(57)【要約】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに対する細胞性免疫応答を増強するためのチモシンの使用を記載する。１種または複数のＣ型肝炎ウイルスペプチドをコードする１種またはそれ以上のポリヌクレオチドを、１種またはそれ以上のチモシンと組み合わせて被検体に投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染にかかりやすい被検体をそのような感染に対して免疫化する方法が開示される。１種またはそれ以上のＣ型肝炎ウイルスペプチドをコードする１種またはそれ以上のポリヌクレオチド、および１種またはそれ以上のチモシンを含む、Ｃ型肝炎ウイルスに対する免疫化に適した組成物もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス感染にかかりやすい被検体をそのような感染に対して免疫化する方法であって、該被検体に、１種またはそれ以上のＣ型肝炎ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドを、１種またはそれ以上のαチモシンと組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、１種またはそれ以上のＣ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、およびＮＳ５Ｂタンパク質からなる群より選択される１種またはそれ以上のＣ型肝炎ウイルスタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、１種またはそれ以上のＮＳ５タンパク質をコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記αチモシンはチモシンα１である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記チモシンが、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重／日および１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で投与される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記チモシンが、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で投与される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［関連する出願］
本出願は、２００１年１０月２６日出願の仮出願第６０／３３０，６３８号の利益を請求する。
【０００２】
慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、慢性肝疾患、肝硬変、および肝細胞癌を導く主要な医療問題である。Ｃ型肝炎ウイルスが、輸血後後天性肝炎の症例の大部分の要因と推定される。血液ドナープールの品質の改善および提供された血液の検査の実行にもかかわらず、輸血をうける人々の中での急性感染の発生率は依然として顕著である。慢性肝炎が、急性ＨＣＶ感染の患者（非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢ）の患者の約９０％に相当する）の少なくとも半分で発症し、そして肝硬変はこの群の少なくとも２０％で発症する。
【０００３】
ＨＣＶ関連疾患の進行を停止させる、または遅延させる目的で、様々な薬物が評価されてきた。現在の標準的な治療には、インターフェロンαおよびリバビリンの使用を伴う。しかしながら、かなりの数の個体がそのような治療に反応しない。遺伝的免疫化は、ＨＣＶ構造タンパク質および非構造タンパク質に対する広範な細胞性免疫応答を増強させることが示されている。しかしながら、様々なＨＣＶ構築物の生物活性は、複数の実験動物モデルにおいて弱いものであった（Tokushige, et al. (1996)。
【０００４】
遺伝的免疫化は、弱毒ウイルスまたはタンパク質サブユニットワクチンのような従来の抗原に基づくワクチンの使用に新たに代わるものである。遺伝的免疫化は、受容者を免疫化するために裸のＤＮＡを使用する。ＤＮＡは、細胞内への進入を促進するように作用し得る任意の感染性送達ビヒクル（ウイルス粒子など）を含まないという意味において、「裸」である。裸のＤＮＡが投与されると、受容者は、プラスミドＤＮＡコードタンパク質を発現することが可能になり、次いでそれが細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、および抗体で構成される特異的免疫応答を刺激し得る。ＤＮＡワクチンの使用は、ワクチン化のための病原または免疫保護的（immunoprotective）抗原の精製の必要性をなくす。そしてＤＮＡが単一のウイルスタンパク質をコードするため、病原性への復帰変異の可能性がない。
