンパク質の濃度に比例し、そしてＵＮＩＣＡＭ８６２５分光光度計を用いて決定された。
【０１１６】
結果
細胞ホモジネート中のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の定量
結果は以下の表に示す。
【表２】
2005530708.tif 000003
【０１１７】
得られた結果は、生理的リポペルオキシデーションからの粉砕生成物の有意な保護、すなわち０．１；０．５および１％の希釈で、それぞれ１８％、２５％および４０％があることを示した。
【０１１８】
誘起されたリポペルオキシデーション
結果は以下の表に示す。
【表３】
2005530708.tif 000004
【０１１９】
得られた結果は、紫外線Ｂ放射（１５０ｍＪ／ｃｍ2）により誘起されたリポペルオキシデーションからの粉砕生成物の有意な保護、すなわち、ＳＯＤ／カタラーゼ保護酵素（３９％）との比較により、０．１；０．５および１％の濃度で、それぞれ３１％、３９％および４７％があることを示した。
【０１２０】
用いられた実験条件下で、粉砕生成物は、２４時間の接触の後、ＳＫＩＮＥＴＨＩＣ（登録商標）再生表皮における有意な抗ラジカル活性を示すと思われた。この活性は、ＭＤＡの定量により明らかとなった。
【０１２１】
事実、ＭＤＡ定量は、０．１；０．５および１％の濃度で、調べられた粉砕生成物が：
−  生理的なＭＤＡのレベルはそれぞれ１８％、２５％および４０％有意に減少する；
−  ＭＤＡのレベルを３９％減少させるＳＯＤ−カタラーゼに比べて、誘起されたＭＤＡのレベルを３１％、３９％および４７％減少させることにより紫外線Ｂ放射（１５０ｍＪ／ｃｍ2）により誘起されるリポペルオキシデーションから細胞を有意に保護する；
ことを示す。
【０１２２】
結論において、粉砕生成物は、生理的な条件下および紫外線Ｂ放射による誘起の条件下の双方で、抗ラジカル効果を示す。この試験から、粉砕生成物が有意な抗ラジカル効果を示すことが明らかである。用いられたモデル（再生表皮）を考慮すると、粉砕生成物は局所使用のための調製物において、０．１％の最小活性投与量で使用することができる。
【実施例４】
【０１２３】
呼吸速度に対する生成物の影響の調査（百万細胞１分間あたりの酸素のナノ原子における酸素消費）
この実験は二つの異なる条件下で行った：
−  細胞呼吸を評価するために、非透過性細胞におけるまたグルコースの存在下の、基底細胞呼吸速度に対する影響。
−  ミトコンドリア呼吸を評価するために、呼吸基体、ピルベート−マレート存在下の、透過性細胞の呼吸速度に対する影響。
【０１２４】
この調査は、解離トリプシン培養において、ヒトケラチン生成細胞上で行われた。培養物中の５百万〜１千万のケラチン生成細胞を、３０℃のグルコース（２０ｍＭ）を含むＨａｎｋｓ−Ｈｅｐｅｓ培地１ｍｌ中の懸濁液に入れた。呼吸は、リアルタイムにモニターされ、１分間あたり１０6細胞あたりの消費酸素のナノ原子で表された。オキシグラフ（Oxygraph）機器のセルに生成物を様々な量で添加することにより、検出すべき呼吸の任意の促進または抑制が可能であった。
【０１２５】
インキュベーション培地に溶解された酸素の量は、Ｃｌａｒｋ電極を用いて測定された。テフロンフィルムを通って拡散した酸素は、白金カソードで還元され、それは−０．８ボルトで分極した。これらの条件下で、このカソードと銀アノードの間を通る電流は、溶液中の酸素濃度に比例した。半飽和ＫＣｌ溶液により、塩橋が形成された。測定値は、マイクロコンピューターで取得され、処理された。
【０１２６】
−基底細胞呼吸速度
この試験は、グルコースの存在下、全体の、非透過性細胞について行われた。試験は、生成物の３％マスター溶液について行われた。
結果は以下の表に示す。
【表４】
2005530708.tif 000005
【０１２７】
−ミトコンドリア呼吸速度に対する影響
この試験は、ピルベート−マレート呼吸基質の存在下に、透過性細胞について行われた。
結果は以下の表に示す。
【表５】
2005530708.tif 000006
【０１２８】
結果は、様々な投与量において、粉砕生成物が、基底細胞呼吸の増加をもたらす、全体の、非透過性細胞（グルコースの存在下）およびミトコンドリア呼吸の増加をもたらす、透過性細胞の双方において呼吸速度（酸素消費）を増加させることを示す。
