(57)【要約】本出願人は、非侵襲性の方法での生物学的分子の生合成および／または分解の比率を決定する効率的な方法を発見した。生物学的分子の生合成または分解の比率を、代謝誘導体および異化産物から決定する方法が、本明細書中で開示される。特に、直接のサンプリングによる採取が困難であるかまたは採取が容易でない生物学的分子の生合成または分解の比率を、採取可能な生物学的サンプルにおける代謝誘導体および異化産物のサンプリングによって測定する方法が、本明細書中で開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において、１つ以上の採取困難な生物学的分子の生合成または分解の比率を決定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）同位体標識された前駆体分子を、該同位体標識された前駆体分子の標識が該１つ以上の採取困難な生物学的分子に取り込まれるのに十分な期間、該個体に投与する工程；
ｂ）１つ以上の採取可能な生物学的サンプルを、個体から得る工程であって、該１つ以上の採取可能な生物学的サンプルが、該１つ以上の採取困難な生物学的分子の１つ以上の代謝誘導体を含み、該代謝誘導体は、該採取困難な生物学的分子のインビボの代謝から生じる、工程；および
ｃ）該１つ以上の代謝誘導体における該標識の取り込みを、質量分析法によって検出し、該１つ以上の採取困難な生物学的分子の生合成または分解の該比率を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記検出工程が、前記採取困難な生物学的分子の同位体濃縮を、質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ）によって計算する工程；および前駆体産物方程式または指数崩壊方程式を適用し、該採取困難な生物学的分子の生合成または分解の該比率を決定する工程を、包含する、方法。
【請求項３】
前記１つ以上の前駆体分子が、インビボで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記同位体標識が、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、および１３１Ｉからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標識が、２Ｈである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記前駆体分子が、水である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）の前に、前記採取可能生物学的分子に由来する前記１つ以上の代謝誘導体を部分的に精製するさらなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記同位体標識された前駆体分子が、経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、前記工程（ｂ）の後に、前記１つ以上の代謝誘導体を分解し、分解された代謝誘導体を形成するさらなる工程を含む、方法。
【請求項１０】
前記分解された代謝誘導体が、ガスクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによってさらに分離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記個体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記代謝誘導体が、異化産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記代謝誘導体が、前記１つ以上の採取困難な生物学的分子に主として由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記同位体標識された前駆体分子の前記標識が、前記１つ以上の採取困難な生物学的分子に取り込まれ、次に前記１つ以上の採取困難な生物学的分子の異化分解が起こり、前記１つ以上の代謝誘導体を形成する、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記１つ以上の代謝誘導体が、前記個体における別の採取困難な生物学的分子の生合成において利用され得ない、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、前記生合成または分解が、工程（ｂ）の前記１つ以上の採取可能な生物学的サンプルにおいて起こらない、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、該方法は、前記投与工程（ａ）を中断するさらなる工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の採取困難な生物学的分子が、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、および炭水化物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の採取困難な生物学的分子が、タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記前駆体分子が、アミノ酸または１つ以上のアミノ酸代謝前駆体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識が、翻訳後に前記タンパク質に取り込まれる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の代謝誘導体が、アミノ酸またはペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質が、コラーゲンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記１つ以上の代謝誘導体が、ピリジノリン、デオキシピリジノリン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、グルコシルガラクトシル−ヒドロキシリジン、ガラクトシルヒドロキシリジン、Ｎ末端テロペプチドα（Ｉ）（配列番号１）、Ｎ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号２）、Ｎ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号３）、Ｎ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号４）、Ｎ末端テロペプチドα１（ＩＩＩ）（配列番号５）、Ｃ末端テロペプチドα１（Ｉ）（配列番号６）、Ｃ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号７）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号８）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号９）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号１０）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩＩ）（配列番号１１）、Ｉ型コラーゲンの架橋カルボキシ末端ペプチド（ＩＣＴＰ）、ＰＩＮＰ（α１）（配列番号１２）、ＰＩＣＰ（α１）（配列番号１３）、ＰＩＮＰ（α２）（配列番号１４）、ＰＩＣＰ（α２）（配列番号１５）、ＰＩＩＮＰ（α１）（配列番号１６）、ＰＩＩＣＰ（α１）（配列番号１７）、ＰＩＩＩＮＰ（α１）（配列番号  １８）、ＰＩＩＩＣＰ（α１）（配列番号１９）、ＰＩＶＮＰ（α１）（配列番号２０）、ＰＩＶＮＰ（α２）（配列番号２１）、ＰＩＶＮＰ（α２）（配列番号２２）、ＰＩＶＮＰ（α３）（配列番号２３）、ＰＩＶＮＰ（α４）（配列番号２４）、ＰＩＶＮＰ（α５）（配列番号２５）、およびＰＩＶＮＰ（α６）（配列番号２６）
からなる群から選択されるコラーゲン特異的代謝誘導体を含む、方法。
【請求項２５】
前記１つ以上の代謝誘導体が、コラーゲンの１つの型に特異的な、Ｎ末端アミノ酸配列またはＣ末端アミノ酸配列である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質がミオシンであり、そして前記代謝誘導体が３−メチルヒスチジンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質がアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）であり、そして前記代謝誘導体がＡＰＰ特異的代謝誘導体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＰＰ特異的代謝誘導体が、アミロイドβ１〜β４０またはアミロイドβ１〜β４２である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上の代謝誘導体が、翻訳後修飾されたアミノ酸またはタンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記翻訳後修飾されたアミノ酸またはタンパク質が、リン酸化アミノ酸またはリン酸化ペプチド、メチル化アミノ酸またはメチル化ペプチド、ヒドロキシル化アミノ酸またはヒドロキシル化ペプチド、グリコシル化アミノ酸またはグリコシル化ペプチド、Ｎ−アセチル−グルコサミン化アミノ酸またはＮ−アセチル−グルコサミン化ペプチド、プレニル化アミノ酸またはプレニル化ペプチド、パルミトイル化アミノ酸またはパルミトイル化ペプチド、およびγ−カルボキシル化アミノ酸またはγ−カルボキシル化ペプチドからなる群から選択される、方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が、脳ミエリン塩基性タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記代謝誘導遺体が、ミエリン塩基性タンパク質様の物質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記採取可能な生物学的サンプルが、尿である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の採取困難な生物学的サンプルが、脂質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３６】
前記脂質が、脳膜脂質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記代謝誘導体が、２４（ｓ）−ヒドロキシコレステロール、ガラクトシル−セレブロシド、スフィンゴミエリン、およびスフィンゴシンからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上の採取困難な生物学的分子が、ポリヌクレオチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記標識が、前記ＤＮＡの複製後に導入される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ以上の代謝誘導体が、１つ以上の核酸残基を有する核酸である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記前駆体分子が、前記工程（ｂ）の前に、所定の期間にわたって、繰り返し投与されるかまたは連続的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記代謝誘導体が、メチル−シトシン、メチル化塩基、８−オキソ−グアノシン、酸化修飾塩基、デオキシリボース、およびリボースからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つ以上の採取困難な生物学的分子が、グルコサミノグリカンまたはプロテオグリカンから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、前記１つ以上の代謝誘導体が、ヒアルロン酸二糖、ヒアルロン酸ポリマー、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、コンドロイチン硫酸二糖、コンドロイチン硫酸ポリマー、ヘパリン硫酸二糖、およびヘパリン硫酸二糖ポリマーからなる群から選択される、方法。
【請求項４６】
疾患の状態を同定する方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法に従って前記生合成または分解の比率を評価する工程を包含し、ここで該比率は、疾患の状態を指示する方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記疾患の状態が、前記１つ以上の採取困難な生物学的分子の前記生合成または分解の比率における変化によって特徴付けられる生理学的状態である、方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法であって、前記疾患の状態または条件が、骨粗しょう症、左心室肥大、肝硬変、肝臓線維症、鬱血心不全、強皮症、黒色肺（炭鉱労働者塵肺症）、心臓線維症、肺繊維症、アルツハイマー病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、糖尿病、筋肉疲労症候群、筋ジストロフィー、スポーツトレーニング、および癌からなる群から選択される、方法。
【請求項４９】
個体において、疾患の状態または条件の応答をモニターし、治療的に介入する方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１に記載の方法に従い、該治療的介入の開始前に、前記生合成または分解の比率を評価する工程；
ｂ）このような治療的介入の開始後に、請求項１に記載の方法に従って前記１つ以上の採取困難な生物学的分子の前記生合成または分解の比率を評価する、工程；および
ｃ）治療的介入の前および後の、生合成または分解の比率を比較し、疾患または条件の、治療的介入への応答をモニターする工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記疾患の状態または条件が、骨粗しょう症、左心室肥大、肝硬変、肝臓線維症、鬱血心不全、強皮症、黒色肺（炭鉱労働者塵肺症）、心臓線維症、肺繊維症、アルツハイマー病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、糖尿病、筋肉疲労症候群、筋ジストロフィー、スポーツトレーニング、および癌からなる群から選択される、方法。
【請求項５１】
個体において、疾患の状態または条件の応答をモニターし、治療的に介入する方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１に記載の方法に従い、前記生合成または分解の比率を評価する、工程；および
ｂ）該生合成または分解の比率を、前記１つ以上の採取困難な生物学的分子の生合成または分解の参照比率と比較する工程であって、該参照比率は、前記疾患の状態または該疾患の状態の危険性を指示する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、前記疾患の状態または条件が、骨粗しょう症、左心室肥大、肝硬変、肝臓線維症、鬱血心不全、強皮症、黒色肺（炭鉱労働者塵肺症）、心臓線維症、肺繊維症、アルツハイマー病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、糖尿病、筋肉疲労症候群、筋ジストロフィー、スポーツトレーニング、および癌からなる群から選択される、方法。
【請求項５３】
個体において、前記１つ以上の採取困難な生物学的分子の全身プールのサイズを決定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１に記載の方法により、該採取困難な生物学的分子の生合成比率を測定する、工程；
ｂ）該１つ以上の採取困難な生物学的分子の生合成の比率を測定する、工程；および
ｃ）前記毎日の排泄比率を、前記１つ以上の代謝誘導体の前記毎日の分画置換比率で割り、前記個体における前記１つ以上の採取困難な生物学的分子の全身プールのサイズを計算する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
個体において、１つ以上の採取困難な生物学的分子の、生合成比率または分解比率を決定するためのキットであって、該キットは、以下：
ａ）同位体標識された前駆体、および
ｂ）該キットの使用説明書
を含み、該キットは、該個体において、該１つ以上の採取困難な生物学的分子の、生合成比率または分解比率を決定するために使用される、キット。
【請求項５５】
前記１つ以上の代謝誘導体を、尿、骨、または筋肉から単離するための化合物をさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前駆体分子を投与するためのツールをさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５７】
被験体からサンプルを回集する器具をさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５８】
生物学的分子の生合成または分解の比率を測定する方法であって、該方法は、以下：
同位体標識された前駆体分子を、個体に投与する工程；
該採取困難な生物学的分子の１つ以上の代謝誘導体を含む採取可能な生物学的サンプルを、該個体から得る工程；
標識された代謝誘導体  対  非標識の代謝誘導体の比率を、１回以上測定する工程；
該採取困難な生物学的分子の同位体濃縮を、質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ）によって計算する工程；および
前駆体産物方程式または指数崩壊方程式を適用し、該採取困難な生物学的分子の生合成または分解の該比率を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５９】
個体において、コラーゲンの生合成または分解の比率を測定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）重水素化した水を、該重水素が該コラーゲンに取り込まれるのに十分な期間、個体に投与する工程；
ｂ）１つ以上の採取可能な生物学的サンプルを、個体から得る工程であって、ここで、該１つ以上の採取可能な生物学的サンプルが、ピリジノリン、デオキシピリジノリン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、グルコシルガラクトシル−ヒドロキシリジン、ガラクトシルヒドロキシリジン、Ｎ末端テロペプチドα（Ｉ）（配列番号１）、Ｎ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号２）、Ｎ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号３）、Ｎ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号４）、Ｎ末端テロペプチドα１（ＩＩＩ）（配列番号５）、Ｃ末端テロペプチドα１（Ｉ）（配列番号６）、Ｃ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号７）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号８）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号９）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号１０）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩＩ）（配列番号１１）、Ｉ型コラーゲンの架橋カルボキシ末端ペプチド（ＩＣＴＰ）、ＰＩＮＰ（α１）（配列番号１２）、ＰＩＣＰ（α１）（配列番号１３）、ＰＩＮＰ（α２）（配列番号１４）、ＰＩＣＰ（α２）（配列番号１５）、ＰＩＩＮＰ（α１）（配列番号１６）、ＰＩＩＣＰ（α１）（配列番号１７）、ＰＩＩＩＮＰ（α１）（配列番号  １８）、ＰＩＩＩＣＰ（α１）（配列番号１９）、ＰＩＶＮＰ（α１）（配列番号２０）、ＰＩＶＮＰ（α２）（配列番号２１）、ＰＩＶＮＰ（α２）（配列番号２２）、ＰＩＶＮＰ（α３）（配列番号２３）、ＰＩＶＮＰ（α４）（配列番号２４）、ＰＩＶＮＰ（α５）（配列番号２５）、およびＰＩＶＮＰ（α６）（配列番号２６）からなる群から選択される１つ以上のコラーゲン誘導体を含む、工程；
