(57)【要約】本発明は、血管新生機構に関与することが明らかになった遺伝子のヌクレオチド配列、それらの相補配列、アンチセンス配列、該遺伝子のコード部分によってコードされたポリペプチド配列ならびに該ポリペプチド配列に対する抗体を含有する血管新生領域での治療組成物に関する。本発明は、さらに、該遺伝子を過少発現または過剰発現する遺伝子修飾細胞、それらを含有し、血管新生異常の治療に有用な治療組成物に関する。本発明は、また、血管新生異常の診断および／または予後の方法ならびに該異常の治療において活性な化合物をスクリーニングする新規方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）それの発現が血管新生抑制因子によって誘導される内皮細胞の遺伝子の核酸分子、それの相補配列または断片、（ｉｉ）該核酸分子によってコードされたポリペプチド配列またはそれの断片、（ｉｉｉ）（ｉ）に記載の核酸分子の発現を阻害しうるアンチセンス核酸分子または（ｉｉ）に記載のポリペプチド配列に固定されうる抗体のうちから選ばれた少なくとも１種の物質を活性成分として含有する、血管新生現象に対して活性な医薬組成物。
【請求項２】
活性成分として、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５、配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているヌクレオチド配列、それらの相補配列およびそれらの相当するアンチセンス配列からなる群から選ばれた少なくとも１つのヌクレオチド配列あるいはそれらの断片のいずれかを含有することを特徴とする、血管新生に関連した疾患の診断、予後および／または治療を目的とした請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
添付の配列表の配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０のうちから選ばれた少なくとも１つの配列のアンチセンス配列を包含する１種または２種以上の血管新生阻害性配列を含有することを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
添付の配列表の配列番号：１１〜配列番号：１４のうちから選ばれた１つまたは２つ以上のアンチセンス配列を含有することを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０として特定されているポリペプチド配列あるいは配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列のうちから選ばれた少なくとも１つのポリペプチド配列もしくはそれらの断片のいずれかを含有することを特徴とする、血管新生関連疾患の診断、予後および／または治療を目的とした請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されている１つまたは２つ以上のポリペプチド配列に対して親和性を有する少なくとも１種の抗体を含有する請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列のいずれか、あるいはそれらの断片のいずれかに対して親和性を有することを特徴とする抗体。
【請求項８】
動物、とりわけ脊椎動物、好ましくは哺乳動物の免疫適格細胞の、添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列のいずれかによるガラス器内免疫化を包含することを特徴とする請求項７に記載の抗体を調製する方法。
【請求項９】
それがモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
それがポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項７に記載の抗体。
【請求項１１】
活性成分として、請求項７、９または１０に記載の、または請求項８の方法に従って調製された１種または２種以上の抗体もしくはそれらの断片のいずれかを含有することを特徴とする血管新生関連疾患診断、予後および／または治療用医薬組成物。
【請求項１２】
配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列のうちから選ばれたヌクレオチド配列のうちの少なくとも１０マーを含有するセンチセンスヌクレオチド配列。
【請求項１３】
添付の配列表において配列番号：１１〜配列番号：１４として特定されている配列のうちから選ばれた配列と少なくとも８５％、好ましくは９５％の相同性を有する請求項１２に記載のアンチセンス配列。
【請求項１４】
請求項１２または１３のいずれかにおいて規定されている少なくとも１つのアンチセンス配列を含有する哺乳動物発現ベクター。
【請求項１５】
配列によって特定されており、添付の配列表における配列番号：１５〜配列番号：１８を有するベクターＧＳ−Ｖ１〜ＧＳ−Ｖ４からなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列の集合のうちから選ばれた少なくとも１つのヌクレオチド配列またはそれらの断片のいずれかを含有する哺乳動物発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１４または１５のいずれかにおいて規定されたベクターの哺乳動物細胞への挿入を包含することを特徴とする、血管新生異常に関与する遺伝子を過少発現する遺伝子修飾細胞の調製方法。
【請求項１８】
添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列の集合から選ばれた１つのヌクレオチド配列もしくはそれらの断片のいずれかにより特定された少なくとも１つの血管新生関連遺伝子を過剰発現することを特徴とする遺伝子修飾細胞。
【請求項１９】
添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列の集合から選ばれた１つのヌクレオチド配列により特定された少なくとも１つの血管新生関連遺伝子を過少発現することを特徴とする遺伝子修飾細胞。
【請求項２０】
（ａ）少なくとも１種の抗生物質に対する抵抗性遺伝子を請求項１８または１９に記載の遺伝子修飾細胞に導入し、
ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を該抗生物質の存在下に培養し、
ｃ）生存細胞を選択する
ことを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれかにおいて規定された発現ベクターを安定的に発現する細胞株を調製する方法。
【請求項２１】
請求項１８または１９のいずれかに記載の遺伝子修飾細胞または請求項２０に記載の方法に従って調製された遺伝子修飾細胞を含有することを特徴とする、哺乳動物、とりわけヒトにおける血管新生異常の治療および／または診断用の医用組成物。
【請求項２２】
下記の工程を包含する組換え蛋白質の調製方法：
ａ）添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列のうちの少なくとも１つもしくはそれらの断片のいずれかを含有する発現ベクターの構築、
ｂ）宿主細胞への該ベクターの導入、
ｃ）適当な培地中での該細胞の培養、
ｄ）発現された蛋白質またはそれらの断片のいずれかの精製。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって得られた組換え蛋白質またはペプチド断片。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組換え蛋白質を含有する医用組成物。
【請求項２５】
血管新生異常が、腫瘍の血管新生、網膜症、慢性関節リウマチ、クローン病、粥状硬化症、卵巣の過剰刺激、乾癬、新血管形成に関連した子宮内膜炎、バルーン血管形成による再狭窄、瘢痕形成による組織産生過多、末梢脈管疾患、高血圧、血管性炎症、レイノー病およびレイノー現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓性静脈炎、リンパ管炎、リンパ節腫脹、瘢痕形成および組織修復、虚血、狭心症、心筋梗塞、慢性心疾患、うっ血性心不全などの心不全、加齢に関連した筋退化および骨粗しょう症のうちから選ばれたものであることを特徴とする請求項１〜６、１１、２１または２４に記載の医用組成物。
【請求項２６】
哺乳動物、とりわけヒトにおける血管新生関連疾患の診断および／または予後の方法であって、該哺乳動物の細胞において、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている１つまたは２つ以上のヌクレオチド配列の過剰発現または過少発現を「ガラス器内」で検出することを特徴とする前記方法。
【請求項２７】
下記の工程を包含することを特徴とする請求項２６に記載の方法：
−  哺乳動物の一細胞集団による該ヌクレオチド配列、配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０の１つまたは２つ以上の発現の検出、
−  それの血管新生状態が既知の一標準細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の１つまたは２つ以上の発現の検出、
−  両細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の発現のレベルに差があった場合のその差の識別・確認。
【請求項２８】
哺乳動物、とりわけヒトにおける血管新生関連疾患の診断および／または予後の方法であって、該哺乳動物から分離した細胞において、添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０として特定されているポリペプチド配列もしくは配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列の１つまたは２つ以上の過剰発現または過少発現をガラス器内で検出することからなる前記方法。
【請求項２９】
下記の工程を包含することを特徴とする請求項２８に記載の方法：
ａ）哺乳動物の一細胞集団による該ポリペプチド配列、配列番号：６〜配列番号：１０または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列の１つまたは２つ以上の発現の検出、
ｂ）それの血管新生状態が既知の一標準細胞集団によるそれ（ら）と同じポリペプチド配列の１つまたは２つ以上の発現の検出、
ｃ）両細胞集団によるそれ（ら）と同じポリペプチド配列の発現のレベルに差があった場合のその差の識別・確認。
【請求項３０】
血管新生異常が、腫瘍の血管新生、網膜症、慢性関節リウマチ、クローン病、粥状硬化症、卵巣の過剰刺激、乾癬、新血管形成に関連した子宮内膜炎、バルーン血管形成による再狭窄、瘢痕形成による組織産生過多、末梢脈管疾患、高血圧、血管性炎症、レイノー病およびレイノー現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓性静脈炎、リンパ管炎、リンパ節腫脹、瘢痕形成および組織修復、虚血、狭心症、心筋梗塞、慢性心疾患、うっ血性心不全などの心不全、加齢に関連した筋退化および骨粗しょう症のうちから選ばれたものであることを特徴とする請求項２６〜２９のいずれかに記載の診断および／または予後の方法。
【請求項３１】
内皮細胞を患者由来の体液の存在下に置いたのちに当該配列の発現の検出を行うことを特徴とする請求項２６〜３０のいずれかに記載の診断および／または予後の方法。
【請求項３２】
哺乳動物、とりわけヒトにおける血管新生関連処置の治療効果を確認する方法であって、該哺乳動物の細胞において、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているヌクレオチド配列の１つによって特定される少なくとも１つの血管新生異常関与遺伝子の過剰発現または過少発現の「ガラス器内」での検出を包含することを特徴とする前記方法。
【請求項３３】
