(57)【要約】本発明は、不飽和ω−３脂肪酸を特異的に製造するための改善された方法、および３つ以上の二重結合を有する不飽和脂肪酸（特にω−３脂肪酸）の含有量が増大しているトリグリセライドの製造方法に関する。本発明は、サクラソウ科植物（Primulaceae）由来のΔ６−不飽和化酵素の発現によってΔ６二重結合を有する脂肪酸、油または脂質の含有量が増大しているトランスジェニック生物、好ましくはトランスジェニック植物またはトランスジェニック微生物の作出に関する。本発明はさらに、核酸配列を含む発現カセット、少なくとも１つの核酸配列または発現カセットを含むベクターおよび生物に関する。本発明はさらに、不飽和脂肪酸、および不飽和脂肪酸の含有量が増大しているトリグリセライド、ならびにそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Δ６−不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列であって、その核酸配列によってコードされるΔ６−不飽和化酵素がω−３脂肪酸を特異的に変換するものである、上記単離された核酸配列。
【請求項２】
ａ）配列番号１または配列番号３に示す配列を有する核酸配列、
ｂ）配列番号１または配列番号３に含まれるコード配列から縮重遺伝子暗号の結果として誘導され得る核酸配列、
ｃ）配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を用い、アミノ酸レベルで配列番号２または配列番号４と少なくとも７５％の相同性を有し、かつΔ６−不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１または配列番号３に示す核酸配列の誘導体
からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸配列。
【請求項３】
前記の配列が植物に由来する、請求項１または２に記載の単離された核酸配列。
【請求項４】
前記の配列がサクラソウ属（Muscariodides）またはユキワリソウ属（Aleuritia）に由来する配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された核酸配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸配列によりコードされるアミノ酸配列。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸を含む遺伝子構築物であって、その核酸が１つ以上の調節シグナルに機能しうる形で連結されている、上記遺伝子構築物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸または請求項６に記載の遺伝子構築物を含むベクター。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸、請求項６に記載の遺伝子構築物または請求項７に記載のベクターを含むトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項９】
微生物、ヒト以外の動物または植物である、請求項８に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項１０】
植物である、請求項８または９に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項１１】
ＰＵＦＡの製造方法であって、ω−３脂肪酸を特異的に不飽和化するΔ６−不飽和化酵素をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸、請求項６に記載の遺伝子構築物または請求項７に記載のベクターを含むトランスジェニック生物を生育させることを含み、そのΔ−６不飽和化酵素の活性によって、ω−３脂肪酸の含有量が増大しているその生物内でＰＵＦＡが形成される、上記方法。
【請求項１２】
ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸が産生される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
多価不飽和脂肪酸分子が、前記生物から油、脂質または遊離脂肪酸の形態で単離される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物が微生物、ヒト以外の動物または植物である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物がトランスジェニック植物である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記多価不飽和脂肪酸が、分子内に少なくとも３つの二重結合を有するＣ１８脂肪酸である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法により製造される油、脂質もしくは脂肪酸またはそれらの画分。
【請求項１８】
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法により製造され、かつトランスジェニック植物に由来するＰＵＦＡを含む油組成物、脂質組成物または脂肪酸組成物。
【請求項１９】
動物用食餌、食料品、化粧品または医薬品における、請求項１７に記載の油、脂質もしくは脂肪酸、または請求項１８に記載の油組成物、脂質組成物もしくは脂肪酸組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不飽和ω−３脂肪酸を特異的に製造するための改善された方法、および３つ以上の二重結合を有する不飽和脂肪酸（特にω−３脂肪酸）の含有量が増大しているトリグリセライドの製造方法に関する。本発明は、サクラソウ科植物（Primulaceae）由来のΔ６−不飽和化酵素（Δ６−デサチュラーゼ）の発現によってΔ６二重結合を有する脂肪酸、油または脂質の含有量が増大しているトランスジェニック生物、好ましくはトランスジェニック植物またはトランスジェニック微生物の作出に関する。
【０００２】
本発明はさらに、核酸配列を含む発現カセット、少なくとも１つの核酸配列または発現カセットを含むベクターおよび生物に関する。本発明はさらに、不飽和脂肪酸、および不飽和脂肪酸の含有量が増大しているトリグリセライド、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
脂肪酸およびトリグリセライドは、食品産業、動物栄養学、化粧品および薬物の分野で非常に多くの用途がある。それらは、遊離の飽和または不飽和の脂肪酸なのか、それとも飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸の含有量が増大しているトリグリセライドなのか、に応じて、非常に様々な用途に適している。したがって、例えば、多価不飽和脂肪酸は、栄養価を高めるために乳児用調製乳に添加される。種々の脂肪酸およびトリグリセライドは、主に、モルティエレラ（Mortierella）属などの微生物や、ダイズ、アブラナ、ヒマワリなどの油生産植物から得られ、通常はトリアシルグリセライドの形態で存在する。しかし、それらは、例えば魚類などの動物からも得ることができる。遊離脂肪酸は、有利には、鹸化により製造される。
【０００４】
使用目的によっては、飽和または不飽和脂肪酸を含有する油が好ましく、かくして、ヒトの栄養学では、例えば、不飽和脂肪酸、特に多価不飽和脂肪酸を含有する脂質が好ましい。この理由は、それらが血中コレステロールレベルに対して、したがって心臓疾患の可能性に対して正の作用を有するからである。それらは、種々の食品および医薬品において用いられる。
【０００５】
それらは、正の特性があることから、不飽和脂肪酸の含有量が改変されている種々の生物において油を産生させるために、脂肪酸またはトリグリセライドの合成に関与する遺伝子を利用できるようにする試みが、これまで多くなされてきた。かくして、ＷＯ９１／１３９７２およびその米国での対応特許では、Δ９−不飽和化酵素が記載されている。ＷＯ９３／１１２４５ではΔ１５−不飽和化酵素が、ＷＯ９４／１１５１６ではΔ１２−不飽和化酵素が特許請求の範囲に記載されている。他の不飽和化酵素は、例えば、ＥＰ−Ａ−０  ５５０  １６２、ＷＯ９４／１８３３７、ＷＯ９７／３０５８２、ＷＯ９７／２１３４０、ＷＯ９５／１８２２２、ＥＰ−Ａ−０  ７９４  ２５０、Stukeyら、J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149、Wadaら、Nature 347, 1990: 200-203またはHuangら、Lipids 34, 1999: 649-659に記載されている。しかし、現在まで、それらの各種不飽和化酵素は生化学的には十分に特性決定されていない。何故ならば、その酵素は膜結合タンパク質の形態では不溶性であり、特性決定には大変な困難が伴うからである（McKeonら、Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147；Wangら、Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792）。一般に、膜結合型の不飽和化酵素は、適切な生物に導入し、次に出発物質と生成物を分析することによりその酵素活性を調べることによって特性決定される。Δ６−不飽和化酵素は、ＷＯ９３／０６７１２、米国特許第５，６１４，３９３号、米国特許第５６１４３９３号、ＷＯ９６／２１０２２、ＷＯ００２１５５７およびＷＯ９９／２７１１１に記載されており、また、トランスジェニック生物における生成のための適用例は、例えばＷＯ９８４６７６３、ＷＯ９８４６７６４およびＷＯ９８４６７６５に記載されている。同時に、ＷＯ９９６４６１６またはＷＯ９８４６７７６におけるように、種々の不飽和化酵素の発現ならびに多価不飽和脂肪酸の形成についても記載され、特許請求されている。不飽和化酵素の発現効率および多価不飽和脂肪酸の形成に及ぼすそれらの作用に関して、注目できる点は、現在までに記載されている
ような単一の不飽和化酵素の発現では、低含有量のΔ６不飽和脂肪酸／脂質（例えばγ−リノレン酸およびステアリドン酸）しか達成されていないことである。さらに、通常得られるのは、ω−３脂肪酸とω−６脂肪酸との混合物である。この理由は、現在までに記載されている全てのΔ６−不飽和化酵素は、例えばリノール酸（ω−６脂肪酸）とα−リノレン酸（ω−３脂肪酸）を変換するからである。
【０００６】
したがって、不飽和脂肪酸の生合成に関与する酵素をコードし、かつ不要な副生成物を形成することなく特定の脂肪酸を工業的規模で特異的に生産できるようにする、新規でより安定な遺伝子が依然として必要とされている。生合成の遺伝子を選定する上で、２つの特徴は、何よりも特に重要である。一方では、できるだけ高い含有量の多価不飽和脂肪酸の改善された製造方法が依然として必要とされている。一方、用いられる酵素は、特定の基質に対して高度に特異的でなければならない。何故ならば、不要な副生成物はできるだけ生成されてはならないからである。そうした副生成物は、食品／食餌の摂取により、ヒトまたは動物に対して、負の作用、またはこれまでに明らかになっていない生理学的作用を及ぼす可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、多価不飽和脂肪酸を合成するための不飽和化酵素の別の遺伝子を油料種子の種子に導入し、そうして不要な副生成物が生成されないようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、この目的が、Δ６−不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードする本発明に係る単離された核酸配列であって、その核酸配列によりコードされるΔ６−不飽和化酵素がω−３脂肪酸を特異的に変換する上記単離された核酸配列により達成されることを見出した。この目的は、特に、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される本発明に係る単離された核酸配列（該核酸配列はΔ６−不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードし、その核酸配列によりコードされるΔ６−不飽和化酵素はω−３脂肪酸を特異的に変換するものである）をクローニングすることにより達成された。
【０００９】
ａ）配列番号１または配列番号３に示す配列を有する核酸配列、
ｂ）配列番号１または配列番号３に含まれるコード配列から縮重遺伝子暗号の結果として誘導され得る核酸配列、
ｃ）配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を用い、アミノ酸レベルで配列番号２または配列番号４と少なくとも７５％の相同性を有し、かつΔ６−不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１または配列番号３に示す核酸配列の誘導体。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
