(57)【要約】Ｗｎｔシグナル伝達に関与する新規タンパク質および対応するＤＮＡを教示する。このタンパク質の発現を標的化する抗体、アンチセンス、およびリボザイムもまた、提供する。このタンパク質の発現を検出および調節する工程を包含する治療方法および検出方法が、さらに提供される。より詳細には、本発明は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質（Ｄｓｈ）に関連し、Ｗｎｔシグナル伝達に関係する新規のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号７に記載の少なくともアミノ酸２〜４６０をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸１〜４６０をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７を有するヒトＮｋｄポリペプチドの少なくともアミノ酸２〜４６０をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド相補体；あるいは
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一なポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、
単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号７の少なくともアミノ酸２〜４６０をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号７のアミノ酸１〜４６０をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号５のコード領域を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
配列番号５のコード領域の少なくとも５０個連続するヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号５のコード領域の少なくとも２００個連続するヌクレオチドを含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号５のコード領域の少なくとも５００個連続するヌクレオチドを含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号５のコード領域の少なくとも７５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
配列番号５のコード領域を構成する１４１６ヌクレオチドを含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号５のコード領域に少なくとも９０％同一な核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号のコード領域に少なくとも９５％同一な核酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号５のコード領域によってコードされるタンパク質に少なくとも９５％同一なポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１３】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、以下：
（ａ）配列番号７のアミノ酸２〜４６０；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸１〜４６０；
（ｃ）配列番号７の非ヒト霊長類ホモログのアミノ酸２〜４６０；
（ｄ）配列番号７の非ヒト霊長類ホモログのアミノ酸１〜４６０、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
単離された核酸分子。
【請求項１４】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組み換えベクター。
【請求項１５】
プロモーターに作動可能に連結された請求項５に記載の単離された核酸分子を含む、組み換えベクター。
【請求項１６】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１２に記載の単離された核酸分子を含む、組み換えベクター。
【請求項１７】
請求項１４に記載の組み換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１５に記載の組み換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１６に記載の組み換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２０】
ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、該ポリペプチドが発現する条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２１】
ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、該ポリペプチドが発現する条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２２】
ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、該ポリペプチドが発現する条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２３】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号７のアミノ酸１〜４６０；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸２〜４６０；
（ｃ）配列番号７を有するポリペプチドの非ヒト霊長類ホモログまたは該ホモログの少なくとも４６０個連続するアミノ酸を含む該ホモログの一部、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも９５％同一なアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、以下：
（ａ）配列番号７のアミノ酸１〜４６０；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸２〜４６０；
（ｃ）配列番号７に対応するポリペプチドの非ヒト霊長類ホモログまたは該ホモログの少なくとも４６０個連続するアミノ酸を含む該ホモログの一部、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、
単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号７のアミノ酸１〜４６０；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸２〜４６０；
（ｃ）配列番号７を有するポリペプチドの全長非ヒト霊長類ホモログまたは該ホモログの少なくとも４６０個連続するアミノ酸を含む該ホモログの一部、
からなる群から選択されるアミノ酸を含む、
単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
ｈＮｋｄに特異的に結合するが、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄに特異的に結合しない抗体の産生を誘発する、配列番号７のポリペプチドのフラグメント。
【請求項２７】
配列番号７の少なくとも５０個連続するアミノ酸を含む、請求項２６に記載のフラグメント。
【請求項２８】
配列番号７のヒトＮｋｄポリペプチドまたはその非ヒト霊長類ホモログに特異的に結合するが、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄに認められ得る程度に結合しない、単離された抗体。
【請求項２９】
モノクローナル抗体である、請求項２８に記載の単離された抗体。
【請求項３０】
ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の単離された抗体。
【請求項３１】
配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質または該タンパク質の全長非ヒト霊長類ホモログおよびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質（Ｄｓｈ）を含む、複合体。
【請求項３２】
配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質のフラグメントまたは該フラグメントの非ヒト霊長類ホモログのフラグメントおよびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質（Ｄｓｈ）を含む、複合体。
【請求項３３】
前記フラグメントが、配列番号７に示されるポリペプチドのＥＦハンド領域を含む、請求項３２に記載の複合体。
【請求項３４】
哺乳動物細胞のＷｎｔシグナル伝達を阻害する方法であって、該方法は、配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質またはその全長非ヒト霊長類ホモログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記哺乳動物細胞は、配列番号７をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換される、方法。
【請求項３６】
異常なＷｎｔシグナル伝達を含む癌を処置する方法であって、該方法は、配列番号７を有するポリペプチド、該ポリペプチドの非ヒト霊長類ホモログ、またはこれらのフラグメントの治療有効量を投与する工程を包含し、該フラグメントは、ｈＮｋｄポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生を誘発する配列番号７の少なくとも２０個連続するアミノ酸を含む、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記癌は、結腸癌、頭頸部癌、卵巣癌および乳癌からなる群から選択される、方法。
【請求項３８】
異常なＷｎｔシグナル伝達を潜在的に含む癌の型を診断する方法であって、該方法は、ヒト患者から得たヒト癌細胞が、配列番号５を有するコード配列と異なるコード配列を有するヒトＮｋｄ遺伝子を含むか否かを検出する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮出願番号６０／２５２，８８４（２０００年１１月２７日出願）および米国仮出願番号６０／２９１，１０９（２００１年５月１６日出願）、および米国仮出願番号６０／３２５，５７１（２００１年１０月１日出願）からの優先権を主張する。これらの出願は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節因子であるタンパク質およびヒトまたは非ヒト霊長類タンパク質をコードする対応する核酸配列、このタンパク質のフラグメントまたは改変体、ならびにこの核酸配列またはタンパク質を治療または診断用途に使用する方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）と呼ばれるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子は、細胞膜から核へのｗｉｎｇｌｅｓｓシグナルを運搬するタンパク質鎖の成分である細胞内調節タンパク質をコードする。Ｄｓｈは他の脊椎動物において発現され、そして十分に保存された構造を有する［Ｍｉｌｌｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：７８６０（１９９９）；Ａｅｌｒｏｄら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２１６０（１９９８）；Ｂｏｕｔｒｏｓら、Ｃｅｌｌ  ９４：１０９（１９９８）；Ｌｉｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：４２３３（１９９９）］。今日までに研究されている全てのＤｓｈタンパク質は、３つの高度に保存されたドメインを有する。これらの中で、Ｎ末端ＤＩＸドメインはまた、ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナルの負のレギュレーターであるＡｘｉｎにも存在する。中間ＰＤＺドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインであることが示されている。さらに、Ｃ末端ＤＥＰドメインは、Ｇタンパク質シグナル伝達に関係する［Ａｘｅｌｒｏｄら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２１６０（１９９８）；Ｂｏｕｔｒｕｓら、Ｃｅｌｌ  ９４：１０９（１９９８）；およびＬｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：４２３３（１９９９）］。
【０００４】
ｗｉｎｇｌｅｓｓ経路において役立っていることに加えて、Ｄｓｈはまた、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける、Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を活性化する平面内極性経路（ｐｌａｎａｒ  ｐｏｒａｌｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ）に必須である。今日までのいくつかの系列の証拠は、Ｄｓｈが、これらの２つの異なる経路に示差的に補充されることを示唆する。Ｄｓｈの第３の既知の機能は、Ｎｏｔｃｈと相互作用する（おそらく、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達をブロックすることにより）ことである。
【０００５】
Ｗｇ／Ｗｎｔリガンドおよびそれらのレセプターｆｒｉｚｚｌｅｄは、少なくとも２つの経路に関係する。１つの経路は、細胞増殖、発達、および腫瘍形成に対する効果を発揮するβ−カテニン経路を介する。この経路のいくつかの成分、β−カテニン、ＡＰＣ、アキシン、ならびにいくつかのＷｎｔリガンドおよびレセプターが、種々のヒト癌において変異しているかまたは誤発現していることが報告されており、このことは、この経路が、腫瘍形成に関係し得ることを示唆する［ＳｍａｌｌｅｙおよびＤａｌｅ、Ｃａｎｃ．Ｍｅｔａｓｔ  Ｒｅｖ．１８（２）：２１５−２３０（１９９９）］。もう一方の経路は、Ｒｈｏおよびｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼを通って表皮構造における平面内極性を確立する。この経路は、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＰＣＰおよび収斂伸長運動を制御する［Ｓｈｕｍａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１４：４５２（１９９８）；ＴａｄａおよびＳｍｉｔｈ、Ｄｅｖｅｌ．１２：２２２７（２０００）；Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：８１（２０００）］。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄは、両方の経路に必要とされる近位の下流成分である。
【０００６】
示されているように、異なるｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターは、可変性の固有のシグナル伝達能力を有し、そして少なくとも２つの同定された異なる経路に関係するが、両方とも伝達成分としてＤｓｈを利用する。従って、２つの構造的に関連するレセプターは、共通のタンパク質を通して（しかし、異なるエフェクター経路を介して）シグナル伝達する［ＢｏｕｔｒｏｓおよびＭｌｏｄｚｉｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１８２５−１８２８（２０００）］。例えば、ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターＦｚ１およびＦｚ２の両方は、膜に対してＤｓｈを効果的に補充し、このことは、異なる細胞下のＤｓｈの局在化が、シグナル伝達の効果および特異性を決定しないことを示唆する［Ｂｏｕｔｒｏｓら（２０００）（同書）］。Ｂｏｕｔｒｏｓらはまた、その中で、Ｆｚ２がＷｎｔ−β−ｃａｔシグナル伝達の強力なアクチベーターであり、Ｆｚ１が平面内極性経路の強力なアクチベーターであるが、これら両方のレセプターはいずれかの経路を相互活性化する固有の能力を有することを報告している［Ｂｏｕｔｒｏｓら（２０００）（同書）］。
【０００７】
高等生物におけるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄの正確な機能は未だ明らかにされていないが、マウスＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ１（ｍＤｖｌ  １）を欠損したマウスの株は、ヒトにおけるいくつかの神経学的障害の特徴を示す［Ｌｉｊａｍら、Ｃｅｌｌ  ９０：８９５−９０５（１９９７）］。このマウスの株はまた、マウスにおけるＤｓｈ遺伝子の役割のさらなる研究のためのモデルを提供する。
【０００８】
Ｄｓｈ機能の損失は、正規のＷｎｔ経路およびＰＣＰ経路の両方を破壊することが知られており、そしてＤｓｈの過剰発現は、正規のＷｎｔ経路を活性化するが、なおＰＣＰ経路を伴うこともまた知られている。これらの結果は、ＰＣＰ経路が用量感受性であり、そしてこの経路の過剰発現または抑制発現のいずれかにより破壊され得ることを示す［Ａｘｅｌｒｏｄら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２６１（１９９８）；Ｂｏｕｔｒｏｓら、Ｃｅｌｌ  ９４：１０９（１９９８）；ＢｏｕｔｒｏｓおよびＭｌｏｄｚｉｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１８２５−１８２８（２０００）；Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：８１（２０００）］。しかし、ｗｉｎｇｌｅｓｓ経路、ＪＮＫ経路、およびＮｏｔｃｈ経路におけるＤｓｈの機能のさらなる理解が、物理的または機能的にＤｓｈに関連するタンパク質（特に、ヒトタンパク質）の発見により促進される。
【０００９】
記載されるように、Ｗｎｔシグナル伝達が多くの異なる悪性腫瘍および他の疾患（例として、結腸癌、黒色腫、肝細胞癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、皮膚癌、多発性嚢胞腎疾患、髄芽腫毛質腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｉｌｏｍａｔｒｉｃｏｍａ）、頭頸部癌、および前立腺癌が挙げられる）の開始において役割を果たし得るので、このようなタンパク質（特に、ヒトホモログ）の同定は有益である（Ｍｏｒｉｎ  ＰＪ  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、２１（１２）：１０２１−１０３０；Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４（１５）：１８３７−１８５１（２０００）；Ｐｅｉｆｅｒ  ＭおよびＰｏｌａｋｉｓ  Ｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１６０６−９（２０００）；Ｓｍａｌｌｅｙ  ＭＪおよびＤａｌｅ  ＴＣ、Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１８（２）：２１５−２３０（１９９９））。また、アルツハイマー病におけるＷｎｔシグナル伝達の役割の可能性が示唆されている［ＤｅＦｅｒｒａｒｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．３３（１）：１−１２（２０００）］。従って、Ｗｎｔシグナル伝達において活発な役割を果たす（特に、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する）新規タンパク質および対応する遺伝子の同定は、これらのタンパク質がＷｎｔシグナル伝達に関係する癌の新規の治療および診断方法の設計において可能性を有し得るので、有益である。なおさらに、これらのタンパク質およびＤＮＡは、Ｗｎｔシグナル伝達に関係する疾患の診断および処置における有用性を有し得る新規のリガンドおよび分子の同定において有用であり得る。
【００１０】
さらに、Ｗｎｔシグナル伝達に関係するヒト遺伝子およびタンパク質の同定は、診断用途を有し得る。なぜならば、このタンパク質の異常な発現またはその異常な形態の発現がＷｎｔ経路に関係する疾患（例えば、結腸癌のような癌）の発症に関係し得るからである。
【００１１】
近年、Ｗｇ／Ｗｎｔシグナル伝達経路に関係するタンパク質であるＮｋｄが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ｚｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０３（９７７１）：７８９−７９５（２０００））およびマウス［Ｙａｎら、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｎｋｄ  ｉｓ  ａ  Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｏｆ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ」（２０００）（本明細書中でその全体が参考として援用される）］において同定された。特にＺｅｎｇら（２０００）（同書）は、Ｗｇ／Ｗｎｔ経路と拮抗するＷｇシグナル伝達のＷｇ誘導性インヒビターをコードするＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ遺伝子の同定を報告した［Ｚｅｎｇら（２０００）］。さらに、Ｙａｎら（２０００）（同書）は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄのマウスホモログの同定を記載しており、さらに、特にＷｇ／Ｗｎｔ経路に対するいくつかのその生物学的効果を報告している。しかし、本発明以前に、Ｎｋｄのヒトまたは非ヒトホモログは同定されていない。このようなヒトまたは非ヒトホモログの同定は有益であり、特に癌（例えば、乳癌、肺癌、および結腸癌）および神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）の潜在的な治療または診断の設計におけるこのようなタンパク質またはその対応するＤＮＡの潜在的な適用をもたらす。より詳細には、ヒトＮｋｄタンパク質または核酸配列転写物の異常な発現の検出が、異なる癌または神経学的障害を診断する手段を提供し得ることが予期される。また、ｈＮｋｄタンパク質の投与または分析は、Ｗｎｔシグナル伝達に関係するいくつかの癌または神経学的障害の処置において有用であり得る。
【００１２】
（発明の要旨および目的）
この目的のために、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質（Ｄｓｈ）に関連し、Ｗｎｔシグナル伝達に関係する新規のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質を提供することが、本発明の目的である。対応するヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性を保持する新規のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質の改変体を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１３】
対応するヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性を保持する新規のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質のフラグメントを提供することが、本発明の別の目的である。
【００１４】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ、または対応するヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性を保持する新規のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのフラグメントもしくは改変体をコードする核酸配列または分子を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１５】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄに特異的に結合するが、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａまたはマウスＮｋｄに認められ得る程度で結合しないポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１６】
生理学的環境または細胞内環境において、ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ  ｍＲＮＡを標的とし、そしてそれらの翻訳を阻害または減少させるアンチセンス核酸またはリボザイムを提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１７】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄをコードする核酸配列に相補的な核酸プローブ（特に、ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄコード配列に特異的に結合し、安定な二本鎖を形成するが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａまたはマウスのそれらに対してはそうではないプローブ）を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１８】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのアゴニストまたはアンタゴニストを提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１９】
少なくとも１つのヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄあるいは対応するネイティブのヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性を保持するそれらの改変体またはフラグメントと組み合わせて、Ｄｓｈまたはそれらのフラグメントもしくは改変体を含む複合体を提供することが、本発明の別の目的である。
【００２０】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ、あるいはそれらの改変体またはフラグメントを利用してＪＮＫ経路を活性化することが、本発明のなお別の目的である。
【００２１】
哺乳動物細胞（好ましくは、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞）において、ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ、あるいはネイティブのヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの活性を有するそれらの改変体またはフラグメントを過剰発現させることにより、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することが、本発明の別の目的である。
【００２２】
ヒトまたは非ヒトＮｋｄの１つまたは両方の対立遺伝子の発現がノックアウトされた、ヒトまたは非ヒト細胞を提供することが、本発明のなお別の目的である。
【００２３】
Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するのに効果的な量のヒトまたは非ヒトＮｋｄあるいはネイティブのヒトまたは非ヒト霊長類の少なくとも１つの生物学的活性を保持するそれらの改変体またはフラグメントの投与により、疾患（特に、癌、神経学的障害、または異常なＷｎｔシグナル伝達に関係する他の疾患）を処置する新規の方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００２４】
有効量のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのアゴニストを投与することにより、Ｗｎｔシグナル伝達に関係する癌（例えば、乳癌または肺癌）を処置することが、本発明のさらに別の目的である。
【００２５】
配列番号１に含まれる核酸配列または５０より長いヌクレオチド長のコード配列のフラグメントを含む単離された核酸分子；あるいは配列番号５によりコードされるタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１に含まれる核酸分子に少なくとも９０％同一の核酸分子を提供することが、本発明のより詳細な目的である。
【００２６】
ｈＮｋｄ遺伝子の調節領域（特に、プロモーター）を用いて、ｈＮｋｄ以外のコード配列の発現を調節することが、本発明のなおさらに別の目的である。
【００２７】
ｈＮｋｄプロモーター配列または少なくともそのような連続するヌクレオチドを含むそのフラグメントを用いて他のプロモーター（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達に関係するβ−カテニンまたは他の分子に応答性のプロモーター）を同定することもまた、本発明の目的である。
【００２８】
配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列、または配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも９０％同一のポリペプチドをコードする核酸、または配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント；もしくはこのフラグメントの改変体（この改変体フラグメントは、このフラグメントに少なくとも９５％同一であるが、ただし、このような改変体は、最も類似する領域が整列される場合、対応するマウス配列またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ配列と最大９０％、好ましくは８５％の同一性を有する）をコードする核酸配列（このフラグメントは、少なくとも５０アミノ酸長である）を提供することが、本発明の別の目的である。
【００２９】
配列番号７に含まれるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号７に含まれるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは少なくとも５０アミノ酸長を含むそれらのフラグメント、あるいはそのフラグメントの改変体（そのアミノ酸残基の少なくとも９５％がこのフラグメントと同一であるが、ただし、このような改変体は、最も類似する領域が整列される場合、対応するマウス配列またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ配列と最大９０％、好ましくは８５％の同一性を有する）を提供することが、本発明の別の詳細な目的である。
【００３０】
配列番号７に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、またはこのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいは配列番号７を有するアミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープを示すそれらのフラグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（ただし、このような抗体はマウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄタンパク質に認められ得る程度で結合しない）を提供することが、本発明のなお別の詳細な目的である。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
先に議論したように、本発明は、以前にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ［Ｚｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（６７７１）：７８９−７９５（Ｆｅｂ．１７，２０００）］およびマウス［Ｙａｎら、（２０００）］において同定されていたＷｇ／Ｗｎｔシグナル伝達に関係するタンパク質であるＮｋｄのヒトまたは非ヒト霊長類ホモログに関する。より詳細には、Ｚｅｎｇら（２０００）（同書）は、Ｗｇ／Ｗｎｔ経路と拮抗するＷｇシグナル伝達のＷｇ誘導性インヒビターをコードするＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ遺伝子を報告した。それらに関連して、Ｙａｎら（２０００）（同書）は、Ｚｅｎｇら（同書）のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子のマウスホモログの同定を報告し、インビトロおよびインビボの両方におけるその生物学的特性ならびにＷｇ／Ｗｎｔ経路に対する効果のいくつかの詳細な説明を提供した。例えば、Ｙａｎら（２０００）は、ｍＮｋｄ遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定レベルが、Ｗｎｔに応答して増加すること；ｍＮｋｄが、細胞培養物および脊椎動物Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓにおけるβ−カテニンおよびＪＮＫおよび平面内極性に対するＷｎｔの効果をブロックすることにより、Ｗｎｔ経路と明らかに拮抗すること；ならびにこれらの効果は、Ｗｎｔ経路および平面内極性経路の共通の成分であるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）とｍＮｋｄとの直接的な相互作用により媒介されるようであることを開示する。
【００３２】
より詳細には、Ｙａｎら（２０００）は、酵母ツーハイブリッドアプローチを用いたマウス胚９．５および１０．５ｄ．ｐ．ｃ．  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによる、ｍＮｋｄ遺伝子の同定を開示している。特に、このスクリーニング方法を用いて、Ｙａｎらは、全長Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３タンパク質と相互作用するいくつかのタンパク質フラグメントの同定を報告している。ｍＮｋｄタンパク質はこれらのタンパク質の中から同定され、そして単一のＥＦ−ハンドカルシウム結合モチーフを含むことが発見された。このモチーフは、カルシウム結合タンパク質のファミリーの研究において見出されたモチーフと最も類似することが開示されている（Ｚｈｅｎら（２０００））。ｍＮｋｄタンパク質は、Ｚｅｎｇら（２０００）（同書）により報告されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄタンパク質に対して４９％類似し、３４％同一であることが開示されており、そして類似するＥＦ−ハンドを含むことが報告されている。Ｙａｎら（２０００）はまた、ツーハイブリッドスクリーニングにおいてＤｖｌと相互作用するｍＮｋｄのドメインの位置が、アミノ酸１０７〜２３０に介在し、そしてＥＦ−ハンドモチーフを含むことを教示している。
【００３３】
Ｙａｎ（２０００）（同書）により報告されたマウスＮｋｄの生物学的特性は、Ｗｎｔ経路およびＪＮＫ経路におけるその役割と一致する。例えば、その中で記載されているように、ｍＮｋｄの過剰発現は、哺乳動物細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害する。さらに、哺乳動物細胞におけるｍＮｋｄの発現は、ＪＮＫを活性化し、応答がＤｓｈの発現によっても見られた。これらの結果は、ｍＮｋｄがＪＮＫ経路のアクチベーターであり、そしてＷｎｔシグナル伝達に関係することを示唆する。
【００３４】
先に示されたように、異常なＷｎｔシグナル伝達は、いくつかの癌および神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）において役割を果たしていることが考えられる。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達のアップレギュレーションは、いくつかの結腸癌を生じる。過剰に活性化されたＷｎｔシグナル伝達はまた、Ｗｎｔシグナル伝達に対する阻害効果を有するｍＮｋｄの機能をダウンレギュレーションすることにより達成され得る。いくつかの結腸癌において、ｍＮｋｄの発現は、正常細胞における発現よりも低くあり得る。この観察に基づき、ｍＮｋｄのヒトホモログは類似の生物学的効果を発揮し、そしていくつかのヒト癌または神経学的障害の発症および発達に関係し得ることが予想される。
【００３５】
従って、これまでに同定されたマウスおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄ遺伝子のヒトまたは非ヒト霊長類の等価物の同定は重要であり、特に、Ｗｎｔ経路の負の調節が哺乳動物において腫瘍形成に関係し得［ＳｍａｌｌｅｙおよびＤａｔｅ、Ｃａｎｃ．Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｓ．１８（２）：２１５−２３０（１９９９）］、そして特に、とりわけ癌（例えば、結腸癌、乳癌、卵巣癌）に関係し得ることを示唆する先行研究に照らして、その重要な潜在的な診断適用および治療適用を与える。
【００３６】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ（例えば、遺伝子または対応するポリペプチド）の同定は、潜在的なヒト治療の関係で、特に重要である。なぜならば、多くの異なる癌の発症に関係するヒトＮｋｄは、それが同定された場合、ヒト細胞においてＷｎｔ経路を調節し得ることが期待されるからである。さらに、ヒトまたは霊長類タンパク質は、ヒト治療のために非ヒトタンパク質よりも優れているようである。なぜならば、ヒトまたは霊長類タンパク質は、そのヒト起源を考慮すると、おそらくヒト被験体においていかなる免疫応答も誘発しないからである。従って、これは、長期的な基礎において（例えば、Ｗｎｔ経路に関係する癌（例えば、乳癌）または異常なＷｎｔシグナル伝達に関係する神経学的障害の処置のために）潜在的に投与可能である。また、ヒトタンパク質は、例えば、ｈＮｋｄ発現の異常なレベルに基づく癌または癌の可能性を診断する手段として、ｈＮｋｄタンパク質の発現レベルを検出するため、またはｈＮｋｄ発現をアゴナイズまたはアンタゴナイズするための診断薬剤または治療薬剤としての有用性を有する抗体を生成するために有用である。
【００３７】
この目的のために、本発明は、その存在が以前に知られておらず、そして本発明の以前に予見され得なかったヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄポリペプチドおよび対応する核酸配列を提供する。
【００３８】
本発明のタンパク質のヒトＮｋｄ核酸配列および対応するポリペプチドは、以下の実施例に開示される方法によって得られた。ヒトＮｋｄ全体の配列について、その配列は、ヌクレオチドレベルで、マウスＮｋｄ遺伝子に８５％同一であり、そしてタンパク質レベルで８７％同一であることが見出された。これらのタンパク質は、残基１３３〜１６８を含む、結合に関与する同一のＥＦ−ハンド領域を含む。マウスＮｋｄの核酸配列に対する本発明のヒトＮｋｄ遺伝子の核酸配列のアライメントを、図１に示す（それぞれ、配列番号２および配列番号１）。さらに、マウスＮｋｄタンパク質に対するヒトＮｋｄタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを、図２に示す（それぞれ、配列番号４および配列番号３）。さらに、ｈＮｋｄおよびｍＮｋｄをコードする核酸配列を、図３および図４に別々に示す（それぞれ、配列番号５および配列番号６）。また、ｈＮｋｄおよびｍＮｋｄのアミノ酸配列を、図５および６に別々に示す（それぞれ、配列番号７および配列番号８）。
【００３９】
本発明の全長ヒトＮｋｄ核酸配列は、ヒト第１６染色体に含まれる。詳細には、コード領域全体ならびに５’および３’ＵＴＲ（１１個のエキソンに含まれる）は、第１６染色体に見出される８６キロベース領域に含まれる。このマッピングの結果を含む図を、図８に示す。さらに、１１個の全てのエキソンの配列ならびに推定プロモーターならびに５’および３’ＵＴＲを、図７に示す（それぞれ、配列番号９〜配列番号２２）。
【００４０】
培養哺乳動物細胞におけるマウスＮｋｄ  ｍＲＮＡの転写レベルに対するＷｎｔリガンドの見かけの誘導性の効果を考慮すると、本発明のヒトＮｋｄの転写が、それによって同様に誘導され得ることが仮定される。この仮定をさらに試験するために、ヒトＮｋｄプロモーター配列を使用して、ヒトゲノム配列を含む公知のデータベースをブラスト（ｂｌａｓｔ）した。実際、これらのゲノム検索は、このプロモーターが、他の遺伝子中のＴｃｆ結合についての逆方向コンセンサス（Ａ／Ｔ  Ａ／Ｔ  ＣＡＡＧ）（Ｇｉｅｓｅら、Ｇｅｖｅｎｓ  Ｄｅｖ．５：２５６７（１９９１））（その全体が本明細書中で参考として援用される）（この領域は、β−カテニン応答性を付与するために必要であり得る）と一致するいくつかの配列エレメントを含むことを明らかにした。高レベルのβ−カテニンを有する結腸癌細胞もまた、高レベルのヒトＮｋｄ  ＲＮＡ転写物を発現するという事実は、この仮定と一致する。このことは、ヒトＮｋｄプロモーターが、β−カテニンの直接的な標的であることを示唆する。これに関連して、β−カテニンがＬＥＦ−１／ＴＣＦ、ＡＰＣおよびコンダクチン（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ）／アキシン（ａｘｉｎ）と相互作用すること、およびそのような相互作用が腫瘍形成に重要であり得ることもまた公知である（Ｖａｎ  Ｋｒｉｅｓら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（９）：８００−８０７（２０００）；Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｊ．Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１０：２１−３３（２０００））。β−カテニンに関与する変異が、いくつかの癌（特に、卵巣癌、乳癌および結腸癌）に関与することが周知である（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２（５）：６２−６２９（１９９９）；Ｌｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｎｏｌ．１５３（３）：７０９−７１４（１９９８）；およびＦｕｋｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３５２６−３５２８（１９９８））。
【００４１】
この観察に基づいて、ｈＮｋｄ、またはその異常な発現（ここで、異常な発現には、減少または増加された発現が含まれる）、または改変形態の発現の検出が、いくつかの癌（例えば、結腸癌、乳癌、卵巣癌、および異常なＷｎｔシグナル伝達に関連する他の癌）を検出する手段を提供することが予測される。
【００４２】
詳細には、これらの結果は、癌および異常なＷｎｔシグナル伝達に関連する他の疾患（とりわけ、結腸癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、皮膚癌、多発性嚢胞腎疾患、髄芽細胞腫、毛質性上皮腫、頭部および頸部の癌、前立腺癌、ならびに神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）の可能性のある治療法としては、ｈＮｋｄ発現を調節する化合物（例えば、抗体、ｈＮｋｄタンパク質、およびそれらのフラグメントまたは改変体；ならびにｈＮｋｄ  ｍＲＮＡ転写を特異的に標的化する、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド；ならびにｈＮｋｄ発現を調節する低分子）の投与が挙げられ得ることを示唆する。潜在的に処置可能な癌の好ましい例としては、結腸癌、乳癌および卵巣癌が挙げられる。
【００４３】
タンパク質レベルおよびＤＮＡレベルの両方での、ヒトＮｋｄとマウスＮｋｄとの間の観察された構造的類似性に基づいて、これらのタンパク質およびＤＮＡが、類似の生物学的活性を示すことが予測される。詳細には、ｈＮｋｄタンパク質が、ｍＮｋｄと同様に、ＪＮＫ経路を活性化し、そしてＷｎｔシグナル伝達を阻害することが予測される。このことに基づいて、本発明は、新規のヒトおよび非ヒト霊長類のＮｋｄタンパク質および核酸配列、それらの改変体およびフラグメント、ならびに新規タンパク質の設計およびその使用におけるそれらの使用に対して広範に関し、これらを、以下により詳細に議論する。しかし、これらのタンパク質、核酸配列およびそれらの使用を詳細に説明する前に、以下の定義を提供する。さもなければ、本明細書中の用語は、関連する分野において理解されるこれらの意味を有する。
【００４４】
「単離されたヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質」とは、その通常のヒトまたは霊長類の細胞環境にはない、任意のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質をいう。これらとしては、例えば、組換えｈＮｋｄを含む組成物、精製ｈＮｋｄを含む薬学的組成物、精製ｈＮｋｄを含む診断組成物、およびｈＮｋｄを含む単離されたタンパク質組成物が挙げられる。好ましい実施形態において、単離されたｈＮｋｄタンパク質は、配列番号３に含まれるアミノ酸配列または実質的に同じ配列を有する天然のホモログもしくは変異体を含む、実質的に純粋なタンパク質を含み、つまり、他のタンパク質を実質的に含まず、好ましくは、少なくとも９０％純粋である。天然に存在する変異体は、例えば、変異されたｈＮｋｄタンパク質配列をコードする遺伝子を発現する腫瘍細胞において見出され得る。
【００４５】
「ネイティブヒトＮｋｄタンパク質」とは、図５および配列番号７に含まれるアミノ酸配列を含むタンパク質をいう。
【００４６】
「ネイティブ非ヒトＮｋｄタンパク質」とは、図５および配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質の非ヒト霊長類ホモログであるタンパク質をいう。他の霊長類に対するヒトの系統学的近縁性を考慮すると、ヒトおよび非ヒトＮｋｄタンパク質は、高度に類似し、おそらく、９５％程度以上の配列同一性のアミノ酸配列を有することが予測される。
【００４７】
「ネイティブマウスＮｋｄタンパク質」とは、図６および配列番号８に含まれるアミノ酸配列を含むタンパク質をいう。
【００４８】
「単離されたヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ核酸分子または配列」とは、その通常のヒトの細胞環境にはない（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類染色体ＤＮＡに含まれない）、ヒトＮｋｄをコードする核酸分子をいう。これらとしては、例えば、ｈＮｋｄ核酸分子を含むベクター、検出可能な部分（例えば、蛍光標識または放射性標識）を直接的または間接的に結合したｈＮｋｄ核酸配列を含むプローブ、または異なるＤＮＡ（例えば、プロモーター、または検出可能なマーカーもしくはエフェクター部分をコードするＤＮＡ）にその５’末端または３’末端が融合されたｈＮｋｄをコードする核酸分子を含むＤＮＡ融合物が挙げられる。好ましい核酸配列は、ヒトＮｋｄタンパク質をコードし、そして図３における配列番号５に含まれる核酸配列を有する。実質的に同じ配列を有する天然のホモログまたは変異体もまた、含まれる。縮重する天然に存在するホモログは、配列番号５がコードする同じタンパク質をコードするが、対応するアミノ酸配列を変化させないヌクレオチド差異を含む。天然に存在する変異体は、腫瘍細胞に見出され得る、ここでは、このようなヌクレオチド差異が、変異体Ｎｋｄタンパク質を生じる。保存的置換を含む天然に存在するホモログもまた、含まれる。
【００４９】
「ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質の改変体」とは、対応するネイティブヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質に対して、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９１％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、そして最も好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、タンパク質をいい、ここで、配列同一性は、以下に定義されるとおりである。好ましくは、この改変体は、ネイティブｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄタンパク質と共通する少なくとも１つの生物学的特性を有し、例えば、この改変体は、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。
【００５０】
「ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ核酸分子または配列の改変体」とは、対応するネイティブヒトまたは非ヒト霊長類核酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、そして最も好ましくは９９％の配列同一性を有する核酸配列をいい、ここで、「配列同一性」は、以下に定義されるとおりである。
【００５１】
「ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの生物学的に活性なフラグメント」とは、その対応するネイティブヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する能力、または対応するネイティブヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの免疫原性エピトープを提示する能力（抗ｈＮｋｄ抗体または抗非ヒトＮｋｄ抗体に結合またはこれらを惹起する能力によって決定されるような））を含むタンパク質をいい；但し、この生物学的に活性なフラグメントは、それに最も類似するマウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄタンパク質の部分と整列させた場合に、それと同一でないアミノ酸配列を有し、そしてより好ましくは、それと高くとも９０％の配列同一性を有し、そしてより好ましくは、それと高くとも８９％、８８％、８７％、８６％または８５％の配列同一性を有し、ここで、配列同一性は、以下に定義されるとおりである。
【００５２】
陽性の生物学的に活性なｈＮｋｄフラグメントまたは改変体の生物学的活性は、そのようなフラグメントまたは改変体が、インビトロまたはインビボで、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する能力、ＪＮＫを活性化する能力、Ｄｓｈと相互作用する能力に基づいて決定され得る。適切なアッセイを、以下の実施例に開示する。
【００５３】
「ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ核酸分子または配列のフラグメント」とは、配列番号７に含まれるネイティブヒトＮｋｄ核酸配列またはネイティブ非ヒト霊長類Ｎｋｄ核酸分子の一部に対応する核酸配列をいい、この部分は、少なくとも約５０ヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００または１８２５ヌクレオチド長である。好ましくは、このようなフラグメントは、配列番号７に含まれるヒトＮｋｄ核酸配列またはそその非ヒト霊長類ホモログの約５００個〜約１５００個連続するヌクレオチドを含む。
【００５４】
「ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの抗原性フラグメント」とは、それ自体かまたは免疫原性キャリアを結合して使用した場合に、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄを特異的に結合する抗体を誘発する、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのフラグメントあるいはそれらの改変体またはホモログに対応するポリペプチドをいう。代表的には、このような抗原性フラグメントは、少なくとも２０アミノ酸長である。
【００５５】
用語「生物学的に等価」は、本発明のタンパク質またはＤＮＡが、ネイティブヒトＮｋｄまたは非ヒト霊長類のＮｋｄタンパク質またはＤＮＡと必ずしも同じ程度ではないが、同じ生物学的特性のいくつかまたは全てあるいは類似の様式を実証し得ることを意味することが、意図される。好ましくは、生物学的に等価とは、ネイティブヒトＮｋｄに匹敵する程度にＷｎｔシグナル伝達を阻害する、ｈＮｋｄの改変体をいう。示されるように、生物学的活性は、そのタンパク質またはＤＮＡが、インビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて、他のＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力、ＪＮＫを活性化する能力、Ｄｓｈと相互作用する能力に基づいて評価され得、これらのアッセイを、以下の実施例に開示する。
【００５６】
「実質的に相同」によって、別の種（好ましくは、別の霊長類）のＮｋｄに対するヒトまたは非ヒト霊長類の相同性の程度は、そのｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄと任意の以前に報告されたＮｋｄ（例えば、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ）との間の相同性の程度より高いことが意味される。
【００５７】
