(57)【要約】IL-6受容体I鎖の結晶を含む結晶組成物が提供される。IL-6Rまたはその変異体と相互作用する化合物をスクリーニングするおよび設計するための、その結晶のおよび関連する構造情報の使用方法もまた、提供される。IL-6受容体を本発明のスクリーニング方法により同定された化合物と接触させる段階を含む、IL-6受容体の調節方法もまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-6受容体と相互作用して受容体により媒介される活性を調節する化合物を選択するかまたは設計する方法であって、以下の段階を含む方法：
(a) (i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の該アミノ酸の部分集合
を含む受容体の局所領域と、化合物との間の立体化学的な相補性を評価する段階；
(b) 受容体の局所領域に対して立体化学的な相補性を有する化合物を得る段階；ならびに
(c) 化合物を、受容体と関連する活性を調節するその能力に対して試験する段階。
【請求項２】
IL-6受容体の局所領域が残基106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256または276〜281およびその組み合わせにより定義されるリガンド結合表面である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
IL-6受容体の局所領域が残基1〜5、19〜23、65〜69、93〜99、118、119、132〜141、166〜172、179〜196、241〜250、261、262、272〜276または282〜290およびその組み合わせにより定義されるホモ二量体の結合界面の領域にある、請求項1記載の方法。
【請求項４】
IL-6受容体の局所領域が残基11、45、46、55、62〜66、69〜72、75、81、88、90〜93、122〜124および178により定義される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
IL-6受容体の局所領域が残基233〜239、244〜248および270〜290により定義される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
以下の段階を含む、IL-6受容体に対する潜在的な調節化合物を同定するための方法：
(a) 別表Iに示される原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である原子座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合により定義されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の3次元構造を提供する段階；
(b) 候補化合物の3次元構造を提供する段階；ならびに
(c) 段階(b)の3次元構造と段階(a)の3次元構造の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階。
【請求項７】
以下の段階をさらに含む、請求項6記載の方法：
(d) 段階(c)で評価された候補化合物を、段階(a)の3次元構造の局所領域との立体化学的な相補性を有するように、合成するかまたは得る段階；ならびに
(e) IL-6受容体と相互作用するおよび/またはIL-6受容体の活性を調節する候補化合物の能力を決定する段階。
【請求項８】
IL-6受容体の局所領域が残基106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256または276〜281およびその組み合わせにより定義されるリガンド結合表面である、請求項6または請求項7記載の方法。
【請求項９】
IL-6受容体の局所領域が残基1〜5、19〜23、65〜69、93〜99、118、119、132〜141、166〜172、179〜196、241〜250、261、262、272〜276または282〜290およびその組み合わせにより定義されるホモ二量体の結合界面の領域にある、請求項6または請求項7記載の方法。
【請求項１０】
IL-6受容体の局所領域が残基11、45、46、55、62〜66、69〜72、75、81、88、90〜93、122〜124および178により定義される、請求項6または請求項7記載の方法。
【請求項１１】
IL-6受容体の局所領域が残基233〜239、244〜248および270〜290により定義される、請求項6または請求項7記載の方法。
【請求項１２】
演算処理装置、入力装置、および出力装置を含むプログラム化されたコンピュータを用いて、IL-6受容体と相互作用し、それによって受容体により媒介される活性を調節できる潜在的な化合物を同定するためのコンピュータ支援による方法であって、以下の段階を含む方法：
(a) プログラム化されたコンピュータに、入力装置を介して、別表Iに示されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の原子座標、または該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の該アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の該アミノ酸の部分集合を含むデータを入力する段階；
(b) コンピュータによる方法を用いて、別表Iに示されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の原子座標、または該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の該アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つもしくは複数の該アミノ酸の部分集合に対して立体化学的な相補性を有する構造の原子座標セットを作成し、これにより基準データセットを作成する段階；
(c) 演算処理装置を用いて、基準データセットを化学構造のコンピュータデータベースと比較する段階；
(d) データベースから、コンピュータによる方法を用いて、該基準データセットの一部に類似する化学構造を選択する段階；ならびに
(e) 出力装置に、基準データセットの一部に相補するかまたは類似する選択された化学構造を出力する段階。
【請求項１３】
IL-6受容体と相互作用する化学物質の能力を評価するための方法であって、以下の段階を含む方法：
(a) 構造座標、ここで該構造座標と別表Iに記載のIL-6受容体のアミノ酸1〜299の構造座標との間の2乗平均平方根偏差が約1.5Å以下である、を用いてIL-6受容体の少なくとも1つの領域のコンピュータモデルを作成する段階；
(b) 化学物質と結合表面の該コンピュータモデルとの間の適合操作を行うためのコンピュータによる手段を使用する段階；および
(c) 化学物質と結合表面モデルとの間の相関性を定量化するため、該適合操作の結果を解析する段階。
【請求項１４】
分子または分子複合体の3次元表示を作成するためのコンピュータであって、以下を含むコンピュータ：
(a) 機械可読データに、別表Iに示されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の原子座標、または該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の該アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の該アミノ酸の部分集合が含まれる、機械可読データがコード化されたデータ記憶機材を含む、機械可読データ記憶媒体；
(b) 機械可読データを処理するための指示を記憶するためのワーキングメモリ；
(c) 機械可読データを3次元表示に加工処理するための、ワーキングメモリと機械可読データ記憶媒体に連結された中央演算処理ユニット；ならびに
(d) 3次元表示を受信するための、中央演算処理ユニットに連結された出力ハードウェア。
【請求項１５】
IL-6、IL-6受容体、gp130六量体の複合体形成に干渉する化合物を選択するかまたは設計する方法であって、以下の段階を含む方法：
(a) 複合体が
(i) 別表IIに示される原子座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸、もしくは該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸、または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の該アミノ酸の部分集合
を特徴とする、化合物と複合体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階；
(b) 受容体の局所領域に対して立体化学的な相補性を有する化合物を得る段階；ならびに
(c) 化合物を、IL-6、IL-6受容体、gp130六量体の複合体形成に干渉するその能力に対して試験する段階。
【請求項１６】
複合体の局所領域が以下からなる群より選択される、請求項15記載の方法：
2005517227.tif 000297
【請求項１７】
演算処理装置、入力装置、および出力装置を含むプログラム化されたコンピュータを用いて、IL-6、IL-6受容体、gp130六量体の複合体形成に干渉する化合物を同定するためのコンピュータ支援による方法であって、以下の段階を含む方法：
(a) プログラム化されたコンピュータに、入力装置を介して、別表IIに示されるIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸の原子座標、または該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の該アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の該アミノ酸の部分集合を含むデータを入力する段階；
(b) コンピュータによる方法を用いて、別表IIに示されるIL-6、IL-6受容体およびgp130六量体複合体の原子座標、または該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の該アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つもしくは複数の該アミノ酸の部分集合に対して立体化学的な相補性を有する構造の原子座標セットを作成し、これにより基準データセットを作成する段階；
(c) 演算処理装置を用いて、基準データセットを化学構造のコンピュータデータベースと比較する段階；
(d) データベースから、コンピュータによる方法を用いて、該基準データセットの一部に類似する化学構造を選択する段階；ならびに
(e) 出力装置に、基準データセットの一部に相補するかまたは類似する選択された化学構造を出力する段階。
【請求項１８】
IL-6、IL-6受容体、gp130六量体複合体と相互作用する化学物質の能力を評価するための方法であって、以下の段階を含む方法：
(a) 構造座標、ここで該構造座標と別表Iに記載の構造座標との間の2乗平均平方根偏差が約1.5Å以下である、を用いてIL-6、IL-6受容体、gp130六量体複合体の少なくとも1つの領域のコンピュータモデルを作成する段階；
(b) 化学物質と該コンピュータモデルとの間の適合操作を行うためのコンピュータによる手段を使用する段階；および
(c) 化学物質とモデルとの間の相関性を定量化するため、該適合操作の結果を解析する段階。
【請求項１９】
分子または分子複合体の3次元表示を作成するためのコンピュータであって、以下を含むコンピュータ：
(a) 機械可読データに、別表IIに示されるIL-6、IL-6受容体、gp130六量体複合体の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転による、別表IIに示される座標の1つまたは複数の部分集合が含まれる、機械可読データがコード化されたデータ記憶機材を含む、機械可読データ記憶媒体；
(b) 機械可読データを処理するための指示を記憶するためのワーキングメモリ；
(c) 機械可読データを3次元表示に加工処理するための、ワーキングメモリと機械可読データ記憶媒体に連結された中央演算処理ユニット；ならびに
(d) 3次元表示を受信するための、中央演算処理ユニットに連結された出力ハードウェア。
【請求項２０】
IL-6受容体の結晶を含む結晶組成物。
【請求項２１】
結晶が別表Iに示される原子座標により定義される構造を有する、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
請求項20記載の結晶組成物を化合物と接触させる段階およびIL-6受容体の結晶との化合物の結合レベルを測定する段階を含む、化合物とIL-6受容体との間の相互作用を評価する方法。
【請求項２３】
以下の段階を含む、構造が知られていない分子または分子複合体に関する構造情報を得るための分子置換を使用する方法：
(i) 該分子または分子複合体を結晶化する段階；
(ii) 該結晶化された分子または分子複合体からX線回折図形を作成する段階；および
(iii) その構造が知られていない分子または分子複合体の少なくとも一部の3次元電子密度図を作成するため、X線回折図形に別表I記載の少なくとも一部の構造座標を適用する段階。
【請求項２４】
構造が知られていない分子がIL-6受容体または変異体である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
構造が知られていない分子複合体が、IL-6受容体またはその変異体とリガンドとの複合体である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
予防または治療が必要な被検者に、化合物と受容体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階を含む方法により同定される化合物を投与する段階を含む、IL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療するための方法であって、受容体が
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の該アミノ酸の部分集合
を含む方法。
【請求項２７】
IL-6受容体の局所領域が残基106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256または276〜281およびその組み合わせにより定義されるリガンド結合表面である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
IL-6受容体の局所領域が残基1〜5、19〜23、65〜69、93〜99、118、119、132〜141、166〜172、179〜196、241〜250、261、262、272〜276または282〜290およびその組み合わせにより定義されるホモ二量体の結合界面の領域にある、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
IL-6受容体の局所領域が残基11、45、46、55、62〜66、69〜72、75、81、88、90〜93、122〜124および178により定義される、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
IL-6受容体の局所領域が残基233〜239、244〜248および270〜290により定義される、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
予防または治療が必要な被検者に、化合物とIL-6、IL-6R、gp130六量体複合体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階を含む方法により同定される化合物を投与する段階を含む、IL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療するための方法であって、六量体複合体が
(i) 別表IIに示される原子座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸、もしくは該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の該アミノ酸の部分集合
を含む方法。
【請求項３２】
複合体の局所領域が以下からなる群より選択される、請求項31記載の方法：
2005517227.tif 000298
【請求項３３】
疾患が多発性骨髄腫、リンパ腫、炎症、関節リウマチ、前立腺癌、キャッスルマン病、AIDS、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、敗血症、骨粗鬆症および乾癬から選択される、請求項26〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
IL-6Rの細胞外部分を含む化合物であって、細胞外部分が以下からなる群より選択されるIL-6Rの1つまたは複数のアミノ酸で改変される化合物：
2005517227.tif 000299
【請求項３５】
請求項34記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項３６】
予防または治療が必要な被検者に請求項35記載の組成物を投与する段階を含む、IL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療する方法。
【請求項３７】
IL-6受容体を式A-B-Cの化合物
（式中
Aは、選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、3つの融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環；または選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、2つの非融合5員もしくは6員の、飽和、不飽和またはアリール環からなり；
Cは、選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、3つの融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環；または選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、2つの非融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環からなり；かつ
Bは、実質的にエチレン部分と同等の長さを有する脂肪族リンカーである）
と接触させる段階を含む、IL-6受容体の活性を調節する方法であって、
該化合物が、
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の該アミノ酸の部分集合
のリガンドが結合する局所領域に対して立体的相補性を有し、
該リガンドが結合する局所領域が、IL-6受容体の残基106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256および276〜281またはその組み合わせにより定義される、方法。
【請求項３８】
Aが、下記式
2005517227.tif 000300
（式中
Zは結合であり；またはZ、R4およびR10が一緒になって、選択的に置換された、5員、6員もしくは7員を有する、飽和、不飽和またはアリール環(選択的にO、NおよびSから選ばれる1つまたは複数のヘテロ原子を含む)を形成し；またはZ、R3およびR6が一緒になって、5員、6員もしくは7員を有する、アリール環またはヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはヘテロシクリル環を形成し、該アリール環または該ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル環は選択的に置換され;