ｃ）該１つ以上のコラーゲン誘導体を、質量分析によって検出する工程；
ｄ）該１つ以上のコラーゲン誘導体の同位体濃縮を、質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ）によって計算する工程；ならびに
ｅ）前駆体産物方程式または指数崩壊方程式を適用し、該コラーゲンの生合成または分解の該比率を決定する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年２月１２日出願の６０／３５６，００８の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、生物学的分子およびポリマーの生合成および分解の割合の測定のための技術に関する。より詳細には、本出願は、個体において、非侵襲性の様式で、目的の組織において直接的に生物学的分子サンプリングすることなく、直接サンプリングによって採取困難であるかまたは採取が容易でない組織または他の部位における生物学的分子（特に重合体クラスの生物学的分子）の生合成および分解の割合を、測定するための技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
本明細書中で、参照番号で呼ばれる公報は、本明細書の末尾の参考文献リストと対応する。
【０００４】
目的の生物学的ポリマーおよび他の生物学的分子の合成または分解の割合を測定する種々の方法が、記載されている。１つのこのような侵襲性の方法は、同位体標識前駆体分子の投与後の、種々の侵襲性の手順（例えば、外科的切除法、経皮生検、死後分析、または他のサンプリング手順（本明細書中で「侵襲性」手順と呼ばれる））による組織の収集、次いで、収集された組織からの目的のポリマーまたは他の分子の単離、その後、上記ポリマーまたは他の分子における同位体含量または標識パターンの測定、および同位体取り込みの割合に基づく上記ポリマーまたは他の分子の合成または分解の割合の計算を包含する。この方法は、幾つかの不利益を有する。これらの不利益としては、特に、医学的危険性を伴う侵襲性組織測定の必要性、不快感、専門家の医学的介入の必要性、および行われ得る測定の数の制限が挙げられる。
【０００５】
別の侵襲性方法は、各組織サンプル中の、目的のポリマーまたは他の分子の含量（濃度またはプールサイズ）の測定、および長期的な正味のプールサイズの変化率の計算（これによって、正味の合成（増加）率または正味の分解（減損）率を決定する）による介入後の上に列挙した侵襲性手順による、組織の繰り返される収集を包含する。この方法は、幾つかの不利益を有し、これらの不利益としては特に、繰り返される測定の必要性および測定される実際の合成または分解の割合の欠如が、挙げられ、代わりに、正味の増加率または減損率が算出される。さらに、濃度の正味の変化（増加または減損）は、合成または分解の実際の割合すなわち絶対率と同一ではなく、これを明らかにしない（７）ことは、生化学における周知の原則である。何故なら、同時に起こる合成および分解（本明細書中で「代謝回転」と呼ばれる））は、濃度の正味の変化によって測定または評価されないからである。
【０００６】
医学的実践において一般的に使用される方法は、繰り返されるＸ線撮影測定（例えば、骨質量を評価するためのＸ線吸光光度法または二重エネルギーＸ線吸光光度法（４）；筋肉質量または脂肪質量を評価するための核磁気共鳴画像法または核磁気共鳴コンピューター連動断層撮影（９）；腫瘍質量を評価するための放射線撮影手順）の使用によるプールサイズまたは濃度、およびそれらの長期的な変化の間接的な評価を含む。このアプローチは、正確性の制限に加えて分子の濃度またはプールサイズの直接的生化学的測定法（上記）と同じ制限を被る。
【０００７】
使用されている別の非侵襲性方法は、目的の生物学的分子または他の分子に特異的であり、これらに由来し、そして血液中または尿中に分泌または排出される分解産物の収集、および上述の分解産物の回収に基づく生物学的分子または他の分子の分解率の計算を包含する（１０、１１）。この方法は、幾つかの不利益を有し、これらの不利益としては、特に、合成率および正味の放出率ではなく実際の分解率の測定ができないこと、およびこれらの方法について十分に記載される他の技術的制限（例えば、その生物学的浄化率および生物体内における異化に起因する分解産物の不完全な回収；分解産物の排出の遅れまたは分解産物の予測不可能な排出による妨害；など）が挙げられる。
【０００８】
採取困難な組織（採取困難な生物学的サンプル）に存在する生物学的分子の合成および分解の割合を測定するこれらの先行の方法の不利益および制限は、実質的であり、重要な分野（医学的診断、薬物の発見、遺伝学、機能的ゲノム学および基礎研究が挙げられる）の向上を妨げている。本命際書中で記載される述べられた不利益は、包括的であることが意図されない；これらの方法の多くの他の制限および不利益が、存在し、そして言及され得る。
【０００９】
生物学的分子の生合成の割合および分解率を測定する最適な非侵襲性方法は、以下の特徴を有する：正確性、生合成または分解の実際の割合または絶対率（すなわち、代謝回転の値）の測定の能力、および分解産物（すなわち、代謝誘導体および異化産物）の全量的収集を必要としないこと。さらに、理想的な方法は、単純な厳密でない様式（例えば、長寿命分子の半減期の数倍程度）で、より長い期間維持されるべき前駆体プールにおける定常的な同位体レベルを許容する。しかし、これらの目的を満たしている技術は、存在していない。直接サンプリングによる採取困難であるかまたは容易でなく、そして広範に適用可能である、生物学的分子（例えば、内臓の組織に存在するかまたはこれに関連する分子）の合成または分解の割合を非侵襲的に測定する方法であって、信頼性があり、実行が容易で、廉価で、毒性または複雑さがなく、ヒト被験体に適用可能であり、医療監督または入院による手順（静脈内輸液など）を必要とせず、複雑な指示を必要とせず、そして理解が単純であるという利点を有する方法は、したがって、非常に価値があり、かつ医学の診断から薬物の発見、遺伝学、機能的ゲノム学および基礎研究におよぶ範囲の分野で、有用である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の簡単な説明）
これらの必要性を満たすため、本発明は、直接サンプリングによって採取困難であるかまたは採取が容易でない生物学的分子（例えば、内臓組織の細胞内分子または細胞外分子）の生合成および分解の割合を、非侵襲性の様式で決定する方法に指向される。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、個体における１つ以上の生物学的分子の生合成または分解の割合を決定するための方法に指向され、この方法は、以下の工程を包含する：同位体標識された前駆体分子を、同位体標識された前駆体分子の標識が１つ以上の生物学的分子に取り込まれるのに十分な期間、個体に投与する工程；１つ以上の生物学的サンプルを個体から得る工程であって、１つ以上の生物学的サンプルが、上記１つ以上の生物学的分子の１つ以上の代謝誘導体を含み、この代謝誘導体は、生物学的分子のインビボの代謝から生じる工程；および上記１つ以上の代謝誘導体における標識の取り込みを、質量分析によって検出し、１つ以上の生物学的分子の生合成または分解の上記割合を決定する工程。
【００１２】
別の局面において、本発明は、個体における１つ以上の生物学的分子の生合成または分解の割合を決定するための方法に指向され、この方法は、以下の工程を包含する：同位体標識された前駆体分子を、同位体標識された前駆体分子の標識が１つ以上の採取困難な生物学的分子に取り込まれるのに十分な期間、個体に投与する工程；１つ以上の採取可能な生物学的サンプルを個体から得る工程であって、１つ以上の採取可能な生物学的サンプルが、上記１つ以上の採取困難な生物学的分子の１つ以上の代謝誘導体を含み、この代謝誘導体は、採取困難な生物学的分子のインビボの代謝から生じる工程；および上記１つ以上の代謝誘導体における標識の取り込みを、質量分析によって検出し、１つ以上の採取困難な生物学的分子の生合成または分解の上記割合を決定する工程。
【００１３】
検出工程は、１つ以上の採取困難な生物学的分子の同位体濃縮を、質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ）によって計算する工程、および前駆体産物または指数崩壊式を適用し、採取困難な生物学的分子の生合成または分解の割合を決定する工程を、包含し得る。
【００１４】
前駆体分子は、インビボで投与され得る。別のバリエーションにおいて、同位体標識は、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、および１３１Ｉを含む群から選択される。さらなるバリエーションにおいて、この標識は、２Ｈである。
【００１５】
前駆体物質は、水であり得る。
【００１６】
本方法は、生物学的サンプルに由来する１つ以上の代謝誘導体を部分的に精製するさらなる工程を包含し得る。
【００１７】
同位体標識された前駆体物質は、経口投与され得る。
【００１８】
本方法は、１つ以上の代謝誘導体を分解し、分解された代謝誘導体を形成するさらなる工程を包含し得る。さらなるバリエーションにおいて、分解された代謝誘導体は、ガスクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣによってさらに分離される。
【００１９】
この個体は、ヒトであり得る。
【００２０】
この代謝誘導体は、異化産物であり得る。さらなるバリエーションにおいて、代謝誘導体は、主に１つ以上の生物学的分子に由来する。
【００２１】
同位体標識された前駆体分子の標識は、１つ以上の代謝産物内に取り込まれ（１つ以上の生物学的分子への生合成的取り込み）、１つ以上の生物学的分子の異化分解が続き、１つ以上の代謝誘導体を形成する。
【００２２】
別のバリエーションにおいて、１つ以上の代謝誘導体は、個体における別の生物学的分子の生合成に、利用され得ない。
さらなるバリエーションにおいて、生合成または分解は、１つ以上の生物学的サンプルにおいて起こらない。
【００２３】
本方法は、投与工程を中断する、さらなる工程を包含し得る。
【００２４】
この１つ以上の生物学的分子は、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン（ｐｒｏｓｔｏｇｌｙｃａｎ）、および炭化水素を含む群から選択され得る。
【００２５】
この１つ以上の生物学的分子は、タンパク質であり得る。さらなるバリエーションにおいて、前駆体分子は、アミノ酸または１つ以上のアミノ酸代謝前駆体である。さらなるバリエーションにおいて、標識は、タンパク質中に翻訳後に取り込まれる。なおさらなるバリエーションにおいて、この１つ以上の代謝誘導体は、アミノ酸またはペプチドである。
【００２６】
この生物学的分子は、コラーゲンであり得る。さらなるバリエーションにおいて、１つ以上の代謝誘導体は、１つ以上の以下のコラーゲン特異的代謝誘導体を含み得る：ピリジノリン、デオキシピリジノリン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、グルコシルガラクトシル−ヒドロキシリジン、ガラクトシルヒドロキシリジン、Ｎ末端テロペプチドα（Ｉ）（配列番号１）、Ｎ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号２）、Ｎ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号３）、Ｎ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号４）、Ｎ末端テロペプチドα１（ＩＩＩ）（配列番号５）、Ｃ末端テロペプチドα１（Ｉ）（配列番号６）、Ｃ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号７）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号８）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号９）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号１０）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩＩ）（配列番号１１）、Ｉ型コラーゲンの架橋カルボキシ末端ペプチド（ＩＣＴＰ）、ＰＩＮＰ（α１）（配列番号１２）、ＰＩＣＰ（α１）（配列番号１３）、ＰＩＮＰ（α２）（配列番号１４）、ＰＩＣＰ（α２）（配列番号１５）、ＰＩＩＮＰ（α１）（配列番号１６）、ＰＩＩＣＰ（α１）（配列番号１７）、ＰＩＩＩＮＰ（α１）（配列番号  １８）、ＰＩＩＩＣＰ（α１）（配列番号１９）、ＰＩＶＮＰ（α１）（配列番号２０）、ＰＩＶＮＰ（α２）（配列番号２１）、ＰＩＶＮＰ（α２）（配列番号２２）、ＰＩＶＮＰ（α３）（配列番号２３）、ＰＩＶＮＰ（α４）（配列番号２４）、ＰＩＶＮＰ（α５）（配列番号２５）、およびＰＩＶＮＰ（α６）（配列番号２６）。なおさらなるバリエーションにおいて、この１つ以上の代謝誘導体は、コラーゲンの１つの型に特異的な、Ｎ末端アミノ酸配列またはＣ末端アミノ酸配列である。
【００２７】
この生物学的な分子は、ミオシンであり得る。さらなるバリエーションにおいて、この代謝誘導体は、３−メチルヒスチジンである。
【００２８】
このタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）であり得る。さらなるバリエーションにおいて、この代謝誘導体は、ＡＰＰ特異的代謝誘導体であり得る。さらなるバリエーションにおいて、このＡＰＰ特異的代謝誘導体は、アミロイド−β  １−４０（配列番号２７）またはアミロイド−β  １−４２（配列番号２８）、またはＡＰＰ  Ｃペプチドである。
【００２９】
この１つ以上の代謝誘導体は、翻訳後に改変されたアミノ酸またはタンパク質であり得る。
【００３０】
この代謝誘導体は、リン酸化アミノ酸またはペプチド、メチル化アミノ酸またはペプチド、ヒドロキシル化アミノ酸またはペプチド、グリコシル化アミノ酸またはペプチド、Ｎ−アセチル−グルコサミン化アミノ酸またはペプチド、プレニル化アミノ酸またはペプチド、パルミトイル化アミノ酸またはペプチド、およびγ−カルボキシル化アミノ酸またはペプチドのうちの１つ以上であり得る。
【００３１】
この生物学的分子は、ミエリン塩基性タンパク質であり得る。さらなるバリエーションにおいて、このタンパク質は、脳ミエリン塩基性タンパク質である。なおさらなるバリエーションにおいて、この代謝誘導体は、ミエリン塩基性タンパク質様物質である。
【００３２】
この生物学的サンプルは、尿であり得る。
【００３３】
この１つ以上の生物学的分子は、脂質であり得る。別のバリエーションにおいて、この脂質は、脳の膜脂質である。なおさらなるバリエーションにおいて、この代謝誘導体は、−２４（ｓ）−ヒドロキシコレステロールである。
【００３４】
この１つ以上の生物学的分子は、ポリヌクレオチドであり得る。さらなるバリエーションにおいて、このポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。さらなるバリエーションにおいて、この標識は、ＤＮＡの複製後に導入される。さらなるバリエーションにおいて、この１つ以上の代謝誘導体は、１つ以上の核酸残基を有する核酸である。なおさらなるバリエーションにおいて、代謝誘導体は、メチルシトシン、メチル化塩基、８−オキソ−グアノシン、酸化修飾塩基、デオキシリボース、およびリボースを含む群から選択される。
【００３５】
この１つ以上の生物学的分子は、グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンであり得る。さらなるバリエーションにおいて、１つ以上の代謝誘導体は、ヒアルロン酸二糖類、ヒアルロン酸ポリマー、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、コンドロイチン硫酸二糖類、コンドロイチン硫酸ポリマー、ヘパリン硫酸二糖類、およびヘパリン硫酸二糖ポリマーのうちの１つ以上である。
【００３６】
この生物学的サンプルは、接近可能な生物学的サンプルであり得る。
【００３７】
この前駆体分子は、規定された期間にわたって、繰り返しまたは継続的に投与され得る。
【００３８】
本発明は、疾患状態を、その生合成比率および分解比率を評価することによって同定する方法に関し得、ここで、この比率は、疾患状態を表す。別のバリエーションにおいて、疾患状態は、１つ以上の生物学的分子の生合成または分解比率における変更によって特徴付けられる生理学的状態である。別のバリエーションにおいて、疾患状態または状況は、骨粗鬆症、左心肥大、肝硬変、肝線維症、うっ血性心不全、強皮症、黒色肺（炭塵肺）、心線維症、肺線維症、アルツハイマー病、多発性硬化症、慢性関節リュウマチ、糖尿病、筋肉疲労症候群、筋ジストロフィー、スポーツトレーニング、および癌である。
【００３９】
別のバリエーションにおいて、本発明は、治療処置開始前に、個体における疾患状態または状況の治療処置に対する応答を、生合成または分解の比率を評価し；このような治療処置の開始後、１つ以上の生物学的分子の生合成または分解の比率を評価し；そして治療処置に対する疾患または状況の応答をモニタリングするために、治療処置前および治療処置後に生合成または分解の比率を比較することによりモニタリングする方法に関する。別のバリエーションにおいて、疾患状態または疾患状況は、骨粗鬆症、左心肥大、肝硬変、肝線維症、うっ血性心不全、強皮症、黒色肺（炭塵肺）、心線維症、肺線維症、アルツハイマー病、多発性硬化症、慢性関節リュウマチ、糖尿病、筋肉疲労症候群、筋ジストロフィー、スポーツトレーニング、および癌のうちの１つ以上である。
【００４０】
さらなるバリエーションにおいて、本発明は、個体における１つ以上の生物学的分子の全身性のプール・サイズを、生物学的分子の生合成比率の測定；１つ以上の生物学的分子の生合成比率の測定；および個体における１つ以上の生物学的分子の全身性のプール・サイズを計算するために、日常の排泄比率を１つ以上の代謝誘導体の日常的な分別置換で割ることによって決定する方法に関し得る。
【００４１】
本発明はまた、個体における１つ以上の生物学的分子の生合成比率または分解比率を決定するためのキットに関し得、このキットは、同位元素標識された前駆体、およびキットを使用するための指示書を含み、ここで、このキットは、個体における１つ以上の生物学的分子の生合成または分解比率を決定するために使用される。別のバリエーションにおいて、キットは、１つ以上の代謝誘導体を尿素、骨、または筋肉から単離するための化学化合物を含み得る。さらなるバリエーションにおいて、キットは、前駆体分子の投与のためのツールを含み得る。このキットはまた、サンプルを被験体から集めるための指示書を含み得る。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本出願人は、非侵襲性の方法での生物学的分子の生合成および／または分解の比率を決定する効率的な方法を発見した。特に、出願人は、直接的なサンプリングに対して接近不可能であるかまたは容易には接近可能できない生物学的分子（例えば、内部器官の組織における細胞内分子または細胞外分子）の非侵襲性の方法での生合成および分解の比率を決定する方法を発見した。
（１．一般的な技術）
本発明の実施は、他の箇所で示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的な技術を使用し、これらは、当該分野の範囲内である。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔら、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ（編）、１９９３〜８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ，Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（編））；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ（編）、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら（編）、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；およびＭａｓｓ  ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｅｉｇｈｔ  ｙｅａｒｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ、ａｎａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｂｙ    Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｅｅｓｅ（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７６（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．３９）Ｅ１１４６〜Ｅ１１６２，１９９９）のような文献において十分に説明される。さらに、市販されるアッセイキットを使用する手順は、他で記載されない限り製造者によって規定されるプロトコールに従って、代表的に使用される。
