(57)【要約】混合物中の物質を分析するための媒体、ならびにその媒体の製造方法及び使用方法を開示する。特に、前記媒体は、誘導ポリマー表面を有する少なくとも１つのポリマー繊維の網状組織を含み、それを介して混合物の通過のための蛇行性間隙通路を形成し、分散性が高くて間隔がランダムな配向性をとった状態で、少なくとも１つの選択的結合剤をその上に固定化することを可能にする。前記物質は、化学物質又は生体物質であってよい。また、アッセイマトリックス、アッセイシステム、及び前記媒体を含むキットも開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合物中の少なくとも１つの物質を分析するための媒体であって、
混合物が通過するための蛇行性間隙通路を形成する分散性が高くて間隔がランダムな配向で、少なくとも１つの特別の結合剤の固定化を許す誘導ポリマー表面を有する少なくとも１つのポリマー繊維の網状組織を有することを特徴とする媒体。
【請求項２】
前記網状組織が、実質的に自己支持性で、３次元で、実質的に水不溶性であることを特徴とする請求項１に記載の媒体。
【請求項３】
前記網状組織が、第２のポリマー繊維を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の媒体。
【請求項４】
前記網状組織が、誘導溶球を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の媒体。
【請求項５】
前記ポリマー繊維の間隔がランダムな接触点が、互いに結合していることを特徴とする請求項１に記載の媒体。
【請求項６】
前記ポリマー繊維が、熱可塑性ポリマーを含むことを特徴とする請求項１に記載の媒体。
【請求項７】
前記ポリマー繊維が鞘・芯型の２成分繊維であることを特徴とする請求項１に記載の媒体。
【請求項８】
前記ポリマー繊維が、多成分繊維であることを特徴とする請求項１に記載の媒体。
【請求項９】
前記第２のポリマー繊維が、誘導ポリマー表面の上に第２の特別の結合剤を固定化することを可能にする該誘導ポリマー表面を含むことを特徴とする請求項３に記載の媒体。
【請求項１０】
前記熱可塑性ポリマーが、炭化水素樹脂類と、ポリアミド類と、ポリエチレンと、ポリ塩化ビニルと、エチレン、プロピレン、エチレンメタクリル酸、エチレンアクリル酸、エチレン−酢酸ビニル、エチレンアクリル酸メチル、ポリスチレン、ナイロン６、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、及びそれらの誘導体のコポリマーなどのポリエステル類とからなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の媒体。
【請求項１１】
前記熱可塑性ポリマーが、ナイロン６、ポリエチレンオキシドジアミン、エチレンメタクリル酸のコポリマー、又はそれらの組合せであることを特徴とする請求項６に記載の媒体。
【請求項１２】
前記熱可塑性ポリマーが、エチレンとメタクリル酸とのコポリマーであることを特徴とする請求項６に記載の媒体。
【請求項１３】
前記熱可塑性ポリマーが、エチレンとアクリル酸とのコポリマーであることを特徴とする請求項６に記載の媒体。
【請求項１４】
前記熱可塑性ポリマーが、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））又はカプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））ＳＪＥＳ親水性ナイロンであることを特徴とする請求項６に記載の媒体。
【請求項１５】
ダイ中の複数の開口部を通して、熱可塑性ポリマーを含む少なくとも１つの表面を有する複数の繊維を連続紡糸する工程と、
連続移動面上に繊維を集めて、主に前記移動面の移動方向にランダムな間隔をとって高分散性の連続繊維の網状組織の形態で、高度に絡み合った繊維のウェブを形成する工程と、
前記網状組織を採集する工程と、
前記網状組織を加熱して接触点で互いに繊維を結合させる工程と、
前記網状組織を冷却して媒体を得る工程とにより製造されることを特徴とする請求項１に記載の媒体。
【請求項１６】
連続紡糸が、溶融紡糸法、メルトブロー法、スパンボンド法、溶液紡糸法、及び冷却延伸法からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の媒体。
【請求項１７】
前記網状組織は、蒸気により加熱されることを特徴とする請求項１５に記載の媒体。
【請求項１８】
請求項１に記載の媒体と、該媒体上に固定化された少なくとも１つの特別の結合剤とを含むことを特徴とする化学的又は生物学的アッセイのためのアッセイマトリックス。
【請求項１９】
請求項１７のアッセイマトリックスを含むことを特徴とするアッセイシステム。
【請求項２０】
前記アッセイシステムが、アッセイトレイ、カラム、皮下注射針、膜又はミクロ遠心管であることを特徴とする請求項１９に記載のアッセイシステム。
【請求項２１】
少なくとも１つの化学的又は生物学的アッセイ試剤と共に包装された請求項１に記載された媒体を含むことを特徴とするキット。
【請求項２２】
使用説明書を更に含むことを特徴とする請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
混合物中の少なくとも１つの物質を分析するための方法であって、
混合物が通過するための蛇行性間隙通路を形成する分散性が高くて間隔がランダムな配向性で、少なくとも１つの特別の結合剤の固定化を許す誘導ポリマー表面を有する少なくとも１つのポリマー繊維の網状組織に、少なくとも１つの前記特別の結合剤を固定化する工程を有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記ポリマー表面を機能化する工程を更に有することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記物質に対する特異性、反応性又は親和性を高めるために、前記ポリマー表面を処理する工程を更に含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記物質が、前記特別の結合剤に特に結合する化学物質又は生体物質であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体物質が、アミノ酸分子、ペプチド類、ポリペプチド類、核酸分子、ポリヌクレオチド類、糖類、炭水化物類、脂質類及びそれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記物質が、治療薬であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリマー繊維が、特別の結合剤、架橋剤、又は双方との特別の結合又は共有結合が可能な複数の相互作用部位を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記物質が、前記媒体、架橋剤、特別の結合剤又はそれらの組合せとの特別の結合、イオン結合又は共有結合により、混合物から単離、精製又は分離されることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
同一の又は他の前記物質が、物理的捕促により混合物から単離、精製又は分離されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記媒体から前記物質を溶出する工程を更に有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質及び生体物質の単離、検出、分離又は精製用の媒体に関する。特に、本発明は、種々の臨床、診断、医療及び研究目的のためのポリマー繊維を用いる分析方法及び精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
分析方法及び診断方法ならびに分析用試薬及び診断用試薬に関しては、生物医学的研究及び開発の必要性が依然として存在している。具体的には、薬剤、麻酔薬、ホルモン剤、ステロイド剤、アミノ酸類、代謝物、毒物、ウィルス、微生物及び核酸などの化学物質及び生体物質に関する分析法及び精製法ならびに分析システム及び生成システムの必要性が依然として存在している。
【０００３】
混合物からの所与の物質の単離、精製又は分離が、種々の方法で種々の理由により達成されてきた。最も一般的な従来の分離法は、機械的篩い分け、すなわちフィルタの孔径が粒径よりも小さい場合の物理的捕促による粒子の除去によって、他の物質を物理的に捕捉して保持する一方で、一定の物質の通過を可能にする多孔性フィルタによる単純な濾過を含む。単純な濾過により非常に微細な物質を除去するためには、フィルタは細孔を有さなければならないことは明らかである。あいにく、細孔は、微細物質及び他の不純物によって詰まり易い。その結果、細孔を有するフィルタ媒体は、許容できないほどの高い圧力低下を急速に引き起こすか、その有効性を失うか、又は両方の現象を引き起こす。
【０００４】
混合物からの化学物質及び生体物質の単離、分離又は精製は、一般に単純な濾過以上のもの必要とする。従来技術において、化学物質及び生体物質に対する多数の分析法及精製法ならびに分析システム及び精製システムがある。これらの方法の多くは、検出、測定又は単離すべき物質としての配位子が特別のかつ優先的に受容体分子と反応する特別の結合反応に基いている。特別の結合反応の例としては、抗体と抗原との間、アビジンとビオチンとの間の結合反応が挙げられる。特別の結合反応を用いる従来技術の方法は、一般に固体基材上に固定化された配位子又は受容体分子などの生体親和性剤を必要とし、それにより配位子又は受容体分子と結合しない任意の物質を、配位子と受容体との複合体から分離できる。従って、このような固定化した配位子及び受容体分子は、一般にアフィニティー・クロマトグラフィー及び他の精製システムにおいて使用され、混合物から所与の化学物質又は生体物質を単離する。
【０００５】
単離、精製又は分離に関する他の従来技術としては、イオン交換媒体及び誘導溶球(derivatized beads)が挙げられる。主にスルホン化ポリマー類から作製される前記イオン交換媒体は、イオン性が高い、架橋剤との誘導に対して極めて反応性が高い、結合反応を妨害して、分析、単離又は精製を受ける生体物質及び化学物質を損傷又は破壊する恐れがある誘導後の残存イオン性を有する、という問題をはらんでいる。アニオン交換樹脂は、活性で、より大きな親和性の被検体との交換により標的被検体を放出できるスルホニル基を有している。前記樹脂は、典型的には溶球又は粒子である。前記アニオン交換樹脂はまた、イオン強度が高いため化学化合物及び生体化合物を損傷又は破壊することが多いという問題を含んでいる。
