(57)【要約】本発明はリパーゼ同族ファミリーI.1又は1.2から選ばれた出発リパーゼのアミノ酸配列中で、プロトタイプリパーゼ配列配列番号１の位置17、29、30、52、86、117、122、160、163、167、265、266、286、289に相当する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を行なうことにより生成し得るリパーゼ変異体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼ同族ファミリーI.1又はI.2から選ばれた出発リパーゼのアミノ酸配列について、プロトタイプリパーゼ配列配列番号１中の位置17、29、30、52、86、117、122、160、163、167、265、266、286、289に相当する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を行なうことにより調製し得るリパーゼ変異体。
【請求項２】
出発リパーゼがリパーゼＡ〜Ｍ：
Ａ  シュードモナス  エルギノーザからのリパーゼ、
Ｂ  ビブリオ  コレラからのリパーゼ、
Ｃ  シュードモナス  フラギからのリパーゼ、
Ｄ  アシネトバクター  カルコアセチカスからのリパーゼ、
Ｅ  シュードモナス  ウィスコンシネンシスからのリパーゼ、
Ｆ  シュードモナス  フルオレッセンスからのリパーゼ、
Ｇ  シュードモナス  ブルガリスからのリパーゼ、
Ｈ  ブルクホルデリア  セパシアからのリパーゼ、
Ｉ  ブルクホルデリア  グルメからのリパーゼ、
Ｊ  ブルクホルデリア  プランタリイからのリパーゼ、
Ｋ  クロモバクテリウム  ビスコスムからのリパーゼ、
Ｌ  シュードモナス  ルテオラからのリパーゼ、
Ｍ  シュードモナス種DSM 8246からのリパーゼ
の群から選ばれたリパーゼである、請求項１記載のリパーゼ変異体。
【請求項３】
アミノ酸置換がリパーゼＡ〜Ｍの下記の位置：
Ａ  シュードモナス  エルギノーザからのリパーゼ、位置Met16における突然変異、
Ｂ  ビブリオ  コレラからのリパーゼ、位置Leu44における突然変異、
Ｃ  シュードモナス  フラギからのリパーゼ、位置Leu17における突然変異、
Ｄ  アシネトバクター  カルコアセチカスからのリパーゼ、位置Leu49における突然変異、
Ｅ  シュードモナス  ウィスコンシネンシスからのリパーゼ、位置Val37における突然変異、
Ｆ  シュードモナス  フルオレッセンスからのリパーゼ、位置Met17における突然変異、
Ｇ  シュードモナス  ブルガリスからのリパーゼ、位置Leu16における突然変異、
Ｈ  ブルクホルデリア  セパシアからのリパーゼ、位置Leu17における突然変異、
Ｉ  ブルクホルデリア  グルメからのリパーゼ、位置Leu17における突然変異、
Ｊ  ブルクホルデリア  プランタリイからのリパーゼ、位置Leu17における突然変異、
Ｋ  クロモバクテリウム  ビスコスムからのリパーゼ、位置Leu17における突然変異、
Ｌ  シュードモナス  ルテオラからのリパーゼ、位置Leu57における突然変異、
Ｍ  シュードモナス種DSM 8246からのリパーゼ、位置Leu17における突然変異、
で行なわれる、請求項２記載のリパーゼ変異体。
【請求項４】
下記のアミノ酸置換がリパーゼＡ〜Ｍについて行なわれる、請求項３記載のリパーゼ変異体。
Ａ  シュードモナス  エルギノーザからのリパーゼのMet16のAla16、Thr16又はPhe16による置換、
Ｂ  ビブリオ  コレラからのリパーゼのLeu44のAla44、Thr44又はPhe44による置換、
Ｃ  シュードモナス  フラギからのリパーゼのLeu17のAla17、Thr17又はPhe17による置換、
Ｄ  アシネトバクター  カルコアセチカスからのリパーゼのLeu49のAla49、Thr49又はPhe49による置換、
Ｅ  シュードモナス  ウィスコンシネンシスからのリパーゼのVal37のAla37、Thr37又はPhe37による置換、
Ｆ  シュードモナス  フルオレッセンスからのリパーゼのMet17のAla17、Thr17又はPhe17による置換、
Ｇ  シュードモナス  ブルガリスからのリパーゼのLeu16のAla16、Thr16又はPhe16による置換、
Ｈ  ブルクホルデリア  セパシアからのリパーゼのLeu17のAla17、Thr17又はPhe17による置換、
Ｉ  ブルクホルデリア  グルメからのリパーゼのLeu17のAla17、Thr17又はPhe17による置換、
Ｊ  ブルクホルデリア  プランタリイからのリパーゼのLeu17のAla17、Thr17又はPhe17による置換、
Ｋ  クロモバクテリウム  ビスコスムからのリパーゼのLeu17のAla17、Thr17又はPhe17による置換、
Ｌ  シュードモナス  ルテオラからのリパーゼのLeu57のAla57、Thr57又はPhe57による置換、
Ｍ  シュードモナス種DSM 8246からのリパーゼのLeu17のAla17、Thr17又はPhe17による置換。
【請求項５】
アミノ酸置換がプロトタイプリパーゼ配列配列番号１中の位置17および52に相当する２つの位置で行なわれる、請求項１記載のリパーゼ変異体。
【請求項６】
下記のアミノ酸置換の少なくとも１つがシュードモナス種DSM 8246からのリパーゼ中で行なわれる、請求項１記載のリパーゼ変異体。
Leu17のAla17、Thr17又はPhe17、Met17による置換
Tyr29のSer29、Thr29、Phe29、Glu29による置換
Trp30のHis30又はPhe30による置換
Phe52のSer52、Thr52、Tyr52又はLeu52による置換
His86のTrp86、Thr86又はSer86による置換
Ser117のAla117、Thr117又はMet117による置換
Phe122のLeu122による置換
Ala160のPhe160、Leu160又はIle160による置換
Ala163のPhe163、Leu163又はIle163による置換
Leu167のAla167、Val167、Ser167又はThr167による置換
Leu265のAla265、Val267、Met265、Ser265又はThr265による置換
Val266のAla266、Leu266、Met266、Ser266又はLys266による置換
Leu286のAla286、Met286、Val286、Ile286又はSer286による置換
Ile289のAla289、Val289又はLeu289による置換
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項記載のリパーゼ変異体をコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項７記載の核酸配列を含んでなる核酸構築物。
