(57)【要約】水溶性金属イオンアフィニティ化合物および、その使用方法が提供される。本発明の化合物は、水溶性ポリマー基材に結合されたアスパラギン酸塩を主成分とする金属キレート形成性リガンドを含有し、このリガンドが、金属イオンと錯体を形成している水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物を含む。態様によっては、本発明の化合物は、信号生成系のメンバー、たとえば、直接または間接的に検出可能な標識部分をさらに含む。本発明の化合物が少なくとも1表面上に存在する、たとえば固定化されている、非水溶性基材も提供される。本発明の化合物は、分析対象物質の検出および分析対象物質の精製の用途を含む、各種多様な用途に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸塩を主成分とし水溶性ポリマー基材に結合した金属キレート形成性リガンドである、金属イオンと錯体を形成する該リガンドを含有する、水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項２】
水溶性ポリマー基材が多糖である、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項３】
多糖がアガロースおよびデキストランから選択される、請求項2記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項４】
金属イオンが硬い金属イオンである、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項５】
硬い金属イオンが、Fe3+、Ca2+、およびAl3+のいずれかである、請求項4記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項６】
金属イオンが中間の金属イオンである、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項７】
中間の金属イオンが、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+のいずれかである、請求項6記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項８】
金属イオンが軟らかい金属イオンである、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項９】
軟らかい金属イオンが、Cu+、Hg2+、およびAg+のいずれかである、請求項8記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１０】
金属イオンがCo2+である、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１１】
金属イオンがFe3+である、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１２】
アスパラギン酸塩を主成分とするリガンドがアスパラギン酸から合成される、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１３】
アスパラギン酸塩を主成分とするリガンドが四座配位子リガンドである、請求項12記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１４】
アスパラギン酸塩を主成分とするリガンドがアルキル化アスパラギン酸塩リガンドである、請求項13記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１５】
アスパラギン酸塩を主成分とするリガンドがカルボキシメチル化アスパラギン酸塩リガンドである、請求項14記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１６】
請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物であって、該水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物が、式
2005517152.tif 000003
を有し、式中
Mが、2+の酸化状態で配位数が6の遷移金属イオンであり、
R1が、CM-Aspのカルボキシメチル基のメチレン炭素原子とR2とを連結する結合アームであり、
R2が、CM-Aspの結合アームR1をR3に連結する結合官能基であり、そして
R3が水溶性ポリマー基材である、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１７】
化合物が信号生成系のメンバーをさらに含む、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１８】
信号生成系のメンバーが、直接的に検出可能な標識である、請求項17記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項１９】
信号生成系のメンバーが、間接的に検出可能な標識である、請求項17記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項２０】
請求項1記載の化合物が表面上に存在する、不溶性基材。
【請求項２１】
キレート化した金属イオンに対してアフィニティを有する分析対象物が、試料中に存在するか否かを判定する方法であって、
（a）試料を請求項1記載の水溶性金属イオンアフィニティ化合物と接触させて、接触済み混合物を生成する段階と、
（b）分析対象物と水溶性金属イオンアフィニティ化合物の錯体が存在するか否かについて該接触済み混合物をスクリーニングする段階とを含む、分析対象物が試料中に存在するか否かについて判定する方法。
【請求項２２】
試料が流体試料であり、分析対象物が流体試料中に溶液として存在する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
試料が、非水溶性基材の表面上に提示された分析対象物を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
分析対象物がリン酸化される、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
金属イオンアフィニティペプチドで分析対象物にタグを付ける、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
金属イオンアフィニティペプチドが、ヒスチジン残基を複数有するペプチドおよびHATペプチドから選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
検出段階に先だって、錯体を接触済み混合物の他の成分から分離しておく段階をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
キレート化した金属イオンに対してアフィニティを有する分析対象物を、試料中の他の成分から分離する方法であって、
（a）試料を請求項1記載の水溶性金属イオンアフィニティ化合物と接触させて、接触済み混合物を生成する段階と、
（b）分析対象物と水溶性金属イオンアフィニティ化合物の錯体を、接触済み混合物の他の成分から分離して、分析対象物を試料中の他の成分から分離する段階を含む方法。
【請求項２９】
水溶性金属イオンアフィニティ化合物が、非水溶性基材の表面上に固定化される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
分析対象物がリン酸化される、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
金属イオンアフィニティペプチドで分析対象物にタグを付ける、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
キレート化金属イオンアフィニティペプチドが、ヒスチジン残基を複数有するペプチドおよびHATペプチドから選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
分離段階（b）の後に、分析対象物を水溶性化合物から分離する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３４】
（a）請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物と、
（b）該水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物を使用して分析対象物の存在の有無について試料をスクリーニングする際の説明書とを含むキット。
【請求項３５】
（a）請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物と、
（b）該水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物を試料中の他の成分から分離する際の説明書とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法119条（e）にもとづいて、本出願は、米国特許仮出願第60/300,336号（2001年6月21日出願）の出願日の優先権を主張するものであり、その出願の開示内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
序文
発明の分野
本発明は、一般的には、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography、IMAC）は、金属イオンに対するアフィニティ部位を含む融合タンパク質を精製する際に最も頻繁に使用された手法の一つである。IMACは、タンパク質の分離に際して、固定化されている金属イオンに対するタンパク質のアフィニティの差を使用する分離方法である。このアフィニティの差は、金属イオンと、タンパク質表面に露出している特定のアミノ酸側鎖との間に形成された配位結合に起因するものである。
【０００４】
固定化金属イオンとアミノ酸側鎖との間の相互作用は、容易に可逆するという特徴を有しているので、この相互作用を吸着に利用し、その後、穏やかな（すなわち、変性を生じない）条件で吸着を切り離すことができる。現在市販されている吸着剤としては、イミノ二酢酸（iminodiacetic acid、IDA）、ニトリロ酢酸（nitriloacetic acid、NTA）、カルボキシメチル化アスパラギン酸（carboxymethylated aspartic acid、CM-Asp）、およびトリスカルボキシメチルエチレンジアミン（triscarboxymethyl ethylene diamine、TED）がある。これらのリガンドは、各金属イオンとの間で、最大で、三座（IDA）、四座（NTA, CM-Asp）、および五座（TED）の錯体を生成する。