下記の工程を包含することを特徴とする請求項３２に記載の治療効果確認方法：
−  血管新生異常の治療を目的とした医用組成物を投与した哺乳動物から分離した一細胞集団による該ヌクレオチド配列、配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０の１つまたは２つ以上の発現の検出、
−  それの血管新生状態が既知の一標準細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の発現の検出、
−  両細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の発現のレベルに差があった場合のその差の識別・確認。
【請求項３４】
１つまたは２つ以上のヌクレオチド配列の発現の検出を、該哺乳動物から分離した細胞集団について行うことを特徴とする請求項３３に記載の治療効果確認方法。
【請求項３５】
血管新生異常が、腫瘍の血管新生、網膜症、慢性関節リウマチ、クローン病、粥状硬化症、卵巣の過剰刺激、乾癬、新血管形成に関連した子宮内膜炎、バルーン血管形成による再狭窄、瘢痕形成による組織産生過多、末梢脈管疾患、高血圧、血管性炎症、レイノー病およびレイノー現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓性静脈炎、リンパ管炎、リンパ節腫脹、瘢痕形成および組織修復、虚血、狭心症、心筋梗塞、慢性心疾患、うっ血性心不全などの心不全、加齢に関連した筋退化および骨粗しょう症のうちから選ばれたものであることを特徴とする請求項３２〜３４のいずれかに記載の治療効果確認方法。
【請求項３６】
内皮細胞を患者由来の体液の存在下に置いたのちに当該配列の発現の検出を行うことを特徴とする請求項３２〜３５のいずれかに記載の治療効果確認方法。
【請求項３７】
下記の工程を包含することを特徴とする、哺乳動物、とりわけヒトの血管新生異常の治療に有用な化合物をスクリーニングする方法：
ａ）血管新生異常に対して治療効果を有する可能性のある化合物の存在下に置かれた哺乳動物から分離した一細胞集団による該ヌクレオチド配列、配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０の１つまたは２つ以上の発現の検出、
ｂ）それの血管新生状態が既知の一標準細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の発現の検出、
ｃ）両細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の発現のレベルに差があった場合のその差の識別・確認。
【請求項３８】
内皮細胞を患者由来の体液の存在下に置いたのちに当該配列の発現の検出を行うことを特徴とする請求項３７に記載のスクリーニング方法。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載のスクリーニング方法を実施するために、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているヌクレオチド配列の１つまたは２つ以上に対して特異的な１種または２種以上のプローブを包含する支持体を包含する装置。
【請求項４０】
前記支持体が、ガラス膜、金属膜、重合体膜、シリカ膜のうちから選ばれたものである請求項３９に記載の装置。
【請求項４１】
請求項３９または４０のいずれかに記載の装置、試料から抽出された配列の増幅、それらと前記装置のプローブとのハイブリダイゼーションおよびディファレンシャル・ディスプレイ測定実施に必要な特異的プライマーおよび付属品を包含する、血管新生異常関与遺伝子のディファレンシャル・ディスプレイ測定用キット。
【請求項４２】
標準細胞集団としての請求項１８または１９に記載の遺伝子修飾細胞の安定株、配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列に特異的な１種または２種以上のプローブおよび前記ディファレンシャル・ディスプレイの検出および測定に必要な手段を包含する、血管新生異常関与遺伝子のディファレンシャル・ディスプレイ測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生機構の制御不調に起因する疾患の治療に有用な医薬組成物の領域に属するものである。
【０００２】
それは、一方では、それらの機能が今日まで確認されておらず、それらの血管新生機構に関与していることが本出願人によって初めて明らかにされた新規遺伝子の配列を、他方では、それらの機能の少なくとも一つが先に確認されていたが、それらが内皮細胞の細胞構成成分をコードする遺伝子として血管新生機構に関与することが本出願人が本発明の枠内で実施した研究によって初めて証明された遺伝子配列を、それぞれ含有する組成物に関するものである。これらの遺伝子は、添付の配列表中のヌクレオチド配列によって同定される。本発明は、血管新生過程の臨床的研究、この過程に関連のある諸疾患の予後、診断および治療ならびに薬理学的、薬理遺伝学的または薬理シグナル論的研究の実施においてそれらの用途が見出されるところの前記遺伝子によってコードされた因子類のポリペプチド配列に関するものでもある。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、それによって新規な血管が形成される重要な過程である。この過程は、生殖、発生、さらには瘢痕形成などの多くの正常な生理学的現象において必須のものである。これらの正常な生物現象においては、血管新生は厳密に制御・調節されている。すなわち、それは、数日間の短い期間の間誘発され、その後は完全に抑制される。しかし、多くの疾患が侵襲的で制御されない血管新生と関連している。たとえば、関節炎は、侵襲性の新生血管による軟骨の損傷に起因する疾患である。糖尿病網膜症では、新生血管による網膜の侵襲によって患者が失明するに至る；眼球の血管新生が失明の主因であり、この血管新生は、眼疾患患者の約２０％に影響を及ぼしている。最後に、腫瘍の増殖および転移は、新血管生成と関連しており、血管新生に依存している。腫瘍は、新生血管を刺激して、これを成長させる。さらに、これらの新生血管は、腫瘍が抜け出して血液循環に加わる経路を提供し、肝臓、肺、骨などの遠隔の部位への転移を惹起させることとなる。
【０００４】
心血管疾患、末梢動脈性疾患、血管または脳の病変などの他の疾患においては、血管新生が、重要な治療上の基礎となりうる。すなわち、損傷を受けた部位における血管新生の促進が、損傷を受けた血管に対する側行および代替新生血管の形成に至らせ、かくして、関連組織の生存に必要な血液を、従って酸素およびその他の栄養因子および生物学的因子を供給することができる。
【０００５】
内皮細胞による新生血管の形成は、内皮細胞の移動、増殖および分化を包含する。これらの生物学的現象の制御は、遺伝子発現に直接関連している。血管新生に関しては、絶えず増え続けている多くの研究が、血管新生の制御は内皮細胞に直接作用する諸因子間の平衡を通じて行われていることを示している。これらの因子は、一方では、とりわけＶＥＧＦ、ＦＧＦ類、ＩＬ−８、ＨＧＦ／ＳＦ、ＰＤＧＦなどの刺激因子でありうる。また、それらは、とりわけＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｇｒｏ−αおよびｇｒｏ−β、血小板第４因子、アンギオスタチン、ヒト軟骨細胞由来の阻害剤、トロンボスポンジン、白血病阻害因子などの阻害物質でもありうる。（イェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）、サージカル・ニューロロジー（Ｓｕｒｇ．Ｎｅｕｒｏｌ．）、１９９８、４９、１８９−１９５；タマタニら、１９９９、カーシノジェネシス（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、２０、９５７−９６２；タナカら、１９９８、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、５８、３３６２−３３６９；ゲー（Ｇｈｅ）ら、１９９７、キャンサー・リサーチ、５７、３７３３−３７４０；カワハラら、１９９８、ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２８、１５１２−１５１７；チャンドフニ（Ｃｈａｎｄｈｕｎｉ）ら、１９９７、キャンサー・リサーチ、５７、１８１４−１８１９；イェンドラシャック（Ｊｅｎｄｒａｓｃｈａｋ）とセージ（Ｓａｇｅ）、１９９６、セミナー・オン・キャンサー・アンド・バイオロジー（Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．）、７、１３９−１４６；マイェフスキ（Ｍａｊｅｗｓｋｉ）ら、１９９６、ジャーナル・オブ・インヴェスティゲーショナル・デルマトロジー（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．）、１０６、１１１４−１１１９）。
【０００６】
今日記載されているごとき血管新生の調節は、つぎの２つのタイプの因子の平衡を介して行われる：
−  内皮細胞に直接作用して、血管新生を誘発する血管新生因子（細胞外ポリペプチド、大部分は分裂誘発性）
−  やはり内皮細胞に直接作用して、血管新生を抑制する血管新生抑制因子（細胞外ポリペプチド、やはり大部分は分裂誘発性であるかまたは分裂誘発に影響を及ぼす）。
【０００７】
これら２つのタイプの細胞外因子の間の平衡が、血管新生を調節する。現段階では、血管新生の制御が、血管新生因子および血管新生抑制因子の産生によって行われていることが、認められている。たとえば、血管新生因子による内皮細胞の刺激が、１）ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）およびその抑制因子ＰＡＩ−Ｉの発現を誘発し（ペパー（Ｐｅｐｐｅｒ）ら、１９９０、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）１１１（２）、７４３−５５；ペパーら、１９９６、エンザイム・アンド・プロテイン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、４９（１−３）、１３８−６２）、２）マトリックスのメタロプロテイナーゼ類（ＭＭＰ）およびこれらＭＭＰの活性の生理学的抑制因子（ＴＩＭＰ）の発現を誘発し（コ−ネリアス（Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ）ら、１９９５、ジャーナル・オブ・インヴェスティゲーショナル・ダーマトロジー（Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ）、１０５（２）、１７０−６；ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）とングイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）、１９９７、インターナショナル・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・セル・バイオロジー（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、２９（１０）、１１６７−７７）、３）アンギポイエチン−２（Ａｎｇ−２）やトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）などの抑制因子の発現を誘発する（マンドリオタ（Ｍａｎｄｒｉｏｔａ）とペパー（Ｐｅｐｐｅｒ）、１９９８、サーキュレーション・リサーチ（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．）、８３，８５２−８５９；オー（Ｏｈ）ら、１９９９、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、２７４（２２）、１５７３２−９；スズマ（Ｓｕｚｕｍａ）ら、１９９９、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｎｒａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、１５４、３４３−３５４）。それゆえ、血管新生状態にある内皮細胞は、血管新生因子を産生するが、血管新生抑制因子をも産生するのが、普通であると思われる。後者の産生は、血管新生の調節を可能にする。