【実施例５】
【０１２９】
百万細胞あたり１分間あたり、ｎｍｏｌでのＰＴＡ合成の速度に対する生成物の影響の調査
この工程は、二つの異なる条件下に行われた：
−  細胞合成の速度を評価するために、非透過性細胞におけるおよびグルコース存在下の、ＰＴＡの合成速度に対する影響。
−  ミトコンドリア合成の速度を評価するために、ピルベート−マレート呼吸基質の存在下の、透過性細胞におけるＰＴＡの合成速度に対する影響。
【０１３０】
この調査は、解離トリプシン培養において、ヒトケラチン生成細胞上で行われた。培養物中の５百万〜１千万のケラチン生成細胞を、３０℃のグルコース（２０ｍＭ）を含むＨａｎｋｓ−Ｈｅｐｅｓ培地１ｍｌ中の懸濁液に入れた。様々な量の生成物を容器へ添加することにより、検知されるべきＰＴＡの合成速度の任意の活性化または阻害を可能にした。培地中に存在するＰＴＡの量は、以下の酵素反応により測定された：
ルシフェラーゼ
ＰＴＡ＋ルシフェリン―――――――＞オキシルシフェリン＋ＰＭＡ＋Ppi＋CO2＋hν
Mg2+
反応は、ベーリンガー・マンハイムが供給するＰＴＡモニター試薬（PTA Bioluminescence Assay Kit HS II）を用いて、ルミノスキャン（Luminoscan）型の装置で行った。
【０１３１】
この反応中に発光された光の強度は、ＲＬＵ（相対的光度単位）でそれを記録した照度計（Luminoscan）により測定した。測定されたＲＬＵは、標準範囲のＰＴＡを基準として用いて、モルＰＴＡに変換した。
【０１３２】
−ＰＴＡの合成速度に対する影響：基底細胞合成速度
この試験は、グルコースの存在下、全体の、非透過性細胞について行われた。結果は以下の表に示す。
【表６】
2005530708.tif 000007
【０１３３】
ミトコンドリアＰＴＡの合成速度に対する影響
【表７】
2005530708.tif 000008
【０１３４】
結果は、様々な投与量において、粉砕生成物が、細胞ＰＴＡ合成の増加をもたらす、全体の、非透過性細胞（グルコースの存在下）およびミトコンドリア合成の増加をもたらす、透過性細胞の双方においてＰＴＡの合成速度を増加させることを示す。
【実施例６】
【０１３５】
培養における細胞のエネルギー代謝に対する生成物の影響の調査。タンパク質のｎｍｏｌ／ｍｇでの細胞アデニルヌクレオチド（ＰＴＡ、ＡＤＰおよびＰＭＡ）の定量と生成物で５日間処理した細胞の動荷重（ＥＬ）の計算
ヒトケラチン生成細胞は、生成物（一測定あたり１０7細胞）の存在下および不存在下に５日間培養物中に入れた。
一旦トリプシン化した後、細胞を収集しそしてアデニルヌクレオチドの濃度をＨＰＬＣで測定した。
【０１３６】
この試験は、全体の、非透過型細胞上で行われた。
結果を以下の表に示す。
【表８】
2005530708.tif 000009
【０１３７】
ＰＴＡ、ＡＤＰおよびＰＭＡの濃度は、ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質で表した。
合計＝［ＰＴＡ］＋［ＡＤＰ］＋［ＰＭＡ］
動荷重（Ｅ．Ｌ．）＝［ＰＴＡ］＋1/2［ＡＤＰ］／［ＰＴＡ］＋［ＡＤＰ］＋［ＰＭＡ］
【０１３８】
結果は、様々な投与量で、粉砕生成物がその投与量に応じて以下のものを増大させることを示す。
−  合成されたＰＴＡの濃度
−  細胞アデニルヌクレオチドの合計濃度
【０１３９】
また、動荷重（ＥＬ）は一定のままであり、アデニルヌクレオチドの間で安定なエネルギー平衡をもたらす：
ＰＴＡ→ＡＤＰ＋Ｐｉ
ＰＴＡ→ＰＭＡ＋ＰＰｉ
（Ｐｉ：無機ホスフェート）
【０１４０】
これらの結果は、最初の２工程の間に得られたものと完全に相関し、そして生成物が細胞エネルギー代謝の促進をもたらすことを確認するものである。
【実施例７】
【０１４１】
粉砕されたブドウ生成物の許容度の調査
生体外での皮膚および眼の許容度の調査は、化粧用調製物の開発に関して、第一の尺度として行われた。
これらの試験は、０．３％の濃度で、粉砕生成物に対して完全な局所的許容度（皮膚および眼）を明確にした。
