(57)【要約】本発明は、受容体／ペプチド三成分複合体の結合部位および官能基を調べることに使用されるコンホーメーション的に束縛された生物活性ペプチドを得るために金属と複合体が形成される場合に、コンホーメーション鋳型として用いられるコンホーメーション的に束縛されたペプチド類およびアザクラウン類を包含するペプチド模倣物のライブラリーの作成に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の受容体との結合のための分子上の１個またはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置の決定に用いられる柔軟な分子をコンホーメーション的に束縛する方法であって、下記工程：
（ａ）少なくとも３個のアミド部分を有する金属イオン複合体化骨格を有するペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択される分子を用意し；
（ｂ）該骨格中の少なくとも１個のアミド部分を少なくとも１個のヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログに置き換えて；ついで
（ｃ）該金属イオン結合部位において該分子と金属イオンを複合体化させ、そのことにより該分子のコンホーメーションを束縛すること
を含む方法。
【請求項２】
該分子が環状ペプチドである請求項１の方法。
【請求項３】
金属イオン結合部位候補として作用して該分子の所望コンホーメーションを形成する該骨格の少なくとも１つの所望部分を選択する工程をさらに含む請求項１の方法。
【請求項４】
該分子の活性部位のコンホーメーションが核磁気共鳴により確認される請求項３の方法。
【請求項５】
該分子の活性部位のコンホーメーションが結晶像により確認される請求項３の方法。
【請求項６】
該金属イオンが、鉄、銅、マンガン、ニッケル、亜鉛、砒素、セレン、テクネチウム、ガドリニウム、コバルト、ルテチウム、パラジウム、銀、カドミウム、インジウム、アンチモン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、ポロニウム、アスタチン、アクチニウム、トリウム、プロタクチニウム、ウラン、ネプツニウム、プルトニウム、アメリシウム、キュリウム、ベルケリウム、カリフォルニウム、アインスタイニウム、フェルミウム、メンデレビウム、ノベリウム、ローレンシウム、セリウム、プラセオジミウム、ネオジミウム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびルテチウムからなる群より選択される元素のイオン形態である請求項１の方法。
【請求項７】
該金属イオンが医学的に有用な金属イオンである請求項１の方法。
【請求項８】
該金属イオンが放射活性または常磁性である請求項１の方法。
【請求項９】
目的の受容体との結合のために柔軟な分子上の１個またはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置を確認する方法であって、下記工程：
（ａ）少なくとも３個のアミド部分を有する金属イオン複合体化骨格を有するペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択される分子を用意し；
（ｂ）金属イオン結合部位候補として作用して該分子の所望コンホーメーションを形成する該骨格の少なくとも１つの所望部分を選択し；
（ｃ）該骨格の所望部分の金属イオン結合部位候補において少なくとも１個のアミド部分を少なくとも１個のヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログに置き換えて；
（ｄ）該金属イオン結合部位候補において該分子と金属イオンと複合体化させ、そのことにより該分子のコンホーメーションを束縛し；
（ｅ）該分子を試験して、目的の受容体への該分子の結合アフィニティーを調べ；
（ｆ）該分子上の１個またはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を分析して、該分子の受容体−結合コンホーメーションを決定すること
を含む方法。
【請求項１０】
該分子が環状ペプチドである請求項９の方法。
【請求項１１】
該分子の活性部位のコンホーメーションが核磁気共鳴により確認される請求項９の方法。
【請求項１２】
該分子の活性部位のコンホーメーションが結晶像により確認される請求項３の方法。
【請求項１３】
該金属イオンが、鉄、銅、マンガン、ニッケル、亜鉛、砒素、セレン、テクネチウム、ガドリニウム、コバルト、ルテチウム、パラジウム、銀、カドミウム、インジウム、アンチモン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、ポロニウム、アスタチン、アクチニウム、トリウム、プロタクチニウム、ウラン、ネプツニウム、プルトニウム、アメリシウム、キュリウム、ベルケリウム、カリフォルニウム、アインスタイニウム、フェルミウム、メンデレビウム、ノベリウム、ローレンシウム、セリウム、プラセオジミウム、ネオジミウム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびルテチウムからなる群より選択される元素のイオン形態である請求項９の方法。
【請求項１４】
該金属イオンが医学的に有用な金属イオンである請求項１の方法。
【請求項１５】
該金属イオンが放射活性または常磁性である請求項１の方法。
【請求項１６】
該試験工程が高処理量アッセイにより行われる請求項９の方法。
【請求項１７】
目的の受容体との結合のための分子上の１個またはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置の決定に用いられる柔軟な分子をコンホーメーション的に束縛する方法であって、下記工程：
（ａ）一般式：
【化１】
2005518334.tif 000013
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ約１ないし２０個のアミノ酸を含み；
Ｒ１およびＲ２はＸにより結合されており；
Ｘは少なくとも１個のヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログ部分を含む金属イオン複合体化骨格であり；
該少なくとも１個のヒドロキサメート部分は金属イオン結合部位として作用する］を有するペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択される分子を用意し；
（ｂ）該分子の金属結合部位において金属イオンを該分子と複合体化させ、そのことにより該分子のコンホーメーションを束縛すること
を含む方法。
【請求項１８】
Ｘが少なくとも３個のヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログ部分を含むものである請求項１７の方法。
【請求項１９】
Ｘが少なくとも４個のヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログ部分を含むものである請求項１７の方法。
【請求項２０】
Ｘが少なくとも５個のヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログ部分を含むものである請求項１７の方法。
【請求項２１】
目的の受容体との結合のための柔軟な分子上の１個またはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置を確認する方法であって、下記工程：
（ａ）少なくとも１種の環状ペプチド分子を用意し；
（ｂ）該環状ペプチド分子中の十分なアミド結合を還元して第２級アミンとし、少なくとも１種のキラルアザクラウンを得て；
（ｃ）金属イオンを該キラルアザクラウンと複合体化させ、そのことにより該キラルアザクラウンのコンホーメーションを束縛し；
（ｄ）該キラルアザクラウン分子を試験して、該キラルアザクラウンの目的の受容体への結合アフィニティーを調べ；ついで
（ｅ）該キラルアザクラウン上の１個またはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を分析して、該キラルアザクラウンの受容体−結合コンホーメーションを決定すること
を含む方法。
【請求項２２】
該環状ペプチド分子がシクロペンタペプチドである請求項２１の方法。
【請求項２３】
該環状ペプチド分子がシクロテトラペプチドである請求項２１の方法。
【請求項２４】
該環状ペプチド分子がシクロヘキサペプチドである請求項２１の方法。
【請求項２５】
該キラルアザクラウンがキラルペンタアザクラウンである請求項２１の方法。
【請求項２６】
該金属イオンが、鉄、銅、マンガン、ニッケル、亜鉛、砒素、セレン、テクネチウム、ガドリニウム、コバルト、ルテチウム、パラジウム、銀、カドミウム、インジウム、アンチモン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、ポロニウム、アスタチン、アクチニウム、トリウム、プロタクチニウム、ウラン、ネプツニウム、プルトニウム、アメリシウム、キュリウム、ベルケリウム、カリフォルニウム、アインスタイニウム、フェルミウム、メンデレビウム、ノベリウム、ローレンシウム、セリウム、プラセオジミウム、ネオジミウム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびルテチウムからなる群より選択される元素のイオン形態である請求項２１の方法。
【請求項２７】
該金属イオンが医学的に有用な金属イオンである請求項２１の方法。
【請求項２８】
該金属イオンが放射活性または常磁性である請求項１の方法。
【請求項２９】
所望の生物学的活性を有する分子を設計する方法であって、下記工程：
（ａ）目的の生物学的に活性のある分子を単離し；
（ｂ）該生物学的に活性のある分子のコンホーメーションを分析し；
（ｃ）目的の受容体に結合するための該分子上の１個またはそれ以上の活性部位の正しい三次元コンホーメーションおよび位置に関する少なくとも１つの仮説を立て；
（ｄ）該生物学的に活性のある分子の少なくとも１種の活性のある束縛されたアナログを得て、該仮説を確認し；
（ｅ）該アナログを試験して、目的の受容体に対する該アナログの結合アフィニティーを調べ；
（ｆ）受容体−結合コンホーメーション中に該アナログ上の１個またはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置をマッピングし；ついで
（ｇ）該アナログ上の１個またはそれ以上の活性部位の該三次元コンホーメーションおよび位置を模倣する少なくとも１種の分子を設計すること
を含む方法。
【請求項３０】
工程（ｄ）が、少なくとも３個のアミド部分を有する金属イオン複合体化骨格を有するペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択される分子を用意し；該活性部位の置換に関する該仮説に従って、金属イオン結合部位として作用する該骨格の少なくとも１つの所望部分を選択し；該骨格の該所望部分において少なくとも１個のアミド部分を少なくとも１個のヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログと置き換えて、該骨格上に少なくとも１個の金属イオン結合部位を提供し；ついで、該少なくとも１個の金属イオン結合部位において金属イオンと該分子を複合体化させ、そのことにより該仮説に従った、活性のある該分子の束縛されたアナログを得る工程をさらに含むものである請求項２９の方法。
【請求項３１】
工程（ｄ）が下記工程：
（ｄ）（１）一般式：
【化２】
2005518334.tif 000014
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ約１ないし２０個のアミノ酸を含み；
Ｒ１およびＲ２はＸにより結合されており；
Ｘは、少なくとも１個のヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログを含む金属イオンと複合体化するための複合体化骨格であり；
該少なくとも１個のヒドロキサメート部分は金属イオン結合部位として作用する］を有するペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択される分子を用意し；
（ｄ）（２）金属イオンを該分子の該骨格において複合体化させ、そのことにより該仮説に従った、活性のある該分子の束縛されたアナログを得ること
をさらに含むものである請求項２９の方法。
【請求項３２】
工程（ｄ）が下記工程：
（ｄ）（１）少なくとも１種の環状ペプチド分子を用意し；（ｄ）（２）該環状ペプチド分子中の十分なアミド結合を第２級アミンに還元して、少なくとも１種のキラルアザクラウンを得て；ついで（ｄ）（３）金属イオンを該キラルアザクラウンと複合体化させること
をさらに含むものである請求項２９の方法。
【請求項３３】
異なるキラリティーおよびそれらの組み合わせを有する少なくとも５種の異なる分子のアレイを含む、１またはそれ以上の所望特性に関して標的化された候補であるペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択されるコンホーメーション的に束縛された分子のライブラリー。
【請求項３４】
該アレイが少なくとも１０種の異なる分子を含むものである請求項３３のライブラリー。
【請求項３５】
該ライブラリー中の該分子の少なくとも一部分が金属イオン複合体化によりコンホーメーション的に束縛されている請求項３３のライブラリー。
【請求項３６】
該ペプチド模倣物がキラル複合体を含むものである請求項３３のライブラリー。
【請求項３７】
所望の生物学的活性を有する天然に存在する分子を選択する方法であって、下記工程：
（ａ）異なるキラリティーおよびそれらの組み合わせを有する少なくとも５種の異なる分子のアレイを含む、ペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択されるコンホーメーション的に束縛された分子のライブラリーを得て；
（ｂ）目的の受容体に対して所望の結合アフィニティーを有する少なくとも１種の分子に関して、生物学的アッセイを用いて該ライブラリーをスクリーニングし；
（ｃ）その受容体−結合コンホーメーションとなっている該少なくとも１種の分子の少なくとも１個またはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を誘導し；
（ｄ）該少なくとも１種の分子に実質的に類似したコンホーメーションを有する少なくとも１種の天然に存在する分子を選択し；ついで
（ｅ）該所望の生物学的活性に関して該少なくとも１種の天然に存在する分子を試験すること
を含む方法。
【請求項３８】
所望の生物学的機能ドメインを模倣するファーマコフォア（pharmacophore）を得る方法であって、下記方法：
（ａ）異なるキラリティーおよびそれらの組み合わせを有する少なくとも５種の異なる分子のアレイを含む、ペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択されるコンホーメーション的に束縛された分子のライブラリーを得て；
（ｂ）目的の受容体に対する結合アフィニティーを有する少なくとも１種の分子に関して該ライブラリーをスクリーニングし；
（ｃ）所望の生物学的機能ドメインを有する分子を選択し；
（ｄ）該分子の１個またはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を分析し；ついで
（ｅ）該分子の１個またはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を模倣するファーマコフォアを得ること
を含む方法。
【請求項３９】
異なるキラリティーおよびそれらの組み合わせを有するペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択される少なくとも５種の柔軟な分子のアレイを含む、分子の１個またはそれ以上の結合部位の三次元構造および位置の解明のためのコンホーメーション的に束縛された生物学的に活性のある分子のライブラリーであって、
該分子のそれぞれは、目的の受容体に結合した場合に５種未満の十分に定義された三次元構造を有するものであり；
該分子のそれぞれは合成により得ることができ；
該分子のそれぞれの少なくとも１個の側鎖が、該受容体との相互作用の間に、独自の方向を向くことができるものである
ライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７８の規定により、本願は、参照により本明細書に記載されているものとされる２００１年６月８日出願の米国仮出願第６０／２９７１７９号の利益を主張するものである。
【０００２】
国の援助による研究または開発
本発明は、ＳＢＩＲ ＤＫ５４１５７、ＡＩ４２７３０およびＡＩ４４５８４の下、National Institutes of Healthからの政府援助で開発されたものである。政府は本発明につき一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
本発明は、特定の標的特性を有する新規なコンホーメーション的に束縛された新規ペプチド、キラルアザクラウン、ペプチド模倣物およびそれらのアナログ、ならびにかかる標的特性に関して獲得可能で分析可能な候補化合物を含むライブラリーおよびそれらのアナログに関する。本発明は、医薬の開発のためにかかる化合物を用いる方法にも関する。
【０００４】
天然に存在するペプチドから誘導される医薬の合理的な設計は、最近のテクノロジーの進歩により促進されかつ混乱させられてきた。第一に、ペプチドおよびペプチド模倣物のコンビナトリアルライブラリーは、生物学的スクリーニングのための多くの異なる化合物を製造するための道具となっている。Houghten et al., Mixture-based synthetic combinatorial libraries, J. Med.Chem., 42: 3743-3778 (1999); Houghten et al.,
Parallel array and mixture-based synthetic combinatorial chemistry : Tools for the next millennium, Annu. Rev. Pharm. Toxicol. 40:3743-3778 (2000)。第２に、ペプチドであるG-プロテイン結合受容体（GPCRｓ）をクローニングおよび発現させることにより変異体およびキメラ受容体が作成され、かくして「受容体サイドから」ペプチド−受容体相互作用を研究する機会が与えられた。Klasse et al.,CD4-Chemokine receptor hybrids in human immunodeficiency virus type 1 infection, J. Virology 73: 7453-7466 (1999)。効率よく処理するための重要な情報を抽出するためにデータが集められているが、ある受容体に関するライブラリーの生物学的試験から得られる膨大な量のスクリーニングデータを合理化する必要がある。変異体およびキメラＧＰＣＲｓへのペプチド結合、例えば、アゴニストおよびアンタゴニストへの結合部位／様式の観察された相違に関して得られるデータについてもこのことがあてはまる。Schwartz et al.,Structure and Function of 7TMReceptors Copenhagen: Munksgaard: 1996参照。
【０００５】
薬剤の設計に対する主な障害の１つは、リガンド−受容体複合体中のペプチドの３次元構造に関する信頼できる情報がないことである。それは主にＧＰＣＲｓに関する構造の情報を得ることが困難だからである。視覚色素である暗−適応ロドプシンの結晶構造が最近報告されたが、ロドプシンはペプチドリガンドにより活性化されない。Palczewski et al.,Crystal Structure of Rhodopsin : A G-Protein- Coupled Receptor, Science 289: 739-745 (2000)。ペプチドリガンドとの複合体の直接的な特徴付けができるほど十分なＧＰＣＲ試料がない場合、複合体の構造を探索する間接的方法があり、それは構造−活性研究に基づくものであることが多い。一貫して、芳香族残基は受容体の認識および活性化において特別な役割を果たすことがわかっており、重要な芳香族側鎖の修飾または除去によりアンタゴニストへと変換されるアゴニストの多くの例がある。堅固な原子配置および結果として生じるＴｙｒ、Ｔｒｐ、ＨｉｓおよびＰｈｅのごとき芳香族側鎖の大きく固定された表面積が一緒になって相互作用のポテンシャル自由エネルギーを最大化する。なぜなら、特別な配置を取るエントロピーコストが芳香族基の原子によりすでに払われているからである。荷電基である平面的なグアニジニウム、カルボキシル、およびアミノ基もまた必須認識部位であることが多い。ペプチド受容体の官能基の特異的認識の例は、ガストリンテトラペプチドではＡｓｐ残基の側鎖カルボキシル；ブラジキニンではＡｒｇ残基のグアニジニウム基およびＣ−末端カルボキシル；ならびにアンギオテンシンでは側鎖フェノール、イミダゾールおよびフェニル基そしてＣ−末端カルボキシル。驚くべきことに、ペプチド−ホルモン受容体を認識する際のホルモンのペプチド骨格のアミド結合の直接的相互作用を支持する文献中の証拠はほとんどない。
【０００６】
認識の間、生物学的に活性のある化合物は、側鎖を再方向付けし、露出させるターンを示し、疎水性の外表面をポテンシャル的に安定化させる。Rose et al., Turns in Peptides and Proteins, Adv. Protein Chem. 37: 1-109 (1985); Nikiforovich et al.,Three-dimensional recognition requirements for angiotensin agonists : A novel solution for an old problem, Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 222-228 (1993); Rizo et al. Constrained Peptides: Models of Bioactive Peptides and Protein Substructures, Annu. Rev. Biochem. 61:387-418 (1992)。逆−ターン模倣物を開発するために多大な合成の努力がなされているが、これらの構築は、ペプチド側鎖をターン模倣物へと方向付けることを欲する場合に合成の困難性を示すことが多い。Hanessian et al., Design and
Synthesis of Conformationally Constrained Amino Acids as Versatile Scaffolds and Peptide Mimetics, Tetrahedron 53: 12789-12854 (1997); Cornille etal., Electrochemical cyclizatoin of dipeptides toward novel bicyclic, reverse-turn peptidomimetics : Synthesis and conformational analysis of 7, 5-bicyclic systems, J. Am. Chem. Soc. 117: 909-917 (1995); Slomczynska et al, Electrochemical Cyclization of Dipeptides to Form Novel Bicyclic,Reverse-Turn Peptidomimetics. 2. Synthesis and Conformational Analysis of 6, 5-Bicyclic Systems, J. Org. Chem. 61: 1198-1204 (1996)。
【０００７】