【００４３】
（ＩＩ．定義）
他で定義されない限り、本明細書中で使用される全ての分野の用語、表記および他の科学的な用語は、本発明が関連する当業者によって通常理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合、通常理解される意味を有する用語は、明確さのためおよび／または容易な参照のために定義され、そして本明細書中のこのような定義の包含は、当該分野において一般的に理解されることにわたる実質的な差異を示すために、必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中で記載されるかまたは参照される技術および手順は、一般的に十分に理解され、そして当業者により慣用的な方法論（例えば、ＨｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎおよびＮｅｅｓｅによる、Ｍａｓｓ  ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｅｉｇｈｔ  ｙｅａｒｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ、ａｎａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７６（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．３９）Ｅ１１４６〜Ｅ１１６２、１９９９）を使用して通常使用される。適切である場合、市販されるキットおよび試薬の使用を包含する手順は、他で記述されない限り、製造者が規定するプロトコールおよび／またはパラメーターに従って、一般的に実行される。
【００４４】
「アイソトポマー（Ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ）」とは、同一元素の組成物を有するが、同位体置換物（例えば、ＣＨ３ＮＨ２、ＣＨ３ＮＨＤおよびＣＨ２ＤＮＨ２）に起因して構造的および／または立体化学的異性体である、同位体異性体または種をいう。
【００４５】
「アイソトポログ（Ｉｓｏｔｏｐｏｌｏｇｕｅ）」とは、同一元素および化学組成物を有するが、同位体含有物（例えば、上記の例におけるＣＨ３ＮＨ２  対  ＣＨ３ＮＨＤ）において異なっている同位体ホモログまたは分子種をいう。アイソトポログは、その同位体含有物によって定義され、従って、それぞれのアイソトポログは、唯一の正確な質量を有するが、唯一の構造を有し得ない。アイソトポログは、通常その分子（例えば、ＣＨ３ＮＨＤおよびＣＨ２ＤＮＨ２は、同じアイソトポログであるが、異なるアイソトポマーである）上の同位元素の位置により異なる同位異性体（アイソトポマー）のファミリーから構成される。
【００４６】
「質量アイソトポマー」とは、同位体組成よりむしろ見かけの質量に基づいて分類される同位異性体のファミリーをいう。質量アイソトポマーは、異なった同位体組成の分子を含み得、アイソトポログとは異なる（例えば、ＣＨ３ＮＨＤ、１３ＣＨ３ＮＨ２、ＣＨ３１５ＮＨ２は、同じ質量アイソトポマーであるが、異なるアイソトポログである）。操作用語において、質量アイソトポマーは、質量分光計によって分解されないアイソトポログのファミリーである。クオドラポール（４極子）質量分光計について、これは、代表的には、質量アイソトポマーは、見かけ上の質量を共有するアイソトポログのファミリーである。従って、アイソトポログなＣＨ３ＮＨ２およびＣＨ３ＮＨＤは、見かけ上の質量が異なり、そして異なる質量アイソトパーとして区別されるが、アイソトポログなＣＨ３ＮＨＤ、ＣＨ２ＤＮＨ２、１３ＣＨ３ＮＨ２およびＣＨ３１５ＮＨ２は、全て同じ見かけ上の質量であり、そしてこれゆえに、同じ質量アイソトポマーである。従って、それぞれの質量アイソトポマーは、代表的に１つより多いアイソトポログから構成され、そして１つより多い正確な質量を有する。アイソトポログと質量アイソトポマーとの間の区別は、実地の際に有用である。なぜなら、全ての個々のアイソトポログは、クオドラポール質量分光計を使用して分解されず、そしてより高い質量分解能を生じる質量分光計を使用してさえも分解され得ず、その結果質量分光データからの計算は、アイソトポログよりむしろ質量アイソトポマーの存在量に関して実行されなければならないからである。質量の最も低い質量アイソトポマーは、Ｍ０として示される；ほとんどの有機分子について、これは、全て１２Ｃ、１Ｈ、１６Ｏ、１４Ｎなどを含む種である。他の質量アイソトポマーは、Ｍ０との質量の違いによって区別される（Ｍ１、Ｍ２など）。所定の質量アイソトポマーについて、この分子内の同位元素の配置または位置は、特定されずそして変動し得る（すなわち、「位置のアイソトポマー」は、区別されない）。
【００４７】
「質量アイソトポマーパターン」とは、分子の質量アイソトポマーの量のヒストグラムをいう。伝統的に、このパターンは、パーセント相対存在量として表され、ここで、この全ての存在量は、最も豊富な質量アイソトポマーの量に対して基準化される；最も豊富なアイソトポマーは、１００％であると言われる。しかし、確率分析を含む適用のために好ましい形態は、割合量または分数量であり、ここで、それぞれの種が総量に寄与する分数が使用される（以下を参照のこと）。用語同位元素パターンは、時々質量アイソトポマーパターンの代わりに使用されるが、技術的に前者の用語は、元素中の同位体の存在量パターンに対してのみ適用する。
【００４８】
「モノマー」とは、ポリマー合成の間に結合し、そしてポリマーにおいて２回以上現れる化学単位をいう。
【００４９】
「ポリマー」とは、モノマーから合成され、そして２個以上のモノマーの繰り返しを含む分子をいう。
【００５０】
「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸の配列をいう。
【００５１】
「代謝誘導体」とは、反応または一連の反応によって、１つの分子を関連分子に生化学的に変換することから生成される任意の分子をいう。この状況における代謝誘導体としては、本明細書中で定義されるような異化産物が挙げられるが、これに限定されない。この状況における代謝誘導体としては、生物学的分子（アミノ酸、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、プルフィリン、ならびにそれらの機能性フラグメントおよび非機能性フラグメントに由来する代謝性産物が挙げられるが、これらに限定されない）に由来する任意の代謝性産物が挙げられるが、これに限定されない。
【００５２】
「異化産物」としては、異化作用の結果として産生される任意の化合物をいう。異化作用は、一般的に、分子がより小さいサブユニットから合成される同化作用とは対照的に、分子がより小さい部分に分裂される工程をいう。異化産物は、代謝誘導体の部分集合である。
【００５３】
「合成後の異化」（または「合成後の異化産物」）とは、以下の生化学的配列を受ける分子または化合物をいう：１）生物学的分子への生合成的取り込み；２）この生物学的分子の異化作用的分解；３）この生物学的分子から接近可能な生物学的サンプルまたは生物学的流体への放出。
【００５４】
「個体」は、脊椎動物であり、好ましくは哺乳類であり、より好ましくはヒトである。
【００５５】
「同位元素標識した前駆体分子」とは、上記のレベルでの元素の同位体を含む任意の分子をいい、この元素は、天然に存在する分子において見出される。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「危険な」状態にある個体は、危険ではない個体よりも疾患状態または生理学的状態を発症しそうであるとみなされる個体である。「危険な」状態にある個体は、この疾患または生理学的状況を示す検出可能な症状を有しても有さなくてもよく、そして本明細書中で記載される処置方法（例えば、治療処置）前に、検出可能な疾患を示しても示さなくてもよい。「危険な」は、個体が、１つ以上のいわゆる危険な因子を有することを示す。これらの危険因子のうちの１つ以上を有する個体は、これらの危険因子を有さない個体よりも１つ以上の疾患または生理学的状況を発達させるより高い確率を有する。これらの危険な因子としては、家族構成員が１つ以上の疾患、関連した状況、または病理を発達させた経歴、既往症の経歴、年齢、性別、人種、栄養状態、前駆型の疾患の存在、遺伝（すなわち、遺伝性の）考察、および環境的暴露が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
「標識された水」は、水素または酸素いずれかの１つ以上の特定の安定同位元素で標識された水を含む。標識された水の具体的な例としては、２Ｈ２Ｏ、３Ｈ２Ｏ、およびＨ２１８Ｏが挙げられる。
【００５８】
「部分的に精製する」とは、他の同様な化合物の混合物の１つ以上の成分を除去する方法をいう。例えば、「タンパク質またはペプチドを部分的に精製する」とは、１つ以上のタンパク質またはペプチドの混合物からの１つ以上のタンパク質またはペプチドの除去をいう。
【００５９】
「単離する」とは、化合物の混合物から１つの化合物を分離することをいう。例えば、「タンパク質またはペプチドを単離する」とは、１つの特定のタンパク質またはペプチドを、１つ以上のタンパク質またはペプチドの混合物中の他の全てのタンパク質またはペプチドから分離することをいう。
【００６０】
「接近可能な生物学的サンプル」とは、最小の侵襲性または非侵襲性のアプローチによって個体から得られた種々のサンプル型（例えば、尿収集物、採血、針吸引、および最小の危険性、不便さまたは労力しか含まない他の手順）を含む。この定義もまた、その獲得（最小の侵襲性または非侵襲性のアプローチによって）後任意の方法（例えば、試薬での処理、可溶化、または特定の成分（例えば、タンパク質またはポリヌクレオチド）のための濃縮による）で操作されるサンプルを含む。用語「接近可能な生物学的サンプル」としては、尿、血液、唾液、涙液、炎症性滲出液、滑液、腫瘍、蓄膿または他の感染性流体、脳脊髄液、汗、肺分泌液（痰）、精液、および糞尿が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
「接近不可能な生物学的サンプル」とは、最小の侵襲性または非侵襲性のアプローチによって容易には得られない生物学的サンプルをいう。接近不可能な生物学的サンプルは、侵襲性の手順（例えば、外科的切除、経皮的な生検、および死後分析）によって集められ得る。特に、接近不可能な生物学的サンプルとしては、内部器官（例えば、肝臓、心臓、腎臓、肺、膵臓、腸、脾臓、脳、骨髄、骨格筋）、内部器官の組織の細胞内間隙、および内部器官の細胞外マトリクス（例えば、骨、軟骨、関節、細胞間質、基底膜、および血管壁）が挙げられる。
【００６２】
「接近不可能な生物学的分子」とは、接近可能な生物学的サンプルから容易に獲得され得ないか、または接近可能な生物学的サンプルにおいて検出可能であり得ない生物学的分子をいう。
【００６３】
（ＩＩＩ．発明の方法）
本発明は、種々の生物学的分子（種々のクラスのポリマー（タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、グリコサミノグリカン、およびプロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されず、生物学および疾患において重要である）を含む）の生合成および分解比率の測定を可能にする方法を包含する。
【００６４】
１つの局面において、本発明は生物学的分子の代謝誘導体の同位元素標識の取り込みを検出することにより、個体における生物学的分子の生合成または分解の比率を決定する方法を包含する。生物学的分子は、タンパク質およびペプチド、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、脂質（例えば、コレステロール）、炭水化物、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、それらの組み合わせまたはポリマー、あるいは他の化学的クラスにおける生物学的分子が挙げられるが、それらに限定されない任意の分子であり得る。
【００６５】
好ましくは、生物学的分子は、接近不可能な生物学的分子であるか、そして／または接近不可能な生物学的サンプル由来である。接近不可能な生物学的分子の生合成または分解の比率は、代謝誘導体または異化産物を測定することによって測定され得る。
【００６６】
さらに、この生物学的分子の代謝誘導体または異化産物は、接近可能な生物学的サンプルにおいて好ましい。この代謝誘導体または異化産物はまた、好ましくは第１に、および必要に応じて特有の方法で、生物学的分子から誘導する。従って、この代謝誘導体または異化産物は、好ましくはこの生物学的分子を同定するかまたは特徴付ける。好ましくは、少量（総量ではない）のみの代謝誘導体または異化産物が、要求される必要がある。さらに、この代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、代謝によって他の生物学的分子に再度取り込まれ得ない。
【００６７】
（Ａ．同位元素標識した前駆体分子の個体への投与）
（１．標識された前駆体分子）
（ａ．同位元素標識）
図１において例示されるように、生合成比率、分解比率、および／または代謝比率を測定する第１ステップは、個体に同位元素標識した前駆体分子を投与する工程を包含する。この同位元素標識した前駆体分子は、安定な同位元素または放射性同位元素であり得る。使用され得る同位元素標識としては、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、または有機的組織中に存在する、他の元素の同位体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
１つの実施形態において、この同位元素標識は、２Ｈである。
【００６９】
（ｂ．前駆体分子）
この前駆体分子は、生物学的分子を形成するために生体中で代謝される任意の分子であり得る。同位元素標識は、本明細書中で開示された全ての前駆体分子を改変するために使用され、同位元素標識した前駆体分子を形成し得る。
【００７０】
全前駆体分子は、１つ以上の生物学的分子に組み込まれ得る。あるいは、前駆体分子の一部分は、１つ以上の生物学的分子に組み込まれ得る。
【００７１】
前駆体分子としては、ＣＯ２、ＮＨ３、糖、乳酸、Ｈ２Ｏ、酢酸、脂肪酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
（ｉ．前駆体分子としての水）
水は、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、それらの改変体または組み合わせ、および他の生物学的分子の前駆体である。このように、標識した水は、本明細書中で教示される方法における前駆体として作用し得る。
【００７３】
標識された水は、市販で容易に得られ得る。例えば、２Ｈ２Ｏは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から購入され得、そして３Ｈ２Ｏは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｉｎｃ．から購入され得る。一般的に、２Ｈ２Ｏは、非放射活性であり、従って、放射活性のある３Ｈ２Ｏよりも少ない毒性関連を示す。２Ｈ２Ｏは、例えば、総体内水分のパーセント（例えば、消費される総生体水分（例えば、１日あたり３リットルの水が消費され、３０マイクロリットルの２Ｈ２Ｏが消費される）の１％）として投与され得る。３Ｈ２Ｏが使用される場合、次いで、非毒性量（当業者によって容易に決定される）が投与される。
【００７４】
２Ｈ２Ｏの比較的高い生体水分の濃縮（例えば、総生体水分のうちの１〜１０％が標識される）が、本発明の技術を使用して達成され得る。これらのレベルが、毒性のいかなる証拠も無しに、ヒトおよび実験動物において数週間または数ヶ月維持される場合、この水分の濃縮は、比較的定常であり、そして安定である（図３〜５）。大多数のヒト被験体（＞１００人）におけるこの所見は、高用量での２Ｈ２Ｏの前庭の毒性についての以前の関連と反対である。出願人は、生体水分の濃縮における急速な変化が妨げられる限り（例えば、少量の分割量での初期投与によって）、２Ｈ２Ｏの高い生体水分の濃縮は、毒性を有することなく維持され得ることを発見した。例えば、市販される２Ｈ２Ｏの低いコストは、比較的低いコストで、１〜５％の範囲にある長期間の濃縮の維持を可能にする（例えば、計算では、２％の２Ｈ２Ｏの濃縮（従って、アラニン前駆体プールにおける７〜８％の濃縮（図６Ａ〜Ｂ））での２ヶ月間標識は、１０％の遊離ロイシン濃縮での２Ｈ−ロイシン（従って、同じ期間でのロイシン前駆体プールにおける７〜８％の濃縮）の１２時間標識よりコストが低い）。
【００７５】
１８Ｏ同位元素は非毒性であり、そして結果として、著しい健康上のリスクを示さないので（図６Ｃ）、Ｈ２１８Ｏの投与のための、比較的高くおよび比較的定常な生体水分の濃縮も達成され得る。
【００７６】
標識された水は、ほとんどのクラスの生物学的分子についてほとんど普遍的な前駆体として使用され得る。
【００７７】
（ｉｉ．タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、および炭水化物の前駆体）
別の実施形態において、前駆体分子は、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂質、および炭水化物の前駆体である。
【００７８】
（タンパク質の前駆体）
この前駆体分子は、当該分野において公知の任意のタンパク質前駆体分子であり得る。これらの前駆体分子は、ＣＯ２、ＮＨ３、糖、乳酸塩、Ｈ２Ｏ、酢酸塩、および脂肪酸であり得る。
【００７９】
タンパク質の前駆体分子はまた、１つ以上のアミノ酸を含み得る。この前駆体は、任意のアミノ酸であり得る。この前駆体分子は、単回または複数回重水素化されたアミノ酸であり得る。この前駆体分子は、１つ以上の１３Ｃ−リジン、１５Ｎ−ヒスチジン、１３Ｃ−セリン、１３Ｃ−グリシン、２Ｈ−ロイシン、１５Ｎ−グリシン、１３Ｃ−ロイシン、２Ｈ５−ヒスチジン、および任意の重水素化されたアミノ酸である。例えば、標識されたアミノ酸は、投与され得、非重水素化アミノ酸で希釈され得ない。全ての同位元素標識された前駆体は、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から市販で購入され得る。
【００８０】
この前駆体分子はまた、翻訳後または翻訳前に改変されたアミノ酸についての任意の前駆体を含み得る。これらの前駆体としては、メチル化の前駆体（例えば、グリシン、セリンまたはＨ２Ｏ）；水酸化の前駆体（例えば、Ｈ２ＯまたはＯ２）；リン酸化の前駆体（例えば、リン酸、Ｈ２ＯまたはＯ２）；プレニル化の前駆体（例えば、脂肪酸、酢酸塩、Ｈ２Ｏ、エタノール、ケトン体、糖、またはフルクトース）；カルボキシル化の前駆体（例えば、ＣＯ２、Ｏ２、Ｈ２Ｏ、または糖）；アセチル化の前駆体（例えば、酢酸塩、エタノール、グルコース、フルクトース、酪酸塩、アラニン、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、またはＯ２）；および当該分野において公知の他の翻訳後改変体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
遊離アミノ酸中に存在する標識の程度は、実験的に決定され得るか、またはアミノ酸中の標識部位の数に基づいて想定され得る。例えば、標識として水素の同位元素を使用する場合、遊離アミノ酸または特にｔＲＮＡ−アミノ酸におけるＣ−Ｈ結合に存在する標識は、生体水分中の２Ｈ２Ｏへの曝露の間に同定され得る。それぞれの非必須アミノ酸中のＣ−Ｈ結合の総数は、公知である（例えば、アラニン中では４つ、グリシン中では２つなど）。
【００８２】
タンパク質についての前駆体分子は、水であり得る。Ｃ−Ｈ結合上の水素原子は、２Ｈ２Ｏからのタンパク質合成を測定するために有用であるアミノ酸上の水素原子である。なぜなら、ペプチドおよびタンパク質のＯ−Ｈ結合およびＮ−Ｈ結合は、水性溶液中で不安定であるためである。このように、２Ｈ２ＯからＯ−Ｈ結合またはＮ−Ｈ結合への２Ｈ−標識の変換は、上述されるような遊離アミノ酸からのタンパク質の合成を伴わずに引き起こる。Ｃ−Ｈ結合は、特定の酵素によって触媒される中間の代謝反応（図６）の間に、Ｈ２Ｏから遊離アミノ酸への取り込みを受ける。従って、２Ｈ２Ｏ投与後の、タンパク質が結合したアミノ酸のＣ−Ｈ結合における２Ｈ−標識の存在は、２Ｈ２Ｏへの曝露の間に、遊離形態で存在するアミノ酸からアセンブリされた（すなわち、タンパク質が新たに合成される）タンパク質を意味する。分析的に、使用されるアミノ酸誘導体は、全てのＣ−Ｈ結合を含まなければならないが、潜在的なＮ−Ｈ結合およびＯ−Ｈ結合の含有を全て除去しなければならない。
