(57)【要約】本発明は、分離した又は組換えフィターゼ酵素を提供する。一態様においては、このフィターゼは、大腸菌の野生型appAの修飾により作製される。この酵素は組換えホスト細胞から産生させることができる。本発明のフィターゼは、所望される場合にフィターゼの消化を援助するために使用し得る。特に、本発明のフィターゼはフィチン酸に富む成分の栄養価を高めるために食品中で使用し得る。本発明のフィターゼは耐熱性及び/又は熱安定性であり得る。また、フィターゼをコードしている変異ポリヌクレオチドを得る方法と高温又は低温で熱安定性又は耐熱性を有するフィターゼを得る方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%の核酸配列を含む分離した又は組換え核酸であって、該核酸がフィターゼ活性を有する少なくとも1種のポリぺプチドをコードし、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査による分析で求められる、前記分離した又は組換え核酸。
【請求項２】
該核酸配列の少なくとも約200残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%である、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項３】
該核酸配列の少なくとも約300残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%である、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項４】
該核酸配列の少なくとも約400残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%である、請求項3記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項５】
該核酸配列の少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも99%である、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項６】
該核酸配列の少なくとも約200残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも99%である、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項７】
該核酸配列の少なくとも約300残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも99%である、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項８】
該核酸配列の少なくとも約400残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも99%である、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項９】
該核酸配列が、配列番号1に示された配列をもつ、請求項8記載の分離した又は組換え核酸。
【請求項１０】
該核酸配列が、配列番号2に示された配列をもつポリぺプチドをコードしている、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項１１】
該配列比較アルゴリズムがBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、ろ過設定がblastall -p blastp -d "nr pataa"  -F Fに設定され、他の選択肢はすべてデフォルトに設定される、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項１２】
フィターゼ活性がフィチン酸塩(myo-イノシトール六リン酸)のイノシトールと無機リン酸への触媒作用を含んでいる、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項１３】
該フィターゼ活性がフィチン酸塩(myo-イノシトール六リン酸)の加水分解を含んでいる、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項１４】
該フィターゼ活性が耐熱性である、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項１５】
約40℃〜約70℃の温度範囲を含む条件下で該ポリぺプチドがフィターゼ活性を保持する、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項１６】
約37℃より高く約90℃までの範囲の温度にさらした後に該ポリぺプチドがフィターゼ活性を保持する、請求項1記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項１７】
約37℃より高く約50℃までの範囲の温度にさらした後に該ポリぺプチドがフィターゼ活性を保持する、請求項16記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項１８】
配列番号1に示された核酸配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列を含む分離した又は組換え核酸であって、該核酸がフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている、分離した又は組換え核酸。
【請求項１９】
長さが少なくとも約100残基である、請求項18記載の前記分離した又は組換え核酸。
【請求項２０】
長さが少なくとも約200残基である、請求項19記載の分離した又は組換え核酸。
【請求項２１】
長さが少なくとも約300残基である、請求項20記載の分離した又は組換え核酸。
【請求項２２】
ストリンジェント条件には、約65℃の温度で約15分間0.2X SSC中での洗浄を含んでいる洗浄ステップが含まれる、請求項18記載の分離した又は組換え核酸。
【請求項２３】
フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を同定するための核酸プローブであって、該プローブが配列番号1に示された配列からなる群より選ばれた配列の少なくとも10の連続した塩基を含み、結合又はハイブリダイゼーションによって該核酸を同定する、前記核酸プローブ。
【請求項２４】
配列番号1に示される配列の少なくとも約10〜50、約20〜60、約30〜70、約40〜80、又は約60〜100の連続した塩基を含むオリゴヌクレオチドを含んでいる、請求項23記載の核酸プローブ。
【請求項２５】
フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を同定するための核酸プローブであって、該プローブが少なくとも100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%である核酸を含み、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査により求められる、前記核酸プローブ。
【請求項２６】
該プローブが配列番号1に示される核酸配列の少なくとも10〜50、約20〜60、約30〜70、約40〜80、又は約60〜100の連続した塩基を含むオリゴヌクレオチドを含んでいる、請求項25記載の核酸プローブ。
【請求項２７】
該プローブの配列番号1に示される核酸配列に対する配列同一性が少なくとも99％である、請求項25記載の核酸プローブ。
【請求項２８】
該プローブが配列番号1に示される配列のサブセットを含んでいる、請求項27記載の核酸プローブ。
【請求項２９】
フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を増幅するための増幅プライマー配列対であって、該プライマー対が配列番号1に示される核酸配列を増幅することができる、前記増幅プライマー配列対。
【請求項３０】
該増幅プライマー配列対のそれぞれの部分が該配列の少なくとも約10〜50の連続した塩基を含むオリゴヌクレオチドを含んでいる、請求項29記載の核酸プローブ。
【請求項３１】
フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を増幅する方法であって、配列番号1に示される核酸配列を増幅することができる増幅プライマー配列対を有する鋳型核酸を増幅するステップを含む、前記方法。
【請求項３２】
少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる核酸配列を含む核酸、又は配列番号1、又はそのサブ配列に示される核酸に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含んでいる発現カセット。
【請求項３３】
少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる核酸配列を含む核酸、又は配列番号1、又はそのサブ配列に示される核酸に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含んでいる発現カセット。
【請求項３４】
請求項33に示されるベクターを含むクローニング伝達体であって、該クローニング伝達体がウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ又は人工染色体を含む、前記クローニング伝達体。
【請求項３５】
該ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターを含む、請求項34記載のクローニング伝達体。
【請求項３６】
細菌の人工染色体(BAC)、プラスミド、バクテリオファージP1由来ベクター(PAC)、酵母の人工染色体(YAC)、哺乳動物の人工染色体(MAC)を含んでいる請求項34記載のクローニング伝達体。
【請求項３７】
ベクターを含む形質転換細胞であって、該ベクターが、少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸配列、又は、配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含む、前記形質転換細胞。
【請求項３８】
少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸配列を含む核酸、又は、配列番号1、又はそのサブ配列に示される核酸配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含む形質転換細胞。
【請求項３９】
該細胞が細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は植物細胞である、請求項38記載の形質転換細胞。
【請求項４０】
少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸配列、又は、配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４１】
該動物がマウスである、請求項40記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４２】
少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸配列、又は、配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含むトランスジェニック植物。
【請求項４３】
該植物がトウモロコシ植物、ジャガイモ植物、トマト植物、小麦植物、脂肪種子植物、なたね植物、大豆植物又はタバコ植物である、請求項42記載のトランスジェニック非ヒト植物。
【請求項４４】
少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸配列、又は、配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含むトランスジェニック種子。
【請求項４５】
該種子がトウモロコシ種子、コムギ粒、脂肪種子、なたね、大豆種子、パーム核、ヒマワリ種子、ごま種子、落花生又はタバコ植物種子である、請求項44記載のトランスジェニック種子。
【請求項４６】
少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸配列、又は、配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸に対して相補的な核酸配列又はストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
長さが10〜50塩基、約20〜60塩基、約30〜70塩基、約40〜80塩基、又は約60〜100塩基である、請求項46記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
細胞においてフィターゼメッセージの翻訳を阻止する方法であって、少なくとも100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる核酸配列、又は、配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸に対して相補的な核酸配列又はストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを該細胞に投与するか又は該細胞中で発現させるステップを含む、前記方法。
【請求項４９】
少なくとも約100残基の領域について配列番号2に対する配列同一性が少なくとも約98%のアミノ酸配列、又は(i)少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる配列、又は(ii)配列番号1に示される核酸に対してストリンジェント条件下にハイブリダイズする配列を含む核酸によってコードされたポリぺプチドを含む分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５０】
該ポリぺプチドがフィターゼ活性を有する、請求項49記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５１】
該フィターゼ活性がフィチン酸塩(myo-イノシトール六リン酸)の加水分解を含んでいる、請求項50の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５２】
該フィターゼ活性が耐熱性である、請求項50記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５３】
フィターゼ活性が熱安定性である、請求項50記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５４】
少なくとも約200残基の領域について配列番号2に対する該ポリぺプチド配列の配列同一性が少なくとも98%である、請求項49記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５５】
少なくとも約300残基の領域について配列番号2に対する該ポリぺプチド配列の配列同一性が少なくとも98％である、請求項54記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５６】
少なくとも約400残基の領域について配列番号2に対する該ポリぺプチド配列の配列同一性が少なくとも98%である、請求項55記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５７】
少なくとも約100残基の領域について配列番号2に対する該アミノ酸配列の配列同一性が少なくとも99%である、請求項49記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５８】
少なくとも約200残基の領域について該アミノ酸配列の配列番号2に対する配列同一性が少なくとも99%である、請求項57記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項５９】
少なくとも約300残基の領域について配列番号2に対する該アミノ酸配列の配列同一性が少なくとも99%である、請求項58記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６０】
該アミノ酸配列が配列番号2に示された配列をもつ、請求項59記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６１】
ポリぺプチドがフィターゼ活性を有し、シグナル配列を欠き、少なくとも約100残基について配列番号2に対する配列同一性が少なくとも98%であるアミノ酸配列、又は(i)少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる配列、又は(ii)配列番号1に示される核酸に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸でコードされたポリぺプチドを含んでいる、分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６２】
該フィターゼ活性が約37℃〜約50℃、約50℃〜約70℃又は約70℃〜約90℃の範囲の温度に加熱した場合に熱安定性を含んでいる、請求項53記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６３】
該熱安定性フィターゼ活性が約37℃において約100〜約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含んでいる、請求項62記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６４】
該熱安定性フィターゼ活性が約500〜約750単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含んでいる、請求項63記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６５】
該熱安定性フィターゼ活性が約37℃において約500〜約1200単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含んでいる、請求項53記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６６】
該熱安定性フィターゼ活性が約37℃において約750〜約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含んでいる、請求項65記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６７】
約37℃〜約90℃の範囲の高温に加熱した後、該フィターゼ活性が耐熱性である、請求項52記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６８】
約37℃〜約70℃の範囲の温度に加熱した後、該フィターゼ活性が耐熱性である、請求項67記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項６９】
高温に加熱した後、該耐熱性が37℃における該フィターゼの該比活性の少なくとも半分の保持を含んでいる、請求項67記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項７０】
高温に加熱した後、該耐熱性が37℃における約500〜約1200単位/mgタンパク質の範囲の比活性の保持を含んでいる、請求項67記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項７１】
該フィターゼが少なくとも1つのグリコシル化部位を含んでいる、請求項49記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項７２】
グリコシル化がN結合グリコシル化である、請求項71記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項７３】
P.パストリス又はS.ポンベ中で発現した後、フィターゼがグリコシル化される、請求項49記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項７４】
該ポリぺプチドが約pH 5を含む条件下でフィターゼ活性を保持する、請求項50記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項７５】
該ポリぺプチドが約pH 4.5を含む条件下でフィターゼ活性を保持する、請求項50記載の分離した又は組換えポリぺプチド。
【請求項７６】
請求項49に示されるポリぺプチドを含むタンパク質製剤であって、液体、固体又はゲルを含む、前記タンパク質製剤。
【請求項７７】
請求項49記載のポリぺプチドと第2ドメインを含むヘテロ二量体。
【請求項７８】
該第2ドメインがポリぺプチドであり、該ヘテロ二量体が融合タンパク質である、請求項77記載のヘテロ二量体。
【請求項７９】
該第2ドメインがエピトープである、請求項78記載のヘテロ二量体。
【請求項８０】
該第2ドメインがタグ標識である、請求項77記載のヘテロ二量体。
【請求項８１】
フィターゼ活性を有する固定化ポリぺプチドであって、該ポリぺプチドが請求項49又は請求項77記載の配列を含んでいる、前記固定化ポリぺプチド。
【請求項８２】
該フィターゼが細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ又は毛管上に固定化されている、請求項81記載の固定化ポリぺプチド。
【請求項８３】
請求項49又は請求項77記載の固定化ポリぺプチドを含むアレイ。
【請求項８４】
請求項1又は請求項18記載の固定化核酸を含むアレイ。
【請求項８５】
請求項49記載のポリぺプチド又は請求項1又は請求項18記載の核酸によってコードされたポリぺプチドに特異的に結合する分離した又は組換え抗体。
【請求項８６】
該抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項85記載の分離した又は組換え抗体。
【請求項８７】
請求項49記載のポリぺプチド又は請求項1又は請求項18記載の核酸によってコードされたポリぺプチドに特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマ。
【請求項８８】
請求項49記載のポリぺプチド又は請求項1又は請求項18記載の核酸によってコードされたポリぺプチドを含む動物用栄養補助食品。
【請求項８９】
該ポリぺプチドがグリコシル化されている、請求項88記載の栄養補助食品。
【請求項９０】
請求項49記載のポリぺプチド又は請求項1又は請求項18記載の核酸によってコードされたポリぺプチドを含む可食用酵素送達マトリックス。
【請求項９１】
該送達マトリックスがペレットを含んでいる、請求項90記載の可食用酵素送達マトリックス。
【請求項９２】
該ポリぺプチドがグリコシル化されている、請求項90記載の可食用酵素送達マトリックス。
【請求項９３】
該フィターゼ活性が耐熱性である、請求項90記載の可食用酵素送達マトリックス。
【請求項９４】
該フィターゼ活性が熱安定性である、請求項90記載の可食用酵素送達マトリックス。
【請求項９５】
顆粒状可食用担体と請求項49記載のポリぺプチド又は請求項1又は請求項18記載の核酸によってコードされたポリぺプチドを含む可食用ペレットであって、該ポリぺプチドがフィターゼ活性を含んでいる、可食用ペレット。
【請求項９６】
配列番号2に示されるアミノ酸配列の少なくとも30の連続した連続したアミノ酸を有する組換えフィターゼタンパク質又はその保存的変異体と可食用担体を含んでいる食料を含む飼料組成物。
【請求項９７】
該フィターゼタンパク質がグリコシル化されている、請求項96記載の飼料組成物。
【請求項９８】
該フィターゼタンパク質が耐熱性又は熱安定性である、請求項97記載の飼料組成物。
【請求項９９】
該食料がペレット形、丸剤形又は錠剤形で製造されている、請求項96記載の飼料組成物。
【請求項１００】
該食料がポリマー被覆添加剤を用いて製造されている、請求項96記載の飼料組成物。
【請求項１０１】
該食料が顆粒剤形で製造されている、請求項96記載の飼料組成物。
【請求項１０２】
該食料が噴霧乾燥によって製造されている、請求項96記載の飼料組成物。
【請求項１０３】
請求項49記載のポリぺプチド又は請求項1又は請求項18記載の核酸によってコードされたポリぺプチドを含む大豆ミールであって、該ポリぺプチドがフィターゼ活性を含んでいる、前記大豆ミール。
【請求項１０４】
フィターゼ活性を有するポリぺプチドを分離又は同定する方法であって、
(a) 請求項85記載の抗体を準備するステップと、
(b) ポリぺプチドを含む試料を準備するステップと、
(c) ステップ(b)の該試料とステップ(a)の該抗体とを該抗体が該ポリぺプチドに特異的結合し得る条件下で接触させ、よってフィターゼを分離又は同定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１０５】
抗フィターゼ抗体をつくる方法であって、請求項1又は請求項18記載の核酸を体液性免疫応答を生じるのに十分な量で非ヒト動物に投与し、よって抗フィターゼ抗体をつくるステップを含む、前記方法。
【請求項１０６】
組換えポリぺプチドを作製する方法であって、
(a) プロモーターに作用可能に結合した核酸を準備し、該核酸が請求項1又は請求項18記載の配列を含んでいるステップと、
(b) ステップ(a)の該核酸を該ポリぺプチドの発現を可能にする条件下で発現させ、よって組換えポリぺプチドを作製するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１０７】
ホスト細胞をステップ(a)の該核酸で形質転換し、続いてステップ(a)の該核酸を発現させ、よって形質転換細胞中で組換えポリぺプチドを作製するステップを更に含んでいる、請求項106記載の方法。
【請求項１０８】
フィターゼ活性を有するポリぺプチドを同定する方法であって、
(a) 請求項49記載のポリぺプチド又は請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを準備するステップと、
(b) フィターゼ基質を準備するステップと、
(c) ステップ(a)の該ポリぺプチド又はその断片又は変異体とステップ(b)の該基質とを接触させ、基質の量の増加と反応産物の量の減少を検出し、該基質の量の減少又は該反応産物の量の増加によりフィターゼ活性を有するポリぺプチドが検出されるステップと
を含む、前記方法。
【請求項１０９】
フィターゼ基質を同定する方法であって、
(a) 請求項49記載のポリぺプチド又は請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを準備するステップと、
(b) 試験基質を準備するステップと、
(c) ステップ(a)の該ポリぺプチド又はその断片又は変異体とステップ(b)の該試験基質とを接触させ、基質の量の増加と反応産物の量の減少を検出し、該基質の量の減少又は該反応産物の量の増加により該試験基質がフィターゼ基質として同定されるステップと
を含む、前記方法。
【請求項１１０】
化合物がポリぺプチドに特異的に結合するかを求める方法であって、
(a) 核酸又は該核酸を含むベクターを該核酸をポリぺプチドに翻訳するのに許容的な条件下で発現させるステップであって、該核酸が請求項1又は請求項18記載の配列をもつ前記ステップ、又は請求項49記載のポリぺプチドを準備するステップと、
(b) 該ポリぺプチドと該試験化合物とを接触させるステップと、
(c) 該試験化合物が該ポリぺプチドに特異的に結合するかを求め、よって該化合物が該ポリぺプチドに特異的に結合することを求めるステップと
を含む、前記方法。
【請求項１１１】
フィターゼ活性のモジュレータを同定する方法であって、
(a) 請求項49記載のフィターゼポリぺプチド又は請求項1又は請求項18記載の核酸によってコードされたフィターゼポリぺプチドを準備するステップと、
(b) 試験化合物を準備するステップと、
(c) ステップ(a)の該ポリぺプチドとステップ(b)の該試験化合物とを接触させ、該フィターゼの活性を測定し、該試験化合物の不在下の該活性と比較した該試験化合物の存在下に測定した該フィターゼ活性の変化により該試験化合物が該フィターゼ活性をモジュレートすることが求められるステップと
を含む、前記方法。
【請求項１１２】
該フィターゼ活性が、フィターゼ基質を準備しかつ該基質の量の増加又は反応産物の量の減少を検出することにより測定される、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
基質又は該試験化合物を含まない反応産物の量と比較した該基質の量の減少又は該試験化合物を含む該反応産物の量の増加により該試験化合物がフィターゼ活性のアクチベータとして同定される、請求項112記載の方法。
【請求項１１４】
基質又は該試験化合物を含まない反応産物のと比較した該試験化合物を含む該基質の量の増加又は該反応産物の量の減少により該試験化合物のフィターゼ活性阻害剤として同定される、請求項112記載の方法。
【請求項１１５】
プロセッサとデータ記憶デバイスを含むコンピュータシステムであって、前記データ記憶デバイスによってポリぺプチド配列又は核酸配列が記憶されており、該ポリぺプチド配列が請求項49記載の配列、又はその配列を含み、該核酸が請求項1又は請求項18記載の配列又はそのサブ配列を含んでいる、前記コンピュータシステム。
【請求項１１６】
配列比較アルゴリズムと、少なくとも1つの参照配列が記憶されているデータ記憶デバイス更に含む、請求項115記載のコンピュータシステム。
【請求項１１７】
該配列比較アルゴリズムが、多型性を表示するコンピュータプログラムを含む、請求項116記載のコンピュータシステム。
【請求項１１８】
前記配列内に1つ以上の特徴を同定するアイデンティファイアを更に含んでいる、請求項115記載のコンピュータシステム。
【請求項１１９】
ポリぺプチド配列又は核酸配列が記憶されたコンピュータ読出し媒体であって、該ポリぺプチド配列が請求項49記載の配列又はそのサブ配列を含み、該核酸が請求項1又は請求項18記載の配列又はそのサブ配列を含む、前記コンピュータ読出し媒体。
【請求項１２０】
配列内の特徴を同定する方法であって、
(a) 該配列を、配列内の1以上の特徴を同定するコンピュータプログラムを用いて読み出すステップであって、該配列がポリぺプチド配列又は核酸配列を含み、該ポリぺプチド配列が請求項49記載の配列又はそのサブ配列を含み、該核酸が請求項1又は請求項18記載の配列又はそのサブ配列を含んでいる、前記ステップと、
(b) 該配列内の1以上の特徴を該コンピュータプログラムにより同定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１２１】
第1配列と第2配列とを比較する方法であって、
(a) 該第1配列と該第2配列を、配列を比較するコンピュータプログラムを用いることにより読み出すステップであって、該第1配列がポリぺプチド配列又は核酸配列を含み、該ポリぺプチド配列が請求項49記載の配列又はそのサブ配列を含み、該核酸が請求項1又は請求項18記載の配列又はそのサブ配列を含んでいる、前記ステップと、
(b) 該第1配列と該第2配列間の違いを該コンピュータプログラムにより求めるステップと
を含む、前記方法。
【請求項１２２】
該第1配列と該第2配列間の違いを求めるステップが多型性を同定するステップを更に含む、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
配列内の1つ以上の特徴を同定するアイデンティファイアを更に含んでいる、請求項121記載の方法。
【請求項１２４】
該第1配列をコンピュータプログラムを用いて読み出し、該配列内の1つ以上の特徴を同定するステップを含む、請求項121記載の方法。
【請求項１２５】
環境的試料からフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を分離又は回収する方法であって、
(a) フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を増幅するための増幅プライマー配列を準備するステップであって、該プライマー対が配列番号1、又はそのサブ配列を増幅することができる前記ステップと、
(b) 該環境的試料から核酸を分離するか又は該環境的試料を該試料中の核酸が該増幅プライマー対に対するハイブリダイゼーションに利用できるように処理するステップと、
(c) ステップ(b)の該核酸とステップ(a)の該増幅プライマー対とを合わせ、該環境的試料からの核酸を増幅させ、よって環境的試料からフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を分離又は回収するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１２６】
該増幅プライマー配列対のそれぞれの部分が配列番号1記載の配列の少なくとも約10〜50の連続した塩基を含んでいるオリゴヌクレオチドを含む、請求項125記載の方法。
【請求項１２７】
環境的試料からフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を分離又は回収する方法であって、
(a) 請求項1又は請求項18記載の配列、又はそのサブ配列を含むポリヌクレオチドプローブを準備するステップと、
(b) 該環境的試料から核酸を分離するか又は該環境的試料を該試料中の核酸がステップ(a)のポリヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションに利用できるように処理するステップと、
(c) ステップ(b)の分離した該核酸又は処理した該環境的試料とステップ(a)の該ポリヌクレオチドプローブとを合わせるステップと、
(d) ステップ(a)のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリッドする核酸を分離し、よって土壌試料からフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を分離又は回収するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１２８】
該環境的試料が水の試料、液体の試料、土壌の試料、空気の試料又は生体の試料を含む、請求項127記載の方法。
【請求項１２９】
該生体の試料が細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞に由来する、請求項128記載の方法。
【請求項１３０】
フィターゼをコードしている核酸の変異体を作成する方法であって、
(a) 請求項1又は請求項18記載の配列を含んでいる鋳型核酸を準備するステップと、
(b) 該鋳型配列、又はその組合わせにおいて少なくとも1つ以上のヌクレオチドを修飾、欠失又は付加して該鋳型核酸の変異体を作成するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１３１】
該変異核酸を発現させて変異フィターゼポリぺプチドを産生するステップを更に含む、請求項130記載の方法。
【請求項１３２】
該修飾、付加又は欠失が、誤りがちなPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アセンブリPCR、性的PCR変異導入、生体内変異導入、カセット変異導入、再帰的集合変異導入、指数的集合変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)及びその組合わせからなる群より選ばれた方法によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１３３】
該修飾、付加又は欠失が、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップドデュプレックス変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠失ホスト株変異導入、化学変異導入、放射性物質変異導入、欠失変異導入、制限選択変異導入、制限純化変異導入、人工遺伝子合成、集合変異導入、キメラ核酸多量体生成及びその組合わせからなる群より選ばれた方法によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１３４】
該修飾、付加又は欠失が誤りがちなPCRによって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１３５】
該修飾、付加又は欠失がシャッフリングによって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１３６】
該修飾、付加又は欠失がオリゴヌクレオチド特異的変異導入によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１３７】
該修飾、付加又は欠失がアセンブリPCRによって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１３８】
該修飾、付加又は欠失が性的PCR変異導入によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１３９】
該修飾、付加又は欠失が生体内変異導入によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１４０】
該修飾、付加又は欠失がカセット変異導入によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１４１】
該修飾、付加又は欠失が再帰的集合変異導入によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１４２】
該修飾、付加又は欠失が指数的集合変異導入によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１４３】
該修飾、付加又は欠失が部位特異的変異導入によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１４４】
該修飾、付加又は欠失が遺伝子リアセンブリによって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１４５】
該修飾、付加又は欠失が合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１４６】
該修飾、付加又は欠失が遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)によって導入される、請求項130記載の方法。
【請求項１４７】
該鋳型核酸によってコードされたフィターゼとは活性が変わった又は異なったフィターゼ又は安定性が変わった又は異なったフィターゼが産生されるまで反復される、請求項130記載の方法。
【請求項１４８】
該変異フィターゼポリぺプチドが耐熱性であり、該フィターゼが高温にさらされた後に活性が残っている、請求項131記載の方法。
【請求項１４９】
鋳型核酸によってコードされた該フィターゼと比較して該変異フィターゼポリぺプチドのグリコシル化が高められた、請求項131記載の方法。
【請求項１５０】
該変異フィターゼポリぺプチドが高温下でフィターゼ活性を有し、該鋳型核酸によってコードされた該フィターゼが該高温下で活性でない、請求項131記載の方法。
【請求項１５１】
該鋳型核酸とはコドン使用が変わったフィターゼコード配列が作製されるまで反復される、請求項130記載の方法。
【請求項１５２】
該鋳型核酸とはメッセージ発現又は安定性レベルが高い又は低いフィターゼ遺伝子が作製されるまで反復される、請求項130記載の方法。
【請求項１５３】
ホスト細胞において発現を増強させるためにフィターゼをコードしている核酸内のコドンを修飾する方法であって、
(a) 請求項1又は請求項18記載の配列を含むフィターゼをコードしている核酸を準備するステップと、
(b) ステップ(a)の該核酸内の全く好ましくない又はより好ましくないコドンを同定し、置換される該コドンと同じアミノ酸をコードしている好ましく又は中立的に用いられるコドンで置換し、好ましいコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過剰に示されるコドンであり、全く好ましくない又はより好ましくないコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過少に示されるコドンであり、よってホスト細胞において発現を増強させるために該核酸を修飾するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１５４】
フィターゼをコードしているコドンを修飾する方法であって、
(a) 請求項1又は請求項18記載の配列を含むフィターゼをコードしている核酸を準備するステップと、
(b) ステップ(a)の該核酸内のコドンを同定し、置換される該コドンと同じアミノ酸をコードしている異なるコドンで置換し、よってフィターゼをコードしている核酸内のコドンを修飾するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１５５】
ホスト細胞において発現を増強させるためにフィターゼをコードしている核酸内のコドンを修飾する方法であって、
(a) 請求項1又は請求項18記載の配列を含むフィターゼをコードしている核酸を準備するステップと、
(b) ステップ(a)の該核酸内の全く好ましくない又はより好ましくないコドンを同定し、置換される該コドンと同じアミノ酸をコードしている好ましく又は中立的に用いられるコドンで置換し、好ましいコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過剰に示されるコドンであり、全く好ましくない又はより好ましくないコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過少に示されるコドンであり、よってホスト細胞において発現を増強させるために該核酸を修飾するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１５６】
ホスト細胞において発現を減少させるためにフィターゼをコードしている核酸内のコドンを修飾する方法であって、
(a) 請求項1又は請求項18記載の配列を含むフィターゼをコードしている核酸を準備するステップと、
(b) ステップ(a)の該核酸内の少なくとも1つの好ましいコドンを同定し、置換される該コドンと同じアミノ酸をコードしている全く好ましくない又はより好ましくないコドンで置換し、好ましいコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過剰に示されるコドンであり、全く好ましくない又はより好ましくないコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過少に示されるコドンであり、よってホスト細胞において発現を減少させるために該核酸を修飾するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１５７】
該ホスト細胞が細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞である、請求項155又は156記載の方法。
【請求項１５８】
修飾活性部位又は基質結合部位が第1活性部位又は第1基質結合部位をコードしている配列を含む第1核酸に由来する、複数の修飾フィターゼ活性部位又は基質結合部位をコードしている核酸のライブラリーを作製する方法であって、
(a) 第1活性部位又は第1基質結合部位をコードしている第1核酸を準備するステップであって、該第1核酸配列が配列番号1記載の配列に対してストリンジェント条件下でハイブリッドする配列を含み、該核酸がフィターゼ活性部位又はフィターゼ基質結合部位をコードしている前記ステップと、
(b) 該第1核酸内の複数の標的コドンに天然に存在するアミノ酸変異体をコードしている変異導入性オリゴヌクレオチドのセットを準備するステップと、
(c) 該変異導入性オリゴヌクレオチドのセットを用いて変異導入した各アミノ酸コドンにアミノ酸変異の範囲をコードしている活性部位コード変異核酸又は基質結合部位コード変異核酸のセットを作成し、よって複数の修飾フィターゼ活性部位又は基質結合部位をコードしている核酸のライブラリーを作製するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１５９】
最適化特異的進化システムを含む方法によってステップ(a)の該第1核酸を変異導入するステップを含む、請求項158記載の方法。
【請求項１６０】
遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)を含む方法によってステップ(a)の該第1核酸を変異導入するステップを含んでいる、請求項158記載の方法。
【請求項１６１】
合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)を含む方法によってステップ(a)の該第1核酸を変異導入するステップを含んでいる請求項158記載の方法。
【請求項１６２】
誤りがちなPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アセンブリPCR、性的PCR変異導入、生体内変異導入、カセット変異導入、再帰的集合変異導入、指数的集合変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)又はその組合わせを含む方法によってステップ(a)の該第1核酸又は変異体を変異導入するステップを更に含む、請求項158記載の方法。
【請求項１６３】
組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップドデュプレックス変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠失ホスト株変異導入、化学変異導入、放射性物質変異導入、欠失変異導入、制限選択変異導入、制限純化変異導入、人工遺伝子合成、集合変異導入、キメラ核酸多量体生成又はその組合わせを含む方法によってステップ(a)の該第1核酸又は変異体を変異導入するステップを更に含む、請求項158記載の方法。
【請求項１６４】
小分子を生成する方法であって、
(a) 小分子を合成又は修飾することができる複数の生合成酵素を準備するステップであって、該酵素の1つが請求項1又は請求項18記載の配列を含む核酸によってコードされたフィターゼ酵素を含んでいる前記ステップと、
(b) ステップ(a)の該酵素の少なくとも1つの基質を準備するステップと、
(c) ステップ(b)の該基質と該酵素とを複数の生触媒反応を促進させる条件下で反応させて一連の生触媒反応によって小分子を生成するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１６５】
小分子を修飾する方法であって、
(a) 請求項1又は請求項18記載の配列を含む核酸によってコードされたフィターゼ酵素を準備するステップと、
(b) 小分子を準備するステップと、
(c) ステップ(a)の該酵素とステップ(b)の該小分子とを該フィターゼ酵素によって触媒される酵素反応を促進させる条件下で反応させ、よってフィターゼ酵素反応によって小分子を修飾するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１６６】
ステップ(a)の該酵素の複数の小分子基質を含み、よって該フィターゼ酵素によって触媒される少なくとも1つの酵素反応によって生成される修飾小分子のライブラリーを作成するステップを含む、請求項165記載の方法。
【請求項１６７】
該複数の酵素反応によって生成された修飾小分子のライブラリーを作成するために該酵素による複数の生触媒反応を促進させる条件下で複数の追加の酵素を更に含む、請求項165記載の方法。
【請求項１６８】
所望の活性を示す具体的な修飾小分子が該ライブラリーの中に存在するかを求めるために該ライブラリーを試験するステップを更に含む、請求項165記載の方法。
【請求項１６９】
該ライブラリーを試験するステップが、該修飾小分子の一部について所望の活性を有する該具体的な修飾小分子の存在又は不在を試験することにより該ライブラリーの中の該複数の該修飾小分子の一部を生成するように用いられる該生触媒反応の1つを除く全部を系統的に排除するステップと、所望の活性の該具体的な修飾小分子を生成する少なくとも1つの特定の生触媒反応を同定するステップとを更に含んでいる、請求項168記載の方法。
【請求項１７０】
フィターゼ酵素の機能的断片を求める方法であって、
(a) フィターゼ酵素を準備するステップであって、該酵素が請求項49記載のアミノ酸配列を含むか又は請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされている前記ステップと、
b) ステップ(a)の該配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、残りの該配列についてフィターゼ活性を試験し、よってフィターゼ酵素の機能的断片を求めるステップと
を含む、前記方法。
【請求項１７１】
フィターゼ基質を準備し、該基質の量の増加又は反応産物の量の減少を検出することにより該フィターゼ活性が測定される、請求項170記載の方法。
【請求項１７２】
該試験化合物を含まない基質又は反応産物の量と比較した試験化合物を含む酵素基質の量の減少又は該反応産物の量の増加により該試験化合物をフィターゼ活性のアクチベーターとして同定する、請求項171記載の方法。
【請求項１７３】
リアルタイム代謝フラックス分析を用いることにより新規な又は修飾した表現型を全細胞操作する方法であって、
(a) 細胞の遺伝組成物を修飾することにより修飾した細胞をつくるステップであって、該遺伝組成物が請求項1又は請求項18記載の配列を含む核酸の該細胞を添加することにより修飾されている前記ステップと、
(b) 該修飾した細胞を培養して複数の修飾した細胞を生産するステップと、
(c) ステップ(b)の細胞培養物をリアルタイムでモニタすることにより該細胞の少なくとも1つの代謝パラメータを測定するステップと、
(d) ステップ(c)のデータを分析して測定した該パラメータが同様の条件下で修飾されていない細胞での比較しうる測定と異なるかを求め、よって該細胞における操作表現型をリアルタイム代謝フラックス分析を用いて同定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１７４】
該細胞の該遺伝組成物を該細胞内の配列の欠失又は配列の修飾を含む方法、又は遺伝子の発現をノックアウトする方法によって修飾される、請求項173記載の方法。
【請求項１７５】
新たに操作した表現型を含む細胞を選択するステップを更に含む、請求項173記載の方法。
【請求項１７６】
該選択された細胞を培養し、よって新たに操作した表現型を含む新規な細胞株を産生するステップを更に含む、請求項175記載の方法。
【請求項１７７】
イノシトール六リン酸をイノシトールと無機リン酸に加水分解する方法であって、
(a) フィターゼ活性を有するポリぺプチドを準備するステップであって、該ポリぺプチドが請求項49記載のアミノ酸配列を含むポリぺプチド、又は請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを含んでいる前記ステップと、
(b) イノシトール六リン酸を含む組成物を準備するステップと、
(c) ステップ(a)の該ポリぺプチドとステップ(b)の該組成物とを該ポリぺプチドが該イノシトール六リン酸を加水分解してイノシトールと無機リン酸を生成する条件下で接触させるステップと
を含む、前記方法。
【請求項１７８】
該条件が約37℃〜70℃の温度を含む、請求項177記載の方法。
【請求項１７９】
該組成物がフィチン酸を含んでいる、請求項178記載の方法。
【請求項１８０】
油の脱ガム方法であって、
(a) フィターゼ活性を有するポリぺプチドを準備するステップであって、該ポリぺプチドが請求項49記載のアミノ酸配列、又は請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを含んでいるステップと、
(b) 植物油を含む組成物を準備するステップと、
(c) ステップ(a)の該ポリぺプチドとステップ(b)の該植物油を該ポリぺプチドがイノシトール-無機リン酸結合を切断し得る条件下で接触させ、該油を脱ガムするステップと
を含む、前記方法。
【請求項１８１】
動物飼料の製造方法であって、
(a) 植物、植物の一部又は植物細胞をフィターゼ酵素ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換するステップであって、該フィターゼが請求項49記載の配列の少なくとも30の連続したアミノ酸、請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチド、又は配列番号2によって示されたポリぺプチドを含む前記ステップと、
(b) 該植物、植物の一部又は植物細胞を該フィターゼ酵素が発現する条件下で培養するステップと
(c) 該植物、植物の一部又は植物細胞を動物用飼料に適した組成物に変換するか又は培養したが植物、植物の一部又は植物細胞を動物飼料に添加し、よって動物飼料を製造するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１８２】
該ポリぺプチドが、植物細胞において該核酸を発現させることができる発現制御配列を含んでいる発現ベクターを含んでいる、請求項181記載の方法。
【請求項１８３】
該動物が単胃動物である、請求項181記載の方法。
【請求項１８４】
動物が反芻動物である、請求項181記載の方法。
【請求項１８５】
フィターゼ酵素サプリメントを補給する方法であって、
(a) 可食用担体とフィターゼ酵素を含む可食用補給マトリックスを調製するステップであって、水性媒体に入れたときに該マトリックスが容易に分散しかつ該フィターゼ酵素を放出する前記ステップと、
(b) 該可食用酵素補給マトリックスを該動物に投与するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１８６】
該可食用補給マトリックスが顆粒状可食用担体を含んでいる、請求項185記載の方法。
【請求項１８７】
該可食用補給マトリックスがペレットの形である、請求項185記載の方法。
【請求項１８８】
該可食用担体が穀物の胚芽、干し草、アルファルファ、チモシー、大豆の外皮、ヒマワリ種子かす及びホイートミールからなる群より選ばれた担体を含む、請求項185記載の方法。
【請求項１８９】
該可食用担体が油かすである穀物の胚芽を含んでいる、請求項188記載の方法。
【請求項１９０】
該フィターゼが請求項49記載の配列の少なくとも30の連続したアミノ酸、又は請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチド、又は配列番号2に示される配列をもつポリぺプチドを含んでいる、請求項185記載の方法。
【請求項１９１】
該フィターゼ酵素がペレット化条件で耐熱性又は熱安定性を与えるようにグリコシル化される、請求項185記載の方法。
【請求項１９２】
該補給マトリックスが、穀物の胚芽と該フィターゼ酵素を含む混合物をペレット化して粒子を得ることにより形成される、請求項185記載の方法。
【請求項１９３】
該ペレットが水蒸気の適用を含む条件下で調製される、請求項187記載の方法。
【請求項１９４】
該ペレットが80℃を超える温度を約5分間適用することを含む条件下で調製される、請求項193記載の方法。
【請求項１９５】
該ペレットが少なくとも350〜約900単位/mg酵素の比活性を含むフィターゼ酵素を含んでいる、請求項194記載の方法。
【請求項１９６】
動物の消化器系での酵素不活性化に対するフィターゼポリぺプチドの耐性を高める方法であって、フィターゼが請求項49記載の配列の少なくとも30の連続したアミノ酸、又は請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチド、又は配列番号2に示された配列をもつポリぺプチドを含む、フィターゼポリぺプチドをグリコシル化し、よって動物の消化器系での酵素不活性化に対する該フィターゼポリぺプチドの耐性を高めるステップを含む、前記方法。
【請求項１９７】
グリコシル化がN結合グリコシル化である、請求項196記載の方法。
【請求項１９８】
該フィターゼポリぺプチドが、細胞における該フィターゼをコードしているポリヌクレオチドの生体内発現の結果としてグリコシル化されている、請求項197記載の方法。
【請求項１９９】
該細胞が真核細胞である、請求項198記載の方法。
【請求項２００】
該真核細胞が真菌細胞である、請求項199記載の方法。
【請求項２０１】
該真核細胞が植物細胞である、請求項199記載の方法。
【請求項２０２】
該真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項199記載の方法。
【請求項２０３】
フィターゼポリぺプチドの耐熱性又は熱安定性を高める方法であって、フィターゼが請求項49記載の配列の少なくとも30の連続したアミノ酸、又は請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチド、又は配列番号2に示された配列をもつポリぺプチドを含む、フィターゼポリぺプチドをグリコシル化し、よって該フィターゼポリぺプチドの該耐熱性又は熱安定性を高めるステップを含む、前記方法。
【請求項２０４】
該フィターゼ比活性が約37℃〜約90℃の範囲にある温度に熱安定性又は耐熱性である、請求項203記載の方法。
【請求項２０５】
トウモロコシ粒やモロコシ粒を処理する方法であって、
(a) フィターゼ活性を有する、請求項49記載のアミノ酸配列、又は請求項1又は請求項18記載の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを準備するステップと、
(b) コーンスティープリカー又はソルガムすティープローブリカーを含む組成物を準備するステップと、
(c) ステップ(a)の該ポリぺプチドとステップ(b)の該組成物とを該ポリぺプチドがイノシトール無機リン酸結合を切断し得る条件下で接触させるステップと
を含む、前記方法。
【請求項２０６】
細胞において組換えフィターゼを過剰発現させる方法であって、少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査によって求められる核酸配列を含む核酸、又は配列番号1に示される核酸配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含むベクターを発現させるステップであって、過剰発現が高活性プロモーター、ジシストロニックなベクターの使用又は該ベクターの遺伝子増幅によって行われる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の説明
本出願は2001年5月24日出願の米国特許出願第(USSN) 09/866,379号の一部係属出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新たに調製されたポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドによってコードされたポリぺプチド、そのポリヌクレオチドやポリぺプチドの使用、及びそのポリヌクレオチドやポリぺプチドの生産と分離に関する。特に、本発明は、フィターゼ活性を有するポリぺプチド、例えば、配列番号1を提供する。本発明は、分離したフィターゼ酵素や組換え酵素を提供する。フィターゼは大腸菌(E. coli)の野生型appAを修飾することにより生産することができ、組換えホスト細胞から生産することができる。本発明のフィターゼは、フィチン酸の消化を援助するために用いることができる。本発明のフィターゼは、フィチン酸を多く含んだ成分の栄養価値を改善するために食料に用いることができる。本発明のフィターゼは、耐熱性及び/又は熱安定性であり得る。また、フィターゼをコードしている変異ポリヌクレオチドを得る方法や高温又は低温で熱安定性又は耐熱性を有するフィターゼを得る方法が提供される。
【０００３】
背景
ミネラルはすべての生物の成長に不可欠な元素である。食物ミネラルは、植物を含む多くの供給原料から得ることができる。例えば、植物の種子は、フィチン酸分子のリン酸基と錯体を形成するイオンを含むので豊富なミネラル源である。これらのフィチン酸結合ミネラルは、ときには、多胃反芻動物のようなある種の飼育生物の食物要求を満たすことができる。従って、反芻動物は、ときには、第一胃内の微生物がフィチン酸塩(myo-イノシトール六リン酸)のイノシトールと無機リン酸への変換を触媒する酵素を産生することから無機リン酸とミネラルによる食事補給を必要とすることが少ない。その過程で、フィチン酸と錯体を形成したミネラルが遊離する。しかしながら、飼育生物の種の大多数は、フィチン酸結合ミネラルを効率よく利用することができない。従って、例えば、単胃動物(例えば、豚、鳥、魚)の家畜生産においては、一般的に、成長速度を高めるために消費生物の消化性寄生菌環境を変えるミネラル及び/又は抗生物質で飼料が補充される。
それだけでは、多くの適用におけるフィチン酸の不十分な加水分解に伴う多くの問題  栄養、生体外処理ステップ、健康と医学、環境保護、資源管理に関する責任がある。下記は、これらの問題の制限されない例である。
1) 無機ミネラルによる食事の補充はコストがかかる。
2) 加水分解されていないフィチン酸塩の存在は生体外適用において望ましくなく問題である(例えば、望まれていないスラッジの存在を引き起こすことにより)。
3) 抗生物質による食餌の補充は抗生物質耐性病原体の存在量を増やすことによりヒトや動物の差別なく医療の脅威を提起する。
4) 吸収されない糞便ミネラルの環境への流出は周囲の土壌、養魚場水、一般の地上水の生態系を破壊し損なう。
5) 多くの潜在的食料の価値のある栄養の提供はほとんど利用されていないし消費されるままである。
【０００４】
多くの潜在的栄養植物、特に種子を含むものは、消費時に栄養素が自由に利用できないような方法でフィチン酸塩と関連がある栄養素、例えば、リン酸塩のかなりの量を含有している。これらの栄養素の無効性は、フィチン酸塩を加水分解するとともに結合栄養素を遊離するのに十分な消化力  消化管の共生生活形の存在に主に由来する  を有する牛や他の反芻動物を含む生物によって少なくとも一部は物克服されている。しかしながら、豚、魚、鶏、七面鳥を含む飼育動物、及び人を含む他の非反芻生物の種の大多数は消化後これらの栄養素を効率よく遊離させることができない。
その結果、フィチン酸塩含有食料には、非常に多くの種の生物によって消費されるときに欠乏した栄養の提供を修正するために外因性栄養素及び/又はフィターゼ活性源による補充が必要である。
他の態様においては、加水分解されていないフィチン酸の存在により食料の処理を含む  これに限定されない  生体外プロセスにおいて問題のある結果が生じる。欧州特許第0321004-B1号 (Vaara et al.)に記載される単なる一例を除く例示においては、トウモロコシ粒やモロコシ粒の処理において硬い粒を水にしみ込ませて軟化することによるステップがある。この過程で浸出する水溶性物質は、コーンスティープリカーの一部であり、蒸発により濃縮される。コーンスティープリカー、主にカルシウム塩やマグネシウム塩の形の加水分解されていないフィチン酸は、リンと結合し、タンパク質や金属イオンにより望ましくないスラッジを沈降する。このスラッジは、コーンスティープリカーの蒸発、運搬、貯蔵の問題がある。
【０００５】
抗生物質による食餌の補充は、家畜生産に多くの有益な結果をもたらす。例えば、病気を防ぐ予防手段としての役割のほかに、外因性抗生物質の投与は3〜5%だけ成長速度が増加することがわかった。この作用のメカニズムは、飼育動物の消化植物環境の変化を  部分的に  含むものであり、栄養素吸収に最適な微生物叢の釣り合いが生じる。
しかしながら、抗生物質の使い過ぎに伴う有意な負の影響は抗生物質耐性病原性微生物株の貯蔵所をつくる危険がある。この危険は差し迫ったものであり、ヒトにおける薬剤耐性病原体の増大は家畜における抗生物質の使用に既に結びついていた。例えば、動物飼料に用いられる抗生物質、アボパルシンは1997年に多くの場所で禁止され、動物は、現在他の抗生物質バージニアマイシンを投与されており、それは人間でのバンコマイシンを置き換えるために用いられる新規薬剤、シネルシドに非常に似ている。しかしながら、研究から飼育動物における腸球菌がシネルシドに対して耐性があることが既に知られている。その結果、アボパルシンやバンコマイシンにおいて既に見られるような望ましくない耐性結果は、飼育動物の全面的予防薬としてどのような新規抗生物質が用いられても再び起こると思われる。従って、研究者は生産での薬剤使用に厳重な制御を要求している。
この開示されたフィターゼ分子で補われた食料で高められた動物において達成された成長速度の増加は、例えば、アボパルシンのような抗生物質を用いて達成されたものと  超えないにしても  釣り合っている。従って、この開示されたフィターゼ分子  単独でも他の試薬との組合わせでも(プロテアーゼのような酵素を含むがこれに限定されない)  は、本応用(例えば、飼育動物の成長速度を増加する)だけでなくフィターゼ加水分解が望ましい他の応用でも使用可能である。
【０００６】
環境上の結果は、フィターゼ欠乏の生物種によるフィターゼ含有食料の消費により  食料がミネラルで補われているかにかかわらず  吸収されないミネラルの排泄から生じる糞便の汚染が生じることである。この汚染は直接棲息地に負の影響を及ぼすだけでなく結果として周囲の水にも影響する。環境上の変化は、主に食物連鎖の下で起こるので、上方や生態系全体に浸透する可能性があり、永続的にかつ破局的に  特に連続的な汚染の数年後には損なわれる。この問題は、濃縮フィチン酸塩処理  生体内(例えば、家畜生産地域、動物園、野生動物保護地区等)や試験管内(例えば、商業的なトウモロコシ湿式摩砕、穀物の浸漬工程等)処理ステップを含む − が生じる領域に現れる可能性がある。
外因的に添加されたフィターゼ分子を用いる決定  外因的に投与されるミネラル及び/又は抗生物質の使用を完全に置き換えるか増加するか  には、生活が家畜生産のような関連した応用に左右される使用者による財政的可能性とコスト的有効性の試験を合格することが最終的には求められる。
その結果、種々の応用において効率がよくコスト的に有効なフィチン酸の加水分解を達成する手段が求められている。特に、商業的応用においてフィチン酸塩の加水分解を最適化する手段が求められている。具体的な態様においては、ヒトや飼育動物による消費用フィチン酸塩含有食料の栄養提供を改善する商業的処理法を最適化することが求められている。
フィチン酸塩は、ほとんどすべての植物飼料において貯蔵リン源として存在している(Graf (Ed.), 1986)。フィチン酸は、穀物やマメ科牧草類の種子の正常部分を形成し、種子から出る新しい植物に不可欠な食物ミネラルを結合するように働く。フィチン酸のリン酸基が種子酵素フィターゼによって除去されるとき、金属イオンを結合する能力が失われ、ミネラルは植物に利用できるようになる。家畜飼料の穀粒において、フィチン酸によって結合した微量ミネラルは、フィターゼ活性を欠く単胃動物による吸収にほとんど用いられない。
【０００７】
フィチン酸塩の加水分解は結腸で生じるが、ほとんどのフィチン酸塩は単胃動物の胃腸管を通過し、肥料に排泄され、集中した家畜生産地域の糞便のリン酸汚染問題の原因になる。結腸で遊離する無機リンは、無機リンが小腸でほとんど  実際に独占的でなくても  吸収されることから家畜に対する栄養価値をかなり減少させる。従って、フィチン酸塩中の栄養的に重要な食物ミネラルのかなりの量が単胃動物には無効である。
要するに、フィチン酸結合栄養素は、フィチン酸塩に共有結合しているリン酸だけでなくフィチン酸塩によってキレート化されている他のミネラルから構成されている。更に、摂取時に、加水分解されていないフィチン酸塩は追加のミネラルとぶつかって結合することができる。ミネラルのキレート化は、これらのミネラルが補因子として働く酵素の活性を阻害することができる。
フィチン酸塩のイノシトールと無機リンへの変換は、広くフィターゼと呼ばれる微生物酵素によって触媒され得る。フィターゼ #EC 3.1.3.8のようなフィターゼは、myo-イノシトール六リン酸をD-myo-イノシトール1,2,4,5,6-五リン酸とオルトリン酸へ加水分解することができる。報告によれば、ある種の真菌フィターゼは、イノシトール五リン酸を四リン酸、三リン酸、低級リン酸へ加水分解する。報告によれば、例えば、A. フィクウム(A. ficuum)フィターゼはmyoイノシトール二リン酸と一リン酸の混合物を生産する(Ullah, 1988)。フィターゼ産生微生物は、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)(Powar and Jagannathan, 1982)やシュードモナス(Pseudomonas)(Cosgrove, 1970)のような細菌; サッカロミセス・セレビシエ(Sacchoromyces cerevisiae)(Nayini and Markakis, 1984)のような酵母; アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)(Yamada et al., 1968)のような真菌から構成されている。