【請求項９】
請求項８記載の核酸構築物を使用して形質転換された宿主生物。
【請求項１０】
請求項９記載の宿主生物をリパーゼ変異体の生産を可能にする条件下で培養し、続いてそのリパーゼ変異体を培地から回収する、請求項１から６のいずれか１項記載のリパーゼ変異体の調製方法。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれか１項記載のリパーゼ変異体の少なくとも１種を含んでなるリパーゼ製剤。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれか１項記載のリパーゼ変異体を単離形態で、固体担体物質に固定して、又は細胞中で使用する、請求項１１記載のリパーゼ製剤。
【請求項１３】
基質を請求項１から６のいずれか１項記載のリパーゼ変異体の存在下で反応させることを含んでなる、基質の酵素触媒変換方法又は鏡像体選択的変換方法。
【請求項１４】
使用される基質がアルコール、アミン又はアミノ酸エステルであり、これらがアシル化剤の存在下でアシル化される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
使用される基質がカルボン酸エステルであり、これらが加水分解される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
リパーゼにより酵素触媒様式で反応し得る基質の立体異性体混合物又はラセミ体を請求項１から６のいずれか１項記載のリパーゼ変異体の存在下で鏡像体選択的に反応させ、次にその混合物を分割することを含んでなる、光学活性化合物の調製方法。
【請求項１７】
使用される基質がアルコール、アミン又はアミノ酸エステルであり、これらがアシル化剤の存在下で鏡像体選択的にアシル化される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から６のいずれか１項記載のリパーゼ変異体の触媒としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は増大した比活性を有するリパーゼ変異体、これらのリパーゼ変異体の調製方法、および化学反応における触媒としての、特に光学活性化合物の調製のためのこれらのリパーゼ変異体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学反応における天然の生体触媒の使用は多くの因子、たとえば、活性、安定性および鏡像体選択性の欠如により制限される。それ故、これらの性質に関して最適化された利用可能な新規生体触媒を有することが望ましい。
【０００３】
リパーゼの工業上重要な用途は光学活性アミン、アルコール、カルボン酸およびカルボン酸エステルの調製である。
【０００４】
EP 0 548 228は洗剤添加剤用に最適化されたリパーゼ変異体を開示している。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は改良された性質、たとえば、増大した比活性を有する利用可能な新規リパーゼ変異体をつくろうとする目的に基づいている。
【０００６】
リパーゼ同族ファミリーI.1又はI.2から選ばれた出発リパーゼのアミノ酸配列中で、酵素的に活性なプロトタイプリパーゼ配列番号１の配列中の位置17、29、30、52、86、117、122、160、163、167、265、266、286、289に相当する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を行なうことにより調製し得るリパーゼ変異体が見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
アミノ酸配列配列番号１を有するリパーゼは以下プロトタイプリパーゼ配列と称される。それはこの場合にはシュードモナス種DSM 8246株のリパーゼである。
【０００８】
このシュードモナス種DSM 8246株はまたブルクホルデリア  プランタリイ(Burkholderia plantarii)と称される。ブルクホルデリア  プランタリイ及びシュードモナス  グルメからのリパーゼは同じ配列を有する（Frenkenら, 「シュードモナス  グルメリパーゼ遺伝子のクローニング及び活性部位残基の決定（Cloning of the Pseudomonas glumae lipase gene and determination of the active site residues）」, Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, 3787-3791）。
【０００９】
リパーゼ同族ファミリーI.1およびI.2の出発リパーゼは本発明によればArpignyおよびJager著Biochem. J. 199, 343, 177により記載された同族クラス（表１）中に分類し得るリパーゼを意味すると理解される。この分類への参照をここで明らかに行う。好ましい出発リパーゼはシュードモナス  エルギノーザ、ビブリオ  コレラ、シュードモナス  フラギ、アシネトバクター  カルコアセチカス、シュードモナス  ウィスコンシネンシス、シュードモナス  フルオレッセンス、シュードモナス  ブルガリス、ブルクホルデリア  セパシア、ブルクホルデリア  グルメ、シュードモナス種DSM 8246、ブルクホルデリア  プランタリイ、クロモバクテリウム  ビスコスムおよびシュードモナス  ルテオラからのリパーゼからのリパーゼである。
【００１０】
特に好ましい出発リパーゼはシュードモナス種DSM 8246からのリパーゼであり、そのアミノ酸配列が配列番号１に示される。
【００１１】
これらの好ましいリパーゼのアミノ酸配列がNardiniら, J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, 31223頁に記載されている。
【００１２】
しかしながら、その他のリパーゼがArpignyおよびJagerの分類基準を満足する限り、それらをリパーゼ同族ファミリーI.1およびI.2の出発リパーゼとして使用することが更に可能である。
【００１３】
リパーゼおよびリパーゼ変異体は本発明によればリパーゼ、すなわち、リパーゼの酵素活性を有する酵素を意味すると理解される。一般に、このようなリパーゼ変異体は出発リパーゼの特定の遺伝子修飾により調製される。出発分子が非誘導（undirected）突然変異および選択により最適化される、“進化的方法”が、本発明のリパーゼ変異体を調製する更なる可能性である。
【００１４】
