(57)【要約】本発明は、すり潰したスズカケノキの樹皮及び／またはスズカケノキの外皮のメタノール抽出物から高純度かつ結晶状のベツリン酸を得るための改良方法に関するものである。本発明はまた、１当量のエタノールで溶媒和されている高純度かつ結晶状のベツリン酸に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
すり潰したスズカケノキの皮層及び／またはスズカケノキの樹皮のメタノール抽出物を濃縮し、アルコールから結晶化することにより、該抽出物から高純度かつ結晶状のベツリン酸を得るための改良方法であって、結晶化の前にメタノール抽出の残渣を無極性の希釈剤で洗浄することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
メタノール抽出物の残渣の洗浄及び単離を以下の処理工程で逐次行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法；
（i）   残渣を無極性希釈剤中で加熱する工程；
（ii）  希釈剤から残渣を分離する工程；
（iii） エタノール中で残渣を加熱し、活性炭を加えることによってエタノール相を浄化し、６０〜９５℃の温度でエタノール相から活性炭を取り除く工程；及び
（iv）  エタノール相からベツリン酸を結晶化し分離する工程。
【請求項３】
すり潰したスズカケノキの皮層を、２〜５倍量のメタノール中で０．５〜５時間、加熱して沸騰させながら抽出を行い、得られた抽出物を４０〜６０℃の温度で濾過し３０〜７０％の体積になるまでエバポレートし、−１０℃〜＋１０℃の温度で結晶化させることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
メタノール抽出物の残渣を２〜８倍量の脂肪族炭化水素、好ましくはn-ヘキサン中に溶解し、その混合物を加熱して沸騰させることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記の手順（ii）において、遠心分離により残渣を希釈剤から分離することを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記の手順（iii）において、２０〜１００倍量のエタノール中に残渣を溶解し、加熱して沸騰させることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記の手順（iv）において、エタノール相を−１０℃〜＋１０℃の温度、好ましくは０℃〜＋５℃の温度に冷却し、析出したベツリン酸を遠心分離により分離し、乾燥させることを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
得られたベツリン酸がモノエトキシドとして存在することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
１当量のエタノールで溶媒和されていることを特徴とする高純度かつ結晶状のベツリン酸。
【請求項１０】
下記式で表される、請求項９に記載の高純度かつ結晶状のベツリン酸。
【化１】
2005517020.tif 000004
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、すり潰したスズカケノキ（plane）の樹皮のメタノール抽出物から高純度かつ結晶状のベツリン酸を得るための改良方法に関するものである。
【０００２】
発明の背景
ベツリン酸は下記式で表される3β-ヒドロキシ-ルパ-20(29)-エン-28-酸である。
【０００３】
【化１】
2005517020.tif 000002
【０００４】
ベツリン酸は、他の癌細胞増大の抑制と同様に（Sunder et al., US Patent US 6,048,847）、メラノーマ細胞の増大を抑えるのに有効であることが知られている（Pisha et al., Nature Medicine 1, 1995, 1046 ff）。さらに、そのアミド類はHIV抑制のための使用に適していると考えられている（Evers et al., J. Med. Chem. 39, 1996, 1056 ff; or Soler et al., J. Med. Chem. 39, 1996, 1069 ff）。したがってベツリン酸には大きな需要があるといえる。
ベツリン酸は、合成による生成（L. Ruzicka et al., Helv. Chim. Acta 21, 1938, 1076 ff）以外に、各種植物、特に樹木類、例えばPicramnia pentandra（ビターブッシュ）の外皮または皮層（Herz et al., Phytochemistry 11, 1972, 3061 ff）、Arbutus menziesii（マドローナ）の皮層（Robinson et al., Phytochemistry 9, 1970, 907 ff）、またZiziphus mauritiana（インドナツメ）の皮層（Pisha et al., Nature Medicine 1, 1995, 1046 ff）からも得ることができる。
