(57)【要約】本発明は、FtsZタンパク質の同族体をコードする卵菌類から単離された遺伝子に関する。本発明は、正常な増殖及び発生に関する遺伝子の必要性に基づく新しい抗微生物薬を発見するためのそれらのタンパク質を使用した方法を含む。本発明は、見込みのある抗微生物薬である阻害物質を同定するためのスクリーニング・アッセイに使用されることもできる。これらの抗微生物薬は、作物と種子の卵菌類の増殖を抑制する方法に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
a)卵菌類FtsZ-mtタンパク質の少なくとも一部に実質的に類似するポリペプチドと、上記ポリペプチドに結合する能力について試験される化合物とを、上記結合を誘導する条件下で混合し、
b)上記ポリペプチドに結合することができるステップ(a)の化合物を選択し、
c)ステップ(b)の化合物を微生物に適用して、抗菌活性を試験し、そして
d)抗菌活性を有するステップ(c)の化合物を選択する、
を含む抗菌活性を有する化合物の同定方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号5又は配列番号9のいずれか1つの配列の少なくとも一部に実質的に類似しているか又は同一であるヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子によってコードされる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4又は配列番号10のいずれか1つのアミノ酸配列に実質的に類似しているか又は同一である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
ステップ(c)における微生物が卵菌類である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記卵菌類がフィトフトラ・インフェスタンスである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
以下のステップ：
a)卵菌類FtsZ-mtタンパク質の少なくとも一部に実質的に類似するポリペプチドと、上記FtsZ-mtタンパク質の活性を阻害する能力について試験される化合物とを、上記阻害を誘導する条件下で混合し、
b)上記FtsZ-mtタンパク質を阻害することができるステップ(a)の化合物を選択し、
c)ステップ(b)の化合物を微生物に適用して、抗菌活性を試験し、そして
d)抗菌活性を有するステップ(c)の化合物を選択する、
を含む抗菌活性を有するFtsZ-mtタンパク質阻害物質の同定方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号5又は配列番号9のいずれか1つの配列の少なくとも一部に実質的に類似しているか又は同一であるヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子によってコードされる、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4又は配列番号10のいずれか1つのアミノ酸配列に実質的に類似しているか又は同一である、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が卵菌類である、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
前記卵菌類がフィトフトラ・インフェスタンスである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
卵菌類から得られたミトコンドリアFtsZタンパク質の少なくとも一部をコードする単離された核酸。
【請求項１２】
前記卵菌類がフィトフトラ・インフェスタンスである、請求項11に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
配列番号1、配列番号3、配列番号5及び配列番号9から成る群から選ばれる配列の少なくとも一部を含む、請求項11に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
配列番号1、配列番号3、配列番号5及び配列番号9から成る群から選ばれる配列の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズしうる単離された核酸であって、ここで、ハイブリダイゼーションを、所定の時間にわたり7%のドデシル硫酸ナトリウム、0.5 MのNaPO4、1 mMのEDTA中、50℃で行い、その後2×SSC、0.1%のドデシル硫酸ナトリウム中、50℃で洗浄する上記単離された核酸。
【請求項１５】
配列番号1、配列番号3、配列番号5及び配列番号9から成る群から選ばれるポリヌクレオチド配列の少なくとも一部と少なくとも約65%の配列同一性をもつ領域を有する単離された核酸。
【請求項１６】
配列番号2、配列番号4及び配列番号10から成る群から選ばれるアミノ酸配列の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１７】
配列番号2、配列番号4及び配列番号10から成る群から選ばれるアミノ酸配列の少なくとも一部を含む単離されたペプチド。
【請求項１８】
以下のステップ：
a)卵菌類FtsZ-mtタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドにより好適な宿主細胞を形質転換し；
b)上記細胞が上記単離されたポリヌクレオチドを発現する条件下で上記宿主細胞を培養し；そして
c)上記卵菌類FtsZ-mtタンパク質を回収する、
を含むFtsZ-mtタンパク質の製造方法。
【請求項１９】
前記単離されたポリヌクレオチドが、配列番号1、配列番号3、配列番号5及び配列番号9から成る群から選ばれる配列を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
以下のステップ：
a)FtsZ-mtタンパク質の3次元構造を予測し；
b)FtsZ-cpタンパク質の3次元構造を予測し；そして
c)コンピュータ・モデルを使って、FtsZ-mtタンパク質の見込みのある阻害物質として、FtsZ-mtタンパク質に結合するが、しかしFtsZ-cpタンパク質には結合しない分子を同定する、
を含むFtsZ-cpタンパク質を阻害しないFtsZ-mtタンパク質の見込みのある阻害物質を同定するための仮想スクリーニング方法。
【請求項２１】
前記FtsZ-mtタンパク質が卵菌類FtsZ-mtタンパク質である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記卵菌類がフィトフトラ・インフェスタンスである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記FtsZ-cpタンパク質が、タバコFtsZ-cpタンパク質又はシロイヌナズナFtsZ-cpタンパク質である、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
前記FtsZ-mtタンパク質が、配列番号2、配列番号4及び配列番号10から成る群から選ばれる配列の少なくとも20のアミノ酸を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
前記FtsZ-mtタンパク質が、配列番号2、配列番号4及び配列番号10から成る群から選ばれる配列を含む、請求項24に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗微生物薬分野、そしてより特に、卵菌類(綱)とα-プロテオバクテリアに対して特効性のある抗微生物薬を得るためのスクリーニング法のターゲットとしてのFtsZタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
卵菌類(綱)
卵菌門は、周囲を囲む水又は土から食物を吸収することによって、あるいはそこで流動物を栄養源とするために他の生体に侵入することによってそれらの栄養を得る糸状原生生物である。いわゆる水生菌類及びべと病を含めた、500以上の種が卵菌門の中に存在する。このような卵菌類(綱)は、腐りかけた物質の分解と再利用において重要な役割を担っている。寄生性の種は、農作物又は魚を壊滅させることによってヒトの活動に支障を与える。
【０００３】
「卵菌門」は、「卵型のカビ」を意味し、それは、大きな丸い卵原細胞、又は雌の配偶子を含む構造を指す。卵菌類(綱)は異形配偶子をもち、卵と呼ばれる大きな非運動性の配偶子と、精子と呼ばれる小さい配偶子を生み出す。卵菌門は非常にわずかな化石記録をもっている。可能性がある卵菌類は、白亜紀の琥珀から発見された。
【０００４】
それらの糸状成長のため、そしてカビがそうするように、それらが腐りかけた物質を食べるので、卵菌門はかつてカビに分類されていた。しかし、卵菌類(綱)の細胞壁は、カビのようにキチン質からは構成されておらず、代わりにセルロース化合物とグリカンの混成物で作られている。他の異なる性質は、フィラメント内の核が、カビのように半数体ではなく、2セットの遺伝情報をもつ二倍体であることである。
【０００５】
これらの生体の限外構造、生化学、及び分子配列は、それらがクロミスタに属していることを示す。１本がマスチゴネマをもつ2本の異なる鞭毛、そしてケルプと珪藻で見つかったものと類似したエネルギー貯蔵分子である化学物質ミコラミナリン(mycolaminarin)の存在といった、クトミスト(chromists)に共通の特徴をもつ自由遊泳性芽胞が生み出される。このように、有機栄養クロミストとして知られている分類学上の少数派に属すると卵菌類(綱)は分類される。
【０００６】