酸ホスファターゼは、種々のリン酸エステルを触媒で加水分解するとともに至適pHが通常6.0より低い酵素である(Igarashi and Hollander, 1968)。例えば、#EC 3.1.3.2酵素は、オルトリン酸モノエステルのオルトリン酸産物への加水分解を触媒する。報告によれば、酸ホスファターゼはA.フィクウムから精製された。酸ホスファターゼの脱グリコシル化形態の見掛け上の分子量は32.6 kDaである(Ullah et al., 1987)。
【０００８】
フィターゼと特異的ではない酸ホスファターゼは細胞外酵素として真菌のアスペルギルス・フィクウムによって産生される(Shieh et al., 1969)。報告によれば、Ullahは見掛け上の分子量が61.7 kDA (SDS-PAGEによる; グリコシル化を補正した); 至適pHがpH 2.5とpH 5.5; Kmが約40μm; 比活性が約50 U/mgである野生型A.フィクウムからフィターゼを精製した(Ullah, 1988)。報告によれば、PCT特許出願第WO 91/05053号には、至適pHがpH 2.5とpH 5.5、Kmが約250μm、比活性が約100 U/mgタンパク質のアスペルギルス・フィクウム(Aspergillus ficuum)からフィターゼの分離と分子クローニングが開示されている。同様に、これらの以前に報告された微生物酵素に引用された比活性は、ほぼ50-100 U/mgタンパク質の範囲にあった。
単胃動物用飼料添加剤としてのフィターゼを生産することができる微生物を用いる可能性は以前に報告されている(Shieh and Ware 米国特許第3,297,548号; Nelson et al., 1971)。この方法のコスト有効性は、この応用と他の商業的応用に主に制限されている。それ故、改良されたフィターゼ分子は非常に望ましい。
報告によれば、微生物フィターゼは、ある種の工業的工程、例えば、小麦やトウモロコシの廃棄物から動物飼料を製造するのに用いることができる。一態様においては、トウモロコシの湿式摩砕から動物飼料として販売されているグルテンが製造される。報告によれば、フィターゼを添加すると飼料産物の栄養価値が改善されることができる。例えば、真菌フィターゼ酵素とプロセス条件(t〜50℃とpH 〜5.5)の使用は以前に(例えば、欧州特許第0 321 004号)に報告されている。報告によれば、概要としては、伝統的なスティーピング法、即ち、外因性フィターゼ酵素を添加しない方法を用いて大豆ミールを処理する際、加水分解されていないフィターゼの存在はミールと廃棄物を魚、家禽、他の非反芻動物、牛乳で飼われた子牛を飼育するのに用いられる飼料に不適切にする。報告によれば、フィターゼはこの高タンパク質大豆材料の栄養素と商業的価値を改善するのに用いられる(Finase Enzymes by Alko, Rajamaeki, Finlandを参照のこと)。A.ニガー(A. niger)由来の真菌フィターゼとpH 2.5至適酸ホスファターゼの組合わせはフィチン酸分解産物 Finas FとFinase Sでの動物飼料補充としてAlko, Ltdで用いられている。しかしながら、この方法のコスト有効性は広範な使用に対して依然として大幅に制限されている。従って、コスト有効性なフィターゼ源は、動物飼料として大豆ミールの価値を大いに高める(Shieh et al., 1969)。
【０００９】
開示された問題を解決するために、食料を外因性フィターゼ酵素で処理することが提案されたが、この方法は、特に実行可能性とコスト効率について十分最適化されていなかった。この最適化には、広範囲の応用が存在するという考慮が、特に大量生産に必要である。例えば、広範囲の食料、その調製法、受容生物の種がある。
具体的な例示においては、魚飼料ペレットの製造には、水に供した際に早まって(例えば、摂取する前に)溶解及び/又は分解しないペレットを製造するために成分を高温及び/又は高圧にさらすことが必要であることが理解される。従って、この製造工程は高温及び/又は高圧条件下で安定である添加剤酵素を得ることが望ましい。従って、異なるフィターゼが異なる応用に差動的に好ましく又は最適であってもよいことが理解される。
更に、酵素プロセスを最適化するのに重要な方法は中心的な触媒酵素の修飾と改善によることも認められる。例えば、フィターゼ分子を発現させる発現系から構成されるトランスジェニック植物を形成することができる。発現レベルのような適当な発現レベルの活性に直接関係しない因子を改善することを試みることにより、一定の  且つ潜在的に不十分な  レベルの最適化しかせいぜい達成することができないことが理解される。従って、特徴の改善された分子を得ることも求められている。
【００１０】
発明の要約
本発明は、少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%の核酸配列を含む分離した又は組換え核酸であって、該核酸がフィターゼ活性を有する少なくとも1種のポリぺプチドをコードし、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査による分析で求められる、前記分離した又は組換え核酸を提供する。代替的実施態様においては、核酸配列の少なくとも約50残基、100残基、150残基、200残基、250残基、300残基、350残基、400残基、450残基、500残基、550残基、600残基、700残基、800残基、900残基、1000残基、1200残基又は1300残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%である。
代替的実施態様においては、核酸配列の少なくとも約50残基、100残基、150残基、200残基、250残基、300残基、350残基、400残基、450残基、500残基、550残基、600残基、700残基、800残基、900残基、1000残基、1200残基又は1300残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%、98.5%、99%又は99.5％である。核酸配列は、配列番号1に示された配列をもつことができる。核酸配列は、配列番号2に示された配列をもつポリぺプチドをコードすることができる。
一態様においては、配列比較アルゴリズムは、BLASTバージョン2.2.2アルゴリズムである。ろ過設定は、blastall -p blastp -d "nr pataa"  -F Fに設定することができ、他の選択肢はすべてデフォルトに設定される。
一態様においては、フィターゼ活性は、フィチン酸塩(myo-イノシトール六リン酸)のイノシトールと無機リン酸、又は等価物への触媒作用を含んでいる。フィターゼ活性は、フィチン酸塩(myo-イノシトール六リン酸)の加水分解を含むことができる。
【００１１】
一態様においては、フィターゼ活性は熱安定性又は耐熱性である。ポリぺプチドは、約40℃〜約70℃の温度範囲を含む条件下でフィターゼ活性を保持することができる。ポリぺプチドは、約37℃より高く約90℃までの範囲の温度にさらした後にフィターゼ活性を保持することができる。ポリぺプチドは、約37℃より高く約50℃までの範囲の温度にさらした後にフィターゼ活性を保持することができる。
配列番号1に示された核酸配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列を含む分離した又は組換え核酸であって、該核酸がフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている、分離した又は組換え核酸を提供する。核酸の長さが少なくとも約50残基、100残基、150残基、200残基、250残基、300残基、350残基、400残基、450残基、500残基、550残基、600残基、700残基、800残基、900残基、1000残基、1200残基又は1300残基である。一態様においては、ストリンジェント条件には、約65℃の温度で約15分間0.2X SSC中での洗浄を含んでいる洗浄ステップが含まれる。
本発明は、フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を同定するための核酸プローブであって、該プローブが配列番号1に示された配列からなる群より選ばれた配列の少なくとも10の連続した塩基を含み、結合又はハイブリダイゼーションによって該核酸を同定する、前記核酸プローブを提供する。プローブは、配列番号1に示される配列の少なくとも約10〜50、約20〜60、約30〜70、約40〜80、又は約60〜100の連続した塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
本発明は、フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を同定するための核酸プローブであって、該プローブが少なくとも100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%である核酸を含み、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査により求められる、前記核酸プローブを提供する。プローブは、配列番号1に示される核酸配列の少なくとも約10〜50、約20〜60、約30〜70、約40〜80、又は約60〜100の連続した塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。プローブは、配列番号1に示される核酸配列に対する配列同一性が少なくとも99％である核酸配列を含むことができる。プローブは、配列番号1に示される配列のサブセットを含むことができる。
【００１２】
本発明は、フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を増幅するための増幅プライマー配列対であって、該プライマー対が配列番号1に示される核酸配列を増幅することができる、前記増幅プライマー配列対を提供する。一態様においては、増幅プライマー配列対のそれぞれの部分が該配列の少なくとも約10〜50の連続した塩基を含むオリゴヌクレオチドを含んでいる。
本発明は、フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を増幅する方法であって、配列番号1に示される核酸配列を増幅することができる増幅プライマー配列対を有する鋳型核酸を増幅するステップを含む、前記方法を提供する。
本発明は、本発明の核酸、例えば、少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる核酸配列、又は配列番号1、又はそのサブ配列に示される核酸に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含んでいる発現カセットを提供する。
本発明は、本発明の核酸、例えば、少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる核酸配列、又は配列番号1、又はそのサブ配列に示される核酸に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含んでいる発現カセットを提供する。
本発明は、本発明のベクター又は本発明の核酸を含むクローニング伝達体であって、該クローニング伝達体がウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージ又は人工染色体を含む、前記クローニング伝達体を提供する。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターを含むことができる。ウイルスベクターは、細菌の人工染色体(BAC)、プラスミド、バクテリオファージP1由来ベクター(PAC)、酵母の人工染色体(YAC)、哺乳動物の人工染色体(MAC)を含むことができる
【００１３】
本発明は、本発明のベクター又は本発明の核酸を含む形質転換細胞を提供する。ベクターは、少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸配列、又は配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含むことができる。
本発明は、本発明のベクター又は本発明の核酸を含む形質転換細胞を提供する。核酸は、少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸配列、又は配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含むことができる。代替的実施態様においては、細胞は細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は植物細胞である。
本発明は、本発明のベクター又は本発明の核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。一態様においては、核酸は、少なくとも約100残基の領域について配列番号に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸、又は配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含んでいる。代替的態様においては、トランスジェニック非ヒト動物はマウス、ヤギ又はブタである。
本発明は、本発明のベクター又は本発明の核酸を含むトランスジェニック植物を提供する。一態様においては、核酸配列は少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められ、核酸は配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズもする。植物はトウモロコシ植物、ジャガイモ植物、トマト植物、小麦植物、脂肪種子植物、なたね植物、大豆植物又はタバコ植物である。
【００１４】
本発明は、本発明のベクター又は本発明の核酸を含むトランスジェニック種子を提供する。一態様においては、核酸配列は少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められ、核酸は配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズもする。代替的態様においては、種子はトウモロコシ種子、コムギ粒、脂肪種子、なたね、大豆種子、パーム核、ヒマワリ種子、ごま種子、落花生又はタバコ植物種子である。
本発明は、少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%の核酸配列に対して相補的な核酸配列又はストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含み、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査で求められる核酸、又は配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約10〜50塩基、約20〜60塩基、約30〜70塩基、約40〜80塩基、又は約60〜100塩基である。
細胞においてフィターゼメッセージの翻訳を阻止する方法であって、少なくとも100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%の核酸配列に対して相補的な核酸配列又はストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸配列を含み、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる核酸、又は配列番号1に示される核酸配列、又はそのサブ配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを該細胞に投与するか又は該細胞中で発現させるステップを含む、前記方法を提供する。
【００１５】
本発明は、少なくとも約100残基の領域について配列番号2に対する配列同一性が少なくとも約98%のアミノ酸配列、又は(i)少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められるアミノ酸配列、又は(ii)配列番号1に示される核酸に対してストリンジェント条件下にハイブリダイズする配列を含む核酸によってコードされたポリぺプチドを含む分離した又は組換えポリぺプチドを提供する。一態様においては、ポリぺプチドはフィターゼ活性を有する。フィターゼ活性は、フィチン酸塩(myo-イノシトール六リン酸)の加水分解を含むことができる。
一態様においては、分離した又は組換えポリぺプチドは耐熱性表現型を有する。即ち、フィターゼ活性は耐熱性である。
代替的態様においては、本発明の分離した又は組換えポリぺプチド(アミノ酸配列)は、少なくとも約100残基の領域について配列番号2に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性は配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる。代替的実施態様においては、アミノ酸配列は、少なくとも約50、100、150、200、250、300、350、400又は435の領域について配列番号2に対する配列同一性が少なくとも98％である。
代替的実施態様においては、本発明の分離した又は組換えポリぺプチド(アミノ酸配列)は、少なくとも約50、100、150、200、250、300、350、400又は435の領域について配列番号2に対する該ポリぺプチド配列の配列同一性が少なくとも98%、98.5%、99%又は99.5％である。本発明の分離した又は組換えポリぺプチド(アミノ酸配列)は、配列番号2に示される配列をもつことができる。ポリぺプチドは、配列番号1に示される配列をもつ核酸によってコードされることができる。一態様においては、配列比較アルゴリズムは、BLASTバージョン2.2.2アルゴリズムである。ろ過設定はblastall -p blastp -d "nr pataa"  -F Fに設定することができ、他の選択肢はすべてデフォルトに設定される。
本発明の分離した又は組換えポリぺプチド(アミノ酸配列)は、フィターゼ活性を有することができる。一態様においては、フィターゼ活性は、フィチン酸塩(myo-イノシトール六リン酸)をイノシトールと無機リン酸への植物を含んでいる。フィターゼ活性は、フィチン酸塩(myo-イノシトール六リン酸)の加水分解を含むことができる。
【００１６】
本発明は、ポリぺプチドがフィターゼ活性を有し、シグナル配列を欠き、本発明のアミノ酸配列、例えば、少なくとも約100残基について配列番号2に対する配列同一性が少なくとも98%である配列、又は(i)少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析又は目視検査で求められる配列、又は(ii)配列番号1に示される核酸に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸でコードされたポリぺプチドを含んでいる、分離された又は組換えポリぺプチドを提供する。代替的態様においては、フィターゼ活性が約37℃〜約50℃、約50℃〜約70℃又は約70℃〜約90℃の範囲の温度に加熱した場合に熱安定性を含んでいる。熱安定性フィターゼ活性は、約37℃において約100〜約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含むことができる。熱安定性フィターゼ活性は、約500〜約750単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含むことができる。該熱安定性フィターゼ活性は、約37℃において約500〜約1200単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含むことができる。熱安定性フィターゼ活性は、約37℃において約750〜約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含むことができる。約37℃〜約90℃の範囲の高温に加熱した後、又は約37℃〜約70℃の範囲の温度に加熱した後、該フィターゼ活性は耐熱性であることができる。高温に加熱した後、耐熱性は、37℃におけるフィターゼの比活性の少なくとも半分の保持を含むことができる。高温に加熱した後、耐熱性は37℃における約500〜約1200単位/mgタンパク質の範囲の比活性の保持を含むことができる。フィターゼは少なくとも1つのグリコシル化部位を含むことができる。グリコシル化は、1つ以上のN結合グリコシル化又は1つ以上のN結合グリコシル化又はその組合わせであり得る。フィターゼは、例えば、細胞、例えば、真核細胞、例えば、P.パストリス(P.pastoris)又はS.ポンベ(S.pombe)、又は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞中で発現した後、試験管内又は生体内でグリコシル化することができる。一態様においては、ポリぺプチドは、酸性条件、例えば、約pH 5を含む条件下、又は約pH4.5を含む条件下でフィターゼ活性を保持する。
【００１７】
本発明は、本発明のポリぺプチドを含むタンパク質製剤であって、液体、固体又はゲルを含む、前記タンパク質製剤を提供する。
本発明は、本発明のポリぺプチドと第2ドメインを含むヘテロ二量体を提供する。一態様においては、第2ドメインはポリぺプチドであり、ヘテロ二量体は融合タンパク質である。第2ドメインはエピトープ又はタグ標識又はその組合わせであり得る。
本発明は、フィターゼ活性を有する固定化ポリぺプチドであって、該ポリぺプチドが本発明のポリぺプチド(アミノ酸)配列又は本発明のヘテロ二量体又は融合タンパク質を含んでいる、前記固定化ポリぺプチドを提供する。一態様においては、フィターゼは細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイ又は毛管上に固定化されている。
本発明は、本発明の固定化ポリぺプチド又は本発明のヘテロ二量体又は融合タンパク質、又は本発明の核酸を含むアレイを提供する。
本発明は、本発明のポリぺプチド又は本発明の核酸によってコードされたポリぺプチドに特異的に結合する分離した又は組換え抗体を提供する。本発明は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。本発明は、本発明のポリぺプチド又は本発明の核酸によってコードされたポリぺプチドに特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマを提供する。
本発明は、本発明のポリぺプチド又は本発明の核酸によってコードされたポリぺプチドを含む動物用栄養補助食品を提供する。栄養補助食品中のポリぺプチドはグリコシル化することができる。
【００１８】
本発明は、本発明のポリぺプチド又は本発明の核酸によってコードされたポリぺプチドを含む可食用酵素送達マトリックスを提供する。可食用送達マトリックスはペレット、錠剤又は丸剤を含むことができる。可食用酵素送達マトリックス中の本発明のポリぺプチドはグリコシル化することができる。可食用酵素送達マトリックス中の本発明のポリぺプチドは、耐熱性及び/又は熱安定性であり得る。
本発明は、顆粒状可食用担体と本発明のポリぺプチド又は本発明の核酸によってコードされたポリぺプチドを含む可食用ペレットであって、該ポリぺプチドがフィターゼ活性を含んでいる、前記可食用ペレットを提供する。
本発明は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の少なくとも30の連続した連続したアミノ酸を有する組換えフィターゼタンパク質又はその保存的変異体と可食用担体を含んでいる食料を含む飼料組成物を提供する。食料中のフィターゼタンパク質はグリコシル化することができる。食料中のフィターゼタンパク質は耐熱性及び/又は熱安定性であり得る。食料はペレット形、丸剤形又は錠剤形で製造することができる。食料はポリマー被覆添加剤を用いて製造することができる。食料は顆粒剤形で製造することができる。食料は噴霧乾燥によって製造することができる。
本発明は、本発明のポリぺプチド又は本発明の核酸によってコードされたポリぺプチドを含む大豆ミールであって、該ポリぺプチドがフィターゼ活性を含んでいる、前記大豆ミールを提供する。
【００１９】
本発明は、フィターゼ活性を有するポリぺプチドを分離又は同定する方法であって、
(a) 本発明の抗体を準備するステップと、(b) ポリぺプチドを含む試料を準備するステップと、(c) ステップ(b)の該試料とステップ(a)の該抗体とを該抗体が該ポリぺプチドに特異的結合し得る条件下で接触させ、よってフィターゼを分離又は同定するステップとを含む、前記方法を提供する。
本発明は、抗フィターゼ抗体をつくる方法であって、本発明の核酸、本発明のポリぺプチドを体液性免疫応答を生じるのに十分な量で非ヒト動物に投与し、よって抗フィターゼ抗体をつくるステップを含む、前記方法を提供する。
本発明は、組換えポリぺプチドを作製する方法であって、(a) プロモーターに作用可能に結合した核酸を準備し、該核酸が本発明の配列を含んでいるステップと、(b) ステップ(a)の該核酸を該ポリぺプチドの発現を可能にする条件下で発現させ、よって組換えポリぺプチドを作製するステップとを含む、前記方法を提供する。本方法は、更に、ホスト細胞をステップ(a)の該核酸で形質転換し、続いてステップ(a)の該核酸を発現させ、よって形質転換細胞中で組換えポリぺプチドを作製するステップを含むことができる。
本発明は、フィターゼ活性を有するポリぺプチドを同定する方法であって、(a) 本発明のポリぺプチド又は本発明の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを準備するステップと、(b) フィターゼ基質を準備するステップと、(c) ステップ(a)の該ポリぺプチド又はその断片又は変異体とステップ(b)の該基質とを接触させ、基質の量の増加と反応産物の量の減少を検出し、該基質の量の減少又は該反応産物の量の増加によりフィターゼ活性を有するポリぺプチドが検出されるステップとを含む、前記方法を提供する。
【００２０】
本発明は、フィターゼ基質を同定する方法であって、(a) 本発明のポリぺプチド又は本発明の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを準備するステップと、(b) 試験基質を準備するステップと、(c) ステップ(a)の該ポリぺプチド又はその断片又は変異体とステップ(b)の該試験基質とを接触させ、基質の量の増加と反応産物の量の減少を検出し、該基質の量の減少又は該反応産物の量の増加により該試験基質がフィターゼ基質として同定されるステップとを含む、前記方法を提供する。
本発明は、化合物がポリぺプチドに特異的に結合するかを求める方法であって、(a) 核酸又は該核酸を含むベクターを該核酸をポリぺプチドに翻訳するのに許容的な条件下で発現させるステップであって、該核酸が本発明の配列をもつ前記ステップ、又は本発明のポリぺプチドを準備するステップと、(b) 該ポリぺプチドと該試験化合物とを接触させるステップと、(c) 該試験化合物が該ポリぺプチドに特異的に結合するかを求め、よって該化合物が該ポリぺプチドに特異的に結合することを求めるステップとを含む、前記方法を提供する。
本発明は、フィターゼ活性のモジュレータを同定する方法であって、(a) 本発明のフィターゼポリぺプチド又は本発明の核酸によってコードされたフィターゼポリぺプチドを準備するステップと、(b) 試験化合物を準備するステップと、(c) ステップ(a)の該ポリぺプチドとステップ(b)の該試験化合物とを接触させ、該フィターゼの活性を測定し、該試験化合物の不在下の該活性と比較した該試験化合物の存在下に測定した該フィターゼ活性の変化により該試験化合物が該フィターゼ活性をモジュレートすることが求められるステップとを含む、前記方法を提供する。一態様においては、フィターゼ活性は、フィターゼ基質を準備しかつ基質の量の増加又は反応産物の量の減少を検出することにより測定される。一態様においては、基質の量の減少又は試験化合物を含む反応産物の量の増加を基質又は試験化合物を含まない反応産物の量と比較して試験化合物をフィターゼ活性のアクチベーターとして同定する。一態様においては、基質の量の減少又は試験化合物を含む反応産物の量の減少を基質又は試験化合物を含まない反応産物の量と比較して試験化合物をフィターゼ活性阻害剤として同定する。
【００２１】
本発明は、プロセッサとデータ記憶デバイスを含むコンピュータシステムであって、前記データ記憶デバイスによってポリぺプチド配列又は核酸配列が記憶されており、該ポリぺプチド配列が本発明の配列、又はその配列を含み、該核酸が本発明の配列又はそのサブ配列を含んでいる、前記コンピュータシステムを提供する。コンピュータシステムは、更に、配列比較アルゴリズムと、少なくとも1つの参照配列が記憶されているデータ記憶デバイス含んでいる。配列比較アルゴリズムは、多型性を表示するコンピュータプログラムを含むことができる。コンピュータシステムは、更に、配列内に1つ以上の特徴を同定するアイデンティファイアを含むことができる。
本発明は、ポリぺプチド配列又は核酸配列が記憶されたコンピュータ読出し媒体であって、該ポリぺプチド配列が本発明の配列又はそのサブ配列を含み、該核酸が本発明の配列又はそのサブ配列を含む、前記コンピュータ読出し媒体を提供する。
本発明は、配列内の特徴を同定する方法であって、(a) 該配列を、配列内の1以上の特徴を同定するコンピュータプログラムを用いて読み出すステップであって、該配列がポリぺプチド配列又は核酸配列を含み、該ポリぺプチド配列が本発明の配列又はそのサブ配列を含み、該核酸が本発明の配列又はそのサブ配列を含んでいる、前記ステップと、(b) 該配列内の1以上の特徴を該コンピュータプログラムにより同定するステップとを含む、前記方法を提供する。
本発明は、第1配列と第2配列とを比較する方法であって、(a) 該第1配列と該第2配列を、配列を比較するコンピュータプログラムを用いることにより読み出すステップであって、該第1配列がポリぺプチド配列又は核酸配列を含み、該ポリぺプチド配列が本発明の配列又はそのサブ配列を含み、該核酸が本発明の配列又はそのサブ配列を含んでいる、前記ステップと、(b) 該第1配列と該第2配列間の違いを該コンピュータプログラムにより求めるステップとを含む、前記方法を提供する。一態様においては、第1配列と第2配列間の違いを求めるステップは、更に、多型性を同定するステップを含むことができる。本方法は、更に、配列内の1つ以上の特徴を同定するアイデンティファイアを含むことができる。本方法は、更に、第1配列をコンピュータプログラムを用いて読み出し、配列内の1つ以上の特徴を同定するステップを含むことができる。
【００２２】
本発明は、環境的試料からフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を分離又は回収する方法であって、(a) フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を増幅するための増幅プライマー配列を準備するステップであって、該プライマー対が配列番号1、又はそのサブ配列を増幅することができる前記ステップと、(b) 該環境的試料から核酸を分離するか又は該環境的試料を該試料中の核酸が該増幅プライマー対に対するハイブリダイゼーションに利用できるように処理するステップと、(c) ステップ(b)の該核酸とステップ(a)の該増幅プライマー対とを合わせ、該環境的試料からの核酸を増幅させ、よって環境的試料からフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を分離又は回収するステップとを含む、前記方法を提供する。一態様においては、増幅プライマー配列対のそれぞれの部分は、配列番号1記載の配列の少なくとも約10〜50の連続した塩基を含んでいるオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明は、環境的試料からフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を分離又は回収する方法であって、(a) 本発明の配列、又はそのサブ配列を含むポリヌクレオチドプローブを準備するステップと、(b) 該環境的試料から核酸を分離するか又は該環境的試料を該試料中の核酸がステップ(a)のポリヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションに利用できるように処理するステップと、(c) ステップ(b)の分離した該核酸又は処理した該環境的試料とステップ(a)の該ポリヌクレオチドプローブとを合わせるステップと、(d) ステップ(a)のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリッドする核酸を分離し、よって土壌試料からフィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を分離又は回収するステップとを含む、前記方法を提供する。環境的試料が水の試料、液体の試料、土壌の試料、空気の試料又は生体の試料を含むことができる。生体の試料が細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞に由来することができる。
【００２３】
フィターゼをコードしている核酸の変異体を作成する方法であって、(a) 本発明の配列を含んでいる鋳型核酸を準備するステップと、(b) 該鋳型配列、又はその組合わせにおいて少なくとも1つ以上のヌクレオチドを修飾、欠失又は付加して該鋳型核酸の変異体を作成するステップとを含む、前記方法を提供する。本発明は、更に、変異核酸を発現させて変異フィターゼポリぺプチドを産生するステップを含むことができる。修飾、付加又は欠失は、誤りがちなPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アセンブリPCR、性的PCR変異導入、生体内変異導入、カセット変異導入、再帰的集合変異導入、指数的集合変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)及び/又はの組合わせによって導入することができる。修飾、付加又は欠失は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップドデュプレックス変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠失ホスト株変異導入、化学変異導入、放射性物質変異導入、欠失変異導入、制限選択変異導入、制限純化変異導入、人工遺伝子合成、集合変異導入、キメラ核酸多量体生成及び/又はその組合わせによって導入される。代替的態様においては、修飾、付加又は欠失は、誤りがちなPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アセンブリPCR、性的PCR変異導入、生体内変異導入、カセット変異導入、再帰的集合変異導入、指数的集合変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子リアセンブリ、合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)及び/又は遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)によって導入される。
【００２４】
一態様においては、方法は鋳型核酸によってコードされたフィターゼとは活性が変わった又は異なったフィターゼ又は安定性が変わった又は異なったフィターゼが産生されるまで反復される。変異フィターゼポリぺプチドは耐熱性であり、フィターゼは高温にさらされた後に活性が残っている。鋳型核酸によってコードされたフィターゼと比較して変異フィターゼポリぺプチドのグリコシル化は高いことができる。変異フィターゼポリぺプチドは高温下でフィターゼ活性を有することができ、鋳型核酸によってコードされたフィターゼは高温下で活性でない。一態様においては、方法は、鋳型核酸とはコドン使用が変わったフィターゼコード配列が作製されるまで反復される。一態様においては、方法は、鋳型核酸とはメッセージ発現又は安定性レベルが高い又は低いフィターゼ遺伝子が作製されるまで反復される。
本発明は、ホスト細胞において発現を増強させるためにフィターゼをコードしている核酸内のコドンを修飾する方法であって、(a) 本発明の配列を含むフィターゼをコードしている核酸を準備するステップと、(b) ステップ(a)の該核酸内の全く好ましくない又はより好ましくないコドンを同定し、置換される該コドンと同じアミノ酸をコードしている好ましく又は中立的に用いられるコドンで置換し、好ましいコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過剰に示されるコドンであり、全く好ましくない又はより好ましくないコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過少に示されるコドンであり、よってホスト細胞において発現を増強させるために該核酸を修飾するステップとを含む、前記方法を提供する。
本発明は、フィターゼをコードしているコドンを修飾する方法であって、(a) 本発明の配列を含むフィターゼをコードしている核酸を準備するステップと、(b) ステップ(a)の該核酸内のコドンを同定し、置換される該コドンと同じアミノ酸をコードしている異なるコドンで置換し、よってフィターゼをコードしている核酸内のコドンを修飾するステップとを含む、前記方法を提供する。
【００２５】
本発明は、ホスト細胞において発現を増強させるためにフィターゼをコードしている核酸内のコドンを修飾する方法であって、(a) 本発明の配列を含むフィターゼをコードしている核酸を準備するステップと、(b) ステップ(a)の該核酸内の全く好ましくない又はより好ましくないコドンを同定し、置換される該コドンと同じアミノ酸をコードしている好ましく又は中立的に用いられるコドンで置換し、好ましいコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過剰に示されるコドンであり、全く好ましくない又はより好ましくないコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過少に示されるコドンであり、よってホスト細胞において発現を増強させるために該核酸を修飾するステップとを含む、前記方法を提供する。
ホスト細胞において発現を減少させるためにフィターゼをコードしている核酸内のコドンを修飾する方法であって、(a) 本発明の配列を含むフィターゼをコードしている核酸を準備するステップと、(b) ステップ(a)の該核酸内の少なくとも1つの好ましいコドンを同定し、置換される該コドンと同じアミノ酸をコードしている全く好ましくない又はより好ましくないコドンで置換し、好ましいコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過剰に示されるコドンであり、全く好ましくない又はより好ましくないコドンが該ホスト細胞内の遺伝子のコード配列に過少に示されるコドンであり、よってホスト細胞において発現を減少させるために該核酸を修飾するステップとを含む、前記方法を提供する。代替的態様においては、ホスト細胞は細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。
【００２６】
本発明は、修飾活性部位又は基質結合部位が第1活性部位又は第1基質結合部位をコードしている配列を含む第1核酸に由来する複数の修飾フィターゼ活性部位又は基質結合部位をコードしている核酸のライブラリーを作製する方法であって、(a) 第1活性部位又は第1基質結合部位をコードしている第1核酸を準備するステップであって、該第1核酸配列が配列番号1に示される配列に対してストリンジェント条件下でハイブリッドする配列を含み、該核酸がフィターゼ活性部位又はフィターゼ基質結合部位をコードしている前記ステップと、(b) 該第1核酸内の複数の標的コドンに天然に存在するアミノ酸変異体をコードしている変異導入性オリゴヌクレオチドのセットを準備するステップと、(c) 該変異導入性オリゴヌクレオチドのセットを用いて変異導入した各アミノ酸コドンにアミノ酸変異の範囲をコードしている活性部位コード変異核酸又は基質結合部位コード変異核酸のセットを作成し、よって複数の修飾フィターゼ活性部位又は基質結合部位をコードしている核酸のライブラリーを作製するステップとを含む、前記方法を提供する。一態様においては、本方法は、最適化特異的進化システムを含む方法、又は遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)を含む方法、合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)を含む方法によってステップ(a)の該第1核酸を変異導入するステップを含んでいる。本方法は、更に、誤りがちなPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アセンブリPCR、性的PCR変異導入、生体内変異導入、カセット変異導入、再帰的集合変異導入、指数的集合変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)又はその組合わせを含む方法によってステップ(a)の該第1核酸又は変異体を変異導入するステップを含むことができる。本方法は、更に、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップドデュプレックス変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠失ホスト株変異導入、化学変異導入、放射性物質変異導入、欠失変異導入、制限選択変異導入、制限純化変異導入、人工遺伝子合成、集合変異導入、キメラ核酸多量体生成又はその組合わせを含む方法によってステップ(a)の該第1核酸又は変異体を変異導入するステップを含むことができる。
【００２７】
本発明は、小分子を生成する方法であって、(a) 小分子を合成又は修飾することができる複数の生合成酵素を準備するステップであって、該酵素の1つが本発明の配列を含む核酸によってコードされたフィターゼ酵素を含んでいる前記ステップと、(b) ステップ(a)の該酵素の少なくとも1つの基質を準備するステップと、(c) ステップ(b)の該基質と該酵素とを複数の生触媒反応を促進させる条件下で反応させて一連の生触媒反応によって小分子を生成するステップとを含む、前記方法を提供する。
本発明は、小分子を修飾する方法であって、(a) 本発明の配列を含む核酸によってコードされたフィターゼ酵素を準備するステップと、(b) 小分子を準備するステップと、(c) ステップ(a)の該酵素とステップ(b)の該小分子とを該フィターゼ酵素によって触媒される酵素反応を促進させる条件下で反応させ、よってフィターゼ酵素反応によって小分子を修飾するステップとを含む、前記方法を提供する。本方法は、ステップ(a)の該酵素の複数の小分子基質を含み、よって該フィターゼ酵素によって触媒される少なくとも1つの酵素反応によって生成される修飾小分子のライブラリーを作成するステップを含むことができる。本方法は、複数の酵素反応によって生成された修飾小分子のライブラリーを作成するために酵素による複数の生触媒反応を促進させる条件下で複数の追加の酵素を更に含むことができる。本方法は、更に、所望の活性を示す具体的な修飾小分子がライブラリーの中に存在するかを求めるためにライブラリーを試験するステップを含むことができる。
一態様においては、本方法は、更に、ライブラリーを試験するステップが、修飾小分子の一部について所望の活性を有する具体的な修飾小分子の存在又は不在を試験することによりライブラリーの中の複数の修飾小分子の一部を生成するように用いられる生触媒反応の1つを除く全部を系統的に排除するステップと、所望の活性の具体的な修飾小分子を生成する少なくとも1つの特定の生触媒反応を同定するステップとを含んでいる。
【００２８】
本発明は、フィターゼ酵素の機能的断片を求める方法であって、(a) フィターゼ酵素を準備するステップであって、該酵素が本発明のアミノ酸配列を含むか又は本発明の配列をもつ核酸によってコードされている前記ステップと、b) ステップ(a)の該配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、残りの該配列についてフィターゼ活性を試験し、よってフィターゼ酵素の機能的断片を求めるステップとを含む、前記方法を提供する。フィターゼ活性は、フィターゼ基質を準備し、該基質の量の増加又は反応産物の量の減少を検出することにより測定することができる。一態様においては、酵素基質の量の減少又は試験化合物を含む反応産物の量の増加を基質又は試験化合物を含まない反応産物の量と比較して試験化合物をフィターゼ活性のアクチベーターとして同定する。
本発明は、リアルタイム代謝フラックス分析を用いることにより新規な又は修飾した表現型を全細胞操作する方法であって、(a) 細胞の遺伝組成物を修飾することにより修飾した細胞をつくるステップであって、該遺伝組成物が本発明の配列を含む核酸の該細胞を添加することにより修飾されている前記ステップと、(b) 該修飾した細胞を培養して複数の修飾した細胞を生産するステップと、(c) ステップ(b)の細胞培養物をリアルタイムでモニタすることにより該細胞の少なくとも1つの代謝パラメータを測定するステップと、(d) ステップ(c)のデータを分析して測定した該パラメータが同様の条件下で修飾されていない細胞での比較しうる測定と異なるかを求め、よって該細胞における操作表現型をリアルタイム代謝フラックス分析を用いて同定するステップとを含む、前記方法を提供する。細胞の遺伝組成物は、細胞内の配列の欠失又は配列の修飾を含む方法、又は遺伝子の発現をノックアウトする方法によって修飾することができる。本方法は、更に、新たに操作した表現型を含む細胞を選択するステップを含むことができる。本方法は、更に、選択された細胞を培養し、よって新たに操作した表現型を含む新規な細胞株を産生するステップを含むことができる。
【００２９】
本発明は、イノシトール六リン酸をイノシトールと無機リン酸に加水分解する方法であって、(a) フィターゼ活性を有するポリぺプチドを準備するステップであって、該ポリぺプチドが本発明のアミノ酸配列を含むポリぺプチド、又は本発明の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを含んでいる前記ステップと、(b) イノシトール六リン酸を含む組成物を準備するステップと、(c) ステップ(a)の該ポリぺプチドとステップ(b)の該組成物とを該ポリぺプチドが該イノシトール六リン酸を加水分解してイノシトールと無機リン酸を生成する条件下で接触させるステップとを含む、前記方法を提供する。条件は、約37℃〜70℃の温度を含むことができる。組成物はフィチン酸を含むことができる。
本発明は、油の脱ガム方法であって、(a) フィターゼ活性を有するポリぺプチドを準備するステップであって、該ポリぺプチドが本発明のアミノ酸配列、又は本発明の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを含んでいるステップと、(b) 植物油を含む組成物を準備するステップと、(c) ステップ(a)の該ポリぺプチドとステップ(b)の該植物油を該ポリぺプチドがイノシトール-無機リン酸結合を切断し得る条件下で接触させ、該油を脱ガムするステップとを含む、前記方法を提供する。
本発明は、動物飼料の製造方法であって、(a) 植物、植物の一部又は植物細胞をフィターゼ酵素ポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換するステップであって、該フィターゼが本発明の配列の少なくとも30の連続したアミノ酸、本発明の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチド、又は配列番号2によって示されたポリぺプチドを含む前記ステップと、(b) 該植物、植物の一部又は植物細胞を該フィターゼ酵素が発現する条件下で培養するステップと(c) 該植物、植物の一部又は植物細胞を動物用飼料に適した組成物に変換するか又は培養したが植物、植物の一部又は植物細胞を動物飼料に添加し、よって動物飼料を製造するステップとを含む、前記方法を提供する。ポリぺプチドは、植物細胞において核酸を発現させることができる発現制御配列を含んでいる発現ベクターを含むことができる。動物は、単胃動物、例えば、反芻動物であり得る。
【００３０】
本発明は、フィターゼ酵素サプリメントを補給する方法であって、(a) 可食用担体とフィターゼ酵素を含む可食用補給マトリックスを調製するステップであって、水性媒体に入れたときに該マトリックスが容易に分散しかつ該フィターゼ酵素を放出する前記ステップと、(b) 該可食用酵素送達マトリックスを該動物に投与するステップとを含む、前記方法を提供する。可食用補給マトリックスは、顆粒状可食用担体を含むことができる。可食用補給マトリックスは、ペレット、丸剤、錠剤等の形であり得る。可食用担体は、穀物の胚芽、干し草、アルファルファ、チモシー、大豆の外皮、ヒマワリ種子かす及びホイートミールからなる群より選ばれた担体を含むことができる。可食用担体は、油かすである穀物の胚芽を含むことができる。フィターゼは、本発明の配列の少なくとも30の連続したアミノ酸、又は本発明の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチド、又は配列番号2に示される配列をもつポリぺプチドを含むことができる。フィターゼ酵素は、種々の条件、例えば、ペレット化条件で耐熱性又は熱安定性を与えるようにグリコシル化することができる。補給マトリックスは、穀物の胚芽とフィターゼ酵素を含む混合物をペレット化して粒子を得ることにより形成することができる。ペレットは、水蒸気の適用を含む条件下で調製することができる。ペレットは、80℃を超える温度を約5分間適用することを含む条件下で調製することができる。ペレットは、少なくとも350〜約900単位/mg酵素の比活性を含むフィターゼ酵素を含むことができる。
本発明は、動物の消化器系での酵素不活性化に対するフィターゼポリぺプチドの耐性を高める方法であって、フィターゼが本発明の配列の少なくとも30の連続したアミノ酸、又は本発明の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチド、又は配列番号2に示された配列をもつポリぺプチドを含む、フィターゼポリぺプチドをグリコシル化し、よって動物の消化器系での酵素不活性化に対する該フィターゼポリぺプチドの耐性を高めるステップを含む、前記方法を提供する。グリコシル化は、N結合グリコシル化及び/又はO結合グリコシル化であり得る。フィターゼポリぺプチドは、細胞におけるフィターゼをコードしているポリヌクレオチドの試験管内発現、又は生体内発現の結果としてグリコシル化することができる。細胞は、真核細胞、例えば、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞であり得る。
【００３１】
本発明は、フィターゼポリぺプチドの耐熱性又は熱安定性を生じる又は高める方法であって、フィターゼが本発明の配列の少なくとも30の連続したアミノ酸、又は本発明の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチド、又は配列番号2に示された配列をもつポリぺプチドを含む、フィターゼポリぺプチドをグリコシル化し、よって該フィターゼポリぺプチドの該耐熱性又は熱安定性を高めるステップを含む、前記方法を提供する。フィターゼ比活性は、約37℃〜約90℃の範囲にある温度に熱安定性又は耐熱性であり得る。
本発明は、トウモロコシ粒やモロコシ粒を処理する方法であって、(a) フィターゼ活性を有する、本発明のアミノ酸配列、又は本発明の配列をもつ核酸によってコードされたポリぺプチドを準備するステップと、(b) コーンスティープリカー又はソルガムすティープローブリカーを含む組成物を準備するステップと、(c) ステップ(a)の該ポリぺプチドとステップ(b)の該組成物とを該ポリぺプチドがイノシトール無機リン酸結合を切断し得る条件下で接触させるステップとを含む、前記方法を提供する。
本発明は、細胞において組換えフィターゼを過剰発現させる方法であって、本発明の核酸、例えば、少なくとも約100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%であり、該配列同一性が配列比較アルゴリズム又は目視検査によって求められる核酸配列を含む核酸、又は配列番号1に示される核酸配列に対してストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸を含むベクターを発現させるステップを含む、前記方法を提供する。過剰発現は、高活性プロモーター、ジシストロニックなベクターの使用又は該ベクターの遺伝子増幅によって行うことができる。
【００３２】
本発明は、フィターゼ酵素をコードしている配列、実質的に同一の配列、相補的な配列、及び少なくとも30の連続したヌクレオチドを含む断片より選ばれたポリヌクレオチド配列を含む核酸を得、前記配列内の1つ以上のヌクレオチドを他のヌクレオチドに修飾し、前記配列内の1つ以上のヌクレオチドを欠失させ、又は1つ以上のヌクレオチドを前記配列に付加することにより所望の活性を有する変異フィターゼを作成する方法を提供する。そのような方法によって、高熱安定性又は高耐熱性のような所望の活性を有する修飾フィターゼ酵素をコードする変異ポリぺプチドが得られる。
更に他の態様においては、本発明は、粒子がその中に含まれるフィターゼ酵素を容易に分散する、可食用酵素補給マトリックスを顆粒状可食用担体と耐熱性組換えフィターゼ酵素を含むペレットの形に調製し、該可食用酵素補給マトリックスを動物に投与することにより動物にフィターゼサプリメントを補給する方法を提供する。
更に他の態様においては、本発明は、動物の消化器系においてフィターゼポリぺプチドの酵素不活性化に対する耐性を高める方法であって、配列番号2に示されるアミノ酸配列、又はその保存的変異体をもつフィターゼポリぺプチドをグリコシル化し、よって動物の該消化器系において該フィターゼポリぺプチドの酵素不活性化に対する耐性を高める方法を提供する。
他の態様においては、本発明は、配列番号2の少なくとも30の連続したアミノ酸を含む組換えフィターゼ酵素を調製し、栄養サプリメントを動物に投与して動物によって消化された食品中に含まれるフィターゼの消費を高めることによる動物の食餌において栄養サプリメントとしてフィターゼを用いる方法を提供する。
【００３３】
更に他の態様においては、本発明は、フィターゼポリぺプチドの耐熱性を高める方法であって、フィターゼポリぺプチド、又はその保存的変異体をグリコシル化し、よって該フィターゼポリぺプチドの耐熱性を高めるステップを含む、前記方法を提供する。
更に他の態様においては、本発明は、対応する実質的に非グリコシル化フィターゼポリぺプチドと比較して37℃より高い温度から約90℃までの範囲の温度にさらした後に該フィターゼポリぺプチドの比活性が高められるように耐熱性フィターゼポリぺプチドがグリコシル化される耐熱性フィターゼポリぺプチドを提供する。
更に他の態様においては、本発明は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の少なくとも30の連続したアミノ酸、又はその保存的変異体をもつ組換えフィターゼタンパク質と、フィターゼ含有食料を含む飼料組成物を提供する。
本発明の1つ以上の態様の詳細は、添付の図面と下記の説明に示される。本発明の他の特徴、目的、利点は、その説明と図面と、特許請求の範囲から明らかである。
本発明に引用されるすべての文献、特許、特許出願、GenBank配列、ATCC寄託物はすべてのために本願明細書に特に含まれているものとする。
図面は、本発明の態様を示すものであり、特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を制限することを意味しない。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、フィターゼポリぺプチド(例えば、配列番号2)及びそれをコードしているポリヌクレオチド(例えば、配列番号1)並びに該ポリヌクレオチドやポリぺプチドの使用方法に関する。“フィターゼ”という用語は、フィターゼ活性を有する酵素、例えば、フィチン酸塩の分解を触媒することができる酵素、例えば、フィチン酸塩 (myo-イノシトール六リン酸)のイノシトールと無機リン酸への触媒作用を包含する。本発明のフィターゼには、熱安定性酵素や耐熱性酵素が含まれる。
フィターゼや本発明のフィターゼをコードしているポリヌクレオチドは、多くの工程、方法、組成物に用いられる。例えば、上述したように、フィターゼは動物飼料や飼料サプリメント、また、環境又は試料から過剰のフィチン酸塩を分解又は除去する処理に使用し得る。他の使用は、上記を含む本発明に示された教示に基づき当業者に明らかである。
一態様においては、本発明のフィターゼ分子  単独で又は他の試薬と組合わせて(プロテアーゼを含む酵素を含むがこれに限定されない)  は食料の処理、例えば、望まれていないコーンスラッジの防止や、フィチン酸加水分解が望ましい他の応用に用いられる。一態様においては、本発明のフィターゼ分子は、加水分解されていないフィチン酸塩の存在を排除又は減少させるために、特に加水分解されていないフィチン酸塩により食料の処理を含むがそれに限定されない生体外工程において問題のある結果が生じる場合に用いられる。一態様においては、本発明のフィターゼ分子は、トウモロコシやモロコシの穀粒を処理し、よって硬い穀粒が水中に浸漬されて軟化するステップを含む、欧州特許第0321004-B1号(Vaara et al.)に記載される手順で用いられる。その工程で浸出する水溶性物質はコーンスティープリカーの一部であり、蒸発によって濃縮される。主にカルシウム塩やマグネシウム塩の形のコーンスティープリカー中の加水分解されていないフィチン酸は、リンと結合し、望ましくないスラッジをタンパク質と金属イオンとともに沈降する。このスラッジは、コーンスティープリカーの蒸発、輸送、貯蔵において問題である。本発明のフィターゼ分子は、このスラッジを加水分解するのに用いられる。
【００３５】
本発明のフィターゼ分子は、以前に同定されたフィターゼ分子、例えば、真菌由来のフィターゼ分子よりかなり優れた商業的性能を与える。
本発明の酵素のフィターゼ活性は、約4400 U/mgであり得る。これは、大体50-100 U/mgタンパク質の範囲であった以前に報告された微生物酵素の活性の約40倍以上の向上に相当する。
本発明は、また、特異的変異、例えば、Diversa Corp.の専売方法(例えば、DirectEvolution(登録商標))を含む変異導入や他の方法によって本発明のフィターゼの特徴を変える方法を提供する。これらの方法は、更に、米国特許第5,830,696号に詳述されている。概要としては、DirectEvolution(登録商標)は、a) 1つ以上の分子鋳型、例えば、本発明のフィターゼ核酸を変異導入に供して新規な分子を作成するステップと、b) より望ましい特徴をもつ新規な分子の子孫種の間で選択するステップとを含んでいる。
特異的変異の能力は、出発鋳型(例えば、配列番号1)の出発選択と、選択される変異導入法や用いられるスクリーニング法に左右される。従って、本発明は、a) 食料の高温製造のような1つ以上の特定の応用のもとで優れた活性を有するので、特定の応用を最適化するのに有効であり、b) 更に改善された新規な分子を達成するために特異的変異用鋳型として有効であり、c) ハイブリダイゼーションに基づく方法のような手段によって追加の関連分子を同定するためのツールとして有効である新規なフィターゼを含む新規な非常に活性で生理的に有効で経済的な原料を提供する。
【００３６】
定義
“抗体”という用語には、抗原又はエピトープを特異的に結合することができる1つ又は複数の免疫グロブリン遺伝子、その断片に由来する、手本にした又は実質的にコードされたぺプチド又はポリぺプチドが含まれる。例えば、Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson  (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97を参照のこと。抗体という用語には、抗原結合部、即ち、(i) Fab断片、VL、VH、CL、CH1ドメインからなる一価断片、(ii) F(ab')2断片、ヒンジ領域にジスルフィド架橋によって結合した2つのFab断片を含む二価断片、(iii) VHとCH1ドメインからなるFd断片、(iv) 抗体の単一アームのVLとVHドメインからなるFv断片、(v) VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)、(vi) 分離した相補性決定領域(CDR)を含む抗原を結合する能力を保持する “抗原結合部位” (例えば、断片、サブ配列相補性決定領域(CDR))が含まれる。単鎖抗体も "抗体" という用語によって含まれる。
本明細書に用いられる “アレイ” 又は “マイクロアレイ” 又は “バイオチップ” 又は “チップ” という用語は、複数の標的要素であり、各標的要素は、後に詳述されるように、基質表面の特定領域に固定化された1つ以上のポリぺプチド(抗体を含む)又は核酸の特定量を含んでいる。
本明細書に用いられる “コンピュータ”、“コンピュータプログラム”、“プロセッサ”という用語は、後に詳述されるように、最大の一般的文脈で用いられ、すべてのデバイスが組込まれている。
【００３７】
特定のポリぺプチド又はタンパク質 “のコード配列” 又は “をコードする配列” は、適切な制御配列の制御によって配置された場合にポリぺプチド又はタンパク質へ転写され翻訳される核酸配列である。
本明細書に用いられる "発現カセット" という用語は、配列と適合するホストにおいて構造遺伝子(即ち、本発明のフィターゼのようなタンパク質コード配列)に影響することができるヌクレオチド配列を意味する。発現カセットには、ポリぺプチドコード配列、場合によっては、他の配列、例えば、転写終結シグナルと作用可能に結合した少なくともプロモーターが含まれる。発現させるのに必要な又は有効な他の因子、例えば、エンハンサーを用いることもできる。本明細書に用いられる “作用可能に結合した"は、プロモーターがDNA配列の転写を仲介するようなDNA配列から上流のプロモーターの結合を意味する。従って、発現カセットには、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、“裸のDNA” 組換えベクターの任意の形等も含まれる。"ベクター" は、細胞に感染させ、トランスフェクトし、一時的に又は永続的に導入し得る核酸を含んでいる。ベクターが裸の核酸、又はタンパク質又は脂質と複合した核酸であり得ることが認識される。ベクターは、場合によっては、ウイルス又は細菌の核酸及び/又はタンパク質、及び/又は膜(例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープ等)を含んでいる。ベクターには、DNA断片を結合することができかつ複製するレプリコン(例えば、RNAレプリコン、バクテリオファージ)が含まれるがこれに限定されない。従って、ベクターには、RNA、自律自己複製環状又は線状DNA又はRNA (例えば、プラスミド、ウイルス等、例えば、米国特許第5,217,879号を参照のこと)が含まれるがこれらに限定されず、発現プラスミドも非発現プラスミドも含まれる。組換え微生物又は細胞培養物を "発現ベクター" をホスト化するように記載される場合には、染色体外環状DNAや線状DNAもホスト染色体に組込まれたDNAも含まれる。ベクターがホスト細胞によって維持されている場合、ベクターは自律構造として有糸分裂中の細胞によって安定して複製することもでき、ホストゲノム内にも組込まれる。
【００３８】
本明細書に用いられる “核酸” 又は “核酸配列” という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はこれらのいずれかの断片、一本鎖又は二本鎖であってもよくかつセンス鎖又はアンチセンス鎖であってもよいゲノム由来又は合成由来のDNA又はRNA (例えば、mRNA、rRNA、tRNA)、ぺプチド核酸(PNA)又は、例えば、iRNA、リボ核タンパク質(例えば、iRNP)を含む由来の天然又は合成のDNA様又はRNA様物質を意味する。その用語には、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、即ち、オリゴヌクレオチドが包含される。その用語には、合成主鎖をもつ核酸様構造も包含される。例えば、Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156を参照のこと。
本明細書に用いられる“アミノ酸”又は“アミノ酸配列”は、オリゴぺプチド、ぺプチド、ポリぺプチド又はタンパク質配列、又はそれらのいずれかの断片、部分、又はサブユニット、天然に存在する分子又は合成分子を意味する。
本明細書に用いられる“分離した”という用語は、物質がもとの環境から除去されることを意味する(例えば、天然に存在する場合には天然の環境)。例えば、生きた動物にある天然に存在するポリヌクレオチド又はポリぺプチドは分離されないが、天然系に共存する物質の一部又は全部から分離された同じポリヌクレオチド又はポリぺプチドは分離される。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であってもよく、且つ／又はそのようなポリヌクレオチド又はポリぺプチドは組成物の一部であってもよく、そのようなベクター又は組成物が天然環境の一部でない点で更に分離することができる。本明細書に用いられる分離した物質又は組成物は、“精製した”組成物であり得る。即ち、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対的定義として意味する。ライブラリーから得られる個々の核酸は、通例は電気泳動均一性まで精製することができる。代替的態様においては、本発明は、少なくとも1桁、2桁、3桁、4桁、5桁以上の大きさだけゲノムDNA又はライブラリ又は他の環境内の他の配列から精製された核酸を提供する。
【００３９】
本明細書に用いられる“組換え”という用語は、核酸が天然環境では隣接しない“主鎖”核酸に隣接することを意味する。一態様においては、核酸は、核酸 “主鎖分子” の集団において核酸挿入断片数が5% 以上である。本発明の “主鎖分子” には、発現ベクターのような核酸、自己複製核酸、ウイルス、組込んでいる核酸、対象の核酸挿入断片を維持又は操作するために用いられる他のベクター又は核酸が含まれる。一態様においては、強化核酸は、組換え主鎖分子の集団中の核酸挿入断片数が15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上である。“組換え” ポリぺプチド又はタンパク質は、組換えDNA技術によって生産された、例えば、所望のポリぺプチド又はタンパク質をコードしている外因性DNA構築物によって形質転換された細胞から生産されたポリぺプチド又はタンパク質を意味する。“合成” ポリぺプチド又はタンパク質は、後に詳述される化学合成によって調製されるものである。
プロモーター配列は、後述されるように、プロモーターで転写を開始するRNAポリメラーゼがコード配列をmRNAへ転写するときにコード配列に “作用可能に結合” する。
“オリゴヌクレオチド” は、化学的に合成することができる一本鎖ポリデオキシヌクレオチドか又は2つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのような合成オリゴヌクレオチドはキナーゼの存在下に5' リン酸がないので、ATPによるリン酸を付加せずに他のオリゴヌクレオチドにライゲートしない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化していない断片にライゲートする。
2つの核酸又はポリぺプチドに関連して “実質的に同一” という用語は、後に詳述される既知の配列比較アルゴリズムを用いて又は目視検査によって測定した、最大対応として比較し整列した場合のヌクレオチド又はアミノ酸残基(配列)同一性が少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%又は99%である2つ以上の配列を意味する。代替的態様においては、本発明は、少なくとも約100、150、200、300、400残基の領域、又は核酸又はポリぺプチドの約50残基の間から全長までの範囲にある領域に対して本発明の例示的配列、例えば、配列番号1、配列番号2に対する同一性がかなりのものである核酸配列やポリぺプチド配列を提供する。本発明の核酸配列は、ポリぺプチドコード領域の全長に対してほぼ同一あり得る。
【００４０】
