(57)【要約】本発明は、哺乳類における腫瘍増殖を低減または抑制するための方法であって、有効量のＶＥＧＦ受容体アンタゴニストおよび放射線および／または付加的受容体アンタゴニストの組合せを用いて哺乳類を治療することを包含する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍増殖の抑制方法であって、治療的有効量の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストならびに治療的有効量の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニストをヒトに投与することを包含する方法。
【請求項２】
腫瘍増殖の抑制方法であって、治療的有効量の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストおよび放射線をヒトに投与することを包含する方法。
【請求項３】
腫瘍増殖の抑制方法であって、治療的有効量の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストおよび化学療法薬をヒトに投与することを包含する方法。
【請求項４】
腫瘍がＶＥＧＦＲを過剰発現する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
腫瘍が乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部または肝臓の腫瘍である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
腫瘍が結腸の腫瘍である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
腫瘍が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストが静脈内に投与される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストが経口的に投与される請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストがＶＥＧＦＲとそのリガンドとの結合を阻害する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストがＶＥＧＦＲを結合する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストがＶＥＧＦＲに特異的な抗体またはその機能的等価物を包含する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストがＶＥＧＦＲに特異的な小分子を包含する請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストがｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体（ｆｌｔ−１）ＶＥＧＦＲ−１のアンタゴニストである請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
抗腫瘍薬を投与することをさらに包含する請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
抗腫瘍薬が化学療法薬または放射線である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
アジュバントを投与することをさらに包含する請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍がＥＧＦＲを過剰発現する請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＥＧＦＲアンタゴニストが静脈内に投与される請求項１、４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＥＧＦＲアンタゴニストが経口的に投与される請求項１、４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＥＧＦＲアンタゴニストがＥＧＦＲとそのリガンドとの結合を阻害する請求項１、４〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ＥＧＦＲアンタゴニストがＥＧＦＲを結合する請求項１、４〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ＥＧＦＲアンタゴニストがＥＧＦＲとＡＴＰとの結合を阻害する請求項１、４〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＥＧＦＲアンタゴニストがＥＧＦＲに特異的な抗体またはその機能的等価物を包含する請求項１、４〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＥＧＦＲアンタゴニストがＥＧＦＲに特異的な小分子を包含する請求項１、４〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
抗体がヒト抗体の定常部を含む請求項１、４〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
抗体がマウス抗体の可変部を含む抗体である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
抗体が、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト抗体の枠組み構造領域を有する可変部を含むヒト化抗体である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
抗体がヒト抗体の可変部を含むヒト抗体である請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
化学療法薬がＶＥＧＦ受容体アンタゴニストに接合されない請求項３〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
化学療法薬が、シスプラチン、ジカルバジン、ダクチノマイシン、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、インターフェロンα、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトーテン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルおよびタキソールならびにそれらの組合せからなる群から選択される請求項３〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
化学療法薬がシスプラチン、ドキソルビシン、タキソールおよびそれらの組合せからなる群から選択される請求項３〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
治療的有効量の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニストおよび治療的有効量の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストを含む腫瘍増殖抑制キット。
【請求項３４】
ＥＧＦＲアンタゴニストがＥＧＦＲに特異的な抗体またはその機能的等価物を包含する請求項３３記載のキット。
【請求項３５】
ＥＧＦＲアンタゴニストがＥＧＦＲに特異的な小分子を包含する請求項３３記載のキット。
【請求項３６】
ＶＥＧＦＲアンタゴニストがＶＥＧＦＲに特異的な抗体またはその機能的等価物を包含する請求項３３〜３５のいずれかに記載のキット。
【請求項３７】
ＶＥＧＦＲアンタゴニストがＶＥＧＦＲに特異的な小分子を包含する請求項３３〜３５のいずれかに記載のキット。
【請求項３８】
抗腫瘍薬をさらに含む請求項３３〜３７のいずれかに記載のキット。
【請求項３９】
アジュバントをさらに含む請求項３３〜３８のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体アンタゴニストを化学療法薬、放射線および／または異なる増殖因子受容体アンタゴニストと組合せて利用する腫瘍の治療方法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
胚および成体生物体における先存血管からの毛細血管の形成を指す血管新生は、腫瘍増殖、存続および転移における重要な素子であることが既知である。増殖因子およびそれらの受容体、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ならびに血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、腫瘍血管新生において一役を演じると考えられる（Klagsbrun & D’Amore, Annual Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991)参照）。これらの増殖因子とそれらの細胞表面受容体との結合は受容体活性化を誘導し、これがシグナル伝達経路を開始し、修正して、細胞増殖および分化をもたらす。内皮細胞特異的マイトジェンであるＶＥＧＦは、それが内皮細胞の増殖を特異的に促進することにより血管新生誘導物質として作用する場合、これらの因子の間で異なる。
【０００３】
ＶＥＧＦは2つの23 kDサブユニットから成るホモ二量体糖タンパク質であり、血管透過性の強力な誘導物質、内皮細胞移動および増殖の刺激剤、ならびに新規形成血管のための重要な存続因子である。ｍＲＮＡの代替的スプライシングに起因するＶＥＧＦの4つの異なる単量体アイソフォームが存在する。これらは2つの膜結合形態（ＶＥＧＦ206およびＶＥＧＦ189）および２つの可溶性形態（ＶＥＧＦ165およびＶＥＧＦ121）を含む。胎盤を除くすべてのヒト組織において、ＶＥＧＦ165は最も豊富なアイソフォームである。
【０００４】
ＶＥＧＦは、in situでの内皮細胞前駆体（血管芽細胞）の分化からの新規の血管のde novo発生である血管形成の重要な調節物質であり、胚組織（Breier et al., Development (Camb.), 114: 521 (1992)）、マクロファージ、創傷治癒中の増殖中上皮ケラチノサイト（Brown et al., J. Exp. Med., 176: 1375 (1992)）中で発現され、そして炎症に関連した組織浮腫に関与し得る（Ferrara et al., Endocr. Rev., 13: 18 (1992)）。多数のヒト腫瘍系、例えば神経膠芽細胞腫多形、血管芽細胞腫、中枢神経系新生物およびエイズ関連カポジ肉腫中での高ＶＥＧＦ発現をin situハイブリダイゼーション試験は実証した（Plate et al. (1992) Nature 359: 845-848; Plate et al. (1993) Cancer Res. 53: 5822-5827; Berkman et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 153-159; Nakamura et al. (1992) AIDS Weekly, 13 (1)）。高レベルのＶＥＧＦは、低酸素症誘発性血管新生においても観察された（Shweiki et al. (1992) Nature 359: 843-845）。
【０００５】
ＶＥＧＦの生物学的応答は、胚形成中（Millauer, Cell, 72: 835-846 (1993)）および腫瘍形成中に内皮細胞上で選択的に発現されるその高親和性受容体により媒介される。ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）は典型的には、それらのアミノ末端細胞外受容体リガンド結合ドメイン中に数個の、典型的には5または7個の免疫グロブリン様ループを有することを特徴とするクラスＩＩＩ受容体型チロシンキナーゼである（Kaipainen et al., J. Exp. Med., 178: 2077-2088 (1993)）。他の2つの領域は、キナーゼインサートドメインと呼ばれる可変長の親水性インターキナーゼ配列の挿入により遮断される膜貫通領域およびカルボキシ末端細胞内触媒ドメインを含む。ＶＥＧＦＲとしては、Shibuya等（Oncogene, 5: 519-524 (1990)）によりシーケンシングされたｆｉｎｓ様チロシンキナーゼ受容体（ｆｉｔ−１）またはＶＥＧＦＲ−１、あるいはWO 92/14248（1992年2月20日提出）およびTerman et al., Oncogene, 6: 1677-1683 (1991)に記載され、Matthews等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991)）によりシーケンシングされたキナーゼインサートドメイン−含有受容体／胎児肝臓キナーゼ（ＫＤＲ／ｆｌｋ−１）またはＶＥＧＦＲ−２が挙げられるが、その他の受容体、例えばニューロピリン−１および−２もＶＥＧＦを結合し得る。もうひとつのチロシンキナーゼ受容体ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）は、ＶＥＧＦ相同体ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄを結合し、リンパ管の発生においてより重要である。
【０００６】
高レベルのＦｌｋ−１は、神経膠腫に浸潤する内皮細胞により発現される（Plate et al., (1992) Nature 359: 845-848）。Ｆｌｋ−１レベルは、ヒト神経膠芽細胞腫により産生されるＶＥＧＦにより特異的に上向き調節される（Plate et al. (1993) Cancer Res. 53: 5822-5827）。神経膠芽細胞腫関連内皮細胞（ＧＡＥＣ）中での高レベルのＦｌｋ−１発現の知見は、Ｆｌｋ−１転写体が正常脳内皮細胞中ではほとんど検出可能でないため、受容体活性がおそらくは腫瘍形成中に誘導される、ということを示す。この上向き調節は、腫瘍に極接近した血管内皮細胞に限定される。中和抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＶＥＧＦ活性の遮断は、ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖抑制を生じた（Kim et al. (1993) Nature 362: 841-844）が、このことは、腫瘍関連血管新生におけるＶＥＧＦに関する直接的役割を示す。
【０００７】
ＶＥＧＦリガンドは腫瘍細胞中で上向き調節され、そしてその受容体は腫瘍浸潤血管内皮細胞中で上向き調節されるが、しかしＶＥＧＦリガンドおよびその受容体の発現は、血管新生に関連しない正常細胞中では低い。したがってこのような正常細胞は、ＶＥＧＦおよびその受容体間の相互作用を遮断して、血管新生を、したがって腫瘍増殖を抑制することによる影響を受けない。
【０００８】
本発明の目的は、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストを提供することである。本発明のさらなる目的は、このようなＶＥＧＦ受容体アンタゴニストを用いて、特に放射線、化学療法または別の受容体アンタゴニストと組合せたこのようなＶＥＧＦ受容体アンタゴニストを用いて、血管新生を抑制し、それにより哺乳類における腫瘍増殖を抑制または低減する方法を提供することである。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
本発明は、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストおよび別の受容体アンタゴニストの有効量の組合せを投与することにより哺乳類における腫瘍増殖を低減または抑制する方法を提供する。ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストおよび放射線の有効量の組合せを投与することにより哺乳類における腫瘍増殖を低減または抑制する方法も、本発明により提供される。さらに本発明は、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストおよび化学療法薬の有効量の組合せを投与することにより哺乳類における腫瘍増殖を低減または抑制する方法を提供する。
本発明の詳細な説明
【００１０】
本発明は、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストと組合せて放射線照射、化学療法および／または付加的受容体アンタゴニストを用いて哺乳類における腫瘍増殖を低減または抑制するための方法を提供する。
【００１１】
好ましい実施態様では、腫瘍、例えばヒト腫瘍が、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストを化学療法薬、放射線または付加的受容体アンタゴニストあるいはそれらの組合せとともに用いて治療される場合に、相乗作用が認められる。言い換えれば、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストによる腫瘍増殖の抑制は、化学療法薬、放射線または付加的受容体アンタゴニストあるいはそれらの組合せと組合せた場合、予期されるより以上に強化される。相乗作用は、例えばＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ならびに化学療法薬、放射線または付加的受容体アンタゴニストによる治療の付加的作用から予期されるより大きい併用治療による腫瘍増殖の抑制により示され得る。好ましくは相乗作用は癌の寛解により実証されるが、この場合、寛解はＶＥＧＦ受容体アンタゴニストおよび化学療法薬、放射線または付加的受容体アンタゴニストの組合せを用いた治療から予期されない（実施例ＶＩＩＩ参照）。
【００１２】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストは、化学療法または放射線療法並びにそれらの任意の組合せの開始の前、最中または後に、即ち化学療法および／または放射線療法の開始の前および最中、前および後、最中および後、あるいは前および後に投与される。例えばＶＥＧＦ受容体アンタゴニストが抗体である場合、抗体は典型的には放射線療法および／または化学療法の開始の1〜30日前に、好ましくは3〜20日前、さらに好ましくは5〜12日前に投与される。
【００１３】
放射線照射
【００１４】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストと組合せて用いられる放射線の供給源は、治療される患者に対して外部または内部であり得る。供給源が患者に対して外部である場合、療法は外部ビーム照射療法（ＥＢＲＴ）として既知である。放射線の供給源が患者に対して内部である場合、治療は近接照射療法（ＢＴ）と呼ばれる。
【００１５】
放射線は、この目的のために製造された標準設備、例えばＡＥＣＬセラトロンTheratronおよびバリアンクリナックVarian Clinacを用いて、周知の標準技法にしたがって投与される。放射線の線量は、当業界で周知であるような多数の因子によっている。このような因子としては、処置される器官、誤まって悪影響を及ぼされ得る放射線の通り道における健常器官、放射線療法に対する患者の耐容性ならびに治療を必要とする身体の領域が挙げられる。線量は、典型的には1〜100Gy、さらに好ましくは280Gyである。報告されたいくつかの線量としては、脊椎に対する35 Gy、腎臓に対する15 Gy、肝臓に対する20 Gyおよび前立腺に対する65〜80 Gyが挙げられる。しかしながら、本発明はいかなる特定の線量にも限定されない、ということは強調されるべきである。線量は、前記の因子を含めた所定の状況における特定の因子にしたがって治療医により確定される。
【００１６】
外部放射線の供給源と患者中への進入点との間の距離は、標的細胞の殺害と副作用の最小化との間の許容可能な平衡を示す任意の距離であり得る。典型的には、外部放射線の供給源は、患者中への進入点から70〜100 cmである。
【００１７】
近接照射療法は一般に、患者中に放射線源を配置することにより実行される。典型的には、放射線源は、処置される組織から約0〜3 cmに配置される。既知の技法としては、間隙、腔間、および表面近接照射療法が挙げられる。放射性核種が、永久的にまたは一時的に移植され得る。永久移植片に用いられたいくつかの典型的放射性原子としては、ヨウ素−１２５およびラドンが挙げられる。一時的移植片に用いられたいくつかの典型的放射性原子としては、ラジウム、セシウム−１３７およびイリジウム−１９２が挙げられる。近接照射療法に用いられたいくつかの付加的放射性原子としては、アメリシウム−２４１および金−１９８が挙げられる。
【００１８】
近接照射療法のための放射線の線量は、外部ビーム放射線療法に関して前記されたものと同一であり得る。外部ビーム放射線療法の線量の確定に関して前記された因子のほかに、用いられた放射性原子の性質も、近接照射療法の線量確定に際して考慮に入れられる。
【００１９】
化学療法
【００２０】
化学療法薬としては、腫瘍増殖を抑制するのに有効であるすべての化学化合物が挙げられる。
【００２１】
化学療法薬の投与は、種々の方法で、例えば非経口的および経腸的経路により全身的に成し遂げられ得る。一実施態様では、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストおよび化学療法薬は別個の分子として投与される。別の実施態様では、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストは化学療法薬と、例えば接合により、結合される。
【００２２】
化学療法薬の例としては、アルキル化薬、例えばナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物およびアルキルスルホネート；代謝拮抗物質、例えば葉酸、プリンまたはピリミジンアンタゴニスト；有糸分裂阻害剤、例えばツルニチニチソウアルカロイドおよびポドフィロトキシン；細胞傷害性抗生物質；ＤＮＡ発現を損害または妨害する化合物が挙げられる。
【００２３】
さらに化学療法薬としては、本明細書中に記載されたような抗体、生物学的分子および小分子が挙げられる。
【００２４】
化学療法薬または化学療法の特定の例としては、シスプラチン、デカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテレ）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、インターフェロンα、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトーテン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、タキソールならびにそれらの組合せが挙げられる。
【００２５】
増殖因子受容体アンタゴニスト
【００２６】
本発明の情況で用いられ得る増殖因子受容体アンタゴニスト（ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト以外）としては、増殖因子受容体リガンドにより増殖因子受容体の刺激を抑制するすべての物質が挙げられる。このような刺激抑制は、増殖因子受容体を発現する細胞の増殖を抑制する。
【００２７】
腫瘍形成に関与する増殖因子受容体のいくつかの例は、上皮増殖因子（ＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦＲ）、神経増殖因子（ＮＧＦＲ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に対する受容体である。
【００２８】
好ましくは本発明に用いられる増殖因子受容体アンタゴニストは、ＥＧＦＲアンタゴニストである。ＥＧＦＲアンタゴニストは、本発明の情況においては、ＥＧＦＲ活性化を抑制し、それによりＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を抑制して、受容体自己リン酸化および種々のＥＧＦＲシグナリング経路に関与するその他のタンパク質のリン酸化を防止する生物学的分子、小分子または任意のその他の物質である。ＥＧＦＲの活性化の抑制とは、ＥＧＦＲの活性化における任意の低減を意味し、これはＥＧＦＲの活性化を完全に防止または停止する必要はない。
【００２９】
さらに、本発明により記載されたようなＥＧＦＲの抑制は、ＥＧＦＲアンタゴニストおよび受容体の相互作用に起因するＥＧＦＲの抑制を意味する。相互作用とは、チロシンキナーゼ活性が抑制されるような、ＥＧＦＲアンタゴニストおよび受容体間の十分な物理的または化学的相互作用を意味する。会合または結合を含めたこのような化学的相互作用の例は当業界で既知であり、例えばＥＧＦＲアンタゴニストと受容体との間の共有結合、イオン結合、水素結合等が挙げられる、と当業者は理解する。これは、リガンドと相互作用し、それにより活性化を抑制するＥＧＦアンタゴニストと対照をなす。
【００３０】
その他の増殖因子に関する場合と同様に、ＥＧＦＲ活性化増大は、高レベルのリガンド、ＥＧＦＲ遺伝子増幅、受容体の転写増大または非調節化受容体シグナリングを生じる突然変異に起因し得る。ＥＧＦＲをコードする遺伝子の増幅は、ＥＧＦＲと結合するリガンド数増大を引き起こし、これがさらに細胞増殖を刺激し得る。ＥＧＦＲはまた、おそらくはＥＧＦＲ転写、ｍＲＮＡ翻訳またはタンパク質の安定性を増大する突然変異により、遺伝子増幅の非存在下で過剰発現され得る。ＥＧＦＲ突然変異体は、構成的活性チロシンキナーゼを有する神経膠腫、非小細胞肺癌、卵巣癌および前立腺癌において同定されたが、このことは、これらの癌におけるＥＧＦＲ過剰発現というよりむしろ高レベルＥＧＦＲ活性に関する役割を示唆する（例えばPedersen et al., Ann. Oncol., 12(6): 745-60 (2001)参照）。（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｄｅ２〜７ＥＧＦＲまたはＡＥＧＦＲと様々に呼ばれるＩＩＩ型ＥＧＦＲ突然変異は、エキソン２〜７によりコードされる細胞外リガンド結合ドメインの一部分を欠く）（Wikstrand et al., Cancer Res., 55: 3140-3148 (1995)も参照）。
【００３１】
本発明の一実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストはＥＧＦＲとそのリガンドとの結合を阻害する。リガンドとＥＧＦＲの外部細胞外ドメインとの結合は、受容体二量体化、ＥＧＦＲの自己リン酸化、受容体の内部細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、ならびにＤＮＡ合成および細胞分裂に関与する多重シグナル伝達経路の開始を刺激する。ＥＧＦＲに関するリガンドとしては、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）およびβレクルリンが挙げられる。ＥＧＦおよびＴＧＦ−αは、ＥＧＦＲ媒介性刺激を生じる主要内因性リガンドであると考えられるが、しかしＴＧＦ−αは血管新生を促す場合により強力であることが示されている。
【００３２】
本発明の別の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストはＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲアンタゴニストは、リガンドの結合を阻害し得る場合もあるＥＧＦＲの細胞外部分と外部的に、あるいはチロシンキナーゼドメインと内部的に結合し得る、と理解されるべきである。ＥＧＦＲを結合するＥＧＦＲアンタゴニストの例としては、生物学的分子、例えばＥＧＦＲに特異的な抗体（およびその機能的等価物）、ならびにＥＧＦＲの細胞質ドメインに直接作用する合成キナーゼ阻害剤、例えば小分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明のＥＧＦＲアンタゴニストは、好ましくは生物学的分子、さらに好ましくはＥＧＦＲに特異的な抗体またはその機能的等価物である。本発明に有用な抗体の説明は、「抗体」という表題の節に見出され得る。さらに以下の抗体結合、ＥＧＦＲ−抗体複合体は、好ましくはインターナライズされ、分解されて、細胞による受容体再利用を防止する。
【００３４】
既知の生物学的分子ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲに特異的なキメラ（ヒト／マウス）モノクローナル抗体であるＥＲＢＩＴＵＸTM（ＩＭＣ−Ｃ225）である（例えば米国特許第4,943,533号（Mendelsohn等）；米国特許第6,217,866号（Schlessinger等）；米国特許出願第08/973,065号（Goldstein等）および第09/635,974号（Teufel）；WO 99/60023（Waksal等）およびWO 00/69459（Waksal）参照）。モノクローナル抗体ＥＲＢＩＴＵＸTMはＥＧＦＲと特異的に結合し、リガンド、例えばＥＧＦの結合を遮断する。この遮断は、ＥＧＦＲ活性化の作用を妨害することにより、腫瘍侵襲、転移、細胞修復および血管新生の抑制を含めた腫瘍増殖の抑制を生じる。さらに、または代替的に、モノクローナル抗体ＥＲＢＩＴＵＸTMは受容体−抗体複合体のインターナライゼーションを促し、そのリガンドによる受容体のさらなる刺激または任意のその他のメカニズムを防止する。
【００３５】
生物学的分子ＥＧＦＲアンタゴニストの別の例はＡＢＸ−ＥＧＦであって、これはＥＧＦＲに特異的な全ヒトＩｇＧ2モノクローナル抗体である。ＡＢＸ−ＥＧＦは、高特異性でＥＧＦＲと結合し、ＥＧＦＲとそのリガンドＥＧＦおよびＴＧＦ−αの両方との結合を遮断する（例えばFiglin et al., Abstract 1102 presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001参照）。クローンＥ７．６．３として以前に既知であったＡＢＸ−ＥＧＦの配列および特性化は、米国特許第6,235,883号（Abgenix, Inc.）において、28段62行〜29段36行および図２９〜３４に開示されている（Yang et al., Critical Rev. Oncol./Hematol., 38(1): 17-23, 2001参照）。
【００３６】
代替的な、しかし好ましくもある実施態様では、本発明のＥＧＦＲアンタゴニストは小分子チロシンキナーゼ阻害剤である。小分子の説明は、表題「小分子」の節に見出され得る。多数の小分子がＥＧＦＲを阻害するのに有用であると記載されている。
【００３７】
例えばSpada等（米国特許第5,656,655号）は、ＥＧＦＲを阻害するスチリル置換化へテロアリール化合物を開示する。ヘテロアリール基は、1または2つの異種原子を有する一環式環、あるいは1〜約4つの異種原子を有する二環式環であり、化合物は任意に置換されるかまたは多重置換される。米国特許第5,656,655号に開示された化合物は、参照により本明細書中に含まれる。
【００３８】
Spada等（米国特許第5,646,153号）は、ＥＧＦＲを阻害するビス一および／または二環式アリール、へテロアリール、炭素環式およびヘテロ炭素環式化合物を開示する。米国特許第5,646,153号に開示された化合物は、参照により本明細書中に含まれる。
【００３９】
Brudges等（米国特許第5,679,683号）は、ＥＧＦＲを阻害する三環式ピリミジン化合物を開示する。化合物は、3段35行〜5段6行に記載された融合複素環式ピリミジン誘導体である。3段35行〜5段6行のこれらの化合物の説明は、参照により本明細書中に含まれる。
【００４０】
Barker（米国特許第5,616,582号）は、受容体チロシンキナーゼ阻害活性を有するキナゾリン誘導体を開示する。米国特許第5,616,582号に開示された化合物は、参照により本明細書中に含まれる。
【００４１】
Fry等（Science, 265: 1093-1095 (1994)）は、ＥＧＦＲを阻害する構造を有する化合物を開示する。Fry等の論文の図１に示された化合物は、参照により本明細書中に含まれる。
【００４２】
