(57)【要約】  糖尿病、特に２型糖尿病の発症の予防に対して有効な薬物のスクリーニング方法が提供される。本発明の１つの態様において、該方法は、候補薬物の存在下でＰＡＩ−１活性についてアッセイすること；および候補薬物が存在しない場合と比較してＰＡＩ−１活性の減少を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物と関連付けることを包含する。または、Ｅ２Ｆ活性が検出され、Ｅ２Ｆ活性の増加がＰＡＩ−１活性の減少を反映する。ＰＡＩ−１活性を阻害する方法、医薬物および医薬組成物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）候補薬物の存在下でＰＡＩ−１活性についてアッセイすること；および
（ｂ）該候補薬物が存在しない場合と比較してＰＡＩ−１活性の減少を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連付けること、
を含む、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニング方法。
【請求項２】
該ＰＡＩ−活性がＰＡＩ−１発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）がＥ２Ｆ活性の増加を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該Ｅ２Ｆ活性の増加がＥ２ＦとｐＲＢとの相互作用の阻止により仲介される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｅ２ＦとｐＲＢとの該相互作用がペプチドを用いて阻止される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）がαｖβ３活性の増加を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
αｖβ３へのビトロネクチンの結合を検出することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）候補薬物の存在下でＥ２Ｆ活性についてアッセイすること；および
（ｂ）該候補薬物が存在しない場合と比較してＥ２Ｆ活性の増加を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連付けること、
を含む、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニング方法。
【請求項９】
該Ｅ２Ｆ活性がＰＡＩ−１発現のモニタリングにより検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ａ）がＰＡＩ−１活性の減少を検出することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
候補薬物の存在下でＥ２ＦとｐＲＢとの結合についてアッセイすること（ここで、該候補薬物が存在しない場合と比較して該結合の低下が、Ｅ２Ｆ活性の増加の指標である）を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
該候補薬物がペプチドまたはペプチド模倣物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２に記載の方法のいずれか１つにより同定される薬物。
【請求項１４】
医薬品としての請求項１３に記載の薬物の使用。
【請求項１５】
薬剤の製造での請求項１３に記載の薬物の使用。
【請求項１６】
糖尿病または糖尿病の素因のある個体の処置方法であって、
該個体のＰＡＩ−１発現を減少させるのに十分な量で、ＰＡＩ−１発現を低下させるのに有効な薬物の医薬的有効量を該個体に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
該薬物がＥ２Ｆまたはそのフラグメントである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該薬物が該個体のＥ２Ｆ活性を増加させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
該薬物が抗体またはそのフラグメントである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
該薬物がＰＡＩ遺伝子発現に特異的なｓｉＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、糖尿病、肥満、薬理学、および医療の分野に関する。より具体的には、本発明は、糖尿病の処置に有用な薬物を同定するスクリーニング方法に関する。
【０００２】
糖尿病は血中グルコースの上昇という臨床症状により特徴付けられ、先進国の死亡主要原因の１つである。インシュリン処置に応答するかどうかによって、糖尿病は２種類に分けられる：インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）およびインシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）であり、それぞれ１型および２型と呼ばれる。それらは、疾患の原因および経過、遺伝的感受性、発生率、および病理が異なる。多くの場合、ＩＤＤＭは若年期に生じ、たいていインシュリン産生の欠陥に至る遺伝性疾患と関連する。ＩＤＤＭの患者はインシュリンに応答するが、ＮＩＤＤＭ患者は応答しない。ＮＩＤＤＭがＩＤＤＭよりずっと一般的であり、全糖尿病患者の８５〜９０％となる。ＮＩＤＤＭは遅延発症型疾患であり、肥満との強固な関連を示すライフスタイルにつながる以外、その原因は確定されていない。インシュリン濃度は正常だが血中糖濃度はやや高く、標的細胞表面にインシュリン受容体が存在するにもかかわらず、インシュリン投与は効果がない。インシュリン応答がないのは、インシュリン利用が損なわれたことに起因すると思われる。
【０００３】