粉砕された細胞生成物は、局所使用のための化粧用組成物を形成するために、直接使用することができる。
局所使用のための組成物のいくつかの非限定的な例を以下に示す。
【実施例８】
【０１４２】
化粧用基材中での誘発された全ブドウ細胞の分散
ブドウ細胞は実施例１Ａ〜１Ｉに記載のように得られた。これらの実施例の細胞は、別々にあるいは混合して、化粧用組成物の製造に使用された。細胞は、凍結乾燥後そして粉砕されることなく、以下の基材に分散された。
−  脱イオン水                        ８５．６１％
−  無機オイル                          ９．００％
−  セチルアルコール                    ３．００％
−  セテアレス−２０                    ０．７５％
−  ブドウ細胞                          ０．２０％
−  芳香剤                              ０．１５％
−  カーボマー                          ０．１０％
−  メチルクロロイソチアゾリンおよび
メチルイソチアゾリン［kathon CG］   ０．０６５％
−  水酸化ナトリウム（４５％）          ０．０６％
−  ブチル化ヒドロキシアニソール        ０．０６％
合計                              １００．００％
【０１４３】
得られた組成物は、クリーム中で細胞の均一な分散および非常に微細な粒径を示した。清浄度についての試験で、細菌および菌類の不存在ならびに組成物の顕著な安定性が示された。経皮調査から得られた結果は、皮膚組織を通しての、活性成分、特にポリフェノールの通過を示した。
【実施例９】
【０１４４】
化粧用基材中での誘発された全ブドウ細胞の分散
ブドウ細胞は実施例１Ａ〜１Ｉに記載のように得られた。これらの実施例の細胞は、別々にあるいは混合して、化粧用組成物の製造に使用された。細胞は、凍結乾燥および粉砕後、以下の基材に分散された。
−  脱イオン水                        ８５．６１％
−  無機オイル                          ９．００％
−  セチルアルコール                    ３．００％
−  セテアレス−２０                    ０．７５％
−  ブドウ細胞                          ０．２０％
−  芳香剤                              ０．１５％
−  カーボマー                          ０．１０％
−  メチルクロロイソチアゾリンおよび
メチルイソチアゾリン［kathon CG］   ０．０６５％
−  水酸化ナトリウム（４５％）          ０．０６％
−  ブチル化ヒドロキシアニソール        ０．０６％
合計                              １００．００％
【０１４５】
得られた組成物は、クリーム中で粉砕細胞生成物の均一な分散および非常に微細な粒径を示した。清浄度についての試験で、細菌及び菌類の不存在並びに組成物の顕著な安定性が示された。経皮調査から得られた結果は、皮膚組織を通しての、活性成分、特にポリフェノールの通過を示した。
【実施例１０】
【０１４６】
化粧用基材における誘発された全ブドウ細胞の分散
ブドウ細胞は実施例１Ａ〜１Ｉに記載のように得られた。これらの実施例の細胞は、別々にあるいは混合して、化粧用組成物の製造に使用された。細胞は、凍結乾燥後そして粉砕されることなく、以下の基材に分散された。
−  水                                    ４６．８９％
−  硫酸ラウリルナトリウム  （２５％）    ３６．４０％
−  ＰＥＧ−７グリセリルココエート          ２．００％
−  ラウレス−２                            １．５０％
−  ラウレス−１１カルボン酸ナトリウム      ４．００％
−  ココアミドプロピルベタイン＆安息香酸    ３．４８％
−  塩化ナトリウム                          １．６０％
