(57)【要約】本発明はセンサーのようなナノスケール又はミクロスケールの対象物の周囲の溶液環境を変化させるマイクロ流体システム及びそれを使用する方法を提供する。本発明は、検出素子がその特徴が知られているであろう或いは知られていないであろう多数の異なる溶液環境へ、迅速、連続的且つ制御可能に露呈させる必要がある如何なるセンサー技術にも供給されることが可能である。
2005517399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センサーの周囲の溶液環境を変化させる基板であって、該基板が複数のチャネルからなり、チャネルの各々が出口からなる基板と
センサーを出口からの流体流へ選択的に露呈させる走査メカニズムからなるシステム。
【請求項２】
センサーの周囲の溶液環境を変化させる基板であって、該基板が：
センサーを受けるための開口−容積チャンバと； 
複数のチャネルであって、チャネルの各々が実質的に個別の流体流をチャンバ中へ配送するための出口からなるチャネルとからなるシステム。
【請求項３】
センサーの周囲の溶液環境を変化させる基板であって、該基板が複数のチャネルからなり、チャネルの各々が実質的に個別の流体流をセンサーへ配送するための出口からなる基板と；
チャネル各々からの流体のセンサーへの配送を制御するための処理装置と：からなるシステム。
【請求項４】
チャンバがチャンバ内部に設置されたセンサーへ電流を配送可能である請求項２のシステム。
【請求項５】
少なくとも一つのチャネルが槽と連通している請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項６】
槽が緩衝液槽である請求項５のシステム。
【請求項７】
槽がサンプル槽である請求項５のシステム。
【請求項８】
複数の緩衝液槽及びサンプル槽からなる請求項５のシステム。
【請求項９】
槽各々が異なるチャネルと連通している請求項７のシステム。
【請求項１０】
交互にかみ合ったサンプル及び緩衝液の槽からなる請求項９のシステム。
【請求項１１】
陽圧又は陰圧を槽へ加えるメカニズムから更になる請求項５のシステム。
【請求項１２】
走査メカニズムが出口に近接したセンサーを移動させるメカニズムからなる請求項１のシステム。
【請求項１３】
走査メカニズムが一つ以上のチャネル全体にわたる圧力を変化させるメカニズムからなる請求項１によるシステム。
【請求項１４】
チャンバと連通する少なくとも一つの排出チャネルから更になる請求項２のシステム。
【請求項１５】
システムがチャネルの出口に近接した位置にセンサーを位置決めする位置決め装置と連結した又は接続したセンサーを保持するメカニズムから更になる請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項１６】
センサーを保持するメカニズムに十分に近接した、或いはセンサーを保持するメカニズムに十分に近接するよう移動させることが可能なキャピラリから更になり、キャピラリは位置決め装置により位置決めされたセンサーへ流体を配送することが可能な請求項１５のシステム。
【請求項１７】
センサーを保持するメカニズムが細胞を保持するメカニズムからなる請求項１５又は１６のシステム。
【請求項１８】
キャピラリからの流体が緩衝液である請求項１６のシステム。
【請求項１９】
センサーから更になる請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項２０】
センサーが細胞又は細胞の一部分から更になる請求項１９のシステム。
【請求項２１】
細胞がパッチクランプされた細胞又はパッチクランプされた細胞膜画分である請求項２１のシステム。
【請求項２２】
細胞又は細胞の一部分がイオンチャネルからなる請求項２０のシステム。
【請求項２３】
細胞又は細胞の一部分がＧ蛋白質連結受容体からなる請求項２０のシステム。
【請求項２４】
細胞又は細胞の一部分が活性化した受容体からなる請求項２０のシステム。
【請求項２５】
細胞又は細胞の一部分が、培養細胞、細菌細胞、原生生物細胞、イースト菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、両生類細胞、魚類細胞、哺乳類細胞、卵母細胞、組み換え型核酸を発現する細胞、及び病的状態の患者由来の細胞から構成される群より選択される請求項２０のシステム。
【請求項２６】
細胞又は細胞の一部分が位置決め装置を用いたチャネルの出口に近接して位置決めされる請求項２０のシステム。
【請求項２７】
システムがセンサーから更になり、センサーが、表面プラズモンエネルギーセンサー；ＦＥＴセンサー；ＩＳＦＥＴ；電気化学センサー；光学センサー；音波バイオセンサー；量子ドット粒子に付随する検出素子からなるセンサー；ポリマー−ベースバイオセンサー；及び基板に固定された生体高分子の配列から構成される群より選択される請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項２８】
システムが複数のセンサーからなる請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項２９】
複数のチャネルの流動流各々が実質的に平行である請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項３０】
チャンバの少なくとも一部が光学的に透過型である請求項２のシステム。
【請求項３１】
チャンバが複数のウェルからなり、ウェルの各々が細胞を受ける請求項２のシステム。
【請求項３２】
チャンバがチャンバ中の溶液の電気的特性を変化させるための少なくとも一つの電気素子からなる請求項２のシステム。
【請求項３３】
ウェル各々が細胞との電気的接触を形成するための電気素子からなる請求項３１の何れかのシステム。
【請求項３４】
ウェル中の細胞を選択されたチャネルからの流動流に選択的に露呈するため、基板における一つ以上のチャネル全体にわたる圧力を変化させるためのメカニズムから更になる請求項３１のシステム。
【請求項３５】
チャネル出口各々の直径が少なくとも約センサーの直径である請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項３６】
センサーが細胞からなる請求項３５のシステム。
【請求項３７】
チャネル各々が槽からの溶液を受けるための少なくとも一つの入り口からなり、槽各々の中心から中心までの間隔がマルチ−ウェルプレート中のウェルの中心から中心までの間隔に対応する請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項３８】
基板が処理チャンバ中に設置された細胞へ電流を配送するための一つ以上の処理チャンバから更になる請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項３９】
保持するためのメカニズムが位置決め装置と接続されたピペット又はキャピラリ及び光学ピンセットから構成される群より選択される請求項１５のシステム。
【請求項４０】
センサーを保持するためのメカニズムがピペットであり、キャピラリがｐピペットと同軸である請求項１６のシステム。
【請求項４１】
ピペットがパッチクランプピペットである請求項３９のシステム。
【請求項４２】
センサーを保持するためのメカニズムが電極からなる請求項１５のシステム。
【請求項４３】
センサーを出口からの流動流に選択的に露呈する走査メカニズムから更になる請求項２又は３のシステム。
【請求項４４】
走査メカニズムが複数のチャネル出口を横切ってセンサーを走査するためのメカニズムからなる請求項４３のシステム。
【請求項４５】
走査メカニズムが基板における一つ以上のチャネル全体にわたる圧力を変化させるためのメカニズムからなる請求項４３のシステム。
【請求項４６】
走査メカニズムが基板又はセンサー、或いは基板及びセンサーの両者を移動させることが可能である請求項１のシステム。
【請求項４７】
走査メカニズムが基板及びセンサーを移動させることが可能である場合、センサー及び基板が互いに個別に移動させることが可能である請求項４３のシステム。
【請求項４８】
センサー又は基板、或いはセンサー及び基板の動きがチャネル出口からの流体へのセンサーの所定の応答に起こる請求項４３のシステム。
【請求項４９】
走査メカニズムと連通する処理装置から更になる請求項１のシステム。
【請求項５０】
走査メカニズムと連通する処理装置から更になる請求項４３のシステム。
【請求項５１】
処理装置が、走査の速度、走査の方向、走査の加速度、走査の回数、チャネルにおける休止間隔及び一つ以上のチャネル全体にわたる圧力変化の一つ以上を制御する請求項１のシステム。
【請求項５２】
処理装置が、走査の速度、走査の方向、走査の加速度、走査の回数、チャネルにおける休止間隔及び一つ以上のチャネル全体にわたる圧力変化の一つ以上を制御する請求項４３のシステム。
【請求項５３】
チャンバ中のセンサーの応答を検知するためのセンサーと連通した検知器から更になる請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項５４】
検知器がデータ収集システムからなる処理装置と連通する請求項５３のシステム。
【請求項５５】
処理装置が更にデータ分析システムからなる、或いはデータ分析システムと連通する請求項４９のシステム。
【請求項５６】
処理装置が応答に関するデータを表示するためのユーザーインターフェースと連通する請求項５３のシステム。
【請求項５７】
ユーザーインターフェースがコンピュータ又はワイヤレス装置である請求項５６のシステム。
【請求項５８】
検知器からの信号に応答して、処理装置が走査の速度、走査の方向、走査の加速度、走査の回数及び一つ以上のチャネル全体にわたる圧力変化の一つ以上を変化させる請求項４９のシステム。
【請求項５９】
少なくとも一つのチャネル出口がセンサーを受けるためのチャンバ中へ開口している請求項１又は３のシステム。
【請求項６０】
チャネルの各々が同時に流動流を開口容積チャンバ中へ配送する請求項２のシステム。
【請求項６１】
チャネルの各々が同時に流動流を開口容積チャンバ中へ配送する請求項６０のシステム。
【請求項６２】
システムが、流動配送システムから基板の槽の一つ以上中へ流体をポンピングするマイクロポンプに作動可能なように関連する流体配送システムに結びつける請求項５のシステム。
【請求項６３】
流体配送システムが一つ以上のマイクロタイタープレートからなる請求項６２のシステム。
【請求項６４】
流体配送システムがサンプル及び／又は緩衝液の異なる種類を槽の一つ以上へプログラム可能な状態にて配送することが可能な請求項６２のシステム。
【請求項６５】
流体配送システムが緩衝液を少なくとも一つの槽へプログラム可能な状態にて配送することが可能な請求項６２のシステム。
【請求項６６】
基板の互いにかみ合ったチャネルを通過して、システムがサンプル及び緩衝液の流れを配送する請求項１０のシステム。
【請求項６７】
細胞が受容体からなり、システムが緩衝液；少なくとも一つのアゴニスト；少なくとも一つのアゴニスト及び緩衝液；少なくとも一つのアンタゴニスト；又は少なくとも一つのアンタゴニスト及び緩衝液を基板のチャネルを通過して配送する請求項２０のシステム。
【請求項６８】
システムが細胞又は蛋白質を受けるためのチャンバからなり、それはチャネルと連通しており、そしてチャンバは緩衝液；少なくとも一つのアゴニスト；少なくとも一つのアゴニスト及び緩衝液；少なくとも一つのアンタゴニスト；少なくとも一つのアンタゴニスト及び緩衝液；又は少なくとも一つのアンタゴニスト、少なくとも一つのアゴニスト及び緩衝液からなる請求項２０又は請求項６７のシステム。
【請求項６９】
少なくとも一つのアゴニスト及び緩衝液；少なくとも一つのアンタゴニスト及び緩衝液；又は少なくとも一つのアンタゴニスト、少なくとも一つのアゴニスト及び緩衝液が基板の交互にかみ合ったチャネルを通過して細胞へ配送される請求項６７のシステム。
【請求項７０】
システムから流体を除去するための少なくとも一つの出口チャネルから更になる請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項７１】
陽圧又は陰圧を少なくとも一つのチャネルへ配送するメカニズムから更になる請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項７２】
圧力を配送するためのメカニズムが処理装置と連通する請求項７１のシステム。
【請求項７３】
処理装置が一つ以上の選択されたチャネルへ圧力を配送するためのメカニズムへ指示を提供する請求項７２のシステム。
【請求項７４】
基板がマルチ−ウェルプレートと結びつけられ、各ウェルが基板上の異なるチャネルと流体で連通する請求項１-３の何れかのシステム。
【請求項７５】
ウェルがチャネルへの流体の配送のための一つ以上の外部チュービング又はキャピラリを介してチャネルと連通している請求項７４のシステム。
【請求項７６】
一つ以上のチュービング又はキャピラリが一つ以上の弁からなり、チュービング又はキャピラリを介した流体流を制御する請求項７４のシステム。
【請求項７７】
少なくとも一つの槽が隔壁によって密閉される請求項５のシステム。
【請求項７８】
チューブ又はニードルが隔壁中へ挿入される請求項７４のシステム。
【請求項７９】
キャピラリが緩衝液のセンサーへの規則的な配送を提供するポンピングメカニズムと連結する請求項１６のシステム。
【請求項８０】
基板が、透明な半導体材料；シリコン；窒化ケイ素；Ｇｅ，ＧａＡｓ;金属；Ａｌ，Ｎｉ；ガラス；石英；透明な絶縁体；セラミック；プラスチック；エラストマー材料；シリコン；ＥＰＤＭ；ホスタフロン；重合体；フッ素重合体；テフロン（登録商標）；ポリメチルメタクリレート；ポリジメチルシロキサン；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリブチレン；ポリメチルペンテン；ポリスチレン；ポリウレタン；ポリ塩化ビニル；ポリアリーレート；ポリアリールスルホン；ポリカプロラクトン；ポリエステルカルボネート；ポリイミド；ポリケトン；ポリフェニルスルホン；ポリフタルアミド;ポリスルホン;ポリアミド;ポリエステル;エポキシポリマー;サーモプラスチック;有機材料;非有機的な材料;それらの組み合わせから構成される群より選択される材料からなる請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項８１】
基板が三次元であり、少なくとも二つのチャネルが少なくとも部分的に異なる平面に位置する請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項８２】
第一のチャネル一組及び第二のチャネル一組からなり、第一のチャネル一組が第二のチャネル一組の上に重なる請求項８１のシステム。
【請求項８３】
少なくとも一つのチャネルが少なくとも二つのチャネルからの流体流と一体化させるための混合チャネルである請求項１−３の何れかのシステム。
【請求項８４】
混合チャネルが基板の様々な濃度からなる流体を供給する請求項８４のシステム。
【請求項８５】
活性化された受容体を生じさせる方法であって、
ａ）基板を準備し、該基板が：
アゴニストによって活性化された受容体からなる細胞−ベースのバイオセンサーからなるチャンバと；
アゴニスト、アンタゴニスト、又はアゴニストとアンタゴニストの両者を配送する複数の配送チャネルであって、チャネルの各々がチャンバ中へ実質的に個別の水流を配送するための出口からなるチャネルとからなり；そして、
ｂ）選択的にバイオセンサーを一つ以上の出口からの流体流に露呈することからなる活性化された受容体を生じさせる方法。
【請求項８６】
チャンバが緩衝液、少なくとも一つのアゴニスト、少なくとも一つのアンタゴニスト、又はそれらの組み合わせからなる請求項８５の方法。
【請求項８７】
受容体の変調成分の検知方法であって、
ａ）基板を準備し、該基板が：
細胞−ベースのバイオセンサーからなるチャンバであって、バイオセンサーが受容体からなるチャンバと；
複数のチャネルであって、チャネルの各々がチャンバ中へ実質的に個別の水流を配送するための出口からなるチャネルと；
バイオセンサーを一つ以上の出口からの流体流へ選択的に露呈する走査メカニズムとからなり、
ｂ）変調成分を含むとされるサンプルを少なくとも一つのチャネルへ準備し、
ｃ）サンプルからなる流体流ひ選択的に露呈することでバイオセンサーの応答を測定し、ここにおいて、バイオセンサーの応答における変化がサンプル中の変調成分の存在を示すことからなる受容体の変調成分の検出方法。
【請求項８８】
露呈ステップが、少なくとも一つのチャネル出口に対して基板又はセンサーの移動、或いは基板及びセンサー両者の移動により達成される請求項８５又は８７の方法。
【請求項８９】
基板及びセンサーの両者を互いに個別に移動させる請求項８８の方法。
【請求項９０】
露呈ステップが、更に一つ以上のチャネル全体にわたる圧力低下を生じさせることからなる請求項８５又は８７の方法。
【請求項９１】
同じ被検変調成分が複数のチャネルへ供給される請求項８７の方法。
【請求項９２】
異なる濃度の変調成分が複数のチャネルへ供給される請求項８７の方法。
【請求項９３】
変調成分の濃度が少なくとも一つのチャネル中において変化し、少なくとも一つのチャネルにおいて変調成分の勾配が形成される請求項８７の方法。
【請求項９４】
変調成分の用量−反応曲線をもたらすことから更になる請求項８７の方法。
【請求項９５】
バイオセンサーを少なくとも一つのチャネルによって配送された緩衝液に露呈することからなる請求項８７の方法。
【請求項９６】
バイオセンサーを緩衝液及びサンプルの流れに選択的に露呈することからなる請求項９５の方法。
【請求項９７】
バイオセンサーを緩衝液及びサンプルの交互の流れに選択的に露呈することからなる請求項９６の方法。
【請求項９８】
細胞−ベースバイオセンサーがパッチ−クランプされた細胞又はパッチ−クランプされた細胞膜画分からなる請求項８５又は８７の方法。
【請求項９９】
位置決め装置に連結され或いは接続されたパッチ−クランプされた細胞がパッチクランプピペットを用いた出口に対して位置決めされる請求項９８の方法。
【請求項１００】
パッチ−クランプされた細胞又はパッチ−クランプされた細胞膜画分がチャンバの底部のくぼみに位置決めされる請求項９８の方法。
【請求項１０１】
受容体が、受容体と結合するとバイオセンサーによって測定可能な応答を生じるアゴニストによって活性化され、変調成分がアゴニストの活性を調節する請求項８７の方法。
【請求項１０２】
受容体が、受容体と結合するとバイオセンサーによって測定可能な応答が消去され或いは減少するアンタゴニストによって不活性化され、変調成分がアンタゴニストの活性を調節する請求項８７の方法。
【請求項１０３】
受容体が、変調成分がアゴニストである請求項８７の方法。
【請求項１０４】
受容体が、変調成分がアンタゴニストである請求項８７の方法。
【請求項１０５】
チャネルが緩衝液、緩衝液；少なくとも一つのアゴニスト；；少なくとも一つのアンタゴニスト；少なくとも一つのアゴニスト及び緩衝液又は少なくとも一つのアンタゴニスト及び緩衝液；又は少なくとも一つのアンタゴニスト、少なくと一つのアゴニスト及び緩衝液を配送する請求項８７の方法。
【請求項１０６】
チャンバが緩衝液、少なくとも一つのアゴニスト、又は少なくとも一つのアンタゴニストからなる請求項８７又は１０５の方法。
【請求項１０７】
受容体が受容体と結合したＧ−蛋白質からなる請求項８５又は８７の方法。
【請求項１０８】
受容体がＧ蛋白質連結受容体からなる請求項８５又は８７の方法。
【請求項１０９】
細胞−ベースバイオセンサーが組み換え技術によって表現された受容体からなる請求項８５又は８７の方法。
【請求項１１０】
組み換え技術によって表現された受容体がオーファン受容体である請求項１０９の方法。
【請求項１１１】
応答が細胞表面積を測定することにより定量される請求項８７の方法。
【請求項１１２】
応答が細胞−ベースバイオセンサーの電気特性を測定することにより定量される請求項８７の方法。
【請求項１１３】
変調成分が神経伝達物質放出の変調成分である請求項８７の方法。
【請求項１１４】
応答がイオン−チャネル浸透特性を測定することにより定量される請求項８７の方法。
【請求項１１５】
ナノスケール又はマイクロスケールの対象物の周囲の溶液環境を局所的に変化させる方法であって、
（ａ）ナノスケール又はマイクロスケールの対象物及び流体からなるチャンバ；及び、
複数のチャネルであって、チャネルの各々がチャンバと交差した出口からなるチャネルからなる基板を準備し、
（ｂ）流体の実質的に個別の流れをチャンバ中へ配送し、少なくとも二つの流れが異なる流体からなり；
（ｃ）少なくとも二つの流れを横切って対象物を連続的に走査し、その結果対象物の周囲の水溶液環境を変化させることからなるナノスケール又はマイクロスケールの対象物の周囲の溶液環境を局所的に変化させる方法
【請求項１１６】
走査が基板、対象物又は基板及び対象物を移動させることにより達成される請求項１１５の方法。
【請求項１１７】
一つ以上のチャネル全体にわたって圧力を変化させることにより達成される請求項１１５の方法。
【請求項１１８】
チャンバが複数のナノスケール又はミクロスケールの対象物からなる請求項１１５の方法。
【請求項１１９】
対象物各々が少なくとも二つの流れを横切って走査される請求項１１５の方法。
【請求項１２０】
走査が処理装置により制御される走査メカニズムによって達成される請求項１１５の方法。
【請求項１２１】
処理装置がチャネルに対する対象物の位置を制御する請求項１２０の方法。
【請求項１２２】
処理装置が、走査の方向、走査の加速度、走査の回数、チャネルにおける休止間隔及び一つ以上のチャネル全体にわたる圧力変化から構成される群より選択される走査パラメータを制御する請求項１２０の方法。
【請求項１２３】
走査パラメータがフィードバック信号に応答して処理装置により修正される請求項１２２の方法。
【請求項１２４】
フィードバック信号が一つ以上の流れに対する対象物の応答である請求項１２３の方法。
【請求項１２５】
基板が、チャンバと交差する出口からなる少なくとも二つのチャネルから更になり、少なくとも二つのチャネルから出る水流がチャンバ内部の多量の流体内で平行にされ層流となる請求項１１５の方法。
【請求項１２６】
複数のチャネルの各々における静水圧が異なる請求項７９,８０又は１０５の方法。
【請求項１２７】
少なくとも二つのチャネルにおける流体の粘度が異なる請求項８５又は８７又は１１５の方法。
【請求項１２８】
チャネル各々が異なる粘度を有する流体からなる請求項８５又は８７又は１０５の方法。
【請求項１２９】
少なくとも二つのチャネル内部の流体が異なる温度である請求項８５又は８７又は１１５の方法。
【請求項１３０】
チャネル各々の流体の温度が異なる請求項８５又は８７又は１１５の方法。
【請求項１３１】
少なくとも二つのチャネル内部の流体の浸透圧が異なる請求項８５又は８７又は１１５の方法。
【請求項１３２】
チャネル各々の流体の浸透圧が異なる請求項１３１の方法。
【請求項１３３】
少なくとも二つのチャネル内部の流体のイオン強度が異なる請求項８５又は８７又は１０５の方法。
【請求項１３４】
少なくとも二つのチャネル中に流れる流れが少なくとも異なる速度で流れる請求項８５又は８７又は１１５の方法。
【請求項１３５】
チャンバに入る流体がチャンバから抜取られる請求項８５又は８７又は１１５の方法。
【請求項１３６】
流体がチャンバに入るのと同じチャネルを通過して引き抜かれる請求項１３５の方法。
【請求項１３７】
流体がチャンバに入るのと異なるチャネルを通過してチャネルから引き抜かれる請求項１３５の方法。
【請求項１３８】
対象物がセンサーであり、方法が一つ以上の流体流へのセンサーの応答を測定することから更になる請求項１１５の方法。
【請求項１３９】
センサーが細胞膜からなり、方法が細胞膜を電界に露呈するステップから更になる請求項１３８の方法。
【請求項１４０】
電界が細胞膜中の細孔形成を引き起こす請求項１３９の方法。
【請求項１４１】
応答がイオン電流を測定することにより定量される請求項１３９の方法。
【請求項１４２】
応答が電圧を測定することにより定量される請求項１３９の方法。
【請求項１４３】
応答が細胞内カルシウムを測定することにより定量される請求項１３９の方法。
【請求項１４４】
応答が膜伸縮を測定することにより定量される請求項１３９の方法。
【請求項１４５】
応答が内部小胞の開放である請求項１３９の方法。
【請求項１４６】
応答が膜による小胞の回復である請求項１３９の方法。
【請求項１４７】
対象物がチャンバの底部に安定的に付随する請求項１３９の方法。
【請求項１４８】
チャネルの少なくとも一つにおける流体が電気泳動によってチャンバへ配送される請求項８５又は８７又は１１５の方法。
【請求項１４９】
チャネルの少なくとも一つにおける流体がポンピングによってチャンバへ配送される請求項８５又は８７又は１１５の方法。
【請求項１５０】
方法が、連続的に又は断続的に異なる波長の光に対象物を露呈することから更になる請求項８５又は８７又は１１５の方法。
【請求項１５１】
対象物がマイクロ−又はナノ−電極である請求項１１５の方法。
【請求項１５２】
対象物が表面プラズモンエネルギーセンサー；ＦＥＴセンサー；ＩＳＦＥＴ；電気化学センサー；光学センサー；音波バイオセンサー；量子ドット粒子に付随する検出素子からなるセンサー；ポリマー−ベースバイオセンサー；及び基板に固定された生体高分子の配列から構成される群より選択される請求項１１５の方法。
【請求項１５３】
対象物が：真核細胞、原核細胞、細胞核、感染細胞、形質転換された細胞、細菌、細胞小器官、細胞小器官アナログ、配偶子、電気穿孔された細胞、シナプトゾーム、プロテオリポソーム、リポソーム及びそれら組み合わせから構成される群より選択される請求項１１５の方法。
【請求項１５４】
チャネル中の流体の流速より速い又は遅い速度にて流体の源からの液体と対象物を連続的に又は断続的に過融解することから更になる請求項１１５の方法。
【請求項１５５】
対象物が細胞であり、細胞の表面が連続的に又は断続的に過融解され、イオンチャネル及び/又は受容体を再過敏化する請求項１１５の方法。
【請求項１５６】
対象物が細胞であり、細胞の表面が連続的に又は断続的に過融解され、イオンチャネル及び/又は受容体を脱過敏化する請求項１１５の方法。
【請求項１５７】
対象物が細胞であり、細胞の表面が液体と連続的に又は断続的に過融解され、イオンチャネル及び/又は受容体をブロックする請求項１１５の方法。
【請求項１５８】
一つ以上のミクロ−又はナノ電極が対象物に近接して設置される請求項１１５の方法。
【請求項１５９】
一つ以上のミクロ−又はナノ電極が連続的に又は断続的に対象物を電界に露呈するために使用される請求項１５８の方法。
【請求項１６０】
露呈することがナノスケール又はミクロスケールの対象物における電気化学的変化を引き起こす請求項１５９の方法。
【請求項１６１】
電気化学的変化が酸化又は還元である請求項１６０の方法。
【請求項１６２】
チャンバが複数のウェルからなり、ウェル各々が細胞を受ける請求項１１５の方法。