【０００６】
シリカ溶球、機能化溶球、磁気溶球及び多孔性プラスチック溶球などの誘導溶球は、種々の理由で問題を含む。例えば、固形支持体上に溶球を固定することは難しいか非実用的であるため、通常、溶球は自由に浮遊しているか容器に詰められており、チャネル形成、低流量、かなりの圧力低下及び詰まりのため、不十分な信頼できない結果を招く。
【０００７】
例えば、いかに慎重かつ完全に溶球などのカラムを調整し詰めても、カラムを通過する混合物は、溶球間の間隔空間又は溶球と溶球を含むカラムとの間の空間である最少抵抗の通路を捜すこととなり、それによって、溶球上の相互作用部位がバイパスされ、工程の有効性を著しく減じることになる。更に、単純な濾過と同様に、溶球を詰めたカラムに詰まりが生じる。詰まりを防ぐためには溶球の多孔性を増加させるが、しかしながら、増加した多孔性のために活性面の領域が減少し、溶球が非常にもろくなる。更に、溶球を使用のたびに慎重に調整して詰めなけらばならないために、自由に浮遊する溶球を用いてキットや在庫アッセイを調整するのは困難となる。半透膜は、二次元性の膜はそれらの使用を少数の適用だけに限定し、３次元形態の表面積と比較して相互作用に供される表面積量が限定されるために、問題にもなる。前記膜は、抗拡散性が最少になるように比較的薄くしなければならない。しかし、薄膜の完全性を維持することは難しく、膜が完全状態を保っていないと実験を繰り替えさなければならない。更に、単純フィルタのように、膜の細孔は目詰まりを受ける。前述のことを考慮すると、化学物質及び生体物質の単離、分離又は精製のための従来の媒体は、限定された初期効率、目詰まりから生じる使用に伴う有効性の減少、好ましくないもろさ、製造及び調整の困難性や高いコスト、又はそれらの組合せなどの重大な不利益を受ける。
【０００８】
従って、比較的安価で製造や使用がし易く、物理的捕促、特別の結合、又はその双方によって混合物から化学物質又は生体物質を単離、分離又は精製するために使用できる媒体が必要である。
【特許文献１】米国特許第３，８５７，９３１号
【特許文献２】米国特許第４，１３８，３８３号
【特許文献３】米国特許第４，１８１，６３６号
【特許文献４】米国特許第４，２６４，７６６号
【特許文献５】米国特許第４，４０１，７６５号
【特許文献６】米国特許第４，４１５，７００号
【特許文献７】米国特許第４，７９４，０９０号
【特許文献８】米国特許第５，０６３，１０９号
【特許文献９】米国特許第５，０９４，９６２号
【特許文献１０】米国特許第５，２２５，５１６号
【特許文献１１】米国特許第５，２６２，２９７号
【特許文献１２】米国特許第５，５９９，６６７号
【特許文献１３】米国特許第５，６３７，５０８号
【特許文献１４】米国特許第５，８６１，３１９号
【特許文献１５】米国特許第５，９９３，９３５号
【特許文献１６】米国特許第５，５０９，４３０号
【特許文献１７】米国特許第６，０２６，８１９号
【特許文献１８】米国特許第６，１０３，１８１号
【特許文献１９】米国特許第５，６５６，４４８号
【特許文献２０】米国特許第５，６６７，９７６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は一般に、混合物中の物質を単離、検出、分析、分離又は精製するための媒体に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、混合物中の少なくとも１つの物質を分析するための媒体に関し、該媒体は、混合物が通過する蛇行性の間隙通路を形成する高分散性で間隔がランダムな配向性の誘導(derivatized)ポリマー表面を有する、少なくとも１つのポリマー繊維の網状組織を含む。前記物質は、化学物質又は生体物質であってよい。好ましい実施形態において、網状組織の繊維を接触点で結合することにより、実質的に自己支持性で、３次元で、実質的に水不溶性である基材を生成する。前記網状組織は、更に、結合性繊維として、又は異なる結合特性、親和性又はその両性質を有する第２のポリマー表面を提供するために、第２のポリマー繊維を含んでもよい。前記第２のポリマー表面は、処理される混合物中の別の基材と特別に結合できる。更に、前記網状組織は、ポリマー繊維の誘導ポリマー表面として同一又は異なる結合特性、親和性又はその両方を有する誘導溶球を含む。
【００１１】
好ましい実施形態において、ポリマー繊維は熱可塑性ポリマーを含む。前記ポリマー繊維は、鞘・芯型の２成分繊維であることが好ましい。前記熱可塑性ポリマーは、炭化水素樹脂、ポリアミド、ポリエチレン、塩化ポリビニル、又はポリエステルでよく、エチレン、プロピレン、エチレンメタクリル酸、エチレンアクリル酸、エチレン−酢酸ビニル、エチレンアクリル酸メチル、ポリスチレン、ナイロン６、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート及びそれらの誘導体、のコポリマーなどのコポリマー類でもあり得る。好ましい実施形態において、前記熱可塑性ポリマーは、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌから入手できるカプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））親水性ナイロンなどのポリカプロラクタムとポリエチレンオキシドジアミンとのブロックコポリマー、又はＤｕＰｏｎｔから入手できるニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））などのエチレンとメタクリル酸とのコポリマー、又はそれらの組合せである。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、従来の方法による連続的紡糸によって製造される上記タイプの混合物中の、少なくとも１つの物質を分析する媒体に関するものである。これら従来の方法は、ダイの複数の開口部を通した熱可塑性ポリマーを含む少なくとも１つの表面を有する複数の繊維を溶融紡糸する、メルトブローする、又は乾式紡糸又は湿式紡糸などのスパンボンド又は溶液紡糸する工程と、連続的移動面上に繊維を集めて、主に移動面の移動方向でランダムに間隔のあいた高分散性網状組織の形態で繊維が十分に絡んだウェブを形づる工程と、網状組織を採集する工程と、網状組織を加熱して接触点で互いに繊維を結合させる工程と、前記網状組織を冷却して媒体を得る工程とを含む。好ましい実施形態においては、前記網状組織を蒸気により加熱する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、上記媒体に固定化された特別の結合剤を含む化学的又は生物学的アッセイのためのアッセイマトリックスに関する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のアッセイマトリックスを含むアッセイシステムに関する。該アッセイシステムは、アッセイトレイ、カラム、皮下注射針、膜、ミクロ遠心管などであってよい。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの化学的試薬又は生物学的アッセイ試薬と共に包装され、それを介して混合物通過のための蛇行性間隙通路を形成する高分散性で間隔がランダムな配向性の、少なくとも１つのポリマー繊維の網状組織を含み、混合物中の少なくとも１つの物質を分析するための前述の媒体を含むキットに関する。前記キットは、使用説明書を更に含むことができる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、それを介して混合物通過のための蛇行性間隙通路を形成する高分散性で間隔がランダムな配向性の、その上に少なくとも１つの特別の結合剤の固定化を可能にするポリマー表面を有する少なくとも１つのポリマー繊維の網状組織に対して、少なくとも１つの特別の結合剤を固定化する工程を含み、混合物中の少なくとも１つの物質を分析する方法に関する。前記物質は、アミノ酸分子、ペプチド、ポリペプチド、核酸分子、ポリヌクレオチド、糖、炭水化物、脂質などの化学物質又は生体物質である。前記物質は治療薬であってもよい。好ましい実施形態において、前記ポリマー繊維は、架橋剤、特別の結合剤、又はその両方で特別の又は共有結合が可能な複数の相互作用部位を含む。前記物質は、物理的捕促により混合物から単離、精製又は分離できる。
【００１７】
他に、前記物質は、媒体、架橋剤、特別の結合剤、又はそれらの組合せに対する、特別の結合、イオン結合又は共有結合によって、混合物から単離、精製又は分離できる。前記方法は、更に、前記媒体から物質を溶出させる工程を含む。
【００１８】
前述の一般的記載及び以下の詳細な記載は、両方とも例示的かつ説明的なものであり、請求項のような本発明のさらなる説明を提供することが意図されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、混合物中の少なくとも１つの化学物質又は生体物質の単離、分析、分離、精製又はそれらの組合せのための媒体、及びその製造方法及び使用方法に関する。具体的には、前記媒体は、種々の臨床、診断、医療及び研究の方法及びシステムに使用できるポリマー繊維である。
【００２０】
本発明の媒体は、酸性、塩基性の有機化合物又は無機化合物などの種々の物質と共有結合で相互作用できる少なくとも１つのポリマー繊維を含む。前記ポリマー繊維は、ポリマー繊維を共有結合で又は化学的に修飾するための複数の相互作用部位を含む。例えば、架橋剤又は特別の結合剤は、共有結合性カップリングによりポリマー繊維上に固定化できる。固定化された特別の結合剤は、次に、生体分子などの少なくとも１つの物質と特別の結合ができる。
【００２１】
ポリマー繊維は、機能化、誘導、又は修飾されて、架橋剤、特別の結合剤又は双方に対してより大きな活性、反応性又は親和性を付与する。本明細書中に用いられる「機能化された(functionized)」、「誘導された(derivatized)」、又は「修飾された(modified)」は、ポリマー表面に対し特別の結合剤を固定化できるポリマー繊維を指すために、交換可能に用いられる。例えば、ポリマー繊維表面上の相互作用部位又はペンダント基は、特別の結合剤であり得る架橋剤と共有結合で反応できるか、又は特別の結合剤を固定化するために使用できる。前記ペンダント基としては、カルボン酸基、アミン基、スルホン酸基などが挙げられる。相互作用部位又はペンダント基をまだ有していないポリマー表面は、その表面上にこのような部位又は基を提供するために処理できる。例えば、ポリスチレンは硫酸と反応してスルホン化面を提供することができる。次にポリマー表面は、特別の結合剤であり、架橋剤と反応させるか又は特別の結合剤と結合するために使用される。