【０００５】
免疫化のためにポリヌクレオチドを使用することには多数の利点がある。例えば、免疫化はポリヌクレオチドによりコードされた任意の抗原を使用して達成され得る。そのうえさらに、ポリヌクレオチドコード抗原は、それらの本来の状態で「純粋な」抗原として発現され、そして正常な宿主細胞修飾を受けている。また、ポリヌクレオチドは、簡単かつ安価に操作され、そして乾燥産生物として、または溶液中で、広い温度範囲にわたり安定である。したがって、この技術は高有効性サブユニットワクチンの開発に有益である。
【０００６】
誘発された体液性および／または細胞性免疫応答は、病原性要因（細菌、ウイルス、および真核生物（例えば、寄生虫）など）による感染に対する保護または保護的免疫を提供し得る。次いで、保護的体液性および／または細胞性免疫応答は、病原の感染性もしくは活性化を妨げるか、またはその拡散もしくは増殖を制限し、結果として病原による攻撃(challenge)に対する保護をもたらす。免疫応答はまた、特定のタンパク質を産生する細胞に関係する疾患および障害とも戦い得る。
【０００７】
筋肉内注射を介した遺伝的免疫化は、多くのウイルスに対して様々な動物で有効であることが示されてきた。例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）２型感染に対するモルモットの免疫化（Boume et al. (1996) ）、インフルエンザウイルスに対するマウスの免疫化（Fu et al. (1997) ）、インフルエンザウイルスに対するニワトリの免疫化（Kodihalli et al. (1997)）、ならびにロタウイルスに対する哺乳類およびトリ（Herrmann et al. 米国特許第５，６２０，８９６号）である。Daheshia et al. (1997) は、ＩＬ−１をコードする裸のＤＮＡの、疱疹性間質角膜炎（herpetic stromal keratitis）を発現する動物の角膜への単一適用が、これらの動物に影響を及ぼす領域を回復させ、寛解を引き起こしたことを開示する。
【０００８】
遺伝的免疫化の一般的議論、およびその使用は、例えば、米国特許第５，８３０，８７６号（Weiner, et al.）に見いだされ得る。
【０００９】
胸腺に由来するポリペプチド免疫修飾因子のクラス(class)、チモシンは、リンパ球での成熟事象の引きがねとなり、Ｔ細胞機能を増強し、そして免疫欠損の再構築を促進することが示されてきた。チモシンα１（ＴＨＮα１）は、３１００の分子量を有する２８個のアミノ酸の酸性ポリペプチドであり、これは、α−およびγ−インターフェロン産生の刺激、マクロファージ遊走阻止因子産生の増加、Ｔ細胞マーカー、ＩＬ−２受容体の発現の誘導、およびＴ細胞ヘルパー細胞活性の改善を包含する強力な免疫活性を有する。ＴＨＮα１の単離、特性決定、および使用は、例えば、米国特許第４，０７９，１２７号に記載されている。
【００１０】
慢性ＨＣＶを処置する試みにおいて、アシクロビル、ビダラビン、およびアデニンアラビノシドを含む様々な抗ウイルス性薬剤が単独治療薬として使用されてきた。これらの抗ウイルス性薬剤での単独治療は、一般に、薬剤が高度に毒性であったか、または最初はウイルス複製の一部阻害をもたらしたが長期のウイルス複製阻害が継続できないことのいずれかの理由で、成功してこなかった。例えば、Alexander, et al., (1988)を参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
有効でありかつより少ない副作用でウイルスを攻撃し、そして免疫応答系を調節して再発頻度を減少させる、ＨＣＶの治療に対する重大な必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＨＣＶの免疫原性ペプチドに対する、好ましい実施形態ではＨＣＶのＮＳ５タンパク質に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞性免疫応答を増強するためのαチモシンの使用を記載する。ウイルス性および細胞性タンパク質に対する細胞性免疫応答を増強することは困難であった。本発明は、ＨＣＶタンパク質のエピトープに対する細胞毒性および増殖性Ｔ細胞応答を著しく向上させるためのαチモシンのｉｎ  ｖｉｖｏ使用を記載する。好ましい実施形態において、チモシンはチモシンα１である。ＤＮＡに基づくワクチンは、実に新しい技術であり、そしてこれまでのワクチン化の型全てと非常に異なっている（タンパク質、ペプチド、または死んだ（killed）ウイルスに基づくもので、全て体液性、または抗体性免疫を作るが、ＤＮＡに基づくワクチンは細胞性免疫を作る）ため、αチモシンがワクチンの効力を増加させるという事実により、ＨＣＶの治療および予防でのＤＮＡに基づくワクチンの使用に新規かつ予期せぬ改善が提供される。
【００１３】