【００８３】
生体水分由来の水素原子は、遊離アミノ酸に取り込まれ得る。標識された水からの２Ｈまたは３Ｈは、細胞中の遊離アミノ酸内へ中間代謝反応によって入り得るが、２Ｈまたは３Ｈは、ペプチド結合中に存在するか、またはＲＮＡを転移するために結合するアミノ酸内へは入り得ない。遊離した、必須アミノ酸は、単一の水素原子を、生体水分からα−炭素のＣ−Ｈ結合へ、急速な可逆性のアミノ基転移反応（図６）によって取り込み得る。遊離した、非必須アミノ酸は、もちろん多数の代謝的に交換可能なＣ−Ｈ結合を含み、従って、新たに合成されたタンパク質における２Ｈ２Ｏ由来の、１分子あたりのより高い同位体濃縮値を示すことが予測される（図６Ａ〜Ｂ）。
【００８４】
当業者は、生体水分由来の標識された水素原子が、他の生化学的経路を通って他のアミノ酸に取り込まれ得ることを理解する。例えば、水由来の水素原子が、クエン酸回路における前駆体α−ケトグルトレート（ｋｅｔｏｇｌｕｔｒａｔｅ）の合成によってグルタミン酸塩に取り込まれ得ることが、当該分野において公知である。同様に、グルタミン酸塩は、グルタミン、プロリン、およびアルギニンについての生化学的前駆体であることが公知である。別の例によって、生体水分由来の水素原子は、翻訳後に改変されたアミノ酸（例えば、３−メチル−ヒスチンにおけるメチル基、ヒドロキシプロリンまたはヒドロキシリジンにおけるヒドロキシル基など）に取り込まれ得る。他のアミノ酸合成経路は、当業者に公知である。
【００８５】
酸素原子（Ｈ２１８Ｏ）はまた、酵素によって触媒される反応によってアミノ酸に取り込まれ得る。例えば、アミノ酸のカルボン酸部分での酸素交換は、酵素によって触媒される反応の間に起こる得る。標識された酸素のアミノ酸への取り込みは、図６Ｃにおいて例示されるように、当業者に公知である。酸素原子はまた、酵素によって触媒される反応によって、１８Ｏ２由来のアミノ酸（ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジンまたは他の翻訳後に改変されるアミノ酸を含む）に取り込まれ得る。
【００８６】
標識された水分由来の水素標識および酸素標識はまた、翻訳後の改変体によってアミノ酸に取り込まれ得る。１つの実施形態において、この翻訳語の改変は、翻訳後の改変前の生合成経路によって標識された水素または酸素をすでに含み得る。別の実施形態において、翻訳後の改変体は、翻訳後の改変ステップ（例えば、メチル化、ヒドロキシル化、リン酸化、プレニル化、硫酸化、カルボキシル化、アセチル化または他の公知の翻訳後改変）の前または後のいずれかで、生体水分由来の標識された水素の自由な交換に関与する代謝誘導体由来の、標識された水素、酸素、炭素、または窒素を取り込み得る。
【００８７】
（ポリヌクレオチドの前駆体）
この前駆体分子は、ポリヌクレオチドの成分を含み得る。ポリヌクレオチドは、プリン塩基およびピリミジン塩基ならびにリボース−リン酸の骨格を含む。この前駆体分子は、当該分野において公知の任意のポリヌクレオチド前駆体分子であり得る。
【００８８】
ポリヌクレオチドの前駆体分子は、ＣＯ２、ＮＨ３、尿素、Ｏ２、糖、酪酸塩、Ｈ２Ｏ、酢酸塩、ケトン体および脂肪酸、グリシン、コハク酸塩または他のアミノ酸ならびにリン酸塩であり得る。
【００８９】
ポリヌクレオチドの前駆体分子はまた、１つ以上のヌクレオチド残基を含み得る。この前駆体分子はまた、ヌクレオチド残基の１つ以上の成分であり得る。例えば、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン、およびテトリヒドロフォレート（ｔｅｔｒｙｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）は、プリン環の前駆体分子として使用され得る。例えば、カルバミルリン酸およびアスパラギン酸は、ピリミジン環の前駆体分子として使用され得る。アデニン、アデノシン、グアニン、グアノシン、シチジン、シトシン、チミン、またはチミジンは、デオキシリボヌクレオシドについての前駆体分子として与えられ得る。全ての同位元素標識した前駆体は、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から市販で購入され得る。
【００９０】
ポリヌクレオチドの前駆体分子は、水であり得る。ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、およびヌクレオチド前駆体またはヌクレオシド前駆体のＣ−Ｈ結合上の水素原子は、２Ｈ２Ｏからのポリヌクレオチド合成を測定するために使用され得る。Ｃ−Ｈ結合は、Ｈ２Ｏからのポリヌクレオチド前駆体への交換を経る。従って、２Ｈ２Ｏ投与後の、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、およびヌクレオチド前駆体またはヌクレオシド前駆体のＣ−Ｈ結合における２Ｈ標識の存在は、このポリヌクレオチドがこの期間の間に合成されることを意味する。存在する標識の程度は、実験的に決定され得るか、またはポリヌクレオチドまたはヌクレオシドにおける標識部位の数に基づいて想定され得る。
【００９１】
生体水分由来の水素原子は、遊離したヌクレオシドまたはポリヌクレオチドに取り込まれ得る。標識した水分由来の２Ｈまたは３Ｈは、中間代謝反応によってこれらの分子に入り得る。
【００９２】
当業者は、生体水分由来の標識された水素原子が、他のポリヌクレオチド、ヌクレオチド、またはヌクレオシドに種々の生化学的経路を通って取り込まれ得ることを理解する。例えば、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン、およびテトリヒドロフォレートであって、これらは、プリン環の公知の前駆体分子である。例えば、カルバミルリン酸およびアスパラギン酸は、公知のピリミジン環の前駆体分子である。リボースおよびリボースリン酸、ならびにその合成経路は、ポリヌクレオチド合成の公知の前駆体である。
【００９３】
酸素原子（Ｈ２１８Ｏ）はまた、酵素によって触媒される生化学反応（上で列挙されたものを含む）によって、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、またはヌクレオシドに取り込まれ得る。１８Ｏ２由来の酸素原子はまた、非酵素的な酸化反応を含む酸化反応（８−オキソ−グアニンおよび他の酸化塩基または酸化ヌクレオチドの形成のような酸化損傷を含む）によって、ヌクレオチドに取り込まれ得る。
【００９４】
同位元素標識された前駆体はまた、複製後の改変において、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、またはヌクレオシドへ取り込まれ得る。複製後の改変は、ＤＮＡ分子の合成後に引き起こる改変を含む。この代謝誘導体は、メチル化された塩基であり得、このメチル化された塩基としては、メチル化シトシンが挙げられるが、これに限定されない。この代謝誘導体はまた、酸化修飾塩基であり得、この酸化修飾塩基としては、８−オキソ−グアノシンが挙げられるが、これに限定されない。当業者は、この標識が改変体の合成の間に取り込まれ得ることを容易に理解する。
【００９５】
（脂質の前駆体）
標識した脂質の前駆体は、脂質生合成における任意の前駆体を含み得る。
【００９６】
脂質の前駆体分子は、ＣＯ２、ＮＨ３、グルコース、乳酸、Ｈ２Ｏ、酢酸塩および脂肪酸であり得る。
【００９７】
前駆体としては、また、以下が挙げられ得る：標識した水、好ましくは、２Ｈ２Ｏ（重水素化水）（これは、脂肪酸、アシル−グリセロールのグリセロール部分、コレステロールおよびその誘導体の前駆体である）；１３Ｃまたは２Ｈ標識した脂肪酸（これらは、トリグリセライド、リン脂質、コレステロールエステル、コアミドおよび他の脂質の前駆体である）；１３Ｃ−または２Ｈ−酢酸塩（これらは、脂肪酸およびコレステロールの前駆体である）；１８Ｏ２（これは、脂肪酸、コレステロール、アシル−グリセライドおよび、酵素的な触媒反応によるかまたは非酵素的な酸化損傷（例えば、脂肪酸になる）によるかのいずれかにより、特定の酸化修飾脂肪酸（例えば、ペルオキシド）の前駆体である）;１３Ｃ−または２Ｈ−グリセロール（それらは、アシルグリセライドの前駆体である）；１３Ｃ−または２Ｈ−標識した酢酸塩、エタノール、ケトン体、または脂肪酸（それらは、内生的に合成された脂肪酸、コレステロールおよびアシルグリセライドの前駆体である）；ならびに、２Ｈまたは１３Ｃ標識したコレステロールまたはその誘導体（胆汁酸およびステロイドホルモンを含む）。全ての同位元素標識した前駆体を、商業的に、例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から購入し得る
複合脂質（例えば、糖脂質およびセレブロシド）も、以下を含む前駆体で標識し得る：２Ｈ２Ｏ（これは、セレブロシド（セレブロシドとしては、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン硫酸塩、グルクロン酸およびグルクロン酸硫酸塩が挙げられるが、これらに限定されない）の糖部分、セレブロシドの脂肪アシル部分およびセレブロシドのスフィンゴシン部分の前駆体である）；２Ｈまたは１３Ｃ標識した脂肪酸（これらは、セレブロシド、糖脂質、および他の誘導体の脂肪アシル部分の前駆体である）。
【００９８】
前駆体分子は、脂質の成分であるかまたは脂質の成分を含み得る。
【００９９】
（グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの前駆体）
グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンは、細胞外空間（例えば、軟骨、間充質および滑膜関節液）で重要な役割を演じる生物分子の複合体クラスである。これらのクラスの分子としては、以下が挙げられる：例えば、グリコサミノグリカン二糖から生成された大型ポリマー（例えば、ヒアルロナン）（これは、グルクロン酸に結合するＮ−アセチルグルコサミンを含む二量体であるヒアルロン酸（ＨＡ）二糖の５０，０００個までの繰り返しユニットからなるポリマーである）；コンドロイチン硫酸塩（ＣＳ）ポリマー（これは、グルクロン酸に結合したＮ−アセチル−ガラクトサミン硫酸塩を含む二量体であるＣＳ二糖の繰り返しユニットから形成される）；ヘパラン硫酸塩ポリマー（これは、グルクロン酸に結合したＮ−アセチル（またはＮ−スルホ）−グルコサミン硫酸塩の二量体であるヘパラン硫酸塩の繰り返しユニットから形成される）；およびケラタン硫酸塩ポリマー（これは、ガラクトースに結合したＮ−アセチルグルコサミン硫酸塩を含む二量体であるケラタン硫酸塩二糖の繰り返しユニットから形成される）。プロテオグリカンとしては、ポリマー中の中央のヒアルロナンに結合するさらなるタンパク質および他のグリコサミノグリカン（例えば、中央のヒアルロナン鎖から分岐するＣＳ）が挙げられる。
【０１００】
グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの標識した前駆体としては、２Ｈ２Ｏ（Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンの種々の硫酸塩、ガラクトース、イズロン酸などを含む糖部分に組み込まれる）、１３Ｃ−または２Ｈ−グルコース（前記糖部分に組み込まれる）、２Ｈ−または１３Ｃ−フルクトース（前記糖部分に組み込まれる）、２Ｈ−または１３Ｃ−ガラクトース（前記糖部分に組み込まれる）、１５Ｎ−グリシン、他の１５Ｎ標識したアミノ酸または１５Ｎ−尿素（例えば、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンなどの前記アミノ糖の窒素部分に組み込まれる）；１３Ｃ−または２Ｈ−脂肪酸、１３Ｃ−または２Ｈ−ケトン体、１３Ｃ−グルコース、１３Ｃ−フルクトース、１８Ｏ２、１３Ｃ−または２Ｈ−酢酸塩（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミンなどのＮアセチル糖のアセチル部分に組み込まれる）ならびに１８Ｏまたは３５Ｓ標識した硫酸塩（コンドロイチン硫酸塩、ヘパラン硫酸塩、ケラタン硫酸塩の硫酸塩部分および他の硫酸塩部分に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。全ての同位元素標識した前駆体を、商業的に、例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から購入し得る。
【０１０１】
（糖質の前駆体）
糖質の標識した前駆体としては、当該分野で公知の糖質生合成の任意の前駆体が挙げられ得る。これらの前駆体としては、Ｈ２Ｏ、単糖（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、グルクロン酸、グルコサミンおよびその誘導体、ガラクトサミンおよびその誘導体、イズロン酸、フルクトース、リボース、デオキシリボース、シアル酸、エリトロース、ソルビトール、アドールおよびポリオールを含む）、脂肪酸、酢酸塩、ケトン体、エタノール、乳酸塩、アラニン、セリン、グルタミンおよび他のグルコース生成アミノ酸、グリセロール、Ｏ２、ＣＯ２、尿素、デンプン、二糖（スクロース、ラクトースなどを含む）、グルコースポリマーおよび前記単糖の他のポリマー（複合多糖類を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
前駆体分子としては、標識した水、好ましくは２Ｈ２Ｏ（これは、前記単糖の前駆体である）、１３Ｃ標識したグルコース生成前駆体（グリセロール、ＣＯ２、グルコース生成アミノ酸、乳酸塩、エタノール、酢酸塩、ケトン体および脂肪酸を含む）、１３Ｃ−または２Ｈ標識した前記単糖、１３Ｃまたは２Ｈ標識したデンプンまたは二糖；２Ｈまたは１３Ｃで標識した糖質の他の成分；および単糖および複合多糖類の前駆体である１８Ｏ２が挙げられ得る。
【０１０３】
（３．標識した前駆体分子を投与する方法）
標識した前駆体を種々のインビボの方法により個体に投与し得、その方法としては、経口的に、非経口的に、皮下に、静脈内におよび腹腔内への投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
個体は、動物であり得る。個体はまた、ヒトでもあり得る。
【０１０５】
例として、１つの実施形態では、標識した前駆体は、個体に消化され得る（例えば、飲むことによるかまたは静脈内注入により）２Ｈ２Ｏである。別の実施形態では、標識した前駆体は、個体に消化され得る（例えば、飲むことによるかまたは静脈内注入により）１３Ｃ１−リジンである。別の実施形態では、標識した前駆体は、個体に消化され得る（例えば、飲むことによるかまたは静脈内注入により）１３Ｃ１−グリシンである。別の実施形態では、標識した前駆体は、個体に消化され得る（例えば、飲むことによるかまたは静脈内注入により）２Ｈ３−ロイシンでである。別の実施形態では、標識した前駆体は、個体に消化され得る（例えば、飲むことによるかまたは静脈内注入により）２Ｈ２−グルコースである。
【０１０６】
標識した前駆体が投与される時間の長さは、前駆体分子が生合成経路に取り込まれることを可能にするために十分であり得る。また、前記同位元素標識した前駆体分子の標識が１個以上の生物学的分子に取り込まれ、次いで、１個以上の生物学的分子の標識したか、または標識していない１個以上の代謝誘導体の形態で放出されるのに十分な時間で、同位元素標識した前駆体分子を個体に導入し得る。時間は、前もって決定した時間の長さであり得る。この必要な持続時間は、数分または数時間（例えば、生物学的分子の早い代謝では）から数週間または、さらに数ヶ月（例えば、生物学的分子の遅い代謝では）の範囲で変動し得る。
【０１０７】
前駆体分子は、連続的にまたは、繰り返し投与され得る。前駆体の投与は、種々の方法により達成され得る。前駆体分子は、連続的にまたは繰り返し投与され得、その結果、十分な量の前駆体が、同位元素の最大のプラトー値または同位元素の富化に近づく（すなわち、時間が経っても、標識した前駆体の濃度が比較的定常になる）ように投与される。例えば、図７を参照のこと。持続的な標識期間が、生物学的分子の４〜５倍の半減期の長さで維持され得る場合、到達された漸近線およびこの漸近線に近づいた同位元素富化曲線の形は、「真の前駆体」同位元素富化を明らかにし、そして、生物学的分子生成物の画分置換比率も明らかにする（図７）。安定な前駆体プール富化を維持しながらプラトーまで標識することにより、細胞の代謝プールの生物学的な複雑性を克服することが可能である。
【０１０８】
前駆体分子を、断続的に投与し得る。断続的な標識方法については、標識した前駆体分子の量を測定し、次いで１回以上投与し、そしてその後標識した前駆体分子への曝露を中断し、その後標識した前駆体分子を体の前駆体プールから洗い流すことで起こる。次いで、生物学的分子の崩壊の時間的経過は、生物学的サンプルの代謝誘導体における標識の減少の測定または標識取り込みの遅れ（希釈または枯渇）の測定によりモニタリングされ得る。
【０１０９】
（Ｂ．生物学的分子および代謝誘導体）
１つの局面では、本発明は、生物学的分子の代謝誘導体における同位元素標識の取り込みを検出することにより、個体中の生物学的分子の合成または分解の比率を決定するための方法を含む。
【０１１０】
好ましくは、生物学的分子は、入手困難な生物学的分子であるかまたは入手困難な生物学的サンプル中で検出される。入手困難な生物学的分子の生合成または分解の比率は、同位元素標識を測定することによるかまたは代謝誘導体もしくは異化産物の崩壊を測定することにより測定され得る。
【０１１１】
さらに、生物学的分子の代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、入手しやすい生物学的サンプル中にある。代謝誘導体または異化産物はまた、好ましくは、主に、および必要に応じて独自に、生物学的分子から誘導される。従って、代謝誘導体または異化産物は、好ましくは生物学的分子を同定または特徴づけし、そして従って、生物学的分子の識別子と言える。好ましくは、代謝誘導体または異化産物の全量ではなく、少量のみを得ることが必要である。さらに、代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、代謝により他の生物学的分子に組み込まれ得ない。
【０１１２】
代表的な前駆体分子、入手しにくい生物学的分子および代謝誘導体を表１に示す。前駆体分子は、生合成により、生物学的分子に組み込まれ得、そして後に１つ以上の代謝誘導体を形成するように分解され得る。次いで、標識を組み込んだ代謝誘導体は、それらが由来する生物学的分子に関連され得、そして、代謝誘導体における標識の組み込みまたは崩壊比率論は、それらが由来する生物学的分子における標識の取り込みまたは崩壊比率論を明らかにする。
【０１１３】
【表１−１】
2005517904.tif 000002
【０１１４】
【表１−２】
2005517904.tif 000003
【０１１５】
【表１−３】
2005517904.tif 000004
【０１１６】
【表１−４】
2005517904.tif 000005
【０１１７】
代謝誘導体を入手しやすい生物学的サンプルから入手し得る。代謝誘導体を同位元素測定、ＭＩＤＡおよび同位元素で標識した種：標識されなかった種の比の計算を実施するために十分な量で入手する。
【０１１８】
（タンパク質およびその代謝誘導体）
生物学的分子は、タンパク質であり得る。タンパク質の例を表１に列挙したが、それは、コラーゲン、ミオシンおよびアミロイド前駆体タンパク質を含む。
【０１１９】
１個以上の代謝誘導体が、タンパク質の生合成または分解の間に産生され得る。タンパク質の代謝誘導体は、アミノ酸およびペプチドであり得る。代謝誘導体は、また、アミノ酸およびペプチドの一部であり得る。
【０１２０】
好ましくは、タンパク質は、入手困難な生物学的サンプル中の入手困難な生物学的分子である。入手困難なタンパク質の入手は、かなりの危険および不快感を伴う侵襲性手順を必要とする。コラーゲンの生合成または分解の比率を、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中のタンパク質の代謝誘導体を測定することにより、測定し得る。
【０１２１】
好ましい代謝誘導体は、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中にある。タンパク質の代謝誘導体は、好ましくは、主に、および必要に応じて独特に、コラーゲンの特定の型に由来する。従って、タンパク質代謝誘導体または異化産物は好ましくは、コラーゲンの型およびそれらの組織源を同定するかまたは特徴付けする。コラーゲン代謝誘導体または異化産物の全量ではなく、少量のみを得ることが必要である。さらに、コラーゲンの代謝誘導体または異化産物を、直接的にはコラーゲンまたは他の生物学的分子には再組み込みし得ない。