【０００５】
市販の吸着剤の大半は、金属キレート形成性リガンドは、平均密度約12Åとして提供される。リガンドに応じて、各種の金属をキレート化することができる。IMAC法で使用される代表的な金属イオンは、3つのカテゴリー、すなわち、求核性部分（nucleophile）に対する選好的反応性にもとづいて、硬い金属イオン、中間の金属イオン、および軟らかい金属イオンに分類される。硬い金属イオンであるFe3+、Ca2+、およびAl3+は、水素に対する選好性を示し、軟らかい金属イオンであるCu+、Hg2+、Ag+などは、硫黄に対する選好性を示す。中間の金属イオン、たとえば、Cu2+、Ni2+、Zn2+、およびCo2+は、窒素、酸、および硫黄と配位する。タンパク質表面のシステイン残基の数は限られているので、ヒスチジン残基は中間の金属イオンの主要な標的となる。
【０００６】
「IMAC」は、商業的な成功をおさめているため、新たな「IMAC」の技術や用途を開発することが引き続き求められている。本発明は、こうした必要性を満たすものである。
【０００７】
関連文献
参照すべき文献としては、米国特許4,569,794号、5,047,513号、5,284,933号、5,310,663号、5,962,641号、5,594,115号、および6,242,581号、ならびにChagaら, Biotechnol. Appl. Biochem. (1997) 26: 7-14がある。また、Fordら、 Protein Expression and Purification (1991) 2: 95-107; Hochuliら, J. Chromatography (1987) 411: 177-184; Mantovaaraら, Biotechnology and Applied Biochemistry (1989) 11: 564-570; Mantovaara ら, Biotechnology and Applied Biochemistry (1991) 13: 315-322; Mantovaaraら, Biotechnology and Applied Biochemistry (1991) 13: 120-126; Porathら, Nature (1975) 258: 598-599; Porath & Olin, Biochemistry (1983) 22: 1621-1630;およびPorath, J., Protein Purification and Expression (1992) 3:263-281も重要である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明では、水溶性金属イオンアフィニティ化合物、および、この化合物を使用した方法が提供される。本発明の化合物では、アスパラギン酸塩を主成分とする金属キレート形成性リガンドが水溶性ポリマー基材に結合されており、このリガンドが金属イオンと錯体を形成している。態様によっては、本発明の化合物は、信号生成系のメンバー、たとえば、直接または間接的に検出可能な標識部分をさらに含んでいる。本発明では、本発明の化合物が少なくとも1表面上に存在する、たとえば固定化されている、非水溶性支持体も提供される。本発明の化合物は、分析対象物の検出および分析対象物の精製を含む各種多様な用途に利用することができる。
【０００９】
定義
「アフィニティペプチド」、「高アフィニティペプチド」、「金属イオンアフィニティペプチド」という用語は、本明細書では、相互に言い換えできるように使用されており、金属イオンと結合するヒスチジンリッチなペプチドについて称するものである。
【００１０】
「目的とするタンパク質」、「融合パートナーであるポリペプチド」という用語は、本発明では相互に言い換えできるように使用されており、精製または固定化の目的でアフィニティペプチドが融合された任意のタンパク質について称するものである。
【００１１】
「融合タンパク質」という用語は、本明細書では、金属イオンアフィニティペプチドと融合パートナーポリペプチドとを含むハイブリッドタンパク質を称するものである。
【００１２】
「金属イオン」という用語は、本明細書では、アフィニティを有し、かつ融合タンパク質の精製または固定化に使用することができるアフィニティーペプチドのための任意の金属イオンを称するものである。こうした金属イオンとしては、Ni+2、Co+2、Fe+3、A1+3、Zn+2、およびCu+2が挙げられるが、これらに限定されない。「硬い金属イオン」という用語は、本明細書では、酸素への結合選好性を示す金属イオンを称する。硬い金属イオンとしては、Fe3+、Ca2+、およびAl3+が挙げられる。「軟らかい金属イオン」という用語は、本明細書では、硫黄への結合選好性を示す金属イオンを称する。軟らかい金属イオンとしては、Cu+、Hg2、およびAg+が挙げられる。「中間の金属イオン」という用語は、本明細書では、窒素、酸素、および硫黄を配位する金属イオンを称する。中間の金属イオンとしては、Cu2+、Ni2+、Zn2+、およびCo2+が挙げられる。
【００１３】
「吸着剤」または「固体支持体」という用語は、本明細書では、金属イオンを固定化するために使用されるクロマトグラフィーまたは固定化の媒介物質を称するものである。
【００１４】
具体的な態様の説明
本発明では、水溶性金属イオンアフィニティ化合物、およびその使用方法が提供される。本発明の化合物では、アスパラギン酸塩を主成分とする金属キレート形成性リガンドが水溶性ポリマー基材に結合されており、このリガンドが金属イオンと錯体を形成している。特定の態様では、本発明の化合物は、信号生成系のメンバー、たとえば、直接または間接的に検出可能な標識部分をさらに含んでいる。本発明では、本発明の化合物が少なくとも1表面上に存在する、たとえば固定化されている、非水溶性基材も提供される。本発明の化合物は、分析対象物の検出および分析対象物の精製を含む各種多様な用途に利用することができる。
【００１５】
本発明をさらに説明する前に、本発明は、本明細書に記載する特定の態様に限定されないことを理解されたい。というのも、こうした態様は、当然のこととして各種の改変が可能であるからである。また、本明細書で使用する用語類は、特定の態様を描写する目的のみにおいて使用したものであって、こうした用語類によって何かを限定する意図はない。というのも、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるものであるからである。
【００１６】
ある範囲の値について記載する場合には、文脈から明らかにそうでないと読みとれる場合以外は、その範囲の上限と下限との間に存在する、下限の単位の10分の1の各値、ならびに、その記載された範囲内の他のすべての、または範囲内に存在する値は、本発明に含まれるものであると理解されたい。これらのより狭い範囲の上限および下限は、それぞれ独立に、このより狭い範囲に含まれていてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された上限または下限以外は、これらも、本発明の範囲内である。記載した範囲が上限および下限の一方または両方を含む場合には、範囲内に含まれるこれらの上限および下限の一方または両方を含まない範囲も、本発明の範囲に含まれる。
【００１７】
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、いずれも、本発明の属する分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有するものである。本発明を実施または試験する場合には、本発明に記載した方法および材料に類似または相当する各種の方法および材料が使用可能ではあるものの、好ましい方法および材料は、以下に説明するとおりである。
【００１８】
本明細書で言及する刊行物は、いずれも、本明細書において言及することをもって、方法および／または材料を開示および記載しているものとして、本明細書に組み込むものである。
【００１９】
本明細書および添付した特許請求の範囲で使用されるように、「a」、「an」、「the」を用いて単数として記載した内容は、文脈に複数でないことを明記していなければ複数の場合も含むことに注意されたい。したがって、たとえば、「タンパク質」を単数として記載した場合には、複数のそうしたタンパク質が含まれ、また、「標識方法」を単数として記載した場合には、1種以上の標識方法および当業者に公知のその等価物が含まれ、他の場合についても同様である。
【００２０】
本明細書に記載した刊行物は、本出願の出願日より前の開示内容に関してのみ引用したものである。本発明のいかなる開示内容も、先行する発明ゆえに、こうした刊行物に先んじる資格がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。また、公表日として記載した日付が、実際に公表された日付と異なっている可能性もあるが、それらについては、別途確認を行う必要があるかもしれない。
【００２１】
本発明では、通常の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を、当技術分野の範囲内で用いる可能性がある。こうした技術は、文献にて詳細に説明されている。たとえば、下記を参照のこと。Maniatis、Fritsch、およびSambrook、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual(1982); 「DNA Cloning: A Practical Approach」IおよびII巻(D.N. Glover編、1985); 「Oligonucleotide Synthesis」(M.J. Gait編、1984); 「Nucleic Acid Hybridization」(B.D. HamesおよびS.J. Higgins編、1985); 「Transcription and Translation」(B.D. HamesおよびS.J. Higgins編、1984); 「Animal Cell Culture」(R.I. Freshney編、1986）; 「Immobilized Cells and Enzymes」(IRL Press、1986); B. Perbal、「A Practical Guide To Molecular Cloning」(1984).