側鎖をアザビシクロアルカンアミノ酸へと向けるある程度の進歩がLubellのグループにより報告されているが、多段階合成が必要である。Halab et al., Design, synthesis, and conformational analysis of azacycloalkane amino acids as conformationally constrainedprobes for mimicry of peptide secondary structures [ReviewJ, Biopolymers 55: 101-102 (2000)。さらに、逆−ターン模倣物の配置は、水素結合を生じさせて多くの逆ターンに特徴的なβ−ヘアピンを形成させるには不適切であることが多い。Chalmers et al.,Pro-D-NMe-Amino Acid and D-Pro-NMe-Amino Acid. Simple, Efficient Reverse-Turn Constraints, J. Am. Chem. Soc. 117: 5927-5937 (1995); Takeuchi et al.,Conformational Analysis of Reverse-Turn Constraints by N-Methylation and N-Hydroxylation of Amide Bondsin Peptides and Non-Peptide Mimetics, J. Am. Chem. Soc. 120: 5363-5372 (1998)。ソマトスタチンのアナログの場合、多くのアミド結合が還元される可能性があり、ペプチド骨格の方向が逆転する可能性があり、あるいはペプチドの全体的な骨格でさえも、受容体において保持された側鎖認識を伴ってサッカリンにより置換される可能性がある。Saski etal., Solid-Phase Synthesis and Biological Properties of yr [CH2NH] Pseudopeptide Analoguesof a Highly Potent Somatostatin Octapeptide, J. Med. Chem. 30: 1162-1166(1987) ; Hirschmann et al., Medicinal Chemistry in the Golden Age of Biology : Lessons from Steroid and Peptide Research, Angew. Chem Int. Ed. Engl. 30: 1278-1301 (1991)。トリペプチドホルモンであるチロトロピン（TRH, Glp-His-Pro-NH2）に関する同様の研究は、シクロヘキシル構造により置換された骨格アミドを有する、ＴＳＨを放出しないＣＮＳ−活性アナログへと導いた。Olson et al., Peptide mimetics oftryrotropin-releasing hormone based on a cyclohexaneframework : design, synthesis, and cognition-enhancing properties, J. Med. Chem.38 : 28662879 (1995)。ＴＲＨの生物活性コンホーメーションを決定する研究は、ＴＳＨ放出の原因となる内分泌受容体において活性を保持している多環式アナログの設計へと導いた。Rutledge et al.,Conformationally Restricted TRH Analogs-a Probe for the Pyroglutamate Region, J. Med. Chem. 39: 1517-1574 (1996); Tong et al., Constrainedpeptidomimetiesfor TRH. cis-peptide bond analogs, Tetrahedron 56: 9791-9800 (2000)。
【０００８】
不幸なことに、ＧＰＣＲｓは、合成的結合により容易に架橋できるように原子を配置させる受容体−結合コンホーメーションを必要としない。確かに環状の束縛はコンホーメーションの自由度を制限するが、それらは間違ったコンホーメーションを安定化することにより、あるいは付加的な原子による受容体の立体破壊により正確な生物学的に重要なコンホーメーションを排除することが多い。２個の原子を結合で連結することにより、ファンデルワールス半径よりも短い距離となり、かくして、共有結合束縛がない場合よりも堅固にコンホーメーションを拘束することとなる。幸運なことに、大部分の受容体はある程度のコンホーメーション耐性を有し、特に、合成的束縛が側鎖の受容体との相互作用を妨害しない場合には、活性が保持されることが多い。ペプチドが束縛されて正確に所望のコンホーメーションとなるならば、プレオーガナイゼーション（preorganization）による結合エントロピーの変化によって有意に増強されたアフィニティーが生じるはずである。しかしながら、環化によるこのような劇的なアフィニティー増強の例はペプチドの文献において極めて珍しいものである。
【０００９】
ペプチド受容体に対する高処理量スクリーニングを用いて非ペプチドリード化合物が単離されている。かくして、特別な有機的構造の概念が出現した。Wiley et al., Peptidomimetics Derived from Natural Products, Med. Res. Rev. 13: 327-384 (1993); Evans et al., Methods for drug discovery : development of potent, selective, orally effective cholecystokinin antagonists, J. Med. Chem. 31: 2235-2246(1988) ; Narlund et al., Peptidomimetic Growth Hormone Secretagogues-Design Considerations and Therapeutic Potential, J. Med. Chem. 41: 3103-3127 (1998)。Evansらにより提案され、PatchettおよびNarglundによりレビューされたように、特別な有機的構造の概念の要旨は、あるＧＰＣＲ系で成功することは証明された化学的構造を用いて、別のＧＰＣＲｓに対してうまくスクリーニングされうるライブラリーを得ることができるというものである。Evans etal., Methods for drugdiscovery : development of potent, selective, orally effective cholecystokinin antagonists, J. Med. Chem. 31: 2235-2246 (1988); Patchett et al., Privileged Structures-An Update, Annu. Rep. Med. Chem. 35: 289-298 (2000)。コンビナトリアル化学の化学者はこの概念を用いてＧＰＣＲｓと相互作用するリード化合物を開発することが多い。Evansらにより用いられたベンゾジアゼピン構造は、逆ターンを模倣するものと考えられ、多数のペプチド受容体に対するリード化合物を得ることを継続させるものである。Evans etal., Methods for drug discovery : development of potent, selective, orally effective cholecystokinin antagonists, J. Med. Chem. 31: 2235-2246 (1988); Blackburn et al., From peptide to non-peptide. 3. Atropisomeric GPIIbIIIa antagonists containing the 3,dihydro-lH-1, 4-benzodiazepine-2, 5-dione nucleus, J. Med. Chem. 40: 717-729 (1997); Shigeri et al., A potentnonpeptide neuropeptide YYI receptor antagonist, a benzodiazepine derivative, Life Sci. 63: L 151-160 (1998);Dziadulewicz et al., The design of non-peptide human bradykinin B2 receptor antagonists employing the benzodiazepine peptidomimetic scaffold, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 463-468 (1999); Miller et al., Discovery of Orally active nonpeptide vitronectin receptor antagonists based on a2-benzazepine Gly-Asp mimetic, J. Med. Chem. 43: 22-26 (2000)。
【００１０】
Kesslerは、受容体認識を探るためのコンホーメーション的構造として環状シクロヘテロキラルペンタ−およびヘキサペプチドを提唱し、そこでは認識モチーフ（ＲＧＤのごとき）が合成的に環状ペプチド骨格構造周辺にシフトされて空間的に種々のコンホーメーションが得られている。Pfaff et al., Selective recognition of Cyclic RGD Peptides of NMR Defined Conformation byaIIb 3, aV and a5 l Integrins, J. Biol. Chem. 269: 20233-20238 (1994); Haubner et al., Stereoisomeric Peptide Libraries and Peptidomimetics for Designing SelectiveInhibitors of the ay/33 Integrin for a New Cancer Therapy, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36: 1374-1389 (1997)。Porcelliらはこのアプローチを用いて新規なサブスタンスＰアンタゴニストを発見した。Porcelli et al. utilized this approach to discover a novel substance P antagonist. Porcelli et al., Cyclic pentapeptides of chiral sequence DLDDL asscaffold for antagonism of G-protein coupled receptors : synthesis, activity and conformational analysis by NMR and molecular dynamics of ITF 1565 a substance P inhibitor, Biopolymers 50: 211-219 (1999)。Haskell-Luevanoらは、β−ターンモチーフに基づいて９５１種の化合物のライブラリーをスクリーニングし、メラノコルチン−１受容体に関連した最初の２種の非ペプチド複素環微小分子アゴニストを同定した。Haskell-Luevano et al., Compounds that activate the mouse melanocortin-1 receptor identified by screening a small molecule library based upon the beta-turn, J. Med. Chem. 42: 4380-4387 (1999)。もう１つの例は、コンビナトリアル化学による５種のソマトスタチン受容体サブタイプの選択的アゴニストの迅速同定であり、それは治療薬におけるそれらの生理学的役割を理解するための重要な薬理学的道具である。Rohrer et al., Rapid Identification of Subtype-Selective Agonists of Somatostatin Receptor Through Combinatorial Chemistry, Science 282: 737-740 (1998)。確かに、特定のＧＰＣＲｓに対するスクリーニングから得られた広範な有機的構造によってリード最適化のための多くの機会が提供されている。
【００１１】
コンビナトリアル化学は、多くの異なる化学構造があるＧＰＣＲと相互作用することができ、最適化によりナノモラーのアフィニティーを有する治療薬候補が得られる可能性があることを我々に教えている。Czarnik et al., A practical Guide to Combinatorial Chemistry, Washington, D. C.: American Chemical Society, 1997。それにもかかわらず、親ペプチドの構造−活性相関（ＳＡＲ）研究および受容体−結合コンホーメーションを決定するための努力により得られたデータは、ライブラリーの設計およびリード最適化において決定的である。ペプチドリードは特別な構造として役立つ可能性がある。例えば、ソマトスタチン受容体サブタイプＩＩの選択的アゴニストは、ソマトスタチンのペプチドアナログに関してMerckにおいて行われた研究により得られた知識に基づくものであった。Yang et al., Synthesis and Biological Activities of Potent Peptidomimetics Selective for Somatostatic Receptor Subtype 2, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10836-10841 (1998)。強力なソマトスタチンペプチドアゴニストのアナログＬ−３６３，３６１ c[Pro-Phe-d-Trp-Lys-Thr-Phe-]によって、ニューロキニン−１のアンタゴニストならびにμ−およびδ−オピオイド受容体アンタゴニストが得られた。Schiller et al., Novel ligands lacking a positive charge for the delta-and mu-opioid receptors, J. Med. Chem. 43: 551-559 (2000)。
【００１２】
親ペプチドに関するその後の相互作用を用いたアプローチはコンビナトリアルアプローチと競うことは期待されないが、異なるコンホーメーション構造を有する多数のアナログ（α−メチルアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、ベチドアミノサン、デヒドロアミノ酸、キメラアミノ酸、アミドおよびジスルフィド環状束縛、二環式逆−ターン模倣物、金属−結合部位等）を並行して合成し、試験することは、受容体−結合コンホーメーションの決定のための迅速なアプローチを提供するものである。Marshall et al.,A Hiearchical Approach to Peptidomimetic Design, Tetrahedron 49: 3547-3558 (1993); River etal., Betidamino acids : versatile and constrained scaffolds for drug discovery, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2031-2036 (1996); See also Hanessian et al., Design and Synthesis of Conformationally Constrained AminoAcids as Versatile ScaXolds and Peptide Mimetics, Tetrahedron 53: 12789-12854 (1997); Cornille et al., Electrochemical cyclization of dipeptides toward novel bicyclic reverse-turn peptidomimetics : Synthesis and conformational analysis of 7, 5-bicyclic systems, J. Am. Chem. Soc. 117: 909-917 (1995); Chalmerset al., Pro-D-NMe-Amino Acid and D-Pro-NMe-Amino Acid. Simple, Efficient Reverse-Turn Constraints, J. Am. Chem. Soc. 117: 5927-5937 (1995)。ペプチド模倣物の設計のための進化したヒエラルヒー的アプローチを図１に示す。Marshall GR, A Hierarchical Approach to Peptidomimetic Design, Tetrahedron 49: 3547-3558 (1993); Beusen et al., Pharmacophore Definition Using the Active AnalogApproach, Pharmacophore Perception, Development, and Use in Drug Design, Edited by Guner OF: International University Line, p. 21-45 (2000)も参照のこと。
【００１３】
通常には、構造−活性相関（ＳＡＲ）は、同じ受容体において活性を有し、競争的結合を示す化合物は同じ部位と相互作用すると仮定するものである。ＧＰＣＲ活性化のアロステリックな性質ならびにＧＰＣＲｓおよびリガンド相互作用に関する変異の研究を考慮すると、このことは明らかに支持できない仮定である。非ペプチドアゴニストおよびアンタゴニストに関連したペプチドの受容体−結合コンホーメーションはスクリーニングにより発見されるかもしれず、あるいは発見されないかもしれない。我々の文献を含め、かかる努力をして蓄積された文献にもかかわらず、同じ部位における相互作用を仮定するための明らかな化学的基礎がないことが多い。それゆえ、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣または拮抗しうるコンホーメーション的に束縛されたペプチド模倣物、非ペプチド構造エレメントを含む化合物を用いて結合必須要件の決定を可能にすることが必要である。概念的には、真のペプチド模倣物間の識別が必要であり、その場合、非ペプチドは親ホルモンと同じ受容体部位に類似の結合様式で結合し、それらの場合において、別のアロステリック部位または別の結合様式が関与する。真のペプチド模倣物の場合においてのみ、受容体−結合コンホーメーションにより真のペプチド模倣物に対する結合必須要件に関する洞察が得られると期待されるであろう。真のペプチド模倣物を誘導するためには、我々は、当該ペプチドの認識に重要な側鎖を保持しているペプチドの段系的変換を提案する。親ペプチドおよびペプチド模倣物中のかかる側鎖の修飾は、共通の結合様式を試験するための間接的な基礎を提供する。ペプチドおよびペプチド模倣物に関する並行ＳＡＲを示すための一連の受容体変異体に対する結合についての研究は、真のペプチド模倣物が由来したという主張を支持するための必要である。
【００１４】
それゆえ、種々の「コンホーメーション鋳型」、すなわち少なくとも下記の３つの必須要件を満たすべきモデルリガンドを開発することはきわめて有用である：（ｉ）それらは唯１つの三次元構造（またはわずかな数の十分に決定された三次元構造）を有するべきである；（ｉｉ）それらは合成的に容易にアクセスできるべきである；そして（ｉｉｉ）それらはペプチド−受容体相互作用を独自に指向できるべきである。コンビナトリアルペプチド化学における膨大な経験により、そして環状ペプチドに商業的に利用可能な種々の保護された普通でないアミノ酸およびそれらの合成的にアクセス可能な誘導体により、キラルアザクラウンはコンホーメーション鋳型の良いソースである。Ovchinnikov et al., The Cyclic Peptides : Structure, Conformation, and Function, The Proteins, Edited by Neurath H, Hill RL: Academic Press, Vol. 5 p. 307-642 (1982)参照。これらの鋳型のいくつかはシクロジペプチドまたはジケトピペラジン（ＤＫＰｓ）、シクロトリペプチド（Ｃ３Ｐｓ）、シクロテトラペプチド（ＣＴＰｓ）およびシクロペンタペプチド（ＣＰＰｓ）であってもよい。かかるコンホーメーション鋳型のさらなる使用のために、ライブラリーの実際上のスクリーニングは効果的な様式で合成標的の合理的選択を可能にするであろう。
【００１５】
大部分はKarleのグループにより、そしてイタリアのグループおよびGieraschのグループによって、Ｘ線結晶回折像によりＣＰＰｓの三次元構造に関するさらなる実験的研究が最近２０年間にわたり行われてきた。Karle IL,Gly-L-Pro-L-Ser-D-Ala-L-Pro in the Crystalline State and an Example of Rotational"Isomerism"between Analogues, J. Am. Chem. Soc. 101: 181-184 (1979); Karle IL, Crystal Structure and Conformation of cycl(Glycylprolylglycyl-D-alanylprolyl) Containing41 and3-1 Intramolecular Hydrogen Bonds, J. Am. Chem. Soc. 100: 1286-1289 (1978); Karle IL, The peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Edited by Gross E,Meienhofer J: Academic Press, Vol. 4, p. 1-54 (1981); Karel IL, Variability in the backbone conformation of cyclic pentapeptides, Int. J. Pept. Prot. Res. 28: 420-427 (1986); Toniolo C,Intramolecularly hydrogen-bonded peptide conformations, CRC Crit. Rev. Biochem., 9: 1-44 (1980); Lombardi et al.,Unusual Conformational Preferences of beta-alanine containing cyclicpeptides. VII, Biopolymers 38: 683-691 (1996); Zanotti etal., Structure of cyclic peptides : the crystal and solution conformation of cyclo (Phe-Phe-Aib-Leu-Pro), J. Peptide Res. 51: 460-466 (1998); Stroup et al., Crystal Structureof cyclo (Gly/-L-Pro2-D-Phe3-L-Ala4-L-Prosp : A Cyclic pentapeptide with a Gly-L-Pro J Turn, J. Am. Chem. Soc. 110: 5157-5161 (1988); Stroup et al., Crystal Structure ofcyclo (Gly-L-Pro-D-Phe-Gly-L-Val) : An Example of a new Type of Three-Residue Turn, J. Am. Chem. Soc. 110: 5157-5161 (1988)。Ｘ線構造は、普通でないアミノ酸を含むＣＰＰｓを包含するいくつかのＣＰＰｓに利用可能である。Zanotti et al., Structure of cyclic peptides : thecrystal and solution conformation of cyclo (Phe-Phe-Aib-Leu-Pro), J. Peptide Res. 51: 460466(1998) ; Anwer et al., Backbonemodifications in cyclic peptides. Conformational analysis of a cyclic pseudopentapeptide containing a thiomethylene ether amide bond replacement, Int. J. Pept. Prot. Res. 36: 392-399 (1990). The Gierasch group, accumulated a large amount of information by NMR concerning CPPs with one or to proline residues, and the Kessler group, which studied mostly CPPs containing D-amino acid residues. Stradley et al., Cyclic Pentapeptides as Models for Reverse Turns : Determination of the Equilibrium Distribution Between Type I and Type II Conformations of Pro-Asn and Pro-Ala -Turns, Biopolymers 29: 263-287 (1990); Koppitz et al.,Synthesis of Unnatural Lipophilic N-(9-H-Fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl-Substituted a-amino Acids and their Incorporation into Cyclic RGD-Peptides : A Structure Activity Study, Helv. Chim. Acta 80:1280-1300 (1997)。