R7、R8またはR9は、リンカーBに結合され；
R1、R2およびR5はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、OR24またはNR25R26であって、ここでR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R3およびR6は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、ここでR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R4およびR10は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、ここでR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R7、R8およびR9は、リンカーBに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、ここでR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである）を有し；
Bが、下記式
2005517227.tif 000301
（式中
YおよびY1がともにO、NまたはSではないという条件で、YおよびY1は、それぞれ独立してC、O、SまたはNであり；
R11およびR12は、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、ここでR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである）を有し；
Cが、下記式
2005517227.tif 000302
（式中
Xは結合であり；またはX、R14およびR18が一緒になって、選択的に置換された、5員、6員もしくは7員を有する、飽和、不飽和またはアリール環(選択的にO、NおよびSから選ばれる1つまたは複数のヘテロ原子を含む)を形成し；またはX、R15およびR22が一緒になって、5員、6員もしくは7員を有する、アリール環またはヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはヘテロシクリル環を形成し、該アリール環または該ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル環は選択的に置換され；
R13、R16またはR17は、リンカーBに結合され；
R19、R20およびR21はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、ここでR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R14およびR18は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、ここでR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R15およびR22は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、ここでR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R13、R16およびR17は、リンカーBに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、ここでR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである）を有する、
請求項37記載の方法。
【請求項３９】
IL-6受容体を式A-B-Dの化合物
（式中
Aは、選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に任意の位置で置換された、3つの融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環；または選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、2つの非融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環からなり；
Dは、選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に任意の位置で置換された、1つの、または2つの融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環；または選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、2つの非融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環からなり；および
Bは、実質的にエチレン部分と同等の長さを有する脂肪族リンカーである）
と接触させる段階を含む、IL-6受容体の活性を調節する方法であって、
該化合物が、
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは該アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の該アミノ酸の部分集合
のリガンドが結合する局所領域に対して立体的相補性を有し；
該リガンドが結合する局所領域が、IL-6受容体の残基106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256および276〜281またはその組み合わせにより定義される、方法。
【請求項４０】
Aが、下記式
2005517227.tif 000303
（式中
Zは結合であり；またはZ、R4およびR10が一緒になって、選択的に置換された、5員、6員もしくは7員を有する、飽和、不飽和またはアリール環(選択的にO、NおよびSから選ばれる1つまたは複数のヘテロ原子を含む)を形成し；またはZ、R3およびR6が一緒になって、5員もしくは6員を有する、アリール環またはヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはヘテロシクリル環を形成し、該アリール環または該ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル環は選択的に置換され；
R7、R8またはR9は、リンカーBに結合され；
R1、R2およびR5はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、OR24またはNR25R26であって、ここでR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R3およびR6は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、ここでR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R4およびR10は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、ここでR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R7、R8およびR9は、リンカーBに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、ここでR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである）を有し；
Bが、下記式
2005517227.tif 000304
（式中
YおよびY1がともにO、NまたはSではないという条件で、YおよびY1は、それぞれ独立してC、O、SまたはNである）を有し；
Dが、下記式
2005517227.tif 000305
（式中
Y2、Y3およびY4のうちの少なくとも2つがCであるという条件で、Y2、Y3またはY4は、それぞれ独立してC、O、NまたはSであり；
R13、R17またはR18は、リンカーBに結合され；
R14、R15およびR16はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、ここでR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；または
R16は水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、ここでR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり、そしてR14およびR15はともに、選択的に置換された、5員、6員もしくは7員を有する、飽和、不飽和またはアリール環(選択的にO、NおよびSから選ばれる1つまたは複数のヘテロ原子を含む)を形成し；または
R14は水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、ここでR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり、R15およびR16はともに、選択的に置換された、5員、6員もしくは7員を有する、飽和、不飽和またはアリール環(選択的にO、NおよびSから選ばれる1つまたは複数のヘテロ原子を含む)を形成し；
R13、R17およびR18は、リンカーBに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、ここでR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである）を有する、
請求項39記載の方法。
【請求項４１】
予防または治療が必要な被検者に請求項37〜40のいずれか一項で定義される化合物を投与する段階を含む、IL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は広くは、インターロイキン-6(IL-6)受容体の構造研究に関する。より具体的には、本発明はIL-6受容体α鎖(IL-6R)の結晶構造に関する。さらにより具体的には、本発明は、IL-6Rの細胞外部分の結晶構造、ならびにIL-6Rまたはその変異体と相互作用する化合物をスクリーニングおよび設計するため、その結晶構造情報および関連構造情報を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インターロイキン-6(IL-6)は、その幅広い免疫および造血活性ならびに急性期応答を誘導するその潜在能力により、宿主防御において中心的な役割を果たす、多機能性サイトカインである(総説としては、Simpsonら, 1997, Protein Sci 6, 929〜55を参照されたい)。それは、感染または組織損傷に対する体内兵器庫としての重要な最前線成分であることを意味するものと思われる(IL-6ノックアウトマウスは、免疫および急性期応答を損なっていた)。IL-6はもともと、インターフェロン-β2、26K因子、B細胞刺激因子2、ハイブリドーマ増殖因子、プラズマサイトーマ増殖因子、肝細胞刺激因子、造血因子および細胞傷害性T細胞分化因子のような種々の名前で呼ばれていた−それぞれの名前は、異なる生物学的活性が同一タンパク質により制御されることを反映している。この10年間に、インターロイキン-6の機能的多面作用により、このサイトカインが多発性骨髄腫、関節リウマチ、キャッスルマン病、AIDS、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、敗血症、骨粗鬆症および乾癬のような多くのヒト疾患の病状に関与していることが明らかとなった。異常なIL-6産生と臨床的疾患との相関を考えれば、IL-6関連疾患を治療する潜在的治療薬として機能的なアゴニスト(作動薬)およびアンタゴニスト(拮抗薬)を開発することには大きな関心がある。
【０００３】
IL-6の生物学的活性は、2つの膜タンパク質、リガンドが結合する受容体α鎖(IL-6R, gp80)とそのシグナルを伝達するβ鎖、gp130(これはLIF、OSM、CNTF、IL-11およびCT-1の受容体複合体の一部もなす)からなるIL-6受容体複合体により介される。IL-6Rとgp130とを共発現すると、IL-6に対し、低親和性結合部位と高親和性結合部位の双方が生じ、2つの鎖の相対量により両親和性状態の比率が決定される。高親和性結合は、IL6-Rとgp130上の部位と同時に相互作用するIL-6能による可能性が高い。典型的には、低親和性結合と高親和性結合との親和性の相違は、約100倍である;例えば、ヒト骨髄腫U266細胞に関しては、IL-6はまず、約1 nMの親和性でIL-6Rに結合し、そしてそのIL-6/IL-6R複合体が次に、結果として約10 pMの親和性でgp130に結合する。多種多様なヒト細胞で、IL-6の結合が実証されている。ヒトIL-6Rは、幅広い分布を示す(例えば、活性化B細胞、休止期T細胞、Bリンパ芽球様細胞種、肝癌細胞株、骨髄腫細胞株および単球細胞株)が、このタイプの受容体を欠損している細胞もある。正常細胞は、102〜103個の受容体を発現しているが、ヒト骨髄腫U266細胞およびEBウイルスで形質転換されたCESS細胞は、最大で104個の受容体を有する。
【０００４】
ヒトIL-6R cDNAは、19アミノ酸のシグナルペプチド、339アミノ酸の細胞外領域、28アミノ酸の膜貫通ドメイン、および82アミノ酸の短い細胞内ドメインを含む、468アミノ酸のタンパク質をコードする(Yamasakiら, 1988, Science 241: 825〜828)。その細胞外ドメインには、潜在的なN-結合型糖鎖付加部位が6箇所存在しており、成熟型の80kDa IL-6Rは、その推定される50kDa前駆体の糖鎖付加型である。2次構造予測から、その細胞外領域はモジュール性が高く、約100残基の3つのドメイン(D1、D2およびD3)からなることが示唆される。これらのドメインは、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに特有のN末端ドメインD1、および2つのIII型フィブロネクチン様(FN III)ドメイン(免疫グロブリンループのサブクラス)からなるサイトカイン結合ドメイン(CBD)で構成される。IL-6RのCBDは、クラスIサイトカイン受容体に特有である。この受容体ファミリーの他のメンバーと同じように、CBDのN末端FIIIドメイン(D2)は、4つの保存されたシステインを有し、一方、C末端FIIIドメイン(D3)は、保存された配列モチーフ、「WSXWS」モチーフを有する。IgドメインD1を欠失させてもIL-6結合またはシグナル伝達に大きな影響を及ぼさなかったことから、CBDがIL-6およびgp130との結合を媒介していることが示唆される。gp130発現細胞において、IL-6と「可溶性の」IL-6R細胞外ドメインとの複合体により、シグナル伝達が誘導されるという事実から示されるように、IL-6Rの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、シグナル伝達に必要とされない。
【０００５】
IL-6R複合体の生物学が知られているにもかかわらず、IL-6R複合体のアゴニストまたはアンタゴニストの設計は、この複合体に対して利用できる3次元構造情報がないことにより、大いに妨げられている。従って、IL-6R複合体の3次元構造座標に関する知識は、潜在的な選択的アゴニスト/アンタゴニスト(言い換えると、治療上の有用性があると期待されるもの)の設計を促進するうえで有用であると思われる。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
今回、本発明者らはIL-6受容体に関する3次元構造情報を得た。治療で用いる、IL-6受容体と相互作用する化合物を開発するため、本出願のなかで提供される情報を使用することができる。
【０００７】
従って、第1の局面として、本発明によりIL-6受容体と相互作用して、その受容体により媒介される活性を調節する化合物を選択するかまたは設計する方法であって、化合物と受容体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階を含み、その受容体が以下を特徴とする方法が提供される：
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進（whole body translation）および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合。
【０００８】
第1の局面の好ましい態様として、構造座標は、前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.0Å以下であり、より好ましくは0.7Å以下である。
【０００９】
「立体化学的な相補性」とは、化合物またはその一部分が、受容体またはその局所領域との結合に関する正味の自由エネルギーを減少させるようにして、受容体またはその局所領域と十分な数のエネルギー的に起こりやすい接触をすることを指す。
【００１０】
第2の局面として、本発明により、演算処理装置、入力装置、および出力装置を含むプログラム化されたコンピュータを用いて、IL-6受容体と相互作用し、それによってその受容体により媒介される活性を調節できる潜在的な化合物を同定するためのコンピュータ支援による方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
(a) プログラム化されたコンピュータに、入力装置を介して、別表Iに示されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合を含むデータを入力する段階；
(b) コンピュータによる方法を用いて、別表Iに示されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合に対して立体化学的な相補性を有する構造の原子座標セットを作成し、これにより基準データセットを作成する段階；
(c) 演算処理装置を用いて、基準データセットを化学構造のコンピュータデータベースと比較する段階；
(d) データベースから、コンピュータによる方法を用いて、前記基準データセットの一部に類似する化学構造を選択する段階；ならびに
(e) 出力装置に、基準データセットの一部に相補するかまたは類似する選択された化学構造を出力する段階。
【００１１】
第3の局面として、本発明により分子または分子複合体の3次元表示を作成するためのコンピュータであって、以下を含むコンピュータが提供される：
(a) 機械可読データがコード化されたデータ記憶機材を含む、機械可読データ記憶媒体であって、その機械可読データには、別表Iに示されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合が含まれる；
(b) 機械可読データを処理するための指示を記憶するためのワーキングメモリ；
(c) 機械可読データを3次元表示に加工処理するための、ワーキングメモリと機械可読データ記憶媒体に連結された中央演算処理ユニット；および
(d) 3次元表示を受信するための、中央演算処理ユニットに連結された出力ハードウェア。
【００１２】
第4の局面として、本発明によりIL-6受容体に結合して、その受容体により媒介される活性を調節できる化合物であって、本発明による方法によって得られる化合物が提供される。
【００１３】
第5の局面として、本発明によりIL-6受容体の局所領域に対して立体化学的な相補性を有し、その受容体により媒介される活性を調節する化合物であって、その受容体は以下：
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合；
を特徴とし、
その化合物はIL-6受容体分子もしくはその変異体の天然に存在するリガンドではないという条件を伴う化合物が提供される。