【００２２】
上記発明の開示部分でも述べたように、本発明では、水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物、ならびに本発明の化合物の使用方法および本発明の化合物を含むキットを提供する。本発明をさらに説明するにあたっては、まず、本発明の化合物を詳細に説明し、次に本発明の化合物が使用されている代表的な方法についての検討ならびに本発明の化合物を含むキットについての検討を行う。
【００２３】
水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物
上記発明の開示部分でも述べたように、本発明は、水溶性金属イオンアフィニティ組成物を提供する。本発明の水溶性金属イオンアフィニティ組成物は、水溶性ポリマー基材に、アスパラギン酸塩を主成分とする金属イオンキレート形成性リガンドが結合していることを特徴とするものである。アスパラギン酸塩を主成分とする金属イオンキレート形成性リガンドとは、アスパラギン酸、たとえば、L-アスパラギン酸から合成したリガンドのことを意味する。特定の態様では、アスパラギン酸塩を主成分とする金属イオンキレート形成性リガンドは、四座配位子リガンドである。四座配位子リガンドとは、リガンドが、金属イオンの4つ以下、そして通常は4つの配位座を占有することによって金属イオンをキレート化することを意味する。たとえば、所定の金属イオンが6つの配位座を有する場合、そのうちの4つが本発明の四座配位子リガンドによって同時に占有されうるものである。
【００２４】
態様によっては、アスパラギン酸塩を主成分とする金属イオンキレート形成性リガンドは、アルキルアスパラギン酸塩リガンドであり、通常、低級アルキルアスパラギン酸塩リガンド、たとえば、1〜6、通常1〜4個の炭素原子を含むアルキルのアルキルアスパラギン酸塩リガンドであって、アルキル部分は、置換されていても、いなくてもよい。代表的なアルキルアスパラギン酸塩リガンドとして重要なものには、カルボキシメチル化アスパラギン酸塩リガンド、カルボキシエチル化アスパラギン酸リガンドなどを含むが、アルキルアスパラギン酸塩リガンドは、これらに限定されない。
【００２５】
上記発明の開示部分でも述べたように、本発明の化合物は、水溶性担体マトリックスと、必要に応じてスペーサと、金属イオン含有部分、たとえば、金属イオンを固定化する有機リガンドとを含む水溶性の金属イオンキレート形成性樹脂である。本発明の組成物は水溶性なので、組成物は水性溶媒に可溶であり、すなわち、水性溶媒中で溶液となる。
【００２６】
水溶性ポリマー基材または担体マトリックスは、水溶性で、アスパラギン酸塩を主成分とするキレート形成性リガンドと適合し、水溶性化合物が使用される用途に合致している限り、有意に異なる各種の組成および重量を有することができる。水溶性ポリマー基材または担体マトリックスとして重要なものとしては、多糖、たとえば、デキストラン、架橋デキストラン、アガロース、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミノポリスチレン；ナイロン；ポリアクリルアミドなどが含まれるが、これらに限定されない。具体的には、ポリマーマトリックス、たとえば、ポリスチレン（たとえば、マイクロタイタープレート）、ナイロン（たとえば、ナイロンフィルター）、SEPHAROSE(商標)（ファルマシア、スウェーデン、ウプサラ）などが、本発明で使用可能である。
【００２７】
本発明の所定の水溶性化合物のポリマー基材成分の分子量は、ポリマー基材が水溶性である限り多岐にわたっていてもよく、たとえば、約300ダルトン〜2,000,000ダルトン、またはそれ以上とすることができる。多くの態様で、本発明の一群の化合物のポリマー基材の平均分子量は、約10〜約100 kdの範囲、たとえば、約10〜約50 kdの範囲であり、約15〜約30 kdの範囲とすることもできるが、範囲はこれに限らない。
【００２８】
本発明の化合物では、上述の水溶性ポリマー基材成分は、上述のアスパラギン酸塩を主成分とする金属イオンキレート形成性リガンドに、必要に応じて結合基を介して結合している。本発明の化合物では、リガンドは、担体マトリックスまたは基材に、直接または結合基を介して結合させることができ、大抵は共有結合である。結合基を用いる場合には、結合基は、リガンドが結合基を介して基材と共有結合しうるように選ぶ。結合基は、基材およびリガンド部分の性質に応じて広く各種のものを用いることができる。結合基を用いる場合には、結合基は、生物学的に不活性であることが好ましい。当業者には各種の結合基が公知であり、本発明の水溶性金属イオンキレート形成性化合物には、各種の結合基を用いることができる。結合基を用いる場合には、結合基のサイズは、多くの態様で一般に少なくとも50ダルトン、大抵は少なくとも約100ダルトン、場合によっては、1000ダルトン以上とすることができるが、通常は約500ダルトンを超えることはなく、大抵は、約300ダルトンを超えることはない。こうした結合基としては、通常、基材またはリガンド部分に共有結合しうる反応性官能基で両端が終端しているスペーサ基を用いることができる。スペーサ基として重要なものとしては、脂肪族および不飽和炭化水素鎖、ヘテロ原子を含むスペーサ、たとえば酸素を含むスペーサ（エーテル、たとえばポリエチレングリコール）または窒素を含むスペーサ（ポリアミン）、ペプチド、炭化水素、必要に応じてヘテロ原子を含む環状または非環状系が挙げられる。スペーサ基は、金属が存在することによって、2つ以上のリガンドが配位して錯体が形成されるよう、金属と結合するリガンドを含むこともできる。具体的なスペーサ要素としては、1,4-ジアミノヘキサン、キシリレンジアミン、テレフタル酸、3,6-ジオキサオクタン二酸、エチレンジアミン-N,N-二酸、1,1'-エチレンビス（5-オキソ3-ピロリジンカルボン酸）、4,4'-エチレンジピペラジンが挙げられる。有用な反応性官能基としては、求核性官能基（アミン、アルコール、チオール、ヒドラジド）、求電子性官能基（アルデヒド、エステル、ビニルケトン、エポキシド、イソシアネート、マレイミド）、環化付加反応性、ジスルフィド結合形成性、または金属結合性の官能基が挙げられる。具体例としては、第一級および第二級アミン、ヒドロキサム酸、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、オキシカルボニルイミダゾール、ニトロフェニルエステル、トリフルオロエチルエステル、グリシジルエーテル、ビニルスルホン、およびマレイミドが挙げられる。本発明の分子で使用しうる具体的な結合基としては、異なった官能基を含む（heterofunctional）化合物、たとえばアジドベンゾイルヒドラジド、N-[4-(p-アジドサリチルアミノ)ブチル]3'-[2'-ピリジルジチオ]プロピオナミド、ビス-スルホスクシンイミジルスベレート、ジメチルアジピミデート、ジスクシンイミジルタートレート、N- -マレイミドブチリロキシスクシンイミドエステル、N-ヒドロキシフルホスクシンイミジル-4-アジドベンゾエート、N-スクシンイミジル[4-アジドフェニル]-1,3'-ジチオプロピオネート、N-スクシンイミジル[4-ヨードアセチル]アミノベンゾエート、グルタルア��デヒド、およびスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（SPDP）、4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（SMCC）などが挙げられる。
【００２９】
アスパラギン酸塩を主成分とするリガンドをポリマー基材に結合させるにあたっては、リガンドは、通常、許容される特性がえられるようなリガンド対残基（たとえばグルコース単位）の比で使用する。このリガンド対ポリマー残基の比は、約1〜100残基ごとに約１リガンド、たとえば、約5〜50残基ごとに約１リガンドとすることが多く、約10〜約20残基ごとに約１リガンドとすることも含まれる。
【００３０】
態様によっては、本発明の水溶性金属イオンキレート形成性組成物のアスパラギン酸塩を主成分とする金属イオンキレート形成性リガンドを、金属イオンとともに錯体形成させ、つまり、リガンドに金属イオンを充填する。すなわち、態様によっては、金属イオンを、本発明の化合物の四座の（たとえばアスパラギン酸カルボキシルメチル）リガンド成分にキレート化する。
【００３１】
本発明の化合物のリガンドは、各種の異なる金属イオンとともに錯体を形成させることができる。使用可能な金属イオンは、求核性部分との選好的反応性にもとづいて、3つのカテゴリー（硬い金属イオン、中間の金属イオン、および軟らかい金属イオン）に分けることができる。硬い金属イオンとして重要なものには、Fe3+、Ca2+およびAl3+などが挙げられるが、これらに限定されない。軟らかい金属イオンとして重要なものには、Cu+、Hg2+、Ag+などが挙げられるが、これらに限定されない。中間の金属イオンとして重要なものには、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+などが挙げられるが、これらに限定されない。態様によっては、リガンドによってキレート化する金属イオンをCo2+とする。また別の態様では、リガンドによってキレート化する金属イオンとしては、Fe3+が重要となる。金属イオンとして重要なものには、他にEu3+、La3+、Tb3+、Yb3+などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
態様によっては、水溶性金属イオンアフィニティ組成物は以下の構造を有する。
2005517152.tif 000002
式中、