更に、“ほぼ同一の” アミノ酸配列は、特に置換が分子の活性部位でない部位で生じる場合でポリぺプチドが機能特性を実質的に保持するならば、1つ以上の保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失、又は挿入による参照配列と異なる配列である。保存的アミノ酸置換は、例えば、同じクラスの1つのアミノ酸に1つのアミノ酸を置換する(例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンのような1つの疎水性アミノ酸に他のアミノ酸を置換する、又は1つの極性アミノ酸に他のアミノ酸を置換する、例えば、アルギニンにリシンを、グルタミンにアスパラギン酸を又はグルタミンにアスパラギンを置換する)。1つ以上のアミノ酸を、例えば、フィターゼポリぺプチドから欠失させることができ、結果として生物活性をほとんど変えずにポリぺプチドの構造が修飾される。例えば、フィターゼ生物活性に必要としないアミノ末端又はカルボキシル末端アミノ酸を除去することができる。本発明の修飾ポリぺプチド配列は、後述されるように、修飾ポリぺプチド配列とフィターゼ基質とを接触させるステップと、修飾ポリぺプチドが分析において特定の基質の量を減少させるか機能フィターゼと基質との酵素反応の生物産物を増加させるかを求めるステップとを含む非常に多くの方法によってフィターゼ生物活性を分析することができる。
“ハイブリダイゼーション”は核酸鎖が塩基対合によって相補鎖と結合する方法を意味する。ハイブリダイゼーション反応は、感受性があり選択的であり得るので対象の具体的な配列を低濃度で存在する試料中でさえ同定することができる。適切なストリンジェント条件は、例えば、プレハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーションの溶液中の塩又はホルムアミドの濃度、又はハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、当該技術において周知である。例えば、ストリンジェンシーは、後に詳述されるように、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、又はハイブリダイゼーション温度の上昇によって高めることができ、ハイブリダイゼーション時間が変わる。代替的態様においては、本発明の核酸は、本明細書に示されるように種々のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力(例えば、高い、中程度、低い)によって定義される。
【００４１】
“変異体”という用語は、1つ以上の塩基対、コドン、イントロン、エキソン、又はアミノ酸残基で修飾されているが(それぞれ)なお本発明のフィターゼの生物活性を保持しているポリヌクレオチド又はポリぺプチドを意味する。変異体は、例えば、誤りがちなPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アセンブリPCR、性的PCR変異導入、生体内変異導入、カセット変異導入、再帰的集合変異導入、指数的集合変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子リアセンブリ、GSSM又はその組合わせのような方法が含まれるかなり多くの手段によって作製することができる。例えば、野生型フィターゼと異なるpH又は温度で活性を有する変異体フィターゼを生産する手法は本明細書に含まれる。
“飽和変異導入” 又は “GSSM” という用語には、後に詳述されるように、ポリヌクレオチドに点変異を導入するために縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを用いる方法が含まれる。
“最適化特異的進化系” 又は “最適化特異的進化” には、関連核酸配列、例えば、関連遺伝子の断片をリアセンブリする方法が含まれ、後に詳述される。
“合成ライゲーションリアセンブリ”又は “SLR”という用語には、非確率論的方法でオリゴヌクレオチド断片をライゲートする方法が含まれ、後に詳述される。
本明細書に用いられる “核酸” 又は “核酸配列” という用語はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はそれらのいずれかの断片、一本鎖又は二本鎖であってもよくセンス又はアンチセンス鎖ぺプチド核酸(PNA)であってもよいゲノム又は合成由来のDNA又はRNA、又は由来が天然又は合成のDNA様又はRNA様物質を意味する。一態様においては、本発明の “核酸配列” には、例えば、配列番号2に示されるポリぺプチドをコードする配列やその変異体が含まれる。他の態様においては、本発明の “核酸配列” には、例えば、配列番号1に示される配列、それに相補的な配列、上記配列の断片又はその変異体が含まれる。
【００４２】
“コード配列” 又は具体的なポリぺプチド又はタンパク質を “コードしているヌクレオチド配列” は、適切な調節配列の制御下に配置された場合にポリぺプチド又はタンパク質に転写翻訳される核酸配列である。
“遺伝子”という用語は、ポリぺプチド鎖を作製するのに関係するDNAのセグメントを意味し、コード領域の前の領域や次の領域(リーダーやトレイラー)、適用できる場合には個々のコードセグメント(エクソン)間の介在配列(イントロン)が含まれる。
明細書に用いられる“アミノ酸” 又は “アミノ酸配列” は、オリゴぺプチド、ぺプチド、ポリぺプチド、又はタンパク質配列、又はこれらのいずれかのサブユニット、天然に存在する又は合成分子を意味する。一態様においては、本発明の “アミノ酸配列” 又は “ポリぺプチド配列” には、例えば、配列番号2に示される配列、前記配列の断片、又はその変異体が含まれる。
本明細書に用いられる “ポリぺプチド” という用語は、ぺプチド結合又は修飾ぺプチド結合によって相互に結合したアミノ酸、即ち、ぺプチドアイソスターに結合したアミノ酸を意味し、20の遺伝子コードしたアミノ酸以外の修飾アミノ酸を含有することができる。ポリぺプチドは、後転写処理のような自然過程か又は当該技術において周知である化学修飾技術によって修飾することができる。修飾は、ぺプチド主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ又はカルボキシル末端を含むポリぺプチドのいずれかに存在し得る。同じタイプの修飾は、一定のポリぺプチド内のいくつかの部位で同じ程度又は異なる程度で存在することができることが理解される。また、一定のポリぺプチドは、多くの種類の修飾をもつこともできる。修飾には、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミノ化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPI固定形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペギル化、タンパク質分解処理、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、又はアルギニル化のようなアミノ酸の転移RNA仲介付加が含まれる。(Proteins Structure and Molecular Properties 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)を参照のこと)
【００４３】
本明細書に用いられる “分離した” という用語は、物質をもとの環境(例えば、天然に存在する場合には自然環境)から除去される。例えば、生きた動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリぺプチドは分離されないが、天然系に共存する物質の一部又は全部から分離される同じポリヌクレオチド又はポリぺプチドは分離される。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であることができ及び/又はそのようなポリぺプチド又はポリぺプチドは組成物の一部であることができ、そのようなベクター又は組成物が自然環境の一部でない点で更に分離される。
本明細書に用いられる “精製した” という用語は、絶対純度を必要とせず、むしろ相対的定義として意味する。ライブラリーから得られた個々の核酸は、通例は電気泳動均一性まで精製される。これらのクローンから得られた配列は、ライブラリーからか又は全ヒトDNAから直接得ることができない。本発明の精製した核酸は、生物内のゲノムDNAの残りから少なくとも104-106倍だけ精製されている。しかしながら、“精製した” という用語は、ゲノムDNAの残りから又はライブラリー又は他の環境における他の配列から少なくとも1桁、典型的には2又は3桁、更に典型的には4桁又は5桁の大きさだけ精製された核酸も含まれる。
本明細書に用いられる “組換え” という用語は、核酸が自然環境において相接していない “主鎖” 核酸に相接していることを意味する。更に、“多く含まれる” べき核酸は、核酸主鎖分子の集団において核酸挿入断片数が5% 以上である。本発明の主鎖分子には、発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組込んでいる核酸、又は対象の核酸挿入断片を維持又は操作するために用いられる他のベクター又は核酸のような核酸が含まれる。典型的には、多く含まれる核酸は、組換え主鎖分子の集団において核酸挿入断片数が15% 以上である。更に典型的には、多く含まれる核酸は、組換え主鎖分子の集団において核酸挿入断片数が50% 以上である。一態様においては、多く含まれる核酸は、組換え主鎖分子の集団において核酸挿入断片数が90% 以上である。
【００４４】
“組換え” ポリぺプチド又はタンパク質は、組換えDNA技術によって生産されるポリぺプチド又はタンパク質を意味する。即ち、所望のポリぺプチド又はタンパク質をコードしている外因性DNA構築物によって形質転換された細胞から生産されるポリぺプチド又はタンパク質を意味する。 “合成” ポリぺプチド又はタンパク質は、化学合成によって調製されたものである。固相化学ぺプチド合成法は、また、本発明のポリぺプチド又は断片を合成するために用いることができる。そのような方法は、1960年代初期から当該技術において既知であり(Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963) (Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2 ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12も参照のこと))、最近では市販の実験用設計合成キットに用いられている(Cambridge Research Biochemicals)。そのような市販の実験用キットは、一般的には、H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984)の教示を用い、すべて単一プレートに結合されている多くの “ロッド” 又は “ピン” の先端にぺプチドを合成するものである。そのようなシステムを用いた場合、ロッド又はピンのプレートは、ピン又はロッドの先端に適切なアミノ酸を結合又は固定するための溶液を含有する対応するウェル又はレザバーの第2プレートへ反転し挿入される。そのようなプロセスステップ、即ち、ロッドやピンの先端を反転し挿入することを繰り返すことにより、アミノ酸が所望のぺプチドへ組込まれる。更に、多くの市販のFMOCぺプチド合成システムが利用できる。例えば、ポリぺプチド又は断片のアセンブリは、Applied Biosystems, Inc. Model 431A自動ぺプチドシンセサイザーを用いた固体支持体上で行うことができる。そのような装置は、直接合成か又は他の既知の手法を用いて結合し得る一連の断片の合成によって本発明のぺプチドへの到達が容易である。
【００４５】
プロモーター配列は、プロモーターで転写を開始するRNAポリメラーゼがmRNAへコード配列を転写する場合にコード配列に “作用可能に結合” する。
“プラスミド” は小文字pの前に及び/又は後ろに大文字及び/又は数字があることにより示される。本明細書の出発プラスミドは、市販されるものか、無制限に公に利用できるものか、発表された手順に従って利用できるプロテアーゼから構築され得るものである。更に、本明細書に記載されるものに等価なプラスミドは、当該技術において既知であり、当業者に明白である。
DNAの“消化” は、DNAのある種配列でのみ作用する制限酵素でDNAを触媒切断することを意味する。本明細書に用いられる種々の制限酵素は、市販され、当業者に既知である反応条件、補因子、他の必要条件を用いた。分析のためには、典型的には1μgのプラスミド又はDNA断片を約2単位の酵素と約20μlの緩衝液中で用いる。プラスミド構築用にDNA断片を分離するためには、典型的には5〜50μgのDNAを大量の20〜250単位の酵素で消化する。具体的な制限酵素に適したバッファーと基質の量は、製造業者によって指定されている。通常は37℃で約1時間のインキュベーション時間が用いられるが、供給業者の説明書に従って異なってもよい。消化後、所望の断片を分離するためにゲル電気泳動を行うことができる。
“オリゴヌクレオチド” は、化学的に合成することができる一本鎖ポリデオキシヌクレオチドか又は2つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。そのような合成オリゴヌクレオチドは5' リン酸をもたないので、キナーゼの存在下にATPによるリン酸を付加せずに他のオリゴヌクレオチドにライゲートしない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化していない断片にライゲートする。
【００４６】
2つの核酸配列又はポリぺプチドに関連して“ほぼ同一” という用語は、既知の配列比較アルゴリズムの1種を用いて又は目視検査により測定されるように、最大対応に対して比較整列された場合のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性が少なくとも60%、70%、80%、ある態様においては、90-95%である2つ以上の配列を意味する。典型的には、実質的な同一性は少なくとも約100残基について存在し、最も一般的には少なくとも約150-200残基についてほぼ同一である。ある態様においては、配列はコード領域の全長についてほぼ同一である。
本明細書に用いられる "約" という用語は、"およそ" 又は "大体" 又は "前後" 又は "領域の" を意味する。"約" という用語が数値範囲とともに用いられる場合、示された数値の上下に境界を広げることによりその範囲が変わる。一般に、本明細書に用いられる "約" という用語は、述べられた数値の上下に20% だけ分散した数値に変わる。
更に、“ほぼ同一の” アミノ酸配列は、特に置換が分子の活性部位でない部位で生じる場合でポリぺプチドが機能特性を実質的に保持するならば、1つ以上の保存的又は非保存的アミノ酸置換、欠失、又は挿入による参照配列と異なる配列である。保存的アミノ酸置換は、例えば、同じクラスの1つのアミノ酸に1つのアミノ酸を置換する(例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンのような1つの疎水性アミノ酸に他のアミノ酸を置換する、又は1つの極性アミノ酸に他のアミノ酸を置換する、例えば、アルギニンにリシンを、グルタミンにアスパラギン酸を又はグルタミンにアスパラギンを置換する)。1つ以上のアミノ酸を、例えば、フィターゼポリぺプチドから欠失させることができ、結果として生物活性をほとんど変えずにポリぺプチドの構造が修飾される。例えば、フィターゼ生物活性に必要としないアミノ末端又はカルボキシル末端アミノ酸を除去することができる。本発明の修飾ポリぺプチド配列は、修飾ポリぺプチド配列とフィターゼ基質とを接触させるステップと、修飾ポリぺプチドが分析において特定の基質の量を減少させるか機能フィターゼと基質との酵素反応の生物産物を増加させるかを求めるステップとを含む非常に多くの方法によってフィターゼ生物活性を分析することができる。
【００４７】
本明細書に用いられる“断片” は、少なくとも2つの異なるコンホメーションに存在し得る天然に存在するタンパク質又は組換えタンパク質の一部である。断片は、天然に存在する同じ又は実質的に同じアミノ酸配列をもつことができる。“実質的に同じ” は、アミノ酸配列が主にではあるが全体にではなく同じであり、関連する配列の少なくとも一つの機能的活性を保持していることを意味する。一般に、少なくとも約70% 、典型的には約85% 以上同一である場合には2つのアミノ酸配列は “ほぼ同じ” 又は “ほぼ相同” である。天然に存在するタンパク質として3次元構造が異なる断片も含まれる。この一例が活性が著しく高い成熟酵素を産生するために切断により修飾することができる低活性プロタンパク質のような “プロ形” 分子である。
“ハイブリダイゼーション”は核酸鎖が塩基対合によって相補鎖と結合する方法を意味する。ハイブリダイゼーション反応は、感受性があり選択的であり得るので対象の具体的な配列を低濃度で存在する試料中でさえ同定することができる。適切なストリンジェント条件は、例えば、プレハイブリダイゼーションやハイブリダイゼーションの溶液中の塩又はホルムアミドの濃度、又はハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、当該技術において周知である。特に、ストリンジェンシーは、塩濃度の低下、ホルムアミド濃度の増加、又はハイブリダイゼーション温度の上昇によって高めることができる。
【００４８】
例えば、高ストリンジェンシー下でのハイブリダイゼーションは約50% のホルムアミド中で約37℃〜42℃で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー条件下で約35% 〜 25% のホルムアミド中で約30℃〜35℃で起こり得る。特に、ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件下で50% ホルムアミド、5X SSPE、0.3% SDS、200 ng/mlの切断し変性したサケ精子DNA中42℃で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、上記低ストリンジェンシー条件下であるが35% のホルムアミド中35℃の低温で起こり得る。具体的なレベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、対象の核酸のプリンとピリミジン比を計算するとともにそれに応じて温度を調整することにより更に狭くすることができる。上記範囲と条件に対する変更は、当該技術において周知である。
“変異体”という用語は、1つ以上の塩基対、コドン、イントロン、エキソン、又はアミノ酸残基で修飾されているが(それぞれ)なお本発明のフィターゼの生物活性を保持しているポリヌクレオチド又はポリぺプチドを意味する。変異体は、例えば、誤りがちなPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アセンブリPCR、性的PCR変異導入、生体内変異導入、カセット変異導入、再帰的集合変異導入、指数的集合変異導入、部位特異的変異導入、ライゲーションリアセンブリ、GSSM又はその組合わせのような方法が含まれるかなり多くの手段によって作製することができる。
酵素について本明細書に用いられる “熱安定性の” や “熱安定性” は、高温で機能する酵素の能力、例えば、70℃と85℃において共通pHで比活性が匹敵する能力を意味する。
“熱安定性” 酵素は、高温で活性の多く又は全部を維持し、高熱安定性を得る変異導入前に標準温度(例えば、室温)又は最適温度より高温度でも活性であることができるものである。
酵素について本明細書に用いられる “耐熱性の” や “耐熱性” は、高温が一時的に酵素を脱活性化したとしても、高温にさらした後に正常に機能する酵素の能力を意味する。
【００４９】
核酸の作成と操作
本発明は、本発明のポリぺプチドとフィターゼをコードしている発現ベクターのような発現カセットを含む核酸を提供する。本発明には、また、本発明の核酸を用いて新規なフィターゼ配列を発見する方法が含まれる。また、本発明の核酸を修飾する方法、例えば、合成ライゲーションリアセンブリ、最適化特異的進化系及び/又は飽和変異導入も提供される。
本発明の核酸は、例えば、cDNAライブラリーのクローニングと発現、PCRによるメッセージDNA又はゲノムDNAの増幅等により作成、分離及び/又は操作することができる。本発明の方法を実施する際に、本明細書に記載されるように鋳型核酸を操作することにより相同遺伝子を修飾することができる。本発明は、科学文献や特許文献に十分に記載されている当該技術において既知の方法又はプロトコール又はデバイスとともに実施することができる。
【００５０】
一般的手法
本発明を実施するために用いられる核酸、RNA、iRNA、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルスかそのハイブリッドかは種々の供給源から分離、遺伝子操作、増幅、及び/又は発現/組換え作成することができる。これらのポリぺプチドから作成された組換えポリぺプチドは、個々に分離又はクローン化することができ、所望の活性を試験することができる。細菌、哺乳動物、酵母、昆虫又は植物細胞発現系を含むいずれの組換え発現系も用いることができる。
また、これらの核酸は、例えば、Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号に記載される周知の化学合成法によって試験管内で合成し得る。
核酸を操作する方法、例えば、サブクローニング、標識化プローブ(例えば、クレノウポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅)、シークエンシング、ハイブリダイゼーション等は化学文献や特許文献に十分に記載されている。例えば、Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)を参照のこと。
本発明の方法を実施するために用いられる核酸を入手し操作する他の有効な手段は、ゲノム試料からクローン化することであり、所望される場合には、例えば、ゲノムクローン又はcDNAクローンから分離又は増幅された挿入断片をスクリーニングし再クローン化することである。本発明の方法に用いられる核酸の供給源には、例えば、哺乳動物人工染色体(MACs)に含まれるゲノム又はcDNAライブラリー、例えば、米国特許第5,721,118号; 同第025,155号を参照のこと; ヒト人工染色体、例えば、Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335を参照のこと; 酵母人工染色体(YAC); 細菌人工染色体(BAC); P1人工染色体例えば、Woon (1998) Genomics 50:306-316を参照のこと; P1由来ベクター(PACs)、例えば、Kern (1997) Biotechniques 23:120-124を参照のこと; コスミド、組換えウイルス、ファージ又はプラスミドが含まれる。
【００５１】
一態様においては、本発明のポリぺプチドをコードしている核酸は、翻訳ポリぺプチド又はその断片の分泌を特定することができるリーダー配列と適切な相でアセンブルされる。
本発明は、融合タンパク質とそれをコードしている核酸を提供する。本発明のポリぺプチドは、高安定性又は簡易化精製のような所望される特徴を与えるN末端同定ぺプチドのような異種ぺプチド又はポリぺプチドに融合し得る。本発明のぺプチド又はポリぺプチドは、例えば、免疫原性のあるぺプチドを生産するために、組換え合成ぺプチドを分離しやすくするために、抗体や抗体発現B細胞を同定し分離するためになど、1つ以上の追加ドメインが結合した融合タンパク質として合成し発現させることができる。検出や精製を容易にするドメインには、例えば、固定化金属上で精製することができるポリヒスチジン管やヒスチジン-トリプトファンモジュールのような金属キレート化ぺプチド、固定化免疫グロブリン上で精製することができるプロテインA、又はFLAGSエクステンション/アフィニティ精製系(Immunex Corp、シアトル、ワシントン州)で使われるドメインが含まれる。精製ドメインと精製を容易にするモチーフを含んでいるぺプチド又はポリぺプチドとの間に因子Xa又はエンテロキナーゼ(Invitrogen、サンディゴ、カリフォルニア州)のような切断可能リンカーを含む配列が決定される。例えば、発現ベクターには、6ヒスチジン残基に続いてチオレドキシンとエンテロキナーゼ切断部位に結合したエピトープコード核酸配列を含めることができる(例えば、Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414を参照のこと)。ヒスチジン残基は検出や精製を促進させるが、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質の残部からエピトープを精製する手段を与える。融合タンパク質をコードしているベクターに関する技術や融合タンパク質の応用は、化学文献や特許文献に十分に記載されている。例えば、Kroll  (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53を参照のこと。
【００５２】
転写と翻訳の制御配列
本発明は、RNA合成/発現を特定又はモジュレートする(例えば、転写又は翻訳)制御配列、例えば、プロモーター又はエンハンサーを発現させるために作用可能に結合した本発明の核酸(例えば、DNA)配列を提供する。発現制御配列は、発現ベクターにあり得る。具体的な細菌プロモーターとしては、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、lambda PR、PL又はtrpが含まれる。具体的な真核プロモーターとしては、最初期CMV、HSVチミジンキナーゼ、初期と後期のSV40、レトロウイルス由来LTRs、又はマウスメタロチオネインIが含まれる。
細菌中でポリぺプチドを発現、又は過剰発現するのに適したプロモーターには、大腸菌lac又はtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、λPRプロモーター、λPLプロモーター、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)のような解糖酵素をコードしているオペロン由来プロモーター、又は酸ホスファターゼプロモーターが含まれる。真核プロモーターには、最初期CMVプロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期と後期のSV40プロモーター、レトロウイルス由来LTR、又はマウスメタロチオネイン-Iプロモーターが含まれる。原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイルス中での発現を制御することが既知の他のプロモーターを用いることもできる。
【００５３】
発現ベクターとクローニングベクター
本発明は、本発明のポリぺプチド(及び核酸、例えば、アンチセンス)を発現や過剰発現させるための、本発明の核酸、例えば、本発明のフィターゼをコードしている配列を含む発現ベクターとクローニング伝達体を提供する。本発明の発現ベクターとクローニング伝達体は、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスDNA (例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルス又はSV40誘導体)、P1系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、又は対象の特定のホストに特異的な他のベクター(例えば、バシラス(bacillus)、アスペルギルス(Aspergillus)又は酵母)を含むことができる。本発明のベクターには、染色体配列、非染色体配列、合成DNA配列を含めることができる。多数の適切なベクターが当業者に既知であり、市販されている。具体的なベクターには、細菌ベクター: pQEベクター(Qiagen)、pBluescriptプラスミド、pNHベクター(λZAPベクター(Stratagene); ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T (Pharmacia); 真核ベクター: pXT1、pSG5 (Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40 (Pharmacia)が含まれる。しかしながら、他のプラスミド又は他のベクターは、ホスト内で複製可能で生存可能である限り用いることができる。低コピー数又は高コピー数のベクターが、本発明において用いることができる。
発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始用リボソーム結合部位と転写ターミネーターを含むことができる。ベクターには、また、発現を増幅するのに適した配列を含めることができる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点と、必要なリボソーム結合部位と、ポリアデニル化部位と、スプライス供与部位と受容部位と、転写終結配列と、5'フランキング非転写配列とを含むことができる。ある態様においては、SV40スプライス部位とポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要とされる非転写遺伝因子を与えるために用いることができる。
【００５４】
一態様においては、発現ベクターは、ベクターを含むホスト細胞の選択を可能にする1つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含んでいる。そのような選択可能マーカーには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ又は真核細胞培養物にネオマイシン耐性を与える遺伝子、E. coliにおいてテトラサイクリン又はS.セレビシエ(S. cerevisiae)TRP1遺伝子を与える遺伝子が含まれる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ(CAT)ベクター又は選択可能マーカーを有する他のベクターを用いて所望の遺伝子から選択することができる。
真核細胞においてポリぺプチド又はその断片を発現させるベクターは、また、発現レベルを高めるエンハンサーを含むことができる。エンハンサーは、転写を高めるためにプロモーターに作用する長さが通常は約10〜約300 bpのDNAのシス作用因子である。例としては、複製起点bp 100〜270の後期側に対するSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーター、複製起点の後期側に対するポリオーマエンハンサー、又はアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
DNA配列は、種々の手順によってベクターに挿入することができる。一般に、DNA配列は、挿入断片とベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化した後にベクター内の所望の位置にライゲートされる。また、挿入断片とベクター双方の平滑末端をライゲートすることができる。種々のクローニング技術は、例えば、Ausubel & Sambrookに記載されるように当該技術において既知である。そのような手順等は、当業者の範囲内であると考えられる。
【００５５】
ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、又はファージの形であってもよい。他のベクターには、染色体配列、非染色体配列、合成DNA配列、SV40の誘導体; 細菌プラスミド、ファージ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組合わせ由来のベクター、ウイルスDNA、例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、又は偽狂犬病が含まれる。原核ホストや真核ホストと用いられる種々のクローニングと発現のベクターは、例えば、Sambrookによって記載されている。
用いることができる具体的な細菌ベクターには、周知のクローニングベクターの遺伝因子を含む市販のプラスミドpBR322 (ATCC 37017)、pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals、ウプサラ、スウェーデン)、GEM1 (Promega Biotec、マディソン、ウィスコンシン州、米国) pQE70、pQE60、pQE-9 (Qiagen)、pD10, psiX174 pBluescript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A (Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)、pKK232-8、pCM7が含まれる。具体的な原核ベクターとしては、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSG、又はpSVL (Pharmacia)が含まれる。しかしながら、他のベクターは、ホスト細胞において複製可能で生存可能である限り用いることができる。
【００５６】
ホスト細胞と形質転換細胞
本発明は、また、本発明の核酸配列、例えば、本発明のフィターゼをコードしている配列、本発明のベクターを含む形質転換細胞を提供する。ホスト細胞は、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は植物細胞のような真核細胞を含む当業者に良く知られたホスト細胞のいずれであってもよい。具体的な細菌細胞には、大腸菌、ストレプトマイセス、バシラス・サチリス、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)又はシュードモナス、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スタフィロコッカス属の様々な種が含まれる。具体的な昆虫細胞には、ショウジョウバエ(Drosophila) S2やスポドプレラ(Spodoptera) Sf9が含まれる。具体的な動物細胞には、CHO、COS又は or Bowesメラノーマ又は任意のマウス又はヒト細胞系が含まれる。適切なホストの選択は、当業者の能力の範囲内である。
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、導入、ウイルス感染、遺伝子ガン、又はTi仲介遺伝子移入を含む様々手法を用いてホスト細胞へ導入することができる。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーション(Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986))が含まれる。
適切な場合には、操作さいたホスト細胞を、プロモーターの活性化、形質転換細胞の選択又は本発明の遺伝子の増幅に適するように修飾した慣用の栄養培地で培養することができる。適切なホスト株を形質転換するとともに該ホスト株を適切な細胞密度まで増殖した後、適切な手段(例えば、温度移動又は化学的誘導)によって選択したプロモーターを誘導し、細胞を所望のポリぺプチド又はその断片を生産させることができる期間更に培養することができる。
【００５７】
細胞を遠心分離によって回収することができ、物理的又は化学的手段によって破壊することができ、得られた粗抽出物は精製するために保持される。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクリング、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含む便利な方法によって破壊することができる。そのような方法は、当業者に周知である。発現したポリぺプチド又はその断片を、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー又はレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって組換え細胞培養物から回収し精製することができる。必要に応じてポリぺプチドの配置を完全にするためにタンパク質リフォールディングステップを用いることができる。所望される場合には、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を最終精製ステップに用いることができる。
種々の哺乳動物細胞培養系は、また、組換えタンパク質を発現、又は過剰発現するために用いることができる。哺乳動物発現系の例には、サル腎線維芽細胞のCOS-7系や適合するベクターからタンパク質を発現させることができる他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、BHKの細胞系が含まれる。
【００５８】
ホスト細胞中の構築物は、組換え配列によってコードされた遺伝子産物を作製するために慣用的な方法で使用し得る。組換え生産手順で用いられるホストによっては、ベクターを含むホスト細胞によって産生されたポリぺプチドはグリコシル化されてもよく、非グルコシル化されてもよい。本発明のポリぺプチドには、最初にメチオニンアミノ酸残基が含まれても含まれなくてもよい。
無細胞翻訳系は、本発明のポリぺプチドを作製するために用いることができる。無細胞翻訳系は、ポリぺプチド又はその断片をコードしている核酸に作用可能に結合したプロモーターを含むDNA構築物から転写したmRNAを用いることができる。ある態様においては、DNA構築物は試験管内転写反応を行う前に線状化することができる。次に転写したmRNAを適切な無細胞翻訳抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球抽出物とインキュベートして所望のポリぺプチド又はその断片を生産する。
発現ベクターは、真核細胞培養物に対してジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、又は大腸菌におけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性のような形質転換ホスト細胞の選択に表現型特性を与える1つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含むことができる。
【００５９】
核酸の増幅
本発明を実施するに当たり、本発明のポリぺプチドをコードしている核酸、又は修飾核酸は、例えば、増幅によって複製することができる。本発明は、プライマー対が具体的な配列番号1、又はその配列を含む核酸配列を増幅することができる、フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を増幅するための増幅プライマー配列対を提供する。当業者は、これらの配列の一部又は全長について増幅プライマー配列対を設計することができる。
具体的な配列番号1は下記配列である。
ATGAAAGCGATCTTAATCCCATTTTTATCTCTTCTGATTCCGTTAACCCCGCAATCTGCATTCGCTCAGAGTGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAAAGTGTGGTGATTGTCAGTCGTCATGGTGTGCGTGCTCCAACCAAGGCCACGCAACTGATGCAGGATGTCACCCCAGACGCATGGCCAACCTGGCCGGTAAAACTGGGTGAGCTGACACCGCGCGGTGGTGAGCTAATCGCCTATCTCGGACATTACTGGCGTCAGCGTCTGGTAGCCGACGGATTGCTGCCTAAATGTGGCTGCCCGCAGTCTGGTCAGGTCGCGATTATTGCTGATGTCGACGAGCGTACCCGTAAAACAGGCGAAGCCTTCGCCGCCGGGCTGGCACCTGACTGTGCAATAACCGTACATACCCAGGCAGATACGTCCAGTCCCGATCCGTTATTTAATCCTCTAAAAACTGGCGTTTGCCAACTGGATAACGCGAACGTGACTGACGCGATCCTCGAGAGGGCAGGAGGGTCAATTGCTGACTTTACCGGGCATTATCAAACGGCGTTTCGCGAACTGGAACGGGTGCTTAATTTTCCGCAATCAAACTTGTGCCTTAAACGTGAGAAACAGGACGAAAGCTGTTCATTAACGCAGGCATTACCATCGGAACTCAAGGTGAGCGCCGACTGTGTCTCATTAACCGGTGCGGTAAGCCTCGCATCAATGCTGACGGAGATATTTCTCCTGCAACAAGCACAGGGAATGCCGGAGCCGGGGTGGGGAAGGATCACCGATTCACACCAGTGGAACACCTTGCTAAGTTTGCATAACGCGCAATTTGATTTGCTACAACGCACGCCAGAGGTTGCCCGCAGCCGCGCCACCCCGTTATTAGATTTGATCAAGACAGCGTTGACGCCCCATCCACCGCAAAAACAGGCGTATGGTGTGACATTACCCACTTCAGTGCTGTTTATCGCCGGACACGATACTAATCTGGCAAATCTCGGCGGCGCACTGGAGCTCAACTGGACGCTTCCCGGTCAGCCGGATAACACGCCGCCAGGTGGTGAACTGGTGTTTGAACGCTGGCGTCGGCTAAGCGATAACAGCCAGTGGATTCAGGTTTCGCTGGTCTTCCAGACTTTACAGCAGATGCGTGATAAAACGCCGCTGTCATTAAATACGCCGCCCGGAGAGGTGAAACTGACCCTGGCAGGATGTGAAGAGCGAAATGCGCAGGGCATGTGTTCGTTGGCAGGTTTTACGCAAATCGTGAATGAAGCACGCATACCGGCGTGCAGTTTGAGATCTCATCTA
【００６０】
従って、具体的な増幅プライマー配列対は、配列番号1の残基1〜21(即ち、ATGAAAGCGATCTTAATCCCAと配列番号1の最後の21残基(即ち、TGCAGTTTGAGATCTCATCTAの相補鎖)である。
増幅反応は、また、試料中の核酸量(例えば、細胞試料中のメッセージ量)を定量するために、核酸(例えば、アレイ又はブロットに適用するために)を標識するために、核酸を検出するために、又は試料中の特定の核酸の量を定量するために使用し得る。本発明の一態様においては、細胞又はcDNAライブラリーから分離したメッセージは増幅される。当業者は、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択し設計することができる。増幅法も当該技術において周知であり、例えば、ポリメラーゼ鎖反応、PCR (例えば、PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990)やPCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.を参照のこと)、リガーゼ鎖反応(LCR) (例えば、Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117を参照のこと); 転写増幅(例えば、Kwoh (1989)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173を参照のこと); 自己維持配列複製(例えば、Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874を参照のこと); Q-βレプリカーゼ増幅(例えば、Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491を参照のこと)、自動Q-βレプリカーゼ増幅分析(例えば、Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271を参照のこと)、他のRNAポリメラーゼ仲介技術(例えば、NASBA, Cangene, ミシソーガ、オンタリオ州)が含まれる。また、Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; 米国特許第4,683,195号; 同第4,683,202号; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564を参照のこと。
【００６１】
配列同一度の定量
本発明は、少なくとも100残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98% である核酸配列を含む分離した又は組換え核酸であって、該核酸がフィターゼ活性を有する少なくとも1つのポリぺプチドをコードし、該配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析や目視検査により求められる、前記核酸を提供する。他の実施態様においては、核酸配列の少なくとも約50残基、100残基、150残基、200残基、250残基、300残基、350残基、400残基、450残基、500残基、550残基、60残基、700残基、800残基、900残基、1000残基、1200残基又は1300残基の領域について配列番号1に対する配列同一性が少なくとも98%、98.5%、99% 又は99.5% である。核酸配列は、配列番号1に示される配列をもち得る。一態様においては、配列同一性(相同性)の程度は本明細書に記載されるもの、例えば、BLAST 2.2.2.又はFASTAバージョン3.0t78を含むコンピュータプログラムと関連パラメータをデフォルトパラメータとともに用いて求めることができる。
相同配列には、ウリジンが核酸配列中のチミンに置き換えられているRNA配列が含まれる。相同配列は、本明細書に記載される手順のいずれかを用いて得ることもでき、シークエンシングエラーの修正から得ることもできる。本明細書に示される核酸配列が伝統的な単一特性形式(例えば、Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd Ed., W. H Freeman & Co., New Yorkを参照のこと)又は配列中のヌクレオチドの同一性を記録する他の形式で示し得ることは理解される。
【００６２】
本明細書で同定された種々のは比較プログラムは、本発明のこの態様において用いられる。タンパク質及び/又は核酸配列同一性(相同性)は当該技術において既知の種々のは比較アルゴリズムとプログラムのいずれを用いても評価することができる。そのようなアルゴリズムとプログラムには、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、CLUSTALWが含まれるがこれらに限定されない(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993)。
相同性又は同一性は、配列分析ソフトウェア(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710ユニバーシティアベニュー、マディソン、ウィスコンシン 53705)を用いて測定し得る。そのようなソフトウェアは、相同度を種々の欠失、置換、他の修飾に当てはめることにより類似の配列と適合させる。2つ以上の核酸又はポリぺプチド配列に関連するThe terms “相同性” や “同一性” という用語は、非常に多くの配列対照アルゴリズム又はマニュアルアラインメントと目視検査を用いて測定される比較ウィンドウ又は表示領域について最大対応に対して比較し整列させる場合、同じであるか又は同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの指定された% をもつ2つ以上の配列又はサブ配列を意味する。配列比較の場合、一つの配列は試験配列が比較される参照配列(配列番号1、配列番号2の具体的な配列)として作用し得る。配列比較アルゴリズムを用いた場合、試験配列と参照配列をコンピュータへ入力し、必要な場合にはサブ配列座標が表示され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが表示される。デフォルトプログラムパラメータを用いることができ、代替的パラメータも表示することができる。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づき参照配列に相対する試験配列の配列同一性% が計算される。
【００６３】
本明細書に用いられる “比較ウィンドウ” には、相接する残基数のいずれか1つのセグメントの参照が含まれている。例えば、本発明の代替的態様においては、具体的な配列の配列番号1、配列番号2の20〜全長のいずれかの範囲にある相接する残基が、2つの配列を最適に整列させた後に相接する位置の同じ数の配列と比較される。参照配列が配列番号1、配列番号2に対して必要な配列同一性、例えば、配列番号1、配列番号2に対する配列同一性が98% である場合には、その配列は本発明の範囲内である。代替的実施態様においては、約20〜600、約50〜200、約100〜150の範囲にあるサブ配列が、2つの配列を最適に整列させた後に相接する位置の同じ数の参照配列と比較される。比較用配列のアラインメント方法は、当該技術において周知である。比較用配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981の局部的相同アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970の相同アラインメントアルゴリズム、person & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性方法の探索、これらのアルゴリズムのコンピュータ実行(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575サイエンスDr.、マディソン、ウィスコンシン州)、又はマニュアルアラインメントや目視検査により行うことができる。相同性又は同一性を求める他のアルゴリズムには、例えば、BLASTプログラム(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information)のほかに、ALIGN、AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences)、AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment)、ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool)、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node)、BLIMPS (BLocks IMProved Searcher)、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanアルゴリズム、DARWIN、Las Vegasアルゴリズム、FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool)、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package)、GAP (Global Alignment Program)、GENAL、GIBBS, GenQuest、ISSC (Sensitive Sequence Comparison)、LALIGN (Local Sequence Alignment)、LCP (Local Content Program)、MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench)、MAP (Multiple Alignment Program)、MBLKP、MBLKN、PIMA (Pattern-Induced Multi-sequence Alignment)、SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm)、WHAT-IFが含まれる。そのようなアラインメントプログラムは、また、ゲノムデータベースをスクリーニングして実質的に同じ配列をもつポリヌクレオチドを同定するために使用し得る。多くのゲノムデータベースが利用できる。例えば、ヒトゲノムのかなりの部分がヒトゲノムシークエンシングプロジェクト(Gibbs, 1995)の一部として利用できる。いくつかのゲノム、例えば、M.ゲニタリウム(M. genitalium) (Fraser et al., 1995)、M.ヤンナシイ(M. jannaschii) (Bult et al., 1996)、H.インフルエンゼ(H. influenzae) (Fleischmann et al., 1995)、大腸菌(Blattner et al., 1997)、酵母(S.セレビシエ(S. cerevisiae)) (Mewes et al., 1997)、D.メラノガスター(D. melanogaster) (Adams et al., 2000)の配列が決定された。マウス、C.エレガンス(C. elegans)、又はアラバドプシス種(Arabadopsis sp.)のようなモデル生物のゲノムのシークエンシングが著しく進歩した。ある機能的情報の注がついたゲノム情報を含むデータベースは、異なる組織によって維持され、インターネットでアクセスできる。
【００６４】
BLAST、BLAST 2.0、BLAST 2.2.2アルゴリズムも本発明を実施するために用いられる。例えば、Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。Software for performing BLAST分析を行うためのソフトウェアは、バイオテクノロジー情報ナショナルセンターによって公に入手できる。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたときにある正の価値のある閾値スコアTと適合するか満足させる照会配列中の長さWの短いワードWを同定することにより高スコアリング配列(HSP)を同定することを必要とする。Tは近傍ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul (1990) supra)。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含む長いHSPを見出す検索を開始するためのシードとして働く。ワードヒットは、累積したアラインメントスコアが増加し得る限りそれぞれの配列に沿って両方向に伸長する。累積したスコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータM (一組の適合している残基に対する報酬スコア; 常に>0)を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、累積したスコアを計算するためにスコアリングマトリックスが用いられる。それぞれの方向のワードヒットの拡張は、累積したアラインメントスコアが得られた最大値から量Xだけ減少する場合; 1つ以上の負のスコアリング残基アラインメントが蓄積するために累積したスコアがゼロ以下になる場合; 又はいずれかの配列の末端に達した場合に停止させる。 BLASTアルゴリズムパラメータW、T、Xはアラインメントの感度と速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルトとしてワード長(W)11、予想(E)10、M=5、N=-4、両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPはデフォルトとしてワード長3、予想(E)10、BLOSUM62スコアリングマトリックス(see Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)アラインメント(B)50、予想(E)10、M=5、N= -4、両鎖の比較を用いる。BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計分析を行う(例えば、Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって示される類似性の一基準は、2つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の適合が偶然に生じる確率を示す最小和確率(P(N))である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較での最小和確率が約0.2未満、約0.01未満、又は約0.001未満である場合には、核酸が参照配列に類似しているとみなされる。一態様においては、タンパク質と核酸配列の相同性はBasic Local Alignment Search Tool ("BLAST")を用いて評価される。例えば、次のタスク: (1) BLASTPとBLAST3はタンパク質配列データベースに対してアミノ酸照会配列を比較する; (2) BLASTNはヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチド照会配列を比較する; (3) BLASTXはタンパク質配列データベースに対して照会ヌクレオチド配列(両鎖)の6フレームの概念的翻訳産物を比較する; (4) TBLASTNは6全リーディングフレーム(両鎖)内で翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して照会タンパク質配列を比較する; (5) TBLASTXはヌクレオチド配列データベースの6フレーム翻訳に対してヌクレオチド照会配列の6フレーム翻訳を比較するを行うために使用し得る。BLASTプログラムは、照会アミノ酸配列又は核酸配列とタンパク質又は核酸配列データベースから得ることができる試験配列との間で本明細書で “高スコアリングセグメント対” と呼ばれる類似セグメントを同定することにより相同配列を同定する。高スコアリングセグメント対は、その多くが当該技術において既知であるスコアリングマトリックスによって同定(即ち、整列)し得る。用いられる具体的なスコアリングマトリックスは、BLOSUM62マトリックス(Gonnet et al., Science 256:1443-1445, 1992; Henikoff and Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993)である。また、PAM又はPAM250マトリックスを用いてもよい(例えば、Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships:  Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington:  National Biomedical Research Foundationを参照のこと)。
【００６５】
本発明の一態様においては、核酸が本発明の範囲内である必要とされる配列同一性をもつかを求めるために、NCBI BLAST 2.2.2プログラムはblastpに対するデフォルトオプションを用いる。BLAST 2.2.2プログラムにおける設定オプションは約38である。本発明のこの具体的な態様においては、デフォルトフィルタリングを除くすべてのデフォルト値が用いられる(即ち、すべてのパラメータは、OFFに設定されるフィルタリングを除いてデフォルトに設定される); その代りに、フィルタリングを無能にする "-F F" 設定が用いられる。デフォルトフィルタリングの使用は、配列の長さが短いためにKarlin-Altschul妨害がしばしば生じる。
本発明のこの具体的な態様において用いられるデフォルトには次が含まれる。
"低複雑性のフィルタ: ON
> ワードサイズ: 3
> マトリックス: Blosum62
> ギャップコスト: 存在形式:11
> 拡張子:1"
"低複雑性のフィルタ: ON
他のデフォルト設定は低複雑性のフィルタOFF、タンパク質のワードサイズ3、BLOSUM62マトリックス、ギャップ存在ペナルティ-11、ギャップ拡張ペナルティ-1である。
具体的なNCBI BLAST 2.2.2プログラム設定は下記実施例1に示される。Note that the "-W" オプションデフォルト0に留意のこと。このことは、設定されない場合、タンパク質についてはワードサイズデフォルト3、ヌクレオチドについては11を意味する。
【００６６】
コンピュータシステムとコンピュータプログラムプロダクト
コンピュータ内で配列同一性、構造相同性、モチーフ等を求めるために、本発明の配列をコンピュータによって読出しアクセスすることができる媒体に記憶、記録、操作することができる。従って、本発明は、本発明の核酸配列やポリぺプチド配列、例えば、具体的なな配列の配列番号1、配列番号2を記録又は記憶したコンピュータ、コンピュータシステム、コンピュータ読取り可能媒体、コンピュータプログラムプロダクト等を提供する。本明細書に用いられる “記録した” や “記憶した” という用語は、コンピュータ媒体に情報を記憶させる方法を意味する。当業者は、本明細書の1つ以上の核酸配列及び/又はポリぺプチド配列を含む製品を生成するためにコンピュータ読出し可能媒体に情報を記録する既知の方法を容易に用いることができる。
本発明の他の態様は、本発明の少なくとも1つの核酸及び/又はポリぺプチド配列を記録したコンピュータ読取り可能媒体である。コンピュータ読取り可能媒体には、磁気読取り可能媒体、光読取り可能媒体、電子読取り可能媒体、磁気/光媒体が含まれる。例えば、コンピュータ読取り可能媒体は、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、CD-ROM、ディジタル汎用ディスク(DVD)、ランダムアクセスメモリ(RAM)、又は読み出し専用メモリ(ROM)、また、当業者に既知の他の種類の他の媒体であってもよい。
【００６７】
本発明の態様には、本明細書に記載される配列や配列情報を記憶し操作するシステム(例えば、インターネットに基づくシステム)、特にコンピュータシステムが含まれる。コンピュータシステム100の一例は、図15のブロック図に示されている。本明細書に用いられる “コンピュータシステム”とは、本発明のヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列を分析するために用いられるハードウェアコンポーネント、ソフトウェアコンポーネント、データ記憶コンポーネントを意味する。コンピュータシステム100には、配列データを処理し、アクセスし、操作するためのプロセッサが含まれ得る。プロセッサ105は、周知のタイプの中央処理装置、例えば、Intel Corp.製のペンティアムIII、又はSun、Motorola、Compaq、AMD又はInternational Business Machines製の類似のプロセッサであり得る。コンピュータシステム100は、プロセッサ105とデータを記憶するための1つ以上の内部データ記憶コンポーネント110と、データ記憶コンポーネントに記憶されたデータを検索するための1つ以上のデータ検索デバイスをと含む汎用システムである。当業者は、現在利用し得るコンピュータシステムのいずかが適していることを容易に理解し得る。
一態様においては、コンピュータシステム100には、メインメモリ115 (RAMとして実行し得る)と1つ以上の内部データ記憶装置110、例えば、ハードドライブ及び/又はデータが記憶された他のコンピュータ読み出し可能媒体に接続されているバスに接続されたプロセッサ105が含まれている。コンピュータシステム100には、更に、内部データ記憶デバイス110に記憶されたデータを読み出すための1つ以上のデータ検索デバイスが含まれ得る。
【００６８】
データ検索デバイス118は、例えば、フロッピーディスクデバイス、コンパクトディスクデバイス、磁気テープドライブ、又はリモート記憶システム(例えば、インターネットによる)に接続できるモデム等であってもよい。ある実施態様においては、内部データ記憶デバイス110は、記憶された制御論理及び/又はデータを含むフロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープ等の交換可能コンピュータ読み取り可能媒体である。コンピュータシステム100には、有利には、データ検索デバイスに一旦挿入されるとデータ記憶コンポーネントから制御論理及び/又はデータを読み出すのに適したソフトウェアがふくまれてもよく、それによってプログラムされてもよい。
コンピュータシステム100には、コンピュータ使用者に出力を表示するために用いられるディスプレイ120が含まれる。また、コンピュータシステム100はコンピュータシステム 100に集中アクセスを与えるネットワーク又は広域ネットワークに他のコンピュータシステム125a-cに結合し得ることは留意されるべきである。本発明のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列にアクセスし処理するソフトウェアは、実行中メインメモリ115内に存在し得る。
ある態様においては、コンピュータシステム100は、更に、本発明の核酸配列と比較するための配列比較アルゴリズムを含むことができる。アルゴリズムと配列は、コンピュータ読み取り可能媒体に記憶され得る。“配列比較アルゴリズム”は、ヌクレオチド配列とデータ記憶手段内に記憶された他のヌクレオチド配列及び/又は化合物とを比較するためにコンピュータシステム100で実行される(ローカル又はリモートで)ことを意味する。例えば、配列比較アルゴリズムは、コンピュータ読み取り可能媒体に記憶された具体的な配列の配列番号1、配列番号2のヌクレオチド配列と相同性又は構造モチーフを同定するためにコンピュータ読み取り可能媒体に記憶された参照配列とを比較することができる。
【００６９】
上記アルゴリズムと用いられるパラメータは、研究される配列の長さや相同性の程度によって修正されてもよい。ある態様においては、パラメータは、使用者からの命令を存在させずにアルゴリズムによって用いられるデフォルトパラメータであってもよい。図16は、 新規な配列とデータベースの配列との間の相同レベルを求めるために新規なヌクレオチド配列又はタンパク質配列と配列のデータベースとを比較する方法200の一態様を示す流れ図である。配列のデータベースは、コンピュータシステム100内に記憶されたプライベートデータベース、又はインターネットによって入手できるGENBANKのような公衆データベースであり得る。方法200は開始状態201から始め、次に状態202に移動し、比較すべき新規な配列がコンピュータシステム100内のメモリに記憶される。上述したようにメモリはRAM又は内部記憶デバイスを含むいずれのタイプのメモリでもあり得る。
方法200は、次に配列のデータベースが分析と比較に開かれる状態204に移動する。方法200は、次にデータベースに記憶された第1配列がコンピュータでメモリへ読み出される状態206に移動する。次に、第1配列が第2配列と同じであるかを求めるために状態210で比較が行われる。このステップは、新規な配列とデータベースの第1配列との間で正確な比較を行うことに限定されないことを留意することは重要である。同一でないとしても2つのヌクレオチド配列又はタンパク質配列を比較する周知の方法は当業者に既知である。例えば、2つの試験配列間の相同レベルを上げるために1つの配列にギャップを導入し得る。比較中にギャップ又は他の特徴を制御するパラメータは、通常はコンピュータシステムの使用者によって入力される。
【００７０】
2つの配列の比較が状態210で行われると、2つの配列が同じであるかが決定状態210で決定される。“同じ”という用語が絶対に同一である配列に限定されないことは当然のことである。使用者によって入力された相同パラメータの範囲内にある配列は、方法200において “同じ” と特徴づけられる。2つの配列が同じである決定が行われる場合には、方法200は、データベースからの配列の名称が使用者に表示される状態214に移動する。この状態は、表示された名称をもつ配列が入力された相同性の束縛を満たしていることを使用者に知らせるものである。記憶された配列の名称が使用者に表示されると、方法200は決定状態218に移動し、配列が更にデータベースに存在するかが決定される。データベースに配列が更に存在しない場合には、方法200は終了状態220で終結する。しかしながら、配列が更にデータベースに存在する場合には、方法200は状態224に移動し、ポインタがデータベースの次の配列に移動するので新規な配列と比較し得る。この方法で、新規な配列を整列させ、データベースのあらゆる配列と比較することができる。
配列が相同でなかった決定状態212で決定された場合には、方法200は他の配列が比較のためにデータベースで入手できたかを求めるために決定状態218に直接移動する。従って、本発明の一態様は、プロセッサと、本発明の核酸配列を記憶しているデータ記憶デバイスと、比較を行うための配列コンペアラとを含むコンピュータシステムである。配列コンペアラは、比較された配列間の相同レベルを示すこと又は構造モチーフを同定することができ、これらの核酸コードとポリぺプチドコードと比較される配列の構造モチーフを同定することもできる。
【００７１】