【０００８】
この実情に並行して、血管新生抑制因子によって刺激された内皮細胞は、血管新生抑制因子を産生するが、血管新生状態調節のために血管新生因子をも産生する。この現象は、血管新生に関与する因子を産生する他のタイプの細胞について既に記載されており、インターフェロン−ガンマなどの血管新生抑制因子によって刺激されるとき、それらは血管新生因子および血管新生抑制因子を産生する（コバヤシら、１９９５、イムノファーマコロジー（Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、３１（１）、９３−１０１；アーキンス（Ａｒｋｉｎｓ）ら、１９９５、モレキュラー・エンドクリノロジー（Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ）、９（３）、３５０−６０；コデリヤ（Ｋｏｄｅｌｊａ）ら、１９９７、イムノバイオロジー（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９７（５）、４７８−９３）。
【０００９】
本発明において、本出願人は、血管新生抑制因子による内皮細胞の刺激が、血管新生の促進に関与する細胞構成成分をコードする遺伝子の発現に至らせることを明らかにした。
【００１０】
かくして、血管新生因子または血管新生抑制因子による内皮細胞の刺激は、いずれも、血管新生の正および負の調節因子の発現に至らせる。
【００１１】
それゆえ、血管新生の制御・調節は、血管新生に関連する多くの病的現象についての我々の知識を向上させるための戦略上の要となるものであり、同時に基礎的研究の要であり、また、血管新生に関連する諸疾患を処置するための新規療法を編み出すための基礎となる。
【００１２】
血管新生を制御するために、多くの製薬グループが、パラクリン信号、刺激因子および抑制因子、たとえば血管新生を促進または抑制する薬剤の利用に直接立脚した治療戦略を開発してきている。これらの戦略は、主として、これらの因子をそれらのポリペプチドという形で、また最近は選択された因子をコードする発現ベクターの形で、血管新生促進または抑制剤として使用することを基礎としている。
【００１３】
血管新生に関与する新規遺伝子を同定・確認できる方法に焦点が合わせられている。それは、ＦＲ２７９８６７４として公表されたフランス特許出願およびＷＯ０１／２１８３１２として公表されたＰＣＴ国際特許出願の対象となっている。この方法は、血管新生調節因子として記述されているすべての細胞外因子、すなわち血管新生因子、血管新生抑制因子ならびに細胞外マトリックスの種々の構成要素を考慮に入れて、血管新生を調節する本質的な機構を忠実に表現するという特徴をもっている。この方法の本質は、十分明確な４つの条件を介してこれら種々の細胞外因子を利用することにある。細胞外マトリックスの十分明確な一構成成分および／またはいくつかの構成成分の混合物を用いて内皮細胞を培養し、４つの実験条件のもとに置く。それらの条件とは、
内皮細胞を刺激しない対照条件。
【００１４】
内皮細胞を１つまたはいくつかの血管新生因子によって刺激する血管新生条件。
【００１５】
内皮細胞を１つまたはいくつかの血管新生因子によって刺激し、１つまたはいくつかの血管新生抑制因子の存在下に置く血管新生阻害条件。
【００１６】
内皮細胞を１つまたはいくつかの血管新生抑制因子によって刺激する別の対照条件。
【００１７】
これら４つの条件によって、血管新生、すなわち血管新生状態および／または血管新生阻害状態に特異的なｍＲＮＡ標品を得ることができ、正の調節因子および負の調節因子を含めて、血管新生の調節に関与する細胞構成成分をコードする遺伝子を見出すことができる。それゆえ、上記の方法は、すべての血管新生因子および血管新生抑制因子ならびに細胞外マトリックスの種々の構成成分を系統的にスクリーニングして、血管新生の調節に関与する細胞構成成分をコードする遺伝子を明らかにし、同定・確認することを可能ならしめる。さらに、内皮細胞による新生血管形成の動力学全体を通じて遺伝子発現を分析できるので、このアプローチは、遺伝子発現を血管新生の生物学的機能パラメータに結びつけることを可能ならしめるガラス器内法に相当する。
【００１８】
４つの実験条件を再現するための細胞外マトリックス構成成分として、血管新生因子、血管新生抑制因子ならびにＩ型コラーゲンを用い、上記の方法に従い、下記の５つの新規遺伝子の同定・確認を行った。
【００１９】
本出願人は、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５により特定されているこれら５つの新規遺伝子が血管新生調節機構に関与していることを明らかにした。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
より詳しくは、本発明は、（ｉ）それの発現が血管新生抑制因子によって誘発される内皮細胞の遺伝子の核酸分子、それの相補配列または断片、（ｉｉ）該核酸分子によってコードされたポリペプチド配列またはそれの断片、（ｉｉｉ）（ｉ）に記載の核酸分子の発現を阻害しうる分子または（ｉｉ）に記載のポリペプチド配列に固定されうる分子のうちから選ばれた少なくとも１種の物質を活性成分として含有し、血管新生現象に対して作用する医薬組成物に関するものである。
【００２１】
特定の一実施態様に従えば、本発明の医薬組成物は、添付配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているヌクレオチド配列、それらの相補配列およびそれらの対応するアンチセンス配列からなる群から選ばれた少なくとも１種の核酸またはそれらの断片のいずれかを活性成分として含有する。
【００２２】
本発明においては、塩基の欠失、変異または付加などの機能を変化させない二義的な構造上の修飾を示すが、添付配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているヌクレオチド配列との相同性が少なくとも９０％であるヌクレオチド配列は、均等な配列であるとみなされるべきである。
【００２３】
他の特定の一実施態様に従えば、血管新生調節のための該医薬組成物は、少なくとも１つの血管新生抑制・阻害配列を含有する。
【００２４】
特定の一実施態様に従えば、本発明の医薬組成物は、添付の配列表の配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０のうちから選ばれた少なくとも１つの配列のアンチセンス配列を含む１つまたは２つ以上の血管新生抑制・阻害配列を含有する。
【００２５】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、添付の配列表における配列番号：１１〜配列番号：１４のうちから選ばれた１つまたは２つ以上のアンチセンス配列を含有する。
【００２６】
本発明はまた、添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０として特定されているポリペプチド配列または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列のうちから選ばれた少なくとも１種のポリペプチド配列を含有していることを特徴とする、血管新生に関連した疾患の診断、予後および／または治療を目的とした医薬組成物を対象とする。
【００２７】
本発明においては、アミノ酸残基の欠失、変異または付加などの機能を変化させない二義的な構造上の修飾を示すが、添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０として特定されているポリペプチド配列または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列との相同性が少なくとも８５％、好ましくは９０％であるポリペプチド配列は、均等な配列であるとみなされるべきである。
【００２８】
本発明は、１種または２種以上の上記ポリペプチド配列の少なくとも１つの拮抗物質を含有する、血管新生関連疾患の診断、予後および／または治療を目的とした医薬組成物をも対象とする。
【００２９】
拮抗物質とは、血管新生機構における該ポリペプチド配列の生物学的活性を阻害するすべての化合物をいう。
【００３０】
かかる拮抗物質の例としては、該ポリペプチド配列に対して親和性を有する抗体を挙げることができる。
【００３１】
本発明は、添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０として特定されているポリペプチド配列または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列の各々またはそれらの断片のいずれかに対して親和性を有する抗体ならびにそれらを含有する治療用組成物に関するものでもある。
【００３２】
前記抗体は、動物、とりわけ脊椎動物、好ましくは哺乳動物を、添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０として特定されているポリペプチド配列または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列のいずれかまたは全蛋白の免疫原性を保存しているそれらの断片のいずれかによって生体内またはガラス器内で免疫処置するいずれの方法によっても得ることができる。
【００３３】
前記抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。（Ｇ・ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とＣ・ミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７５年８月７日；２５６（５５１７）：４９５−７。）
【００３４】
本発明は、配列番号：６〜配列番号：１０として特定されているポリペプチド配列あるいは配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列の１つまたは２つ以上に対して親和性を有する１種または２種以上の抗体もしくはこの親和性を保存する、または前記のようにして調製されたそれらの断片のいずれかを含有する治療用または診断用組成物に関するものでもある。
【００３５】
本発明の他の一目的は、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているヌクレオチド配列のアンチセンスヌクレオチド配列に関する。
【００３６】
本発明の枠内において、アンチセンス配列とは、もともとのｍＲＮＡ配列の一部とハイブリダイズして、その発現、すなわちそれの蛋白質への翻訳を阻害するところの、ｍＲＮＡに対して相補的な少なくとも１０マーのＤＮＡ配列すべてを包含する。
【００３７】
とりわけ、本発明は、添付の配列表において配列番号：１１〜配列番号：１４として特定されている配列のうちから選ばれた１つの配列と少なくとも８５％、好ましくは９５％の相同性を有するアンチセンス配列を対象とする。
【００３８】
本発明はまた、上記定義のアンチセンス配列を少なくとも１種含有する哺乳動物発現ベクターをも対象とする。
【００３９】
好ましい実施態様に従えば、前記哺乳動物発現ベクターは、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている少なくとも１つの配列の少なくとも１つのアンチセンス配列ならびに該アンチセンスＤＮＡの発現を可能ならしめるプロモーターを含有する。
【００４０】
より詳しくは、前記ベクターは、添付の配列表の配列番号：１５〜配列番号：１８の配列によって特定されるベクターＧＳ−Ｖ１〜ＧＳ−Ｖ４からなる群から選ばれる。
【００４１】
