(57)【要約】本発明は、核酸分子および核酸構築物、および脂肪酸合成と関連する他の因子、詳細には、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の比率に指向される。さらに、本発明は、植物が飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の変化した比率を示すかかる因子を取り込んだ植物に指向される。詳細には、本発明は、植物が多価不飽和脂肪酸に対する単価不飽和脂肪酸の変化した比率を示すかかる因子を取り込んだ植物に指向される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される配列に少なくとも７０％配列同一性を有する核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子。
【請求項２】
作動可能に連結されたコンポーネントとして（ａ）ｍＲＮＡ分子の産生を生じるように植物細胞中で機能するプロモーター；および（ｂ）高ストリンジェンシー条件下で、配列番号：４、配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列にハイブリダイズする核酸配列、を含む組換え核酸分子。
【請求項３】
（ａ）配列番号：１、配列番号：２、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｂ）配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子を含み、ここに該第２の核酸分子がポリシストロン性構造で第１のプロモーターにまたは第２のプロモーターに作動可能に連結している、核酸分子を有する形質転換されたダイズ植物。
【請求項４】
単一のプロモーターが第１および第２の核酸分子に作動可能に連結している請求項３記載の形質転換されたダイズ植物。
【請求項５】
単一プロモーターが種子特異的プロモーターである請求項４記載の形質転換されたダイズ植物。
【請求項６】
該第１のプロモーターおよび該第２のプロモーターが両方とも種子特異的プロモーターである請求項３記載の形質転換されたダイズ植物。
【請求項７】
該第１のプロモーターおよび該第２のプロモーターが両方とも７Ｓプロモーターである請求項６記載の形質転換されたダイズ植物。
【請求項８】
該第１のプロモーターが該第２のプロモーターと異なる請求項３記載の形質転換されたダイズ植物。
【請求項９】
該第１のプロモーターが７Ｓプロモーターであって、該第２のプロモーターがナピン・プロモーターである請求項８記載の形質転換されたダイズ植物。
【請求項１０】
該第１の核酸分子が、ＦＡＤ２−２遺伝子によってコードされる転写物のレベルに部分的に影響しないで、転写されて、ＦＡＤ２−１遺伝子によってコードされる転写物のレベルを選択的に低下することができる請求項３記載の形質転換されたダイズ植物。
【請求項１１】
該第１の核酸分子が、ＦＡＤ２−２遺伝子によってコードされる転写物のレベルに実質的に影響しないで、転写されて、ＦＡＤ２−１遺伝子によってコードされる転写物のレベルを選択的に低下することができる請求項３記載の形質転換されたダイズ植物。
【請求項１２】
該第１の核酸分子が、ＦＡＤ２−２遺伝子によってコードされる転写物のレベルに本質的に影響しないで、転写されて、ＦＡＤ２−１遺伝子によってコードされる転写物のレベルを選択的に低下することができる請求項３記載の形質転換されたダイズ植物。
【請求項１３】
２またはそれを超える核酸分子を有する形質転換されたダイズ植物であって、ここに各核酸分子はプロモーターに作動可能に連結されており、各核酸分子は配列番号：１、２、４−１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する核酸配列である該形質転換されたダイズ植物。
【請求項１４】
請求項１３記載の形質転換されたダイズ植物であって、ここに第１の核酸分子は、第２のＦＡＤ遺伝子によってコードされる転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないでまたは本質的に影響しないで、転写されて、第１のＦＡＤ遺伝子によってコードされる転写物のレベルを選択的に低下することができる該形質転換されたダイズ植物。
【請求項１５】
ＦＡＤ２−１Ａ、ＦＡＤ２−１Ｂ、ＦＡＤ２−２Ｂ、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂ、ＦＡＤ３−１Ｃよりなる群から選択される遺伝子によってコードされる転写物のレベルに少なくとも部分的に影響しないで、ＦＡＤ２−１Ａ、ＦＡＤ２−１Ｂ、ＦＡＤ２−２Ｂ、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂ、ＦＡＤ３−１Ｃよりなる群から選択される異なる遺伝子によってコードされる転写物のレベルが選択的に低下した形質転換されたダイズ植物。
【請求項１６】
（ａ）配列番号：１、２、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｂ）配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子を含む核酸分子でダイズ植物を形質転換し、ここに該第２の核酸分子が第１のプロモーターまたは第２のプロモーターに作動可能に連結されており；ついで、該植物を生育させることを含む、低下したリノレン酸含量を有する種子を有するダイズ植物を作製する方法であって、ここに該植物が同様な遺伝的背景を有するが該核酸分子を欠いている植物よりもより低いリノレン酸含量を含む種子を産生する該方法。
【請求項１７】
（ａ）配列番号：１、２、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｂ）配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子を含む核酸分子でダイズ植物を形質転換し、ここに該第２の核酸分子が第１のプロモーターまたは第２のプロモーターに作動可能に連結されており；ついで、該植物を生育させることを含む、上昇したオレイン酸含量を含む種子を有するダイズ植物を作製する方法であって、ここに該植物が同様な遺伝的背景を有するが該核酸分子を欠いている植物よりもより多くのオレイン酸含量を含む種子を産生する該方法。
【請求項１８】
作動可能に連結されたコンポーネントとして、第１のプロモーターおよび配列番号：１、２、４ないし１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子を含む核酸分子で植物を形質転換し；ついで該植物を生育させることを含む、修飾された油組成を含む種子を有する植物を作製する方法であって、ここに該植物が同様な遺伝的背景を有するが該核酸分子を欠いている植物と比較して修飾された油組成を含む種子を産生する該方法。
【請求項１９】
作動可能に連結されたコンポーネントとして、各々が配列番号：１、２、４ないし１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する核酸配列を有する２またはそれを超える核酸分子を含む構築物で植物を形質転換し、ここに各核酸分子はプロモーターに作動可能に連結されており；ついで、該植物を生育させることを含む多価不飽和脂肪酸に対する単不飽和脂肪酸の変化した比率を有する種子を有する植物を作製する方法であって、ここに該植物が同様な遺伝的背景を有するが該２またはそれを超える核酸分子を欠いている植物と比較して多価不飽和脂肪酸に対する単不飽和脂肪酸の変化した比率を有する種子を生産する該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、脂肪酸合成と関連する核酸分子および核酸構築物、および他の因子に指向される。また、本発明は植物が変化した比率の飽和および不飽和脂肪を示すかかる因子を取り込む植物に指向される。詳細には、本発明は、植物が多価不飽和脂肪酸に対する一価不飽和脂肪酸の変化した比率を示すかかる因子を取り込む植物に指向される。
【０００２】
背景
植物油は種々の適用に使用されている。生合成または自然界の植物起源からの、新規な植物油組成物および植物油組成物を得るための改善された手段が求められている。意図する油の用途に依存して、種々の異なる脂肪酸組成物が望まれる。
【０００３】
高等植物は共通の代謝経路−−脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）経路、を介して脂肪酸を合成するようである。さらなる発芽のためのエネルギー源として貯蔵するために脂肪酸がグリセロール骨格に結合してトリアシルグリセリドを形成する種子の発達においては、ＦＡＳ経路はプラスチドに存在する。第１の引き渡し工程は、酵素、アセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＡＴＡ）によって触媒されるアセチル−ＣｏＡおよびＡＣＰからのアセチル−ＡＣＰ（アシルキャリアータンパク質）の形成である。１６−および１８−炭素脂肪酸へのアセチル−ＡＣＰの伸長には、以下の反応の連続の循環作用が含まれる：マロニル−ＣｏＡからの２−炭素単位と縮合してβ−ケトアシル−ＡＣＰ（β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ）の形成、ケト官能基のアルコールへの還元（β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ）、脱水してエノイル−ＡＣＰの形成（β−ケトアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ）、およびエノイル−ＡＣＰが最終的に還元されて伸長した飽和アシル−ＡＣＰ（エノイル−ＡＣＰレダクターゼ）の形成。β−ケトアシルＡＣＰシンターゼＩはＣ４：０からパルミトイル−ＡＣＰ（Ｃ１６：０）までの伸長を触媒する一方、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩはステアロイル−ＡＣＰ（Ｃ１８：０）までの最終伸長を触媒する。貯蔵トリアシルグリセリド中に見出されるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸のごとき一般的な植物不飽和脂肪酸は、可溶性プラスチドΔ−９デサチュラーゼ（"ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ"と呼ばれる場合もある）によって触媒される反応におけるステアロイル−ＡＣＰの不飽和化に起源を発する。分子酸素は還元型フェレドキシンが電子共供与体として作用する不飽和化に必要である。さらなる不飽和化は膜結合型Δ−１２デサチュラーゼおよびΔ−１５デサチュラーゼの作用によって順次に行われる。したがって、これらの"デサチュラーゼ"は多価不飽和脂肪酸を生成する。
【０００４】
ＦＡＳ、不飽和化および／または脂肪酸のグリセロール骨格への取込みを生じて油脂の生成を表現型を創生することができる核酸配列を得ることは、限定されるものではないが、関心のある代謝因子の同定、有用な力学的特性を有する酵素源の選択および特徴付け、関心のあるタンパク質のそのアミノ酸配列決定が出来るレベルまでの精製、アミノ酸配列データを利用して所望のＤＮＡ配列を回収するためのプローブとして使用することができる核酸配列を得ること、ならびに構築物の調製、形質転換および得られる植物の解析を含む種々の障害を受ける。
【０００５】
したがって、脂肪酸組成を修飾するためのさらなる核酸標的および方法が必要とされている。詳細には、種々の脂肪酸組成範囲を生成する構築物および方法が必要とされている。
【０００６】
発明の概要
本発明は、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントからなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも７０％配列同一性を有する核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子を提供する。
【０００７】
さらに本発明は、配列番号：１２の配列を有する核酸分子の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む核酸分子；配列番号：１３の配列を有する核酸分子の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む核酸分子；配列番号：１４の配列を有する核酸分子の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む核酸分子；および配列番号：４の配列を有する核酸分子の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む核酸分子もさらに提供する。
【０００８】
また、本発明は、作動可能に連結したコンポーネントとして（Ａ）植物細胞中でｍＲＮＡ分子の生成を引き起こすように機能するプロモーター；および（Ｂ）配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントより成群から選択される核酸配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列、を含む組換え核酸分子も提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、（ａ）配列番号：１ないし配列番号：２、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第１の核酸分子に作動可能に連結された第１のプロモーター、および（ｂ）配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子を含む核酸分子を有し、ここに第２の核酸分子が多シストロン構造で第１のプロモーターにまたは第２のプロモーターに作動可能に連結している形質転換されたダイズ植物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、（ａ）配列番号：1ないし配列番号：２、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に作動可能に連結した第１のプロモーター、および（ｂ）配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子を含む核酸分子を有し、ここに第２の核酸分子が多シストロン性構造で第１のプロモーターにまたは第２のプロモーターに作動可能に連結している形質転換されたダイズ植物も提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、配列番号：1ないし配列番号：２、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に第１のプロモーターが作動可能に連結した二本鎖ＲＮＡｉ構築物を含み、ここに配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子が第１の核酸分子に作動可能に連結している形質転換されたダイズ植物も提供する。
【００１２】
また、本発明は、配列番号：1ないし配列番号：２、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に第１のプロモーターが作動可能に連結しており、配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子がｄｓＲＮＡ構造中で第２のプロモーターに作動可能に連結している二本鎖ＲＮＡｉ構築物を含む形質転換されたダイズ植物も提供する。
【００１３】
また、本発明は、２またはそれを超える核酸分子を有し、ここに各核酸分子がプロモーターに作動可能に連結しており、ここに各核酸分子が配列番号：１、２、４−１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する核酸配列を有する、形質転換されたダイズ植物も提供する。
【００１４】
本発明は、ＦＡＤ２−１Ａ、ＦＡＤ２−１Ｂ、ＦＡＤ２−２Ｂ、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂ、ＦＡＤ３−1Ｃよりなる群から選択される異なる遺伝子によってコードされる転写物のレベルに少なくとも部分的に影響しないで、ＦＡＤ２−１Ａ、ＦＡＤ２−１Ｂ、ＦＡＤ２−２Ｂ、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂ、ＦＡＤ３−１Ｃよりなる群から選択される遺伝子によってコードされる転写物のレベルが選択的に低下した形質転換されたダイズ植物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、（ａ）配列番号：1ないし配列番号：２、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に作動可能に連結した第１のプロモーター、および（ｂ）配列番号：４ないし配列番号：１４、その相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子を含む核酸分子でダイズ植物を形質転換し；ついで、該植物を成長させることを含み、ここに第２の核酸分子が第１のプロモーターまたは第２のプロモーターに作動可能に連結しており、ここに植物が同様な遺伝的背景を有するが該核酸分子を欠いている植物よりもより少ないリノレン酸を有する種子を産生する、減少したリノレン酸含量を有する種子を有するダイズ植物を生産する方法も提供する。
【００１６】
また、本発明は、（ａ）配列番号：1ないし配列番号：２、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に作動可能に連結した第１のプロモーター、および（ｂ）配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子を含む核酸分子でダイズ植物を形質転換し；ついで、該植物を成長させることを含み、ここに第２の核酸分子が第１のプロモーターまたは第２のプロモーターに作動可能に連結しており、ここに植物が同様な遺伝的背景を有するが該核酸分子を欠いている植物よりもより多いオレイン酸を有する種子を産生する、増加したオレイン酸含量を有する種子を有するダイズ植物を生産する方法も提供する。
【００１７】
また、本発明は、作動可能に連結したコンポーネントとして、配列番号：１、２、４ないし１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子と第１のプロモーターとを含む核酸分子で植物を形質転換し；ついで、該植物を成長させることを含み、ここに該植物が同様な遺伝的背景を有するが該核酸分子を欠いている植物と比較して修飾された油脂組成を有する種子を産生する、修飾された油脂組成を有する種子を有する植物を生産する方法も提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、作動可能に連結されたコンポーネントとして、各々が配列番号：１、２、４ないし１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する核酸配列を有する２またはそれを超える核酸分子を含む構築物で植物を形質転換し；ついで、該植物を成長させることを含み、ここに各核酸分子はプロモーターに作動可能に連結しており、ここに該植物が同様な遺伝的背景を有するが該２またはそれを超える核酸分子を欠いている植物と比較して多価不飽和脂肪酸に対する一価飽和脂肪酸の変化した比率を有する種子を産生する、多価不飽和脂肪酸に対する一価不飽和脂肪酸の変化した比率を有する種子を有する植物を生産する方法も提供する。
【００１９】