【請求項１６３】
ウェル各々が細胞との電気的接触を形成するための電気素子からなる請求項１６２の方法。
【請求項１６４】
少なくとも一つのチャネルを通過してチャンバ中へ運搬することから更になる請求項１１５の方法。
【請求項１６５】
一つ以上の薬剤が複数のチャネルを通過して配送される請求項１１５の方法。
【請求項１６６】
対象物が互いにかみ合った薬剤及び緩衝液流に露呈させる請求項１１５の方法。
【請求項１６７】
候補薬物；既知薬物；懸念発癌性物質；既知発癌性物質；候補毒剤、既知毒剤；及び直接的に又は間接的にイオンチャネルに作用する薬剤から構成される群より薬剤が選択される請求項１６５の方法。
【請求項１６８】
対象物が細胞であり、細胞の流体流に対する応答が細胞の生理的応答における変化を監視するために使用される請求項１１５の方法。
【請求項１６９】
生理反応が病状に付随する異常な生理反応である請求項１１５の方法。
【請求項１７０】
基板が生物の体に埋め込まれる請求項１１５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞ベースのバイオセンサーのようなセンサーへの水流の迅速且つプログラム可能な配送システム及び方法に関する。特に、本発明は高処理能力のパッチクランプ分析のための方法及びシステムを提供する。
【背景技術】
【０００２】
イオン−チャネルは重要な治療標的である。神経単位の伝達、心機能及び記憶は全てリガンド−開閉及び電位−開閉イオン−チャネルの機能に決定的に依存している。加えて、心臓、消化管及び脳のような多くの器官における広い範囲の慢性及び急性の病態生理学的状態はイオンチャネルによって生じる。実際に、多くの現存する薬はイオン−チャネルに直接的又は間接的に関係がある受容体と結合する。例えば、抗−精神病の薬はドーパミン作動性、セロトニン作動性、コリン作動性及びグルタミン酸作動性の神経伝達に従事する受容体と相互作用する。
【０００３】
薬物標的としてのイオン−チャネルの重要性により、リガンド−開閉及び電位−開閉チャネルに作用する化合物の高処理能力選別（ＨＴＳ）を可能とする方法が必要である(例えば、シンクレア等，２００２，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４：６１３３−６１３８参照)。しかしながら、イオンチャネルを標的とした現存するＨＴＳ創薬システムは、粗結合（ｒａｗ  ｂｉｎｄｉｎｇ）分析又は蛍光−ベース読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）のような間接的な方法を採用するので、一般的に著しい薬物活性を見逃してしまう。百万の化合物の選別から一万もの薬物誘導が確認され得るが、偽陽性及び偽陰性の同定により、潜在的な高治療性の超大型新薬が相手にされず、偽薬物誘導に不必要なそして高価な投資が更に生じることになる。
【０００４】
パッチクランプ法は細胞中のイオンチャネル活性を測定するための他の如何なる技術より優れており、細胞膜を越えるピコアンペア（ｐｉｃｏ  Ａｍｐｓ）という低い範囲内の電流を測定することが可能である（例えば、ネエル及びザクマン，１９７６，Ｎａｔｕｒｅ２６０：７９９−８０２；ハミル等，１９８１，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ３９１：８５−１００；ザクマン及びネエル，１９８３，Ｓｉｎｌｅ−Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇの中のｐｐ．３７−５２，Ｅｄｓ．Ｂ．ザクマン及びＥ．ネエル．ニューヨーク及びロンドン，プレナムプレス，１９８３参照）。しかしながら、パッチクランプ方法は一般的にＨＴＳプラットフォームを開発するために選択される方法ではない。
【発明の要約】
【０００５】
本発明はセンサーのようなナノスケール又はミクロスケールの対象物の周囲の溶液環境を変化させるマイクロ流体システム及びその使用方法を提供する。本発明は、検出素子が多数の異なる溶液環境（例えば、１０以上、そして望ましくは約９６以上の異なる環境）へ迅速、連続的且つ制御可能に露呈させる必要がある如何なるセンサー技術においても応用されることが可能であり、この特徴は既知であって未知であってもよい。従来技術のマイクロ流体システムとは対照的に、サンプル配送の間の間隔が最小化され、例えば、マイクロ秒及び秒のオーダーでの化合物（例えば、薬物）の迅速な分析が可能となる。
【０００６】
一態様において、本発明はセンサーのようなナノスケール又はミクロスケールの対象物の周囲の溶液環境を変えるための基板からなるシステムを提供する。基板は、センサーのための開口−容積チャンバと複数のチャネルとからなる。各々のチャネルはチャンバ中に実質的に個別の水流を配送するための出口からなる。一態様において、出口は実質的に平行、すなわち単一の平面において直線状に配列される。出口の寸法は変化可能である；しかし、一態様において、センサーが生物学的細胞である場合、望ましくは各々の出口の直径は少なくとも約細胞の直径である。望ましくは、全てではないが複数のチャネルがチャンバ中へ流体流をプログラム可能に配送する。
【０００７】
好適な態様において、基板の各々のチャネルは槽からの溶液を受けるための少なくとも一つの入口からなり、基板上の形状及び配置についてマルチ−ウェルプレート中のウェルの形状及び配置に合致させている。例えば、基板は９６−１０２４の槽からなり得、各々が基板上の独立したチャネルに接続している。望ましくは、各々の槽の中心から中心までの距離は、業界標準マイクロタイタ又はマルチ−ウェルプレートにおけるウェルの中心から中心までの距離と一致する。
【０００８】
更なる態様において、基板は、処理チャンバ内部に設置された細胞へ処理を遂行するための一つ以上の処理チャンバ又はマイクロチャンバからなっている。処理は、化学物質又は化合物（例えば、蛍光発生染料をキレート化しているカルシウムイオンのような薬物又は染料）に細胞を露呈すること、電流に細胞を露呈すること（例えば、電気穿孔法、電気融合等）、或いは光に細胞を露呈すること（例えば、光の特定の波長への露出）からなり得る。処理チャンバは、連続的に又は同時に遂行され得る多様な種類の処理のために使用されることが可能である。例えば、電気的に処理された細胞はまた化学物質又は化合物に露呈させることが可能であり及び／又は光に露呈させることが可能である。処理はある期間にわたって連続的又は断続的であり得る（例えば、規則的又は不規則な間隔にわたって間隔があけられる）。細胞処理チャンバは、処理された細胞をセンサーチャンバへ、又はチャンバ内部で細胞を位置決めするための位置決め装置（例えば、マイクロ位置決め装置又はナノ位置決め装置）に連結される細胞を保持するためのメカニズムへ直接配送するための出口を有するチャネルからなり得る。
【０００９】
望ましくは、センサーチャンバの底部は光学的に透明であり、一つの態様において、本システムは更に開口容積チャンバと光学的に連通する（例えば、レーザのような）光源からなり得る。光源は、センサーを同じ又は異なる波長の光に連続的に又は断続的に露呈するために使用され得る。センサーチャンバ及び／又はチャネルは加えて制御装置を備えることができる。例えば、センサーチャンバ及び／又はチャネルは、温度センサー、ｐＨセンサー等からなり得、チャンバ及び／又はチャネルの条件に関する信号をシステム処理装置へ提供する。
【００１０】
センサーチャンバは、様々な異なるセンサーを受けるよう適用され得る。一態様において、センサーは細胞又は細胞の一部（例えば細胞膜画分）からなる。別の態様において、細胞又は細胞膜画分はイオンチャネルからなり、予備接合的に（ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃａｌｌｙ）に発現したイオンチャネル、リガンド開閉チャネル、電圧開閉チャネル等を含むがこれらに限定されない。更なる態様において、細胞は、Ｇ−蛋白質−連結受容体（ＧＰＣＲ）のような受容体、又はリガンドが既知でないオーファン受容体、又は既知のリガンドからなる受容体からなる。
【００１１】
培養細胞はセンサーとして使用されることが可能であり、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ-３Ｔ３細胞及びＨＥＫ−２９３細胞から構成される群より選択されることが可能であり、イオンチャネル又は受容体のような検出分子を発現するために組み換え技術によって設計されることが可能である。多くの他の異なる細胞の種類も使用され得、これは哺乳類細胞（例えばヒト細胞、霊長類細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、他の家畜等を含むがこれに限定されない）;細菌細胞;原生生物細胞;イースト菌細胞;植物細胞;昆虫細胞を含む無脊椎細胞;両生類細胞;鳥類細胞;魚;等から構成される群より選択され得る。
【００１２】
細胞膜画分は上記した細胞のいずれかから単離されることが可能であり、或いは当技術分野においてお決まりの方法を使用してイオンチャネル又は受容体のような検出分子を有するリポソーム又は他の脂質−ベース粒子を凝集することによって生み出され得る。
【００１３】
細胞又は細胞の一部は、ピペット（例えば、パッチクランプピペット）又は位置決め装置（例えば、マイクロ位置決め装置又はナノ位置決め装置又はマイクロ遠隔操縦装置）に連結されたキャピラリ又は光学ピンセットのような細胞又は細胞の一部を保持するためのメカニズムを使用してチャンバ中に位置決めされ得る。望ましくは、位置決め装置は少なくともｘ−、ｙ−、ｚ−、方向にピペットを移動させる。代案として又は追加として、位置決め装置はピペットを回転させ得る。また、好ましくは、位置決め装置は処理装置と連通する駆動ユニットに連結し、ピペットの移動が処理装置によって制御されるようにする。
【００１４】
一態様において、チャンバの底部は、一つ以上のくぼみからなり、細胞又は細胞の一部は一つ以上の電極と連通し得るくぼみに設置される（例えば、センサーは平面のパッチクランプチップからなり得る）。
【００１５】
非−細胞−ベースセンサーもまた本システムにおいて使用され得る。好適な非−細胞−ベースセンサーとしては、表面プラズモンエネルギーセンサー；ＦＥＴセンサー；ＩＳＦＥＴ；電気化学センサー；光学センサー；音波センサー；量子ドット粒子に付随する検出素子からなるセンサー；ポリマー−ベースセンサー；基板上に固定された単一分子又は分子の配列（例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、小分子等）が挙げられるが、これに限定されるものではない。センサーチャンバはまた複数の異なる種類のセンサー、非−細胞ベース及び／又は細胞−ベースからなり得る。センサー基板はチャンバの底部に添付されることが可能であり、或いは基板は単にチャンバの底部に配置されることが可能である。代案として、チャンバの底部それ自身もまたセンサー基板としての機能を果たすことが可能であり、一つ以上の検出素子は当技術分野においてありきたりな方法を用いて底部に安定的に付随させることが可能である。一態様において、検出素子は基板上又はセンサーチャンバの底部上の周知の位置にて付随させる。
【００１６】
しかしながら、チャンバ内部に配置された対象物はセンサーである必要はない。例えば、対象物はコロイド粒子、ビーズ、ナノチューブ、非−検出分子、シリコンウェハ又は他の小さな成分でありえる。
【００１７】
本発明はまた、基板からなるシステムを提供し、これは細胞−ベースバイオセンサー、複数のチャネル、少なくとも一つの細胞貯蔵チャンバ及び少なくとも一つの細胞処理チャンバを受ける少なくとも一つのチャンバからなる。望ましくは、チャネルの各々は、チャンバ中に流体流を配送するための出口からなり、細胞処理チャンバは細胞処理チャンバ内部に設置された細胞へ電流を配送するよう適合される。一態様において、細胞処理チャンバは細胞−ベースバイオセンサーを受けるためのセンサーチャンバへ細胞を配送する出口を有するチャネルから更になる。本システムは、電気穿孔及び／又は電気溶解（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｅ）した、及び／又はさもなければ細胞処理チャンバ内部にて処理された細胞の周囲の溶液環境を迅速且つプログラム可能に変化させるために使用され得る。代案として又は追加として、センサーチャンバも処理チャンバとして使用されることが可能であり、一態様において、センサーチャンバは連続的に又は断続的にセンサーを電界に露呈するための一つ以上の電極と電気的に連通する。
【００１８】
一態様において、本発明によるシステムはチャネルの出口に対するセンサーの位置を走査するための走査メカニズムから更になる。走査メカニズムは、固定されたセンサーに対して基板を平行移動することができ、或いは固定された基板に対してセンサーを平行移動することができ、或いは速度及び方向を互いに関連させて変化させることでセンサー及び基板の両者を移動させることができる。一態様において、センサーは、位置決め装置（例えば、マイクロ位置決め装置又はナノ位置決め装置又はマイクロ遠隔操縦装置）に連結するセンサー（例えばピペット又はキャピラリ）を保持するためのメカニズムを用いて、出口に対して位置決めされる。このように、位置決め装置はセンサーを保持するためのメカニズムを移動させることによってチャネルの出口を出る複数の流体流を横切ってセンサーを移動させるために用いることができる。代案として又は追加として、走査はまた、隣接したマイクロチャネルの全体にわたって連続的に圧力低下を生じさせることによって調整されることが可能である。
【００１９】
望ましくは、走査メカニズムは処理装置と連通し、処理装置からの指示（例えばプログラム指示又はフィードバック信号の結果として生じた指示）に応答して平行移動が起こる。一態様において、処理装置は、走査の速度、走査の方向、走査の加速度及び走査の回数の一つ以上を制御する。このように、本システムは、特定の（例えば、プログラム可能な）時間の長さの間に使用者により選択され又はシステムにより選択された配置へチャンバ中のナノスケール又はミクロスケールの対象物を移動させるために使用され得る。望ましくは、本システム処理装置はまたチャンバ中の一つ以上の対象物の位置を設置するために使用されることが可能であり、例えば、システム検知器によって検知された事前の走査アクションに応答し及び／又は対象物からの光学的信号に応答する。一態様において、本システムは使用者と相互作用するグラフィカルユーザー表示からなる処理装置に連通するユーザー装置から更になる。例えば、表示はチャンバ内部の対象物の座標や、光学データや、チャンバから得られるその他のデータを表示するために使用される。
【００２０】
本発明は加えて、受容体又はイオンチャネルからなる細胞−ベースバイオセンサーを受けるチャンバからなる基板を提供する。一態様において、本システムは基板の交互にかみ合ったチャネルを通過させ受容体／イオンチャネルと結合している一つ以上のリガンドに短時間、及びリガンドを含有しない緩衝液に短時間細胞−ベースバイオセンサーを連続的に露呈する。例えば、これら異なる溶液条件への短時間の細胞バイオセンサーの選択的な露呈は、一つ以上のリガンド及び緩衝液の配送を交互に行う交互にかみ合ったチャネルを横切る細胞−ベースバイオセンサーを走査することによって達成され得る。各々のマイクロ流体チャネルにおける緩衝液及びサンプル溶液の流れは望ましくは等速の定常状態流である。
【００２１】
しかしながら、別の態様において、本システムは細胞−ベースバイオセンサー又は他の種類のセンサーと流体が流れる出口との両者に近接して位置決めされた過融解キャピラリを通過して受容体へ緩衝液の脈動（例えば脈打つオン／オフ流）を配送する。例えば、本システムは、キャピラリからセンサーへ緩衝液を配送するためのセンサーを保持するためのメカニズムに十分に近接した出口からなるキャピラリ及び出口に近接するｃセンサーを位置決めするための位置決め装置（例えば、マイクロ位置決め装置、ナノ位置決め装置、マイクロ遠隔操縦装置等）に連結されたセンサーを保持するためのメカニズムからなり得る。走査メカニズムはキャピラリ及びセンサーの両者を同時に移動させるために用いることができ、センサーに対するキャピラリの適切な近接を維持する。キャピラリはまたセンサーに緩衝液の脈打つ配送を提供するためのポンピングメカニズムに連結されることができる。別の態様において、一つ以上のセンサーに近接した一つ以上の過融解キャピラリからの緩衝液の流速は、チャネルからの流体の流速より速い或いは遅い可能性がある。
【００２２】
本発明は円筒形の壁及び底からなるセンサーを受けるための循環チャンバからなる基板を更に提供する。一態様において、基板は出口からなる複数のチャネルからなり、その開口部はチャンバの壁の円周に放射状に配置され（例えば、スポーク−ホイール配置）、チャンバ中へサンプルを配送する。望ましくは、基板はまたチャンバから廃棄物を排出するための少なくとも一つの出力チャネルからなる。一態様において、少なくとも一つの追加のチャネルはチャンバへ緩衝液を配送する。望ましくは、緩衝液を配送するための少なくとも一つの追加のチャネル及び出力チャネルの間の角度は、１０°より大きい。より好ましくは、角度は９０°より大きい。チャネル「スポーク」は全て同じ平面にあってよく、或いはスポークのうちの少なくとも二つが異なる平面にあってよい。
【００２３】
チャンバ中の水溶液の迅速且つプログラムされた交換はチャンバ中に配置されたセンサーの周囲の溶液環境を変化させるために使用され、多様な出力チャネルはこの配置にて提供され得る。例えば、サンプル／緩衝液を配送するためのチャネル各々の出力チャネルがあってよい。配達するためのチャネルの数も、例えば、基板が業界標準マイクロタイタープレートと相互作用するのに好適になるように変化させることができる。例えば、サンプルを配送するため９６乃至１０２４のチャネルであってよい。別の態様において、（例えば、互いにかみ合ったサンプル及び緩衝液の流体流を提供するよう）緩衝液を配達するためのチャネルが更に同じ数あってもよい。
【００２４】
本発明はまたセンサーの周囲の溶液環境を変化させる多層基板を提供し、これはセンサーへ流体を配送するためのチャネルからなる第１基板；第１基板に近接した一つ以上のセンサーを保持するフィルター層；及びフィルター層から流体を受けるための廃棄物槽からなる第２基板からなる。一つ以上のセンサーは、第一基板及びフィルター層の間に備えられ得る。一態様において、少なくとも一つのセンサーは細胞である。望ましくは、本システムは第１及び第２の基板の間に圧力差を引き起こすためのメカニズムから更になり、第一基板中のチャネルからのフィルターを通過させたそして廃棄物槽中への流体の流れを押し進め、すなわちフィルター（すなわち、センサー）層を通過させた迅速な流体交換を提供する。
【００２５】
本発明は、加えて、センサーを受けるチャンバ、チャンバと交差する出口からなる第一チャネル、及び第一チャネルと交差する複数のサンプル配送チャネルからなる基板を提供する。第１チャネルはまた、（例えば、接続チャネルを通過して）緩衝液槽に連結される。一態様において、サンプル配送チャネルの縦軸は互いに平行であるが、第１のチャネルの縦軸に対して曲げられる（例えば、「魚の骨」型を提供する）。第１のチャネル及び／又はサンプルチャネルを通過する溶液の迅速な流れは、緩衝液槽及び／又はサンプルチャネルと連通する陽圧メカニズムを通じて達成され得る。受動的一方通行弁がサンプル配送チャネル及び第１チャネルの間の継目に備えられ得、流速を更に調整する。
一態様において、サンプル槽の少なくとも一つは、ニードル又はチューブをその中にからなり得る隔壁によって密封される。
【００２６】
本発明は、センサーを受けるチャンバ、サンプル又は緩衝液をチャンバ中へ供給する出口からなる複数の配送チャネル、及び配送チャネルの出口の反対側の入り口からなる複数の排出チャネルからなる基板を更に提供する。送達チャネルの縦軸は、排出チャネルの縦軸と同じ又は異なる平面にあることが可能である。一態様において、複数の排出チャネルは複数の入口チャネルの上にある（すなわち、基板は三次元である）。
【００２７】
上記したシステムの何れもが、基板の少なくとも一つのマイクロチャネルにて加えられる陽圧及び陰圧を制御するための圧力制御装置から更になり得る。システムにおいて、基板が出力チャネルのみならず配送チャネル両者からなる場合、本システムは望ましくは少なくとも一つの配送チャネルへ陽圧を加え、その上少なくとも一つの出力チャネルへ陰圧を加えるメカニズムから更になる。望ましくは、チャネルの少なくとも一つの静水圧は、処理装置によって受けるフィードバック信号に応答して変化し得る。
【００２８】
本システムは、チャネルを通過して、流体流がチャンバから引き抜かれる時、このように調整することが可能である。例えば、規定された期間の後、流体流はそれがシステムに入ったのと同じチャネルを通過して又は別のチャネルを通過して、チャンバから引き抜かれることが可能である。排出チャネルが配送チャネルと隣接するときに、本システムは配送チャネルを通過して配送される化合物を効率的に再循環することが可能なＵ−型流体流を発生させることが可能である。
【００２９】
上記の通り、多数の配送チャネルの配置は直線、曲がった、分岐、魚−骨型等に規定され得る。一態様において、配送チャネルは各々一つ以上の交差チャネルからなり、その縦軸は配送チャネルの縦軸に垂直である。別の態様において、配送チャネルは各々一つ以上の交差チャネルからなり、その縦軸は配送チャネルに対してある角度をなしている。
【００３０】
一般に、上記したチャネル配置の何れも、（例えば、容器を槽／入口と連結しているキャピラリ又はチュービングを通過して）槽又はサンプル入口にサンプルを配送する容器に相互作用可能である。一態様において、少なくとも一つのチャネルは分岐しており、多数の入口からなりている。望ましくは、多数の入口は単一の容器と相互作用する。しかし、多数の入口はまた異なるいくつかのコンテナと相互作用してもよい。
【００３１】
更に、上記した基板の何れも、一つ以上の外部チュービング又はキャピラリを介してマルチ−ウェルプレート（例えばマイクロタイタープレート）と相互作用し得る。一つ以上のチュービング又はキャピラリは一つ以上の外部弁からなり得、チュービング又はキャピラリを通過した流体流れを制御する。一態様において、マルチ−ウェルプレートの複数のウェルは既知の溶液からなる。本システムはまた複数のマイクロタイタープレートと相互作用し得；例えば、プレートは順に重ねて積層され得る。望ましくは、本システムはマイクロタイタープレート又はその他の好適な容器のウェルから基板の槽中へ流体をポンピングするマイクロポンプから更になる。より好ましくは、本システムは槽を通過した基板の選択されたチャネルへ流体をプログラム可能に配送する。
【００３２】
一態様において、本発明によるシステムは、センサー応答を検知するセンサーチャンバと連通した検知器から更になる。例えば、検知器は：センサーの電気的、光学的、又は化学的性質の一つ以上の変化を検知するために使用され得る。一態様において、検知器からの信号に応答して、処理装置は：走査の速度、走査の方向、走査の加速度、走査の回数及び一つ以上のチャネルの圧力の一つ以上を変化させる。
【００３３】
本発明はまた、ナノスケール又はミクロスケールの対象物（例えば、センサーのような）の周囲の局所的な水溶液環境を変化させる方法を提供する。本方法は、ナノスケール又はミクロスケールの対象物及び水流からなる開口容積チャンバからなる基板を提供することからなる。基板は複数のチャネルから更になり、チャネルは各々開口容積チャンバと交差する出口からなる。流体の実質的に別個な水流は開口容積チャンバ中へ配送され、これらのうちの少なくとも二つは異なる流体からなる。
【００３４】
望ましくは、少なくとも二つの隣接したチャネルから出る流体流は開口容積内部にて平行であり層状である。しかしながら、本システムは複数組のチャネル（少なくとも二つの隣接したチャネル）からなり得、ここにおいて、少なくとも一つの組は平行で層状の流れを配送し、一方、別の少なくとも一つの組は平行でも層状でもない流れを配送する。一態様において、流れは異なる速度で流れる。流体は、電気泳動法及び／又は電気浸透法及び／又はポンピングを含む、多くの異なる方法によってチャネルからチャンバへ配送され得る。
【００３５】
一態様において、チャネルの縦軸は実質的に平行である。チャネルは、直線配列、二次元配列、又は三次元配列にて配置され得、処理チャンバ、センサーチャンバ、槽及び／又は廃棄チャネルからなり得、上記の通り容器又はマルチウェルプレートと相互作用し得る。一態様において、出力チャネルは入力チャネルの上に重なり得る（すなわち、三次元配置）。望ましくは、少なくとも一つの入力チャネルの縦軸に対して、少なくとも一つの出力又は排出チャネルの縦軸は平行であるが、異なる平面に位置する。陰圧が隣接した出力又は排出チャネルに加えられると同時に、陽圧が入力チャネルに加えられることによって、Ｕ型の流体流がチャンバ内部で生じ得る。このような方法で、入口チャネルからの流体流中の化合物にチャンバ内部の対象物が露呈され得、例えば、これは隣接する出力又は排出チャネルを介してチャンバから引き抜かれることによって再循環され得る。Ｕ型の流体流は、望ましくは、大容量の槽又は開口容積中の特定の組成を有する流体流の局所的に明確な領域を作り出すために使用され得る。
【００３６】
望ましくは、対象物は少なくとも二つの水流体流を横切って連続的に走査され、その結果対象物の周囲の水溶液環境を変化させる。走査は基板及び／又は対象物を移動させることによって実行され得、或いはチャネルへ加えられた圧力降下によって仲介される。
【００３７】
開口容積チャンバは複数の対象物からなり得；望ましくは、対象物の各々が少なくとも二つの流れを横切って走査される。走査は、上記の通りの処理装置によって制御される走査メカニズムによって実行され得る。開口容積は、加えて、溶液の添加及び引き抜きのための入口及び出口を有し得る。例えば、新しい緩衝溶液が臑動ポンプを使用することによって記録チャンバへ添加され得る。
【００３８】
一態様において、本方法は、一つ以上の走査パラメータ、例えば走査の速度、走査の方向、走査の加速度、走査の回数及び一つ以上のチャネル全体にわたる圧力を修正することから更になる。走査パラメータは、例えば一つ以上の水流への対象物の応答に対する信号のようなフィードバック信号に応答して修正され得る。走査はまた他のシステム操作によって調整され得る。例えば、細胞−ベースバイオセンサーからなるシステムにおいて、バイオセンサーは過去の一つ以上のサンプル出口を走査するので、走査はバイオセンサーの電流への露呈によって調整され得、すなわちバイオセンサーの細胞膜中に細孔を形成することを含む。
【００３９】
一つ以上のチャネルの静水圧はまた、プログラムされた指示による及び／又はフィードバック信号に応答する処理装置によって変化され得る。一態様において、複数のチャネルの各々での静水圧は異なる。
【００４０】