アミノ酸置換は本発明によれば出発リパーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸の別のアミノ酸、好ましくは天然アミノ酸による置換を意味すると理解される。天然アミノ酸はAla、Asp、Asn、Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpおよびTyrを意味すると理解される。
【００１５】
出発リパーゼのアミノ酸配列は一般にプロトタイプリパーゼ配列と同じ長さを有しないので、プロトタイプリパーゼ配列の位置は出発リパーゼに直接移し得ず、相当する相同位置が同定される必要がある。これらの位置を決定するために、プロトタイプリパーゼ配列との配列アライメントが、たとえば、Nardiniら, J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, 31223頁（図３）に記載されているように、行なわれる。この文献ならびに配列アライメントおよび相同位置に関して本明細書中に挙げられた更なる文献への参照をここで明らかに行う。
【００１６】
たとえば、Nardiniら, J. Biol. Chem. 2000, 275, 40, 31223頁の相同比較から推定されるように、シュードモナス  エルギノーザからのリパーゼの位置Met16はビブリオ  コレラからのリパーゼ中の位置Leu44、シュードモナス  フラギからのリパーゼ中の位置Leu17、アシネトバクター  カルコアレチカスからのリパーゼ中の位置Leu49、シュードモナス  ウィスコンシネンシスからのリパーゼ中の位置Val37、シュードモナス  フルオレッセンスからのリパーゼ中の位置Met17、シュードモナス  ブルガリスからのリパーゼ中の位置Leu16、ブルクホルデリア  セパシアからのリパーゼ中の位置Leu17、ブルクホルデリア  グルメからのリパーゼ（配列番号１と同じ）中の位置Leu17、クロモバクテリウム  ビスコスムからのリパーゼ中の位置Leu17、およびシュードモナス  ルテオラからのリパーゼ中の位置Leu57に相当する。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態は下記の群から選ばれる出発リパーゼから調製し得るリパーゼ変異体である：
Ａ  シュードモナス  エルギノーザからのリパーゼ、
Ｂ  ビブリオ  コレラからのリパーゼ、
Ｃ  シュードモナス  フラギからのリパーゼ、
Ｄ  アシネトバクター  カルコアセチカスからのリパーゼ、
Ｅ  シュードモナス  ウィスコンシネンシスからのリパーゼ、
Ｆ  シュードモナス  フルオレッセンスからのリパーゼ、
Ｇ  シュードモナス  ブルガリスからのリパーゼ、
Ｈ  ブルクホルデリア  セパシアからのリパーゼ、
Ｉ  ブルクホルデリア  グルメからのリパーゼ、
Ｊ  ブルクホルデリア  プランタリイからのリパーゼ、
Ｋ  クロモバクテリウム  ビスコスムからのリパーゼ、
Ｌ  シュードモナス  ルテオラからのリパーゼ、
Ｍ  シュードモナス種DSM 8246からのリパーゼ。
【００１８】
更に好ましい実施形態は出発リパーゼと較べて下記の位置で突然変異されるこれらのリパーゼ変異体である：
Ａ  位置Met16で突然変異された、シュードモナス  エルギノーザからのリパーゼ、
Ｂ  位置Leu44で突然変異された、ビブリオ  コレラからのリパーゼ、
Ｃ  位置Leu17で突然変異された、シュードモナス  フラギからのリパーゼ、
Ｄ  位置Leu49で突然変異された、アシネトバクター  カルコアセチカスからのリパーゼ、
Ｅ  位置Val37で突然変異された、シュードモナス  ウィスコンシネンシスからのリパーゼ、
Ｆ  位置Met17で突然変異された、シュードモナス  フルオレッセンスからのリパーゼ、
Ｇ  位置Leu16で突然変異された、シュードモナス  ブルガリスからのリパーゼ、
Ｈ  位置Leu17で突然変異された、ブルクホルデリア  セパシアからのリパーゼ、
Ｉ  位置Leu17で突然変異された、ブルクホルデリア  グルメからのリパーゼ、
Ｊ  位置Leu17で突然変異された、ブルクホルデリア  プランタリイからのリパーゼ、
Ｋ  位置Leu17で突然変異された、クロモバクテリウム  ビスコスムからのリパーゼ、
Ｌ  位置Leu57で突然変異された、シュードモナス  ルテオラからのリパーゼ、
Ｍ  位置Leu17で突然変異された、シュードモナス種DSM 8246からのリパーゼ。
【００１９】
更に好ましい実施形態は出発リパーゼと較べて下記の置換を有するこれらのリパーゼ変異体である：
Ａ  シュードモナス  エルギノーザからのリパーゼ、Met16がAla16、Thr16又はPhe16により置換される、
Ｂ  ビブリオ  コレラからのリパーゼ、Leu44がAla44、Thr44又はPhe44により置換される、
Ｃ  シュードモナス  フラギからのリパーゼ、Leu17がAla17、Thr17又はPhe17により置換される、
Ｄ  アシネトバクター  カルコアセチカスからのリパーゼ、Leu49がAla49、Thr49又はPhe49により置換される、
Ｅ  シュードモナス  ウィスコンシネンシスからのリパーゼ、Val37がAla37、Thr37又はPhe37により置換される、
Ｆ  シュードモナス  フルオレッセンスからのリパーゼ、Met17がAla17、Thr17又はPhe17により置換される、
Ｇ  シュードモナス  ブルガリスからのリパーゼ、Leu16がAla16、Thr16又はPhe16により置換される、
Ｈ  ブルクホルデリア  セパシアからのリパーゼ、Leu17がAla17、Thr17又はPhe17により置換される、
Ｉ  ブルクホルデリア  グルメからのリパーゼ、Leu17がAla17、Thr17又はPhe17により置換される、
Ｊ  ブルクホルデリア  プランタリイからのリパーゼ、Leu17がAla17、Thr17又はPhe17により置換される、
Ｋ  クロモバクテリウム  ビスコスムからのリパーゼ、Leu17がAla17、Thr17又はPhe17により置換される、
Ｌ  シュードモナス  ルテオラからのリパーゼ、Leu57がAla57、Thr57又はPhe57により置換される、
Ｍ  シュードモナス種DSM 8246からのリパーゼ、Leu17がAla17、Thr17又はPhe17により置換される。
【００２０】
更に好ましい実施形態はシュードモナス種DSM 8246からの出発リパーゼと較べて下記のアミノ酸置換の少なくとも１つを有するこれらのリパーゼ変異体である：
Ala17、Thr17又はPhe17、Met17によるLeu17の置換
Ser29、Thr29、Phe29、Glu29によるTyr29の置換