【００１６】
実際、既知の三次元構造を有する受容体プローブに関するコンホーメーション鋳型としてのＣＰＰｓの使用は１９９０年代初めにKesslerのグループにより開始された。Mastle et al.,Cyclo (D-Pro-L-Pro-D-Pro-L-Pro) : Structural Properties and cisltrans Isomerizationofthe Cyclotetrapeptide Backbone, Biopolymers 28: 161-174(1989) ; Kessler et al.,Selective RGD peptides for Inhibition of Cell-Cell interactions via backbone cyclization, Peptides 1992, Proc. Twenty-Second Europ. Peptide Symp. Edited by Schneider et al., ESCOM ; p. 75-76(1993) ; Muller et al., Pharmacophorerefinement of gpIlb/IIIa antagonists based on comparative studies of antiadhesive cyclic and acyclic RGD peptides, J. Comp Aided Mol. Design, 8: 709-730(1994) ; Muller et al., Dynamic Forcing, a Method for Evaluating Activity and Selectivity Profilesof RGD (Arg-Gly-Asp) Peptides, Angew. Chem. Inst. Ed. Engl. 31: 326-328 (1992).さらなるＮＭＲ測定に基づいて、彼らは（ａＢＣＤＥ）型の「コンホーメーション鋳型」（小文字はＤ−アミノ酸を示す）を提案した。それはａＢフラグメントの中心にあるβＩＩ’−ターンおよびＤ残基におけるγ−ターンにより特徴づけられる単一のコンホーメーションを有するものであった。Gurrath et al.,Conformation/activity studies of rationally designed potent anti-adhesive RGD peptides, Eur. J. Biochem. 210: 911-921 (1992)。配列中のＤ−アミノ酸残基の位置を動かすと、同じタイプの新たなコンホーメーション鋳型が得られ、ペプチドファーマコフォア（pharmacophore）の検討のためにそれらの生物学的試験のデータを用いることができるであろう。Kesslerのグループは上記アプローチをＲＧＤペプチドに適用し、いくつかのタイプの対応ペプチド模倣物を設計した。Haubner et al., Stereoisomeric Peptide Libraries and Peptidomimetics for Designing Selective Inhibitorsof the anss3 Integrin for a New Cancer Therapy, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36: 1374-1389 (1997); Haubner et al., Structural and Functional Aspects of RGD-Containing CyclicPentapeptides and Highly Potent and Selective Integrin AVss3 Antagonists, J. Am. Chem. Soc. 118: 7461-7472 (1996); Haubner et al., Cyclic RGD PeptidesContaining ss-Turn Mimetics, J. Am. Chem. Soc. 118: 7881-7891 (1996)。Schumannらは、γ−タ−ン模倣物として作用するβ−アミノ酸を用いる全体構造の安定化を生じさせる環状ペプチドについて最近報告している。Schumann et al., Are Amino Acids y-Turn Mimetics ? Exploring a New Design Principle for Bioactive Cyclopeptides, J. Am. Chem. Soc. 122: 12009-12010 (2000)。
【００１７】
しかしながら、このアプローチは重大な欠点を有する可能性がある。大部分の短いペプチドは、環状のものであっても、溶液中では異なる相互変換コンホーマーとして存在するのである。結果として、ＣＰＰｓの三次元構造決定のために実験的手法のみを使用する場合に避けがたい困難性がある。Ｘ線による研究は、結晶格子中の分子間相互作用による結晶化のプロセスの間に安定化されるわずかな三次元構造に関する知識しかもたらさない。これらの三次元構造は稀に「受容体−結合」コンホーマー（複数も可）に対応する。Marshall GR, Peptide Interactionswith G-Coupled Protein Receptors, Curr. Pharmaceutical Design, 2001 (印刷中)。一方、ＮＭＲスペクトル測定法により測定されるコンホーメーションパラメーターの各値は（ビシナルカップリング定数、ＮＯＥｓ等と同様）有意な統計学的重量を有する未知数のコンホーマーの平均値を示す。すべての測定されたパラメーターを単一の三次元構造中に適合させて対応する束縛をインポーズする試みは、１のコンホーマーが非常に優勢な統計学的重量を持って溶液中に存在するという非常にあり得ないケースにおいてのみ正当化されうる。多くの研究者は、単一のコンホーマーにインポーズされるＮＭＲ由来の制限を緩和することにより、あるいは全体としてＮＭＲ制限を満足するコンホーマーのランダムなファミリーを得ることにより、このコンホーメーション平均化の問題に挑んでいる。Muller et al., Dynamic Forcing, aMethod fo Evaluating Activity and Selectivity Profiles of RGD (Arg-Gly-Asp J Peptides, Angew. Chem. Inst. Ed. Engl. 31: 326-328 (1992); Mierke et al., Peptide flexibility and calculations of an ensemble of molecules, J. Am. Chem. Soc. 116: 1042-1049(1994) ; Cuniasse et al.,Accountingfor Conformational Variability in NMR Structure ofCyclopeptides : Ensemble Averaging of Interproton Distance and Coupling ConstantRestraints, J. Am. Chem. Soc. 119: 5239-5248 (1997)。両方の場合において、示唆された三次元構造は、分子運動論シミュレーションのごときエネルギー計算を含むいくつかの方法によりリファインされる。結果として、分子は最も近いエネルギー最小値（複数も可）のものとされ、該最小値は必ずしもコンホーメーションエネルギーよりも低いものではない。Zanottiらによる最近の研究により実際的な例が提供され、それは同じシクロペンタペプチド[シクロ(Phe-Phe-Aib-Leu-Pro)]は結晶状態および種々の無極性溶液中において異なるコンホーメーションを有し、それらのコンホーメーションのうちβＩＩ’Ｄ型のものは１つもないことを示している。Zanotti et al., Structure of cyclic peptides : the crystal and solution conformation of cyclo (Phe-Phe-Aib-Leu-Pro), J. Peptide Res. 51: 460-466 (1998)。
【００１８】
コンホーメーション的に束縛されたアミノ酸およびペプチドの合成およびコンホーメーション分析、ならびにアミノ酸の化学修飾および環状束縛の包含のコンホーメーション上の影響は医薬品の製造に重要である。この領域の最近の刊行物は逆−ターンペプチド模倣物ならびに１，５−二置換テトラゾールおよびアザプロリンを包含するシス−アミド結合模倣物の化学およびコンホーメーション分析の両方に関するものである。Chalmers, et al.,Pro-D-NMe-Amino and D-Pro-NMe-Amino Acid : Simple, Efficient Reverse-Turn Constraints. J. Am. Chem. Soc., 117: 5927-5937 (1995); Takeuchi et al., Conformational Analysis of Reverse-Turn Constraints by N-Methylation andN-Hydroxylation of Amide Bonds in Peptides and Non-Peptide Mimetics. J. Am. Chem. Soc., 120: 5363-5372 (1998); Zabrocki et al.,Conformational Mimicry. 3. Synthesis and Incorporation of1, 5-Disubstituted Tetrazol Dipeptide Analogues Into Peptides with Preservation of Chiral Integrity : Bradykinin, J. Org. Chem., 57: 202-209 (1992); Zabrocki et al.,Synthesis of a Somatostation Analog Containing a Tetrazole cis-Amide Bond Surrogate, Proc.llth Am. PeptideSymp., 195-197 (1990); Berglund et al., Conformational analysis of azaproline and other turninducers, Peptides for the New Millenium (Proc.16th AM Peptide Soc.), Edited by Fields et al., Kluwer Academic Publishers; 309-310 (1999); Zhang et al.,[AzPro3J-TRH. Impact of Azapoline on Cis-Trans Isomerism, Peptides 2000: Proc. 26th European Peptide Symp., Edited by Martines J: EDK; 2001, 印刷中。キメラアミノ酸が製造され、種々の生物学的活性ペプチド中に組み込まれてそれらの生物学的活性コンホーメーションが探索されている。Nikiforovich et al., Three-dimensional recognition requirementsfor angiotensin agohists : A vcovel solution for an old problem, Biochem. Biophys. Res. Commun., 195: 222-228 (1993); Marshall et al., Chimeric Amino Acid as Tools in Conformational Analysis: Bradykinin and Angiotensin II, In Peptide Chemistry, Proc. 2nd Japanese Symposium on Peptide Chemistry, Edited byYanihara N: ESCOM Scientific Publishers; 1993: 474-478 (1992);Kaczmarek et al., Chimeric amino acids in, cyclic bradykininanalogs : evidence for receptor-bound turn conformation, Peptides: Chemistry, Structure and Biology(13th American Peptide Symposium) ; Leiden, Edited by Hodges et al., ESCOM Scientific Publishers: 687-689 (1994); Olma et al., Chimeric amino acids in cyclicGnRH anatagonists, Peptides: Chemistry, Structure and Biology(13th American Peptide Symposium) ; Leiden, Edited by Hodges et al., ESCOM Scientific Publishers: 684-686(1994) ; Nikiforovich et al., Topographical Requirements for Delta-Selective Opiod Peptides, Biopolymers, 31:941-955 (1991) ; Nikiforovich et al., Models for A-and B-receptor-bound conformations of CCK-8, Biochem. Biophys. Res. Commun.194 : 9-16 (1993)。
【００１９】
最近、プロトタイプＧＰＣＲである光活性化ロドプシンに結合したトランスデューシンのα−サブユニットのペプチド、Ｃ−末端ウンデカペプチドのコンホーメーションが、トランスファーＮＯＥスペクトル測定法により決定された。Kisselev et al.,Light-activated rhodopsin induces structural binding motif in G protein alpha subunit, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4270-4275 (1998)。ＧＰＣＲと複合体化したペプチドの最初の受容体−結合コンホーメーションに関するこの成功した決定にもかかわらず、かかる直接的方法は、生物物理学的研究に使用できる量が限られているので、他のＧＰＣＲｓには使用できない。側鎖を配置するための置換プロリンおよびピペコリン酸の合成は興味深いものである。Kolodziej et al.,Ac- (3- ad 4- alkylthioproline31]-CCK4 analogs: synthesis and implications for the CCK-B receptorbound conformation, J. Med. Chem., 38: 137-149(1995) ; Kolodziej et al., Stereoselective Syntheses of3-Mercaptoproline Derivatives Protected for Solid Phase Peptide Synthesis, International Journal of Peptide & Protein Research(1996) ; Makara et al., A Facile Synthesisof 3-Substituted Pipecolic Acids, Chimeric Amino Acids, Tetrahedron Lett. 38: 5069-5072 (1997)。化学、コンホーメーション分析およびペプチド模倣物の設計におけるこのさらなるバックグラウンドは、本発明に関する理解しやすい基礎を提供する。
【００２０】
したがって、受容体に対するリガンド結合部位を決定する目的で１のコンホーメーションに束縛された、モデルリガンドに関するコンホーメーション鋳型に対する必要性がある。
【００２１】
発明の概要
本発明は、上で議論した従来技術の問題を解決し、当該分野の現状に明らかな進歩をもたらすものである。詳細には、本発明は、目的の受容体と結合するための該柔軟な分子上の１またはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置の決定に使用するために柔軟な分子をコンホーメーション的に束縛する方法を提供する。該方法は、分子中に少なくとも１つのアミド部分を含む金属イオン複合体化骨格を有するペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択される分子を用意する最初の工程を含む。次の工程は、骨格中の少なくとも１つのアミド部分を少なくとも１つのヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログ部分に置き換えて、骨格上に少なくとも１つの金属イオン結合部位を用意することを含む。最後に、金属イオン結合部位において金属イオンを該分子と複合体化させ、そのことにより分子のコンホーメーションを得る。
【００２２】
本発明のもう１つの好ましい方法は、目的の受容体との結合のための柔軟な分子上の１つまたはそれ以上の三次元コンホーメーションおよび位置を確立する方法を包含する。先ず、ペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択される分子を用意する。該分子は、少なくとも１つのアミド部分を伴う金属イオン複合体化骨格を有する。次に、該骨格の１つまたはそれ以上の所望のセクションを選択して金属イオン結合部位の候補として作用させて、該分子の所望のコンホーメーションを形成させる。金属イオン結合部位候補における少なくとも１つのアミド部分を少なくとも１つのヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログ部分に置き換える。次いで、金属イオン結合部位候補において金属イオンを該分子と複合体化させ、そのことにより該分子のコンホーメーションを束縛する。該分子を試験して、目的の受容体との結合アフィニティーを調べ、該分子上の１つまたはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を分析して、該分子の受容体−結合コンホーメーションを決定する。
【００２３】
目的の受容体との結合のための分子上の１つまたはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置の決定に使用するために柔軟な分子をコンホーメーション的に束縛するもう１つの方法が提供される。該方法は、一般式：
【化１】
2005518334.tif 000002
[式中、Ｒ１およびＲ２はＸにより結合され、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ約１個ないし２０個のアミノ酸を含む]
を有するペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択される分子を用意する工程を含む。Ｘはその中に少なくとも１つのヒドロキサメートまたはヒドロキサメートアナログ部分を有する金属イオン複合体化骨格であり、少なくとも１つのヒドロキサメート部分は金属イオン結合部位として作用する。次いで、金属イオン複合体化部位において該分子を金属イオンと複合体化させ、そのことにより該分子のコンホーメーションを束縛する。
【００２４】
また本発明は、目的の受容体と結合するための柔軟な分子上の１つまたはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置を確立する方法も提供する。該方法は、少なくとも１種の環状ペプチド分子を用意し、環状ペプチド分子中の十分なアミド結合を還元して第２級アミンとして少なくとも１種のキラルアザクラウンを得て、ついで、金属イオンをキラルアザクラウンと複合体化させ、そのとによりキラルアザクラウンのコンホーメーションを束縛することを含む。次に、キラルアザクラウン分子を試験して、目的受容体に対するキラルアザクラウンの結合アフィニティーを調べ、キラルアザクラウン上の１つまたはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を分析して、キラルアザクラウンの受容体−結合コンホーメーションを決定する。
【００２５】
そのうえ、本発明は、目的の生物学的活性分子の単離、生物学的活性分子のコンホーメーションの分析、および目的の受容体に結合するための分子上の１つまたはそれ以上の活性部位の正しい三次元コンホーメーションおよび位置に関する１またはそれ以上の仮説を得ることを包含する、所望の生物学的活性を求めて化合物を設計する方法を提供する。次に、該仮設に合致した、少なくとも１種の、生物学的活性分子の活性のある束縛されたアナログを得る。アナログを試験して、目的の受容体に対するその結合アフィニティーを調べ、受容体−結合コンホーメーションにおけるアナログ上の１つまたはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置をマッピングする。最後に、アナログ上の１種またはそれ以上の活性部位の三次元コンホーメーションおよび位置を模倣する少なくとも１種の分子をそれより設計する。
【００２６】
さらにそのうえ、本発明は、ペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択されるコンホーメーション的に束縛された分子のライブラリーを提供し、それらの分子は１またはそれ以上の所望特性に標的化された候補である。本発明のライブラリーは、異なるキラリティーおよびそれらの組み合わせを有する少なくとも５種の異なる分子のアレイを含み、候補分子は所望標的特性に関して取り出し可能であり分析可能である。
【００２７】
所望の生物学的活性を有する天然分子を選択する方法も本発明により提供される。この方法は、異なるキラリティーおよびそれらの組み合わせを有する少なくとも５種の異なる分子のアレイを有するペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択されるコンホーメーション的に束縛された分子のライブラリーを得ることを包含する。生物学的アッセイを用いて、目的の受容体に対する所望の結合アフィニティーを有する少なくとも１種の分子に関してライブラリーをスクリーニングする。次いで、その受容体−結合コンホーメーション中の分子の１またはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を誘導する。次に、上述の分子に実質的に類似したコンホーメーションを有する少なくとも１種の天然分子を選択し、次いで、所望生物学的活性に関して試験する。
【００２８】