菌類又は水生菌類とも呼ばれる、いくつかの卵菌類(綱)は、他の生体への寄生生物である。水生菌類は、魚の鱗又は卵、あるいは両生類の皮膚で増殖する。水生菌類であるミズカビ(Saprolegnia)は、多くの場合、水族館か養魚場における場面、あるいは産卵のために上流にのぼるサケのような高い個体群密度といった、水がよどんでいるときに問題となる魚の病変を引き起こす。ミズカビは、広い表面積を傷つけ、急速に広がることができる。これらの感染症は、処置が困難であるかもしれない。他の種類のミズカビは、ワムシ、線虫、及び節足動物のような水生無脊椎動物と珪藻に寄生する。
【０００７】
しかし、ヒトへのそれら最大の影響は、顕花植物の寄生生物である多くの種類の卵菌類から生じる。これらは、根を腐らす病卵菌類(綱)、苗木を枯らす菌類、瘤病、白サビ病アルブゴ(Albugo)、並びにブドウ、レタス、トウモロコシ、キャベツ、及び多くの他の作物に影響するべと病を含んでいる。これらの病気を引き起こす卵菌類(綱)の2つが、世界の歴史に重要な影響をもっていた。
【０００８】
これらで最初のものは、ジャガイモの葉枯れ病を引き起こす菌体、フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)である。ジャガイモは南アメリカに固有であったが、しかし、16世紀の終わりにヨーロッパに持ち込まれた後に、急速に主要な食物農作物になった。葉枯れ病は、そのずっとあとまで大西洋をわたりその宿主植物についてこなかった。病原生物は茎葉組織の中で成長して死を引き起こし、同様に塊茎にはびこることもある。病気は涼しく、湿っぽい条件下で急速に広がり、それらは西ヨーロッパに流行した。1つの有名なケースにおいて、1846年の夏の間のたった1週間でこの病気は、ジャガイモが貧しい人の主食だったアイルランドのジャガイモ収穫高のほとんど全てを死滅させた。このフィトフトラ胴枯れ病は、アイルランドのほぼ100万人の住人の死をもたらし、そして他の国々にさらに150万の移民を引き起こした。他の種類のフィトフトラは、ユーカリ、アボカド、パイナップル、及び他の熱帯の作物を死滅させる。化学薬品が卵菌類感染症と戦うために開発される一方で、有効な化学薬品の禁止に併せて化学薬品抵抗性の菌株の出現が、現在深刻な問題であるP.インフェスタンスの流行の発生をもたらした。
【０００９】
最近の歴史に重大な影響を与えた他の卵菌類は、プラスモパラ・ビチコラ(Plasmopara viticola)のブドウべと病である。北米に固有であったが、しかし1870年代の終わり偶然ヨーロッパに持ち込まれた。当時、フランスのワイン業界は大規模なアブラムシ感染に影響され、そのためかれら自身のブドウにそれらを品種改良するためにアメリカから抵抗性のつる植物株を持って来た。これらのアメリカの株が着いたとき、アメリカのつる植物は、べと病をももたらし、それはほとんど全てのフランスのワイン業界を一掃した。前記業界は、石灰と硫酸銅の混合液であるボルドー液の偶然の発見によって救われた。その液は、植物の葉に適用される場合にその病気を抑制下に置く。この発見は、最初に知られた抗真菌薬としても重要であり、かつ、実際に植物の病気を抑制するために使われた最初の化学薬品である。しかし、ボルドー液は、多くの他の生物にとって危険である。
【００１０】
現在の問題は、これまで知られていない種類のフィトフトラによって引き起こされるオーク突然死症候群である。1995年に最初に観察されて、5年以内にこの植物病原菌による寄生生物侵襲が、タンオーク、海岸リブオーク、及び黒オークに伝染してカリフォルニア海岸沿いの350マイルに広がった。いくつかの地域で、樹木の80%程が感染した。最も猛烈に襲われている地域の1つであるマリン郡では非常緊急事態が宣言された。このフィトフトラ種と戦うための、有効であって、環境に安全な手段は、決定されていない。
【００１１】
この病気は、オークだけでなく、これらの樹木からの葉及びドングリに頼る何千もの動物種にも影響を与え、並びに死滅した木の急速な蓄積によってもたらされる火災の危険性を増やす。
【００１２】
FtsZタンパク質
FtsZ(温度感受性株Zの糸状化にちなんで名づけられた)は、真正細菌と古細菌に遍在する40kDaのタンパク質である。細菌の細胞分裂タンパク質FtsZは、細菌の細胞分裂機構の主要成分である。FtsZと緑色蛍光性のタンパク質との融解構成物は、分裂の発現でFtsZが細胞分裂領域で糸状リングを形成し、そして中隔形成が完了した後に分解されることを示した。FtsZは、曲がった端をもつ長い細糸のいかだ状に、並びにシート及びリングに自己集合することができる。FtsZに関する細胞骨格の役割は、インビトロにおけるGTP依存性重合を受ける能力、及びそのチューブリンとの類似に基づいて仮定されている。細菌のFtsZは、限定された配列同一性をチューブリンと共有し、これらの細糸の軸上の繰り返しは、プロトフィラメントのチューブリンモノマーのそれと同じくおよそ40Åである。FtsZの構造は超好熱性メタン生成微生物であるメタノコッカス・ジャナスチイ(Methanococcus jannaschii)由来のFtsZ1タンパク質から得られた結晶を使ったX線結晶解析によって解析された。2.8Åに精製されたモデルは、GDPの分子を含んでいる。
【００１３】
最近まで、唯一知られていた真核生物のFtsZsは、植物中の葉緑体のFtsZs(FtsZ-cp)だった。高等植物で、FtsZタンパク質は色素体の分割に関係しているが、しかし、色素体分裂機構へのその関与についてわずかな情報しかない。数種類の原核生物及び真核生物のFtsZタンパク質の比較は、6つの高度に保存されたドメインがFtsZの核となる領域中にあることを示す。系統発生の解析は、FtsZが色素体分裂に係わっているという現在の合意を支持して、シアニジウム・カルダリウム(Cyanidium caldarium)RK-1及び他の真核生物のFtsZ遺伝子がシアノバクテリアFtsZ遺伝子の子孫であることを示す。C.カルダリウムにおけるFtsZをコードして遺伝子(FtsZ遺伝子)の発現研究は、FtsZ遺伝子が色素体分裂の直前に転写されることを示した。シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)から単離された原核生物FtsZは、GTP結合にとって重要な、FtsZタンパク質とチューブリンの間で保存されているグリシン-リッチなチューブリン・サイン・モチーフを含み、さらに真核生物のFtsZタンパク質がチューブリンのそれと類似した細胞骨格の役割を持っているかもしれないという示唆を支持する(米国特許番号第5,981,836号)。
【００１４】
動物、植物及び真菌類のような真核生物の主なグループのミトコンドリアの分裂が、非FtsZ機構によって仲介される。それぞれのゲノムが完全に配列決定されている酵母又は線虫にFtsZ遺伝子は存在しない。有色植物藻のFtsZ(FtsZ-mt)のミトコンドリア形態の最近の発見(Beech et al.,(2000) Science 287：1276-1279)は、真核生物の主要な群と異なる原始的な真核生物でFtsZ-mtがミトコンドリアの分裂のために必要とされることを強く示唆する。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、抗菌活性をもつ化合物を同定し、使用する方法、抗FtsZ活性がある化合物を同定し、使用する方法、微生物の成長を抑制する方法、農作物改良方法、FtsZ-mtタンパク質の生産方法、FtsZ-cpタンパク質を抑制しないFtsZ-mtタンパク質の可能性がある阻害物質を同定するための仮想スクリーニングのために使用する方法、並びに卵菌類病原菌の感染した魚の治療方法に向けられる。
【００１６】
本発明の態様は、本発明の方法によって同定された抗菌活性を持っている化合物を同定する方法を提供し、上記方法は、結合を導く条件下、卵菌類FtsZ-mtタンパク質をコードしているアミノ酸配列を含んでいるポリペプチド又はタンパク質の少なくとも1つの部分で、FtsZ-mtタンパク質にか又はそのポリペプチドに結合する能力について試験される化合物とを混合し、FtsZ-mtタンパク質又はポリペプチドに結合することができるとして同定されるような化合物を選別し、選ばれた化合物を微生物に利用して抗菌活性の検査をし、そして抗菌活性がある選択された化合物を選ぶことによる。これらの方法は、配列番号1又は配列番号3又は配列番号5又は配列番号9の配列に実質的に相似なヌクレオチド配列をもつ単離されたDNA分子によってコードされたFtsZ-mtタンパク質を用いて実施されうる。これらの方法は、配列番号2又は配列番号4又は配列番号10のアミノ酸配列をコードする単離されたDNA分子によってコードされたFtsZ-mtタンパク質を使ってが実施されうる。1の態様において、微生物は、卵菌類、例えばフィトフトラ・インフェスタンスである。本発明のさらなる側面は、抗菌活性がある化合物を同定するための本発明の方法を実施することによって同定された化合物である。
【００１７】
本発明の態様は、FtsZ-mtタンパク質又はその一部を、FtsZ-mtタンパク質にか又はその活性領域の活性を阻害する能力について試験される化合物とを、そのような結合を導く条件下で混合し、上記FtsZ-mtタンパク質の活性を抑制することができるとして同定されるような化合物を選別し、上記FtsZ-mt活性を抑制することができるとして同定された化合物を微生物に利用して抗菌活性の検査をし、そして抗菌活性がある選択された化合物を選ぶことによる、抗菌活性をもつFtsZ-mt活性の阻害物質を同定するための方法を提供する。抗菌活性をもつFtsZ-mt活性阻害物質の同定のための本発明の方法は、配列番号1又は配列番号3又は配列番号5又は配列番号9の配列と実質的に類似のヌクレオチド配列をもつ単離されたDNA分子によりコードされたFtsZ-mtタンパク質の少なくとも一部又は実質的に類似のポリペプチドを使って実施される。抗菌活性をもつFtsZ-mt活性の阻害物質の同定のための本発明の方法は、FtsZ-mtタンパク質かその一部、あるいは配列番号2又は配列番号4又は配列番号10の少なくとも1部と実質的に類似しているか又は同じアミノ酸配列をコードする単離されたDNA分子によりコードされる、実質的に類似のポリペプチドを使って実施されうる。抗菌活性をもつFtsZ-mt活性の阻害物質を同定するための方法の1の態様において、微生物は、卵菌類、例えばフィトフトラ・インフェスタンスである。本発明のさらなる側面は、抗菌活性をもつFtsZ-mt活性の阻害物質を同定するための本発明の方法によって同定された化合物である。