また、本発明は、配列番号：1、２、４ないし１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子および第１のプロモーターを作動可能に連結したコンポーネントとして含む核酸分子で植物を形質転換し；ついで該植物を成長させることを含み、ここに該植物が同様な遺伝的背景を有するが該核酸分子を欠いている植物と比較して修飾された油脂組成を有する種子を有する植物を生産する方法も提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、作動可能に連結したコンポーネントとして、２またはそれを超える核酸分子を含む構築物で植物を形質転換し；ついで該植物を成長させることを含み、ここに各核酸分子は配列番号：１、２、４ないし１４、それらの相補体、およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して８５％以上の同一性を有する核酸配列を有し、ここに各核酸分子はプロモーターに作動可能に連結されており、ここに該植物が同様な遺伝的背景を有するが該核酸分子を欠いている植物と比較して多価不飽和脂肪酸に対する一価不飽和脂肪酸の修飾された比率を有する種子を産生する、多価不飽和脂肪酸に対する一価不飽和脂肪酸の修飾された比率を有する種子を有する植物を生産する方法も提供する。
【００２１】
発明の詳細な説明
核酸配列の説明
配列番号：１は、ＦＡＤ２−１Ａ  イントロン１の核酸配列を記載する。
配列番号：２は、ＦＡＤ２−１Ｂ  イントロン１の核酸配列を記載する。
配列番号：３は、部分ＦＡＤ２−２  ゲノムクローンの核酸配列を記載する。
配列番号：４は、ＦＡＤ２−２Ｂ  イントロン１の核酸配列を記載する。
配列番号：５は、ＦＡＤ３−１Ａ  イントロン１の核酸配列を記載する。
配列番号：６は、ＦＡＤ３−１Ａ  イントロン２の核酸配列を記載する。
配列番号：７は、ＦＡＤ３−１Ａ  イントロン３Ａの核酸配列を記載する。
配列番号：８は、ＦＡＤ３−１Ａ  イントロン４の核酸配列を記載する。
配列番号：９は、ＦＡＤ３−１Ａ  イントロン５の核酸配列を記載する。
配列番号：１０は、ＦＡＤ３−１Ａ  イントロン３Ｂの核酸配列を記載する。
配列番号：１１は、ＦＡＤ３−１Ａ  イントロン３Ｃの核酸配列を記載する。
配列番号：１２は、ＦＡＤ３−１Ｂ  イントロン３Ｃの核酸配列を記載する。
配列番号：１３は、ＦＡＤ３−１Ｂ  イントロン４の核酸配列を記載する。
配列番号：１４は、ＦＡＤ３−１Ｃ  イントロン４の核酸配列を記載する。
配列番号：１５は、ＦＡＤ２−１Ａ遺伝子配列のｃＤＮＡ配列を記載する。
配列番号：１６および１７は、ＦＡＤ２−１Ａ  ＰＣＲプライマーの核酸配列を記載する。
配列番号：１８は、部分ＦＡＤ２−１ゲノムクローンの核酸配列を記載する。
配列番号：１９は、部分ＦＡＤ２−１Ｂ  ゲノムクローンの核酸配列を記載する。
配列番号：２０および２１は、ＦＡＤ３−１Ａ  ＰＣＲプライマーの核酸配列を記載する。
配列番号：２２は、ＦＡＤ２−１Ｂ  プロモーターの核酸配列を記載する。
配列番号：２３は、部分ＦＡＤ３−１Ａ  ゲノムクローンの核酸配列を記載する。
配列番号：２４ないし３９は、ＰＣＲプライマーの核酸配列を記載する。
【００２２】
定義
本明細書中で使用する"遺伝子"なる用語は、それを用いて遺伝子産物の発現と関連するプロモーター領域を含む５’非翻訳領域、いずれかのイントロンおよびエキソン、および遺伝子産物の発現と関連する５’または３’非翻訳領域を包含する核酸配列をいう。
【００２３】
本明細書中で使用する"ＦＡＤ２"、"Δ１２デサチュラーゼ"または"オメガ−６デサチュラーゼ"遺伝子とは、カルボキシ末端からカウントして１２番目のポジションに位置する脂肪アシル基への二重結合の挿入を触媒することができる酵素をコードする遺伝子である。
【００２４】
本明細書中でタンパク質および核酸をいう場合において、通常の書体、例えば"ＦＡＤ２"を使用する場合には酵素、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを参照することを示し、イタリック書体、例えば"ＦＡＤ２"を使用する場合には、限定するものではないが、遺伝子、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む核酸を参照することを示す。
【００２５】
本明細書中で使用する"ＦＡＤ２−１"なる用語を用いて、種子組織中で特異的な様式で自然に発現したＦＡＤ２遺伝子をいう。
本明細書中で使用する"ＦＡＤ２−２"なる用語を用いて、（ａ）ＦＡＤ２−１遺伝子とは異なり、（ｂ）種子を含む複数の組織で自然に発現した遺伝子をいう。
【００２６】
本明細書中で使用する"ＦＡＤ３"、"Ａ１５デサチュラーゼ"または"オメガ−３デサチュラーゼ"遺伝子とは、カルボキシ末端からカウントして１５番目のポジションの脂肪アシル基への二重結合の挿入を触媒することができる酵素をコードする遺伝子である。
【００２７】
本明細書中で使用する用語"ＦＡＤ３−１"とは、種子を含む複数の組織中で自然に発現されるＦＡＤ３遺伝子をいうために用いる。
本明細書中で使用する遺伝子用語につづく文字（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、ファミリーメンバー、すなわちＦＡＤ２−１ＡはＦＡＤ２−１Ｂとは異なる遺伝子ファミリーメンバーであることを示すために用いる。
本明細書中で使用する"高オレイン酸ダイズ種子"とは、種子の油組成物中に存在する７５％のオレイン酸を超える油を有する種子である。
"非コード"なる語は、発現されたタンパク質の一部分または全体をコードしない核酸分子の配列をいう。非コード配列には、限定されるものではないが、イントロン、プロモーター領域、３’非翻訳領域、および５’非翻訳領域が含まれる。
【００２８】
本明細書中で用いる"イントロン"なる語は、核酸分子のセグメント、通常は発現されたタンパク質の一部分または全部をコードしていないＤＮＡを意味する用語の通常の意味をいい、それは、内因的な条件でＲＮＡ分子に転写されるが、それはＲＮＡがタンパク質に翻訳される前に内因性ＲＮＡから切り出される。
【００２９】
本明細書中で使用する"エキソン"なる語は、核酸分子のセグメント、通常は発現されたタンパク質の一部分または全部をコードするＤＮＡを使用を意味する用語の通常の意味をいう。
本明細書中で用いる１またはそれを超える核酸配列に"作動可能に連結した"プロモーターは、１またはそれを超える核酸配列の発現を駆動することができ、ポリシストロン性構成で配置した複数のコードまたは非コード核酸配列が含まれる。
【００３０】
"ポリシストロン性遺伝子"または"ポリシストロン性ｍＲＮＡ"は、発現が標的された１を超える遺伝子の核酸配列に対応する転写された核酸配列を含むいずれかの遺伝子またはｍＲＮＡである。かかるポリシストロン性の遺伝子またはｍＲＮＡがイントロン、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲまたはそれらの組合せに相当する配列を含み得ること、および、組換えポリシストロン性の遺伝子またはｍＲＮＡが例えば制限なしに１の遺伝子からの１またはそれを超えるＵＴＲおよび第２の遺伝子からの１またはそれを超えるイントロンに対応する配列を含み得ることは理解される。
【００３１】
本明細書中で使用する核酸配列の相補体なる語は、その完全長に沿った配列の相補体をいう。
本明細書中で使用するように、記載したいずれの範囲も別段指摘しない限りは、該範囲の終点を含む。
【００３２】
因子
本発明の因子は、好ましくは他の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子の能力のごとき構造属性、または抗体によって結合される（あるいは、かかる結合について他の分子と競合する）タンパク質の能力のいずれかに関して好ましくは"生物学的に活性"であろう。あるいは、かかる属性は触媒とし得、したがって化学反応または応答を仲介する因子の能力を含む。該因子は好ましくは"実質的に精製した"であろう。本明細書中で使用する"実質的に精製した"なる語は、その天然の環境条件でそれと通常関連する実質的にすべての他の分子から分離された分子をいう。さらに好ましくは、実質的に精製された分子は調製物中に存在する優勢な種である。実質的に精製された分子は、天然の混合物中に存在する他の混合物を（溶媒を除いて）６０％を超えて、７５％を超えて、好ましくは９０％を超えて、最も好ましくは９５％を超えて含まないこともある。"実質的に精製された"なる用語は、それらの天然の環境条件下に存在する分子を包含することを意図するものではない。
本発明の因子は組換体とすることもできる。本明細書中で使用する"組換え体"なる語は、いずれかの因子（例えば、限定するものではないがＤＮＡ、ペプチドを含む）、すなわち、あるいは間接的であるが核酸分子のヒトによる操作からの結果物を意味する。
本発明の因子を当該因子の検出を促進する試薬（例えば、蛍光標識、Proberら, Science 238:336-340(1987);Albarellaら, EP 144914; chemical labels, Sheldonら, 米国特許第4,582,789号;Albarellaら, 米国特許第4,563,417号；modified bases, Miyoshiら, EP 119448）で標識し得ることは理解される。
【００３３】
核酸分子
本発明の因子には核酸分子が含まれる。本発明の態様において、核酸分子は核酸配列を含み、これは、細胞または生物に導入した場合、第２のＦＡＤ２またはＦＡＤ３によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、ＦＡＤ２またはＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下させることができる。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、核酸分子は核酸配列を含み、それは細胞または生物に導入した場合、第２のＦＡＤ２またはＦＡＤ３によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに実質的に影響しないで、ＦＡＤ２またはＦＡＤ３によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下させることができる。本発明の非常に好ましい態様において、核酸分子には核酸配列が含まれ、それは細胞または生物に導入した場合、第２のＦＡＤ２またはＦＡＤ３によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに実質的に影響しないで、ＦＡＤ２またはＦＡＤ３によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下させることができる。
【００３５】
好ましい態様において、他の遺伝子に対して遺伝子のレベルを選択的に低下させる核酸分子の能力は、ｍＲＮＡ転写物のレベルの比較によって行う。本発明のもう１の好ましい態様において、本発明の核酸分子は、配列番号：１ないし１５、１８、１９、２２、２３、それらの相補体よりなる群から選択される核酸配列、およびいずれかのフラグメントを含む。本発明のもう１の好ましい態様において、本発明の核酸分子は、配列番号：１６、１７、２０、２１、２４ないし３９、それらの相補体よりなる群から選択される核酸配列、およびいずれかのフラグメントを含む。
【００３６】
本発明の１の態様において、本発明の核酸は、導入された核酸分子という。核酸分子は、ヒトの操作の結果として、たとえ間接的であっても、それが細胞または生物に挿入された場合に”導入された”という。導入された核酸分子の例には、限定するものではないが、形質転換、トランスフェクション、注入およびプロジェクションを介して細胞に導入された核酸、ならびに、限定するものではないが、接合、エンドサイトーシスおよびファゴサイトーシスを含む方法を介して生物に導入されたものを含む。細胞または生物は、植物、植物細胞、藻類細胞、藻類、菌類細胞、菌類、または細菌細胞とすることができ、あるいはそれに由来し得る。
【００３７】
本明細書中で使用する"本質的に影響しない"とは、特定の事象によって変化されず、またはその因子の生理学的機能に影響しない程度で変化したかのいずれかである。好ましい態様において、本質的に影響しない因子のレベルは、選択的に他の因子を低下することができる核酸分子を欠いている細胞または生物において見出されるレベルの２０％以内、より好ましくは１０％以内、およびなおより好ましくは５％以内である。
【００３８】
本明細書中で使用する"実質的に影響しない"とは、タンパク質またはｍＲＮＡ転写物のごとき因子のレベルをいい、ここに実質的に影響しない因子のレベルは、選択的に他の因子を低下することができる核酸分子を欠いている細胞または生物において見出されるレベルの４９％以内、より好ましくは３５％以内、およびなおより好ましくは２４％以内である。
【００３９】
本明細書中で使用する"部分的に影響しない"とは、タンパク質またはｍＲＮＡ転写物のごとき因子のレベルをいい、ここに部分的に影響しない因子のレベルは、他の因子を選択的に低下することができる核酸分子を欠いている細胞または生物において見出されるレベルの８０％以内、より好ましくは６５％以内、およびなおより好ましくは５０％以内である。
【００４０】
本明細書中で使用するタンパク質またはｍＲＮＡのごとき因子の"選択的低下"とは、因子を選択的に低下することができる核酸分子を欠いている細胞または生物に対してである。好ましい態様において、因子のレベルは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％を超えて、およびなおより好ましくは少なくとも９０％または９５％を超えて選択的に低下する。
【００４１】
因子のレベルを比較する場合、かかる比較は好ましくは同様な遺伝的背景を有する生物間で行う。好ましい態様において、同様な遺伝的背景とは、比較する生物が５０％以上のその核遺伝物質を共有している背景である。より好ましい態様において、同様な遺伝的背景とは、比較する生物が７５％以上、なおより好ましくは９０％以上のその核遺伝物質を共有している背景である。なおより好ましい態様において、同様な遺伝的背景とは、比較する生物が植物であって、植物が植物形質転換技術を用いて元来導入したいずれかの遺伝物質を除いて同質遺伝子である背景である。
【００４２】
本発明の形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、第２のＦＡＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。好ましい態様において、他の遺伝子に対してある遺伝子のレベルを選択的に低下する核酸分子の能力は、ｍＲＮＡ転写物のレベルを比較することによって行う。本明細書中で使用するｍＲＮＡ転写物には、プロセシングされたおよびプロセシングされていないｍＲＮＡ転写物が含まれる。
【００４３】
もう１の形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ２−２遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。異なる形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ２−１遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ２−２遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。
【００４４】
さらなる形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ２遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。好ましい形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。
【００４５】
異なる形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。
【００４６】
さらなる形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ３−１Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ３−１Ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。さらなる形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ３−１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ３−１Ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。
【００４７】
異なる形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ３−１Ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ３−１Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。異なる形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ３−１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ３−１Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。
【００４８】
さらなる形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ３−１Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ３−１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。さらなる形態において、核酸分子は、細胞または生物に導入した場合、ＦＡＤ３−１Ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ３−１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる。
【００４９】
本発明のさらに好ましい形態は、本発明の核酸分子に対してその全長にわたって少なくとも５０％、６０％または７０％同一である核酸分子、およびかかる核酸分子に対して相補的である核酸分子である。より好ましくは、本発明の核酸分子に対してその全長にわたって少なくとも８０％または８５％同一である領域を含む核酸分子およびそれに対して相補的である核酸分子である。このことに関して、その全長にわたって少なくとも９０％同一である核酸分子が特に好ましく、少なくとも９５％同一であるものはとりわけ好ましい。さらに、少なくとも９７％同一性を有するものは非常に好ましく、少なくとも９８％および９９％同一性を有するものは特に非常に好ましいが、少なくとも９９％のものは最も非常に好ましい。
【００５０】
本発明は、核酸分子配列またはそのフラグメントの配列を有するプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列表に記載した核酸分子配列の完全遺伝子を含む適当なライブラリーをスクリーニングし；該核酸分子配列を単離することによって得ることができる核酸分子配列を含む核酸分子も提供する。かかる核酸分子を得るのに有用なフラグメントには、例えば、本明細書中に記載するプローブおよびプライマーが含まれる。
【００５１】
本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーション・プローブとして使用して、完全長ｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離し、配列表に記載する核酸分子の配列に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離することができる。
【００５２】