His30、Phe30によるTrp30の置換
Ser52、Thr52又はTyr52、Leu52によるPhe52の置換
Trp86、Thr86、Ser86によるHis86の置換
Ala117、Thr117、Met117によるSer117の置換
Leu122によるPhe122の置換
Phe160、Leu160、Ile160によるAla160の置換
Phe163、Leu163、Ile163によるAla163の置換
Ala167、Val167、Ser167、Thr167によるLeu167の置換
Ala265、Val267又はMet265、Ser265、Thr265によるLeu265の置換
Ala266、Leu266、Met266、Ser266、Lys266によるVal266の置換
Ala286、Met286、Val286又はIle286、Ser286によるLeu286の置換
Ala289、Val289又はLeu289によるIle289の置換。
【００２１】
特に好ましい実施形態はシュードモナス種DSM 8246からの出発リパーゼと較べて下記のアミノ酸置換の２つを有するリパーゼ変異体である：
Ala17、Thr17、Phe17、Met17によるLeu17の置換
Leu52、Ser52、Thr52又はTyr52によるPhe52の置換。
【００２２】
本発明の更なる主題は上記の本発明のリパーゼ変異体をコードする核酸配列である。好適な核酸配列は遺伝子コードによるポリペプチド配列の逆翻訳により得られる。
【００２３】
このために使用されるコドンは生物に特異的なコドン使用（codon usage）に従って頻繁に使用されるものであることが好ましい。コドン使用は関係する生物のその他の、既知の遺伝子のコンピュータ分析の助けにより容易に決められる。
【００２４】
リパーゼ変異体が、たとえば、細菌中で発現される場合、逆翻訳中に細菌のコドン使用を使用することが有利であることが多い。
【００２５】
本発明の更なる主題は本発明の核酸配列を含む核酸構築物である。これらの核酸構築物は、該核酸配列に加えて、たとえば、発現、複製又は組換えに有利である調節配列をまた有することが好ましい。
【００２６】
本発明の更なる主題はこれらの核酸構築物を使用して形質転換し得る宿主生物である。好適な宿主生物は単細胞生物又は多細胞生物であり、微生物が宿主生物として好ましい。
【００２７】
本発明の更なる主題はリパーゼ変異体をコードする核酸配列を使用して形質転換された宿主生物を、これらの宿主生物中のリパーゼ変異体の生産を可能にする条件下で培養することによるリパーゼ変異体の調製方法である。続いて、培地中のリパーゼ変異体の濃度が所望のレベルに達した時に、リパーゼ変異体を培地から単離し得る。リパーゼの所望の意図される使用に応じて、これはまた沈殿およびクロマトグラフィーの如きタンパク質化学の慣用方法を使用して精製し得る。しかしながら、意図される使用によっては、宿主生物全体を場合によっては先に破壊した後に使用することもできる。
【００２８】
更に、本発明は本発明のリパーゼ変異体の少なくとも１種を含んでなるリパーゼ製剤に関する。
【００２９】
リパーゼ変異体は単離された形態で、固体担体物質に固定化されて、又は細胞中でこの製剤中に使用し得る。このようなリパーゼ製剤は、リパーゼ変異体に加えて、また更に安定化剤、界面活性剤および酵素基質を含み得る。
【００３０】
リパーゼの固定化方法は、たとえば、WO 00/05354、EP 1069183に記載されている。
【００３１】
リパーゼ変異体は固定化形態で使用されることが好ましい。
【００３２】
更に、本発明は基質を本発明のリパーゼの存在下で反応させることによる基質の酵素触媒変換方法又は鏡像体選択的変換方法に関する。
【００３３】
それ故、本発明のリパーゼ変異体は化学反応で触媒として使用し得る。本発明のリパーゼ変異体は多くの化学反応に使用し得る。
【００３４】
本発明のリパーゼ変異体の触媒特性は基準反応を使用して測定される。従って、出発リパーゼと較べて高い良好な比活性がまた測定し得る。
【００３５】
リパーゼ変異体の比活性の測定は下記の基準反応において本発明に従って行なわれ、その場合、リパーゼ又はリパーゼ変異体はラセミ体のトランス-メトキシシクロヘキサノールとラウリン酸ビニルとのの反応を触媒してラウリン酸1R,2R-2-メトキシシクロヘキシルエステルおよび1S,2S-メトキシシクロヘキサノールを生じる。
【００３６】
比活性はこの基準反応において下記の条件下で測定される。
【００３７】
基準反応は96キャビティを有するマイクロタイタープレート中で行う。マイクロタイタープレートは、キャビティ当り
Ａ  リパーゼを発現する天然生物又は組換え生物の培養物の培養上清150μlのリパーゼ含有凍結乾燥物、又は
Ｂ  単離されたリパーゼの相当する、しっかりと予め規定された量
を含む。
【００３８】
ラセミ体の分離のために、ラセミ体のトランス-メトキシ-シクロヘキサノールおよびラウリン酸ビニルを1:0.65のモル比〔すなわち、プレート当り、メトキシシクロヘキサノール10gおよびラウリン酸ビニル11.3g〕で使用する。この混合物200μlがそれぞれのウェルにピペットで入れられる。
【００３９】
それぞれのプレートを「プレートシーラー」を使用してシールし、蓋で閉じ、96時間にわたって室温で150rpmの回転シェーカー中でインキュベートする。次にそれぞれの場合にキャビティ当り100μlを除去し、酢酸エチルで処理し、そしてガスクロマトグラフィーにより分析する。
【００４０】
生成されるメトキシシクロヘキシルラウレートの量を、使用されたリパーゼの量（場合Ｂ）又はマイクロタイタープレートのキャビティ中の細胞懸濁液の光学密度（場合Ａ）に対して測定する。
【００４１】
場合Ａでは、全ての更なる測定パラメーターおよびその他のパラメーター、たとえば、誘導性発現および構成的発現、がそれぞれのリパーゼを発現する生物で同じであることが保証されることが必要である。
【００４２】
リパーゼの量に対してこの方法に従って測定されたメトキシシクロヘキシルラウレートの量が多いことは比活性がより高いことを意味する。
【００４３】
酵素触媒変換は、リパーゼが触媒し得る基質の化学反応を意味するものと理解される。下記の反応が例として挙げられる：
アルコールのアシル化又は鏡像体選択的アシル化、
アミンのアシル化又は鏡像体選択的アシル化、
アミノエステル、たとえば、アミノ酸エステルのアシル化又は鏡像体選択的アシル化、
カルボン酸エステルの加水分解又は鏡像体選択的加水分解、
シアノヒドリンのアシル化又は鏡像体選択的アシル化、
シアノヒドリンエステルの加水分解又は鏡像体選択的加水分解、
メソ-ジオールの不斉化、或いは
加水分解によるメソ-ジエステルの不斉化。
【００４４】
好ましい方法は
アルコールのアシル化又は鏡像体選択的アシル化、