Mは、金属イオン、
R1は、CM-Aspのカルボキシメチル基のメチレン炭素基をR2に連結する結合アーム、
R2は、CM-Aspの結合アームR1とともに、R3に連結する結合官能基、そして、
R3は、水溶性ポリマー基材であって、基材は、同一または非同一の構造（しかし通常は同一の構造）を有するリガンドを、1つ以上の他の残基に付加しうる。
【００３３】
多くの態様で特に重要なのは、米国特許第6,242,581号および5,962,641号ならびに第2002/0019496号として公開された米国特許出願第09/920,684号に開示されている金属イオンキレート形成性組成物を可溶としたもの、またはそれらの可溶誘導体、といった水溶性金属イオンアフィニティ組成物である。これらの特許の開示内容は、参照として本発明に組み入れられる。
【００３４】
態様によっては、（たとえば、化合物を、後述するような分析対象物の検出の用途に利用しようとする場合、）本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物は、信号生成系のメンバーを含むこともできる。信号生成系とは、検出可能な信号を生成すべく機能する1種以上の物質からなる系を意味し、化合物に含まれる信号生成系の構成部分を、本明細書では、信号生成系部分と称する。信号生成系部分は、直接的に検出可能であっても、間接的に検出可能であってもよく、すなわち、金属イオンアフィニティ組成物は、直接的に検出可能な標識を含むことも、間接的に検出可能な標識を含むこともできる。「含む」とは、この部分が、アフィニティ化合物に対して結合しており、この結合が、共有結合であっても、非共有結合であってもかまわないことを意味する。
【００３５】
直接的測定が可能な金属イオンアフィニティ組成物の標識の例としては、各種の標識、たとえば蛍光標識、アイソトープ標識、粒子状標識、などが挙げられる。適当な標識としては、たとえば、蛍光色素、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、テキサスレッド（Texas Red）、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、2',7'-ジメトキシ-4'5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、シアニン染料、たとえばCy5、Cy3、BODIPY染料、たとえばBODIPY 630/650、Alexa542などが挙げられる。適当なアイソトープ標識としては、放射能標識、たとえば32P、33P、35S、3Hが挙げられる。他の適当な標識としては、光散乱特性、蛍光特性を有する、または、取り込まれた複数のフルオロフォアを含むサイズ粒子が挙げられる。
【００３６】
間接的測定が可能な標識の例としては、基質が有色の生成物または蛍光生成物を生じるような酵素が挙げられる。たとえば、金属イオンアフィニティ組成物は、適当な基質を加えると、検出可能な生成物を信号として生じうるような酵素、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を共有結合させることによって標識することができる。使用が可能な酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコーズオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコーズ-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。こうした酵素の基質としては、発色性の基質が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、適当な基質としては、o-フェニレンジアミン（OPD）、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）、3,3'-ジアミノベンジドテトラヒドロクロリド（DAB）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
信号生成系とその標識成分は、多段系の一部を構成するものであってもよい。二段系の一例としては、アフィニティ組成物が、特異的結合対のうちの第一物質、たとえばビオチン、ハプテンなどと結合され、この第一物質が、特異的結合対の第二物質、たとえばアビジン、ストレプトアビジン、特異的抗体などに対して高度のアフィニティを有するようなシステムがある。この特異的結合対の第二物質、すなわち、結合パートナーは、直接的検出が可能または不可能であるような標識部分、たとえば、基質を色素生成性生成物に転化しうる酵素標識、蛍光標識、アイソトープ標識などに結合させることができる。したがって、酵素を金属イオンアフィニティ組成物に共有結合させるかわりに、金属アフィニティ組成物に結合させる物質を、酵素に結合させた特異的結合対の第二物質に特異的に結合する特異的結合対の第一物質とするよう改変することができ、たとえば、金属アフィニティ組成物をビオチンに共有結合し、酵素をストレプトアビジンに結合させておくことができる。
【００３８】
態様によっては、本発明の水溶性化合物は、不溶性支持体または基材、すなわち固体支持体の表面に固定化される。態様によっては、固体支持体または基材は、平坦な基材である。これらの態様では、基材を各種の材料から製造することができる。態様によっては、この材料を、可視光線および／または紫外線に対して透明であるような材料とする。態様によっては、この材料を、可撓性基材とし、可撓性材料には、変性および未変性のナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレンなどが含まれ、ナイロン膜およびその誘導体を用いることができる。態様によっては、この材料を剛固な基材とすることができ、具体的に剛固な材料として重要なものには、ガラス、プラスチック、たとえばポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびそれらの配合物など、金属、たとえば金、白金などが挙げられる。複合材料も重要であり、たとえば、ガラスまたはプラスチックをナイロン、ニトロセルロースなどの膜で覆ったものを使用することができる。
【００３９】
固体支持体として重要なものには、複数の個別の固体支持体から（すなわち、他の固体支持体に物理的に結合されていない固体支持体を複数用いて）形成された組成物も含まれる。こうした態様では、固体支持体は、ビーズとすることが多い。ビーズは、任意の形状、たとえば、球状、不規則、立方体状などとすることができる。本発明で使用するのに適したビーズは、化合物をビーズに付着させる際の化学反応において安定であるような任意の材料、たとえばラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン／ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、クロロメチルポリスチレン-1%-ジビニルベンゼン、シリカ、多孔質ガラス、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、金属酸化物、たとえばアルミナおよび酸化ニッケル、ならびに各種のクレイから形成することができるが、材料はこれらに限定されるものではない。「ポリスチレン」という用語には、アルキル置換基、たとえば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルコキシ置換基など、合成に用いる条件では反応しえない置換基である程度まで置換したポリマーが含まれる。有機溶剤中での安定性と不溶性とを増大させる目的で、ジビニルベンゼンまたはブタジエンと共重合させることによって架橋したポリスチレン樹脂も使用できる。使用に適したビーズとしては、磁気ビーズも含まれる。
【００４０】
用いることのできるビーズとしては、セルロースビーズ、多孔性ガラスビーズ、シリカゲル、ポリスチレンビーズ、特に、ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレンビーズ、グラフト共重合体ビーズ、たとえばポリエチレングリコール、ポリスチレン、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、ジメチルアクリルアミドビーズ、特に、N,N'-ビス-アクリロイルエチレンジアミンで架橋し、かつN-t-ブトキシカルボニル-bアラニル-N'-アクリロイルヘキサメチレンジアミンを含むもの、複合材料、たとえば架橋ポリスチレンのような疎水性ポリマーで被覆したガラス粒子、または線状ポリスチレンをグラフトしたフッ化エチレンポリマーなどが挙げられる。反応性官能基を共有結合させた有用な固体支持体（粒子）の総説については、Athertonら, Prospectives in Peptide Chemistry, Karger, 101-117 (1981); Amamathら, Chem. Rev., 77: 183-217 (1977); およびFridkin, The Peptides, Vol. 2, Chapter 3, Academic Press, Inc., (1979), pp. 333-363を参照されたい。
【００４１】
上記の態様では、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物は、固体支持体の表面に固定されている。化合物は、当技術分野で周知のように、共有または非共有結合によって固定することができる。態様によっては、化合物を固体支持体の表面に吸着させる。
【００４２】
