(57)【要約】本発明は、癌を検出、診断および処置する際に使用するための新規配列に関する。本発明は、その発現が癌と関連する癌関連（ＣＡ）ポリヌクレオチド配列を提供する。本発明は、癌と関連するＣＡポリペプチドを提供し、そして診断組成物癌の検出のための方法を提供する。本発明は、ＣＡポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を提供する。本発明はまた、診断ツールおよび治療組成物、ならびに癌のスクリーニング、予防および処置のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、表１〜６に示される配列番号５、１１、１７、２３、２９および３２のヒトポリヌクレオチドｍＲＮＡ配列からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む、核酸分子またはその相補体。
【請求項２】
請求項１に記載の組換え核酸を含む、宿主細胞。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドまたはその相補体もしくはそのフラグメントが、検出可能な標識をさらに含む、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドまたはその相補体もしくはそのフラグメントが、固体支持体に結合される、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドまたはその相補体もしくはそのフラグメントが、少なくとも部分的に、化学合成によって調製される、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドまたはその相補体もしくはそのフラグメントが、アンチセンスフラグメントである、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドまたはその相補体もしくはそのフラグメントが、一本鎖である、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドまたはその相補体もしくはそのフラグメントが、二本鎖である、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
癌関連（ＣＡ）核酸を検出するためのマイクロアレイであって、以下：
表１〜６に示される配列番号５、１１、１７、２３、２９および３２のヒトポリヌクレオチド配列からなる群より選択される配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドまたはその相補体を含む少なくとも１つのプローブ、
を備える、マイクロアレイ。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマイクロアレイであって、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む、マイクロアレイ。
【請求項１５】
請求項１３に記載のマイクロアレイであって、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む、マイクロアレイ。
【請求項１６】
単離されたポリペプチドであって、表１〜６に示される配列番号４、１０、１６、２２、２８および３１のヒトゲノムポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるＣＡ配列のオープンリーディングフレームまたはその相補体内にコードされる、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、表１〜６に示される配列番号５、１１、１７、２３、２９および３２からなる群より選択されるヒトポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、表１〜６に示される配列番号６、１２、１８、２４、３０および３３からなる群より選択されるヒトコード配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、表１〜６に示される配列番号６、１２、１８、２４、３０および３３からなる群より選択されるＣＡポリペプチドのアミノ酸配列のエピトープのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１６に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドまたはそのフラグメントが、固体支持体に結合される、ポリペプチド。
【請求項２１】
単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
請求項２１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合フラグメントが、固体支持体に結合される、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
請求項２１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体が、モノクローナル抗体である、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
請求項２１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体が、ポリクローナル抗体である、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
請求項２１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合フラグメントが、検出可能な標識をさらに含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
単離された抗体であって、請求項１６〜２０のいずれかに記載のポリペプチドまたはその抗原結合フラグメントに結合し、該抗体が、以下の工程：（ｉ）宿主動物を該ポリペプチドまたはその抗原結合フラグメントを含む組成物で免疫する工程、およびｉｉ）該抗原またはその抗原結合フラグメントに対する抗体を発現する該宿主から細胞を収集する工程、を包含する方法によって調製される、単離された抗体。
【請求項２７】
試験サンプル中の癌の存在を診断するためのキットであって、該キットが、表１〜６に示される配列番号４、１０、１６、２２、２８および３１のポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるＣＡポリヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはそれらの相補体を含む、キット。
【請求項２８】
試験サンプル中の癌の存在を診断するためのキットであって、該キットが、表１〜６に示される配列番号５、１１、１７、２３、２９および３２のポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列の配列に選択的にハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチド、そのフラグメントまたはそれらの相補体を含む、キット。
【請求項２９】
電子ライブラリーであって、表１〜６に示される配列番号４、１０、１６、２２、２８および３１のポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるＣＡポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含む、電子ライブラリー。
【請求項３０】
電子ライブラリーであって、表１〜６に示される配列番号５、１１、１７、２３、２９および３２のポリヌクレオチド配列からなる群より選択されるＣＡポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含む、電子ライブラリー。
【請求項３１】
電子ライブラリーであって、表１〜６に示される配列番号６、１２、１８、２４、３０および３３のポリヌクレオチド配列からなる群より選択される配列のポリヌクレオチドによってコードされるＣＡポリペプチドを含むポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、電子ライブラリー。
【請求項３２】
潜在的薬物の抗癌活性についてスクリーニングするための方法であって、該方法が、以下：
（ａ）表１〜６に示される配列番号４、１０、１６、２２、２８および３１の配列からなる群より選択される核酸配列によってコードされる癌関連（ＣＡ）遺伝子またはそのフラグメントを発現する細胞を提供する、工程；
（ｂ）癌細胞由来の組織サンプルを抗癌薬物候補と接触させる工程；および
（ｃ）該組織サンプル中でのＣＡ遺伝子の発現に対する該抗癌薬物候補の効果をモニタリングする工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の抗癌活性をスクリーニングする方法であって、ここで、前記ＣＡ遺伝子が、表１〜６に示される配列番号５、１１、１７、２３、２９および３２の配列からなる群より選択される少なくとも１つの核酸配列を含む、方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の抗癌活性をスクリーニングする方法であって、さらに以下：
（ｄ）前記薬物候補の非存在下での発現レベルを該薬物候補の存在下での発現レベルと比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の抗癌活性をスクリーニングする方法であって、ここで、前記薬物候補が、ＳＮＬ、ＦＯＳＢ、ＣＣＮＤ１、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ１、およびＰＶＴ１からなる群より選択されるＣＡＰ配列の活性を調節する、方法。
【請求項３６】
試験細胞サンプル中のポリペプチドの発現と関連する癌を検出するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）表１〜６に示される配列番号６、１２、１８、２４、３０および３３からなる群より選択されるヒトコード配列によってコードされるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドまたはそのフラグメントの発現レベルを検出する工程；および
（ｉｉ）該試験サンプル中での該ポリペプチドの発現のレベルを正常細胞サンプル中でのポリペプチドの発現のレベルと比較する工程であって、ここで、該正常細胞サンプル中でのポリペプチド発現のレベルと比較した該試験細胞サンプル中での該ポリペプチドの発現の変化したレベルが、該試験細胞サンプル中の癌の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
試験細胞サンプル中のポリペプチドの発現と関連する癌を検出するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）表１〜６に示される配列番号６、１２、１８、２４、３０および３３からなる群より選択されるヒトコード配列によってコードされるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドまたはそのフラグメントの活性レベルを検出する工程であって、ここで、該活性が、表１３０に列挙されるポリペプチドについての少なくとも１つの活性に対応する、工程；および
（ｉｉ）該試験サンプル中での該ポリペプチドの活性のレベルを正常細胞サンプル中でのポリペプチドの活性のレベルと比較する工程であって、ここで、該正常細胞サンプル中でのポリペプチド活性のレベルと比較した該試験細胞サンプル中での該ポリペプチドの活性の変化したレベルが、該試験細胞サンプル中の癌の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
試験血清サンプル中の抗体の存在と関連する癌を検出するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）表１〜６に示される配列番号６、１２、１８、２４、３０および３３からなる群より選択されるヒトコード配列によってコードされるアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントに対する抗体のレベルを検出する工程；および
（ｉｉ）該試験細胞サンプル中の該抗体のレベルをコントロールサンプル中の該抗体のレベルと比較する工程であって、ここで、該コントロールサンプル中の抗体のレベルと比較した該試験サンプル中の抗体の変化したレベルが、該試験血清サンプル中の癌の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の活性を調節し得る生物活性薬剤をスクリーニングするための方法であって、ここで、該ＣＡＰが、表１〜６に示される配列番号５、１１、１７、２３、２９および３２のポリヌクレオチド配列からなる群より選択される核酸配列を含む核酸によってコードされ、該方法が、以下：
ａ）該ＣＡＰおよび候補生物活性薬剤を組み合わせる工程；および
ｂ）該ＣＡＰの生物活性に対する該候補薬剤の効果を決定する工程、
を包含する
方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の生物活性薬剤をスクリーニングする方法であって、該生物活性薬剤が、ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の発現に影響する、方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の生物活性薬剤をスクリーニングする方法であって、該生物活性薬剤が、ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）の活性に影響し、ここで、該ＣＡＰがＳＮＬ、ＦＯＳＢ、ＣＣＮＤ１、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ１、およびＰＶＴ１からなる群より選択される、方法。
【請求項４２】
癌を診断するための方法であって、以下：
ａ）第１の個体の第１の組織型における、表１〜６に概説されたヒト配列からなる群より選択された核酸配列を含む、一つ以上の遺伝子の発現を決定する工程；および
ｂ）該遺伝子の発現と該第１の個体に由来する第２の正常な組織型または第２の罹患していない個体に由来する正常な組織型とを比較する工程；
を包含し、
ここで、該発現の相違は、該第１の個体が癌を有することを示す、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の癌を診断するための方法であって、ここで、前記発現の差異が、第１の個体が癌に対する傾向を有することを示す、方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の癌を診断するための方法であって、ここで、前記遺伝子が配列番号４、５、および６に対応するＳＮＬ１配列を含み、そして前記組織が乳癌組織である、方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の癌を診断するための方法であって、ここで、前記遺伝子が、配列番号１０〜１２に対応するＦＯＳＢ配列を含み、そして前記組織が、結腸癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、乳癌および前立腺癌の組織からなる群より選択される、方法。
【請求項４６】
請求項４２に記載の癌を診断するための方法であって、ここで、前記遺伝子が、配列番号２２〜２４に対応するＭＹＣ配列を含み、そして前記組織が、乳癌組織である、方法。
【請求項４７】
請求項４２に記載の癌を診断するための方法であって、ここで、前記遺伝子が、配列番号１６〜１８に対応するＣＣＮＤ１配列を含み、そして前記組織が、結腸癌（Ｓ状）、結腸癌（横行）、肺癌、卵巣癌、および乳癌の組織からなる群より選択される、方法。
【請求項４８】
請求項４２に記載の癌を診断するための方法であって、ここで、前記遺伝子が、配列番号２８〜３０に対応するＮＦＫＢ１配列を含み、そして前記組織が、肺癌、皮膚癌、および乳癌の組織からなる群より選択される、方法。
【請求項４９】
請求項４２に記載の癌を診断するための方法であって、ここで、前記遺伝子が、配列番号３１〜３３に対応するＰＶＴ１配列を含み、そして前記組織が、乳癌組織である、方法。
【請求項５０】
請求項４２に記載の癌を診断するための方法であって、ここで、前記癌組織における遺伝子発現が、前記正常組織における遺伝子発現と比較してアップレギュレートされる、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の癌を診断するための方法であって、ここで、前記発現の差異が、第１の個体が癌に対する傾向を有することを示す、方法。
【請求項５２】
癌または癌に対する傾向を診断するための方法であって、第１の個体に由来する第２の正常な組織型または第２の罹患していない個体に由来する正常な組織型に対して、該第１の個体の第１の組織型における表１〜６に概説されるヒト配列からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む１つ以上の遺伝子の増幅を決定する工程を包含し、ここで、該ＤＮＡの増幅が、該第１の個体が癌または癌に対する傾向を有することを示す、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の癌または癌に対する傾向を診断するための方法であって、ここで、前記遺伝子がＭＹＣを含み、そして前記ＤＮＡ配列が配列番号２２、またはそのフラグメントである、方法。
【請求項５４】
請求項５２に記載の癌または癌に対する傾向を診断するための方法であって、ここで、前記遺伝子がＰＶＴ１を含み、そして前記ＤＮＡ配列が配列番号３１、またはそのフラグメントである、方法。
【請求項５５】
癌を処置するための方法であって、ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）のインヒビターを患者に投与する工程を包含し、ここで、該ＣＡＰが、表１〜６に概説される配列からなる群より選択されるヒト核酸配列を含む核酸によってコードされる、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の癌を処置するための方法であって、ここで、前記ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）のインヒビターが、ＣＡタンパク質に結合する、方法。
【請求項５７】
請求項５５に記載の癌を処置するための方法であって、ここで、前記ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）のインヒビターが、ＳＮＬ、ＦＯＳＢ、ＣＣＮＤ１、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ１、およびＰＶＴ１からなる群より選択されるＣＡＰ配列の活性を調節する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／３６７，０２５号、標題「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ」（２００２年３月２１日出願）の優先権を主張する。この出願は、米国出願、標題「Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ」、米国特許出願第０９／７４７，３７７号（２０００年１２月２２日出願）、同第０９／７９８，５８６号（２００１年３月２日出願）、同第１０／００４，１１３号（２００１年１０月２３日）、同第１０／０５２，４８２（２００１年１１月８日出願）および米国特許出願第０９／９９７，７２２号（２００１年１１月３０日出願）に関連し、これら全ての出願は、本明細書中に参考として明示的に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して、癌関連遺伝子の分野に関する。具体的には、本発明は、癌および腫瘍の診断および処置における使用のための新規配列、ならびにスクリーニング方法における新規組成物の使用に関する。本発明は、関連癌の検出、診断、予防および／または処置において、癌関連ポリヌクレオチドを使用する方法、それらの対応遺伝子産物および遺伝子産物に特異的な抗体を使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
癌遺伝子は、癌を生じさせ得る遺伝子である。発癌は、広範な種々の機構（細胞の、癌遺伝子を含むウイルスによる感染、宿主ゲノムにおける癌原遺伝子の活性化、および癌原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の変異を含む）によって、起こり得る。発癌は、基本的には、体細胞進化（すなわち、増殖制御の進行性の喪失を伴う改変体の変異および自然淘汰）によって引き起こされる。これらの体細胞変異に対する標的として働く遺伝子は、それらの変異表現型がドミナントであるか、または劣性であるかに依存して、それぞれ原癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のいずれかとして分類される。
【０００４】
動物の癌と同様、ヒト癌に関係することが公知である、多くのウイルスが存在する。ここで特に興味深いのは、それ自体に癌遺伝子を含まないウイルスである；これらは、遅性トランスフォーミングレトロウイルス（ｓｌｏｗ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）である。これらは、宿主ゲノム内へと組込み、種々の方法で近隣の癌原遺伝子に影響することにより、腫瘍を誘導する。プロウイルス挿入変異は、レトロウイルス生活環の正常な結果である。感染細胞において、レトロウイルスゲノムのＤＮＡコピー（プロウイルスといわれる）は、宿主ゲノムに組み込まれる。新たに組み込まれたプロウイルスは、２つの機構のうちの一方によって組み込み部位においてまたはその付近で、シスで遺伝子発現に影響を及ぼしうる。Ｉ型挿入変異は、プロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）内の調節配列（エンハンサーおよび／またはプロモーター）の結果として近位遺伝子の転写をアップレギュレートする。ＩＩ型挿入変異は、オープンリーディングフレーム内に直接組み込まれるか、または両末端がコード配列に隣接しているイントロン内に組み込まれるかのいずれかに起因して、コード領域の短縮化を生じる。挿入部位にあるかまたは挿入部位付近にある配列の分析は、多くの新たな原癌遺伝子の同定をもたらした。
【０００５】
リンパ腫および白血病に関して、ＡＫＶマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはＳＬ３−３  ＭＬＶのようなレトロウイルスは、感染しやすい新生児マウスに接種される場合か、または生殖系列内で運ばれる場合、腫瘍の強力な誘発因子である。多くの配列が、リンパ腫および白血病の誘発において、挿入部位の分析により、関連する配列として同定されている；以下を参照のこと：Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：２１６１（２０００）；Ｈａｎｓｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０（２）：２３７−４３（２０００）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：４０６３（１９９６）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：７１１８（１９９３）；Ｊｏｏｓｔｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６８：３０８（２０００）；およびＬｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３：３４８（１９９９）；これらの全ては、本明細書中で参考として明白に援用される。癌（特に、乳癌、前立腺癌、および上皮起源の癌）に関して、哺乳動物レトロウイルス、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）は、感染しやすい新生児マウスに接種される場合か、または生殖系列内にて運ばれる場合、腫瘍の強力な誘発因子である。Ｍａｍｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ、Ｊ．Ｈｉｌｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｌｕｙｓｅｒ編；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．。
【０００６】
乳癌は、女性に罹患する最も重大な疾患のうちの１つである。現在の割合では、米国人女性が９５歳までに乳癌を発症する危険性は、８人に１人である（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９２）。後の段階での乳癌の処置は、効果がなく効力がない（ｄｉｓｆｉｇｕｒｉｎｇ）ことがしばしばであり、このことが、この疾患の医療的管理において、早期検出を最優先にしている。
【０００７】
特定の生細胞における遺伝子発現のパターンは、その現在の状態に特徴的である。細胞の状態または型におけるほぼ全ての差異は、１以上の遺伝子のＲＮＡレベルにおける差異に反映される。特徴付けられていない遺伝子の発現パターンを比較すると、それらの機能の糸口が提供され得る。数百または数千もの遺伝子の発現のハイスループット分析は、（ａ）複雑な遺伝病の同定、（ｂ）組織状態と疾患状態との間の経時的な差示的遺伝子発現の分析、（ｃ）薬物発見および毒性学研究に役立ちうる。特定の遺伝子の発現レベルの増加または減少は、癌の生物学と相関する。例えば、癌遺伝子は、腫瘍発生の正の調節因子である一方、腫瘍サプレッサ遺伝子は、腫瘍発生の負の調節因子である（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｅｌｌ、６４：３１３−３２６（１９９１）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１１３８−１１４６（１９９１））。
【０００８】
ＳＮＬ（ｆａｓｃｉｎとして公知）は、ウニの卵の細胞質抽出物から初めて単離されたアクチン結束タンパク質であり（Ｋａｎｅ，１９７５：Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６６：３０５−３１５）、インビトロで特徴づけられた初めての結束タンパク質であった。その後の研究により、ｆａｓｃｉｎが、受精卵微絨毛におけるアクチンフィラメントおよび食細胞の体腔細胞（ｃｏｅｌｏｍｏｃｙｔｅ）の糸状仮足を束ねることが示された（Ｏｔｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．１：３１−４０；ＯｔｔｏおよびＢｒｙａｎ，１９８１，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．１：１７９−１９２）。Ｆａｓｃｉｎは、広範な組織および生物において見いだされる、広く発現されるタンパク質である。
【０００９】
インビボで、ＡＰ−１（すなわち、転写因子活性化タンパク質１）は、ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎ（ＦｏｓＢ、Ｆｒａ−１、Ｆｒａ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤなどを含む）に加えて、いくつかの関連タンパク質サブユニットのヘテロダイマーの不均一な混合物である（Ｔｈｅ  ＦＯＳ  ａｎｄ  ＪＵＮ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＡｎｇｅｌおよびＨｅｒｒｌｉｃｈ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９４）。ＡＰ−１は、異常な細胞増殖および腫瘍形成、従って、ｃ−ｆｏｓおよび／またはｃ−ｊｕｎの発現を調節することによって制御されうる事象に関連付けられていたが、これらのタンパク質の各々の細胞増殖または腫瘍形成に対する正確な寄与は、未知である。
【００１０】
このｃ−ｍｙｃタンパク質は、Ｍａｘとヘテロダイマーを形成するヘリックス−ループ−ヘリックス／ロイシンジッパー（ＨＬＨ／ＬＺ）ファミリーの転写因子のメンバーである。一般に、トランス活性化Ｍｙｃ：Ｍａｘヘテロダイマーは、増殖している細胞中に見いだされる。その一方、トランス抑制Ｍａｄ：Ｍａｘヘテロダイマーは、分化した細胞において見いだされる。ｃ−ｍｙｃタンパク質レベルは、おそらく、Ｍｙｃ：ＭａｘヘテロダイマーとＭａｄ：Ｍａｘヘテロダイマーとの間の平衡に影響を及ぼすことによって、細胞増殖、分化、および新生物形質転換に影響を及ぼす。
【００１１】
サイクリンＤ１は、染色体１１ｑ１３上のＰＲＡＤ１、ＣＣＮＤ１またはｂｃｌ−１遺伝子に由来するタンパク質である。このタンパク質は、細胞周期の両方の調節に関与する。細胞周期のＧ１（休止）期においては、サイクリンＤ１は、そのサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）パートナーとともに、網膜芽腫遺伝子（ｐＲＢ）の生成物をリン酸化することによって、Ｓ（ＤＮＡ合成）期への移行を担う。次いで、このことによって、ＤＮＡ複製の開始において重要な転写因子が放出される。核因子κＢは、細胞を、ホルボールエステル、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子−α（ＩＮＦ−α）のような因子で処理した後に複数の細胞遺伝子の調節に関与する、誘導性転写因子である。これらの遺伝子は、免疫、急性相、および炎症応答の前初期プロセスに関与する。ＮＦ−κＢはまた、いくつかのウイルス（最も顕著には、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ））の転写活性化に関連していた（Ｎａｂｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３２６：７１１，１９８７；Ｋａｕｆｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３７５９，１９８７；Ｓａｍｂｕｃｅｔｔｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ，８：４２５１，１９８９）。ＮＦ−κＢは、デカマーのシス作用性ＮＦ−κＢ  ＤＮＡモチーフを結合し、これを介して、遺伝子発現を調節するダイマー転写因子である。ｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマーが伝統的に、ＮＦ−κＢといわれ、依然として原型かつ最も豊富な形態であるが、いくつかの異なるが、密に関連したホモダイマー因子およびヘテロダイマー因子は、ＮＦ−κＢ部位依存性のＤＮＡ結合活性および調節を担うことが最近認識された。種々のダイマー因子は、Ｒｅｌ関連ポリペプチドのファミリーのメンバーから構成される。このファミリーの１つのサブクラスは、前駆体形態からタンパク質分解的にプロセシングされること、および認識されている活性化ドメインがないことにより区別され、このクラスには、ｐ５０（ＮＦκＢ１）およびｐ５０Ｂ（ＮＦκＢ２、ｐ５２）が含まれるのに対して、第２のサブクラスは、認識された活性ドメインを含み、これらとしては、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質Ｄｏｒｓａｌが含まれる。全てのＲｅｌ関連メンバーは、３００アミノ酸相同性領域であるＲＨＤ（ＤＮＡ結合およびダイマー形成を担い、Ｒｅｌ相同性ドメインといわれる）を共有する。細胞質では、ＮＦ−κＢタンパク質およびＲｅｌタンパク質は、「Ｒｅｌ複合体」を形成する。
【００１２】
ＮＦ−κＢ遺伝子調節は、多くの病的事象（後天性免疫不全疾患（ＡＩＤＳ）の進行、急性相応答、ならびに毒性ショック、同種移植片拒絶、および照射応答の間の、免疫細胞および内皮細胞の活性化を含む）に関与する。さらに、ＮＦ−κＢ遺伝子トランス活性化は、ＨＩＶおよびＣＭＶ複製に重要であり得る。
【００１３】
ＰＶＴ−１遺伝子座は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座と関連する。しばしば、一方または他方の遺伝子座における変異は、リンパ腫のような疾患と相関する。ＰＶＴ遺伝子座の再配置および増幅は、リンパ腫において見出されているものの、ＰＶＴ−１の役割は、依然として明らかでない。
【００１４】
従って、本発明の目的は、癌、特に腫瘍形成に関与するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を提供することである。
【００１５】
免疫療法、または治療目的での抗体の使用は、近年、癌を処置するために使用されてきた。受動免疫は、癌の処置においてモノクローナル抗体の使用を包含する。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第６版（２００１）第２０章、ｐｐ４９５〜５０８を参照のこと。これらの抗体の固有の治療上の生物学的活性は、腫瘍細胞の増殖または生存の直接阻害、および身体の免疫系の天然の細胞殺傷活性を補充する能力を含む。これらの薬剤は、単独または照射もしくは化学療法剤と組み合わせて投与される。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、それぞれ、リンパ腫および乳癌の処置について承認されており、このような治療剤の２つの例である。あるいは、抗体は、その抗体が、毒性薬剤に連結されており、腫瘍へ特異的に結合することによって腫瘍にその薬剤を指向する、抗体結合体を作製するために使用される。Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）は、白血病の処置のために使用される承認された抗体結合体の一例である。
【００１６】
従って、本発明の目的は、診断用標的として種々の癌と関連する抗原（癌関連ポリペプチド）および／または治療抗体を提供することである。これらの抗原はまた、薬物発見（建生場、低分子）のために、ならびに細胞調節、増殖および分化のさらなる特徴付けのために有用である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
上で概略を述べた目的に従い、本発明は、癌（特にリンパ腫および白血病）を調節する組成物のスクリーニングの方法を提供する。本発明は、癌腫（特に乳腺癌）を調節する組成物をスクリーニングする方法を提供する。細胞（好ましくは、リンパ腫細胞または乳癌細胞）の増殖を阻害する方法もまた、本明細書中で提供される。癌を処置する方法（診断を含む）もまた、本明細書中で提供される。
【００１８】
一局面において、薬物候補をスクリーニングする方法は、癌腫関連遺伝子（ＣＡ遺伝子）またはそのフラグメントを発現する細胞を提供する工程を包含する。ＣＡ遺伝子の好ましい実施形態は、癌細胞（好ましくはリンパ細胞、乳房細胞、前立腺細胞または上皮細胞）において、他の細胞と比較して異なって発現される遺伝子である。本明細書中の方法において使用されるＣＡ遺伝子の好ましい実施形態としては、表１〜６から選択される核酸が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、これらの遺伝子としては、ＰＶＴ１、ＳＮＬ１、ＣＣＮＤ１、ＦＯＳＢ、ＭＹＣ、またはＮＦＫＢ１が挙げられるが、これらに限定されない。この方法は、細胞へ薬物候補を添加する工程、およびＣＡ遺伝子の発現に対する薬物候補の効果を決定する工程を、さらに包含する。
【００１９】
一実施形態において、薬物候補をスクリーニングする方法は、薬物候補の非存在下における発現のレベルを、薬物候補の存在における発現のレベルと比較する工程を包含する。
【００２０】
ＣＡタンパク質（ＣＡＰ）に結合し得る生物活性剤をスクリーニングする方法もまた、本明細書中で提供され、この方法は、ＣＡＰおよび候補生物活性剤を合わせる工程、および候補薬剤のＣＡＰへの結合を決定する工程を包含する。
【００２１】
ＣＡＰの活性を調節し得る生物活性剤をスクリーニングする方法が、本明細書中でさらに提供される。一実施形態において、この方法は、ＣＡＰおよび候補生物活性剤を合わせる工程、およびＣＡＰの生物活性に対する薬物候補の効果を決定する工程を、包含する。
【００２２】
患者に薬物を投与する工程、および患者から細胞サンプルを採取する工程を包含する、候補癌腫薬物の効果を評価する方法もまた、提供される。細胞の発現プロファイルが、次いで、決定される。この方法は、患者の発現プロファイルを、健常な個体の発現プロファイルと比較する工程を、さらに包含し得る。
【００２３】
さらなる局面において、ＣＡタンパク質の活性を阻害する方法が、提供される。一実施形態において、この方法は、表１〜６において概略を示される配列またはその相補体からなる群から好ましくは選択されるＣＡタンパク質の阻害剤を、患者に投与する工程を包含する。
【００２４】
ＣＡタンパク質（好ましくは表１〜６において概略を示される配列の群から選択される核酸にコードされるタンパク質）の効果を中和する方法もまた、提供される。好ましくは、この方法は、上述のタンパク質に特異的な薬剤を、中和をもたらすのに充分な量で、上述のタンパク質に接触させる工程を包含する。
【００２５】
その上、ＣＡタンパク質をコードする核酸セグメント（好ましくは表１〜６において概略を示される配列から選択される）を含むバイオチップ／マイクロアレイが、本明細書中で提供される。すなわち、これらの核酸セグメントは、ＰＶＴ１、ＳＮＬ１、ＣＣＮＤ１、ＦＯＳＢ、ＭＹＣ、またはＮＦＫＢ１を含む遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。異なる実施形態において、本発明のマイクロアレイは、表１〜６からの１、２、３、４、５以上のヒト配列を含み、これらの配列としては、ＰＶＴ１、ＳＮＬ１、ＣＣＮＤ１、ＦＯＳＢ、ＭＹＣ、またはＮＦＫＢ１に関連した配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
癌（特にリンパ腫または白血病または癌腫（乳癌を含む））に対する傾向を、ある個体の少なくとも１つの癌腫またはリンパ腫の遺伝子を配列決定することにより、診断または決定する方法もまた、本明細書中で提供される。本発明のさらに別の局面において、個体における癌（リンパ腫および白血病を含む）遺伝子のコピー数を決定する方法が、提供される。
【００２７】
癌と関連する新規配列もまた、本明細書中で提供される。本発明の他の局面は、本発明の以下の説明によって、当業者にとって明確である。
【００２８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、癌（特にリンパ腫、乳癌または前立腺癌）に関連する多くの配列に関する。クローン的に組み込まれたプロウイルス（ｃｌｏｎａｌｌｙ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｒｏｖｉｒｕｓ）と癌原遺伝子との間の比較的緊密な連結は、「プロウイルスタギング（ｐｒｏｖｉｒｕｓ  ｔａｇｇｉｎｇ）」を形成し、ここで、挿入変異機構（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）により作用する遅延性トランスフォーミングレトロウイルスが、癌原遺伝子を単離するために使用される。いくつかのモデルにおいて、非感染動物は、低い癌比率を有し、そして感染動物は、高い癌比率を有する。関係するレトロウイルスの多くは、形質導入された宿主癌原遺伝子または病原性トランス作用性（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ）ウイルス遺伝子を持たず、従って、その癌発生率は、宿主癌原遺伝子中へのプロウイルスの組み込みの影響の直接的な結果であることは、公知である。プロウイルスの組み込みはランダムであるため、極少数の組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）しか、選択的増殖の有利性を提供する宿主癌原細胞を「活性化」しない。これらの稀な出来事は、腫瘍におけるクローン化学量論にて新しいプロウイルスを生じる。化学物質、放射線、または自然発生的エラーにより生じる変異とは対照的に、癌原遺伝子挿入変異は、便利なサイズの既知配列（プロウイルス）遺伝子マーカーが変異部位に存在するという事実によって、容易に位置決めされ得る。クローン的に組み込まれたプロウイルスに隣接する宿主配列は、種々のストラテジーを使用してクローン化され得る。一旦これらの配列を所有すると、タグ化癌原遺伝子が、後に同定され得る。２つ以上の独立した腫瘍中の同じ遺伝子座にプロウイルスが存在することは、癌原遺伝子がそのプロウイルス組込み部位またはそのごく近くに存在することの明白な証拠である。これは、ゲノムが大きすぎてランダムな組込みは、観察可能なクラスター形成を生じないからである。検出されるいかなるクラスター形成も、生物学的選択（すなわち、腫瘍表現型）についての明快な証拠である。さらに、プロウイルス組込み体のパターン（方向を含む）は、各クラスターにある標的遺伝子の位置決定を比較的簡単にする、強力な位置情報を提供する。挿入変異機構により癌を引き起こすことが公知である３つの哺乳動物レトロウイルスは、ＦｅＬＶ（ネコにおける白血病／リンパ腫）、ＭＬＶ（マウスおよびラットにおける白血病／リンパ腫）、ならびにＭＭＴＶ（マウスにおける乳癌）である。
【００２９】
従って、腫瘍形成レトロウイルス（宿主生物のゲノムにその配列が挿入されて癌腫を生じる）の使用によって、癌腫に関与する宿主配列の同定が可能にされる。これらの配列は、次いで、多くの異なった方法（診断、予後判定、調節因子（アゴニストおよびアンタゴニストの両方を含む）のスクリーニング、抗体産生（免疫療法および画像化のため）などが挙げられる）において、使用され得る。しかし、当業者に理解されるように、１種類の癌（リンパ腫または白血病など）において同定される癌遺伝子は、同様に、他の種類の癌に関わる可能性が強い。従って、本明細書中で概略が示される配列は、最初に、リンパ腫と相関すると同定されるが、以下で概略を示されるように、他の種類の癌においてもまた、それらの配列は見出され得る。
【００３０】
（定義）
従って、本発明は、癌腫に関連する核酸およびタンパク質の配列（本明細書中で「癌腫関連」配列または「ＣＡ」配列と名付ける）を、提供する。１つの実施形態において、本発明は、リンパ組織を起源とする癌腫に関連する核酸およびタンパク質の配列（本明細書中で「リンパ腫関連」配列、「白血病関連」配列または「ＬＡ」配列と名付ける）を、提供する。別の実施形態において、本発明は、乳房組織を起源とする癌腫に関連する核酸配列およびタンパク質配列（本明細書中で「乳癌関連」配列または「ＢＣＡ」配列と呼ぶ）を提供する。
【００３１】
本発明の方法を使用して診断され得るかまたはスクリーニングされ得る適切な癌としては、部位によってかまたは組織学的型によって分類された癌が挙げられる。部位によって分類される癌としては、以下が挙げられる：口腔および咽頭（唇、舌、唾液腺、口の床、歯肉および他の口腔、鼻咽頭、扁桃、口腔咽頭部、下咽頭、他の口／他の咽頭）の癌；消化系（食道；胃；小腸；結腸および直腸；肛門、肛門管、および肛門直腸；肝臓；肝臓内胆汁管；胆嚢；他の胆管；膵臓；腹膜後腔；腹膜、網、および腸間膜、他の消化）の癌；呼吸系（鼻腔、中耳、および洞；喉頭；肺および気管支；胸膜；気管；縦隔；ならびに他の呼吸系）の癌；中皮腫；骨および関節；および軟組織（心臓を含む）の癌；皮膚癌（黒色腫および他の非上皮性皮膚癌を含む）；カポージ肉腫および乳癌；女性生殖系（子宮頸；子宮体；子宮（ｎｏｓ）；卵巣；膣；外陰；および他の女性生殖器）の癌；男性生殖系（前立腺；精巣；陰茎；および他の男性生殖器）の癌；泌尿系（膀胱；腎臓および腎盤；尿管；および他の泌尿器）の癌；眼および眼窩の癌；脳および神経系（脳；および他の神経系）の癌；内分泌系（甲状腺、および胸腺を含む他の内分泌腺）の癌；リンパ腫の癌（ホジキン病リンパ腫および非ホジキン性リンパ腫）、多発性骨髄腫、ならびに白血病（リンパ性白血病；骨髄性白血病；単球性白血病；および他の白血病）。
【００３２】