【０１２２】
代謝誘導体は、１個以上の翻訳後修飾を含み得る。１つの実施形態においては、代謝誘導体としては、リン酸化、メチル化、ヒドロキシル化、グリコシル化、Ｎ−アセチルグルコサミン化、プレニル化、パルミトイル化、γ−カルボキシル化、アセチル化、または硫酸化したアミノ酸またはペプチド、あるいはペプチドの組成またはアミノ酸の構造が独特に、それの由来した生物学的タンパク質を同定する、翻訳後に修飾された他のアミノ酸またはペプチドが挙げられ得るが、これらに限定されない。代謝誘導体（およびそれらが由来するタンパク質）のこの型の例としては、３−メチル−ヒスチジン（筋肉ミオシン（ｍｙｓｉｎ）、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、グルコシルガラクトシルヒドリキシリジン、ガラクトシルヒドロキシリジン（コラーゲン）およびγカルボキシグルタミン酸塩（コラーゲン）が挙げられる。
【０１２３】
（コラーゲン）
生物学的分子は、コラーゲンであり得、そして、代謝誘導体はコラーゲンの識別子である。コラーゲンの生合成および分解は、骨粗鬆症、線維形成誘導性障害（例えば、肝硬変、鬱血心不全、線維性肺疾患および光加齢）、慢性リウマチ、真性糖尿病ならびに数種の癌および無秩序な細胞成長に関連する障害に関係している。
【０１２４】
コラーゲンは、３個の別のポリペプチドを有する、トロポコラーゲンと呼ばれる三重鎖らせん状タンパク質である。コラーゲンを、最初に３個の別のプロコラーゲン鎖として合成する。プロコラーゲンは、三重鎖ヘリックスを形成する。プロコラーゲンのＮ末端ペプチドおよびＣ末端ペプチドを、切断してトロポコラーゲンを生成する。コラーゲンは、交差結合し得る。
【０１２５】
コラーゲンは、入手困難な生物学的サンプルの入手困難な生物学的分子である。直接骨からのコラーゲンサンプルの入手は、例えば、かなりの危険および不快感を要求する侵襲性手順による。コラーゲンの生合成または分解の比率を、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中のコラーゲンの代謝誘導体を測定することにより測定する。
【０１２６】
コラーゲンの代謝誘導体は、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中にある。コラーゲンの代謝誘導体は、好ましくは、主に、および必要に応じて独特に、コラーゲンの特定の型に由来する。例えば、Ｎ−末端およびＣ−末端のコラーゲンテロペプチド、Ｎ−末端およびＣ−末端のコラーゲンプロペプチド（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）およびコラーゲンの翻訳後修飾は、主に特定のコラーゲン型に由来する。従って、コラーゲン代謝誘導体または異化産物は、好ましくはコラーゲンの型およびそれらの組織源を同定するかまたは特徴付けする。コラーゲン代謝誘導体または異化産物の全量ではなく、少量のみを得ることが必要である。さらに、コラーゲンの代謝誘導体または異化産物を、直接的にはコラーゲンまたは他の生物学的分子には再組み込みし得ない。
【０１２７】
コラーゲンは、いくつかの異なる型に分類される。
【０１２８】
Ｉ型コラーゲンは、人体中に最も豊富にあるタンパク質種の一つであり、全コラーゲンの少なくとも７０％を占める。これの大部分は骨中に存在し、そこでは、有機マトリックスの約９０％がＩ型コラーゲンからなる。残りは、肝臓組織、心臓組織、肺組織および皮膚を含む身体全体の柔結合組織に検出される。Ｉ型コラーゲン分子は、組織中のコラーゲン線維の一部としてのその機能のために必要な、長く、柔軟性のない棒状の形状である。正常なＩ型コラーゲン分子の３個の構成要素鎖の２個は、同一のα１（Ｉ）鎖であるが、第３は、異なり、相同なα２（Ｉ）鎖である。これらの鎖は、全て、絡み合って３重ヘリックスになっている。元の遺伝子産物である、Ｉ型プロコラーゲンの前α１（Ｉ）および前α２（Ｉ）は、対応する最終産物であるα鎖より約５０％長い。その分子の両末端にある２個のさらなるバルキーな領域は、通常、Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドおよびカルボキシ末端プロペプチドと呼ばれる。一旦分子が細胞外空間に到達すると、２個の特異的なエンドプロテイナーゼである、Ｎ−プロテイナーゼおよびＣ−プロテイナーゼにより、これらの部分は、プロコラーゲンからまとめて取り除かれる。
【０１２９】
ＩＩ型コラーゲンは、軟骨中のコラーゲンの８０〜９０％を占める、軟骨の主要な線維コラーゲンである。ＩＩ型コラーゲンは、軟骨細胞で生成され、そして、その線維は、乾燥重量で軟骨の４０〜５０％を構成する。それは、ＸＩ型コラーゲンにしっかりと結合し、それは、ＸＩ型コラーゲンと著しい配列相同性を有する。ＸＩ型の球状ドメイン、ならびにＩ型およびＩＩＩ型と比較して増大したＩＩ型コラーゲンのグリコシル化は、線維直径の決定に、役割を演じ得る。ＩＩ型コラーゲンの主要な機能は、軟骨の引っ張り強さおよび強靭性を提供することである。
【０１３０】
柔組織中のＩ型コラーゲンを合成する主要な細胞は、線維芽細胞であり、それはまた、顕著な量のＩＩＩ型コラーゲンを常に生成する。ＩＩＩ型コラーゲンは、人体中で、２番目に多いコラーゲン型である。その細い原線維は、血管の主要なコラーゲンを構成し、Ｉ型コラーゲンと一緒に、新規に形成される柔結合組織の主要なコラーゲンを構成する。その相対的な濃度は、代謝的に活性な若い結合組織（例えば、治癒中の外傷の肉芽組織）中で特に高い。外傷治癒の間、その割合は、おそらく、Ｉ型コラーゲンより短いＩＩＩ型コラーゲンの半減期のために減少する。ＩＩＩ型コラーゲン分子は、３個の同一のα１（ＩＩＩ）鎖のホモ三量体である。その線維は、一般に、Ｉ型コラーゲンを主に含むものより細く、これらの線維は、保持されたアミノ末端プロペプチドを有するＩＩＩ型ｐＮ−コラーゲンにより覆われる。このような分子は、線維のさらなる横方向の成長を防止すると考えられる。
【０１３１】
ＩＶ型コラーゲンは、網状組織を形成するコラーゲンである。ＩＶ型コラーゲンは、成熟基底層の主要部分を構成するフェルト様シートまたは網目構造を作る。
【０１３２】
コラーゲンの代表的な代謝誘導体を表１に列挙する。代謝誘導体は、Ｎ−末端もしくはＣ−末端のテロペプチドまたはＮ−末端もしくはＣ−末端のプロペプチドであり得、Ｎ−末端テロペプチドα（Ｉ）（配列番号１）、Ｎ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号２）、Ｎ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号３）、Ｎ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号４）、Ｎ末端テロペプチドα１（ＩＩＩ）（配列番号５）、Ｃ末端テロペプチドα１（Ｉ）（配列番号６）、Ｃ末端テロペプチドα２（Ｉ）（配列番号７）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号８）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号９）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩ）（配列番号１０）、Ｃ末端テロペプチドα１（ＩＩＩ）（配列番号１１）、Ｉ型コラーゲンの架橋したカルボキシ末端ペプチド（ＩＣＴＰ）、ＰＩＮＰ（α１）（配列番号１２）、ＰＩＣＰ（α１）（配列番号１３）、ＰＩＮＰ（α２）（配列番号１４）、ＰＩＣＰ（α２）（配列番号１５）、ＰＩＩＮＰ（α１）（配列番号１６）、ＰＩＩＣＰ（α１）（配列番号１７）、ＰＩＩＩＮＰ（α１）（配列番号１８）、ＰＩＩＩＣＰ（α１）（配列番号１９）、ＰＩＶＮＰ（α１）（配列番号２０）、ＰＩＶＮＰ（α２）（配列番号２１）、ＰＩＶＮＰ（α２）（配列番号２２）、ＰＩＶＮＰ（α３）（配列番号２３）、ＰＩＶＮＰ（α４）（配列番号２４）、ＰＩＶＮＰ（α５）（配列番号２５）およびＰＩＶＮＰ（α６）（配列番号２６）が挙げられるが、これらに限定されない。各ペプチドは、コラーゲンの特定の型を同定する。
【０１３３】
コラーゲンの代謝誘導体は、コラーゲンの源に特異的である。表１は、各組織に関連した特異的コラーゲン産物を示す。代謝誘導体化は、また、コラーゲンの翻訳後の修飾かまたは架橋でもあり得る。コラーゲンの翻訳後の修飾としては、ピリジノリン、ヒドロキシピリジノリン、４−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、グルコシルガラクトシルヒドロキシリジンおよびガラクトシルヒドロキシリジンが挙げられる。これらの代謝誘導体の各々は、コラーゲンの識別子である。
【０１３４】
当業者は、コラーゲンの他の公知の代謝誘導体が、本明細書に記載された方法により検出され得ることを認識する。
【０１３５】
（ミオシン）
生物学的分子は、また、筋肉組織由来のミオシンでもあり得る。筋肉は、アクチンに結合し、ＡＴＰを加水分解することにより筋肉収縮を促進する筋肉タンパク質である。ミオシン生合成および分解を、ミオシン分解産物を同定することにより決定し得る。
【０１３６】
ミオシンは、入手困難な生物学的サンプル中に見出される入手困難な生物学的分子である。筋組織生検中のミオシンサンプルの直接の入手は、例えば、かなりの危険および不快感を要求する侵襲性手順である。ミオシンの生合成または分解の比率を、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中のミオシンの代謝誘導体を測定することにより、決定する。
【０１３７】
ミオシンの代謝誘導体は、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中にある。ミオシンの代謝誘導体は、好ましくは、主に、および必要に応じて独特に、ミオシンに由来する。例えば、３−メチルヒスチジンは、主にミオシンに由来する。タンパク質分解の間、ミオシンから放出されたペプチドは、血行中に漏れ、ミオシンを同定し得る。従って、ミオシン代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、ミオシンを同定するかまたはミオシンを特徴付けする。ミオシン代謝誘導体または異化産物の全量ではなく、少量のみを得ることが必要である。必要に応じて、ミオシンの代謝誘導体または異化産物を、直接的にはミオシンまたは他の生物学的分子には再組み込みし得ない。
【０１３８】
表１は、ミオシンに特異的な代謝誘導体の例を列挙する。
【０１３９】
当業者は、ミオシンの他の公知の代謝誘導体が、本明細書に記載された方法により検出され得ることを認識する。
【０１４０】
（アミロイド前駆体タンパク質）
生物学的分子は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）であり得る。アミロイド豊富なプラークの同定は、長い間、病理学者がアルツハイマー病を調査するための診断上の手段であった。プラークは、ＡＰＰに由来するβアミロイドペプチドの蓄積および凝集を介して形成し、脳実質および血管の周囲に、特徴的に検出される。
【０１４１】
ＡＰＰは、入手困難な生物学的サンプル中に見出される入手困難な生物学的分子である。脳由来のＡＰＰサンプルの直接の入手は、例えば、かなりの危険を要求するか、または深刻な傷害もしくは死を生じる侵襲性手順である。ＡＰＰの生合成または分解の比率を、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中のＡＰＰの代謝誘導体を測定することにより、決定する。
【０１４２】
ＡＰＰの代謝誘導体は、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中にある。ＡＰＰの代謝誘導体は、好ましくは、主に、および必要に応じて独特に、ＡＰＰに由来する。例えば、βアミロイド前駆体ペプチドは、特に、ＡＰＰに由来する。従って、ＡＰＰ代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、ＡＰＰを同定するかまたはＡＰＰを特徴付けする。ＡＰＰ代謝誘導体または異化産物の全量ではなく、少量のみを得ることが必要である。さらに、ＡＰＰの代謝誘導体または異化産物を、直接的にはＡＰＰまたは他の生物学的分子には再組み込みし得ない。
【０１４３】
代謝誘導体は、ＡＰＰ特異的な代謝誘導体であり得る。代謝誘導体は、アミロイドβ（１〜４０）（配列番号２７）、アミロイドβ（１〜４２）（配列番号２８）またはＡＰＰ  Ｃペプチドでもあり得る。当業者は、代謝誘導体がアミロイドβ（１〜４０）（配列番号２７）、アミロイドβ（１〜４２）（配列番号２８）または他のＡＰＰ特異的代謝誘導体の成分であり得ることを認識する。
【０１４４】
当業者は、ＡＰＰの他の公知の代謝誘導体が、本明細書に記載された方法により検出され得ることを認識する。
【０１４５】
（ミエリン基礎タンパク質）
生物学的分子は、ミエリン基礎タンパク質（ＭＢＰ）であり得る。ＭＢＰの喪失または脱髄は、多発性硬化症、神経変性疾患と関連している。尿中のＭＢＰ様物質の増加は、脱髄と関連している。
【０１４６】
ＭＢＰは、入手困難な生物学的サンプル中に検出される入手困難な生物学的分子である。脳由来のＭＢＰサンプルの直接の入手は、例えば、深刻な傷害または死の危険を有する侵襲性手順である。好ましくは、ＭＢＰの生合成または分解の比率を、入手の容易な生物学的サンプル中のＭＢＰの代謝誘導体を測定することにより決定する。
【０１４７】
ＭＢＰの代謝誘導体は、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中にある。ＭＢＰの代謝誘導体は、好ましくは、主に、および必要に応じて独特に、ＭＢＰに由来する。例えば、ＭＢＰ様物質は、主に、ＭＢＰに由来する。従って、ＭＢＰ代謝誘導体または異化産物は、ＭＢＰを同定するかまたはＭＢＰを特徴付けする。ＭＢＰ代謝誘導体または異化産物の全量ではなく、少量のみを得ることが必要である。さらに、ＭＢＰの代謝誘導体または異化産物を、直接的にはＭＢＰまたは他の生物学的分子には再組み込みし得ない。
【０１４８】
代謝誘導体は、ＭＢＰに特異的であり得る。１つの実施形態では、触媒産物は、ＭＢＰ様物質である。さらなる実施形態では、ＭＢＰ様物質は、尿中である。
【０１４９】
当業者は、ＭＢＰの他の公知の代謝誘導体が、本明細書に記載された方法により検出され得ることを認識する。
【０１５０】
（ポリヌクレオチドおよびそれらの代謝誘導体）
生物学的分子は、また、ポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０１５１】
ＤＮＡ生合成および分解は、それぞれ細胞増殖およびと死と関連している。ポリヌクレオチドの生合成および分解の割合を決定することにより、細胞増殖に関連する癌および他の障害をモニタリングし得る。
【０１５２】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、入手困難な生物学的サンプル中にある入手困難な生物学的分子である。好ましくは、ポリヌクレオチドの生合成または分解の比率を、入手の容易な生物学的サンプル中のポリヌクレオチドの代謝誘導体を測定することにより測定する。
【０１５３】
ポリヌクレオチドの代謝誘導体は、好ましくは、入手の容易な生物学的サンプル中にある。ポリヌクレオチドの代謝誘導体は、好ましくは、主に、および必要に応じて独特に、ポリヌクレオチドに由来する。代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、ポリヌクレオチドおよび必要に応じてそれらの組織源を、同定するかまたは特徴付けする。代謝誘導体または異化産物の全量ではなく、少量のみを得ることが必要である。さらに、代謝誘導体または異化産物を、直接的にはポリヌクレオチドまたは他の生物学的分子には再組み込みし得ない。
【０１５４】
表１は、ポリヌクレオチド由来の代謝誘導体の例を列挙する。
【０１５５】
代謝誘導体は、ＤＮＡまたはＲＮＡ特異的代謝誘導体（例えば、デオキシリボース、リボースまたはポリヌクレオチドの特異的配列）であり得る。代謝誘導体は、ＤＮＡ中の塩基の複製後の修飾により生成され得る。別の実施形態において、代謝誘導体は、メチル化塩基または酸化修飾塩基である。別の実施形態において、代謝誘導体は、メチルシトシン、８−オキソグアノシン、デオキシリボースおよびリボースであり得る。
【０１５６】
当業者は、ポリヌクレオチドの他の公知の代謝誘導体が本明細書に記載された方法により検出され得ることを認識する。
【０１５７】
（脂質およびそれらの代謝誘導体）
その生物学的分子はまた、脂質であり得る。脂質は、膜の成分であり、これらの膜としては、脳、膵臓、および他の組織の膜が挙げられる。脂質としては、アシル-グリセリド、リン脂質、コレステロールおよびその誘導体、セラミド、スフィンゴシン、および糖脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
頻繁には、脂質は、入手しにくい生物学的サンプル中で見出される入手しにくい生物学的分子である。脳から直接脂質サンプルを入手することは、例えば、侵襲的手順であり、実質的な危険および困難を要することである。脂質の生合成および分解の比率は、好ましくは、入手しやすい生物学的サンプル中の脂質の代謝誘導体を測定することによって測定される。
【０１５９】
脂質の代謝誘導体は、好ましくは、入手しやすい生物学的サンプル中に存在する。２２−（Ｒ）−ヒドロキシコレステロール、２４−（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、または２４，２５−（Ｓ）−エポキシコレステロール、ガラクトセレブロシド、ガラクトセレブロシド由来のガラクトース、スフィンゴミエリン、およびスフィンゴシンは、例えば、それらの脂質の起源を特異的に同定する。脂質の代謝誘導体は、好ましくは、主に、および必要に応じて独自に脂質から得られる。従って、脂質の代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、脂質を同定または特徴付ける。ごく少量の（総量ではない）脂質代謝誘導体または異化産物を得ることが必要である。さらに、脂質の代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、脂質または他の生物学的分子に直接再度組み込まれることはできない。
【０１６０】
（グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、およびそれらの代謝誘導体）
グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンは、細胞外空間（例えば、軟骨、基質、および滑膜関節液）において重要な役割を果たす生物分子の複雑なクラスである。
【０１６１】
好ましくは、グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンは、入手しにくい生物学的サンプル中の入手しにくい生物学的分子である。ポリヌクレオチドの生合成または分解の比率は、好ましくは、入手しやすい生物学的サンプル中のグリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの代謝誘導体を測定することにより測定される。
【０１６２】
グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの代謝誘導体は、好ましくは、入手しやすい生物学的サンプル中に存在する。グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの代謝誘導体は、好ましくは、主に、および必要に応じて、独自にグリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンから得られる。その代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカン、ならびに必要に応じて、それらの組織供給源を同定または特徴付けする。ごく少量の（総量ではない）代謝誘導体または異化産物を得ることが必要である。さらに、代謝誘導体または異化産物は、グリコサミノグリカン、プロテオグリカンまたは他の生物学的分子に直接再度組み込まれることはできない。
【０１６３】
それらの代謝誘導体は、以下のうちの１つ以上が挙げられ得る：ヒアルロン酸ジサッカリドまたはそのポリマー、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、コンドロイチン硫酸ジサッカリドまたはそのポリマー、ヘパリン硫酸ジサッカリドまたはそのポリマー、およびケラチン硫酸ジサッカリドまたはそのポリマー。
【０１６４】