製造方法
本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物は、任意の好都合なプロトコールを用いて製造することができる。多くの態様では、非水溶性の金属イオンアフィニティ組成物、たとえばゲルを生成し、その後、この非水溶性の組成物を分解して最終的な水溶性の生成物を生成する方法を用いる。この最初の非水溶性金属イオンアフィニティ組成物は、任意の好都合なプロトコールを使用することによって製造することができる。代表的なプロトコールは、米国特許第6,242,581および5,962,641号に開示されており、参照として本発明に組み入れられる。
【００４３】
この最初の非水溶性金属イオンアフィニティ組成物は、任意の好都合なプロトコールを使用することによって水溶性とすることができる。通常、水溶性とする際のプロトコールは、非水溶性組成物の重合体主鎖を切断、破壊、または分解して、最初の組成物の水溶性断片を生成する工程を含んでいる。多くの態様では、この可溶化工程で、最初の非水溶性組成物の重合体主鎖の残基間の結合を、たとえば加水分解によって切断する。結合は、任意の好都合なプロトコールを用いることによって、たとえば、化学的加水分解剤と接触させたり、主鎖を加水分解する酵素、たとえば、デキストラナーゼと接触させたりすることによって切断することができる。代表的なプロトコールについては、以下の実験例の項で記載する。結合は、たとえば、剪断などの機械的な破壊力を加えることによって機械的に切断することもできる。
【００４４】
製造した水溶性金属イオンアフィニティ化合物は、必要に応じて、各種の方法により改変することができる。たとえば、本発明の化合物を標識する際には、ジアミン結合基等を介して化合物に標識を共有結合させことを含め、化合物を標識する任意の好都合なプロトコールを使用することができる。当業者には、各種のプロトコールが直ちに明らかであろうし、代表的なプロトコールについては、以下に記載する。
【００４５】
用途
本発明の水溶性金属イオンアフィニティ組成物は、各種の用途に使用することができる。こうした用途には、精製と、分析対象物の検出とが挙げられる。これらの各用途について、以下に詳細に説明する。
【００４６】
精製への利用
本発明の水溶性金属イオンアフィニティ組成物を利用することのできる用途の一つが、精製である。具体的には、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物は、キレート化した金属イオン、たとえば、2+の酸化状態で配位数が6のキレート化金属イオンに対してアフィニティを有するような分析対象物を精製する際に利用することができる。精製という用語は、分析対象物（すなわち標的分子）を、その分析対象物の当初の環境から、たとえば、その分析対象物が存在している試料から分離するような、より具体的には、その分析対象物の当初の環境の分析対象物以外の成分から分離するような任意の用途について広く言及するべく使用するものである。本発明の精製の用途で用いるプロトコールには、一般に、目的とする分析対象物を含む流体試料と、水溶性金属イオンアフィニティ化合物との接触を、キレート化金属イオンに対してアフィニティを有するすべての分析対象物が水溶性金属イオンアフィニティ化合物の金属イオン成分に結合しうるような条件下で行う工程が含まれるものである。すなわち、金属イオンアフィニティ組成物と試料との混合は、生成混合物内で分析対象物と水溶性化合物との間に錯体が十分形成しうる条件で実施する。水溶性金属イオンアフィニティ組成物は、溶液中で遊離な状態で存在させておいてもよいし、上述したような不溶性支持体、たとえばビーズ、プレート、マイクロタイタープレートのウェルなどに結合させておいてもよい。
【００４７】
この最初の工程に引き続き、生じたすべての錯体を、出発試料の残りの部分から分離する。この分離は、各種の方法、たとえば、二相分離のプロトコール、重量を利用した分離、たとえば遠心分離のようなプロトコール、電気泳動のプロトコールなど、クロマトグラフィーのプロトコールなどによって実施することができる。
【００４８】
本発明の方法で精製することのできる分析対象物としては、リン酸化化合物と、金属イオンに対してアフィニティを有するペプチドのタグを付した化合物の双方が挙げられる。多くの態様では、標的分析対象物は、金属イオンに対してアフィニティを有するタグを含んでおり、たとえば、分析対象物は、金属イオンアフィニティタグのドメインを有する融合タンパク質であって、その特定の金属イオンアフィニティタグが、1つ以上のヒスチジン残基を有するタグを含むような融合タンパク質、たとえば、ポリhis含有アフィニティペプチドである。代表的な金属イオンアフィニティペプチドとしては、米国特許第4,569,794号および米国特許第5,594,115号、ならびに係属中の米国特許出願第09/858,332号に記載されたものが挙げられる。これらの特許ならびに特許出願は、参照として本発明に組み入れられる。
【００４９】
態様によっては、アフィニティペプチド部分は、一般配列：(XHYZ)n（式中のXおよびYは、ヒスチジン以外の任意のアミノ酸、Zは、任意のアミノ酸、そしてnは、2以上である）で表されるヒスチジンリッチなポリペプチド配列である。別の態様では、アフィニティペプチドは、式：(His-X1-X2)n1-(His-X3-X4-X5)n2-(His-X6)n3（式中のX1およびX2は、それぞれ独立に、脂肪族またはアミド側鎖を有するアミノ酸、X3、X4、X5は、それぞれ独立に、塩基性または酸性の側鎖を有するアミノ酸、各X6は、脂肪族またはアミド側鎖を有するアミノ酸、n1およびn2は、それぞれ独立に、1〜3、そしてn3は、1〜5である）のペプチドである。態様によっては、アフィニティペプチドは、アミノ酸配列：NH2-His-Leu-Ile-His-Asn-Val-His-Lys-Glu-Glu-His-Ala-His-Ala-His-Asn-COOHを有している。また、態様によっては、アフィニティペプチドは、式：(His-Asn)n（式中のnは、3〜10である）を有している。具体的態様の一つでは、nは6である。態様によっては、アフィニティペプチドは、式：(His-X1-X2)n（式中のX1およびX2は、それぞれ、酸性の側鎖を有するアミノ酸、そしてnは、3〜10である）を有している。一態様では、アフィニティペプチドは、配列：(His-Asp-Asp)6を有している。別の態様では、アフィニティペプチドは、配列：(His-Glu-Glu)6を有している。さらに別の態様では、アフィニティペプチドは、配列：(His-Asp-Glu)6を有している。これらのアフィニティペプチドおよび、分析対象物、たとえばアフィニティペプチドのタグを付された融合タンパク質の製造方法については、米国特許出願第09/858,332号の「金属イオンアフィニティタグおよびその使用方法（Metal Ion Affinity Tags And Methods Of Thereof）」（2001年5月15日に出願）にさらに記載されており、この開示内容は、参照として本発明に組み入れられるものである。
【００５０】
態様によっては、錯体を、出発試料の錯体以外の部分から分離した後に、分析対象物を、水溶性金属イオンアフィニティ成分から分離する。分析対象物の金属イオンアフィニティ成分からの分離は、任意の好都合なプロトコールを使用することによって行うことができ、適当なプロトコールは、環境条件、たとえば塩濃度などを変化させて分析対象物をキレート化金属イオンから解離させる工程を含む。解離を生じさせることのできる適当な条件については、当業者、特に、IMAC技術についての知識、より具体的にはIMAC樹脂からの結合タンパク質の溶出についての知識を有する当業者であれば承知しているはずである。解離を生じさせる際に用いることのできる代表的なプロトコールについては、参照により本明細書に組み込まれる上記の特許を参照されたい。
【００５１】
本発明の水溶性金属イオンアフィニティ組成物を使用することのできる代表的な精製用途の具体例としては、（1）二相分離プロトコールによる精製、たとえば、リン酸化タンパク質、ポリヒスチジンなどの金属イオンアフィニティペプチドの精製、（2）ガラス、プラスチック、磁気支持体などの固体支持体の表面を本発明の水溶性化合物で被覆して、本発明の水溶性化合物に対してアフィニティを有するポリヒスチジンのような分析対象物、またはリン酸化タンパク質の精製を行う固体支持体ベースの精製、が挙げられる。
【００５２】
代表的な二相分離のプロトコールでは、2種の水溶液相、すなわち、非混和性である等の理由で、静置すると互いに分離する2種の液体から構成される系であって、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物の分配係数が1ではない系を使用する。たとえば、塩類バッファー液とポリエチレングリコール液から構成された二相系を用いることができ、この系では、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物の塩類溶液とポリエチレングリコールとの間の分配係数が1ではなく、これは、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物がポリエチレングリコール相の方を好み、したがって、平衡状態に達した後は、塩類バッファー相よりポリエチレングリコール相の方に高濃度で存在するからである。こうした系の使用にあたっては、精製する分析対象物を含む試料と、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物を二相系に加えてから、十分に混合または撹拌する。その後、得られた混合物を、非混和相が互いに分離するのに十分な時間静置する。その後、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物が好んだ相（または、水溶性金属イオンアフィニティ化合物および水溶性金属イオンアフィニティ化合物に錯化した分析対象物を高濃度で含有する、上記相の少なくとも一部、たとえば、二相系の界面部分）を、系の残りの部分から分離し、精製対象である分析対象物を、分離した相またはその一部から集める。分析対象物は、上述のようにして、分析対象物が錯体を形成している水溶性金属イオンアフィニティ化合物から分離することによって、さらに単離することもできる。以上のプロトコールを1回以上反復して、所望純度の分析対象物の調製物を得ることができる。