【００１４】
「変異体」とは、1つもしくは複数の点突然変異、アミノ酸の挿入またはアミノ酸の欠失により改変されたリガンドを指す。
【００１５】
第6の局面として、本発明により、本発明による化合物および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。本発明によりまた、IL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療する方法における、本発明の化合物または薬学的組成物の使用が提供される。
【００１６】
関連する局面として、本発明によりIL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療する方法であって、予防または治療が必要な被検者に本発明による化合物を投与する段階を含む方法が提供される。
【００１７】
さらに別の局面として、本発明によりIL-6受容体と相互作用する化学物質の能力を評価するための方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
(a) 構造座標、ここでその構造座標と別表Iに記載のIL-6受容体のアミノ酸1〜299の構造座標との間の2乗平均平方根偏差が約1.5Å以下である、を用いてIL-6受容体の少なくとも1つの領域のコンピュータモデルを作成する段階；
(b) 化学物質と結合表面の前記コンピュータモデルとの間の適合操作を行うためのコンピュータによる手段を使用する段階；および
(c) 化学物質と結合表面モデルとの間の相関性を定量化するため、前記適合操作の結果を解析する段階。
【００１８】
さらなる局面として、本発明によりIL-6、IL-6R、gp130六量体の複合体形成に干渉する化合物を選択するかまたは設計する方法であって、化合物と複合体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階を含み、その複合体が以下を特徴とする方法が提供される：
(i) 別表IIに示される原子座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合。
【００１９】
別の局面として、本発明により演算処理装置、入力装置、および出力装置を含むプログラム化されたコンピュータを用いて、IL-6、IL-6R、gp130六量体の複合体形成に干渉する化合物を同定するためのコンピュータ支援による方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
(a) プログラム化されたコンピュータに、入力装置を介して、別表IIに示されるIL-6、IL-6Rおよびgp130のアミノ酸の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合を含むデータを入力する段階；
(b) コンピュータによる方法を用いて、別表IIに示されるIL-6、IL-6Rおよびgp130六量体複合体の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合に対して立体化学的な相補性を有する構造の原子座標セットを作成し、これにより基準データセットを作成する段階；
(c) 演算処理装置を用いて、基準データセットを化学構造のコンピュータデータベースと比較する段階；
(d) データベースから、コンピュータによる方法を用いて、前記基準データセットの一部に類似する化学構造を選択する段階；ならびに
(e) 出力装置に、基準データセットの一部に相補するかまたは類似する選択された化学構造を出力する段階。
【００２０】
別の局面として、本発明により分子または分子複合体の3次元表示を作成するためのコンピュータであって、以下を含むコンピュータが提供される：
(a) 機械可読データがコード化されたデータ記憶機材を含む、機械可読データ記憶媒体であって、その機械可読データには、別表IIに示されるIL-6、IL-6R、gp130六量体複合体の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転による、別表IIに示される座標の1つまたは複数の部分集合が含まれる；
(b) 機械可読データを処理するための指示を記憶するためのワーキングメモリ；
(c) 機械可読データを3次元表示に加工処理するための、ワーキングメモリと機械可読データ記憶媒体に連結された中央演算処理ユニット；および
(d) 3次元表示を受信するための、中央演算処理ユニットに連結された出力ハードウェア。
【００２１】
別の局面として、本発明によりIL-6、IL-6Rおよびgp130六量体複合体の局所領域に対して立体化学的な相補性を有し、その複合体により媒介される活性を調節する化合物であって、その複合体が以下を特徴とする化合物が提供される：
(i) 別表IIに示される原子座標に位置するIL-6、IL-6Rおよびgp130のアミノ酸、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6、IL-6Rおよびgp130のアミノ酸；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合。
【００２２】
別の局面として、本発明によりIL-6、IL-6R、gp130六量体複合体と相互作用する化学物質の能力を評価するための方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
(a) 構造座標、ここでその構造座標と別表Iに記載の構造座標との間の2乗平均平方根偏差が約1.5Å以下である、を用いてIL-6、IL-6R、gp130六量体複合体の少なくとも1つの領域のコンピュータモデルを作成する段階；
(b) 化学物質と前記コンピュータモデルとの間の適合操作を行うためのコンピュータによる手段を使用する段階；および
(c) 化学物質とそのモデルとの間の相関性を定量化するため、前記適合操作の結果を解析する段階。
【００２３】
別の局面として、本発明は、IL-6受容体もしくはその一部またはこれらの変異体を含む結晶組成物にある。
【００２４】
当業者により容易に理解されるように、本発明の方法によりIL-6受容体と相互作用する化合物を設計するおよび選択するための合理的な方法が提供される。多くの場合、活性を増加させるため、これらの化合物をさらに発展させることができる。そのようなさらなる発展は、当技術分野において日常業務であり、本出願において提供される構造情報により支援されると思われる。特定の態様として、本発明の方法には、そのようなさらなる発展段階が含まれることが意図される。
【００２５】
別の局面として、本発明は化合物とIL-6受容体との間の相互作用を評価する方法にあり、その方法には化合物にIL-6受容体もしくはその一部またはこれらの変異体を含む結晶組成物をさらす段階および結晶との化合物の結合レベルを測定する段階が含まれる。
【００２６】
別の局面として、本発明により、以下の段階を含む、構造が知られていない分子または分子複合体に関する構造情報を得るための分子置換を使用する方法が提供される：
(i) 前記分子または分子複合体を結晶化する段階；
(ii) 前記の結晶化された分子または分子複合体からX線回折図形を作成する段階；
(iii) その構造が知られていない分子または分子複合体の少なくとも一部の3次元電子密度図を作成するため、そのX線回折図形に別表I記載の少なくとも一部の構造座標を適用する段階。
【００２７】
「分子置換」という用語は、観測された未知結晶の回折図を説明するのに最良となるように、その構造座標が知られている分子(例えば、別表IからのIL-6受容体の細胞外の座標)を未知結晶の単位格子内で正しい方位に置くことおよびその位置を合わせることにより、その構造座標が知られていない、IL-6細胞外ドメインの結晶の予備試験モデルを作成することを含む方法を指す。次に、位相をこのモデルから算出することができ、それを観測された振幅と組み合わせて、その座標が知られていない構造のしかるべきフーリエ合成を得ることができる。これを、次に、未知結晶の最終的で正確な構造を得るため、いくつかの精密化法のいずれかにかけることができる(Lattman, 1985, Methods in Enzymology 115: 55〜77; M. G. Rossmann(編), 「The Molecular Replacement Method」, Int. Sci. Rev. Ser., No. 13, Gordon & Breach, New York, 1972)。
【００２８】
別の局面として、本発明によりIL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療するための方法であって、その方法には、予防または治療が必要な被検者に、化合物と受容体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階を含む方法により同定される化合物を投与する段階が含まれ、その受容体が以下を含む方法が提供される：
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合。
【００２９】
別の局面として、本発明によりIL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療するための方法であって、その方法には、予防または治療が必要な被検者に、化合物とIL-6、IL-6R、gp130六量体複合体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階を含む方法により同定される化合物を投与する段階が含まれ、その六量体複合体が以下を含む方法が提供される：
(i) 別表IIに示される原子座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合。
【００３０】
本明細書の全体にわたって、「含む(comprise)」という用語、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変化形は、記述された要素、そのものもしくは段階、または要素、そのものもしくは段階の群を含むが、他の如何なる要素、そのものもしくは段階、または要素、そのものもしくは段階の群を排除することを意味するわけではないことが理解されよう。
【００３１】
詳細な説明  
本発明者らは、IL-6Rの細胞外領域の3次元構造を決定した。IL-6RのX線構造により、古典的なCBD(D2, D3)に連結したN末端Igドメイン(D1)からなる構造が明らかとなる。X線構造のなかで、N末端の最初の5残基は不明瞭であり、そして残基299を越えたアミノ酸は目に見えない。D2とD3は相互に約90度で連結され、そしてD1はD2に約45度で連結されている。3つのドメインは同様の平面上にあるため、受容体は長い「平面」構造をとっている。糖鎖は、その全てが分子の「平坦な」面のうちの1つのみにある4つの部位(Asn226部位には5個のヘキソース)に認められることから、この面のシグナル伝達複合体への関与は極めて限定的であることが示唆される。これは、機能的なsIL-6Rを大腸菌(Escherichia coli)で発現して得られる証拠と一致する。N末端のCys6は、D2のCys174にジスルフィド結合しており、この固定がD1のβ-シートの配置を独特なものとしている。D1は、SタイプIgトポロジーを有するが(繊維芽細胞増殖因子のリガンド結合ドメインでは、2乗平均平方根偏差が0.7Å(Stauberら, 2000, PNAS 97: 49〜54))、3本鎖β-シートの1番目の「a」ストランドが4本鎖β-シートの5番目の「h」ストランドを形成するように移動していた。これはおそらく、結晶の充填による結果であると思われ、そしてこのドメインには立体構造のスイッチとして機能し、D1が約20度回転するのをβ-ストランドの移動により可能とする、ある程度の自由度があることを表していると思われる。これによりまた、このドメインの不規則性がより高く、IL-6Rの結晶間に同型がないことが説明できると思われる。他のサイトカインのFnIIIドメインに見られるように、そのドメインは、プロリン-プロリン・モチーフ(D1、D2およびD3それぞれの末端にあるPro94-Pro95、Pro199-Pro200およびPro302-Pro303)により分離されている。
【００３２】
IL-6RのCBDの他の特性は、他のクラス1 CBD構造(Carrら, 2001)で見られる、長いトリプトファン-アルギニン・ラダー(D3のC末端から、Arg239、Phe246、Arg237、Trp287、Arg274、Trp284、Gln276)である。このラダーには、CBDのカルボキシ末端に位置する、保存されたWSXWSモチーフ(IL-6Rの残基284〜287)が組み込まれている。このモチーフのポリペプチド骨格は、ポリプロリン・ヘリックスに類似した、珍しい左巻きの310ヘリックスをとり、これは主鎖による水素結合ではなく、トリプトファンとアルギニンによる大きなスタッキング(積み重なり)により安定化されている。これにより、D3のL字部の内側面に沿って続く(グアニジニウムおよびトリプトファンの窒素由来の)正電荷の長い表面縞、およびそれと平行して続く310ヘリックスにより形成される溝が生じる。この構造の機能は知られていないが、他のCBDとの類似性から、それはおそらく一般的な受容体輸送システムに関与し、IL-6結合には関与していないことが示唆される。
【００３３】
繊維芽細胞増殖因子の実例(Stauberら, 2000)に従うと、IL-6は、D2由来の4ループ(L1〜L4)とD3由来の3ループ(L5〜L7)を特徴とする、D2とD3の連結部に形成されるL字部の外側の領域に結合すると予測される。IL-6はおそらく、これらのループ中の残基に結合すると思われ、これらの残基に変異があるとIL-6結合に影響を及ぼすと思われる。変異解析から、変異のほとんどが、それを結晶構造上に位置付けた場合、トリプトファン/アルギニン・ラダー中の変異では特に、分子構造の完全性の変化によって結合性を変化させた。これらの「構造的な」変異を除いても、IL-6との結合性を低下させる変異クラスターがループL3、L5およびL7中に存在する。この部位はD2およびD3ドメインの連結部にあって、主としてIL-6結合を担っていると推察することができる。
【００３４】
結晶格子中で、結晶学的2回軸で関連付けられたIL-6Rの2分子は、各分子の全長に沿って密接に会合している。その会合は主に、ドメインD2のPhe134およびPhe168を含む2回軸周辺の疎水的密着、Glu97-Arg274の塩結合、ならびにThr186の主鎖窒素とのGlu283の水素結合である。各分子の埋没した接近可能な表面積は、約1230Å2(形状的および静電的相補性は、0.722および0.728)であり、そして溶液中でのタンパク質-タンパク質相互作用が予測され得る部分である。さらに、タンパク質複合体の埋没表面は、膜結合受容体が相互作用するのに、一方または両方の成分が溶液中に存在して形成される複合体と比較して、必ずしも同じぐらい広いわけではない。従って、それは結晶中で観測されたタイプの細胞表面上にてIL-6Rが形成する二量体と一致する。
【００３５】
二量体の配位は、その相互作用が分子の糖鎖のない「平坦な」面に沿うようなもの(配位)である。このモデルでは、ドメインD3は45度で膜から離れるように上昇し、そしてドメインD2は30度で膜の方向へ下降し、最後にD1は膜に平行して続いている。このように、二量体は、三角形横断面(底辺 約40Å；高さ 約22Å)の50Åのトンネルを伴う、IL-3の共通β受容体に似た橋構造のように見える。gp130のシグナル伝達に影響を及ぼすIL-6Rの非構造的な変異が、ループL1、L3、L5およびL6上で、そしてまた、D2のd、fおよびgストランドのN末端側のそれぞれ残基140〜142、167〜171(シグナル伝達を低下させる)および182〜186(シグナル伝達を増加させる)からなる、二量体の結合界面にあるいくつかの残基で発見されている。結合を低下させる、ドメインD2の膜遠位側にあるいくつかの残基の変異(209〜213および261〜263)も存在している。
【００３６】
最近の、gp130のIgおよびCBDドメインとウイルスIL-6との複合体の構造(Chowら, 2001, Science 291: 2150〜5)から、gp130のIL-6結合ドメイン間には二量体としての関係が可能であることが示される。従って、全てのIL-6結合受容体ドメイン間に二量体としての関係を織り込むと、実質的に、現在のモデル案と異なりかつ利用可能な変異データと一致する、シグナル伝達複合体のモデルを構築することが可能である。ここで、2つのIL-6分子がIL-6R二量体に結合し、続けて2つのgp130それぞれが、ウイルスIL-6/gp130断片複合体と同様に、両方のIL-6分子に結合する。gp130は、その2番目のCBDが膜から離れて伸びるようにして結合すると思われる。gp130の残る3つのFnIIIドメインは、膜に向かって下向きになり、そしてシグナル伝達は、ジスルフィド架橋結合を介している可能性が高いIL-6R二量体の橋の下での、膜近位のFnIIIドメインの二量体化により活性化されると思われる。
【００３７】
明らかに、本出願にて提供される情報により、IL-6Rと相互作用すると思われる化合物の合理的な設計/選択が可能になると思われる。
【００３８】
従って、第1の局面として、本発明によりIL-6受容体と相互作用してその受容体により媒介される活性を調節する化合物を選択するかまたは設計する方法であって、
(a) 化合物と受容体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階であり、その受容体には以下が含まれる：
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合；
(b) 受容体の局所領域に対して立体化学的な相補性を有する化合物を得る段階；および
(c) その化合物を、受容体と関連する活性を調節するその能力に対して試験する段階、
を含む方法が提供される。
【００３９】
第1の局面の好ましい態様として、アミノ酸の部分集合は、D1ドメイン(残基1〜93)に相当するアミノ酸の部分集合、D2ドメイン(残基94〜194)に相当するアミノ酸の部分集合およびD3ドメイン(残基195〜299)に相当するアミノ酸の部分集合からなる群より選択される。
【００４０】
前述のように、繊維芽細胞増殖因子受容体の実例に従うと、IL-6は、D2由来の4ループ(L1〜L4)とD3由来の3ループ(L5〜L7)を特徴とする、D2とD3の連結部に形成されるL字部の外側の領域でIL-6Rに結合すると予測される。従って、IL-6Rのリガンド結合表面は、残基106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256および276〜281により定義される。
【００４１】
従って、好ましい態様として、106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256、276〜281およびその組み合わせからなる群より選択される、IL-6Rの1つまたは複数の残基との天然リガンドの結合に干渉するようにしてIL-6受容体と相互作用する化合物が選択されるかまたは設計される。
【００４２】
本発明者らは、IL-6Rホモ二量体が、その2つのIL-6受容体の糖鎖のない平坦な面に沿った相互作用を伴うことを確定した。この二量体の結合界面は、残基1〜5、19〜23、65〜69、93〜99、118、119、132〜141、166〜172、179〜196、241〜250、261、262、272〜276および282〜290により定義される。
【００４３】
従って、好ましい態様として、IL-6Rのホモ二量体形成に干渉するようにしてIL-6受容体と相互作用する化合物が選択されるかまたは設計される。
【００４４】
化合物は、さまざまな形でリガンド結合または二量体形成に干渉することができる。例えば、化合物は、1つもしくは複数の特定残基またはその対応領域で、またはその近傍で、受容体と結合するかまたは相互作用することができ、ならびに立体的な重なりおよび/または静電反発により、天然リガンドの結合または二量体形成を妨害することができる。または、化合物は、天然リガンドの結合または二量体形成をアロステリック干渉するように、受容体に結合することができる。