本発明の配列に関連し得る他の癌（組織学的型によって分類される）としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：新生物（悪性）；癌腫（ＮＯＳ）；癌腫（未分化、ＮＯＳ）；巨細胞癌腫および紡錘体細胞癌；小細胞癌（ＮＯＳ）；乳頭状癌（ＮＯＳ）；扁平上皮癌（ＮＯＳ）；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌（ＮＯＳ）；毛質癌腫；移行上皮癌（ＮＯＳ）；乳頭状移行上皮癌；腺癌（ＮＯＳ）；ガストリノーマ（悪性）；胆管癌；肝細胞癌（ＮＯＳ）；肝細胞癌および胆管癌の複合；メルケル細胞腺腫；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープにおける腺癌；腺癌（大腸家族性ポリポシス）；固形癌腫（ＮＯＳ）；カルチノイド腫瘍（悪性）；気管支槽腺癌；乳頭状腺癌（ＮＯＳ）；色素嫌性癌腫；好酸性（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉ）癌腫；好酸性（ｏｘｙｐｈｉｌｃ）腺癌；好塩基性癌腫；明細胞腺癌（ＮＯＳ）；顆粒細胞癌腫；濾胞状腺癌（ＮＯＳ）；乳頭状かつ濾胞状の腺癌；非被包硬化癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；脂腺腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌（ＮＯＳ）；乳頭状嚢胞腺癌（ＮＯＳ）；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌（ＮＯＳ）；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤腺管癌；髄様癌（ＮＯＳ）；小葉癌；炎症性乳癌；パジェット疾患（乳房）；腺房細胞癌腫；腺扁平上皮癌；扁平化生を伴う腺癌；胸腺腫（悪性）；卵巣間質腫瘍（悪性）；莢膜腫（悪性）；顆粒膜細胞腫（悪性）；男性ホルモン産生細胞腫（悪性）；セルトーリ細胞癌腫；ライディッヒ細胞腫（悪性）；脂質細胞腫瘍（悪性）；パラガングリオーマ（悪性）；乳房外パラガングリオーマ（悪性）；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫（ＮＯＳ）；メラニン欠乏症黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑（悪性）；肉腫（ＮＯＳ）；線維肉腫（ＮＯＳ）；線維性組織球腫（悪性）；粘液肉腫；脂肪肉腫（ＮＯＳ）；平滑筋肉腫（ＮＯＳ）；横紋筋肉腫（ＮＯＳ）；胎児性横紋筋肉腫；槽横紋筋肉腫；間質肉腫（ＮＯＳ）；複合腫瘍（悪性、ＮＯＳ）；ミュラー複合腫瘍；腎臓芽細胞腫；肝臓芽細胞腫；癌肉腫（ＮＯＳ）；間葉腫（悪性）；ブレンナー腫（悪性）；葉状腫瘍（悪性）；滑膜肉腫（ＮＯＳ）；中皮腫（悪性）；未分化胚細胞腫；胎生期癌（ＮＯＳ）；奇形腫（悪性、ＮＯＳ）；卵巣甲状腺腫（悪性）；絨毛癌；中腎腫（悪性）；血管肉腫；血管内皮腫（悪性）；カポージ肉腫；血管周囲細胞腫（悪性）；リンパ管肉腫；骨肉腫（ＮＯＳ）；皮質近接部骨肉腫；軟骨肉腫（ＮＯＳ）；軟骨芽細胞腫（悪性）；間葉軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍（悪性）；エナメル上皮歯原性肉腫；エナメル上皮腫（悪性）；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫（悪性）；脊索腫；神経膠腫（悪性）；上衣腫（ＮＯＳ）；星状細胞腫（ＮＯＳ）；原型質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫（ＮＯＳ）；希突起膠腫（ＮＯＳ）；希突起膠細胞腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫（ＮＯＳ）；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫（ＮＯＳ）；網膜芽腫（ＮＯＳ）；嗅神経神経原性腫瘍；髄膜腫（悪性）；神経線維肉腫；神経鞘腫（悪性）；顆粒細胞腫瘍（悪性）；悪性リンパ腫（ＮＯＳ）；ホジキン病（ＮＯＳ）；ホジキン性病側肉芽種（ＮＯＳ）；悪性リンパ腫（小リンパ球性）；悪性リンパ腫（大細胞、散在性）；悪性リンパ腫（濾胞状、ＮＯＳ）；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキン性リンパ腫；悪性組織球増殖；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病（ＮＯＳ）；リンパ性白血病（ＮＯＳ）；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病（ＮＯＳ）；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病（ＮＯＳ）；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；およびヘアリーセル白血病。
【００３３】
さらに、このＣＡ遺伝子は、加齢または神経変性に関連する疾患などの他の疾患（しかしこれらに限定はされない）に関与し得る。
【００３４】
この文脈において、「関連」とは、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が、癌腫において、正常な細胞と比較して差次的に発現されるか、活性化されるか、不活化されるかまたは改変されるかのいずれかであることを意味する。以下で概略を示すように、ＣＡ配列としては、癌腫において、アップレギュレーションされる（すなわち、より高レベルで発現する）配列、ならびにダウンレギュレーションされる（すなわち、より低レベルで発現する）配列が、挙げられる。ＣＡ配列としてはまた、改変された配列（すなわち、切断された配列、または置換、欠失、もしくは挿入（点変異を含む）を有する配列）もまた挙げられ、同じ発現プロファイルまたは改変されたプロファイルのどちらかを示す。好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、ヒト由来である；しかし、当業者によって理解されるように、他の生物由来のＣＡ配列は、疾患の動物モデルおよび薬物評価の動物モデルにおいて、有用であり得る。従って、他のＣＡ配列は、哺乳類（げっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモット、など）、霊長類、家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、などが挙げられる）を含む）を含む、脊椎動物から、提供される。幾つかの場合において、原核生物のＣＡ配列は、有用であり得る。他の生物由来のＣＡ配列は、以下で概要を示す技術を使用して、得られ得る。
【００３５】
ＣＡ配列は、核酸配列およびアミノ酸配列の両方を包含し得る。１つの実施形態において、ＣＡ配列は、組換え核酸である。本明細書中の用語「組換え核酸」によって、一般的にポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、自然界で普通に見出されない形態にて、本来はインビトロで形成される核酸が、意味される。従って、組換え核酸はまた、直鎖形態で単離された核酸、または普通は結合されないＤＮＡ分子の連結によってインビトロで形成されたベクターであり、両方とも、本発明の目的のための組換え体と考えられる。一旦、組換え核酸が作られ、そして宿主細胞または宿主生物に再導入されれば、組換え核酸は、インビトロ操作ではなくむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を使用して複製することが、理解される；しかし、このような核酸は、一旦組換え的に生産されれば、その後インビボで複製されても、やはり、本発明の目的のための組換え体であるかまたは本発明の目的のために単離されていると考えられる。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）のポリマー形態である。この用語は、この分子の一次構造のみを指す。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。この用語はまた、公知の型の改変（例えば、当該分野で公知である標識）、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上をアナログで置換すること、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電結合（例えば、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合など）を有する改変、付属部分（例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）を含む改変、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を含む改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変結合（例えば、αアノマー核酸など）を含む改変、ならびにそのポリヌクレオチドの非改変形態を包含する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、指定配列に「由来する」ポリヌクレオチドとは、指定ヌクレオチド配列の一領域に対応する、少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列から構成される、ポリヌクレオチド配列を指す。「対応する」とは、その指定配列と相同であることまたはその指定配列に対して相補的であることを意味する。好ましくは、そのポリヌクレオチドが由来する領域の配列は、ＣＡ遺伝子にとって独特である配列と相同であるかまたはその配列と相補的である。
【００３７】
同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して（すなわち、上で示されるような組換え核酸の発現を通して）作られる、タンパク質である。組換えタンパク質は、少なくとも１つ以上の特徴により、天然に存在するタンパク質から区別される。例えば、そのタンパク質は、通常は野生型の宿主において関連しているタンパク質および化合物のうちのいくらかまたは全てから、単離され得るかまたは精製され得、従って、実質的に純粋であり得る。例えば、単離されたタンパク質は、通常は天然の状態において関連している物質のうちの少なくとも幾つかが付随しない（所定のサンプルの総タンパク質重量のうちの、好ましくは少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成する）。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質重量のうちの約５０〜７５重量％を構成し、約８０重量％が好ましく、そして約９０重量％が特に好ましい。この定義は、ある生物由来のＣＡタンパク質を異なった生物または宿主細胞にて産生することを含む。あるいは、このタンパク質は、そのタンパク質が増加した濃度レベルで生成されるように、誘導プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を通して、通常に見られるより有意に高い濃度にて生成され得る。あるいは、このタンパク質は、天然で通常には見出されない形態（以下に考察されるような、エピトープタグの付加、またはアミノ酸の置換、挿入および欠失におけるような）で、あり得る。
【００３８】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、核酸である。当業者に理解されるように、そして以下により完全に概略が示されるように、ＣＡ配列は、種々の適用において有用である。ここで適用としては、診断適用（天然に存在する核酸を検出する）ならびにスクリーニング適用が挙げられる；例えば、ＣＡ配列に対する核酸プローブを含むバイオチップが、生産され得る。最も広い意味においては、本明細書中の「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」または等価物は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド、８ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、または１００個までのヌクレオチドのオリゴマーである。「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、またはホスホジエステル結合および／もしくは任意の代替結合により連結されたヌクレオチドのポリマーを包含し得る。
【００３９】
本発明の核酸は、一般にリン酸ジエステル結合を含むが、以下で概略を示されるような幾つかの場合（例えば、アンチセンス適用において、または核酸が候補薬剤である場合）において、代替の骨格（例えば、以下が挙げられる：ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）（Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびこの中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４），Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら，Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）、ならびにペプチド核酸の骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７（１９９６）（全ては参考として援用される））を有する核酸アナログが、使用され得る。他のアナログ核酸としては、陽性の骨格（Ｄｅｎｐｃｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７（１９９５））；非イオン化骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７（１９９４）；第２章および第３章，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））および非リボース骨格（米国特許第５，２３５，０３３号および第５，０３４，５０６号、ならびに第６章お��び第７章，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編に記載されるものを含む）を有する、アナログ核酸が挙げられる。１つ以上の炭素環式糖を含む核酸もまた、ある核酸の定義（Ｊｅｎｋｉｎｓら，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ１６９−１７６）の範囲内に、含まれる。幾つかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ，Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ  ６月２日（１９９７）３５頁において、記載される。これらの参考文献の全ては、本明細書中で明示的に参考として援用される。リボース−リン酸骨格のこれらの改変は、種々の理由のため（例えば、アンチセンス適用における使用またはバイオチップ上のプローブとしての使用についての生理学的環境における、このような分子の安定性および半減期を増加させるため）に、なされ得る。
【００４０】
当業者に理解されるように、これらの核酸アナログの全ては、本発明における用途を見出し得る。さらに、天然に存在する核酸とアナログとの混合物が、作製され得る；あるいは、異なった核酸アナログの混合物、および天然に存在する核酸とアナログとの混合物が、作製され得る。
【００４１】
この核酸は、特定されるように、一本鎖または二本鎖であり得るか、あるいは二本鎖配列もしくは一本鎖配列の両方の部分を含み得る。当業者に理解されるように、一本鎖「ワトソン」の叙述はまた、他方の鎖「クリック」の配列を定義する；従って、本明細書中で記載される配列はまた、この配列の相補鎖も含む。この核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡまたはハイブリッド（この核酸が、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどが挙げられる塩基の任意の組合せを含む）であり得る。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドならびにヌクレオチドアナログ、ならびに改変されたヌクレオシド（アミノ改変ヌクレオシドなど）を含む。さらに、「ヌクレオシド」は、非天然アナログ構造を含む。従って、例えば、ペプチド核酸の個々のユニット（それぞれ塩基を含む）は、本明細書中でヌクレオシドと呼ばれる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「タグ」、「配列タグ」または「プライマータグ配列」とは、そのようなタグを中に保有するポリヌクレオチド単位を同定するために役立つ、特定の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを指す。同じ生物学的供給源由来のポリヌクレオチドは、その後の分析においてそのポリヌクレオチドがその供給起源に従って同定され得るように、特定の配列タグを用いて共有結合タグ化される。その配列タグはまた、核酸増幅反応のためのプライマーとしても役立つ。
【００４３】
「マイクロアレイ」とは、固体支持体表面上に形成された、好ましくは別個の領域（各々は、規定領域を有する）からなる線状または２次元のアレイである。マイクロアレイ上の別個の領域の密度は、単一固相支持体表面上にて検出されるべき標的ポリヌクレオチド総数によって決定され、好ましくは少なくとも約５０／ｃｍ２、より好ましくは少なくとも約１００／ｃｍ２、なおより好ましくは少なくとも約５００／ｃｍ２、なおより好ましくは少なくとも約１，０００／ｃｍ２である。本明細書中で使用される場合、ＤＮＡマイクロアレイは、標的ポリヌクレオチドを増幅またはクローン化するために使用されるチップまたは他の表面上に配置された、オリゴヌクレオチドプライマーのアレイである。そのアレイ中の特定のプライマー群各々の位置は既知であるので、標的ポリヌクレオチドの正体は、そのマイクロアレイ中の特定の位置に対するその標的ポリヌクレオチドの結合に基づいて、決定され得る。  
【００４４】
「リンカー」は、制限部位を含む合成オリゴデオキシリボヌクレオチドである。リンカーは、ＤＮＡフラグメントの末端に平滑末端結合されて、後にそのフラグメントをベクター分子中へとクローニングする際に使用され得る制限部位を生じ得る。
【００４５】
用語「標識」とは、アッセイサンプルにおける標的ポリヌクレオチドの存在を示す、検出可能なシグナルを生成可能な組成物をさす。適切な標識としては、放射性同位体、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁気粒子、生体発光部分などが挙げられる。このように、標識とは、分光光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電子的手段、光学的手段、化学的手段、または他の適切な任意の手段によって検出可能である、任意の組成物である。用語「標識」は、検出可能な物理的特性を有する任意の化学基または化学部分を指すため、あるいは化学基または化学部分が検出可能な物理的特性を示すのを引き起こし得る任意の化合物（例えば、基質を検出可能な産物へと転換するのを触媒する酵素）を指すために、使用される。用語「標識」はまた、特定の物理的特性の発現を示す化合物を包含する。標識はまた、結合対のメンバーである化合物であり得、その結合対のもう一方のメンバーは、検出可能な物理的特性を保有する。
【００４６】
用語「支持体」は、従来の支持体、例えば、ビーズ、粒子、ディップスティック、繊維、フィルター、膜、およびシラン支持体またはケイ酸支持体（例えば、スライドガラス）を指す。
【００４７】
用語「増幅する」とは、例えば、さらなる標的分子、または標的様分子もしくはその標的分子と相補的な分子（これらの分子は、サンプル中の標的分子の存在によって生成される）を含み得る、増幅産物を生成することを意味するために広い意味で使用される。その標的が核酸である状況において、増幅産物は、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼ、またはリバーストランスクリプターゼを用いて酵素的に生成され得る。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」とは、個体から単離された組織または体液（血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、気道、腸管、および尿生殖器管、涙液、唾液、乳汁、細胞（血球を含むが、これに限定されない）、腫瘍、器官、およびインビトロでの細胞培養物構成物サンプルを含むが、これらに限定されない）のサンプルを指す。
【００４９】
用語「生物学的供給源」とは、本明細書中で使用される場合、標的ポリヌクレオチドの起源である供給源を指す。その供給源は、上記のような「サンプル」のどの形態（細胞、組織、または体液を含むが、これらに限定されない）であってもよい。「異なる生物学的供給源」とは、同じ個体の異なる細胞／組織／器官、または同じ種の異なる個体由来の細胞／組織／器官、または異なる種由来の細胞／組織／器官を指し得る。
【００５０】
（癌関連配列）
本発明のＣＡ配列は、リンパ腫を生じるレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ））をマウスに感染させることによって、最初に同定された。そのＣＡ配列は、その後、乳癌サンプルおよび他の癌組織サンプルにおける対応する遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現レベルを決定することによって、確認された。レトロウイルスは、ＲＮＡから生成されたゲノムを有する。レトロウイルスが宿主細胞に感染した後、そのレトロウイルスゲノムの二本鎖ＤＮＡコピー（「プロウイルス」）が、その宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に挿入される。組込まれたプロウイルスは、組込み部位または組込み部位付近の宿主遺伝子の発現に影響を与え得る。これは、レトロウイルス挿入変異誘発として公知の現象である。起こり得る宿主細胞遺伝子発現の変化としては、（ｉ）転写プロモーターおよびエンハンサーとして作用するエレメントとそのプロウイルス中で近いことから生じる、組込み部位付近の遺伝子発現の増加、（ｉｉ）遺伝子自体にプロウイルスが組込んで機能的遺伝子産物の合成を妨げることにより引き起こされる、その遺伝子の機能的不活化、または（ｉｉｉ）正常タンパク質とは異なる活性を有する変異タンパク質の発現が、挙げられる。代表的には、そのようなタンパク質は、未成熟切断されており、Ｃ末端付近の調節ドメインを欠く。そのようなタンパク質は、構成的に活性であり得るか、または正常タンパク質のドミナントネガティブインヒビターとして作用し得る。例えば、レトロウイルスエンハンサー（ＳＬ３−３のエンハンサーを含む）は、挿入部位から約２００キロベースまでの遺伝子に対して作用することが公知である。さらに、これらの配列のうちの多くはまた、他の癌および疾患状態に関与する。この様式で同定される本発明に従うマウス遺伝子配列が、表１〜６に示される。
【００５１】
ＣＡ配列は、本明細書中で概略を示されるＣＡ配列に対する実質的な核酸配列相同性および／またはアミノ酸配列相同性により、最初に同定され得る。このような相同性は、全体的核酸配列または全体的アミノ酸配列に基づき得、一般に、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーション条件のどちらかを使用して、以下で概略を示したように決定される。
【００５２】
１つの実施形態において、ＣＡ配列は、癌腫においてアップレギュレーションされる；つまり、これらの遺伝子の発現は、同じ分化段階の正常組織と比較して、癌腫組織においてより強い。「アップレギュレーション」は、本明細書中で使用される場合、約５０％、より好ましくは約１００％、より好ましくは約１５０％〜約２００％を意味し、３００〜１０００％が好ましい。
【００５３】
別の実施形態において、ＣＡ配列は、癌腫においてダウンレギュレーションされる；つまり、これらの遺伝子の発現は、同じ分化段階の正常組織と比較して、癌腫組織において弱い。「ダウンレギュレーション」は、本明細書中で使用される場合、約５０％、好ましくは約１００％、より好ましくは約１５０％〜約２００％を意味し、３００〜１０００％〜発現なしが、好ましい。
【００５４】
なお別の実施形態において、ＣＡ配列は、改変された配列を有するが、同じ分化段階の正常リンパ組織と比較して、同じ発現プロファイルを示すかまたは改変されたプロファイルを示す、ＣＡ配列である。「改変ＣＡ配列」はまた、本明細書中で使用される場合、短縮された配列、挿入を含む配列、または点変異を含む配列をいう。
【００５５】
本発明のＣＡタンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパク質として分類され得る。好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、細胞内タンパク質である。細胞内タンパク質は、細胞質および／または核において見出され得る。細胞内タンパク質は、細胞機能および複製（例えば、シグナル伝達経路が挙げられる）の全ての局面に、関連する；このようなタンパク質の異常な発現は、無制御または非制御の細胞プロセスを生じさせる。例えば、多くの細胞内タンパク質は、酵素的活性（例えば、プロテインキナーゼ活性、プロテインホスファターゼ活性、プロテアーゼ活性、ヌクレオチドシクラーゼ活性、ポリメラーゼ活性など）を有する。細胞内タンパク質はまた、ドッキングタンパク質（タンパク質の複合体を組織することまたは種々の亜細胞位置にタンパク質を標的化することに関与する）として働き、そしてオルガネラの構造的完全性を保持することに関与する。
【００５６】
細胞内タンパク質の特徴付けにおいてますます認識される概念は、規定された機能が帰因されている、１つ以上のモチーフのタンパク質における存在である。タンパク質の酵素的ドメインにおいて見出される高度に保存された配列に加えて、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質において、高度に保存された配列が同定されている。例えば、Ｓｒｃ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ−２（ＳＨ２）ドメインは、チロシンリン酸化標的を、配列依存的様式にて結合する。ＳＨ２ドメインとは異なったＰＴＢドメインもまた、チロシンリン酸化標的を結合する。ＳＨ３ドメインは、プロリンリッチな標的に結合する。さらに、ごくわずかに例を挙げると、ＰＨドメイン、テトラトリコペプチド反復およびＷＤドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することが示されている。これらの幾つかは、リン脂質または他の二次メッセンジャーとの結合に関与し得る。当業者に理解されるように、これらのモチーフは、一次配列に基づいて同定され得る；従って、タンパク質の配列の分析は、その分子の酵素的可能性および／またはそのタンパク質が結合し得る分子の両方についての洞察を、提供し得る。
【００５７】
好ましい実施形態において、ＣＡ配列は、膜貫通タンパク質である。膜貫通タンパク質は、細胞のリン脂質二重層にまたがる分子である。これらは、細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または両方を有し得る。このようなタンパク質の細胞内ドメインは、細胞内タンパク質について既に記載された機能を含む、多くの機能を有し得る。例えば、その細胞内ドメインは、酵素的活性を有し得、かつ／または追加のタンパク質についての結合部位として働き得る。膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは、両方の役割を果たす。例えば、特定のレセプターチロシンキナーゼは、プロテインキナーゼ活性およびＳＨ２ドメインの両方を有する。その上、そのレセプター分子自体におけるチロシンの自己リン酸化は、さらなるＳＨ２ドメイン含有タンパク質に対する結合部位を作り出す。
【００５８】
膜貫通タンパク質は、１個〜多くの膜貫通ドメインを含み得る。例えば、レセプターチロシンキナーゼ、特定のサイトカインレセプター、レセプターグアニリルシクラーゼおよびレセプターセリン／トレオニンプロテインキナーゼは、１つの膜貫通ドメインを含む。しかし、チャネルおよびアデニリルシクラーゼを含む種々の他のタンパク質は、多くの膜貫通ドメインを含む。多くの重要な細胞表面レセプターは、７つの膜に広がる領域を含むので、「７回膜貫通ドメイン」タンパク質として分類される。重要な膜貫通タンパク質レセプターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター、ヒト成長ホルモンレセプター、グルコーストランスポーター、トランスフェリンレセプター、上皮成長因子レセプター、低密度リポタンパク質レセプター、レプチンレセプター、インターロイキンレセプター（例えば、ＩＬ−１レセプター、ＩＬ−２レセプターなど）。ＣＡタンパク質は、アポトーシスを調節する遺伝子（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＢｃｌ−ｘ）に由来し得るか、またはアポトーシスの調節において役割を果すことが示されている。
【００５９】
膜貫通ドメインの特徴としては、その後に荷電アミノ酸が続き得るおよそ２０個連続する疎水アミノ酸を含む。従って、特定のタンパク質のアミノ酸配列の分析において、そのタンパク質内における膜貫通ドメインの位置決定および数は、予測され得る。
【００６０】
膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、様々である；しかし、保存されたモチーフが、種々の細胞外ドメインの間で、くり返し見出される。保存的な構造および／または機能は、異なった細胞外モチーフに帰せられている。例えば、サイトカインレセプターは、システインクラスターおよびＷＳＸＷＳ（Ｗ＝トリプトファン、Ｓ＝セリン、Ｘ＝任意のアミノ酸）モチーフによって特徴付けられる。免疫グロブリン様ドメインは、高度に保存的である。ムチン様ドメインは、細胞接着に関与し得、そしてロイシンリッチ反復は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与し得る。
【００６１】
多くの細胞外ドメインは、他の分子への結合に関連する。一局面において、細胞外ドメインは、レセプターである。レセプタードメインを結合する因子は、循環型リガンド（ペプチド、タンパク質、またはアデノシンのような低分子などであり得る）を含む。例えば、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦなど）は、同族のレセプターに結合して種々の細胞応答を開始する、循環型成長因子である。他の因子としては、サイトカイン、マイトジェン因子、神経栄養因子などが挙げられる。細胞外ドメインは、細胞結合分子にもまた、結合する。この点において、細胞外ドメインは、細胞間相互作用を媒介する。細胞結合リガンドは、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより細胞に係留され得るか、または、それ自体が膜貫通タンパク質であり得る。細胞外ドメインは、細胞外マトリックスにもまた結合し、細胞構造の保持に貢献する。
【００６２】
膜貫通ＣＡタンパク質が、本発明において特に好ましい。なぜなら、それは、本明細書中で記載されるように、免疫療法の良い標的であるからである。さらに、以下で概略を示されるように、膜貫通タンパク質は、画像化様式において、有用であり得る。
【００６３】
膜貫通タンパク質は、膜貫通配列の除去により（例えば、組換え方法を通して）、可溶性にされ得ることもまた、当業者に理解される。さらに、可溶性にされている膜貫通タンパク質は、適切なシグナル配列の付加により、組換え手法を通して分泌され得る。
【００６４】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、分泌タンパク質である；この分泌は、構成的分泌または制御される分泌の、どちらかであり得る。これらのタンパク質は、分泌経路へその分子を標的化する、シグナルペプチドまたはシグナル配列を有する。分泌タンパク質は、多くの生理学的事象に関与する；その循環する性質のために、分泌タンパク質は、種々の他の細胞型に、シグナルを伝達するために働く。この分泌タンパク質は、オートクライン様式（その因子を分泌する細胞に対して作用する）、パラクライン様式（その因子を分泌する細胞に近い細胞に対して作用する）またはエンドクライン様式（遠くの細胞に対して作用する）で、機能し得る。従って、分泌分子は、多くの生理学の局面の調節または改変において、用途を見出す。分泌タンパク質であるＣＡタンパク質は、診断マーカー（例えば、血液検査のため）に対する良い標的として働くので、本発明において特に好ましい。
【００６５】
（ＣＡ配列およびホモログ）
ＣＡ配列は、本明細書中で概略を示されるＣＡ配列に対する実質的な核酸配列相同性および／または実質的なアミノ酸配列相同性により、最初に同定される。このような相同性は、核酸またはアミノ酸の配列全体に基づき得、大概、相同性プログラムまたはハイブリダイゼーション条件のどちらかを使用して、以下で概略を示したように、決定される。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、核酸は、その核酸配列と表１〜表６の核酸のうちの１つとの全体の相同性が、好ましくは約７５％より高く、より好ましくは約８０％より高く、さらにより好ましくは約８５％より高く、そして最も好ましくは約９０％より高い場合、「ＣＡ核酸」である。幾つかの実施形態において、その相同性は、約９３％から９５％または９８％までと同じくらいの高さである。好ましい実施形態において、配列同一性または配列類似性を決定するために使用される配列は、表１〜表６の核酸配列から選択される。別の実施形態において、この配列は、表１〜表６の核酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体である。別の実施形態において、その配列は、本明細書中でさらに記載される配列改変体である。
【００６７】
この文脈における相同性とは、配列類似性または配列同一性を意味する（同一性が好ましい）。相同性の目的のために好ましい比較は、配列決定エラーを含む配列を、正しい配列に対して比較することである。この相同性は、当該分野で公知である標準的技術を使用して決定される。この標準的技術としては以下が挙げられるが、これらに限定はされない：局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））、相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））、類似性探索法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８））、これらのアルゴリズムの電算化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、Ｂｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）に記載）（好ましくはデフォルト設定を使用する）、または視覚的検査。
【００６８】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連配列群から、進行的な対合アラインメントを使用して、多様な配列アラインメントを作製する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントの作製に使用されるクラスター関係（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を示すツリー（ｔｒｅｅ）もまた、プロットし得る。ＰＩＬＥＵＰは、進行的アラインメント法（Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７））の単純化を使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）に記載される方法と類似する。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、デフォルトギャップ重量（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）３．００、デフォルトギャップ長重量（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）０．１０、および重み付けエンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｅｎｄ  ｇａｐ）が挙げられる。
【００６９】
有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）アルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）において記載）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／から得られる）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、幾つかの探索パラメータを使用する。パラメータの殆どは、デフォルト値に設定される。この調節可能なパラメータは、以下の値に設定される：重複範囲（ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ）＝１、重複画分（ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝０．１２５、ワード閾値（ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  ＳパラメータおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは、動値（ｄｙｎａｍｉｃ  ｖａｌｕｅ）であり、そして特定の配列の組成および目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に依存して、プログラム自体によって確立される；しかし、この値は、感度を上げるために調節され得る。アミノ酸配列同一性％は、整列された領域の「長い方の」配列の残基の総数によって除算された、対応同一残基の数によって決定される。「長い方の」配列は、整列された領域において最も多くの実際の残基を有する配列である（ＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により、アラインメントスコアを最大にするために導入されるギャップは無視される）。
【００７０】
従って、「核酸配列同一性百分率（％）」は、表１〜表６の核酸のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基の百分率として、定義される。好ましい方法は、デフォルトパラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを、重複範囲および重複画分（それぞれ１および０．１２５に設定される）と共に利用する。
【００７１】
このアラインメントは、整列される配列におけるギャップの導入を、含み得る。さらに、表１〜表６の核酸のヌクレオチドより多いかより少ないかどちらかであるヌクレオチドを含む配列について、相同性の百分率は、相同なヌクレオチドの数に基づいて（ヌクレオチドの総数と関係して）決定されることが理解される。従って、例えば、本明細書中で同定される配列より短い配列の相同性は、短い方の配列におけるヌクレオチドの数を使用して、決定される。
【００７２】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列もしくはそのフラグメント、またはそれらの相補配列に対して、中ストリンジェンシー〜高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド組成が、提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野で周知である。例示のために、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ（「生理食塩水クエン酸ナトリウム」；９ｍＭ  ＮａＣｌ、０．９ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液中での予備洗浄；５０〜６０℃、５×ＳＳＣにて一晩のハイブリダイゼーション；その後、０．１％ＳＤＳを含む、各々２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣを用いる、６５℃で２０分間の２回の洗浄を包含する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはそのハイブリダイゼーションを実施する温度を変化することによって、容易に操作され得ることを、当業者は理解する。例えば、別の実施形態において、適切な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、ハイブリダイゼーション温度が例えば６０〜６５℃または６５〜７０℃に増加されること以外は、上記のような条件が挙げられる。ストリンジェントな条件はまた、不安定化剤（例えば、ホルムアミド）の添加によっても、達成され得る。
【００７３】
従って、例えば、図において同定される核酸またはその相補鎖に、高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする核酸は、ＣＡ配列と考えられる。高ストリンジェンシー条件は、当該分野に公知である；例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９およびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編を参照のこと。これらは両方、本明細書において参考として援用される。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、異なった環境において異なる。より長い配列は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見出される。一般に、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度、ｐＨにおいて、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように、選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）その標的に相補的なプローブのうちの５０％が、その標的配列と平衡状態でハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍで、５０％のプローブが平衡状態を占める）。ストリンジェント条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０からｐＨ８．３で、約１．０Ｍナトリウムイオン未満（代表的には、約０．０１Ｍから１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩））、ならびに温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対し少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）に対し少なくとも約６０℃である、条件である。別の実施形態において、より低いストリンジェントハイブリダイゼーション条件が、使用される；当該分野で公知であるように、例えば、中程度ストリンジェンシー条件または低いストリンジェンシー条件が、使用され得る；ＭａｎｉａｔｉｓおよびＡｕｓｕｂｅｌ（既出）およびＴｉｊｓｓｅｎ（既出）を参照のこと。
【００７４】
さらに、本発明のＣＡ核酸配列は、より大きい遺伝子の断片である（すなわち、核酸セグメントである）。あるいは、ＣＡ核酸配列は、癌遺伝子位置の指標として役立ち得る。例えば、ＣＡ配列は、癌原遺伝子を活性化させるエンハンサーであり得る。この文脈における「遺伝子」は、コード領域、非コード領域、およびコード領域と非コード領域との混合を含む。従って、当業者に理解されるように、本明細書中で提供される配列を使用して、より長い配列または全長配列のどちらかのクローニングのための当該分野で周知である技術（ＭａｎｉａｔｉｓらおよびＡｕｓｕｂｅｌら（既出）（本明細書で参考として明示的に援用される）を参照）を使用して、ＣＡ遺伝子のさらなる配列が、得られ得る。大概、これは、ＰＣＲ（例えば、速度論的（ｋｉｎｅｔｉｃ）ＰＣＲ）を使用して行われる。
【００７５】
（ＣＡ発現の検出）
一旦ＣＡ核酸が同定されれば、これは、クローン化され得、必要な場合、その構成部分は、ＣＡ核酸全体を形成するように組換えられる。一旦天然の供給源から単離される（例えば、プラスミドもしくは他のベクターの中に含まれるか、またはこれらから直鎖状核酸セグメントとして切り出される）と、その組換えＣＡ核酸は、さらに他のＣＡ核酸（例えば、追加のコード領域）を同定および単離するためのプローブとして、使用され得る。これは、改変ＣＡ核酸または改変体ＣＡ核酸および改変ＣＡタンパク質または改変体ＣＡタンパク質を作製するための「前駆体」核酸としてもまた、使用され得る。好ましい実施形態において、一旦ＣＡ遺伝子が同定されると、そのヌクレオチド配列は、そのＣＡ遺伝子に特異的なプローブを設計するために使用される。
【００７６】
本発明のＣＡ核酸は、いくつかの方法で使用される。最初の実施形態において、ＣＡ核酸に対してハイブリダイズ可能な核酸プローブが、作製され、そして、バイオチップに結合される。このバイオチップは、スクリーニング方法および診断方法において使用されるか、または遺伝子療法および／またはアンチセンス適用のために、使用される。あるいは、ＣＡタンパク質のコード領域を含むＣＡ核酸は、ＣＡタンパク質発現のための発現ベクターに入れられ得る。この発現は、やはり、スクリーニング目的または患者への投与の目的のためのどちらかである。
【００７７】
ＤＮＡマイクロアレイ技術における最近の発展は、１つの固相支持体上における複数の標的ＣＡ核酸分子の大規模アッセイを実施することを可能にする。米国特許第５，８３７，８３２号（Ｃｈｅｅら）および関連特許出願は、サンプル中の特定の核酸配列のハイブリダイゼーションおよび検出のためのオリゴヌクレオチドプローブのアレイを固定することを記載する。目的の組織から単離された目的の標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡチップにハイブリダイズされ、そしてその標的ポリヌクレオチドの優先度および別個のプローブ位置でのハイブリダイゼーションの程度に基づいて、その特定の配列が検出される。アレイの１つの重要な使用は、差次的な遺伝子発現の分析においてであり、この場合、種々の細胞（しばしば、目的の細胞とコントロール細胞）における遺伝子発現プロフィールが比較され、個々の細胞間での遺伝子発現のなんらかの差異が同定される。そのような情報は、特定の細胞型または組織型において発現される遺伝子の型の同定のため、およびその発現プロフィールに基づく癌状態の診断のために有用である。
【００７８】
代表的には、目的のサンプル由来のＲＮＡは、逆転写に供されて、標識ｃＤＮＡが得られる。米国特許第６，４１０，２２９号（Ｌｏｃｋｈａｒｔら）を参照のこと。その後、そのｃＤＮＡは、チップまたは他の表面上に既知の順序で整列された既知配列のオリゴヌクレオチドもしくはｃＤＮＡに対して、ハイブリダイズされる。その標識ｃＤＮＡがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの位置は、そのｃＤＮＡの配列情報を提供し、一方、標識されたハイブリダイズＲＮＡまたはｃＤＮＡの量は、目的のＲＮＡまたはｃＤＮＡの相対的提示の推定値を提供する。Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７〜４７０（１９９５）を参照のこと。例えば、ヒト癌における遺伝子発現パターンを分析するためのｃＤＮＡマイクロアレイの使用が、ＤｅＲｉｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７〜４６０（１９９６）により記載される。
