(57)【要約】本発明は、胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、種々の診断方法および治療方法において有用である。本発明はさらに、胸部癌細胞の増殖を低下させる方法を提供する。これらの方法は、胸部癌細胞を処置するために有用である。本発明は、癌性細胞の検出、癌性細胞の表現型を調節する因子の同定、および癌性細胞の化学療法についての治療標的の同定において有用な、方法および組成物を提供する。
2005525097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌性哺乳動物細胞とＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３活性の阻害のための因子とを接触させる工程を包含する、細胞の癌性表現型を阻害する方法。
【請求項２】
前記試験細胞が胸部細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌性表現型が、正常細胞に対する異常な細胞増殖である、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌性表現型が、細胞増殖の接触阻止の喪失である、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記因子が、低分子、抗体、アンチセンスポリヌクレオチド、およびＲＮＡｉ分子からなる群より選択される、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害が、ＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３タンパク質レベルにおける減少と関連する、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害が、ＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３ＲＮＡレベルにおける減少と関連する、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項８】
前記阻害が、ＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３タンパク質の活性レベルにおける減少と関連する、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項９】
癌性細胞を検出するための方法であって、該方法は、以下；
被験体の細胞から得られた試験サンプルにおいて、ＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３またはそのフラグメントのレベルを検出する工程、
該ＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３のレベルとＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３のコントロールレベルとを比較する工程を包含し、ここで、癌性細胞の存在は、該レベルの検出およびＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３のコントロールレベルとの比較によって示される、方法。
【請求項１０】
前記癌性細胞が癌性胸部細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子産物が核酸である、請求項９〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子産物がポリペプチドである、請求項９〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する、請求項９〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出する工程がハイブリダイゼーションを使用する、請求項９〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが、胸部組織のサンプルである、請求項９〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記産物のレベルが、前記試験サンプル細胞の癌性状態の指標である、請求項９〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
癌を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、薬学的に有効な量の因子を被験体に投与する工程を包含し、ここで、該因子がＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３の活性を調節する、方法。
【請求項１８】
前記癌が胸部癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記因子が、低分子、抗体、アンチセンスポリヌクレオチド、およびＲＮＡｉ分子からなる群より選択される、請求項１７〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
被験体の腫瘍負荷量を評価するための方法であって、該方法は、被験体からの試験サンプルにおけるＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３のレベルを検出する工程を包含し、ここで、該試験サンプルにおけるＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３のレベルが、該被験体における腫瘍負荷量の指標である、方法。
【請求項２１】
正常細胞と比較して癌性細胞において差次的に発現された遺伝子産物の生物学的活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、ＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３と候補因子とを接触させる工程；および候補因子の非存在下におけるＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３の生物学的活性のレベルに対するＤＫＦＺＰ５６６Ｉ１３３の生物学的活性の調節を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記癌性細胞および前記正常細胞が胸部細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出する工程が、前記遺伝子産物の発現を評価する工程による、請求項２１〜２２に記載の方法。
【請求項２４】
発現が、ポリヌクレオチド遺伝子産物を検出する工程によって評価される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
発現が、ポリペプチド遺伝子産物を検出する工程によって評価される、請求項２３〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記候補因子が、低分子、抗体、アンチセンスポリヌクレオチド、およびＲＮＡｉ分子からなる群より選択される、請求項２１〜２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的活性が、癌性表現型の調節である、請求項２１〜２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌性表現型が、異常な細胞増殖である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌性表現型が、接触阻止の喪失である、請求項２７〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列の少なくとも１５連続するヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の権利の宣言）
アメリカ合衆国政府は、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａとの間のＣＲＡＤＡ（ＢＧ９８−０５３）に従って、本発明の特定の権利を有する。これらは、契約番号ＤＥ−ＡＣ０３−７６ＳＦ０００９８の下で、ｔｈｅ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙを運営する。
【０００２】
（関連参照）
本特許出願は、２００２年１月８日に出願された米国仮出願番号６０／３４５，６３７（この出願は、その全体が参考として援用される）の利益を主張する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、実質的に単離された形態でのヒト起源のポリヌクレオチドおよび胸部癌細胞において差次的に発現された遺伝子産物、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
癌は、多くの疾患と同様に、一つの十分に規定された原因の結果ではなく、むしろ情報経路における種々の異常（最終的には明らかに類似の病理学的表現型を生じる）によって各々引き起こされるいくつかの疾患として考えられ得る。同じ組織型の正常細胞に対して、癌性細胞、前癌細胞、または転移の可能性の低い細胞において差次的に発現された遺伝子に対応するポリヌクレオチドの同定は、診断手段のための基礎を提供し、候補因子に対する標的を提供することによって薬物開発を促進し、そして処置される癌の型に対してより良好に調整された、癌治療に対する治療標的の同定のためにさらに働く。
【０００５】
差次的に発現された遺伝子産物の同定はまた、癌のような複雑な疾患の進行および性質の理解を促進し、そして例えば、転移性表現型の発症に関連する表現型を担う遺伝的要因を同定するために重要である。種々の段階、および種々の型の癌において差次的に発現された遺伝子産物の同定は、初期の診断試験を提供し得、さらに治療標的として働き得る。さらに、差次的に発現された遺伝子産物は、その活性（例えば、発現、生物学的活性など）を調節する化学療法剤を同定するためのスクリーニングアッセイについての基礎となり得る。
【０００６】
早期疾患の診断は、疾患進行の停止、および罹患率の減少のために重要である。差次的に発現された遺伝子産物を同定するための患者の腫瘍の分析、および差次的に発現された遺伝子産物の活性を調節するように設計された治療薬剤の投与は、従来の治療に比べて有害な副作用を減少させ得る、より特異的であり合理的な癌治療についての基礎を提供する。さらに、患者に対して腫瘍をがより少ない危険性を与えることの確認（例えば、腫瘍が良性である）は、不必要な治療を回避し得る。手短に言うと、癌性細胞において差次的に発現される遺伝子およびコードされる遺伝子産物の同定は、治療、診断、予後、治療測定学（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）などの基礎を提供し得る。
【０００７】
胸部癌は、女性における主な死亡原因である。胸部癌研究における優先事項の１つは、胸部癌の診断、予後およびモニタリングのために使用され得る新規の生化学マーカーの開発である。これらのマーカーの予後的有用性は、このマーカーが、攻撃的治療処置を必要とする胸部癌を有する患者と、モニタリングされるべき患者との間を識別する能力に依存する。
【０００８】
胸部癌の病因は明らかではないが、悪性因子表現型への非腫瘍形成性胸部上皮のトランスフォーメーションは、特に３０歳未満の女性においては、遺伝的因子の結果であり得る（Ｍｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：６６−７１，１９９４）。しかし、おそらく、他の非遺伝的因子もまた、この疾患の病因において重要であるようである。癌の起源にかかわらず、病巣が癌の進行初期において検出されない場合、胸部癌の罹患率は有意に増加する。従って、相当の努力が、胸部組織におけるトランスフォーメーションの周囲の初期細胞内事象の解明に焦点を置いている。このような努力は、いくつかの潜在的な胸部癌マーカーの同定を導いている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、胸部癌に関連する新規のマーカーの同定、および癌性表現型への細胞のトランスフォーメーションに関わる遺伝子の同定は、この疾患の管理における重大な目標を残している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
例示的な局面において、本明細書中に記載される本発明は、ポリヌクレオチドおよび／またはそのコードされる遺伝子産物に基づく、胸部癌の診断、予後、治療側定学、および治療を提供する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、癌性細胞の検出、癌性細胞の表現型を調節する因子の同定、および癌性細胞の化学療法についての治療標的の同定において有用な、方法および組成物を提供する。癌性胸部細胞は、本発明のこれらの局面の各々において特に目的のものである。より詳細には、本発明は、胸部癌細胞において差次的に発現される、実質的に単離された形態のポリヌクレオチド、およびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。コードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体もまた提供される。従って、これらのポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体は、種々の診断方法、治療方法、および薬物開発方法において有用である。いくつかの実施形態において、胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドは、胸部癌細胞を検出するための診断アッセイにおいて使用され得る。他の実施形態において、胸部癌において差次的に発現されるポリヌクレオチド、および／またはそれによってコードされるポリペプチドは、それ自体、治療的介入のための標的である。
【００１２】
従って、１つの局面において、本発明は、癌性胸部細胞を検出するための方法を提供する。一般に、本方法は、胸部癌において差次的に発現された遺伝子産物を検出するためのプローブと、胸部癌細胞である疑いのある細胞から得た試験サンプルとを接触させる工程を包含する。本発明の多くの実施形態は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列と同定可能であるかまたはその配列を含む遺伝子を含み、プローブの遺伝子産物への結合に十分な時間にわたってこのプローブと遺伝子産物とを接触させること；およびプローブのコントロールサンプル（既知の癌性状態のコントロール胸部細胞から得られる）への結合レベルと、プローブのサンプルへの結合レベルとを比較することを含む。コントロールサンプルにおける結合レベルに比べて、試験胸部細胞サンプルにおけるプローブの調節された（すなわち、増加または減少した）結合レベルは、試験胸部細胞の癌性状態の指標である。特定の実施形態において、通常、少なくとも１つのコントロール遺伝子に対する試験細胞サンプルにおけるプローブの結合レベルは、癌性細胞サンプルへのプローブの結合に類似する。特定の他の実施形態において、通常、少なくとも１つのコントロール遺伝子に対する試験細胞サンプルにおけるプローブの結合レベルは、非癌性細胞サンプルへのプローブの結合と異なる（すなわち、反対である）。特定の実施形態において、このプローブは、ポリヌクレオチドプローブであり、遺伝子伝物は核酸である。他の特定の実施形態において、遺伝子産物はポリペプチドである。さらなる実施形態において、遺伝子産物またはプローブは、アレイ上に固定されている。
【００１３】
別の局面において、本発明は、胸部細胞の癌性表現型（例えば、転移、転移の可能性、異常な細胞増殖など）を評価するための方法を提供し、この方法は、試験胸部細胞サンプルにおける遺伝子産物の発現を検出する工程であって、この遺伝子は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列を含む、工程；およびコントロール細胞サンプルにおける遺伝子の発現レベルと、試験胸部細胞サンプルにおける遺伝子産物の発現レベルとを比較する工程を包含する。コントロール細胞サンプルにおける発現レベルに対する、試験細胞サンプルにおける遺伝子発現レベルの比較は、試験細胞サンプルの癌性表現型の指標である。特定の実施形態において、遺伝子発現の検出は、試験細胞サンプルにおけるＲＮＡ転写物のレベルを検出することによってである。他の特定の実施形態において、この遺伝子の発現の検出は、試験サンプルにおけるポリペプチドのレベルを検出することによってである。
【００１４】
別の局面において、本発明は、癌性細胞の癌性表現型を抑制または阻害するための方法を提供し、この方法は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列によって同定される遺伝子の発現を阻害するための発現調節因子（例えば、アンチセンス分子、低分子、抗体、中和抗体、阻害性ＲＮＡ分子など）を哺乳動物細胞に導入する工程を包含する。遺伝子発現の阻害は、細胞における癌性表現型の発達を阻害する。特定の実施形態において、癌性表現型は、転移、正常細胞に比べて異常な細胞増殖、または細胞増殖の接触阻止の喪失である。本発明の文脈において、遺伝子の「発現」は、遺伝子産物の活性の発現を含むことを意図し、それゆえ、遺伝子の発現を阻害することは、遺伝子産物の活性を阻害することを含む。
【００１５】
別の局面において、本発明は、被験体の腫瘍負荷量を評価する方法を提供し、この方法は、腫瘍を有するか、またはその疑いのある被験体からの試験サンプルにおいて差次的に発現された遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、この差次的に発現された遺伝子産物は、配列番号１〜４９９からなる群より選択されるは配列を含む。試験サンプルにおける遺伝子産物レベルの検出は、被験体における腫瘍負荷量の指標である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、癌治療のための標的としての遺伝子産物を同定する方法を提供し、この方法は、候補遺伝子産物を発現する癌細胞と抗癌剤とを接触させる工程であって、この候補遺伝子産物が、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列に対応する、工程；および候補遺伝子産物の生物学的活性および／または癌性細胞の癌性表現型に対する抗癌剤の効果を分析する工程を包含する。候補遺伝子産物の生物学的活性の調節および癌性細胞の癌性表現型の調節は、この候補遺伝子産物が癌治療の標的であることを示す。特定の実施形態において、癌性細胞は癌性胸部細胞である。他の特定の実施形態において、インヒビターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらなる実施形態において、癌性表現型は、正常細胞に比べて異常な細胞増殖であるか、または細胞増殖の接触阻止の喪失に起因するコロニー形成である。
【００１７】
別の局面において、本発明は、癌性細胞において差次的に発現された遺伝子産物の生物学的活性を調節（すなわち、増加または減少する）因子を同定するための方法を提供し、この方法は、候補因子と差次的に発現された遺伝子産物とを接触させる工程であって、この差次的に発現された遺伝子産物は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列に対応する、工程；および候補因子の非存在下における遺伝子産物の生物学的活性のレベルと比較した遺伝子産物の生物学的活性における調節を検出する工程を包含する。特定の実施形態において、検出する工程は、差次的に発現された遺伝子産物の発現における増加または減少を同定することによってである。他の特定の実施形態において、遺伝子産物は、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ遺伝子産物から調製されたｃＤＮＡである。さらなる実施形態において、遺伝子産物はポリペプチドである。
【００１８】
別の局面において、本発明は、遺伝子産物の発現を調節することによって腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供し、ここでこの遺伝子産物は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列によって同定される遺伝子によってコードされる。
【００１９】
本発明は、細胞の癌性状態を決定する方法を提供し、この方法は、試験細胞における遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、この遺伝子は配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列によって規定され、ここで、試験細胞の癌性状態はこのレベルの検出およびこの遺伝子産物のコントロールレベルとの比較によって示される。本方法の特定の実施形態において、この遺伝子産物は核酸またはポリペプチドである。本方法の特定の実施形態において、遺伝子産物はアレイ上に固定される。本方法の１つの実施形態において、コントロールレベルは、既知の癌性状態のコントロール細胞に関連したこの遺伝子産物のレベルである。本方法の他の実施形態において、既知の癌性状態は非癌性状態である。本方法の別の実施形態において、このレベルはコントロールレベルと少なくとも２倍異なり、これは、試験細胞が、コントロールレベルによって示される癌性状態と同じ癌性状態ではないことを示す。
【００２０】
本発明はまた、サンプルにおける癌性胸部細胞を検出するための方法を提供する。本方法は、被験体から得られた試験サンプルにおいて遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、ここで、この遺伝子は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列によって規定され、癌性胸部細胞の存在または転移した胸部癌細胞は、このレベルの検出およびこの遺伝子産物のコントロールレベルとの比較によって示される。本方法の特定の実施形態において、このサンプルは、胸部組織のサンプルである。本方法の他の特定の実施形態において、このサンプルは、肝臓、脳、腎臓、肺、骨および皮膚のサンプルからなる群より選択される。本方法の１つの実施形態において、癌性胸部細胞は転移した癌性胸部細胞である。本方法の他の特定の実施形態において、コントロールレベルは、既知の癌性状態の細胞を含むコントロールサンプルに関連するこの遺伝子産物のレベルである。別の実施形態において、既知の癌性状態は非癌性状態である。
【００２１】
本発明はまた、癌性哺乳動物細胞の癌表現型を抑制するための方法を提供し、この方法は、この癌性細胞に、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列により規定される遺伝子の発現の阻害のためにアンチセンスポリヌクレオチドを導入する工程を包含し、ここでこの遺伝子の発現の阻害は、その癌表現型の発生を抑制する。この方法の多くの実施形態において、その癌表現型は、転移性である。この方法の特定の実施形態において、その癌表現型は、正常細胞と比較して異常な細胞増殖である。この方法の他の実施形態において、その癌表現型は、細胞増殖の接触阻止の喪失である。この方法の特定の他の実施形態において、その癌表現型は、正常細胞と比較して、転移した胸部癌細胞の異常な細胞増殖である。
【００２２】
本発明は、被験体の腫瘍負荷を評価するための方法をさらに提供する。この方法は、腫瘍を有すると疑われる被験体に由来する試験サンプル中で差示的に発現される遺伝子産物のレベルを検出する工程を包含し、その差示的に発現される遺伝子産物は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列を含む；ここでその試験サンプル中の遺伝子産物のレベルの検出は、その被験体における腫瘍負荷の指標である。
【００２３】
この方法はさらに、癌治療のための標的としての遺伝子産物を同定するための方法をさらに提供する。この方法は、候補遺伝子産物を発現する癌性細胞と、抗癌剤とを接触させる工程であって、ここでこの候補遺伝子産物は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列に対応する、工程；ならびにこの抗癌剤の、候補遺伝子産物の生物学的活性に対する効果、およびこの癌性細胞の癌表現型に対する効果を分析する工程を包含し；ここでその候補遺伝子産物の生物学的活性の調節およびその癌性細胞の癌表現型の調節は、その候補遺伝子産物が、癌治療のための標的であることを示す。この方法の特定の実施形態において、その癌性細胞は、癌性胸部細胞である。この方法の他の実施形態において、インヒビターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。この方法の特定の他の実施形態において、その癌表現型は、正常細胞と比較して異常な細胞増殖である。この方法の別の実施形態において、その癌表現型は、増殖の接触阻止の喪失に起因したコロニー形成である。
【００２４】
本発明はさらに、癌性細胞において差示的に発現される遺伝子産物の生物学的活性を減少させる薬剤を同定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：候補薬剤と、差示的に発現される遺伝子産物とを接触させる工程であって、この差示的に発現される遺伝子産物は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列に対応する、工程；およびその候補薬剤の非存在下での遺伝子産物の生物学的活性のレベルと比較して、その遺伝子産物の生物学的活性の減少を検出する工程。この方法の特定の実施形態において、その検出工程は、差示的に発現される遺伝子産物の発現の減少を検出することによる。この方法の特定の他の実施形態において、その遺伝子産物は、ｍＲＮＡまたはこのｍＲＮＡ遺伝子産物から調製されるｃＤＮＡである。本発明の他の実施形態において、その遺伝子産物は、ポリペプチドである。
【００２５】
本発明はさらに、遺伝子産物の発現を調節することによる腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供し、この遺伝子産物は、配列番号１〜４９９からなる群より選択される配列により同定される遺伝子によってコードされる。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下により十分に記載されるように、発明の詳細な説明を読めば、当業者に明らかになる。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、胸部癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチド、およびこのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供する。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、胸部癌細胞の増殖を検出および減少させるために使用される方法が提供される。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、胸部癌のための種々の診断的適用および治療的適用において使用される方法もまた、提供される。
【００２８】
本発明を記載する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、よって、当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語が、特定の実施形態を記載する目的にすぎず、限定することを意図しないこともまた理解されるべきである。
【００２９】
別段記載されなければ、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料に類似または等価の任意の方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物および特許出願は、刊行物が引用される方法および／または材料に関して、方法および／または材料を開示および記載するために、本明細書中に参考として援用される。
【００３０】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明瞭にそうでないことを示さない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」に対する言及は、複数のこのようなポリヌクレオチドを含み、「胸部癌細胞（ｔｈｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ）」に対する言及は、１つ以上の細胞および当業者に公知のそれらの等価物を含む、など。
【００３１】
本明細書中で議論される刊行物および出願は、本出願の出願日前のそれらの開示を提供するにすぎない。本明細書中で、本発明が、先行発明によってこのような刊行物が先立つ権利を付与するという容認として解釈されるものではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる可能性があり、これらの日付は、独立して確認される必要があり得る。
【００３２】
（定義）
本明細書中で交換可能に使用される用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。従って、これらの用語は、一本鎖、二本鎖または多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン塩基およびピリミジン塩基または他の天然の、化学的に改変されたかまたは生化学的に改変された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。これらの用語はさらに、イントロン配列を含む、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを包含するが、これらに限定されない（例えば、Ｎｉｗａら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９９（７）：６９１−７０２を参照のこと)。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（代表的には、ＲＮＡまたはＤＮＡで見られ得るように）、あるいは改変または置換された糖またはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミダイトのような合成サブユニットのポリマーを含み得、従って、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデートまたは混合されたホスホルアミデート−ホスホジエステルオリゴマーであり得る。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８４１−１８４８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２３１８−２３２３。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）、ウラシル、他の糖、および連結基（例えば、フルオロリボースおよびチオエート）、ならびにヌクレオチド分枝を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって遮られ得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識成分との結合体化によってさらに改変され得る。この定義中に含まれる他の型の改変は、キャップ、１以上の天然に存在するヌクレオチドの、アナログでの置換、ポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体に結合するための手段の導入である。用語「ポリヌクレオチド」はまた、ペプチド核酸を包含する（Ｐｏｏｇａら、Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．（２００１）１：２３１−９）。
【００３３】
「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現または生成される生体ポリマー産物である。遺伝子産物は、例えば、スプライシングされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライス改変体ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後修飾ポリペプチド、スプライス改変体ポリペプチドなどであり得る。テンプレートとしてＲＮＡ遺伝子産物を使用して作製される生体ポリマー産物（すなわち、このＲＮＡのｃＤＮＡ）もまた、この用語に含まれる。遺伝子産物は、酵素的に、組換え的に、化学的に、またはその遺伝子がネイティブである細胞内で生成され得る。多くの実施形態において、この遺伝子産物がタンパク質である場合、この遺伝子産物は、生物学的活性を示す。多くの実施形態において、この遺伝子産物が核酸である場合、この遺伝子産物は、生物学的活性を示すタンパク質の遺伝子産物に翻訳され得る。
【００３４】
「単離された」または「実質的に単離されている形態の」組成物(例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞)とは、その組成物が天然に存在する環境とは異なる環境中にある組成物をいう。例えば、実質的に単離された形態のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが天然に存在する宿主細胞の外部にあるか、ＤＮＡの精製フラグメントであり得るか、異種ベクターの一部であり得るか、またはポリヌクレオチドが天然に存在する宿主細胞ではない宿主細胞内に含まれ得る。用語「単離された」とは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、完全細胞総タンパク質またはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物、あるいは単離されたヒト染色体をいうのではない。実質的に単離された形態である組成物は、通常、実質的に精製されている。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に精製された」とは、その天然の環境から取り出され、通常、天然に関連している他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、および最も好ましくは９０％含まない化合物（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体など）をいう。従って、例えば、Ａを含む組成物は、組成物中のＡ＋Ｂの合計の少なくとも８５重量％がＡである場合、「実質的にＢを含まない」。好ましくは、Ａは、組成物中のＡ＋Ｂの合計の少なくとも約９０重量％を含み、より好ましくは、少なくとも約９５重量％または９９重量％すら含む。ポリヌクレオチドの場合、「Ａ」および「Ｂ」は、例えば、異なる染色体上に位置した２つの異なる遺伝子であり得るか、または同じ染色体上に隣接しているか、または２つの単離されたｃＤＮＡ種であり得る。