本発明は、所望生物学的機能ドメインを模倣するファーマコフォアを得る方法も包含する。先ず、ペプチドおよびペプチド模倣物からなる群より選択されるコンホーメーション的に束縛された分子のライブラリーを得る。ライブラリーは、異なるキラリティーを有する少なくとも５種の分子およびその組み合わせのアレイを含む。次いで、目的の受容体に対する結合アフィニティーを有する少なくとも１種の分子に関してライブラリーをスクリーニングし、所望生物学的機能ドメインを有する分子を選択する。該分子上の１つまたはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を分析し、該分子の１またはそれ以上の活性部位の三次元構造および位置を模倣するファーマコフォアを得る。
【００２９】
最後に、コンホーメーション的に束縛された生物学的活性分子のライブラリーを用意して、該分子の１つまたはそれ以上の結合部位の三次元構造および位置をはっきりさせる。ライブラリーは、異なるキラリティーおよびそれらの組み合わせを有するペプチドおよびペプチド模倣物から選択される少なくとも５種の柔軟な分子のアレイを含む。目的の受容体に結合する場合には、各分子は５つ未満の十分に定義された三次元構造を有し、各分子は合成的に得られるものであり、各分子の少なくとも１つの側鎖は受容体との相互作用の間、独自に方向付けられうるものである。
【００３０】
本発明のこれらのおよび他の特徴、態様および利点は、以下の説明、特許請求の範囲および添付図面を参照すれば、よりよく理解されるようになるであろう。
【００３１】
発明の詳細な記載
一般的には、以下に用いる命名法ならびに研究室的方法は当該分野においてよく知られ、通常使用されているものである。特記したいかぎり、本明細書中のすべての技法および科学用語は本発明が属する分野の当業者により通常に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を本発明の実施および試験に使用することができる。本発明の理解を容易ならしめるために、本明細書に用いる多くの用語を以下に定義する。
【００３２】
本明細書の用語「コンホーメーション的に束縛された」または「コンホーメーション的に束縛する」は、ペプチド化合物、キラルアザクラウン化合物またはペプチド模倣物を安定化させて、化合物をただ１つの三次元コンホーメーション、好ましくはその受容体−結合三次元コンホーメーションに維持することをいう。本明細書の用語「活性部位」または「官能基」は、受容体への結合のために受容体と相互作用するリガンド分子の部分をいう。本明細書の用語「ペプチド模倣物」は、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣または拮抗しうる非ペプチド構造エレメントを含む化合物をいう。
【００３３】
本発明は、受容体／ペプチド三成分複合体上の結合部位の解明のためにコンホーメーション的に束縛された生物活性分子を得るために金属と複合体化される場合においてコンホーメーション鋳型として用いられるキラルアザクラウン、ペプチドおよびそれらの合成可能な誘導体のごときペプチド模倣物のライブラリーを作成することに指向される。かかるコンホーメーション鋳型の最適な使用のためには、効果的な様式でのライブラリーの実質的なスクリーニングにより合成標的の合理的な選択をすることができよう。コンホーメーション鋳型はモデルリガンドであり、以下の少なくとも３つの基準を満たすべきである：（i）ただ１つの三次元構造（または十分に定義されたわずかな数の三次元構造）を有すべきである;（ｉｉ）容易に合成により得られるべきである；（ｉｉｉ）ペプチド−受容体相互作用の間に大部分の情報を移すと考えられるペプチド側鎖をユニークに方向付けることができるべきである。いくつかの有用な環状ペプチドおよびその合成誘導体はシクロジペプチド類、シクロトリペプチド類、シクロテトラペプチド類およびシクロペンタペプチド類である。本発明にとり有用ないくつかのキラルアザクラウンはキラルペンタアザクラウン類（ＰＡＣｓ）である。
【００３４】
シクロジペプチド類またはジケトピペラジン類（ＤＫＰｓ）は、非常に制限されたコンホーメーションのものが容易に合成により得ることができる。なぜなら、２個のシス−アミド結合が閉環に必要だからである。非常に限定されたセットの骨格構造の修飾が可能であり（Ｌ，Ｌ；Ｄ，Ｌ；およびそれらの鏡像体）、これらはすべて結晶像により試験されている。これらの化合物は側鎖の方向の多様性が限定されており、結合ポイントとしてアミド窒素を用いる可能性がある。ＤＫＰｓのライブラリーに都合のよい固相法が公表されている。Del Fresno et al.,Solid-Phase Synthesis of Diketopeperazine, Useful Scaffolds for Combinatorial Chemistry, Tetrahedron Lett. 39: 2639-2642(1998) ; Bianco et al., Solid-phase Synthesis and structural characterization of highly substituted hydroxyproline-based 2,5diketopiperazines, J. Org. Chem. 65: 2179-2187(2000); Lin et al., Utilizationof Fukuyama's sulfonamede protecting group for the synthesis of N-substituted alpha-amino acids and derivatives, Tetrahedron Lett. 41: 3309-3313 (2000); Nefzi et al., Solid-phase synthesis of substituted 2,3-diketopiperazines from reduced polyamides, Tetrahedron 56: 3319-3326 (2000)。酵素によりペプチドからＤＫＰｓが得られ、それら自体、興味深い生物学的効果を有することが多い。Prasad etal., Bioactive Cyclic Dipeptides, Peptides 16:151- 164 (1995)。
【００３５】
シクロトリペプチド類（Ｃ３Ｐｓ）は９員環を有するが、時々環化が困難で、それゆえ、３個のシス−アミド結合の配置の歪みが時々必要である。Ovchinnikov et al., The Cyclic Peptides : Structure, Conformation, and Function, The Proteins, Edited by Neurath etal., Academic Press, vol. 5, p. 307-642 (1982)。この理由により、比較的わずかな例しか文献にない。一般的には、骨格のＣ３−対称コンホーメーションはゆっくりと非対称コンホーメーションと相互変換する。Cyclo (D-Pro-L-Pro-D-Pro)は溶液および結晶の両方においてボート型コンホーメーションとして存在する。Bats etal., Boat Conformationof cyclo-[L-Pro2-D-Pro, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 18: 538-539 (1979)。
【００３６】
コンホーメーション鋳型のための限定された候補はシクロテトラペプチド類（ＣＴＰｓ）である。なぜなら、それらは小さい１２員環であり、シス−およびトランス−アミド結合コンホーマー間の平衡があるためである。ＣＴＰｓは研究されており、それらのコンホーメーションを予想するための経験的法則が提案されている。Kato et al., Empiricalrules predicting conformation of cyclic tetrapeptides Rom primary structure, Int. J. Peptide Protein REs. 29: 53-61 (1989)。おそらく、ＣβおよびＣγ原子の異なった縮みと組み合わされたたった２つのシクロエナンチオマー骨格（シス-トランス-シス-トランスまたはトランス-シス-トランス-シスアミド結合）コンホーメーションを有するシクロ(D-Pro-L-Pro-D-Pro-L-Pro)が最も興味深い。Mastle et al.,Cyclo (D-Pro-L-Pro-D-Pro-L-Pro): Structural Properties and cisltrans Isomerization of the Cyclotetrapeptide Backbone, Biopolymers 28: 161-174 (1989)。Mastleらにより議論された固相合成によりあるいは収束溶液経路（convergent solution route）により環化中の収率８５％で誘導体を容易に得ることができる。Gilbertson et al., The synthesis and conformation ofdihydroxy-cyclo (D-pro-L-pro-D-pro-L-pro), Tetrahedron Lett. 36: 1229-1232 (1995)。広範な置換プロリン誘導体（例えば、3-および4-メルカプトプロリンおよび5-アルキルプロリン）およびそれらの製造のための立体選択的経路を考慮すると、このコンホーメーション構造は考慮する価値がある。Kolodziej et al., Stereoselective Synthesis of 3-Mercaptoproline Derivatives Protectedfor Solid Phase Peptide Synthesis, Int. Jour. Pept. & Protein Research, (1996); Ho et al., An Asymmetric Synthesis of cis-5-Alkylproline Derivatives, J. Org. Chem. 51: 2405-2408 (1986); Ibrahim et al., Synthesis of Enantiopure Delta-Oxo Alpha-Amino Esters and Prolines Vis Acylation of N- (Phenylfluorenyl) Glutamate Enolates, J. Org. Chem. 58: 6438-6441 (1993); Weisshoff et al., Cycliccholecystokinin-analog pentapeptide cyclo (Asp-Trp-Met-Asp-Phe): An unexpected solution conformation, Biochem. Biophys. Res. Commun. 213: 506-512 (1995)。シクロ(D-Pro-L-Pro(4-OH)-D-Pro-L-Pro(4-OH))の場合、直鎖状テトラペプチドの環化によりただ１つのエナンチオマー（ｔｃｔｃ）が得られる。Gilbertson et al., The synthesis and conformation of dihydroxy-cyclo (D-pro-L-pro-D-pro-L-pro), Tetrahedron Lett. 36: 1229-1232 (1995)。
【００３７】
本発明のコンホーメーション鋳型の優れた候補はシクロペンタペプチド類（ＣＰＰｓ）である。ＣＰＰは本発明にとり好ましいコンホーメーション鋳型である。第１に、それらは比較的コンホーメーション的に堅固である。第２に、異なるタイプのＣＰＰｓは異なるタイプのペプチド骨格のコンホーメーションエレメント、種々のβ−ターン、γ−ターンおよびα−らせん様構造さえも生じさせることができる。Weisshoff et al., Cyclic cholecystokini analog pentapeptide cyclo (Asp-Trp-Met-Asp-Phe) : An unexpected solution conformation, Biochem. Biophys. Res. Commun. 213: 506-512 (1995)。第３に、ＣＰＰｓを修飾して多種多様な側鎖を含ませることが容易にできる。さらに、第４に、それらは合成により得ることができる。最近のレビューは、Ｌ−アミノ酸のほかにＤ−または非−キラルアミノ酸を含むＣＰＰｓが容易に得られることを指摘している。Schmidt et al.,Cyclotetrapeptids and cyclopentapeptides : occurrence and synthesis, J. Pept. Res. 49: 67-73 (1997)。７−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾールから誘導された試薬を用いて、全く合理的な収率ですべてのＬ−アミノ酸ＣＰＰｓを固相合成により得ることもできる。Ehrlich et al., Synthesis of cyclic peptides via efficient new coupling reagents, Peptides Chemistry, Structure and Biology, Proceedins of the13th American Peptide Symposium, Edited by Hodges et al., ESCOM p. 95-96(1995) ; Ehrlich et al., Cyclization of all-L pentapeptides by means of HAPyU, Peptides 1994, Proceedings of the 23rd European Peptide Symposium, Edited by Maia HLS: ESCOM p.167-168 (1995)。
【００３８】
本発明は、所望生物学的活性を有する医薬の開発に使用される、ペプチドおよびそれらの合成アナログならびにペンタアザクラウンのごときキラルアザクラウンのコンビナトリアルライブラリーの作成に指向される。医薬およびペプチド模倣物の設計のためのヒエラルヒー的アプローチを図１に示す。また本発明は、このヒエラルヒー的アプローチに２つの工程を付加するものである。これらの２つの工程は、本発明において開発されたコンホーメーション鋳型を用いて受容体による側鎖の三次元的認識必須要件（すなわち、ファーマコフォア）に関する仮説を立てるのに役立つ。対応する実際的なライブラリーのスクリーニングにより、これらの仮説を検証する他の化合物を容易に同定し、最終工程において合成することができる。側鎖基の三次元的配置が確認されると、多くのコンピューターにより援助される設計ツールを用いることにより、より望ましい薬剤様特性を有する他の構造をリガンドの設計に使用することができる。Lauri et al., CAVEAT : A program to facilitate the design of Organic Molecules, J. Comput.-Aided Mol. Des. 8: 51-66 (1994); Ho et al., FOUNDATION: A program to retrieve subsets of query elements, including active site regionaccessibility, from three-dimensional databases, J. Comput. Aided Mol. Des. 7: 3-22 (1993); Martin et al., MENTHOR, a database system for the storage and retrieval of threedimensional molecular structures and associate data searchable by substructure, biologic, physical, or geometric properties., J. Comput. Aided Mol. Des. 2: 15-29 (1988)。
【００３９】
生物学的活性ペプチドをそれらの受容体−結合コンホーメーションにコンホーメーション的に束縛することに多くの努力がなされてきた。主にプレオーガナイゼーションによりペプチドリガンドの受容体に対するアフィニティーを向上させる必要性によりこれらの努力がなされてきた。このアプローチへのはずみは、多くの生物学的活性ペプチドに関する主要生物学的標的であるＧ−プロテイン結合受容体の構造的詳細が得られていないことからももたらされた。かくして、間接的方法は受容体−結合コンホーメーションを決定するのに適したものであるが、治療薬としてのペプチド模倣物の開発を妨げるものである。ジスルフィド、アミド、あるいは金属を用いることによる炭素−炭素結合による慣用的な環化ならびにペプチド自体に特異的な金属結合部位を導入することに努力が払われてきた。「金属イオンとの複合体化によりコンホーメーション的に束縛された球状二次構造を有する、診断イメージング、放射線治療、または治療薬」として用いられるペプチドを包含する、最近付与された特許米国特許第５８９１４１８号参照。短いペプチドのコンホーメーションを制御して結合コンフォーメーションにするための戦略としての金属鋳型の使用は、TianおよびBartlettにより明らかに示されていた。Tian et al.,Metal Coordination As a Methodfor Templating Peptide Conformation, J. Am. Chem. Soc. 118: 943-949 (1996)。Ｃｕ（ＩＩ）のペプチド複合体を用いて、α−アミラーゼの蛋白性阻害剤であるテンダミスタット（tendamistat）のＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒβ−ターンセグメントが模倣された。これらの模倣物は、図１３に示すようにＮ−末端アミノ基および次の３個のアミド窒素が金属とともに四角形の平面を示しているＣｕ（ＩＩ）とペンタグリシンとの複合体の構造に基づいていた。Ｔｒｐ、Ａｒｇ、およびＴｙｒ残基を含む３種のテトラペプチドはＣｕ（ＩＩ）存在下においてほぼ１００倍の阻害増強を示した。この研究における１つの厄介な要因は、固有のアミラーゼ阻害活性を有する複合体からの銅の解離であった。金属複合体が対応する生物学的環境において安定性を有し、その作用機構の曖昧さを減らし、生じうる毒性を減らすことが最も望ましい。
【００４０】
ShiおよびSharmaは、金属イオンにより誘導される構造の特殊アレイ（ＭＩＤＡＳ）といわれるコンビネーション法を開発し、該方法において、ペプチドＮ−末端のシステイン残基に先行する２個のアミノ酸のアミド窒素がレニウム試薬と反応して、固相または溶液相の化学により、安定なレニウム複合体を形成するようになる。Shi et al., Metallopeptide Approach to the Design of Biologically Active Ligands : Design of Specific Human Neutrophil Elastase Inhibitors, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 1469-1474 (1999)。このことは、TienおよびBartlettのＣｕ（ＩＩ）複合体についても類似の構造を有する安定な複合体を導く。Tian et al., Metal Coordination As a Method for Templating Peptide Conformation, J. Am. Chem. Soc. 118: 943-949 (1996)。図１４に示すような、ヒト好中球エラスターゼの選択的阻害剤およびメラノコルチン−１受容体の非常に選択的なアゴニストがＭＩＤＡＳ法により見出された。Shi et al., Metallopeptide Approach to the Design of Biologically Active Ligands : Design of Specific Human Neutrophil Elastase Inhibitors, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 1469-1474 (1999); Shi et al.,Conformationally ConstrainedMetallopeptide Template for Melanocortin-1 Receptor, Abstr. 218th ACS Natl. Meeting; New Orleans, LA: American Chemical Society: MEDI-257 (1999)。
同様のアプローチにおいて、Giblin1らは、レニウムおよびテクネチウムを用いてα−メラノトロピンアナログを環化させ、そこでは還元された[Cys4,10, D-Phe7]-α.-Msh4-13がＲｅ（Ｖ）と複合体化された。Giblin et al., Synthesis and characterization of rhenium-complexed alpha-melanotropin analogs, Bioconjugate Chem. 8:347-353 (1997); Giblin et al., Design and characterization of alpha-melanotropin peptide analogs cyclized through rhenium and technetium metal coordination, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12814-12818 (1998)。Ｃｙｓ−１０のチオレートイオウおよび２個の先行するアミド窒素ならびにＣｙｓ−４のチオレートイオウが、図１４に示す複合体と同様のドナー原子の四角形の平面を提供することが、ＮＭＲにより示唆された。ジスルフィド親化合物と比較すると、結合アフィニティーは約１００分の１に低下していた。そのかわり、[Cys3,4,10, D-Phe7]-α-Msh4-13を用いた場合には、ドナー原子は３個のチオレートイオウおよびＣｙｓ−３とＣｙｓ−４との間のアミド窒素であった。この場合、結合アフィニティーは以前のレニウム複合体よりも２５倍改善されたが、やはり親化合物の４分の１であった。
【００４１】
いくつかの他のグループもアミノ酸側鎖（システイン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸等）を用いて特定の金属の連結に関与させ、所望コンホーメーションを安定化させている。このアプローチを説明する例が少しある。GhadiriらはＣｙｓおよびＨｉｓを短いらせんペプチド配列の残基ｉおよびｉ＋４に導入し、特定の金属の存在下におけらせん性の増大を示した。Ghadiri et al., Secondary Structure Nucleation in Peptides. Transition Metal Ion Stabilized α-Helices, J. Am. Chem. Soc. 112:1630-1632 (1990); Ghadiri et al., Peptide Architecture. Design of Stable α-Helical Metallopeptides via a Novel Exchange-Inert RulIl Complex, J. Am. Chem. Soc. 112:9403-9404 (1990)。Ruanらは、アミノジ酢酸を含む普通でないアミノ酸をｉおよびｉ＋３位に導入して金属存在下においてらせんを安定化させた。Ruan et al., Metal Ion Enhanced Helicity in Synthetic Peptides Containing Unnatural, Metal-Ligating Residues, J. Am. Chem. Soc. 112:9403-9404 (1990)。Chengらは、側鎖中に強力な二座配位子を含む数種のアミノ酸を調製した。Cheng et al., Metallopeptide Design - Tuning the Metal Cation Affinities with Unnatural Amino Acids and Peptide Secondary Structure, J. Am. Chem. Soc. 118:11349-11356 (1996)。SchneiderおよびKellyは、Ｃｕ（ＩＩ）と複合体化した場合にβ−ターンのｉ＋１およびｉ＋２残基と置き換わるように設計された新規６，６’−ビス（アシルアミノ）−２，２’−ビピリジンをベースにしたアミノ酸を用いた。Schneider et al., Synthesis and Efficacy of Square Planar Copper Complexes Designed to Nucleate β-Sheet Structure, J. Am. Chem. Soc. 117:2533-2546 (1995)。