【００７９】
好ましい実施形態において、ＣＡ核酸（図面において概略が示される核酸配列および／またはその相補配列の両方）に対応する核酸プローブが、作製される。代表的には、これらのプローブは、開示される本発明の配列に基づいて、合成される。バイオチップに結合される核酸プローブは、ＣＡ核酸（すなわち、標的配列（（例えばサンドイッチアッセイにおける）サンプルの標的配列または他のプローブ配列のどちらか））に対して実質的に相補的であるように設計され、よって、標的配列と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが起こる。以下で概略が示されるように、この相補性は、以下の点で、完全である必要はない；任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得、標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨げる。ヌクレオチドレベルでの遺伝子の全体的相同性は、おそらく、約４０％以上、おそらく約６０％以上、なおよりおそらく約８０％以上であることが、予期される。さらに、約８〜１２個以上連続する対応するヌクレオチド配列が存在することが、予期される。しかし、変異の数があまりにも多いために、最低のストリンジェントハイブリダイゼーション条件の下ですら、ハイブリダイゼーションが起こらない場合、この配列は、相補的標的配列ではない。従って、本明細書中で「実質的に相補的」とは、本明細書中で概略を示されるように、プローブが、標的配列に対し、通常の反応条件（特に高いストリンジェンシー条件）下でハイブリダイズするのに充分に相補的であることを、意味する。配列が本発明に従うＣＡ遺伝子に対して独特であるか否かは、当業者に公知である技術によって決定され得る。例えば、その配列は、データバンク（例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ）中の配列と比較されて、非感染宿主または他の生物中にその配列が存在するか否かが決定され得る。その配列はまた、他のウイルス因子（癌を誘導することが公知であるウイルス因子を含む）の既知配列と比較され得る。
【００８０】
核酸プローブは、一般に一本鎖であるが、部分的に一本鎖および部分的に二本鎖であり得る。プローブの鎖状態（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は、標的配列の構造、組成、および特性によって示される。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは、約６塩基長、８塩基長、１０塩基長、１２塩基長、１５塩基長、２０塩基長、３０塩基長〜約１００塩基長の範囲であり、約１０塩基〜約８０塩基が好まし、約３０〜約５０塩基が、特に好ましい。つまり、一般に、遺伝子全体は、まれにしかプローブとして使用されない。幾つかの実施形態において、１００塩基までの、ずっと長い核酸が、使用され得る。プローブは、相補的テンプレート配列と、当業者によって公知である条件下でハイブリダイズするに充分に特異的である。プローブ配列と、それらがハイブリダイゼーションの間にハイブリダイズする相補的テンプレート（標的）配列との間のミスマッチ数は、ＦＡＳＴＡ（デフォルト設定）により決定した場合に、一般的には、１５％を超えず、通常は１０％を超えず、好ましくは５％を超えない。
【００８１】
オリゴヌクレオチドプローブとしては、核酸中で通常見出される天然に存在する複素環塩基（ウラシル、シトシン、チミン、アデニンおよびグアニン）、ならびに改変された塩基および塩基アナログが挙げられ得る。標的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションに適合性の任意の改変された塩基または塩基アナログは、本発明の実施に有用である。これらのプローブの糖部分またはグリコシド部分は、デオキシリボース、リボースおよび／またはこれらの糖の改変された形態（例えば、２’−Ｏ−アルキルリボースのようなもの）を含み得る。好ましい実施形態において、糖部分は、２’−デオキシリボースであるが、標的配列へとハイブリダイズするプローブの能力に適合性の任意の糖部分が使用され得る。
【００８２】
１つの実施形態において、プローブのヌクレオシド単位は、当該分野で周知のようにホスホジエステル骨格で連結されている。さらなる実施形態において、ヌクレオチド内結合は、プローブの特異的なハイブリダイゼーションに適合性の、当業者に公知の任意の結合（ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルファメート（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号）およびポリアミド（すなわち、ペプチド核酸）が挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る。ペプチド核酸は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００、米国特許第５，７１４，３３１号、およびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５に記載されている。
【００８３】
特定の実施形態において、プローブは、キメラ分子であり得る；すなわち、１種以上の塩基もしくは糖サブユニットを含み得るか、そして／または、１種以上の結合が同じプライマー内であり得る。プローブは、当該分野で公知であるように、その標的配列へのハイブリダイゼーションを促進する部分（例えば、インターカレーターおよび／または副溝結合剤）を含み得る。塩基、糖およびヌクレオシド内骨格の改変、ならびにプローブ上の任意の吊り下げ基（ｐｅｎｄａｎｔ  ｇｒｏｕｐ）の存在は、配列特異的な様式でその標的配列に結合するプローブの能力に適合性である。既知または開発されるものの両方の、多数の構造改変体が、これらの結合内で可能である。有利なことには、本発明に従うプローブは、シグナル増幅を可能にするような構造特性を有し得る。このような構造特性は、例えば、Ｕｒｄｅａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２４：１９７−２００（１９９１））または欧州特許番号ＥＰ−０２２５，８０７によって記載されたような分枝ＤＮＡプローブである。さらに、プローブを形成する種々の複素環塩基、糖ヌクレオシドおよびヌクレオチドを調製するための合成方法、ならびに特定の所定の配列のオリゴヌクレオチドの調製はよく開発されており、当該分野で公知である。オリゴヌクレオチド合成についての好ましい方法は、米国特許第５，４１９，９６６号の教示を援用する。
【００８４】
標的核酸の多型および／または二次構造、データの冗長性などを説明するために、多数のプローブが特定の標的配列について設計され得る。配列あたり１種以上のプローブが使用されるいくつかの実施形態において、オーバーラッププローブまたは単一の標的ＣＡ遺伝子の異なる部位に対するプローブのいずれかが使用される、すなわち、２、３、４、またはそれ以上（３つが好ましい）のプローブが特定の標的についての冗長性を構築するために使用される。プローブは、オーバーラップ（すなわち、いくつかの共通した配列を有する）であり得るか、または、ＣＡ遺伝子の別々の配列について特異的であり得る。複数の標的ポリヌクレオチドが本発明に従って検出される場合、特定の標的ポリヌクレオチドに対応する各プローブまたはプローブ基は、マイクロアレイの別個の領域に配置される。
【００８５】
プローブは、溶液中（例えば、ウェル中またはマイクロアレイの表面上）であり得るか、または固体支持体に結合され得る。使用され得る固体支持体物質の例としては、プラスチック、セラミック、金属、樹脂、ゲルおよび膜が挙げられ得る。固体支持体の有用な型としては、プレート、ビーズ、磁気物質、マイクロビーズ、ハイブリダイゼーションチップ、膜、クリスタル、セラミックおよび自己アセンブリ単層が挙げられる。好ましい実施形態は、二次元または三次元マトリクス（例えば、複数のプローブ結合部位を有するゲルまたはハイブリダイゼーションチップ）を含む（Ｐｅｖｚｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．＆Ｄｙｎ．９：３９９−４１０，１９９１；ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１６７９−８４，１９９２）。ハイブリダイゼーションチップは、標的核酸に実質的にハイブリダイズする非常に大きなプローブアレイを構築するのに使用され得る。チップのハイブリダイゼーションパターンの分析は、標的ヌクレオチド配列の同定を補助し得る。パターンは、手動または機械的に分析され得るが、ハイブリダイゼーションによる位置配列決定が、コンピュータ分析および自動化につながることは明らかである。配列再構築のために開発されているアルゴリズムおよびソフトウェアは、本明細書中に記載される方法に適用可能である（Ｒ．Ｄｒｍａｎａｃら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．＆Ｄｙｎ．５：１０８５−１１０２，１９９１；Ｐ．Ａ．Ｐｅｖｚｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．＆Ｄｙｎ．７：６３−７３，１９８９）。
【００８６】
当業者に理解されるように、核酸は、広汎な種々の方法によって、固体保持体に結合され得るか、または固定化され得る。本明細書中の「固定化された」および文法的同義語により、核酸プローブと固体支持体との間の接着または結合が、以下で概略を示すような、結合、洗浄、分析、および除去の条件下で、充分に安定であることが、意味される。結合は、共有結合または非共有的結合であり得る。本明細書中の「非共有的結合」および文法的同義語により、静電的、親水性、および疎水性の相互作用のいずれか１つ以上を意味する。非共有的結合には、分子（ストレプトアビジンなど）の支持体への共有結合およびビオチン化プローブのストレプトアビジンへの非共有的結合が、含まれる。本明細書中の「共有結合」および文法的同義語は、固体支持体およびプローブの２つの部分が、少なくとも１つの結合（σ結合、π結合、および配位結合が挙げられる）により、結合していることを意味する。共有結合は、プローブと固体支持体との間に直接形成され得るか、またはクロスリンカーにより、あるいは固体支持体もしくはプローブまたは両分子のいずれかに特異的な反応基を含めることにより、形成され得る。固定化はまた、共有的相互作用および非共有的相互作用の組合せに関与し得る。
【００８７】
核酸プローブは、共有結合によって（例えば、カップリング剤を用いた結合によって）か、または、共有結合もしくは非共有結合によって（例えば、静電気的相互作用、水素結合もしくは抗体−抗原結合、または、これらの組み合せによって）、固体支持体に結合され得る。代表的なカップリング剤としては、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡ／ＩｇＧ抗体Ｆｃフラグメント、およびストレプトアビジン／プロテインＡキメラ（Ｔ．ＳａｎｏおよびＣ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７８−８１（１９９１））もしくはこれらの誘導体、またはこれらの薬剤の組合せが挙げられる。核酸は、光切断可能な結合、静電気的結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合、ジエステル結合、またはこれらの結合の種類の組合せによって固体支持体に接着され得る。このアレイはまた４，４’−ジメトキリトリチルまたはその誘導体のような選択的に解放可能な結合によって固体支持体に接着され得る。有用であることが見出されている誘導体としては、３［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸または４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸またはＮ−スクシンイミジル−４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−メチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３［ビス−（４−メトキシフェニル）］−ヒドロキシメチル−安息香酸またはＮ−スクシンイミジル−４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−ヒドロキシメチル−安息香酸、Ｎ−スクシンイミジル−３［ビス−（４−メトキシフェニル）］−クロロメトキシ−安息香酸またはＮ−スクシンイミジル−４［ビス−（４−メトキシフェニル）］−クロロメトキシ−安息香酸およびこれらの酸の塩が挙げられる。
【００８８】
一般に、プローブは、（当業者が理解するように）バイオチップに、広汎な種々の方法で結合する。本明細書中に記載されるように、核酸は、最初に合成され、その後にバイオチップに結合するか、または直接バイオチップ上に合成され得る。
【００８９】
バイオチップは、適切な固体基質を含む。本明細書中の「基質」もしくは「固体支持体」または他の文法的同義語は、核酸プローブの結合または接着に適切な、別個のそれぞれの部位を含むように改変され得る、任意の物質であり、少なくとも１つの検出方法に容易である。本発明の固相支持体は、任意の固体物質であり得、ヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび合成を支持するのに適した構造であり得る。好ましくは、固体支持体は、少なくとも１つの実質的に強固な表面を備え、この上にプライマーが固定され得、逆転写反応が行われる。ポリヌクレオチドマイクロアレイ要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）が安定に会合する基質は、種々の物質から製造され得、これらとしては、以下が挙げられる：プラスチック、セラミック、金属、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリケイ酸、ポリカーボネート、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ酢酸、ポリオルソエステル、フマル酸ポリプロピル、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸。基質は、二次元または三次元の形態（例えば、ゲル、メンブラン、薄膜、ガラス、プレート、シリンダー、ビーズ、磁気ビーズ、光ファイバー、織物など）であり得る。アレイの好ましい形態は、三次元アレイである。好ましい三次元アレイは、タグ化ビーズの集合である。各タグ化ビーズには、異なるプライマーが接着されている。タグは、信号手段（例えば、呈色（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）および電磁場（Ｐｈａｒｍａｓｅｑ））によって検出可能であり、タグ化されたビーズ上のシグナルは、（例えば、光ファイバーを用いて）さらに遠隔で検出され得る。固体支持体のサイズは、ＤＮＡマイクロアレイ技術に有用な任意の標準のマイクロアレイサイズであり得、このサイズは、本発明の反応を実施するのに使用される特定の機器にフィットするように仕立てられ得る。一般にこの基質は、光学的検出を可能にし、感知される蛍光を発さない。
【００９０】
好ましい実施形態において、バイオチップの表面およびプローブは、この２つの後の結合のための化学官能基により、誘導体化され得る。従って、例えば、バイオチップは、化学官能基を用いて誘導体化され、この化学官能基としては、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基が挙げられる（アミノ基が特に好ましい）が、これらに限定されない。これらの官能基を使用して、プローブは、プローブ上の官能基を使用して結合され得る。例えば、アミノ基を含む核酸は、アミノ基を含む表面に、例えば（当該分野で公知であるように）リンカーを使用して、結合され得る；例えば、ホモ−二官能性リンカーまたはヘテロ−二官能性リンカーが、周知である（（１９９４）Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｃａｔａｌｏｇ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，１５５−２００ページを、参照のこと（本明細書中に参考として援用される））。さらに、ある場合は、アルキル基のような追加のリンカー（置換された基およびヘテロアルキル基を含む）が、使用され得る。
【００９１】
この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、当該分野に公知であるように合成され、次いで固体支持層の表面上に結合される。当業者に理解されるように、５’末端または３’末端のどちらかが固体支持体に結合され得るか、またはこの結合は、内在性ヌクレオチドを経由し得る。追加の実施形態において、固体支持体への固定化は、非共有的であるのに、とても強くあり得る。例えば、ストレプトアビジンで共有結合的にコートされる表面に結合し、結合を生じるビオチン化オリゴヌクレオチドが、作製され得る。
【００９２】
このアレイは、任意の簡便な方法論（例えば、ポリヌクレオチドマイクロアレイ要素を実施し、次いで、その表面に安定に会合させること）に従って製造される。あるいは、当該分野で公知なように、オリゴヌクレオチドがこの表面上で合成され得る。多数の異なるアレイ構成およびその製造方法が当業者に公知であり、これらは、ＷＯ９５／２５１１６およびＷＯ９５／３５５０５（光合成技術）、米国特許第５，４４５，９３４号（光合成によるインサイチュ合成）、米国特許第５，３８４，２６１号（機械指示流路によるインサイチュ合成）；および米国特許第５，７００，６３７号（スポッティング、印刷または結合による合成）；に開示されている（これらの開示はその全体が本明細書中に参考として援用される）。ＤＮＡをビーズに結合させる別の方法は、ＤＮＡの末端に接着させた特異的なリガンドを用い、ビーズに接着されたリガンド結合分子をつなぐ。可能なリガンド結合パートナー対としては、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、または種々の抗体／抗原対（例えば、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体（Ｓｍｉｔｈら、「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１１２２−１１２６（１９９２）））が挙げられる。支持体へのＤＮＡの共有化学結合は、ホスホアミダイト結合を介してＤＮＡの５’リン酸をコーティングされたミクロスフェアに連結する標準的な結合剤を用いて達成され得る。オリゴヌクレオチドを固体静止基質に固定化する方法は、十分に確立されている。Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）を参照のこと。オリゴヌクレオチドを固体静止基質に接着される好ましい方法は、Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）によって記載されている。固定化は、インサイチュＤＮＡ合成（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：１６７９−１６８４（１９９２））によってか、化学合成オリゴヌクレオチドの共有結合（Ｇｕｏら、前出）によってかのいずれかで、機械式のアレイ技術と組合せて達成され得る。
【００９３】
バイオチップアレイに代表される固相技術に加えて、遺伝子発現はまた、液相アレイを使用して定量し得る。このような系の１つは、キネティックポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。キネティックＰＣＲは、特異的核酸配列の同時の増幅および定量を可能にする。この特異性は、標的部位をまとめた一本鎖核酸配列に優先的に接着するように設計された、合成オリゴヌクレオチドプライマーに由来する。このオリゴヌクレオチドプライマー対は、標的配列のそれぞれの鎖に、特異的非共有的結合複合体を形成する。これらの複合体は、逆方向の二本鎖ＤＮＡのインビトロ転写を容易にする。反応混合物の温度周期は、プライマー結合、転写、および核酸から別々の鎖への再融解の、連続の周期を作り出す。この結果は、標的ｄｓＤＮＡ産物の指数増加である。この産物は、挿入色素または配列特異的プローブのどちらかの使用を通してリアルタイムで定量され得る。ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩは、挿入色素の例であり、ｄｓＤＮＡに優先的に結合し、蛍光シグナルの同時の増加を生じる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術に使用されるような配列特異的プローブは、オリゴヌクレオチドの逆末端に共有的に結合する蛍光色素およびクエンチング分子から構成される。このプローブは、２つのプライマーの間で標的ＤＮＡ配列に、選択的に結合するように設計される。ＰＣＲ反応の間にＤＮＡ鎖が合成される場合、蛍光色素は、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブから切り離され、シグナルの脱クエンチングを生じる。プローブシグナル伝達方法は、挿入色素法より特異的であり得るが、それぞれの場合において、シグナル強度は、産生されるｄｓＤＮＡ産物に比例する。定量方法のそれぞれの種類は、多ウェル液相アレイにおいて使用され得、この多ウェル液相アレイは、それぞれのウェルが、目的の核酸配列に特異的なプライマーおよび／またはプローブを示す。組織または細胞株のメッセンジャーＲＮＡ調製に使用される場合、プローブ／プライマー反応のアレイは、同時に多くの目的の遺伝子産物発現を定量し得る。Ｇｅｒｍｅｒ，Ｓ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：２５８−２６６（２０００）；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６，９８６−９９４（１９９６）を、参照のこと。
【００９４】
（ＣＡタンパク質の発現）
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質をコードするＣＡ核酸は、ＣＡタンパク質を発現する種々の発現ベクター（以下で記載されるようにスクリーニングアッセイにおいて使用され得る）を作製するために使用される。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主遺伝子に組み込まれるベクターのどちらかであり得る。一般に、これらの発現ベクターは、転写調節核酸および翻訳調節核酸（ＣＡタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結される）を含む。用語「制御配列」は、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列の発現に不可欠なＤＮＡ配列を言う。原核生物に対し適切な制御配列としては、例えば、プロモーター、（必要に応じて）オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が、挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが、公知である。
【００９５】
核酸が、別の核酸配列との機能的関係の中に配置される場合、「作動可能に連結される」。例えば、ポリペプチドの分泌に関わる前駆体タンパク質として発現する場合、前駆体配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響する場合、この配列に、作動可能に連結される；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置された場合、コード配列に、作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が、隣接し、分泌リーダーの場合は、隣接し、リーディングフレームにあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接する必要はない。連結は、都合の良い制限部位で結合することによって、達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来技術の実施に従って使用される。転写調節核酸および翻訳調節核酸は、大概、ＣＡタンパク質を発現させるために使用される宿主細胞に、適切である；例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来の転写調節核酸配列および翻訳調節核酸配列は、好ましくは、ＢａｃｉｌｌｕｓにおいてＣＡタンパク質を発現するために使用される。多くの種類の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が、種々の宿主細胞について、当該分野で公知である。
【００９６】
一般に、転写調節配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写停止配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、調節配列は、プロモーターならびに転写開始配列および転写停止配列を含む。
【００９７】
プロモーター配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのどちらかをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのどちらかであり得る。１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせるハイブリッドプロモーターもまた、当該分野に公知であり、本発明において有用である。
【００９８】
さらに、発現ベクターは、追加の要素を含み得る。例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し得、これによって２種の生物（例えば、発現のための哺乳動物細胞または昆虫細胞、およびクローニングおよび増幅のための原核生物宿主）において維持される。さらに、発現ベクターの組み込みのために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列（好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同配列）を含む。組み込むベクターは、ベクター内封入のために適切な相同配列の選択により、宿主細胞における特定の遺伝子座に指向され得る。組み込みベクターの構築物は、当該分野で周知である。
【００９９】
さらに、好ましい実施形態において、発現ベクターは、選択マーカー遺伝子を含み、形質転換される宿主細胞の選択を可能にする。選択遺伝子は、当該分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変化する。
【０１００】
本発明のＣＡタンパク質は、ＣＡタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターによって形質転換された宿主細胞の、ＣＡタンパク質の発現を誘導するかまたは引き起こす適切な条件下での培養によって、産生される。ＣＡタンパク質発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変化し、当業者により、慣用的実験を通して容易に確かめられる。例えば、発現ベクターにおける構成的プロモーターの使用は、宿主細胞の生育および増殖の最適化を必要とし、一方、誘導性プロモーターの使用は、誘導に適切な成育条件を必要とする。さらに、幾つかの実施形態において、収集のタイミングは、重要である。例えば、昆虫細胞発現において使用されるバキュロウイルス系は、溶解性のウイルスであり、従って、収集時間選択は、産物産生に決定的であり得る。
【０１０１】
適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、古細菌、真菌、および昆虫、植物ならびに動物細胞（哺乳動物を含む）が挙げられる。特に重要なのは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、Ｓｆ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ細胞、ＴＨＰ１細胞株（マクロファージ細胞株）およびヒト細胞ならびにヒト細胞株である。
【０１０２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現系はまた、当該分野において公知であり、そしてレトロウイルス系を含む。好ましい発現ベクター系は、例えば、一般的にＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８（いずれも本明細書中で参照として明白に援用される）において記載されるレトロウイルスベクター系である。このウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして幅広い宿主範囲を有するので、哺乳動物プロモーターとして特に使用されるのは、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーターが挙げられる。代表的に、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従ってプロモーターエレメントとともにコード配列の側に隣接する。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０に由来するものを含む。
【０１０３】
哺乳動物宿主および他の宿主内に外来核酸を導入する方法は、当該分野において周知であり、そして使用される宿主細胞とともに変化する。技術は、デキストラン媒介性トランスフェクション、カルシウムホスフェート沈殿、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接微量注入を包含する。
【０１０４】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、細菌系において発現される。細菌性発現系は、当該分野において周知である。バクテリオファージ由来のプロモーターはまた、使用され得、そして当該分野において公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターはまた、有用である；例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する、天然に存在する非細菌起源のプロモーターを含み得る。機能性プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が望ましい。発現ベクターはまた、バクテリア中へのＣＡタンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列を含み得る。このタンパク質は、増殖培地内に分泌されるか（グラム陽性細菌）、または細胞膜周辺腔（細胞の内膜と外膜の間に位置される（グラム陰性細菌））内に分泌されるかのいずれかである。細菌発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にするような選択マーカー遺伝子を含み得る。適切な選択遺伝子は、細菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンのような薬物に対して耐性にする遺伝子を含む。選択マーカーはまた、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路におけるもの）を含む。これらの成分は、発現ベクター中で構築される。細菌のための発現ベクターは当該分野において周知であり、とりわけ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓのためのベクターが挙げられる。細菌性発現ベクターは、当該分野において周知の技術（例えば、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーションなど）を使用して細菌宿主細胞内に形質転換される。
【０１０５】
１つの実施形態において、ＣＡタンパク質は、昆虫細胞中で産生される。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、および特にバキュロウイルスをベースにした発現ベクターは、当該分野において周知である。
【０１０６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、酵母細胞中で産生される。酵母発現系は、当該分野において周知であり、そしてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓとＣ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓとＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉとＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅとＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのための発現ベクターを含む。
【０１０７】
ＣＡタンパク質はまた、当該分野で周知の技術を使用して融合タンパク質として作られ得る。従って、例えば、モノクローナル抗体作成のためである。所望のエピトープが小さい場合、ＣＡタンパク質は、免疫原を形成するためにキャリアタンパク質に対して融合され得る。あるいは、ＣＡタンパク質は、発現を増強するために、または他の理由のために融合タンパク質として作られ得る。例えば、ＣＡタンパク質がＣＡペプチドである場合、このペプチドをコードする核酸は、発現目的のために、他の核酸に結合され得る。
【０１０８】
１つの実施形態において、本発明のＣＡ核酸、タンパク質および抗体は、標識される。本明細書中の「標識される」によって、化合物は、化合物の検出を可能にするために結合する少なくとも１つの元素、同位体または化学化合物を有することが意味される。一般的に、標識は、３つのクラスに分類される：ａ）同位体標識であり、これは放射能または重同位体であり得る；ｂ）免疫標識であり、これは、抗体または抗原であり得る；およびｃ）着色または蛍光色素である。標識は、ＣＡ核酸、タンパク質および抗体内に任意の位置で組み込まれ得る。例えば、標識は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを産生し得るべきである。検出可能な部分は、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉのような放射性同位体、例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光または化学発光化合物、あるいは、例えば、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素であり得る。抗体を標識に結合体化するための当該分野で公知の任意の方法が使用され得、これは、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３０：４０７（１９８２）によって記載される方法を含む。
【０１０９】
従って、本発明はまた、ＣＡタンパク質配列を提供する。本発明のＣＡタンパク質は、いくつかの方法で同定され得る。この意味における「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドが挙げられる。当業者によって理解されるように、本発明の核酸配列は、タンパク質配列を生成するために使用され得る。タンパク質配列生成を行なうための種々の方法があり、これには、全遺伝子をクローニングすること、ならびにそのフレームおよびアミノ酸配列を変更すること、またはＣＡタンパク質が、組み込まれるデータベース中のいくつかのタンパク質との相同性を有することと仮定して、フレームを提供するための相同性を検索するために公知の配列とアミノ酸配列を比較することが挙げられる。概して、核酸配列は、相同性について全ての３つのフレームを検索するプログラムに入力される。これは、以下のＮＣＢＩ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴパラメータを使用する好ましい実施形態において行なわれる。このプログラムは、ｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓｔｎである。データベースは、ｎｒである。入力データは、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  ＦＡＳＴＡ  ｆｏｒｍａｔ」としてある。生物リストは、「ｎｏｎｅ」である。「ｅｘｐｅｃｔ」は１０であり；フィルターはデフォルトである。「ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ」は５００であり、「アライメント」は５００であり、そして「整列図」は２つ１組である。「問い合わせ遺伝暗号」は標準（１）である。マトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２であり；ギャップの存在コストは１１であり、残基ギャップコストあたり１であり；そしてλ比は、０．８５デフォルトである。これは、推定タンパク質配列の生成を生じる。
【０１１０】
一般に、本明細書中で用いる用語「ポリペプチド」は、列挙されるポリヌクレオチドによってコードされる全長ポリペプチド、列挙されるポリヌクレオチドによって表される遺伝子によりコードされるポリペプチド、ならびにそれらの部分またはフラグメントの両方をいう。本発明は、天然に存在するタンパク質の改変体を包含し、このような改変体は、天然に存在するタンパク質のホモログであるか、または実質的に類似であり、そして、天然に生じるタンパク質と同じかまたは異なる種（例えば、ヒト、マウス、または列挙されるポリペプチドを天然に発現する他の種（通常は哺乳動物種））の起源であり得る。一般に、改変ポリペプチドは、ギャップオープンペナルティ＝１２、ギャップ拡大ペナルティ＝２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス＝６２のアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムで決定した場合、本明細書中に記載される、差次的に発現されるポリペプチドと、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、通常、少なくとも約９０％、少なくとも９１％、少なくと９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、そしてより通常は、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２−４８９に教示されている。改変ポリペプチドは、天然または非天然にグリコシル化され得、すなわち、このポリペプチドは、対応する天然に存在するタンパク質において見られるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する。
【０１１１】
改変体もまた本発明の範囲内である。ポリペプチドの改変体としては、変異体、フラグメントおよび融合体が挙げられる。変異体は、アミノ酸の置換、付加または欠失を含み得る。アミノ酸置換は、保存的なアミノ酸置換であり得、例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位、もしくはアセチル化部位を変更して非必須アミノ酸を排除するか、または、機能するのに必要としない１つ以上のシステイン残基の置換もしくは欠失による誤った折り畳みを最小限にする。保存的アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の全体の電荷、疎水性／親水性および／または立体障害を防ぐものである。改変体は、タンパク質の特定の領域の生物学的活性（例えば、機能ドメイン、および／または、ポリペプチドがタンパク質ファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列に関する領域）を保持または増強するように設計され得る。改変体の作製のためのアミノ酸の変更の選択は、アミノ酸のアクセスのしやすさ（内側  対  外側）（例えば、Ｇｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９８０）１５：２１１を参照のこと）、改変体ポリペプチドの熱安定性（例えば、Ｑｕｅｒｏｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９６）９：２６５を参照のこと）、所望のグリコシル化部位（例えば、ＯｌｓｅｎおよびＴｈｏｍｓｅｎ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１３７：５７９を参照のこと）、所望のジスルフィド結合（例えば、Ｃｌａｒｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３）３２：４３２２；およびＷａｋａｒｃｈｕｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９４）７：１３７９を参照のこと）、所望の金属結合部位（例えば、Ｔｏｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）３０：９７およびＨａｅｚｅｒｂｒｏｕｃｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９３）６：６４３を参照のこと）、およびプロリンループ内の所望の置換基（例えば、Ｍａｓｕｌら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４）６０：３５７９を参照のこと）に基づき得る。システイン欠失ムテインは、米国特許第４，９５９，３１４号に開示されるようにして作製され得る。
【０１１２】
改変体はまた、本明細書中で開示されるポリペプチドのフラグメント（特に、生物学的に活性なフラグメントおよび／または機能ドメインに対応するフラグメント）を含む。目的のフラグメントは、代表的に、少なくとも約８アミノ酸（ａａ）長、１０ａａ長、１５ａａ長、２０ａａ長、２５ａａ長、３０ａａ長、３５ａａ長、４０ａａ長〜少なくとも約４５ａａ長、通常少なくとも約５０ａａ長、少なくとも約７５ａａ長、少なくとも約１００ａａ長、少なくとも約１２５ａａ長、少なくとも約１５０ａａ長、少なくとも約２００ａａ長、少なくとも約３００ａａ長、少なくとも約４００ａａであり、そして、５００ａａ長以上であり得るが、通常、約１０００ａａ長を超えず、このフラグメントは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはそれらのホモログと同一のアミノ酸ストレッチを有する。本明細書中に記載されるタンパク質改変体は本発明の範囲内のポリヌクレオチドによってコードされる。遺伝的コードが、適切なコドンを選択するために使用され得、対応する改変体を構築する。
【０１１３】
癌に関連するポリヌクレオチドの変更された発現が観察される場合、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現の変更されたレベルが癌において役割を果たすようであり得る。
【０１１４】
本明細書中で記載されるように、天然に存在する配列のアミノ酸改変体がまた、ＣＡタンパク質の１つの実施形態内に含まれる。改変体は、好ましくは、野生型配列に対して、好ましくは約７５％より大きい、より好ましくは約８０％より大きい、さらにより好ましくは約８５％より大きい、そして最も好ましくは９０％より大きい相同性を有する。いくつかの実施形態において、相同性は、約９３〜９５または９８％ほど高い。核酸に関する限りでは、このような情況における相同性は、配列類似性または同一性（同一性が好ましい）を意味する。この相同性は、核酸相同性に関して上で略述されるように、当該分野において公知の標準的技術を使用して決定される。
【０１１５】
本発明のＣＡタンパク質は、野生型アミノ酸配列より短くても長くてもよい。従って、好ましい実施形態において、本明細書中の野生型配列の部分またはフラグメントが、ＣＡタンパク質の定義内に含まれる。さらに、上で略述されるように、本発明のＣＡ核酸は、付加的コード領域、および付加的タンパク質配列を当該分野において公知の技術を使用して得るために使用され得る。
【０１１６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、野生型配列と比較して誘導体または改変ＣＡタンパク質である。つまり、以下に、より十分に略述されるように、誘導体ＣＡペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入（アミノ酸置換が特に好ましい）を含む。アミノ酸置換、挿入または欠失は、ＣＡペプチド内の任意の残基で生じ得る。
【０１１７】
本発明のＣＡタンパク質の１つの実施形態において、アミノ酸配列改変体もまた含まれる。これらの改変体は、以下の３つのクラスのうちの１つ以上に含まれる：置換改変体、挿入改変体または欠失改変体。これらの改変体は、通常、改変体をコードするＤＮＡを産生するために、当該分野において周知のカセット式またはＰＣＲ変異誘発あるいは他の技術を使用して、ＣＡタンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異性変異誘発によって調製され、そしてその後、上で略述されるように組み換え細胞培養においてＤＮＡを発現する。しかし、約１００〜１５０残基まで有する改変ＣＡタンパク質フラグメントは、確立された技術を使用するインビトロ合成によって調製され得る。アミノ酸配列改変体は、改変体の前もって決定された性質（ＣＡタンパク質のアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子または種間バリエーションと改変体を区別する特徴）によって特徴付けられる。代表的に改変体は、天然に存在するアナログと同じ定性的生物活性を示すが、より十分に以下に略述されるように、改変された特徴を有する改変体がまた、選択され得る。