Δ６−不飽和化酵素活性を有するポリペプチドをコードし、かつ植物（有利には、サクラソウ属（Muscariodides）またはユキワリソウ属（Aleuritia）などのサクラソウ科植物）に由来する本発明に係る核酸配列はω−３脂肪酸の変換に特異的であり、したがって、好ましくは、これが異種系で発現され、α−リノレン酸およびリノール酸の二つの脂肪酸がその生物において利用可能であると、例えばα−リノレン酸を変換してリノール酸は変換しない。このことは、例えばステアリドン酸、エイコサペンタエン酸またはドコサヘキサンエン酸が植物や微生物などの宿主生物内で産生され、この際にアラキドン酸は形成されないことを意味する。こうして、ω−３脂肪酸ファミリーの脂肪酸が有利に合成され、一方、ω−６脂肪酸は（もし存在するとしても）ごく僅かしか形成されない。本発明に係るΔ６−不飽和化酵素は、ω−３脂肪酸に対する活性が、ω−６脂肪酸と比較して少なくとも１．５倍、有利には少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、特に好ましくは少なくとも４倍、最も特に好ましくは少なくとも５倍高い。この特異性によって、不要な脂肪酸の形成が抑制できるかまたは完全に防止できる。
【００１１】
本発明に係る配列の誘導体とは、例えば、上記の同じ特異的酵素活性を示す、配列番号１または配列番号３によりコードされるポリペプチドまたは酵素の機能的相同体を意味する。この特異的酵素活性により、有利にも、脂肪酸分子内に３つ以上の二重結合を有する不飽和脂肪酸が合成されるようになる。不飽和脂肪酸とは、二重結合を有する二価不飽和化または多価不飽和化脂肪酸を意味する。それらの二重結合は、共役結合であってもよいし、共役結合でなくてもよい。上記の配列は、Δ６−不飽和化酵素活性を示す酵素をコードする。
【００１２】
本発明に係る酵素、すなわちΔ６−不飽和化酵素は、有利にも、グリセロ脂質の脂肪酸残基のＣ６〜Ｃ７の位置にｃｉｓ二重結合を導入する（配列番号１および配列番号３を参照）。この酵素はさらに、有利にもグリセロ脂質の脂肪酸残基のＣ６〜Ｃ７の位置にｃｉｓ二重結合だけを導入するΔ６−不飽和化酵素活性を有する。この活性は、配列番号１〜３で特定される配列を有する酵素（単官能性Δ６−不飽和化酵素）も有する。
【００１３】
本発明に係る核酸配列（本願では、単数形は複数形を包含し、また複数形は単数形を包含する）またはその断片は、有利にも、相同性スクリーニングによる他のゲノム配列の単離に使用できる。
【００１４】
上記の誘導体は、例えば、他の生物、真核生物（例えば植物、特にコケ、渦鞭毛虫、真菌）から単離できる。
【００１５】
対立遺伝子変異体としては、特に、配列番号１または配列番号３に示す配列のヌクレオチドの欠失、挿入または置換により得ることができる機能的変異体が含まれ、誘導される合成タンパク質の酵素活性は保持されている。
【００１６】
配列番号１および配列番号３に記載されているＤＮＡ配列またはそれらの配列の一部から出発して、上記のＤＮＡ配列は、例えば通常のハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法を用いて、例えば上記で特定したような他の真核生物から単離しうる。これらのＤＮＡ配列は、標準的な条件下で上記の配列とハイブリダイズできる。ハイブリダイゼーションの場合、変換される領域の短鎖オリゴヌクレオチド、例えば当業者に公知のようにして他の不飽和化酵素遺伝子との比較により決定できるものを用いることが有利である。ヒスチジンボックス配列を用いることが有利である。しかし、本発明に係る核酸のより長い断片または完全な配列もまた、ハイブリダイゼーションに使用可能である。用いる核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片または完全配列）に応じて、またハイブリダイゼーションにどのタイプの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いるのかに応じて、これらの標準的な条件は決まってくる。したがって、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの濃度よりも約１０℃低い。
【００１７】
標準的な条件とは、例えば、目的の核酸に応じて、０．１〜５×ＳＳＣの濃度（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の水性緩衝溶液中で、またはさらに５０％のホルムアミドの存在下で４２℃〜５８℃の温度、例えば、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中で４２℃を意味する。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣおよび約２０℃〜４５℃、好ましくは約３０℃〜４５℃の温度とすることが有利である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合、ハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣおよび約３０℃〜５５℃、好ましくは約４５℃〜５５℃の温度とすることが有利である。これらの特定のハイブリダイゼーション温度は、例えば長さが約１００ヌクレオチドであり、かつホルムアミドの不在下でのＧ＋Ｃ含量が５０％の核酸について算出した融解温度の値である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、例えばSambrookら, “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989などの関連する遺伝子関係の教科書に記載されており、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの性質またはＧ＋Ｃ含量の関数として、当業者に公知の方程式により算出することができる。当業者であれば、ハイブリダイゼーションについてのさらなる情報を次の教科書から得ることができる：Ausubelら（編）, 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York；HamesおよびHiggins（編）, 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford；Brown（編）, 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。
【００１８】
さらに、誘導体とは、配列番号１および３の配列の相同体、例えば真核性相同体、末端切断型配列、コードおよび非コードＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡ、またはコードおよび非コードＤＮＡ配列のＲＮＡを意味する。
【００１９】
さらに、配列番号１および配列番号３の配列の相同体とは、例えば、プロモーター変異体のような誘導体を意味する。これらの変異体は、プロモーターの機能または効率に悪影響を及ぼすことなく、１個以上のヌクレオチドを変化させて（例えば挿入および／または欠失により）改変することが可能である。さらに、プロモーターは、配列を改変することによりその効率を増大させてもよいし、または、外来生物の効率の高いプロモーターで完全に置き換えてもよい。
【００２０】
また、誘導体とは、有利には、そのヌクレオチド配列が開始コドンの−１〜−２０００だけ前にある領域で改変されて、遺伝子の発現および／またはタンパク質の発現が変化を受けた（好ましくは増大する）変異体を意味する。さらに、誘導体とは、３’末端で修飾されている変異体も意味する。
【００２１】
また、誘導体とは、本発明に係るタンパク質のタンパク質生合成を抑制するのに使用されるアンチセンスＤＮＡも意味する。これらのアンチセンスＤＮＡは、酵素活性を全く示さない誘導体などの本発明に係る非機能性誘導体に含められる。当業者に公知である他の非機能性誘導体の作製方法は、共抑制（コサプレッション）として知られている方法、リボザイムおよびイントロンの使用、ならびにＲＮＡｉ法である。リボザイムは、それらに対して相補的な一本鎖核酸（例えばｍＲＮＡ）を切断できるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。この方法では、これらのリボザイム（HaselhoffおよびGerlach, Nature, 334, 1988: 585-591）を用いて、ｍＲＮＡ転写産物は触媒作用によって切断することができ、かくして、このｍＲＮＡの翻訳は抑制される。このタイプのリボザイムは、それらの目的に合うように特別に調製することができる（米国特許第４，９８７，０７１号；米国特許第５，１１６，７４２号およびBartelら, Science 261, 1993: 1411-1418）。このようにして、アンチセンスＤＮＡにより、飽和脂肪酸の含有量が増大している脂肪酸、脂質または油を製造することができる。
【００２２】
Δ６−不飽和化酵素をコードする本発明に係る核酸配列は、合成により作製してもよいし、天然から得てもよく、あるいは、合成ＤＮＡ成分と天然ＤＮＡ成分との混合物を含んでいてもよいし、さらには、異なる生物に由来する各種の異種Δ６−不飽和化酵素遺伝子断片から構成されるであってもよい。一般に、合成ヌクレオチド配列は、対応する宿主生物（例えば植物）にとって好ましいコドンを用いて作製される。これにより、通常は、異種遺伝子の最適な発現が起こる。植物にとって好ましいコドンは、目的とする植物種の多くにおいて発現される、最も高いタンパク質頻度を有するコドンから確定できる。コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）についての一例は、Wadaら (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118に提供されている。そのような実験は、標準的な方法を用いて実施でき、当業者には公知である。
【００２３】
Δ６−不飽和化酵素遺伝子をコードする機能的に等価な配列は、ヌクレオチド配列が異なってはいるが、それでも目的とする機能（すなわち、酵素活性およびタンパク質の特異的選択性）を保持している、本発明に係る配列の誘導体である。したがって、機能的に等価なものとしては、本明細書に記載されている配列の天然に存在する変異体、ならびに人為的な変異体（例えば、化学合成により得られた、植物のコドン用法に適合させてある人工ヌクレオチド配列）が含まれる。
【００２４】
さらに、人工ＤＮＡ配列は、上記で記載したように、目的とする特性、例えば作物植物におけるΔ６−不飽和化酵素遺伝子の過剰発現によって、生物（例えば植物）における脂肪酸、油または脂質中のΔ６二重結合の含有量の増大を媒介するならば、適切であるとする。そのような人工ＤＮＡ配列は、例えば分子設計により構築されるタンパク質の逆翻訳により、あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選別により決定することによって、Δ６−不飽和化酵素活性を示すことができる。ＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで進化させてＤＮＡ配列を改変または改良させるために可能な技法は、Patten, P.A.ら, Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733(1997)またはMoore, J.C.ら, Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997)に記載されている。特に適するものは、宿主植物に特異的なコドン用法にしたがうポリペプチド配列の逆翻訳により得られるコードＤＮＡ配列である。植物の遺伝学の方法に精通している当業者であれば、形質転換しようとする植物の他の公知の遺伝子のコンピューター解析により特異的なコドン用法を容易に決定しうる。
【００２５】
例示することができる他の好適な等価な核酸配列は、融合タンパク質をコードする配列であり、その融合タンパク質の１つの成分が、Δ６−不飽和化酵素のポリペプチドまたはその機能的に等価な部分である。融合タンパク質の第２の部分は、例えば、酵素活性を有する別のポリペプチド、またはΔ６−不飽和化酵素の発現を判定することが可能な抗原性ポリペプチド配列（例えばｍｙｃタグまたはｈｉｓタグ）とすることができる。しかし、これは好ましくは、調節タンパク質配列であり、例えばΔ６−不飽和化酵素タンパク質を目的とする作用点に誘導する小胞体（＝ＥＲ）の単一配列、または本発明に係る核酸配列の発現に影響を及ぼす調節配列（例えばプロモーターまたはターミネーター）が挙げられる。
【００２６】