別の態様において、少なくとも二つのチャネル中の流体の粘度は異なる。更にもう一つの態様において、少なくとも二つのチャネル内部の流体は異なる温度である。更に別の態様において、少なくとも二つのチャネル内部の流体の浸透性は異なる。更なる態様において、少なくとも二つのチャネル内部の流体のイオン強度は異なる。少なくとも一つのチャネル中の流体はまた有機溶媒からなり得る。これらのパラメータを異なる出口で変化させることによって、センサー反応は検知感度を最大にし、バックグラウンドを最小にするよう最適化され得る。いくつかの態様において、パラメータはまた提供される特定の細胞処理（例えば、電気穿孔又は電気融合など）を最適化するために変化し得る。
【００４１】
本発明はまた、ナノスケール又はミクロスケールの対象物の周囲の溶液環境を迅速に変更する方法を提供し、これはナノスケール又はミクロスケールの対象物からなるセンサーチャンバ中の流体を迅速に交換することからなる。一態様において、チャンバ中の流体交換は約１分未満以内、望ましくは、約３０秒未満、約２０秒未満、約１０秒未満、約５秒未満又は約１秒未満で起こる。別の態様において、流体交換はミリ秒の範囲内で起こる。別の態様において、流体交換はナノ秒の範囲内で起こる。
【００４２】
一態様において、本方法は対象物（これはセンサー又は単一分子であってよい）からなるチャンバを提供することからなり、ここにおいて、チャンバはチャンバ中へ流体を配送する複数の入口チャネルとチャンバからの流体を排出する複数の出口チャネルとからなる。望ましくは、排出チャネルの縦軸は配送チャネルの縦軸に対して角度をなしている。一態様において、少なくとも一つの排出チャネルの縦軸は、配送チャネルの縦軸に対して≧９０°である。望ましくは、角度は約１８０°である。チャンバに入る流体は、所定の期間の後又はフィードバック信号に応答してチャンバから引き抜かれる。入口チャネル及び出力又は排出チャネルを通過する流体の流れの速度を制御することによって、チャンバ中の流体の完全な交換が約３０秒未満で、そして望ましくはミリ秒で起こり得る。
【００４３】
望ましくは、互いに角度をなすチャネルの流体の速度は異なる。一態様において、互いに角度をなすチャネルの流体の静水圧は異なる。別の態様においては、互いに角度をなすチャネルの流体の粘性は異なる。更に別の態様において、互いに角度をなすチャネルの流体の浸透性は異なる。更なる態様において、互いに角度をなすチャネルの流体のイオン強度は異なる。また更なる態様において、互いに角度をなすチャネルは異なる有機溶媒からなる。
【００４４】
チャンバは円形であり得、円筒形の壁及び底部からなり、出口は壁の円周の周囲を放射状に、すなわち、二次元又は三次元のスポーク−ホイール配置に配置され得る。他の配置もまた可能である。例えば、各配送チャネルは交差入口チャネルからなり得、この縦軸は配送チャネルと直角をなす。
【００４５】
本方法は、上記した基板の何れのチャンバ中にも細胞又はその一部分を供給し、条件を作り出す一つ以上の水流に細胞又はその一部を露呈させ、そして細胞又はその一部分の条件に対する応答を検知し及び／又は測定することによって、水性環境における条件に対する細胞又はその一部分の応答を測定するために一般的に使用され得る。例えば、条件は細胞又はその一部が露呈させる化学物質又は化合物であってよく、及び／又は細胞又はその一部が入浴する溶液の浸透圧及び／又はイオン強度及び／又は温度及び／又は粘度であり得る。
【００４６】
上記した基板の何れのセンサーチャンバ中のバルク水溶液の組成も、例えば、センサーチャンバのイオン構成を変化させるか又は溶液に化学物質又は化合物を提供して制御され得る。例えば、センサーチャンバに近接した過融解システムを提供することによって、例えば薬物のような化学物質又は化合物が実験の進行の間にセンサーチャンバへ添加され得る。
【００４７】
一態様において、条件に対する細胞又はその一部の露呈がセンサーチャンバにおいて起こる。しかしながら、代案として又は追加として、条件に対する細胞又はその一部の露呈は一つ以上のチャネルを介してセンサーチャンバに連結するマイクロチャンバにおいて起こり得る。細胞の周囲の条件を変化させることによって誘導される応答を測定するために、細胞又はその一部はセンサーチャンバへ移送され得る。
【００４８】
一態様において、本発明はまた、アンタゴニストの検知又は選別のために、活性化した受容体又はイオンチャネルを生じさせる方法を提供する。本方法は、（例えば、上記した基板の何れかを用いて）センサーチャンバ中へ供給する複数のマイクロチャネルを通過させてセンサーチャンバ中の細胞−ベースバイオセンサーへアゴニストの一定の流れを配送することからなる。望ましくは、細胞−ベースバイオセンサーは受容体／イオンチャネル複合体を発現し、これは脱過敏化されない或いは非常にゆっくり脱過敏化する。アゴニストに対するバイオセンサーの露呈は測定可能な応答を生じさせ、その結果受容体はアゴニストを配送するマイクロチャネルを通過するたびに活性化される。望ましくは、細胞−ベースバイオセンサーがこれらのマイクロチャネルを通り過ぎる時、多数のアゴニスト配送マイクロチャネルはまた、その存在が測定可能な応答（例えば、アンタゴニズム）の減少と相関し得るアンタゴニストからなる。一態様において、多数のマイクロチャネルは同量のアゴニストからなるが、異なる濃度のアンタゴニストからなる。測定可能な応答の抑制は、このようにアンタゴニストの特定の用量の存在と相関し得る。別の態様において、複数のマイクロチャネルは同量のアゴニストからなるが、一つ以上そして望ましくは全ての多数のマイクロチャネルは異なる種類のアンタゴニストからなる。このような方法で、特定のタイプのアンタゴニスト（又はアンタゴニストであることを疑われる化合物）の活性は、監視され得る。
【００４９】
一態様において、周期的に再過敏化された受容体は細胞-ベースバイオセンサーへ緩衝液の脈動を配送するために上記の過融解システムを使用することが提供され、その結果、受容体がアゴニスト又は受容体変調成分を含む次のチャネル出口に露呈させる前に、如何なる結合したアゴニスト又は受容体を脱過敏化する変調成分を除去する。アンタゴニストの検知において、脈動された過融解システムはまた、絶え間なく加えられるアゴニストを周期的に除去し得る。脱過敏化されたバイオセンサーがアゴニストに露呈させるときに、過渡的ピーク応答（これは定常応答に脱過敏化される）が生じる。このピーク応答の生成は、アンタゴニストの検知のより良い信号対ノイズ比を提供し得る。
【００５０】
別の態様において、細胞−ベースバイオセンサー中のイオン−チャネルは、細胞−膜全体にわたって電位を変えることによって連続的に活性化されるか又は周期的に活性化される。これは、電圧-依存イオン−チャネルを調整する薬物又は化合物の検知のためのセンサーを提供する。
【００５１】
本システム又は方法によって測定される応答は、使用するセンサーの種類によって変化する。細胞−ベースバイオセンサーが使用されるとき、アゴニスト−、アンタゴニスト−又はモジュレータ−によって誘導された以下のパラメータ又は細胞特性：細胞表面積、細胞膜伸縮、イオン−チャネル浸透性、細胞からの内部小胞の開放、細胞膜からの小胞の回復、細胞内カルシウムの度合い、イオン-チャネルで誘導された電気的性質（例えば、電流、電圧、膜容量等）光学的性質又は生存度の変化が測定され得る。
【００５２】
一つの方法では、センサーは少なくとも一つのパッチ−クランプされた細胞からなる。例えば、本方法は本システムを従来のパッチクランプ設備と結合することによって実行され得る。従って、細胞又は細胞膜画分は、例えばマイクロ位置決め装置又はナノ位置決め装置のような位置決め装置に接続しているパッチクランプピペットを使用してチャネル出口に対して適切に位置決めされ得る。
【００５３】
代案として、パッチ−クランプされた細胞又はパッチ−クランプされた細胞膜画分は、一つ以上の電極（例えば、パッチクランプチップを提供する）と連通するチャンバの底部中のくぼみに位置決めされ得る。
【００５４】
本発明によるシステム及び方法は、イオンチャネルリガンド及び直接的又は間接的にイオンチャネルに作用する薬物又はリガンドの高処理能力選別を達成するために使用し得る。しかしながら、更に一般的にいえば、本システム及び方法は細胞外、細胞内、又は膜−結合標的の何れかに影響を及ぼす化合物／条件を選別するために使用され得る。従って、本システム及び方法は、例えば、細胞上の薬物の効果を特徴づけるために使用し得る。本発明によるそのような目的のために得られ得るデータの例としては用量反応曲線、ＩＣ５０及びＥＣ５０値、電圧-電流曲線、オン／オフ比率、運動情報、熱力学情報等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５５】
従って、本システムは、例えば、イオンチャネル又は受容体アンタゴニストが競合的又は非-競合的阻害剤であるかどうか特徴づけるために用いる。本発明によるシステム及び方法はまた毒物検査選別のため、例えば化合物の種類又は用量を変化させることに応答して細胞生存度を監視することによって使用され得、又は診断上の選別において使用され得る。本方法はまた、薬物の効果が細胞膜結合外表面受容体又は標的或いは細胞内受容体又は標的を通過する相互作用由来であるかどうか確認するために、例えば電気穿孔を用いて、細胞質中に薬物を吸収するために使用し得る。本発明によるシステムが、対象物が溶液環境の変化から利益を得る如何なる方法においても使用され得、そしてそのような方法は本発明の範囲内からなることは、当業者にとって明らかなはずだ。
【００５６】
本発明の目的及び特徴は以下の詳細な説明及び添付の図面を参照してより一層理解され得る。図は実物大ではない。
【発明の詳細な説明】
【００５７】
本発明は、細胞−ベースバイオセンサーのようなセンサーの周囲の局所的な溶液環境を迅速且つプログラム可能に変化させるシステム及び方法を提供する。本発明は更にマイクロ流体をパッチ−クランプ検知と相互作用させるシステム及び方法を提供する。
【００５８】
定義
以下の定義は、以下の明細書中にて使用される特定の用語のために規定される。
【００５９】
ここにおいて使用されるように、「マイクロチャネル」は二つの壁、一つの底及び少なくとも一つの入口及び少なくとも一つの出口からなる基板中の溝を指している。一態様において、マイクロチャネルはまた天井を有する。用語「マイクロ」は寸法の下限値を意味するものではなく、用語「マイクロチャネル」は一般的に「チャネル」と同義に使用される。望ましくは、マイクロチャネルは約０．１μｍ乃至５００μｍの寸法の範囲であり、より望ましくは１乃至１５０μｍの範囲である。
【００６０】
ここにおいて使用されるように、「位置決め装置」は対象物又は装置（例えば、基板、センサー、細胞、センサーを保持するためのメカニズム等）をそれが連結されるよう移動させることができるメカニズム又は器具を指す。望ましくは、位置決め装置はナノメートル（例えば、位置決め装置がナノ位置決め装置である）マイクロメートル（例えば、位置決め装置がマイクロ位置決め装置である）及び／又はミリメートルのような距離にわたる対象物の移動を制御し得る。好適な位置決め装置は少なくともｘ−、ｙ−又はｚ−方向に移動する。一態様において、本発明による位置決め装置はまた使用者によって規定された如何なる回転軸についても回転する。好ましい態様において、位置決め装置は処理装置と連通した駆動ユニットと連結し、対象物の動きが、プログラムされた指示、ジョイスティック又はその他の同種の器具の使用、或いはそれらの組み合わせを通じて処理装置によって制御され得る。
【００６１】
ここにおいて使用されるように、「センサーを保持するメカニズム」は、メカニズムに対して相対的に静止した位置にセンサーを維持するセンサーの少なくとも位置を受ける装置を指す。一態様において、本メカニズムはセンサーの少なくとも位置を受ける開口部からなる。例えば、そのようなメカニズムとしてはパッチクランプピペット、キャピラリ、中空電極等が上げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
ここにおいて使用されるように、用語「センサーを移動させる」は、センサーを直接的に又はセンサーを保持するメカニズム、これはそれ自身で動かされる、の使用を通して移動させることを指す。
【００６３】
ここにおいて使用されるように、「チャンバ」は、底を取り囲む壁（これは開口部を有していても、或いは有していなくても良い）によって形成された区域を指す。チャンバは（例えば、覆われていない）「開口容積」又は（例えば、カバースリップによって覆われた）「閉口容積」であって良い。「センサーチャンバ」は、一つ以上のセンサー受けるものであり、そして少なくとも二つのマイクロチャネルから一つ以上の壁において出口からなる。しかしながら、本発明によるセンサーチャンバは一般的に一つ以上のナノスケール又はマイクロスケールの対象物を受けることが可能であり、それらの目的に関して限定されることが無い。センサーチャンバは、平行面である必要はない異なる多数の壁からなり得、或いは、（例えば、チャンバが「ディスク−型」の場合）一般的に円筒形の単一の壁からなり得る。センサーチャンバの形状は本発明の態様を限定するということを意図しない。壁及び／又は底の一つ以上は光学的に透過型である。一般的に、センサーチャンバはサイズに幅があるが、少なくとも約１μｍである。一態様において、チャンバの寸法は哺乳類細胞のような少なくとも単一の細胞を受けるのに少なくとも十分に大きい。センサーチャンバはまたマイクロチャネルからなる基板から個別の存在であり得る。例えば、一態様において、センサーチャンバはペトリ皿であり、マイクロチャネルはマイクロチャネル及びペトリ皿の間の流体伝達が可能となるようにペトリ皿中へ開口する基板の表面にまで及ぶ。
【００６４】
ここにおいて使用されるように、「センサー」は、（例えば、一つ以上の分子に結合する化合物の存在のような）分子が露呈させる水性環境中の条件と相互作用する測定可能な応答を生み出すことが可能な一つ以上の分子からなる装置を指す。一態様において、分子は基板に固定化され、一方、別の態様において、分子は細胞の一部である（例えば、センサーは「細胞−ベースバイオセンサー」である）。
【００６５】
ここにおいて使用されるように、「ナノスケール又はマイクロスケールの対象物」は、その寸法がｎｍ乃至ｍｍの範囲である対象物である。
【００６６】
ここにおいて使用されるように、用語「細胞−ベースバイオセンサー」は、無傷の細胞又は無傷の細胞の一部（例えば、膜パッチ）を指し、これは細胞（又はその一部）が設置された水性環境中の条件を走査したときの検知可能な生理学的な応答を提供することが可能である。一態様において、細胞−ベースバイオセンサーは、パッチクランプ電極又は電解質溶液のような導電性素子と電気的に連通する完全な細胞又は細胞膜の一部である。
【００６７】
ここにおいて使用されるように、用語「受容体」は、リガンド分子と具体的に相互作用する巨大分子を指す。受容体は、細胞膜、ゴルジ膜又は核膜のような脂質二重層膜に付随し得、又は細胞の細胞質中に遊離して或いは分子と結合して存在し得、又は基板に固定され得る。受容体からなる細胞−ベースバイオセンサーは、細胞によって普通に発現した受容体からなり得、或いは外からの又は組換え技術によって発現した受容体からなり得る（例えば、トランスフェクトされた細胞や卵母細胞）。
【００６８】
ここにおいて使用されるように、用語「周期的に再過敏化された」又は「周期的に敏感な」は、リガンドからなると疑われ又は知られているサンプルを提供するマイクロチャネル出口を横切って走査されるときの、閉鎖（すなわち、リガンド敏感に）位置に維持したイオン−チャネルを指す。例えば、一態様において、受容体又はイオン−チャネルは、サンプル及び緩衝液の交互にかみ合った流れを提供する複数の互いにかみ合ったチャネルを横切ってそれを走査することによって周期的に再過敏化される。互いにかみ合ったチャネルを横切って受容体／イオンチャネルが走査される速度はそれがサンプルからなる流体流へ露呈させるとき、リガンド−敏感状態に維持されるように使用される。追加として又は代案として、受容体／イオンチャネルは例えば一つ以上の過融解キャピラリを使用して緩衝液の脈動をイオンチャネルへ提供することにより、又はイオンチャネルからなるセンサーチャンバ中の溶液の迅速な交換を提供することにより、周期的に再過敏化された状態に維持される。
【００６９】
ここにおいて使用されるように、「実質的に個別の流体流」は、流体の容積（例えば、チャンバ内部）中を流れる流体を指し、すなわち、容積の内側の流れの外側で、或いは容積の内部の別の流れで流体と物理的に連結するが、これは、流れ又は流体の容積内部の別の流れの外側の流体のかさ特性と平衡しない又は異なる少なくとも一つのかさ特性を有する。ここにおいて使用される「かさ特性」は、水流の流れの方向と垂直に進む、流れの断面を横切る流れ中の構成成分（例えば、薬剤、溶質、物質又は緩衝分子）の特有な性質の平均値を指す。「特性」は例えば構成成分の濃度、温度、ｐＨ、イオン強度又は粘度のような化学的又は物理的特性であり得る。
【００７０】
ここにおいて使用されるように、用語「連通する」は、あるシステムの構成成分又は別のシステムからの入力データを受け、そして入力データに応答して出力応答を提供するシステム又はシステムの構成要素の能力を指す。「出力」はデータの形態であって良く、或いはシステム又はシステムの構成要素によってとられたアクションの形態であっても良い。例えば、「走査メカニズムと連通する」処理装置はプログラム命令を信号の形態で走査メカニズムへ送り、蒸気のような多様な走査パラメータを制御する。「センサーチャンバと連通する検知器」はチャンバに対して光学的に十分に近接した検知器を指し、センサーチャンバからの光信号（例えば、光）を受ける。チャンバと「光学的に連通した光源」はチャンバに十分に近接した光源を指し、チャンバからシステム検知器へ光路を作り出し、その結果チャンバ又はその中の対象物の光学的特性が検知器によって検知され得る。
【００７１】
ここにおいて使用されるように、「測定可能な応答」は、既知の技術にふさわしい制御を使用して検知されたバックグラウンドと著しく異なる応答を指す。
【００７２】
ここにおいて使用されるように、チャンバ又はマイクロチャンバと「交差する」出口は、開口し、チャンバ又はマイクロチャンバの壁又は底部又は頂部中へ或いはチャンバ又はマイクロチャンバによって含有される流体容積中へ供給する出口を指す。
【００７３】
ここにおいて使用されるように、「過融解」は、対象物又はセンサー（例えば、細胞）の外表面を洗浄することを指す。
【００７４】
システム
一態様において、本システムは基板を備えており、これはその上に組立てられた複数のマイクロチャネルからなり、その出口が一つ以上のセンサーからなるセンサーチャンバと交差する又はセンサーチャンバ中へ供給されている。本システムは更に一つ以上のセンサー及び異なるチャネルからの溶液への露呈に対するセンサーの応答を監視する検知器に対するマイクロチャネルの位置をプログラム可能に変化させる走査メカニズムからなる。好ましい態様において、センサーチャンバは電極電気的に連通する細胞−ベースバイオセンサーからなり、検知器は細胞−ベースバイオセンサーの電気的特性における変化を検知する。
【００７５】
本システムは望ましくはまた、走査メカニズム（例えば、機械的又はマイクロチャネル全体にわたるプログラム可能な圧力低下を通した）による走査の速度を制御すること、基板の一つ以上のチャネルを通した流体流を制御すること、流体流を導くために存在する弁及びスイッチの操作を制御すること、検知器によって検知するセンサー応答を記録すること、そしてセンサー応答に関するデータを表示すること：を含むシステム操作を実施する処理装置からなるが、それに限定されない。望ましくは、本システムはまたシステムの操作を表示するため及びシステムのパラメータを変化させるためのグラフィカルインターフェイスからなるシステム処理装置と連通するユーザー装置からなる。
【００７６】
基板
好ましい態様において、本システムはセンサーチャンバ内部に少なくとも一部分含まれる溶液を一つ以上のセンサーへ配送する基板からなる。基板は、更に以下に記載するように、二次元（２Ｄ）又は三次元（３Ｄ）構造として構成され得る。基板は、２Ｄであろうと３Ｄであろうと、一般的に複数のマイクロチャネルからなり、その出口は一つ以上のセンサーを受けるセンサーチャンバと交差している。センサーチャンバの底部は光学的に透明であり得、センサーチャンバ中に設置された一つ以上のセンサーからの光学的データが収集可能である。センサーチャンバの頂部が例えばカバースリップ又は覆い基板（ｏｖｅｒｌｙｉｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）によって覆われている場合、チャンバの頂部は望ましくは光学的に透明である。
【００７７】
マイクロチャネル各々は（例えば、サンプル又は緩衝液を受けるための）少なくとも一つの入口からなっている。望ましくは、入口は槽（例えば、図２Ａ及びＢ中に円として示されている）からの溶液を受け、基板の形状及び配置を業界−基準のマイクロタイタープレート中のウェルの形状及び配置に一致させている。基板はシステムの取り外し可能な構成成分であり、従って、一態様において、本発明はシステム中にて利用するための一つ以上の基板からなるキットを提供し、異なるチャネル形状から選択する選択肢をユーザーに与えている。
【００７８】
異なる基板材料の限定されない例としては、透明な半導体材料（例えば、シリコン、窒化ケイ素、Ｇｅ、ＧａＡｓ）、金属（例えば、Ａｌ、Ｎｉ）、ガラス、石英、透明な絶縁体、セラミック、プラスチック又はエラストマー材料（例えば、シリコン、ＥＰＤＭ及びホスタフロン）、その他の重合体（例えば、テフロン（登録商標）、ポリメチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアリーレート、ポリアリールスルホン、ポリカプロラクトン、ポリエステルカルボネート、ポリイミド、ポリケトン、ポリフェニルスルホン、ポリフタルアミド、ポリスルホン、ポリアミド、ポリエステル、エポキシポリマー、サーモプラスチック等のフッ素重合体）その他の有機及び非有機的な材料及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００７９】
マイクロチャネルは当技術分野においてありきたりな方法を用いてこれらの材料から組立てられ得る。チャネル幅は、更に以下に記載するように用途に依存して変化され得、一般的に約０．１μｍ乃至約１０ｍｍの範囲であり、望ましくは約１μｍ乃至約１５０μｍであり、一方、センサーチャンバの寸法はチャンバ中へ流れ込むチャネル出口の配置に依存して一般的に変化される。例えば、出口が実質的に互いに平衡である場合（例えば、図２Ａ−Ｃ中のように）、チャンバの縦軸の長さは少なくともチャンバ中へ流れ込む出口の幅の合計である。一態様において、細胞全体のバイオセンサーがセンサーチャンバ中のセンサーとして使用される場合、マイクロチャネルの出口の一つ以上の幅は細胞の少なくとも約直径である。
【００８０】
一態様において、ガラスのような光学的に透明な原料のカバー層は当技術分野においてありきたりな方法を用いて基板と結合され得、従来のマイクロピペット−ベースパッチクランプ検知システムと相互作用する場合、望ましくは槽又はセンサーチャンバ上の開口部を残しておく。望ましくは、センサーチャンバの底部もまた光学的に透明であり、センサーからの光学的なデータの収集を容易にする。
【００８１】
センサー
細胞−ベースバイオセンサー
本システムは細胞−ベースバイオセンサーに連結して使用され得、多様な細胞の応答が監視される。バイオセンサーは細胞全体又はその一部（例えば、細胞膜パッチ）からなり得、これは、ピペット、キャピラリ、又はマイクロ位置決め装置、ナノ位置決め装置或いはマイクロ遠隔操縦装置のようなマイクロ位置決め装置に接続されたカラム、又は光学ピンセットのような（固定された又は可動の）センサーを保持するためのメカニズムを使用したセンサーチャンバ中に位置決めされ、或いは流れや表面張力を制御することにより、その結果、細胞−ベースバイオセンサーをチャンバ中の溶液へ露呈させる。バイオセンサーは基板の多様なチャネルを横切って基板を移動させることにより、すなわち、バイオセンサーに対するチャネルの位置を変えるか、又は細胞を移動させることにより（例えば、マイクロ位置決め装置を走査することにより、又は流れ及び／表面張力を変化させることにより）、走査され得る。
【００８２】
一態様において、細胞−ベースバイオセンサーはイオンチャネルからなり、本システムはイオンチャネル活性を監視するために使用される。好適なイオンチャネルとしては、電圧、リガンド、内在カルシウム、別の蛋白質、膜伸縮（例えば、側方（ｌａｔｅｒａｌ）膜伸縮）及びリン酸化反応（ヒルＢ．，興奮性膜のイオンチャネル１９９２，Ｓｉｎａｕｅｒ，サンダーランド、マサチューセッツ、ＵＳＡの記載を参照）により開閉するイオンチャネルが挙げられる。別の態様において、イオン−開閉チャネルは電圧−開閉チャネルである。電圧−開閉チャネルは閾値膜貫通型電圧に応答して開く。電圧−開閉ナトリウム、カリウム及びカルシウムチャネルは全て軸索を遠ざかる活動電位（又は神経パルス）を他の神経細胞（又は神経単位）へ伝えるために必須である。これらのイオンチャネルは典型的には、リジン／アラニンの豊富なＳ４共通配列を備えた膜貫通型配列からなりている。Ｓ４配列内部の陽性アミノ酸は、異なる電圧条件の下開口又は閉鎖の何れかをする配列を含むイオンチャネルによって、細胞膜をわたる電圧を検知すると思われる。
【００８３】
別の態様において、細胞−ベースバイオセンサーのイオンチャネルはリガンド−開閉チャネルである。リガンド−開閉チャネルはリガンド結合に関して開閉（開閉）する。二つのタイプのリガンド−開閉チャネルが存在し、これらは細胞内リガンドによって束縛されるとき開閉するものと、細胞外リガンドによって開閉するものである。細胞の外側からのリガンドによって開閉するイオンチャネルは化学的シナプス伝達において非常に重要である。これらの種類のイオンチャネルは神経伝達物質によって開閉され、これは二つの神経細胞の間に信号を実際に運ぶ低分子である。細胞の内部から開閉するイオンチャネルは一般的に第二伝達物質によって制御される、これは細胞内部の小さな信号物質である。細胞内、カルシウムイオン、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰが第二伝達物質の例である。最も一般的なカルシウム−開閉チャネルはカルシウム−開閉カリウムチャネルである。このイオンチャネルは、正のフィードバック環境におかれる場合、膜電圧における変化にて振動運動（例えば、耳の中の有毛細胞の周波数同調）を生じ得る。
【００８４】
更に別の態様において、イオンチャネルは他の蛋白質によって開閉される。いくらかのシグナル伝達蛋白質がイオンチャネルを直接開閉することが見出されている。この一つの例が、Ｇ蛋白質のベータ−ガンマサブユニットによって開閉されるカリウムチャネルであり、これはいくらかの膜受容体によって活性化された一般的なシグナル伝達蛋白質である。
【００８５】
更なる態様において、イオンチャネルはリン酸化反応によって開閉される。リン酸化反応は蛋白質キナーゼ（例えば、セリン、スレオニン又はチロシンキナーゼ）によって仲立ちされ得る。
【００８６】
