(57)【要約】循環血液中のα２−マクログロブリンの中和効果を回避しながら、閉塞フィブリン含有血餅を溶解するのに安全で有効な量の線維素溶解性メタロプロテイナーゼをヒト対象に血管内局所投与する方法を提供する。留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅又は装置に付着した血餅を処理する方法も提供する。留置血管アクセス装置の開通性及び機能を回復する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維素溶解性メタロプロテイナーゼの、ヒトの体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えない量を血管アクセス装置を介して投与することを含む、ヒト用留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅又は装置に付着した血餅を溶解する方法。
【請求項２】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼの、ヒトにおけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量を血管アクセス装置を介して投与することを含む、ヒト用留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅又は装置に付着した血餅をタンパク質分解する方法。
【請求項３】
０．１〜８０ｍｇ／ｍｌの線維素溶解性メタロプロテイナーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
０．１〜５０ｍｇ／ｍｌの線維素溶解性メタロプロテイナーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記血管アクセス装置がカテーテルである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記血管アクセス装置がシャントである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記血管アクセス装置がアクセスグラフトである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記血管アクセス装置が針である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記血管アクセス装置が液体組成物をヒト動脈又は静脈に導入するために使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記血管アクセス装置がヒト動脈又は静脈から血液を抜き取るために使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記血管アクセス装置が血液透析手順に関連して使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記血管アクセス装置が輸血手順に関連して使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記血管アクセス装置が化学療法に関連して使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
末梢動脈閉塞の治療に使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
前記血管アクセス装置が血液の抜き出しに関連して使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記血餅が留置血管アクセス装置の内面にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１７】
前記血餅が留置血管アクセス装置の外面にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
前記血餅が留置血管アクセス装置に付着している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１９】
前記血管アクセス装置が動脈中にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
前記血管アクセス装置が静脈中にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２１】
前記血管アクセス装置が「側穴」カテーテル装置を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２２】
前記血管アクセス装置が「圧力応答流出口」（ＰＲＯ）カテーテル送達装置を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２３】
線維素溶解性メタロプロテイナーゼ溶液をボーラス投与する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２４】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼが新規作用血栓溶解剤（ＮＡＴ）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２５】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼがフィブロラーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２６】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼを、ヒトの体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えなく、前記ヒトにおけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量、血管アクセス装置を介して投与することを含む、フィブリンを主体とする閉塞を有するヒト用留置血管アクセス装置の開通性を回復する方法。
【請求項２７】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼを、ヒトの体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えなく、前記ヒトにおけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量、血管アクセス装置を介して投与することを含む、フィブリンを主体とする閉塞を有するヒト用留置血管アクセス装置の機能を回復する方法。
【請求項２８】
留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅又は装置に付着した血餅の処置用医薬品の製造における、薬剤的に許容される溶液中の、ヒト対象の体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えない量の線維素溶解性メタロプロテイナーゼの使用。
【請求項２９】
留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅又は装置に付着した血餅をタンパク質分解する医薬品の製造における、前記留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺のアルファ−２マクログロブリン又は装置に付着したアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが前記血餅を容易に溶解するのに十分な量の、薬剤的に許容される溶液中の、アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼの使用。
【請求項３０】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼの濃度が０．１〜８０ｍｇ／ｍｌである、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼが０．１〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記血管アクセス装置がカテーテルである、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項３３】
前記血管アクセス装置がシャントである、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項３４】
前記血管アクセス装置がアクセスグラフトである、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項３５】