本発明の核酸分子は、本明細書に記載する核酸分子またはそのフラグメントを用いて、植物種または他の適当な生物から得たｃＤＮＡまたはゲノム・ライブラリーをスクリーニングすることによって容易に得ることができる。これらの方法は、かかるライブラリーを形成する方法として当業者に知られている。１の形態において、かかる配列は、本発明の核酸分子とゲノム・ライブラリーのメンバーとをインキュベートし、ついでそのかかる核酸分子にハイブリダイズするクローンを回収することによって得る。第２の形態において、染色体ウォーキングまたはインバースＰＣＲの方法を用いてかかる配列を得ることができる。第３の形態において、本発明の核酸分子の配列を用いて、当該技術分野において知られているバイオインフォマティクス技術を用いてライブラリーまたはデータベースをスクリーニングし得る。例えば、Bioinformatics, Baxevanis & Ouellette編, Wiley-Interscience (1998)を参照されたい。
【００５３】
様々な方法のうちのいずれかを用いて、１またはそれを超える本発明の核酸分子を得ることができる。自動核酸合成機をこの目的に使用してもよく、細胞または生物中でも見出される配列を有する核酸分子を作製し得る。かかる合成の代わりに、開示した核酸分子を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応と使用していずれかの望ましい核酸分子またはフラグメントを増幅し、得ることができる一対のプライマーを規定し得る。
【００５４】
当該技術分野でよく理解されている"同一性"とは、配列を比較することによって決定される、２またはそれを超えるポリペプチド配列あるいは２またはそれを超える核酸分子配列の間の関係である。当該技術分野で"同一性"とは、配列のストリング間のマッチによって決定される、ポリペプチドまたは核酸分子配列間の配列関連性の程度も意味する。"同一性"は、限定するものではないが、Computatiorzal Molecular Biology, Lesk, A. M.編, Oxford University Press, New York(1988); Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.編, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. and Griffin, H. G.編, Humana Press, New Jersey (1994);Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press (1987) ;Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J.編, Stockton Press, New York (1991);およびCarillo, H.およびLipman, D., SIAM J Applied Math, 48: 1073 (1988)に記載されているものを含む公知の方法によって簡単に計算し得る。同一性を決定する方法を設計して、テストした配列間の最大マッチを得る。さらに、同一性を決定する方法は、公共的に入手可能なプログラムに体系化されている。２の配列間の同一性を決定するために使用することができるコンピュータ・プログラムには、限定するものではいが、GCG (Devereux, J.,ら, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984);５のＢＬＡＳＴプログラムの組、ヌクレオチド配列クエリー用に設計された３つのプログラム（ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびＴＢＬＡＳＴＸ）ならびにタンパク質配列クエリー用に設計された２つのプログラム（ＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮ）が含まれる(Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birrenら, Genome Analysis, 1: 543-559 (1997))。BLASTXプログラムはＮＣＢＩおよび他のソース(BLAST Manual, Altschul, S.ら, NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら, J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990))から公共的に入手可能である。よく知られているSmith Watermanアルゴリズムを用いても同一性を決定し得る。
【００５５】
典型的に、ポリペプチド配列比較のパラメータには以下のものが含まれる：
アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス: HentikoffおよびHentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992)からのBLOSSUM62 
Gap Penalty: 12
Gap Length Penalty: 4 
【００５６】
本明細書中で使用する"％同一性"は、核酸分子配列比較用のデフォルト・パラメータとしての上記パラメータおよびＧＣＧ、version 10.2からの"ギャップ"プログラムを用いて決定する。
【００５７】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子に関する。詳細には、本発明は、前記の核酸分子にストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子に関する。本明細書中で使用する"ストリンジェントな条件"および"ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件"なる語は、配列間に少なくとも９５％および好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合に一般的にハイブリダイゼーションが起こることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃にての一晩インキュベーション、それにつづく０．１×ＳＳＣ中のハイブリダイゼーション支持体のほぼ６５℃にての洗浄である。他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)、詳細には第１１章に例示されている。
【００５８】
核酸配列が、発現した場合に、植物中のＦＡＤ２−２遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに部分的、実質的、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルならびに少なくとも１のＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる場合、好ましいＦＡＤ２−１核酸配列は（１）配列番号：１、配列番号：２およびそれらのフラグメントよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列であるが、ストリンジェントな条件下で配列番号：４のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしない核酸配列；（２）ダイズＦＡＤ２−１遺伝子イントロン中にも見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を示す核酸分子、よりなる群から選択される。
【００５９】
核酸配列が、発現した場合に、植物中のＦＡＤ２−１遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに部分的、実質的、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ２−２遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルならびに少なくとも１のＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物のレベルを選択的に低下することができる形態において、好ましいＦＡＤ２−２核酸配列は（１）配列番号：４のヌクレオチド配列およびそれらのフラグメントを有する核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列であるが、ストリンジェントな条件下で配列番号：１および配列番号：２よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしない核酸配列；（２）ダイズＦＡＤ２−２遺伝子イントロン中にも見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を示す核酸分子、よりなる群から選択される。
【００６０】
核酸配列が、発現した場合に、ＦＡＤ３遺伝子を選択的に低下することができる場合、好ましいＦＡＤ３核酸配列は（１）配列番号：５−１４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子およびそのフラグメントの全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列であるが、ストリンジェントな条件下で配列番号：１、配列番号：２および配列番号：４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしない核酸配列；（２）ダイズＦＡＤ３遺伝子イントロン中にも見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を示す核酸分子、よりなる群から選択される。
【００６１】
本発明の核酸分子の１のサブセットには、フラグメント核酸分子が含まれる。フラグメント核酸分子は、具体的に開示されているもののごとき、本発明の極めて重要な部分（または複数の部分）の、あるいは本発明の実に大部分の核酸分子からなり得る。あるいは、該フラグメントは、より少ないオリゴヌクレオチド（約１５ないし約４００の隣接するヌクレオチド残基およびより好ましくは約１５ないし約３０の隣接するヌクレオチド残基、または約５０ないし約１００の隣接するヌクレオチド残基、または約１００ないし約２００の隣接するヌクレオチド残基、または約２００ないし約４００の隣接するヌクレオチド残基、または約２７５ないし約３５０の隣接するヌクレオチド残基）を含み得る。
【００６２】
もう１の態様において、フラグメント核酸分子は、本発明の核酸分子の少なくとも１５、２５、５０または１００の隣接するヌクレオチドである核酸配列を有する。好ましい具体例において、核酸分子は配列番号：１ないし配列番号：１４およびそれらの相補体よりなる群から選択される核酸配列を有する核酸分子の少なくとも１５、２５、５０または１００の隣接するヌクレオチドである核酸配列を有する。
【００６３】
１またはそれを超える本発明の核酸分子のフラグメントは、プローブ、具体的にはＰＣＲプローブとなり得る。ＰＣＲプローブとは、もう１との核酸分子との二本鎖構造のままで、ポリメラーゼ活性を開始することができる核酸分子である。ＰＣＲプローブの構造を決定するための種々の方法およびＰＣＲ技術等が当該技術分野に存在する。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)、ＳＴＳＰｉｐｅｌｉｎｅ(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www-STSPipeline)、またはＧｅｎｅＵｐ(Pesoleら, BioTechniques 25 : 112-123 (1998))を用いて潜在的なＰＣＲプライマーを同定し得る。
【００６４】
本発明の核酸分子またはそのフラグメントは、ある種の環境下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができる。本発明の核酸分子には、配列番号：１ないし配列番号：１４よりなる群から選択される核酸配列を有する核酸分子、その相補体、およびいずれかのフラグメントに特異的にハイブリダイズするものが含まれる。
【００６５】
本明細書中で使用するように、２の核酸分子が対向平行の二本鎖核酸構造を形成することができる場合、２の核酸分子は互いに特異的にハイブリダイズすることができるという。
本発明の核酸分子は、ホモログ核酸分子もコードし得る。本明細書中で使用するホモログ核酸分子またはそのフラグメントは、第２の種における対応核酸分子またはそのフラグメントである（例えば、トウモロコシＦＡＤ２−１イントロン核酸分子は、アラビドプシス（Arabidopsis）ＦＡＤ２−１イントロン核酸分子のホモログである）。ホモログは、分子が元のポリペプチドの少なくとも１の機能または構造特徴を保持するように、分子進化法またはＤＮＡシャフリング技術によっても作製し得る（例えば、米国特許第5,811,238号）。
【００６６】
もう１の形態において、ホモログは、アルファルファ、アラビドプシス（Arabidopsis）、オオムギ、ブラシカ・カンペストリス（Brassica campestris）、セイヨウアブラナ、ブロッコリ、キャベツ、キャノーラ、柑橘属、ワタ、ニンニク、エンバク、アリウム（Allium)、アマ、観賞植物、ホホバ、ラッカセイ、コショウ、ジャガイモ、ナタネ、コメ、ライ麦、ソルガム、イチゴ、サトウキビ、テンサイ、トマト、コムギ、ポプラ、マツ、モミ、ユーカリノキ、リンゴ、レタス、ヒラマメ、ブドウ、バナナ、チャノキ、シバ、ヒマワリ、ファセオラス（Phaseolus)、ハマナ、カラシナ、ヒマ、ゴマ、綿実、アマニ、ベニバナ、およびオリーブ油よりなる群から選択される植物から得る。より詳細には、好ましいホモログは、キャノーラ、トウモロコシ、ブラシカ・カンペストリス、セイヨウアブラナ、ダイズ、ハマナ、カラシナ、ヒマ、ラッカセイ、ゴマ、綿実、アマニ、ナタネ、ヒマワリ、ギネアアブラヤシ、アマおよびヒマワリよりなる群から選択される植物から得る。なおより好ましい形態において、ホモログは、キャノーラ、ナタネ、トウモロコシ、ブラシカ・カンペストリス、セイヨウアブラナ、ダイズ、ヒマワリ、ベニバナ、ギネアアブラヤシおよびラッカセイよりなる群から選択される植物から得る。
【００６７】
植物構築物および植物形質転換体
１またはそれを超える本発明の核酸分子を、植物の形質転換またはトランスフェクションに用い得る。外来性の遺伝物質は植物細胞に移入し、その植物細胞を全体の受精能力のあるまたは不稔性の植物または植物部分に再生することができる。外来性の遺伝物質は、天然に発生するものか否かにかかわらず、いずれかの生物に挿入することができるいずれかの起源からのいずれかの遺伝物質である。
【００６８】
植物は、１を超えるＦＡＤ２またはＦＡＤ３遺伝子のファミリー（すなわち、植物のゲノム内の異なる場所に存在する特定された活性を有する酵素をコードする遺伝子）を有し得る。本明細書中で使用する"ＦＡＤ２遺伝子ファミリーメンバー"とは植物の遺伝物質内に見出されるいずれかのＦＡＤ２遺伝子である。本明細書中で使用する"ＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバー"とは、植物の遺伝子物質内に見出されるいずれかのＦＡＤ３遺伝子である。１の形態において、遺伝子ファミリーは核酸配列の類似性によってされらに分類し得る。この形態の好ましい態様において、遺伝子ファミリーメンバーは、遺伝子のコーディング配列部分において少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の核酸配列同一性を示す。
【００６９】
本発明の１の態様において、植物には二本鎖ＲＮＡｉ構築物が含まれ、そこにおいて、第１のプロモーターは、配列番号：１ないし配列番号：２、その相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約８５％同一性を有する第１の核酸配列、および配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約８５％同一性を有する第２の核酸配列を有する第１の核酸分子に作動可能に連結されている。
【００７０】
本発明により提供するのは、第１のプロモーターが、配列番号：１ないし２、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約８５％同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に作動可能に連結されており、配列番号：４ないし配列番号：１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも約８５％同一性を有する第２の核酸配列を有する第２の核酸分子がｄｓＲＮＡｉ構造中の第２のプロモーターに作動可能に連結されている二本鎖ＲＮＡｉ構築物を含む植物である。
【００７１】
本発明の１の形態において、第２のファミリーメンバーのタンパク質または転写物のレベルに部分的に影響せずに、その遺伝子の１のファミリーメンバーにおけるタンパク質または転写物の発現レベルを選択的に低下する。本発明の好ましい形態において、第２のファミリーメンバーのタンパク質または転写物のレベルに実質的に影響せずに、その遺伝子の１のファミリーメンバーにおけるタンパク質または転写物の発現レベルを選択的に低下する。本発明の非常に好ましい形態において、第２のファミリーメンバーのタンパク質または転写物のレベルに本質的に影響せずに、その遺伝子の１のファミリーメンバーにおけるタンパク質または転写物の発現レベルを選択的に低下する。
【００７２】
特に好ましい形態において、本発明の植物には、発現した場合、植物中の少なくとも１の他のＦＡＤ２またはＦＡＤ３遺伝子のタンパク質および／転写物のレベルに部分的に影響しないで、特定のＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／転写物の発現レベルを選択的に低下することができる核酸配列が含まれる。特に好ましい形態において、本発明の植物には、発現した場合、植物中の少なくとも１の他のＦＡＤ２またはＦＡＤ３遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに実質的に影響せずに、ある種のＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる核酸配列が含まれる。特に好ましい形態において、本発明の植物には、発現した場合、植物中の少なくとも１の他のＦＡＤ２またはＦＡＤ３遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに本質的に影響しないで、特定のＦＡＤ２およびＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる核酸配列が含まれる。
【００７３】
より特に好ましい形態において、本発明のダイズ植物には、発現した場合、植物中のＦＡＤ２−２遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響せずに、ＦＡＤ２−１遺伝子および少なくとも１のＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる核酸配列が含まれる。より特に好ましい形態において、本発明のダイズ植物には、発現した場合、植物中のＦＡＤ２−２遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに実質的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子および少なくともＦＡＤ３遺伝子によってコードされたタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる核酸配列が含まれる。より特に好ましい形態において、本発明のダイズ植物には、発現した場合、植物中のＦＡＳ２−２遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに本質的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子および少なくともＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる核酸配列が含まれる。