【００４５】
しかし目下、化合物は、1つもしくは複数の特定残基でまたはその近傍で、受容体と結合するかまたは相互作用することが好ましい。
【００４６】
本発明者らはまた、IL-6受容体の活性に影響を及ぼす化合物を開発するうえで特に関心のある、IL-6受容体の他の2つの領域も同定した。その1つは、D1中の明らかなアロステリック・スイッチである。D1の3本鎖β-シートの1番目の「a」ストランドが4本鎖β-シートの5番目の「h」ストランドを形成するように移動していたことが認められた。これはおそらく、結晶の充填による結果であると思われ、そして立体構造のスイッチとして機能し、D1が約20度回転するのをβ-ストランドの移動により可能とする、このドメインの自由度の程度を表していると思われる。提案したこのアロステリックな移動は、このスイッチの領域に結合してその推定される動きを阻止する分子を設計することによって、阻止することができる。この領域は、残基11、45、46、55、62〜66、69〜72、75、81、88、90〜93、122〜124および178により定義される。
【００４７】
もう1つは、保存されたWSXWSモチーフが組み込まれた、長いトリプトファン-アルギニン・ラダーである。このモチーフのポリペプチド骨格は、ポリプロリン・ヘリックスに類似した、珍しい左巻きの310ヘリックスをとり、これは主鎖による水素結合ではなく、トリプトファンとアルギニンによる大きなスタッキング(積み重なり)により安定化されている。これにより、D3のL字部の内側面に沿って続く正電荷(グアニジニウムおよびトリプトファンの窒素由来)の長い表面縞、およびそれと平行して続く3/10ヘリックスにより形成される溝が生じる。この構造の機能は知られていないが、他のCBDとの類似性から、それはおそらく一般的な受容体輸送システムに関与し、IL-6結合には関与していないことが示唆される。この領域を遮断することは、おそらく受容体の細胞表面への輸送を調節するのに有用であると思われる。この領域は、次の残基233〜239、244〜248および270〜290により定義される。WSXWSモチーフは、残基284〜287である。
【００４８】
従って、本発明の第1の局面の好ましい態様として、その方法には、以下に位置する残基に適合する部分を有する化合物を選択するかまたは設計する段階が含まれる：
(i) アミノ酸106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256および276〜281により定義されるIL-6Rのリガンド結合表面；または
(ii) アミノ酸1〜5、19〜23、65〜69、93〜99、118、119、132〜141、166〜172、179〜196、241〜250、261、262、272〜276および282〜290により定義されるIL-6R二量体の結合界面；または
(iii) IL-6Rのアミノ酸11、45、46、55、62〜66、69〜72、75、81、88、90〜93、122〜124および178；または
(iv) IL-6Rのアミノ酸残基233〜239、244〜248および270〜290。
【００４９】
「適合する」とは、同定された部分が表面残基と、例えば、水素結合を介してまたはエンタルピーを減少させるファン・デル・ワールスの相互作用(これは、生物学的に活性な化合物の、受容体との脱溶媒和を促進させる)により、受容体による化合物の保持がエネルギー的に起こりやすいような形で相互作用することを指す。
【００５０】
本発明のさらに好ましい態様として、立体化学的な相補性は、化合物がその受容体部位に対して10-6M未満のKdを有することである。より好ましくは、Kd値は10-8M未満であり、さらにより好ましくは、10-9M未満である。
【００５１】
本発明の第1の局面の好ましい態様として、化合物は、データベースから同定された既知化合物から選択されるかまたは改変される。
【００５２】
例えば、本明細書により受容体結合に関与するIL-6の部分に関する情報が提供される。この情報を利用して、IL-6変異体を、受容体と結合できるがシグナル伝達を開始できないように、その変異体の特定残基を修飾するかまたは改変させて、設計してもよい。そのような変異体は、受容体との結合に関して、天然リガンドと競合すると予測される。従って、そのような変異体は、アンタゴニストになるものと思われる。同様な方法で、アゴニストとして機能すると思われる変異体を設計することができる。この場合、シグナル伝達を促進させるため、受容体と変異体との間の相互作用の強さを増大させるように、修飾するかまたは改変するかが選択されると思われる。
【００５３】
当業者には理解されるように、タンパク質複合体の構造に関する知識は、そのタンパク質のパートナーに対する親和性が高められた、タンパク質のうちの1つの変異体を開発するうえで役立つ。構造情報は、部位特異的突然変異誘発またはファージ・ディスプレイのような方法による改変を目的として、複合体のタンパク質結合界面の1つまたは複数上の残基を選択するのに使用することができる。例えば、成長ホルモンの変更可能なアミノ酸の位置は、ヒト成長ホルモンの2分子の細胞外領域に結合した、成長ホルモンの複合体の結晶構造の一部から選択された(LowmanおよびWells, 1993, J. Mol. Biol. 234: 564〜578)。顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)受容体のリガンド結合ドメインのモデルを使って、突然変異誘発のための受容体残基を、ヒト成長ホルモン受容体と結合したヒト成長ホルモンの構造から類推して選択した(Laytonら, 1997, J Biol Chem. 272: 29735〜29741)。変異型G-CSF受容体のいくつかは、僅かに高い親和性でG-CSFを結合することが判明した。複合体の構造はまた、結合親和性を、例えば結合界面間の水素結合および/またはファン・デル・ワールス相互作用の量を増加させることによって、高める可能性がある変異体を設計するために使用することができると思われる。
【００５４】
タンパク質の結合親和性を高めるタンパク質残基の修飾は、その相当するタンパク質-タンパク質結合界面中の残基に限定されることはない。結合界面外の残基の修飾により、相互作用している2つのタンパク質間の幅広い静電相互作用(これが会合速度とそれに続いて平衡結合定数を変化させる)が変化するため、改変につながる可能性がある(SelzerおよびSchreiber, 1999, J Mol Biol. 287: 409〜419; Selzerら, 2000, Nat Struct Biol. 7: 537〜541)。会合速度への変異の寄与は、計算可能である。これを利用して、β-ラクタマーゼ阻害タンパク質のTEM1 β-ラクタマーゼとの会合速度および親和性が(解離速度を大きく変化させることなく)250倍まで増加された(Selzerら, 2000)。
【００５５】
「変異体」とは、IL-6の天然配列が1つもしくは複数の点突然変異、アミノ酸の挿入、アミノ酸の欠失またはアミノ酸の置換により、特に、天然アミノ酸のD異性体、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロアミノ酸のような非天然アミノ酸、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、β-ナフタリモアミノ酸のような特製(designer)アミノ酸およびアミノ酸類似体を広く用いて、改変されたことを指す。
【００５６】
第2の局面として、本発明により演算処理装置、入力装置、および出力装置を含むプログラム化されたコンピュータを用いて、IL-6受容体と相互作用し、それによってその受容体により媒介される活性を調節できる潜在的な化合物を同定するためのコンピュータ支援による方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
(a) プログラム化されたコンピュータに、入力装置を介して、別表Iに示されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合を含むデータを入力する段階；
(b) コンピュータによる方法を用いて、別表Iに示されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合に対して立体化学的な相補性を有する構造の原子座標セットを作成し、これにより基準データセットを作成する段階；
(c) 演算処理装置を用いて、基準データセットを化学構造のコンピュータデータベースと比較する段階；
(d) データベースから、コンピュータによる方法を用いて、前記基準データセットの一部に類似する化学構造を選択する段階；ならびに
(e) 出力装置に、基準データセットの一部に相補するかまたは類似する選択された化学構造を出力する段階。
【００５７】
好ましい態様として、アミノ酸の部分集合は、リガンド結合表面もしくは二量体の結合界面もしくはアロステリック・スイッチを規定するアミノ酸またはトリプトファン-アルギニン・ラダーである。
【００５８】
第2の局面の好ましい態様として、その方法は、受容体により媒介される活性を減少させる能力を有する潜在的な化合物を同定するために使用される。
【００５９】
第2の局面のさらに好ましい態様として、その方法には、以下のようにしてIL-6受容体と相互作用する、段階(e)に由来する1つまたは複数の化学構造を選択する段階がさらに含まれる：
(i) 106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256、276〜281およびその組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のIL-6R残基との天然リガンドの結合に干渉する；または
(ii) IL-6Rのホモ二量体形成に干渉する。
【００６０】
第2の局面のさらに好ましい態様として、その方法には、以下と相互作用する、段階(e)に由来する1つまたは複数の化学構造を選択する段階がさらに含まれる：
(i)  106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256、276〜281およびその組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のIL-6R残基；または
(ii) アミノ酸1〜5、19〜23、65〜69、93〜99、118、119、132〜141、166〜172、179〜196、241〜250、261、262、272〜276および282〜290により定義されるIL-6R二量体の結合界面；または
(iii) 11、45、46、55、62〜66、69〜72、75、81、88、90〜93、122〜124、178およびその組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のIL-6R残基；または
(iv) 233〜239、244〜248、270〜290およびその組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数のIL-6R残基。
【００６１】
第2の局面のさらに好ましい態様として、その方法には、段階(d)および段階(e)で選択された化学構造を有する化合物を得る段階、ならびにその化合物を、受容体により媒介される活性を減少させる能力に対して試験する段階がさらに含まれる。
【００６２】
第2の局面のさらに好ましい態様として、その方法には、段階(d)および段階(e)で選択された化学構造を有する分子を得る段階、ならびにその化合物を、受容体分子により媒介される活性を増加させる能力に対して試験する段階がさらに含まれる。
【００６３】
本発明によりまた、IL-6受容体の活性を調節する能力を有すると推定される化合物をスクリーニングする方法であって、推定される化合物を第1または第2の局面による方法により同定する段階、およびその化合物を、その分子により媒介される活性を増加させるかまたは減少させる能力に対して試験する段階を含む方法が提供される。1つの態様として、試験はインビトロで行われる。好ましくは、インビトロ試験は高速大量処理アッセイである。別の態様として、試験はインビボで行われる。
【００６４】
第3の局面として、本発明により分子または分子複合体の3次元表示を作成するためのコンピュータであって、以下を含むコンピュータが提供される：
(a) 機械可読データがコード化されたデータ記憶機材を含む、機械可読データ記憶媒体であって、その機械可読データには、別表Iに示されるIL-6受容体のアミノ酸1〜299の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合が含まれる；
(b) 機械可読データを処理するための指示を記憶するためのワーキングメモリ；
(c) 機械可読データを3次元表示に加工処理するための、ワーキングメモリと機械可読データ記憶媒体に連結された中央演算処理ユニット；および
(d) 3次元表示を受信するための、中央演算処理ユニットに連結された出力ハードウェア。
【００６５】
好ましい態様として、アミノ酸の部分集合は、少なくとも1つのリガンド結合表面もしくは二量体もしくはアロステリック・スイッチを規定するアミノ酸またはトリプトファン-アルギニン・ラダーである。
【００６６】
第4の局面として、本発明によりIL-6受容体に結合して、その分子により媒介される活性を調節できる化合物であって、本発明による方法によって得られる化合物が提供される。
【００６７】
第4の局面の好ましい態様として、その化合物は、その受容体と相互作用する天然リガンドの領域中に少なくとも1つの変異が起こる、IL-6受容体の天然リガンドの変異体である。
【００６８】
第5の局面として、本発明によりIL-6受容体の局所領域に対して立体化学的な相補性を有し、その受容体により媒介される活性を調節する化合物であって、その受容体は以下：
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合；
を特徴とし、
その化合物はIL-6受容体もしくはその変異体の天然に存在するリガンドではないという条件を伴う化合物が提供される。
【００６９】
「変異体」とは、1つもしくは複数の点突然変異、アミノ酸の挿入またはアミノ酸の欠失により改変されたリガンドを指す。
【００７０】
第5の局面の好ましい態様として、受容体の局所領域がアミノ酸106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256および276〜281、またはアミノ酸1〜5、19〜23、65〜69、93〜99、118、119、132〜141、166〜172、179〜196、241〜250、261、262、272〜276および282〜290により定義されるIL-6R二量体の結合界面、またはアミノ酸11、45、46、55、62〜66、69〜72、75、81、88、90〜93、122〜124および178、またはアミノ酸233〜239、244〜248および270〜290、ならびにその組み合わせにより定義される。
【００７１】
第4および第5の局面の好ましい態様として、化合物と受容体部位との間の立体化学的な相補性は、化合物がその受容体部位に対して10-6M未満、より好ましくは、10-8M未満のKdを有することである。
【００７２】
第4および第5の局面の他の態様として、化合物は、IL-6受容体により媒介される活性を減少させる。
【００７３】
第6の局面として、本発明によりIL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療するための薬学的組成物であって、本発明の第4または第5の局面による化合物と薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む薬学的組成物が提供される。
【００７４】
別の態様として、本発明によりIL-6受容体によるシグナル伝達と関連した疾患を予防するかまたは治療する方法が提供され、その方法には、予防または治療が必要な被検者に、本発明の第4または第5の局面による化合物を投与する段階が含まれる。好ましくは、疾患は、多発性骨髄腫、リンパ腫、炎症、関節リウマチ、前立腺癌、キャッスルマン病、AIDS、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、敗血症、骨粗鬆症および乾癬から選択される。
【００７５】
さらに別の局面として、本発明によりIL-6受容体と相互作用する化学物質の能力を評価するための方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
(a) 構造座標、ここでその構造座標と別表Iに記載のIL-6受容体のアミノ酸1〜299の構造座標との間の2乗平均平方根偏差が約1.5Å以下である、を用いてIL-6受容体の少なくとも1つの領域のコンピュータモデルを作成する段階；
(b) 化学物質と結合表面の前記コンピュータモデルとの間の適合操作を行うためのコンピュータによる手段を使用する段階；および
(c) 化学物質と結合表面モデルとの間の相関性を定量化するため、前記適合操作の結果を解析する段階。
【００７６】
本発明のこの局面の好ましい態様として、IL-6Rの領域がアミノ酸106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256、276〜281およびその組み合わせにより定義されるリガンド結合表面、またはアミノ酸1〜5、19〜23、65〜69、93〜99、118、119、132〜141、166〜172、179〜196、241〜250、261、262、272〜276および282〜290により定義されるIL-6R二量体の結合界面、またはアミノ酸11、45、46、55、62〜66、69〜72、75、81、88、90〜93、122〜124および178、またはアミノ酸233〜239、244〜248および270〜290ならびにその組み合わせ、97、134、140〜142、167〜171、209〜213、261〜263、および274からなる群より選択される。
【００７７】
上述のように、本発明者らは、IL-6、IL-6R、gp130の六量体複合体のモデルを開発した。この複合体に対する座標は、6分子を下記として、別表IIに並記されている：
AAAA    gp130
BBBB    gp130
CCCC    IL-6R
DDDD    IL-6R
EEEE    IL-6
FFFF    IL-6
【００７８】
この複合体における結合界面は、下記の通りである：
2005517227.tif 000002
2005517227.tif 000003
【００７９】
この情報により、この六量体形成に干渉する化合物の選択または設計が可能となる。
【００８０】
従って、さらなる局面として、本発明によりIL-6、IL-6R、gp130六量体の複合体形成に干渉する化合物を選択するかまたは設計する方法であって、化合物と複合体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階を含み、その複合体が以下を特徴とする方法が提供される：
(i) 別表IIに示される原子座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6、IL-6受容体およびgp130のアミノ酸；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合。
【００８１】
別の局面として、本発明により演算処理装置、入力装置、および出力装置を含むプログラム化されたコンピュータを用いて、IL-6、IL-6R、gp130六量体の複合体形成に干渉する化合物を同定するためのコンピュータ支援による方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