脂質の代謝誘導体は、好ましくは、入手しやすい生物学的サンプル中に存在する。ヒアルロン酸ジサッカリドまたはそのポリマー、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、コンドロイチン硫酸ジサッカリドまたはそのポリマー、およびヘパリン硫酸ジサッカリドまたはそのポリマーは、例えば、それらの起源を特異的に同定する。その代謝誘導体または異化産物は、好ましくは、特異的グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンを同定または特徴付ける。
【０１６５】
（ｉｉ）１つ以上の生物学的サンプルを個体から得ること
生物学的サンプルは、個体から得られる。生物学的サンプルを得る特定の方法は、当該分野で周知である。好ましくは、その生物学的サンプルは、入手しやすい生物学的サンプルである。
【０１６６】
生物学的分子の生合成または分解は、得られた１以上の生物学的サンプルとは異なる組織または流体で起こり得る。
【０１６７】
１以上の代謝誘導体が得られ得、必要に応じて、当該分野で公知の標準的な生化学的方法を使用して、その生物学的サンプルから部分的に精製または単離され得る。
【０１６８】
生物学的サンプリングの頻度は、種々の因子に依存して変動し得る。このような因子としては、代謝誘導体の性質、サンプリングの容易さおよび安全性、これらが由来する代謝誘導体もしくは生物学的分子の生物学的比率定数およびターンオーバー比率論、および処置に対する応答をモニタリングする場合に、処置において使用される薬物の半減期が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
１以上の代謝誘導体はまた、部分的に精製され得、または必要に応じて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、化学的抽出、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および／または当業者に公知の他の分離方法を含む、従来の精製方法によって単離され得る。
【０１７０】
別の実施形態において、その１以上の代謝誘導体は、加水分解され得るか、またはさもなければより低分子量の分子を形成するために分解され得る。加水分解法としては、以下の当該分野で公知の任意の方法が挙げられるが、これらに限定されない：化学的加水分解（例えば、酸加水分解）および生化学的加水分解（例えば、ペプチダーゼまたはヌクレアーゼ分解）。加水分解または分解は、その代謝誘導体の精製および／または単離の前または後のいずれかに行われ得る。その代謝誘導体はまた、部分的に精製され得るか、または必要に応じて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ならびに／または化学的および／もしくは生化学的化合物を分離する当業者に公知の任意の他の分離方法を含む、従来の精製方法によって単離され得る。
【０１７１】
ｉｉｉ）上記１以上の代謝誘導体中の上記標識の組み込みの検出
代謝誘導体中の同位体富化は、質量分析法のような種々の方法によって決定され得る。この質量分析法としては、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、同位体比質量分析、ＧＣ−同位体比−燃焼−ＭＳ、ＧＣ−同位体比−熱分解−ＭＳ、液体クロマトグラフィー−ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化−ＭＳ、マトリクス補助レーザー脱離−飛行時間−ＭＳ、フーリエ変換−イオン−サイクロトロン−共鳴−ＭＳ、サイクロイド−ＭＳ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、または液体シンチレーション計測が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
標識同位体の生物学的分子への組み込みは、直接測定され得る。あるいは、標識同位体の組み込みは、標識同位体の１以上の代謝誘導体への組み込み、または代謝誘導体の加水分解産物もしくは分解産物を測定することによって決定され得る。加水分解産物は、必要に応じて、先に記載されるような任意の公知の分離方法による部分的精製または単離のいずれかの後に測定され得る。
【０１７３】
（a.質量分析法）
質量分析機は、サンプルの成分を、迅速に動く気体イオンへ変換し、それらの質量−対−電荷比に基づいてそれらを分離する。従って、同位体、またはイオンのアイソトポログ、またはイオンフラグメントの分布は、１以上の代謝誘導体中の同位体富化を測定するために使用され得る。
【０１７４】
一般に、質粒分析機は、イオン化手段および質量分析器を備える。多くの異なる型の質量分析器が、当該分野で公知である。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：磁気セクター分析器、静電分析器、クアドラポール（ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ）、イオントラップ、飛行時間質量分析器、およびフーリエ変換分析器。さらに、２以上の質量分析器は、前駆イオンをまず分離し、次いで、気相フラグメントイオンを分離および測定するために連結され得る（ＭＳ／ＭＳ）。
【０１７５】
質量分析機はまた、多くの異なるイオン化法を含み得る。これらのとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：気相イオン化供給源（例えば、電子衝撃、化学的イオン化、および電解イオン化、ならびに脱離供給源（例えば、電場脱着、高速原子ボンバードメント、マトリクス補助レーザー脱離／イオン化、ならびに表面増強レーザー脱離／イオン化。
【０１７６】
さらに、質量分析機は、分離手段（例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））に連結され得る。ガスクロマトグラフィー質量−分析法（ＧＣ／ＭＳ）において、ガスクロマトグラフからのキャピラリーカラムは、必要に応じて、ジェットセパレーター（ｊｅｔ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ）を用いて、質量分析器に直接連結される。このような適用において、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラムは、サンプル成分を、サンプル気体混合物から分離し、この分離された成分は、質量分析機でイオン化され、化学的に分析される。
【０１７７】
ＧＣ／ＭＳが、有機分子の質量アイソトポログ量を測定するために使用される場合、標識された水からの水素標識同位体の組み込みが、標識された水からその有機分子へ組み込まれる水素原子の数に依存して、３〜７倍増幅する。
【０１７８】
一実施形態において、代謝誘導体の同位体富化は、質量分析機によって直接測定され得る。
【０１７９】
別の実施形態において、その代謝誘導体は、部分的に精製され得るか、または必要に応じて、質量スペクトル分析の前に単離され得る。さらに、代謝誘導体の加水分解または分解産物は、精製され得る。
【０１８０】
別の実施形態において、代謝誘導体の加水分解後の代謝誘導体の同位体富化は、ガスクロマトグラフィー−質量分析によって測定される。
【０１８１】
上記実施形態の各々において、生物学的分子の生合成比率は、真の前駆体プール富化を表すために、完全にターンオーバーされた生物学的分子の関連する代謝誘導体において、標識された前駆体分子富化値または漸近同位体富化のいずれかを使用して、前駆体-生成物の関係の適用によって計算され得る。あるいは、生合成または分解の比率は、指数関数的または他の減衰（ｄｉｅ−ａｗａｙ）比率論モデルの適用によって、指数関数的減衰曲線を使用して計算され得る。
【０１８２】
（ｂ．液体シンチレーション）
放射性同位体は、液体シンチレーションカウンターを使用して観察され得る。放射性同位体（例えば、３Ｈ）は、液体シンチレーション検出器によって検出される放射線を放射する。この検出器は、その放射線を電気シグナルに変換し、この電気シグナルが増幅される。従って、代謝誘導体中の放射性同位体の数が、測定され得る。
【０１８３】
一実施形態において、生物学的サンプル中の放射性同位体富化値は、液体シンチレーションによって直接測定され得る。さらなる実施形態において、放射性同位体は、３Ｈである。
【０１８４】
別の実施形態において、代謝誘導体またはそれらの成分は、部分的に精製され得るか、または必要に応じて単離され得、その後、液体シンチレーション計測によって測定され得る。
【０１８５】
上記実施形態の各々において、生物学的分子の生合成比率は、真の前駆体プール富化を表すために、完全にターンオーバーされた生物学的分子の関連する代謝誘導体において、標識された前駆体分子富化値または漸近同位体富化のいずれかを使用して、前駆体-生成物の関係の適用によって計算され得る。あるいは、その分解比率は、指数関数的減衰曲線または他の減衰（ｄｉｅ−ａｗａｙ）モデルの減衰曲線を使用して計算され得る。
【０１８６】
（ｉｖ）生合成または分解の比率の決定
生合成および分解の比率は、手動によってまたはアルゴリズムを介して、コンビナトリアル分析によって計算され得る。質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ）コンビナトリアルアルゴリズムのバリエーションは、当業者に公知の多くの異なる出典において議論される。具体的には、ＭＩＤＡ計算法は、米国特許第５，３３６，６８６号（本明細書中に参考として援用される）の主題である。この方法は、ＨｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎおよびＮｅｅｓｅ（１９９９）、ならびにＣｈｉｎｋｅｓら（１９９６）、ならびにＫｅｌｌｅｈｅｒおよびＭａｓｔｅｒｓｏｎ（１９９２）によってさらに議論される。
【０１８７】
上記で引用された文献に加えて、この方法を実行する計算ソフトウェアが、Ｍａｒｃ  Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）から公的に入手可能である。
【０１８８】
生物学的分子の生合成比率（ｋ）は、標準的な同位体希釈式、例えば、
Ａｔ＝Ａ０・ｅ−ｋｔ
ここでＡｔ＝時間ｔでのサンプル中の標識された代謝誘導体の割合
Ａ０＝時間０でのサンプル中の標識された代謝誘導体の割合
ｔ＝時間
ｋ＝生合成比率定数
【０１８９】
【数１】
2005517904.tif 000006
【０１９０】
を使用して、計算され得る。
【０１９１】
同様に、分解比率定数は、当業者に公知の指数関数的減衰曲線または他の比率論的減衰曲線に基づいて計算され得る。
【０１９２】
（ＩＶ．使用方法）
本明細書中で開示される方法は、多くの生物学的および医学的な用途を有する。本明細書中で記載される測定法は、薬学的研究用途（例えば、候補遺伝子またはタンパク質標的のスクリーニング、候補薬物因子の表現型確認、候補薬物因子のＦＤＡの第Ｉ相および第ＩＩ相のヒト確認研究、ＦＤＡの候補薬物因子の第ＩＩＩ相評価、ならびにＦＤＡの第ＩＶ相評価研究、または他の評価後市場位置づけもしくは薬物作用機構の研究）に加えて、多くの医学的用途（例えば、既にある生理学的状態のモニタリング、疾患状態の診断、および疾患状態または生理学的状態の発生の危険性の評価）に適用可能である。表２は、種々の入手しにくい生物学的分子に相関する、多くの疾患および障害を示す。
【０１９３】
一局面において、本発明は、目的の分子の組織合成または分解の比率の決定を提供する。このような目的の分子は、特定の疾患状態の指標であり得るか、または特定の疾患状態を発症する傾向の指標である。別の局面において、本発明は、多くの疾患状態または生理学的状態または生物学的分子の合成および／もしくはターンオーバー比率の変化によって特徴付けられる状態の、診断および医療的管理のための能力を提供し、それらの状態としては、骨粗鬆症（例えば、骨コラーゲン合成およびターンオーバーの比率）；線維形成障害（例えば、肝硬変、うっ血性心不全、線維症の肺疾患、強皮症および光加齢）における肝臓、心臓、肺および皮膚のコラーゲン合成比率；アルツハイマー病における中枢神経系のアミロイド前駆体タンパク質およびアミロイドの原線維の合成比率、タンパク質分解経路、寿命および滞留時間；消耗病、スポーツトレーニング、およびタンパク質同化治療（ａｎａｂｏｌｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）における、筋肉ミオシン合成およびターンオーバーの比率；多発性硬化症（脳の髄鞘形成、脱髄および再髄鞘形成の比率）；慢性関節リウマチおよび変形性関節症（関節保護性のグリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの、滑液および関節軟骨の合成および分解の比率）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
本発明の方法により診断され得る他の生理学的状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：骨粗鬆症、左心室肥大、肝硬変、肝臓線維症、うっ血性心不全、強皮症、黒色肺（炭坑夫のじん肺症）、心臓線維症、肺線維症、アルツハイマー病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、糖尿病、筋肉疲労症候群、筋ジストロフィー、スポーツトレーニング、および癌。
【０１９５】
別の局面において、本発明は、治療介入または疾患予防介入に対する個体における疾患または状態の応答をモニタリングするための方法であり、この方法は、生物学的分子の合成または分解の比率をこのような介入の開始の前に評価し、次いで、このような治療介入または疾患予防介入の開始の後に、同じ生物学的分子の合成または分解の比率を評価し；そして合成および分解の両方の比率を比較することによる。一実施形態において、この治療介入は、タンパク質同化治療である。筋肉におけるミオシンの合成および分解の比率は、タンパク質同化治療（例えば、組換え成長ホルモン、アンドロゲンなど）前およびタンパク質同化治療後両方での、標識前駆体（例えば、２Ｈ３−ロイシン、２Ｈ５−ヒスチジン、１３Ｃ−セリン、２Ｈ２Ｏ）の尿の３−メチルヒスチジンへの組み込みによって測定される。治療後の比率は、治療前の比率と比較されて、治療の効果が確立される。
【０１９６】
別の局面において、本発明は、その疾患状態の指標である生物学的分子の合成または分解の比率を決定し、その合成または分解の比率と、その生物学的分子の合成または分解の参照比率とを比較することによって、個体における疾患状態の発生の危険性を決定するための方法である。ここでこの参照比率は、その疾患状態の危険性を示す。一実施形態において、その疾患状態は、骨粗鬆症であり、骨コラーゲンの合成および／または分解の比率は、この疾患の発症に関する危険因子である。骨コラーゲンの合成および／または分解の比率は、標識前駆体（例えば、１３Ｃ１−リジン、２Ｈ２Ｏ）の被験体における骨コラーゲンの分泌代謝誘導体（例えば、Ｎ末端テロペプチド、デオキシピリジノリン）への組み込みに基づいて測定され、参照値と比較されて、その後の骨粗鬆症の発症に対する危険性が評価される。
【０１９７】
別の局面において、本発明は、個体中の生体分子の全身プールサイズ（ｐｏｏｌ  ｓｉｚｅ）を、以下によって決定するための方法である：（１）上述の方法を使用する方法によって１日当たりの部分的な合成比率を測定する工程；（２）指示的（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ）代謝誘導体の総排出を回収する工程；（３）１日当たりの完全排出比率（ＥＲ）を測定する工程；（４）以下の式
【０１９８】
【数２】
2005517904.tif 000007
【０１９９】
を使用して、この代謝誘導体の１日当たりの部分的な置換比率によって１日当たりＥＲを除算して、個体中の生体分子の全身プールサイズを計算する工程であって、ここで、ｋ＝部分的な置換比率定数である。これは、実施例５において例示したような癌の存在に対する評価のために使用され得る。
【０２００】
（Ｖ．本発明によって提供される利点）
本発明は、物理的な手段による組織の直接的サンプリングを必要とする生体高分子の生合成の比率および生体高分子の分解の比率を測定するための、従来技術よりも数多くの利点を有する。最も重要であるのは、直接的な組織のサンプリングを必要としないことである。この直接的な組織のサンプリングは、多くの状況において、非実用的であるか、不便であるか、潜在的に危険であるか、不安を引き起こすものであるか、または実用上不可能である（例えば、脳組織のサンプリング）。
【０２０１】
血液中または尿中に放出された異化産物の濃度または量を測定する従来の方法と本発明とを比較すると、本発明は、多くの利点を有している。第１に、代謝誘導体の定量的な回収の必要がない。従来技術は、代謝誘導体の産生の比率（そして、これにより、その代謝誘導体が誘導される分子の生合成または分解の比率）を推定するために、生物学的サンプルに由来する代謝誘導体の完全またはほぼ完全な定量的回収を必要としていた。これらの技術に影響を与える因子としては、代謝誘導体の、インビボのクリアランス効率、代謝的な変換比率、貯蔵またはさらなる代謝的な変換が挙げられる。対照的に、本発明は、その同位体標識部分の測定にとって十分な量の代謝誘導体の単離のみを必要する。なぜならば、非標識の代謝誘導体または異化産物に対する標識された代謝誘導体または異化産物の比は、取得された代謝誘導体または異化産物の収率に依存していないからである。従って、代謝誘導体の収率または回収は、制限因子ではなく、すなわち、本発明および本発明において教示される方法の前提は、代謝誘導体の、インビボのクリアランス、貯蔵などのような変数とは全く無関係に実施され得る。
【０２０２】
第２に、血流中または尿中に放出された代謝誘導体の濃度または量を測定に関与する従来技術において、目的の生体分子の分解比率のみを直接的に推定することは、代謝誘導体の放出比率に基づいて、可能であった（６）。対照的に、本発明は、目的の分子の分解比率に加え、生合成の状況（例えば、合成比率、遷移時間、組織残存時間など）の測定のための方法を教示する。
（表２．疾患および障害、組織および器官、ならびに関連する「利用不能な（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｌｒｅ）分子」）
【０２０３】
【表２】
2005517904.tif 000008
【０２０４】
（引用文献）
【０２０５】
【数３】
2005517904.tif 000009
【実施例】
【０２０６】
（実施例１：代謝誘導体として、（遊離であるかまたは骨コラーゲンＮ末端ペプチド由来である）尿中のピリジノリン／デオキシピリジノリンを使用する骨コラーゲンの生合成）
骨粗鬆症もしくは骨コラーゲンの生合成または分解の他の障害であることが疑われるかまたはそうであると診断された個体に、その身体中で新たに合成されるコラーゲンに組み込まれる標識した前駆体分子を与える。１つのこのような実施形態において、これは、７日間に亘って朝夕の食事の際に（合計１４用量）、飲料用（２５ｍｌ）として経口的に与えられる（例えば、水中で、２０ｍｇ／ｍｌの用量の）１３Ｃ１−リジンである。尿のアリコート（１０ｍｌ）を、規定の時点（例えば、１３Ｃ１−リジンプロトコルの最終日（第７日）および１３Ｃ１−リジン取り込みプロトコルが完了した７日後（第１４日））でその個体から回収する。別の実施形態において、この個体に、１３Ｃ１−リジンと類似の方法で水（例えば、７日間に亘り、１日につき２回、５０ｍｌの７０％２Ｈ２Ｏ）を与える。
【０２０７】
尿中の遊離しているかまたはペプチド結合したピリジノリン／デオキシピリジノリン（ＨＰ／ＤＰ）を、単離する（例えば、ペプチド結合ＨＰ／ＤＰを含まないように分離するためのサイズ排除クロマトグラフィーまたは濾過；ＭＷ１，０００カットオフ；免疫沈降または免疫アフィニティクロマトグラフィー）。あるいは、または、それに加え、骨、肝臓、および心臓に由来する特異的なＮ末端コラーゲンペプチドを（市販の抗体を使用して）単離するために、酸加水分解（密閉した試験管の中で、２４時間、１１０℃にした６Ｎ  ＨＣｌ）し；ＳＰＥ逆相カラムを通過させることによりＨＰ／ＤＰを浄化し；逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムからＨＰ／ＤＰを回収する。
【０２０８】
骨コラーゲンに由来する目的の画分からのＨＰ／ＤＰ（例えば、遊離しているかまたは骨コラーゲンに由来のＮ末端ペプチドからの総量）を、ＬＣ／ＭＳ（例えば、ＢｉｏＱエレクトロスプレイ／ＭＳ）に注入する。ＨＰの質量アイソトポマーピーク（ｍ／ｚ  ４２９．２、４３０．２．および４３１．２）ならびにＤＰの質量アイソトポマーピーク（４１３．２、４１４．２、４１５．２）を、モニターする。上記の質量アイソトポマーの相対存在量は、分析されるサンプルおよび標識していない標準において定量化される（例えば、第１４日のサンプルにおいて、ｍ／ｚ  ４３０．２／（４２９．２＋４３０．２＋４３１．２）＝０．１６５であり、そして、非標識標準において０．１５００である）。次いで、存在するＨＰ分子またはＤＰ分子の標識：非標識の割合を、ＭＩＤＡ法によって計算する。