【０００５】
これらの出発原料からベツリン酸を単離することは困難であるのに対し、スズカケノキ（Platanus acerifolia）の皮層及び／または樹皮からはより効率的にベツリン酸を得ることができると考えられる。DE 197 13 768中に、スズカケノキの樹皮から得られた粉末をジクロロメタン、クロロフォルムまたはジエチルエーテルなどの中性極性溶媒で抽出することによりベツリン酸を得る方法が提案されている。
しかし、この方法ではベツリン酸抽出の際に大量の中性極性溶媒の使用が必要となるため（粉末状のスズカケノキ樹皮１５０ｇに対しジクロロメタン７Ｌを使用）、大量のベツリン酸の産業回収には不向きである。
BrucknerらはJ. Chem. Soc. 1948, 948-951中で、スズカケノキの樹皮からベツリン酸を得る方法として、すり潰した樹皮をメタノールで抽出し、得られた抽出物を気化させることにより濃縮して、活性炭の存在下でメタノールから繰り返し再結晶を行う方法を記載している。しかしこのようにして得られたベツリン酸にも大量の不純物を含有してしまうという難点がある。
【０００６】
従って本発明は、スズカケノキの樹皮及び／またはスズカケノキの皮層から高純度かつ結晶状のベツリン酸を大量回収するための、既知の方法の欠点を回避した改良方法を提供することを目的とする。
【０００７】
発明の詳細な説明
意外なことに高純度の結晶状ベツリン酸は、結晶化の前にメタノール抽出の残渣を無極性の希釈剤で洗浄すると、すり潰したスズカケノキの樹皮及び／またはスズカケノキの皮層のメタノール抽出物をエバポレートしてアルコールから結晶化することにより、該抽出物から得られるということが分かった。
従って本発明は、すり潰したスズカケノキの皮層及び／またはスズカケノキの樹皮のメタノール抽出物をエバポレートし、アルコールから結晶化することにより、該抽出物から高純度かつ結晶状のベツリン酸を得るための方法であって、結晶化の前にメタノール抽出の残渣を無極性の希釈剤で洗浄することを特徴とする前記方法に関するものである。
【０００８】
上記および下記に用いられる「ベツリン酸」という語はベツリン酸そのもの、またその水和物及び溶媒和物も含む。１から２当量のアルコールで溶媒和されたベツリン酸が好ましく、特に１当量のエタノールで溶媒和されたものが好ましい。
本発明は更に、１当量のエタノールで溶媒和されている高純度の結晶状ベツリン酸に関するものである。
【０００９】
本発明におけるスズカケノキとしては、アメリカスズカケノキ（Platanus occidentalis）が特に適していることが分かった。
粗ベツリン酸を再結晶化するための適当なアルコール類としては、一般的に１から４個の炭素原子を持つ脂肪族アルコールが挙げられる。特にメタノール、エタノール、イソプロパノール、またはそれらの混合物が好ましく、エタノールが最も好ましい。
適当な無極性希釈剤としては、一般的に脂肪族炭化水素、脂環式炭化水素、芳香族炭化水素、またはそれらの混合物が挙げられる。好ましくは５から８個の炭素原子を持つ脂肪族炭化水素であり、特にペンタン、ヘキサンまたはヘプタンが好ましい。最も好ましくはn-ヘキサン、５から８個の炭素原子を持つ脂環式炭化水素、とくにシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、または６から９個の炭素原子を持つ芳香族炭化水素、とくにトルエンまたはキシレンである。
ここで簡略化のため、以上また以下における２つの物質の割合を「ｘ〜ｙ倍量」の形で表すこととする。ｘ及びｙは特定の物質量の下限及び上限をそれぞれ意味し、一方の物質量を１重量部としたときに、他方の物質の重量が「ｘ〜ｙ」重量部であることを表す。
【００１０】
発明の好ましい実施態様は以下の通りである。
（Ａ）メタノール抽出物の残渣の洗浄及び単離を以下の処理工程で逐次行う方法；
（i）   残渣を無極性希釈剤中で加熱する工程；
（ii）  希釈剤から残渣を分離する工程；
（iii） エタノール中で残渣を加熱し、活性炭を加えることによってエタノール相を浄化し、６０〜９５℃の温度でエタノール相から活性炭を取り除く工程；及び
（iv）  エタノール相からベツリン酸を結晶化し分離する工程。
（Ｂ）すり潰したスズカケノキの皮層を、２〜５倍量のメタノール中で０．５〜５時間、加熱して沸騰させながら抽出を行い、得られた抽出物を４０〜６０℃の温度で濾過し３０〜７０％の体積になるまでエバポレートし、−１０℃〜＋１０℃の温度で結晶化させる方法。
