(57)【要約】本発明は、実質的に純粋なヒト膀胱由来上皮細胞の集団、および膀胱由来上皮細胞を単離し、そして培養する方法を開示する。さらに、ヒト膀胱由来上皮細胞およびそれから分化する細胞のいくつかの用途を本明細書で開示する。本発明の別の局面において、本発明は、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を使用することで、ヒト胎児前立腺上皮細胞のヒト組織モデルを作成し、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を非ヒト（哺乳動物レシピエント）に投与する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団であって、該細胞が膀胱上皮または前立腺上皮に分化する能力を有する、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団。
【請求項２】
請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団であって、該細胞が無血清培地で維持される、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団。
【請求項３】
請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団であって、該細胞の細胞表面は実質的に血清生体分子がない、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団。
【請求項４】
請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を含む組織培養容器。
【請求項５】
実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を単離する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の起源を顕微解剖する工程；
（ｂ）胎児膀胱上皮細胞を維持するのに十分な培養条件下で、無血清栄養培地中に膀胱由来上皮細胞起源を置く工程で、該無血清培地は、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロールおよびアプロチニンを含む栄養物を含む、工程；
（ｃ）該無血清栄養培地中で該膀胱由来上皮細胞起源から胎児膀胱由来上皮細胞の移動を可能にするのに十分な、適切な培養条件を維持する工程；
（ｄ）膀胱由来上皮細胞が単層コロニーを形成するのを許容するのに十分な、適切な培養条件を維持する工程；そして
（ｅ）実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を獲得するために、該単層コロニーを継代培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
前記無血清栄養培地がさらに、プロゲステロン、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）およびヘレグリン（ＨＲＧ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下：
（ａ）ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の起源を顕微解剖する工程；
（ｂ）胎児膀胱上皮細胞を維持するのに十分な培養条件下で、無血清栄養培地中に膀胱由来上皮細胞起源を置く工程で、該無血清培地は、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロールおよびアプロチニンを含む栄養物を含む、工程；
（ｃ）該無血清栄養培地中で該膀胱由来上皮細胞起源から胎児膀胱由来上皮細胞の移動を可能にするのに十分な、適切な培養条件を維持する工程；
（ｄ）膀胱由来上皮細胞が単層コロニーを形成するのを許容するのに十分な、適切な培養条件を維持する工程；そして
（ｅ）実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を獲得するために、該単層コロニーを継代培養する工程、
を包含する工程によって産生された、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞集団であって、前記工程で使用された前記無血清栄養培地はさらに、プロゲステロン、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）およびヘレグリン（ＨＲＧ）を含む、無血清栄養培地。
【請求項９】
異種レシピエントに免疫原の起源を提供する方法であって、該方法は、該レシピエントに免疫応答を誘導するために、請求項１に記載の有効量の多数のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を該レシピエントに投与する工程を包含する方法。
【請求項１０】
異種レシピエントに免疫応答を誘発する方法であって、該方法は、該レシピエントに免疫応答を誘導するために、請求項１に記載の有効量の多数のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を該レシピエントに投与する工程を包含する方法。
【請求項１１】
ヒト胎児膀胱由来上皮細胞から分化したヒト膀胱上皮細胞の集団を産生する方法であって、該方法は、非ヒト哺乳動物レシピエント内の該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を支持し得る該レシピエント内の位置に、請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含し、ここで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、エキソビボで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞のヒト膀胱上皮細胞への分化に影響し得るよう、間葉組織と組み換えられる、方法。
【請求項１２】
ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を支持し得る非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、請求項１に記載の該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含するプロセスによって産生された、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞から分化したヒト膀胱上皮細胞の集団であって、ここで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、エキソビボで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞のヒト膀胱上皮細胞への分化に影響し得るよう、間葉組織と組み換えられる、ヒト膀胱上皮細胞の集団。
【請求項１３】
ヒト胎児膀胱由来上皮細胞から分化したヒト前立腺上皮細胞の集団を産生する方法であって、該方法は、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を支持し得る非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含し、ここで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、エキソビボで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞のヒト前立腺上皮細胞への分化に影響し得る間葉組織と組み換えられる、方法。
【請求項１４】
ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を支持し得る非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、請求項１に記載の該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含するプロセスによって産生された、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞から分化したヒト前立腺上皮細胞の集団であって、ここで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、エキソビボで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞のヒト前立腺上皮細胞への分化に影響し得るよう、間葉組織と組み換えられる、ヒト前立腺上皮細胞の集団。
【請求項１５】
非ヒト哺乳動物レシピエントの中でヒト膀胱組織モデルを産生する方法であって、該方法は、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を支持し得る非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含し、ここで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、エキソビボで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞のヒト膀胱上皮細胞への分化に影響し得るよう、間葉組織と組み換えられる、方法。
【請求項１６】
ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を支持し得る非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、請求項１に記載の該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含するプロセスによって産生された、ヒト膀胱組織モデルであって、ここで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、エキソビボで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞のヒト膀胱上皮細胞への分化に影響し得るよう、間葉組織と組み換えられる、ヒト膀胱組織モデル。
【請求項１７】
非ヒト哺乳動物レシピエントの中でヒト前立腺組織モデルを産生する方法であって、該方法は、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を支持し得る非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含し、ここで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、エキソビボで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞のヒト前立腺上皮細胞への分化に影響し得るよう、間葉組織と組み換えられる、方法。
【請求項１８】
非ヒト哺乳動物レシピエント内のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を支持し得る該レシピエント内の位置に、請求項１に記載の該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含するプロセスによって産生された、ヒト前立腺組織モデルであって、ここで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、エキソビボで、該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞のヒト前立腺上皮細胞への分化に影響し得る間葉組織と組み換えられる、ヒト前立腺組織モデル。
【請求項１９】
少なくとも一つの薬物の医薬品開発のために、膀胱由来組織特異的な生物学的構成成分の供給源を提供する方法であって、該方法は、以下：請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を単離する工程、および開発中の薬物の標的として、該膀胱由来上皮細胞またはその細胞の任意の細胞部分を使用する工程、を包含する、方法。