Ｉ型プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＰＡＩ−１）は、線溶で重要な働きをする酵素であるウロキナーゼ型および組織型プラスミノーゲン活性化因子の特異的なインヒビターである（Vassalli, JD. et al., 1991, J Clin Invest., 88(4):1067-72; Loskutoff, D.J. et al., 1998, Arterioscler Thromb Vasc Biol.,18(1):1-6）。糖尿病患者で検出されるＰＡＩ−１の血漿濃度の上昇が（Juhan-Vague, I. et al., 1996, Ann Med. 28:371-380）フィブリン塊の蓄積を誘発し、このことがアテローム性動脈硬化症の様な循環器疾患の合併症のリスクを増加させると考えられる（Dawson, S. et al., 1992, Atherosclerosis. 95:105-117; Juhan-Vague, I. et al., 1996, Ann Med. 28:371-380; Loskutoff, D.J. et al., 1998, Arterioscler Thromb Vasc Biol.,18(1):1-6; Sobel, B.E., et al., 1998 Circulation, 97(22):2213-21; Meigs, J.B., et al., 2000, JAMA, 283(2):221-8）。糖尿病で見られるＰＡＩ−１産生の増加は、高レベルの血中グルコースに直接起因すると考えられる（Nordt, T. K. et al., 1993, Arterioscler Thromb. 13:1822-1828）。グルコースは、血管平滑筋細胞においてＰＡＩ−１プロモーターの−８５と−４２との間に位置する２つのＳｐｌ部位を通じて、ＰＡＩ−１遺伝子発現を制御する（Chen, Y. Q. et al., 1998, J Biol Chem. 273:8225-8231）。
【０００４】
ＰＡＩ−１発現は様々な種類の細胞で見られ、成長因子（ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、血小板由来成長因子、ＢＦＧＦ）、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ−α）、およびホルモン（コルチコステロイド、インシュリン）を含む複数の制御因子が、ＰＡＩ−１転写において働くと同定された。脂肪組織は、体内のＰＡＩ−１の主な供給源の１つである（Loskutoff, D.J. et al., 1998, Arterioscler Thromb Vasc Biol.,18(1):1-6, ）。特に、内臓脂肪は糖尿病患者におけるＰＡＩ−１の主な供給源である（Mertens, I.,  et al., 2001, Horm Metab Res., 33(10):602-7）。ＴＮＦα（Samad, F., 1996, J Clin Invest., 97(1):37-46）、ＴＧＦβ（Alessi, M.C., 1997, Diabetes, 46(5):860-7）、レプチン（De Mitrio, V., et al., 1999, Metabolism, 48(8):960-4）、アンギオテンシンＩＩ（Skurk, T., et al., 2001, Hypertension, 37(5):1336-40）、およびインシュリン（Samad, F. et al., 1996, Mol Med, 2(5):568-82）を含むいくつかのタンパク質因子が、脂肪組織の主要構成要素である脂肪細胞におけるＰＡＩ−１高発現の調節因子であると提唱されている。
【０００５】
最近、Ｅ２Ｆ１が、ＬＬＣ−ＰＫＬブタ腎臓上皮細胞、ＨＥＫ２９３ヒト胚由来腎臓細胞、ＭＥＦマウス胚線維芽細胞、ＷＩ−３８ヒト肺線維芽細胞、およびＵ２０ＳおよびＳＡＯＳ−２ヒト骨肉腫細胞を含む様々な種類の分裂中の培養細胞において、ある意味ではポケット−結合タンパク質に依存しないが、Ｅ２ＦのＤＮＡ−結合ドメインを必要として、ＰＡＩ−１遺伝子を抑制すると分かった（Koziczak, M., et al., 2000, Mol Cell Biol 20(6): 2014-22; Koziczak, M., et al., 2001, Eur J Biochem 268(18): 4969-78）。これらの研究では、転写因子Ｅ２ＦによるＰＡＩ−１遺伝子の負の制御が転写性のものであるとも分かった。背景にある分子機序は完全には分かっていないが、活性化されたＥ２ＦによるＰＡＩ−１遺伝子の抑制がタンパク質合成阻害剤シクロヘキサミドによっては影響されないため、ＰＡＩ−１プロモーターへのＥ２Ｆの作用は直接的であると思われる（Koziczak, M., et al., 2001, Eur J Biochem 268(18): 4969-78）。ＰＡＩ−１遺伝子発現が、もはや細胞周期になく、Ｅ２Ｆが不活性な状態の細胞中で調節されるかどうかという問題は残されている。脂肪細胞は、終末まで分化したそれ自体は最早分裂しない細胞である。Altiok等（Altiok, S. et al., 1997, Genes Dev. 1997 Aug 1;11(15):1987-98）は、セリン／スレオニンタンパク質脱リン酸酵素ＰＰ２Ａのダウンレギュレーションを含む機序を介するＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）の活性化により、前脂肪細胞が脂肪細胞に分化するときに、Ｅ２Ｆ活性が低下すると報告した。
【０００６】
Ｅ２Ｆ転写因子は、ＤＮＡ複製および細胞周期の進行に必要な様々な遺伝子を制御しつつ、Ｇ０／Ｇ１期およびＳ期の境界で、細胞周期事象における中枢的な役割を果たす（Helin, K., 1998, Curr Opin Genet Dev, 8(1):28-35. Review; (Nevins, J.R., 1998, Cell Growth Differ. 1998 Aug;9(8):585-93. Review）。活性化Ｅ２Ｆは、Ｅ２Ｆファミリーのメンバー（Ｅ２Ｆ１−６）とＤＰファミリーのメンバー（ＤＰ１またはＤＰ２）とのヘテロ２量体である（Wu, C. L. et al, 1995, Mol Cell Biol. 15:2536-2546）。Ｅ２Ｆ活性は、ポケット結合タンパク質（ｐＲＢ、ｐ１０７、およびｐ１３０）との相互作用により制御される。Ｅ２Ｆへのポケットタンパク質の結合は、そのトランス活性化活性を抑制するか（Cobrinik, D. et al., 1993, Genes Dev. 7:2392-2404; and Qin, X. Q. et al., 1995, Mol Cell Biol. 15:742-755）、あるいは部分的にヒストン脱アセチル酵素を動員し（Brehm, A. et al., 1998,  Nature. 391:597-601）もしくは一般的な転写因子との相互作用により（Weintraub, S. J. et al., 1995, Nature. 375:812-815）、Ｅ２Ｆをその阻害作用を発揮する活性化リプレッサーに変換する（Helin, K. et al., 1993, Mol Cell Biol. 13:6501-6508; and , Zhang, H. S. et al., 1999, Cell. 97:53-61）。サイクリン依存性キナーゼによるポケット結合タンパク質のリン酸化により、Ｇ０／Ｇ１からＳ期への境界で活性化Ｅ２Ｆが遊離され、これはＳ期の最後で別のサイクリン依存性キナーゼによるＤＰサブユニットのリン酸化によって不活性化される。よって、Ｅ２Ｆ活性は、細胞が終末まで分化するかまたは老化に至り（Good, L., et al., 1996, J Cell Physiol. 1996 Sep;168(3):580-8; Gill, R. M., et al., 1998, Exp Cell Res 244(1): 157-70）、ゲノムが複製される必要がなくなったときに低下する。