有利には、本発明に係る方法におけるΔ６−不飽和化酵素遺伝子は、脂肪酸生合成のための他の遺伝子と組み合わせることができる。そのような遺伝子の例は、アセチルトランスフェラーゼや、他の不飽和化酵素または伸長酵素、例えばΔ４−、Δ５−、Δ６−もしくはΔ８−不飽和化酵素、またはω−３および／もしくはω−６特異的不飽和化酵素［例えばΔ１２（Ｃ１８脂肪酸の場合）、Δ１５（Ｃ１８脂肪酸の場合）もしくはΔ１９（Ｃ２２脂肪酸の場合）］、またはΔ５−もしくはΔ６−伸長酵素（エロンガーゼ）などである。ｉｎ  ｖｉｖｏ合成および特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成の場合、例えば還元等価物を取込みまたは放出することができるＮＡＤＨチトクロームＢ５レダクターゼとの組合せが有利である。
【００２７】
本発明に係るアミノ酸配列とは、配列番号２および配列番号４の配列に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそれらの配列から１つ以上のアミノ酸残基の置換、転換、挿入または欠失により得ることができる配列を含むタンパク質を意味し、配列番号２および４に示すタンパク質の酵素活性は保持されているか、実質的に低下していない（すなわち、それらは同じ酵素活性を依然として有している）。「実質的に低下していない」または「同じ酵素活性」とは、上記のサクラソウ科生物の野生型から得られる元の酵素の酵素活性の少なくとも１０％、好ましくは２０％、特に好ましくは３０％を示す全ての酵素を意味する。この実施において、例えば、特定のアミノ酸は、同様の物理化学的特性（空間充填、塩基性、疎水性など）を有する他のアミノ酸と置き換えることができる。例えば、アルギニン残基はリシン残基と交換され、バリン残基はイソロイシン残基と交換され、またはアスパラギン酸残基はグルタミン酸残基と交換される。しかし、１つ以上のアミノ酸を配列内で交換したり、付加したり、除去することも可能であるし、これらの単位の複数を１つの別のものと組み合わせることも可能である。
【００２８】
また、誘導体とは、特に、Δ６−不飽和化酵素をコードする最初に単離された配列の天然または人為的な突然変異を含み、目的とする機能を依然として示す（すなわち、その酵素活性および基質選択性が実質的に低下していない）、機能的に等価なものを意味する。突然変異としては、１つ以上のヌクレオチド基の置換、付加、欠失、交換または挿入が含まれる。したがって、例えば、本発明はまた、Δ６−不飽和化酵素のヌクレオチド配列の改変により得られるヌクレオチド配列も包含する。そのような改変の目的は、例えば、含まれるコード配列をさらに結合すること、または、例えばさらなる制限酵素境界部分を挿入することである。
【００２９】
機能的な等価物はまた、その機能が、元の遺伝子または遺伝子断片と比較して減衰している（＝実質的に低下していない）または増強されている（＝酵素活性が元の酵素の活性よりも高い、すなわち、活性が１００％を上回る、好ましくは１１０％を上回る、特に好ましくは１３０％を上回る）変異体も含む。
【００３０】
同時に、上記の核酸配列は、例えば、有利にはＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列とすることができる。本発明に係る発現カセットに挿入するための好適なコード配列としては、例えば、上記で記載され、かつΔ６位に二重結合を有する脂肪酸、油または脂質を過剰産生する能力を宿主に付与する配列を有する、Δ６−不飽和化酵素をコードする配列が挙げられ、これは、同時に、少なくとも４つの二重結合を有するω−３脂肪酸を生成させる場合に有利である。これらの配列は、同種または異種の起源のものとすることができる。
【００３１】
本発明に係る発現カセット（＝核酸構築物もしくは断片または遺伝子構築物）とは、有利には遺伝子発現を増大させるために宿主細胞内でのコード配列の発現を調節する１つ以上の調節シグナルと機能しうる形で連結された遺伝子コードおよび／またはその機能的もしくは非機能的誘導体から得られる、配列番号１および配列番号３に特定した配列を意味する。これらの調節配列は、遺伝子の選択的発現およびタンパク質の発現を可能にするものでなければならない。宿主生物によっては、これは、例えば、遺伝子が誘導後にのみ発現および／または過剰発現されること、あるいはそれが直ちに発現および／または過剰発現されることを意味する。これらの調節配列の例は、インデューサーまたはレプレッサーが結合していて、そうして核酸の発現を調節する配列である。これらの新規な調節配列に加えて、またはこれらの配列の代わりに、真の構造遺伝子の前に存在するこれらの配列の天然の調節を存在させておくことができ、場合によっては、自然の調節がオフに切り替わって遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されている。しかし、遺伝子構築物は、もっと単純に構成することもできる。すなわち、核酸配列またはその誘導体の前に追加の調節シグナルは何も挿入されておらず、それを調節する天然のプロモーターが除去されていないものとすることができる。この代わりに、別の調節が確実に起こらず、かつ／または、遺伝子発現が高まるように、天然の調節配列を突然変異させた。これらの部分配列の形態の改変プロモーター（＝本発明に係る核酸配列の一部を含むプロモーター）もまた、天然の遺伝子の前に配置して活性を増大させることも可能である。さらに、遺伝子構築物は、有利には、プロモーターと機能しうる形で連結されている、核酸配列の発現を増大させる１つ以上のいわゆるエンハンサー配列を含むことができる。ＤＮＡ配列の３’末端において、さらに別の調節エレメントまたはターミネーターなどの、さらに別の有利な配列を挿入することも可能である。Δ６−不飽和化酵素遺伝子は、発現カセット（＝遺伝子構築物）内で１コピー以上で存在することができる。
【００３２】
上述したように、調節配列または因子は、好ましくは正の影響を及ぼして、導入した遺伝子の遺伝子発現を増大させることができる。したがって、有利には転写レベルでの調節エレメントの増強は、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの強力な転写シグナルを用いて行うことができる。しかし、さらに、例えばｍＲＮＡの安定性を向上させることによって、翻訳を増強することも可能である。
【００３３】
発現カセット内の好適なプロモーターは、基本的には、原虫（例えば繊毛虫）、藻類（例えば緑藻、褐藻、紅藻もしくは青藻）、細菌（例えばグラム陽性細菌もしくはグラム陰性細菌）、酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属もしくはシゾカッサロミセス（Schizosaccharomyces）属）または真菌（例えばモルティエレラ（Mortierella）属、トラウストチトリウム（Traustochytrium）属もしくはシゾチトリウム（Schizochytrium）属）のような微生物などの生物内で、有利には植物内または真菌内での外来遺伝子の発現を調節可能な全てのプロモーターである。特に、植物プロモーターまたは植物ウイルスに由来するプロモーターを使用することが好ましい。本発明に係る方法に有利な調節配列は、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲ、またはλ−ＰＬプロモーターなどのプロモーターであり、これらはグラム陰性細菌において有利に用いられる。他の有利な調節配列は、例えば、グラム陽性プロモーターであるａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母もしくは真菌のプロモーターであるＡＤＣ１、ＭＦα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ、または植物プロモーターであるＣａＭＶ／３５Ｓ［Franckら, Cell 21(1980) 285-294］、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ（＝ノパリンシンターゼプロモーター）、またはユビキチンプロモーターである。また、発現カセットは、生物内での外因性Δ６−不飽和化酵素遺伝子の発現を有利にも植物内で特定の時点に調節することができる化学的に誘導可能なプロモーターを含むことも可能である。このタイプの有利な植物プロモーターは、例えば、ＰＲＰ１プロモーター［Wardら, Plant.Mol. Biol.22(1993), 361-366］、ベンゼンスルホンアミドにより誘導可能なプロモーター（ＥＰ３８８１８６）、テトラサイクリンにより誘導可能なプロモーター（Gatzら, (1992) Plant J. 2,397-404）、サリチル酸により誘導可能なプロモーター（ＷＯ９５／１９
４４３）、アブシシン酸により誘導可能なプロモーター（ＥＰ３３５５２８）、およびエタノールもしくはシクロヘキサノンにより誘導可能なプロモーター（ＷＯ９３／２１３３４）である。有利に使用できる植物プロモーターの他の例は、馬鈴薯由来の細胞質ＦＢＰａｓｅのプロモーター、馬鈴薯由来のＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Stockhausら, EMBO J. 8 (1989) 2445-245）、ダイズ由来のホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼのプロモーター（ジーンバンク（gene bank）アクセッション番号Ｕ８７９９９も参照のこと）、またはＥＰ２４９６７６に記載されているようなノジエン特異的プロモーターである。特に有利なのものは、例えば内胚乳または発達中の胚などの脂肪酸生合成またはその前段階が起こる組織または植物の部分／器官における発現を確実にする植物プロモーターである。特に注目すべきは、種子特異的発現を確実にする有利なプロモーター、例えばＵＳＰプロモーターもしくはその誘導体、ＬＥＢ４プロモーター、ファセオリンプロモーター、またはナピンプロモーターである。本発明にしたがって引用される特に有利なＵＳＰプロモーターまたはその誘導体は、種子の発達において極初期の遺伝子発現を媒介する（Baeumleinら, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67）。単子葉植物または双子葉植物に適し得る他の有利な種子特異的プロモーターは、同様に例えばアブラナ由来のナピン（napin）遺伝子プロモーター（米国特許第５，６０８，１５２号）、シロイヌナズナ（アラビドプシス）（Arabidopsis）由来のオレオシンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、インゲン豆（ファセオラス・ブルガリス）（Phaseolus vulgaris）由来のファセオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号）、ブラッシカ（Brassica）由来のＢｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）もしくはマメ科のＢ４プロモーター（ＬｅＢ４，Baeumleinら, Plant J., 2, 2, 1992: 233-239）などの双子葉植物に適するプロモーター、あるいは、オオムギのｌｐｔ２もしくはｌｐｔ１遺伝子のプロモーター（ＷＯ９５／１５３８９およびＷＯ９５／２３２３０）、またはＷＯ９９／１６８９０に記載されているオオムギホルデイン遺伝子、イネグルテイン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、ホワイト（white）グルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、モロコシカシリン遺伝子もしくはライムギセカリン遺伝子のプロモーターなどの単子葉植物に適するプロモーター（これらは全てＷＯ９９／１６８９０に記載されている）である。
【００３４】
さらに、特に好ましいプロモーターは、例えば脂肪酸、油および脂質の生合成またはその前段階が起こる組織または植物の部分での発現を確実にするプロモーターである。特に注目すべきは、種子特異的発現を確実にするプロモーターである。注目すべきものは、アブラナ由来のナピン遺伝子のプロモーター（米国特許第５，６０８，１５２号）、ソラマメ（Vicia faba）由来のＵＳＰプロモーター（ＵＳＰ＝未知の種子タンパク質、Baeumleinら, Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67）、シロイヌナズナ由来のオレオシン遺伝子のプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、ファセオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号）またはレグミン（legumin）Ｂ４遺伝子のプロモーター（ＬｅＢ４；Baeumleinら, 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9）である。挙げられる他のプロモーターは、オオムギ由来のｌｐｔ２遺伝子またはｌｐｔ１遺伝子のプロモーター（ＷＯ９５／１５３８９およびＷＯ９５／２３２３０）であり、これらは単子葉植物における種子特異的発現を媒介する。
【００３５】