(a) プログラム化されたコンピュータに、入力装置を介して、別表IIに示されるIL-6、IL-6Rおよびgp130のアミノ酸の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合を含むデータを入力する段階；
(b) コンピュータによる方法を用いて、別表IIに示されるIL-6、IL-6Rおよびgp130六量体複合体の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合に対して立体化学的な相補性を有する構造の原子座標セットを作成し、これにより基準データセットを作成する段階；
(c) 演算処理装置を用いて、基準データセットを化学構造のコンピュータデータベースと比較する段階；
(d) データベースから、コンピュータによる方法を用いて、前記基準データセットの一部に類似する化学構造を選択する段階；ならびに
(e) 出力装置に、基準データセットの一部に相補するかまたは類似する選択された化学構造を出力する段階。
【００８２】
別の局面として、本発明により分子または分子複合体の3次元表示を作成するためのコンピュータであって、以下を含むコンピュータが提供される：
(a) 機械可読データがコード化されたデータ記憶機材を含む、機械可読データ記憶媒体であって、その機械可読データには、別表IIに示されるIL-6、IL-6R、gp130六量体複合体の原子座標、または前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標、または1つもしくは複数の前記アミノ酸の部分集合、または全体での並進および/もしくは回転による、別表IIに示される座標の1つまたは複数の部分集合が含まれる；
(b) 機械可読データを処理するための指示を記憶するためのワーキングメモリ；
(c) 機械可読データを3次元表示に加工処理するための、ワーキングメモリと機械可読データ記憶媒体に連結された中央演算処理ユニット；および
(d) 3次元表示を受信するための、中央演算処理ユニットに連結された出力ハードウェア。
【００８３】
別の局面として、本発明によりIL-6、IL-6Rおよびgp130六量体複合体の局所領域に対して立体化学的な相補性を有し、その複合体により媒介される活性を調節する化合物であって、その複合体が以下を特徴とする化合物が提供される：
(i) 別表IIに示される原子座標に位置するIL-6、IL-6Rおよびgp130のアミノ酸、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6、IL-6Rおよびgp130のアミノ酸；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表IIに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合。
【００８４】
別の局面として、本発明によりIL-6、IL-6R、gp130六量体複合体と相互作用する化学物質の能力を評価するための方法であって、以下の段階を含む方法が提供される：
(a) 構造座標、ここでその構造座標と別表Iに記載の構造座標との間の2乗平均平方根偏差が約1.5Å以下である、を用いてIL-6、IL-6R、gp130六量体複合体の少なくとも1つの領域のコンピュータモデルを作成する段階；
(b) 化学物質と前記コンピュータモデルとの間の適合操作を行うためのコンピュータによる手段を使用する段階；および
(c) 化学物質とそのモデルとの間の相関性を定量化するため、前記適合操作の結果を解析する段階。
【００８５】
化合物は、さまざまな形で六量体形成に干渉することができる。例えば、化合物は、1つもしくは複数の特定残基またはその対応領域でまたはその近傍で、分子のうちの1つと結合するかまたは相互作用することができ、ならびに立体的な重なりおよび/または静電反発により、天然リガンドの結合または二量体形成を妨害することができる。または、化合物は、六量体形成をアロステリック干渉するように、分子のうちの1つに結合することができる。
【００８６】
しかし現在では、化合物は、結合界面に位置する分子のうちの少なくとも1つと結合するかまたは相互作用することが好ましい。
【００８７】
従って、本発明の好ましい態様として、その方法には、六量体を構成する分子の少なくとも1つの領域に適合する部分を有する化合物を選択するかまたは設計する段階が含まれ、その領域は以下からなる群より選択される：
2005517227.tif 000004
【００８８】
さらなる局面として、本発明は、IL-6受容体もしくはその一部またはこれらの変異体を含む結晶組成物にある。
【００８９】
当業者により容易に理解されるように、本発明の方法によりIL-6受容体と相互作用する化合物を設計するおよび選択するための合理的な方法が提供される。たいていの場合、活性を増加させるため、これらの化合物をさらに発展させる必要がある。そのようなさらなる発展は、当技術分野において日常業務であり、本出願において提供される構造情報により支援されるであろう。特定の態様として、本発明の方法には、そのようなさらなる発展段階が含まれることが意図される。
【００９０】
別の局面として、本発明は化合物とIL-6受容体との間の相互作用を評価する方法にあり、その方法には化合物にIL-6受容体もしくはその一部またはこれらの変異体を含む結晶組成物をさらす段階および結晶との化合物の結合レベルを測定する段階が含まれる。
【００９１】
従って、別の局面として、本発明はIL-6Rシグナル伝達を調節する化合物を設計するかまたは選択する方法にあり、その方法には本発明の先の局面のいずれか1つによる方法により得られる化合物を生物学的スクリーニングにかける段階および化合物のIL-6Rシグナル伝達調節能を評価する段階が含まれる。
【００９２】
別の局面として、本発明により、以下の段階を含む、構造が知られていない分子または分子複合体に関する構造情報を得るための分子置換を使用する方法が提供される：
(i) 前記分子または分子複合体を結晶化する段階；
(ii) 前記の結晶化された分子または分子複合体からX線回折図形を作成する段階；
(iii) その構造が知られていない分子または分子複合体の少なくとも一部の3次元電子密度図を作成するため、そのX線回折図形に別表I記載の少なくとも一部の構造座標を適用する段階。
【００９３】
IL-6受容体の構造は、治療薬としての使用を目的として、変異型IL-6受容体分子またはその断片を設計するために使用することができる。
【００９４】
従って、本発明によりまた、細胞外断片が以下からなる群より選択されるIL-6Rの1つまたは複数のアミノ酸で修飾された、IL-6Rの細胞外断片を含む化合物が提供される：
2005517227.tif 000005
【００９５】
本発明のこの局面の好ましい態様として、表2に記載されていないアミノ酸が修飾される。
【００９６】
さらに好ましい態様として、IL-6R断片には配列番号:1の残基1〜325が含まれる。
【００９７】
この局面の1つの態様として、修飾によりIL-6R断片の、その天然リガンドの1つまたは複数に対する親和性が、修飾されていない断片に比べて増加される。
【００９８】
当業者には認識されるように、これらの化合物は薬学的組成物中に製剤化されて、IL-6Rのシグナル伝達と関連する疾患を治療するのに使用されてもよい。
【００９９】
今回、本発明者らはIL-6受容体に関する3次元構造情報を得た。これにより、リガンドの結合がシグナル伝達をいかにして引き起こすかということのより正確な理解が可能となる。そのような情報により、特定の治療応用を目的としたリガンドであって、これまでは、利用可能な配列データから新たに予測できなかったものを開発するうえでの合理的な根拠が与えられる。
【０１００】
当業者であれば、X線結晶学により決定される構造座標セットには、標準誤差があることを理解するものと思われる。本発明において、タンパク質の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å未満である、IL-6RまたはIL-6R複合体に対する構造座標セットはいずれも、別表Iまたは別表IIに記載の構造座標上に(骨格原子を用いて)重ね合わされる場合、同一であると見なされるものとする。
【０１０１】
アゴニストおよびアンタゴニストのIL-6受容体との結合の基礎となる正確な機構は、完全には解明されていない。しかし、リガンドの受容体部位との結合(好ましくは、10-8Mまたはそれより高い親和性を伴う)は、天然に存在するIL-6受容体リガンドに対して立体化学的な相補性が高いために起こると考えられている。
【０１０２】
本発明による、そのような立体化学的な相補性は、別表Iに記載された座標として列挙されているような、受容体部位の溝に並んだ部位内の表面残基に適合する分子の特徴である。「適合する」とは、同定された部分が表面残基と、例えば、水素結合を介してまたはファン・デル・ワールスおよびクーロンの非共有的相互作用(これは、部位内での生物学的に活性な化合物の脱溶媒和を促進させる)により、溝内部での生物学的に活性な化合物の保持がエネルギー的に起こりやすいような形で相互作用することを指す。
【０１０３】
別表Iに記載の原子座標に位置するアミノ酸を特徴とする受容体部位の形状および静電的または化学的性質に相補性のある物質が、その受容体に結合することができると思われ、そしてその結合が十分に強い場合、天然に存在するリガンドのその部位への結合が実質的に阻害される。
【０１０４】
当然のことながら、リガンドとその受容体部位との間の相補性は、天然リガンドの結合を阻害するため、溝に並ぶ全ての残基に及ぶことが必要とされるというわけではない。
【０１０５】
一般的に、立体化学的な相補性を有する分子の設計は、分子と標的受容体との間の「適合性」を、化学的におよび/または幾何学的に最適化する技術により達成することができる。この種の公知技術は、SheridanおよびVenkataraghavan, 1987, Acc. Chem Res. 20: 322; Goodford, 1984, J. Med. Chem. 27: 557; Beddell, 1985, Chem. Soc. Reviews 279; Hol, 1986, Angew. Chem. 25: 767, VerlindeおよびHol, 1984, Structure 2: 577, Waltersら, 1998, Drug Discovery Today 3: 160; LangerおよびHoffmann, 2001, Current Pharmaceutical Design 7: 509; Good, 2001, Current Opinion in Drug Disc. Devel. 5, 301; GaneおよびDean, 2000, Curr. Opinion Struct. Biol. 10: 401に概説されており、これらの各内容は、参照として本明細書に組み入れられる。Blundellら, 1987, Nature 326: 347(受容体構造に関する情報に基づいた薬剤開発)およびLoughneyら, 1999, Med. Chem. Res. 9: 579(成長ホルモン受容体に関するデータベース・マイニングの適用)も参照されたい。
【０１０６】
本発明によれば、IL-6受容体の立体化学性を相補する分子の設計には、2つの好ましい手法がある。最初の手法は、特定分子の受容体部位との適合度を評価するための幾何学的基準を主に、しかし排他的にではなく用いて、3次元構造データベース由来の分子を、その部位に、インシリコで直接的にドッキング(合体)させるものである。この手法では、内部自由度の数(および分子の配座空間における対応するその極小状態)は、2つの剛体の幾何学(剛体球)的な相互作用のみを考慮することにより減少され、ここで一方の体(活性部位)には、もう一方の体(リガンドのような、相補分子)に対する結合部位を形成する「ポケット」または「溝」が含まれる。
【０１０７】
この手法は、Kuntzら, 1982, J. Mol. Biol. 161: 269、およびEwingら, 2001, J. Comput-Aid. Mol. Design 15: 411で説明されており(その内容は、参照として本明細書に組み入れられる)、リガンド設計に対するそのアルゴリズムは、カリフォルニア大学評議員(Regents of the University of California)により配布され、そしてさらにその配布者により提供される、書籍(その題名は、「Overview of the DOCK program suite」であり、その内容は、参照として本明細書に組み入れられる)で説明されている、商用ソフトウェア・パッケージDOCKバージョン4.0で実施される。Kuntzアルゴリズムによれば、IL-6受容体部位によりもたらされる穴の形状は、一連の重複する、半径の異なる球体と定義される。次に、前記のように定義された形状に近い分子を求めて、ケンブリッジ大学(University Chemical Laboratory, Lensfield Road, Cambridge CB2 1EW, U.K.)により維持されているケンブリッジ構造データベースシステム(Cambridge Structural Database System)、構造バイオインフォマティクス研究共同体(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics)(Rutgers University, N. J., U.S.A.)により維持されているタンパク質データバンク(Protein Data Bank)、LeadQuest(Tripos Associates, Inc., St. Louis, MO)、Available Chemicals Directory(Molecular Design Ltd., San Leandro, CA)、およびNCIデータベース(National Cancer Institute, U.S.A)のような、現存している結晶データのデータベースの1つまたは複数を検索する。
【０１０８】
幾何学的パラメータを基に、このようにして同定された分子を次に、化学的相補性、例えば水素結合、イオン性相互作用およびファン・デル・ワールスの相互作用と関連した基準を満足するように改変することができる。データベースから最良の分子をランク付けして選択するために、種々のスコアリング機能を使用することができる。例えば、BohmおよびStahl, 1999, M. Med. Chem. Res. 9: 445を参照されたい。Tripos Associates, Inc.(St. Louis, MO)から市販されているソフトウェア・パッケージFlexXは、この直接合体による手法で使用できる別のプログラムである(Rarey, M.ら, J. Mol. Biol. 1996, 261: 470を参照されたい)。
【０１０９】
もう一つの好ましい手法は、活性部位との各化学基(「プローブ」)の相互作用を、その部位内およびその周辺のサンプル位置で評価して、一連のエネルギー値(これから、選択されたエネルギー水準にある3次元の等高線表面が作成可能となる)を得ることを伴う。リガンド設計のための化学プローブによる手法は、例えば、Goodford, 1985, J. Med. Chem. 28:849(その内容は、参照として本明細書に組み入れられる)で説明されており、いくつかの商用ソフトウェア・パッケージ、例えばGRID(Molecular Discovery Ltd.の製品, West Way House, Elms Parade, Oxford OX2 9LL, U.K.)で実施される。この手法によれば、部位相補的な分子に対する化学的必須条件は、最初に、活性部位を異なる化学プローブ、例えば、水、メチル基、アミン基の窒素、カルボキシル基の酸素、および水酸基で精査することにより同定される。活性部位と各プローブとの間の相互作用に好ましい部位がこのようにして決定されたら、結果として得られたその部位の3次元パターンから、推定される相補分子を作成することができる。これは、所望の薬理活性団のパターンが組み込まれている分子を同定するために、3次元データベースを検索できるプログラムにより、または好ましい部位とプローブを入力してデノボ設計を実行するプログラムにより行われてもよい。
【０１１０】
所望の薬理活性団を持つ分子を同定するため、3次元データベースを検索するのに適したプログラムには：MACCS-3DおよびISIS/3D(Molecular Design Ltd., San Leandro, CA)、ChemDBS-3D(Chemical Design Ltd., Oxford, U.K.)、ならびにSybyl/3DB Unity(Tripos Associates, Inc., St. Louis, MO)が含まれる。
【０１１１】
薬理活性団の選択および設計に適したプログラムには：DISCO(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)、Catalyst(Accelrys, San Diego, CA)、およびChemDBS-3D(Chemical Design Ltd., Oxford, U.K.)が含まれる。
【０１１２】
化学構造のデータベースは、Cambridge Crystallographic Data Centre(Cambridge, U.K.)、Molecular Design Ltd.(San Leandro, CA)、Tripos Associates, Inc.(St. Louis, MO)、およびChemical Abstracts Service(Columbus, OH)を含むいくつかの供給元から市販されている。
【０１１３】
デノボ設計プログラムには、Ludi(Biosym Technologies Inc., San Diego, CA)、Leapfrog(Tripos Associates, Inc.)、Aladdin(Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA)、およびLigBuilder(Peking University, China)が含まれる。
【０１１４】
当業者であれば、模倣体の設計には、本発明の方法を用いて設計されたかまたは同定された化学構造の若干の構造改変または調整が必要とされるかもしれないことを認識するであろう。
【０１１５】
本発明はハードウェアまたはソフトウェアで実施されても、または両方を組み合わせて実施されてもよい。しかし、好ましくは、本発明はコンピュータプログラムを、演算処理装置、データ記憶システム(揮発性および不揮発性メモリならびに/または記憶素子を含む)、少なくとも1つの入力装置、および少なくとも1つの出力装置をそれぞれ含むプログラム可能なコンピュータ上で実行して実施される。上述の機能を実行して出力情報を作成するため、入力データにはプログラムコードが割り当てられる。出力情報は1つまたは複数の出力装置に、周知の方法で与えられる。コンピュータは、例えば、パーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータまたは従来型のワークステーションとしてもよい。
【０１１６】
各プログラムは、コンピュータシステムと通信するための高水準の手続き型言語またはオブジェクト指向プログラミング言語で実行されるのが好ましい。しかし、プログラムは、必要に応じて、アセンブリ言語または機械語で実行することができる。いかなる場合でも、その言語は、コンパイラ型言語またはインタープリタ型言語としてよい。
【０１１７】
そのような各コンピュータプログラムは、本明細書に記載の手順を実行するため、記憶媒体または記憶装置がコンピュータにより解読される際にコンピュータを設定するおよび操作するために、汎用のまたは専用のプログラム可能なコンピュータにより解読可能な、記憶媒体または記憶装置(例えば、ROMまたは磁気ディスク)に貯蔵されるのが好ましい。創意工夫に富んだシステムもまた、コンピュータプログラムが組み込まれた、コンピュータ可読の記憶媒体として実践されると見なされてもよく、その組み込まれた記憶媒体により、コンピュータが、本明細書に記載の機能を実行するための特殊なかつ所定の方法で作動することが可能となる。
【０１１８】