さらに、添付の配列表において配列番号：１１〜配列番号：１４として特定されているアンチセンス配列またはそれらのホモログ（相同体）のいずれかの哺乳動物発現ベクターへの導入およびその後の該ベクターの哺乳動物細胞への導入によって、血管新生機構に影響を及ぼす遺伝子を過少発現する細胞株を得ることができる。
【００４２】
また、本発明は、添付の配列表の配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０のうちから選ばれた少なくとも１つのヌクレオチド配列を過少発現する少なくとも１つのアンチセンス配列含有ベクターを含有する遺伝子修飾細胞をも対象とする。
【００４３】
本発明は、前記の発現ベクターの哺乳動物細胞への導入を包含することを特徴とする、血管新生異常に関与する遺伝子を過少発現するかかる遺伝子修飾細胞の調製方法をも対象とする。
【００４４】
これらのベクターを構築するためには、特定されている配列の各々に対する特定のプライマーを設計する。それらは、それらの両末端に、クローン化された断片には含まれておらず、発現ベクターの多部位領域に存在する制限部位を含有している。
【００４５】
これらのプライマーは、表１（材料および方法の項参照）に示されており、添付の配列表において配列番号：１９〜配列番号：２６として特定されているものであることがとくに好ましい。
【００４６】
本発明は、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列の集合から選ばれた少なくとも１つのヌクレオチド配列またはそれらの断片のいずれかを含有する哺乳動物発現ベクターをも対象とする。
【００４７】
これらの構築物は、一方では、血管新生異常の細胞療法による治療を目的とした治療組成物を調製するのに、他方では、哺乳動物、とりわけヒトにおける血管新生異常の治療の有効性を確認するのに、また該哺乳動物において場合により血管新生機構に関与している遺伝子の機能を確認するのに、有用である。
【００４８】
本発明の他の主題は、配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている少なくとも１つの配列のアンチセンス配列を少なくとも１つ含有し、さらに該アンチセンスＤＮＡの発現を可能ならしめるプロモーターを含有する発現ベクターを安定して発現する遺伝子修飾細胞株を調製する方法であって、下記の工程を包含する該方法に関するものである：
（ａ）少なくとも１種の抗生物質に対する抵抗性遺伝子を該遺伝子修飾細胞に導入する、
ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を該抗生物質の存在下に培養する、
ｃ）生存細胞を選択する。
【００４９】
本発明は、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列の集合のうちから選ばれた１つのヌクレオチド配列もしくはそれらの断片のいずれかを含有し、該配列を過剰発現する少なくとも１種のベクターを含有する遺伝子修飾細胞に関するものでもある。
【００５０】
本発明は、活性成分として該遺伝子修飾細胞を含有する、血管新生関連疾患診断、予後および／または治療用医薬組成物に関するものでもある。
【００５１】
また、本発明は、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている少なくとも１つの配列もしくはそれらの断片の１つならびに該配列の発現を可能ならしめるプロモーターを含有する発現ベクターを安定して発現する遺伝子修飾細胞株を調製する方法であって、下記の工程を包含する該方法に関するものである：
（ａ）少なくとも１種の抗生物質に対する抵抗性遺伝子を該遺伝子修飾細胞に導入する、
ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を該抗生物質の存在下に培養する、
ｃ）生存細胞を選択する。
【００５２】
それゆえ、ヒト細胞を単離して、それらを、その配列が配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている遺伝子の少なくとも１つもしくはそれらの断片の１つをコードする上記ベクターの少なくとも１つによりガラス器内でトランスフェクトすることが考えられる。これらの遺伝子修飾細胞は、つぎに、哺乳動物、好ましくはヒトという哺乳動物に投与することができる。
【００５３】
かかる細胞を含有する治療用組成物は、単純な細胞懸濁液の形を呈することもできるが、適当な装置中に、たとえば半透膜を用いて、充填することもできる。
【００５４】
本発明の他の一主題は、その配列が添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている遺伝子の少なくとも１つもしくはそれらの断片の１つによってコードされた蛋白質を調製する方法である。
【００５５】
添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０および配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているこれらの蛋白質またはそれらの断片は、相応する適当な発現ベクターを適当な宿主に導入することによってガラス器内で組換え蛋白質の形で製造し、精製し、つぎに治療剤として使用することができる。
【００５６】
かかる組換え蛋白質調製方法は、下記の工程を包含する：
ａ）添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているもののうちの少なくとも１つの配列もしくはそれらの断片の１つを含有するベクターの構築、
ｂ）該ベクターの宿主細胞への導入、
ｃ）適当な培地中での該細胞の培養、
ｄ）発現された蛋白質もしくはそれらの断片の１つの精製。
【００５７】
本発明はまた、上記の方法によって得られた組換え蛋白質に関するものでもある。
【００５８】
本発明は、かかる組換え蛋白質を含有する治療用組成物をも対象とする。
【００５９】
たとえば、大腸菌などの細菌における組換え蛋白質発現系を、蛋白質または非グリコシル化ポリペプチドの発現のために利用できる。
【００６０】
対象となる遺伝子のコード配列または部分配列を、両末端に制限酵素部位、好ましくは発現ベクター中での遺伝子の方向付けを可能ならしめるために異なる制限酵素部位を有するこの遺伝子に対して特異的なプライマーを用いてのＰＣＲによって、増幅する。増幅されたＤＮＡを精製したのち、制限酵素によって消化し、前もって同じ酵素で消化した発現ベクターにライゲーションによって挿入する。ｐＢＲ３２２（ボリヴァー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２（１９７７）９５−１１３）またはたとえば高発現レベルを得るためのバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモータを含有するその誘導体、たとえば、好ましくは選択マーカー（抗生物質耐性）をコードする配列、ＤＮＡの挿入のための適当な制限酵素部位を含むマルチクローニング部位を含有するプラスミドｐＥＴ３ａ（スチュディエ（Ｓｔｕｄｉｅｒ）とモファット（Ｍｏｆｆａｔｔ）、１９８６、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）、１８９（１）：１１３−３０）などの多くのベクターを使用することができ、細胞／宿主系は、増殖因子ＦＧＦ２の生体内放射能標識に用いられ（コリン（Ｃｏｌｉｎ）ら、１９９７、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、２４９、４７３−４８０）、すでにパトリ（Ｐａｔｒｙ）ら（１９９４、フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ）、３４９（１）：２３−８）により記載されているものなどの誘導系であることが好ましく、それは、精製を容易にするために当該ポリペプチドの末端のポリヒスチジンテールをコードする領域を含有していてもよい。
【００６１】
増幅されたＤＮＡは、プラスミドに連結して、サムルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らにより記載されている方法（１９８９、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）に従って細菌を軽質転換する。軽質転換細胞を、抗生物質含有ＬＢ寒天培地上に置き、それらの抗生物質に対して耐性のコロニーをＰＣＲによってチェックし、つぎにゲルで分析する。当該プラスミドＤＮＡは、単離して、配列を決定し、構築を確認することができる。組換え蛋白質の産生および精製は、記載されている通りにして（パトリ（Ｐａｔｒｙ）ら、１９９４、フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ）、３４９（１）：２３−８）実施することができる。簡潔に言えば、単離したコロニーを、抗生物質を添加したＬＢ培地などの液体培地に接種する。一夜インキュベートしたのち、その前培養物を播種に用いて、さらに大量の培養物を得ることができる。そのときにポリペプチドの発現が誘導され、数時間生育した細胞をつぎに遠心分離によって集める。細胞沈渣は、既知の化学的試薬により、または機械的に、たとえば超音波処理により、溶解させることができる。蛋白質は、その物理化学的諸性質に基づいて、組換えＦＧＦ２について記載されているようにして（コリン（Ｃｏｌｉｎ）ら、１９９７、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、２４９、４７３−４８０）精製でき、該蛋白質がポリヒスチジンテールによって標識されている場合には、記載されているように（タング（Ｔａｎｇ）ら、プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピュアリフィケーション（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ）１９９７年１２月、１１（３）：２７９−８３）、このテールを介しての金属イオンキレート化支持体への固定化によって精製できる。
【００６２】
たとえば、グリコシル化などの翻訳後修飾を有するポリペプチドを発現させるための組換え蛋白質の発現系、たとえば真核生物（酵母、植物、昆虫）の系を使用できる。
【００６３】
かくして、たとえば、スレークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ）ら（１９８８、ジャーナル・オブ・ベイシック・マイクロバイオロジー（Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）、２８（４）：２６５−７８）に記載されているごとき酵母ピキア・パストーリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で、組換え蛋白質を産生させることができる。増幅したＤＮＡは、同様にして消化および連結ののち、好ましくは選択マーカーをコードする配列を含有するピキア・パストーリスの発現ベクター（スコアラー（Ｓｃｏｒｅｒ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ニューヨーク）、１９９４年２月；１２（２）：１８１−４）に導入することができる。蛋白質は、細胞内蛋白質であっても、遺伝子末端に導入されたたとえば酵母サッカロマイセス・セレヴィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプレプロペプチド因子（クレッグ（Ｃｒｅｇｇ）ら、１９９３；スコアラー（Ｓｃｏｒｅｒ）ら、１９９３）などの分泌シグナル配列をコードする配列をベクターが含有している場合には、分泌蛋白質であってもよい。組換え蛋白質が、精製を容易にするために、末端の一つにヒスチジンテールが付加されていているものであってもよい（モズリー（Ｍｏｚｌｅｙ）ら、１９９７、フォトケミストリー・アンド・フォトバイオロジー（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ）、６６（５）：７１０−５）。