【００３６】
本明細書中で交換可能に使用される用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、コードされたアミノ酸またはコードされないアミノ酸、化学的に改変されたアミノ酸、もしくは生化学的に改変されたアミノ酸、または誘導体化されたアミノ酸を含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドをいう。この用語は、融合タンパク質を含み、この融合タンパク質としては、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基ありまたはなしの異種および同種のリーダー配列との融合物；免疫学的にタグ化されたタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
「異種」とは、異なる供給源に由来する（例えば、異なる遺伝子、異なる種などに由来する）物質をいう。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「胸部癌細胞において差示的に発現される遺伝子」および「胸部癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチド」は、本明細書中で交換可能に使用され、一般に、癌性でない同じ細胞型の細胞と比較した場合、癌性胸部細胞において差示的に発現される遺伝子を示すかまたはこれに対応するポリヌクレオチドをいい、例えば、ｍＲＮＡは、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％〜約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約５０倍以上異なる（例えば、より多いかまたはより少ない）レベルで見いだされる。この比較は、例えば、組織中の細胞型の中である程度の区別を可能にするインサイチュハイブリダイゼーションまたは別のアッセイ法が使用される場合、組織中で行われ得る。この比較はまた、または代わりに、それらの組織供給源から取り出された細胞間で行われ得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「差示的に発現されるポリヌクレオチド」とは、差示的に発現される遺伝子を示す配列を含む核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）をいい、例えば、差示的に発現されるポリヌクレオチドは、サンプル中の差示的に発現されるポリヌクレオチドの検出が、サンプル中の差示的に発現される遺伝子の存在と相関されるように、差示的に発現される遺伝子を特有に同定する配列（例えば、遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレーム；非コード配列）を含む。「差示的に発現されるポリヌクレオチド」はまた、開示されるポリヌクレオチドのフラグメント（例えば、生物学的活性を保持するフラグメント）ならびに開示されるポリヌクレオチドに対して類似または実質的に同一な（例えば、約９０％の配列同一性を有する）核酸ホモログを含むことが意味される。
【００４０】
「サイクリンＧ会合キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ  Ｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）」、または「ＧＡＫ」は、サイクリンＧ会合キナーゼ活性を示す、任意のポリペプチドを意味する。サイクリンＧ会合キナーゼの例としては、ＮＣＢＩ登録番号ＸＭ＿００３４５０、ＮＭ＿００５２５５、ＮＰ＿００５２４６およびＮＭ＿０３１０３０によって規定されるポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドが、サイクリンＧ会合キナーゼ活性を有するか否かを決定するためのアッセイは、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載される。生物学的活性を保持するヒトサイクリンＧ会合キナーゼの改変体は、とりわけ、２つのサイクリンＧ会合キナーゼ（例えば、ラットおよびヒトに由来するサイクリンＧ会合キナーゼ）の間の等価な位置に存在するアミノ酸を置換することによって生成され得る。
【００４１】
サイクリンＧ会合キナーゼに関して、興味深いさらなる参考文献としては、以下が挙げられる：Ｋａｎａｏｋａら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７  Ｊａｎ  ２７；４０２（１）：７３−８０；Ｋｉｍｕｒａら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９７  Ｓｅｐ  １；４４（２）：１７９−８７；Ｇｒｅｅｎｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００  Ｊａｎ  １４；２７５（２）：１３６５−７０；およびＫｏｒｏｌｃｈｕｋら，Ｔｒａｆｆｉｃ．２００２  Ｊｕｎ；３（６）：４２８−３９。
【００４２】
「ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３」および「ＤＫＦＺ」は、ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３活性を示すポリペプチド組成物をいうために本明細書中で交換可能に使用される。ポリペプチドが、ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３活性を有するか否かを決定するための（すなわち、ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３が、細胞質内液胞促進活性を有し得るか否かを決定するための）アッセイは、Ｄｕｓｅｔｔｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００２  Ｊａｎ  １８；２９０（２）：６４１−９）に記載される。生物学的活性を保持するＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３の改変体は、とりわけ、２つのＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３（例えば、ラットおよびヒトに由来するＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３）の間の等価な位置に存在するアミノ酸を置換することによって生成され得る。ＤＫＦＺはまた、ＶＭＰ１（すなわち、液胞膜タンパク質１）として公知である。
【００４３】
あるいは、「ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３」または「ＤＫＦＺ」とは、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿１１２２００、ＡＡＨ０９７５８、ＮＭ＿１３８８３９、およびＮＭ＿０３０９３８、これらの登録番号に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（それぞれ、配列番号５１２および配列番号５１３）によって規定されるアミノ酸配列をいう。
【００４４】
さらに、「ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３」または「ＤＫＦＺ」とは、スポットＩＤ番号２２７９３、２６８８３および２７４５０（それぞれ、配列番号２７４〜２７５および配列番号２７６〜２７７および配列番号４５９〜４６０）によって示されるポリヌクレオチド配列をいう。図４は、これらのスポットＩＤに対応するとしてＶＭＰ１またはＤＫＦＺ遺伝子産物を同定する、スポットＩＤ番号２２７９３、２６８８３およびＶＭＰ１（ＮＭ＿０３０９３８）（すなわち、ＤＫＦＺ）の間の整列を示す。図５は、ＶＭＰ１と整列しているスポットＩＤ番号２２７９３、２６８８３、２７４５０のフラグメント（それぞれ、配列番号５１４、５１５、および５１６）を示す。これらのフラグメント、またはそれらのコード産物はまた、ＤＫＦＺ同定配列として使用され得る。
【００４５】
例えば、遺伝子に「対応する」または遺伝子を「示す」ポリヌクレオチドまたは配列の状況において使用される場合「対応する」または「示す」とは、ポリヌクレオチドの配列の少なくとも一部分が、遺伝子に存在するかまたは核酸遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）に存在することを意味する。主題の核酸はまた、そのポリヌクレオチドが、この遺伝子に対応するかまたはこの遺伝子を示す場合に、ポリヌクレオチドによって「同定され」得る。配列表のポリヌクレオチドによって同定されるいくつかの遺伝子は、表１に見いだされ得る。ポリヌクレオチドによって同定される遺伝子は、その遺伝子のゲノム配列のエキソン内に完全に存在する同定配列の全てまたは一部分を含み得るか、あるいはそのポリヌクレオチド配列の異なる部分が、異なるエキソンに存在し得る（例えば、連続するポリヌクレオチド配列が、遺伝子の発現産物であるように、スプライシング前またはスプライシング後のいずれかのｍＲＮＡに存在する）。いくつかの実施形態において、このポリヌクレオチドは、正常細胞と比較して、癌性細胞において改変された遺伝子を示し得るか、またはこの遺伝子に対応し得る。癌性細胞における遺伝子は、このポリヌクレオチドに対して、欠失、挿入、置換、または転座を含み得、改変された調節配列を有し得るか、あるいは例えば、スプライス改変遺伝子産物をコードし得る。癌性細胞における遺伝子は、内因性レトロウイルス、転移因子、または他の天然に存在するかもしくは天然に存在しない核酸の挿入によって改変され得る。たいていの場合、ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドの配列が、他の遺伝子もしくはそれらの産物と比較して、遺伝子またはその産物（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の配列とほとんど同一である場合、遺伝子に対応するかまたは遺伝子を示す。大部分の実施形態において、最も同一な遺伝子は、ポリヌクレオチドと、デフォルト設定でＢＬＡＳＴプログラムを使用するポリヌクレオチドのデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）との配列比較を使用して決定される。例えば、例示的ポリヌクレオチドに対するヒトゲノム中の最も類似の遺伝子が、プロテインキナーゼＣ遺伝子である場合、この例示的なポリヌクレオチドは、プロテインキナーゼＣに対応する。ほとんどの場合、例示的なポリヌクレオチドのフラグメントの配列は、「Ｎ」であるヌクレオチドがＧ、Ａ、ＴまたはＣを示す場合、対応する遺伝子またはその産物（ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の少なくとも１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、もしくは５０個の連続するヌクレオチドの配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または最大１００%同一である。
【００４６】
「同定配列」は、ポリヌクレオチド配列またはその相補体を特有に同定または規定する連続するヌクレオチドの配列の最小フラグメントである。多くの実施形態において、ポリヌクレオチドのフラグメントは、ポリヌクレオチド配列またはその相補体を特有に同定または規定する。いくつかの実施形態において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、もしくは他の提供される配列の連続する配列全体は、同定配列である。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「診断」は、一般に、疾患または障害に対する被験体の感受性の決定、被験体が現在、疾患または障害に罹患しているか否かに関する決定、疾患または障害に罹患した被験体の予後（例えば、転移前または転移性癌状態、癌の段階、または治療に対する癌の応答の同定）、および治療的測定（例えば、治療の効果または有効性に関する情報を提供するための被験体の状態のモニタリング）の使用を含む。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「胸部癌と関連するポリペプチド」とは、胸部癌細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをいう。胸部癌と関連するポリペプチドのいくつかの例は、表１に示される。
【００４９】
用語「生物学的サンプル」は、生物から得られる種々のサンプル型を含み、診断アッセイまたはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。この用語は、生物起源の血液および他の液体サンプル、固形組織サンプル（例えば、生検標本または組織培養物またはこれらに由来する細胞およびこれらの子孫）を含む。この用語は、そのサンプルの獲得後に（試薬での処理、可溶化、または特定の成分の富化によって）任意の様式で操作されたサンプルを含む。この用語は、臨床サンプルを含み、細胞培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体、および組織サンプルもまた含む。
【００５０】
用語「処置（処理）」、「処置（処理）している」、「処置（処理）する」などは、一般に、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることをいうために、本明細書中で使用される。この効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防することに関して予防的であり得、ならびに／あるいは疾患および／またはその疾患に起因する有害な効果の部分的または完全な安定化または治癒に関して治療的であり得る。「処置」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を網羅し、以下を含む：（ａ）疾患または症状が、その疾患または症状に対して罹患しやすい可能性があるが、未だその疾患または症状を有するとは診断されていない被験体において発生することを予防する；（ｂ）その疾患症状を阻害する（すなわち、その進展の停止）；または（ｃ）その疾患症状の軽減（すなわち、その疾患または症状の後退を引き起こす）。
【００５１】
用語「個体」、「被験体」、「宿主」、および「患者」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして診断、処置、または治療が所望される任意の哺乳動物被験体（特に、ヒト）をいう。他の被験体としては、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが挙げられ得る。
【００５２】
「宿主細胞」とは、本明細書中で使用される場合、単細胞実体として培養された微生物または真核生物細胞または細胞株であって、組換えベクターまたは他の移入ポリヌクレオチドのためのレシピエントとして使用され得るか、または使用されたものをいい、そしてトランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。単細胞の子孫は、天然、偶発、または故意の変異に起因して、必ずしも、形態またはゲノム成分もしくは全ＤＮＡ成分が、その元の親と完全に同一である必要はないかもしれないと理解される。
【００５３】
用語「癌」、「新生物」、「腫瘍」、および「癌腫」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして比較的自律的な増殖を示し、その結果、細胞増殖の制御の有意な損失によって特徴付けられる異常な増殖表現型を示す、細胞をいう。一般に、本願において検出または処置に対する目的の細胞としては、前癌（例えば、良性）、悪性、転移前、転移性、および非転移性の細胞が挙げられる。癌性細胞の検出は、特に興味深い。
【００５４】
用語「正常」とは、「正常細胞」の文脈において使用される場合、形質転換されていない表現型の細胞、または試験されている組織型の非形質転換細胞の形態を示す細胞を意味する。
【００５５】
「癌性表現型」とは、一般に、癌性細胞に特徴的な、任意の種々の生物学的現象をいい、この現象は、癌の型とともに変動し得る。癌性の表現型は、一般に、例えば、細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ  ｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の異常（例えば、制御されない増殖）、細胞周期の調節の異常、細胞移動性の異常、細胞−細胞相互作用の異常、または転移性の異常などによって同定される。
【００５６】
「治療標的」とは、一般に、その活性の調節の際に（例えば、発現、生物学的活性などの調節によって）、癌性表現型の調節を提供し得る、遺伝子または遺伝子産物をいう。
【００５７】
全体にわたって使用される場合、「調節」とは、示される現象の増加または減少をいうことを意味する（例えば、生物学的活性の調節とは、生物学的活性の増加または生物学的活性の減少をいう）。
【００５８】
（ポリヌクレオチド組成物）
本発明は、胸部癌細胞において差示的に発現される遺伝子を提示する、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチド、およびそれによってコードされるポリペプチドは、種々の治療方法および診断方法において、用途を見出す。
【００５９】
本明細書中に記載される方法において有用な、単離されたポリヌクレオチドを含有する組成物に関して、本発明の範囲は、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列の任意の１つに記載される配列を有するポリヌクレオチド；ストリンジェントな条件下（特に、高ストリンジェンシーの条件）でのハイブリダイゼーションによる、本明細書中に記載される生物学的材料または他の生物学的供給源（特に、ヒト供給源）から得られるポリヌクレオチド；提供されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子；提供されるポリヌクレオチドに対応するｃＤＮＡ；提供されるポリヌクレオチドおよびその対応する遺伝子の改変体（特に、コードされる遺伝子産物の生物学的活性（例えば、タンパク質ファミリーへの遺伝子産物の割り当ておよび／または遺伝子産物中に存在する機能的ドメインの同定の結果として、提供されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子産物に起因する生物学的活性）を維持する改変体）；を包含するが、必ずしもこれらに限定されない。本発明によって企図され、そして本発明の範囲内である、他の核酸組成物は、本明細書中の開示が提供される場合、当業者に容易に明らかである。「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書中で組成物の核酸を参照して使用される場合、具体的に示されなき限り、その核酸の長さまたは構造に関して制限することを意図されない。
【００６０】
本発明は、ヒト組織（特にヒト乳房組織）において発現される遺伝子を提示するポリヌクレオチド、特に、癌性胸部細胞において差示的に発現されるポリヌクレオチドを特徴とする。本明細書中に記載される、特に興味深い核酸組成物は、少なくとも約１５ｂｐ長、少なくとも約３０ｂｐ長、少なくとも約５０ｂｐ長、少なくとも約１００ｂｐ長、少なくとも約２００ｂｐ長、少なくとも約３００ｂｐ長、少なくとも約５００ｂｐ長、少なくとも約８００ｂｐ長、少なくとも約１ｋｂ長、少なくとも約２．０ｋｂ長、少なくとも約３．０ｋｂ長、少なくとも約５ｋｂ長、少なくとも約１０ｋｂ長、少なくとも約５０ｋｂ長であり、そして通常、約２００ｋｂ長未満である。これらのポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチドフラグメント）は、本明細書中に議論されるような、プローブおよびプライマーのための出発物質として、診断プローブおよびプライマーが挙げられるがこれらに限定されない用途を有する。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは、通常、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列（例えば、配列表、表中に参照として組み込まれるもの（例えば、ＮＣＢＩ登録番号によって）、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託されたｃＤＮＡ、またはそのフラグメントもしくは改変体）のいずれか１つの記載される配列を含む。ポリヌクレオチドの「フラグメント」または「部分」とは、少なくとも約１０ｎｔ〜約１２ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１８ｎｔまたは２０ｎｔの残基、通常、少なくとも約２２ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、６０ｎｔ、７０ｎｔ、８０ｎｔ、９０ｎｔ、１００ｎｔから、少なくとも約１５０ｎｔ、２００ｎｔ、２５０ｎｔ、３００ｎｔ、３５０ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、８００ｎｔ、または約１０００ｎｔ、１５００ｎｔまたは２０００ｎｔの長さの連続した配列である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのフラグメントは、ポリヌクレオチドのコード配列である。ポリヌクレオチドのフラグメントは、本明細書中に提供されるヌクレオチド配列の位置１（すなわち、最初のヌクレオチド）で開始し得るか、または約位置１０、２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００もしくは２０００で開始し得るか、または本明細書中に提供されるヌクレオチド配列のＡＴＧ翻訳開始コドンで開始し得る。この文脈において、「約」は、具体的に記載される値、または数ヌクレオチド（５、４、３、２または１）大きいかまたは小さい値を含む。記載されるポリヌクレオチドおよびそのフラグメントは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、ＢＬＡＳＴプローブ、または同定配列としての用途を見出す。
【００６２】
本発明の核酸は、本明細書中に提供される配列の改変体または縮重改変体であり得る。一般に、本明細書中に提供されるポリヌクレオチドの改変体は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に実装されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される場合、提供される配列の同じ大きさのフラグメントと比較して、少なくとも約６５％より大きい、少なくとも約７０％より大きい、少なくとも約７５％より大きい、少なくとも約８０％より大きい、少なくとも約８５％より大きい、または少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より大きい、またはそれより大きい（すなわち、１００％）配列同一性のフラグメントを有する。本発明の目的で、同一性％を計算する好ましい方法は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムである。広範なＤＮＡ配列同一性は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に実装されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムで、検索パラメータ（ギャップオープンペナルティー１２；およびギャップエクステンションペナルティー１）を用いるギャップ検索を使用して決定される場合、６５％より大きいべきである。
【００６３】
本発明の核酸組成物は、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つ由来の連続したヌクレオチドの同定配列を含む、全長ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む。
【００６４】
上で議論されたように、本明細書中に記載される方法において有用なポリヌクレオチドはまた、配列類似性または配列同一性を有する、ポリヌクレオチド改変体を含む。配列類似性を有する核酸は、低ストリンジェンシー条件下（例えば、５０℃および１０×ＳＳＣ（０．９Ｍ生理食塩水／０．０９ｍＭクエン酸ナトリウム）および５５℃で１×ＳＳＣ中での洗浄に供される場合の残りの結合）でのハイブリダイゼーションによって、検出される。配列同一性は、高ストリンジェンシー条件下（例えば、５０℃以上および０．１×ＳＳＣ（９ｍＭ生理食塩水／０．９ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションによって、決定され得る。ハイブリダイゼーションの方法および条件は、当該分野において周知であり、例えば、ＵＳＰＮ５，７０７，８２９号を参照のこと。提供されるポリヌクレオチド配列に実質的に同一の核酸（例えば、対立遺伝子改変体、遺伝子の遺伝子的に変更されたバージョンなど）は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、提供されたポリヌクレオチド配列に結合する。プローブ（特に、ＤＮＡ配列の標識されたプローブ）を使用することによって、相同遺伝子または関連遺伝子を単離し得る。相同遺伝子の供給源は、任意の種であり得、例えば、霊長類種（特に、ヒト）；げっ歯類（例えば、ラットおよびマウス）；イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、線虫などであり得る。
【００６５】
１つの実施形態において、ハイブリダイゼーションは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの、少なくとも１５の連続したヌクレオチド（ｎｔ）のフラグメントを使用して実施される。すなわち、開示されるポリヌクレオチド配列の１つの少なくとも１５の連続するｎｔが、プローブとして使用され、このプローブは、相補配列を含む核酸と優先的にハイブリダイズし、選択されたプローブに独特にハイブリダイズする核酸の同定および検索を可能にする。本明細書中に提供される１つより多いポリヌクレオチド配列由来のプローブは、これらが由来するｃＤＮＡが１つのｍＲＮＡに対応する場合、同じ核酸配列とハイブリダイズし得る。
【００６６】
本発明において使用が企図されるポリヌクレオチドとしてはまた、ヌクレオチド配列の天然に存在する改変体（例えば、縮重改変体（例えば、同じポリペプチドをコードするが、遺伝子コードの縮重の性質に起因して、ヌクレオチド配列が異なる配列）、対立遺伝子改変体など）の配列を有するものが挙げられる。本発明によって企図されるポリヌクレオチドの改変体は、本明細書中に開示されるヌクレオチド配列との、推定改変体のハイブリダイゼーション（好ましくは、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション）によって同定される。例えば、適切な洗浄条件を使用することによって、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの改変体は、その対立遺伝子改変体が、選択されたポリヌクレオチドプローブに対して最大約２５〜３０％の塩基対（ｂｐ）ミスマッチを示す場合に、同定され得る。一般に、対立遺伝子改変体は、１５〜２５％ｂｐのミスマッチを含み、そして最低５〜１５％、２〜５％ｂｐのミスマッチ、または１〜２％ｂｐのミスマッチ、ならびに単一のｂｐミスマッチを含み得る。
【００６７】
本発明はまた、本明細書中に提供さえるポリヌクレオチド配列のいずれか１つに対応するホモログを包含し、ここで、この相同遺伝子の供給源は、任意の哺乳動物種（例えば、霊長類種（特に、ヒト）；げっ歯類（例えば、ラット）；イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ）、酵母、線虫などであり得る。哺乳動物種の間（例えば、ヒトとマウス）で、ホモログは、一般に、かなりの配列同一性を有し、例えば、ヌクレオチド配列間で少なくとも７５％の配列同一性、通常、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％さえの同一性である。配列類似性は、参照配列に基づいて計算され、この参照配列は、より大きい配列のサブセット（例えば、保存されたモチーフ、コード領域、隣接領域など）であり得る。参照配列は、通常、少なくともおよそポリヌクレオチド配列のフラグメントであり、そして比較される完全配列まで伸張し得る。配列分析のためのアルゴリズムは、当該分野において公知であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９−３４０２に記載されるギャップドＢＬＡＳＴ、またはＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ、Ｎｅｖａｄａ）から入手可能なＴｅｒａＢＬＡＳＴである。
【００６８】
さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表的な例（例えば、プローブとして有用）としては、例えば、本発明の核酸、またはその相補鎖のヌクレオチド番号約１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、２００１〜２０５０、２０５１〜２１００、２１０１〜２１５０、２１５１〜２２００、２２０１〜２２５０、２２５１〜２３００、２３０１〜２３５０、２３５１〜２４００、２４０１〜２４５０、２４５１〜２５００、２５０１〜２５５０、２５５１〜２６００、２６０１〜２６５０、２６５１〜２７００、２７０１〜２７５０、２７５１〜２８００、２８０１〜２８５０、２８５１〜２９００、２９０１〜２９５０、２９５１〜３０００、３００１〜３０５０、３０５１〜３１００、３１０１〜３１５０、３１５１〜３２００、３２０１〜３２５０、３２５１〜３３００、３３０１〜３３５０、３３５１〜３４００、３４０１〜３４５０、３４５１〜３５００、３５０１〜３５５０、３５５１〜３６００、３６０１〜３６５０、３６５１〜３７００、３７０１〜３７５０、３７５１〜３８００、３８０１〜３８５０、３８５１〜３９００、３９０１〜３９５０、３９５１〜４０００、４００１〜４０５０、４０５１〜４１００、４１０１〜４１５０、４１５１〜４２００、４２０１〜４２５０、４２５１〜４３００、４３０１〜４３５０、４３５１〜４４００、４４０１〜４４５０、４４５１〜４５００、４５０１〜４５５０、４５５１〜４６００、４６０１〜４６５０、４６５１〜４７００、４７０１〜４７５０、４７５１〜４８００、４８０１〜４８５０、４８５１〜４９００、４９０１〜４９５０、４９５１〜５０００、５００１〜５０５０、５０５１〜５１００、５１０１〜５１５０、５１５１〜５２００、５２０１〜５２５０、５２５１〜５３００、５３０１〜５３５０、５３５１〜５４００、５４０１〜５４５０、５４５１〜５５００、５５０１〜５５５０、５５５１〜５６００、５６０１〜５６５０、５６５１〜５７００、５７０１〜５７５０、５７５１〜５８００、５８０１〜５８５０、５８５１〜５９００、５９０１〜５９５０、５９５１〜６０００、６００１〜６０５０、６０５１〜６１００、６１０１〜６１５０、および６１５１由来の配列を含むか、あるいはその配列からなるフラグメントが挙げられる。この文脈において、「約」とは、具体的に記載される範囲、またはいずれかの末端もしくは両末端において、数ヌクレオチド（５、４、３、２または１）ヌクレオチド大きいかもしくは小さい範囲を含む。いくつかの実施形態において、これらのフラグメントは、機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードするが、一方で他の実施形態において、これらのフラグメントは、プローブ、またはプローブのための出発物質である。これらの核酸分子の１つ以上に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、あるいはより低いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、これらのポリヌクレオチドまたはフラグメントによってコードされるポリペプチドと同様に、本発明によって包含される。
【００６９】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、およびそのフラグメントであり得、特に、生物学的に活性な遺伝子産物をコードするフラグメント、および／または本明細書中に開示される方法（例えば、診断において、差示的に発現される目的の遺伝子の独特の識別子としてなど）において有用なフラグメントであり得る。用語「ｃＤＮＡ」とは、本明細書中で使用される場合、ネイティブな成熟ｍＲＮＡ種において見出される配列エレメントの配置を共有する、全ての核酸を含むことが意図され、ここで、配列エレメントは、エキソンならびに３’非コード領域および５’非コード領域である。通常、ｍＲＮＡ種は、連続したエキソンを有し、介在するイントロンは、存在する場合、核ＲＮＡスプライシングによって除去されて、ポリペプチドをコードする連続したオープンリーディングフレームを作製する。ｍＲＮＡ種はまた、エキソンとイントロンとの両方を備えて存在し得、ここで、イントロンは、選択的スプライシングによって除去され得る。さらに、同じゲノム配列によってコードされる異なる種のｍＲＮＡが、細胞において種々のレベルで存在し得、そしてこれらの種々のレベルのｍＲＮＡ種の検出は、細胞においてコードされる遺伝子産物の差示的発現の指標であり得ることが、注目されるべきである。
【００７０】
目的のゲノム配列は、配列表に規定されるように、開始コドンと終止コドンとの間に存在する核酸を含み、ネイティブな染色体中に通常存在するイントロンの全てを含む。これはさらに、成熟ｍＲＮＡにおいて見出される３’非翻訳領域および５’非翻訳領域を含み得る。これはさらに、約１ｋｂであるがおそらくそれより大きい、隣接ゲノムＤＮＡを転写領域の５’末端および３’末端のいずれかに含む、特異的な転写調節配列および翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含み得る。ゲノムＤＮＡは、１００ｋｂｐ以下のフラグメントとして単離され得、そして隣接染色体配列を実質的に含まない。コード領域に、３’または５’で隣接するか、あるいはイントロンにおいて時々見出されるような内部調節配列と隣接するゲノムＤＮＡは、適切な組織、段階特異的、または疾患状態特異的な発現のために必要とされる配列を含む。