【００１８】
本発明の態様は、例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号5又は配列番号9から選ばれたポリヌクレオチドと実質的に類似しているヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含む卵菌類FtsZ-mtタンパク質の活性を抑える化合物を、卵菌類の成長を抑制するのに十分な量で卵菌類に利用することによって卵菌類の成長を抑制する方法をさらに提供する。
【００１９】
本発明の態様は、本発明の方法により決定される抗菌活性をもつ化合物を植物、植物の一部、植物種子、又は周囲の土に適用することによる農作物の改良方法を提供する。ここで、前記化合物は、顕著に植物又は植物種子の成長を抑制することなく少なくとも1の微生物分類群の微生物の成長を抑える量で適用される。他の目的は、本発明の方法により決定される抗菌活性をもつFtsZ-mtの阻害物質を植物、植物の一部、植物種子、又は周囲の土に適用することによる農作物の改良方法を提供する。ここで、前記化合物は、顕著に植物又は植物種子の成長を抑制することなく少なくとも1の微生物分類群の微生物の成長を抑える量で適用される。本発明による農作物の改良方法のさらなる側面は、様々な分類群の微生物、例えば、ラゲナ(Lagena)、ペロノフィトラ(Peronophythora)、トラキスフェエラ(Trachysphaera)、ピチウム(Pythium)、フィトフトラ(Phytophora)、アルブゴ(Albugo)、ペロノスポラ(Peronospora)、プラスモポラ(Plasmopora)、プソイドペロノスポラ(Pseudoperonospora)、ブレミア(Bremia)、ブレミラ(Bremiella)、バシジオホラ(Basidiophora)などを含む。本発明による農作物の改良方法のよりさらなる側面は、あらゆる農作物植物、例えばジャガイモ、トマト、タバコ、オーク、コーヒーベリー(Rhamnus種)、カボチャ、綿、モロコシ、エンドウ、タマネギ、メロン、キュウリ、エンドウ、ビート、スイカ、トウガラシ、ポート・オーフォード・シダー、タロイモ、リンゴ、アブラナ種、サツマイモ(Ipomea)、ホウレンソウ、豆、ブドウのつる、ヒマワリ、ホップ、レタス、スミレ、アスター、大豆、及びトウモロコシ、米、大麦、小麦、ライ麦などを含む穀類などの治療を含んでいる。
【００２０】
本発明の態様は、卵菌類から得られたミトコンドリアFtsZタンパク質をコードする単離されたDNA分子を提供する。1の態様において、単離されたDNA分子はフィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)から得られる。他の態様において、卵菌類から得られた単離されたDNA分子は、配列番号1又は配列番号3又は配列番号5又は配列番号9の配列をもつ。
【００２１】
本発明の態様は、例えば配列番号1、配列番号3、配列番号5又は配列番号9から選ばれる配列をもつポリヌクレオチドにハイブリダイズしうる単離されたDNA分子を提供する。ここで、前記ハイブリダイゼーションは、所定の時間50℃で、7%のドデシル硫酸ナトリウム、0.5 M NaPO4、1 M EDTA中で行い、続いて50℃で2×SSC、0.1%のドデシル硫酸ナトリウム中で洗浄する。本発明のさらなる側面は、例えば配列番号1又は配列番号3又は配列番号5又は配列番号9のポリヌクレオチド配列と少なくとも65%の配列同一性をもつ単離されたDNA分子を提供する。
【００２２】
本発明の他の側面は、例えば配列番号2、配列番号4又は配列番号10から選ばれたアミノ酸配列をもつペプチドをコードする単離されたDNA分子を提供する。本発明のさらなる側面は、例えば配列番号2、配列番号4又は配列番号10の配列をもつ単離されたペプチドを提供する。
【００２３】
本発明の態様は、卵菌類FtsZ-mtタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む構築物により適当な宿主細胞を形質転換し、細胞が上記単離されたポリヌクレオチドを発現する条件下で上記宿主細胞を培養して、そして卵菌類FtsZ-mtタンパク質を回収することにより少なくとも1のFtsZ-mtタンパク質を製造する方法を提供する。これらの方法の態様は、卵菌類FtsZ-mtタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより適当な宿主細胞を形質転換することによってFtsZ-mtタンパク質を製造することを含む。様々な態様において、単離されたポリヌクレオチドは、例えば配列番号1、配列番号3、配列番号5又は配列番号9から選ばれた配列をもつ。
【００２４】
本発明の態様は、FtsZ-cpタンパク質を抑制しないFtsZ-mtタンパク質に対する見込みのある阻害物質を同定するための仮想スクリーニングを使用する方法をさらに提供し、この方法は、FtsZ-mtタンパク質の3次元構造を予測して、FtsZ-cpタンパク質の3次元構造を予測して、そしてFtsZ-mtタンパク質に対する見込みのある阻害物質として、FtsZ-mtタンパク質に結合するがFtsZ-cpタンパク質に結合しない分子を同定するためにコンピュータ・モデルを使用することによる。いくつかの態様において、前記FtsZ-mtタンパク質は卵菌類FtsZ-mtタンパク質である。好ましくは、卵菌類はフィトフトラ属に属している。より更に好ましくは、卵菌類はフィトフトラ・インフェスタンスである。好ましくは、前記FtsZ-mtタンパク質は、配列番号2、配列番号4又は配列番号10のいずれかの配列の少なくとも約20のアミノ酸をもつ。同様に好ましくは、FtsZ-mtタンパク質は、配列番号2、配列番号4又は配列番号10のいずれかから選ばれた配列をもつ。他の側面は、本発明によるFtsZ-cpタンパク質を抑制しないFtsZ-mtタンパク質に対する見込みのある阻害物質を同定するための仮想スクリーニングを使用する方法によって同定されたFtsZ-mtタンパク質の阻害物質である。他の態様において、タバコFtsZ-cpタンパク質が使われうる。さらに別の態様において、シロイヌナズナFtsZ-cpタンパク質が使われうる。
【００２５】
本発明の態様は、卵菌類の成長を抑える抗微生物薬を提供し、上記抗微生物薬は卵菌類のFtsZ-mtタンパク質に影響する。本発明の態様は、抗菌活性をもつ化合物を同定するための本発明の方法によって同定された化合物の適用によって卵菌類病原菌に感染した魚の治療方法を提供する、ここで上記の本発明の方法は、結合を誘導する条件下で卵菌類FtsZ-mtタンパク質の少なくとも一部に実質的に類似したポリペプチドをFtsZ-mtタンパク質に結合する能力について試験する化合物と組み合わせ、それにより同定されたFtsZ-mtタンパク質に結合ことができる化合物を選択し、抗菌活性について試験するために選ばれた化合物を微生物に適用し、次に抗菌活性をもつ化合物を選ぶスッテップを含むことができる。好ましくは、前記卵菌類病原菌はミズカビ属(Saprolegnia)に属している。
【００２６】
本発明の態様は、抗菌活性をもつFtsZ-mt活性の阻害物質を同定するための本発明の方法によって同定された化合物の適用によって卵菌類病原菌に感染した魚の治療方法を提供し、上記本発明の方法は、FtsZ-mtタンパク質とFtsZ-mtタンパク質の活性を抑える能力について試験される化合物を抑制作用を誘導する条件下で組み合わせ、それにより上記FtsZ-mt活性抑えることができると同定された化合物を選び、抗菌活性について試験するために上記FtsZ-mt活性抑えることができると同定された化合物を微生物に適用し、そして抗菌活性をもつ化合物を選ぶことによる。好ましくは、前記卵菌類病原菌はミズカビ属である。
【００２７】
本発明及び先行技術を上回って成し遂げられた利点を要約する目的で、本発明の特定の目的及び利点を記載した。当然、全ての前記目的又は利点が本発明のいずれか特定の実施例によっても達成されうると限らないことは理解されるべきである。従って、例えば当業者は、本発明が必ずしも他の目的を達成することなく本明細書中に教示される1つの利点又は利点の群、あるいは本明細書中に教示されるか又は提案される利点を達成するか又は最大限に利用するやり方で具体化されるか又は実行されることを認識する。
本願本発明のさらなる側面、機能及び利点は、以下の好ましい態様の詳細な説明から明らかになる。
【００２８】
配列表の簡単な説明
配列番号1    フィトフトラ・インフェスタンスFtsZ-mt1 CDS
配列番号2    フィトフトラ・インフェスタンスFtsZ-mt1アミノ酸配列
配列番号3    フィトフトラ・インフェスタンスFtsZ-mt2 CDS
配列番号4    フィトフトラ・インフェスタンスFtsZ-mt2アミノ酸配列
配列番号5    フィトフトラ・インフェスタンスFtsZ-mt2ゲノムDNA
配列番号6    PCRプライマー
配列番号7    PCRプライマー
配列番号8    PCRプライマー
配列番号9    フィトフトラ・インフェスタンスFtsZ-mt2の完全なCDS
配列番号10   フィトフトラ・インフェスタンスFtsZ-mt2の完全なアミノ酸配列
【００２９】
配列番号11   アグロバクテリウム・チュメファシエンスFtsZアミノ酸配列、ジーンバンク登録番号O30992
配列番号12   シノリゾビウム・メリロチ(Sinorhizobium meliloti)FtsZアミノ酸配列、ジーンバンク登録番号P30327
配列番号13   バルトネラ・クラリドゲイア(Bartonella clarridgeiae)FtsZアミノ酸配列、ジーンバンク登録番号AAD31718