【００１１】
（Ｃ）メタノール抽出物の残渣を２〜８倍量の脂肪族炭化水素、好ましくはシクロヘキサン、メチルシクロヘキサンもしくはn-ヘキサン、特にn-ヘキサン中に溶解し、その混合物を加熱して沸騰させる方法。
（Ｄ）上記の手順（ii）において、遠心分離または吸引濾過により残渣を希釈剤から分離する方法。
（Ｅ）上記の手順（iii）において、２０〜１００倍量、好ましくは３０〜８０倍量、特に４０〜６０倍量のエタノール中に残渣を溶解し、加熱して沸騰させる方法。
（Ｆ）上記の手順（iv）において、エタノール相を−１０℃〜＋１０℃の温度、好ましくは０℃〜＋５℃の温度に冷却し、析出したベツリン酸を遠心分離または吸引濾過により分離し、乾燥させる方法。
（Ｇ）得られたベツリン酸がモノエトキシドの形である方法。
１当量のエタノールで溶媒和されている高純度の結晶状ベツリン酸が特に好ましく、特に下記式のベツリン酸エトキシドが好ましい。
【００１２】
【化２】
2005517020.tif 000003
【００１３】
本発明の最も好ましい実施態様は次の通りである。粉末状のスズカケノキの皮層を２〜５倍量、好ましくは３〜４倍量のメタノール中で懸濁させ、１〜５時間加熱、特に約２時間加熱、好ましくは還流により加熱するのが好ましい。懸濁液を４０〜６０℃、特に約５０℃で濾過し、メタノール抽出物を６０〜４０％、特に約５０％の体積になるまでエバポレートする。濃縮された抽出物を０〜１０℃、特に約５℃に冷却し、濾過し、冷やしたメタノールで洗浄する。残渣を４０〜７０℃、特に約５０℃で真空乾燥させるのが好ましい。
この方法で、ベツリン酸の粗製物は無色粉末として得られる（収率約２．０〜２．５％、スズカケノキ皮層を基準）。これを４〜８倍量、特に５〜６倍量のn-ヘキサン、シクロヘキサンまたはメチルシクロヘキサン中で懸濁させ、０．５〜２時間加熱、特に１時間加熱、特に還流により加熱するのが好ましい。得られた懸濁液を遠心分離または吸引濾過し、１．５〜４．５倍量、特に約３倍量の熱したn-ヘキサン、シクロヘキサンまたはメチルシクロヘキサンで洗浄する。残渣を約４０℃で一晩乾燥、好ましくは真空乾燥させる。
このようにして得られたベツリン酸を３０〜５０倍量のエタノール中に加熱しながら溶解する。活性炭を加え、混合物を熱いうちに濾過する。熱が冷めるにつれて結晶化が始まる。混合物を０〜１０℃、特に５℃に冷却し、吸引濾過または遠心分離し冷やしたエタノールで洗浄する。
このようにして１モルのエタノールで溶媒和されている高純度の結晶状ベツリン酸が得られる。
以下の実施例は、ベツリン酸を得る方法を一例として例示するものである。あくまでも実施可能な手順として例示することを意図したものあり、本発明はこの実施例の内容に限定されるものではない。
【００１４】
実施例
１Ａ  スズカケノキの皮層の抽出
スズカケノキ皮層の粉末４５００ｇ（カッターミルにて粉砕）をメタノール１５Ｌ中で懸濁し、２時間還流する。懸濁液を約５０℃で濾過し、メタノール抽出物を５０％の体積（７．５Ｌ）になるまでエバポレートする。濃縮した抽出物を５℃に冷却、濾過し、冷やしたメタノール２Ｌで洗浄する。残渣を５０℃で真空乾燥させる。ベツリン酸粗製物１０４ｇが無色粉末として得られる（収率２．３％、スズカケノキ皮層を基準）。ＨＰＬＣ：９０．６％
１Ｂ  無極性溶媒からの攪拌・取り出し
実施例１Ａにて得られたベツリン酸９３ｇをn-ヘキサン６００ｍＬ中で懸濁し、１時間還流する。懸濁液をヌッチェ（nutsche）にて吸引濾過し、熱したn-ヘキサン３００ｍＬで洗浄したのち残渣を４０℃で一晩真空乾燥させる。ベツリン酸８９．５ｇ（収率９６．２％）が無色粉末として得られる。ＨＰＬＣ：９４．７５％
シクロヘキサン、メチルシクロヘキサンまたはこれら溶媒の混合物を同様に使用してもよい。
【００１５】
１Ｃ  エタノールからの再結晶化
実施例１Ｂにて得られたベツリン酸８９ｇを還流し、エタノール４Ｌ中に溶解する。活性炭４０ｇを加え、混合物を熱いうちにヌッチェにて濾過する。周囲温度にまで冷却後、結晶化が始まる。混合物を５℃に冷却、吸引濾過し、冷やしたエタノール５００ｍＬで洗浄する。１モルのエタノールで溶媒和されている結晶状のベツリン酸６３．５ｇ（収率７１．３％）が得られる。ＨＰＬＣ：９３．８％（パーセンテージ・エリア１００％）；融点＝２９６-２９８℃，[α]Ｄ＝＋８，ｃ＝ピリジン中０．９
１Ｄ  母液からの検出
実施例１Ｃ中のエタノール洗浄母液４Ｌを１Ｌになるまで真空にてエバポレートし、５℃で吸引濾過し、冷やしたエタノールで洗浄すると、ベツリン酸２０ｇ（収率２２．５％）が得られる。ＨＰＬＣ：９６．５％
【国際調査報告】
2005517020.tif 000005
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