【００５３】
別の態様では、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ錯体を固体支持体に固定して、試料から1種以上の分析対象物を精製するための固体支持体結合アフィニティ物質として使用する。こうした態様では、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物を表面に固定化した固体支持体を試料と接触させて、金属イオンアフィニティ化合物に対してアフィニティを有するすべての分析対象物を、表面に固定された金属イオンアフィニティ化合物に結合させる。こうして得られた、固体支持体に結合した錯体を、その後、混合物の残りの部分から分離して、精製した分析対象物を得る。この精製した分析対象物は、上述したように、さらに、固体支持体固定化水溶性金属イオンアフィニティ化合物から分離することができる。
【００５４】
分析対象物質の検出への利用
本発明では、試料中の分析対象物の有無を検出する分析対象物検出の用途も提供される。分析対象物は、通常、キレート化金属イオン、たとえば、上述したような、酸化状態が2+で配位数が6であるような金属イオンに対するアフィニティを有する分析対象物である。代表的な分析対象物としては、金属イオンアフィニティペプチド、たとえば、上述したようなポリhisを含むペプチドのタグを付した融合タンパク質、リン酸化タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
分析対象物検出の用途では、標的分析対象物を含有している可能性のある試料、すなわち、スクリーニングまたはアッセイに供する試料を、本発明の方法にしたがって、水溶性金属イオンアフィニティ化合物と接触させ、その際には、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物は、通常、上述した信号生成系の要素を含んでいる。水溶性金属イオンアフィニティ化合物と検査対象試料との接触は、飼料中、水溶性金属イオンアフィニティ化合物と、この水溶性金属イオンアフィニティ化合物に対して結合アフィニティを有する分析対象物との間に錯体が十分に生成するような条件で実施する。すなわち、接触は、互いに結合アフィニティを有する分析対象物と水溶性金属イオンアフィニティ化合物とが結合しうるように時間および温度を設定して行う。当業者であれば、適当な温度および接触時間をたやすく決定するはずである。
【００５６】
接触の後、得られた接触済み混合物を、分析対象物と水溶性金属イオンアフィニティ化合物とで形成される結合錯体の有無についてスクリーニングする。すなわち、接触済み試料混合物中の分析対象物／水溶性金属イオンアフィニティ化合物錯体の有無を測定する。目的の結合錯体は、任意の好都合なプロトコールを用いて検出することができ、こうしたプロトコールの例としては、分光光度法、蛍光定量法、目視による方法などが挙げられるが、これらに限定されない。態様によっては、接触済み混合物に特定の物質を加えて、検出を可能とする。たとえば、酵素標識を用いる場合には、酵素を、適当な基質、好ましくは発色性の基質と反応させ、分光光度法、蛍光定量法、目視による方法などによって検出が可能な化学物質部分が生成されるような様式にして用いる。
【００５７】
態様によっては、上記のような検出工程を分離工程の後に行い、この場合、まず、目的とする結合錯体を、非結合水溶性金属イオンアフィニティ化合物も含む接触済み混合物の残りの部分から分離しておく。その際には、任意の好都合な分離プロトコールを使用してもよい。代表的な分離プロトコールは、上述のプロトコールである。
【００５８】
最終工程は、検出可能なかたちで標識しておいた金属イオンアフィニティ/分析対象物錯体から生じた検出信号を、検定を行った流体試料中の対応する分析対象物の存在と関連づける工程である。検出した信号は、検定を行った試料中に目的とする分析対象物が存在しているかどうかを定量的に判断する際に使用することができる。検出した信号は、また、検定を行った試料中に目的とする分析対象物が存在しているかどうかを定性的に判断する際にも使用することができる。定量的判断は、通常、検出信号のパラメータ、たとえば強度を、標準値（たとえば、既知量の標識から発生する信号の強度）と比較することによって実施する。
【００５９】
このように、上記の方法は、流体試料中に1種以上の分析対象物が存在するか否かを、定量的または定性的に検出する際に使用することができる。
【００６０】
本発明の水溶性金属イオンアフィニティ組成物を利用することのできる具体的な分析対象物の検出事例としては、（1）固定化金属イオンに対してアフィニティを有する分析対象物、たとえば、リン酸化タンパク質、金属イオンアフィニティペプチドのタグを付したタンパク質などのホモジニアスな（たとえば、液相の）用途およびヘテロジニアスな（たとえば、アレイのような固相の）用途での検出;（2）タンパク質-タンパク質相互作用の検出（たとえば、リン酸化タンパク質またはポリヒスチジンのタグを付したタンパク質をベイトとして用いた検出）;（3）増幅反応、などがある。
【００６１】
ホモジニアス検出の用途では、水溶性金属イオンアフィニティ化合物および検出する分析対象物は、双方とも、この双方を接触させて結合錯体を生成させる際に溶液相中に存在している。その後、溶液相で生成した結合錯体の検出を、任意の好都合なプロトコールを用いて行い、たとえば、得られた錯体を、（たとえば、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物に対してアフィニティを有する樹脂を使用して）出発混合物の残りの部分から分離することによって、また、水溶性金属イオンアフィニティ化合物が分析対象物と錯体を形成しているか否かに応じて異なった信号を生じるような信号生成系を用いることによって検出を行う。
【００６２】
ヘテロジニアス検出の用途では、水溶性金属イオンアフィニティ化合物および検出する分析対象物のうちの一方が、固体支持体に固定化されている。すなわち、水溶性金属イオンアフィニティ化合物と検出する分析対象物のうちの一方が固体支持体に固定されており、接触過程の間に、他方が、固体支持体に固定化された成分を介して固体支持体に固定化される。たとえば、ヘテロジニアス検出の特定の用途では、目的とする分析対象物を固体支持体表面に固定しておく。また別の態様では、水溶性金属イオンアフィニティ化合物を固体支持体表面に固定しておく。
【００６３】
重要な用途の一つでは、本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物を、米国特許第6,197,599号に記載されているアレイと類似のアレイを利用したタンパク質-タンパク質相互作用の用途に使用する。この特許の開示内容は、参照として本発明に組み入れられる。たとえば、こうした用途では、上述したような水溶性金属イオンアフィニティ化合物でコーティングした平坦な支持体を使用することができる。この平坦な支持体上に、組み替えによって生成した金属イオンアフィニティタグを付した融合タンパク質を堆積させて、空間的にアドレスを付与することのできるタグ付き融合タンパク質のアレイを製造する。次に、得られたアレイを、第二標識タンパク質群と接触させ、第一群と第二群間に生じたすべての表面結合錯体を検出すれば、タンパク質-タンパク質相互作用を容易に識別することができる。識別されたタンパク質-タンパク質相互作用における、タンパク質の性質についてのそれ以上の情報は、たとえば、得られたアレイを、リン酸化タンパク質のような特定の種類のタンパク質と錯体を形成する金属イオンを付加した第二群の溶液相水溶性金属イオンアフィニティ化合物と接触させることによって得ることができる。当業者であれば、上記に示した典型的なスキームをもとに、加えることのできる各種の変更が容易に想起されるでろうし、そうした変更態様も、特許請求の範囲に記載した分析対象物の検出という用途の広義の範囲に含まれるものである。
【００６４】
上記用途の特定の態様では、本発明の金属イオンアフィニティリガンド化合物と錯体を形成させるタンパク質を、金属イオンアフィニティリガンドに対して共有結合させることが望ましい。こうした錯体での2つのメンバー間の共有結合を形成するうえで好都合なプロトコールの一例は、金属イオンアフィニティ化合物の水溶性ポリマー成分上に存在するヒドロキシル部分を酸化させておいてから、得られた酸化部分、たとえば、-CHO部分を、さらに、錯体を形成させるタンパク質上に存在する第一級アミンに共有結合させるものである。たとえば、一群のタグ付きタンパク質が、金属イオンアフィニティ化合物でコーティングした基材の表面に固定化されている、6xHisおよびポリヒスチジンのタグ付きタンパク質のアレイは、固体表面上のキレート化したポリマーを酸化させ、（Hisタグを付したタンパク質の大半で、タグに近接している）ポリペプチドN末端のNH2基との間でシッフ結合を形成させ、この結合を、その後、還元剤を用いて単共有結合に還元することによって共有結合させることができる。こうしたプロトコールは、ペプチドアレイを合成する際に、プローブペプチドが固体支持体表面に共有結合していることが望ましい場合に使用することができる。