【００７４】
もう１のより特に好ましい形態において、本発明のダイズ植物には、発現した場合、植物中のＦＡＤ２−２遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子ならびに少なくとも２、３またはそれを超えるＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる核酸配列が含まれる。もう１のより特に好ましい具体例において、本発明のダイズ植物には、発現した場合、植物中のＦＡＤ２−２遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに実質的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子ならびに少なくとも２、３またはそれを超えるＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる核酸配列が含まれる。もう１のより特に好ましい形態において、本発明のダイズ植物には、発現した場合、植物中のＦＡＤ２−２遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに本質的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子ならびに少なくとも２、３またはそれを超えるＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる核酸配列が含まれる。
【００７５】
好ましい形態において、本発明のダイズには、ＦＡＤ３イントロンまたはそのフラグメントよりなる群から選択される、より好ましくは配列番号：５−１４またはそのフラグメントよりなる群から選択される核酸分子から選択される外来性核酸配列が含まれる。
【００７６】
特に好ましい形態において、本発明のダイズには、発現した場合、植物中のＦＡＤ３−１Ｂ遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、ＦＡＤ３−１Ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを低下することができる核酸配列が含まれる。特に好ましい形態において、本発明のダイズには、発現した場合、植物中のＦＡＤ３−１Ｂ遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに実質的に影響しないで、ＦＡＤ３−１Ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを低下することができる核酸配列が含まれる。特に好ましい形態において、本発明のダイズには、発現した場合、植物中のＦＡＤ３−１Ｂ遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに本質的に影響しないで、ＦＡＤ３−１Ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを低下することができる核酸配列が含まれる。
【００７７】
核酸配列が、発現した場合、植物中のＦＡＤ２−２遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる場合、好ましいＦＡＤ２−１核酸配列は、（１）配列番号：１、配列番号：２およびそれらのフラグメントよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する核酸配列であるが、ストリンジェントな条件下で配列番号：４のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしない核酸配列；（２）ダイズＦＡＤ２−１遺伝子イントロン中にも見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を示す核酸分子、よりなる群から選択される。
【００７８】
核酸配列が、発現した場合、ＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる場合、好ましいＦＡＤ３核酸配列は、（１）配列番号：５−１４およびそれらのフラグメントよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列であるが、ストリンジェントな条件下で配列番号：１、配列番号：２および配列番号：４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしない核酸配列；（２）ダイズＦＡＤ３遺伝子イントロン中にも見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を示す核酸分子、よりなる群から選択される。
【００７９】
好ましい形態において、本発明のダイズ種子は５０％以上のオレイン酸および１０％以下のリノレン酸である油組成を有する。より好ましい形態において、本発明のダイズ種子は６０％以上のオレイン酸および７％以下のリノレン酸である油組成を有する。特に好ましい具体例において、本発明のダイズ種子は６５％以上のオレイン酸および５％以下のリノレン酸、好ましくは４％以下のリノレン酸、およびより好ましくは３％以下のリノレン酸である油組成を有する。本明細書中で使用する、植物または種子のごとき植物部分内の油のすべての％組成は、相対モルパーセントによって決定する。
【００８０】
もう１の好ましい形態において、本発明のダイズ種子は５０％ないし９０％のオレイン酸、および１０％以下のリノレン酸である油組成を有する。より好ましい形態において、本発明のダイズ種子は６０％ないし８０％のオレイン酸および７％以下のリノレン酸である油組成を有する。特に好ましい形態において、本発明のダイズ種子は６５％ないし７５％のオレイン酸、および５％以下のリノレン酸、好ましくは４％以下のリノレン酸およびより好ましくは３％以下のリノレン酸である油組成を有する。
【００８１】
もう１の好ましい形態において、本発明のダイズ種子は５０％ないし９０％のオレイン酸、８％ないし１６％のパルミチン酸および１０％以下のリノレン酸である油組成を有する。より好ましい形態において、本発明のダイズ種子は６０％ないし８０％のオレイン酸、６％ないし１２％のパルミチン酸および７％以下のリノレン酸である油組成を有する。特に好ましい形態において、本発明のダイズ種子は６５％ないし７５％のオレイン酸、８％ないし１１％のパルミチン酸および５％以下のリノレン酸、好ましくは４％以下のリノレン酸およびより好ましくは３％以下のリノレン酸である油組成を有する。
【００８２】
特に好ましい形態において、本発明のダイズ種子は６５％ないし７５％のオレイン酸、および５％以下のリノレン酸、好ましくは４％以下のリノレン酸およびより好ましくは３％以下のリノレン酸である油組成を有し、核酸配列が、発現した場合、植物中のＦＡＤ２−２遺伝子のタンパク質および／または転写物のレベルに部分的に影響しないで、実質的に影響しないで、または本質的に影響しないで、ＦＡＤ２−１遺伝子ならびに少なくとも１のＦＡＤ３遺伝子によってコードされるタンパク質および／または転写物の発現レベルを選択的に低下することができる場合、ＦＡＤ２−１核酸配列は（１）配列番号：１、配列番号：２およびそれらのフラグメントよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列であるが、ストリンジェントな条件下で配列番号：４のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしない核酸配列；（２）ダイズＦＡＤ２−１遺伝子イントロン中にも見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を示す核酸分子、よりなる群から選択され、ＦＡＤ３核酸配列は（１）配列番号：５−１４およびそれらのフラグメントよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列であるが、ストリンジェントな条件下で配列番号：１、配列番号：２および配列番号：４よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズしない核酸配列；（２）ダイズＦＡＤ３遺伝子イントロン中にも見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を示す核酸分子、よりなる群から選択される。
【００８３】
もう１の形態において、本発明のダイズ種子は８０％以上、より好ましくは９０％以上のオレイン酸および５％以下のリノレン酸、好ましくは４％以下のリノレン酸およびより好ましくは３％以下のリノレン酸である油組成を有する。
【００８４】
好ましい形態において、本発明のダイズ種子は８０％以上、より好ましくは９０％以上のオレイン酸および５％以下のリノレン酸、好ましくは４％以下のリノレン酸、およびより好ましくは３％以下のリノレン酸である油組成を有し、核酸配列はＦＡＤ２−１、ＦＡＤ２−２および少なくとも１のＦＡＤ３遺伝子の発現を低下することができる。この態様の特に好ましい形態において、核酸配列は配列番号：１ないし配列番号：１４、それらの相補体およびいずれかのフラグメントよりなる群から選択される。
【００８５】
本発明の好ましい形態において、本発明のダイズ種子は５０％以上のオレイン酸、より好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上のオレイン酸の油組成を有する。
【００８６】
本発明のもう１の好ましい形態において、本発明のダイズ種子は１０％以下のリノレン酸、より好ましくは５％以下の、４％以下のまたは３％以下のリノレン酸である油組成を有する。
【００８７】
類似の遺伝物質は、他の種、例えば単子葉植物または双子葉植物からも得ることができ、それには限定するものではないが、キャノーラ、トウモロコシ、ダイズ、アラビドプシス（Arabidopsis)、ファセオラス（Phaseolus）、ラッカセイ、アルファルファ、コムギ、コメ、エンバク、サトウモロコシ、セイヨウアブラナ、ライムギ、オオムギ、キビ（millet）、フェストゥーカ属各種草本、多年生ライグラス、サトウキビ、クランベリー、パパイヤ、バナナ、ベニバナ、ギネアアブラヤシ、アマ、マスクメロン、リンゴ、キュウリ、デンドロビウム、グラジオラス、キク、ユリ、ワタ、ユーカリノキ、ヒマワリ、ブラシカ・カンペストリス（Brassica campestris)、セイヨウアブラナ（oilseed rape）、シバ（turfgrass）、テンサイ、コーヒーおよびヤマノイモ属各種植物（dioscorea）(Christou, INO : Particle Bombardment for Genetic Engineering of Plants, Biotechnology Intelligence Unit. Academic Press, San Diego, California (1996))が含まれるが、キャノーラ、トウモロコシ、ブラシカ・カンペストリス、セイヨウアブラナ、ナタネ、ダイズ、ハマナ、カラシナ、ヒマ、ラッカセイ、ゴマ、綿実、アマニ、ベニバナ、ギネアアブラヤシ、アマ、およびヒマワリが好ましく、キャノーラ、ナタネ、トウモロコシ、ブラシカ・カンペストリス、セイヨウアブラナ、ダイズ、ヒマワリ、ベニバナ、ギネアアブラヤシ、およびラッカセイがより好ましい。より好ましい形態において、遺伝物質をキャノーラに移す。もう１のより好ましい形態において、遺伝物質をセイヨウアブラナに移した。もう１の特に好ましい形態において、遺伝物質をダイズに移した。
【００８８】
転写物またはタンパク質のごとき生成物のレベルは植物のごとき生物全体を通して増減し得、あるいは生物の１またはそれを超える特定の器官または組織に局在し得る。例えば、生成物のレベルは、限定するものではないが：地下部、塊茎、茎、稈、果実、食用小果実、殻斗果、樹皮、莢、種子および花が含まれる。好ましい器官はは種子である。
【００８９】
外来性遺伝物質は、かかる目的で設計したＤＮＡベクターまたは構築物の使用によって宿主細胞に移入し得る。かかるベクターの設計は、一般的に当該技術分野の範囲内である（Plant Molecular Biology : A Laboratory Manual, Clark (編), Springer, New York (1997)を参照されたい)。 
【００９０】
構築物またはベクターには、選択の核酸分子を発現するための植物プロモーターが含まれ得る。好ましい形態において、本明細書中に記載するいずれかの核酸分子を、植物細胞中で機能してｍＲＮＡの生成を引き起こすプロモーター領域に作動可能に連結し得る。例えば、植物細胞中で機能してｍＲＮＡ分子の生成を引き起こすいずれかのプロモーターを使用することができ、限定するものでないが本明細書中に記載されているプロモーターのごときを使用することができる。好ましい形態において、プロモーターは植物プロモーターである。
【００９１】
植物細胞中で活性である多くのプロモーターが文献に記載されている。これらには、限定するものではないが、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebertら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84 : 5745-5749 (1987))、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（これはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＴｉプラスミド上で行う）、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＮＶ）１９Ｓプロモーター（Lawtonら, Plant Mol. Biol. 9: 315-324 (1987)）およびＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Odellら, Nature 313: 810-812 (1985)) のごときカリモウイルス・プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓ−プロモータ（米国特許第5,378,619号）、リブロース−１,５−ビス−リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット(ssRUBISCO）からの光誘導型プロモーター、Ａｄｈプロモーター（Walkerら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 84 : 6624-6628 (1987))、スクロースシンターゼプロモーター（Yangら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 87 : 4144-4148 (1990))、Ｒ遺伝子複合体プロモーター(Chandlerら, The Plant Cell 1 : 1175-1183 (1989))およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーターが含まれる。これらのプロモーターを用いて、植物中で発現しているＤＮＡ構築物を作製する；例えば、国際公開ＷＯ８４／０２９１３を参照されたい）。ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターは植物における使用に好ましい。植物細胞におけるＤＮＡの転写を引き起こすことが知られているまたは見出されているプロモーターは本発明において使用し得る。
【００９２】
特に好ましいプロモーターを用いて、種子または果実中で本発明の核酸分子を発現することもできる。事実、好ましい形態において、使用するプロモーターは種子特異的プロモーターである。かかるプロモーターの例には、ナピン（Kridlら, Seed Sci. Res. 1: 209: 219 (1991)、ファゼオリン（Bustosら, Plant Cell, 1 (9): 839-853 (1989)）、ダイズ・トリプシン・インヒビター（Riggsら, Plant Cell 1 (6): 609-621 (1989)）、ＡＣＰ（Baersonら, Plant Mol. Biol., 22 (2): 255-267 (1993)）、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（Slocombeら, Plant Physiol. 104(4): 167-176 (1994)）、ダイズのｂ−コングリシニンのａ’サブユニット（soy 7s, (Chenら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8560-8564 (1986)))、およびオレオシン（例えば、Hongら, Plant Mol. Biol., 34 (3): 549-555 (1997)を参照されたい）からの５'調節領域が含まれる。さらなる例には、β−コングリシンのプロモーター（Chenら, Dev. Genet. 10: 112-122 (1989)）およびＦＡＥのプロモーター（国際公開ＷＯ０１／１１０６１）が含まれる。種子において発現するための好ましいプロモーターは７Ｓおよびナピン・プロモーターである。
【００９３】
利用し得るさらなるプロモーターは、例えば、米国特許第5,378,619号；第5,391,725号；第5,428,147号；第5,447,858号；第5,608,144号；第5,608,144号；第5,614,399号；第5,633,441号；第5,633,435号および第4,633,436号に記載されている。
さらに、組織特異的エンハンサーを使用し得る（Frommら, The Plant Cell 1: 977-984 (1989)）。
【００９４】
構築物またはベクターは、関心のある領域と一緒に、全体または部分的に、その領域の転写を終止するよう作用する核酸配列も含み得る。多くのかかる配列が単離されており、Ｔｒ７ ３’配列およびＮＯＳ３'配列（Ingelbrechtら, The Plant Cell 1: 671-680 (1989); Bevanら, Nucleic Acids Res. 11: 369-385 (1983)）が含まれる。同様に、本発明の植物発現構築物には、調節転写終止領域を供し得る。転写終止領域は、関心のある遺伝子をコードするＤＮＡ配列または異なる遺伝子源に由来する簡単な転写終止領域、例えば、転写開始領域と天然に関連する転写終止領域によって提供される。当業者であれば、植物細胞において転写を終止することができるいずれかの簡単な転写終止領域を本発明の構築物に用い得ることを認識するであろう。
【００９５】
ベクターまたは構築物には調節エレメントも含まれ得る。それらの例には、Ａｄｈイントロン１（Callisら, Genes and Develop. 1: 1183-1200 (1987)）、スクロースシンターゼ・イントロン（Vasilら, Plant Physiol. 91: 1575-1579)）およびＴＭＶオメガ・エレメント（Gallieら, The Plant Cell 1: 301-311 (1989)）が含まれる。これらおよび他の調節エレメントを適当な場合には含め得る。
【００９６】