配列同一性または同一性％は、２つの配列を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅバイオコンピューティングソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，ＩＮＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるマルチプル配列アライメントのＣｌｕｓｔａｌ法［Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｃａｂｉｏｓ  ８：１８９−１９１（１９９２）］を使用して整列させた場合、その２つの配列間で共有される同じ残基のパーセンテージ（非ヒトＮｋｄ（例えば、マウスＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ）との同一性％を決定する場合、ヒトＮｋｄを基準として）を意味することが意図される。この方法において、マルチプルアライメントを、順送り様式で行い、ここで、より大きいアライメント群とより大きいアライメント群が、一連の対合アライメントから計算された類似性スコアを使用してアセンブルされる。最適な配列アライメントは、最大アライメントスコアを見出すことによって得られ、このスコアは、アライメント中の別々の残基間の全てのスコアの平均であり、これは、所定の進化的間隔にわたって２つの関連するタンパク質に生じる所定のアミノ酸変化の可能性を表す、残基重み表（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｗｅｉｇｈｔ  ｔａｂｌｅ）から決定される。アライメント中にギャップを空けそして伸長させるためのペナルティーは、このスコアに寄与する。このプログラムで使用されるデフォルトパラメーターは、以下の通りである：マルチプルアライメントについてのギャップペナルティー＝１０；マルチプルアライメントについてのギャップ長ペナルティー＝１０；対合アライメントにおけるｋ−タプル値＝１；対合アライメントにおけるギャップペナルティー＝３；対合アライメントにおけるウインドウ値＝５；対合アライメントにおいて保存される対角線＝５。アライメントプログラムに使用される残基重み表は、ＰＡＭ２５０［Ｄａｙｈｏｆｆｅｔら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｄａｙｈｏｆｆ編、ＮＤＲＦ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、第５巻、補遺３、３４５頁（１９７８）］である。
【００５８】
保存％は、２つの残基が保存的置換（ＰＡＭ２５０残基重み表にいて０．３以上のログオッズ値（ｌｏｇ  ｏｄｄｓ  ｖａｌｕｅ）を有するものして定義される）を示す位置のパーセンテージに、同一残基のパーセンテージを加えることによって、上記アライメントから計算される。保存は、保存％を決定する場合、非ヒトＮｋｄ（例えば、ｍＮｋｄ）との保存％を決定する場合のヒトＮｋｄを基準とする。この要件を満足する保存的アミノ酸変化は、以下である：Ｒ−Ｋ；Ｅ−Ｄ、Ｙ−Ｆ、Ｌ−Ｍ；Ｖ−Ｉ、Ｑ−Ｈ。
【００５９】
（ポリペプチドフラグメント）
本発明は、開示されたタンパク質のポリペプチドフラグメントを提供する。本発明のポリペプチドフラグメントは、ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄまたはそれらのアナログの、少なくとも８アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２５アミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも５０アミノ酸残基を含み得る。より詳細には、このようなフラグメントは、配列番号７を有するポリペプチドの少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４５５、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６または４６７残基を含む。さらにより好ましくは、タンパク質フラグメントは、ネイティブＮｋｄの大部分（すなわち、ｈＮｋｄの少なくとも約２００〜４００個連続する残基、またはさらにより好ましくは、少なくとも４００〜４６０個連続する残基）を含む。好ましいタンパク質フラグメントとしては、ＥＦハンドを含むフラグメントが挙げられる。好ましくは、このようなフラグメントは、ヒトまたは非ヒトＮｋｄタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を有する。このような生物学的活性を確認するために、インビトロまたはインビボアッセイを行って、例えば、そのフラグメントが、Ｄｖｌを結合するか否か、哺乳動物細胞によるＷｎｔシグナル伝達を阻害するか否か、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ胚におけるＷｎｔ誘導性二次軸形成を誘導するか否か、またはＪＮＫ平面極性経路に影響を及ぼすか否かを決定し得る。例示的な方法を、本願の実施例に開示する。
【００６０】
（生物学的に活性なフラグメント）
本明細書中に開示されるタンパク質およびポリペプチドの改変体もまた、存在し得る。改変体は、天然に存在し得るかまたは天然に存在しないものであり得る。天然に存在する改変体は、ヒトまたは非ヒト霊長類種に見出され、配列番号７に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。ヒトＮｋｄタンパク質の非ヒト霊長類ホモログまたは改変体は、以下に記載されるような、本発明の部分ゲノムポリヌクレオチドを使用して、他のヒトまたは非ヒト霊長類細胞由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングに適切なプローブまたはプライマーを作製して、得られ得る。あるいは、霊長類ホモログは、ヒトＮｋｄタンパク質またはＤＮＡ配列を用いて霊長類ＤＮＡデータベースをブラストすることによって同定され得る。
【００６１】
天然に存在するタンパク質改変体と実質的に同じ生物学的活性を保持する、天然に存在しない改変体もまた、本発明に包含される。好ましくは、天然に存在する改変体または天然に存在しない改変体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、これらの分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一である。同一性％は、当該分野で公知の方法によって決定される。限定されない例は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムであり、これは、ギャップオープンペナルティー、１２およびギャップ伸長ペナルティー、２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス、６２を用いるアフィンギャップ（ａｆｆｉｎｅ  ｇａｐ）検索を使用する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２−４８９に教示される。
【００６２】
どのアミノ酸残基が、生物学的または免疫学的活性を失うことなく置換、挿入または欠失され得るかの決定についてのガイダンスは、当該分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を使用して見出され得る。好ましくは、タンパク質改変体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化（すなわち、類似の荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸の置換）である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に、以下の４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として共に分類される。
【００６３】
ムテインと呼ばれる、変異体のサブセットは、中性アミノ酸（例えば、セリン）が、ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基に代わって置換されたポリペプチドの群である。これらの変異体は、ネイティブの分泌タンパク質よりも広い温度範囲にわたって安定であり得る。Ｍａｒｋら、米国特許第４，９５９，３１４号を参照のこと。
【００６４】
イソロイシンまたはバリンでのロイシンの分離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、セリンでのトレオニンでの置換、または構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似の置換は、得られる分泌タンパク質またはポリペプチド改変体の生物学的特性に対して大きな効果を有さないことが当然予測される。ｈＮｋｄタンパク質またはポリペプチドの改変体の特性および機能は、配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と同じ型の特性および機能であるが、改変体の機能および特性は、ある程度異なり得る。
【００６５】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質改変体としては、グリコシル化形態、他の分子との凝集結合体、および関連しない化学部分との共有結合改変体が挙げられる。また、ｈＮｋｄタンパク質改変体としてはまた、対立遺伝子改変体、種改変体、およびムテインが挙げられる。ｈＮｋｄタンパク質の差示的な発現に影響しない領域の切断または欠失もまた、改変体である。共有結合改変体は、当該分野で公知のように、アミノ酸側鎖に見出される基に対してか、あるいはＮ末端残基またはＣ末端残基で、官能基を連結することによって、調製され得る。
【００６６】
本発明のｈＮｋｄタンパク質のいくつかのアミノ酸は、タンパク質の構造または機能に対する有意な効果を伴わずに変更され得ることが当該分野で認識される。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質の重要な領域が存在することに留意する。一般に、類似の機能を果す残基を使用する場合には、三次構造を形成する残基を置換することが可能である。他の例において、変更がそのタンパク質の重要でない領域で生じる場合、残基の型は、完全には重要でない。アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化させ得る。Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、２つの公知の型のＴＮＦレセプターのうちの１つのみに対するＴＮＦ−αの選択的結合を生じる、特定の変異を記載する。したがって、本発明のポリペプチドは、天然の変異または人為操作のいずれか由来の、１以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
【００６７】
本発明は、比較可能な発現パターンを示すかまたは抗原性領域を含む、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄポリペプチドのバリエーションをさらに包含する。このような変異体は、欠失、挿入、逆位、反復、および型置換を含む。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントであるのかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出され得る。
【００６８】
別の荷電アミノ酸での荷電アミノ酸の置換、および中性または負に荷電したアミノ酸での荷電アミノ酸の置換は、重要な目的である。後者は、開示されるタンパク質の特性を改善するように正電荷を減少したタンパク質を生じる。凝集の防止は、非常に望ましい。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるのみならず、それらが免疫原性であり得ることに起因して、薬学的処方物を調製する際に問題となり得る（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７（１９９３））。
【００６９】
機能に必須である本発明のポリペプチド中のアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって同定され得る。後者の手順は、分子中の各残基に１個のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子を、生物学的活性（例えば、天然または合成の結合パートナーに対する結合）について試験する。リガンド−レセプター結合に重要である部位はまた、構造分析（例えば、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））によって決定され得る。
【００７０】
示されるように、変化は、好ましくは、重要でない特性の変化（例えば、タンパク質のフォールディングにも活性にも有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換）である。もちろん、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、多くの要因（上記のような要因を含む）に依存する。一般には、任意の所定のポリペプチドの置換の数は、５０個、４０個、３０個、２５個、２０個、１５個、１０個、５個または３個よりも多くない。
【００７１】
（融合タンパク質）
ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのタンパク質またはポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質もまた、構築され得る。融合タンパク質は、アミノ酸配列に対する抗体を作製するため、および種々のアッセイ系における使用のために、有用である。例えば、融合タンパク質は、本発明のタンパク質と相互作用するタンパク質またはその生物学的機能に干渉するタンパク質を同定するために使用され得る。物理的方法（例えば、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー）、またはタンパク質−タンパク質相互作用のライブラリーベースのアッセイ（例えば、酵母ツーハイブリッド系またはファージディスプレイ系）もまた、この目的に使用され得る。このような方法は、当該分野で周知であり、そして薬物スクリーニングとしても使用され得る。ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのシグナル配列および／または膜貫通ドメインあるいはそれらのフラグメントを含む融合タンパク質を使用して、他のタンパク質ドメインを、これらのドメインが通常見出されない細胞部位に標的化し得る（例えば、細胞膜に結合させるか、細胞外に分泌させる）。
【００７２】
融合タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に融合された２つのタンパク質セグメントを含む。本発明の融合タンパク質における使用のためのアミノ酸配列は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を利用し得るか、または配列番号７の生物学的に活性な改変体またはフラグメント（例えば、上記に記載されるもの）から調製され得る。第１のタンパク質セグメントは、全長ｈＮｋｄまたはその改変体もしくはフラグメントからなり得る。
【００７３】
上記のように、これらのフラグメントは、長さが、約８アミノ酸から、約２５アミノ酸、５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、１２５アミノ酸、１５０アミノ酸、１７５アミノ酸、２００アミノ酸、２２５アミノ酸、２５０アミノ酸、２７５アミノ酸、３００アミノ酸、３２５アミノ酸、３５０アミノ酸、３７５アミノ酸、４００アミノ酸、４２５アミノ酸、４５０アミノ酸、４５５アミノ酸、４６０アミノ酸、４６５アミノ酸までのサイズの範囲にわたり得る。
【００７４】
第２のタンパク質セグメントは、全長タンパク質またはポリペプチドフラグメントであり得る。融合タンパク質構築物において一般に使用されるタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が挙げられる。さらに、エピトープタグが、融合タンパク質構築物において使用され得、これらのタグとしては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。他の融合構築物としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合物、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ  １６タンパク質融合物が挙げられ得る。
【００７５】
これらの融合物は、例えば、２つのタンパク質セグメントの共有結合により、または分子生物学分野における標準的な手順により作製され得る。例えば、当該分野で公知であるように、組み換えＤＮＡ法が用いられて、第２のタンパク質セグメントをコードするヌクレオチドと適切なリーディングフレームで配列番号７に含まれるアミノ酸配列をコードするコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製し、宿主細胞においてこのＤＮＡ構築物を発現することにより、融合タンパク質が調製され得る。融合タンパク質を構築するための多くのキットが、発現のためのツールを研究機関に供給する会社（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）が挙げられる）から入手可能である。
【００７６】
本発明のタンパク質、融合タンパク質またはポリペプチドは、組み換えＤＮＡ法により生成され得る。組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはポリペプチドの生成のために、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のコード配列が、当該分野で公知の発現系を用いて、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において発現され得る。これらの発現系としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。
【００７７】
次いで、得られた発現タンパク質は、当該分野で公知の精製手順を用いて、培養培地または培養細胞の抽出物から精製され得る。例えば、培養培地に十分に分泌されたタンパク質については、無細胞培地を、酢酸ナトリウムを用いて希釈し、陽イオン交換樹脂と、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィーと接触させ得る。この方法を用いると、所望のタンパク質またはポリペプチドは、代表的には、９５％を超える純度である。例えば、上記に列挙した技術のいずれかを用いて、さらなる精製が行われ得る。
【００７８】
機能的タンパク質を得るために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により、酵母または細菌において生成されるタンパク質を改変することが必要であり得る。このような共有結合は、公知の化学的方法または酵素的方法を使用して作製され得る。
【００７９】
本発明のヒトまたは非ヒト霊長類のＮｋｄタンパク質またはＮｋｄポリペプチドはまた、精製を容易にする形態において、培養宿主細胞において発現され得る。例えば、タンパク質またはポリペプチドは、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはチオレドキシンを含む融合タンパク質として発現され得、市販のキットを使用して精製され得る。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような会社から入手可能である。タンパク質、融合タンパク質、またはポリペプチドはまた、エピトープ（例えば、「Ｆｌａｇ」エピトープ（Ｋｏｄａｋ））を用いてタグ化され得、そのエピトープに特異的に結合する抗体を用いて精製され得る。
【００８０】
本明細書中に開示されるコード配列はまた、トランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジ）を構築するために使用され得る。次いで、雌性トランスジェニック動物は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、または融合タンパク質をそれらの乳汁中に生成し得る。このような動物を構築するための方法は、当該分野で公知であり、かつ広く用いられている。
【００８１】
あるいは、合成化学方法（例えば、固相ペプチド合成）を用いて、分泌タンパク質または分泌ポリペプチドを合成し得る。ペプチド、アナログまたは誘導体を生成するための一般的手段は、  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編（１９８３）に概説されている。通常のＬ立体異性体の代わりにＤ−アミノ酸を用いて置換することが、分子の半減期を増大させるために行われ得る。
【００８２】
代表的には、相同なポリヌクレオチド配列は、当該分野で公知のように、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにより確認され得る。例えば、以下の洗浄条件：２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％  ＳＤＳ、室温で２回、各３０分間；次いで２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃で１回、３０分間；次いで、２×ＳＳＣ、室温で２回、各１０分間、を用いて、相同な配列が同定され得る（この配列は、最大で約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む）。より好ましくは、相同な核酸鎖は、１５〜２５％の塩基対ミスマッチ、なおより好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００８３】
本発明はまた、例えば、ハイブリダイゼーションプロトコル（例えば、ノーザンブロッティングもしくはサザンブロッティング、またはインサイチュハイブリダイゼーション）において相補的ヌクレオチド配列を検出するために使用され得るポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリヌクレオチドプローブは、配列番号１の少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、もしくは４０、またはそれ以上連続したヌクレオチドを含む。ただし、この配列は、マウスＮｋｄ配列もしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ配列に対して９０％以下の同一性であり、より好ましくは、それらに対して約８９、８８、８７または８６％以下の同一性であり、最も好ましくは、それらに対して約８５％以下の同一性である。本発明のポリヌクレオチドプローブは、検出可能な標識（例えば、放射性同位体標識、蛍光標識、酵素標識、または化学発光標識）を含み得る。
【００８４】
本明細書中に開示されたｃＤＮＡ配列に対応する単離された遺伝子もまた、提供される。標準的な分子生物学方法が使用されて、本明細書中に提供されるｃＤＮＡ配列を用いて対応する遺伝子が単離され得る。これらの方法は、哺乳動物（ヒトを含む）のゲノムライブラリーもしくはヒトゲノムＤＮＡの他の供給源から遺伝子を同定または増幅する際に使用するための配列番号５に示されるヌクレオチド配列からのプローブもしくはプライマーの調製を含む。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチド分子はまた、ポリヌクレオチド増幅方法を用いて、ポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るためにプライマーとして使用され得る。ポリヌクレオチド分子は、当該分野で周知の技術を用いて、ベクターおよび細胞株中で増加され得る。ポリヌクレオチド分子は、直鎖状分子であってもよいし、環状分子であってもよい。ポリヌクレオチド分子は、自動的に複製する分子上にあってもよいし、複製配列を含まない分子上にあってもよい。ポリヌクレオチド分子は、当該分野で公知のように、このポリヌクレオチド分子自身の調節配列により調節されてもよいし、他の調節配列により調節されてもよい。
【００８６】
（ポリヌクレオチド構築物）
本明細書中に開示されるコード配列を含むポリヌクレオチド分子は、ポリヌクレオチド構築物（例えば、ＤＮＡ構築物もしくはＲＮＡ構築物）において使用され得る。本発明のポリヌクレオチド分子は、例えば、タンパク質の全てもしくは一部、改変体、融合タンパク質、または単鎖抗体を宿主細胞において発現するために発現構築物において使用され得る。発現構築物は、選択された宿主細胞において機能的であるプロモーターを含む。当業者は、当該分野で公知かつ使用されている多数の細胞型特異的プロモーターから適切なプロモーターを容易に選択し得る。この発現構築物はまた、宿主細胞において機能的な転写ターミネーターを含み得る。この発現構築物は、所望のタンパク質の全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。このポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターの下流に位置する。このポリヌクレオチドセグメントの転写は、プロモーターにおいて開始される。発現構築物は、直鎖状であってもよいし、環状であってもよく、所望であれば、自己複製のための配列を含み得る。
【００８７】
Ｎｋｄコード配列、または検出マーカーもしくは選択マーカーをコードする他の配列のいずれかに作動可能に連結された、ヒトまたは非ヒト霊長類のＮｋｄ遺伝子プロモーターおよびＵＴＲ配列（配列番号９）（配列番号１０、１１、または配列番号２２）を含むポリヌクレオチド分子もまた含まれる。このようなプロモーターおよび／またはＵＴＲベースの構築物は、Ｎｋｄ発現の転写調節および翻訳調節を研究するため、ならびに活性化調節タンパク質および／または阻害性調節タンパク質を同定するために有用である。ｈＮｋｄプロモーターは、β−カテニンによって明らかに調節され、従って、作動可能に連結された場合に、非ｈＮｋｄ遺伝子の発現をβ−カテニン応答性にするために用いられ得る。
【００８８】
（宿主細胞）
発現構築物は、宿主細胞に導入され得る。発現構築物を含む宿主細胞は、任意の適切な原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。細菌における発現系としては、以下に記載されるものが挙げられる：Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）；ＥＰ３６，７７６；Ｕ．Ｓ．４，５５１，４３３；ｄｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３）；およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら，Ｃｅｌｌ  ２０：２６９（１９８０）。
【００８９】
酵母における発現系としては、以下に記載されるものが挙げられる：Ｈｉｎｎｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９（１９７８）；Ｉｔｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １５３：１６３（１９８３）；Ｋｕｒｔｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２（１９８６）；Ｋｕｎｚｅら，Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｇｌｅｅｓｏｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９（１９８６），Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２（１９８６））；Ｄａｓら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５（１９８４）；Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７（１９８３），Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５（１９９０）；Ｋｕｎｚｅら，Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｃｒｅｇｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６（１９８５）；米国特許第４，８３７，１４８号；米国特許第４，９２９，５５５号；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６（１９８１）；Ｄａｖｉｄｏｗら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９（１９８５）；Ｂａｌｌａｎｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら，Ｇｅｎｅ  ２６：２０５−２２（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４（１９８４）；ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５４７９（１９８５）；ＥＰ  ２４４，２３４；ならびにＷＯ９１／００３５７。
【００９０】
昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る：米国特許第４，７４５，０５１号；Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」ｉｎ：ＴＨＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰ１２７，８３９；ＥＰ１５５，４７６；Ｖｌａｋら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５−７７６（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７（１９８８）；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，Ｇｅｎｅ  ７３：４０９（１９８８）；Ｍａｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２−５９４（１９８５）；Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：３１２９（１９８８）；Ｓｍｉｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８４０４（１９８５）；Ｍｉｙａｊｉｍａら，Ｇｅｎｅ  ５８：２７３（１９８７）；およびＭａｒｔｉｎら，ＤＮＡ  ７：９９（１９８８）。多くのバキュロウイルス系統および改変体、ならびに対応する宿主から許容される昆虫宿主細胞は、以下に記載される：Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５，Ｍｉｌｌｅｒら，ｉｎ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編），Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−２７９（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６）；ならびにＭａｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：５９２−５９４（１９８５）。
【００９１】
哺乳動物発現は、以下に記載されるように達成され得る：Ｄｉｊｋｅｍａら，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１（１９８５）；Ｇｏｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７（１９８２ｂ）；Ｂｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１（１９８５）；および米国特許第４，３９９，２１６号。哺乳動物発現の他の特徴は、以下に記載されるように容易にされ得る：ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）；ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）；米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；米国特許第４，５６０，６５５号；ＷＯ９０／１０３４３０，ＷＯ８７／００１９５，ならびに米国再発行特許第３０，９８５号。
【００９２】
発現構築物は、当該分野で公知の任意の技術を用いて、宿主細胞に導入され得る。これらの技術としては、以下が挙げられる：トランスフェリン−ポリカチオン媒介性ＤＮＡ移入、裸の核酸またはカプセル化核酸を用いたトランスフェクション、リポソーム媒介性細胞融合、ＤＮＡコーティングラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」、およびリン酸カルシウム媒介性トランスフェクション。
【００９３】
本発明のタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現はまた、この内因性遺伝子とインフレームで転写ユニットを含むＤＮＡ構築物を相同組換えにより導入して、この転写ユニットを含む相同組換え細胞を形成することによって操作され得る。この転写ユニットは、標的化配列、調節配列、エキソン、および対になっていないスプライスドナー部位を含む。新しい転写ユニットは、所望される場合、内因性遺伝子をオンまたはオフにするために用いられ得る。この内因性遺伝子発現に影響をもたらす方法は、米国特許第５，６４１，６７０号に教示される。
【００９４】
標的化配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列の少なくとも１０、１２、１５、２０、または５０の連続するヌクレオチドのセグメントである。ただし、上記配列は、マウスＮｋｄ配列もしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ配列に対して９０％以下の同一性であり、より好ましくは、これらに対して約８９、８８、８７または８６％以下の同一性であり、最も好ましくは、それらに対して８５％以下の配列同一性である。転写ユニットは、内因性遺伝子のコード配列の上流に位置する。外因性調節配列は、この内因性遺伝子のコード配列の転写を方向付ける。
【００９５】
ヒトまたは非ヒト霊長類のＮｋｄとしてはまた、ハイブリッドおよびそれらの改変形態が挙げられ得、これらとしては、このハイブリッドまたは改変形態が、ヒトもしくは霊長類Ｎｋｄタンパク質の生物学的活性を維持する限り、融合タンパク質、フラグメントおよびハイブリッド、ならびに改変形態（ここで特定のアミノ酸は、欠失または置換されている）、例えば、１以上のアミノ酸が改変アミノ酸もしくは異常アミノ酸に変化されているような改変、およびグリコシル化のような改変）が挙げられる。ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの生物学的活性を維持するとは、ＪＮＫ経路が活性化され、そして／またはＷｎｔシグナル伝達が阻害されるが、本明細書中に記載されるように単離されたｈＮｋｄの効力と同じレベルである必要も、組換え生成されたｈＮｋｄの効力と同じレベルである必要もないことを意味する。
【００９６】
任意のヒトまたは非ヒト霊長類タンパク質であるＮｋｄ（本明細書中に記載されたｈＮｋｄに対する抗体との交差反応性により単離され得るか、またはＮｋｄのコードヌクレオチド配列（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが挙げられる）が、本明細書中に記載のｈＮｋｄもしくはそのフラグメントのゲノムヌクレオチド配列またはサブゲノムヌクレオチド配列またはｃＤＮＡの相補的配列とのハイブリダイゼーションを介して単離され得る）がまた、実質的に相同性の意味内に含まれる。縮重ＤＮＡ配列がヒトまたは非ヒト霊長類のＮｋｄをコードし得ることは当業者に明らかであり、これらはまた、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの対立遺伝子改変体であるとして、本発明内に含まれることが意図される。
【００９７】
本発明の好ましいｈＮｋｄは、記載されるように、精製された形態で同定および単離されている。組換えＤＮＡ技術により調製されたｈＮｋｄもまた、好ましい。「精製形態」、「精製（された）形態」または「実質的に精製された形態」とは、ｈＮｋｄ組成物が、ｈＮｋｄではない他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。
【００９８】
本発明はまた、疾患を有する患者を処置するために有効な量のｈＮｋｄもしくは非ヒト霊長類Ｎｋｄを含む治療的組成物または薬学的組成物、および治療的有効量のｈＮｋｄを投与する工程を包含する方法を含む。これらの組成物および方法は、癌を含む多くの疾患を処置するために有用である。当業者は、ｈＮｋｄが、生存を促進することまたは特定の細胞型において機能することにおいて有用であるか否かを決定するために当該分野で公知の種々のアッセイを容易に使用し得る。
【００９９】
特定の状況において、発現されるｈＮｋｄの量を調節または減少させることは望ましいことであり得る。従って、本発明の別の局面において、ｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドが作製され得、１以上のｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、細胞によるｈＮｋｄの発現レベルを減少させるための方法が利用され得る。ｍＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドの参照は、ｈＮｋｄの発現が減少されるようにｈＮｋｄの発現に関与する特定の相補的核酸配列と対形成する塩基をして相互作用するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに対して行われる。好ましくは、ｈＮｋｄの発現に関与する特定の核酸配列は、ｈＮｋｄをコードするゲノムＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である。このゲノムＤＮＡ分子は、ｈＮｋｄ遺伝子の調節領域、または成熟ｈＮｋｄタンパク質のコード配列を含み得る。
【０１００】
ｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそのための方法の文脈において、用語ヌクレオチド配列に相補的は、細胞において（すなわち、生理学的条件下で）このような配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために、その配列に十分相補的であることを意味する。ｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約８〜約１００ヌクレオチドを含む配列を含み、より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５〜約３０ヌクレオチドを含む。ｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、核分解に耐性を付与する種々の改変を含み得、例えば、改変されたヌクレオシド間連結［ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５４８（１９９０）；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＢａｎｎｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５，（１９９０）（これらは、参考として援用される）］、５，９５８，７７３およびそこに開示される特許に開示されるように改変された核酸塩基、ならびに／または糖などである。
【０１０１】
アンチセンス技術に広く適用可能であることが公知である、アンチセンス分子の任意の改変および変化は、本発明の範囲内に含まれる。このような改変は、米国特許第５，５３６，８２１号；同５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号、同５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；同５，５８７，３６１号；同５，６２５，０５０号および同５，９５８，７７３号に開示されるようなリン含有結合の調製を含む。
【０１０２】
本発明のアンチセンス化合物は、改変された塩基を含み得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、そのオリゴヌクレオチドを１つ以上の部分または結合体に化学的に結合させて、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞内取り込みを増強させることによって改変され得る。このような部分または結合体としては、脂質（例えば、コレステロール、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質）、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分、例えば、米国特許第５，５１４，７５８号、同５，５６５，５５２号、同５，５６７，８１０号、同５，５７４，１４２号、同５，５８５，４８１号、同５，５８７，３７１号、同５，５９７，６９６号および同５，９５８，７７３号に開示される他のもの）が挙げられる。
【０１０３】
キメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、本発明の範囲内であり、例えば、米国特許第５，０１３，８３０号、同５，１４９，７９７号、同５，４０３，７１１号、同５，４９１，１３３号、同５，５６５，３５０号、同５，６５２，３５５号、同５，７００，９２２号および同５，９５８，７７３号に記載される方法を使用して、本発明のオリゴヌクレオチドから調製され得る。
【０１０４】
アンチセンスの分野において、特定の程度の慣用的実験が、特定の標的に対する最適なアンチセンス分子を選択するために必要とされる。効果的であるために、アンチセンス分子は、好ましくは、標的ＲＮＡ分子のアクセス可能である部分、すなわち、または露出された部分に標的化される。いくつかの場合では、標的ｍＲＮＡ分子の構造について情報が利用可能であるが、アンチセンスを使用する阻害についての現在のアプローチは、実験による。細胞中のｍＲＮＡレベルは、処理された細胞およびコントロール細胞において、ｍＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡレベルのアッセイによって慣用的に測定され得る。生物学的効果は、当該分野において公知であるように、細胞増殖または生存度を測定することによって慣用的に決定され得る。
【０１０５】
ｃＤＮＡレベルをアッセイおよび分析することによってアンチセンス活性の特異性を測定することは、アンチセンスの結果を検証する、当該分野において認識された方法である。処理された細胞およびコントロール細胞由来のＲＮＡが逆転写され、生じたｃＤＮＡ集団が分析されるべきであることが、示唆されてきた［Ｂｒａｎｃｈ，Ａ．Ｄ．，Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．２３：４５−５０（１９９８）］。
【０１０６】
本発明の治療組成物または薬学的組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、髄腔内または大脳内を含む、当該分野において公知の任意の適切な投与経路によって投与され得る。投与は、注射によって迅速にか、あるいは、緩やかな注入または徐放性処方物の投与によるように一定の期間にわたっての、いずれかであり得る。
【０１０７】
さらに、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄはまた、所望の薬学的または薬力学的な特徴を提供する薬剤と連結または結合体化され得る。例えば、ｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄは、血液脳関門を越える浸透または移動を促進するための、当該分野において公知の任意の物質（例えば、トランスフェリンレセプターに対する抗体）に結合され得、そして静脈注射によって投与され得る（例えば、Ｆｒｉｄｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３７３−３７７（１９９３）（これは、参考として援用される）を参照のこと）。さらに、このヒトまたは霊長類のＮｋｄタンパク質は、可溶性、安定性、半減期および他の薬学的に有利な特徴といった望ましい特性を得るために、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）に安定に連結され得る［例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇ．４：１６９−７３（１９７８）；Ｂｕｒｕｈａｍ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．５１：２１０−２１８（１９９４）（これらは、参考として援用される）を参照のこと）。
【０１０８】
組成物は、通常、薬学的調製物の形態で利用される。このような調製物は、薬学的な分野において周知の様式で作製される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｅｒｍ  ＰＡ（１９９０）を参照のこと。１つの好ましい調製物は、生理食塩水溶液のビヒクルを利用するが、他の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理学的濃度の他の非毒性の塩、５％グルコース水溶液、滅菌水など）もまた、使用され得ることが、企図される。適切な緩衝液が組成物中に存在することもまた、所望され得る。このような溶液は、所望される場合、凍結乾燥され得、そして容易な注射のための滅菌水の添加による再構成に容易な滅菌アンプル中に貯蔵され得る。基本的な溶媒は、水性であってもあるいは非水性であってもよい。このヒトまたは霊長類のＮｋｄタンパク質、そのフラグメントまたは改変体はまた、処置が必要とされる組織に移植され得る、固体または半固体の、生体適合性のマトリクスに組み込まれ得る。
【０１０９】
キャリアはまた、処方物のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘性、清澄度、色、無菌せい（ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）、安定性、分解速度または臭気を改変または維持するための、薬学的に受容可能な他の賦形剤を含み得る。同様に、キャリアはさらに、血液脳関門を越える放出または吸収または浸透を改変または維持するための、薬学的に受容可能な他の賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、単位用量または複数用量形態のいずれかでの非経口投与のため、あるいは連続的または周期的な注入による脳脊髄液中への直接注入のための投薬量を処方するために、通常および慣用的に使用される物質である。
【０１１０】
用量投与は、投薬処方物の経路の薬物動態学的パラメーターおよび使用される投与に依存して反復され得る。
【０１１１】
このｈＮｋｄ、霊長類Ｎｋｄまたはその改変体もしくはフラグメントを含む特定の処方物は、経口投与されるべきであることもまた、企図される。このような処方物は、好ましくは、カプセル化され、適切なキャリアを用いて固体投薬形態で処方される。適切なキャリア、賦形剤および希釈剤のいくつかの例としては、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、水、鉱油などが挙げられる。処方物は、さらに、潤沢剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、保存薬、甘味料または矯味矯臭剤を含み得る。組成物は、当該分野において周知の手順を使用することによる患者への投与の後に活性成分の迅速な放出、持続的な放出、または遅延放出を提供するように、処方され得る。処方物はまた、蛋白質分解を減少させそして吸収を促進させる物質（例えば、界面活性剤）を含み得る。
【０１１２】
特定の用量は、患者のおよその体重または体表面積または占められるべき体空間の容積に従って計算される。用量はまた、選択された特定の投与経路に依存して計算される。処置に適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる改善は、当業者によって慣用的になされる。このような計算は、標的細胞のアッセイ調製物における本明細書中に開示される活性の観点から、当業者によって過度の実験なくなされ得る。正確な投与量は、標準的な用量応答研究と併用して決定される。処置される状態、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の徴候の重篤度、ならびに投与経路の選択を含む、関連する状況の観点から、実際に投与される組成物の量が開業医によって決定されることは、理解される。
【０１１３】
本発明の１つの実施形態において、ｈＮｋｄは、生物学的に活性な形態のｈＮｋｄまたはｈＮｋｄの前駆体（すなわち、身体によりｈＮｋｄの生物学的に活性な形態に容易に変換され得る分子）を生成し得るベクターまたは細胞を患者に移植することによって、治療的に投与され得る。１つのアプローチにおいて、ｈＮｋｄを分泌する細胞は、患者への移植のために半透膜中にカプセル化され得る。これらの細胞は、ｈＮｋｄまたはその前駆体を正常に発現する細胞であり得るか、あるいは、ｈＮｋｄまたはその前駆体を発現するように形質転換され得る。患者がヒトの場合、細胞がヒト起源であり、そしてｈＮｋｄがヒトｈＮｋｄであることが、好ましい。しかし、非ヒト霊長類Ｎｋｄが効果的であり得ることは、予期される。
【０１１４】
多くの状況において、患者中のＮｋｄタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを決定することが所望される。Ｎｋｄがいくつかの疾患（例えば、癌）の間に種々のレベルで発現され得ることを示唆するこれまでの発現の証拠に沿う、本明細書中でのヒトＮｋｄの同定は、ｈＮｋｄの存在が細胞増殖および細胞生存に関連する正常な生理学的機能を果たすという結論の基礎を提供する。内因的に生成されたヒトＮｋｄはまた、特定の疾患条件において役割を果たし得る。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、用語「検出」は、患者におけるｈＮｋｄの存在を検出する文脈において、患者中でのｈＮｋｄの量、またはある量のｈＮｋｄを発現する能力を決定すること、疾患の予想される結果および回復の見込みの観点において、予後の判断を推定すること、状況の状態の尺度として一定期間にわたってｈＮｋｄレベルをモニタリングすること、ならびに患者についての好ましい治療レジメンを決定するためにｈＮｋｄレベルをモニタリングすることを含むことが意図される。
【０１１６】
患者中のｈＮｋｄの存在を検出するために、サンプルが、患者より得られる。サンプルは、組織生検サンプルまたは血液、血漿、血清、ＣＳＦなどのサンプルであり得る。ｈＮｋｄがいくつかの癌（例えば、結腸癌、乳癌および肺癌）において高レベルで発現されることを、見出した。ｈＮｋｄを検出するためのサンプルは、これらの組織から採取され得る。ｈＮｋｄの末梢レベルを評価する場合、サンプルは、血液、血漿または血清のサンプルであることが好ましい。中枢神経系におけるｈＮｋｄのレベルを評価する場合、好ましいサンプルは、脳脊髄液または神経組織から得られたサンプルである。
【０１１７】
いくつかの場合において、患者においてか、または患者内の細胞または細胞株において、ｈＮｋｄ遺伝子がインタクトであるか否かを決定することが所望される。インタクトなｈＮｋｄ遺伝子によって、遺伝子中に変更（例えば、点変異、欠失、挿入、染色体崩壊、染色体再配列など）がないことが意味され、ここで、このような変更は、ｈＮｋｄの生成を変更するか、またはその生物学的活性、安定性などを変更して、疾患の進行を導き得る。よって、本発明の１つの実施形態において、ｈＮｋｄにおける任意の変更を検出および特徴付けるための方法が提供される。この方法は、ｈＮｋｄ  ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントもしくはその誘導体を含むオリゴヌクレオチドを提供する工程を包含する。オリゴヌクレオチドの誘導体によって、誘導体化されたオリゴヌクレオチドは、この誘導体化された配列は、ｈＮｋｄ遺伝子に特異的なハイブリダイズに十分な配列相補性を由来する配列に対して有する点で、由来する配列と実質的に同一であることが意味され、誘導体化されたヌクレオチド配列は、必ずしも物理的にそのヌクレオチド配列に由来しないが、任意の様式（例えば、化学合成またはＤＮＡ複製もしくは逆転写もしくは転写を含む）において生成され得る。
【０１１８】
典型的には、患者のゲノムＤＮＡは、患者由来の細胞サンプルより単離され、そして１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＴａｑＩおよびＡｌｕＩ）で消化される。当該分野において周知であるサザンブロットプロトコルを使用して、このアッセイは、患者、または患者中の特定の組織がインタクトなｈＮｋｄ遺伝子またはｈＮｋｄ遺伝子異常を有するか否かを決定する。
【０１１９】
ｈＮｋｄ遺伝子に対するハイブリダイゼーションは、染色体ＤＮＡを変性して一本鎖ＤＮＡを得る工程；この一本鎖ＤＮＡをＮｋｄ遺伝子配列に関連する遺伝子プローブに接触させる工程；およびハイブリダイズしたＤＮＡプローブを同定してヒトｈＮｋｄ遺伝子の少なくとも一部を含む染色体ＤＮＡを検出する工程、を包含する。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、プローブ配列と標的領域中の配列との相補性に起因して標的配列とハイブリッド構造を形成する、ポリヌクレオチドから構成される構造をいう。プローブとしての使用に適切なオリゴマーは、標的化された配列に対して相補的である、最小で約８〜１２個、好ましくは、最小限約２０個連続するヌクレオチドを含み得る。
【０１２１】
本発明のｈＮｋｄ遺伝子プローブは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドであってもＲＮＡオリゴヌクレオチドであってもよく、そして当該分野において公知の任意の方法（例えば、切除、転写または化学合成）によって作製され得る。プローブは、当該分野において公知の任意の検出可能な標識（例えば、放射標識もしくは蛍光標識または酵素的マーカー）で標識され得る。プローブの標識化は、当該分野において公知の任意の方法（例えば、ＰＣＲ、ランダムプライミング、末端標識、ニックトランスレーションなど）によって達成され得る。当業者はまた、標識されたプローブを使用しない他の方法がハイブリダイゼーションを検出するために使用され得ることを、認識する。ハイブリダイゼーションを検出するために使用され得る方法の例としては、サザンブロッティング、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、およびＰＣＲ増幅を用いる一本鎖高次構造多型が挙げられる。
【０１２２】
ハイブリダイゼーションは、典型的には、２５〜４５℃、より好ましくは、３２〜４０℃、より好ましくは、３７〜３８℃で実施される。ハイブリダイゼーションに必要な時間は、約０．２５〜約９６時間、より好ましくは、約１〜７２時間、最も好ましくは、約４〜約２４時間である。
【０１２３】
ｈＮｋｄ遺伝子異常はまた、ＰＣＲ法、およびｈＮｋｄ遺伝子に隣接するかまたはｈＮｋｄ遺伝子内にあるプライマーを使用することによって、検出され得る。ＰＣＲ法は、当該分野において周知である。簡単には、この方法は、ｈＮｋｄ遺伝子内にある標的配列に隣接する核酸配列にハイブリダイズしその標的配列を増幅し得る、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチドプライマー」は、約８〜約３０塩基長にわたるＤＮＡまたはＲＮＡの短鎖をいう。上流プライマーおよび下流プライマーは、典型的には、約２０〜約３０塩基対の長さであり、そしてヌクレオチド配列の複製のために、隣接する領域にハイブリダイズする。そのポリマー化は、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、またはヌクレオチドアナログの存在下で、二本鎖ＤＮＡ分子を生成するＤＮＡポリメラーゼによって特徴付けられる。次いで、二本鎖は、物理的変性方法、化学的変性方法または酵素的変性方法を含む任意の変性方法によって分離される。一般に、物理的変性方法は、典型的には、約８０℃〜１０５℃の温度にまで、約１〜約１０分間の範囲の時間にわたって、核酸を加熱する工程を包含する。このプロセスは、所望の数のサイクルについて反復される。
【０１２４】