図17は、2つの配列が相同であるかを求めるためのコンピュータでの方法250の一実施態様を示す流れ図である。方法250は開始状態252から始め、次に比較すべき第1配列をメモリに記憶させる状態254に移動する。次に比較すべき第2配列を状態256でメモリに記憶させる。方法250は、次に第1配列中の第1キャラクタを読み出す状態260に移動してから第2配列中の第1キャラクタを読み出す状態262に移動する。配列がヌクレオチド配列である場合には、キャラクタは、通常、A、T、C、G又はUであることを理解すべきである。配列がタンパク質配列である場合には、第1配列と第2配列が容易に比較することができるように単一文字アミノ酸コードであり得る。次に、2つのキャラクタが同じであるかが決定状態264で決定される。同じである場合には、方法250は第1配列と第2配列中の次のキャラクタを読み出す状態268に移動する。次に、次のキャラクタが同じであるかが決定される。同じである場合には、方法250は2つのキャラクタが同じでなくなるまでこのループを続ける。次の2つのキャラクタが同じでない決定がなされる場合には、方法250は読み出す配列中のキャラクタが更にあるかを求めるために決定状態274に移動する。読み出すキャラクタが更にない場合には、方法250は第1配列と第2配列間の相同レベルが使用者に表示される状態276に移動する。相同レベルは、第1配列中の合計配列数から同じであった配列間のキャラクタ割合を計算することにより求められる。従って、100の第1ヌクレオチド配列中のすべてのキャラクタが第2配列中のすべてのキャラクタと整列した場合には、相同レベルは100%である。
また、コンピュータプログラムは、配列が1つ以上の位置で異なっているかを求めるために参照配列と本発明の配列とを比較し得る。プログラムは、参照か本発明かの配列について挿入、欠失又は置換ヌクレオチド又はアミノ酸残基の長さと同一性を記録し得る。コンピュータプログラムは、参照配列が本発明の配列について単一ヌクレオチド多型性(SNP)を含むか或いは本発明の配列が既知の配列のSNPを含むかを求めるプログラムであってもよい。従って、ある態様においては、コンピュータプログラムはSNPを同定するプログラムである。該方法は上記コンピュータシステムと図17に示される方法によって実行することができる。該方法は、コンピュータプログラムの使用によって本発明の配列と参照配列を読み出すとともにコンピュータプログラムにより差を同定することにより行うことができる。
【００７２】
他の態様においては、コンピュータに基づくシステムは、本発明の核酸又はポリぺプチド内の特徴を同定するアイデンディファイアを含んでいる。“アイデンディファイア”とは、核酸配列内のある種の特徴を同定する1つ以上のプログラムを意味する。例えば、アイデンディファイアは、核酸配列中のオープンリーディングフレーム(ORF)を同定するプログラムを含むことができる。図18は、配列中の特徴の存在を検出するアイデンティファイア方法300の一態様を示す流れ図である。方法300は、開始状態302から始め、次に特徴を調べられるべき第1配列がコンピュータシステム100内のメモリ115に記憶される状態304に移動する。方法300は、次に配列特徴のデータベースが開かれる状態306に移動する。そのようなデータベースには、特徴の名称にそって各特徴の属性のリストが含まれている。例えば、特徴名は “開始コドン” であってもよく、属性は “ATG” である。他の例は、特徴名 “TAATAA Box” であり、特徴属性は “TAATAA”である。そのようなデータベースの一例は、ユニバーシティオブウィスコンシンジェネティクスコンピュータグループによって作製されている。また、特徴は、αらせん、βシートのような構造ポリぺプチドモチーフ、又は酵素活性部位、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ又は当業者に既知の他のモチーフであってもよい。特徴のデータベースが状態306で開かれると、方法300は第1直腸がデータベースから読み出される状態308に移動する。次に、第1特徴の属性と第1配列との比較が状態310で行われる。次に、特徴の属性が第1配列に見られたかが決定状態316で決定される。属性がわかった場合には、方法300はわかった特徴の名称が使用者に表示される状態318に移動する。方法300は更に特徴がデータベースに存在するかが決定される決定状態320に移動する。特徴が更に存在しない場合には、方法300は終了状態324で終結する。しかしながら、特徴が更にデータベースに存在しない場合には、方法300は状態326で配列特徴を読み出し、第1配列に対して次の特徴の属性が比較される状態310にループが戻る。決定状態316で第1配列に特徴属性が見られない場合には、方法300は特徴が更にデータベースに存在するかを求めるために直接決定状態320に移動する。従って、一態様においては、本発明はオープンリーディングフレーム(ORF)を同定するコンピュータプログラムを提供する。
【００７３】
本発明のポリぺプチド配列又は核酸配列は、種々のデータプロセッサプログラムに種々のフォーマットで記憶し操作することができる。例えば、配列は、MicrosoftWORD又はWORDPERFECTのようなワードプロセシングファイルでのテキストとして又はDB2、SYBASE、又はORACLEのような当業者に良く知られた種々のデータベースプログラムでのASCIIファイルとして記憶され得る。更に、多くのコンピュータプログラムとデータベースは、配列比較アルゴリズム、アイデティファイア、又は本発明の核酸配列と比較すべき参照ヌクレオチド配列又はポリぺプチド配列の供給源として用いることができる。本発明を実質するために用いられるプログラムとデータベースには、MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group)、GeneMine (Molecular Applications Group)、Look (Molecular Applications Group)、MacLook (Molecular Applications Group)、BLAST and BLAST2 (NCBI)、BLASTN and BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990)、FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988)、FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990)、Catalyst (Molecular Simulations Inc.)、Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.)、HypoGen (Molecular Simulations Inc.)、Insight II, (Molecular Simulations Inc.)、Discover (Molecular Simulations Inc.)、CHARMm (Molecular Simulations Inc.)、Felix (Molecular Simulations Inc.)、DelPhi、(Molecular Simulations Inc.)、QuanteMM、(Molecular Simulations Inc.)、Homology (Molecular Simulations Inc.)、Modeler (Molecular Simulations Inc.)、ISIS (Molecular Simulations Inc.)、Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.)、WebLab(Molecular Simulations Inc.)、WebLab Diversity Explorer(Molecular Simulations Inc.)、Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.)、SeqFold (Molecular Simulations Inc.)、MDL Available Chemicals Directoryデータベース、MDL Drug Data Reportデータベース、Comprehensive Medicinal Chemistryデータベース、Derwent's World Drug Indexデータベース、BioByteMasterFileデータベース、Genbankデータベース、Genseqnデータベースが含まれるがこれらに限定されない。他の多くのプログラムやデータベースは当業者には明らかである。
上記のプログラムを用いて検出することができるモチーフには、ロイシンジッパをコードしている配列、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、αらせん、βシート、コードされたタンパク質の分泌を特定するシグナルぺプチドをコードしているシグナル配列、ホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位、又は酵素切断部位のような転写調節に関係する配列が含まれる。
【００７４】
核酸のハイブリダイゼーション
本発明は、本発明の具体的な配列、例えば、配列番号1に示される配列、又は配列番号2に示される配列を含むポリぺプチドをコードしている核酸に対してストリンジェント条件下でハイブリッドする分離した又は組換え核酸を提供する。ストリンジェント条件は、本明細書に記載される高ストリンジェント条件と低ストリンジェント条件を含む高ストリンジェント条件、中ストリンジェント条件、低ストリンジェント条件であり得る。代替的実施態様においては、ストリンジェント条件下でハイブリッドする能力によって定義される本発明の核酸は、配列番号1の分子の約5残基と全長の間にあり得る。例えば、長さが少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200、250、300、350、400残基であり得る。全長より短い核酸も含まれる。これらの核酸は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、標識プローブ、PCRオリゴヌクレオチドプローブ、iRNA、アンチセンス又は抗体結合ぺプチド(エピトープ)をコードしている配列、モチーフ、活性部位等として有効である。
一態様においては、本発明の核酸は、約50% ホルムアミド中約37℃〜42℃での条件を含む高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする能力によって定義される。一態様においては、本発明の核酸は、約35%〜25% ホルムアミド中約30℃〜35℃での条件を含む低ストリンジェンシー下でハイブリダイズする能力によって定義される。また、本発明の核酸は、50% ホルムアミド、5X SSPE、0.3% SDS、cot-1又はサケ精子DNA (例えば、200 n/mlせん断変性したサケ精子DNA)中42℃での条件を含む高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする能力によって定義される。一態様においては、本発明の核酸は、35℃の低温での35% ホルムアミドを含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力によって定義される。
ハイブリダイゼーション後、フィルタは6X SSC、0.5% SDSと50℃で洗浄することができる。これらの条件は、ホルムアミドが25% より多い“中程度”条件とホルムアミドが25% より低い“低”条件であるとみなされる。“中程度”のハイブリダイゼーションの個々の例は、上記ハイブリダイゼーションが30% ホルムアミドで行われる場合である。“低ストリンジェンシー” のハイブリダイゼーション条件の個々の例は、上記ハイブリダイゼーションが10% ホルムアミドで行われる場合である。
具体的なレベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、対象の核酸のプリンとピリミジン比率を計算し、それに応じて温度を調節することにより更に狭くすることができる。本発明の核酸は、また、Ausubel & Sambrookに示されるように高、中、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力によって定義される。上記範囲と条件に関する変更は当該技術において周知である。ハイブリダイゼーション条件は後述される。
【００７５】
オリゴヌクレオチドプローブとその使用方法
本発明は、また、フィターゼ活性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を同定するための核酸プローブを提供する。一態様においては、プローブは、配列番号1に示される配列の少なくとも10の連続した塩基を含んでいる。また、本発明のプローブは、配列番号1に示される配列の少なくとも約5、6、7、8又は9〜約40、約10〜50、約20〜60、約30〜70の連続した塩基であり得る。プローブは結合又はハイブリダイゼーションによって核酸を同定する。プローブは、例えば、毛管アレイを含む本発明のアレイに使用し得る。下記を参照のこと。本発明のプローブは、また、他の核酸又はポリぺプチドを分離するために使用し得る。
本発明のプローブは、土壌試料のような生物試料が本発明の核酸配列をもつ生物又は核酸が得られた生物を含むかを求めるために使用し得る。そのような手順においては、核酸を分離した生物を潜在的に含んでいる生物試料が入手され、その試料から核酸が得られる。核酸とプローブが試料中に存在する相補的配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる条件下で接触させる。必要な場合には、プローブを相補的配列に対して特異的にハイブリダイズさせることができる条件は、相補的配列を含むことが既知の試料からの相補的配列や、相補的配列を含まない対照配列と接触させた状態におくことにより求めることができる。ハイブリダイゼーションバッファーの塩濃度、ハイブリダイゼーションバッファーのホルムアミド濃度、又はハイブリダイゼーション温度のようなハイブリダイゼーション条件は、プローブを相補的核酸に対して特異的にハイブリダイズさせることができる条件を同定するために変動させることができる(個々のハイブリダイゼーション条件に関する記述を参照のこと)。
【００７６】
試料が核酸を分離した生物を含む場合には、プローブの個々のハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションは、検出可能な産物の形成を触媒することができる放射性同位体、蛍光色素又は酵素のような検出可能物質でプローブを標識することにより検出することができる。試料中の相補的核酸の存在を検出するために標識プローブを用いる多くの方法が当業者に良く知られている。それらには、サザンブロット、ノーザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション法、又はドットブロットが含まれる。これらの方法の各々のプロトコールがAusubel & Sambrookに示されている。
また、1以上のプローブ(核酸試料中に存在する相補的配列に対して特異的にハイブリダイズできるプローブの少なくとも1つ)は、試料が本発明の核酸配列を含んでいる生物(例えば、核酸を分離した生物)を含むかを求めるために増幅反応において用いることができる。一態様においては、プローブはオリゴヌクレオチドを含んでいる。一態様においては、増幅反応はPCR反応を含むことができる。PCRプロトコールは、Ausubel & Sambrookに記載されている(増幅反応についての記述を参照のこと)。そのような方法においては、試料中の核酸をプローブと接触させ、増幅反応を行い、得られた増幅産物を検出する。増幅産物は、反応産物によるゲル電気泳動を行うとともにゲルを臭化エチジウムのようなインターカレータで染色することにより検出することができる。また、1つ以上のプローブは、放射性同位体で標識することができ、ゲル電気泳動後に放射性増幅産物の存在をオートラジオグラフィによって検出することができる。
本発明の核酸配列の3' 又は 5' 端近傍の配列に由来するプローブは、追加の、例えば、ゲノム配列を含むクローンを同定するために染色体ウォーキング法において使用し得る。そのような方法は、ホスト生物から対象のタンパク質を更にコードしている遺伝子を分離させることができる。
【００７７】
一態様においては、本発明の核酸配列は、関連核酸を同定し分離するためにプローブとして用いられる。ある態様においては、そのように同定された関連核酸は、本発明の核酸が最初に分離されたもの以外の生物由来のcDNA又はゲノムDNAであり得る。そのような方法においては、核酸試料とプローブとをプローブが関連配列に対して特異的にハイブリッドすることができる条件下で接触させる。次に、関連生物由来の核酸に対してプローブをハイブリッドさせることにより上記方法のいずれを用いても検出される。
核酸ハイブリダイゼーション反応においては、具体的なレベルのストリンジェンシーを得るために用いられる条件はハイブリダイズされる核酸の種類によって変動する。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成(例えば、GCとATの含量)、核酸の種類(例えば、RNAとDNA)は、ハイブリダイゼーション条件を選定するのに考慮し得る。追加の問題は、核酸の1つが、例えば、フィルタに固定化されるかである。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー、中程度ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシーの条件下で行うことができる。核酸ハイブリダイゼーションの一例として、固定化変性核酸を含むポリマー膜を、まず、0.9 M NaCl、50 mM NaH2PO4、pH 7.0、5.0 mM Na2EDTA、0.5% SDS、10X Denhardt試薬、0.5 mg/mlポリリボアデニル酸からなる溶液中45℃で30分間プレハイブリダイズする。次に、その溶液に約2×107 cpm (比活性4-9×108 cpm/ug)の32P末端標識オリゴヌクレオチドプローブを添加する。インキュベーションの12-16時間後、膜を室温(RT)で30分間0.5% SDSを含有する1X SET (150 mM NaCl、20 mMトリス塩酸塩、pH 7.8、1 mM Na2EDTA)中で洗浄し、続いてオリゴヌクレオチドプローブのTm-10℃で新しい1X SET中で30分間洗浄する。次に、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために膜をオートラジオグラフィ膜にさらす。
【００７８】
検出可能なプローブに対してハイブリダイズするcDNA又はゲノムDNAのような核酸を同定するために用いられるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることにより、プローブに対する相同レベルの異なる核酸を同定し分離することができる。ストリンジェンシーは、プローブの溶融温度より低い種々の温度でハイブリダイゼーションを行うことにより変えることができる。溶融温度、Tmは、標的配列の50% が完全な相補的プローブに対してハイブリダイズする温度(特定のイオン強度とpHの下で)である。非常にストリンジェントな条件は、具体的なプローブのTmに同じか約5℃低いように選定される。プローブの溶融温度は、次の具体的な式を用いて計算することができる。長さが14〜70ヌクレオチドのプローブの場合、溶融温度(Tm)は次式: Tm=81.5+16.6(log [Na+])+0.41(G+C断片)-(600/N) (式中、Nはプローブの長さである。）を用いて計算される。ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含有する溶液中で行われる場合には、溶融温度は: Tm=81.5+16.6(log [Na+])+0.41(G+C断片)-(0.63% ホルムアミド)-(600/N) (式中、Nはプローブの長さである。)を用いて計算することができる。プレハイブリダイゼーションは、6X SSC、5X Denhardt試薬、0.5% SDS、100μgの変性断片サケ精子DNA又は6X SSC、5X Denhardt試薬、0.5% SDS、100μgの変性断片化サケ精子DNA、50% ホルムアミド中で行うことができる。SSCとDenhardt試薬の製剤や他の溶液は、例えば、Sambrookに示されている。
【００７９】
ハイブリダイゼーションは、検出可能なプローブを上記プレハイブリダイゼーション溶液に添加することにより行われる。プローブが二本鎖DNAを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前に変性される。フィルタとハイブリダイゼーション溶液とをプローブが相補的又は相同的配列を含むcDNA又はゲノムDNAに対してハイブリダイズさせることができるのに十分な時間接触させる。長さが200ヌクレオチドを超えるプローブの場合、ハイブリダイゼーションはTmより低い15〜25℃で行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブのような短いプローブの場合、ハイブリダイゼーションはTmより低い5-10℃で行うことができる。一態様においては、6X SSC中のハイブリダイゼーションは約68℃で行われる。一態様においては、ハイブリダイゼーションは50% ホルムアミド含有溶液中のハイブリダイゼーションは約42℃で行われる。前述のハイブリダイゼーションのすべては高ストリンジェンシーの条件下であると考えられる。
ハイブリダイゼーション後、非特異的に結合した検出可能プローブを除去するためにフィルタを洗浄する。フィルタを洗浄するために用いられるストリンジェンシーは、ハイブリダイズされる核酸の種類、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成(例えば、GCとATの含量)、核酸の種類(例えば、RNAとDNA)によって変えることができる。より高くなるストリンジェンシー条件の例は次の通りである:  2X SSC、0.1% SDS、室温で15分間(低ストリンジェンシー); 0.1X SSC、0.5% SDS、室温で30分〜1時間(中程度のストリンジェンシー); 0.1X SSC、0.5% SDS、ハイブリダイゼーション温度68℃で15〜30分間(高ストリンジェンシー); 0.15M NaCl、72℃で15分間(非常に高いストリンジェンシー)、最後の低ストリンジェンシー洗浄は0.1X SSC中室温で行うことができる。上記例は、フィルタを洗浄するために使用し得る一組の条件を単に例示するものである。当業者は、異なるストリンジェンシー洗浄に多くのレシピがあることを知っている。
【００８０】
プローブに対してハイブリダイズした核酸は、オートラジオグラフィ又は他の通例の技術によって同定し得る。上記方法は、プローブ配列に対する相同性のレベルが低下した核酸を同定するために修飾することができる。例えば、検出可能なプローブに対する相同性を低下する核酸を得るために、よりストリンジェントでない条件を用いることができる。例えば、ハイブリダイゼーション温度を、約1MのNa+濃度をもつハイブリダイゼーションバッファー中68℃から42℃まで5℃ずつ低下させることができる。ハイブリダイゼーション後、フィルタをハイブリダイゼーション温度で2X SSC、0.5% SDSで洗浄することができる。これらの条件は、50℃より高い“中程度”条件や50℃より低い低条件と考えられる。中程度ハイブリダイゼーション条件の一例は、上記ハイブリダイゼーションを55℃で行う場合である。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの一例は、上記ハイブリダイゼーション条件を45℃で行う場合である。
また、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含有する6X SSCのようなバッファー中42℃の温度で行うことができる。この場合、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミドの濃度は、プローブに対する相同性のレベルが低下したクローンを同定するために50%から0%まで5%ずつ低下させることができる。アヒブリダイゼーション後、フィルタは6X SSC、0.5% SDSで50℃において洗浄することができる。これらの条件は、ホルムアミドが25% より多い“中程度”条件とホルムアミドが25% より低い“低”条件であると考えられる。“中程度”ハイブリダイゼーション条件の個々の例は、上記ハイブリダイゼーションが 30% のホルムアミドで行われる場合である。“低ストリンジェンシー”ハイブリダイゼーション条件の個々の例は、上記ハイブリダイゼーションが10% のホルムアミドで行われる場合である。
【００８１】
本発明のこれらのプローブと方法は、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、又は500の連続した塩基を含む本発明の核酸配列に対する相同性が少なくとも約99%、98%、97%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、又は少なくとも50% である配列をもつ核酸、又はそれに相補的な配列を分離するために使用し得る。本明細書に述べられるように、相同性はアラインメントアルゴリズムを用いて測定することができる。例えば、同種ポリヌクレオチドは本明細書に記載されるコード配列の1つの天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列をもつことができる。そのような対立遺伝子変異体は、本発明の核酸と比較した場合に1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加をもつことができる。
更に、本発明のプローブと方法は、配列アラインメントアルゴリズム(例えば、FASTAバージョン3.0t78アルゴリズムとデフォルトパラメータ、又は BLAST 2.2.2プログラムと本明細書に示される具体的な設定)を用いて決定されるように、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100又は150の連続したアミノ酸に対する配列同一性(相同性)が少なくとも約99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、少なくとも75%、少なくとも70%、少なくとも65%、少なくとも60%、少なくとも55%、又は少なくとも50%であるポリぺプチドをコードしている核酸を分離するために用いることができる。
【００８２】
フィターゼの発現を阻害する
本発明は、更に、本発明の核酸配列に相補的な核酸(例えば、アンチセンス配列)を提供する。アンチセンス配列は、フィターゼコード遺伝子の運搬、スプライシング又は転写を阻害することができる。阻害は、ゲノムDNA又はメッセンジャRNAのターゲティングによって行うことができる。標的核酸の転写又は機能は、例えば、ハイブリダイゼーション及び/又は切断により阻害することができる。本発明によって示される特に有効な一組の阻害剤には、フィターゼ遺伝子か又はメッセージを結合することができるオリゴヌクレオチドが含まれ、いずれの場合もフィターゼ酵素の生産又は機能が防止又は阻害される。会合は配列特異的ハイブリダイゼーションによることができる。他の有効な種類の阻害剤には、フィターゼメッセージの不活性化又は切断を引き起こすオリゴヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、リボザイムのような切断を引き起こす酵素活性を有し得る。オリゴヌクレオチドは、相補的核酸を切断することができる酵素又は組成物に化学的に修飾又は結合し得る。多くのことなるオリゴヌクレオチドのプールについて所望の活性を有するものをスクリーニングすることができる。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、mRNAをターゲティングすることによりフィターゼ活性を阻害し得るフィターゼメッセージを結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する戦略は、科学文献や特許文献に十分に記載され、当業者は本発明の新規な試薬を用いてフィターゼオリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするための遺伝子ウォーキング/RNAマッピングプロトコールは当該技術において周知である。例えば、有効なアンチセンス配列選択の簡単で信頼できる方法を与える標準分子技術に基づくRNAマッピング分析が記載されているHo (2000) Methods Enzymol. 314:168-183を参照のこと。Smith (2000) Euro. J. Pharm. Sci. 11:191-198も参照のこと。
天然に存在する核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、代替的態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約5〜100、約10〜80、約15〜60、約18〜40である。最適な長さは、通常のスクリーニングによって求めることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の濃度で存在し得る。最適濃度は、通常のスクリーニングによって求めることができる。この潜在的問題に取り組み得る種々の天然に存在しない合成ヌクレオチドや核酸の類似体が既知である。例えば、N-(2-アミノエチル)グリシン単位を含む非イオン主鎖を含んでいるぺプチド核酸(PNA)を使用し得る。国際出願第97/03211号; 国際出願第96/39154号; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agarwal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)に記載されるようにホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドも使用し得る。本発明によって示される合成DNA主鎖類似体を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドには、上記のホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、3'-チオアセタール、メチレン(メチルイミノ)、3'-N-カルバメート、又はモルホリノカルバメート核酸が含まれる得る。
本発明のセンスとアンチセンスのフィターゼ配列のような標的に対して適切な結合親和性や特異性を有する特異的なオリゴヌクレオチドを急速にスクリーニングし得る多くのオリゴヌクレオチドを生成するためにコンビナトリアルケミストリー法が使用し得る(例えば、Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584を参照のこと)。
【００８４】
阻害性リボザイム
本発明は、mRNAをターゲティングすることによりフィターゼ酵素活性を阻害し得るフィターゼメッセージを結合することができるリボザイムを提供する。リボザイムを設計しターゲティング用フィターゼ特異的アンチセンス配列を選択するための戦略は、科学文献や特許文献に十分に記載され、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなリボザイムを設計し得る。リボザイムは、標的RNAを切断するRNAの酵素部分に近接して保持されているリボザイムの標的RNA結合部分を介して標的RNAに結合することにより作用する。従って、リボザイムは相補的塩基対合によって標的RNAを認識し結合し、正しい部位に結合されると、標的RNAを切断し不活性化するように酵素的に作用する。そのような方法で標的RNAを切断すると、切断がコード配列にある場合にはコードされたタンパク質の合成を特定する能力が破壊される。リボザイムがそのRNA標的を結合し切断した後、典型的にはそのRNAから遊離するので、繰返し新たな標的を結合し切断し得る。
ある場合には、治療的処理に必要なリボザイムの有効な濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドより低くし得るので、リボザイムの酵素の種類はアンチセンス技術のような他の技術(核酸分子が核酸標的に簡単に結合して転写、翻訳又は他の分子との会合を遮断する場合)より有利であり得る。この潜在的利点は、酵素的に作用するリボザイムの能力を反映する。従って、単一リボザイム分子は、標的多くのRNA分子切断することができる。更に、リボザイムは、典型的に、高度に特異的な阻害剤であり、阻害特異性は結合の塩基対合機序に左右されるだけでなく、分子が結合するRNAの発現を阻害する機序にも左右される。即ち、阻害はRNA標的の切断によって生じるので、特異性は標的RNA切断率と非標的RNA切断率の割合として定義される。この切断機序は、塩基対合に関係するものの追加の要因に左右される。従って、リボザイムの作用特異性は、同じRNA部位を結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドより大きくなり得る。酵素リボザイムRNA分子ハンマーヘッドモチーフに形成され得るが、ヘアピンのモチーフ、肝炎δウイルス、I型イントロン又はRNaseP様RNA (RNAガイド配列と結合している)にも形成することができる。そのようなハンマーヘッドモチーフの例は、Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; hairpin motifs by Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, and Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299によって記載され、肝炎δウイルスモチーフはPerrotta (1992) Biochemistry 31:16; the RNaseP motif by Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849によって記載され、I型イントロンはCechの米国特許第4,987,071号に記載されている。これらの個々のモチーフの列挙は限定するものではなく、本発明の酵素RNA分子が標的遺伝子RNA領域の1つ以上に相補的な特定の基質結合部位を有し、分子にRNA切断活性を与えるその基質結合部位内に又はその周囲にヌクレオチド配列をもつことを当業者は認識する。
【００８５】
核酸の修飾
本発明は、本発明の核酸の変異体、例えば、フィターゼ酵素をコードしているものをを作成する方法を提供する。これらの方法は、鋳型核酸によってコードされたフィターゼから変わった又は異なった活性又は変わった又は異なった安定性を有するフィターゼ酵素を作成するためにいろいろに組合わせて反復又は使用し得る。これらの方法は、また、例えば、、遺伝子/メッセージ発現、メッセージ翻訳又はメッセージ安定性の変化を生じるようにいろいろに組合わせて反復又は使用し得る。他の態様においては、細胞の遺伝的組成は、例えば、生体内での相同遺伝子の修飾に続いて細胞へ再挿入することにより変わる。
本発明の核酸は、任意の手段、例えば、ランダム又は確率論的な方法、又は非確率論的な、又は“特異的進化”方法によって変えることができる。
遺伝子のランダム変異の方法は、当該技術において周知である。例えば、米国特許第5,830,696号を参照のこと。例えば、変異原は、遺伝子をランダムに変異するために使用し得る。変異原には、組換えによる修復の影響をうけやすいDNA破壊を誘発する、例えば、紫外光又はγ照射、又は化学変異原、例えば、マイトマイシン、亜硝酸、光活性プソラレンが単独で又は組合わせて含まれる。他の化学変異原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン又はギ酸が含まれる。他の変異原は、ヌクレオチド前駆体、例えば、ニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、又はアクリジンの類似体である。これらの物質は、ヌクレオチド前駆体の代りにPCR反応に添加することができ、よって配列が変異する。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリン等の挿入剤も使用し得る。
分子生物学の手法、例えば、ランダムPCR変異導入、例えば、Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471を参照のこと; 又はコンビナトリアルマルチプルカセット変異導入、例えば、Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196を参照のことを用いることもできる。また、核酸、例えば、遺伝子をランダム、又は“確率論的”な断片化後に再構築し得る。例えば、米国特許第6,291,242号; 同第6,287,862号; 同第6,287,861号; 同第5,955,358号; 同第5,830,721号; 同第5,824,514号; 同第5,811,238号; 同第5,605,793号を参照のこと。代替的態様においては、修飾、付加又は欠失は、誤りがちなPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アセンブリPCR、性的PCR変異導入、生体内変異導入、カセット変異導入、再帰的集合変異導入、指数的集合変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップドデュプレックス変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠失ホスト株変異導入、化学変異導入、放射性物質変異導入、欠失変異導入、制限選択変異導入、制限純化変異導入、人工遺伝子合成、集合変異導入、キメラ核酸多量体生成及び/又はこれらの及び他の方法の組合わせによって導入される。
【００８６】
次の文献には、再帰的組換え法及び/又は本発明の方法へ組込むことができる方法が記載されている。Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling," Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling" Nature Medicine 2:100-103; Crameri et al. (1996) "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling" Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor `headpiece dimer`" Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR": The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp.447-457; Crameri and Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; and Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。
【００８７】
多様性を生じる変異法には、例えば、部位特異的変異導入(Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237:1-7; and Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); ウラシル含有鋳型を用いた変異導入(Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382; and Bass et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245); オリゴヌクレオチド特異的変異導入(Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500; and Zoller & Smith (1987) "Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154:329-350); ホスホロチオエート修飾DNA変異導入(Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 16:791-802; and Sayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803-814); ギャップドデュプレックスDNAを用いた変異導入(Kramer et al. (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA" 154:350-367; Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207; and Fritz et al. (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999)が含まれる。
【００８８】
本発明の方法に用いられる追加のプロトコールには、点ミスマッチ修復(Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887), mutagenesis using repair-deficient host strains 修復欠失ホスト株を用いた変異導入(Carter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; Carter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403)、欠失変異導入(Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115)、制限選択変異導入や制限純化変異導入(Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423)、全遺伝子合成による変異導入(Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34:315-323; Grundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale `shot-gun` gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316)、二本鎖切断修復(Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181)が含まれる。上記方法の多くについての詳細は、更に、Methods in Enzymology Volume 154に見出すことができ、様々な変異導入法によるトラブルシューティングの有効な制御が記載されている。
【００８９】
米国特許第5,605,793号, Stemmer (Feb. 25, 1997), "Methods for In Vitro Recombination;" 米国特許第5,811,238号, Stemmer et al. (Sep. 22, 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" 米国特許第5,830,721号, Stemmer et al. (Nov. 3, 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" 米国特許第5,834,252号, Stemmer, et al. (Nov. 10, 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction;" 米国特許第5,837,458号, Minshull, et al. (Nov. 17, 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" 国際出願第95/22625号, Stemmer & Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" 国際出願第96/33207号, Stemmer & Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction;" 国際出願第97/20078号, Stemmer & Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" 国際出願第97/35966号, Minshull & Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" 国際出願第99/41402号, Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors;" 国際出願第99/41383号, Punnonen et al. "Antigen Library ImLmunization;" 国際出願第99/41369号, Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering;" 国際出願第99/41368号, Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines;" 欧州特許第752008号, Stemmer & Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" EP 0932670 by Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination;" 国際出願第99/23107号, Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling;" 国際出願第99/21979号, Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors;" 国際出願第98/31837号, del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination;" 国際出願第98/27230号, Patten and Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering;" 国際出願第98/27230号, Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection," 国際出願第00/00632号, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries" 国際出願第00/09679号, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences," 国際出願第98/42832号, Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers," 国際出願第99/29902号, Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences, 国際出願第98/41653号, Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library," 国際出願第98/41622号, Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling," 国際出願第98/42727号, Pati and Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination"も参照のこと。
【００９０】
ある種の米国出願には、更にPattenらによる1999年9月28日出願の"SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" (U.S. Ser. No. 09/407,800); del Cardayreらによる1998年7月15日出願と1999年7月15日出願の"EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" (米国出願第09/166,188号)と(米国出願第09/354,922号); Crameriらによる1999年9月28日出願の"OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" (米国出願第09/408,392号), Crameriらによる2000年1月18日出願の "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" (PCT/US00/01203); Welchらによる1999年9月28日出願の"USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" (米国出願第09/408,393号); Selifonovらによる2000年1月18日出願の"METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" (PCT/US00/01202), 例えば、Selifonovらによる2000年7月18日出願の"METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" (米国出願第09/618,579号); Selifonov & Stemmerによる2000年1月18日出願の"METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" (PCT/US00/01138); Affholterによる2000年9月6日出願の"SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" (米国出願第09/656,549号)を含む多様性を生じる方法に関する詳細が示されている。
非確率論的、又は“特異的進化”方法には、新しい又は改変した性質を有するフィターゼを生成するために本発明の核酸を修飾するために用いられる、例えば、飽和変異導入、(GSSM)、合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)、又はその組合わせが含まれる。フィターゼ又は他の活性を試験する前に修飾した核酸によってコードされたポリぺプチドについて活性をスクリーニングすることができる。試験様式又はプロトコールを、例えば、毛管アレイプラットホームを用いて使用し得る。例えば、米国特許第6,280,926号; 同第5,939,250号を参照のこと。
【００９１】
飽和変異導入、又はGSSM
本発明の一態様においては、新しい又は改変した性質を有するフィターゼを生成するために非確率論的遺伝子修飾、“特異的進化法”が用いられる。この方法の変異は、“遺伝子部位飽和変異導入”、“部位飽和変異導入”、“飽和変異導入”又は簡単に“GSSM”と呼ばれてきた。他の変異導入法と組合わせて用いることができる。例えば、米国特許第6,171,820号; 同第6,238,884号を参照のこと。一態様においては、GSSMは、鋳型ポリヌクレオチドと各オリゴヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドに相同の配列を含む複数のオリゴヌクレオチド を準備し、よって鋳型ポリヌクレオチドの特定の配列と、相同遺伝子の変異体である配列をターゲティングするステップ; 鋳型ポリヌクレオチドをオリゴヌクレオチドで複製することにより非確率論的配列変異を含む子孫ポリヌクレオチドを作成し、よって相同遺伝子配列変異を含むポリヌクレオチドを作成するステップを含んでいる。
【００９２】
合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)
本発明は、新しい又は改変した性質を有するフィターゼを生成するために“合成ライゲーションリアセンブリ”、又は簡単に“SLR”、“特異的進化法”と呼ばれる非確率論的遺伝子修飾システムを提供する。SLRは、オリゴヌクレオチド断片を共に非確率論的にライゲートする方法である。この方法は、核酸構成ブロックがランダムにシャフル、鎖状体形成又はキメラ化せず、むしろ非確率論的に構築されるという点で確率論的オリゴヌクレオチドシャッフリングと異なっている。例えば、“Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution”と称する1999年6月14日出願(“USSN 09/332,835”)の米国特許出願第(USSN) 09/332,835号を参照のこと。一態様においては、SLRは、(a) 相同遺伝子をコードしている配列を含んでいる鋳型ポリヌクレオチドを準備するステップと、(b) 構成ブロックポリヌクレオチドが所定の配列で鋳型ポリヌクレオチドと交差再構築するように設計され、一つの構成ブロックポリヌクレオチドが相同遺伝子の変異体である配列と変異配列に隣接している鋳型ポリヌクレオチドに相同な配列を含んでいる、複数の構成ブロックポリヌクレオチドを準備するステップと、(c) 構成ブロックポリヌクレオチドと鋳型ポリヌクレオチドとを合わせ、該構成ブロックポリヌクレオチドが該鋳型ポリヌクレオチドと交差再構築して相同遺伝子配列変異を含むポリヌクレオチドを作成するステップとを含んでいる。
【００９３】
SLRは、再配列されるポリヌクレオチド間の高レベルの相同性の存在に左右されない。従って、この方法は、10100を超える異なったキメラから構成される子孫分子のライブラリ(又はセット)を非確率論的に作成するために使用し得る。SLRは、101000を超える異なった子孫キメラから構成されるライブラリーを作成するために使用し得る。従って、本発明の態様は、設計によって選ばれる全アセンブリ順序を削る完成キメラ核酸分子のセットを作成する非確率論的方法を含んでいる。この方法は、相互に適合性の役に立つライゲート可能な末端をもつ複数の特定の核酸構成ブロックを設計により作成するステップと、これらの核酸構成ブロックを構築し、設計された全アセンブリ順序が得られるステップとを含んでいる。構築すべき核酸構成ブロックの相互に適合性のライゲート可能な末端は、構成ブロックが所定の順序で結合することを可能にする場合にはこのタイプの順序づけられたアセンブリに対して“役に立つ”と考えられる。従って、核酸構成ブロックを結合することができる全アセンブリ順序は、ライゲート可能末端の設計により指定される。1つ以上のアセンブリステップが用いられる場合には、核酸構成ブロックを結合することができる全アセンブリ順序はアセンブリステップの連続的順序によって指定される。一態様においては、アニールされた構成片をリガーゼ(例えば、T4 DNAリガーゼ)のような酵素で処理することにより、構成片の共有結合が達成される。一態様においては、確率論的シャッフリングに幾分関係がある合成ライゲーションリアセンブリ(SLR)と呼ばれる非確率論的方法は、核酸構成ブロックがランダムにシャフル又は鎖状態形成又はキメラ化されず、むしろ非確率論的に構築される以外は変異体をつくるために使用し得る。
【００９４】
SLR法は、シャッフルしようとするポリヌクレオチド間の高レベルの相同性の存在に依存しない。本発明を用いて、10100を超える様々なキメラから構成される子孫分子のライブラリー（又はセット）を非確率論的に作成することができる。更には、SLRを用いて、101000を超える様々な子孫キメラから構成されるライブラリーを作成することも可能である。
従って、一態様では、本発明は、設計により選択される全アセンブリ順序を有する完成キメラ核酸分子のセットを作製する非確率論的方法を提供する。この方法は、設計により、相互に適合性の役に立つライゲート可能な末端を有する複数の特定の核酸構成ブロックを作成するステップと、これらの核酸構成ブロックをアセンブリさせることにより、設計された全アセンブリ順序が達成されるようにするステップから構成される。
アセンブリさせようとする核酸構成ブロックの相互に適合性のライゲート可能な末端は、それらが、構成ブロックを所定の順序に結合させることができれば、このタイプの順序づけられたアセンブリに役に立つと考えられる。従って、一態様では、核酸構成ブロックを結合することができる全アセンブリ順序は、ライゲート可能な末端の設計により指定され、１を超えるアセンブリステップを用いる場合には、核酸構成ブロックを結合することができる全アセンブリ順序も、アセンブリステップの連続的順序により指定される。本発明の一態様では、アニールされた構成片をリガーゼ（例えば、T4 DNAリガーゼ）のような酵素で処理することにより、構成片の共有結合が達成される。
他の態様では、核酸構成ブロックの設計は、完成キメラ核酸分子の子孫セットを作製する基礎として役に立つ前駆体核酸鋳型のセットの配列を解析する際に得られる。これらの前駆体核酸鋳型は、変異導入させようとする、即ち、キメラ化又はシャッフルしようとする、核酸構成ブロックの設計を助ける配列情報の供給源として役に立つ。
【００９５】
一態様では、本発明は、関連遺伝子のファミリー及びそれらのコードされた関連産物のファミリーのキメラ化を提供する。具体的態様では、コードされた産物は酵素である。本発明に用いられる酵素とポリペプチドは、本発明に記載された方法に従い、変異導入することができる。
従って、本発明の一態様によれば、複数の前駆体核酸鋳型の配列をアラインメントすることにより、１以上の分界点を選択する。これらの分界点は、相同性の領域に位置していてもよい。これらの分界点を用いて、作製しようとする核酸構成ブロックの境界を画定することができる。従って、前駆体分子中で識別し選択された分界点は、子孫分子のアセンブリにおける潜在的キメラ化点として役立つ。
典型的には、役に立つ分界点は、少なくとも２つの前駆体鋳型が共有する相同性の領域（少なくとも１つの相同的ヌクレオチド塩基を含む）であるが、分界点は前駆体鋳型の少なくとも半分、前駆体鋳型の少なくとも2／3、前駆体鋳型の少なくとも3／4、又は、前駆体鋳型のほぼ全てが共有する相同性領域でよい。一態様においては、役に立つ分界点は、前駆体鋳型の全てが共有する相同性領域である。
一態様では、ライゲーションリアセンブリ法を網羅的に実施することにより、網羅的ライブラリーを作成する。言い換えれば、核酸構成ブロックの可能な順序づけられた組合せはすべて、完成キメラ核酸分子セットに呈示される。同時に、各組合せにおけるアセンブリ順序（即ち、各完成キメラ核酸の5から3配列までの各構成ブロックのアセンブリの順序）は、設計によるものである(又は非確率論的である)。この方法の非確率論的性質のために、不要な副産物の可能性は大幅に減少する。
【００９６】
他の態様では、上記方法によれば、ライゲーションリアセンブリ法が系統的に実施され、これにより、例えば、系統的にコンパートメント化されたライブラリーを作成し、これらのコンパートメントを、例えば、一つずつ系統的にスクリーニングすることができる。言い換えれば、本発明によれば、特定の核酸構成ブロックの選択的かつ賢明な使用と、順次段階を経たアセンブリ反応物の選択的かつ賢明な使用を組み合わせることにより、複数の反応容器の各々に子孫産物の特定セットが作製される、実験的設計を達成することができる。これによって、系統的試験とスクリーニング方法を実施することが可能になる。従って、上記方法により、極めて多数の子孫分子を、これまでより小さなグループ別に系統的に試験することができる。
特に、前駆体分子間に低レベルの相同性がある場合には、非常にフレキシブルで、しかも網羅的かつ系統的な方法でキメラ化を実施することができるため、本発明は、多数の子孫分子からなるライブラリー（又はセット）の作製を可能にする。本発明のライゲーションリアセンブリの非確率論的性質により、作成された子孫分子は、好ましくは、設計により選択される全アセンブリ順序を有する完成キメラ核酸分子のライブラリーを含むことができる。具体的な態様では、このように作成されたライブラリーは、103より大きいものから101000より大きいものまでの異なる子孫分子種から構成される。
一態様では、前記のように作製した完成キメラ核酸分子のセットは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから構成される。一態様によれば、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、これは人工の遺伝子でよい。他の態様によれば、このポリヌクレオチドは遺伝子経路であり、これは人工の遺伝子経路でよい。本発明によれば、本発明により作成された１以上の人工の遺伝子を、真核生物（植物を含む）中で作用可能な経路などの人工の遺伝子経路に組み込むことができる。
【００９７】
他の実施形態では、構成ブロックが作製されるステップの合成的性質により、ヌクレオチド（例えば、１個以上のヌクレオチドであり、これは、例えば、コドン又はイントロンもしくは調節配列でよい）の設計と導入が可能になり、このヌクレオチドは後に、試験管内方法（例えば、変異導入により）又は生体内方法（例えば、ホスト生物の遺伝子スプライシング能力を用いて）のいずれかで任意に除去することができる。多くの場合、これらヌクレオチドの導入は、また、役に立つ分界点を形成する潜在的利点に加え、その他多くの理由から望ましいことは理解されよう。
従って、他の態様によれば、本発明は、核酸構成ブロックを用いて、イントロンを導入するのを可能にする。従って、本発明によれば、機能的イントロンは、本発明の人工遺伝子に導入することができる。また、本発明により、機能的イントロンを本発明の人工遺伝子経路に導入することもできる。このように、本発明は、１（又は１以上）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの作成を提供する。
従って、本発明は、また、１（又は１以上）の人工的に導入されたイントロンを含む人工遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの作成も可能にする。好ましくは、人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングに機能的に働くのと同様に、遺伝子スプライシングのための１以上のホスト細胞において機能的である。本発明は、組換え及び／又はスプライシングのためのホスト生物に導入される人工イントロン含有ポリヌクレオチドの作製方法を提供する。
【００９８】
本発明を用いて作製される人工遺伝子は、また、他の核酸との組換え用の基質としても働くことができる。同様に、本発明を用いて作製される人工遺伝子経路は、また、他の核酸との組換え用の基質としても働くことができる。一態様では、組換えは、人工イントロン含有遺伝子と、組換えパートナーとして働く核酸の間の相同性の領域により促進されるか、又は該領域で起こる。一態様では、組換えパートナーは、人工遺伝子又は人工遺伝子経路など、本発明により作成された核酸でもよい。組換えは、人工遺伝子中の１（又は１以上）の人工的に導入されたイントロンに存在する相同性の領域により促進されるか、又は該領域で起こり得る。
本発明の合成ライゲーションリアセンブリ方法は、複数の核酸構成ブロックを用いるが、それらの各々は２つのライゲート可能な末端を有し得る。各核酸構成ブロック上の２つのライゲート可能な末端は２つの平滑末端でよく（即ち、各々がゼロ個のヌクレオチドの突出部を有する）か、好ましくは、１つの平滑末端と１つの突出部、或いは、２つの突出部でもよい。
このために用いられる突出部は3突出部又は5突出部でよい。従って、核酸構成ブロックは3突出部又は5突出部、或いは、２つの3突出部又は２つの5突出部を有していてよい。核酸構成ブロックをアセンブリさせて完成キメラ核酸分子を形成する全順序は、意図的な実験的設計により決定されるものであり、ランダムではない。
一つ態様では、核酸構成ブロックは、２つの一本鎖核酸（一本鎖オリゴとも呼ばれる）を化学的に合成し、これらを接触させることにより、アニーリングして、二本鎖核酸構成ブロックを形成する。
【００９９】
二本鎖核酸構成ブロックは、様々なサイズのものでよい。これら構成ブロックのサイズは小さくても大きくてもよい。構成ブロックの好ましいサイズは、１塩基対（突出部は一切含まない）から100,000塩基対（突出部は一切含まない）までの範囲である。これ以外の好ましいサイズ範囲として、下限が１bp〜10,000 bp（その間の全整数を含む）、上限が２bp〜100,000 bp（その間の全整数を含む）が挙げられる。
本発明に役に立つ二本鎖核酸構成ブロックを作成することができる多くの方法が存在し、これらは当技術分野では公知であり、当業者により容易に実施が可能である。
一態様によれば、二本鎖核酸構成ブロックは、初めに２つの一本鎖核酸を作成した後、これらをアニーリングして、二本鎖核酸構成ブロックを形成することにより、形成される。二本鎖核酸構成ブロックの２つの鎖は、突出部を形成するものを除いて、すべてのヌクレオチドで相補的でよく、従って、突出部を除けば、ミスマッチを一切含まない。他の態様によれば、二本鎖核酸構成ブロックの２つの鎖は、突出部を形成するものを除いて、すべてではないが、ヌクレオチドで相補的である。従って、この態様によれば、二本鎖核酸構成ブロックを用いて、コドン縮重を導入することができる。一態様によれば、コドン縮重は、本明細書に記載した部位飽和変異導入を用いて、又は１以上のN,N,G/Tカセット、或いは、１以上のN,N,Nカセットを用いて導入される。
本発明の生体内組換え法は、特定のポリヌクレオチド又は配列の未知のハイブリッド又は対立遺伝子のプールについて盲目的に実施することができる。しかし、特定のポリヌクレオチドの実際のDNA又はRNA配列を知る必要はない。
【０１００】
遺伝子の混合集団内の組換えを用いる手法は、あらゆる有用なタンパク質、例えば、インターロイキンI、抗体、tPA及び成長ホルモンの作成に用いることができる。この手法を用いて、特異性又は活性が改変されたタンパク質を作成することができる。この手法は、また、ハイブリッド核酸配列、例えば、プロモーター領域、イントロン、エキソン、エンハンサー配列、遺伝子の3' 非翻訳領域又は5’非翻訳領域の作成にも用いることができる。従って、この手法を用いて、発現率が増加した遺伝子を作成することができる。この手法は、また、反復DNA配列の研究にも用いることができる。最後に、この手法は、リボザイム又はアプタマーに変異を起こすのにも用いることができる。
一態様では、本明細書に記載するポリヌクレオチド及びポリペプチドの変異体は、DNA、RNA又はタンパク質など、極めて複雑な線状配列の組換えの特異的分子進化を可能にする還元的再構築、組換え及び選択の反復サイクルの使用によって得られる。
分子の生体内シャッフリングは変異体の作製に有用であり、多量体を組み換える細胞の自然な特性を利用して実施することができる。生体内での組換えが分子の多様性に対する主要な天然経路を与えているのに対し、遺伝的組換えは比較的複雑な過程のままであり、下記のステップ：１）相同性の認識と；２）組換えキアズマの作製をもたらす、鎖切断、鎖侵入、代謝のステップと；３）キアズマの個々の組換え分子への分解とを含む。キアズマの形成には相同的配列の認識が必要である。
【０１０１】
他の態様では、本発明は、少なくとも第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを作製する方法を包含する。本発明を用いて、部分的配列相同性(例えば、配列番号1)の少なくとも一領域を共有する、少なくとも第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドを好適なホスト細胞に導入することにより、ハイブリッドポリヌクレオチドを作製することができる。部分的配列相同性の領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを作製する配列再構成が起こる過程を促進する。本明細書で用いるハイブリッドポリヌクレオチドとは、本発明の方法により得られ、かつ、少なくとも２つの元のポリヌクレオチド配列からの配列を含むヌクレオチド配列である。このようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列組み込みを促進する分子間組換え事象によって起こり得る。加えて、そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、反復配列を利用して、DNA分子内のヌクレオチド配列を改変する分子内還元的再構築過程によっても起こり得る。
本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチド（例えば、ハイブリッドフィターゼ）をコードすることができるハイブリッドポリヌクレオチドの作成方法を提供する。一態様では、元のポリヌクレオチドは生物学的に活性のポリペプチドをコードする。本発明の方法は、得られたハイブリッドポリヌクレオチドが元の生物学的に活性のポリペプチドに由来する活性を示すポリペプチドをコードするように、元のポリヌクレオチドの配列を組み込む細胞過程を利用することにより、新規のハイブリッドポリヌクレオチドを作製する。例えば、元のポリヌクレオチドは様々な微生物由来の特定の酵素をコードし得る。ある生物に由来する第１ポリヌクレオチド又は変異体によりコードされた酵素が、例えば、具体的な環境条件、例えば、高塩度の下で効果的に機能するとする。また、これとは異なる生物に由来する第２ポリヌクレオチドもしくは変異体によりコードされる酵素が、超高温など、異なる環境条件下で効果的に機能するとする。第１及び第２の元のポリヌクレオチドに由来する配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドは、元のポリヌクレオチドによりコードされた両酵素の特性を示す酵素をコードすることができる。従って、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされた酵素は、第１及び第２ポリヌクレオチドによりコードされた両酵素各々が有する環境条件、例えば、高塩度及び超高温下で、効果的に機能する。