【００７１】
本発明の核酸組成物は、天然に存在するポリペプチドの全てまたは一部をコードし得る。二本鎖フラグメントまたは一本鎖フラグメントは、従来の方法に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって、または制限酵素消化によって、ＰＣＲ増幅によって、などで、ＤＮＡ配列から得られ得る。
【００７２】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに特異的なプローブは、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列を使用して、作製され得る。これらのプローブは、通常、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のフラグメントである。これらのプローブは、化学的に合成され得るか、または制限酵素を使用して、より長いポリヌクレオチドから作製され得る。これらのプローブは、例えば、放射活性タグ、ビオチン化タグ、または蛍光タグで、標識され得る。好ましくは、プローブは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つの同定配列に基づいて、設計される。より好ましくは、プローブは、配列に対して低い複雑性をマスクするためのマスキングプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒなど）の適用後にマスクされずに残る、本発明のポリヌクレオチドの１つの連続配列に基づいて、設計される。すなわち、マスキングプログラムによって産生されたマスクされた配列のポリｎストレッチの外側のポリヌクレオチドによって示されるような、マスクされない領域を選択する。
【００７３】
本発明における目的のポリヌクレオチドは、かなりの純度で、一般に、インタクトな染色体以外として、単離および獲得される。通常、ポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）は、これらが通常会合する、他の天然に存在する核酸配列を実質に含まずに、一般に、少なくとも約５０％、通常は少なくとも約９０％の純度で得られ、そして代表的に、「組換え」（例えば、天然に存在する染色体上で通常会合しない、１つ以上のヌクレオチドによって隣接される）である。
【００７４】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、線状分子としてか、または環状分子内に提供され得、そして自律的に複製する分子（ベクター）内、または複製配列を有さない分子内に提供され得る。ポリヌクレオチドの発現は、それら自体によって、または当該分野において公知の他の調節配列によって、調節され得る。ポリヌクレオチドは、当該分野において利用可能な種々の技術（例えば、トランスフェリンポリカチオン媒介ＤＮＡ移入、裸の核酸もしくはカプセル化された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介ＤＮＡ移入、ＤＮＡコーティングされたラテックスビーズの細胞内移送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションなど）を使用して、安定な宿主細胞に導入され得る。
【００７５】
本明細書中に記載される核酸組成物は、例えば、ポリペプチドを産生するため、生物学的サンプル（例えば、ヒト細胞の抽出物）中のｍＲＮＡまたはこのようなサンプルから産生されるｃＤＮＡの検出のためのプローブとして、ポリヌクレオチドのさらなるコピーを産生するため、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの産生のため、ならびに一本鎖ＤＮＡプローブまたは三重鎖形成オリゴヌクレオチドとして、使用され得る。本明細書中に記載されるプローブは、例えば、サンプル中の、本明細書中に提供されるポリヌクレオチドまたはその改変体のいずれか１つの存在または非存在を決定するために使用され得る。これらおよび他の用途は、以下にさらに詳細に記載される。
【００７６】
（ポリペプチドおよびその改変体）
本発明は、胸部癌細胞において差示的に発現される遺伝子を提示するポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチドをさらに提供する。このようなポリペプチドは、本明細書中で、「胸部癌に関連するポリペプチド」と称される。これらのポリペプチドは、胸部癌に関連するポリペプチドに特異的な抗体を産生するために使用され得、この抗体は、次に、本明細書中により詳細に議論されるように、診断方法、予後方法、治療方法などにおいて有用である。ポリペプチドはまた、本明細書中により詳細に議論されるように、治療介在のための標的として有用である。
【００７７】
本発明によって企図されるポリペプチドとしては、開示されるポリヌクレオチドによってコードされるもの、およびこれらのポリヌクレオチドが対応する遺伝子、ならびに遺伝コードの縮重によって、開示されるポリヌクレオチドと配列が同一ではない核酸が挙げられる。本発明によって企図されるさらなるポリペプチドとしては、配列表のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが挙げられる。従って、本発明は、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチド、またはその改変体によってコードされるポリペプチドを、その範囲内に含む。
【００７８】
一般に、用語「ポリペプチド」とは、本明細書中で使用される場合、記載されるポリヌクレオチドによってコードされる全長ポリペプチド、記載されるポリヌクレオチドによって提示される遺伝子によってコードされるポリペプチド、ならびにその部分またはフラグメントをいう。「ポリペプチド」とはまた、天然に存在するタンパク質の改変体を包含し、ここで、このような改変体は、天然に存在するタンパク質と相同であるか、または実質的に類似であり、そして天然に存在するタンパク質と同じかまたは異なる種（例えば、ヒト、マウス、または記載されるポリペプチドを天然に発現する何らかの他の種（通常、哺乳動物種））を起源とし得る。一般に、改変体ポリペプチドは、上記パラメータを使用してＢＬＡＳＴ  ２．０によって測定される場合に、本明細書中に記載される差示的に発現されるポリペプチドと、少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％、そしてより通常には少なくとも約９８％の配列同一性を有する配列を有する。この改変対ポリペプチドは、天然にかまたは非天然にグリコシル化され得る。すなわち、このポリペプチドは、対応する天然に存在するタンパク質において見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する。
【００７９】
本発明はまた、開示されるポリペプチド（またはそのフラグメント）のホモログを包含し、ここで、これらのホモログは、他の種（すなわち、他の動物種または植物種）から単離され、ここで、このようなホモログは、通常、哺乳動物種（例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）；家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ）；およびヒトである。「ホモログ」とは、上で同定されるような特定の差示的に発現されるタンパク質に対して、少なくとも約３５％、通常は少なくとも約４０％、そしてより通常には少なくとも約６０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味し、ここで、配列同一性は、上記パラメータを用いて、ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムを使用して決定される。
【００８０】
一般に、本発明の目的のポリぺプチドは、天然に存在しない環境において提供され、例えば、それらの天然に存在する環境から分離されている。特定の実施形態において、本発明のタンパク質は、このタンパク質を天然に産生する細胞または細胞の抽出物と比較した場合、そのタンパク質について富化された組成物中に存在する。このように、単離されたポリペプチドが提供され、ここでは「単離された」とは、タンパク質が他のポリペプチドが実質的に存在しない組成物中に存在することが意味され、ここで実質的に存在しないとは、その組成物の９０％未満、通常６０％未満、およびより通常５０％未満が、タンパク質が天然に見出される細胞の他のポリペプチドから構成されることを意味する。
【００８１】
また、本発明の範囲内にあるのは、改変体であり；ポリペプチドの改変体は、変異体、フラグメント、および融合物を含む。変異体は、アミノ酸の置換、付加、または欠失を含み得る。アミノ酸の置換は、保存的なアミノ酸の置換、または非必須アミノ酸を排除するため（例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位、またはアセチル化部位を変化するため）の置換、または機能について必須ではない１つ以上のシステイン残基の置換または欠失によって誤った折畳みを最小にするための置換であり得る。保存的なアミノ酸の置換は、置換されたアミノ酸の全体的な電荷、疎水性／親水性、および／または立体的なバルクを保存する置換である。
【００８２】
改変体は、タンパク質の特定の領域（例えば、機能的ドメインおよび／または、ポリペプチドがタンパク質ファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列と関連する領域）の増強された生物学的活性を、保持するかまたは有するように設計され得る。例えば、抗原性の増大について最適化されたムテインが、作製され得、すなわち、ポリペプチドの抗原性を増強するポリペプチドのアミノ酸改変体が、作製され得る。改変体の生成についてのアミノ酸変化の選択は、アミノ酸の接近可能性（内部対外部）（例えば、Ｇｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９８０）１５：２１１を参照のこと）、改変体ポリペプチドの熱安定性（例えば、Ｑｕｅｒｏｌら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．（１９９６）９：２６５を参照のこと）、所望のグリコシル化部位（例えば、ＯｌｓｅｎおよびＴｈｏｍｓｅｎ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）１３７：５７９を参照のこと）、所望のジスルフィド架橋（例えば、Ｃｌａｒｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３）３２：４３２２；およびＷａｋａｒｃｈｕｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９４）７：１３７９を参照のこと）、所望の金属結合部位（例えば、Ｔｏｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）３０：９７、およびＨａｅｚｅｒｂｒｏｕｃｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９３）６：６４３）、ならびにプロリンループ内での所望の置換（例えば、Ｍａｓｕｌら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４）６０：３５７９）に基づき得る。システイン涸渇されたムテインは、米国特許第４，９５９，３１４号において記載されるように生成され得る。改変体はまた、本明細書中に開示されるポリペプチドのフラグメント、特に生物学的に活性なフラグメントおよび／または機能的ドメインに対応するフラグメントを含む。目的のフラグメントは、代表的に、少なくとも約１０アミノ酸長から少なくとも約１５アミノ酸長、通常少なくとも約５０アミノ酸長であり、および３００アミノ酸長またはそれよりも長くあり得るが、通常約１０００アミノ酸長を超えず、ここではフラグメントは、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドの配列のいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドまたはそれらのホモログによってコードされるポリペプチドに同一であるアミノ酸のストレッチを有する。本明細書中に記載されるタンパク質改変体は、本発明の範囲内であるポリヌクレオチドによってコードされる。遺伝子コードは、対応する改変体を構築するために適切なコドンを選択するために使用され得る。
【００８３】
本発明のポリペプチドのフラグメントは、例えば、本発明のポリペプチドの部分のアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、配列番号１〜４９９またはその相補体の配列のいずれか１つによって同定される本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）である。本発明のポリペプチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約９アミノ酸長であり、少なくとも約１５アミノ酸長であり、およびより好ましくは、少なくとも約２０アミノ酸長であり、なおより好ましくは、少なくとも約３０アミノ酸長であり、そしてさらにより好ましくは、少なくとも約４０アミノ酸長であり、少なくとも約５０アミノ酸長であり、少なくとも約７５アミノ酸長であり、少なくとも約１００アミノ酸長であり、少なくとも約１２５アミノ酸長であるか、または少なくとも約１５０アミノ酸長である。例えば、「少なくとも２０アミノ酸長」フラグメントは、例えば、登録されたライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローン中のｃＤＮＡ、または配列番号１〜４９９に示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖によってコードされるポリペプチド由来の、２０以上の連続したアミノ酸を含むことが意図される。この文脈において、「約」は、特に列挙された値またはいくつか（５、４、３、２、または１）のアミノ酸、より大きい値もしくはより小さい値を含む。これらのポリペプチドフラグメントは、本明細書中で議論されるような抗体の産生を含むがこれに限定されない用途を有する。もちろん、より大きなフラグメント（例えば、少なくとも１５０アミノ酸長、１７５アミノ酸長、２００アミノ酸長、２５０アミノ酸長、５００アミノ酸長、６００アミノ酸長、１０００アミノ酸長、または２０００アミノ酸長）はまた、本発明に含まれる。
【００８４】
さらに、本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例は、約アミノ酸数１〜１０、５〜１０、１０〜２０、２１〜３１、３１〜４０、４１〜６１、６１〜８１、９１〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６２、１６２〜２００、２０１〜２４０、２４１〜２８０、２８１〜３２０、３２１〜３６０、３６０〜４００、４００〜４５０、４５１〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００などからの配列を含むか、あるいは、これらからなる。この文脈において、「約」は、いずれかの末端または両方の末端で、特に列挙された範囲またはいくつか（５、４、３、２、または１）のアミノ酸、より大きい値もしくはより小さい範囲を含む。いくつかの実施形態において、これらのフラグメントは、機能的活性（例えば、生物学的活性）を有し、その一方で、他の実施形態において、これらのフラグメントは、抗体を作製するために使用され得る。
【００８５】
さらなるポリペプチド改変体は、ＰＣＴ公報ＷＯ／００−５５１７３、ＷＯ／０１−０７６１１およびＷＯ／０２−１６４２９に記載され得る。
【００８６】
（ベクター、宿主細胞およびタンパク質産生）
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および組換え技術によるポリペプチドの産生に関する。ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能であっても、複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的に相補する宿主細胞においてのみ生じる。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドは、宿主中での増殖のための選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般的に、プラスミドベクターは、沈殿（例えば、リン酸カルシウム沈殿）中にか、または帯電脂質との複合体中に導入される。ベクターがウイルスの場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用して、インビトロでパッケージされ、次いで、宿主細胞に形質導入され得る。
【００８８】
ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（ほんの少し例を挙げると、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、転写開始部位、転写終結部位、および転写される領域における転写のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、最初に転写開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００８９】
示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、真核生物細胞培養のためのＧ４１８耐性またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌中での培養のためのテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００９０】
適切な宿主の代表例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；および植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。上記宿主について、５つの適切な培養培地および条件が、当業者に公知である。
【００９１】
ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃから入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨＳＡ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃから入手可能）は、細菌における使用について好ましいベクターの中に含まれる。ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）は、好ましい真核生物ベクター中に存在する。ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ，ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全て、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｏａｄ，ＣＡから入手可能）は、酵母系における使用のために好ましい発現ベクターに挙げられるがこれらに限定されない。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【００９２】
目的の核酸は、慣用的な（ｒｏｕｔｅ）方法によって適切なベクターにクローン化され得る。適切なベクターとしては、プラスミド、コスミド、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、ＹＡＣ、ＢＡＣなど）、ファージベクターが挙げられる。
【００９３】
構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって実施され得る。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアル（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））に記載される。本発明のポリペプチドが、組換えベクターを欠く宿主細胞によって実際に発現され得ることが特に企図される。
【００９４】
本発明のポリペプチドは、組換え細胞培養物から、周知の方法（硫酸アンモニウム法、エタノール沈殿法、酸抽出法、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる）によって回収され、精製され得る。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製のために使用される。
【００９５】
本発明のポリペプチドはまた、以下から回収され得る：天然供給源から精製された生成物（体液、組織および細胞が挙げられ、直接単離されるか、培養されるかのいずれか）；化学合成手順の産物；原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞）から組換え技術によって産生される生成物。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。さらに、本発明のポリペプチドはまた、（いくらかの場合、宿主媒介性プロセスの結果として）最初の、改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、翻訳開始コドンによってコードされるＮ−末端メチオニンが、全ての真核生物細胞における翻訳の後に、一般的に、任意のタンパク質から高い効率で除去されることは、周知である。ほとんどのタンパク質上のＮ−末端メチオニンが、ほとんどの原核生物において効率的に除去され、その一方で、いくつかのタンパク質について、この原核生物除去プロセスは、Ｎ−末端メチオニンが共有結合されるアミノ酸の性質に依存して非効率的である。
【００９６】
ポリペプチド発現のための適切な方法および組成物は、ＰＣＴ公報ＷＯ／００−５５１７３、ＷＯ／０１−０７６１１およびＷＯ／０２−１６４２９に記載される。
【００９７】
さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を使用して化学的に合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポリペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用によって合成され得る。さらに、所望の場合、非伝統的なアミノ酸または化学的アミノ酸アナログは、ポリペプチド配列への置換または付加として導入され得る。非伝統的アミノ酸としては、通常のアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｂｕ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、５−ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ）が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【００９８】
天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を使用して生成され得、これとしては、オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７３：４３３１（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７０：６４８７（１９８２）を参照のこと）；カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ  ３７７：４１５（１９８６）を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９９】
スキャニングアミノ酸分析はまた、連続配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定するために使用され得る。相対的に小さな天然アミノ酸が、好ましいスキャニングアミノ酸の中に存在する。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが挙げられる。アラニンは、この群の中で、代表的に好ましいスキャニングアミノ酸である。なぜなら、これは、β−炭素の向こうの側鎖を除去し、改変体の主鎖コンフォメーションを変更する可能性がより低いからである。アラニンは、代表的に好ましい。なぜなら、これは、最も共通のアミノ酸であるからである。アラニン置換が、十分な量の改変体を生じない場合、等配電子アミノ酸が、使用され得る。
【０１００】
適切なコンフォメーションのポリペプチドの維持に関与しない任意のシステイン残基はまた、一般的にセリンで置換され、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防止し得る。逆に、システイン結合は、ポリペプチドに加えられ、その安定性を改善し得る。
【０１０１】
本発明は、さらに、翻訳の間またはその後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって、差示的に改変された本発明のポリペプチドを包含する。任意の多くの化学的改変は、公知の技術によって実施され得、この技術としては、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的分解；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０２】
本発明によって包含されるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ−連結炭水化物鎖またはＯ−連結炭水化物、Ｎ−末端またはＣ−末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学的部分の結合、Ｎ−連結炭水化物鎖またはＯ−連結炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ−末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。ポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識またはアフィニティー標識）を用いて改変され、タンパク質の検出および単離を可能にし得る。
【０１０３】
本発明のポリペプチドの化学的に改変された誘導体がまた、本発明によって提供され、この誘導体は、さらなる利点（溶解性の増加、ポリペプチドの安定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと））を提供し得る。誘導体化のための化学的部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。５のポリペプチドが、分子内のランダムな位置または分子内の所定の位置で改変され得、そして、１、２、３以上の結合された化学的部分を含み得る。
【０１０４】
改変されたポリペプチドの産生のために適切な方法および組成物は、ＰＣＴ公報ＷＯ／００−５５１７３、ＷＯ／０１−０７６１１およびＷＯ／０２−１６４２９に記載される。
【０１０５】
（抗体および他のポリペプチドまたはポリヌクレオチド結合分子）
本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドおよび／または本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子のポリペプチドに特異的な抗体（単離された抗体であり得る）をさらに提供する。抗体は、抗体および緩衝液ならびに／または薬学的に受容可能な賦形剤を含有する組成物中に提供され得る。胸部癌に関連するポリペプチドに特異的な抗体は、本明細書中で詳細に考察されるように、種々の診断方法および治療方法において有用である。
【０１０６】
遺伝子産物（ポリペプチド、ｍＲＮＡ（特に異なる二次構造および／または三次構造を有するｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、または完全遺伝子を含む）は、実験目的、診断目的、および治療目的のために抗体を惹起するために調製され、そして使用され得る。抗体は、ポリヌクレオチドに対応する遺伝子を同定するために使用され得る。ポリヌクレオチドまたは関連ｃＤＮＡは、上記のように発現され、抗体が、調製される。これらの抗体は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド上のエピトープに対して特異的であり、細胞調製物もしくは組織調製物中か、またはインビトロ発現系の無細胞抽出物中の、対応するネイティブなタンパク質を沈殿するかまたはそれに結合し得る。
【０１０７】
（抗体）
本発明のさらなるポリペプチドは、抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関し、これらは、本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドフラグメント、もしくはこれらの改変体、および／またはこれらのエピトープ（特異的な抗体−抗原結合をアッセイするための当該分野で周知の免疫アッセイによって決定される場合）を免疫特異的に結合する。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）および上記の任意のエピトープ−結合フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであり得る。
【０１０８】
最も好ましい抗体は、本発明のヒト抗原−結合抗体フラグメントであり、これとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。抗原−結合抗体フラグメント（単鎖抗体を含む）は、可変領域を、単独で、またはヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの全体もしくは部分との組み合わせで含み得る。可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインとのいずれかの組み合わせをまた含む抗原−結合フラグメントはまた、本発明に含まれる。本発明の抗体は、トリおよび哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、フネウサギ（ｓｈｉｐ  ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、下記されるようにそして例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによって米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるように、これは、ヒト免疫グロブリンライブラリーまたは外因性免疫グロブリンを発現しない１以上のヒト免疫グロブリンに対するトランスジェニック動物から単離された抗体を含む。
【０１０９】
本発明の抗体は、一特異的、二特異的、三特異的またはそれより多い多特異的であり得る。多特異的抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種エピトープ（例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体材料）の両方に対して特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１１０】
本発明の抗体は、これら抗体が認識するか特異的に結合する、本発明のポリペプチドのエピトープまたは部分に関して記載され得るか、または特定され得る。エピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるように、例えば、Ｎ−末端部分およびＣ−末端部分によってか、または連続的なアミノ酸残基のサイズによって、特定され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体を包含し、そして、その抗体の排除を可能にする。
【０１１１】
本発明の抗体はまた、それらの交差反応性の点で記載または特定され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ、またはホモログに結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドに対して、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知である方法および本明細書中に記載される方法を使用して計算される）を有するポリペプチドに結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびにそれらの対応するエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当該分野で公知である方法および本明細書中に記載される方法を使用して計算される）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、上記交差反応性は、任意の１つの特定の抗原性または免疫原性のポリペプチド、あるいは、本明細書中に開示される２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の特定の抗原性および／または免疫原性のポリペプチドの組み合わせに関してである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中に開示される）で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する抗体が、さらに本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性の点で記載または特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものが挙げられる。
【０１１２】