プライマーは、増幅されるＤＮＡ鎖に実質的に相補的であるように選択される。よって、プライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、増幅される鎖と選択的にハイブリダイズするために十分相補的であらねばならない。
【０１２５】
ＰＣＲ増幅後、次いで、ｈＮｋｄまたはそのフラグメントを含むＤＮＡ配列は、直接配列決定されるか、または本明細書中に開示される配列との配列比較によって分析されて、活性または発現レベルなどを変化させ得る変更が同定される。
【０１２６】
別の実施形態において、ｈＮｋｄタンパク質を検出する方法が、ｈＮｋｄ遺伝子を発現する組織の分析に基づいて提供される。特定の組織（例えば、乳房、肺、結腸など）は、ｈＮｋｄ遺伝子を発現することが見出された。この方法は、ｈＮｋｄ遺伝子を正常に発現する組織のサンプル由来のｍＲＮＡに、ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程を包含する。サンプルは、ｈＮｋｄ遺伝子中に異常を有することが予期される患者より得られる。
【０１２７】
ｈＮｋｄタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在を検出するために、サンプルが、患者より得られる。サンプルは、血液由来であっても、組織生検サンプル由来であってもよい。サンプルは、そこに含まれる核酸を抽出するために処理され得る。サンプルより得られた核酸は、ゲル電気泳動または他のサイズ分離技術に供される。
【０１２８】
サンプルのｍＲＮＡを、プローブとして働くＤＮＡ配列と接触させて、ハイブリッド二重鎖を形成する。上記で議論された標識プローブの使用は、生じる二重鎖の検出を可能にする。
【０１２９】
ｈＮｋｄタンパク質をコードするｃＤＮＡまたはこのｃＤＮＡの誘導体をプローブとして使用する場合、高ストリンジェンシー条件が、偽陽性を防ぐために使用され得、この偽陽性は、インタクトであり分画されたｈＮｋｄ遺伝子が実際存在しない場合の、ｈＮｋｄヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションおよび見かけ上の検出である。ｈＮｋｄ  ｃＤＮＡ由来の配列を使用する場合、よりストリンジェントでない条件が使用され得るが、これは、偽陽性の可能性が原因でより好ましくないアプローチである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション手順および洗浄手順の間の多くの因子（温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミドの濃度を含む）によって決定される。これらの因子は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）上述］に概略される。
【０１３０】
ｈＮｋｄタンパク質をコードするｍＲＮＡの、サンプル中での検出感度を増強させるために、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）の技術を使用して、ｈＮｋｄタンパク質をコードするｍＲＮＡより転写されたｃＤＮＡを増幅し得る。ＲＴ／ＰＣＲの方法は、当該分野において周知であり、そして以下のように実施され得る。総細胞性ＲＮＡを、例えば、標準的グアニジンイソチオシアネート法によって単離し、そしてこの総ＲＮＡを逆転写する。逆転写法は、逆転写酵素および３’末端プライマーを使用する、ＲＮＡのテンプレート上でのＤＮＡの合成を包含する。典型的には、プライマーは、オリゴ（ｄＴ）配列を含む。次いで、ｃＤＮＡが、ＰＣＲ法およびｈＮｋｄ特異的プライマーを使用して増幅される。［Ｂｅｌｙａｖｓｋｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：２９１９−２９３２（１９８９）；ＫｒｕｇおよびＢｅｒｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：３１６−３２５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８７）（これらは、参考として援用される）］。
【０１３１】
ポリメラーゼ連鎖反応法は、増幅されるＤＮＡセグメントの２つの隣接する領域に実質的に相補的な２つのオリゴプライマーを使用して上記のように実施される。増幅に続いて、次いで、ＰＣＲ産物を電気泳動し、そしてエチジウムブロミド染色またはホスホイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｉｎｇ）によって検出する。
【０１３２】
本発明はさらに、患者から得られたサンプル中におけるｈＮｋｄタンパク質の存在を検出するための方法を提供する。タンパク質を検出するための当該分野において公知の任意の方法が、使用され得る。このような方法としては、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫化学法、バインダー−リガンドアッセイ、免疫組織化学技術、凝集アッセイおよび補体アッセイが挙げられるがこれらに限定されない。［Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２１７−２６２，ＳｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９１）（これは、参考として援用される）］。抗体をｈＮｋｄタンパク質のエピトープと反応させる工程、および標識化ｈＮｋｄタンパク質またはその誘導体を競合的に置換させる工程を包含するバインダー−リガンド免疫アッセイ法が、好ましい。
【０１３３】
本明細書中で使用される場合、ｈＮｋｄタンパク質の誘導体は、特定のアミノ酸が欠失されたか、あるいは改変されたアミノ酸または通常ではないアミノ酸に置換されたかまたは変更されたポリペプチドを含むことが意図され、ここで、この誘導体は、ｈＮｋｄに生物学的に等価であり、ここで、このポリペプチド誘導体は、ｈＮｋｄタンパク質に対して惹起された抗体と交差反応する。交差反応によって、抗体が、その形成を誘導する抗原以外の抗原と反応することを意味する。
【０１３４】
多くの競合的タンパク質結合免疫アッセイおよび非競合的タンパク質結合免疫アッセイが、当該分野において周知である。このようなアッセイにおいて使用される抗体は、例えば、凝集試験において使用される場合未標識であり得るか、または広範な種々のアッセイ法における使用のために標識され得る。使用され得る標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、酵素基質または補因子、酵素インヒビター、粒子、色素などが、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））、蛍光免疫アッセイなどにおける使用のために、挙げられ得る。
【０１３５】
被験体非ヒト霊長類またはヒトのＮｋｄタンパク質またはそのエピトープに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当該分野において公知の多くの方法のいずれかによって、免疫アッセイにおける使用のために作製され得る。エピトープによって、ポリペプチドの抗原決定基に対して言及がなされる。エピトープは、そのエピトープに独特である空間的コンフォーメーションの３つのアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォーメーションを決定する方法は、当該分野において公知であり、そして例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる。
【０１３６】
タンパク質に対する抗体を調製するための１つのアプローチは、そのタンパク質の全てまたは一部のアミノ酸配列を選択および調製し、この配列を化学的に合成し、そして適切な動物（典型的には、ウサギ、ハムスターまたはマウス）へ注入することである。
【０１３７】
疎水性領域中にあり、よって、成熟タンパク質においてされる可能性があるオリゴペプチドに基づいて、ｈＮｋｄタンパク質に対する抗体を生成するための候補として、オリゴペプチドが、選択され得る。ｈＮｋｄに対する抗体を生成するために使用されるペプチド配列は、以下を含む：
さらなるオリゴペプチドは、例えば、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ，Ｗｅｌｌｉｎｇ，Ｇ．Ｗ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８８：２１５−２１８（１９８５）（これは、参考として本明細書中に援用される）を使用して決定され得る。
【０１３８】
本発明の他の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体が提供され、ここで、この抗体は、ｈＮｋｄに対して特異的であるが、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄタンパク質を感知されるほどには結合しない。句「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体（典型的には、マウスモノクローナル抗体）由来の抗体をいう。あるいは、ヒト化抗体は、親の非ヒト抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するキメラ抗体由来であり得るが、ヒト化抗体は、ヒトに投与される場合、親の抗体と比較して低減された免疫原性を示す。本明細書中で使用される場合、句「キメラ抗体」は、典型的には異なる種由来である２つの異なる抗体由来の配列を含む抗体をいう（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメント（一般的には、ヒト定常領域およびマウス定常領域）を含む。
【０１３９】
ヒト化抗体が、ヒトにおいて、親のマウスモノクローナル抗体よりもほとんど免疫原性ではない場合、これらは、アナフィラキシーの危険性をほとんど有することなくヒトの処置に使用され得る。よって、これらの抗体は、ヒトに対するインビボ投与を包含する治療的適用（例えば、新生物性疾患の処置のための放射線増感剤としての使用、または例えば、癌治療の副作用を低減させる方法における使用）において好ましくあり得る。
【０１４０】
ヒト化抗体は、以下を含む種々の方法によって達成され得る：例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域および定常領域上に移植すること（当該分野において「ヒト化」といわれるプロセス）、あるいは（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、これらを表面残基の置換によるヒト様表面で「覆う（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」こと（当該分野において「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」といわれるプロセス）。本発明において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体および「ベニアリングした」抗体の両方を含む。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７（１９９４）、ならびにＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３（１９９１）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）中に開示される。
【０１４１】
句「相補性決定領域」は、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）を参照のこと。句「定常領域」は、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。本発明において、マウス定常領域は、ヒト定常領域によって置換される。そのヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリン由来である。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ（α、δ、ε、γまたはμ）のいずれかから選択され得る。
【０１４２】
ヒト化抗体の１つの方法は、ヒト重鎖配列および軽鎖配列に対して非ヒト重鎖配列および軽鎖配列を整列する工程、選択する工程、このような整列に基づいて非ヒトフレームワークをヒトフレームワークと置換する工程、ヒト化配列のコンフォーメーションを予想するために分子モデリングする工程、そして親の抗体のコンフォーメーションに比較する工程を包含する。このプロセスの後に、ＣＤＲ領域内の残基のバックミューテーションが反復され、この変異は、予想したヒト化配列モデルのコンフォーメーションが、親の非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンフォーメーションにかなり近似するまでＣＤＲの構造を妨害する。このようなヒト化抗体はさらに、（例えば、Ａｓｈｗｅｌｌレセプターを介する）取り込み及びクリアランスを容易にするように誘導体化され得る。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号および同５，５８５，０８９号（これらの特許は本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１４３】
ｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄに対するヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されているトランスジェニック動物を使用して生成され得る。例えば、ＷＯ  ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示し、ここで、これらの動物は、内因性の重鎖および軽鎖の遺伝子座の不活化に起因して、機能的な内因性免疫グロブリンを生成しない。ＷＯ  ９１／１０７４１はまた、免疫原に対する免疫応答をマウントし得るトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示し、ここで、これらの抗体は、霊長類の定常領域および／または可変領域を有し、そしてここで、内因性の免疫グロブリンをコードする遺伝子座は、置換されているかまたは不活化されている。ＷＯ  ９６／３０４９８は、哺乳動物中の免疫グロブリン遺伝子座を改変して、例えば、定常領域または可変領域の全てもしくは一部を置換して改変された抗体分子を形成するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示する。ＷＯ  ９４／０２６０２は、不活化内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示する。米国特許第５，９３９，５９８号は、トランスジェニックマウスの作製法を開示し、ここで、このマウスは、内因性重鎖を欠き、そして１つ以上の異種定常領域を含む内因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する。
【０１４４】
上記のトランスジェニック動物を使用して、選択された抗原性分子に対する免疫応答を生成し得、そして抗体産生細胞は、この動物から取り出され得、そしてヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するために使用され得る。免疫化プロトコル、アジュバントなどは、当該分野において公知であり、そして（例えば、ＷＯ  ９６／３３７３５に開示されるようなトランスジェニックマウスの）免疫化において使用される。この公開物は、種々の抗原性分子（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ、ヒトＣＤ４、Ｌ−セレクチン、ｇｐ３９および破傷風毒素を含む）に対するモノクローナル抗体を開示する。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物学的活性または生理学的効果を阻害または中和する能力について試験され得る。ＷＯ  ９６／３３７３５は、ＩＬ−８で免疫されたトランスジェニックマウスの免疫細胞由来のＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が、好中球のＩＬ−８誘導性機能をブロックしたことを開示する。トランスジェニック動物を免疫するために使用した抗原に対して特異性を有するヒトモノクローナル抗体がまた、ＷＯ  ９６／３４０９６に開示される。
【０１４５】
本発明において、本発明のｈＮｋｄポリペプチドまたは霊長類Ｎｋｄポリペプチドおよびこれらの改変体を使用して、上記のようにトランスジェニック動物を免疫する。モノクローナル抗体は、当該分野において公知の方法を使用して作製され、そしてこれらの抗体の特異性は、単離されたｈＮｋｄポリペプチドまたは霊長類Ｎｋｄポリペプチドを使用して試験される。
【０１４６】
ヒトもしくは霊長類のＮｋｄのタンパク質またはそのエピトープの調製法としては、化学合成、組換えＤＮＡ技術または生物学的サンプルからの単離が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドの化学合成は、例えば、以下によって実施され得る：固相ペプチド合成の古典的なＭｅｒｒｉｆｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３（これは、参考として援用される）、またはＲａｐｉｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍにおけるＦＭＯＣストラテジー［Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）（ＣａｐｒｉｎｏおよびＨａｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３７：３４０４（１９７２）（これは、参考として援用される）］。
【０１４７】
ポリクローナル抗体は、ウサギまたは他の動物に抗原を注射することにより免疫すること、続いて適切な間隔でブーストすることによって調製され得る。これらの動物から採血し、そして精製したｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄのタンパク質に対して、通常ＥＬＩＳＡによって、あるいはｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄの作用をブロックする能力に基づくバイオアッセイによって、血清をアッセイする。非限定的な例示において、ｈＮｋｄに対する抗体は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質に対するｈＮｋｄの結合をブロックし得る。鳥種（例えば、ニワトリ、七面鳥など）を使用する場合、抗体は、卵黄より単離され得る。モノクローナル抗体は、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒの方法の後に、免疫したマウス由来の脾細胞を、継続的に複製する腫瘍細胞（例えば、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞）と融合することによって調製され得る。［ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒ：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；ＧｕｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７３：１−４６，ＬａｎｇｏｎｅおよびＢａｎａｔｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１）（これらは、参考として援用される）］。次いで、このように形成されたハイブリドーマ細胞を、限界希釈法によってクローニングし、そして抗体の産生について、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはバイオアッセイによって上清をアッセイする。
【０１４８】
抗体が、標的タンパク質を認識しそしてそれに特異的に結合する独特の能力は、このタンパク質の過剰発現を標的とするためのアプローチを提供する。従って、本発明の別の局面は、ｈＮｋｄタンパク質に対する特異的抗体を用いて患者を処置することによって、このｈＮｋｄタンパク質の過剰発現に関係する疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【０１４９】
ｈＮｋｄタンパク質または霊長類Ｎｋｄタンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体のいずれかが、上記のように当該分野で公知の適切な任意の方法により産生され得る。例えば、マウスモノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって産生され得るか、あるいは、ｈＮｋｄタンパク質もしくは霊長類Ｎｋｄタンパク質、またはそれらの免疫学的に活性なフラグメント、あるいは抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントが、ｈＮｋｄタンパク質または霊長類Ｎｋｄタンパク質を認識し結合することができる抗体の産生を惹起するために、動物に投与され得る。このような抗体は、任意のクラスの抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが挙げられ、鳥類種の場合、ＩｇＹが挙げられるが、これらに限定されない）に、そして任意のサブクラスの抗体に、由来し得る。
【０１５０】
単離されたヒトＮｋｄタンパク質または霊長類Ｎｋｄタンパク質を利用可能なことにより、高スループットスクリーニング法（ＨＴＳ）の慣用的な適用を介して、結合パートナーへのｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄの結合を阻害する、低分子および低分子量化合物を同定することが、可能となる。ＨＴＳ法は、一般的には、治療能力についてのリード化合物の迅速なアッセイを可能にする技術を指す。ＨＴＳ技術は、試験物質の自動取扱い、ポジティブシグナルの検出、およびデータの解釈を使用する。リード化合物は、放射能の取込みを介してか、あるいは読み出しとして吸光度、蛍光、または発光に頼る光学アッセイを介して、同定され得る。［Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６２４〜６３１（１９９８）］。
【０１５１】
例えば、リガンド結合についてｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄと競合することによって、ｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄとそのリガンドとの相互作用を阻害する化合物についての高スループットスクリーニングにおける使用のために適合され得るモデル系が、利用可能である。Ｓａｒｕｂｂｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：７０〜７５（１９９６）は、ＩＬ−１レセプターの活性部位への結合について天然のリガンドと競合する分子を発見するための、無細胞非同位体アッセイを記載する。Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｃ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７３：２０〜３１（１９９９）は、標識リガンドが、粒子上に固定されたそのレセプターに結合し、レセプター結合について標識リガンドと競合する分子の存在下では、その粒子上の標識が減少する、一般的な粒子ベースの非放射性法を記載する。
【０１５２】
本発明の、治療ｈＮｋｄポリヌクレオチドまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄポリヌクレオチド、ならびに治療ｈＮｋｄポリペプチドまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクル中で利用され得る。この遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源であっても、非ウイルス起源であってもよい（一般的に、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１〜６４（１９９４）；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：８４５〜８５２（１９９４）；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１８５〜１９３（１９９５）；ならびにＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１４８〜１５３（１９９４）を参照のこと）。本発明による治療剤のコード配列を含む構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所投与または全身投与のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを使用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導され得る。このコード配列の発現は、構成的であるかまたは調節されるかのいずれかであり得る。
【０１５３】
本発明は、選択された目的の核酸分子を保有または発現するように構築された組換えレトロウイルスを使用し得る。使用され得るレトロウイルスベクターとしては、ＥＰ  ０  ４１５  ７３１；ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９４／０３６２２；ＷＯ  ９３／２５６９８；ＷＯ  ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ  ９３／１１２３０；ＷＯ  ９３／１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３８６０〜３８６４（１９９３）；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２〜９６７（１９９３）；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３〜８８（１９９３）；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３〜５０３（１９９２）；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９〜７３５（１９９３）；米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；ならびにＥＰ  ０  ３４５  ２４２に記載されるベクターが、挙げられる。好ましい組換えレトロウイルスとしては、ＷＯ  ９１／０２８０５に記載されるものが、挙げられる。
【０１５４】
上記レトロウイルスベクター構築物を用いる使用に適切なパッケージング細胞株は、容易に調製され得（ＰＣＴ公開ＷＯ  ９５／３０７６３およびＷＯ  ９２／０５２６６を参照のこと）、そして組換えベクター粒子を産生する産生細胞株（ベクター細胞株とも呼ばれる）を作製するために使用され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、パッケージング細胞株は、ヒト細胞株（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、それにより、ヒト血清における不活化を生存し得る組換えレトロウイルスの作製が、可能になる。
【０１５５】
本発明はまた、遺伝子送達ビヒクルとして機能し得る、アルファウイルスベースのベクターを使用する。このようなベクターは、広範な種類のアルファウイルスから構築され得、そのようなアルファウイルスとしては、例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）が、挙げられる。このようなベクター系の代表的例としては、米国特許第５，０９１，３０９号；同第５，２１７，８７９号；および同第５，１８５，４４０号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９２／１０５７８；ＷＯ９４／２１７９２；ＷＯ  ９５／２７０６９；ＷＯ  ９５／２７０４４；およびＷＯ  ９５／０７９９４に記載されるものが、挙げられる。
【０１５６】
本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのような、パルボウイルスを使用し得る。代表的例としては、ＷＯ  ９３／０９２３９においてＳｒｉｖａｓｔａｖａにより、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２〜３８２８（１９８９）により；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４〜１６５（１９８８）により；およびＦｌｏｔｔｅら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０：１０６１３〜１０６１７（１９９３）により開示される、ＡＡＶベクターが、挙げられる。
【０１５７】
アデノウイルスベクターの代表的例としては、Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２７（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４（１９９１）；ＷＯ  ９３／１９１９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．２１５〜２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｂｉｓｌｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０：１１４９８〜１１５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８〜２８４８（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７５：２０７〜２１６（１９９３）；Ｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４０３〜４０９（１９９３）；Ｃａｉｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１２８７〜１２９１（１９９３）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０〜１３４（１９９３）；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１：３７２〜３７８（１９９２）；ならびにＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ  １０１：１９５〜２０２（１９９２）により記載されるものが、挙げられる。本発明において使用可能な例示的アデノウイルス遺伝子治療ベクターとしてはまた、ＷＯ  ９４／１２６４９、ＷＯ  ９３／０３７６９；ＷＯ  ９３／１９１９１；ＷＯ  ９４／２８９３８；ＷＯ  ９５／１１９８４およびＷＯ  ９５／００６５５に記載されるものが、挙げられる。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７〜１５４（１９９２）に記載されるようなアデノウイルスを死滅させるために連結されたＤＮＡの投与は、使用され得る。
【０１５８】
他の遺伝子送達ビヒクルおよび遺伝子送達方法が、使用され得、これらとしては、アデノウイルスのみを殺傷するための、連結されたかまたは連結されていない、ポリカチオン性濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７〜１５４（１９９２））；リガンドに連結されたＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５〜１６９８７（１９８９）を参照のこと）；真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、１９９４年５月９日出願の米国特許出願番号０８／２４０，０３０および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）；光重合ヒドロゲル材料の沈着；携帯型遺伝子移入粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載される）；米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ  ９２／１１０３３に記載される電離放射線；核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられる。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：２４１１〜２４１８（１９９４）およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１５８１〜１５８５（１９９４）に記載される。
【０１５９】
裸ＤＮＡもまた、使用され得る。例示的裸ＤＮＡ導入法は、ＷＯ  ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取込み効率は、生分解性ラテックスビーズを使用して改善され得る。ＤＮＡコーティングラテックスビーズは、そのビーズによるエンドサイトーシス開始の後、細胞中に効率的に輸送さえる。この方法は、疎水性を増加するため、そしてそれにより、エンドソームの破壊および細胞質中へのＤＮＡの放出を容易にするためのこのビーズの処理によりさらに改善され得る。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ９５／１３７９６、ＷＯ  ９４／２３６９７、およびＷＯ  ９１／１４４４５、ならびにＥＰ番号０  ５２４  ９６８に記載される。
【０１６０】
使用に適切なさらなる非ウイルス送達としては、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２４）：１１５８１〜１１５８５（１９９４）に記載されるアプローチのような、機械的送達系が、挙げられる。さらに、コード配列およびそのような発現の生成物は、光重合ヒドロゲル材料の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達に使用され得る遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような携帯型遺伝子移入粒子銃の使用；米国特許第５，２０６，１５２号およびＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ９２／１１０３３に記載されるような、移入遺伝子を活性化するための電離放射線の使用が、挙げられる。
【０１６１】
本発明は、好ましい実施形態を含んで上記に記載されているが、以下の実施例は、本発明をさらに例証するために提供される。
【０１６２】
（実施例１）
（ヒトＥＳＴデータベースからの部分的ヒトＮｋｄ配列の同定）
図１に含まれる配列（配列番号２）を有するマウスＮｋｄ核酸配列を使用して、ＢＬＡＳＴシリーズのプログラム［Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：５５０９〜５５１３（１９９０）］を使用してヒトＥＳＴデータベース中の潜在的ヒトホモログを同定した。候補配列の多重アライメントを、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０（１９９９）］を使用して行った。
【０１６３】
この検索は、２つのヒットＡＩ１６７９１０およびＨ５５１４８を生じた。このＡＩ１６７９１０  ＥＳＴを順番付け、配列決定した。この配列分析により、マウスＮｋｄ配列と実質的な類似性を有するがこの遺伝子の５’末端を欠く、配列が、明らかになった。
【０１６４】
（実施例２）
（全長ｈＮｋｄのクローニング）
全長ｈＮｋｄを、レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）法とＲＴ−ＰＣＲ  ＲＡＣＥ法との組合せによって、クローニングした。全ＲＮＡを、レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）（Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ（ＣＡ））により、霊長類ヒト結腸癌細胞から抽出した。ＬＣＭを、当該分野で周知の方法によって実行した（Ｓｉｍｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｒｏｔｏｌ．１５６（ａ）：４４５〜４５２（２０００）を参照のこと）。これにより、実質的に均質な細胞サンプルを得るための特定の細胞型の単離が、提供される。
【０１６５】
５’末端を含む遺伝子全体を、上記のような結腸癌患者からＬＣＭにより得た全ＲＮＡ（ＲＮＡ  ｐｒｅｐ  ＩＤ＃  １００／サンプル１ｂ３５２１サンプル名ＵＣ−Ｃ２ＣＡ）から合成したｃＤＮＡを、ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡテンプレートとして使用して、製造業者のプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｋ１８１１−１）に従って、５’  ＲＡＣＥによりクローニングした。この製造業者のプロトコルは、下記に記載される：
５’  ＲＡＣＥプロトコル：
ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡテンプレートを、癌患者からＬＣＭにより単離したＲＮＡ（ＲＮＡ  ｐｒｅｐ  ＩＤ＃  １００／サンプルＩＤ３５２／サンプル名ＵＣ−Ｃ２ＣＡ）から、製造業者のプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｋ１８１１−１）に従って、合成した。増幅は、製造業者のプロトコルに従って、１Ｍ  ＧＣにてＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ−ｃＤＮＡ  ＰＣＲキット（Ｋ１９０７−１）を用いて、上記のｃＤＮＡテンプレートと、製造業者により提供されたユニバーサルプライマー混合物と、ヒトＮｋｄに特異的なプライマー（ＣＨ３０８：ＣＴＴＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＣＡＡＡＧＴＣ）とを使用して、実施した。ＰＣＲを、９４℃で０．５分間／５８℃で０．５分間／６８℃で２分間の３０サイクル、その後、９４℃で１分間／５８℃で１分間／６８℃で２分間の１０サイクルについて、実行した。最終回の伸長は、７２℃にて１０分間行った。このＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。正確な５’ＲＡＣＥ産物を保有する細菌クローンを、ネスティッドプライマー（ＣＨ３０６：ＣＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＡＡＣＴＴＣＡおよびＣＨ３０８：ＣＴＴＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＣＡＡＡＧＴＣ）を使用するＰＣＲスクリーニングによって、同定した。
【０１６６】
これにより、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域を含む、全長ｈＮｋｄ遺伝子の単離が生じる。この配列は、図１および図３（それぞれ、配列番号１および配列番号５）に含まれる。
【０１６７】
ヒトＮｋｄの核酸配列（５’非翻訳領域および３’非翻訳領域を含む）を、図１にあるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔにより整列する。ヌクレオチドレベルでｍＮｋｄとｈＮｋｄとが８５％同一であることが、このアライメントから理解され得る。さらに、このｈＮｋｄ  ＤＮＡ配列およびｍＮｋｄ  ＤＮＡ配列は、図３および図４（配列番号５および配列番号６）に、別々に示される。
【０１６８】
ヌクレオチド配列の再吟味により、このタンパク質配列を識別した。この配列は、図５および配列番号７に示される。これから、ｈＮｋｄタンパク質が、４７０アミノ酸長であることが、理解され得る。
【０１６９】
ｈＮｋｄおよびｍＮｋｄのアミノ酸配列が、図２において整列される。マウスＮｋｄのアミノ酸配列およびヒトＮｋｄのアミノ酸配列が、タンパク質レベルで８７％同一であること、ならびにマウスＮｋｄが、ヒトＮｋｄタンパク質より１つ少ないアミノ酸残基を含むことが、このアライメントから理解され得る。さらに、ｈＮｋｄについてのアミノ酸配列およびｍＮｋｄについてのアミノ酸配列が、図５および図６（配列番号７および配列番号８）に別個に示される。これらのタンパク質が、結合に関与する残基１３３〜１６８に相当する、同一のＥＦハンド領域を含むこともまた、理解され得る。
【０１７０】
（実施例３）
（ヒト染色体領域へのｈＮｋｄのマッピング）
直前の実施例において得た全長Ｎｋｄ核酸配列を使用して、Ｇｅｎｂａｎｋゲノム配列データベースをブラスト実行して、ｈＮｋｄを含む染色体領域を同定した。この配列は、ヒト第１６染色体から、２つのＢＡＣヒットを生じた。図７および図８に示されるように、ｈＮｋｄのコード領域全体は、１１個のエキソンからなる。これらのエキソンは、ヒト第１６染色体上の８６Ｋｂ領域にマッピングされ得る。配列分析によって、このゲノム配列が、５’ＲＡＣＥによりクローン化したｈＮｋｄ配列として、同一のコード領域および３’非翻訳領域を含むことが、明らかとなった。唯一の配列の差異は、Ｇｅｎｂａｎｋゲノム配列と比較した、５’ＵＴＲ中の２つのヌクレオチド変化である。この１１個のエキソン（非翻訳領域およびコード領域を含む）のヌクレオチド配列は、図７（配列番号９〜２２）に含まれる。この時点で、５’ＵＴＲ中のこの２つのヌクレオチド変化が、ｈＮｋｄ発現に対して何らかの効果を有するか否かは、未知である。
【０１７１】
（実施例４）
（融合タンパク質の調製）
ＧＳＴ融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１  ＤＥ３（ｐｌｙＳ）において発現させ、そしてグルタチオンビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製する。Ｍｙｃ−ｈＮｋｄタンパク質を、３５Ｓ−メチオニンの存在下でＴＮＴ共役（ＴＮＴ  ｃｏｕｐｌｅｄ）網状赤血球ライセートシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用するインビトロ転写および翻訳によって、調製する。この３５Ｓ標識ｈＮｋｄを、抗Ｍｙｃ抗体およびプロテインＡビーズによってかまたはグルタチオンビーズに固定したＧＳＴ融合タンパク質によって、４℃にて３時間沈殿させる。
【０１７２】
（実施例５）
（ｈＮｋｄによるＷｎｔシグナル伝達の阻害）
２９３細胞を、ホタルルシフェラーゼを発現するＬＥＦルシフェラーゼレポーター、ＬＥＦ−１発現ベクター、トランスフェクションコントロールとしてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現するｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、と、以下のプラスミド：ｐＣＤＮＡＨｉｓ３Ｃ  β−ガラクトシダーゼ；ｐＣＧＷｎｔ−１プラスｐＣＤＮＡＨｉｓ３Ｃ  βガラクトシダーゼ；ｐＣＧＷｎｔ−１プラスｐＣ５２＋ＭｙｃｈＮｋｄ；ｐＣ５２＋ＭｙｃｈＮｋｄ単独とで同時トランスフェクトした。各サンプルのＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポーター活性を、製造業者の指示書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、測定し、そして標準化した。
【０１７３】
詳細には、２９３細胞を、１２ウェルプレートにおいて増殖させた。細胞を、ＬＥＦ−１、ＬＥＦ−１レポーター、Ｒｅｎｉｌｌａと、β−ガラクトシダーゼ、ｈＮｋｄ、Ｗｎｔ−１プラスβガラクトシダーゼ、またはＷｎｔ−１プラスｈＮｋｄの発現構築物でトランスフェクトした。トランスフェクション３６時間後の相対的ルシフェラーゼ活性を、測定した。
【０１７４】
この実験のデータの平均を、図１４に含める。これらの結果に基づいて、ｈＮｋｄが、２９３細胞におけるルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、Ｗｎｔ−１シグナル伝達を阻害したことが、理解され得る（この図において、ＲＬＶは、相対的ルシフェラーゼ単位を指す）。
【０１７５】
（実施例６）
（正常なヒト細胞株およびヒト細胞組織とヒト癌細胞株およびヒト癌組織における、ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡの発現）
（正常組織）
ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを、脳、男性心臓、腎臓、肝臓、肺、結腸、骨髄、小腸、脾臓、胃、胸腺、前立腺、骨格、筋肉、精巣、子宮、胎児脳、胎児肝臓、脊髄、胎盤、副腎、膵臓、唾液腺、気管、および乳腺において、リアルタイム定量ＰＣＲにより測定した。すべての組織におけるｈＮｋｄの発現を、β−グルクロニダーゼのレベルに対して標準化した。この比は、１．００Ｅ−０３（骨髄において最低の発現）〜４．００Ｅ−０２（脊髄において最高の発現）の範囲であった。この実験の結果は、図１５にあり、これは、ｈＮｋｄの基礎ｍＲＮＡレベルが、正常な組織では低いことを示す。
【０１７６】
（癌細胞株）
ヒト細胞株のコレクションを、ＡＴＣＣにより推奨される培地にて増殖させた。このコレクションは、Ｃａｇｏ．２、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、Ｃｏｌｏ  ３２０  ＤＭ、Ｔ８４、ＨＣＴ１５、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＯＶＯ、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６（結腸癌細胞株）；１８４Ｂ５（初代乳房細胞株）；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ａｌａｂ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌細胞株）；ＤＵ１４５、ＬＮＣＡＰ、ＷＯＣＡ、ＰＣ３、ＧＲＤＰ２（前立腺癌細胞株）；ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３（卵巣癌細胞株）；ＩＭＲ９０（初代線維芽細胞株）；８４７（ＳＶ４０形質転換線維芽細胞株）；ＨＴ１０８０（線維肉腫細胞株）；Ａ−４３１（類表皮癌細胞株）；Ｕ３７３ＭＧ（神経膠芽腫細胞株）；ＮＣＩＨ２３（非小細胞肺癌細胞株）；ＨＭＶＥＣ（内皮細胞株）を含んだ。全ＲＮＡの抽出後、ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて合成し、そして定量リアルタイムＰＣＲ分析において使用して、その中のアクチンｍＲＮＡのレベルに対して標準化したｈＮｋｄ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。これらの結果は、図１６に含まれ、そして、ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡが、結腸癌株においてのみ高レベルで発現され、試験したヒト癌細胞株の他の型においては高レベルでは発現されなかったことを、示す。
【０１７７】
（実施例７）
（ｈＮｋｄによるＪＮＫの活性化）
ＪＮＫアッセイを、改変を加えて、記載された［Ｂｏｕｔｒｏｓら、Ｃｅｌｌ  ９４：１０８〜１１８（１９９８）］ように実行する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、６ウェルプレート中で、１０％仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地において対数増殖まで増殖させる。この細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥプラス試薬（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、トランスフェクトする。トランスフェクションの２２時間後に、細胞を、ＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解する。等量のサンプルを、トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）により分離させ、ニトロセルロース膜上にトランスファーする。この膜を、ｃ−ＪｕｎのＮ末端の６３位にあるリン酸化セリンを認識するＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ  ｃ−Ｊｕｎ（Ｓｅｒ６３）ＩＩ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてブロッティングする。その後、同じ膜を、ストリッピングし、そして、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてブロッティングして、発現された、Ｘ−ｐｒｅｓｓタグ化ｈＮｋｄおよびβ−ガラクトシダーゼの量を検出する。同じ膜を再びストリッピングし、そして抗ＧＡＰ抗体を用いてブロッティングして、ローディングコントロールとして、各サンプル中のＧＡＰの量を検出する。
【０１７８】
リン酸化ｃ−Ｊｕｎバンドの強度の増加が存在することが、予期される。
【０１７９】
（実施例８）
（哺乳動物組織におけるｈＮｋｄの発現）
哺乳動物組織におけるｈＮｋｄの発現を、ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して調査する。このＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔを、ｈＮｋｄの放射標識フラグメントとハイブリダイズさせる。このフラグメントは、ｈＮｋｄのＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ結合ドメインを含む。分析されるべき組織としては、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、筋肉、腎臓、および精巣が、挙げられる。
【０１８０】
（実施例９）
（ＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄとのｈＮｋｄの相互作用）
ベクターｐＣＤＮＡ３．ＩＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）においてｈＮｋｄ、ｈＮｋｄ−δ  ＥＦハンド、またはＧＦＰ遺伝子を発現するＣｏｓ７細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎとプロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）とを含む緩衝液において、溶解する。全細胞溶解物を、モノクローナルＤｖｌ抗体１、２、および３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて免疫沈降させ、そしてＸｐｒｅｓｓ抗体を用いてブロッティングする。ｈＮｋｄのＥＦドメインがｍＮｋｄのＥＦドメインと同様に挙動することを予期すると、このＥＦハンドにおけるＮｋｄ変異は、ＤｖｌへのｈＮｋｄの結合に対して有意な効果は有さないはずである。この仮説を試験するために、Ｍｙｃタグ化Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、ＤＤ２を含むＭｙｃタグ化Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄフラグメント、ＤｓｈのＮ末端ドメインまたはＣ末端ドメインを含むＭｙｃタグ化Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄフラグメント、およびｈＮｋｄ変異体を発現する、Ｃｏｓ７細胞からの細胞溶解物を、Ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いて免疫沈降させ、Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いてブロッティングする。ｈＮｋｄ変異体は、ネイティブｈＮｋｄと比較して変化したＥＦハンド中の１アミノ酸または２アミノ酸を有する部位特異的変異誘発によって作製する。
【０１８１】
別の実験において、３５Ｓで標識したＭｙｃタグ化ｈＮｋｄタンパク質を、抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降させるか、またはＧＳＴ融合タンパク質により沈降させる。この免疫複合体を、電気泳動およびオートラジオグラフィーに供する。細菌由来のＧＳＴ融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離させ、クーマシーブルー染色する。ｈＮｋｄがｍＮｋｄと同様に挙動すること、および３５Ｓ−ｈＮｋｄが、ＰＤＺおよび隣接Ｎ末端塩基性アミノ酸残基を含むがＤｓｈのＮ末端ドメインもＣ末端ドメインも含まないＤｓｈフラグメントと結合することが、予期される。
【０１８２】
（実施例１０）
（哺乳動物細胞におけるＷｎｔ応答性ＬＥＦ−１レポーター活性に対する、ｈＮｋｄおよびｈＮｋｄのＥＤハンド変異の効果）
ｍＮｋｄ転写は、Ｗｎｔおよび塩化リチウム処理誘導性である。ｈＮｋｄ転写が、同様に誘導性であることが、予期される。この仮説を試験するために、ＨＥＫ  ２９３細胞を、１２ウェル培養プレート中２×１０５／ウェルで播種する。各ウェルを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を合計０．５４μｇのＤＮＡとともに使用して、トランスフェクトする。このトランスフェクトＤＮＡは、０．０２μｇのＬＥＦ−１、０．２μｇのルシフェラーゼレポーター［Ｈｓｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９１８（１９９８）］、０．０２ｇのｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および０．１μｇのｐＣＧＷｎｔ−１と０．２μｇのｐＣＤＮＡ３．１ＨｉｓＣ  ＧＦＰ、ｈＮｋｄ、またはその誘導体のいずれかとの組合せを含む。ＥＦハンドにおける変異またはＥＦハンドの欠失を含むサンプル（Ｗｎｔ−１はトランスフェクしない）において、ＧＦＰ、ｈＮｋｄまたはｈＮｋｄ誘導体単独（０．３μｇまたは０．１μｇ）を、トランスフェクトする。ＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポーター活性を、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、測定して標準化する。この結果は、ｈＮｋｄがβカテニン活性化ＬＥＦ−１レポーター発現を阻害しないことを示し、ｈＮｋｄが標準Ｗｎｔシグナル伝達を負に調節することを示し、ＥＦハンドの点変異および欠失が、Ｗｎｔ媒介転写応答をｈＮｋｄが阻害する能力を損なうことを示すことが、予期される。
【０１８３】
マウス肝臓上皮細胞を、Ｗｎｔ−３ａ馴化培地またはＮｅｏコントロール培地のいずれかで、９時間、１９．５時間、または２７時間処理する。４０ｍＭ  ＬｉＣｌを含む増殖培地または含まない増殖培地を使用して、細胞を１６時間処理する。適切なプライマーを、ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用して、ｈＮｋｄおよびＧＡＰＤＨをそれぞれ増幅する。
【０１８４】
（実施例１１）
（Ｘｅｎｏｐｕｓ胚におけるｈＮｋｄの効果）