【０１０２】
上記種々の方法のほかに、酵素特性が高められたハイブリッドポリヌクレオチドを得るために使用し得る様々な方法が当該技術において既知である。次の例は、対象の野生型酵素をコードしているポリヌクレオチドの変異導入によって熱安定性又は耐熱性の酵素を得るための手順の使用を示すものである。
例えば、M. Lehmann et al. (Biochimica et Biophysica Acta 1543:408-415, 2000)には、相同真菌フィターゼの配列アラインメントを用いて共通アミノ酸配列を計算した “共通方法”が記載されている。対応する遺伝子の構築、組換え発現、精製の際に、得られた組換えフィターゼは、設計に用いられるすべての親フィターゼより15〜22℃高い変性温度(Tm)を示した。組換えタンパク質をコードしている遺伝子の部位特異的変異導入を用いてTm値が更に90.4℃まで上昇した。熱安定化作用は、タンパク質の全配列に対して配分されかつ表面がさらされた残基に主に影響する多重アミノ酸交換の組合わせに起因した。
熱特性が高められた酵素を得る他の方法は、L. Jermutus et  al. (J. of Biotechnology 85:15-24, 2001)に記載されている。この方法では、アスペルギルス・テレウスフィターゼ(Aspergillus terreus)の表面上のイオン相互作用と水素結合をまず回復させてA. ニガー(A. niger)由来の同種であるがより熱安定性のある酵素に存在するものに対応させた。第2の全構造要素を同じ領域に置き換え、A. ニガーフィターゼの結晶構造に基づくものにした。A. レウスフィターゼ(A. terreus)の表面上の１つのαヘリックスをA.ニガーフィターゼの対応する伸長部で置き換えることにより、結果として熱案テ性が改善され酵素活性が改変されていない構造系キメラ酵素(融合タンパク質)が得られる。
【０１０３】
バシラス・サチリスp-ニトロベンジルエステラーゼをコードしているポリヌクレオチドの変異導入性PCR中に導入されたランダム変異導入の６世代に続いてStemmerの方法に基づく試験管内組換えにより、結果として低温での触媒活性を妥協せずに熱安定性が高められた(Tmが14℃の増加より高い)組換えエステラーゼが得られる、更に他の方法がL. Giver et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12809-12813, 1998)に示されている。
C. Vetriani et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:12300-12305, 1998)には、超好熱菌フィロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)やテルモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来の六量体グルタミン酸デヒドロゲナーゼの100℃と88℃の最適増殖温度による相同性によるモデリングと直接構造の比較を用いて鍵となる熱安定化特徴を決定した手順が記載されている。安定でない酵素ではかなり減少することが見られるサブユニット間のイオン対ネットワークは、安定な酵素に見られる相互作用を回復させるために２つの残基の変異導入によって改変された。単一変異が熱安定性に対して逆効果を有したが、定位置での両変異においては、野生型酵素に対して104℃における安定性が４倍改善されたことが見られた。
A. Tomschy et al. (Protein Science 9:1304-1311, 2000)には、アスペルス・ニガー(Aspergillus Niger)フィターゼの結晶構造(2.5オングストローム分解能における)を用いて酵素の全活性部位を指定する手順が記載されている。次に多重アミノ酸配列アラインメントを用いて対象のある一定の有利な性質と相関することができる非保存活性部位残基が同定されている。この方法を用いて、A.ニガーのLeu27と異なるA.フミガツス(A. fumigatus)フィターゼのGln27が、基質結合及び/又は遊離に関係しフミガツスフィターゼ(A. fumigatus)フィターゼ(26.5 U/mgタンパク質と196 6 U/mgタンパク質、pH 5.0)の低い比活性に関与すると考えられるように識別された。A.フミガツス(A. fumigatus)フィターゼのGln27のLeuへの部位特異的変異導入により、変異酵素の比活性が92.1 U/mgタンパク質まで増加した。
【０１０４】
一態様では、本発明は酵素活性の熱失活に高い耐性を示すフィターゼ活性を有し、長期保存の際もフィターゼ活性を保持する安定な水性液体製剤を調製する方法(及びその産物)を提供する。この液体製剤は安定剤としての尿素及び/又はソルビトールやグリセロールなどのポリオールの添加によって安定化される。また、かかる安定な水性液体製剤の使用によって得られる、単胃動物用の飼料製剤とその製造方法も提供される。この方法に関しての更なる詳細は文献に載っており、当業者に公知である。限定されるものではないが具体的な例では、かかる文献としては欧州特許第0626010号(国際出願第9316175 A1号)(Barendse et al.)が挙げられるが、これらの参考文献は本発明の分子を教示するものではない。
元のポリヌクレオチドによりコードされた酵素として、限定するものではないが、フィターゼが挙げられる。本発明の方法により得られるハイブリッドポリペプチドは、元の酵素では示されなかった特殊な酵素活性を示すことができる。例えば、ヒドロラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドの組換え及び／又は還元的再構築の後、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされたハイブリッドポリペプチドをスクリーニングして、元の各酵素から得られた特別のヒドロラーゼ活性（即ち、ヒドロラーゼが作用する結合のタイプ及びヒドロラーゼが機能する温度）について調べることができる。従って、例えば、ヒドロラーゼをスクリーニングすることにより、元のヒドロラーゼからハイブリッドヒドロラーゼを区別する化学的機能性を確認することができ、このような化学的機能性として、例えば、下記のものが挙げられる：（a）アミド（ペプチド結合）、即ち、プロテアーゼ；（b）エステル結合、即ち、エステラーゼ及びリパーゼ；（c）アセタール、即ち、グリコシダーゼ、並びに、例えば、ハイブリッドポリペプチドが機能する温度、pHもしくは塩濃度。
【０１０５】
元のポリヌクレオチドの供給源は、個々の生物から単離したもの（“単離物”）、規定培地中で生育させた生物の収集物（“濃縮培養物”）、或いは、非培養生物（“環境サンプル”）のいずれでもよい。生物多様性の未開発資源へ到達するために、環境サンプルから新規生物活性をコードするポリヌクレオチドを誘導する培養非依存的手法を用いることができる。
“環境ライブラリー”は、環境サンプルから作製され、好適な原核生物ホストで増やすことができるクローン化ベクター中に収容された天然に存在する生物の集合的ゲノムを呈示する。クローン化されたDNAは、初めに環境サンプルから直接抽出し、純粋培養物中で増殖させることができる原核生物細胞の小画分に限定されるわけではない。加えて、これらサンプルに存在する環境DNAの標準化は、元のサンプルに存在するすべての種から、これまでより同等のDNA呈示を可能にする。これにより、優勢な種と比較して、呈示量が数桁少ないサンプルの微量成分から興味深い遺伝子をみいだす効率を顕著に高めることができる。
例えば、１つ以上の非培養微生物から作製した遺伝子ライブラリーを、関心のある活性についてスクリーニングする。まず、関心のある生物活性分子をコードする可能性がある経路を、遺伝子発現ライブラリーの形で原核細胞中に捕獲する。次に、関心のある活性をコードするポリヌクレオチドをこのようなライブラリーから単離し、ホスト細胞に導入する。新規又は増強された活性を有する潜在的な活性生物分子を生成する組換え及び／又は還元的再構築を促進する条件下で、上記ホスト細胞を増殖させる。
【０１０６】
ポリヌクレオチドを調製することができる微生物としては、キサントバクター（Xanthobacter）、真正細菌及び古細菌のような原核微生物、並びに、真菌、数種の藻類及び原生動物のような下等真核微生物が挙げられる。ポリヌクレオチドは、環境サンプルから単離することができるが、その場合、生物を培養することなく核酸を回収することもできるし、或いは、１以上の培養生物から回収することも可能である。一形態では、このような微生物は、超好熱菌、好冷菌、低温発育菌、好塩基性菌、好圧菌及び好酸性菌などの好極限性細菌でよい。好極限性微生物から単離したポリヌクレオチドコード化酵素が特に好ましい。このような酵素は、地熱温泉や深海の熱道（thermal vents）で100℃を超える温度、北極海水中の０℃を下回る温度、死海の飽和塩環境、石炭鉱床及び地熱イオウ多含有泉における０前後のpH値、或いは、汚泥における11を超えるpH値でも機能し得る。例えば、好極限性生物からクローン化及び発現された数種のエステラーゼやリパーゼは、広い温度及びpH範囲において高い活性を示す。
以上記載してきた、選択及び単離されたポリヌクレオチドは、好適なホスト細胞中に導入する。好適なホスト細胞は、組換え及び／又は還元的再構築を促進することができるあらゆる細菌である。選択されたポリヌクレオチドは、好ましくは、好適な制御配列を含むベクター中にすでに存在する。ホスト細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞、又は酵母細胞のような下等真核生物細胞のいずれでもよく、或いは、好ましくは、ホスト細胞は、細菌細胞などの原核生物細胞でよい。ホスト細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、もしくはエレクトロポレーションにより実施することができる(Davis et al., 1986)。
好適なホストの代表例として、下記のものを挙げることができる：大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞；酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）S2及びSpodoptera Sf9などの昆虫細胞；CHO、COSまたはBowes黒色腫などの動物細胞；アデノウイルス；並びに、植物細胞。好適なホストの選択は、本明細書における教示から当業者の技量の範囲内にあると認められる。
【０１０７】
現在使用中の大多数の生物活性化合物は、土壌微生物に由来している。土壌や他の複合共同体に存在する多くの微生物は、生存し増殖する能力を高める種々の化合物を産生する。これらの化合物は、生物の増殖に必要なものではないと一般に考えられ、中間代謝、それ故“二次代謝産物”という名前に関係する遺伝子によって合成される。二次代謝産物は、一般的には複雑な生合成経路の産物であり、通常は一般的な細胞前駆体に由来する。他の生物の増殖又は生存に影響する二次代謝産物は、“生物活性”化合物として知られ、微生物と肉眼で見える生物双方の化学防御蓄積の鍵となる成分として役に立つ。ヒトは、これらの化合物を構成物質、抗感染剤、広範囲の原核病原体や真核病原体に対する活性を有する他の生物活性化合物として用いるために利用してきた。微生物由来の約6,000の生物活性化合物が確認されており、60% を超える化合物がストレプトマイセス属のグラム陽性土壌菌によって産生されたものである。(Barnes et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 91, 1994)。
高密度フィルタ又はバイオパニングを用いたハイブリダイゼーションスクリーニングは、未知の対応部分を有してよい新規な生物活性分子を発見するために対象の遺伝子を含む経路の同族体を検出するのに効率の良い方法であった。対象のポリヌクレオチドがクローンのライブラリーに多く含まれると、活性をスクリーニングすることが望ましい。例えば、小分子環構造又は“主鎖”の発現をスクリーニングすることが望ましい。これらの多環式構造をコードしている遺伝子が大腸菌中でしばしば発現し得ることから、不活性形態でも小分子主鎖を製造し得る。構造を活性形態に修飾又は"装飾"し得る必要なグリコシル化とメチル化遺伝子を発現させる適切なホストに分子又は経路を伝達する際に生物活性が与えられる。従って、大腸菌中で不活性環化合物が組換え発現されてクローンを識別されても、生物活性分子の続いての生産のためにストレプトマイセス(例えば、ストレプトマイセス・ジベルセ(Streptomyces diversae)又はベネズエレ(venezuelae))のような代謝的に富んだホストにシャトルされる。大腸菌(E. coli)が活性小分子を産生することができ、ある場合には、構造の“装飾”のために代謝的に富んだホストにクローンをシャトルすることが望ましいが、必要ではないことは理解すべきである。高スループットロボットシステムの使用は、マイクロタイター皿の多重化アレイにおいて数十万のクローンのスクリーニングを可能にする。
【０１０８】
本発明の核酸は、試験管内又は生体内発現系において発現、又は過剰発現させ得る。細菌、昆虫、酵母、真菌又は哺乳動物の培養物を含む、組換えタンパク質を発現、又は過剰発現させるために任意の細胞培養系を用いることができる。過剰発現は、プロモーター、エンハンサー、(例えば、レプリコンベクター、ジシストロンベクターの使用(例えば、Gurtu (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:295-8を参照のこと))、媒体、培養系等の適切な選択により行うことができる。一態様では、細胞系において選択マーカー、例えば、グルタミンシンテターゼ(例えば、Sanders (1987) Dev. Biol. Stand. 66:55-63を参照のこと)を用いた遺伝子増幅は、本発明のポリぺプチドが過剰発現させるために用いられる。
特に、組換えタンパク質を発現させるのに用いることができる各種哺乳動物細胞培養系に関して、哺乳動物発現系の例として、“SV40-形質転換したサル細胞が、初期SV40突然変異体の複製を支持する”(Gluzman, 1981)に記載されているサル腎繊維芽細胞のCOS-7系、並びに、適合性ベクターを発現することができるその他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、Hela及びBHK細胞系が挙げられる。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーター及びエンハンサー、並びに、あらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与及び受容部位、転写終結配列、及び5'フランキング非転写配列を含んでなる。SV40スプライスに由来するDNA配列、並びに、ポリアデニル化部位を用いて、必要な非転写遺伝エレメントを提供することができる。
関心のあるポリヌクレオチドを含むホスト細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅のために適宜改変した通常の栄養培地で培養することができる。温度やpHなどの培養条件は、発現のために選択したホスト細胞についてすでに用いたものと同様であり、当業者には明らかであろう。次に、特別の酵素活性を有するものとして識別されたクローンを配列決定することにより、活性が増強された酵素をコードするポリヌクレオチド配列を同定することができる。
【０１０９】
本発明の酵素及びポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、好ましくは、均一に精製される。本発明のフィターゼポリペプチドは、いくつかの標準的方法のいずれを用いても取得することができる。例えば、フィターゼポリペプチドは、標準的組換え発現系（以下を参照）で生産するか、化学的に合成する（この手法は、小さいフィターゼポリペプチド断片に限られる）か、或いは、それらを天然で発現する生物から精製することができる。使用可能な組換え発現方法は、哺乳動物ホスト、微生物ホスト、及び植物ホストの使用を含む。
本発明のフィターゼ分子の組換え発現は、例えば、その他の酵素など、１以上の追加の分子と組み合わせて達成することができる。この手法は、本発明のフィターゼ分子と１以上の追加の分子を含む植物又は植物部分などの、組合せ産物を生産するのに使用可能であり、好ましくは、上記フィターゼ分子と追加の分子は組合せ処理で使用可能である。その結果得られる、組換えにより発現された分子は、均一化及び／又は精製された形態で、或いは、あまり精製されていない形態で（例えば、フィチン酸の分解を触媒するためにその他の食物と混合したとき使用できる摂取可能な植物部分として）使用することができる。
要約すれば、非制限的態様において、本発明は、ホストに発現させた組換え酵素を提供する。別の非制限的態様では、本発明は、実質的に純粋なフィターゼ酵素を提供する。従って、本発明の酵素は、組換え酵素、天然酵素、もしくは合成酵素、好ましくは、組換え酵素であり得る。
具体的な態様では、本発明は、トランスジェニック植物又は植物器官におけるフィターゼの発現、並びに、その作製方法を提供する。フィターゼの発現を指令することができる調節配列の制御下にあるフィターゼをコードする遺伝子により植物を形質転換するためのDNA発現構築物が提供される。これらの調節配列には、構成的、もしくは発達段階的及び／又は組織特異的な様式で、植物において転写を指令することができる配列が含まれる。
【０１１０】
発現の方法は、一部には、植物又は植物部分の使用に応じて違ってくる。本発明によって提供されるトランスジェニック植物及び植物器官は、例えば動物飼料など、様々な産業プロセスにおいて直接使用することができ、或いはまた、発現されたフィターゼを抽出し、所望であれば、使用前に精製することもできる。これ以外にも、組換えホスト植物又は植物部分を直接用いてもよい。具体的な態様では、本発明は、増加量のフィターゼを含む種子を用いてフィチン酸加水分解反応を触媒する方法を提供する。この方法は、例えば、粉砕又は破砕形態の、トランスジェニック非野生型種子と、フィチン酸含有基質とを接触させることにより、種子中の酵素が反応速度を高めるようにすることを含む。種子をフィチン酸含有基質に直接添加することにより、本発明は、コスト高で面倒な酵素の抽出及び精製方法を解消する。一具体例では、本発明は、酵素の十分な供給が欠如している生物に、増加量の酵素を含む種子の形態で、酵素を投与する処置方法も提供する。一態様では、生物に酵素を投与するタイミングは、フィチン酸含有食物の摂取に合わせて調整する。
植物におけるフィターゼの発現は様々な手段により達成することができる。具体的には、例えば、双子葉植物種（例えば、タバコ、ジャガイモ、トマト、ペチュニア属、アブラナ属）などの多数の植物種を形質転換するのに、上記技法を使用することができる。加えて、例えば、植物における外来遺伝子の発現のための戦略も利用可能である。更には、植物遺伝子由来の調節配列が同定されており、これらは植物及び植物細胞において機能的に発現させることができるキメラ遺伝子を構築するのに使用できる(例えば、Klee et al., 1987；Clark et al., 1990；Smith et al., 1990)。
【０１１１】
植物への遺伝子構築物の導入は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換など、数種の技法を用いて、達成することができる。このように形質転換することができる植物組織の非制限的例として、プロトプラスト、小胞子又は花粉、並びに、葉、茎、根、胚軸、及び子葉のような外植片が挙げられる。更に、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、粒子ボンバードメント、及び直接DNA取込みにより、DNAをプロトプラストや植物細胞又は組織に直接導入することができる。
様々な発現系により、タンパク質を植物において生産することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（Guilley et al., 1982）などの構成プロモーターは、トランスジェニック植物のほぼすべての器官における発現タンパク質の蓄積に使用することができる。或いは、高度に組織特異的及び／又は発達段階特異的であるプロモーターは、所望の組織及び／又は所望の発達段階に向けて発現を偏らせるために本発明で使用することができる（Higgins, 1984；Shotwell, 1989）。本発明のフィターゼ分子の植物における発現に関して更に詳しくは、例えば、米国特許第5,770,413号（Van Ooijen et al.）及び米国特許第5,593,963号(Van Ooijen et al.)に開示されているが、これらの文献は本発明の分子を教示しておらず、真菌性フィターゼの使用について教示している。
要約すると、本発明によれば、様々な手段を用いて、トランスジェニック植物又は植物部分におけるフィターゼの組換え発現を達成することができる。このようなトランスジェニック植物又は植物部分は、組換えにより発現したフィターゼの供給源として使用が可能であり、これをフィチン酸含有源に直接添加することができる。或いは、組換え植物により発現したフィターゼを植物源から抽出し、所望であれば、フィターゼ基質と接触させる前に、精製することができる。
【０１１２】
本発明において、選択すべき植物としては、限定するものではないが、カリフラワー（キャベツ）、アーティチョーク（チョウセンアザミ）のような食用の花；リンゴ（リンゴ属、例えば、リンゴ）、バナナ（バショウ属、例えば、ムサ・アクミナタ）、ベリー（スグリ、スグリ属、例えば、アカフサスグリ）、サクランボ（セイヨウミザクラ、スモモ属、例えば、セイヨウミザクラ）、キュウリ（ウリ属、例えば、キュウリ）、ブドウ（ブドウ属、例えば、ヨーロッパブドウ）、レモン（レモン）、メロン（メロン）、ナッツ類（クルミノキ、クルミ属、例えば、カシグルミ；ピーナツ、ナンキンマメ）、オレンジ（ミカン属、例えば、maxima）、モモ（スモモ属、例えば、モモ）、ナシ（Pyra、例えば、communis）、スモモ（スモモ属、例えば、セイヨウスモモ）、イチゴ（イチゴ属、例えば、フラガリア・モスタカ）、トマト（トマト属、例えば、トマト）などの果実；アルファルファ（ウマヤゴシ属、例えば、ムラサキウマヤゴシ）、キャベツ（例えば、キャベツ）、エンダイブ（キクニガナ属、例えば、エンダイブ）、ニラネギ（ネギ属、例えば、ニラネギ）、レタス（アキノノゲシ属、例えば、チシャ）、ホウレンソウ（ホウレンソウ属、例えば、ホウレンソウ）、タバコ（タバコ属、例えば、タバコ）などの葉；クズウコン（クズウコン属、例えば、クズウコン）、フダンソウ（テンサイ属、例えば、フダンソウ）、ニンジン（ニンジン属、例えば、ニンジン）、キャッサバ（イモノキ、例えば、キャッサバ）、カブ（アブラナ属、例えば、アブラナ）、ハツカダイコン（ダイコン属、例えば、ダイコン）、ヤマノイモ（ヤマノイモ属、例えば、ハリイモ）、サツマイモ（サツマイモ）などの根；インゲンマメ（インゲンマメ属、例えば、インゲンマメ）、エンドウマメ（エンドウ属、エンドウ）、ダイズ（ダイズ属、例えば、ダイズ）、コムギ（コムギ属、例えば、パンコムギ）、オオムギ（オオムギ属、例えば、オオムギ）、トウモロコシ（トウモロコシ属、例えば、トウモロコシ）、コメ（イネ属、例えば、イネ）、ナタネ（ハクラン）、キビ（キビ）、ヒマワリ（ヒマワリ）、オートムギ（カラスムギ）などの種子；コールラビ（アブラナ属、例えば、キャベツ）、ジャガイモ（ナス属、例えば、ジャガイモ）などの塊茎をもたらす作物が挙げられる。
【０１１３】
本発明に関しては更なる植物並びに非植物発現系が使用できると考えられる。植物種の選択は主として植物又はその部分の意図される用途並びにその植物の形質転換の受けやすさによって決定される。
フィターゼをコードするDNA配列を含む発現構築物を目的植物へ導入するにはいくつかの技術が利用できる。かかる技術としては限定されるものではないが、カルシウム／ポリエチレングリコール法を用いたプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクション又は(被覆)粒子ボンバードメント(Potrykus, 1990)が挙げられる。これらのいわゆる直接DNA形質転換法の他、ウイルスベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来のもの)及び細菌ベクター(例えば、アグロバクテリア属由来のもの)などベクターを含む形質転換系が広く利用できる(Potrykus, 1990)。選択及び／又はスクリーニングの後、形質転換されたプロトプラスト、細胞又は植物部分は当技術分野で公知の方法を用いて完全な植物体へと再分化させることができる(Horsch et al., 1985)。形質転換及び／又は再分化技術の選択は本発明にとって重要なことではない。
双子葉植物については、バイナリーベクター系(Hoekema et al., 1983; 欧州特許第0120516号 Schilperoort et al.)を用いることができる。例えば、毒性遺伝子を有するvirプラスミドと導入される遺伝子構築物を含む適合プラスミドを含むアグロバクテリア株を用いることができる。このベクターは大腸菌とアグロバクテリアの双方で複製可能であって、本発明には関連のない細部で変更されているバイナリーベクターBin19(Beven, 1984)に由来するものである。この例で用いられるバイナリーベクターは、T-DNAの左ボーダー配列と右ボーダー配列との間にカナマイシン耐性をコードする同一のNPTII遺伝子(Bevan, 1984)及び必要な遺伝子構築物内にクローニングするための多重クローニング部位を含む。
【０１１４】
単子葉作物の形質転換及び再分化は標準的な方法とはいえない。しかし、最近の科学の進歩は、主な単子葉植物は形質転換に従い、形質転換細胞から稔性のあるトランスジェニック植物が再分化し得ることを示している。これらの作物の再現性ある組織培養系の開発は、植物細胞へ遺伝材料を導入する有効な方法と相まって形質転換を容易にしてきた。現在のところ単子葉植物の形質転換の方法の選択肢としては、外植体又は浮遊細胞のマイクロプロジェクタイルボンバードメント、及びプロトプラストの直接DNA取り込み又はエレクトロポレーションがある。例えば、トランスジェニックイネ植物体は選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性をコードする細菌のhgh遺伝子を用いて上手く得ることができている。この遺伝子はエレクトロポレーションにより導入されたものである(Shimamoto et al., 1993)。トランスジェニックトウモロコシ植物体は、ホスフィノトリシンアセチルトランフェラーゼ(除草剤ホスフィノトリシンを不活性化する酵素)をコードするストレプトマイセス・ヒグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)変種遺伝子を微粒子ボンバードメントによってトウモロコシ懸濁培養不定胚形成細胞に導入することにより得られている(Gordon-Kamm et al., 1990)。コムギ及びオオムギなど他の単子葉作物のアリューロンプロトプラストへの遺伝材料の導入(Lee et al., 1989)。コムギ植物体は不定胚形成懸濁培養物の確立のために成熟した稠密な球状不定胚形成カルス組織だけを選抜することで不定胚形成懸濁培養物から再分化されている(Vasilｍ et al., 1972; Vasil et al., 1974)。これら作物のための形質転換系と組み合わせると、本発明の単子葉植物への適用が可能となる。またこれらの方法は双子葉植物の形質転換及び再分化にも適用できる。
【０１１５】
フィターゼ構築物の発現は、組換えDNA技術の分野の当業者に公知の植物ポリメラーゼによる遺伝子の転写、mRNAの翻訳などの詳細を必要とする。本発明の適切な理解に関連のある詳細だけを以下に述べる。公知であるか、又はフィターゼを発現させることが分かっている調節配列が本発明で使用できる。用いる調節配列の選択は目的の標的作物及び／又は標的器官によって異なる。かかる調節配列は植物又は植物ウイルスから得てもよいし、或いは化学的に合成してもよい。かかる調節配列としては、どの植物又はその一部を使用するかによって、構成的に又は発達段階及び／又は組織特異的に植物体において転写を命令するうえで有効なプロモーターがある。これらのプロモーターとしては、限定されるものではないが、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター(Guilley et al., 1982)などの構成的発現を示すプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプロモーター(Coruzzi et al., 1984)などの葉特異的発現のためのもの、グルタミンシンターゼ遺伝子由来プロモーター(Tingey et al., 1987)などの根特異的発現のためのもの、ブラッシカ・ナパス(Brassica napas)由来クルシフェリンAプロモーター(Ryan et al., 1989)などの種子特異的発現のためのもの、ジャガイモ由来クラスIパタチンプロモーター(Koster-Topfer et al., 1989; Wenzler et al., 1989)などの塊茎特異的発現のためのもの、又はトマト由来ポリガラクツロナーゼ(PG)プロモーター(Birdら, 1988)などの果実特異的発現のためのものが挙げられる。
ターミネーター配列及びポリアデニル化シグナルなどの他の調節配列としては、それ自体植物体で機能するいずれの配列も含み、その選択は当業者の技術の範囲内にある。かかる配列の例としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacience)のノパリンシンターゼ(nos)遺伝子の3'フランキング領域がある(Bevan, 上記)。調節配列はまたCaMVの35Sプロモーターに見られるようなエンハンサー配列、及びアルファルファモザイクウイルス(AlMV)RNA4のリーダー配列(Brederode et al., 1980)などのmRNA安定化配列、又はその他同じように機能するいずれの配列を含んでもよい。
【０１１６】
フィターゼは発現したタンパク質の安定性を可能にする環境で発現させるべきである。本発明においてはフィターゼの生物物理学的パラメーターに応じてかかる安定した環境を作り出すために、サイトゾル、小胞、液胞、タンパク質体または小胞体などの細胞コンパートメントの選択を用いることができる。かかるパラメーターとしては、限定されるものではないが、pHの至適化、プロテアーゼ感受性又は好ましいコンパートメントのモル濃度に対する感受性が挙げられる。
細胞の細胞質で発現を得るためには、発現した酵素は分泌シグナルペプチド又はその他の標的配列を含んでいてはならない。葉緑体及びミトコンドリアでの発現については、発現した酵素はこれらのオルガネラへの輸送のためのいわゆるトランジットペプチドを含んでいなければならない。これを達成するために目的酵素に結合させ得るターゲッティング配列は公知である(Smeekens et al., 1990; van den Broeck et al., 1985; Wolter et al., 1988)。液胞中で酵素活性が求められる場合には、分泌シグナルペプチド並びにこれらの液胞へ酵素を向ける特異的ターゲッティング配列を提供する必要がある(Tague et al., 1990)。種子中のタンパク質体においても同じことが言える。目的酵素をコードするDNA配列は、その酵素が細胞内の所望の場所でその作用を発揮することができるように改変しなければならない。
フィターゼの細胞外発現を達成するには、本発明の発現構築物は分泌シグナル配列を用いる。植物ホスト種と同種の(天然型)シグナル配列が好ましいが、異種シグナル配列(即ち、他の植物種由来のもの又は微生物起源のもの)も同様に用いてよい。かかるシグナル配列は当業者に公知である。本発明の範囲内で使用できる適当なシグナル配列は、Blobelら, 1979; Von Heijne, 1986; Garciaら, 1987; Sijimonsら, 1990; Ngら, 1994;及びPowersら, 1996に記載されている。
関連のDNA構築物の全ての部分(プロモーター配列、調節配列、分泌配列、安定化配列、ターゲッティング配列又は終結配列)は、所望により、当業者に公知の方法を用いて、それらの制御特性に影響を与えるように改変してもよい。本発明によって得られたフィターゼを含有する植物を用いて、いっそう高いフィターゼレベルを有する植物体又は植物器官を得ることもできる。例えば、ソマクローナル変異法の使用により、或いは交配育種法によってかかる植物体又は植物器官を得ることもできる。かかる技術は当業者に周知のものである。
【０１１７】
一態様では、本発明はフィターゼ及びその他の分子の高効率過剰発現系を達成する方法(及びその産物)を提供する。好ましい態様では、本発明はトリコデルマ(Trichoderma)のフィターゼ及びpH2.5酸性ホスファターゼの高効率過剰発現系を達成する方法(及びその産物)を提供する。この系によって動物飼料産業で特に有用な酵素組成物が得られる。このアプローチに関してのさらなる詳細は文献に載っており、当業者には公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としては欧州特許第0659215号(国際出願第9403612 A1号)(Nevalainen et al.)が挙げられるが、これらの参考文献は本発明の分子を教示するものではない。
別の態様では、上記方法を用いて、１以上のオペロン又は遺伝子クラスターもしくはその部分から生化学的経路をコードする新規のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、細菌及び多くの真核生物は、遺伝子（その産物が関連するプロセスに関与する）を調節するための同調機構を有する。遺伝子は、単一の染色体上に又は互いに直接隣接して、“遺伝子クラスター”と呼ばれる構造にクラスター化した後、全クラスターの転写を開始する単一プロモーターなど、単一の調節配列の制御下で一緒に転写される。従って、遺伝子クラスターは、通常機能に関して同一であるか関連している隣接遺伝子の一群である。遺伝子クラスターによりコードされる生化学的経路の一例はポリケチドである。ポリケチドは、抗生物質（テトラサイクリン及びエリスロマイシンなど）、抗癌剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（FK506及びラパマイシン）、並びに、動物用薬品（モネンシン）など、極めて豊富な生物活性の供給源となる分子である。多くのポリケチド（ポリケチドシンターゼにより生成される）は治療薬として価値がある。ポリケチドシンターゼは、長さ及び機能性と環化のパターンが様々である非常に多種の炭素鎖の生合成を触媒する多機能酵素である。ポリケチドシンターゼ遺伝子は遺伝子クラスターに分類され、少なくとも１種（Ｉ型と呼ばれる）のポリケチドシンターゼが大きなサイズの遺伝子及び酵素を有し、遺伝子操作及びこれらの遺伝子／タンパク質の試験管内実験を複雑にしている。
【０１１８】
遺伝子クラスターDNAは、様々な生物から単離して、ベクター（特に連結された遺伝子クラスターから検出可能なタンパク質又はタンパク質関連アレイ活性の生産を制御し調節することができる発現調節配列を含むベクター）に連結することができる。外因性DNA導入の能力が非常に大きいベクターを用いるのが、このような遺伝子クラスターの使用には特に適しており、その例として、本明細書では、例えば、大腸菌のｆ因子（即ち稔性因子）が挙げられる。大腸菌のこのｆ因子は、接合の際、それ自体の高頻度転移に影響を与えるプラスミドであり、混合微生物サンプル由来の遺伝子クラスターのような大きなDNA断片を成し遂げて、安定的に増殖させるのに理想的である。ひとたび適切なベクターに連結されたら、異なるフィターゼ遺伝子クラスターを含む２以上のベクターを好適なホスト細胞に導入することができる。遺伝子クラスターが共有する部分的配列相同性の領域が、配列再構成を達成する過程を促進し、これによって、ハイブリッド遺伝子クラスターが得られる。次に、この新しいハイブリッド遺伝子クラスターをスクリーニングし、元の遺伝子クラスターには存在しない増強された活性について調べることができる。
従って、一態様では、本発明は、生物学的に活性のハイブリッドポリペプチドを作製した後、下記のステップにより、このようなポリペプチドを、増強された活性についてスクリーニングする方法に関する：
１）少なくとも、機能的に連結された第１ポリヌクレオチドと、機能的に連結された第２ポリヌクレオチドとを好適なホスト細胞に導入するステップ、その際、上記少なくとも第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドが、部分的配列相同性の少なくとも１領域を共有していること；
２）配列再構成を促進する条件下でホスト細胞を増殖させることにより、機能的に連結されたハイブリッドポリヌクレオチドを取得するステップ；
３）上記ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされたハイブリッドポリペプチドを発現させるステップ；
４）増強した生物学的活性の識別を促進する条件下で上記ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングするステップ；及び
５）上記ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するステップ。
【０１１９】
各種酵素活性をスクリーニングする方法は、当業者には公知であり、本明細書全体を通して説明する。このような方法は、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを単離する際に用いることができる。
本明細書で用いることができる発現ベクターの代表的な例として、下記のものを挙げることができる：ウイルス粒子、バキュロウイルス、バクテリオファージ１挿入ベクター又は置換ベクター、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体(BAC)、ウイルスDNA(例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びSV40の誘導体)、P1系の人工染色体(PAC)、酵母プラスミド、酵母人工染色体(YAC)、並びに、関心のある特定のホストに特異的なその他のベクター(バチルス、アスペルギルス及び酵母)。従って、例えば、上記DNAを、ポリペプチドを発現させる多様な発現ベクターのいずれか１つに含有させることができる。このようなベクターとして、染色体、非染色体及び合成DNA配列がある。多数の好適なベクターが当業者には公知であり、市販されている。例として、下記のベクターが挙げられる；細菌性：pQEベクター(Qiagen)、pBluescriptプラスミド、pNHベクター(λ-ZAPベクター(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核生物性：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。しかし、ホスト内で複製可能かつ生存可能であれば、これ以外のどのようなプラスミド又はベクターを用いてもよい。本発明では、低コピー数又は高コピー数のベクターを用いることもできる。
本発明で使用するのに好ましいタイプのベクターは、ｆ因子複製起点を含んでいる。大腸菌におけるｆ因子（即ち、稔性因子）は、接合の際、それ自体の高頻度転移、並びに、これより低い頻度の細菌染色体自体の転移に影響を与えるプラスミドである。特に好ましい態様では、“フォスミド”もしくは細菌人工染色体（BAC）ベクターと呼ばれるクローニングベクターを用いる。これらは、ゲノムDNAの大きなセグメントを安定して組み込むことができる大腸菌ｆ因子から誘導される。非培養の混合環境サンプルからのDNAを組み込む場合には、これによって、大きなゲノム断片を安定した“環境DNAライブラリー”の形に成し遂げることができる。
【０１２０】
本発明で用いる別のタイプのベクターは、コスミドベクターである。コスミドベクターは、本来、ゲノムDNAの大きなセグメントをクローン化及び増殖させるよう設計されたものである。コスミドベクターへのクローン化については、“分子クローニング：研究室マニュアル”（Sambrookら、1989）に詳しく記載されている。
発現ベクターにおけるDNA配列は、RNA合成を指令するのに適した発現制御配列（プロモーター）に機能的に連結させる。特に挙げられる細菌プロモーターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL及びtrpがある。真核生物のプロモーターとしては、CMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、並びに、マウスメタロチオネイン-Iが挙げられる。適したベクター及びプロモーターの選択は、当業者の技術レベルの範囲内にある。発現ベクターはまた、翻訳開始用のリボソーム結合部位と、転写ターミネーターも含む。加えて、このベクターは、発現を増幅するのに適した配列を含んでいてもよい。プロモーター領域は、選択マーカーを有するCAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターもしくはその他のベクターを用いて、所望の遺伝子から選択することができる。更に、発現ベクターは、１以上の選択マーカー遺伝子を含むことにより、真核生物細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、或いは、大腸菌におけるテトラサイクリンもしくはアンピリシン耐性など、形質転換されたホスト細胞を選択するための表現型特性を提供することができる。
【０１２１】
生体内再構築は、“分子間”過程に集約されるが、これらの過程は、まとめて“組換え”と呼ばれ、細菌での場合、一般には、“RecA依存性”の現象とみられている。本発明は、配列を組換え及び再構築するホスト細胞の組換え過程、つまり、欠失により細胞における準反復配列の複雑性を軽減するために細胞が還元過程を媒介する能力、を利用することができる。この“還元的再構築”の過程は、“分子内の”、RecA-非依存過程により起こる。
従って、本発明の別の形態では、還元的再構築の方法により、変異体ポリヌクレオチドを作製することができる。この方法は、隣接した配列（元のコード配列）を含む構築物の作製、適したベクターへの挿入、続いて、適したホスト細胞への導入を含んでなる。個々の分子の再構築は、相同性領域を含む構築物における隣接配列間、もしくは準反復単位間のコンビナトリアルプロセスによって起こる。再構築過程は、反復配列の複雑性及び程度を組み換え、且つ／又は軽減し、その結果、新しい分子種を生成させる。再構築率を高めるために各種の処理を実施することができる。このような処理として、紫外線、もしくはDNA損傷化学薬品による処理、及び／又は増強されたレベルの“遺伝的不安定性”を展示するホスト細胞系の使用が挙げられる。従って、再構築過程は、相同的組換え又は準反復配列の天然の特性を含めることにより、それら自身の進化を指令することができる。
反復又は“準反復”配列は、遺伝的不安定性においてある役割を果たしている。本発明では、“準反復配列”とは、その元の単位構造に限定されない反復配列を意味する。準反復単位は、構築物における配列のアレイ、類似配列の連続した単位、として表すことができる。いったん連結されると、隣接する配列間の接続は、ほとんど見えなくなり、得られた構築物の準反復性が分子レベルで連続することになる。得られた構築物の複雑性を軽減するために細胞が行う細胞の欠失過程は、準反復配列間で機能する。この準反復単位は、滑り（slippage）事象が起こり得る鋳型のほぼ無制限のレパートリーを提供する。従って、準反復配列を含む構築物は、欠失（及び潜在的に挿入）事象が準反復単位内のほぼどこでも起こり得るように十分な分子弾性を効果的に提供する。
【０１２２】
準反復配列がすべて同じ配向、例えば、頭−尾又はその反対方向に連結されると、細胞は個々の単位を識別することができない。その結果、還元的過程が配列全体で起こる可能性がある。対照的に、例えば、単位が頭−尾ではなく、頭−頭で示される場合には、逆転が隣接する単位の終点を正確に描く結果、欠失の形成は個別の単位の喪失に有利となる。従って、本発明の方法の場合には、配列が同じ配向であることが好ましい。準反復配列のランダム配向では、再構築効率の低下をまねくのに対し、配列の一貫した配向は、最も高い効率をもたらすであろう。しかし、同じ配向の隣接した配列が少ないほど効率が下がるものの、それでも、新しい分子の効率的回収に十分な弾性を提供し得る。同じ配向の準反復配列を用いて構築物を作製することにより、効率を高めることができる。
下記を含む様々な方法のいずれかを用いて、頭−尾配向に配列をアセンブリさせることができる：
a）ポリA頭及びポリT尾を含むプライマーであって、一本鎖に作製されたとき、配向を付与するものを用いることができる。これは、プライマーの最初の数塩基をRNAから作製し、そこから容易にRNAseHを除去することにより達成される。
b）ユニーク制限切断部位を含むプライマーを使用することができる。多数の部位、一群のユニーク配列、並びに、反復合成及び連結段階が必要である。
c）プライマーの内部の数塩基をチオール化し、エキソヌクレアーゼを用いて、適正にテイル（尾部）化した分子を生成する。
【０１２３】
再構築された配列の回収は、還元されたRIを含むクローニングベクターの同定により行なう。次に、再構築されたコード配列を増幅により回収することができる。産物を再クローン化し、発現させる。還元RIを含むクローニングベクターの回収は、下記により実施することができる：
１）構築物の複雑度が軽減されている場合にのみ安定して維持されるベクターの使用。
２）物理的方法による、短くなったベクターの物理的回収。この場合、クローニングベクターを標準的プラスミド単離方法により回収した後、標準的方法を用いてアガロースゲル又は低分子量カットオフを有するカラムのいずれかでサイズ分画する。
３）挿入物のサイズが減少すると選択することができる分断遺伝子を含むベクターの回収。
４）発現ベクター及び適切な選択による直接選択法の使用。
関連する生物からのコード配列（例えば、遺伝子）は、高度の相同性を示すと同時に、かなり多様なタンパク質産物をコードする。これらのタイプの配列は、準反復配列として、本発明において特に有用である。しかし、以下に示す実施例では、ほぼ同じ元のコード配列（準反復配列）の再構築を示すが、この方法は、このようなほぼ同じ準反復配列に限定されるわけではない。
以下の実施例は本発明の方法を示す。３つのユニークな種に由来するコード化核酸配列（準反復配列）について説明する。各配列は明確に異なるセットの特性を有するタンパク質をコードする。これらの配列は、それぞれ、“Ａ”、“Ｂ”及び“Ｃ”と称する配列におけるユニークな位置で、単一又は数個の塩基対が異なる。準反復配列は個別に又は集団として増幅して、ランダムアセンブリに連結することにより、連結分子の集団においてあらゆる可能な順列・組合せが利用可能となるようにする。準反復単位の数はアセンブリ条件により制御することができる。構築物における準反復単位の平均数を反復指数（RI）として定義する。
いったん形成されると、構築物は、公開されたプロトコルに従ってアガロースゲル上でサイズ分画してもよいし、しなくてもよい。次に、該構築物をクローニングベクターに挿入した後、適したホスト細胞にトランスフェクトする。次いで、該細胞を増殖させ、「還元的再構築」を実施する。還元的再構築プロセスの速度は、所望であれば、DNA損傷の導入により刺激することができる。RIの還元（低減）が「分子内」機構による反復配列間の欠失形成か、或いは、「分子間」機構を介した組換え様事象のいずれにより媒介されているかは、重要ではない。目的とする結果は、あらゆる可能な組合せへの分子の再構築である。
【０１２４】
場合によっては、上記方法は、結合もしくは相互作用する能力、或いは、特定の反応を触媒する（例えば、ハロアルカンの加水分解を触媒するなどの）能力を有する個別のシャッフルされたライブラリーメンバーを同定するために、シャッフルされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングする追加のステップを含む。
このようなライブラリーから同定したポリペプチドは、治療、診断、研究及び関連目的（例えば、触媒や、水溶液の容量オスモル濃度を高めるための溶質など）のために用いることができ、且つ／又は、更にシャッフリング及び／又は選択の1以上のサイクルに付してもよい。
別の態様では、組換え又は再構築の前もしくはその最中に、本発明のポリヌクレオチド、或いは、本明細書に記載した方法により作製されたポリヌクレオチドを、元のポリヌクレオチドへの変異導入を促進する薬剤又は工程に付すことができる。このような変異導入により、得られるハイブリッドポリヌクレオチドと、それからコードされたポリペプチドの多様性が増加する。変異導入を促進する薬剤又は工程として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：(+)-CC-1065、もしくは(+)-CC-1065-(N3-アデニン)のような合成類似体(Sun & Hurley、1992参照)；DNA合成を阻害することができるN-アセチル化又は脱アセチル化4'-フルオロ-4-アミノビフェニル付加物(例えば、van de Pollら、1992を参照); DNA合成を阻害することができるN-アセチル化又は脱アセチル化4-アミノビフェニル付加物(同様に、van de Pollら、1992、pp. 751-758を参照)；DNA複製を阻害することができる三価クロム、三価クロム塩、多環式芳香族炭化水素（“PAH”）DNA付加物、例えば、7-ブロモメチル-ベンズ[a]アントラセン(“BMA”)、トリ(2,3-ジブロモプロピル)ホスフェート(“Tris-BP”)、1,2-ジブロモ-3-クロロプロパン(“DBCP”)、2-ブロモアクロレイン(2BA)、ベンゾ[a]ピレン-7,8-ジヒドロジオール-9-10-エポキシド（“BPDE”）、白金（II）ハロゲン塩、N-ヒドロキシ-2-アミノ-3-メチルイミダゾ[4,5-f]-キノリン(“N-ヒドロキシ-IQ”)、及びN-ヒドロキシ-2-アミノ-1-メチル-6-フェニルイミダゾ[4,5-f]-ピリジン(N-ヒドロキシ-PhIP)。PCR増幅を遅速化又は停止する特に好ましい手段は、紫外線、(+)-CC-1065及び(+)-CC-1065-(N3-アデニン)からなる。特に好ましい手段は、DNA付加物、もしくはポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドプールからのDNA付加物を含んでなるポリヌクレオチドであり、これらは、該ポリヌクレオチドを含む溶液を処理する前に、加熱などの方法により放出又は回収することができる。
【０１２５】
別の態様では、本発明は、ハイブリッド又は再構築ポリヌクレオチドの生産を可能にする本発明に従う条件下で、野生型タンパク質をコードする二本鎖鋳型ポリヌクレオチドを含むサンプルを処理することにより、生物活性を有する組換えタンパク質を作製する方法に関する。
本発明はまた、専売特許のコドンプライマー（縮重N,N,N配列を含む）を用いて、点変異をポリヌクレオチドに導入することにより、全範囲の単一アミノ酸置換を各アミノ酸位置で呈示する子孫ポリペプチドのセットを作製することを可能にする(遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）)。用いるオリゴは、第１相同配列、縮重N,N,N配列、並びに、好ましくは（しかし必ずしも必要ではない）第２相同配列から連続的に構成される。このようなオリゴの使用により得られる下流の子孫翻訳産物は、N,N,N配列の縮重性が20種のアミノ酸すべてのコドンを含んでいるために、ポリペプチドに沿って各アミノ酸部位にあらゆる可能なアミノ酸改変を含んでいる。
一態様では、このような１つの縮重オリゴ（１つの縮重N,N,G/Tカセットからなる）を用いて、親ポリヌクレオチド鋳型中の元の各コドンを全範囲のコドン置換に付す。別の形態では、少なくとも２つの縮重N,N,G/Tカセット（同じオリゴでも、違うものでもよい）を用いて、親ポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも２つの元のコドンを全範囲のコドン置換に付す。従って、１つのオリゴに１以上のN,N,G/T配列を含ませることにより、１以上の部位にアミノ酸変異を導入することができる。このような複数のN,N,G/T配列は、直接隣接していてもよいし、或いは、１以上の別のヌクレオチド配列により隔てられていてもよい。別の態様では、付加及び欠失を導入するのに使用可能なオリゴを単独で、或いは、N,N,G/T配列を含むコドンと組み合わせて用いることにより、アミノ酸付加、欠失、及び／又は置換のあらゆる組合せもしくは順列を導入することができる。
【０１２６】
一態様では、連続したN,N,G/Tトリプレット、即ち、縮重(N,N,G/T)n配列を含むオリゴを用いて、２以上の隣接するアミノ酸位置に同時に変異を導入することも可能である。
別の態様では、本発明は、N,N,G/T配列より縮重が低い縮重カセットの使用を提供する。例えば、いくつかのケースでは、ただ１つのNからなる縮重トリプレット配列を（例えば、オリゴにおいて）用いるのが望ましく、その際、Nは、上記トリプレットの最初の第２又は第３位置にあってよい。上記トリプレットの残る２つの位置には、前記のあらゆる組合せ及び順列を含むその他いずれかの塩基を用いることもできる。或いは、いくつかのケースでは、縮重N,N,Nトリプレット配列、もしくはN,N,G/Cトリプレット配列を（例えば、オリゴにおいて）用いるのが望ましい。
しかし、本発明で開示する縮重トリプレット（N,N,G/T又はN,N,G/Cトリプレット配列）の使用は、いくつかの理由で有利であることに留意されたい。一態様では、本発明は、ポリペプチドにおける各及び全アミノ酸位置への全範囲の可能なアミノ酸（合計20種のアミノ酸）の置換を系統的且つ／非常に容易に作製する手段を提供する。従って、100アミノ酸ポリペプチドについては、本発明は、2000の個別種（即ち、１位置につき20種の可能なアミノ酸に、100のアミノ酸位置をかける）を系統的且つ／非常に容易に作製する手段を提供する。縮重N,N,G/T又はN,N,G/Cトリプレット配列を含むオリゴの使用により、20種の可能なアミノ酸をコードする32の個別配列が提供されることを理解されたい。従って、このようなオリゴを用いて、親ポリヌクレオチド配列を飽和変異導入に付す反応容器中では、20の個別ポリペプチドをコードする32の個別子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異導入に非縮重オリゴを用いると、１反応容器につき、ただ１つの子孫ポリペプチドしか生成されない。
【０１２７】
本発明はまた、非縮重オリゴの使用も提供するが、これは、場合によっては、縮重プライマーと組み合わせて用いることができる。状況によっては、非縮重オリゴを用いて、実施ポリヌクレオチドに特定の点変異を発生させるのが有利であることも理解されたい。これにより、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸改変を起こす点変異、並びに、停止コドンの生成や、ポリペプチド断片の対応する発現を起こす点変異を発生させる手段を提供する。
従って、一態様では、各飽和変異誘導反応容器は、少なくとも20種の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含み、これにより、20アミノ酸すべてが、親ポリヌクレオチドで変異導入されたコドン位置に対応する１つの特定アミノ酸位置に呈示される。各飽和変異誘導反応容器から生産された32倍縮重子孫ポリペプチドをクローン増幅に付した（例えば、発現ベクターを用いて、好適な大腸菌ホストにクローン化する）後、発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより、（親ペプチドと比較して）有利な特性変化を示す個々の子孫ポリペプチドをスクリーニングして同定したら、そこに含まれる有利なアミノ酸置換を確認することができる。
本明細書に開示するように、飽和変異誘導を用いて、親ポリペプチド中の各及び全アミノ酸位置に変異を導入すると、１以上のアミノ酸位置で、有利なアミノ酸変化を同定することができる。これらの有利なアミノ酸置換の全部又は一部の組合せを含む１以上の新しい子孫分子を生成することができる。例えば、２つの特定の有利なアミノ酸変化が、ポリペプチドの３つのアミノ酸位置の各々で確認されれば、順列は、各位置での３つの可能性（元のアミノ酸からの変化なし、及び２つの有利な変化の各々）と３つの位置を含む。従って、３×３×３、即ち、合計27の可能性がある。そのうち７つはすでに試験済であり、６つは単一点変異（即ち、３位置の各々で２つ）であり、１つはどの位置にも改変がない。
【０１２８】
別の態様では、部位飽和変異導入は、スクリーニングと共に、シャッフリング、キメラ化、組換え及びその他の変異導入方法と一緒に用いることができる。本発明は、反復方式で、飽和変異導入などのあらゆる変異導入方法の使用を提供する。一態様では、いずれかの変異導入方法の反復使用をスクリーニングと組み合わせて用いる。
従って、非制限的例では、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、別の変異導入方法と組み合わせた飽和変異導入により誘導することができる。組み合わせる方法として、例えば、２以上の関連ポリヌクレオチドを好適なホスト細胞に導入し、組換え及び還元的再構築により、ハイブリッドポリヌクレオチドを作製する方法がある。
遺伝子の全配列に沿って変異導入を実施する以外に、変異導入を用いて、ポリヌクレオチド配列におけるどんな数の塩基も各々置換することができ、その際、変異を導入しようとする塩基数は、好ましくは、15から100,000までのあらゆる整数である。従って、分子に沿ってすべての位置に変異を導入するのではなく、各塩基又は個別の数の塩基（合計15〜100,000のサブセットであり得る）を変異導入に付すことができる。好ましくは、個別のヌクレオチドを用いて、ポリヌクレオチド配列に沿った各位置又は位置グループに変異を導入する。変異を導入しようとする３つの位置のグループがコドンである。変異は、変異導入プライマーを用いて導入することができ、その際、該プライマーは、異種カセットを含み、変異導入カセットとも呼ばれている。具体的なカセットは１〜500塩基をもつことができる。このような異種カセットにおける各ヌクレオチド位置は、N、A、C、G、T、A/C、A/G、A/T、C/G、C/T、G/T、C/G/T、A/G/T、A/C/T、A/C/G又はEであり、その際、Eは、A、C、G、又はTではない任意の塩基である(Eは、デザイナーオリゴと呼ぶことができる)。
【０１２９】
一般的な意味で、飽和変異導入は、変異を導入しようとする規定ポリヌクレオチド配列（ここで、変異を導入しようとする配列は、長さが約15〜100,000塩基である）における変異導入カセット（ここで、各カセットは、長さが約１〜500塩基である）の完全なセットに変異を導入することからなる。従って、変異の１グループ（１〜100変異）を、変異を導入しようとする各カセットに導入する。１つのカセットに導入すべき変異のグループ分けは、飽和変異導入の１ラウンドの実施中に、第２のカセットに導入すべき変異の第２グループ分けと異なっていても、同じでもよい。このようなグループ分けの例としては、欠失、付加、特定コドンのグループ分け、並びに、特定のヌクレオチドカセットのグループ分けが挙げられる。
変異を導入しようとする規定配列としては、全遺伝子、経路、cDNA、全オープンリーディングフレーム（ORF）、並びに、全プロモーター、エンハンサー、リプレッサー／トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーター、或いは、あらゆるポリヌクレオチド官能基が挙げられる。一般に、この目的の“規定配列”は、15塩基ポリヌクレオチド配列、並びに、長さが15塩基から15,000塩基（本発明では、特に、その間の全整数を挙げる）までのポリヌクレオチド配列を含むあらゆるポリヌクレオチドでよい。コドンのグループ分けに際しては、縮重変異導入カセットによりコードされるアミノ酸の種類も考慮する。
変異導入カセットに導入することができる変異のグループ分けの一態様では、本発明は特に、各位置で２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20種のアミノ酸をコードする縮重コドン置換（縮重オリゴを使用）、並びに、これによってコードされるポリペプチドのライブラリーを提供する。
【０１３０】
本発明の態様は、配列番号1、それにほぼ同一の配列、相補的な配列、又は配列番号1の配列の1つの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500の連続した塩基を含む断片を含む分離した核酸である。分離した核酸は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAを含むDNAを含んでもよい。DNAは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖の場合にはコーディング鎖でも非コーティング(アンチセンス)鎖でもよい。また、分離した核酸はRNAを含んでもよい。
後に詳述されるように、本発明の分離した核酸は、配列番号2、それにほぼ同一の配列のポリぺプチド、又は配列番号2、それにほぼ同一の配列のポリぺプチドの1つの少なくとも510, 15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片を調製するために用いることができる。
従って、本発明の他の態様は、配列番号2のポリぺプチドの1つをコードしている分離した核酸配列、それにほぼ同一の配列、又は配列番号2のポリぺプチドの1つの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片である。これらの核酸のコード配列は、配列番号1、又はその断片のコード配列の1つと同じでもよく、配列番号2、それにほぼ同一の配列の1つをコードしている異なるコード配列、遺伝コードの重複又は縮重の結果として配列番号2のポリぺプチドの1つの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を有する断片でもよい。遺伝コードは当業者に周知であり、例えば、B. Lewin, Genes VI, Oxford University Press, 1997の214頁から入手し得る。
【０１３１】
配列番号2、それにほぼ同一の配列のポリぺプチドの1つをコードしている分離した核酸には、配列番号1、それにほぼ同一の配列の1つのコード配列、追加のコード配列、例えば、リーダー配列又はプロタンパク質配列又は非コード配列、例えば、イントロン又はコード配列の5' 及び/又は3' の非コード配列を含めることができるがこれらのみに限定されない。従って、本明細書に用いられる“ポリぺプチドをコードしているポリヌクレオチド”という用語は、ポリぺプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドと、追加のコード配列及び/又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
また、本発明の核酸配列は、配列番号1、又はそれにほぼ同一の配列のポリヌクレオチドへサイレント変化を導入するために部位特異的変異導入のような慣用的な手法、又は当業者によく知られた他の手法を用いて変異導入することができる。本明細書に用いられる“サイレント変化”には、例えば、ポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配列を変化させない変化が含まれる。そのような変化は、ホスト生物において頻繁に存在するコドン又はコドン対を導入することによりポリぺプチドをコードしているホスト細胞によって作製されるポリぺプチドのレベルを高めるために望ましいものである。
本発明は、また、本発明のポリぺプチド(例えば、配列番号2)においてアミノ酸置換、付加、融合、切断を生じるヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチドに関する。そのようなヌクレオチドの変化は、部位特異的変異導入、ランダム化学変異導入、エキソヌクレアーゼIII欠失、又は他の組換えDNA技術のような手法を用いて導入することができる。また、そのようなヌクレオチド変化は、配列番号1、又はそれにほぼ同一の配列(又は相補的な配列)の１つの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500の連続した塩基を含むプローブに対して本明細書に示された高い、中程度の、又は低いストリンジェンシーの下で特異的にハイブリッドする核酸配列を同定することにより分離される天然に存在する対立遺伝子変異体であってもよい。
【０１３２】
配列番号1、それにほぼ同一の配列、相補的配列、又は前述の配列の1つの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500の連続した塩基を含む断片は、また、土壌試料のような生物試料が本明細書の核酸配列をもつ生物又は核酸が得られた生物を含むかを求めるためにプローブとして用いることができる。そのような手順においては、核酸が分離された生物を潜在的に含んでいる生物試料を入手し、その試料から核酸が得られる。核酸とプローブとを、存在している相補的配列に対してプローブが特異的にハイブリッドすることができる条件下で接触させる。
必要な場合、プローブが相補的配列に対して特異的にハイブリッドすることができる条件は、相補的配列を含むことが既知の試料からの相補的配列と相補的配列を含まない対照配列とを接触させた状態でプローブを置き換えることにより求めることができる。ハイブリダイゼーションバッファーの塩濃度、ハイブリダイゼーションバッファーのホルムアミド、又はハイブリダイゼーション温度のようなハイブリダイゼーション条件は、プローブが相補的核酸に対して特異的にハイブリダイズすることができる条件を同定するために変動させることができる。
核酸が分離された生物を試料が含む場合には、プローブの特異的ハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションは、放射性同位体、蛍光色素又は検出可能産物の形成を触媒することができる酵素のような検出可能物質でプローブを標識することにより検出することができる。
試料中の相補的核酸の存在を検出するために標識プローブを用いる多くの方法は、当業者によく知られている。これらには、サザンブロット、ノーザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション法、又はドットブロットが含まれる。これらの方法の各々のプロトコールは、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997やSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に示されている。
【０１３３】
また、１を超えるプローブ(少なくとも１つが核酸試料中に存在する相補的配列に対して特異的にハイブリダイズすることができる)は、試料が本発明の核酸配列を含む生物(例えば、核酸が分離された生物)を含むかを求めるために増幅反応において用いることができる。典型的には、プローブはオリゴヌクレオチドを含んでいる。一態様においては、増幅反応はPCR反応を含むことができる。PCRプロトコールは、上記Ausubel & Sambrookに記載されている。また、増幅はリガーゼ鎖反応、3SR、又は鎖置換反応を含むことができる。(Barany, F., “The Ligase Chain Reaction in a PCR World,” PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991; E. Fahy et al., “Self-sustained Sequence Replication (3SR): An Isothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR”, PCR Methods and Applications 1:25-33, 1991; Walker G.T. et al., “Strand Displacement Amplification-an Isothermal in vitro DNA Amplification Technique”, Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992を参照のこと)。そのような手順においては、試料中の核酸とプローブとを接触させ、増幅反応を行い、得られた増幅産物を検出する。増幅産物は、反応産物についてゲル電気泳動を行い、そのゲルを臭化エチジウムのような挿入剤で染色することにより、検出することができる。また、プローブの1つ以上を放射性同位体で標識することができ、放射性増幅産物の存在をゲル電気泳動後のオートラジオグラフィにより検出することができる。