【０１１８】
アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位または領域が前もって決定される一方で、変異自体は、前もって決定される必要はない。例えば、所定の部位での変異の実行を最適化にするために、ランダムな変異誘発は、標的コドンまたは領域で実行され得、そして発現したＣＡ改変体は、所望される活性の最良の組み合わせについてスクリーニングされる。公知の配列を有するＤＮＡにおける前もって決定された部位での置換変異を起こすための技術は、周知である（例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＬＡＲ変異誘発）。変異体のスクリーニングは、ＣＡタンパク質活性のアッセイを使用して行なわれる。
【０１１９】
アミノ酸置換は、代表的に、単一残基である；挿入は、通常約１〜２０個のアミノ酸のオーダーであるが、かなり大きな挿入が許容され得る。欠失は、約１〜約２０残基の範囲であるが、いくつかの場合において、欠失はより大きくあり得る。
【０１２０】
置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせが、最終的な誘導体に到達するために使用され得る。概してこれらの変化は、分子の変化を最小にするために数個のアミノ酸上で行なわれる。しかし、より大きな変化は、特定の情況において許容され得る。ＣＡタンパク質の特徴における小さい変化が所望される場合、置換は、概して以下のチャートに従って行なわれる。
【０１２１】
【表１】
2005520543.tif 000002
機能または免疫学的同一性における本質的な変化は、チャートＩに示されるものより保存的でない置換を選択することによって、行なわれる。例えば：変更領域におけるポリペプチドの中軸構造（例えば、α−ヘリックス構造またはβシート構造）；標的部位における分子の電荷または疎水性；あるいは側鎖のかさ高さ、により著しい影響を及ぼす置換が行なわれ得る。一般的にポリペプチド特性における最大の変化を産生することが予測される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル（ｔｈｒｅｏｎｙｌ））は、疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）と（またはこれらによって）置換される；（ｂ）システインまたはプロリンは、任意の他の残基と（またはこれらによって）置換される；（ｃ）電気陽性側鎖（例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジル）を有する残基は、電気陰性残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）と（またはこれらによって）置換される；または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）は、側鎖をもたないもの（例えば、グリシン）と（またはこれらによって）置換されるものである。
【０１２２】
代表的に、改変体は、天然に存在するアナログと同じ定性的生物学的活性を示し、そして同じ免疫応答を顕在化させるが、必要とされる場合、改変体はまた、ＣＡタンパク質の特徴を改変するために選択される。あるいは、改変体は、ＣＡタンパク質の生物学的活性が変更されるように設計され得る。例えば、グリコシル化部位は、変更され得るか、または除去され得、優性な陰性変異が創造され得る、など。
【０１２３】
ＣＡポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内（例えば、スクリーニングにおいて使用するために）に含まれる。共有結合修飾の１つの型は、ＣＡポリペプチドの標的化アミノ酸残基と、ＣＡポリペプチドの選択された側鎖あるいはＮ−またはＣ−末端残基と反応し得る有機誘導体化剤との反応工程を包含する。以下でより十分に記載されるように、二官能性薬剤を用いる誘導体化は、例えば、ＣＡポリペプチドと非水溶性支持マトリクスあるいは抗ＣＡ抗体の精製またはスクリーニングアッセイのための方法において使用するための表面を架橋するために有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル）が挙げられ、そしてジスクシンイミジルエステル（例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）および薬剤（例えば、メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート）が挙げられる。
【０１２４】
他の改変としては、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル、トレオニルまたはチロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のａ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，７９〜８６頁（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１２５】
本発明の範囲内に含まれるＣＡポリペプチドの別の型の共有結合修飾は、ポリペプチドのネイティブのグリコシル化パターンの変更を含む。「ネイティブのグリコシル化パターンの変更」は、本明細書中の目的のために、ネイティブ配列ＣＡポリペプチドにおいて見出される１つ以上の糖質部分の欠失、および／またはネイティブ配列ＣＡポリペプチド中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味することが意図される。
【０１２６】
ＣＡポリペプチドに対するグリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列の変更によって達成され得る。例えば、変更は、ネイティブ配列ＣＡポリペプチドに対する（Ｏ−連結グリコシル化部位について）１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはこれらによる置換によってなされ得る。ＣＡアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化（特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、ＣＡポリペプチドをコードするＤＮＡを前もって選択された塩基で変異させることによって）を介して必要に応じて変性され得る。
【０１２７】
ＣＡポリペプチド上の糖質部分の数を増加する別の方法は、グリコシドをポリペプチドに対して化学的または酵素的に結合することによる。そのような方法は、当該分野において記載される（例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ  ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ，ＬＡ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９〜３０６頁（１９８１））。
【０１２８】
ＣＡポリペプチド上に存在する糖質部分の除去は、グリコシル化のための標的として作用するアミノ酸残基をコードするコドンの、化学的置換または酵素的置換あるいは変異性置換によって達成され得る。化学的脱グリコシル化技術は、当該分野において公知であり、そして例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ、ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８：１３１（１９８１）によって記載される。ポリペプチド上の糖質部分の酵素切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８：３５０（１９８７）によって記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【０１２９】
ＣＡの共有結合修飾の別の型は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号において示される様式で、ＣＡポリペプチドと種々の非タンパク性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つとの連結を含む。
【０１３０】
本発明のＣＡポリペプチドはまた、別のもの（異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列）と融合したＣＡポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法において改変され得る。１つの実施形態において、そのようなキメラ分子は、ＣＡポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。一般的にエピトープタグは、ＣＡポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置されるが、内部融合がまた、いくつかの実施例において許容され得る。ＣＡポリペプチドのこのようなエピトープ−タグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体の使用によって検出され得る。また、エピトープタグの提供は、ＣＡポリペプチドが抗タグ抗体またはエピトープタグに結合するアフィニティーマトリクスの他の型を使用するアフィニティー精製によって容易に精製されることを可能にする。代替の実施形態において、キメラ分子は、ＣＡポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合を含み得る。キメラ分子の二価形態について、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対してであり得る。
【０１３１】
種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は、当該分野において周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９〜２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０〜３６１６（１９８５））；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）５４７〜５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐら，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４〜１２１０（１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２〜１９４（１９９２））；チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３〜１５１６６（１９９１））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３〜６３９７（１９９０））が挙げられる。
【０１３２】
１つの実施形態において、ＣＡタンパク質の定義を用いると、ＣＡファミリーの他のＣＡンパク質、および他の生物由来のＣＡタンパク質もまた含まれ、これは以下に略述されるようにクローン化され、そして発現される。従って、プローブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が、ヒトまたは他の生物由来の他の関連ＣＡタンパク質を見出すために使用され得る。当業者によって理解されるように、特定の有用なプローブおよび／またはＰＣＲプライマー配列は、ＣＡ核酸配列の独特の領域を含む。一般的に当該分野で公知であるように、好ましいＰＣＲプライマーは、約１５〜約３５ヌクレオチド長（約２０〜約３０が好ましい）であり、そして必要であるならばイノシンを含み得る。ＰＣＲ反応のための条件は、当該分野において周知である。
【０１３３】
さらに、本明細書中で略述されるように、図面の核酸によってコードされるものより長いＣＡタンパク質（例えば、付加配列の説明、エピトープまたは精製タグの付加、他の融合配列の付加、などによって）が作られ得る。
【０１３４】
ＣＡタンパク質はまた、ＣＡ核酸によってコードされるタンパク質として同定され得る。従って、本明細書中で略述されるように、ＣＡタンパク質は、配列表の配列、またはその相補体とハイブリダイズする核酸によってコードされる。
【０１３５】
（ＣＡ抗原およびそれに対する抗体）
１つの実施形態において、本発明は、ＣＡ特異的抗体を提供する。好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質が、例えば、免疫療法のために、抗体を生成するために使用され得る場合、ＣＡタンパク質は、少なくとも１つのエピトープまたは決定因子を全長のタンパク質と共有するべきである。ＭＨＣの場合、本明細書中での「エピトープ」または「決定因子」によって、抗体またはＴ細胞レセプターを生成するおよび／または結合するタンパク質の部分が意味される。従って、ほとんどの例において、より小さいＣＡタンパク質に対して作られた抗体は、全長のタンパク質に結合し得る。好ましい実施形態において、エピトープは独特である；つまり、独特のエピトープに対して生成された抗体は、ほとんどまたは全く交差反応を示さない。
【０１３６】
ＣＡポリヌクレオチド配列によってコードされる任意のポリペプチド配列を分析して、ポリペプチドの特定の好ましい領域を決定し得る。高い抗原性の領域は、データから、抗原領域が免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境で、ポリペプチドの表面上に露出されやすいポリペプチドの領域を表す値を選択することによってＤＮＡＳＴＡＲ分析により決定される。例えば、ＣＡポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡＳＴＡＲコンピュータアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて分析され得る（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）。
【０１３７】
慣用的にＤＮＡＳＴＡＲコンピュータアルゴリズムを用いて得られ得るポリヌクレオチドレオチドの特徴としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域およびコイル領域（Ｇａｒｎｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２０：９７（１９７８））；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域およびターン領域（Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８））；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２（１９８２））；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα領域およびβ領域；Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可動性領域；Ｅｍｉｎｉの表面形成領域（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５５（３）：８３６−８３９（１９８５））；ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高い抗原性値の領域（ＣＡＢＩＯＳ，４（ｌ）：１８１−１８６（１９８８））。Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域Ｅｍｉｎｉの表面形成領域ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高い抗原性値の領域（すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメータを用いて同定された場合に、１．５以上の抗原性値を有する４つ以上の連続するアミノ酸を含む領域）は、慣用的に抗原性について高い程度の化能性を示すポリペプチド領域を決定するのに用いられ得る。タンパク質に対する抗体を調製する１つのアプローチは、タンパク質の全てまたは一部のアミノ酸配列の選択および調製、その配列の化学合成、そして適切な動物（代表的にはウサギ、ハムスターまたはマウス）への注射である。オリゴペプチドは、親水性領域に存在するオリゴペプチドに基づくＣＡタンパク質に対する抗体産生の候補として選択され得、従って、成熟なタンパク質中で露出されている傾向にある。さらなるオリゴペプチドは、例えば、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（Ｗｅｌｌｉｎｇ，Ｇ．Ｗ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１８８：２１５−２１８（１９８５）（本明細書中に参考として援用される））を用いて決定され得る。
【０１３８】
１つの実施形態において、用語「抗体」は、抗体フラグメント（当該分野で公知であるように、抗体全体の改変によって産生されるか、または組み換えＤＮＡ技術を使用して新規に合成されたもののいずれかである、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、単鎖抗体（例えば、Ｆｖ）、キメラ抗体、などを含む）を含む。
【０１３９】
ポリクローナル抗体の調製方法は、当業者によって公知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤、および望ましくは、アジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動物中で惹起される。代表的には、免疫剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって哺乳動物内へ注射される。免疫剤としては、図面の核酸によってコードされるタンパク質またはそれらのフラグメントもしくは融合タンパク質が挙げられ得る。免疫された哺乳動物において免疫原であることが公知のタンパク質を免疫剤に結合体化することが有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。使用され得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫プロトコルは、過度の実験をすることなく、当業者によって選択され得る。
【０１４０】
あるいは、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって記載される）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、代表的に、特異的に免疫剤に結合する抗体を産生するか、または産生し得るリンパ球を導き出すために免疫剤で免疫される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。代表的に、免疫剤としては、表１〜１１２の核酸によってコードされるポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合、脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、ハイブリドーマ細胞（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）５９〜１０３頁）を形成するために、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して不死化細胞株とともに使用される。不死化細胞株は、通常形質転換された哺乳動物細胞（特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、その親細胞が酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠乏する場合、代表的に、ハイブリドーマのための培養培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、この物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【０１４１】
モノクローナル抗体技術は、研究、診断および治療の実行に使用される。モノクローナル抗体は、インビトロ診断のために、およびヒト疾患の診断および免疫治療のためにインビボで、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法、免疫細胞病理学およびフローサイトメトリーにおいてしようされる。Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６５７−１６６２。特に、モノクローナル抗体は、癌の診断および治療に広く適用されており、この場合、正常な細胞を回避しつつ、標的悪性病巣を標的化することが望まれる。例えば、米国特許第４，７５３，８９４（Ｆｒａｎｋｅｌら）；同第４，９３８，９４８号（Ｒｉｎｇら）；および同第４，９５６，４５３号（Ｂｊｏｒｎら）を参照のこと。
【０１４２】
一実施形態において、抗体は、二重特異的抗体である。二重特異的抗体は、モノクローナル抗体、好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、これらの抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む多数の「ヒト化」抗体分子が、記載されており、これには、ヒト定常ドメインに融合したげっ歯類Ｖ領域を有するキメラ抗体およびその関連ＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前にヒト支持ＦＲにグラフト化されたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５）、および組換え的にベニアリングされた（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲ（欧州特許公報５１９，５９６（１９９２年１２月２３日公開））が挙げられる。これらの「ヒト化」分子は、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する不要な免疫学的応答を最小限にするように設計され、このことは、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続時間および効力を制限する。本発明の場合、結合特異性の一方は、表１〜６の核酸またはそのフラグメントによってコードされるタンパク質に対してであり、そして他方は、任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニットに対してであり、好ましくは腫瘍特異的なこれらに対してである。
【０１４３】
好ましい実施形態において、以下に記載されるように、ＣＡに対する抗体は、ＣＡの生物学的機能を減少し得るか、または除去し得る。つまり、ＣＡ（またはＣＡを含む細胞）への抗ＣＡ抗体（ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナルのいずれか）の付加は、ＣＡ活性を減少し得るか、または除去し得る。一般的に、活性において、少なくとも２５％の減少が好まれ、さらに、少なくとも約５０％の減少が特に好ましく、そして約９５〜１００％の減少が特に好ましい。
【０１４４】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質に対する抗体は、ヒト化抗体である。「ヒト化」抗体とは、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有し、かつヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいて分子の免疫グロブリン構造を維持する分子をいう。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域にグラフト化された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含み得る。抗原結合部位は、野生型であっても、１つ以上のアミノ酸置換によって改変（例えば、ヒト免疫グロブリンにより密接に類似するように改変）されていても良い。あるいは、ヒト化抗体は、親の非ヒト抗体の抗原結合特性を維持するかまたは実質的に維持しているが、ヒトに投与された場合に、親抗体と比較して減少した免疫原性を示すキメラ抗体に由来し得る。成句「キメラ抗体」とは、本明細書中で使用される場合、２つの異なる抗体（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）由来の配列を含む抗体をいい、これらは代表的には、異なる種由来である。代表的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、１種の哺乳動物由来の抗体の可変領域を模倣し、一方、定常部分は、別の種由来の抗体における配列に相同である。より詳細には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウス抗体フラグメント、一般には、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、ここで、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基は、例えば、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）由来の残基によって置換される。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においてもインポートＣＤＲのいずれにおいても見出されない残基あるいはフレームワーク配列を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、実質的に少なくとも１つ、および代表的には２つの可変ドメインの全てを含み、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応するＣＤＲ領域の全てまたは実質上全ておよび免疫グロブリンのフレームワーク残基（ＦＲ）領域の全てまたは実質上全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、少なくとも免疫グロブリン定常部分（Ｆｃ）（代表的にヒト免疫グロブリンの定常部分）の一部を含む（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３〜５９６（１９９２））。このようなキメラ形態に対する１つの明確な利点は、例えば、可変領域が、通常、例えば、ヒト細胞調製物由来の定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物由来の容易に入手可能なハイブリドーマまたはＢ細胞使用して、現在公知の供給源から誘導され得ることである。可変領域は、調製が容易であり、かつその特異性がその供給源によって影響されないという利点を有するが、ヒトの定常領域は、抗体が注射された場合、非ヒト供給源由来の定常領域よりも、ヒト被験体からの免疫応答を引き起こす可能性がより小さい。
【０１４５】
ヒトにおいて、ヒト化抗体は、親マウスモノクローナル抗体よりも、免疫原性がはるかに小さいので、このヒト化抗体は、アナフィラキシーの危険性が非常に小さいヒトの処置のために使用され得る。従って、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療適用（例えば、新生物疾患の処置のための放射線増感剤としての使用、または例えば、癌治療の副作用を低減する方法における使用）において好ましくあり得る。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、ヒトではない供給源からヒト抗体へ導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と称され、これは、代表的にインポート可変ドメインから得られる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよびその共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））に従って（げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列とヒト抗体の対応配列とを置換することによって）本質的に実行され得る。従って、そのようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで実質的にほとんどインタクトではないヒト可変ドメインは、非ヒト種由来の対応配列によって置換されている。実際問題として、ヒト化抗体は、代表的にいくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１４６】
ヒト抗体はまた、当該分野において公知の種々の技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を使用して産生され得る（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用できる（Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６〜９５（１９９１））。ヒト化抗体は、例えば、以下を含む種々の方法によって達成され得る：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域および定常領域にグラフト化すること（当該分野で「ヒト化」と称されるプロセス）、あるいは、（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様表面でこれらの可変領域を「覆う（ｃｌｏａｋ）」こと（当該分野で、「ベニアリング」と称されるプロセス）。本発明において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体および「ベニアリング」抗体の両方を含む。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座をトランスジェニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されるマウス）内へ導入することによって作られ得る。チャレンジの際に、ヒト抗体産生が観察され、このヒト抗体は、遺伝子の再配列、集合、および抗体レパートリーを含む、全ての点で、ヒトにおいて見出されるものと密接に似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、および以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５〜９３（１９９５）；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７（１９９４）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３（１９９１）（これらの各々は本明細書中で参考と��て援用される）において記載される。
【０１４７】
成句「相補性決定領域」とは、ネイティブの免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に規定するアミノ酸配列をいう。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｋａｂａｔら．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）を参照のこと。成句「定常領域」とは、エフェクター機能を与える抗体分子の部分をいう。本発明において、マウス定常領域は、ヒト定常領域で置換される。本発明のヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリン由来である。重鎖定常領域は、以下の５つのアイソタイプのいずれかから選択され得る：α、δ、ε、γまたはμ。抗体をヒト化する１つの方法は、非ヒト重鎖および軽鎖の配列をヒト重鎖および軽鎖の配列と整列し、非ヒトフレームワークを選択し、そしてこの非ヒトフレームワークを、このような整列に基づいて、ヒトフレームワークで置換し、分子モデリングしてヒト化配列のコンフォメーションを予測し、そして親抗体のコンフォメーションと比較することを包含する。このプロセスに続いて、このヒト化配列モデルの推定コンフォメーションが親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンフォメーションに密接に近づくまで、ＣＤＲの構造を妨害するＣＤＲ領域中の残基の繰返し復帰変異が行われる。このようなヒト化抗体は、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌレセプターによって、取込みおよびクリアランスを促進するようにさらに誘導体化され得る。米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号（これらは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１４８】
ＣＡポリペプチドに対するヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニック動物を使用して作製され得る。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示し、ここで、この動物は、内因性の重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の不活性化に起因して、機能的内因性免疫グロブリンを産生しない。ＷＯ９１／１０７４１はまた、免疫原に対する免疫応答を有し（ｍｏｕｎｔ）し得るトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示し、ここで、抗体は、霊長類定常／可変領域を有し、そしてここで、この抗体は、霊長類定常および／または可変領域を有し、そしてここで、内因性免疫グロブリンコード遺伝子座は置換されているかまたは不活性化されている。ＷＯ  ９６／３０４９８は、哺乳動物における免疫グロブリン遺伝子座を改変する（例えば、定常領域または可変領域の全てまたは一部を置換して改変抗体分子を形成する）Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステムの使用を開示する。ＷＯ  ９４／０２６０２は、不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示する。米国特許第５，９３９，５９８号は、トランスジェニックマウスを作製する方法を開示し、ここでこのマウスは、内因性重鎖を欠き、そして１つ以上の異種定常領域を含む外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現する。
【０１４９】
上記のトランスジェニック動物を使用して、免疫応答は、選択された抗原性分子に生成され得、そして抗体産生細胞が、この動物から取り出されて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用される。免疫化プロトコル、アジュバントなどが、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５に記載されるようなトランスジェニックマウスの免疫化に使用される。モノクローナル抗体は、対応するタンパク質の生物学的活性または生理学的効果を阻害または中和する能力について試験され得る。
【０１５０】
本発明において、本発明のＣＡポリペプチドおよびその改変体は、上記のようなトランスジェニック動物を免疫するために使用される。モノクローナル抗体は、当該分野で公知の方法を使用して作製され、そしてその抗体の特異性は、単離されたＣＡポリペプチドを使用して試験される。ヒトまたは霊長類のＣＡまたはそのエピトープの調製のための方法としては、化学合成、組換えＤＮＡ技術または生物学的サンプルからの単離が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドの化学合成は、例えば、固相ペプチド合成の古典的Ｍｅｒｒｉｆｅｌｄ法（Ｍｅｒｒｉｆｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９，１９６３、本明細書中で参考として援用される）、またはＲａｐｉｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステムを用いるＦＭＯＣストラテジー（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）（ＣａｐｒｉｎｏおよびＨａｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３７：３４０４，１９７２、本明細書中で参考として援用される）によって実施され得る。
【０１５１】
ポリクローナル抗体は、抗原を注射し、次いで、適切な間隔でブーストすることにより、ウサギまたは他の動物を免疫することによって調製され得る。動物は採血され、そして血清が、通常はＥＬＩＳＡまたはバイオアッセイによって、ＣＡタンパク質の作用をブロックする能力に基づいて、精製ＣＡタンパク質に対してアッセイされる。鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウなど）を使用する場合、抗体は、卵黄から単離され得る。モノクローナル抗体は、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒの方法の後、骨髄腫またはリンパ種細胞のような連続的に複製する腫瘍細胞と免疫されたマウス由来の脾細胞を融合することによって調製され得る（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５；ＧｕｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７３：１−４６，ＬａｎｇｏｎｅおよびＢａｎａｔｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１、これらは本明細書中で参考として援用される）。このように形成されたハイブリドーマ細胞は、次いで、限界希釈法によってクローン化され、そして上清が、ＩＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはバイオアッセイによって、抗体産生についてアッセイされる。
【０１５２】
抗体が標的タンパク質を認識しそして特異的に結合する固有の能力は、タンパク質の過剰発現を処置するためのアプローチを提供する。従って、本発明の別の局面は、ＣＡタンパク質に対する特異的抗体で患者を処置することによって、ＣＡポリペプチドの過剰発現に関連する疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【０１５３】
ＣＡタンパク質に対する特異的抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれか）は、上記のように、当該分野で公知の任意の適切な方法によって生成され得る。例えば、マウスまたはヒトのモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術によって生成され得るか、あるいは、ＣＡタンパク質もしくはその免疫学的に活性なフラグメント、または抗イデオタイプ抗体もしくはそのフラグメントが、動物に投与され得、ＣＡタンパク質を認識し、かつこのＣＡタンパク質に結合し得る抗体の産生が誘導される。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含むがこれらに限定されない抗体の任意のクラス由来であり得るか、または鳥類の場合、ＩｇＹおよび抗体の任意のサブクラスに由来し得る。
【０１５４】
免疫治療によって、ＣＡタンパク質に対して惹起された抗体での癌腫の処置が意味される。本明細書中で使用される場合、免疫治療は、受動的であるか、または能動的であり得る。本明細書中で定義されるように、受動免疫治療は、レシピエント（患者）への抗体の受動移送である。能動免疫は、レシピエント（患者）における抗体および／またはＴ細胞応答の誘導である。免疫応答の誘導は、レシピエントに抗体が惹起される抗原を提供することの結果である。当業者によって理解されるように、抗原は、抗体が惹起されることが望ましいポリペプチドをレシピエントに注射すること、または抗原の発現のための条件下でレシピエントと、抗原を発現し得る核酸とを接触させることによって、提供され得る。
【０１５５】
好ましい実施形態において、分泌された成長因子をコードする癌遺伝子は、上述されるように分泌されたタンパク質であるＣＡタンパク質に対して抗体を惹起することによって阻害され得る。理論によって束縛されることなく、処置のために使用される抗体が結合し、そして分泌されたタンパク質がそのレセプターに結合することを防止し、それによって分泌されたＣＡタンパク質を不活化する。
【０１５６】
別の好ましい実施形態において、抗体が惹起されるＣＡタンパク質は、膜タンパク質である。理論によって束縛されることなく、処置のために使用される抗体は、ＣＡタンパク質の細胞外ドメインに結合し、そしてＣＡタンパク質が他のタンパク質（例えば、循環リガンドまたは細胞関連分子）に結合することを防止する。抗体は、膜貫通ＣＡタンパク質のダウンレギュレートを引き起こし得る。当業者によって理解されるように、抗体は、競合的、非競合的であり得るか、またはＣＡタンパク質の細胞外ドメインに結合するタンパク質の非競合的インヒビターであり得る。抗体はまた、ＣＡタンパク質のアンタゴニストである。さらに、抗体は、膜貫通ＣＡタンパク質の活性化を防止する。１つの局面において、抗体がＣＡタンパク質への他の分子の結合を防止する場合、抗体は、細胞の成長を防止する。抗体はまた、細胞傷害性剤（ＴＮＦ−、ＴＮＦ−、ＩＬ−１、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−２が挙げられるがこれらに限定されない）、または化学治療剤（５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキサートなどを含む）に対して細胞を感作し得る。いくつかの例において、抗体が膜タンパク質と複合体化し、それによって細胞傷害性を媒介する場合、抗体は、血清補体を活性化する亜類型に属する。従って、癌は、患者に膜貫通ＣＡタンパク質に対して指向される抗体を投与することによって処置され得る。
【０１５７】
別の好ましい実施形態において、抗体は、治療部分と結合体化される。１つの局面において、治療部分は、ＣＡタンパク質の活性を調節する低分子である。別の局面で、治療部分は、ＣＡタンパク質と関連するか、またはＣＡタンパク質と密接に近位にある分子の活性化を調節する。この治療部分は、癌と関連するプロテアーゼ活性またはプロテインキナーゼ活性のような酵素活性を阻害し得る。
【０１５８】
好ましい実施形態において、治療部分はまた、細胞傷害性の薬剤であり得る。この方法において、細胞傷害性薬剤を腫瘍組織または細胞に対して標的化することは、罹患細胞の数の減少を生じ、それゆえ、癌（リンパ腫を含む）に関連する症状を減少させる。細胞傷害性薬剤は、多数および多様であり、そして細胞傷害性薬剤としては、傷害性薬物または毒素あるいはそのような毒素の活性フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。適切な毒素およびその対応フラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）などが挙げられる。細胞傷害性薬剤はまた、放射性同位元素をＣＡタンパク質に対して惹起される抗体に結合体化すること、または放射性核種を抗体と共有結合するキレート剤に結合することによって作られる放射化学物質を含む。治療部分の膜貫通ＣＡタンパク質への標的化は、目的の癌（すなわち、リンパ腫）における治療部分の局所濃度を増加するばかりでなく、治療部分と関連し得る有害な副作用を減少するように作用する。多くの研究者が、薬剤を悪性組織に選択的に指向する試みにおいて、細胞傷害性物質のキャリアとしてモノクローナル抗体を使用している。より詳細には、多数のモノクローナル抗体が、毒素（例えば、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素）に、またはその酵素活性タンパク質（Ａ鎖）に、ヘテロ二機能性因子を介して結合体化された。例えば、米国特許第４，７５３，８９４号（Ｆｒａｎｋｅｌら）；Ｎｅｖｅｌｌｅら（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ６２：７５−９１；Ｒｏｓｓら（１９８０）Ｅｕｒ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０４；Ｖｉｔｔｅｒａら（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ６２：１５８−１８３；Ｒａｓｏら（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４２：４５７−４６４、およびＴｒｏｗｂｒｉｄｇｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：１７１−１７３を参照のこと。