【００６４】
該宿主は、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞のうちから選ぶことが好ましい。
【００６５】
かかる蛋白質を含有する治療用組成物の投与は、たとえば、局所、経口、皮内、経皮、静脈内の各経路によって行うことができる。
【００６６】
該蛋白質の断片は、それらが由来する蛋白質の拮抗物質として利用できる。たとえば、かかる断片を含有する治療用組成物を動物に適宜投与することが、ある所与の疾患における血管新生機構での該蛋白質の活性低下を誘起させるのに推奨される。
【００６７】
本発明は、哺乳動物、とりわけヒトにおける血管新生関連疾患の診断および／または予後方法であって、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている１つまたは２つ以上のヌクレオチド配列の該哺乳動物の細胞中での発現を検出することからなる診断および／または予後方法に関するものでもある。
【００６８】
かかる診断および／または予後方法は、下記の工程を包含する：
−  哺乳動物の一細胞集団による該ヌクレオチド配列、配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０の１つまたは２つ以上の発現の検出、
−  それの血管新生状態が既知の一標準細胞集団によるそれ（ら）と同じ配列の発現の検出、
−  両細胞集団によるそれ（ら）と同じ配列の発現のレベルに差があった場合のその差の識別・確認。
【００６９】
本発明は、哺乳動物、とりわけヒトにおける血管新生関連疾患の診断および予後の方法であって、該哺乳動物の細胞において、添付の配列表において配列番号：６〜配列番号：１０として特定されているポリペプチド配列の１つまたは２つ以上もしくは配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列の１つまたは２つ以上の過剰発現または過少発現を検出することからなる方法に関するものでもある。
【００７０】
好ましい一実施態様に従えば、前記の方法は、下記の工程を包含する：
ａ）哺乳動物の一細胞集団による該ポリペプチド配列、配列番号：６〜配列番号：１０または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列の１つまたは２つ以上の発現の検出、
ｂ）それの血管新生状態が既知の標準細胞集団によるそれ（ら）と同じ配列の発現の検出、
ｃ）両細胞集団によるそれ（ら）と同じポリペプチド配列の発現のレベルに差があった場合のその差の識別・確認。
【００７１】
特別な一実施態様に従えば、前記の本発明の診断・予後方法において、該当配列の発現の検出は、内皮細胞を患者由来の体液の存在下に置いたのちに実施する。
【００７２】
本発明は、哺乳動物、とりわけヒトにおける血管新生関連処置の治療効果を確認する方法であって、該哺乳動物において、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているヌクレオチド配列の１つまたは２つ以上を過剰発現または過少発現しうる細胞集団を特定することによるものである方法に関するものでもある。
【００７３】
かかる治療効果確認方法は、下記の工程を包含する：
−  血管新生異常の治療を目的とした治療用組成物を投与した哺乳動物の一細胞集団による該ヌクレオチド配列、配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０の１つまたは２つ以上の発現の検出、
−  それの血管新生状態が既知の一標準細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の発現の検出、
−  両細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の発現のレベルに差があった場合のその差の識別・確認。
【００７４】
好ましい実施態様に従えば、前記の確認方法は、哺乳動物の細胞集団について生体内、半生体内（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で、あるいはまた、該哺乳動物から単離した細胞集団についてガラス器内で実施する。
【００７５】
特別な一実施態様に従えば、上記の本発明の確認方法において、該当配列の発現の検出は、内皮細胞を患者由来の体液の存在下に置いたのちに実施する。
【００７６】
本発明は、哺乳動物、とりわけヒトの血管新生関連処置に有用な化合物をスクリーニングする方法に関するものでもある。
【００７７】
好ましい一実施態様に従えば、かかるスクリーニング方法は、下記の工程を包含する：
−  血管新生異常に対して治療効果を有する可能性のある化合物の存在下に置かれた哺乳動物の一細胞集団による該ヌクレオチド配列、配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０の１つまたは２つ以上の発現の検出、
−  それの血管新生状態が既知の一標準細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の発現の検出、
−  両細胞集団によるそれ（ら）と同じヌクレオチド配列の発現のレベルに差があった場合のその差の識別・確認。
【００７８】
他の好ましい一実施態様に従えば、かかるスクリーニング方法は、下記の工程をも包含する：
−  血管新生異常に対して治療効果を有する可能性のある化合物の存在下に置かれた一細胞集団による添付の配列表において配列番号：５〜配列番号：１０として特定されている当該ポリペプチド配列または配列番号：３１〜配列番号：３４として特定されているポリペプチド配列の１つまたは２つ以上の発現の検出、
−  それの血管新生状態が既知の一標準細胞集団によるそれ（ら）と同じポリペプチド配列の発現の検出、
−  両細胞集団によるそれ（ら）と同じポリペプチド配列の発現のレベルに差があった場合のその差の識別・確認。
【００７９】
特別な一実施態様に従えば、前記の本発明のスクリーニング方法において、該当配列の発現の検出は、内皮細胞を患者由来の体液の存在下に置いたのちに実施する。
【００８０】
本発明の医薬組成物によって診断または治療することのできる血管新生異常としては、つぎのものを挙げることができる：腫瘍の血管新生、網膜症、慢性関節リウマチ、クローン病、粥状硬化症、卵巣の過剰刺激、乾癬、新血管形成に関連した子宮内膜炎、バルーン血管形成による再狭窄、瘢痕形成による組織産生過多、末梢脈管疾患、高血圧、血管性炎症、レイノー病およびレイノー現象、動脈瘤、動脈再狭窄、血栓性静脈炎、リンパ管炎、リンパ節腫脹、瘢痕形成および組織修復、虚血、狭心症、心筋梗塞、慢性心疾患、うっ血性心不全などの心不全、加齢に関連した筋退化および骨粗しょう症。
【００８１】
本発明は、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているヌクレオチド配列の１つまたは２つ以上に特異的な１つまたは２つ以上のプローブを含有する支持体を包含する、本発明のスクリーニング方法を実施するための装置をも対象とする。
【００８２】
本発明の枠内において、プローブとは、その配列が求める配列に対して相補的なすべての一本鎖ＤＮＡ断片をいう：それは、標識した（放射性原子または蛍光基の導入によって）プローブとのハイブリダイゼーションによって見つけることができる。このプローブは「釣り針」分子の役割を果す。
【００８３】
好ましい実施態様に従えば、前記装置の支持体は、ガラス、金属膜、重合体膜、シリカ膜のうちから選ばれる。
【００８４】
かかる装置は、たとえば、添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されているヌクレオチド配列の１つまたは２つ以上を含有するＤＮＡチップである。
【００８５】
本発明はまた、前述のごとき装置、特定のプライマーならびに試料から抽出した配列の増幅、それらと該装置のプローブとのハイブリダイゼーションおよびディファレンシャル・ディスプレイの実施に必要な付属品を包含する、血管新生異常関与遺伝子のディファレンシャル・ディスプレイ測定用キットを対象とする。
【００８６】
本発明はまた、血管新生異常関与遺伝子のディファレンシャル・ディスプレイ測定用キットであって、標準細胞集団としての添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列の少なくとも１つまたはそれらの断片のいずれかを発現するベクターを安定的に発現する遺伝子修飾細胞株および該ディファレンシャル・ディスプレイの測定に必要な手段を包含する前記キットを対象とする。
【００８７】
本発明はまた、血管新生異常関与遺伝子のディファレンシャル・ディスプレイ測定用キットであって、標準細胞集団としての添付の配列表において配列番号：１〜配列番号：５および配列番号：２７〜配列番号：３０として特定されている配列の１つまたはそれらの断片にいずれかに対する少なくとも１つのアンチセンス配列を発現するベクターを安定的に発現する遺伝子修飾細胞株および該ディファレンシャル・ディスプレイの測定に必要な手段を包含する前記キットを対象とする。
【００８８】
特定された５つの遺伝子およびそれらのホモログが血管新生機構に関与していることの確認は、材料および方法の節に記載した方法に従って実施した。
【００８９】
この関与は、添付の図１によって説明される。
【００９０】
図１は、ヒト内皮細胞におけるベクターＧＳ−Ｖ１、ＧＳ−Ｖ２、ＧＳ−Ｖ３、ＧＳ−Ｖ４の影響下での毛細管形成について得られた結果を示す。
−  図１Ａは、ＧＳ−Ｎ１に特異的なアンチセンス転写産物をコードするＧＳ−Ｖ１によってトランスフェクトされた内皮細胞において毛細管の形成が阻害されることを示す。
−  図１Ｂは、ＧＳ−Ｎ２に特異的なアンチセンス転写産物をコードするＧＳ−Ｖ２によってトランスフェクトされた内皮細胞において毛細管の形成が阻害されることを示す。
−  図１Ｃは、ＧＳ−Ｎ３に特異的なアンチセンス転写産物をコードするＧＳ−Ｖ３によってトランスフェクトされた内皮細胞において毛細管の形成が阻害されることを示す。
−  図１Ｄは、ＧＳ−Ｎ４およびそのホモログであるＧＳ−Ｎ５に特異的なアンチセンス転写産物をコードするＧＳ−Ｖ４によってトランスフェクトされた内皮細胞において毛細管の形成が阻害されることを示す。
−  図１Ｆは、ブランクベクターによってトランスフェクトされた内皮細胞において毛細管の形成が変化しないことを示す（対照）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９１】
材料および方法
【００９２】
１．細胞の培養および血管新生試験
【００９３】
この場合、前記の４つの培養条件のもとにおいて、臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて、血管新生の制御に関与している細胞構成成分をコードする遺伝子を特定・確認する。
【００９４】
それらの内皮細胞を完全培地（クロンティックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）社のＥＧＭ−２）中で維持する。
【００９５】
モンテザーノ（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ）ら（１９８６，プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、８３（１９）：７２９７−３０１）のモデルに従ったガラス器内血管新生試験において、血管新生関与遺伝子を同定・確認するために、それらの細胞を、まず初めに、完全培地中のＩ型コラーゲンゲル上にコンフルエンスになるまで播く。つぎに、標準ＨＵＶＥＣ細胞を、貧血清で、成長因子類を含まない培地：ＥＢＭ−２＋２％血清中で培養し、試験条件下で種々の因子を添加する。
【００９６】