ベクターまたは構築物には選択マーカーも含まれ得る。選択マーカーを用いて、外来性遺伝物質を含有する植物または植物細胞を選抜することもできる。それらの例には、限定するものではないが：ｎｅｏ遺伝子（Potrykusら, Mol. Gen. Genet. 199: 183- 188 (1985))、これはカナマイシン耐性をコードし、カナマイシンを用いて選抜することができる、ＲｐｔＩＩ, Ｇ４１８, ｈｐｔ；ビアラホス耐性をコードするｂａｒ遺伝子；突然変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（Hincheeら, Bio/Technology 6: 915-922 (1988)；Reynaertsら, Selectable and Screenable Markers.  In Gelvin and Schilperoort.  Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht (1988); Reynaertsら, Selectable and screenable markers. In Gelvin and Schilperoort. Plant Molecular Biology Manual, Kluwer, Dordrecht (1988))、グリホセート耐性をコードするａａｄＡ（Jonesら, Mol. Gen. Genet. (1987))；ブロモキシニルに対する耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子（Stalkerら, J. Biol. Chem. 263: 6310-6314 (1988)）；イミダゾリノンまたはスルホリニル尿素耐性を付与する突然変異アセトラクテート・シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許出願１５４,２０４（１９８５年９月１１日））、ＡＬＳ（D'Halluinら, Bio/Technology 10: 309-314 (1992)）およびメトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（Thilletら, J. Biol. Chem. 263: 12500-12508 (1988)）が含まれる。
【００９７】
ベクターまたは構築物には選択マーカーも含まれ得る。スクリーニング可能なマーカーを用いて発現をモニターすることができる。例示的なスクリーニング可能なマーカーには：種々の発色体基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson, Plant Mol. Biol, Rep. 5. 387-405 (1987); Jeffersonら, EMBO J 6: 3901-3907 (1987)）；植物組織中のアントシアニン色素（赤色）の生成を調節する生成物をコードするＲ−遺伝子座遺伝子（Dellaportaら, Stadler Symposium 11 : 263-282 (1988)）；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffeら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 75 : 3737-3741 (1978)）、種々の発色体基質が知られている酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色体セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Owら, Science 234: 856-859 (1986)）；発色体カテコールを変換し得るカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowskyら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80: 1101-1105 (1983)；α−アミラーゼ遺伝子（Ikatuら, Bio/Technol. 8: 241-242 (1990)）；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化し、ついでこれはメラニンに縮合する酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katzら, J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714 (1983)）; 発色体α−ガラクトース基質に変化するであろうα−ガラクトシダーゼが含まれる。
【００９８】
本発明のいずれの核酸分子および構築物も、恒久的または一時的な様式で植物または植物細胞に導入し得る。本発明の好ましい核酸分子および構築物は、発明の詳細な説明および実施例に前記している。本発明のもう１の形態は、一般的に、好適な植物または植物細胞を選抜し、該植物または植物細胞を組換えベクターで形質転換し、ついで形質転換宿主細胞を得る工程を含むトランスジェニック植物の作製方法に指向される。
【００９９】
好ましい形態において、植物または細胞は、食用および産業用途用の植物油の産生に関与する植物であるか、またはその植物に由来する。とりわけ好ましいのは、温帯性の脂肪種子作物である。関心のある植物には、限定されるものではないが、ナタネ（キャノーラおよび高エルカ酸品種）、トウモロコシ、ダイズ、ハマナ、カラシナ、ヒマ、ラッカセイ、ゴマ、ワタ、アマニ、ベニバナ、ギネアアブラヤシ、アマ、ヒマワリ、およびココヤシが含まれる。本発明は単子葉植物種または双子葉植物種に対して同様に適用可能であり、新たなおよび／または改良された形質転換および調節技術に容易に適用可能である。
【０１００】
植物細胞にＤＮＡを導入する方法および技術は当業者によく知られており、細胞に核酸分子を導入し得るいずれの方法も本発明における使用に好適である。好適な方法の非限定的な例には：化学的方法；マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ジーンガン、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントおよび真空浸透のごとき物理学的方法；ウイルスベクター；および受容体媒介機構が含まれる。細胞形質転換の他の方法を用いることもでき、それには、限定するものではないが、花粉への直接ＤＮＡ移入、植物の生殖器へのＤＮＡの直接注射、または未成熟胚の細胞へのＤＮＡの直接注射につづく乾燥した胚の脱水による植物へのＤＮＡの直接注射の導入が含まれる。
【０１０１】
アグロバクテリウム媒介移入は、植物細胞へ遺伝子を導入するための広く適用可能なシステムである。例えば、Fraleyら, Bio/Technology 3: 629-635 (1985); Rogersら, Methods Enzymol. 153: 253-277 (1987)を参照されたい。移入すべきＤＮＡの領域は境界配列によって画定し、通常、介在するＤＮＡが植物ゲノムに挿入される。Spielmannら, Mol. Gen. Genet. 205: 34 (1986)。現代のアグロバクテリウム形質転換ベクターはアグロバクテリウムと同様にイー・コリ（E．coli）中で複製することができ、簡便な操作が許容される（Klee ら, In: Plant DNA Infectious Agents, HohnおよびSchell (編), Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985)）。
【０１０２】
単一の植物プロトプラスト形質転換体または種々の形質転換エクスプラントからの植物の再生、生育および栽培は当該技術分野でよく知られている（一般的に、Maligaら, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); WeissbachおよびWeissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA (1988)を参照されたい）。本発明の植物は、育種プログラムの一部分とすることもでき、またはそれから創製することができ、アポミクシスを用いて再生することもできる。アポミクト植物の作製方法は当該技術分野で知られている。例えば、米国特許第5,811,636号を参照されたい。
【０１０３】
共抑制（cosuppression）は、内因性遺伝子の転写物と同じ要素を有するｍＲＮＡを転写することができる相同なセンス構築物の発現による、特定の内因性遺伝子または遺伝子ファミリーの発現レベル、通常はＲＮＡのレベルでの発現レベルにおける低下である（Napoliら, Plan Cell 2: 279-289 (1990); van der Krolら, Plant Cell 2: 291-299 (1990)）。共抑制は細胞とともに見出された核酸配列に相同な単一コピー核酸分子での（ProllsおよびMeyer, Plant J. 2: 465-475 (1992)）、または細胞とともに見出された核酸配列に相同である核酸分子の複数のコピーでの（Mittlestenら, Mol. Gen. Genet. 244: 325-330 (1994)）安定な形質転換から生じ得る。異なっていても相同プロモーターにリンクする遺伝子は、リンクした遺伝子の共抑制を生じる（Vaucheret, C. R. Acad. Sci. III 316: 1471-1483 (1993); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 91: 3490-3496 (1994)；van Bloklandら, Plant J. 6: 861-877 (1994); Jorgensen, Trends Biotechnol. 8: 340-344 (1990); MeinsおよびKunz, In: Gene Inactivation and Homologous Recombination in Plants, Paszkowski (編), pp. 335-348, Kluwer Academic, Netherlands (1994)；Kinney, Induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement, Proceedings of a Symposium 19-23 June 1995 (IAEAおよびFAによる共同組織), pages 101-113 (IAEA-SM 340-49)）。
【０１０４】
本発明の１またはそれを超える核酸を植物細胞に導入し得、内因性タンパク質の共抑制を生じるかかる転写を有する適当なプロモーターを用いて転写し得ることは理解される。かかる核酸分子は、多シストロン構造の同じプロモーターまたは異なるプロモーターに作動可能に連結し得る。
【０１０５】
アンチセンス・アプローチは、遺伝子物質をターゲティングすることによって遺伝子機能を妨害または低下させる方法である（Molら, FEBS Lett. 268 : 427-430 (1990)）。アンチセンス・アプローチの目的は、標的遺伝子に相補的な配列を用いてその発現を遮断し、単一の選択されたタンパク質のレベルを選択的に低下または破壊された突然変異セルラインまたは生物を創製することである。アンチセンス技術は"逆遺伝子"アプローチを超える幾つかの利点を有する。不活性化の部位およびその発展的効果は、アンチセンス遺伝子のプロモーターの選択または外部適用またはマイクロインジェクションのタイミングによって操作することができる。アンチセンスは、他の関連する遺伝子に相同性を共有している標的遺伝子または領域のいずれかのユニークな領域を選択することによってその特異性を操作し得る（Hiattら, In: Genetic Engineering, Setlow (編), Vol. 11, New York: Plenum 49-63 (1989)）。
【０１０６】
アンチセンスＲＮＡ技術には、標的ｍＲＮＡに対して相補的であるＲＮＡを細胞に導入することが含まれ、これはアンチセンス基質と標的ｍＲＮＡとの間の塩基対形成によって形成される特異的なＲＮＡ：ＲＮＡを生じる（Greenら, Annu. Rev. Biochem. 55: 569-597 (1986)）。１の形態の下で、方法にはアンチセンス遺伝子配列の導入および発現が含まれる。かかる配列は、"間違った"または相補鎖が標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする非コードアンチセンスＲＮＡに転写され、その発現を妨害するように、正常な遺伝子配列の一部分または全部が逆の向きでプロモーター下に置かれたものである(TakayamaおよびInouye, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25: 155-184 (1990)）。アンチセンスベクターは、標準的な手法によって構築し、限定するものではないが、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびインフェクションを含む方法によって細胞に導入する。形質転換の型およびベクターの選択は、発現が一時的であるか安定であるかを決定するであろう。アンチセンス遺伝子に用いるプロモーターは、アンチセンス阻害のレベル、タイミング、組織、特異性または誘導性に影響し得る。
【０１０７】
二本鎖ＲＮＡの細胞への導入は内因性遺伝子の機能を崩壊させるためにも使用し得る（Fireら, Nature 391: 806-811 (1998)）。かかる崩壊は、例えば、カエノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）で実証されており、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉといわれる場合がある（Fireら, Nature 391 : 806-811 (1998)）。二本鎖ＲＮＡによるシイ・エレガンスにおける遺伝子発現の崩壊は、転写後機構による抑制を誘導すると報告されている（Montgomeryら, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 15502-15507 (1998)）。二本鎖ＲＮＡによる遺伝子サイレンスの事実は植物についても報告されている（Waterhouseら, Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 13959-13964 (1998)）。
【０１０８】
報告されているところによれば、イントロン・スプライシングされたヘアピン構造を用いても、転写後遺伝子抑制に影響し得る（Smithら, Nature 407: 319-320 (2000)）。かかる報告は、転写後の遺伝子サイレンス化が、ヘアピン構造を有するイントロン・スプライシングされたＲＮＡを使用することによってほぼ１００％の効率で誘導し得ることを示している（Smithら, Nature 407: 319-320 (2000)）。
【０１０９】
本発明の１またはそれを超える核酸を、ＲＮＡｉまたは転写後遺伝子抑制のもう１のモードに影響するために修飾し得ることは理解される。
【０１１０】
また、本発明は、植物の部分、詳細には生殖部分または貯蔵部分も提供する。植物の部分には、限定するものではないが、種子、内胚乳、胚珠、花粉、地下部、
塊茎、茎、葉、柄、果実、液果、堅果、樹皮、莢、種子および花が含まれる。本発明の特に好ましい形態において、植物部分は種子である。
【０１１１】
本発明は、１００００種子を超える、より好ましくは２００００種子を超える、なおより好ましくは４００００種子を超える種子の容器も提供し、ここにその１０％を超える、より好ましくは２５％を超える、より好ましくは５０％を超える、およびなおより好ましくは７５％または９０％を超える種子は本発明の植物に由来する種子である。
【０１１２】
本発明は、１０ｋｇを超える、より好ましくは３５ｋｇを超える、なおより好ましくは７５％または９０％を超える種子の容器も提供し、ここにその１０％を超える、より好ましくは２５％を超える、より好ましくは５０％を超える、なおより好ましくは７５％または９０％を超える種子は本発明の植物に由来する。
【０１１３】
本発明のいずれの植物またはその部分も加工して、食餌、粉餌、タンパク質または油調製物を製造し得る。この目的に特に好ましい植物部分は、種子である。好ましい形態において、食餌、粉餌、タンパク質または油調製物は、家畜動物またはヒト、またはその両方用に設計する。食餌、粉餌、タンパク質および油調製物を製造する方法は当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第4,957,748号、第5,100,679号、第5,219,596号、第5,936,069号、第6,005,076号、第6,146,669号および第6,156,227号を参照されたい）。好ましい形態において、タンパク質調製物は高タンパク質調製物である。かかる高タンパク質調製物は、好ましくは５％ｗ／ｖを超える、より好ましくは１０％ｗ／ｖを超える、なおより好ましくは１５％ｗ／ｖを超えるタンパク質含量を有する。好ましい油調製物において、油調製物は５％ｗ／ｖを超える、より好ましくは１０％ｗ／ｖを超える、なおより好ましくは１５％ｗ／ｖを超える本発明の植物またはその部分由来の油含量を有する高油調製物である。好ましい形態において、油調製物は液体であり、１、４、１０または５０リットルを超える体積のものである。本発明は、本発明の植物から製造したか、または本発明の方法によって創製した油を提供する。かかる油は、高められた酸化安定性を示し得る。また、かかる油はいずれかの得られる生成物の微量または主要な成分となり得る。さらに、かかる油は他の油と混合してもよい。好ましい具体例において、本発明の植物から製造したかまたは本発明の方法によって創製した油は、いずれかの生成物の油成分の０.５％、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または９０％（体積％または重量％）を超える部分を構成する。もう１の形態において、油調製物は混合することができ、混合物の１０％、２５％、３５％、５０％または７５％を超える部分を構成することができる。本発明の植物から製造した油は１またはそれを超える有機溶媒または石油蒸留物と混合することができる。
【０１１４】
１の形態において、本発明の油は５０％以上のオレイン酸および１０％以下のリノレン酸である油組成を有する。もう１の形態において、本発明の油は６０％以上のオレイン酸および７％以下のリノレン酸である油組成を有する。もう１の形態において、本発明の油は６５％以上のオレイン酸および５％以下のリノレン酸、好ましくは４％以下のリノレン酸、およびより好ましくは３％以下のリノレン酸である油組成を有する。
【０１１５】
もう１の形態において、本発明の油は５０％ないし９０％のオレイン酸および１０％以下のリノレン酸である油組成を有する。もう１の形態において、本発明の油は６０％ないし８０％のオレイン酸および７％以下のリノレン酸である油組成を有する。もう１の形態において、本発明の油は６５％ないし７５％のオレイン酸および５％以下のリノレン酸、好ましくは４％以下のリノレン酸、およびより好ましくは３％以下のリノレン酸である油組成を有する。
【０１１６】
もう１の形態において、本発明の油は８０％以上、より好ましくは９０％以上のオレイン酸および５％以下のリノレン酸、好ましくは４％以下のリノレン酸、およびより好ましくは３％以下のリノレン酸である油組成を有する。もう１の形態において、本発明の油は５０％以上のオレイン酸、より好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上のオレイン酸である油組成を有する。もう１の形態において、本発明の油は１０％以下のリノレン酸、好ましくは５％以下、４％以下、または３％以下のリノレン酸である油組成を有する。
【０１１７】
本発明の植物は、育種プログラムの一部分とし、またはそれから創製し得る。育種法の選択は植物繁殖の様式、改善する特性（複数の特性）の遺伝性、および商業的に使用されている栽培品種の型（例えば、Ｆ１雑種品種、純粋系統品種、ほか）に依存する。本発明の植物を育種するための選択した、非限定的なアプローチを以下に記載する。育種プログラムは、いずれかの交配の子孫のマーカー支援選抜を用いて高め得る。さらに、いずれかの商業的および非商業的な栽培品種を育種プログラムに利用し得ることは理解される。本発明の植物は、育種プログラムの一部分とし、またはそれから創製し得る。育種方法の選択は、植物繁殖の様式、改善する特性（複数の特性）の遺伝性、および商業的に使用されている栽培品種の型（例えば、Ｆ１雑種品種、純粋系統品種、ほか）に依存する。本発明の植物を育種するための選択した、非限定的なアプローチを以下に記載する。育種プログラムは、いずれかの交配の子孫のマーカー支援選抜を用いて高め得る。さらに、いずれかの商業的および非商業的な栽培品種を育種プログラムに利用し得ることは理解される。