【０１５９】
別の好ましい実施形態において、抗体が惹起されるＣＡタンパク質は、細胞内タンパク質である。この場合において、抗体は、細胞内への侵入を促進するタンパク質に結合体化され得る。１つの場合において、抗体は、エンドサイトーシスによって細胞へ入る。別の実施形態において、抗体をコードする核酸は、個体または細胞に投与される。そのうえ、ここでＣＡタンパク質は、細胞内で（すなわち、核に）標的化され得、これに対する抗体は、局在を標的にするためのシグナル（すなわち、核局在シグナル）を含む。
【０１６０】
本発明のＣＡ抗体は、特異的にＣＡタンパク質に結合する。本明細書中の「特異的結合」によって、抗体は、少なくとも１０−４〜１０−６Ｍ−１の範囲にある結合定数を有する（好ましくは、１０−７〜１０−９Ｍ−１の範囲を有する）タンパク質と結合することが意味される。
【０１６１】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は、発現後に精製されるかまたは単離される。ＣＡタンパク質は、どのような他の成分がサンプル中に存在するかに依存して、当業者に公知の種々の方法で単離されるか、または精製され得る。標準的な精製方法としては、電気泳動的技術、分子的技術、免疫学的技術およびクロマトグラフィー技術（イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー）ならびに等電点電気泳動が挙げられる。例えば、ＣＡタンパク質は、標準的な抗ＣＡ抗体カラムを使用して精製され得る。タンパク質濃度に関連して、限外濾過技術およびダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）技術もまた、有用である。適切な精製技術における一般的な指針については、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｒ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ（１９８２）を参照のこと。精製の必要性の程度は、ＣＡタンパクの使用に依存して変化する。いくつかの例において、精製は必要ない。
【０１６２】
（癌表現型の検出）
一旦発現され、そして必要に応じて精製されたならば、ＣＡタンパク質および核酸は、多くの適用において有用である。１つの局面において、遺伝子の発現レベルは、癌腫表現型における異なる細胞状態について決定される；つまり、正常な組織および癌組織における遺伝子発現のレベル（以下で略述されるように、いくつかの場合において、予後と関係するリンパ腫の重症度を変えるために）は、発現プロファイルを提供するために評価される。特定の細胞状態または発生点での発現プロファイルは、本質的にその状態の「フィンガープリント」であり；２つの状態は、類似して発現した任意の特定の遺伝子を有し得る一方で、多くの遺伝子の評価は、細胞の状態に独特である遺伝子発現プロファイルの生成を同時に可能にする。異なる状態における細胞の発現プロファイルを比較することによって、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要である（遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方を含む）かに関する情報が得られる。次いで、診断がなされ得るか、または確認され得る：特定の患者由来の用量組織は、正常組織または癌腫組織の遺伝子発現プロファイルを有する。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合、「差示的発現」または文法的に等価なものは、細胞内および細胞間での、遺伝子の一時的発現パターンおよび／または細胞性発現パターンにおける定性的差異ならびに定量的差異の両方をいう。従って、差示的に発現した遺伝子は、定性的に発現を変化させ得、この変化としては、例えば、正常組織  対  癌腫組織における活性化または不活化を含む。つまり、遺伝子は、他の状態と関連して、特定の状態においてスイッチが入り得るか、または切れ得る。当業者によって理解されるように、２つ以上の状態の任意の比較が行われ得る。そのように定性的に調節される遺伝子は、１つのそのような状態または細胞型において標準的な技術によって検出可能であるが、両方では検出不可能である１つの状態または細胞型内における発現パターンを示す。あるいは、発現が増加するまたは減少するという点で、この決定は、定量的である：つまり、遺伝子発現はアップレギュレートされ、転写物の量の増加を生じるか、またはダウンレギュレートされ、転写物の量の減少を生じるかのいずれかである。発現の差異の程度としては、以下に略述されるように、標準的な特性付け技術を介して（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標登録）発現分析（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５〜１６８０（１９９６））（本明細書中で参照として明確に援用される）の使用によって）定量するために十分大きいことのみが必要である。他の技術としては、定量逆転写ＰＣＲ、ノーザン分析およびＲＮａｓｅ保護が挙げられるが、これらに限定されない。上で略述されるように、好ましくは、発現における変化（すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）は、少なくとも約５０％であり、より好ましくは少なくとも約１００％であり、より好ましくは少なくとも約１５０％であり、より好ましくは、少なくとも約２００％であり、３００から少なくとも１０００％までが特に好ましい。
【０１６４】
当業者によって理解されるように、これは、遺伝子転写またはタンパク質レベルのいずれかでの評価によってなされ得る；つまり、遺伝子発現量は、遺伝子転写物のＤＮＡまたはＲＮＡ等価物に対する核酸プローブを使用することでモニターされ得、そして遺伝子発現レベルの定量、あるいは最終的な遺伝子産物自体（タンパク質）は、例えば、ＣＡタンパク質に対する抗体および標準的な免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡなど）の使用または他の技術（質量分光計アッセイ、２Ｄゲル電気泳動アッセイなどを含む）の使用を介してモニターされ得る。従って、ＣＡ遺伝子に対応するタンパク質（すなわち、特定の癌腫表現型（すなわち、リンパ腫）において重要であるとして同定されたもの）は、癌腫に特異的な診断試験において評価され得る。
【０１６５】
好ましい実施形態において、遺伝子発現モニタリングが行われ、そして多くの遺伝子（すなわち、発現プロファイル）は、同時にモニターされるが、複数のタンパク質発現モニタリングもまた、行われ得る。同様に、これらのアッセイはまた、個々に基づいて行われ得る。
【０１６６】
この実施形態において、ＣＡ核酸プローブは、本明細書中で略述されるように、特定の細胞におけるＣＡ配列の検出および定量のためにバイオチップに結合され得る。アッセイは、当該分野で公知のように行われる。当業者によって理解されるように、任意の数の異なるＣＡ配列が、プローブとして使用され得、いくつかのケースにおいて、単一配列アッセイが使用され、そして本明細書中で記載される複数の配列が他の実施形態において使用される。さらに、固相アッセイが記載されているが、任意の数の溶液ベースアッセイもまた、行われ得る。
【０１６７】
好ましい実施形態において、固相ベースアッセイおよび溶液ベースのアッセイの両方が、正常組織と比較された場合、癌腫においてアップレギュレートされるか、またはダウンレギュレートされるＣＡ配列を検出するために使用され得る。ＣＡ配列は変性されるが、同じ発現プロファイルまたは変更された発現プロファイルを示す例において、このタンパク質は、本明細書中で略述されるように検出される。
【０１６８】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質をコードする核酸が検出される。ＣＡタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは検出され得るが、ＣＡタンパク質をコードするｍＲＮＡを検出する方法が、特に興味深い。サンプルにおけるｍＲＮＡの存在は、ＣＡ遺伝子がｍＲＮＡを形成するために転写されることの指標であり、そしてタンパク質が発現されることを示唆する。ｍＲＮＡを検出するためのプローブは、ｍＲＮＡと相補的であり、そしてこのｍＲＮＡとの塩基対である任意のヌクレオチド／デオキシヌクレオチドプローブであり得、そしてこのプローブとしては、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。プローブはまた、本明細書中で規定されるように、検出可能な標識を含むべきである。１つの方法において、ｍＲＮＡは、試験されるべき核酸を固形支持体上（例えば、ナイロン膜）に固定化し、そしてプローブをサンプルにハイブリダイズした後に検出される。洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後、標識が検出される。別の方法において、ｍＲＮＡの検出は、インサイチュで実行される。この方法において、浸透細胞または組織サンプルは、プローブを標的ｍＲＮＡとハイブリダイズさせるために十分な時間の間、検出可能に標識された核酸プローブと接触される。洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後、標識が検出される。例えば、ＣＡタンパク質をコードするｍＲＮＡと相補的なジゴキシゲニン標識リボプローブ（ＲＮＡプローブ）は、ジゴキシゲニンと抗ジゴキシゲニン二次抗体の結合によって検出され、そしてニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェートで発色される。
【０１６９】
好ましい実施形態において、本明細書中で記載されるように、３つのクラスのタンパク質のうちのいずれか（分泌性タンパク質、膜貫通タンパク質または細胞内タンパク質）が、診断アッセイにおいて使用される。ＣＡタンパク質、抗体、核酸、ＣＡ配列を含む改変タンパク質および細胞が、診断アッセイにおいて使用される。この診断アッセイは、個々の遺伝子または対応するポリペプチドレベルについて行われるか、またはアッセイのセットとして行われる。
【０１７０】
本明細書中で記載され、そして定義されるように、ＣＡタンパク質は、癌腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫のようなリンパ腫が含まれるが、これに限定されない）のマーカーとしての使用を見出す。癌腫と推定される組織または患者におけるこれらのタンパク質の検出は、癌腫の型の決定または診断を可能にする。当業者に公知の多くの方法は、癌腫を検出する際の使用を見出す。１つの実施形態において、抗体は、ＣＡタンパク質を検出するために使用される。好ましい方法は、ゲル（代表的には、変性および還元したタンパク質ゲルであるが、等電点電気泳動ゲルなどを含む任意の他の型のゲルでもあり得る）上での電気泳動によって、タンパク質をサンプルまたは患者から分離する。タンパク質を分離した後、ＣＡタンパク質は、このＣＡタンパク質に対して惹起された抗体との免疫ブロッティングによって検出される。免疫ブロッティングの方法は、当業者に周知である。
【０１７１】
別の好ましい方法において、ＣＡタンパク質に対する抗体は、インサイチュでの画像化技術における使用を見出す。この方法において、細胞は、ＣＡタンパク質に対する１から多くの抗体と接触される。洗浄して非特異的抗体結合を除去した後、抗体の存在が検出される。１つの実施形態において、抗体は、検出可能な標識を含む二次抗体とともにインキュベートすることによって検出される。別の方法において、ＣＡタンパク質に対する一次抗体は、検出可能な標識を含む。別の好ましい実施形態において、複数の一次抗体のうちのそれぞれ１つは、別個の検出可能な標識を含む。この方法は、複数のＣＡタンパク質についての同時スクリーニングにおける特定の使用を見出す。当業者によって理解されるように、多くの他の組織学的画像化技術は、本発明において有用である。
【０１７２】
好ましい実施形態において、標識は、異なる波長の放出を検出し、そして区別する能力を有する蛍光計で検出される。さらに、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が、本方法において使用され得る。
【０１７３】
別の好ましい実施形態において、抗体は、血液サンプルから癌腫を診断する際の使用を見出す。以前に記載されたように、特定のＣＡタンパク質は、分泌された分子／循環分子である。それゆえ、血液サンプルは、プローブされるべきサンプルとして有用であるか、または分泌されたＣＡタンパク質の存在について試験される。当業者によって理解されるように、抗体は、以前に記載された免疫アッセイ技術（ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング（ウエスタンブロット）、免疫沈降、ＢＩＡＣＯＲＥ技術などが含まれる）のいずれかによってＣＡタンパク質を検出するために使用され得る。
【０１７４】
好ましい実施形態において、標識されたＣＡ核酸プローブの組織アレイとのインサイチュハイブリダイゼーションが行われる。例えば、組織サンプル（ＣＡ組織および／または正常組織を含む）のアレイが作製される。次いで、当該分野において公知のインサイチュハイブリダイゼーションが行われ得る。
【０１７５】
個体と標準との間の発現フィンガープリントが比較される場合、当業者は、診断および予後を行い得ることが理解される。さらに、診断を示す遺伝子は、予後を示す遺伝子とは異なり得ることが理解される。
【０１７６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質、抗体、核酸、ＣＡ配列を含む改変タンパク質および細胞は、予後アッセイにおいて使用される。上記のように、癌腫（特に、リンパ腫）、長期予後の点からみた重症度に関連する遺伝子発現プロファイルが生成され得る。さらに、これは、タンパク質または遺伝子レベルのいずれかで行われ得る（遺伝子の使用が、好ましい）。上記のように、ＣＡプローブは、組織または患者内でのＣＡ配列の検出および定量化のためにバイオチップに結合される。このアッセイは、診断のために略述されるように行われる。
【０１７７】
（ＣＡ標的化薬物のスクリーニング）
１つの実施形態において、本明細書中で記載されるようなＣＡ配列のいずれかが、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用される。ＣＡタンパク質、抗体、核酸、ＣＡ配列を含む改変タンパク質および細胞が、薬剤スクリーニングアッセイにおいて、または「遺伝子発現プロファイル」もしくはポリペプチドの発現プロファイルに対する薬物候補の効果を評価することによって使用される。１つの実施形態において、好ましくは、候補薬剤で処置した後の発現プロファイル遺伝子に関するモニタリングを可能にするための高スループットスクリーニング技術（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，８４〜８（１９９８），Ｈｅｉｄら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６：９８６〜９９４（１９９６））と併用して、発現プロファイルが使用される。
【０１７８】
別の実施形態において、ＣＡタンパク質、抗体、核酸、改変ＣＡタンパク質およびネイティブのＣＡタンパク質または改変ＣＡタンパク質を含む細胞が、スクリーニングアッセイにおいて使用される。つまり、本発明は、癌腫表現型を調節する組成物についてのスクリーニングのための新規の方法を提供する。上記のように、これは、遺伝子発現のための調節因子またはタンパク質活性の調節因子についてのスクリーニングによって行われ得る。同様に、これは、個々の遺伝子またはタンパク質レベルについて、あるいは「遺伝子発現プロファイル」に対する薬物候補の効果を評価することによって行われ得る。好ましい実施形態において、好ましくは、候補薬剤で処置した後に発現プロファイル遺伝子に関するモニタリングを可能にするための高スループットスクリーニング技術（Ｚｌｏｋａｒｎｉｋ，前出を参照のこと）と併用して、発現プロファイルが使用される。
【０１７９】
本明細書でＣＡ遺伝子を同定したので、遺伝子発現に対する薬剤の効果を評価するために多様なアッセイが実施され得る。好ましい実施形態において、アッセイは、個々の遺伝子レベルまたはタンパク質レベルに対して実行され得る。すなわち、癌腫において異常に調節される遺伝子として、特定の遺伝子を同定し、遺伝子応答を調節する候補生物活性薬剤が、スクリーンされ得る。このように「モジュレーション」は、遺伝子発現または活性における増加および減少の両方を包含する。好ましいモジュレーション量は、正常組織  対  腫瘍組織における遺伝子発現の最初の変化に依存し、少なくとも１０％、好ましくは５０％、さらに好ましくは１００〜３００％の変化を有し、そしてある実施形態においては３００〜１０００％以上の変化を有する。このように、ある遺伝子が正常組織と比較して腫瘍組織では４倍の増加を表す場合、約４倍の減少が所望される；正常組織と比較して、腫瘍組織では１０倍の減少は、候補薬剤の発現において１０倍の増加を与えることが所望される、など。あるいは、ＣＡ配列が変更されるが、同一の発現プロファイルまたは変更された発現プロファイルを示す場合、本明細書で概要を述べられるように、タンパク質は検出され得る。
【０１８０】
当業者により理解されるように、これは、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルのいずれかでの評価により実施され得る；すなわち遺伝子発現量は、核酸プローブおよび遺伝子発現レベルの定量化を用いてモニターされ得、あるいは、遺伝子産物それ自身のレベルはモニターされ得る（例えば、ＣＡタンパク質に対する抗体および標準的な免疫学的検定法の使用によって）。あるいは、タンパク質を用いた結合アッセイおよび生物活性アッセイは、以下に概要を述べられているように実施され得る。
【０１８１】
好ましい実施形態において、遺伝子発現のモニタリングが実施され、多くの遺伝子、すなわち発現プロファイルが同時にモニターされるが、多くのタンパク質の発現をモニターすることが、同様に実施され得る。
【０１８２】
本実施形態において、特定の細胞において、本明細書中に概要を述べられるように、ＣＡ配列の検出および定量化のために、ＣＡ核酸プローブはバイオチップに結合される。アッセイは、さらに以下に記述される。
【０１８３】
概して、好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、分析前に細胞に添加される。さらに、スクリーンは、癌腫の特定の型を調節するか、ＣＡタンパク質を調節するか、ＣＡタンパク質に結合するか、またはＣＡタンパク質と抗体との結合間で干渉する、候補生物活性薬剤を同定するように提供される。
【０１８４】
本明細書中で使用される場合、「候補生物活性薬剤」または「薬物候補」という用語、または文法的な同義語は、癌腫表現型（ＣＡタンパク質に結合し、そして／またはＣＡタンパク質の生物活性を調節する）またはＣＡ配列の発現（核酸配列およびタンパク質配列の両方の発現を含む）のいずれかを直接的にもしくは間接的に変え得る、生物活性薬剤について試験されるべき、任意の分子、例えば、タンパク質、オリゴペプチド、有機低分子または無機低分子、多糖類、ポリヌクレオチドなどを記載する。特に好ましい実施形態において、候補薬剤は、例えば正常組織フィンガープリントに対して、ＣＡ表現型を抑制する。同様に、候補薬剤は、好ましくは重症ＣＡ表現型を抑制する。概して、複数のアッセイ混合物は、種々の濃度に対して異なる応答を得るため、異なる薬剤の濃度で平行して実施される。代表的に、これらの濃度の１つは、ネガティブコントロール（すなわち、ゼロ濃度または検出レベル以下で）としての役割を果たす。
【０１８５】
一つの局面において、候補薬剤は、ＣＡタンパク質の効果を無効にする。「無効にする」は、細胞に実質的な効果を与えないように、タンパク質の活性が、阻害されるか、または反対に作用されるかのいずれかを意味する。
【０１８６】
候補薬剤は、多くの化学的分類（代表的にそれらは有機分子または無機分子であるが、好ましくは１００を超え、そして約２，５００ダルトン未満の分子量を有する有機低分子化合物）を包含する。好ましい低分子は、２０００未満または１５００未満または１０００未満または５００Ｄ未満である。候補薬剤は、タンパク質との構造相互作用（特に水素結合）に必要な官能基を含み、この官能基としては、代表的には少なくとも一つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を包含し、好ましくは少なくとも二つの化学官能基が挙げられる。候補薬剤は、しばしば、一つ以上の上記の官能基で置換された環式炭素構造または複素環式構造、および／あるいは芳香族構造または多芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、これらの構造アナログまたはそれらの組み合わせを含む生体分子の中から見出される。ペプチドが、特に、好ましい。
【０１８７】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含有する、広範囲の多様な供給源から得られる。例えば、多くの手段は、広範囲の多様な有機化合物および生体分子のランダムそして指向的な合成（ランダム化したオリゴヌクレオチドの発現を含む）のために利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態において、天然化合物のライブラリーは、入手可能であるかまたは容易に作製される。さらに、天然にかまたは合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生物化学的手段により、容易に改変される。公知の薬理学的な薬剤は、構造的アナログを生成するために、指向的またはランダムな化学修飾（アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような）に供され得る。
【０１８８】
一実施形態において、候補生物活性薬剤はタンパク質である。本明細書において「タンパク質」は、少なくとも二つの共有結合されたアミノ酸（それは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する）を意味する。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造から構成され得る。このように、本明細書で使用される場合、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸と考慮される。「アミノ酸」はまた、イミノ酸残基（プロリンおよびヒドロキシプロリンのような）も包含する。側鎖は、（Ｒ）体または（Ｓ）体のいずれかであり得る。好ましい実施形態において、アミノ酸は、（Ｓ）体またはＬ体である。天然に存在しない側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換基は、例えば、インビボでの分解を妨げるかもしくは遅らせるために使用され得る。
【０１８９】
好ましい実施形態において、候補生物活性薬剤は、天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質のフラグメントである。このように、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、またはタンパク様の細胞抽出物のランダムなもしくは指向的な消化が使用され得る。この方法において、原核生物タンパク質および真核生物タンパク質のライブラリーは、本発明の方法でスクリーニングするために作製され得る。本実施形態において、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳類のタンパク質のライブラリーが特に好ましく、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【０１９０】
別の実施形態では、候補生物活性薬剤は、約５〜約３０アミノ酸のペプチドであり、約５〜約２０アミノ酸が好ましく、約７〜約１５が特に好ましい。そのペプチドは、上記に概要を述べられているように、天然に存在するタンパク質、ランダムなペプチド、または「偏った（ｂｉａｓｅｄ）」ランダムなペプチドの消化であり得る。本明細書中の「ランダム化」または文法的な同義語は、本質的にランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなる、それぞれ核酸およびペプチドのいずれかを意味する。概して、これらのランダムなペプチド（または核酸、以下に検討される）は、化学的に合成されるので、それらは、任意の位置で、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を組み込み得る。合成プロセスは、ランダム化されたタンパク質または核酸を生成するように設計され、配列の長さにわたる全てのまたはほとんどの可能な組み合わせの形成を可能にし、従ってランダム化された候補生物活性タンパク様薬剤のライブラリーを形成し得る。
【０１９１】
１つの実施形態において、ライブラリーは、任意の位置での配列優先性または一定配列を有さずに、十分にランダム化される。好ましい実施形態において、ライブラリーは偏る。すなわち、配列内のいくつかの位置は、一定配列を保持されるか、または限られた数の可能性から選択されるかのいずれかである。例えば、好ましい実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、規定された分類（例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った（小さいかまたは大きいかのいずれか）残基、核酸結合ドメインの生成について、システインの作製、交差結合について、ＳＨ−３ドメインについてのプロリン、リン酸化部位についてのセリン、スレオニン、チロシンまたはヒスチジンなど、または、プリンなど）内でランダム化される。
【０１９２】
一実施形態において、候補生物活性薬剤は、上記で規定されるような核酸である。タンパク質について概して上で記述されるように、核酸候補生物活性薬剤は、天然に存在する核酸、ランダムな核酸、または「偏った」ランダムな核酸であり得る。例えば、原核生物ゲノムまたは真核生物ゲノムの消化は、タンパク質について、上記に概要を述べられたように使用され得る。別の実施形態において、候補生物活性薬剤は、有機化学的部分であり、この広い範囲は文献において入手可能である。
【０１９３】
一つ以上のＣＡ遺伝子の発現プロファイルを変更するためのアッセイにおいて、候補薬剤が添加され、細胞はしばらくの間インキュベートされた後、分析される標的配列を含むサンプルは、バイオチップに添加される。必要な場合、標的配列は、公知技術を用いて調製される。例えば、公知の溶解緩衝液、エレクトロポレーションなどを用いて、精製および／または必要に応じて生じるＰＣＲのような増幅を用いて、当業者に理解されるように、サンプルは細胞を溶解するように処理され得る。例えば、ヌクレオシドに共有結合された標識を用いてインビトロの転写が行われる。概して、核酸は、本明細書中で規定されるように、標識（ビオチン−ＦＩＴＣまたはＰＥ、ｃｙ３およびｃｙ５が特に好ましい）を用いて標識化される。
【０１９４】
当業者に理解されるように、これらのアッセイは、直接的なハイブリダイゼーションアッセイであり得るか、または「サンドイッチアッセイ」（それは多くのプローブの使用を含み、概して米国特許第５，６８１，７０２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５９４，１１７号、同第５，５９１，５８４号、同第５，５７１，６７０号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５７１，６７０号、同第５，５９１，５８４号、同第５，６２４，８０２号、同第５，６３５，３５２号、同第５，５９４，１１８号、同第５，３５９，１００号、同第５，１２４，２４６号および同第５，６８１，６９７号（これらの全てが本明細書中で参考として援用される）に概要が述べられている）、を包含し得る。本実施形態において、一般的に、標的核酸は、上記に概要が述べられているように調製され、次いで、ハイブリダイゼーション複合体を形成をさせる条件下で、複数の核酸プローブを含むバイオチップに添加される。
【０１９５】
多様なハイブリダイゼーションの条件が、本発明で使用され得、上記に概要が述べられているように高い、中程度のおよび低いストリンジェンシー条件を包含する。アッセイは、概してストリンジェンシー条件下で実施され、これは、標的の存在下のみで標識プローブハイブリダイゼーション複合体を形成させる。ストリンジェンシーは、工程パラメータ（熱力学的変数であり、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度ｐＨ、有機溶媒濃度等が挙げられるが、これらに限定されない）を変えることによりコントロールされ得る。これらのパラメータはまた、概して米国特許第５，６８１，６９７号に概要が述べられているように、非特異的な結合を制御するために使用され得る。従って、非特異的な結合を減少するため、より高いストリンジェンシー条件で特定の工程を実施することが望ましくあり得る。
【０１９６】
本明細書中で概要が述べられた反応は、当業者に理解されるように、多様な方法で達成され得る。反応の構成要素は、任意の順序で、同時にまたは連続的に添加され得、好ましい実施形態は、以下に概要を述べられる。さらに、反応は、アッセイに含有され得る多くの他の試薬を含有し得る。これらは、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤等の様な試薬を含み、これらは最適なハイブリダイゼーションおよび検出を容易にするために使用され得、そして／または非特異的な相互作用もしくはバックグラウンドの相互作用を減少するために使用され得る。また、アッセイの効率を別な方法で改善する試薬（プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤などのような）が使用され得、それはサンプル調製法および標的の純度に依存する。さらに、固相または液体ベースの（すなわち動力学的ＰＣＲ）いずれかのアッセイが使用され得る。
【０１９７】
一度そのアッセイが実施されると、データは、個々の遺伝子の発現レベル、およびその状態の間の発現レベルの変化を決定するために分析され、遺伝子発現プロファイルを形成する。
【０１９８】
好ましい実施形態において、診断用途および予後用途に関しては、任意の一つの状態で重要な差次的に発現された遺伝子または変異遺伝子を同定したので、スクリーンは、遺伝子個々の発現を変えるために実施され得る。すなわち、単一遺伝子発現の制御を調節するためのスクリーニングが行われ得る。このように、例えば、特にその存在または非存在が２つの状態の間で特有である標的遺伝子の場合において、スクリーニングは標的遺伝子発現の調節因子に対して行われる。
【０１９９】
さらに、スクリーンは、候補因子に応答して誘導される新規遺伝子について行われ得る。正常な発現パターンへ導くＣＡ発現パターンを抑制するか、または正常組織からの遺伝子発現を模倣するように１つのＣＡ遺伝子発現プロファイルを調節するその能力に基づいて候補因子を同定した後、上記に記述されるようにスクリーンが、因子に応答して特に調節される遺伝子を同定するために実施され得る。正常組織と因子で処理されたＣＡ組織との間において、発現プロファイルを比較することは、正常組織またはＣＡ組織で発現されないが、因子で処理された組織で発現される遺伝子を明らかにする。これらの因子特異的な配列は、同定され得、そしてＣＡ遺伝子またはタンパク質について本明細書で記述された任意の方法により使用され得る。特に、これらの配列およびそれらがコードするタンパク質は、因子で処理された細胞に目印をつけるか、または同定することにおける用途を発見する。さらに、抗体は、因子誘導タンパク質に対して惹起され得、そして、処理されたＣＡ組織サンプルに対する新規治療薬を標的化するために使用され得る。
【０２００】
このように、一つの実施形態において、候補因子は、このように関連したＣＡ発現プロファイルを有する、ＣＡ細胞集団に対して投与される。本明細書中の「投与」または「接触」は、候補因子が、摂取または細胞内作用、または細胞表面での作用のいずれかにより、因子が細胞に作用するようにする様式で細胞に添加されることを意味する。ある実施形態において、タンパク質様候補因子（すなわちペプチド）をコードする核酸は、ウイルス構築物（例えば、レトロウイルス構築物）に入れられ得、そして、細胞に添加され、その結果、ペプチド因子の発現が達成される（ＰＣＴ米国９７／０１０１９を参照のこと、本明細書中で参考として明白に援用される）。
【０２０１】
一旦、候補因子が細胞に投与されると、所望される場合に細胞は洗浄され得、そして、いくらかの期間好ましい生理条件下でインキュベートされる。次いで、本明細書で概要を述べたように、細胞が回収され、新しい遺伝子発現プロファイルが生成される。
【０２０２】
このように、例えば、ＣＡ組織は、ＣＡ表現型を減少するか、または抑制する因子についてスクリーンされ得る。少なくとも一つの遺伝子の発現プロファイルの変化は、因子がＣＡ活性に対する効果を有すことを示す。ＣＡ表現型に対するこのようなサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を規定することにより、表現型を変える新しい薬物のスクリーニングが考案され得る。このアプローチの場合、薬物の標的は公知である必要はなく、元々の発現スクリーニングプラットフォームにおいて示される必要もなく、標的タンパク質についての転写レベルが変化する必要もない。
【０２０３】
好ましい実施形態において、上記で概要を述べたように、スクリーンは個々の遺伝子および遺伝子産物（タンパク質）に対して実施され得る。すなわち、特定の状態において重要であるような特に差次的に発現される遺伝子が同定されるので、遺伝子または遺伝子産物それ自身の発現のいずれかの調節因子のスクリーニングが行われ得る。差次的に発現された遺伝子の遺伝子産物は、時々、本明細書中で「ＣＡタンパク質」または「ＣＡＰ」といわれる。ＣＡＰは、フラグメントであり得るか、あるいは、表１〜１１２の核酸によりコード化されるフラグメントについての全長タンパク質であり得る。好ましくは、ＣＡＰは、フラグメントである。別の実施形態において、配列は、さらに本明細書に記述されているように、配列改変体である。
【０２０４】
好ましくは、ＣＡＰは、約１４〜２４のアミノ酸長のフラグメントである。さらに好ましくは、フラグメントは可溶性フラグメントである。好ましくは、フラグメントは、非膜貫通領域を含む。好ましい実施形態において、フラグメントは、溶解性を補助するためにＮ末端にＣｙｓを有する。一つの実施形態において、フラグメントのｃ末端は、遊離酸として保たれ、ｎ末端は、結合を補助するための遊離アミン（すなわち、システインに対する）である。
【０２０５】
一つの実施形態において、ＣＡタンパク質は、本明細書中で検討されているように、免疫原性因子に結合体化される。一つの実施形態において、ＣＡタンパク質は、ＢＳＡに結合体化される。
【０２０６】
好ましい実施形態において、スクリーニングは、ＣＡ遺伝子の発現産物の生物学的機能を変えるために実施される。また、特定の状態にある遺伝子の重要性を同定されるので、遺伝子産物を結合し、そして／または遺伝子産物の生物学的活性調節する因子についてのスクリーニングは、以下にさらに十分に概要を述べるように実行され得る。
【０２０７】
好ましい実施形態において、スクリーンは、ＣＡタンパク質に結合し得る候補因子をまず見つけるように設計され、次いで、これらの因子は、ＣＡＰ活性および癌腫表現型を調節する候補因子の能力を評価するアッセイにおいて使用され得る。このように、当業者に理解されるように、実施され得る多くの様々なアッセイ（結合アッセイおよび活性アッセイ）が存在する。
【０２０８】
好ましい実施形態において、結合アッセイが実施される。一般的に、精製または単離された遺伝子産物が使用される；すなわち、一つ以上のＣＡ核酸の遺伝子産物が作製される。一般的に、これは、当該分野に公知であるように実施される。例えば、抗体は、タンパク質遺伝子産物に対して産生され、標準免疫アッセイは、存在するタンパク質量を決定するために実行される。あるいは、ＣＡタンパク質を含む細胞が、アッセイに使用され得る。
【０２０９】
このように、好ましい実施形態において、方法は、ＣＡタンパク質と候補生物活性因子とを合わせる工程、およびＣＡタンパク質への候補因子の結合を決定する工程を包含する。好ましい実施形態はヒトまたはマウスのＣＡタンパク質を利用するが、他の哺乳動物タンパク質をまた、例えば、ヒト疾患の動物モデルの開発のために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に概要が述べられるように、改変体または誘導体のＣＡタンパク質が使用され得る。
【０２１０】
概して、本明細書中の方法の好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質または候補因子は、単離されたサンプル受容領域（例えば、マイクロタイタープレート、アレイなど）を有する、不溶性支持体に非拡散的に結合される。この不溶性支持体は、任意の組成物から作製され得、これらの組成物はこの支持体に結合され得、可溶性物質から容易に分離され、そうでなければ、全般的なスクリーニング方法と適合性である。このような支持体の表面は、中実または多孔性であり得、任意の都合のよい形状である。適切な不溶性支持体の例としては、マイクロタイタープレート、アレイ、メンブレンおよびビーズが挙げられる。これらは、代表的には、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、ＴｅｆｌｏｎＴＭなどからつくられる。マイクロタイタープレートおよびアレイは、特に都合がよい。なぜなら、少量の試薬およびサンプルを用いて、膨大な数のアッセイが同時に実行され得るからである。
【０２１１】
組成物の特定様式の結合は、試薬および本発明の全般的な方法と適合性であり、組成物の活性を維持し、そして、非拡散性である限り、重要ではない。好ましい結合方法としては、抗体（タンパク質が支持体に結合される場合、リガンド結合部位または活性化配列のいずれも立体的にブロックしない）、「粘着性」支持体またはイオン性支持体への直接結合、化学的架橋、タンパク質または因子の表面上での合成などの使用が挙げられる。タンパク質または因子の結合後、過剰の非結合性材料は洗浄により除去される。次いで、サンプル受容領域は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは他の無害なタンパク質もしくは他の成分とのインキュベーションによりブロック化され得る。
【０２１２】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質は支持体に結合され、そして候補生物活性因子は、アッセイに添加される。あるいは、候補因子は、支持体に結合され、ＣＡタンパク質が添加される。新規結合因子としては、特定の抗体、化学的なライブラリーのスクリーンで同定された非天然の結合因子、ペプチドアナログなどが挙げられる。ヒト細胞に対して低い毒性を有する因子についてのスクリーニングアッセイは特に興味深い。広範囲の多様なアッセイは、この目的のために使用され得、このアッセイとしては、標識化インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合についての免疫アッセイ、機能的アッセイ（リン酸化アッセイなど）などが挙げられる。
【０２１３】
ＣＡタンパク質への候補生物活性因子の結合の決定は、多くの方法で実施され得る。好ましい実施形態において、候補生物活性因子は標識され、結合が直接的に決定される。例えば、これは、固体支持体にＣＡタンパク質の全てまたは一部を結合することにより、標識化候補因子（例えば、蛍光標識）を添加することにより、過剰な試薬を洗い流すことにより、そして標識が固体支持体上に存在するかどうかを決定することにより、実施され得る。多様なブロッキング工程および洗浄工程が、当該分野で公知であるように利用され得る。
【０２１４】
本明細書中の「標識化」は、検出可能なシグナル（例えば、放射線同位元素、蛍光体、酵素、抗体、磁気粒子のような粒子、化学発光体または特異的な結合分子など）を提供する標識を用いて、化合物が直接的または間接的のいずれかで標識化されることを意味する。特異的な結合分子は、ビオチンとストレプトアビジンや、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどのような対を含む。特異的な結合メンバーについて、相補的なメンバーは、通常、上に概要を述べたように、公知の手順に従って、検出を提供する分子を用いて標識化される。標識は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に与え得る。
【０２１５】
ある実施形態において、構成要素の一つのみが標識化される。例えば、タンパク質（またはタンパク様候補因子）は、１２５Ｉまたは発蛍光団を用いてチロシン位で標識され得る。あるいは、１を超える成分は、異なる標識を用いて（；例えば、タンパク質に対して１２５Ｉを用いて、そして候補因子について蛍光体を用いて）標識され得る。
【０２１６】
好ましい実施形態において、候補生物活性因子の結合は、競合結合アッセイの使用により決定される。この実施形態において、競合剤（例えば、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなど）は、標的分子（すなわち、ＣＡタンパク質）に結合することが、公知の結合部分である。特定の状況下で、生物活性因子を置換する結合部分を用いて、生物活性因子および結合部分の間のように競合的結合が存在し得る。
【０２１７】
ある実施形態において、候補生物活性因子は標識される。候補生物活性因子または競合剤のいずれか、あるいはその両方が存在する場合、結合させるのに十分な時間の間、タンパク質にまず添加される。インキュベーションは、最適の活性を容易にする任意の温度（代表的には４〜４０℃の間）で実施され得る。インキュベーション期間は、最適の活性について選択されるが、また、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化もされ得る。代表的に、０．１〜１時間の間が十分である。過剰の試薬は、概して除去されるかもしくは洗い流される。次いで、第２番目の成分要素が添加され、標識された成分の存在もしくは非存在が追跡され、結合を示す。
【０２１８】
好ましい実施形態において、競合剤が、まず添加され、その後、候補生物活性因子が添加される。競合剤の置換は、候補生物活性因子がＣＡタンパク質に結合していることを示し、従って、ＣＡタンパク質に結合し得、ＣＡタンパク質の活性を潜在的に調節し得る。この実施形態において、いずれかの成分が標識され得る。従って、例えば、競合剤が標識化される場合、洗浄溶液中の標識の存在は、因子による置換を表す。あるいは、候補生物活性因子が標識される場合、支持体上の標識の存在は、置換を表す。
【０２１９】
代替的な実施形態において、候補生物活性因子がまず添加され、インキュベーションおよび洗浄を行い、その後、競合剤が添加される。競合剤による結合の非存在は、生物活性因子がより高い親和性でＣＡタンパク質と結合される、ということを表し得る。従って、候補生物活性因子が標識される場合、支持体上の標識の存在は、競合剤結合の欠損と合わせて、候補因子がＣＡタンパク質に結合し得ることを表し得る。
【０２２０】
好ましい実施形態において、方法は、ＣＡタンパク質の活性を調節し得る、生物活性因子を同定するために、差次的スクリーニング工程を包含する。この実施形態において、この方法は、第１サンプル中の、ＣＡタンパク質と競合剤とを組み合わせる工程を包含する。第２サンプルは、候補生物活性因子、ＣＡタンパク質および競合剤を含む。競合剤の結合は、両サンプルについて決定され、そして２つのサンプル間の結合の変化または相違は、ＣＡタンパク質に結合し得る因子の存在、およびその活性を潜在的に調節することを表す。すなわち、競合剤の結合が、第１サンプルに比べて第２サンプルにおいて異なる場合、因子は、ＣＡタンパク質に結合し得る。
【０２２１】
あるいは、好ましい実施形態は、ネイティブなＣＡタンパク質に結合するが、改変されたＣＡタンパク質に結合し得ない、薬物候補を同定するために差次的スクリーニングを利用する。ＣＡタンパク質の構造は、モデル化され得、その部位と相互作用する因子を合成するために、合理的な薬物設計において使用され得る。ＣＡ生物活性に影響を及ぼす薬物候補はまた、タンパク質の活性を増強するかまたは減少する能力について、薬物をスクリーニングすることにより同定される。
【０２２２】
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、アッセイにおいて使用され得る。好ましくは、全てのコントロールおよび試験サンプルは、統計上有意な結果を得るために、少なくとも三連で実施される。全てのサンプルのインキュベーションは、タンパク質に因子を結合するために、十分な時間の間である。インキュベーション後、全てのサンプルは、非特異的に結合された材料を含まないように洗浄され、そして結合された量は、概して標識因子を決定する。例えば、放射標識が使用される場合で、サンプルは、結合化合物量を決定するために、シンチレーションカウンターで計数され得る。
【０２２３】
多様な他の試薬は、スクリーニングアッセイにおいて包まれ得る。これらは、試薬（塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤など）を含み、それは、最適なタンパク質−タンパク質結合を容易にし、そして／または非特異的な相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を減らすために使用され得る。そうでなければ、アッセイの効率を改善する試薬（プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤など）もまた、使用され得る。成分の混合物は、必須の結合を提供する任意の順番で添加され得る。
【０２２４】