また更なる態様において、細胞−ベースバイオセンサーは機械形質導入（ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）チャネルからなり、これはメカニカルトリガーによって直接開閉され得る。例えば、細胞−ベースバイオセンサーは、内耳有毛細胞のカチオンチャネルからなり得、これは音のような機械的振動によって直接的に開閉する。特定の方向への毛束の屈折はチャネル開閉の確立に影響を与え、その結果脱分極受容体電流の振幅に影響を与える。
【００８７】
別の態様において、細胞−ベースバイオセンサーは受容体、望ましくは、信号伝達経路に関与する受容からなる。例えば、細胞−ベースバイオセンサーはＧ蛋白質連結受容体すなわちＧＰＣＲ、グルタミン酸受容体、代謝調節型受容体、造血性受容体又はチロシンキナーゼ受容体からなり得る。バイオセンサー発現組み換え型受容体はまた、病気の進行を阻害又は調節し得る薬物に対して敏感であるように設計され得る。
【００８８】
バイオセンサーからなる好適な細胞としては、神経単位；リンパ球；マクロファージ；小グリア細胞；心臓細胞；肝細胞；平滑筋細胞；及び骨格筋細胞が挙げられるがこれらに限定されない。一態様において、哺乳類細胞が使用される；これらとしてはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞；ＮＩＨ−３Ｔ３，及びＨＥＫ−２９３細胞のような培養細胞が挙げられ得、そして組み換え型分子（例えば、組み換え型受容体及び／又はイオンチャネル）を発現し得る。しかしながら、細菌細胞（大腸菌、バチルスｓｐ．、黄色ブドウ球菌等）、原生生物細胞、イースト菌細胞、植物細胞、昆虫及び他の無脊椎動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、及び、卵母細胞もまた、これらは組み換え型分子の発明に非常にこうてきであるので、使用され得る。細胞は一般的に当技術分野において知られているような細胞培養技術を用いて細胞培養株から又は精製のひとつ以上の一連の精製（例えば、フローサイトメトリー、パンニング、磁気的選別等）の後解剖した組織から調製されている。
【００８９】
非−細胞性センサー
一態様において、センサーは検出素子、望ましくは細胞標的（例えば、細胞内受容体、酵素、シグナル伝達蛋白質、細胞外蛋白質、膜蛋白質、核酸、脂質分子等）である分子からなり、これは基板に固定されている。基板はセンサーチャンバの底部それ自身であり得、又はチャンバの底部に設置された基板であり得、チャンバ中に安定的に位置決めされた基板であり得（例えば、マイクロ位置決め装置を介して）、そしてこれは可動又は固定されている。
【００９０】
センサーは、固体基板；基板に結合する一つ以上の付着層、及び一つ以上のチャネル出口からセンサーチャンバ中へ導入される化合物を検出するための検出分子の如何なる組み合わせが挙げられ得る一つ以上の層で構成され得る。本発明による好適なセンサーとしては、免疫センサー、親和センサー及びリガンド結合センサーが挙げられるがこれらに限定されず、これらの各々は、特定の質量変化、電気化学的反応、又は光信号の発生（例えば、検出分子の蛍光性又は光学スペクトルの変化）のような測定可能な応答を発生することによって結合相手の存在に応答し得る。そのようなセンサーは米国特許第６，３３１，２４４号明細書中に記載されており、例えば、その内容はここに参照として組み込まれる。
【００９１】
一態様において、センサーはマイクロ電極からなり、これは電子を運ぶ分子で修飾されている。マイクロチャネルの一つからの水流中の一つ以上の化合物との接触により引き起こされた化学的反応に応答して、分子は電極表面にて電気的特性に変化を生じさせる。例えば、分子は電子−輸送酵素、又は相互作用する分子の還元又は酸化によって信号を変換する分子からなり得る(例えば、グレッグ等，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９５：５９７０−５９７５，１９９１；ヘレル，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３（５）：１２８−１３４，１９９０；Ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．
ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ．５５６；ウサミ，Ａ  Ｍ，Ａｋｍａｌ，Ｎ；ｅｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ；ワシントン，Ｄ．Ｃ．；ｐｐ．４７−７０，１９９４；米国特許第５，２６２，０３５号明細書の記載を参照)。酵素反応はまた電界−効果−トランジスタ（ＦＥＴｓ）又はイオン−感応電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴｓ）を用いて達成され得る。
【００９２】
別の態様において、センサーは電子部品に連通した石英チップのような固体基板に固定化した検出分子からなる。電子部品は、センサーチャンバへ送られる一つ以上の化合物と検出素子との間の相互作用の測定として、電圧、電流、光、音、温度又は質量のうちの如何なるものにおける変化を測定するため選択され得る(ホール，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０（４）：３５７−６２，１９８８；米国特許第４，７２１，６７７号明細書；米国特許第４，６８０，２６８号明細書；米国特許第４，６１４，７１４号明細書；米国特許第６，８７９，１１号明細書の記載を参照)。例えば、一態様において、センサーは音波バイオセンサー又は水晶微量天秤からなり、これにはセンサー素子が結合している。この実施の形態において、本システムは、マイクロチャネルからセンサー素子へ配送された水流中の化合物の結合についてのセンサーの共鳴特性における変化を検知する。
【００９３】
別の態様において、センサーは光学的バイオセンサーからなる。光学的バイオセンサーは表面プラズモン共鳴、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）、臨界角屈折率測定、偏光角顕微鏡検査、導光板ライトモード分光分析法（ＯＷＬＳ）、表面電荷測定、及び一過性波偏光解析法及び当技術分野において知られた方法（例えば、米国特許第５，３１３，２６４；欧州特許出願公開第００６７９２１号明細書；欧州特許出願公開第０２７８５７７号明細書；Ｋｒｏｎｉｃｋ等,１９７５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．８：２３５−２４０）のような検知原理に依存し得る。
【００９４】
例えば、一過性波偏光解析法を採用したセンサーに関して、検出分子への化合物の結合に関する光学的応答が反射による楕円偏光の偏光の状態における変化として測定される。偏光の状態は検出表面（例えば、検出素子からなる基板）にて結合したサンプルの屈折率、厚さ及び表面濃度に関係する。ＴＩＲＦにおいて、先天的な蛍光性又は蛍光−標識されたサンプル分子の何れかから放射される放射線の強度及び波長が測定される。一過性の波動励起散乱光技術は、（結合した化合物を伴う又は伴わない）検出分子と光との相互作用によってセンサー表面に散乱された放射線の強度を測定することに依存する。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、薄金属膜基板へ近接したセンサー分子の層の屈折率の変化を測定する（例えば、Ｌｉｅｄｂｅｒｇ等，１９８３，センサー及び差動装置４：２９９；英国特許第２１９７０６８号明細書参照）。これらの検出計画の各々が本発明による有効なセンサーを提供するために使用され得る。
【００９５】
更に別の態様において、センサーは蛍光性半導体ナノ結晶又は量子ドット粒子に付随する検出素子からなる。量子ドット（商標）粒子はその組成及び粒子寸法に関係して特有の分光放射を有している。検出素子への化合物の結合は、量子ドット粒子の（例えば、分光的な）放出を監視することによって検知され得る（例えば、米国特許第６，３０６，６１０号明細書参照）。
【００９６】
センサーは更にポリマー−ベースバイオセンサーからなり、これの物理的特性は、化合物がポリマー上の検出素子へ結合すると、変化する。例えば、結合は（膨張又は収縮のような）容積の変化、（電圧又は電流又は共鳴の変化のような）電気的特性の変化或いは（伝達効率の変調又はけ移行強度の変化のような）光学的特性として明かにされ得る。
【００９７】
様々な異なる種類のセンサーが本発明において用いるのに適している可能性があることは当業者にとって明白なはずであり、そして上記の例では限定されないことを意図している。
【００９８】
概して、一つ以上のセンサーの測定出力は、検出装置及び／又はシステム処理装置と電気的に連通した制御及び評価装置に接続している。制御及び評価装置はセンサーの基板及び／又は検出チャンバの底部と一体化し得る。制御及び評価装置はマイクロプロセッサ、マルチプレクサ、１０ユニット等のような多様な電子部品からなり得る（例えば、米国特許第６，２８０，５８６号明細書の記載参照）。
【００９９】
マイクロ流体
好ましい態様において、本発明による基板はサンプル及び／又は緩衝液のセンサーチャンバへのマイクロ流体輸送に適している。
【０１００】
マイクロ流体構造のウェルプレートとの相互作用
サンプル−ウェルプレート(例えば、９６−ウェルプレートのような業界標準マイクロタイタープレート)中に収容されたサンプル（すなわち、薬物等）は、望ましくは、当技術分野において知られているようなロボットを利用して自動化した配列ピペットを用いて操作され移送される（例えば、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ,ＣＡ製の、Ｂｅｃｋｍａｎ’ｓ  Ｂｉｏｍｅｋ１０００＆２０００自動化ワークステーション参照）。
【０１０１】
ウェルプレート中のサンプルを配列するために使用される同じサンプルの移動式足場を利用するために、ある重要な設計パラメータとしては上記のチップ中の槽の配列がそのような配列ピペットで使用する時に相性の良いことを確実にすることである。例えば、望ましくは、マイクロ流体チップ中の槽は、槽の各々の間の中心から中心までの（ｃｅｎｔｅｒ−ｔｏ−ｃｅｎｔｅｒ）間隔が、チップが相互作用するウェルプレートのウェルの各々の間の中心から中心までの間隔と同一であるように配置される。望ましくは、槽の各々は、配列ピペットからの流体の流れを著しく邪魔することのないように、配列ピペットからの流体流を受けるのに好適な直径を有している。
【０１０２】
配列ピペットに加えて、ロボットを利用した連続ピペットのような、チップ上のウェルプレートからサンプルを移送するための別の好適な自動化された装置も存在する。これらの別の装置の使用はチップ上の槽及びマイクロチャネルのより柔軟な配置を許容し得、チャネルパラメータの設計においてより高い柔軟性が提供される。９６−ウェル配列ピペットの間の相互作用に好適な基板はこれらのピペットの広範囲に及ぶ使用のせいで以下により詳細に記載されているが、チップの一般的な設計及び槽の配置は、あらゆる記載されたサンプル移動式足場との相互作用のために修正され得るということは、そのような足場も発展するので、当業者にとって明らかなはずだ。一般的に、９６−ウェルプレートへの言及はそれに限定することを意図していない。
【０１０３】
図２Ａ及び２Ｂは本発明によるマイクロ流体チップの例を示しており、これは９６−ウェルプレートに相互作用することに適している。図２Ａは緩衝液の槽が必要とされない槽の配置を図示している。図２Ｂは緩衝液及びサンプルの交互にかみ合った（すなわち、互いにかみ合った）流れがセンサーへ供給される用途のための槽の配置を図示している。この配置において、リガンドと緩衝液の槽の両者の中心から中心までの間隔が９６−ウェルプレートのウェルの中心から中心までの間隔と同一である。チップ上の槽の数が２倍になったことを相殺するために、全ての槽の直径は半分に減らす。
【０１０４】
図３は如何に単純に溶液が、従来のロボットを利用して自動化した配列ピペットを用いて本発明の一態様によるチップ上の槽中へ９６−ウェルプレートのウェルから移送され得るかを図示している。リガンド及び緩衝液の互いにかみ合う槽を備えたマイクロチップに関して（例えば、図２Ｂに示すように）、緩衝溶液は、一つのみの緩衝液が必要である場合水槽から、或いは同じ又は異なる緩衝液を収容したウェルを備えた９６−ウェルプレートから移送され得る。
【０１０５】
サンプル及び／又は緩衝液（例えば、ウェルプレート）の源と相互作用するために必要な槽に加えて、細胞又は興味のある別のサンプルを貯蔵し移送するためのチップ上に設置された更なる槽があっても良い。図２Ｃは、本発明の一態様による、チップのセンサーチャンバ又は槽中へ細胞を貯蔵及び移送する更なる槽及びマイクロチャネルの可能な配置を図示している。
【０１０６】
細胞は細胞のチップ上の操作を達成することに適していることが可能である。一態様において、チップは、電気穿孔、エレクトロインジェクション及び／又は電気融合のうちの一つ以上を達成するために一つ以上の細胞処理チャンバを備えている。化学物質及び／又は分子は、電流の電源と電気的に連通するチャンバ内部の細胞中へ導入され得る。例えば、一つ以上の電極がチャンバと近接して設置され得、又はチャンバは、例えば国際公開第９９／２４１１０号パンフレットに記載されているような電極／キャピラリ配列から電流が発信され得る電解質溶液を受けるよう形状が定められていることが可能であり、その公報の中身はここに参照として組み込まれる。
【０１０７】
細胞処理チャンバ中の細胞中へ導入され得る好適な分子としては、核酸（遺伝子、フラグメント、ｃＤＮＡ、アンチセンス分子、リボゾーム及びアプタマー）；抗体；蛋白質；ポリペプチド；ペプチド；アナログ；薬物；及びそれらの修飾されたものが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、本システム処理装置は一つ以上の細胞処理チャンバへの（例えば、上記したようなキャピラリ配列を経由した）分子の配送及び条件のインキュベーション（例えば、時間、温度等）の両者を制御する。例えば、細胞は所望の生物学的活性、例えばｍＲＮＡ及び／又は蛋白質の転写；核酸又は蛋白質の化学標識；核酸又は蛋白質の修飾又はプロセシング；経路又は毒素の不活性化；及び／又は表現型の発現（例えば、形態の変更）が明確に示されるまで好適な期間インキュベートされ得る。
【０１０８】
処理された細胞はセンサーチャンバ中のセンサーへ興味のある分子を配送するために使用され得、例えば、分泌された分子細胞の表面に発現した分子へセンサーを露呈する。この態様において、本システムは細胞処理チャンバからの細胞をセンサーチャンバと交差するシステムのチャネル中へ放出するようプログラムされ得、その結果センサーチャンバ中のセンサーを興味のある分子に露呈する。
【０１０９】
代案として又は追加として、本システムが細胞−ベースバイオセンサーと結合して使用される場合、細胞処理チャンバはバイオセンサー自身を調製するために使用され得る。一態様において、細胞は処理チャンバからその出口がセンサーチャンバと交差するチャネルへ配送され得る。一態様において、本システムの走査メカニズムは出口と近接したマイクロ位置決め装置を設置するために使用され、その結果マイクロ位置決め装置はセンサーチャンバ内部の細胞を位置決めすることが可能である。別の態様において、流体流又は表面張力は好適な位置に細胞を位置決めするために使用される。例えば、本システムはパッチクランプシステムの一部であるピペットの開口へ細胞を配送するために使用され得る。
【０１１０】
別の態様において、細胞はセンサーチャンバへ配送され得、センサーチャンバ中の細胞−ベースバイオセンサーを周期的に交換する。この態様において、細胞は処理なしで良く、例えば、実質的に遺伝的に及び薬理的に同一な細胞（すなわち、通常の生物学上の相違の範囲内にて）を前のセンサー細胞として提供する。代案として、交換細胞は生物化学的に又は遺伝学的に操作され得、以前のセンサー細胞とは異なるものとなり、本システムが生物化学的及び／又は遺伝学的な細胞の特徴における違いを監視し、相互に関連付けることをセンサー応答の違いによって可能とした。生物化学的又は遺伝的相違は知られていても良く又は知られていなくても良い。
【０１１１】
本システムは、細胞による化学物質及び分子の取り込みを監視する制御実験に基づき、選択された時間にて細胞処理チャンバから細胞を配送するためにプログラムされ得る。代案として、本システムは細胞の表現型を監視し、ある表現型が発現したら細胞を配送することが可能である。例えば、一態様において、細胞処理チャンバは光学的センサーへ連通し、これは細胞の光学的特性に関する情報をシステム処理装置へ供給し、特定の表現型からの発現を示唆する光学的パラメータに応答し、本システムが細胞処理チャンバから細胞の放出を誘発し得る。光学的パラメータとしては蛍光性レポーター分子の取り込み又は制御実験において同定される光学的パラメータが挙げられ得る。
【０１１２】
チップ上の電気穿孔のマイクロ流体及びパッチクランプ（又は細胞応答を監視する別の方法）との組み合わせは、細胞内標的の活性を調整する分子（例えばリガンド又は薬物）の選別を容易にする。一態様において、本システムは、細胞を一時的に電気穿孔することにより細胞−非浸透性分子の細胞内部への配送のために使用される。この方法において、分子は細胞内受容体、細胞内蛋白質、転写調節因子及びその他の細胞内標的へ導入され得る。細胞はセンサーチャンバへ配送され得、細胞の応答が（例えば、もし分子が蛍光ラベルで標識される場合、蛍光発光によって又はパッチクランプによって）監視され得る。代案として、センサーチャンバは処理及び応答検知の両者を達成するために修飾され得る。
【０１１３】
更なる態様において、本システムは走査によって電気穿孔を達成するために修正され得る。例えば、細胞は、それが異なる化合物を含む複数の異なる流体流を横切って平行移動され又は走査されるので、繰返し電気穿孔され得る。一態様において、細胞がサンプル流に接触するようになるにつれて、細孔が一つ以上の細胞中へ導入され、細胞によってサンプル流中の化合物が吸収され得る。
【０１１４】
センサーの周囲の溶液環境の迅速な変化
本発明の中心は、センサーチャンバ中のセンサーへ異なる溶液を繰返し且つ迅速に配送することが可能な方法にて、流体中に含まれる化合物又は試薬の複合操作のためにマイクロ流体チャネルの二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）ネットワークを使用することである。例えば、本システムで使用されるマイクロ流体は、システムが受容体からなる細胞−ベースバイオセンサーへリガンドをプログラム可能に配送することを可能とする。これはシステムがサンプル（例えば化合物ライブラリー）のＨＴＳ選別のために使用されるようにし、バイオセンサーの応答への化合物の効果を監視する。一態様において、細胞−ベースバイオセンサーの電気的特性は電圧クランプ又はパッチクランプ技術を用いて監視される。
【０１１５】
本システムはセンサーに対するチャネルの位置を変化させる走査メカニズムを提供するので、本システムは、サンプル化合物への露呈の後、細胞−ベースバイオセンサーに緩衝液を勢いよく流すために使用され得、バイオセンサーの一部である受容体又はイオンチャネルが次の化合物へ露呈させる前に再過敏化されるようにする。従って、本システムは受容体機能（例えば、アゴニスト又はアンタゴニスト）の潜在的な変調成分への露呈のため周期的に再過敏化された受容体を提供し得る。脱過敏化していない受容体のために、本システムは緩衝液の受容体への脈動配送を提供するので、例えば受容体からの非結合リガンドの除去のため、特異性及び／又は応答のバックグラウンドを減少させるため、更に有利である。
【０１１６】
マイクロチャネルの異なるネットワーク構造の形状は、マイクロ−寸法における流体の性質の他に類を見ない特徴を十分に引き出すよう設計されている。三つの典型的な設計が以下に記載される。
【０１１７】
第一の設計は一つ以上のセンサーを輸送するシステムの能力に依存しており、チャネルを横切ってセンサーを輸送することにより、又は一つ以上のセンサーに対してチャネルからなる基板を輸送することにより、チャネル出口から流れる流体の異なる流れを迅速に横切る。本システムはまた、基板の個別のチャネル全体にわたる圧力低下を変化させることにより固定されたセンサーを横切る異なる流体流を掃射することが可能である。この設計は新規且つ他に類を見ない流体の性質の発見から導かれており；すなわち、横方向の相互作用及び隣接する流体流の間の連結が、密集したマイクロチャネルの組みから開口容積中へそれらは出て行くので、これらの流れが平行なままの間隔を劇的に広げることが可能となる。第二の設計は低レイノルズ数における流体の性質の可逆性を有効に生かしており、一方第三の設計はマイクロチャネル及びチャンバ中の流体を迅速に交換する能力に基づくものである。
【０１１８】
これらの設計を貫く主題は、迅速且つ効率的に一つ以上のバイオセンサーの存在する局所的な溶液環境を変化させるマイクロ流体−ベースアプローチであり、完全な又はほぼ−完全な溶液交換を提供する。本システムは少量のサンプル（ｎＬ、μＬ）しか必要ではなく、ＨＴＳ用途のために容易に自動化され又はプログラムされ得る。
【０１１９】
（１）流体の異なる流れを横切るセンサーの迅速な輸送
本発明による基板の複数のマイクロチャネルを出る隣接した流体流は低レイノルズ数を有し、拡散によって最小限の混合しか受けない。例えば、約５×１０−６ｃｍ２／秒の拡散係数を備えた低分子は、距離が拡散時間に二乗依存するので(ｘ２＝２Ｄｔ，ここにおいてＤは拡散係数である)、１０μｍ拡散するのにおおよそ０．１秒かかるが、１００μｍ拡散するのに１０秒かかるであろう。同様に、Ｄ〜１０−６ｃｍ２／秒を有する典型的な蛋白質にとって、１０μｍ拡散するのに０．５秒かかり、１００μｍ拡散するのに５０秒かかる。
【０１２０】
しかしながら、マイクロチャネル中の流速は一秒当たり数メートルから一秒当たりマイクロメートルまで劇的に変化し得る。本システムの流速はセンサーの活性を阻害することなく使用され得る最高流速へ限定される。例えば、パッチクランプセンサーを使用する場合、チャネル開口に細胞を位置決めするピペットによるパッチ−クランプされた細胞の遊離を避けるため、流速は典型的にはパッチ−クランプされた細胞に関してμｍ／秒乃至ｍｍ／秒の百倍のオーダーである（以下の議論を参照）。
【０１２１】
センサーチャンバ中へ入る多数の流体流の流れプロファイル
複数のμチャネルが使用される場合、マイクロチャネルの出口と開口−容積槽との間の接点での流体の多数の流れのフロープロファイルの理解が肝心である。図１６Ａ及び１６Ｂは、一つのチャネル（図１６Ａ）及び多数のチャネル（１６Ｂ）からの５００μＭの蛍光染料（フルオレセイン）からなる流体のフロープロファイルの顕微鏡写真を示している。蛍光トレーサの励起が、アルゴンイオンレーザの４８８−ｎｍラインをエピ−イルミネーション（ｅｐｉ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）配置にて用いて実施され、トレーサの蛍光が収集されＣＣＤカメラを用いて撮像された。図１６Ａに示すように、近接したマイクロチャネル及び流体流がないので、流体は単一のチャネルを出て、チャネル出口にて半円のスタイルに分散した。図１６Ｂは、複数のチャネル出口から出る緩衝液及びフルオレセイン流体流の互いにかみ合う流れのフロープロファイルを示している。マイクロチャネルの寸法は１００μｍの幅、５０μｍの厚さ、２５μｍのチャネル間の間隔であった。図１６Ａ及び図１６Ｂの両者におけるマイクロチャネルの流速は４ｍｍ／秒であった。
【０１２２】
図１６Ｂに示すように、多数のマイクロチャネルから開口容量中へ出る流体流は、約４ｍｍ／秒の流速で、少なくともある間隔、すなわちマイクロチャネルの約４−５倍の幅（例えば、約数百マイクロメートル）で平行にされる。この低速度（すなわちｍｍ／秒）の範囲において、流体流の速度は拡散よりはずっと速い。例えば、ｍｍ／秒の流速、１０μｍのチャネル幅及び１０μｍのチャネル間隔（チャネルの間の空間）にて、低分子（Ｄ＝５×１０−６ｃｍ２／秒）を含む流体の異なる流れが異なるチャネル出口を出ることは、チャネル出口の下流少なくとも約０．４ｍｍ離れてやっと十分に混合されないであろう。これはチャネルの出口の外側１０乃至２０μｍに設置された約１０乃至２０μｍの直径を有する典型的な哺乳類細胞の測定にとって十分すぎる距離である。拡散時間は距離の二乗で変化するので、マイクロチャネルの幅を二倍にして、間隔を２０μｍにすることは、細胞が設置され得る下流の距離を少なくとも約１．６ｍｍまで伸ばす。流れの平均線速度は、１０μｍ細胞に関して約１００μｍ／秒乃至約１０ｍｍ／秒の範囲の典型的な流速で、まさにその用途に依存して変化する。従って、センサーはマイクロチャネル出口から出る実質的には識別可能でありそして分離された流体の水流を横切って走査され得る。
【０１２３】
パッチクランプ測定で使用される好ましい流速にて、そして細胞と出口との距離が約２０μｍ以下にて、異なる流体流が本質的に識別可能でありそして分離されており、パッチ−クランプされた細胞の存在によって邪魔されない。非常に低い流速（例えば、＜１００μｍ／秒）であっても、パッチクランプ測定に使用され得、異なる流体流は依然十分に分離される。マイクロチャンネルの出口にて開口容積センサーチャンバ中へ流れる流れのこの観察された性質（例えば、流体流の平行化）は、異なる流体流に関するパッチされた細胞の比較的迅速な移送が要求されるＨＴＳの用途を促進する。マイクロチャネル出口の間の空間は流体流の間の隔離距離を最適化するために最適化される。例えば、流速がより速くなると、混合はより少なく観察される。望ましくは、流速及びチャネル間の間隔は境界域（すなわち、混合の区域）の幅を最小にするため最適化される。望ましくは、境界域は流体流の幅の約５０％未満、又は約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満又は約１％未満である。一態様において、境界域は約２−３ミクロンである。最適な流体流速及びチャネル間の間隔は上記したような一つ以上のトレーサ染料を使用して容易に考え得る。
【０１２４】
流体流の他に類を見ない性質を開口容積中にて有効に生かすために、複数のマイクロチャネルの各々に加えられた圧力は流体流各々の緻密な操作のため個別に変更され得る。例えば、陽圧が一つのチャネルに加えられ、陰圧が近接したチャネルへ加えられるといった極端な場合、流体流は「Ｕ−ターン」が作り出され、陽圧のチャネルから陰圧のチャネルの一つへ進み、陰圧のチャネル中へ緩衝液の覆いが引き込まれる。従って、流体流の組成のみならず位置、幅、平行、方向及び流速が各チャネルへ加えられた相対圧力を変えることにより制御され得る。
【０１２５】
図５Ｄ−Ｆに示されるように、これはＵ−型流体流を作り出すために使用され得、これは、陽圧を受けているチャネルからの細胞上へ配送されたサンプルが陰圧を受けている廃棄チャネル中へ引き込まれルことが可能であるという利点を有している。これは、パッチ−クランプされた細胞が存在する場合、開口容積中のリガンドの蓄積を最小限にする。サンプル（例えば、薬物、リガンド等）が低濃度で存在する及び／又は高価である場合、本システムは更にリガンドを再循環し及び／又はシステム中へリガンドを戻すために使用され得る（すなわち、Ｕ−型流は閉回路に変更し得る）。