Osherov等（J. Biol. Chem., 268(15): 11,134-42 (1993)）は、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１およびＨＥＲ２を阻害するチルホスチンを開示する。Osherov等の論文に開示された化合物、特に表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ中の化合物は、参照により本明細書中に含まれる。
【００４３】
Levitzki等（米国特許第5,196,446号）は、ＥＧＦＲを阻害するヘテロアリールエチレンジイルまたはヘテロアリールエチレンジイルアリール化合物を開示する。米国特許第5,196,446号2段42行〜3段40行に開示された化合物は、参照により本明細書中に含まれる。
【００４４】
Panek等（J. Pharma. Exp. Thera., 283: 1433-1444 (1997)）は、受容体のＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＦＧＦＲファミリーを阻害するＰＤ１６６２８５と同定される化合物を開示する。ＰＤ１６６２８５は、1436ページの図１に示された構造を有する６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−（２−ジエチルアミノエトキシ）フェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−オンと同定される。Panek等の論文の1436ページの図１に記載された化合物は、参照により本明細書中に含まれる。
【００４５】
小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの一例は、ＩＲＥＳＳＡTM（ＺＤ1939）であって、これはＡＴＰ模倣物として機能してＥＧＦＲを阻害するキノザリン誘導体である（米国特許第5,616,582号（Zeneca Limited）；WO 96/33980（Zeneca Limited）p. 4参照。Rowinsky et al., Abstract 5 presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001; Anido et al., Abstract 1712 presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001）。
【００４６】
ＴＡＲＣＥＶＡTMは、小分子ＥＧＦＲアンタゴニストのもうひとつの例である。ＴＡＲＣＥＶＡTM（ＯＳＩ−７７４）は、４−置換化フェニルアミノキノザリン誘導体塩酸［６，７−ビス（２−メトキシ−エトキシ）−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニル−フェニル）アミンＥＧＦＲ阻害剤であり、これはWO 96/30347（Pfizer Inc.）の、例えば2ページ12行〜4ページ34行、および19ページ14〜17行に記載されている（Moyer et al., Cancer Res., 57: 4838-48 (1997); Pollack et al., J. Pharmacol., 291: 739-48 (1999)も参照）。ＴＡＲＣＥＶＡTMは、ＥＧＦＲのリン酸化およびその下流ＰＩ３／ＡｋｔおよびＭＡＰ（マイトジェン活性化タンパク質）キナーゼシグナル伝達経路を阻害することにより機能して、ｐ２７媒介性細胞終期停止を生じ得る(Hidalgo et al., Abstract 281 presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001参照)。
【００４７】
多数のその他の小分子は、ＥＧＦＲを阻害することが既知である。小分子ＥＧＦＲアンタゴニストのいくつかの例は、WO 91/116051、WO 96/30347、WO 96/33980、WO 97/27199（Zeneca Limited）、WO 97/30034（Zeneca Limited）、WO 97/42187（Zeneca Limited）、WO 97/49688（Pfizer Inc.）、WO 98/33798（Warner Lambert Company）、WO 00/18761（American Cyanamid Company）およびWO 00/31048（Warner Lambert Company）に記載されている。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストの例としては、チロシンキナーゼ、特にＥＧＦＲのキノザリン（Ｎ−［４−(３−クロロ−４−フルオロ−フェニルアミノ)−７−(３−モルホリン−４−イル−プロポキシ)−キノザリン−６−イル］−アクリルアミド）阻害剤であり、WO 00/31048（Warner Lambert Company）の8ページの22-6行に記載されているＣｌ−１０３３；ＥＧＦＲのピロロピリミジン阻害剤であり、WO 97/27199（Novartis AG）の10〜12ページに記載されているＰＫＩ１６６；ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の阻害剤であるＧＷ２０１６；ならびにＥκＢ５６９が挙げられる。
【００４８】
更なるＥＧＦＲアンタゴニストは、周知の方法を用いて容易に確定され得る。本発明のＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害し、これは一般にリン酸化事象を包含する。したがってリン酸化検定は、本発明の情況において有用なアンタゴニストを確定するのに有用である。チロシンキナーゼ活性に関するいくつかの検定は、Panek et al. (1997)およびBatley et al., Life Sci., 62: 143-50 (1998)に記載されている。さらにＥＧＦＲ発現の検出に特異的な方法が利用され得る。これらの例としては、タンパク質発現の検出のための免疫組織化学(ＩＨＣ)、遺伝子増幅の検出のための蛍光in situハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)、競合ラジオリガンド結合検定、固体マトリクスブロッティング技法、例えばノーザンおよびサザンブロット、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡが挙げられる(例えばGrandis et al., Cancer, 78: 1284-1292 (1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res., 85: 567-571 (1994); Sauter et al., Am. J. Path., 148: 1047-1053 (1996); Collins, Glia, 15: 289-296 (1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res., 1: 19-31 (1995); Petrides et al., Cancer Res., 50: 3934-3939 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res., 17: 4419-4426 (1997); Wikstrand et al., Cancer Res., 55: 3140-3148 (1995)参照)。
【００４９】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト
【００５０】
一実施態様では、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストはＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメイン上のエピトープと特異的に結合する。ＶＥＧＦ受容体の細胞外ドメインは、リガンド結合ドメインである。リガンド結合ドメインは受容体のいずれかの末端に見出され得るが、しかし普通はアミノ末端に見出される。
【００５１】
ＶＥＧＦ受容体のいくつかの例としては、ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、ＫＤＲおよびｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）として文献中に言及されたタンパク質チロシンキナーゼ受容体が挙げられる。別記しない限り、または本文により別の方法で明らかに示唆されない限り、本明細書は、ＶＥＧＦ受容体の通例の文献呼称に従う。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)は、分子量180 kDを有するヒト形態のＶＥＧＦ受容体として言及される（Terman et al.、上記）。ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)は、ＫＤＲのネズミ相同体として言及される(Mattews et al.、上記)。ｆｌｔ−１(ＶＥＧＦＲ−１)は、ＫＤＲ／ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)受容体と異なるが、しかし関連したＶＥＧＦ受容体の一形態として言及される(Shibuya et al.、前記、参照)。
【００５２】
その他のＶＥＧＦ受容体としては、ＶＥＧＦで架橋標識化され得るもの、あるいはＫＤＲと共免疫沈降され得る物(ＶＥＧＦＲ−２)が挙げられる。これらのＶＥＧＦ受容体のいくつかの既知の形態は、約170 KD、150 KD、130〜135 KD、120〜125 KDおよび85 KDの分子量を有する(例えばQuinn et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7533-7537 (1993); Scher et al., J. Biol. Chem., 271: 5761-5767 (1996)参照)。
【００５３】
ＶＥＧＦ受容体は、通常は細胞、例えば内皮細胞に結合される。ＶＥＧＦ受容体は、非内皮細胞、例えば腫瘍細胞とも結合され得る。あるいはＶＥＧＦ受容体は、細胞から除去され、好ましくは可溶性形態である。
【００５４】
本発明のアンタゴニストは、ＶＥＧＦ受容体を中和する。本明細書において、受容体を中和するとは、受容体の固有のキナーゼ活性を不活性化して、シグナルを伝達することを意味する。ＶＥＧＦ受容体中和に関する信頼できる検定は、受容体リン酸化の阻害である。
【００５５】
本発明は、ＶＥＧＦ受容体中和の任意の特定のメカニズムにより限定されない。この出願の提出時点で、抗体によるＶＥＧＦ受容体中和のメカニズムは十分に理解されなかったし、一アンタゴニストが従うメカニズムは、別のアンタゴニストが従うものと必ずしも同一でない。いくつかの考え得るメカニズムとしては、ＶＥＧＦリガンドとＶＥＧＦ受容体の細胞外結合ドメインとの結合の防止、ならびに受容体の二量体化またはオリゴマー化の防止が挙げられる。しかしながらその他のメカニズムは除外され得ない。
【００５６】
ＶＥＧＦ受容体(またはＶＥＧＦＲ)アンタゴニストは、本発明の情況においては、受容体のＶＥＧＦＲサブファミリーを阻害する生物学的分子、小分子または任意のその他の物質である。受容体のＶＥＧＦＲサブファミリーの活性化の抑制とは、ＶＥＧＦＲの活性化における任意の低減を意味する。即ち、活性化の防止は、ＶＥＧＦＲの活性化を完全に停止する必要はない。さらに本発明に記載されているようなＶＥＧＦＲ活性化の抑制は、ＶＥＧＦＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦＲの相互作用後のＶＥＧＦＲアンタゴニストの阻害を意味する。会合とは、受容体のチロシンキナーゼ活性が抑制されるような、ＶＥＧＦＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦＲ間の十分な物理的または化学的相互作用を意味する。会合または結合を含めたこのような化学的相互作用の例は当業界で既知であり、例えば共有結合、イオン結合、水素結合等が挙げられる、と当業者は理解する。したがって本発明のＶＥＧＦＲアンタゴニストは受容体のチロシンキナーゼ活性を抑制し、これが受容体の自己リン酸化、ならびにＶＥＧＦＲシグナリング経路に関与する種々のその他のタンパク質のリン酸化を防止する。血管形成および血管新生の調節に関与するこのような経路としては、以下のいずれかが挙げられる：ホスホリパーゼＣγ(ＰＬＣγ)経路、あるいはホスファチジルイノシトール３‘キナーゼ(ＰＩ３−Ｋ)／Ａｋｔおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)経路(例えばLarrivee et al., Int’l J. Mol. Med., 5: 447-56 (2000)参照)。
ＶＥＧＦＲサブファミリーの受容体は、細胞外ドメイン中の7つの免疫グロブリン様ループ、単一膜貫通領域、ならびに細胞内領域中のスプリットチロシンキナーゼドメイン(クラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼ)の存在により特性化される。受容体のＶＥＧＦＲサブファミリーの数個の既知の成員が存在し、その例としては、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３が挙げられる。一般に、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)は、内皮細胞の増殖、移動、分化、管形成、血管透過性の増大、および血管完全性の保持を生じる腫瘍ＶＥＧＦシグナル伝達物質である、と考えられる。ＶＥＧＦＲ−１は非常に弱いキナーゼ活性を保有し、ＶＥＧＦにより刺激された場合に有糸分裂応答を生じることができないが、しかしそれはＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の約10倍の親和性でＶＥＧＦと結合する。ＶＥＧＦＲ−１は、単球およびマクロファージのＶＥＧＦおよび胎盤増殖因子(ＰｌＧＦ)誘導性移動、ならびに組織因子の産生にも結び付けられ得る。
【００５７】
前記のＥＧＦＲに関する場合と同様に、ＶＥＧＦＲ活性化増大は、高レベルのリガンド、ＶＥＧＦＲ遺伝子増幅、上向き調節化受容体シグナリングを引き起こす受容体の転写または突然変異増大に起因し得る。
【００５８】
本発明の一実施態様では、ＶＥＧＦＲアンタゴニストはＶＥＧＦＲとそのリガンドとの結合を抑制する。リガンドとＶＥＧＦＲの外部細胞外ドメインとの結合は、受容体二量体化、ＶＥＧＦＲの自己リン酸化、受容体の内部細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、ならびに血管形成および血管新生の調節に関与する多重シグナル伝達経路の開始を刺激する。
【００５９】
ＶＥＧＦＲに関するリガンドとしては、例えばＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｅが挙げられる。例えばＶＥＧＦＲ−１を結合するだけの二量体分泌因子であるＰｌＧＦは、絨毛性細胞栄養芽層、シンシチウム栄養芽層および絨毛外栄養芽層により多量に産生され、そしてＶＥＧＦとの密接なアミノ酸相同性を有する。3つのアイソフォーム、即ちＰｌＧＦ−１、ＰｌＧＦ−２およびＰｌＧＦ−３がヒトにおいて存在する。ＰｌＧＦ欠損マウスを用いた試験は、この増殖因子が血管新生それ自体には関与せず、むしろ病理学的状態中のＶＥＧＦの血管新生性および透過性作用を特異的に調整する、ということを実証する。さらにまたＶＥＧＦ−Ｄは、他のＶＥＧＦファミリー成員においては見出されないＮ−およびＣ末端伸長の存在という点から見て、ＶＥＧＦ−Ｃに密接に関連する。成人組織においては、ＶＥＧＦ−ＤｍＲＮＡは、心臓、肺、骨格筋、結腸および小腸中で最も豊富である。ＶＥＧＦ−Ｄ受容体特異性の分析は、ＶＥＧＦ−ＤがＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ１）およびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）の両方に関するリガンドであり、そしてこれらの受容体を活性化するが、しかしながらＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−１とは結合しない、ということを明示した。さらにＶＥＧＦ−Ｄは、内皮細胞に関するマイトジェンである。
【００６０】
本発明の別の実施態様では、ＶＥＧＦＲアンタゴニストはＶＥＧＦＲと結合する。ＶＥＧＦＲアンタゴニストは、リガンドの結合を阻害することもあり得るＶＥＧＦＲの細胞外部分と外部的に、あるいはチロシンキナーゼドメインと内部的に結合し得る、と理解されるべきである。ＶＥＧＦＲと結合するＶＥＧＦＲアンタゴニストの例としては、生物学的分子、例えば受容体リボザイムおよびＶＥＧＦＲに特異的な抗体（またはその機能的等価物）、ならびにＶＥＧＦＲの細胞質ドメイン上に直接作用する合成キナーゼ阻害剤、例えば小分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは本発明のＶＥＧＦＲアンタゴニストは、生物学的分子、さらに好ましくはＶＥＧＦＲに特異的な抗体またはその機能的等価物であって、これらの詳細は以下にさらに記載される。あるいは本発明のＶＥＧＦＲアンタゴニストは、小分子キナーゼ阻害剤であり、詳細は以下に記載される。
【００６１】
好ましい一実施態様では、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストはＶＥＧＦＲ−１と特異的に結合する。特に好ましいのは、ＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインと結合して、そのリガンド、即ちＶＥＧＦおよびＰｌＧＦの一方または両方による結合を遮断し、および／またはＶＥＧＦＲ−１のＶＥＧＦ誘導性またはＰｌＧＦ誘導性活性化を中和する抗原結合タンパク質である。例えばｍＡｂ６．１２は、可溶性および細胞表面発現性ＶＥＧＦＲ−１と結合するｓｃＦｖである。ｓｃＦｖ６．１２は、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ６．１２のＶLおよびＶHドメインを含む。ｍＡｂ６．１２を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−3344として寄託されている。寄託は、特許手法の目的およびそれらの下での調節のための微生物の寄託についての国際認識International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and the regulations thereunder（ブダペスト条約）に関するブダペスト条約の条項によりなされた。これは、寄託日から30年間の生育可能培養の保持を保証する。生物体は、ブダペスト条約の条項下でＡＴＣＣにより利用可能にされて、関連米国特許の発行時における非制限性利用可能性を保証する。寄託株の利用可能性は、その特許法にしたがって任意の政府の権限下で交付された権利に違反して本発明を実施するための認可と解釈されない。
【００６２】
その他の好ましい抗体は、実施例に、特に実施例ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶに、ならびに配列番号１〜８３に記載されている。さらにこれらの好ましいＶＥＧＦＲ抗体アンタゴニストのいくつかは、Lu et al., Int’l J. Cancer, 97: 393-399 (2002)にも記載されている。
【００６３】
ＶＥＧＦＲ−２抗体を産生する種々のハイブリドーマも存在する。例えばラット抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体（ＤＣ１０１）を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ  ＨＢ11534として寄託され；マウス抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体ｍＡｂ２５を産生するハイブリドーマ細胞株（Ｍ２５．１８Ａｌ）は、ＡＴＣＣ  ＨＢ12152として寄託され；マウス抗マウスＶＥＧＦＲ−２モノクローナル抗体ｍＡｂ７３を産生するハイブリドーマ細胞株（Ｍ７３．２４）は、ＡＴＣＣ  ＨＢ12153として寄託された。
【００６４】
さらに抗ＶＥＧＦＲ−１抗体を産生する種々のハイブリドーマが存在し、その例としては、WO 98/22616、WO 99/59636、オーストラリア認可出願AU 1998 50666 B2およびカナダ国出願CA 2328893に開示されたハイブリドーマＫＭ1730（ＦＥＲＭ  ＢＰ−5697として寄託）、ハイブリドーマＫＭ1731（ＦＥＲＭ  ＢＰ−5718として寄託）、ハイブリドーマＫＭ1732（ＦＥＲＭ  ＢＰ−5698として寄託）、ハイブリドーマＫＭ1748（ＦＥＲＭ  ＢＰ−5699として寄託）、ハイブリドーマＫＭ1750（ＦＥＲＭ  ＢＰ−5700として寄託）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
多数のその他のＶＥＧＦＲアンタゴニストが当業界で既知である。ＶＥＧＦＲアンタゴニストのいくつかの例は、米国特許出願07/813,593；07/906,397；07/946,507；07/977,451；08/055,269；08/252,517；08/601,891；09/021,324；09/208,786；および09/919,408（すべてLemischka等）；米国特許第5,840,301号（Rockwell等）；米国特許出願08/706,804；08/866,969；08/967,113；09/047,807；09/401,163；および09/798,689（すべてRockwell等）；米国特許出願09/540,770（Witte等）；ならびにPCT/US01/06966（Liao等）に記載されている。米国特許第5,861,301号（Terman等）、Terman et al. Oncogene 6: 1677-1683 (1991年9月)、WO 94/10202（Ferrara等）およびWO 95/21865（Ludwig）は、ＶＥＧＦＲアンタゴニストを、特に抗ＶＥＧＦＲ−２抗体を開示する。さらにPCT/US95/01678（Kyowa Hakko）は、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体を記載する。抗ＶＥＧＦＲ抗体は米国特許出願09/976,787（Zhu等）にも記載されている。米国特許第6,177,401号（Ulrich等）、第5,712,395号（App等）および第5,981,569号（App等）は、有機分子であるＶＥＧＦＲアンタゴニストを記載する。さらに、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）およびＶＥＧＦＲ−１に向けられる2つの異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である二特異的抗体（ＢｓＡｂｓ）が既知である（例えば米国特許出願09/865,198（Zhu）；60/301,299（Zhu）参照）。
【００６６】
Hennequin等は、J. Med. Chem. 42, 5369-5389 (1999)において、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストとして有用であるとして、ある種のキナゾリン、キノリンおよびシンノリンを開示する（Annie et al., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 17, A41 (1998)も参照）。Hennequin等の文献に開示されたＶＥＧＦ受容体アンタゴニストは、参照により本明細書中に含まれる。
【００６７】
さらにApp等（米国特許第5,849,742号 ）は、チロシンキナーゼ阻害剤として作用するキナゾリン、キノキシリン、置換アニリン、イソキサゾール、アクリロニトリルおよびフェニルアクリロニトリル化合物の小分子誘導体を開示する。Hennequin等、Annie等およびApp等により記載された小分子は、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストとして本発明に含まれる。
【００６８】
さらにＶＥＧＦＲアンタゴニストの確定のための検定は当業界で周知であり、したがって本発明に用いるのに適した代替的アンタゴニストは容易に同定され得る。本発明のＶＥＧＦＲアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を抑制し、これは一般にリン酸化事象を包含する。したがってリン酸化検定は、本発明の情況においてＶＥＧＦＲアンタゴニストを確定するのに有用である。チロシンキナーゼ活性に関するいくつかの検定は、Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera., 283: 1433-1444 (1997)およびBatley et al., Life Sci., 62: 143-50 (1998)に記載されている。さらにＶＥＧＦＲ発現の検出に特異的な方法が利用され得る。
【００６９】
抗体
【００７０】
本発明の抗体は、当業界で既知の方法により産生され得る。これらの方法としては、Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)およびCampbell, Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridoma, Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)に記載された免疫学的方法、ならびにHuse et al., Science, 246, 1275-1281 (1989)により記載された組換えＤＮＡ法が挙げられる。
【００７１】
本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、あるいは任意のその他の適切な種類の抗体、例えば抗体の断片または誘導体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）あるいは抗体の合成相同体であり得るが、但し、抗体は、全抗体の場合と同一の結合特性を有し、あるいはそれに匹敵する結合特性を有する。本明細書中で用いる場合、別記しない限り、あるいは文脈から明らかでない限り、抗体のドメイン、領域および断片は、当業界で周知のような標準的定義に一致する（例えばAbbas et al., Cellular and Molecular Immunology, W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA (1991)参照）。好ましくは本発明の抗体はモノクローナル抗体である。
【００７２】
抗体断片は、全抗体を切断することにより、あるいはその断片をコードするＤＮＡを発現することにより産生され得る。抗体の断片は、Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983)により、ならびにParham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983)により記載された方法により調製され得る。このような断片は、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ‘）2断片の一方または両方を含有する。このような断片は、一本鎖断片可変部抗体、即ちｓｃＦｖ、ダイボディ（dibody）またはその他の抗体断片も含有する。このような機能的等価物の産生方法は、ＰＣＴ出願WO 93/21319、欧州特許出願第239,400号；ＰＣＴ出願WO 89/09622；欧州特許出願第338,745号；および欧州特許第EP 332,424号に開示されている。
【００７３】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、相互連結リンカーを用いてまたは用いずに、軽鎖の可変部に連結された抗体の重鎖の可変部からなるポリペプチドである。したがってｓｃＦｖは、全抗体−結合部位を含む。これらの鎖は、細菌中で、または真核生物細胞中で産生され得る。一本鎖抗体の一例は、ｐ１Ｃ１１である（以下の実施例ＩＸ参照）。ｐ１Ｃ１１は、ＶＥＧＦ−ＫＤＲ（ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ−２）相互作用を遮断し、ＶＥＧＦ刺激性受容体リン酸化およびＨＵＶＥＣの有糸分裂誘発を阻害することが示された。このｓｃＦｖは、可溶性ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）およびＨＵＶＥＣ上の細胞表面発現化ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）の両方と結合する。ｐ１Ｃ１１の配列は、配列番号２１として示されている。前記の一本鎖抗体は、当業界で既知の方法により、キメラ化またはヒト化抗体に作り上げられ得る（例えば以下の実施例ＩＸ−３参照）。キメラ化ｓｃＦｖの一例は、キメラ化ｐ１Ｃ１１、即ちｃ−ｐ１Ｃ１１である。
【００７４】
好ましくは抗体断片は全抗体の6つの相補性決定領域すべてを含有するが、しかしこのような領域のすべてより少ない、例えば3、4または5つのＣＤＲを含有する断片も機能的であり得る。抗体断片が免疫原性であるには短すぎる場合、それは担体分子と接合され得る。いくつかの適切な担体分子としては、カギアナカサガイヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンが挙げられる。接合は、当業界で既知の方法により実行され得る。
【００７５】
本発明の抗体は、結合特性が直接的突然変異、親和性成熟の方法、ファージ表示または鎖シャッフリングにより改良されたものも包含する。親和性および特異性は、ＣＤＲを突然変異させ、そして所望の特性を有する抗原結合部位に関してスクリーニングすることにより、修飾または改良され得る（例えばYang et al., J. Mol. Bio., 254: 392-403 (1995)参照）。ＣＤＲは、種々の方法により突然変異化される。一方法は、層でなければ同一の抗原結合部位の一集団中で、12個のアミノ酸すべてが特定位置に見出されるよう、個々の残基または残基の組合せを無作為化することである。あるいは突然変異は、エラー傾向ＰＣＲ法により一連のＣＤＲ残基に亘って誘導される（例えばHawkins et al., J. Mol. Bio., 226: 889-896 (1992)参照）。重鎖および軽鎖可変部遺伝子を含有するファージ表示ベクターは、大腸菌の突然変異誘発体株中で増殖される（例えばLow et al., J. Mol. Bio., 250: 359-368 (1996)参照）。これらの突然変異誘発方法は、当業者に既知の多数の方法の例証となる。
【００７６】
本発明の抗体は、ある種の、例えばマウスの抗体の可変部、ならびに異なる種の、例えばヒトの抗体の定常部を有するキメラ抗体でもあり得る。あるいは本発明の抗体は、ある種からの、例えばマウスからの超可変部または相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびにヒト抗体の枠組み構造可変部および定常部を有するヒト化抗体であり得る。あるいはまた、本発明の抗体は、ヒト抗体の定常部および可変部の両方を有するヒト抗体であり得る。
【００７７】
抗体、特にモノクローナル抗体は、当業界で既知の方法により産生され得る。抗体産生に関する例としては、ハイブリドーマ細胞中での産生、ならびに受容体アンタゴニストをコードするＤＮＡを用いた哺乳類細胞の形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法は種々の出版物中に記載されており、例としては、Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)およびCampbell in “Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas” in Burdon et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)により記載された免疫学的方法、ならびにHuse et al. in Science, 246: 1275-1281 (1989)により記載された組換えＤＮＡ法が挙げられる。