【００６５】
本発明の水溶性金属イオンアフィニティ物質は、本発明の物質が増幅信号生成系のメンバーであって、通常は、1種以上の別の物質、たとえば、（直接的および間接的に検出可能な標識の双方をはじめとする）金属イオンアフィニティ物質のタグを付された標識も含むような信号増幅反応にも利用することができる。増幅の用途の代表的な例としては、下記の実験例の項に詳述するものを含む。こうした増幅としては、アレイを利用した用途で得られた信号の増幅、ゲルを利用した用途（たとえば、SDSゲルを利用した用途）で得られた信号の増幅などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
キットと装置
先にも述べたように、本発明では、本発明の方法を実施する際に使用するキットおよび装置も提供する。キットおよび装置は、少なくとも、上述した本発明の水溶性金属イオンアフィニティ化合物を含むものである。キットおよび装置は、本発明の方法で有用な各種の構成要素を、必要に応じて含むことができる。必要に応じて含むことのできる構成要素の例としては、信号生成系またはその成分、たとえば、発色性の基質などがある。本発明のキットの多くの態様で、キットは、本発明の方法を実施するための説明書または、説明書を入手するための手段（たとえば、使用者が、説明書を提供しているウェブページにたどり着けるようにするためのウェブサイトのURL）をさらに含んでおり、こうした説明書は、通常、基体、たとえばパッケージ挿入物、パッケージ、物質の容器などの1種以上に印刷されている。本発明のキットでは、1つ以上の構成要素が、同じまたは異なる容器に、好都合なように、または所望に応じて収納されている。
【００６７】
以下の実施例は、本発明を例示するために示すものであって、本発明は、これらの実施例によって限定されない。
【００６８】
実験例
I.  水溶性CM-Asp-デキストラン誘導体（タロン（TALON）デキストラン）の調製プロトコール
A.  5gのセファデックス（Sephadex）G-150 SF（シグマ（Sigma）G-150-50）を、ミリQ（Milli Q）水中で24時間膨潤させる。膨潤容積は、〜100mLとなる。250〜300mLのミリQ水を使用する。
【００６９】
B.  タロン-セファデックスG150
1.  セファデックスG-150のエポキシ活性化
膨潤させたビーズから、余分な水を真空濾過によって除去する。100gの吸引乾燥セファデックスG-200を、100mLの2M NaOH、5mlのエピクロロヒドリン、190mgのNaBH4、および100mLのミリQ水の入った1L三角フラスコに移す。混合物を、室温にて振盪装置にかける。４時間後に、新鮮な20mLのエピクロロヒドリンを混合物に加え、合計で20時間反応させる。
【００７０】
2.  アスパラギン酸の結合
エポキシ活性化したセファデックスを、流出液のpHが8となるのが検出されるまで、ミリQ水で十分洗浄する。次に、ゲル（100g）を、125mLのNa2CO3とともに、2L三角フラスコに移す。10gのアスパラギン酸を含む250mLの1.0M Na2CO3（0.2M NaOHを用いてpHを >12に調整）を加え、16時間にわたって結合を進行させる。pH=8となるまで、ゲルをミリQ水で洗浄する。
【００７１】
3.  カルボキシメチル化
Asp-セファデックスG-150をカルボキシメチル化する。アスパラ銀酸塩-セファデックスを、1 x 700mLの10% Na2CO3で洗浄する。吸引乾燥する。250mlフラスコ中で、11.25gのNaOHを、150mLのH2Oに、機械的に撹拌しながら溶解する。溶液の上部を覆い、冷蔵庫に入れて一晩冷やす。NaOH溶液を冷蔵庫から取り出し、氷浴に入れる。37.5 gのブロモ酢酸（MW 139）を、7.5gずつ、撹拌しながら加える。この添加の間は、溶液の温度を監視し、温度が、添加終了の時点で30℃を超えることのないようにする。pHが <7である場合は、NaOHのペレットを、1度に0.5gずつ加え、溶液のpHが >7となるまで、温度が30℃を超えないようにする。8.25gのNa2CO3 （MW 106）を、撹拌しながら注意深く加え、氷浴を取り去ると、溶液の温度が上昇するのにつれて、Na2CO3が完全に溶液に溶解する。標準化したpHメーターを使用して、pHを、濃HClまたは濃NaOHで10.0〜10.1の範囲に調整する。機械的撹拌装置を装着した10ガロンのバケツを用意する。洗浄して吸引乾燥しておいた樹脂を、フラスコに移す。ブロモ酢酸溶液をフラスコに移し、周囲温度で少なくとも43時間撹拌する。樹脂を濾過によって集める。6 x 100mLのミリQ水、1 x 700mLの10%酢酸、そして18 x 100mLのミリQ水で、十分に洗浄する。最初の二回分の洗浄水は、水性廃棄物の容器に廃棄すること。最後のミリQ水による洗浄工程では、（ミリQ水のpH <6でない限りは）リトマスでpHが6となるまで水洗を続ける必要がある（ミリQ水のpHが <6の場合には、濾液のpHが水のpHと等しくなるまで洗浄を続けるべきである。）。吸引乾燥する。
【００７２】
4.  金属イオン含量
2gの最終的に得られた膨潤タロン-セファデックスG-150を、10mLの50mM CuSO4のミリQ水溶液で充填し、ミリQ水で複数回洗浄し、前もって秤量しておいたチューブ内で減圧乾燥する（濃縮の間は、40℃より高い温度を使用しないこと）。当初の重量を、チューブの最終重量から引いて、セファデックスの量を決定する。金属イオン含量を、旧来のタロン法（EDTA抽出）にしたがって測定し、1mgの乾燥セファデックスG-150あたりのCu量（μmol）で報告する。（金属イオン含量の目標値は、Cu 1μmol/セファデックスG-150 3.6mgまたはそれ以上である）。
【００７３】
C.  タロン-セファデックスG-150（タロン-デキストラン）の加水分解
95gのタロン-セファデックスG-150を、500mLの0.2M リン酸Na（pH 6.0）ともに、2L三角フラスコに移す。混合物の合計容積を、ミリQ水を用いて1600mLに調整する。1mLの試料を取り出す。10mLの1.1mg/mLデキストラナーゼ（Dextranase、〜0.78U）（シグマ、D-5884）を加え、混合物を、回転振盪機（設定、5.5）にかけておく。24時間にわたって加水分解させた後、反応混合物を、5000xgで遠心する。遠心後、上清を新しい清浄な容器に移す。次に、タロン-デキストラン溶液を、100℃で30分間インキュベートし、再度遠心する。遠心後、上清を新しい清浄な容器に移す。上記プロトコールによって、水溶性タロン化合物が生成する。
【００７４】
II.  水溶性タロン化合物の修飾
A.  水溶性タロン化合物の酸化
31mgの上記乾燥水溶性タロン化合物を、0.5mLの800mMクエン酸ナトリウム（pH4.0）と10mgのNaIO4を含有する脱イオン水2mLに溶解する。3時間にわたって酸化させる。
【００７５】
B.  酸化水溶性タロンのNH2-C2H4-NH2を用いた修飾
次に、得られた酸化水溶性タロンから、20mMリン酸Naと0.15M NaCl（pH7.5）で平衡化しておいたPD-10カラムでのSECによって、過剰なNaIO4を除去する。次に、酸化デキストランを含む溶出液を、6mgのNH2-C2H4-NH2（MW=60.10（0.1mM））の入ったチューブに集める。室温でゆっくり撹拌しながら、１時間、シッフ結合を形成させる。不飽和シッフ結合を、5mgのNaBH4を加えることによって還元する。室温に１時間置いた後、試料を一晩脱イオン水に対して透析して、過剰なNH2-C2H4-NH2を取り除く。
【００７６】
同様の修飾は、NH2-PEG-NH2または類似化合物を使用することによっても行うことができ、こうした修飾は、水溶性タロン生成物に、検出が可能な標識を付すような（たとえば、導入した一級アミンの部分に対する共有結合によって標識を付すような）標識プロトコールで有用である。
【００７７】
C.  HRP-N-TALON複合体の調製
9mgの西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）（ベーリンガーマンハイム（Boerhinger Mannheim）、108090）を、2.5mLのリン酸バッファー（100mMのリン酸ナトリウム、pH7.2）に溶解する。10μlのグルタルアルデヒド（50%グルタルアルデヒド（写真等級））を加え、得られた混合物を室温で１時間インキュベートする。次に、インキュベートした生成物を、PD10カラムで、リン酸バッファーに対して脱塩する。次に、１ mLの活性化したHRPを、それぞれ5、10、および20μlの0.5Mの水溶性タロン（それぞれ2.5、5、および10μm）の入った3本のチューブに加える。別のチューブに、0.5mLを、20μのエタノールアミンとともに加えておく。次に、混合物を、室温で4時間インキュベートする。得られた4変種を、2mMのMOPS（pH7.5）1Lに対して、4℃で1時間透析し、その後、新鮮な同じバッファー1Lに対して、4℃で一晩透析する。次に、得られた各変種を、再度、1mMのCoCl2・7H2Oの2mM MOPS溶液（pH7.5）に対して、3時間透析する。次に、得られた変種を、1Lの2mM MOPS（pH7.5）に対して、4℃にて2時間透析し、その後新鮮な同じバッファー1Lに対して、4℃で一晩透析する。
【００７８】
III.  水溶性タロン化合物の代表的な用途