本発明はまた、競合的結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセイ）によって決定される本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害する。
【０１１３】
異なる型の抗体を作製、スクリーニング、ヒト化、および改変するための方法は、当該分野において周知であり、ＰＣＴ公報ＷＯ／００−５５１７３、ＷＯ／０１−０７６１１およびＷＯ／０２−１６４２９に見出され得る。
【０１１４】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、本発明は、部分的にまたは完全にのいずれかで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する抗体を含む。好ましくは、本発明の抗体は、本明細書中に開示される抗原性エピトープまたはその一部に結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方を特徴とする。本発明はまた、リガンド結合を妨げないが、レセプター活性化を妨げるレセプター特異的抗体を特徴とする。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載される技術またはそれ以外の当該分野で公知の技術によって決定され得る。例えば、レセプター活性化は、免疫沈降によるレセプターまたはその基質のリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）を検出し、続いて、ウェスタンブロット分析（例えば、上記されるように）を行うことによって決定され得る。特定の実施形態において、抗体の非存在下での活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、および少なくとも５０％、リガンド活性またはレセプター活性を阻害する抗体が提供される。
【０１１５】
本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識し、好ましくは、非結合レセプターまたは非結合リガンドを特異的に認識しない抗体を特徴とする。同様に、リガンドに結合し、リガンドのレセプターへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合することを妨げない抗体が、本発明に含まれる。レセプターを活性化する抗体が本発明にさらに含まれる。レセプターを活性化する抗体が、さらに本発明に含まれる。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得る（すなわち、リガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性の全てまたはサブセットのいずれかを増強または活性化する（例えば、レセプターの２量化を誘導することによる））。抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特定の生物学的活性を含む生物学的活性に対する、アゴニスト、アンタゴニスト、または逆アゴニストとして特定され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を使用して作製され得る。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７；Ｄｅｎｇら，Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−４９９８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）：Ｙｏｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１  ｌ（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（Ｉ７）：１１２９５−１  １３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら，Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４−２０（１９９６）を参照のこと（これらは、全て、その全体が、本明細書中において参考として援用される）。
【０１１６】
本発明の抗体は、例えば、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化するため（これらに限定されない）に使用され得る（インビトロおよびインビボの診断方法および治療法の両方を含む）がこれらに限定されない。例えば、抗体は、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）（その全体が本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。
【０１１７】
抗体を含むさらなる方法および組成物は、ＰＣＴ公報ＷＯ／００−５５１７３、ＷＯ／０１−０７６１１およびＷＯ／０２−１６４２９に見出され得る。
【０１１８】
（抗体をコードするポリヌクレオチド）
本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、あるいは、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（例えば、上で規定される）下で、好ましくは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（好ましくは、対象のポリペプチドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。
【０１１９】
ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法によって、得られ得、そしてそのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載される）から構築され得る。これは、簡単に述べると、抗体をコードする配列の部分を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いで、ＰＣＲによる連結したオリゴヌクレオチドの増幅を包含する。
【０１２０】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドが、適切な供給源由来の核酸から作製され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンが利用可能でないが、抗体分子の配列が公知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって、化学的に合成され得るか、または適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織または細胞（例えば、本発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞）由来のｃＤＮＡライブラリー、またはこれらから単離された核酸（好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡ））から得られ得る。ＰＣＲによって作製される、増幅される核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法を使用して複製可能クローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１２１】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製するために（例えば、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入を作製するために）、ヌクレオチド配列の操作のための当該分野において周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（これらはともに、その全体が、本明細書中において参考として援用される）を参照のこと）を使用して操作され得る。
【０１２２】
（抗体を産生する方法）
本発明の抗体は、抗体の合成についての当該分野において公知の任意の方法（特に、化学合成、または好ましくは、組換え発現技術による）によって作製され得る。本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその部分（好ましくは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を使用して、組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。従って、抗体コードヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法は、本明細書中に記載される。当業者に周知の方法は、抗体コード配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。本発明は、従って、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ８６／０５８０７；ＰＣＴ公報ＷＯ  ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、そして抗体の可変ドメインは、重鎖全体または軽鎖全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
【０１２３】
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入され、そしてトランスフェクトされた細胞は、次いで、従来の技術によって培養されて、本発明の抗体を産生する。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために、宿主細胞において同時発現され得る。
【０１２４】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現するために利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され得、次いで精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換またはトランスフェクトされる場合、本発明の抗体分子をインサイチュで発現し得る細胞を表す。これらには、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ））で感染されたか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、より好ましくは、真核生物細胞（特に、組換え抗体分子全体の発現のため）が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要極初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターとともに、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ））は、抗体についての効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０１２５】
細菌系において、多くの発現ベクターが、発現される抗体分子について意図される用途に依存して有利に選択され得る。例えば、多くの量のこのようなタンパク質が産生される場合、抗体分子の薬学的組成物の作製のために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが、望ましくあり得る。このようなベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（（Ｒｕｔｈｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））（ここで、この抗体コード配列は、ｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターに個々に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））；など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用され得る。一般的に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリクスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物が、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１２６】
昆虫系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａカルフォルニカ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｎｉｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｉｌｓで増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。
【０１２７】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現系が、利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３部からなる（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列）に連結され得る。このキメラ遺伝子は、次いで、インビトロまたはインビボの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）での挿入は、生存可能で、感染された宿主において抗体分子を発現し得る組換えウイルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特異的な開始シグナルはまた、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳に必要であり得る。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を保証するために、所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズ（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの含有によって増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０１２８】
抗体産生は、当該分野において周知である。抗体を作製するための例示的な方法および組成物は、ＰＣＴ公報ＷＯ／００−５５１７３、ＷＯ／０１−０７６１１およびＷＯ／０２−１６４２９に見出され得る。
【０１２９】
（免疫表現型決定）
本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型決定に利用され得る。本発明の遺伝子の翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、より詳細には、種々の段階の特定の細胞型の分化および／または成熟において差示的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特定のエピトープ、またはエピトープの組合せに特異的なモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能にする。種々の技術は、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするためにモノクローナル抗体を使用し得、そして抗体コーティング磁石ビーズを使用する磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に結合された抗体を用いる「パニング」、およびフローサイトメトリーが挙げられる（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら  Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこと）。
【０１３０】
これらの技術は、特定の集団の細胞のスクリーニングを可能にする。例えば、血液学的悪性疾患（すなわち、急性白血病患者における微小残存白血病（ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＭＲＤ））、および対宿主移植片病（ＧＶＨＤ）を防ぐための移植における非自己細胞とともに見出され得る。あるいは、これらの技術は、増殖および／または分化を受け得る造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可能にし、これは、ヒト臍帯血において見出され得る。
【０１３１】
（抗体結合のためのアッセイ）
本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法によって免疫特異的結合のためにアッセイされ得る。使用され得る免疫アッセイとしては、少しだけ挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体−結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイのような技術を使用する競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは、慣用的であり、当該分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと（これは、本明細書中において、その全体が、参考として援用される））。例示的な免疫アッセイは、以下に簡単に記載される（しかし、限定として意図されない）。
【０１３２】
免疫沈降プロトコルは、一般的に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲ１ＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液において集団の細胞を溶解する工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、所定の期間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液においてビーズを洗浄する工程、およびＳＤＳ／サンプル緩衝液においてビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウェスタンブロットによって評価され得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加し、そしてバックグラウンドを減少する（例えば、セファロースビーズを細胞溶解物で予備洗浄する）ように改変され得るパラメーターを知り得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる議論について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの１０．１６．１を参照のこと。
【０１３３】
ウェスタンブロット分析は、一般的に、タンパク質サンプルの調製、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に依存して、８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でのタンパク質サンプルの電気泳動、ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質サンプルの膜（例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロン）への移動、ブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは無脂肪乳を有するＰＢＳ）での膜のブロッキング、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）での膜の洗浄、ブロッキング緩衝液中に希釈された１次抗体（目的の抗体）での膜のブロック、洗浄緩衝液での膜の洗浄、ブロッキング緩衝液中に希釈された酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合された２次抗体（１次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）での膜のブロック、洗浄緩衝液での膜の洗浄、および抗原の存在の検出を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加し、そしてバックグラウンドのノイズを減少するように改変され得るパラメーターを知り得る。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる議論について、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの１０．８．１．を参照のこと。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡは、抗原の調製、その抗原での９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルのコーティング、検出可能な化合物（例えば、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）に結合された目的の抗体のそのウェルへの添加、およびある期間のインキュベート、および抗原の存在の検出を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合される必要はなく；代わりに、検出可能な化合物に結合した２次抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され得る。さらに、抗原でのウェルのコーティングの代わりに、抗体は、ウェルにコーティングされ得る。この場合において、検出可能な化合物に結合された二次抗体は、目的の抗原のコーティングされたウェルへの添加後に添加され得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメーターならびに当該分野で公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションについて知り得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる議論について、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの１１．２．１を参照のこと。
【０１３５】
抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、競合結合アッセイによって決定され得る。競合結合アッセイの一例は、標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５１）を、非標識抗原の増加する濃度の存在下で目的の抗体と共にインキュベートすること、および標識抗原への抗体の結合を検出することを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によって、データから決定され得る。二次抗体との競合はまた、ラジオイムノアッセイを使用して決定され得る。この場合、抗原は、非標識二次抗体の増加する量の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５１）と結合体化された目的の抗体と共にインキュベートされる。
【０１３６】
（治療的用途）
本発明はさらに、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの患者に、開示される疾患、障害または状態の１つ以上を処置するために、本発明の抗体を投与する工程を包含する、抗体ベースの治療に関する。本発明の治療用化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）、および本発明の抗体（本明細書中に開示されるような、そのフラグメント、アナログおよび誘導体、ならびに抗イデオタイプ抗体を含む）をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害または状態（本明細書中に記載される疾患、障害または状態の任意の１つ以上を含むが、これらに限定されない）を処置するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害または状態の処置および／または予防としては、これらの疾患、障害または状態に関連する症状の軽減が挙げられるが、これに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるかまたは本明細書中に記載されるような薬学的に受容可能な組成物の形態で提供され得る。
【０１３７】
本発明の抗体が治療的に使用され得る様式の概要は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、身体に局所的にまたは全身的に、または抗体の直接細胞傷害性（例えば、補体細胞（ＣＤＣ）またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）によって媒介されるような）によって、結合することを包含する。これらのアプローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教示をふまえて、当業者は、本発明の抗体が、診断、モニタリングまたは治療の目的のためにどのように使用されるかを、過度の実験を行うことなく理解する。
【０１３８】
本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と共に、または例えば、リンホカインもしくは造血性増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７)と組合せて有利に使用され得、これらは、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増大するように働く。
【０１３９】
本発明の抗体は、単独でか、または他のタイプの処置（例えば、放射線治療、化学治療、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）と組み合わせて投与され得る。一般に、親と同じ種の、種の起源または種の反応性（抗体の場合）の産物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態において、ヒト抗体、フラグメント、誘導体、アナログまたは核酸は、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
【０１４０】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に関連する障害に対する免疫アッセイおよびこの障害の治療の両方のために、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはそのフラグメントもしくは領域に対する、高い親和性および／または強力なインビボ結合抗体および／または中和抗体を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメントまたは領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ、未満の解離定数またはＫｄを有するものを含む。
【０１４１】
（キット）
上記のような本発明の方法を実施するためのキットもまた、本発明によって提供される。本発明のキットは、少なくとも１つ以上の、本発明の核酸、単離されたポリペプチドまたはそれに対する抗体を備える。このキットの他の任意の構成要素としては、制限酵素、制御プライマーおよびプラスミド；緩衝液、細胞、キャリア、アジュバントなどが挙げられる。このキットの核酸は、制限部位、多重クローニング部位、プライマー部位などを含み、他のプラスミドとのライゲーションを容易にし得る。このキットの種々の構成要素は、別個の容器中に存在し得るか、または所望の場合、特定の適合性の構成要素が、単一の容器中に予め組み合わされ得る。多くの実施形態において、活性剤の単位用量（例えば、経口用量または注射容量）を有するキットが、提供される。特定の実施形態において、コントロール（例えば、癌細胞または非癌細胞由来のサンプル）が、本発明によって提供される。キットのさらなる実施形態は、本発明のポリペプチドに対する抗体、およびこのポリペプチドと組み合わせて使用される化学治療剤を、治療剤として含む。
【０１４２】
上記の構成要素に加えて、本発明のキットは、代表的に、本発明の方法を実施するためのキットの構成要素を使用するための指示書をさらに備える。本発明の方法を実施するための指示書は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、この指示書は、基材（例えば、紙、プラスチックなど）印刷され得る。このように、この指示書は、キット中にパッケージ挿入物として、キットまたはその構成要素の容器のラベル（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージング関する）などに存在し得る。他の実施形態において、この指示書は、適切なコンピューター読み取り可能保存媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスクなど）に電子保存データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の指示書は、キットに存在しないが、例えば、インターネットを介して、リモートソースから指示書を得るための手段が、提供される。この実施形態の例は、指示書を見ることが出来るウェブアドレス、および／またはこの指示書をダウンロード出来るウェブアドレスを含むキットである。この指示書を使用する場合、この指示書を得るための手段は、適切な基材に記録されている。
【０１４３】
（コンピューター関連実施形態）
一般に、ポリヌクレオチドのライブラリーは、配列情報のコレクションであり、この情報は、生化学的形態（例えば、ポリヌクレオチド分子のコレクションとして）、または電子形態（例えば、コンピューターシステム中および／またはコンピュータープログラムの一部として、コンピューターで読み出し可能な形態で格納されたポリヌクレオチド配列のコレクションとして）のいずれかで提供される。ポリヌクレオチドのこの配列情報は、種々の方法で（例えば、遺伝子発見の資源として、選択された細胞型で発現される配列の代表として（例えば、細胞型マーカー）、および／または所定の疾患または疾患状態のマーカーとして）用いられ得る。例えば、本発明の場合、癌、特に、胸部癌において差次的に発現される遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列、ならびにこれらの遺伝子自体の核酸配列およびアミノ酸配列は、コンピューターデータベースにおいて電子形態で提供され得る。
【０１４４】
一般に、疾患マーカーは、疾患により影響されたすべてに、通常細胞（例えば、疾患により実質的に影響されていない同じかまたは類似の型の細胞）に対して増加したかまたは減少したかいずれかのレベルで存在する遺伝子産物の代表である。例えば、ライブラリー中のポリヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドによりコードされるその他の遺伝子産物を代表するポリヌクレオチドであり得、それは、正常な（すなわち、実質的に疾患がない）胸部細胞に対して癌によって影響された胸部癌細胞中で過剰発現されるか、または過小発現されるかのいずれかである。
【０１４５】
ライブラリーのヌクレオチド配列情報は、任意の適切な形態、例えば、電子形態または生化学的形態で具現化され得る。例えば、電子形態で具現化された配列情報のライブラリーは、例えば、ｉ）癌細胞と正常細胞；ｉｉ）癌細胞と形成異常細胞；ｉｉｉ）癌細胞と癌以外の疾患また状態により影響された細胞；ｉｖ）転移癌細胞と正常細胞および／または非転移癌細胞；ｖ）悪性癌細胞と非悪性癌細胞（または通常細胞）および／またはｖｉ）通常細胞に対する形成異常細胞、との間のように、差次的に発現される（例えば、過剰発現または過小発現される）遺伝子の代表的なヌクレオチド配列を含むアクセス可能なコンピューターデータファイル（または、核酸分子のコレクションである、生化学的形態で）を含む。その他の組み合わせ、および種々の疾患または疾患の段階により影響された細胞の比較は、当業者に容易に明らかである。ライブラリーの生化学的実施形態は、ライブラリー中の遺伝子の配列を有する核酸のコレクションを含み、ここでは、これらの核酸は、以下でより詳細に記載されるように、ライブラリー中の全遺伝子またはそのフラグメントに対応し得る。
【０１４６】
本発明のポリヌクレオチドライブラリーは、一般に、複数のポリヌクレオチド配列の配列情報を含み、ここで、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される任意の配列の配列を有する。複数は、少なくとも２、通常少なくとも３を意味し、そしてこれらの配列のすべてまでを含み得る。ライブラリー中のポリヌクレオチドの長さおよび数は、ライブラリーの性質、例えば、ライブラリーがオリゴヌクレオチドアレイである場合、ｃＤＮＡアレイ、配列情報のコンピューターデータベースなどとともに変化する。
【０１４７】
ライブラリーが電子ライブラリーである場合、核酸配列情報は、種々の媒体中に存在し得る。「媒体」は、本発明の配列情報を含む、単離された核酸分子以外の製造物をいう。このような製造物は、配列が核酸で存在するとき、配列に直接適用可能ではない手段により調査され得る形態にあるゲノム配列またはそのサブセットを提供する。例えば、本発明のヌクレオチド配列、例えば、本明細書中に記載される配列の任意のポリヌクレオチドの核酸配列は、コンピューター読み出し可能媒体、例えば、コンピューターによって直接読みかつアクセスされ得る任意の媒体上に記録され得る。このような媒体は：フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク格納媒体、および磁気テープのような磁気格納媒体；ＣＤ−ＲＯＭのような光学的格納媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電子的格納媒体；および磁気／光学的格納媒体のようなこれらのカテゴリーのハイブリッドを含むがこれらに限定されない。
【０１４８】