【００７８】
抗体の等価物も、当業界で既知の方法により調製され得る。例えば抗体の断片は、全抗体から酵素的に調製され得る。好ましくは抗体の等価物は、このような等価物をコードするＤＮＡから調製される。抗体の断片をコードするＤＮＡは、全長抗体をコードするＤＮＡのすべてのしかし所望の一部分を欠失することにより調製され得る。キメラ化抗体をコードするＤＮＡは、実質的にまたは専ら対応するヒト抗体領域に由来するヒト定常部をコードするＤＮＡ、ならびに実質的にまたは専らヒト以外の哺乳類の可変部の配列に由来する可変部をコードするＤＮＡを組換えることにより調製され得る。ヒト化抗体をコードするＤＮＡは、実質的にまたは専ら対応するヒト抗体領域に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の定常部および可変部をコードするＤＮＡ、ならびに実質的にまたは専らヒト以外の哺乳類に由来するＣＤＲをコードするＤＮＡを組換えることにより調製され得る。
【００７９】
抗体の断片をコードするＤＮＡ分子の適切な供給源としては、全長抗体を発現する細胞、例えばハイブリドーマが挙げられる。断片は、それら自体、抗体等価物として用いられ得るし、あるいは前記のように等価物に組換えられ得る。本説に記載されたＤＮＡ欠失および組換えは、既知の方法により、例えば「抗体の機能的等価物」という表題の節で前記された公開済み特許出願に記載された方法により、および／または以下に記載されるようなその他の標準組換えＤＮＡ技法により、実行され得る。
【００８０】
本発明のベクターの形質転換および受容体アンタゴニストの発現のための好ましい宿主細胞は、哺乳類細胞、例えばＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびリンパ系起源の細胞株、例えばリンパ腫、骨髄腫、あるいはハイブリドーマ細胞である。その他の真核生物宿主、例えば酵母は、代替的に用いられ得る。例えばマウス胎仔肝臓ストローマ細胞株2018はＡＰｔａｇ−ｆｌｋ１およびＡＰｔａｇ−ｆｌｋ２融合タンパク質と結合し、即ちＶＥＧＦＲ−２およびｆｌｋ−２のリガンドを含有し（ATCC, Manassas, VA, CRL 10907）、ヒト胎児脾臓細胞株Ｆｓｐ62891はｆｌｋ−２リガンドを含有し（ATCC CRL 10935）、そしてヒトストローマ胎児胸腺細胞株Ｆ．ｔｈｙ62891はＶＥＧＦＲ−２リガンドを含有する（ATCC CRL 10936）。
【００８１】
形質転換化宿主細胞は、炭素（炭水化物、例えばグルコースまたはラクトース）、窒素（アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはそれらの分解産物、例えばペプトン、アンモニウム塩等）および無機塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、リン酸塩および／または炭酸塩）の同化可能供給源を含有する液体培地中で、当業界で既知の方法により培養される。培地はさらに、例えば増殖促進物質、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等を含有する。
【００８２】
酵母中で遺伝子を発現することが望ましい場合、酵母中で用いるための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al. Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異体株、例えばＡＴＣＣNo.44076またはＰＥＰ４−１に関する選択マーカーを提供する（Jones, Genetics, 85: 12 (1977)）。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１病変の存在は次に、トリプトファンの非存在中での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母菌株（ＡＴＣＣ20,622または38,626）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する既知のプラスミドにより補足される。
【００８３】
あるいはさらにまた、受容体アンタゴニストをコードするＤＮＡは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスのようなウイルス由来のベクター中にクローン化され得る。遺伝子発現は、誘導性または非誘導性調節配列により制御される。
【００８４】
要するに、抗体、抗体等価物またはＶＥＧＦ受容体のような所望のＤＮＡを発現する核酸分子を含有する細胞の適切な供給源が選択される。総ＲＮＡは、適切な供給源から標準手法により調製される。総ＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成を指図するために用いられる。ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成するための標準方法は、例えば前記のような分子生物学の標準マニュアル中に提示される。
【００８５】
ｃＤＮＡは、既知の方法により増幅され得る。例えばｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のための鋳型として用いられ得る（Saiki et al., Science, 239, 487 (1988)またはMullis等（米国特許第4,683,195号）参照）。ＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、増幅される既知の配列から得られる。オリゴヌクレオチドは、当業界で既知の方法により合成される。適切な方法としては、CaruthersによりScience 230, 281-285 (1985)に記載された方法が挙げられる。
【００８６】
上流および下流オリゴヌクレオチドの混合物が、ＰＣＲ増幅に用いられる。条件は、標準手法にしたがって各々の特定のプライマー対に対して最適化される。ＰＣＲ産物は、例えばプライマー間の配列に対応する正確なサイズを有するｃＤＮＡに関する電気泳動により、分析される。あるいはコード領域は、2またはそれ以上の重複断片中に増幅され得る。重複断片は、断片からの無傷ｃＤＮＡのアセンブリーを可能にする制限部位を含むよう意図される。
【００８７】
ＶＥＧＦ受容体に関する完全タンパク質コード領域を単離するために、例えば上流ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは５‘末端の配列と相補的であり、好ましくはＡＴＧ開始コドンならびに開始コドンの上流の少なくとも5〜10個のヌクレオチドを包含する。下流ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、所望のＤＮＡ配列の３’末端の配列と相補的である。所望のＤＮＡ配列は、好ましくはＶＥＧＦ受容体の全細胞外部分をコードし、任意に膜貫通領域の全部または一部を、および／または終止コドンを含めた細胞内領域の全部または一部をコードする。
【００８８】
増幅されるＤＮＡ、例えば抗体、抗体等価物またはＶＥＧＦ受容体をコードするＤＮＡはまた、広範な種々の宿主細胞中の広範な種々のクローニングベクター中で複製され得る。宿主細胞は、原核生物または真核生物細胞であり得る。
【００８９】
ＤＮＡがスプライシングされるベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含み得る。いくつかの適切な原核生物クローニングベクターとしては、大腸菌E. coliからのプラスミド、例えばｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭおよびＲＰ４が挙げられる。原核生物ベクターは、ファージＤＮＡの誘導体、例えばＭ１３およびその他の糸状一本鎖化ＤＮＡファージも含む。ＶＥＧＦ受容体をコードする核酸をクローニングするための好ましいベクターは、バキュロウイルスベクターである。
【００９０】
発現されるＤＮＡを含有するベクターは、適切な宿主細胞中でトランスフェクトされる。宿主細胞は適切な培地中に保持されて、細胞およびベクターが複製する条件を施される。ベクターは、細胞から回収され得る。発現されるＤＮＡは、ベクターから回収され得る。
【００９１】
発現されるＤＮＡ、例えば抗体、抗体等価物または受容体をコードするＤＮＡは、適切な発現ベクター中に挿入されて、適切な原核生物または真核生物宿主細胞中で発現され得る。
【００９２】
例えば宿主細胞中に挿入されるＤＮＡは、ＶＥＧＦ受容体の全細胞外部分またはＶＥＧＦ受容体の細胞外部分の可溶性断片をコードし得る。ＤＮＡによりコードされるＶＥＧＦ受容体の細胞外部分は、任意に５‘末端または３’末端のいずれかまたは両方で、付加的アミノ酸配列に結合される。付加的アミノ酸配列は、事実上ＶＥＧＦ受容体細胞外領域、例えばリーダー配列、膜貫通領域および／またはＶＥＧＦ受容体の細胞内領域に結合され得る。付加的アミノ酸配列は、事実上ＶＥＧＦ受容体に結合されない配列でもあり得る。好ましくはこのような付加的アミノ酸配列は、特定の目的に、例えば発現レベル、分泌、可溶性または免疫原性を改良するのに役立つ。
【００９３】
細菌、特に大腸菌E. coli中でタンパク質を発現するためのベクターが既知である。このようなベクターとしては、Dieckmann and Tzagoloff によりJ. Biol. Chem. 260, 1513-1520 (1985)に記載されたＰＡＴＨベクターが挙げられる。これらのベクターは、アントラニル酸シンターゼ（ＴｒｐＥ）を、その後カルボキシ末端でポリリンカーをコードするＤＮＡ配列を含有する。その他の発現ベクター系は、β−ガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）；λＰL；マルトース結合タンパク質（ｐＭＡＬ）；およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ｐＧＳＴ）に基づいている（Gene 67, 31 (1988)およびPeptide Research 3, 167 (1990)参照）。
【００９４】
酵母中で有用なベクターが利用可能である。適切な例は、2μプラスミドである。
【００９５】
哺乳類細胞中での発現に適したベクターも既知である。このようなベクターとしては、ＳＶ−４０の周知の誘導体、アデノウイルス、レトロウイルス由来ＤＮＡ配列および機能性哺乳類ベクターの組合せから得られるシャトルベクター、例えば前記のもの、ならびに機能的プラスミドおよびファージＤＮＡが挙げられる。
【００９６】
さらなる真核生物発現ベクターが当業界で既知である（例えばP.J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1: 854-864 (1981); Kaufmann and Sharp, “Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene,” J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); Kaufmann and Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664 (1982); Scahill et al., “Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells, “Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 80, 4654-4659 (1983); Urlaub and Chasin, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)）。
【００９７】
本発明に有用な発現ベクターは、発現されるＤＮＡ配列または断片と操作可能的に連結される少なくとも1つの発現制御配列を含有する。クローン化ＤＮＡ配列の発現を制御し、調節するために、制御配列がベクター中に挿入される。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター、例えば３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター、酵母賛成ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母α接合因子、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスおよびサルウイルス由来のプロモーター、例えば初期および後期プロモーターまたはＳＶ４０、ならびに原核生物および真核生物細胞の遺伝子の発現を制御することが既知であるその他の配列、ならびにそれらのウイルスまたはその組合せである。
【００９８】
制御シグナルならびに発現されるＤＮＡ、例えば抗体、抗体等価物またはＶＥＧＦ受容体をコードするＤＮＡを含有するベクターは、発現のために宿主細胞中に挿入される。いくつかの有用な発現宿主細胞としては、周知の原核生物および真核生物細胞が挙げられる。いくつかの適切な原核生物宿主としては、例えば大腸菌、例えば大腸菌ＳＧ−９３６、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｗ3110、大腸菌Ｘ1776、大腸菌Ｘ2282、大腸菌ＤＨＩおよび大腸菌ＭＲＣ１、シュードモナス菌、バシラス菌、例えば枯草菌、ならびにストレプトミセス菌が挙げられる。適切な真核生物細胞としては、組織培養中の酵母およびその他の真菌、昆虫、動物細胞、例えばＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞、ヒト細胞ならびに植物細胞が挙げられる。
【００９９】
適切な培地中に保持された宿主中での発現後、発現されるポリペプチドまたはペプチド、例えば抗体、抗体等価物またはＶＥＧＦ受容体をコードするものは、当業界で既知の方法により培地から単離され、精製される。ポリペプチドまたはペプチドが培地中に分泌されない場合には、宿主細胞は、単離および精製前に溶解される。
【０１００】
さらに本発明の抗体は、可溶性受容体で哺乳類を免疫感作することにより調製され得る。可溶性受容体は、それら自体、免疫原として用いられ得るし、あるいは担体タンパク質と、またはその他の対象物、例えばビーズ、即ちセファロースビーズと結合され得る。哺乳類が抗体を産生した後、抗体産生細胞、例えば脾臓細胞の混合物が単離される。モノクローナル抗体は、混合物から個々の抗体産生細胞を単離し、例えばそれらを腫瘍細胞、例えば骨髄腫細胞と融合することにより細胞を不死にさせることにより産生され得る。その結果生じたハイブリドーマは培養中に保存され、そしてモノクローナル抗体を発現し、これが培地から採取される。
【０１０１】
抗体は、当該特定受容体を発現する細胞の表面に結合される受容体からも調製され得る。受容体が結合される細胞は、受容体を自然に発現する細胞、例えばＶＥＧＦＲに関する血管内皮細胞であり得る。あるいは受容体が結合される細胞は、受容体をコードするＤＮＡがその中でトランスフェクトされている細胞、例えばＶＥＧＦＲでトランスフェクトされている３Ｔ３細胞であり得る。
【０１０２】
受容体は、本発明の抗体を産生するための免疫原として用いられ得る。受容体ペプチドは、天然供給源から、例えば受容体を発現する細胞から得られる。例えばＶＥＧＦ受容体ペプチドは、血管内皮細胞から得られる。あるいは合成受容体ペプチドは、市販の機械を用いて調製され得る。このような実施態様では、ＶＥＧＦ受容体アミノ酸配列は、例えばｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）に関してはShibuya et al., Oncogene 5, 519-524 (1990)；ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）に関してはPCT/US92/01300およびTerman et al., Oncogene 6: 1677-1683 (1991)；ならびにｆｌｋ−１に関してはMattews et al. Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991)により提供され得る。
【０１０３】
さらなる代替物として、受容体をコードするＤＮＡ、例えばｃＤＮＡまたはその断片は、クローン化され、発現されて、その結果生じたポリペプチドは回収され、本発明の抗体を産生するための免疫原として用いられ得る。例えばそれに対して抗体が作られるＶＥＧＦ受容体を調製するために、本発明のＶＥＧＦ受容体をコードする核酸分子またはその一部分、特にその細胞外部分が、下記のような標準組換えＤＮＡ技法を用いて宿主細胞中での発現のために既知のベクター中に挿入され得る。このような核酸分子の適切な供給源としては、ＶＥＧＦ受容体を発現する細胞、即ち血管内皮細胞が挙げられる。
【０１０４】
抗体は任意の哺乳類中で調製され得る。ヒト以外の適切な哺乳類としては、例えばウサギ、ラット、マウス、ウマ、ヤギまたは霊長類が挙げられる。マウスが好ましい。抗体は、以下の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥおよびそれらのサブクラスのうちの1つの一成員であり、好ましくはＩｇＧ１抗体である。本発明の抗体およびそれらの機能的等価物は、免疫グロブリンクラスのうちのいずれかの成員であり得るし、あるいはそれと組合せ得る。
【０１０５】
非抗体ＶＥＧＦＲアンタゴニスト
【０１０６】
前記の抗体または抗体の機能的等価物のほかに、本発明において有用な受容体アンタゴニストは、特に前記の治療に関連して、その他の生物学的および小分子でもあり得る。
【０１０７】
生物学的分子としては、450より大きい分子量を有する単糖、アミノ酸およびヌクレオチドのすべての脂質ならびにポリマーが挙げられる。したがって生物学的分子としては、例えばオリゴ糖および多糖；オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質；ならびにオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとしては、例えばＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。
【０１０８】
生物学的分子としてはさらに、前記の分子のいずれかの誘導体が挙げられる。例えば生物学的分子の誘導体としては、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質の脂質およびグリコシル化誘導体が挙げられる。生物学的分子の誘導体としてはさらに、オリゴ糖および多糖の脂質誘導体、例えばリポ多糖が挙げられる。
【０１０９】
生物学的分子でない任意の分子は、本明細書中では、小分子であると考えられる。本発明の小分子は、炭素および水素原子、ならびに異種原子、例えば窒素、イオウ、酸素およびリン（これらに限定されない）を有する存在物である。小分子中の原子は、共有結合およびイオン結合を介して一緒に連結される。前者は小有機化合物、例えば小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイレッサ（IressaTM）およびタルセバ（TarcevaTM）典型的であり、そして後者は小無機分子化合物に典型的である。小有機分子中の原子の整列は、鎖、例えば炭素−炭素鎖または炭素−異種原子鎖、あるいは炭素原子を含有する環、例えばベンゼンあるいは炭素と異種原子の組合せ、即ち複素環、例えばピリミジンまたはキナゾリンを示し得る。環系に結合される小有機分子中の１つまたはそれ以上の鎖の組合せは、置換環系を構成し、そして2つの環の融合は、単に多環系と呼ばれ得る多環式系を構成し、この一例はイレッサ（IressaTM）の親足場である。小分子としては、事実上見出される両方の化合物、例えばホルモン、神経伝達物質、ヌクレオチド、アミノ酸、糖、脂質およびそれらの誘導体、ならびに伝統的有機合成、生媒介性合成またはそれらの組合せにより合成的に作られる化合物が挙げられる（例えばGanesan, Drug Discov. Today, 7(1): 47-55 (Jan. 2002); Lou, Drug Discov. Today, 6(24): 1288-1294 (Dec. 2001参照）。
【０１１０】
小分子のいくつかの例としては、有機化合物、有機金属化合物、有機および有機金属化合物の塩、糖類、アミノ酸、ヌクレオシドおよびヌクレオチドが挙げられる。小分子は任意の分子量を有し得る、と力説される。それらは単に、典型的には450未満の分子量を有するため、小分子と呼ばれる。小分子としては、天然に見出される化合物、ならびに合成化合物が挙げられる。
【０１１１】
ヒト患者への小分子および生物学的薬剤の投与は、当業界で既知の方法により成し遂げられる。小分子に関するこのような方法の例は、米国特許第5,646,153号（Spada）57段47行〜59段67行に記載されている。小分子の投与についてのこの説明は、参照により本明細書中に含まれる。
【０１１２】
ＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ活性化の中和
【０１１３】
内皮または非内皮細胞、例えば腫瘍細胞の試料中のＶＥＧＦ受容体の活性化の中和は、in vitroまたはin vivoで実施され得る。ＶＥＧＦ受容体発現細胞の試料中のＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ活性化の中和は、細胞をアンタゴニスト、例えば本発明の抗体と接触することを包含する。細胞は、細胞試料へのＶＥＧＦの付加の前に、同時にまたは後に、アンタゴニスト、例えば抗体とin vitroで接触される。
【０１１４】
in vivoでは、本発明のアンタゴニスト、例えば抗体は、哺乳類への投与によりＶＥＧＦ受容体と接触される。哺乳類への投与の方法としては、例えば経口、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与が挙げられる。
【０１１５】
このin vivo中和方法は、哺乳類における血管新生を抑制するのに有用である。血管新生抑制は、例えば病理学的状態、例えば腫瘍増殖に関連した血管新生を防止または抑制するための有用な治療方法である。したがって本発明のアンタゴニスト、例えば抗体は、抗血管新生および抗腫瘍免疫療法剤である。
【０１１６】
哺乳類という語は、任意の哺乳類を意味する。哺乳類のいくつかの例としては、ペット動物、例えばイヌおよびネコ；家畜動物、例えばブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギ；実験室動物、例えばマウスおよびラット；霊長類、例えばサル、類人猿およびチンパンジー；ならびにヒトが挙げられる。
【０１１７】
ＶＥＧＦ受容体は、いくつかの非内皮細胞、例えば腫瘍細胞上に見出され、このことは、これらの細胞におけるオートクリンおよび／またはパラクリンループの予期せぬ存在を示す。本発明のアンタゴニスト、例えば抗体は、このような細胞上のＶＥＧＦ受容体の活性を中和し、それによりオートクリンおよび／またはパラクリンループを遮断し、そして腫瘍増殖を抑制するのに有用である。
【０１１８】
哺乳類において血管新生を抑制し、そして病理学的状態、例えば腫瘍増殖を抑制する方法は、有効量の本発明のアンタゴニストのいずれか、例えば抗体を、その機能的等価物のいずれかを含めて、哺乳類に全身的に、あるいは哺乳類内の腫瘍に直接的に投与することを包含する。哺乳類は、好ましくはヒトである。この方法は、固形腫瘍、好ましくは高血管性腫瘍、ならびに非固形腫瘍の両方を有する被験者を治療するのに有効である。
【０１１９】
腫瘍増殖の抑制または低減は、腫瘍、例えば癌および非癌性腫瘍の進行の防止または抑制を包含する。腫瘍の進行は、腫瘍の侵襲性、転移、再発およびサイズ増大を包含する。腫瘍増殖の抑制または低減は、腫瘍の破壊も包含する。
【０１２０】
すべての種類の腫瘍が、本発明の方法により治療され得る。腫瘍は、固形または非固形であり得る。
【０１２１】
本発明のアンタゴニストを用いて治療され得る固形腫瘍のいくつかの例としては、癌、肉腫、芽腫または神経膠腫が挙げられる。このような腫瘍のいくつかの例としては、類表皮腫瘍、扁平腫瘍、例えば頭部および頚部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、例えば小細胞および非小細胞肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍ならびに肝臓腫瘍が挙げられる。その他の例としては、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および大脳転移、黒色腫、消化管および腎臓癌および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽細胞腫、好ましくは多形性神経膠芽細胞腫および平滑筋肉腫が挙げられる。本発明のアンタゴニストが有効である血管形成皮膚癌の例としては、悪性ケラチノサイト、例えばヒト悪性ケラチノサイトの増殖を抑制することにより治療され得る扁平細胞癌、基底細胞癌および皮膚癌が挙げられる。
【０１２２】
非固形腫瘍のいくつかの例としては、白血病、多発性骨髄腫およびリンパ腫が挙げられる。白血病のいくつかの例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤血球性白血病または単球せい白血病が挙げられる。リンパ腫のいくつかの例としては、ホジキン病および非ホジキン病に関連したリンパ腫が挙げられる。
【０１２３】
後記の実験結果は、本発明の抗体が、トランスフェクト化３Ｔ３細胞中で発現されるマウス細胞外ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）（ＶＥＧＦＲ−２）／細胞内ｆｍｓキメラ受容体のＶＥＧＦ誘導性リン酸化を特異的に遮断する、ということを実証する。抗体は、ＣＳＦ−１により十分に刺激されたキメラ細胞外ｆｍｓ／細胞内ＦＬＫ−２受容体に影響を及ぼさなかった。さらにまた下記のin vivo試験は、抗体がヌードマウス中での腫瘍増殖を有意に抑制し得たことを示す。
【０１２４】
ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えばモノクローナル抗体のカクテルは、腫瘍細胞の増殖を抑制するための特に効率的な治療を提供する。カクテルは、2、3または4という少数の抗体を、そして6、8または10といった多数の抗体を含み得る。
【０１２５】
血管新生の防止または抑制も、過剰血管新生により特性化される非新生物性病理学的状態、例えば血管新生緑内障、増殖性網膜症、例えば増殖性糖尿病性網膜症、関節炎、黄斑変性、血管腫、血管繊維腫および乾癬を治療するのにも有用である。
【０１２６】
ＶＥＧＦ受容体を単離および精製するための本発明のアンタゴニストの使用
【０１２７】
本発明のアンタゴニストは、慣用的方法、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いてＶＥＧＦ受容体を単離および精製するために用いられ得る（Dean et al., Affinity Chromatography: A Practical Approach, IRL Press, Arlington, VA(1985)）。当業界で周知のその他の方法としては、抗体被覆磁気ビーズを用いた磁気分離、固体マトリクスに結合された抗体による「パニング」、およびフローサイトメトリーが挙げられる。
【０１２８】
ＶＥＧＦ受容体の供給源は、典型的には、ＶＥＧＦ受容体を発現する血管細胞、特に血管内皮細胞である。血管内皮細胞の適切な供給源は、血管、例えば臍帯血細胞、特にヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）である。
【０１２９】
ＶＥＧＦ受容体は、その他の物質、例えばＶＥＧＦ受容体を認識し、それと結合する付加的モノクローナルおよびポリクローナル抗体を製造するための抗原、あるいはＶＥＧＦ発現細胞の表面のその他の抗原を産生するための出発物質として用いられ得る。
【０１３０】
ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）陽性腫瘍細胞を単離および精製するための本発明のアンタゴニストの使用
【０１３１】
本発明のアンタゴニストは、慣用的方法、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いてｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）（ＶＥＧＦＲ−２）陽性腫瘍細胞、即ちｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）受容体を発現する腫瘍細胞を単離および精製するために用いられ得る（Dean et al., Affinity Chromatography: A Practical Approach, IRL Press, Arlington, VA(1985)）。当業界で周知のその他の方法としては、抗体被覆磁気ビーズを用いた磁気分離、抗体に接合される細胞傷害作用物質、例えば補体、固体マトリクスに結合された抗体による「パニング」、およびフローサイトメトリーが挙げられる。
【０１３２】
in vitroまたはin vivoでのＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体レベルのモニタリング
【０１３３】
本発明のアンタゴニスト、例えば抗体は、標準検定および当業界で既知の方法を用いて、生物学的試料におけるin vitroまたはin vivoでのＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体のレベルをモニタリングするために用いられ得る。生物学的試料のいくつかの例としては、体液、例えば血液が挙げられる。標準検定は、当業界で周知であるような、例えば抗体の標識、ならびに標準イムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイの実行を包含する。
【０１３４】
本発明を実行するのに有用な標準組換えＤＮＡ技法は、Sambrook et al., “Molecular Cloning,” Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987)およびAusubel et al.(Eds) “Current Protocols in Molecular Biology,” Green Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York (1990)に記載されている。
【０１３５】
投与
【０１３６】
本発明の受容体アンタゴニストは、腫瘍の進行、例えば腫瘍の増殖、侵襲、転移および／または再発を防止し、抑制し、または低減するのに十分な量で、腫瘍に罹患している患者に療法的処置のために投与され得る。これを成し遂げるのに適した量は、治療的有効用量と定義される。この使用のために有効な量は、疾患の重症度、ならびに患者自身の免疫系の全身状態によっている。投与計画も、疾患状態および患者の状態に伴って変化し、そして典型的には1回ボーラス投薬または連続注入〜多数回投与／日（例えば4〜6時間毎）の範囲、あるいは治療担当医および患者の症状により指示されるような範囲である。しかしながら、本発明はいかなる特定の用量にも限定されない、と留意すべきである。
【０１３７】
本発明は、任意の適切な腫瘍、例えば乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭および頚部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸または肝臓の腫瘍を治療するために用いられ得る。好ましくは本発明の方法は、腫瘍が結腸の腫瘍である場合、または腫瘍が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である場合に、用いられる。
【０１３８】
さらに本発明の腫瘍は、好ましくはＥＧＦＲを過剰発現する。ＥＧＦＲの発現増強は、有意のパーセンテージの多数のヒト腫瘍で検出されている：例えば、頭および頚部（80〜100％）、結腸直腸（25〜77％）、膵臓（30〜50％）、肺（40〜80％）、食道（43〜89％）、腎細胞（50〜90％）、前立腺（65％）、膀胱（31〜48％）、頸部／子宮（90％）、卵巣（35〜70％）および乳房（14〜91％）。ＥＧＦＲの発現も、ある種の型の腫瘍における不十分な予後、生存率低減ならびに転移増大の指標であることが実証されている。