発生Ｘｅｎｏｐｕｓ胚は、Ｗｎｔシグナル伝達についての有効なインビボアッセイを提供する。なぜなら、この経路の異所性腹側活性化は、異所性背側構造を誘導するからである。ｍＮｋｄのＸｗｎｔ−８  ｍＲＮＡの５〜１０ｐｇの腹側注射は、６０％以上の胚において第２の軸を誘導することを示した。正規のＷｎｔ誘導されたＬＥＦ−１依存性転写を阻害するｍＮｋｄの能力と一致して、３５ｐｇのｈＮｋｄ  ｍＲＮＡの注射は、同時注射されたＸｗｎｔ−８の活性を抑制することが予想された。高用量のｈＮｋｄの同時注射は、いっそう少ない第２の軸を生じるはずである。なぜなら、非常に高用量のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄの腹側発現が異所性頭部構造を誘導することが報告されているからである（Ｚｅｎｇら；（２０００））。
【０１８５】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの脊椎動物同族の平面内極性経路は、脊椎動物発生の間の収斂に伸びる移動を制御する。ＸｅｎｏｐｕｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの両方において、この経路の超活性化は、正規のＷｎｔシグナル伝達と独立した細胞極性表現性を誘発する。ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）の野生型Ｄｓｈの過剰発現は、上皮平面内極性を破壊し、一方、Ｘｅｎｏｐｕｓにおいて、野生型Ｘｄｓｈ、Ｘｆｚ−８またはＸｆｚ−７の過剰発現は、細胞極性を破壊し、そして収斂した伸長を阻害する。従って、収斂した伸長は、脊椎動物の平面内極性シグナル伝達の有効なインビボアッセイを示す。
【０１８６】
インビトロにおいてＪＮＫを活性化するというその予期された能力と一致して、ｈＮｋｄの過剰発現は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＮｋｄおよびマウスＮｋｄと類似した様式で、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚の正常な伸張を阻害するはずである。収斂した伸長に対するｈＮｋｄのこの効果をより直接的に評価するために、背側中胚葉の片側（ｏｐｅｎ−ｆａｃｅ）Ｋｅｌｌｅｒ外植片を調べた。Ｘｅｎｏｐｕｓ胚を、４細胞段階の２つの背側割球または２つの腹側割球のいずれかにインビトロ転写したｍＲＮＡを用いて注射し、そして表現型のスコア付けのために、３０段階まで１／３×ＭＭＲにおいて培養する。Ｋｅｌｌｅｒ外植片を、ｓｔ．１０．２５で切断し、ｓｔ．２０まで１×Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ中でカバーガラスの下で培養する。
【０１８７】
コントロールＸｅｎｏｐｕｓ胚を、二次的な軸を発生する５〜１０ｐｇのＸｗｎｔ−８  ｍＲＮＡを用いて腹部注射する。ｈＮｋｄとＸｗｎｔ−８との同時発現は、Ｘｗｎｔ−８単独と比較して、二次的な軸形成の頻度ならびに完全な二次的軸の比率を減少する。
【０１８８】
発生Ｘｅｎｏｐｕｓ胚におけるｍＮｋｄの背側発現は腹背軸の正常な伸長および直線性を阻害したので、ｈＮｋｄを用いて類似の結果が予想される。初期の構造の正常な形成（例えば、ｍＮｋｄを発現する胚において）は、その表現型が腹側形成の結果ではないこと示し、これは、ｍＮｋｄが収斂の伸張を阻害することを示唆する。同様に、背側周辺領域のコントロール外植片は伸張し、そして形状を有意に変化させたが、ｍＮｋｄを発現する外植片は、伸張もせず形状を変化もしなかった。ＤＮ−ＧＳＫ３の同時発現による正規のＷｎｔ経路の下流活性化は、収斂の伸張に対するｍＮｋｄの効果をレスキューしなかった。
【０１８９】
この実験の結果は、コントロール胚から作製した外植片は有意に伸張したが、ｈＮｋｄを発現する胚から作製した外植片は、伸張しなかったことを示す。これらの予期された結果は、平面内極性カスケードの他の野生型成分（Ｘｄｓｈ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−７、およびＷｎｔ−１１を含む）の過剰発現によって誘発される結果と類似する。
【０１９０】
ｈＮｋｄはＷｎｔ経路の潜在的なインヒビターであると予想されるので、収斂の伸張に対するｈＮｋｄの効果がこの活性から生じ得るか否かを試験することが重要である。ＤＮ−ＧＳＫ３（これは、正規のＷｎｔシグナル伝達を強力に活性化する（Ｐｉｅｒｃｅ、１９９５））とｈＮｋｄの実験を実行したが、収斂の伸張のレスキューは見出されなかった。ｍＮｋｄがＪＮＫを活性化する能力と組み合わせて、これらのデータは、ｍＮｋｄが平面内極性シグナル伝達カスケードを過剰に刺激することによって、収斂の伸張を阻害することが示される。
【０１９１】
本発明者らは、特定の作用機構に束縛されないが、ｍＮｋｄを用いて実行した実験に基づいて、正規のＷｎｔシグナル伝達は本明細書中のｈＮｋｄによって阻害され、ｈＮｋｄは正規ではない平面内極性経路を活性化し、ｈＮｋｄはＤｓｈに結合するということが、予想される。従って、ｈＮｋｄはＤｓｈを正規の経路からシャットダウンして平面経路に入れることに関与し得ることが、予想される。このことは、ｈＮｋｄを、正規のＷｎｔ経路と正規ではないＷｎｔ経路との間のの分岐を決定する重要なレギュレーターにする。
【０１９２】
（実施例１２  ｍＮｋｄに結合し得る抗体）
ｈＮｋｄまたはそのフラグメントに対する抗体を、以下のように調製した。ウサギまたは他の適切な哺乳動物もしくは動物に、ｈＮｋｄポリペプチドまたはその配列番号７を有するタンパク質の少なくとも２０アミノ酸を含む抗原性フラグメントを注射し、続いて、適切な間隔でブーストした。動物を採血し、そして血清を、精製したｈＮｋｄタンパク質またはそのフラグメントに対してアッセイした。抗ｈＮｋｄ抗体を産生するためのペプチド配列としては、その少なくとも２０個連続するアミノ酸を含むｈＮｋｄのフラグメントが挙げられる。
【０１９３】
好ましくは、ｈＮｋｄに特異的に結合するがマウスＮｋｄまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄに明らかに結合しない抗体が、選択される。ｈＮｋｄに特異的に結合するがマウスＮｋｄまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄに結合しないモノクローナル抗体が、免疫した動物由来のＢ細胞からハイブリドーマを産生すること、およびヒトＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄに特異的に結合するがマウスＮｋｄまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄに実質的に結合しないモノクローナル抗体を産生するものを選択することによって、得られる。ｈＮｋｄの異なる部分（例えば、ＥＦハンド）に対して結合する抗体が、好ましくは選択される。
【０１９４】
（実施例１３  抗ｈＮｋｄ抗体を用いる乳癌の処置）
異常なＷｎｔシグナル伝達を含む癌（特に、乳癌）を有する患者を、薬学的に受容可能なキャリアを含む、本発明に従う抗ｈＮｋｄ抗体の治療有効量を投与することによって、処置する。
【０１９５】
この投与は、所望の治療応答が達成されるまで、必要である場合繰り返す。
【０１９６】
（実施例１４  Ｗｎｔシグナル伝達を含む癌の検出）
被験体を、本発明に従う抗ｈＮｋｄ抗体を用いてこのような被験体の血清中のｈＮｋｄタンパク質の量を測定し、そしてこれらのレベルをコントロール血清サンプル（正常な患者の血清）に対応させることによって、ｈＮｋｄの異常な発現を含む癌の存在についてスクリーニングする。これらのレベルが正常血清サンプル中のｈＮｋｄレベルを実質的に超えた場合、陽性の診断がなされる。
【０１９７】
（実施例１５  ｍＮｋｄ  ｍＲＮＡは、Ｗｎｔリガンドによって誘導される）  漸増する量のβ−カテニンに対する細胞培養物の曝露の際の、ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルに対する効果を決定する実験を実行した。これらの結果を、図１０に含ませ、８時間、１９．５時間および２７時間の期間での増加したβ−カテニンの量が、増加したｍＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルによって実証されるように、ｍＮｋｄ発現の誘導を生じることが示される。コントロールとして、コントロール遺伝子（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）は、ｍＲＮＡレベルのこのような増加を示さなかった。これらの結果は、ｍＮｋｄがＷｎｔ／β−カテニン経路のネガティブフィードバックループの一部であり得ることを示唆する。
【０１９８】
（実施例１６  ｈＮｋｄおよびβ−カテニンｍＲＮＡレベルの割合に対する、アンチセンスオリゴの影響）
特定の癌（特に、結腸癌）におけるｈＮｋｄ遺伝子の関与を確認するために、結腸癌細胞ＳＷ６２０を、β−カテニンＲＣ／ＡＳオリゴで処理した。具体的にいうと、ＳＣ６２０細胞を、以下のアンチセンスオリゴで試験した：ＣＨＩＲ３０−５ＡＳ  ５’−ＡＣＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＡＧＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣ−３’、および逆方向コントロールオリゴであるＣＨＩＲ３０−５ＲＣ  ５’−ＣＧＧＡＣＴＧＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＴＣＧＡＣＴＣＡ−３’。この実験を以下のように記載する。
【０１９９】
（アンチセンスアッセイ）ＳＷ６２０細胞を、１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞を、アンチセンスβ−カテニンオリゴ（ＡＳ）または逆方向コントロールオリゴ（ＲＣ；異なる配向の同じヌクレオチド配列）を用いて、会社の特許のあるトランスフェクション試薬を用いて１００μＭの最終濃度でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、そして総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。逆転写および定量的ＲＮＡ分析を、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムを用いることによって、実行した。
【０２００】
（ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルは、β−カテニンによって調節される）ＳＷ６２０は、Ｗｎｔシグナル伝達の遺伝子における変異に起因して、アップレギュレートされた細胞質β−カテニンレベルを有する、結腸癌細胞株である。ＳＷ６２０細胞のβ−カテニンアンチセンス処理は、β−カテニンのｍＲＮＡレベルを特異的にダウンレギュレートし、このことは、逆方向コントロールオリゴ（ＲＣ）を用いて処理した細胞のβ−カテニン  ｍＲＮＡレベルと比較した、β−カテニンアンチセンス（ＡＳ）を用いて処理した細胞のβ−カテニン  ｍＲＮＡレベルにおける８０％以上の低下によって実証される。これらの結果を、図１１に示す。β−カテニンタンパク質レベルもまた、β−カテニンアンチセンス処理したサンプルにおいてダウンレギュレートされる（データは示していない）。同様に、β−カテニンアンチセンスで処理した細胞のｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルもまた、逆方向コントロールオリゴを用いて処理した細胞のｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルよりも８０％低い。ネガティブコントロールとして、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルを決定し、β−カテニンアンチセンス処理または逆方向コントロール処理のいずれによっても、影響されなかった。従って、β−カテニンアンチセンスを用いて処理した細胞のＧＡＰＤＨと逆方向コントロールオリゴを用いて処理した細胞のＧＡＰＤＨの割合は、１に等しい。
【０２０１】
（実施例１７  結腸癌サンプルおよび正常組織におけるｈＮｋｄ  ＲＮＡの分布）
ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルが細胞培養物におけるβ−カテニンの増加によってアップレギュレートされるという本発明者らの発見に基づいて、そしてさらに、ｈＮｋｄプロモーター中の多数のＴＣＦ結合エレメントを本発明者らが同定したことに基づいて、本発明者らは、ｈＮｋｄレベルが正常なヒトと比較して、結腸癌患者において上昇していることを予想した。実際、以下により詳細に記載するように、ｈＮｋｄ  ＲＮＡレベルは、正常培養物と比較して、約７０％の結腸癌サンプル中で有意に上昇していることが見出された。
【０２０２】
（結腸癌サンプルおよび匹敵する患者の正常サンプルにおけるｈＮｋｄメッセンジャーＲＮＡレベルの定量的分析）ｍＲＮＡを、レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）で調製した結腸癌サンプルから単離した。逆転写反応を、ＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、そのキットに提供されるランダムプライマーによって実行した。定量的ＲＮＡ分析を、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムを用いることによって実行した。
【０２０３】
（ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルは、結腸癌患者においてアップレギュレートされる）
８０％を超える結腸癌患者が、細胞質β−カテニンレベルのアップレギュレーションを生じるＷｎｔ経路の異常な調節を有する。ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルはβ−カテニンの量によって調節されるので、本発明者らは、２８対の、結腸癌サンプルおよび匹敵する患者の正常サンプルにおけるｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを調べた。これらの結果を、図１２に含ませ、そして６８％の結腸癌患者が、上昇したｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを有することを示し、このことは、β−カテニンがｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを調節するという本発明者らの知見と一致する。
【０２０４】
（実施例１８）
上記の結果に基づいて、ｈＮｋｄ発現を、結腸癌を診断するためのマーカーとして使用する。結腸サンプルを、結腸癌について試験される被験体から得る。ｈＮｋｄ  ＲＮＡのレベルを測定し、そして正常コントロール中のｈＮｋｄ  ＲＮＡレベルに対して比較する。被験体がコントロールと比較して増大したｍＮｋｄ  ＲＮＡレベルを示すか否かに基づいて、陽性の結腸癌診断をした。
【０２０５】
（実施例１９  レポーターの発現をダウンレギュレートする低分子インヒビターについてスクリーニングするための、ｈＮｋｄプロモーターの使用）
ｈＮｋｄプロモーターを使用して、プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現をダウンレギュレートする低分子を同定する。例えば、複数ＴＣＦ結合エレメント（ＣＴＴＴＧＡ／ＴＡ／Ｔ）を含むことが見出されたｈＮｋｄプロモーターを含むＤＮＡ構築物（図１３に図示される）を、緑色蛍光タンパク質のコード配列に作動可能に連結させ、そして適切な哺乳動物細胞株に導入する。次いで、この細胞株を異なる低分子と接触させ、そしてレポーター発現に対するその効果を測定する。レポーター発現をダウンレギュレートする低分子を、選択する。これらの分子は、潜在的に、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の異常な調節を含む疾患（特に、癌（例えば、結腸癌））を処置する際に有用である。
【０２０６】
本発明は、特定の実施形態を参照して記載してきた。しかし、本出願は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得る変更および置換をカバーすることが意図される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、マウスＮｋｄおよびヒトＮｋｄのコード領域ならびに５’および３’非コード領域の核酸配列［それぞれ、配列番号１および配列番号２］の整列を含む。
【図２】
図２は、ヒトＮｋｄ（「ｍｄａｐ．ｐｅｐ」）およびマウスＮｋｄのアミノ酸配列［それぞれ、配列番号３および配列番号４］の整列を含む。
【図３】
図３は、ヒトＮｋｄのヌクレオチド配列［配列番号５］を含む。
【図４】
図４は、マウスＮｋｄのヌクレオチド配列［配列番号６］を含む。
【図５】
図５は、ヒトＮｋｄのアミノ酸配列［配列番号７］を含む。
【図６】
図６は、マウスＮｋｄのアミノ酸配列［配列番号８］を含む。
【図７】
図７は、ｈＮｋｄの推定プロモーター、ならびに５’ＵＴＲ、コード配列、および３’ＵＴＲのエキソン（エキソン１〜１１）の核酸配列［配列番号９〜２２］を含む。
【図８】
図８は、ｈＮｋｄ遺伝子のコード領域ならびに５’および３’非翻訳領域（エキソン１〜１１に含まれる）を、ヒト第１６染色体の８６Ｋｂ領域にマッピングした概略図を含む。
【図９】
図９は、Ｗｎｔ／Ｂカテニン経路を示し、そして特に、細胞増殖を促進する遺伝子を同定する。
【図１０】
図１０は、経時的に漸増する量のβ−カテニンに曝された細胞培養物におけるｍＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを比較したインビトロ実験の結果を含む。
【図１１】
図１１は、ＳＷ６２０細胞をβ−カテニンアンチセンスまたは逆コントロールオリゴで処理し、そしてＳＷ６２０  ｈＮｋｄ、ＳＷ６２０  β−カテニンｍＲＮＡ、およびコントロールＳＷ６２０ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルの比率を処理後に測定した実験の結果を含む。
【図１２】
図１２は、癌／正常結腸組織におけるｈＮｋｄレベルの比率を示す。
【図１３】
図１３は、ｈＮｋｄプロモーターを調節する低分子を同定するために使用された構築物を図解により示す。
【図１４】
図１４は、２９３細胞における２つのルシフェラーゼレポーターアッセイ実験において獲得されたデータの平均を含む（「ＲＬＶ」は、「相対的ルシフェラーゼ単位」である）。
【図１５】
図１５は、種々の正常組織におけるｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを測定したＰＣＲ実験の結果を含む（この実験において、このデータを、β−グルコロニダーゼのレベルに対して正規化した）。
【図１６】
図１６は、ヒト結腸癌細胞株を含む種々のヒト細胞株におけるｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを測定したリアルタイムＰＣＲ実験の結果を含む（この実験において、結果を、アクチンのレベルに対して正規化した）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月2日(2005.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】  明細書
【特許請求の範囲】
【請求項１】  単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号７に記載の少なくともアミノ酸２〜４６０をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸１〜４６０をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号７を有するヒトＮｋｄポリペプチドの少なくともアミノ酸２〜４６０をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド相補体；あるいは
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一なポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、
単離された核酸分子。
【請求項２】  配列番号７の少なくともアミノ酸２〜４６０をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】  配列番号７のアミノ酸１〜４６０をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】  配列番号５のコード領域を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】  配列番号５のコード領域の少なくとも５０個連続するヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項６】  配列番号５のコード領域の少なくとも２００個連続するヌクレオチドを含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】  配列番号５のコード領域の少なくとも５００個連続するヌクレオチドを含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】  配列番号５のコード領域の少なくとも７５０個連続するヌクレオチドを含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】  配列番号５のコード領域を構成する１４１６ヌクレオチドを含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】  配列番号５のコード領域に少なくとも９０％同一な核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１１】  配列番号のコード領域に少なくとも９５％同一な核酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】  配列番号５のコード領域によってコードされるタンパク質に少なくとも９５％同一なポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１３】  単離された核酸分子であって、該核酸分子は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、以下：
（ａ）配列番号７のアミノ酸２〜４６０；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸１〜４６０；
（ｃ）配列番号７の非ヒト霊長類ホモログのアミノ酸２〜４６０；
（ｄ）配列番号７の非ヒト霊長類ホモログのアミノ酸１〜４６０、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
単離された核酸分子。
【請求項１４】  プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、組み換えベクター。
【請求項１５】  プロモーターに作動可能に連結された請求項５に記載の単離された核酸分子を含む、組み換えベクター。
【請求項１６】  プロモーターに作動可能に連結された請求項１２に記載の単離された核酸分子を含む、組み換えベクター。
【請求項１７】  請求項１４に記載の組み換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】  請求項１５に記載の組み換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】  請求項１６に記載の組み換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２０】  ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、該ポリペプチドが発現する条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２１】  ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、該ポリペプチドが発現する条件下で請求項１８に記載の宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２２】  ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、該ポリペプチドが発現する条件下で請求項１９に記載の宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
【請求項２３】  単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号７のアミノ酸１〜４６０；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸２〜４６０；
（ｃ）配列番号７を有するポリペプチドの非ヒト霊長類ホモログまたは該ホモログの少なくとも４６０個連続するアミノ酸を含む該ホモログの一部、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも９５％同一なアミノ酸を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２４】  単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を除いて、以下：
（ａ）配列番号７のアミノ酸１〜４６０；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸２〜４６０；
（ｃ）配列番号７に対応するポリペプチドの非ヒト霊長類ホモログまたは該ホモログの少なくとも４６０個連続するアミノ酸を含む該ホモログの一部、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、
単離されたポリペプチド。
【請求項２５】  単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号７のアミノ酸１〜４６０；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸２〜４６０；
（ｃ）配列番号７を有するポリペプチドの全長非ヒト霊長類ホモログまたは該ホモログの少なくとも４６０個連続するアミノ酸を含む該ホモログの一部、
からなる群から選択されるアミノ酸を含む、
単離されたポリペプチド。
【請求項２６】  ｈＮｋｄに特異的に結合するが、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄに特異的に結合しない抗体の産生を誘発する、配列番号７のポリペプチドのフラグメント。
【請求項２７】  配列番号７の少なくとも５０個連続するアミノ酸を含む、請求項２６に記載のフラグメント。
【請求項２８】  配列番号７のヒトＮｋｄポリペプチドまたはその非ヒト霊長類ホモログに特異的に結合するが、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄに認められ得る程度に結合しない、単離された抗体。
【請求項２９】  モノクローナル抗体である、請求項２８に記載の単離された抗体。
【請求項３０】  ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の単離された抗体。
【請求項３１】  配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質または該タンパク質の全長非ヒト霊長類ホモログおよびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質（Ｄｓｈ）を含む、複合体。
【請求項３２】  配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質のフラグメントまたは該フラグメントの非ヒト霊長類ホモログのフラグメントおよびＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質（Ｄｓｈ）を含む、複合体。
【請求項３３】  前記フラグメントが、配列番号７に示されるポリペプチドのＥＦハンド領域を含む、請求項３２に記載の複合体。
【請求項３４】  哺乳動物細胞のＷｎｔシグナル伝達を阻害する方法であって、該方法は、配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質またはその全長非ヒト霊長類ホモログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】  請求項３４に記載の方法であって、前記哺乳動物細胞は、配列番号７をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換される、方法。
【請求項３６】  異常なＷｎｔシグナル伝達を含む癌を処置する方法であって、該方法は、配列番号７を有するポリペプチド、該ポリペプチドの非ヒト霊長類ホモログ、またはこれらのフラグメントの治療有効量を投与する工程を包含し、該フラグメントは、ｈＮｋｄポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生を誘発する配列番号７の少なくとも２０個連続するアミノ酸を含む、方法。
【請求項３７】  請求項３６に記載の方法であって、前記癌は、結腸癌、頭頸部癌、卵巣癌および乳癌からなる群から選択される、方法。
【請求項３８】  異常なＷｎｔシグナル伝達を潜在的に含む癌の型を診断する方法であって、該方法は、ヒト患者から得たヒト癌細胞が、配列番号５を有するコード配列と異なるコード配列を有するヒトＮｋｄ遺伝子を含むか否かを検出する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮出願番号６０／２５２，８８４（２０００年１１月２７日出願）および米国仮出願番号６０／２９１，１０９（２００１年５月１６日出願）、および米国仮出願番号６０／３２５，５７１（２００１年１０月１日出願）からの優先権を主張する。これらの出願は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節因子であるタンパク質およびヒトまたは非ヒト霊長類タンパク質をコードする対応する核酸配列、このタンパク質のフラグメントまたは改変体、ならびにこの核酸配列またはタンパク質を治療または診断用途に使用する方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）と呼ばれるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子は、細胞膜から核へのｗｉｎｇｌｅｓｓシグナルを運搬するタンパク質鎖の成分である細胞内調節タンパク質をコードする。Ｄｓｈは他の脊椎動物において発現され、そして十分に保存された構造を有する［Ｍｉｌｌｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
１８：７８６０（１９９９）；Ａｅｌｒｏｄら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２１６０（１９９８）；Ｂｏｕｔｒｏｓら、Ｃｅｌｌ  ９４：１０９（１９９８）；Ｌｉｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：４２３３（１９９９）］。今日までに研究されている全てのＤｓｈタンパク質は、３つの高度に保存されたドメインを有する。これらの中で、Ｎ末端ＤＩＸドメインはまた、ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナルの負のレギュレーターであるＡｘｉｎにも存在する。中間ＰＤＺドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインであることが示されている。さらに、Ｃ末端ＤＥＰドメインは、Ｇタンパク質シグナル伝達に関係する［Ａｘｅｌｒｏｄら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２１６０（１９９８）；Ｂｏｕｔｒｕｓら、Ｃｅｌｌ  ９４：１０９（１９９８）；およびＬｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：４２３３（１９９９）］。
【０００４】
ｗｉｎｇｌｅｓｓ経路において役立っていることに加えて、Ｄｓｈはまた、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける、Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）を活性化する平面内極性経路（ｐｌａｎａｒ  ｐｏｒａｌｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ）に必須である。今日までのいくつかの系列の証拠は、Ｄｓｈが、これらの２つの異なる経路に示差的に補充されることを示唆する。Ｄｓｈの第３の既知の機能は、Ｎｏｔｃｈと相互作用する（おそらく、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達をブロックすることにより）ことである。
【０００５】
Ｗｇ／Ｗｎｔリガンドおよびそれらのレセプターｆｒｉｚｚｌｅｄは、少なくとも２つの経路に関係する。１つの経路は、細胞増殖、発達、および腫瘍形成に対する効果を発揮するβ−カテニン経路を介する。この経路のいくつかの成分、β−カテニン、ＡＰＣ、アキシン、ならびにいくつかのＷｎｔリガンドおよびレセプターが、種々のヒト癌において変異しているかまたは誤発現していることが報告されており、このことは、この経路が、腫瘍形成に関係し得ることを示唆する［ＳｍａｌｌｅｙおよびＤａｌｅ、Ｃａｎｃ．Ｍｅｔａｓｔ  Ｒｅｖ．１８（２）：２１５−２３０（１９９９）］。もう一方の経路は、Ｒｈｏおよびｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼを通って表皮構造における平面内極性を確立する。この経路は、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＰＣＰおよび収斂伸長運動を制御する［Ｓｈｕｍａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１４：４５２（１９９８）；ＴａｄａおよびＳｍｉｔｈ、Ｄｅｖｅｌ．１２：２２２７（２０００）；Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：８１（２０００）］。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄは、両方の経路に必要とされる近位の下流成分である。
【０００６】
示されているように、異なるｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターは、可変性の固有のシグナル伝達能力を有し、そして少なくとも２つの同定された異なる経路に関係するが、両方とも伝達成分としてＤｓｈを利用する。従って、２つの構造的に関連するレセプターは、共通のタンパク質を通して（しかし、異なるエフェクター経路を介して）シグナル伝達する［ＢｏｕｔｒｏｓおよびＭｌｏｄｚｉｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１８２５−１８２８（２０００）］。例えば、ｆｒｉｚｚｌｅｄレセプターＦｚ１およびＦｚ２の両方は、膜に対してＤｓｈを効果的に補充し、このことは、異なる細胞下のＤｓｈの局在化が、シグナル伝達の効果および特異性を決定しないことを示唆する［Ｂｏｕｔｒｏｓら（２０００）（同書）］。Ｂｏｕｔｒｏｓらはまた、その中で、Ｆｚ２がＷｎｔ−β−ｃａｔシグナル伝達の強力なアクチベーターであり、Ｆｚ１が平面内極性経路の強力なアクチベーターであるが、これら両方のレセプターはいずれかの経路を相互活性化する固有の能力を有することを報告している［Ｂｏｕｔｒｏｓら（２０００）（同書）］。
【０００７】
高等生物におけるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄの正確な機能は未だ明らかにされていないが、マウスＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ１（ｍＤｖｌ  １）を欠損したマウスの株は、ヒトにおけるいくつかの神経学的障害の特徴を示す［Ｌｉｊａｍら、Ｃｅｌｌ  ９０：８９５−９０５（１９９７）］。このマウスの株はまた、マウスにおけるＤｓｈ遺伝子の役割のさらなる研究のためのモデルを提供する。
【０００８】
Ｄｓｈ機能の損失は、正規のＷｎｔ経路およびＰＣＰ経路の両方を破壊することが知られており、そしてＤｓｈの過剰発現は、正規のＷｎｔ経路を活性化するが、なおＰＣＰ経路を伴うこともまた知られている。これらの結果は、ＰＣＰ経路が用量感受性であり、そしてこの経路の過剰発現または抑制発現のいずれかにより破壊され得ることを示す［Ａｘｅｌｒｏｄら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２６１（１９９８）；Ｂｏｕｔｒｏｓら、Ｃｅｌｌ  ９４：１０９（１９９８）；ＢｏｕｔｒｏｓおよびＭｌｏｄｚｉｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１８２５−１８２８（２０００）；Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：８１（２０００）］。しかし、ｗｉｎｇｌｅｓｓ経路、ＪＮＫ経路、およびＮｏｔｃｈ経路におけるＤｓｈの機能のさらなる理解が、物理的または機能的にＤｓｈに関連するタンパク質（特に、ヒトタンパク質）の発見により促進される。
【０００９】
記載されるように、Ｗｎｔシグナル伝達が多くの異なる悪性腫瘍および他の疾患（例として、結腸癌、黒色腫、肝細胞癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、皮膚癌、多発性嚢胞腎疾患、髄芽腫毛質腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｉｌｏｍａｔｒｉｃｏｍａ）、頭頸部癌、および前立腺癌が挙げられる）の開始において役割を果たし得るので、このようなタンパク質（特に、ヒトホモログ）の同定は有益である（Ｍｏｒｉｎ  ＰＪ  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、２１（１２）：１０２１−１０３０；Ｐｏｌａｋｉｓ  Ｐ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４（１５）：１８３７−１８５１（２０００）；Ｐｅｉｆｅｒ  ＭおよびＰｏｌａｋｉｓ  Ｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１６０６−９（２０００）；Ｓｍａｌｌｅｙ  ＭＪおよびＤａｌｅ  ＴＣ、Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１８（２）：２１５−２３０（１９９９））。また、アルツハイマー病におけるＷｎｔシグナル伝達の役割の可能性が示唆されている［ＤｅＦｅｒｒａｒｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．３３（１）：１−１２（２０００）］。従って、Ｗｎｔシグナル伝達において活発な役割を果たす（特に、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する）新規タンパク質および対応する遺伝子の同定は、これらのタンパク質がＷｎｔシグナル伝達に関係する癌の新規の治療および診断方法の設計において可能性を有し得るので、有益である。なおさらに、これらのタンパク質およびＤＮＡは、Ｗｎｔシグナル伝達に関係する疾患の診断および処置における有用性を有し得る新規のリガンドおよび分子の同定において有用であり得る。
【００１０】
さらに、Ｗｎｔシグナル伝達に関係するヒト遺伝子およびタンパク質の同定は、診断用途を有し得る。なぜならば、このタンパク質の異常な発現またはその異常な形態の発現がＷｎｔ経路に関係する疾患（例えば、結腸癌のような癌）の発症に関係し得るからである。
【００１１】
近年、Ｗｇ／Ｗｎｔシグナル伝達経路に関係するタンパク質であるＮｋｄが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（Ｚｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０３（９７７１）：７８９−７９５（２０００））およびマウス［Ｙａｎら、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｎｋｄ  ｉｓ  ａ  Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｏｆ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ」（２０００）（本明細書中でその全体が参考として援用される）］において同定された。特にＺｅｎｇら（２０００）（同書）は、Ｗｇ／Ｗｎｔ経路と拮抗するＷｇシグナル伝達のＷｇ誘導性インヒビターをコードするＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ遺伝子の同定を報告した［Ｚｅｎｇら（２０００）］。さらに、Ｙａｎら（２０００）（同書）は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄのマウスホモログの同定を記載しており、さらに、特にＷｇ／Ｗｎｔ経路に対するいくつかのその生物学的効果を報告している。しかし、本発明以前に、Ｎｋｄのヒトまたは非ヒトホモログは同定されていない。このようなヒトまたは非ヒトホモログの同定は有益であり、特に癌（例えば、乳癌、肺癌、および結腸癌）および神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）の潜在的な治療または診断の設計におけるこのようなタンパク質またはその対応するＤＮＡの潜在的な適用をもたらす。より詳細には、ヒトＮｋｄタンパク質または核酸配列転写物の異常な発現の検出が、異なる癌または神経学的障害を診断する手段を提供し得ることが予期される。また、ｈＮｋｄタンパク質の投与または分析は、Ｗｎｔシグナル伝達に関係するいくつかの癌または神経学的障害の処置において有用であり得る。
【００１２】
（発明の要旨および目的）
この目的のために、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質（Ｄｓｈ）に関連し、Ｗｎｔシグナル伝達に関係する新規のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質を提供することが、本発明の目的である。対応するヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性を保持する新規のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質の改変体を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１３】
対応するヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性を保持する新規のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質のフラグメントを提供することが、本発明の別の目的である。
【００１４】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ、または対応するヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性を保持する新規のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのフラグメントもしくは改変体をコードする核酸配列または分子を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１５】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄに特異的に結合するが、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａまたはマウスＮｋｄに認められ得る程度で結合しないポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１６】
生理学的環境または細胞内環境において、ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ  ｍＲＮＡを標的とし、そしてそれらの翻訳を阻害または減少させるアンチセンス核酸またはリボザイムを提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１７】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄをコードする核酸配列に相補的な核酸プローブ（特に、ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄコード配列に特異的に結合し、安定な二本鎖を形成するが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａまたはマウスのそれらに対してはそうではないプローブ）を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１８】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのアゴニストまたはアンタゴニストを提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１９】
少なくとも１つのヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄあるいは対応するネイティブのヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性を保持するそれらの改変体またはフラグメントと組み合わせて、Ｄｓｈまたはそれらのフラグメントもしくは改変体を含む複合体を提供することが、本発明の別の目的である。
【００２０】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ、あるいはそれらの改変体またはフラグメントを利用してＪＮＫ経路を活性化することが、本発明のなお別の目的である。
【００２１】
哺乳動物細胞（好ましくは、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞）において、ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ、あるいはネイティブのヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの活性を有するそれらの改変体またはフラグメントを過剰発現させることにより、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害することが、本発明の別の目的である。
【００２２】
ヒトまたは非ヒトＮｋｄの１つまたは両方の対立遺伝子の発現がノックアウトされた、ヒトまたは非ヒト細胞を提供することが、本発明のなお別の目的である。
【００２３】
Ｗｎｔシグナル伝達を阻害するのに効果的な量のヒトまたは非ヒトＮｋｄあるいはネイティブのヒトまたは非ヒト霊長類の少なくとも１つの生物学的活性を保持するそれらの改変体またはフラグメントの投与により、疾患（特に、癌、神経学的障害、または異常なＷｎｔシグナル伝達に関係する他の疾患）を処置する新規の方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００２４】
有効量のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのアゴニストを投与することにより、Ｗｎｔシグナル伝達に関係する癌（例えば、乳癌または肺癌）を処置することが、本発明のさらに別の目的である。
【００２５】
配列番号１に含まれる核酸配列または５０より長いヌクレオチド長のコード配列のフラグメントを含む単離された核酸分子；あるいは配列番号５によりコードされるタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を有するタンパク質をコードする、配列番号１に含まれる核酸分子に少なくとも９０％同一の核酸分子を提供することが、本発明のより詳細な目的である。
【００２６】
ｈＮｋｄ遺伝子の調節領域（特に、プロモーター）を用いて、ｈＮｋｄ以外のコード配列の発現を調節することが、本発明のなおさらに別の目的である。
【００２７】
ｈＮｋｄプロモーター配列または少なくともそのような連続するヌクレオチドを含むそのフラグメントを用いて他のプロモーター（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達に関係するβ−カテニンまたは他の分子に応答性のプロモーター）を同定することもまた、本発明の目的である。
【００２８】
配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列、または配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも９０％同一のポリペプチドをコードする核酸、または配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント；もしくはこのフラグメントの改変体（この改変体フラグメントは、このフラグメントに少なくとも９５％同一であるが、ただし、このような改変体は、最も類似する領域が整列される場合、対応するマウス配列またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ配列と最大９０％、好ましくは８５％の同一性を有する）をコードする核酸配列（このフラグメントは、少なくとも５０アミノ酸長である）を提供することが、本発明の別の目的である。
【００２９】
配列番号７に含まれるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号７に含まれるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、あるいは少なくとも５０アミノ酸長を含むそれらのフラグメント、あるいはそのフラグメントの改変体（そのアミノ酸残基の少なくとも９５％がこのフラグメントと同一であるが、ただし、このような改変体は、最も類似する領域が整列される場合、対応するマウス配列またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ配列と最大９０％、好ましくは８５％の同一性を有する）を提供することが、本発明の別の詳細な目的である。
【００３０】
配列番号７に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、またはこのアミノ酸配列に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいは配列番号７を有するアミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープを示すそれらのフラグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（ただし、このような抗体はマウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄタンパク質に認められ得る程度で結合しない）を提供することが、本発明のなお別の詳細な目的である。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
先に議論したように、本発明は、以前にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ［Ｚｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ４９３（６７７１）：７８９−７９５（Ｆｅｂ．１７，２０００）］およびマウス［Ｙａｎら、（２０００）］において同定されていたＷｇ／Ｗｎｔシグナル伝達に関係するタンパク質であるＮｋｄのヒトまたは非ヒト霊長類ホモログに関する。より詳細には、Ｚｅｎｇら（２０００）（同書）は、Ｗｇ／Ｗｎｔ経路と拮抗するＷｇシグナル伝達のＷｇ誘導性インヒビターをコードするＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ遺伝子を報告した。それらに関連して、Ｙａｎら（２０００）（同書）は、Ｚｅｎｇら（同書）のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子のマウスホモログの同定を報告し、インビトロおよびインビボの両方におけるその生物学的特性ならびにＷｇ／Ｗｎｔ経路に対する効果のいくつかの詳細な説明を提供した。例えば、Ｙａｎら（２０００）は、ｍＮｋｄ遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定レベルが、Ｗｎｔに応答して増加すること；ｍＮｋｄが、細胞培養物および脊椎動物Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓにおけるβ−カテニンおよびＪＮＫおよび平面内極性に対するＷｎｔの効果をブロックすることにより、Ｗｎｔ経路と明らかに拮抗すること；ならびにこれらの効果は、Ｗｎｔ経路および平面内極性経路の共通の成分であるＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）とｍＮｋｄとの直接的な相互作用により媒介されるようであることを開示する。
【００３２】
より詳細には、Ｙａｎら（２０００）は、酵母ツーハイブリッドアプローチを用いたマウス胚９．５および１０．５ｄ．ｐ．ｃ．  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによる、ｍＮｋｄ遺伝子の同定を開示している。特に、このスクリーニング方法を用いて、Ｙａｎらは、全長Ｄｖｌ２およびＤｖｌ３タンパク質と相互作用するいくつかのタンパク質フラグメントの同定を報告している。ｍＮｋｄタンパク質はこれらのタンパク質の中から同定され、そして単一のＥＦ−ハンドカルシウム結合モチーフを含むことが発見された。このモチーフは、カルシウム結合タンパク質のファミリーの研究において見出されたモチーフと最も類似することが開示されている（Ｚｈｅｎら（２０００））。ｍＮｋｄタンパク質は、Ｚｅｎｇら（２０００）（同書）により報告されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄタンパク質に対して４９％類似し、３４％同一であることが開示されており、そして類似するＥＦ−ハンドを含むことが報告されている。Ｙａｎら（２０００）はまた、ツーハイブリッドスクリーニングにおいてＤｖｌと相互作用するｍＮｋｄのドメインの位置が、アミノ酸１０７〜２３０に介在し、そしてＥＦ−ハンドモチーフを含むことを教示している。
【００３３】
Ｙａｎ（２０００）（同書）により報告されたマウスＮｋｄの生物学的特性は、Ｗｎｔ経路およびＪＮＫ経路におけるその役割と一致する。例えば、その中で記載されているように、ｍＮｋｄの過剰発現は、哺乳動物細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害する。さらに、哺乳動物細胞におけるｍＮｋｄの発現は、ＪＮＫを活性化し、応答がＤｓｈの発現によっても見られた。これらの結果は、ｍＮｋｄがＪＮＫ経路のアクチベーターであり、そしてＷｎｔシグナル伝達に関係することを示唆する。
【００３４】