【００４２】
Marshallらは、潜在的に経口活性のある鉄キレーターおよび可能な抗生物質としての、天然に存在する種々のヘドロキシメート−含有サイデロフォア（siderophores）（デスフェリオキサミン、エキソヘリン類、マイコバクチン類、およびアエロバクチン類）のアナログを得るためのコンビナトリアル固相法を開発した。Slomczynska et al., Hydroxamate analog libraries and evaluation of iron affinities, Transfusion Science 23:265-266 (2000); Marshall et al., Combinatorial Chemistry of Metal Binding Ligands, Adv. Suprmolecular Chem. (2001) 印刷中。これらの方法は米国特許出願第０９／３６０４１７号ならびに国際公開ＷＯ００／０４８６８号に開示されており、参照により本発明系に記載されているものとする。これらのライブラリーのために開発された化学は保護されたノシルヒドロキシルアミン誘導体のセットならびにライブラリーの製造を最適化する方法を含むものであり、本発明に有用である。これらのライブラリーの典型的な化学構造を下に示す：
【化２】
2005518334.tif 000003
【００４３】
YeおよびMarshallは、アミド骨格をヒドロキシメート基に修飾して複数の金属結合部位を提供するための合成経路を開発した。これらの分子は、微生物の鉄輸送に関与するデスフェリオキサミンのような天然に存在するヒドロキシメート−含有サイデロフォアを模倣するものである。Neilands JB, Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds, J. Biol. Chem. 270:26723-26726 (1995)。１：１複合体中の３個のヒドロキシメートを含むペプチドによるＦｅ（ＩＩＩ）のごとき金属の結合は、一般的には、ペプチドのコンホーメーションを固定し、側鎖の相対的方向を束縛しうる。明らかに、かかる複合体の安定性はペプチド骨格の３個のヒドロキシル基の配置に依存する。図４は、鉄イオンに対してアミド結合のかわりに３個の代替ヒドロキシメート基Ψ[CONOH]を含むペプチドの予想される六座配位子の八面体構造を示す。
【００４４】
合成の簡便性のために、サイデロフォアでの研究における保護ヒドロキシルアミンのin situ取り込みとは対照的に、ペプチド中に取り込まれる保護されたＮ−ヒドロキシ−Ｌ−α−アミノ酸前駆体が調製された。米国特許出願第０９／３６０４１７号ならびに国際公開第ＷＯ００／０４８６８号参照。該アプローチを説明するために、３種のＯ−保護Ｎ−ヒドロキシ−Ｌ−α−アミノ酸の合成の概要を示す。すなわち、ブロモ酢酸ｔ−ブチルエステルおよびＯ−ベンジルヒドロキシアミンからＮ−ベンジルオキシグリシンｔ−ブチルエステル（１）が容易に調製された。対応Ｄ−α−ヒドロキシ酸エステルアナログから、それらのトリフレート誘導体を経てＳｎ２機構により、高い光学純度のＮ−ヒドロキシ−Ｌ−α−アミノ酸誘導体が効率的に合成された。我々は、市販のＤ−（−）−乳酸ｔ−ブチルエステルを用いてＮ−ベンジルオキシアラニンｔ−ブチルエステル（２）を全工程の収率７５％で得た。Feenstra et al., An Efficient Synthesis of N-Hydroxy-α-Amino Acid Derivatives of High Optical Purity, Tetrahedron Lett. 28:1215-1218(1987)。市販のＤ−３−フェニル酢酸から出発してＮ−ベンジルオキシフェニルアラニン（３）の合成が同様に行われた。Ｄ−３−フェニル酢酸は、先ず、アリクアント３３６（aliquant 336）およびＮａＨＣＯ３の存在下において臭化アリルにより対応アリルエステルに変換された。得られたＮ−ベンジルオキシフェニルアラニンアリルエステルをピペリジン／Ｐｄ（ＰＰｈ３）４にて脱ブロックして、全工程の収率６５％で（３）が得られた。Friedrich-Bochtnitschek et al., J. Org. Chem. 54:751 (1989)。標準的なペプチドカップリング法を用いてＮ−ベンジルオキシアミノ酸構築ブロックをペプチド中に含ませることは困難である。なぜならそのＮＨＯＢｎ基の求核性が比較的低いからである。Perlow, D. S.らは、立体的に隠れたＮδ−Ｃｂｚ−ピペラジン酸のアシル化においてＦｍｏｃ−Ｌ−イソロイシンおよび塩素をうまく用い、トルエン中の酸塩化物とＡｇＣＮとの組み合わせによりアシル化効率が更に向上した。Perlow et al., .J. Org. Chem. 57:4390-4400 (1992)。トルエン中ＡｇＣＮ存在下におけるＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｌと１との反応により収率８５％でFmoc-Val-[CO(NOH)]-Gly-Butが得られた。ＴＦＡでのＢｕｔ基の開裂により対応酸が得られ、次いで、それはＨＢＴＵを用いてアラニンｔ−ブチルエステルとカップリングされてトリペプが得られた。Ｆｍｏｃ−アミノ酸塩化物／ＡｇＣＮ／トルエンの組み合わせは５のモデル化合物の合成に用いられた。モデル化合物は：H-Leu-Ψ[CO(NOH)]-Phe-Ala-NHOH、H-Val-Ψ[CO(NOH)]-Xxx-Ala-Leu-NHOH (Xxxx = Gly, Ala または Phe)、および H-VaI-Ψ[CO(NOH)]-Phe-Ala-Pro-Leu-NHOHである。モデル反応により、ＮＨＯＢｎ基をさらに保護せずに慣用的なペプチドカップリング法を用いると、Ｎ−ベンジルオキシフェニルアラニン（３）のＣＯＯＨ基の別のアミノ酸誘導体のＮＨ２基へのカップリングが円滑に進行することが明らかになった。このことは、ＮＨＯＢｎ基の比較的低い塩基性および求核性によるものといえる。
【００４５】
一例がスキーム１に示されているペプチドヒドロキシメート類の合成のための固相法は、汎用コンビナトリアル金属−結合ペプチドライブラリーの構築の助けとなる。金属プロテアーゼ阻害剤の検索に有用なＣ−末端ペプチドヒドロキサム酸の固相合成に関する数個の報告が文献にある。Chen et al., Solid Phase Synthesis of Peptide Hydroxamic Acids, Tetrahedron Letters 38:1511-1514 (1997); Dankwardt et al., Solid Phase Synthesis of Hydroxamic Acids, Synlett, 761 (1998); Bauer et al., A Novel Linkage for the Solid-Phase Synthesis of Hydroxamic Acids, Tetrahedron Letters, 38:7233-7236 (1997); Floyd et al., A Method for the Synthesis of Hydroxamic Acids on Solid Phase, Tetrahedron Letters, 37:8045-8048 (1996); Golebiowski et al., Solid Supported Synthesis of Hydroxamic Acids, Tetrahedron Letters 39:3397-3400 (1998); Grigg et al, Solution and Solid-Phase synthesis of Hydroxamic Acids Via Palladium Catalyzed Cascade Reactions, Tetrahedron Letters, 40:7709-7711 (1999)。ヒドロキサム酸およびアナログの他の合成法に関して米国特許第５９３２６９５号および米国特許第５８４９９５１号も参照。ジペプチド５を構築ブロックとして用いて、Ｎ−Ｆｍｏｃ−ヒドロキシルアミノ２−クロロトリチル樹脂から、全工程の収率６０％で９が合成された。この固相生成物は溶液中で得られた生成物と同一のスペクトル的特性を有していた。
【化３】
2005518334.tif 000004
【００４６】
鉄イオン（ＩＩＩ）と結合する３つのヒドロキサム基を有する１０種の化合物および銅と結合する２つのヒドロキサム基を有する９種の化合物を含むプロトタイプライブラリーを調製して、それらの金属アフィニティーを調べることができる。しかしながら、これらのスキームは説明であり、本発明はこれらの化合物の使用に限定されるものではない：
2. H-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-OH
3. c(-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-)
8. H-Pro-Ψ(CONOH)-Phen-Ala-Pro-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Pro-Ψ(CONOH)-Phen-Ala-OH 
9. c(-Pro-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Pro-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Pro-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-)
10. H-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Pro-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Pro-Leu-CONOH 
14. H-Val-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Pro-Leu-CONOH
15. H-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-OH 
16. c(-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-Leu-Ψ(CONOH)-Phe-Ala-)
【００４７】
金属に対するこれらのペプチドの結合能をエレクトロスプレイ−イオン化質量スペクトル測定法（以下、「ＥＳＩ−ＭＳ」という）により調べた。非共有結合複合体を無傷のまま気相に導入できる穏やかな性質のＥＳＩ−ＭＳをうまく用いて広範な非共有結合相互作用を研究した。かくして、ＥＳＩ−ＭＳは、溶液および異なるペプチド−金属結合複合体の相対的豊富さに関する平衡の情報を提供する。ペプチドリガンドを５０％ ＣＨ３ＣＮまたはメタノールに溶解し、次いで、１ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮＨ４／１０％ ＣＨ３ＯＨ溶液を用いて１０ｍＭにまで希釈した。金属イオンのストック溶液（２００μＭ）（CuSO4, NiSO4, ZnSO4, HgSO4, Co(NO3)2）を作成した。４０μｌのリガンド溶液を４０μｌの金属イオン溶液と混合し、メタノールまたは１ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮＨ４で希釈した。溶液をＫＯＨで処理して複合体を形成させた。競争的結合を用いて、２種の異なる金属イオンの添加による各リガンドの相対的金属−結合特性を研究した。競争的結合の分析により、化合物１４が２個のヒドロキシメート基を含むペプチドのうちで最強の金属−結合能を示し、以下の特異性を有することが決定された：
Cu(II)>Co(II)>Fe(III)>Cd(II)>Zn(II)>Ni(II)。
【００４８】
直鎖状構築物の１つの困難性は金属周辺の異なる順番のヒドロキシメート基に金属がキレートすることにより生じうる異性体の数が多いことである。３つのヒドロキシメートを有するデスフェリオキサミンの場合、Ｆｅ（ＩＩＩ）のごとき３価金属に結合するときには、図４に示すように５つの異性体（いわゆる「ラッピング（wrapping）異性体」）が生じる可能性があり、各々ラセミ体混合物として存在する。Leong et al., Coordination, isomers of biological iron transport compounds. III.(1) Transport of lambda-cis-chromic desferriferrichrome by Ustilago sphaerogena, Biochemical & Biophysical Research Communications, 60:1066-1071 (1974)。他のキラル中心が分子中に含まれる場合に、１つはエネルギー的に他の９つよりも可能性があるとしても、溶液中では数種の異性体が共存しうること、化合物の混合物の生物学的活性の解釈が複雑になりうることを考慮しなくてはならない。Yakirevitch et al., Chiral Siderophore Analogs: Ferrioxamines and Their Iron (III) Coordination Properties, Inorganic Chemistry 32:1779-1787 (1993)。環化により、直鎖状構築物のＮ−末端基およびＣ−末端基が隣接していない異性体が除かれる。複合体の構造におけるこの曖昧さはペプチドヒドロキシメートをコンホーメーション鋳型として適用することを制限する。しかしながら、それらは大型の受容体−結合構造の擬態であるという長所がある。なぜならヒドロキシメートの正しい位置的相互作用を可能にするにはスペーサーとして数個のアミノ酸が必要だからである。
【００４９】
本発明にとり有用な他の化合物はキラルペンタ−アザクラウン類（以下、「ＰＡＣｓ」という）の金属複合体である。アミド結合を環状ペンタペプチド前駆体の第２級アミンへと還元することは柔軟なキラル環状アザクラウンを生じさせる。金属と複合体化させることにより柔軟性を制限して、側鎖の方向を扱いやすいセットにすることができる。Rileyおよび共同研究者らは、スキーム２に示すようにＬｉＡｌＨ４またはボランにより環状ペンタペプチド中のアミド結合を還元してペンタ−アザクラウンエーテルを得た。それはマンガンと複合体を形成した場合に酵素スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）を模倣する。Aston et al., Asymmetric Synthesis of Highly Functionalized Polyazamacrocycles Via Reduction of Cyclic Peptide Precursors, Tetrahedron Lett. 35:3687-3690 (1994); Neumann et al,, Synthesis of Conformationally Tailored Pentaazacyclopentadecanes. Preorganizing Peptide Cyclizations, Tetrahedron Lett. 38:779-782 (1997); Riley et al., Manganese Marcrocyclic Ligand Complexes as Mimics of Superoxide Dismutase, J. Am. Chem. 116:387-388 (1994)。米国特許第５８７４４２１号および第５６３７５７８号および第５６９６１０９号には、１５員の環状化合物のマンガン（ＩＩ）、マンガン（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）または鉄（ＩＩＩ）複合体が記載されており、それらはすべて参照により本明細書に記載されているものとする。さらに、米国特許第６２１４８１７号、第５６１０２９３号および第６１８０６２０号には、これらの環状化合物の合成および使用が記載されており、それらはすべて参照により本明細書に記載されているものとする。ジアミノシクロヘキサン誘導体を取り入れることによる直鎖状ペプチドのプレオーガナイゼーションは、高い環化収率および最終的に得られる金属複合体の安定性向上をもたらした。Neumann et al., Synthesis of Conformationally Tailored Pentaazacyclopentadecanes. Preorganizing Peptide Cyclizations, Tetrahedron Lett. 38:779-782 (1997)。
【化４】
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スキーム２：スーパーオキサイドを不均化させる、マンガンと複合体化したペンタ−アザクラウンからなる合成酵素またはシンザイムの環状ペンタペプチド経路による合成。
【００５０】
これらのＳＯＤ模倣物の安定性および触媒効率のさらなる最適化は、拡散抑制触媒活性およびインビボ代謝安定性を有するＭ４０４０３およびＭ４０４０１（下に示す）のごとき化合物をもたらした。種々の炎症ならびに虚血／再潅流傷害および難治性低血圧のための臨床的候補がＳＯＤ模倣物のクラスから得られている。米国特許第6,214,817号、第5,610,293号および第6,180,620号; Salvemini et al., A nonpeptidyl mimic of Superoxie with Therapeutic Activity in Rats, Science 286:304-306 (1999); Macartur et al., Inactivation of catecholamines by superoxide gives new insight on the pathogenesis of septic shock, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9753-9758 (2000)。米国特許第6,214,817号、第5,610,293号および第6,180,620号も参照。
【化５】
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このアプローチの開発を導いたエレガントな化学および触媒の洞察はRileyによりレビューされている。Riley DP, Functional Mimics of Superoxide Dismutase Enzymes as Therapeutic Agents, Chem. Rev. 99:2573-2587 (1999); Riley et al., Computer Aide Design (CAD) of Synzymes: Use of Molecular Mechanics (MM) for the Rational Design of Superoxide Dismutase Mimics, Inor. Chem. 38:1908-1917 (1999); Riley DP, Rational Design of Syunthetic Enrymes and Their Potential Utility as Human Pharmaceuticals: Development of Manganese(II)-Based Superoxed Dismutase Mimics, Adv. Supramolecular Chem. 6:217-244 (2000)。
【００５１】
目的の生物学的活性ペプチドを模倣し、金属結合基を含む環状ペプチドまたはそのアナログまたはキラルアザクラウンが得られたならば、それを束縛して、金属イオンと複合体化させることにより、受容体への結合のための三次元コンホーメーションとする。本発明にとり有用でありうるいくつかの金属イオンは、鉄、銅、マンガン、ニッケル、亜鉛、砒素、セレン、テクネチウム、ガドリニウム、コバルト、ルテチウム、パラジウム、銀、カドミウム、インジウム、アンチモン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、ポロニウム、アスタチン、アクチニド類またはランタニド類のイオン形態を包含するが、これらに限らない。アクチニド類はトリウム、プロタクチニウム、ウラン、ネプツニウム、プルトニウム、アメリシウム、キュリウム、ベルケリウム、カリフォルニウム、アインスタイニウム、フェルミウム、メンデレビウム、ノベリウムおよびローレンシウムを包含する。ランタニド類はセリウム、プラセオジミウム、ネオジミウム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびルテチウムを包含する。
【００５２】
本発明は、ペプチド骨格のために有意に異なるコンホーメーション可能性を有する比較的堅固なペプチド、環状ペプチドおよびそれらの合成アナログのコンミナトリアルライブラリーの調製を包含する。ライブラリーから得られたコンホーメーション鋳型の三次元構造の証明は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）およびＸ線による研究を用いて行ってもよい。
【００５３】
本発明にとり有用な種々の環状ペンタペプチドを溶液中で調製してもよく、ポリマー支持体を用いる樹脂上環化により調製してもよい。本発明にとり有用な環状ペンタペプチドの調製のための種々の別法もあり、アミノ酸の選択ならびに側鎖を介する支持体への可能な結合に応じて選択できる。Shao et al., A Novel Method to Synthesis of Cyclic Peptides, Tetrahedron Lett. 39:3911-3914 (1998)。より一般的なアプローチは骨格アミドを介する伸長中のペプチド鎖の直接結合である。Jenson et al., Backbone Amide Linker (BAL) Strategy for Solid-Phase Synthesis of C-Terminal-Modified and Cyclic Peptide, J. Am. Chem. Soc. 120:5441-5452 (1998)。このアプローチは、リンカーの結合部位における第２級アミドの潜在的利点に、樹脂上環化のための最終ペプチドをプレオーガナイズするシス−アミド結合の増加した傾向を加えるものである。アミノ酸側鎖との樹脂上環化およびポリマー支持体へのエステル結合によりＣＰＰｓおよび対応ＰＡＣｓのライブラリーを容易に調製することができる。一例は、スキーム３に示すように、Ａｓｐ側鎖および開裂可能なポリマーへのエステル結合を用いることであり、該ポリマーを酸により開裂させて遊離カルボキシルを有するＣＰＰを得るか、あるいはボランまたはＬｉＡｌＨ４を用いる還元によりセリンヒドロキシルを有するＰＡＣを得る。酸による開裂、次いで、還元することにより遊離カルボキシルを有するＰＡＣを得ることができる。我々が計画する通常のＣＰＰ合成の１のバリエーションは、ＣＰＰｔｏｉｄ合成である。コンビナトリアル化学におけるペプチド多様性からの最初の主な変化は、ペプトイド（peptopid）を得るためのアミノ酸のα−炭素からアミド窒素への側鎖の移動であった。Zuckermann et al., Efficient Method for the Preparation of Peptoids [Oligo(N-substituted glycines)] by Submonomer Solid-Phase Synthesis, J. Am. Chem. Soc. 114:10646-10647 (1992)。これを、適当なアルキルアミンをブロモ酢酸でアルキル化することにより容易に行うことができる。Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1992)。次の工程は、MillerおよびScanlonにより公表されたノシルアミノ酸を経る固相合成の間の正常アミノ酸の窒素のＮ−アルキル化を用いるペプトイド単位（Ｎ−アルキル−Ｇｌｙ）の付加を包含する。Miller et al., Site-Selective N-Methylation of Peptide on Solid Supports, J. Am. Chem. Soc. 119 (1997)。かくして、ＣＰＰのアミド水素は側鎖位置決めのためのもう１つの部位となる。下のスキーム３は、金属複合体化のためのキラルアザクラウンならびに開裂法により生成物が決定される環状ペンタペプチドのコンビナトリアルライブラリーの同時調製を示す。