ＦＧＦ２：５ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で；ＶＥＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で；ＰＦ４：０．１μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの間、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの間の濃度で；ＴＮＦ−アルファ：２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で；ＩＦＮ−ガンマ：５０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは８０ｎｇ／ｍｌ〜１２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で。
【００９７】
そのときには、前記の４つの培養条件下に置かれたヒト内皮細胞を、血管新生の調節・制御に関与する細胞構成成分をコードする遺伝子を特定するために使用するのである。
【００９８】
２．血管新生因子および血管新生抑制因子
【００９９】
例として本発明の範囲内で使用した、それぞれ新生血管の形成または新生血管の阻害に関連あると確認された遺伝子の発現に対して影響のある血管新生因子および血管新生抑制因子を、以下に示す：
ＶＥＧＦ＝血管内皮細胞増殖因子
ＰＦ４＝血小板因子４
ＴＮＦ−α＝腫瘍壊死因子−アルファ
【０１００】
ＴＮＦ−アルファは、血管新生調節因子であり、生体内での血管新生を誘導できるが、ガラス器内では血管形成を阻害することもできる（フラーテル・シュレーダー（Ｆｒａｔｅｒ−Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）ら、１９８７、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）、８４（１５）：５２７７−８１；サトー（Ｓａｔｏ）ら、１９８７、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティチュート（Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ）７９（６）、１３８３−９１；ファジャード（Ｆａｊａｒｄｏ）ら、１９９２、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ）、３月、１４０（３）：５３９−４４；ニイダ（Ｎｉｉｄａ）ら、１９９５、ニューロロジカル・メディシン・アンド・カイラージャリー（Ｎｅｕｒｏｌ  Ｍｅｄ  Ｃｈｉｒ）（東京）、３５（４）：２０９−１４）。我々のガラス器内血管新生モデルでは、ＴＮＦ−アルファを、血管新生阻害条件下で用いている。
【０１０１】
３．遺伝子発現の比較
【０１０２】
その場合、ＤＮＡチップ、ＳＡＧＥ、定量的ＰＣＲによる増幅反応、サブトラクティヴ（差し引き）バンク構築のためのウイルスベクターあるいはディファレンシャル・ディスプレイを用いることにより、遺伝子発現を比較することができる。
【０１０３】
本発明に導いてくれた実験の範囲内では、本出願人は、当該遺伝子同定・確認のために、ディファレンシャル・ディスプレイ手法を優先的に利用した。
【０１０４】
ディファレンシャル・ディスプレイ
コラーゲンゲル上で種々の使用因子の存在下に培養したＨＵＶＥＣ細胞から、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキット（キアゲン社）法に従い、メーカーが推奨するプロトコールに従ったＤＮアーゼＩ消化工程を組み込んで、全ＲＮＡを調製する。
【０１０５】
全ＲＮＡからのディファレンシャル・ディスプレイは、リヤング（Ｌｉａｎｇ）とパーディー（Ｐａｒｄｅｅ）が記載している方法（１９９２、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１４；２５７（５０７２）：９６７−７）に従い、ＰＣＲによる増幅の間に同位体希釈アルファ−Ｐ３３−ＡＴＰを用いて実施し、電気泳動ゲルのオートラジオグラフィーによりバンドを視覚可能にする。
【０１０６】
すなわち、分析培養条件に応じてゲル上に示差的に存在するＤＮＡの断片を切り分け、再増幅し、プラスミドＰＧＥＭイージーベクター（プロメガ社）中にクローン化し、配列決定し、ＢＬＡＳＴバンクに照会して、特定する。
【０１０７】
４．特定された遺伝子の血管新生機構への関与の確認
【０１０８】
遺伝子の機能性の試験
第二段階では、特定された各配列の機能性を、該配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現ベクターによりトランスフェクトした内皮細胞を用いたガラス器内血管新生モデルで試験する。
【０１０９】
これらのベクターの構築のために、特定された配列の各々に特異的なプライマーを設計する。これらのプライマーを表１に示すが、それらは添付の配列表における配列番号：１９〜配列番号：２６によって特定されている。
【０１１０】
【表１】
2005530489.tif 000002
【０１１１】
これらのプライマーは、それらの末端の各々に、異なる制限酵素部位（ＳａｌＩ：ＧＴＣＧＡＣまたはＭlｕＩ：ＡＣＧＣＧＴ）を含んでいる。
【０１１２】
各遺伝子の増幅された断片を、前記プライマーを用いて、特定された遺伝子断片を含有する細菌プラスミドからＰＣＲによって取得する。
【０１１３】
これらの断片を精製し、制限酵素ＳａｌＩおよびＭｌｕＩにより消化し、やはりこれらの制限酵素により消化したｐＣｉ−ｎｅｏベクタータイプの哺乳動物発現ベクター（プロメガ社）に挿入する。
【０１１４】
各断片をアンチセンス方向に導入する。
【０１１５】
一般的に言って、本発明により血管新生機構において同定された遺伝子の機能性の証明に使用できるベクターは、クローン化された遺伝子の発現を可能ならしめるプロモーター（たとえばヒトサイトメガウイルス（ＣＭＶ）の「強力」プロモーターを挙げることができる）を含めての哺乳動物発現ベクターのすべてのシステムを含んでいる。
【０１１６】
同様に使用可能な他の構成的または誘導的発現ベクターを、網羅的なものではない以下のリストに示す：
ｐＣＩ哺乳動物発現ベクター類、発現ベクター系クローニングベクターｐＡＬＴＥＲ（Ｒ）＊−ＭＡＸ（プロメガ社）、ベクター類ｐｃＤＮＡ３．１、−／ｈｙｇｒｏ、−／Ｚｅｏ、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭＡｘ、−／Ｅ、ｐＢｕｄＣＥ４、ｐＲｃＲＳＶ、ｐＲｃＣＭＶ２、ｐＳｅｃＴａｑ２、−／ｈｙｇｒｏ分泌ベクター類、ベクターｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、ＢおよびＣ）（インビトロゲン社）、哺乳動物発現ベクターｐＩＲＥＳ、ｐＩＲＥＳ−ＥＹＦＰ、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ、ｐＣＭＶ−ＭｙｃおよびｐＣＭＶ−ＨＡ、エピトープ標識ｐＴＲＥ、ベクターＶＰ１６ミニマルドメイン（ｐｔＴＡ２、ｐｔＴＡ３およびｐｔＴＡ４）、二方向Ｔｅｔ発現ベクター類（ｐＢＩ、ｐＢＩ−ＥＧＦＰ、ｐＢＩ−Ｇ、ｐＢＩ−Ｌ）、ｐＲｅｖＴＲＥ、ｐＴＲＥ２、ｐＬＥＧＦＰ−Ｎ１レトロウイルスベクターｐＬＥＧＦＰ−Ｃ１、アデノウイルス発現系Ａｄｅｎｏ−Ｘ、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ、ｐｄ１ＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐｄ２ＥＣＦＰ−Ｎ１、ｐｄ２ＥＹＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ（−Ｃ１、−Ｃ２、−Ｃ３、−Ｎ１、−Ｎ２、−Ｎ３）、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１、−Ｎ１（クロンテック社）。
【０１１７】
そのとき、前記アンチセンス断片を含有する各ベクターは、大腸菌において生産させ、抽出し、精製し、定量する。各ベクター１μｇを、内皮細胞とともに、形質移入剤（エフェクテン、キアゲン社）の存在下に、メーカーの推奨するプロトコールに従って、インキュベートする。トランスフェクションから２４時間後、内皮細胞をトリプシン処理し、血管新生因子含有細胞外マトリックス、すなわちグラント（Ｇｒａｎｔ）らが記載しているモデル（１９８９、セル（Ｃｅｌｌ）、５８（５）、９３３−４３）によればマトリゲル、の上にひろげる。２４時間のインキュベーションののち、血管の形成を観察し、ブランクの哺乳動物発現ベクターでトランスフェクトした対照細胞と比較する。
【０１１８】
５．遺伝子配列またはそれらの断片あるいはアンチセンス配列を含有する発現ベクターを発現する安定細胞株バンクの樹立
【０１１９】
当該発現系は、ベクター中にクローン化された核酸を含有する該ベクターを安定に発現するトランスフェクト細胞を選択するための、同一ベクター内のあるいはコトランスフェクションに用いられる第二のベクター中の、対抗生物質選択マーカーを含有していることができる。
【０１２０】
この発現ベクターは、構成的発現系であっても、誘導的発現系であってもよい。
【０１２１】
以下に記載する特別な例において、特定された各遺伝子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現するための安定な細胞株が、構成的発現ベクターを用い、抗生物質存在下で選択することによって得られた。
【０１２２】
これを行うためには、上記条件下で行ったトランスフェクションの２４時間後に、ＢＡＥＣ内皮細胞をトリプシン処理し、７００μｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８（プロメガ社）の存在下に、６ウエルプレートに８００００細胞／ｍｌの割合で播く。対照のウエルには、トランスフェクトしていない細胞を播く。３時間ごとに培地を交換し、抗生物質も再添加する。８〜１０時間後に、生育抑制された細胞を除去し、抗生物質抵抗性細胞をコンフルエントな状態（２〜３週間）になったときに集め、やはり抗生物質存在下に培養フラスコへ移す。つぎに、安定細胞株を、ガラス器内での血管新生試験により、それらの血管形成能を試験する。
【０１２３】
６．結果
【０１２４】
６．１  遺伝子の特定
【０１２５】
ＧＳ−Ｎ１と名付けた核酸配列および該核酸配列ＧＳ−Ｎ１によりコードされ、配列番号：６として特定されており、アンギオパルトネリン（ａｎｇｉｏｐａｒｔｎｅｒｉｎ）と呼ばれる蛋白質は、以前には、何らかの生物学的役割をもつとは確認されておらず、ましてや血管新生過程または内皮細胞の毛細管への分化において何らかの役割をもつとは確認されていない。添付の配列表において配列番号：２〜配列番号：５により特定されているＧＳ−Ｎ２〜ＧＳ−Ｎ５と名付けた核酸配列ならびにそれらの核酸によってコードされ、添付の配列表において配列番号：７〜配列番号：１０として特定されているそれぞれの蛋白質は、今までに、血管新生過程あるいは内皮細胞の毛細管への分化において何らかの生物学的役割をもつとは確認されていなかった。これらの配列を以下に記述する。
【０１２６】
上記ディファレンシャル・ディスプレイ法によって、次のｍＲＮＡを同定・確認することができた：
−  ＧＳ−Ｎ１：添付の配列表の配列番号：１によって特定される６１６０ｂｐのｍＲＮＡ。遺伝子バンクＧＥＮＢＡＮＫの配列データベースのＢＬＡＳＴ（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール）検索により、これを受入れ番号ＡＢ０３７８５７のものであると同定できる。
【０１２７】
このｍＲＮＡの配列は、ヌクレオチド１からヌクレオチド２７７７までのコード配列をもつ。すなわち、我々は、このｍＲＮＡの翻訳によって生じる蛋白質ＧＳ−Ｐ１を確認・同定した。この蛋白質は、９２４個のアミノ酸から構成され、添付の配列表において配列番号：６として特定され、アンギオパルトネリンと呼ばれる。
【０１２８】