【０１３９】
さらに本発明の腫瘍は、好ましくはＶＥＧＦＲの異所性発現またはシグナリングを有する。ＶＥＧＦＲによるシグナリング増強は、多数の異なるヒト癌において観察されている。高レベルのＶＥＧＦＲ−２は、神経膠腫に浸潤する内皮細胞により発現される（Plate et al., (1992) Nature 359:845-848）。ＶＥＧＦＲ−２レベルは、ヒト神経膠芽細胞腫により産生されるＶＥＧＦにより特異的に上向き調節される（Plate et al., (1993) Cancer Res. 53: 5822-5827）。神経膠芽細胞腫関連内皮細胞（ＧＡＥＣ）中での高レベルのＶＥＧＦＲ−２発現の知見は、ＶＥＧＦＲ−２転写体が正常脳内皮細胞中ではほとんど検出されないため、受容体活性がおそらくは腫瘍形成中に誘導されることを示す。この上向き調節は、腫瘍に密接に近接する血管内皮細胞に限定される。
【０１４０】
本発明は、腫瘍増殖の抑制または低減に有用である。腫瘍増殖の抑制または低減とは、腫瘍の進行、例えば腫瘍の増殖、侵襲性、転移および／または再発の防止、抑制または低減を意味する。さらに本発明は、血管新生病状、例えばアテローム硬化症、関節炎、黄斑変性および乾癬を治療するのにも有用である。本発明が有用である病状を有する患者の同定は、十分に当業者の能力および理解の範囲内である。
【０１４１】
本発明において、任意の適切な方法または経路を用いて、例えば経口、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与で、ＥＧＦＲアンタゴニストおよび／またはＶＥＧＦＲアンタゴニストを投与し得る。投与されるアンタゴニストの用量は、多数の因子に、例えばアンタゴニストの種類、治療されている腫瘍の種類および重症度ならびにアンタゴニストの投与経路によっている。しかしながら、本発明は投与のいかなる特定の方法または経路にも限定されない、と力説されるべきである。
【０１４２】
代替的一実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦＲアンタゴニストは、１つまたはそれ以上の抗腫瘍作因と組合せて投与され得る（例えば米国特許第6,217,866号（Schlessinger等）（抗腫瘍剤と組合せた抗ＥＧＦＲ抗体）；米国特許出願第09/312,286号（Waksal等）（放射線と組合せた抗ＥＧＦＲ抗体）参照）。任意の適切な抗腫瘍作因、例えば化学療法薬または放射線が用いられ得る。化学療法薬の例としては、シスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、トポテカンまたはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。抗腫瘍作因が放射線である場合、放射線源は、治療されている患者に対して外部（外部ビーム放射線療法−ＥＢＲＴ）または内部（近接照射療法−ＢＴ）であり得る。投与される抗腫瘍作因の用量は、多数の因子、例えば作因の種類、治療されている腫瘍の種類および重症度、ならびに作因の投与経路によっている。しかしながら本発明はいかなる特定の用量にも限定されない、と力説されるべきである。
【０１４３】
さらなる代替的実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦＲアンタゴニストは、１つまたはそれ以上の適切なアジュバント、例えばサイトカイン（例えばＩＬ−１０およびＩＬ−１３）またはその他の免疫刺激剤と組合せて投与され得る（例えばLarrivee et al.、上記、参照）。しかしながら、ＥＧＦＲアンタゴニストおよびＶＥＧＦＲアンタゴニストのみの投与は、治療的に有効な方法で腫瘍の進行を防止し、抑制しまたは低減するのに十分である、と理解されるべきである。
【０１４４】
さらにＥＧＦＲアンタゴニストおよび／またはＶＥＧＦＲアンタゴニストは、リガンド接合体として投与され、これは受容体と特異的に結合し、そしてリガンド−毒素インターナライゼーション後の有毒な致死性荷重を送達する。毒素と受容体との間の接合体は、非特異的毒性を最小限にしながら、ＥＧＦＲ−またはＶＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞に特異的な毒性作用物質を発生する目的で意図された。例えばＥＧＦおよびシュードモナスない毒素（ＰＥ）から成る接合体は、in vitroでＥＧＦＲ発現ＨｅＬａ細胞に対して有毒であることが示された。種々の作因、例えばチオリダジンおよびアデノウイルスは接合体の細胞取込みを増強し、ならびに接合体の細胞傷害性を増大し得る。
【０１４５】
本発明のＥＧＦＲおよび／またはＶＥＧＦＲアンタゴニストは、予防または治療のために哺乳類に用いられる場合、製薬上許容可能な担体を付加的に含む組成物の形態で投与される、と理解される。適切な製薬上許容可能な担体としては、例えば１つまたはそれ以上の水、生理食塩水、リン酸塩緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそれらの組合せが挙げられる。製薬上許容可能な担体はさらに、少量の補助物質、例えば湿潤または乳化剤、防腐剤あるいは緩衝剤を含み得るが、これらは結合タンパク質の保存寿命または有効性を増強する。注射用の組成物は、当業界で周知のように、哺乳類への投与後に活性成分の迅速な持続性または遅延性放出を提供するよう処方され得る。
【０１４６】
本発明のＥＧＦＲアンタゴニストおよび／またはＶＥＧＦＲアンタゴニストは、種々の形態であり得る。これらの例としては、例えば固体、半固体および液体投薬形態、例えば錠剤、ピル、粉末、液体溶液、分散液または懸濁液、リポソーム、座薬、注射用および注入用溶液が挙げられる。好ましい形態は、意図された投与方式および療法的適用によっている。
【０１４７】
このようなアンタゴニストは、製薬業界で周知の方法で調製され得る。組成物の製造に際しては、活性成分は通常は、担体と混合され、または担体により希釈され、および／または例えばカプセル、サッシェ、紙またはその他の容器の形態であり得る担体内に封入される。担体が希釈剤として供される場合、それは固体、半固体または液体物質であり得るが、これは活性成分のためのビヒクル、賦形剤または媒質として作用する。したがって組成物は、錠剤、ロゼンジ、サッシェ、カシェー、エリキシル、懸濁液、エーロゾル（固体としてまたは液体媒質中で）、例えば10重量％までの活性化合物を含有する軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、注射溶液、懸濁液、滅菌包装粉末、ならびに局所パッチの形態であり得る。
【０１４８】
腫瘍増殖抑制用キット
【０１４９】
本発明は、治療的有効量のＥＧＦＲアンタゴニストおよび治療的有効量のＶＥＧＦＲアンタゴニストを含む腫瘍増殖抑制用キットも包含する。本発明のキットのＥＧＦＲまたはＶＥＧＦＲアンタゴニストは、任意の適切なアンタゴニストであり、例は前記されている。好ましくはキットのＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲに特異的な抗体またはその機能的等価物を含む。あるいは、そしてまた好ましくは、キットのＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲに特異的な小分子を含む。キットのＶＥＧＦＲアンタゴニストは、好ましくはＶＥＧＦＲに特異的な抗体またはその機能的等価物を含む。あるいはキットのＶＥＧＦＲアンタゴニストは、好ましくはＶＥＧＦＲに特異的な小分子を含む。さらに本発明のキットは、抗腫瘍剤をさらに含み得る。本発明の情況における適切な抗腫瘍剤の例は本明細書中に記載された。本発明のキットはアジュバントをさらに含み、実例も前記されている。
【０１５０】
したがって本発明の受容体アンタゴニストは、当業界で周知である研究、診断、予防または治療法のために、in vivoおよびin vitroで用いられ得る。もちろん、本明細書中に開示された本発明の原理における変更が当業者によりなされ得る、と理解され、予期されるべきであり、そしてこのような修正が本発明の範囲内に含まれるべきである、と意図される。
【０１５１】
本明細書中に記述された参考文献はすべて、その記載内容が本明細書中に含まれる。
【実施例】
【０１５２】
以下の実施例は、本発明の理解に役立てるために記述差あれたものであるが、しかしいかなる点においても本発明の範囲を限定するよう意図されないし、意図されるべきでない。実施例は、慣用的方法、例えばベクターおよびプラスミドの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子のこのようなベクターおよびプラスミドへの挿入、あるいは宿主細胞中へのプラスミドの導入に用いられる方法の詳細な説明を包含しない。このような方法は当業者に周知であり、多数の出版物に、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【０１５３】
実施例Ｉ．細胞株および培地
【０１５４】
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、アメリカ培養細胞コレクションAmerican Type Culture Collection （Rockville MD）から入手した。キメラ受容体マウスｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ヒトｆｍｓを用いて３Ｔ３細胞をトランスフェクトすることにより、Ｃ４４１細胞株を構築した。１０Ａ２は、キメラ受容体ヒトｆｍｓ／マウスＦＬＫ−２を含有する３Ｔ３トランスフェクト体であり、この単離および特性化が記載されている（Dosil et al., Mol. Cell. Biol. 13: 6572-6585 (1993)）。10％仔ウシ血清（ＣＳ）、1 mMＬ−グルタミン、抗生物質および600 ug/mlのＧ４１８（ゲネチシン；Sigma St Louis, MO）を補足したダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥ）中に、細胞をルーチンに保持した。
【０１５５】
神経膠芽細胞腫細胞株ＧＢＭ−１８を、5％仔ウシ血清、1 mMＬ−グルタミンおよび抗生物質を補足したＤＭＥ中に保持した。
【０１５６】
可溶性キメラタンパク質であるマウスｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）：ＳＥＡＰ（分泌性アルカリ性ホスファターゼ）を分泌する安定３Ｔ３株を生成し、ＤＭＥＭおよび10％仔ウシ血清中に保持した。状態調節培地を収集した。可溶性ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）：ＳＥＡＰを状態調節培地から単離する。
【０１５７】
実施例ＩＩ．モノクローナル抗体の単離
【０１５８】
実施例ＩＩ−１．ラット抗マウスｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）モノクローナル抗体ＤＣ−１０１（ＩｇＧ１）
【０１５９】
マウスｆｌｋ−１：ＳＥＡＰ可溶性受容体、ウサギ抗アルカリ性ホスファターゼポリクローナル抗体およびプロテインＧセファロースビーズからなる免疫複合体を用いて、ルイス（Lewis）ラット（Charles River Labs）を高度免疫感作した。3ヶ月間に亘って（0、14、21、28、49、63、77日目）、この複合体の7回の腹腔内注射を動物に施した。種々の時期に、動物を尾静脈から採血し、ｍｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）：ＳＥＡＰとの高力価結合に関してＥＬＩＳＡにより免疫血清をスクリーニングした。最終注射の5日後にラットを屠殺して、脾臓を無菌的に取り出した。脾臓細胞を洗浄し、計数して、ネズミ骨髄腫細胞株ＮＳ１と2:1の比で融合した。ハイブリドーマをＨＡＴ培地中で選択し、ＳＥＡＰタンパク質とでなく、ｍｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）：ＳＥＡＰとの特異的結合に関してＥＬＩＳＡによりコロニーをスクリーニングした。多数の陽性ハイブリドーマを展開させて、希釈を限定することにより3倍にクローン化した。ＤＣ−１０１と命名した一サブクローンをさらに特性化した。
【０１６０】
実施例ＩＩ−２．マウス抗マウスｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）モノクローナル抗体Ｍａｂ２５およびＭａｂ７３
【０１６１】
ＤＣ−１０１に関して用いたのと同様のプロトコールを用いて、ネズミ抗ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を産生した。要するに、トランスフェクト化ＮＩＨ３Ｔ３細胞の状態調節培地からの抗ＳＥＡＰ−タンパク質／Ａセファロース複合体または小麦胚芽アグルチニンセファロースに結合されたｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ＳＥＡＰ可溶性受容体の複合体を、マウスに注射した。6ヶ月間の期間に亘って周期的間隔で、マウスを高度免疫感作した。免疫脾臓細胞をプールし、ネズミ骨髄腫細胞株ＮＳＩと融合させた。ハイブリドーマをＨＡＴ培地中で選択し、インキュベーション後、マウスＭａｂ産生に関してコロニーをスクリーニングした。ＤＣ−１０１に関して用いたプロトコールと違って、ｆｍｓのＣ末端領域に対するペプチド生成ポリクローナル抗体で被覆されたＥＬＩＳＡプレート上のＣ４４１細胞溶解物から捕獲されたｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)／ｆｍｓ受容体との結合に関して、陽性上清を最初にスクリーニングした。次に、無傷Ｃ４４１細胞との、ならびに精製ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)／ＳＥＡＰ対ＳＥＡＰ単独との結合に関してＥＬＩＳＡにより反応性Ｍａｂを検定した。Ｃ４４１との結合、ならびにｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)／ＳＥＡＰ(ＳＥＡＰではなく)との反応性を示すハイブリドーマからの上清を展開して、腹水中で増殖させ、精製した(ＥＺ−ＰＲＥＰ、Pharmacia)。精製ＭａｂをＣ４４１細胞上での検定に付して、ＦＡＣＳによりそれらの細胞表面結合を、ならびにリン酸化検定においてｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓのＶＥＧＦ誘導性活性化を抑制するそれらの能力を確定した。これらの試験の結果は、ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)と特異的に結合し，そしてＤＣ−１０１に関して観察されたものに匹敵するレベルで受容体活性化を遮断するそれらの能力に基づいたさらなる特性化のためのＭａｂ２５および７３(アイソタイプＩｇＧ１)のクローニングをもたらした。
【０１６２】
実施例ＩＩＩ．検定
【０１６３】
実施例ＩＩＩ−１．ＥＬＩＳＡ法
【０１６４】
種々のｍＡｂとｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）：ＳＥＡＰタンパク質との結合特性を比較する固相ＥＬＩＳＡにより、抗体をスクリーニングした。ｐＨ9.6の炭酸塩緩衝液中の50〜100 ng／ウエルのｆｌｋ−１：ＳＥＡＰまたはＡＰを用いて、4℃で一夜、マイクロタイタープレートを被覆した。10％新生仔ウシ血清(ＮＢ１０)を補足したリン酸塩緩衝化生理食塩水で、37℃で1時間、プレートを遮断した。ハイブリドーマ上清または精製抗体を37℃で2時間、プレートに付加し、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Tago）に接合されたヤギ抗ラットＩｇＧを37℃でさらに1時間付加した。広範な洗浄後、ＴＭＢ（Kirkegaad and Perry, Gaithersburg, MD）＋過酸化水素を色素原として付加し、ＥＬＩＳＡ読取機で450 nmでプレートを読み取った。
【０１６５】
実施例ＩＩＩ−２．アイソタイプ化
【０１６６】
ラットアイソタイプ特異的試薬（Zymed Labs, South San Francisco CA）を用いて、前に記載された方法（Songsakphisarn, R. and Goldstein, N.I., Hybridoma 12: 343-348, 1993）と同様に、種々のモノクローナル抗体のアイソタイプ化を実行した。
【０１６７】
実施例ＩＩＩ−３．リン酸化、免疫沈降および免疫ブロット検定
Ｃ４４１および１０Ａ２細胞を用いたリン酸化検定およびウエスタンブロット分析を、前に記載された（Tessler et al., 1994）方法と同様に、それにいくつかの修正を加えて実施した。要するに、ＤＭＥ−10％ＣＳ中で細胞を90％集密に増殖させて、次に実験の前に、ＤＭＥ−0.5％ＣＳ中の血清を24時間枯渇させた。ＥＧＭ基本培地中でＨＵＶＥＣ細胞を亜集密に増殖させた。中和検定のために、室温で15分間、ｍＡｂＤＣ−１０１の存在下および非存在下で、無血清条件下（ＤＭＥ−0.1％ＢＳＡ）で種々の濃度の適切なリガンドで細胞を刺激した。リガンドＶＥＧＦおよびＣＳＦ−１を、それぞれ10〜80 ng/mlおよび20〜40 ng/mlの濃度で検定した。モノクローナル抗体を、0.5 μg/ml〜10 μg/mlの範囲の濃度で検定した。ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のＶＥＧＦ誘導性活性化に及ぼすｍＡｂＤＣ−１０１の作用を評価するために、リガンドの付加前に室温で15分間、抗体を同時に（競合的阻害）細胞に付加するかまたは細胞と予備結合させた。ＤＣ−１０１の非存在下および存在下で無血清培地中でインキュベートされた細胞は、それぞれリガンドの非存在下および抗体の存在下での受容体自己リン酸化に関する対照として用いた。ｆｍｓ／ＦＬＫ−２キメラ受容体を発現する対照細胞株(１０Ａ２)を飢えさせて、20および40 ng/mlのＣＳＦ−１で刺激し、5 μg/mlのＤＣ−１０１の存在下および非存在下で検定した。
【０１６８】
刺激後、1 mMオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで単一層を洗浄した。次に溶解緩衝液（20 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.4、1％トリトンＸ−100、137 mMＮａＣｌ、10％グリセロール、10 mMＥＤＴＡ、2 mMオルトバナジン酸ナトリウム、100 mMＮａＦ、100 mMピロリン酸ナトリウム、5 mMペファブロック（Pefabloc）（Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN）、100 μgアプロチニンおよび100 μg/mlロイペプチン）中に細胞を溶解し、14000xgで10分間遠心分離した。ヒトｆｍｓ受容体のＣ末端領域（Tessler et al., J. Biol. Chem. 269, 12456-12461, 1994）またはプロテインＡセファロースビーズと結合されたネズミＦＬＫ−２インターキナーゼドメイン（Small et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 459-463, 1994）に対応するペプチドに対して生成されたポリクローナル抗体を用いて、トランスフェクト化細胞の清澄化溶解物からタンパク質を免疫沈降させた。指示された場合には、ＤＣ−１０１または無関連ラットＩｇＧを用いた免疫沈降を、プロテインＧビーズに結合された抗体10 μgを用いて実施した。次にビーズを、0.2％トリトンＸ−100、10 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.0、150 mMＮａＣｌ、2 mMＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）で1回、500 mMＮａＣlを含有する緩衝液Ａで2回、そしてトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.0で2回洗浄した。排液（ドレーン）ビーズを2 x ＳＤＳ負荷緩衝液中で30 μlと混合して、4〜12％勾配ゲル（Novex, San Diego, CA）中でＳＤＳ  ＰＡＧＥに付した。電気泳動後、分析のためにタンパク質をニトロセルロースフィルターに対してブロットした。5％ウシ血清アルブミンおよび10％脱脂粉乳（Biorad, CA）を含有する遮断（ブロッキング）緩衝液（50 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.4、150 mMＮａＣｌ）(ＴＢＳ)中で一夜、フィルターを遮断した。リン酸化受容体を検出するために、遮断緩衝液中で室温で1時間、ホスホチロシン（UBI, Lake Placid, NY）に向けられるモノクローナル抗体を用いてブロットをプローブした。次に、0.1％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する0.5x ＴＢＳ(ＴＢＳ−Ｔ)でブロットを広範に洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗マウスＩｇ（Amersham）とともにインキュベートした。ブロットをＴＢＳで洗浄し、化学発光試薬（ECL, Amersham）とともに1分間インキュベートした。高速発光検出フィルム（ハイパーフィルム−ＥＣＬ、Amersham）に0.5〜10分間露出することにより、リン酸化タンパク質と反応する抗ホスホチロシンを検出した。
【０１６９】
Ｃ４４１細胞受容体レベルでｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓを検出するために、メーカーのプロトコール（Amersham）にしたがってブロットを剥ぎ取って、抗ｆｍｓウサギポリクローナル抗体で再プローブした。
【０１７０】
実施例ＩＩＩ−４．フローサイトメーター結合検定
【０１７１】
Ｃ４４１細胞を、10 cmプレート中でほぼ集密に増殖させた。細胞を非酵素的解離緩衝液(Sigma)で取り出し、冷無血清培地中で洗浄して、100万個細胞／試験管の濃度で1％ＢＳＡを補足したハンクス平衡塩溶液(ＨＢＳＳ−ＢＳＡ)中に再懸濁した。モノクローナルＡｂＤＣ−１０１またはアイソタイプ適正無関連抗体抗ＦＬＫ−２  ２３Ｈ７を、氷上で60分間、10 μg／試験管で付加した。洗浄後、ＦＩＴＣ（TAGO）に接合されたヤギ抗マウスＩｇＧ5 μlを氷上でさらに30分間付加した。細胞を3回洗浄し、1 mlのＨＢＳＳ−ＢＳＡ中に再懸濁し、Coulter Epics Elite血球計算機で分析した。蛍光第二抗体の特異的結合を，第一抗体を欠く試料から確定した。
【０１７２】
実施例ＩＩＩ−５．無傷細胞との結合検定
【０１７３】
Ｃ４４１細胞を用いて検定を実施し、細胞を24ウエル皿中で集密に増殖させた。ＨＵＶＥＣ細胞を6ウエル皿中で集密に増殖させた。単層を、結合緩衝液(ＤＭＵＥＭ、50 mMＨＥＰＥＳ、ｐＨ7.0、0.5％ウシ血清アルブミン)中の種々の量のｍＡｂＤＣ−１０１とともに4℃で2時間インキュベートした。次に細胞を冷リン酸塩緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、2.5 ug/mlの最終濃度でビオチンに接合された第二抗ラットＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。4℃で1時間後、細胞を洗浄し、ストレプタビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体とともに4℃で30分間インキュベートした。洗浄後、比色検出系（TMB, Kirkegaard and Perry）を用いて得られる540 nmでの吸光度を測定することにより、細胞結合抗体を確定した。第二抗体単独のＯＤ540 ｎｍは、非特異的結合に関する対照として用いた。
【０１７４】
実施例ＩＩＩ−６．細胞増殖検定
細胞力価96非放射性細胞増殖検定キット(Promega Corp., Madison, WI)を用いて、マイトジェン検定を実施した。この検定では、ホルマザン産物への生存可能細胞によるテトラゾリウム塩の還元から得られる値として、増殖は比色測定的に測定される。要するに、1000細胞／ウエルでＥＧＭ基本培地中の24ウエルゼラチン被覆プレート中で、ＨＵＶＥＣ細胞を増殖させた。48時間インキュベーション後、種々の構成成分をウエルに付加した。1 μg/mlのｍＡｂＤＣ−１０１の存在下および非存在下で、培地にＶＥＧＦを10 ng/mlで付加した。指示された場合、ヘパリン（Sigma）を付加して、最終濃度を1 μg/mlとした。次に細胞をさらに3日間インキュベートした。細胞増殖を測定するために、テトラゾリウム染料の20 μlアリコートを各ウエルに付加し、細胞を37℃で3時間インキュベートした。細胞を可溶化し、ホルマザン産物の吸光度(ＯＤ570)を増殖の定量として測定した。
【０１７５】
実施例ＩＶ.in vitro活性検定
【０１７６】
実施例ＩＶ−１．ネズミ抗ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)Ｍａｂ２５および７３はｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のＶＥＧＦ誘導性活性化の特異的中和を引き出す
【０１７７】
等濃度のｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓトランスフェクト化３Ｔ３細胞株Ｃ４４１からの免疫沈降ＦＬＫ／ｆｍｓおよびＰＤＧＦ受容体を用いて検定を実施し、一方、ヒトＥＧＦＲは、腫瘍細胞株ＫＢから免疫沈降した。10 ug/mlのネズミ抗ｆｌｋ−１Ｍａｂ２５および７３の存在下および非存在下で、20 ng/mlＶＥＧＦ(ｆｌｋ−１／ｆｍｓ)を含有するＲＰＭＩ−0.5％ＢＳＡ、ＤＭＥＭ−10％仔ウシ血清(ＰＤＧＦＲ)または10 ng/mlＥＧＦ(ＥＧＦＲ)で細胞を刺激した。刺激後、細胞をＰＢＳ−1 mMオルトバナジン酸ナトリウムで洗浄し、溶解した。それぞれｃ−ｆｍｓ（ＩＭ１３３）およびＰＤＧＦ（ＵＢＩ）受容体のＣ末端領域に対するペプチド生成ポリクローナル抗体を用いて溶解物から、ｆｌｋ−１／ｆｍｓおよびＰＤＧＦＲを免疫沈降した。ＥＧＦＲは、ヒト受容体のＮ末端領域に対して産生されるＭａｂ(Ｃ２２５)で免疫沈降させた。免疫沈降溶解物にＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を、その後ウエスタンブロッティング処理を施した。抗ＰＴｙｒＭａｂ(ＵＢＩ)を用いてブロットをプローブして、受容体活性化を検出した。刺激細胞の受容体中和を、無関連Ｍａｂおよび非刺激対照に関連して査定した。
【０１７８】
実施例ＩＶ−２．プローブとしてＭａｂ２５およびＭａｂ７３を用いたウエスタンブロッティングによるｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体の検出
【０１７９】
等濃度のｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓトランスフェクト化３Ｔ３細胞株Ｃ４４１から調整された溶解物からのｃ−ｆｍｓ受容体のＣ末端領域に対するペプチド生成ポリクローナル抗体により免疫沈降させたｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のウエスタンブロットでのネズミ抗ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）Ｍａｂにより、受容体を検出した。ＳＤＳゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングによる分析後、ブロットを4部に分けて、各セクションを50 μg/mlの抗ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)Ｍａｂ２５および７３を用いてプローブした。次にブロットを剥ぎ取り、抗ｆｍｓポリクローナル抗体で再プローブして、各Ｍａｂにより検出された帯域がｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体を表すことを立証した。
【０１８０】
実施例ＩＶ−３．抗ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）Ｍａｂを用いた免疫沈降によるＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣおよびＯＶＣＡＲ−３細胞からの活性化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の検出
【０１８１】
新たに単離されたＨＵＶＥＣの溶解物からの異なる抗体により、タンパク質を免疫沈降した。溶解前に、ＲＰＭＩ−0.5％ＢＳＡ中で20 ng/mlＶＥＧＦで室温で10分間、細胞を刺激し、1 mMオルトバナジン酸ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄した。等容量の溶解物を用いて個々の免疫沈降を実施し、次にＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を、その後ウエスタンブロッティング処理を施した。ブロットを、最初に抗ＰＴｙｒＭａｂ(ＵＢＩ)で、次に順次、剥ぎ取り、ｆｌｋ−１／ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−１／ＶＥＧＦＲ−２、ＩＭ  １４２)のインターキナーゼ二対するペプチド生成ポリクローナル抗体で、その後、ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−１)（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）のＣ末端領域に対するポリクローナル抗体で再プローブした。無関連ラットＭａｂ、２３Ｈ７、無関連マウスＭａｂ、ＤＡＢ８対抗ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)Ｍａｂ、ＤＣ−１０１、７３、２５および抗ｆｌｋ−１／ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−１／ＶＥＧＦＲ−２)ポリクローナル抗体、ＩＭ１４２を用いて、免疫沈降を実施した。いくつかの場合、ブロットを剥ぎ取り、抗ｆｌｋ−１Ｍａｂ７３および２５で再プローブして、交差反応性帯域を検出した。
【０１８２】
同様のプロトコールを用いて、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３中のＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体形態を検出した
【０１８３】
実施例Ｖ．抗体の活性
【０１８４】
実施例Ｖ−１．ＤＣ−１０１を用いたＥＬＩＳＡおよび免疫沈降
【０１８５】
ラットＩｇＧ１モノクローナル抗体ＤＣ−１０１は、ネズミチロシンキナーゼ受容体ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)に特異的であることが判明した。ＥＬＩＳＡデータは、当該抗体が、アルカリ性ホスファターゼまたはその他の受容体チロシンキナーゼ、例えばＦＬＫ−２でなく、精製ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)：ＳＥＡＰに結合される、ということを示した。図１に示したように、ＤＣ−１０１は、ＳＥＡＰＳ単独ではなく、ネズミｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)：ＳＥＡＰＳを免疫沈降する。
【０１８６】
実施例Ｖ−２．ＤＣ−１０１によるｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)受容体リン酸化の抑制
【０１８７】