【０００７】
糖尿病またはその発症の処置に有効な薬物が依然必要であり、本発明がその必要性を満たす。候補薬物の存在下でＰＡＩ−１活性についてアッセイすること；および候補薬物が存在しない場合と比較してＰＡＩ−１活性の減少を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連付けることにより、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニン方法が提供される。
【０００８】
１つの実施態様において、ＰＡＩ−１発現は、Ｅ２Ｆ活性の上昇により減少するから、ＰＡＩ−１活性の減少がＥ２Ｆ活性の増加を検出することで推測できる。従って、本発明のさらなる態様において、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニング方法が提供され、該方法は、候補薬物の存在下でＥ２Ｆ活性についてアッセイすること；および候補物質が存在しない場合と比較してＥ２Ｆ活性の増加を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連付けることを含む。
【０００９】
Ｅ２Ｆ活性の増加は、例えば、ペプチドを用いてＥ２ＦとｐＲＢとの相互作用を阻止する（disrupt）ことにより仲介される。従って、本発明の別の態様において、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニング方法が提供され、該方法は：候補薬物の存在下でＥ２ＦとｐＲＢとの結合についてアッセイすること；および候補薬物が存在しない場合と比較してＥ２Ｆ−ｐＲＢ結合の低下（例えば、複合体からの活性化Ｅ２Ｆの遊離）を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連付けることを含む。
【００１０】
ＰＡＩ−１活性は、αｖβ３インテグリン活性に影響を与えると考えられている（実施例６参照）。従って、本発明のさらなる態様において、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニング方法が提供され、これは：
（ａ）候補薬物の存在下でαｖβ３活性についてアッセイすること；および
（ｂ）該候補薬物が存在しない場合と比較してαｖβ３活性の増加を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連付けること、
を含む。
【００１１】
該候補薬物は例えば、小有機化学物質、天然産物、またはペプチドである。αｖβ３活性を活性化するのに有効な活性化抗体、または例えば、ｐＲＢとＥ２Ｆとの相互作用を阻害する阻害抗体の様な抗体も有効である。阻害性核酸分子も可能性のある有効な薬物である。
【００１２】
従って、本発明により、本発明のスクリーニング方法のいずれか１つにより同定される薬物も提供される。該薬物はさらなる開発（例えば、特異性、細胞の取り込み、または他の望ましい特徴の改善）のために用いられるか、あるいは薬剤の製造においてまたは医薬品として、必要に応じて他の成分または有効成分と共に用いられる。
【００１３】
従って、本発明は、個体のＰＡＩ−１発現を減少させるのに十分な量で、ＰＡＩ−１発現を低下させるのに有効な薬物の医薬的有効量を個体に投与することによる、糖尿病または糖尿病の素因のある個体の処置方法も提供する。
【００１４】
本発明は、Ｅ２Ｆ活性を増加させるのに有効な薬物の医薬的有効量を個体に投与することによる、糖尿病または糖尿病の素因のある個体の処置方法も提供する。従って、該薬物は、Ｅ２Ｆまたはその活性フラグメント（例えば、ＰＡＩ−１発現を阻害可能なフラグメント）、または個体のＥ２Ｆ活性を増加させる薬物である。
【００１５】
さらに、本発明は、αｖβ３インテグリン活性を増加させるのに有効な薬物の医薬的有効量を個体に投与することによる、糖尿病または糖尿病の素因のある個体の処置方法を提供する。該薬物は、αｖβ３インテグリンまたはその活性フラグメント（例えば、ＰＡＩ−１活性を阻害可能なフラグメント）、または個体のαｖβ３インテグリン活性を増加させる薬物、例えば、以下の実施例６で例示される活性化抗体である。
【００１６】
プラスミノーゲン活性化因子の強力な阻害因子であるＰＡＩ−１は様々な組織で発現されるが、最近、脂肪組織がその主な供給源であることが明らかにされた。肥満および２型糖尿病に罹患する患者の脂肪組織含有は、高レベルの血中循環ＰＡＩ−１を生じ（Loskutoff, D.J. et al., 1998, Arterioscler Thromb Vasc Biol.,18(1):1-6; Juhan-Vague, I., et al., 1997, Thromb Haemost 78(1): 656-60）、ひいては血栓症およびアテローム性動脈硬化症（artherosclerosis）の様な循環器系合併症を生じる。本発明者は、ＰＡＩ−１発現の上昇は、ＮＩＤＤＭの原因であって、単にＮＩＤＤＭの結果ではないことを提唱した。従って、本発明は、糖尿病に対して、または特に脂肪細胞でのＰＡＩ−１発現の阻害に基づいて糖尿病の発症を予防する際に有効な薬物のスクリーニング方法を提供する。
【００１７】
従って、本発明は、ＮＩＤＤＭの病理的展開を予防、改善、または矯正する候補薬物の同定方法を提供する。特に、候補薬物の存在下でＰＡＩ−１活性、好ましくはＰＡＩ−１発現についてアッセイすること、および該候補薬物が存在しない場合と比較してＰＡＩ−１活性の減少を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連づけることを含む、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニング方法が提供される。ＰＡＩ−１活性または発現は、当該技術分野で既知の方法のいずれか、またはなお開発されるべき方法のいずれかで検出される。以下の実施例ではノーザンブロット技術を用いて本発明を例示する。しかしながら、他の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法、逆転写、ＰＡＩ−１に特異的な抗体などを使用することは、当該技術分野の通常の技術者には明らかである。または、構造物が、ＰＡＩ−１制御配列のコントロール下で異種配列を発現させるために設計される。続いて、ＰＡＩ−１（またはＥ２Ｆ）発現レベルが、ＰＡＩ−１のコントロール下で発現されるタンパク質マーカーの存在に従って検出される。該タンパク質マーカーは、ＰＡＩ−１遺伝子に作動可能に結合したレポーター遺伝子または作動可能なフラグメント（すなわち、ＰＡＩ−１と同一の発現パターンを有するタンパク質マーカーの発現をもたらすことが可能である）によりコード化される。該タンパク質マーカーは、βガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、グルコロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミナーゼ、カタラーゼ、ウレアーゼ、および蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ）を含むが、これらに限られない。または、ＰＡＩ−１またはＥ２Ｆを含むタンパク質産物が、当該技術分野でよく知られている、興味あるタンパク質に特異的な抗体を用いて検出される。