【００２２】
本明細書中に用いられる「特別の結合剤(specific binding agent)」は、通常「生体親和剤(bioaffinity)」として当業界に知られており、所与の物質に特別の配位子又は受容体分子を指す。最も通常の受容体分子は、抗体及び当業界に知られた特別の結合蛋白質である。受容体は、配位子に対し可逆的で特別の結合親和性を有することを特徴とする。前記配位子は、受容体に対する配位子として実質的に同一又は同様の特殊性又は親和性を有する受容体分子、配位子又は双方に結合する酵素又は蛍光タグなどの検出性マーカを更に含み得る。好適な特別の結合剤としては、抗体及びその断片、抗原、ポリペプチド類、ポリヌクレオチド類、多糖類、脂質などが挙げられる。
【００２３】
特別の結合剤は、本発明の媒体のポリマー繊維表面上に固定化できる。結合は、配位子又は受容体分子をポリマー繊維に単純に接触させることによって一時的又は可逆的であり得、あるいは結合は架橋剤を用いて永続的又は不可逆的であり得る。受容体分子又は配位子をポリマー繊維上に固定化できる従来の方法としては、吸着、吸収、共有結合、免疫複合化、又はそれらの組合せが挙げられる。例えば、米国特許第３，８５７，９３１号、米国特許第４，１３８，３８３号、米国特許第４，１８１，６３６号、米国特許第４，２６４，７６６号、米国特許第４，４０１，７６５号、米国特許第４，４１５，７００号、米国特許第４，７９４，０９０号、米国特許第５，０６３，１０９号、米国特許第５，０９４，９６２号、米国特許第５，２２５，５１６号、米国特許第５，２６２，２９７号、米国特許第５，５９９，６６７号、米国特許第５，６３７，５０８号、米国特許第５，８６１，３１９号及び米国特許第５，９９３，９３５号を参照されたい。これらは全て、その全体を参照により本明細書中に組み込んでいる。
【００２４】
本明細書中に用いられる「架橋剤(crosslinking agent)」とは、本発明によるポリマー繊維の相互作用部位に対し、所与の物質を結合、付加、又は固定化させるために使用できる試剤を指す。グルタルアルデヒドなどのアミン架橋剤は、特別の結合剤のアミン基と反応し、ポリマー表面のアミン基が好適である。他の好適なアミン架橋剤としては、ジエポキシド類、ジ−又はトリイソシアナート類、スベリン酸ジスクシンイミジル又はジメチルスベルイミダートなどのジ−又はトリ官能性アミン反応性剤が挙げられる。他に、ポリマー表面のアミノ基は、カルボジイミド類又はカルボニルジイミダゾール類などの架橋剤を用いて特別の結合剤のカルボキシレート基に付加できる。架橋剤は、特別の結合剤の適用前に、適用と共に、適用後に付加できる。
【００２５】
好ましさは減じるが、架橋剤は本発明により使用する必要はない。例えば、特別の結合剤は、乾燥又は他の好適な手段により本発明の媒体と接触でき、またポリマー繊維に固定化できる。特別の結合剤の固定化は永続的でないこともあるが、ある状態における物質の分析に好適かつ十分であり得る。更に、非特別の蛋白結合は望ましくないことが多く、本発明の媒体を、当業界の従来法により非特別の蛋白結合耐性を供与するために処理できる。
【００２６】
前記媒体は、高分散性で間隔がランダムな配置をとる少なくとも１つのポリマー繊維の網状組織の形態であり得る。前記網状組織は、物質の通過又は捕促のための蛇行性間隙通路を提供する。前記網状組織はまた、複数の相互作用部位が、特別の結合剤と共有結合で相互作用できる広い合計の表面積を提供する。その上に固定化された特別の結合剤を含む網状組織は、生体分子などの物質を分析するために使用できる。本明細書中に用いられる用語の物質を「分析する」とは、知られているか又は知られていない物質を、「単離する(isolating)」、「検出する(detecting)」、「測定する(measuring)」、「分離する(separating)」、「精製する(purifying)」、「アッセイする(assaying)」、又は「特性化する(characterizing)」ことを意味する。
【００２７】
前記ポリマー繊維は、乾式紡糸又は湿式紡糸又は冷却延伸などの、溶融紡糸、メルトブローもしくはスパンボンド又は溶液紡糸などの従来法による紡糸によって製造された２成分熱可塑性ポリマー繊維であることが好ましい。前記ポリマー繊維は溶融紡糸により製造されるのが好ましい。前記ポリマー繊維は、単一成分又は２成分、３成分又はそれより多い多成分繊維であってもよい。次に、前記ポリマー繊維は、「メルトブロー(ment blowing)」法又は「スパンボンド(spun bonding)」法により、分散性が高く、また間隔がランダムなポリマー繊維の網状組織へと結合できる。次いで、前記網状組織を、熱風又は蒸気などの熱源により所望の形状又は構造に熱的に結合できる。
【００２８】
種々の共有する従来技術特許は、それを介して流体混合物通過のための蛇行性通路を規定する３次元の実質的に自己維持性基材を形成するために好ましい加工法と装置を明確に示し、記載しており、該基材はそれらの接触点で結合された間隙がランダムなポリマー繊維の網状組織を含む。例えば、参照として米国特許第５，５０９，４３０号、１９９０年４月２３日に発行、及び米国特許第６，０２６，８１９号、２０００年２月２２日に発行されており、それら各々の開示の全体は、本明細書中に組み込まれている。これらの特許は、本発明による基礎的基材又は未処理基材の製造に関する好ましい工程であるメルトブローの２成分繊維からこのような基材を製造することを開示している。
【００２９】
２０００年８月１５日に発行の米国特許第６，１０３，１８１号（‘１８１号特許）が特に興味深く、その開示はまた、その全体が本明細書中に組み込まれており、ここで化学物質及び生体物質を分析する媒体を形成するために、本発明に従って混合ポリマー繊維のウェブを製造でき、処理すべき自己維持性の３次元基材に蒸気結合できる。‘１８１号特許の方法及び装置は、混合ポリマー繊維の均一ウェブを形成でき、そのいくつかの表面は、ポリマー繊維をそれらの接触点で互いに結合する働きをする異なるポリマー繊維により誘導又は修飾できる。前記ポリマー繊維は、その鞘を誘導又は修飾でき、その芯は、結合性ポリマー繊維と同一か、又は異なる比較的安価な支持体材料である２成分ポリマー繊維であってよい。
【００３０】
‘１８１特許の技術を用いて、更に、両繊維の芯は同じで、鞘は各々混合物中の異なる物質を結するために誘導又は修飾される異なるポリマー材料である、混合された２成分ポリマー繊維の均一性ウェブを製造することが可能である。従って、ポリマー繊維の鞘は、それらが安定な多孔性基材と接触した場合に、共にポリマー繊維と結合し、また、混合物中の少なくとも１つの物質と特別の結合をする両方の働きをすることができる。
【００３１】
前述の特許は、本発明による化学物質及び生体物質を分析するために自己保持性基材又は媒体の網状組織を形成するための、好ましい方法と装置を提供するが、他のよく知られた加工技術も利用でき、当業者により本発明の媒体の製造に容易に適合できる。
【００３２】
本発明のポリマー繊維は、熱可塑性ポリマー類を含むことが好ましい。好適なポリマー類としては、炭化水素樹脂、ポリアミド類、ポリエチレン、塩化ポリビニル、及びポリエステル類が挙げられ、又は、エチレン、プロピレン、エチレンメタクリル酸、エチレンアクリル酸、エチレン−酢酸ビニル、エチレンアクリル酸メチル、ポリスチレン、ナイロン６、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレートのコポリマーなどのコポリマー類及びそれらの誘導体であり得る。好ましい実施形態において、前記熱可塑性ポリマーは、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））親水性ナイロンなどのポリカプロラクタムとポリエチレンオキシドジアミンとのブロックコポリマー、又はニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））などのエチレンとメタクリル酸とのコポリマー、又はそれらの組合せである。他の好適なポリマー類としては、サーリン（Ｓｕｒｌｙｎ（登録商標））（ＤｕＰｏｎｔ）及びカチオン性ジポリエステル類が挙げられる。
【００３３】
好ましい実施形態において、前記媒体は、ナイロン６、ポリエチレンオキシドジアミン、エチレンメタクリル酸及びそれらの組合せよりなる群から選択されるコポリマーの少なくとも１つの面を有する複数のポリマー繊維を含む繊維質媒体である。ポリマー繊維は、一端から他端まで相互に連絡する通路を形成するために接触点で結合できる。例えば、複数のポリマー繊維を、任意の従来法において紡糸口金から連続移動面に押出して、カレンダーにかけてポリマー繊維を互いに結合させて絡み合った繊維塊を形成し、多孔性シート又はパッドを形成する。他に、混合物が通過するための蛇行性通路を定める３次元多孔性媒体内の接触点で結合しているポリマー繊維塊内へ、結合剤を任意の従来法により組み込むことができる。
【００３４】
本発明の媒体は、複数のポリマー類を含むことができる。例えば、前記媒体は、１種以上のポリマーを含むポリマー繊維を含むことができるか、又は前記媒体は、異なるポリマー類を有する少なくとも２種のポリマー繊維を含むことができる。複数のポリマー類を含む本発明の媒体は、任意の従来法により製造できる。例えば、第１のポリマーを含む少なくとも１つのポリマー繊維を、第２のポリマーを含む少なくとも１つのポリマー繊維と共に棒状形に寄せ集め、連続的蒸気処理ゾーン及び冷却ゾーンを通過させて、第１のポリマーの少なくとも一部及び第２のポリマーの少なくとも一部を有する連続３次元繊維質媒体を形成できる。ポリマー繊維は、任意の従来法により形成された２成分ポリマー繊維であり得る。例えば、前記２成分ポリマー繊維は、第１のポリマーの鞘及び第２のポリマーの芯を含むことができる。少なくとも２種の異なるポリマーを含む媒体は、第１のポリマーを含むポリマー繊維を第２のポリマーを含む結合剤繊維と結合させることにより形成できる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、前記媒体は、複数の結合親和性、結合特異性又はそれらの組合せを有するように機能的にし、次いで混合物中の複数の物質を分析するために使用できる異なるポリマー類の混合物を含む。例えば、混合物を有する媒体は、１種のポリマーを含む少なくとも１つのポリマー繊維及び異なるポリマーを含む他のポリマー繊維を含むことができる。他に、誘導溶球を、ポリマー繊維の網状組織に付加、固定化、又はそれと組合せて、ポリマー繊維と溶球の混合物である媒体を提供できる。もちろん、ポリマー繊維はある１種類のポリマーを含み、溶球は異なる種類のポリマーを含んでもよい。