アミンのアシル化又は鏡像体選択的アシル化、
アミノエステル、たとえば、アミノ酸エステルのアシル化又は鏡像体選択的アシル化のための方法、或いは
カルボン酸エステルの加水分解又は鏡像体選択的加水分解のための方法、
である。
【００４５】
基質の酵素触媒変換方法又は鏡像体選択的変換方法は、基質を本発明のリパーゼ変異体の存在下で反応させることを含んでなる。
【００４６】
反応の型がそれを必要とするか否かに応じて、更なる試薬がここに添加されることが好ましい。従って、たとえば、アシル化はアシル化剤の添加を必要とし、一方、たとえば、加水分解は試薬の更なる添加を必要としない。
【００４７】
基質は、酵素触媒作用により反応し得る、すなわち、リパーゼにより化学的に修飾し得る化学的化合物を意味するものと理解される。鏡像体選択的変換では、立体異性体混合物（そのうちの一方の立体異性体のみが反応する）は同様に基質である。
【００４８】
例として、アルコール、アミン、アミノエステル、アミド、カルボン酸エステル、チオエステル、チオール、シアノヒドリン、シアノヒドリンエステルおよびメソ-ジオールならびにそれらの立体異性体混合物が基質として挙げられる。好ましい基質はアルコール、アミン、アミノエステルおよびカルボン酸エステル又はラセミ体のアルコール、アミン、アミノエステルならびにカルボン酸エステルである。
【００４９】
この方法は溶液中で、液体基質の場合には溶媒を用いて、又は用いないで行なわれることが好ましい。使用し得る溶媒は、たとえば、水、有機溶媒又は水／有機の２相混合物である。
【００５０】
使用される有機溶媒はジオキサン、THF、ジエチルエーテル、メチルt-ブチルエーテル(MTBE)、トルエン又はヘプタンであることが好ましい。使用される水／有機の２相混合物はあらゆる所望の比の水／MTBE混合物であることが好ましい。
【００５１】
方法を溶液中で行なう場合、基質濃度は重要ではないが、溶液を基準として0.5重量％〜50重量％であることが好ましい。20〜30重量％が特に好ましい。反応を行なう場合の温度は同様に重要ではないが、酵素の温度安定性により上限が制限される。０℃〜60℃で方法を行うことが好ましい。15℃〜40℃が特に好ましい。
【００５２】
この方法は連続的又はバッチ式で行ない得る。方法を連続的に行なうために、液体移動相を、それ自体公知の様式で、たとえば、固定化リパーゼ変異体の充填床を通って反応器に通す。移動相は基質（および試薬）の溶液であっても、又は溶媒を使用しない液体基質（および試薬）であってもよい。流速は重要ではなく、プロセス技術の観点、たとえば、充填床の高さ、直径および粒子サイズ、ならびに反応器のデザインに依存する。
【００５３】
連続方法に使用される反応器は、連続の、不均一触媒方法（液体／固体反応）に通例の反応器であることが好ましい（J. Hagen, Chemische Reaktionstechnik, VCH, Weinheim 1992, 165-169頁）。例として、流動床反応器および固定床反応器、たとえば、管状反応器、カラム反応器、チャンバー反応器、棚式反応器、管束反応器および触媒炉が挙げられる。
【００５４】
バッチ式方法の操作では、固定化リパーゼ変異体を、それ自体公知の様式で反応器中の基質（および試薬）の溶液、又は溶媒を含み、もしくは含まない液体基質（および試薬）中に懸濁し、そしてその懸濁液を充分に混合する。バッチ式の方法に使用される反応器は、バッチ式の、不均一触媒方法（液体／固体反応）に通例の振とう、混合又は撹拌装置を有する反応器であることが好ましい。例として、撹拌容器およびそれに由来するデザイン、そしてまた振とう装置を有する反応容器が挙げられる。
【００５５】
反応の完結（熱力学的平衡の到達）後に、固定化リパーゼ変異体を、たとえば、デカント、遠心分離又は濾別および洗浄により単離し、更なる反応に使用する。
【００５６】
この方法の好ましい実施形態では、アシル化可能な官能基、たとえば、ヒドロキシル基又はアミノ基を含む基質、たとえば、アルコール、アミン又はアミノ酸エステルが、触媒としての固定化リパーゼおよびアシル化剤の存在下でアシル化又は鏡像体選択的アシル化される。
【００５７】
この酵素触媒変換は有機溶媒、たとえば、ジオキサン、THF、ジエチルエーテル、メチルt-ブチルエーテル(MTBE)、トルエン又はヘプタン中で行なわれることが好ましい。
【００５８】
アシル化剤および配列番号１のリパーゼ変異体の存在下のアルコール、アミンもしくはアミノ酸エステル又はラセミ体のアルコール、アミンもしくはアミノ酸エステルのアシル化方法又は鏡像体選択的アシル化方法が特に好ましい。
【００５９】
アルコール、アミンおよびアミノ酸エステルに関して事実上制限はない。従って、
１価アルコールおよび多価アルコール、たとえば、
1-フェニルエタノール、
場合により置換されていてもよい2-クロロ-1-フェニルエタノール、
ペント-3-イン-2-オール、
1-ブチン-3-オール、
2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸エステル、
α-メチル-(1,3)-ベンゾジオキソール-5-エタノール、
2-プロパノール-1-(1,3-ベンゾジオキソール-4-イル)、
トランス-2-メトキシシクロヘキサノール、
2-メトキシ-2-フェニルエタノール、
シス-2-メチル-4-ヒドロキシピラン又は
トランス-2-メチル-4-ヒドロキシピラン
或いはそれらの立体異性体混合物、
１価アミンおよび多価アミン又はそれらの立体異性体混合物、或いは
α,β又はγ-アミノ酸エステル、たとえば、天然アミノ酸の場合によりハロゲン置換されていてもよいC1-C4-アルキルエステル、アルキルアリールエステル、アリールエステル、C2-C6-アルケニルエステルもしくはC2-C6-アルキニルエステル又はそれらの立体異性体混合物、
を使用することが可能である。
【００６０】
場合により置換されていてもよい2-クロロ-1-フェニルエタノールは特に2-クロロ-1-フェニルエタノールおよび置換2-クロロ-1-フェニルエタノールを意味すると理解される。好ましい置換2-クロロ-1-フェニルエタノールは式III
【化１】
2005506088.tif 000002
【００６１】
［式中、
ｎは１〜３であり、
Ｒは互いに独立してハロゲン、特にＦ又はCl、C1-C4-アルコキシ、特にメトキシ、およびNO2である。］
のアルコールである。
【００６２】
特に好ましい置換2-クロロ-1-フェニルエタノールは2-クロロ-1-(m-クロロフェニル)エタノールである。
【００６３】
使用されることが好ましい基質はラセミ体のトランス-2-メトキシ-シクロヘキサノールである。
【００６４】
アシル化剤は溶液中でリパーゼの存在下でアシル転移剤として機能し得る有機化合物を意味すると理解される。例として、下記の化合物が挙げられる：