配列番号14   リケッチア・プロワツェキィイ(Rickettsia prowazekii)FtsZアミノ酸配列、ジーンバンク登録番号Q9ZCQ3
配列番号15   カウロバクター・クレズセンツス(Caulobacter crescentus）FtsZアミノ酸配列、ジーンバンク登録番号P52976
配列番号16   シアニジオスキゾ・メロラ(Cyanidioschyzon merolae)FtsZ (mt)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号BAA85115
配列番号17   マロモナス・スプレンデンス(Mallomonas splendens)FtsZ (mt)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号AAF35432
配列番号18   セイヨウハルリンドウ(Gentiana lutea)FtsZ(cp)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号T51088
配列番号19   タバコ(Nicotiana tabacum)FtsZ(cp、2-1)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号T51087
配列番号20   シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)FtsZ(cp,2-1)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号T49028
【００３０】
配列番号21   ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)FtsZ(cp,1)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号T51089
【００３１】
配列番号22   ヒメツリガネゴケFtsZ(cp,2)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号T51090
配列番号23   ギラルディア・シータ(Guillardia theta)FtsZ(cp)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号CAB40398
配列番号24   マロモナス・スプレンデンス(Mallomonas splendens)FtsZ(cp)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号AAF35433
配列番号25   アナベナPCC7120(Anabaena PCC7120) FtsZアミノ酸配列、ジーンバンク登録番号CAA83241
配列番号26   シネコシスチスPCC6803(Synechocystis PCC6803)FtsZアミノ酸配列、ジーンバンク登録番号P73456
配列番号27   シロイヌナズナFtsZ(cp,1-1)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号Q42545
配列番号28   ピスムサチブム(Pisumsativum)FtsZ(cp)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号T06774
配列番号29   タバコ(Nicotiana tabacum)FtsZ(cp,1-3)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号CAB89287
配列番号30   タバコFtsZ(cp,1)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号CAB41987
【００３２】
配列番号31   タバコFtsZ(cp,1-1)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号CAB89286
配列番号32   タバコFtsZ(cp,2)アミノ酸配列、ジーンバンク登録番号AAF23770
ここで請求した発明は、抗微生物薬をターゲットとしたFtsZ-mtの使用にせまる。FtsZ-mtは、卵菌類のような原始的な真核生物に特有であり、そして本物のカビ及びより高等な真核生物は対応するものをもたないので、理想的なターゲットである。
【００３３】
本発明の好ましい態様を以下に説明する。しかし、本発明は様々な実施例を含んでいるが、好ましい態様により制限されない。
【００３４】
本発明は、ミトコンドリアの分裂において提案された役割をもつ必要不可欠なタンパク質をコードするフィトフトラ・インフェスタンスから単離された遺伝子に関する(Beech et al. (2000)Science 287:1276-1279)。本発明は、正常な増殖及び発生のための遺伝子の不可欠性に基づき、抗菌性のターゲットとしてこれらのタンパク質を使用する方法をも含んでいる。本発明は、見込みのある抗微生物薬である阻害物質を同定するためのスクリーニング・アッセイとしても有用である。
【００３５】
病気を引き起こす望ましくない微生物の増殖を抑制するための抗微生物薬の使用は、ほとんど普遍的な慣習になった。植物病原体に対する抗微生物薬は、植物、植物の一部、及び/又は植物の周囲の土に適用される。動物の病原体に対する抗微生物薬は、直接的に動物に適用されるか、又は環境、例えば魚を治療するための溶液中に適用されうる。しかし、抗微生物薬への微生物の抵抗の発達が重大な問題である。同じ抗微生物薬の幅広い使用は、感受性の個体を殺菌するが、一方で抵抗性のある個体が生き残って、それが抵抗性の個体が再生、そしてそれらの子孫への抵抗性に関するそれらの能力の伝播を可能にする。前記子孫は、以前は感受性の個体によって占められた生態的地位を譲り受ける。結局、個体群全体が抵抗性となり、有害生物抑制の慣行の失敗に終わる。
【００３６】
抗微生物薬は、ターゲット個体群の抵抗性の発達に負け、有効な新しい抗微生物薬の製造がますます重要になる。また、これらの化学物質が高等真核生物に無害であることが重要である。現在、組換えDNA技術を使った高性能スクリーニングを用いて新規抗微生物薬を発見することができる。微生物の増殖及び発生に不可欠であると判明した代謝酵素は、標準的な分子生物学的技術により遺伝子組み換えを用いて製造され、そしてタンパク質機能の新規阻害物質のためのスクリーニングにおける抗菌性ターゲットとして利用されることができる。そのようなスクリーニングによって発見された新規阻害物質は、その後抗微生物薬として望ましくない微生物の増殖を抑制するために使用される。
【００３７】
着目のタンパク質の予測された3次元構造に基づいた仮想スクリーニングを使用することもできる。微生物タンパク質に結合するが対応する高等植物タンパク質には結合しない化学物質は、抗微生物薬の優れた候補物質であり、その後特定の生物への有効性を試験される可能性がある。抗微生物薬の候補物質は、農作物系又は水産養殖系のような栽培系、あるいは入り混じって立っているオークの木ようなより管理されていない系における有効性を試験される。
【００３８】
根腐れ病、果実腐れ病、斑点腐れ病、立ち枯れ病、皮層腐れ病、葉枯れ病、黒葉枯れ病、地下茎腐れ病、根の病気、白サビ病、及びべと病を含む様々な植物の病気を引き起こす微生物の蔓延による永続的な、そして進行中の問題が残っている(表1を参照のこと)。さらに、人口母集団が増加し続けた場合、食物は収穫前及び収穫後の病気に取られるため、食糧不足が増す。従って、長い間の、そしてまだ満たされていない新しくて、効果的で、経済的な抗微生物薬の発見の必要性が存在する。
【００３９】
定義：
明確にするために、本明細書中に使用されるいくつかの用語は、以下のとおり一般的に定義され、そして示される：
【００４０】
本明細書中に使用されるとき、「キメラ」は、天然にない核酸配列をもたらす組み換え技術によって融合された核酸配列であるところの異なる起源の2以上の核酸配列を含むベクター又は遺伝子のような核酸配列を示すために一般に使用される。
【００４１】
本明細書中に使用されるとき、「発現」は、内在性遺伝子、導入遺伝子、又は転写及び/又は翻訳されうる他の構成物の転写及び/又は翻訳を表す。例えば、アンチセンス構成物の場合に、発現はアンチセンスRNAの転写を一般に表す。
【００４２】
本明細書中に使用されるとき、「遺伝子」は、場合により調節配列に関係しているコード配列を一般に表し、ここでコード配列は、通常RNA、例えばmRNA、rRNA、tRNA、snRNA、センスRNA、又はアンチセンスRNAに転写される。調節配列の例は、プロモーター配列、5'及び3'の翻訳されない配列などである。存在するかもしれないさらなる要素は、例えばイントロンである。
【００４３】
本明細書中に使用されるとき、「抗微生物薬」は、細菌、カビ、白カビ、菌類、及び卵菌類のような微生物を殺すか、あるいはその増殖又は複製を抑制するために使用される化学的、生物学的、又はそれ以外の物質、化合物、又は組成物を一般に表す。
【００４４】
本明細書中に使用されるとき、「異種の配列」は、天然の核酸又はポリペプチド配列の天然にはない複数のコピーを含む、それが導入された宿主細胞に関係しない核酸又はポリペプチド配列を一般に表し、同様にこの用語は、天然では構成物中の他の核酸又はポリペプチド配列と関係しない核酸又はポリペプチド配列を表す。
【００４５】
本明細書中に使用されるとき、「阻害物質」は、活性又は機能的分子又は複合体、例えば生合成酵素、レセプター、シグナル伝達タンパク質、構造遺伝子産物、又は輸送タンパク質の活性を不活化する化学的、生物学的又はそれ以外の物質、化合物、又は組成物を一般に表す。好ましい阻害物質は、植物の増殖、繁殖、又は生存に不可欠である活性を乱さない。
【００４６】