−  プロピレングリコール                    １．００％
−  芳香剤                                  ０．１３％
−  ＰＥＧ−４０硬化ひまし油＆
プロピレングリコール＆水                ０．５０％
−  オレス−１０                            ０．５０％
−  リン酸ナトリウム                        ０．３０％
−  リン酸ジナトリウム                      ０．０８％
−  クエン酸（５０％）                      ０．５２％
−  安息香酸ナトリウム                      ０．５０％
−  ブドウ細胞                              ０．２０％
−  サリチル酸                              ０．２０％
−  フェノキシエタノール                    ０．２０％
合計                                  １００．００％
【０１４７】
得られた組成物は、クリーム中で細胞の均一な分散および非常に微細な粒径を示した。清浄度についての試験で、細菌及び菌類の不存在並びに組成物の顕著な安定性が示された。経皮調査から得られた結果は、皮膚組織を通しての、活性成分、特にポリフェノールの通過を示した。
【実施例１１】
【０１４８】
化粧用基材中での誘発された全ブドウ細胞の分散
ブドウ細胞は実施例１Ａ〜１Ｉに記載のように得られた。これらの実施例の細胞は、別々にあるいは混合して、化粧用組成物の製造に使用された。細胞は、凍結乾燥および粉砕後、以下の基材に分散された。
−  水                                    ４６．８９％
−  硫酸ラウリルナトリウム（２５％）      ３６．４０％
−  ＰＥＧ−７グリセリルココエート          ２．００％
−  ラウレス−２                            １．５０％
−  ラウレス−１１カルボン酸ナトリウム      ４．００％
−  ココアミドプロピルベタイン＆安息香酸    ３．４８％
−  塩化ナトリウム                          １．６０％
−  プロピレングリコール                    １．００％
−  芳香剤                                  ０．１３％
−  ＰＥＧ−４０硬化ひまし油＆
プロピレングリコール＆水                ０．５０％
−  オレス−１０                            ０．５０％
−  リン酸ナトリウム                        ０．３０％
−  リン酸ジナトリウム                      ０．０８％
−  クエン酸（５０％）                      ０．５２％
−  安息香酸ナトリウム                      ０．５０％
−  ブドウ細胞                              ０．２０％
−  サリチル酸                              ０．２０％
−  フェノキシエタノール                    ０．２０％
合計                                  １００．００％
【０１４９】
得られた組成物は、クリーム中で細胞の均一な分散および非常に微細な粒径を示した。清浄度についての試験で、細菌及び菌類の不存在並びに組成物の顕著な安定性が示された。経皮調査から得られた結果は、皮膚組織を通しての、活性成分、特にポリフェノールの通過を示した。
【実施例１２】
【０１５０】
クリーム
−水相Ａ：湿潤化物と組み合わされた脱塩水
−油相Ｂ：乳化剤＋皮膚軟化剤＋オイル
−相Ｃ：保存料、香料
−相Ｄ：活性物質：粘性懸濁液またはゲルまたは実質的に乾燥した粉末としての、脱分化された、誘起ブドウ細胞の粉砕生成物。
【実施例１３】