【請求項２０】
少なくとも一つの薬物の医薬品開発のために、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の供給源を提供する方法であって、該方法は、以下：請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を提供する工程、および開発中の薬物の標的として、その該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を使用する工程、を包含する、方法。
【請求項２１】
バイオアッセイのために、核酸またはタンパク質の供給源を提供する方法であって、該方法は、請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞から核酸またはタンパク質を単離する工程、および一つ以上の主成分として、バイオアッセイで該核酸またはタンパク質を使用する工程、を包含する、方法。
【請求項２２】
バイオアッセイのために、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の供給源を提供する方法であって、該方法は、請求項１に記載のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を提供する工程、およびバイオアッセイで該ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を使用する工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国特許法１１９条（e）項に基づき、米国仮特許出願番号第６０／３５７，０３５号（２００２年２月１２日出願）の優先権を主張し、これは本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、発生生物学および細胞生物学の分野に関し、さらに詳しく言えば、精製された胎児ヒト膀胱由来上皮細胞、および胎児ヒト膀胱上皮細胞株に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ヒト膀胱は、本質的に、筋外壁および非常に専門化された管腔の上皮内層からなる、２層の器官である。分化された膀胱上皮は、膀胱表在性細胞またはアンブレラ細胞の管腔表面上の尿路上皮性プラークの存在によって特徴付けられる。これらのプラークは、細胞質側の単層の２倍の厚さで管腔側に単層を有する、非常に珍しい膜構造（すなわち、非対称性単位膜（ＡＵＭ））によって特徴付けられる。管腔層の肥厚は、半透明性組織を表す粒子の存在に起因し、そして、主に四つの膜貫通性タンパク質で構成される：ウロプラキン（ＵＰ）Ｉａ(２７ｋＤａ)；ＵＰ  Ｉｂ（２８ｋＤａ）；ＵＰ  ＩＩ（１５ｋＤａ）およびＵＰ  ＩＩＩ（４７ｋＤａ）。ＵＰ  ＩＩＩは、尿路上皮性糖衣の形成において役割を果たすと考えられており、細胞質部分を介して、細胞骨格と相互作用をし得る（Ｈｕら、２０００．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５１（５）：９６１−７２）。
【０００４】
膀胱の発生起起源は、内胚葉組織において見出される。膀胱は、総排出腔（膀胱と下部消化管の両方は総腔から誘導される）から生じる。発生が進むにつれて、総排出腔は後腸と泌尿生殖洞に分割される。膀胱の筋層は、膀胱上皮からのシグナルによって隣接している間葉から誘導されるが、シグナルの正体は知られていない。
【０００５】
米国の男性の間で、膀胱癌はすべての悪性腫瘍の約２％、およびすべての尿路悪性腫瘍の約７％と見積もられているが、女性は、男性の約１／３の発生率である。さらに、人種も要因となり、アフリカ系アメリカ人は、非スペイン系人の発生率（年齢で調節）のほぼ２倍である。アメリカ癌協会は、翌年には新規の膀胱癌患者は５万人以上になると推定し、９５００人の死亡と推定されている。表層性（軽度のグレードの疾患）に対して、化学療法は、腫瘍部位に薬物を集結して、切除後の任意の残存した腫瘍塊を取り除くために、膀胱内（直接膀胱に）に施される。全身性の化学療法および／または放射線は、通常、根治的な膀胱切除術との組み合わせで、重度の疾患で施される。しかし、重度の患者の約５０％において、重度の腫瘍は、膀胱切除術後にいつかは再発するので、これらの患者の症状を緩和するための手術はめったに実施しない。
【０００６】
人種および性的因子に加えて、化学物質の曝露は、膀胱癌に対する危険因子と規定さている。化学物質の曝露の主要な危険因子は喫煙であるが、職業被曝（特に、アリールアミン）もまた重要な危険因子である。
【０００７】
多くの研究者は、尿路上皮細胞の分化段階の分析または転移性膀胱癌の診断に対して、ウロプラキン抗体の使用を記載している（Ｙｕら、１９９２．Ｅｐｉｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：４−ｂ  １２；Ｍｏｌｌら、１９９３  Ｖｅｒｈ．Ｄｅｕｔｓｃ．Ｇｅｓ．Ｐａｔｈ．７７およびＭｏｌｌら、１９９５．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７：１３８３−１３９７）。
【０００８】
尿路上皮性細胞のインビトロの研究は、代表的に、膀胱腫瘍から誘導された細胞株、または原始尿路上皮細胞を利用するが、正常な尿路上皮組織誘導性細胞株は限られた数しか報告されていない（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９８４，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４：３１９−３８）。国際特許出願ＷＯ  ０２／１０２９９７は、受精されていない第１減数分裂後の２倍体の生殖細胞から誘導されたホモ接合体の幹細胞（種々の細胞型へ分化され得るといわれている）を開示する（Ｋｅａｙら、１９９６，Ｊ  Ｕｒｏｌ，１５６（６）：２０７３−８；およびＯｗｅｎｓら、１９７６，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｌｎｓｔ．５６（４）：８４３−９）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（本発明の開示）
一つの局面において、本発明は、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来の上皮細胞（膀胱上皮および／または前立腺上皮へ分化する能力を有する）の集団に関する。従って、膀胱上皮または前立腺上皮に分化する能力に対する参照は、いずれかの細胞型に分化する能力を表す。細胞は、無血清培養液で培養され得、そして、実質的に、血清生体分子のない細胞表面を有し得る。本発明のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、Ｈ１９マーカー遺伝子を発現する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、以下の実質的に純粋な膀胱由来上皮細胞の集団を単離する方法を提供する：（ａ）ヒト胎児膀胱由来上皮細胞が単層のコロニーを形成するのに十分な、適切な培養条件を維持する工程；ここで、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、単層のコロニーを形成するために、顕微解剖された膀胱由来上皮細胞起源からの膀胱由来上皮細胞の移動を、無血清培養液の中に許容するのに十分な、適切な培養条件を維持している；ここで、膀胱由来上皮細胞起源は、膀胱由来上皮細胞を維持するのに十分な培養条件下で、無血清培地において培養され、無血清培地は、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロールおよびアプロチニンを含む栄養素を含有する；および（ｂ）実質的に純粋な膀胱由来上皮細胞の集団を獲得するために、前記単層コロニーを継代培養する工程。いくつかの実施形態において、無血清培養液はさらに、プロゲステロン、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）およびヘレグリン（ＨＲＧ）を含む。
【００１１】
別の局面において、本発明は、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の起源を顕微解剖し、；前述の膀胱由来上皮細胞を維持するために、十分な培養条件下で、膀胱上皮誘導性上皮細胞起源を無血清培養液の中に置き（ここで、無血清培地は、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロールおよびアプロチニンを含む栄養素を含有する）、；膀胱由来上皮細胞起源から無血清培養液への膀胱由来上皮細胞の移動を許容するのに十分な、適切な培養条件を維持し、；膀胱由来上皮細胞が単層のコロニーを形成するのを許容するのに十分な、適切な培養条件を維持し、；実質的に純粋な膀胱由来上皮細胞の集団を獲得するために、前記単層のコロニーを継代培養することによって、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を産生する方法を提供する。この方法で使用された培地はさらに、プロゲステロン、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、およびヘレグリン（ＨＲＧ）を含み得る。従って、本発明のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、生殖細胞に由来しない。
【００１２】
別の局面において、本発明は、以下の工程によって産生された、実質的に純粋なヒト膀胱由来上皮細胞の集団を提供する：（ａ）ヒト胎児膀胱由来上皮細胞が単層のコロニーを形成するのを許容するのに十分な、適切な培養条件を維持する工程；ここで、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、単層のコロニーを形成するために、顕微解剖された膀胱由来上皮細胞起源から無血清培養液への膀胱由来上皮細胞の移動を許容するのに十分な、適切な培養条件を維持している；ここで、膀胱由来上皮細胞の起源は、膀胱由来上皮細胞を維持するのに十分な培養条件下で、無血清培地において培養され、無血清培地は、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロールおよびアプロチニンを含む栄養素を含有する；および（ｂ）実質的に純粋な膀胱由来上皮細胞の集団を獲得するために、前記単層コロニーを継代培養する工程。いくつかの実施形態において、前記工程で使用された無血清培養液はさらに、プロゲステロン、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）およびヘレグリン（ＨＲＧ）を含む。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の起源を顕微解剖する工程；前述の膀胱由来上皮細胞を維持するために、十分な培養条件下で、膀胱由来上皮細胞の起源を無血清培養液に置く工程（ここで、無血清培地は、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロールおよびアプロチニンの栄養物を含む）；膀胱由来上皮細胞の起源から無血清培養液への膀胱由来上皮細胞の移動を許容するのに十分な培養条件を維持する工程；膀胱由来上皮細胞が単層コロニーを形成するのを許容するのに十分な培養条件を維持する工程；そして、実質的に純粋な膀胱由来上皮細胞の集団を獲得するために、前述の単層コロニーを継代培養する工程で産生された、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を提供する。この方法で使用された培地は、さらに、プロゲステロン、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、およびヘレグリン（ＨＲＧ）を含み得る。
【００１４】
さらに別の局面において、本発明は、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞（膀胱上皮もしくは前立腺上皮へ分化する能力を有する）の集団を維持する方法、およびこれらのヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を維持し、そして培養する方法（その結果、この細胞は、分裂停止を回避する間に分化する能力を保持する）に関する。