ＣＡタンパク質の活性を調節する因子のスクリーニングもまた、実施され得る。好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質の活性を調節し得る生物活性因子をスクリーニングする方法は、上述のように、ＣＡタンパク質のサンプルに候補生物活性因子を添加する工程およびＣＡタンパク質の生物学的活性の変化を決定する工程を包含する。「ＣＡタンパク質の活性を調節する」ことは、活性の増大；活性の減少、または存在する活性の型もしくは種類の変化を包含する。このように、この実施形態において、候補因子は、本明細書中に規定される場合、ＣＡタンパク質と結合すること（これは必要というわけではないが）およびその生物学的活性または生化学的な活性を変えること、の両方をすべきである。方法は、ＣＡタンパクの存在、分布、活性または量の変化について、インビトロのスクリーニング方法（概して上に概要が述べられるように）およびインビボの細胞スクリーニングの両方を包含する。
【０２２５】
従って、この実施形態において、方法は、ＣＡサンプルと候補生物活性因子とを組み合わせる工程、およびＣＡ活性に対する効果を評価する工程を包含する。本明細書中において「ＣＡ活性」または文法的な同義語は、ＣＡタンパク質の生物学的活性（腫瘍形成におけるその役割（細胞分裂、好ましくはリンパ組織における細胞分裂、細胞増殖、腫瘍増殖および細胞の形質転換を包含する）がこれらに限定されない）のうちの一つを意味する。一つの実施形態において、ＣＡ活性は、表１〜１１２の核酸によりコードされるタンパク質の活性化、または、表１〜１１２の核酸によりコード化されたタンパク質による活性化を包含する。ＣＡ活性のインヒビターは、任意の一つ以上のＣＡ活性の阻害である。
【０２２６】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質の活性は増大される；別の好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質の活性は減少される。従って、アンダゴニストである生物活性因子は、いくつかの実施形態において好ましく、アゴニストである生物活性因子は、他の実施形態において好ましくあり得る。
【０２２７】
好ましい実施形態において、本発明は、ＣＡタンパク質の活性を調節し得る生物活性因子をスクリーニングするための方法を提供する。本方法は、上に規定されるように、ＣＡタンパク質を含む細胞に、候補生物活性因子を添加する工程を包含する。好ましい細胞型は、ほとんどの任意の細胞を含む。細胞は、ＣＡタンパク質をコードする組換え核酸を含む。好ましい実施形態において、候補因子のライブラリーは、複数の細胞に対して試験される。
【０２２８】
一つの局面において、アッセイは、生理学的なシグナル（例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、増殖因子、活動電位）、化学療法剤を包含する薬理学的な因子、放射線、発癌剤、または他の細胞（すなわち、細胞と細胞との接触）の存在下または非存在下、あるいはこれらの生理学的なシグナルの曝露前または曝露後で評価される。別の実施例において、決定因子は、細胞周期過程の異なる段階で決定される。
【０２２９】
このようにして、生物活性因子は同定される。薬理学的な活性を有する化合物は、ＣＡタンパク質の活性を増強し得るか、または妨害し得る。
【０２３０】
（本発明の用途）
一実施形態において癌細胞分裂を阻害する方法が提供される。別の実施形態において、腫瘍増殖を阻害する方法が提供される。さらなる実施形態において、癌を有する細胞または個体を処置する方法が提供される。
【０２３１】
一実施形態において、癌腫細胞分裂を阻害する方法が提供される。この方法は、癌腫インヒビターの投与を包含する。一実施形態において、癌腫細胞は、リンパ腫であり、別の実施形態において、癌腫細胞は、乳癌である。
【０２３２】
別の実施形態において、腫瘍増殖を阻害する方法が提供される。この方法は、癌腫インヒビターの投与を包含する。特定の実施形態において、リンパ組織における腫瘍増殖を阻害する方法が提供され、この方法は、リンパ腫インヒビターの投与を包含する。別の実施形態において、哺乳動物組織における腫瘍増殖を阻害する方法が提供され、この方法は、乳癌インヒビターの投与を包含する。
【０２３３】
この方法は、癌インヒビターの投与を包含する。特定の実施形態において、癌インヒビターは、アンチセンス分子、薬学的組成物、治療剤または低分子、あるいはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。特定の実施形態において、治療剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体と結合される。
【０２３４】
他の実施形態において、個体における癌細胞を検出または診断する方法が提供される。特定の実施形態において、診断／検出剤は、本発明に従って、ＣＡＰに優勢に結合する低分子である。一実施形態において、この診断／検出剤は、抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体であり、好ましくは、検出可能な薬剤に結合された抗体である。
【０２３５】
本発明の他の実施形態において、動物モデルおよびトランスジェニック動物が提供され、これは、癌、特に、リンパ腫および腺腫の動物モデルの作製における用途を見出す。
【０２３６】
（ａ）アンチセンス分子
一つの実施形態において、癌インヒビターは、アンチセンス分子である。本明細書中で使用される場合、アンチセンス分子は、癌腫性癌分子についての標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。本発明に従うと、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、概して、少なくとも約１４ヌクレオチドのフラグメントを含み、好ましくは約１４〜３０ヌクレオチドのフラグメントである。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、以下に記述される（例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，（１９８８）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，（１９８８））。
【０２３７】
アンチセンス分子は、リガンド結合分子を用いた結合体形成により、標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入され得る（ＷＯ９１／０４７５３に記載）。適切なリガンド結合分子は、限定されないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを包含する。好ましくは、リガンド結合分子の結合体は、リガンド結合分子が、その対応する分子もしくはレセプターに結合する能力を実質的に妨げないか、または、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、もしくはその結合体バージョンの細胞への進入をブロックしない。あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含む細胞へ導入され得る（ＷＯ９０／１０４４８に記載）。アンチセンス分子またはノックアウトモデルおよびノックインモデルの使用はまた、処理方法に加えて、上記で検討されているように、スクリーニングアッセイで使用され得ることが理解される。
【０２３８】
（ｂ）薬学的組成物
本発明に包含される薬学的組成物は、活性剤として、本明細書中で開示された本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは抗体を、治療有効量で含む。「有効量」は、有益な結果または所望の結果（臨床結果を含む）をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。本発明の目的のために、アデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の進行を緩和するか、改善するか、安定化するか、逆転させるか、または遅らせる（ｓｌｏｗまたはｄｅｌａｙ）するのに十分な量である。
【０２３９】
この組成物は、癌および原発性癌の転移を処置するために使用され得る。さらに、この薬学的組成物は、例えば、放射線または従来の化学治療に対して腫瘍を感作するために、従来の癌処置法と共に使用され得る。用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」などは、一般に本明細書中で、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることをいうために使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にかまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、そして／あるいは疾患および／またはこの疾患に起因する悪影響の部分的または完全な安定化または治癒という点で治療的であり得る。「処置」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物、特に、ヒトにおける疾患の任意の処置を網羅し、そして以下を包含する：（ａ）疾患または症状にかかりやすいが、これらの疾患または症状を有するとはまだ診断されていない被験体において生じる、この疾患または症状を予防すること；（ｂ）この疾患症状を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること；または（ｃ）この疾患症状を軽減すること、すなわち、この疾患または症状の退行を生じさせること。
【０２４０】
薬学的組成物が、差次的に発現されたポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物に特異的に結合する抗体を含む場合、この抗体は、処置部位への送達のための薬物に結合され得るか、または検出可能な標識に結合され得、癌細胞（例えば、前立腺癌細胞）を含む部位の画像化を容易にする。抗体を薬物および検出可能な標識に結合するための方法は、検出可能な標識を使用する画像化のための方法と同様に、当該分野で周知である。
【０２４１】
本発明の目的のために、「患者」は、ヒトおよび他の動物、特に、哺乳動物、および生物の両方を含む。従って、この方法は、ヒトの治療または獣医の両方に適用可能である。好ましい実施形態において、患者は、哺乳動物であり、最も好ましい実施形態において、患者はヒトである。
【０２４２】
用語「治療的有効量」とは、本明細書中で使用される場合、所望の疾患または状態を処置するか、回復するかまたは予防するか、あるいは検出可能な治療効果または予防効果を示す治療剤の量をいう。この効果は、例えば、化学マーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温の低下のような生理学的症状の低下を含む。被験体に有効な正確な量は、被験体の大きさおよび健康状態、状態の性質および程度、ならびに投与のために選択された治療剤または治療剤の組合せに依存する。所定の状況に有効な量は、慣用的な実験によって決定され、そして医師の判断に任される。本発明の目的のために、有効用量は、一般的に、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの本発明の組成物である。
【０２４３】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、治療剤（例えば、抗体またはポリペプチド、遺伝子および他の治療剤）の投与のためのキャリアをいう。この用語は、それ自体ではこの組成物を投与された個体に対して有害抗体の産生を誘導せず、過度な毒性を伴うことなく投与され得る薬学的キャリアを指す。適切なキャリアは、ゆっくり代謝される大きな高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ酪酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子）であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。治療組成物中の薬学的に受容可能なキャリアとしては、液体（例えば、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノール）が挙げられ得る。補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化物質など）もまた、このようなビヒクル中に存在し得る。代表的には、治療組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとしての注射液として調製され；注射の前に、液体ビヒクル溶液または液体ビヒクル懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。リポソームが、薬学的に受容可能なキャリアの定義内に含まれる。薬学的に受容可能な塩（例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など））もまた、薬学的組成物中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９５）Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓで入手可能である。
【０２４４】
薬学的組成物は、多様な形態（例えば、顆粒、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル、懸濁剤、軟膏剤、ローション剤など）で調製され得る。経口および局所の使用に適した、医薬品等級の有機または無機キャリアおよび／または希釈薬は、治療活性化合物を含む組成物を構成するために使用され得る。当該分野に公知の希釈薬としては、水性媒体、植物および動物油、および脂肪が挙げられる。安定化薬、湿潤剤および乳化薬、浸透圧を変える塩、または適切なｐＨ値に安定化するための緩衝液および皮膚浸透増強剤は、補助的な薬剤として使用され得る。
【０２４５】
本発明の薬学的組成物は、患者への投与に適切な形態でＣＡタンパク質を含む。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、水溶性形態（例えば、薬学的に受容可能な塩として存在する）であり、酸および塩基の双方の付加塩を包含することを意味する。「薬学的に受容可能な酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的効果を保持し、そして以下の酸と生物学的には形成されず、そうでなければ所望されない塩をいい、酸としては、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）および有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）である。「薬学的に受容可能な塩基付加塩」としては、無機塩基（ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩など）から誘導される塩が挙げられる。特に好ましくは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩である。薬学的に受容可能な有機非毒性塩基から誘導される塩としては、第１級、第２級および第３級アミンの塩、置換アミン（天然に存在する置換アミンを包含する）、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミン）が挙げられる。
【０２４６】
薬学的組成物はまた、以下の一つ以上を含み得る：血清アルブミンのようなキャリアタンパク質；緩衝剤；微晶性セルロース、乳糖、トウモロコシデンプンおよび他のデンプンのような充填剤；結合剤；甘味料および他の矯味矯臭剤；着色剤；およびポリエチレングルコール。添加剤は、当該分野に周知であり、多様な処方物中で使用される。
【０２４７】
所望の薬理活性を有する化合物は、前述したように、宿主に対して生理学的に受容可能なキャリアにおいて投与され得る。薬剤は、多様な方法（経口、非経口（例えば、皮下、腹腔内、脈管内など））で投与され得る。導入方法に依存して、化合物は、多様な方法で処方され得る。処方物中の、治療活性化合物の濃度は、約０．１〜１００％ｗｇｔ／ｖｏｌで変動し得る。一旦処方されると、本発明によって企図される組成物は、（１）被験体に（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、低分子アゴニストもしくはアンタゴニストなどとして）直接投与され得るか、または（２）被験体由来の細胞にエキソビボで（例えば、エキソビボ遺伝子治療として）送達され得る。組成物の直接送達は、一般に、非経口注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射もしくは筋肉内注射、腫瘍内注射または組織の間質領域への注射）によって達成される。投与の他の様式としては、経口投与および肺投与、座剤、ならびに経皮適用、針、そして遺伝子銃または皮下噴射器（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が挙げられる。投薬処置は、単回投薬計画または複数回投薬計画であり得る。
【０２４８】
エキソビボ送達および形質転換細胞の被験体への再移植についての方法は、当該分野で公知であり、例えば、国際特許公開番号ＷＯ  ９３／１４７７８において記載される。エキソビボ適用に有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞（特に造血幹細胞）、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が、挙げられる。一般に、核酸のエキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための送達は、例えば、デキストラン媒介性トランスフェクション、カルシウムホスフェート沈殿、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接微量注入（これらは全て当該分野で周知である）によって達成され得る。
【０２４９】
一旦、本明細書中で記載されるＣＡポリヌクレオチドに対応する遺伝子の差次的発現が、増殖性障害（例えば、新生物形成、異形成、および過形成）と関連することが見出されると、この障害は、提供されるポリヌクレオチド、対応するポリペプチドまたは他の対応する分子（例えば、アンチセンス、リボザイムなど）に基づく治療薬剤の投与による処置に対して、感受性であり得る。他の実施形態において、障害は、低分子薬物の投与による処置に感受性であり得る。低分子薬剤は、例えば、癌性細胞において、正常細胞と比較してより高い発現を有する遺伝子のコードされる遺伝子産物の機能のインヒビター（アンタゴニスト）として作用するか、または癌性細胞において発現が低下している遺伝子産物に対するアゴニストとして作用する（例えば、腫瘍抑制因子として作用する遺伝子産物の活性を促進する）。
【０２５０】
本発明の薬学的組成物の用量および投与手段は、治療組成物の特定の質、患者の状態、年齢および体重、疾患の進行、および他の関連因子に基づいて決定される。例えば、ポリヌクレオチド治療組成物薬剤の投与としては、局所投与および全身投与が挙げられ、これらとしては、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与、および局所投与が、挙げられる。好ましくは、治療ポリヌクレオチド組成物は、本明細書中で開示されるポリヌクレオチドの、少なくとも１２個の連続する、２２個の連続する、２５個の連続する、３０個の連続する、または３５個の連続するポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター含む発現構築物を含有する。種々の方法が、治療組成物を体内の特定の部位に直接投与するために使用され得る。例えば、小さな転移病変が局在し、そして治療組成物は、体内での腫瘍の幾つかの異なった位置において、幾度か注射される。あるいは、腫瘍に栄養する動脈が同定され、そして治療組成物が、この組成物を腫瘍内に直接送達するためにこのような動脈に注射される。壊死性の癌を有する腫瘍は吸引され、そしてここで腫瘍の空洞中心内に、組成物が直接注射される。アンチセンス組成物は、腫瘍表面に、例えば組成物の局所適用により、直接的に投与される。Ｘ線画像化は、上述の特定の送達方法を補助するために使用される。
【０２５１】
アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノムポリヌクレオチド、または特定の組織に対する抗体を含有する、治療組成物の標的された送達もまた、使用され得る。レセプター媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えば以下に記載される：Ｆｉｎｄｅｉｓら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，編）（１９９４）；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８。ポリヌクレオチドを含有する治療組成物は、遺伝子治療プロトコールにおいて、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で、局所投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇおよび約２０μｇ〜約１００μｇの範囲の濃度のＤＮＡがまた、遺伝子治療プロトコールの間に使用され得る。作用の方法（例えば、コードされる遺伝子産物のレベルの増大または阻害について）ならびにトランスフォーメーションおよび発現の効力のようなアンチセンスサブゲノムポリヌクレオチドの最大の効力に必要とされる用量に影響する因子が、考慮される。組織のより広い領域にわたって、より高い発現が所望される場合、より多量のアンチセンスサブゲノムポリヌクレオチドもしくは連続的な投与プロトコールにおける同量の再投与、または例えば腫瘍部位の異なった隣接する組織部分または異なった近接する組織部分への幾度かの投与が、良い治療結果をもたらすために必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験における慣用実験が、最適な治療効果のための特定の範囲を決定する。
【０２５２】
本発明の治療ポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達され得る。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る（全般的に、Ｊｏｌｌｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照のこと）。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導され得る。コード配列の発現は、恒常的または調節的であり得る。
【０２５３】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当該分野で公知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：組換えレトロウイルス（例えば、ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９４／０３６２２；ＷＯ  ９３／２５６９８；ＷＯ  ９３／２５２３４；ＵＳＰＮ  ５，２１９，７４０；ＷＯ  ９３／１１２３０；ＷＯ  ９３／１０２１８；ＵＳＰＮ  ４，７７７，１２７；ＧＢ特許番号２，２００，６５１；ＥＰ  ０  ３４５  ２４２；およびＷＯ  ９１／０２８０５を参照）、αウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルスベクター（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロス川ウイルスベクター（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）（例えば、ＷＯ  ９４／１２６４９、ＷＯ  ９３／０３７６９；ＷＯ  ９３／１９１９１；ＷＯ  ９４／２８９３８；ＷＯ  ９５／１１９８４およびＷＯ  ９５／００６５５を参照）。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７に記載されるような、殺傷したアデノウイルスに結合したＤＮＡの投与もまた、使用され得る。
【０２５４】
非ウイルス性送達ビヒクルおよび非ウイルス性送達方法もまた使用され得、以下が挙げられるが、これらに限定されない：殺傷したアデノウイルスのみに結合されるかまたは結合されない、ポリカチオン性濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照）；リガンド結合ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、ＵＳＰＮ  ５，８１４，４８２；ＷＯ  ９５／０７９９４；ＷＯ  ９６／１７０７２；ＷＯ  ９５／３０７６３；およびＷＯ  ９７／４２３３８）ならびに核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられる。裸のＤＮＡもまた、使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ  ９０／１１０９２およびＵＳＰＮ  ５，５８０，８５９において記載される。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、ＵＳＰＮ  ５，４２２，１２０；ＷＯ  ９５／１３７９６；ＷＯ  ９４／２３６９７；ＷＯ  ９１／１４４４５；およびＥＰ  ０５２４９６８において記載される。さらなるアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１において記載される。
【０２５５】
使用のために適切な、さらなる非ウイルス性送達としては、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１（２４）：１１５８１に記載されるアプローチのような、機械的送達系が挙げられる。その上、このようなコード配列および発現産物は、光重合ヒドロゲル物質の沈着、または電離放射線の使用を通して、送達され得る（例えば、ＵＳＰＮ  ５，２０６，１５２およびＷＯ  ９２／１１０３３を参照のこと）。コード配列の送達のために使用され得る遺伝子送達のための他の従来方法としては、例えば、ハンドヘルド（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ）遺伝子輸送粒子銃の使用（例えば、ＵＳＰＮ  ５，１４９，６５５を参照）；輸送された遺伝子の活性化のための電離放射線（例えば、ＵＳＰＮ  ５，２０６，１５２およびＷＯ  ９２／１１０３３を参照のこと）。
【０２５６】
本発明のＣＡタンパク質およびモジュレーターの投与は、上で検討されたように、多様な方法（限定されないが、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、膣的、直腸的または眼内を包含する）において実施され得る。幾つかの例において、例えば、創傷および炎症の処置において、ＣＡタンパク質およびモジュレーターが、溶液またはスプレーとして、直接適用され得る。
【０２５７】
好ましい実施形態において、ＣＡタンパク質およびモジュレーターは、治療薬として投与され得、上に概要が述べられているように、処方され得る。同様に、ＣＡ遺伝子（全長配列、部分配列の両方またはＣＡコード領域の調節配列を含む）は、当該分野に公知なように、遺伝子治療の適用において投与され得る。これらのＣＡ遺伝子は、当業者により理解されるように、遺伝子治療（すなわち、ゲノムへの組み込み）として、またはアンチセンス組成物としてのいずれかで、アンチセンスの適用を包含し得る。
【０２５８】
このように、一つの実施形態において、細胞または生物でのＣＡ遺伝子活性を調節する方法が提供される。一つの実施形態において、この方法は、内因性ＣＡタンパク質の生物学的活性を減少または排除する抗ＣＡ抗体を細胞に投与することを包含する。あるいは、この方法は、ＣＡタンパク質をコードする組換え核酸を、細胞または生物に投与することを包含する。当業者により理解されるように、これは、任意の数の方法で実行され得る。好ましい実施形態において、例えば、ＣＡ配列が癌においてダウンレギュレーションされる際、公知の遺伝子治療技術を用いて、細胞内のＣＡ発現量の増加により（例えば、内因性ＣＡ遺伝子を過剰発現することによるか、またはＣＡ配列をコードする遺伝子を投与することにより）、ＣＡ遺伝子産物の活性は増大される。好ましい実施形態において、遺伝子治療技術は、増強された相同組換え（ＥＨＲ）（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８（本明細書中で全体が参考として援用される）に記述されるような）を用いる外因性遺伝子の組み込みを包含する。あるいは、例えばＣＡ配列が癌においてアップレギュレーションされる際、内因性ＣＡ遺伝子の活性は、例えば、ＣＡアンチセンス核酸の投与により減少される。
【０２５９】
（（ｃ）ワクチン）
好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、ＤＮＡワクチン（単一遺伝子またはＣＡ遺伝子の組み合わせのいずれか）として投与される。裸のＤＮＡワクチンは、概して当該分野で公知である、Ｂｒｏｗｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：１３０４〜１３０５（１９９８）。
【０２６０】
一つの実施形態において、本発明のＣＡ遺伝子は、ＤＮＡワクチンとして使用される。ＤＮＡワクチンとしての遺伝子の使用のための方法は、当業者に対して周知であり、癌を有する患者における発現のためのプロモーターの制御下で、ＣＡ遺伝子またはＣＡ遺伝子の一部を配置することを包含する。ＤＮＡワクチンに使用されるＣＡ遺伝子は、全長ＣＡタンパク質をコードし得るが、さらに好ましくは、ＣＡタンパク質由来のペプチドを含むＣＡタンパク質の一部をコードし得る。好ましい実施形態において、患者は、ＣＡ遺伝子由来の複数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫される。同様に、複数のＣＡ遺伝子またはその部分を用いて、患者を免疫することが可能である。理論に束縛されずに、ＣＡタンパク質を発現する細胞を認識しそして破壊もしくは除去する、ＤＮＡワクチンによりコードされるポリペプチド、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞および抗体の発現が、誘導される。
【０２６１】
好ましい実施形態において、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンとともに、アジュバント分子をコード化する遺伝子を包含する。このようなアジュバント分子は、サイトカイン（ＤＮＡワクチンによりコードされるＣＡポリペプチドに対する免疫原性応答を増大する）を含む。さらなるアジュバントまたは代替的なアジュバントは、当業者に公知であり、発明での有用性を見出す。
【０２６２】
（（ｄ）抗体）
一つの実施形態において、癌インヒビターは、上で考察されたような抗体である。一つの実施形態において、本発明のＣＡタンパク質は、ＣＡタンパク質に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成するために使用され得、それは本明細書に記載されるように有用である。同様に、ＣＡタンパク質は、標準技術を用いて、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合され得る。次いで、これらのカラムは、ＣＡ抗体を精製するために使用され得る。好ましい実施形態において、抗体は、ＣＡタンパク質に特有のエピトープに対して生成される；すなわち、抗体は、他のタンパク質に対して、ほとんどもしくは全く交差反応を示さない。これらの抗体は、多くの適用において有用性を見出す。例えば、ＣＡ抗体は、標準アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合され得、ＣＡタンパク質を精製するために使用され得る。抗体はまた、ＣＡタンパク質に特異的に結合するので、上に概要が述べられているように、ポリペプチドをブロッキングする際に治療的に使用され得る。
【０２６３】
本発明は、コードされるポリペプチドに特異的な抗体を使用して、生物学的サンプル中のポリペプチドの存在を検出する方法および／または生物学的サンプル中のポリペプチドのレベルを測定する方法を、さらに提供し、ここで、ＣＡポリペプチドは、癌細胞において差次的に発現するＣＡポリヌクレオチドによってコードされる。これらの方法は、一般に以下を包含する：ａ）サンプルを、ＣＡポリヌクレオチド（前立腺癌細胞において差次的に発現する）によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程；およびｂ）抗体とサンプルの分子との間の結合を検出する工程。
【０２６４】
適切なコントロールと比較した場合、コードされる癌関連ポリペプチドに特異的な抗体の特定の結合の検出は、コードされるポリペプチドがサンプル中に存在することの指標である。適切なコントロールとしては、コードされるＣＡポリペプチドを含まないことが既知であるサンプル、または高いレベルのポリペプチドを含まないことが既知であるサンプルが挙げられる；例えば、正常組織、およびコードされるポリペプチドに特異的でない抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）に接触されたサンプル。特異的な抗体−抗原相互作用を検出するための種々の方法は、当該分野で公知であり、そして以下に挙げられるがこれらに限定されない方法において、使用され得る：標準的な免疫組織学的方法免役沈降、酵素イムノアッセイ、およびラジオイムノアッセイ。一般に、特異的抗体は、直接または間接に、検出可能に標識される。直接標識としては、放射性同位体；その産物が検出可能である酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）；蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンなど）；蛍光放射金属（例えば、金属キレート基（例えば、ＥＤＴＡ）を介して抗体に結合する１５２Ｅｕまたは他ランタニド系列；化学発光化合物（例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など）；生物発光化合物（例えば、ルシフェリン、アクオリン（緑色蛍光タンパク質）など）が、挙げられる。この抗体は、ポリスチレンプレートまたはポリスチレンビーズのような不溶支持体に結合（ａｔｔａｃｈ）（結合（ｃｏｕｐｌｅ））し得る。間接標識としては、コードされるポリペプチドに特異的な抗体（「一次特異的抗体」）に特異的な二次抗体（この二次抗体は、上述のように標識される）；および特異的結合対（例えば、ビオチン−アビジン）のメンバーなどが挙げられる。生物学的サンプルは、ニトロセルロースのような固体支持体またはキャリア（細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化し得る）と接触し、固定化され得る。次いで、この支持体は、適切な緩衝液で洗浄され得、その後、検出可能標識された一次特異的抗体と接触され得る。当該分野で公知の検出方法は、検出可能標識により発されるシグナルに適切であるように選択される。検出は、一般に、適切なコントロールおよび適切な標準との比較によって実行される。
【０２６５】
幾つかの実施形態において、本方法は、例えば、インビボでの使用に適合され、癌細胞が存在する部位を位置決めまたは同定する。これらの実施形態において、検出可能に標識された部分（例えば、抗体）は、癌関連ポリペプチドに特異的であり、例えば、注入によって個体に投与され、標識された細胞は、標準的な画像化技術（磁気共鳴画像化、コンピューター断層走査などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて位置決めされる。この様式において、癌細胞は、差次的に標識される。
【０２６６】
（（ｅ）癌の検出および診断）
理論に束縛されずに、種々のＣＡ配列は、癌において重要であるようである。従って、変異体または改変体のＣＡ遺伝子に基づいた障害が、決定され得る。一つの実施形態において、本発明は、細胞において少なくとも一つの内因性ＣＡ遺伝子の配列の全部または一部を決定することを包含する、改変体ＣＡ遺伝子を含む細胞を同定するための方法を提供する。当業者により理解されるように、これは、任意の数の配列決定の技術を使用して行われ得る。好ましい実施形態において、本発明は、個体の少なくとも一つのＣＡ遺伝子の配列の全部または一部を決定することを包含する、１個体のＣＡ遺伝子型を同定する方法を提供する。これは、概して、少なくとも一つの個体組織において実施され、多くの組織または同一組織の異なるサンプルの評価を包含し得る。この方法は、配列決定されたＣＡ遺伝子の配列と公知のＣＡ遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）とを比較することを包含し得る。当業者により理解されるように、あるＣＡ遺伝子の配列における変化は、疾患の存在または疾患を発生する傾向、または予後評価のいずれかの指標であり得る。
【０２６７】
次いで、ＣＡ遺伝子の全部または一部の配列は、任意の相違が存在するか否かを決定するために公知のＣＡ遺伝子の配列と比較され得る。これは、任意の数の公知の相同性プログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔなど）を用いて、実施され得る。好ましい実施形態において、患者のＣＡ遺伝子と公知ＣＡ遺伝子との間の配列における相違の存在は、本明細書で概要が述べられているように、疾患状態の指標または疾患状態についての傾向の指標である。
【０２６８】
好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、ゲノムにおけるＣＡ遺伝子のコピー数を決定するためのプローブとして使用され得る。例えば、幾つかの癌は、染色体欠失または挿入を呈し、その結果、遺伝子のコピー数が変化する。
【０２６９】
別の好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、ＣＡ遺伝子の染色体位置を決定するためのプローブとして使用される。染色体異常（例えば、転座など）などがＣＡ遺伝子座で同定される際、染色体位置のような情報は、特に診断または予後診断を提供する有効性を見出す。
【０２７０】
本発明は、癌細胞を検出するために本明細書中で記載されるポリヌクレオチドを使用する方法、被験体における癌の診断および癌の重症度（例えば、腫瘍の段階、腫瘍体積など）を容易にする方法、被験体の予後の決定を容易にする方法、および治療に対する被験体の応答性を評価する方法（例えば、化学療法レジメンの間、またはその後に、腫瘍体積を評価することで、治療効果の測定を提供することによって）を提供する。検出は、癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドの検出、および／または癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの検出に基づき得る。本発明の検出方法は、単離された細胞、または全組織または体液（例えば、血液、血漿、精液、尿など）に対して、インビトロまたはインビボで実施され得る。
【０２７１】
幾つかの実施形態において、癌細胞において差次的に発現される転写物の細胞における発現を検出することによって癌細胞を検出するための方法が、提供される。任意の種々の公知の方法が、以下が挙げられるが、これらに限定されない検出のために使用され得る：前立腺癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる転写物の検出；特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応による転写物の検出；前立腺癌において差次的に発現される遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして使用する、細胞のインサイチュハイブリダイゼーション。これらの方法を使用して、癌細胞において差次的に発現される遺伝子のｍＲＮＡレベルを検出および／または測定し得る。幾つかの実施形態において、これらの方法は、ａ）本明細書に記載される差次的に発現される遺伝子とサンプルとをハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させること；および、ｂ）存在する場合に、ハイブリダイゼーションを検出することを含む。
【０２７２】
差次的ハイブリダイゼーションの検出は、適切なコントロールと比較した場合に、癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドのサンプル中での存在の指標となる。適切なコントロールとしては、例えば、癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドを含まないことが既知であるサンプルが挙げられ、そして、癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドとして同じ「センス」の標識されたポリヌクレオチドの使用を含む。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当該分野で公知であり、上で詳述されている。検出はまた、任意の公知の方法（インサイチュハイブリダイゼーション、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）、ＴＭＡ、ｂＤＮＡ、およびＮａｓｂａｕならびに「Ｎｏｒｔｈａｎ」ブロッティングもしくはＲＮＡブロッティング、またはこのような技術の組み合わせ（これらは、適切に標識されたポリヌクレオチドを使用する）が挙げられるが、これらに限定されない）によって達成され得る。ポリヌクレオチドに対する種々の標識および標識方法は、当該分野で公知であり、本発明のアッセイ方法において使用され得る。ハイブリダイゼーションの特異性は、適切なコントロールに対する比較によって決定され得る。
【０２７３】
一般的に、本明細書に提供されるポリヌクレオチドの少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１２ｎｔまたは少なくとも１５ｎｔ連続するヌクレオチドを含み、例えば、表１〜６に示されるような配列を有するポリヌクレオチドが種々の目的（例えば、前立腺癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドの転写レベルを検出および／または測定するためのプローブ）に対して使用される。当業者によって容易に理解されるように、このプローブは、検出可能に標識され得、そして、例えば、試験サンプルから得られる固定化されたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含むアレイと接触され得る。あるいは、このプローブは、アレイ上に固定化され得、そして試験サンプルは検出可能に標識される。本発明の方法のこれらのバリエーションおよび他のバリエーションは、十分に当該分野の技術内であり、本発明の範囲内である。
【０２７４】
ヌクレオチドプローブを使用して、提供されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出する。Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロットにおいて、ｍＲＮＡは電気泳動で分離され、そしてプローブと接触される。特定のサイズのｍＲＮＡ種にハイブリダイズする際に、プローブが検出される。ハイブリダイゼーションの量を定量して、例えば、特定の条件下での発現の相対量を決定し得る。細胞に対するインサイチュハイブリダイゼーションに対してプローブを使用して、発現を検出する。プローブはまた、ハイブリダイズ配列の診断的検出のために使用され得る。プローブは、代表的に、放射性同位体により標識される。例えば、発色団、発蛍光団、および酵素のような他の型の検出可能な標識が使用され得る。ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの他の例は、ＷＯ９２／０２５２６および米国特許第５，１２４，２４６号に記載される。
【０２７５】
ＰＣＲは、少量の標的核酸を検出するための別の手段である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５；米国特許第４，６８３，１９５号；および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）。標的核酸とハイブリダイズする２つのプライマーオリゴヌクレオチドを使用して、反応をプライムする。これらのプライマーは、本明細書中に開示されるＣＡポリヌクレオチド内の配列またはＣＡポリヌクレオチドに対して３’および５’から構成され得る。あるいは、これらのプライマーが、これらのポリヌクレオチドに対して３’および５’である場合、これらのプライマーは、これらのポリヌクレオチドまたはそれらの相補体にハイブリダイズする必要はない。
【０２７６】
熱安定ポリメラーゼによる標的の増幅後、増幅された標的核酸は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット）によって検出され得る。ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡはまた、従来のブロッティング技術（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット、Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロットなど）によって検出され得、これらの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）（例えば、ＰＣＲ増幅を用いない）に記載される。一般に、ポリメラーゼ酵素を用いてｍＲＮＡから生成されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を用いて精製および分離され得、そして固体支持体（例えば、ニトロセルロース）に移される。固体支持体は、標識されたプローブに曝され、洗浄されて、いかなるハイブリダイズしていないプローブを除去し、そして標識されたプローブを含む二重鎖が検出される。