【０２０９】
１つのこのような方法によって、過剰な標識ＨＰ／ＤＰ分子の割合を、標識されたサンプルから非標識標準を差し引くことによって計算する（例えば、０．０１５０すなわち１．５％）。遊離リジンを、ＳＰＥカラムを使用して１３Ｃ１−リジン取り込みプロトコルの最終日（第７日）において採取された尿サンプルから単離し；次いで、ブタノール性ＨＣｌならびにその後の無水酢酸を使用してブチルエステルアセトアミド−リジンへと誘導体化する。この誘導体化されたリジンを、ガスクロマトグラフィー／質量分析計（例えば、ＨＰモデル５９７３機器）にＤＢ−２５５カラムを使用して注入する。このリジンピークの質量スペクトルを、収集し、ｍ／ｚ  ２８７および２８８において質量をモニターし、そして、非標識標準と比較してそれらの相対存在量を定量化する（例えば、第７日のサンプルにおいてｍ／ｚ  ２８８／（２８７＋２８８）＝０．３７５２であり、そして、非標識標準について０．１４３３）。
【０２１０】
遊離リジン分子における標識：非標識の割合は、質量アイソトポマー計算を使用して計算され、１３Ｃ１−リジン取り込み期間に組織コラーゲンに取り込まれ得た標識の最大割合（例えば、３０％）を実証する。骨（遊離ＨＰ／ＤＰの全体）に主に由来するか、または骨（骨コラーゲンＮ末端ペプチド）から排他的に由来し、そして、存在する３リジン標識位置について修正された、ＨＰ分子またはＤＰ分子の標識部分の比は、遊離リジン分子の標識された割合に対して比較され、そして、この比が、前駆体−生成物式に基づいて、計算され（例えば、０．００５０／０．３００、すなわち、１．６７％）；この比は、７日間の１３Ｃ１−リジン取り込みに新規に合成された骨コラーゲンの割合を示す。
【０２１１】
１３Ｃ１−リジン取り込みの期間の間に、個体における骨コラーゲンの生合成比率が、計算される（例えば、１日あたり０．２４％であり、これは、２８９日間の倍加時間または置換半減期を反映する）。
【０２１２】
上記の手順および計算を、治療的介入（例えば、結合体化したエストロゲン、上皮小体ホルモン、カルシウム、ビスホスフェートなどを用いた処置）の後の同一の個体において反復し、この個体における組織コラーゲン生合成に対する処置の効果を決定するか、または疾患活性の潜在的な変化（例えば、病床での療養）の後において、個体中の骨粗鬆症の進行度を決定する。
【０２１３】
（実施例２：肝臓、心臓、肺または皮膚のコラーゲンのＮ末端ペプチドに由来する尿ピリジノリン／デオキシピリジノリンを代謝誘導体として使用する組織繊維形成）
繊維形成障害（例えば、肝臓繊維症および／または肝硬変、間質性肺繊維症（PIF）、または進行性心不全）であると疑われたかまたは診断されたか、または問題となる皮膚光加齢（しわ）を有する個体に、身体中の生合成の間にコラーゲンに取り込まれる標識された前駆体が与える。１つのこのような実施形態において、これは、２Ｈ２Ｏ（例えば、５０ｍｌの用量）を、４２日間（６週間）に亘って朝夕の食事で飲むために経口的に与えられる。尿のアリコート（１０ｍｌ）を、規定の時点（例えば、１２Ｈ２Ｏプロトコルの最終日（第４２日））でその個体から回収した。
【０２１４】
肝臓、心臓または皮膚に特異的な尿Ｎ末端コラーゲンペプチドを、例えば、以下によって単離する：コラーゲン由来ペプチドから遊離ＨＰ／ＤＰを分離するための濾過；市販の抗体を使用する、肝臓または心臓から放出された特異的Ｎ末端コラーゲンペプチドを単離するための免疫沈降または免疫アフィニティクロマトグラフィー；酸加水分解（密閉された試験管中で、２４時間、１１０℃の６Ｎ  ＨＣｌ）；ＳＰＥ逆相カラムを通過させることによる放出されたＨＰ／ＤＰの浄化；逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムからＨＰ／ＤＰの回収。１つの実施形態において、肝臓または心臓のコラーゲンを反映する目的のペプチド画分から加水分解によって放出されたアラニンおよびグリシンを、誘導体化（例えば、グリシンまたはアラニンのＮ−アセチル−ブチル−エステルであって、これは、ブタノール性ＨＣｌおよび無水酢酸の反応によって形成される）し、条件に従って、ＧＣ／ＭＳに注入する。グリシンの質量アイソトポマーピーク（ｍ／ｚは、１７４、１７５、および１７６であり、それぞれ、親、Ｍ＋１イオンおよびＭ＋２イオンを表す）ならびにアラニン（ｍ／ｚは、１８８、１８９、および１９０であり、それぞれ、親、Ｍ＋１イオンおよびＭ＋２イオンを表す）をモニタリングする。
【０２１５】
上記のアイソトポマーの相対存在量を、サンプルおよび非標識標準の両方で定量する（例えば、第１４日の、サンプル中において、ｍ／ｚ  １８９／（１８８＋１８９＋１９０）＝０．１０５０であり、そして、アラニンの非標識標準において０．０９００であり；第１４日の、サンプルにおいて、グリシンについて、ｍ／ｚ  １７４／（１７４＋１７５＋１７６）＝０．０９３５であり、そして、アラニンについて、非標識標準において０．０８６０である）。次いで、サンプル中に存在するアラニン分子またはグリシン分子の標識：非標識の比を、計算する。
【０２１６】
１つのこのような計算に方法によって、存在するアラニン分子またはグリシン分子の過剰な標識：非標識の比を、標識されたサンプルから非標識標準を差し引いて計算する（例えば、アラニンについて、０．０１５０すなわち１．５％であり；グリシンについて、０．００７５すなわち０．７５％である）。身体の２Ｈ２Ｏの濃縮度を測定する（例えば、塩化カルシウムを添加することによってアセチレンに変換し、次いで、ガスクロマトグラフ／質量分析による分析のためにテトラブロモエタンに誘導体化する）。次いで、組織タンパク質の生合成のプールに存在する標識したアラニンまたはグリシンの割合を、前駆体−生成物式およびＭＩＤＡを使用して身体の２Ｈ２Ｏの濃縮度に基づいて計算する（例えば、２Ｈ２Ｏが１．０％である場合に、アラニンについて、０．１２６０Ｍ＋１、すなわち３．１％過剰なＭ＋１；２Ｈ２Ｏが１．０％である場合に、グリシンについて、０．１０２０Ｍ＋１、すなわち、１．６％過剰なＭ＋１である）。
【０２１７】
肝臓または心臓のコラーゲン由来のアラニン分子またはグリシン分子の標識比率を、組織タンパク質生合成プールに存在するアラニンまたはグリシンの標識比率と比較し、その割合を前駆体−生成物式に基づいて計算する（例えば、１．５％／３．１％＝アラニンからの４８％または０．７５％／１．６％＝グリシンからの４７％）。この割合は、２Ｈ２Ｏ取り込みの7日間中に新たに合成された肝臓、心臓、肺または皮膚のコラーゲンの分画を示す。次いで、２Ｈ２Ｏ取り込み期間中の、個体における肝臓または心臓のコラーゲンの生合成率を計算する（例えば、１日あたり１．６％または４５日間の倍加時間または取替え半減期）。
【０２１８】
前駆体−生成物の数学的関係に適した上記の手順および計算、またはその他の計算方法を、個体の肝臓または心臓の線維形成の処置効果を決定するために、治療的介入（例えば、抗線維形成薬による処置）後に、あるいは個体の潜在的な線維形成の進行を決定するために、疾患活性の潜在的変化（例えば、肝線維症を有する個体のアルコール取り込み休止、ＰＩＦの抗線維形成薬または抗炎症薬による処置、心線維症を有する個体のアンジオテンシン変換酵素インヒビターによる心不全の処置）後に、同じ個体において繰り返す。
（実施例３：アミロイド（Ａ）−β１−４０および１−４２ペプチドを代謝誘導体として使用する脳アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）生合成）
アルツハイマー病のリスクが懸念される個体または初期アルツハイマー病が診断されている個体に、体内で新たに合成されたタンパク質に取り込まれる標識前駆体を与える。１３Ｃ１グリシンの１０％溶液を、合計３用量（０時間、２時間、４時間；３０ｍＬ用量、合計９０ｍＬ）、２時間ごとに経口投与（１００ｍｇ／ｍＬ、水溶液中）する。血漿（２ｍＬ）サンプルを、１３Ｃ１グリシン取り込みの既知時間（例えば、６時間）後に個体から回収する。尿アリコート（２０ｍＬ）を規定の時点（例えば、１３Ｃ１グリシン投与の３日後）で個体から回収する。尿アリコートから、例えばセファロースビーズ（Ｓｅｎｅｔｅｋ，Ｉｎｃ．）にカップリングしたモノクローナル抗Ａ−β抗体を用いて、全アミロイド−β（Ａ−β）ペプチドを免疫沈降させ、次いで、イソプロパノール／水  ギ酸（４：４：１）、およびシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸でそのビーズから溶出する。そのＡ−βペプチドを、マトリックス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）／飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計（１．５マイクロリットルが追加された）にロードする。Ａ−β  １−４０エンベロープ（例えば、ｍ／ｚ  ４，３２７−４，３３５）およびＡ−β  １−４２エンベロープ（例えば、ｍ／ｚ  ４，５１１−４，５１９）における質量アイソトポマーをモニタリングする。
【０２１９】
上述の質量アイソトポマーの相対的存在量をそのサンプルにおいて定量化し、非標識化標準物質からの値と比較してそのサンプル中に存在する標識化分子の比率を計算する。
【０２２０】
このような計算方法の１方法により、過剰標識化Ａ−β分子の比率を、標識化サンプルからの非標識化標準物質の減算により計算する（例えば、Ａ−β  １−４０の標準値を超えるｍ／ｚ  ４，３２７−４，３３５＝０．００４０の合計およびＡ−β  １−４２のこの標準値を超えるｍ／ｚ  ４，５１１−４，５１９＝０．００３０の合計）。遊離グリシンをＳＰＥカラムを用いて血漿サンプルから単離し、例えばブタノールＨＣｌに続いて無水酢酸を用いることにより、ブチルエステルアセトアミド誘導体に変換する。この誘導体化されたグリシンは、ＤＢ−２２５カラムおよび条件を用いてガスクロマトグラフ／質量分析計（例えば、ＨＰモデル５９７３）に注入する。グリシンピークの質量スペクトルを収集し、質量ｍ／ｚ  １７４および１７５をモニタリングし、非標識化標準物質と比較してその相対的存在量を定量化する（例えば、ｍ／ｚ  １７５／（１７４＋１７５）は、サンプル中で０．４３４９、標準で０．０８７２）。標識：非標識のグリシン分子の存在比率を計算し、１３Ｃ１グリシン取り込み期間中の、脳ＡＰＰ内への最大限の標識取り込み（例えば、４０％）を確立する。
【０２２１】
次いで、Ａ−β  １−４０またはＡ−β  １−４２分子の標識比率の割合を、遊離グリシン分子の標識比率と比較し、１つの計算方法により、Ａ−β  １−４０またはＡ−β  １−４２におけるグリシンサブユニットの数を補正する。これらの割合は、１３Ｃ１グリシン標識期間中に新たに合成されたＡ−β  １−４０およびＡ−β  １−４２に変換される脳ＡＰＰの分画を表し；Ａ−β  １−４０とＡ−β  １−４２との間の差異はそれぞれＡ−β  １−４０およびＡ−β  １−４２の対象とされている脳ＡＰＰの生合成の差異を示す。１３Ｃ１グリシン投与期間中のその個体の脳におけるＡＰＰ生合成の比率を、ＭＩＤＡにより計算する（例えば、１．０％生合成／６時間または４．０％生合成／１日、あるいは個体の脳ＡＰＰについての２５日間(１．０／０．０４）の滞留時間）。
【０２２２】
実験的介入（例えば、セクレターゼインヒビター；エストロゲン処置）後、一例として脳の総ＡＰＰ生合成および代謝回転についての処置効果、もしくは別の例としてＡ−β  １−４０とＡ−１−４２との間を分割する際にその介入の有効性指数を決定するか、または、疾患活性の潜在的変化（例えば、精神状態の主観的変化）後に潜在的なアルツハイマーのリスクまたは疾患活性の進行の指数を決定するために同じ手順を個体において繰り返す。
【０２２３】
代替として、前記個体に２Ｈ２Ｏを（７０％、５０ｍＬを１日２回の経口で）１４日間与える。血漿、唾液または尿サンプルを、２Ｈ２Ｏ取り込みの７日目および１４日目にその被験体から回収する。尿アリコートを、１４日目に個体から採取する。尿アリコートから、上述のとおり、総Ａ−βペプチドまたはＡ−β  １−４０ペプチドおよびＡ−β  １−４２ペプチドを免疫沈降により単離する。次いで、Ａ−βペプチドを酸加水分解（ＨＣｌ  １００℃、６０分間）に供し、遊離アミノ酸を放出する。アミノ酸をＧＣ／ＭＳ分析用に誘導体化する。
【０２２４】
このような１つの方法により、アラニンのＮ−アセチル−ブチル−エステル誘導体を、ブタノールＨＣｌを用いて、その後、無水酢酸を用いて形成する。
【０２２５】
誘導体化されたアミノ酸を、ＤＢ−２２５カラムを用いてＧＣ／ＭＳ（例えば、ＨＰ５９７３機器）に注入する。アラニンおよびグリシンのピークの質量スペクトルを収集する。ｍ／ｚ  １８８〜１９０の相対化存在量を、サンプルおよび非標識化標準物質中のアラニンにおいて測定する（例えば、アラニンｍ／ｚ  １８８（ｍ／ｚ  １８８＋１８９＋１９０）は、サンプルで０．１０２５、標準物質で０．０９５０）。次いで、このサンプル中に存在するアラニン分子の標識：非標識の比率を計算する。
【０２２６】
このような１つの方法により、サンプル中の過剰標識化アラニン分子の比率を、標識化サンプルから非標識標準物質中のＭ＋１アラニンの相対化存在量を減算することにより計算する（例えば、０．１０２５−０．０９５０＝０．００７５、すなわち、０．７５％標識化Ｍ＋１アラニン分子）。
【０２２７】
これらの相対化存在量を、測定された体内２Ｈ２Ｏ濃縮存在下で、計算された最大限の存在量と比較する（例えば、体内２Ｈ２Ｏ濃縮＝１．０％において、アラニン過剰Ｍ＋１存在量＝３．１％）。単離されたＡ−βペプチドの分画合成の比率を、当業者に公知の標準の前駆体−生成物式を用いて計算する（例えば、測定されたアラニン過剰Ｍ＋１＝０．７５％、計算された最大アラニン過剰Ｍ＋１＝３．１％、比率＝０．７５／３．１％＝２４％の１４日以上をかけての新規のＡ−β合成、または１日あたりＡＰＰからの脳Ａ−βの１．９６％置換）。
【０２２８】
上記の手順を、例えば上述のとおり、実験的介入後に個体において繰り返す。
【０２２９】
（実施例４：代謝誘導体としてヒアルロン二糖ポリマーおよびコンドロイチン硫酸ポリマーを用いて、滑液および軟骨のヒアルロンまたは他のグリコサミノグリカンもしくはプロテオグリカンの生合成ならびに分解の比率）
慢性関節リウマチ（ＲＡ）または変形性関節症（ＯＡ）が診断確定しているかまたは疑いのある個体あるいはＲＡまたはＯＡの危険性がある個体に、滑膜関節液または軟骨におけるグリコサミノグリカンあるいはプロテオグリカン（例えば、ヒアルロン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン−硫酸など）に取り込まれる標識化前駆体を与える。標識化前駆体の例としては、２Ｈ２Ｏ（ヒアルロンのＮ−アセチル−グリコサミンおよびグルクロン酸の部分；コンドロイチン硫酸のＮ−アセチル−グルコサミン−硫酸およびグルクロン酸の部分；またはヘパラン−硫酸のＮ−アセチル−グルコサミン−硫酸およびグルクロン酸−硫酸の部分に取り込まれる）；２Ｈ−グルコースまたは１３Ｃ−グルコース（これらのグリコサミノグリカンあるいはプロテオグリカンのＮ−アセチル−ガラクトサミンおよびＮ−アセチル−グルコサミンの部分に取り込まれる）；１３Ｃ−アセテート（Ｎ−アセチル−ガラクトサミンまたはＮ−アセチル−グルコサミンのアセチル−部分に取り込まれる）；ならびに１５Ｎ−グリシン（Ｎ−アセチル−ガラクトサミンまたはＮ−アセチル−グルコサミンの窒素成分に取り込まれる）が挙げられる。血液または尿のアリコートを個体から
採取する。当業者に理解されるＨＰＬＣ手順を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を実施し、ヒアルロン酸二糖（ＨＡｎ）ポリマー、コンドロイチン−硫酸−二糖（ＣＳｎ）ポリマーおよび／またはヘパラン−硫酸−二糖（ＨＳｎ）ポリマーなどの他のグリコサミノグリカン二糖ポリマーを単離する。代わりに、これらのグリコサミノグリカン−二糖ポリマーを、その遊離二糖ユニットに変換し得る（例えば、ヒアルロニダーゼを用いるサンプルのインキュベーションによる）。次いで、クリコサミノグリカン二糖ポリマーまたは遊離二糖ユニットを誘導することにより、その成分の１つをＧＣ／ＭＳにより分析することが可能である（メタノールＨＣＬ［１００℃］、その後の無水酢酸：ピリジンによる処理により、例えば、ＨＡｎまたはＨＡからメチル誘導体、トリアセチル誘導体、Ｎ−アセチルグルコサミンを生成する）。
【０２３０】
次いで、前述の誘導体化された構成要素の同位体濃縮を、適切な質量の選択イオンモニタリングなどのＧＣ／ＭＳにより測定する。例えば、メチル誘導体、トリアセチル誘導体、Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体を、ｍ／ｚ  ３３１〜３３３として分析する（Ｍ０質量、Ｍ＋１質量およびＭ＋２質量を表す）。上記質量アイソトポマーの相対化存在量を標識化サンプルにおいて定量化し、非標識化標準物質と比較する（例えば、非標識標準物質において、３３２／（３３１＋３３２＋３３３）＝０．１３７０）。このような１つの質量スペクトルの一例を表９に示す。
【０２３１】
次に各サンプルに存在する標識化分子  対  非標識分子の比率を計算する。このような１つの計算方法により、サンプル中の過剰標識されたメチル−トリアセチル−Ｎ−アセチル−グルコサミン分子の比率を、標識化サンプルから非標識化標準物質を減算することにより計算する（例えば、サンプルで０．１５４０Ｍ＋１、標準物質で０．１３７０Ｍ＋１、すなわち０．０１７０Ｍ＋１＝１．７０％標識化Ｍ＋１メチル−トリアセチル−Ｎ−アセチル−グルコサミン）。組織ヒアルロン生合成プールに存在する標識化Ｎ−アセチルグルコサミン分子の比率を、ＭＩＤＡを用いて体内２Ｈ２Ｏ濃縮に基づき計算する（例えば、体内２Ｈ２Ｏ濃縮が１．０％の場合、組織プールにおいて０．１７１０Ｍ＋１Ｎ−アセチル−グルコサミン、すなわち３．４％標識Ｍ＋１Ｎ−アセチル−グルコサミン）。次いで、滑液または硝子軟骨ヒアルロンの生合成および分解の比率を、サンプル中の標識Ｎ−アセチル−グルコサミン分子の比率と組織Ｎ−アセチルグルコサミンプール中の標識分子の比率との比較により計算する（例えば、１．７０％／３．４％＝５０％の滑液および軟骨における新たに合成されたＨＡ分子）。
【０２３２】
滑液および軟骨におけるヒアルロンまたは他のグリコサミノグリカンの生合成および分解の比率は、関節グリコサミノグリカンの置換および破壊の比率を反映し、特に関節保護性抗リウマチ薬の評価において、ＲＡまたはＯＡの疾患活性および／または治療効果の尺度として使用できる。
【０２３３】
上記の手順および計算は、ヒアルロン、コンドロイチン−硫酸または他の滑液グリコサミノグリカン（グルコサミン−硫酸など）の生成を刺激し、ＲＡまたはＯＡの進行を遅らせることを意図した介入の後に介入効果の指標として、あるいは疾患活性（例えば、徴候の新しいセット）の明白な変化の後に疾患の活性または進行の指標または試験として、繰り返す場合がある。
【０２３４】
（実施例５：尿３−メチル−ヒスチジンを代謝誘導体として用いる、筋ミオシン生合成）
筋ミオシン生合成の増大により筋肉の質量を増加させることを意図した身体的訓練プログラムまたは医学的治療レジメンを受けている個体（例えば、運動選手；発作後に身体的治療を受けている高齢者；栄養療法または同化剤療法を受けている、癌またはエイズに関連する悪液質を有する患者）に、生合成中に体内タンパク質に取り込まれる標識化前駆体を与える。標識化前駆体の例としては、２時間ごとの４用量の経口投与（１０ｍｌ／用量）による１５Ｎ−ヒスチジン（水中５０ｍｇ／ｍｌ）が挙げられる。尿アリコート（１０ｍｌ）を、規定の時点で（例えば、１５Ｎ−ヒスチジンまたは３−１３Ｎセリンの投与プロトコルの終わりに、および１５Ｎ−ヒスチジン投与後３日目に再度）個体から採取する。代替的実施形態において、２Ｈ２Ｏを７日間、１日２回与える（５０ｍｌの７０％２Ｈ２Ｏ）。全尿アミノ酸をＳＰＥカラムにより単離する。アミノ酸をガスクロマトグラフ／質量分析用に誘導体化する。このような方法の１つにより、ブタノールＨＣｌを用いて、その後無水酢酸を用いてアミノ酸を、ブチル−エステルアセトアミド誘導体に変換する。
【０２３５】
誘導体化されたアミノ酸を、例えばＤＢ−２２５カラムを用いて、ガスクロマトグラフ／質量分析計（例えば、ＨＰ５９７３機器）内に注入する。３−メチルヒスチジンピークの質量スペクトルを、ｍ／ｚ  ２６７および２６８（それぞれ親およびＭ＋１イオン）で質量アイソトポマーのモニタリング中に採取する。上記の質量アイソトポマーの相対化存在量をサンプルにおいて定量化し、非標識化標準物質と比較する（例えば、ｍ／ｚ  ２６７／［ｍ／ｚ  ２６７＋２６８］は、サンプルで０．１２００、標準物質で０．０９６０）。サンプル中に存在する、標識化分子：非標識化の分子の比率をＭＩＤＡを用いて３−メチルヒスチジンについて計算する。
【０２３６】