先に示されたように、異常なＷｎｔシグナル伝達は、いくつかの癌および神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）において役割を果たしていることが考えられる。例えば、Ｗｎｔシグナル伝達のアップレギュレーションは、いくつかの結腸癌を生じる。過剰に活性化されたＷｎｔシグナル伝達はまた、Ｗｎｔシグナル伝達に対する阻害効果を有するｍＮｋｄの機能をダウンレギュレーションすることにより達成され得る。いくつかの結腸癌において、ｍＮｋｄの発現は、正常細胞における発現よりも低くあり得る。この観察に基づき、ｍＮｋｄのヒトホモログは類似の生物学的効果を発揮し、そしていくつかのヒト癌または神経学的障害の発症および発達に関係し得ることが予想される。
【００３５】
従って、これまでに同定されたマウスおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄ遺伝子のヒトまたは非ヒト霊長類の等価物の同定は重要であり、特に、Ｗｎｔ経路の負の調節が哺乳動物において腫瘍形成に関係し得［ＳｍａｌｌｅｙおよびＤａｔｅ、Ｃａｎｃ．Ｍｅｔａｓｔ．Ｒｅｓ．１８（２）：２１５−２３０（１９９９）］、そして特に、とりわけ癌（例えば、結腸癌、乳癌、卵巣癌）に関係し得ることを示唆する先行研究に照らして、その重要な潜在的な診断適用および治療適用を与える。
【００３６】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ（例えば、遺伝子または対応するポリペプチド）の同定は、潜在的なヒト治療の関係で、特に重要である。なぜならば、多くの異なる癌の発症に関係するヒトＮｋｄは、それが同定された場合、ヒト細胞においてＷｎｔ経路を調節し得ることが期待されるからである。さらに、ヒトまたは霊長類タンパク質は、ヒト治療のために非ヒトタンパク質よりも優れているようである。なぜならば、ヒトまたは霊長類タンパク質は、そのヒト起源を考慮すると、おそらくヒト被験体においていかなる免疫応答も誘発しないからである。従って、これは、長期的な基礎において（例えば、Ｗｎｔ経路に関係する癌（例えば、乳癌）または異常なＷｎｔシグナル伝達に関係する神経学的障害の処置のために）潜在的に投与可能である。また、ヒトタンパク質は、例えば、ｈＮｋｄ発現の異常なレベルに基づく癌または癌の可能性を診断する手段として、ｈＮｋｄタンパク質の発現レベルを検出するため、またはｈＮｋｄ発現をアゴナイズまたはアンタゴナイズするための診断薬剤または治療薬剤としての有用性を有する抗体を生成するために有用である。
【００３７】
この目的のために、本発明は、その存在が以前に知られておらず、そして本発明の以前に予見され得なかったヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄポリペプチドおよび対応する核酸配列を提供する。
【００３８】
本発明のタンパク質のヒトＮｋｄ核酸配列および対応するポリペプチドは、以下の実施例に開示される方法によって得られた。ヒトＮｋｄ全体の配列について、その配列は、ヌクレオチドレベルで、マウスＮｋｄ遺伝子に８５％同一であり、そしてタンパク質レベルで８７％同一であることが見出された。これらのタンパク質は、残基１３３〜１６８を含む、結合に関与する同一のＥＦ−ハンド領域を含む。マウスＮｋｄの核酸配列に対する本発明のヒトＮｋｄ遺伝子の核酸配列のアライメントを、図１に示す（それぞれ、配列番号２および配列番号１）。さらに、マウスＮｋｄタンパク質に対するヒトＮｋｄタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを、図２に示す（それぞれ、配列番号４および配列番号３）。さらに、ｈＮｋｄおよびｍＮｋｄをコードする核酸配列を、図３および図４に別々に示す（それぞれ、配列番号５および配列番号６）。また、ｈＮｋｄおよびｍＮｋｄのアミノ酸配列を、図５および６に別々に示す（それぞれ、配列番号７および配列番号８）。
【００３９】
本発明の全長ヒトＮｋｄ核酸配列は、ヒト第１６染色体に含まれる。詳細には、コード領域全体ならびに５’および３’ＵＴＲ（１１個のエキソンに含まれる）は、第１６染色体に見出される８６キロベース領域に含まれる。このマッピングの結果を含む図を、図８に示す。さらに、１１個の全てのエキソンの配列ならびに推定プロモーターならびに５’および３’ＵＴＲを、図７に示す（それぞれ、配列番号９〜配列番号２２）。
【００４０】
培養哺乳動物細胞におけるマウスＮｋｄ  ｍＲＮＡの転写レベルに対するＷｎｔリガンドの見かけの誘導性の効果を考慮すると、本発明のヒトＮｋｄの転写が、それによって同様に誘導され得ることが仮定される。この仮定をさらに試験するために、ヒトＮｋｄプロモーター配列を使用して、ヒトゲノム配列を含む公知のデータベースをブラスト（ｂｌａｓｔ）した。実際、これらのゲノム検索は、このプロモーターが、他の遺伝子中のＴｃｆ結合についての逆方向コンセンサス（Ａ／Ｔ  Ａ／Ｔ  ＣＡＡＧ）（Ｇｉｅｓｅら、Ｇｅｖｅｎｓ  Ｄｅｖ．５：２５６７（１９９１））（その全体が本明細書中で参考として援用される）（この領域は、β−カテニン応答性を付与するために必要であり得る）と一致するいくつかの配列エレメントを含むことを明らかにした。高レベルのβ−カテニンを有する結腸癌細胞もまた、高レベルのヒトＮｋｄ  ＲＮＡ転写物を発現するという事実は、この仮定と一致する。このことは、ヒトＮｋｄプロモーターが、β−カテニンの直接的な標的であることを示唆する。これに関連して、β−カテニンがＬＥＦ−１／ＴＣＦ、ＡＰＣおよびコンダクチン（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ）／アキシン（ａｘｉｎ）と相互作用すること、およびそのような相互作用が腫瘍形成に重要であり得ることもまた公知である（Ｖａｎ  Ｋｒｉｅｓら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（９）：８００−８０７（２０００）；Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｊ．Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１０：２１−３３（２０００））。β−カテニンに関与する変異が、いくつかの癌（特に、卵巣癌、乳癌および結腸癌）に関与することが周知である（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８２（５）：６２−６２９（１９９９）；Ｌｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｎｏｌ．１５３（３）：７０９−７１４（１９９８）；およびＦｕｋｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３５２６−３５２８（１９９８））。
【００４１】
この観察に基づいて、ｈＮｋｄ、またはその異常な発現（ここで、異常な発現には、減少または増加された発現が含まれる）、または改変形態の発現の検出が、いくつかの癌（例えば、結腸癌、乳癌、卵巣癌、および異常なＷｎｔシグナル伝達に関連する他の癌）を検出する手段を提供することが予測される。
【００４２】
詳細には、これらの結果は、癌および異常なＷｎｔシグナル伝達に関連する他の疾患（とりわけ、結腸癌、卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、皮膚癌、多発性嚢胞腎疾患、髄芽細胞腫、毛質性上皮腫、頭部および頸部の癌、前立腺癌、ならびに神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）の可能性のある治療法としては、ｈＮｋｄ発現を調節する化合物（例えば、抗体、ｈＮｋｄタンパク質、およびそれらのフラグメントまたは改変体；ならびにｈＮｋｄ  ｍＲＮＡ転写を特異的に標的化する、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド；ならびにｈＮｋｄ発現を調節する低分子）の投与が挙げられ得ることを示唆する。潜在的に処置可能な癌の好ましい例としては、結腸癌、乳癌および卵巣癌が挙げられる。
【００４３】
タンパク質レベルおよびＤＮＡレベルの両方での、ヒトＮｋｄとマウスＮｋｄとの間の観察された構造的類似性に基づいて、これらのタンパク質およびＤＮＡが、類似の生物学的活性を示すことが予測される。詳細には、ｈＮｋｄタンパク質が、ｍＮｋｄと同様に、ＪＮＫ経路を活性化し、そしてＷｎｔシグナル伝達を阻害することが予測される。このことに基づいて、本発明は、新規のヒトおよび非ヒト霊長類のＮｋｄタンパク質および核酸配列、それらの改変体およびフラグメント、ならびに新規タンパク質の設計およびその使用におけるそれらの使用に対して広範に関し、これらを、以下により詳細に議論する。しかし、これらのタンパク質、核酸配列およびそれらの使用を詳細に説明する前に、以下の定義を提供する。さもなければ、本明細書中の用語は、関連する分野において理解されるこれらの意味を有する。
【００４４】
「単離されたヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質」とは、その通常のヒトまたは霊長類の細胞環境にはない、任意のヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質をいう。これらとしては、例えば、組換えｈＮｋｄを含む組成物、精製ｈＮｋｄを含む薬学的組成物、精製ｈＮｋｄを含む診断組成物、およびｈＮｋｄを含む単離されたタンパク質組成物が挙げられる。好ましい実施形態において、単離されたｈＮｋｄタンパク質は、配列番号３に含まれるアミノ酸配列または実質的に同じ配列を有する天然のホモログもしくは変異体を含む、実質的に純粋なタンパク質を含み、つまり、他のタンパク質を実質的に含まず、好ましくは、少なくとも９０％純粋である。天然に存在する変異体は、例えば、変異されたｈＮｋｄタンパク質配列をコードする遺伝子を発現する腫瘍細胞において見出され得る。
【００４５】
「ネイティブヒトＮｋｄタンパク質」とは、図５および配列番号７に含まれるアミノ酸配列を含むタンパク質をいう。
【００４６】
「ネイティブ非ヒトＮｋｄタンパク質」とは、図５および配列番号７に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質の非ヒト霊長類ホモログであるタンパク質をいう。他の霊長類に対するヒトの系統学的近縁性を考慮すると、ヒトおよび非ヒトＮｋｄタンパク質は、高度に類似し、おそらく、９５％程度以上の配列同一性のアミノ酸配列を有することが予測される。
【００４７】
「ネイティブマウスＮｋｄタンパク質」とは、図６および配列番号８に含まれるアミノ酸配列を含むタンパク質をいう。
【００４８】
「単離されたヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ核酸分子または配列」とは、その通常のヒトの細胞環境にはない（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類染色体ＤＮＡに含まれない）、ヒトＮｋｄをコードする核酸分子をいう。これらとしては、例えば、ｈＮｋｄ核酸分子を含むベクター、検出可能な部分（例えば、蛍光標識または放射性標識）を直接的または間接的に結合したｈＮｋｄ核酸配列を含むプローブ、または異なるＤＮＡ（例えば、プロモーター、または検出可能なマーカーもしくはエフェクター部分をコードするＤＮＡ）にその５’末端または３’末端が融合されたｈＮｋｄをコードする核酸分子を含むＤＮＡ融合物が挙げられる。好ましい核酸配列は、ヒトＮｋｄタンパク質をコードし、そして図３における配列番号５に含まれる核酸配列を有する。実質的に同じ配列を有する天然のホモログまたは変異体もまた、含まれる。縮重する天然に存在するホモログは、配列番号５がコードする同じタンパク質をコードするが、対応するアミノ酸配列を変化させないヌクレオチド差異を含む。天然に存在する変異体は、腫瘍細胞に見出され得る、ここでは、このようなヌクレオチド差異が、変異体Ｎｋｄタンパク質を生じる。保存的置換を含む天然に存在するホモログもまた、含まれる。
【００４９】
「ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質の改変体」とは、対応するネイティブヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質に対して、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９１％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、そして最も好ましくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、タンパク質をいい、ここで、配列同一性は、以下に定義されるとおりである。好ましくは、この改変体は、ネイティブｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄタンパク質と共通する少なくとも１つの生物学的特性を有し、例えば、この改変体は、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞において、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。
【００５０】
「ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ核酸分子または配列の改変体」とは、対応するネイティブヒトまたは非ヒト霊長類核酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９４％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、そして最も好ましくは９９％の配列同一性を有する核酸配列をいい、ここで、「配列同一性」は、以下に定義されるとおりである。
【００５１】
「ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの生物学的に活性なフラグメント」とは、その対応するネイティブヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの生物学的活性（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する能力、または対応するネイティブヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの少なくとも１つの免疫原性エピトープを提示する能力（抗ｈＮｋｄ抗体または抗非ヒトＮｋｄ抗体に結合またはこれらを惹起する能力によって決定されるような））を含むタンパク質をいい；但し、この生物学的に活性なフラグメントは、それに最も類似するマウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄタンパク質の部分と整列させた場合に、それと同一でないアミノ酸配列を有し、そしてより好ましくは、それと高くとも９０％の配列同一性を有し、そしてより好ましくは、それと高くとも８９％、８８％、８７％、８６％または８５％の配列同一性を有し、ここで、配列同一性は、以下に定義されるとおりである。
【００５２】
陽性の生物学的に活性なｈＮｋｄフラグメントまたは改変体の生物学的活性は、そのようなフラグメントまたは改変体が、インビトロまたはインビボで、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する能力、ＪＮＫを活性化する能力、Ｄｓｈと相互作用する能力に基づいて決定され得る。適切なアッセイを、以下の実施例に開示する。
【００５３】
「ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ核酸分子または配列のフラグメント」とは、配列番号７に含まれるネイティブヒトＮｋｄ核酸配列またはネイティブ非ヒト霊長類Ｎｋｄ核酸分子の一部に対応する核酸配列をいい、この部分は、少なくとも約５０ヌクレオチド長、より好ましくは、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５、１２００、１２２５、１２５０、１２７５、１３００、１３２５、１３５０、１３７５、１４００、１４２５、１４５０、１４７５、１５００、１５２５、１５５０、１５７５、１６００、１６２５、１６５０、１６７５、１７００、１７２５、１７５０、１７７５、１８００または１８２５ヌクレオチド長である。好ましくは、このようなフラグメントは、配列番号７に含まれるヒトＮｋｄ核酸配列またはそその非ヒト霊長類ホモログの約５００個〜約１５００個連続するヌクレオチドを含む。
【００５４】
「ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの抗原性フラグメント」とは、それ自体かまたは免疫原性キャリアを結合して使用した場合に、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄを特異的に結合する抗体を誘発する、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのフラグメントあるいはそれらの改変体またはホモログに対応するポリペプチドをいう。代表的には、このような抗原性フラグメントは、少なくとも２０アミノ酸長である。
【００５５】
用語「生物学的に等価」は、本発明のタンパク質またはＤＮＡが、ネイティブヒトＮｋｄまたは非ヒト霊長類のＮｋｄタンパク質またはＤＮＡと必ずしも同じ程度ではないが、同じ生物学的特性のいくつかまたは全てあるいは類似の様式を実証し得ることを意味することが、意図される。好ましくは、生物学的に等価とは、ネイティブヒトＮｋｄに匹敵する程度にＷｎｔシグナル伝達を阻害する、ｈＮｋｄの改変体をいう。示されるように、生物学的活性は、そのタンパク質またはＤＮＡが、インビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて、他のＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力、ＪＮＫを活性化する能力、Ｄｓｈと相互作用する能力に基づいて評価され得、これらのアッセイを、以下の実施例に開示する。
【００５６】
「実質的に相同」によって、別の種（好ましくは、別の霊長類）のＮｋｄに対するヒトまたは非ヒト霊長類の相同性の程度は、そのｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄと任意の以前に報告されたＮｋｄ（例えば、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ）との間の相同性の程度より高いことが意味される。
【００５７】
配列同一性または同一性％は、２つの配列を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅバイオコンピューティングソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，ＩＮＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）におけるマルチプル配列アライメントのＣｌｕｓｔａｌ法［Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｃａｂｉｏｓ  ８：１８９−１９１（１９９２）］を使用して整列させた場合、その２つの配列間で共有される同じ残基のパーセンテージ（非ヒトＮｋｄ（例えば、マウスＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄ）との同一性％を決定する場合、ヒトＮｋｄを基準として）を意味することが意図される。この方法において、マルチプルアライメントを、順送り様式で行い、ここで、より大きいアライメント群とより大きいアライメント群が、一連の対合アライメントから計算された類似性スコアを使用してアセンブルされる。最適な配列アライメントは、最大アライメントスコアを見出すことによって得られ、このスコアは、アライメント中の別々の残基間の全てのスコアの平均であり、これは、所定の進化的間隔にわたって２つの関連するタンパク質に生じる所定のアミノ酸変化の可能性を表す、残基重み表（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｗｅｉｇｈｔ  ｔａｂｌｅ）から決定される。アライメント中にギャップを空けそして伸長させるためのペナルティーは、このスコアに寄与する。このプログラムで使用されるデフォルトパラメーターは、以下の通りである：マルチプルアライメントについてのギャップペナルティー＝１０；マルチプルアライメントについてのギャップ長ペナルティー＝１０；対合アライメントにおけるｋ−タプル値＝１；対合アライメントにおけるギャップペナルティー＝３；対合アライメントにおけるウインドウ値＝５；対合アライメントにおいて保存される対角線＝５。アライメントプログラムに使用される残基重み表は、ＰＡＭ２５０［Ｄａｙｈｏｆｆｅｔら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｄａｙｈｏｆｆ編、ＮＤＲＦ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、第５巻、補遺３、３４５頁（１９７８）］である。
【００５８】
保存％は、２つの残基が保存的置換（ＰＡＭ２５０残基重み表にいて０．３以上のログオッズ値（ｌｏｇ  ｏｄｄｓ  ｖａｌｕｅ）を有するものして定義される）を示す位置のパーセンテージに、同一残基のパーセンテージを加えることによって、上記アライメントから計算される。保存は、保存％を決定する場合、非ヒトＮｋｄ（例えば、ｍＮｋｄ）との保存％を決定する場合のヒトＮｋｄを基準とする。この要件を満足する保存的アミノ酸変化は、以下である：Ｒ−Ｋ；Ｅ−Ｄ、Ｙ−Ｆ、Ｌ−Ｍ；Ｖ−Ｉ、Ｑ−Ｈ。
【００５９】
（ポリペプチドフラグメント）
本発明は、開示されたタンパク質のポリペプチドフラグメントを提供する。本発明のポリペプチドフラグメントは、ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄまたはそれらのアナログの、少なくとも８アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２５アミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも５０アミノ酸残基を含み得る。より詳細には、このようなフラグメントは、配列番号７を有するポリペプチドの少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４５５、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６または４６７残基を含む。さらにより好ましくは、タンパク質フラグメントは、ネイティブＮｋｄの大部分（すなわち、ｈＮｋｄの少なくとも約２００〜４００個連続する残基、またはさらにより好ましくは、少なくとも４００〜４６０個連続する残基）を含む。好ましいタンパク質フラグメントとしては、ＥＦハンドを含むフラグメントが挙げられる。好ましくは、このようなフラグメントは、ヒトまたは非ヒトＮｋｄタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を有する。このような生物学的活性を確認するために、インビトロまたはインビボアッセイを行って、例えば、そのフラグメントが、Ｄｖｌを結合するか否か、哺乳動物細胞によるＷｎｔシグナル伝達を阻害するか否か、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ胚におけるＷｎｔ誘導性二次軸形成を誘導するか否か、またはＪＮＫ平面極性経路に影響を及ぼすか否かを決定し得る。例示的な方法を、本願の実施例に開示する。
【００６０】
（生物学的に活性なフラグメント）
本明細書中に開示されるタンパク質およびポリペプチドの改変体もまた、存在し得る。改変体は、天然に存在し得るかまたは天然に存在しないものであり得る。天然に存在する改変体は、ヒトまたは非ヒト霊長類種に見出され、配列番号７に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。ヒトＮｋｄタンパク質の非ヒト霊長類ホモログまたは改変体は、以下に記載されるような、本発明の部分ゲノムポリヌクレオチドを使用して、他のヒトまたは非ヒト霊長類細胞由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングに適切なプローブまたはプライマーを作製して、得られ得る。あるいは、霊長類ホモログは、ヒトＮｋｄタンパク質またはＤＮＡ配列を用いて霊長類ＤＮＡデータベースをブラストすることによって同定され得る。
【００６１】
天然に存在するタンパク質改変体と実質的に同じ生物学的活性を保持する、天然に存在しない改変体もまた、本発明に包含される。好ましくは、天然に存在する改変体または天然に存在しない改変体は、配列番号７に示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、これらの分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一である。同一性％は、当該分野で公知の方法によって決定される。限定されない例は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムであり、これは、ギャップオープンペナルティー、１２およびギャップ伸長ペナルティー、２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス、６２を用いるアフィンギャップ（ａｆｆｉｎｅ  ｇａｐ）検索を使用する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２−４８９に教示される。
【００６２】
どのアミノ酸残基が、生物学的または免疫学的活性を失うことなく置換、挿入または欠失され得るかの決定についてのガイダンスは、当該分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア）を使用して見出され得る。好ましくは、タンパク質改変体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化（すなわち、類似の荷電アミノ酸または非荷電アミノ酸の置換）である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に、以下の４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として共に分類される。
【００６３】
ムテインと呼ばれる、変異体のサブセットは、中性アミノ酸（例えば、セリン）が、ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基に代わって置換されたポリペプチドの群である。これらの変異体は、ネイティブの分泌タンパク質よりも広い温度範囲にわたって安定であり得る。Ｍａｒｋら、米国特許第４，９５９，３１４号を参照のこと。
【００６４】
イソロイシンまたはバリンでのロイシンの分離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、セリンでのトレオニンでの置換、または構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の類似の置換は、得られる分泌タンパク質またはポリペプチド改変体の生物学的特性に対して大きな効果を有さないことが当然予測される。ｈＮｋｄタンパク質またはポリペプチドの改変体の特性および機能は、配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と同じ型の特性および機能であるが、改変体の機能および特性は、ある程度異なり得る。
【００６５】
ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄタンパク質改変体としては、グリコシル化形態、他の分子との凝集結合体、および関連しない化学部分との共有結合改変体が挙げられる。また、ｈＮｋｄタンパク質改変体としてはまた、対立遺伝子改変体、種改変体、およびムテインが挙げられる。ｈＮｋｄタンパク質の差示的な発現に影響しない領域の切断または欠失もまた、改変体である。共有結合改変体は、当該分野で公知のように、アミノ酸側鎖に見出される基に対してか、あるいはＮ末端残基またはＣ末端残基で、官能基を連結することによって、調製され得る。
【００６６】
本発明のｈＮｋｄタンパク質のいくつかのアミノ酸は、タンパク質の構造または機能に対する有意な効果を伴わずに変更され得ることが当該分野で認識される。配列におけるこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質の重要な領域が存在することに留意する。一般に、類似の機能を果す残基を使用する場合には、三次構造を形成する残基を置換することが可能である。他の例において、変更がそのタンパク質の重要でない領域で生じる場合、残基の型は、完全には重要でない。アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化させ得る。Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６−２６８（１９９３）は、２つの公知の型のＴＮＦレセプターのうちの１つのみに対するＴＮＦ−αの選択的結合を生じる、特定の変異を記載する。したがって、本発明のポリペプチドは、天然の変異または人為操作のいずれか由来の、１以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
【００６７】
本発明は、比較可能な発現パターンを示すかまたは抗原性領域を含む、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄポリペプチドのバリエーションをさらに包含する。このような変異体は、欠失、挿入、逆位、反復、および型置換を含む。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントであるのかに関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出され得る。
【００６８】
別の荷電アミノ酸での荷電アミノ酸の置換、および中性または負に荷電したアミノ酸での荷電アミノ酸の置換は、重要な目的である。後者は、開示されるタンパク質の特性を改善するように正電荷を減少したタンパク質を生じる。凝集の防止は、非常に望ましい。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるのみならず、それらが免疫原性であり得ることに起因して、薬学的処方物を調製する際に問題となり得る（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７（１９９３））。
【００６９】
機能に必須である本発明のポリペプチド中のアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって同定され得る。後者の手順は、分子中の各残基に１個のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子を、生物学的活性（例えば、天然または合成の結合パートナーに対する結合）について試験する。リガンド−レセプター結合に重要である部位はまた、構造分析（例えば、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））によって決定され得る。
【００７０】
示されるように、変化は、好ましくは、重要でない特性の変化（例えば、タンパク質のフォールディングにも活性にも有意に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換）である。もちろん、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、多くの要因（上記のような要因を含む）に依存する。一般には、任意の所定のポリペプチドの置換の数は、５０個、４０個、３０個、２５個、２０個、１５個、１０個、５個または３個よりも多くない。
【００７１】
（融合タンパク質）
ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのタンパク質またはポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質もまた、構築され得る。融合タンパク質は、アミノ酸配列に対する抗体を作製するため、および種々のアッセイ系における使用のために、有用である。例えば、融合タンパク質は、本発明のタンパク質と相互作用するタンパク質またはその生物学的機能に干渉するタンパク質を同定するために使用され得る。物理的方法（例えば、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー）、またはタンパク質−タンパク質相互作用のライブラリーベースのアッセイ（例えば、酵母ツーハイブリッド系またはファージディスプレイ系）もまた、この目的に使用され得る。このような方法は、当該分野で周知であり、そして薬物スクリーニングとしても使用され得る。ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄのシグナル配列および／または膜貫通ドメインあるいはそれらのフラグメントを含む融合タンパク質を使用して、他のタンパク質ドメインを、これらのドメインが通常見出されない細胞部位に標的化し得る（例えば、細胞膜に結合させるか、細胞外に分泌させる）。
【００７２】
融合タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に融合された２つのタンパク質セグメントを含む。本発明の融合タンパク質における使用のためのアミノ酸配列は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を利用し得るか、または配列番号７の生物学的に活性な改変体またはフラグメント（例えば、上記に記載されるもの）から調製され得る。第１のタンパク質セグメントは、全長ｈＮｋｄまたはその改変体もしくはフラグメントからなり得る。
【００７３】
上記のように、これらのフラグメントは、長さが、約８アミノ酸から、約２５アミノ酸、５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、１２５アミノ酸、１５０アミノ酸、１７５アミノ酸、２００アミノ酸、２２５アミノ酸、２５０アミノ酸、２７５アミノ酸、３００アミノ酸、３２５アミノ酸、３５０アミノ酸、３７５アミノ酸、４００アミノ酸、４２５アミノ酸、４５０アミノ酸、４５５アミノ酸、４６０アミノ酸、４６５アミノ酸までのサイズの範囲にわたり得る。
【００７４】
第２のタンパク質セグメントは、全長タンパク質またはポリペプチドフラグメントであり得る。融合タンパク質構築物において一般に使用されるタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）が挙げられる）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が挙げられる。さらに、エピトープタグが、融合タンパク質構築物において使用され得、これらのタグとしては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。他の融合構築物としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン融合物、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ  １６タンパク質融合物が挙げられ得る。
【００７５】
これらの融合物は、例えば、２つのタンパク質セグメントの共有結合により、または分子生物学分野における標準的な手順により作製され得る。例えば、当該分野で公知であるように、組み換えＤＮＡ法が用いられて、第２のタンパク質セグメントをコードするヌクレオチドと適切なリーディングフレームで配列番号７に含まれるアミノ酸配列をコードするコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製し、宿主細胞においてこのＤＮＡ構築物を発現することにより、融合タンパク質が調製され得る。融合タンパク質を構築するための多くのキットが、発現のためのツールを研究機関に供給する会社（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ；Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ；１−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）が挙げられる）から入手可能である。
【００７６】
本発明のタンパク質、融合タンパク質またはポリペプチドは、組み換えＤＮＡ法により生成され得る。組み換えタンパク質、融合タンパク質、またはポリペプチドの生成のために、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のコード配列が、当該分野で公知の発現系を用いて、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において発現され得る。これらの発現系としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。
【００７７】
次いで、得られた発現タンパク質は、当該分野で公知の精製手順を用いて、培養培地または培養細胞の抽出物から精製され得る。例えば、培養培地に十分に分泌されたタンパク質については、無細胞培地を、酢酸ナトリウムを用いて希釈し、陽イオン交換樹脂と、続いて疎水性相互作用クロマトグラフィーと接触させ得る。この方法を用いると、所望のタンパク質またはポリペプチドは、代表的には、９５％を超える純度である。例えば、上記に列挙した技術のいずれかを用いて、さらなる精製が行われ得る。
【００７８】
機能的タンパク質を得るために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により、酵母または細菌において生成されるタンパク質を改変することが必要であり得る。このような共有結合は、公知の化学的方法または酵素的方法を使用して作製され得る。
【００７９】
本発明のヒトまたは非ヒト霊長類のＮｋｄタンパク質またはＮｋｄポリペプチドはまた、精製を容易にする形態において、培養宿主細胞において発現され得る。例えば、タンパク質またはポリペプチドは、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはチオレドキシンを含む融合タンパク質として発現され得、市販のキットを使用して精製され得る。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような会社から入手可能である。タンパク質、融合タンパク質、またはポリペプチドはまた、エピトープ（例えば、「Ｆｌａｇ」エピトープ（Ｋｏｄａｋ））を用いてタグ化され得、そのエピトープに特異的に結合する抗体を用いて精製され得る。
【００８０】
本明細書中に開示されるコード配列はまた、トランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジ）を構築するために使用され得る。次いで、雌性トランスジェニック動物は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、または融合タンパク質をそれらの乳汁中に生成し得る。このような動物を構築するための方法は、当該分野で公知であり、かつ広く用いられている。
【００８１】
あるいは、合成化学方法（例えば、固相ペプチド合成）を用いて、分泌タンパク質または分泌ポリペプチドを合成し得る。ペプチド、アナログまたは誘導体を生成するための一般的手段は、  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編（１９８３）に概説されている。通常のＬ立体異性体の代わりにＤ−アミノ酸を用いて置換することが、分子の半減期を増大させるために行われ得る。
【００８２】
代表的には、相同なポリヌクレオチド配列は、当該分野で公知のように、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにより確認され得る。例えば、以下の洗浄条件：２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％  ＳＤＳ、室温で２回、各３０分間；次いで２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃で１回、３０分間；次いで、２×ＳＳＣ、室温で２回、各１０分間、を用いて、相同な配列が同定され得る（この配列は、最大で約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含む）。より好ましくは、相同な核酸鎖は、１５〜２５％の塩基対ミスマッチ、なおより好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００８３】
本発明はまた、例えば、ハイブリダイゼーションプロトコル（例えば、ノーザンブロッティングもしくはサザンブロッティング、またはインサイチュハイブリダイゼーション）において相補的ヌクレオチド配列を検出するために使用され得るポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリヌクレオチドプローブは、配列番号１の少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、もしくは４０、またはそれ以上連続したヌクレオチドを含む。ただし、この配列は、マウスＮｋｄ配列もしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ配列に対して９０％以下の同一性であり、より好ましくは、それらに対して約８９、８８、８７または８６％以下の同一性であり、最も好ましくは、それらに対して約８５％以下の同一性である。本発明のポリヌクレオチドプローブは、検出可能な標識（例えば、放射性同位体標識、蛍光標識、酵素標識、または化学発光標識）を含み得る。
【００８４】
本明細書中に開示されたｃＤＮＡ配列に対応する単離された遺伝子もまた、提供される。標準的な分子生物学方法が使用されて、本明細書中に提供されるｃＤＮＡ配列を用いて対応する遺伝子が単離され得る。これらの方法は、哺乳動物（ヒトを含む）のゲノムライブラリーもしくはヒトゲノムＤＮＡの他の供給源から遺伝子を同定または増幅する際に使用するための配列番号５に示されるヌクレオチド配列からのプローブもしくはプライマーの調製を含む。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチド分子はまた、ポリヌクレオチド増幅方法を用いて、ポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るためにプライマーとして使用され得る。ポリヌクレオチド分子は、当該分野で周知の技術を用いて、ベクターおよび細胞株中で増加され得る。ポリヌクレオチド分子は、直鎖状分子であってもよいし、環状分子であってもよい。ポリヌクレオチド分子は、自動的に複製する分子上にあってもよいし、複製配列を含まない分子上にあってもよい。ポリヌクレオチド分子は、当該分野で公知のように、このポリヌクレオチド分子自身の調節配列により調節されてもよいし、他の調節配列により調節されてもよい。
【００８６】
（ポリヌクレオチド構築物）
本明細書中に開示されるコード配列を含むポリヌクレオチド分子は、ポリヌクレオチド構築物（例えば、ＤＮＡ構築物もしくはＲＮＡ構築物）において使用され得る。本発明のポリヌクレオチド分子は、例えば、タンパク質の全てもしくは一部、改変体、融合タンパク質、または単鎖抗体を宿主細胞において発現するために発現構築物において使用され得る。発現構築物は、選択された宿主細胞において機能的であるプロモーターを含む。当業者は、当該分野で公知かつ使用されている多数の細胞型特異的プロモーターから適切なプロモーターを容易に選択し得る。この発現構築物はまた、宿主細胞において機能的な転写ターミネーターを含み得る。この発現構築物は、所望のタンパク質の全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。このポリヌクレオチドセグメントは、プロモーターの下流に位置する。このポリヌクレオチドセグメントの転写は、プロモーターにおいて開始される。発現構築物は、直鎖状であってもよいし、環状であってもよく、所望であれば、自己複製のための配列を含み得る。
【００８７】
Ｎｋｄコード配列、または検出マーカーもしくは選択マーカーをコードする他の配列のいずれかに作動可能に連結された、ヒトまたは非ヒト霊長類のＮｋｄ遺伝子プロモーターおよびＵＴＲ配列（配列番号９）（配列番号１０、１１、または配列番号２２）を含むポリヌクレオチド分子もまた含まれる。このようなプロモーターおよび／またはＵＴＲベースの構築物は、Ｎｋｄ発現の転写調節および翻訳調節を研究するため、ならびに活性化調節タンパク質および／または阻害性調節タンパク質を同定するために有用である。ｈＮｋｄプロモーターは、β−カテニンによって明らかに調節され、従って、作動可能に連結された場合に、非ｈＮｋｄ遺伝子の発現をβ−カテニン応答性にするために用いられ得る。
【００８８】
（宿主細胞）
発現構築物は、宿主細胞に導入され得る。発現構築物を含む宿主細胞は、任意の適切な原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。細菌における発現系としては、以下に記載されるものが挙げられる：Ｃｈａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９）；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）；ＥＰ３６，７７６；Ｕ．Ｓ．４，５５１，４３３；ｄｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５（１９８３）；およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら，Ｃｅｌｌ  ２０：２６９（１９８０）。
【００８９】
酵母における発現系としては、以下に記載されるものが挙げられる：Ｈｉｎｎｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９（１９７８）；Ｉｔｏら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １５３：１６３（１９８３）；Ｋｕｒｔｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２（１９８６）；Ｋｕｎｚｅら，Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｇｌｅｅｓｏｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９（１９８６），Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２（１９８６））；Ｄａｓら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５（１９８４）；Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７（１９８３），Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５（１９９０）；Ｋｕｎｚｅら，Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１（１９８５）；Ｃｒｅｇｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６（１９８５）；米国特許第４，８３７，１４８号；米国特許第４，９２９，５５５号；ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０６（１９８１）；Ｄａｖｉｄｏｗら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９（１９８５）；Ｂａｌｌａｎｃｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら，Ｇｅｎｅ  ２６：２０５−２２（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４（１９８４）；ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５４７９（１９８５）；ＥＰ
２４４，２３４；ならびにＷＯ９１／００３５７。
【００９０】
昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る：米国特許第４，７４５，０５１号；Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」ｉｎ：ＴＨＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰ１２７，８３９；ＥＰ１５５，４７６；Ｖｌａｋら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５−７７６（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：１７７（１９８８）；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，Ｇｅｎｅ  ７３：４０９（１９８８）；Ｍａｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２−５９４（１９８５）；Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：３１２９（１９８８）；Ｓｍｉｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：８４０４（１９８５）；Ｍｉｙａｊｉｍａら，Ｇｅｎｅ  ５８：２７３（１９８７）；およびＭａｒｔｉｎら，ＤＮＡ  ７：９９（１９８８）。多くのバキュロウイルス系統および改変体、ならびに対応する宿主から許容される昆虫宿主細胞は、以下に記載される：Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５，Ｍｉｌｌｅｒら，ｉｎ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編），Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−２７９（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６）；ならびにＭａｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：５９２−５９４（１９８５）。
【００９１】
哺乳動物発現は、以下に記載されるように達成され得る：Ｄｉｊｋｅｍａら，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１（１９８５）；Ｇｏｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７（１９８２ｂ）；Ｂｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１（１９８５）；および米国特許第４，３９９，２１６号。哺乳動物発現の他の特徴は、以下に記載されるように容易にされ得る：ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）；ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）；米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；米国特許第４，５６０，６５５号；ＷＯ９０／１０３４３０，ＷＯ８７／００１９５，ならびに米国再発行特許第３０，９８５号。
【００９２】
発現構築物は、当該分野で公知の任意の技術を用いて、宿主細胞に導入され得る。これらの技術としては、以下が挙げられる：トランスフェリン−ポリカチオン媒介性ＤＮＡ移入、裸の核酸またはカプセル化核酸を用いたトランスフェクション、リポソーム媒介性細胞融合、ＤＮＡコーティングラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」、およびリン酸カルシウム媒介性トランスフェクション。
【００９３】
本発明のタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現はまた、この内因性遺伝子とインフレームで転写ユニットを含むＤＮＡ構築物を相同組換えにより導入して、この転写ユニットを含む相同組換え細胞を形成することによって操作され得る。この転写ユニットは、標的化配列、調節配列、エキソン、および対になっていないスプライスドナー部位を含む。新しい転写ユニットは、所望される場合、内因性遺伝子をオンまたはオフにするために用いられ得る。この内因性遺伝子発現に影響をもたらす方法は、米国特許第５，６４１，６７０号に教示される。
【００９４】
標的化配列は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列の少なくとも１０、１２、１５、２０、または５０の連続するヌクレオチドのセグメントである。ただし、上記配列は、マウスＮｋｄ配列もしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄ配列に対して９０％以下の同一性であり、より好ましくは、これらに対して約８９、８８、８７または８６％以下の同一性であり、最も好ましくは、それらに対して８５％以下の配列同一性である。転写ユニットは、内因性遺伝子のコード配列の上流に位置する。外因性調節配列は、この内因性遺伝子のコード配列の転写を方向付ける。
【００９５】
ヒトまたは非ヒト霊長類のＮｋｄとしてはまた、ハイブリッドおよびそれらの改変形態が挙げられ得、これらとしては、このハイブリッドまたは改変形態が、ヒトもしくは霊長類Ｎｋｄタンパク質の生物学的活性を維持する限り、融合タンパク質、フラグメントおよびハイブリッド、ならびに改変形態（ここで特定のアミノ酸は、欠失または置換されている）、例えば、１以上のアミノ酸が改変アミノ酸もしくは異常アミノ酸に変化されているような改変、およびグリコシル化のような改変）が挙げられる。ヒトまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの生物学的活性を維持するとは、ＪＮＫ経路が活性化され、そして／またはＷｎｔシグナル伝達が阻害されるが、本明細書中に記載されるように単離されたｈＮｋｄの効力と同じレベルである必要も、組換え生成されたｈＮｋｄの効力と同じレベルである必要もないことを意味する。
【００９６】
任意のヒトまたは非ヒト霊長類タンパク質であるＮｋｄ（本明細書中に記載されたｈＮｋｄに対する抗体との交差反応性により単離され得るか、またはＮｋｄのコードヌクレオチド配列（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが挙げられる）が、本明細書中に記載のｈＮｋｄもしくはそのフラグメントのゲノムヌクレオチド配列またはサブゲノムヌクレオチド配列またはｃＤＮＡの相補的配列とのハイブリダイゼーションを介して単離され得る）がまた、実質的に相同性の意味内に含まれる。縮重ＤＮＡ配列がヒトまたは非ヒト霊長類のＮｋｄをコードし得ることは当業者に明らかであり、これらはまた、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄの対立遺伝子改変体であるとして、本発明内に含まれることが意図される。
【００９７】
本発明の好ましいｈＮｋｄは、記載されるように、精製された形態で同定および単離されている。組換えＤＮＡ技術により調製されたｈＮｋｄもまた、好ましい。「精製形態」、「精製（された）形態」または「実質的に精製された形態」とは、ｈＮｋｄ組成物が、ｈＮｋｄではない他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。
【００９８】