前記血管アクセス装置が針である、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項３６】
前記血管アクセス装置が液体組成物をヒト動脈又は静脈に導入するために使用される、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項３７】
前記血管アクセス装置がヒト動脈又は静脈から血液を抜き取るために使用される、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項３８】
前記血管アクセス装置が血液透析手順に関連して使用される、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項３９】
前記血管アクセス装置が輸血手順に関連して使用される、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４０】
前記血管アクセス装置が化学療法に関連して使用される、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４１】
前記血管アクセス装置が末梢動脈閉塞の処理に使用される、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４２】
前記血管アクセス装置が血液の抜き出しに関連して使用される、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４３】
前記血餅が留置血管アクセス装置の内面にある、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４４】
前記血餅が留置血管アクセス装置の外面にある、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４５】
前記血餅が留置血管アクセス装置に付着している、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４６】
前記血管アクセス装置が動脈内にある、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４７】
前記血管アクセス装置が静脈内にある、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４８】
前記血管アクセス装置が「側穴」カテーテル装置を含む、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項４９】
前記血管アクセス装置が「圧力応答流出口」（ＰＲＯ）カテーテル送達装置を含む、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項５０】
前記医薬品がボーラス投与用に調製される、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項５１】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼが新規作用血栓溶解剤（ＮＡＴ）を含む、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項５２】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼがフィブロラーゼを含む、請求抗２８又は２９に記載の使用。
【請求項５３】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する量の、ヒト対象におけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量の、およびヒト対象の体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えない量の、フィブリンを主体とする閉塞を有する留置血管アクセス装置の開通性を回復する医薬品の製造における薬剤的に許容される溶液中の、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの使用。
【請求項５４】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する量の、ヒト対象におけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量の、およびヒト対象の体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えない量の、フィブリンを主体とする閉塞を有する留置血管アクセス装置の機能を回復する医薬品の製造における薬剤的に許容される溶液中の、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照により本明細書に援用する１９９９年１２月１７日に出願された米国出願第０９／４６６，２７６号の一部継続出願である。
【０００２】
本発明は、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの治療投与に関し、より具体的には、血餅を溶解するためにこのような薬剤を局所送達によってインビボで血管血栓に投与する方法に関する。本発明は、血管アクセス装置の機能を回復するために、留置カテーテル、シャントなどの血管アクセス装置中の血餅を溶解する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
血栓、塞栓などの血餅によって引き起こされる血管の閉塞は、処置が遅れると四肢喪失又は生命を脅かす重大な疾患である。血管の血餅を処理し除去する装置及び方法がこれまでに開発されてきている。例えば、１９８４年５月８日に発行された米国特許第４，４４７，２３６号（Ｑｕｉｎｎ）、１９８７年９月８日に発行された米国特許第４，６９２，１３９号（Ｓｔｉｌｅｓ）、１９８８年７月５日に発行された米国特許第４，７５５，１６７号（Ｔｈｉｓｔｌｅ他）、１９９２年１２月１日に発行された米国特許第５，１６７，６２８号（Ｂｏｙｌｅｓ）、１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２２，９４１号（Ｄｏｎ  Ｍｉｃｈａｅｌ）、１９９３年１０月５日に発行された米国特許第５，２５０，０３４号（Ａｐｐｌｉｎｇ他）、１９９４年１２月６日に発行された米国特許第５，３７０，６５３号（Ｃｒａｇｇ）、１９９５年１月１０日に発行された米国特許第５，３８０，２７３号（Ｄｕｂｒｕｌ他）、１９９６年３月１２日に発行された米国特許第５，４９８，２３６号（Ｄｕｂｒｕｌ他）、１９９７年５月６日に発行された米国特許第５，６２６，５６４号（Ｚｈａｎ他）、１９９８年１月２０日に発行された米国特許第５，７０９，６７６号（Ａｌｔ）、１９９９年２月２日に発行された米国特許第５，８６５，１７８号（Ｙｏｃｋ）、及び（１９９０年７月１２日に発行された）国際公開第９０／０７３５２号を参照されたい。このような方法及び装置としては、血栓溶解剤又は線維素溶解剤を血餅に送達し、それを溶解する注入カテーテルなどがある。注入カテーテルは、一般に、血餅中のフィブリンを分解することができ、したがって血餅を効果的に溶解することができる酵素活性薬剤とともに用いられる。このような酵素は、一般に、「血栓溶解」剤又は「線維素溶解」剤と呼ばれる。
【０００４】
フィブロラーゼ（Ｆｉｂｒｏｌａｓｅ）は、サザンコッパーヘッド（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｃｏｐｐｅｒｈｅａｄ  ｓｎａｋｅ）（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ）（アメリカマムシ）の毒液から最初に単離された公知の線維素溶解性亜鉛メタロプロテイナーゼである。Ｇｕａｎ等、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２８９巻、２号、１９７〜２０７ページ（１９９１）；Ｒａｎｄｏｌｐｈ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）、５９０〜６００ページ；１９８９年７月１２日に公開された欧州特許出願第０  ３２３  ７２２号（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ他）；及び１９８６年９月９日に発行された米国特許第４，６１０，８７９号（Ｍａｒｋｌａｎｄ他）を参照されたい。フィブロラーゼは線維素溶解性であることが判明し、このメタロプロテイナーゼは、フィブリノーゲンＡα鎖に対するタンパク質分解活性を有し、フィブリノーゲンのＢβ鎖のタンパク質分解切断性が低く、γ鎖に対しては活性を持たないことが報告された；Ａｈｍｅｄ等、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２０巻、１４７〜１５４ページ（１９９０）。フィブリンは血餅の主成分であるので、フィブロラーゼの線維素溶解性は、インビボでの血栓溶解用血餅溶解剤としての可能性を示すものである。Ｍａｒｋｌａｎｄ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９巻、５号、２４４８〜２４５６ページ（１９９４）、及びＡｈｍｅｄ等、前出を参照されたい。