単離されたDNA又はタンパク質分子のような本発明の文中で使用される「単離された」は、ヒトの手によって天然の環境から離れて存在し、従って天然の産物ではない分子、物質、化合物、又は組成物を一般に表す。例えば、単離されたDNA分子又はタンパク質は、精製された形態で存在するか、又は外来の環境、例えばトランスジェニック宿主細胞の状態で存在する。
【００４７】
本明細書中に使用されるとき、「成熟タンパク質」は、転写後修飾の対照であり、かつ、1以上のそのような修飾をを受けたタンパク質を一般に表す。例えば、輸送ペプチドが取り除かれた、葉緑体のような細胞小器官を通常対象とするタンパク質が成熟タンパク質である。
【００４８】
本明細書中に使用されるとき、「使用できるように連結された」又は「関連する」は、機能的に並べて置かれているか又は隣接している2以上の核酸配列を一般に表す。例えば、調節DNA配列がコードされたDNA配列の発現に影響するように2つの配列が位置していれば、調節DNA塩基配列は、RNA又はタンパク質をコードする「使用できるように連結された」又は「関連する」DNA配列であると言われる。
【００４９】
本明細書中に使用されるとき、「植物」は、あらゆる植物又は植物の一部、例えば葉、茎、根、花、又は花の部品、果実、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、卵細胞、接合子、胚、種子、切り枝、そして特に種子植物を一般に表す。
【００５０】
本明細書中に使用されるとき、「植物細胞」は、植物の構造及び生理学的単位を一般に表す。植物細胞は、単離された1つの細胞又は細胞壁を含むかもしれない培養細胞、あるいは高度に組織化された部分、例えば植物組織又は植物器官の形態であるかもしれない。
【００５１】
本明細書中に使用されるとき、「植物材料」は、植物全体、あるいは植物の一部、例えば葉、茎、根、花、又は花の部品、果実、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、卵細胞、接合子、胚、種子、切り枝、細胞、若しくは組織培養、又は植物のいずれか他の部分又は産物、例えばゴム、寒天若しくは木製品を一般に表す。
【００５２】
本明細書中に使用されるとき、核酸かポリペプチド配列の「領域」又は「部分」は、そのドメインが他の配列によって分けられているかどうかにかからわず、上記セグメントが、機能的又は活性なポリペプチドの部分、あるいは複数のそのような機能的又は活性ドメインをコードする又は含むのに十分な長さであるような、核酸又はポリペプチド配列中の隣接する核酸又はアミノ酸の実質的に隣接している部分を一般に表す。選択肢として、領域又は部分は、天然のタンパク質の立場からは機能的又は活性ではないが、しかしそれは少なくとも1つの有用な機能、例えば抗体によって認められるエピトープ、阻害物質によって認識される構造などを担持するポリペプチドの一部をコードするか又は含んでいる。
【００５３】
本明細書中に使用されるとき、「選択マーカー」は、その発現がマーカーを発現している細胞、マーカーを発現するか又は含んでいる細胞とマーカーを発現しないか又は含んでいない細胞の間の区別を可能にする配列を一般に表す。好ましい選択マーカーは、それを発現するか又はそれを含んでいる細胞に選択的な優位性一般に与える。選択マーカーをもつ形質転換細胞により所有されている選択的な優位性は、非形質転換細胞の増殖に比べて、負の選択薬剤、例えば抗生物質又は抗微生物薬の存在で増殖するためのそれらの能力による。非形質転換細胞と比べて形質転換細胞により所有されている選択的な優位性は、栄養素、増殖因子、又はエネルギー源として加えられた化合物を利用するためのそれらの高められたか又は新規能力にもよるかもしれない。「選択マーカー遺伝子」は、細胞内でのその発現が細胞に負及び正の選択的な優位性の両方を与える遺伝子又は遺伝子の組み合わせを表すこともできる。
【００５４】
「配列同一性」は、2以上の配列が同一である程度の定量的測定を一般に表す。配列同一性のパーセンテージは、動的計画法アルゴリズムに基づくコンピュータ・プログラムを使って一般に決定される。本発明の範囲内で好ましいコンピュータ・プログラムは、クエリーがタンパク質かDNAかにかかわらず利用可能な配列データベースの全てを探検するように設計されたBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)検索プログラムを含んでいる。この検索ツールのVersion BLAST 2.0(Gapped BLAST芽細胞)は、インターネットで公的に入手可能になった(http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/で現在入手可能)。それは、広範囲のアラインメントに対立するものとしての局所を検索し、よって単離された領域だけを共有する配列の間の関係を検出することができる発見的なアルゴリズムを使用する。BLAST検索で割り当てられたスコアは、明確な統計上の重要性をもつ。
【００５５】
本明細書中に使用されるとき、用語「実質的に類似していること」は、基準配列に対する与えられたヌクレオチド又はポリペプチド配列の一致を一般に表す。基準配列と実質的に類似する核酸配列は、基準ヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと実質的に同じ構造及び機能をもつポリペプチドをコードし、好ましくは、例えば、アミノ酸だけの変化がポリペプチドに影響しない。望ましくは、実質的に類似のヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドをコードする。用語「実質的に類似している」は、その配列が特定の細胞内での発現に最適化するように修飾されたヌクレオチド配列を含むことが特に意図される。実質的に類似のヌクレオチド配列と基準ヌクレオチド配列の間の同一性のパーセンテージは、望ましくは少なくとも約65%、より望ましく少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、さらにより好ましくは少なくとも約95%、まださらにより好ましくは少なくとも約99%である。
【００５６】
基準ヌクレオチド配列に対して「実質的に類似の」ヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列と50℃で2×SSC、0.1%のSDS中での洗浄を伴い、50℃で7%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5 MのNaP04、1 mMのEDTA中ハイブリダイズし；より望ましくは、ハイブリダイゼーションは、50℃で1×SSC、0.1%のSDS中での洗浄を伴い、50℃で7%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5 MのNaP04、1 mMのEDTA中で存在し；さらにより望ましくは、ハイブリダイゼーションは、50℃で0.5×SSC、0.1%のSDS中での洗浄を伴い、50℃で7%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5 MのNaP04、1 mMのEDTA中で存在し；より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、50℃で0.1×SSC、0.1%のSDS中での洗浄を伴い、50℃で7%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5 MのNaP04、1 mMのEDTA中で存在し；より好ましくは、ハイブリダイゼーションは、65℃で1×SSC、0.1%のSDS中での洗浄を伴い、50℃で7%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5 MのNaP04、1 mMのEDTA中で存在する。
【００５７】
本明細書中に使用されるとき、「形質転換」は、細胞、組織又は植物中に1以上の異種核酸を導入するための方法を一般に表す。変えられた細胞、組織、又は植物は、形質転換方法の最終産物だけではなく、そのトランスジェニック子孫をも含むと理解される。
【００５８】
本明細書中に使用されるとき、「トランスジェニック」は、細胞、あるいは例えば、好ましくは使用できるように着目のDNA配列と連結された適当なプロモーターを含む組み換えDNA分子により形質転換された細胞を含む生物を表す。
【００５９】
本発明の1つの目的は、抗菌活性をもつ抑制作用化合物のためのスクリーニング・アッセイに使用するための卵菌類に必要不可欠な遺伝子を提供することである。FtsZ-mtとFtsZ-cpの両者は核にコードされている。タンパク質産物は、N末端シグナル・ペプチドにより、それぞれミトコンドリアと葉緑体の中に運搬される。FtsZ-mt遺伝子は、卵菌類のミトコンドリアの分裂に必須であると思われるが、対応する葉緑体遺伝子、FtsZ-cpと比較的低い配列同一性しか持っていない。これは、卵菌類のFtsZタンパク質の機能を抑えるある化学物質は、卵菌類にたいして有害な影響をもちうるが、しかしそれらの植物宿主に対して全く効果を持たないか又はわずかの効果しか持たないので、上記化学物質が優れた抗菌性の候補物質である可能性があることを示す。FtsZ-mtは、哺乳動物のような高等な真核生物において対応物もない。このように、FtsZ-mtに対する活性をもつ選ばれた化学物質は、高等な真核生物の主要な群に対して害がなく、ヒトへの毒性が存在しないことが見込まれる。一方で、卵菌類に対する活性をもつ化学物質は、この生物のFtsZをコードしている遺伝子の間の保存によって、α-プロテオバクテリアのような他の微生物に対する活性をもつことが見込まれる。よって、本発明は、その後に植物の卵菌類、例えばフィトフトラ、特にフィトフトラ・インフェスタンス、並びにアグロバクテリウム種、例えばα-プロテオバクテリアの増殖を抑制する抗微生物薬として使用される可能性がある、本明細書中に記載の遺伝子配列によってコードされた精製タンパク質を用いた、その阻害物質を同定するための方法を提供する。