当業者は、現在知られたコンピューター読み出し可能な媒体のいずれもが、本発明の配列情報の記録を含む製造物を作成するためにどのように用いられ得るかを容易に認識し得る。「記録された」は、当該分野で公知の任意のこのような方法を用いて、コンピューター読み出し可能な媒体上に情報を格納するためのプロセスをいう。任意の便利なデータ格納構造が、格納された情報にアクセスするために用いられる手段を基に選択され得る。種々のデータプロセッサプログラムおよびフォーマット、例えばワードプロセッシングテキストファイル、データベースフォーマットなどが、格納のために用いられ得る。配列情報に加えて、本明細書中に記載される１つ以上の配列を含むライブラリーの電子バージョンが、その他のコンピューター読み出し可能な情報および／またはその他の型のコンピューター読み出し可能なファイル（例えば、サーチプログラムソフトウェアなどを含むがこれに限定されない、例えば、サーチ可能なファイル、実行可能なファイルなど）と連結されるか、または組み合わされて提供され得る。
【０１４９】
コンピューター読み出し可能な形態でヌクレオチド配列を提供することにより、この情報は、種々の目的のためにアクセスされ得る。配列情報（例えば、ＮＣＢＩ配列データベース）にアクセスするためのコンピューターソフトウェアは、公に利用可能である。例えば、Ｓｙｂａｓｅシステム上のギャップ（ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７）２５：３３８９−３４０２）およびＢＬＡＺＥ（Ｂｒｕｔｌａｇら、Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）１７：２０３）サーチアルゴリズム、またはＴｅｒａＢＬＡＳＴ（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）プログラム（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃから入手可能な特定のコンピュータープラットフォームで必要に応じて実行する）を用いて、他の生物由来のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対する相同性を含むゲノム内のＯＲＦを同定し得る。
【０１５０】
本明細書で用いられるように、「コンピューターベースのシステム」は、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するために用いられる、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ格納手段をいう。本発明のコンピューターベースのシステムの最小のハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ格納手段を備える。当業者は、現在利用可能なコンピューターベースのシステムの任意の１つが、本発明における使用に適切であることを容易に認識し得る。データ格納手段は、上記のように本発明の配列情報の記録を含む任意の製造物、またはこのような製造物にアクセスし得るメモリーアクセス手段を含み得る。
【０１５１】
「サーチ手段」は、コンピューターベースのシステム上で履行される１つ以上のプログラムをいい、標的配列または標的構造モチーフまたはサンプル中のポリヌクレオチドの発現レベルを、格納された配列情報と比較する。サーチ手段を用いて、特定の標的配列または標的モチーフに一致するゲノムのフラグメントまたは領域を同定する。種々の既知のアルゴリズム（例えば、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＴｅｒａＢＬＡＳＴ（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（ＮＣＢＩ））が公に知られ、そして市販されている。「標的配列」は、６以上のヌクレオチドであるか、または２以上のアミノ酸、好ましくは約１０〜１００アミノ酸であるか、または約３０〜３００ｎｔの任意のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列であり得る。核酸またはポリペプチドを比較するための種々の方法が、データ保存手段を用いて、配列比較を達成するため（例えば、標的配列、標的モチーフまたは相対発現レベルを分析するため）に使用され得る。当業者は、公的に利用可能な相同性検索プログラムの任意のものを使用して、本発明のコンピュータベースのシステムを検索し、標的配列およびモチーフを比較し得ることを容易に理解し得る。サンプルおよびコントロールにおける発現レベルを分析するためのコンピュータープログラムもまた、当該分野で公知である。
【０１５２】
「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」は、任意の合理的に選択された配列または配列の組み合わせをいい、ここで配列（単数または複数）は、標的モチーフの折り畳みに際し形成される三次元形態を基に、または調節または活性部位のコンセンサス配列を基に選択される。当該分野で公知の種々の標的モチーフがある。タンパク質標的モチーフとしては、酵素活性部位およびシグナル配列、キナーゼドメイン、レセプター結合ドメイン、ＳＨ２ドメイン、ＳＨ３ドメイン、リン酸化部位、タンパク質相互作用ドメイン、膜貫通ドメインなどが挙げられるが、これらに限定されない。核酸標的モチーフとしては、ヘアピン構造、プロモーター配列および転写因子の結合部位のようなその他の発現エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
入力および出力手段のための種々の構造的フォーマットを使用して、本発明のコンピューターベースのシステムにおいて情報を入力および出力し得る。出力手段のための１つのフォーマットは、異なるポリヌクレオチドの相対的発現レベルをランク付けする。このような提示は、当業者に、遺伝子発現プロフィールを決定するための相対発現レベルのランク付けを提供する。遺伝子発現プロフィールは、例えば、癌性または前癌性であると疑われる試験細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリーから、クローンの配列または部分配列を電子データベースの配列と比較して作製され得、ここで、この電子データベースの配列は、癌細胞（例えば、胸部癌細胞）において差次的に発現される遺伝子を示す。ついで、癌細胞において差次的に発現される遺伝子を示す配列に対する実質的な相同性を有する配列を有するクローンの数が決定され、そしてこのような遺伝子の各々に対応するクローンの数が決定される。差次的に発現される遺伝子に対応するクローンの増加した数（例えば、正常細胞のｃＤＮＡにおいて発現されるクローンの数と比較して）は、試験細胞が癌性であることを示す。
【０１５４】
上記のように、本明細書中で使用される場合、「ライブラリー」はまた、本明細書中で記載される配列のポリヌクレオチドの生化学的ライブラリー（例えば、提供されるポリヌクレオチドを表す核酸のコレクション）を包含する。この生化学的ライブラリーは、種々の形態（例えば、ｃＤＮＡの溶液、固体支持体（すなわち、アレイ）などの表面と安定に結合したプローブ核酸のパターンなど）をとり得る。本明細書中で記載される遺伝子の１つ以上がアレイ上に配列によって表されている核酸アレイが、特に目的とされる。アレイとは、その表面の１つ以上の上に、少なくとも２つの別個の核酸標的を有する少なくとも基板を有する製造物の物品を意味し、ここで、別個の核酸の数は、かなり高く、代表的には、少なくとも１０ｎｔ、通常は少なくとも２０ｎｔ、そしてしばしば少なくとも２５ｎｔである。種々の異なるアレイフォーマットが、開発され、そして当業者に公知である。本発明のアレイは上記の例示的な特許文献に開示されるように、種々の用途（遺伝子発現分析、薬物スクリーニング、変異分析などを含む）における用途を見出す。
【０１５５】
上記の核酸ライブラリーに加えて、ポリペプチドの相同ライブラリーもまた、提供され、ここで、このライブラリーのポリペプチドは、本明細書中で記載される配列に対応する遺伝子によってコードされるポリペプチドの少なくとも一部分を表す。
【０１５６】
（差次的に発現される遺伝子の検出を含む診断方法および他の方法）
本発明は、例えば、癌の診断および発現プロフィールに従う癌細胞の分類において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドを使用する方法を提供する。特定の非限定的な実施形態において、この方法は、胸部癌細胞を検出するため、被験体における癌の診断および癌の重篤度（例えば、腫瘍段階、腫瘍荷重など）の診断を容易にするため、被験体の予後の決定を容易にするため、および治療に対する被験体の応答性を評価するため（例えば、化学治療レジメンの間または後の腫瘍荷重を評価することによって、治療効果の指標を提供することによって）に有用である。検出は、胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドの検出、および／または胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「胸部癌に関連するポリペプチド」）の検出に基づく。本発明の検出方法は、インビトロまたはインビボで、単離された細胞において、または全組織もしくは体液（例えば、血液、血漿、血清、尿など）中で実施され得る。
【０１５７】
一般的に、遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、このようなｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡ、およびポリペプチド）の検出を包含する本発明の方法は、サンプルを、目的の遺伝子産物に特異的なプローブに接触させることを包含する。このような方法において、本明細書中で使用される場合、「プローブ」とは、目的の遺伝子産物に特異的に結合する分子をいう（例えば、プローブは、標的への結合を非標的（バックグラウンド）分子への非特異的結合から区別するのに十分な特異性で、標的遺伝子産物に結合する）。「プローブ」とは、核酸プローブ（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変核酸など）、抗体（例えば、抗体、標的エピトープへの結合を保持する抗体フラグメント、単鎖抗体など）、または目的の標的遺伝子産物に特異的に結合する他のポリペプチド、ペプチドもしくは分子（例えば、レセプターリガンド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
プローブおよび目的の遺伝子産物を有すると疑われるサンプルは、このプローブが遺伝子産物に結合するのに適切な条件下で、接触される。例えば、接触は、一般に、プローブが標的産物に結合するのを可能にするのに充分な時間（例えば、数分〜数時間）で、プローブのバックグラウンド結合から十分に識別可能なレベルで、遺伝子産物へのプローブの結合を提供する温度および湿度条件（例えば、非特異的結合を最小限にする条件下）などである。プローブ標的遺伝子産物の結合のための適切な条件は、コントロールおよび当業者に利用可能でありかつ公知の他の技術を使用して、容易に決定され得る。
【０１５９】
この実施形態において、プローブは、抗体または他のポリペプチド、ペプチドもしくは目的の標的ポリペプチドに特異的に結合する分子（例えば、レセプターリガンド）であり得る。
【０１６０】
検出方法は、キットの部品として提供され得る。従って、本発明はさらに、生物学的サンプル中の、胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチド、および／またはこれによりコードされるペプチドの存在および／またはレベルを検出するため（例えば、目的の差次的に発現される遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの検出によって）のキットを提供する。これらのキットを使用する手順は、臨床研究所、実験研究所、医師または個人によって実施され得る。胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを検出するための本発明のキットは、ポリペプチドに特異的に結合する部分（これは、特異的抗体であり得る）を含む。胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドを検出するための本発明のキットは、このようなポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする部分を含む。このキットは、必要に応じて、この手順に有用な付加的な構成要素を提供し、このような構成要素としては、緩衝液、発色試薬、標識、反応表面、検出のための手段、コントロールサンプル、標準物質、指示書および解釈情報が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
（胸部癌細胞において差次的に発現されるポリペプチドによってコードされるポリペプチドの検出）
いくつかの実施形態において、胸部癌細胞において差次的に発現される遺伝子によってコードされるポリペプチドを、細胞（特に、胸部細胞）において検出することによって、胸部癌細胞を検出するための方法が提供される。任意の種々の公知方法が、検出のために使用され得、これらの方法としては、コードポリペプチド特異的な抗体を使用する免疫アッセイ（例えば、抗体結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）；放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）；およびコードポリヌクレオチドに対する機能アッセイ（例えば、結合活性または酵素活性））、などによる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
例えば、免疫蛍光アッセイは、そのコードされたポリペプチドをはじめに単離することなしに、細胞に対して容易に実施され得る。これらの細胞は、まず、固体支持体（例えば、顕微鏡スライドまたはマイクロタイタープレート）に固定される。この固定工程は、その細胞膜を透過性にし得る。その細胞膜を透過性にすることによって、ポリペプチド特異的プローブ（例えば、抗体）が結合することを可能にする。あるいは、そのポリペプチドが分泌または膜結合される場合、またはそうでなければ、細胞表面（例えば、レセプターおよびその外側細胞膜に安定して結合するか、そうでなければその細胞膜に安定して結合する他の分子）に接触可能な場合、このような透過は、必要でないかもしれない。
【０１６３】
次に、この固定した細胞を、そのコードポリペプチドに対して特異的な抗体に曝露する。アッセイの感度を増大させるために、これらの固定した細胞は、さらに、二次抗体に曝露され得る。これらの二次抗体は、標識されており、そして（そのコードポリペプチドに特異的な）一次抗体に結合しる。代表的には、その二次抗体は、例えば、蛍光マーカーによって検出可能に標識されている。そのコードポリペプチドを発現する細胞は、蛍光標識され、そして、顕微鏡のもとで容易に視覚化される。例えば、Ｈａｓｈｉｄｏら（１９９２)Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍ.１８７:１２４１−１２４８を参照のこと。
【０１６４】
本明細書を読むことで当業者にとって容易に理解されるように、これらの検出方法および本明細書に記載の他の方法は、改変され得る。このようなバリエーションは、本発明の企図する範囲にある。例えば、上記の検出スキームにおいて、検出における用途のためのプローブは、固体支持体に固定され得、そして、この試験サンプルは、固定されたプローブと接触する。次いで、そのプローへのにその試験サンプルの結合は、例えば、試験サンプルに結合する検出可能な標識を検出することによって種々の様相で検出され得る。
【０１６５】
本発明は、そのコードするポリペプチドにとって特異的なプローブを用いて、生物学的サンプルにおけるポリペプチド（このポリペプチドは、癌において差次的に発現される遺伝子を表すポリヌクレオチド、特に、遺伝的に差次的な癌細胞を表現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）の存在を検出し、そして／またはそのレベルを測定するための方法をさらに提供する。この実施形態において、そのプローブは、抗体または他のポリペプチド、ペプチドまたは目的の標的ポリペプチドに特異的に結合する分子（例えば、レセプターリガンド）であり得る。
【０１６６】
これらの方法は、一般的に以下を包含する：ａ）試験細胞中でポリペプチドを差次的に発現されたポリペプチドに特異的な抗体とサンプルを接触させる工程;およびｂ）その抗体とサンプルの分子との間の結合を検出する工程。抗体結合のレベル（定性的または定量的のいずれかである）は、細胞の癌状態を示す。例えば、差次的に発現された遺伝子が癌細胞において増大した場合、正常細胞に関する抗体の結合レベルと比較したときの、試験サンプルに対する抗体の結合レベルの増大の検出は、試験細胞が癌性であることを示す。
【０１６７】
適切なコントロールは、そのコードポリペプチドを含まないことが既知であるサンプルを包含する；およびサンプルはそのコードポリペプチドに対して特異的でない抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）と接触される。特異的な抗体抗原相互作用を検出するための種々の方法が、当該分野において既知であり、そして、標準的な免疫組織学的方法、免疫沈降法、酵素免疫アッセイ、および放射性免疫アッセイを含むがこれらに限定されない方法において使用され得る。
【０１６８】
一般的に、その特異的抗体は、直接的または間接的に、検出可能に標識される。直接的な標識しては、放射性同位体；その生成物が検出可能である酵素(例えば、ルシフェラーゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼなど）；蛍光標識(例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリンなど）；蛍光放出金属（例えば、金属キレート基（例えば、ＥＤＴＡ）を介して抗体に結合した、１５２Ｅｕまたは他のランタニド系列）;化学発光化合物（例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジン塩など）；生物学的化合物（例えば、ルシフェリン、エクオリン（緑蛍光タンパク質））など挙げられる。
【０１６９】
この抗体は、不溶性支持体（例えば、ポリエチレンプレートまたはポリエチレンビーズ）に付着（結合）し得る。間接的な標識としては、そのコードポリペプチドに対して特異的な抗体（「第１の特異的抗体」）にとって特異的な二次抗体（ここで、二次抗体は、上述のように標識される）および特異的な結合ペア（例えば、ビオチン−アビジンなど）のメンバーが挙げられる。生物学的サンプルは、固体支持体またはキャリア（例えば、ニトロセルロース）と接触され得るか、またはそれらは固定され得、この固体支持体またはキャリアは、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定し得る。次いで、この支持体は、適切な緩衝液で洗浄され得、その後、検出可能に標識した第１の特異的な抗体と接触する。検出方法は当該分野で公知であり検出可能な標識によって放出されるシグナルに対して適切なように選択される。検出は、一般的に、適切なコントロールおよび適切な標準と比較して達成される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、これらの方法は、例えば、胸部癌細胞が存在する部位を位置づけるかまたはそれらを同定するために、インビボにおける用途のために適合される。これらの実施形態において、胸部癌関連ペプチドに特異的である検出可能に標識した部分（例えば、抗体）が、個体に（例えば、注射によって）投与され、そして、標識された細胞は、標準的な画像化技術（磁気共鳴像、コンピュータ断層撮影などが挙げられるがこれらに限定されない）を使用して位置決定される。このように、癌細胞は、差次的に標識される。
【０１７１】
（胸部癌細胞において差次的に発現される遺伝子を表すポリヌクレオチドを検出する工程）
いくつかの実施形態において、転写物の細胞内発現を検出するか、胸部癌細胞において差次的発現を検出することによって胸部癌細胞を検出するための方法が提供される。種々の既知方法のいずれかは、検出（胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによる転写物の検出；特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応による転写物の検出；胸部癌細胞中で差次的に発現される遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドをプローブとして使用する細胞のインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない）のために使用され得る。
【０１７２】
多くの実施形態において、目的遺伝子産物のレベルが測定される。測定されることによって、直接的（例えば、遺伝子産物の絶対レベルを決定または推定することによる）または相対的（第２のコントロール生物的サンプルに対してそのレベルを比較することによる）のいずれかで、第１の生物学的産物中の遺伝子サンプルのレベルを定性的または定量的に評価することを意味する。多くの実施形態において、第２のコントロール生物的サンプルは、胸部癌に罹患していない個体から取得される。当該分野で理解されているように、一旦、遺伝子発現の標準的コントロールレベルが既知となると、比較のための標準として反復して使用され得る。他のコントロールサンプルは、癌性の乳組織のサンプルを含む。
【０１７３】
この方法は、胸部癌細胞中で差次的に発現される遺伝子のｍＲＮＡを検出および／または測定を行うために使用され得る。いくつかの実施形態において、これらの方法は、以下を包含する：ａ)ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で本明細書に記載のような差次的に発現した遺伝子に対応するポリヌクレオチドとサンプルとを接触させる工程；およびｂ)必要であれば、ハイブリダイゼーションを検出する工程。適切なコントロールと比較した場合に、差次的なハイブリダイゼーションの検出は、胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドのサンプル中における存在を示すものである。適切なコントロールとしては、例えば、胸部癌細胞において差次的に発現されるポリヌクレオチドを含まないことが既知であるサンプルが挙げられる。ハイブリダイゼーションを可能にする条件が、当該分野で公知であり、上で詳細に記載されている。
【０１７４】
以下に挙げられるがそれらに限定されることはない公知の方法のいずかによって、検出がまた達成され得る：適切な標識ポリヌクレオチドを使用する、インサイチュハイブリダイゼーション、ＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ(逆転写ＰＣＲ）、および「ノーザン」（すなわちＲＮＡの）ブロッティング、「ノーザン」アレイ、「ノーザン」マイクロアレイなど、またはこのような技術の組み合わせ。ポリヌクレオチドに対する種々の標識および標識方法は、当該分野で公知であり、そして、本発明のアッセイにおいて使用され得る。特定のハイブリダイゼーションは、適切なコントロールに対して比較することによって決定され得る。
【０１７５】
一般に、配列表（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ）において示されるような本明細書で提供されるポリヌクレオチドまたはまたは配列表のポリヌクレオチドポリヌクレオチドに対応する遺伝子の配列の少なくとも１２連続したヌクレオチド（ｎｔ）を含むポリヌクレオチドが、種々の目的（例えば、胸部癌細胞において差次的に発現するポリヌクレオチドの転写レベルの検出および／または測定のためのプローブ）のために使用される。開示したポリヌクレオチド配列の好ましい領域のさらなる開示は、実施例において見出される。本明細書に開示されるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブは、他の関係ない配列を用いて提供されるバックグラウンドハイブリダイゼーションよりも、少なくとも、２倍、５倍、１０倍、または２０倍高い検出シグナルを提供するべきである。
【０１７６】
核酸の検出の文脈において使用される「プローブ」は、試験サンプル中の差次的発現の遺伝子産物を検出するために使用されるポリヌクレオチド配列をいう。当業者によって容易に理解されるように、このプローブは、検出可能に標識され、そして、例えば、試験サンプル（例えば、ｍRNA）から取得された固定ポリヌクレオチドを含むアレイと接触され得る。あるいは、このプローブは、アレイに固定され得、そして、この試験サンプルは、検出可能に標識され得る。本発明の方法のこれらのおよび他のバリエーションは、当該分野において十分な技術的範囲内であり、そして、本発明の範囲に包含される。
【０１７７】
標識された核酸プローブを使用して、提供されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出し得る。ノザンブロットにおいて、ｍＲＮＡを電気泳動的に分離し、そしてプローブと接触させる。プローブは、特定サイズのｍＲＮＡ種にハイブリダイズするとして検出される。ハイブリダイゼーションの量が定量されて、例えば、特定条件下で発現の相対量を決定する。プローブは、細胞に対するインサイチュハイブリダイゼーションのために用いられ、発現を検出する。プローブは、ハイブリダイズする配列の診断的検出のためにインビボで用いられ得る。代表的には、プローブは放射性同位体で標識される。発色団、蛍光、および酵素のような、他の型の検出可能な標識が用いられ得る。ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイのその他の例は、ＷＯ９２／０２５２６および米国特許第５，１２４，２４６号に記載される。
【０１７８】
ＰＣＲは、少量の標的核酸を検出するための別の手段であり、この方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，ｐｐ．１４．２−１４．３３に見出され得る。
【０１７９】
検出可能な標識が、増幅反応に含まれ得る。適切な検出可能な標識としては、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ））、放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなど）などが挙げられる。標識は、２段階の系（ポリヌクレオチドが、高い親和性の結合パートナー（例えば、アビジン、特異的抗体など）を有するビオチン、ハプテンなどに結合体化され、結合パートナーが検出可能な標識に結合体化する）であり得る。標識は、１つまたは両方のプライマーに結合体化され得る。あるいは、増幅において使用されるヌクレオチドのプールは、標識化され、増幅産物に標識を取り込む。
【０１８０】
（アレイ）
ポリヌクレオチドアレイは、サンプル中の多数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをアッセイし得る高スループット技術を提供する。この技術は、差示的発現について試験するためのツールとして使用され得る。
【０１８１】
アレイを生産するための種々の方法ならびにこれらの方法のバリエーションは、当該分野で公知であり、そして本発明における使用のために考慮される。例えば、アレイは、２次元マトリックスまたは結合プローブを有するアレイにおいて基板（例えば、ガラス、ニトロセルロースなど）上にポリヌクレオチドプローブをスポットすることによって作製され得る。このプローブは、共有結合によってか、または非特異的相互作用（例えば、疎水性相互作用）によってのいずれかで基板に結合され得る。
【０１８２】
ポリヌクレオチドのサンプルは、検出可能に標識され得（例えば、放射性標識または蛍光標識を使用して）、次いでプローブにハイブリダイズされ得る。プローブポリヌクレオチドに結合した標識化サンプルポリヌクレオチドを含む、二本鎖ポリヌクレオチドは、一旦このサンプルの非結合部分が洗浄されると、検出され得る。あるいは、試験サンプルのポリヌクレオチドは、アレイ上に固定化され得、そしてプローブは検出可能に標識され得る。アレイを構築する技術およびこれらのアレイを使用する方法は、例えば、以下に記載される：Ｓｃｈｅｎａら（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９３（２０）：１０６１４−９；Ｓｃｈｅｎａら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０（５２３５）：４６７−７０；Ｓｈａｌｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６（７）：６３９−４５米国特許第５，８０７，５２２号、ＥＰ第０７９９８９７号；ＷＯ９７／２９２１２；ＷＯ９７／２７３１７；ＥＰ第０７８５２８０号；ＷＯ９７／０２３５７；米国特許第５，５９３，８３９号；米国特許第５，５７８，８３２号；ＥＰ第０７２８５２０号；米国特許第５，５９９，６９５号；ＥＰ第０７２１０１６号；米国特許第５，５５６，７５２号；ＷＯ９５／２２０５８および米国特許第５，６３１，７３４号。最もな実施形態において、「プローブ」は、検出可能に標識される。他の実施形態において、プローブは、アレイ上に固定化されるが、検出可能に標識されない。
【０１８３】
使用され得るアレイは、例えば、遺伝子の示差的発現を試験するために使用され得、そして遺伝子機能を決定するために使用され得る。例えば、発現が、試験細胞とコントロール細胞（例えば、癌細胞および正常細胞）との間で比較される場合、アレイは、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の差示的な発現を検出するために使用され得る。例えば、癌細胞中での特定のメッセージの高発現（これは、対応する正常細胞中で観察されない）は、癌特異的遺伝子産物を示し得る。アレイの例示的な使用は、例えば、Ｐａｐｐａｌａｒａｄｏら、Ｓｅｍ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌ．（１９９８）８：２１７；およびＲａｍｓａｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９８）１６：４０にさらに記載される。さららに、アレイを使用する検出の方法における多くのバリエーションは、当業者の十分に技術範囲内であり、そして本発明の範囲内である。例えば、固体支持体へプローブを固定化するよりも、試験サンプルを固体支持体上に固定化し得、次いでこれをプローブと接触させる。
【０１８４】
（癌の診断、予後、治療の評価（治療測定基準：ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃ）および管理）
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドならびにそれらの遺伝子産物ならびに対応する遺伝子および遺伝子産物は、発癌経路に沿った最初期の変化を検出し、そして／または種々の治療的および予防的介入の有効性をモニターする、（例えば、血液または組織中の）遺伝学的マーカーまたは生化学的マーカーとして特に興味深い。
【０１８５】
例えば、特定のポリヌクレオチドの発現レベルは、より劣った予後を示し得、従って、患者に対するより攻撃的な化学療法または放射療法を是認し得る（逆もまた同様）。新規の代替的な腫瘍特異的な特徴と、処置に対する応答および患者における結果との相関関係は、その腫瘍の分子プロフィールに基づいて仕立てられる治療法を設計し得る特定の予後の指標を規定し得る。これらの治療法は、抗体標的化、アンタゴニスト（例えば低分子）および遺伝子治療を含む。
【０１８６】
特定のポリヌクレオチドの発現の決定、ならびに患者のプロフィールと正常組織における既知の発現および疾患の改変体との比較は、処置の特異性という点および患者の快適さのレベルという点の両方で、患者に対する最良の可能な処置の決定を可能にする。ポリヌクレオチド発現のような、代理の腫瘍マーカーはまた、癌の異なる形態および疾患の状態をよりよく分類し、そして従って診察および処置するために使用され得る。本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現レベルの同定から利益を得ることが可能である腫瘍学において広く使用される２つの分類は、癌性障害の病期分類化、および癌性組織の性質の類別である。
【０１８７】
差次的に発現された遺伝子に対応するポリヌクレオチドならびにそれらにコードされた遺伝子産物は、癌を有するかまたは癌にかかり易い患者をモニターするのに特に有用であり得、その癌が全体の形態学的レベルで検出可能となる前に、分子レベルで潜在的な悪性の事象を検出し得る。さらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドならびにこのようなポリヌクレオチドに対応する遺伝子は、例えば、ポリヌクレオチドまたはそれらにコードされた遺伝子産物を使用することによって治療の有効性を評価するため、例えば、治療の前、最中および後に患者における腫瘍負荷量（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）を評価するための治療測定基準として有用であり得る。
【０１８８】
さらに、１つの型の癌において差示的に発現され、従って１つの型の癌について重要である遺伝子に対応するとして同定されたポリヌクレオチドはまた、例えば、ポリヌクレオチドは、種々の癌の型を通して差示的に発現された遺伝子を表す場合、他の型の癌の発症または発症の危険性の暗示を有し得る。従って、例えば、胸部癌について臨床的な暗示を有する遺伝子に対応するポリヌクレオチドの発現はまた、転移性の胸部癌、結腸癌または卵巣癌についての臨床的な暗示を有し得る。
【０１８９】
（病期分類化）
病期分類化は、患者において癌性状態がどのくらい進行しているのかを記載するために医師により使用されるプロセスである。病期分類化は、予後の決定、処置の計画、およびそのような処置の結果の評価をする際に医師を補助する。この病期分類化の系は、癌の型とともに変化しするが、一般に以下の「ＴＮＭ」を含む：腫瘍の型（Ｔと示される）；その癌が近辺のリンパ節に転移したか否か（Ｎと示される）；およびその癌は、体のより離れた部分に転移したか否か（Ｍと示される）。一般に、癌が、任意のリンパ節へ広がることなく原発性病変の領域においてのみ検出可能である場合、それを病期Ｉと呼ぶ。癌が、最も近いリンパ節に対してのみ広がった場合、それを病期ＩＩを呼ぶ。病期ＩＩＩにおいて、その癌は一般に、原発性病変の部位にほぼ近位のリンパ節に広っている。体の離れた部分（例えば、肝臓、骨、脳、または別の部位）に広がった癌は、病期ＩＶと呼ばれ、最も進行した状態である。