【化６】
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【００５４】
ＰＡＣ金属複合体を束縛して単一のコンホーマーとし、そのバイオアッセイのための安定性を向上させるためには、ＤＡＣＨやＭ４０４０３中に見られるピリジン単位のごとき二環式化合物を含ませる。
【化７】
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【００５５】
本発明は、環状ペプチド由来のキラルアザクラウンの金属複合体のコンビナトリアルライブラリーの製造も包含する。環状ペプチドの潜在的欠点は、受容体との最適な相互作用をするために多くのファーマコフォア基間で競争が起こること、ならびに鋳型コンホーメーション上の鋳型上の側鎖位置に対する衝撃である。環状ペンタグリシン（Ｃ１０Ｎ５Ｏ５Ｈ１５）の場合、側鎖に関して５つの位置があり、それらはＲまたはＳのいずれかであり、加えて、合計１５個（水素の数）の潜在的な側鎖位置に関して置換する５つのアミド窒素が存在する。あるキラリティーおよびアミド置換パターンのある環状ペプチドに関して、コンホーメーション鋳型は限定されたセットのコンホーメーションに固定されるか、あるいは側鎖の相対的方向を予想するには柔軟でありすぎるかのいずれかである。アザクラウン鋳型を用いることにより、炭素を結合させている環上の２０個の潜在的な側鎖位置および第２級アミンをアルキル化することにより得られる５個のさらなる位置が可能となる。Ｍ４０４０３のような環状束縛を有するアザクラウンを用いて柔軟性を減少させ、複合体の安定性を向上させる場合、各シクロヘキシル環は６個のさらなる置換部位（環１個につき８個のシクロヘキシル環の水素マイナス２個のメチレン水素）を与え、各々はそれ自身の合成経路を必要とする。実際には、ピリジル環は置換位置の数を２個減じるが（３個の水素マイナス４個のメチレン水素マイナス１個の窒素の水素）、堅固さは劇的に増大する。鋳型コンホーメーションを撹乱させる異なる金属の使用と組み合わされたオフライン置換位置の汎用性は、受容体部位との相互作用の最適化において有意な利点を提供する。このことは、単一のβ−アミノ酸の使用により１６員環に拡張できる、あるいはベチダミノ酸（betidamino acid）の取り込みにより１４員環システムに縮小されうる１５員の環システムの分析に基づいている。Rivier et al., Betidamino acids: versatile and constrained scaffolds for drug discovery, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2031-2036 (1996)。本発明のこの態様に関与する化学の汎用性は、潜在的なコンホーメーション骨格の開発利用への多くの道筋を提供する。１，２−ジアミノシクロヘキサン（ＤＡＣＨ）のごとき残基を含ませてペプチド末端を環化に指向させるNeummanらのプレオーガナイゼーション法を用いてもよい。Neumann et al., Synthesis of Conformationally Tailored Pentaazacyclopentadecanes. Preorganizing Peptide Cyclizations, Tetrahedron Lett. 38:779-782 (1997)。プロリンまたはピペコリン酸を同様に用いてこれを行うことができる。これらの場合、付加された側鎖基を有するキメラアミノ酸を得ることは当該分野において知られている。Kolodziej et al., Ac-[3- and 4-alkylthioproline31]-CCK4 analogs: synthesis and implications for the CCK-B receptor-bound conformation, J. Med. Chem., 38:137-149 (1995); Kolodziej et al., Stereoselective Syntheses of 3-Mercaptoproline Derivatives Protected for Solid Phase Peptide Synthesis, International Journal of Peptide & Protein Research (1996); Makara et al., A Facile Synthesis of 3-Substituted Pipecolic Acids, Chimeric Amino Acids, Tetrahedron Lett. 38:5069-5072 (1997)。アザクラウン上の２５個のすべての位置が側鎖置換のために合成的にアクセス可能であることが必須である。
【００５６】
Ｍ４０４０３のようなさらに堅固なＰＡＣｓは、Rileyらにより最適化された金属−鋳型化エナンチオ選択的合成により利用可能である。Cornille et al., Electrochemical cyclization of dipeptides toward novel bicyclic, reverse-turn peptidomimetics: Synthesis and conformational analysis of 7,5-bicyclic systems, J. Am. Chem. Soc., 117:909-917 (1995); Riley et al., Rational Design of Synthetic Enzymes and Their Potential Utility as Human Pharmaceuticals: Development of Manganese(II)-Based Superoxide Dismutase Mimics, Adv. Supramolecular Chem. 6:217-244 (2000)。Ｍ４０４０３の分子式Ｃ２１Ｎ５Ｈ３５を考慮すると、潜在的な側鎖位置の３５個の水素がある。ピリジン環のｐ−位のごときいくつかの位置が容易に利用できる。Riley et al., Radical alternatives, Chem. Britain 36:43-44 (2000); Udipi et al., Modifications of inflammatory response to implanted biomedical materials in vivo by surface bound superoxide dismutase mimics, J. Biomed. Materials Res. 51:549-560 (2000)。他の化合物は購入するか、あるいは適当に誘導体化されたシクロヘキサンジアミン類の合成が必要である。かかる化合物を実際的なデータベース中に導入し、特別な誘導体をcase-to-caseで評価する。
【００５７】
各ＰＡＣを種々の金属と複合体化させ、目下のところ目的とする標的に対してアッセイしてもよい。ＨＰＬＣおよび／またはＭＳ分析によりアッセイ条件下での複合体の安定性を調べてもよい。すべてのＭｎ（ＩＩ）およびＦｅ（ＩＩＩ）複合体をＳＯＤ活性に関してアッセイしてもよい。このことは、バイオアッセイにおける活性が酵素活性により干渉されうる化合物の排除を可能にするであろう。同様に、生物学的活性を示す他の金属ＰＡＣ複合体をＳＯＤならびにカタラーゼ活性に関してアッセイしてもよい。コンホーメーション鋳型としてのアザクラウンの金属複合体の使用は本発明の好ましい具体例であるが、安定性によっては複合体自体が潜在的な治療薬の候補でありうる。これらのアザクラウン複合体の安定性は環のサイズ、金属、複合体化、および置換のパターンに依存する。Rileyらは、１，２−ジアミノシクロヘキサン（ＤＡＣＨ）のごとき環状置換基を用いて、ＰＡＣのＭｎ（ＩＩ）複合体の安定性が親複合体よりも向上することを示した（親の未置換複合体についてｌｏｇＫ＝１０．７であるのに対し、ｌｏｇＫ＞１７）。Riley DP, Functional Mimics of Superoxide Dismutase Enzymes as Therapeutic Agents, Chem. Rev. 99:2573-2587 (1999)。
【００５８】
１の具体例において、本発明は、本発明の方法に使用するための、ペプチド、環状ペプチド、キラルアザクラウンおよび他のペプチド模倣物複合体の側鎖の潜在的相対的方向のデータベースまたはライブラリーを提供する。本発明は、ファーマコフォア解明のためのコンホーメーション鋳型としての、好ましくは、シクロペンタペプチドのごとき環状ペプチドの、そしてアザクラウン類の金属複合体の理解しやすいコンホーメーションの研究を提供する。詳細には、本発明は、骨格の局部的な環境において異なっているＣＴＰそよびＣＰＰｓに関するコンホーメーション構造、すなわち、Gly、Ala、D-Ala、Aib、Pro、D-Pro、N-Me-AlaおよびD-N-Me-Alaの種々の組み合わせにより得られる種々のコンホーマーの開発を提供する（ＣＰＰｓの数＝８５＝３２７６８）。その目的のために、本発明は、ＥＣＥＰＰ力の場を用いるエネルギー計算を用いることにより、これらのＣＴＰおよびＣＰＰｓの多様な例のための、よりコンホーメーション的に束縛された低エネルギーコンホーマーのセットを提供する。Nikiforovich GV, Computational Molecular Modeling in Peptide Design, Int. J. Peptide Protein Res., 44:513-531 (1994)。次いで、例えば、明確に異なるコンホーメーション可能性を有するＣＴＰそよびＣＰＰｓのような低エネルギーコンホーマーのセットを分析し、さらに、非常に好ましいコンホーメーションを有する、種々のβ−ターン、γ−ターン等のごとき明確なコンホーメーションエレメントを有する低エネルギーコンホーマーのセットを分析する。同定されたコンホーマーを実験的に証明してもよく、また、量子力学（ＡＭＳＯＬ、ＤＦＴ）、異なる力の場における分子力学、溶媒和モデル（明確なものおよび内在的なものの両方）、ならびに方法論（ポテンシャルスムージング（potential smoothing）、ＭＣ／ＭＤ等）およびデータベースに記録された不一致をコンピューター計算することにより証明してもよい。
【００５９】
さらなる具体例において、検索用およびドラッグデザインに使用されるデータベース中にこれらの鋳型に関する情報が提供される。このデータベースまたはライブラリー中の情報を用いて、ペプチド、キラルアザクラウンまたはペプチド模倣物のフラグメントに関するファーマコフォアの三次元モデルについての仮説を確認してもよい。次いで、例えば、低エネルギーコンホーマーの異なるセットを用いてかかるコンホーメーション鋳型を含むライブラリーを作成することができ、各コンホーマーは所望三次元方向に側鎖を配置することができるものである。次いで、選択された鋳型に基づいて対応する好ましいＣＴＰｓ、ＣＰＰｓおよび／またはＰＡＣｓを合成し、生物学的試験に供することができる。得られた生物学的データは、仮説の信頼できる有効な確認を確実なものにする。なぜならコンホーメーション的に束縛された異なる化合物において同じタイプの三次元構造が異なって提示される（配列の異なった位置により）からである。
【００６０】
本発明のデータベースまたはライブラリーを用いて、ペプチド、キラルアザクラウンまたはペプチド模倣物のフラグメントに関するファーマコフォアの新たな三次元モデルを作成してもよい。この場合、受容体−結合コンホーメーションの可能な三次元モデルとしてチェックされうる異なる低エネルギーコンホーマーのセットを特徴づけるモデルＣＴＰｓ、ＣＰＰｓおよびＰＡＣｓのソースとしてライブラリーを用いる。さらに、選択された鋳型に基づいて対応化合物を合成し、生物学的試験に供することができる。その結果を用いて、新たなペプチドおよびペプチド模倣物のさらなる合理的設計を行う。
【００６１】
さらに、ライブラリーを用いて、所望ＣＴＰｓ、ＣＰＰｓおよびＰＡＣｓへの合成経路を導いてもよい。ライブラリーは、合成される各ＣＴＰ、ＣＰＰおよびＰＡＣに関する合成プロトコルを含んでいてもよく、すでにライブラリーに含まれているＣＰＰやＰＡＣに類似した新たなＣＰＰやＰＡＣの合成に用いてもよい。
【００６２】
さらにそのうえ、データベースは、多くのＣＴＰｓ、ＣＰＰｓおよびＰＡＣｓに関するＮＭＲピークの一次帰属のごとき常套的なＮＭＲデータを提供するものであってもよい。合成データに関しては、データベースは種々のＣＴＰｓ、ＣＰＰｓおよびＰＡＣｓに関して得られたＮＭＲデータを含んでいてもよい。この情報は、新たに合成されるＣＰＰｓ、またはＰＡＣｓに関するＮＭＲデータの解釈に役立ちうる。
【００６３】
本発明のさらなる態様において、好ましい環状ペプチドおよびそれらのアナログ、ペプチド模倣物およびキラルアザクラウンを包含するペプチドのコンホーメーションの分析を用いてもよい。短いペプチドの骨格のためのすべての低エネルギーコンホーマーを、別個のエネルギー計算により解明することができ、次いで、それらを候補コンホーメーションのアンサンブルのメンバーとして評価してもよい。そのうえ、別個のＮＭＲ測定値およびエネルギー計算値を組み合わせて用いることにより、溶液中で観察される実際のコンホーマーに関する統計学的重量の評価が可能となる。エネルギー計算により、ＣＰＰに関して利用可能な全体的なコンホーメーション空間を調査し、骨格に関してすべての低エネルギーコンホーマーを調べることができる。同時に、計算された低エネルギーコンホーマーのセットを、ＮＭＲスペクトル測定法および／またはＸ線結晶像により確認することができる。
【００６４】
一例として、異なる置換基パターンを有し、３種の異なる金属（Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｄ）と複合体化したＰＡＣｓの１１種の結晶構造が調べられ、側鎖の相対的方向を親のＣＰＰまたは目的とするβ−ターンのごとき他の構造において見られるものと比較された。Riley et al., Synthesis, Characterization, and Stability of Manganese(II) C-Substituted 1 4 7,10,13-Pentaazacyclopentadecane Complexes Exhibiting Superoxide Dismutase Activity. Inorg. Chem., 35:5213-5231 (1996); Zhang et al., Iron(III) Complexes as Superoxide Dismutase Mimics: Synthesis, Characterization, Crystal Structure, and Superoxide Dismutase (SOD) Activity of Iron(III) Complexes Containing Pentaaza Macrocyclic Ligands. Inorg. Chem., 37:956-963 (1998)。ＣＡＤＤツールＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮを用いて、ＰＡＣ金属複合体のβ−ターンコンホーメーションと結晶構造との間の側鎖方向に対応するベクトルの重複が見出された。Ho et al., FOUNDATION. A program to retrieve subsets of query elements, including active site region accessibility, from three-dimensional databases. J. Comput. Aided Mol. Des., 7:3-22 (1993)。例えば、未置換ペンタ−アザクラウンのＭｎ（ＩＩ）複合体が側鎖置換基を理想的なタイプのβ−ターンのｉおよびｉ＋１残基に関して見られるものと丁度同じように方向づけている状況がある。このターンのペプチド模倣物として、この例は、たった２個の側鎖が正確に方向づけられ、体積の重複において有意な差異があるという事実に遭遇する。それにもかかわらず、正確に重複したたった２つの側鎖が受容体認識に関与しているはらば、Ｍｎ−複合体は活性を示すはずである。異なる金属は異なるファンデルワールス半径を有し、それゆえ、金属と内球（innersphere）窒素との異なる距離を必要とする。これまで分析されたＰＡＣ−金属複合体に結晶構造において見られる平均距離は、Ｆｅ（ＩＩＩ）−Ｎに関して２．２７１、Ｍｎ（ＩＩ）−Ｎに関して２．２８３であり、Ｃｄ（ＩＩ）−Ｎに関しては不明である。Riley et al., Computer-Aide Design (CAD) of Synzymes: Use of Molecular Mechanics (MM) for the Rational Design of Superoxide Dismutase Mimics. Inorg. Chem., 38:1908-1917 (1999)。かくして、各金属はＰＡＣ環を異なったように曲げ、各コンホーマーについて側鎖位置が異なって固定された方向を有することとなる。
【００６５】
本発明のコンホーメーション分析は、これらのペプチドまたはアナログ、またはキラルアザクラウンの三次元コンホーメーションに関する結論が力の場、パラメーターまたはアルゴリズムに依存するものでないことを確認するための当該分野で知られた方法を用いるものであってもよい。ＥＣＥＰＰ力の場および系統的なサーチ法を用いるＣＰＰｓに関するNikiforovichらの文献に説明された方法を最初に適用してもよい。Nikiforovich et al., Combined use of spectroscopic and energy calculation methods for the determination of peptide conformation in solution. Biophys. Chem., 31:101-106 (1988)。別法として、逆ターン模倣物に関するコンホーメーション分析のためのＧＢ／ＳＡ溶媒和モデルを用いるMarcoModelのＭＣ／ＭＤ法を同様に適用してもよい。Chalmers, et al., Pro-D-NMe-Amino and D-Pro-NMe-Amino Acid: Simple, Efficient Reverse-Turn Constraints. J. Am. Chem. Soc., 117:5927-5937 (1995); Takeuchi et al., Conformational Analysis of Reverse-Turn Constraints by N-Methylation and N-Hydroxylation of Amide Bonds in Peptides and Non-Peptide Mimetics. J. Am. Chem. Soc., 120:5363-5372 (1998)。最近、拡散等式法が拡張されて内在的ＧＢ／ＳＡ溶媒和モデルを包含するようになった。Pappu et al., Analysis and application of potential energy smoothing and search methods for global optimization. J. Phys. Chem. B., 102:9725-9742 (1998); Pappu et al., A potential smoothing algorithm accurately predicts transmembrane helix packing. Nature Struct. Biol., 6:50-55 (1999)。それらのコンホーメーション最小値は矛盾なく確認され、最も使用できる可能性が高いものと思われた。得られた最小値を証明するために、それらをＡＭＳＯＬならびにＤＦＴ最小化のインプットとして用いてもよい。
【００６６】
例えば、近い将来のプロジェクトの発展段階、例えば、リードの発見またはリードの最適化にような生物学的スクリーニングに関していずれの化合物が作成され、試験されるべきかを決定するために多くの因子が重量測定されることを必要とする。リードの発見には、潜在的な側鎖の方向を広く調査してもよく、それにより、類似の側鎖方向を示す化合物がクラスター化されるべきであり、最も効率的な可能性の調査を可能にするために典型的な試料のみがアッセイされるべきである。リードか見つかれば、リードと類似の側鎖方向を有する化合物に集中してアフィニティーを最適化することができる。
【００６７】
本発明によれば、実際上の化合物に関する１つよりも多いデータベースまたはライブラリーを用いてコンビナトリアル複雑さを管理し、合成のための化合物の選択を導くことができる。例えば、環状ペンタペプチド（ＣＰＰｓ）の異なるキラルコンフィギュレーション、例えば、ｃ（ａＡＡａＡ）または環状（Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ）に利用可能な環状コンホーマーのコンホーメーション−鋳型データベースを用いてもよい。環状ペンタ−アラニンをモデルとして用いる場合、３２種の化合物を考慮するだけでよい。好ましくは、ある程度の堅固さが導入された化合物を用いて、ペプチドに利用可能なコンホーメーションのアンサンブルを単純化してもよく、１つの位置がプロリン（ＤまたはＬ）またはＡｉｂにより占領されることが必要であるかもしれない。プロリンまたはＮ−Ｍｅ−アミノ酸を用いる場合、両方のアミノ酸の異性体（シスまたはトランス）をコンホーメーション分析の際に考慮すべきである。例えば、Ａｉｂ−およびＡｌａ−含有ＣＰＰｓについてのみ基本分析が行われると仮定する場合、このことは、ＡｌａまたはＡｉｂを含むＣＣＰｓの２４３（３５）回のコンホーメーション分析が行われることを意味するであろう。それぞれの分析について、球状物の５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲内で検出される最小値は化合物およびα−βベクトルのＣＡＶＥＡＴ−様分析に関連したものであり、該分析は各コンホーマーに関してエンターされた可能な側鎖の方向を示すものである。Lauri et al., CAVEAT: A program to Facilitate the Design of Organic Molecules. J. Comput.-Aided Mol. Des., 8:51-66 (1994)。データベースを逆転させ、β−炭素間の距離Ｄα次いで、β−炭素間の距離Ｄβ、歪み角ω (β1-α1-α2-β2)等により組織化して、容易にアクセス可能で効率的な比較およびクラスタリングを提供してもよい。一置換および二置換ＤＡＣＨおよびピリジルＣＰＰｓがコンホーメーション柔軟性を有意に減じる場合には、それらに関する分析を同様に行ってもよい。異なるサイズの環および幾何学的束縛は、かかる化合物のライブラリーに利用可能な側鎖の方向に有意な多様性を提供する。
【００６８】
本発明のライブラリーは数種の用途を有しうる。例えば、合成可能なコンホーメーション鋳型における多様性を特徴づけ、スクリーニング鋳型としての多様なセットを選択してもよい。ヒットが得られたならば、類似の側鎖方向を有する鋳型を選択できる。得られたヒットに関し、鋳型は異なる側鎖方向の数種のコンホーメーションを有していてもよく、たった１つまたは制限された数の側鎖方向にて重複しうる他の鋳型を合成およびスクリーニングのために選択してもよい。このようにして、かかる活性に関連する側鎖方向をすみやかに決定することができる。さらに、分子認識のための仮の側鎖方向が示唆されたならば、本発明の方法を用いて類似の方向を向くことのできるコンホーメーション鋳型のセットを容易に確認し、スクリーニングに関して評価することができる。
【００６９】
上述のごとく、本発明は、実際上の化合物に関する１つよりも多いデータベースまたはライブラリーを用いてコンビナトリアル複雑さを管理し、合成のための化合物の選択を導くことを企図する。例えば、フェニル、フェノール、インドール、カルボキシル、グアニジニウム、カルボキシアミド等のごとき特定の側鎖基の既知のまたは仮定されたファーマコフォア方向付けのために、第２のより限定されたデータベースを構築してもよい。より複雑な評価を行ってもよい。そのコンホーメーション鋳型はこれらの官能基を適当な三次元幾何学的パターン中に置くことができるものである。側鎖を三次元空間の特定領域に置くことに関してさらなる歪みの自由度（X１、X２等）が存在する。特定のＧＰＣＲ受容体サブタイプにおける認識のための三次元ファーマコフォアパターンがすでに決定されている（ＡＩＩ、オピオイド、ＣＣＫ、ガストリン、ブラジキニン、ニューロキニン等）。
【００７０】