【０１２６】
圧力を制御することによって、本システムは流体流の速度（振幅及び方向の両者）を制御され得る。速度制御はまた、各チャネルの抵抗を制御することにより圧力を変化させることなく行われても、或いは抵抗及び圧力の両者を変化させることにより行われてもよい。流体剪断もまた異なる粘度の溶液（例えば、異なる量の蔗糖のような糖を流体流中に添加する）を使用することによりマイクロチャネル及びセンサーチャンバの両者中にて変化され得る。従って、多数の異なるパラメータを変化させることにより異なる流体流のフロープロファイルがはっきりと調整され得る。
【０１２７】
流体流下のパッチクランプ
受容体又は変調成分（アゴニスト又はアンタゴニスト）及び緩衝液の互いにかみあった流れを横切って、パッチクランプされた細胞を迅速に走査する能力は、走査速度のみならず所要の条件の下パッチされた細胞の機械的安定に依存する。ここに、流体条件の範囲の下のパッチ−クランプされた細胞の「ギガシール」及びイオン−チャネル活性の安定性を記載する。
【０１２８】
パッチ−クランプされた細胞の液体流の効果は、細胞の流れによって与えられた力（ストークス薬物）から生じる。このストークス薬物は以下の方程式から計算され得る：
力＝（摩擦係数）×（流体の速度）
ここにおいて、摩擦係数（ｆ）は：
ｆ＝６πｒμ
から計算され得る。
ここにおいて、ｒは細胞の半径でありｕは溶液の粘度である。この関係は低レイノルズ数の流れ及び球形の粒子に有効である。両条件は、本発明に関連して利用される方法及び装置に十分に合っている。
【０１２９】
室温における水に関して、μは〜１センチポイズ（１センチポイズ＝０．０１ｇ／［ｃｍｓ］）であり及び、典型的な哺乳類細胞に関して、ｒ＝５μｍである。これらの値及び流速について１ｍｍ／秒を用いた場合、力＝９．４×１０−１１Ｎ又は９４ピコニュートンである。力は流速に対して直線的に比例するので、０．１ｍｍ／ｓの場合、力は９．４ピコＮである。この数値を正しい角度で見直すと、マイクロピペットは細胞のような小粒子上のナノ−及びマイクロ−ニュートンに通常通り影響を与え得る。流体流からの細胞上の薬物のせいで生じる力に加えて、一定速度での細胞の走査は、流体流の方向に対して典型的には直角な細胞の平行移動の方向における同じ薬物の力に影響を与える。流れのない条件での１ｍｍ／秒での細胞の走査は、同じ速度で流体を流し細胞を固定したままとするときと同じ効果を有している。
【０１３０】
細胞の遊離が問題となり始め得るきわめて高い流速が要される用途に関して、パッチ−クランプされた細胞は、センサーチャンバ中の細胞の寸法に合った凹型の領域又はウェル中へ載せることが可能である。この設計は、流体と固体表面（すなわち、）の接点での滑りのない境界条件のおかげでチャネル又はチャンバ中のフロープロファイルが放物線状であるので、細胞の遊離を避けながら高い流速の使用を可能とする。細胞と同じような寸法を有するウェル中に細胞を設置することによって、細胞は本質的に高速度流動領域から「遮蔽され」これはウェル及び固体表面から離れて配置される。従って、たとえ平均流速及び固体表面から離れる流速が非常に高いとしても、パッチされた細胞が置かれているウェル付近の流速は非常にゆっくりであり得る。このストラテジーを使用することによって、非常に高い平均流速が使用可能である。
【０１３１】
上記の通り、流体流はまたパッチクランプの感受性を最大化するために使用され得る。図５Ｄ−Ｆにし召したように、２つの平行したチャネルによって作り出されたＵ−型流体流は細胞及びパッチクランプマイクロピペットの間の光学的密閉を作り出すために使用され得る。
【０１３２】
走査メカニズム
走査は機械的に（センサーが固定されている場合基板を移動させることによって、または基板が固定されている場合センサーを移動させることによって、基板及びセンサーの両者を異なる速度及び／又は異なる方向へ移動させることによって）又は異なるマイクロチャネルを横切る圧力低下によって仲立ちされ得る。図８Ａ−Ｉはこれらの方法の各々如何に実施され得るかを概略的に表現している。センサーの機械的動き及び走査はセンサーを位置決めするマイクロ位置決め装置を平行移動させることにより容易に実店される。例えば、細胞−ベースバイオセンサーは物理的にマイクロピペットへ吸引により接続され、これは入れ替わってマイクロ遠隔操縦装置へ接続される。最も多く、マイクロ遠隔操縦装置が電子的に作動されるのみならず手動で制御され得、そうすると前もってプログラムされた動きが容易に実行され得る。プログラムされ得る多数のパラメータとしては、等速走査のための線速度；変速走査のための加速度；二次元及び三次元の両者における走査の軌道；及び繰返し走査の数が挙げられるがこれに限定されない。センサーチャンバ中の一つ以上のセンサーからの即時応答信号フィードバックに基づく走査に関して、プログラム可能なパラメータとしては、信号検知及び走査設定の変化の間の時間遅延が挙げられるがこれに限定されない。多様な信号処理及び計算的機能は、走査のための出力に対して誤りのないフィードバックパラメータを決定するために実施され得る。
【０１３３】
基板（例えば、チップ）が静止しているプラットフォームの機械的動き及び走査もまた容易に実行され得、その結果固定されたバイオセンサーに対して基板を動かすことが可能である。例えば、異なる設計（例えば、圧電性結晶によるもの、又は電子的に作動されるネジ（ｔｈｒｅａｄ  ｓｃｒｅｗｓ））を備え必要とされる規格を有するコンピュータで制御された顕微鏡試料台が工業的に利用可能である（例えば、プライヤーサイエンティフィックＩｎｃ．，８０槽パークドライブ，ロックランド，ＭＡ製）。好適な走査パラメータは、例えば、上記のようなセンサーチャンバ中の一つ以上のセンサーからのフィードバックシグナル又は使用者の指示に応答して、プラットフォームと連通したシステム処理装置を用いてプログラムされることが可能である。
【０１３４】
一態様において、センサーチャンバ中の密集したチャネルの出口の間の間隔全体にわたって一つ以上のセンサーが迅速に移動され、出口を出る流体の異なる流れにチャンバ中の一つ以上のバイオセンサーを露呈する。例えば、センサーはチャネルの出口を横切って移動するようプログラムされたマイクロピペットへ接続された細胞又は膜パッチであってよく、別の態様において、一つ以上の固定された細胞がセンサーチャンバ（例えば、平面的−パッチクランプ形式）中に固定化され、異なる流れが固定された細胞全体にわたって掃射するために、例えば、異なる流れが出る夫々個別のチャネルにて圧力及び流速を調節することにより、作り上げられる。代案として、チャネル出口は上記のような固定された細胞を越えて物理的に移動し得る。
【０１３５】
チャネルを通過して流れる水溶液は圧縮されていないので（空気とは異なり）、各流体流の幅及び配置はマイクロチャネル各々を通過する相対流速に依存する。従って、マイクロチャネルからの流体流はまた、チャネル各々を通過する流速を変化させることにより動かされ平行移動され得る。これはチャネル各々を横切る圧力を低下させ制御すること、またはチャネルの各々の抵抗を変化させることにより最も容易に実行される。センサーが細胞−ベースである及びチップ上に固定されている用途において、圧力変動（又は別の手段）によって流体流を動かす能力は特に有効であり、細胞のチップに対する機械的動きは最善ではない。機械的走査と同様に、各チャネルの圧力及び抵抗は、システム処理装置を使用して、プログラムされ得る。プログラムされ得るパラメータとしては各チャネルの圧力及び抵抗における直線状変化、各チャネルの圧力及び抵抗における階段状又は絶えず変化する変化、及び異なるチャネルの間の変化の配列が挙げられるがこれらに限定されない。加えて、圧力及び抵抗の変化は即時フィードバック信号に基づき得、これらのシグナルは新しい圧力及び抵抗パラメータを出力する前に処理及び計算され得る。
【０１３６】
走査スピードは用途に依存して変更され得る。例えば、センサーが、アゴニストへの連続した露呈で脱過敏化された受容体からなる場合、センサーはサンプル−含有流から緩衝液−含有流へと移動され得、受容体が再過敏かされるようになる。サンプル流及び緩衝液流を横切ってセンサーを連続して掃射することによって（機械的に又は圧力差を通じて）、アゴニスト及び緩衝液の脈動配送が提供され得、その結果周期的に再過敏化された受容体が生じる。
【０１３７】
走査スピードは、再過敏化に必要な時間を調整するためにこのシナリオにおいて変更され得、これはイオンチャネルの場合、しばしばミリ秒のオーダーである（リガンド−イオンチャネルの組に依存する）。一般的に、センサーの溶液に対する露呈時間は制御され得、マイクロ秒から時間の範囲であり得る。長い平衡時間を有する薬物−受容体の組に関して、しかしながら、処理時間は平衡時間の長さによって限定され得る。同様に、細胞−ベースバイオセンサーの応答は生化学的経路を通過する信号の形質転換に依存しても良く、これはミリ秒からより長い間隔（例えば、分）まで要求し得る。走査速度は従って、使用されるセンサーの種類に順応するよう変更され、制御実験例えば経時変化実験から容易に決定されることが可能である。
【０１３８】
望ましくは、従って、走査メカニズム（それがセンサー又はチップを移動させようとも、又はチャネルを横切る圧力低下を制御することにより作動しようとも）は、使用者の選択又はシステムの選択速度にてシステム処理装置がチップに対してセンサーの位置を動かすことによって制御される。例えば、使用者は、走査メカニズムの、例えばシステム処理装置と連通したコンピュータ上に表示されたグラフィカルインターフェイスのアクションボタンを選択する選択することによって平行移動パラメータを変更するシステムプログラムを実行することが可能である。代案として、走査速度はフィードバック信号に応答したシステム処理装置によって修正され得る（例えば、脱過敏化を示す細胞パッチクランプ記録）。走査メカニズムは直線状又は階段状走査としてプログラムされ得る（例えば、センサーが露呈された以前の出口と隣接していないチャネル出口へセンサーを移動させる）。
【０１３９】
センサーは受容体／イオンチャネルからなり得、これは脱過敏化されず、受容体を再過敏化する必要をなくしている。しかしながら、本システムは更に緩衝液の脈動配送を提供するために使用され得、例えば、細胞を洗浄し未結合化合物をなくす。このシナリオにおいて、走査速度は応答中に観察される「ノイズ」に基づき変更され得る。例えば、サンプル化合物の特定の濃度を超えて直線用量−反応を達成するように、走査速度は変更し得る。
【０１４０】
リガンドはまた、不可逆的にセンサーを妨害し得、別の流体流中の別のリガンドに反応しないようにする。この場合、緩衝液で脈動させることは何の効果もない。細胞が既知の効果の化合物を細胞へ周期的に導入することにより不活性化されるかどうか究明すること及び適切な応答が得られるかどうか検証することは簡単である。望ましくは、本システムは、選択された数のサンプル流体流を越えて走査されるときに、応答の欠如をセンサーによって検出することが可能である。例えば、本システムは、パッチクランプ記録中に応答が全く観察されない場合、センサーが選択された数の連続的な流体流を越えて走査されるので、フィードバック信号を提供し得る。
【０１４１】
代案として又は追加として、装置はセンサーチャンバ中にセンサー機能を監視するため提供され得る。一態様において、光学的センサーが細胞−ベースバイオセンサーの実現可能性を監視するためにセンサーチャンバと連通して提供される。例えば、細胞死に付随するスペクトル変化（例えば、染色体の凝縮化）が観察され得、又は死んだ又は死にかけている細胞による染料の摂取が監視され得る。
【０１４２】
一態様において、センサー信号を一つも受けない走査間隔が選択され多く過ぎるとき、システムが特定のプログラム命令を達成する。例えば、本システムは特定のチャネルにて圧力を変化し得、それらのチャネル中の流れを止め、その結果サンプルの廃棄を最低限に留める。別の態様において、閾値の期間にわたってセンサーからの応答シグナル無しに応答して、一つ以上の置換バイオセンサーがセンサーチャンバへ（例えば、上記の細胞処理チャンバから）送付される。
【０１４３】
センサーがチャネル出口からの流速（例えば、ｍｍ／秒）と比較して一定のスピードで平行移動されるならば、その結果、約１０μｍの幅及び間隙を有するチャネルに関する選別速度（例えば、一秒当たりの選択された化合物）はおおよそ２５Ｈｚである。約１００μｍの広いチャネルをチャネル間隔を約１０μｍで使用する場合、選別速度は約４．５Ｈｚである。もし平衡移動速度が増加したら、走査範囲は数百Ｈｚの範囲であり得る。いくつかの用途にとって、例えばセンサーが迅速に脱過敏化するイオンチャネルからなる場合、狭い出口を備えた流体チャネルは短期間にわたって著しい濃度プロファイルを提供するので、これらが好ましい。望ましくは、そのようなチャネルは約１μｍ乃至約１００μｍの幅の範囲である。
【０１４４】
走査速度は一定又は一定ではない可能性がある。例えば、サンプル流を提供する（例えば、アゴニストを提供する）チャネルを横切る走査速度は緩衝液流を提供するチャネルを横切る走査速度と異なっている可能性がある。多様な走査速度が、予備プログラミング又はパッチクランプ測定のようなセンサー測定からのフィードバック信号にい基づく可能性がある。実際の走査速度はまさにその選別システムに依存して変化するが、典型的な直線走査速度は、約１０μｍの直径を有する哺乳類細胞からなるセンサーについて約１００μｍ／秒乃至数百ｍｍ／秒の間の範囲である。
【０１４５】
二次元のマイクロ流体システムが図４Ａ及び５Ａに示される。本システムは、例えば９６チャネルのマイクロチャネルが相互作用する業界−標準のマイクロタイタープレート中のウェルの数に合計で対応する複数のマイクロチャネルからなる基板からなる。本システムがサンプル及び緩衝液の交互にかみ合った流れをセンサーへ供給するために使用され、少なくとも９６サンプル及び９６緩衝液のマイクロチャネル（少なくとも総計１９２チャネル）が提供される。マイクロタイタープレートの又は別の好適な容器のウェルはサンプルを又は緩衝液をチャネル経供給する槽に連結されており、例えば、以前記載したシステムでは、基板は１９２の槽からなり、槽の各々が異なるチャネルへつながっている。更なる槽が細胞貯蔵及び配送のために例えばパッチクランプ記録のための細胞を提供するために、準備され得る。
【０１４６】
図４Ａ及び５Ａに示した実施の形態において、マイクロチャネルは実質的に平行であり、約１００μｍの幅及び５０μｍの厚さを有している。チャネルの正確な厚さは幅広い範囲で変化してよいが、望ましくはセンサーの直径、例えばパッチされた細胞に相当するか或いはそれより大きい。図において、約１０μｍのチャネル間の間隔が提供されている。
【０１４７】
溶液の定常状態の流れが全てのマイクロチャネルを通過して同じ速度にてセンサーを収容している開口容積中へ流されるように、圧力は全てのチャネルに同時に加えられ得る。この方法にて、リガンド又は純粋な緩衝液を含む異なる溶液の定常状態の濃度はマイクロチャネル各々隣り合う出口にて達成される。チャネル各々の幅はマイクロチャネル各々における所望の流速を達成するよう調節され得る。
【０１４８】
上記下実施の形態において、平行なチャネルから出る流体流は開口容積センサーチャンバに入るが、サンプル及び緩衝液のチャネルの組と対照的な平行な排出チャネルの一組を提供することはより便利且つ望ましいであろう。適切な幅（例えば、約５０μｍ）を有する溝が二組のチャネル（すなわち、配送及び排出チャネル）間に、そして直交して設置され得、センサーチャンバ中のセンサーの走査を調整する。好適なフロープロファイルを達成するため、全ての排出チャネルへ陰圧が加えられ、一方同時に陽圧を配送チャネルへ加える。これは配送チャネルを出る流体を排出チャネルの組へ入るよう促す。
【０１４９】
図５Ｃは三次元マイクロ流体システムを示している。この３Ｄ構造及び図５Ｂ中に示された平面構造の間の主な違いは、平行配列チャネルの出口（例えば、互いにかみ合ったサンプル及び緩衝液のチャネル）と廃棄チャネルの入口との間を流れる流体のｚ軸に沿った移動である。この実施の形態において、陽圧が全てのサンプル及び緩衝液チャネルへ加えられ、一方陰圧が同時に全ての廃棄チャネルへ加えられる。その結果、定常状態の流れがサンプル／緩衝液チャネルの出口と廃棄チャネルの入口との間で達成される。この配置において、パッチ−クランプされた細胞のようなセンサーは、望ましくはサンプル／緩衝液マイクロチャネルの出口に近接した流体のｚ−方向の流れを横切って走査される。
【０１５０】
この３Ｄ構造の組立ては平面構造より複雑であるが、ｚ−方向の流れの存在は多くの場合、パッチ−クランプされた細胞のようなセンサーを走査する好ましいフロープロファイルを提供する（例えば、より鋭い濃度勾配）。ｚ−方向の流れが確立される長さは、使用されるセンサーの直径／長さより著しく大きくあるべきである。例えば、パッチ−クランプされた細胞のような細胞−ベースバイオセンサーのｚ−方向の流れは、望ましくは約１０μｍ乃至数百μｍの範囲であるべきだ。
【０１５１】
走査に加え、交互にかみ合ったサンプル流及び緩衝液流を提供する別のストラテジーは、図７Ａ−Ｎに示される。この実施の形態において、サンプル及び緩衝液をそれぞれセンサーチャンバ中へ供給する互いにかみ合った出口を提供するよりむしろ、全ての出口流がサンプル流である。緩衝液過融解が、一つ以上のセンサーに近接して設置された一つ以上のキャピラリを通過して実行される。図７Ａにおいて、示されたセンサーはマイクロ位置決め装置又はナノ位置決め装置又はマイクロ遠隔操縦装置のような位置決め装置へ接続したパッチクランプピペットを用いて出口に近接して位置決めされたパッチ−クランプされた細胞である。キャピラリはパッチクランプピペットに隣接して設置され、過融解、例えば脱過敏化された細胞を再過敏化するのために使用され得る。この方法によって、イオンチャネルからなる細胞−ベースバイオセンサーは周期的に敏感状態に維持され得、すなわち、（例えば、薬物に露呈されてアゴニストに結合した）リガンド非−敏感状態及び（例えば、緩衝液による過融解の後でのリガンド敏感の）リガンド敏感状態の間を切り替える。
【０１５２】
この同軸又は側面−キャピラリ配置を通過した緩衝液のプログラムされた配送はあらかじめ設定され得又はセンサーからのフィードバック信号に基づき（例えば、信号検知後、緩衝液過融解がシステム処理装置からの指令に対する応答に誘発され得、すべての結合したリガンドを洗い落とす）、緩衝液のセンサーへの脈動配送を提供する。一態様において、キャピラリの縦軸はパッチクランプマイクロピペットの縦軸に対して角度９０°であり、一方、別の態様において、縦軸は９０°未満である。
【０１５３】
マイクロチャネル出口それ自身もまた３Ｄ配列に配置され得る（例えば、図６Ａ−Ｂに示されるように）。出口の３Ｄ配置は処理能力を増強し得（例えば、選別されるサンプルの数を増加させ）、従ってセンサーが評価する生物学的情報の量を増加させる。一態様において、マイクロ流体システムはイオンチャネルのような細胞標的に関する薬理学的情報を得るために使用される。
【０１５４】
前節に記載された走査形式に関して、この形式でＨＴＳを実行するいくつかの利点がある：（１）リガンド露呈時間は、リガンド流の走査スピード及び幅によってよりむしろ過融解の間の期間（例えば、緩衝液の脈動の間の時間）によって決定され；（２）緩衝液過融解及び再過敏化時間はまた緩衝液流中の滞留時間によってよりむしろ過融解脈動の継続時間によって決定され；（３）リガンド流数の高い記録密度が提供され得、その結果、実験当たり、たくさんのリガンドを走査する能力がもたらされる。
【０１５５】
（２）迅速な配送の循環
本発明によるシステムの他の特徴事項は、流体がセンサーチャンバ中へチャネルを通過して迅速に配送され得、化合物がセンサーの微環境中へ導入され、その微環境から迅速に抜き取られることが可能なことである。
【０１５６】
ミクロン−寸法のチャネル内部の流体流は層流であり反転でき、無次元数によって測定され得た特徴はレイノルズ数（Ｒｅ）と呼ばれる：例えば、典型的には、低レイノルズ数を有する流体流は反転でき、一方高Ｒｅ数では、流体流は乱れ、反転できない。層流反転可能流と乱流との間の変わり目は、滑らかな円形のチャネルを通過する流れ（例えば、マイクロチャネルを通過する近似流）に基づく試算で、Ｒｅ数が約２０００にて起こるように見える。どんなに高い流速（ｍ／秒）でも、幅数ミクロンと測定されるチャネルのＲｅは〜＜１０である。これはミクロン−寸法のチャネル中の流体流は層流反転レジームで十分静まる範囲であることを意味している。ここに有効利用されている流体の性質の重要な特徴は、流体流の可逆性である。
【０１５７】
一態様において、陽圧がマイクロチャネルにて加えられ、化合物又は薬物がバイオセンサー、望ましくはパッチ−クランプされた細胞の収容されたセンサーチャンバ中へ導入される。化合物／薬物及びバイオセンサーの間の相互作用に好適なインキュベーション時間の後、陰圧が加えられ化合物／薬物をチャンバから抜き取る。流体流は完全に反転可能であるので、そしてまた拡散は、使用された条件下（例えば、比較的速い流れ）では取るに足らないので、薬物は完全にチャンバから抜き取られそれが来たマイクロチャネル中へ戻る。この方法で、潜在的な相互作用を選別するため細胞上へ配送された化合物の各々が実質的に細胞から抜き取られ得、その結果細胞は再び緩衝液中に入浴され、再−過敏化され、そして異なるマイクロチャネルを介して配送された次の化合物と相互作用する準備される。
【０１５８】
この計画は、本発明の特定の態様において使用されたチャネル及びチャンバの寸法が小さいので、特に有効である。多数のチャネルの形状、特に、上記及び図９Ａ−Ｃ及び１０に示したスポーク−ホイール配置がこのシナリオを実行するために好適であり得る。図からもわかるように、マイクロチャネルの配列はスポーク−ホイール形式にて配置されており、ここにおいてマイクロチャネルは中心で円状のセンサーチャンバ中に集まっている。使用されたマイクロチャネルの数は、マイクロチャネルが相互作用されるサンプルウェルプレート中のサンプルウェルの数に依存している。例えば、９６サンプルウェルプレートは少なくとも９６マイクロチャネルを必要とする。中心のセンサーチャンバは、パッチ−クランプされた細胞のような一つ以上のセンサーを収容し得、この細胞はマイクロピペットを用いてパッチ−クランプされ又はチップ上でパッチ−クランプされ得る。図９Ａ−Ｃは９６サンプルウェルプレートと相互作用するチップ構造全体にわたるレイアウトを示している、ここで９６−ウェルプレートからの溶液は直接サンプル−ウェルプレートから対応するチップの槽上へ標準的な配列ピペットを用いて移動され得る。
【０１５９】
図１０は概略的に中央チャンバ周囲の拡大領域を表現している。チャンバの寸法はまさにその用途に非常に依存し得（例えば、センサーが細胞からなっていても、或いは別の種類のセンサーであっても）、典型的な直径は約１０乃至数百μｍの範囲を有する。マイクロチャネルの幅もまた中心チャンバの直径に非常に依存し、典型的な幅は約１乃至約２０μｍの範囲を有する。マイクロチャネルの厚さはあまり気にかけなくても良く、ほとんどの場合、約１乃至約５０ミクロンの範囲である、流速も変化し得、マイクロチャネル内部の典型的な流速はｍｍ／秒乃至ｃｍ／秒の範囲を有し、センサーを横切る開口チャンバ中の流速に関してはμｍ／秒乃至ｍｍ／秒の範囲である。マイクロチャネルの各々へ加えられた陽圧及び陰圧は、一つのマイクロチャネルへ加えられた陽圧がその溶液内容がセンサー全体にわたって撒き散らし、一方陰圧はこの溶液の抜き取りがその個別のマイクロチャネルへ戻るようになされ、その結果バイオセンサーがその元の緩衝溶液中に入浴したままとするシステム処理装置によって個別に制御され得る。
【０１６０】
（３）流体の迅速な転換
この設計は、マイクロチャネル及びセンサーチャンバ（及び／又は細胞処理チャンバ）中に含まれる溶液が迅速且つ効率的に交換し転換し得るという事実をあてにしている。迅速な溶液転換は多様な異なるマイクロチャネルネットワーク形状を用いて達成され得る。一態様において、複数のマイクロチャネルがセンサーチャンバ中へ集中し又は供給し、一方、別の態様において、複数のマイクロチャネルがセンサーチャンバ中へそれ自身が集中する単一のチャネル中へ集中する。複数のマイクロチャネルはサンプル及び緩衝液それぞれの配送のための互いにかみ合ったチャネルからなり得る。好ましい態様において、本設計はパッチクランプシステムと一体化されている。三つの模範的な構成を以下に記載する。
【０１６１】
ｉ）平面放射状スポーク−ホイール形式
本構成において、たくさんの（例えば、９６−１０２４）のマイクロチャネルが放射状スポークとしてチャンバ中へ配置され、約１０μｍ乃至約１０ｍｍの範囲の寸法を有し、センサーを収容している。使用されるマイクロチャネルの数は、業界−標準マイクロタイタープレート中のサンプルウェルの数たとえば９６乃至１０２４ウェルに適合するよう選択される。ウェルプレートからの入口の数と一致するマイクロチャネルの数に加えて、少なくとも二つの更なるマイクロチャネルが望ましくは存在する、一つは過融解／再−過敏化のための緩衝液の配送のためであり、その他は廃棄物の除去のためである。マイクロピペットを使用するパッチクランプのために、この配置はまた細胞にアクセスするための開口容積領域を含む；しかしながら、（国際公開第９９／３１５０３号パンフレット及び国際公開第０１／２５７６９号パンフレットに記載されているような）チップ−ベースパッチクランプ測定にとって、如何なる開口容量領域も望ましくは存在しない。マイクロチャネルからの流体流によって細胞が遊離することを裂けるために、細胞の寸法に合った凹型の領域又はウェル中へ細胞を設置すると良い。一つの細胞より十分に小さな寸法を有する膜パッチに関して、パッチの流体流による遊離は問題にならない、なぜならストークス薬物により与えられた力が対象物（すなわち、パッチ）の寸法に逆比例する。
【０１６２】
チャネルからの流体の流入によるチャンバ中に含まれる流体の有効な置換について準備するために、入力チャネル及び廃棄チャネルの間の角度は最適化される。流体混合及び置換は、この角度が約１８０°で最適であり、この角度が０°に向かって減少するにつれてだんだん悪くなる。高流速（ｃｍ／秒乃至ｍ／秒）に関して、この角度の効果は徐々に重要となり、一方低流速に関して、入力チャネル及び廃棄チャネルの間の角度は殆んど関係ない。
【０１６３】
高流速での流体の置換を最大限に有効にするために、放射状チャネルの数は増加され得、その結果、全ての入力チャネルが一つの共有廃棄チャネルを分かち合うよりもむしろ入力チャネル各々が対応する廃棄チャネルを有する。この形式において、入力及び出力チャネルの間の全ての角度が約１８０°であると、最適の流体置換が確実になる。第二のストラテジーは三次元放射スポーク−ホイールチャネルネットワークを構成することであり、一方第三のストラテジーは分岐したチャネル形状の使用を伴う。これらのストラテジーは更に以下に記載される。
【０１６４】