次に、ＤＣ−１０１が、そのコグネイトリガンドＶＥＧＦ165によるＣ４４１細胞中のｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)のリン酸化を中和し得るか否かを確定するための実験を実施した。これらの試験では、モノクローナル抗体およびＶＥＧＦを同時に、室温で15分間、単層に付加した。これらの条件は、受容体／リガンド結合に及ぼす抗体の競合的作用(競合的抑制)を確定するために意図された。図２ａに示したこれらの検定の結果は、ＤＣ−１０１の存在下で細胞を検定した場合、ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のＶＥＧＦ165誘導性リン酸化が顕著に低減された、ということを示す。さらにこれらのデータは、ＭａｂがＶＥＧＦ165と競合して、リガンドによる受容体の全活性化を防止する、ということを示唆する。ＤＣ−１０１による抑制に対するＶＥＧＦ−ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)相互作用の感受性を確定するために、種々のレベルの抗体と組合されたＶＥＧＦ165の最大濃度（40 ng/ml）で、Ｃ４４１細胞を検定した。これらのＭａｂ力価滴定の結果を、図２ｂに示す。ＶＥＧＦ165によるｆｌｋ−１(ＶＥＧＦ−２)のリン酸化における顕著な低減は、ＤＣ−１０１が0.5 μg/mlより大きい濃度で含まれる場合に観察された。これらのデータは、相対的に低濃度の抗体(＜1 μg/ml)がリガンドによる受容体活性化を抑制するのに十分である、ということを示す。5 μg/mlでは、抗体は、80 ng/mlの過剰リガンドの存在下で、ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)のＶＥＧＦ165刺激を中和し得る(図３ａおよび３ｂ)。対照として、ＤＣ−１０１の作用を、ＣＳＦ−１を用いて全刺激化ｆｍｓ／ＦＬＫ−２受容体(１０Ａ２細胞株)に関して試験した。これらの条件下では、ＤＣ−１０１は受容体活性化に及ぼす作用を示さなかった。
【０１８８】
実施例Ｖ−３.ＤＣ−１０１を用いた抑制試験
【０１８９】
リガンドを付加して抗体と受容体との相互作用を最大にする前に、ＤＣ−１０１を細胞とともに予備インキュベートした試験により、Ｍａｂ抑制の程度および特異性をさらに査定した。これらの実験では、5 μg/mlのＤＣ−１０１、慣用的技法により調製されたラット抗ＦＬＫ−２Ｍａｂ（２Ａ１３）（ImClone, NY）、ならびに対照ラットＩｇＧ１（Zymed Labs）とともに、室温で１５分間、単層をインキュベートした後、40 ng/mlのＶＥＧＦ165をさらに15分間付加した。比較のために、ＤＣ−１０１およびＶＥＧＦ165を同時に付加する(競合的抑制)検定を実行した。これらの試験の結果(図４)は、ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓトランスフェクト化細胞を用いた抗ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)モノクローナル抗体の予備インキュベーションが、ＶＥＧＦ165による受容体活性化を完全に阻止することを示す。同様の結果は、刺激のためにＶＥＧＦ121を用いて観察された。ＶＥＧＦによるｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)のリン酸化は無関連アイソタイプ適正ラット抗体の付加により影響されないが、しかし抗ｆｍｓポリクローナル抗体でプローブされた同一ブロットの反応性は、等レベルの受容体タンパク質／レーンを示す。これらのデータは、ＤＣ−１０１を用いて観察されたリン酸化の抑制が、試験試料中の受容体タンパク質の欠損というよりむしろ、受容体活性化の遮断によるものであった、ということを示す。
【０１９０】
実施例Ｖ−４.ＦＡＣＳ分析によるＤＣ−１０１とＣ４４１細胞との結合
【０１９１】
ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体(Ｃ４４１細胞)でトランスフェクトした３Ｔ３細胞との結合に関するＦＡＣＳ分析により、ｍＡｂを検定した。図６に示した結果は、Ｃ４４１細胞の表面に発現されたキメラｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓが、ｍＡｂＤＣ−１０１により特異的に認識され、そして関連チロシンキナーゼ受容体ＦＬＫ−２に対して産生された同一アイソタイプの抗体により認識されない、ということを実証する。細胞表面でのｍＡｂ−受容体相互作用の効力を、種々のレベルのｍＡｂ結合を無傷Ｃ４４１細胞で測定した検定から確定した。図７に示したこれらの結果は、ｍＡｂが、約500 ng/mlという相対的識別可能な親和性でｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体と結合する、ということを示す。これらの結果は、ｍＡｂが細胞表面発現ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)に対して強い親和性を有する、ということを示す。
【０１９２】
実施例Ｖ−５.免疫沈降によるＤＣ−１０１の反応性
【０１９３】
ＶＥＧＦによる活性化合物に受容体を免疫沈降する抗体の能力を確定することにより、ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体とのＤＣ−１０１反応性の程度をさらに査定した。図８は、ＶＥＧＦ刺激Ｃ４４１細胞からのリン酸化ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のｍＡｂＤＣ−１０１による免疫沈降を示す。結果は、ＤＣ−１０１モノクローナルおよび抗ｆｍｓポリクローナル抗体が同様のレベルの受容体相互作用を示すが、一方、ラット抗ＦＬＫ−２抗体２Ｈ３７(ＩｇＧ１)および２Ａ１３(ＩｇＧ２ａ)は反応性を示さない、ということを示す。次に、ｍＡｂＤＣ−１０１が、リガンドの最大刺激濃度（40 ng/ml）でのｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓのＶＥＧＦ誘導性リン酸化を中和し得るか否かを確定するために、実験を実施した。この試験では、モノクローナル抗体を、リガンドと同時に、あるいはリガンド刺激の前に単層に付加し、そして室温で15分間検定した。これらの条件を試験して、受容体／リガンド結合に及ぼす抗体の競合的作用(競合的抑制)、ならびに受容体活性化を防止する予備結合抗体の効力を確定した。図４に示したこれらの検定の結果は、ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓのリン酸化がｍＡｂとＶＥＧＦの同時付加により低減され、そして受容体に予備結合された抗体により顕著に抑制される、ということを示す。これらのデータのデンシメトリー走査は、ｍＡｂＤＣ−１０１がｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓと相互作用して、完全刺激受容体対照(レーン４)の6％(レーン５、Ｐ)および40％(レーン６、Ｃ)であるレベルにリン酸化を抑制する、ということを明示した。これらのデータから、ｍＡｂＤＣ−１０１はリガンド−受容体相互作用と強力に競合して、ｆｌｋ−１受容体活性化を中和する、とわれわれは推測する。ｍＡｂＤＣ−１０１による抑制に対するＶＥＧＦ−ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)相互作用の感受性を確定するために、漸増濃度の抗体の存在下で最大ＶＥＧＦレベルで、Ｃ４４１細胞を検定した。検定は、競合的および予備結合条件下で、ｍＡｂを用いて実施した。これらのｍＡｂ力価滴定の結果を図９に示す。ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)のリン酸化の顕著な低減は、ｍＡｂＤＣ−１０１が0.5 μg/mlより高い濃度でＶＥＧＦ抗体と競合する場合に観察される。これらのデータは、相対的低濃度の予備結合抗体(＜1 μg/ml)がリガンドによる受容体活性化を完全に抑制するのに十分である、ということも示す。
【０１９４】
実施例Ｖ−６.リン酸化検定によるＤＣ−１０１の活性
【０１９５】
受容体活性化に及ぼすｍＡｂＤＣ−１０１のアンタゴニスト的振舞いをさらに評価するために、漸増量のリガンドで刺激されたＣ４４１に一定量の抗体（5 μg/ml）を付加するリン酸化検定を実施した(図３ａ)。ｍＡｂＤＣ−１０１の存在下および非存在下で各リガンド濃度により誘導されるリン酸化のレベルも、デンシメトリー読取りにより定量した。図３ｂに示したこれらのデータのプロットは、余分量のＶＥＧＦの存在下でさえ、受容体リン酸化を抗体が部分的に中和し得る、ということを示す。受容体活性化に及ぼすｍＡｂＤＣ−１０１の特異性を評価するために、３Ｔ３トランスフェクト化細胞株１０Ａ２におけるｆｍｓ／ＦＬＫ−２受容体のＣＳＦ−１誘導性活性化を競合的に抑制するその能力に関して、抗体を試験した。これらの実験では、受容体の完全活性化を生じることが既知であるＣＳＦ−１濃度（20〜40 ng/ml）と一緒に、5 μg/mlのｍＡｂＤＣ−１０１を試験した。図１０に示したこれらの結果は、ｍＡｂＤＣ−１０１がｆｍｓ／ＦＬＫ−２受容体のＣＳＦ−１媒介性リン酸化に及ぼす作用を有さない、ということを示す。
【０１９６】
実施例Ｖ−７.予備インキュベーション試験によるＤＣ−１０１阻害
【０１９７】
抗体と受容体との最大相互作用の確保のためにリガンドを付加する前に、ＤＣ−１０１または無関連抗体を細胞とともに予備インキュベートした試験により、抗体抑制の程度および特異性をさらに査定した。これらの実験では、5 μg/mlのＤＣ−１０１、ラット抗ＦＬＫ−２ｍＡｂ（２Ａ１３）または対照ラットＩｇＧ１（Zymed Labs）とともに単層をインキュベートした後、40 ng/mlのＶＥＧＦを付加した。比較のために、抗体およびＶＥＧＦを同時に付加する検定を実行した。これらの試験の結果は、ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓトランスフェクト化細胞を用いた抗ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)モノクローナル抗体の予備インキュベーションのみが、ＶＥＧＦによる受容体活性化を完全に阻止するが、一方、ＶＥＧＦによるｆｌｋ−１(ＶＥＧＦ−２)のリン酸化は無関連アイソタイプ適正ラット抗体の付加により影響されない、ということを示す。抗ｆｍｓポリクローナル抗体でプローブされた同一ブロットの反応性(図１１)は、等レベルの受容体タンパク質／レーンを示す。これらのデータは、ｍＡｂＤＣ−１０１を用いて観察されたリン酸化の欠損が、等量の発現受容体のＶＥＧＦ誘導性リン酸化の遮断によるものであった、ということを示す。
【０１９８】
実施例Ｖ−８.抗体と相同受容体形態との相互作用
【０１９９】
次に、抗ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)モノクローナル抗体がヒト内皮細胞上の相同受容体形態と相互作用するか否かを確定するために、実験を実行した。クローン化ＨＵＶＥＣ細胞(ＡＴＣＣ)上での漸増濃度のＤＣ−１０１の滴定は、抗体が複雑な結合行動を示す、ということを示した。データは、内皮細胞上で起こると報告されたＶＥＧＦ受容体との示差的抗体相互作用を表す（Vaisman et al., J. Biol. Chem. 265, 19416-19446, 1990）。次に図８に関して報告したものと同様の条件下でのリン酸化検定を用いて、ＶＥＧＦ刺激性ＨＵＶＥＣ細胞とのＤＣ−１０１相互作用の特異性を検討した。これらの試験では、ＤＣ−１０１は、リガンド構成成分を差し引いた場合に架橋ＶＥＧＦ−受容体帯域に関して報告したものと同様の分子量を有するＨＵＶＥＣ細胞からのタンパク質帯域を免疫沈降する(図１２)。これらの帯域は、ＶＥＧＦで細胞を刺激すると、リン酸化増大を示す(図１２のレーン１および２を比較)。さらに、受容体帯域のＶＥＧＦ誘導性リン酸化は、検定における1 μg/mlヘパリンの含入により強化される(図１２のレーン３)。これらの知見は、低濃度のヘパリンの存在下で内皮細胞と結合するＶＥＧＦ増大についての従来の報告と一致する（Gitay-Goren et al., J.Biol. Chem. 267, 6093-6098, 1992）。
【０２００】
種々の受容体形態がＨＵＶＥＣ上でＶＥＧＦと結合することが示されており、そして刺激時にそれらが会合する可能性があるとすると、免疫沈降タンパク質がＤＣ−１０１と相互作用して、図１２で観察されたリン酸化帯域の複合体を生じる、ということを確証することは難しい。約180(ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２))、155、130〜135、120〜125および85の分子量を有する細胞表面発現受容体形態は、ＨＵＶＥＣ上でＶＥＧＦと結合することが報告されている。このような知見は、数個の異なる受容体形態が、ＫＤＲ−ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２／ＶＥＧＦＲ−１)に関して報告されたものと類似の方法での刺激時にヘテロ二量体化し得る、という可能性を検討する。しかしながらＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)を除いて、これらの受容体形態の精確な性質および役割はいずれは限定されるに違いない。したがって抗体反応性は、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)とは無関係に数個のＶＥＧＦ受容体のうちの1つとの相互作用(単数または複数)に起因し得る。
【０２０１】
ＤＣ−１０１はＥＬＩＳＡ形式でヒトＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と反応しないし、あるいはＦＡＣＳ分析により新たに単離されたＨＵＶＥＣと結合しない。これらの結果は、ＤＣ−１０１とヒトＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)との直接的相互作用が非常にありそうもない、ということを示唆する。
【０２０２】
ＤＣ−１０１とは違って、Ｍａｂ２５およびＭａｂ７３はともに、ＥＬＩＳＡ形式でヒトＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と反応し、そしてＦＡＣＳ分析により新たに単離されたＨＵＶＥＣと結合する。
【０２０３】
実施例Ｖ−９.ＨＵＶＥＣのマイトジェン検定
【０２０４】
内皮細胞に及ぼすＤＣ−１０１の阻害作用は、抗体の存在下および非存在下でＶＥＧＦで刺激したＨＵＶＥＣ細胞(ATCC)のマイトジェン検定で抗体を試験した場合に観察された(図１２)。これらの結果は、ＶＥＧＦによる細胞増殖の顕著な増大がＤＣ−１０１により約35％低減される、ということを示す。ヘパリンは、これらの検定に用いられた増殖条件下で細胞増殖に及ぼす示差的作用を示さない。
【０２０５】
ＤＣ−１０１はＶＥＧＦ誘導性リン酸化およびＨＵＶＥＣの受容体リン酸化に及ぼす作用を発揮し得るため、これらの結果が、細胞表面では不十分に接近可能であるが、しかしＨＵＶＥＣ増殖において、小さくはあるが、いくつかの役割を演じる非限定性受容体形態とのＭａｂ相互作用によるものである、と考えられる。ＶＥＧＦ刺激性ＨＵＶＥＣからのＤＣ−１０１による精確な分子量のリン酸化帯域の免疫沈降は、ＤＣ−１０１が、活性化受容体複合体と会合する非限定ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)様タンパク質と相互作用し得る、という考えも支持する。
【０２０６】
実施例Ｖ−１０.Ｍａｂ２５およびＭａｂ７３とＣ４４１およびＨＵＶＥＣとの結合
【０２０７】
Ｍａｂ２５およびＭａｂ７３は、ＦＡＣＳ分析によりＣ４４１およびＨＵＶＥＣと結合し、両細胞株においてインターナライゼーションを示す。ウエスタンブロットからの結果は、両抗ｆｌｋ−１Ｍａｂが、Ｃ４４１細胞からの抗ｆｍｓポリクローナル抗体により免疫沈降物中のＦＬＫ／ｆｍｓ受容体に関する帯域(単数または複数)を検出し得る、ということを示す(プロトコールに関しては前記の実施例ＩＶ−２参照)。これらの抗体は、ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のＶＥＧＦ誘導性活性化の特異的中和を引き出し、そしてＰＤＧＦによるマウスＰＤＧＦ受容体の、またはＥＧＦによるヒトＥＧＦ受容体のリン酸化に及ぼす作用を有さない(プロトコールに関しては前記の実施例ＩＶ−１参照)。それらは、増殖検定においてＶＥＧＦ刺激性ＨＵＶＥＣを50％抑制する能力を有するが、一方、ＤＣ−１０１ははるかに低い程度に増殖に影響を及ぼす。
【０２０８】
実施例Ｖ−１１.Ｍａｂ２５およびＭａｂ７３を用いたＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の免疫沈降
【０２０９】
ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)は、活性化ＨＵＶＥＣからＭａｂ２５およびＭａｂ７３により免疫沈降されたホスホタンパク質のうちの1つを表す。ＶＥＧＦ刺激性初期継代ＨＵＶＥＣからの抗ｆｌｋ−１／ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)ポリクローナル抗体(ＩＭ１４２)を用いて、ウエスタンブロットおよび免疫沈降分析で、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)を検出した。逆に、ＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣからこれらの抗体により免疫沈降された帯域は、ＩＭ１４２と交差反応性であるが、しかし抗ｆｌｋ−１（抗ＶＥＧＦＲ−１）ポリクローナル抗体とは反応性でない。これらの知見は、Ｍａｂが、活性化内皮細胞における増殖性応答に関与するＶＥＧＦ受容体としてのＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)に関連する実験的証拠に基づいたＨＵＶＥＣ中のＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の活性に影響し得る、と推測される(プロトコールに関しては前記の実施例ＩＶ−３参照)。
【０２１０】
実施例ＶＩ．非内皮(腫瘍)細胞上のＶＥＧＦ受容体形態の存在
【０２１１】
免疫沈降および抗ホスホチロシンを用いた検出により、ＤＣ−１０１とのタンパク質反応性に関して数個の腫瘍株をスクリーニングした。細胞株８１６１（黒色腫）およびＡ４３１（類表皮癌）からの免疫ブロットは、約170〜120 kDの分子量を有するリン酸化帯域を生じた。これらの結果は、ヒトＶＥＧＦ受容体形態が非内皮細胞、例えば腫瘍細胞中で発現される、ということを示す。
【０２１２】
同様の実験は、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)様受容体が卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３中で発現される、ということを示している。これらの細胞は、ＶＥＧＦを分泌するとも思われる。リン酸化帯域は、ウエスタンブロッティングにより抗ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）Ｍａｂと反応性であるＶＥＧＦ刺激性ＯＶＣＡＲ−３細胞から、抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)ポリクローナル抗体により免疫沈降される。さらにこれらの細胞からネズミＭａｂにより免疫沈降された帯域は、同一ポリクローナル抗体との交差反応性を示す。さらにある種のネズミ抗ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）Ｍａｂは、増殖検定においてこれらの細胞に及ぼす阻害作用を引き出す。これらの結果は、ヒトＶＥＧＦ受容体形態の非内皮性発現(即ち腫瘍細胞上)を実証する。リン酸化および増殖検定からのデータは、腫瘍形成中にＶＥＧＦがオートクリンおよびパラクリン方式で受容体活性を調整し得る、ということも示唆する(プロトコールに関しては前記の実施例ＩＶ−３参照)。
【０２１３】
実施例ＶＩＩ．ＤＣ−１０１を用いたin vivo試験
【０２１４】
実施例ＶＩＩ−１.ＤＣ−１０１による血管新生のin vivoでの抑制
【０２１５】
抗ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)モノクローナル抗体がＶＥＧＦ発現腫瘍細胞の増殖を遮断するか否かを確定するようin vivo試験を意図した。これらの実験では、高レベルのＶＥＧＦをメッセージとして送り、無血清培地中で24時間状態調節後に約5 ng/mlのＶＥＧＦ増殖因子を分泌するヒト神経膠芽細胞腫多形細胞株を用いた(図５)。
【０２１６】
0日目に、無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ；Charles River Labs）の側腹に100〜200百万個の神経膠芽細胞腫細胞を注入した。同日に開始して、ＤＣ−１０１および対照抗体（100 ug／動物）の腹腔内注射を動物に施した。3、5、7、10、12、14、17、19および21日目に、マウスにその後の抗体治療を施した。合計1 mg／動物の接種のために、0、3、5、7、10、12、14、17、19および21日目に、ＤＣ−１０１またはネズミＦＬＫ−２(２Ａ１３)に対する対照ラット抗体100 μgを動物に注射した。5日目までに腫瘍が出現し始め、50日間続いた。カリパスを用いて腫瘍サイズを毎日測定し、以下の方程式により腫瘍容積を算出した：ｐ／6 x 長径ｘ(短径)2（Baselga J. Nat’l Cancer Inst. 85: 1327-1333）。測定は少なくとも週3回実施し、腫瘍容積を前記のように算定した。ＤＣ−１０１群の腫瘍保有動物１匹は試験の初期に死亡したので、群間の統計学的有意を確定するために用いられなかった。
【０２１７】
図１４ａおよび１４ｂは、個々の動物における38日間の腫瘍増殖の低減についてのＤＣ−１０１および対照２Ａ１３群間の比較を示す。試験経過中に全動物が種々のサイズおよび数の腫瘍を発症したが、しかしＤＣ−１０１処置マウスは腫瘍進行の全体的遅延を示した。ＤＣ−１０１群の１匹のマウスは、小増殖が観察された49日目まで、ずっと腫瘍を有さなかった。その時点でさえ、腫瘍増殖は顕著に抑制された。データの統計学的分析を実行して、2群間の腫瘍サイズの差を査定した。データを、腫瘍サイズが共変数として治療を伴う時点で退行される共分散の標準分析に付した。結果は、ＤＣ−１０１軍に関する長期間の腫瘍サイズの低減が、２Ａ１３注射マウスに関して観察されたものと有意に異なる(ｐ＜0.0001)ということを示した。
【０２１８】
図１５は、ＶＥＧＦを分泌するヒト神経膠芽細胞腫細胞株ＧＢＭ−１８を皮下注射した無胸腺ヌードマウスの治療効力を示す。ヌードマウスにＧＢＭ−１８細胞を皮下注射して、3つの処置群：ＰＢＳ対照、無関連ラットＩｇＧ１対照２３Ｈ７およびＤＣ−１０１に分けた。ＧＭＢ−１８腫瘍異種移植片を用いて処置を同時に施して、4週間持続した。結果は、ＤＣ−１０１処置ヌードマウスにおけるＧＢＭ−１８腫瘍増殖が対照と比較して有意に低減される、ということを示した。この実験は、腫瘍関連血管内皮細胞上でのｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)のＶＥＧＦ活性化を遮断することによりＤＣ−１０１が腫瘍増殖を抑制する、そしてＤＣ−１０１が、ＶＥＧＦを分泌する血管形成腫瘍に対する抗血管新生試薬としての治療価値を有する、ということを示した。
【０２１９】
ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)受容体チロシンキナーゼに対するモノローナル抗体は、血管新生を阻止することにより腫瘍侵襲を抑制する。侵襲性増殖および血管新生は、悪性腫瘍の不可欠な特性である。両現象は、表面移植検定において良性ケラチノサイトを悪性ケラチノサイトと区別するのに適していることを立証した。ヌードマウスの背筋上でのコラーゲンゲルに結合された細胞単層の移植後、腫瘍細胞はすべて最初に組織化扁平上皮を形成したが、しかし悪性ケラチノサイトのみは2〜3週間以内に侵襲的に増殖した。良性および悪性細胞はすべて、血管新生を誘導した。しかしながら初期に起きた悪性細胞に対する血管新生性応答は、非常に強い、そして悪性上皮に向けられる毛細血管増殖である。さらに、良性腫瘍細胞の移植片では、毛細血管は2〜3週間後に退行したが、一方、悪性ケラチノサイト進行中の血管新生のレベルを保持する。血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)およびそのコグネイト受容体は、腫瘍血管新生において中枢的役割を演じる。ＤＣ−１０１の投与は進行中の血管新生を中断させて、腫瘍侵襲の抑制をもたらす。抗体は、新規に形成された血管網状構造の成熟とさらなる拡大を防止するが、しかし初期血管新生誘導を有意に妨害しなかった。これらの結果は、腫瘍侵襲が先行血管新生を要し、ＶＥＧＦ受容体がこのモデル系における血管新生を保持するのに決定的である、という証拠を提供する。
【０２２０】
実施例ＶＩＩ−２.確立された神経膠芽細胞腫(ｇｂｍ−１８)腫瘍に及ぼす異なる濃度のＤＣ−１０１の作用
【０２２１】
無胸腺マウス(ｎｕ／ｎｕ)にＧＢＭ−１８(ヒト多形性神経膠芽細胞腫)を皮下接種した。腫瘍が100〜200 mm3の平均容積に達したときに、抗体療法を開始した。処置は、以下の6回の注射(週2回で3週間)からなっていた：(ｉ)ＤＣ−１０１（200、400または800 μg／注射）；(ｉｉ)無関連アイソタイプ適正ラットＩｇＧ（400 μg／注射）；あるいは(ｉｉｉ)ＰＢＳ。カリパスを用いて腫瘍容積を測定した。ＤＣ−１０１群における腫瘍抑制は、ＰＢＳおよび無関連モノクローナル抗体群に対して有意である（*）ことが判明した。
【０２２２】
別の実験は、ヌードマウスにおけるＧＢＭ−１８腫瘍の増殖に及ぼすラット抗ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)モノクローナル抗体ＤＣ−１０１の作用を実証する。動物（ｎｕ／ｎｕ；Charles River Labs；動物10匹／群）に、ＧＢＭ−１８細胞（ヒト神経膠芽細胞腫［100］；100万／動物）を０日目に地価注射した。ＰＢＳまたはＤＣ−１０１（200 μg／注射）による処置を7日目に開始し、週2回で3週間継続した（6x）。グラフは、それらのそれぞれの腫瘍増殖率（λとして示される勾配；実線）および99％信頼限界（点線）を有する長時間の各群に関する平均腫瘍容積および退行化データのプロットを示す。ＤＣ−１０１で処置した動物に関する線の勾配は、ＰＢＳのものと有意に異なった(ｐ＜0.01)。無関係ラットＩｇＧ１モノクローナル抗体(抗マウスＩｇＡ；Pharmigen)は、ＧＢＭ−１８異種移植片の増殖に及ぼす作用を有さず、そしてＰＢＳを用いて観察されたものと同様の結果を示した(データは示されていない)、ということに留意するのは重要である。
【０２２３】
実施例ＶＩＩＩ．抗ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)抗体はヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の放射線誘導性治癒率を選択的に増大する
【０２２４】
この実施例は、腫瘍血管のネズミ内皮細胞上のきわめて重要なＶＥＧＦ受容体−２,ｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)を遮断するモノクローナル抗体ＤＣ−１０１が分別化放射線療法(ＲＴ)による腫瘍異種移植片の治癒率を増大するか否か、そして抗体が同時に正常組織(ネズミ皮膚)の放射線反応を調整するか否かを評価する。
【０２２５】
材料＆方法：ヒト小細胞肺癌５４Ａおよび多形性神経膠芽細胞腫Ｕ８７をヌードマウスの後足に皮下移植した。腫瘍が直径8 mmに達したら（0日目）、処置を開始した。ＤＣ−１０１を、合計６回の注射に関して、20または40 mg／体重1kgの用量で3日毎に腹腔内注射した。5連続日に、段階的総線量の放射線を等しい1日分画で投与した。0日目に、マウスに最初の抗体注射を施し、あるいはＲＴを開始した。併用治療のために、ＤＣ−１０１投与を０日目に開始し、ＲＴを１日目に開始した。処置後、週に2〜3回、腫瘍サイズを測定した。最終腫瘍再発が任意の群において観察された後、局所的制御腫瘍を有するマウスを90日間追跡調査した。腫瘍放射線照射の分野における皮膚の急性反応を、ＲＴの開始後最初の30日間に、評価スケールを用いて評価した。
【０２２６】
結果：単独で用いた抗体は、用量依存性方式で両腫瘍の増殖抑制(退行ではなく)を誘導した。その作用は、Ｕ８７異種移植片よりも５４Ａにおいて顕著であった。最低線量の放射線（計25〜30 Gy）との組合せでは、ＤＣ−１０１は、いずれのモデルにおいても、ＲＴ単独と比較した場合、付加的腫瘍増殖遅延を提供した。抗体は、さらにまた用量依存性様式で、ＲＴの治癒作用を増大した。例えばその高容量で、ＤＣ−１０１は、腫瘍の50％を局所的に制御するのに必要な放射線の線量を低減した：５４Ａ異種移植片では１．７倍（ＲＴ単独に関する67.6 Gyから併用療法に関する39.1 Gyに）、ならびにＵ８７では1.3倍（９７．８から74.8 Gy）。ＤＣ−１０１のこのような作用が腫瘍に対して選択的であった、ということも特別な重要性を有する。即ち、抗体による皮膚放射線反応の平行変化は検出されなかった。付加的実験で査定したように、腫瘍の放射線応答のＤＣ−１０１誘導性増強は酸素処理におけるそれらの放射能感作または変化に関連しなかったが、一方、抗体による腫瘍間隙液圧の有意の低減と相関した。
【０２２７】
結論：これらの増殖因子分子に対する腫瘍受容体に対する抗体によるＶＥＧＦシグナリング経路の遮断は、分別ＲＴに対する腫瘍治癒応答を選択的に強化し、したがって治療的利益を提供する、ということを結果は集合的に示唆する。
【０２２８】
実施例ＩＸ．一本鎖抗体の産生
【０２２９】
実施例ＩＸ−１.材料
【０２３０】
実施例ＩＸ−１(ａ)．細胞株およびタンパク質
【０２３１】
一次培養ＨＵＶＥＣをＥＢＭ−２培地中に37℃、5％ＣＯ2で保持した。全検定のために、2〜5継代の細胞を用いた。ＶＥＧＦ165タンパク質をバキュロウイルス中で発現させて、精製した。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の細胞外ドメインをコードする相補的ＤＮＡをヒト胎児腎臓ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより単離し、ベクターＡＰ−ＴａｇのＢｇｌＩＩおよびＢｓｐＥ１部位にサブクローニングした。このプラスミドにおいて、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)細胞外ドメインに関するｃＤＮＡはヒト胎盤ＡＰに関するｃＤＮＡと枠組み内で融合される。プラスミドをネオマイシン発現ベクターｐＳＶ−Ｎｅｏと一緒にＮＩＨ  ３Ｔ３細胞中に電気穿孔処理して、安定細胞クローンをＧ４１８を用いて選択した。ＡＰに固定されたモノクローナル抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより、可溶性融合タンパク質ＫＤＲ−ＡＰを細胞培養上清から精製した。
【０２３２】
実施例ＩＸ−１(ｂ)．マウス免疫感作および一本鎖抗体ファージ表示ライブラリーの構築
【０２３３】
雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、200 ulのＲＩＢＩアジュバント系中の10 μgのＫＤＲ−ＡＰを2回腹腔内（i.p.）注入し、その後、2ヶ月間に亘ってＲＩＢＩアジュバントを用いずに1回i.p.注入した。マウスには、最初の免疫感作の時点で、200 ulのＲＩＢＩアジュバント系中の10 μgのＫＤＲ−ＡＰの皮下（s.c.）注入も施した。安楽死の3日前に、20 μgのＫＤＲ−APを用いてマウスにi.p.追加免疫を施した。ドナーマウスから脾臓を取り出して、細胞を単離した。ＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡを脾細胞の総ＲＮＡから精製した。糸状ファージＭ１３の表面に表示されたｍＲＮＡを用いて、ｓｃＦｖファージ表示ライブラリーを構築した。
【０２３４】