本発明はまた、疾患を有する患者を処置するために有効な量のｈＮｋｄもしくは非ヒト霊長類Ｎｋｄを含む治療的組成物または薬学的組成物、および治療的有効量のｈＮｋｄを投与する工程を包含する方法を含む。これらの組成物および方法は、癌を含む多くの疾患を処置するために有用である。当業者は、ｈＮｋｄが、生存を促進することまたは特定の細胞型において機能することにおいて有用であるか否かを決定するために当該分野で公知の種々のアッセイを容易に使用し得る。
【００９９】
特定の状況において、発現されるｈＮｋｄの量を調節または減少させることは望ましいことであり得る。従って、本発明の別の局面において、ｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドが作製され得、１以上のｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する、細胞によるｈＮｋｄの発現レベルを減少させるための方法が利用され得る。ｍＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドの参照は、ｈＮｋｄの発現が減少されるようにｈＮｋｄの発現に関与する特定の相補的核酸配列と対形成する塩基をして相互作用するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに対して行われる。好ましくは、ｈＮｋｄの発現に関与する特定の核酸配列は、ｈＮｋｄをコードするゲノムＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である。このゲノムＤＮＡ分子は、ｈＮｋｄ遺伝子の調節領域、または成熟ｈＮｋｄタンパク質のコード配列を含み得る。
【０１００】
ｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそのための方法の文脈において、用語ヌクレオチド配列に相補的は、細胞において（すなわち、生理学的条件下で）このような配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために、その配列に十分相補的であることを意味する。ｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約８〜約１００ヌクレオチドを含む配列を含み、より好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５〜約３０ヌクレオチドを含む。ｈＮｋｄアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、核分解に耐性を付与する種々の改変を含み得、例えば、改変されたヌクレオシド間連結［ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５４８（１９９０）；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＢａｎｎｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５，（１９９０）（これらは、参考として援用される）］、５，９５８，７７３およびそこに開示される特許に開示されるように改変された核酸塩基、ならびに／または糖などである。
【０１０１】
アンチセンス技術に広く適用可能であることが公知である、アンチセンス分子の任意の改変および変化は、本発明の範囲内に含まれる。このような改変は、米国特許第５，５３６，８２１号；同５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号、同５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；同５，５８７，３６１号；同５，６２５，０５０号および同５，９５８，７７３号に開示されるようなリン含有結合の調製を含む。
【０１０２】
本発明のアンチセンス化合物は、改変された塩基を含み得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、そのオリゴヌクレオチドを１つ以上の部分または結合体に化学的に結合させて、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞内取り込みを増強させることによって改変され得る。このような部分または結合体としては、脂質（例えば、コレステロール、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質）、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分、例えば、米国特許第５，５１４，７５８号、同５，５６５，５５２号、同５，５６７，８１０号、同５，５７４，１４２号、同５，５８５，４８１号、同５，５８７，３７１号、同５，５９７，６９６号および同５，９５８，７７３号に開示される他のもの）が挙げられる。
【０１０３】
キメラのアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、本発明の範囲内であり、例えば、米国特許第５，０１３，８３０号、同５，１４９，７９７号、同５，４０３，７１１号、同５，４９１，１３３号、同５，５６５，３５０号、同５，６５２，３５５号、同５，７００，９２２号および同５，９５８，７７３号に記載される方法を使用して、本発明のオリゴヌクレオチドから調製され得る。
【０１０４】
アンチセンスの分野において、特定の程度の慣用的実験が、特定の標的に対する最適なアンチセンス分子を選択するために必要とされる。効果的であるために、アンチセンス分子は、好ましくは、標的ＲＮＡ分子のアクセス可能である部分、すなわち、または露出された部分に標的化される。いくつかの場合では、標的ｍＲＮＡ分子の構造について情報が利用可能であるが、アンチセンスを使用する阻害についての現在のアプローチは、実験による。細胞中のｍＲＮＡレベルは、処理された細胞およびコントロール細胞において、ｍＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡレベルのアッセイによって慣用的に測定され得る。生物学的効果は、当該分野において公知であるように、細胞増殖または生存度を測定することによって慣用的に決定され得る。
【０１０５】
ｃＤＮＡレベルをアッセイおよび分析することによってアンチセンス活性の特異性を測定することは、アンチセンスの結果を検証する、当該分野において認識された方法である。処理された細胞およびコントロール細胞由来のＲＮＡが逆転写され、生じたｃＤＮＡ集団が分析されるべきであることが、示唆されてきた［Ｂｒａｎｃｈ，Ａ．Ｄ．，Ｔ．Ｉ．Ｂ．Ｓ．２３：４５−５０（１９９８）］。
【０１０６】
本発明の治療組成物または薬学的組成物は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経皮、髄腔内または大脳内を含む、当該分野において公知の任意の適切な投与経路によって投与され得る。投与は、注射によって迅速にか、あるいは、緩やかな注入または徐放性処方物の投与によるように一定の期間にわたっての、いずれかであり得る。
【０１０７】
さらに、ｈＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄはまた、所望の薬学的または薬力学的な特徴を提供する薬剤と連結または結合体化され得る。例えば、ｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄは、血液脳関門を越える浸透または移動を促進するための、当該分野において公知の任意の物質（例えば、トランスフェリンレセプターに対する抗体）に結合され得、そして静脈注射によって投与され得る（例えば、Ｆｒｉｄｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３７３−３７７（１９９３）（これは、参考として援用される）を参照のこと）。さらに、このヒトまたは霊長類のＮｋｄタンパク質は、可溶性、安定性、半減期および他の薬学的に有利な特徴といった望ましい特性を得るために、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）に安定に連結され得る［例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇ．４：１６９−７３（１９７８）；Ｂｕｒｕｈａｍ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．５１：２１０−２１８（１９９４）（これらは、参考として援用される）を参照のこと）。
【０１０８】
組成物は、通常、薬学的調製物の形態で利用される。このような調製物は、薬学的な分野において周知の様式で作製される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｅｒｍ  ＰＡ（１９９０）を参照のこと。１つの好ましい調製物は、生理食塩水溶液のビヒクルを利用するが、他の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理学的濃度の他の非毒性の塩、５％グルコース水溶液、滅菌水など）もまた、使用され得ることが、企図される。適切な緩衝液が組成物中に存在することもまた、所望され得る。このような溶液は、所望される場合、凍結乾燥され得、そして容易な注射のための滅菌水の添加による再構成に容易な滅菌アンプル中に貯蔵され得る。基本的な溶媒は、水性であってもあるいは非水性であってもよい。このヒトまたは霊長類のＮｋｄタンパク質、そのフラグメントまたは改変体はまた、処置が必要とされる組織に移植され得る、固体または半固体の、生体適合性のマトリクスに組み込まれ得る。
【０１０９】
キャリアはまた、処方物のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘性、清澄度、色、無菌せい（ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ）、安定性、分解速度または臭気を改変または維持するための、薬学的に受容可能な他の賦形剤を含み得る。同様に、キャリアはさらに、血液脳関門を越える放出または吸収または浸透を改変または維持するための、薬学的に受容可能な他の賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、単位用量または複数用量形態のいずれかでの非経口投与のため、あるいは連続的または周期的な注入による脳脊髄液中への直接注入のための投薬量を処方するために、通常および慣用的に使用される物質である。
【０１１０】
用量投与は、投薬処方物の経路の薬物動態学的パラメーターおよび使用される投与に依存して反復され得る。
【０１１１】
このｈＮｋｄ、霊長類Ｎｋｄまたはその改変体もしくはフラグメントを含む特定の処方物は、経口投与されるべきであることもまた、企図される。このような処方物は、好ましくは、カプセル化され、適切なキャリアを用いて固体投薬形態で処方される。適切なキャリア、賦形剤および希釈剤のいくつかの例としては、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、水、鉱油などが挙げられる。処方物は、さらに、潤沢剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、保存薬、甘味料または矯味矯臭剤を含み得る。組成物は、当該分野において周知の手順を使用することによる患者への投与の後に活性成分の迅速な放出、持続的な放出、または遅延放出を提供するように、処方され得る。処方物はまた、蛋白質分解を減少させそして吸収を促進させる物質（例えば、界面活性剤）を含み得る。
【０１１２】
特定の用量は、患者のおよその体重または体表面積または占められるべき体空間の容積に従って計算される。用量はまた、選択された特定の投与経路に依存して計算される。処置に適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる改善は、当業者によって慣用的になされる。このような計算は、標的細胞のアッセイ調製物における本明細書中に開示される活性の観点から、当業者によって過度の実験なくなされ得る。正確な投与量は、標準的な用量応答研究と併用して決定される。処置される状態、投与される組成物の選択、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の徴候の重篤度、ならびに投与経路の選択を含む、関連する状況の観点から、実際に投与される組成物の量が開業医によって決定されることは、理解される。
【０１１３】
本発明の１つの実施形態において、ｈＮｋｄは、生物学的に活性な形態のｈＮｋｄまたはｈＮｋｄの前駆体（すなわち、身体によりｈＮｋｄの生物学的に活性な形態に容易に変換され得る分子）を生成し得るベクターまたは細胞を患者に移植することによって、治療的に投与され得る。１つのアプローチにおいて、ｈＮｋｄを分泌する細胞は、患者への移植のために半透膜中にカプセル化され得る。これらの細胞は、ｈＮｋｄまたはその前駆体を正常に発現する細胞であり得るか、あるいは、ｈＮｋｄまたはその前駆体を発現するように形質転換され得る。患者がヒトの場合、細胞がヒト起源であり、そしてｈＮｋｄがヒトｈＮｋｄであることが、好ましい。しかし、非ヒト霊長類Ｎｋｄが効果的であり得ることは、予期される。
【０１１４】
多くの状況において、患者中のＮｋｄタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを決定することが所望される。Ｎｋｄがいくつかの疾患（例えば、癌）の間に種々のレベルで発現され得ることを示唆するこれまでの発現の証拠に沿う、本明細書中でのヒトＮｋｄの同定は、ｈＮｋｄの存在が細胞増殖および細胞生存に関連する正常な生理学的機能を果たすという結論の基礎を提供する。内因的に生成されたヒトＮｋｄはまた、特定の疾患条件において役割を果たし得る。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、用語「検出」は、患者におけるｈＮｋｄの存在を検出する文脈において、患者中でのｈＮｋｄの量、またはある量のｈＮｋｄを発現する能力を決定すること、疾患の予想される結果および回復の見込みの観点において、予後の判断を推定すること、状況の状態の尺度として一定期間にわたってｈＮｋｄレベルをモニタリングすること、ならびに患者についての好ましい治療レジメンを決定するためにｈＮｋｄレベルをモニタリングすることを含むことが意図される。
【０１１６】
患者中のｈＮｋｄの存在を検出するために、サンプルが、患者より得られる。サンプルは、組織生検サンプルまたは血液、血漿、血清、ＣＳＦなどのサンプルであり得る。ｈＮｋｄがいくつかの癌（例えば、結腸癌、乳癌および肺癌）において高レベルで発現されることを、見出した。ｈＮｋｄを検出するためのサンプルは、これらの組織から採取され得る。ｈＮｋｄの末梢レベルを評価する場合、サンプルは、血液、血漿または血清のサンプルであることが好ましい。中枢神経系におけるｈＮｋｄのレベルを評価する場合、好ましいサンプルは、脳脊髄液または神経組織から得られたサンプルである。
【０１１７】
いくつかの場合において、患者においてか、または患者内の細胞または細胞株において、ｈＮｋｄ遺伝子がインタクトであるか否かを決定することが所望される。インタクトなｈＮｋｄ遺伝子によって、遺伝子中に変更（例えば、点変異、欠失、挿入、染色体崩壊、染色体再配列など）がないことが意味され、ここで、このような変更は、ｈＮｋｄの生成を変更するか、またはその生物学的活性、安定性などを変更して、疾患の進行を導き得る。よって、本発明の１つの実施形態において、ｈＮｋｄにおける任意の変更を検出および特徴付けるための方法が提供される。この方法は、ｈＮｋｄ  ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントもしくはその誘導体を含むオリゴヌクレオチドを提供する工程を包含する。オリゴヌクレオチドの誘導体によって、誘導体化されたオリゴヌクレオチドは、この誘導体化された配列は、ｈＮｋｄ遺伝子に特異的なハイブリダイズに十分な配列相補性を由来する配列に対して有する点で、由来する配列と実質的に同一であることが意味され、誘導体化されたヌクレオチド配列は、必ずしも物理的にそのヌクレオチド配列に由来しないが、任意の様式（例えば、化学合成またはＤＮＡ複製もしくは逆転写もしくは転写を含む）において生成され得る。
【０１１８】
典型的には、患者のゲノムＤＮＡは、患者由来の細胞サンプルより単離され、そして１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＴａｑＩおよびＡｌｕＩ）で消化される。当該分野において周知であるサザンブロットプロトコルを使用して、このアッセイは、患者、または患者中の特定の組織がインタクトなｈＮｋｄ遺伝子またはｈＮｋｄ遺伝子異常を有するか否かを決定する。
【０１１９】
ｈＮｋｄ遺伝子に対するハイブリダイゼーションは、染色体ＤＮＡを変性して一本鎖ＤＮＡを得る工程；この一本鎖ＤＮＡをＮｋｄ遺伝子配列に関連する遺伝子プローブに接触させる工程；およびハイブリダイズしたＤＮＡプローブを同定してヒトｈＮｋｄ遺伝子の少なくとも一部を含む染色体ＤＮＡを検出する工程、を包含する。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、プローブ配列と標的領域中の配列との相補性に起因して標的配列とハイブリッド構造を形成する、ポリヌクレオチドから構成される構造をいう。プローブとしての使用に適切なオリゴマーは、標的化された配列に対して相補的である、最小で約８〜１２個、好ましくは、最小限約２０個連続するヌクレオチドを含み得る。
【０１２１】
本発明のｈＮｋｄ遺伝子プローブは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドであってもＲＮＡオリゴヌクレオチドであってもよく、そして当該分野において公知の任意の方法（例えば、切除、転写または化学合成）によって作製され得る。プローブは、当該分野において公知の任意の検出可能な標識（例えば、放射標識もしくは蛍光標識または酵素的マーカー）で標識され得る。プローブの標識化は、当該分野において公知の任意の方法（例えば、ＰＣＲ、ランダムプライミング、末端標識、ニックトランスレーションなど）によって達成され得る。当業者はまた、標識されたプローブを使用しない他の方法がハイブリダイゼーションを検出するために使用され得ることを、認識する。ハイブリダイゼーションを検出するために使用され得る方法の例としては、サザンブロッティング、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、およびＰＣＲ増幅を用いる一本鎖高次構造多型が挙げられる。
【０１２２】
ハイブリダイゼーションは、典型的には、２５〜４５℃、より好ましくは、３２〜４０℃、より好ましくは、３７〜３８℃で実施される。ハイブリダイゼーションに必要な時間は、約０．２５〜約９６時間、より好ましくは、約１〜７２時間、最も好ましくは、約４〜約２４時間である。
【０１２３】
ｈＮｋｄ遺伝子異常はまた、ＰＣＲ法、およびｈＮｋｄ遺伝子に隣接するかまたはｈＮｋｄ遺伝子内にあるプライマーを使用することによって、検出され得る。ＰＣＲ法は、当該分野において周知である。簡単には、この方法は、ｈＮｋｄ遺伝子内にある標的配列に隣接する核酸配列にハイブリダイズしその標的配列を増幅し得る、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチドプライマー」は、約８〜約３０塩基長にわたるＤＮＡまたはＲＮＡの短鎖をいう。上流プライマーおよび下流プライマーは、典型的には、約２０〜約３０塩基対の長さであり、そしてヌクレオチド配列の複製のために、隣接する領域にハイブリダイズする。そのポリマー化は、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、またはヌクレオチドアナログの存在下で、二本鎖ＤＮＡ分子を生成するＤＮＡポリメラーゼによって特徴付けられる。次いで、二本鎖は、物理的変性方法、化学的変性方法または酵素的変性方法を含む任意の変性方法によって分離される。一般に、物理的変性方法は、典型的には、約８０℃〜１０５℃の温度にまで、約１〜約１０分間の範囲の時間にわたって、核酸を加熱する工程を包含する。このプロセスは、所望の数のサイクルについて反復される。
【０１２４】
プライマーは、増幅されるＤＮＡ鎖に実質的に相補的であるように選択される。よって、プライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、増幅される鎖と選択的にハイブリダイズするために十分相補的であらねばならない。
【０１２５】
ＰＣＲ増幅後、次いで、ｈＮｋｄまたはそのフラグメントを含むＤＮＡ配列は、直接配列決定されるか、または本明細書中に開示される配列との配列比較によって分析されて、活性または発現レベルなどを変化させ得る変更が同定される。
【０１２６】
別の実施形態において、ｈＮｋｄタンパク質を検出する方法が、ｈＮｋｄ遺伝子を発現する組織の分析に基づいて提供される。特定の組織（例えば、乳房、肺、結腸など）は、ｈＮｋｄ遺伝子を発現することが見出された。この方法は、ｈＮｋｄ遺伝子を正常に発現する組織のサンプル由来のｍＲＮＡに、ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程を包含する。サンプルは、ｈＮｋｄ遺伝子中に異常を有することが予期される患者より得られる。
【０１２７】
ｈＮｋｄタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在を検出するために、サンプルが、患者より得られる。サンプルは、血液由来であっても、組織生検サンプル由来であってもよい。サンプルは、そこに含まれる核酸を抽出するために処理され得る。サンプルより得られた核酸は、ゲル電気泳動または他のサイズ分離技術に供される。
【０１２８】
サンプルのｍＲＮＡを、プローブとして働くＤＮＡ配列と接触させて、ハイブリッド二重鎖を形成する。上記で議論された標識プローブの使用は、生じる二重鎖の検出を可能にする。
【０１２９】
ｈＮｋｄタンパク質をコードするｃＤＮＡまたはこのｃＤＮＡの誘導体をプローブとして使用する場合、高ストリンジェンシー条件が、偽陽性を防ぐために使用され得、この偽陽性は、インタクトであり分画されたｈＮｋｄ遺伝子が実際存在しない場合の、ｈＮｋｄヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションおよび見かけ上の検出である。ｈＮｋｄ  ｃＤＮＡ由来の配列を使用する場合、よりストリンジェントでない条件が使用され得るが、これは、偽陽性の可能性が原因でより好ましくないアプローチである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション手順および洗浄手順の間の多くの因子（温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミドの濃度を含む）によって決定される。これらの因子は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）上述］に概略される。
【０１３０】
ｈＮｋｄタンパク質をコードするｍＲＮＡの、サンプル中での検出感度を増強させるために、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）の技術を使用して、ｈＮｋｄタンパク質をコードするｍＲＮＡより転写されたｃＤＮＡを増幅し得る。ＲＴ／ＰＣＲの方法は、当該分野において周知であり、そして以下のように実施され得る。総細胞性ＲＮＡを、例えば、標準的グアニジンイソチオシアネート法によって単離し、そしてこの総ＲＮＡを逆転写する。逆転写法は、逆転写酵素および３’末端プライマーを使用する、ＲＮＡのテンプレート上でのＤＮＡの合成を包含する。典型的には、プライマーは、オリゴ（ｄＴ）配列を含む。次いで、ｃＤＮＡが、ＰＣＲ法およびｈＮｋｄ特異的プライマーを使用して増幅される。［Ｂｅｌｙａｖｓｋｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：２９１９−２９３２（１９８９）；ＫｒｕｇおよびＢｅｒｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：３１６−３２５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８７）（これらは、参考として援用される）］。
【０１３１】
ポリメラーゼ連鎖反応法は、増幅されるＤＮＡセグメントの２つの隣接する領域に実質的に相補的な２つのオリゴプライマーを使用して上記のように実施される。増幅に続いて、次いで、ＰＣＲ産物を電気泳動し、そしてエチジウムブロミド染色またはホスホイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｉｎｇ）によって検出する。
【０１３２】
本発明はさらに、患者から得られたサンプル中におけるｈＮｋｄタンパク質の存在を検出するための方法を提供する。タンパク質を検出するための当該分野において公知の任意の方法が、使用され得る。このような方法としては、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫化学法、バインダー−リガンドアッセイ、免疫組織化学技術、凝集アッセイおよび補体アッセイが挙げられるがこれらに限定されない。［Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２１７−２６２，ＳｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９１）（これは、参考として援用される）］。抗体をｈＮｋｄタンパク質のエピトープと反応させる工程、および標識化ｈＮｋｄタンパク質またはその誘導体を競合的に置換させる工程を包含するバインダー−リガンド免疫アッセイ法が、好ましい。
【０１３３】
本明細書中で使用される場合、ｈＮｋｄタンパク質の誘導体は、特定のアミノ酸が欠失されたか、あるいは改変されたアミノ酸または通常ではないアミノ酸に置換されたかまたは変更されたポリペプチドを含むことが意図され、ここで、この誘導体は、ｈＮｋｄに生物学的に等価であり、ここで、このポリペプチド誘導体は、ｈＮｋｄタンパク質に対して惹起された抗体と交差反応する。交差反応によって、抗体が、その形成を誘導する抗原以外の抗原と反応することを意味する。
【０１３４】
多くの競合的タンパク質結合免疫アッセイおよび非競合的タンパク質結合免疫アッセイが、当該分野において周知である。このようなアッセイにおいて使用される抗体は、例えば、凝集試験において使用される場合未標識であり得るか、または広範な種々のアッセイ法における使用のために標識され得る。使用され得る標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、酵素基質または補因子、酵素インヒビター、粒子、色素などが、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））、蛍光免疫アッセイなどにおける使用のために、挙げられ得る。
【０１３５】
被験体非ヒト霊長類またはヒトのＮｋｄタンパク質またはそのエピトープに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当該分野において公知の多くの方法のいずれかによって、免疫アッセイにおける使用のために作製され得る。エピトープによって、ポリペプチドの抗原決定基に対して言及がなされる。エピトープは、そのエピトープに独特である空間的コンフォーメーションの３つのアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォーメーションを決定する方法は、当該分野において公知であり、そして例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる。
【０１３６】
タンパク質に対する抗体を調製するための１つのアプローチは、そのタンパク質の全てまたは一部のアミノ酸配列を選択および調製し、この配列を化学的に合成し、そして適切な動物（典型的には、ウサギ、ハムスターまたはマウス）へ注入することである。
【０１３７】
疎水性領域中にあり、よって、成熟タンパク質においてされる可能性があるオリゴペプチドに基づいて、ｈＮｋｄタンパク質に対する抗体を生成するための候補として、オリゴペプチドが、選択され得る。ｈＮｋｄに対する抗体を生成するために使用されるペプチド配列は、以下を含む：
さらなるオリゴペプチドは、例えば、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ，Ｗｅｌｌｉｎｇ，Ｇ．Ｗ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８８：２１５−２１８（１９８５）（これは、参考として本明細書中に援用される）を使用して決定され得る。
【０１３８】
本発明の他の実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体が提供され、ここで、この抗体は、ｈＮｋｄに対して特異的であるが、マウスまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＮｋｄタンパク質を感知されるほどには結合しない。句「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体（典型的には、マウスモノクローナル抗体）由来の抗体をいう。あるいは、ヒト化抗体は、親の非ヒト抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するキメラ抗体由来であり得るが、ヒト化抗体は、ヒトに投与される場合、親の抗体と比較して低減された免疫原性を示す。本明細書中で使用される場合、句「キメラ抗体」は、典型的には異なる種由来である２つの異なる抗体由来の配列を含む抗体をいう（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメント（一般的には、ヒト定常領域およびマウス定常領域）を含む。
【０１３９】
ヒト化抗体が、ヒトにおいて、親のマウスモノクローナル抗体よりもほとんど免疫原性ではない場合、これらは、アナフィラキシーの危険性をほとんど有することなくヒトの処置に使用され得る。よって、これらの抗体は、ヒトに対するインビボ投与を包含する治療的適用（例えば、新生物性疾患の処置のための放射線増感剤としての使用、または例えば、癌治療の副作用を低減させる方法における使用）において好ましくあり得る。
【０１４０】
ヒト化抗体は、以下を含む種々の方法によって達成され得る：例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域および定常領域上に移植すること（当該分野において「ヒト化」といわれるプロセス）、あるいは（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、これらを表面残基の置換によるヒト様表面で「覆う（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」こと（当該分野において「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」といわれるプロセス）。本発明において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体および「ベニアリングした」抗体の両方を含む。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７（１９９４）、ならびにＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３（１９９１）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）中に開示される。
【０１４１】
句「相補性決定領域」は、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）を参照のこと。句「定常領域」は、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。本発明において、マウス定常領域は、ヒト定常領域によって置換される。そのヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリン由来である。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ（α、δ、ε、γまたはμ）のいずれかから選択され得る。
【０１４２】
ヒト化抗体の１つの方法は、ヒト重鎖配列および軽鎖配列に対して非ヒト重鎖配列および軽鎖配列を整列する工程、選択する工程、このような整列に基づいて非ヒトフレームワークをヒトフレームワークと置換する工程、ヒト化配列のコンフォーメーションを予想するために分子モデリングする工程、そして親の抗体のコンフォーメーションに比較する工程を包含する。このプロセスの後に、ＣＤＲ領域内の残基のバックミューテーションが反復され、この変異は、予想したヒト化配列モデルのコンフォーメーションが、親の非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンフォーメーションにかなり近似するまでＣＤＲの構造を妨害する。このようなヒト化抗体はさらに、（例えば、Ａｓｈｗｅｌｌレセプターを介する）取り込み及びクリアランスを容易にするように誘導体化され得る。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号および同５，５８５，０８９号（これらの特許は本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１４３】
ｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄに対するヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されているトランスジェニック動物を使用して生成され得る。例えば、ＷＯ  ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示し、ここで、これらの動物は、内因性の重鎖および軽鎖の遺伝子座の不活化に起因して、機能的な内因性免疫グロブリンを生成しない。ＷＯ  ９１／１０７４１はまた、免疫原に対する免疫応答をマウントし得るトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示し、ここで、これらの抗体は、霊長類の定常領域および／または可変領域を有し、そしてここで、内因性の免疫グロブリンをコードする遺伝子座は、置換されているかまたは不活化されている。ＷＯ  ９６／３０４９８は、哺乳動物中の免疫グロブリン遺伝子座を改変して、例えば、定常領域または可変領域の全てもしくは一部を置換して改変された抗体分子を形成するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示する。ＷＯ  ９４／０２６０２は、不活化内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示する。米国特許第５，９３９，５９８号は、トランスジェニックマウスの作製法を開示し、ここで、このマウスは、内因性重鎖を欠き、そして１つ以上の異種定常領域を含む内因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する。
【０１４４】
上記のトランスジェニック動物を使用して、選択された抗原性分子に対する免疫応答を生成し得、そして抗体産生細胞は、この動物から取り出され得、そしてヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するために使用され得る。免疫化プロトコル、アジュバントなどは、当該分野において公知であり、そして（例えば、ＷＯ  ９６／３３７３５に開示されるようなトランスジェニックマウスの）免疫化において使用される。この公開物は、種々の抗原性分子（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ、ヒトＣＤ４、Ｌ−セレクチン、ｇｐ３９および破傷風毒素を含む）に対するモノクローナル抗体を開示する。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物学的活性または生理学的効果を阻害または中和する能力について試験され得る。ＷＯ  ９６／３３７３５は、ＩＬ−８で免疫されたトランスジェニックマウスの免疫細胞由来のＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が、好中球のＩＬ−８誘導性機能をブロックしたことを開示する。トランスジェニック動物を免疫するために使用した抗原に対して特異性を有するヒトモノクローナル抗体がまた、ＷＯ  ９６／３４０９６に開示される。
【０１４５】
本発明において、本発明のｈＮｋｄポリペプチドまたは霊長類Ｎｋｄポリペプチドおよびこれらの改変体を使用して、上記のようにトランスジェニック動物を免疫する。モノクローナル抗体は、当該分野において公知の方法を使用して作製され、そしてこれらの抗体の特異性は、単離されたｈＮｋｄポリペプチドまたは霊長類Ｎｋｄポリペプチドを使用して試験される。
【０１４６】
ヒトもしくは霊長類のＮｋｄのタンパク質またはそのエピトープの調製法としては、化学合成、組換えＤＮＡ技術または生物学的サンプルからの単離が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドの化学合成は、例えば、以下によって実施され得る：固相ペプチド合成の古典的なＭｅｒｒｉｆｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３（これは、参考として援用される）、またはＲａｐｉｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍにおけるＦＭＯＣストラテジー［Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）（ＣａｐｒｉｎｏおよびＨａｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３７：３４０４（１９７２）（これは、参考として援用される）］。
【０１４７】
ポリクローナル抗体は、ウサギまたは他の動物に抗原を注射することにより免疫すること、続いて適切な間隔でブーストすることによって調製され得る。これらの動物から採血し、そして精製したｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄのタンパク質に対して、通常ＥＬＩＳＡによって、あるいはｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄの作用をブロックする能力に基づくバイオアッセイによって、血清をアッセイする。非限定的な例示において、ｈＮｋｄに対する抗体は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質に対するｈＮｋｄの結合をブロックし得る。鳥種（例えば、ニワトリ、七面鳥など）を使用する場合、抗体は、卵黄より単離され得る。モノクローナル抗体は、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒの方法の後に、免疫したマウス由来の脾細胞を、継続的に複製する腫瘍細胞（例えば、骨髄腫細胞またはリンパ腫細胞）と融合することによって調製され得る。［ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒ：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；ＧｕｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７３：１−４６，ＬａｎｇｏｎｅおよびＢａｎａｔｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１）（これらは、参考として援用される）］。次いで、このように形成されたハイブリドーマ細胞を、限界希釈法によってクローニングし、そして抗体の産生について、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはバイオアッセイによって上清をアッセイする。
【０１４８】
抗体が、標的タンパク質を認識しそしてそれに特異的に結合する独特の能力は、このタンパク質の過剰発現を標的とするためのアプローチを提供する。従って、本発明の別の局面は、ｈＮｋｄタンパク質に対する特異的抗体を用いて患者を処置することによって、このｈＮｋｄタンパク質の過剰発現に関係する疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【０１４９】
ｈＮｋｄタンパク質または霊長類Ｎｋｄタンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体のいずれかが、上記のように当該分野で公知の適切な任意の方法により産生され得る。例えば、マウスモノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって産生され得るか、あるいは、ｈＮｋｄタンパク質もしくは霊長類Ｎｋｄタンパク質、またはそれらの免疫学的に活性なフラグメント、あるいは抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントが、ｈＮｋｄタンパク質または霊長類Ｎｋｄタンパク質を認識し結合することができる抗体の産生を惹起するために、動物に投与され得る。このような抗体は、任意のクラスの抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが挙げられ、鳥類種の場合、ＩｇＹが挙げられるが、これらに限定されない）に、そして任意のサブクラスの抗体に、由来し得る。
【０１５０】
単離されたヒトＮｋｄタンパク質または霊長類Ｎｋｄタンパク質を利用可能なことにより、高スループットスクリーニング法（ＨＴＳ）の慣用的な適用を介して、結合パートナーへのｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄの結合を阻害する、低分子および低分子量化合物を同定することが、可能となる。ＨＴＳ法は、一般的には、治療能力についてのリード化合物の迅速なアッセイを可能にする技術を指す。ＨＴＳ技術は、試験物質の自動取扱い、ポジティブシグナルの検出、およびデータの解釈を使用する。リード化合物は、放射能の取込みを介してか、あるいは読み出しとして吸光度、蛍光、または発光に頼る光学アッセイを介して、同定され得る。［Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６２４〜６３１（１９９８）］。
【０１５１】
例えば、リガンド結合についてｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄと競合することによって、ｈＮｋｄまたは霊長類Ｎｋｄとそのリガンドとの相互作用を阻害する化合物についての高スループットスクリーニングにおける使用のために適合され得るモデル系が、利用可能である。Ｓａｒｕｂｂｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：７０〜７５（１９９６）は、ＩＬ−１レセプターの活性部位への結合について天然のリガンドと競合する分子を発見するための、無細胞非同位体アッセイを記載する。Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｃ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７３：２０〜３１（１９９９）は、標識リガンドが、粒子上に固定されたそのレセプターに結合し、レセプター結合について標識リガンドと競合する分子の存在下では、その粒子上の標識が減少する、一般的な粒子ベースの非放射性法を記載する。
【０１５２】
本発明の、治療ｈＮｋｄポリヌクレオチドまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄポリヌクレオチド、ならびに治療ｈＮｋｄポリペプチドまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクル中で利用され得る。この遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源であっても、非ウイルス起源であってもよい（一般的に、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１〜６４（１９９４）；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：８４５〜８５２（１９９４）；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１８５〜１９３（１９９５）；ならびにＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１４８〜１５３（１９９４）を参照のこと）。本発明による治療剤のコード配列を含む構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所投与または全身投与のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを使用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導され得る。このコード配列の発現は、構成的であるかまたは調節されるかのいずれかであり得る。
【０１５３】
本発明は、選択された目的の核酸分子を保有または発現するように構築された組換えレトロウイルスを使用し得る。使用され得るレトロウイルスベクターとしては、ＥＰ  ０  ４１５  ７３１；ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９４／０３６２２；ＷＯ  ９３／２５６９８；ＷＯ  ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ  ９３／１１２３０；ＷＯ  ９３／１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３８６０〜３８６４（１９９３）；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２〜９６７（１９９３）；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３〜８８（１９９３）；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３〜５０３（１９９２）；Ｂａｂａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９〜７３５（１９９３）；米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；ならびにＥＰ  ０  ３４５  ２４２に記載されるベクターが、挙げられる。好ましい組換えレトロウイルスとしては、ＷＯ  ９１／０２８０５に記載されるものが、挙げられる。
【０１５４】
上記レトロウイルスベクター構築物を用いる使用に適切なパッケージング細胞株は、容易に調製され得（ＰＣＴ公開ＷＯ  ９５／３０７６３およびＷＯ  ９２／０５２６６を参照のこと）、そして組換えベクター粒子を産生する産生細胞株（ベクター細胞株とも呼ばれる）を作製するために使用され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、パッケージング細胞株は、ヒト細胞株（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、それにより、ヒト血清における不活化を生存し得る組換えレトロウイルスの作製が、可能になる。
【０１５５】
本発明はまた、遺伝子送達ビヒクルとして機能し得る、アルファウイルスベースのベクターを使用する。このようなベクターは、広範な種類のアルファウイルスから構築され得、そのようなアルファウイルスとしては、例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）が、挙げられる。このようなベクター系の代表的例としては、米国特許第５，０９１，３０９号；同第５，２１７，８７９号；および同第５，１８５，４４０号；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９２／１０５７８；ＷＯ９４／２１７９２；ＷＯ
９５／２７０６９；ＷＯ  ９５／２７０４４；およびＷＯ  ９５／０７９９４に記載されるものが、挙げられる。
【０１５６】
本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのような、パルボウイルスを使用し得る。代表的例としては、ＷＯ  ９３／０９２３９においてＳｒｉｖａｓｔａｖａにより、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２〜３８２８（１９８９）により；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４〜１６５（１９８８）により；およびＦｌｏｔｔｅら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０：１０６１３〜１０６１７（１９９３）により開示される、ＡＡＶベクターが、挙げられる。
【０１５７】
アデノウイルスベクターの代表的例としては、Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２７（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４（１９９１）；ＷＯ
９３／１９１９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．２１５〜２１９（１９９４）；Ｋａｓｓ−Ｂｉｓｌｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９０：１１４９８〜１１５０２（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８〜２８４８（１９９３）；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７５：２０７〜２１６（１９９３）；Ｌｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４０３〜４０９（１９９３）；Ｃａｉｌａｕｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１２８７〜１２９１（１９９３）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０〜１３４（１９９３）；Ｊａｆｆｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１：３７２〜３７８（１９９２）；ならびにＬｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ  １０１：１９５〜２０２（１９９２）により記載されるものが、挙げられる。本発明において使用可能な例示的アデノウイルス遺伝子治療ベクターとしてはまた、ＷＯ  ９４／１２６４９、ＷＯ  ９３／０３７６９；ＷＯ  ９３／１９１９１；ＷＯ  ９４／２８９３８；ＷＯ  ９５／１１９８４およびＷＯ  ９５／００６５５に記載されるものが、挙げられる。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７〜１５４（１９９２）に記載されるようなアデノウイルスを死滅させるために連結されたＤＮＡの投与は、使用され得る。
【０１５８】
他の遺伝子送達ビヒクルおよび遺伝子送達方法が、使用され得、これらとしては、アデノウイルスのみを殺傷するための、連結されたかまたは連結されていない、ポリカチオン性濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７〜１５４（１９９２））；リガンドに連結されたＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５〜１６９８７（１９８９）を参照のこと）；真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、１９９４年５月９日出願の米国特許出願番号０８／２４０，０３０および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）；光重合ヒドロゲル材料の沈着；携帯型遺伝子移入粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載される）；米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ  ９２／１１０３３に記載される電離放射線；核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられる。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：２４１１〜２４１８（１９９４）およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１５８１〜１５８５（１９９４）に記載される。
【０１５９】
裸ＤＮＡもまた、使用され得る。例示的裸ＤＮＡ導入法は、ＷＯ  ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取込み効率は、生分解性ラテックスビーズを使用して改善され得る。ＤＮＡコーティングラテックスビーズは、そのビーズによるエンドサイトーシス開始の後、細胞中に効率的に輸送さえる。この方法は、疎水性を増加するため、そしてそれにより、エンドソームの破壊および細胞質中へのＤＮＡの放出を容易にするためのこのビーズの処理によりさらに改善され得る。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ９５／１３７９６、ＷＯ  ９４／２３６９７、およびＷＯ  ９１／１４４４５、ならびにＥＰ番号０  ５２４  ９６８に記載される。
【０１６０】
使用に適切なさらなる非ウイルス送達としては、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２４）：１１５８１〜１１５８５（１９９４）に記載されるアプローチのような、機械的送達系が、挙げられる。さらに、コード配列およびそのような発現の生成物は、光重合ヒドロゲル材料の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達に使用され得る遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような携帯型遺伝子移入粒子銃の使用；米国特許第５，２０６，１５２号およびＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ９２／１１０３３に記載されるような、移入遺伝子を活性化するための電離放射線の使用が、挙げられる。
【０１６１】
本発明は、好ましい実施形態を含んで上記に記載されているが、以下の実施例は、本発明をさらに例証するために提供される。
【０１６２】
（実施例１）
（ヒトＥＳＴデータベースからの部分的ヒトＮｋｄ配列の同定）
図１に含まれる配列（配列番号２）を有するマウスＮｋｄ核酸配列を使用して、ＢＬＡＳＴシリーズのプログラム［Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｒ．およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：５５０９〜５５１３（１９９０）］を使用してヒトＥＳＴデータベース中の潜在的ヒトホモログを同定した。候補配列の多重アライメントを、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメント［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０（１９９９）］を使用して行った。
【０１６３】
この検索は、２つのヒットＡＩ１６７９１０およびＨ５５１４８を生じた。このＡＩ１６７９１０  ＥＳＴを順番付け、配列決定した。この配列分析により、マウスＮｋｄ配列と実質的な類似性を有するがこの遺伝子の５’末端を欠く、配列が、明らかになった。