【００３６】
ポリマー繊維又は複数のポリマー繊維を含む媒体を、ハウジングに挿入できる連続３次元形状に形成でき、それを介して混合物の通過のために蛇行性通路が提供される。前記３次元形状は自己支持的形態をとることができる。本発明の媒体は、任意の所望の形状に形成できることを特筆する必要がある。例えば、ポリマー繊維又は網状組織を、精製法及び分離法の使用のためにカラムに挿入できる円柱状に形成できる。前記媒体を、ミクロ遠心管又はアッセイプレートのウェルに挿入できるディスク状に形成できる。前記媒体を、皮下注射針の液溜に挿入できる形状に形成できる。前記媒体を、シート状及び規則的又は不規則的な横断面の結合繊維形状に形成できる。明らかに本発明の媒体が形成できる種々の形状は、無数にある。
【００３７】
本発明の媒体は、混合物に網状組織を通過させるか、又は混合物を誘導ポリマー繊維と接触させることによって、混合物中の少なくとも１つの物質を分析するために使用できる。本発明の媒体は、物理的捕促、イオン結合、共有結合、特別の結合又はそれらの組合せによって、物質を単離、分離、精製、又はそれらの組合せを行う。媒体によって結合又は捕捉された物質は、使用される誘導ポリマー繊維の物理化学的特性に基づいた物理的特性、化学的特性又はその双方を測定することにより分析できる。前記物質は、免疫アッセイ法及びＨＰＬＣなどの当業界における従来法により更に分析できる。
【００３８】
前記物質の誘導ポリマー繊維に対する結合は、可逆的又は不可逆的であってもよい。イオン結合性物質は、希酸又は無機塩により網状組織の相互作用部位から容易に遊離できる。例えば、希酸溶液は、網状組織から得られた物質を溶出するために使用できる。更に、前記物質は、アルカリ金属の炭酸塩又は水酸化物によって遊離し得る。このように、混合物又は物質ならびに混入物を含む溶液を本発明の誘導媒体と接触させることにより、物質を、混入物などの他の物質から単離、分離又は精製できる。誘導網状組織に結合した物質又は混入物は、当業界に知られた従来の溶出法と同様の様式で溶出できる。
【００３９】
明らかに、本発明の媒体は、きわめて多目的に使用でき、物質を単離、検出、分析、分離、精製又はそれらの組合せのための種々の適用に使用できる。このような適用の少数の例としては、尿、血液及び他の体液などのサンプルを試験するための比色アッセイ又はディップスティックアッセイなどの診断、ウィルス検出、核酸検出及び精製、及び分析化学製剤及びクロマトグラフィーが挙げられる。例えば、米国特許第５，６５６，４４８号及び米国特許第５，６６７，９７６号を参照されたく、双方ともそれらの全体が、参照により本明細書に組み込まれている。
【００４０】
以下の実施例は例示であって、本発明を限定する意図はない。
【実施例１】
【００４１】
＜ポリマー繊維及びその網状組織を作製する方法＞
Ａ．ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））：表面上にカルボキシル基を有する２成分ポリマー繊維
エチレンとメタクリル酸とのコポリマーの鞘及びポリプロピレンの芯を含む２成分ポリマー繊維を、従来法によって溶融紡糸した。鞘ポリマーは、約１０重量％のメタクリル酸モノマーを含み、商標ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））でＤｕＰｏｎｔから商品として入手できる。未延伸撚り糸は、約４０重量％の鞘を含む８デニールの単繊維より作製した。
【００４２】
多重撚り糸トウを作製するために、前記撚り糸を３５０パーセント延伸し、ひだを作りかさばらせた。次に、このかさばらせたトウを、間隔がランダムな配置を形成するために高圧気流交絡法により絡ませる。次いで、前記トウを、ダイ内で低圧蒸気により急速加熱してから、冷却ダイに導き、高度に多孔性の結合３次元構造を成形する。
【００４３】
Ｂ．ヒドロフィル（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌ（登録商標））：表面上にアミン基を有する２成分ポリマー繊維
親水性ナイロンの約４０重量％の鞘及びポリエチレンテレフタレートの約６０重量％の芯を含む２成分ポリマー撚り糸を、従来法によって溶融紡糸した。前記親水性ナイロンは、ポリカプロラクタムとポリエチレンオキシドジアミンとのブロックコポリマーである商標カプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））で、Ａｌｌｉｅｄ−Ｓｉｇｎａｌ（現Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ又はＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）から商品として入手できる。多重撚り糸トウを作製するために、前記撚り糸を３００パーセント延伸し、ひだを作りかさばらせた。このかさばらせたトウを、間隔がランダムな配置を形成するために、高圧気流交絡法により絡ませる。次に、この撚り糸を４５０°Ｆと５００°Ｆとの間でエアオーブン中、約１０秒未満の時間だけ加熱し、加熱成形ダイに導き、高度に多孔性の結合３次元構造を成形し、次に空気冷却した。
【実施例２】
【００４４】
＜ポリマー繊維の官能基密度＞
本発明のポリマー繊維の官能基密度、カルボキシル基又はアミン基の量は、当業界の従来法に従ってアッセイできる。具体的には、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））ポリマー繊維又はカプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））ＳＪＥＳ親水性ナイロン繊維の表面活性を以下のとおり決定できる。以下の実施例において、ＰＢＳは、以下の処方により作製されるリン酸緩衝液である。すなわち、１３７ｍＭ塩化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ、ペンシルバニア州ピッツバーグ所在）と、２．７ｍＭ塩化カリウム（Ｆｉｓｈｅｒ、ペンシルバニア州ピッツバーグ所在）と、１０ｍＭ、７．４ｐＨ、ドイツ国ダームシュタット、ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｍｅｒｃｋにより供給されるリン酸緩衝液との脱イオン水溶液である。ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））繊維及びナイロン（カプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））ＳＪＥＳ親水性ナイロン／ＰＥＴ）繊維の、１０ｍｇ、５０ｍｇ及び１００ｍｇの３つのサンプルは、２ｍｌ脱イオンＨ2Ｏ／１０ｍｇ繊維、２ｍｌイソプロパノール／１０ｍｇ繊維、及び、１Ｍ  ＮａＯＨ  ２ｍｌ／ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））繊維１０ｍｇ、又は４Ｍ  ＨＣｌ  ２ｍｌ／カプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））ＳＪＥＳ親水性ナイロン繊維１０ｍｇによる連続洗浄により前処理された。次に、前記繊維を２ｍｌ脱イオンＨ2Ｏ／１０ｍｇ繊維で４回洗浄し、次いで、２ｍｌＰＢＳ／１０ｍｇ繊維で１回洗浄した。次に、繊維を室温で約３０分から６０分ＰＢＳに浸した。繊維を２ｍｌＰＢＳ／１０ｍｇ繊維で３回洗浄した。
【００４５】
ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））繊維上のカルボキシル基の表面活性は、滴定により約０．００７μｅｑ／ｃｍ2から約０．０３μｅｑ／ｃｍ2であると決定され、ナイロン繊維上のアミン基の表面活性は、ニンヒドリンアッセイ及び滴定により約０．００１μｅｑ／ｃｍ2から約０．０２μｅｑ／ｃｍ2であると決定された。
【００４６】
ニンヒドリンアッセイによりポリマー繊維の表面活性を決定するには、以下のプロトコルに従った。ニンヒドリン溶液Ａは、１０ｍｌエタノール中、４０ｇの結晶フェノール（Ｆｉｓｈｅｒ、ペンシルバニア州ピッツバーグ所在）を含むフェノール溶液を作製し、次いで、６５ｍｇＫＣＮ（Ｆｉｓｈｅｒ、ペンシルバニア州ピッツバーグ所在）を１００ｍｌ  ｄＨ２Ｏに溶解することにより調整し、２ｍｌのＫＣＮ溶液をピリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ、ウィスコンシン州ミルウォーキー所在）により１００ｍｌまで希釈することにより希釈ＫＣＮ液を調整した。次いで、フェノール溶液を希釈ＫＣＮ液に加えてニンヒドリンＡ溶液を得た。ニンヒドリンＢ溶液は、２．５ｇのニンヒドリン（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を５０ｍｌエタノール中に溶解することにより調整した。ニンヒドリンの検量線を作成し、６−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在）に関してプロットした。試験すべきポリマー繊維の１０ｍｇ、５０ｍｇ及び１００ｍｇサンプルを、上記のとおり前処理した。次いで、１００μｌのニンヒドリンＡ溶液及び２５μｌのニンヒドリンＢ溶液を加えてから、１００℃で１０分間インキュベートした。次いで、７７５μｌの５０％エタノールを加えた。サンプルを、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清液の吸光度を、ＵＶ分光光度計により５５０ｎｍで読んだ。次に、未知サンプルの活性を検量線から推測した。
【００４７】
更に、ナイロン（カプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））ＳＪＥＳ親水性ナイロン／ＰＥＴ）媒体及びニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体上でのニンヒドリン及び３Ｈ−無水酢酸のアッセイを、ナイロン（カプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））ＳＪＥＳ親水性ナイロン／ＰＥＴ）繊維及びニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））繊維の表面上のアミン基密度及びカルボキシル基密度を決定するために実施した。