【００１８】
本発明者は、Ｅ２Ｆタンパク質が分化した脂肪細胞に存在し、ＰＡＩ−１遺伝子発現を制御するために再活性化されることを、最初に示した。Ｅ２Ｆ不活性化を逆にすることは、インシュリンによるＰＡＩ−１誘導を抑制する。従って、本発明のさらなる態様において、候補薬物の存在下でＥ２Ｆ活性についてアッセイすること、および候補薬物が存在しない場合と比較してＥ２Ｆ活性の増加を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連付けることを含む、糖尿症に対して有効な薬物のスクリーニング方法が提供される。Ｅ２Ｆ活性はＰＡＩ−１発現のモニタリングにより検出され、ＰＡＩ−１発現の減少がＥ２Ｆ活性の増加を反映する。しかしながら、Ｅ２Ｆ活性についてのアッセイ方法はこれに限られず、他の方法が例えば、Ｅ２Ｆ制御配列のコントロール下で発現されるマーカー遺伝子、またはＥ２Ｆに特異的な抗体を用いる上記の発現アッセイの修飾を用いることは、当該技術分野の通常の技術者には明らかである。しかしながら、ただ単にＥ２Ｆ発現を検出するよりむしろＥ２Ｆ活性（例えば、転写活性またはＤＮＡ結合活性）についてアッセイすることが好ましい。ここで、本発明者は、ＰＡＩ−１遺伝子が脂肪細胞においてＥ２Ｆ活性により制御され、Ｅ２Ｆが循環器疾患の様な糖尿病と関連する症状、ならびに糖尿病自体の処置の新たな標的を提供することを示した。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様において、Ｅ２Ｆ活性の増加は、例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、天然産物、抗体、または小有機分子を用いて、Ｅ２ＦとｐＲＢ（ポケット結合タンパク質）との相互作用を阻止することにより仲介される。従って、本発明により、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニング方法が提供され、該方法は、候補薬物の存在下でＥ２ＦとｐＲＢとの結合についてアッセイすること；および候補薬物が存在しない場合と比較して、当該結合の低下を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物の存在と関連づけることを含む。以下の実施例では、電気移動度シフトアッセイ（またはゲルシフトアッセイ；実施例２および３を参照）を用いて本発明の該態様を例示するが、他の技術も同じ目的のため容易に適用されることは、当該技術分野の通常の技術者には明らかである。例えば、１以上のタンパク質化合物が標識され（１より多くのタンパク質化合物が標識されるなら、必要に応じて別々に）、選択された標識化合物の遊離が通常通り高速大量処理フォーマットで検出される。または、相互作用部分の両方が標識され、両標識が近接すると（すなわち、両タンパク質部分が互いに結合する）蛍光の消光が起こるが、蛍光シグナルが一方のタンパク質部分の遊離（結合の低下）の際検出される状況下でアッセイされる。従って、該タンパク質は、マイクロタイタープレートまたはビーズのような個体支持体に固定化されてもよいし；またはビオチン、または放射性、蛍光、または化学発光群の様な１以上の同定可能なマーカーを有していてもよい。
【００２０】
本発明者は、ＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を用いた脂肪生成の経時分析において、ＰＡＩ−１  ｍＲＮＡレベルが細胞が脂肪細胞へと分化する時に増加し、インシュリンによるその誘導も増強されることを示した（実施例１参照）。細胞周期−制御転写因子Ｅ２Ｆ１（Ｅ２Ｆの主な成分）のタンパク質レベルは一定のままである。これは、終末まで分化した細胞中でＥ２Ｆが不活性であるという事実を反映する。電気移動度シフトアッセイによる核抽出物のＥ２Ｆ  ＤＮＡ−結合活性の解析は、ＤＮＡ−タンパク質複合体が高分子量形にシフトしたことを示した。これは、正常では終末分化に付随するＥ２Ｆ不活性化が、Ｅ２Ｆタンパク質レベルのダウンレギュレーションによっては引き起こされないが、別の因子であるｐＲＢの様なポケット結合タンパク質との相互作用により引き起こされることを示している（実施例２参照）。
【００２１】
本発明の１つの実施態様において、Ｅ２Ｆ１のｐＲＢ−結合領域に対応する合成ペプチドを用いて、Ｅ２ＦとｐＲＢとの相互作用を阻止し、電気移動度シフトアッセイで示される高分子量のＤＮＡ−結合複合体の形成を抑制する。ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質由来の細胞−貫通型ペプチドへの該ペプチドの結合（Schwarze, S. R., et al., 1999, Science 285(5433): 1569-72）により、該干渉ペプチドがそれが作用し得る細胞へ入ることを阻害する。該細胞−貫通型、干渉ペプチドでの脂肪細胞の処理は、ＰＡＩ−１  ｍＲＮＡのベースレベル、ならびにインシュリン誘導レベルを下げるが、対照の細胞−貫通型ペプチドは如何なる作用も示さない（実施例４参照）。
【００２２】
本明細書の実施例では終末まで分化した細胞として脂肪細胞を用いるが、本発明は、インシュリンＰＡＩ−１誘導が類似の機序によっても表されるか、あるいは他の遺伝子の実質的なＲｂ−Ｅ２Ｆ制御が所望される、他の細胞、特に、平滑筋細胞または肝細胞（これらに限らない）を含む終末まで分化した細胞でも適用される。それにもかかわらず、本発明のスクリーニングアッセイは特定の細胞に依存せず、実際には構成要素を用いて試験管内で行われる。
【００２３】
ＰＡＩ−１活性はαｖβ３インテグリン活性に影響すると考えられている（実施例６参照）。それゆえ、本発明のさらなる態様において、候補薬物の存在下でαｖβ３活性についてアッセイすること；および候補薬物が存在しない場合と比較してαｖβ３活性の増加を、糖尿病に対して有効な可能性のある薬物と関連付けることを含む、糖尿病に対して有効な薬物のスクリーニング方法が提供される。ＰＡＩ−１またはＥ２Ｆについて上で記載したものに類似のアッセイを含む、αｖβ３インテグリン活性についての如何なるアッセイも用いられ得る。例えば、αｖβ３インテグリン発現は、αｖβ３インテグリンに特異的な抗体、またはαｖβ３インテグリン制御配列のコントロール下で発現されるマーカー遺伝子を用いる上記の発現アッセイを用いて検出される。しかしながら、αｖβ３インテグリン活性への影響（例えば、ビトロネクチン結合の増加）についてか、またはＰＡＩ−１発現のモニタリングによりただ単に発現を検出するよりむしろαｖβ３インテグリン活性の増加を反映するＰＡＩ−１発現の減少についてアッセイすることが好ましい。