【０１５１】
ローション
水相Ａのみを含む：脱塩水、プロピレングリコール、保存料、香料および活性物質：粘性懸濁液またはゲルまたは実質的に乾燥した粉末としての、脱分化された、誘起ブドウ細胞の粉砕生成物。
【実施例１４】
【０１５２】
シャンプー
脱塩水、洗浄剤、起泡剤、増粘剤、香料および活性物質：粘性懸濁液またはゲルまたは実質的に乾燥した粉末としての、脱分化された、誘起ブドウ細胞の粉砕生成物をベースとする、水相Ａのみを含む。
【実施例１５】
【０１５３】
ゲル
−水相Ａまたは油相Ｂに乳化剤および増粘剤を添加することにより得られた、ヒドロゲルおよびオレオゲル
−相Ｃ：香料、保存料
−相Ｄ：粘性懸濁液またはゲルまたは実質的に乾燥した粉末としての、脱分化された、誘起ブドウ細胞。
【実施例１６】
【０１５４】
溶液
脱塩水、香料、保存料および活性物質：粘性懸濁液またはゲルまたは実質的に乾燥した粉末としての、粉砕され、脱分化された、誘起ブドウ細胞をベースとする、基本的に、水相Ａのみを含む溶液。
【実施例１７】
【０１５５】
乳液
−水相Ａ：基本的に脱イオン水をベースとする
−油相Ｂ：オイル＋乳化剤＋皮膚軟化剤
−相Ｃ：保存料＋湿潤化物
−相Ｄ：活性物質：粘性懸濁液またはゲルまたは実質的に乾燥した粉末としての、脱分化した誘起ブドウ細胞の粉砕生成物。
【０１５６】
クリーム、ゲルまたは乳液に関する上記の実施例において、異なる相Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、所望の用途に応じて変化しうる比率で、当業者が通常行うような、慣用の方法で混合される。
【０１５７】
ローション、溶液およびシャンプーに関しては、局所使用のための組成物は、当業者が通常行うような、その含量は用途に応じて変化できて、一つの水相で混合される、異なる成分を含む。
【０１５８】
粘性懸濁物またはゲルまたは実質的に乾燥した粉末としての、脱分化した、誘起ブドウ細胞の粉砕生成物の比率は、局所使用のための組成物の性質および所望の用途に依存する。それは、有利には、０．０１〜５％の範囲であり、２５％の量であってもよい。
【０１５９】
本発明は、明らかに上記の実施例に限定されるものではなく、そして、同様に本発明の範囲に入る、油状物、軟膏、ラッカー、色状物（ファンデーション、パウダー、口紅、眉墨、マスカラ、アイシャドウ）等の他の形態での局所使用のための組成物を製造することができる。
【０１６０】
また、本発明は、ブドウ細胞に限定されず、そして脱分化形態で得ることができかつ誘発を受けることができて、局所使用で生物学的な活性を助長するのに十分な量で二次代謝物の蓄積をもたらす限り、他のタイプの植物細胞に適用することができる。
【０１６１】
全ての場合において、誘発された脱分化植物細胞の粉砕生成物を含む局所使用のための組成物は、粘性懸濁物またはゲルまたは実質的に乾燥した粉末として得られる。
【実施例１８】
【０１６２】
異なる植物種または異なる植物種の混合物に由来する脱分化植物細胞を用いて、実施例１を繰り返した。これらの実施例において、剥離皮、種、豆、根、葉、茎、芽、果実、皮またはクチクラが、脱分化植物細胞を得るために用いられた。
以下の表は、使用された植物種を列挙する。
【表９】
2005530708.tif 000010
【実施例１９】
【０１６３】
様々な植物種の粉砕生成物の酸化防止活性
様々な植物種由来の粉砕生成物の抗ラジカル活性は、生体外で研究された。ＳＫＩＮＥＴＨＩＣ（登録商標）再生モデル表皮が、紫外線B放射によりその誘起の後に、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の定量によりこの活性を実証するために使用された。
【０１６４】
誘起されたリポペルオキシデーション
実施例３の実験条件を繰り返した。
結果を以下の表に示す。
【表１０】
2005530708.tif 000011
【０１６５】
得られた結果は、１％の濃度で、粉砕生成物がＵＶＢ放射（１５０ｍＪ／ｃｍ2）により誘起されたリポペルオキシデーションからの有意な保護を提供することを示す。
【０１６６】
使用された実験条件下で、粉砕生成物は、２４時間の接触ののち、ＳＫＩＮＥＴＨＩＣ（登録商標）再生表皮での有意な抗ラジカル活性を示すと思われた。