【０００５】
新規作用血栓溶解剤（Ｎｏｖｅｌ  Ａｃｔｉｎｇ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ）（ＮＡＴ）は、元のフィブロラーゼのＮ末端配列はＥＱＲＦＰＱＲで始まり２０３アミノ酸長であるのに対し、Ｎ末端配列がＳＦＰＱＲである２０１個のアミノ酸を含む点でフィブロラーゼとは異なる修飾フィブロラーゼである。このアミノ末端修飾は、可変量の環化グルタミン（ピログルタミン酸）が形成されて生成物の品質及び均一性のロット間ばらつきの原因になり得るアミノ酸残基の化学反応を防止するように設計されている。したがって、ＮＡＴは、より安定な分子と考えることができる。
【０００６】
これらの構造上の相違にもかかわらず、ＮＡＴとフィブロラーゼは酵素（線維素溶解）活性の点では類似している。生物活性におけるこの類似性は、ＭａｎｎｉｎｇがＴｏｘｉｃｏｎ、３３巻、１１８９〜１２００ページ（１９９５）において述べているように、フィブロラーゼ分子の活性サイトがアミノ酸１３９〜１５９に広がっており、その予測される三次元空間位置がアミノ末端から離れているとするデータと一致する。フィブロラーゼとＮＡＴ分子の活性サイトは、３個のヒスチジン残基と錯体を構成している亜鉛原子を含んでいる。
【０００７】
毒液に由来するフィブロラーゼに関する文献は、Ｌｙｓ４１３−Ｌｅｕ４ｌ４部位におけるフィブリノーゲンに対するそのタンパク質分解活性、及びＡｌａ１４−Ｌｅｕ１５部位におけるインスリンの酸化β鎖に対するそのタンパク質分解活性を示している；Ｒｅｔｚｉｏｓ及びＭａｒｋｌａｎｄ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７４巻、３５５〜３６７ページ（１９９４）；Ｐｒｅｔｚｅｒ等、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８巻、１１０３〜１１１２ページ（１９９１）、並びにＰｒｅｔｚｅｒ等、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９巻、８７０〜８７７ページ（１９９２）。ＮＡＴも、同じ切断部位においてこれらの基質に対するタンパク質分解活性を有することが明らかになっている。
【０００８】
フィブロラーゼ、ＮＡＴなどの線維素溶解性メタロプロテイナーゼに対して、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔＰＡ）などの血餅溶解剤は、内在性線維素溶解系を活性化することによって血栓溶解を促進するプラスミノゲンアクチベータである。より具体的には、プラスミノゲンアクチベータは、プラスミノゲンからセリンプロテアーゼの一種であるプラスミンへの転化を触媒する。プラスミンは、フィブリノーゲン及びフィブリンをアルギニル−リジル結合で切断することができ、プラスミノゲンアクチベータが最終的にフィブリン分解や血餅溶解に影響を及ぼすのはプラスミンが産生されるためである。現在市販されている血栓溶解剤は、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ｔＰＡなどのプラスミノゲンアクチベータである。
【０００９】
プラスミノゲンアクチベータクラスの血栓溶解薬とは異なり、フィブロラーゼ、ＮＡＴなどの線維素溶解性メタロプロテイナーゼは、内在性線維素溶解系（プラスミノゲンからプラスミンへの転化）に依拠しない。したがって、このクラスの血餅溶解剤は、その独特な作用様式によってプラスミノゲンアクチベータと区別することができ、「直接的な」線維素溶解剤として定義される。
【００１０】
アルファ２−マクログロブリンは、哺乳動物の血清中に広く認められるプロテイナーゼ阻害剤であり、最も大きな血清タンパク質の１つである（分子量７２５キロダルトン）。プロテイナーゼに対するα２−マクログロブリンの特異性は広範にわたり、セリン、システイン、アスパラギン酸及びメタロプロテイナーゼクラスに及ぶ。α２−マクログロブリン分子は同一サブユニットの四量体であり、ジスルフィド結合によって対になり分子の半分が非共有結合性会合をしている。したがって、還元条件下では、未修飾α２−マクログロブリンをその４個の単量体サブユニットに解離させることができる。
【００１１】
α２−マクログロブリンの各サブユニットは、タンパク質分解性切断に対して極めて感受性の高い領域（「餌（ｂａｉｔ）」領域）を有する。餌領域のタンパク質分解によってα２−マクログロブリンのコンホメーションが変化し、それによってα２−マクログロブリン分子構造内にプロテイナーゼが閉じ込められる。このプロセスは、「ハエジゴク（ｖｅｎｕｓ  ｆｌｙ−ｔｒａｐ）」相互作用として文献に記載されている。プロテイナーゼが閉じ込められると、立体障害を受け、したがってその巨大分子基質に近づくことができなくなる。
【００１２】
また、α２−マクログロブリンと、それが捕捉した多数のプロテイナーゼとの間で共有結合を形成することができる。上述したように、プロテイナーゼが閉じ込められると、α２−マクログロブリン分子のコンホメーション変化が起こる。このコンホメーション変化によって、α２−マクログロブリン分子内部のチオエステル結合の反応性が高くなり、閉じ込められたプロテイナーゼの求核性残基（リジンなど）と共有結合を形成することができると推定される。したがって、全身循環では、α２−マクログロブリンは、様々なプロテイナーゼを効果的に中和することができる。
【００１３】
さらに、プロテイナーゼの捕捉によってもたらされるα２−マクログロブリンのコンホメーション変化から、細網内皮系によって認識される形状が生じる。α２−マクログロブリンに閉じ込められたプロテイナーゼのクリアランスは、一般に、半減期が分単位であり、マクロファージ、肝細胞及び繊維芽細胞上で発現される低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質によって行われると考えられる。α２−マクログロブリンの詳細については、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、（１９８１）、７３７〜７５４ページを参照されたい。
【００１４】
α２−マクログロブリンは、フィブロラーゼ、ＮＡＴなどのプロテイナーゼと巨大分子複合体を形成することができる。α２−マクログロブリンとともに解離可能な複合体を形成することができる一部のプロテイナーゼとは異なり、フィブロラーゼ及びＮＡＴは、生理条件下ではα２−マクログロブリンから解離することができない複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼの２つの例である。例えば、精製ヒトα２−マクログロブリンとＮＡＴを一緒にインキュベートすると、複合体の形成が数秒で始まり数分でほぼ完結する。この現象は、インビトロでの複合体形成が急速であり、α２−マクログロブリンとＮＡＴなどの線維素溶解性メタロプロテイナーゼとのインビボでの複合体形成が速いことを示唆している。
【００１５】
α２−マクログロブリンは主要な血漿タンパク質の１つであるが、線維素溶解性メタロプロテイナーゼに結合し中和することができる循環内のα２−マクログロブリン量は限られている。したがって、α２−マクログロブリン結合能は飽和し得る。α２−マクログロブリン結合能を超えると、試料に添加される線維素溶解性メタロプロテイナーゼに比例して非結合性線維素溶解性メタロプロテイナーゼ濃度が上昇する。
【００１６】
患者の全身循環中にα２−マクログロブリンが存在することによって、全身の血液循環中のα２−マクログロブリンが結合するフィブロラーゼ、ＮＡＴなどの線維素溶解性メタロプロテイナーゼの全身（例えば、静脈内）投与が困難になる。このような線維素溶解性メタロプロテイナーゼの全身投与量が先天的α２−マクログロブリン飽和レベルを超えない限りは、線維素溶解性メタロプロテイナーゼはほぼ中和されて治療上無効になる。
【００１７】
ウサギで実施されたあるインビボ研究では、毒液に由来するフィブロラーゼの生物学的効果が静脈内全身投与後に調べられた。Ａｈｍｅｄ等、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、前出。使用されたフィブロラーゼ用量は３．７ミリグラム／キログラムであり、３．０キログラムのウサギでは約６０マイクログラム／ミリリットルの最終血中濃度になると推定された。この量は、血液又は血漿存在下でのおそらくはα２−マクログロブリンによるこの酵素の不活性化を調べる研究に基づいて選択された（３３６及び３３９ページ参照）。
【００１８】