【００１５】
さらに別の局面において、本発明は、免疫原の起源を異種性レシピエントに提供する方法、および免疫原として実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団の使用に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、免疫原の起源を異種性レシピエントに提供する方法を提供し、前述のレシピエントにおいて免疫応答を誘導するために、有効量の本発明の多数のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を、前述のレシピエントに投与する工程を包含する。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は、異種性レシピエントにおいて免疫応答を惹起する方法に関し、前述のレシピエントで免疫応答を誘導するために、有効量の本発明の多数のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を前述のレシピエントに投与する工程を包含する。
【００１７】
さらに別の局面において、本発明は、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞から分化したヒト膀胱上皮細胞の集団を産生する方法に関し、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を維持する能力のある非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、本発明のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含する（ここで、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞をヒト膀胱上皮細胞に分化する能力のある間葉組織とエキソビボで組み換えられる）。
【００１８】
さらに別の局面において、本発明は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を維持する能力のある非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、本発明のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含するプロセスによって産生した、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞から分化したヒト膀胱上皮細胞の集団に関する（ここで、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞をヒト膀胱上皮細胞に分化する能力のある間葉組織とエキソビボで組み換えられる）。
【００１９】
さらに別の局面において、本発明は、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞から分化したヒト前立腺上皮細胞の集団を産生する方法に関し、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を維持する能力のある非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、本発明のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含する（ここで、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞をヒト前立腺上皮細胞に分化する能力のある間葉組織とエキソビボで組み換えられる）。
【００２０】
さらに別の局面において、本発明は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を支持する能力のある非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、本発明のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含するプロセスによって産生した、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞から分化したヒト前立腺上皮細胞の集団に関する（ここで、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞をヒト前立腺上皮細胞に分化する能力のある間葉組織とエキソビボで組み換えられる）。
【００２１】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を使用することで、ヒト胎児前立腺上皮細胞のヒト組織モデルを作成し、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を非ヒト（哺乳動物レシピエント）に投与する方法に関する。
【００２２】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を使用することで、ヒト膀胱組織モデルを作成し、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を維持する能力のある非ヒト（哺乳動物レシピエント）内の位置に、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する方法に関する（ここで、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞をヒト膀胱上皮細胞にさらに分化する能力のある間葉組織とエキソビボで組み換えられる）。
【００２３】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を維持する能力のある非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、本発明のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する工程を包含するプロセスによって産生した、ヒト膀胱組織モデルに関する（ここで、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞をヒト膀胱上皮細胞に分化する能力のある間葉組織とエキソビボで組み換えられる）。
【００２４】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を使用することで、ヒト胎児前立腺上皮細胞のヒト組織モデルを作成し、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を非ヒト（哺乳動物レシピエント）に投与する方法に関する。
【００２５】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団を使用することで、ヒト前立腺組織モデルを作成し、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を維持する能力のある非ヒト（哺乳動物レシピエント）内の位置に、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞を投与する方法に関する（ここで、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞をヒト前立腺上皮細胞にさらに分化する能力のある間葉組織とエキソビボで組み換えられる）。
【００２６】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞の増殖を維持する能力のある非ヒト哺乳動物レシピエント内の位置に、本発明のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を、に投与する工程を包含するプロセスによって産生した、ヒト前立腺組織モデルに関する（ここで、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞をヒト前立腺上皮細胞に分化する能力のある間葉組織とエキソビボで組み換えられる）。
【００２７】
本発明の別の局面において、本発明は、細胞療法を提供する方法に関し、これによって、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞またはこれらから分化した細胞の集団がレシピエントへ導入される。いくつかの実施形態において、本発明は、細胞療法をレシピエントに提供する方法に関し、本発明の多数のヒト胎児膀胱由来上皮細胞を前述のレシピエントに投与する工程を包含する（ここで、前述のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、まず始めに無血清培地で増殖され、次いで、前述のレシピエント内の位置に投与され、前記位置は、前記膀胱上皮細胞の増殖および分化を維持する能力のある位置である）。いくつかの実施形態において、本発明のヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、レシピエントの膀胱の管腔に投与される。
【００２８】
本発明の別の局面において、本発明は、細胞療法を提供する方法に関し、これによって、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞から分化した実質的に純粋なヒト前立腺上皮細胞の集団がレシピエントへ導入される。
【００２９】
本発明の別の局面において、本発明は、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団が、開発される薬物の標的として、ヒト胎児膀胱上皮細胞の起源またはこれらの細胞の成分として使用される、医薬品開発の手段を提供する方法に関する。
【００３０】
本発明の別の局面において、本発明は、実質的に純粋なヒト胎児膀胱由来上皮細胞の集団が、開発される薬物の標的として、ヒト膀胱上皮細胞またはヒト前立腺上皮細胞の起源として使用される、医薬品開発の手段を提供する方法に関する。
【００３１】
本発明の別の局面において、本発明は、バイオアッセイの開発においてこれらの細胞からの核酸またはタンパク質の供給源を提供する方法、またはヒト胎児膀胱由来上皮細胞から核酸またはタンパク質を単離する工程を包含するバイオアッセイを提供する方法に関し、バイオアッセイにおいて一つ以上の主成分として、前述の核酸またはタンパク質を使用する。別の局面において、本発明は、バイオアッセイの開発において、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の供給源を提供するか、またはバイオアッセイにおいてヒト胎児膀胱由来上皮細胞を使用する工程を包含するバイオアッセイを提供する方法に関する。
【００３２】
（本発明を実施する方法）
以下の本発明の詳細な説明は、本発明を実施する当業者を補助するために提供される。本明細書に開示された実施形態の修飾が、本発明の要旨を逸脱しない範囲で当業者によって作製され得るため、本発明の詳細な説明は、本発明を限定するという意味に受け取られるべきではない。本開示を通して、種々の刊行、特許および公開された特許明細書は、引用によって参照される。これらの刊行物、特許、および公開された特許の開示は、本開示でその全体が参考として援用される。
【００３３】
本発明の実施は、別の方法で示されない限り、従来の免疫技術、分子生物学、微生物学、細胞生理学、および組換えＤＮＡ（これらは、当業者の範囲内である）を使用する（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：実験マニュアル、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）、Ａｄｕｌｔ  ａｎｄ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｇｉｌｌｅｎｗａｔｅｒら編（２００２）、およびＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７）を参照のこと）。