場合によりハロゲン、たとえば、Cl、Br、Ｉ、Ｆにより置換されていてもよい脂肪族、芳香族脂肪族又は芳香族のカルボン酸（アシル化）、たとえば、
C1-C6-アルカンカルボン酸、たとえば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸又は
芳香族脂肪族又は芳香族のカルボン酸、たとえば、安息香酸、3-フェニルプロピオン酸又は
相当するカルボン酸エステル（エステル交換）、たとえば、
3-フェニルプロピオン酸エステルもしくはアルキルアセテート、たとえば、酢酸エチル。
【００６５】
アシル化剤として好ましいカルボン酸エステルは式Ｉ
【化２】
2005506088.tif 000003
【００６６】
［式中、
R1は水素又はC1-C4-アルキル基、好ましくはメチル基であり、
R2は水素、場合によりハロゲンにより置換されていてもよいC1-C18-アルキル、フェニル又は(C1-C3-)アルコキシ-(C1-C4)-アルキルである。］
のビニルエステルである。
【００６７】
式Ｉの好ましいビニルエステルはギ酸ビニル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニルおよびラウリン酸ビニルである。
【００６８】
アシル化剤は更に脂肪族、脂環式、芳香族脂肪族又は芳香族の無水カルボン酸および混合無水カルボン酸（アシル化）、たとえば、無水酢酸、無水コハク酸(SA)、無水酪酸、無水2-エチルヘキサン酸又は無水メチルコハク酸である。アシル化剤として無水コハク酸(SA)又はその他の難溶性の酸無水物を使用する場合、プロピレンカーボネートがSAを溶液に溶解するために混合されることが特に有利であり得る。これは連続方法に関して特に重要である。
【００６９】
特に好ましいアシル化剤はラウリン酸ビニルである。
【００７０】
この方法の更に好ましい実施形態では、カルボン酸エステルが本発明のリパーゼ変異体又はリパーゼ製剤の存在下で加水分解又は鏡像体選択的加水分解される。
【００７１】
この場合、更なる試薬が添加される必要はない。それにもかかわらず、水の存在が必要である。カルボン酸エステルの加水分解は本発明のリパーゼ変異体又はリパーゼ製剤の存在下で好ましい２相系、たとえば、水/MTBEを使用して、水の添加により行なわれることが好ましい。
【００７２】
カルボン酸エステルに関して事実上制限はない。従って、たとえば、式II
【化３】
2005506088.tif 000004
【００７３】
の化合物又はそれらの立体異性体混合物を使用することが可能である。
【００７４】
［式中、
R3、R4およびR5は互いに独立して
水素、
ハロゲン、たとえば、Ｆ、Cl、Br又はＩ、
分岐又は非分岐、場合により置換されていてもよい
C1-C8-アルキル基、たとえば、場合により置換されていてもよいメチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、1,2-ジメチルプロピル、1,1-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1-メチルペンチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、1,1-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1-エチル-2-メチルプロピル、ヘプチル又はオクチル、
C2-C6-アルケニル基、たとえば、場合により置換されていてもよい2-プロペニル、2-ブテニル、3-ブテニル、1-メチル-2-プロペニル、2-メチル-2-プロペニル、2-ペンテニル、3-ペンテニル、4-ペンテニル、1-メチル-2-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、3-メチル-2-ブテニル、1-メチル-3-ブテニル、2-メチル-3-ブテニル、3-メチル-3-ブテニル、1,1-ジメチル-2-プロペニル、1,2-ジメチル-2-プロペニル、1-エチル-2-プロペニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、4-ヘキセニル、5-ヘキセニル、1-メチル-2-ペンテニル、2-メチル-2-ペンテニル、3-メチル-2-ペンテニル、4-メチル-2-ペンテニル、3-メチル-3-ペンテニル、4-メチル-3-ペンテニル、1-メチル-4-ペンテニル、2-メチル-4-ペンテニル、3-メチル-4-ペンテニル、4-メチル-4-ペンテニル、1,1-ジメチル-2-ブテニル、1,1-ジメチル-3-ブテニル、1,2-ジメチル-2-ブテニル、1,2-ジメチル-3-ブテニル、1,3-ジメチル-2-ブテニル、1,3-ジメチル-3-ブテニル、2,2-ジメチル-3-ブテニル、2,3-ジメチル-2-ブテニル、2,3-ジメチル-3-ブテニル、1-エチル-2-ブテニル、1-エチル-3-ブテニル、2-エチル-2-ブテニル、2-エチル-3-ブテニル、1,1,2-トリメチル-2-プロペニル、1-エチル-1-メチル-2-プロペニル又は1-エチル-2-メチル-2-プロペニル、
C3-C6-アルキニル基、たとえば、場合により置換されていてもよい2-プロピニル、2-ブチニル、3-ブチニル、1-メチル-2-プロピニル、2-ペンチニル、3-ペンチニル、4-ペンチニル、1-メチル-3-ブチニル、2-メチル-3-ブチニル、1-メチル-2-ブチニル、1,1-ジメチル-2-プロピニル、1-エチル-2-プロピニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、4-ヘキシニル、5-ヘキシニル、1-メチル-2-ペンチニル、1-メチル-2-ペンチニル、1-メチル-3-ペンチニル、1-メチル-4-ペンチニル、2-メチル-3-ペンチニル、2-メチル-4-ペンチニル、3-メチル-4-ペンチニル、4-メチル-2-ペンチニル、1,1-ジメチル-2-ブチニル、1,1-ジメチル-3-ブチニル、1,2-ジメチル-3-ブチニル、2,2-ジメチル-3-ブチニル、1-エチル-2-ブチニル、1-エチル-3-ブチニル、2-エチル-3-ブチニル又は1-エチル-1-メチル-2-プロピニル、
又はC3-C8-シクロアルキル基、たとえば、場合により置換されていてもよいシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロヘプチル、シクロオクチル、
場合により置換されていてもよい
アリール基、たとえば、場合により置換されていてもよいフェニル、1-ナフチル又は2-ナフチル、
アリールアルキル基、たとえば、場合により置換されていてもよいベンジル、