【００４８】
Ａ．ニンヒドリンアッセイ
ナイロン（カプロンＳＪＥＳ親水性ナイロン／ＰＥＴ）又はニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））（Ｎｕｃｒｅｌ  ５３５／ＰＰ）繊維を含む本発明の媒体を、以下のように前処理した。約５０ｍｇの前記媒体を、１ｍｌの水及び１ｍｌのイソプロパノール中で洗浄した。カプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体を１ｍｌの４Ｎ  ＨＣｌでリンスし、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体を１ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨでリンスした。次に、前記媒体を１ｍｌの水で４回、１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。前処理中、ＨＣｌで処理されると対照サンプル、ナイロン６は溶解するので、ＨＣｌステップなしに前処理された他の対照サンプルを用いた。サンプル、Ｎｙｎ−Ｄ２８９５及び２８９６は安定であり、完全な前処理がなされた。
【００４９】
全サンプルは、５０ｍｇ量で３回繰り返しアッセイした。前述のように、ナノモルの遊離アミノ基を、標品として６−アミノヘキサン酸を用いて検量線と比較することにより定量した。この結果は表１に要約する。
【００５０】
【表１】
2005525534.tif 000002
【００５１】
このように、Ｎｙｎ  Ｄ２８９５及び２８９６に関する結果は、以前に得られた結果と同様であり、ＮＹＮ６の結果は約２０倍高い。
Ｂ．３Ｈ−無水酢酸アッセイ
このアッセイのために、未希釈の無水酢酸を、９０μＣｉ／μｍｏｌの特定の放射活性を有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ミズーリ州セントルイス）から得た。それを未希釈の無水酢酸で１：１００に希釈して、０．９μＣｉ／μｍｏｌの特定の放射活性（１．９８ｅ６ＤＰＭ／μｍｏｌ又は２．２ｅ７ＤＰＭ／μｌ）を有する１０．６Ｍの作業溶液を生成した。前記サンプルを前述のように前処理した。反応には、１０μｌの無水酢酸作業溶液を、５００μｌの水に希釈し、次いで５０ｍｇの前処理サンプルに加えた。混合物を、緩やかに連続振とうしながら室温で２時間インキュベートした。反応液を除去し、サンプルを１ｍｌＰＢＳによりスピン装置内で３回洗浄し、次いで、１ｍｌの水で３回洗浄した。全ての洗浄液及びサンプルをカウントした。各タイプ５０ｍｇのサンプルを用いて２回の反応を行った。
【００５２】
次いで特定の放射活性及びシンチレーションカウンタの３Ｈカウント効率（０．５１ＣＰＭ／ＤＰＭ）と関連して検出された放射活性から取り込まれたミクロモルを計算した。この結果を表２に要約する。
【００５３】
【表２】
2005525534.tif 000003
【００５４】
このように、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は、ナイロン（カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン／ＰＥＴ）媒体よりも、１ｍｇサンプル当り約１４０ｍｍｏｌの置換レベルで１００倍以上の反応性があると思われる。
アッセイを、新しいサンプルで繰り返した。この結果を表３に要約する。
【００５５】
【表３】
2005525534.tif 000004
【００５６】
上記に示されたように、無水酢酸による結果（表３）は、以前に得られた結果（表２）と同様である。対照は予想された結果を供し、サンプルの約１％の濃度で反応した。
アミド類を形成するためにアミン類と反応させることに加えて、エステル類を形成するために無水物をアルコール類と反応させることができる。エステル形成の可能性を試験するために、サンプルを２回、無水酢酸と反応させ、前述のように洗浄した。次に誘導化サンプルのうちの１つを、５００μｌの１Ｍ  ＮａＯＨにより室温で、１時間処理した。次にサンプルを１ｍｌの水で３回洗浄してから、全洗浄液及びサンプルをカウントした。結果を表４に示す。各サンプル対に関して、１番サンプルは誘導化されただけであり、２番サンプルは誘導化とＮａＯＨ処理を行った。
【００５７】
【表４】
2005525534.tif 000005
【００５８】
上記に示されたように、置換レベルは、以前に得られたものと同様であり、やはりカプロンＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体よりも、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体に１００倍以上取り込まれた。両サンプルに関して、カウントの約１／３がＮａＯＨ処理により遊離したが、その差は洗浄液に原因があると説明できた。残りの２／３は、塩基性加水分解に対する抵抗性により安定に結合していると思われる。
【実施例３】
【００５９】
＜相互作用部位又は官能基の誘導又は官能基化＞
本発明のポリマー繊維は、酵素又は抗原などの特定の化合物と結合する架橋剤と反応できる好適な表面濃度で、アミン基、カルボキシル基又は双方を有し、これが次に所与の化学物質又は生体物質と特別の結合をする。当業界の従来法を用いて、本法を、本発明の誘導ポリマー繊維を創作するために使用できる。誘導又は官能化ポリマー繊維は、所与の化学物質又は生体物質の検出、測定又はその双方を可能にすることが好ましい。
【００６０】
例えば、当業界の従来法を用いて、ポリマー繊維、又は約０．００１μｅｑ／ｃｍ2から約０．０２μｅｑ／ｃｍ2までの量で表面上に活性アミン基を有する親水性ナイロン鞘を含む少なくとも１つのポリマー繊維の３次元網状組織は、少なくとも１つのビオチン化末端及び第一級アミン類と反応する少なくとも１つの反応性末端を有する架橋剤と反応する。好適な架橋剤の例は、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（ＥＺ−リンク）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在）である。ＥＺ−リンクは、第一級アミン類と反応性があるので、触媒を必要としない。架橋剤は、ビオチン化末端と反応性末端との間のジスルフィドリンカーを更に含み、このジスルフィドリンカーは、少なくとも１つの還元剤により開裂できる。
【００６１】
この架橋反応後、ポリマー繊維を洗浄し、ポリマー繊維に架橋されたビオチン部分と結合するストレプアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在）と共にインキュベートする。ポリマー繊維を洗浄し、ジスルフィドリンカーを還元剤により開裂する。ビオチン−ストレプアビジン−ホスファターゼ複合体をアッセイし、その値を検量線と比較する。ＰＮＰＰなどの好適な基材、アルカリホスファターゼ基材（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在）を使用できる。ＰＮＰＰは、４０５ｎｍで検出できる黄色を呈する。具体的に、架橋反応及び検出は、架橋剤と共に含まれる製造元の取扱い説明書に従って実施する。ポリマー繊維の重量を計り、ｐＨが約７から約９を有する好適な緩衝液に入れる。架橋反応を実施する。次にポリマー繊維を、脱イオンＨ２Ｏで洗浄してから、ストレプアビジン−アルカリホスファターゼと共に中性ｐＨで約１５分から約３０分間インキュベートし、複合化ポリマー繊維を得る。次に複合化ポリマー繊維を脱イオンＨ２Ｏで洗浄して、ビオチン−ストレプアビジン−ホスファターゼを約５ｍＭから約１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在）で開裂する。上清液を採取し、基材、ＰＮＰＰを加える。回収したビオチン−ストレプアビジン−アルカリホスファターゼ−ＰＮＰＰ部分を４０５ｎｍで比色定量し、未反応のストレプアビジン−アルカリホスファターゼを用いて作成した検量線と比較する。使用済みの洗浄液をアルカリホスファターゼに関してアッセイして、非共有結合物質が繊維から除去されたかどうかを決定する。
【００６２】
さらなる対照を実施でき、ポリマー繊維に共役したビオチン−ストレプアビジン−アルカリホスファターゼを直接検出でき、ＤＴＴがアルカリホスファターゼに影響を与える可能性が存在するので、架橋剤を開裂することなく定量できる。
【００６３】
スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）（ＢＳ３）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在）などの他の架橋剤は、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）親水性ナイロンなどのポリマー繊維の両末端上の第一級アミン類と反応する。第１に、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン繊維は、２ｍｌ脱イオンＨ２Ｏ／１０ｍｇ繊維、２ｍｌイソプロパノール／１０ｍｇ繊維、及び２ｍｌ  ０．１Ｍ  ＨＣｌ／１０ｍｇ繊維を用いた連続洗浄により前処理する。次に、前記繊維を２ｍｌ脱イオンＨ２Ｏ／１０ｍｇ繊維により４回洗浄、次いで、２ｍｌＰＢＳ／１０ｍｇ繊維で１回洗浄した。次いで、前記繊維をＰＢＳ中に、室温で約３０分から約６０分間浸漬する。前記繊維を２ｍｌＰＢＳ／１０ｍｇ繊維で３回洗浄した。次に、ＢＳ３を、ポリマー繊維の繊維表面及び抗原又は酵素などの他の化合物又は当業界の従来法による標識と反応させるために使用する。所与の物質の免疫検出は、従来法又はイムノピュア（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標））ＤＡＢ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在）などの当業界のキットを用いて実施できる。
【００６４】
ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））などのカルボキシル基を有するポリマー繊維は、上記に提供された同様の様式で誘導できる。具体的には、前記繊維を２ｍｌ脱イオンＨ２Ｏ／１０ｍｇ繊維、２ｍｌイソプロパノール／１０ｍｇ繊維、及び２ｍｌ  ０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＨ／１０ｍｇ繊維による連続洗浄により前処理する。次いで、前記繊維を２ｍｌ脱イオンＨ２Ｏ／１０ｍｇ繊維により４回洗浄、次いで２ｍｌＰＢＳ／１０ｍｇ繊維で１回洗浄した。次いで前記繊維をＰＢＳ中に、室温で約３０分から約６０分間浸漬する。前記繊維は２ｍｌＰＢＳ／１０ｍｇ繊維で３回洗浄した。次に塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在）などの架橋剤を、当業界の従来法により蛋白質をポリマー繊維に複合化するために使用できる。検出は、免疫検出などの当業界の従来法を用いることにより実施できる。
【００６５】
誘導化又は官能基化ポリマー繊維の表面活性は、実施例２に従って分析できる。
【実施例４】
【００６６】
＜ポリマー繊維の官能基密度＞
以下の実験は、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン鞘／ＰＥＴ芯繊維（アミン繊維）及びニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））鞘／ＰＰ芯繊維（カルボン酸繊維）上で実施し、本発明の繊維の官能基密度を決定した。
【００６７】
次の実験において、以下の試薬を用いた：
・ＮＨＳ−ビオチン；ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン；２１３３１番、Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在、
・ＰＥＯ−ビオチン；ＥＺ−リンクビオチンＰＥＯ−アミン；２１３４６番、Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在、
・ＥＤＣ又はＥＤＡＣ；塩酸１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド；Ｄ−１７６９番、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在、
・ＤＴＴ；ジチオトレイトール；Ｄ−９１６３番、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在
・ＤＴＮＢ；５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在。
【００６８】
１．カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン
親水性ナイロンカプロン（Ｃａｐｒｏｎ（登録商標））は、ナイロン６（約８０％）とポリ（エチレングリコール）（約２０％）とのコポリマーである：
【００６９】
【化１】
2005525534.tif 000006
【００７０】
本発明のカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン繊維の表面上のアミン基密度を、上記に提供されたニンヒドリン第一級アミン測定及びトリチウム化（3Ｈ）無水酢酸測定によりアッセイした。両方法とも、０．６ｎｍｏｌ／ｍｇから１．２ｎｍｏｌ／ｍｇの間、又は１５０ｎｍｏｌ／ｃｍ３から４００ｎｍｏｌ／ｃｍ3との間の同様の結果を得た。この結果は、未結合カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン繊維に対する酸／塩基滴定により確認され、２ｎｍｏｌ／ｍｇの活性を示した。
本発明のカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン繊維表面上のカルボキシル基量を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）及びＮ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド（ＮＨＳ）により媒介される２ステップ反応でカルボキシル基上に縮合される14Ｃ−メチルアミンを用いて決定された。
【００７１】
販売元（ＩＣＮ、カリフォルニア州アーバイン所在）により供給される原型物質は、５０μＣｉ／ｕｍｏｌの特定の放射活性を有するメチルアミンの溶液であった。アッセイ前に、フィルタを、結合実験で用いられた一連の同一洗浄（水、イソプロパノール、ＨＣｌ又はＮａＯＨ、水、そしてＰＢＳ）により予め活性化した。要約すると、８０ｍｇのＥＤＡＣ固体及び８０ｍｇのＮＨＳを４ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ４．５に溶解した。２ｍｌのＥＤＡＣ／ＮＨＳ溶液を各フィルタに加え、次いで室温で２時間インキュベートして活性化エステルを形成した。前記フィルタを２ｍｌのＰＢＳで４回洗浄してから、排水した。前記メチルアミンを５μｌの（０．５μＣｉ＝１０ｎｍｏｌ＝１．１ｅ６ＤＰＭ）１４ＣＨ３ＮＨ２を９５μｌの水に加えることにより希釈した。１００μｌの希釈メチルアミンを４００μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２に加え、次いで５００μｌの緩衝液をフィルタに加えた。室温で３０分後、反応液を取り、次にフィルタを１ｍｌＰＢＳで３回洗浄し、次いで１ｍｌの水で３回洗浄した。全洗浄液とフィルタをカウントした。
【００７２】
次に、取り込まれたピコモルは、特定の放射活性及びシンチレーションカウンタの１４Ｃカウント効率（０．７３ＣＰＭ／ＤＰＭ）と関連して、検出されたＣＰＭから計算した。カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン繊維は、１ｐｍｏｌ／ｍｇのカルボキシル基を含むことが判明した。
【００７３】
２．ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））
ニュクレルは、構造：
【００７４】
【化２】
2005525534.tif 000007
【００７５】
（式中、濃度はｘ＝約０．９及びｙ＝約０．１である）のエチレン／メタクリル酸コポリマーである。
本発明のニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））繊維表面上のカルボキシル基量は、上記に供された酸／塩基滴定を用いて決定した。ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））繊維は、７．３ｎｍｏｌ／ｍｇ（又は２０００ｎｍｏｌ／ｃｍ３）のカルボン酸表面密度を有した。
【００７６】
更に、上記の１４Ｃ−メチルアミンアッセイを、本発明のニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））繊維のカルボン酸表面密度を決定するために実施した。カルボキシル基の観察できる量は、ベースラインの上に見出されなかった。上記のトリチウム化（３Ｈ）無水酢酸測定法を用いて、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））繊維が、無水酢酸に対して優れた反応性を有することが判明した。この結果を表５に示す。
【００７７】
【表５】
2005525534.tif 000008
【００７８】
このように上記に測定されたとおり、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロンのアミン基密度は、約１ｎｍｏｌ／ｍｇ又は４００ｎｍｏｌ／ｃｍ3であり、またカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロンのカルボン酸基密度は、約１ｐｍｏｌ／ｍｇ又は４００ｐｍｏｌ／ｃｍ3であった。ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））のカルボン酸基密度は、約７ｎｍｏｌ／ｍｇ又は２０００ｎｍｏｌ／ｃｍ3であった。14Ｃ−標識メチルアミン試験の負の結果にもかかわらず、該繊維のカルボキシル基蜜度が、下記のＰＥＯ−ビオチンアッセイにより示される優れた特別の結合により本発明のポリマー繊維上に確認されたことを特筆することは重要である。
アミン基及びカルボキシル基の双方が表面上に存在するカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロンの結果は、ナイロン−６の成分が分解し易く、アミン基及びカルボキシル双方の末端基を形成することと一致する。ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））の結果もまた、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））の構造と一致する。さらなる実験において、ナイロン−６は、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロンよりも約２０倍高い、同様の官能性（約８ｎｍｏｌ／ｍｇ）を有することが判明した。
【００７９】
ナイロン−６の活性は、分解の結果であると思われるので、本発明の繊維を、非特別の結合が最少になるように更に誘導できる。例えば、スルホン酸基で置換されているポリスチレン鞘を使用できる。又は、アミン基をアンモニアを用いたプラズマ重合によりポリエチレン鞘の表面に配置することができる。当業界に知られた他の方法を使用できる。
【実施例５】
【００８０】
＜ポリマー繊維のビオチン化＞
本発明の繊維の特別の結合及びビオチン化量を決定するために、以下の実験を実施した。次の実験において、以下の試薬が使用された：
・ＮＨＳ−ビオチン；ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン；２１３３１番、Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在、
・ＰＥＯ−ビオチン；ＥＺ−リンクビオチンＰＥＯ−アミン；２１３４６番、Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード所在、
・ＥＤＣ又はＥＤＡＣ；塩酸１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド；Ｄ−１７６９番、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在、
・ＤＴＴ；ジチオトレイトール；Ｄ−９１６３番、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在