実際的なデータベースを用いて、異なる金属と複合体化したＰＡＣｓを包含せしめてもよい。このアプローチに関する１の制限は、ＤＦＴ計算により検討可能ではあろうが、分子力学によっては遷移金属のリガンド−場の力を現すことが困難なことである。しかしながら、力の場は銅に関してキャリブレーションされており、他の遷移金属にも拡張されつつある。Carlsson AE., Angular and Torsional Forces Via Quantum Mechanics. Journal of Phase Equilibria, 18:60-613 (1997); Carlsson AE., Angular Forces around Transition Metals in Biomolecules. Physical Review Letters, 81:477-480 (1998)。Rileyらは、パラメータがキャリブレーションされた場合、Ｍｎ、Ｚｎ、およびＦｅに関してＣＡＣｈｅにおける力の場が良好な幾何学および相対エネルギーを作り出すことを見出した。Riley et al. have that the force field in CAChe produces good geometries and relative energies for Mn, Zn, and Fe when the parameters are calibrated. Riley DP., Functional Mimics of Superoxide Dismutas Enzymes as Therapeutic Agents. Chem. Rev., 99:2573-2587 (1999); Riley DP., Rational Design of Synthetic Enzymes and Their Potential Utility as Human Pharmaceuticals: Development of Manganese(II)-Based Superoxide Dismutase Mimics. Adv. Supramolecular Chem, 6:217-244 (2000)。MarcoModel中のパラメーターを結晶構造を複製するように調節した後、同様の結果がエンテロバクチンアナログのＦｅ（ＩＩＩ）複合体について得られている。異なる金属（Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｄ、Ｚｎ、Ｇｄ、Ｃｏ、Ｍｂ等）と複合体化した単一のＰＡＣを用いて数シリーズの化合物を作成することができ、結晶構造を得て、候補の力の場のパラメーターを援助し、複合体化検索法により見られる構造の変動の範囲を決定することができる。さらに、コンホーメーション鋳型データベースに基づく実際的なライブラリーのプレスクリーニングは、いずれの金属複合体を実際に調製しスクリーニングするのかを決定することを助けるであろう。
【００７１】
生物学的に活性のあるペプチドに関する、薬剤の開発に使用される三次元ファーマコフォアを決定するために本発明のライブラリーおよび方法を用いてもよい。種々の酵素および受容体の使用例を後で示す。
【００７２】
予想される複合体がＮＭＲまたは結晶像により容易に確認されうるある種の酵素が知られている。この目的のために、TienおよびBartlettの研究ならびに蛋白性阻害剤テンダミスタットのＴｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒβ−ターンセグメントの構造に基づく環状ペプチド阻害剤に関する以前の研究に基づいて、α−アミラーゼを標的として選択した。Tian et al, Metal Coordination as a Method for Templating Peptide Conformation. J. Am. Chem. Soc., 118:943-949 (1996); Etzkorn et al, Cyclic Hexapeptides and Chimeric Peptides as Mimics of Tendamistat. J. Am. Chem. Soc., 116:10412-10425 (1994)。もう１つの既知酵素はＨＩＶプロテアーゼである。この場合、我々は、高処理量蛍光アッセイを用いて化合物ライブラリーを阻害剤に関してスクリーニングした。Toth et al., A simple, continuous fluorometric assay for HIV protease. Int. J. Pep. Prot. Res., 36:544-550 (1990)。この場合、我々は、実際的なライブラリーのスクリーニングを助けるのに使用できるＨＩＶプロテアーゼの潜在的阻害剤の複合体のアフィニティーを予測する方法も有している。Walter et al., 3-D QSAR of human immunodeficiency virus (I) protease inhibitors. I. A CoMFA study employing experimentally-determined alignment rules. J. Med. Chem, 36:4152-4160 (1993); Head et al., VALIDATE-a new method for the receptor-based prediction of binding affinity of novel ligands. J. Am. Chem. Soc., 118:3959-3969 (1996)。ＰＤＢにおいて利用可能な酵素と複合体化した広範な化合物の結晶構造により、既知複合体を模倣しうるＣＰＰおよびＰＡＣｓの標的化および評価をすることができる。
【００７３】
もう１つの十分にサーチされた生物学的活性ペプチドであるトライアッドＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）はインテグリン受容体と相互作用するものであり、本発明に用いることができる。これは工業的な薬剤開発のための治療薬標的であり、Kesslerおよび共同研究者らにより研究されたシステムである。より最近になって、Schumannらのβ−アミノ酸環状ペンタペプチドアナログが研究されている。Kopple et al., Conformationals of Arg-Gly-Asp Containing Heterodetic Cyclic Peptides: Solution and Crystal Studies. J. Am. Chem. Socl., 114:9615-9623 (1992); Ali et al., Conformationally constrained peptides and semipeptides derived from RGH as potent inhibitors of the platelet fibrinogen receptor and platelet aggregation. J. Med. Chem, 37:769-780 (1994); Cheng et al., Design and Synthesis of Novel Cyclic RGD-Containing Peptides as Highly Potent and Selective Integrin αIIbβ3 Antagonists. J. Med. Chem, 37:1-8 (1994); McDowell et al., From Peptide to Non-Peptide. 2. The de Novo Design of Potent, Non-Peptide Inhibitors of Platelet Aggregation Based on a Benzodiazepinedione Scaffold. J. Am. Chem. Soc., 116:5077-5083 (1994); Pfaff et al., Selective recognition of cyclic RGD peptides of NMR defined conformation by αIIbβ3, V\pard f4 b3 and α5β1 Integrins. J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994); Haubner et al., Cyclic RGD Peptides Containing β-Turn Mimetics. J. Am. Chem. Soc., 118:7881-7891 (1996); Haubner et al., Structural and Functional Aspects of RGD-Containing Cyclic Pentapeptides as Highly Potent and Selective Integrain avβ3 Antagonists, J. Am. Chem. Soc., 118:7461-7472 (1996); Schumann et al.,β-Amino Acids γ-Turn Mimetics? Exploring a New Design Principle for Bioactive Cyclopeptides. J. Am. Chem. Soc., 122:12009-12010 (2000)。
【００７４】
我々が受容体−結合コンホーメーションに関する仮説を有しているＴＲＨ、α−ＭＳＨ、ＣＲＦ、ブラジキニンおよびソマトスタチンのごときペプチドホルモン系も本発明に使用できる。実際的なライブラリーのために構築されたデータベースを用いて、提案されたファーマコフォアと重複する少しの化合物を選択し合成してもよい。例えば、c(His-D-Phe-Arg-Trp-Aib)はα−ＭＳＨ受容体の候補である。ＣＲＦ受容体に関しては、c(Gln-Ala-His-Ser-Asn)が第１の候補である。ソマトスタチンに関しては、ＣＰＰ候補は(Phe-D-Trip-Lys-D-Thr-Aib)であってもよい。また、提案されたファーマコフォアと重複しうるＰＡＣｓおよび他のクラスの化合物を求めて提供されたデータベースを検索してもよい。
【００７５】
さらに、リードＣＰＰおよびＰＡＣ構造に対するアフィニティーの向上のために側鎖方向を最適化することにおけるリファイメントのために本発明を用いてもよく、ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮおよびＣＡＶＥＡＴのごときプログラムならびにBartlettのグループによるところのかかる目的にかなう置換基方向分析を行うＴＲＩＡＤおよびＩＬＬＩＡＤのごときデータベースを用いることにより他の構造（例えば、ベンゾジアゼピン等）に直接翻訳してもよい。Lauri et al., CAVEAT: A program to Facilitate the Design of Organic Molecules. J. Comput.-Aided Mol: Des., 8:51-66 (1994); Ho et al., FOUNDATION: A program to retrieve subsets of query elements, including active site region accessibility, from three-dimensional databases. J. Comput. Aided Mol. Des., 7:3-22 (1993); Bartlett Pea, TRIAD and ILLIAD three-dimensional Databases. Edited by Berkeley, CA 94704: Office of Technology Licensing - Berkeley (1993)。
【００７６】
上の詳細な説明は、当業者の本発明の実施を助けるためのものである。そうであるとしても、この詳細な説明は、本発明の不当に限定するものと解してはならず、本明細書における具体例の修飾および変更は、本発明の精神または範囲を逸脱することなく当業者により行われうる。
本願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の文献を、参照により本明細書に記載されているものとする。
さらなる努力をせずに、当業者は上記説明を用いて、本発明を最大限に用いることができると確信する。それゆえ、以下に示す好ましい特別な具体例は単なる説明と解すべきであり、開示の残りの部分を限定するものと解してはならない。
【００７７】
実施例１
受容体−結合コンホーメーションおよびペプチド模倣物
G. V. Nikiforovich, K.E. Kover, W.,J. Zhang, and G.R. Marshall, Cyclopentapeptides as Flexible Conformational Templates for Receptor Probes. J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 3262 (Appendix)に従ってシクロペンタペプチドを調製した。
【００７８】
第１の重要性は、単離されたＣＰＰｓのコンホーメ−ションの研究に関するＥＣＥＰＰの力の場の使用を有効ならしめることであった。２つのモデル配列cyclo(Gly-Pro-Gly-Gly-Pro)およびcyclo(Gly-Pro-Gly-Gly-Ala)に端を発する既知のＸ線構造を有する７種のシクロペンタペプチドに関するエネルギー計算により、Ｐｒｏ残基に関するシス／トランスコンホーマーを包含する、両方の配列中のすべてのアミノ酸残基の局部エネルギー最小値のすべての組み合わせを調べた。幾何学的にＸ線構造と類似する低エネルギーコンホーマーがすべての場合において見出された。特記すべきことは、シス−コンホーメーション[c(APGfP) および c(GPfAP)]におけるω１２角に関する２つの場合が再現された。対応Ｘ線構造[C(APGfP), c(GPfGA) および c(CPfGV)]と比較した場合、計算された低エネルギーコンホーマーにおいていくつかのペプチド結合平面が回転している。これらすべての場合において、隣接分子間の強い水素結合が結晶セル内で観察された。Karle et al., Variability in the backbone Conformation of Cyclic pentapeptides, Int. J. Pept. Prot. Res. 28:420-427 (1986); Stroup et al., Crystal Structure of cyclic(GIy-L-Pro-D-Phe-Gly-L-Val): An Example of a new Type of Three-Residue Turn, J. Am. Chem. Soc. 109:7146-7150 (1987); Gierarsch et al., Crystal and Solution structure of cyclo(Ala-Pro-Gly-D-Phe-Pro): A New Type of Cyclic Pentappeptide Which Undergoes Cis-Trans Isomerization of the Ala-Pro Bond, J. Am. Chem. Soc. 107:3321-3327 (1985)。
【００７９】
次のステップは、独立したエネルギー計算がシクロペンタペプチドの三次元構造について、挿入されたＮＭＲ束縛を用いるエネルギー最小化によるＮＭＲデータから推論されるよりもさらに信頼できる結論を生じさせることを示すものであった。Cyclo(D-Pro1-Ala2-Ala3-Ala4-Ala5)[c(pAAAA)]ペプチドのＤＭＳＯ中の三次元構造がすでにKesslerのグループにより後者のアプローチを用いて研究されていた。Mierke et al., Peptide flexibility and calculations of an ensemble of molecules, J. Am. Chem. Soc. 116:1042-1049 (1994)。最終的な結果として、５種の可能な三次元構造がｃ（ｐＡＡＡＡ）に関して提案された。Mierke et al., Peptide flexibility and calculations of an ensemble of molecules, J. Am. Chem. Soc. 116:1042-1049 (1994)。それらはすべて同じβＩＩ’タイプであり、Ｄ−Ｐｒｏ１−Ａｌａ２フラグメントを含むβＩＩ’タ−ンを含み、シクロペンタペプチドの「γ」位置における残基Ａｌａ４のコンホーメーションが異なっている。これら５種の構造に関するＡｌａ４のΦ,Ψ値は以下のとおりである(90, -60); (0,-60); (-120,-60); (30,120); (-170,120)。これらの結果は現実的とは思えない。なぜなら正のΦ値および負のΨ値を有するコンホーメーションにおいてＬ−コンフィギュレーションの残基を見出すことは非常に普通でないからである（Ｌ−Ａｌａに関するRamachandran platの「禁じられた」領域）。シクロペンタペプチドの既知のＸ線構造でこの特徴を有するものはない。そのうえ、すべての既知Ｘ線構造おにおいて、「γ」位置にある残基は、それがＰｒｏである場合においてのみ、Φ,Ψに関して実際の「逆転γ−ターン」の値（約−７０，７０）を有する。さらに、すべての既知「γ−ターン」値（約７０，−７０）はＤ−Ａｌａに属する。
【００８０】
ｃ（ｐＡＡＡＡ）に関する独立したエネルギー計算は、ペンタペプチド環を幾何学的に閉環させられた３９８５種のペプチドコンホーメーに関するものである。それらのうち５種が相対エネルギー５ｋｃａｌ／ｍｏｌを有し、その値は「低エネルギー」三次元構造の選択のための基準であった。Ｄ−Ｐｒｏ１−Ａｌａ２領域中に明らかなβＩＩ’ターンを有する構造はないが、それらすべてが議論したβＩＩ’タイプに幾何学的に類似するものである。
【００８１】
計算されたｃ（ｐＡＡＡＡ）の低エネルギー三次元構造はKesslerのグループのＮＭＲデータと矛盾しない。比較のために、すでに開発されたアプローチを用いた。該アプローチは、実験的に測定され計算されたパラメーターの平均値が統計学的に区別できない場合には、それらのパラメーターは良好な一致を示すことを指摘するものである。Nikiforovich et al., Combined Use of spectroscopic and energy calculation methods for the determination of peptide conformation in solution, Biophys. Chem. 31:101-106 (1998)。
【００８２】
要約すると、独立したエネルギー計算は図３に示すようなｃ（ｐＡＡＡＡ）の低エネルギー三次元構造のファミリーを見出すことが可能であったし、それはＣＰＰｓに関するＮＭＲデータおよび利用可能なＸ線データの両方と矛盾しなかった（１つのコンホーマーがＤＭＳＯ溶液中で優勢であるが、それはペプチド−受容体複合体に関与するコンホーマーでなはいであろう）。Kesslerのグループとは対照的に、溶液中での好ましいＡｌａ４コンホーメーションが右または左のα−らせんに対応する領域中に存在することが見出された。
【００８３】
Ａｉｂ残基（アミノイソ酪酸、α−メチルアラニン、ＭｅＡ）は、右方または左方のα−らせんに対する骨格のコンホーメーション柔軟性を制限することが知られている。Marshall GR, A Hierarchical Approach to Peptidomimetic Design, Tetrahedron 49:3547-3558 (1993)。ｃ（ｐＡＡＡｉｂＡ）に関する出願人の研究は、ＣＰＰｓのコンホーメーションの研究に関する独立したエネルギー計算の有効性および信頼性を示した。ｃ（ｐＡＡＡｉｂＡ）に関するエネルギー計算は、ペンタペプチド環を幾何学的に閉環させられた２８４０種のペプチドコンホーマーに関するものである。それらのうち４種は相対エネルギー５ｋｃａｌ／ｍｏｌを有することが示された。４種のコンホーマー中のＡｉｂ４残基は以下のΦ,Ψ値を有する：(59,20); (70,14); (171,-37); (-61,-31)。さらに、Ｄ−Ｐｒｏ１−Ａｌａ２領域中に明らかなβＩＩ’ターンを有する構造はないが、それらすべてが議論したβＩＩ’タイプに幾何学的に類似するものである。エネルギー計算により、Ａｉｂ４残基に関する好ましいコンホーメーションとしてｃ（ｐＡＡＡｉｂＡ）ペプチドの低エネルギーコンホーマーが右方または左方α−らせんを保持していることが確認された後に、合理的な全工程の収率（３６％）でｃ（ｐＡＡＡｉｂＡ）を合成し、ＤＭＳＯ中でのその構造をＮＭＲにより調べた。ＡＬＬ  ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹおよびＲＯＳＥＹスペクトルは、無視できる量のシス−コンホーマー（Ａｌａ５−Ｄ−Ｐｒｏ１ペプチド結合）を伴う非常に秩序ある三次元構造の存在を示した。
【００８４】
ＣＰＰファーマコフォアを調べる際にＮＭＲスペクトル測定法を用いる最もよく知られた場合は、KesslerのグループによるＲＧＤ−含有ＣＰＰｓに関する先駆的研究である。彼らは、ｃ（ＲＧＤｆＶ）およびｃ（ＲＧＤＦｖ）の両方が、フィブロネクチンへのαＩＩｂβ３インテグリン類の結合およびビトロネクチンへのαｖβ３インテグリンの結合に対してほとんど同等の阻害剤であることを見出した（２００〜３００ナノモラーのアフィニティーを有する）。Pfaff et al., Selective Recognition of Cyclic RGD Peptides of NMR Defined Conformation by αIIbβ3, αVβ3, α5β1 Integrins, J. Biol. Chem. 269:20233-20238 (1994); Gurrath et al:, Conformational/activity studies of rationally designed potent anti-adhesive RGD peptides, Eur. J. Biochem. 210:911-921 (1992); Aumailley et al., Arg-Gly-Asp constrained within cyclic pentapeptides, FEBS Letters 291:50-54 (1991)。しかしながら、彼らのＮＭＲデータの解釈によれば、両方のペプチドはβＩＩ’γ型の単一のコンホーメーションを有するべきなので、活性配列、すなわちＲＧＤのコンホーメーションはこれら２つのペプチドとは類似していないはずである。Aumailley et al., Arg-Gly-Asp constrained within cyclic pentapeptides, FEBS Letters 291:50-54 (1991)。両方のペプチド中のＣα−ＣβベクトルＡｒｇおよびＡｓｐの空間的配置の仮定された類似性によりその矛盾が説明された。Muller et al., Pharmacophore refinement of gpIIb/IIIa antagonists based on comparative studies of antiadhesive cyclic and acyclic RGD peptides, J. Comp-Aided Mol. Design, 8: 709-730 (1994)。しかしながら、その著者らは、彼らの「ベクトル分析」の結果はＸ線を用いた研究により確認されたＲＧＤファーマコフォアに関する三次元モデルとは一致しなないことを記載していた。Kopple et al., Conformation of Arg-Gly-Asp Containing Heterodetic Cyclic Peptides: Solution and Crystal Studies, J. Am. Chem. Soc. 114:9615-9623 (1992)。そのうえ、示唆されたβＩＩ’型構造を安定化させる堅固なペプチド模倣物エレメントの導入は、フィブロネクチンへのαＩＩｂβ３インテグリン類の結合およびビトロネクチンへのαｖβ３インテグリンの結合び対する阻害を完全に消失させたが、異なる三次元構造を安定化させると最良の化合物が得られた。Haubner et al., Cyclic RGD Peptides Containing β-Turn Mimetics, J. Am. Chem. Soc. 118:7881-7891 (1996)。それゆえ、c(RDG"R-ANC")がαｖβ３受容体へのビトロネクチン結合の優れた阻害（IC50=0.85 nM[30]）を示したという知見は、KesslerのグループによるＣＰＰｓをコンホーメーション鋳型として用いる合理的なドラッグデザインの成功によるものとすることはできない。