本発明は、ＨＣＶに対する細胞性免疫応答を著しく向上させるための、ＤＮＡに基づく、または「遺伝的」免疫化と組み合わせたαチモシンの使用を記載する。好ましい実施形態として、チモシンα１（チマルファシン（thymalfasin））を用いたＤＮＡに基づくワクチンの増強を提供する。本発明は、予防用および治療用ワクチン開発に広く関連し、そしてＤＮＡに基づく免疫化の結果としての、ウイルスおよび細胞タンパク質における細胞性免疫応答の顕著な改善を提供する。
【００１４】
免疫原性ＨＣＶペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１種または複数のαチモシンと組み合わせて、ｉｎ  ｖｉｖｏで動物に直接投与される。ポリヌクレオチドは、ターゲットされる免疫原性ＨＣＶタンパク質と少なくとも１つのエピトープを共有するポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドは、個体の細胞で発現されて、広範囲なＨＣＶに対する免疫応答を誘発する免疫原性ターゲットタンパク質を形成する。ＨＣＶゲノムは、２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１およびＥ２）および６つの構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ）をコードする（図２）。これらのウイルスタンパク質のいずれかによりコードされるポリヌクレオチド、またはそれらの組合せもしくはフラグメントが、本発明で使用され得る。
【００１５】
本発明は、本来の（すなわち、天然に生じる）αチモシン、ならびに本来のαチモシンのアミノ酸配列を有する、合成αチモシンおよび組換えαチモシン（アミノ酸配列は、実質的に、それらと同様であるかまたはそれらから省略された配列である）、ならびに本来のチモシンのものと実質的に同様な生物活性をする、置換、除去、延長、交換、またはその他で修飾された配列を有するそれらの生物活性類似体に、応用可能である。好ましいチモシンは、チモシンα１である。
【００１６】
αチモシンの単離、特性決定、および使用は、例えば、米国特許第４，０７９，１２７号、米国特許第４，３５３，８２１号、米国特許第４，１４８，７８８号、および米国特許第４，１１６，９５１号に記載される。ＤＮＡに基づくワクチンの効果の所望の度合いの増強を誘発するのに必要なαチモシンの量は、用量−滴定(dose-titration)の日常業務上の実験で決定され得る。αチモシンは、１６ｍｇ／ｋｇ体重／日もの用量で投与されても、ヒトに関して安全であることが見いだされている。αチモシンの好ましい用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／の範囲にあり、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量が最も好ましい。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチド配列は、転写調節配列に操作可能に連結した抗原性／免疫原性ＨＣＶポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。これらの配列は、これらのポリペプチドの発現を制御する調節タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列と共に使用されてもよい。調節タンパク質は、ゲノムＤＮＡの転写を調節するようにゲノムＤＮＡに結合することにより作用し得るか、あるいは、調節タンパク質はメッセンジャーＲＮＡの安定性または翻訳効率を増加または減少させるようにメッセンジャーＲＮＡに結合することにより作用し得る。
【００１８】
用語「転写および翻訳調節配列に操作可能に連結した」とは、ポリペプチドコード配列ならびに最小限の転写および翻訳制御配列が、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が調節配列（単数または複数）に結合した場合にポリペプチド発現を許容するような方法で連結していることを意味する。ポリヌクレオチドは、それがターゲット細胞による発現に必要な遺伝情報（プロモーターなど）を全て有する場合に、ポリペプチドを操作可能にコードする。用語「プロモーター」または「プロモーター配列」は、本明細書中、転写を指示するのに十分な最小限の配列を示す。ＤＮＡポリヌクレオチド配列は、普通は開始部位および終結部位により境界を付けられてＤＮＡ転写単位を形成し、そして転写されて一次転写物を産生する。
【００１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に送達されるポリヌクレオチド物質は、任意の数の形態を取ることができるため、本発明は任意の特定のＨＣＶポリペプチドをコードする任意の特定のポリヌクレオチドに限定されないが、ＮＳ５タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントが好ましい。ＨＣＶ抗原または免疫原をコードする遺伝子を含有するプラスミドが文献で報告されており、そして当業者により容易に入手され得る（例えば、 Tokushige, et al., 1996を参照）。