【０１９０】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドならびに対応する遺伝子および遺伝子産物は、本発明のポリヌクレオチドは、癌の攻撃力（例えば、転移の可能性）、ならびに体の異なる領域における存在についてのマーカーを同定することによって、病期分類化プロセスの細密な調整を容易にし得る。従って、高い転移の可能性の癌を示すポリヌクレオチドを有する病期ＩＩの癌は、境界上の病期ＩＩの腫瘍を、病期ＩＩＩの腫瘍に変化するために使用され得、このことはより積極的な治療を正当化する。逆に、より低い転移可能性を示すポリヌクレオチドの存在は、腫瘍のより現状を維持する病期分類化を可能にする。
【０１９１】
胸部癌の１つの型は、上皮内腺管癌（ＤＣＩＳ）である：ＤＣＩＳは、胸部癌細胞が完全に胸部管（ミルクを乳首に運ぶ胸部におけるチャネル）内に含まれ、そして周囲の胸部組織に広がらない場合である。これはまた、癌細胞が未だ周囲の胸部組織に広がらず、そのため通常身体のいかなる他の部分にも広がらないので、非侵襲性癌または管内の癌として呼ばれる。
【０１９２】
上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）は、細胞変化が胸部の小葉の管壁にみいだされることを意味する。これらの癌は両方の胸部に存在し得る。これはまた、周囲の胸部組織に広がらないので、非侵襲性の癌と呼ばれる。
【０１９３】
侵襲性胸部癌は、以下のような状態であり得る。：１期腫瘍：これらは、２センチメートル未満の測定値である。腋窩中のリンパ節は罹患されず、そして癌が身体のいかなる場所へ広がるサインはない；２期腫瘍：これらは、２〜５センチメートルの寸法であるか、または腋窩中のリンパ節は罹患されるか、あるいは両方である。しかし、癌がさらに広がるサインはない；３期腫瘍：５センチメートル以上であり、そして周囲の構造（例えば、筋肉または皮膚）に結合され得る。リンパ節は、通常影響されるが、胸部または腋窩中のリンパ節を超えて癌が広がる兆候はない；４期腫瘍：任意のサイズであるが、リンパ節は通常罹患し、そして癌は身体の他の部分に広がる。これは二次胸部癌である。
【０１９４】
（癌の病期分類）
病期は、腫瘍がその同じ型の正常な組織にどのくらい近く似ているかを記載するために使用される用語である。腫瘍の顕微鏡的な見かけは、細胞形態学、細胞組織化、および分化の他のマーカーのようなパラメーターに基づいて腫瘍の悪性度を同定するために使用される。一般的な法則として、腫瘍の病期は、その増殖の速度または攻撃性に対応し、未分化のまたは高い病期の腫瘍は、十分に分化されたまたは低い病期の腫瘍よりも一般に攻撃性である。
【０１９５】
配列表のポリヌクレオチドならびにその対応する遺伝子および遺伝子産物は、腫瘍の病期を決定する際に特に有益であり得る。なぜなら、これらは、腫瘍細胞の分化状態を決定する際に補助し得るだけでなく、腫瘍の攻撃性（例えば、転移可能性）を決定する際に有益な、分化以外の他の因子を同定し得るからである。
【０１９６】
低い病期（ｇｒａｄｅ）とは、癌細胞が、乳房の正常細胞と非常に似て見えることを意味する。これらは、通常、ゆっくりと増殖し、そして広がる可能性が低い。高い病期の腫瘍において、これらの細胞は、非常に異常に見える。これらは、より迅速に増殖する可能性が高く、そして広がる可能性がより高い。
【０１９７】
（腫瘍における細胞増殖の評価）
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの差示的発現レベルは、腫瘍細胞の増殖速度の評価を容易にし得、従って、腫瘍増殖の速度の攻撃性の指標を提供する。例えば、細胞周期に関与する遺伝子の相対的発現レベルの評価は、細胞増殖の指標を提供し得、従って、増殖のマーカーとして作用する。
【０１９８】
（胸部癌の検出）
適切な発現パターンを示す遺伝子に対応する本発明のポリヌクレオチドは、被験体において胸部癌を検出するために使用され得る。胸部癌は、女性における最も一般的な新生物の１つであり、予防および早期検出は、胸部癌の制御および治癒において重要な因子である。適切なポリヌクレオチドの発現は、胸部癌の診断、予後および管理において用いられ得る。胸部癌の検出は、任意のこれらの配列の発現レベルを単独で、または他の公知の癌遺伝子の発現のレベルと組み合わせて使用して決定され得る。胸部癌の攻撃性の性質および／または転移可能性の決定は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の１つ以上の遺伝子産物のレベルを比較し、そして癌組織において変化することが知られる別の配列（例えば、ｐ５３、ＤＣＣ  ｒａｓ、ＦＡＰの発現）の総レベルを比較することによって決定され得る（例えば、Ｆｅａｒｏｎ  ＥＲら、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１（５）：７５９；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＳＲら、Ｃａｎｃｅｒ（１９９３）７２：９５７；Ｂｏｄｍｅｒ  Ｗら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）４（３）：２１７；Ｆｅａｒｏｎ  ＥＲ、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．（１９９５）７６８：１０１を参照のこと）。例えば、胸部癌の発症は、癌遺伝子（例えば、ｒａｓ）または腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＦＡＰまたはｐ５３）のレベルに対する本明細書中に記載のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現レベルを試験することによって検出され得る。従って、特異的マーカーポリヌクレオチドの発現は、正常な乳房組織と癌性の乳房組織との間を区別する、起源の異なる細胞を伴う胸部癌の間を区別する、異なる潜在的な転移速度を伴う胸部癌の間を区別するなどのために、使用され得る。癌の他のマーカーの総説については、例えば、Ｈａｎａｈａｎら（２０００）Ｃｅｌｌ  １００：５７−７０を参照のこと。
【０１９９】
胸部癌の処置。
【０２００】
本発明はさらに、胸部癌細胞の増殖を低減するための方法を提供する。この方法は、胸部癌細胞において差示的に発現される遺伝子の発現の低減、または胸部癌関連ポリペプチドのレベルの低減および／もしくはその活性の低減を提供する。一般に、この方法は、胸部癌細胞を、（１）胸部癌において差示的に発現される遺伝子の発現、または（２）胸部癌関連ポリペプチドのレベルおよび／もしくは活性、を調節する物質と接触させる工程を包含する。
【０２０１】
「胸部癌細胞の増殖の低減」としては、胸部癌細胞の増殖の低減、および癌性胸部細胞になる非癌性胸部細胞の発生の低減が挙げられるが、これらに限定されない。胸部癌細胞の増殖の低減が達成されたか否かは、任意の公知のアッセイ（［３Ｈ］−チミジン取り込み；一定期間にわたる細胞数の計数；胸部癌に関連するマーカー（例えば、ＰＳＡ）の検出および／または測定が挙げられるがこれらに限定されない）を使用して、容易に決定され得る。
【０２０２】
本発明は、胸部癌を処置するための方法を提供し、この方法は、一般に、乳房癌細胞の増殖を低減し、そして胸部癌を処置するために十分な量の、胸部癌細胞の増殖を低減する物質を、このような処置を必要とする個体に投与する工程を包含する。物質または特定の量の物質が、胸部癌の処置に有効であるか否かは、胸部癌についての任意の種々の公知の診断アッセイ（直腸鏡、直腸試験、生検、造影Ｘ線写真研究、ＣＡＴ走査、および個体の血液中の胸部癌関連腫瘍マーカー（例えば、ＰＳＡ（乳房特異的抗原））の検出が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して評価され得る。この物質は、全身的または局所的に投与され得る。従って、いくつかの実施形態において、この物質は、局所的に投与され、そして胸部癌増殖は、投与部位で低減される。局所投与は、例えば、固形腫瘍の処置において有用であり得る。
【０２０３】
胸部癌細胞の増殖を低減する物質は、胸部癌細胞に標的化され得る。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、胸部癌細胞に薬物を送達する方法を提供し、この方法は、被験体に薬物−抗体複合体を投与する工程を包含し、ここで、この抗体は、胸部癌関連ポリペプチドに特異的であり、そしてこの薬物は、胸部癌細胞増殖を低減する薬物であり、種々のものが当該分野で公知である。標的化は、薬物を、胸部癌関連ポリペプチドに特異的な抗体と結合する（例えば、薬物−抗体複合体を形成するように、共有結合または非共有結合のいずれかによって、直接的またはリンカーを介して、連結する）ことによって、達成され得る。薬物を抗体に結合する方法は、当該分野で周知であり、本明細書中で詳述する必要はない。
【０２０４】
（腫瘍の分類および患者の層化）
本発明は、腫瘍において差示的に発現される選択された遺伝子の発現プロフィールに従って、腫瘍を分類する（ｃｌａｓｓｉｆｙ）方法、従って、患者を分類（ｇｒｏｕｐ）または「層化」する方法をさらに提供する。差示的に発現される遺伝子は、単一の腫瘍型において、または腫瘍型にわたって、他の差示的に発現される遺伝子との相関について、分析され得る。所定の癌細胞型における（例えば、胸部癌細胞または胸部癌の型における）発現プロフィールにおける一貫した相関を実証する遺伝子は、例えば、１つの遺伝子が腫瘍において過剰発現され、第二の遺伝子もまた通常過剰発現される場合、一緒に分類され得る。次いで、腫瘍は、１つ以上の群から選択された１つ以上の遺伝子の発現プロフィールに従って分類され得る。
【０２０５】
潜在的な患者のプール中の各患者の腫瘍は、上記のように分類され得る。次いで、同様に分類された腫瘍を有する患者は、均質な集団が所望される癌治療の調査または臨床試験における参加のために、選択され得る。患者の腫瘍分類はまた、均質な患者集団における癌治療の有効性を評価する際に使用され得る。さらに、所定の発現プロフィールの腫瘍を有する患者についての治療は、次いで、しかるべく選択され得る。
【０２０６】
別の実施形態において、差示的に発現される遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）は、ワクチン接種による処置において有効に使用され得る。癌細胞の増殖は、免疫監視機構に一部起因して、天然では制限されている。特定の腫瘍特異的抗原を使用する免疫系の刺激は、抗原を発現する腫瘍に対する効果を増強する。本発明のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを含む活性ワクチンは、対応するＲＮＡの変更（例えば、大過剰）を有する被験体に適切に投与されるか、または同じＲＮＡの変更を有する癌細胞を発症しやすくする。ポリペプチド抗原は、代表的に、ワクチン組成物の一部としてアジュバントと合わされる。このワクチンは、好ましくは、開始用量として最初に投与され、次いで、追加免疫用量として、通常少なくとも４週間後に再び投与される。さらなる追加免疫用量が、効果を増強するために与えられ得る。この用量およびそのタイミングは、通常、処置に対して責任を負う個人によって決定される。
【０２０７】
本発明はまた、患者の腫瘍において差示的に発現される遺伝子の発現プロフィールに基づいた、治療レジメンの選択を包含する。例えば、腫瘍は、本明細書中に記載されるような配列番号１〜４９９に対応する遺伝子の発現プロフィールについて分析され得る。例えば、腫瘍は、どの遺伝子が、同じ組織型の正常細胞と比較して、上昇したレベルまたは低下したレベルで発現されるかを決定するために分析される。次いで、この腫瘍の発現パターンは、選択された治療に応答する腫瘍の発現パターンと比較される。試験腫瘍細胞の発現プロフィールと、公知の薬物応答性の腫瘍細胞の発現プロフィールとが、少なくとも実質的に一致する場合（例えば、公知の薬物応答性の腫瘍において上昇したレベルで、そして試験腫瘍細胞においても上昇したレベルでの、選択された遺伝子セット）、治療のために選択される治療剤は、腫瘍がその発現パターンで応答する薬物である。
【０２０８】
（アレイを使用する診断におけるパターン一致）
別の実施形態において、本発明の診断および／または予後方法は、試験発現パターン（ＴＥＰ）を生成するための、試験サンプル中の遺伝子の選択されたセットの発現の検出を包含する。ＴＥＰは、参照発現パターン（ＲＥＰ）（これは、参照サンプル（例えば、ポジティブコントロールサンプルまたはネガティブコントロールサンプル）中の遺伝子の選択されたセットの発現の検出によって生成される）と比較される。遺伝子の選択されたセットは、本発明の遺伝子の少なくとも１つを含み、この遺伝子は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に対応する。特に目的のものは、試験サンプルがスクリーニングされる疾患において差示的に発現される遺伝子を含む遺伝子の、選択されたセットである。
【０２０９】
（治療標的および抗癌治療剤の同定）
本発明はまた、差示的に発現される遺伝子産物の活性を調節する能力を有する薬剤の同定のための方法、ならびに癌（特に胸部癌）の処置のための治療標的として差示的に発現される遺伝子産物を同定するための方法を包含する。
【０２１０】
差示的に発現される遺伝子産物の活性を調節する化合物の同定は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかを用いて達成され得る。このような薬剤は、癌治療の開発のための候補である。特に目的のものは、正常な非癌性ヒト細胞に対して許容性の毒性を有する薬剤についてのスクリーニングアッセイである。本発明のスクリーニングアッセイは、一般に、薬剤が、差示的に発現される遺伝子産物の活性を調節する能力、および／または癌関連の表現型（例えば、細胞増殖、コロニー形成、細胞周期停止、転移など）を阻害もしくは抑制する能力に基づく。
【０２１１】
（候補薬剤のスクリーニング）
スクリーニングアッセイは、当業者に容易に利用可能かつ公知の種々の技術のいずれかに基づき得る。一般に、このスクリーニングアッセイは、癌性細胞（好ましくは、癌性胸部細胞のような癌性細胞）を、候補薬剤に接触させる工程、および差示的に発現される遺伝子産物の生物学的活性に対する影響を評価する工程、を包含する。生物学的活性に対する影響は、例えば、差示的に発現される遺伝子の遺伝子産物の発現の検出によって、検出され得る（例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルの減少は、次いで、遺伝子産物の生物学的活性における減少を引き起こす）。あるいは、またはさらに、候補薬剤の影響は、機能的アッセイにおいて候補薬剤の影響を試験することによって、評価され得る。例えば、差示的に発現される遺伝子産物が酵素である場合、生物学的活性に対する影響は、差示的に発現される遺伝子産物に関連する酵素活性のレベルを検出することによって、評価され得る。機能的アッセイは、差示的に発現される遺伝子産物に従って選択される。一般に、差示的に発現される遺伝子が、癌性細胞において発現が増大している場合、目的の薬剤は、差示的に発現される遺伝子産物の活性を低減する薬剤である。
【０２１２】
下記のアッセイは、本発明のスクリーニングアッセイ実施形態において容易に適合され得る。候補薬剤のスクリーニングにおいて有用な例示的アッセイとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ハイブリダイゼーションベースのアッセイ（例えば、発現レベルを評価するための、核酸プローブまたはプライマーの使用）、抗体ベースのアッセイ（例えば、ポリペプチド遺伝子産物のレベルを評価するため）、結合アッセイ（例えば、差示的に発現されるポリペプチドと候補薬剤との相互作用を検出するため）（このアッセイは、ポリペプチドについての天然または合成のリガンドが利用可能な場合、競合アッセイであり得る）など。さらなる例示的アッセイとしては、細胞増殖アッセイ、アンチセンスノックアウトアッセイ、細胞周期の阻害を検出するためのアッセイ、細胞死／アポトーシスの誘導のアッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、このようなアッセイは、インビトロで実施されるが、多くのアッセイが、（例えば、癌の動物モデルにおける）インビボ分析のために適合され得る。
【０２１３】
（治療標的の同定）
別の実施形態において、本発明は、治療標的としての、差示的に発現される遺伝子および遺伝子産物の同定を意図する。いくつかの局面において、これは、差示的に発現される遺伝子産物の活性を調節（例えば、低減または増大）する活性を有する薬剤の同定についての上記アッセイの逆である。
【０２１４】
この実施形態において、治療剤は、癌性表現型を調節する（例えば、癌性表現型の発症を、阻害または抑圧または予防する）ことが実証され得るか、または実証された、薬剤の影響を試験することによって、同定される。このような薬剤は、本明細書中で「抗癌剤」と一般にいわれ、この薬剤は、化学療法剤を包含する。例えば、この薬剤は、選択された遺伝子転写物に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載される差示的に発現される遺伝子の配列（例えば、配列番号１〜４９９の１つの配列）に対応する配列を有し得る。
【０２１５】
治療標的の同定のためのアッセイは、当業者に周知の方法を使用して、種々の方法で実施され得る。例えば、差示的に発現される遺伝子を発現または過剰発現する試験癌性細胞は、抗癌剤と接触されて、癌性表現型および候補遺伝子産物の生物学的活性に対するその影響が評価される。候補遺伝子産物の生物学的活性は、例えば、候補遺伝子産物をコードする遺伝子の発現の調節（例えば、転写物レベルまたはポリペプチドレベルにおける増大または減少によって検出されるような）、または遺伝子産物の酵素活性もしくは他の活性の調節を試験することによって、アッセイされ得る。癌性表現型は、例えば、細胞増殖、増殖の接触阻止の喪失（例えば、コロニー形成）、腫瘍増殖（インビトロまたはインビボ）などであり得る。あるいは、またはさらに、細胞死／アポトーシスまたは細胞周期調節に対する、候補標的遺伝子の生物学的活性の調節の影響が、評価され得る。
【０２１６】
候補遺伝子産物の生物学的活性の調節の結果としての、癌性表現型の阻害もしくは抑制、または細胞死もしくはアポトーシスの増大は、この候補遺伝子産物が、癌治療についての適切な標的であることを示す。下記のアッセイは、治療剤の同定のためのアッセイについて、容易に適合され得る。一般に、このようなアッセイは、インビトロで実施されるが、多くのアッセイが、（例えば、適切な人工的に受容した癌の動物モデルにおける）インビボ分析のために適合され得る。
【０２１７】
（候補薬剤）
用語「因子（ａｇｅｎｔ）」は、本明細書中で使用される場合、差示的に発現される遺伝子の遺伝子産物の生物学的活性を調節し得る、任意の分子（例えば、タンパク質または薬剤）を記載する。一般に、複数のアッセイ混合物が、異なる薬剤濃度を用いて平行して実施され、種々の濃度に対する差示的応答が得られる。代表的に、これらの濃度の１つが、ネガティブコントロール（すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満）として作用する。
【０２１８】
候補薬剤は、多数の化学的クラスを包含するが、代表的にはこれらは、有機分子であり、好ましくは、５０ダルトンより大きいが約２，５００ダルトン未満の分子量を有する、有機低分子化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用（特に、水素結合）に必要な官能基を含み、そして代表的には、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基（好ましくはこれらの化学的官能基のうちの少なくとも２つ）を含む。この候補薬剤はしばしば、上記の官能基のうちの１以上で置換された、環状炭素あるいは複素環式構造および／または芳香族構造もしくは多芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）構造を含む。候補薬剤はまた、以下を包含するがこれらに限定されない生体分子中で見出される：ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造的アナログ、または組み合わせ。
【０２１９】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含め、広範な種々の供給源から得られる。例えば、多数の手段（ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が挙げられる）が、広範な種々の有機化合物および生体分子のランダム合成および指向的合成について利用可能である。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物（差示的に発現される遺伝子産物に影響を与える内因性因子を同定するためのヒト組織由来の抽出物が挙げられる）の形態の天然化合物のライブラリーは、入手可能であるかまたは容易に産生される。さらに、天然の、または合成によって生成された、ライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段および生化学的手段によって容易に改変され、そしてコンビナトリアルライブラリーを生成するために用いられ得る。既知の薬理学的薬剤は、指向性またはランダムの化学的改変（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など）に供されて、構造的アナログが産生され得る。
【０２２０】
特に目的の例示的な候補薬剤としては、アンチセンスおよびＲＮＡｉポリヌクレオチド、ならびに抗体、可溶性レセプターなどが挙げられるがこれらに限定されない。抗体および可溶性レセプターは、標的の差示的に発現される遺伝子産物が、分泌されるかまたは細胞表面で接触可能である（例えば、レセプターおよび細胞外膜に安定に会合した他の分子）場合、候補薬剤として特に目的のものである。
【０２２１】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）に関与する方法については、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子が通常用いられる。ｄｓＲＮＡは、対象のポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子）の少なくともセグメントに対して実質的に同一であるように調製される。一般に、このｄｓＲＮＡは、この候補遺伝子の少なくともセグメントに対して、対象のポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の配列同一性を有するように選択される。他の例では、配列同一性はさらにより高く（例えば、９５％、９７％または９９％）、そしてなお他の例では、対象のポリヌクレオチドの少なくともセグメントに対して、対象のポリヌクレオチドとの１００％の配列同一性が存在する。配列同一性が存在するセグメントのサイズは、対象ポリヌクレオチドのサイズに依存して変動し得る。しかし、一般に、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドにわたって、実質的な配列同一性が存在する。他の例では、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチドまたは少なくとも１０００ヌクレオチドにわたって、実質的配列同一性が存在する；なお他の例では、対象ポリヌクレオチド（すなわち、候補遺伝子のコード領域および非コード領域）の全長にわたって、実質的配列同一性が存在する。
【０２２２】
対象ポリヌクレオチドとｄｓＲＮＡとの間では実質的に配列類似性しか必要とされないので、遺伝的変異、進化的分岐および多型から生じるこれらの２つの種の間での配列バリエーションが容認され得る。さらに、以下にさらに記載されるように、ｄｓＲＮＡは、種々の改変されたまたはヌクレオチドのアナログを含み得る。
【０２２３】
通常、ｄｓＲＮＡは、２つの別個の相補的ＲＮＡ鎖からなる。しかし、いくつかの例では、ｄｓＲＮＡは、鎖がそれ自体ループを形成してヘアピンループを形成するように、自己相補的である一本鎖ＲＮＡによって形成され得る。形態にかかわらず、ＲＮＡ二本鎖形成は、細胞の内側または外側で生じ得る。
【０２２４】
利用されるｄｓＲＮＡのサイズは、発現が抑制されるべきであって、かつ、細胞における対象ポリヌクレオチドの発現を低減する際に有効であるに充分に長い、対象ポリヌクレオチドのサイズに依存して変動する。一般に、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１０〜１５ヌクレオチド長である。特定の適用では、ｄｓＲＮＡは、２０ヌクレオチド未満、２１ヌクレオチド未満、２２ヌクレオチド未満、２３ヌクレオチド未満、２４ヌクレオチド未満または２５ヌクレオチド未満の長さである。他の例では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチドまたは少なくとも２００ヌクレオチドの長さである。ｄｓＲＮＡは、特定の他の適用において、依然として、より長くてもよい（例えば、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００または少なくとも６００ヌクレオチド）。代表的には、ｄｓＲＮＡは、３０００ヌクレオチド以下である。任意の特定の対象ポリヌクレオチドの最適なサイズは、合成様式におけるｄｓＲＮＡのサイズを変動させ、そして選択されたサイズが対象ポリヌクレオチドの発現を妨害する際に有効であるか否かを決定することによって、過度の実験を行うことなく、当業者によって決定され得る。
【０２２５】
ｄｓＲＮＡは、インビトロでの方法およびインビボでの方法を含め、当該分野で公知の多数の方法のうちのいずれかに従って、ならびに合成化学アプローチによって、調製され得る。
【０２２６】
インビトロでの方法。特定の方法は一般に、転写されるべき候補遺伝子に対応するセグメントを、挿入されるセグメントの転写を駆動するように指向されたプロモーターまたは一対のプロモーターの間に挿入し、次いで適切なＲＮＡポリメラーゼを利用して転写を行う工程を包含する。１つのこのような配置は、候補遺伝子またはそのセグメントに対応するＤＮＡフラグメントを、それが２つの向かい合わせのポリメラーゼ特異的プロモーター（同じであっても異なっていてもよい）と隣接するように、ベクター中に配置することを含む。このようなプロモーターからの転写は、２つの相補的ＲＮＡ鎖を生成し、これは続いて、アニーリングして、所望のｄｓＲＮＡを形成し得る。このような系において使用するための例示的なプラスミドとしては、プラスミド（ＰＣＲ  ４．０  ＴＯＰＯ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）が挙げられる。別の例は、対向して配向されるプロモーターがＴ７およびＳＰ６であり、Ｔ３プロモーターもまた用いられ得る、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）である。
【０２２７】
第２の配置において、転写される対象のポリヌクレオチドのセグメントに対応するＤＮＡフラグメントは、単一のプロモーターの下流に、センス方向およびアンチセンス方向の両方に挿入される。この系において、センスフラグメントおよびアンチセンスフラグメントは、同時転写されて、自己相補的な単一のＲＮＡ鎖を生成し、従って、ｄｓＲＮＡを形成し得る。
【０２２８】
種々の他のインビトロ方法が記載されている。このような方法の例としては、Ｓａｄｈｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．１４：１０１５，１９８７）；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ（Ｎａｔｕｒｅ  ３４３：４８４、１９９０）；およびＬｉｖａｃｈｅら（米国特許第５，７９５，７１５号）に記載される方法が挙げられるがこれらに限定されない（各々の文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）。
【０２２９】
一本鎖ＲＮＡもまた、酵素的合成および有機合成の組み合わせを用いて、または完全な有機合成により生成され得る。合成化学法の使用により、ｄｓＲＮＡに、所望の改変ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを導入することが可能である。
【０２３０】
（インビボ方法）
ｄｓＲＮＡはまた、多くの確立された方法に従って、インビボで調製され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；およびＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）を参照のこと（各々の文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される））。
【０２３１】
一旦、一本鎖ＲＮＡが形成されると、その相補鎖がアニーリングされ、二重鎖ＲＮＡが形成される。転写物は、代表的に、ＤＮＡａｓｅで処理され、そしてタンパク質を除去するための確立されたプロトコルに従ってさらに精製される。通常、このような精製方法は、フェノール：クロロホルムを用いて実施されない。得られる精製転写物はその後、ＲＮＡａｓｅフリーの水または適切な組成の緩衝液に溶解される。
【０２３２】
ｄｓＲＮＡは、インビトロでセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡをアニーリングすることにより生成される。一般的に、鎖は、鎖の分離を維持し、自己アニーリングを回避するために、最初に変性される。アニーリングプロセスの間、代表的には、特定の比率のセンス鎖およびアンチセンス鎖が合わされ、アニーリングプロセスを容易にされる。いくつかの例において、３：７のセンス鎖対アンチセンス鎖の分子量比が使用され；他の例では、４：６の比が使用され；そしてさらに他の例では、比は１：１である。
【０２３３】
アニーリングプロセスの間に使用される緩衝液の組成は、いくつかの例において、アニーリングプロセスの効率およびその後のトランスフェクション手順に影響し得る。アニーリングプロセスを実施するのに使用される緩衝化溶液は、カリウム塩（例えば、塩化カリウム）（例えば、約８０ｍＭの濃度で）を含むべきであることが示されている。いくつかの実施形態において、緩衝液は、実質的にカリウムを含まない。一旦一本鎖ＲＮＡがアニーリングして二重鎖ＲＮＡを形成すると、代表的には、任意の一本鎖オーバーハングが、このようなオーバーハングを特異的に切断する酵素（例えば、ＲＮＡａｓｅ  ＡまたはＲＮＡａｓｅ  Ｔ）を用いて除去される。
【０２３４】
一旦ｄｓＲＮＡが形成されると、それは参照細胞に導入される。参照細胞は、個々の細胞または細胞集団（例えば、組織、胚、および生物全体）を含み得る。細胞は、本質的には、動物、植物、ウイルス、細菌、真菌、および他の供給源を含む任意の供給源由来であり得る。組織の場合、組織は、分裂細胞または非分裂細胞、および分化細胞または非分化細胞を含み得る。さらに、組織は、生殖細胞および体細胞を含み得る。使用され得る分化細胞の例としては、神経細胞、グリア細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、抗酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、脂肪細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、内分泌腺または外分泌腺の細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、および内皮細胞が挙げられるがこれらに限定されない。細胞は、胚の個々の細胞であり得、そして未分化胚芽細胞または卵母細胞であり得る。
【０２３５】
特定の方法は、特定の細胞状態（例えば、疾患）についてのモデル系を用いて実施される。例えば、本明細書中に提供される特定の方法は、種々の癌に関連する遺伝子を調査するためのモデル系として利用できる癌細胞株を用いて実施される。
【０２３６】
ｄｓＲＮＡを細胞または細胞集団（例えば、細胞培養物、組織、または胚）に送達するのに、多くのオプションが使用され得る。例えば、ＲＮＡは、細胞内に直接導入され得る。一般的に、種々の物理的方法が、このような例において使用される（例えば、マイクロインジェクションによる投与（例えば、Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら（１９９７）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：１１３３−１１３７；およびＷｉａｎｎｙら（１９９８）Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １０７：４３０−４３９）を参照のこと）。
【０２３７】
細胞送達の他のオプションとしては、ｄｓＲＮＡの存在下での細胞膜の透過およびエレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、または化学物質（例えば、リン酸カルシウム）を用いるトランスフェクションが挙げられる。多くの確立された遺伝子治療技術もまた、細胞にｄｓＲＮＡを導入するために使用され得る。ウイルス粒子内にウイルス構築物を導入することにより、例えば、細胞内への発現構築物の効率的な導入およびその構築物によりコードされるＲＮＡの転写が達成され得る。
【０２３８】
ｄｓＲＮＡが生物または組織に導入される場合、遺伝子銃技術が、使用され得るオプションである。これは、一般的に、金粒子上にｄｓＲＮＡを固定化し、その後、所望の組織に発射されることを含む。哺乳動物細胞が、ｄｓＲＮＡを取り込むための輸送機構を有することもまた、研究が示している（例えば、Ａｓｈｅｒら（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２３：７１５−７１７を参照のこと）。結果として、別の送達オプションは、ｄｓＲＮＡを、このような輸送プロセスによるその後の取り込みのために、哺乳動物の身体管腔へ、間隙空間へと、または血液系へと細胞外で投与することである。血液系およびリンパ系ならびに脳脊髄液は、ｄｓＲＮＡを注射するための潜在部位である。経口投与、局所投与、非経口投与、直腸投与、および腹腔内投与もまた、投与の可能な様式である。
【０２３９】
導入される組成物はまた、ｄｓＲＮＡに加えて、種々の他の因子を含み得る。このような因子の例としては、ｄｓＲＮＡを安定化する薬剤、細胞取り込みを増強する薬剤、および／または干渉の程度を増加させる薬剤が挙げられるがこれらに限定されない。代表的には、ｄｓＲＮＡは、細胞が衝撃を受けるのを防止するようＲＮＡが導入される細胞の組成と適合性の緩衝液中に導入される。遺伝子サイレンシングを効果的に達成するｄｓＲＮＡの最小サイズもまた、送達系および溶液組成の選択に影響を及ぼし得る。