・ＤＴＮＢ；５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス所在。
【００８１】
１．前処理（湿潤）及び活性化
ナイロン（カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン／ＰＥＴ）又はニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標）５３５／ＰＰ）繊維を含む本発明の媒体は、以下のとおり前処理された：約５０ｍｇの媒体を１ｍＬの水と１ｍｌのイソプロパノールとで洗浄した。ナイロン媒体は、１ｍｌの４Ｎ  ＨＣｌでリンスし、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は、１ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨでリンスした、次に前記媒体を１ｍｌの水で４回、１ｍｌＰＢＳで２回洗浄した。
【００８２】
２．ＮＨＳ−ビオチンによる修飾
（試験１）
１０ｍＭ溶液のスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（１ｍｌＰＢＳ、０．５ｍｌビオチン）の５００μｌを、ビオチン化のために指定された各媒体サンプルに加えた。該反応を氷上で２時間進行させた。次にサンプルを１ｍｌＰＢＳで３回洗浄してから、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用い室温で３０分間阻止した。再度、サンプルを１ｍｌＰＢＳで３回洗浄した。１μｌＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：１０００希釈）を各サンプルに加え、室温で３０分間反応させた。前記サンプルを１ｍｌＰＢＳで６回洗浄してから、５００μｌＴＭＢ基材を加えた。約１５秒後、反応を停止させるために、反応させた基材を、等しい容量（５００μｌ）の１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を含む管に移した。次に停止溶液を１：１０に希釈し、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【００８３】
ＮＨＳ−ビオチンは、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体ではなく、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体に特別のに結合することが予想された。表６に示されるように、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は特別の結合を示さない。カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体は、ＢＳＡで前処理（遮蔽）されると、ある程度の特別の結合を示すが、全ての場合でバックグランドが高かった。
【００８４】
【表６】
2005525534.tif 000009
【００８５】
（試験２）
ビオチン化のバックグランドレベルを減少させるために、以下のことを実施した。この目的のために、実験は陰性対照のみと共に行われた。遮蔽のために使用されるＢＳＡの濃度を５ｍｇ／ｍｌに増加し、次いで１０ｍｇ／ｍｌに増加した。ＨＲＰ−ストレプトアビジンを更に希釈（１：２０００希釈）し、１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡで遮蔽されたフィルタ上で用いた。ストレプトアビジン反応と基材添加との間の洗浄ステップは、サンプルフィルタを円筒内に置いた、５ｍｌシリンジを用いることにより１５ｍｌに増加した。ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体については、結合のバックグランドレベルは、５ｍｇ／ｍｌ及び１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ遮蔽ステップの双方により、それぞれ０．１８８及び０．２２２に減少した。カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体については、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ遮蔽ステップのみがバックグランドを０．１５１に減じた（５ｍｇ／ｍｌ後、吸光度はまだ０．６９１であった）。
【００８６】
上記のこの実験は、上記の変更を組み込んで繰り返し、また、ビオチン化ステップを、氷上２時間の代わりに、室温で３０分間インキュベートした。１０ｍｇ／ｍｌ濃度でのＢＳＡを遮蔽のために用いた。ＤＴＴ処理に指定されたサンプルを、５０ｍＭ  ＤＴＴと共に室温で３０分間インキュベートした。ＨＲＰ−ストレプトアビジンを更に希釈（１：５０００希釈）し、５分未満サンプルと接触し続けた。前記媒体をシリンジ内で洗浄してから、洗浄媒体を清浄な管に入れ、ＴＭＢ基材を加えた。基材反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。これらのサンプルは、吸光度を測定する前に希釈しなかった。
【００８７】
表３に示すように、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は、サンプル間の反応性に有意差を示さなかった。また、ＤＴＴでの処理により、反応性を減少させるよりもむしろ増加させた。カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体については、バックグランドは、特に前処理をしないものにおいて有意に減少した。それにもかかわらず、これらの条件下でＮＨＳ−ビオチンの特別の結合は生じなかった。表７に示されるように、全体的なＮＨＳ−ビオチンの結果は、ストレプアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼは、試験条件下でニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体に特別のに結合しないことを示した。カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体については、特別の結合の兆候が、試験１に使用された条件下で観察されたが、バックグランドはかなり高かった。この場合、この程度の特別の結合を達成するためにはＢＳＡによる遮蔽が必要である。
【００８８】
【表７】
2005525534.tif 000010
【００８９】
（試験３）
次に、サンプルをＰＥＯ−ビオチンにより修飾した。具体的には、サンプルを上記のとおり前処理した（又は前処理しなかった）。ビオチン化反応は、ＰＥＯ−ビオチンを用いて行った。サンプルを０．５ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．５に入れた。ＰＥＯ−ビオチンの５０ｍＭストック溶液を調整し、２５ｍｌを処理に指定されたサンプルに加えた。ＥＤＣを、０．１Ｍ  ＭＥＳ、ｐＨ５．５中に、１ｍｇ／ｍｌで溶解した；６．２５ｍｌを指定されたサンプルに加えた。反応液を室温で２時間インキュベートした。ビオチン化後のステップは、基材の添加以外、以前に実施されたものと本質的に同一であった。ＴＭＢを、ｄＨ２Ｏ中に希釈し、各サンプル上にちょうど２分間おいた。この溶液を等しい容量の１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４に取り、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００９０】
表８のデータは、ＰＥＯ−ビオチンによるニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体のビオチン化は、ＢＳＡ前処理ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））サンプルに特別のであったが、前処理なしのサンプルには特別のでなかったことを示している。このデータはまた、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体では、ＢＳＡにより前処理（遮蔽）された場合ＰＥＯ−ビオチンを用いて、ある程度の特別の結合があることを示している。
【００９１】
【表８】
2005525534.tif 000011
【００９２】
（試験４）
高バックグランド結合の問題を更に扱うために、使用するサンプル量を５ｍｇに減じた。小スケール実験において、５ｍｇのニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））サンプルを前処理せず、又はビオチンと反応させた。少量のサンプルをＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：５０００）と反応させ、シリンジ内で洗浄し、ＴＭＢ（ｄ−Ｈ2Ｏ中１：５）とちょうど２分間反応させた。０．３４３の測定吸光度は、５０ｍｇのサンプル（０．４８３）よりも有意に低くなかった。
【００９３】
（試験５）
試験２に記載されたＮＨＳ−ビオチン化実験を、ＰＢＳ中で繰り返したが、最終反応は、希釈基材（ＴＭＢ、１：５）との時間を決めた（２分）インキュベートであった。本実験の他の全てのパラメータは、上記試験２に記載されたものと本質的に同じであった。
【００９４】
試験５の条件下で、前処理なしのビオチン化ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は、ほんのわずかにバックグランド以上の活性を示したが、ＤＴＴ処理は反応性を低下させたが、差は有意ではない。前処理によるビオチン化ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は、対照の約２倍の反応性を示したが、ＤＴＴ処理は、またバックグランドレベルまで反応性を低下させた。このように、シグナル対ノイズ比が高くはないが、これらの条件下で前処理ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体に対するＮＨＳ−ビオチンの特別の結合のいくらかの兆候がある。
【００９５】