一つの好ましい実施の形態の迅速な溶液転換のための２Ｄ放射状スポーク−ホイール形式は図１１Ａ−Ｃ及び図１２に示される。この実施の形態において、マイクロチャネルの配列はスポーク−ホイール形式に配置され、中心にて円状のセンサーチャンバ中へ集中している。使用されるマイクロチャネルの数は、マイクロチャネルが相互作用されるウェルプレート中のウェルの数に依存する。例えば、９６サンプル−ウェルプレートは少なくとも９６マイクロチャネルをリガンド配送のために必要とし、更に９６マイクロチャネルを廃棄のために必要とし、廃棄マイクロチャネルは各々その対応するサンプル配送マイクロチャネルに対して約１８０°に方向付けられる。これらの１９２マイクロチャネルに加えて、緩衝液の過融解及び緩衝液の廃棄のために使用される一組のマイクロチャネルが存在し、これは９６サンプル−ウェルプレートへ相互作用させる場合、チャネルの総数を１９４にする。パッチ−クランプされた細胞のようなセンサーは中心チャンバに収容され、従来のマイクロピペット−ベースパッチクランプシステムと相互作用するならば、中心チャンバは開口容積であり得、チップ−ベースのパッチクランプシステムと相互作用するならば閉口容積であり得る。図１１Ａ−Ｃは本マイクロ流体システムの構造を示しており、この場合も、９６−ウェルプレートと相互作用することに相性の良いように設計されている。パッチ−クランプされた検知細胞を各々有するいくつかのスポーク−ホイールマイクロ流体配置が同じチップ構造において使用され得、平行測定を得る。
【０１６５】
図１２はセンサーチャンバの拡大図を示している。この中心チャンバの寸法はまさにその用途に依存して変化し得、約１０−１００μｍの範囲の典型的な直径を有する。マイクロチャネルの幅も変化し、中心チャンバの直径に依存し、約１−１０μｍの範囲の典型的な幅を有する。マイクロチャネルの厚さはあまり気にかけなくても良く、ほとんどの場合約１−１０μｍの範囲である。流速もまた変化し得、マイクロチャネル内部の典型的な流速はμｍ／秒乃至ｃｍ／秒の範囲を有し、中心チャンバ中の流速に関してはμｍ／秒乃至ｍｍ／秒の範囲である。
【０１６６】
ｉｉ）三次元放射状スポーク−ホイール形式
センサーチャンバに入る流体を効率的に交換するために三次元放射状スポーク−ホイール配置もまた使用され得る。この構成において、一つ以上のセンサー（例えば、細胞）が放射状チャネルからなる基板及び廃棄槽からなる基板の間に挟まれたフィルター膜上に設置される。この形式において、流体は最上層から下へ、放射状チャネルが存在する場合（例えば、放射状チャネル中へ供給される入力チャネルを通過して）センサーを過ぎて、その後、フィルターを通過して廃棄チャネル中へ流れ下らざるを得ない。フィルターは従って、センサー（例えば、細胞）を支持する間、センサーが速い流体流で過融解されるのを可能とし、従ってそれらは流れによって運び去られず、遊離されない。加えて、流体はセンサーを過ぎて流れ、センサーを取り囲む全ての流体を交換せざるを得ない。
【０１６７】
この３Ｄ設計によって提供される多くの利点がある：（１）細胞の周囲の流体が完全に、効率的にそして迅速に転換され；（２）細胞のようなセンサーがフィルター上にしっかりと設置され、軸方向に又はｚ−方向に、流れは細胞をフィルターに対して押し付けるので、細胞のどんなに極度に高速の流速であっても流体流によって遊離されず；そして（３）上記の平面放射状設計と比較して最小限の数の放射状チャネルしか要求されない。その他の平面デザインと比較してこの設計の主な欠点は微細加工に複雑性が増加していることである。
【０１６８】
３Ｄ放射状スポーク−ホイール形式の一つの好ましい実施の形態は図１３に示される。この３Ｄ構造と図１２に示された平面構造との間の主な違いは、マイクロチャネルの出口から廃棄マイクロチャネルの入口への流体のｚ−方向の流れの存在である。その他の違いは、センサー（例えば細胞）が設置される多孔性の膜の存在であり、これは、ｚ−方向の流れが細胞を膜に対して押し付けるので、センサーに関して機械的支持を供給する。この実施の形態において、マイクロチャネルの配置及び寸法は２Ｄ平面形式（図１２）のものに相当する。この３Ｄ構造の加工は平面構造より複雑であるが、ｚ−方向の流れの存在が多くの場合、特に開口容積槽にとってより好ましいフロープロファイルを提供する。センサーが廃棄チャネルの入口の外側（すなわち、頂部）に迅速に設置されるので、リガンド流及び過融解流の両者がセンサーを過ぎて流れざるを得ず、このことはより効率的及び完全なセンサーの投与を異なる流体流によってもたらされる。また、多孔性膜の支持の存在がより高速の流速の使用を可能とし、従ってより高い処理能力が可能となる。
【０１６９】
ｉｉｉ）分岐チャネル形式
この設計において、望ましくはただ二つのチャネルが直接一つ以上のセンサー（例えば、パッチ−クランプ細胞）と隣接して設置される、一つは化合物の配送のため、そしてもう一つは廃棄のためである。全ての入力チャネルを分離し入力チャネルの各々の出口を集め、その結果それらが中心センサーチャンバ中へ送り込まれるよりはむしろ、チャネルは分岐した形状に配置されている。９６−１０２４ウェルプレートと相互作用させるため、センサーに隣接する単一の配送チャネルは多数の入力マイクロチャネルに接続し、入力チャネルの各々は９６−１０２４ウェルプレートの異なるウェルからの入力を受ける。この形式はチャネル配送化合物及び廃棄チャネルがセンサーと非常に近接して設置されるという利点を有しており、その結果システムからの迅速な応答を確実にする。続けざまにセンサー上へ多数の化合物を配送することは、センサーチャンバ中へ直接供給する一つのチャネル中への化合物を含む流体の制御され多重化された配送によって達成される。
【０１７０】
このデザインの一つの好ましい実施の形態は図１４Ａ−Ｃ及び１５中に示される。この実施の形態において、「魚−骨」構造が加工され、「骨」各々がサンプル（例えば、リガンド）配送マイクロチャネルに相当し、これは主要な「背骨」に交差し、これは緩衝液槽へ接続される。センサーチャンバ中の一つ以上のセンサー上へのサンプル及び緩衝液の迅速且つ連続的な配送は、サンプル配送マイクロチャネルの一つへの第一の陽圧印加によって達成され、その結果、サンプル（例えばリガンド）のプラグをそのマイクロチャネルから緩衝液を含有する主要なマイクロチャネル中へ導入する。このプラグは、陽圧を緩衝液槽へ印加することにより細胞上へ導入され、これはプラグをセンサー上へ運び、そして次に緩衝溶液でセンサーを洗浄する（例えば、それを再過敏化する）。このサンプル及び緩衝液過融解の配送のサイクルは異なるマイクロチャネル中に含有される異なるサンプルと繰り返される。このチップ設計のレイアウトはず１４Ａ−Ｃ二示される。図に示される実施の形態において、チップは９６−ウェルプレートと相互作用され得る。
【０１７１】
図１５は主要緩衝液チャネル及びセンサーチャンバの周囲の区域の拡大図である。（サンプル配送及び緩衝液配送の両者のための）マイクロチャネルの寸法（幅及び厚さ）はきわめて多様性があり、典型的な寸法の範囲は約１−１００μｍ、望ましくは約１０−９０μｍの範囲である。流速もまた好ましい流速の範囲μｍ／秒乃至ｃｍ／秒で変化し得る。
【０１７２】
圧力は等方性であり、従って、陽圧又は陰圧の印加がなされ、流体は如何なる特別な方向へも優先することなくあらゆる圧力低下に従って流れる。従って、望ましくは、受動的な一方向弁がサンプル配送マイクロチャネル及び主要緩衝液チャネルの間の接合にて一体化する。これらの一体化された一方向弁の目的は、緩衝液槽へ陽圧を印加したときの主要緩衝液チャネルからサンプル配送マイクロチャネルの各々中へ如何なる流れも防御するものであり、陽圧が槽に加えられサンプルをこれらのマイクロチャネルへ提供するとき、サンプル配送マイクロチャネルの各々から主要緩衝液チャネル中へ流れることを可能とする。ポンピングメカニズムのみならずマイクロ流体弁の多数の好適な設計が存在する。
【０１７３】
以下の議論は実施の単純化のおかげで圧力促進された流れを強調しているが、多くの適切な手段がマイクロチャネル中の液体を運送するために設計され得、圧力−促進流、電気−浸透流、表面−張力促進流、移動−壁促進流、熱−勾配促進流、超音波−誘発流及び剪断−促進流が挙げられるが、これらに限定されない。これらの技術は当技術分野において知られている。
【０１７４】
バルビング及びポンピング
計画１：個別のマイクロチャネルに対応する隔壁の使用
この計画において、マイクロチャネル各々に接続する槽が隔壁により、例えば密閉用のポリメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）又は当技術分野において知られているようなその他の好適な材料を用いて密閉される。隔壁は気密な密封を作り出すので、隔膜に挿入されたニードル又はチューブを経由した（例えば空気又は窒素による）陽圧の印加は、流体がマイクロチャネルを（例えば、放射状マイクロチャネルが集まるスポーク−ホイールの中心へ）センサーチャンバ中の一つ以上のセンサー上へ流れ下るようにする。隔膜に挿入されたニードル又はチューブを通過した小さな吸引による陰圧の印加は、流体が異なる方向へ（例えば、スポーク−ホイールの中心にてチャンバから槽へマイクロチャネル中へ供給して）引き抜かれるようにする。
【０１７５】
そのようなニードル−隔膜配置の配列は、槽各々が、そしてそれ故、各々のマイクロチャネルが、個別に対応することを可能とする。この計画の使用は、マイクロチャネルの各々内部に含有される流体の同時に起こり且つ連続的なポンピング及びバルビングを可能とする。マイクロチャネルの各々に加えられた陽圧及び陰圧の精密制御を行使することにより、一つ以上のセンサー上への制御された流体流及び化合物の配送が達成され得る。マイクロチャネルの個別の対応を要求しない設計のためには（例えば、設計１−異なる流体の流れを横切るパッチされた細胞の迅速な運搬）、信号又は信号を備えた２，３の隔膜又は２，３の圧力制御装置で十分である。
【０１７６】
計画２：チャネル寸法を変化させることによる流体抵抗の制御
個別の隔膜を使用した上記設計は卓越した柔軟性及び制御を提供するが、化合物の配送及び流体流の連続性があらかじめ定められている特定の用途にとって、より単純な設計が実現の単純化及び容易化を提供する。この計画において、均等な陽圧が、例えば単一の隔膜を経由して全ての槽に均一的に加えられた加圧された空気を使用することによって又は入口及び出口槽の間の高さの違いによって引き起こされた重力流の使用を通して全ての槽に加えられる。一つ以上のセンサー上への各マイクロチャネルからの化合物の迅速で連続的な配送は各マイクロチャネルの流体抵抗を変化させることにより達成され、これは各マイクロチャネルの幅及び長さを変化させることによって容易に達成される。
【０１７７】
流体抵抗は、円形キャピラリに関して直径の４分の１の力及び長さによって直線的に増加する。マイクロチャネル各々の直径を徐々にそして体系的に変化させることによって、センサーチャンバ中の一つ以上のセンサー上への化合物の配送におけるマイクロチャネルの間の時間遅延が制御され得る。この計画は、多数の化合物が連続的に及び迅速にあらかじめ定められた時間遅延でパッチされた細胞／細胞上へ配送される高−処理能力薬物選別用途に対して特に適切である。
【０１７８】
計画３：チャネル寸法を変化させることによる流体抵抗の制御
この配置において、配列ウェルプレートの各々のウェルからの化合物は対応するマイクロチャネルに接続した外部チュービング又はキャピラリを通過して導入される。これらの外部チュービング又はキャピラリに付属する外部弁は流体流を制御するために使用され得る。多数の好適な外部弁としては手動的、機械的、電子的、空気圧的に、磁気的に、流体的に又は化学的手段（例えばヒドロゲル）によって作動されるものが挙げられ存在する。
【０１７９】
計画４：内部弁による流体流の制御
外部弁で流体流を制御するよりむしろ、使用され得る多数のチップ−ベース弁もある。これらのチップ−ベース弁は外部弁のために使用されるいくつかの同じ原理に基づき得、或いは、ボール弁、泡弁、動電弁、ダイヤフラム弁及び単発弁のように、完全に異なり得る。チップ−ベース弁を使用することの利点はそれらがマイクロ流体システムとの一体化に本質的にふさわしいことである。特に適切なものは受動的単発弁であり、これは上記した設計の実施に適している（例えば、分岐したチャネル形式）。
【０１８０】
その他の好適な形状は如何なる上記システムとも一体化し得る。一態様において、上記したマイクロ流体システムの少なくとも一つのチャネルは、二つ以上の別のチャネルからの流体の二つ以上の分離流を受ける混合チャネルである。混合チャネルは単一チャネル中の分離流を合流させるために使用され得る。そのような配置は、国際公開第０２／２２２６４号パンフレットに記載されているような二つ以上の分離流において異なる濃度に準備された材料の濃度勾配を確立するために使用され得る。
【０１８１】
パッチクランプ検知のマイクロ流体との相互作用
本システムは、細胞の電気的特性の変化を測定することにより細胞応答を監視するために使用され得る。一態様において、チップのセンサーチャンバは細胞−ベースバイオセンサーからなり、本システムはバイオセンサーのチャネルからの溶液の流れに対する応答を監視する検知器からなる。監視され得る一つの応答は、イオンチャネルの開閉に応答するバイオセンサーの電気的特性の変化である。例えば、バイオセンサーの膜を横切って流れる電流における変化は電圧クランプ技術を用いて測定され得る。電流は（例えば、単一イオン−チャネル開口に関して）数ピコアンペア（ｐＡ）乃至（ゼノパス卵母細胞のような巨大な細胞の細胞膜に関して）数μＡの範囲である。
【０１８２】
電圧クランプ技術の間で、パッチクランプはｐＡ範囲の電流を測定するために最も好適である（例えば、ネエル及びザクマン，１９７６，ｓｕｐｒａ；ハミル等，１９８１，ｓｕｐｒａ，ザクマン及びネエル，１９８３，ｓｕｐｒａ参照）。パッチクランプの低ノイズ特性は、無傷の細胞の原形質膜上へガラスマイクロ電極又はパッチクランプピペットをしっかりと密封し、その結果隔離されたパッチを生じることによって達成される。ピペット及び原形質膜の間の抵抗はバックグラウンドノイズを最小限にするために絶対不可欠であり、１０９オームを越えて「ギガシール」を形成すべきである。「ギガシール」形成の背後にある正確なメカニズムは議論されているが、塩−架橋、静電相互作用、及びファン・デル・ワールス力のような多様な相互作用がピペットのガラス表面及び細胞膜の脂質層中の親水性ヘッドとの間の相互作用を仲介することが提案されている(例えば、コーリー及びスティーブン，１９８３，単一−チャネルにおける記録，ｐｐ．５３−６８，Ｅｄｓ．Ｂ．ザクマン及びＥ．ネエル．ニューヨーク及びロンドン，プレナムプレス参照)。パッチクランプ技術の変化は、当技術分野において知られているような細胞全体記録、インサイド−アウト記録、アウトサイド−アウト記録、及び穿孔されたパッチ記録にて利用され得る。
【０１８３】
細胞全体記録において、細胞内部及び電極溶液の間の電気的接続（及び化学的経路）を確立するために電極チップを覆う細胞膜は吸引によって破裂される。電極溶液は細胞中の細胞質の量に比べて非常に過剰な量であるため（約１０μｌ対約１ｐｌ）、電極溶液中のイオン種を変化させることは細胞膜を越えて濃度勾配を作り出し、一定の受容体／イオン−チャネル複合体の膜貫通型のイオンの流れの方向及び規模を制御する手段を提供する。
【０１８４】
インサイド−アウト、及びアウトサイド−アウトパッチクランプ配置において、細胞質環境は細胞全体からの膜パッチの切除によって喪失する(例えば，ネエル及びザクマン，１９７６，ｓｕｐｒａ；ザクマン及びネエル，１９８３，ｓｕｐｒａ参照)。インサイド−アウト及びアウトサイド−アウトの両者の配置におけるパッチの切除を得るために、細胞は望ましくはセンサーチャンバの底部へ付着される。強く分離された細胞の場合、例えばポリ−Ｌ−リジンが、チャンバの底部と細胞を固定するために使用され得る。
【０１８５】
インサイド−アウト配置は膜の細胞質側をチャンバ中の溶液へ露呈することを可能とする。従って、それは単一−チャネルの度合いにおける第二−メッセンジャー活性化イオン−チャネルの開閉特性を研究するための選択の方法である。よって、細胞質のシグナル伝達分子の効果又はイオン−チャネル機能における酵素的活性は本配置を用いて研究され得る。一方、アウトサイド−アウト配置は、パッチの細胞外の側の露呈を可能とする。従って、それはリガンド−開閉又は受容体−操作イオン−チャネルの活性を監視するために使用され得る。
【０１８６】
低ノイズ度合いは、変調成分（例えば、アゴニスト又はアンタゴニスト）でより良い信号対ノイズ比を提供する。光学的条件の下、より高いフェムト−アンペア（１０−１５Ａ）範囲における単一−チャネル電流は変化し得る。（例えば、電極と細胞の間の好ましくない密閉によって引き起こされるような）ＧΩ−密閉の形成を容易にするノイズを減少させるストラテジーとしては、ガラス電極の火造り又は薬剤例えばシグマコート（ｓｉｇｍａｃｏｔｅ）を用いたガラス電極の表面処理が上げられるが、これらに限定されない。誘電性ノイズ及び容量性−抵抗性帯電ノイズはまた、都合のよい電極／ピペット形状を選択し、石英ガラスを使用し、そしてできるだけピペットの先端を絶縁するためにピペットのガラス表面をシルガード（登録商標）（シリコン、ＰＤＭＳ）で被覆することにより減少することが可能である。
【０１８７】
細胞全体配置の一つの頻繁に使用される修正である、穿孔パッチモードもまた使用され得る（例えば,Ｐｕｓｃｈ及びネエル，１９８８，ｓｕｐｒａの記載参照）。この技術において、穴はアンフォテリシン又はナイスタチン(例えば、アカイケ等，１９９４，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ４４：４３３−４７３；ファルケ等，１９８９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５１：１６７；Ｂｏｌａｒｄ等，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：５７０７−５７１５参照)のような細孔−作成蛋白質を用いて、細胞内信号伝達分子を損失することなくパッチされた細胞膜を横切る伝導性の増加を生じさせるために選択的に細胞膜中に作られる。
【０１８８】
定膜電位イオンチャネルを横切るイオン電流の測定に加えて、パッチクランプ技術が、公知の定電流又は時間依存性電流での膜電圧を測定するために使用され得る。このパッチクランプ配置は、「電流固定」と呼ばれ、リガンド−開閉イオン−チャネルの活性化又は電圧−開閉イオンチャネルによって引き起こされる膜電位の変化を測定し、活動電位（すなわち、周波数、継続時間及び振幅）における薬剤（例えば、薬物）の効果を監視するために使用され得るバイオセンサーを作り出すのに特にふさわしい。この技術はまた、神経細胞の興奮性における薬剤の影響を研究するため、薬剤の効果を研究するために使用され得る。従って、一態様において、本システムは、活動電位が誘発されたとき、電流固定モードにおける細胞−ベースバイオセンサーの圧力の閾値（例えば、過分極化又は脱分極化）の変調を監視するために使用される。
【０１８９】
別の態様において、本システムは、開口容量槽における細胞−ベースバイオセンサーを提供し、ＡＣモードにおけるバイオセンサーの膜を横切る膜の電気抵抗を測定することにより細胞膜における容量変化を監視するために使用される。例えば、本システムは、細胞からの小胞の放出（すなわち、エクソサイトーシス）及び／又は細胞による小胞の取り込み（すなわち、エンドサイトーシス）での薬剤の効果を監視するために使用され得る。
【０１９０】
マイクロ流体システムの電気生理学的パッチクランプ記録との相互作用の好ましい実施の形態の一つが図１Ａに記載されている。図１Ａには、単一のパッチ−クランプされた細胞が示されており；しかしながら、いくつかのパッチ−クランプされた細胞が同時に使用され得る。外部ポンプ及び流体制御設備が標準的な顕微鏡に隣接して設置される。望ましくは、全体的に一体化されたシステムがコンピュータで制御され、自動化される。本システムの異なる構成（すなわち、マイクロ流体、走査メカニズム、パッチクランプ等）が、分離した制御装置及び分離したソフトウェアを用いて分離して制御され得るが、望ましくはこれらの構成は全て上記のような単一のシステム処理装置によって制御される。
【０１９１】
本システムは従来のパッチクランプピペット又はマイクロピペットでの使用に容易に適用可能である。一態様において、細胞又は細胞の画分（例えば、細胞膜）がパッチクランプマイクロピペットの開口に位置決めされる。パッチクランプマイクロピペットは当技術分野において知られており、例えば、世界精密器具株式会社（サラソータ、フロリダ３４２４０ＵＳＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｐｉｉｎｃ．ｃｏｍ／ＷＰＩ  Ｗｅｂ／Ｇｌａｓｓ−Ｈｏｌｄｅｒｓ／Ｐａｔｃｈ  Ｃｌａｍｐ  Ｇｌａｓ．ｈｔｍｌ）から入手できる。ギガ−シール（ギガ−オーム）がマイクロピペットの端部及び細胞の膜との間に生じるまで、吸引がパッチクランプマイクロピペットへ加えられる。望ましくは、細胞の一つ以上の電気的特徴における変化が、細胞と接触するまでの流体流中のリガンド又は別の化合物の存在の決定の手段として監視される。例えば、電気的信号はマイクロピペット中の電極によって検知され得、望ましくは増幅して、システム処理装置へ送信され得る。基準電極もまた必要とされ、これはセンサーチャンバ中の溶液と接触している。
【０１９２】
多様な支持溶液がシステムチャンバ中での使用のために適応され得る。溶液の種類はセンサー及び評価される化合物に依存する。例えば、センサー溶液は従来のイオンチャネルのパッチクランプ分析のために使用される記録溶液であり得る。一般的に、パッチクランプ記録用溶液の正確な組成は評価されるチャネルの種類に依存して変化する（例えば，カリウムチャネルについて米国特許６，３３３，３３７号明細書；Ｃｌ−チャネルについて米国特許６，３２３，１９１号明細書及びナトリウムチャネルについて国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／０２００８号参照）；そのような溶液は当技術分野においてよく知られている。
【０１９３】
一態様において、パッチクランプ記録は自動化され、システム処理装置によって制御されている。例えば、システム処理装置は一つ以上のマイクロピペットの動きを事前にプログラム化された場所へ導く。別の態様において、システム処理装置は、一つ以上のマイクロピペットの動きをセンサーチャンバ中の細胞の画像分析に応答して導く（例えば、細胞の一つ以上の処理チャンバからマイクロピペットへの配送を監視するシステム）。好ましい態様において、パッチクランプデータの取得及び分析にマイクロ流体セッティング（例えば、圧力、弁及びスイッチ）を変化させるためそして走査パラメータ（例えば、走査の速度及び軌道、チャネルを超えた圧力降下）を制御するためのフィードバック制御が続き、システム処理装置によって、実行される。
【０１９４】
従来のパッチクランプシステムとの一体化に加えて、本発明によるマイクロ流体プラットフォームもまた、例えば、国際公開第９９／３１５０３号パンフレット；国際公開第０１／２５７６９号パンフレット；国際公開第０１／５９４４７号パンフレット；及び国際公開第９９／６６３２９号パンフレットに記載のようなチップ−ベースパッチクランプとの相互作用に関して理想的に適応される。この実施の形態は図１Ｃに示され、顕微鏡、マイクロピペット、マイクロ遠隔操縦装置等のようなシステムの構成要素を排除し得る。チップ−ベースパッチクランプは本発明の基板と容易に一体化する。チップ−ベースパッチクランプシステムはまた、単一の基板上でいくつかの細胞を一緒にパッチクランプする能力を提供する。
【０１９５】
本システムの使用方法
本発明は、多数の異なる生物学的活性分子及び化合物（例えば、候補薬）の標的分子からなるセンサーへの配送を制御するマイクロ流体システムを使用するための潜在能力を有効利用している。評価され得る好適な分子／化合物としては、薬物；刺激；毒物；蛋白質：ポリペプチド；ペプチド；アミノ酸；蛋白質、ポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸のアナログ及び修正形態；それらの抗体及びアナログ；免疫剤（例えば、その抗原及びアナログ、パプテン、ピロゲン等）；細胞（例えば真核細胞、原核細胞、感染細胞、トランスフェクトされた細胞、組換え細胞、細菌、イースト、配偶子）及びその蛋白質（例えば、細胞核、細胞小器官、分泌促進薬物；細胞膜の蛋白質）；ウィルス；受容体；受容体の変調成分（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト等）；酵素；酵素変調成分（例えば、阻害剤、補因子等）；酵素基質；ホルモン；代謝産物及びそのアナログ；核酸（例えばオリゴヌクレオチド；ポリヌクレオチド；フィブリノチド（ｆｉｂｒｉｎｏｔｉｄｅｓ）；遺伝子又はフラグメント、調節配列、及び／又はイントロン、及び／又はコーディング領域；対立遺伝子多型；ＲＮＡ；抗原分子、リボゾーム、ヌクレオチド、アプタマー）が挙げられるがこれらに限定されず、そのアナログ及び修正形態；化学及び生物戦争剤；金属クラスター；及び無機イオンを含む。
【０１９６】
如何なるこれら分子の二つ又はそれ以上の組み合わせは、連続的に又は同時にセンサーチャンバ中の一つ以上のセンサーへ配送され得る。化合物はまた製薬会社及び当技術分野におけるその他の商業的に可能な源（例えば、８０，０００化合物以上からなるリードクエスト（登録商標）ライブラリー、http://www.chemrx.Comから利用可能な足場当たり１０００乃至５０００化合物からなるＣｈｅｍＲｘ多様性ライブラリー、メンロパーク、ＣＡ，ナノスケール連結合成株式会社製を通して利用可能なナノシンファルマライブラリー等が挙げられるがこれらに限定されない）からの合成ライブラリーから得られ得、当技術分野においてよく知られた方法を用いた従来の合成方法を通して作り出され得る。分子が細胞へ配送された態様において、上記の分子の如何なるものも上記のように電界へ細胞を（例えば、電気穿孔に適応した細胞処理チャンバ中でまたはセンサーチャンバ中で）一時的に露呈することによって細胞によって吸収され得る。
【０１９７】
周期的に再過敏化されたイオンチャネルセンサーの提供
化合物（アゴニスト又は変調成分又は薬物）を広い範囲のイオンチャネルと結合させることは、これらのチャネルに立体構造変化を喚起するのみならず、細胞膜越えるイオンの流動を可能とし、イオンチャネルが脱過敏化されることを引き起こす、すなわち、長続きする、リガンド−結合、更に遮断及び不伝導状態になる(例えば、ジョーンズ及びウェストブルック，１９９６，ＧＬ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：９６−１０１参照)。多くの種類のイオン−チャネルの脱過敏化は通常数ミリ秒の間に起こり、中枢神経系におけるシナプスの情報が処理され修正される一つのメカニズムであると考えられる。脱過敏化はまた、神経伝達物質又はその他の神経修飾物質によるイオンチャネルの過度の活性で引き起こされた興奮毒性処理を防止する負のフィードバックメカニズムとして役割を果たす(例えば，ネイハム−レビー等，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．８０：２１５２−２１６６；スウォープ等，１９９９，Ａｄｖ．第二メッセンジャー燐蛋白質．Ｒｅｓ．３３：４９−７８参照)。