【００３４】
（定義）
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、用語「膀胱由来上皮細胞（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」、「膀胱由来上皮細胞（ｂｌａｄｄｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」および「膀胱由来細胞」とは、相互可能に使用され、そしてヒト胎児膀胱上皮組織から誘導された細胞をいう。これらの細胞は、インビトロにおいて分裂し、継代され得る。
【００３５】
「抗体」とは、抗原と結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、この用語は完全な免疫グロブリン分子を含むだけではなく、特異性を必要とされる抗原認識部位を含む抗イディオタイプ抗体、変異体、フラグメント、融合タンパク質、ヒト化されたタンパク質、および免疫グロブリン分子の改変も包含する。
【００３６】
「モノクローナル抗体」とは、均質の抗体集団をいい、モノクローナル抗体が抗原の選択的結合に関わるアミノ酸（天然存在と非天然存在）からなる。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向されている。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけを含むのではなく、それのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単一鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ化モノクローナル抗体、および他の任意に改変された免疫グロブリン分子構造（特異性を必要とされる抗原認識部位および抗原に結合する能力を含む）を含む。抗体の供給源またはそれが作製される方法に関しては、これらに限定されない（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物など）。
【００３７】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト種由来の免疫グロブリンから誘導された抗原結合部位を有し、残りの構造がヒト免疫グロブリンの構造、および／または配列に基づく分子をいう。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合された完全な可変ドメイン、または可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含み得る。
【００３８】
用語「抗原」は、抗体が結合し得る一つまたは多数のエピトープを含み得る分子である。抗原は、免疫原性の性質を有し得る（すなわち、免疫応答を誘導する）物質である。抗原は、免疫原の一種と考えられている。本明細書で使用される場合、用語「抗原」とは、全長タンパク質、および一つまたは多数のエピトープを含むそのペプチドフラグメントをいう。
【００３９】
用語「表面抗原」および「細胞表面抗原」とは、本明細書で交換可能に使用され、細胞の原形質膜構成成分をいう。これらの構成成分は、膜結合タンパク質および末梢膜タンパク質、糖タンパク質、多糖、脂質ならびにグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合性タンパク質を含むが、これらに限定されない。「膜結合タンパク質」は、細胞の原形質膜の脂質二重層にまたがる膜貫通型タンパク質である。代表的な膜結合タンパク質は、一般的に、疎水性アミノ酸残基を含む少なくとも一つの膜貫通セグメントからなる。末梢膜タンパク質は、脂質二重層の疎水性の内部に伸長しておらず、そしてこれらは、他の膜タンパク質との非共有結合的な結合相互作用によって、膜表面に結合される。ＧＰＩ結合性タンパク質は、細胞表面で脂質二重層に挿入される脂質尾部によって維持されるタンパク質である。
【００４０】
「免疫原」とは、免疫抗応を誘導する任意の物質をいう。免疫原である物質は、「免疫原性である」と記載されている。免疫応答の誘導は、体液性応答の活性化（例えば、抗体を産生する）または細胞性応答（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞を初回刺激する）、炎症性応答（例えば、白血球の漸増）、ならびにサイトカインおよびリンフォカインの分泌を含むが、これらに限定されない。
【００４１】
免疫または移植に使用される細胞に適用される場合、用語「異種」は、この細胞がレシピエント由来の遺伝子的に別個の物から誘導されることを意味する。例えば、異種細胞は、レシピエントと同じ種由来の異なる種、または異なった個体から誘導され得る。一つの種の個体から誘導された胚細胞は、同一種の成体と異種である。レシピエントに適用される場合、「異種」は、レシピエントが、レシピエントへ導入されるこの細胞の供給源と遺伝的に別個の物であることを意味する。
【００４２】
「外移植」とは、ヒト胎児から取り出された膀胱組織をいう。一般に、外移植は膀胱由来細胞の起源として使用される。外移植からの細胞を単離することは、いくつかの方法によって達成され得る。一つの方法は、培地に膀胱上皮組織の外移植（全組織またはより小さい断片にカットしたもののいずれか）を置き、そして、上皮細胞が天然に、固体組織塊を培地に遊走することを許容することである。別の方法は、この組織に酵素消化、または、固体組織から離れている細胞に機械的な力を与えることを供することである。
【００４３】
少なくとも胎児膀胱由来上皮細胞表面の約５０％、さらに好ましくは少なくとも胎児膀胱由来上皮細胞表面の約７５％、さらに好ましくは少なくとも胎児膀胱由来上皮細胞表面の約９０％、および最も好ましくは少なくとも胎児膀胱由来上皮細胞表面の約９５％が、細胞表面に結合される血清由来の血清生体分子を有さない場合（その結果、抗原部位または抗体結合部位は結合されるか、または抗体または抗体の一部による抗原性認識を利用できない）、細胞表面は、「実質的に血清生体分子を有さない」。細胞表面は、細胞サイズを測定する顕微鏡法またはフローサイトメトリーのいずれかによって決定され得る。例えば、種々の既知のサイズの合成ビーズは、一般的にフローサイトメトリーの調整に使用される。少量の調整ビーズは、膀胱由来上皮細胞と混合され得、そして、得られた集団はフローサイトメトリーによって分析される。次いで、膀胱由来上皮細胞は、調整ビーズのサイズと比較され得る。ビーズのサイズが知られているので、細胞表面量の計算は達成され得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、細胞の「実質的に純粋な」集団は、目的の細胞の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして、さらに好ましくは約９５％以上（例えば、９８％以上）を構成する細胞の集団である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「移植組み換え体」とは、ヒト胎児膀胱由来細胞および間葉組織の結合単位をいう。間葉組織は、膀胱由来か、または非膀胱由来の起源（例えば、膀胱間葉、精嚢間葉）であり得る。間葉組織は、被移植者に対して異種性種由来であり得る。間葉組織はまた、非ヒト種由来であり得る。移植組み換え体は、１〜９６時間の間、さらに好ましくは約６〜４８時間の間、さらに好ましくは約２４時間のインキュベーションを伴う一晩の間、基質、好ましくはやわらかい、生物学的基質（例えば、寒天）上でインキュベートされ得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「血清」とは、血液が凝固した後に残存する哺乳動物血液の流動相をいう。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「血清生体分子」とは、血清で発見された生物学的な組成物をいう。例えば、アルブミン、α１−グロブリン、α２−グロブリン、β−グロブリン、およびγ−グロブリンが挙げられるが、これらに限定されない。血清生体分子は、血清に天然に見出されるか、または血清の処理および操作から得られる、生物学的全体的または部分的な組成物を含み得る。
【００４８】
用語「哺乳動物（ｍａｍｍａｌ）」または「哺乳動物(ｍａｍｍａｌｉａｎ)」とは、温血脊椎動物をいい、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、娯楽動物、およびペットを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
（ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の単離および維持）
本発明の胎児膀胱の上皮性の細胞は、ヒト胎児膀胱組織から単離される。胎児の年齢は、妊娠約６週〜約４０週の間であり得、好ましくは妊娠約８週〜約３０週の間、さらに好ましくは妊娠約１４週〜約２１週の間、さらに好ましくは妊娠約１６週であり得る。胎児膀胱は、肉眼解剖学、外観、および胎児の中の位置で同定され得る。膀胱は、腹壁の近くの下腹の正中線に位置している。位置および外観による同定に加えて、尿膜管（成体において正中臍索として知られている尿膜の残遺物）への付着（膀胱の上面に）によって膀胱は同定され得る。一旦同定されると、胎児膀胱は切除され、そして、好ましくは何度かリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）でリンスされる。隣接の組織および余分な結合組織は、取り除いて解剖され、そして、膀胱は再びＰＢＳでリンスされる。全体の膀胱は、約１ｍｍの立方体に刻まれ、基本培地の中に懸濁され、遠心分離管に移され、そして刻まれた組織をペレットにするために遠心分離される。上清は除去され、この組織は追加の基本培地で再懸濁し、次いで、培養皿へ移される。胎児膀胱上皮細胞の生存を促進する範囲で、液体のｐＨを保つために、種々の基本培地が使用され得る。非制限例は、Ｆ１２／ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、ＣＭＲＬ−１０６６、最小基本培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）およびＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＥＭ）が挙げられる。さらに、ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｓ．、５８：４４、ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２：２５５、またはＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．およびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｐ．Ｅ．（１９９８）「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている任意の基本培養液もまた、使用され得る。
【００５０】