【００２４】
本発明は、本発明のスクリーニング方法のいずれか１つにより同定される薬物、および医薬品としてまたは薬剤の製造でのその使用も提供する。該薬物は、小有機分子、抗体（特にヒト化抗体）、ＰＡＩ−１に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの様な阻害性核酸である。ｓｉＲＮＡテクノロジーはＰＡＩ−１に特異的な配列に基づき日常的に利用され、そしてｓｉＲＮＡの標的発現は、脂肪組織に特異的なプロモーターの様な組織−特異的プロモーターを用いて達成される。抗体を用いて、タンパク質相互作用または活性をブロックするか、または活性を増強する。これは当該技術分野においてよく知られている。
【００２５】
従って、本発明は、本発明の活性薬物を含む医薬調製物を提供する。これにより、本発明は、本発明の方法で同定される薬物での興味ある疾病、異常または状態（特に糖尿病）の個体の処置方法を提供する。本発明者は、食後のインシュリン急上昇時にＰＡＩ−１誘導をコントロールすることが特に有益であると考えた。さらに、ＰＡＩ−１発現を減少させる（または、Ｅ２Ｆまたはαｖβ３インテグリン活性を増加させる）糖尿病に対して有効な薬物が、糖尿病の予防のため日常的に用いられ得る。
【００２６】
活性薬物は、医薬的に許容されかつ該活性薬物と相性の良い添加剤と、上記の治療方法での使用に適当な量で混合される。適当な添加剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールまたは同等のもの、およびその組合せであり、植物性油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびベンジルアルコール（点滴または液体調製物用）；およびワセリン、植物性油、動物性脂肪、およびポリエチレングリコール（外用調製物用）を含む。さらに所望なら、該組成物は、湿潤剤または乳化剤、等張剤、溶解促進剤、安定剤、着色剤、防腐剤、および同等の添加剤（従来通りの医薬調製物に対する補助添加剤）、ｐＨ緩衝剤、および有効成分の効果を増強する同等のものを含有する。
【００２７】
本発明の治療組成物は、その中に成分の医薬的に許容される塩を含む。医薬的に許容される塩は、例えば、塩酸またはリン酸の様な無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの様な有機酸と形成される酸添加塩（例えば、３アミノ基で形成される）を含む。遊離カルボキシ基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第２鉄の様な無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からもたらされる。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「医薬的に許容される」、「生理的に耐容性である」、およびその文法上のバリエーションは、組成物、担体、希釈剤、および試薬に言及する様に同義的に用いられ、該物質が吐き気、目まい、胃の不調などの様な望まない生理的な作用を提示することなく、対象（例えば、哺乳類）に投与可能であることを表す。
【００２９】
生理的に耐容性である担体は当該技術分野においてよく知られている。液体担体の例は、有効成分および水以外の物質は含有しないか、または生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムの様な緩衝液、生理食塩水、またはリン酸緩衝食塩水の様に両方を含有する、滅菌済み水溶液である。なおさらに、水溶液担体は、１以上の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムの様な塩、ブドウ糖、ポリエチレングリコール等を含有する。液体組成物は、水に加えてかつ水を除外して、液相を含有する。該追加液相の例は、グリセリン、綿実油の様な植物性油、および油中水滴型乳化剤である。
【００３０】
糖尿病に対して有効な薬物を含有する医薬組成物は、硬膜外、経口、経直腸、非経腸、経膣、腹腔内、局所（粉剤、軟膏、滴剤、または経皮貼付として）、頬側（bucally）、または経口または経鼻スプレー剤として投与される。「医薬的に許容される担体」により、毒性のない固体、半固体、または液体の添加剤、希釈剤、カプセル化剤、または任意の種類の成形補助剤を意味する（上記参照）。本明細書で用いられる用語「非経腸」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内注入および投与を含む投与方法を意味する。好ましくは、薬物は食物摂取を通じて経口投与される。
【００３１】
さらに本発明には、有効量の化合物でＰＡＩ−１活性を特異的に減少させる方法、ならびに有効量の化合物でＥ２Ｆ活性を特異的に増加させる方法も含まれる。該方法は、臨床ならびに予防目的に利用される。例えば、ＰＡＩ−１を減少させる（または、Ｅ２Ｆまたはαｖβ３インテグリンを増加させる）、本発明に記載の化合物の有効量で疾病を処置する方法が、本発明に含まれる。該疾病の例としては、肥満、２型糖尿病、循環器疾患、血栓症、アテローム性動脈硬化症（artherosclerosis）を含むが、これらに限られない。従って、好ましい実施態様において、本発明は、糖尿病または糖尿病の素因のある個体を処置する方法を提供し、該方法は、個体のＰＡＩ−１発現を減少させるのに十分な量で、ＰＡＩ−１発現を低下させる際に有効な薬物の医薬的有効量を個体に投与することを含む。該薬物は、Ｅ２Ｆまたはその活性フラグメントであってもよいが、ペプチド、抗体、または有機分子の様な個体のＥ２Ｆまたはαｖβ３インテグリン活性を増加させる薬物が好ましい。Ｅ２Ｆ活性は、例えば、ペプチド模倣物または阻害性抗体を用いてｐＲＢとＥ２Ｆとの結合を阻止することにより増加される。または、ＰＡＩ−１自体が、例えば、ｓｉＲＮＡテクノロジーを用いて標的とされる（ＥＰ１  １４４  ６２３）。
【００３２】
本発明は、本発明の方法によって同定される薬物、および上記の様な医薬的に許容される担体を含む組成物、ならびに本発明の１以上の医薬組成物を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。該容器に関しては、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により定められた形態による注意書が添付され得る。該注意書は、ヒト投与のための製造、使用、または販売についての当局による承認を反映するものである。該キットは必要に応じて、注入器、注射器等の様な組成物の投与の際に有用な器具を含む。
【００３３】
本発明は以下の実施例においてさらに記載されるが、これは例示的な目的のみである。
実施例１：ＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化
コンフルエントなＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＬ−１７３）をインシュリン、デキサメサゾン、およびイソブチルメチルキサンチンの混合物で処置することにより脂肪細胞へ分化誘導し、続いて別の培地へ変えた（Student, A. K. et al., 1980, J Biol Chem. 255:4745-4750）。要するに、ＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞（２×１０５細胞）を、６０ｍｍプラスチックディッシュ中で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した４ｍｌダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞がコンフルエントに至った２日後、培地を１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌインシュリン、１μＭデキサメサゾン、および０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチンを含有するＤＭＥＭに変えた。２日後、この培地を１０μｇ／ｍｌインシュリンのみ添加したＤＭＥＭで置き換えた。続いて２日後、この培地を回収し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで置き換え、その後細胞を２日毎に同じ培地で満たした。
【００３４】
脂肪細胞分化をオイルレッドＯでの脂質染色によりモニターした。要約すると、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド溶液で１時間固定した。ＰＢＳで２回洗浄後、細胞をオイルレッドＯ［０．５％ストック溶液（ｖ／ｖ、イソプロパノール中）の水中６０：４０（ｖ／ｖ）希釈］で１時間染色した。次に、細胞をＰＢＳで２回、そして水で２回洗浄した。脂質−陽性細胞が誘導の３日目に明らかとなり始め、８日目までに９０％より多くなった。脂肪細胞分化の別のマーカーであるＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）ｍＲＮＡも３日目に明らかになり始め、５日目までにプラトーに達した。ＲＮＡ分析のため、酸性グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム法で調製した総ＲＮＡ（１２μｇ）を、変性条件下でのアガロースゲル電気泳動で分離し、上記のナイロン膜に移した（ノーザンブロット）（Ziegler, A., et al., 1991, J Biol Chem 266(31): 21067-74）。当量のＲＮＡ添加し、そしてナイロン膜への移動をメチレンブルーでのｒＲＮＡ染色により確認した（Herrin, D. L. and G. W. Schmidt, 1988, Biotechniques 6(3): 196-7, 199-200）。プラスミド由来のＤＮＡインサートを、ランダムオリゴ開始反応を用いて｛α−３２Ｐ｝で標識した（Feinberg, A. P. and B. Vogelstein, 1983, Anal.Biochem., 132: 6-13）。特異的なＲＮＡレベルをMolecular Dynamic社のホスホイメージャーを用いて測定した。
【００３５】
ヒト、ラット、およびマウスＰＡＩ−１遺伝子は既に単離され、そのプロモーター配列が同定されている（Bosma, P.J., et al, 1988, J Biol Chem. 263:9129-41; Bruzdzinski, C.J. et al., 1990, J Biol Chem. 265: 2078-85; Loskutoff, D.J., et al, 1987, Biochemistry. 26:3763-68; Prendergast, G.C. et al., 1990, Mol Cell Biol. 10:1265-69）。５’−フランキング領域の比較により、隣接プロモーター（−９０から−２５）および遠位配列（−７５３から−５１２）と８０％より高い同一性の２つの高保存エレメントが明らかとなった。これら３種のＰＡＩ−１遺伝子の５’フランキング領域で検出される共通の特徴は、連続ＴＡＴＡボックス、およびＰＥＡ３、ＡＰＩ、ＣＴＦ／ＮＦ−１、およびＳｐｌ認識部位に密接に関係する配列である（Descheemaeker, K.A., et al., 1992, J Biol Chem. 267:15086-91;Johnson, M.R., et al., 1992, J Biol Chem. 267: 12202-10; Riccio, A., et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 2805-24）。
【００３６】
ＰＡＩ−１  ｍＲＮＡレベルは、細胞がコンフルエントとなり、脂肪細胞分化を始めた時には低かった。分化の異なるステージの細胞をインシュリンで処理すると、ＰＡＩ−１  ｍＲＮＡを、非常に低い程度で誘導するか（細胞がコンフルエントになる前）、または全く（細胞がコンフレントの時）誘導しないかであったが、終末まで分化した細胞（４および８日）では顕著に誘導した。
【００３７】
Ｅ２Ｆ１タンパク質のレベルを調べるために、６０ｍｍプラスチックディッシュの細胞をＰＢＳで洗浄し、４００μｌ溶解緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、１％Triton−Ｘ１００、１０％グリセロール、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイプチン、および１０ｍＭ  ＤＴＴ］（ジチオスレイトール）で回収した。試料（２０μｇのタンパク質）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、二フッ化ビニリデン樹脂膜にブロットし、Ｅ２Ｆ１、２、および３に対するポリクローナル抗体を用いて分析した。増強化学発光検出法（ＥＣＬ；Amersham）を利用し、該膜をKodak Biomax MRフィルムに露光した。Ｅ２Ｆ１タンパク質のレベルの調査により、細胞がコンフルエントに至った後増殖を止めるが、それは実験期間中一定であったことを示した。このことは、それが、脂肪細胞終末分化中ダウンレギュレートされるＥ２Ｆタンパク質のレベルではなく、Ｅ２Ｆ活性である可能性を生じる。このことと一致して、別のＥ２Ｆ１ファミリーメンバーのＥ２Ｆ２および３（我々がＰＡＩ−１プロモーターの負の制御因子であると示した（Koziczak, M., et al., 2000, Mol Cell Biol 20(6): 2014-22））の分析も、細胞が分化する際、全く減少しないことを示した；Ｅ２Ｆタンパク質レベルは増加し、そしてＥ２Ｆ３はＥ２Ｆ１同様一定のままであった。異なるステージの細胞由来の核抽出物を用いる電気移動度シフトアッセイによるＥ２Ｆ  ＤＮＡ−結合活性の測定（実施例２参照）は、分化−依存性の減少を示した。このことはＥ２Ｆの制御が転写後、おそらく翻訳後であることを示している（実施例４参照）。