【００８５】
一方、エネルギー計算は、ｃ（ＲＧＤｆＶ）に関して７種の低エネルギー骨格コンホーマーを明らかにし（ΔＥ ５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、ｃ（ＲＧＤＦｖ）に関して６種の低エネルギー骨格コンホーマーを明らかにした。６種すべてのコンホーマーはともにＮＭＲデータを満たし、すべての平均の統計学的重量値は０．１５〜０．１８であると思われる。ｃ（ＲＧＤｆＶ）およびｃ（ＲＧＤＦｖ）に関する低エネルギーコンホーマーの幾何学的類似性（すなわち、４２ペアーのコンホーマーを比較）により、ＲＧＤ配列に関するＣαおよびＣβ原子の空間的配置ならびにＬ／Ｄ−ＰｈｅおよびＬ／Ｄ−Ｖａｌ残基に関するＣα原子の最良の適合が成し遂げられた。７個すべての対応原子間の距離は、１ペアーのコンホーマーに関してのみ０．５０未満であった。これらのコンホーマーの重複を図１２に示し、それは矛盾のないＲＧＤ−含有ＣＰＰｓに関する三次元ファーマコフォアモデルとみなすことができ、他の著者らにより提案されたＲＧＤファーマコフォアに関するモデルと良好な一致を示す。Kopple et al., Conformation of Arg-Gly-Asp Containing Heterodetic Cyclic Peptides: Solution and Crystal Studies, J. Am. Chem. Soc. 114:9615-9623 (1992)。
【００８６】
実施例２
以下の放射性リガンド結合アッセイにおけるＭ４０４０３およびＭ４０４０１の評価。カリウムチャンネル（ATP-感受性, Ca2+Act., VI, カリウムチャンネル, CA2 + Act., VS）およびナトリウムチャンネル（部位１および部位２）。１０□Ｍの１回使用にてＭ４０４０３およびＭ４０４０１を試験した。各イオンチャンネルアッセイに使用した適切な放射性リガンドの一覧を表１に示す。結果は、ナトリウムチャンネル部位２の有意な阻害を示す（Ｍ４０４０３について８４．７％阻害、Ｍ４０４０１に関して９３．８４％阻害）。これらの結果を図５（ａ）および５（ｂ）に示し、表２にまとめる。
【表１】
2005518334.tif 000009
【００８７】
スクリーニングアッセイは、化合物の生物学的活性および選択性に関する貴重な情報を提供しうるものである。ＮＯＶＡＳＣＲＥＥＮ Biosciences Corporation of Hanover, Marylandがこれらのアッセイに使用された。データを理解し評価するために、これらのガイドラインを用いて提示データを解釈すべきである。
【００８８】
大部分のアッセイにおいて、我々の標準的なベースライン範囲は結合または酵素活性の−２０％ないし２０％の阻害である。ＮＯＶＡＳＣＲＥＥＮは、この範囲の結果を示す化合物をこのサイトにおいて不活性とみなす。ＮＯＶＡＳＣＲＥＥＮのアッセイは結合または酵素活性の阻害を試験するように設計されている。場合によっては、化合物、特に天然由来の産物および抽出物は高い負の阻害を示すであろうし（すなわち、使用する抽出法が原因）、クライアントの裁量で、低濃度における再試験の正当な理由となりうる。これらの結果を示す化合物は受容体サイトにおいて重要でない活性を示し、通常には、クライアントが特に指向しない場合にはさらなる試験の正当な理由にはならない。
【００８９】
ＮＯＶＡＳＣＲＥＥＮは、化合物を活性があるとするために５０％の阻害（またはそれより大）の基準を用いる。複数濃度において試験された活性化合物は、通常おには、用量依存的応答を示すと考えることができ、かかるフォローアップ研究が推奨される。
【００９０】
実施例３
インビトロ放射性リガンド結合アッセイにてオピオイド受容体に対するＭ４０４０３の結合アフィニティーの評価。図６〜１１を参照して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中にトランスフェクションされたヒトオピオイド受容体に関して受容体結合の研究を行った。１０％ウシ胎児血清および４００μｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８硫酸塩）を補足したＨａｍのＦ−１２培地中でμ細胞系を維持する。１０％ウシ胎児血清および５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンＢを補足したＨａｍのＦ−１２培地中でδ細胞系を維持する。１０％ウシ胎児血清、４００μｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８硫酸塩）および０．１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したDulbeccoの最少必須培地（ＤＭＥＭ）中でｋ細胞系を維持した。すべての細胞を完全に集密になるまで装飾させ、ついで、膜の調製のために集める。結合アッセイ用の膜を５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー，ｐＨ７．７中に調製する。ゴム製ヘラでプレートをかき取ることにより細胞を集め、５００ｘｇで１０分間遠心分離する。細胞ペレットをバッファーＡまたはＴｒｉｓバッファーに懸濁し、ポリトロンホモジナイザー中でホモジナイズし、ついで、２００００ｘｇで２０分間遠心分離する。細胞ペレットをバッファーＡまたはＴｒｉｓで洗浄し、２００００ｘｇでさらに２０分間遠心分離し、最後に少量のバッファーに懸濁して蛋白量を調べる。膜の一部を小型バイアルに入れバイアルあたり６ｍｇ／ｍｌの濃度とし、−７０℃で保存し、必要に応じて使用する。
【００９１】
それぞれμ、δおよびｋ受容体に結合する[3H]DAMGO、[3H]C1-DPDPE、および [3H]U69,593を用いて常套的な結合アッセイを行った。μおよびδの結合に関しては、９６−ウェルプレート中、合計体積２００μｌとして、通常には２５℃で１時間、細胞膜を適当な放射性リガンドおよび未標識薬剤とともにインキュベーションする。ｋの結合に関しては、プレートではなく試験管中で、合計体積２ｍｌとしてインキュベーションする。なぜなら、ｋ細胞中のオピエート受容体数または受容体占有率が他の細胞系ほど高くないからである。常套的な実験のために、１０−５ないし１０−１０Ｍの範囲の濃度の試験化合物とともに膜をインキュベーションする。インキュベーション後、Tomtecセルハーベスターを用いてガラス繊維フィルターで試料を濾過する。放射活性レベルを調べる前にフィルターを一晩乾燥させる。各放射性リガンドの１．０μＭの未標識カウンターパートを用いることにより非特異的結合を決定する。
【００９２】
化合物の完全な特徴付けは、プログラムＰＲＩＭＳを用いることによるＩＣ５０値およびHill係数に関するデータの分析を含む。Cheng Prusoff変換：
Ｋｉ＝  ＩＣ５０
１＋Ｌ／Ｋｄ
［式中、Ｌは放射性リガンド濃度であり、Ｋｄはあらかじめ飽和分析により決定しておいた放射性リガンドの結合アフィニティーである］を用いてＫｉ値を計算する。
【表２】
2005518334.tif 000010
Ψ＊  低いアフィニティーのためHill係数は決定しなかった。
【００９３】
受容体結合アッセイは、Ｍがミューまたはデルタ受容体に対して有意なアフィニティーを有していないことを示すが、約２４０ｎＭを示したことから、この受容体における中程度のアフィニティーが示唆される。
【００９４】
実施例４
生物学的に活性のあるペプチドコンホーメーションを模倣するためのマクロアザクラウン類（ＭＡＣｓ）の設計の幾何学的実行可能性を調べるために、古典的なβ−ターンのセットを用い、α−β側鎖ベクトルの重複に関してＭＡＣ結晶構造の小さなセットと比較した。異なる置換基パターンを有し、３種の異なる金属（Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｄ）と複合体化したＭＡＣｓの１１種の結晶構造を調べて、側鎖の相対的方向を親のＣＰＰｓまたはβ−ターンのごとき目的とする他の構造において見られる側鎖の相対的方向と比較した。CADD tool FOUNDATIONを用いて、理想的なβ−ターンのコンホーメーションとＭＡＣ金属複合体の結晶構造（Reaka, Ho および Marshall, 未公表）との間の側鎖方向に対応するベクトルの重複を見つけた。図１５を参照すると、単純な例において、示されたＭｎ（ＩＩ）複合体は、側鎖置換基を理想的なＩ型β−ターンのｉ、ｉ＋１、ｉ＋２残基に見られる側鎖置換基の方向とほぼ同じ方向に向けている。このターンのペプチド模倣物として、それは、β−ターンの４個の側鎖のうち３個のみが正しい方向を向いているという事実に直面する。それにもかかわらず、正しく重複しているそれら３個の側鎖のみが受容体認識に関与する場合には、Ｍｎ−複合体は活性を示すはずである。
【００９５】
図１６を参照すると、インテグリン受容体に結合する場合のＲＧＤのコンホーメーションを決定するためにナノモラーのアフィニティーを有する２種の環状ペンタペプチドがNikiforovichらにより用いられた。ＣＰＰファーマコフォアを調べる際にＮＭＲスペクトル測定法を用いる最もよく知られた場合は、KesslerのグループによるＲＧＤ−含有ＣＰＰｓに関する研究である。彼らは、ｃ（ＲＧＤｆＶ）およびｃ（ＲＧＤＦｖ）の両方が、フィブロネクチンへのαＩＩｂβ３インテグリン類の結合およびビトロネクチンへのαｖβ３インテグリンの結合に対してほとんど同等の阻害剤であることを見出した（２００〜３００ナノモラーのアフィニティーを有する）。
【００９６】
これらのコンホーマーの重複を図１７に示し、それは矛盾のないＲＧＤ−含有ＣＰＰｓに関する三次元ファーマコフォアモデルとみなすことができ、他の著者らにより提案されているＲＧＤファーマコフォアに関するモデルとよく一致する。
【００９７】
これらの骨格を鋳型として用い、Tripos, Inc. of St. Louis, Missouriにより製造されたＳＹＢＹＬを用いて骨格のカルボニルを除去した。ＲＧＤモチーフは認識に必須なので、試験した構造はすべてＲＧＤモチーフを含んでいた。他の２つの位置のＲおよびＳ両方のコンフィギュレーションを含む数個のアミノ酸側鎖および炭素環を変更した。各リガンド構造は複合体化していないものを模倣するものであった。リガンドの分析はすべてのΦおよびΨ角の測定を含み、それらをシクロ（ＲＧＤＦｖ）およびシクロ（ＲＧＤｆＶ）のものと比較した。マクロサイクルを横切る距離、特に、アルギニン残基のα−炭素とアスパラギン酸残基のα−炭素との間の距離を測定し、さらに、ＡｒｇおよびＡｓｐ側鎖のＣα−Ｃβの二面角を測定した。Ｓｙｂｙｌから最良の構造が決定されたならば（シクロ（ＲＧＤＦｖ）およびシクロ（ＲＧＤｆＶ）との比較で）、それらをＣａＣｈｅに移して、さらにマクロサイクル中において複合体化している金属に関して試験した。ＲＧＤ鋳型の模倣において成功の程度が異なる３種の金属（亜鉛、マンガンおよびニッケル）を試験した。シクロ（ＲＧＤＦｖ）およびシクロ（ＲＧＤｆＶ）鋳型に合致する２つの構造が見つかった。１つはペンタアザサイクル cyclored（ＲＧＤａＡ）であった（cycloredはペンタアザ環、すなわち骨格上にカルボニルがないことを示す）。第２のものは縮合シクロヘキサン環 cyclored（ＲＧＤａch）を有していた（chはシクロヘキサン環を示す）。両方とも複合体化金属として亜鉛を有する。
【表３】
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【００９８】
試験された最良の重複構造はcyclored（ＲＧＤＦｃｐ）であり、それはシクロヘキサン束縛物のかわりに縮合シクロペンタン環（図６）を有する。シクロペンタンの増加した環の緊張はマクロサイクルのひだを減少させ、ペプチド鋳型に対してより良く合致させる。
【００９９】
実施例５
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中にトランスフェクションされたヒトオピオイド受容体に関して受容体結合の研究を行う。１０％ウシ胎児血清および４００μｇ／ｍｌのGENETICIN（Ｇ４１８硫酸塩）を補足したＨａｍのＦ−１２培地中でμ細胞系を維持する。１０％ウシ胎児血清および５００μｇ／ｍｌヒグロマイシンＢを補足したＨａｍのＦ−１２培地中でδ細胞系を維持する。１０％ウシ胎児血清、４００μｇ／ｍｌのGENETICIN（Ｇ４１８硫酸塩）および０．１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したDulbeccoの最少必須培地でｋ細胞系を維持する。すべての細胞系を十分に集密となるまで増殖させ、ついで、膜調合物とするために集める。機能アッセイに使用する膜をバッファーＡ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）中に調製し、結合アッセイ用の膜を５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー，ｐＨ７．７中に調製する。ゴム製ヘラでかき取ることにより細胞を集めついで、５００ｘｇで１０分間遠心分離する。砂防ペレットをバッファーＡまたはＴｒｉｓバッファーに懸濁し、Polytronホモジナイザーでホモジナイズし、２００００ｘｇで２０分間遠心分離する。バッファーＡまたはＴｒｉｓバッファー中で細胞ペレットを洗浄し、２００００ｘｇでさら２０分間遠心分離し、最後に少量のバッファーに懸濁し、蛋白含量を調べる。膜の一部をバイアルあたり６ｍｇ／ｍｌの濃度として小バイアル中に取り、使用の必要があるまで−７０℃で保存する。
【０１００】
それぞれμ、δおよびｋ受容体に結合する［３Ｈ］ＤＡＭＧＯ、［３Ｈ］Ｃｌ−ＤＰＤＰＥ、および［３Ｈ］Ｕ６９，５９３を用いて常套的な結合アッセイを行う。μおよびδの結合には、９６ウェルプレート中、合計体積２００μｌとして、細胞膜を適当な放射性リガンドおよび未標識薬剤とともに、２５℃で１時間インキュベーションする。ｋの結合には、プレートではなく試験管中合計体積２ｍｌとして細胞膜をインキュベーションした。なぜなら、ｋ細胞におけるオピエート受容体または受容体占有率が他の細胞系におけるものほど高くないからである。常套的な実験には、１０−５ないし１０−１０Ｍの範囲の濃度の試験化合物とともに膜をインキュベーションする。インキュベーション後、Tomtec細胞ハーベスターを用いることによりガラス繊維フィルターで試料を濾過する。フィルターを一晩乾燥させ、その後、放射活性レベルを調べる。各放射性リガンドの１．０μＭの未標識カウンターパートを用いることにより非特異的結合を調べる。
【０１０１】
化合物の十分な特徴づけは、プログラムＰＲＩＭＳを用いることによるＩＣ５０値およびＨｉｌｌ係数に関するデータの分析を包含する。Cheng Prusoff変換を用いてＫｉ値を計算する：
Ｋｉ＝ＩＣ５０
１＋Ｌ／Ｋｄ
式中、Ｌは放射性リガンド濃度であり、Ｋｄはあらかじめ飽和分析により決定しておいた放射性リガンドの結合アフィニティーである。
【０１０２】
実施例６
上記のごとき調製した膜を［３５Ｓ］ＧＴＰｙＳ（５０ｐＭ）、ＧＤＰ（通常は１０μＭ）および所望化合物を、合計体積２００μｌとして、２５℃で６０分インキュベーションする。試料をガラス製フィルターで濾過し、結合アッセイに関して説明したようにカウントする。各実験においてプロトタイプの完全アゴニスト（ＤＡＭＧＯ、ＤＰＤＰＥ、およびＵ６９５９３）を用いて用量応答曲線を作成して、完全アゴニスト化合物および不完全アゴニスト化合物を同定する。
【０１０３】
アゴニスト活性を示さない高アフィニティー化合物（Ｋｉ値が２００ｎＭまたはそれ未満）をアンタゴニストとして試験する。少なくとも３種の濃度のアンタゴニストの存在下における完全アゴニスト用量応答曲線を用いて、各化合物について完全Schild分析（full Schild analysis）を行う。これらの実験値用に設計された統計学的プログラムを用いてｐＡ２値およびSchild勾配を決定する。Schild勾配が−１．００とは有意に異なる場合、拮抗は競争的ということができず、ｐＡ２値を報告することができない。これらの化合物に関し、平衡解離定数（Ｋｅ）をまとめのページに挙げる。下式から平衡解離定数（Ｋｅ）を計算する：
Ｋｅ＝ａ／Ｄｒ−１
式中、アンタゴニストのａはナノモラー濃度であり、Ｄｒはアンタゴニストの存在濃度においてアゴニスト濃度−応答曲線の右への実際上のシフトである。
【０１０４】
体重３５０〜４００ｇのオスのHartleyモルモットを斬首し、小腸を取り、約２０ｃｍの末端回腸を捨てる。PatonおよびVizi(1969)の方法により、筋層間神経叢を伴う縦方向の筋肉をその下の環状筋肉からゆっくり取り外す。ウォータージャケットを装備した、下記組成（ｍＭ）のKrebs-重炭酸溶液の入った８ｍｌのオーガンバスに筋肉片を入れる：ＮａＣｌ １１８，ＣａＣｌ２ ２．５，ＫＣｌ ４．７，ＮａＨＣＯ３ ２５，ＫＨ２ＰＯ３ １．２，およびグルコース１１．５。組織を３７℃に保ち、酸素中５％ ＣＯ２を吹き込む。初期張力０．６ｇを片に適用する。筋肉片を６０分間刺激し、その後、各実験を解すする。オーガンバスの上下に３．５ｃｍ離して設置した白金電極を通してフィールド電気的刺激を伝達する。上の電極は直径４ｍｍの環状である。方形の刺激のパラメーターは最大上刺激電圧であり、０．１Ｈｚで１−ｍｓのパルス時間である。Grass S-88電気刺激装置を刺激に使用する。マルチチャンネルポリグラフ（Gould 3400）に接続されたイソメトリック変換器（isometric transducer）（Metrigram）を用いて、電気的に誘発された収縮を記録する。
【０１０５】
濃度−応答曲線から試験化合物のアゴニスト能を決定し、それらのＩＣ５０値により特徴づける。ＩＣ５０は、電気的に誘発された収縮を５０％阻害するアゴニスト濃度と定義される。
【０１０６】
下式：
Ｋｅ＝ａ／Ｄｒ−１
［式中、アンタゴニストのａはナノモラー濃度であり、Ｄｒはアンタゴニストの存在濃度においてアゴニスト濃度−応答曲線の右への実際上のシフトである］
から計算された平衡解離定数（Ｋｅ）によりアンタゴニスト活性を有する化合物を特徴づける。
【表４】
2005518334.tif 000012
【０１０７】
上のことから、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が生じている。本発明を詳細に説明したので、当業者は、本明細書で説明した本発明の精神から離れることなく本発明の他の具体例を実施できることを理解するであろう。それゆえ、本発明の範囲は本明細書に記載された特定の好ましい具体例に限定されると解してはならない。むしろ、本発明の範囲は特許請求の範囲およびそれらの均等物に決定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、シクロペンタペプチドおよびペンタアザクラウンを用いるペプチド模倣物の設計のためのヒエラルヒー的アプローチの工程を示すフローチャートスキームである。
【図２】図２は、受容体中に結合する金属の共同作用を用いることによる柔軟なペプチドの構造のプレオーガナイゼーション（preorganization）を示すスキームダイヤグラムである。
【図３】低エネルギーのシクロ(DProl-Ala2-Ala3-Ala4-Ala5)（[c(pAAAA)]としても知られる）に関する統計学的重量のヒストグラムを示すチャートであり、エネルギー計算値の相対値を示す。
【図４】図４は、プレオーガナイズペプチドコンホーメーションのための金属結合部位を提供するためのアミド結合に代わるヒドロキシメートを含むペプチドを示すダイヤグラムである。鉄（ＩＩＩ）イオンに対する３つの置き換わったヒドロキシメート基Ψ[CONOH]を含む期待されるヘキサデンテート八面体形態のペプチドが図式的に示されている。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例２に示すカリウムチャンネル（ＡＴＰ−感受性、Ｃａ２＋Ａｃｔ、ＶＩ、カリウムチャンネル、Ｃａ２＋Ａｃｔ、ＶＳ）およびナトリウムチャンネル（部位１および部位２）に対するＭ４０４０１に関する放射性リガンド結合アッセイの結果を示すチャートである。１回分１０μＭのＭ４０４０１を試験した。結果は、ナトリウムチャンネル２の有意な阻害（９３．８４％阻害）を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例２に示すカリウムチャンネル（ＡＴＰ−感受性、Ｃａ２＋Ａｃｔ、ＶＩ、カリウムチャンネル、Ｃａ２＋Ａｃｔ、ＶＳ）およびナトリウムチャンネル（部位１および部位２）に対するＭ４０４０３に関する放射性リガンド結合アッセイの結果を示すチャートである。１回分１０μＭのＭ４０４０３を試験した。結果は、ナトリウムチャンネル２の有意な阻害（８４．７６％阻害）を示す。
【図６】図６は、実施例３に記載されたＣＨＯ細胞における標識ヒトオピオイドミュー、デルタおよびカッパ受容体を標識することが知られているリガントとの競争を含む、Ｍ４０４０３の可能なオピオイド活性を調べるためのインビトロ結合アッセイの結果を示すチャートである。
【図７】図７は、実施例３に記載されたＣＨＯ細胞における標識ヒトオピオイドミュー、デルタおよびカッパ受容体を標識することが知られているリガントとの競争を含む、Ｍ４０４０３の可能なオピオイド活性を調べるためのインビトロ結合アッセイの結果を示すチャートである。
【図８】図８は、実施例３に記載されたＣＨＯ細胞における標識ヒトオピオイドミュー、デルタおよびカッパ受容体を標識することが知られているリガントとの競争を含む、Ｍ４０４０３の可能なオピオイド活性を調べるためのインビトロ結合アッセイの結果を示すチャートである。
【図９】図９は、実施例３に記載されたＣＨＯ細胞における標識ヒトオピオイドミュー、デルタおよびカッパ受容体を標識することが知られているリガントとの競争を含む、Ｍ４０４０３の可能なオピオイド活性を調べるためのインビトロ結合アッセイの結果を示すチャートである。
【図１０】図１０は、実施例３に記載されたＣＨＯ細胞における標識ヒトオピオイドミュー、デルタおよびカッパ受容体を標識することが知られているリガントとの競争を含む、Ｍ４０４０３の可能なオピオイド活性を調べるためのインビトロ結合アッセイの結果を示すチャートである。
【図１１】図１１は、実施例３に記載されたＣＨＯ細胞における標識ヒトオピオイドミュー、デルタおよびカッパ受容体を標識することが知られているリガントとの競争を含む、Ｍ４０４０３の可能なオピオイド活性を調べるためのインビトロ結合アッセイの結果を示すチャートである。
【図１２】Kopple et al.,Conformationals of Arg-Gly-Asp Containing Heterodetic Cyclic Peptides : Solution and Crystal Studies. J.Am. Chem.Socl., 114: 96159623 (1992)に記載されたc[B-メルカプトベンゾイル)-N-Me-Arg-Gly-Asp-2-マルカプトアニリド]のＸ線構造との比較におけるc(RGDFv)およびc(RGDfV)の低エネルギーコンホーマーの重複である。
【図１３】ペプチドのＮ−末端セグメントのＣｕ（ＩＩ）複合体および束縛された構造である。α−アミラーゼに対する阻害剤に関し、R1=H, R2=Trp, R3=Arg, R4=Tyrである。
【図１４】金属イオンにより誘導された異なるアレイの構造（ＭＩＤＡＳ）に関するレニウム複合体形成である。ヒト好中球エラスターゼ阻害剤に関し、R=Bz, Rl=Ile, R2=Lys (Adam), R3=Val-Hであり、メラノコルチン−１アゴニストに関し、R=Ac-His, Rl=Phe, R2=Arg, R3=Trp-NH2である。
【図１５】未置換ペンタ−アザクラウンのＭｎ（ＩＩ）複合体の結晶構造に関する、理想的なＩ型β−ターンの残基ｉ、ｉ＋ＩおよびＩ＋２ベクトルの側鎖方向の重複のオーソルゴナル（orthorgonal）図である。
【図１６】c[(p-メルカプトベンゾイル)-N-Me-Arg-Gly-Asp-2-メルカプトアニリド]（左）のＸ線構造との比較におけるc(RGDFv)およびc(RGDfV)（右）の低エネルギーコンホーマーの重複である。
【図１７】金属−複合体化ＭＡＣｓ（左）の２つのかのうな修飾物に関する、c(RGDFv)およびc(RGDfV)から演繹されたＲＧＤトライアッドの示唆された受容体−結合コンホーマーの重複の正投影図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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