別のインビボ研究では、イヌにおいて、血餅溶解に対する組換えフィブロラーゼの生物学的効果が調べられた。Ｍａｒｋｌａｎｄ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、前出。左頚動脈にあらかじめ誘発させた血栓の近位にカテーテルを用いて組換えフィブロラーゼ４ミリグラム／キログラム（動物体重）を５分間にわたって注入した（２４５０ページ参照）。フィブロラーゼの不活性化が、おそらくはα２−マクログロブリンが存在することによって全身血液循環中で起こることがここでも注目された（２４５４ページ、第２カラム、最終パラグラフ参照）。
【００１９】
これら２つの研究が示すように、α２−マクログロブリンの不活性化効果は、先天的α２−マクログロブリン飽和レベルを超える線維素溶解性メタロプロテイナーゼの投与又は全身投与量によって（ウサギの研究）、或いは血餅部位に局所的にこの酵素を送達し（イヌの研究）、全身投与を回避することによって克服することができる。一方、α２−マクログロブリン飽和レベルを超える線維素溶解性メタロプロテイナーゼ用量は、全身的に送達されても局所的に送達されても、治療対象に安全で忍容性が良好なレベルを超える恐れがある。特に、線維素溶解性メタロプロテイナーゼは、フィブリンを破壊するだけでなく、他の構造タンパク質も分解する恐れがあり、したがって、α２−マクログロブリン飽和レベルを超えて多量に存在するときにはインビボで毒性となり得る。
【００２０】
血餅などのフィブリンを主体とする閉塞の形成は、留置カテーテルなどの血管アクセス装置を使用したときにも問題になる。カテーテル、アクセスグラフト（ａｃｃｅｓｓ  ｇｒａｆｔ）、シース、針、動静脈瘻、シャントなどの血管アクセス装置の反復使用又は長期使用を必要とする疾患は多数ある。例えば、血液透析、化学療法、血液注入又は交換に付随する様々な手順、及び繰り返しの静脈内又は動脈内薬物送達（又は体液回収）を含めた他の手順は、留置カテーテルなどの恒久的又は半恒久的移植医療用具の使用を必要とすることがある。血餅は、血管空間に導入された装置中に、装置周辺に、又は装置に付着して、特に装置が血管空間に長期間置かれる場合、又は装置が１個以上の極めて小さな開口を有する場合に形成され得る。また、他のフィブリンを主体とする閉塞は、留置血管アクセス装置のあらゆる部分に付着して装置の正常な機能を阻害し妨げる恐れがある。
【００２１】
留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺に形成された、又は装置に付着して形成された血餅などの閉塞を処理、すなわち、破壊、分解又は溶解する迅速で効率的な方法を有することは有用なはずである。血管アクセス装置中又は装置周辺に形成された血餅を処理する効率的方法がない場合には、医師が留置装置を交換しなければならない場合もあり、コスト及び患者へのリスクが増す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
したがって、本発明の一目的は、留置血管アクセス装置中又は装置周辺の血餅又は閉塞を処理する安全で有効な方法を提供することである。
【００２３】
本発明の一目的は、完全に又は部分的に閉塞された留置血管アクセス装置の開通性を回復する方法を提供することでもある。
【００２４】
本発明の別の目的は、フィブリンを主体とする閉塞によって機能が変化した留置血管アクセス装置の機能を回復する方法を提供することである。
【００２５】
本発明の一目的は、局所投与された線維素溶解性メタロプロテイナーゼを使用して血餅をインビボで溶解する安全で生物学的に有効な方法を提供することでもある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
ある実施形態において、本発明は、薬剤として許容される溶液中の線維素溶解性メタロプロテイナーゼの、治療を受けるヒト対象の体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えない量を血管アクセス装置を介して投与することによって、留置血管アクセス装置中の血餅を処置する方法である。ある実施形態において、血管アクセス装置は、ヒト対象の動脈又は静脈中に留置される。ある実施形態において、留置血管アクセス装置は、カテーテル、シャント、アクセスグラフト、針又はシースである。ある実施形態において、血管アクセス装置は血管野から血液を導入し、又は抜き出すために使用される。ある実施形態において、本発明の血管アクセス装置は、血液透析、輸血、抜き出し若しくは交換、化学療法、又は他の、静脈若しくは動脈からの血液の導入若しくは抜き出しを必要とする任意の手順に関連して使用される。
【００２７】
ある実施形態において、本発明は、薬剤として許容される溶液中のアルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼの、ヒト対象におけるアルファ−２マクログロブリン飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量を血餅に局所投与することによって、留置血管アクセス装置中の血餅を溶解する方法である。
【００２８】
ある実施形態において、本発明は、完全に又は部分的に閉塞された留置血管アクセス装置の開通性を回復する方法である。ある実施形態においては、本発明は、留置血管アクセス装置の機能を回復する方法である。
【００２９】
ある実施形態において、本発明は、例えばカテーテルなどの血管アクセス装置を使用して、生物学的有効量の安全な線維素溶解性メタロプロテイナーゼを血餅に局所投与することを含む、ヒト対象における血餅を線維素溶解性メタロプロテイナーゼによってインビボで処理する方法である。一般に、フィブリン血餅は、ヒト対象中の血管（動脈又は静脈、天然又は人工（例えば、移植））中に動かずに存在する。ある実施形態において、本発明は、留置カテーテル、シャント、針などの血管アクセス装置の中若しくは周囲に存在する血餅、又はそれらに付着して存在する血餅を処理する方法である。ある実施形態において、本発明は、完全に又は部分的に閉塞された留置血管アクセス装置の開通性を回復する方法である。ある実施形態において、本発明は、フィブリンを主体とする閉塞によって機能が変化した、又は一部損なわれた血管アクセス装置の機能を回復する方法である。
【００３０】
「安全な生物学的有効」量とは、治療を受ける患者の循環系中のα２−マクログロブリン飽和レベルをかなり上回るレベル（すなわち、血管壁に損傷を与える恐れがあるレベル）を超えずに、フィブリンを分解し、血餅（すなわち、血栓）を容易に溶解するのに十分な量である。一般に、この量は、インビトロでのα２−マクログロブリン含量及び結合能について試験されたヒト対象由来の血液試料を用いて実施された研究から求めて、治療を受けるヒト対象の体重１キログラム当たり０．０２５〜１．７ミリグラムである。このインビトロでの研究結果から、すべての実用目的についてα２−マクログロブリンのインビボでの飽和レベルを規定することができ、したがって、生物学的効果に必要な線維素溶解性メタロプロテイナーゼの最低レベルだけでなく、忍容性が良好な最大投与レベルも考慮した生物学的有効量を示すことができる。以下の実施例中でこの研究をさらに詳細に説明する。
【００３１】
線維素溶解性メタロプロテイナーゼの送達様式に使用される「局所（的）に」又は「局所（的）」という用語は、本明細書では、血餅自体（すなわち、血栓内）への直接の動脈内投与又は静脈内投与、或いは血餅の近く（血流よりも近位又は遠位）で線維素溶解性メタロプロテイナーゼの大部分が血餅によって吸収される十分に近距離での動脈内投与又は静脈内投与を意味する。血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅、又は装置に付着した血餅を処理する場合には、或いは血管アクセス装置の開通性又は機能を回復するためには、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの送達は、一般に、血管アクセス装置自体によって行われ、したがって本質的に局所的である。ある実施形態において、カテーテルなどの副次的な血管アクセス装置を使用して、ステントなどの移植された医療用具に線維素溶解性メタロプロテイナーゼを送達することができる。
【００３２】
「カテーテル送達手段」又は「血管アクセス装置」という用語は、流体を注入し又は抜き取るために、或いは通路の開放状態を保つために、溝、血管、通路又は体腔に挿入される管状の医療用具を指す従来の意味合いで使用される。一般に、このような手段は、通常、１本以上の内部通路（又は「穴（ｌｕｍｅｎ）」）、すなわち、材料（すなわち、血餅溶解剤）をカテーテル本体に導入し穴を通って流動させる近位部分と、先細の末端を場合によっては有する遠位部分と、加えた圧力に応じてカテーテルから材料が吐出される遠位部分末端又はその近くの１個以上の流出口を含む長く柔軟なカテーテル本体とを含む。
【００３３】