【００３８】
実施例２：Ｅ２ＦのＤＮＡ結合パターンの変化
脂肪生成の間のＥ２Ｆ  ＤＮＡ−結合パターンの変化を調べた。核抽出物を、分化誘導中の異なる時間でＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１細胞から調製し、そのＥ２Ｆ  ＤＮＡ−結合活性を、アデノウイルスＥ２プロモーターの２つのタンデムＥ２Ｆ結合部位に対応する放射性Ｅ２ｐｒｏオリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡゲルシフトアッセイにより評価した。該オリゴヌクレオチドプローブを、Ｅ．ｃｏｌｉポリヌクレオチドキナーゼおよび｛γ−３２Ｐ｝ＡＴＰを用いて放射性標識した。電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）に用いた該オリゴヌクレオチドは以下である（上方鎖のみ示す）：Ｅ２ｐｒｏ（アデノウイルスＥ２プロモーターの−７２から−３２領域に対応する；Ｅ２Ｆ結合部位）、５’−ＡＴＣＡＧＴＴＴＴＣＧＣＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＡＧＧＧＣＧＣＧＡＡＡＣＴＡＧ−３’（配列番号：１）；ＣｙｃＤ１（サイクリンＤ１プロモーター由来のＥ２Ｆ結合部位）、５’−ＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＣＧＴＴＴＧＧＣＧＣＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：２）；ＣｙｃＤ１ｍ、５’−ＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＴＣＧＴＴＡＧＧＴＧＴＣＣＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：３、下線のヌクレオチドが変異）。核抽出物（４μｇ）をまず、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸］（ｐＨ７．９）、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、８％グリセロール、１μｇサケ精子ＤＮＡ、６μｇウシ血清アルブミン、および１ｍＭ  ＤＴＴからなる２０μｌの結合反応液中で、貫通型ペプチドおよび抗体ありまたはなしで１５分間室温でインキュベートし、続いて０．３ｎｇの放射性標識オリゴヌクレオチドプローブの添加後、さらに１５分間インキュベートした。一定分量（５μｌ）の反応混合液を、０．２５×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ）緩衝液中の４．５％ポリアクリルアミドゲル泳動で分離した。ゲルを乾燥させ、ホスホイメージャーを用いて分析した。
【００３９】
ゲルシフトアッセイで示す、アデノウイルスＥ２プロモーターのＥ２Ｆ部位への核タンパク質のＤＮＡ−結合パターンは、増殖−関連性の変化を示した。細胞がコンフルエントに達する前は、ＤＮＡ−タンパク質複合体は低分子量であったが、分化誘導の時間を経て高分子量形にシフトした。全てのＤＮＡ−タンパク質複合体は、サイクリンＤ１プロモーターのＥ２Ｆ−結合部位由来の特異的なオリゴヌクレオチド配列によっては競合されるが、変異型Ｅ２Ｆ−結合部位のオリゴヌクレオチドによっては競合されないため、特異的なものである。
【００４０】
実施例３：ｐＲＢ−Ｅ２Ｆ相互作用の阻害
脂肪細胞分化中のＤＮＡ−結合タンパク質複合体の高分子量形へのシフトは、低分子量形が遊離し、活性化Ｅ２Ｆおよび高分子量形が、可能なら網膜芽細胞腫タンパク質ｐＲＢとの巨大な複合体中の不活性化Ｅ２Ｆであることを示す（Helin, K., 1998, Curr Opin Genet Dev 8(1): 28-35; Nevins, J. R., 1998, Cell Growth Differ 9(8): 585-93）。従って、脂肪細胞でのＥ２Ｆ再活性化、そしてこれにより、可能なｐＲＢ−Ｅ２Ｆ複合体を阻止することによりＰＡＩ−１発現を調節するための可能性が検討される。生理学的に、ｐＲＢを、ｐ１３ＩＮＫおよびｐ１９ＡＲＦの様な低分子量の様々な阻害分子の負の制御下にあるｃｄｋ４／６が仲介するｐＲＢの過剰リン酸化を通じて、Ｅ２Ｆから分離できる。しかしながら、脂肪細胞でのＥ２Ｆの再活性化は明らかになっておらず、この実施例はｐＲＢ−Ｅ２Ｆ相互作用の物理的競合を示すことで本発明を例示する。
【００４１】
競合を、Ｅ２Ｆ１のｐＲＢ−結合領域に対応するＥ２Ｆ１のアミノ酸４０２〜４１９（Helin, K., et al., 1992, Cell 70(2): 337-50）に由来する配列の過剰量特異的ペプチド、または特異的ペプチドと同じアミノ酸組成だがランダムに入れ替えた配列の対照ペプチドを用いて、ＥＭＳＡ（実施例２参照）により調べた。放射性Ｅ２ｐｒｏオリゴヌクレオチドおよび８日目のＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１細胞由来の核抽出物を用いたＥＳＭにおいて、特異的干渉ペプチドを結合反応液に増加濃度で添加した。高分子量形のＤＮＡ−タンパク質複合体から低分子量型の複合体へのシフトが見られた。対照ペプチドでは何も見られなかった。これらの結果は、ｐＲＢとＥ２Ｆとの相互作用を干渉するために特異的ペプチドを使用することの実行可能性を示す。
【００４２】
結合ペプチドの細胞−貫通を可能にする１８アミノ酸長のＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の特異的領域を干渉ペプチドのアミノ末端に結合することにより、細胞貫通性を改善するために特異的ポリペプチドを修飾した（Schwarze, S. R., et al., 1999, Science 285(5433): 1569-72）。この長くした干渉ペプチドのＥ２Ｆへの作用を、まず上記の試験管内で評価した。アデノウイルスＥ２プロモーターのＥ２Ｆ−結合部位のＤＮＡ−結合複合体は、増加濃度で特異的な細胞貫通型ペプチドを結合混合液に加えると低分子量形にシフトしたが、対照細胞−貫通型ペプチドは何の作用も示さなかった。該結果は、干渉ペプチドのアミノ末端への１１アミノ酸の添加がＥ２Ｆ−ｐＲＢ複合体の分離能力には影響しないことを示す。続いて、ペプチドが試験管内でＥ２Ｆ−ｐＲＢ相互作用と干渉するかどうかを調べた。このため、まず脂肪細胞（誘導後８日）を異なる濃度の細胞−貫通型干渉ペプチドで１６時間処理し、核抽出物をＥＭＳＡによる分析のため調製した。細胞−貫通型干渉ペプチドはＤＮＡ−結合複合体を低分子量形にシフトしたが、対照ペプチドはしなかった。これらの結果は、特異的な細胞−貫通型ペプチドが実際に細胞を貫通し、Ｅ２Ｆ−ｐＲＢ複合体を遊離Ｅ２Ｆに変換することを示す。
【００４３】