上述したように、発現構築物（＝遺伝子構築物、核酸構築物）は、生物に導入すべきさらに他の遺伝子を含むことが可能である。これらの遺伝子は、Δ６−不飽和化酵素遺伝子とは別の調節に供されてもよいし、Δ６−不飽和化酵素遺伝子と同一の調節領域に供されてもよい。これらの遺伝子は、例えば、合成を増大させる他の生合成遺伝子、有利には脂肪酸生合成遺伝子である。例示することができる例は、Δ１５−、Δ１２−、Δ９−、Δ６−、Δ５−、Δ４−不飽和化酵素、β−ケトアシルレダクターゼ、β−ケトアシルシンターゼ、伸長酵素、または種々のヒドロキシラーゼおよびアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの遺伝子である。この不飽和化酵素遺伝子は、有利には、核酸構築物内で用いられる。
【００３６】
基本的に、調節配列を有する全ての天然のプロモーターが使用可能であり、例えば、本発明に係る発現カセットおよび本発明に係る方法に関して上記で例示したものが挙げられる。これ以外に、合成プロモーターもまた有利に使用可能である。
【００３７】
発現カセットの調製では、正しい方向に有効に読み取り、かつ正しい読み枠を備えているヌクレオチド配列を得るように、種々のＤＮＡ断片を操作することができる。ＤＮＡ断片（＝本発明に係る核酸）を連結するために、アダプターまたはリンカーをそれらの断片に付加することができる。
【００３８】
プロモーター領域およびターミネーター領域は、この配列を挿入するための１つ以上の制限部位を含むリンカーまたはポリリンカーを用いて、転写方向に有効に提供できる。一般に、リンカーは、１〜１０、通常は１〜８、好ましくは２〜６の制限部位を有する。一般に、調節領域内でのリンカーの大きさは、１００ｂｐ未満、通常は６０ｂｐ未満であるが、少なくとも５ｂｐである。プロモーターは、生来のものであっても、または宿主生物（例えば宿主植物）と同種のものであってもよいし、外来または宿主生物と異種であってもよい。発現カセットは、５’−３’の転写方向で、プロモーター、Δ６−不飽和化酵素遺伝子をコードするＤＮＡ配列、および転写終結のための領域を含む。異なる終結領域は、どのように互いに交換されてもよい。
【００３９】
さらに、適切な制限境界部分を提供する操作、または過剰なＤＮＡもしくは制限境界部分を取り除く操作を用いることが可能である。転位および塩基転換などの挿入、欠失または置換を考慮に入れる場合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー修復、制限または連結を用いることができる。平滑末端の突出部の制限、チューイングバック（chewing back）または充填などの適切な操作では、連結のために断片の相補的末端を提供することができる。
【００４０】
有利な高発現のためには、特に特定のＥＲ保持シグナルであるＳＥＫＤＥＬを結合させることが重要な場合がある（Schouten, A.ら, Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792）。このようにして、平均発現レベルは３倍、さらには４倍になる。ＥＲ内に位置する植物タンパク質および動物タンパク質に天然に存在する他の保持シグナルもまた、このカセットの構築に使用可能である。
【００４１】
好ましいポリアデニル化シグナルは、植物ポリアデニル化シグナルであり、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（根頭癌腫病菌）由来のＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナルに実質的に対応するものであり、特にはＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（Gielenら, EMBO J.3 (1984), 835以下）のＴ−ＤＮＡの第３遺伝子（オクトピンシンターゼ）または対応する機能的等価物である。
【００４２】
発現カセットは、例えばT. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)ならびにT.J. Silhavy, M.L. BermanおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)、ならびにAusubel, F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)に記載されているような一般的な組換え法およびクローニング法により、適切なプロモーターと適切なΔ６−不飽和化酵素ＤＮＡ配列とをポリアデニル化シグナルとともに融合させることにより作製される。
【００４３】
発現カセットの調製では、正しい方向に有効に読み取り、かつ正しい読み枠を備えているヌクレオチド配列を得るように種々のＤＮＡ断片を操作することができる。ＤＮＡ断片を連結するために、アダプターまたはリンカーをそれらの断片に付加することができる。
【００４４】
プロモーター領域およびターミネーター領域は、この配列を挿入するための１つ以上の制限部位を含むリンカーまたはポリリンカーと共に、転写方向に有効に提供できる。一般に、リンカーは、１〜１０、通常は１〜８、好ましくは２〜６の制限部位を有する。一般に、調節領域内でのリンカーの大きさは、１００ｂｐ未満、通常は６０ｂｐ未満であるが、少なくとも５ｂｐである。プロモーターは、生来のものであってもよいし、または同種であってもよいし、外来または宿主生物と異種であってもよい。発現カセットは、５’−３’の転写方向で、プロモーター、Δ６−不飽和化酵素遺伝子をコードするＤＮＡ配列、および転写終結のための領域を含む。異なる終結領域は、どのように互いに交換されてもよい。
【００４５】
発現カセットの調製では、正しい方向に有効に読み取り、かつ正しい読み枠を備えているヌクレオチド配列を得るように、種々のＤＮＡ断片を操作することができる。ＤＮＡ断片同士を連結するために、アダプターまたはリンカーをそれらの断片に付加することができる。
【００４６】
ムスカリオディデス・ヴィアリー（Muscariodides vialii）およびアレウリティア・ファリノーサ（Aleuritia farinose）に由来する２種のΔ６−不飽和化酵素をコードするＤＮＡ配列は、脂肪酸、脂質または油の生合成の部位の正しい局在化を達成するのに必要な配列特性を全て含んでいる。したがって、さらに別のターゲッティング配列は、それ自体必要ない。しかし、そうした局在化は望ましく有利であり、したがって、人為的に改変または増強されていてもよく、そのような融合構築物もまた本発明の好ましく有利な実施形態である。
【００４７】
特に好ましい配列は、色素体内でのターゲッティングを確実にする配列である。特定の環境下では、例えば液胞、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、ペルオキシソーム、脂質構造物、またはサイトゾル（元の部位で対応する機能的配列が保持されていない場合）などの、他の細胞小器官へのターゲティング（Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423に報告されている）がまた望ましい場合もある。
【００４８】
有利には、本発明に係る核酸配列または遺伝子構築物は、少なくとも１つのレポーター遺伝子と共に発現カセットにクローニングされ、それをベクターにより生物に導入するか、ゲノムへ直接導入する。このレポーター遺伝子は、増殖アッセイ、蛍光アッセイ、化学アッセイ、生物発光アッセイもしくは耐性アッセイにより、または、測光により容易に検出できるようにするものでなければならない。例示することができるレポーター遺伝子の例は、抗生物質耐性遺伝子もしくは除草剤耐性遺伝子、ヒドロラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、生物発光遺伝子、糖もしくはヌクレオチドの代謝遺伝子もしくは生合成遺伝子（例えばＵｒａ３遺伝子、Ｉｌｖ２遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ｇｆｐ遺伝子、２−デスオキシグルコース−６−ホスフェートホスファターゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、またはＢＡＳＴＡ（＝グルホシネート耐性）遺伝子である。これらの遺伝子は、転写活性、ひいては遺伝子の発現の容易な測定および定量を発現可能にする。このようにして、異なる産生性を示すゲノムの位置を同定することができる。
【００４９】
１つの好ましい実施形態において、発現カセットは、コード配列の上流（すなわち５’末端側）にプロモーターと、そして下流（すなわち３’末端側）にポリアデニル化シグナルと、場合によりΔ６−不飽和化酵素の介在コード配列および／またはΔ６−不飽和化酵素ＤＮＡ配列と機能しうる形で連結された他の調節エレメントとを含む。機能しうる形での連結とは、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および場合により他の調節エレメントが、その調節エレメントの各々が常法によるコード配列の発現においてその機能を実現できるように、順次並べられていることを意味する。機能しうる形での連結に好ましい配列は、色素体内での細胞内局在化を確実にするためのターゲッティング配列である。しかし、ミトコンドリア、小胞体（＝ＥＲ）、核、油封入体（oil corpuscles）または他の小器官における細胞内局在化を確実にするためのターゲッティング配列は、タバコモザイクウイルスの５’リード配列（Gallieら, Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711）などの転写プロモーターと共に使用可能である。
【００５０】
発現カセットは、例えば、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーター（好ましくはＵＳＰまたはナピンプロモーター）、発現させようとする遺伝子、およびＥＲ保持シグナルを含むことができる。ＥＲ保持シグナルでは、ＫＤＥＬアミノ酸配列（リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン）またはＫＫＸアミノ酸配列（リシン−リシン−Ｘ−停止、式中、Ｘはあらゆる他の公知のアミノ酸を意味する）が好ましく用いられる。
【００５１】
原核または真核宿主生物、例えば真菌などの微生物または植物などにおいて発現させる場合、発現カセットは、有利には、例えばプラスミド、ファージ、または宿主生物における遺伝子の最適な発現を可能にする他のＤＮＡなどのベクターに挿入される。好適なプラスミドの例は：大腸菌（E. coli）ではｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲシリーズ（例えばｐＢＲ３２２）、ｐＵＣシリーズ（例えばｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９）、Ｍ１１３ｍｐシリーズ、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１またはｐＢｄＣＩ；ストレプトミセス（Streptomyces）では、ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２またはｐＩＪ３６１；バチルス（Bacillus）では、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム（Corynebacterium）では、ｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７；真菌では、ｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２またはｐＢＢ１１６であり、他の有利な真菌ベクターはRomanos, M.A.ら, [(1992) “Foreign gene expression in yeast: a review”, Yeast 8: 423-488]およびvan den Hondel, C.A.M.J.J.ら [(1991) “Heterologous gene expression in filamentous fungiおよびMore Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., pp.396-428: Academic Press: San Diego]、ならびに“Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi” [van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F.ら編, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge]に記載されている。有利な酵母プロモーターの例は、２∝Ｍ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３またはｐＥＭＢＬＹｅ２３である。藻類および植物プロモーターの例は、ｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４、ｐＶＫＨまたはｐＤＨ５１である（Schmidt, R.およびWillmitzer, L., 1988を参照）。上記で特定したベクターまたは上記で特定したベクターの誘導体は、可能性のあるプラスミドのほんの一部である。さらに別のプラスミドは、当業者には周知であり、例えば書籍Cloning Vectors（Pouwels P.H.ら（編）, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN-0-444-904018）に見ることができる。好適な植物ベクターは、特に、“Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press), 6/7章, pp. 71-119に記載されている。有利なベクターは、大腸菌またはアグロバクテリウアにおいて複製するシャトルベクターまたはバイナリーベクターとして知られているものである。