【０１９８】
一態様において、例えばＨＴＳ用途において高選別速度を達成するためには、センサーチャンバ中のパッチクランプ細胞を一つのマイクロチャネルの出口から次へ続けざまに移動させる。イオンチャネル及び受容体の迅速な再過敏化を達成するために、被検変調成分（ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、アゴニスト又は受容体／イオンチャネルの薬物からなるマイクロチャネル配送サンプルは、受容体／イオンチャネル（例えば、如何なるアゴニストも含まない緩衝液）の再過敏化のためのマイクロチャネル配送緩衝液と互いにかみ合う。イオンチャネル及び受容体の再過敏化に加えて、リガンド及び薬物露呈の間の細胞上へのこの緩衝液の配送は、細胞へ事前に投与したリガンド及び薬物を洗い去るために供給される。従って、この態様において、本システムは、周期的に敏感なイオンチャネルセンサーを提供することによって特定のイオンチャネルのアゴニスト又は変調成分又は薬物を選別するために使用される。例えば、センサーへの緩衝液の脈動した又は定常−状態の流体の配送を提供することによって、本システムは候補アゴニスト又は変調物質又は薬物を配送するチャネル出口へ露呈するとき、再過敏化される細胞を提供する。図２４Ａ−Ｃはセンサーチャンバ中へ流れ込む２６の出口からなるマイクロ流体チップを使用した一つの方法による未知のアゴニストの擬似選別を示している。チャネル各々の中身は図２４Ａに示される。既知の薬理作用（例えば、既知の効能又は潜在効果）を備えたアゴニストは内部統制又は内部標準としての役割を果たす特定のチャネルに含まれる。この実験の得点表、すなわちマイクロチャネル各々について得られたパッチクランプ応答は図２４Ｃに示される。
【０１９９】
別の実施の形態において、パッチ−クランプされた細胞に近接した追加の過融解ピペットが、例えばパッチピペットに隣接するか又はパッチピペットに対して同軸の配置にて（詳細は以下のように）、細胞表面の受容体／イオンチャネルを連続的に再過敏化／洗浄するために使用される。これは細胞がきわめて迅速に再過敏化されそして洗浄されることを可能とし（例えば、ｍ秒以内）、イオンチャネル活性のいくつかの異なる読み込み／位置合わせによって細胞がチャネル出口を横切って動くようにすることを可能とする。図２７Ａ−Ｃは、パッチ−クランプされた細胞に同軸又は直角又は別の方法で非常に近接して流体チャネル（又はマイクロピペット）を用いたアゴニストを含まない緩衝溶液の脈動過融解とセンサーチャンバ中へ流れ込む１４出口からなるマイクロ流体チップの使用とを組み合わせたアゴニストの選別のために使用される迅速な再過敏化の擬似方法を示している。各マイクロ流体チャネルの中身は図２７Ａに示される、既知の薬理作用（例えば、既知の効能又は潜在効果）を備えたアゴニストは内部統制又は内部試験化合物としての役割を果たす特定のチャネルに含まれる。
【０２００】
図２７Ｂに示される、マイクロ流体チャネル出口を横切る細胞−ベースバイオセンサーの直線、単一、前方への走査に関する擬似トレースは、単一のマイクロチャネル出口当たり得られた複数のピーク応答を示している。この実験に関する得点表、すなわち各マイクロチャンネルに関して得られたパッチクランプ応答が図２７Ｃに示される。この場合、開口容積中へとマイクロチャネルを出るリガンドはガウス分布を有するということを模範にしたので、ガウス−分布応答が得られた。多くの別の種類の分布が、流れの平行の度合いのような実験パラメータ及び基板の形状に依存して得られ得る。しかしながら、単一のマイクロチャネルの出口を横切るそれらの通過の間のこの種の繰返される細胞の過融解は、用量−反応情報及び高信号対ノイズ比が迅速に脱過敏化する受容体／チャネルのために得られる。
【０２０１】
所望のデータを得るため、サンプル及び緩衝液の個別の流れを横切る細胞の多様な走査速度及びマイクロチャネルの各々を横切る多様な圧力低下は、本システムによって、事前にプログラムされた指令から又はパッチクランプ電極（例えば、検知された信号に基づくか又は即時応答にて）と電気的に連通した検知器からのフィードバックシグナルに応答するかの何れかで、実行され得る。
【０２０２】
本システムは、従って、受容体／イオンチャネルからなる細胞の周囲の微環境を迅速に変化させるために使用され得る。例えば、本システムは周期的に敏感なイオンチャネルを提供し得る。ここにおいて使用される基板及びマイクロチャネルの寸法が小さいので、これは迅速な大量輸送を可能とし、本システムは使用者が薬物の選別をすること可能とし、場合によっては、薬物及び再過敏化溶液が連続的に同程度の速度でセンサーへ配送される場合、一秒当たり数百の速度で（すなわち、一時間当たり数百万）一つのパッチクランプセンサーを使用する。上記のように、走査速度は、細胞−ベースセンサーの生理学上の応答の責任を負うために修正され得、例えばよりゆっくりな走査速度をゆっくり釣り合う受容体に提供する。
【０２０３】
用量−反応曲線の作成及びイオン−チャネル薬理学の分析
用量−反応曲線は薬物の活性及び潜在能力に関する多様な情報を提供する。マイクロピペットを伴う従来の方法を用いて用量−反応曲線を得ることは、しばしば時間がかかり得、うんざりするものであった。本発明は、細胞の周囲の微環境の迅速且つ制御された操作のためマイクロ流体を使用しており、用量−反応測定に他に類を見ないほど合っている。用量−反応の関係は殆んどの場合線形対数プロットのＳ状曲線に従い、ヒルロジスティック関数によって説明され得る：
Ｉ−Ｉｍａｘ／［ｌ＋（ＥＣ５０／Ｃ）ｎ］
ここにおいて、Ｉは細胞全体電流であり、Ｃはリガンドの濃度、Ｉｍａｘは最高電圧（すなわち、全てのチャネルが開口状態の場合）、ＥＣ５０は最高値の半分であり（すなわち、受容体集団の半分が活性化されたとき、及びしばしばＫＤリガンドの解離定数と等しい）、ｎは、受容体に結合するリガンドの化学量論を反映するヒル係数である。
【０２０４】
一態様において、アゴニストの用量−反応情報を達成するために、センサーチャンバ中のパッチ−クランプされた細胞が一つのマイクロチャネルの出口から続けざまに次へ移動する。異なる濃度のアゴニストを配送するマイクロチャネルはアゴニストの含まない緩衝液を配送するマイクロチャネルと互いにかみ合わせる（例えば、上記したように受容体／イオンチャネルを再過敏化するため及び／又は事前に細胞へ投与した化合物を洗い去るため）。望ましくは、直列的又は連続的に希釈されたアゴニストが異なるチャネル中へ装填される。図２６Ａは５６−チャネル基板中のそのような装填計画である。アゴニストはチャネル５２中で最も高い濃度で存在し、次に各々の次に続くチャネルにてチャネル６まで直列的に希釈される。既知の薬理作用（例えば、既知の効能又は潜在効果）を有するアゴニストは内部標準としての役割を果たす特定のチャネル中に含有されている。望ましくは、最も高い濃度を備えたチャネルから最も低い濃度を有するチャネルへのアゴニスト濃度は多くの桁数の範囲にわたる。図２６Ｂは上記したような異なる濃度のアゴニストの擬似パッチクランプ記録を示している。この擬似実験に関する得点表、すなわち、図２６Ｃに示されるようなマイクロチャネル各々に関して得られたパッチクランプ応答、から、用量−反応曲線が構成され得る。
【０２０５】
同様に、いくつかの変更で、用量−反応曲線が、以下により詳細に記載されている本システムを用いるのと同様にアンタゴニストについて得られ得た。その上、上記のように、マイクロ流体のパッチクランプとの組み合わせは、例えばリガンドのその受容体に対する会合及び解離定数や、変調成分がアゴニストかアンタゴニストかといった、イオン−チャネルの変調成分についての広い範囲の情報を提供し得る。しかしながら、用量−反応情報を、緩衝液の互いにかみ合う流れで受容体を洗浄又は再過敏化することなく、リガンドの度重なる応答から得ることも可能である。この態様において、マイクロチャネルは異なる濃度でのリガンド溶液のみを含む必要がある。
【０２０６】
（ｉ）アゴニストの検知及び特徴づけ
不完全アゴニスト
受容体−仲介応答を達成する薬物分子の能力は、全か無かの特徴というよりはむしろ段階的な特徴である。同じ受容体における一連の化学的に関係のあるアゴニスト活性が細胞で試験された場合、最高の応答（すなわち、高濃度のアゴニストによって生じられ得る最も高い応答）は一般的にあるアゴニストと互いに異なる。（「全的アゴニスト」として知られる）いくつかの化合物は最高の応答を生じ得、一方、その他は「不完全アゴニスト」と称され、亜最大の応答を生じ得るのみである。「不完全アゴニスト」は従って、受容体との結合から全てのアゴニストを妨害することにより「弱いアンタゴニスト」として作用し得る。従って、最高の応答を生じる基地のアゴニストと共に規定されたイオン−チャネルを使用することによって、アゴニストの活性の勾配が監視され得る（図２４参照）。
【０２０７】
（ｉｉ）アンタゴニストの検知及び特徴づけ
一態様において、本システムは、イオン−チャネル活性のアンタゴニストについて選別するために使用される。評価し得る好適なイオン−チャネルとしては：（ｉ）脱−過敏化しないイオンチャネル；（ｉｉ）脱過敏化されたイオン−チャネル（ｉｉｉ）脱過敏化されたイオン−チャネルであるが、活性化されると大きな電流変動を仲介する；及び（ｉｖ）その脱過敏化特性がアロステリック変調成分（例えばレクチン）の不可逆的結合によってブロックされたイオンチャネルが挙げられる。アンタゴニストを検知するため、バイオセンサーによって発現されたイオン−チャネル又は受容体は、アンタゴニストの用途の前又は後に、アゴニスト薬物によって実行される又は「試験される」必要がある。例えば、異なるアンタゴニストは既知の薬理学的特性を備えた明確なアゴニスト共に適用され得る。異なる濃度のアンタゴニストはまた一定の濃度のアゴニストと共にマイクロチャネル中へ装填され得る。
【０２０８】
イオンチャネル及び受容体の迅速な再過敏化を達成するために、（例えば、リガンド及び薬物のような）アゴニスト及びアンタゴニストを含むマイクロチャネルは、如何なるアゴニスト又はアンタゴニストも存在しない緩衝液（例えば、受容体／イオンチャネルの再過敏化のための緩衝液）を配送するマイクロチャネルと互いにかみ合わせることが可能である。再過敏化イオンチャネル及び受容体に加えて、リガンド及び薬物への露呈の期間の間の緩衝液への細胞の露呈は、細胞へ事前に投与したリガンド及び薬物を荒いサル役割を果たす。従って、この態様において、本システムは、周期的に敏感なイオンチャネルセンサーを提供するために使用され得る。アンタゴニストはアンタゴニスト−誘発性応答の阻止によってこのシステムにおいて検知される。
【０２０９】
別の態様において、本システムは常に予備−活性化された受容体／イオン−チャネルによって仲介された信号における減衰を通して検知され得たアンタゴニストについて選別するために使用される。この特別な装置において、異なるチャネルが異なるアンタゴニスト、又は同じアンタゴニストを異なる濃度、又は両者の組み合わせで装填され、一方、アンタゴニストからなる各チャネルは、一定の濃度のアゴニストからなる。受容体及びイオンチャネルの連続的な活性を達成するために、アゴニスト及びアンタゴニストを含有するマイクロチャネルは、アンタゴニストを補足したチャネルにおいて見られるように、緩衝液及びアゴニストを同じ濃度で配送するマイクロチャネルと互いにかみ合っている。リガンド及び薬物の露呈の間に細胞上へアゴニストを補足したこの緩衝液の配送は、細胞へ事前に投与されたリガンド及び薬物を洗い去る役割を果たし、また受容体／イオンチャネルを再過敏化する役割を果たし得る。
【０２１０】
そのような実験の模擬試験はず２５Ａ−Ｃに示される。各チャネルの中身は図２５Ａに示される。既知の薬理作用（遮断効力）を有するアンタゴニストは内部標準としての役割を果たす特定のチャネル中に含有される。図２５Ｂ中に示された擬似トレースは、マイクロ流体チャネル出口を横切る細胞−ベースバイオセンサーの直線的な単一前進走査を表現している。図に示すように、複数のピーク応答が単一マイクロチャネル出口ごとに得られる。この実験のための得点表、すなわちマイクロチャネル各々に関して得られたパッチクランプ応答は、図２５Ｃに示し、これから最も高い遮断効力を有するアンタゴニストが特定され得る。
【０２１１】
競合的拮抗作用
この種の拮抗作用は、受容体上の同じ結合サイトでのアゴニストとアンタゴニストとの間の競合に注意を向ける。同じ最高応答及び曲線の傾きを維持する間に、反転可能拮抗作用は用量−反応曲線の傾きにおけるより高い濃度へのシフトにより特徴付けられる。不可逆競合的拮抗作用において、細胞がアゴニストへ露呈させる場合、アンタゴニストの占有する変化は観察されない。
【０２１２】
非競合的拮抗作用
非競合的拮抗作用とは、ある時点でアンタゴニストがブロックされると、一連の出来事がアゴニストによる応答の発生をもたらすという事態を表現している。この種の拮抗作用において、アゴニスト及びアンタゴニストのいずれかが受容体／イオンチャネルの異なる部位へ結合するか、或いはアンタゴニストが単純にイオンチャネル細孔をふさいでしまう。正味効果はアゴニストの用量−反応曲線の傾斜及び最高値を減少させることである。
【０２１３】
等比体積の阻害
この種の拮抗作用は、ある濃度以上でアゴニストの自己−阻害と呼ばれる；すなわち、アゴニストは十分高濃度ではそれ自身の活性に拮抗し始める。ベル形用量−反応曲線はしばしばこの種の拮抗作用の存在を示唆する。
【０２１４】
予備接合的に発現したイオン−チャネルの変調成分の検知
別の態様において、本システムは予備接合的に発現したイオン−チャネルの変調成分を検知するために使用される。予備接合的局所的イオンチャネルを研究するためのストラテジーとしてはしばしば、プロテオリポソーム又は平面的なリン脂質二重層中へ挿入されたシナプトソームのパッチクランプ記録（すなわち、脳組織を均質化することにより生成されたピンチド−オフ（ｐｉｎｃｈｅｄ−ｏｆｆ）神経末端）が挙げられる(例えば、ファーリー及びルーディー，１９８８，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５３：９１９−９３４；ヒラシマ及びキリノ，１９８８，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ９４６：２０９−２１４の記載を参照)。上記のヒラシマ及びキリノ，１９８８の方法は、予備接合的に発現したイオン−チャネルからなる巨大プロテオリポソームを作成する単純で迅速な技術であるので、特に好ましく、これは本発明によるシステムにおいてパッチクランプ分析のためのバイオセンサーとして使用され得る。
【０２１５】
オーファン受容体／イオン−チャネルに作用するリガンドの検知
従来の薬物発見アプローチはしばしばリガンドの生物学的活性の発見によって始まり、これは実質的にその組織の薬理学及び生理学的役割を特徴付けるために使用されている。典型的には、リガンドが特徴付けられた後、対応する受容体がＨＴＳの用途において選別される薬物のための標的として同定される。オーファン受容体（すなわち、未定義の生物学的活性を備えた受容体）を特徴付けるための比較的新規なストラテジーはしばしば「逆の薬理学的」アプローチと呼ばれている。
【０２１６】
逆のアプローチは、そのリガンドの検知のための標的として使用される未知の機能のオーファン受容体で始まる。リガンドは次に受容体の生物学的及び病態生理学的役割を探求するために使用される。受容体の治癒的価値を決定するのに助けになるアンタゴニストを作り出すために、高処理能力の選別はリガンドが生物学的に特定されると同時に受容体上で始まる。
【０２１７】
本発明は、逆の薬理学的アプローチに特に有効である。一態様において、本システムは外因性オーファン受容体を発現する外からの細胞株である細胞−ベースバイオセンサーからなる（例えば、イオンチャネル）。好適な体内の細胞株としてはＨＥＫ−２９３，ＣＨＯ−ＫＩ及びＣＯＳ−７が挙げられるがこれに限定されない。
【０２１８】
外からの細胞バックグラウンド中のイオンチャネルの選別と連結するいくつかの利点がある。第一に、（例えば、オーファン受容体を通常発現しない）ゼロのバックグラウンドを含むトランスフェクトされた細胞株は、観察されたシグナルに関与する遺伝子の分子同一性を確信させる。第二に、オーファン受容体は発現されすぎ得る、よってシグナルとノイズの選別読み出しを改良する。第三に、低いバックグラウンド導電性を有する宿主細胞はイオンチャネルの特定の種類の非常に感度の良い検定が可能なため選択され得る。最後に、これらの細胞は培養することが比較的容易であり、自動化された選別システムによって扱われるのに十分丈夫である。
【０２１９】
小胞が放出する神経伝達物質の変調成分の検知
膜容量を測定するためのパッチ−クランプ技術は、１０年以上前に開発され（例えば、ネエル及びマーティ，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：６７１２−６７１６参照）、根本的なメカニズムを研究しエクソサイトーシスを制御する強力な道具を提供している。
【０２２０】
細胞の表面積はエクソサイトーシス及びエンドサイトーシスの間のバランスに依存する。エクソサイトーシは小胞の中身（すなわち、神経伝達物質）の細胞外空間中への放出、及び小胞膜の原形質膜への組み込みをもたらし、細胞表面領域の増加をもたらす。エクソサイトーシス的な又エンドサイトーシス的な活性の変化は従って、細胞表面積の変化の測定により監視され得る。
【０２２１】
膜容量は細胞の電気的パラメータであり、原形質膜面積に比例する。従って、特定の容量が一定のままである場合、予備接合的に（ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃａｌｌｙ）に配置されたイオン−チャネルを通過するエクソサイトーシス的な又エンドサイトーシス的な活性の活性薬物−誘発性変調から生じる原形質膜領域中の変化は、本システムの開口センサーチャンバにおけるパッチクランプを用いて膜容量を測定することによって監視され得る。
【０２２２】
細胞の浸透特性の決定
選別手順において使用される細胞が広い範囲イオンチャネルタイプを発現する場合、細胞の活性化されたイオンチャネルの浸透特性を特性化することは、薬物の細胞との相互作用を特性化するために使用され得る。イオン−チャネルの浸透特性についての情報は、異なる保持電位でのアゴニスト−誘発電流の測定から生じる、電流と電圧との関係を評価することにより決定され得る逆転電位を監視することによって決定され得る。逆転電位と、細胞内及び細胞外イオン濃度についての知識とを採用することにより、相対的イオン−チャネル浸透性が異なるモデルから決定される。
【０２２３】
電流トレースのノイズ分析
アゴニストによって活性化されたイオンチャネルからの電流−トレースの分析は、アゴニスト−イオン−チャネル相互作用の更なる特徴づけのための全体的な−及び単一の−チャネルの度合いの両者にて達成され得る。総電流のために得られる自己相関関数のフーリエ変換は、単一又は二つのローレンツ関数に適合させることが可能な細胞全体パッチクランプ生産量パワースペクトルで記録された。これらの適合は、電流感度（すなわち、折点周波数）の周波数依存の分析を通して平均単一−イオンチャネル伝導性及びイオン−チャネル動力学（例えば、平均単一チャネル開口時間）についての情報を提供する。原理上は、より困難で時間のかかる技術ではあるが、外部−外（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔ）パッチ−クランプ配置から得られる記録もまた、単一−チャネル開口間隔及び同じ受容体−イオンチャネル複合体によって仲立ちされた異なる伝導性の度合いを測定するために分析され得る。
【実施例】
【０２２４】
本発明は、ここに以下の実施例に関して更に例示される。当然のことながら以下のものは実施例のためでしかなく、細部に対する変更は本発明の範囲内に入る場合常になされ得る。
【０２２５】
実施例１．マイクロ加工
図１９は、ＳＦ６の深部反応性イオンエッチングによってシリコンに加工されるマイクロチャネルの例を示している。フォトリソグラフィのためのマスクをＪＥＯＬＪＢＸ−５ＤＩＩ電子ビームリソグラフィシステム（中反射（ｍｅｄｉｕｍ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ）４”クロムマスク及びシプリーＵＶ５レジスト、５０ｋｅＶ  ａｃｃ．電圧、線量１５μＣ／ｃｍ−２、露光電圧５ｎＡ）で書き込む標準ｅ−ビームを使用して作製した。レジストを２０００ｒｐｍにて６０秒スピンコートし、２５０ｎｍのレジストを生じさせ、露光前に熱板上にて１３０℃で１０分間弱焼付けした（ｓｏｆｔ  ｂａｋｅ）。パターンを１３０℃のオーブンにて２０分間後露光焼付けし、シプリーＭＦ２４−Ａ中にて現像し、６０秒ＤＩ水中にてすすぎ、そして活性イオンエッチャー（ｅｔｃｈｅｒ）中にてエッチングした（プラズマサーム（Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍ）ＲＩＥ  ｍ−９５，３０ｓ，５０Ｗ，２５０ｍトル，１０ｃｃｍ  Ｏ２）。クロムを１−２分間バルザーズクロムエッチ＃４（Ｂａｌｚｅｒｓ  ｃｈｒｏｍｅ  ｅｔｃｈ＃４）中にてエッチングし、シプレー１１６５リムーバを用いてマスクの残ったレジストを剥ぎ取り、アセトン、イソプロパノール及びＤＩ水にてすすいだ。７００ｎｍの熱成長二酸化ケイ素及び全厚さ３８０μｍのＡ３”、［１００］、二面磨き上げられた、低Ｎ−ドープシリコンウェアを活性イオンエッチャー（ｅｔｃｈｅｒ）プラズマサーム（Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍ）ＲＩＥ  ｍ−９５（３０ｓ，５０Ｗ，２５０ｍトル，１０ｃｃｍ  Ｏ２）中にて洗浄し、シプリーＳ−１８１３フォトレジストで４０００ｒｐｍにてスピンコートし、１．３μｍのレジストを生じさせ、そしてＣａｒｌ  Ｓｕｅｓｓ  ＭＡ６マスクアライナー上を４００ｎｍの波長にて１００ｍＪ／ｃｍ−２の線量で露光した。ウェハをシプリーＭＦ３１９中にて４５秒間現像し、ＤＩ水中にてすすぎ、そして活性イオンエッチャー（ｅｔｃｈｅｒ）（プラズマサーム（Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍ）ＲＩＥ  ｍ−９５，３０ｓ，５０Ｗ，２５０ｍトル，１０ｃｃｍ  Ｏ２）中にて灰色にした（ａｓｈｅｄ）。ウェハを１０分間１３０℃にて強焼きし、二酸化ケイ素をシオテック（ＳｉｏＴｅｃｈ）緩衝化酸化エッチングでエッチングし、ＤＩ水中にてすすいだ。ウェハの残ったレジストをアセトンで剥ぎ取り、イソプロパノール及びＤＩ水ですすいた。ウェハの反対側をシプリーＡＺ４５６２フォトレジストで３０００ｒｐｍにて３０秒間スピンコートし、おおよそ８μｍのレジストを生じさせ、熱板上にて３分間１００℃にて弱焼付けし、そしてＣａｒｌ  Ｓｕｅｓｓ  ＭＡ６マスクアライナー上を４００ｎｍの波長にて４８０ｍＪ／ｃｍ−２の線量で露光した。パターンをシプリーＭＦ３１２及びＤＩ水の５０：５０混合物中にて２００秒現像し、ＤＩ水中にてすすぎ、そして活性イオンエッチャー（ｅｔｃｈｅｒ）（プラズマサーム（Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍ）ＲＩＥ  ｍ−９５，３０ｓ，５０Ｗ，２５０ｍトル，１０ｃｃｍ  Ｏ２）中にて灰色にした（ａｓｈｅｄ）。
【０２２６】
パターンはフォトレジストＡＺ４５６２にて輪郭をはっきりさせ、記録チャンバ及び連結したアクセスホール及びサンプルウェルはＳＴＳマルチプレックス深部反応性イオンエッチャー（ｅｔｃｈｅｒ）中にてＳＦ６をエッチングガスとして、Ｃ４Ｆ８を不活性化ガスとして使用し、６００ＷのＲＦ電力（ＲＦ  ｐｏｗｅｒ）及び３０Ｗのプラテン電力（ｐｌａｔｅｎ  ｐｏｗｅｒ）にて、エッチングされた。本システムは一定のＡＰＣ角度の７４％にて操作され、エッチング時間は１２秒であり超過時間１秒を含み、不動態化時間８秒であり超過時間１秒を含んでいた。エッチング速度はおおよそ４．９ｍ／分でありエッチング時間６０分でおおよそ３００μｍの深さとなる。ウェハの残ったレジストをアセトン中にて剥ぎ取り、イソプロパノール及びＤＩ水中にてすすいだ。
【０２２７】
マイクロチャネルを特徴付ける二酸化ケイ素におけるパターンを、８００ＷのＲＦ電極、一定のＡＰＣ角度の６８％にて、そしてエッチング時間が７秒であり超過時間０．５秒を含み、そして不動態化時間４秒であり超過時間１秒を含む以外は、前記と同じシステムでエッチングした。エッチング速度はおおよそ３．３ｍ／分でありエッチング時間３０分でおおよそ１００μｍの深さとなる。ウェル及び記録チャンバを完全にエッチングしその結果これらのポイントにてウェハ中に穴が得られた。チャネルはコーニング社の＃７７４０ホウケイ酸ガラスの３”，１００μｍの厚さのウェアに４５０℃の温度及び１０００Ｖの電圧にて陽極結合を用いて密閉した。結合の間の最大電流は典型的には５００μＡであった。
【０２２８】
実施例２．パッチ−クランプされた細胞のマイクロ流体−ベース緩衝液過融解及び細胞走査を用いた再−過敏化
マイクロチャネルをポリマー、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中に成型し、これらを次にガラスカバースリップ上に不可逆的に密閉して、４つの壁を有する閉鎖チャネルを形成した。
【０２２９】
用いられた手順は以下の通りである：
（１）ＰＤＭＳを成型するために使用されるシリコンマスターを、ウェハを第一に洗浄することによりフォトレジストへの良好な接着性を確保し、続いてウェハ上にネガティブフォトレジスト（ＳＵ８−５０）の層（〜５０μｍ）をスピンコーティングすることにより加工した。このネガティブフォトレジストの層を次に弱焼付けしフォトレジスト中に含まれた溶媒を蒸発させた。マスクアライナーを備えたフォトリソグラフィを、ｅ−ビーム書き込みを用いて調製された適切なパターンを有するフォトマスクを用いて実行した。露光されたウェハを次に焼付け、適切な現像液（例えば、プロピレングリコールメチルエーテルアセテート）中にて露光されていないフォトレジストを洗い流すことにより現像した。
（２）この現像されたウェハ（マスター）は、トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル−１−トリクロロシラン数百マイクロリットルを有する真空で数時間シラン化すること（ｓｉｌａｎｉｚｉｎｇ）により不動態化された表面であった。
（３）脱気ＰＤＭＳプレポリマーをシリコンマスターの頂部に注ぎ、オーブンに入れ６０℃で２時間硬化させ、（４）マイクロチャネル特性を含む硬化したＰＤＭＳモールドを、次に酸素プラズマ中にて１分間酸化した後、ガラス基板へ不可逆的に密閉した。本実施例において我々が使用したチャネルの寸法はおおよそ１００μｍの幅及び５０μｍの深さであった。
【０２３０】