糸状ファージ表面でのｓｃＦｖの表示に際して、抗体ＶHおよびＶLドメインを、15アミノ酸長リンカー（ＧＧＧＧＳ）3により一緒に連結し、ファージタンパク質ＩＩＩのＮ末端と融合した。アンバーコドンが後に続く15アミノ酸長Ｅタグを、検出およびその他の分析目的のために、ＶLのＣ末端とタンパク質ＩＩＩの間に挿入した。Ｅタグとタンパク質ＩＩＩの間に置かれたアンバーコドンは、構築物を、サプレッサー宿主(例えばＴＧＩ細胞)中で形質転換されると表面表示形式のｓｃＦｖに、非サプレッサー宿主(例えばＨＢ２１５１細胞)中に形質転換されると可溶性形態のｓｃＦｖにし得る。
【０２３５】
集成したｓｃＦｖＤＮＡをｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅベクターに結繋した。形質転換化ＴＧ１細胞を２ＹＴＡＧプレート上でプレート化して、インキュベートした。コロニーを10 mlの２ＹＴ培地中に掻き取って、50％グリセロール5 mlと混合し、−70℃でライブラリーストックとして保存した。
【０２３６】
実施例ＩＸ−１(ｃ)．バイオパニング
【０２３７】
ライブラリーストックを増殖させて対数相とし、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いて奪取し、そして２ＹＴＡＫ培地（100 μg/mlのアンピシリンおよび50 μg/mlのカナマイシンを含有する２ＹＴ）中で30℃で一夜増幅した。ファージ調製物を4％ＰＥＧ／0.5 MＮａＣｌ中で沈降させ、500 μg/mlのＡＰタンパク質を含有する3％脱脂乳／ＰＢＳ中に再懸濁し、37℃で1時間インキュベートして、ファージ表示抗ＡＰｓｃＦｖを捕獲して、他の非特異的結合を遮断した。
【０２３８】
ＫＤＲ−ＡＰ（10 μg/ml）被覆Maxisorp Star管（Nunc, Denmark）を先ず3％乳／ＰＢＳを用いて、37℃で1時間遮断し、次にファージ調製物とともに室温で1時間インキュベートした。試験管をＰＢＳＴ（0.1％Ｔｗｅｅｎ20を含有するＰＢＳ）で10回、その後ＰＢＳで10回洗浄した。1 mlの新たに調製された100 mMトリエチルアミンの溶液を用いて、結合ファージを室温で10分間溶離した。溶離ファージを、10 mlの中期対数相ＴＧ１細胞を用いて、37℃で静止で30分間、振盪しながら30分間、インキュベートした。次に感染ＴＧ１細胞を２ＹＴＡＧプレート上でプレート化して、30℃で一夜インキュベートした。
【０２３９】
3回のパニング後にスクリーニングされたクローンの99％（185/186）は、特異的ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)結合体であることが判明した。しかしながらこれらの結合体のうち15（8％）だけが、固定化ＶＥＧＦに結合するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)を遮断し得た。これら15のクローンのＤＮＡ  ＢｓｔＮＩフィンガープリントは、2つの異なる消化パターンの存在を示した。一方、21の無作為摘出ＶＥＧＦ非遮断薬は、4つの異なるパターンを生じた。消化パターンはすべて、2回目のパニング後に同定されたクローン中でも観察された。各消化パターンの代表的クローンを2回目のパニング後に回収されたクローンから摘み取り、ＤＮＡシーケンシングに付した。シーケンシングされた15のクローンのうち、2つの独自のＶＥＧＦ遮断薬および3つの非遮断薬を同定した。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と結合しないし、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と結合するＶＥＧＦを遮断もしない一ｓｃＦｖ、ｐ２Ａ７を、すべての試験のための陰性対照として選択した。
【０２４０】
実施例ＩＸ−１(ｄ)．ファージＥＬＩＳＡ
【０２４１】
個々のＴＧ１クローンを96ウエルプレート中で37℃で増殖させて、前記のようにＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いて奪取した。増幅ファージ調製物を、1/6容積の18％乳／ＰＢＳを用いて室温で1時間遮断し、ＫＤＲ−ＡＰまたはＡＰ（1 μg/ml x 100 ul）で被覆されたMaxi-sorp 96ウエルマイクロタイタープレート（Nunc）に付加した。室温で1時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで3回洗浄し、ウサギ抗Ｍ１３ファージＡｂ−ＨＲＰ接合体とともにインキュベートした。プレートを5回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を付加し、450 nmでのＯＤを、マイクロプレート読取り機を用いて読み取り、ｓｃＦｖ抗体を同定し、シーケンシングした。
【０２４２】
実施例ＩＸ−１(ｅ)．可溶性ｓｃＦｖの調製
【０２４３】
個々のクローンのファージを用いて、非サプレッサー大腸菌宿主ＨＢ２１５１を感染させ、感染体を２ＹＴＡＧ−Ｎプレート上で選択した。30℃で、1 mMイソプロピル−１−チオ−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する２ＹＴＡ培地中で細胞を培養することにより、ＨＢ２  １５１細胞中のｓｃＦｖの発現を誘導した。20％（w/v）スクロース、200 mMＮａＣｌ、1 mMＥＤＴＡおよび0.1 mMＰＭＳＦを含有する25 mMトリス(ｐＨ7.5)中に細胞ペレットを再懸濁し、その後、静かに振盪しながら4℃で1時間インキュベートすることにより、細胞の細胞周辺抽出物を調製した。15,000 rpmで15分間の遠心分離後、ＲＰＡＳ精製モジュール（Pharmacia Biotech）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、可溶性ｓｃＦｖを上清から精製した。
【０２４４】
実施例ＩＸ−２.検定
【０２４５】
実施例ＩＸ−２(ａ)．定量的ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)結合検定
【０２４６】
2つの検定を用いて、精製可溶性ｓｃＦｖとＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)との結合を定量的に調べた。
【０２４７】
4つの異なるクローン、例えば2つのＶＥＧＦ遮断薬、ｐ１Ｃ１１およびｐＦ１２、1つの非遮断薬、優勢クローンｐ２Ａ６および非結合体ｐ２Ａ７を、非サプレッサー宿主大腸菌ＨＢ２１５１細胞を用いて振盪フラスコ中で発現させた。抗Ｅタグアフィニティークロマトグラフィーにより、大腸菌の細胞周囲抽出物から可溶性ｓｃＦｖを精製した。これらのクローンの精製ｓｃＦｖの収率は、100〜400 μg／培養1リットルの範囲であった。
【０２４８】
直接結合検定では、種々の量の可溶性ｓｃＦｖをＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)被覆96ウエルMaxi-sorpマイクロタイタープレートに付加し、室温で1時間インキュベートし、その後、プレートをＰＢＳＴで3回洗浄した。次に100 μlのマウス抗Ｅタグ抗体を用いて室温で1時間インキュベートし、その後、100 plのウサギ抗マウス抗体−ＨＲＰ接合体を用いてインキュベートした。プレートを洗浄し、ファージＥＬＩＳＡのための前記の手法にしたがって現像させた。
【０２４９】
別の検定では、即ち競合的ＶＥＧＦ遮断検定では、種々の量の可溶性ｓｃＦｖを一定量のＫＤＲ−ＡＰ（50 ng）と混合し、室温で1時間インキュベートした。次に混合物をＶＥＧＦ165（200 ng／ウエル）で被覆された96ウエルマイクロタイタープレートに移し、室温でさらに2時間インキュベートし、その後、プレートを5回洗浄し、ＡＰのための基質を付加して、結合ＫＤＲ−ＡＰ分子を定量した。ＩＣ50、即ちＶＥＧＦに結合するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の50％阻害に要するｓｃＦｖ濃度を次に算定した。
【０２５０】
図１６は、直接結合ＥＬＩＳＡにより検定した場合の固定化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)とのｓｃＦｖの用量依存性結合を示す。図１７に示すように、クローンｐ１Ｃ１１およびｐ１Ｆ１２も、固定化ＶＥＧＦと結合するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)を遮断するが、しかしｐ２Ａ６は遮断しない。図１７に示したデータは、三重反復確定の平均±ＳＤである。陰性クローンｐ２Ａ７は、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と結合しないし、ＶＥＧＦと結合するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)を遮断しない(図１６および１７)。各回のパニング後の優勢クローンであるクローンｐ１Ｃ１１は、最高ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)結合能力、ならびにＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)に結合するＶＥＧＦを遮断する最高効力を示した(表１)。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)との最大結合の50％、ならびにＶＥＧＦと結合するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の50％阻害に要するクローンｐ１Ｃ１１の抗体濃度は、それぞれ0.3 nMおよび3 nMであった(表１参照)。ＦＡＣＳ分析は、ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｆ１２およびｐ２Ａ６がＨＵＶＥＣ上の細胞表面発現受容体とも結合し得る、ということを実証した。
【０２５１】
実施例ＩＸ−２(ｂ)．可溶性ｓｃＦｖのＢＩＡｃｏｒｅ分析
【０２５２】
ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー（Pharmacia Biosensor）を用いて、可溶性ｓｃＦｖとＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)との結合動力学を測定した。ＫＤＲ−ＡＰ融合タンパク質をセンサーチップ上に固定し、可溶性ｓｃＦｖを62.5 nM〜1000 nMの範囲の濃度で注入した。センサーグラムを各濃度で得て、プログラムＢＩＡ評価2.0を用いて評価して、速度定数konおよびkoffを確定した。速度定数koff/konの比から、Ｋｄを算定した。
【０２５３】
表１は、ＢＩＡｃｏｒｅ計器での表面プラスモン共鳴の結果を示す.ＶＥＧＦ遮断ｓｃＦｖ、ｐ１Ｃ１１およびｐ１Ｆ１２は、それぞれ2.15.9 nMのＫｄで固定化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)に結合した。非遮断ｓｃＦｖ、ｐ２Ａ６は、主として非常に速い解離速度のために、最良結合体ｐ１Ｃ１１の約1/6の弱い親和性（Ｋｄ、11.2 nM）でＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と結合した。予測どおり、ｐ２Ａ７は、ＢＩＡｃｏｒｅ上の固定化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と結合しない。
【０２５４】
実施例ＩＸ−２(ｃ)．リン酸化検定
【０２５５】
前記のプロトコールにしたがって、初期継代ＨＵＶＥＣを用いてリン酸化検定を実施した。要するに、5 μg/mlでのｓｃＦｖの存在下または非存在下で、0.5％ウシ血清アルブミンを補足した無血清ＥＢＭ−２基本培地中で、室温で１０分間、ＨＵＶＥＣをインキュベートし、その後、20 ng/mlＶＥＧＦ165を用いて室温でさらに15分間刺激した。細胞を溶解し、ウサギ抗ＫＤＲ(抗ＶＥＧＦＲ−２)ポリクローナル抗体（ImClone Systems Incorporated）に結合されたプロテインＡセファロースビーズを用いて、細胞溶解物からＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体を免疫沈降させた。ビーズを洗浄し、ＳＤＳ負荷緩衝液と混合し、上清をウエスタンブロット分析に付した。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)リン酸化を検出するために、抗ホスホチロシンＭａｂ、４Ｇ１０を用いてブロットをプローブした。ＭＡＰキナーゼ活性検定のために、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、その後、リン特異的ＭＡＰキナーゼ抗体を用いてウエスタンブロット分析を施した。シグナルはすべて、ＥＣＩを用いて検出した。
【０２５６】
結果は、ＶＥＧＦ遮断ｓｃＦｖｐ１Ｃ１１はＶＥＧＦにより刺激されたＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体リン酸化を抑制し得るが、しかし非遮断ｓｃＦｖｐ２Ａ６を抑制しない、ということを示した。それに反して、ｐ１Ｃ１１もｐ２Ａ６も、ＭＡＰキナーゼｐ４４／ｐ４２のＦＧＦ刺激性活性を抑制しなかった。
【０２５７】
実施例ＩＸ−２(ｄ)．抗マイトジェン検定
【０２５８】
ＨＵＶＥＣ（5 x 103細胞／ウエル）を、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦを含有しない200 ｕｌのＥＢＭ−２培地中で96ウエル組織培養プレート（Wallach, Inc., Gaithersburg, MD）上でプレート化し、37℃で72時間インキュベートした。種々の量の抗体を二重反復試験ウエルに付加し、37℃で1時間予備インキュベートし、その後、ＶＥＧＦ165を付加して、最終濃度を16 ng/mlとした。18時間のインキュベーション後、0.25 μCiの［３Ｈ］−ＴｄＲ(Amersham)を各ウエルに付加し、さらに4時間インキュベートした。細胞を氷上に置き、血清含有培地で2回洗浄し、その後、10％ＴＣＡとともに4℃で10分間インキュベートした。次に細胞を水で1回洗浄し、25 μlの2％ＳＤＳ中に溶解した。シンチレーション流体（150 μl／ウエル）を付加し、ＤＮＡ取込み放射能をシンチレーション計数器（Wallach, Model 1450 Microbeta Scintillation Counter）で確定した。
【０２５９】
ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ刺激性マイトジェン活性を遮断するｓｃＦｖ抗体の能力を、図１８に示す。ＶＥＧＦ遮断ｓｃＦｖｐ１Ｃ１１は、約5 nMのＥＣ50で、即ちＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ刺激性有糸分裂の50％を阻害する抗体濃度で、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性ＤＮＡ合成を強力に抑制した。非遮断ｓｃＦｖｐ２Ａ６は、ＶＥＧＦのマイトジェン活性に及ぼす抑制作用を示さなかった。ｐ１Ｃ１１もｐ２Ａ６も、ＨＵＶＥＣ中のｂＦＧＦ誘導性ＤＮＡ合成を抑制しなかった(示されていない)。図１８に示したデータは、少なくとも3つの別個の実験の代表的なものである。（！）ＶＥＧＦのみ；（∀）ＶＥＧＦなし。
【０２６０】
実施例ＩＸ−３.ｐ１Ｃ１１からのキメラ抗体の産生
【０２６１】
実施例ＩＸ−３(ａ)．細胞株およびタンパク質
【０２６２】
一次培養ヒト臍帯静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を、37℃、5％ＣＯ2でＥＢＭ−２培地中に保持した。全検定のために、2〜5継代の細胞を用いた。前記の手法にしたがって、ＶＥＧＦ165およびＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−アルカリ性ホスファターゼ融合タンパク質(ＫＤＲ−ＡＰ)をそれぞれバキュロウイルスおよびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞中で発現させて、精製した。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と結合するが、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−ＶＥＧＦ相互作用を遮断しない抗体である抗ＫＤＲ(抗ＶＥＧＦＲ−２)ｓｃＦｖｐ１Ｃ１１およびｓｃＦｖｐ２Ａ６を、前記のようにＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)で免疫感作されたマウスから構築されたファージ表示ライブラリーから単離した。Ｃ２２５は、上皮増殖因子(ＥＧＦ)受容体に対して向けられるキメラＩｇＧ１抗体である。
【０２６３】
実施例ＩＸ−３(ｄ)．ｓｃＦｖｐ１Ｃ１１の可変部のクローニング
【０２６４】
ｐ１Ｃ１１の軽鎖（ＶL）（配列番号８および配列番号１６）および重鎖（ＶH）（配列番号７および配列番号１５）の可変部を、それぞれプライマー１および２，ならびにプライマー３および４を用いて、ＰＣＲによりｓｃＦｖ発現ベクターからクローン化した。次に哺乳類細胞におけるタンパク質分泌のためのリーダーペプチド配列を、それぞれプライマー５および２、ならびにプライマー５および４を用いて、ＰＣＲによりＶLおよびＶHの５‘に付加した。
【０２６５】
プライマー１：5’CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAG CTC3’［配列番号３７］
【０２６６】
プライマー２：5’TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG3’ BamHI［配列番号３８］
【０２６７】
プライマー３：5’CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC AAG CTG3’［配列番号３９］
【０２６８】
プライマー４：5’TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT3’ BamHI［配列番号４０］
【０２６９】
プライマー５：5’GGT CAA AAG CTT ATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTT HindIII CTA GTA GCA ACT3’［配列番号４１］
【０２７０】
実施例ＩＸ−３(ｃ)．キメラｐ１Ｃ１１  ＩｇＧに関する発現ベクターの構築
【０２７１】
キメラＩｇＧ軽鎖および重鎖の発現のための別個のベクターを構築した。クローン化ＶL遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトκ軽鎖定常部(ＣL)を含有するベクターｐＫＮ１００に結繋して、キメラｐ１Ｃ１１軽鎖ｃ−ｐ１Ｃ１１−Ｌのための発現ベクターを作製した。クローン化ＶH遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ヒトＩｇＧ１(γ)重鎖定常部(ＣH)を含有するベクターｐＧＩＤ１０５に結繋して、キメラｐ１Ｃ１１重鎖ｃ−ｐ１Ｃ１１−Ｈのための発現ベクターを作製した。両構築物を制限酵素消化により検査して、ジデオキシヌクレオチドシーケンシングにより立証した。
【０２７２】
図１９に示したように、ＶHおよびＶLドメインをそれらの５‘末端で、印をつけたようなリーダーペプチド配列(配列番号２３および配列番号２４)をコードする遺伝子セグメントに融合する。ＶHおよびＶLドメインを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位を介して、それぞれヒトγ１定常部遺伝子のｃＤＮＡバージョンを含有する発現ベクターｐＧ１Ｄ１０５、ならびにヒトκ鎖定常部遺伝子のｃＤＮＡバージョンを含有するｐＫＮ１００に結繋する。各々の場合、発現はＨＣＭＶｉプロモーターの制御下にあり、人工末端配列により終結される。Kabat等の超可変配列定義により定義される軽鎖および重鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)残基に下線を付し、それぞれＣＤＲ−Ｈ１〜Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ１〜Ｌ３を標識した。ＣＤＲ−Ｈ１(配列番号１および配列番号９)；ＣＤＲ−Ｈ２(配列番号２および配列番号１０)；ＣＤＲ−Ｈ３(配列番号３および配列番号１１)；ＣＤＲ−Ｌ１(配列番号４および配列番号１２)；ＣＤＲ−Ｌ２(配列番号５および配列番号１３)；ＣＤＲ−Ｌ３(配列番号６および配列番号１４)。
【０２７３】
実施例ＩＸ−３(ｄ)．ＩｇＧ発現および精製
【０２７４】
一過性発現のために等量のｃ−ｐ１Ｃ１１−Ｌおよびｃ−ｐ１Ｃ１１−Ｈプラスミドを用いて、ＣＯＳ細胞を同時トランスフェクト化した。150 mm培養皿中のＤＭＥＭ／10％ＦＣＳ中で増殖した亜集密性ＣＯＳ細胞を、40 mMトリス(ｐＨ7.4)を含有するＤＭＥＭ20 mlで1回すすいだ後、4 mlのＤＭＥＭ／ＤＥＡＥ−デキストラン／ＤＮＡ混合物（40 mMトリス、0.4 mg/mlのＤＥＡＥ−デキストラン(Sigma)および各々20 μgのｃ−ｐ１Ｃ１１−Ｌおよびｃ−ｐ１Ｃ１１−Ｈプラスミドを含有するＤＭＥＭ）を用いて37℃で4.5時間インキュベートした。100 nMのクロロキン(Sigma)を含有するＤＭＥＭ／2％ＦＣＳ4 mlを用いて37℃で1時間、細胞をインキュベートし、その後、20％グリセロール／ＰＢＳ1.5 mlを用いて室温で1分間インキュベートした。細胞をＤＭＥＭ／5％ＦＣＳで2回洗浄し、同一培地20 ml中で37℃で一夜インキュベートした。細胞を純ＤＭＥＭで2回洗浄した後、細胞培地を無血清ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳに取り換えた。細胞培養上清を、トランスフェクション後48時間目および120時間目に収集した。メーカー（Pharmacia Biotech）が記載したプロトコールにしたがって、プロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、プール上清からキメラＩｇＧを精製した。ＩｇＧ含有分画をプールし、緩衝液をＰＢＳに交換して、Centricon 10濃縮機（Amicon Corp., Beverly, MA）を用いて濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＩｇＧの純度を分析した。捕獲剤としてヤギ抗ヒトｙ鎖特異的抗体を、そして検出剤としてＨＲＰ接合ヤギ抗ヒトｋ鎖抗体を用いて、ＥＬＩＳＡにより精製抗体の濃度を確定した。臨床等級抗体Ｃ２２５を用いて、標準曲線を調整した。
【０２７５】
プロテインＧによるアフィニティー精製後、〜150 kDの単一タンパク質帯域をＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察した。ＨＲＰ接合抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析は、精製タンパク質中のヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分の存在を確証した(示されていない)。
【０２７６】
ＥＬＩＳＡの結果は、ｃ−ｐ１Ｃ１１が、親ｓｃＦｖより効率的に固定化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と結合する、ということを示す(図２０)。
【０２７７】
実施例ＩＸ−４.検定および分析
【０２７８】
実施例ＩＸ−４(ａ)．ＦＡＣＳ分析
【０２７９】
増殖因子枯渇化ＥＢＭ−２培地中で一夜、初期継代ＨＵＶＥＣ細胞を増殖させて、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の発現を誘導した。細胞を採取し、ＰＢＳで3回洗浄して、ｃ−ｐ１Ｃ１１  ＩｇＧ（5 μg/ml）を用いて4℃で1時間インキュベートし、その後、ＦＩＴＣ標識化ウサギ抗ヒトＦｃ抗体（Capper, Organon Teknika Corp., West Chester, PA）を用いてさらに60分間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメーター(モデルＥＰＩＣＳ（登録商標）、Coulter Corp., Edison, NJ)により分析した。
【０２８０】
図２１は、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）発現ＨＵＶＥＣと結合するｃ−ｐ１Ｃ１１のＦＡＣＳ分析を示すグラフである。親ｓｃＦｖｐ１Ｃ１１を用いて前に観察されたように、ｃｐ１Ｃ１１は、初期継代ＨＵＶＥＣ上に発現されるＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と特異的に結合する。
【０２８１】
実施例ＩＸ−４(ｂ)．定量的ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)結合検定
【０２８２】
種々の量の抗体をＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)被覆96ウエルMaxisorpマイクロタイタープレート（Nunc, Denmark）に付加し、室温で1時間インキュベートし、その後、プレートを、0.1％Ｔｗｅｅｎ20を含有するＰＢＳで3回洗浄した。次に、scFvに関しては100 ulのマウス抗Ｅタグ抗体−ＨＲＰ接合体(Pharmacia Biotech)を、あるいはキメラＩｇＧに関してはウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体−ＨＲＰ接合体（Cappel, Organon Teknika Corp.）を用いて室温で1時間インキュベートした。プレートを5回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（KPL, Gaithersburg, MD）を付加し、450 nmでのＯＤを、マイクロプレート読取り機を用いて読み取った（Molecular Device, Sunnyvale, CA）。
【０２８３】
図２０は、抗体と固定化ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）との直接結合を示すグラフである。ｃ−ｐ１Ｃ１１は、親ｓｃＦｖより効率的に固定化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体と結合することが示されている。
【０２８４】
実施例ＩＸ−４(ｃ)．ＢＩＡコア分析
【０２８５】
ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー（Pharmacia Biosensor）を用いて、抗体とＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)との結合動力学を測定した。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−ＡＰ融合タンパク質をセンサーチップ上に固定し、抗体またはＶＥＧＦを25 nM〜200 nMの範囲の濃度で注入した。センサーグラムを各濃度で得て、プログラムＢＩＡ評価2.0を用いて評価して、速度定数konおよびkoffを確定した。速度定数koff/konの比から、Ｋｄを算定した。
【０２８６】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、親ｓｃＦｖより高い親和性で、ｃ−ｐ１Ｃ１１がＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)に結合することを明示する。ｃｐ１Ｃ１１のＫｄは0.82 nMであり、それに比してｓｃＦｖは2.1 nMである。ｃ−ｐ１Ｃ１１の親和性増大は、主として、二価キメラＩｇＧのより遅い解離速度（koff）のためである。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)との結合のためのｃ−ｐ１Ｃ１１の親和性は、われわれのＢＩＡｃｏｒｅ分析で確定した場合に0.93 nMであるＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と結合するための天然リガンドＶＥＧＦの親和性と同様である、ということに留意することは重要である(表２)。
【０２８７】
実施例ＩＸ−４(ｄ)．競合的ＶＥＧＦ結合検定
【０２８８】
一次検定において、種々の量の抗体を一定量のＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−ＡＰ（50 ng）と混合し、室温で1時間インキュベートした。次に混合物をＶＥＧＦ165（200 ng／ウエル）で被覆された96ウエルマイクロタイタープレートに移し、室温でさらに2時間インキュベートし、その後、プレートを5回洗浄し、ＡＰのための基質(ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Sigma)を付加して、結合ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−ＡＰ分子を定量した。ＥＣ50、即ちＶＥＧＦと結合するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の50％阻害に要する抗体濃度を次に算定した。
【０２８９】
図２２は、ｃ−ｐ１Ｃ１１が、用量依存性方式で、固定化ＶＥＧＦとの結合からＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体を遮断することを示す。キメラ抗体は、ｓｃＦｖに関して2.0 nMであるのに比して、0.8 nMというＩＣ50(即ち、ＶＥＧＦとの結合からＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の50％を抑制するのに要する抗体濃度)でＶＥＧＦ−ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）相互作用を遮断する場合により効力を有する。対照ｓｃＦｖ  ｐ２Ａ６もＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と結合する(図２０)が、しかしＶＥＧＦ−ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)相互作用を遮断しない(図２２)。
【０２９０】
二次検定において、種々の量のｃ−ｐ１Ｃ１１抗体または冷ＶＥＧＦ165タンパク質を一定量の125Ｉ標識ＶＥＧＦ165と混合し、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体で被覆された96ウエルマイクロタイタープレートに付加した。プレートを室温で2時間インキュベートし、5回洗浄して、固定化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体と結合した放射能標識化ＶＥＧＦ165の量を計数した。放射能標識ＶＥＧＦと固定化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)との結合の50％を遮断するのに要するｃ−ｐ１Ｃ１１および冷ＶＥＧＦ165の濃度を確定した。
【０２９１】
放射能標識ＶＥＧＦ165の結合の抑制の結果を図２３に示す。示されたデータは、三重反復確定の平均である。ｃ−ｐ１Ｃ１１は、用量依存性方式での固定化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体との結合に関して、125Ｉ標識化ＶＥＧＦと効率的に競合することが示されている。予測どおり、ＥＧＦ受容体に対して向けられるキメラ抗体であるＣ２２５は、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体と結合せず、あるいはＶＥＧＦ−ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)相互作用を遮断しない(示されていない)。
【０２９２】
実施例ＩＸ−４(ｅ)．リン酸化検定
【０２９３】