アンギオパルトネリンは、それぞれ添付の配列表において配列番号：２７および配列番号：２８として特定されているプロスタグランジンＦ２受容体の負の調節因子（ＰＴＧＦＲＮ）（受入れ番号ＸＭ  ０４０７０９、核酸配列：５９７５ｂｐ、蛋白質配列：５６０アミノ酸）、ヒト平滑筋細胞関連蛋白質６（ＳＭＡＰ６）（受入れ番号ＡＢ０１４７３４、核酸配列：２１９７ｂｐ、蛋白質配列：１８６アミノ酸）のホモログであり、それ自体は、無関係にＣＤ９Ｐ−１と名付けられ、スティップ（Ｓｔｉｐｐ）らによって（２００１、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２７６、４４、４０５４５−４０５５４）ＥＷＩ−Ｆと名付けなおされたプロスタグランジンＦ２アルファ受容体調節蛋白質（ＦＰＲＰ）に類似している。ＧＳ−Ｎ１の配列は、配列番号：２７および配列番号：２８の配列を含んでおり、それらと９９％の相同性を示す。
【０１２９】
ＲＰＲＰは、６つの細胞外免疫グロブリンドメインを含有する１型膜貫通糖蛋白質である。それは、最初は、それのプロスタグランジンＦ２アルファと会合でき、後者のそれの受容体との結合を阻害できる能力ゆえに同定・確認され、特徴を指摘されたものである。それは、また、７つの膜貫通ドメインを含有するＧ蛋白質と結合した蛋白質の受容体と会合し、リガンド−受容体相互作用を減少させることができる（オルリツキー（Ｏｒｌｉｃｋｙ）とノルデーン（Ｎｏｒｄｅｅｎ）、１９９６、プロスタグランジンズ・ルーコトリエンズ・アンド・エッセンシャル・ファッティー・アシッズ（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ）、５５：２６１−２６８；オルリツキーら、１９９８、ジャーナル・オブ・リピド・リサーチ（Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．）、３９巻、１１５２−１１６１）。ＦＰＬＰの発現の増大は、すでに、細胞の分化、とりわけ脂肪細胞のそれと関連付けられている（オルリツキーら、１９９８、ジャーナル・オブ・リピド・リサーチ、３９巻、１１５２−１１６１）。別個の研究が、ＣＤ９Ｐ−１またはＦＰＬＰが、蛋白質複合体中のテトラスパニン（ＴＭ４ＳＦとも呼ばれる）ファミリーの２つのメンバー、ＣＤ９およびＣＤ８１の主要なパートナーであり、ＣＤ８１あるいはＣＤ９およびＣＤ８１と特異的に会合する（Ｓ・シャラン（Ｃｈａｒｒｉｎ）ら、２００１、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ）；スティップ（Ｓｔｉｐｐ）ら、２００１、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２７６、７、４８５３−４８６２）。テトラスパニン類は、接着、遊走、共刺激、シグナル伝達、分化などの細胞の多くの機能に関連付けられており、テトラスパニン類にあるとされた種々の機能が、特定のパートナー分子との特異的会合と関係がありうる；（ル・ナウール（Ｌｅ  Ｎａｏｕｒ）ら、２０００、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８７、３１９−３２１）。
【０１３０】
蛋白質ＣＤ９は、組織分布が広く、とりわけ、種々のタイプの腫瘍中に（シ（Ｓｉ）とハーシー（Ｈｅｅｒｓｅｙ）、１９９３、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ）、５４：３７−４３；ミヤケら、１９９６、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、５６：１２４４−１２４９）ならびに内皮細胞によって形成された血管中に（ゾラ（Ｚｏｌａ）ら、１９８９、イムノロジカル・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）；６７：６３−７０）見出されている。それは、シグナル伝達、細胞接着、運動性、腫瘍の進行などの機能に関連付けられており（オザキら、１９９５、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２７０：１５１１９−１５１２４；フォーサイス（Ｆｏｒｓｙｔｈ）ら、１９９１、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、７２：２９２−２９６；アントン（Ａｎｔｏｎ）ら、１９９５、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ）、１５：５８４−５９５；ショー（Ｓｈａｗ）ら、１９９５、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２７０：２４０９２−２４０９９；イケヤマら、１９９３、ジャーナル・オブ・エクスメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ）、１７７：１２３１−１２３７）、とりわけ、血管新生の間の内皮細胞の接着および遊走に関連付けられている（クライン−ゾイヤー（Ｋｌｅｉｎ−Ｓｏｙｅｒ）ら、アーテリオスクレローシス・スロンボーシス・アンド・ヴァスキュラー・バイオロジー（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ）、２０：３６０−９）。腺癌細胞中でのＣＤ９の過剰発現は、運動性をなくさせ、転移の可能性をなくさせ（イケヤマら、１９９３、ジャーナル・オブ・エクスメンタル・メディシン、１７７：１２３１−１２３７）、それの発現は、黒色腫、肺癌、結腸癌および乳がんにおける原発腫瘍および転移の発生と反比例する（シ（Ｓｉ）とハーシー（Ｈｅｅｒｓｅｙ）、１９９３、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、５４：３７−４３；ミヤケら、１９９５、キャンサー・リサーチ、５５：４１２７−４１３１；アダチら、１９９８、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．）、１６、１３９７−１４０６；モリら、１９９８、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、４、１５０７−１５１０）。
【０１３１】
蛋白質ＣＤ９Ｐ−１（またはＦＰＬＰ）は、癌細胞株におけるＣＤ９の主要なパートナー分子であると同定・確認されている（セル（Ｓｅｒｒｕ）ら、１９９９、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ）、３４０、１０３−１１１）。
【０１３２】
蛋白質ＣＤ８１は、細胞内シグナル伝達やＢリンパ球の活性化（フィアロン（Ｆｅａｒｏｎ）とカーター（Ｃａｒｔｅｒ）、１９９５）、Ｔリンパ球の増殖調節（ミヤザキら、１９９７、エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ）、１６、４２１７−４２２５）などの種々機能に関与しているとも記載されており、それは、癌においてある役割を果すことができる。なぜなら、ＣＤ８１は、肝癌の主要原因であるＣ型肝炎ウイルスに対する可能性のある受容体である（ピレリ（Ｐｉｌｅｒｉ）ら、１９９８、サイエンス、２８２、９３８−９４１）。
【０１３３】
ＣＤ９Ｐ−１またらＦＰＲＰの正確な役割はいまだ明確ではないが、それとＣＤ９またはＣＤ８１との関連は、受容体ＣＤ９またはＣＤ８１の調節機能においての役割を示唆することができる。しかしながら、今日まで、添付の配列表において配列番号：６として特定されており、アンギオパルトネリンと呼ばれる蛋白質についても、ＰＴＧＦＲＮ蛋白質、ＣＤ９Ｐ−１／ＦＰＲＰについても、血管新生の調節におけるいかなる役割も記載されていない。
【０１３４】
−  ＧＳ−Ｎ２：添付の配列表の配列番号：２によって特定される３２６６ｂｐのｍＲＮＡ。ＧＥＮＢＡＮＫ配列データベースのＢＬＡＳＴ検索により、これを受入れ番号ＡＦ２４７７０４のものであると同定できる。
【０１３５】
このｍＲＮＡの配列は、ヌクレオチド４９からヌクレオチド７５３までのコード配列をもつ。すなわち、このｍＲＮＡの翻訳によって生じる蛋白質ＧＳ−Ｐ２が同定・確認された。この蛋白質は、２３４個のアミノ酸から構成され、添付の配列表において配列番号：７として特定されている。それは、ホメオボックスＮＫＸ３．１蛋白質と呼ばれる。
【０１３６】
蛋白質ＮＫＸ３．１は、ショウジョウバエのＮＫ−３蛋白質と密接に関連したホメオボックス蛋白質のＮＫクラスの１員である（Ｙ・キム（Ｋｉｍ）とニーレンベルク（Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇ）、１９８９、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユー・エス・エイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８６、７７１６−７７２０；ヘ（Ｈｅ）ら、１９９７、ジェノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、４３、６９−７７）。コウモリでの研究によって、胎仔および発生中の胚において、中胚葉、血管平滑筋、上皮、中枢神経系領域などの種々のタイプの組織におけるＮｋｘ３．１遺伝子の発現を示すことができている（コス（Ｋｏｓ）ら、１９９８、メカニズムズ・オブ・デヴェロップメント（Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．）、７０，２５−３４；タナカら、１９９９、メカニズムズ・オブ・デヴェロップメント、８５、１７９−１８２；ブハティア−ガウル（Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒ）ら、１９９９、ジーンズ・アンド・デヴェロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．）、１３、９６６−９７７）。成熟動物では、ＮＫＸ３．１蛋白質は主として前立腺に、より詳しくは上皮細胞に局在しており、それの発現はアンドロゲン類によって調節されている（ヘ（Ｈｅ）ら、１９９７、ジェノミックス、４３、６９−７７；プレスコット（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ）ら、１９９８、プロステイト（Ｐｒｏｓｔａｔｅ）、３５、７１−８０；シャヴォリーノ（Ｓｃｉａｖｏｌｉｎｏ）ら、１９９７、デヴェロップメンタル・ダイナミックス（Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．）、２０９、１２７−１３８；オルンスタイン（Ｏｒｎｓｔｅｉｎ）ら、２００１、ジャーナル・オブ・ユロロジー（Ｊ  Ｕｒｏｌ）、１６５（４）：１３２９−３４）。それは、前立腺の機能において重要な役割を演じているようであり、前立腺の外皮細胞の増殖を調節しているようである；ＮＫＸ３．１遺伝子は、前立腺特異的腫瘍の抑制遺伝子であると提唱されている（ブハティア−ガウル（Ｂｈａｔｉａ−Ｇａｕｒ）ら、１９９９、ジーンズ・アンド・デヴェロップメント、１３（８）：９６６−９７７）。ヒトの前立腺癌においてＮＫＸ３．１の発現がなくなっていることが、最近、腫瘍の進行と相関関係があるとされている（ボウエン（Ｂｏｗｅｎ）ら、２０００、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、６０（２１）：６１１１−５）。他方、ホメオボックス蛋白質が血管新生の調節に関与していることが報告されている（総説：ゴルスキー（Ｇｏｒｓｋｉ）とウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）、２０００、サーキュレーション・リサーチ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、８７：８６５−８７２）。
【０１３７】
しかしながら、ホメオボックス蛋白質ＮＫＸ３．１について、血管新生調節におけるいかなる役割も、今日まで記載されていない。
【０１３８】
−  ＧＳ−Ｎ３：添付の配列表の配列番号：３によって特定される６７７１ｂｐのｍＲＮＡ。ＧＥＮＢＡＮＫ配列データベースのＢＬＡＳＴ検索により、これを受入れ番号Ｕ９１５４３のものであると同定できる。