【０２７７】
ＰＣＲ増幅を用いる方法は、単一の細胞由来のＤＮＡに対して実施され得るが、少なくとも約１０５の細胞を使用することが都合が良い。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、Ｓａｉｋｉら，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７、および現在の技術の概説は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，ｐｐ．１４．２〜１４．３３に見出され得る。検出可能な標識は、増幅反応に含まれ得る。適切な検出可能な標識としては、発蛍光団（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ））、放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなど）などが挙げられる。この標識は、２段階の系であり、ここで、ポリヌクレオチドは、ビオチン、ハプテンなどに結合体化し、これらは、高親和性結合パートナー（例えば、アビジン、特異的抗体など）を有し、ここで、結合パートナーは、検出可能な標識に結合体化される。標識は、これらのプライマーの１つまたは両方に結合体化され得る。あるいは、増幅において使用されるヌクレオチドのプールを標識して、標識を増幅産物へ組み込む。
【０２７８】
検出方法は、キットの一部として提供され得る。従って、本発明はさらに、生物学的サンプルにおいて、癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチド、およびそれによってコードされるポリペプチドの存在および／またはレベルを検出する（例えば、差次的に発現される目的の遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの検出により）ためのキットを提供する。これらのキットを使用する手順は、臨床研究室、実験的研究室、医師、または各個人によって実施され得る。癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを検出するための本発明のキットは、ポリペプチドに特異的に結合する部分を含み得、これは、ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する抗体であり得る。癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドを検出するために使用される本発明のキットは、このようなポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする部分を含み得る。このキットは、必要に応じて、この手順において有用なさらなる構成要素を含み得、これらとしては、緩衝液、現像試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、標準物質、指示書、および解釈情報が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、表１〜６に示される配列を有するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの少なくとも１つを含む前立腺癌を検出するためのキットを提供する。
【０２７９】
本発明はさらに、哺乳動物（例えば、ヒト）において腫瘍性状態または前新生物状態を検出／診断する方法に関する。本明細書中で使用される場合、「診断」は、一般に、疾患または障害の疑いのある被験体の決定、被験体が現在疾患または障害に罹患しているか否かの決定、疾患または障害に罹患している被験体の予後診断（例えば、前転移性癌性状態または転移性癌性状態、癌の段階、または治療に対する癌の応答性）、ならびに治療測定（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、被験体の状態をモニタリングして、治療の効果または有効性に関する情報を提供する）を含む。
【０２８０】
用語「処置」、「処置すること」、「処置する」などは、本明細書中で一般に、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることをいうために使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという観点から予防的であり得るか、そして／あるいは、疾患および／もしくは疾患の原因となり得る副作用に対する部分的または完全な安定化もしくは治癒の観点から治療的であり得る。「処置」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を含み、そして、以下の工程を包含する：（ａ）疾患または症状に罹患する状態にあり得るが、罹患しているとは診断されていない被験体において、疾患または症状が発生することを予防する工程；（ｂ）疾患症状を阻害する工程（すなわち、その発生を停止させる工程）；または（ｃ）疾患症状を軽減する工程（すなわち、疾患または症状の退行を引き起こす工程）。
【０２８１】
「有効量」は、臨床結果を含む有益または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１つ以上の投与で投与され得る。
【０２８２】
「細胞サンプル」は、個体から得られる種々のサンプルの型を含み、診断アッセイまたはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。この定義は、生物学的起源の血液および他の液体サンプル、固形組織サンプル（例えば、生検標本）または組織培養物またはそれから誘導される細胞、ならびにその子孫を含む。この定義はまた、それらの獲得後に任意の方法（例えば、試薬による処理、可溶化、または特定の成分（例えば、タンパク質もしくはポリヌクレオチド）に対する冨化による）で操作されるサンプルを含む。用語「細胞サンプル」は、臨床サンプルを含み、そしてまた、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体、および組織サンプルを含む。
【０２８３】
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍性細胞」、「腫瘍性」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」（これらは交換可能に使用される）は、相対的に自律的な増殖を呈し、その結果、細胞増殖（すなわち、自由な細胞分裂）の制御の有意な損失によって特徴付けられる異常な増殖表現型を呈する細胞をいう。腫瘍性細胞は、悪性または良性であり得る。
【０２８４】
用語「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は、本明細書中で交換可能に使用され、診断、処置または治療が所望される任意の哺乳動物被験体（特に、ヒト）をいう。他の被験体としては、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが挙げられ得る。これらの方法に従って検出／診断され得る状態の例としては、癌が挙げられ得る。適切な発現パターンを呈する遺伝子に対応するポリヌクレオチドを使用して、被験体における癌を検出し得る。癌のマーカーの概説については、例えば、Ｈａｎａｈａｎら，Ｃｅｌｌ  １００：５７−７０（２０００）を参照のこと。
【０２８５】
１つの検出／診断方法は、以下を含む：（ａ）哺乳動物（例えば、ヒト）から生物学的サンプルを得る工程、（ｂ）サンプル中のＣＡタンパク質の存在を検出する工程および（ｃ）存在するサンプルの量とコントロールサンプル中の量とを比較する工程。本方法に従って、サンプル中のＣＡ遺伝子産物の上昇したレベルの存在は、被験体が腫瘍性状態または前新生物性状態にあることを示す。
【０２８６】
本方法の使用に適切な生物学的サンプルとしては、生物学的流体（例えば、血清、血漿、胸水、尿および大脳−脊髄液、ＣＳＦ）が挙げられ、組織サンプル（例えば、乳腺腫瘍または前立腺組織切片）がまた、本発明の方法において使用され得、サンプルとしては、生検に由来するサンプルが挙げられる。細胞培養物または、例えば、組織生検に由来する抽出物もまた、使用され得る。
【０２８７】
化合物は、好ましくは、結合タンパク質（例えば、抗体、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント）であり、これは、検出可能なマーカー（例えば、発色団、発蛍光団または同位体など）により標識され得る。適切である場合、化合物は、固体支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、樹脂など）に結合され得る。複合体の形成の決定は、第１の化合物（または複合体）に特異的に結合するさらなる化合物（例えば、抗体）とこの複合体とを接触させることによって実施され得る。第１の化合物のように、さらなる化合物は、固体支持体に結合され得、そして／または検出可能なマーカーにより標識され得る。
【０２８８】
本発明に従う上昇したＣＡタンパク質レベルの同定は、アジュバント療法から利益を享受する可能性のある被験体（患者）の同定を可能にする。例えば、第一次療法後の被験体（例えば、手術を受けた被験体）からの生物学的サンプルは、循環ＣＡタンパク質の存在についてスクリーニングされ得、正常な集団の研究により決定された同タンパク質の上昇したレベルの存在は、残存腫瘍組織の指標である。同様に、外科的に除去された腫瘍の切断部位からの組織が試験され得（例えば、免疫蛍光により）、（周囲の組織に対して）上昇した生成物レベルの存在が、腫瘍の不完全な除去の指標である。このような被験体を同定する能力は、特定の患者の要求に対して治療を取り繕うことを可能にする。非外科的治療（例えば、化学療法または放射線療法）を受けた被験体もまたモニターされ得、このような上昇したＣＡタンパク質レベルの被験体由来のサンプルにおける存在は、継続的な処置を必要とする患者の指標である。疾患の段階分け（ｓｔａｇｉｎｇ）（例えば、処置レジメンを最適化する目的で）もまた、例えば、バイオプシーにより（例えば、ＣＡタンパク質に対する抗体を用いたバイオプシーにより）なされ得る。
【０２８９】
（ｆ）動物モデルおよびトランスジェニック
別の好ましい実施形態において、ＣＡ遺伝子は、癌（特にリンパ腫および癌腫）の動物モデルを作製する有用性を見出す。当業者により理解されるように、同定されたＣＡ遺伝子が、ＣＡ組織内で抑制されるまたは減少される際、アンチセンスＲＮＡがＣＡ遺伝子に指向された遺伝子治療技術もまた、遺伝子の発現を減少または抑制する。そのように作製された動物は、生物活性薬剤候補のスクリーニングにおける有用性を見出すＣＡの動物モデルとして機能する。同様に、例えば、適切な遺伝子標的化ベクターを用いた相同性組換えの結果としての、遺伝子ノックアウト技術は、ＣＡタンパク質の非存在という結果となる。
【０２９０】
ＣＡタンパク質が癌において過剰発現される可能性もある。所望ならば、ＣＡタンパク質の組織特異的な発現またはノックアウトは、必要であり得る。従って、ＣＡタンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物が作製され得る。所望の発現レベルに依存して、種々の強度のプロモーターが、トランスジーンを発現するために使用され得る。また、組み込まれたトランスジーンのコピー数は、トランスジーンの発現レベルの決定のために、決定および比較され得る。このような方法により作製された動物は、ＣＡの動物モデルとしての有用性を見出し、癌腫の処置のための生物活性分子のスクリーニングにおいてさらに有用である。
【０２９１】
（（ｇ）ＣＡ配列の特徴付け）
本発明のＣＡ核酸配列を表１〜６に示す。各表の配列は、マウス遺伝子およびヒト遺伝子の両方についてのＤＮＡ配列、ｍＲＮＡに対応する配列およびｍＲＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を含む。異なる配列には、以下の配列番号を割り当てた：
表１（マウス遺伝子：Ｆｓｃｎ１；ヒト遺伝子ＳＮＬ）
マウスゲノム配列（配列番号１）
マウスｍＲＮＡ配列（配列番号２）
マウスコード配列（配列番号３）
ヒトゲノム配列（配列番号４）
ヒトｍＲＮＡ配列（配列番号５）
ヒトコード配列（配列番号６）
【０２９２】
【化１】
2005520543.tif 000003
【０２９３】
【化２】
2005520543.tif 000004
【０２９４】
【化３】
2005520543.tif 000005
【０２９５】
【化４】
2005520543.tif 000006
【０２９６】
【化５】
2005520543.tif 000007
【０２９７】
【化６】
2005520543.tif 000008
【０２９８】
【化７】
2005520543.tif 000009
【０２９９】
【化８】
2005520543.tif 000010
【０３００】
【化９】
2005520543.tif 000011
【０３０１】
【化１０】
2005520543.tif 000012
【０３０２】
【化１１】
2005520543.tif 000013
【０３０３】
【化１２】
2005520543.tif 000014
【０３０４】
【化１３】
2005520543.tif 000015
【０３０５】
【化１４】
2005520543.tif 000016
【０３０６】
【化１５】
2005520543.tif 000017
【０３０７】
【化１６】
2005520543.tif 000018
【０３０８】
【化１７】
2005520543.tif 000019
【０３０９】
【化１８】
2005520543.tif 000020
表２（マウス遺伝子：Ｆｏｓｂ；ヒト遺伝子ＦＯＳＢ）
マウスゲノム配列（配列番号７）
マウスｍＲＮＡ配列（配列番号８）
マウスコード配列（配列番号９）
ヒトゲノム配列（配列番号１０）
ヒトｍＲＮＡ配列（配列番号１１）
ヒトコード配列（配列番号１２）
【０３１０】
【化１９】
2005520543.tif 000021
【０３１１】
【化２０】
2005520543.tif 000022
【０３１２】
【化２１】
2005520543.tif 000023
【０３１３】
【化２２】
2005520543.tif 000024
【０３１４】
【化２３】
2005520543.tif 000025
【０３１５】
【化２４】
2005520543.tif 000026
【０３１６】
【化２５】
2005520543.tif 000027
【０３１７】
【化２６】
2005520543.tif 000028
【０３１８】
【化２７】
2005520543.tif 000029
【０３１９】
【化２８】
2005520543.tif 000030
【０３２０】
【化２９】
2005520543.tif 000031
【０３２１】
【化３０】
2005520543.tif 000032
【０３２２】
【化３１】
2005520543.tif 000033
【０３２３】
【化３２】
2005520543.tif 000034
【０３２４】
【化３３】
2005520543.tif 000035
【０３２５】
【化３４】
2005520543.tif 000036
表３（マウス遺伝子：Ｃｃｎｄ１；ヒト遺伝子ＣＣＮＤ１）
マウスゲノム配列（配列番号１３）
マウスｍＲＮＡ配列（配列番号１４）
マウスコード配列（配列番号１５）
ヒトゲノム配列（配列番号１６）
ヒトｍＲＮＡ配列（配列番号１７）
ヒトコード配列（配列番号１８）
【０３２６】
【化３５】
2005520543.tif 000037
【０３２７】
【化３６】
2005520543.tif 000038
【０３２８】
【化３７】
2005520543.tif 000039
【０３２９】
【化３８】
2005520543.tif 000040
【０３３０】
【化３９】
2005520543.tif 000041
【０３３１】
【化４０】
2005520543.tif 000042
【０３３２】
【化４１】
2005520543.tif 000043
【０３３３】
【化４２】
2005520543.tif 000044
【０３３４】
【化４３】
2005520543.tif 000045
【０３３５】
【化４４】
2005520543.tif 000046
【０３３６】
【化４５】
2005520543.tif 000047
【０３３７】
【化４６】
2005520543.tif 000048
【０３３８】
【化４７】
2005520543.tif 000049
【０３３９】
【化４８】
2005520543.tif 000050
【０３４０】
【化４９】
2005520543.tif 000051
表４（マウス遺伝子：Ｍｙｃ；ヒト遺伝子ＭＹＣ）
マウスゲノム配列（配列番号１９）
マウスｍＲＮＡ配列（配列番号２０）
マウスコード配列（配列番号２１）
ヒトゲノム配列（配列番号２２）
ヒトｍＲＮＡ配列（配列番号２３）
ヒトコード配列（配列番号２４）
【０３４１】
【化５０】
2005520543.tif 000052
【０３４２】
【化５１】
2005520543.tif 000053
【０３４３】
【化５２】
2005520543.tif 000054
【０３４４】
【化５３】
2005520543.tif 000055
【０３４５】
【化５４】
2005520543.tif 000056
【０３４６】
【化５５】
2005520543.tif 000057
【０３４７】
【化５６】
2005520543.tif 000058
【０３４８】
【化５７】
2005520543.tif 000059
【０３４９】
【化５８】
2005520543.tif 000060
【０３５０】
【化５９】
2005520543.tif 000061
【０３５１】
【化６０】
2005520543.tif 000062
【０３５２】
【化６１】
2005520543.tif 000063
【０３５３】
【化６２】
2005520543.tif 000064
【０３５４】
【化６３】
2005520543.tif 000065
【０３５５】
【化６４】
2005520543.tif 000066
【０３５６】
【化６５】
2005520543.tif 000067
表５（マウス遺伝子：Ｎｆｋｂ１；ヒト遺伝子ＮＦＫＢ１）
マウスゲノム配列（配列番号２５）
マウスｍＲＮＡ配列（配列番号２６）
マウスコード配列（配列番号２７）
ヒトゲノム配列（配列番号２８）
ヒトｍＲＮＡ配列（配列番号２９）
ヒトコード配列（配列番号３０）
【０３５７】
【化６６】
2005520543.tif 000068
【０３５８】
【化６７】
2005520543.tif 000069
【０３５９】
【化６８】
2005520543.tif 000070
【０３６０】
【化６９】
2005520543.tif 000071
【０３６１】
【化７０】
2005520543.tif 000072
【０３６２】
【化７１】
2005520543.tif 000073
【０３６３】
【化７２】
2005520543.tif 000074
【０３６４】
【化７３】
2005520543.tif 000075
【０３６５】
【化７４】
2005520543.tif 000076
【０３６６】
【化７５】
2005520543.tif 000077
【０３６７】
【化７６】
2005520543.tif 000078
【０３６８】
【化７７】
2005520543.tif 000079
【０３６９】
【化７８】
2005520543.tif 000080
【０３７０】
【化７９】
2005520543.tif 000081
【０３７１】
【化８０】
2005520543.tif 000082
【０３７２】
【化８１】
2005520543.tif 000083
【０３７３】
【化８２】
2005520543.tif 000084
【０３７４】
【化８３】
2005520543.tif 000085
【０３７５】
【化８４】
2005520543.tif 000086
【０３７６】
【化８５】
2005520543.tif 000087
【０３７７】
【化８６】
2005520543.tif 000088
【０３７８】
【化８７】
2005520543.tif 000089
【０３７９】
【化８８】
2005520543.tif 000090
【０３８０】
【化８９】
2005520543.tif 000091
【０３８１】
【化９０】
2005520543.tif 000092
【０３８２】
【化９１】
2005520543.tif 000093
【０３８３】
【化９２】
2005520543.tif 000094
【０３８４】
【化９３】
2005520543.tif 000095
【０３８５】
【化９４】
2005520543.tif 000096
【０３８６】
【化９５】
2005520543.tif 000097
【０３８７】
【化９６】
2005520543.tif 000098
【０３８８】
【化９７】
2005520543.tif 000099
【０３８９】
【化９８】
2005520543.tif 000100
【０３９０】
【化９９】
2005520543.tif 000101
【０３９１】
【化１００】
2005520543.tif 000102
【０３９２】
【化１０１】
2005520543.tif 000103
表６（ヒトＰＶＴ１）
ヒト転写産物（配列番号３１）
ヒトゲノム（配列番号３２）
ヒトタンパク質（配列番号３３）
【０３９３】
【化１０２】
2005520543.tif 000104
【０３９４】
【化１０３】
2005520543.tif 000105
【０３９５】
【化１０４】
2005520543.tif 000106
【０３９６】
【化１０５】
2005520543.tif 000107
【０３９７】
【化１０６】
2005520543.tif 000108
【０３９８】
【化１０７】
2005520543.tif 000109
【０３９９】
【化１０８】
2005520543.tif 000110
【０４００】
【化１０９】
2005520543.tif 000111
【０４０１】
【化１１０】
2005520543.tif 000112
【０４０２】
【化１１１】
2005520543.tif 000113
【０４０３】
【化１１２】
2005520543.tif 000114
【０４０４】
【化１１３】
2005520543.tif 000115
【０４０５】
【化１１４】
2005520543.tif 000116
【０４０６】
【化１１５】
2005520543.tif 000117
【０４０７】
【化１１６】
2005520543.tif 000118
【０４０８】
【化１１７】
2005520543.tif 000119
【０４０９】
【化１１８】
2005520543.tif 000120
【０４１０】
【化１１９】
2005520543.tif 000121
【０４１１】
【化１２０】
2005520543.tif 000122
【０４１２】
【化１２１】
2005520543.tif 000123
【０４１３】
【化１２２】
2005520543.tif 000124
【０４１４】
【化１２３】
2005520543.tif 000125
【０４１５】
【化１２４】
2005520543.tif 000126
【０４１６】
【化１２５】
2005520543.tif 000127
【０４１７】
【化１２６】
2005520543.tif 000128
【０４１８】
【化１２７】
2005520543.tif 000129
【０４１９】
【化１２８】
2005520543.tif 000130
【０４２０】
【化１２９】
2005520543.tif 000131
本発明の特定の局面は、続く非限定的な実施例においてより詳細に記載される。
【実施例】
【０４２１】
以下の実施例は、本発明の生成方法および使用方法の完全な開示および詳細を当業者に提供するために記されており、本発明者らの発明に関する範囲を限定することを意図せず、また以下の実施例は、実施した実験全てであり、かつ実施した実験のみであることを表すことを意図していない。使用する数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。そうでないことが示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧またはその付近である。
【０４２２】
（実施例１：マウスにおける腫瘍誘導後の挿入部位の分析）
マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）またはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のいずれかを用いて、腫瘍をマウスにおいて誘導する。ＭＭＴＶは乳房腺癌を引き起こし、そしてＭＬＶは、種々の異なる造血性悪性腫瘍（主に、Ｔ細胞リンパ腫またはＢ細胞リンパ腫）を引き起こす。３つの経路の感染を使用する：（１）新生仔への精製したウイルス調製物の注射、（２）育児中の乳骨ウイルスによる感染、および（３）生殖系列を介した病原性プロウイルスの遺伝子導入（Ａｋｖｒ１および／またはＭｔｖ２）。各々の罹患マウスに存在する悪性腫瘍の型を、ホルマリン固定、パラフィン包埋バイオプシーサンプルのＨ＆Ｅ染色薄切片の組織学的分析により決定する。各々の腫瘍における、全てのクローン組み込みプロウイルスに隣接する宿主ＤＮＡ配列を、２つのウイルス特異的プライマーおよび制限酵素消化された腫瘍ＤＮＡに連結された４０ｂｐ二本鎖ＤＮＡアンカーに特異的な２つのプライマーを用いる入れ子のアンカーＰＣＲにより回収する。宿主／ウイルス連結フラグメントを表す増幅したバンドをクローニングし、配列決定する。次いで、宿主配列（「タグ」と呼ばれる）を、Ｃｅｒｅｌａマウスゲノム配列をＢＬＡＳＴ分析するのに使用される。各個々のタグについて、３つのパラメータを記録する：（１）マウス染色体配置、（２）組み込みが起こる塩基対座標、および（３）プロウイルス指向性。この情報を用いて、全ての分析した腫瘍からの全ての利用可能なタグを、マウスゲノムにマッピングする。プロウイルス挿入変異のプロトオンコジーン標的を同定するため、組み込み体の各クラスターにおけるプロウイルス組み込みパターンを、トランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）中の全ての既知遺伝子の位置に対して分析する。２つ以上の独立した腫瘍における同じ遺伝子座におけるプロウイルスの存在は、プロトオンコジーンがプロウイルス組み込み部位またはその非常に近い位置に存在する明白な証拠である。その理由は、ランダム組み込みにはゲノムは長すぎて観察可能なクラスター形成がなされないからである。検出される任意のクラスター形成は、腫瘍形成の間の生物学的選択についての明瞭な証拠である。プロウイルス挿入変異のプロトオンコジーン標的のヒトオルソログを同定するためにマウスゲノムおよびヒトゲノムの合成領域の比較分析を実施する。
【０４２３】
宿主／ウイルス連結フラグメントのＰＣＲ増幅の例を、図１に示す。レーン１は、正常なコントロールＤＮＡからの増幅産物を含み、そしてレーン２は、腫瘍ＤＮＡからの増幅産物を含む。これらのバンドは、ＤＮＡサンプル中に存在する５’宿主／ウイルス連結フラグメントから生じる。レーン１は、全てのプロウイルスからのｅｎｖ／３’ＬＴＲ連結由来のバンドを有し（上）、病原性内因性Ｍｔｖ２プロウイルス由来の宿主／５’ＬＴＲが、この特定のマウス系統に存在する。この内因性プロウイルスの配列は、腫瘍中の新規のクローン組み込みプロウイルスと同一なので、内因性プロウイルスを検出する。腫瘍に存在することが知られている４つ全ての新規のクローン組み込みプロウイルスは、容易に検出される。
【０４２４】
（実施例２．定量ＲＴ−ＰＣＲの分析：比較ＣＴ法）
標的遺伝子の発現レベルを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて定量する。この方法は、参照（正規化群）ハウスキーピング遺伝子（Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，２００１）のコピー数と比較した場合の標的テンプレートの最初のコピー数の量に基づく。各々のＰＣＲサイクルによるＤＮＡ産物の蓄積は、増幅効率および初期テンプレート濃度に関連する。従って、標的および正規化群の両方の増幅効率は、ほぼ等しくなければならない。出発テンプレートコピー数およびＤＮＡ増幅効率に依存する閾値サイクル（ＣＴ）は、ＰＣＲ産物の増幅（ｇｒｏｗｔｈ）が指数関数的である間のＰＣＲサイクルである。標的および正規化群についての類似する動的な範囲と共に、比較ＣＴ法が適用可能である。
【０４２５】
定量ＲＴ−ＰＣＲについての遺伝子発現の比較ＣＴ法の例を、図２に示す。第１の工程において、正常組織およびいくつかのサンプル組織に対して４連でアッセイを実施する。これらの組織において、ＣＴ値の平均および標準偏差を、ハウスキーピング遺伝子（疾患状態と無関係に、種々のサンプル間で生物学的に安定であることが示される場合、コントロールとして選択される）および標的遺伝子について決定する。図２は、ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子の平均ＣＴ値の例を示す。これらの値は、特定の組織におけるその遺伝子の固有の発現レベルに依存して、１０代前半〜４０の範囲内であり得る。全ての複製セットの変動係数は、１．５％を超過し得ない。
【０４２６】
ΔＣＴがテンプレート希釈と共にどのように変化するかの評価は、テンプレートＲＮＡの対数入力量  対  ΔＣＴプロットが＜０．１０の傾斜を有する場合に標的およびハウスキーパーアンプリコンの効率がほぼ等しいことを立証する。標的およびハウスキーパーについて立証された相対効率により、上述のようにΔΔＣＴ比較計算が有効となる。種々のサンプル値についての標的およびハウスキーパー遺伝子のＣＴ値（ΔＣＴ）の間の算出された差を図３に示す。ΔΔＣＴを、規定（較正）サンプルのΔＣＴ値からそのΔＣＴ値を引くことによって、各々のサンプルについて計算する。いくつかのサンプルにおいて発現が増加し、他のサンプルにおいて減少する場合、ΔΔＣＴは、ネガティブ値とポジティブ値の混合である。計算の最終工程は、これらの値を絶対値に変換することである。その式は、以下の通りである：
比較発現レベル＝２−ΔΔＣＴ
キャリブレーターについての最終値は、必ず１つであるはずである。図４は、図３からの各サンプルについてのΔΔＣＴおよび比較発現レベルを示す。
【０４２７】
（実施例３．癌サンプルにおける種々の遺伝子のｍＲＮＡ発現の分析）
ｍＲＮＡを、当該分野で公知のような標準的な手順により種々の癌サンプルから調製した。遺伝子発現を、上記実施例２に記載されるように、かつ以下にさらに記載されるようにして測定した。５’−ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ）化学は、２つのＰＣＲプライマーの間でアニーリングする二重標識（レポーターおよびクエンチャー）蛍光プローブを添加する点が、標準的なＰＣＲとは異なる。レポーター色素の蛍光は、近接するクエンチャーによりクエンチされる。熱サイクルの間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、アニーリングしたプローブを開裂し、そしてレポーターおよびクエンチャー色素を遊離させる。蛍光の増加が見られ、そして蛍光がバックグラウンドを越えて増加するサイクル数は、対数直線様式でその出発テンプレート濃度に関連する。
【０４２８】
データ分析のために、標的遺伝子の発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子の発現レベルで正規化した。ハウスキーピング遺伝子の平均発現レベルを、標的遺伝子の平均発現レベルから引いた。次いで、標準偏差を決定した。さらに、癌組織における標的遺伝子の発現レベルを、正常組織における標的遺伝子の発現レベルと比較する。図５〜２４において、バーは、発現レベルの平均を表し、そして誤差バーは、標準偏差を現す。
【０４２９】
（ｉ）ＳＮＬ１
図５は、乳癌組織におけるＳＮＬ１のｍＲＮＡ発現を正常組織における発現と比較して示す。サンプル１〜５０は乳癌サンプルである。サンプル５１および５２は、正常組織である。ＳＮＬ１は、試験した乳癌サンプルの約２０％においてアップレギュレートされた。
【０４３０】
（ｉｉ）ＦＯＳＢ
図６は、結腸癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡ発現を正常組織における発現と比較して示す。サンプル１〜１１は正常サンプルである。サンプル１２〜３１は、結腸癌組織である。
【０４３１】
図７は、肺癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡ発現を正常組織における発現と比較して示す。サンプル１〜９は正常サンプルである。サンプル１０〜４３は、肺癌組織である。
【０４３２】
図８は、膵臓癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡ発現を正常組織における発現と比較して示す。サンプル１〜１０は正常サンプルである。サンプル１１〜３１は、膵臓癌組織である。
【０４３３】
図９は、卵巣癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡ発現を正常組織における発現と比較して示す。サンプル１〜１６は正常サンプルである。サンプル１７〜４４は、卵巣癌組織である。
【０４３４】
図１０は、胃癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡ発現を正常組織における発現と比較して示す。サンプル１〜１０は正常サンプルである。サンプル１１〜３９は、胃癌組織である。ＦＯＳＢは、試験した乳癌サンプルの約２６％においてアップレギュレートされた。
【０４３５】
図１１は、乳癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡ発現を正常組織における発現と比較して示す。サンプル１〜９は正常サンプルである。サンプル１０〜３０は、乳癌組織である。
【０４３６】
図１２は、前立腺癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡ発現を正常組織における発現と比較して示す。サンプル１〜７は正常サンプルである。サンプル８〜３７は、前立腺癌組織である。
【０４３７】
（ｉｉｉ）ＭＹＣ
図１３は、正常な組織における発現と比較される乳癌組織におけるＭＹＣのｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。ＭＹＣは、試験される乳癌サンプルのおよそ８％アップレギュレートされた。
【０４３８】
図１４は、正常な組織における発現と比較される乳癌組織におけるＭＹＣのＤＮＡ増幅を描く。サンプル１〜４９は、乳癌サンプルである。ＭＹＣ  ＤＮＡは、試験される乳癌サンプルのおよそ約２１％増幅された。
【０４３９】
（ｉｖ）ＣＣＮＤ１
図１５は、正常な組織における発現と比較される乳癌組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。サンプル５１および５２は、正常な組織である。ＣＣＮＤ１は、試験される乳癌サンプルのおよそ２６％アップレギュレートされた。
【０４４０】
図１６は、正常な組織における発現と比較される結腸癌（Ｓ字結腸）組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜１２は、正常なサンプルである。サンプル１３〜２９は、結腸癌組織である。
【０４４１】
図１７は、正常な組織における発現と比較される結腸癌（横行結腸）組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜１２は、正常なサンプルである。サンプル１３〜３０は、結腸癌組織である。
【０４４２】
図１８は、正常な組織における発現と比較される肺組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜９は、正常なサンプルである。サンプル１０〜４３は、肺癌組織である。
【０４４３】
図１９は、正常な組織における発現と比較される卵巣組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜１４は、正常なサンプルである。サンプル１５〜４１は、卵巣癌組織である。
【０４４４】
（ｖ）ＮＦＫＢ１
図２０は、正常な組織における発現と比較される乳癌組織におけるＮＦＫＢ１のｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。サンプル５１および５２は、正常な組織である。ＮＦＫＢ１は、試験される乳癌サンプルのおよそ２５％アップレギュレートされた。
【０４４５】
図２１は、正常な組織における発現と比較される肺組織におけるＮＦＫＢ１のｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜９は、正常なサンプルである。サンプル１０〜４４は、肺癌組織である。
【０４４６】
図２２は、正常な組織における発現と比較される皮膚組織におけるＮＦＫＢ１のｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜９は、正常なサンプルである。サンプル１０〜４６は、皮膚癌組織である。
【０４４７】
（ｖｉ）ＰＶＴ１
図２３は、正常な組織における発現と比較される乳癌組織におけるＰＶＴ１のｍＲＮＡ発現を描く。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。ＰＶＴ１は、試験される乳癌サンプルのおよそ１０％アップレギュレートされた。  
【０４４８】
図２４は、正常な組織における発現と比較される乳癌組織におけるＰＶＴ１のＤＮＡ増幅を描く。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。
【０４４９】
（実施例４：アレイを使用する癌と関連付けられるｃＤＮＡの増加したレベルの検出）
癌における示差的発現についてスクリーニングされる種々の候補ＣＡ遺伝子を表すｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドアレイにおけるハイブリダイゼーションによりアッセイされる。ｃＤＮＡ配列は、目的の細胞株または組織から単離されるｃＤＮＡクローンを含む。分析されるｃＤＮＡ配列はまた、Ｕｎｉｇｅｎｅデータベースにおける配列と重複する配列を含むポリヌクレオチドを含み、この重複する配列は、種々の起源、機能および特徴づけのレベルの種々の遺伝子産物をコードする。ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡのおよそ２００ｎｇ／μｌのおよそ０．８μｌで二連でスポットされる４，０６８配列（コントロールを含む）を表すスライド当たり９，２１６スポットの密度で当該分野で周知の方法に従って、反射スライド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にスポットされる。
【０４５０】
目的の遺伝子産物に対応する選択されたｃＤＮＡクローンのＰＣＲ産物は、５０％ＤＭＳＯ溶液中で調製される。これらのＰＣＲ産物は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｒｏｂｏｔを使用してアレイ当たり９２１６クローンの密度でＡｍｅｒｓｈａｍアルミニウムマイクロアレイスライド上にスポットされる。クローンは、チップ当たり合計４６０８の異なる配列について二連でスポットされる。
【０４５１】
ｃＤＮＡプローブは、患者から単離される腫瘍組織サンプルおよび正常な組織サンプルのレーザー捕捉微小切開（ＬＣＭ，Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により得られる総ＲＮＡから調製される。
【０４５２】
総ＲＮＡは、最初に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを使用してｃＤＮＡ中に逆転写され、続いて第２の鎖ＤＮＡ合成が行われる。次いで、ｃＤＮＡは、インビトロで転写され、Ｔ７プロモーター媒介発現（例えば、Ｌｕｏら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ５：１１７−１２２）を使用するアンチセンスＲＮＡを生成し、次いでアンチセンスＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換される。ｃＤＮＡの第２のセットは、Ｔ７プロモーターを使用して、インビトロで再び転写され、アンチセンスＲＮＡを提供する。次いで、このアンチセンスＲＮＡは、蛍光標識され、またはＲＮＡが再びｃＤＮＡに変換され、Ｔ７媒介増幅の第３ラウンドを可能にし、より多くのアンチセンスＲＮＡを生成する。従って、この手段は、インビトロ転写の２ラウンドまたは３ラウンドを提供し、蛍光標識に使用される最終ＲＮＡを生成する。プローブは、ＲＮＡ出発物質から蛍光標識されたｃＤＮＡを作製することにより標識される。腫瘍ＲＮＡサンプルから調製される蛍光標識されたｃＤＮＡは、正常な細胞ＲＮＡサンプルから調製される蛍光標識されたｃＤＮＡと比較される。例えば、正常な細胞からのｃＤＮＡプローブは、Ｃｙ３蛍光色素（緑）で標識され、そして推定される癌細胞から調製されるｃＤＮＡプローブは、Ｃｙ５蛍光色素（赤）で標識される。
【０４５３】
差示的な発現アッセイが、同じ患者の腫瘍細胞からのプローブと正常な細胞からのプローブを等しい量混合することにより実施される。アレイが、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡで６０℃で約２時間インキュベーションすることにより予めハイブリダーゼーションされ、次いで水で３回、イソプロパノールで２回洗浄する。アレイの予めのハイブリダイゼーションに続いて、プローブ混合物が、高ストリンジェントな条件（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中で一晩）でアレイにハイブリダイゼーションされる。ハイブリダイゼーション後、このアレイは、以下のように５０℃で３回洗浄される：１）１×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳにおいて一回目の洗浄；２）０．１×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳにおいて二回目の洗浄；および３）０．１×ＳＳＣにおいて三回目の洗浄。
【０４５４】
次いで、このアレイを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ  ｄｕａｌ  ｃｏｌｏｒ  ｌａｓｅｒ−ｓｃａｎｎｅｒ／ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用して緑色蛍光および赤色蛍光についてスキャンした。イメージをＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｕｔｏｇｅｎｅソフトウェアを使用してプロセスし、各々のスキャンからのデータを標準化する。この実験を繰り返し、両方の「色指示」におけるアッセイを実施するために、この場合２つのプローブを全く異なる色で標識する。各々の実験は、時々２つ以上のスライド（各々の色指示において１つ）で繰り返される。各々のスキャンからのデータは、標準化され、そして４つのアレイから８複製スポット／遺伝子または２つのアレイからの４複製スポット／遺伝子またはいくつかの他の順列の幾何学的平均の比として表現されるアレイ上の各々の配列についての蛍光のレベルである。
【０４５５】
標準化：標準化の目的は、特定の細胞型または組織において発現される全ての転写物が同様に表されるｃＤＮＡライブラリを生成することであり（Ｓ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．４（３）：１３３−１４３（１９８７）；Ｐａｔａｎｊａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（５）：１９４３−１９４７（１９９１））、従って最適標準化されたライブラリにおけるわずか３０，０００の組換えクローンの単離は、細胞の完全遺伝子発現レパートリー（細胞当たりの数１０，０００と推定される）を表し得る。
【０４５６】
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙＴＭ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用する収集された細胞から抽出され、その後に製造者の推薦する手順を行う。ＲＮＡは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ  ＲＮＡ定量化キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して定量化される。総ＲＮＡの１μｇは、逆転写され、ＳＭＡＲＴＴＭ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してＰＣＲ増幅される。ｃＤＮＡ産物は、標準的手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を使用してアガロースゲル電気泳動により大きさを選択される。ｃＤＮＡは、Ｂｉｏ  １０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（登録商標）ＩＩキット（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して抽出する。ｃＤＮＡの標準化は、ハイブリダイゼーション原理の動力学を使用して行われる：１．０μｇのｃＤＮＡが、１０分間１００℃の熱により変性され、次いで１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ．Ｎａ＋および５０％ホルムアミドの存在下、４２時間の間４２℃でインキュベートされる。単鎖ｃＤＮＡ（「標準化された」）は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（＃１３０−０５２０，ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により精製され、製造者の推薦した手順が続き、３サイクルのＰＣＲ増幅により二本鎖ｃＤＮＡに増幅かつ変換され、標準的手順を使用してプラスミドベクターにクローニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。標準化およびクローニング過程において使用される全てのプライマー／アダプターは、ＳＭＡＲＴＴＭＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）において製造者により提供される。スーパーコンピテント細胞（ＸＬ−２  Ｂｌｕｅ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が、標準化ｃＤＮＡライブラリでトランスフェクトされ、固体培地にプレートされ、３６℃で一晩増殖される。