A.  スライドガラス上に印刷しておいたポリヒスチジンタンパク質の、HRP-TALON複合体による検出
【００７９】
HAT-GFPuv-EK（HATタグを付した緑色蛍光タンパク質）の一連の希釈液を国際公開公報第02/25288号に公開されているプロトコールを使用して、PIDTCスライドガラス上に印刷した。得られたスライドガラスを、BLOTTOで1時間にわたってブロッキングし、2 x 300μlのTST バッファーで洗浄し、3 x 300μlの50mMリン酸ナトリウム、0.25M NaCl、0.05%トウィーン20（pH7.0）で洗浄した。
【００８０】
3μlの上記HRP-タロンを、スライドガラス上の新鮮な300μlの50mMリン酸ナトリウム、0.25M NaCl、0.05%トウィーン20（pH7.0）に加える。スライドガラスを約15°の角度に注意深く逆さ向きにして、フレームから溶液が漏れないようにしつつHRP-タロン複合体を混合する。１時間後、未結合のHRP-タロンを5 x 300μlの50mMリン酸ナトリウム、0.24M NaCl、0.05%トウィーン20（pH7.0）で洗浄する。300μlのTMB基体を加え、呈色反応を進行させる。
【００８１】
B.  リン酸化の検出
1.  金属イオンアフィニティ（Metal Ion Affinity, MIA）物質の調製
水溶性タロン-デキストラン（上記にしたがって調製）を、NaIO4で酸化し、NH2-PEG-NH2を結合することによって、アミノ修飾する。第一級アミンを、ビオチン（ビオチン-NHSエステル）の結合に使用する。ビオチン-タロン-デキストランにFe(III)を充填し、過剰のFe(III)を透析によって除去する。
【００８２】
2.  アレイ上でのリン酸化の検出への利用
a.  タンパク質抽出物を、Cy5染料で標識する。抽出物を、抗体アレイとともにインキュベートする。結合しなかったタンパク質を洗浄除去する。抗原を結合させたアレイとともに、Fe(III)-タロン-ビオチン-デキストランをインキュベートする。結合しなかったFe(III)-タロン-ビオチン-デキストランを洗浄除去する。Cy3-ストレプトアビジンを、抗原/Fe(III)タロン-ビオチン-デキストランとともにインキュベートする。結合しなかったCy3-ストレプトアビジンを洗浄除去する。スライドガラスを、適当なスキャナーで走査する。Cy5およびCy3の信号の比は、アレイに結合した任意の特定抗原についてのリン酸化レベルの相対測定値となる。2種の試料の相対的リン酸化レベルの判定は、2種の試料を適用した2種の別々のアレイのスポットでの内的なCy5/Cy3の比を比較することによって行うことができる。このプロトコールを使用して、Jurkat株化細胞およびHeLa株化細胞を検定し、リン酸化レベルの相対的な差を検出した。金属イオンアフィニティ物質の抗原への結合は、金属イオンアフィニティ物質がリン酸塩またはEDTAによってスポットから除去されることによって、特異的であることが示された。
【００８３】
b.  酵素活性の複合検出
リン酸化されていないタンパク質を、アレイフォーマットに固定化する。アレイを、リン酸化活性を有する酵素を含むタンパク質抽出物とともにインキュベートする。タンパク質抽出物を洗浄除去する。Fe(III)-タロン-ビオチン-デキストランを、結合抗原のアレイとともにインキュベートする。結合しなかったFe(III)-タロン-ビオチン-デキストランを洗浄除去する。Cy3-ストレプトアビジンを、抗原/Fe(III)-タロン-ビオチン-デキストランとともにインキュベートする。結合しなかったCy3-ストレプトアビジンを洗浄除去する。スライドガラスを走査し、リン酸化酵素のプロファイルを得る。2種の異なる試料のプロファイルを比較することができる。この方法は、（たとえばCy5で標識した）基質タンパク質の一次バインダーとして抗体アレイを用い、その後ホスファターゼを用いて脱リン酸化し、上記各工程を繰り返すことによって、実施することができる。
【００８４】
3.  可溶性タロン-デキストランの信号増幅への利用
A.  試料をビオチン標識する。ビオチン標識試料を抗体アレイに適用する。吸着しなかった材料を、洗浄除去する。ストレプトアビジン（SA）を、アレイとともにインキュベートする。結合しなかったSAを洗浄除去する。Co(II)-タロン-ビオチン-デキストランを、抗体アレイとともにインキュベートする。結合しなかった金属イオンアフィニティ物質を洗浄除去する。6 x His-タンパク質-6 x His-Cy3複合体をアレイとともにインキュベートする。結合しなかったタンパク質を洗浄除去する。最後の4工程を複数回繰り返して、増幅信号を得ることができる。
【００８５】
B.  上述の信号増幅方法の変形例では、Hisタグを二重に付し、標識したタンパク質の複数の層をタロン-デキストランとともに使用するかわりに、蛍光または化学発光した基質を生じる任意の6 x Hisでタグを付した酵素を使用することができる。
【００８６】
代表的なプロコールの一例は、以下のとおりである。
1.  生体試料を、ビオチンで標識する。
2.  試料をアレイ（またはSDSゲル）に適用する。
3.  吸着しなかった材料を洗浄する（または、タンパク質のバンドを膜に移し、膜をブロッキングする）。
4.  ストレプトアビジン（SA）/ビオチン-デキストラン-タロン、またはSA-デキストラン-タロンを適用する。
5.  過剰なタロンを洗浄する。
6.  任意の6 x Hisでタグを付した酵素（または、ポリヒスチジンで化学的に修飾した糖タンパク酵素）を適用する。
7.  過剰な酵素を洗浄する。
8.  酵素の基質を適用する。
9.  転化されなかった基質を洗浄除去する。
10.  信号を読みとる。
【００８７】
以上の議論および結果から明らかなように、本発明は、選択性の増した新規なタンパク質の選択的精製の用途、新規な分析対象物質検出の用途を含む各種の異なった用途に利用しうる重要な新しいタイプの金属イオンアフィニティ物質を提供するものである。このように、本発明は、当技術分野において有意な貢献をなすもである。
【００８８】
以上では、本発明を特定の態様に言及しつつ説明してきたが、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、各種の変更を加えたり等価物で置き換えることが可能なはずである。また、特定の状況、材料、物質の組成、方法、方法の各工程を本発明の目的、精神、範囲に適合させるべく、数多くの変更を加えることもできるはずである。こうした変更は、いずれも、本発明に添付の特許請求の範囲の範囲内であると考える。
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月3日(2004.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸塩を主成分とし水溶性ポリマー基材に結合した金属キレート形成性リガンドである、金属イオンと錯体を形成する該リガンドを含有する、水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項２】
水溶性ポリマー基材が多糖である、請求項1記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項３】
多糖がアガロースおよびデキストランから選択される、請求項2記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項４】
金属イオンがCo2+である、請求項1〜3のいずれか一項記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項５】
硬い金属イオンがFe3+である、請求項1〜3のいずれか一項記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項６】
アスパラギン酸塩を主成分とするリガンドが四座配位子リガンドである、請求項1〜5のいずれか一項記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項７】
信号生成系のメンバーをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項記載の化合物が表面上に存在する、不溶性基材。
【請求項９】
キレート化した金属イオンに対してアフィニティを有する分析対象物が、試料中に存在するか否かを判定する方法であって、
（a）試料を請求項1〜7のいずれか一項記載の水溶性金属イオンアフィニティ化合物と接触させて、接触済み混合物を生成する段階と、
（b）分析対象物と水溶性金属イオンアフィニティ化合物の錯体が存在するか否かについて該接触済み混合物をスクリーニングする段階とを含む、分析対象物が試料中に存在するか否かについて判定する方法。
【請求項１０】
キレート化した金属イオンに対してアフィニティを有する分析対象物を、試料中の他の成分から分離する方法であって、
（a）試料を請求項1〜7のいずれか一項記載の水溶性金属イオンアフィニティ化合物と接触させて、接触済み混合物を生成する段階と、
（b）分析対象物と水溶性金属イオンアフィニティ化合物の錯体を、接触済み混合物の他の成分から分離して、分析対象物を試料中の他の成分から分離する段階を含む方法。
【請求項１１】
（a）請求項1〜7のいずれか一項記載の水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物と、
（b）該水溶性ポリマー金属イオンアフィニティ化合物を請求項9または10記載の方法に従って使用するための説明書とを含むキット。
【国際調査報告】
2005517152.tif 000004
2005517152.tif 000005