【０１１８】
育種の非限定的な例において、ダイズＦＡＤ２−１Ａイントロン抑制系統を用いて、自然突然変異に由来するか、または限定するものではないが、ゲノム中の標的誘導局部損傷（Targeted Induced Local Lesions in Genomues(TILLING））(McCallumら, Nature Biotech, 18: 455-457 (2000)）、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドを介した遺伝子置換、相同性組換え、Ｔ−ＤＮＡまたはトランスポゾン突然変異導入のごとき方法に由来する低リノレン酸ダイズＦＡＤ３突然変異系統を授粉し得る。ノックアウトを含む、１またはそれを超える発現されたＦＡＤ２イントロン領域およびＦＡＤ３突然変異の両方を含むダイズ種子からのＲＮＡは、（実施例５に記載するごとき）ノザンブロットを用いてスクリーニングしてＦＡＤ２−１、ＦＡＤ２−２、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１ＣおよびＦＡＤ３−１Ｂ転写物のレベルを決定し得る。得られた植物は両方の親の属性を有すると予想される。検出不可能または低レベルのＦＡＤ２またはＦＡＤ３転写物を有するダイズ植物は、油組成についてスクリーニングし得る。
【０１１９】
本発明の植物は、育種プログラムの一部分とすることができ、またはそれから創製することができ、例えば、その場合、ダイズＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂおよび／またはＦＡＤ３−１Ｃイントロン抑制系統を用いて、自然突然変異に由来するか、または限定するものではないが、例えばTILLING、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドを介した遺伝子置換、相同性組換え、Ｔ−ＤＮＡまたはトランスポゾン突然変異導入のごとき方法に由来するＦＡＤ２突然変異系統を含む高レベルのオレイン酸を有するダイズ植物を授粉する。ノックアウトを含む１またはそれを超える発現したＦＡＤ３イントロン領域およびＦＡＤ２突然変異の両方を含むダイズ種子からのＲＮＡは、（実施例５に記載するように）ノザンブロットを用いてスクリーニングして、ＦＡＤ２−１、ＦＡＤ２−２、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１ＢおよびＦＡＤ３−１Ｃ転写物のレベルを決定することができる。検出不可能または低レベルのＦＡＤ２またはＦＡＤ３転写物を有するダイズ植物は、脂肪酸組成についてスクリーニングし得る。得られる植物は、両方の親の属性を有することが予想される。
【０１２０】
新たな栽培品種の開発には、品種の開発および選抜、これらの品種の交配および優れた雑種交配の選抜が必要である。雑種種子は、選抜した雄性−雌性親間の手動交配によって、または雄性不稔系を用いることによって作製し得る。雑種は、種子が真に雑種であることを示す、莢の色、花の色、種子収量、軟毛の色または除草剤耐性のごときある種の単一遺伝子特性について選抜する。親系統に対するさらなるデータならびに雑種の表現型は、特定の雑種交配で続行するかの育種家の決定に影響する。かかる雑種作成における親は、例えば、ダイズＦＡＤ２−１Ａイントロン抑制系統、ダイズＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂおよび／またはＦＡＤ３−１Ｃイントロン抑制系統、またはいずれか望ましい組合せでＦＡＤ２−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂ、および／またはＦＡＤ３−１Ｃを含むイントロン抑制系統とし得る。これらの親のいずれかを、例えば、上昇したレベルのオレイン酸および／または低下したレベルのリノレン酸を有するいずれかの自然発生突然変異体または人工の突然変異体と交配し得る。
【０１２１】
戻し交配育種を用いて、トランスジーンのごとき、単純に遺伝した、非常に遺伝性の高い特性について遺伝子を、望ましい同型接合体の栽培品種または近交系に移入し、それは反復親である。移入すべき特性の起源は供与親とよばれる。得られる植物は反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から移入した望ましい特性を有すると予想される。最初の交配の後に、供与親の表現型を所有している固体を選抜し、繰り返して反復親に交配する（戻し交配する）。得られる親は反復親（例えば、栽培品種）の属性および供与親から移行した望ましい特性を有することが予想される。かかる戻し交配作成における供与親は、例えば、ダイズＦＡＤ２−１Ａイントロン抑制系統またはダイズＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂおよび／またはＦＡＤ３−１Ｃイントロン抑制系統、またはいずれか望ましい組合せでＦＡＤ２−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂおよび／またはＦＡＤ３−１Ｃを含むイントロン抑制系統とし得る。反復親は、例えば、上昇したレベルのオレイン酸および／または低下したレベルのリノレン酸を有するいずれかの自然発生突然変異体または人工突然変異体とし得る。
【０１２２】
配列番号：１ないし１５、１８、１９、２２、２３またはそれらのフラグメントまたはそれらの相補体、あるいは配列番号：１ないし１５、１８、１９、２２、２３またはそれらのフラグメントまたはそれらの相補体で提供される配列に対して少なくとも５０％、６０％または７０％同一、好ましくは８０％、８５％同一、または特に好ましくは９０％または９５％同一、または特に非常に好ましくは９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列で提供されるヌクレオチド配列は、使用を促進する種々の媒体で"提供"し得る。かかる媒体は、当業者が配列を調べることができる形態のそのサブセットも提供する。
【０１２３】
この形態の１の適用において、本発明のヌクレオチド配列はコンピュータ読出し可能な媒体上に記録することができる。本明細書中で使用する"コンピュータ読出し可能な媒体"とは、コンピュータによって直接的に読み出し可能であって、アクセス可能であるいずれの媒体をもいう。かかる媒体には、限定するものではないが：フロッピーディスク、ハードディスク、記憶媒体および磁気テープのごとき磁気記憶媒体；ＣＤ−ＲＯＭのごとき光記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのごとき電気的記憶媒体；ならびに磁気／光記憶媒体のごときこれらのカテゴリーのハイブリッドが含まれる。当業者であれば、いかにして、いずれかの現在知られているコンピュータ読出し可能な媒体を用いて、本発明のヌクレオチド配列が記録されているコンピュータ読出し可能な媒体を含む製造品を創製するかを容易に認識するであろう。
【０１２４】
本明細書中で使用する"記録した"とは、コンピュータ読出し可能な媒体上に情報を記憶させる工程をいう。当業者であれば、コンピュータ読出し可能な媒体上に情報を記憶させる現在知られているいずれかの方法を容易に適用して、本発明のヌクレオチド配列情報を含む媒体を作り出し得る。種々のデータ記憶構造が、本発明のヌクレオチド配列をその上に記憶させたコンピュータ読出し可能な媒体を作成するために当業者に利用可能である。データ記憶構造の選択は、一般的に、記憶された情報にアクセスするために選択した手段に基づくであろう。また、種々のデータプロセッサー・プログラムおよびフォーマットを用いて、本発明のヌクレオチド配列情報をコンピュータ読み出し可能な媒体上に記憶させ得る。配列情報は、ワードプロセシング・テキストファイルで示すことができ、Word PerfectおよびMicrosoft Wordのごとき市販されているソフトウェアにフォーマット化することができ、またはＤＢ２、Sybase、Oracleなどのごときデータベース・アプリケーションに記憶させることができる。当業者であれば、本発明のヌクレオチド配列情報がその上に記憶されたコンピュータ読出し可能な媒体を得るために、多数のデータプロセッサー構築フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を容易に適用し得る。
【０１２５】
本発明の１またはそれを超えるヌクレオチド配列を得ることによって、当業者は、種々の目的で配列情報に日常的にアクセスすることができる。コンピュータ読出し可能な媒体で提供される配列情報に当業者がアクセスすることを許容するコンピュータソフトウェアは、公共的に利用可能である。ＢＬＡＳＴ(Altschulら, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）およびＢＬＡＺＥ（Brutlagら, Comp. Chem. 17 : 203-207 (1993)）検索アルゴリズムをＳｙｂａｓｅシステム上で実行するソフトウェアを用いて、他の生物からの非コード領域に対する相同性を含むゲノム内の非コード領域および本発明の他の核酸分子を同定することができる。かかる非コード領域を利用して、アミノ酸生合成、代謝、転写、翻訳、ＲＮＡプロセシング、核酸およびタンパク質分解、タンパク質修飾、およびＤＮＡ複製、制限、修飾、組換えおよび修復に使用される酵素のごとき商業的に重要なタンパク質の発現に影響することができる。
【０１２６】
さらに、本発明は、システム、詳細には本明細書中に記載した配列情報を含むコンピュータに基づくシステムを提供する。かかるシステムは、本発明の核酸分子の商業的に重要なフラグメントを同定するために設計する。本明細書中で使用する"コンピュータに基づくシステム"とは、本発明のヌクレオチド配列情報を解析するために使用するハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段をいう。本発明のコンピュータに基づくシステムの最小限のハードウェア手段には、中央演算処理ユニット（ＣＰＵ）、入力手段、およびデータ記憶手段が含まれる。当業者であれば、現在利用可能なコンピュータに基づくシステムのいずれか１が本発明における使用に好適であることを容易に評価することができる。
【０１２７】
上記に示したごとく、本発明のコンピュータに基づくシステムには、その中に本発明のヌクレオチド配列を記憶しているデータ記憶手段ならびに検索手段を支持および実行するための必要なハードウェア手段およびソフトウェア手段が含まれる。本明細書中で使用する"データ記憶手段"とは、本発明のヌクレオチド配列情報を記録できるメモリー、または本発明のヌクレオチド配列情報をその上に記録している製品にアクセスすることができるメモリーアクセス手段をいう。本明細書中で使用する"検索手段"とは、コンピュータに基づくシステム上で実行して標的配列または標的構造モチーフとデータ記憶手段内に記憶された配列情報とを比較する１またはそれを超えるプログラムをいう。検索手段を用いて、特定の標的配列または標的モチーフとマッチする本発明の配列のフラグメントまたは領域を同定する。種々の知られているアルゴリズムが公共的に開示されており、検索手段を行うための種々の市販のソフトウェアが利用可能であって、本発明のコンピュータに基づくシステムで使用し得る。かかるソフトウェアの例には、限定するものではないが、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＩＮ、およびＢＬＡＳＴＩＸ（ＮＣＢＩＡ）が含まれる。ホモロジー検索を行うための利用可能なアルゴリズムまたは実行ソフトウェア・パッケージの１を、本発明のコンピュータに基づくシステムにおける使用に適用し得る。
【０１２８】
標的配列の最も好ましい配列の長さは、約１０ないし１００アミノ酸または約３０ないし３００ヌクレオチド残基である。しかしながら、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関与する配列フラグメントのごとき、本発明の核酸分子の商業的に重要なフラグメントの検索の間に、標的配列はより短い長さのものであり得ることはよく認識されている。
【０１２９】
本明細書中で使用する"標的構造モチーフ"または"標的モチーフ"とは、標的モチーフのフォールディングの際に形成される三次元構造に基づいて配列を選択するいずれかの合理的に選択した配列または配列の組合せをいう。当該技術分野で知られている種々の標的モチーフが存在する。タンパク質標的モチーフには、限定するものではないが、酵素活性部位およびシグナル配列が含まれる。核酸標的モチーフには、限定するものではないが、プロモーター配列、ｃｉｓエレメント、ヘアピン構造、および誘導可能な発現エレメント（タンパク質結合配列）が含まれる。
【０１３０】
かくして、さらに、本発明は、標的配列を受容するための入力手段、前記した検索手段を用いて同定した本発明の配列の標的配列を記憶するためのデータ記憶手段、および同定した相同配列を出力するための出力手段を提供する。入力および出力手段のための種々の構造形式を用いて、本発明のコンピュータに基づくシステム中の情報を入力および出力することができる。出力手段の好ましい形式は、標的配列または標的モチーフに対する相同性の程度を変化させることによって本発明の配列のフラグメントに等級を付ける。かかる表示は、種々の量の標的配列または標的モチーフを含む配列の等級付けを当業者に提供し、同定されたフラグメントに含まれる相同性の程度を同定する。
【０１３１】
種々の比較手段を用いて、標的配列または標的モチーフとデータ記録手段とを比較して、本発明のフラグメント配列を配列決定する。例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＺＥアルゴリズムを実行する実行ソフトウェア（Altschulら, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）を用いて、本発明の核酸分子内の非コード領域を同定することができる。当業者であれば、公共的に利用可能なホモロジー検索プログラムのいずれか１を、本発明のコンピュータに基づくシステムの検索手段として用い得ることを容易に認識し得る。
以下の実施例は説明目的のものであって、いかなる場合においても限定することを意図するものではない。
【０１３２】
実施例
実施例１  デサチュラーゼのゲノム配列のクローニング
１Ａ．ダイズΔ１２デサチュラーゼ（ＦＡＤ２−１）
ダイズＦＡＤ２−１Ａ配列は、ダイズＦＡＤ２−１ｃＤＮＡプローブを用いてダイズ・ゲノムライブラリーからスクリーニングすることによって同定する。３の推定ダイズＦＡＤ２−１クローンを同定し、プラーク精製する。３のダイズＦＡＤ２−１クローンのうちの２をpBluescript II KS+（Stratagene）に連結し、配列決定する。両方のゲノムクローン（１４−１および１１−１２）は同一であって、ダイズＦＡＤ２−１ｃＤＮＡ中の対応する配列と正確にマッチする。全体ＦＡＤ２−１Ａクローンの配列を配列番号：１５に掲載する。
【０１３３】
完全長クローンを得る前に、ＦＡＤ２−１Ａゲノムクローンの一部分を、５’非翻訳配列から設計した（プライマー１２５０６、5'-ATACAAGCCACTAGGCAT-3'、配列番号：１６）およびｃＤＮＡ内(プライマー１１６９８：5'-GATTGGCCATGCAATGAGGGAAAAGG-3'、配列番号：１７）のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングし、配列決定する。イントロン領域（配列番号：１）内のダイズＦＡＤ２−１Ａ部分ゲノムクローン（配列番号：１８）は、MacvectorのPustell比較プログラムを用いたダイズｃＤＮＡ配列との比較によって同定する。ＦＡＤ２−１Ａイントロン配列（配列番号：１）はＡＴＧ開始コドン後に開始し、４２０塩基長である。
【０１３４】
第２のＦＡＤ２−1遺伝子ファミリーメンバーも同定し、クローニングし、これは本明細書中でＦＡＤ２−１Ｂという。ダイズＦＡＤ２−１Ｂ部分ゲノムクローン（配列番号：１９）はコード領域（塩基対１７８３−１７８５および２１９１−２４６３）およびイントロン領域（塩基対１７８６−２１９０）を有し、これは、MacvectorのPustell比較プログラムを用いたダイズｃＤＮＡ配列との比較によって同定する。ＦＡＤ２−１Ｂイントロン配列（配列番号：２）はＡＴＧ開始コドン後に開始し、４０５塩基長である。ＦＡＤ２−１Ｂ部分ゲノムクローン（配列番号：１９）中の他の領域には、プロモーター（塩基対１−１７０４）（配列番号：２２）および５'ＵＴＲ（塩基対１７０５−１７８２）が含まれる。
【０１３５】
１Ｂ．ダイズΔ１５デサチュラーゼ（ＦＡＤ３）
部分ダイズＦＡＤ３−１Ａゲノム配列は、プライマー１０６３２、5'-CUACUACUACUACTCGAGACAAAGCCTTTAGCCTATG-3'（配列番号：２０）および１０６３３：5'-CAUCAUCAUCAUGGATCCCATGTCTCTCTATGCAAG-3'（配列番号：２１）を用いてダイズＤＮＡからＰＣＲ増幅する。Expand Long Template PCRシステム（Roche Applied Sciences, Indianapolis)は製造業者の指示書にしたがって使用する。得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１(Invitrogen)にクローニングし、配列決定する。ダイズＦＡＤ３−１Ａ部分ゲノムクローン配列（配列番号：２３）およびイントロン領域は、MacvectorのPustellプログラムを用いたダイズＦＡＤ３−１ＡｃＤＮＡ配列との比較によって確認する。
【０１３６】
同定した部分ゲノムダイズＦＡＤ３−１Ａ配列（配列番号：２３）から７のイントロンを同定する：ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号１（配列番号：５）、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号２（配列番号：６）、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号３Ａ（配列番号：７）、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４（配列番号：８）、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号５（配列番号：９）、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号３Ｂ（配列番号：１０）、およびＦＡＤ３−１Ａイントロン番号３Ｃ（配列番号：１１）。ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号１は１９１塩基対長であってポジション２９４と４８４との間に位置し、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号２は３４６塩基対長であってポジション５７７と９２２との間に位置し、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号３Ａは１４２塩基対長であってポジション９９１と１１３２との間に位置し、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号３Ｂは９８塩基対長であってポジション１２２４と１３２１との間に位置し、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号３Ｃは１１５塩基対長であってポジション１５０９と１６２３との間に位置し、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４は１２２８塩基対長であってポジション１７０７と２９３４との間に位置し、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号５は６２５塩基対長であってポジション３０７５と３６９９との間に位置する。