【０４５７】
標準化ライブラリ当たり１０，０００の組換え配列が、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してキャピラリー配列決定により分析される。ライブラリ中の転写物の表示を決定するために、ＢＬＡＳＴ分析が、クローン配列上で実施され、転写同一性を各々の単離されたクローンに割り当てる。すなわち、単離されたポリヌクレオチドの配列が、最初にマスキングされてＸＢＬＡＳＴマスキングプログラムを用いる低複雑配列（ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を除外する（Ｃｌａｖｅｒｉｅ  「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｓｅａｒｃｈｅｓ」Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２１２−２２７  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ（１９９６）；特にＣｌａｖｅｒｉｅ，ｉｎ「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｄａｍｓら編、Ｃｈａｐ．３６，ｐ２６７  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９４およびＣｌａｖｅｒｉｅら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）１７：１９１を参照のこと）。一般に、低複雑性のために比較的小さい目的の配列を除外すること、および複数の配列に共通の繰り返し配列（例えば、Ａｌｕ繰り返し）への類似性に基づく複数の「ヒット」を除外することを除いて、マスキングは、最終検索結果に影響しない。次いで、残る配列が、ＢＬＡＳＴＮ対ＧｅｎＢａｎｋ検索において使用される。配列はまた、ＢＬＡＳＴＸ対ＮＲＰ（非重複タンパク質）データベース検索において問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用される。
【０４５８】
自動化配列決定反応が、製造者の指示に従って、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＦＳを含むＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して実施される。反応は、一分間の間２０℃または３０℃でアニールされることを除いて、製造者の指示により、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００上でサイクルされる。配列決定反応は、エタノールで沈殿され、ペレットは、８μｌのローディングバッファー中で再懸濁され、１．５μｌが、配列決定ゲル上に載せられ、そしてデータが、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより収集される（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【０４５９】
配列がライブラリ中で表される回数が、クローニングされたｃＤＮＡ配列上で配列同一性分析を実施し、かつ転写同一性を各々の単離されたクローンに割り当てることにより決定される。第一に、各々の配列は、それが細菌性汚染物質か、リボソーム汚染物質か、またはミトコンドリア汚染物質かを決定するために調べられる。このような配列は、続く分析から除外される。第二に、ベクターおよび繰り返し要素のような、配列アーチファクト（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｒｔｉｆａｃｔ）が、マスキングされ、および／または各々の配列から除去される。
【０４６０】
残る配列が、遺伝子同定のためのＧｅｎｂａｎｋおよびＥＳＴデータベースに対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０，１９９０）を介して比較され、ＦａｓｔＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ，８５：２４４４，１９９８）を介して互いに比較され、標準化ｃＤＮＡライブラリにおいてｃＤＮＡ発生の頻度を計算する。配列はまた、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ＢＬＡＳＴＮ  １．３ＭＰ：Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２１５：４０３，１９９０）を使用するＧｅｎｅｂａｎｋおよびＧｅｎｅＳｅｑヌクレオチドデータベースに対して検索される。第四に、配列が、ＢＬＡＳＴＸプログラム（ＢＬＡＳＴＸ  １．３ＭＰ：Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前述）で非重複タンパク質（ＮＲＰ）データベースに対して分析される。このタンパク質データベースは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＰＩＲおよびＮＣＢＩ  ＧｅｎＰｅｐｔタンパク質データベースの組み合わせである。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、フィルターパラメーター：（「ｘｎｕ＋ｓｅｇ」）とともにデフォルトＢＬＯＳＵＭ−６２置換マトリックスを使用して行われる。利用されるスコアカットオフは、７５である。コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）への重複するクローンのアセンブリは、プログラムＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．；Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ）を使用して行われる。アセンブルされたコンティグは、ＧＣＧパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１におけるプログラムを使用して分析される。
【０４６１】
（実施例５：ヒト癌細胞およびヒト組織におけるＣＡ配列の検出）
前立腺癌組織および乳癌組織ならびに他のヒト癌組織、ヒト大腸、非癌性前立腺を含む正常ヒト組織からのＤＮＡ、ならびに他のヒト細胞株からのＤＮＡを、Ｄｅｌｌｉ  Ｂｏｖｉら（１９８６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：６３３３−６３３８）の手順に従って抽出する。このＤＮＡを、０．０５ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶液に再懸濁し、そして回収されたＤＮＡの量をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素を使用する微蛍光測定により定量する。Ｃｅｓａｒｏｎｅ，Ｃ．ら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １００：１８８−１９７（１９７９）。
【０４６２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｔａｑポリメラーゼを使用し、緩衝液濃度、Ｍｇ２＋濃度、およびヌクレオチド濃度に関してこの製造者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）により推奨される条件に従って実施する。熱サイクルを、ＤＮＡサイクラーの中で９４℃で３分間の変性、ならびに引続いての３５サイクルもしくは５０サイクルのいずれかの、９４℃で１．５分間、５０℃で２分間および７２℃で３分間により実施する。このＰＣＲの、このＣＡ遺伝子の選択された領域を増幅する能力を、クローニングされたＣＡポリヌクレオチドを陽性鋳型としてを使用することにより試験する。最適なＭｇ２＋濃度、プライマー濃度および異なったサイクル温度についての必要性を、これらの鋳型により決定する。この製造者により推奨されるマスター混合物を、使用する。このマスター混合物成分の潜在的な異物混入を検出するために、鋳型を除いた反応を、慣用的に試験する。
【０４６３】
サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションを、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７，１９７５）により記載されるように、ランダムプライマー手順（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ら，１９８３，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３）により標識された、そのクローニングされた配列を使用して、実施する。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＰＥ、５％デンハルト、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精巣ＤＮＡを含有する溶液の中で実施し、１８時間４２℃でインキュベートし、引続き２×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳで室温でそして３７℃で洗浄し、そして最終的に０．１×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳの中で６８℃で３０分洗浄する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ）の中）。パラフィン包埋された組織切片については、ＷｒｉｇｈｔおよびＭａｎｏｓ（１９９０，「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）ｐｐ．１５３−１５８の中）により記載される条件に従い、２５０塩基対の配列を検出するように設計されたプライマーを使用する。
【０４６４】
（実施例６：ヒト癌細胞およびヒト組織におけるＣＡ配列の検出）
ヒト癌組織、正常ヒト組織からのＤＮＡ、および他のヒト細胞株からのＤＮＡを、Ｄｅｌｌｉ  Ｂｏｖｉら（１９８６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：６３３３−６３３８）の手順に従って抽出する。このＤＮＡを、０．０５ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶液に再懸濁し、そして回収されたＤＮＡの量をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素を使用する微蛍光測定により定量する。Ｃｅｓａｒｏｎｅ，Ｃ．ら，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １００：１８８−１９７（１９７９）。
【０４６５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｔａｑポリメラーゼを使用し、緩衝液濃度、Ｍｇ２＋濃度、およびヌクレオチド濃度に関してこの製造者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）により推奨される条件に従って実施する。熱サイクルを、ＤＮＡサイクラーの中で９４℃で３分間の変性、ならびに引続いての３５サイクルもしくは５０サイクルのいずれかの、９４℃で１．５分間、５０℃で２分間および７２℃で３分間により実施する。このＰＣＲの、ＣＡ遺伝子の選択された領域を増幅する能力を、クローニングされたＣＡポリヌクレオチドを陽性鋳型としてを使用することにより試験する。最適なＭｇ２＋濃度、プライマー濃度および異なったサイクル温度についての必要性を、これらの鋳型により決定する。この製造者により推奨されるマスター混合物を、使用する。このマスター混合物成分の潜在的な異物混入を検出するために、鋳型を除いた反応を、慣用的に試験する。
【０４６６】
サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションを、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７，１９７５）により記載されるように、ランダムプライマー手順（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ら，１９８３，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３）により標識された、そのクローニングされた配列を使用して、実施する。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＰＥ、５％デンハルト、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精巣ＤＮＡを含有する溶液の中で実施し、１８時間４２℃でインキュベートし、引続き２×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳで室温でそして３７℃で洗浄し、そして最終的に０．１×ＳＳＣと０．５％ＳＤＳの中で６８℃で３０分洗浄する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ）の中）。パラフィン包埋された組織切片については、ＷｒｉｇｈｔおよびＭａｎｏｓ（１９９０，「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）ｐｐ．１５３−１５８の中）により記載される条件に、従い、２５０塩基対の配列を検出するように設計されたプライマーを使用する。
【０４６７】
（実施例７：クローニングされたポリヌクレオチドの宿主細胞での発現）
ＣＡ遺伝子のタンパク質産物を調査するために、ＣＡ  ＤＮＡからの制限酵素断片を、発現ベクターｐＭＴ２の中にクローニングし（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ１６．１７−１６．２２（１９８９））、そして１０％ＦＣＳ補充ＤＭＥＭで増殖させたＣＯＳ細胞の中にトランスフェクトする。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）ｐｐ．１６．３２−１６．４０，同上）を使用して実施し、そして細胞溶解物を、トランスフェクションから４８時間後に、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞とトランスフェクトされないＣＯＳ細胞との両方から調製する。溶解物を、抗−ペプチド抗体を使用するイムノブロッティングにより分析に供する。
【０４６８】
イムノブロッティング試験では、細胞溶解物の調製および電気泳動を、標準的な手順に従って実施する。タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄプロテインアッセイ溶液を使用して定量する。ニトロセルロースへのセミドライ式電気泳動的転写の後に、メンブレンを、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＴＢＳ）と５％ドライミルクの中でブロッキングする。ＴＴＢＳの中での洗浄および二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を伴うインキュベーションの後に、増強化学発光（ＥＣＬ）プロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、この製造者により記載されるように検出を容易にするために実施する。
【０４６９】
（実施例８：ポリペプチドに対する抗体の産生）
ＣＡ遺伝子に固有の、ポリペプチドを、細菌発現系または他（例えば、酵母、バキュロウイルス）の発現系から合成もしくは単離し、そしてｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）とともにウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）へと結合させる。これらのペプチドによる免疫化のプロトコールを、標準的な方法に従って実施する。はじめに、これらのウサギのプレ採血を、免疫化に先立って実施する。第一免疫化は、フロイント完全アジュバントならびに５００μｇの結合体化ペプチドまたは１００μｇの精製ペプチドを含む。すべての引続いての免疫化（その以前の注入の４週間後に実施される）は、フロイント不完全アジュバントおよび同じ量のタンパク質を含む。採血を、これらの免疫化の７〜１０週間後に実施する。
【０４７０】
この抗体アフィニティー精製のために、対応するＣＡポリペプチドを、ＭＢＳとともにＲＳＡと結合体化させ、そしてＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）と結合させる。抗血清を、１０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）の中で１０倍に希釈し、そして一晩このアフィニティーマトリックスとともにインキュベートする。洗浄した後に、結合した抗体を、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）によりこの樹脂から溶出させる。
【０４７１】
（実施例９：ＣＡポリペプチドに対するモノクローナル抗体の産生）
非変性アジュバント（Ｒｉｂｉ，Ｒ７３０，Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＴ）を、リン酸緩衝化生理食塩水の中で４ｍｌまで再水和する。１００μｌのこの再水和アジュバントを、その後４００μｌのＨａｎｋ平衡塩類溶液で希釈し、そしてこれを、その後、免疫化のために使用される細胞ペレットとともに穏やかに混合する。約５００μｇの結合体化したペプチドもしくは１００μｇの精製ペプチド、ならびにフロイント完全を、一週間に一度、Ｂａｌｂ／ｃマウスに足蹠を通して注入する。毎週の注入の６週間後に、一滴の血液を、各々の免疫化された動物の尾部から採取して、ＣＡポリペプチドに対する抗体の力価をＦＡＣＳ分析を使用して試験する。この力価が少なくとも１：２０００に到達する場合に、このマウスを、ＣＯ２チャンバーの中で屠殺し、引続いて頚椎脱臼を施す。リンパ節を、ハイブリドーマの調製のために回収する。最高力価を有するマウスからのリンパ球を、３５％ポリエチレングリコール４０００を使用してマウスミエローマ株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合する。この融合の後の１０日目に、このハイブリドーマ上清を、ＣＡＰ特異的モノクローナル抗体の存在について蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によりスクリーニングする。各々のハイブリドーマからの馴化培地を、ＰＣ３細胞、Ｃｏｌｏ−２０５細胞、ＬｎＣａｐ細胞、またはＰａｎｃ−１細胞の組み合わせたアリコートとともに３０分間インキュベートする。インキュベーションの後に、この細胞試料を洗浄し、０．１ｍｌ希釈液の中で再懸濁し、そして１μｇ／ｍｌのヤギ抗−マウスＩｇＧのＦＩＴＣ結合体化Ｆ（ａｂ’）２断片とともに３０分間４℃でインキュベートする。これらの細胞を洗浄し、０．５ｍｌ  ＦＡＣＳ希釈液の中で再懸濁し、そしてＦＡＣＳｃａｎ細胞分析器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析する。ハイブリドーマクローンを、さらなる増殖、クローニング、およびこれらの、ＦＡＣＳにより評価されるようなこのＣＡポリペプチドを発現する一つ以上の細胞株の表面との結合に基づく特徴付けのために選別する。Ａｇ−ＣＡ．ｘと命名される抗原とＡｇ−ＣＡ．ｘ．１と命名されるその抗原上のエピトープに結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂＣＡと命名）とを作製するハイブリドーマが、選別される。
【０４７２】
（実施例１０：ＣＡ関連抗原を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ）
血液試料を組換え的に産生されたＣＡ抗原に特異的に結合する抗体について試験するために、以下の手順を、使用する。組換えＣＡ関連タンパク質を精製した後で、この組換えタンパク質を、ＰＢＳに５μｇ／ｍｌ（５００ｎｇ／１００μｌ）の濃度まで希釈する。１００マイクロリットルのこの希釈された抗原溶液を、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ  １プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖａ．）の各々のウェルに加え、そしてその後、このプレートを、室温で１時間、または４℃で一晩インキュベートし、かつＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄する。抗体の非特異的結合を減少させるためのブロッキングを、各々のウェルへの、２００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０中のウシ血清アルブミンの１％溶液の添加および１時間のインキュベーションにより実施する。このブロッキング溶液の吸引の後に、１００μｌの一次抗体溶液（抗凝固化総血液、血漿、または血清）（１／１６〜１／２０４８の範囲でブロッキング溶液に希釈する）を、加え、そして室温で１時間または４℃で一晩インキュベートする。それらのウェルを、その後３回洗浄し、そして１００μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化したヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｃ．）（１／５００もしくは１／１０００でＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０に溶解する）、１００μｌのｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド（ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ）溶液を、各々のウェルに加え、そして５〜１５分間インキュベートする。このＯＰＤ溶液は、５ｍｇのＯＰＤ錠剤を５０ｍｌのＨ２Ｏ中の１％メタノールに溶解しそして使用直前に５０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を加えることにより調製される。この反応を、２５ｌの４Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えることにより停止する。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の中で４９０ｎｍで読取る。
【０４７３】
（実施例１１：癌細胞表面上のＣＡ抗原の同定および特徴付け）
約２５μｌの押し固められた細胞体積の癌細胞調製物の細胞ペレットを、始めに細胞を水中で０．５ｍｌに希釈し、引続き３回凍結融解することにより溶解する。この溶液を、１４，０００ｒｐｍで遠心する。生じるペレット（細胞膜断片を含む）を、５０μｌのＳＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中で再懸濁する。この試料を、８０℃で５分間加熱し、そしてその後２分間１４，０００ｒｐｍで遠心して任意の不溶性物質を除去する。
【０４７４】
この試料を、４〜２０％ポリアクリルアミドグラジエントゲルをトリス−グリシンＳＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）の中でこの製造者の指示に従って使用するウェスタンブロットにより分析する。１０マイクロリットルのメンブレン試料を、このポリアクリルアミドゲル上の１レーンに適用する。個々の１０μＬの試料を、始めに２μｌのジチオスレイトール（１００ｍＭ）の添加および８０℃で２分間の加熱により還元し、そしてその後別のレーンの中にロードする。プレ染色された分子量マーカーＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、分子量をこのゲル上で評価するために使用する。これらのゲルのタンパク質を、１４．４ｇ／ｌグリシン、３ｇ／ｌのトリス塩基、１０％メタノールと、０．０５％ＳＤＳの移動緩衝液を使用してニトロセルロースメンブレンに移す。このメンブレンを、ブロッキングし、ＣＡＰ特異的モノクローナル抗体（０．５μｇ／ｍｌの濃度で）によりプローブ分析し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｋｉｔ−ＡｎｔｉＭｏｕｓｅをこの製造者の指示に従って使用して展開する。この腫瘍細胞のメンブレン試料の還元された試料においては、目立ったバンドが、対応するＣＡタンパク質の予測される分子量の約１０％の中での分子量での移動が観察される。
【０４７５】
（実施例１２：ワクチンの調製）
本発明は、悪性細胞により産生される抗原もしくは悪性細胞と会合する抗原として作用する本発明のＣＡポリペプチドを使用しての、患者においてＣＡポリペプチドを発現する細胞に対する免疫応答を刺激させる方法にもまた、関連する。本発明のこの局面により、ヒトにおいて癌細胞あるいはＣＡポリヌクレオチドおよびＣＡポリペプチドを発現する細胞に対する免疫応答を刺激する方法を提供する。この方法は、ヒトに免疫原性量の以下を含むポリペプチドを投与する工程を包含する：（ａ）ヒトＣＡタンパク質のアミノ酸配列または（ｂ）ヒト内因性レトロウイルスＣＡタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドの変異タンパク質もしくは改変体。
【０４７６】
（実施例１３：治療法を試験するための手段としての、ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物の産生）
ＣＡ核酸は、遺伝的に改変された非ヒト動物、または細胞株の中で、前立腺腫瘍関連遺伝子の機能もしくは調節を調査するための、これの部位特異的遺伝子改変を産生するために、あるいは前立腺癌を含む、疾患の動物モデルを作製するために使用される。用語「トランスジェニック」とは、宿主細胞に安定に導入されて、そこでその遺伝子が改変タンパク質を産生するように配列において変更され得る外因性ＣＡ遺伝子を有する遺伝的に改変された動物、またはレポーター遺伝子と作動可能に連結した外因性ＣＡ  ＬＴＲプロモーターを有する遺伝的に改変された動物を包含するように意図される。トランスジェニック動物は、ゲノムの中にランダムに組込まれる核酸構築物を通して作製され得る。安定な組込みのためのベクターとして、プラスミド、レトロウイルスおよび他の動物ウイルス、ＹＡＣなどが挙げられる。目的のものとしては、トランスジェニック哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど）、および特定の齧歯類（例えば、ラット、マウスなど）がある。
【０４７７】
これらの改変された細胞または改変された動物は、ＣＡ遺伝子の機能または調節の調査において有用である。例えば、一連の小さい欠失および／または置換を、腫瘍形成における種々の遺伝子の役割を決定するために、このＣＡ遺伝子の中で作製し得る。目的の特定の構築物としては、ＣＡ遺伝子の発現をブロックするためのアンチセンス構築物、ドミナントネガティブなＣＡ遺伝子の変異の発現、およびＣＡ遺伝子の過剰発現が挙げられるが、それらに限定されない。通常はＣＡ遺伝子もしくはそれの改変体が発現しない細胞または組織でのそのＣＡ遺伝子もしくはそれの改変体の発現、あるいは発生の異常な時間でのＣＡ遺伝子もしくはそれの改変体の発現が、提供される。さらに、ＣＡに由来するタンパク質の発現を、通常はそうでなければそれが産生されない細胞の中に提供することにより、細胞の挙動における変化を、誘導し得る。
【０４７８】
ランダムな組込みのためのＤＮＡ構築物は、組換えを媒介するための相同領域を含む必要はない。簡便のため、ポジティブ選択およびネガティブ選択のためのマーカーが、含まれる。哺乳類細胞にトランスフェクトするための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５２７−５３７（１９９０）を参照のこと。
【０４７９】
胚性幹（ＥＳ）細胞については、ＥＳ細胞株を、使用するか、または胚性細胞を、宿主（例えば、マウス、ラット、モルモットなど）から新鮮に取得する。このような細胞を、適切な線維芽細胞供給層の上で増殖させるか、または白血病抑制因子（ＬＩＦ）のような、適切な増殖因子の存在下で増殖させる。ＥＳ細胞が形質転換される場合に、それらを、トランスジェニック動物を産生するために使用し得る。形質転換の後に、これらの細胞を、供給層の上で適切な培地の中でプレーティングする。この構築物を含有する細胞を、選択培地を使用することにより検出し得る。コロニーが成長するために十分な時間の後に、これらを摘み取りそしてこの構築物の組込みの発生について分析する。ポジティブであるこれらのコロニーを、その後胚操作および胚盤胞注入のために使用し得る。胚盤胞を、４〜６週間の過排卵させた雌から取得する。このＥＳ細胞を、トリプシン処理し、そしてこの改変された細胞を、この胚盤胞の胞胚腔の中に注入する。注入の後に、この胚盤胞を、偽妊娠雌の各々の子宮角に戻す。雌を、その後出産間近となるようにさせ、そして生じるキメラ動物をその構築物を保持する細胞についてスクリーニングする。これらの胚盤胞およびＥＳ細胞の、異なった表現形が提供されることにより、キメラの子孫を、用意に検出し得る。
【０４８０】
このキメラ動物を、この改変遺伝子の存在についてスクリーニングし、そして、この改変を有する雄および雌を、交配してホモ接合型子孫を産生させる。この遺伝子の変化が発生のある時点で致死性を引き起こす場合、組織または器官は、同種異系間もしくは類遺伝子のグラフトまたは同種異系間もしくは類遺伝子の移植片として維持されるか、あるいはインビトロ培養物の中で維持される。これらのトランスジェニック動物は、実験動物、家畜などのような任意の非ヒト哺乳動物であり得る。これらのトランスジェニック動物を、機能上の調査、薬剤スクリーニングなどにおいて、例えば、前立腺癌に対する候補薬剤の効果を決定するために、潜在的な治療法または処置レジメンを試験するためになどで、使用する。
【０４８１】
（実施例１４：ＣＡ特異的抗体を使用する診断的画像化）
本発明は、初期症状においておよび癌の転移性広がりの早期検出のために、正確に癌患者を段階付けるためのＣＡポリペプチドに対する抗体の使用を包含する。ＣＡポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を使用するラジオイムノシンチグラフィーは、さらなる癌特異的診断試験を提供し得る。本発明のモノクローナル抗体は、癌腫の組織病理学的診断のために使用される。
【０４８２】
ヌードマウスでの皮下のヒトの癌細胞の異種移植片は、本発明のテクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）−標識化モノクローナル抗体が、Ｍａｒｋｓら，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．７５：２２５（１９９５）により精上皮腫細胞について記載されるように外部ガンマシントグラフィーにより異種間移植された癌を首尾よく画像化し得るか否かを試験するために使用される。ＣＡポリペプチドに特異的な各々のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの腹水から、プロテインＡ−セファロース上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。精製された抗体（アビジン特異的モノクローナル抗体（Ｓｋｅａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：３５５７（１９９３））のようなコントロールモノクローナル抗体が挙げられる）は、Ｍａｔｈｅｒら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：６９２（１９９０）およびＺｈａｎｇら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９：６０７（１９９２）の方法を使用して、還元に引続いて９９ｍＴｃで標識化される。ヒトの癌細胞を抱えるヌードマウスに、腹腔内に２００〜５００μＣｉのの９９ｍＴｃ−標識化抗体を注入する。注入の２４時間後、マウスの画像を、動物から約８ｃｍに位置する６ｍｍピンホールコリメータを装備するＳｉｅｍｅｎｓ  ＺＬＣ３７００ガンマカメラを使用して得る。画像化に引続きモノクローナル抗体の体内分布を決定付けるために、正常器官と腫瘍とを、採取し、秤量し、そしてこの組織とこの被注入体の試料との放射活性を測定する。さらに、抗腫瘍化合物に結合体化されたＣＡ特異的抗体を、癌特異的化学療法に使用する。
【０４８３】
（実施例１５：免疫組織化学的方法）
癌患者からの凍結組織試料を、最適な切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、ドライアイスを含むイソペンタン中で、急速に凍結する。凍結切片をＬｅｉｃａ  ３０５０  ＣＭ  ミクロトームを用いて５μｍの厚さに切断し、その後、ｖｅｃｔａｂｏｕｎｄで被覆したスライド上に、融解しながらマウントする。切片を、−２０℃でエタノールを使用して固定し、室温で一晩、風乾させる。固定した切片を、使用するまで、−８０℃で保管する。免疫組織化学については、組織切片を回収し、最初に、室温で３０分間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、５％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中でインキュベートし、次いで、ブロッキング緩衝液（１μｇ／ｍｌ）中に希釈したＣＡタンパク質特異的モノクローナル抗体およびコントロールのモノクローナル抗体とともに、１２０分間インキュベートする。次いで、その切片をブロッキング緩衝液で３回洗浄する。結合したモノクローナル抗体を、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ５．０５および０．００３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ  カタログＮｏ．Ｈ１００９）中のヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２−ペルオキシダーゼ結合体およびペルオキシダーゼ基質であるジアミノベンジジン（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  カタログＮｏ．Ｄ５６３７）を用いて検出する。染色したスライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡下で調べる。
【０４８４】
種々の型の組織由来の種々の細胞株との反応性を試験するために、ＣＡタンパク質（抗原）に対するモノクローナル抗体を使用する。種々に確立した細胞株由来の細胞を、プロテアーゼを使用せずに、増殖表面から取り除き、まとめ、その後ＯＣＴ化合物中に包埋する。細胞を凍結し、切り出し、次いで標準的ＩＨＣプロトコルを使用して染色する。ＣｅｌｌＡｒｒａｙＴＭ技術は、ＷＯ  ０１／４３８６９に記載される。外科的切除により入手した正常な組織（ヒト）を凍結し、マウントする。凍結切片を、Ｌｅｉｃａ  ３０５０  ＣＭミクロトームを使用して、５μｍの厚さに切削し、その後、ｖｅｃｔａｂｏｕｎｄで被覆したスライド上に、融解しながらマウントする。切片を、−２０℃でエタノールを使用して固定し、室温で一晩、風乾させる。ＣＡ特異的モノクローナル抗体の正常な組織への結合を決定するために、ＰｏｌｙＭＩＣＡＴＭ検出キットを使用する。一次モノクローナル抗体を、１μｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
【０４８５】
各個々の出版物または特許出願が、特に、および個々に参考として援用されることが示されるように、本明細書に引用された全ての出版物および特許出願は、本明細書に参考として援用される。
【０４８６】
前述の発明は、理解の明瞭性の目的のために、図および実施例を使用してある程度詳細に記載されているが、本発明の教示を考慮に入れて、添付した特許請求の範囲の精神または範囲を離れることなく、それに対して、いくつかの変化および改変がなされ得ることが、当業者には、容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０４８７】
【図１】図１は、宿主−プロウイルス接合フラグメントのＰＣＲ増幅を示す。
【図２】図２は、ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子についての平均閾値サイクル（ＣＴ）値の例を示す。
【図３】図３は、種々のサンプルについて、標的遺伝子のＣＴ値とハウスキーピング遺伝子のＣＴ値との間の計算された差（ΔΔＣＴ）の例を示す。
【図４】図４は、図３からの、各サンプルについてのΔΔＣＴ値と比較発現レベルを示す。
【図５】図５は、正常組織における発現と比較された乳癌組織におけるＳＮＬ１のｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。サンプル５１および５２は、正常組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図６】図６は、正常組織における発現と比較された結腸癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜１１は、正常サンプルである。サンプル１２〜３１は、結腸癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図７】図７は、正常組織における発現と比較された肺癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜９は、正常サンプルである。サンプル１０〜４３は、肺癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図８】図８は、正常組織における発現と比較された膵臓癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜１０は、正常サンプルである。サンプル１１〜３１は、膵臓癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図９】図９は、正常組織における発現と比較された卵巣癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜１６は、正常サンプルである。サンプル１７〜４４は、卵巣癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１０】図１０は、正常組織における発現と比較された胃癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜１０は、正常サンプルである。サンプル１１〜３９は、胃癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１１】図１１は、正常組織における発現と比較された乳癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜９は、正常サンプルである。サンプル１０〜３０は、乳癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１２】図１２は、正常組織における発現と比較された前立腺癌組織におけるＦＯＳＢのｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜７は、正常サンプルである。サンプル８〜３７は、前立腺癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１３】図１３は、正常組織における発現と比較された乳癌組織におけるＭＹＣのｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１４】図１４は、正常組織における発現と比較された乳癌組織におけるＭＹＣのＤＮＡの発現を示す。サンプル１〜４９は、乳癌サンプルである。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１５】図１５は、正常組織における発現と比較された乳癌組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１６】図１６は、正常組織における発現と比較された結腸癌（Ｓ状）組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜１２は、正常サンプルである。サンプル１３〜２９は、結腸癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１７】図１７は、正常組織における発現と比較された結腸癌（横行）組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜１２は、正常サンプルである。サンプル１３〜３０は、結腸癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１８】図１８は、正常組織における発現と比較された肺組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜９は、正常サンプルである。サンプル１０〜４３は、肺癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１９】図１９は、正常組織における発現と比較された卵巣組織におけるＣＣＮＤ１のｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜１４は、正常サンプルである。サンプル１５〜４１は、卵巣癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図２０】図２０は、正常組織における発現と比較された乳癌組織におけるＮＦＫＢ１のｍＲＮＡの発現を示す。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。サンプル５１および５２は、正常組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図２１】図２１は、正常組織における発現と比較した、肺組織中のＮＦＫＢ１のｍＲＮＡ発現を示す。サンプル１〜９は、正常サンプルである。サンプル１０〜４４は、肺癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図２２】図２２は、正常組織における発現と比較した、皮膚組織中のＮＦＫＢ１のｍＲＮＡ発現を示す。サンプル１〜９は、正常サンプルである。サンプル１０〜４６は、皮膚癌組織である。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図２３】図２３は、正常組織における発現と比較した、乳癌組織中のＰＶＴ１のｍＲＮＡ発現を示す。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図２４】図２４は、正常組織における発現と比較した、乳癌組織中のＰＶＴ１のＤＮＡ増幅を示す。サンプル１〜５０は、乳癌サンプルである。バーは、発現レベルの平均を示す。誤差バーは、標準偏差を示す。
【図１】
2005520543.tif 000132
【図２】
2005520543.tif 000133
【図３】
2005520543.tif 000134
【図４】
2005520543.tif 000135
【図５】
2005520543.tif 000136
【図６】
2005520543.tif 000137
【図７】
2005520543.tif 000138
【図８】
2005520543.tif 000139
【図９】
2005520543.tif 000140
【図１０】
2005520543.tif 000141
【図１１】
2005520543.tif 000142
【図１２】
2005520543.tif 000143
【図１３】
2005520543.tif 000144
【図１４】
2005520543.tif 000145
【図１５】
2005520543.tif 000146
【図１６】
2005520543.tif 000147
【図１７】
2005520543.tif 000148
【図１８】
2005520543.tif 000149
【図１９】
2005520543.tif 000150
【図２０】
2005520543.tif 000151
【図２１】
2005520543.tif 000152
【図２２】
2005520543.tif 000153
【図２３】
2005520543.tif 000154
【図２４】
2005520543.tif 000155
【国際調査報告】
2005520543.tif 000156
2005520543.tif 000157
2005520543.tif 000158
2005520543.tif 000159
2005520543.tif 000160
2005520543.tif 000161
2005520543.tif 000162