【０１６４】
（実施例２）
（全長ｈＮｋｄのクローニング）
全長ｈＮｋｄを、レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）法とＲＴ−ＰＣＲ  ＲＡＣＥ法との組合せによって、クローニングした。全ＲＮＡを、レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）（Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ（ＣＡ））により、霊長類ヒト結腸癌細胞から抽出した。ＬＣＭを、当該分野で周知の方法によって実行した（Ｓｉｍｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｒｏｔｏｌ．１５６（ａ）：４４５〜４５２（２０００）を参照のこと）。これにより、実質的に均質な細胞サンプルを得るための特定の細胞型の単離が、提供される。
【０１６５】
５’末端を含む遺伝子全体を、上記のような結腸癌患者からＬＣＭにより得た全ＲＮＡ（ＲＮＡ  ｐｒｅｐ  ＩＤ＃  １００／サンプル１ｂ３５２１サンプル名ＵＣ−Ｃ２ＣＡ）から合成したｃＤＮＡを、ＲＡＣＥ用のｃＤＮＡテンプレートとして使用して、製造業者のプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｋ１８１１−１）に従って、５’  ＲＡＣＥによりクローニングした。この製造業者のプロトコルは、下記に記載される：
５’  ＲＡＣＥプロトコル：
ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡテンプレートを、癌患者からＬＣＭにより単離したＲＮＡ（ＲＮＡ  ｐｒｅｐ  ＩＤ＃  １００／サンプルＩＤ３５２／サンプル名ＵＣ−Ｃ２ＣＡ）から、製造業者のプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｋ１８１１−１）に従って、合成した。増幅は、製造業者のプロトコルに従って、１Ｍ  ＧＣにてＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ−ｃＤＮＡ  ＰＣＲキット（Ｋ１９０７−１）を用いて、上記のｃＤＮＡテンプレートと、製造業者により提供されたユニバーサルプライマー混合物と、ヒトＮｋｄに特異的なプライマー（ＣＨ３０８：ＣＴＴＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＣＡＡＡＧＴＣ）とを使用して、実施した。ＰＣＲを、９４℃で０．５分間／５８℃で０．５分間／６８℃で２分間の３０サイクル、その後、９４℃で１分間／５８℃で１分間／６８℃で２分間の１０サイクルについて、実行した。最終回の伸長は、７２℃にて１０分間行った。このＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換した。正確な５’ＲＡＣＥ産物を保有する細菌クローンを、ネスティッドプライマー（ＣＨ３０６：ＣＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＡＡＣＴＴＣＡおよびＣＨ３０８：ＣＴＴＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＣＡＡＡＧＴＣ）を使用するＰＣＲスクリーニングによって、同定した。
【０１６６】
これにより、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域を含む、全長ｈＮｋｄ遺伝子の単離が生じる。この配列は、図１および図３（それぞれ、配列番号１および配列番号５）に含まれる。
【０１６７】
ヒトＮｋｄの核酸配列（５’非翻訳領域および３’非翻訳領域を含む）を、図１にあるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔにより整列する。ヌクレオチドレベルでｍＮｋｄとｈＮｋｄとが８５％同一であることが、このアライメントから理解され得る。さらに、このｈＮｋｄ  ＤＮＡ配列およびｍＮｋｄ  ＤＮＡ配列は、図３および図４（配列番号５および配列番号６）に、別々に示される。
【０１６８】
ヌクレオチド配列の再吟味により、このタンパク質配列を識別した。この配列は、図５および配列番号７に示される。これから、ｈＮｋｄタンパク質が、４７０アミノ酸長であることが、理解され得る。
【０１６９】
ｈＮｋｄおよびｍＮｋｄのアミノ酸配列が、図２において整列される。マウスＮｋｄのアミノ酸配列およびヒトＮｋｄのアミノ酸配列が、タンパク質レベルで８７％同一であること、ならびにマウスＮｋｄが、ヒトＮｋｄタンパク質より１つ少ないアミノ酸残基を含むことが、このアライメントから理解され得る。さらに、ｈＮｋｄについてのアミノ酸配列およびｍＮｋｄについてのアミノ酸配列が、図５および図６（配列番号７および配列番号８）に別個に示される。これらのタンパク質が、結合に関与する残基１３３〜１６８に相当する、同一のＥＦハンド領域を含むこともまた、理解され得る。
【０１７０】
（実施例３）
（ヒト染色体領域へのｈＮｋｄのマッピング）
直前の実施例において得た全長Ｎｋｄ核酸配列を使用して、Ｇｅｎｂａｎｋゲノム配列データベースをブラスト実行して、ｈＮｋｄを含む染色体領域を同定した。この配列は、ヒト第１６染色体から、２つのＢＡＣヒットを生じた。図７および図８に示されるように、ｈＮｋｄのコード領域全体は、１１個のエキソンからなる。これらのエキソンは、ヒト第１６染色体上の８６Ｋｂ領域にマッピングされ得る。配列分析によって、このゲノム配列が、５’ＲＡＣＥによりクローン化したｈＮｋｄ配列として、同一のコード領域および３’非翻訳領域を含むことが、明らかとなった。唯一の配列の差異は、Ｇｅｎｂａｎｋゲノム配列と比較した、５’ＵＴＲ中の２つのヌクレオチド変化である。この１１個のエキソン（非翻訳領域およびコード領域を含む）のヌクレオチド配列は、図７（配列番号９〜２２）に含まれる。この時点で、５’ＵＴＲ中のこの２つのヌクレオチド変化が、ｈＮｋｄ発現に対して何らかの効果を有するか否かは、未知である。
【０１７１】
（実施例４）
（融合タンパク質の調製）
ＧＳＴ融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１  ＤＥ３（ｐｌｙＳ）において発現させ、そしてグルタチオンビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製する。Ｍｙｃ−ｈＮｋｄタンパク質を、３５Ｓ−メチオニンの存在下でＴＮＴ共役（ＴＮＴ  ｃｏｕｐｌｅｄ）網状赤血球ライセートシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用するインビトロ転写および翻訳によって、調製する。この３５Ｓ標識ｈＮｋｄを、抗Ｍｙｃ抗体およびプロテインＡビーズによってかまたはグルタチオンビーズに固定したＧＳＴ融合タンパク質によって、４℃にて３時間沈殿させる。
【０１７２】
（実施例５）
（ｈＮｋｄによるＷｎｔシグナル伝達の阻害）
２９３細胞を、ホタルルシフェラーゼを発現するＬＥＦルシフェラーゼレポーター、ＬＥＦ−１発現ベクター、トランスフェクションコントロールとしてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを発現するｐＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、と、以下のプラスミド：ｐＣＤＮＡＨｉｓ３Ｃ  β−ガラクトシダーゼ；ｐＣＧＷｎｔ−１プラスｐＣＤＮＡＨｉｓ３Ｃ  βガラクトシダーゼ；ｐＣＧＷｎｔ−１プラスｐＣ５２＋ＭｙｃｈＮｋｄ；ｐＣ５２＋ＭｙｃｈＮｋｄ単独とで同時トランスフェクトした。各サンプルのＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポーター活性を、製造業者の指示書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して、測定し、そして標準化した。
【０１７３】
詳細には、２９３細胞を、１２ウェルプレートにおいて増殖させた。細胞を、ＬＥＦ−１、ＬＥＦ−１レポーター、Ｒｅｎｉｌｌａと、β−ガラクトシダーゼ、ｈＮｋｄ、Ｗｎｔ−１プラスβガラクトシダーゼ、またはＷｎｔ−１プラスｈＮｋｄの発現構築物でトランスフェクトした。トランスフェクション３６時間後の相対的ルシフェラーゼ活性を、測定した。
【０１７４】
この実験のデータの平均を、図１４に含める。これらの結果に基づいて、ｈＮｋｄが、２９３細胞におけるルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、Ｗｎｔ−１シグナル伝達を阻害したことが、理解され得る（この図において、ＲＬＶは、相対的ルシフェラーゼ単位を指す）。
【０１７５】
（実施例６）
（正常なヒト細胞株およびヒト細胞組織とヒト癌細胞株およびヒト癌組織における、ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡの発現）
（正常組織）
ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを、脳、男性心臓、腎臓、肝臓、肺、結腸、骨髄、小腸、脾臓、胃、胸腺、前立腺、骨格、筋肉、精巣、子宮、胎児脳、胎児肝臓、脊髄、胎盤、副腎、膵臓、唾液腺、気管、および乳腺において、リアルタイム定量ＰＣＲにより測定した。すべての組織におけるｈＮｋｄの発現を、β−グルクロニダーゼのレベルに対して標準化した。この比は、１．００Ｅ−０３（骨髄において最低の発現）〜４．００Ｅ−０２（脊髄において最高の発現）の範囲であった。この実験の結果は、図１５にあり、これは、ｈＮｋｄの基礎ｍＲＮＡレベルが、正常な組織では低いことを示す。
【０１７６】
（癌細胞株）
ヒト細胞株のコレクションを、ＡＴＣＣにより推奨される培地にて増殖させた。このコレクションは、Ｃａｇｏ．２、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、Ｃｏｌｏ  ３２０  ＤＭ、Ｔ８４、ＨＣＴ１５、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＯＶＯ、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６（結腸癌細胞株）；１８４Ｂ５（初代乳房細胞株）；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ａｌａｂ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳癌細胞株）；ＤＵ１４５、ＬＮＣＡＰ、ＷＯＣＡ、ＰＣ３、ＧＲＤＰ２（前立腺癌細胞株）；ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３（卵巣癌細胞株）；ＩＭＲ９０（初代線維芽細胞株）；８４７（ＳＶ４０形質転換線維芽細胞株）；ＨＴ１０８０（線維肉腫細胞株）；Ａ−４３１（類表皮癌細胞株）；Ｕ３７３ＭＧ（神経膠芽腫細胞株）；ＮＣＩＨ２３（非小細胞肺癌細胞株）；ＨＭＶＥＣ（内皮細胞株）を含んだ。全ＲＮＡの抽出後、ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いて合成し、そして定量リアルタイムＰＣＲ分析において使用して、その中のアクチンｍＲＮＡのレベルに対して標準化したｈＮｋｄ  ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。これらの結果は、図１６に含まれ、そして、ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡが、結腸癌株においてのみ高レベルで発現され、試験したヒト癌細胞株の他の型においては高レベルでは発現されなかったことを、示す。
【０１７７】
（実施例７）
（ｈＮｋｄによるＪＮＫの活性化）
ＪＮＫアッセイを、改変を加えて、記載された［Ｂｏｕｔｒｏｓら、Ｃｅｌｌ
９４：１０８〜１１８（１９９８）］ように実行する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、６ウェルプレート中で、１０％仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地において対数増殖まで増殖させる。この細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥプラス試薬（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、トランスフェクトする。トランスフェクションの２２時間後に、細胞を、ＳＤＳサンプル緩衝液中に溶解する。等量のサンプルを、トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）により分離させ、ニトロセルロース膜上にトランスファーする。この膜を、ｃ−ＪｕｎのＮ末端の６３位にあるリン酸化セリンを認識するＰｈｏｓｐｈｏＰｌｕｓ  ｃ−Ｊｕｎ（Ｓｅｒ６３）ＩＩ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてブロッティングする。その後、同じ膜を、ストリッピングし、そして、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてブロッティングして、発現された、Ｘ−ｐｒｅｓｓタグ化ｈＮｋｄおよびβ−ガラクトシダーゼの量を検出する。同じ膜を再びストリッピングし、そして抗ＧＡＰ抗体を用いてブロッティングして、ローディングコントロールとして、各サンプル中のＧＡＰの量を検出する。
【０１７８】
リン酸化ｃ−Ｊｕｎバンドの強度の増加が存在することが、予期される。
【０１７９】
（実施例８）
（哺乳動物組織におけるｈＮｋｄの発現）
哺乳動物組織におけるｈＮｋｄの発現を、ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して調査する。このＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔを、ｈＮｋｄの放射標識フラグメントとハイブリダイズさせる。このフラグメントは、ｈＮｋｄのＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ結合ドメインを含む。分析されるべき組織としては、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、筋肉、腎臓、および精巣が、挙げられる。
【０１８０】
（実施例９）
（ＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄとのｈＮｋｄの相互作用）
ベクターｐＣＤＮＡ３．ＩＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）においてｈＮｋｄ、ｈＮｋｄ−δ  ＥＦハンド、またはＧＦＰ遺伝子を発現するＣｏｓ７細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎとプロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）とを含む緩衝液において、溶解する。全細胞溶解物を、モノクローナルＤｖｌ抗体１、２、および３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて免疫沈降させ、そしてＸｐｒｅｓｓ抗体を用いてブロッティングする。ｈＮｋｄのＥＦドメインがｍＮｋｄのＥＦドメインと同様に挙動することを予期すると、このＥＦハンドにおけるＮｋｄ変異は、ＤｖｌへのｈＮｋｄの結合に対して有意な効果は有さないはずである。この仮説を試験するために、Ｍｙｃタグ化Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、ＤＤ２を含むＭｙｃタグ化Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄフラグメント、ＤｓｈのＮ末端ドメインまたはＣ末端ドメインを含むＭｙｃタグ化Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄフラグメント、およびｈＮｋｄ変異体を発現する、Ｃｏｓ７細胞からの細胞溶解物を、Ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いて免疫沈降させ、Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いてブロッティングする。ｈＮｋｄ変異体は、ネイティブｈＮｋｄと比較して変化したＥＦハンド中の１アミノ酸または２アミノ酸を有する部位特異的変異誘発によって作製する。
【０１８１】
別の実験において、３５Ｓで標識したＭｙｃタグ化ｈＮｋｄタンパク質を、抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降させるか、またはＧＳＴ融合タンパク質により沈降させる。この免疫複合体を、電気泳動およびオートラジオグラフィーに供する。細菌由来のＧＳＴ融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離させ、クーマシーブルー染色する。ｈＮｋｄがｍＮｋｄと同様に挙動すること、および３５Ｓ−ｈＮｋｄが、ＰＤＺおよび隣接Ｎ末端塩基性アミノ酸残基を含むがＤｓｈのＮ末端ドメインもＣ末端ドメインも含まないＤｓｈフラグメントと結合することが、予期される。
【０１８２】
（実施例１０）
（哺乳動物細胞におけるＷｎｔ応答性ＬＥＦ−１レポーター活性に対する、ｈＮｋｄおよびｈＮｋｄのＥＤハンド変異の効果）
ｍＮｋｄ転写は、Ｗｎｔおよび塩化リチウム処理誘導性である。ｈＮｋｄ転写が、同様に誘導性であることが、予期される。この仮説を試験するために、ＨＥＫ  ２９３細胞を、１２ウェル培養プレート中２×１０５／ウェルで播種する。各ウェルを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を合計０．５４μｇのＤＮＡとともに使用して、トランスフェクトする。このトランスフェクトＤＮＡは、０．０２μｇのＬＥＦ−１、０．２μｇのルシフェラーゼレポーター［Ｈｓｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９１８（１９９８）］、０．０２ｇのｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および０．１μｇのｐＣＧＷｎｔ−１と０．２μｇのｐＣＤＮＡ３．１ＨｉｓＣ  ＧＦＰ、ｈＮｋｄ、またはその誘導体のいずれかとの組合せを含む。ＥＦハンドにおける変異またはＥＦハンドの欠失を含むサンプル（Ｗｎｔ−１はトランスフェクしない）において、ＧＦＰ、ｈＮｋｄまたはｈＮｋｄ誘導体単独（０．３μｇまたは０．１μｇ）を、トランスフェクトする。ＬＥＦ−１ルシフェラーゼレポーター活性を、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、測定して標準化する。この結果は、ｈＮｋｄがβカテニン活性化ＬＥＦ−１レポーター発現を阻害しないことを示し、ｈＮｋｄが標準Ｗｎｔシグナル伝達を負に調節することを示し、ＥＦハンドの点変異および欠失が、Ｗｎｔ媒介転写応答をｈＮｋｄが阻害する能力を損なうことを示すことが、予期される。
【０１８３】
マウス肝臓上皮細胞を、Ｗｎｔ−３ａ馴化培地またはＮｅｏコントロール培地のいずれかで、９時間、１９．５時間、または２７時間処理する。４０ｍＭ  ＬｉＣｌを含む増殖培地または含まない増殖培地を使用して、細胞を１６時間処理する。適切なプライマーを、ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用して、ｈＮｋｄおよびＧＡＰＤＨをそれぞれ増幅する。
【０１８４】
（実施例１１）
（Ｘｅｎｏｐｕｓ胚におけるｈＮｋｄの効果）
発生Ｘｅｎｏｐｕｓ胚は、Ｗｎｔシグナル伝達についての有効なインビボアッセイを提供する。なぜなら、この経路の異所性腹側活性化は、異所性背側構造を誘導するからである。ｍＮｋｄのＸｗｎｔ−８  ｍＲＮＡの５〜１０ｐｇの腹側注射は、６０％以上の胚において第２の軸を誘導することを示した。正規のＷｎｔ誘導されたＬＥＦ−１依存性転写を阻害するｍＮｋｄの能力と一致して、３５ｐｇのｈＮｋｄ  ｍＲＮＡの注射は、同時注射されたＸｗｎｔ−８の活性を抑制することが予想された。高用量のｈＮｋｄの同時注射は、いっそう少ない第２の軸を生じるはずである。なぜなら、非常に高用量のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄの腹側発現が異所性頭部構造を誘導することが報告されているからである（Ｚｅｎｇら；（２０００））。
【０１８５】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの脊椎動物同族の平面内極性経路は、脊椎動物発生の間の収斂に伸びる移動を制御する。ＸｅｎｏｐｕｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの両方において、この経路の超活性化は、正規のＷｎｔシグナル伝達と独立した細胞極性表現性を誘発する。ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）の野生型Ｄｓｈの過剰発現は、上皮平面内極性を破壊し、一方、Ｘｅｎｏｐｕｓにおいて、野生型Ｘｄｓｈ、Ｘｆｚ−８またはＸｆｚ−７の過剰発現は、細胞極性を破壊し、そして収斂した伸長を阻害する。従って、収斂した伸長は、脊椎動物の平面内極性シグナル伝達の有効なインビボアッセイを示す。
【０１８６】
インビトロにおいてＪＮＫを活性化するというその予期された能力と一致して、ｈＮｋｄの過剰発現は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＮｋｄおよびマウスＮｋｄと類似した様式で、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚の正常な伸張を阻害するはずである。収斂した伸長に対するｈＮｋｄのこの効果をより直接的に評価するために、背側中胚葉の片側（ｏｐｅｎ−ｆａｃｅ）Ｋｅｌｌｅｒ外植片を調べた。Ｘｅｎｏｐｕｓ胚を、４細胞段階の２つの背側割球または２つの腹側割球のいずれかにインビトロ転写したｍＲＮＡを用いて注射し、そして表現型のスコア付けのために、３０段階まで１／３×ＭＭＲにおいて培養する。Ｋｅｌｌｅｒ外植片を、ｓｔ．１０．２５で切断し、ｓｔ．２０まで１×Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ中でカバーガラスの下で培養する。
【０１８７】
コントロールＸｅｎｏｐｕｓ胚を、二次的な軸を発生する５〜１０ｐｇのＸｗｎｔ−８  ｍＲＮＡを用いて腹部注射する。ｈＮｋｄとＸｗｎｔ−８との同時発現は、Ｘｗｎｔ−８単独と比較して、二次的な軸形成の頻度ならびに完全な二次的軸の比率を減少する。
【０１８８】
発生Ｘｅｎｏｐｕｓ胚におけるｍＮｋｄの背側発現は腹背軸の正常な伸長および直線性を阻害したので、ｈＮｋｄを用いて類似の結果が予想される。初期の構造の正常な形成（例えば、ｍＮｋｄを発現する胚において）は、その表現型が腹側形成の結果ではないこと示し、これは、ｍＮｋｄが収斂の伸張を阻害することを示唆する。同様に、背側周辺領域のコントロール外植片は伸張し、そして形状を有意に変化させたが、ｍＮｋｄを発現する外植片は、伸張もせず形状を変化もしなかった。ＤＮ−ＧＳＫ３の同時発現による正規のＷｎｔ経路の下流活性化は、収斂の伸張に対するｍＮｋｄの効果をレスキューしなかった。
【０１８９】
この実験の結果は、コントロール胚から作製した外植片は有意に伸張したが、ｈＮｋｄを発現する胚から作製した外植片は、伸張しなかったことを示す。これらの予期された結果は、平面内極性カスケードの他の野生型成分（Ｘｄｓｈ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−７、およびＷｎｔ−１１を含む）の過剰発現によって誘発される結果と類似する。
【０１９０】
ｈＮｋｄはＷｎｔ経路の潜在的なインヒビターであると予想されるので、収斂の伸張に対するｈＮｋｄの効果がこの活性から生じ得るか否かを試験することが重要である。ＤＮ−ＧＳＫ３（これは、正規のＷｎｔシグナル伝達を強力に活性化する（Ｐｉｅｒｃｅ、１９９５））とｈＮｋｄの実験を実行したが、収斂の伸張のレスキューは見出されなかった。ｍＮｋｄがＪＮＫを活性化する能力と組み合わせて、これらのデータは、ｍＮｋｄが平面内極性シグナル伝達カスケードを過剰に刺激することによって、収斂の伸張を阻害することが示される。
【０１９１】
本発明者らは、特定の作用機構に束縛されないが、ｍＮｋｄを用いて実行した実験に基づいて、正規のＷｎｔシグナル伝達は本明細書中のｈＮｋｄによって阻害され、ｈＮｋｄは正規ではない平面内極性経路を活性化し、ｈＮｋｄはＤｓｈに結合するということが、予想される。従って、ｈＮｋｄはＤｓｈを正規の経路からシャットダウンして平面経路に入れることに関与し得ることが、予想される。このことは、ｈＮｋｄを、正規のＷｎｔ経路と正規ではないＷｎｔ経路との間のの分岐を決定する重要なレギュレーターにする。
【０１９２】
（実施例１２  ｍＮｋｄに結合し得る抗体）
ｈＮｋｄまたはそのフラグメントに対する抗体を、以下のように調製した。ウサギまたは他の適切な哺乳動物もしくは動物に、ｈＮｋｄポリペプチドまたはその配列番号７を有するタンパク質の少なくとも２０アミノ酸を含む抗原性フラグメントを注射し、続いて、適切な間隔でブーストした。動物を採血し、そして血清を、精製したｈＮｋｄタンパク質またはそのフラグメントに対してアッセイした。抗ｈＮｋｄ抗体を産生するためのペプチド配列としては、その少なくとも２０個連続するアミノ酸を含むｈＮｋｄのフラグメントが挙げられる。
【０１９３】
好ましくは、ｈＮｋｄに特異的に結合するがマウスＮｋｄまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄに明らかに結合しない抗体が、選択される。ｈＮｋｄに特異的に結合するがマウスＮｋｄまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄに結合しないモノクローナル抗体が、免疫した動物由来のＢ細胞からハイブリドーマを産生すること、およびヒトＮｋｄまたは非ヒト霊長類Ｎｋｄに特異的に結合するがマウスＮｋｄまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｎｋｄに実質的に結合しないモノクローナル抗体を産生するものを選択することによって、得られる。ｈＮｋｄの異なる部分（例えば、ＥＦハンド）に対して結合する抗体が、好ましくは選択される。
【０１９４】
（実施例１３  抗ｈＮｋｄ抗体を用いる乳癌の処置）
異常なＷｎｔシグナル伝達を含む癌（特に、乳癌）を有する患者を、薬学的に受容可能なキャリアを含む、本発明に従う抗ｈＮｋｄ抗体の治療有効量を投与することによって、処置する。
【０１９５】
この投与は、所望の治療応答が達成されるまで、必要である場合繰り返す。
【０１９６】
（実施例１４  Ｗｎｔシグナル伝達を含む癌の検出）
被験体を、本発明に従う抗ｈＮｋｄ抗体を用いてこのような被験体の血清中のｈＮｋｄタンパク質の量を測定し、そしてこれらのレベルをコントロール血清サンプル（正常な患者の血清）に対応させることによって、ｈＮｋｄの異常な発現を含む癌の存在についてスクリーニングする。これらのレベルが正常血清サンプル中のｈＮｋｄレベルを実質的に超えた場合、陽性の診断がなされる。
【０１９７】
（実施例１５  ｍＮｋｄ  ｍＲＮＡは、Ｗｎｔリガンドによって誘導される）
漸増する量のβ−カテニンに対する細胞培養物の曝露の際の、ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルに対する効果を決定する実験を実行した。これらの結果を、図１０に含ませ、８時間、１９．５時間および２７時間の期間での増加したβ−カテニンの量が、増加したｍＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルによって実証されるように、ｍＮｋｄ発現の誘導を生じることが示される。コントロールとして、コントロール遺伝子（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）は、ｍＲＮＡレベルのこのような増加を示さなかった。これらの結果は、ｍＮｋｄがＷｎｔ／β−カテニン経路のネガティブフィードバックループの一部であり得ることを示唆する。
【０１９８】
（実施例１６  ｈＮｋｄおよびβ−カテニンｍＲＮＡレベルの割合に対する、アンチセンスオリゴの影響）
特定の癌（特に、結腸癌）におけるｈＮｋｄ遺伝子の関与を確認するために、結腸癌細胞ＳＷ６２０を、β−カテニンＲＣ／ＡＳオリゴで処理した。具体的にいうと、ＳＣ６２０細胞を、以下のアンチセンスオリゴで試験した：ＣＨＩＲ３０−５ＡＳ  ５’−ＡＣＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＡＧＴＧＴＧＴＣＡＧＧＣ−３’、および逆方向コントロールオリゴであるＣＨＩＲ３０−５ＲＣ  ５’−ＣＧＧＡＣＴＧＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＴＣＧＡＣＴＣＡ−３’。この実験を以下のように記載する。
【０１９９】
（アンチセンスアッセイ）ＳＷ６２０細胞を、１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞を、アンチセンスβ−カテニンオリゴ（ＡＳ）または逆方向コントロールオリゴ（ＲＣ；異なる配向の同じヌクレオチド配列）を用いて、会社の特許のあるトランスフェクション試薬を用いて１００μＭの最終濃度でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、そして総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。逆転写および定量的ＲＮＡ分析を、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムを用いることによって、実行した。
【０２００】
（ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルは、β−カテニンによって調節される）ＳＷ６２０は、Ｗｎｔシグナル伝達の遺伝子における変異に起因して、アップレギュレートされた細胞質β−カテニンレベルを有する、結腸癌細胞株である。ＳＷ６２０細胞のβ−カテニンアンチセンス処理は、β−カテニンのｍＲＮＡレベルを特異的にダウンレギュレートし、このことは、逆方向コントロールオリゴ（ＲＣ）を用いて処理した細胞のβ−カテニン  ｍＲＮＡレベルと比較した、β−カテニンアンチセンス（ＡＳ）を用いて処理した細胞のβ−カテニン  ｍＲＮＡレベルにおける８０％以上の低下によって実証される。これらの結果を、図１１に示す。β−カテニンタンパク質レベルもまた、β−カテニンアンチセンス処理したサンプルにおいてダウンレギュレートされる（データは示していない）。同様に、β−カテニンアンチセンスで処理した細胞のｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルもまた、逆方向コントロールオリゴを用いて処理した細胞のｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルよりも８０％低い。ネガティブコントロールとして、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルを決定し、β−カテニンアンチセンス処理または逆方向コントロール処理のいずれによっても、影響されなかった。従って、β−カテニンアンチセンスを用いて処理した細胞のＧＡＰＤＨと逆方向コントロールオリゴを用いて処理した細胞のＧＡＰＤＨの割合は、１に等しい。
【０２０１】
（実施例１７  結腸癌サンプルおよび正常組織におけるｈＮｋｄ  ＲＮＡの分布）
ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルが細胞培養物におけるβ−カテニンの増加によってアップレギュレートされるという本発明者らの発見に基づいて、そしてさらに、ｈＮｋｄプロモーター中の多数のＴＣＦ結合エレメントを本発明者らが同定したことに基づいて、本発明者らは、ｈＮｋｄレベルが正常なヒトと比較して、結腸癌患者において上昇していることを予想した。実際、以下により詳細に記載するように、ｈＮｋｄ  ＲＮＡレベルは、正常培養物と比較して、約７０％の結腸癌サンプル中で有意に上昇していることが見出された。
【０２０２】
（結腸癌サンプルおよび匹敵する患者の正常サンプルにおけるｈＮｋｄメッセンジャーＲＮＡレベルの定量的分析）ｍＲＮＡを、レーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）で調製した結腸癌サンプルから単離した。逆転写反応を、ＲＥＴＲＯｓｃｒｉｐキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、そのキットに提供されるランダムプライマーによって実行した。定量的ＲＮＡ分析を、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムを用いることによって実行した。
【０２０３】
（ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルは、結腸癌患者においてアップレギュレートされる）
８０％を超える結腸癌患者が、細胞質β−カテニンレベルのアップレギュレーションを生じるＷｎｔ経路の異常な調節を有する。ｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルはβ−カテニンの量によって調節されるので、本発明者らは、２８対の、結腸癌サンプルおよび匹敵する患者の正常サンプルにおけるｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを調べた。これらの結果を、図１２に含ませ、そして６８％の結腸癌患者が、上昇したｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを有することを示し、このことは、β−カテニンがｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを調節するという本発明者らの知見と一致する。
【０２０４】
（実施例１８）
上記の結果に基づいて、ｈＮｋｄ発現を、結腸癌を診断するためのマーカーとして使用する。結腸サンプルを、結腸癌について試験される被験体から得る。ｈＮｋｄ  ＲＮＡのレベルを測定し、そして正常コントロール中のｈＮｋｄ  ＲＮＡレベルに対して比較する。被験体がコントロールと比較して増大したｍＮｋｄ
ＲＮＡレベルを示すか否かに基づいて、陽性の結腸癌診断をした。
【０２０５】
（実施例１９  レポーターの発現をダウンレギュレートする低分子インヒビターについてスクリーニングするための、ｈＮｋｄプロモーターの使用）
ｈＮｋｄプロモーターを使用して、プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現をダウンレギュレートする低分子を同定する。例えば、複数ＴＣＦ結合エレメント（ＣＴＴＴＧＡ／ＴＡ／Ｔ）を含むことが見出されたｈＮｋｄプロモーターを含むＤＮＡ構築物（図１３に図示される）を、緑色蛍光タンパク質のコード配列に作動可能に連結させ、そして適切な哺乳動物細胞株に導入する。次いで、この細胞株を異なる低分子と接触させ、そしてレポーター発現に対するその効果を測定する。レポーター発現をダウンレギュレートする低分子を、選択する。これらの分子は、潜在的に、Ｗｎｔ／β−カテニン経路の異常な調節を含む疾患（特に、癌（例えば、結腸癌））を処置する際に有用である。
【０２０６】
本発明は、特定の実施形態を参照して記載してきた。しかし、本出願は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得る変更および置換をカバーすることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、マウスＮｋｄおよびヒトＮｋｄのコード領域ならびに５’および３’非コード領域の核酸配列［それぞれ、配列番号１および配列番号２］の整列を含む。
【図２】
図２は、ヒトＮｋｄ（「ｍｄａｐ．ｐｅｐ」）およびマウスＮｋｄのアミノ酸配列［それぞれ、配列番号３および配列番号４］の整列を含む。
【図３】
図３は、ヒトＮｋｄのヌクレオチド配列［配列番号５］を含む。
【図４】
図４は、マウスＮｋｄのヌクレオチド配列［配列番号６］を含む。
【図５】
図５は、ヒトＮｋｄのアミノ酸配列［配列番号７］を含む。
【図６】
図６は、マウスＮｋｄのアミノ酸配列［配列番号８］を含む。
【図７】
図７は、ｈＮｋｄの推定プロモーター、ならびに５’ＵＴＲ、コード配列、および３’ＵＴＲのエキソン（エキソン１〜１１）の核酸配列［配列番号９〜２２］を含む。
【図８】
図８は、ｈＮｋｄ遺伝子のコード領域ならびに５’および３’非翻訳領域（エキソン１〜１１に含まれる）を、ヒト第１６染色体の８６Ｋｂ領域にマッピングした概略図を含む。
【図９】
図９は、Ｗｎｔ／Ｂカテニン経路を示し、そして特に、細胞増殖を促進する遺伝子を同定する。
【図１０】
図１０は、経時的に漸増する量のβ−カテニンに曝された細胞培養物におけるｍＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを比較したインビトロ実験の結果を含む。
【図１１】
図１１は、ＳＷ６２０細胞をβ−カテニンアンチセンスまたは逆コントロールオリゴで処理し、そしてＳＷ６２０  ｈＮｋｄ、ＳＷ６２０  β−カテニンｍＲＮＡ、およびコントロールＳＷ６２０ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルの比率を処理後に測定した実験の結果を含む。
【図１２】
図１２は、癌／正常結腸組織におけるｈＮｋｄレベルの比率を示す。
【図１３】
図１３は、ｈＮｋｄプロモーターを調節する低分子を同定するために使用された構築物を図解により示す。
【図１４】
図１４は、２９３細胞における２つのルシフェラーゼレポーターアッセイ実験において獲得されたデータの平均を含む（「ＲＬＶ」は、「相対的ルシフェラーゼ単位」である）。
【図１５】
図１５は、種々の正常組織におけるｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを測定したＰＣＲ実験の結果を含む（この実験において、このデータを、β−グルコロニダーゼのレベルに対して正規化した）。
【図１６】
図１６は、ヒト結腸癌細胞株を含む種々のヒト細胞株におけるｈＮｋｄ  ｍＲＮＡレベルを測定したリアルタイムＰＣＲ実験の結果を含む（この実験において、結果を、アクチンのレベルに対して正規化した）。
【０２０７】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Chiron Corporation
<120> HUMAN AND NON-HUMAN PRIMATE HOMOLOGUES OF NKD PROTEIN,
NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING, AND USES THEREOF
<130> F1-03G73A7O
<140> JP P2002-589698
<141> 2001-11-27
<150> 60/252,884
<151> 2000-11-27
<150> 60/291,109
<151> 2001-05-16
<150> 60/325,571
<151> 2001-10-01
<160> 26
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1786
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
agtcgggccg cggcgacggc ggcaggagcg cgtcccggcg ccgcctcggg ctccgctcgg 60
ctcgggggct gcttcgggag gaggagagcc aagggaggcg ccaggcccgc gggccgggcg 120
catggcttag ggacgctccc ggccgccgca gccccagcat ggggaaactt cactccaagc 180
cggccgccgt gtgcaagcgc agggagagcc cggaaggtga cagcttcgcc gtgagcgctg 240
cctgggctcg gaagggcatc gaggagtgga tcgggagaca gcgctgcccg ggcggtgtct 300
cgggaccccg acagctgcgg ttggcgggca ccataggccg aagcacccgg gagctcgtgg 360
gcgacgtgtt gagagacacg ctcagcgagg aagaggagga cgactttcgg ctggaagtgg 420
ccctgcctcc tgagaagact gacgggctgg gcagcggaga tgagaagaag atggagagag 480
tgagcgaacc ctgcccaggc tccaagaagc agctgaagtt tgaagagctc cagtgcgacg 540
tgtccatgga ggaggacagc cggcaggagt ggaccttcac cctgtatgac tttgacaaca 600
acggcaaggt cacccgagag gacatcacca gcttgctgca caccatctat gaggtggtgg 660
actcctctgt caaccactcc ccaacatcca gcaagatgct gcgggtaaag ctcaccgtgg 720
cccccgatgg cagccagagc aagaggagcg tccttgtcaa tcaggctgac ctgcagagcg 780
caaggccccg agcagagacc aagcccactg aggacctgcg gagctgggag aagaagcagc 840
gagccccgct caggttccag ggtgacagcc gcctggagca gtctggctgc taccaccatt 900
gcgtagatga gaacatcgag aggagaaacc actacttaga tctcgccggg atagaaaact 960
acacgtccca atttgggcct ggctcccctt ccgtggccca gaagtcagaa ctgccccccc 1020
gcacctccaa tcccactcga tctcgctccc atgagccgga agccatccac atcccacacc 1080
gaaagcccca aggcgtggac ccggcctcct tccacttcct tgacacccca atcgccaagg 1140
tctcagagct ccagcaacgg ctccggggca cccaggacgg gagcaagcac tttgtgaggt 1200
cccccaaggc ccagggcaag agtgtgggtg tgggccacgt ggccagaggg gcaagaaaca 1260
agccccctct gggacccgcc atccctgcgg tgtccccctc cgcccacctg gctgccagcc 1320
cggccctcct cccctcccta gcccccctcg ggcacaagaa gcacaagcac cgagccaagg 1380
agagccagca gggctgccgg ggcctgcagg caccactggc ctcaggtggc cctgtcctgg 1440
ggcgggagca cctgcgggag ctgcccgcct tggtggtgta tgagagccag gccgggcagc 1500
cggtccagag acatgagcac caccaccacc atgaacatca ccaccattac caccacttct 1560
accagacata gagcccctcc ccagggcccc accctgccat atgaaggacc ccacccccga 1620
caccacaagg cattattatt ctattaatta ttgttattat gatgattatt gttattaata 1680
attattgtta ctccactaat atttagctag cctacatgta gaagatctat ggaaacacag 1740
aactaaactt ttatttatat gttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                1786
<210> 2
<211> 1416
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 2
atggggaaac ttcactcgaa gccggccgcc gtgtgcaagc gcagggagag cccggaaggt 60
gacagctttg ctgtaagcgc tgcttgggca aggaaaggca tcgaggagtg gatcgggagg 120
cagcgctgtc caggcagcgt ctcaggaccc cgtcagctga gattggcagg cactgttggt 180
cgaggcactc gggaactcgt gggtgacact tctagagagg ctctcggtga ggaggacgag 240
gacgacttcc ccctagaagt ggccctgccg cctgagaaga tcgacagcct aggtagtgga 300
gatgagaaga gaatggagag actgagcgaa cctggccagg cctccaagaa gcagctcaag 360
tttgaagagc tacagtgtga tgtctctgtg gaggaggaca gccggcaaga gtggactttc 420
actctatatg acttcgacaa caatggcaaa gtgacccgtg aggacattac cagcttgctg 480
cataccatct atgaagtggt tgactcctct gtgaaccatt cccccacatc aagcaagaca 540
ctgcgggtga agctcaccgt ggctcctgac gggagccaga gtaagaggag cgtccttttc 600
aaccataccg atctgcagag cacaaggccc cgagcagaca ccaaacccgc tgaggagctg 660
cgtggctggg agaagaagca gcgagcccca ctcaggttcc agggtgacag ccacctggag 720
cagccagact gctaccacca ttgcgtggat gagaacattg agaggagaaa ccactaccta 780
gacctggcgg ggatagagaa ctacacgtct cagtttggac cgggatcccc ttcggtggcc 840
cagaagtcag agctgccccc tcgaatctcc aaccccactc gctctcgctc ccacgagcca 900
gaagctgccc acatcccaca ccggaggccc caaggtgtgg acccaggctc cttccacctc 960
cttgacaccc catttgccaa ggcatcagag ctccagcaac ggctccgggg cactcaggat 1020
gggagcaagc actttgtgag gtcccccaag gcccagggca agaacatggg tatgggccac 1080
ggggccagag gtgcaagaag caagcctcca ctggtaccca ccacccatac tgtctccccc 1140
tctgcccatc tggccaccag cccagccctt ctccccaccc tggcacccct ggggcacaag 1200
aaacacaagc atcgagccaa ggagagccag gcgagctgcc ggggcctgca gggccccctg 1260
gctgcaggag gctccaccgt catggggcgg gagcaggtga gggagctgcc tgccgtggtg 1320
gtgtacgaga gccaggctgg gcaggccgtc cagagacacg aacaccatca ccaccaccaa 1380
catcaccacc attatcacca cttctatcag ccctag                           1416
<210> 3
<211> 470
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gly Lys Leu His Ser Lys Pro Ala Ala Val Cys Lys Arg Arg Glu
1               5                  10                  15
Ser Pro Glu Gly Asp Ser Phe Ala Val Ser Ala Ala Trp Ala Arg Lys
20                  25                  30
Gly Ile Glu Glu Trp Ile Gly Arg Gln Arg Cys Pro Gly Gly Val Ser
35                  40                  45
Gly Pro Arg Gln Leu Arg Leu Ala Gly Thr Ile Gly Arg Ser Thr Arg
50                  55                  60
Glu Leu Val Gly Asp Val Leu Arg Asp Thr Leu Ser Glu Glu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Arg Leu Glu Val Ala Leu Pro Pro Glu Lys Thr Asp Gly
85                  90                  95
Leu Gly Ser Gly Asp Glu Lys Lys Met Glu Arg Val Ser Glu Pro Cys
100                 105                 110
Pro Gly Ser Lys Lys Gln Leu Lys Phe Glu Glu Leu Gln Cys Asp Val
115                 120                 125
Ser Met Glu Glu Asp Ser Arg Gln Glu Trp Thr Phe Thr Leu Tyr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Asn Asn Gly Lys Val Thr Arg Glu Asp Ile Thr Ser Leu Leu
145                 150                 155                 160
His Thr Ile Tyr Glu Val Val Asp Ser Ser Val Asn His Ser Pro Thr
165                 170                 175
Ser Ser Lys Met Leu Arg Val Lys Leu Thr Val Ala Pro Asp Gly Ser
180                 185                 190
Gln Ser Lys Arg Ser Val Leu Val Asn Gln Ala Asp Leu Gln Ser Ala
195                 200                 205
Arg Pro Arg Ala Glu Thr Lys Pro Thr Glu Asp Leu Arg Ser Trp Glu
210                 215                 220
Lys Lys Gln Arg Ala Pro Leu Arg Phe Gln Gly Asp Ser Arg Leu Glu
225                 230                 235                 240
Gln Ser Gly Cys Tyr His His Cys Val Asp Glu Asn Ile Glu Arg Arg
245                 250                 255
Asn His Tyr Leu Asp Leu Ala Gly Ile Glu Asn Tyr Thr Ser Gln Phe
260                 265                 270
Gly Pro Gly Ser Pro Ser Val Ala Gln Lys Ser Glu Leu Pro Pro Arg
275                 280                 285
Thr Ser Asn Pro Thr Arg Ser Arg Ser His Glu Pro Glu Ala Ile His
290                 295                 300
Ile Pro His Arg Lys Pro Gln Gly Val Asp Pro Ala Ser Phe His Phe
305                 310                 315                 320
Leu Asp Thr Pro Ile Ala Lys Val Ser Glu Leu Gln Gln Arg Leu Arg
325                 330                 335
Gly Thr Gln Asp Gly Ser Lys His Phe Val Arg Ser Pro Lys Ala Gln
340                 345                 350
Gly Lys Ser Val Gly Val Gly His Val Ala Arg Gly Ala Arg Asn Lys
355                 360                 365
Pro Pro Leu Gly Pro Ala Ile Pro Ala Val Ser Pro Ser Ala His Leu
370                 375                 380
Ala Ala Ser Pro Ala Leu Leu Pro Ser Leu Ala Pro Leu Gly His Lys
385                 390                 395                 400
Lys His Lys His Arg Ala Lys Glu Ser Gln Gln Gly Cys Arg Gly Leu
405                 410                 415
Gln Ala Pro Leu Ala Ser Gly Gly Pro Val Leu Gly Arg Glu His Leu
420                 425                 430
Arg Glu Leu Pro Ala Leu Val Val Tyr Glu Ser Gln Ala Gly Gln Pro
435                 440                 445
Val Gln Arg His Glu His His His His His Glu His His His His Tyr
450                455                460
His His Phe Tyr Gln Thr
465                 470
<210> 4
<211> 471
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 4
Met Gly Lys Leu His Ser Lys Pro Ala Ala Val Cys Lys Arg Arg Glu
1               5                  10                  15
Ser Pro Glu Gly Asp Ser Phe Ala Val Ser Ala Ala Trp Ala Arg Lys
20                  25                  30