【００２０】
ポリヌクレオチドは、１または複数の抗原（２種またはそれ以上の異なるウイルスタンパク質からの抗原など）をコードし得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、２種またはそれより多くの異なるＤＮＡ配列を含んでもよく、１つの配列は抗原をコードし、そしてその他（単数または複数）はポリペプチドをコードし、これは抗原性であってもそうでなくてもよい。例えば、ベクターは、２種（またはそれ以上）のＨＣＶ抗原をコードしてもよい。別の実施形態において、その他のポリペプチド（単数または複数）は、ＨＣＶに対する免疫応答を向上させるように働き得る（例えば、ヘルパーエピトープ、サイトカイン、キャリアポリペプチド、コレラ毒素サブユニット、または他の免疫賦活薬）。
【００２１】
ポリヌクレオチドは、さらに、ポリヌクレオチド発現のための配列を含むベクター中に挿入され得る。２種またはそれ以上のポリペプチドコードＤＮＡ配列が１つのベクターに存在する場合、各抗原コードＤＮＡ配列の転写は、２種またはそれ以上の融合していないポリペプチド発現のためのそれ自身のプロモーターから指示され得る。あるいは、１つのプロモーターが、インフレームで互いに連結した２種またはそれ以上の抗原をコードするＤＮＡ配列の発現を駆動して融合タンパク質を発現させ得る。
【００２２】
これらの方法で使用されるポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム中に組込まれない配列であり得る。これらは、非複製ＤＮＡ配列、またはゲノム組込み能力を欠くように遺伝子操作された特異的複製配列であってもよい。ポリヌクレオチドは、核酸取り込みを促進するかまたは免疫系細胞を接種部位へ動員する能力を有する、アジュバントまたは他の物質の存在下、被検体に投与され得る。宿主細胞により提供される、またはＤＮＡ転写ユニットにより提供される転写因子により、ポリヌクレオチド自身が宿主細胞で発現することが理解されるはずである。
【００２３】
本発明の方法では、発現可能なＤＮＡおよびｍＲＮＡの両方が細胞に送達されてポリペプチド翻訳産生物をその中で形成し得る。核酸が適切な制御配列を含有する場合、それらは比較的大量のコードタンパク質の合成を指示する。
【００２４】
免疫原性ポリペプチドの投薬量は、動物モデルまたは当該技術分野で既知の他の試験系を用いて臨床医または獣医により容易に決定され得る。配合物は、水溶液中に有効量のＤＮＡを含み得る。投与されるべきＤＮＡの量は、ワクチン化を予定された被検体の年齢、体重、および身体状態などの因子に依存する。ＤＮＡの量はまた、被検体の免疫系の抗体を合成する能力、および所望の保護の程度に依存する。有効投薬量は、用量応答曲線を確立する日常業務上の検査を通じて当業者により容易に確立され得る。好ましい用量範囲は、１μｇ／ｋｇ被検体体重〜１ｍｇ／ｋｇ被検体体重の間である。被検体は、１回のＤＮＡ投与により、または複数回投与により、免疫化され得る。複数回投与は、被検体による特定の病原に対する免疫状態を維持するために要求され得る。
【００２５】
成功した形質転換のための異種ポリヌクレオチドを構築する組成物および方法は、当業者に既知であり、そして構築の同じ組成物および方法が、本明細書中有用なポリヌクレオチドを産生するために使用され得る。ポリヌクレオチドの特定の組成物は本発明の中心ではなく、そして本発明は、使用される特定のトランスフォーミングポリヌクレオチドの組成物に依存しない。プロモーター、ポリアデニル化配列、終止シグナル、スプライシングシグナル、選択マーカー、レポーター遺伝子、エンハンサー、ウイルスレプリコン、イントロン、および細菌プラスミド配列を包含するポリヌクレオチドの適した構成成分は、当該技術分野で既知である。Sambrook et al. (1989)は、異種ポリヌクレオチド構築の適した方法を提供する。
【００２６】
ポリヌクレオチドは、いくつかの既知の方法により生成され得る。例えば、あらかじめ選択された抗原をコードするＤＮＡが発現ベクター中に挿入され得る（例えば、Sambrook et al. (1989)を参照）。自動核酸合成装置が利用可能になったことで、ＤＮＡは、ヌクレオチド配列が既知の場合は直接、またはＰＣＲ、クローニング、および発酵との組合せにより合成され得る。そのうえ、あらかじめ選択されたポリペプチドの配列が既知の場合、ポリヌクレオチドに関し、適切にコードしている配列が推測され得る。
【００２７】