基本培地は培養皿に添加され、そして、組織は加湿下（３７℃）でインキュベートされる。胎児膀胱上皮細胞生存および増殖を促進するためのより最適の条件のために、種々の栄養物が、基本培地を補うために添加され得る（その結果、「培養液」を作製する）。例としては、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、プロゲステロン、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、およびアプロチニンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、以下の量の栄養物が胎児膀胱上皮細胞の生存および増殖を促進するために使用される：少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌインスリンおよび約１ｍｇ／ｍｌ以下のインスリンで、より好ましくは約１０μｇ／ｍｌのインスリン；少なくとも約１μｇ／ｍｌトランスフェリンおよび約１００μｇ／ｍｌ以下のトランスフェリンで、より好ましくは、約１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン；少なくとも約０．１μｇ／ｍｌのα−トコフェロールおよび約１ｍｇ／ｍｌ以下のα−トコフェロールで、より好ましくは、約５μｇ／ｍｌのα−トコフェロール；少なくとも約０．３ｎＭのプロゲステロンおよび約３００ｎＭ以下のプロゲステロンで、より好ましくは、約３ｎＭのプロゲステロン；少なくとも約１ｎｇ／ｍｌのＫＧＦおよび約１００ｎｇ／ｍｌ以下のＫＧＦで、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌのＫＧＦ、少なくとも約０．５ｎＭのＨＲＧおよび約５００ｎＭ以下のＨＲＧで、より好ましくは、約５ｎＭのＨＲＧ、ならびに少なくとも約１μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび約１００μｇ／ｍｌ以下のアプロチニンで、より好ましくは、約２５μｇ／ｍｌのアプロチニン。抗生物質および／または抗真菌薬（例えば、ゲンタマイシン、ペニシリン、および／またはストレプトマイシン）はまた、培地に添加され得るが、抗生物質／抗真菌薬は初期の培養（例えば、最初の２〜５日間）の間だけ添加されることが好ましい。ヒト胎児膀胱上皮細胞は、好ましくは無血清培地で培養される。
【００５１】
胎児膀胱上皮細胞は、胎児膀胱組織から胎児膀胱組織が置かれる培地に移動する。たいていの場合、線維芽細胞型の細胞はまた、膀胱組織から移動する。細かく刻まれた組織の残遺物（これらは、培養皿に付着しない）は、培地の中で流動し、そして、短時間の培養（例えば、１〜２週間）後に、培地交換によってきれいにされる。線維芽細胞型の細胞は、実質的に純粋な胎児膀胱由来上皮細胞の集団を産生するために、培養物から除去される。好ましくは、線維芽細胞型の細胞は、培養物の光タンパク質分解消化によって除去され、好ましくはＥＤＴＡなどのカルシウムキレート剤の存在下で行われる。培養物は、線維芽細胞型の細胞の剥離を検出するために、例えば、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（例えば、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製品番号２５３００−０５４）などを用いたタンパク質分解の処置の間、顕微鏡法で観察した（好ましくは、倒立位相差顕微鏡を利用する）。線維芽細胞型の細胞が剥離される場合、これらは、吸引によって培養物から除去される。培養物の中の残存細胞は、ＰＢＳでリンスされ、そして、新しい培地で培養される。
【００５２】
胎児膀胱上皮細胞は、コーティングされていない組織培養容器（例えば、フラスコ、プレートなど）、または異なる基質でコーティングされている組織培養容器のいずれかで増殖され得る。使用され得る基質の非制限例は、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ポリリシン、ニトロセルロース、ナイロン、およびポリテトラフルオロエチレンが挙げられる。組織培養容器のサイズは、容器の中に入れられる膀胱上皮組織の量に比例する。当業者は、組織培養容器の中に入れられた胎児膀胱組織の段階的な増殖により、正しいサイズの組織培養容器を決定し得る。胎児膀胱組織が組織培養容器の中に最初に置かれる場合、培地は全体的な混濁度において一般的に透明である。細胞が移動し、膀胱組織の断片から離れる場合、培地は、より不透明になり、そしてより濁る。培地が非常に濁った時点で、より多くの新しい培地を添加するか、または培地を完全に変えることによって、膀胱由来細胞に消費された栄養物を補給するために、さらなる培養液が組織培養容器に置かれる。さらに、または別な方法において、培地が濁った場合、少量の細胞は、組織培養容器から除去され得、そして、例えばトリパンブルー染色を用いて、細胞生存率をチェックされ得る。あまりに多くの細胞で超過されている組織培養容器は、細胞生存率の減少が認められ始める。
【００５３】
一般に、胎児膀胱由来上皮細胞の継続的な培養は、一つ以上の新しい培養容器に細胞の移動を含む。好ましくは、培養容器が細胞で超過させる前に、そのような移行が実施される（例えば、減少した細胞生存率によって示される場合）。この細胞は、増加する細胞量を収容するために、他の大きなサイズの容器（例えば、より大きい体積）へ移行され得る。さらに、この細胞は、新しい培養液（「継代培養」として知られている）を有するいくつかの別々の組織培養容器へ「分配（ｓｐｌｉｔ）」し得る。このように、実質的に純粋な胎児膀胱由来上皮細胞の集団が獲得され得、そして増殖され得る。
【００５４】
組織培養容器からの細胞の除去は、好ましくは、プラスチックの組織培養容器の表面から細胞を剥離するために、酵素的処理によって達成される。より好ましい実施形態において、コラゲナーゼジスパーゼなどの酵素は、組織培養フラスコの側面から胎児膀胱上皮細胞を剥離する有効な量で使用される。有効量は、少なくとも約１０重量％のコラゲナーゼジスパーゼ、より好ましくは少なくとも約１重量％のコラゲナーゼジスパーゼ、そして、最も好ましくは少なくとも約０．１重量％のコラゲナーゼジスパーゼである。組織培養容器の表面からの細胞の剥離後に、酵素は、基本培地（好ましくは、本明細書に開示された培養液）で洗浄され、そして、細胞は培養液（好ましくは、本明細書で開示された培養液）を有する新しい培養容器に置かれる。好ましい実施形態において、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）（線維芽細胞増殖第７因子（ＦＧＦ７）ともいう）、およびヘレグリン（ＨＲＧ）は、膀胱由来上皮細胞の増殖および寿命に対する培地補充物の増殖因子として使用される。
【００５５】
胎児膀胱由来上皮細胞に栄養補給する頻度は、この細胞の栄養代謝率に依存する。栄養代謝率が高いと、この細胞は多くの頻度で栄養補給を必要とする。一般に、細胞が培地で栄養物を代謝する場合、培地の酸性度は増加する。いくつかの培養液（例えば、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭなど）は、酸性を示すｐＨ感受性の染料を含むので、この結果、酸性になると、培地は変色する。次いで、生命を維持し、そして細胞の増殖を促進する酸性度に対して、既存の培地を酸性にもたらすために、培養液が添加され得る。あるいは、ごく一部の細胞は、組織培養容器から除去され得、そして、例えば、トリパンブルー染色で細胞生存率を評価され得る。培養液が代謝されている場合、細胞生存率は低くなる（例えば、５０％未満）。胎児膀胱由来上皮細胞の生存および増殖を促進するのに、好ましい栄養補給の頻度は、１週間あたり約２回である。本発明の胎児膀胱由来上皮細胞は、停止状態がない状態で、複数回（最大１２回まで）継代され得る。
【００５６】
（胎児膀胱由来上皮細胞の特性）
本明細書に開示された方法で単離された、本発明の胎児膀胱由来上皮細胞の集団は、いくつかの規定された特性を有する。胎児膀胱由来上皮細胞の同定は、形態学または特異的マーカー、または両方の技術の組み合わせによって達成され得る。
【００５７】
胎児膀胱由来上皮細胞の形態学は、移行性の上皮細胞の特性によって特徴付けられる。上皮細胞コロニーをクラスター形成して、細胞は増殖する。移行性の上皮組織なので、形態学はいくらか変化する。中間に、密接した多角形の上皮細胞、細長化プロセスにより細長くなった細胞、そして、形態学的に他の細胞がある。細長い細胞は、細胞の塊を形成した。密接した多角形の細胞は、尿路上皮細胞分化マーカー（例えば、サイトケラチン７およびサイトケラチン１９、ならびにウロプラキン  ＩＩＩ）をより少なく発現するか、または尿路上皮細胞分化マーカーを発現しないので、これらの細胞は、分化を抑えた膀胱上皮細胞を表した。形態学的に拡大された細長い細胞および丸い細胞は、さらに分化した特性を表した。
【００５８】
胎児膀胱由来上皮細胞を検出するために使用され得るマーカーは、胎児膀胱由来上皮細胞表面上のサイトケラチン（ＣＫ）１、サイトケラチン５、サイトケラチン６、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１０、サイトケラチン１１、サイトケラチン１３、サイトケラチン１５、サイトケラチン１６、サイトケラチン１８、およびサイトケラチン１９ならびにウロプラキン（例えば、ウロプラキンＩａ、ウロプラキンＩｂ、ウロプラキンＩＩ、およびウロプラキンＩＩＩ）を含むが、これらに限定されない。これらの細胞表面マーカーは、ＣＫおよびウロプラキンに対して特異的な抗体を使用することによって、評価される。使用され得る抗体の例は、以下に挙げられるが、これらに限定されない：抗サイトケラチンＣＫ−７（Ｚｙｍｅｄ  １８−０２３４ロット００４６０１１８）、ＣＫ−１９（ＮＣＬ−ＣＫ１９  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｂａｔｃｈ  １００９０２）および抗ウロプラキン抗体（マウス抗ウロプラキン  ＩＩＩ  ｃｌｏｎｅ  ＡＵＩ，ｍＩｇＧ１ロット番号１０５３００ａ  カタログ番号ＲＤＩ−ＰＲ０６５１１０８、ＲＤＩ）。抗ＣＫ抗体および抗ウロプラキン抗体は、免疫組織化学において、またはフローサイトメトリーによって、直接的な膀胱由来上皮細胞の染色または間接的な膀胱由来上皮細胞の染色のいずれかにおいて、使用され得る。
【００５９】
胎児膀胱由来上皮細胞はまた、平滑筋アクチンマーカーである抗αアクチン抗体（ＤＡＫＯＡ／Ｓ  Ｃｌｏｎｅ  １Ａ４  Ｃｏｄｅ  Ｍ０８５１）で染色される。この結果はネガティブであり、これは、培養された胎児膀胱由来上皮細胞がいずれの平滑筋細胞をも含まないことを示す。さらなる特性において使用され得るさらにもう一つのマーカーは、実施例３に示されるように、Ｈ１９インプリント遺伝子である。
【００６０】
（胎児膀胱由来上皮細胞の使用）
（免疫原）
胎児膀胱由来上皮細胞における使用は、免疫原である。本発明で開示されるように、独特な無血清培養条件は、胎児膀胱由来上皮細胞の細胞表面を、表面に結合され得る血清タンパク質または血清生体分子がない状態であり続けさせる。血清生体分子による結合で「覆われる（ｍａｓｋｅｄ）」抗原部位の潜在的な問題は、開示された無血清の単離を使用して、そし培養技術を使用することによって回避される。従って、抗体のパネルは、血清を含む培養条件を使用する場合、「覆われる」新たに利用可能な抗原を作成され得る。
【００６１】
本明細書で開示された方法を用いて単離され、そして培養された胎児膀胱由来上皮細胞は、異種レシピエントに投与される免疫原として使用され得る。免疫原として胎児膀胱由来細胞を異種レシピエントに投与する方法は、以下を含むが、これらに限定されていない：免疫、直接的な接触（例えば、塗布または擦過傷装置）による膜への投与、エアゾールによる粘膜への投与、および経口投与。当業者において周知であるように、免疫は受動免疫または能動免疫のいずれかであり得る。免疫の方法は、腹腔内注射、皮内注射、局所注射を含む異なる経路を通じて生じ得るが、これらに限定されていない。免疫の被験体は、例えばマウスなどの哺乳動物を含み得る。一般に、免疫経路および免疫スケジュールは、抗体刺激および産生において、確立された従来の技術である。マウスが本実施形態で使用される場合、ヒトを含む任意の哺乳動物の被験体またはこれからの抗体産生細胞は、哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の産生の基礎としての機能を果たすために、本発明の工程に従って操作され得る。代表的に、マウスは、腹腔内に免疫原性量の胎児膀胱由来細胞を接種されて、次いで、同量の免疫原で追加免疫される。選択的に、非生体膜マトリックスで増殖した細胞は、宿主哺乳動物の腹腔内に外科的に移植される。リンパ球系細胞（好ましくは、マウス由来の脾臓リンパ球系細胞）は、最終追加免疫数日後に回収され、そして細胞懸濁液は、細胞融合で使用するために、これらから調製される。
【００６２】