表９に示したように、前処理なしのビオチン化カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体は、対照の約２倍の反応性を示したが、ＤＴＴ処理は、バックグランド濃度以下に反応性を低下させた。このように、シグナル対ノイズ比は高くはないが、これらの条件下で前処理なしのカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体に対するＮＨＳ−ビオチンの特別の結合のいくらかの兆候がある。
【００９６】
しかしながら、前処理カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体のビオチン化は、矛盾する結果を示した。ビオチン化サンプルの反応性は、バックグランド対照よりも低く、ＤＴＴ処理はそれを更に低下させた。これは、これらの条件下での非特別の結合を示している。
【００９７】
【表９】
2005525534.tif 000012
【００９８】
（試験６）
試験５のＮＨＳ−ビオチン化実験を、ナイロンを用いてｐＨ８．５で繰り返した。全ての反応ステップは、ＰＢＳの代わりに５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．５を用いたこと以外、以前に記載されたものと同じであった。希釈基材との時間を決めたインキュベートもまた用いた。
【００９９】
表１０に示されるように、前処理の有り無しのサンプルともバックグランドは著しく高かった。ビオチン化は、明らかに（しかし、恐らく人工的に）反応性を減じる効果を有していた。ゆえに、ｐＨ８．５でのカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロンフィルタのビオチン化は特別のではない。
【０１００】
【表１０】
2005525534.tif 000013
【０１０１】
（試験７）
ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体及びカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体の双方に対するビオチン化程度を決定するために、フィルタ１マス当りモルビオチンの条件でのフィルタ上ビオチンの置換レベルで以下の実験を実施した。ＮＨＳ−ビオチンは、鎖の中間にジスルフィドを有していることから、チオール試薬ＤＴＮＢ（５，５’−ビス−ジチオ（２−ニトロ安息香酸））が決定用の簡便な手段であると思われた。要約すると、ＤＴＮＢは酸化されたビス体では、無色である。還元されると半分に分裂して黄色のチオニトロ安息香酸塩（吸光度４１２ｎｍ）を得る。従って、遊離スルフヒドリルの存在下、ＤＴＮＢの半分がフィルタ上でスルフヒドリルとジスルフィドを形成する、ジスルフィド交換反応を生じ、他の半分が遊離されて色を呈する。それらを開始するためには、ＤＴＴとの最初の処理による内部ジスルフィドを還元することによってビオチンから遊離スルフヒドリルを生成させる必要がある。ＤＴＮＢ反応後、溶解性遊離スルフヒドリル剤を再度加えて、フィルタからＤＴＮＢの他の半分を遊離し（より濃い色を呈する）、元来の遊離スルフヒドリルを再生する、第２の交換を行うことも可能である。一連の処理及び反応全体を以下に掲げる。洗浄は全てのステップ間で行われ、また、各ステップは、対照に適切であれば故意に削除してもよい：
イソプロパノール、次いで水との前処理フィルタ；
・ＰＢＳで洗浄；
・ＰＢＳ中ＮＨＳ−ビオチンとの反応；
・ＰＢＳで洗浄；
・ビオチンリンカーを開裂し、遊離ＳＨを生成するために、ＰＢＳ中ＤＴＴと処理；
・ＰＢＳで洗浄；
・重炭酸塩中ＤＴＮＢと反応し、溶液中の色を測定；
・ＰＢＳ又は重炭酸塩で洗浄；及び
・ＤＴＴで２回目の処理をし、色を測定。
【０１０２】
ＮＨＳ−ビオチン化条件は、前述のとおりであった。ＢＳＡはＤＴＮＢとまた反応するスルフヒドリル類を有していることから、ＢＳＡによる遮蔽はなかったことに注意されたい。ビオチン化後、サンプルをＤＴＴの５ｍＭ溶液中、室温で３０分間インキュベートした。次にフィルタをＰＢＳで広範囲にわたって洗浄し、１０ｍＭ  ＤＴＮＢ溶液（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3中、ｐＨ８．５）中、２分間インキュベートした。溶液の光学密度を４１２ｎｍで測定した。
【０１０３】
以前に用いられたサンプルロットを用いて陰性対照（前処理なし、ビオチンなし、ステップ３と４のみ）を試験するために予備実験を行った。予備実験結果により、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体は、低レベルの反応性（０．０４８）を有し、またニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は、明らかに反応性がなかったことが示された。さらなる陰性対照実験を行った（前処理なし、ビオチンなし、ＤＴＴステップ３の有り無し、次いでＤＴＮＢ）。
【０１０４】
下の表１１に見られるように、他の全ての試薬がない場合、サンプルはどれもＤＴＮＢと反応しなかった。ＤＴＴが含まれた場合、ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は反応性がないままであった。しかしながらこの場合、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体は、色を呈した。前記の色は、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロンから明らかに洗浄できなかったＤＴＴに帰するものと思われる。
【０１０５】
【表１１】
2005525534.tif 000014
【０１０６】
一連の全体反応が、ＤＴＴによる第２の処理を含んでなされた。この実験において、ＤＴＮＢ処理後、サンプルを洗浄し、追加のＤＴＴで２分間インキュベートし、この溶液のＯＤもまた測定した。下表１２に見られるように、ステップ４の後、陰性対照は、最高の読取値を与え、前処理サンプルは、前処理なしのサンプルよりも低い読取値を有した。ステップ５の後、陰性対照は、依然として高いバックグランドを有した。前処理サンプルは、前処理なしのサンプルよりも高い読取値を有したが、ビオチンの存在により反応性が増加したとは見えない。
【０１０７】
【表１２】
2005525534.tif 000015
【０１０８】
表１３に示されるようにニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））サンプルに関して、陰性対照はゼロであり、ビオチンの存在及び前処理は、反応性をわずかに高くした。引き続くＤＴＴ処理は、色を呈さなかった。ＤＴＮＢ及び引き続くＤＴＴ処理の双方とも、非常に低いレベルのビオチン結合を示している。従って、置換レベルはこの方法論によって決定できなかった。
【０１０９】
【表１３】
2005525534.tif 000016
【０１１０】
以下は追加のビオチン化作業の要約である：ＮＨＳ−ビオチン化実験を、ＰＢＳ中で繰り返したが、最終反応は希釈基材と（ＴＭＢ、１：５）の決められた時間（２分）でのインキュベートであった。本実験の他の全てのパラメータは、本質的に上記と同一であった。
表１４に見られるように、前処理なしのビオチン化ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は、わずかにバックグランド以上の活性を示し、ＤＴＴ処理は反応性を低下させたが、その差は恐らく有意ではない。前処理したビオチン化ニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体は、対照のほぼ２倍の反応性を示したが、ＤＴＴ処理は、バックグランドレベルまで反応性を低下させた。従って、シグナル対ノイズ比は高くはないが、前処理したニュクレル（Ｎｕｃｒｅｌ（登録商標））媒体に対するＮＨＳ−ビオチンの特別の結合のいくらかの兆候がある。
【０１１１】
【表１４】
2005525534.tif 000017
【０１１２】
下の表１５に見られるように、前処理なしのビオチン化カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体は、対照の２倍の反応性を示したが、ＤＴＴ処理は、バックグランドレベル以下に反応性を低下させた。従って、シグナル対ノイズ比は高くはないが、前処理なしのカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体に対するＮＨＳ−ビオチンの特別の結合のいくらかの兆候がある。
前処理カプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロン媒体のビオチン化は、入り混じった結果を与えた。ビオチン化サンプルの反応性は、バックグランド対照よりも低く、ＤＴＴ処理は、それを更に低下させた。これは恐らく、非特別の結合を示している。
【０１１３】
【表１５】
2005525534.tif 000018
【０１１４】
ＮＨＳ−ビオチン化実験を、ｐＨ８．５でカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロンサンプルを用いて繰り返した。全ての反応ステップは、ＰＢＳの代わりに５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．５を用いること以外、以前に記載されたものと同じであった。希釈基材との時間が決められたインキュベートもまた用いた。
表１６に示されるように、前処理の有り無しのサンプルにおいてバックグランドは著しく高かった。ビオチン化は、明らかに（しかし、恐らく人工的に）反応性を減じる効果を有していた。ゆえに、ｐＨ８．５でのカプロン（Ｃａｐｒｏｎ）（登録商標）ＳＪＥＳ親水性ナイロンサンプルのビオチン化は特別のではない。
【０１１５】
【表１６】
2005525534.tif 000019
【０１１６】
本発明の開示を理解し、又は完結させるために必要な範囲で、本明細書中に述べられた全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々が個々に組み込まれているのと同じ範囲で、参照によりそれに明白に組み込まれている。
このように、本発明の代表的な実施形態を記載したが、開示内のものは代表的であり、種々の他の代替、改造、及び修飾が、本発明の範囲内で成し得ることは当業者により認識されるべきである。従って、本発明は、本明細書中に例示された特定の実施形態に限定されず、以下の請求項によってのみ限定される。
【国際調査報告】
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