【００６０】
本発明の他の目的は、抗菌活性をもっているとして同定された化合物を使った農作物の改良方法を提供する。卵菌類及びα-プロテオバクテリアの増殖を抑制するための抗微生物薬は、植物、植物の一部、植物種子又は周囲の土に適用される。本発明の方法により抗菌活性をもっていると同定された化合物を用いた方法は、適当な混合物の状態でのこれらの化合物の葉への適用、根ドレンチ又は根ディップの形態での根への適用、樹皮下又は木部内への注入によるこれらの化合物の植物内への直接的な導入、接ぎ木又はカット表面を介した導入、又は農作物が生育する耕地での適用を含む。本発明の側面は、幅広い植物、特にこれだけに制限されることなく、ジャガイモ、トマト、タバコ、オーク、コーヒーベリー(Rhamnus種)、カボチャ、綿、モロコシ、エンドウ、タマネギ、メロン、キュウリ、エンドウ、ビート、スイカ、トウガラシ、ポート・オーフォード・シダー、タロイモ、リンゴ、アブラナ種、サツマイモ(Ipomea)、ホウレンソウ、豆、ブドウのつる、ヒマワリ、ホップ、レタス、スミレ、アスター、大豆、及びトウモロコシ、米、大麦、小麦、ライ麦などを含む穀類などを含む作物学的に重要な農作物の治療を含む。
【００６１】
代わりの態様において、同定された阻害物質は、魚の病原菌、例えば卵菌類ミズカビ、並びにヒトを含む動物に対する病原菌であるα-プロテオバクテリア種に対しても使用される。本発明の利点は、その産物が新規抗微生物薬の作用形態のターゲットとして当業者が容易に、そしてすぐに新規抗微生物薬を同定することを可能にする新しく発見された必須遺伝子である。本発明の他の利点は、本発明の方法により抗菌活性をもっていると同定された化合物がこの化合物により治療される高等な真核生物に対して効果をもたないことである。
【００６２】
1の態様において、本発明は、配列番号1、3、5又は9の配列をもつ新規ポリヌクレオチドを提供する。配列番号1のヌクレオチド配列は、配列番号2の推定アミノ酸配列をもつFtsZ-mt1として指定されたタンパク質をコードしている。同様に、配列番号4のアミノ酸配列をもつ(ゲノム)FtsZ-mt2として指名される2番目のFtsZ-mtタンパク質をコードする配列番号5で示された配列をもつ2番目の新規ポリヌクレオチドを提供する。(ゲノム)FtsZ-mt2は、「GT-AG」規則及び他のFtsZタンパク質に対するアミノ酸配列相同性によって決定されるように2つのイントロンをもつ部分的なゲノム配列をコードする。(ゲノム)FtsZ-mt2に対応するcDNA配列を、配列番号3に示す。部分的なゲノム配列FtsZ-mt2に相当する完全なcDNA配列を、配列番号9に示す。
【００６３】
本発明は、配列番号1、3、5又は9に記載のものと実質的に類似のヌクレオチド配列も含み、上記ヌクレオチド配列は、卵菌類、細菌、又は原始的な真核生物、例えば単細胞的体制のヌクレオチド配列である。好ましいものは、配列番号1、3、5又は9に記載のものと実質的に類似のヌクレオチド配列であり、上記ヌクレオチド配列がフィトフトラ・インフェスタンスのヌクレオチド配列である。
【００６４】
配列番号1、3、5又は9に記載のものと実質的に類似のヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドをさらに含み、上記コード・タンパク質はFtsZ活性をもつ。特に好ましいものは、配列番号1、3、5又は9に記載のものと実質的に類似のヌクレオチド配列であり、上記コード・タンパク質はFtsZ活性をもつ。配列番号1、3、5又は9に記載のものと実質的に類似のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列がさらに含まれる。配列番号1、3、5又は9によってコードされたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列がさらに含まれる。
【００６５】
配列番号1、3、5又は9のいずれかに対し実質的な配列同一性をもつポリヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約65%の配列同一性、さらにより好ましくはほとんどの約70%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約75%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約80%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、さらにより好ましくは配列番号1、3又は5のいずれかに対して少なくとも約99%の配列同一性をもつポリヌクレオチドをも含む。
【００６６】
本発明は、アミノ酸配列が配列番号2、4又は10に記載のアミノ酸配列と実質的に類似のタンパク質をも含む。配列番号2又は4又は10のいずれかに実質的に類似のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をも含む。好ましいものは、配列番号2、4又は10のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号1、3、5又は9のいずれかと実質的に類似のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を本明細書中に含み、上記タンパク質はFtsZ活性をもつ。配列番号2、4又は10のいずれかのアミノ酸配列の少なくとも20の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列をさらに含む。
【００６８】
さらなる態様は、配列番号1、3、5又は9のいずれかに実質的に類似のヌクレオチド配列に使用できるように連結されたプロモーターを含むキメラ遺伝子をさらに含む。配列番号1、3、5又は9のいずれかに実質的に類似のヌクレオチド配列に使用できるように連結されたプロモーターを含んでいるキメラ遺伝子を含む組み換えベクターをさらに含み、上記ベクターは安定的に宿主細胞内に形質転換されることができる。配列番号1、3、5又は9のいずれかに実質的に類似のヌクレオチド配列に使用できるように連結されたプロモーターを含むキメラ遺伝子を含むベクターを包含する宿主細胞をさらに含み、上記ベクターは、安定的に宿主細胞内に形質転換され、上記ヌクレオチド配列は、上記細胞内で発現可能である。
【００６９】
本発明による好ましい宿主細胞は、原核生物か真核生物の細胞である。E.コリ(E.coli)、酵母、又は昆虫細胞である宿主細胞が最も好ましい。
【００７０】
他の態様において、配列番号1、3、5又は9の配列をもつ新規ポリヌクレオチドは、卵菌類中で過剰発現されるか又は低発現され、そして細胞分裂、増殖、栄養摂取、複製などへの効果が計測される。
【００７１】
さらなる態様は、以下のステップ：a)配列番号1、配列番号3、配列番号5及び配列番号9から成る群から選ばれるヌクレオチド配列と実質的に類似のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を含むタンパク質と、上記タンパク質に結合する能力を試験すべき化合物とを、結合を誘導する条件下で混ぜ合わせ、b)上記タンパク質に結合することができる、ステップ(a)で同定された化合物を選択し、c)ステップ(b)で同定された化合物を卵菌類又は他の微生物に適用して、抗菌活性を試験し、そしてd)抗菌活性をもつ化合物を選択する、抗菌活性をもつ化合物の同定方法である。本発明による方法で同定可能な抗菌活性をもつ化合物をさらに含む。以下のステップ：a)FtsZ-mtタンパク質と、FtsZ-mtタンパク質の活性を抑える能力を試験すべき化合物とを、上記抑制を誘導する条件下で混ぜ合わせ、b)上記FtsZ-mtタンパク質活性を抑えることができる、ステップ(a)で同定された化合物を選択し、c)ステップ(b)で同定された化合物を卵菌類又はα-プロテオバクテリウムのような微生物に適用して、抗菌活性を試験し、そしてd)抗菌活性をもつ化合物を選択する、を含む抗菌活性をもつFtsZ活性阻害物質の同定方法をさらに含む。
【００７２】
さらに他の態様において、卵菌類における配列番号1、3、5又は9の配列をもつ新規ポリヌクレオチドの発現を減少させ、そして細胞分裂、増殖、栄養摂取、複製などに対する影響が計測される。あらゆるFtsZ活性阻害物質が、高等植物の卵菌類感染症の抑制のための抗真菌薬としての可能性を持っている。
【００７３】
本発明のさらなる態様は、本発明による方法によって同定可能な抗微生物活性をもつ化合物である。卵菌類の増殖を抑制する方法をさらに含み、上記方法は、上記卵菌類に配列番号1、3、5又は9と実質的に類似のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の活性を抑制する化合物を上記卵菌類の増殖を抑制するのに十分な量で適用することを含む。好ましい態様において、抑制化合物は、フィトフトラ・インフェスタンスに適用される。
【００７４】
以下のステップ：a)配列番号2、配列番号4及び配列番号10から成る群から選ばれるタンパク質と、上記タンパク質に結合する能力を試験すべき化合物とを、結合を誘導する条件下で混ぜ合わせ、b)上記タンパク質に結合することができる、ステップ(a)で同定された化合物を選択し、c)ステップ(b)で同定された化合物を卵菌類にような微生物に適用して、抗菌活性を試験し、そしてd)抗菌活性をもつ化合物を選択する、抗菌活性をもつ化合物の同定方法をさらに含む。
【００７５】
植物、植物の一部、植物種子、又は周囲の土に本発明による抗菌活性をもつ化合物を、植物又は種子の成長を大幅に抑制することなく望ましくない微生物の増殖を抑える量で適合することを含む農作物の改善方法をさらに含む。
【００７６】