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，ＢおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（Ｂｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら（１９８２）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１８：３７７−３８１で修正）の全身性体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用して、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製される。利用可能な骨髄腫細胞株は、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３を含むが、これに限定されず、そして、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡからの細胞株がハイブリダイゼーションに使用され得る。この技術は、融合原（例えば、ポリエチレングリコール）を使用するか、または当業者に周知の電気手段によって、骨髄腫細胞およびリンパ球系細胞を融合させる。融合後に、この細胞は、融合培地から分離され、そしてハイブリダイゼーションしていない親細胞を除去するために、ＨＡＴ培地などの選択的な増殖培地で増殖される。本明細書に記載される任意の培地は、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用され得る。細胞融合技術の別の代替技術として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞は、本発明のモノクローナル抗体を産生するために使用される。所望の場合、ハイブリドーマは、増殖されて、継代され、そして上清は、従来の免疫学的アッセイの手順（例えば、放射性同位元素標識免疫測定法、酵素免疫学的アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）によって、抗免疫原活性についてアッセイされる。
【００６３】
このような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を用いて、インビトロまたはインビボで増殖され得る。モノクローナル抗体は、所望の場合、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、硫酸沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィーおよび限外濾過）で、培地または体液から単離され得る。所望でない活性が存在する場合、例えば、免疫原で作製された吸着剤を固相に付着させ、その上に調製物を流し、そして、所望の抗体を免疫原から溶出するかまたは解離することによって、除去され得る。
【００６４】
このように、胎児膀胱由来上皮細胞に特異的な細胞表面抗原に対する新しい抗体のパネルは、本発明の胎児膀胱由来上皮細胞を使用することで作成され得る。ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の代表的な細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体の集団はまた、ＰＣＴ  ＷＯ  ００／３７５０３で説明された方法を使用することで作成され得る。胎児膀胱由来上皮細胞上の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体が、本明細書で開示された方法によって一旦作製されると、抗体はいくつかの用途を有する。
【００６５】
組換え抗体またはヒト化抗体を作成する目的のために、この抗体は配列決定され、そしてクローン化され得る。膀胱由来上皮細胞の特異的な抗体の他の用途は、生物学的試験または精製（例えば、フローサイトメトリーまたはパニングによって、胎児膀胱由来上皮細胞を単離する）、治療用途（例えば、標的細胞への抗体の結合により細胞増殖を促進するかまたは阻止する、あるいは、標的細胞への抗体の結合により細胞塊の増殖を促進するかまたは阻止する）、生物学的マーカー（例えば、他の胎児膀胱由来細胞の同定）、および臨床診断（例えば、癌性膀胱上皮細胞の同定）を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
（創薬）
ヒト胎児膀胱由来上皮細胞の別の用途（または、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞由来の分化細胞）は、創薬に関する。ヒト胎児膀胱由来上皮細胞集団は、開示された方法において、以前に単離され、そして培養されていないので、胎児膀胱由来上皮細胞集団は、これまでに発見されていないか、または特徴付けられていないタンパク質を分泌し得る。血清を使用する以前の培養法は、タンパク質の分泌を阻害し得る。あるいは、分泌されて、そして血清生体分子と相互作用している場合、タンパク質は、機能、高次構造、または活性を変化し得る。胎児膀胱由来上皮細胞によって分泌されたタンパク質は、血清生体分子からの最小限の障害を有し、その結果、正確にはより生理学的および位相的であり得る。従って、胎児膀胱由来上皮細胞によって分泌されたタンパク質は、薬物開発の標的として使用され得る。一つの実施形態において、薬物は、胎児膀胱由来上皮細胞および／またはインビボにおいてこれから分化した細胞上の特定のタンパク質を標的にするように作製され得る。薬物の結合は、完全に分化させた膀胱上皮細胞へと膀胱細胞の分化を促進し得る。膀胱上皮細胞の新生が所望される場合、例えば、膀胱を含む放射線療法後または膀胱内化学療法後（膀胱上皮を損傷し得るか、または破壊し得る）に、このアプローチが使用され得る。
【００６７】
さらに別の用途において、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞（または、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞由来の分化細胞）は、膀胱由来上皮細胞と相互作用する小分子を開発するか、または発見するために使用され得る。これらの小分子は、合成または天然であり得、そして、膀胱由来上皮細胞の増殖および／または分化を阻害するかあるいは促進するために使用され得る。
【００６８】
さらに別の用途において、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞（または、そこから誘導された分化細胞）は、一つ以上の薬物の医薬開発において、組織特異的な構成成分の起源として使用され得、そしてこれらの構成成分は、開発中の薬物に対する標的として使用される。
【００６９】
（細胞療法）
別の用途において、胎児膀胱由来上皮細胞は、細胞療法に使用される。胎児膀胱由来上皮細胞の移殖は、細胞療法の一例である。この用途を実施するために、胎児膀胱由来上皮細胞が単離され、そして、無血清（開示された方法を使用した規定された培養液）で培養される。本明細書で開示されるように、移殖に利用可能な胎児膀胱由来上皮細胞の数を増殖するために、細胞集団は継代され得る。次いで、胎児膀胱由来上皮細胞は、レシピエントに投与され得、そして、膀胱の管腔表面を再増殖させる。あるいは、胎児膀胱由来上皮細胞が、遺伝子治療の細胞性キャリアとして使用され得る（ここで、胎児膀胱由来上皮細胞は、一つ以上の遺伝子と共にトランスフェクトされ、次いで、レシピエントに投与（好ましくは、膀胱内投与）される）。別の実施形態において、胎児膀胱由来上皮細胞は、デバイス（細胞を含み、免疫系応答を制限するために、他の細胞からのアクセスを制限する）で使用される（例えば、Ｔｈｅｒａｃｙｔｅ（登録商標））。
【００７０】
本発明の胎児膀胱由来上皮細胞の可塑性はまた、前立腺の関係で利用され得る。従って、胎児膀胱由来上皮細胞は、前立腺上皮を再増殖するか、または増大するために、個々の前立腺へ移植され得る。胎児膀胱由来上皮細胞はまた、前立腺へ送達するために、遺伝的に改変されている胎児膀胱由来上皮細胞の投与によって（例えば、胎児膀胱由来上皮細胞へ一つ以上の遺伝子のトランスフェクション後、前立腺へ移植する）、遺伝子治療の細胞性キャリアとして使用され得る。
【００７１】
（ヒト組織モデル）
胎児膀胱由来上皮細胞の別の用途は、非ヒト哺乳動物におけるヒト組織モデルを作製することである。胎児膀胱由来上皮細胞は、移植組み換え体を形成するために、間葉組織の上に置かれる。間葉組織は、膀胱由来組織または非膀胱由来組織のいずれかであり得、そして、胎児膀胱由来上皮細胞が単離される異なる種由来であり得る。実施例において、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞は、移植組み換え体を形成するために、ラットの膀胱間葉組織の上に置かれる。別の模範的な移植組み換え体は、前立腺の間葉（例えば、ラット精嚢間葉）の上に置かれた胎児膀胱由来上皮細胞である。当業者は、最初に、本明細書に開示された方法を使用してヒト胎児膀胱由来上皮細胞を単離し、次いで、異なった器官由来の間葉組織と結合することによる、段階的な方法で最適な組合せを決定し得る。いくつかの実施形態において、異なる種（例えば、ラット）は、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞との組み合わせで間葉組織の起源として使用される。異種種の使用は、ヒト特異的マーカーが分化した胎児膀胱由来細胞の同一性を決定するのに使用されることを許容する。ラット間葉組織が使用される場合、偽陽性の可能性は減少する。
【００７２】
間葉組織に位置する胎児膀胱由来上皮細胞領域を包含する移植組み換え体は、軟質の基質（例えば、寒天）上で、好ましくは約半日〜約３日間、より好ましくは約１日培養され、次いで、レシピエント哺乳動物の腎臓被膜の下に置かれる。可能なレシピエント哺乳動物は、マウスおよびラットを含むが、これらに限定されない。代表的に、移植状況において、ドナー組織は、レシピエントの免疫系による攻撃に、脆弱性である。移植片拒絶を軽減するために、いくつかの技術が使用され得る。一つの方法は、移植片を攻撃し得る免疫細胞を破壊するために、致死量以下の放射線量をレシピエントに照射することである。別の方法は、レシピエントにシクロスポリンまたは他のＴ細胞免疫抑制剤を与えることである。レシピエント哺乳動物としてのマウスの使用において、種々の方法が移植片拒絶を軽減するために可能である。そのような方法の一つは、免疫不全マウス（ヌード、または重症複合型免疫不全もしくはＳＣＩＤ）の使用である。
【００７３】
実施例において、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞領域は、ラットの膀胱間葉組織またはラット精嚢間葉上に位置し、そして、免疫不全マウスの腎臓被膜の下に位置する。移植片が増殖され、そして胎児膀胱由来上皮細胞分化について分析される前に、移植組み換え体は、約１週〜約５２週の間、好ましくは約５週〜約４０週の間、さらに好ましくは約６週〜約１０週の間、そしてさらに好ましくは約８週の間、レシピエントに残存する。いくつかの場合において、小さな移植部分が分析に必要である。本明細書で開示されたように、胎児膀胱由来上皮細胞およびこれらから誘導された細胞に特異的なマーカーは、免疫組織学的分析で利用され得る。さらに、一つ以上のこれらのマーカーの組み合わせは、移植の効果を決定するために、細胞形態と組み合わせて使用され得る。
【００７４】
一つの実施形態において、ヒト胎児膀胱由来モデルは、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）マウスで作成される。この胎児膀胱由来モデルは、本明細書で開示された方法を用いて、単離され、そして培養されたヒト胎児膀胱由来上皮細胞を利用することによって作製され得、そして、移植組み換え体を作製するためにヒト胎児膀胱由来上皮細胞を用いることによって作製され得る。次いで、移植組み換え体は、マウスの腎臓被膜下に置かれる。腎臓被膜下への移植から約１〜１０週後、好ましくは約６〜８週後、移植片またはその一部は回収され、そして免疫組織学で分析される。使用され得る胎児膀胱由来上皮細胞上の細胞表面マーカーは、ＣＫ１、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１０、ＣＫ１１、ＣＫ１３、ＣＫ１５、ＣＫ１６、ＣＫ１８およびＣＫ１９、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、酸性のアルカリホスファターゼ、ウロプラキンＩａ、ウロプラキンＩｂ、ウロプラキンＩＩおよびウロプラキンＩＩＩ、ならびにＨ１９インプリント遺伝子を含むが、これらに限定されない。ＰＳＡ抗体が、前立腺組織モデル系を分析するのに有用である場合、本明細書に開示された抗ＣＫ抗体または抗ウロプラキン抗体は、膀胱組織モデル系の効果を分析するために使用される。胎児膀胱由来上皮細胞分化の結果を評価する別の方法は、形態学による。膀胱由来上皮細胞は移行性上皮を形成し、そして、膀胱間葉組織と組み換えられる場合、膀胱上皮に並んだ空洞構造をいつも形成する。精嚢間葉と再結合された膀胱由来上皮細胞は、典型な前立腺上皮の形態学をとる。より完全な評価のために、形態学は細胞表面マーカーに結合され得る。