配列番号1、又はそれにほぼ同一の配列の末端近傍の配列に由来するプローブは、上記の核酸配列に隣接して位置するゲノム配列を含むクローンを同定するために染色体ウォーキング法において用いることができる。そのような方法は、追加のタンパク質をコードしている遺伝子をホスト生物から分離させることを可能にする。
【０１３４】
配列番号1、それにほぼ同一の配列、相補的な配列、又は前述の配列の1つの少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500の連続した塩基を含む断片に示された分離した核酸配列は、関連した核酸を同定し分離するためにプローブとして用いることができる。ある態様においては、関連した核酸は核酸が分離されたもの以外の生物由来のcDNA又はゲノムDNAであってもよい。例えば、その他の生物は関連した生物であってもよい。そのような手順においては、核酸試料とプローブとを関連した配列に対してプローブが特異的にハイブリダイズすることができる条件下で接触させる。次に、関連した生物由来の核酸に対するプローブのハイブイリダイゼーションは、上記方法のいずれかを用いて検出される。
核酸ハイブイリダイゼーション反応では、具体的なレベルのストリンジェンシーを得るために用いられる条件は変動し、ハイブリダイズされる核酸の種類に左右される。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成(例えば、GCとATの含量)、核酸のタイプ(例えば、RNAとDNA)がハイブイリダイゼーション条件の選択に考慮し得る。更に、核酸の1つが、例えば、フィルタ上に固定されるかが考慮される。
ハイブイリダイゼーションは、低い、中程度又は高いストリンジェンシーの条件下で行うことができる。核酸ハイブイリダイゼーションの一例として、固定された変性核酸を含むポリマー膜をまず0.9 M NaCl、50 mM NaH2PO4、pH 7.0、5.0 mM Na2EDTA、0.5% SDS、10Xデンハート溶液、0.5 mg/mlポリリボアデニル酸からなる溶液中45℃で30分間プレハイブリダイズする。次に約2 × 107 cpm (比活性4-9×108 cpm/ug)の32P末端標識オリゴヌクレオチドプローブをその溶液に添加する。12-16時間インキュベートした後、膜を0.5% SDSを含有する1X SET (150 mM NaCl、20 mMトリス塩酸塩、pH 7.8、1 mM Na2EDTA)中室温で30分間洗浄し、続いてオリゴヌクレオチドプローブに対するTm-10℃で新しい1X SET中で30分間洗浄する。次に膜をハイブイリダイゼーションシグナルを検出するためにオートラジオグラフィにさらす。
【０１３５】
検出可能なプローブに対してハイブリダイズするcDNA又はゲノムDNAのような核酸を同定するために用いられるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることにより、プローブに対する相同レベルの異なる核酸を同定し分離することができる。ストリンジェンシーは、プローブの溶融温度より低い種々の温度でハイブリダイゼーションを行うことにより変えることができる。溶融温度、Tmは、標的配列の50% が完全な相補的プローブに対してハイブリダイズする温度(特定のイオン強度とpHの下で)である。非常にストリンジェントな条件は、具体的なプローブのTmに同じか約5℃低いように選定される。プローブの溶融温度は、次の具体的な式を用いて計算することができる。長さが14〜70ヌクレオチドのプローブの場合、溶融温度(Tm)は次式: Tm=81.5+16.6(log [Na+])+0.41(G+C断片)-(600/N) (式中、Nはプローブの長さである。）を用いて計算される。ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含有する溶液中で行われる場合には、溶融温度は: Tm=81.5+16.6(log [Na+])+0.41(G+C断片)-(0.63% ホルムアミド)-(600/N) (式中、Nはプローブの長さである。)を用いて計算することができる。プレハイブリダイゼーションは、6X SSC、5Xデンハート試薬、0.5% SDS、100μgの変性断片サケ精子DNA又は6X SSC、5Xデンハート試薬、0.5% SDS、100μgの変性断片化サケ精子DNA、50% ホルムアミド中で行うことができる。SSCとデンハート試薬の製剤や他の溶液は、例えば、Sambrookに示されている。
【０１３６】
ハイブリダイゼーションは、検出可能なプローブを上記プレハイブリダイゼーション溶液に添加することにより行われる。プローブが二本鎖DNAを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前に変性される。フィルタとハイブリダイゼーション溶液とをプローブが相補的又は相同的配列を含むcDNA又はゲノムDNAに対してハイブリダイズさせることができるのに十分な時間接触させる。長さが200ヌクレオチドを超えるプローブの場合、ハイブリダイゼーションはTmより低い15-25℃で行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブのような短いプローブの場合、ハイブリダイゼーションはTmより低い5-10℃で行うことができる。典型的には、6X SSC中のハイブリダイゼーションの場合、ハイブイリダイゼーションは約68℃で行われる。通常は、50% ホルムアミド含有溶液中のハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーションは約42℃で行われる。前述のハイブリダイゼーションのすべては高ストリンジェンシーの条件下であると考えられる。
ハイブリダイゼーション後、非特異的に結合した検出可能プローブを除去するためにフィルタを洗浄する。フィルタを洗浄するために用いられるストリンジェンシーは、ハイブリダイズされる核酸の種類、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成(例えば、GCとATの含量)、核酸の種類(例えば、RNAとDNA)によって変えることができる。より高くなるストリンジェンシー条件の例は次の通りである:  2X SSC、0.1% SDS、室温で15分間(低ストリンジェンシー); 0.1X SSC、0.5% SDS、室温で30分〜1時間(中程度のストリンジェンシー); 0.1X SSC、0.5% SDS、ハイブリダイゼーション温度68℃で15〜30分間(高ストリンジェンシー); 0.15M NaCl、72℃で15分間(非常に高いストリンジェンシー)、最後の低ストリンジェンシー洗浄は0.1X SSC中室温で行うことができる。上記例は、フィルタを洗浄するために使用し得る一組の条件を単に例示するものである。当業者は、異なるストリンジェンシー洗浄に多くのレシピがあることを知っている。他の例を次に示す。
【０１３７】
プローブに対してハイブリダイズした核酸は、オートラジオグラフィ又は他の通例の技術によって同定し得る。
上記方法は、プローブ配列に対する相同性のレベルが低下した核酸を同定するために修飾することができる。例えば、検出可能なプローブに対する相同性を低下する核酸を得るために、よりストリンジェントでない条件を用いることができる。例えば、ハイブリダイゼーション温度を、約1MのNa+濃度をもつハイブリダイゼーションバッファー中68℃から42℃まで5℃ずつ低下させることができる。ハイブリダイゼーション後、フィルタをハイブリダイゼーション温度で2X SSC、0.5% SDSで洗浄することができる。これらの条件は、50℃より高い“中程度”条件や50℃より低い“低”条件と考えられる。“中程度”ハイブリダイゼーション条件の個々の例は、上記ハイブリダイゼーションを55℃で行う場合である。“低ストリンジェンシー”ハイブリダイゼーションの個々の例は、上記ハイブリダイゼーション条件を45℃で行う場合である。
また、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを含有する6X SSCのようなバッファー中42℃の温度で行うことができる。この場合、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミドの濃度は、プローブに対する相同性のレベルが低下したクローンを同定するために50%から0%まで5%ずつ低下させることができる。ハイブリダイゼーション後、フィルタは6X SSC、0.5% SDSで50℃において洗浄することができる。これらの条件は、ホルムアミドが25% より多い“中程度”条件とホルムアミドが25% より低い“低”条件であると考えられる。“中程度”ハイブリダイゼーション条件の個々の例は、上記ハイブリダイゼーションが 30% のホルムアミドで行われる場合である。“低ストリンジェンシー”ハイブリダイゼーション条件の個々の例は、上記ハイブリダイゼーションが10% のホルムアミドで行われる場合である。
【０１３８】
例えば、前の方法は、配列番号1に示される核酸配列、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500の連続した塩基を含む断片、又は前述の配列のいずれかに相補的な配列に示される核酸配列に対する相同性が少なくとも約99%、少なくとも98%、少なくとも97%、少なくとも95%、少なくとも90%、又は少なくとも80%である核酸を分離するために用いることができる。相同性は、アラインメントアルゴリズムを用いて測定することができる。例えば、相同ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるコード配列の1つの天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列をもつことができる。そのような対立遺伝子変異体は、配列番号1、又はそれに相補的な配列に示される核酸と比較した場合、1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加をもつことができる。
更に、上記手順は、配列アラインメントアルゴリズム(例えば、デフォルトパラメータによるFASTAバージョン3.0t78アルゴリズム)を用いて求められる配列番号2に示される配列、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片をもつポリぺプチドに対する相同性が少なくとも約99%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、少なくとも80%、又は少なくとも70% であるポリぺプチドをコードしている核酸を分離するために用いることができる。
本発明の他の態様は、配列番号1に示される配列、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片を含んでいる分離した又は精製したポリぺプチドである。上述したようにそのようなポリぺプチドは、コード配列がコードされたポリぺプチドの適切なホスト細胞中での発現を動かすことができる配列に作用可能に結合されるように、ポリぺプチドをコードしている核酸をベクターへ挿入することにより得ることができる。例えば、発現ベクターは、プロモーターと、翻訳開始用リボソーム結合部位と、転写ターミネーターとを含むことができる。ベクターは、また、発現を増幅するのに適切な配列も含むことができる。
【０１３９】
細菌中でポリぺプチド又はその断片を発現させるのに適したプロモーターには、大腸菌lac又はtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、λPRプロモーターλPLプロモーター、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)のような解糖酵素をコードしているオペロン由来のプロモーター、又は酸ホスファターゼプロモーターが含まれる。真菌プロモーターには、α因子プロモーターが含まれる。真核プロモーターには、CMV即時型プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期と後期のSV40プロモーター、レトロウイルス由来のLTR、又はマウスメタロチオネイン-Iプロモーターが含まれる。原核細胞又は真核細胞又はそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーターを用いることもできる。
哺乳動物発現ベクターは、また、複製起点と、必要なリボソーム結合部位と、ポリアデニル化部位と、スプライス供与部位と受容部位と、転写終結配列と、5' フランキング非転写配列を含むことができる。ある態様においては、SV40スプライスとポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要とされる非転写遺伝子要素を与えるために用いることができる。
真核細胞においてポリぺプチド又はその断片を発現させるベクターは、また、発現レベルを高めるためにエンハンサーを含むことができる。エンハンサーは、転写を高めるためにプロモーターに作用する長さが通常は約10〜300 bpのDNAのシス作用要素である。例としては、複製起点bp 100〜270の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、又はアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
【０１４０】
更に、発現ベクターは、典型的には、ベクターを含有するホスト細胞を選択することができる1つ以上の選択可能マーカー遺伝子を含んでいる。そのような選択可能マーカーには、ジヒドロ葉酸レダクダーゼをコードしている遺伝子又は真核細胞培養物にネオマイシン耐性を与える遺伝子、大腸菌にテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を与える遺伝子、又はS.セレビシエTRP1遺伝子が含まれる。
発現ライブラリーを作成した後、細胞選別によってスクリーニングする前にそのようなライブラリーを"バイオパニング"するステップを更に含めることができる。"バイオパニング"方法は、(i)指定された生物活性を有する酵素をコードしているDNA配列の少なくとも一部を含む少なくとも1つのプローブDNAの使用により、少なくとも1つの微生物に由来するDNAから標的DNAを選択的に分離し、(ii)場合によっては、指定された生物活性をスクリーニングするクローンのライブラリーを作成するためにホストを分離した標的DNAで形質転換することにより調製されたクローンのライブラリーにおいて配列相同性をスクリーニングすることにより指定された生物活性を有するクローンを同定する方法を意味する。
少なくとも1つの微生物に由来するDNAから対象の標的DNAを選択的に分離するために用いられるプローブDNAは、既知の活性の酵素のDNAの全長コード領域配列又は部分コード 領域配列であり得る。もとのDNAライブラリーは、指定された酵素活性を有する酵素をコードしているDNA配列の少なくとも一部を含むプローブの混合物を用いてプローブすることができる。これらのプローブ又はプローブライブラリーは、一本鎖であり得る。また、プローブされる微生物DNAは一本鎖形態へ変換することができる。適したプローブは、スクリーニングされる指定された酵素活性と同様の又は同一の活性を有する酵素をコードしているDNAに由来するものである。
【０１４１】
プローブDNAは、少なくとも約10塩基又は少なくとも15塩基であり得る。一態様においては、全コード領域は、プローブとして用いることができる。標的DNAが少なくとも1つのDNAプローブの使用により選択的に分離されるハイブイリダイゼーションの条件は、少なくとも約50% の配列相同性のハイブイリダイゼーションストリンジェンシー、特に少なくとも約70% の配列相同性を与えるストリンジェンシーを与えるように設計される。
核酸ハイブイリダイゼーション反応においては、ストリンジェンシーの具体的なレベルを達成するために用いられる条件は変動し、ハイブリダイズされる核酸の種類に左右される。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成(例えば、GCとATの含量)、核酸のタイプ(例えば、RNAとDNA)がハイブイリダイゼーション条件を選択するのに考慮し得る。更に、核酸の1つが、例えば、フィルタ上に固定されるかが考慮される。
ストリンジェンシーが次第に高くなる条件の一例は、次の通りである: 2X SSC/0.1% SDS、ほぼ室温(ハイブイリダイゼーション条件); 0.2X SSC/0.1% SDS、ほぼ室温(低ストリンジェンシー条件); 0.2X SSC/0.1% SDS、約42℃(中程度ストリンジェンシー条件); 0.1X SSC、約68℃(高ストリンジェンシー条件)。洗浄は、これらの条件の1つだけ、例えば、高ストリンジェンシー条件を用いて行うことができ、条件のそれぞれを、例えば、各10-15分間上記の順序で上記ステップのいずれか又はすべてを繰り返して用いることもできる。しかしながら、上記のように、最適条件は必要とされる具体的なハイブイリダイゼーション反応によって変動し、経験的に求めることができる。
潜在的対象の標的DNAを分離するために微生物DNAライブラリーをプローブするためのハイブイリダイゼーション法は当該技術において周知であり、文献に記載される手法のいずれか、特に微生物に由来するDNAの残部からの分離が容易な固相結合、直接又は間接結合プローブDNAを用いるものが本明細書に用いるのに適している。
【０１４２】
プローブDNAは、特定の結合対(即ち、リガンド)の一方のパートナーで“標識”することができ、その結合対のもう一方のパートナーは標的をその供給原から分離しやすくするために固体マトリックスに結合する。リガンドと特定の結合パートナーは、次のものからいずれかの向きで選択することができる: (1)抗原又はハプテンと抗体又はその特異的結合断片; (2)ビオチン又はイミノビオチンとアビジン又はストレプトアビジン; (3)糖とそれに特異的なレシチン; (4)酵素とその阻害剤; (5)アポ酵素と補因子; (6)補助的ホモポリマーオリゴヌクレオチド; (7) ホルモンとその受容体。固相は、 (1)ガラス又はポリマーの表面; (2)ポリマービーズの充填カラム; (3)磁気又は常磁性粒子より選ばれる得る。
更に、分離された標的DNAの増幅を行うことは任意であるが望ましい。この態様においては、標的DNAは分離後プローブDNAから分離される。次に増幅した後にホストを形質転換するために用いられる。少なくとも一部として所定のDNA配列を含むように選択された二本鎖DNAは一本鎖にすることができ、増幅に供することができ、再アニールして選択された二本鎖DNAの増幅数を得ることができる。現在では多くの増幅方法が当該技術において周知である。
次に、適切な生物を形質転換することによりスクリーニングするライブラリーを調製するために選択されたDNAが用いられる。形質転換の助けになる条件下で接種することにより標的DNAを含むベクターを人工的に導入することにより、ホスト、例えば、本明細書で特に同定されたものが形質転換される。次に得られた形質転換クローンのライブラリーについて対象の酵素に対する活性を示すクローンをスクリーニングする。
生物から選択的に分離したDNAからクローンの多様性を調製して、そのようなクローンについて特定の酵素活性をスクリーニングし、指定された酵素特性を有するクローンを同定する。
【０１４３】
酵素活性のスクリーニングは、個々の発現クローンに対して行うことができ、混合物が1つ以上の指定された酵素活性を有するか否かを確認するために発現クローンの混合物に対してまず行うこともできる。混合物が指定された酵素活性を有する場合には、個々のクローンはそのような酵素活性又はより比活性のためのFACSマシーンを用いて再スクリーニングすることができる。また、ゲル微小滴法のような封入法は、クローンのグループ内の正の発現クローンのためにFACSマシーンでスクリーニングされる1つの位置に多重クローンを局在させるために用いることができ、次に正の個々のクローンを同定するために FACSマシーンで再びスクリーニングされる個々のクローンへ取り出されることができる。従って、例えば、クローン混合物がヒドラーゼ活性を有する場合には、個々のクローンを回収し、FACSマシーンを用いてスクリーニングしてそのようなクローンがヒドラーゼ活性を有することを決定することができる。本明細書に用いられる“小挿入断片ライブラリー”は、約500塩基対までのランダム小サイズ核酸挿入断片を有するクローンを含む遺伝子ライブラリーを意味する。本明細書に用いられる“大挿入断片ライブラリー”は、約5000から数十万の塩基対以上までのランダム大サイズ核酸挿入断片を有するクローンを含む遺伝子ライブラリーを意味する。
上記態様の1つについて記載されるように、本発明は、微生物に由来する選択DNAを含むクローンを酵素活性スクリーニングする方法であって、ライブラリーについて酵素活性をスクリーニングするステップであって、前記ライブラリーが複数の組合わせローンを含み、前記クローンがDNAを選択した微生物のゲノムDNAから回収することにより調製されており、そのDNAが指定された活性を有するDNAの全部又は一部である少なくとも1つのDNA配列に対するハイブイリダイゼーションによって選択される前記ステップと、指定された酵素活性をスクリーニングするクローンを作製するために選択DNAでホストを形質転換するステップとを含む、前記方法を提供する。
【０１４４】
一態様においては、微生物由来のDNAライブラリーは、(a)二本鎖ゲノムDNA集団を一本鎖DNA集団にするステップと、(b)(a)の一本鎖DNA集団とリガンドに結合したDNAプローブとをハイブイリダイゼーションの許容的条件下で接触させてプローブとそれにハイブリダイズするゲノムDNA集団の部分との一本鎖複合体を作製するステップと、(c)(b)の二本鎖複合体と前記リガンドの固相特異的結合パートナーとを接触させて固相複合体を作製するステップと、(d)(b)の一本鎖DNA集団から固相複合体を分離するステップと、(e)固相結合プローブに結合したゲノム集団の部分をプローブから遊離するステップと、(f)(e)のゲノム集団の部分から二本鎖DNAを形成するステップと、(g)(f)の二本鎖DNAを適切なホストへ導入して選択DNAを含む複数のクローンを含むライブラリーを形成するステップと、(h)ライブラリーについて指定された酵素活性をスクリーニングするステップにより指定された酵素活性を有する酵素をコードしているDNA配列の全部又は一部である1つ以上のプローブDNA配列に対してハイブリダイズするDNAを選択する選択手順に供される。
他の態様においては、本方法は、シグナル配列又は分泌配列を含むDNAを回収する前選択を含んでいる。この方法では、シグナル配列又は分泌配列を含む上記でDNAのみ記載されたようにハイブイリダイゼーションによりゲノムDNAから選択することが可能である。次の段落には、本発明のこの態様のプロトコール、一般の分泌シグナル配列の種類と機能、そのような配列の分析又は選択過程への個々の具体的な適用が記載される。
この態様の一態様は、更に、(a)の後で上記(b)の前に、(ai)(a)の一本鎖DNA集団と一定の種類のタンパク質にユニークな分泌シグナル配列に対して相補的なリガンド結合オリゴヌクレオチドプローブとをハイブイリダイゼーションの許容的ナトリウム条件下で接触させて二本鎖複合体を形成するステップと、(aii)(ai)の二本鎖複合体と前記リガンドの固相特異的結合パートナーとを接触させて固相複合体を作製するステップと、(aiii)固相複合体を(a)の一本鎖DNA集団から分離するステップと、(aiv)前記固相結合プローブに結合したゲノム集団の部分を遊離するステップと、(av)結合したゲノム集団の部分から固相結合プローブを分離するステップとを含んでいる。
【０１４５】
次に、シグナル配列が含まれるように選択され分離されたDNAを上記選択手順に供して指定された酵素活性を有する酵素をコードしているDNAに由来する1つ以上のプローブDNA配列に結合しているDNAを選択し分離する。本発明を実施するために使用し得るこの手順や他の手順は、例えば、米国特許第6,368,798号や同第6,054,267号に記載されている。
生体内バイオパニングは、FACSによるマシーンと非光学(例えば、磁気)によるマシーンを用いて行うことができる。複合遺伝子ライブラリーは、転写RNAを安定化する要素を含むベクターによって構築される。例えば、RNAの転写領域に隣接するように設計されるヘアピンのような二次構造を生じる配列が含まれると安定性を高める働きがあるので、細胞内での半減期が増大する。バイオパニング過程に用いられるプローブ分子は、標的分子にプローブを結合する際にのみ蛍光を発するレポーター分子で標識されたオリゴヌクレオチドからなっている。これらのプローブは、いくつかの形質転換法の1つを用いてライブラリーから組換え細胞へ導入される。プローブ分子は、転写標的The mRNAに結合し、結果としてヘテロ二本鎖分子が生じる。プローブを標的に結合すると、スクリーニング過程で FACSマシーンにより検出され選別される。
ある態様においては、配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片の1つをコードしている核酸を翻訳ポリぺプチド又はその断片の分泌を特定することができるリーダー配列により適切な相中で構築される。場合によっては、核酸は、配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸のポリぺプチドの1つが高安定性又は簡易化精製のような所望の特性を与えるN末端同定ぺプチドのような異種ぺプチド又はポリぺプチドに融合している融合ポリぺプチドをコードしている。
【０１４６】
適切なDNA配列は、種々の手順によってベクターへ挿入することができる。一般的には、挿入断片とベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化した後にベクターの所望される位置にDNA配列はライゲートされる。また、挿入断片とベクター双方の平滑末端をライゲートすることができる。種々のクローニング技術は、Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997やSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に開示されている。そのような手順等は当業者の範囲内であると思われる。
ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、又はファージの形でもよい。他のベクターには、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、合成DNA配列、SV40誘導体; 細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAの組合わせに由来するベクター、ウイルスDNA、例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、又は仮性狂犬病ウイルスが含まれる。原核ホストや真核ホストとともに用いられる種々のクローニングや発現ベクターは、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)に記載されている。
用いることができる具体的な細菌ベクターには、周知のクローニングベクターpBR322 (ATCC 37017)、pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals、ウプサラ、スウェーデン)、GEM1 (Promega Biotec、マディソン、ウィスコンシン州、米国)、pQE70、E60、pQE-9 (Qiagen)、pD10、psiX174、Bluescript II KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A (Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3, pKK233-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)、pKK232-8又はpCM7の遺伝子要素を含む市販のプラスミドが含まれる。具体的な真核ベクターには、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL (Pharmacia)が含まれる。しかしながら、ホスト細胞中で複製可能で生存可能である限り他のベクターを用いることができる。
【０１４７】
ホスト細胞は、原核細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は植物細胞を含む当業者によく知られたホスト細胞のいずれであってもよい。適切なホストの代表例として、細菌細胞、例えば、大腸菌、ストレプトマイセス、バシラス・サチラス、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、又はシュードモナス属、ストレプトマイセス属、又はスタフィロコッカス属の各種、真菌細胞、例えば、酵母、昆虫細胞、例えば、ドロソフィラ(Drosophila)S2又はソポドプテラ(Spodoptera)Sf9、動物細胞、例えば、CHO、COS又はBowesメラノーマ、又はアデノウイルスを挙げることができる。適切なホストの選択は、当業者の能力の範囲内である。
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子ガン、又はTi仲介遺伝子移入を含む種々の手法のいずれを用いてもホスト細胞へ導入することができる。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーション(Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986))が含まれる。
適切な場合には、操作したホスト細胞をプロモーターの活性化、形質転換細胞の選択又は本発明の遺伝子の増幅に適切なように修飾された慣用の栄養培地中で培養し得る。適切なホスト株の形質転換とホスト株の適切な細胞密度までの増殖後、選択されたプロモーターを適切な手段(例えば、温度移動又は化学的誘導)によって誘導し、所望のポリぺプチド又はその断片を作製することを可能にする期間細胞を更に培養することができる。
【０１４８】
細胞を、典型的には、遠心分離により回収して物理又は化学的手段により破砕した後、得られた粗抽出物を次の精製のために保持する。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤の使用など、通常の方法で破砕することができ、このような方法は当業者には公知である。発現ポリぺプチド又はその断片は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈澱、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィーなどの方法により、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。必要に応じて、ポリぺプチドの立体配置を完成させるために、タンパク質リフォールディングステップを使用してもよい。所望される場合には、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製ステップで使用してもよい。
また、各種哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることも可能である。哺乳動物発現系の例として、サル腎繊維芽細胞のCOS-7系（Gluzmanによって記載されている、Cell, 23:175, 1981）、又は適合性ベクターからタンパク質を発現することのできる他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、Hela又はBHK細胞系が挙げられる。
ホスト細胞中の構築物は、組換え配列によってコードされた遺伝子産物を作製するために慣用の方法で使用し得る。組換え作製手順において用いられるホストによっては、ベクターを含むホスト細胞によって産生されたポリぺプチドをグリコシル化することができ、非グリコシル化することもできる。本発明のポリぺプチドは、初期のメチオニンアミノ酸残基を含んでも含まなくてもよい。タンパク質の組換え発現に関する追加の詳細は、当業者に入手できる。例えば、Protein Expression: A Practical Approach (Practical Approach Series, S. J. Higgins (Editor), B. D. Hames (Editor) (July 1999) Oxford University Press; ISBN: 0199636249は、種々の生物におけるタンパク質の発現について当業者には十分な手引きになる。
【０１４９】
また、配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片のポリぺプチドは、慣用のぺプチドシンセサイザーによって合成的に生産することができる。他の態様においては、ポリぺプチドの断片又は部分をぺプチド合成による対応する全長ポリぺプチドの生産に用いることができる。それ故、断片を全長ポリぺプチドの生産の中間体として用いることができる。
当業者に既知であるように、本発明の核酸は種々の生物における発現に最適であり得る。一態様においては、本発明の配列は対象の生物、例えば、S.セレビシエのような真菌又は大腸菌のような細菌におけるコドン使用に最適である。具体的なアミノ酸をコードするために生物によって好ましい具体的なコドンの選択を意味するコドン使用のための核酸配列の最適化は、当該技術においてよく理解されている。最適化コドン使用の表は、多くの生物に対して既知である。例えば、Transfer RNA in Protein Synthesis, Dolph L. Hatfield, Byeong J. Lee, Robert M. Pirtle (Editor) (July 1992) CRC Press; ISBN: 0849356989を参照のこと。従って、本発明は、また、生物のコドン使用に適合した本発明の核酸を包含する。
本発明の核酸配列の最適化発現は、また、コードされたタンパク質の発現を増強するために核酸の特異的又はランダム変異導入を意味する。本発明の核酸の変異導入は、直接又は間接に発現タンパク質の収量の増加を与える。制限されない例によって、本明細書に記載される変異導入法は、5' 非翻訳領域、3' 非翻訳領域、又は核酸のコード領域の変異を行うために用いることができ、その変異により結果としてRNA又はタンパク質レベルでの安定性が増大し、よってタンパク質の収量が増加し得る。
【０１５０】
無細胞翻訳系は、また、ポリぺプチド又はその断片をコードしている核酸に作用可能に結合したプロモーターを含むDNA構築物から転写したmRNAを用いて、配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片のポリぺプチドの1つを生産するために用いることができる。ある態様においては、試験管内転写反応を行う前にDNA構築物を線状化することができる。次に転写mRNAを、ウサギ網状赤血球抽出物のような適切な無細胞翻訳抽出物とインキュベートして所望のポリぺプチド又はその断片を生産する。
本発明は、また、配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸のポリぺプチドの変異体に関する。“変異体”という用語には、これらのポリぺプチドの誘導体又は類似体が含まれる。特に、変異体は、組合わせて存在してもよい1つ以上の置換、付加、欠失、融合、切断により、アミノ酸配列において配列番号2、又はそれにほぼ同一の配列と異なってもよい。
変異体は、天然に存在してもよく試験管内で作成されてもよい。特に、そのような変異体は、部位特異的変異導入、ランダム化学的変異導入、エキソヌクレアーゼIII欠失法、又は標準クローニング技術のような遺伝子操作技術を用いて作成することができる。また、そのような変異体、断片、類似体、又は誘導体は化学的合成又は修飾法を用いて作成することができる。
変異体を作成する他の方法は、また、当業者によく知られている。これらには、天然の分離物から得られた核酸を工業用途又は実験用途での価値を高める特性を有するポリぺプチドをコードしている核酸を作成するために修飾する方法が含まれる。そのような方法では、天然の分離物から得られた配列についての差が1つ以上のヌクレオチドである多くの変異体配列が作成され確認されている。典型的には、これらのヌクレオチドの差により、天然分離物由来の核酸によってコードされたポリぺプチドについてアミノ酸の変化が生じる。
【０１５１】
例えば、変異体は、誤りがちなPCRを用いて作成することができる。誤りがちなPCRでは、PCRはDNAポリメラーゼのコピーイングフィディリティが低い条件下で行われ、PCR産物の全長に沿って高率の点変異が得られる。誤りがちなPCRは、Leung, D.W., et al., Technique, 1:11-15, 1989)やCaldwell, R. C. & Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2:28-33, 1992に記載されている。概要としては、そのような方法では、変異導入すべき核酸をPCRプライマー、反応バッファー、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼ、PCR産物の全長に沿って高率の点変異を達成するのに適した濃度のdNTPと混合する。例えば、反応は、20フェムトモルの変異導入すべき核酸、30ピコモルの各PCRプライマー、50 mM KClと、10 mMトリスHCl (pH 8.3)と、0.01% ゼラチンとを含む反応バッファー、7mM MgCl2、0.5 mM MnCl2、5単位のTaqポリメラーゼ、0.2 mM dGTP、0.2 mM dATP、1 mM dCTP、1 mM dTTPを用いて行うことができる。PCRは、94℃で1分間、45℃で1分間、72℃で1分間を30サイクル行うことができる。しかしながら、適切なようにこれらのパラメータを変動させることができることは理解される。変異導入した角さんを適切なベクターへクローン化し、変異導入した核酸によってコードされたポリぺプチドの活性が評価される。
変異体は、また、対象のクローン化DNAにおいて部位特異的変異を生じるオリゴヌクレオチド特異的変異導入を用いて作成することができる。オリゴヌクレオチド変異導入は、Reidhaar-Olson, J.F. and Sauer, R.T., et al., Science, 241:53-57, 1988に記載されている。概要としては、そのような手順においては、クローン化DNAへ導入すべき1つ以上の変異をもつ複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、変異導入すべきクローン化DNAへ挿入する。変異導入したDNAを含むクローンを回収し、コードしているポリぺプチドの活性を評価する。
【０１５２】
変異体を作成する他の方法はアセンブリPCRである。アセンブリPCRは、小DNA断片の混合物からPCR産物のアセンブリを含んでいる。多くの異なるPCR反応が同じバイアル中で同時に起こり、1つの配列の産物が他の反応の産物を開始する。アセンブリPCRは、Method of “DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or interrupting a Synthesis or Amplification Process”と称する1996年7月9日出願の米国特許係属出願第08/677,112号に記載されている。
変異体を作成する他の方法は、性的PCR変異導入である。性的PCR変異導入では、配列相同性に基づくDNA分子のランダム断片化の結果として試験管内で異なっているが非常に関連のあるDNA配列のDNA分子間で起こり、続いてPCR反応においてプライマーエクステンションによる交差の固定が起こる。性的PCR変異導入は、Stemmer, W.P., PNAS, USA, 91:10747-10751, 1994に記載されている。概要としては、そのような手順では、組換えすべき複数の核酸をDNアーゼで消化して平均サイズが50-200ヌクレオチドの断片を作成する。所望の平均サイズを有する断片を精製し、PCR混合物中に再懸濁する。PCRは核酸断片間の組換えを容易にする条件下で行われる。例えば、PCRは10-30ng/μl濃度の精製した断片を0.2 mMの各dNTP、2.2 mM MgCl2、50 mM KCL、10 mMトリスHCl、pH 9.0、0.1% トリトンX-100の溶液に再懸濁することにより行うことができる。100μlの反応混合液に対して2.5単位のTaqポリメラーゼを添加し、次のレジメ: 94℃で60秒間、94℃で30秒間、50-55℃で30秒間、72℃で30秒間(30-45回)、72℃で5分間を用いてPCRを行う。しかしながら、これらのパラメータは適切な場合には変えてもよいことは理解される。ある態様においては、オリゴヌクレオチドをPCR反応に含めてもよい。他の態様においては、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片をPCR反応の最初のセットに用いることができ、Taqポリメラーゼを PCR反応の続いてのセットに用いることができる。組換え配列を分離し、コードしているポリぺプチドの活性を評価する。
【０１５３】
変異体は、また、生体内変異導入により作成することができる。ある態様においては、対象の配列内のランダム変異は、DNA修復経路の1つ以上に変異をもつ大腸菌(E. coli)株のような細菌株中で対象の配列を増殖させることにより作成される。そのような “変異導入”株は、野生型の親よりランダム変異率が高い。これらの株の1つでDNAを増殖すると、最終的にDNA内にランダム変異を生じる。生体内変異導入に用いるのに適した変異導入株は“Methods for Phenotype Creation from Multiple Gene Populations”と称する1991年10月31日公開のPCT公開第WO 91/16427号に記載されている。
変異体は、また、カセット変異導入を用いて作成することができる。カセット変異導入では、二本鎖DNA分子の小領域を未変性配列と異なる合成オリゴヌクレオチド“カセット”で置き換える。
再帰的集合変異導入は、また、変異体を作成するために用いることができる。再帰的変異導入は、一部がアミノ酸配列において異なる表現型に関連した変異体のまちまちの集団を作製するために開発されたタンパク質操作(タンパク質変異導入)のためのアルゴリズムである。この方法は、連続ラウンドのコンビナトリアルカセット変異導入を制御するためにフィードバックメカニズムを用いる。再帰的集合変異導入は、Arkin, A.P. and Youvan, D.C., PNAS, USA, 89:7811-7815, 1992に記載されている。
ある態様においては、変異体は指数関数的集合変異導入を用いて作成される。指数関数的変異導入は、高割合のユニークで機能的な変異体を有するコンビナトリアルライブラリーを作成する方法であって、小グループの残基をランダム化すると同時にそれぞの改変位置で機能的タンパク質になるアミノ酸を同定する前記方法である。指数関数的集合変異導入は、Delegrave, S. and Youvan, D.C., Biotechnol. Res., 11:1548-1552, 1993に記載されている。ランダム変異導入と部位特異的変異導入は、Arnold, F.H., Current Opinion in Biotechnology, 4:450-455, 1993に記載されている。
【０１５４】
ある態様においては、変異体は、異なるポリぺプチドをコードしている複数の核酸の一部を一緒に融合してキメラポリぺプチドをコードしているキメラ核酸配列を作成するシャッフリング方法を用いて作成され、“Method of DNA Shuffling with Polynucleotides Produced by Blocking or interrupting a Synthesis or Amplification Process”と称する1996年7月9日出願の米国特許係属出願第08/677,112号や“Combinatorial Enzyme Development”と称する1996年5月22日出願の米国特許係属出願第08/651,568号に記載されている。
配列番号2のポリぺプチドの変異体は、配列番号2のポリぺプチドのアミノ酸残基の1つ以上が保存又は非保存アミノ酸残基(例えば、保存アミノ酸残基)で置換されている変異体であってもよく、そのような置換アミノ酸は遺伝コードによってコードされたものであってもなくてもよい。
保存的置換は、ポリぺプチド内のあるアミノ酸を同じような特性を有する他のアミノ酸で置換するものである。典型的には、保存的置換として見られるのは次の置換である: Ala、Val、Leu、又はIleのような脂肪族アミノ酸を他の脂肪族アミノ酸で置換する; SerをThrで又はその逆に置換する; AspやGluのような酸性残基を他の酸性残基で置換する ; AsnやGlnのようなアミド基をもつ残基をアミド基をもつ他の残基で置換する; LysやArgのような塩基性残基を他の塩基性残基で置換する; Phe、Tyrのような芳香族残基を他の芳香族残基で置換する。
他の変異体は、配列番号2のポリぺプチドのアミノ酸残基の1つ以上が置換基を含んでいるものである。
他の変異体は、更に、ポリぺプチドをポリぺプチドの半減期を増大させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような他の化合物と結合しているものである。
追加の変異体は、追加のアミノ酸がリーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列又はポリぺプチドの精製、強化、又は安定化を促進させる配列のようなポリぺプチドに融合しているものである。ある態様においては、断片、誘導体、又は類似体は、配列番号2のポリぺプチドやそれにほぼ同一の配列のポリぺプチドと同じ生物機能又は活性を維持している。他の態様においては、断片、誘導体、又は類似体にはプロタンパク質が含まれ、断片、誘導体、又は類似体は活性ポリぺプチドを生産するためにプロタンパク質部分を切断することにより活性化することができる。
【０１５５】
ホスト細胞において高レベルのタンパク質発現を達成するためにコドンを最適化する
本発明は、コドン使用を修飾するためにフィターゼをコードしている核酸を修飾する方法を提供する。一態様においては、本発明は、ホスト細胞において発現を増強又は減弱するためにフィターゼをコードしている核酸中のコドンを修飾する方法を提供する。本発明は、また、ホスト細胞において発現を増強するために修飾されたフィターゼをコードしている核酸、そのように修飾されたフィターゼ酵素、修飾されたフィターゼ酵素の製造方法を提供する。本方法は、フィターゼをコードしている核酸中“好ましくない”又は“より好ましくない”コドンを識別するステップと、核酸中の置き換えられたコドンと少なくとも1つの好ましくない又はより好ましくないコドンが同じアミノ酸をコードしている好ましいコドンで置き換えられているように、それらの好ましくない又はより好ましくないコドンの1つ以上を置き換えられたコドンと同じアミノ酸をコードしている“好ましいコドン”で置き換えるステップを含んでいる。好ましいコドンは、ホスト細胞中遺伝子でのコード配列に上に示されたコドンであり、好ましくない又はより好ましくないコドンは、ホスト細胞中遺伝子でのコード配列に下に示されたコドンである。
核酸を発現させるためのホスト細胞、発現カセット、本発明のベクターには、細菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞が含まれる。従って、本発明は、これらの細胞のすべてにおけるコドン使用、コドン改変核酸、コドン改変核酸により作成されたポリぺプチドを最適化する方法を提供する。具体的なホスト細胞には、グラム陰性菌、例えば、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)又はシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens); グラム陽性菌、例えば、ストレプトマイセス・ダイバーサ(Streptomyces diversa)、ラクトバシラス・ガッセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ラクトコッカス・クレモリス(Lactococcus cremoris)、バシラス・サチリスが含まれる。具体的なホスト細胞には、真核生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・パストリス、又はクルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)を含むサッカロミセス種、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)のような種々の酵母、又は哺乳動物細胞又は細胞系又は昆虫細胞又は細胞系が挙げられる。従って、本発明は、これらの生物や種での発現に最適化された核酸やポリぺプチドを提供する。
例えば、細菌細胞から分離されたフィターゼをコードしている核酸のコドンを、フィターゼが由来している細菌と異なる細菌細胞、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞において核酸が最適に発現されるように修飾する。コドンを最適化する方法は、当該技術において周知である。例えば、米国特許第5,795,737号; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253を参照のこと。また、マウス系でのコドンを最適化することが記載されているNarum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253、酵母でのコドンを最適化することが記載されているOutchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24、大腸菌でのコドンを最適化することが記載されているFeng (2000) Biochemistry 39:15399-15409、大腸菌での分泌に影響するコドン使用を最適化することが記載されているHumphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264を参照のこと。
【０１５６】
トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、本発明の核酸、ポリぺプチド、発現カセット又はベクター、又はトランスフェクト細胞又は形質転換細胞Tを含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。トランスジェニック非ヒト動物は、本発明の核酸を含む、例えば、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラット又はマウスであり得る。これらの動物は、例えば、フィターゼ活性を研究する生体内モデルとして、又は生体内フィターゼ活性をスクリーニングするモデルとして用いることができる。トランスジェニック非ヒト動物において発現すべきポリぺプチドのコード配列は、構成的であるように、又は組織特異的、発育特異的又は誘導性転写調節因子の制御下で設計し得る。トランスジェニック非ヒト動物は、当該技術において既知の方法を用いて設計し作成し得る。形質転換細胞又は卵又はトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ又はウシを作成し使用することが記載されている、例えば、米国特許第6,211,428号; 同第6,187,992号; 同第6,156,952号; 同第6,118,044号; 同第6,111,166号; 同第6,107,541号; 同第5,959,171号; 同第5,922,854号; 同第5,892,070号; 同第5,880,327号; 同第5,891,698号; 同第5,639,940号; 同第5,573,933号; 同第5,387,742号; 同第5,087,571号を参照のこと。また、例えば、トランスジェニック酪農動物の乳における組換えタンパク質の生産が記載されているPollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157; トランスジェニックヤギの作製を示しているBaguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461を参照のこと。米国特許第6,211,428号には、DNA配列を含む核酸構築物を脳中で発現させるトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製と使用が記載されている。米国特許第5,387,742号には、クローン化組換え又は合成DNA配列を受精したマウスタマゴへ注入するステップと、注入した卵を偽妊娠雌に移植するステップと、細胞がアルツハイマー病の病状に関連したタンパク質を発現させるトランスジェニックマウスと呼ばれるように発育させるステップとが記載されている。米国特許第6,187,992号には、ゲノムがアミロイド前駆体タンパク質(APP)をコードしている遺伝子の破壊を含んでいるトランスジェニックマウスの作製と使用が記載されている。.
“ノックアウト動物”は、また、本発明の方法を実施するのに使用し得る。例えば、一態様においては、本発明のトランスジェニック又は修飾動物は、フィターゼを発現させない又は発現させることができないように操作された“ノックアウト動物”、例えば、“ノックアウトマウス”を含んでいる。
【０１５７】
スクリーニング方法と“オンライン”モニタリング装置
本発明の方法を実施する際に、種々の装置と方法が本発明のポリぺプチドや核酸とともに、例えば、ポリぺプチドについてフィターゼ活性をスクリーニングするために、本発明のポリぺプチドに結合する抗体に対して活性の潜在的モジュレータ(例えば、酵素活性の増強又は阻害)としての化合物について本発明の核酸に対してハイブリダイズする核酸ををスクリーニングするために等に使用し得る。
【０１５８】
固定化酵素固体支持体
フィターゼ酵素、その断片、酵素と断片をコードしている核酸は、固体支持体に付けることができる。これは、工業的工程でのフィターゼの使用にしばしば経済的であり効率が良い。例えば、個々の化学反応に用いられるフィターゼ酵素(又はその活性断片)の共同体又は反応混液を固体支持体に結合することができ、プロセスバットへ浸漬することができる。酵素反応が起こり得る。次に、固体支持体をそれに付けた酵素とともに反復使用のためにバットから取り出すことができる。本発明の一実施態様においては、固体支持体は、フェル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極及びその組合わせの群より選ばれる。
例えば、本発明に用いられる固体支持体には、ゲルが含まれる。ゲルの一部の例には、セファロース、ゼラチン、グルタルアルデヒド、キトサン処理グルタルアルデヒド、アルブミン-グルタルアルデヒド、キトサン-キサンタン、トヨパールゲル(ポリマーゲル)、アルギン酸塩、アルギン酸-ポリリシン、カラゲーナン、アガロース、グリオキシルアガロース、磁気アガロース、デキストラン-アガロース、ポリ(カルバモイルスルホン酸)ヒドロゲル、BSA-PEGヒドロゲル、リン酸化ポリビニルアルコール(PVA)、モノアミノエチル-N-アミノエチル(MANA)、アミノ、又はその組合わせが挙げられる。
本発明に用いられる他の固体支持体は、樹脂又はポリマーである。樹脂又はポリマーの一部の例には、セルロース、アクリルアミド、ナイロン、レーヨン、ポリエステル、アニオン交換樹脂、AMBERLITEＴＭ XAD-7、AMBERLITEＴＭ XAD-8、MBERLITEＴＭ IRA-94、AMBERLITEＴＭ IRC-50、ポリビニル、ポリアクリル、ポリメタクリレート、又はその組合わせが挙げられる。本発明に用いられる固体支持体の他の種類はセラミックである。一部の例には、非多孔質セラミック、多孔質セラミック、SiO2、Al2O3が挙げられる。本発明に用いられる固体支持体の他の種類はガラスである。一部の例には、非多孔質ガラス、多孔質ガラス、アミノプロピルガラス又はその組合わせが含まれる。使用し得る固体支持体の他の種類は微小電極である。一例はポリエチレンイミン被覆マグネタイトである。固体支持体としてグラファイト粒子を使用し得る。固体支持体の他の例は、細胞、例えば、赤血球である。
【０１５９】
固定化方法
酵素、その断片、又は核酸を固体支持体に固定化するために当業者に既知である多くの方法がある。そのような方法の一部の例には、例えば、静電的小滴生成、電気化学的手段、吸着による、共有結合による、架橋による、化学反応又は工程による、封入による、からみつきによる、アルギン酸カルシウムによる、又はポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)によるが挙げられる。同様の方法がMethods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Part C. 1987. Academic Press. Edit. S. P. Colowick and N. O. Kaplan. Volume 136; Immobilization of Enzymes and Cells.  1997.  Humana Press. Edit. G. F. Bickerstaff.  Series: Methods in Biotechnology, Edit. J. M. Walkerに記載されている。
【０１６０】
毛管アレイ
GIGAMATRIXＴＭ、Diversa Corporation、サンディエゴ、カリフォルニア州のような毛管アレイが本発明の方法に使用し得る。本発明の核酸又はポリぺプチドは、毛管アレイを含むアレイに固定化又は適用し得る。アレイは、本発明の核酸又はポリぺプチドの活性に結合又は活性をモジュレートする能力のために組成物(例えば、小分子、抗体、核酸等)のライブラリーをスクリーニング又はモニタリングするために使用し得る。毛管アレイは、試料を保持しスクリーニングするための他の系を与える。例えば、試料スクリーニング装置には、各毛管が試料を保持するための管腔を画成する少なくとも1つの壁を含んでいる、隣接毛管のアレイに形成された複数の毛管を含めることができる。装置は、更に、アレイ内の隣接毛管間に配置された中間物質と、中間物質の中に形成された1つ以上の参照指示物とを含めることができる。毛管もアレイに結合されるように毛管が適合されている試料をスクリーニングするための毛管は、試料を保持するための管腔を画成する第1壁と、試料を励起するために管腔に供給される励起エネルギーをろ過するためのろ過材料から形成された第2壁を含めることができる。
ポリぺプチド又は核酸、例えば、リガンドは、毛管アレイの毛管の少なくとも一部の中の第1成分へ導入することができる。毛管アレイの各毛管は、第1成分を保持するための管腔を画成する少なくとも1つの壁を含んでもよい。気泡は、第1成分の後に毛管へ導入し得る。第2成分を毛管へ導入することができ、第2成分は気泡によって第1成分から分けられる。対象の試料は、検出可能な粒子で標識した第1液体として毛管アレイの毛管へ導入することができ、毛管アレイの各毛管は第1液体と検出可能な粒子を保持するための管腔を画成する少なくとも1つの壁を含み、少なくとも1つの壁は検出可能な粒子を少なくとも1つの壁に結合するための結合材料で被覆されている。該方法は、更に、毛細管から第1液体を除去するステップであって、結合した検出可能な粒子が毛管内に維持されている前記ステップと、第1液体を毛細管へ導入するステップとを含むことができる。
毛管アレイには、管腔を画成する少なくとも1つの外壁を含む複数の個々の毛管を含めることができる。毛管の外壁は共に融合した1つ以上の壁であり得る。同様に、壁が液体又は試料を保持する管腔を形成する限り円筒形、四角形、六角形又は他の形である管腔を画成し得る。毛管アレイの毛管は、平面構造をつくるように接近して共に保持することができる。毛管は、並べて融合(例えば、毛管がガラスからできている場合)、接着、結合、又はクランプすることにより共に結合することができる。毛管アレイは、多くの個々の毛管、例えば、100〜4,000,000毛管の範囲から形成し得る。毛管アレイは、共に結合した個々の毛管が約100,000以上であるマイクロタイタープレートを形成し得る。
【０１６１】
アレイ、又は“バイオチップ”
本発明の核酸又はポリぺプチドは、アレイに固定化又は適用し得る。アレイは、本発明の核酸又はポリぺプチドの活性に結合又は活性をモジュレートする能力に対する組成物(例えば、小分子、抗体、核酸等)のライブラリーをスクリーニング又はモニタリングするために使用し得る。例えば、本発明の一態様においては、モニタリングされたパラメータは、フィターゼ遺伝子の転写発現である。1つ以上、又はすべての細胞の転写物を、細胞の転写物を含む試料のハイブリダイゼーションにより、又は細胞の転写物の代表的な又は転写物に相補的な核酸をアレイ、又は“バイオチップ”上に固定された核酸に対するハイブリダイゼーションにより測定し得る。マイクロチップ上に核酸の“アレイ”を用いることにより、細胞の転写物の一部又は全部を同時に定量することができる。また、ゲノム核酸を含むアレイも本発明の方法によって作成された新たに操作された菌株の表現型を決定するために使用し得る。“ポリぺプチドアレイ”も複数のタンパク質を同時に定量するために使用し得る。
本発明は、“マイクロアレイ”又は“核酸アレイ”又は“ポリぺプチドアレイ”又は"抗体アレイ"又は“バイオチップ”とも呼ばれる既知の“アレイ”、又はその変形で実施し得る。アレイは、全般的には複数の“スポット”又は“標的要素”であり、各標的要素は試料分子、例えば、mRNA転写物に特異的に結合するための基質表面の画成された領域に固定された１種以上の生物分子、例えば、オリゴヌクレオチドの特定量を含んでいる。
本発明の方法を実施する際に、既知のアレイ及び/又はアレイを作成し使用する方法を全体に又は一部に、又は変更して組込むことができ、例えば、米国特許第6,277,628号; 同第6,277,489号; 同第6,261,776号; 同第6,258,606号; 同第6,054,270号; 同第6,048,695号; 同第6,045,996号; 同第6,022,963号; 同第6,013,440号; 同第5,965,452号; 同第5,959,098号; 同第5,856,174号; 同第5,830,645号; 同第5,770,456号; 同第5,632,957号; 同第5,556,752号; 同第5,143,854号; 同第5,807,522号; 同第5,800,992号; 同第5,744,305号; 同第5,700,637号; 同第5,556,752号; 同第5,434,049号に記載されている; また、例えば、国際出願第WO 99/51773号; 同第99/09217号; 同第97/46313号; 同第96/17958号を参照のこと; また、例えば、Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:25-32を参照のこと。また、公開された米国特許出願第20010018642号; 同第20010019827; 同第20010016322号; 同第20010014449号; 同第20010014448号; 同第20010012537号; 同第20010008765号を参照のこと。
【０１６２】
ポリぺプチドとぺプチド
本発明は、本発明の具体的な配列、配列番号2に対して配列相同性を有する分離した又は組換えポリぺプチドを提供する。上述したように、相同性はポリぺプチドの全長にわたることができ、相同性は少なくとも約50、77、100、150、200、250、300以上の残基の領域にわたることもできる(ポリぺプチドの全長に対して)。本発明のポリぺプチドは、具体的なポリぺプチドの全長より短いこともできる(例えば、配列番号2)。代替的実施態様においては、本発明は、ポリぺプチドのサイズが約5〜全長の範囲にあるポリぺプチド(ぺプチド、断片)、例えば、フィターゼを提供する。具体的なサイズは約5、10、15、20、25、30, 35、40、45、50、55、60、65、70, 75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400以上の残基、例えば、配列番号2の具体的なフィターゼの相接する残基を有する。本発明のぺプチドは、例えば、標識プローブ、抗原、寛容原、モチーフ、フィターゼ活性部位として用いうる。
本発明のポリぺプチドやぺプチドは、天然供給源から分離することができ、合成することもでき、組換え作成したポリぺプチドであることもできる。ぺプチドやタンパク質は、試験管内又は生体内で組換え発現することができる。本発明のぺプチドやポリぺプチドは、当該技術において既知の方法を用いて作成し分離することができる。本発明のポリぺプチドやぺプチドは、当該技術において周知の化学法を用いて全部又は一部合成することができる。例えば、Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., ランカスター、ペンシルバニア州を参照のこと。例えば、ぺプチド合成は、種々の固相技術を用いて行うことができ(例えば、Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13を参照のこと)、自動合成を、例えば、 ABI 431Aペプチドシンセサイザー(Perkin Elmer)を用いて製造業者によって供給された説明書に従って達成することができる。
【０１６３】
本発明のぺプチドやポリぺプチドは、グリコシル化することができる。グリコシル化は、化学的にか又は細胞生合成機序で翻訳後に加えることができ、後者は既知のグリコシル化モチーフの使用を組込んでおり、配列に対して未変性であってもよく、ぺプチドとして付加しても核酸コード配列で付加してもよい。グリコシル化は、O結合又はN結合、又はその組合わせであり得る。
本発明のぺプチドやポリぺプチドには、上で定義したように“ミメティック”形態や“ペプチドミメティック”のすべてが包含される。“ミメティック”や“ペプチドミメティック”という用語は、本発明のポリぺプチドの構造及び/又は機能特性がほぼ同じである合成化学的化合物を意味する。ミメティックは、全体にアミノ酸の合成、非天然類似体から構成されてもよく、アミノ酸の部分的に天然のぺプチドとアミノ酸の部分的に非天然の類似体のキメラ分子でもある。ミメティックは、また、置換がミメティックの構造及び/又は活性を大幅に変えない限り任意量の天然アミノ酸保存的置換を組込むことができる。保存的変異体である本発明のポリぺプチドのように、通常の実験により、ミメティックが本発明の範囲内であるか、即ち、その構造及び/又は機能がほとんど変化していないことが求められる。従って、一態様においては、ミメティック組成物は、フィターゼ活性があれば本発明の範囲内である。
【０１６４】
本発明のポリぺプチドミメティック組成物は、非天然構造成分の組合わせを含むことができる。代替的態様においては、本発明のミメティック組成物には、次の3種の構造グループの1つ又は全部: a)天然アミド結合(“ぺプチド結合”)結合以外の結合グループ残基; b)天然に存在するアミノ酸残基の代りに非天然残基; 又はc)二次構造ミミクリーを誘導する、即ち、二次構造、例えば、βターン、γターン、βシート、αヘリックスコンホメーション等を誘導又は安定化する残基が含まれる。例えば、本発明のポリぺプチドは、残基の全部又は一部が天然ぺプチド結合以外の化学的手段によって結合する場合にミメティックとして確認し得る。個々のペプチドミメティック残基は、ぺプチド結合、他の化学結合又はカップリング手段、例えば、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスルシンイミドエステル、二官能性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)又はN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)によって結合することができる。伝統的アミド結合(“ぺプチド結合”)結合に代替し得る結合基には、例えば、ケトメチレン(例えば、-C(=O)-NH-を-C(=O)-CH2-に)、アミノメチレン(CH2-NH)、エチレン、オレフィン(CH=CH)、エーテル(CH2-O)、チオエーテル(CH2-S)、テトラゾール(CN4-)、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、又はエステルが含まれる(例えば、Spatola (1983), Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, “Peptide Backbone Modifications,” Marcell Dekker, NYを参照のこと).