さらに、本発明は、潜在的抗微生物薬である阻害物質を同定するためのスクリーニング・アッセイに使用されることができる。以下のステップ：a)コンピュータ・モデルを使ってFtsZ-mtタンパク質の3次元構造を決定し、b)コンピュータ・モデルを使ってFtsZ-cpタンパク質の3次元構造を決定し、c)コンピュータ・モデルを使って、FtsZ-mtに結合し、そしてFtsZ-cpに結合しないそれらの能力について化学物質を試験する、を含む試験すべきFtsZ機能阻害物質の仮想スクリーニングを利用する方法をさらに具体化する。
【００７７】
本発明は、卵菌類又はα-プロテオバクテリウムに、卵菌類又はα-プロテオバクテリウム中に天然のFtsZ-mt活性を抑える化学物質を適用するステップを含む卵菌類又はα-プロテオバクテリウムの増殖を抑制する方法も提供する。関連した側面において、本発明は、植えられた農作物種子又は植物から成る農作物を含む耕地における、これだけに制限されることなく、微生物、例えばアグロバクテリウム、ラゲナ、ペロノフィトラ、トラキスフェエラ、ピチウム、フィトフトラ、アルブゴ、ペロノスポラ、プラスモポラ、プソイドペロノスポラ、ブレミア、ブレミラ、及びバシジオホラを含む植物の病原菌の増殖を選択的に抑制する方法に向けられる。前記方法は、以下のステップ：a)場合により農作物を植え；そしてb)農作物の植物、植物の一部、植物種子、又は耕地内の周囲の土に、植物色素体のFtsZ-cp活性に影響することなく卵菌類又はα-プロテオバクテリウムの天然のFtsZ-mt活性を抑える量で抗微生物薬を適用する、を含み、上記抗微生物薬は大幅に農作物の増殖を抑制することなく、微生物、例えばラゲナ、ペロノフィトラ、トラキスフェエラ、ピチウム、フィトフトラ、アルブゴ、ペロノスポラ、プラスモポラ、プソイドペロノスポラ、ブレミア、ブレミラ、及びバシジオホラ属由来の微生物の増殖を抑制する。
【００７８】
本発明のさらなる側面は、これだけに制限されることなく、ジャガイモ、トマト、タバコ、オーク、コーヒーベリー(Rhamnus種)、カボチャ、綿、モロコシ、エンドウ、タマネギ、メロン、キュウリ、エンドウ、ビート、スイカ、トウガラシ、ポート・オーフォード・シダー、タロイモ、リンゴ、アブラナ種、サツマイモ(Ipomea)、ホウレンソウ、豆、ブドウのつる、ヒマワリ、ホップ、レタス、スミレ、アスター、大豆、及びトウモロコシ、米、大麦、小麦、ライ麦などを含む穀類などを含む植物種の治療手段を提供する。
【００７９】
代わりの態様において、本発明は卵菌類、例えばミズカビ属由来の卵菌類に感染した魚を治療する手段を提供する。感染した魚は、卵菌類の天然のFtsZ-mt活性を抑える化学物質で治療される。魚は、本発明の方法によって同定された化合物の直接的な外部又は内部への適用によって治療されるか、及び/又は溶液により本発明の方法によって同定された化合物に晒されることによって治療される。
【００８０】
FtsZの遺伝子組み換えによる製造とその使用。宿主生物によるFtsZの組み換えによる製造のために、FtsZタンパク質をコードしているヌクレオチド配列が、選ばれた宿主のために設計された発現カセットに挿入され、そして宿主に導入される、ここでそれを組み換えにより製造する。選ばれた宿主に適当な特定の調節配列、例えばプロモーター、シグナル配列、5'及び3'非翻訳配列、及びエンハンサーの選択は、当業者の知識の範囲内である。適切な読み取り枠内に使用できるよう連結された個々の要素を含む、得られた分子は、前記宿主細胞ないに形質転換されることができるベクター内に挿入される。好適な発現ベクター及びタンパク質の組み換えによる製造方法は、宿主生物、例えばE.コリ、酵母、及び昆虫細胞 (例えばLuckow and Summers(1988) BioTechnol 6:47を参照のこと)、及びバキュロウイルス発現ベクター、例えばキンウワバ(Autographa californlca)核多角体病ウイルス(AcMNPV)のゲノム由来のものについて周知である。
【００８１】
好ましい態様において、FtsZ-mt活性をもつタンパク質をコードしているヌクレオチド配列は、卵菌類、そして最も好ましくはP.インフェスタンス由来である。さらに好ましい態様において、前記ヌクレオチド配列は、配列番号1、3、5又は9のいずれかに記載のヌクレオチド配列に一致するか又はそれと実質的に類似であるか、あるいはそのアミノ酸配列が配列番号2、4又は10のいずれかに記載のアミノ酸配列と一致するか又は実質的に類似するFtsZ-mt活性をもつタンパク質をコードする。
【００８２】
配列番号1に記載のヌクレオチドは、フィトフトラ・インフェスタンスFtsZ-mt1タンパク質をコードするゲノム配列であり、そのアミノ酸配列は配列番号2に記載されている。配列番号5に記載のゲノム・ヌクレオチド配列も、GT-AG規則及び既知のFtsZタンパク質に対するアミノ酸配列相同性によって決定されるように2つのイントロン含むFtsZ-mt2タンパク質をコードする。対応するcDNAは配列番号3に記載されている。配列番号9が、FtsZ-mt2ゲノム配列に相当する完全長のcDNA配列を示す。対応するタンパク質配列は、配列番号10として示されている。FtsZ-mt2タンパク質(配列番号10)は、TargetP(Emanuelsson et al. (2000) J. Mol. Biol 300:1005-1016)によってミトコンドリア内に輸送されることが予測される。
【００８３】
組み換えにより製造されたFtsZ-mtを、単離し、そして種々の標準的な技術を使って精製する。使用されうる実際の技術は、使用される宿主生物に依存して変化する(例えば、John Wiley & Sons, Inc. (1994)により出版されたAusubel, F. et al., "Current Protocols in Molecular Biology" の第16章を参照のこと)。
【００８４】
ランダムな化学物質及び既知の抗微生物薬のスクリーニング。組み換えにより製造されたFtsZ-mtタンパク質は、種々の目的に役立つ。例えば、それらはターゲットが同定されていない既知の抗菌性化学物質をスクリーニングし、上記物質がFtsZ-mtを抑制するかどうかを決定するためのインビトロ・アッセイに使用することができる。そのようなインビトロ・アッセイは、FtsZタンパク質機能を抑え、従って新規抗菌薬の候補物質である化学物質を同定するためのより一般的なスクリーニングとしても使用されうる。あるいは、組み換えにより製造されたFtsZタンパク質は、これらの分子の複雑な構造を明らかにし、さらに新規抑制性の抗微生物薬並びに酵素の抗微生物薬寛容型を合理的に設計するために既知の阻害物質とそれらの関係を特徴づけるために使用されうる。
【００８５】
微生物の起源を含むあらゆる起源からの配列番号1、3、5又は9のいずれかに実質的に類似のヌクレオチド配列、及び配列番号2、4又は10に実質的に類似のタンパク質は、本明細書中に例証されたアッセイに使用されることができる。望ましくは、そのようなヌクレオチド配列及びタンパク質は、卵菌類由来である。より望ましくは、それらは、P.インフェスタンス由来である。
【００８６】
新規技術は、タンパク質の生物学的機能とは関係なくタンパク質とリガンドの間の相互作用を検出することができる検査をする。蛍光相関分光法、表面増強レーザー脱離/イオン化、及びbiacore技術を含む3つの方法の簡単な説明が示される。更に多くのこれらの方法が現在発見されていて、一部はこの開示の観点から、自動化された大規模スクリーニングの影響を受けやすい。
【００８７】
蛍光相関関係スペクトル法(FCS)理論は、1972年に開発されたが、ほんの最近数年でFCSを実施するための技術を利用できるようになった(Madge et al. (1972) Phys Rev Lett, 29: 705-708; Maiti et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA, 94: 11753-11757)。FCSはわずかなサンプル容量内の蛍光性分子の平均の拡散速度を計測する。サンプルサイズは、103個の蛍光分子ほど小さく、そして1つのバクテリアの細胞質と同じほど少ないサンプル容量でありうる。拡散速度は分子量の関数であり、質量が増えるほど低下する。従って、FCSは結合による分子の質量、結果として拡散速度の変化を計測することによってタンパク質-リガンド相互作用の分析に利用されることができる。
【００８８】
表面-増強レーザー脱離/イオン化(SELDI)は、1980年代後半にHutchens及びYipにより発明された(Hutchens and Yip (1993) Rapid Comm Mass Spectrom 7: 576-580)。飛行時間質量分析計(TOF)につないだ場合、SELDIはチップに保持された分子を速く分析する手段を提供する。それは、チップ上に標的タンパク質を共有結合させ、そしてこのタンパク質により保持された小分子のMSにより分析することによってリガンド-タンパク質相互作用分析に利用されることができる(Worrall et al. (1998) Anal Biochem 70: 750- 756)。
【００８９】
Biacoreは、層に固定化されたタンパク質へのリガンドの結合による表面層での屈折率の変化を基にする。このシステムで、小さいリガンドの回収物が、固定化されたタンパク質を伴う2〜5 μlセルに連続的に注入される。結合は、表面からのレーザー光線の屈折を記録することにより表面プラズモン共鳴(SPR)によって検出される。一般的に、表面層での質量濃度の得られた変化に関する屈折率の変化は、全てのタンパク質及びペプチドに関して実質的に同じものであり、単一の方法が全てのタンパク質について適用できることを可能にしている(Liedberg et al. (1983) Sensors Actuators 4: 299-304;Malmquist (1993) Nature, 361: 186-187)。
【００９０】