このような計算方法の１つにより、このサンプル中の過剰標識３−メチルヒスチジン分子の比率を、標識化サンプルからの非標識化標準物質の減算により計算する（例えば、０．０２４０すなわち２．４％）。誘導体化されたヒスチジンまたはセリンの（同位体投与プロトコルの終わりに採取される時点以降の）ピークの質量スペクトルを、ヒスチジンでは２６３および２６４（それぞれ、親およびＭ＋１イオン）の質量アイソトポマーまたはセリンでは２４６および２４７（それぞれ、親およびＭ＋１イオン）の質量アイソトポマーをモニタリング中に採取する。サンプル中の上記質量アイソトポマーの相対化存在量を定量化し、非標識化標準物質と比較する（例えば、ヒスチジンの場合、ｍ／ｚ  ２６４／（２６３＋２６４）は、サンプルでは０．４４５０および標準物質では０．０９５０）。標識化分子  対  非標識分子の割合をヒスチジンまたはセリンについて計算する（例えば、０．３５００すなわち３５％）。
【０２３７】
存在する標識された３−メチルヒスチジン分子の比率から存在する標識された遊離ヒスチジン分子または遊離セリン分子の比率と比較した、８時間の２Ｈ５ヒスチジン投与期間の間の個体における新規筋ミオシン生合成の比率を、標準の前駆体産物方程式を用いて計算する（例、０．０２４０／０．３５００＝６．８％）。
【０２３８】
上記手順を周期的に繰り返し、筋ミオシン生合成の向上を意図される個体のプログラムまたは医学的治療プログラムの効果を確立する。
【０２３９】
ヒト被験体でのこの手順の一例を表８に示す。これは、血液中の代謝誘導体を、脳内分子への標識取り込みを反映するために使用し得る場合があることを実証する。表３は、４〜８週間の２Ｈ２Ｏ取り込みの間のヒト被験体における、２Ｈの２Ｈ２Ｏから尿３−メチルヒスチジン中への取り込みを示す。このデータは、これらのヒト被験体における筋ミオシンについてのおよそ３週間の半減期を示唆する。
【０２４０】
（表３：４〜８週間の２Ｈ２Ｏ取り込みの間のヒト被験体における、２Ｈの２Ｈ２Ｏから尿３−メチルヒスチジン中への取り込み）
ＥＭ１：３−メチルヒスチジンのｔ−ブチルジメチルシリル誘導体における過剰Ｍ＋１質量アイソトポマー；２Ｈ２Ｏ（％）：体内水分濃縮；Ａ１∞：測定された２Ｈ２Ｏでの３−メチルヒスチジンの計算された最大のＥＭ１；ｆ（％）：合成割合；ｋ：３−メチルヒスチジンの置換比率定数。
【０２４１】
【表３】
2005517904.tif 000010
【０２４２】
（実施例６：代謝誘導体としてメチルデオキシシトシンを用いる全身性細胞分裂（ＤＮＡ生合成））
細胞増殖に関連する癌またはその他の障害のリスクを有するヒト個体に、体内で新たに合成されるＤＮＡ中に取り込まれる標識前駆体を投与する。２Ｈ２Ｏを経口投与する（７０％２Ｈ２Ｏを飲料水として、１４日間１日１回８０ｍｌ）。尿アリコート（＜１０ｍｌ）を１つの規定の時点で（例、１４日の２Ｈ２Ｏ投与期間の完了時）、個体から採取する。全尿ヌクレオシドをＳＰＥカラムを用いて単離し、次いでデオキシシトシンおよびメチルデオキシシトシンで濃縮された画分を水洗により溶出する。メチルデオキシシトシンを含む単離ヌクレオシドを、既知の計算方法による方法に従って、ガスクロマトグラフ／質量分析用に誘導体化する。このような１つの方法により、存在するメチルデオキシシトシンおよび他のヌクレオシドのトリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体を、ビス（トリメチル［シリル］）アセトアミドを用いて形成する。このＴＭＳメチルデオキシシトシンを、ＤＢ−１７カラムを用いて、ガスクロマトグラフ／質量分析計（例、ＨＰモデル５９７３）内に注入する。
【０２４３】
メチルデオキシシトシン・ピークの質量スペクトルを、ｍ／ｚ  ４５７〜４５９（親、Ｍ＋１イオンおよびＭ＋２イオン）で質量アイソトポマーをモニタリングしながら収集する。上記質量アイソトポマーの相対存在量をサンプルにおいて定量化し、非標識標準と比較する（例、サンプルで０．０９５０Ｍ＋１、非標識標準で０．０８２０Ｍ＋１）。サンプル中に存在する標識：非標識の分子比率をメチルデオキシシトシンについて計算する。
【０２４４】
このような１つの方法により、サンプル中の過剰標識メチルデオキシシトシン分子の比率を、標識サンプルからの非標識標準の除算により計算する（例、０．０１３０または１．３％標識メチルデオキシシトシン）。
【０２４５】
存在する標識メチルデオキシシトシン分子の比率から、１４日の２Ｈ２Ｏ標識期間の間の全身ＤＮＡの生合成を、標準の前駆体産物物方程式およびこれらの２Ｈ２Ｏ投与率での最大限のデオキシシトシン濃縮の推定または直接測定を用いて計算する（例、１５％の新規ＤＮＡ／１４日間、すなわち１日あたり約１．１％の生合成率）。
【０２４６】
上記手順を、カロリー制限、ビタミンＤ投与または細胞周期阻害薬などの体全体の細胞増殖（ＤＮＡ生合成）を低下させることを意図される介入の後に繰り返し、それによって個体の一般的癌リスクを低下させる。
【０２４７】
（実施例７：代謝誘導体として血漿中２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールを用いる脳膜脂質生合成（脳の成長および発達））
ヒト個体に体内の新規合成脂質に取り込まれる標識前駆体を投与する。２Ｈ２Ｏを規定の期間の間、経口投与する（例、７０％２Ｈ２Ｏを飲料水として、８０ｍｌを１日１回、７日間）。血液アリコートを規定の時点で個体から採取する。脳内コレステロールから独自に合成され血流中に逃れる組織コレステロールの異化産物である２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールを、血液から抽出し、ガスクロマトグラフ／質量分析測定用に誘導体化する。
【０２４８】
２Ｈ−２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールの同位体濃縮を、ＭＩＤＡにより、非標識標準と比較した、サンプルにおけるｍ／ｚ  ４５８、４５９および４６０のイオン存在量から決定する（例、サンプルで０．１０００、非標識標準で０．０９００）。サンプル中に存在する２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールの標識対非標識の分子の比率を計算する。
【０２４９】
このような１つの計算方法により、サンプル中の過剰標識２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール分子の比率を、標識サンプルからの非標識標準の除算により計算する（例、０．０１００すなわち１％）。体内水分の同位体濃縮をＭＩＤＡにより決定する（例、１．５％）。
【０２５０】
脳コレステロールの生合成比率、および従って脳ミエリン（ミエリンで２：１の比のコレステロール：セラミド）を同定するが、それは体内水分中の標識水素から前駆体−生成物の関係を新規合成コレステロール中の標識水素へ適用することによる（例、２３１日の倍加時間または半減期の、７日を超える２．１％の新規２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール、すなわち１日あたり０．３％の脳細胞膜の生合成比率）。
【０２５１】
上記手順を、脳の成長および／または発達の刺激を意図した介入（例、小児における食事介入、教育プログラムまたは他の刺激性活性、薬理療法）後に繰り返し、その介入の効果を確立する。
【０２５２】
（実施例８：代謝誘導体として血漿ガラクトシル−セレブロシドを用いる、脳ミエリンの生合成および分解の比率（髄鞘形成、脱髄および再髄鞘形成））
多発性硬化症などの既知の脱髄障害を有するまたは疑われるヒト個体に、脳ミエリン鞘内に排他的にまたはほとんど排他的に存在する脂質部分（例えば、ガラクトシル−セレブロシド）内に取り込まれる、脳ミエリン分解後に血流または脳脊髄液内に放出される標識前駆体を投与する。このような標識前駆体としては、２Ｈ２Ｏ（ミエリン鞘内のガラクトシル−セレブロシドのガラクトース部分、スフィンゴシン部分および脂肪酸部分内に取り込まれる）、２Ｈ−グルコースまたは１３Ｃ−グルコース（ガラクトシル−セレブロシドのガラクトース部分内に取り込まれる）、１３Ｃ−セリン（セレブロシドのスフィンゴシン部分内に取り込まれる）、または１３Ｃ−脂肪酸（ガラクトシル−セレブロシドの脂肪アシル部分内に取り込まれる）が挙げられる。血液または尿アリコートを個体から採取する。脂質を、例えばＦｏｌｃｈ抽出により、血液または尿サンプルから抽出する。次いで、ミエリン鞘のガラクトシル−セレブロシド−または別の特徴的な脂質構成成分を、薄膜クロマトグラフィーのような、脂質抽出物から分離する。次いで、ガラクトシル−セレブロシドを誘導体化し、その構成成分の一つをガスクロマトグラフ／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により分析できるようにする。例えば、メチル、トリアセチル−ガラクトースを生成する無水酢酸−ピリジンの前に生じるメタノール性ＨＣｌ、または、脂肪酸−メチルエステルを生成するメタノール性ＨＣｌ、スフィンゴシンの誘導体を生成するメタノール性ＨＣｌである。
【０２５３】
次いで、分析するガラクトシル−セレブロシド（例えば、誘導体化されたガラクトース、脂肪酸またはスフィンゴシン）の標識された構成成分の同位体濃縮を、適切な質量の選択イオンモニタリングにより測定する。４週間２Ｈ２Ｏを投与した個体の例において、親イオン、Ｍ＋１イオンおよびＭ＋２イオンを表すメチル−テトラセチル−ガラクトースのｍ／ｚ  ３３１、３３２および３３３として、サンプルおよび非標識標準物質のＧＣ／ＭＳ分析中の選択イオンモニタリングにより測定するように、血漿からのガラクトセレブロシドのガラクトース部分を分析する。上記質量アイソトポマーの相対存在量をサンプルにおいて定量化し、非標識標準物質と比較する（例えば、サンプルで０．１４５０Ｍ＋１、非標識標準物質で０．１３５０Ｍ＋１）。次いで、各サンプルに存在する標識分子対非標識分子の比率を計算する。この種の１つの計算方法により、サンプル中の過剰標識メチル、トリアセチル−ガラクトース分子の比率を、標識サンプルからの非標識標準物質を除算することにより計算する（例えば、上記実施例における、０．０１００すなわち１．００％標識Ｍ＋１メチル−テトラセチル−ガラクトース）。組織ガラクトシル−セレブロシド生合成プールに存在する標識ガラクトース分子の比率を、ＭＩＤＡを用いて体内２Ｈ２Ｏ濃縮に基づき計算する（例えば、体内水分２Ｈ２Ｏ濃縮が１．０％の場合、組織プールで０．１６８０Ｍ＋１、すなわち３．３％標識Ｍ＋１）。次いで、脳ミエリン鞘脂質の生合成および分解の比率を、サンプル中の標識ガラクトース分子の比率と組織ガラクトシル−セレブロシド生合成プール内の標識ガラクトース分子の比率との比較により計算する（例えば、被験体の２Ｈ２Ｏ摂取期間にわたって脳ミエリン内で新たに合成されるガラクトシル−セレブロシドは、１．００％／３．３％＝３０％）。ガラクトシル−セレブロシドの生合成および分解の比率は、脳内の髄鞘形成、脱髄および再髄鞘形成の比率を反映し、多発性硬化症またはその他の臨床的脱髄状態での疾患活性および／または治療効果の尺度として使用され得る。
【０２５４】
上記手順および計算を、再髄鞘形成の促進もしくは脱髄の減少および多発性硬化症の進行を遅延することを意図する介入後に介入効果の指標として、または疾患活性の明確な変化（例えば、一連の新症状）の後に疾患の活性もしくは進行の指標または試験として、繰り返され得る。
【０２５５】
図９に示すこの手順の一例は、ＧＣ／ＭＳ手順によるＨＡにおける同位体濃縮の測定を示す。
【０２５６】
（実施例９）
（代謝誘導体としての尿中ミエリン塩基性タンパク質様物質（ＭＢＰＬＭ）由来の脳ミエリンの生合成および分解（髄鞘形成、脱髄および再髄鞘形成））
多発性硬化症などの脱髄障害が既知であるかまたは脱髄障害が疑われるヒト個体に、体内で新たに合成されるタンパク質内に取り込まれる標識前駆体（例えば、２Ｈ２Ｏまたは１３Ｃ−ロイシンのような標識アミノ酸）を、４週間などの確定期間、投与する。血液アリコートを個体から採取する。ミエリン塩基性タンパク質様物質（ＭＢＰＬＭ）を、１つの特定の抗体を用いることにより、例えば免疫親和性カラムを用いることにより、血液から単離する。このＭＢＰＬＭを、酸性条件またはプロテアーゼ酵素を用いて遊離アミノ酸に加水分解する。遊離アミノ酸をガスクロマトグラフィー／質量分析法による分析用に誘導体化する。
【０２５７】
ＭＢＰＬＭから単離した標識アミノ酸の同位体濃縮を、サンプルおよび非標識標準物質における適切な質量（例えば、１３Ｃ１−ロイシンを被験体に投与する場合はロイシンのｎ−ブチル−エステル−アセトアミドについてｍ／ｚ  ２３１、２３２および２３３、２Ｈ２Ｏを被験体に投与する場合はＮ−アセチル−ゴチルエステル誘導体についてｍ／ｚ  １８８〜１９０）の選択イオンモニタリングにより測定する。
【０２５８】
サンプル中に存在する標識対非標識のロイシンまたはアラニン分子の比率を計算する。
【０２５９】
この種の１つの計算方法により、サンプル中の過剰標識アラニン分子の比率を、標識サンプルから非標識標準物質中のＭ＋１アラニンの相対存在量を減算することにより計算する（例えば、非標識標準物質内のＭ＋１アラニンが０．０９５０、標識サンプル内のＭ＋１アラニンが０．１０５０、よってサンプル中の標識アラニン分子の比率は０．０１００すなわち１．０％）。次いで、組織タンパク質生合成プールに存在する標識アラニンの比率を、体内水分の２Ｈ２Ｏ濃縮に基づき確立する（例えば、３．１％Ｍ＋１アラニン、すなわち、体内水分の２Ｈ２Ｏ濃縮が１．０％の場合に組織プール内に０．１２６０Ｍ＋１アラニン）。さらに、脳ＭＢＰＬＭの生合成および分解の比率を、当該分野で公知の前駆体−生成物の関係またはその他の方程式の適用により、ＭＢＰＬＭに存在する標識アラニン分子の比率と組織タンパク質生合成プールに存在する標識アラニンの比率を比較すること（例えば、４週間にわたるＭＢＰＬＭの生合成が１．０％／３．１％＝３３％）により決定する。
【０２６０】
ＭＢＰＬＭの生合成および／または分解の比率は、髄鞘形成、脱髄および再髄鞘形成の比率を反映し、そして多発性硬化症もしくはその他の臨床的脱髄状態の疾患活性および／または治療効果の基準として使用され得る。
【０２６１】
上記の手順および計算を、再髄鞘形成の促進もしくは脱髄の減少および多発性硬化症の進行を遅延することを意図する介入後に介入効果の指標として、または疾患活性の潜在的変化（例えば、原因不明の新症状）の後に疾患の活性もしくは進行の指標または試験として、繰り返され得る。
【０２６２】
（実施例１０）
（標識投与中止後のピリジノリン／デオキシピリジノリンにおける標識の希釈率から求める組織コラーゲン生合成）
次いで、ピリジノリン／デオキシピリジノリン（ＨＰ／ＤＰ）を用いる組織コラーゲン生合成のために、上述と同じ手順（実施例１または２を参照）を行う（組織コラーゲン生合成のための１３Ｃ１−ロイシンまたはその他の標識前駆体の投与の後の確定時（例えば、０時間）における、存在する標識：非標識のＨＰおよびＤＰ分子の比率の計算による）。引き続き、１つの尿アリコートまたは多数の尿アリコート（１０ｍｌ）を、０時間後の１つまたは複数の規定の時点で（例えば、１つの実施形態において２ヶ月間２週間ごとに）採取する。
【０２６３】
続けて、同じ分析手順を元の尿サンプルについて行い（実施例１または２を参照）、各時点で存在する標識：非標識のＨＰおよびＤＰの分子の比率を計算する。希釈率（すなわち、存在する標識ＤＰ／ＨＰ分子の比率の低下率）から、以下の標準同位体希釈方程式を用いて、組織コラーゲンの生合成の比率（ｋ）を計算する：
Ａｔ＝Ａ０・ｅ−ｋｔ、
（Ａｔ＝ｔ時間後のサンプル内の標識ＤＰ／ＨＰの比率）
Ａ０＝０時間後のサンプル内の標識ＤＰ／ＨＰの比率
ｔ＝時間
ｋ＝組織コラーゲン生合成のための比率定数
【０２６４】
【数４】
2005517904.tif 000011
【０２６５】
同じ手順を、骨コラーゲンまたはその他の組織コラーゲンの生合成の比率の変更を意図した治療的介入の実施後に、個体において介入効果の指標として繰り返す。
【０２６６】
本明細書中に記載する実施例および実施形態が例証のみを目的とし、本明細書中に開示される概念の種々の改変または変更が、当業者に示唆され、そしてそのような改変または変更が、本願の精神および範囲内に含まれるであろうことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】図１は、本発明の実施形態のフローチャートである。
【図２】図２は、組織分子の交代を推定するために、合成後に改変された代謝誘導体に予め非同位元素を使用することに関する、本発明の利点を概略的に要約する。破線矢印を有する閉ざされたアイテムは、以前の方法の信頼性および解釈能力を変更し得る因子を示す。
【図３】図３は、上昇からプラトーの原則を示す。図３Ａにおいて、標識（＊）がプールＡ（前駆体プール）に進入し、そしてプールＢ（生成物）は、Ａから合成された。プールＢへの置換比率定数（ｋ）は、上昇からプラトーへの曲線の形により明らかにされ、本明細書で示されるように、ｋ＝０．１ｄ−１、０．５ｄ−１および１．０ｄ−１である。プールＢに到達した標識のプラトー値は、前駆体物質のプールに由来する分画Ｂに依存する。内部合成からの５０％の送達例（左）および１００％（Ｂ）の送達例（右）が示される。
【図４】図４は、１０〜１２週間、日常的に５０〜１００ｍｌの２Ｈ２Ｏを飲む、典型的なヒト被験体の体内水分中での２Ｈ２Ｏの濃縮を示す。このデータは、生体水分の前駆体プールが、それぞれの被験体について、この週の間にわたり安定である。
【図５】図５は、２．５〜３．０％の生体水分の濃縮に対する、ベースラインの起爆的なボーラス後、４％飲料水で維持されたラットにおける生体２Ｈ２Ｏの濃縮の時間経過を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、標識した水から選択された遊離アミノ酸への、標識された水素変換の経路を示す。２つの非必須アミノ酸（アラニン、グリシン）および必須アミノ酸（ロイシン）を、一例として示す。アラニンおよびグリシンは、図６Ａにおいて示される。ロイシンは、図６Ｂにおいて示される。略語：ＴＡ、トランスアミナーゼ；ＰＥＰ−ＣＫ、ホスホエノールピルビン酸カルボキナーゼ（ｃａｒｂｏｋｉｎａｓｅ）；ＴＣＡＣ、トリカルボン酸サイクル；ＳＴＨＭ、セリンテトラヒドロ葉酸メチル転移酵素。
【図６Ｂ】図６Ｂは、標識した水から選択された遊離アミノ酸への、標識された水素変換の経路を示す。２つの非必須アミノ酸（アラニン、グリシン）および必須アミノ酸（ロイシン）を、一例として示す。アラニンおよびグリシンは、図６Ａにおいて示される。ロイシンは、図６Ｂにおいて示される。略語：ＴＡ、トランスアミナーゼ；ＰＥＰ−ＣＫ、ホスホエノールピルビン酸カルボキナーゼ；ＴＣＡＣ、トリカルボン酸サイクル；ＳＴＨＭ、セリンテトラヒドロ葉酸メチル転移酵素。
【図６Ｃ】図６Ｃは、タンパク質合成のための遊離アミノ酸のＨ２１８Ｏ標識を示す。
【図７】図７は、水素が標識されたＨ２Ｏ（＊Ｈ）の、タンパク質が結合したアミノ酸への取り込みに由来する、新規タンパク質合成の測定のための概略モデルを示す。標識された水素は、黒丸；未標識の水素は白丸によって示される。標識されたそれぞれの区画（体内水分、遊離アミノ酸、タンパク質が結合したアミノ酸）の予測される時間経過は、挿入によって示される。
【図８Ａ】図８Ａは、２Ｈ２Ｏから、飲料水として８％の２Ｈ２Ｏで維持されるマウスにおいて、脳ガラクトシルセレブロシドのガラクトース部分への２Ｈの取り込みの過程を示す。それぞれの時間点は５頭のマウスを示す。ＥＭ１は、メチルテトラアセチルガラクトースにおける、Ｍ＋１質量アイソポトーマー（ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ）の過剰な発生量である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、飲料水中の８％の２Ｈ２Ｏで維持されるマウス由来の脳  対  血液におけるガラクトシルセレブロシドのガラクトース部分への２Ｈの取り込みの比較を示す。
【図９】図９は、ヒアルロン酸（ＨＡ）のメチル誘導体、トリアセチルアセテート誘導体、Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体のガスクロマトグラフィー／質量スペクトルを示す。
【配列表】
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2005517904.tif 000019
2005517904.tif 000020
【図１】
2005517904.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005517904.tif 000025
【図６Ａ】
2005517904.tif 000026
【図６Ｂ】
2005517904.tif 000027
【図６Ｃ】
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【図７】
2005517904.tif 000029
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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