【０２４０】
利用可能な検出方法を用いて、標的遺伝子の発現における検出可能な変化を引き起こす（ｄｓＲＮＡが導入される細胞中で、候補遺伝子が実際に発現されていると推定される）ために、十分なｄｓＲＮＡが組織中に導入される。従って、いくつかの例において、ｄｓＲＮＡが導入されない細胞と比較して、候補遺伝子発現における少なくとも５〜１０％の減少を達成するよう十分なｄｓＲＮＡが導入される。他の例において、阻害は、少なくとも２０％、３０％、４０％または５０％である。さらに他の例において、阻害は、少なくとも６０、７０、８０、９０、または９５％である。いくつかの例における発現は、検出不可能なレベルまで、本質的に完全に阻害される。
【０２４１】
導入されるｄｓＲＮＡの量は、利用される投与様式、ｄｓＲＮＡのサイズ、ｄｓＲＮＡが導入される細胞の数、ならびにｄｓＲＮＡが動物に導入される場合、動物の年齢およびサイズのような種々の因子に依存する。適切な量は、例えば、いくつかの異なる濃度のｄｓＲＮＡを最初に投与することにより、当業者により決定され得る。特定の例において、ｄｓＲＮＡが細胞培養物に導入される場合、細胞内に導入されるｄｓＲＮＡの量は、約０．５〜３μｇ／１０６細胞まで変化する。
【０２４２】
多くのオプションが、候補遺伝子発現の干渉を検出するのに（すなわち、候補遺伝子のサイレンシングを検出するのに）利用可能である。一般的に、発現の阻害は、候補遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルの低下を検出することにより、その遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルを決定することにより、および／または候補遺伝子発現と関連する表現型における変化を検出することにより検出される。
【０２４３】
（ペプチドアナログおよびアンタゴニストをスクリーニングするためのポリペプチドの使用）
本明細書中で同定された差次的に発現される遺伝子によりコードされるポリペプチドは、コードされるポリペプチドから結合パートナー（例えば、レセプター）を同定するために、ペプチドライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。ペプチドライブラリーは、当該分野で公知の方法に従って合成され得る（例えば、ＵＳＰＮ５，０１０，１７５号およびＷＯ９１／１７８２３を参照のこと）。
【０２４４】
本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、当該分野で公知の利用可能な任意の方法（たとえば、シグナル伝達、抗体結合、レセプター結合、有糸分裂促進アッセイ、化学走性アッセイなど）を用いてスクリーニングされ得る。そのアッセイ条件は、理想的には、インビボでネイティブの活性が示される条件（すなわち、生理学的ｐＨ、温度、およびイオン強度）に類似するべきである。適切なアゴニストまたはアンタゴニストは、被験体における毒性の副作用を引き起こさない濃度でのネイティブ活性の強い阻害または増強を示す。ネイティブポリペプチドへの結合について競合するアゴニストまたはアンタゴニストは、ネイティブの濃度以上の濃度を必要とし得るが、そのポリペプチドと不可逆的に結合し得るインヒビターは、ネイティブ濃度のオーダーの濃度で添加され得る。
【０２４５】
このようなスクリーニングおよび実験により、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子またはｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの結合パートナー（例えば、レセプター）、および結合パートナーの少なくとも１つのペプチドアゴニストまたはアンタゴニストの同定を可能にし得る。このようなアゴニストおよびアンタゴニストは、細胞中でのレセプター機能（そのレセプターがネイティブであるかまたは遺伝子操作の結果としてレセプターを保有する細胞）を調節、増強、または阻害するために使用され得る。さらに、そのレセプターが、既知のレセプターと生物学的に重要な特徴を共有する場合、アゴニスト／アンタゴニストの結合についての情報は、既知のレセプターの改善されたアゴニスト／アンタゴニストの開発を促進し得る。
【０２４６】
（ワクチンおよび使用）
差次的に発現される核酸および本発明の核酸により生成されるポリペプチドはまた、癌を防止または処置するために主要な免疫応答を調節するために使用され得る。それぞれの免疫応答は複雑であり、そしていくつかの細胞型を含む現象の綿密に調節された系列である。それは、抗原が体内に侵入し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる特定のクラスの細胞と遭遇する場合に誘発される。これらのＡＰＣは、多くの抗原を捕捉し、そして抗原特異的ヘルパーＴリンパ球により認識され得る形態でそれを提示する。ヘルパー（Ｔｈ）細胞は活性化され、その後、他のクラスのリンパ球（例えば、Ｂ細胞または細胞障害性Ｔ細胞）の活性化を促進する。次いで、活性化リンパ球は増殖し、そしてそれらの特定のエフェクター機能を発揮し、多くの場合、その抗原を首尾よく活性化または排除する。従って、癌細胞に関連する特定の抗原に対する免疫応答を活性化することにより、患者が癌を発達させるのを防止するか、またはその抗原を発現する癌細胞を除去し得るリンパ球を生成し得る。
【０２４７】
遺伝子産物（ポリペプチド、ｍＲＮＡ（特に、明確な二次構造および／または三次構造を有するｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、または完全遺伝子を含む）が調製され得、そして過剰増殖障害および癌の処置または予防のためのワクチンにおいて使用され得る。核酸およびポリペプチドは、免疫応答を増強するため、腫瘍の進行を防止するため、過剰増殖細胞の増殖を防止するため、などのために使用され得る。免疫応答を増強し得る核酸およびポリペプチドを選択するための方法は当該分野で公知である。好ましくは、ワクチンにおいて使用するための遺伝子産物は、細胞表面に存在し、リンパ球および抗体により認識可能な遺伝子産物である。
【０２４８】
これらの遺伝子産物は、当該分野で公知の方法により、薬学的に受容可能なキャリアと共に、薬学的組成物中に処方され得る。この組成物は、癌を予防または処置するためのワクチンとして有用である。この組成物はさらに、少なくとも１つの同時刺激分子（１つ以上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（例えば、クラスＩまたはクラスＩＩ分子、好ましくは、クラスＩ分子）が挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る。この組成物はさらに、免疫強化のために、他の刺激分子（Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２などが挙げられる）、免疫刺激ポリヌクレオチド（シトシンが非メチル化された５’−ＣＧ−３’を含む）、およびサイトカイン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＣＴＡＰ  ＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βまたはそれらの組み合わせなどが挙げられるがこれらに限定されない）を含み得る。１つの実施形態において、特定の目的の免疫強化は、Ｔｈ１免疫応答を促進する。
【０２４９】
遺伝子産物はまた、体内からの迅速な除去から遺伝子産物を保護するキャリアと共に調製され得る（例えば、制御放出処方物（移植物およびマイクロカプセル化送達系を含む））。生物分解性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など）が使用され得る。このような処方物の調製のための方法もまた、当該分野で公知である。
【０２５０】
癌を予防または処置する方法において、遺伝子産物は、いくつかの経路（経皮投与、経粘膜投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、くも膜下投与、胸膜腔内投与、子宮内投与、直腸投与、膣投与、局所投与、腫瘍内投与などが挙げられるがこれらに限定されない）のうちのひとつを通じて投与され得る。経粘膜投与または経皮投与のために、透過する障壁に対して適切な透過剤が、この処方物において使用される。このような透過剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして例えば、胆汁塩およびフシジン酸誘導体の投与が挙げられる。さらに、界面活性剤が、透過を容易にするために使用され得る。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐薬により得る。経口投与のために、遺伝子産物は、従来型の経口投与形態（例えば、カプセル剤、錠剤、エリキシル剤、など）に処方される。
【０２５１】
遺伝子産物は、癌を予防または処置するのに有効な量で患者に投与される。一般的には、少なくとも約１ｐｇ／Ｋｇレシピエント体重、好ましくは少なくとも約１ｎｇ／Ｋｇレシピエント体重、より好ましくは少なくとも約１μｇ／Ｋｇ体重またはそれ以上の遺伝子産物の用量を患者に提供することが望ましい。約１ｎｇ／Ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／Ｋｇレシピエント体重の範囲が好ましいが、より低い用量またはより高い用量が投与され得る。用量は、抗原特異的Ｔリンパ球、好ましくは細胞障害性Ｔリンパ球のクローン性増殖をプライム、刺激、および／または引き起こすのに有効な用量であり、次いで、レシピエントにおいて癌を予防または処置し得る。この用量は、少なくとも１回投与され、そしてボーラスまたは連続投与として提供され得る。数週間〜数ヶ月の期間にわたる用量の複数回の投与が好ましくあり得る。その後は、示されるような用量が投与され得る。
【０２５２】
別の処置方法において、自己細胞障害性リンパ球または腫瘍浸潤性リンパ球が癌を有する患者から得られ得る。リンパ球は、培養物中で増殖され、そして抗原特異的リンパ球は、特定の遺伝子産物の、単独でかまたは少なくとも１つの共免疫刺激分子（サイトカイン）と組み合わせての存在下で培養することにより増殖される。次いで、抗原特異的リンパ球は、患者における腫瘍を減少または除去するのに有効な量で患者に戻し注入される。癌ワクチンおよびそれらの使用は、ＵＳＰＮ５，９６１，９７８；ＵＳＰＮ５，９９３，８２９；ＵＳＰＮ６，１３２，９８０；およびＷＯ００／３８７０６にさらに記載される。
【０２５３】
（薬学的組成物およびその使用）
薬学的組成物は、本発明の差次的に発現される遺伝子により生成されるポリペプチドを特異的に結合するポリペプチド、レセプター（例えば、本発明の抗体、またはポリヌクレオチド（アンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムを含む））を治療有効量で含み得る。この組成物は、原発性腫瘍および原発性腫瘍の転移を処置するために使用され得る。さらに、薬学的組成物は、例えば、放射線または従来の化学療法に対して腫瘍を感作するために、従来法の癌処置を組み合わせて使用され得る。
【０２５４】
薬学的組成物が、差次的に発現される遺伝子によりコードされる遺伝子産物に特異的に結合するレセプター（例えば、抗体）を含む場合、そのレセプターは、処置部位への送達のために、薬物に連結され得るかまたは、胸部癌細胞を含む部位の画像化を容易にするために検出可能な標識に連結され得る。抗体を薬物および検出可能な標識に連結する方法は、当該分野で周知であり、検出可能な標識を用いて画像化するための方法もまた同様である。
【０２５５】
本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、所望の疾患または状態を処置、緩和、もしくは予防するか、または検出可能な治療効果または予防効果を示す治療剤の量をいう。その効果は、例えば、化学的マーカーまたは抗原レベルにより検出され得る。治療効果はまた、生理的徴候の減少（例えば、体温の低下）を含む。
【０２５６】
被験体についての正確な有効量は、被験体のサイズおよび健康状態、その状態の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療剤またはその組み合わせに依存する。従って、前もって正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定の状況についての有効量は、慣用的な実験により決定され、それは医師の裁量である。本発明の目的のためには、有効用量は、一般的に、投与される被験体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
【０２５７】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、治療剤（抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療剤）の投与のためのキャリアをいう。この用語は、それ自体が、その組成物を受けた個体に対して有害な抗体の産生を誘導せず、そして過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、脂質凝集体、および不活性なウイルス粒子）であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。治療組成物中の薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールのような液体が挙げられ得る。補助的物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）もまた、このようなビヒクル中に存在し得る。
【０２５８】
代表的には、治療組成物は、注入可能物質（液体溶液または懸濁物のいずれか）として調製される；注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁物に適した固体形態もまた調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義に含まれる。薬学的に受容可能な塩はまた、薬学的組成物中に存在し得る（例えば、鉱物酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など））。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９５）Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓにおいて利用可能である。
【０２５９】
（送達方法）
一旦処方されると、本発明により企図される組成物は、（１）被験体に直接投与され得る（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、低分子アゴニスト、またはアンタゴニストなどとして）か；または（２）被験体由来の細胞にエキソビボで送達され得る（例えば、エキソビボ遺伝子治療において）。組成物の直接送達は、一般的に、非経口注入（例えば、皮下的に、腹腔内に、静脈内に、もしくは筋肉内に、腫瘍内に、または組織の隙間空間に）により達成される。他の投与様式としては、経口投与および肺投与、坐薬、および経皮適用、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーが挙げられる。投薬処置は、単回投薬スケジュールまたは多回投薬スケジュールであり得る。
【０２６０】
被験体への形質転換細胞のエキソビボ送達および再移植のための方法は当該分野で公知であり、そして例えば、国際公開ＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用において有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞、特に造血細胞、リンパ節細胞、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が挙げられる。一般的には、エキソビボおよびインビトロの両方の適用のための核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションによって達成され得、これらは全て、当該分野で周知である。
【０２６１】
一旦本明細書中に記載されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の示差的発現が、増殖障害（例えば、新生物、異形成症、および過形成）と関連することが見出されれば、その障害は、提供されるポリヌクレオチド、対応するポリペプチド、または他の対応する分子（例えば、アンチセンス、リボザイムなど）に基づく治療剤の投与による処置に感受性を有し得る。他の実施形態において、障害は、例えば、正常細胞に対して癌細胞において増加した発現を有する遺伝子のコードされる遺伝子産物の機能のインヒビター（アンタゴニスト）として、または癌細胞において発現が低下した遺伝子産物に対するアゴニスト（例えば、腫瘍サプレッサーとして作用する遺伝子産物の活性を促進する）として機能する低分子薬物の投与による処置に感受性を有し得る。
【０２６２】
本発明の薬学的組成物の投与の用量および手段は、治療組成物の特定の品質、患者の状態、患者の年齢、および患者の体重、疾患の進行、ならびに他の関連の因子に基づいて決定される。例えば、本発明のポリヌクレオチド治療組成物薬剤の投与は、局所投与または全身投与を包含し、これらの投与は、注射、経口投与、パーティクルガン、またはカテーテル法による投与、および局所的な投与を包含する。一般に、治療ポリヌクレオチド組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの少なくとも１２個、２２個、２５個、３０個、または３５個連続ヌクレオチドのポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、発現構築物を含む。種々の方法が、治療組成物を身体の特定の部位に直接的に投与するために使用され得る。例えば、小さな転移性病変が位置決めされ、そして治療組成物が、腫瘍本体中のいくつかの異なる位置において数回注射される。あるいは、腫瘍に供給する動脈が同定され、そして治療組成物が、その組成物を腫瘍に直接的に送達するために、このような動脈に注射される。壊死中心を有する腫瘍は吸引され、そして組成物が、いまや空となっている腫瘍の中心に直接注射される。アンチセンス組成物が、例えば、その組成物の局所的な適用によって腫瘍の表面に直接的に投与される。Ｘ線画像化が、上述の送達法のいくらかを補助するために使用される。
【０２６３】
アンチセンスポリヌクレオチドを含有するか、サブゲノムポリヌクレオチドを含有するか、または特定の組織に対する抗体を含有する、治療組成物の標的化送達もまた、使用され得る。レセプター媒介性のＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４）；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３：６２１；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０）８７：３６５５；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８において記載される。ポリヌクレオチドを含有する治療組成物は、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与について、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲にて投与される。約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコルの間に使用され得る。（例えば、コードされる遺伝子産物のレベルを増強または阻害するための）作用の方法、形質転換および発現の効力のような要因が、アンチセンスサブゲノムポリヌクレオチドの最大の効力のために必要とされる投薬量に影響する、考慮すべき事柄である。
【０２６４】
より大きな組織領域にわたってより多くの発現が所望される場合、アンチセンスサブゲノムポリヌクレオチドのより多くの量、もしくは継続的な投与プロトコルにおいて再投与される同じ量、または例えば、腫瘍部位の異なる近接組織部分または近い組織部分への数回の投与が、正の治療結果を達成するために必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験における慣用的な実験が、至適な治療効果のための特定の範囲を決定する。抗炎症活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関連する遺伝子についての、適切な使用、用量、および投与は、米国特許第５，６５４，１７３号において記載されている。
【０２６５】
本発明の治療ポリヌクレオチドおよび治療ポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達され得る。この遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る（概して、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：８５１；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８を参照のこと）。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導され得る。コード配列の発現は、構成的または調節性のいずれかであり得る。
【０２６６】
所望のポリヌクレオチドの送達のためのウイルスベースのベクター、および所望の細胞における発現は、当該分野において周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとしては、組換えレトロウイルス（例えば、ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；ＥＰ  ０  ３４５  ２４２；およびＷＯ９１／０２８０５を参照のこと）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）ベクター、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）ベクター、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）ベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４、およびＷＯ９５／００６５５を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７において記載されるような死滅（ｋｉｌｌｅｄ）アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与もまた、用いられ得る。
【０２６７】
非ウイルス送達ビヒクルおよび非ウイルス送達方法もまた、用いられ得、死滅アデノウイルス単独に連結されているかまたは連結されていないポリカチオン性濃縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７を参照のこと）；リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１６９８５を参照のこと）；真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８を参照のこと）、ならびに核電荷中和化、または細胞膜との融合が挙げられるがこれらに限定されない。裸のＤＮＡもまた、用いられ得る。例示的な裸のＤＮＡの導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号において記載される。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号；ＷＯ９５／１３７９６号；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；およびＥＰ  ０５２４９６８において記載される。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１において記載される。
【０２６８】
使用のために適切なさらなる非ウイルス送達は、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１（２４）：１１５８１において記載されるアプローチのような、機械的送達系を含む。さらに、コード配列およびこのような配列の発現の産物は、光重合化ヒドロゲル材料の沈着または電離放射線の使用を介して送達され得る（例えば、米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３を参照のこと）。コード配列の送達のために使用され得る遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、携帯型遺伝子移入パーティクルガン（例えば、米国特許第５，１４９，６５５号を参照のこと）の使用；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（例えば、米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３を参照のこと）が挙げられる。
【実施例】
【０２６９】
以下の実施例は、本発明をいかにして作製し使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために示される。以下の実施例は、本発明者らが自身の発明であるとみなすものの範囲を限定することも、下記の実験が実施したすべての実験であることまたは実施した唯一の実験であることを示すことも、意図されない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関する正確さを確保するための努力を行ったが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他のように示されない限り、部とは、重量部であり、分子量とは、重みつき平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、そして圧力は、大気圧であるかまたは大気圧付近である。
【０２７０】
（実施例１）
（生物学的材料の供給源）
胸部癌関連遺伝子の差次的発現を検出するために使用した細胞は、米国特許第５，８４６，５３６号および同第６，１２３，９４１号（本明細書中に参考として援用される）に開示される、ＨＭＴ−３５２２腫瘍復帰変異（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）モデルのために以前に記載された細胞であった。このモデルは、１回の減少乳房形成術からの連続継代によって誘導した、非腫瘍形成細胞（ＨＭＴ−３５２２  Ｓ１）および腫瘍形成細胞（ＨＭＴ−３５２２  Ｔ４−２）の両方を使用した。プラスチック上での２次元（２次元）単層において、Ｓ１細胞およびＴ４−２細胞の両方が、類似する形態を示す。しかし、３次元（３次元）マトリゲル培養において、Ｓ１は、表現型が正常である乳房組織構造を形成し、一方、Ｔ４−２細胞は、これらの構造へと組織化できず、代わりに、マトリックス中に広まった。β−１インテグリンもしくはＥＧＦＲブロック抗体を用いる処理によってか、またはＥＧＦＲシグナル伝達経路の化学インヒビター（チロホスチンＡＧ  １４７８）を用いて処理することによって、３次元でＳ１様構造を形成するようにＴ４−２細胞を誘導し得るという点で、このアッセイを、腫瘍復帰変異モデルと呼んだ。これらの処理Ｔ４−２細胞（Ｔ４Ｒ細胞と呼ぶ）は、非腫瘍形成性である。
【０２７１】
（実施例２）  
（細胞増殖およびＲＮＡ単離）
マイクロアレイ実験のための２次元および３次元での細胞増殖：ＨＭＴ３５２２  Ｓ１およびＴ４−２細胞を、２次元および３次元で増殖させた。Ｔ４−２細胞は、以前に記載された（Ｗｅａｖｅｒら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３７：２３１〜４５、１９９７；およびＷａｎｇら、ＰＮＡＳ  ９５：１４８２１〜１４８２６、１９９８）ように、抗ＥＧＦＲ、抗β１インテグリン、またはチロホスチンＡＧ  １４７８によって、復帰変異（ｒｅｖｅｒｔ）した。抗ＥＧＦＲ（モノクローナル抗体２２５）をＯｎｃｏｇｅｎｅから購入し、４μｇ／ｍｌ精製マウスＩｇＧ１の濃度で、ゲル化時間にてマトリゲル中に導入した。抗β１インテグリン（モノクローナル抗体ＡＩＩＢ２）を、Ｓａｎ  ＦｒａｎｃｉｓｃｏにあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＣ．Ｄａｍｓｋｙから贈与された。この抗β１インテグリンをまた、１００μｇ／ｍｌ腹水タンパク質濃度（これは、４〜１０μｇ／ｍｌ精製ラットＩｇＧ１に対応する）にて、ゲル化時間にマトリゲル中に導入した。チロホスチンＡＧ  １４７８を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、１００ｎＭ濃度で使用した。
【０２７２】
マイクロアレイ実験のためのＲＮＡ単離：ＲＮＡを、Ｓ１継代６０  ２次元培養物；Ｔ４−２継代４１  ２次元培養物；Ｓ１継代５９  ３次元培養物；ならびにＴ４−２およびＴ４−２復帰変異体（抗ＥＧＦＲ、抗β１インテグリン、およびチロホスチン）継代３５  ３次元培養物から、調製した。
【０２７３】
マイクロアレイ実験のためのすべてのＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎから得た市販のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して単離した。２次元増殖した細胞からの全ＲＮＡの単離を、このキットの手引きに指示される通りに実施した。簡単に述べると、培地を細胞から吸引し、キットＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを、フラスコに直接添加した。細胞溶解物をゴム製細胞へら（ｓｃｒａｐｅｒ）を用いて収集し、その溶解物を、シリンジに取り付けた２０Ｇ針に５回通した。１容量の７０％エタノールを均質化溶解産物に添加し、そしてピペッティングによってよく混合した。７００μｌまでのサンプルを２−ｍｌコレクションチューブに入れたＲＮｅａｓｙミニスピンカラムに適用し、そして＞８０００×ｇで１５秒間遠心分離した。７００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＷ１をこのカラムに添加し、そして＞８０００×ｇで１５秒間遠心分離して洗浄した。このカラムを新たなコレクションチューブに移した。５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥをこのカラムに添加し、そして＞８０００×ｇで１５秒間遠心分離して洗浄した。さらに５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＰＥをこのカラムにさらなる洗浄のために添加し、そしてこのカラムを最大速度で２分間遠心分離して乾燥させた。このカラムを新たなコレクションチューブに移し、そしてＲＮＡを、ＲＮａｓｅを含まない水３０μｌを用い、＞８０００×ｇで１分間遠心分離することによってこのカラムから溶出させた。
【０２７４】
３Ｄで増殖させた細胞からの総ＲＮＡの単離を、細胞をＲＮＡ単離の前にマトリゲルから単離したこと以外は上記のとおりに行った。細胞を、氷冷ＰＢＳ／ＥＤＴＡ（１３８ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２））を用いてマトリゲルからコロニーとして単離した。Ｗｅａｖｅｒら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３７：２３１−２４５，１９９７；およびＷａｎｇら．ＰＮＡＳ  ９５：１４８２１−１４８２６，１９９８を参照のこと。
【０２７５】
（実施例３：）
（示差的発現を示す遺伝子の検出および同定）
選択された配列の相対発現レベル（これは次いで、単一の転写産物の指標である）を、上記のとおりの二次元（２Ｄ）単層または三次元（３Ｄ）マトリゲル培養のいずれかでの細胞（Ｓ１、Ｔ４−２およびＴ４Ｒ）の培養後、上記の非腫瘍形成性細胞株と比較して、腫瘍形成性細胞株において調べた。選択された配列についての示差的発現を、Ｓ１  ２Ｄ培養物およびＴ４−２  ２Ｄ培養物由来のｍＲＮＡ、ならびにＳ１  ３Ｄ培養物、Ｔ４−２  ３Ｄ培養物およびＴ４Ｒ  ３Ｄ培養物由来のｍＲＮＡを、以下の通りに、以下に記載のとおりのマイクロアレイチップに対してハイブリダイズさせることによって評価した：Ｅｘｐ１＝Ｔ４−２  ２Ｄ／Ｓ１  ２Ｄ；Ｅｘｐ２＝Ｔ４−２  ３Ｄ／Ｓ１  ３Ｄ；Ｅｘｐ３＝Ｓ１  ３Ｄ／Ｓ１  ２Ｄ；Ｅｘｐ４＝Ｔ４−２  ３Ｄ／Ｔ４−２  ２Ｄ；Ｅｘｐ５＝Ｔ４−２  ３Ｄ／Ｔ４Ｒ（抗ＥＧＦＲ）３Ｄ；Ｅｘｐ６＝Ｔ４−２  ３Ｄ／Ｔ４Ｒ（抗β１インテグリン）３Ｄ；およびＥｘｐ７＝Ｔ４−２  ３Ｄ／Ｔ４Ｒ（チロホスチン（ｔｙｒｏｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ  １４７８）  ３Ｄ。
【０２７６】
用いた各アレイは、同一の空間レイアウトおよびコントロールスポットセットを有した。各マイクロアレイを２つの領域に分け、各領域は、各半分に、３２×１２個のスポットの１２のグルーピング（各アレイにつき合計約９，２１６個のスポット）を伴う１つのアレイを有した。これらの２つの領域は、同一にスポッティングされ、１つのアレイあたり各クローンの少なくとも２つの重複物を提供する。スポッティングを、０．５ｋｂ〜２．０ｋｂのＰＣＲ増幅産物を用いて達成し、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎ  ＩＩＩスポッターを製造業者によって推奨されるとおりに用いてスポッティングした。アレイ上の２４個の領域の各々の第１列は、４個のネガティブコントロールスポットおよび８個の試験ポリヌクレオチドを含め、約３２個のコントロールスポットを有していた。
【０２７７】
試験ポリヌクレオチドを、２〜６００ｐｇ／スライドの一定範囲の濃度で、そして１：１の比で、標識反応前に各サンプルにスパイクした。各アレイ設計について、２枚のスライドを、標識反応において逆に標識した試験サンプルとハイブリダイズさせた。このことは、各サンプルについて、各クローンにつき約４回（うち２つは一方の色、そして他方は別の色）の二連測定値を提供した。
【０２７８】
（差次的に発現される遺伝子の同定）