【００５２】
ベクターとは、プラスミドを除き、当業者に公知である他のベクターの全てを意味し、例えば、ファージ、ウイルス（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス、アデノウイルス）、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、線状もしくは環状ＤＮＡが挙げられる。これらのベクターは、宿主生物内で自律的に複製するか、または染色体で複製することができ、染色体複製が好ましい。
【００５３】
ベクターのもう１つの実施形態において、本発明に係る発現カセットはまた、有利には、線状ＤＮＡの形態で生物に導入し、例えば異種もしくは相同組換えにより宿主生物のゲノムに組み込むことができる。この線状ＤＮＡは、線状化したプラスミドからなるものであるか、あるいは、本発明に係るベクターとしての発現カセットまたは核酸配列だけからなるものとすることができる。
【００５４】
もう１つの有利な実施形態において、本発明に係る核酸配列は、それだけで生物に導入することも可能である。
【００５５】
本発明に係る核酸配列に加えて、さらに別の遺伝子を生物に導入しようとする場合、それら全てがレポーター遺伝子と共に１つのベクターに入っているもの、またはそれぞれの単一の遺伝子をそれぞれレポーター遺伝子と共にベクターに入っているものを、それぞれ生物に導入することが可能であり、そうすることにより、異なるベクターを同時または逐次に導入することができる。
【００５６】
ベクターは、有利には、少なくとも１コピーの本発明に係る核酸配列および／または本発明に係る発現カセット（＝遺伝子構築物）を含む。
【００５７】
例えば、植物発現カセットは、ｐＲＴ形質転換ベクター（(a) Toepferら, 1993, Methods Enzymol., 217: 66-78；(b) Toepferら 1987, Nucl. Acids. Res. 15: 5890 ff.）に組み入れることができる。
【００５８】
あるいはまた、組換えベクター（発現ベクター）を、例えばＴ７プロモーターおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することも可能である。
【００５９】
原核生物において用いられる発現ベクターは、融合タンパク質または融合オリゴペプチドを含むかまたは含んでいない誘導性の系を用いる場合が多く、この場合、これらの融合体は、Ｎ末端およびＣ末端の双方において、またはタンパク質の他の有用なドメインにおいて生じ得る。そのような融合ベクターには、一般に次の目的がある：ｉ）ＲＮＡの発現率を増大させること；ｉｉ）達成可能なタンパク質合成速度を増大させること；ｉｉｉ）タンパク質の溶解性を増大させること；またはｉｖ．）アフィニティクロマトグラフィーに使用可能な結合配列を用いて精製を簡易にすること。また、融合タンパク質の一部の切断および精製を可能にするタンパク質分解酵素切断点が融合タンパク質により導入されることも多い。そのようなタンパク質分解酵素の認識配列は公知であり、例えばＸａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【００６０】
典型的な有利な融合および発現ベクターは、ｐＧＥＸ［Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B.およびJohnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40］、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, MA）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, NJ）であり、これは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質またはプロテインＡを含んでいる。
【００６１】
他の大腸菌発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ［Amannら, (1988) Gene 69:301-315］およびｐＥＴベクター［Studierら, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, The Netherlands］である。
【００６２】
酵母において使用するための他の有利なベクターは、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari,ら, (1987) Embo J. 6:229-234）、ｐＭＦａ（KurjanおよびHerskowitz, (1982) Cell 30:933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら, (1987) Gene 54:113-123）およびｐＹＥＳ誘導体（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）である。糸状菌において使用するためのベクターは、van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi”, Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy,ら編集, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridgeに記載されている。
【００６３】
あるいはまた、例えばＳｆ９細胞で発現させるためには、昆虫細胞発現ベクターもまた有利に用いることができる。これらとしては、例えば、ｐＡｃシリーズ（Smithら (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39）のベクターが挙げられる。
【００６４】
さらに、植物細胞または藻細胞は、遺伝子発現に有利に用いることができる。植物発現ベクターの例は、Becker, D.,ら (1992) “New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197またはBevan, M.W. (1984) “Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721に見ることができる。
【００６５】
さらに、本発明に係る核酸配列は、哺乳動物細胞、有利にはヒト以外の哺乳動物細胞において発現させることができる。対応する発現ベクターの例は、Seed, B. (1987) Nature 329:840 or Kaufmanら (1987) EMBO J. 6: 187-195で述べられているpCDM8およびpMT2PCである。同時に、使用に好ましいプロモーターは、ウイルス起源のものであり、例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスまたはシミアンウイルス４０のプロモーターである。他の原核性および真核性の発現系は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual.第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の16章および17章に述べられている。
【００６６】
本発明に係る核酸、発現カセットもしくはベクターの生物（例えば植物）への導入は、基本的に、当業者に公知である全ての方法により行うことができる。この核酸配列の導入により、組換えまたはトランスジェニック生物が得られる。
【００６７】
微生物の場合、当業者であれば、Sambrook, J.ら (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、F.M. Ausubelら (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons、D.M. Gloverら, DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9)、Kaiserら (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press、またはGuthrieら Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Pressの教科書に載っている方法を理解することができる。
【００６８】
植物のゲノムへの外来遺伝子の導入は、形質転換と呼ばれる。このため、植物の形質転換および植物組織もしくは植物細胞からの再生について記載されている方法が、一過性または安定な形質転換に用いられる。好適な方法は、ポリエチレングリコール誘導ＤＮＡ取込み、遺伝子銃を用いる「バイオリスティック（biolistic）」法（粒子ボンバードメント法と呼ばれる）、エレクトロポレーション、ＤＮＡ溶液中での乾燥胚子のインキュベーション、マイクロインジェクションおよびアグロバクテリウム媒介遺伝子導入による、プロトプラストの形質転換である。上記の方法は、例えば、B. Jenesら, Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, 第1巻, Engineering and Utilization, S.D. KungおよびR. Wu編, Academic Press (1993) 128-143およびPotrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225に記載されている。発現させようとする構築物は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを形質転換するのに適したベクター、例えばpBin19（Bevanら, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711）にクローニングされる。そのようなベクターで形質転換されたアグロバクテリウムは、次いで、公知の方法で植物（特にタバコ植物などの作物植物）の形質転換に用いることができ、これは、例えば叩き潰した葉または刻んだ葉をアグロバクテリウム溶液に浸漬し、次にそれらを適切な培地で培養することにより行われる。アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる植物の形質転換は、例えば、HofgenおよびWillmitzerによりNucl. Acid Res. (1988) 16, 9877に記載されているか、または特にF.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, 第１巻, Engineering and Utilization, S.D. KungおよびR. Wu編, Academic Press, 1993, pp. 15-38から公知である。
【００６９】
本発明に係る発現ベクターで形質転換したアグロバクテリウムは、同様に、公知の方法で、植物、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis）などの試験植物や、穀物作物、トウモロコシ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コムギ、ダイズ、イネ、綿、テンサイ、カノーラ、ヒマワリ、アマ、麻、馬鈴薯、タバコ、トマト、ニンジン、カボチャ、アブラナ、タピオカ、キャッサバ、クズウコン、マンジュギク、アルファルファ、レタスなどの作物植物、ならびに種々の木、堅実およびブドウの品種または作物植物、特にダイズ、落花生、ヒマシ油用植物、ヒマワリ、トウモロコシ、綿、アマ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ（カルタムス・チンクトリウス）（Carthamus tinctorius）またはカカオ豆などの油含有作物植物の形質転換に用いることができ、これは、例えば叩き潰した葉または刻んだ葉をアグロバクテリウウム溶液に浸漬し、次にそれらを適切な培地で培養することにより行われる。ＰＵＦＡ（例えばステアリドン酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸）の精製には、ルリヂサまたはサクラソウ科植物が有利に適する。