ポリヌクレオチドがｍＲＮＡの場合、それは、対応するＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易に調製され得る。例えば、従来技法は、ファージＲＮＡポリメラーゼＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７を使用して、個々のリボヌクレオシドトリホスフェート存在下、ＤＮＡテンプレートからｍＲＮＡを調製する。適切なファージプロモーター（Ｔ７複製起点部位など）が、転写されるべき遺伝子の直前の上流のテンプレートＤＮＡに置かれる。この様式でＴ７を使用するシステムはよく知られており、文献に記載されている。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、免疫学的組成物に関し、これは、免疫学的応答をその中で誘導する能力があるかまたは誘導している個体に導入された場合、そのような個体でそれらからコードされたＨＣＶタンパク質に対する免疫学的応答を誘導する。ここでその組成物は、１種またはそれ以上のＨＣＶ抗原／免疫原をコードし発現するポリヌクレオチドを、１種またはそれ以上のαチモシンと組み合わせて含む。免疫学的応答は、治療にまたは予防に使用されてもよく、そして抗体免疫、またはＣＴＬまたはＣＤ４＋Ｔ細胞から生じるような細胞免疫の形態をとってもよい。
【実施例】
【００２９】
（実施例１）
プラスミド構築
ウイルス遺伝子源として、ＨＣＶの全長オープンリーディングフレーム（open reading frame）（ＯＲＦ）をカバーする、ｐＢＲＴＭ／ＨＣＶ１−３０１１と称するプラスミドを使用して、発現ベクター中にクローニングした(Grakoui, et al., 1993)。作製された開始および終止コドンならびに以下のプライマーを使用する制限酵素部位の挿入後、構築物ｐＡｐ０３１−Ｎｓ５をＰＣＲクローニングした。ＮＳ５に対しては、５'−  Ｔ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＧＡ−３'  （Ｘｂａｌ）［配列番号１］および５'−Ａ  ＧＣＴ  ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＴＣＡ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＴ−３'  （ＭｌｕＩ）［配列番号２］である。高忠実度（high-fidelity）ＰＣＲ系（Bochringer Mannheim, Indianapolis, IN）を使用したＰＣＲ増幅後、ｃＤＮＡフラグメントを、ラウス肉腫ウイルスエンハンサーエレメントおよびＣＭＶプロモーターを含有するプラスミド発現ベクターｐＡｐ０３１中に挿入した。構築物を、ＤＨ５α細胞中に形質転換し、続いて２×塩化セシウム遠心分離またはＥｎｄｏｆｒｅｅ緩衝液系を使用するQiagen Gigaキット（Santa Clara, CA）でのいずれかでプラスミドＤＮＡを精製した。非構造タンパク質をコードするｃＤＮＡの正確な挿入が、標準的な方法を使用する配列決定分析により実証された。ＣＴＬアッセイ用ターゲット細胞として安定なＮＳ５発現細胞株を確立するために、非構造タンパク質コード遺伝子フラグメントを、ネオマイシン選択マーカーを有する、ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）発現ベクター（Invitrogen, San Diego, CA）中にもクローニングした。ＸｂａＩおよびＭｌｕＩフラグメントＮＳ５を、Ｌｉｔｍｕｓ−３８ベクター（New England Biolabs, Beverly, MA）のＮｈｅＩ／ＭｌｕＩ部位中にサブクローニングし、ＥｃｏＲ１およびＳａｌＩで切断し、そしてそれぞれ、ｐｃＤＮＡ３およびｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ多重クローニング部位中に連結した。ＮＳ４を含むＨｂａＩおよびＢａｍＨＩフラグメントを、Ｌｉｔｍｕｓ−２９（New England Biolabs）中に連結し、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで再切断し、続いてｐｃＤＮＡ３ベクター中に連結した。プラスミドを、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）−ＮＳ５と称した。マウスＩＬ−２（ｐｃＤ／３−ＩＬ２）をコードするＤＮＡ発現プラスミドを、先に記載されるようにクローニングおよび精製した(Geissler, et al., 1997a, 1997b, 1997c)。
【００３０】
遺伝的免疫化
プラスミドＤＮＡの細胞取込みを向上させるために、Ｂａｌｂ／ｃマウスの四頭筋の複数部位に合計１００μＬの０．２５％フピバカイン（hupivacaine）を注射した。４日後、プラスミド構築物を、最終体積１００μＬの０．９％ＮａＣｌで、同じ領域中の異なる３つの部位に注射した。２週間後、反対の脚で、プラスミドＤＮＡでマウスを追加免疫した。最後の免疫化から１０日後にマウスを殺した。マウスは３群にわかれており、それぞれ５匹の動物を含んだ。群１＝１００μｇの偽(mock)ＤＮＡで免疫化されたマウス、群２＝５０μｇのｐＡｐ０３１ＮＳ５および５０μｇの偽ＤＮＡで免疫化されたマウス、群３＝５０μｇのｐＡｐ０３１ＮＳ５および５０μｇの偽ＤＮＡで免疫化され、そして２回／週で５μｇチモシンαを腹腔内投与で受けたマウス。２週間離して３回動物を免疫化し、そして最終免疫化から１０日後に研究を行った。