実施例４：細胞−貫通型ペプチドのＰＡＩ−１  ｍＲＮＡレベルへの作用
実施例１で記載した結果は、脂肪細胞でＥ２Ｆを転写後制御することを示す。おそらくポケット−結合タンパク質ｐＲＢと複合体を形成したＥ２Ｆは不活性化状態である（実施例３参照）。Ｅ２Ｆを活性化するために、貫通型ペプチドシステム（Lindgren, M. et al., 2000, Trends Pharmacol Sci. 21:99-103）を用いてＥ２ＦからｐＲＢを分離した。従って、細胞−透過性ペプチドを構築した（興味あるペプチドを細胞−貫通型ペプチドのカルボキシ末端で結合した）。カルボキシ末端領域に位置するＥ２Ｆ１のｐＲＢ−結合領域は、１８アミノ酸長でありそして哺乳類種で保存されていると示した。該配列のペプチドを合成貫通型ペプチド（ＫＬＡＬ）４ＬＡ（配列番号：４；Oehlke, J. et al., 1998, Biochim Biophys Acta. 1414:127-139）に結合した。本実施例では、貫通型ペプチドにより脂肪細胞中のＥ２Ｆ−ｐＲＢ複合体を分離させることによりＥ２Ｆの再活性化を調べ、このことからＰＡＩ−１遺伝子発現のダウンレギュレーションを導くことができた。Ｅ２Ｆ１のｐＲＢ−結合領域に対応する１８ａａペプチド（Helin, K., et al., 1992, Cell 70(2): 337-50）をＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の細胞−貫通領域（４７〜５７ａａ）（Schwarze, S. R., et al., 1999, Science 285(5433): 1569-72）と結合させることで、細胞−貫通型ペプチドを調製した。対照として、同じ長さおよびアミノ酸組成だが入れ替えた配列のペプチドを結合した。貫通型ペプチドを培養液に加え、そして細胞を１６時間インキュベートし、続いて１０μｇ／ｍｌインシュリンありまたはなしで２時間インキュベートした。Ｅ２Ｆ活性およびＰＡＩ−１  ｍＲＮＡレベルを、電気移動度シフトアッセイ（実施例２参照）およびノーザンブロットハイブリダイゼーション（実施例１参照）によりそれぞれ測定した。貫通型特異的ペプチドが、ベースおよびインシュリン−誘導ＰＡＩ−１  ｍＲＮＡレベルを下げることを示し、後になるほど可能性のある作用をし、該作用は最適には３０μＭに達した。対照貫通型ペプチドはなんの作用も示さなかった。
【００４４】
実施例５：ベースレベル、またはインシュリン、ＴＮＦαまたはグルコースでの誘導後のＰＡＩ−１遺伝子発現を増強するＰ１３Ｋ経路の阻害
ＳｈｃおよびＰ１３Ｋを含むインシュリン−誘導性シグナル伝達経路を独立して阻害した。Ｐ１３Ｋ活性をワートマニンにより特異的に阻害し（Kanai, F. et al., 1993, Biochem Biophys Res Commun. 195:762-768）、ＡＰ１のＳｈｃ−仲介性活性化をＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９により阻害した（Servant, M. J. et al., 1996, J Biol Chem. 271:16047-16052）。本実施例において、脂肪細胞を該阻害剤の存在下または非存在下でインシュリンで処理し、続いてＰＡＩ−１発現を調べた（例えば、ノーザンブロット分析により；実施例１参照）。Ｐ１３Ｋ阻害剤の存在下で、インシュリンによるＰＡＩ−１誘導を増強する一方で、ＭＥＫ１阻害剤の存在下ではインシュリンによるＰＡＩ−１誘導を抑制せず、このことはインシュリンが脂肪細胞中のＰＡＩ−１プロモーターへの正および負のシグナル両方を発揮することを示している。または、グルコースおよびＴＮＦαを、ＰＡＩ−１遺伝子の可能性のある正のシグナルとして調べた（Chen, Y. Q. et al., 1998, J. Biol. Chem., 273, 8225-8231; or Samad, F., et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 37-46に記載）。
【００４５】
実施例６：Ｐ１３Ｋのインシュリン誘導活性である、αｖβ３インテグリンの活性化／不活性化
αｖβ３インテグリンを、活性化モノクローナル抗体ＬＭ６０９（Charo, I. F. et al., 1990, J Cell Biol. 111:2795-2800）またはヘビ毒素エキスタチンＡ（Fisher, J. E. et al., 1993, Endocrinology. 132:1411-1413）をそれぞれ用いて、活性化または阻害する。ビトロネクチン−コートディッシュ上の脂肪細胞を該試薬の存在下または非存在下のインシュリンで処理する。Ｐ１３Ｋ仲介性グルコース取り込みへの該試薬の作用を、インシュリン仲介性シグナル伝達でのαｖβ３の関与を確立するために調べる。グルコース取り込みを｛３Ｈ｝−標識２−デオキシグルコースを用いて測定した（Standaert, M. L. et al., 1997, J Biol Chem. 272:30075-30082）。ＩＲＳ−１のインシュリン誘導チロシンリン酸化およびＰ１３Ｋの活性化への該試薬の作用を評価した。インシュリン誘導グルコース取り込みをＬＭ６０６が増強し、エキスタチンＡが抑制する。これは、ＰＡＩ−１がαｖβ３インテグリン機能の調節を通じてインシュリン抵抗性の原因となることを示す。
【００４６】
実施例７：肥満とＮＩＤＤＭの関連；ＰＡＩ−１ノックアウト肥満マウスで増強されるインシュリン誘導グルコース取り込み
ＰＡＩ−１ノックアウトマウス（Carmeliet, P. et al., 1995, Ann N Y Acad Sci. 748:367-381; discussion 381-382）または正常マウスを肥満−高血糖マウス（ｏｂ／ｏｂ）と交雑し、（ＰＡＩ−１＋／＋、ｏｂ／ｏｂ）および（ＰＡＩ−１−／−、ｏｂ／ｏｂ）マウスの脂肪細胞のグルコース取り込み力を生体内および試験管内で調べた。インシュリン誘導グルコース取り込みは、ＰＡＩ−１＋／＋、ｏｂ／ｏｂマウスよりＰＡＩ−１−／−、ｏｂ／ｏｂマウスで高く、このことはＰＡＩ−１がＮＩＤＤＭのインシュリン抵抗性の原因となることを示す。
【００４７】
本明細書で引用された全引例、ならびに２００１年１２月１４日に出願の優先権主張出願ＧＢ０１３０００７．８は、個々に言及された様に引用により本明細書に取り込まれる。
【配列表】
2005512546.tif 000002
2005512546.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月12日(2004.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005512546000001.app
【国際調査報告】
2005512546.tif 000004
2005512546.tif 000005
2005512546.tif 000006
2005512546.tif 000007
2005512546.tif 000008