【０１６５】
本発明のポリぺプチドは、また、天然に存在するアミノ酸残基の代りに全部又は一部の非天然残基を含むことにより確認し得る。非天然残基は、科学文献や特許文献に十分に記載されている。天然アミノ酸のミメティクスとして用いられるいくつかの具体的な非天然組成物と指針を次に記載する。芳香族アミノ酸のミメティクスは、例えば、D-又はL-ナフチルアラニン; D-又はL-フェニルグリシン; D-又はL-2チエネイルアラニン; D-又はL-1, -2, 3-又は4-ピレネイルアラニン; D-又はL-3チエネイルアラニン; D-又はL-(2-ピリジニル)アラニン; D-又はL-(3-ピリジニル)アラニン; D-又はL-(2-ピラジニル)アラニン; D-又はL-(4-イソプロピル)フェニルグリシン; D-(トリフルオロメチル)フェニルグリシン;  D-(トリフルオロメチル)フェニルアラニン; D-p-フルオロフェニルアラニン; D-又はL-p-ビフェニルフェニルアラニン; K-又はL-p-メトキシビフェニルフェニルアラニン; D-又はL-2-インドール(アルキル)アラニン; 又はD-又はL-アルキルアミンで置き換えることにより作成することができ、ここで、アルキルは置換又は無置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、sec-イソチル、iso-ペンチル、又は非酸性アミノ酸であり得る。非天然アミノ酸の芳香環には、例えば、チアゾイル、チオフェニル、ピラゾイル、ベンズイミダゾイル、ナフチル、フラニル、ピロリル、又はピリジル芳香環が含まれる。
【０１６６】
酸性アミノ酸のミメティクスは、例えば、負電荷を維持しつつ非カルボキシレートアミノ酸; (ホスホノ)アラニン; 硫酸化トレオニンで置換することにより作成することができる。カルボキシル側鎖基(例えば、アスパルチル又はグルタミル)は、また、カルボジイミド(R'-N-C-N-R')、例えば、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミド又は1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドと反応させることにより選択的に修飾することができる。アスパルチル又はグルタミルは、また、アンモニウムイオンと反応させることによりアスパラギニル残基やグルタミニル残基に変換し得る。塩基性アミノ酸のミメティクスは、例えば、(リシンとアルギニンのほかに)アミノ酸のオルニチン、シトルリン、又は(グアニジノ)酢酸、又は(グアニジノ)アルキル酢酸で置換することにより作成することができ、ここで、アルキルは上で定義されている。ニトリル誘導体(例えば、COOHの代りにCN部分を含む)はアスパラギン又はグルタミンを置換することができる。アスパラギニル残基やグルタミニル残基は、対応するアスパルチル残基又はグルタミル残基に脱アミノ化し得る。アルギニン残基ミメティクスは、アルギニルと、例えば、1つ以上の慣用の試薬、例えば、フェニルグリオキサル、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、又はニンヒドリン等と、好ましくはアルカリ性条件下で反応させることにより作成し得る。チロシン残基ミメティクスは、チロシルと、例えば、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとを反応させることにより作成し得る。N-アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンは、それぞれO-アセチルチロシル化合物と3-ニトロ誘導体を形成するために使用し得る。システイン残基ミメティクスは、システイニル残基と、例えば、2-クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなα-ハロアセテート又は対応するアミンと反応させてカルボキシメチル誘導体又はカルボキシアミドメチル誘導体を得ることにより作成し得る。システイン残基ミメティクスは、また、システイニル残基と、例えば、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミダゾイル)プロピオン酸; クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルファイド; メチル2-ピリジルスルファイド; p-クロロマーキュリベンゾエート; 2-クロロマーキュリ-4-ノトロフェノール; 又はクロロ-7-ニトロベンゾオキサ-1,3-ジアゾールとを反応させることにより作成し得る。リシンミメティクスは、リシニルと、例えば、コハク酸又は他のカルボン酸無水物とを反応させることにより作成し得る(また、末端残基を変えることができる)。リシンと他のα-アミノ含有残基ミメティクスは、また、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、ピリドキサルホスフェート、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4-ペンタンジオンとの反応、又はグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応により作成し得る。メチオニンのミメティクスは、例えば、メチオニンスルホキシドとの反応により作成し得る。プロリンのミメティクスには、例えば、ピペコール酸、チアゾリジンカルボン酸、3-又は4-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-又は4-メチル��ロリン、又は3,3-ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基ミメティクスは、ヒスチジルと、例えば、ジメチルプロカーボネート又はp-ブロモフェナシルブロミドとを反応させることにより作成し得る。他のミメティクスには、例えば、プロリンとリシンのヒドロキシル化; セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化; リシン、アルギニン又はヒスチジンのα-アミノ基のメチル化; N末端アミンのアセチル化; 主鎖アミド残基のメチル化又はN-メチルアミノ酸での置換; 又はC末端カルボキシル基のアミノ化により作成されたものが含まれる。
【０１６７】
本発明のポリぺプチドの残基、例えば、アミノ酸は、また、反対のキラリティのアミノ酸(又はぺプチドミメティック残基)で置き換えることができる。従って、L配置で天然に存在するアミノ酸(化学物質の構造によってはR又はSとも呼ばれ得る)は、同じ化学構造型又はぺプチドミメティックの、反対のキラリティのアミノ酸、D-アミノ酸と呼ばれるが R-又はS-形とも呼ばれ得るアミノ酸で置き換えることができる。
本発明は、また、転写後プロセシング(例えば、リン酸化、アシル化等)のような天然の過程か又は化学修飾法により本発明のポリぺプチドを修飾する方法と、得られた修飾ポリぺプチドを提供する。修飾は、ぺプチド主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ又はカルボキシル末端を含むどこにでも起こり得る。同じタイプの修飾が一定のポリぺプチドのいくつかの部位で同じ程度又は種々の程度に存在してもよいことは理解される。また、一定のポリぺプチドは多くのタイプの修飾をもつことができる。修飾には、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミノ化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ぺギル化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、硫酸化、アミノ酸のタンパク質への転移RNA仲介付加、例えば、アルギニル化が含まれる。例えば、Creighton, T.E., Proteins  Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)を参照のこと。
【０１６８】
固相化学ぺプチド合成法は、また、本発明のポリぺプチド又は断片を合成するために使用し得る。そのような方法は、1960年代初期まで当該技術において既知であり(Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963) (Stewart, J. M. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12も参照のこと))、最近では市販の実験用ぺプチド設計と合成キットが用いられている(Cambridge Research Biochemicals)。そのような市販の実験用キットは、一般的には、H. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984)の教示が使われ、すべて単一プレートに接続された多くの“ロッド”又は“ピン”の先端でぺプチドが合成される。そのようなシステムを用いる場合、ロッド又はピンのプレートを逆さにし、ピンの先端又はロッドの先端へ適切なアミノ酸を結合又は固定するための溶液を含む、対応するウェル又はレザバーの第2プレートへ挿入する。そのような工程ステップを繰り返すことにより、即ち、ロッドの先端とピンの先端を逆さにし、適切な溶液へ挿入することにより、アミノ酸は所望のぺプチドに作られる。更に、多くの有効なFMOCぺプチド合成システムが利用可能である。例えば、ポリぺプチド又は断片のアセンブリは Applied Biosystems, Inc. Model 431AＴＭ 自動ぺプチドシンセサイザーを用いて固体支持体上で行うことができる。そのような装置は、直接合成か又は既知の手法を用いて結合し得る一連の断片の合成により、本発明のぺプチドへ容易に到達する。
本発明の他の態様は、配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片のポリぺプチドの1つに対する相同性が少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は約95%を超えるポリぺプチド又はその断片である。相同性は、比較されるポリぺプチド又は断片を整列する上記プログラムのいずれを用いても求めることができ、アミノ酸同一性又は類似性の程度を決定する。アミノ酸“相同性”には上記のような保存的アミノ酸置換が含まれることは理解される。
【０１６９】
配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片のポリぺプチドの1つに対する相同性を有するポリぺプチド又は断片は、上記手法を用いてコードしている核酸を分離することにより得ることができる。
また、相同ポリぺプチド又は断片は、生化学的強化法又は精製法により得ることができる。潜在的に相同のポリぺプチド又は断片の配列は、タンパク質分解消化、ゲル電気泳動及び/又はマイクロシークエンシングにより求めることができる。予想される相同ポリぺプチド又は断片の配列は、本明細書に記載されるプログラムのいずれを用いても配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸のポリぺプチドの1つと比較することができる。
本発明の他の態様は、配列番号2やそれにほぼ同一の配列のポリぺプチドの酵素機能を保持する、配列番号2、又はそれにほぼ同一の配列の断片又は変異体を同定する分析である。例えば、ポリぺプチドの断片又は変異体は、前記断片又は変異体が配列番号2のポリぺプチドの酵素活性を保持することを意味する、生化学的反応を触媒するために用いることができる。
変異体の断片が配列番号2、それにほぼ同一の配列のポリぺプチドの酵素活性を保持するかを求めるために分析には、ポリぺプチド断片又は変異体と基質分子とをポリぺプチド断片又は変異体が機能することができる条件下で接触させるステップと、基質レベルの低下か又はポリぺプチドと基質間の反応の個々の反応産物レベルの増加を検出するステップとが含まれる。
配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片は、種々の適用に用いることができる。例えば、そのポリぺプチド又は断片は、生化学的反応を触媒するために用いることができる。本発明の一態様によれば、ハロアルカンを加水分解するために配列番号2やそれにほぼ同一の配列のポリぺプチド、又はそのようなポリぺプチドをコードしているポリヌクレオチドを用いる方法が提供される。そのような方法においては、ハロアルカン化合物を含む物質と配列番号2、それにほぼ同一の配列のポリぺプチドの1つとを化合物の加水分解を促進させる条件下で接触させる。
【０１７０】
抗体と抗体に基づくスクリーニング法
本発明は、本発明のフィターゼに特異的に結合する分離した又は組換え抗体を提供する。これらの抗体は、本発明のフィターゼ又は関連したポリぺプチドを分離、同定又は定量するために使用し得る。これらの抗体は、本発明の酵素の活性を阻害するために使用し得る。これらの抗体は、本発明に関連した分離したポリぺプチド、例えば、関連したフィターゼ酵素に用いることができる。
これらの抗体は、免疫沈降、染色(例えば、FACS)、イムノアフィニティーカラム等に使用し得る。所望される場合には、特異抗原に対してコードしている核酸配列は、免疫化に続いてポリぺプチド又は核酸の分離、増幅又はクローニング、ポリぺプチドの本発明のアレイへの固定化により作成することができる。また、本発明の方法は、修飾すべき細胞によって産生された抗体の構造を修飾するために使用し得る。例えば、抗体の親和性を増大又は低下させることができる。更に、抗体を生産又は修飾する能力は、本発明の方法によって細胞へ操作した表現型であり得る。
抗体を生産し分離する免疫化の方法(ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体)は当業者に既知であり、科学文献や特許文献に記載されている。例えば、Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA (“Stites”); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照のこと。抗体は、また、例えば、動物を用いた伝統的な生体内方法のほかに、ファージディスプレイライブラリーを発現する組換え抗体結合部位を用いて試験管内で生産することができる。例えば、Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45を参照のこと。
【０１７１】
ポリぺプチドは、本発明のポリぺプチドに特異的に結合する抗体を生産するために使用し得る。得られた抗体は、ポリぺプチドを分離又は精製するために又はポリぺプチドが生物試料中に存在するかを求めるためにイムノアフィニティクロマトグラフィー法で用いることができる。そのような手順においては、抽出物のようなタンパク質標品、又は生物試料と本発明のポリぺプチドの1つに特異的に結合することができる抗体と接触させる。
イムノアフィニティ法においては、抗体をビーズ又は他のカラムマトリックスのような固体支持体に結合する。タンパク質標品は、抗体が本発明のポリぺプチドの1つに特異的に結合する条件下で抗体と接触した状態に置く。非特異的結合タンパク質を除去するために洗浄した後、特異的に結合したポリぺプチドを溶離する。
抗体に結合するための生物試料中のタンパク質の能力は、当業者によく知られた種々の手順のいずれを用いても求めることができる。例えば、抗体を蛍光物質、酵素標識、又は放射性同位体のような検出可能な標識で標識することにより結合を決定することができる。また、試料に対する抗体の結合は、そのような検出可能な標識を有する二次抗体を用いて検出することができる。具体的な分析には、ELISA分析、サンドイッチ分析、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットが含まれる。
本発明のポリぺプチドに対して産生されたポリクローナル抗体は、ポリぺプチドを動物に直接注入することにより又はポリぺプチドを動物、例えば、非ヒトに投与することにより得ることができる。そのように得られた抗体は、次にポリぺプチドを結合する。この方法では、ポリぺプチドの断片のみをコードしている配列さえ未変性全ポリぺプチドに結合することができる抗体を生産するために使用し得る。そのような抗体は、次にそのポリぺプチドを発現させる細胞からポリぺプチドを分離するために使用し得る。
【０１７２】
モノクローナル抗体の製造のためには、細胞系の連続培養によって抗体を作製するいずれの技術を用いてもよい。例としてはハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、EBV-ハイブリドーマ技術(例えば、Cole(1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp77-96を参照のこと)が挙げられる。
一本鎖抗体の製造に関して記載されている技術(例えば、米国特許第4,946,778号を参照のこと)は、本発明のポリぺプチドに対する一本鎖抗体を作製するために適合させることができる。また、トランスジェニックマウスを用いてこれらのポリぺプチド又は断片に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
本発明のポリぺプチドに対して生産された抗体は、他の生物と試料から同様のポリぺプチドをスクリーニングするのに用いることができる。そのような手法では、生物由来のポリぺプチドと抗体とを接触させ、抗体を特異的に結合するポリぺプチドを検出する。上記手順のいずれもが抗体結合を検出するために用いることができる。
【０１７３】
キット
本発明は、組成物、例えば、核酸、発現カセット、ベクター、細胞、本発明のポリぺプチド(例えば、フィターゼ)及び/又は抗体を含むキットを提供する。キットは、また、本明細書に記載されたように本発明の方法と工業的使用を教示する説明資料を含むことができる。
配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片のポリぺプチドは、また、酵素ポリぺプチド又は断片に特異的に結合する抗体を生産するために用いることができる。得られた抗体は、ポリぺプチドを分離又は精製するために又はポリぺプチドが生物試料中に存在するかを求めるためにイムノアフィニティクロマトグラフィー法で用いることができる。そのような方法では、抽出物のようなタンパク質標品、又は生物試料と配列番号２、それにほぼ同一の配列、又は前述の配列の断片のポリぺプチドの1つに特異的に結合することができる抗体と接触させる。
イムノアフィニティ法においては、抗体をビーズ又は他のカラムマトリックスのような固体支持体に結合する。タンパク質標品は、抗体が本発明のポリぺプチドの1つに特異的に結合する条件下で抗体と接触した状態に置く。非特異的結合タンパク質を除去するために洗浄した後、特異的に結合したポリぺプチドを溶離する。
抗体に結合するための生物試料中のタンパク質の能力は、当業者によく知られた種々の手順のいずれを用いても求めることができる。例えば、抗体を蛍光物質、酵素標識、又は放射性同位体のような検出可能な標識で標識することにより結合を決定することができる。また、試料に対する抗体の結合は、そのような検出可能な標識を有する二次抗体を用いて検出することができる。具体的な分析には、ELISA分析、サンドイッチ分析、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロットが含まれる。
【０１７４】
配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片のポリぺプチドに対して産生されたポリクローナル抗体は、ポリぺプチドを動物に直接注入することにより又はポリぺプチドを動物、例えば、非ヒトに投与することにより得ることができる。そのように得られた抗体は、次にポリぺプチド自体を結合する。この方法では、ポリぺプチドの断片のみをコードしている配列さえ未変性全ポリぺプチドに結合することができる抗体を生産するために使用し得る。そのような抗体は、次にそのポリぺプチドを発現させる細胞からポリぺプチドを分離するために使用し得る。
モノクローナル抗体の製造のためには、細胞系の連続培養によって抗体を作製するいずれの技術を用いてもよい。例としてはハイブリドーマ技術(Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983)、EBV-ハイブリドーマ技術(Cole(1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp77-96)が挙げられる。
一本鎖抗体の製造に関して記載されている技術(米国特許第4,946,778号)は、例えば、配列番号2、又はその断片のポリぺプチドに対する一本鎖抗体を作製するために適合させることができる。また、トランスジェニックマウスを用いてこれらのポリぺプチド又は断片に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含む断片のポリぺプチドに対して産生されたポリクローナル抗体は、ポリぺプチドのポリぺプチドに対して生産された抗体は、他の生物と試料から同様のポリぺプチドをスクリーニングするのに用いることができる。そのような手法では、生物由来のポリぺプチドと抗体とを接触させ、抗体を特異的に結合するポリぺプチドを検出する。上記手順のいずれもが抗体結合を検出するために用いることができる。そのような一スクリーニング分析は、“Methods for Measuring Cellulase Activities”, Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116に記載されている。
【０１７５】
本明細書に用いられる、“配列番号1に示された核酸配列” は、配列番号1に示された核酸配列、それにほぼ同一の配列、前述の配列の1つ以上のだ、配列番号1に対して相同な、又は配列番号1の断片に対して相同なヌクレオチド配列、又は前の配列のすべてに相補的な配列を包含する。断片には、配列番号1、又はそれにほぼ同一の配列の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500の連続したヌクレオチドを含む配列番号1の部分が含まれる。配列番号1、又はそれにほぼ同一の配列の相同配列や断片は、これらの配列に対する相同性が少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%又は70%である配列を意味する。相同性は、デフォルトパラメータによるFASTAバージョン3.0t78を含む本明細書に記載されるコンピュータプログラムとパラメータのいずれを用いても求めることができる。相同配列には、また、配列番号1に示される核酸配列中のチミンがウリジンに置き換わっているRNA配列が含まれる。相同配列は、本明細書に記載される手順のいずれを用いても得ることができ、シークエンシングエラーの訂正から得られてもよい。本発明の核酸配列が伝統的なシングルキャラクタフォーマット(Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd edition. W. H Freeman and Co., New Yorkの内側のバックカバーを参照のこと)又は配列でのヌクレオチドの同定を記録する他のフォーマットで示され得ることは理解される。
【０１７６】
本明細書で用いられる“配列番号2に示されるポリぺプチド配列”という用語は、配列番号1に示される配列によってコードされている、配列番号2、それにほぼ同一の配列に示されるポリぺプチド配列、配列番号2、それにほぼ同一の配列、又は前の配列のいずれもの配列に相同のポリぺプチド配列を包含している。相同ポリぺプチド配列は、本明細書のポリぺプチドの1つに対する相同性が少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%又は70%であるポリぺプチド配列を意味する。相同性は、デフォルトパラメータ又は修飾パラメータによるFASTAバージョン3.0t78を含む、本明細書に記載されるコンピュータプログラムとパラメータのいずれを用いても求めることができる。相同配列は、本明細書に記載される方法のいずれを用いても得ることができ、シークエンシングエラーの訂正からも得ることができる。ポリぺプチド断片は、配列番号2、又はそれにほぼ同一の配列のポリぺプチドの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、又は150の連続したアミノ酸を含んでいる。本発明のポリぺプチドが3文字フォーマットの伝統的なシングルキャラクタフォーマット(Starrier, Lubert. Biochemistry, 3rd edition. W. H Freeman and Co., New Yorkの内側のバックカバーを参照のこと)又は配列でのポリぺプチドの同定に関する他のフォーマットで示され得ることは理解される。
上記プログラムを用いて検出することができるモチーフには、ロイシンジッパー、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、αらせん、又はβシートをコードしている配列、コードされたタンパク質の分泌を特定するシグナルぺプチドをコードしているシグナル配列、ホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位、又は酵素切断部位のような転写調節に関係する配列が含まれる。
【０１７７】
分離したポリヌクレオチド配列、ポリぺプチド配列、その変異体や突然変異体は、例えば、酵素のフィターゼ活性を検出するための分析において、本発明の酵素に特徴のある生物活性の保持を測定することができる(Food Chemicals Codex, 4th Ed.)。そのような酵素には、フィターゼの切断型形態、又は配列番号2に示されるポリぺプチド配列の欠失や挿入変異体のような変異体が含まれる。これらのフィターゼは、耐熱性である。即ち、フィターゼの残存比活性は70℃で30分間処理した後に約90% 、75℃で30分間処理した後に約50% である。本発明のフィターゼの耐熱性は、飼料が高温で成形、粒状化、又はペレット化し得るので飼料添加剤として酵素を用いるのに有利である。
例えば、一態様においては、本発明は、ペレット化可食用酵素送達マトリックスとフィターゼを動物に、例えば、栄養補給として送達するための使用方法を提供する。酵素送達マトリックスは、フィターゼ酵素、例えば、配列番号2のアミノ酸配列又はその少なくとも30の相接するアミノ酸を有するものを水性媒体、例えば、動物の消化液中で遊離しやすい。本発明の酵素送達マトリックスは、含有する組換え酵素を水性媒体へ分散しやすい、油かすである穀物の胚芽、干し草、アルファルファ、チモシー、大豆の外皮、ヒマワリ種子かす、ホイートミール等の成分から選択された粒状可食用担体から調製される。使用中、ペレット化可食用酵素活性マトリックスは、フィターゼを動物に送達するために動物に投与される。適切な穀物に基づく基質は、小麦、トウモロコシ、ダイズ、モロコシ、アルファルファ、大麦等の適切な可食用穀物を含んでもよく誘導されてもよい。具体的な穀物に基づく基質はトウモロコシに基づく基質である。基質は、湿式又は乾式ミリングプロセスで得られたトウモロコシ胚芽のような動物飼料用に承認された、穀物の適切な部分、例えば、穀物の胚芽から誘導することができる。穀物の胚芽は、例えば、加圧又はヘキサン又は他の溶媒抽出により油が放出された穀物の胚芽である油かすを含んでもよい。また、穀物の胚芽は、抽出した、即ち、加圧により油が除去された搾りかすである。
【０１７８】
本発明の酵素送達マトリックスは、分離している複数の粒子、ペレット又は顆粒の形にある。"顆粒"とは、マトリックスから水を除去するために、例えば、ペレット化、押出し、又は同様の圧縮により圧搾又は圧縮した粒子を意味する。そのような粒子の圧搾又は圧縮は、粒子の粒子内凝集を促進させる。例えば、顆粒はペレットミルで穀物に基づく基質をペレット化することにより調製することができる。それにより調製されたペレットは、動物飼料中の補助剤としての使用に適した顆粒サイズまで粉砕又は崩壊する。マトリックスは動物飼料に用いるそれ自体承認されているので、動物飼料中の酵素の送達に希釈剤として使用し得る。
酵素送達マトリックスは、顆粒サイズが約4〜約400メッシュ(USS); 又は約8〜約80メッシュ; 又は約14〜約20メッシュの範囲にある顆粒の形であり得る。穀物の胚芽が溶媒抽出による油かすである場合には、コーン油のような潤滑剤の使用がペレタイザーに必要であってもよいが、胚芽が抽出された搾りかすである場合にはそのような潤滑剤は通常必要でない。本発明の他の態様においては、マトリックスは、例えば、ダイを通って穀物に基づく基質を押出すとともに適切な顆粒サイズまで押出し量を粉砕することにより他の圧縮又は圧搾工程によって調製される。
酵素送達マトリックスは、更に、マトリックス顆粒の凝集を高めるために凝集剤としてポリサッカリド成分を含んでもよい。凝集剤は、マトリックス顆粒内に穀物タンパク質間の結合を高めるヒドロキシル基を追加すると考えられる。更に、タンパク質のデンプンや他のタンパク質への水素結合を高めることにより追加のヒドロキシル基がそのように機能すると考えられる。凝集剤は、酵素送達マトリックスの顆粒の凝集を高めるのに適した量で存在することができる。適切な凝集剤には、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン、例えば、コーンスターチ、フラワー、セルロース、ヘミセルロース等の1種以上が含まれる。例えば、マトリックス(酵素を含まない)中の穀物の胚芽と凝集剤の割合は78% のコーン胚芽ミールと20重量% のコーンスターチである。
【０１７９】
本発明の酵素放出マトリックスは生分解性材料から作られていることから、マトリックスはカビなどにより損傷を受けることがある。そのようなカビを予防又は防止するためにマトリックスは酵素放出マトリックスのカビを阻止するのに十分な量で存在することができるプロピオン酸塩のようなカビ防止剤を含めることができるので、冷凍を必要としない安定な配合物中の送達マトリックスが得られる。
本発明の酵素送達マトリックス中に含まれるフィターゼ酵素と方法は、一態様においては、本明細書に記載されるように耐熱性フィターゼであり、高温及び/又は高温の蒸気がペレット化酵素送達マトリックスを調製するために使うことができる製造でフィターゼの不活性化に抵抗する。本発明の酵素送達マトリックスを含む飼料の消化で、消化水溶液が活性酵素の放出を引き起こす。他のタイプの耐熱性酵素と耐熱性である栄養補給は、いずれのタイプの水性条件下でも放出用送達マトリックスに組込むことができる。
動物飼料にフレーバー又は栄養補給を添加するために、胃の条件で動物飼料補給と酵素の放出を送らせるためになど多くの異なった用途に本発明の酵素マトリックス粒子にコーティングを施すことができる。或いは、例えば、マトリックス粒子から酵素の放出を遅らせるか酵素が放出される条件を制御するかが望ましい機能上の目標を達成するためにコーティングが施されてもよい。コーティング材料の組成物は、感受性のある因子(例えば、熱、酸又は塩基、酵素又は他の化学薬品)によって選択的に分解されるようなものであり得る。また、そのような異なる分解因子に感受性のある2つ以上のコーティングがマトリックス粒子に引き続き施されてもよい。
【０１８０】
本発明は、また、酵素放出マトリックスを調製する方法に関する。本発明によれば、本方法は、粒子が配列番号2又はその少なくとも30の連続したアミノ酸によってコードされたフィターゼ酵素を含む、酵素放出マトリックスとして用いられるのに適した粒径で穀物に基づく基質の複数の分離している粒子を供給するステップを含んでいる。本方法には、ペレット化によって達成し得る、酵素放出マトリックス粒子を顆粒に圧縮又は圧搾するステップが含まれ得る。カビ防止剤と凝集剤が用いられる場合には、適切な時に添加することができ、穀物に基づく基質のペレット化の前に穀物に基づく基質と所望の割合で混合することができる。ペレットミル飼料中の水分は、完成製品中の水分について上で示した範囲にあってもよく、好ましくは14-15% である。酵素の水性標品の形の供給原料に水分を添加して供給原料をこの水分にすることができる。ペレットミルの温度は、蒸気により約82℃にすることができる。ペレットミルは、ペレットを得るために供給原料に十分な動作を与える条件下で作動させることができる。ペレット成形工程自体は、酵素含有組成物から水を除去するためのコスト有効方法である。一態様においては、ペレットミルは0.3cm×5cm(1/8 in.×2 in.)のダイにより45kg/min(100 lb./min.)の圧力で82℃において作動させてペレットを得、次にペレットミルクランブラで粉砕して粒径が8メッシュのスクリーンを通過することができるが20メッシュスクリーン上に保持される複数の分離している粒子を得る。
【０１８１】
本明細書に記載される耐熱性フィターゼは、最適温度が高いものであり、耐熱性又は熱許容性が高いものである。従って、本発明のフィターゼは、上記最適と通常考えられる温度で酵素反応を行うことができる。本発明のフィターゼは、また、高温にさらされた後に酵素反応を行うこともできる(耐熱性は、高温が酵素の活性を不活性化又は低下させ得るとしても、予め高温にさらされた後に野生型フィターゼが活性である温度で酵素活性を保持する能力であり、上記耐熱性の定義を参照のこと)。本発明のフィターゼをコードしている遺伝子(例えば、配列番号1に示される)は、配列番号2のフィターゼと異なる特徴をもつフィターゼ(至適pH、最適温度、耐熱性、溶媒安定性、比活性、基質に対する安定性、分泌能、翻訳率、転写制御等の点で)の調製(例えば、本明細書に記載されるGSSMを用いた)に使用し得る。更に、熱安定性又は耐熱性の改善又は修飾のような所望の活性を有するものを求めるために本明細書に記載される方法によって調製される変異体フィターゼのスクリーニングに配列番号1のポリヌクレオチドを用いることができる。例えば、米国特許第5,830,732号には、フィターゼの耐熱性を求めるスクリーニング分析が記載されている。
そのようなスクリーニング分析の一試験管内例は、下記のフィターゼ活性を検出するための分析である。150μlの酵素標品を600μlの2 mMフィチン酸ナトリウムと1 mM CaCl2で補足した100 mMトリスHClバッファー、pH 7.5中でインキュベートすることによりフィターゼ活性を測定することができる。インキュベートした後、750μlの5% トリフルオロ酢酸を添加することにより反応を停止させる。1500μlの呈色試薬(4容量の1.5% モリブデン酸アンモニウム/5.5% 硫酸と1容量の2.7% 硫酸第一鉄; Shimizu, 1992)を添加した後、標準リン酸に対して遊離したリン酸を分光光度法で700nmにおいて測定した。1単位の酵素活性は、分析条件下で1マイクロモルのPi/minを遊離するのに要する酵素量として定義される。比活性は、酵素活性単位/mgタンパク質で表すことができる。本発明の酵素は、フィチン酸のイノシトールと遊離リン酸への加水分解に関する酵素活性を有する。
【０１８２】
一態様では、本発明はフィチン酸と本明細書で開示される1以上の新規なフィターゼ分子(配列番号2)を接触させることからなるフィチン酸の加水分解法を提供する。従って、本発明は、フィチン酸複合体からのミネラルの遊離を伴う、フィチン酸のイノシトール及び遊離リン酸への加水分解を触媒する方法を提供する。この方法は、フィチン酸基質を、配列番号2で示される酵素のような本発明の酵素の分解有効量と接触させることを含む。“分解有効量”とは、酵素と接触していないフィチン酸と比べた場合に少なくとも50%のフィチン酸を分解するのに必要とされる酵素量をさす。少なくとも80%のフィチン酸が分解されるのが好ましい。
もう1つの態様では、本発明はフィチン酸のホスホ-モノエステル結合を加水分解する方法を提供する。この方法は、有効量の本発明のフィターゼ分子(例えば配列番号２)を投与してイノシトールと遊離リン酸を得ることを含む。“有効”量とは、酵素と接触していないフィチン酸と比べた場合に少なくとも50%のホスホ-モノエステル結合を加水分解するのに必要とされる酵素量をさす。少なくとも80%の結合が加水分解されるのが好ましい。
特定の態様では、所望により、フィチン酸分子内で、及び／又は基質源の他の分子内での化学変化(例えば加水分解)を起こすために、このフィターゼ分子を他の触媒などの他の試薬と併用してもよい。この態様によれば、好ましくはフィターゼ分子及び更なる試薬は互いに阻害しない。フィターゼ分子と更なる試薬は全体として付加作用を有してもよく、或いはフィターゼ分子と更なる試薬は全体として相乗作用を有してもよい。
基質フィチン酸分子の適切な供給源としては、食物、潜在的食物、食物の副産物(試験管内副産物と生体内副産物の両方、例えば生体外反応産物及び動物排泄物)、食物前駆体及び他のいずれかのフィチン酸の原料が挙げられる。
限定されるものではないが、一態様では、この組換えフィターゼは生物により消費でき、かつ、消費の際にも活性を保持する。別の例では、トランスジェニックアプローチを用いて、例えば、制御された様式で、組換えフィターゼの発現を達成することができる(これらの方法は時間特異的かつ組織特異的にトランスジェニック分子の発現を制御するために利用できる)。
【０１８３】
一態様では、供給材料(例えばトランスジェニック植物源又は組換え原核生物ホスト)のフィターゼ活性は消費の際に上昇しうるが、この活性の上昇は、例えばプロフォームの前駆体フィターゼ分子がより成熟した形態の顕著に高い活性の酵素に変換する際に起こり、この変換はフィターゼ源の摂取及び消化によるものであると考えられる。フィチン酸基質の加水分解はフィターゼをフィチン酸と接触させた際にはいつも起こり、例えばこれは基質又は酵素のいずれか或いは両者の摂取前又は摂取後、或いは摂取の前後の双方に起こり得る。更に、フィチン酸基質は、フィターゼのほかに、その供給材料から直接、又は精製後に適用することができる、他の酵素のような1以上の更なる試薬と接触させてもよいと考えられる。
フィターゼ供給材料はフィチン酸供給材料と、例えば試験管内又は生体内においてフィターゼ源及びフィチン酸源の一方又は双方を粉砕又は破壊した後で、直接接触させることができる。また、フィターゼ酵素とフィチン酸基質を接触させる前に、フィターゼ酵素を供給材料から精製してもよいし、或いはフィチン酸基質を供給材料から精製してもよいし、或いはフィターゼ酵素とフィチン酸の両者を供給材料から精製してもよい。酵素又は基質或いはその両者を含む精製及び非精製試薬の組合せが使用できると考えられる。
フィターゼ活性の供給源としては２以上の供給材料が使用できると考えられる。これは供給材料からの試薬の一定時間後の放出を達成する1つの方法として使用可能であり、例えば摂取された供給材料が生体内で消化された場合、又は供給材料が試験管内適用で処理された場合に、それらの供給材料に由来する異なる試薬からの放出が異なる時間に生じる。フィターゼ活性の１を超える供給材料の使用はまた、例えば、ある応用例の異なる処理ステップの際に直面するある範囲の条件-ある範囲のpH値、温度、塩濃度及び時間間隔など-及びその変動の下でフィターゼ活性を得るのに便利である。また、種々の供給材料の使用は、フィターゼ及び／又はフィチン酸及び／又はその他の材料の1以上の形態又は異性体により例示されるような、種々の試薬を得るのに便利である。
【０１８４】
単一の供給材料であるトランスジェニック植物種(又はその植物部分)はフィターゼ及びフィチン酸双方の供給材料となり、酵素及び基質は該単一供給源の中で異なって区画化され得ることは理解される。例えば、それらは分泌されるのに対して分泌されないか、異なって発現されるか、且つ／又は、異なる植物部分又は器官又は組織における、或いは同じ植物部分又は器官又は組織内の細胞下コンパートメントにおける存在量が異なる。そこに含まれるフィターゼ分子の精製は1以上の望ましい植物部分又は器官又は組織又は細胞下コンパートメントの単離及び／又は更なる処理を含んでもよい。
特定の態様では、本発明は増大した量の酵素を含有する種子を用いて生体内及び／又は試験管内反応を触媒する方法を提供する。この方法はトランスジェニック非野生型種子を好ましくは粉砕した状態で反応混合物へ加え、種子中の酵素が反応速度を高めることができるようにすることを含んでなる。この種子を反応混合物に直接加えることで、この方法は費用がかかり煩雑な酵素の抽出及び精製を解消するものである。処理方法も提供され、それによれば酵素の十分な供給を欠いた生物に、増大した量の酵素を含む1以上の植物種、好ましくはトランスジェニック植物種由来の種子の形態の酵素が投与される。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。
限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としては米国特許第5,543,576号(Van Ooijen et al.)及び米国特許第5,714,474号(Van Ooijen et al.)が挙げられ、これらの文献は本発明の分子を教示するものではなく、真菌類のフィターゼの使用を教示している。
限定されるものではないが特定の例では、本発明のフィターゼ分子は、組換え消化系生物形態(又は微生物もしくは菌叢)の作出、及び該組換え消化系生物形態の動物への投与に使用できる。投与は所望により単独で、或いは他の酵素及び／又は消化系に酵素活性を供し得るその他の生物形態と組み合わせて行うことができ、他の酵素及び生物形態は組換え型であってもなくてもよい。例えば、投与はキシラン分解細菌と組み合わせて行ってもよい。
【０１８５】
限定されるものではないが一態様では、本発明は、1以上のフィチン分解酵素を、好ましくはトウモロコシ又はソルガムに存在するフィチンが実質的に分解されるような量で、含んでなる酵素調製物の存在下で、二酸化硫黄を含有する温水にトウモロコシ又はソルガム粒を浸漬する方法を提供する。この酵素調製物はフィターゼ及び／又は酸性ホスファターゼ、並びに所望により他の植物材料分解酵素を含んでいてもよい。浸漬時間は12〜18時間であってよい。この浸漬中に中間的な粉砕工程を差し挟むと浸漬時間が短くなる。一態様では、トウモロコシ又はソルガム粒を、フィターゼ及び酸性ホスファターゼなどの1以上のフィチン分解酵素を含む酵素調製物の存在下、二酸化硫黄を含有する温水に浸漬して、フィチン酸及びフィチン酸の塩を除去又は大幅に少なくする。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としては米国特許第4,914,029号(Caransa et al.)及び欧州特許第0321004号(Vaara et al.)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
限定されるものではないが一態様では、本発明は、パン生地にフィターゼ分子を添加することを含んでなる、非粘着性及び弾性などの所望の物理特性を有するパン生地、並びに一定容量などの優れた品質のパン製品を得る方法を提供する。一態様では、本発明のフィターゼ分子は続いて成形して焼かれる発酵中のパン生地配合物に添加される。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。一具体例では、かかる文献としては日本特許公報第03076529号(Hara et al.)が挙げられるが、この文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０１８６】
限定されるものではないが一態様では、本発明は、改良されたダイズ食品を製造する方法を提供する。ダイズを本発明のフィターゼ分子と組み合わせてダイズからフィチン酸を除去することで、消費生物にとって不可欠な微量栄養素の供給において、またタンパク質の消化性において改良されたダイズ食品が製造される。一態様では、豆乳の製造において、フィチン酸含量を少なくするために本発明のフィターゼ分子をダイズに加えて接触させる。限定されるものではないが一具体例では、適用プロセスは、加熱下で豆乳を酵素とともにかきまぜることで、或いは固定化酵素を用いて攪拌容器中で混合型反応を行うことで加速
させることができる。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが具体例では、かかる文献としては日本公報第59166049号(Kamikudo et al.)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
一態様では、本発明は、飲料水又は液状の動物飼料用の混合製品を製造する方法を提供し、この方法はミネラル混合物及びビタミン混合物並びに本発明の新規なフィターゼ分子を使用することを含んでなる。一態様では、重要なミネラル／ビタミンの沈殿や破壊のリスクを伴わない消費生物に必要な栄養素の適正量・適正配合の混合物が得られ、同時に飼料中のフィチン結合リン酸の最適な利用が可能である。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。一具体例では、かかる文献としては欧州特許第0772978号(Bendixenら)が挙げられるが、この文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０１８７】
本発明のフィターゼ分子はまたカビの使用、及び／又は穀粒、及び／又は他の植物をもとにした他のアルコール性及び非アルコール性飲料食品(又は飲料)の製造にも使用できる。これらの飲料食品としては、酒類、ワイン、ミックスアルコール飲料(例えば、ワインクーラー、アイリッシュコーヒーなどのその他のアルコールコーヒーなど)、ビール、ニアビール、ジュース、抽出液、ホモジネート及びピューレが挙げられる。一態様では、本明細書で開示されるフィターゼ分子を用いて、かかる飲料食品の製造に便利なトランスジェニック型のカビ、及び／又は穀粒、及び／又はその他の植物を作出する。もう1つの好ましい例では、かかる飲料食品の製造工程及び／又は最終含量中の付加的成分として本明細書で開示されるフィターゼ分子を用いる。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。しかし、本発明の新規性のため、これらの文献は本明細書に開示される本発明分子を教示するものではない。
限定されるものではないがもう1つの例では、本発明は、フィチン量が少なくイノシトール含量が高い清酒を得る手段を提供する。かかる酒は肝臓病、動脈硬化症その他の疾病に対する直接的及び／又は精神的作用、即ち予防作用を有し得る。一態様では、酒は米麹から、原料として高フィターゼ活性を有する米麹カビを多機能的に働かせることで製造される。本発明のフィターゼ分子は活性が向上し(好ましくはトランスジェニックカビ)、且つ／又は麹カビの作用を外因的に高めるために加える有用なカビを作出するのに使用できると考えられる。この菌株を蒸した米に加え、麹を常法により作製する。一具体例では、このように準備した麹を用い、米全粒を二段階で準備し、15℃の一定した酒温で酒を製造して、フィチン量が少なくイノシトール量の多い目的の清酒を得る。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。一具体例では、かかる文献としては特許公報第06153896号(Soga et al.)及び同第06070749号(Soga et al.)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０１８８】
限定されるものではないが一態様では、本発明は、胃液又は腸液により消化されない摂取カルシウムをはじめとするミネラルの吸収を低コストで促進することができる吸収促進剤を得る方法を提供する。一態様では、該ミネラル吸収促進剤は有効成分としてフィチン酸の部分加水分解を含む。フィチン酸の部分加水分解は本発明の新規なフィターゼ分子を用いてフィチン酸又はその塩を加水分解することで製造される。該フィターゼ分子による処理は単独で行っても、且つ／又は併用処理を行ってもよく(最終作用を阻害するため、又は促進するため)、その後、リン酸残基を全ては遊離しないような範囲内で加水分解を阻害してもよい。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが一具体例では、かかる文献としては日本特許公報第04270296号(Hoshino)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
限定されるものではないが一態様では、本発明は、相加的又は好ましくは相乗作用的フィターゼ加水分解活性を有する酵素組成物を製造する方法(及びそれからの産物)を提供し、該組成物は本発明の新規なフィターゼ分子及び併用処理に有用な組成物を得るための1以上の付加的試薬を含んでなる。一態様では、本発明の併用処理は位置特異性が異なる少なくとも2種類のフィターゼ、即ち、1-、2-、3-、4-、5-及び6-フィターゼのいずれかの組合せを用いることで達成される。位置特異性が異なるフィターゼを組み合わせることで相加又は相乗作用が得られる。かかるフィターゼを組み合わせて含む食品並びに飼料又は食品及び飼料添加物などの組成物も、それらの製法と同じく本発明に含まれる。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。一具体例では、かかる文献としては国際出願第9830681号(Ohmann et al.)が挙げられるが、これらの文献は本発明の分子を教示するものではない。
【０１８９】
もう1つの態様では、本発明の併用処理はpH2.5でフィチン酸加水分解活性を有する酸性ホスファターゼを、約0.1:1.0〜10:1、好ましくは約0.5:1.0〜5:1、より好ましくは約0.8:1.0〜3:1、又は約0.8:1.0〜2:1のpH2.5:5.0活性プロフィールに相当する低い割合で用いることで達成される。該酵素組成物は熱処理によってより高い相乗的フィチン酸加水分解作用を示すことが好ましい。該酵素組成物はフィチン酸の加水分解を向上させることを目的とした食品(飲用及び固形食品、飼料及び飼料製品)の処理に有用である。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが一具体例では、かかる文献としては米国特許第5,554,399号(Vanderbeke et al.)及び同第5,443,979号(Vanderbeke et al.)が挙げられるが、これらの文献は本発明分子を教示するものではなく、むしろ真菌(特にコウジカビ属)フィターゼの使用を教示するものである。
限定されるものではないが一態様では、本発明は多糖類に作用する1以上の付加的酵素と組み合わせた、この新規なフィチン酸作用酵素からなる組成物を製造する方法(及びそれからの産物)を提供する。かかる多糖類としてはアラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクツロカロロース、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコゲン、アミロペクチン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストラン、パスツラン、キチン、アガロース、ケラタン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、及びアルドース、ケトース、また、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガロース、グルクロン酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、マニュロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン及びノイラミン酸からなる群より選択される酸又はアミンの少なくとも1種を含有する多糖類からなる群から選択することができる。
【０１９０】
具体的な態様では、本発明は本発明の1以上の新規なフィターゼ分子、セルラーゼ(キシラナーゼも含むことができる)、所望により１つのプロテアーゼ及び所望により1以上の付加的試薬を含んでなる、相乗的フィチン酸加水分解活性を有する組成物を製造する方法(及びそれからの産物)を提供する。代替的態様では、かかる併用処理は食品、紙製品などの木製品、並びにクレンジング液及び固形クレンジングの処理に有用である。
限定されるものではないが一具体例では、本フィターゼ分子はセルロース成分と併用するのに有用である。多くのセルロース分解細菌のセルラーゼはセルロソームと呼ばれる個々の多酵素複合体に組織化されることが知られている。セルロソームの複数のサブユニットは、互いに、また、セルロース基質と反応する多くの機能的ドメインからなる。これらのサブユニットのあるものは、接着性複合体に種々のセルラーゼ及びキシラナーゼサブユニットを選択的に組み込んだ明らかに新しいクラスの非触媒性スキャホールドポリペプチドを含んでなる。セルロソームハイブリッド及びセルロソームドメインのキメラ構築物の情報化応用はセルロース系バイオマスのよりよい利用を可能とし、研究、医学及び工業における広範な新規の応用をもたらすことができる。
限定されるものではないがもう1つの例では、本フィターゼ分子は、パルプ及び製紙工業で従来使用されてきた環境上有害な化学物質の使用の削減が望まれるバイオパルプ及びバイオ漂白の分野での単独又は併用処置に有用である。廃水処理は、生物酵素が脱色のみならず有害である可能性のある物質を有用な生物産物へと生物変換する上でも有効であることが知られている他の広範な応用を示す。
【０１９１】
限定されるものではないがもう1つの例では、本フィターゼ分子は、生物の消化系の処理において少なくとも1つの酵素活性を提供し得る生物形態を単独で、又は併用処理で作出するのに有用である。特に適切な処理生物としては非反芻生物が挙げられる。特に、このアプローチは単独又はその他の生物分子(例えば、キシラナーゼ)と併用して行って、複数の生物分子を発現する組換えホストを作出することができると考えられる。また、本フィターゼ分子及び／又は本フィターゼ分子を発現する組換えホストの投与は単独で行ってもよいし、消化系で酵素活性を提供し得るその他の生物分子及び／又は生物形態−なお、その他の酵素及び生物形態は組換え型であってもなくてもよい−を併用して行ってもよいと考えられる。例えば、投与はキシラン分解細菌を併用して行ってもよい。
例えば、多くの生物はフィチン酸の他、ヘミセルロースも十分に消化することができる。ヘミセルロース又はキシランは植物素材の主成分(35%)である。反芻動物では、食餌キシランの約50%は消化されるが、非反芻動物及びヒトの下方腸管では少量のキシランが消化されるだけである。反芻動物では、主要なキシラン分解種はブチルリビブリオ・フィブリソルベンス(Butyrivibrio fibrisolvens)及びバクテロイデス・ルミニコラ(Bacteroides ruminicola)であり、ヒトの結腸ではバクテロイデス・オバータス(Bacteroides ovatus)及びバクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)亜種“a”が主要なキシラン分解細菌である。キシランは化学複合体であり、それらの分解には複数の酵素が必要である。腸管細菌によるこれらの酵素の発現は種間で大きく異なる。ブチルリビブリオ・フィブリソルベンス(Butyrivibrio fibrisolvens)は細胞外キシラナーゼを産生するが、バクテロイデス(Bacteroides)種は細胞結合型のキシラナーゼ活性を有する。腸管細菌由来のキシラン分解酵素の生化学的同定はまだ完全には行われていない。キシロシダーゼ遺伝子がB.フィブロソルベンス(B.fibrosolvens) 113からクローニングされている。B.フィブロソルベンス(B. fibrosolvens) 49からクローニングされたキシラナーゼ遺伝子を用いたDNAハイブリダイゼーションから得られたデータは、この遺伝子は他のB.フィブロソルベンス(B. fibrosolvens)株にも存在し得ることを示している。Bact.ルミニコラ(Bact. Ruminicola)からクローニングされたキシラナーゼがBact.フラジリス(Bact. Fragilis)及びBact.ユニフォルミス(Bact. Uniformis)に導入され、そこで高い発現を示した。Bact.オバツス(Bact. Ovatus)由来のアラビノシダーゼ及びキシロシダーゼ遺伝子がクローンニングされており、両活性とも新規な単一の二機能性酵素によって触媒されることが明らかである。
【０１９２】
従って、本フィターゼ分子は1)好適なホスト(Bact. フラジリス又はBact.ユニフォルミスなど)への導入、2)結果として得られた組換えホストにおける十分な発現、及び3)処理された生物のフィチン酸分解能を高めることを目的とした生物への該組換えホストの投与に使用できる。遺伝学及び生化学の分野の研究を続ければ、腸管レベルでの消化の取り扱いに関する知見や洞察、また、結腸の繊維消化に関するよりよい理解が得られよう。
このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが特定の例では、かかる文献としては米国特許第5,624,678号(Bedford et al.)、同第5,683,911号(Bodie et al.)、同第5,720,971号(Beauchemin et al.)、同第5,759,840号(Sung et al.)、同第5,770,012号(Cooper)、同第5,786,316号(Baeck et al.)、同第5,817,500号(Hansen et al.)及び雑誌文献(Jeffries, 1996; Prade, 1996; Bayer et al., 1994; Duarte et al., 1994; Hespell; Whitehead, 1990; Wong et al., 1988)が挙げられるが、これらの文献は本発明分子を教示するものではないし、それらはいずれも食品、紙製品などの木製品、並びにクレンジング液及び固形クレンジングの製造におけるフィターゼ分子の添加を教示するものではない。これに対し、本発明は、フィターゼ分子‐例えば、本発明のフィターゼ分子‐を、付加的なフィターゼ活性を有する調製物を得るために、開示された試薬に添加することができるということを教示する。試薬と付加的フィターゼ分子は互いに阻害し合わないものである。試薬と付加的フィターゼ分子は全体として相加作用を有してもよい。試薬と付加的フィターゼ分子は全体として相乗作用を有してもよい。
【０１９３】
限定されるものではないが一態様では、本発明は、ヒドロキシル化ビタミンD3誘導体を含有する飼料組成物を動物に投与することにより、フィチン酸リン利用の向上、並びに動物、特に家禽の頸骨軟骨形成不全の治療及び予防のための方法(及びそれからの産物)を提供する。ビタミンD3誘導体は、フィチン酸リンの利用を高めるために低レベルのカルシウムとリンを含有する飼料として動物に投与する。従って、ビタミンD3誘導体は、フィチン酸リンの利用を更に高めるために本発明の新規なフィターゼ分子と併用投与する。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが一具体例では、かかる文献としては米国特許第5,516,525号(Edwards et al.)及び同第5,366,736号(Edwards et al.)、同第5,316,770号(Edwards et al.)が挙げられるが、これらの文献は本発明分子を教示するものではない。
限定されるものではないが一態様では、本発明は、1)生物体にイノシトールの形態で容易に吸収されて利用されるフィチンを含んでなり、2)排泄物中のリンを軽減することができ、かつ、3)従って、環境汚染の改善に有用な食物を得る方法(及びそれからの産物)を提供する。該食物はフィチン含有粒、乳酸産生微生物、及び本発明の新規なフィターゼ分子の混合物から構成される。一態様では、該食物はフィチン含有粒(好ましくは、例えば米糠)を、好酸性を有し、乳酸を産生するが酪酸は産生せず、病原性がない有効な微生物群及びフィターゼと、混合することで製造する。有効な微生物群の例としては、例えば、放線菌のグループに属すストレプトミセス(Streptomyces)sp.(American Type Culture Collection No. ATCC 3004)及び乳酸菌のグループに属すラクトバチルス(Lactobacillus)sp. (IFO 3070)が挙げられる。また、有効な微生物群の添加の好ましい量は穀粒材料に対する菌体重量で0.2重量%である。また、フィターゼの添加量は好ましくは穀粒材料中のフィチンに対して1〜2重量%である。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが具体例では、かかる文献としては日本特許公報第08205785号(Akahori et al.)が挙げられるが、この文献は本発明分子を教示するものではない。
【０１９４】
限定されるものではないが一態様では、本発明は植物タンパク質の溶解度を高める方法を提供する。より詳しくは、本発明は植物タンパク源におけるタンパク質の可溶化のための方法に関し、その方法は植物タンパク源を本発明のフィターゼ分子を含む1以上のフィターゼ酵素の有効量で処理し、更に植物タンパク源を1以上のタンパク質分解酵素の有効量で処理することを含む。もう1つの態様では、本発明はフィターゼ及び1以上のタンパク質分解酵素を含んでなる動物飼料添加物を提供する。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが具体例では、かかる文献としては欧州特許第0756457号(国際出願第9528850 A1号)(Nielsen & Knap)が挙げられるが、これらの文献は本発明分子を教示するものではない。
限定されるものではないが一態様では、本発明は植物タンパク源材料を2〜6のpH範囲の水に分散させ、その中に本発明のフィターゼ分子を混合することを含んでなる植物タンパク質調製物の製造方法を提供する。可溶性タンパク質を含有する酸性抽出物を分離し、乾燥させて、所望の特性の固形タンパク質を得る。タンパク質の特性を改良するために1以上のプロテアーゼを用いてもよい。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが一具体例では、かかる文献としては米国特許第3,966,971号(Morehouse et al.)が挙げられるが、この文献は本発明分子を教示するものではない。
限定されるものではないが一態様では、本発明はコンポストに3種類の試薬、即ち、フィターゼ、サポニン及びキトサンを添加することで、土壌及び／又はコンポスト中の不活性なリンを活性化させて窒素成分の利用率を高め、かつ、病原性のカビの繁殖を抑える方法(及びそれからの産物)を提供する。限定されるものではないが一態様では、本方法は、1)培地中のフィターゼ含有微生物、好ましくは本発明の新規なフィターゼ分子を過剰発現する組換えホストを、例えば100ml培地／100kgコンポスト湿重で添加し、2)或いはまた、コムギふすまなどのフィターゼ含有植物源を、例えば0.2〜1kg/100kgコンポスト湿重で添加し、3)ピート、ヨモギ及びユッカ植物などのサポニン含有源を、例えば0.5〜3.0g/kgで添加し、4)エビ、カニなどの殻を粉砕したものなどキトサン含有材料を、例えば100〜300kg/kgコンポスト湿重で添加することでコンポストを処理することを含み得る。限定されるものではないがもう1つの態様では、組換え型としての3種類の試薬、即ちフィターゼ、サポニン及びキトサンを用いる。このアプローチに関しての更なる詳細は文献に載っており、且つ／又は当業者に公知である。限定されるものではないが一具体例では、かかる文献としては日本特許公報第07277865号(Toya Taisuke)が挙げられるが、この文献は本発明分子を教示するものではない。
【０１９５】
本発明の全長遺伝子の断片をcDNA又はゲノムライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、全長DNAを単離し、また、その遺伝子に対して高い配列類似性又は同じ生物活性を有する他のDNAを単離することができる。この種のプローブは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、いっそう好ましくは少なくとも30塩基を有し、例えば少なくとも50以上の塩基を含む場合もある。またこのプローブを用いて、全長転写物に相当するDNAクローン及びゲノムクローン、即ち、調節及びプロモーター領域、エキソン及びイントロンを含む完全な遺伝子を含むクローンを同定することもできる。