「タンパク質分解」、「分解」、「溶解」及び「処置」という用語は、本明細書ではすべて、血餅などのフィブリンを主体とする閉塞の分解、崩壊、解体、分割又は他の除去を指すために使用される。血餅は、血管又は医療用具の穴を部分的に又は完全に閉塞させることができる。同様に、「開通性の回復」とは、血管又は装置穴又は流出口を通る血流の、その中の血餅を溶解することによる、測定可能（例えば、体積又は速度）な増加を示すことを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する「血餅」又は「閉塞」という用語は、フィブリンを主体とする塊、クラスター、障害物又は増殖物を意味する。一般に、血餅は、血液が動脈又は静脈中で凝固し、そこを通る血流を完全に又は部分的に邪魔し、妨害し、遅らせ又は封鎖するときに生じる。血餅は、血管空間内に持ち込まれた異物中又はその周辺でも形成され得る。血餅は、血栓（血管中で形成されそこに留まる血餅）などのように定着するものもあれば、塞栓（形成部位から体内の別の位置に移動する血餅）などのように移動するものもある。血餅は、大きさ、形状及び組成も大きく変わり、球状の塊及びフラップ又は他の平面構造をとり得る。アテローム硬化型プラーク片、小さな腫瘍片、脂肪球、空気、羊水、又は血液中にある他の材料が、血餅と同様に作用することもある。このような塊が、線維素溶解性メタロプロテイナーゼによって分解されやすいフィブリン又は他の物質を含む限りは、本発明による一方法は、その処理に有用なはずである。
【００３５】
本発明の別の方法を、末梢動脈閉塞（ＰＡＯ）に関連して以下にさらに説明する。ＰＡＯは、アテローム性動脈硬化による末梢血管疾患に起因する。その症状は、アテローム性動脈硬化症の進行につれ何年にもわたって緩やかに進行し、下肢疾患患者の約１５〜２０％が重大な虚血レベルに達する。医学的治療は限られており、もっぱら脂質低下剤、抗血小板薬などの薬物療法、禁煙プログラムや運動によって予防やリスク軽減が図られる。Ｊａｃｋｓｏｎ及びＣｌａｇｅｔｔ、Ｃｈｅｓｔ、１１４巻、６６６Ｓ〜６８２Ｓページ（１９９８）。
【００３６】
末梢血管疾患の臨床症状には、四肢を脅かす虚血の急性発症、又は血管疾患のより慢性的徴候（すなわち、間欠性跛行）の存在が含まれる。慢性のＰＡＯは、一般に、極度の生活習慣の制限又は四肢を脅かす虚血が発生するまで、上記予防的処置以外の治療はされない。利用可能な医療行為としては、罹患した血管部位及び閉塞の程度に応じて、経皮経管的血管形成術、外科的血行再建術、血栓溶解などがある。いくつかの研究によれば、血餅溶解剤の動脈内注入、特に閉塞初期における血餅溶解剤の動脈内注入によって、外科的処置の必要性を回避することができる。急性ＰＡＯの治療においてプラスミノゲンアクチベータであるウロキナーゼを用いた血栓溶解と手術を比較したＲｏｃｈｅｓｔｅｒ治験において実証されたように（Ｏｕｒｉｅｌ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、１９９４、１９巻、１０２１〜１０３０ページ）、この研究の血栓溶解群患者の約３３パーセントが医療行為のみで順調に治療することができ、それによってより侵襲性の処置を回避することができた。これに対して、手術群の９８パーセントの患者は、血管内処置又は外科的処置を受けた。
【００３７】
急性心筋梗塞、虚血性脳卒中、深部静脈血栓症及び肺塞栓症を含めて、ただしこれらだけに限定されない、閉塞性血餅が関わる他の医学的障害を、本発明の方法によって類似の様式で有効に処置することができる。ある実施形態においては、本発明による方法を使用して、留置カテーテル、血液透析アクセスグラフトなどの慢性的移植医療用具で発生する血餅を溶解することもできる。他の例示的な移植医療用具としては、シャント、アクセス部品、針、シース、他の血管アクセス装置などがある。
【００３８】
ある実施形態において、α２−マクログロブリンと複合化し得るあらゆる線維素溶解性メタロプロテイナーゼの治療送達に本発明を適用することができる。このような線維素溶解性メタロプロテイナーゼは、天然のものである場合には、例えば、ヘビ毒液からのフィブロラーゼのようにその自然源から精製することができる。あるいは、その核酸配列及びアミノ酸配列が判明しているポリペプチド線維素溶解性メタロプロテイナーゼ薬を、従来の組換え発現法及び精製法を利用して製造することができる。
【００３９】
一般に、組換え方法は、適切な宿主細胞中で発現させるために適切なベクターに挿入される、目的とする線維素溶解性メタロプロテイナーゼをコードするＤＮＡ分子を使用する。ベクターは、使用される特定の宿主細胞において機能するように選択される。すなわち、ＤＮＡの発現が起こり得るように宿主細胞機構に適合したものである。ベクターは、５’フランキング配列（「プロモーター」とも呼ばれる）、発現するＤＮＡに作動可能に結合された他の発現調節性要素、並びに複製開始点要素、転写性終結要素、ドナー及び受容体スプライス部位を含む完全イントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位要素、ポリアデニレーション配列、コード核酸を挿入するポリリンカー領域、選択可能なマーカー要素などの他の公知の要素を含むこともできる。ベクターは、「タグ」配列、すなわち、ｐｏｌｙＨｉｓをコードするポリペプチドコード配列の５’末端又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド配列、或いは他の小さな免疫原性配列を場合によっては含んでいてもよい。このタグは、目的タンパク質とともに発現され、宿主細胞からこのポリペプチドを精製するための親和性タグとして働くことができる。所望であれば、続いてこのタグを精製ポリペプチドから様々な手段によって、例えば、選択的ペプチダーゼを使用して除去することができる。
【００４０】
ポリペプチドが宿主細胞から分泌されることが望ましい場合には、シグナル配列を使用してそれが合成された宿主細胞の外にポリペプチドを誘導することができる。一般に、シグナル配列は、核酸配列のコード領域にあり、又はコード領域の５’末端に直接位置する。多数のシグナル配列が特定されており、そのうち、選択された宿主細胞中で機能する任意のシグナル配列を使用することができる。
【００４１】
ベクターを構築し、ベクターの適切な部位に核酸を挿入した後に、完成したベクターを適切な宿主細胞に挿入して、増幅及び／又はポリペプチド発現させることができる。宿主細胞は、原核生物（エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）でも真核生物（酵母細胞、昆虫細胞、脊椎動物細胞など）でもよい。
【００４２】
適切な宿主細胞又は細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞とすることができる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、並びに形質転換方法、培養方法、増幅方法、スクリーニング方法及び生成物産生方法及び精製方法は当分野で公知である。他の適切な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ−１及びＣＯＳ−７細胞系、並びにＣＶ−１細胞系である。さらに例示的な哺乳動物宿主細胞としては、形質転換細胞系を含めて、霊長類細胞系及びげっ歯類細胞系が挙げられる。正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養によって得られる細胞株、並びに初代外植片も適切である。候補細胞は、遺伝子型として選択遺伝子が欠損していてもよく、又は優性選択遺伝子を含んでいてもよい。さらに別の適切な哺乳動物細胞系としては、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ又はＮＩＨマウス由来の３Ｔ３系、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞系などがあるが、これらだけに限定されない。
【００４３】
細菌細胞、例えば、様々な系統のエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び様々な系統の酵母細胞も宿主細胞として有用である。
【００４４】
選択された宿主細胞へのベクターの挿入（「形質転換」又は「形質移入」とも呼ぶ）は、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、微量注入法、リポフェクション法又はＤＥＡＥ−デキストラン法のような方法を用いて実施することができる。選択される方法は、使用する宿主細胞タイプによってある程度決まる。これらの方法及び他の適切な方法は、当業者には周知である。
【００４５】
この宿主細胞を適切な条件下で培養すると、目的とする線維素溶解性メタロプロテイナーゼを合成することができる。宿主細胞は、当業者には周知である標準培地を使用して培養することができる。培地は、通常、細胞の増殖及び生存に必要なすべての栄養素を含む。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を培養するのに適切な培地は、例えば、ルリアブロス（ＬＢ）及び／又はテリフィックブロス（ＴＢ）である。真核細胞を培養するのに適切な培地はＲＰＭＩ  １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、これらはすべて、培養される特定の細胞系に必要とされる血清及び／又は増殖因子を補充することができる。