【００７０】
遺伝子改変した植物細胞は、当業者に公知である全ての方法により再生させることができる。適切な方法は、S.D. KungおよびR. Wu、Potrykus、またはHofgenおよびWillmitzerによる上記で引用した刊行物に見ることができる。
【００７１】
したがって、本発明のさらにもう１つの態様は、本発明に係る少なくとも１つの核酸配列、発現カセットまたはベクターで形質転換されたトランスジェニック生物、ならびに細胞、細胞培養物、組織、部分（例えば、植物生物の場合には葉、根など）またはそうした生物から誘導される再生可能な物質に関する。「宿主生物」、「宿主細胞」、「組換え（宿主）生物」および「トランスジェニック（宿主）細胞」という用語は、本明細書中では交換可能に用いられる。もちろん、これらの用語は、特定の宿主生物もしくは特定の標的細胞だけでなく、これらの生物もしくは細胞の子孫もしくは可能性のある子孫に関する。突然変異または環境の影響により、後続の世代で特定の改変が起こる可能性があるので、これらの子孫は、必ずしも親細胞と同一であるとは限らないが、それでも、本明細書中で用いられるような上記の用語に包含される。
【００７２】
本発明の目的のために、「トランスジェニック」または「組換え」とは、例えば、本発明に係る核酸配列、発現カセット（＝遺伝子構築物）もしくは該核酸配列を含むベクター、または、本発明に係る核酸配列、発現カセットもしくはベクターで形質転換された生物に関しての意味を持つものであり、それらの構築物は全て、遺伝子工学的方法により作製されるか（ここで、
ａ）本発明に係る核酸配列、または
ｂ）本発明に係る核酸に機能しうる形で連結された遺伝子調節配列（例えばプロモーター）、または
ｃ）（ａ）と（ｂ）
はいずれも、天然の遺伝子環境には見られない）、あるいは遺伝子工学的方法で改変されている（ここで、改変は、例えば１つ以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位または挿入とすることができる）。天然の遺伝子環境とは、起源となる生物内の天然のゲノムまたは染色体の遺伝子座であるか、またはゲノムライブラリーに存在することを意味する。ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の天然の遺伝子環境は、好ましくは少なくとも部分的に保持されている。この環境は、核酸配列を少なくとも片側で境界を付け、少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも５００ｂｐ、特に好ましくは少なくとも１，０００ｂｐ、最も特に好ましくは少なくとも５，０００ｂｐの配列長を有する。天然に存在する発現カセット、例えば本発明に係る核酸配列の天然プロモーターと対応するＰＳＥ遺伝子との天然に存在する組合せは、後者が自然でない合成的（人為的）な方法（例えば突然変異誘発）により改変されると、トランスジェニック発現カセットに変わる。適切な方法は、例えば、米国特許第５，５６５，３５０号またはＷＯ００／１５８１５に記載されている。
【００７３】
本発明に係る核酸、発現カセットまたはベクターについて好適な生物または宿主生物は、基本的には、脂肪酸（特に不飽和脂肪酸）を合成することが可能であるか、または組換え遺伝子の発現に適する全ての生物とすることが有利である。挙げることができる例は、植物、例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis）や、カレンデュラ（Calendula）のようなキク科植物（Asteraceae）、またはダイズ、落花生、ヒマシ油用植物、ヒマワリ、トウモロコシ、綿、アマ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ（カルタムス・チンクトリウス）（Carthamus tinctorius）またはカカオ豆のような作物植物など；微生物、例えばモルティエレラ（Mortierella）属、サプロレグニア（Saprolegnia）属もしくはピシウム（Pythium）属などの真菌、エシェリキア（Escherichia）属などの細菌、サッカロミセス（Saccharomyces）属などの酵母、藍藻類、繊毛虫類、藻類、または渦鞭毛虫（例えば海産渦鞭毛藻）などの原生動物などである。好ましい生物は、天然で油を比較的多量に合成できる生物、例えば、モルティエラ・アルピナ（Mortierella alpina）、ピシウム・インシディオサム（Pythium insidiosum）のような真菌、またはダイズ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ、アマ、ヒマシ油用植物、カレンデュラ、落花生、カカオ豆またはヒマワリのような植物、またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母であり、特に好ましいのは、ダイズ、アマ、アブラナ、ヒマワリ、カレンデュラ、モルティエラまたはサッカロミセス・セレビシエである。基本的に、上記で特定したトランスジェニック生物に加えて、トランスジェニック動物、有利にはＣ．エレガンスなどのヒト以外の動物が適する。
【００７４】
さらに有用な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に特定されている。
【００７５】
使用可能な発現株、例えばプロテアーゼ活性が比較的低い発現株は、Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128に記載されている。
【００７６】
本発明のもう１つの目的は、Δ６−不飽和化酵素遺伝子をコードするＤＮＡ配列またはそれとハイブリダイズするＤＮＡ配列を含む発現カセットの、植物細胞、組織または植物の一部を形質転換するための使用に関する。この使用目的は、Δ６位での二重結合の含有量が増大している脂肪酸、油または脂質の含有量を増大させることである。
【００７７】
そうすることにより、プロモーターの選定に応じて、Δ６−不飽和化酵素遺伝子を植物の葉、種子、根瘤、根、幹または他の部分で特異的に発現させることができる。Δ６二重結合を有する脂肪酸、油または脂質を過剰産生するトランスジェニック植物、それらの再生可能な物質、ならびに植物細胞、組織またはそれらの部分は、本発明のもう１つの目的である。本発明に係る１つの好ましい目的は、本発明に係る機能的もしくは非機能的な（＝アンチセンスＤＮＡまたは酵素活性が不活性な酵素の）核酸配列または機能的もしくは非機能的な発現カセットを含むトランスジェニック植物を含む。
【００７８】
さらに、Δ６−不飽和化酵素遺伝子配列を含む本発明に係る発現カセットまたは核酸配列は、Δ６二重結合を有する脂肪酸、油または脂質の含有量が増大しているという目的を達成している上記で特定したような生物、例えば細菌、藍藻、酵母、糸状菌、繊毛虫および藻の形質転換にも使用可能である。
【００７９】
本発明の範囲において、Δ６二重結合を有する脂肪酸、油または脂質の含有量の増大とは、例えば、少なくとも植物１世代にわたり、遺伝子改変されていない元の植物と比較した場合の、本発明に係る生物内、有利には本発明に係るトランスジェニック植物内でのΔ６−不飽和化酵素遺伝子の機能的過剰発現による生合成性能の増大という人為的に獲得した形質を意味する。
【００８０】
例えば脂肪酸、油または脂質の生合成の好ましい部位は、一般に、Δ６−不飽和化酵素遺伝子の種子特異的発現が適当であるような種子または種子の細胞層である。しかし、明らかに、脂肪酸、油または脂質の生合成は、種子組織に限定する必要はなく、例えば表皮細胞や根瘤などの全ての植物の他の部分においても組織特異的に起こり得る。
【００８１】
さらに、外来Δ６−不飽和化酵素遺伝子の構成的発現が有利である。しかし、一方では、誘導的発現が望ましいと思われる場合もある。
【００８２】
Δ６−不飽和化酵素遺伝子の発現効率は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分裂組織の増殖によって測定することができる。さらに、性質、レベル、ならびに脂肪酸、油または脂質の生合成性能に対するその作用を改変したΔ６−不飽和化酵素遺伝子の発現は、温室試験において試験植物について試験することが可能である。
【００８３】
本発明のもう１つの目的は、本発明に係るΔ６−不飽和化酵素遺伝子配列またはそれとハイブリダイズするＤＮＡ配列を含む発現カセットで形質転換されたトランスジェニック植物などのトランスジェニック生物、ならびにそのような植物のトランスジェニック細胞、組織、部分および再生可能な物質を含む。この場合に特に好ましいものは、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、綿、テンサイ、アブラナおよびカノーラ、ヒマワリ、アマ、麻、アザミ、馬鈴薯、タバコ、トマト、アブラナ、タピオカ、キャッサバ、クズウコン、アルファルファ、レタスならびに種々の木、堅実およびブドウの品種などのトランスジェニック作物植物である。
【００８４】
本発明の目的のために、その植物は単子葉植物および双子葉植物、コケまたは藻である。
【００８５】
本発明によるもう１つの改善点は、本発明に係る機能的もしくは非機能的な核酸配列または機能的もしくは非機能的な発現カセットを含む、上述したようなトランスジェニック植物である。「非機能的」とは、酵素活性が活性なタンパク質が合成されないことを意味する。さらに、非機能的な核酸または核酸構築物とは、酵素活性が低下しているか酵素活性を全く示さないトランスジェニック植物を生じるアンチセンスＤＮＡとして知られているものを意味する。アンチセンス法を用いると、特に核酸配列がアンチセンスＤＮＡ内で他の脂肪酸合成遺伝子と結合した場合に、飽和脂肪酸または飽和脂肪酸の含有量が増大しているトリグリセライドを合成することが可能である。さらに、共発現として知られている方法またはＲＮＡｉ法により、トランスジェニック植物は、その植物において酵素活性が失われるか低下するように操作することが可能になる。トランスンジェニック植物とは、固体培地上もしくは液体培養物中にある単一の植物細胞およびその培養物、植物の部分、ならびに植物全体を意味する。
【００８６】
本発明の他の目的は、次のとおりである：
−植物の形質転換方法であって、サクラソウ科植物に由来するΔ６−不飽和化酵素遺伝子配列またはそれにハイブリダイズするＤＮＡ配列を含む本発明に係る発現カセットを、植物細胞、カルス組織、植物全体または植物のプロトプラストに導入することを含む上記方法
−ＰＵＦＡの製造方法であって、ω−３脂肪酸を特異的に不飽和化するΔ６−不飽和化酵素をコードする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸、請求項６に記載の遺伝子構築物または請求項７に記載のベクターを含むトランスジェニック生物を生育させることを含み、そのΔ−６不飽和化酵素の活性によって、ω−３脂肪酸の含有量が増大している生物内でＰＵＦＡが形成される、上記方法。この方法では、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸などのω−３脂肪酸が有利に製造される
−植物においてΔ６−不飽和化酵素ＤＮＡ配列が発現されるためにΔ６二重結合を有する脂肪酸、油または脂質の含有量が増大している植物を作製するための、Δ６−不飽和化酵素ＤＮＡ配列またはそれとハイブリダイズするＤＮＡ配列の使用
−植物においてΔ６−不飽和化酵素ＤＮＡ配列が発現されるためにΔ６二重結合を有する脂肪酸、油または脂質、特にω−３脂肪酸の含有量が増大している植物を作製するための、Δ６−不飽和化酵素ＤＮＡ配列またはそれとハイブリダイズするＤＮＡ配列の使用。
【００８７】
−配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質
−不飽和脂肪酸を製造するための、配列番号２または４の配列を有する上記タンパク質の使用。
【００８８】
本発明によるもう１つの目的は、不飽和脂肪酸の製造方法であって、少なくとも１つの本発明に係る上記核酸配列または少なくとも１つの本発明に係る核酸構築物を、好ましくは油生産植物に導入し；その生物を生育させ；その生物に含まれる油を単離し；その油中に存在する脂肪酸を遊離させることを含む、上記方法である。これらの不飽和脂肪酸は、有利にも、例えば塩基性の加水分解（例えばＮａＯＨまたはＫＯＨを用いるもの）により、油または脂質から遊離させることができる。
【００８９】
また、不飽和脂肪酸の含有量が増大しているトリグリセライドの製造方法であって、少なくとも１つの本発明に係る上記核酸配列または少なくとも１つの本発明に係る発現カセットを油生産生物に導入し；その生物を生育させ；その生物に含まれる油を単離することを含む、上記方法も、本発明の目的に含まれる。
【００９０】
本発明のもう１つの目的は、飽和もしくは不飽和、または飽和および不飽和脂肪酸を含有するトリグリセライドを、配列番号２または４の配列によりコードされる少なくとも１つのタンパク質と共にインキュベートすることによる、不飽和脂肪酸の含有量が増大しているトリグリセライドの製造方法である。この方法は、有利には、還元等価物を取込みまたは放出することができる化合物の存在下で行われる。次に、この脂肪酸は、トリグリセライドから遊離させることができる。