他の態様においては、本発明のフィターゼ(例えば、配列番号2)をコードしている異種配列を含むトランスジェニック非ヒト生物が提供される。本発明のトランスジェニック動物を作出するため種々の方法を用いることができる。概して、3種類の方法が使用できる。1つの方法では、前核ステージの胚(“一核胚”)を雌から採取し、トランスジーンをその胚にマイクロインジェクションするが、この場合にはトランスジーンは得られた成熟動物の生殖系細胞と体細胞の双方の染色体に組み込まれることとなる。もう1つの方法では、胚幹細胞を単離し、エレクトロポレーション、プラスミドトランスフェクション又はマイクロインジェクションによってトランスジーンをその中へ組み込んだ後、コロニーを形成し、生殖系に寄与する胚にこの幹細胞を再導入する。哺乳類種のマイクロインジェクションの方法は米国特許第4,873,191号に記載されている。更にもう1つの方法では、胚形成細胞にトランスジーンを含むレトロウイルスを感染させ、それにより胚の生殖細胞は染色体に組み込まれたトランスジーンを有するようになる。トランスジェニックとなる動物が鳥類である場合、鳥類の受精卵は一般に卵管内で最初の12時間の間に細胞分裂を始めるので、受精卵の前核へのマイクロインジェクションは前核に接近できないために問題がある。従って、一般に上記のようなトランスジェニック動物作出法では、例えば米国特許第5,162,215号に記載のように、鳥類種についてはレトロウイルス感染が好ましい。しかし、鳥類種にマイクロインジェクションを用いる場合には、Loveら(Biotechnology, 12, Jan 1994)により発表されている手法を用いることができ、これにより前の玉の産卵の後約2時間半の時点で雌鳥を犠牲にして胚を得、胚盤の細胞質へトランスジーンをマイクロインジェクションし、その胚をホストの殻の中で成熟するまで培養する。トランスジェニックとする動物がウシ又はブタである場合、卵が不透明なために、従来の示差干渉コントラスト顕微鏡観察によって核を確認するのが困難であることから、マイクロインジェクションの妨げとなる可能性がある。この問題を克服するためには、まず卵を遠心分離して前核を分離し、よく見えるようにすればよい。
【０１９６】
本発明の“非ヒト動物”とは、ウシ類、ブタ類、ヒツジ類、鳥類である(例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ)。本発明の“トランスジェニック非ヒト動物”は“トランスジーン”をその非ヒト動物の生殖系へ導入することで作出する。様々な発達段階の胚の標的細胞を用いてトランジーンを導入することができる。胚の標的細胞の発達段階に応じて種々の方法を用いる。接合子はマイクロインジェクションに最良の標的である。遺伝子導入の標的としての接合子の使用は、ほとんどの場合で注入されるDNAは最初の分裂の前にホスト遺伝子へ組み込まれるという主な利点を持つ(Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985)。結果としてトランスジェニック非動物の全ての細胞にトランスジーンが組み込まれているようになる。一般にこのことはまた、生殖細胞の50%がトランスジーンを含むようになるので、その創始個体の子孫へのトランスジーンの効果的な伝達に反映される。
“トランスジェニック”とは、その細胞の全てに外来の遺伝材料を含む動物を表すのに用いられる。“トランスジェニック”動物は、生殖に用いられる細胞内に外来の遺伝材料を含む2種のキメラ動物を交配することで作出することができる。得られた子孫の25%がトランスジェニック、即ち、両対立遺伝子においてそれらの細胞の全てに外来の遺伝材料を含む動物となり、得られる動物の50%は一方の対立遺伝子に外来の遺伝材料を含み、25%は外来の遺伝材料を全く含まないものとなる。
本発明の実施に有用なマイクロインジェクション法では、トランスジーンを消化し、例えばゲル電気泳動によっていずれのベクターDNAも含まないように精製する。トランスジーンは、転写に関連する細胞内タンパク質と相互作用する機能し得る形で連結されたプロモーターを含み、最終的には構成的発現となることが好ましい。この点で有用なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)、モロニー白血病ウイルス(MLV)、及びヘルペスウイルスに由来するのもの、並びにメタロチオネイン、骨格アクチン、P-エノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPCK)、ホスホグリセレート(PGK)、DHFR、及びチミジンキナーゼをコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。ラウス肉腫ウイルスなどのウイルスの長い末反復(LTR)のプロモーターも使用できる。トランスジェニックとする動物が鳥類である場合、好ましいプロモーターとしてはニワトリβ-グロブリン遺伝子、ニワトリライソザイム遺伝子、及びトリ白血病ウイルスのものが挙げられる。胚幹細胞のプラスミドトランスフェクションに有用な構築物は、転写を刺激するエンハンサーエレメント、スプライシング受容体、終結及びポリアデニル化シグナル、並びに翻訳を可能とするリボゾーム結合部位など、当技術分野で周知の更なる調節エレメントを用いる。
【０１９７】
レトロウイルス感染もまた、上記のように非ヒト動物にトランスジーンを導入するために使用できる。発達中の非ヒト胚を試験管内で胚盤胞段階まで培養することができる。このとき、卵割球はレトロウイルス感染の標的となり得る(Jaenich, R., Proc. Natl. Acad. Sci USA 73:1260-1264, 1976)。卵割球の効果的な感染は透明層を取り除く酵素処理によって得られる(Hogan et al.(1986), Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。トランスジーンを導入するために用いられるウイルスベクター系としては典型的には、トランスジーンを運ぶ複製欠陥レトロウイルスである(Jahner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927-6931, 1985; Van der Puttrn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152, 1985)。トランスフェクションはウイルス産生細胞単層上で卵割球を培養することで容易かつ効果的に得られる(Vander Petten, 上記; Stewart et al., EMBO J. 6:383-388, 1987)。或いは、感染はもっと後の段階で行ってもよい。ウイルス又はウイルス産生細胞を卵割腔に注入することができる(D. Jahnerら, Nature 298:623-628, 1982)。創始個体の大部分は、トランスジェニック非ヒト動物となった細胞のサブセットにおいてのみ組込みが起こるので、創始個体の大部分はトランスジーンに関してモザイク状態であろう。更に、創始個体はゲノム中の様々な場所にトランスジーンの種々のレトロウイルス挿入配列を含み、これは一般に子孫では分離すると考えられる。また、低い効率ではあるが、トランスジーンを妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって生殖系に導入することもできる(D. Jahner et al.,上記)。
【０１９８】
トランスジーンの導入のための標的細胞の第3のタイプとして、胚性幹細胞(ES)がある。ES細胞は試験管内で培養して胚と融合させた移植前胚から得られる(M.J. Evans et al., Nature 292:154-156, 1981; M. O. Bradley et al., Nature 309:255-258, 1984; Gossler et al., Proc. Natl. Sci USA 83:9065-9069, 1986及びRobertson et al., Nature 322:445-448, 1986)。トランスジーンはDNAトランスフェクション又はレトロウイルスを媒介とした形質導入によってES細胞に効率的に導入することができる。その後、かかる形質転換ES細胞を非ヒト動物の胚盤胞と組み合わせることができる。その後、そのES細胞を胚を形成し、得られたキメラ動物の生殖系に寄与する。(総説としては、Jaenisch, R., Science 240:1468-1474, 1988参照。)
“形質転換された”とは、組換え核酸技術によりそれに(又はその祖先に)異種核酸分子が導入された細胞を意味する。「異種」とは、別の種に起源するか、或いはそのもとの形態即ちその細胞でもともと発現していた形態から改変された核酸配列をさす。
“トランスジーン”は技術によって細胞内へ挿入されるDNA片を意味し、その細胞から発達する生物のゲノムの一部となる(即ち、安定して組み込まれているか、或いは安定した染色体外エレメントとして)。かかるトランスジーンはトランスジェニック生物に対して部分的異種又は完全に異種(即ち、外来)である遺伝子を含んでもよいし、或いはその生物の内在遺伝子と同種の遺伝子であってもよい。DNAへと転写され、次にゲノムへ組み込まれるRNA配列を提供することで作出されたトランスジーンもこの定義の中に含まれる。本発明のトランスジーンとしては、フィターゼ又はフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列を含み、トランスジェニック非ヒト動物で発現し得るポリヌクレオチドを含む。また本明細書において“トランスジェニック”とは、初期胚又は受精卵の試験管内操作により、又は特定の遺伝子ノックアウトを誘導するいずれかのトランスジェニック技術によりそのゲノムが変更されたいずれの生物も含む。本明細書において“遺伝子ノックアウト”とは、当業者に公知のいずれかのトランスジェニック技術によって達成された機能の完全な欠損を伴った生体内における遺伝子のターゲッティング破壊をさす。ある態様では、遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物とは、相同組換えによって機能しなくさせる遺伝子に向けた挿入によって標的遺伝子を機能しなくさせたものである。本明細書において“トランスジェニック”とは、トランスジーンが導入された生物を作出できる当業者に公知のいずれかのトランスジェニック技術、あるいは内在する遺伝子が機能しなくさせた、又は“ノックアウト”されたものを含む。
【０１９９】
本発明の実施に用いられるトランスジーンはフィターゼ又はフィターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでなるDNA配列である。本明細書でそのように定義するならば、一態様では、配列番号1で示される配列を有するポリペプチド、又は配列番号2で示される配列を有するポリペプチドをコードする配列がトランスジーンである。適当であれば、トランケート型、対立遺伝子変異体及び種間ホモログのように、フィターゼ活性を有するタンパク質をコードするが、遺伝子コードの縮重のために核酸配列が異なるDNA配列も本明細書で使用できる。
胚はマイクロインジェクションし、トランスフェクトされた胚性幹細胞とともにコロニーを形成させた後、或いはトランスジーンを含むレトロウイルスを感染させた後(ただし、本明細書の他所に記載されているトリ種における本発明の実施を除いて)、胚を偽妊娠の雌の卵管に移植する。得られた子孫についてトランスジーン特異的プローブを用いた血液又は組織サンプルのサザンブロット分析により、トランスジーンが組み込まれたかどうかを試験する。この点でPCRが特に有用である。陽性子孫(G0)を交配して後代(G1)を得、これを組織サンプルのノーザンブロット分析によってトランスジーン発現に関して分析する。
このように本発明はトランスジェニック動物のリンの取り込みを高め、且つ／又はトランスジェニック生物の厩肥の汚染物質量を約15%、典型的には約20%、より典型的には約20%ないし約50%引き下げる方法を含む。
本発明の実施上使用を意図される動物は、ペット(例えばイヌ、ネコ、トリ種など)をはじめとする一般に飼育動物とみなされる動物、及び食品加工に有用なもの、即ち、食肉種や産卵用のニワトリ及びシチメンチョウなどの鳥類、ラムなどのヒツジ、肉牛や乳牛などのウシ、魚類及びブタである。本発明の目的では、これらの動物は、かかる動物がその動物の生殖細胞の染色体に組み込まれた異種DNA配列、又は通常その動物に内在する1以上の付加的DNA配列(ひとまとめにして本明細書では“トランスジーン”と呼ぶ)を有していた場合に“トランスジェニック”と呼ばれる。トランスジェニック動物(その子孫を含む)はまた、偶然に体細胞の染色体に組み込まれたトランスジーンを有する場合もある。
【０２００】
いくつかの例では、本発明のフィターゼ配列を局部的に(例えば、特定の組織又は細胞タイプ内に)送達して発現させるのに有利であると考えられる。例えば、動物の腸管でのフィターゼ又は消化酵素の局部発現はそれぞれ例えばフィチン酸及びリンの消化及び取り込みの助けとなる。この核酸配列は例えば唾液腺、組織及び細胞に、且つ／又は腸管の上皮細胞ライニングに直接送達してもよい。かかる送達法は当技術分野で公知であり、エレクトロポレーション、ウイルスベクター法及び直接DNA取り込み法が挙げられる。フィターゼ活性を有するポリペプチドならばいずれのものでも本発明の方法で利用できる(例えば、ここで特に記載されるもの、並びに本発明の他の節で記載されるもの)。
例えば、本発明の核酸構築物はホスト組織内の標的細胞への取り込みに好適な形態の核酸分子を含んでなる。核酸は裸のDNA又はRNA分子の形態であってもよく、ここでこれらの分子は1以上の構造遺伝子、1以上の調節遺伝子、アンチセンス鎖、三重らせんを形成し得る鎖などを含み得る。一般に、この核酸構築物は好適な調節領域の転写及び翻訳制御下にある少なくとも1つの構造遺伝子を含む。より多くの場合では、本発明の核酸構築物はトランスフェクション効率を向上させるために送達ビヒクルに組み込んだ核酸を含んでなり、この送達ビヒクルは乾燥親水性賦形剤材料を含んでなるより大きな粒子内に分散させる。
かかる送達ビヒクルのあるものは、自己複製を妨げるよう不活性化してはいるが、標的ホスト細胞と結合し、標的ホスト細胞の細胞質に遺伝材料を送達し、粒子に組み込まれていた構造遺伝子又はその他の遺伝子の発現を促進する天然のウイルスの能力を維持しているレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターを含んでなる。遺伝子導入の媒介に好適なレトロウイルスは、Kahn et al.(1992) CIRC. RES. 71:1508-1517に記載されている。好適なアデノウイルス遺伝子送達は、Rosenfeld et al.(1991) SCIENCE 252:431-434に記載されている。Friedman (1989) SCIENCE 244:1275-1281にはレトロウイルス及びアデノウイルス送達の双方が記載されている。
【０２０１】
核酸送達ビヒクルの第二のタイプは、陰イオン及び陽イオン双方のリポソーム構築物をはじめとするリポソームトランスフェクション小胞を含んでなる。陰イオンリポソームの使用には核酸をリポソーム内に捕捉する必要がある。陽イオンリポソームには核酸を捕捉する必要はなく、単に核酸とリポソームを混合することで形成することができる。陽イオンリポソームはDNA及びRNAの両者をはじめとする負電荷を有する核酸分子と好んで結合し、多くの細胞タイプで妥当なトランスフェクション効率を示す複合体が得られる。Farhood et al.(1992) BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA. 1111:239-246参照。リポソーム小胞の形成に具体的な材料としては、Felgner & Ringold (1989) NATURE 337:387-388に記載のように、ジオレイルホルファチジルエタノールアミン(DOPE)及びジオレイルオキシトリエチルアンモニウム(DOTMA)の等モル混合物からなるリポフェクチンがある。
また、これら2種の送達系を組み合わせることもできる。例えば、Kahn et al.(1992)(上記)は形質転換効率を更に高めるにはレトロウイルスベクターを陽イオンDEAEデキストラン小胞に組み合わせればよいことを教示している。また、核タンパク質をウイルス及び／又はリポソーム送達小胞に組み込むとトランスフェクション効率がいっそう高めることができる。Kanedaら(1989) SCIENCE 243:375-378参照。
もう1つの態様では、酵素を単独の有効成分として、又は1以上のその他の薬剤及び／又は酵素と組み合わせて含有する消化補助剤が提供される。家畜又は飼育動物の消化補助剤における酵素その他の薬剤の使用は動物の健康状態や平均余命を高めるだけでなく、家畜の健康状態を高め、家畜からの食品の製造の助けともなる。
【０２０２】
現在、数種の家畜飼料(例えば、ある種の家禽飼料)には多くのミネラル(例えば、無機リン)、酵素、成長因子、薬剤及びその他家畜への送達を目的とした物質が多量に添加されている。これらのサプリメントは例えば穀粒に存在するカロリー及び天然の栄養素の多くと取って換わっている。
飼料そのものから無機リンサプリメント及びその他のサプリメントを(例えば、微量ミネラル塩類、成長因子、酵素、抗生物質)を減らす又はなくせば、飼料の栄養素やカロリーをもっと高くすることができる。従って、残りの食餌はより有用なエネルギーを含むこととなる。例えば、粒状ナタネミール食は一般に代謝エネルギー約3,200kcal/kg食餌を含み、ミネラル塩類は代謝エネルギーを供給しない。不要なミネラルを除いて穀粒に置き換えれば食餌中に有用なエネルギーが増す。このように本発明は一般に用いられているフィターゼ含有飼料とは異なる。例えばある態様では、生物の胃腸管による消化に耐性のある生体適合性材料を用いる。
例えばニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、オウム、クジャク、ダチョウ、キジ、ウズラ、イエバト、エミュー、キウイ、アビ、オカメインコ、バタンインコ、カナリア、ペンギン、フラミンゴ、及びハトなどの家禽又は鳥類をはじめとする多くの生物では、消化管は種子その他の鳥類によって消費される餌の消化を助けるため、堅い生体適合物(例えば、石や貝殻)を格納・使用する砂嚢を含んでいる。この生物属の典型的な消化管は、素嚢と呼ばれる、しばらく食物を溜めておく袋を含む食道を含んでいる。その素嚢から本当の胃に食物が送られ、塩酸やペプシンが消化のプロセスを始める。次に食物は、卵型で強力な筋肉の薄い壁を持つ砂嚢へ送られる。砂嚢の主な働きは食物の粒子を摩砕又はつぶすことであり、このプロセスは鳥が砂礫や砂利を少量飲み込むことで助けられている。食物は砂嚢から十二指腸に送られる。鳥類の小腸は哺乳類のものとよく似ている。小腸と大腸の接合部に長さ約10〜15cm(約4〜6インチ)の2つの出口のない袋、即ち、盲腸がある。大腸は短く、長さ約8〜10cm(約3〜4インチ)の大部分直腸からなる。直腸は排泄腔へと開いており、肛門を通って糞が排泄される。
【０２０３】
砂嚢に摂取(或いは導入)され、供される堅い生体適合物は種々の酵素、化学薬品、治療薬及び抗生物質の送達のための有用なベクターとなる。これらの堅い物質は数時間から数日の寿命を有し、一定の時間の後に通り抜ける。従って本発明は、生物に有用な消化剤又は治療薬を送達するためのコーティングされ、含浸された(例えば、含浸マトリックス及びメンブラン)食餌改変補助剤を提供する。かかる食餌補助剤は、砂嚢内で消化を助けるために典型的には生物によって摂取される物(例えば、石又は砂利)を含む。本発明は生物の消化補助剤として、又は治療薬又は医薬又は化学薬品の送達に有用な薬剤をその上にコーティング又はそれに含浸させた生体適合物を提供する。
一態様では、本発明は消化を助ける薬剤の放出のために設計された生体適合性組成物を有する食餌補助剤を提供し、この生体適合性組成物は経口摂取及び生物の消化管(例えば砂嚢)での放出を目的として設計されている。“生体適合性”とはホスト生物(例えば鳥類)と接触した際にその物質の拒絶が起こったり、その物質を働かなくするような有害な応答を引き起こさない物質を意味する。この働かないということは、例えば物質の周囲に繊維構造が形成されて含浸させた薬剤のホスト生物への拡散が限定されることにより、或いは毒性や感染のために生物の死亡率又は罹患率が高まってしまうような物質によって起こり得る。生体適合性物質は非生分解性であっても生分解性であってもよい。一態様では、生体適合性組成物は胃腸管による分解又は消化に耐性がある。もう1つの態様では、生体適合性組成物は石又は小石のコンシステンシーを有する。
【０２０４】
本発明で有用な非生分解性材料としては、食餌剤を付着又は含浸させたものがある。かかる非生分解性材料としては、例えばアクリル系、モダクリル系、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、及びポリフッ化ビニリデンなどの熱可塑性プラスチックが挙げられる。エラストマーも有用な材料であり、例えばポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール及びシリコーン(例えば、シリコーンベースのもの、又はシリカ含有物)が挙げられる。本発明は生体適合性組成物がかかる複数の材料を含んでもよいということを提案し、例えばこれは混合又は積層してブレンドとしたもの、コポリマー又はその組合せであってよい。
本明細書において“生分解性”材料とは、生体で腐食又は分解してより小さな化学種となる組成物を意味する。分解は例えば酵素的プロセス、化学的プロセス又は物理的プロセスによって起こり得る。本発明での使用が意図される好適な生分解性材料としては、ポリ(ラクチド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(酪酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリカーボネート、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリアクリレートが挙げられる。かかる材料は混合又は積層してブレンドとしたもの、コポリマー又はその組合せであってよい。
【０２０５】
いくつかの異なる生体適合性物質を同じ生物に同時に、又は種々の組合せで(例えば、ある材料の前にあるものを)摂取又は提供してもよいと考えられる。また、生体適合性物質は消化管をゆっくり通過するように設計してもよい。例えば、大きい物質又は脂肪性の物質は消化管をゆっくり移動する傾向があることから、消化管をすぐに通り抜けてしまうことを避けるためにより大きな生体適合性材料を用いてもよい。かかる大きな物質は非生分解性及び生分解性物質の組合せであってもよい。例えば、小さな非生分解性物質は、一定時間経過するとその生分解性部分が分解されて非生分解部分が消化管を通過するように生分解物質に包含させることができる。また、摂取を助けるために数種のフレーバーを生体適合性物質に供することができると考えられる。
例えば、ポリペプチド(例えば、酵素、抗体、サイトカイン又は治療用の小分子)及び抗生物質をはじめとする数種の薬剤を単独で、又は他の薬剤を組み合わせて生体適合性物質にコーティングしてもよい。特に有用な薬剤の例は下記表1及び表2に一覧化されている。また、本発明の生体適合性材料に細胞を封入して酵素又は治療薬を送達するため使用できるということも考えられる。例えば、中で細胞が増殖するに十分な大きさの孔を有する多孔性物質を設計し、次にこれらの多孔性材料を消化管に取り込ませることもできる。例えば、生体適合性物質は複数の細胞種を支持する複数の微生物叢環境(例えば、異なる孔隙率、pHなど)からなってもよい。細胞は生物に特定の薬剤、酵素又は化学物質を送達するように遺伝子操作することができる。これらの細胞は真核細胞であっても原核細胞であってもよい。
【０２０６】
【表１−１】
2005505254.tif 000002
【０２０７】
【表１−２】
2005505254.tif 000003
【０２０８】
【表２−１】
2005505254.tif 000004
【０２０９】
【表２−２】
2005505254.tif 000005
【０２１０】
ある種の薬剤をある条件下(例えば、あるpH、活性化剤の存在下など)で活性となる、又は活性化状態となるように設計することができる。また、本発明の組成物ではプロ酵素を用いるのが有利である。例えば、プロ酵素はプロテアーゼ(例えば、生物の消化管に存在する、又は消化管に人工的に導入させる唾液プロテアーゼ)によって活性化させることができる。本発明の生体適合性組成物によって送達される薬剤は、生物によって摂取させるか、或いはその他の送達を行ってもよいが、活性化剤の添加によって活性化又は不活性化することができると考えられる。消化管内での薬剤の制御のための別の機構としては、適切な消化コンパートメントで活性化される環境感受性剤がある。例えば、ある薬剤は低pHでは不活性であるが、中性pHでは活性となる。従って、その薬剤は消化管では不活性であるが、腸管では活性となる。或いは、その薬剤は微生物特異的因子(例えば、腸内に存在する微生物)の存在に応答して活性となり得る。
要するに、本発明の可能性ある利点としては、例えば(1)日常の飼料又は穀粒からミネラルサプリメント(例えば、無機リンサプリメント)、酵素又は動物(魚類を含む)用の治療薬の必要性を少なくする、又はおそらくはなくし、それによって飼料中に存在するカロリー及び栄養素の量を高めること、及び(2)例えば家禽、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、及びネコをはじめとする飼い動物と非飼い動物の健康及び成長の増進を含む。
【０２１１】
本発明の方法と組成物には多数の酵素が使用できる。これらの酵素としては摂取された食物の適切な消化、又は消化管を通じて動物に送達した化学物質、プロドラッグ又はその他の薬剤もしくは化合物の適切な代謝、活性化もしくは誘導体化に必要な酵素が挙げられる。本発明の組成物へ送達又は配合できる酵素酵素の例としては、例えば、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、フィターゼ、β-グルカナーゼ、特にエンド-β-1,4-グルカナーゼ及びエンド-β-1,3(4)-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、特にアラビノガラクタンエンド-1,4-β-ガラクトシダーゼ及びアラビノガラクタンエンド-1,3-β-ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド-1,2-β-グルカナーゼ、エンド-1,3-α-グルカナーゼ、及びエンド-1,3-β-グルカナーゼ、ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン-α-ラムノシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、及びα-ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ、β-マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ、並びにリパーゼ、ホスホリパーゼ及びクチナーゼなどの飼料強化酵素が挙げられる。フィターゼは配列番号２に示されるアミノ酸配列をもつフィターゼに加えて本発明の方法と組成物に使用し得る。
一態様では、本発明の組成物(例えば食餌補助剤)で用いる酵素は熱に安定かつ耐熱性であって、フィターゼの酵素的加水分解を触媒するフィターゼ酵素であり、即ち、この酵素は短時間(即ち、5ないし30秒)又はより長い時間、例えば、数分又は数時間の間約50℃より高い温度に曝しても復元して活性を取り戻すことができる。
【０２１２】
“飼料”と“食品”はそれぞれ、動物及びヒトが食す、摂取する、消化することを意図した、或いはそれに適した天然又は人工の食餌、食物など、或いは食物成分のいずれもを意味する。本明細書において“食餌補助剤”とは、例えば動物又は生物に治療薬又は消化剤を与える薬剤を含有する組成物を表す。“食餌補助剤”とは典型的には生物のためのカロリー摂取の供給源ではなく、言い換えれば食餌補助剤は典型的には生物にとってのエネルギー源ではなく、むしろ典型的な“食餌”又は“食品”に加えて摂取される組成物である。
本発明の種々の態様では、配列番号2のアミノ酸配列をもつタンパク質の少なくとも30の連続したアミノ酸を有する組換えフィターゼタンパク質と、フィターゼ含有食料を含む飼料組成物が提供される。当業者に既知であるように、そのような組成物は、ポリマー被覆添加剤を含む又は含まないペレットとして、粒状として、噴霧乾燥によるなどのこれらに限定されない多くの方法で調製することができる。限定されない例として、飼料の調製に関する当該技術における教示には、国際出願第0070034 A1号、同第0100042 A1号、同第0104279 A1号、同第0125411 A1号、同第0125412 A1号、同第欧州特許第1073342A号が挙げられる。
薬剤又は酵素(例えば、フィターゼ)は試験管内又は生体内で、即ち、それぞれ生物の胃又は砂嚢に取り込まれる、又はそこに存在する前にその作用を発揮し得る。作用の組合せも可能である。
いずれの酵素を食餌補助剤に配合してもよいが、本明細書では本発明の方法及び組成物の一例としてフィターゼを挙げている。本発明の食餌補助剤は1種類の酵素(例えば、フィターゼ)を含む。一般に、フィターゼ組成物を含有する食餌補助剤は液体又は乾燥物である。
【０２１３】
液体組成物は、好ましくはよく精製された形態の酵素(例えば、フィターゼ)以外には何も含む必要はない。しかし通常には、グリセロール、ソルビトール又はモノプロピレングリコールなどの安定剤も含む。また液体組成物は塩類、糖類、保存剤、pH調整剤、タンパク質、フィチン酸塩(フィターゼ基質)などのその他の添加物を含んでもよい。典型的な液体組成物は水性又はオイルベースのスラリーである。この液体組成物は徐放性を目的として生体適合性組成物に添加することができる。好ましくは酵素は生体適合性材料(例えば、生分解性又は非生分解性)であり、例えば多孔質マイクロビーズに組換え細胞を添加したものが含まれる。
乾燥組成物はスプレー用乾燥組成物であってもよく、この場合、組成物は乾燥形態の酵素以外には何も含む必要はない。しかし通常には、乾燥組成物は、食品又は飼料成分と容易に混合するいわゆる顆粒状であり、或いはより好ましくはプレミックスの成分を形成する。酵素顆粒の粒径はその混合物の他の成分と適合するものであることが好ましい。これにより動物飼料に酵素を配合する安全かつ便宜な手段が得られる。好ましくはこれらの顆粒は生体適合性であり、より好ましくはこの生体適合性顆粒は非生分解性である。
酵素をコーティングした凝集粒子は高剪断ミキサーにて凝集技術を用いて製造することができる。吸着顆粒は酵素を吸収する／酵素によってコーティングされる担体材料の核を持たせることで製造する。好ましくはこの担体材料は、動物の砂嚢で小石や砂利の働きを刺激する生体適合性の非生分解性材料である。凝集技術に用いる典型的な増量剤としては硫酸二ナトリウムなどの塩が挙げられる。他の増量剤としてはカオリン、タルク、珪酸マグネシウムアルミニウム、セルロース繊維がある。所望によりデキストリンなどの結合剤も凝集顆粒に含ませてもよい。担体材料は生分解性及び非生分解性材料を含むいずれの生体適合性材料であってもよい(例えば、石、小石、セラミック、種々のポリマー)。所望により顆粒はコーティング混合物でコーティングしてもよい。かかる混合物はコーティング剤、好ましくは硬化ヤシ油及び牛脂などの疎水性コーティング剤、及び所望により炭酸カルシウム又はカオリンなどのその他の添加物を含んでなる。
【０２１４】
更に、食餌補助組成物(例えば、フィターゼ食餌補助組成物)は着色剤、芳香化合物、安定剤、ビタミン類、ミネラル類、その他の飼料又は食品強化酵素などの他の置換物質を含んでもよい。典型的な添加物としては通常、ビタミン類、ミネラル類又は飼料強化酵素などの1以上の化合物と好適な担体及び／又は賦形剤を含んでなる。
一態様では、本発明の食餌補助組成物は有効量の1以上の飼料強化酵素、特に、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、特にラクターゼ、他のフィターゼ、β-グルカナーゼ、特にエンド-β-1,4-グルカナーゼ及びエンド-β-1,3(4)-グルカナーゼ、セルラーゼ、キシロシダーゼ、ガラクタナーゼ、特にアラビノガラクタンエンド-1,4-β-ガラクトシダーゼ及びアラビノガラクタンエンド-1,3-β-ガラクトシダーゼ、エンドグルカナーゼ、特にエンド-1,2-β-グルカナーゼ、エンド-1,3-α-グルカナーゼ、及びエンド-1,3-β-グルカナーゼ、ペクチン分解酵素、特にペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、アラビナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナン-α-ラムノシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、及びα-ガラクツロニシダーゼ、マンナナーゼ、β-マンノシダーゼ、マンナンアセチルエステラーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、アラビノキシラナーゼ、並びにリパーゼ、ホスホリパーゼ及びクチナーゼなどの脂肪分解酵素からなる群より選択される飼料強化酵素を更に含んでなる。
本発明の動物食餌補助剤は、食餌の前又は食餌と同時に単胃動物に与える。一態様では、本発明の食餌補助剤は食餌と同時に単胃動物に与える。他の態様では、この食餌補助剤は顆粒又は安定な液体の形態で食餌中に添加する。
【０２１５】
本発明の食餌補助剤中の酵素の有効量は、約10〜20,000、好ましくは約10〜15,000、より好ましくは約10〜10,000、特に約100〜5,000、特には約100〜約2,000FYT/食餌補助剤kgである。
本発明のフィターゼの他の特殊な使用例としては、醤油加工時、及びイノシトール又はその誘導体の製造時におけるものがある。
本発明はまた、動物糞尿中のフィターゼレベルを低減させる方法に関し、ここでは動物に有効量の本発明のフィターゼを含有する食餌を与える。本明細書の冒頭で述べたように、その重要な効果の１つが環境のリン汚染を軽減することである。
もう１つの態様では、食餌補助剤は磁性担体である。例えば磁性担体内に、磁性担体上に、又は磁性担体により分布させた酵素(例えば、フィターゼ)を含有する磁性担体(例えば、多孔質磁性ビーズ)をフィチン酸塩が高い領域に分布させ、一定時間の後に磁石で回収することができる。このようにビーズを分布及び再回収することで更なる汚染が低減し、ビーズの再利用が可能となる。また、かかる磁性ビーズを生体内で使用すると、例えばフィターゼ活性が生じ得る消化管の位置に食餌補助剤を局在化することが可能となる。例えば、消化酵素(例えば、フィターゼ)を含有する本発明の食餌補助剤を、磁性担体の食餌補助剤を動物に摂取させた後に動物の砂嚢付近に磁石を近づけることで動物の砂嚢に局在化させることができる。一定時間の後に磁石を取り除けば、食餌補助剤は消化管を通過することができる。また、この磁性担体は犠牲にした後の生物体から取り出すにも適しており、回収の助けとなる。
【０２１６】
食餌補助剤が多孔質粒子である場合、かかる粒子は典型的には、それとともに緩慢に放出することが望まれる物質に含浸させて徐放性粒子を形成する。かかる徐放性粒子は多孔質粒子を、放出することが望まれる物質に含浸させることで製造できるだけでなく、最初の分散相に所望の物質を最初に溶解することによっても製造できる。この場合、放出させる粒子をまず最初の分散相に溶解する方法によって製造された徐放性粒子もまた本発明の範囲及び精神の範囲内にある。例えば多孔質中空粒子に医薬、農薬又は酵素などの徐放性物質を含浸させてもよい。特に酵素を含浸させる多孔質中空粒子が生分解性ポリマーから作製される場合には、その粒子自体を農薬又は肥料として使用してもよく、それらは環境に悪影響を及ばさない。一態様では、多孔質粒子は本質的に磁性体である。
これらの多孔質中空粒子はバイオリアクターの支持体、特に酵素支持体として使用することもできる。従って、例えば、数日、好ましくは約３〜20日の間にわたってある一定用量が放出されるリポソームなどのマイクロ小胞に薬剤酵素を封入することよって、徐放法を用いた食餌補助剤を製造するのが有利である。あるいは、薬剤(例えば、酵素)を、数日、好ましくは約２〜30日の間、更にはその動物の寿命までの範囲の期間にわたってその薬剤(例えば、酵素)用量がゆっくりと放出される徐放性ポリマー中に組み込むなど、徐放用に処方してもよい。
当技術分野で公知のように、リポソームは一般にリン脂質又はその他の脂質物質から誘導される。リポソームは水性媒質に分散した単層又は多層水和液体結晶によって形成される。リポソームを形成し得る無毒の生理学上許容され、代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム形態の本組成物は薬剤の他に安定剤、保存剤、賦形剤などを含んでもよい。好ましい脂質としてはリン脂質及びホスファチジルコリン(レシチン)があり、天然品でも合成品でもよい。リポソームの形成法は当技術分野で公知である。例えば、Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Vol. XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p.33などを参照。
【０２１７】
食品もしくは飼料製品又は添加物の製造の際に本発明のフィターゼを用いることも本発明の範囲内にあり、即ち、このフィターゼは製造中にのみそのフィターゼ活性を発揮し、最終的な食品又は飼料製品では活性はない。この態様は、例えば、パン生地の製造及びベーキングに適切である。従って、フィターゼ又はフィターゼを発現する組換え酵母を磁性担体の中、磁性担体の上、又は磁性担体を介して含浸させ、パン生地又は食品媒体に分散させ、磁石で回収することができる。
本発明の食餌補助剤は生体適合性(例えば、生分解性又は非生分解性)担体にて動物に単独に投与してもよいし、或いはその他の消化添加剤と組み合わせて投与してもよい。その本発明の食餌補助剤は上面ドレッシングとして、又は動物飼料に直接混合して、飼料とは別に与えることで、単独の経口投与形により、注射、又は経皮手段により、或いは他の成長関連可食性化合物と組み合わせて容易に投与することができ、その組合せ中の各化合物の割合は特定の生物、取り組むべき問題、及び所望の応答程度によって異なる。当業者には周知であるが、ある場合に投与される特定の食餌用量は投与する特定の化合物、処置すべき問題、被験体の状態、及び有効成分の活性や被験体の応答を改変し得るその他の関連因子に応じて調節されるものと理解すべきである。当技術分野では周知であるが、一般に、単回日用量又は分割日用量のいずれを用いてもよい。
動物飼料とは別に投与する場合、食餌補助剤配合物は、当技術分野で周知のように、無毒の医薬上許容される可食性担体と組み合わせて即時放出製剤又は徐放性製剤のいずれかとすることで製造することができる。かかる可食性担体は、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ダイズフレーク、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、及びプロピレングリコールなどの固体担体又は液体担体のいずれであってもよい。固体担体を用いる場合、化合物の投与剤形は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤又はロゼンジ剤、微小分散形態としての上面ドレッシングであり得る。液体担体を用いる場合では、軟ゼラチンカプセル剤、又はシロップ剤もしくは液体懸濁剤、乳剤又は溶剤が投与剤形となる。これらの投与剤形はまた、保存剤、安定剤、湿潤剤又は乳化剤、溶液促進剤などの助剤を含んでもよい。それらはまた他の治療上有用な物質を含んでもよい。摂取したときに酵素を放出するために高温で可食用粒状担体を調製する方法は、2001年7月20日出願の米国特許同時係属出願第09/910,579号に記載されている。
【０２１８】
このように本発明の著しい利点は、例えば1)有効成分を配合した生体適合性組成物の製造が容易なこと、2)利用し得るポリマー及び／又は有効成分の種類に関して融通がきくこと、3)収率がよく、添加効率がよいこと、4)生体内で活性で完全な有効物質を放出する徐放性製剤を提供し、従って、長時間にわたって有効物質の徐放性を提供することが挙げられる。また、もう1つの利点としては、生物の消化管(例えば、砂嚢)への薬剤の局部送達によるものである。本明細書において“に含ませる”とは、長時間にわたって薬剤の徐放性を得るのに有用な組成物に薬剤を配合する方法を表す。
本発明の徐放性組成物又は遅延放出組成物では、有効量の薬剤(例えば、酵素又は抗生物質)が用いられる。本明細書において徐放性又は遅延放出とは、長時間にわたって生体適合性材料から薬剤を徐々に放出することをさす。徐放性は連続的であっても不連続であってよく、直線的であっても非直線的であってよく、1以上の生分解性又は非生分解性組成物、薬剤添加量、賦形剤の選択、又は他の改変によって達成することができる。しかし、生物に一度に摂取される即時放出をもたらす“即時”放出組成物を提供するのが望ましい場合もあると考えられる。また、“放出”とは必ずしも生体適合性担体から薬剤が放出することを意味するのではないと考えられる。一態様ではむしろ、徐放性は生体適合性組成物に存在する薬剤がゆっくり活性化すること、又は継続して活性化することを包含する。例えば、フィターゼは何も生体適合性組成物から放出されて有効となる必要はない。この態様では、フィターゼは生体適合性組成物上に固定化されている。
【０２１９】
動物飼料は、動物の食餌要求を満たすために通常用いられるいずれのタンパク質含有有機物ミールであってもよい。かかるタンパク質含有ミールの多くは典型的には主としてトウモロコシ、ダイズミール、又はトウモロコシ／ダイズミール混合物からなる。例えば、家禽に与える典型的な市販製品としては、Land O'Lakes AG Servicesの家禽用飼料製品であるEgg Maker Complete並びにAgwa, Inc.の製品であるCountry Game & Turkey Growerが挙げられる(Phillip Minnaar及びMaria MinnaarによるThe Emu Farmer's Handbookも参照)。これらの市販製品はいずれも、それに本食餌補助剤及び／又はフィターゼ酵素を配合して、かかる組成物に必要なリン、亜鉛、マンガン及び鉄摂取物の添加量を削減又はなくすことができる動物飼料の典型例である。
本発明は多くの動物(本明細書では哺乳動物(ヒトを含む)、家禽及び魚類を含むものと定義される)の食餌に適用できる。特に、この食餌はブタ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、実験齧歯類(ラット、マウス、ハムスター及びアレチネズミ)などの商業上重要な哺乳動物、ミンクやキツネなどの毛皮動物、並びにサルや類人猿などの動物園動物、更にはネコやイヌなどのペット動物に使用できる。典型的な商業上重要な鳥類種としては、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、キジ、エミュー、ダチョウ、アビ、キウイ、ハト、オウム、オカメインコ、バタンインコ、カナリア、ペンギン、フラミンゴ、及びウズラが挙げられる。マスなどの商業的養殖魚も本明細書に開示される食餌補助剤から利益を受けよう。利益を受け得る他の魚としては、例えば、特に水槽や養殖環境にある魚(例えば、熱帯魚)、金魚、その他の装飾鯉、ナマズ、マス、サケ、サメ、エイ、カレイ、シタビラメ、テラピア、メダカ、グッピー、モーリー、プラティ、カブトガニ、ゼブラフィッシュ及びドジョウが挙げられる。
【０２２０】
代謝パラメータの測定
本発明の方法には、細胞の遺伝組成物を修飾することにより新しい表現型をもつ新規な細胞株を開発するために細胞の全細胞進化、又は全細胞操作が必要であり、遺伝組成物を本発明の核酸の細胞に添加することにより修飾される。新しい表現型を検出するために、修飾した細胞の少なくとも1つの代謝パラメータが“リアルタイム”又は“オンライン”時間枠で細胞においてモニターされる。一態様においては、細胞培養物のような複数の細胞が  “リアルタイム”又は“オンライン”でモニターされる。一態様においては、複数の代謝パラメータが“リアルタイム”又は“オンライン”でモニターされる。
代謝フラックス分析(MFA)は既知の生化学骨格に基づくものである。直線的に独立している代謝マトリックスは、質量保存の法則と細胞内代謝産物に対する見掛けの定常状態の仮説(PSSH)に基づいて構築される。本発明の方法を実施する際に、下記のことを含む代謝網が設定される。
すべての経路基質、産物、中間代謝産物の同一、
すべての経路代謝産物を相互交換する化学反応、経路反応の化学量論の同一、
すべての反応を触媒する酵素、酵素反応速度論の同一、
経路成分間の調節相互作用、例えば、アロステリック相互作用、酵素-酵素相互作用等、
酵素の細胞内画分化又は酵素の他の超分子体制、
代謝産物、酵素又はエフェクター分子又はそれらの運動に対する拡散バリヤの濃度勾配の存在。
【０２２１】
ある株の代謝網が作られると、行列概念による数学の提示が導入されて、オンラインメタボロンデータが利用可能である場合には細胞内代謝フラックスを測ることができる。
代謝表現型は、細胞内の全代謝網の変化による。代謝表現型は、環境条件、遺伝的調節、発育状態、遺伝子型等についての経路利用の変化による。本発明の方法の一態様においては、オンラインMFA計算後、細胞の動的挙動、表現型、他の性質を経路利用を調べることにより分析される。例えば、酵母の発酵でグルコースの供給が高くなり、酸素が減少する場合には、呼吸経路の利用が減少及び/又は停止し、発酵経路の利用が優位になる。細胞培養物の生理的状態の制御は、経路分析後可能になる。本発明の方法は、望ましい向きに沿って移動する細胞の生理的状態を制御するために基質供給、温度、誘導物質の使用等をどのように変化すべきかを求めることにより、発酵をどのように操作するかの決定を援助することができる。本発明の方法を実施する際に、MFA結果とトランスクリプトームとプロテオームデータとを比較して代謝操作又は遺伝子シャッフリング等の実験やプロトコールを設計することができる。
本発明の方法を実施する際に、細胞における新しい又は改善された特徴を含む修飾した又は新しい表現型を与え検出することができる。代謝又は発育の態様はモニターすることができる。
【０２２２】
mRNA転写物の発現のモニタリング
本発明の一態様においては、操作した表現型は、細胞におけるmRNA転写物の発現の増強又は減弱又は新しい転写物の作成を含んでいる。mRNA転写物、又はメッセージを、例えば、ノーザンブロット、定量的増幅反応、アレイに対するハイブイリダイゼーション等を含む当該技術において既知の方法により検出し定量することができる。定量的増幅反応には、例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ鎖反応、又はRT-PCR; 定量的リアルタイムRT-PCR、又は“リアルタイム動力学的RT-PCR”などを含む定量的PCRが含まれる(例えば、Kreuzer (2001) Br. J. Haematol. 114:313-318; Xia (2001) Transplantation 72:907-914を参照のこと)。
本発明の一態様においては、相同遺伝子の発現を破壊することにより操作した表現型が作成される。遺伝子のコード配列又は1つ以上の転写制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサーを破壊することができる。従って、転写物の発現は、完全に除去され減弱だけすることもできる。
本発明の態様においては、操作した表現型は相同遺伝子の発現の増強を含んでいる。これは、シス-又はトランス-に作用する転写調節要素を含む負の制御要素を破壊するか、又は正の制御要素を変異導入することにより行うことができる。
詳細に述べたように、細胞の転写物の１つ以上又は全部は、細胞の転写物、又は細胞の転写物の代表的な又はそれに相補的な核酸を含む試料のハイブイリダイゼーションによって、アレイ上に固定された核酸に対するハイブイリダイゼーションによって測定することができる。
【０２２３】
ポリぺプチド、ぺプチド、アミノ酸の発現のモニタリング
本発明の一態様においては、操作した表現型は細胞におけるポリぺプチドの発現の増強又は減弱又は新しいポリぺプチドの生産を含んでいる。ポリぺプチド、ぺプチド、アミノ酸は、例えば、核磁気共鳴(NMR)、分光光度法、ラジオグラフィー(例えば、タンパク質放射性標識)、電気泳動、毛管電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、超核酸クロマトグラフィー、種々の免疫学的方法、例えば、免疫沈降、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ、(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、ゲル電気泳動(例えば、SDS-PAGE)、抗体による染色、蛍光活性化細胞選別(FACS)、熱分解質量分析、フーリエ-トランスフォーム赤外分析、ラマン分光法、GC-MS、又はLC-エレクトロスプレー又はキャップ-LC-タンデム-エレクトロスプレー質量分析等を含む当該技術において既知の方法で検出し定量することができる。新規な生物活性は、また、米国特許第6,057,103号に記載されている方法、又はその変法を用いてスクリーニングすることができる。更に、後に詳述されるように、細胞のポリぺプチドの１つ以上、又はすべてをタンパク質アレイを用いて測定することができる。
一様に13C標識と非標識した炭素源化合物の混合物を生物反応網へ供給することにより、タンパク質原性アミノ酸の生物合成特異的部分13C標識モニターすることができる。得られた標識パターンの分析は、ネットワークトポロジーの網羅的な確認とアミノ酸の代謝フラックス分率の定量を可能にする; 例えば、Szyperski (1999) Metab. Eng. 1:189-197を参照のこと。
次の実施例は、本発明を具体的に示すものであるが、制限するものではない。実施例に記載される手順は本発明のある種の態様を行うために使用し得る手順の典型であり、当業者に既知の他の手順も使用し得る。
【０２２４】
実施例１
大腸菌(K12株)由来の野生型フィターゼappA遺伝子(配列番号3)(図13)は、野生型フィターゼ(配列番号4)(図14)をコードする遺伝子であり、これを用いてGSSM修飾ポリヌクレオチドを調製した。修飾ポリヌクレオチドは、配列番号1(図1A)に示された塩基配列をもち、非グリコシル化フィターゼ(配列番号:2)(図1B)をコードしている。特にGSSMを用いて大腸菌K12 appAの耐熱性を高める単一点変異を見出した。耐熱性を高める点変異を含む8つの変異ポリヌクレオチドを識別した。これら8つの変異は、図8Aと8Bに示されるように、単一のタンパク質へ組換えられた。
野生型で変異導入したポリヌクレオチドは、大腸菌中で発現させた後、精製して均一にした。耐熱アッセイにおいて、100mM MOPS/pH7.0中の100μlの0.01mg/mlのタンパク質をRJリサーチサイクラー中で37℃、50℃、60℃、70℃、80℃又は90℃に加熱した。前記温度で5分間の加熱後、試料を4℃まで冷却し、氷上でインキュベートした。活性アッセイは、1.5mlの100mM NaOAc/4mMフィチン酸塩/pH4.5中の40μlの酵素溶液を用いて37℃で行なった。60μlのアリコートを2分間隔で回収し、TNOアッセイ用の60μlの発色剤／停止液を加えた。この方法は、溶液中のリン酸塩を検出する業界標準の技術として知られており、A.J.Engelenら(“Related Articles Simple and rapid determination of phytase activity”, J.AOAC Int. 1994 May-Jun 77(3):760-4)に記載されている。大腸菌の野生型appA酵素と比較して8アミノ酸が変化した修飾酵素である配列番号2は、野生型酵素よりも高い温度まで耐熱性を示すことは明らかである(図3を参照のこと)。
【０２２５】
実施例２
人工消化条件におけるフィターゼ酵素の安定性
本実施例は、配列番号2のグリコシル化フィターゼと非グルコシル化フィターゼの消化に対する人工胃腸液の影響を示すものである。試験管内で消化した大腸菌K12株と配列番号2の非グリコシル化フィターゼの残存活性%(初期速度に対する割合)を時間に対してプロットした。2mg/ml NaCl、6MHCl及び3.2mg/mlペプシンを含有する標準濃度の人工胃腸液(SGIF)を記載のように調製した。この溶液のpHは約1.4であり、調整しなかった。試験管内消化性アッセイは、消化溶液に1:4(vol:vol)のフィターゼを添加し、すぐに37℃でインキュベートして消化反応を開始させることで行った。この消化反応混合物のアリコートを種々の時間間隔で取り出し、TNOアッセイを用いて残存するフィターゼ活性をアッセイした。各アッセイは少なくとも2回行った。式y=Ae-ktの指数曲線をこれらのデータに当てはめた。タンパク質の半減期は式t1/2=ln 2/kを用いて求めた。大腸菌K12株フィターゼの半減期はわずか2.7±0.2分であったが、配列番号2の非グリコシル化フィターゼの半減期は8.4±1.1分であった。従って、野生型大腸菌K12株フィターゼの変異は試験管内消化条件下で酵素の安定性を高めるものであった。図4参照。
【０２２６】
実施例3
ペプシン消化フィターゼのグリコシル化による安定化
ペプシンは胃腸液の主要な成分であるため、ペプシンを人工胃腸液として用い、ペプシンに曝した状態で、フィターゼ酵素活性の半減期に対して、グリコシル化がどのような影響を与えるか評価するための実験を行なった。ペプシンに曝したフィターゼの半減期を検査した結果を図5に示す。これらの結果は、フィターゼのグリコシル化形態が、酵素の非グリコシル化形態よりも長い半減期を有することを示した。
コンピュータ分析により、グリコシル化により翻訳後修飾された推定残留アミノ酸残基を予測する方法が提供されている。ワールドワイドウェッブ上のアドレスexpasy.chサイト上で提供されているPost-translational Modification Predictionプログラムを用いて、フィターゼのグリコシル化部位の予測を行なった。グリコシル化されたペプチドの同定は、前記ウェブサイトで提供されているPeptideMassプログラムによりマッピングした。予測されるフィターゼのグリコシル化部位を図6に示す。
次いで、ピキア・パトリス(Pichia pastoris)とS.セレビシエ(S.cerevisiae)中で発現したフィターゼのグリコシル化タイプを決定するための実験を行なった。各生物からタンパク質を精製した後、20mMトリスpH7.5を含むバッファー中の50μgのフィターゼに1mUのO-グリコシダーゼ(Roche Molecular Biochemicals、ドイツ)を添加することによって、タンパク質からO-グリコシル化鎖と推定される部分を取り出し、次いで、37℃にて一晩インキュベートした。50mUのエンドグリコシダーゼH(Roche Molecular Biochemicals、ドイツ)を50mMリン酸ナトリウムpH6.5を含むバッファー中の50μgのフィターゼに添加することによってN-グリコシル化鎖を取り出し、37℃で一晩インキュベートした。これらの消化処理後、1μgのタンパク質を12%トリス-グリシンゲル(Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア州)で分析した。結果の概要を表形式で図7に示す。
【０２２７】
次いで、最大ペプチドマッピング(図8A)とグリコシル化マッピング(図8B)のために、質量スペクトル分析によりタンパク質の分析を行なった(データは示していない)。本実験では、全てのタンパク質は変性、還元、アルキル化させる必要がある。このための処理をを簡単に説明すると、同量の8M尿素(Sigma、ミシガン州)をフィターゼ溶液に添加し、30分間37℃でインキュベートした。タンパク質の還元には、新鮮に作られたDTT(10mg/ml)(Sigma、ミシガン州)を最終的な濃度が0.04gm/mlとなるように前記混合液に添加し、次いで、30分間37℃でインキュベートした。次に、20mg/mlのヨードアセトアミド(Sigma、ミシガン州)を最終的な濃度が20μg/mLとなるように還元タンパク質混合液に加えて、30分間37℃でインキュベートし、アルキル化を行なった。
フィターゼタンパク質を変性、還元、アルキル化した後、該タンパク質を34mM NaClと0.08N HClを含むバッファー中にて透析した。ペプシン(5〜20mg/ml)を加えてフィターゼを37℃で一晩消化させた。タンパク質が完全に消化されたかは、SDS-PAGEで分析し得る。
ペプシンにより消化されたフィターゼ断片を、20mMトリス、pH7.4、0.5M NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM MgCl2を含むバッファー中のCon A カラム(Pharmacia Biotech、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に装填した。前記カラムは、前記バッファーにより頻繁に洗浄した。グリコシル化ペプチドは、0.5M D-メチルマンノシドを含む20mMトリスバッファーpH7.5を用いて溶出させた。
MALDIマススペクトル分析において、ペプチド又はタンパク質分析実験には、2種類のマトリックスを用いた。タンパク質分析には、49.9%水、50%メタノール、0.1%TFAに溶解した3,5-ジメトキシ-4-ヒドロキシコハク酸(10mg/ml)を用いた。ペプチド分析には、50%メタノール、49.9%エタノール、0.1%TFAに溶解したα-シアノ-4-ヒドロキシコハク酸(10mg/ml)を用いた。スチール製のプローブチップを用いて、1μlの試料を1μlのマトリックス液と十分に混合した。マトリックスと混合した試料を、プローブ上で空気乾燥させ、Voyager-DE STR装置（PE Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州）で分析した。
S.セレビシエとP.パストリス由来フィターゼのグリコシル化部位を、図9Aと9Bに示す。これらの実験の結果を図10に纏めた。
【０２２８】
実施例４
発現ホストの比較
配列番号1由来のGSSM DNA構築物を、発現のために大腸菌、P.パストリス、S.ポンベに挿入した。発現したタンパク質を均質になるまで精製した。耐熱アッセイでは、100mM MOPS,pH7.0中0.01mg/mlタンパク質の100μlをRJリサーチサーモサイクラーで5分間所定のインキュベーション温度まで加熱した。その温度にて5分が完了したら、サンプルを4℃まで冷却し、氷上でインキュベートした。活性アッセイは37℃にて100mM NaOAc/4mMフィチン酸塩/pH4.5の1.46mL中40μlの酵素溶液を用いて行った。2分毎に60μlアリコートを採取し、TNOアッセイの発色剤/停止液60μlに加えた(図11参照)。
【０２２９】
実施例５
試験管内で消化した組換えフィターゼ(配列番号2)を大腸菌(非グリコシル化)、S.ポンベ(グリコシル化)、P.パストリス(グリコシル化)で発現させたものの残存活性%(初期速度に対する割合)を時間に対してプロットした。2mg/ml NaCl、6M HCl、3.2mg/mLペプシンを含有する標準濃度の人工胃液をS.O.P.に記載のように調製した。この溶液のpHは1.4であり、調整しなかった。試験管内消化性アッセイは、消化溶液に1:4(vol:vol)のフィターゼを添加し、すぐに37℃でインキュベートして消化反応を開始させることで行った。この消化反応混合物のアリコートを種々の時間間隔で取り出し、TNOアッセイを用いて残存するフィターゼ活性をアッセイした。各アッセイは3回行った。式y=Ae-ktの指数曲線をこれらのデータに当てはめた。タンパク質の半減期は式t1/2=ln 2/kを用いて求めた。大腸菌で発現した配列番号2の非グリコシル化フィターゼの半減期は8,4±1.1分であったが、S.ポンベで発現したグリコシル化フィターゼの半減期10.4±0.9分であり、P.パストリスで発現した同じフィターゼの半減期は29.2±6.7分であった。従って、配列番号2フィターゼのグリコシル化は試験管内人工消化条件下で酵素の安定性を高めるものであった(図12参照)。
【０２３０】
実施例5
大腸菌、P.パストリス、S.ポンベ中で発現したときの本発明のGSSM修飾フィターゼ(SEQ ID NO:2)の耐熱性を検査するため、試料を37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃で5分間加熱した後、比活性アッセイを行なった。大腸菌中に発現した野生型のK12フィターゼ(配列番号3)は、対照として用いた。ミリグラム単位で測定した酵素の37℃における比活性範囲を、上述のTNO手順に従って、pH4.5で測定した。耐熱性／特定活性検査の結果を下記の表3に纏めた。
【０２３１】
表3
大腸菌や酵母中に発現した配列番号2フィターゼの耐熱性と比活性
2005505254.tif 000006
【０２３２】
これらの検査の結果から、P.パストリスとS.ポンベ中で発現させて得たグリコシル化フィターゼ酵素が37℃より高い温度に曝したときに、野生型酵素と比較して優れた耐熱性を示し、また、GSSM修飾された非グリコシル化フィターゼと比較すると、更に向上した耐熱性を示すことがわかる。その上、S.ポンベでの酵素の発現は、70℃〜90℃の温度に曝した後の酵素比活性の少なくとも半分(610〜100単位/mgタンパク質)が保持した状態で、最も高い耐熱性を有する。それに対して、野生型の酵素は、前記温度範囲では比活性がゼロであり、大腸菌発現(非グリコシル化)GSSM修飾フィターゼ(配列番号2)でさえ、70℃〜90℃の範囲の温度に5分間曝した後に、わずか100-500単位/mg酵素の酵素活性しか保持していなかった。従って、配列番号2のフィターゼのグリコシル化は、耐熱性を向上させ、高温曝露後に酵素の比活性を向上させる。
【０２３３】
引用文献
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【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】図1Aは修飾フィターゼ(配列番号1)のヌクレオチド配列を示す図である。図1Bは修飾フィターゼ(配列番号2)のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図2Aと図2Bは本発明のフィターゼ酵素(配列番号2)のpHと温度のプロファイルと安定性データを示すグラフである。図2のグラフのY軸にはOD/700nmが示されている。グラフのX軸には温度又はpHが示されている。
【図３】配列番号4 (野生型フィターゼ)と配列番号2 (修飾フィターゼ)間の耐熱性分析の結果を示すグラフである。ペプシンによる人工胃腸酸(SGF)において残存フィターゼ活性を示すグラフである。種々の発現ホスト中で発現した試験管内消化組換えフィターゼ(配列番号2)の残存活性% (最初の比率に基づく)を時間に対してプロットした。フィターゼは、大腸菌(非グリコシル化)又は、S.ポンベ又はP.パストリス(グリコシル化)中で発現した。
【図４】人工胃腸液としてペプシンを用いたシミュレート消化性条件下でK12SGFフィターゼと配列番号2フィターゼ(非グリコシル化)の残存活性% を示すグラフである
【図５】人工胃腸液としてのペプシンに曝した後に大腸菌、P.パストリス、S.セレビシエ由来のフィターゼの相対半減期を求めるように設計された実験からのデータを示す表である。
【図６】太字のグリコシル化部位が予想されたフィターゼ酵素のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】O-グリコシダーゼとEndo Hで消化したP.パストリスとS.セレビシエフィターゼタンパク質の12% トリス-グリシンゲルによる分析から得られた結果を表形式で示す図である。
【図８】図8Aは最大ぺプチドマッピングのステップを示す概略図である。図8Bはグリコシル化ぺプチドマッピングのステップを示す概略図である。
【図９】図9Aは配列番号4の部分配列において実験的に示された太字を求めた残基がグリコシル化されたP.パトリス中で発現した配列番号2フィターゼのアミノ酸配列を示す図である。図9Bは配列番号4の部分配列において実験的に示された太字を求めた残基がグリコシル化されたS.セレビシエ中で発現した配列番号2フィターゼのアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】配列番号4の部分配列をもつ9Aと図9Bのフィターゼのグリコシル化マッピングの結果を示すまとめである。
【図１１】種々のホスト細胞における修飾フィターゼ(配列番号2)の発現用耐熱性分析の結果を示すグラフである。
【図１２】ペプシンでシミュレートした胃腸管(SGF)を用いた試験管内消化性分析に曝した後の配列番号2フィターゼの残存活性を示すグラフである。残存活性(最初の比率に基づく)は大腸菌(非グリコシル化)、又はP.パストリス又はS. ポンベ(グリコシル化)での発現が示されている。
【図１３】野生型大腸菌appAフィターゼ(配列番号3)をコードしている核酸を示す図である。
【図１４】野生型大腸菌appAフィターゼポリぺプチド(配列番号4)のアミノ酸配列を示す図である。
【図１５】後に詳述されるコンピュータシステムのブロック図である。
【図１６】後に詳述される新しい配列とデータベースの配列と間の相同レベルを求めるために新しいヌクレオチド又はタンパク質配列とデータベースの配列とを比較するプロセス200の一態様を示す流れ図である。
【図１７】後に詳述される、2つの配列が相同であるかを求めるためのコンピュータでの一実施態様を示す流れ図である。
【図１８】後に詳述される、配列内の特徴の存在を検出するためのアイデンティファイアの一態様を示す流れ図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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