事実、ＭＤＡ定量は、１％の濃度で、誘起されたＭＤＡのレベルを減少させることにより、粉砕生成物が紫外線Ｂ放射（ＵＳＢ１５０ｍＪ／ｃｍ2）により誘起されたリポペルオキシデーションからの有意な保護を提供することを示す。
【０１６７】
結論として、調べた様々な植物種の粉砕生成物は、紫外線Ｂ放射による誘起の条件下で、抗ラジカル効果を示す。この試験から、粉砕生成物が有意な抗ラジカル効果を示すことは明らかである。用いられたモデル（再生表皮）を勘案すると、これらの粉砕生成物を局所使用のための調製物中で０．１％の最小活性投与量で使用することがすでに考慮されうる。
【実施例２０】
【０１６８】
誘起されたリポペルオキシデーション
芳香性植物と他の種とを組み合わせて用いて、実施例３の実験条件を繰り返した。
結果を以下の表に示す。
【表１１】
2005530708.tif 000012
【実施例２１】
【０１６９】
細胞の含水量をそれぞれ５質量％、１０質量％および１５質量％に減少させるために、脱分化され、誘発されそして洗浄された細胞が、約３０℃の温度で（例えば、窒素）雰囲気中で乾燥された以外は、実施例１Ａ〜１Ｉを繰り返した。細胞の膜構造は、このようにして保存された。
脱分化され、誘発され、洗浄されたそして乾燥された細胞は、次いで、粉砕に付された。
【実施例２２】
【０１７０】
脱分化され、誘発され、洗浄されたそして乾燥された細胞（それらの膜構造が保存されたもの）が、粉砕工程の前に、１以上の賦形剤および／または化粧用組成物の化合物と混合されたこと以外は、実施例２０を繰り返した。
【０１７１】
以下のリストは、細胞が粉砕される前に、細胞と混合される賦形剤のいくつかを示す。
−硫酸ラウリルナトリウム（例えば、２５％水溶液）
−ＰＥＧ−７グリセリルココエート
−酸化防止剤（ビタミンＥの水溶液を含む）
−ラウレス−２
−ラウレス−１１カルボン酸ナトリウム
−ココアミドプロピルベタイン
−ベタイン（グリシノベタイン）
−精油
−プロピレングリコール
−エタノール
−ＰＥＧ−４０硬化ひまし油
−植物油（ココナッツ油、オリーブ油など）
−精油
−１以上の上記の化合物のお互いのおよび／または水との混合物
【０１７２】
細胞に添加される賦形剤および／または水の量は、例えば、粉砕される乾燥細胞の１０質量％とその重量の１００％あるいはそれ以上の間で変動しうる。
【０１７３】
１以上の界面活性剤と１以上の酸化防止剤の使用は、細胞、特に膜の粉砕を促進し、付着し結合したフィトアレキシンの放出を促進し、そして湿度により化合物が分解する問題を減少または回避する上で、興味深いと思われる。それに引き続いて、抽出工程（例えば、連続するエタノール抽出工程と濾過）により、粉砕生成物からフィトアレキシンを抽出することができる。
この実施例は、したがって、
−  脱分化植物細胞を培養培地に入れ、
−  培養の後におよび／またはその間に、脱分化細胞が培養培地中で誘発され、
−  脱分化され、誘発された細胞が培養培地から分離され、
−  脱分化され、誘発された細胞が、任意に１以上の洗浄工程に付され、
−  脱分化され、誘発された細胞が、有利には乾燥、好ましくは凍結乾燥され、
−  脱分化され、誘発された細胞が、粉砕生成物を形成するために粉砕され、そして
−  おそらくは、粉砕された細胞を培地、特に水性および／またはアルコール性培地に導入する工程の後に、粉砕生成物から１以上のフィトアレキシンを抽出するために、粉砕生成物を抽出工程に付する、
フィトアレキシンの取得方法の例である。
【実施例２３】
【０１７４】
細胞膜の外側の存在する洗浄水を除去しそして細胞中に存在する含水量をそれぞれ０％、１０％、２５％、５０％および７５質量％減少させるために、脱分化され誘発された細胞が、洗浄されそして乾燥された（３０℃で窒素気流を用いて）以外は、実施例１Ａ〜１Ｉを繰り返した。このようにして得られた粉砕生成物は、減少した含水量または正常細胞に存在する水に対応する含水量（正常細胞含水量）のいずれかと共に、細胞中に存在する全ての成分を実質的に含んでいた。
【国際調査報告】
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