【００７５】
これらの方法を通して、本発明はまた、分化したヒト膀胱上皮細胞およびヒト前立腺上皮細胞の集団を産生する方法を提供する。
【００７６】
（バイオアッセイ）
本明細書で開示されたヒト胎児膀胱由来上皮細胞（または、これから分化された細胞）およびこれらの細胞の構成成分は、種々のバイオアッセイで使用され得る。一つの用途において、膀胱由来上皮細胞は、どの生物学的因子が分化に必要であるかを決定するために使用される。異なった生物学的化合物（例えば、ホルモン、特定の増殖因子など）の組み合わせにおける段階的な方法で、膀胱由来上皮細胞を使用することにより、一つ以上の特定の生物学的化合物は、膀胱細胞または前立腺細胞に分化を誘導することを見出され得る。
【００７７】
本発明はまた、ヒト胎児膀胱由来上皮細胞由来の核酸またはタンパク質を単離する工程を包含するバイオアッセイに関する核酸またはタンパク質の供給源を提供する方法、およびバイオアッセイにおいて一つ以上の主成分として、前記核酸またはタンパク質を使用する方法を提供する。膀胱由来上皮細胞に関するバイオアッセイの他の用途は、ディファレンシャルディスプレイ法（例えば、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ法）および膀胱由来上皮細胞からの分泌タンパク質を使用するタンパク質−タンパク質の相互作用である。タンパク質−タンパク質の相互作用は、例えば、酵母のツーハイブリッドシステムなどの技術で決定され得る。膀胱由来上皮細胞由来のタンパク質は、他の未知のタンパク質または膀胱由来上皮細胞と相互作用する他の細胞型を同定するために、使用され得る。これらの未知のタンパク質は、以下の一つ以上であり得る：増殖因子、ホルモン、酵素、転写因子、翻訳因子および腫瘍サプレッサー。膀胱由来上皮細胞およびこれらの細胞が形成するタンパク質−タンパク質の相互作用に関するバイオアッセイ、ならびにタンパク質−タンパク質または一様の細胞−細胞の接触の効果は、間葉組織などの周辺組織がどのように膀胱由来上皮細胞の分化に寄与するかを決定するために、使用され得る。
【００７８】
以下の実施例は、胎児膀胱由来上皮細胞の単離、特性決定、および用途の詳細な説明を提供する。これらの実施例は、いかなる方法においても、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【００７９】
（実施例１  胎児膀胱由来上皮細胞の単離）
ヒト胎児膀胱組織（妊娠週齢１４〜２１週）を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｔ  Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手した。組織が到着するとすぐに、２０ｍｌの冷たいＰＢＳでこれらをリンス（３回）した。膀胱から余分な結合組織を取り除き、冷たいＰＢＳでさらに２回リンスし、次いで、カミソリの刃またはハサミを用いて顕微鏡下で解剖し、小さいセグメント（約１ｍｍに細かく刻む）にカットした。
【００８０】
刻んだ組織を１０ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁し、次いで、プラスチックピペット（ピペット壁への組織の結合を最小にするために、ウシ血清アルブミンでプレコートした）を用いて１５ｍｌの遠心管へ移した。刻まれた組織をペレットにするために、刻まれた組織を、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｍｅｇａｆｕｇｅ  ２．０（カタログ番号７５００３４８５）で５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を吸引し、そして、このペレットを６ｍｌの新しいＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）で再懸濁した。
【００８１】
組織懸濁液を移して、そして、６ウェルの組織培養処理化６ウェル組織培養プレートに分注した。さらに３ｍｌの培養液（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、１０μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、５μｇ／ｍｌ  α―トコフェロール（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ３２５１）、２５μｇ／ｍｌ  アプロチニン、３ｎＭ  プロゲステロン、１０ｎｇ／ｍｌ  ＫＧＦ、５ｎＭ  ＨＲＧ、１００μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン含有ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標））をこのウェルに添加し、次いで、このプレートを９５％空気（５％  ＣＯ２雰囲気）の加湿インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。培養の最初の２日間後は、ゲンタマイシンを使用しなかった。
【００８２】
限定的なタンパク質分解による培養物から、線維芽細胞を取り出した。培養物を０．５ｍｌの０．０５％  ＥＤＴＡ−トリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で短時間トリプシン処理し、線維芽細胞が縮むまで、位相差顕微鏡下で観察した。プレートを徹底的に振盪し、そして、線維芽細胞をプレートから剥がした。線維芽細胞を基質から剥離した場合、培地を吸引することによって線維芽細胞を除去し、そして、細胞を剥離した。培養物を５ｍｌのＰＢＳで２回リンスし、次いで、新しい培養液を供給した。
【００８３】
結果として生じた精製胎児膀胱由来上皮細胞の集団を、１２回まで継代した。トリプシン処理（１ｍｌの０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号２５３００−０５４）またはコラゲナーゼ／ジスパーゼ（３ｍｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カタログ番号２６９６３８）によって、培養器から細胞を剥離した。剥離した細胞を回収し、ペレット（１０００ｒｐｍで５分間）にし、基本培地で２回洗浄し、新しい培養液で再懸濁し、そして、再プレートした。
【００８４】
（実施例２  免疫組織化学の特徴づけ）
４ウェルチャンバースライドに培養された単層の胎児膀胱由来上皮細胞を、冷たいＰＢＳで３回洗浄し、そして、−２０℃の１００％の試薬アルコールで５分間固定した。次いで、固定スライドを一晩中、風乾した。この細胞を、ブロッキング緩衝液（５％ヤギ血清含有ＰＢＳ）で約１時間、一次抗体で一晩中、そして、ペルオキシダーゼ結合性Ｆ（ａｂ）２フラグメントのヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）で約１時間、連続してインキュベートした。これらの工程の間、細胞をＰＢＳで３回（５分／洗浄）洗浄した。使用された一次抗体は、業者によって推奨された希釈で、サイトケラチン７およびサイトケラチン１９、ウロプラキンＩＩＩならびにα−アクチンであった。抗体による細胞の染色を可視化するために、胎児膀胱由来上皮細胞をＳｉｇｍａから調製されたペルオキシダーゼ基質ＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２でインキュベートした。
【００８５】
いくつかの細胞は、ウロプラキンＩＩＩならびにサイトケラチン７およびサイトケラチン１９に対して陽性だった。これらの細胞は通常、上皮性コロニーの辺縁の方に位置した。上皮性コロニーの中心に位置するより少数の分化細胞は、これらのマーカーに対して陰性だった。培養中の細胞はα−アクチンに対して陽性ではない。ウロプラキンＩＩＩ（膀胱上皮に対して非常に特異的なマーカー）の陽性染色は、この細胞が膀胱上皮であることを示すが、α−アクチンでの染色の欠如は、培養物が平滑筋細胞を混入していないことを示す。
【００８６】
（実施例３  胎児膀胱細胞分子マーカーＨｌ９インプリントｍＲＮＡ遺伝子の検出）
Ｈ１９インプリントｍＲＮＡ遺伝子は、胎児ヒト膀胱細胞で特異的に発現されるマーカーとして特徴付けられるが、正常のヒト成体膀胱細胞（Ｅｌｋｉｎら、１９９５、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７４（１）：５７−６１；Ｃｏｏｐｅｒら、１９９６、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５５（６）：２１２０−２７）で発現されていない。Ｈｌ９  ｍＲＮＡを検出するために、Ｑｉａｇｅｎから購入したＲＮｅａｓｙキット（カタログ番号７４１０４）を用いて、業者によって提供されたプロトコールに従って、同型胎児膀胱由来上皮細胞培養（各々約１０５細胞）の２つの継代から総ＲＮＡを抽出した。各サンプルに対して、５０μｌの水で最終的に総ＲＮＡを溶出した。ランダムプライマーを有するｃＤＮＡ合成キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  カタログＡ３５００）を用いて、業者によって提供されたプロトコールに従って、２０μｌの反応中に、初めのｃＤＮＡ鎖を入れて、総ＲＮＡ（各サンプル９．５μｌ）を逆転写した。Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ番号２  １４０  ３１４）によって製造された以下のハイファイＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを用いて、ＰＣＲ反応をセットアップした（カタログ番号２  １４０  ３１４）。
【００８７】
【表１】
2005517403.tif 000002
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのカスタムオリゴヌクレオチドによって、両方のプライマーを合成し、そして２．５  Ｏ．Ｄ．（２６０ｎｍ）／ｍｌの濃度で、水に溶かした。このプライマー対を用いて、特定のＨ１９  ｍＲＮＡについての予測されたＰＣＲ産物は、１１７塩基対であった。
【００８８】
ＰＣＲ反応をＴｅｃｈｎｅ  ＧｅｎｉｕｓＴＭのヒートサイクルセットで実施した（９４℃３分間での最初の変性後、変性を９４℃３０秒、その後のアニーリングおよび伸長を６０℃３０秒で２５サイクル）。最後の伸長は７２℃７分であった。Ｔｒｉｓホウ酸緩衝液中に調製された２％アガロースゲルの電気泳動（８０ボルト、２時間）によって、ＰＣＲ産物を分画化し、エチジウムブロマイドで染色し、そして、紫外光を用いた照明によって可視化した。Ｋｏｄａｋイメージステーション４４０  ＣＦで、蛍光写真を撮影した。
【００８９】
ヒト胎児膀胱由来上皮細胞のｃＤＮＡの増幅は、予測されたサイズ（約１１７ｂｐ）のＰＣＲ増幅産物のクリアなバンドを生じた。総ＲＮＡをテンプレートとして使用した場合、増幅産物は全く観察されなかった。Ｈ１９  ｍＲＮＡから増幅し、ＲＴ−ＰＣＲ産物を確認した。
【００９０】
（実施例４  ヒト膀胱組織モデリング）