Gly Ile Glu Glu Trp Ile Gly Arg Gln Arg Cys Pro Gly Ser Val Ser
35                  40                  45
Gly Pro Arg Gln Leu Arg Leu Ala Gly Thr Val Gly Arg Gly Thr Arg
50                  55                  60
Glu Leu Val Gly Asp Thr Ser Arg Glu Ala Leu Gly Glu Glu Asp Glu
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Pro Leu Glu Val Ala Leu Pro Pro Glu Lys Ile Asp Ser
85                  90                  95
Leu Gly Ser Gly Asp Glu Lys Arg Met Glu Arg Leu Ser Glu Pro Gly
100                 105                 110
Gln Ala Ser Lys Lys Gln Leu Lys Phe Glu Glu Leu Gln Cys Asp Val
115                 120                 125
Ser Val Glu Glu Asp Ser Arg Gln Glu Trp Thr Phe Thr Leu Tyr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Asn Asn Gly Lys Val Thr Arg Glu Asp Ile Thr Ser Leu Leu
145                 150                 155                 160
His Thr Ile Tyr Glu Val Val Asp Ser Ser Val Asn His Ser Pro Thr
165                 170                 175
Ser Ser Lys Thr Leu Arg Val Lys Leu Thr Val Ala Pro Gly Asp Ser
180                 185                 190
Gln Ser Lys Arg Ser Val Leu Phe Asn His Thr Asp Leu Gln Ser Thr
195                 200                 205
Arg Pro Arg Ala Asp Thr Lys Pro Ala Glu Glu Leu Arg Gly Trp Glu
210                 215                 220
Lys Lys Gln Arg Ala Pro Leu Arg Phe Gln Gly Asp Ser His Leu Glu
225                 230                 235                 240
Gln Pro Asp Cys Tyr His His Cys Val Asp Glu Asn Ile Glu Arg Arg
245                 250                 255
Asn His Tyr Leu Asp Leu Ala Gly Ile Glu Asn Tyr Thr Ser Gln Phe
260                 265                 270
Gly Pro Gly Ser Pro Ser Val Ala Gln Lys Ser Glu Leu Pro Pro Arg
275                 280                 285
Ile Ser Asn Pro Thr Arg Ser Arg Ser His Glu Pro Glu Ala Ala His
290                 295                 300
Ile Pro His Arg Arg Pro Gln Gly Val Asp Pro Gly Ser Phe His Leu
305                 310                 315                 320
Leu Asp Thr Pro Phe Ala Lys Ala Ser Glu Leu Gln Gln Arg Leu Arg
325                 330                 335
Gly Thr Gln Asp Gly Ser Lys His Phe Val Arg Ser Pro Lys Ala Gln
340                 345                 350
Gly Lys Asn Met Gly Met Gly His Gly Ala Arg Gly Ala Arg Ser Lys
355                 360                 365
Pro Pro Leu Val Pro Thr Thr His Thr Val Ser Pro Ser Ala His Leu
370                 375                 380
Ala Thr Ser Pro Ala Leu Leu Pro Thr Leu Ala Pro Leu Gly His Lys
385                 390                 395                 400
Lys His Lys His Arg Ala Lys Glu Ser Gln Ala Ser Cys Arg Gly Leu
405                 410                 415
Gln Gly Pro Leu Ala Ala Gly Gly Ser Thr Val Met Gly Arg Glu Gln
420                 425                 430
Val Arg Glu Leu Pro Ala Val Val Val Tyr Glu Ser Gln Ala Gly Gln
435                 440                 445
Ala Val Gln Arg His Glu His His His His His Glu His His His His
450                 455                 460
Tyr His His Phe Tyr Gln Pro
465                 470
<210> 5
<211> 1859
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gaattcgccc ttctaatacg actcactata gggcaagcag tggtaacaac gcagagtacg 60
cggggagtcg ggccgcggcg acggcggcag gagcgcgtcc cggcgccgcc tcgggctccg 120
ctcggctcgg gggctgcttc gggaggagga gagccaaggg aggcgccagg cccgcgggcc 180
gggcgcatgg cttagggacg ctcccggccg ccgcagcccc agcatgggga aacttcactc 240
caagccggcc gccgtgtgca agcgcaggga gagcccggaa ggtgacagct tcgccgtgag 300
cgctgcctgg gctcggaagg gcatcgagga gtggatcggg agacagcgct gcccgggcgg 360
tgtctcggga ccccgacagc tgcggttggc gggcaccata ggccgaagca cccgggagct 420
cgtgggcgac gtgttgagag acacgctcag cgaggaagag gaggacgact ttcggctgga 480
agtggccctg cctcctgaga agactgacgg gctgggcagc ggagatgaga agaagatgga 540
gagagtgagc gaaccctgcc caggctccaa gaagcagctg aagtttgaag agctccagtg 600
cgacgtgtcc atggaggagg acagccggca ggagtggacc ttcaccctgt atgactttga 660
caacaacggc aaggtcaccc gagaggacat caccagcttg ctgcacacca tctatgaggt 720
ggtggactcc tctgtcaacc actccccaac atccagcaag atgctgcggg taaagctcac 780
cgtggccccc gatggcagcc agagcaagag gagcgtcctt gtcaatcagg ctgacctgca 840
gagcgcaagg ccccgagcag agaccaagcc cactgaggac ctgcggagct gggagaagaa 900
gcagcgagcc ccgctcaggt tccagggtga cagccgcctg gagcagtctg gctgctacca 960
ccattgcgta gatgagaaca tcgagaggag aaaccactac ttagatctcg ccgggataga 1020
aaactacacg tcccaatttg ggcctggctc cccttccgtg gcccagaagt cagaactgcc 1080
cccccgcacc tccaatccca ctcgatctcg ctcccatgag ccggaagcca tccacatccc 1140
acaccgaaag ccccaaggcg tggacccggc ctccttccac ttccttgaca ccccaatcgc 1200
caaggtctca gagctccagc aacggctccg gggcacccag gacgggagca agcactttgt 1260
gaggtccccc aaggcccagg gcaagagtgt gggtgtgggc cacgtggcca gaggggcaag 1320
aaacaagccc cctctgggac ccgccatccc tgcggtgtcc ccctccgccc acctggctgc 1380
cagcccggcc ctcctcccct ccctagcccc cctcgggcac aagaagcaca agcaccgagc 1440
caaggagagc cagcagggct gccggggcct gcaggcacca ctggcctcag gtggccctgt 1500
cctggggcgg gagcacctgc gggagctgcc cgccttggtg gtgtatgaga gccaggccgg 1560
gcagccggtc cagagacatg agcaccacca ccaccatgaa catcaccacc attaccacca 1620
cttctaccag acatagagcc cctccccagg gccccaccct gccatatgaa ggaccccacc 1680
cccgacacca caaggcatta ttattctatt aattattgtt attatgatga ttattgttat 1740
taataattat tgttactcca ctaatattta gctagcctac atgtagaaga tctatggaaa 1800
cacagaacta aacttttatt tatatgttaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agcggccgc  1859
<210> 6
<211> 1401
<212> DNA
<213> Mus sp.
<400> 6
atggggaaac ttcactcgaa gccggccgcc gtgtgcaagc gcagggagag cccggaaggt 60
gacagctttg ctgtaagcgc tgcttgggca aggaaaggca tcgaggagtg gatcgggagg 120
cagcgctgtc caggcagcgt ctcaggaccc cgtcagctga gattggcagg cactgttggt 180
cgaggcactc gggaactcgt gggtgacact tctagagagg ctctcggtga ggaggacgag 240
gacgacttcc ccctagaagt ggccctgccg cctgagaaga tcgacagcct aggtagtgga 300
gatgagaaga gaatggagag actgagcgaa cctggccagg cctccaagaa gcagctcaag 360
tttgaagagc tacagtgtga tgtctctgtg gaggaggaca gccggcaaga gtggactttc 420
actctatatg acttcgacaa caatggcaaa gtgacccgtg aggacattac cagcttgctg 480
cataccatct atgaagtggt tgactcctct gtgaaccatt cccccacatc aagcaagaca 540
ctgcgggtga agctcaccgt ggctcctgac gggagccaga gtaagaggag cgtccttttc 600
aaccataccg atctgcagag cacaaggccc cgagcagaca ccaaacccgc tgaggagctg 660
cgtggctggg agaagaagca gcgagcccca ctcaggttcc agggtgacag ccacctggag 720
cagccagact gctaccacca ttgcgtggat gagaacattg agaggagaaa ccactaccta 780
gacctggcgg ggatagagaa ctacacgtct cagtttggac cgggatcccc ttcggtggcc 840
cagaagtcag agctgccccc tcgaatctcc aaccccactc gctctcgctc ccacgagcca 900
gaagctgccc acatcccaca ccggaggccc caaggtgtgg acccaggctc cttccacctc 960
cttgacaccc catttgccaa ggcatcagag ctccagcaac ggctccgggg cactcaggat 1020
gggagcaagc actttgtgag gtcccccaag gcccagggca agaacatggg tatgggccac 1080
ggggccagag gtgcaagaag caagcctcca ctggtaccca ccacccatac tgtctccccc 1140
tctgcccatc tggccaccag cccagccctt ctccccaccc tggcacccct ggggcacaag 1200
aaacacaagc atcgagccaa ggagagccag gcgagctgcc ggggcctgca gggccccctg 1260
gctgcaggag gctccaccgt catggggcgg gagcaggtga gggagctgcc tgccgtggtg 1320
gtgtacgaga gccaggctgg gcaggccgtc cagagacacg aacaccatca ccaccaccaa 1380
catcaccacc attatcacca c                                           1401
<210> 7
<211> 470
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Gly Lys Leu His Ser Lys Pro Ala Ala Val Cys Lys Arg Arg Glu
1               5                  10                  15
Ser Pro Glu Gly Asp Ser Phe Ala Val Ser Ala Ala Trp Ala Arg Lys
20                  25                  30
Gly Ile Glu Glu Trp Ile Gly Arg Gln Arg Cys Pro Gly Gly Val Ser
35                  40                  45
Gly Pro Arg Gln Leu Arg Leu Ala Gly Thr Ile Gly Arg Ser Thr Arg
50                  55                  60
Glu Leu Val Gly Asp Val Leu Arg Asp Thr Leu Ser Glu Glu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Arg Leu Glu Val Ala Leu Pro Pro Glu Lys Thr Asp Gly
85                  90                  95
Leu Gly Ser Gly Asp Glu Lys Lys Met Glu Arg Val Ser Glu Pro Cys
100                 105                 110
Pro Gly Ser Lys Lys Gln Leu Lys Phe Glu Glu Leu Gln Cys Asp Val
115                 120                 125
Ser Met Glu Glu Asp Ser Arg Gln Glu Trp Thr Phe Thr Leu Tyr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Asn Asn Gly Lys Val Thr Arg Glu Asp Ile Thr Ser Leu Leu
145                 150                 155                 160
His Thr Ile Tyr Glu Val Val Asp Ser Ser Val Asn His Ser Pro Thr
165                 170                 175
Ser Ser Lys Met Leu Arg Val Lys Leu Thr Val Ala Pro Asp Gly Ser
180                 185                 190
Gln Ser Lys Arg Ser Val Leu Val Asn Gln Ala Asp Leu Gln Ser Ala
195                 200                 205
Arg Pro Arg Ala Glu Thr Lys Pro Thr Glu Asp Leu Arg Ser Trp Glu
210                 215                 220
Lys Lys Gln Arg Ala Pro Leu Arg Phe Gln Gly Asp Ser Arg Leu Glu
225                 230                 235                 240
Gln Ser Gly Cys Tyr His His Cys Val Asp Glu Asn Ile Glu Arg Arg
245                 250                 255
Asn His Tyr Leu Asp Leu Ala Gly Ile Glu Asn Tyr Thr Ser Gln Phe
260                 265                 270
Gly Pro Gly Ser Pro Ser Val Ala Gln Lys Ser Glu Leu Pro Pro Arg
275                 280                 285
Thr Ser Asn Pro Thr Arg Ser Arg Ser His Glu Pro Glu Ala Ile His
290                 295                 300
Ile Pro His Arg Lys Pro Gln Gly Val Asp Pro Ala Ser Phe His Phe
305                 310                 315                 320
Leu Asp Thr Pro Ile Ala Lys Val Ser Glu Leu Gln Gln Arg Leu Arg
325                 330                 335
Gly Thr Gln Asp Gly Ser Lys His Phe Val Arg Ser Pro Lys Ala Gln
340                 345                 350
Gly Lys Ser Val Gly Val Gly His Val Ala Arg Gly Ala Arg Asn Lys
355                 360                 365
Pro Pro Leu Gly Pro Ala Ile Pro Ala Val Ser Pro Ser Ala His Leu
370                 375                 380
Ala Ala Ser Pro Ala Leu Leu Pro Ser Leu Ala Pro Leu Gly His Lys
385                 390                 395                 400
Lys His Lys His Arg Ala Lys Glu Ser Gln Gln Gly Cys Arg Gly Leu
405                 410                 415
Gln Ala Pro Leu Ala Ser Gly Gly Pro Val Leu Gly Arg Glu His Leu
420                 425                 430
Arg Glu Leu Pro Ala Leu Val Val Tyr Glu Ser Gln Ala Gly Gln Pro
435                 440                 445
Val Gln Arg His Glu His His His His His Glu His His His His Tyr
450                 455                 460
His His Phe Tyr Gln Thr
465                 470
<210> 8
<211> 471
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 8
Met Gly Lys Leu His Ser Lys Pro Ala Ala Val Cys Lys Arg Arg Glu
1               5                  10                  15
Ser Pro Glu Gly Asp Ser Phe Ala Val Ser Ala Ala Trp Ala Arg Lys
20                  25                  30
Gly Ile Glu Glu Trp Ile Gly Arg Gln Arg Cys Pro Gly Ser Val Ser
35                  40                  45
Gly Pro Arg Gln Leu Arg Leu Ala Gly Thr Val Gly Arg Gly Thr Arg
50                  55                  60
Glu Leu Val Gly Asp Thr Ser Arg Glu Ala Leu Gly Glu Glu Asp Glu
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Pro Leu Glu Val Ala Leu Pro Pro Glu Lys Ile Asp Ser
85                  90                  95
Leu Gly Ser Gly Asp Glu Lys Arg Met Glu Arg Leu Ser Glu Pro Gly
100                 105                 110
Gln Ala Ser Lys Lys Gln Leu Lys Phe Glu Glu Leu Gln Cys Asp Val
115                 120                 125
Ser Val Glu Glu Asp Ser Arg Gln Glu Trp Thr Phe Thr Leu Tyr Asp
130                 135                 140
Phe Asp Asn Asn Gly Lys Val Thr Arg Glu Asp Ile Thr Ser Leu Leu
145                 150                 155                 160
His Thr Ile Tyr Glu Val Val Asp Ser Ser Val Asn His Ser Pro Thr
165                 170                 175
Ser Ser Lys Thr Leu Arg Val Lys Leu Thr Val Ala Pro Gly Asp Ser
180                 185                 190
Gln Ser Lys Arg Ser Val Leu Phe Asn His Thr Asp Leu Gln Ser Thr
195                 200                 205
Arg Pro Arg Ala Asp Thr Lys Pro Ala Glu Glu Leu Arg Gly Trp Glu
210                 215                220
Lys Lys Gln Arg Ala Pro Leu Arg Phe Gln Gly Asp Ser His Leu Glu
225                 230                 235                 240
Gln Pro Asp Cys Tyr His His Cys Val Asp Glu Asn Ile Glu Arg Arg
245                 250                 255
Asn His Tyr Leu Asp Leu Ala Gly Ile Glu Asn Tyr Thr Ser Gln Phe
260                 265                 270
Gly Pro Gly Ser Pro Ser Val Ala Gln Lys Ser Glu Leu Pro Pro Arg
275                 280                 285
Ile Ser Asn Pro Thr Arg Ser Arg Ser His Glu Pro Glu Ala Ala His
290                 295                 300
Ile Pro His Arg Arg Pro Gln Gly Val Asp Pro Gly Ser Phe His Leu
305                 310                 315                 320
Leu Asp Thr Pro Phe Ala Lys Ala Ser Glu Leu Gln Gln Arg Leu Arg
325                 330                 335
Gly Thr Gln Asp Gly Ser Lys His Phe Val Arg Ser Pro Lys Ala Gln
340                 345                 350
Gly Lys Asn Met Gly Met Gly His Gly Ala Arg Gly Ala Arg Ser Lys
355                 360                 365
Pro Pro Leu Val Pro Thr Thr His Thr Val Ser Pro Ser Ala His Leu
370                 375                 380
Ala Thr Ser Pro Ala Leu Leu Pro Thr Leu Ala Pro Leu Gly His Lys
385                 390                 395                 400
Lys His Lys His Arg Ala Lys Glu Ser Gln Ala Ser Cys Arg Gly Leu
405                 410                 415
Gln Gly Pro Leu Ala Ala Gly Gly Ser Thr Val Met Gly Arg Glu Gln
420                 425                 430
Val Arg Glu Leu Pro Ala Val Val Val Tyr Glu Ser Gln Ala Gly Gln
435                 440                 445
Ala Val Gln Arg His Glu His His His His His Glu His His His His
450                 455                 460
Tyr His His  Phe Tyr Gln Pro
465                  470
<210> 9
<211> 6455
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
gaattcatat gcacattaaa ttccagggag ccctcctcta ggctatttga ccctagctca 60
agaaaggggg attaagagtc ttacagggag ggatccaagg tcagcatata cagttagtca 120
gggaccagtc tgtctgtgtc tctctctcca tggggtttac tatcattgct ttcccctaat 180
ggttcttact cctgcttctt cctgcttatt tttcagccca cagcgacccc aagaagctgc 240
tccaacccct gggactatgg agctctacag ctgtagagac caccaggaag tggactgcag 300
gcccctggcc tctccattca gattctgcaa agagatcctg atgggttggg ccaatgggtc 360
aggcatccag tcagctctgg ctaaggggtg aaggagtcag gtgttaccaa cgtggtggca 420
ggggccacct tgaagctgtg ttctgtgcca tggaagaagg aagaggagga ggaagctaag 480
ctggaaggga aggcaggtga tacaggaaaa ttaactatga gctttgctat agtgaccact 540
tttccttcac tccttgagct gtggccttaa gaactgtgta ccaatgggag gcacttgcat 600
agtaagtgtt catttgctga atacttacag agggctataa gtggacaaat atgtccaaaa 660
acacatgaaa cacacaccat caacacttgc agatggtctc cttcagggaa cctttccaca 720
ctggctctcc cctcactgag ctttccttcc tatcaccctc ccagtctagg ctcctggagt 780
cagtagttgg aatctcagat gggaagaaac cttaaaagtc atctggtcca gtattttcca 840
aagcatgttc catgaacttg ttttccagaa atggtttcct ggtctggtga gtttaagaaa 900
ccctgcttat gacgatgctc tccatttaga gaatcacaaa gcttggctac tcaatgaaag 960
ctctgacaag tcctgcagga aaaaacttgt cttcttttgg ctaagctagg gctgcccaaa 1020
gtttctcatg gagtcctttc ttgcacataa taatagcatc tcacaaacca gtggtcgggg 1080
gaacccatta cgggaaatgc taatcttctg gacccttcct tctattttat aggtggagag 1140
gctgtgtggt ggtctggttg gctgcatgta actgaaaaac aaaggcttaa aaagataggg 1200
gcttcttttg ctcttttgtt aacaaagtct gggaatagtc aaagactggt actgtgacta 1260
gaaaggcttc tgatatggtt tggctctgtg ttcccaccca aatctcacct tgagttgtaa 1320
tgatccccat atgtcaaggg caggatcagg tggaggtaat tgaatcatga gggcagttaa 1380
tcccatgctg ttcttgtgat agtgagttct cacaggatct gatggtttta taaggggctt 1440
ttcccctttg ctcggcacct ctctctcctg ctgctatgtg aagagggacg tgtttgcttc 1500
tccttctgtc atgattgtaa gtttcctgag gcctccccag ccatgtagaa ctgtgagtca 1560
attaaacctc tttcctttat aaattgccca gttccggtat gttcttgtag cagcctgaga 1620
acggactaat atagcttctc tgcccagtgt gaagaagagc agagaggcag ggctgggagg 1680
agaacaaggc acctgccaag gagatgggga ggctgggctg gctttccctc tcctccaggc 1740
tcacctggga agcctgtgct ctaaacttgc tcaaacatcc tgaacccagg aggagttggt 1800
ggtacacaaa ttcaattcaa ttcaacccca catccagact gtactcaagc agcagtcttt 1860
tggcccagtc atctccaacc tcatcttctc ccctctactc ccaaaccatg ctctctctgc 1920
tccagagcca ggggcctctt tgctgtttcc aaaacatcca tggcagtctc cacttcaggg 1980
cctttacatg tgctgttccc tctgccttta gtacccaaac agaatggctt ggagacccca 2040
gccctagttc ttggggaagc ccagcctcct ccatctcata tctaaggcct gaggcctcct 2100
ggctgcctct ggctcccatc ttttctcctg cagggtatct ccactgtgaa gattgctgtt 2160
ggccccatta attacctgta ggagtcatct ttctgattcc ttaattttgt cctgtgccac 2220
taacccagga agtggctagg attttgctga gggcttggag taacagagga agaagagagc 2280
actgccaatc gcatgttaga gctcactgtc ccaaaagtga attggccagt ccccaccttg 2340
ctggctgtgc cttcttaggc cccattatca ctctcttctc atgctgtttc ctttgagatc 2400
tttgttttcc cttccctcca aaatgcctga tattttctca ggcagagtag tctaactttc 2460
ccctcctcac ccaaactagg cttccaggcc ctttagcaat gccaaaactc accagggaac 2520
tataaaataa agcaactcca gggatccagg aggaaccagt ggagacttgg gaactgattt 2580
tctccttcat atatccaaga tcgtattatt ggcagtactc cctccttatt gaccacaaca 2640
tgctcctggc tgaggctggg cagagagagt ttgtctcctt ccacagcagg tgtgatggca 2700
cctgctatag gcagtgctgt gttcggcatt gcattcagag atgcaagtaa ggcaagaacc 2760
ctggcctcaa ggagccctgg ctccaggagt gaaacttagc ctcatgcata aaataagtgg 2820
agatgggagg gggcagggaa accttggcta atcagagcag agaagagccc ttcaggttgg 2880
aaggtcaagg agggcttcct ttaggaaatg gcatttgaag gggccagatc agatggctta 2940
acttcgggga caagctttgg agcagctaac ttgggtgatg taggattttt ttttttttta 3000
aatctcccag ctctatgtct gacagatttc acctaaacca gccttgttaa atctcaagcc 3060
ccatgaaacc cgtttctgtt ataatctctc tctcttatct cttccttgcc ttcctttccc 3120
attctcctcc cccaaaggat aggaaatctt caaagaaaaa gatgtgtcac tgcaagtata 3180
cagcccaaga aatgggccag ataaattatt aaaacacacg aaaagacagt gagttatggg 3240
gtgggaagcc ctcggaggcc gaatggccac cccaggtaga cagcatgctg gtggcccctg 3300
gagaccccct tctcagagac ctggacagac taacattttg ccacaaggcc catctcttgg 3360
gttctcaccc cagatctggg taagggtatc atgattccaa tagcagtgaa gtcccaggcg 3420
cctgctgggc tgggaggcac cagggtgaag gtggaggggg gctttgtgtc tgggctggac 3480
atttgggatt tactccccgc aagactcaaa ctgctaactg cagttttagt tcttgctttt 3540
acctcttttt gaactgtaaa aagaaattcc caaggggaag aggggatact tttttctcat 3600
ggaagaagaa agccaggacc ggtttaagaa agtaaccaac tttctaagca ctgtgagaaa 3660
ggatgctcca agttttgctt tgatttagag gcaccctggt accagcaggg aggggtgaga 3720
aaggcaaaca ggaattccag acgaattcca ttgccttttg aggggtctga aagagggtgc 3780
ccactccgac tcagatgctc aaacccctgg ctccctctta cacctgaccc ccgccgttct 3840
gccccacttt ttcatgttcc tacagctcag gggttcttac ttcagcatta cccacatttg 3900
atgctggatc atttgttctg gtagggtggg ggggctgcct tatgcattgt ggtatgtgta 3960
gcagcaaccc tggcctctac ccactagata cctccaggca ttaccaagtg tcccctagag 4020
ggcaaaattg tttgctgtca ggtccttatg ggatggaaag aaagaaaaat ggcctgttac 4080
ccctggtgta acttactaca ctgtttacta attcatcatt tattgtttct tgcctatctt 4140
ccccctaggt gagtgggagt tcgatgagag tggcagttgt ctattttgtt caccgatgta 4200
tcttaggtga ctaaaacaat ggttgtcaca tggctggccc ttcatatttg tttccagatg 4260
gaagactctc tttctagtgg tggaacatta gttttgcact gtgttgggac aacctgatgt 4320
agtgaaaaca agcctgggca atgaaatcaa cagattggag ttcagttcct aattgggtca 4380
tggatgaact ttgtgacctt gggcaagtga gttcacctct ctgagttgaa taggttccct 4440
cctttctaga acaagtatga gtctgcatca gagagtggtt gcgagggcta cacatgatgg 4500
aggatgagga ctggcacatc agaagtactg aatgaagaat tgtaacataa aaatgacaac 4560
agtaatatat ttttgtggtt tcagcactct tcaaatgaaa ccacctggcc aacaggattt 4620
tagtgtacct gcttataaca ttagccttcg tttccaccaa aaagggtgtt aaaaaaggaa 4680
gcttggaaca tgaaagtaag acacttggat gaagagattt atgactctgg ggggctgtga 4740
attcctaatg tccttttgag acatgtagat cttccagagc gatgctgccc aatgcagtag 4800
ccactagcca agtgcaaatg gtcacttgca atatggctag tctttgagat gtgttttaag 4860
tgtaaaatac acactgaatt ttaaagactt agcgcaatac aaagaatgta aaatatctca 4920
ttatatcttg aaattatact attttggata tatggtgttc ccttggtgtc tttggggact 4980
ggttccagga tcctagagga tacccaaatc cccagatgtc aagtccgcta tataaaatgt 5040
cctgtagtat ttgcatataa cctacacaca tccttctgaa tactttaaat catctctaga 5100
ttccttgtaa ttcctaatac aatgtaaatg ttatgtaaat agttgttata ctatattaaa 5160
aagtttttta ttctttattt ttgctgtatt attctttttg catattttca gtccacagat 5220
ggttgatgcc acagatgtgg aacctgtgaa taaggagggc tgactgtatt gagttaagcg 5280
aaatatatta ttaatatttc atctatttct ttttacttct aaaagatgtg gcgacaagaa 5340
aatttaaaat tacaaatgtg gcccacatta tatttctatt gggcagtgct gctctagaga 5400
gtcggcaaaa agggcagaat ggagcctcca ttatacagat cacaaaactg agcacaggta 5460
attcactcca aaggtcgggg ctggtctcac tctgagctgc gggttttctt ttcccacgcc 5520
agagctgcct ggtgccagga cgagcgtaac acggacccac agtgtcccca gaagggggca 5580
ggcgttctga gagccacaaa ggtggggtgg aatcccttga tgtcgaccgc caccatcccc 5640
ctccccccgc gcgacctccc cgcagagacc tccccagaca aaacaaacaa acccttgggt 5700
ctggcgaact gcagcgggga gcggaaacca aggaagatca aagactcagc ggttaccccc 5760
ttccgggccg cgcagtttgg cagcgcgccc cgacccgggc gggcacccac gggcccccgg 5820
acgaggagat cccagagact ggctgataac ggggcgcttt ggacatttgt cgctgcctgg 5880
agagggctgg gctcacactg gcccggggtg cgctgggggc tcctcctgga ctccccaaat 5940
aagaaactag aggagtgcgg tggtgggggg cgggtcacgg ggcgggtaat gaacactttc 6000
tgcagaaggt aggtcgtggg aagactggga aaaggcagcg ctgccgaagc ttgcacctga 6060
gcagctaagg tctccgctcc cgacctcagt ttccccacct gtaaattgga gccgccgagt 6120
cccgccctgc ccgtttagag agaacgtgga gcggagggaa gtgacagtac agttagcgat 6180
ggccgggctg ttctgtccca atacgcctcc tggacaagcc gccccgccgg gtcgccagcc 6240
ctggagctcg gcccccggcc ccagaccgcg gcagggagcg cggactgtgt cccgcccctc 6300
ccgtcagcgc cccgccctcg tccccgccca tgccccgcct ccggccccgc ccccgccgca 6360
accagccttg cctttgatgc gccgcaccgg ccaatgggcg cgcggggagg cgcgggccgc 6420
ggcggcgggc tgggggctcg gcgctcccgg gcgtc                            6455
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
agtcgggccg cggcgacggc ggcaggagcg cgtcccggcg ccgcctcggg ctccgctcgg 60
ctcgggggct gcttcgggag gaggagagcc aagggaggcg ccaggcccgc gggccgggcg 120
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
catggcttag ggacgctccc ggccgccgca gccccagc                        38
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
atggggaaac ttcactccaa gccg                                       24
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
gccgccgtgt gcaagcgcag ggagagcccg gaag                            34
<210> 14
<211> 134
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
gtgacagctt cgccgtgagc gctgcctggg ctcggaaggg catcgaggag tggatcggga 60
gacagcgctg cccgggcggt gtctcgggac cccgacagct gcggttggcg ggcaccatag 120
gccgaagcac ccgg                                                   134
<210> 15
<211> 67
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
gagctcgtgg gcgacgtgtt gagagacacg ctcagcgagg aagaggagga cgactttcgg 60
ctggaag                                                           67
<210> 16
<211> 107
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
tggccctgcc tcctgagaag actgacgggc tgggcagcgg agatgagaag aagatggaga 60
gagtgagcga accctgccca ggctccaaga agcagctgaa gtttgaa               107
<210> 17
<211> 96
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
gagctccagt gcgacgtgtc catggaggag gacagccggc aggagtggac cttcaccctg 60
tatgactttg acaacaacgg caaggtcacc cgagag                           96
<210> 18
<211> 148
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
gacatcacca gcttgctgca caccatctat gaggtggtgg actcctctgt caaccactcc 60
ccaacatcca gcaagatgct gcgggtaaag ctcaccgtgg cccccgatgg cagccagagc 120
aagaggagcg tccttgtcaa tcaggctg                                    148
<210> 19
<211> 85
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
acctgcagag cgcaaggccc cgagcagaga ccaagcccac tgaggacctg cggagctggg 60
agaagaagca gcgagccccg ctcag                                      85
<210> 20
<211> 128
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
gttccagggt gacagccgcc tggagcagtc tggctgctac caccattgcg tagatgagaa 60
catcgagagg agaaaccact acttagatct cgccgggata gaaaactaca cgtcccaatt 120
tgggcctg                                                          128
<210> 21
<211> 590
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
gctccccttc cgtggcccag aagtcagaac tgcccccccg cacctccaat cccactcgat 60
ctcgctccca tgagccggaa gccatccaca tcccacaccg aaagccccaa ggcgtggacc 120
cggcctcctt ccacttcctt gacaccccaa tcgccaaggt ctcagagctc cagcaacggc 180
tccggggcac ccaggacggg agcaagcact ttgtgaggtc ccccaaggcc cagggcaaga 240
gtgtgggtgt gggccacgtg gccagagggg caagaaacaa gccccctctg ggacccgcca 300
tccctgcggt gtccccctcc gcccacctgg ctgccagccc ggccctcctc ccctccctag 360
cccccctcgg gcacaagaag cacaagcacc gagccaagga gagccagcag ggctgccggg 420
gcctgcaggc accactggcc tcaggtggcc ctgtcctggg gcgggagcac ctgcgggagc 480
tgcccgcctt ggtggtgtat gagagccagg ccgggcagcc ggtccagaga catgagcacc 540
accaccacca tgaacatcac caccattacc accacttcta ccagacatag            590
<210> 22
<211> 215
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
agcccctccc cagggcccca ccctgccata tgaaggaccc cacccccgac accacaaggc 60
attattattc tattaattat tgttattatg atgattattg ttattaataa ttattgttac 120
tccactaata tttagctagc ctacatgtag aagatctatg gaaacacaga actaaacttt 180
tatttatatg ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                            215
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 23
cttgccgttg ttgtcaaagt c                                          21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 24
cccagcatgg ggaaacttca                                            20
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Descriptionof Artificial Sequence: Antisense
oligonucleotide
<400> 25
actcagcttg gttagtgtgt caggc                                      25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Reverse
control oligonucleotide
<400> 26
cggactgtgt gattggttcg actca                                      25