仮想スクリーニング。仮想スクリーニングは、試験されるタンパク質の構造に、又は組み換えによりに製造されたFtsZ-mtタンパク質の結晶解析によって決定された3次元構造に基づいて実行することもできる。あるいは、FtsZ-mtタンパク質の3次元構造は、古細菌FtsZの既知の3次元構造を利用しているコンピュータによりモデル化される。次に、モデルは、本発明のFtsZ-mtに結合する化学物質の仮想スクリーニングに使用される。細胞分裂の間のそれらの正常な機能の一部としてFtsZタンパク質は、他のFtsZタンパク質分子を含む他のタンパク質分子と相互作用することが知られているので、相互作用表面で又はその付近で反応する化学物質は特に優れた候補物質である。
【００９１】
3次元のFtsZ-mtモデルと反応する化学物質は、FtsZ-cpタンパク質のモデルに対してさらに試験される。特異的な微生物阻害物質の優れた候補物質であるために、試験化学物質は、植物増殖の見込みのある抑制作用がないことを条件とするためにFtsZ-cpタンパク質に結合してはならない。そのような化学物質は、動物及び人間を含む他の高等真核生物の病原菌に対する標的特異的な抗微生物薬の見込みのある候補物質でもある。
【００９２】
次に、FtsZ-mtモデルに結合しFtsZ-cpモデルには結合しない化学物質が、卵菌類の見込みのある特異的阻害物質の優れた候補物質として選ばれる。
【００９３】
見込みのある標的領域は、経験的にそして本技術分野で知られるいずれかの方法により決定される。1つの戦略は、FtsZの卵菌類ミトコンドリア形態とFtsZの高等植物葉緑体形態の間で異なる領域を特定することである。類似の配列のクラスター間の相違は、配列アラインメントの比較によって決定されることができる。見込みのある標的領域は、タンパク質配列の以下の領域：第18位、第30位、第31位、第62位、第135位、第142位、第156-157位、第159位、第163位、第189-190位、第198位、第210位、第217位、第223位、第227位、第236位、第245位、第251-252位、第266位、第271位、第276位、第287-289位、第300位、第302位及び第306位アミノ酸に見られる。これらの領域は、下等真核生物とα-プロテオバクテリア由来のミトコンドリアに関するクラスター、そして高等植物葉緑体とシアノバクテリアに関するクラスターの間のFtsZタンパク質配列の相違を示す。その結果、これらの領域は、FtsZ-mt機能の見込みのある阻害物質によるターゲッティングのための好ましい態様を表す。
【００９４】
インビボ阻害物質アッセイ。1の態様において、例えばインビトロ又は仮想スクリーニングによって同定された推測される抗微生物薬は、様々な濃度で微生物に、好ましくは卵菌類に、より好ましくはのP.インフェスタンスに適用される。疑わしい抗微生物薬の適用後、その効果、例えば消滅又は増殖の低下を記録する。
【００９５】
卵菌類FtsZに対して有効な化合物は、表Iに列挙した卵菌類病原菌を抑制し、そして列挙した卵菌類によって引き起こされた病気に対抗するために使用されうる。
【００９６】
【表１】
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【００９７】
【表２】
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【００９８】
【表３】
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【実施例】
【００９９】
実施例1：フィトフトラ・インフェスタンスからのゲノムFtsZ配列の分離
FtsZ-mt1(配列番号1)及び(ゲノム)FtsZ-mt2(配列番号5)を、製造業者(LTI)によって推薦された反応条件を用いたPlatinum Taq(LTI、ホットスタートPCR用)を使って、P.インフェスタンス・ゲノム配列から縮重PCRによって得た。30 μlの反応液は、20ngのP.インフェスタンス・ゲノムDNAと各15 pmolのプライマーを含む。プライマーの2つの組み合わせ(PI01A&PI03B又はPI01A&PI06B；以下に示す)の1つを使用した。以下に示したプライマー中の文字「I」は、イノシンがその領域で使用されることを示す。プライマーPI01A(配列番号6)中の文字「Y」は、T又はC(ピリミジン塩基)がその領域で使用されることを示すために使用される。プライマーPI06B(配列番号8)中の文字「R」は、G又はA(プリン塩基)がその領域で使用されることを示すために使用される。
【０１００】
PI01A：5'-AAYGCIGTIAAYAAYATGAT-3'(配列番号6)
PI03B：5'-GTICCIGTICCICCICCCAT-3'(配列番号7)
PI06B：5'-GTICK3ACRTCIGCRAARTC-3'(配列番号8)
PCRプログラムは以下のステップ：
1)94℃、3分
2)94℃、15秒
3)52℃、25秒
4)72℃、45秒
ステップ2〜4を34回(合計35のサーマル・サイクル)を繰り返す
5)72℃、15分、
によって表される。
ステップ3で使用されるアニーリング温度を、予備的な温度勾配実験に基づいて決定した。
【０１０１】
PCR産物を、アガロースゲル電気泳動法によって分けた。PI01A(配列番号6)とPI03B(配列番号7)のプライマー組み合わせによる反応からの250 bp(FtsZ-mt1)及び420 bp((ゲノム)FtsZ-mt2)の2つの産物、並びにPI01A(配列番号6)とPI06B(配列番号8)のプライマー組み合わせによる反応からの600 bp(FtsZ-mt1)の1つの産物をゲルから単離した。
【０１０２】
単離したPCR産物を、TOPO-TAクローン化キット(Invitrogen)を使ってPCR2.1-TOPOベクターの中にクローン化し、そしてこの挿入断片の配列を決定した。FtsZ-mt1(配列番号1)は、イントロンをもっていない。FtsZ-mt1に関する推定されたアミノ酸配列を、配列番号2に示す。(ゲノム)FtsZ-mt2(配列番号5)は、2つのイントロンをもち、そして(ゲノム)FtsZ-mt2 cDNA(配列番号3)は、GT-AG規則及びアミノ酸配列相同性に基づく人為的にスプライシングされた配列をもっている。(ゲノム)FtsZ-mt2に関する推定されたアミノ酸配列を、配列番号4に示す。
【０１０３】
実施例2：フィトフトラ・インフェスタンスからの完全長FtsZ-mt2 cDNAの単離
ノバルティス農業関連産業バイオテクノロジー研究法人(NABRI)によって調整されたP.インフェスタンスEST配列ライブラリーを検索することにより完全長FtsZ-mt2 cDNAを分離した。FtsZに特異的なプローブを用いることにより同定されたクローンを単離し、そしてFtsZ-mt2に対して陽性のESTクローンの挿入断片を配列決定した。FtsZ-mt2(cDNA)(配列番号9)は、(ゲノム)FtsZ-mt2 cDNA(配列番号3)に相当する完全なcDNA配列を表す。FtsZ-mt2(cDNA)に関する推定されたアミノ酸配列を、配列番号10に示す。
【０１０４】
実施例3：FtsZの阻害物質のスクリーニング：コンピュータ・モデリング
FtsZ-mt1及びFtsZ-mt2(ゲノム及びcDNA)、並びに葉緑体FtsZ(FtsZ-cp)の3次元構造を、ソフトウェア・プログラム、例えばMolSoft(商標)使ってコンピュータにより決定する。
【０１０５】
FtsZ-mtに結合することができるが、FtsZ-cpに結合しない化学物質を捜すために仮想スクリーニングする。FtsZ-mtに結合することができるが、FtsZ-cpに結合しないあらゆる化学物質が、FtsZ-mtの特異的な阻害物質の優れた候補物質であり、そして病原菌抑制の方法における抗菌性薬剤としての可能性をもっている。さらに、FtsZタンパク質は、細胞分裂中のそれらの正常な機能の一部として他のタンパク質と相互作用することが知られている。その結果、相互作用表面又はその付近で結合する化学物質は、見込みのある抗微生物薬としての特に良好な候補物質を作り出す。
【０１０６】
見込みのある標的領域は、タンパク質配列の以下の領域：第18位、第30位、第31位、第62位、第135位、第142位、第156-157位、第159位、第163位、第189-190位、第198位、第210位、第217位、第223位、第227位、第236位、第245位、第251-252位、第266位、第271位、第276位、第287-289位、第300位、第302位及び第306位に存在する。示した領域は、(α)-プロテオバクテリア及び他のミトコンドリア形態由来のFtsZsとの同一性によりはっきりクラスター形成され、そして葉緑体形態及びシアノバクテリアFtsZsに関するクラスターからはっきり分離される。得られたクラスターのアミノ酸の1つを区別し、そして認識することができる化学物質を設計する。そのような化学物質は、FtsZ-mtタンパク質をもつ原始的な真核生物、例えば卵菌類、及び高度に一致したFtsZタンパク質をもついくつかのバクテリア、例えばα-プロテオバクテリウムのみを殺菌するが、植物と動物を含む他の真核生物に影響しない。
【０１０７】
示した残基は、系統発生のこの枝内の残基を保存するための制約を示すクラスター内で十分に保存された。制約により、化学物質が先に列挙した残基の1つを標的とする場合、これらの位置の突然変異はおそらく負の効果を引き起こすので、卵菌類病原菌がその化学物質への抵抗を容易に開発できない可能性が高い。また、他の卵菌類も保存された残基をもつ。このように、前記化学物質は、単にフィトフトラ・インフェスタンスだけでなく幅広い種類の微生物病原菌に有効であろう。
【０１０８】
多数の、かつ、様々な変更が本発明の本質から離れることなく作製されうることは、当業者によって理解される。従って、本発明の形態は説明のためだけであって、本発明の範囲を制限しないことが、はっきりと理解されるべきである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506041.tif 000071
【国際調査報告】
2005506041.tif 000072
2005506041.tif 000073