実験の前に、増殖因子枯渇ＥＢＭ−２培地中で24〜48時間、亜集密ＨＵＶＥＣ細胞を増殖させた。50 nMオルトバナジン酸ナトリウムで30分間前処理後、細胞を抗体の存在下または非存在下で15分間インキュベートし、その後、20 ng/mlのＶＥＧＦ165または10 ng/mlのＦＧＦを用いて室温でさらに15分間刺激した。次に細胞を溶解緩衝液（50 nMトリス、150 mMＮａＣｌ、1％ＮＰ−４０、2 mMＥＤＴＡ、0.25％ナトリウムデオキシクロレート、1 mMＰＭＳＦ、1 μg/mlロイペプシン、10 μg/mlアプロチニン、ｐＨ7.5）中に細胞を溶解し、細胞溶解物をＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)およびＭＡＰキナーゼリン酸化検定のために用いた。
抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)抗体Ｍａｂ４．１３（ImClone Systems）に結合されたプロテインＡセファロースビーズ（Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA）を用いて、細胞溶解物からＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体を免疫沈降させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解して、ウエスタンブロット分析に付した。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)リン酸化を検出するために、抗ホスホチロシンＭａｂ、ＰＹ２０（ICN Biomedicals, Inc. Aurora, OH）を用いてブロットをプローブした。ＭＡＰキナーゼ活性検定のために、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解し、その後、リン特異的ＭＡＰキナーゼ抗体（New England BioLabs, Beverly, MA）を用いてウエスタンブロット分析を施した。ＥＣＬ（Amersham, Arlington Heights, IL）を用いて全シグナルを検出した。両検定において、ブロットをポリクローナル抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)抗体（ImClone Systems）で再プローブして、等量のタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各レーンに負荷されたことを保証した。
【０２９４】
ｃ−ｐ１Ｃ１１は、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体のＶＥＧＦ刺激性リン酸化およびｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼの活性化を有効に抑制する。反対に、Ｃ２２５は、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体およびＭＡＰキナーゼのＶＥＧＦ刺激性活性化のいかなる抑制も示さない。ｃ−ｐ１Ｃ１１もＣ２２５単独も、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体およびｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼの活性に及ぼすいかなる作用も有さない。ｓｃＦｖ  ｐ１Ｃ１１を用いて前に観察されたように、ｃ−ｐ１Ｃ１１はｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼのＦＧＦ刺激性活性化を抑制しない（示されていない）。さらにｓｃＦｖｐ２Ａ６も、キメラＩｇＧ形態のｐ２Ａ６（ｃ−ｐ２Ａ６）も、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体およびＭＡＰキナーゼのＶＥＧＦ刺激性活性化を抑制しない（示されていない）。
【０２９５】
実施例ＩＸ−４（ｆ）．抗マイトジェン検定
【０２９６】
ヒト内皮細胞のＶＥＧＦ刺激性有糸分裂誘発に及ぼす抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)抗体の作用を、ＨＵＶＥＣを用いて、［3Ｈ］−ＴｄＲ  ＤＮＡ取込み検定により確定した。ＨＵＶＥＣ（5 x 103細胞／ウエル）を、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦを含有しない200 ｕｌのＥＢＭ−２培地中で96ウエル組織培養プレート中でプレート化し、37℃で72時間インキュベートした。種々の量の抗体を二重反復試験ウエルに付加し、37℃で1時間予備インキュベートし、その後、ＶＥＧＦ165を付加して、最終濃度を16 ng/mlとした。18時間のインキュベーション後、0.25 μCiの［3Ｈ］−ＴｄＲを各ウエルに付加し、さらに4時間インキュベートした。ＤＮＡ取込み放射能をシンチレーション計数器で確定した。図２４に示したデータは、少なくとも3つの別個の実験の代表的なものである。
【０２９７】
ｃ−ｐ１Ｃ１１およびｓｃＦｖ  ｐ１Ｃ１１はともに、ＶＥＧＦにより刺激されるＨＵＶＥＣの有糸分裂誘発を効果的に抑制する（図２４）。ｃ−ｐ１Ｃ１１は、親ｓｃＦｖより強力なＶＥＧＦ誘導性有糸分裂誘発の阻害剤である。ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導性有糸分裂誘発の50％を抑制するのに必要な抗体濃度は、それぞれｃ−ｐ１Ｃ１１に関しては0.8 nMおよびｓｃＦｖに関しては6 nMである。予測どおり、ｓｃＦｖ  ｐ２Ａ６は、ＶＥＧＦ刺激性内皮細胞増殖に及ぼすいかなる阻害作用も示さない。
【０２９８】
特許請求したような本発明は、前記の明細書、ならびに容易に利用可能な参考文献および出発物質により可能になる。それにもかかわらず、出願人等は、アメリカ培養細胞コレクションAmerican Type Culture Collection （12301 Parklawn Drive, Rockville MD., 20852 USA）（ＡＴＣＣ）に、以下に列挙するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を寄託した。
【０２９９】
1994年1月26日に寄託されたラット抗マウスｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＤＣ−１０１（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ11534）。
【０３００】
1996年7月19日に寄託されたマウス抗マウスｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)モノクローナル抗体Ｍａｂ２５を産生するハイブリドーマ細胞株Ｍ２５．１８Ａ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ12152）。
【０３０１】
1996年7月19日に寄託されたマウス抗マウスｆｌｋ−１(ＶＥＧＦＲ−２)モノクローナル抗体Ｍａｂ７３を産生するハイブリドーマ細胞株Ｍ７３．２４（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ12153）。
【０３０２】
これらの寄託は、特許手法の目的およびそれらの下での調節のための微生物の寄託についての国際認識International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and the regulations thereunder（ブダペスト条約）に関するブダペスト条約の条項によりなされた。これは、寄託日から30年間の生育可能培養の保持を保証する。生物体は、ブダペスト条約の条項下でＡＴＣＣにより利用可能にされて、関連米国特許の発行時における非制限性利用可能性を保証する。寄託株の利用可能性は、その特許法にしたがって任意の政府の権限下で交付された権利に違反して本発明を実施するための認可と解釈されない。
表１：抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)ｓｃＦｖ抗体のＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)結合分析
【表１】
2005506288.tif 000002
１.直接結合ＥＬＩＳＡにより確定。括弧内の数値は、最大結合の50％を生じるｓｃＦｖ濃度を示す。
２．競合的ＶＥＧＦ遮断ＥＬＩＳＡにより確定。括弧内の数値は、固定化ＶＥＧＦと結合するＫＤＲの50％阻害に要するｓｃＦｖ濃度を示す。
３．ＢＩＡｃｏｒｅ分析により確定。ＮＡ＝適用可能でない。
表２．ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)受容体に対するｐ１Ｃ１１ｓｃＦｖおよびｃ−ｐ１Ｃ１１の結合動力学
【表２】
2005506288.tif 000003
*速度はすべて、ＢＩＡｃｏｒｅ系を用いた表面プラスモン共鳴により確定され、少なくとも3つの別個の測定の平均である。
【０３０３】
実施例Ｘ
【０３０４】
本実施例は、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、即ち抗ｆｌｋ−１(抗ＶＥＧＦＲ−１)モノクローナル抗体ＭＦ−１の産生を実証する。
【０３０５】
ラット抗ＶＥＧＦＲ−１モノクローナル抗体を、標準ハイブリドーマ技法により発現させた。完全フロイントアジュバントと混合した100 μgのＶＥＧＦＲ−１Ｆｃ（定常部）組換えタンパク質（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて、8週齢ラットを腹腔内（i.p.）感作した。次に、不完全フロイントアジュバントと混合した同一タンパク質との融合の前に、ラットに追加免疫を3回施した。
【０３０６】
骨髄腫細胞Ｐ３かけ６３Ａｇ８．６５３を感作マウスからの脾細胞および骨髄細胞と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を生成した。ＥＬＩＳＡベースの結合および遮断検定において、ＶＥＧＦＲ−１アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）組換えタンパク質を用いて、抗ＶＥＧＦＲ−１特異的クローンを選択した。希釈を限定することにより、陽性クローンをサブクローニングした。
【０３０７】
無血清培地中での連続給餌発酵により、ハイブリドーマから抗ＶＥＧＦＲ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を得た。γ結合タンパク質Ｇ−セファロースを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより、無血清状態調節培地からｍＡｂを精製した。In vivo試験に用いたｍＡｂを、ピロゲントプラスPyrogent plus（登録商標）カブトガニアメーバ様細胞溶解物キット（BioWhittaker, Walkersville, MD）を用いて、内毒素に関して試験した。動物試験に用いた抗体調製物はすべて、≦1.25 EU/mlの内毒素を含有した。組換えＶＥＧＦＲ−１ＡＰタンパク質免疫感作ウサギから抗ＶＥＧＦＲ−１ポリクローナル抗体を生成し、γ結合タンパク質Ｇカラム（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）により精製した。
【０３０８】
抗ＶＥＧＦＲ−１ｍＡｂの免疫化学的特性を、ＥＬＩＳＡベースの結合および遮断検定、ならびに親和性に関するＢＩＡｃｏｒｅ分析で特性化した。50 ng／ウエルのＶＥＧＦＲ−１ＡＰまたはＶＥＧＦＲ−２ＡＰタンパク質を用いて、4℃で一夜、96ウエルマイクロタイタープレート（Falcon Flexible plate, Becton Dickinson, Bedford, MA）を被覆することにより、結合検定を実施した。5％ウシ血清、0.05％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水（遮断緩衝液）200 μlを負荷して、室温（ＲＴ）で2時間インキュベートすることにより、ウエルを遮断した。次にウエルを洗浄（5x）し、遮断緩衝液中に希釈した50 μlの種々の濃度のｍＡｂとともにＲＴで1時間インキュベートした。ウエルを再び洗浄（5x）し、50 μlのヤギ抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（BioSource International, Camarillo, CA）とともにＲＴで1時間インキュベートした。ウエルを最終時間洗浄（5x）し、次に３，３‘，５，５’−テトラ−メチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Kirkegaard and Perry Lab Inc., Gaithersburg, MD）50 μlとともにＲＴで1時間インキュベートした。50 μlの1 Mリン酸（Ｈ3ＰＯ4）を付加することにより反応を停止し、マイクロタイタープレート読取機で450 nmでウエルを読取った。
【０３０９】
ＶＥＧＦＲ−１／ＶＥＧＦまたはＰ１ＧＦ遮断検定のために、100 ngのＶＥＧＦまたはＰ１ＧＦ（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて、4℃で一夜、ウエルを被覆した。前記と同様にウエルを遮断し、次に種々の濃度のｍＡｂとともに1時間予備インキュベートさせておいたＶＥＧＦＲ−１ＡＰ100 ngを用いてＲＴで1時間インキュベートした。ウエルを洗浄し、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ、Sigma , St. Louis, MO）とともにインキュベートした。ＲＴで30分間発色させ、次にマイクロタイタープレート読取機で405 nmで読取った。
【０３１０】
ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー（Pharmacia Biosensor）を用いて、ＶＥＧＦＲ−１に対する抗ＶＥＧＦＲ−１ｍＡｂの結合動力学を確定した。ＶＥＧＦＲ−１Ｆｃ融合タンパク質をセンサーチップ上に固定し、ｍＡｂを3.125 nM〜50 nMの範囲の濃度で注入した。センサーグラムを各濃度で得て、プログラムＢＩＡ評価2.0を用いて評価して、Ｋｄ値に関して速度定数koff/kon比を確定した。
【０３１１】
実施例ＸＩ
【０３１２】
本実施例は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト、モノクローナル抗体ＥＲＢＩＴＵＸTM（ＩＭＣ−Ｃ２２５またはＣ２２５としても既知である）および治療的有効量の血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）アンタゴニスト、抗ＶＥＧＦＲ−１モノクローナル抗体ＤＣ−１０１の投与後の腫瘍増殖の抑制を実証する。
【０３１３】
免疫組織化学的分析および抗血管新生療法のために入手した抗体を以下に示す：ラット抗マウスＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１抗体（Pharmingen, San Diego, CA）；マウス抗増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）クローンＰＣ１０ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ（DAKO Corp., Carpinteria, CA）；ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ラット免疫グロブリン（ＩｇＧ）（Ｈ＋Ｌ）およびテキサスレッド接合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Jackson Research Laboratories, West Grove, PA）；ペルオキシダーゼ接合ラット抗マウスＩｇＧ２ａ（Serotec Harlan Bioproducts for Science, Inc., Indianapolis, IN）；ならびにラット抗マウスＶＥＧＦ受容体−２モノクローナル抗体（Prewett et al., 1999; Witte et al., 1998）およびキメラ抗ヒトＥＧＦ受容体モノクローナル抗体（Goldstein et al., 1995）（ImClone Systems, Inc., New York, NY）（Prewett et al., 1999; Witte et al., 1998）。
【０３１４】
1-ml注射器に取り付けた30ゲージ針で、500 μlのＨＢＳＳ中の1.0 x 106ＫＭ１２Ｌ４結腸癌細胞を、8週齢雄無胸腺ヌードマウス（National Cancer Institute, Animal Production Area, Frederick, MD）に腹腔内注入した。次にマウスを4つの処置群（マウス10匹／群）：対照、ＤＣ−１０１、Ｃ２２５、またはＤＣ−１０１およびＣ２２５のうちの1つに無作為化した。動物試験はすべて、Animal Care and Use Committee of MD Anderson Cancer CenterおよびUKCCCR, 1998により認可されたガイドライン下で実行した。
【０３１５】
腫瘍細胞注入後3日目に開始して、マウスに3日毎に対照ビヒクル（リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））、ＤＣ−１０１（0.8 mg）、Ｃ２２５（1.0 mg）またはＤＣ−１０１（0.8 mg）およびＣ２２５（1.0 mg）（各注射は、700 μl容積で投与）を1-ml注射器に取り付けた27ゲージ針で腹腔内注入した。マウスを毎週計量した。対照群が絶滅寸前になった時（治療開始後約30日）に、マウスを屠殺し、完全剖検を実施して、腫瘍負荷を定量し、腫瘍を取り出して、以下のように分析した。
【０３１６】
各マウスに関して、剖検を実施し、腹膜腫瘍のサイズをカリパスで測定し、平均腫瘍サイズを確定して、代表的病変を切除した。処置群割り当てを知らない調査員が、腹水の程度を以下のように査定した：等級０、腹水なし；等級１、少腹水；等級２、中等度腹水；等級３、大容積腹水；等級４、腹部緊張を伴う塊状腹水（Aparicio et al., 1999）。腫瘍切片をＯＣＴ化合物中に包埋し、マイナス70℃で凍結させるか、またはホルマリン中で固定して、次にパラフィン中に包埋した。
【０３１７】
標準脱パラフィン処理（ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織に関して）により、またはアセトンおよびクロロホルム中での固定（ＯＣＴ中で凍結した組織に関して）により、組織切片を処理し、前に記載されたように（Shaheen et al., 1999）、免疫組織化学分析を実施した。要するに、内因性ペルオキシダーゼをメタノール中の3％Ｈ2Ｏ2で遮断し、スライドをＰＢＳで洗浄して、タンパク質遮断溶液（1％正規ヤギ血清および1％正規ウマ血清を補足したＰＢＳ）中で20分間インキュベートし、ＣＤ３１またはＰＣＮＡに対する第一抗体とともに4℃で一夜インキュベートした。次にスライドを洗浄し、タンパク質遮断溶液とともにインキュベートして、ペルオキシダーゼ接合第二抗体とともに室温で1時間インキュベートし、洗浄して、ＤＡＢとともにインキュベートし、洗浄して、ヘマトキシリンで対比染色し、洗浄して、ユニバーサルマウント（Universal Mount）に載せて、ホットプレート上で65℃で乾燥した。ＣＤ３１に関して染色される凍結切片を、ペルオキシダーゼ接合抗体の代わりにテキサスレッド（赤色蛍光）と接合させた第二抗体を用いてインキュベートした。第一抗体を含有しないものは、陰性対照として用いた。
【０３１８】
メーカーのプロトコールにしたがって、ターミナルデオキシヌクレチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介性ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を実施した。要するに、切片を4％メタノール無含有パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、0.2％トリトンＸ−100で透過性にして、洗浄し、キット平衡緩衝液とともにインキュベートし、平衡緩衝液、ヌクレオチドミックスおよびＴｄＴ酵素を含有する反応ミックスとともに37℃で1時間インキュベートして、2x標準クエン酸塩生理食塩水を用いて室温で15分間インキュベートしてＴｄＴ反応を停止し、洗浄し、ＤＡＰＩスライドを用いて染色し（核を可視化するため）、カバーガラスを適用した。
【０３１９】
光学顕微鏡により腫瘍血管の数およびＰＣＮＡ陽性細胞を評価し（倍率100倍で5つの無作為0.159 mm2視野で計数）、デジタルに画像化して、Optimas Image Analysisソフトウエア（Biscan, Edmond, WA）で処理した。アポトーシス細胞を、以下のように免疫蛍光法を用いて可視化した。切片をデジタルに画像化し、Adobe Photoshopソフトウエア（Adobe Systems, Mountain View, CA）で可視化した。ローダミンフィルターを用いて局在赤色蛍光により、ＣＤ３１１陽性内皮細胞（ＥＣ）を検出した。蛍光フィルターを用いて、腫瘍細胞（ＴＣ）に関しては局在緑色蛍光により、またはＥＣに関しては赤色蛍光を用いた緑色により、アポトーシスを確定した。そのフィルターを用いたＤＡＰＩの青色蛍光により、核を検出した。腫瘍の非壊死部分で無作為に選択した5つの視野を用いて、倍率400倍で、5連続非重複市や0.011 mm2視野／スライド中で、細胞を計数した。次にアポトーシスＥＣおよびＴＣ／視野のパーセンテージを、［％アポトーシス細胞＝（アポトーシス細胞数／細胞総数）ｘ100］として算定した。
【０３２０】
治療開始後30日目の腹膜病変に関する直径測定を用いて、総腫瘍負荷を査定した。平均腹膜腫瘍サイズは、ＤＣ−１０１群（50.3％小さい）および組合せＤＣ−１０１＋Ｃ２２５群（66.7％小さい）においては、対照群より小さかった。対照およびＣ２２５マウスの100％が試験終了時に腹膜疾患を有したが、しかし疾患の証拠を示さなかったのは、ＤＣ−１０１マウスの10％および組合せ療法マウスの30％だけであった。最後に、平均腹水等級は、ＤＣ−１０１（66.7％低い）および組合せ療法群（100％低い）に関しては、対照マウスよりも低かった。さらにＤＣ−１０１＋Ｃ２２５群は、ＤＣ−１０１群より有意に低い腹水を有した；事実上、組合せ群においては腹水は見出されなかった。
【０３２１】
免疫組織化学的分析によるＰＣＮＡのために腫瘍細胞を染色し、腫瘍細胞増殖を査定した。腹膜腫瘍は、ＤＣ−１０１（50.3％少ない）およびＤＣ−１０１＋Ｃ２２５群（66.7％少ない）においては、対照群より少なかった。
【０３２２】
マウスに関する腹膜病変の切片をまた、ＣＤ３１免疫蛍光に関して染色して、血管新生の測定値としてＥＣ数を検出した。ＤＣ−１０１およびＤＣ−１０１＋Ｃ２２５群において、対照群より有意に少ないＥＣを観察した。
【０３２３】
免疫蛍光ＴＵＮＥＬ染色を、ＣＤ３１に関する同時染色とともに、または伴わずに、腹膜転移の切片で実施して、ＴＣおよびＥＣアポトーシスを定量した。対照群より多いアポトーシスＴＣおよびＥＣを、ＤＣ−１０１群（ＴＣに関しては14.3倍、ＥＣに関しては226倍）およびＤＣ−１０１＋Ｃ２２５群（ＴＣに関しては23.6倍、ＥＣに関しては331倍）で観察し、ＤＣ−１０１群単独より多いアポトーシスＴＣおよびＥＣをＤＣ−１０１＋Ｃ２２５群で観察した（ＴＣに関しては1.7倍、ＥＣに関しては1.46倍）。
【０３２４】
実施例ＸＩＩ．ヒトＦＡＢの産生
【０３２５】
実施例ＸＩＩ（ａ）．タンパク質および細胞株
【０３２６】
一次培養ＨＵＶＥＣをS. Rafii博士（Cornell Medical Center, New York）から入手し、ＥＢＭ−２培地（Clonetics, Walkersville, MD）中に37℃、5％ＣＯ2で保持した。可溶性融合タンパク質、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−ＡＰ、その免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン欠失変異体、およびＦｌｋ−１−ＡＰを、安定的トランスフェクト化ＮＩＨ  ３Ｔ３中で発現させて、Lu et al., J. Biol. Chem. 275: 14321-30 (2000)により記載されているように、ＡＰに固定されたモノクローナル抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。Zhu et al., Cancer Res. 58: 3209-14 (1998)に記載された手法にしたがって、ＶＥＧＦ165タンパク質をバキュロウイルス中で発現させ、精製した。白血病細胞株ＨＬ６０およびＨＥＬを、10％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ中に保持した。
【０３２７】
実施例ＸＩＩ（ｂ）．ファージＥＬＩＳＡ
【０３２８】
前記のように個々のＴＧ１クローンを摘み取り、96ウエルプレート中で37℃で増殖させて、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いて奪取した。増幅ファージ調製物を、1/6容積の18％乳／ＰＢＳを用いて室温で1時間遮断し、ＫＤＲ−ＡＰまたはＡＰ（1 μg/ml x 100 ul）で被覆されたMaxi-sorp 96ウエルマイクロタイタープレート（Nunc）に付加した。室温で1時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで3回洗浄し、ウサギ抗Ｍ１３ファージ−ＨＲＰ接合体（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）とともにインキュベートした。プレートを5回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（KPL, Gaithersburg, MD）を付加し、450 nmでの吸光度を、マイクロプレート読取機（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて読み取った。
【０３２９】
実施例ＸＩＩ（ｃ）．ＤＮＡ  ＢｓｔＮ  Ｉパターン分析およびヌクレオチドシーケンシング
【０３３０】
各回の選択後の抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂクローンの多様性を、制限酵素消化パターン（即ちＤＮＡフィンガープリント）により分析した。プライマー：ＰＵＣ１９逆5’AGCGGATAACAATTTCACACAGG3’；およびｆｄｔｅｔ配列5’GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT3’をもちいて、個々のクローンのＦａｂ遺伝子挿入物をＰＣＲ増幅した。増幅産物を高頻度切断酵素ＢｓｔＮＩで消化し、3％アガロースゲル上で分析した。各消化パターンからの代表的クローンのＤＮＡ配列を、ジデオキシヌクレオチドシーケンシングにより確定した。
【０３３１】
実施例ＸＩＩ（ｄ）．可溶性Ｆａｂ断片の発現および精製
【０３３２】
個々のクローンのプラスミドを用いて、非サプレッサー大腸菌宿主ＨＢ２１５１を形質転換した。1 mMイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Sigma）を含有する２ＹＴＡ培地中で、30℃で細胞を培養することにより、ＨＢ２１５１中でのＦａｂ断片の発現を誘導した。20％（w/v）スクロース、200 mMＮａＣｌ、1 mMＥＤＴＡおよび0.1 mMＰＭＳＦを含有する25 mMトリス(ｐＨ7.5)中に細胞ペレットを再懸濁し、その後、静かに振盪しながら4℃で1時間インキュベートすることにより、細胞の細胞周辺抽出物を調製した。15,000 rpmで15分間の遠心分離後、メーカーのプロトコール（Amersham Pharmacia Biotech）にしたがって、プロテインＧカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、可溶性Ｆａｂタンパク質を上清から精製した。
【０３３３】
実施例ＸＩＩ（ｅ）．ファージ表示ライブラリーからのヒト抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂの選択
【０３３４】
3.7 x 1010クローンを含有する大型ヒトＦａｂファージ表示ライブラリー（DeHaard et al., J. Biol. Chem. 274: 18218-30 (1999)）を、選択のために用いた。ライブラリーは、それぞれヒト定常軽鎖遺伝子（κおよびλ）ならびにＩｇＧ１重鎖ＣH１ドメインをコードするＤＮＡに融合されたＰＣＲ増幅抗体可変軽鎖遺伝子および可変重鎖遺伝子からなる。重鎖および軽鎖構築物はともに、単一配列−軽鎖に関してはｐｅｌＢおよび重鎖に関しては遺伝子ＩＩＩシグナル配列により先行される。重鎖構築物はさらに、ファージ表示のための遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部分、ヘキサヒスチジンタグおよび11アミノ酸長ｃ−ｍｙｃタグを、その後、アンバーコドン（ＴＡＧ）をコードする。ヘキサヒスチジンおよびｃ−ｍｙｃタグは、精製または検出のために用いられ得る。アンバーコドンは、サプレッサー宿主（例えばＴＧ１細胞）をもちいたファージ表示を、あるいは非サプレッサー宿主（例えばＨＢ２１５１細胞）中に形質転換される場合、可溶性形態のＦａｂ断片の産生を可能にする。
【０３３５】
ライブラリーストックを増殖させて対数相とし、Ｍ１３−ＫＯ７ヘルパーファージを用いて奪取し、そして２ＹＴＡＫ培地（100 μg/mlのアンピシリンおよび50 μg/mlのカナマイシンを含有する２ＹＴ）中で30℃で一夜増幅した。ファージ調製物を4％ＰＥＧ／0.5 MＮａＣｌ中で沈降させ、500 μg/mlのＡＰタンパク質を含有する3％脱脂乳／ＰＢＳ中に再懸濁し、37℃で1時間インキュベートして、ファージ表示抗ＡＰＦａｂ断片を捕獲して、他の非特異的結合を遮断した。
【０３３６】
ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）−ＡＰ（ＰＢＳ中10 μg/ml）被覆Maxisorp Star管（Nunc, Rosklide, Denmark）を先ず3％乳／ＰＢＳを用いて、37℃で1時間遮断し、次にファージ調製物とともに室温で1時間インキュベートした。試験管をＰＢＳＴ（0.1％Ｔｗｅｅｎ20を含有するＰＢＳ）で10回、その後ＰＢＳで10回洗浄した。1 mlの新たに調製された100 mMトリエチルアミンの溶液（Sigma, St Louis, MO）を用いて、結合ファージを室温で10分間溶離した。溶離ファージを、10 mlの中期対数相ＴＧ１細胞を用いて、37℃で静止で30分間、振盪しながら30分間、インキュベートした。次に感染ＴＧ１細胞をペレット化し、数個の大型２ＹＴＡＧプレート上でプレート化して、30℃で一夜インキュベートした。プレート上で増殖したコロニーすべてを、3〜5 mlの２ＹＴＡ培地中に掻きとって、グリセロール（最終濃度の10％）と混合し、アリコート化して、−70℃で保存した。次回の選択のために、100 μlのファージストックを25 mlの２ＹＴＡＧ培地に付加して、中期対数相に増殖させた。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用いて培養を奪取して、増幅し、沈降させて、そして免疫管上に固定されるＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−ＡＰの濃度を低減し、結合過程後の洗浄回数を増大して、前記の手法にしたがって、選択のために用いた。
【０３３７】