IL-6受容体の活性調節因子
本発明により、IL-6受容体αサブユニットの可溶性である細胞外部分の結晶構造の原子座標およびリガンドIL-6とIL-6受容体の両サブユニット(sIL-6αおよびgp130)からなる六量体複合体の結晶構造の原子座標が提供される。上述のように、これらの座標をIL-6R活性の潜在的な活性調節因子に対する、インシリコ・スクリーニングを行う本発明の方法のなかで使用することができる。
【０１１９】
従って、本発明によりIL-6Rの活性を調節する化合物であって、本発明の方法により同定された/同定可能な化合物が提供される。好ましくは、その化合物はIL-6Rに特異的であって、例えばその化合物は、IGR受容体のような他のサイトカイン受容体よりもIL-6Rに対して少なくとも10倍、好ましくは少なくとも50倍高い活性を示す。
【０１２０】
1つの態様として、その方法には、化合物と受容体の局所領域との間の立体化学的な相補性を評価する段階が含まれ、その受容体は以下を含む：
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合。
【０１２１】
好ましくは、IL-6受容体の局所領域が以下から選択される：
(i) 残基106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256または276〜281およびその組み合わせにより定義されるリガンド結合表面；
(ii) 残基1〜5、19〜23、65〜69、93〜99、118、119、132〜141、166〜172、179〜196、241〜250、261、262、272〜276または282〜290およびその組み合わせにより定義されるホモ二量体の結合界面；
(iii) 残基11、45、46、55、62〜66、69〜72、75、81、88、90〜93、122〜124および178；ならびに
(iv) 残基233〜239、244〜248および270〜290。
【０１２２】
本発明の方法により設計された化合物をホルモン機能のインビトロおよびインビボアッセイの多くにより評価してもよい。例えば、IL-6受容体アンタゴニストの同定を、固相受容体結合アッセイを用いて行ってもよい。潜在的なアンタゴニストを、可溶性の組換え型IL-6受容体とのユウロピウム標識したIL-6受容体リガンドの結合を阻害するその能力に対して、マイクロプレート形式でスクリーニングしてもよい。ユウロピウムはランタノイド系蛍光物質であり、その存在を、時間分解蛍光測定法を用いて測定することができる。このアッセイ法の感度は、放射性同位元素により達成される感度に匹敵し、測定は、迅速でありかつ試料の高速大量処理を可能とするマイクロプレート形式で行われ、そしてその方法は、受容体アゴニスト/アンタゴニストに対するスクリーニング法を開発するうえで最適な方法として広く受け入れられている。(Apellら, J. Biomolec. Screening 3: 19〜27, 1998; Ingleseら, Biochemistry 37: 2372〜2377, 1998を参照されたい)。
【０１２３】
バイオセンサー技術を用い、候補阻害剤に対して、結合親和性および阻害剤性能を測定してもよい。
【０１２４】
IL-6Rの活性を測定する生物学的アッセイ法は、当技術分野においてよく知られている。特に、種々のアッセイ系がHammacherら, 1998, J. Biol. Chem. 273, 22701〜22707;およびHammacherら, 1994, Protein Science, 3, 2280〜2293の中で説明されており、その開示は参照として組み入れられる。
【０１２５】
本発明の方法を使用して、IL-6活性のアゴニストまたはアンタゴニストの可能性がある多くの化合物を同定した。続いて、これらの化合物をインビトロで試験して、生物学的活性および特異性を決定した。特異的なIL-6Rアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示す化合物を、本発明の結晶構造を用いてモデル化し、化合物が接触するIL-6Rαの結合部位およびそのアミノ酸残基を決定した。これらの結果により、前述のループL1〜L7により定義されるIL-6リガンド結合表面の全部または一部を占有する、アンタゴニスト類とアゴニスト類の双方に対する全般的な構造基準の作成が可能となった。
【０１２６】
アンタゴニスト
好ましい態様として、IL-6受容体のアンタゴニストは、式A-B-Cの化合物であって、式中
Aは、選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、3つの融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環；または選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、2つの非融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環からなり；
Cは、選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、3つの融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環；または選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、2つの非融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環からなり；および
Bは、実質的にエチレン部分と同等の長さを有する脂肪族リンカー、例えば、ペプチド結合(即ち、約3.5Åの長さを有する)に近い長さと幾何学構造のリンカーであり；
前記化合物は、以下：
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合、
のリガンドが結合する局所領域に対して立体的相補性を有し；
前記のリガンドが結合する局所領域は、IL-6受容体の残基106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256および276〜281またはその組み合わせにより定義される。
【０１２７】
環の置換基は、IL-6リガンド結合表面との立体的相補性を壊さないようにして、選択されるべきである。従って、置換基は通常、C1〜C4アルキル、ハロゲン、OR24またはNR25R26から選択され、このR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである。さらに、Aの環は、リンカーBに対して、Aが実質的に「直線的な」配置となるように連結されるのが好ましい。同様に、Aの環は、リンカーBに対して、Cが実質的に「直線的な」配置となるように連結されるのが好ましい。
【０１２８】
好ましくは、Aは下記式を有する：
2005517227.tif 000006
式中
Zは結合であり；またはZ、R4およびR10が一緒になって、選択的に置換された、5員、6員もしくは7員を有する、好ましくは5員もしくは6員を有する、飽和、不飽和またはアリール環(選択的にO、NおよびSから選ばれる1つまたは複数のヘテロ原子を含む)を形成し；またはZ、R3およびR6が一緒になって、5員、6員もしくは7員を有する、好ましくは5員もしくは6員を有する、アリール環またはヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはヘテロシクリル環を形成し、前記アリール環または前記ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル環は選択的に置換され；
R7、R8またはR9は、リンカーBに結合され；
R1、R2およびR5はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、OR24またはNR25R26であって、このR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R3およびR6は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、このR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R4およびR10は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、このR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R7、R8およびR9は、リンカーBに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、このR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである。
【０１２９】
好ましくは、リンカーBは下記式を有する：
2005517227.tif 000007
式中
YおよびY1がともにO、NまたはSではないという条件で、YおよびY1は、それぞれ独立してC、O、SまたはNであり；
R11およびR12は、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR24またはNR25R26であって、このR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
好ましくは、少なくともYおよびR11がともに、またはY1およびR12がともに、COである。好ましくは、YまたはY1はNR25R26であって、このR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり、好ましくは水素である。
【０１３０】
好ましくは、Cは下記式を有する：
2005517227.tif 000008
式中
Xは結合であり；またはX、R14およびR18が一緒になって、選択的に置換された、5員、6員もしくは7員を有する、好ましくは5員もしくは6員を有する、飽和、不飽和またはアリール環(選択的にO、NおよびSから選ばれる1つまたは複数のヘテロ原子を含む)を形成し；またはX、R15およびR22が一緒になって、5員、6員もしくは7員を有する、好ましくは5員もしくは6員を有する、アリール環またはヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはヘテロシクリル環を形成し、前記アリール環または前記ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル環は選択的に置換され；
R13、R16またはR17は、リンカーBに結合され；
R19、R20およびR21はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R14およびR18は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R15およびR22は、Zとともに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；
R13、R16およびR17は、リンカーBに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである。
【０１３１】
非常に好ましい態様として、前記アンタゴニストは下記式Iを有する：
2005517227.tif 000009
式中
X、Y、Y1、ZおよびR1〜R29は、上記に定義した通りである。
【０１３２】
より好ましくは、アンタゴニストは式IIの化合物である：
2005517227.tif 000010
式中
X、Y、Y1、ZおよびR1〜R29は、上記に定義した通りであり；および
R23、R24、R25およびR26は、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり、好ましくはOである。
【０１３３】
アゴニスト
好ましい態様として、IL-6受容体のアゴニストは、式A-B-Dの化合物であって、
式中
Aは、アンタゴニストに対して上記に定義した通りであり；
Dは、選択的に1つまたは複数のヘテロ原子を含むおよび選択的に置換された、1つの、または2つの融合5員、6員もしくは7員の、飽和、不飽和またはアリール環からなり；および
Bは、アンタゴニストに対して上記に定義したような脂肪族リンカーであり；
前記化合物は、以下：
(i) 別表Iに示される原子座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299、もしくは前記アミノ酸の骨格原子からの2乗平均平方根偏差が1.5Å以下である構造座標に位置するIL-6受容体のアミノ酸1〜299；または
(ii) 全体での並進および/もしくは回転によって、別表Iに示される座標に関連する1つまたは複数の前記アミノ酸の部分集合、
のリガンドが結合する局所領域に対して立体的相補性を有し；
前記のリガンドが結合する局所領域は、IL-6受容体の残基106〜110、133〜138、160〜168、190〜193、227〜233、250〜256および276〜281またはその組み合わせにより定義される。
【０１３４】
環の置換基は、IL-6リガンド結合表面との立体的相補性を壊さないようにして、選択されるべきである。従って、置換基は通常、C1〜C4アルキル、ハロゲン、OR24またはNR25R26から選択され、このR24、R25およびR26はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである。D基の長さは、アンタゴニスト化合物のC基の長さよりも短い。従って、置換基は、D基の長さが2つのアリール環に相当する長さを超えないようにして、選択されるべきである。さらに、このDは2つの融合環からなり、その環は、リンカーBに対して、Dが実質的に「直線的な」配置となるように連結されるのが好ましい。
【０１３５】
好ましくは、Dは下記式を有する：
2005517227.tif 000011
式中
Y2、Y3およびY4のうちの少なくとも2つがCであるという条件で、Y2、Y3またはY4は、それぞれ独立してC、O、NまたはSであり；
R13、R17またはR18は、リンカーBに結合され；
R14、R15およびR16はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；または
R16は水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり、そしてR14およびR15はともに、選択的に置換された、5員、6員もしくは7員を有する、飽和、不飽和またはアリール環(選択的にO、NおよびSから選ばれる1つまたは複数のヘテロ原子を含む)を形成し；または
R14は水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり、R15およびR16はともに、選択的に置換された、5員、6員もしくは7員を有する、飽和、不飽和またはアリール環(選択的にO、NおよびSから選ばれる1つまたは複数のヘテロ原子を含む)を形成し；
R13、R17およびR18は、リンカーBに結合されていなければ、それぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルである。
【０１３６】
好ましい態様として、前記アゴニストは下記式IIIを有する：
2005517227.tif 000012
式中
Y、Y1、Y2、ZおよびR1〜R29は、上記に定義した通りである。好ましくは、Y2はNである。
【０１３７】
別の好ましい態様として、前記アゴニストは下記式IVを有する：
2005517227.tif 000013
式中
X、Y、Y1、R1〜R13およびR17は、上記に定義した通りであり；
R14、R15およびR16はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキルであり；好ましくは、R14、R15およびR16はそれぞれ独立して水素、C1〜C2アルキル、NH2、OHまたはハロゲンであり；
R23は水素、C1〜C4アルキル、ハロゲン、O、OR27またはNR28R29であって、このR27、R28およびR29はそれぞれ独立して水素またはC1〜C4アルキル、好ましくはOである。
【０１３８】
上記のハロゲンへの言及には、I、Br、ClおよびFが含まれる。好ましくは、ハロゲンはBrまたはClである。
【０１３９】
上記のC1〜C4アルキルについて言及すると、C1〜C3アルキルが好ましく、C1〜C2アルキルが特に好ましい。環にN、OおよびSから選択されるヘテロ原子が含まれる場合、任意の特定の環にヘテロ原子を3つよりも少なく、好ましくは、ヘテロ原子を2つよりも少なく有することが好ましい。5員、6員または7員環について言及すると、5員または6員環が好ましい。
【０１４０】
IL-6Rの活性調節因子の使用
上述の化合物は、細胞のIL-6R活性を調節する、即ちIL-6R活性を活性化するかまたは阻害するために使用してもよい。異常なIL-6R/IL-6活性が各種の疾患に関与していることを考えれば、上述の化合物はまた、異常なIL-6シグナル伝達を特徴とする疾患を治療するか、改善するかまたは予防するために使用されうる。そのような疾患の例には、多発性骨髄腫、関節リウマチ、キャッスルマン病、AIDS、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、敗血症、骨粗鬆症および乾癬が含まれる。
【０１４１】
投与
本発明の化合物、即ち、本発明のスクリーニング法により同定されたまたは同定可能なIL-6Rの活性調節因子は、本発明の組成物を作製するため、種々の成分と好ましく組み合わせることができる。組成物は、薬学的組成物(これは、ヒトまたは動物への使用を目的としうる)を作製するため、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わされるのが好ましい。
【０１４２】
製剤は、化合物の性質および投与経路に依存すると思われるが、典型的には、それらは局所、非経口、筋肉内、経口、静脈内、腹腔内、鼻内吸入、肺吸入、皮内または関節内投与を目的として製剤化することができる。化合物は、注射可能な剤形で使用されてもよい。従って、それは全身投与されてもよいが、注射可能な剤形のための、好ましくは治療される部位に直接注射するための、薬学的に許容される任意のビヒクルと混合されてもよい。
【０１４３】
薬学的に許容される担体または希釈剤は、例えば滅菌等張食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水のような他の等張溶液としてもよい。本発明の化合物は、任意の適当な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、溶解補助剤と混合されてもよい。化合物を経口的に活性な剤形として製剤化することも好ましい。
【０１４４】
一般的には、本発明の化合物とその塩を含む本発明の化合物の、治療的に効果のある1日の経口または静脈投与量は、治療される被検者の体重1kgあたり0.01〜50mg、好ましくは体重1kgあたり0.1〜20mgに及ぶ可能性が高い。本発明の化合物とその塩はまた、静脈内注射により、ある投与量(その投与量は、1時間につき体重1kgあたり0.001〜10mgに及ぶ可能性が高い)で投与されてもよい。
【０１４５】
化合物の錠剤またはカプセル剤は、必要に応じて、1回につき1つずつまたは2つもしくはそれ以上が投与されてもよい。化合物を徐放製剤として投与することも可能である。
【０１４６】
通常、医師により患者個人に最適とされる実際の投与量が決定され、それは特定の患者の年齢、体重および応答性によって変化するものと思われる。上記の投与量は、平均的な症例からの具体例である。勿論、より多いまたはより少ない投与量が正当であるような個別例も有り得て、そしてそれは本発明の範囲内である。
【０１４７】
ある種の用途に対しては、組成物は澱粉もしくは乳糖のような賦形剤を含有する錠剤の形で、またはカプセル剤もしくは腔坐剤（ovule）(単独でまたは賦形剤を混合して)で、または香料添加剤もしくは着色剤を含有するエリキシル剤、液剤または懸濁剤の形で、経口投与されるのが好ましい。