ヘテロアリール基、たとえば、場合により置換されていてもよい2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-フリル、3-フリル、2-ピロリル、3-ピロリル、2-チエニル、3-チエニル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ピリミジル、6-ピリミジル、3-ピラゾリル、4-ピラゾリル、5-ピラゾリル、3-イソチアゾリル、4-イソチアゾリル、5-イソチアゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、5-イミダゾリル、3-ピリダジニル、4-ピリダジニル、5-ピリダジニル又は6-ピリダジニル、好ましくは2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-チアゾリル、4-チアゾリル又は5-チアゾリル、
又はヘテロシクロアルキル基もしくはヘテロシクロアルケニル基である。］
C1-C8-アルキル基、C2-C6-アルケニル基、C2-C6-アルキニル基、C3-C8-シクロアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、ヘテロアリール基、ヘテロシクロアルキル基又はヘテロシクロアルケニル基の可能なモノ〜トリプル置換基は、たとえば、ハロゲン、ニトロ基、アミノ基、ヒドロキシル基又はシアノ基、C1-C4-アルキル基、C1-C4-ハロアルキル基、C1-C4-アルコキシ基、C1-C4-ハロアルコキシ基、C1-C4-アルキルチオ基、ヘタリール（hetaryl）基、アリール基又は基-O-CO-C1-C4-アルキルである。
【００７５】
好ましいカルボン酸エステルは、たとえば、
1-ブチン-3-オールアセテート、
1-ブチン-3-オールブチレート、
1-フェニルエチルアセテート又は
2-アセトキシ-4-フェニル酪酸エステルである。
【００７６】
本発明のリパーゼ変異体又はリパーゼ製剤を使用する基質の鏡像体選択的酵素触媒変換方法は、立体異性体の分離、特に基質の立体異性体混合物からの鏡像体又はジアステレオマーの分離に使用し得る。特に好ましくはラセミ体の基質からの鏡像体又はジアステレオマーの分離、従ってそれぞれのラセミ体の混合物からの光学活性化合物の調製に使用される。
【００７７】
本発明のリパーゼ変異体又はリパーゼ製剤の鏡像体選択的基質特異性のために、たとえばラセミ体の基質の一方の鏡像体のみが変換される。他方の鏡像体は反応しない。得られる生成物はそれ自体知られている様式で化学的分離方法、物理的分離方法および機械的分離方法により容易に分離し得る。
【００７８】
結晶化、沈殿、２相溶媒系中の抽出、クロマトグラフィー分離方法、たとえば、HPLC、GCもしくはシリカゲルによるカラムクロマトグラフィー又は熱分離方法、たとえば、蒸留が例として挙げられる。
【００７９】
それ故、本発明は更に基質（これらはリパーゼによる酵素触媒作用により反応し得る）の立体異性体混合物又はラセミ体を本発明のリパーゼ変異体の存在下で鏡像体選択的に反応させ、次に混合物を分割することを含んでなる、光学活性化合物の調製方法に関する。
【００８０】
本発明の方法を使用して、好ましくは、リパーゼの基質としての立体異性体混合物として反応し得る光学活性化合物が調製でき、又はそれらの立体異性体混合物の少なくとも１種の立体異性体がリパーゼの基質として反応し得る。
【００８１】
アルコール、アミン又はアミノ酸エステルの鏡像体選択的アシル化方法は、ラセミ体のアルコール、アミン又はアミノ酸エステルの分離、従って光学活性アルコール、アミン又はアミノ酸エステルの調製に使用されることが好ましい。
【００８２】
カルボン酸エステルの鏡像体選択的加水分解方法は、ラセミ体のカルボン酸エステルの分離、従って光学活性カルボン酸エステルの調製に使用されることが好ましい。
【００８３】
本発明のリパーゼ変異体又はリパーゼ製剤は、不変の鏡像体選択性と一緒に増大した比活性を有するという利点を有する。
【００８４】
以下の実施例は本発明を説明する。
【００８５】
一般的な実験条件
実験の詳細な説明が行なわれない場合の全てにおいて、公知であり、たとえば、Current Protocols of Molecular Biology, 1999, John Wiley＆Sonsに記載されている分子生物学的方法を使用した。
【００８６】
使用した細菌株：
大腸菌  XL1-Blue (Stratagene)
大腸菌  XJS5037 (pRK2013) (Proc. Natl. Acad. Sci., 1979, 1648-1652)
シュードモナス種DSM 8246
使用したプラスミド：
pBluescriptIIKS (Stratagene)、
pBP1500：シュードモナス種DSM 8246からのリパーゼオペロンを含む2.6 kBp DNA断片を有するpML131 (Gene, 1990, 89:37-46)の誘導体。pBP1500は酵素的に不活性なリパーゼ(lipA-)をコードする。
【００８７】
pBP1520：シュードモナス種DSM 8246からのリパーゼオペロンを含む2.6 kBp DNA断片を有するpML131 (Gene, 1990, 89:37-46)の誘導体。pBP1520は酵素的に活性なリパーゼ(lipA)をコードする。
【００８８】
pBP2112：シュードモナス種DSM 8246からのリパーゼオペロンを含み、かつリパーゼ変異体LipA L17Aの生成のための突然変異を含む2.6 kBp DNA断片を有するpML131 (Gene, 1990, 89:37-46)の誘導体。
【実施例１】
【００８９】
増大した酵素比活性を有するリパーゼ変異体の調製
A)細菌の培養
大腸菌の組換え株を、固体LB寒天又はLB培地中で37℃のロータリーシェーカー中、200rpmで16時間培養した。培地はシュードモナス種DSM 8246の選択に必要な抗生物質を含み、この株の組換え誘導体を固体FG寒天又はFP培地中で30℃のロータリーシェーカー中、200rpmで24時間インキュベートするか、又は(NH4)2SO4 6g/l、CaCl2 0.02 g/l、MgSO4 x 7 H2I 1 g/l、KH2PO4 3.5 g/l、K2HPO4 3.5 g/l、酵母エキス 5 g/l、グルコース 5 g/l、痕跡量の塩溶液 10 ml/l中で30℃のロータリーシェーカー中、150rpmで24時間インキュベートした。培地は選択に必要な抗生物質を含んでいた。インキュベーション容器として、ペトリ皿、培養管又はマイクロタイタープレートを使用した。
【００９０】