【０１３７】
部分ダイズＦＡＤ３−１Ｂゲノム配列は、プライマー１９３８６、5'-GGTAACAGAGAAAGAAACATTTGAGC-3'および１９３６９：5'-GCATGCTAACAAAAGTAAGTGC-3'を用いてダイズＤＮＡからＰＣＲ増幅する。Expand Long Template PCRシステム（Roche Applied Sciences, Indianapolis）は製造業者の指示書に従って使用する。得られたＰＣＲ産物はベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニングし、配列決定する。ダイズＦＡＤ３-１Ｂ部分ゲノムクローン配列およびイントロン領域は、シークエンサーにPustellプログラムを用いてダイズＦＡＤ３−１ＢｃＤＮＡ配列と比較することによって確認する。同定した部分ゲノムダイズＦＡＤ３−１Ｂ配列から、７のイントロンを同定する：ＦＡＤ３-１Ｂイントロン番号１、ＦＡＤ３-１Ｂイントロン番号２、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号３Ａ、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号4（配列番号：１３）、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号５、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号３Ｂ、およびＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号３Ｃ（配列番号：１２）。
【０１３８】
実施例２  発現構築物
２Ａ．ｐＣＧＮ５４６８、ｐＣＧＮ５４６９、ｐＣＧＮ５４７１、ｐＣＧＮ５４８５およびｐＣＧＮ５４８６の構築
ＦＡＤ２−１Ａイントロン配列（配列番号：１）は、鋳型としてＦＡＤ２−１Ａ部分ゲノムクローン（配列番号：１８）およびプライマー１２７０１(5'-ACGAATTCCTCGAGGTAAATTAAATTGTGCCTGC-3'（配列番号：２４）)および１２７０２（5'-GCGAGATCTATCGATCTGTGTCAAAGTATAAAC-3'（配列番号：２５））を用いてＰＣＲを介して増幅する。得られた増幅産物をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen）にクローニングし、配列決定する。ついで、ＦＡＤ２−１Ａイントロンをセンスおよびアンチセンスの向きで発現カセット、ｐＣＧＮ３８９２にクローニングする。ベクターｐＣＧＮ３８９２にはダイズ７ＳプロモーターおよびエンドウＲＢＣＳ３'が含まれる。ついで、両方の遺伝子融合物を、ＦＭＶプロモーターによって調節されるＣＰ４遺伝子を含むベクターであるｐＣＧＮ９３７２に別々に連結する。得られた発現構築物（ｐＣＧＮ５４６９センス（図２）およびｐＣＧＮ５４７１アンチセンス（図３））を、以下に記載するバイオリスティック方法を用いてダイズの形質転換に用いる。
【０１３９】
ＦＡＤ２−１Ｂイントロン配列（配列番号：２）は、鋳型としてＦＡＤ２−１Ｂ部分ゲノムクローン（配列番号：１９）およびプライマー１３８８３（5'-GCGATCGATGTATGATGCTAAATTAAATTGTGCCTG-3'（配列番号：２８））および１３８７６（5'-GCGGAATTCCTGTGTCAAAGTATAAAGAAG-3'（配列番号：２９））を用いてＰＣＲを介して増幅する。得られた増幅産物をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen）にクローニングし、配列決定する。ＦＡＤ２−１Ｂイントロンは、プラスミドｐＣＧＮ５４６８（図１）（ＦＡＤ２−１Ａイントロン（センス）およびエンドウＲＢＣＳ３’に融合したダイズ７Ｓプロモーターを含む）またはｐＣＧＮ５４７０（ＦＡＤ２−１Ａイントロン（アンチセンス）およびエンドウＲＢＣＳ３’に融合したダイズ７Ｓプロモーターを含む）中のＦＡＤ２−１Ａイントロンの３'末端に、各々センスまたはアンチセンスの向きで連結する。ついで、得られたイントロン組合せ融合物を、ＦＭＶプロモーターによって調節されるＣＰ４遺伝子を含むベクターであるｐＣＧＮ９３７２に別々に連結する。得られた発現構築物（ｐＣＧＮ５４８５（図４）、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＤ２−１Ｂイントロンセンス；およびｐＣＧＮ５４８６（図５）、ＦＡＤ２−１ＡおよびＦＡＤ２−１Ｂイントロンアンチセンス）を、以下に記載するバイオリスティック方法を用いてダイズの形質転換に用いる。
【０１４０】
２Ｂ．ＦＡＤ３−１ＡイントロンのＰＣＲ増幅
ダイズＦＡＤ３−１Ａゲノムクローンから同定した７のイントロンのうちの４は、鋳型としてＦＡＤ３−１Ａ部分ゲノムクローンおよび以下のプライマー：ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号１、プライマー１２５６８: 5'-GATCGATGCCCGGGGTAATAATTTTTGTGT-3'(配列番号：３０)および１２５６９：5'-CACGCCTCGAGTGTTCAATTCAATCAATG-3'(配列番号：３１)；ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号２、プライマー１２５１４：5'-CACTCGAGTTAGTTCATACTGGCT-3'(配列番号：３２)および１２５１５：5'-CGCATCGATTGCAAAATCCATCAAA-3' (配列番号：３３)；ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４、プライマー１０９２６: 5'-CUACUACUACUACTCGAGCGTAAATAGTGGGTGAACAC-3'(配列番号：３４)および１０９２７：5'-CAUCAUCAUCAUCTCGAGGAATTCGTCCATTTTAGTACACC-3'(配列番号：３５)；ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号５、プライマー１０９２８: 5'-CUACUACUACUACTCGAGGCGCGTACATTTTATTGCTTA-3'（配列番号：３６）および１０９２９：5'-CAUCAUCAUCAUCTCGAGGAATTCTGCAGTGAATCCAAATG-3' (配列番号：３７)
を用いてＰＣＲを介して増幅する。各イントロンについて得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen）にクローニングし、配列決定する。
【０１４１】
２Ｃ．ｐＣＧＮ５４５５、ｐＣＧＮ５４５９、ｐＣＧＮ５４５６、ｐＣＧＮ５４６０、ｐＣＧＮ５４６６およびｐＣＧＮ５４７３の構築
ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号１、番号２、番号４および番号５は、センスまたはアンチセンス方向でｐＣＧＮ３８９２に各々別々に連結する。ｐＣＧＮ３８９２には、ダイズ７ＳプロモーターおよびエンドウＲＢＣＳ３’が含まれる。これらの融合物を、ダイズへの形質転換するため、ＦＭＶプロモーターによって調節されるＣＰ４遺伝子を含むベクターであるｐＣＧＮ９３７２に連結する。得られた発現構築物（ｐＣＧＮ５４５５（図１２）、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４、センス；ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４アンチセンスを含むｐＣＧＮ５４５９（図１３）；ｐＣＧＮ５４５６、ＦＡＤ３イントロン番号５センス；ｐＣＧＮ５４６０、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号５アンチセンス；ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号２アンチセンスを含むｐＣＧＮ５４６６（図７）；ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号１を含むｐＣＧＮ５４７３（図９））を、以下に記載するバイオリスティック方法を用いてダイズの形質転換に用いる。
【０１４２】
イントロン番号３Ｃおよび番号４も、第２のＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバー（ＦＡＤ３−１Ｂ）からＰＣＲ増幅する。ダイズＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号３Ｃおよび番号４は、以下のプライマーを用いてダイズＤＮＡからＰＣＲ増幅する：5'-CATGCTTTCTGTGCTTCTC-3'(配列番号：２６）および5'-GTTGATCCAACCATAGTCG-3'（配列番号：２７）。ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen）にクローニングし、配列決定する。ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号３Ｃおよび番号４の配列を、各々配列番号：１２および１３に掲載する。
【０１４３】
３のダイズＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１ＢおよびＦＡＤ３−１Ｃからのイントロン番号４をＰＣＲ増幅する。ＦＡＤ３−１Ａ遺伝子からのイントロン番号４は、鋳型としてＦＡＤ３−１Ａ部分ゲノムクローンおよびプライマー１０９２６：5'-CUACUACUACUACTCGAGCGTAAATAGTGGGTGAACAC-3'（配列番号：３４）および１０９２７：5'-CAUCAUCAUCAUCTCGAGGAATTCGTCCATTTTAGTACACC-3' (配列番号：３５）を用いてＰＣＲ増幅する。ＦＡＤ３−１Ｂ遺伝子からのイントロン番号４は、鋳型としてダイズゲノムＤＮＡおよびプライマー番号１７８２３: GTATCCCATTTAACACおよび番号１７８２４：CTGTGAAATTACATATAGを用いてＰＣＲ増幅する。ＦＡＤ３−１Ｃ遺伝子からのイントロン番号４は、鋳型としてのダイズゲノムＤＮＡおよびプライマー番号１７８２６：GCGCCGCTCGAGCTGTCCATTTTTGTACACおよび番号１７８２５：CCGGCGCTCGAGGTAACAAAAATAAATAGAAAATAGTGAGTGをｍｍ落ちいてＰＣＲ増幅する。各イントロンについて得られたＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２.１（Invitorogen）にクローニングし、配列決定する。ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４はセンス方向でｐＣＧＮ３８９２に連結する。得られた発現カセット、ｐＣＧＮ５４５３は、エンドウＲＢＣＳ３'と一緒にＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４に融合した７Ｓアルファプロモーターを含んでいた。
【０１４４】
２Ｄ．ｐＭＯＮ６８５２１の構築
ｐＭＯＮ６８５２１（図１０）を構築するために、ｐＣＧＮ５４５３（エンドウＲＢＣＳ３’を有するＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４に融合した７Ｓアルファプロモーター）およびＫＷＨＩＴ０３２８５８（ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４を含むＰＣＲ２.１)をＥｃｏＲＩで消化し、一緒に連結してＫＷＨＩＴ０３００４（エンドウＲＢＣＳ３'と一緒にＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４およびＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４に融合した７Ｓアルファプロモーター）を形成する。
【０１４５】
ＫＷＨＩＴ０３００４はＸｈｏＩで消化し、ＫＡＷＨＩＴ０３２９８０（ＰＣＲ２．１中のＦＡＤ３−１Ｃイントロン番号４）はＥｃｏＲＩで消化し、両方の消化したプラスミドの末端を埋め、その後に連結する。得られたプラスミドはＫＡＷＨＩＴ０３０００５（エンドウＲＢＣＳ３'と一緒に、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４、およびＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４に融合した７Ｓアルファプロモーター）である。ＫＡＷＨＩＴ０３０００５をＳａｃＩで消化し、末端をＴ４ポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて埋めて平滑末端を作成した。ｐＣＧＮ５４８６（図１、エンドウＲＢＣＳ３'と一緒に、ＦＡＤ２−１Ａイントロンに融合した７Ｓアルファプロモーターを含む）をＥｃｏＲＩで消化し、末端をＴ４ポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて埋めて平滑末端を作成した。プラスミドＫＡＷＨＩＴ０３０００５およびｐＣＧＮ５４６８の平滑末端を一緒に連結してＫＷＨＩＴ０３００１（エンドウＲＢＣＳ３'と一緒に、ＦＡＤ２−１Ａイントロン、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号4、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４、ＦＡＤ３−１Ｃイントロン番号４に融合した７Ｓプロモーター)を形成する。ＫＷＨＩＴ０３００１およびｐＭＯＮ７０２７６（ＦＭＶ−ＥＦ−１／ＣＰ４）は両方ともＮｏｔＩで消化し、一緒ｂに連結してｐＭＯＮ６８５２１（図１０、エンドウＲＢＣＳ３'と一緒に、ＦＡＤ２−１Ａイントロン、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４、ＦＡＤ３−１Ｃイントロン番号４、およびエンドウＲＢＣＳ３'と一緒に、ＦＭＶ−ＥＦ−１／ＣＰ４に融合した７Ｓアルファプロモーター）を形成する。ｐＭＯＮ６８５２１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡＢＩ株に形質転換し、ダイズに同時培養した。
【０１４６】
２Ｅ．ｐＭＯＮ６８５１９の構築
プラスミドｐＭＯＮ６８５１９（図１１）の構築においては、ｐＣＧＮ５４５３（エンドウＲＢＣＳ３'と一緒にＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４に融合した７Ｓアルファプロモーターを含む）およびＫＷＨＩＴ０３２８５８（ＦＡＤ１Ｂイントロン番号４を含むｐＲＣ２.１）をＥｃｏＲＩで消化し、一緒に連結してＫＷＨＩＴ０３００４（エンドウＲＢＣＳ３'と一緒にＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４およびＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４に融合した７Ｓアルファプロモーターを含む）を形成する。ＫＷＨＩＴ０３００４をＸｈｏＩで消化し、ＫＡＷＨＩＴ０３２９８０（ＰＣＲ２.１中のＦＡＤ３−１Ｃイントロン番号４を含む）をＥｃｏＲＩで消化する。両方の消化したプラスミドの末端を埋め、つづいてプラスミドを連結する。得られたプラスミドをＫＡＷＨＩＴ０３０００５（エンドウＲＢＣＳ３'と一緒にＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４およびＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４に融合した７Ｓアルファプロモーターを含む）と命名する。ＫＡＷＨＩＴ０３０００５はＳａｃＩで消化し、ついでＤＮＡをＴ４ポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理して平滑末端を作製する。ｐＣＧＮ７７７０（ナピンプロモーターおよびＮａｐｉｎ３'を含む）をＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼのクレノウフラグメントで平滑末端化する。プラスミドＫＡＷＨＩＴ０３０００５およびｐＣＧＮ７７７０の平滑末端を一緒に連結してＫＷＨＩＴ０３００７（ナピン３'と一緒にＦＡＤ２−１Ａイントロン、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４、ＦＡＤ３−１Ｃイントロン番号４に融合したナピンプロモーターを含む）を形成する。
【０１４７】
ついで、ＫＷＨＩＴ０３００７をＮｏｔＩで消化し、末端をＴ４ポリメラーゼのクレノウフラグメントで埋めて平滑末端を形成する。ナピン３'と一緒にＦＡＤ２−１Ａイントロン、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４、ＦＡＤ３−１Ｃイントロン番号４に融合したナピンプロモーター（ＫＷＨＩＴ０３００７）を、ＥｃｏＲＶで消化したｐＭＯＮ６８５０４に平滑末端連結する。ｐＭＯＮ６８５０４は、２ｔＤＮＡベクターｐＭＯＮ４１１６２内の７Ｓアルファプロモーターに融合したダイズＦＡＤ２−１Ａイントロンを含み、それはエンドウＲＢＣＳ３'と一緒にＦＭＶプロモーターによって制御されたＣＰ４遺伝子を含む。ＫＷＨＩＴ０３００４およびｐＭＯＮ６８５０の間の平滑末端連結は、プラスミドｐＭＯＮ６８５１９を生じる。ｐＭＯＮ６８５１９は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＡＢＩ株に形質転換し、ダイズに同時培養する。
【０１４８】
実施例３  植物の形質転換および解析
△１２およびΔ１５デサチュラーゼのセンスおよびアンチセンス抑制用の発現カセットを含む線状ＤＮＡフラグメントを、McCabeら（1988), Bio/Technology, 6: 923-926のパーティクル・ボンバードメント法によって、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス、ＡＢＩ株との同時培養（Martinell, 米国特許第6,384,310号）を介してダイズ（Asgrow品種Ａ３２４４またはＡ４９２２Ａ３２）に安定に導入する。形質転換したダイズ植物は、グリホセートを含有する培地上の選択によって同定する。
【０１４９】
脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィーを用いてイントロン発現構築物で形質転換したダイズ系統の種子から分析する。Ｒ１プールした種子およびＲ１単一種子の油組成は、非形質転換ダイズからの種子の油組成と比較して、トランスジェニックダイズ系統からの種子の油において一価不飽和および多価不飽和脂肪酸組成が変化していることを示している。表Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩは、前記した構築物を用いて得た結果の要約を掲載している。これらのデータは、デサチュラーゼ遺伝子の非コード領域のセンスおよびアンチセンス発現が脂肪酸組成の修飾を生じることを示している。該データは、変化する脂肪酸組成を有する種々の系統を得るためにイントロンを使用し得ることも示している。望ましい相対脂肪酸組成に依存して、かかる系統から選抜を行い得る。各イントロンは変化する範囲で各脂肪酸のレベルを修飾することができるため、望ましい組成に依存してイントロンの組合せを使用し得ることが意図される。
【０１５０】
【表１】
2005530507.tif 000002
【０１５１】
【表２】