【０１３９】
このｍＲＮＡの配列は、ヌクレオチド１５１からヌクレオチド６１５３までのコード配列をもつ。すなわち、このｍＲＮＡの翻訳によって生じる蛋白質ＧＳ−Ｐ３が確認・同定された。この蛋白質は、２０００個のアミノ酸から構成され、添付の配列表において配列番号：８として特定され、ジンクフィンガーヘリカーゼと呼ばれる。
【０１４０】
蛋白質ｈＺＦＨ（ヒト・ジンクフィンガーヘリカーゼ）は、同義遺伝子に対する転写調節因子として作用することが知られているＳｎｆ２型ヘリカーゼのファミリーに属する（オーブリー（Ａｕｂｒｙ）ら、１９８８、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２５４（３）：５５８−６４）。それはまた、クロモドメインを含み、添付の配列表において配列番号：２９および配列番号：３０によって特定される蛋白質ＣＨＤ３（「クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合蛋白質３」）に対するホモログである。蛋白質ＣＨＤ３は、クロマチンの構造の変化を介して転写を抑制することにより遺伝子発現を調節できると記載されている（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら、１９９８、セル（Ｃｅｌｌ）、９５、２７８−２８９；ケーレ（Ｋｅｈｌｅ）ら、１９９８、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８２、１８９７−１９００）。今日まで、蛋白質ｈＺＦＨについても、蛋白質ＣＨＤ３についても、血管新生に関与する遺伝子の発現調節におけるいかなる役割も記載されていない。
【０１４１】
−  ＧＳ−Ｎ４：添付の配列表の配列番号：４によって特定される３０４１ｂｐのｍＲＮＡ。ＧＥＮＢＡＮＫ配列データベースのＢＬＡＳＴ検索により、これを受入れ番号ＢＣ００１５７１のものであると同定できる。
【０１４２】
このｍＲＮＡの配列は、ヌクレオチド６７からヌクレオチド２８０８までのコード配列をもつ。すなわち、このｍＲＮＡの翻訳によって生じる蛋白質ＧＳ−Ｐ４が確認・同定された。この蛋白質は、９１３個のアミノ酸から構成され、添付の配列表において配列番号：９として特定され、真核生物翻訳開始因子サブユニット８（１１０ｋＤ）（ＥＩＦ３Ｓ８）と呼ばれる。
【０１４３】
この配列ＧＳ−Ｎ４は、つぎの配列とホモログである：
−  ＧＳ−Ｎ５：添付の配列表の配列番号：５によって特定される１５０７ｂｐのｍＲＮＡ。ＧＥＮＢＡＮＫ配列データベースのＢＬＡＳＴ検索により、これを受入れ番号ＢＣ０００５３３のものであると同定できる。
【０１４４】
このｍＲＮＡの配列は、ヌクレオチド４０７からヌクレオチド１３８４までのコード配列をもつ。すなわち、このｍＲＮＡの翻訳によって生じる蛋白質ＧＳ−Ｐ５が確認・同定された。この蛋白質は、３２５個のアミノ酸から構成され、添付の配列表において配列番号：１０として特定され、真核生物翻訳開始因子サブユニット８（１１０ｋＤ）類似蛋白質と呼ばれる。
【０１４５】
サイズが６５０ｋＤのより大きい蛋白質合成開始因子である真核生物翻訳開始因子３（ＥＩＦ３）は、サブユニット８（１１０ｋＤ）を含めて（アサノら、１９９７、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７２、１１０１−１１０９）少なくとも９つのペプチドサブユニットから構成されている（ハーシー（Ｈｅｒｓｈｅｙ）ら、１９９６、ビオシミー（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ）、７８、９０３−９０７）。ＥＩＦ３は、蛋白質合成開始過程において、とりわけ開始複合体４０Ｓ形成のためのリボソーム４０Ｓサブユニットへの開始メチオニルｔＲＮＡおよびｍＲＮＡの結合において、中心的役割を演じる（メリック（Ｍｅｒｒｉｃｋ）とハーシー（Ｈｅｒｓｅｙ）、１９９６、真核生物蛋白質合成の経路および機構。ＪＷＢ・ハーシー、ＭＢ・マシューズ（Ｍａｔｈｅｗｓ）、Ｎ・ゾネンバーグ（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ）編、翻訳制御（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）中。コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・プレス；１９９６：３１−６７）。ＥＩＦ３は、他の多くの翻訳成分との相互作用による開始において中心的役割を演じるようである（フォルンロッハー（Ｖｏｒｎｌｏｃｈｅｒ）ら、１９９９、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２７４巻２４号、１６８０２−１６８１２）。各々のサブユニットの機能はいまだあまり知られていない。ｐ１５０、ｐ１７０など、いくつかのサブユニットの発現レベルの上昇が腫瘍において検出されており、ｐ１７０は、翻訳開始機能に加えて、他の役割も果すと提唱されている（リン（Ｌｉｎ）ら、２００１、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、８０（４）：４８３−９０；ピンケイラ（Ｐｉｎｃｈｅｉｒａ）ら、２０００、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、８０（６）：４１０−８）。サブユニット８の過剰発現も、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）ら（２０００、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｎｒａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、１５７：１５９７−１６０４）によって、生殖細胞腫瘍において明らかにされており、このことは、普通には細胞の増殖および分裂の増進に至らしめる翻訳増強によっての腫瘍発生におけるこのサブユニットの役割を示唆している。
【０１４６】
ＥＩＦ３のサブユニット８あるいは類似の蛋白質が血管新生調節に関与するということは、今日まで、なんら記載されていない。
【０１４７】
上に特定したｍＲＮＡ類の発現が、血管新生と同義である毛細管形成時にヒト内皮細胞において観察され、血管新生抑制因子の作用により阻害される。
【０１４８】
本出願人は、これらのｍＲＮＡの各々に対応する遺伝子の発現増大が、それらの内皮細胞による新生血管の形成阻害を伴うことを明らかにした。
【０１４９】
すなわち、ある血管新生因子による刺激に続いて新生血管を形成するヒト内皮細胞は、このｍＲＮＡのきわめて弱い発現を示すが、同じ血管新生因子により刺激され、血管新生抑制因子の存在下（そこでは血管新生が阻害される）に置かれた同じヒト内皮細胞および／または血管新生抑制因子のみによって刺激された同じ内皮細胞が、この遺伝子の発現増大を示す（表２に示したように）。
【０１５０】
これらの結果は、これらの遺伝子の各々の発現とヒト内皮細胞の血管新生抑制状態（すなわち血管新生阻害）との間に直接的相関関係があることを示す。
【０１５１】
【表２】
2005530489.tif 000003
【０１５２】
６．２  特定された遺伝子の血管新生調節における役割の確認。
【０１５３】
さらに、ヒト内皮細胞による新生血管形成におけるこれらの遺伝子の機能的役割も明らかにされた。
【０１５４】
すなわち、添付の配列表において配列番号：１１〜配列番号：１４の配列によって特定されたヌクレオチド配列のうちから選ばれた、特定された遺伝子の各々に特異的なヌクレオチド配列を、発現ベクターであるｐＣＩ−ｎｅｏベクターに、アンチセンス方向に導入した。
【０１５５】
生じたベクター、すなわち添付の配列表において配列番号：１５〜配列番号：１８の配列によって特定され、ＧＳ−Ｖ１〜ＧＳ−Ｖ４と名付けたベクターを用い、ヒト内皮細胞をこのベクターによってトランスフェクトすることによって、これらの細胞でのこのｍＲＮＡをコードする遺伝子の発現を抑制した。
【０１５６】
そのとき、ヒト内皮細胞を血管新生因子類によって刺激した。配列ＧＳ−Ｎ１〜ＧＳ−Ｎ５の各々について、アンチセンス配列および相当するベクターを用いて得られた結果は、つぎのことを示している：
配列番号：１〜配列番号：５として特定されている遺伝子の発現抑制が、ヒト内皮細胞による新生血管形成を阻害する。
【０１５７】
それらの配列の各々について、相当するアンチセンス配列およびベクターを用いて得られた、下記表３に示した結果を、添付の図１（図１Ａ〜１Ｅ）に示す。
【０１５８】
【表３】
2005530489.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】ヒト内皮細胞について、ベクターＧＳ−Ｖ１、ＧＳ−Ｖ２、ＧＳ−Ｖ３、ＧＳ−Ｖ４発現の影響下での毛細管形成について得られた結果を示す。
【配列表】
2005530489.tif 000005
2005530489.tif 000006
2005530489.tif 000007
2005530489.tif 000008
2005530489.tif 000009
2005530489.tif 000010
2005530489.tif 000011
2005530489.tif 000012
2005530489.tif 000013
2005530489.tif 000014
2005530489.tif 000015
2005530489.tif 000016
2005530489.tif 000017
2005530489.tif 000018
2005530489.tif 000019
2005530489.tif 000020
2005530489.tif 000021
2005530489.tif 000022
2005530489.tif 000023
2005530489.tif 000024
2005530489.tif 000025
2005530489.tif 000026
2005530489.tif 000027
2005530489.tif 000028
2005530489.tif 000029
2005530489.tif 000030
2005530489.tif 000031
2005530489.tif 000032
2005530489.tif 000033
2005530489.tif 000034
2005530489.tif 000035
2005530489.tif 000036
2005530489.tif 000037
2005530489.tif 000038
2005530489.tif 000039
2005530489.tif 000040
2005530489.tif 000041
2005530489.tif 000042
2005530489.tif 000043
2005530489.tif 000044
2005530489.tif 000045
2005530489.tif 000046
2005530489.tif 000047
2005530489.tif 000048
2005530489.tif 000049
2005530489.tif 000050
2005530489.tif 000051
2005530489.tif 000052
2005530489.tif 000053
2005530489.tif 000054
【図１】
2005530489.tif 000055
【国際調査報告】
2005530489.tif 000056
2005530489.tif 000057
2005530489.tif 000058
2005530489.tif 000059
2005530489.tif 000060
2005530489.tif 000061
2005530489.tif 000062
2005530489.tif 000063
2005530489.tif 000064
2005530489.tif 000065
2005530489.tif 000066
2005530489.tif 000067
2005530489.tif 000068