【００３１】
Ｔ細胞増殖アッセイ
マウスにイソフルラン（Aerrane, Anaquest, NJ）で麻酔をかけ、眼球後穿刺により血液を除去し、そして脾臓細胞を回収した。８．３％ＮＨ４Ｃｌ／０．１７ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中３７℃で１０分間のインキュベーションにより赤血球を除去した。９６ウェル平底プレートを使用して、１０％ＦＣＳ含有完全（ダルベッコ改変イーグル培地、Mediatech, Washington,  DC）１００μｌ中、１ウェルあたり５×１０５細胞で、脾臓細胞を三連で培養した。異なる濃度（１、５、１０μｇ／ｍＬ）で組換えＮＳ５を用いて、脾臓細胞を刺激した。最後に、２−メルカプトエタノールを、最終濃度５０μｍｏｌ／Ｌまで加えた。抗原特異性に対する制御として、エフェクター細胞を１０μｇ／ｍＬの組換え体（ヒト絨毛性ドナゴトロピンのβ−サブユニットであり、これは細胞から分泌され、そして強力なＴ細胞免疫原であることが示されている（Geissler, et al. , 1997d)）で刺激した。脾臓細胞を３日間刺激した。［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ウェル）の添加後、細胞を１８時間インキュベートした。ＤＮＡ中への［３Ｈ］−チミジン組込みを、回収後に測定した（図３）。放射活性の組込みをバックグラウンド活性（Λｃｐｍ）について補正した。
【００３２】
細胞傷害アッセイ
免疫化したマウスからの脾臓細胞を、１０％ＦＣＳおよび５０μｍｏｌ／Ｌ２−メルカプトエタノールを含有する完全ＤＭＥＭ中に懸濁させた。次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の５日後に、細胞を細胞傷害活性について分析した。組換えマウスＩＬ−２を、５Ｕ／ｍＬの濃度で１度加え、そして２０，０００ｒａｄでの処理後、レスポンダー(responder)細胞（４×１０７）を、安定にＮＳ５を発現する６．２５×１０６の同系細胞と同時培養した。細胞傷害エフェクターリンパ球集団を、インキュベーションの５日後に回収した。ターゲット細胞株として５１Ｃｒ−標識ＳＰ２−ＮＳ５細胞を使用して、４時間５１Ｃｒ−放出アッセイを、９６ウェル丸底プレートで行った。ＣＴＬアッセイを、１：１０および１：１００のリンパ球エフェクター：標的（Ｌ／Ｔ）比で行った。細胞傷害パーセントを以下のように計算した：
実験による放出−自発的放出／最大放出−自発的放出
実験による放出は、エフェクター細胞の存在下で標的細胞による放出の１分当たりの平均計数を表す。合計放出は、標的細胞の５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００での完全溶解後に放出される放射活性を表す（図４）。
自発的放出は、標的細胞のみに由来する、培地中に存在する放射活性を表す。
【００３３】
統計学的分析
異なる群間の結果を比較するため、本発明者らはノンパラメトリックＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を用いた。Ｐ＜．０５を、統計的に有意であると判断した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答によるＰ値についての数は、それぞれ、刺激に使用された全ての組換えＮＳ５の濃度およびＥ：Ｔ比に由来する。
【００３４】
図３および図４に示される結果は、ＤＮＡに基づく免疫化処置でαチモシンの同時投与により達成され得る免疫応答の劇的な改善を実証する。αチモシンの同時投与は、３種の負荷濃度全てに対して約１００％でＣＤ４増殖性応答を増加させた（図３）。細胞傷害パーセントもまた、αチモシンの同時投与により、１００％またはそれより多く増加した（図４）。
【００３５】
【表１−１】
2005506997.tif 000002
【表１−２】
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【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＤＮＡに基づく免疫化の機構の図である。
【図２】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノムの模式図である。
【図３】３種の攻撃誘発濃度（０．１μｇ、０．５μｇ、および１μｇ）でのＴ細胞増殖性応答における、５μｇチモシンα１のＮＳ５コードポリヌクレオチドとの腹腔内同時投与の効果を示す。
【図４】２種のリンパ球エフェクター／ターゲット（Ｌ／Ｔ）比での細胞傷害応答における、５μｇチモシンα１のＮＳ５コードポリヌクレオチドとの腹腔内同時投与の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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