下記の抗生物質（選択）を使用した：テトラサイクリン10μg/ml（XL1-Blue）、アンピシリン100μg/ml（pBluescriptIIKS）、ゲンタマイシン10μg/ml（大腸菌中のpBPプラスミド）、ゲンタマイシン45μg/ml（シュードモナス種DSM 8246中のpBPプラスミド）、クロラムフェニコール20μg/ml（シュードモナス種DSM 8246）、カナマイシン25μg/ml（大腸菌XJS5037 (pRK2013)又はシュードモナス種DSM 8246）。
【００９１】
B)突然変異誘発
オーバーラップ伸長PCR方法(Recombinant PCR, 1990, 177-183, Academic Press,San Diego)を使用して、シュードモナス種DSM 8246からのlipAの突然変異体L17Aを部位特異的突然変異誘発により生成した。
【００９２】
シュードモナス種DSM 8246からの染色体DNAをマトリックスDNAとして使用した。使用したプライマーは
MAT16     5’-GATCGACGTAAGCTTTAACGATGGAGAT-3’ （配列番号６）
MAT109    5’-CGGTGCCCGCGGCGCCGTGGACGAGGATCACCG-3’ （配列番号３）
MAT108    5’-CGTCCACGGCGCCGCGGGCACCGACAAGTTCGC-3’ （配列番号４）
MAT19     5’-CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3’ （配列番号５）
であった。
【００９３】
第一PCR工程では、MAT16およびMAT109を使用してlipAのサブフラグメントを生成し、MAT108およびMAT19を使用してlipAの更なるサブフラグメントを生成した。サブフラグメントをアガロースゲル中で分離し、GFXキット(Pharmacia)を使用して精製した。リパーゼ変異体L17Aをコードする断片lipA*を、MAT16およびMAT19を使用する第二PCR工程で精製断片から生成した。
【００９４】
GC-richキット(Pharmacia)を使用し、製造業者の操作に従って下記の温度プロフィールでPCRを行なった：(1)95℃−３分、(2)95℃−30秒、(3)40℃−30秒、(4)72℃−30秒、(5)95℃−30秒、(6)60℃−30秒、(7)72℃−30秒、(8)72℃−10分；５サイクルで工程(2)−(4)；次に15サイクルで工程(5)−(7)。
【００９５】
HindIIIおよびSacIを使用して断片lipA*およびベクターpBluescriptIIKSを切断し、アガロースゲル中で分離し、GFXキットを使用して精製し、つないだ。次にバッチを大腸菌に形質転換した。組換えプラスミドを精製し、突然変異を検出するために配列決定した。突然変異L17A以外は、DNA中での更なる突然変異は検出されなかった。
【００９６】
C)クローニング
HindIIIおよびSacIを使用してベクターpBP1500およびlipA*を含む組換えpBluescript誘導体を切断し、つないだ。得られた組換えプラスミドをpBP2112と命名した。pBP2112を大腸菌XL1-Blueに形質転換した。次にpBP2112をヘルパー株大腸菌XJS5037 (pRK2013)の助けにより大腸菌XL1-Blueのコンジュゲーションによりシュードモナス種DSM 8246に導入した。組換え株をシュードモナス種DSM 8246 (pBP2112)と命名した。
【００９７】
D)酵素生成および処理
シュードモナス種DSM 8246 (pBP2112)を、それぞれキャビティ当り培地250μlを含む96キャビティマイクロタイタープレート中、150rpmのロータリーシェーカーで30℃で24時間インキュベートした。対照として、シュードモナス種DSM 8246 (pBP1520)を培養した。この株はプラスミドにコードされた形態でシュードモナス種DSM 8246のlipA遺伝子を有する（比較例）。下記の培地を細菌の培養に使用した：(NH4)2SO4 6g/l、CaCl2 0.02 g/l、MgSO4 x 7 H2O 1 g/l、KH2PO4 3.5 g/l、K2HPO4 3.5 g/l、酵母エキス 5 g/l、グルコース 5 g/l、痕跡量の塩溶液 10 ml/l、カナマイシン25μg/ml、ゲンタマイシン45μg/ml。培養後、マイクロタイタープレートを遠心分離した。次に培養上清をポリプロピレンマイクロタイタープレートに移し、-80℃で16時間にわたって凍結し、次に48時間にわたって凍結乾燥した。
【００９８】
リパーゼ遺伝子の染色体コピーは培養条件下では発現されない。それ故、比較例もプラスミドにコードされた形態で天然リパーゼを有する。
【００９９】
E)分割および分析
rac-トランス-2-メトキシシクロヘキサノールの分割を凍結乾燥させた上清を含むマイクロタイタープレート中で行なった。分割のために、メトキシシクロヘキサノールおよびラウリン酸ビニルを1:0.65のモル比〔すなわち、プレート当りメトキシシクロヘキサノール10gおよびラウリン酸ビニル11.3g〕で使用した。この混合物200μlをそれぞれのキャビティにピペットで入れた。「プレートシーラー」を使用してそれぞれのプレートをシールし、カバーで閉じ、96時間にわたって室温で150rpmのロータリーシェーカー中でインキュベートした。
【０１００】
次にキャビティ当り100mlを除去し、酢酸エチルで処理し、そしてガスクロマトグラフィーにより分析した。
【０１０１】
表１は生成されたメトキシシクロヘキサニルラウレートの測定された量（重量％）を示す。
【表１】
2005506088.tif 000005
【０１０２】
天然酵素と比較して、リパーゼ変異体LipA L17Aはメトキシシクロヘキサノールの分割において8.5倍高い活性を示した。
【０１０３】
酵素比活性はこの場合には生成されたメトキシシクロヘキサニルラウレートの量〔重量％〕をOD660nmにおける細菌懸濁液の光学密度により割ったものと定義される。生成された活性酵素の量はOD660nmの光学密度の範囲約0.0〜0.7±0.2で細菌懸濁液の濁度と線形の相関関係がある。
【０１０４】
ここで比活性については下記の値が得られた。
【表２】
2005506088.tif 000006
【０１０５】
天然酵素と比較して、リパーゼ変異体LipA L17Aはメトキシシクロヘキサノールの分割において7.3倍高い酵素比活性を示した。
【国際公開パンフレット】
2005506088.tif 000007
2005506088.tif 000008
2005506088.tif 000009
2005506088.tif 000010
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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