【０１４８】
組成物(化合物単独の場合も)はまた、非経口的に、例えば陰茎海綿体内に、静脈内に、筋肉内にまたは皮下に注射することができる。この場合、組成物には適当な担体または希釈剤が含まれる。
【０１４９】
非経口投与に対しては、組成物は滅菌水溶液(これには他の物質、例えばその溶液を血液と等張にするのに十分な塩類または単糖類が含まれてもよい)の形で最良に使用される。
【０１５０】
口腔内または舌下投与に対しては、組成物は従来の方法で製剤化できる、錠剤またはトローチ剤の形で投与されてもよい。
【０１５１】
被検者(例えば、患者)への経口、非経口、口腔内および舌下投与に対しては、本発明の化合物ならびにその薬学的に許容される塩および溶媒和化合物の1日の投与量は通常、10〜500mg(単回または分割投与で)とすることができる。このように、それから一例として、錠剤またはカプセル剤には、投与のための活性化合物を単独で、または必要に応じて、1回につき2つもしくはそれ以上で5〜100mg含むことができる。上述のように、医師により患者個人に最適とされる実際の投与量が決定され、それは特定の患者の年齢、体重および応答性によって変化するものと思われる。
【０１５２】
当業者であれば、特定の患者に対し、例えば患者の年齢、体重および症状に応じて最適な投与経路および投与量を容易に決定することができるので、上述の投与経路および投与量は、単なる参考に過ぎないことが意図される。
【０１５３】
本発明を以降、単なる例示に過ぎず限定ではない、以下の実施例を参照してさらに説明する。実施例では、図を参照する。
【０１５４】
実施例
実施例1 - sIL-6の結晶化および構造解析
方法
sIL-6Rの発現、精製および結晶化
sIL-6R単量体は、sIL-6Rをコードする、コンストラクトpEE14sIL6RL325でトランスフェクションした、糖鎖形成欠損変異株であるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株Lec3.2.8.1(Stanley, 1989, Mol. Cell Biol. 9: 377〜383)の条件培地から精製した。簡単に説明すると、sIL-6Rで形質転換したLec3.2.8.1細胞は、作業容量が1.25Lの培養装置(New Brunswick Celligen Plus fermenter, New Brunswick, USA)中で増殖させた。条件培地を限外ろ過法により20倍濃縮した。sIL-6Rは、Lec3.2.8.1細胞の濃縮培地から、ヒトIL-6-セファロースの5mLカラムに結合させることにより精製した。sIL-6Rをサイズ排除分取クロマトグラフィーによりさらに精製し、これを10000 MWCO遠心濃縮器(Centricon, Millipore, USA)を用いて10 mg/mLに濃縮した。
【０１５５】
タンパク質(5 mM Tris-HCl pH8.0中で8 mg/ml)は、50 mM硫酸アンモニウム、18% PEG 3350、2.5 mMクエン酸ナトリウムを含有する容器に対するハンギングドロップ蒸気拡散法によりpH 5.6で結晶化させた。結晶は、溶媒51%を伴う、空間群P43212(a = 51.4 Å, c = 305.4 Å)に成長した。重金属誘導体の同型を確実にするため、16時間、0.1%グルタルアルデヒドをウェル溶液に添加した。その後、結晶を2.5 mM Tris-HCl(pH 6.5)が入った0.1 M硫酸リチウムの安定化溶液に移し、最後に20% PEG 3350、16%グリセロール、0.1 M硫酸リチウム、2.5 mMクエン酸ナトリウムおよび2.5 mM Tris-HCl(pH 6.5)の凍結用溶液に移した。
【０１５６】
回折データ
X線データは、窒素流中で100Kに急速凍結した結晶から収集した。天然型および2つの白金誘導体(PIP: ジ-u-ヨード-ビス(エチレン-ジアミン)-ジ-白金(II)硝酸塩; PTN: K2Pt(NO2)4)のそれぞれに対し、3つのデータセットを収集した。天然型および2つの誘導体のそれぞれに対し、3つのデータセットを収集した。ミラーおよびモノキャピラリー光学素子の両方が取り付けられたR-AXIS IIおよびIVイメージプレート検出器(Balaicら, 1996, J. Synchrotron Rad. 3: 289〜295)をそれぞれ用いて、c*軸が回転軸に平行で1つが回転軸に垂直なデータセット、および低分解能のデータセットを収集した。2.4Åの天然型のデータセットは、Advance Photon Source(Argonne, U.S.A.)において、ADSC Quantum-4 CCD-detectorを用い、beam line BM14Cで収集された。全データセットは、0.5°または1.0°の振動で収集し、HKLを用いて、これを処理およびスケーリングした(OtwinowskiおよびMinor, 1997, Macromolec. Crystallog. Pt A. 276: 307〜326)(表1)。
【０１５７】
（表１）データ収集およびMIR位相決定による統計値
2005517227.tif 000014
＊括弧内の数値は高分解能の範囲での値であり、ここでRmerge = Σ(Ii-<I>)/ΣIiの全独立反射にわたる総和
†各位置をペアに分割した。
‡3つの数値は以下の総和を表す:
中心の(中心外の)[中心外の異常な]反射。
?2乗平均平方根 (rms) fh/residual=√(Σ(Fderi-FPH)2)、ここでfhおよびFPHはそれぞれ、計算した重原子のおよび誘導体の構造因子である。
¶Rcullis=Σ||fh|-(|Fderi|-|Fnati|)/|Σ||Fderi|-|Fnati||、ここでFderiおよびFnatiはそれぞれ、観測された誘導体のおよび天然型の構造因子である。
【０１５８】
構造解(Structure solution)
PIPおよびPTN誘導体の重原子位置は、パターソン法(CCP4, 1994, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50: 760〜763)およびSOLVE(TerwilligerおよびBerendzen, 1999, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55: 849〜861)により決定した。重原子位置の空間群と方向は、両誘導体からの重原子異常データを用いて決定した。位置のポジションを、SHARP(de la FortelleおよびBricogne, 1997, Macromolec. Crystallog. Pt A. 276: 472〜494)を用いて4Åまで精密化した。位相決定による統計値は、表1に示されている。タンパク質のC□鎖を描くため、溶媒領域(溶媒51%)を平滑化したMIRAS-位相による分解能4Åの電子密度図(the 4 A solvent-flattened (51% solvent) MIRAS-phased electron density map)を骨格抽出して使用した。この図により、CBDモジュールおよびIgドメインが明瞭に示された。FnIIIドメインおよびIgドメインの一部の部分的な原子モデルを、「O」のレゴ片(Lego fragments)を用いて組み立てた(Jonesら、1991, Acta Crystallogr. A. 47: 110〜119)。アスパラギンN36、N74、N202およびN226のN-結合型糖鎖に加えて、80個の溶媒分子も含めた。ジスルフィド結合は、初期の質量分析データと一致していた。その後、このモデルを、CNS(Brungerら, 1998, Acta Crystallogr. D. Biol Crystallogr. 54: 905〜921)を用い、モデル再構築ならびにストランドを連結する比較的長いループ上の残基の段階的な同定および精密化を含む反復過程によって、分解能を2.4Åまで拡張して精密化した。Igドメインの、電子密度の質および熱パラメーターがCBDに比べて乏しかったことから、不規則性が高いことが示唆される。残基1〜5および82〜84は、その密度が乏しく、299を越える残基(C末端)を観測できなかったので、占有率0にセットした。ループの49〜52および136〜138の側鎖は、移動性または不規則性が高いと思われた。精密化の過程で、溶媒(2つの硫酸イオンを含む)をさらに加えた。以前に報告されている、システイン・ジスルフィド結合した、フリーのC192が観測され、これをモデルに組み込んだ。最終的なR-因子は、全異方性温度因子B11 = B22 = -6.4A2およびB33 = 12.7A2を個々の原子等方性B-値に加えて、0.22(データの5%に対してはR-free値0.29)となり、結合の長さおよび角度のr.m.s.d.はそれぞれ、0.015Åおよび1.96度となった。
【０１５９】
IL-6R構造の座標は、別表Iとして本明細書で提供される。
【０１６０】
複合体のモデル化
六量体インターロイキン-6シグナル伝達複合体のモデル(図6aを参照されたい)を、タンパク質間のドッキング・アルゴリズムであるFTDOCK 2.0の平行バージョンを用いて組み立てた(Gabbら, 1997, J. Mol. Biol. 272: 106〜120)。タンパク質鎖については、IL-6のNMR構造(PDBコード1IL6)(Xuら, 1997, J. Mol. Biol. 268: 468〜481)、ウイルスIL-6とgp130複合体から得たgp130のX線構造(PDBコード1I1R)(Chowら, 2001, Science 291: 2150〜2155)およびIL-6R二量体を利用した。0.5Åの格子間隔を用いておよび静電的処理と組み合わせて、以下のタンパク質間のドッキングの計算を行った。IL-6をIL-6Rと、IL-6をIL-6R二量体と、IL-6をgp130とおよびIL-6Rに対してgp130をドッキングさせた。複合体を再スコアし(Moontら, 1999, Proteins 35: 364〜373)、利用可能な変異データ(表2, Salvatiら, 1995, J. Biol. Chem. 270: 12242〜12249)を満足する上位ランクの複合体を、MULTIDOCKプログラム(Jacksonら, 1998, J. Mol. Biol. 276: 265〜285)を用いて、剛体精密化および側鎖回転異性体の最適化にかけた。IL-6とIL-6RおよびIL-6とIL-6R二量体に対して行ったドッキング解(docking solutions)に有意な相違がなかったので、IL-6のIL-6R二量体との解(solutions)を、複合体を組み立てるため、二量体の各α鎖をその同族のIL-6に結合させて使用した。最終的な複合体は、INSIGHT II(Accelrys Inc, San Diego, California, USA)を用いて、最適解由来の鎖をともに重ね合わせることにより構築した。このようにして得られた複合体を次に、CNS(Brungerら, 1998)を用い、α炭素骨格に調和による拘束（harmonic restraint）を適用して極小化した。
【０１６１】
IL-6R/IL-6/gp130六量体の座標は、別表IIとして本明細書で提供される。
【０１６２】
結果および考察
IL-6Rの細胞外構造
ヒトIL-6Rの完全な細胞外領域を、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株であり、糖鎖欠損糖タンパク質を産生するLec3.2.8.1(Stanley, 1989)より発現かつ分泌させた。正常型CHO細胞株は不均質に糖鎖化されたタンパク質(これは結晶化しなかった)を産生するので、これが必要とされた。Lec3.2.8.1細胞により、IL-6Rの細胞外ドメイン型(残基1〜325)を分泌させ、これを2.4Åで回折するために精製かつ結晶化した。IL-6Rの3次元構造は、2つの重原子誘導体からの異常散乱による多重同型置換法(MIRAS法)により決定された。
【０１６３】
本発明者らによるIL-6Rの細胞外ドメインのX線構造(図1)は、古典的なCBD(D2、残基94〜194;D3、残基195〜299)に連結したN末端Igドメイン(D1、残基1〜93)からなる。X線構造のなかで、N末端の最初の5残基は不明瞭であり、そして残基299を越えたアミノ酸は目に見えない。3つのドメインが同じ平面上にあるため、受容体は長い「平面」構造をとっており、その構造中で、D2とD3は相互に約90度で連結され、そしてD1はD2に約135度で連結されている。糖鎖は、分子面のうちの1つにある4つの部位に付着している(図1)ことから、おそらくこの面がIL-6の結合またはgp130とのシグナル伝達複合体の形成に関与している可能性は低いことが示唆される。この結論は、糖鎖を欠いた機能的なsIL-6Rを大腸菌(Escherichia coli)で発現することにより支持される。
【０１６４】
N末端のシステイン残基C6は、D2の残基C174にジスルフィド結合しており、D1のβ-シートの配置を独特なものとしている(図1a)。D1は、繊維芽細胞増殖因子のリガンド結合ドメイン(LBD-FGF)に非常に類似したSタイプIgトポロジーを有するが、LBD-FGFのIgドメインの3本鎖β-シートの1番目の「A」ストランドは、IL-6Rには認められない。これらの残基は、LBD-FGFのこのストランド(「A」ストランドの原子を除いた2つのドメイン構造内のα炭素間0.7Å r.m.s.d.)と比較して、シートから「剥がれて」しまっているように思われる。このドメインのC末端が、SタイプIgトポロジーの4本鎖β-シートの5番目の「A」ストランドを形成する。このβ-シートの「A」ストランドの配置は、結晶の充填による結果であると思われ、そして本発明者らにより、このドメインには立体構造のスイッチとして機能し、D1が20度まで回転するのをβ-ストランドの移動により可能とする、ある程度の自由度が存在していることが提案される。D2またはD3と比較してドメインD1残基の温度因子がより高いことにより示される(ドメインD1、D2およびD3に対する平均B値はそれぞれ、68Å2、49Å2および44Å2である)ように、他のドメインと比較して、このドメインの不規則性をより高くしていると思われるものを、この自由度により説明することができると思われる。結晶中のIL-6R分子は、頭部から尾部にかけて2重螺旋配置で、その螺旋軸が長い格子端(cell edge)(c-軸)方向の結晶学的四回螺旋軸に沿うようにして充填され、そしてドメインD1およびD2間の角度が変われば、その螺旋のピッチおよび直径は変化する。ドメインのこのような自由度により、本研究で観察されたIL-6Rの別個の結晶間に同型がないことが説明できると思われる。
【０１６５】
IL-6RのCBDの特性は、他のクラス1 CBD構造でも見られる、長いトリプトファン-アルギニン・ラダー(D3のN末端から、R239、F246、R237、W287、R274、W284、Q276)である。このラダーには、CBDのドメインD3のカルボキシ末端領域に位置する、保存されたWSXWSモチーフ(IL-6Rの残基284〜287)が組み込まれている(図2)。WSXWS配列のポリペプチド骨格は、珍しいモチーフ、即ち、ポリプロリン・ヘリックスに類似した、左巻きの310ヘリックスを有する。このヘリックスは、主鎖による水素結合ではなく、アルギニン側鎖(R237およびR274)とのWSXWS配列の2つのトリプトファン残基のインドール側鎖のスタッキング(積み重なり)、およびセリン側鎖の水酸基の水素結合により安定化されている。ラダーにより、D2-D3のL字部の内側面近傍をD3に沿って続く(グアニジニウムおよびトリプトファンのインドール窒素由来の)正電荷の長い表面縞、およびその縞と平行して続く310ヘリックスにより形成される溝が生じる(図2)。この構造は他の周知のCBD構造でも保存されているが、その機能的な役割は今のところ解明されていない。それはCBDの折り畳み、複合体形成に関与しているかまたは一般的な受容体輸送システムに関与している可能性が考えられる。
【０１６６】
成長ホルモン(de Vosら, 1992)および利用可能な変異データの実例に従うと、IL-6は、D2由来の4ループ(S106〜N110(L1)、K133〜P138(L2)、A160〜F168(L3)、Q190〜G193(L4))とD3由来の3ループ(S227〜R233(L5)、M250〜H256(L6)およびQ276〜Q281(L7))(図3)を特徴とする、D2とD3の連結部に形成されるL字部の外側の領域(図3)で結合すると予測される。これらのループにより、サイトカイン結合ドメインの硬いD2およびD3骨格によって適所に保持される、長くて狭い(43Å×9.5Å)潜在的な結合領域が供与される。IL-6は、これらのループ内の一部の残基に結び付くと思われる。
【０１６７】
結晶中の二量体
結晶格子中で、IL-6Rの2分子は、結晶学的2回軸で関係付けられ、そして各分子の全長に沿って密接に会合している(図4)。これらの2分子(埋没した接近可能な表面の総面積約2460Å2を有する)は、潜在的なIL-6Rの生理学的二量体に相当する。その会合は主に、ドメインD2のF134およびF168を含む2回軸周辺の疎水的密着、E97-R274の塩結合、ならびにT186の主鎖アミドとのE283の側鎖カルボン酸の水素結合である。各分子の埋没した接近可能な表面積(図4)(表面的および静電的相補性はそれぞれ、0.722および0.728)は、溶液中でのタンパク質-タンパク質相互作用表面のそれ(通常、約800Å2)よりもずっと広い。さらに、膜会合受容体複合体の埋没表面は、それらの自由度が膜の2次元表面に限定されるので、必ずしも溶液中でのその対応物と同じくらい広いわけではない。故に、本明細書で観測される結晶中での二量体の会合はおそらく、細胞表面上に形成される複合体に相当するものと思われる。
【０１６８】
二量体となった単量体の配位は、その相互作用が分子の糖鎖のない「平坦な」面に沿うようなものである(図5)。この結晶構造で、二量体の2回軸が膜表面に垂直であるとするならば、ドメインD3は45度で膜から離れるように突出し、そしてD2は30度で膜の下方に向いている。それから、D1は膜に平行して続いていると思われる(図4)。二量体は、三角形横断面(底辺 約40Å；高さ 約22Å)の50Åの長さのトンネルを伴う、IL-3の共通β受容体に似た橋構造(図6)のように見える。
【０１６９】
変異の構造的関与
変異データのIL-6Rの結晶構造へのマッピングは、IL-6の結合に極めて重要である、およびgp130を介するシグナル伝達に関与している、IL-6R表面の領域を理解する上での手掛かりとなる。これらのデータの解析から、大部分の変異、特にトリプトファン/アルギニン・ラダー、ジスルフィド結合を形成するシステイン、および疎水性中心部を形成する埋没した疎水性残基の変異は、結晶構造上にマップしてみると、分子構造の完全性が危うくなるため、結合性の変化を引き起こすことが示唆される。非構造的な変異は、IL-6R表面上の3つのクラスターで起こる(表2、図5)。
【０１７０】
IL-6に対する結合部位を形成する一群の残基(図5、クラスター1を参照されたい)が明らかに存在する。IL-6結合に最も大きな影響を及ぼす残基の変異は、L3由来のP162およびE163、L5由来のS228、F229、Y230およびR231ならびにL7由来のE278およびF279における変異である(表1)。これらのループのうちの2つ、L5およびL7は、両方ともD3上に位置しており、このことは、D3単独でIL-6に結合できるという報告(18)と一致する。これはD2およびD3ドメインの連結部に位置しており、主にIL-6結合を担っていると推察される。
【０１７１】