「差次的に発現される」とは、本実施例の文脈では、腫瘍形成性細胞と非腫瘍形成性細胞との間で、または三次元培養で増殖させた細胞と二次元培養で増殖させた細胞との間で、特定の遺伝子の発現において差が存在することを意味する。差次的に発現される遺伝子を同定するために、総ＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを用いてｃＤＮＡに第１逆転写し、続いて第２鎖ＤＮＡ合成を行った。次いで、ｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーター媒介発現（例えば、Ｌｕｏら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ５：１１７−１２２を参照のこと）を用いてインビトロで転写してアンチセンスＲＮＡを生成し、次いでこのアンチセンスＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。第２セットのｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーターを用いてインビトロで再度転写して、アンチセンスＲＮＡを提供した。必要に応じて、このＲＮＡをｃＤＮＡに再度変換して、３回までのＴ７媒介増幅を可能にして、より多くのアンチセンスＲＮＡを生成した。従って、この手順は、蛍光標識で用いられる最終ＲＮＡを提供するために、２回または３回のインビトロ転写を提供した。
【０２７９】
蛍光プローブを、コントロールＲＮＡをこのアンチセンスＲＮＡ混合物に最初に添加し、そしてＲＮＡ出発物質から蛍光標識されたｃＤＮＡを生成することによって作製した。腫瘍形成性ＲＮＡサンプルから調製された蛍光標識ｃＤＮＡを、非腫瘍形成性細胞のＲＮＡサンプルから調製された蛍光標識ｃＤＮＡと比較した。例えば、非腫瘍形成性細胞由来のｃＤＮＡプローブをＣｙ３蛍光色素（緑色）で標識し、そして腫瘍形成性細胞から調製されたｃＤＮＡプローブをＣｙ５蛍光色素（赤色）で標識した。
【０２８０】
この差次的発現アッセイを、腫瘍形成細胞由来のプローブおよび非腫瘍形成細胞由来のプローブ、ならびに／または２次元増殖した細胞に対する３次元増殖した細胞を等量混合することによって、実施した。このアレイを、５×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で６０℃にて約２時間インキュベートすることによってプレハイブリダイズし、その後、水中で３回洗浄し、イソプロパノール中で２回洗浄した。このアレイのプレハイブリダイゼーション後、プローブ混合物を、高ストリンジェンシー条件（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および０．２％  ＳＤＳ中４２℃にて一晩）下でこのアレイにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、このアレイを５５℃で３回洗浄した。この洗浄は、以下の通りであった：１）１×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ中で１回目の洗浄；２）０．１×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ中で２回目の洗浄；および３）０．１×ＳＳＣ中で３回目の洗浄。
【０２８１】
次いで、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ二色レーザー−スキャナ／検出器を使用して、緑色蛍光および赤色蛍光についてアレイをスキャンした。この画像は、ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｕｔｏｇｅｎｅソフトウェアを使用して処理し、各スキャンセットからのデータを、二次元または三次元で増殖した非腫瘍形成細胞または腫瘍形成細胞に対する発現の比を提供するように正規化した。マイクロアレイ実験からのデータを、米国特許出願第６０／２５２，３５８号（２０００年１１月２０日出願、Ｅ．Ｊ．Ｍｏｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ＢｏｙｌｅおよびＦ．Ｍ．Ｒａｎｄａｚｚｏ、標題「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｕｒａｃｙ  ｉｎ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ」であり、本明細書中に具体的に参考として援用される）に記載のアルゴリズムに従って、分析した。
【０２８２】
この実験を反復した。この時、２つのプローブを反対色で標識して、両方の「色指示（ｃｏｌｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）」においてこのアッセイを実施した。各実験を、時には、さらなる２つのスライド（各色指示において１つ）を用いて反復した。このアレイにおける各配列についての蛍光レベルを、幾何平均の比（８重複スポット／４つのアレイからの遺伝子、または４重複スポット／２つのアレイからの遺伝子、または他のいくらかの置換）として表した。このデータを、各重複領域中に存在する強化（ｓｐｉｋｅｄ）ポジティブコントロールを使用して正規化した。この正規化の精度を、各格差の有意性の最終決定に含めた。各スポットの蛍光強度もまた、各重複領域中のネガティブコントロールと比較して、どのスポットが各サンプル中の有意な発現レベルを検出したかを決定した。
【０２８３】
蛍光強度の統計分析を、重複スポットの各セットに適用して、各差次的測定の精度および有意性を評価して、ｐ値を得た。このｐ値は、腫瘍形成細胞と非腫瘍形成細胞との間または３次元増殖細胞に対する２次元増殖細胞の間の発現レベルに差異は存在しないという帰無仮説を試験した。マイクロアレイの初期分析の間に、ｐ＞１０−３の場合にこの仮説は受容された。これらのスポットについて、差次比を１．０００に設定した。他のすべてのスポットは、比較した２つのサンプル間で有意な発現差異を有する。例えば、腫瘍形成サンプルは、検出可能な発現を有し、非腫瘍形成サンプルは、そうではない場合、その比は、１０００で切り捨てる。なぜなら、非腫瘍形成サンプルにおける発現の値は、ゼロであるからであり、この比は、数学的に有用な値（例えば、無限）ではないからである。非腫瘍形成サンプルが検出可能な発現を有し、腫瘍形成サンプルがそうではない場合、その比は、０．００１まで切り捨てる。なぜなら、腫瘍サンプルにおける発現の値はゼロであり、この比は、数学的に有用な値ではないからである。これら後者２つの状況は、「オン／オフ」と本明細書中で呼ばれる。データベース表は、９５％信頼レベル（ｐ＞０．０５）を使用して場所を占めさせ（ｐｏｐｕｌａｔｅ）した。
【０２８４】
一般に、ポリヌクレオチドは、２つのサンプル間で有意に差次的に発現される遺伝子（少なくとも１つのサンプル中の発現の検出可能なレベルがあり、その比の値が、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍より大きい場合）を示すためにいわれ、ここでその比の値は、上記に記載の方法を使用して計算される。
【０２８５】
１の差次的発現比は、腫瘍形成細胞における遺伝子の発現レベルが、比較される特定の非腫瘍形成細胞における遺伝子の発現レベルとは統計学的に異ならないことを示す。非腫瘍形成胸部細胞と比較して腫瘍形成胸部細胞において１より有意に大きな差次的な発現比は、非腫瘍形成細胞と比較して、その遺伝子が、腫瘍形成細胞での発現を増加されることを示す。このことは、その遺伝子が、腫瘍形成表現型の発生において役割を果たし、細胞の転移の促進に関与し得ることを示唆する。このような遺伝子に由来する遺伝子産物の検出は、細胞が癌性である指標を提供し得、治療標的および／または診断標的を提供し得る。同様に、非腫瘍形成胸部細胞と比較して腫瘍形成胸部細胞において１より有意に小さな差次的な発現比は、例えば、その遺伝子が、腫瘍形成表現型の抑制に関与していることを示す。このような遺伝子によりコードされる遺伝子産物の活性の増大、またはこのような活性の置換は、化学療法の基本を提供し得る。このような遺伝子はまた、癌性細胞のマーカーとして働き得る。例えば、非腫瘍形成胸部細胞と比較して、胸部細胞におけるその遺伝子産物の不在または存在の減少は、その細胞が癌性であることを示す。
【０２８６】
上記の方法論を使用して、３６７の遺伝子またはその産物を、これらの実験のうちの１回以上において２倍以上に過剰発現されるとして分析された（ｐ値は、０．００１以下）、２０，０００のチップクローンから同定した。これらの同定された遺伝子またはその産物を、スポットされたポリヌクレオチドのスポットＩＤ、サンプルＩＤ、対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号（Ｎｏ．）、対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号についてのＧｅｎＢａｎｋの説明（入手可能な場合）、およびＧｅｎＢａｎｋスコア（ｐ値；配列番号とその遺伝子もしくは遺伝子産物との間で、関連性が偶然に発生した確率）に従って、表１に列挙する。任意の開示されるＧｅｎＢａｎｋ登録によって提供されるポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号を参照することによって、本明細書中に参考として援用される。上記に列挙した７回の差次的発現マイクロアレイ実験からの差次的ハイブリダイゼーション結果は、表２に提供されるが、配列は、７回の実験においてその発現比に対応する測定値を有した（例えば、スポットＩＤ１０５９４は、３Ｄ  Ｓ１細胞と比較して、３Ｄ  Ｔ４−２細胞において２．２倍過剰発現される）。配列番号１〜４９９（これは、表１および２に列挙されるスポットＩＤに対応する配列を示す）は、配列表に提供される。表１１は、スポットＩＤ（すなわち、マイクロアレイにスポットされた核酸）と、配列表に提供される配列との間の関係を示すルックアップテーブルである。
【０２８７】
（実施例４：サイクリンＧ会合キナーゼ（ＧＡＫ））
サイクリンＧ会合キナーゼ（すなわち、ＧＡＫ）といわれる遺伝子またはその産物を、３Ｄ  Ｓ１培養物（比：７．９２９６）および２Ｄ  Ｔ４−２培養物（比：３４．６６８２）の両方と比較して、３Ｄ  Ｔ４−２培養物において過剰発現されると同定した（サンプルＩＤ  ＲＧ：１０５６６９２：１００１２：Ｃ１１、スポットＩＤ  １９９９０）。ＧＡＫは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿００３４５０に対応する。
【０２８８】
（実施例５）
（ＧＡＫ発現のアンチセンス調節）
ＧＡＫについてのさらなる機能的情報を、アンチセンスノックアウト技術を用いて作製した。対応するコントロール（ＲＣ）を用いて、ＧＡＫ  ｍＲＮＡに相補的な（ＡＳ）多数の異なるオリゴヌクレオチドを設計し（ＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧＣＴＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＡ（配列番号：５００；ＣＨＩＲ１５９−１ＡＳ、ｇａｋ：Ｐ１８６８ＡＳ）、ＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＴＴＴＣＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧ（配列番号：５０１；ＣＨＩＲ１５９−１ＲＣ、ｇａｋ：Ｐ１８６８ＲＣ）；ＧＡＣＣＧＴＧＴＡＣＴＧＣＧＴＧＴＣＧＴＧＣＧ（配列番号：５０２；ＣＨＩＲ１５９−７ＡＳ、ｇａｋ：Ｐ０８３９ＡＳ）およびＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＣＡＴＧＴＧＣＣＡＧ（配列番号：５０２；ＣＨＩＲ１５９−７ＲＣ、ｇａｋ：Ｐ０８３９ＲＣ））、そしてヒト悪性結腸直腸癌ＳＷ６２０細胞、ヒト胸部癌ＭＤＡ２３１細胞、およびヒト胸部癌Ｔ４−２細胞におけるそれらのＧＡＫ発現抑制能力について試験した。各トランスフェクション混合物について、キャリア分子、好ましくはリピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄ）またはコレステロイド（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｉｄ）を、水中に０．５ｍＭの作業濃度になるように調製し、超音波処理して、均質な溶液を得て、そして０．４５μｍ  ＰＶＤＦメンブレンを通して濾過した。次いで、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ滅菌水中に１００μＭの作業濃度になるように調製した。このオリゴヌクレオチドをさらに、微量遠心管中のＯｐｔｉＭＥＭＴＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中に、２μＭまたは約ＯｐｔｉＭＥＭＴＭ１ｍｌあたり２０μｇオリゴになるようにさらに希釈した。別々の微量遠心管中で、（代表的にアンチセンスオリゴヌクレオチド１ｐｇあたり約１．５〜２ｎｍｏｌリピトイドの量の）リピトイドまたはコレステロイドを、このオリゴヌクレオチドを希釈するのに用いたのと同じ体積のＯｐｔｉＭＥＭＴＭ中に希釈した。この希釈されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、希釈したリピトイドに直ちに添加し、そして上下にピペッティングすることによって混合した。オリゴヌクレオチドを、３００ｎＭの最終濃度になるようにこの細胞に添加した。
【０２８９】
トランスフェクトした細胞中の標的ｍＲＮＡ（ＧＡＫ）のレベルを、プライマーＣＨＩＲ１５９＿２８９６（ＧＣＣＧＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＣＡ；配列番号５０４；正方向）およびＣＨＩＲ１５９＿３０８９（ＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＴＧＣ；配列番号５０５；逆方向）を用いる方法を用いて癌細胞株中で定量した。ＲＮＡを、製造業者の指示に従って上記の通りに抽出した。
【０２９０】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、まず、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニプレップキットを用いて上記の組織／細胞からＲＮＡを単離することによって実施した。合計０．５μｇのＲＮＡを用い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭｕＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用い、推奨された濃度の緩衝液、酵素およびＲｎａｓｉｎを用いて、第１鎖ｃＤＮＡを生成した。ｄＮＴＰおよびオリゴｄＴ、またはランダムヘキサマーの濃度および体積は、ｑＰＣＲにおけるバックグラウンドプライマー二量体化のレベルを低下させるために、推奨された濃度よりも低かった。
【０２９１】
次いで、このｃＤＮＡをｑＰＣＲに用い、ＡＢＩによるＧｅｎｅＡｍｐ  ７０００を製造業者に推奨されるように用いて、ＧＡＫの発現レベルを決定する。アクチンについてのプライマーをまた、この値を正規化し、そしてｃＤＮＡテンプレート濃度、ピペッティング誤差などのあり得るバリエーションを除去するために用いた。
【０２９２】
各２０μｌ反応物について、抽出されたＲＮＡ（一般に、合計０．２〜１μｇ）を、０．５ｍｌまたは１．５ｍｌの無菌微量遠心管に配置し、そして１２．５μｌの総容積になるように水を添加した。各管に、７．５μｌの緩衝液／酵素混合物を添加した。この緩衝液／酵素混合物は、２．５μｌ  Ｈ２Ｏ、２．０μｌ  １０×反応緩衝液、１０μｌオリゴｄＴ（２０ｐｍｏｌ）、１．０μｌ  ｄＮＴＰ混合物（各々１０ｍＭ）、０．５μｌ  ＲＮＡｓｉｎ（登録商標）（２０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、および０．５μｌ  ＭＭＬＶ逆転写酵素（５０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を（列挙した順番で）混合することによって調製した。内容物を上下にピペッティングすることによって混合し、そして反応混合物を４２℃で１時間インキュベートした。各管の内容物を、増幅前に遠心分離した。
【０２９３】
増幅混合物を、以下の順番で混合することによって調製した：１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各１４０μＭのｄＮＴＰ、各０．１７５ｐｍｏｌのオリゴ、１：５０，０００希釈のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１単位のＴａｑポリメラーゼ、および２０μｌにするためのＨ２Ｏ（ＰＣＲ緩衝液ＩＩは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから１０×濃度で入手可能である）。１×濃度では、これは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．３および５０ｍＭ  ＫＣｌを含む。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）は、二本鎖ＤＮＡに結合した場合に蛍光を発する色素である。二本鎖ＰＣＲ産物が増幅の間に生成されるにつれて、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎからの蛍光が増加する。各２０μｌのアリコートの増幅混合物に、２μｌのテンプレートＲＴを添加し、そして増幅を標準的プロトコルに従って実施した。
【０２９４】
表３は、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、３つ全ての細胞株におけるＧＡＫ  ｍＲＮＡの発現を、コントロールと比較して減少させたことを示す。ＧＡＫ  ｍＲＮＡの減少は、逆（すなわち、センス）のコントロールオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした細胞と比較して、約５０％〜約９０％の範囲であった。
【０２９５】
【表３】
2005525097.tif 000003
ＳＷ６２０、ＭＤＡ２３１およびＴ４−２におけるアンチセンスポリヌクレオチドによるＧＡＫタンパク質の減少が、ＧＡＫを特異的に認識する抗体を用いて確認された。図１は、抗ＧＡＫ抗体が施された、上記の細胞株のタンパク質抽出物のウェスタン（すなわち、タンパク質）ブロットを示す。ＧＡＫタンパク質発現は、ＧＡＫアンチセンスオリゴヌクレオチドを受ける細胞株において減少している。
【０２９６】
（実施例６）
（足場非依存性細胞増殖におけるＧＡＫの役割）
ＳＷ６２０細胞およびＭＢＡ−２３１細胞の足場非依存性細胞増殖に対するＧＡＫ遺伝子発現の影響を、軟寒天におけるコロニー形成によって測定した。軟寒天アッセイを、非組織培養物処理プレートをＰｏｌｙＨＥＭＡで最初にコーティングして、細胞がプレートに付着するのを防止することによって、行った。非トランスフェクト細胞を、０．０５％トリプシンを用い、そして培地中で２回洗浄することによって、収集した。細胞を、血球計算板を用いて計数し、そして培地中１ｍｌあたり１０４で懸濁する。５０μｌアリコートをポリ−ＨＥＭＡコーティング９６ウェルプレートに配置し、そしてトランスフェクトする。各トランスフェクション混合物について、キャリア分子（好ましくは、リピトイドまたはコレステロイド）を、水中０．５ｍＭの作業濃度になるように調製し、超音波処理して均質な溶液を得て、そして０．４５μｍ  ＰＶＤＦメンブレンを通して濾過した。次いで、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ滅菌水中に１００μＭの作業濃度になるように調製した。このオリゴヌクレオチドをさらに、微量遠心管中のＯｐｔｉＭＥＭＴＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中に、２μＭまたはＯｐｔｉＭＥＭＴＭ１ｍｌあたり約２０μｇとなるように希釈した。別々の微量遠心管中で、（代表的にアンチセンスオリゴヌクレオチド１μｇあたり約１．５〜２ｎｍｏｌリピトイドの量の）リピトイドまたはコレステロイドを、このオリゴヌクレオチドを希釈するのに用いたのと同じ体積のＯｐｔｉＭＥＭＴＭ中に希釈した。この希釈されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、希釈したリピトイドに直ちに添加し、そして上下にピペッティングすることによって混合した。オリゴヌクレオチドを、３００ｎＭの最終濃度になるようにこの細胞に添加した。トランスフェクション（約３０分間）後、３％  ＧＴＧアガロースを、０．３５％アガロースの最終濃度にてこの細胞に添加する。細胞層の寒天が凝固した後、１００μｌの培地を、各ウェルの上部に滴下する。コロニーが７日以内に形成される。増殖の読み取りのために、２０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを各ウェルに添加し、そしてこのプレートを１５分間振盪する。蛍光読み取り（５３０ｎｍ励起、５９０ｎｍ発光）を、６〜２４時間のインキュベーション後に行う。
【０２９７】
表４に示されるデータは、ＳＷ６２０細胞およびＭＤＡ２３１細胞に対するＧＡＫアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用が、コロニー形成の阻害をもたらすことを示し、そしてＧＡＫが、足場非依存性細胞増殖を生じるのに役割を果たすことを示す。表４は、数回の実験についての平均蛍光読み取りを示す。蛍光読み取りの標準偏差（Ｓｔ．Ｄｅｖ）および変動係数（％  ＣＶ）もまた示す。
【０２９８】
【表４】
2005525097.tif 000004
（実施例７）
（ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３（ＤＫＦＺ））
以前には特徴付けられていないいくつかの遺伝子は、これらの実験において誘導されると同定された。１つのこのような遺伝子は、２つのスポット（スポットＩＤ番号２２７９３およびスポットＩＤ番号２６８８３（遺伝子割当ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３））によって表された。この遺伝子は、２つの２次元（２Ｄ）Ｔ４−２対２Ｄ  Ｓ１実験において約２．２の比で、そして３次元（３Ｄ）Ｔ４−２細胞を種々の腫瘍転換培養物と比較して約２の比で発現された。しかし、発現の比は、３次元（３Ｄ）Ｔ４−２培養物を２Ｄ  Ｓ  １培養物と比較した場合、平均３．２まで増加した。対照的に、３Ｄ  Ｓ１培養物を２Ｄ  Ｓ１培養物と比較した場合、発現レベルにおいて本質的に相違は存在しなかった。このことは、この遺伝子の発現が、腫瘍形成性細胞株Ｔ４−２において特異的に上昇し、そして腫瘍形成性細胞株を三次元培養物中で増殖させる場合になおさらに上昇することを示唆する（表５を参照のこと）。
【０２９９】
【表５】
2005525097.tif 000005
これらのアレイデータを、上記の方法ならびに遺伝子特異的ＰＣＲプライマー（ＰＣＲ  プライマーＣＨＩＲ１８０＿１２０７  ＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＴＧＧＴＴＧＴＣＣＴＧＧ（配列番号５０６；正方向）およびＣＨＩＲ１８０＿１４０３  ＡＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＣＡＡ（配列番号５０７；逆方向））を用いたｑＰＣＲによって確認した。独立した培養物をこれらの実験について用い、そしてデータをＢ−カテニンに対して正規化した。これらのデータを表６に示す。
【０３００】
【表６】
2005525097.tif 000006
ＤＫＦＺは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿１１２２００、ＡＡＨ０９７５８、およびＮＭ＿０３０９３８に対応する。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ以外の種において同定される、ＤＫＦＺのオルソログとしては、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由来のＮＭ＿１３８８３９が挙げられる。
【０３０１】
膜貫通ヘリックス予測アルゴリズム（Ｓｏｎｈａｍｍｅｒら，Ａ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｉｎ  Ｐｒｏｃ．ｏｆ  Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７５−８２頁，Ｊ．Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｔ．Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎ，Ｆ．Ｍａｊｏｒ，Ｒ．Ｌａｔｈｒｏｐ，Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ，およびＣ．Ｓｅｎｓｅｎ編，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ：ＡＡＡＩ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８）を用いたＤＫＦＺの配列の分析は、ＤＫＦＺタンパク質が６回膜貫通領域（図２）を有し、その結果、膜貫通タンパク質であるようであることを示す。
【０３０２】
（実施例８）
（ＤＫＦＺ発現のアンチセンス調節）
ＤＫＦＺについてのさらなる機能的情報を、アンチセンスノックアウト技術を用いて作成した。ＤＫＦＺ  ｍＲＮＡに相補的な多数の異なるオリゴヌクレオチド（ＡＳ）を、対応するコントロール（ＲＣ）を用いて設計し（ＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＴＴＴＧＧＣＡＴＡＡＣＴ（配列番号５０８；ＣＨＩＲ１８０−７ＡＳ、ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１：Ｐ１３０１ＡＳ）、ＴＣＡＡＴＡＣＧＧＴＴＴＧＣＴＴＡＧＧＴＣＧＴＣＧ（配列番号５０９；ＣＨＩＲ１８０−７ＲＣ、ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１：Ｐ１３０１ＲＣ）、ＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴ（配列番号５１０；ＣＨＩＲ１８０−８ＡＳ、ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１：Ｐ１３２０ＡＳ）およびＴＣＧＴＣＧＣＣＡＡＣＴＴＧＡＧＴＣＴＣＣＴＣＴ（配列番号５１１；ＣＨＩＲ１８０−８ＲＣ、ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１：Ｐ１３２０ＡＳ））、そして上記のとおり、ヒト悪性結腸直腸癌ＳＷ６２０細胞、ヒト胸部癌ＭＤＡ２３１細胞、およびヒト胸部癌Ｔ４−２細胞におけるそれらのＤＫＦＺ発現抑制能力について試験した。
【０３０３】
表７は、上記のアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドが、３つ全ての細胞株において、コントロールと比較して、ＤＫＦＺ  ｍＲＮＡの発現を減少させたことを示す。ＤＫＦＺ  ｍＲＮＡの減少は、逆（すなわち、センス）のコントロール（ＲＣ）オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした細胞と比較した場合、約９５％〜約９９％の範囲であった。
【０３０４】
【表７】
2005525097.tif 000007
（実施例９）
（細胞増殖に対するＤＫＦＺ発現の効果）
細胞増殖の阻害に対する遺伝子発現の効果を、転移性胸部癌細胞株ＭＤＡ−２３１および胸部癌細胞株Ｔ４−２において評価した。細胞を、９６ウェルディッシュにおいて約６０〜８０％コンフルエンシーになるようにプレーティングした。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは逆コントロールオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉＭＥＭＴＭ中に２μＭに希釈し、そして送達ビヒクル（好ましくはリピトイドまたはコレステロイド）が希釈されたＯｐｔｉＭＥＭＴＭ中に添加した。次いで、オリゴ／送達ビヒクル混合物を、細胞についての血清を有する培地中にさらに希釈した。全ての実験についてのオリゴヌクレオチドの最終濃度は３００ｎＭであり、そして全ての実験について、送達ビヒクルに対するオリゴの最終的な比率は、１．５ｎｍｏｌリピトイド／μｇオリゴヌクレオチドであった。
【０３０５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製した。細胞を、３７℃にて４時間または一晩トランスフェクトし、そしてトランスフェクション混合物を新鮮培地で置換した。プレートを、４日間インキュベートし、０日目〜４日目の各々についてプレートを収集する。細胞数の相違を決定するために、ＣｙＱｕａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、製造業者の指示によって用いた。蛍光読み取り（４８０ｎｍ励起、５２０ｎｍ発光）を、５分間のインキュベーション後に行った。
【０３０６】
これらのアッセイの結果を、表７Ａおよび表８に示す。このデータは、ＤＫＦＺアンチセンスポリヌクレオチドが、コントロールと比較して、細胞増殖を有意に減少させ、それゆえ、ＤＫＦＺは、癌性胸部細胞における癌の表現型の生成または維持において役割を果たすことを示す。
【０３０７】
【表７Ａ】
2005525097.tif 000008
【０３０８】
【表８】
2005525097.tif 000009
（実施例１０）
（足場非依存性細胞増殖におけるＤＫＦＺの役割）
ＭＤＡ４３５ヒト胸部癌細胞およびＭＣＦ７ヒト胸部癌細胞の足場非依存性細胞増殖に対するＤＫＦＺ遺伝子発現の効果を、軟寒天におけるコロニー形成によって測定した。軟寒天アッセイを、上記にＧＡＫについて記載した方法によって行った。
【０３０９】
表９に提示したデータは、ＭＤＡ４３５細胞およびＭＣＦ７細胞に対するＤＫＦＺアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用が、コロニー形成の阻害をもたらすことを示し、そしてＤＫＦＺが、癌細胞の足場非依存性細胞増殖において役割を果たすことを示す。表９は、いくつかの実験についての平均蛍光読み取りを示す。蛍光読み取りの標準偏差（Ｓｔ．Ｄｅｖ）および変動係数（％  ＣＶ）ならびに確立（Ｐ値）もまた示す。
【０３１０】
【表９】
2005525097.tif 000010
ＭＤＡ２３１ヒト胸部癌細胞の侵入性に対するＤＫＦＺ遺伝子発現の効果を、マトリゲルアッセイによって測定した。細胞の３次元再構成基底膜培養物を、商業的に調製された再構成された基底膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、以前（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９０６４−９０６８）に記載されたとおりに作製し、そして当該分野で周知の方法を用いて調べた。
【０３１１】
表１０（軟寒天アッセイと類似のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを用いて定量した）および図３は、ＤＫＦＺの発現が減少したＭＤＡ２３１細胞の侵襲性を試験するための、Ｍａｔｒｉｇｅｌ侵入／移動度アッセイの例示的な結果を提供する。一般に、これらのデータは、ＤＫＦＺの発現の減少が、ＭＤＡ２３１細胞の侵入性を顕著に減少させることを示す。
【０３１２】
【表１０】
2005525097.tif 000011
（実施例１１）
（癌組織におけるＤＫＦＺの発現）
以下のペプチドを、ポリクローナル抗体生成のために用いた：ＤＫＦＺタンパク質のアミノ酸９７〜１０８に対応するペプチド８０９：ｇｖｈｑｑｙｖｑｒｉｅｋ（配列番号３８０）およびＤＫＦＺタンパク質のアミノ酸２１５〜２２７に対応するペプチド８１０：ｓｇａｅｐｄｄｅｅｙｑｅｆ（配列番号３８１）。
【０３１３】
ＤＫＦＺに特異的な抗体をＦＡＣＳおよび免疫局在分析において用いて、ＤＫＦＺがメンブレンに関連し、そして癌患者由来の生検の癌組織においてアップレギュレートされることが示される。
【０３１４】
さらに、ＤＫＦＺに特異的な抗体は、癌性胸部におけるＤＫＦＺ活性を調節するために用いられ、さらにこの抗体は、胸部癌についての処置として、単独で、または毒性部分に結合体化して用いられる。
【０３１５】
本発明を、その特定の実施形態を参照して記載してきたが、種々の変更が行われ得、そして等価物が、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく置換され得ることが当業者によって理解されるべきである。さらに、多くの改変が、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの工程を、本発明の目的、趣旨および範囲に適合させるために行われ得る。全てのこのような改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０３１６】
【表１】
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【０３１７】
【表２】
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【０３１８】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０３１９】
【図１】図１は、異なる細胞株におけるＧＡＫポリペプチドの発現を示すオートラジオグラフの３つのパネルである。
【図２】図２は、ＤＫＦＺｐ５６６Ｉ１３３の疎水性領域を示すヒドロパシープロットのグラフおよび表である。
【図３】図３は、Ｃ１８０−７、Ｃ１８０−８ならびにポジティブコントロールアンチセンス（ＡＳ）およびコントロール（ＲＣ）オリゴヌクレオチドに曝されたＭＤＡ−２３１細胞の写真の６つのパネルである。
【図４】図４は、スポットＩＤ  ２２７９３およびスポットＩＤ  ２６８８３の整列である。
【図５】図５は、ＶＭＰ１（ＤＫＦＺ）に対する３つの配列各々のマッピングを示す３つの配列の整列の図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月16日(2005.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005525097000001.app
【国際調査報告】
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