【００４６】
一般に、形質転換細胞のみの選択的増殖に有用な抗生物質などの化合物をサプリメントとして培地に添加する。使用すべき化合物は、宿主細胞を形質転換したプラスミド上に存在する選択可能マーカー要素によって決まる。例えば、選択可能マーカー要素がカナマイシン耐性である場合には、培地に添加する化合物はカナマイシンである。
【００４７】
宿主細胞中で産生されるタンパク質の量は、ウエスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降、及び／又は活性アッセイＤＮＡ結合ゲルシフト法を含めて、当分野で既知の標準方法によって評価することができる。
【００４８】
タンパク質がグラム陰性細菌以外の宿主細胞から分泌される場合には、その大部分は細胞培地中に見出される可能性が高い。分泌されない場合には、細胞質中に存在するはずである。細胞内タンパク質の場合には、一般に、宿主細胞をまず機械的に破壊する。周辺質部位を有するタンパク質の場合には、機械的破壊又は浸透圧処理によって周辺質内容物を緩衝溶液中に遊離させ、次いでこの溶液からポリペプチドを単離することができる。溶液からの精製は、その後に様々な技術を用いて実施することができる。
【００４９】
タンパク質が、そのカルボキシル末端又はアミノ末端にヘキサヒスチジン、他の小ペプチドなどのタグを含むように合成された場合には、溶液をアフィニティーカラムに通すことによって一段階プロセスで本質的に精製することができる。この場合、カラムマトリックスは、タグに対して又は直接ポリペプチドに対して（すなわち、モノクローナル抗体）高親和性を有する。ポリペプチドがタグを持たず、抗体も利用可能できない場合には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶出と組み合わせたネイティブゲル電気泳動、及び分離用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」装置／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの他の周知の精製手順を使用することができる。これらの技術を２つ以上組み合わせて純度を高めることもできる。
【００５０】
本発明の実施を説明するために本明細書で利用する新規作用血栓溶解（ＮＡＴ）ポリペプチドは、一般に、配列番号１の線維素溶解性メタロプロテイナーゼである。ＮＡＴポリペプチドは、配列番号２のｃＤＮＡ分子によってコードされるが、同じポリペプチドをコードする配列の異なる任意のＤＮＡ分子を、さらに以下に示す特定の方法に従って発現及び製造に使用することができる。
【００５１】
フィブロラーゼは、科学文献及び特許に記載されている。上記文献を参照されたい。一般に、本発明の実施に使用される形式のフィブロラーゼは配列番号３のものである。これは、配列番号４のｃＤＮＡ分子、又は同じアミノ酸配列をコードするその変異体によってコードされる
ＮＡＴの組換え発現には酵母発現系を使用することが好ましい。なかでも、使用に最も有利で好ましいものとして、ピキア種、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。このような系の詳細な説明は、米国特許第４，８５５，２３１号（Ｓｔｒｏｍａｎ他）、米国特許第４，８１２，４０５号（Ｌａｉｒ他）、米国特許第４，８１８，７００号（Ｃｒｅｇｇ他）、米国特許第４，８８５，２４２号（Ｃｒｅｇｇ）、及び米国特許第４，８３７，１４８号（Ｃｒｅｇｇ）などに見られ、それらの開示を参照により本明細書に援用する。このような系におけるフィブロラーゼの発現は、一般に、「成熟」ポリペプチド（ヌクレオチド７８４〜１３９２）に加えて「プリプロ」配列（ヌクレオチド１〜７８３）をコードする配列番号５のＤＮＡ分子を必要とする。このような系におけるＮＡＴの発現は、一般に、「成熟」ポリペプチド（ヌクレオチド７８４〜１３８６）に加えて「プリプロ」配列（ヌクレオチド１〜７８３）をコードする配列番号６のＤＮＡ分子を必要とする。
【００５２】
本発明によって使用される線維素溶解性メタロプロテイナーゼは、ＮＡＴ、フィブロラーゼ、又はある種の他の線維素溶解性メタロプロテイナーゼであろうと、薬剤的に許容される溶液の形で、単体で、又は薬剤的に許容される追加の成分を加えて投与される。所望であれば、このような溶液は、線維素溶解性メタロプロテイナーゼ及び溶媒（すなわち、蒸留水又は生理食塩水）に加えて、（水性媒体中でのタンパク質凝集又は物理分解又は化学分解を防止する）安定剤、（バルクを形成する）増量剤、希釈剤、抗菌剤、粘度調節剤、抗酸化剤など通常の量の標準成分を含むことができる。製剤に入れることができる公知の賦形剤としては、（マンニトール、ソルビトール及びグリセリンを含めた）ポリオール、（グルコース及びスクロースを含めた）糖、（アラニン、グリシン及びグルタミン酸を含めた）アミノ酸などがある。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａを参照されたい。本発明に有用な様々な組成の線維素溶解剤を開示する国際公開第０１／２４８１７号Ａ２（その全体を参照により本明細書に援用する）も参照されたい。
【００５３】
医薬組成物は、投与前に中性（７．０）又は中性付近のｐＨ、通常は約６．５〜約８．０ｐＨ（±０．５）に（生体適合性緩衝剤、例えば、クエン酸又はクエン酸塩によって）緩衝することが望ましい。
【００５４】
フィブロラーゼ、ＮＡＴなどのように線維素溶解性メタロプロテイナーゼの金属イオンが亜鉛である場合には、水溶性亜鉛塩（例えば、硫酸亜鉛又は酢酸亜鉛）を安定剤として入れることが好ましいことがある。組成物の長期安定性をさらに高め、有効期間をさらに延長するには、溶液を凍結させるか、使用前に解凍又は元に戻す凍結乾燥（フリーズドライ）生成物に転化することが有利な場合もある。
【００５５】
説明のために述べると、本発明による方法に使用することができる凍結可能な薬用液体組成物は、フィブロラーゼ又はＮＡＴ、水溶性亜鉛塩、クエン酸緩衝剤を含み、水溶性カルシウム塩からなる群から選択される追加の安定剤や増量剤（例えば、マンニトール）を含んでいてもよい。Ｔｗｅｅｎ  ８０（ＢＡＳＦ、Ｇｕｒｎｅｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）などの界面活性剤を添加して凍結融解安定性を高めることもできる。Ｔｒｉｓ緩衝剤（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、又は緩衝能がｐＨ７．０を超える別の緩衝剤を添加してｐＨを７．４又はそれ以上に安定化させることもできる。これらの成分のほとんどは、０．００１〜２．０ミリモル（ｍＭ）又は１０パーセント（ｗ／ｖ）未満の少量である。緩衝剤は所望のｐＨを得るのに十分な量だけ添加され、この量は特定の処方に応じて変わり得る。
【００５６】
さらに説明のために示すと、本発明による方法に使用できる凍結乾燥可能な医薬組成物又は凍結乾燥された医薬組成物は、フィブロラーゼ又はＮＡＴ、亜鉛安定剤（例えば、上記のものなどの水溶性亜鉛塩）及びクエン酸緩衝剤を含み、他の賦形剤（例えば、マンニトール、グリシンなどの増量剤）を含んでも含まなくてもよい。凍結乾燥組成物は、分散保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）としてスクロース、トレハロースなどの二糖を含むこともできる。Ｔｗｅｅｎ  ８０などの界面活性剤を添加して、凍結乾燥応力から線維素溶解性メタロプロテイナーゼ（例えば、フィブロラーゼ又はＮＡＴ）を保護することもできる。ｐＨは、ｐＫａがこの範囲にある適切な緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）を用いてｐＨ８．０±０．５に維持することが理想的である。各成分量は、上記したとおりである。
【００５７】
上述したように、ある実施形態においては、本発明の方法を使用して、０．０２５〜１．７ｍｇ／ｋｇの用量範囲にある生物学的有効量の線維素溶解性メタロプロテイナーゼを局所投与する。この量は、約０．１〜約０．５ｍｇ／ｋｇの範囲にあることが好ましい。投与時に必要に応じて希釈して溶液強度をしかるべく調整する。
【００５８】
ＰＡＯなどの自然の動脈又は静脈における血栓症の治療とは対照的に、移植又は留置血管アクセス装置中で発生する血餅の処理はさらに難題である。例えば、閉塞された中心静脈ラインの場合には、カテーテルの「デッドボリューム」（すなわち、カテーテルの内径ｘその長さ）はカテーテル内に含まれ得る最大容積である。例えば、内径１．０ｍｍ、長さ４０．０ｃｍのカテーテルは、デッドボリュームが約０．３ｍｌである。そのように容積が限られているので、適正な溶液強度を定義することは重要である。したがって、溶液強度又は濃度を増加させることは、標的血餅を溶解するのに利用可能な薬物量を増加させる有効な手段である。