gp130シグナル伝達に影響を及ぼすIL-6Rの非構造的な変異は、2つの主なクラスター上に分類することができる(図5)。最初のものは、二量体の2分子を関連付ける、結晶学的2回軸周辺に位置する二量体結合界面(図5、クラスター2)の疎水性の部分(残基F134、F168およびY169)で起こる。ここでの変異は、シグナル伝達を低下させるが結合には影響を及ぼさない。シグナル伝達を低下させるが結合を低下させることはない、この結合界面中のドメインD3上の、クラスター2には含まれない、他の残基も存在する(図5を参照されたい)。これらのデータから、IL-6R二量体の形成に干渉すると予測される変異は、IL-6結合にではなくIL-6シグナル伝達に顕著な影響を及ぼすことが示唆される。14 gp130シグナル伝達に影響を及ぼす他の変異クラスターは、ドメインD3上の残基H261周辺に集中するいくつかの残基(図5、クラスター3)で起こる。IL-6Rのこの領域の変異研究は、成長ホルモン複合体の2番目のCBDドメイン間の密着領域を明らかとした成長ホルモンの実例(de Vosら, 1992, Science 255: 306〜312)を基礎とした。この部分は明らかに、IL-6結合またはIL-6Rの二量体化に関与していないが、変異すると、この領域はシグナル伝達に影響を及ぼす。ここは、gp130とのIL-6/IL-6R複合体の形成に関与している可能性の最も高い領域である。
【０１７２】
IL-6Rの2つのSSFY繰り返し配列がIL-6に対する結合部位に関与していることが以前から予測されている。最初の繰り返しS165〜Y169は、D2内のL3に位置している。S167およびY169の変異はシグナル伝達を低下させるが、これは、これらの埋没残基の構造的な重要性によるものである可能性が高い。F168は溶媒露出性であり、そしてIL-6結合ではなく、IL-6Rの二量体形成に関与するクラスター2の中心部を形成する。第2の芳香族残基F134は、クラスター2の他の主要残基である。第二のSSFYの繰り返し(S227〜Y230)は、IL-6RのD3上のL5に位置している(図3)。これらの残基(S227を除く)は、IL-6結合に極めて重要であり、そしてその全てが表面露出残基である。
【０１７３】
N211、H261およびD262はともに、IL-6のIL-6Rとの結合ではなくシグナル伝達に影響を及ぼす残基群を形成するということが以前から報告されている。驚いたことに、これらの残基はW214およびV259(これらは(それぞれNおよびQに)変異すると、IL-6のシグナル伝達を野生型以上に増加させる)と集団をなす。システイニル-システインC192の役割は、不明のままである。この残基は、IL-6結合部位の周辺にある。C192をアラニンに変異すると、IL-6のIL-6Rとの結合およびシグナル伝達は、若干増加する。ヒトIL-6R配列は、現在までのデータベースのなかで、この位置にシステインを有する、唯一の脊椎動物の配列である(ブタおよびウシはチロシンを有しており、それからマウスおよびラットはロイシンを有している)。
【０１７４】
（表２）選択された変異データの構造解析
2005517227.tif 000015
N.T = 試験していない;
R = 参考文献 - K=Kalaiら, 1997, Blood 89: 1319〜1333; Y=Yawataら, 1993, EMBO J. 12: 1705〜1712; およびS=Salvatiら, 1995, J. Biol. Chem. 270: 12242〜12249。
【０１７５】
シグナル伝達六量体複合体
IL-6R二量体が組み込まれている六量体複合体(図6a)を、クラスター3の変異(これだと、このモデルでは同族の結合相手を持たない)を除き、文献にある利用可能な変異および機能データと適合するようにして構築することができる。さらに、gp130由来の3つのC末端III型フィブロネクチンドメイン(D4、D5およびD6)の配置は、考慮しなかった。これらのドメインにはいくつかの配位が可能であるが、構造情報がないため、これらを十分な確実性を伴うようにしてドッキングさせるのは困難である。これらの3つのドメインの相同モデルを利用し、図6bで図式的に示されているように、それらが複合体の下部でIL-6R内のD3のクラスター3と密着して、gp130のD5との間で得られるジスルフィド架橋を形成するようにして配位させることができる。
【０１７６】
最近の、ウイルスIL-6とのgp130のIgおよびCBDドメインの複合体構造から、ヒトIL-6とgp130の結合ドメインとの間には二量体としての関係が可能であることが示される。ウイルスIL-6/gp130複合体の二量体としての関係は、IL-6R二量体のように、結晶学的2回軸の関係である。全てのIL-6結合受容体ドメイン間に同じく二量体としての関係を織り込むと、シグナル伝達複合体に対するモデルを構築することが可能である(図6a)。このモデルでは、2つのIL-6分子が部位Iを介してIL-6R二量体に結合し(図6)、続けて2つのgp130分子のそれぞれが、ウイルスIL-6/gp130断片複合体と同様に、別々のIL-6分子の部位IIおよび部位IIIを介して結合する。シグナル伝達分子gp130は、D3が膜から離れて伸びるようにしてIL-6/IL-6R複合体に結合すると思われる。それぞれのgp130の残る3つのFnIIIドメインは、膜に向かって配位し、そしてシグナル伝達は、ジスルフィド架橋結合を介している可能性が高いIL-6R二量体の橋の下での、gp130膜近位のFnIIIドメイン(図6b)の二量体化により活性化されると思われる。このモデルは、実質的に現在のモデル案とは異なるが、利用可能な生物学的データとは一致する。他のgp130シグナル伝達複合体(例えば、IL-11)は、同様の機構を介して機能することができると思われる。このモデルの注目すべき特徴は、IL-6のIL-6Rとの結合配位が成長ホルモン、プロラクチンおよびエリスロポエチン受容体構造、ならびにIL-12構造の類似の位置と比較して、180度回転していることである。
【０１７７】
IL-6Rの結晶構造および六量体複合体のモデルにより、この複合体に関与する、タンパク質の変異の設計に対する基礎が提供される。それによりまた、IL-6シグナル伝達により調節される疾患を標的とした治療につながり得る、IL-6シグナル伝達に対する分子量の小さなアンタゴニストおよびアゴニストの設計/選択も可能となる。多数の分子量の小さな化合物の選択およびIL-6シグナル伝達に対するアンタゴニストまたはアゴニストとしての活性の試験方法については、下記で説明する。
【０１７８】
実施例2- IL-6Rのアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニング
インシリコ・スクリーニング
別表Iで提供されるsIL-6Rの構造情報を、ループL1〜L7により定義されるIL-6Rのリガンド結合表面に対して相補性を有する化合物のインシリコ・スクリーニングに使用した。スクリーニングは、DOCKおよび集団内での格付け(in-house ranking)および再スコアリング手順を利用し、NCIデータベース中の化合物について行った。簡単に説明すると、正しい配位であると見なされたドッキング・アルゴリズム由来の配位は、DOCKのエネルギー機能に基づいたスコアリング機能(Kuntzら, 1982, J. Mol Biol 161: 269〜288)、SCORE(Wangら, 1988, J Mol Model 4: 379〜394)、chemscore(Gohlkeら, 2000, J Mol Biol 295: 337〜336)、平均力ポテンシャル(Mueggeら, 1999, J Med. Chem. 4: 379〜394)、SMOG(DeWitteら, 1996, J Am Chem Soc. 118: 11733〜11744)を利用し、標準化された数値によるランク付け(normalised rank-by-number)戦略(WangおよびWang, 2001, Journal of Chemical Information and Computer Sciences 41(5):1422〜6)で計算した。次に、それぞれに関連するスコアをランクによるランク付け(rank-by-rank)戦略(WangおよびWang, 2001)で再ランク付けする。次いで、上位100の化合物を、計算したオクタノール/水溶解度(log P)(Wang, 1997, J. Chem. Inf. Comput. Sci. 37: 615)によって、6より大きいlog Pを有する化合物をその対象リストから除外しつつ分別した。上位100の化合物の代表例を表3に記載した。
【０１７９】
IL6/IL6Rα/gp130相互作用のアゴニスト/アンタゴニストの検出のための高速大量処理スクリーニングアッセイ
表3に記載の化合物のうちの10個を、それらがIL-6のIL-6R/gp130との結合を調節する能力に対して試験した。この目的で使用した高性能スクリーニングアッセイでは、マイクロタイター・プレートのウェル表面上に固定化された、ヒト可溶性インターロイキン6受容体α鎖(hsIL6R α)およびhsgp130とのユウロピウム標識ヒトIL6(Eu-hIL6)の結合を検出する。従った手順は、本質的には下記の通りとした。
【０１８０】
hIL-6のユウロピウム標識
hIL-6(2.13 mg, 100 nmol)をEu標識試薬1 mg(1,500 nmol)と100 mM NaHCO3緩衝液; pH 9.3中で混合し、4℃にて48時間インキュベートした。次いで、Eu標識IL-6を50 mM Tris-HCl; pH 7.75、0.9% NaClおよび0.1%アジ化ナトリウムを含有する緩衝液で平衡化したPharmacia Superdex-200カラム(HR 16/10)を用いて、未反応標識試薬および高分子量タンパク質凝集体から分離した。カラムへの流速は0.5 mL/分とし、各分画0.5 mLを回収した。
【０１８１】
各分画は、DELFIA増強溶液200μLで10,000倍希釈してユウロピウム蛍光を測定することにより、ユウロピウムに対して試験した。高分子量タンパク質凝集体(11〜12分)の後かつ未反応標識試薬(19分)の前に、Eu-IL6(14〜15分)は溶出した。Eu-IL6濃度は280 nmでの吸光度(0.5 AU/mg/mL)から決定し、標識の化学量論は分子量21,300に基づいて行った。
【０１８２】
スクリーニングアッセイ手順
アッセイは384ウェル黒色マイクロタイター・プレート中で行った。hsgp130 50μL(PBS; pH 7.2中で2.5μg/mL)をアッセイ・プレートの1〜22列中の各ウェルに添加した。23〜24列中のウェルに対しては、PBSのみ添加した。次いで、その試料を4℃で一晩インキュベートした。プレートは、EMBLA 384ウェル プレートウォッシャーを用いて、DELFIA(登録商標)洗浄用緩衝液100μLで4回洗浄した。DELFIA(登録商標)アッセイ用緩衝液(25μL)を、Multidrop 384ウェル ディスペンサーを用いて、全ウェルに添加した。
【０１８３】
試験化合物をメタノール中で再構成し、これをSAGIAN Multimekを用いて、適当なアッセイ・プレートのウェルに移した(試料3μL)。メタノールは、室温にて15分間インキュベートすることにより、アッセイ・プレートから蒸発させた。
【０１８４】
Eu-hIL6(90 ng/mL)およびhsIL6Rα(2μg/mL)を含有する溶液を、DELFIA(登録商標)アッセイ用緩衝液中で調製し、これをMultidrop 384ウェル ディスペンサーを用いて、プレートの全ウェルに添加した(試料25μL)。プレートを室温にて2時間インキュベートした。次いで、プレートのウェルを、EMBLA 384プレートウォッシャーを用いて、DELFIA(登録商標)洗浄用緩衝液100μL/ウェルで8回洗浄した。DELFIA(登録商標)増強溶液(75μL)を各ウェルに添加した後、プレートに蓋をして室温で一晩インキュベートした。次に、プレートをWallac 1420 Victor Multilabel Counterに載せ、384ウェル プレートのためのユウロピウム・プロトコル(手順)にセットして測定した。
【０１８５】
特異性について調べるため、化合物をまた、IGF受容体系に対して同様の方法でアッセイした。
【０１８６】
このアッセイ手順を用いて試験した化合物の結果が図7に示されている。図7Aには、gp130/IL-6Rα/IL-6系を用いて得られた結果が示されており、図7Bには、IGF-1R/IGF-1系を用いて得られた結果が示されている。これらの結果から、化合物39914がIL-6のIL-6R/gp130との結合のアンタゴニストとして特異的に作用していること、ならびに化合物17791および化合物56681がIL-6のIL-6R/gp130との結合のアゴニストとして特異的に作用していることが示される。
【０１８７】
モデル化研究により、化合物39914および化合物17791は、残基Phe229、Tyr230、Phe279、Glu278、Glu163、Cys192、Pro162およびLeu108により定義されるIL-6R上の溝を介して、IL-6Rと相互作用する可能性が高いことが明らかとなった(図8を参照されたい)。
【０１８８】
（表３）インシリコスクリーニングにより同定された化合物の例
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【０１８９】
本出願で引用した全ての刊行物の開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１９０】
当業者により、特定の態様において明らかにされている本発明に対し、それがより広く記述されるように、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、ほかにいろいろな変更および/または改変が可能なことが理解されると思われる。従って、本実施態様はあらゆる点で単なる例示にすぎず、限定的ではないと解釈されるべきである。
【０１９１】
別表I
sIL-6Rの構造座標
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【０１９２】
二量体座標の推定
第1単量体ユニットおよび第2単量体ユニットを含む二量体に対して、第1単量体ユニットの構造座標(Åとして)は、前述のX1、Y1およびZ1により定義され、そして第2単量体ユニットの構造座標(Åとして)は、以下の方程式から推定可能な、X2、Y2およびZ2により定義される:
X2 = 51.13 - Y1                                            (1)
Y2 = 51.13 - X1                                            (2)
Z2 = 151.7 - Z1                                            (3)
【０１９３】
別表II
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【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】(a) βシートの配置(ドメインD1、D2およびD3それぞれに対して緑色、橙色、青色)を示すsIL-6RのMOLSCRIPTによる図。別色のβストランドは、構造中の別のβシートを示す。4個のアスパラギン(青色の球体)連結部位は、これらに結合した糖鎖部分(黄色の結合で連結された黄色の球体により示される)とともに示されている。N末端残基1〜15(灰色の管状体)は、ジスルフィド結合によってD2のストランドFと連結している。310ヘリックス(紫)、D2およびD3の連結部周辺でIL-6と相互作用する可能性のある、L1〜L7ループ(赤)(L1〜L7は、S106〜N110(L1)、K133〜P138(L2)、A160〜F168(L3)、Q190〜G193(L4)、S227〜R233(L5)、M250〜H256(L6)およびQ276〜Q281(L7)のポリペプチドからなる)も示されている。ジスルフィド結合と同様にして、C192にジスルフィド結合した1個のシステイン残基も示されている。(b) ドメインD1を緑で、ドメインD2を赤で、およびドメインD3を青で、さらに糖鎖を黄色の球体で示した、sIL-6Rのドメイン構造(CPKモデル)。
【図２】IL-6RのWSXWS配列(緑色の結合)モチーフとD3中のトリプトファン/アルギニン・ラダー内のその他の残基(黄色の結合)とのその関係とに関する表面図。WSXWSモチーフの骨格は、サイトカイン結合ドメイン中に見られる310ヘリックスの一部分として示され、表面上の溝がこのヘリックスの上方に位置する。正荷電残基(アルギニン)の縞がこの溝と平行に位置する。側鎖の窒素および酸素原子は、これらの原子の近くにある表面が着色された、それぞれ青色の球体および赤色の球体である。
【図３】IL-6結合ループL1〜L7を示す、図1a上部から見たsIL-6RのCBDのMOLSCRIPT図。ループの側鎖は球棒表示として示されており、残りの構造は図1aと同様である。IL-6結合ループは、ワーム状の骨格(backbone worm)をそれぞれ赤色(L1)、黄色(L2)、緑色(L3)、藍色(L4)、ピンク色(L5)、濃緑色(L6)および橙色(L7)で着色表示することにより、示されている。側鎖の結合は、各ループに適合した色となっている。ループ側鎖の酸素、窒素および硫黄原子は、それぞれ赤色の、青色のおよび黄色の球体として着色されている(57)。システイニル・システインC192がまた、ループL4上に示されている。
【図４】赤色、緑色、青色、紫色および藍色の領域は、二量体間の距離がそれぞれ5Å、4Å、3Å、2Åおよび1Å未満を表すとして相互作用領域を示した、IL-6R二量体の結合界面。結晶2回軸は垂直であり、そして膜はその分子の下方で平行となっている。
【図５】IL-6R構造上に見られる3つの変異クラスターを示す、膜アンカーに向かって見た、IL-6Rの結晶学的二量体のMOLSCRIPT CPK表示。結晶学的2回軸は、図の中央に位置し且つ紙面に垂直であり、二量体の結合界面は、2回軸を通る東西方向に位置している。IL-6RとのIL-6結合に影響を及ぼす変異を表すため、図中の上側の分子中の残基が着色されている(赤色の、ピンク色のおよび緑色の球体はそれぞれ、その結合活性が野生型の＜25%、25%〜75%および＞75%となる、残基原子を表している)。gp130シグナル伝達に影響を及ぼす変異を表すため、下側の分子中の残基が着色されている(赤色の、ピンク色のおよび緑色の球体はそれぞれ、そのシグナル伝達が野生型の＜25%、25%〜75%および＞75%となる、残基原子を表している)。変異データが存在していないかまたは構造を変化させるD1、D2およびD3内の残基がそれぞれ、白色、薄灰色および灰色で着色されている。システイニル-システインC192は、濃灰色に着色されており、糖鎖は、黄色の結合により表されている。
【図６】(a) IL-6、IL-6Rおよびgp130鎖の各2分子(それぞれ紫色と青色、薄緑色と濃緑色、橙色と赤色で表示)からなる、六量体受容体複合体の空間充填モデル案である。IL-6は、その結合部位がI、IIおよびIIIと標識されている。(b) 六量体複合体(D1〜D6は、1〜6と標識されている)のモジュール表示。(a)と同じように着色されているが、モデル化されていなかった、gp130の3つのフィブロネクチンドメイン(D4〜D6)がさらに、IL-6R二量体の「トンネル」下での、gp130両分子由来の2つのD5’モジュールの会合によって、細胞質ドメイン(白丸)の二量体化によるシグナル伝達がいかにして活性化され得るかを示すようにして配置されている。
【図７】固相受容体結合アッセイ。表3から選択した10個の化合物(NCI化合物)を、マイクロプレートに基づく方式で、(A)可溶性組換え型IL-6受容体とのユウロピウム標識IL-6の結合または(B)可溶性組換え型IGF-1受容体とのユウロピウム標識IGF-1の結合を調節するその能力について試験した。受容体との結合は、対照に対する割合(%)として、時間分解蛍光測定法(TRF)により測定されている。
【図８】アンタゴニスト(NCI化合物39914)(A)およびアゴニスト(NCI化合物17791)(B)の結合部位を示すIL-6受容体のモデル。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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