【００９１】
飽和もしくは不飽和脂肪酸、または飽和および不飽和脂肪酸の含有量が増大している、有利には不飽和脂肪酸の含有量が増大しているトリグリセライドの製造方法の、本発明に係るもう１つの目的は、脂肪酸を、当業者に公知の塩基性加水分解またはリパーゼなどの酵素によりトリグリセライドから遊離させる方法である。
【００９２】
上記で特定した方法は、有利にも、Δ６二重結合を含む脂肪酸の含有量が増大している脂肪酸またはトリグリセライドの合成を可能にする。
【００９３】
上記で特定した方法は、有利にも、Δ６二重結合を含む脂肪酸の含有量が増大している脂肪酸またはトリグリセライドの合成を可能にし、そこにおいて、Δ６−不飽和化酵素の反応に用いる基質は、好ましくはα−リノレン酸である。このようにして、上記で特定した方法は、有利にも、特にステアリドン酸（Ｃ１８：４Δ６，９，１２，１５）から誘導される脂肪酸、例えばエイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸などの合成を可能にする。
【００９４】
いわゆるアンチセンス法を用いることによっても、１つの方法において、飽和脂肪酸の含有量が増大している脂肪酸またはトリグリセライドを製造することができる。
【００９５】
挙げることができる上記の方法のための生物の例は、シロイヌナズナ、サクラソウ科植物、ルリヂサ、オオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、綿、テンサイ、アブラナおよびカノーラ、ヒマワリ、アマ、麻、馬鈴薯、タバコ、トマト、セイヨウアブラナ（rape）、タピオカ、キャッサバ、クズウコン、アルファルファ、落花生、ヒマシ油用植物、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ（Carthamus tinctorius）またはカカオ豆のような植物；モルティエレラ（Mortierella）属、サプロレグニア（Saprolegnia）属もしくはピシウム（Pythium）属などの真菌；エシェリキア（Escherichia）属やシアノバクテリア（Cyanobacteria）属などの細菌；サッカロミセス（Saccharomyces）属などの酵母などの微生物；藻類；または渦鞭毛虫（例えば海産渦鞭毛藻）などの原生動物である。好ましいものは、天然で油を比較的多量に合成できる生物、例えば、モルティエラ・アルピナ（Mortierella alpina）、ピシウム・インシディオサム（Pythium insidiosum）のような真菌、またはダイズ、アブラナ、ココナッツ、アブラヤシ、ベニバナ、ヒマシ油用植物、カレンデュラ、落花生、カカオ豆またはヒマワリのような植物、またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母であり、特に好ましいのは、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、アマ、サクサソウ科植物、ルリヂサ、ベニバナ（Carthamus）またはサッカロミセス・セレビシエである。
【００９６】
宿主生物に応じて、上記方法で用いられる生物は、当業者に公知の方法で生育または培養される。微生物は通常、炭素源（通常は糖の形態）、窒素源（通常は酵母エキスもしくは硫酸アンモニウムなどの塩などの有機窒素源の形態）、微量元素（例えば鉄、マンガンまたはマグネシウム塩）、そして場合によりビタミン類を含有する液体培地で、１０℃〜６０℃の温度で、気体酸素に暴露しながら増殖させる。そうすることにより、栄養液体のｐＨを一定の値に維持することができる。すなわち、増殖させている間、それは制御されているか、制御されていない。増殖は、バッチ式、半バッチ式、または連続式で行うことができる。栄養素は培養（発酵）の開始時に加えてもよいし、または半連続的もしくは連続的に供給してもよい。
【００９７】
形質転換後、まず、植物を上記のようにして再生させ、次に常法により培養または栽培する。
【００９８】
生育させた後、常法により脂質を生物から単離する。この目的のために、採取後、生物は、まず第一には分解（digest）してもよいし、あるいはそのまま使用してもよい。脂質は、有利には、例えばヘキサン、エタノール、イソプロパノールなどの非極性溶剤、またはヘキサン／イソプロパノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールなどの混合物のような適切な溶剤を用いて、０℃〜８０℃、好ましくは２０℃〜５０℃の温度で抽出される。バイオマスは一般に、過剰な溶剤（例えばバイオマスに対する溶剤が１：４という過剰）を用いて抽出される。次に、溶剤を例えば蒸留により除去する。また、抽出は、超臨界ＣＯ２を用いて行うこともできる。抽出後、残留しているバイマスは、例えば濾過により取り出すことができる。
【００９９】
このようにして単離された粗製油は、次に、例えばアセトンまたはクロロホルムなどの極性溶剤での処理、次いでに濾過または遠心分離することによって濁り（cloudiness）を除去することによって、さらに精製できる。また、カラムによるさらなる精製も可能である。
【０１００】
トリグリセライドから遊離の酸を得るために、後者を常法により鹸化する。
【０１０１】
本発明のもう１つの目的は、上記で特定した方法により製造される不飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の含有量が増大しているトリグリセライド、ならびに食品、動物用食餌、化粧品または医薬品を製造するためのそれらの使用を含む。この目的のために、後者は、食品、動物用食餌、化粧品または医薬品に慣用の量で添加する。
【０１０２】
上記で特定した方法により製造される、上記の本発明に係る不飽和脂肪酸ならびに不飽和脂肪酸の含有量が増大しているトリグリセライドは、種々の宿主生物における本発明に係る核酸の発現によって得られるものである。これにより、全体的にみて、不飽和脂肪酸を含む宿主細胞内での化合物の組成が、上記核酸を含んでいない元の出発宿主細胞の場合と比較して改変される。これらの改変は、天然の状態で上記核酸によりコードされるタンパク質または酵素を含んでいる宿主生物よりも、天然の状態では上記核酸によりコードされるタンパク質も酵素も含んでいない宿主生物（例えば植物細胞）においてより顕著である。これにより、ＰＵＦＡの含有量がより高い油、脂質、リン脂質、スフィンゴリピド、グリコリピド、トリアシルグリセロールおよび／または遊離脂肪酸を含む宿主生物が得られる。本発明の目的のために、含有量の増大とは、宿主生物が、本発明に係る核酸を含んでいない元の生物と比較して、少なくとも５％、有利には少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、特に好ましくは少なくとも３０％、最も特に好ましくは少なくとも４０％多い多価不飽和脂肪酸を含んでいることを意味する。これは、天然の状態ではＤＨＡ、ＥＰＡまたはＡＲＡなどの長鎖多価不飽和Ｃ２０またはＣ２２脂肪酸を含んでいない植物の場合に特に適合する。この核酸の発現のために、上記の手段により新規な脂質組成物が得られ、これらは本発明のもう１つの態様である。
【０１０３】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：一般的なクローニング方法
制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、ニトロセルロース膜およびナイロン膜への核酸の転写、ＤＮＡ断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌の培養、および組換えＤＮＡの配列分析などのクローニング方法は、Sambrookら(1989) （Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6）に記載されてようにして行った。
【０１０５】
実施例２：組換えＤＮＡの配列分析
組換えＤＮＡ分子の配列決定は、ＡＢＩ社製のレーザー蛍光ＤＮＡ配列決定装置を用いて、Ｓａｎｇｅｒの方法（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４，５４６３−５４６７）により行った。ポリメーラーゼ連鎖反応により得られた断片を配列決定し、発現させようとする構築物におけるポリメラーゼのエラーが起こらないように確認した。
【０１０６】
実施例３：ムスカリオディデス・ヴィアリー（Muscariodides vialii）に由来するΔ６−不飽和化酵素（配列番号３）のクローニング
若いムスカリオディデス・ヴィアリーの葉から得た全ＲＮＡを、Qiagen社（Valencia, CA, USA）製のＲＮＡｅａｓｙキットを用いて単離した。オリゴ−ｄＴ−セルロースを用いて、その全ＲＮＡからポリ−Ａ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離した（Sambrookら, 1989）。Promega社製の逆転写システムキットを用いて、ＲＮＡを逆転写し、合成されたｃＤＮＡをΔ６−不飽和化酵素のＰＣＲ増幅に用いた。Δ６−不飽和化酵素の増幅には、縮重プライマーを用いた。このヌクレオチド配列はルリヂサ（borage）のΔ６−不飽和化酵素の第１および第３のヒスチジンボックスモチーフから誘導したものとした（Syanovaら, 1997, WO9621022）。
【０１０７】
プライマー１：GGITGGHTIGGICAYGAYKYIKSICA
プライマー２：GGRAAIAGRTGRTGYTCDATYTG
ここで特定したプライマーおよび下記に示すプライマー配列において、Ｗｏｂｂｌｅ  ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに従う記号および文字は、次の意味を有する：
Ｒ＝Ａ／Ｇ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ；  Ｍ＝Ａ／Ｃ；Ｋ＝Ｇ／Ｔ；Ｓ＝Ｇ／Ｃ；Ｗ＝Ａ／Ｔ；Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ；Ｂ＝Ｇ／Ｔ／Ｃ；Ｖ＝Ｇ／Ｃ／Ａ；Ｄ＝Ｇ／Ｔ／ＡおよびＮ＝Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ。
【０１０８】
ＰＣＲプロトコール
添加温度：４５℃で１分
変性温度：９４℃で１分
伸長温度：７２℃で２分
サイクル数：３５回
ＰＣＲ混合物をアガロースゲルで分離し、６６０ｂｐの断片を単離した。このＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Promega）にクローニングし、次にインサートを配列決定した。
【０１０９】
ムスカリオディデス・ヴィアリー由来の単離された遺伝子断片の欠損する５’および３’領域を、Ｓｍａｒｔ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡキット（Clonetech）を用いて単離し、次に配列決定した。３’および５’配列から出発して、プライマーを誘導して、完全なクローンを単離した。この目的のために、プライマーは、開始メチオニンおよび停止コドンの近傍のＤＮＡ領域から誘導した。ＰＣＲにより、予想通りの大きさの単一のバンドが得られた。再度、ｃＤＮＡをｐＧＥＭ  Ｔｅａｓｙベクターにクローニングし、そこで完全遺伝子を配列決定した。
【０１１０】
実施例４：アレウリティア・ファリノーサ（Aleuritia farinosa）由来のΔ６−不飽和化酵素（＝配列番号１）のクローニング
若いアレウリティア・ファリノーサの葉から得た全ＲＮＡを、Qiagen社（Valencia, CA, USA）製のＲＮＡｅａｓｙキットを用いて単離した。オリゴ−ｄＴ−セルロースを用いて、その全ＲＮＡからポリ−Ａ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離した（Sambrookら, 1989）。Promega社製の逆転写システムキットを用いて、ＲＮＡを逆転写し、合成されたｃＤＮＡをΔ６−不飽和化酵素のＰＣＲ増幅に用いた。Δ６−不飽和化酵素の増幅には、縮重プライマーを用いた。このヌクレオチド配列はルリヂサのΔ６−不飽和化酵素の第１および第３のヒスチジンボックスモチーフから誘導したものとした（Syanovaら, 1997, WO9621022）。
【０１１１】
プライマー１：GGITGGHTIGGICAYGAYKYIKSICA
プライマー２：GGRAAIAGRTGRTGYTCDATYTG
【０１１２】
ＰＣＲプロトコール
添加温度：４５℃で１分
変性温度：９４℃で１分
伸長温度：７２℃で２分
サイクル数：３５回
ＰＣＲ混合物をアガロースゲルで分離し、６６０ｂｐの断片を単離した。このＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Promega）にクローニングし、次にインサートを配列決定した。
【０１１３】