【００５９】
ある実施形態においては、本発明による方法は、血管アクセス装置に関連する閉塞の処理に対する線維素溶解性メタロプロテイナーゼの使用に関する。このような血餅は、血管アクセス装置中で、装置周辺で、又は装置に付着して起こり得る。一般に、血餅は、カテーテルなどの装置の穴又は流出口に形成され、カテーテルの機能を損なう恐れがある。血餅は、流出口を覆うことができる弁などの血管アクセス装置外部でも発生することがあり、それによって薬物の導入又は血液の抜き出しが妨げられる。血餅は、血管アクセス装置に付着して装置の正常な機能を損なうこともある。障害は部分的閉塞又は封鎖から生じ、すなわち、血液の一部が通過することができる場合もあれば、血液が全く通過できない完全な閉塞もある。
【００６０】
本発明による一方法を実証するために、インビトロでのカテーテル血栓モデルを使用して、留置カテーテル型装置における血餅をシミュレートした。このモデルでは、コラーゲン被覆されたパスツールピペットを使用して、カテーテルの留置部分をシミュレートした。フィンガースティック（ｆｉｎｇｅｒ  ｓｔｉｃｋ）を用いた毛管作用によってヒトの血液を長さ３．０ｍｍだけ抜き取り、凝固させた。１本のピペットの先端を食塩水を含むバイアルに挿し、別のピペットをＮＡＴ溶液４ｍｇ（４０ｍｇ／ｍｌ溶液濃度１００ｕｌ）に挿した。図５に、このインビトロでのカテーテル血栓モデルの結果を示す。図５によれば、食塩水中の血餅は変化していないが、４０ｍｇ／ｍｌ中の血餅は血餅を溶解するのに活性である。
【００６１】
別の実験においては、（それぞれがその先端に血餅を含む）別個のグループのピペットを、食塩水１００ｕｌ、ウロキナーゼ溶液（５０００ＩＵ／ｍｌ）１００ｕｌ及びＮＡＴ溶液１００ｕｌを含むバイアルに挿し、その中でインキュベートした。ここで、溶液強度を５ｍｇ／ｍｌから４０ｍｇ／ｍｌに増加させることによって、薬物量を０．５から４ｍｇに変化させた。図６に多数の実験結果を要約して示す。得られた平均データによれば、ＮＡＴは、市販のカテーテル清掃用ウロキナーゼ製品であるアボキナーゼ（登録商標）、Ｏｐｅｎ  Ｃａｔｈ（登録商標）よりも最大で４０％速く閉塞をインビトロで解消する（第２カラム、ＵＫ  ５００Ｉ．Ｕ．）。図６は、ＮＡＴが血餅に作用してタンパク質分解する速度はＮＡＴの用量に依存することも示している。
【００６２】
インビトロでのカテーテル血栓モデルによってシミュレートされたような比較的小さな留置カテーテル閉塞を処理する場合には、好ましい処理範囲は、フィブロラーゼ、ＮＡＴなどの線維素溶解性メタロプロテイナーゼで約５〜４０ｍｇ／ｍｌである。しかし、血管アクセス装置などの医療用具のタイプ及びサイズ、並びに血餅又は閉塞の位置、サイズ及び程度に応じて、より少ない用量又はより多い用量が必要となり得る。例えば、比較的大きい血液透析シャント中の血餅は、直径１．０ｍｍのカテーテル流出口を封鎖する血餅よりも高濃度の線維素溶解性メタロプロテイナーゼを必要とする可能性が高い。したがって、この指標となる濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ以下から、８０ｍｇ／ｍｌを超えるどの範囲にもなり得る。
【００６３】
留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺にある血餅又は装置に付着した血餅の場合には、パルス状注入、連続注入、ボーラス投与、又は３つすべての組み合わせを含めて無数の方法で有効量を送達することができる。「デッドボリューム」の制約による困難があるとすれば、ボーラス投与が一般に好ましい。
【００６４】
典型的な場合において、本発明による方法は、カテーテルを主体とする血栓溶解手順と組み合わせて実施することができる。このような手順は、あらかじめ滅菌したカテーテル型薬物送達装置を使用する必要があり、その側壁は、薄い半硬質又は柔軟な生体適合性材料（例えば、ポリオレフィン、フルオロポリマーなどの不活性ポリマー）で作製することができる。一般に、適切なカテーテルは、装置の長さ方向の少なくとも１個の内部空洞（又は穴）を有する。カテーテルを構成する材料は、血管壁に損傷を与えずに脈管構造内を移動させるのに十分な柔軟性と、装置の内部空洞が完全に広がったまま処理部位までの距離にわたって延びるのに十分な剛性を有する。一般に、このようなカテーテル装置は、カテーテル直径がフレンチスケールで２〜２０（１／３ミリメータ＝１フレンチ）であり、長さが２〜６フィート（６０ｃｍ〜１８０ｃｍ）以上である。
【００６５】
本発明による血栓溶解薬物を血管内送達する例示的なカテーテル装置を図２及び３に示す。その実際的な適用例を以下の実施例で詳細に説明する。しかし、本明細書に示す特定の装置を含めて、ただしこれらだけに限定されないこの方法に適切な従来の任意のカテーテル送達装置又は血管アクセス装置を利用することができる。
【００６６】
例えば、図２は、血管中での血栓溶解剤の局所送達用に設計されたタイプのカテーテル装置である。側断面図で示されたこの装置は、加えられた流体圧力下で注入剤（血栓溶解剤）が放出される「側穴（ｓｉｄｅ  ｈｏｌｅｓ）」を送達末端に含む。この図及び次の図のカテーテル管の直径は、詳細に示すために全体のサイズに対して拡大してある。血管中での血栓溶解剤の別のタイプの局所送達用カテーテル装置の側断面図である図３も参照されたい。この装置は、カテーテル内部の流体圧力が臨界点に達したときに、スリットが開いて注入剤が流出するように、カテーテル壁に一定間隔で刻まれた「圧力応答流出口（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｕｔｌｅｔ）」（ＰＲＯ）と称する細いスリットを有する。この装置は、薬物注入のパルスを送達することができる自動ピストン駆動パルス注入装置（図示しないが、さらに以下に例示する）とともに使用することができる。
【００６７】
静脈又は動脈内に発生し、血管アクセス装置などの医療用具の導入に関連しない血餅の場合には、パルス状注入、連続注入、ボーラス投与、又は３つすべてを組み合わせて、カテーテルを通して局所的処理部位に有効量の線維素溶解性メタロプロテイナーゼを送達することができる。処理溶液中の線維素溶解性メタロプロテイナーゼの溶液強度（すなわち、濃度）も、これらのタイプの血餅には重要なパラメータである。より具体的には、（ボーラス投与に特に重要な）線維素溶解性メタロプロテイナーゼの有効性が最も低い最低希釈と、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの有効性が最も高い最大溶解性との間の範囲を選択すべきである。一般に、約０．１〜約８０ｍｇ／ｍｌの溶液強度が使用される。次いで、上記範囲内の有効量の線維素溶解性メタロプロテイナーゼを送達するようにボーラス体積（又は「パルス」送達の場合には複数のボーラスの総体積）を選択する。
【００６８】
具体的実施形態の説明
本発明を以下の実施例でさらに説明する。これらの実施例は、説明のためだけのものであって、本発明を記載した実施形態に限定するためのものではない。これらの実施例においては、並びに本発明の記載を通して、「ｋｇ」は試験対象の体重のキログラムであり、「ｍｇ」はミリグラムであり、「ｍＬ」はミリリットルであり、「ｍｉｎ」は分である。示した線維素溶解性メタロプロテイナーゼ、すなわち新規作用血栓溶解剤（ＮＡＴ）は、上述した方法に従って組換えられ調製されたものである。
【実施例１】
【００６９】
成体ブタの総頚動脈亜急性血栓症における血栓溶解
契約研究所（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）において、平均体重７５ｋｇの成体ブタの頚動脈亜急性血栓症モデルにおけるＮＡＴを試験した。この試験の意図は、ヒトの末梢血管閉塞に関連する血栓症モデルにおけるＮＡＴの線維素溶解活性を証明することであった。
【００７０】
この動物モデルにおいては、バルーン傷害、トロンビン及び血行停止を組み合わせて、頚動脈全体の長さ（大動脈の起点から頚動脈分岐部までの約２０センチメートル）に沿って頚動脈に血栓を形成させた。この血栓サイズは、末梢動脈閉塞のヒトにおいて臨床的に見られる血栓サイズに近い。血栓が順調にできた後に、この動物を４日間回復させた。４日間は、フィブリンの大規模な架橋、血栓の再構築、及び細胞の浸潤を起こさせるために設定された。特に、このモデルにおける血栓のサイズ及び期間は、ヒトの末梢動脈閉塞におけるプラスミノゲンアクチベータを用いた血栓溶解について最近出版されたＴＯＰＡＳ治験に報告された虚血症状のサイズ及び期間を正当に再現するものである。参考のため、Ｏｕｒｉｅｌ等、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３８巻、１１０５〜１１１１ページ（１９９８）を参照されたい。