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系の新生仔（２４時間）ラットから、膀胱間葉を解剖し、１％トリプシンを含む皿に移し、そして、４℃で９０分間インキュベートした。培地を除去し、次いで、トリプシン活性を中和するために、遺物を２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで数回洗浄した。次いで、解剖顕微鏡下で膀胱上皮および結合する間葉をさらに切り離した。組織遺伝子組み換え体を作製するために、１％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを含む０．４％の寒天プレートの表面上に、結合性上皮を有さない間葉を置いた。血清含有培地への間葉および組織遺伝子組み換え体のこれらの短期間の曝露は、血清含有培地に「培養する」と考えられていない、ことは注目すべきことである。
【００９１】
０．５％  コラゲナーゼ／ジスパーゼを用いた処置によって、原始胎児ヒトの膀胱由来上皮細胞を収集した。膀胱由来上皮細胞をシートとして剥がした。次いで、滅菌済のピンセットを用いて、細胞シートを間葉の上に置き、そして、この組織を９５％空気（５％  ＣＯ２雰囲気）の加湿インキュベーターにおいて３７℃で一晩中インキュベートした。翌日、ＣＤ１ヌードマウスの腎被膜下に、組織遺伝子組み換え体を移植した。
【００９２】
移植８週後に、宿主マウスを屠殺し、この組織を回収し、そして１０％の中性ホルマリンで一晩中固定した。一連の段階的なエタノール水溶液の使用によって、固定組織を脱水し、そして、Ｈｉｓｔｏ−Ｃｌｅａｒ溶液できれいにした。次いで、組織をパラフィンで包埋し、６μｍにカットした。基本染色のために、切片をＨｉｓｔｏ−Ｃｌｅａｒで脱ワックス化し、段階的なエタノール溶液で再水和し、そしてヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００９３】
免疫組織学において、抗ヒト平滑筋αアクチン抗体、抗ヒトウロプラキン抗体、抗ヒトサイトケラチン７抗体、および抗ヒトサイトケラチン１９抗体を使用した。サイトケラチン７およびサイトケラチン１９の免疫組織学において、抗原検索プロトコールを実施した。簡潔に、この切片をＴａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ溶液（Ｄａｋｏ、カタログ番号１６９９、１０×ストックから１：１０に希釈）に浸し、マイクロ波（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ、ＮＮ−７５２３モデル、１２０Ｖ、１２．８Ａ）を用いて３０分間強力に加熱し、次いで、室温（約２５℃）まで冷却した。抗ヒト平滑筋αアクチンおよびウロプラキンＩＩＩに関しては、抗原検索を実施しなかった。
【００９４】
切片を３％  Ｈ２Ｏ２含有Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏで２０分間ブロックし、そして１×ＰＢＳで３回（２分／洗浄）リンスした。次いで、ＩｍｍｅｄｇｅＴＭペン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｈ−４０００）を用いて、この切片に丸をつけ、そして、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有１×ＰＢＳで２分間、再度洗浄した。この切片を、さらに５％ヤギ血清含有１×ＰＢＳ（ブロッキング緩衝液）で１時間ブロックした。次いで、一次抗体をこの切片を覆うように加えた（約５００μｌ）。使用した一次抗体は、マウス抗ヒト平滑筋αアクチン抗体（Ｄａｋｏ  カタログ番号Ｍ０８５１、希釈なしで使用）、マウス抗ウロプラキンＩＩＩクローンＡＵ１抗体（カタログ番号ＲＤＩ−ＰＲ０６５１１０８、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１：５００希釈）、マウス抗ヒトサイトケラチン７抗体（カタログ番号１８−０２３４、Ｚｙｍｅｄ、１：５０希釈）、およびマウス抗ヒトサイトケラチン１９ＮＣＬ−ＣＫ１９（カタログ番号１００９０２、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、１：１００希釈）であった。一次抗体のインキュベーションは、４℃で一晩中実施した。
【００９５】
一晩のインキュベーション後、余分な一次抗体を流し、そして、この切片を０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有１×ＰＢＳで３回（２分間／洗浄）リンスした。二次抗体（１：５００で希釈されたビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（カタログ番号Ｅ０４３３、Ｄａｋｏ））を添加し（各切片５００μｌ）、そして、室温で１時間インキュベートした。この切片を０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有１×ＰＢＳで３回（２分間／洗浄）再度リンスし、そして、製造業者によって提供されたプロトコールに従って、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅキット（カタログ番号ＰＫ−６１００、Ｖｅｃｔｏｒ）を用いてさらに処置した。スライドを０．１Ｍ  ＮａＡｃ含有１ｍｇ／ｍｌ  ＤＡＢ溶液（ジアミノベンジジン、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ−５９０５）（ｐＨ５．０で０．０１５％の過酸化水素含有）で発色させた。最後にスライドを水で洗浄し、核を同定するために、ヘマトキシリン（カタログ番号ＨＸＨＨＥＧＡＬ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でカウンター染色し、そして段階的なエタノール（７０％、８０％、９５％、１００％）（Ｈａｒｌｅｃｏ、カタログ番号６５３４７／８５）の中で脱水した。
【００９６】
結果は、図１および図２に示す。図１ａは、Ｈ＆Ｅ染色の組織遺伝子組み換え体の切片を示す。図１ｂ、図１ｃおよび図１ｄは、α−アクチン、ヒトサイトケラチン７、およびヒトサイトケラチン１９染色各々を示す。サイトケラチン染色は、組織遺伝子組み換え体の中に形成された細胞内腔の内面の上皮層に限定されることは注目すべきことである。図２ａは、抗ヒトウロプラキン抗体を用いた染色を示す（図２ｂは、二次抗体だけのコントロールである）。正常で見出されるように、染色は、インサイチュの膀胱上皮において、遺伝子組み換え体における上皮層の細胞内腔表面に限定される。抗ウロプラキンＩＩＩ抗体は、胎児膀胱由来上皮細胞の一部のみを染色し、これは、組織遺伝子組み換え体内の胎児膀胱由来上皮細胞の分化の変動レベルを示し、注目すべきことである。
【００９７】
（実施例５  ヒト前立腺組織モデリング）
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系の新生仔（出生時）ラットから、精嚢間葉を解剖し、１％トリプシンを含む皿に移し、そして、４℃で９０分間インキュベートした。培地を除去し、次いで、トリプシン活性を中和するために、遺物を２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで数回洗浄した。次いで、解剖顕微鏡下で精嚢上皮および結合する間葉をさらに切り離した。組織遺伝子組み換え体を作製するために、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを含む０．４％の寒天プレートの表面上に、結合性上皮を有さない間葉を置き、ヒト胎児膀胱上皮誘導性細胞（実施例４に記載されるように、培養しそして収集した）を間葉上に置き、そして、９５％空気（５％  ＣＯ２）の加湿下において、３７℃で一晩、接着させた。血清含有培地への間葉および組織遺伝子組み換え体のこれらの短期間の曝露は、血清含有培地に「培養する」と考えられていない、ことは注目すべきことである。
【００９８】
組織遺伝子組み換え体をオスのＳＣＩＤマウスの腎被膜下に移植した。移植６ヶ月後に、宿主マウスを屠殺し、そしてこの移植片を除去した。
【００９９】
実施例４のように、固定組織を処置し、そして、免疫組織学によって前立腺に特異的な抗原を染色した。免疫組織学のために、切片をヒストクリア（ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ）で脱パラフィン化し、そして、エタノールの連続浴を通して、リン酸緩衝生理食塩水の中で脱水した。内因性ペルオキシダーゼは、３％過酸化水素で１５分間ブロックした。次いで、組織切片は、前立腺に特異的な抗原に対する抗体（Ｄａｋｏ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と共に、４℃で一晩中、インキュベートした。サンプルをＰＢＳで洗浄し、次いで、二次抗体（ビオチン化ヤギ抗マウス抗体、ｄａｋｏ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）でインキュベートし、その後、アビジン−ビオチン複合体でインキュベートした。染色は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で発色した。余分なＤＡＢを除去するために、サンプルを水で広範に洗浄し、段階的なアルコールで脱水し、キシレンでクリアにし、そしてカバーガラスでマウントした。図３に示されるように、精嚢間葉と組み換えられた場合、膀胱上皮細胞は、形態学的にそして生化学的に、前立腺上皮細胞に分化したということをこの結果は示した。
【０１００】
本願は、少なくとも一つのカラーで作成された図を含む。カラーの図を有する本願のコピーは、請求し、そして必要な料金を支払った上で、特許商標庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１Ａは、位相差顕微鏡（１００倍、Ｎｉｋｏｎ）下で観察された第１継代のヒト胎児膀胱誘導性上皮細胞のサンプルの顕微鏡写真を示す。
【０１０２】
図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅおよび図１Ｆは、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色した第１継代のヒト胎児膀胱誘導性上皮細胞のサンプルの顕微鏡写真を示す。図１Ｂは、一次抗体がないネガティブコントロールを示す。図１Ｃは、サイトケラチン７染色を示す。図１Ｄは、抗ヒト平滑筋αアクチン染色を示す。図１Ｅは、サイトケラチン１９染色を示す。図１Ｆは、ｕｒｏｐｌａｋｉｎ染色を示す。褐色領域は、陽性染色であり、青色は、核染色である。
【図２】図２は、ヒト胎児膀胱誘導性上皮細胞およびラット膀胱間葉を含む組織組換え体からの切片の顕微鏡写真を示す。図２Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片の顕微鏡写真である。図２Ｂは、抗ヒト平滑筋α−アクチン抗体で染色された切片を示す。図２Ｃおよび図２Ｄは、ヒトサイトケラチン７およびヒトサイトケラチン１９の各々に特異的な抗体を用いた染色を示す。抗体の結合は、褐色の反応産物の沈着によって示される。図２Ｅは、抗ヒトｕｒｏｐｌａｋｉｎ−ＩＩＩで染色された切片を示し、そして、図３Ｆは、コントロール（一次抗体なし）を示す。抗体の結合（濃い紫色／黒の反応産物の沈着によって示される）は、管腔表面上で、図２Ｅにおいて観察され得る。
【図３】図３．組織組換え体における前立腺上皮細胞へのヒト膀胱上皮細胞株の分化。図３Ａは、新生児ラット精嚢間葉と組み換えする前に、膀胱上皮細胞株の培養物から放出された上皮細胞シートのパラフィン切片（Ｈ＆Ｅ染色）の顕微鏡写真を示す。図３Ｂは、６ヶ月間、膀胱上皮細胞株およびＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下で増殖したラット精嚢間葉の組織組換え体のパラフィン切片（Ｈ＆Ｅ染色）の顕微鏡写真を示す。典型的な前立腺構造が認められる。図３Ｃは、図３Ｂのように、同じ組織組換え体における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の免疫組織化学染色の顕微鏡写真を示す。上皮細胞系列に強度の陽性染色（褐色）が認められる。この切片は、細胞核を青色で染色するヘマトキシリンによって、カウンター染色された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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