初回の結合過程の後タンパク質濃度および洗浄回数を変更して、合計3回の選択を、固定化ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)上で実施した。各回の選択後、93クローンを無作為に摘み取って、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)との結合に関してファージＥＬＩＳＡにより試験した。93のクローンのうちの70（75％）を、第2回選択後に摘み取り、3回目の選択後の回収クローンの90％以上がＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)結合において陽性であったが、このことは、高効率の選択過程を示唆する。2回目選択において同定された70の結合体すべてからのＦａｂをコードするＤＮＡセグメントを増幅し、ＢｓｔＮＩで消化し、そしてフィンガープリントパターンを比較した。合計42の異なるパターンが観察されたが、これは、単離抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂの優れた多様性を示す。交差反応性試験は、42の抗体のうち19が特異的ＦＬＴ−１（ＶＥＧＦＲ−１）結合体であり、一方、残り23の抗体はＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)およびそのネズミ相同体Ｆｌｋ−１の両方と結合する、ということを実証した。抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂ断片の存在下または非存在下での可溶性ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)と固定化ＶＥＧＦとの結合が確定される競合的ＶＥＧＦ結合検定を用いて、さらなる選択を達成した。当該検定は、ＶＥＧＦおよびＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)間の結合を遮断し得る4つのＦａｂクローンを同定した。3つがＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)特異的結合体であり、そして1つがＦｌｋ−１と交差反応した。ＤＮＡフィンガープリンティングおよびシーケンシング分析は、4つのＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)／ＶＥＧＦ遮断抗体すべてが異なっており、独自のＤＮＡおよびアミノ酸配列を有する、ということを確証した。
【０３３８】
4つのクローンに関するＶHおよびＶLのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に関するアミノ酸配列を、表３に示す。
表３−選定ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)結合ヒトＦａｂのＣＤＲ配列
【表３】
2005506288.tif 000004
【０３３９】
ＶHおよびＶL鎖に関する完全配列は、配列表に示されている。Ｄ１Ｆ７に関しては、ＶHに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９および２０で表され、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１および２２で表される。
【０３４０】
Ｄ２Ｃ６に関しては、ＶHに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２３および２４で表され、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号２５および２６で表される。
【０３４１】
Ｄ２Ｈ２に関しては、ＶHに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３０および３１で表され、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号３２および３３で表される。
【０３４２】
Ｄ１Ｈ４に関しては、ＶHに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７および２４で表され、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号２８および２９で表される。
【０３４３】
Ｄ２Ｃ６の単一重鎖を、オリジナルライブラリーに由来する軽鎖の多様性集団と組合せて、二次ライブラリーを作製した。付加的Ｆａｂを同定し、ＳＡ１、ＳＡ３、ＳＢ１０、ＳＢ５、ＳＣ７、ＳＤ２、ＳＤ５、ＳＦ２、ＳＦ７および１１２１と呼んだ。10のＦａｂのＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、以下のように表される。ＳＡ１に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号３４および３５で表される。ＳＡ３に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号３６および３７で表される。ＳＢ１０に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号３８および３９で表される。ＳＢ５に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号４０および４１で表される。ＳＣ７に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号４２および４３で表される。ＳＤ２に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号４４および４５で表される。ＳＤ５に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号４６および４７で表される。ＳＦ２に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号４８および４９で表される。ＳＦ７に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号５０および５１で表される。１１２１に関しては、ＶLに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号５２および５３で表される。
【０３４４】
ＶLＣＤＲ配列を、表４に示す。
表４−ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)結合ヒトＦａｂの軽鎖ＣＤＲ配列
【表４】
2005506288.tif 000005
【０３４５】
実施例ＸＩＩＩ．検定
【０３４６】
実施例ＸＩＩＩ（ａ）．ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)／ＶＥＧＦ相互作用の定量的ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)結合および遮断
【０３４７】
直接結合検定において、種々の量の可溶性Ｆａｂタンパク質をＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)被覆96ウエルMaxi-sorpマイクロタイタープレートに付加し、室温で1時間インキュベートし、その後、プレートをＰＢＳＴで3回洗浄した。次に100 μlのウサギ抗ヒトＦａｂ抗体−ＨＲＰ接合体（Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc., West Grove, PA）を用いて室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ファージＥＬＩＳＡのための前記の手法にしたがって発現させた。競合的ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)／ＶＥＧＦ遮断検定では、種々の量のＦａｂタンパク質を一定量のＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−ＡＰ（100 ng）と混合し、室温で1時間インキュベートした。次に混合物をＶＥＧＦ165（200 ng／ウエル）で予備被覆された96ウエルマイクロタイタープレートに移し、室温でさらに2時間インキュベートし、その後、プレートを5回洗浄し、ＡＰのための基質(ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Sigma)を付加した。405 nmでの吸光度を測定して、結合ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−ＡＰ分子（８）を定量した。ＩＣ50、即ちＶＥＧＦと結合するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の50％阻害に要するＦａｂタンパク質濃度を次に算定した。
【０３４８】
4つのＶＥＧＦ遮断クローン（Ｄ２Ｃ６、Ｄ２Ｈ２，Ｄ１Ｈ４、Ｄ１Ｆ７）を可溶性Ｆａｂとして発現させて、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより大腸菌の細胞周辺抽出物から精製した。これらのクローンの精製Ｆａｂタンパク質の収率は、60〜400 μg／リットルの範囲であった。各精製Ｆａｂ調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、予測分子サイズを有する単一タンパク質帯域を生じた。
【０３４９】
クローンＤ２Ｃ６およびＤ２Ｈ２はより効率的な結合体であって、クローンＤ１Ｈ４およびＤ１Ｆ７が後に続く。4つのＦａｂはまた、固定化ＶＥＧＦと結合するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)を遮断する。ＶＥＧＦと結合するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)の50％阻害に要する抗体濃度は、クローンＤ２Ｃ６、Ｄ２Ｈ２およびＤ１Ｈ４に関しては約2 nM、クローンＤ１Ｆ７に関しては20 nMである。クローンＤ１Ｆ７のみがＦｌｋ−１との結合からＶＥＧＦを遮断し、ＩＣ50は約15 nMである。
【０３５０】
実施例ＸＩＩＩ（ｂ）．可溶性ｓｃＦｖのＢＩＡｃｏｒｅ分析
【０３５１】
ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー（Pharmacia Biosensor）を用いて、可溶性Ｆａｂタンパク質とＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)との結合動力学を測定した。ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）−ＡＰ融合タンパク質をセンサーチップ上に固定し、可溶性Ｆａｂタンパク質を1.5 nM〜100 nMの範囲の濃度で注入した。センサーグラムを各濃度で得て、プログラムＢＩＡ評価2.0を用いて評価して、速度定数konおよびkoffを確定した。速度定数koff/konの比から、Ｋｄを算定した。
【０３５２】
3つのＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)特異的Ｆａｂ断片はすべて、2〜4 nMのＫｄで固定化受容体と結合する（表５）。交差反応性クローンＤ１Ｆ７は45 nMというＫｄを有するが、これはＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)特異的クローンの約1/10〜1/15である。3つのＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)特異的Ｆａｂ断片に関する全体的Ｋｄは類似しているが、しかし個々の結合動力学、即ちこれらの抗体に関するkonおよびkoffはまったく異なり、例えばＤ２Ｃ６は最速オン−レートを保有し、一方Ｄ１Ｈ４は最も遅いオフ−レートを有する、ということは注目に値する（表５）。
表５−4つの中和ヒト抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂ断片の結合動力学
【表５】
2005506288.tif 000006
【０３５３】
数値はすべて、ＢＩＡｃｏｒｅ分析により確定され、そして少なくとも3つの別個の確定からの平均±ＳＥを表す。
【０３５４】
実施例ＸＩＩＩ（ｃ）．結合エピトープマッピング
【０３５５】
ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)細胞外Ｉｇ様ドメイン欠失変異体の産生は、以前に記載されている（Lu et al. (2000)）。エピトープ−マッピング検定では、全長ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)−ＡＰ、2つのＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｉｇ−ドメイン欠失変異体のＡｐ融合物、およびＦｌｋ−１−ＡＰを先ず、捕獲試薬としてウサギ抗ＡＰ抗体（DAKO−免疫グロブリン、Glostrup, Denmark）を用いて、96ウエルプレート（Nunc）上に固定した。次に、種々の抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂタンパク質を用いて、室温で1時間インキュベートし、その後、ウサギ抗ヒトＦａｂ抗体−ＨＲＰ接合体を用いてインキュベートした。プレートを洗浄し、前記と同様に現像した。
【０３５６】
全長ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)および2つのＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｉｇドメイン欠失変異体を用いて、抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂ断片の結合エピトープをマッピングした。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)（１−３）は、最初の3つのＮ末端Ｉｇドメインを含有するＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)変異体である。ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)（３）は、第三Ｉｇドメインのみを含有する変異体である。クローンＤ２Ｃ６およびＤ１Ｈ４は、等しく良好に、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)（１−３）およびＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)（３）と結合し、したがってＩｇドメイン３内にそれらの結合エピトープ（単数または複数）を配置する。クローンＤ２Ｈ２およびＤ１Ｆ７は全長ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)およびＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)（１−３）と非常に効率的に結合し、このことは、ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｉｇドメイン１〜３内のより広範な結合エピトープ（単数または複数）を示す。クローンＤ１Ｆ７だけが、Ｆｌｋ−１と交差反応する。
【０３５７】
実施例ＸＩＩＩ（ｄ）．抗マイトジェン検定
【０３５８】
ＨＵＶＥＣ（5 x 103細胞／ウエル）を、ＶＥＧＦ、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）または上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含有しない200 μｌのＥＢＭ−２培地中で96ウエル組織培養プレート（Wallach, Inc., Gaithersburg, MD）上でプレート化し、37℃で72時間インキュベートした。種々の量のＦａｂタンパク質を二重反復試験ウエルに付加し、37℃で1時間予備インキュベートし、その後、ＶＥＧＦ165を付加して、最終濃度を16 ng/mlとした。18時間のインキュベーション後、0.25 μCiの［3Ｈ］−ＴｄＲ(Amersham)を各ウエルに付加し、さらに4時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで1回洗浄し、トリプシン処理して、ガラスフィルター（印刷フィルターマットＡPrinted Filtermat A, Walach）上に採取機（Harvester 96, MACH III, TOMTEC, Orange, CT）を用いて採取した。膜をＨ2Ｏで3回洗浄し、風乾した。シンチレーション流体を付加し、ＤＮＡ取込み放射能をシンチレーション計数器（Wallach, Model 1450 Microbeta Scintillation Counter）で確定した。
【０３５９】
ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ刺激性マイトジェン活性を遮断するヒト抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂの能力。4つのヒトＦａｂ断片はすべて、用量依存性方式でＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性ＤＮＡ合成を阻害した。ＨＵＶＥＣ中のＶＥＧＦ刺激性［3Ｈ］−ＴｄＲ取込みの50％を阻害する（ＥＣ50）Ｆａｂ濃度は、クローンＤ２Ｃ６およびＤ１Ｈ４に関しては約0.5 nM、Ｄ２Ｈ２に関しては0.8 nM、そしてクローンＤ１Ｆ７に関しては15 nMである。対照は、ＶＥＧＦのみ（1500 cpm）および純培地（60 cpm）を含有した。二重反復試験ウエルを検定した。示したデータは、少なくとも3つの別個の実験を代表するものである。
【０３６０】
実施例ＸＩＩＩ（ｅ）．白血病移動検定
【０３６１】
ＨＬ６０およびＨＥＬ細胞を無血清純ＲＰＭＩ1640培地で3回洗浄し、1 x 106/mlで培地中に再懸濁した。100 μl細胞懸濁液のアリコートを、ＨＬ６０に関しては3 μm孔トランスウエル挿入物に、またはＨＥＬ細胞に関しては8 μm孔トランスウエル挿入物（コスタルCostar（登録商標）、Corning Incorporated, Corning, NY）に付加し、抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂタンパク質（5 μg/ml）とともに37℃で30分間インキュベートした。次に挿入物を、ＶＥＧＦ165を伴ってまたは伴わずに、0.5 mlの無血清ＲＰＭＩ1640を含有する24ウエルプレートのウエル中に入れた。37℃で5％ＣＯ2で、ＨＬ６０に関しては16〜18時間、あるいはＨＥＬ細胞に関しては4時間、移動を実行した。下部区画から移動細胞を収集し、Coulter計数器（モデルＺ１、Coulter Electronics Ltd., Luton, England）で計数した。
【０３６２】
最大刺激による用量依存性方式でのＨＬ６０およびＨＥＬ細胞のＶＥＧＦ誘導性移動を、200 ngで達成した。抗ＫＤＲ(ＶＥＧＦＲ−２)Ｆａｂ断片はすべて、ＨＬ６０およびＨＥＬ細胞のＶＥＧＦ刺激性移動を有意に阻害した。対照として、ＥＧＦ受容体に対して特異的な抗体であるＣ２２５のＦａｂ断片は、この検定において有意の阻害作用を示さなかった。
【０３６３】
実施例ＸＩＶ．ＩｇＧの産生
【０３６４】
実施例ＸＩＶ（ａ）．ＩｇＧの発現のためのベクターの構築
【０３６５】
ＩｇＧ軽鎖および重鎖の発現のための別個のベクターを構築した。クローン化ＶL遺伝子を消化し、ベクターｐＫＮ100に結繋した。クローン化ＶH遺伝子を消化し、ヒトＩｇＧ  Ｉ（γ）重鎖定常部を含有するベクターｐＧＩＤ105に結繋した。構築物を制限酵素消化により検査し、ジデオキシヌクレオチドシーケンシングにより立証した。いずれの場合も、発現は、ＨＣＭＶプロモーターの制御下にあり、人工終結配列により終結した。
【０３６６】
次に集合重鎖および軽鎖遺伝子をLonza GS発現ベクターｐＥＥ６．１中でクローン化した。ＣＨＯ細胞およびＮＳＯ細胞の安定トランスフェクションのために、重鎖および軽鎖ベクターを単一ベクターに再結合した。トランスフェクト化細胞をグルタミン（−）培地中で培養すると、1 g/Lという高レベルで抗体を発現する。
【図面の簡単な説明】
【０３６７】
【図１】モノクローナル抗体ＤＣ−１０１によるｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ＳＥＡＰＳ免疫沈降のウエスタンブロット。ＤＣ−１０１がネズミｆｌｋ−１：ＳＥＡＰＳを免疫沈降するが、しかしＳＥＡＰＳ単独は沈降しないことを実証する。
【図２ａ】トランスフェクト化３Ｔ３細胞中のｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のＶＥＧＦ165誘導性リン酸化に及ぼす抗ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）モノクローナル抗体ＤＣ−１０１の作用を示す競合的阻害検定。
【図２ｂ】モノクローナル抗体ＤＣ−１０１による阻害に対するｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のＶＥＧＦ誘導性リン酸化の感受性。種々のレベルの抗体と組合せたＶＥＧＦの最大刺激濃度（40 ng/ml）で、Ｃ４４１細胞を検定した。
【図３ａ】ｍＡｂＤＣ−１０１の存在下でのｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のＶＥＧＦ誘導性リン酸化の滴定。5 μg/mlのｍＡｂＤＣ１０１の存在下（レーン１〜４）または非存在下（レーン５〜８）での指示されたＶＥＧＦの濃度で、Ｃ４４１細胞を刺激した。抗体の存在下で検定された非刺激細胞（レーン９）は、対照として用いる。
【図３ｂ】各ＶＥＧＦ濃度に対応する図３ａ中の各レーンにおけるリン酸化受容体のレベルの濃度測定スキャンをプロットして、過剰リガンド濃度でのｍＡｂ抑制の程度を示す。以下の実施例に記載したような抗ホスホチロシンによる検出のために、細胞溶解物を調製した。
【図４】予備結合化ｍＡｂＤＣ−１０１によるＶＥＧＦ−ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ活性化の抑制。ＤＣ−１０１の非存在下（レーン３および４）および存在下（レーン５および６）で指示されたＶＥＧＦの濃度で、Ｃ４４１細胞を刺激した。非刺激細胞（レーン１および２）は対照として用いる。2組の条件を用いて、ｍＡｂを検定した。Ｐに関しては、細胞をｍＡｂで予備結合し、その後、室温で15分間ＶＥＧＦで刺激した。Ｃに関しては、ｍＡｂおよびリガンドを同時に付加して、前記と同様に検定した。
【図５】種々の濃度のモノクローナル抗体ＤＣ−１０１および神経膠芽細胞腫細胞（ＧＢ  ＣＭ）からの状態調節化培地を用いた処理によるｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のＶＥＧＦ誘導性リン酸化。
【図６】ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓトランスフェクト化３Ｔ３細胞（Ｃ４４１）と結合する抗ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）ｍＡｂのＦＡＣＳ分析。トランスフェクト化ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ３Ｔ３細胞を、10 μg/mlの抗ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）ｍＡｂまたはアイソタイプ適正化無関連抗ｆｌｋ−１ｍＡｂ２３Ｈ７とともに、氷上で60分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣに接合された5 μgのヤギ抗マウスＩｇＧとともに再インキュベートし、洗浄して、フローサイトメトリーにより分析して、抗体結合を確定した。データは、無関連ｍＡｂ２３Ｈ７を用いて検出されたものと比較したＣ４４１細胞に対するＤＣ−１０１に関する蛍光のレベルを示す。
【図７】ｍＡｂＤＣ−１０１とトランスフェクト化３Ｔ３細胞株Ｃ４４１上のｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体との飽和結合。集密的Ｃ４４１細胞を、漸増濃度のｍＡｂＤＣ１０１（50 ng/ml〜2 μg/ml）を用いて、4℃で2時間、24ウエルプレート中でインキュベートした。細胞を洗浄し、5 μgの抗ラットＩｇＧ−ビオチン接合体とともにインキュベートした。結合を検出するために、細胞を洗浄し、ストレプタビジン−ＨＲＰの1:1000希釈液とともにインキュベートし、洗浄して、比色検出系（ＴＭＢ）中でインキュベートした。データは、540 nmでの吸光度対漸増濃度のｍＡｂＤＣ１０１を表す。第二抗体と細胞単独との結合を各確定値から差し引いて、非特異的結合に関して調整した。データは、3つの個々の実験の平均を表す。
【図８】ＶＥＧＦ刺激性ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓトランスフェクト化３Ｔ３細胞からのリン酸化ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓの免疫沈降。細胞を実験手法に記載されたようにＶＥＧＦで刺激して、溶解物を、以下のような無関連または関連抗体で免疫沈降させた：１．ラット抗ＦＬＫ２ＩｇＧ２ａ（ｍＡｂ２Ａ１３）；２．ラット抗ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）ＩｇＧ１（ｍＡｂＤＣ−１０１）；３．ラット抗ＦＬＫ２ＩｇＧ１（ｍＡｂ２３Ｈ７）；４．ウサギ抗ｆｍｓポリクローナル抗体。免疫沈降タンパク質にＳＤＳ  ＰＡＧＥ処理を、その後ウエスタンブロッティングを施した。抗ホスホチロシン抗体でブロットをプローブすることにより、ＶＥＧＦ活性化受容体の免疫沈降を検出した。
【図９】ｍＡｂＤＣ−１０１による抑制に対するｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のＶＥＧＦ誘導性リン酸化の感受性。支持された抗体濃度で40 ng/mlのＶＥＧＦを用いて、予備結合および競合検定を実施した。以下の実施例に記載されたように抗ホスホチロシンを用いた受容体検出のために、細胞溶解物を調製した。
【図１０】ｆｍｓ受容体のＣＳＦ−１誘導性リン酸化に及ぼすｍＡｂＤＣ１０１の作用。（Ｂ）において、ｆｍｓ／ＦＬＫ−２トランスフェクト化３Ｔ３細胞株１０Ａ２を、5 μg/mlのｍＡｂＤＣ−１０１の非存在下（レーン３および４）および存在下（レーン５および６）で、最適刺激レベルのＣＳＦ−１を用いて刺激した。抗体の非存在下（レーン１）または存在下（レーン２）で検定された非刺激細胞を対照として使用する。以下の実施例に記載されたように抗ホスホチロシンによる検出のために、細胞溶解物を調製した。
【図１１】活性化ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体のｍＡｂＤＣ−１０１中和の特異性。ＤＣ−１０１（ＩｇＧ１）あるいは無関連抗ＦＬＫ−２ラットモノクローナル抗体２Ａ１３（ＩｇＧ２ａ）または２３Ｈ７（ＩｇＧ１）の存在下で20または40 ng/mlのＶＥＧＦを用いて、Ｃ４４１細胞を刺激した。ＶＥＧＦ非存在下（レーン１〜３）で、ならびに競合（レーン４〜８）または予備結合（レーン９〜１１）条件下でのＶＥＧＦの存在下で、各抗体を用いて検定を実施した。以下の実施例に記載されたように抗ホスホチロシンによる検出のために、細胞溶解物を調製した。ブロットを取り除いて、再プローブし、ｆｍｓ受容体のＣ末端領域に対するウサギポリクローナル抗体を用いてｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）／ｆｍｓ受容体を検出した。
【図１２】ＶＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ細胞からのリン酸化受容体帯域の免疫沈降。培地を交換せずに3日間、内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ）中で亜集密にＨＵＶＥＣ細胞を増殖させた。非刺激細胞（レーン１）、ＶＥＧＦ刺激細胞（レーン２）および1μg/mlヘパリンの存在下でＶＥＧＦで刺激した細胞（レーン３）の溶解物からのｍＡｂＤＣ１０１により、受容体生成物を免疫沈降させた。実験手法に記載されたように、リン酸化検定、免疫沈降およびリン酸化受容体形態の検出を実施した。
【図１３】ＶＥＧＦに対する応答におけるＨＵＶＥＣの増殖に及ぼすｍＡｂＤＣ−１０１の作用。図６に対する説明文に記載されたように、細胞を48時間増殖させた。次に細胞に以下の検定条件を施した：培地への付加なし（非処理）；新鮮な内皮細胞増殖培地（完全培地）の交換；1 μg/mlヘパリンの非存在下または存在下での10 ng/mlのＶＥＧＦの付加；ならびに1 μg/mlのＤＣ１０１の存在下で検定されるＶＥＧＦ−ヘパリン処理細胞。細胞増殖検定キット（Promega）を用いた550 nmでの比色検定により、増殖に関して細胞を検定した。
【図１４ａ】ＤＣ１０１（ラット抗ｆｌｋ−１モノクローナル抗体）による個々の動物の腫瘍増殖の低減。
【図１４ｂ】対照２Ａ１３群（ラット抗ｆｌｋ−２モノクローナル抗体）による個々における動物の腫瘍増殖の低減。
【図１５】無胸腺ヌードマウスにヒト神経膠芽細胞腫細胞株ＧＢＭ−１８を皮下注射して、3群：ＰＢＳ対照、無関連ラットＩｇＧ１対照２３Ｈ７およびＤＣ−１０１に分けた。腫瘍異種移植片を用いて処置を同時に施して、4週間持続した。
【図１６】異なるｓｃＦｖ抗体（ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｆ１２、ｐ２Ａ６およびｐ２Ａ７）と固定化ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）との直接結合を示すグラフ。
【図１７】異なるｓｃＦｖ抗体（ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｆ１２、ｐ２Ａ６およびｐ２Ａ７）によるＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）と固定化ＶＥＧＦ165との結合の抑制を示すグラフ。
【図１８】ｓｃＦｖ抗体（ｐ２Ａ６およびｐ１Ｃ１１）によるＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖の抑制を示すグラフ。
【図１９】ｃ−ｐ１Ｃ１１のＶHおよびＶL鎖のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列。
【図２０】抗体（ｃ−ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｃ１１、ｐ２Ａ６）と固定化ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）との直接結合を示すグラフ。
【図２１】ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）発現ＨＵＶＥＣと結合するｃ−ｐ１Ｃ１１のＦＡＣＳ分析を示すグラフ。
【図２２】異なるｓｃＦｖ抗体（ｃ−ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｃ１１およびｐ２Ａ６）によるＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）受容体と固定化ＶＥＧＦ165との結合の抑制を示すグラフ。
【図２３】ｃ−ｐ１Ｃ１１および冷ＶＥＧＦ165による放射能標識ＶＥＧＦ165と固定化ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）との結合の抑制を示すグラフ。
【図２４】抗ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）抗体（ｃ−ｐ１Ｃ１１、ｐ１Ｃ１１）によるＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖の抑制を示すグラフ。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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