アレウリティア・ファリノーサ由来の単離された遺伝子断片の欠損する５’および３’領域を、Ｓｍａｒｔ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡキット（Clonetech）を用いて単離し、次に配列決定した。３’および５’配列から出発して、プライマーを誘導して、完全なクローンを単離した。この目的のために、プライマーは、開始メチオニンおよび停止コドンの近傍のＤＮＡ領域から誘導した。ＰＣＲにより、予想通りの大きさの単一のバンドが得られた。再度、ｃＤＮＡをｐＧＥＭ  Ｔｅａｓｙベクターにクローニングし、そこで完全遺伝子を配列決定した。
【０１１４】
実施例５：植物内での構成的発現のための発現プラスミドのクローニング
適当なプライマーを用いて、両者の新規な不飽和化酵素の５’末端および３’末端に、ＣＬＡＩおよびＸｂａＩの境界部分を導入した。
【０１１５】
Ｍ．ヴィアリー由来のΔ６−不飽和化酵素のためのプライマー設計
atcgatatggctaacaaatctcccacc（ClaI）
tctagattagccgtgtgtgtggacggctt（XbaI）
Ａ．ファリノーサ由来のΔ６−不飽和化酵素のためのプライマー設計
atcgatatggctaacaaatctcccacc（ClaI）
tctagatcacccgagagttttaagagct（XbaI）
【０１１６】
ＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し、ＣｌａＩ／ＸｂａＩで消化し、適切に切断したベクターｐＳＬＪ４Ｋ１に連結した。得られたプラスミドは、ベクターｐＳＬＪ４Ｋ１中に、３５Ｓプロモーター（カリフラワーモザイクウイルス；Franckら(1980) Cell 21, 285）、ムスカリオディデス・ヴィアリーまたはアレウリティア・ファリノーサに由来するΔ６−不飽和化酵素、および３５Ｓターミネーターを含む。上記のプロモーターまたはターミネーターの代わりに、有利にはｎｏｓプロモーター（Wilkinsonら, Journal of Experimental Botany, 48, 1997: 307以下）またはユビキチンプロモーターなどの、全ての構成的プロモーターまたは全ての植物ウイルスプロモーターが使用可能である。本明細書中で特定したプロモーターおよびターミネーターもまた、基本的には発現に有利に使用することが可能である。
【０１１７】
この構築物を、シロイヌナズナ（アラビドプシス・タリアーナ）（Arabidopsis thaliana）、アブラナ、タバコおよびアマニの形質転換に用いた。
【０１１８】
実施例５：植物における種子特異的発現のための発現プラスミドのクローニング
植物を形質転換するために、Ｍ．ヴィアリーまたはＡ．ファリノーサに由来するΔ６−不飽和化酵素のＢａｍＨＩ断片を含んだｐＢｉｎ−ＵＳＰに基づくさらに別の形質転換ベクターを作製した。ＢａｍＨＩ境界部分は、実施例４で記載したように、適切なプライマーを用いてＰＣＲにより、開始ＡＴＧまたは停止コドンに結合させた。
【０１１９】
Ｍ．ヴィアリー由来のΔ６−不飽和化酵素のためのプライマー設計
ggatccatggctaacaaatctcccacc
ggatccttagccgtgtgtgtggacggctt
Ａ．ファリノーサ由来のΔ６−不飽和化酵素のためのプライマー設計
ggatccatggctaacaaatctcccacc
ggatcctcacccgagagttttaagagct
【０１２０】
ｐＢｉｎ−ＵＳＰはプラスミドｐＢｉｎ１９の誘導体である。ｐＢｉｎ−ＵＳＰは、ｐＢｉｎ１９から、ＵＳＰプロモーターをＥｃｏＲＩ−ＢａＭＨＩ断片としてｐＢｉｎ１９（Bevanら (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711）に挿入することにより作製した。ポリアデニル化シグナルは、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（Gielenら, (1984) EMBO J. 3, 835）のＴ−ＤＮＡの第３遺伝子のものであり、それにより、ヌクレオチド１１７４９〜１１９３９がＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として単離され、ベクターのＳｐＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ境界部分の間にあるＰｖｕＩＩ境界部分にＳｐｈＩリンカーを付加した後でクローニングした。ＵＳＰプロモーターは、ヌクレオチド１〜６８４（ジーンバンクアクセッション番号Ｘ５６２４０）に相当し、そこにおいてＵＳＰ遺伝子の非コード領域の一部はそのプロモーターに含まれている。６８４塩基対まで及ぶプロモーター断片を、標準的な方法により、市販のＴ７標準プライマー（Stratagene）を用い、合成プライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅した。（プライマー配列：5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCC GGATCTGCTGGCTATGAA-3’）。ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩを用いて再切断し、ＯＣＳターミネーターを含むベクターｐＢｉｎ１９に挿入した。ｐＢｉｎＵＳＰと呼ぶプラスミドが得られた。この構築物を、シロイヌナズナ、アブラナ、タバコおよびアマニの形質転換に用いた。
【０１２１】
実施例６：トランスジェニック植物の作製
ａ）トランスジェニック植物の作製（Moloneyら, 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242の方法にしたがって修正を加えたもの）
トランスジェニックアブラナ植物を作製するために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）Ｃ５８Ｃ１：ｐＧＶ２２６０または大腸菌（Escherichia coli）内でバイナリーベクター（Deblaereら, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788）を用いた。アブラナ植物を形質転換するために（var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Germany）、３％のサッカロースを含有するMurashige-Skoog培地（MurashigeおよびSkoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473）（３ＭＳ培地）中に陽性に形質転換されたアグロバクテリウムコロニーの一夜培養物を１：５０に希釈したものを用いた。新たに発芽した無菌アブラナ植物の葉柄または子葉下軸（hypocotyledon）（それぞれ約１ｃｍ２）を、１：５０のアグロバクテリウム希釈物が入ったシャーレで５〜１０分間インキュベートした。これに続いて、０．８％のバクト−アガーを含有する３ＭＳ培地で、暗所にて２５℃で３日間コンキュベーション（concubation）を行った。３日後、５００ｍｇ／ｌのクラホラン（Claforan）（セフォタキシムナトリウム）、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン、２０μＭのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）および１．６ｇ／ｌのグルコースを含有するＭＳ培地で、明所で１６時間／暗所で８時間のサイクルを一週間にわたり培養を継続した。成長したシュートを、２％のサッカロース、２５０ｍｇ／ｌのクラホランおよび０．８％のバクト−アガーを含有する３ＭＳ培地に移した。３週間後に根が形成されなかった場合は、出根させる目的で、成長ホルモンとして２−インドリル酪酸を培地に添加した。
【０１２２】
２ＭＳ培地でカナマイシンおよびクラホランを用いて再生したシュートを得、出根後に土壌に移し、栽培後に気候を調節したチャンバー内で２週間生育させ、花を咲かせ、採取後に成熟した種子を脂質分析によりΔ６−不飽和化酵素発現について調べた。Δ６位の二重結合の含有量が増大した系統を同定した。導入遺伝子を機能的に発現している安定に形質転換されたトランスジェニック系統では、形質転換されていない対照植物と比較してΔ６位の二重結合の含有量が増大していることが判った。
【０１２３】
ｂ）トランスジェニックアマ植物は、例えば、Bellら, 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6):456-465の方法により、粒子ボンバードメント（particle bombardment）により作製することができる。アグロバクテリウム媒介形質転換体は、例えばMlynarovaら (1994), Plant Cell Report 13: 282-285に記載されているようにして作製できる。
【０１２４】
実施例７：種子からの脂質抽出
まず、植物材料を、破砕により機械的にホモジナイズして、より抽出しやすくした。
【０１２５】
次に、それを１００℃まで１０分間加熱し、氷上で冷却後、再度沈降させた。細胞沈降物を、１Ｍメタノール硫酸および２％ジメトキシプロパンで９０℃にて１時間加水分解し、脂質をメチル基転移した。最後に、得られた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を石油エーテルに抽出した。抽出されたＦＡＭＥを、キャピラリーカラムを使用した気−液クロマトグラフ（Chrompack、ＷＣＯＴ溶融シリカ、ＣＰワックス５２  ＣＢ、２５ｍ、０．３２ｍｍ）により１７０℃〜２４０℃の温度勾配で２０分間、２４０℃で５分間分析した。脂肪酸メチルエステルの正体を、対応するＦＡＭＥ標準物質（Sigma）との比較により確認した。二重結合の存在および位置は、ＦＡＭＥ混合物を適切に化学的に誘導体化して、例えば４，４−ジメトキシオキサゾリン誘導体（Christie, 1998）を形成することにより、ＧＣ−ＭＳによってさらに分析した。Δ６−不飽和化酵素の種子特異的発現を示すこのトランスジェニックアブラナ種子から得られた脂肪酸メチルエステルのＧＣ分析を表１に示す。このトランスジェニックアブラナは、種子中に５％のγ−リノレン酸を含有していた。
【０１２６】
実施例８：酵母（サッカロミセス・セレビシエ）におけるサクラソウ科植物由来のΔ６−不飽和化酵素の発現
ムスカリオディデス・ヴィアリーおよびアレウリティア・ファリノーサから得たΔ６−不飽和化酵素のオープンリーディングラスター（open reading raster）を、それぞれ、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（Invitrogen）のガラクトース誘導性ＧＡＬ１プロモーターの後方にクローニングした。そのオープンリーディングラスターをＰＣＲにより増幅させた。クローニングに用いた境界部分はＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩとした。
【０１２７】
Ｍ．ヴィアリー用のプライマー設計：
ggtaccatggctaacaaatctcccacc（KpnI）
gaattcttagccgtgtgtgtggacggctt（EcoRI）
Ａ．ファリノーサ用のプライマー設計：
ggtaccatggctaacaaatctcccacc（KpnI）
gaattctcacccgagagttttaagagct（EcoRI）
【０１２８】
作製されたベクターを、酵母での発現に用いた。基質特異性は、形質転換した酵母株にα−リノレン酸およびリノール酸を供給することにより判定した。用いた方法論は、例えばNapierおよびMichaelson, 2001,Lipids. 36(8):761-766；Sayanovaら, 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585；Sperlingら, 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298ならびにMichaelsonら, 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218に記載されている。
【０１２９】
特異性を比較するために、ルリヂサ（ボラーゴ・オフィシナリス）（Borago officinalis）由来のΔ６−不飽和化酵素を同様にして酵母内で発現させた（Sayanovaら,1999, Plant Physiol. 121(2):641-646）。
【表１】
2005518213.tif 000002
【表２】
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【０１３０】
上記の表から、本発明の核酸配列が、ω-3脂肪酸に特異的なΔ6-不飽和化酵素をコードすると結論づけることができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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