2005530507.tif 000003
【０１５２】
【表３】
2005530507.tif 000004
【０１５３】
実施例４
Δ１２およびΔ１５デサチュラーゼ遺伝子の抑制用のｄｓＲＮＡｉ構築物を含む線状ＤＮＡフラグメントを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、ＡＢＩ株との同時培養（Martinell, 米国特許第6,384,310号）またはMcCabeら（1988), Bio/Technology, 6: 923-926のパーティクル・ボンバードメント法によってダイズ（Asgrow品種Ａ３２４４またはＡ４９２２Ａ３２）に安定に導入する。導入した構築物には：（１）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ａセンスイントロン−ＦＡＤ３−１Ａセンスイントロン−ＦＡＤ３−１Ｂセンスイントロン−スプライシング可能なＦＡＤ３イントロン番号５−ＦＡＤ３−１Ｂアンチセンスイントロン−ＦＡＤ３−１Ａアンチセンスイントロン−ＦＡＤ２−１Ａアンチセンスイントロン−エンドウｒｂｃＳ；（２）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ３−１Ａセンスイントロン−ＦＡＤ３−１Ｂセンスイントロン−スプライシング可能なＦＡＤ３イントロン番号５−ＦＡＤ３−１Ｂアンチセンスイントロン−ＦＡＤ３−１Ａアンチセンスイントロン−エンドウｒｂｃＳ；（３）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ａセンスイントロン−ＦＡＤ３−１Ａセンスイントロン−スプライシング可能なＦＡＤ３イントロン番号５−ＦＡＤ３−１Ａアンチセンスイントロン−ＦＡＤ２−１Ａアンチセンスイントロン−エンドウｒｂｃＳ、が含まれる。ＦＡＤ２−１Ａ、ＦＡＤ２−１Ｂ、ＦＡＤ２−２Ｂ、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１ＢおよびＦＡＤ３−１Ｃイントロンの代表的な配列は、限定するものではないが、２００２年６月２１日に出願された米国特許出願番号１０／１７６,１４９号、２０００年８月１１日に出願された米国特許出願番号０９／６３８,５０８号、および１９９９年８月２６日に出願された米国仮特許出願番号６０／１５１,２２４号、１９９９年１２月１７日に出願された米国仮特許出願番号６０／１７２,１２８号に見出し得る。形質転換されたダイズ植物は、グリホセートを含有する培地上での選択によって同定する。
【０１５４】
脂肪酸組成は、イントロンＲＮＡｉ抑制構築物を含む形質転換ダイズ種子から分析する。望ましい相対脂肪酸組成に依存して特定の系統を選択する。
【０１５５】
実施例５
５Ａ．
ＲＮＡを、２のＦＡＤ２−１イントロン抑制系統（５４６９−１４および５４６９−２２）からの、２のＦＡＤ２−１ｃＤＮＡ抑制系統（陽性対照）（５４６２−８７および５４６２−１３３）からの、および陰性対照（野生型種子および各イントロン抑制された事象からの無効セグメントからの種子）からの同型接合Ｒ２種子から単離する。これらのＲＮＡ試料を含有するノザンゲルを、ＦＡＤ２−１  ｃＤＮＡでプローブする。ＦＡＤ２−１Ａ転写物レベルは、陰性対照と比較して、イントロン抑制系統およびｃＤＮＡ抑制系統の両方で顕著に低下する。同じノザンブロットを構造ＦＡＤ２−２  ｃＤＮＡでプローブしたが、ＦＡＤ２−１イントロン抑制系統と対照との間にＦＡＤ２−２転写物レベルにおける顕著な差異は全く観察されない。それに対して、ｃＤＮＡ抑制系統中のＦＡＤ２−２転写物は顕著に低下する。このノザンのデータは、ＦＡＤ２−１ＡイントロンがＦＡＤ２−１転写物の蓄積を特異的に阻害するが、ＦＡＤ２−２の転写物については阻害しないことを示している。部分ＡＦＤ２−２ゲノムクローン（配列番号：３）をＰＣＲ増幅し、配列解析は遺伝子の５'非翻訳領域中の４.７ｋＢのイントロンを明らかにした。ＦＡＤ２−２イントロンの配列（配列番号：４）は、ＦＡＤ２−１イントロンとホモロジーを全く共有していない。
【０１５６】
５Ｂ．
ＲＮＡを、４のＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４抑制系統からの、３のＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４抑制系統からの、陰性対照種子（非形質転換野生型種子）および各イントロン抑制された事象からの無効セグメントからの種子からの同型接合Ｒ２種子から単離する。これらのＲＮＡ試料を含有するノザンゲルを、ＦＡＤ３−１Ａ  ３’ＵＴＲ領域でプローブする。内因性ＦＡＤ３−１Ａ転写物レベルは、野生型または無効対照と比較して、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４抑制系統で顕著に低下する。同じノザンブロットをＦＡＤ３−１Ｂ  ３'ＵＴＲ領域でプローブしたが、ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４抑制系統、野生型または無効対照に対する内因性ＦＡＤ３−１Ｂ転写物における顕著な差異は全く観察されない。ＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４の配列（配列番号：８）は、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４（配列番号：１３）とホモロジーを全く共有していない。
【０１５７】
実施例６
サザンブロットのデータは、少なくとも２のＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーが存在することを示している。他のＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーの配列を決定するため、および、他のメンバーが存在するかを決定するために、ＦＡＤ３−１Ａ遺伝子配列をMonsantoダイズＤＮＡ配列データベースに対するクエリーＢｌａｓｔ検索に用いた。異なるＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーからの候補ＥＳＴを用いてプライマーを設計する。このストラテジーを用いて、推定ＦＡＤ３配列に基づいて２のプライマーのセットを設計する。２の他のＦＡＤ３遺伝子ファミリーメンバーからのイントロン番号４領域を単離する。プライマーは、ＦＡＤ３−１Ａ遺伝子のイントロン番号４のポジションに対応する領域中の２１１５６５ １.ｒ１０４０ＥＳＴ（ＦＡＤ３−１Ｂと命名する）、（５'プライマー番号１５０２４：5'-CATGCTTTCTGTGCTTCTC-3'（配列番号：２６）および３'プライマー番号１５０２７：5'-GTTGATCCAACCATAGTCG-3'（配列番号：２７））から設計する。これらのプライマーを用いて、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４（配列番号：１３）をＰＣＲ増幅し、これは、配列決定した場合にＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４（配列番号：８）と配列相同性を全く共有していない。ＦＡＤ３−１Ｂ遺伝子はイントロン番号３Ｃ（配列番号：１２）も含み、これはＦＡＤ３−１Ａイントロン番号３Ｃ（配列番号：１１）といずれの相同性も共有していなかった。
【０１５８】
もう１のさらなるイントロン番号４は、以下のプライマーのセット：５'プライマー番号１６２４１：5'-CACCATGGTCATCATCAGAAAC（配列番号：３８）および３'プライマー番号１６２４２：TCACGATCCACAGTTGTGAGAC（配列番号：３９）を用いて、第２のＥＳＴ、ｇｓｖ７０１０５１９８９．Ｈ１（ＦＡＤ３−１Ｃと命名する）からＰＣＲ増幅する。ＦＡＤ３−１Ｃイントロン番号４（配列番号：１４）はＦＡＤ３−１Ａイントロン番号４（配列番号：８）と５０％相同性を共有し、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン番号４（配列番号：１３）とは相同性を全く共有していない。ＦＡＤ３−１Ｃ  ＥＳＴも、ＦＡＤ３−１Ｂ  ＥＳＴと同様に、遺伝子の同一領域中にイントロン番号４スプライシング部位を含んでいる。
【０１５９】
実施例７  ＦＡＤ２−１Ａ／ＦＡＤ３−１Ａ形質転換植物
７Ａ．
ダイズＦＡＤ２−１Ａイントロン抑制系統を用いて、実施例３に記載した方法に従って作製したダイズＦＡＤ３−１Ａイントロン抑制系統を授粉する。発現したＦＡＤ２−１Ａイントロン領域およびＦＡＤ３−１Ａイントロン領域の両方を含むダイズ種子からのＲＮＡを、（実施例５に記載したごとく）ノザンブロットを用いてスクリーニングして、ＦＡＤ２−１、ＦＡＤ２−２、ＦＡＤ３−１ＡおよびＦＡＤ３−１Ｂ転写物のレベルを決定する。検出不可能なまたは低レベルのＦＡＤ２−１およびＦＡＤ３−１Ａ転写物を有するダイズ植物を、実施例３に記載したごとく、脂肪酸組成についてスクリーニングする。
【０１６０】
７Ｂ．
ダイズＦＡＤ２−１Ａイントロン抑制系統を用いて、突然変異に由来する低リノレン酸ダイズＦＡＤ３突然変異系統も授粉する。ノックアウトを含む、１またはそれを超える発現したＦＡＤ２イントロン領域およびＦＡＤ３突然変異の両方を含むダイズ種子からのＲＮＡを、（実施例５に記載したごとく）ノザンブロットを用いてスクリーニングし、ＦＡＤ２−１、ＦＡＤ２−２、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１ＣおよびＦＡＤ３−１Ｂ転写物のレベルを決定する。検出不可能なまたは低レベルのＦＡＤ２およびＦＡＤ３転写物を有するダイズ植物を、実施例３に記載した脂肪酸組成につきスクリーニングする。
【０１６１】
ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１ＢおよびＦＡＤ３−１Ｃイントロン抑制を有するダイズ系統を用いて、自然突然変異に由来するＦＡＤ２突然変異系統を含有する上昇したレベルのオレイン酸を有するダイズ植物を授粉する。ＦＡＤ３−１ＡおよびＦＡＤ３−１Ｂイントロン抑制を有するダイズ系統、ＦＡＤ３−１ＡおよびＦＡＤ３−１Ｃイントロン抑制を有する系統、ＦＡＤ３−１ＢおよびＦＡＤ３−１Ｃイントロン抑制を有する系統、ＦＡＤ３−１Ａイントロン抑制を有する系統、ＦＡＤ３−１Ｂイントロン抑制を有する系統およびＦＡＤ３−１Ｃイントロン抑制を有する系統を各々個別に用いて、自然突然変異に由来するＦＡＤ２突然変異系統を含む上昇したレベルのオレイン酸を有するダイズ植物を授粉する。ノックアウトを含む１またはそれを超える発現したＦＡＤ３イントロン領域およびＦＡＤ２突然変異の両方を含むダイズ種子からのＲＮＡを、実施例５に記載したごとくノザンブロットを用いてスクリーニングして、ＦＡＤ２−１、ＦＡＤ２−２、ＦＡＤ３−１Ａ、ＦＡＤ３−１ＢおよびＦＡＤ３−１Ｃ転写物のレベルを決定する。検出不可能なまたは低レベルのＦＡＤ２およびＦＡＤ３転写物を有するダイズ植物を、実施例３に記載した脂肪酸組成につきスクリーニングする。
【０１６２】
実施例８  単一ＦＡＤ２／ＦＡＤ３構築物
センスおよびアンチセンスＦＡＤ２およびＦＡＤ３イントロンを含む線状ＤＮＡフラグメントならびにｄｓＲＮＡを産生することができるＦＡＤ２およびＦＡＤ３イントロンを、表ＩＶに記載するごとく構築する。
【０１６３】
【表４】
2005530507.tif 000005
【０１６４】
示すごとく、表に掲載する各構築物は、構築物中の構造核酸の性質および方向に依存して幾つかの構成を有し得る。例えば、構築物３０は以下のような構成となり得る：（１）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ｂイントロン１（センス）−ＣａＭＶプロモーター−ＦＡＤ２−２Ｂイントロン１（センス）；（２）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ｂイントロン１（センス）−ＣａＭＶプロモーター−ＦＡＤ２−２Ｂイントロン１（アンチセンス）；（３）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ｂイントロン１（センス）−ＣａＭＶプロモーター−ＦＡＤ２−２Ｂイントロン１（ｄｓＲＮＡ）；（４）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ｂイントロン１（アンチセンス）−ＣａＭＶプロモーター−ＦＡＤ２−２Ｂイントロン１（センス）；（５）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ｂイントロン１（アンチセンス）−ＣａＭＶプロモーター−ＦＡＤ２−２Ｂイントロン１（アンチセンス）；（６）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ｂイントロン１（アンチセンス）−ＣａＭＶプロモーター−ＦＡＤ２−２Ｂイントロン１（ｄｓＲＮＡ）；（７）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ｂイントロン１（ｄｓＲＮＡ）−ＣａＭＶプロモーター−ＦＡＤ２−２Ｂイントロン１（センス）；（８）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ｂイントロン１（ｄｓＲＮＡ）−ＣａＭＶプロモーター−ＦＡＤ２−２Ｂイントロン１（アンチセンス）；または（９）７Ｓプロモーター−ＦＡＤ２−１Ｂイントロン１（ｄｓＲＮＡ）−ＣａＭＶプロモーター−ＦＡＤ２−２Ｂイントロン１（ｄｓＲＮＡ）。
【０１６５】
これらの構築物を、McCabeら（1988), Bio/Technology, 6: 923-926のパーティクル・ボンバードメント法またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換（Martinell, 米国特許第6,384,310号）を含む先に記載した方法によってダイズ（例えば、Asgrow品種Ａ４９２２またはＡ３２４４）に安定に導入することができる。形質転換したダイズ植物は、グリホセートを含む培地上の選択によって同定する。脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィーを用いて構築物で形質転換したダイズ系統の種子から分析する。
【０１６６】
実施例９
ＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２−２イントロンのセンスおよびアンチセンス発現用の線状ＤＮＡフラグメントを含む発現構築物を、McCabeら（1988), Bio/Technology, 6: 923-926のパーティクル・ボンバードメント法またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換（Martinell, 米国特許第6,384,301号）を含む先に記載した方法によってダイズ（例えば、Asgrow品種Ａ４９２２またはＡ３２４４）に安定に導入することができる。以下の構築物を導入する：（１）ＦＡＤ２−１Ａイントロン（センス）−ＦＡＤ２−２イントロン（アンチセンス）；（２）ＦＡＤ２−１Ａイントロン（センス）−ＦＡＤ２−２イントロン（センス）；（３）ＦＡＤ２−１Ａイントロン（アンチセンス）−ＦＡＤ２−２イントロン（アンチセンス）；（４）ＦＡＤ２−１Ａイントロン（アンチセンス）−ＦＡＤ２−２イントロン（センス）；（５）ＦＡＤ２−１Ｂイントロン（センス）−ＦＡＤ２−２イントロン（アンチセンス）；（６）ＦＡＤ２−１Ｂイントロン（センス）−ＦＡＤ２−２イントロン（センス）；（７）ＦＡＤ２−１Ｂイントロン（アンチセンス）−ＦＡＤ２−２イントロン（アンチセンス）；および（８）ＦＡＤ２−１Ｂイントロン（アンチセンス）−ＦＡＤ２−２イントロン（センス）。形質転換したダイズ植物は、グリホセートを含む培地上の選択によって同定する。脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィーを用いて構築物で形質転換したダイズ系統の種子から分析する。形質転換した植物の種子は、高レベルのオレイン酸（８０％を超える）を示す。
【０１６７】
ＦＡＤ２−１、ＦＡＤ２−２およびＦＡＤ３イントロンのセンスおよびアンチセンス発現用の発現構築物を含むさらなる線状のＤＮＡフラグメントを、McCabeら（1988), Bio/Technology, 6: 923-926の方法によってダイズ（Asgrow品種Ａ４９２２）に安定に導入する。例示的な構築物には：（１）ＦＡＤ２−１Ａイントロン（センスまたはアンチセンス）−ＦＡＤ２−２イントロン（センスまたはアンチセンス）−ＦＡＤ３−１Ａイントロン１（センスまたはアンチセンス）；（２）ＦＡＤ２−１Ａイントロン（センスまたはアンチセンス）−ＦＡＤ２−２イントロン（センスまたはアンチセンス）−ＦＡＤ３−１Ａイントロン４（センスまたはアンチセンス）；（３）ＦＡＤ２−１Ａイントロン（センスまたはアンチセンス）−ＦＡＤ２−２イントロン（センスまたはアンチセンス）−ＦＡＤ３−１Ｂイントロン４（センスまたはアンチセンス）；および（４）ＦＡＤ２−１Ａイントロン（センスまたはアンチセンス）−ＦＡＤ２−２イントロン（センスまたはアンチセンス）−ＦＡＤ３−１Ｃイントロン４（センスまたはアンチセンス）が含まれる。形質転換したダイズ植物は、グリホセートを含む培地上の選択によって同定する。脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィーを用いて構築物で形質転換したダイズ系統の種子から分析する。形質転換した植物の種子は、高レベルのオレイン酸（８０％を超える）を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は構築物ｐＣＧＮ５４６８の模式図である。
【図２】図２は構築物ｐＣＧＮ５４６９の模式図である。
【図３】図３は構築物ｐＣＧＮ５４７１の模式図である。
【図４】図４は構築物ｐＣＧＮ５４８５の模式図である。
【図５】図５は構築物ｐＣＧＮ５４８６の模式図である。
【図６】図６は構築物ｐＣＧＮ５４６２の模式図である。
【図７】図７は構築物ｐＣＧＮ５４６６の模式図である。
【図８】図８は構築物ｐＣＧＮ５４６４の模式図である。
【図９】図９は構築物ｐＣＧＮ５４７３の模式図である。
【図１０】図１０は構築物ｐＭＯＮ６８５２１の模式図である。
【図１１】図１１は構築物ｐＭＯＮ６８５１９の模式図である。
【図１２】図１２は構築物ｐＣＧＮ５４５５の模式図である。
【図１３】図１３は構築物ｐＣＧＮ５４５９の模式図である。
【配列表】
2005530507.tif 000006
2005530507.tif 000007
2005530507.tif 000008
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【図１】
2005530507.tif 000029
【図２】
2005530507.tif 000030
【図３】
2005530507.tif 000031
【図４】
2005530507.tif 000032
【図５】
2005530507.tif 000033
【図６】
2005530507.tif 000034
【図７】
2005530507.tif 000035
【図８】
2005530507.tif 000036
【図９】
2005530507.tif 000037
【図１０】
2005530507.tif 000038
【図１１】
2005530507.tif 000039
【図１２】
2005530507.tif 000040
【図１３】
2005530507.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月21日(2005.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005530507000001.app
【国際調査報告】
2005530507.tif 000042
2005530507.tif 000043
2005530507.tif 000044