ここに記載された実験は単純な単一−チャネル構造を使用した。適切な寸法を有する鋭い穴−穿孔機でＰＤＭＳを貫通する滑らかな穴を第一に開けることにより、このマイクロチャネルをポリエチレンチュービングへ相互作用させた。穿孔された穴よりわずかに大きい外径を有するポリエチレンチュービングが穴中へ挿入され、チュービングがＰＤＭＳのゴム上の性質によって圧力シールを形成した。ポリエチレンチューブを適切な大きさ（内径）を有するシリンジの針へ接続し、これをシリンジへ接続した。流体流を配送するため制御された圧力を高精度シリンジポンプ（ＣＭＡ／１００，マイクロ注入ポンプ、Ｃａｍｅｇｅｉ  Ｍｅｄｉｃｉｎ）で完成させた。
【０２３１】
パッチクランプ実験を細胞全体配置（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）にて実施した。細胞全体記録用のピペットを肉厚の１．５ｍｍの外径及び０．８６ｍｍの内径を有するホウケイ酸ガラスキャピラリ(ハーバード器具ＬＴＤ、イーデンブリッジ、ケント、ＵＫ)から加工した。先端の直径及び電気抵抗は夫々〜２．５Ｍ及び５−１５ＭΩであった。おおよその直列抵抗は常に５０ＭΩより大きく、保持電位は直列抵抗による電圧エラーのために修正される。パッチクランプ電極溶液は１００−ｍＭのＫＣＩ，２−ｍＭのＭｇＣｌ２，１−ｍＭのＣａＣｌ２，１１−ｍＭのＥＧＴＡ及び１０−ｍＭのＨＥＰＥＳを含み；ｐＨはＫＯＨで７．２に調整された。全ての実験を室温（１８−２２℃）にて実行した。
【０２３２】
信号をアクソパッチ２００Ａ（アクソン株式会社、カリフォルニア、Ｕ．Ｓ．Ａ）パッチ−クランプ増幅器で、−７０ｍＶの保持電位にて記録し、デジタル化し、コンピュータハードドライブ（サンプル周波数１０ｋＨｚ，フィルタ周波数２００Ｈｚ、８極ベッセルフィルタ）に記憶させ、そしてＰＣ及びクランプフィット（Ｃｌａｍｐｆｉｔ）８．１ソフトウェア（アクソン株式会社）を用いて分析した。マイクロチャネル構造を含有する実験のチャンバを４０×及び１０×の対物レンズ（ニコン、日本）を備えた倒立顕微鏡試料台に取り付けた。走査速度を記録するためのビデオに接続されたＣＣＤカメラ（ハママツ）が顕微鏡に取り付けられ、ビデオのためのサンプリング速度は２５Ｈｚであった。極微操作装置（ナリシギ、日本）に加えてこの設備をファラデー箱内部の振動隔離テーブル上に設置した。パッチクランプ増幅器、デジデータ（Ｄｉｇｉｄａｔａ）ボード、フィルタ、ビデオ及びＰＣを箱の外部に保ち、回線周波数からの干渉を最小化した。
【０２３３】
接着性ＰＣ−１２細胞をペトリ皿中の円形のカバースリップ上で２−６日間培養した（抗体及びアンチミオコチン（ａｎｔｉｍｙｏｃｏｔｉｎ）（０．２％），牛胎仔血清（１０％）及びＬ−グルタミン）の補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液）。パッチクランプ実験の前に、１０ＨＥＰＥＳ，１４０ＮａＣＩ，５ＫＣＩ，１ＣａＣ１２，１ＭｇＣＩ２，１０Ｄ−グルコース（ｐＨ７．４）を（ｍＭ単位で）含む：ＨＥＰＥＳ−塩緩衝液中で細胞を洗浄し分離させ開口緩衝液槽中のマイクロチャネルの出口に設置した。
【０２３４】
パッチ−クランプされた細胞で細胞全体の配置を調査することなく密閉強度を試験した。−７０ｍＶの膜保持電位を印加し、チャネル出口から１０μｍ離して細胞を位置決めした。密閉が連続的にモニタされる間に、異なる流速を、これは０．３−２１ｍｍ／秒の間の値であるが、適用した。この特定の実験において、パッチされた密閉は６．７ｍｍ／秒までの流速に（現時点のトレースに変化がない場合）安定であった。
【０２３５】
再−過敏化に関し、アゴニストを開口槽へ添加し、ここで、緩衝液がシリンジからマイクロチャネル中へ配送され開口槽中へマイクロチャネルから出る間に、細胞がパッチされた。パッチ−クランプされた細胞をマイクロチャネルの出口から〜１０μｍ離して設置した。パッチ−クランプされた細胞が存在する槽を１ｍＭのアセチルコリン（アゴニスト）で満たした。緩衝液をマイクロチャネル中へシリンジ・ポンプによって配送し、マイクロチャネルを通過させて連続的に〜３ｍｍ／秒にて流した。
【０２３６】
マイクロチャネルの出口から〜１０μｍ乃至〜８０μｍマイクロチャネルと平行な方向に細胞を移動させたので、ギガオームシール（ｓｅａｌ）は安定（５−２０Ｇオーム）であり、電流が観察されなかった。この事実はパッチ−クランプされた細胞はマイクロチャネルから出る緩衝液によって過融解され、その結果、開口槽中のアゴニストと接触しないことを意味する。〜８０μｍにてマイクロチャネルの出口からパッチされた細胞が走査され、繰返して〜１００μｍ／秒にてアゴニスト含有槽とマイクロチャネル出口との間でマイクロチャネルと垂直な方向に走査された（図２０）。
【０２３７】
より長い時間（＞５秒）アゴニストへ露呈させた後、細胞全体の平均電流の減少として電流応答の脱−過敏化が観察され得た。アゴニストへのより短い露呈時間（＜５秒）の細胞の脱−過敏化も、短い露呈を繰り返す間の細胞の脱過敏化も、パッチされた細胞がアゴニスト無しの緩衝液中にて各露呈の間に脱−過敏化されない限り観察されなかった。
【０２３８】
実施例３．ＨＴＳの用途に関する、リガンド及び緩衝液の互いにかみ合う流れ全体にわたるパッチ−クランプされた細胞の迅速な走査
本発明を用いるＨＴＳの実施の好ましい実施の形態の一つは、緩衝液及びリガンドの互いにかみ合った流れを横切ってパッチ−クランプされた細胞を迅速に走査することであり、各リガンド流が異なる薬物に対応している。これらの用途において、上記したように、マイクロチャネルを出る流体の流速及びパッチされた細胞の走査速度の両者が重要である。図２１Ａ−Ｄは、７−チャネル構造の出口を横切って走査された後の、パッチ−クランプされた細胞全体の応答を示している。各チャネルの幅は１００μｍであり、厚さは５０μｍであり、そしてチャネル間の間隔は２５μｍである。この７−チャネル構造は図１６Ｂに示されるものと同一である。マイクロチャネルを加工するため及びパッチクランプするために使用される手順は実施例２に記載されたものと同一である（上記参照）。使用されるパッチクランプされた細胞はＰＣ−１２細胞であった、これはマイクロチャネルの出口から１０乃至２０マイクロメータの間離れて設置された。チャネル１，３，５及び７をＰＢＳ緩衝液で満たし、一方チャネル２，４及び６をアセチルコリンで満たした。流体流の流速は６．８ｍｍ／秒であった。
【０２３９】
図２１Ａ−Ｄにおいて、パッチ−クランプされた細胞を異なる４つの走査速度：Ａ、０．６１ｍｍ／秒；Ｂ、１．２２ｍｍ／秒；Ｃ、２ｍｍ／秒；及びＤ、４ｍｍ／秒にて互いにかみ合った流れを横切って走査した。走査速度における違いは細胞全体の電流応答ピークの幅を反映しており、幅が広いと、経過時間が長く、ピーク幅が広くなる。加えて、ゆっくりな走査速度（例えば、図２１Ａ）について、パッチ−クランプされた細胞があるアセチルコリン流から次へ走査されるにつれて各ピークの最高応答が減少している。ピーク応答におけるこの減少はパッチ−クランプされた細胞の脱過敏化によって引き起こされ、その結果アセチルコリン中の細胞により長い滞留時間をもたらすようなゆっくりな走査速度となる。
【０２４０】
図２１Ａから、第一から第二ピークへの減少と比較したとき、第二から第三ピークへの高さにおける減少が見られる。これは第二流中のパッチ−クランプされた細胞のより長い滞留時間（すなわち、より長いピーク幅）が更なる脱過敏化を引き起こすという事実と一致する。走査速度が増加するにつれて（図２１Ｃ及び２１Ｄ）、アセチルコリン流中の滞留時間は減少し脱過敏化はもはや問題とならない。図２１Ｄに例えば示したように速い走査速度（例えば、ミリ秒単位で）では、脱過敏化が検知され得ない。図２２は反対のシナリオが示されており、ここでは走査速度がゆっくり（秒）であり、パッチ−クランプされた細胞がアセチルコリン流の幅にわたって走査されるにつれて脱過敏化が顕著である。
【０２４１】
これらの実験から、走査速度がＨＴＳの用途ためのシステムの最適性能を達成するために重要であることが明らかである。走査速度は上記のメカニズムの何れかによって又は当技術分野において知られた他の方法によって制御され得る。
【０２４２】
脱過敏化及び再−過敏化の原動力に関するシステムによって得られたデータはイオン−チャネル薬理学、動力学及び恒等式を説明する有効な情報を提供するために有効利用され得る。
【０２４３】
実施例４．異なる濃度を有する緩衝液及びリガンドの互いにかみ合う流れ全体にわたるパッチ−クランプされた細胞の迅速な走査による用量−反応測定
実施例３にて使用されたチャネル構造及び実験装置が用量−反応測定を実施するために使用され得、リガンド流の各々におけるリガンドの濃度が所定の量によって異なる。図２３はその一実験の結果を示しており、三つの異なる濃度（１μＭ，１２μＭ及び２００μＭ）のニコチンがパッチ−クランプされた細胞に適用された。この７−チャネル構造において、チャネル１，３，５及び７をＰＢＳ緩衝液で満たし、一方チャネル２，４及び６を１μＭ，１２μＭ及び２００μＭのニコチンで夫々満たした。使用した流速は３．２４ｍｍ／秒であり、細胞−走査スピードは２５０μｍ／秒であった。パッチ−クランプされた細胞はマイクロチャネルの出口から１０乃至２０μｍの間離れて設置された。
【０２４４】
１−μＭの濃度のニコチンにて、細胞全体電流応答がパッチ−クランプトレースにおいて辛うじて認識可能であった。１２μＭの電流ピークは好ましい信号対ノイズ比で検知され、２００μＭに関するピークは１２−μＭのピークのおおよそ１５乃至２０倍であった。これらの測定に伴い、薬物反応及びイオン−チャネル薬理学についての有益な情報を提供する用量−反応曲線がもたらされ得る。リガンドの異なる濃度を調整するためのオフ−チップ方法のみならず勾配がもたらされる多くのチップ上（オン−チップ）での技術が使用され得ることが強調されるべきである（例えば、デルティンガー等，２００１，分析化学７３：１２４０−１２４６参照）。加えて、用量−反応曲線を構成するために使用される異なる濃度の数は本実施例において使用されたものよりほとんどの場合多く、そして特定の用途のために望まれる所要の濃度、解像度及び範囲に依存するであろう。
【０２４５】
ここに記載されていることの変化、変更及び他の実施は、本発明の精神と範囲から逸脱せず当業者の心に浮かぶであろう。ここに記載された公報、特許、出願及び他の引用文献は全てその完全な状態にてここに参考のため包含される。
【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは本発明の一つの態様によるシステムの概略図を示しており、イオンチャネル活性のパッチクランプ記録とマイクロ流体チップの一体化を示している。図１Ａは、位置決め装置に接続したパッチクランプマイクロピペットを用いたチップのマイクロチャネル出口に細胞が近接して設置されたマイクロ流体チップの斜視図である。図１Ｂは図１Ａの側面、部分的に断面図である。図１Ｃはチップ−ベースパッチクランプシステムの側面、部分的に断面図である。操作中、チップは望ましくは覆われている。
【図２】図２Ａ−Ｃは本発明の態様によるマイクロ流体チップの異なる実施の形態の上面図を示しており、９６−ウェルプレートと連結した槽（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の典型的な配置を図示している。図２Ａはリガンド槽からなるチップを示してる（例えば、槽は９６−ウェルプレートからのリガンドのサンプルを受け入れる）。図２Ｂは交互の又は互いにかみ合うリガンドと緩衝液槽からなるチップを示している（例えば、ある９６−ウェルプレートからのリガンドのサンプルを一つおきの槽が受け、一方、別の９６−ウェルプレートからの緩衝液のサンプルを残りの槽が受ける)。図２Ｃに示すように、興味のある細胞又は別のサンプルの貯蔵及び移送のためチップ上に更なる槽を設置し得る。
【図３】図３は本発明の一つの態様によるキットの斜視図であり、自動化した配列ピペットを用いた互いにかみ合う槽とピペットを用いた細胞配送とからなるマイクロ流体チップ上に９６−ウェルプレートから流体を分配する方法を図示している。
【図４】図４Ａ−Ｃは本発明の一つの態様による薬物のＨＴＳのためのマイクロ流体チップ構造の上面図からなり、互いにかみ合ったリガンドと緩衝液の流れを横切ってパッチクランプされた一つの細胞又は複数の細胞のようなセンサーを走査するためのものである。図４Ａは２Ｄ及び３Ｄの両方のマイクロ流体システムの全体的なチップ構造を表現している。図４Ｂはチップの槽及びそれらの一つの接続チャネルの拡大図を示している。図４Ｃは互いにかみ合ったマイクロチャネルの拡大図を示しており、その出口はチップのセンサーチャンバと交わっている。
【図５】図５Ａは、マイクロ流体チップの互いにかみ合ったチャネルの上面図を概略的に表現しており、パッチ−クランプされた細胞がチャネルの出口を過ぎて移動している。図５Ｂ及び５Ｃは出口及びマイクロチャネルの別の実施の形態の側面図を表現している。図５Ｂ及び５Ｃは２Ｄ及び３Ｄのマイクロ流体チップの設計を夫々表現している。図５Ｄは本発明の一つの態様による３Ｄチップの設計の斜視図であり、ここでチップはチャネルの底部の一組及び頂部の一組からなる。図５Ｅは図５Ｄの側面図であり、流体流が圧力差で制御され得、その結果底部の一組中のチャネルの中から外へ流体が流れることが覆っているチャネルの中に「Ｕ−ターン」を作り出すことが示されている。図５Ｆは図５Ｄの上面図であり「Ｕ−ターン」流体流を横切って細胞走査することを示している。
【図５−１】図５の分図である。
【図６】図６Ａは、ＨＴＳの用途において処理能力を向上させるためのマイクロチャネル出口の配置の３Ｄ配列を示す斜視図である。図６Ｂは図６Ａに表現されたマイクロチャネル配列の多数のパッチ−クランプされた細胞での使用を表現している。図中の矢印はパッチ−クランプされた細胞が走査されることが可能な方向を示している。
【図７】図７Ａ−Ｎは、緩衝液の過融解を用いリガンド流を横切って細胞を走査することを実施するチップの設計を示す概略図であり、周期的に再過敏化されるセンサーを提供する。図７Ａはチップの設計及びマイクロ流体システム全体にわたる斜視図である。図７Ｂ−Ｇは、マイクロチャネルの出口及び、異なる流体流を横切ってパッチ−クランプされた細胞を走査する間に、細胞過融解を実施する手順のみならず過融解キャピラリ及びパッチクランプピペットに関するそれらの位置の拡大図を示している。「Ｐ」はマイクロチャンネル又はキャピラリ中の流体への圧力の源を示している。太い矢印は動きの方向を示す。図７Ｈ−７Ｎは過融解細胞の異なる実施の形態を示している。図７Ｈの斜視図中に示されるように、緩衝液の配送のために準備したキャピラリのみならず、リガンド配送チャネルの出口の夫々に設置された多数の小さなマイクロチャネルが緩衝液の配送のために使用される。パッチ−クランプ細胞がリガンドチャネルへ移動しシステムが応答を検知する時、緩衝液に脈動が小さなマイクロチャネルを介して過融解のため細胞上へ配送されることが可能である。このシステムを使用する利点はパッチ−クランプされた細胞のリガンドに露呈させる時間が精密に制御されることが信号検知及び緩衝液過融解の間の遅延時間を変化させることにより可能であることである。図７Ｉはこの方法において使用されるマイクロ流体システムの側面を貫く横断面であり、パッチ−クランプされた細胞のリガンド及び緩衝液の両者の出口への近接を示している。図７Ｊはシステムの正面図の横断面であり、緩衝液流の流れを示している。図７Ｋは装置の上面図を貫く横断面であり、リガンド流の流れと緩衝液マイクロチャネルの配置を示している。図７Ｌ−７Ｍはリガンド及び／又は緩衝液チャネルへ加えられた圧力を使用して、パッチクランプされた細胞をリガンドへそして次に緩衝液に露呈することが示されている。
【図７−１】図７の分図である。
【図８】図８Ａ−Ｉはパッチ−クランプされた細胞と関連するマイクロチャネル出口の上面図であり、パッチ−クランプされた細胞を流体流に関連して移動し得る異なる方法をまとめて示している。図８Ａ−８Ｃは固定されたマイクロチャネル出口を横切ってパッチされた細胞の機械的走査を示している。図８Ｄ−８Ｆは固定されたパッチ−クランプされた細胞に対するマイクロチャネル出口の機械的走査を示している。図８Ｇ−Ｉは、夫々個別のマイクロチャネルを、通過する流量及び、全体にわたる圧力の制御された変化によって固定化しパッチされた細胞を横切って流体流を掃射する方法を示している。
【図９】図９Ａ−Ｃは、パッチ−クランプされた細胞を収容するための細胞チャンバ中へのそしてチャンバからの化合物の何度も繰り返される迅速な配送及び抜取りを実施するためのマイクロ流動チップの一つの設計の上面図である。図９Ａは細胞チャンバに流れ込むマイクロチャネルの配置全体を示している。図９Ｂは槽及びアクセスされる個別のチャネルの拡大図である。図９Ｃは細胞チャンバ中へ供給するマイクロチャネル出口の拡大図を示している。
【図１０】図１０は図９Ａの細胞チャンバの上面拡大図であり、パッチ−クランプされた細胞からなる細胞チャンバの周囲のマイクロチャネルの配置を表現している。
【図１１】図１１Ａ−Ｃは、パッチ−クランプされた細胞の周囲の流体の迅速且つ連続的な交換を実施するためのマイクロ流体チップを示す上面図である。図１１Ａは細胞チャンバ、から排出されそして、チャンバ中へ流れ込むチャネルの配置全体を示している。排出チャネルは多数の槽中へ流れ込み、各チャネル中の圧力の低下が独立して制御され得る。図１１Ｂは槽及びそれらの接続チャネルの拡大図を示している。図１１Ｃは細胞チャンバ中へ流れ込むマイクロチャネル出口の拡大図を示している。
【図１２】図１２は図１１Ａの拡大説明図であり、本発明の一つの態様による平面的な２Ｄマイクロ流体システムにおけるパッチ−クランプされた細胞を供えた細胞チャンバの周囲のマイクロチャネルにおける流体の配置及び流れ方向を表現している。
【図１３】図１３は図１１Ａのシステムの拡大斜視図であり、本発明の一つの態様による３Ｄマイクロ流体システムにおけるマイクロチャネルの配置及び流れ方向を表現している。
【図１４】図１４Ａ−Ｃは上面図であり、本発明の一つの態様によるパッチ−クランプされた細胞（図示せず）の周囲の流体の迅速且つ連続的な交換を実施する魚の骨型の設計のチップ構造を表現している図１４Ａに示された実施例において、単一の排出チャネルは単一の廃棄物槽中へ流れ込むよう規定されている。図１４Ｂはマイクロチャネルへのサンプルを供給する槽の拡大図を示している。図１４Ｃはセンサーチャンバ中へサンプルを流れ込む中央「背骨」チャネルと交差する複数の入り口チャネルの拡大図を示している。この拡大図において、流れ込むチャネルと背骨チャネルは斜めというよりは垂直に交わり；立体形状であっても良い。
【図１５】図１５は図１４Ａの概略説明の拡大図であり、受動的一方通行弁、これは概略的に十字で表現している、の存在のみならず、本発明の一つの態様によるチップにおけるマイクロチャネル及びパッチ−クランプされた細胞の配置及びそこにおける流れ方向を表現している。
【図１６】図１６Ａ及びＢは顕微鏡写真であり、単一のマイクロチャネル（図１６Ａ）の出口における流れの縦断図及びマイクロチャネルの配列（図１６Ｂ）を示している。流れトレーサとして蛍光染料（フルオレセイン）を用いた蛍光発光の下、蛍光流れを撮像した。チャネルは１００−μｍの幅、５０μｍの厚さであり、チャネル間の間隔は２５μｍであり；流速は４ｍｍ／ｓであった。
【図１７】図１７はマイクロチャネルの互いにかみ合った配列の出口の配置の概略説明であり、サンプル（例えば、薬物）の希釈の変化を一つおきのマイクロチャネルに準備される。パッチ−クランプされた細胞をチャネルの出口を横切って走査することにより、用量−反応測定値が得られる。
【図１８】図１８Ａ−Ｉは、パッチ−クランプされた細胞の高−頻度の過融解及び再−過敏化に基づく用量−反応測定値を得るためのシステムの概略図を示している。マイクロチャネル出口から出る流れによって創出される濃度勾配にわたってパッチ−クランプされた細胞を平行移動させる間に、パッチ−クランプピペットに対して同軸方向に設置されたキャピラリを通じて、或いは、過融解に好適なパッチピペットに隣接するよう設置されたあらゆるキャピラリを通じて過融解が達成され得る。図１８Ａ−Ｃはマイクロチャネル中のリガンドプラグの拡散の広がりによって生じた濃度勾配を示している。図１８Ｄ−Ｆはリガンド流がマイクロチャネルから出る時の横方向の拡散の波及を示している。「Ｐ」はシステムの一つ以上のマイクロチャンネルにて加えられた圧力の源を示している。
【図１９】図１９Ａ−Ｃは、シリコンにて加工されたマイクロチャネルの走査電子顕微鏡写真を示している。図１９Ａは、パッチ−クランプされた一つの細胞又は複数の細胞が互いにかみ合ったリガンドと緩衝液の流れを横切って走査されることが可能な単純なマイクロチャンネル配置を示している。図１９Ｂは、パッチ−クランプされた細胞を収容する細胞チャンバ中へのそしてチャンバからの化合物の何度も繰り返される迅速な配送及び抜取りを実施するため単純な平面放射状スポーク−ホイール構造を示している。図１９Ｃは、パッチ−クランプされた細胞の周囲の流体の迅速且つ連続的な交換を実施するためのマイクロチャネル出口の単純な魚の骨型配列を示している。
【図２０】図２０は、チャネル出口を横切って細胞を手動繰返し走査することにより誘導された膜貫通型電流感度の細胞全体パッチクランプ記録を示しており、ここにおいてそれはアセチルコリン（１ｍＭ）の入った開口槽中へ緩衝液により過融解されている。過融解−発生勾配にわたってパッチされた細胞を手動繰返し走査することにより、ピークのトレーン（ｔｒａｉｎｏｆ ｐｅａｋ）が引き起こされる。１００μｍ／ｓの平均走査速度にてそして１５０μｍ／ｓまでの最高速度にて、差込図中に表現されたマイクロチャネルの出口を横切って、細胞は後方及び前方へ走査された。
【図２１】図２１Ａ−Ｄは、パッチ−クランプされた細胞が平行な７つのチャネル構造（図１６Ｂに示されるものと同じ構造）の出口を横切って走査される時の、細胞全体の１ｍＭのアセチルコリンに対するパッチクランプ電流感度を示している。チャネル１，３，５及び７はＰＢＳ緩衝液で満たされており、一方、チャネル２，４及び６はアセチルコリンで満たされていた。チャネル流速は６．８ｍｍ／ｓであり、図中の細胞走査速度はＡ）０．６１ｍｍ／ｓ、Ｂ）１．２２ｍｍ／ｓ、Ｃ）２ｍｍ／ｓ及びＤ）４ｍｍ／ｓであった。
【図２２】図２２は、パッチ−クランプされた細胞が７つのチャネル構造（図１６Ｂに示されるものと同じ構造）の出口を横切って走査される時の、細胞全体の１ｍＭのアセチルコリンに対するパッチクランプ電流感度を示している。チャネル１，３，５及び７はＰＢＳ緩衝液で満たされており；チャネル２，４及び６はアセチルコリンで満たされていた。チャネル流速は２．７ｍｍ／ｓであり、細胞走査速度は６．２５μｍ／ｓであった。
【図２３】図２３は、パッチ−クランプされた細胞が７つのチャネル構造（図１６Ｂに示されるものと同じ構造）の出口を横切って走査される時の、全細胞の１μＭ、１２μＭ及び２００μＭのニコチンに対する濃度−依存パッチクランプ電流感度を示しており；チャネル１，３，５及び７はＰＢＳ緩衝液で満たされており；チャネル２は１μＭの、４は１２μＭの、そして６は２００μＭのニコチンで夫々満たされていた。流速は３．２４ｍｍ／ｓであり、細胞走査速度は２５０μｍ／ｓであった。
【図２４】図２４Ａ−Ｃは本発明の一つの発明によるアゴニスト選別を示しており、センサーチャンバ中へ流れ込む２６個の出口からなるマイクロ流体チップを用いている。図２４Ａに示されるように、選別はチャネル出口の位置１乃至２６から直線的に実行される。十分な数の走査が達成されるまで、走査は繰り返され得る。マイクロ流体チャネル出口にわたる前方への単一の走査に関する擬似トレース及び得点表が図２４Ｂ及びＣに示される。
【図２４−１】図２４の分図である。
【図２５】図２５Ａ−Ｃは本発明の一つの態様によるアンタゴニスト選別方法を示しており、センサーチャンバ中へ流れ込む２６個の出口からなるマイクロ流体チップを用いている。図２５Ａに示されるように、選別はチャネル出口の位置１乃至２６から直線的に実行される。十分な数の走査が達成されるまで、走査は繰り返され得る。擬似トレース及び得点表、図２５Ｂ及びＣ夫々に示されるように、マイクロ流体チャネル出口にわたる前方への単一の走査について、ζ３は最も高い効力を備えたアンタゴニストであり、次にζ５が続く。
【図２５−１】図２５の分図である。
【図２６】図２６Ａ−Ｃは用量−反応選別方法を示しており、センサーチャンバ中へ流れ込む２８個の出口からなるマイクロ流体チップを用いている。図２４Ａに示されるように、選別はチャネル出口の位置１乃至２８から直線的に実行される。十分な数の走査が達成されるまで、走査は繰り返され得る。マイクロ流体チャネル出口にわたる前方への単一の走査に関する擬似トレース及び得点表が図２６Ｂ及びＣに示される。
【図２６−１】図２６の分図である。
【図２７】図２７Ａ−Ｃはセンサーチャンバ中へ流れ込む１４個の出口からなるマイクロ流体チップを用いたアゴニスト選別、及びパッチ−クランプされた細胞に近接して設置された流動チャネルを用いた高繰返し速度緩衝液過融解（ｈｉｇｈ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を示している。図２７Ａに示されるように、選別はチャネル出口の位置１乃至１４から直線的に実行される。十分な数の走査が達成されるまで、走査は繰り返され得る。マイクロ流体チャネル出口にわたる前方への単一の走査に関する擬似トレース及び得点表が図２７Ｂ−Ｃに示される。複数のピーク応答が一つのマイクロチャネル出口を介して得られる。この分析から、α３は最も高い効力を備えたアンタゴニストであり、次にα５が続く。
【図２７−１】図２７の分図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５−１】
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【図６】
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【図７】
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【図７−１】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２４−１】
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【図２５】
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【図２５−１】
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【図２６】
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【図２６−１】
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【図２７】
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【図２７−１】
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【国際調査報告】
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