【００７１】
手短に述べると、蛍光透視法により誘導されたバルーンによる傷害によって、総頚動脈の全体の長さに沿って血栓を形成させることができる。使用するバルーンは必要以上に大きく不適格なものである。バルーンを最高１２気圧で膨張させて、血管内膜層に挫傷を生じさせる。バルーンを膨張させている間に、血管内皮を剥ぎ取るためにそれを前後させる。
【００７２】
このバルーニング法は、極めて傷害性が高く、血栓形成性の高い血管表面を形成し、総頚動脈全体の長さにわたって繰り返される。動脈全体に徹底して傷害を与えた後に、大動脈近くの近位にバルーンを引っ込め、膨張させて血管を通る血流を遮断する。遮断している間に、凝固を刺激するためにバルーンカテーテルの遠位ポートを通してウシのトロンビン５０単位を注射する。バルーンを３０分間膨張させたままにすると、血管の血栓閉塞が起こる。３０分後にバルーンを収縮させ、血管造影図を撮影して血管が閉塞されたことを確認する。これらの手順を用いて、９０パーセントを超える確率で血管閉塞が得られた。
【００７３】
図１Ａは、バルーンカテーテルによってもたらされる傷害及び閉塞性血栓形成前の、成体ブタの頚動脈の基準血管造影図である。矢印は、左総頚動脈中の造影剤の位置及び存在を示し、動脈中の血流が遮られていないことを示している（すなわち、血管は「開存性」又は「」である）。図１Ｂは、４日目に本発明の方法によってＮＡＴを投与する前に撮影された同じ動物の血管造影図である。矢印は、左総頚動脈の位置を示しているが、閉塞性血栓が存在するために造影剤は動脈中を流れていない。図１Ｃは、「ＰＲＯ」カテーテル（この装置図については図３を参照されたい）を通してＮＡＴ３０ｍｇを投与してから２時間後の血管造影図である。矢印は、血管中に造影剤が存在することを示しており、左頚動脈の開通性が回復したことを示している。動脈管腔中に極小の残留血栓が見られる。
【００７４】
血栓が形成された後に、バルーンカテーテル、ガイドカテーテル及びアクセスシースを取り外し、動物を４日間回復させる。４日目に、動物に再度麻酔をかけ、閉塞を再確認し、複数の側穴を有する薬物送達カテーテル（図２及び３を参照されたい）を蛍光透視誘導装置下で進め、側穴が血栓内に位置するように配置する。１０〜３０ｍｇ（又は体重補正基準で約０．１〜０．４ｍｇ／ｋｇ）の固定ＮＡＴ投与量を使用して、図１Ａ〜１Ｃに示すように、ＮＡＴによる血栓溶解が血管造影によって観察された。
【００７５】
図１Ｂの造影図が示すように、ＮＡＴは、血管造影法によって判断して、順行性血流を回復するのに有効である。より定量的に述べると、標的血管中の血流は４段階（０〜３）で定性的に採点される。
【００７６】
０＝血流なし
１＝（血栓が形成されていない）反対側の頚動脈の３０％未満と推定される血流
２＝反対側の頚動脈の３０〜８０％と推定される血流
３＝反対側の頚動脈と区別不能な血流
図１Ｂに示した造影図は血流グレード３と採点され、血栓が形成され、３０ｍｇ固定ＮＡＴ投与量（７５ｋｇのブタで約０．４ｍｇ／ｋｇ）で処理された血管では普通の結果であった。以下の実施例の表１〜３は、治療計画と、連続血管造影図から得られた平均血流スコアである。すべての試験において、呼吸、体温、心拍数及び動脈圧が連続してモニターされ、ＮＡＴの投与による変化は認められず生理的範囲内とどまった。
【実施例２】
【００７７】
ＰＲＯカテーテルとパルススプレー送達の選択
末梢動脈閉塞の臨床治療においては、血栓溶解剤は、血栓の近くに位置するカテーテル又は血栓に埋め込まれたカテーテルを通して送達される。図２及び３に示すように、一般に使用されるカテーテルには２つのタイプがある。
【００７８】
その１つの「側穴」カテーテル（図２）は、閉じた遠位末端６近くのカテーテル（４）に刻まれた小さな丸い側穴（２）、及び近位末端１２に取り付けられた接続リング１０中の（線維素溶解性メタロプロテイナーゼ溶液用）流入口８を有する。カテーテル４は、中空薄肉の長い柔軟な生体適合性ポリマー管材料で構成され、２〜２０フレンチ、好ましくは３〜５フレンチの均一な直径を有する。カテーテルは、側穴２を含むカテーテル部分を仕切る２個の放射線不透過性マーカー１４を遠位末端６近くの外面に有する。実際には、閉塞動脈又は静脈中の外科的開口にカテーテルを挿入し、標準の承認された手順に従って蛍光透視によって観察しながら、遠位末端６が血栓中又はその近くに位置するように慎重に血管を通して動かす。蛍光透視画像上に明瞭に現れるマーカー１４は、側穴２から流出する注入剤が血栓に直接接触するようにカテーテル部分を位置決めするガイドとして役立ち得る。次いで、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの薬剤溶液を軽い圧力でシリンジ様容器１６から流入口８に注入し、遠位末端６方向に押し進め、穴２を通って血栓中に流出させ、線維素性材料を分解させる。
【００７９】
このタイプのカテーテルを使用して線維素溶解性メタロプロテイナーゼを注入するときには、線維素溶解剤含有溶液の大部分は、近位の側穴（すなわち、薬物流入口８に近い側穴）を通って流出しやすく、処理部位における薬物送達の均一性が損なわれる。負圧下では側穴２を通ってカテーテル中に血液が逆流する恐れもある。
【００８０】
図３に示す別の種類のカテーテルも中空薄肉の生体適合性ポリマー材料で構成され、閉じた遠位末端６近くの柔軟なカテーテル４に規則的な間隔でレーザー切断された極めて細いスリット２を有する。圧力応答流出口（「ＰＲＯ」）と呼ばれるスリットは十分堅く閉まっており、カテーテル内の流体圧が臨界点に達し、同時にスリットを広げさせ、それによって一時的に開口しない限り、注入剤は流出しない。このカテーテルも、血栓部位に装置を位置決めするのに役立つ放射線不透過性マーカー８を外面に備えることができる。
【００８１】
このような「ＰＲＯ」注入カテーテルは、カテーテル４の近位末端１４に取り付けられた接続リング１２中の流入口１０に低体積の調節された薬物注入パルスを送達させることができる自動ピストン駆動パルス注入装置（図示せず）とともに使用することが理想的である。パルスを送達すると、カテーテル内部の圧力が一時的に上昇する。これに応じて、圧力応答流出口（スリット２）が一次的に開き、注入剤（例えば、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの薬剤溶液）が流出する。注入剤のパルス送達とＰＲＯタイプカテーテルの理論上の利点は、注入剤がスリットを通してカテーテル全長にわたって均一に送達されることにある。これに対し、「側穴」カテーテル（図２）を通って送達される注入剤は、最小抵抗の経路に従い、上述したように近位の側穴から不均一に流出する。
【００８２】
４日間の頚動脈血栓症のブタモデルを利用し、ＮＡＴ３０ｍｇ（７５ｋｇのブタで約０．４ｍｇ／ｋｇ）の固定投与量で上述の２タイプのカテーテルの性能を評価した。結果を表１に要約する。
【００８３】
【表１】
2005530846.tif 000002
ＣＭ：Ｃｒａｇｇ−ＭｃＮａｍａｒａ（商標）バルブ付き注入「側穴」型カテーテル（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ＰＳ：自動パルス注入装置（ＰＵＬＳＥ＊ＳＰＲＡＹ  ＩＮＪＥＣＴＯＲモデルＰＳＩ−１、ＡｎｇｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｑｕｅｅｎｓｂｕｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）とともに使用される圧力応答流出口（ＰＲＯ）カテーテル（Ｕｎｉ＊Ｆｕｓｅ  Ｃａｔｈｅｒｔｅｒ（商標）、ＡｎｇｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｑｕｅｅｎｓｂｕｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を使用する「パルススプレー」送達。
【００８４】
表１に示すように、パルススプレー法による治療群の血管造影血流スコアは、３０分目の血管造影図ではわずかに高い初期血流スコアを示し、それは４時間目まで継続したと考えられる。統計上の差は得られなかったが、血管造影結果は一般に優れていると判定された。したがって、パルススプレー送達と組み合わせたＰＲＯ型カテーテルは、本発明による線維素溶解性メタロプロテイナーゼの好ましい送達様式である。
【実施例３】
【００８５】
薬物送達時間の評価
急性末梢動脈閉塞は、一般に、多くの場合２４時間、時には４８時間もの長時間の注入によって送達されるウロキナーゼなどのプラスミノゲンアクチベータによって治療される。この極めて長時間の注入は、閉塞性血栓を有効に溶解するために、長時間にわたって低レベルのプラスミン産生を持続させるためと考えられる。ＮＡＴとフィブロラーゼはどちらも線維素溶解性メタロプロテイナーゼであるので、このような長時間の注入は必要がない可能性がある。送達速度が血管造影血餅溶解に影響を及ぼすかどうかを評価するために、３０ｍｇ固定用量のＮＡＴ（７５ｋｇのブタで約０．４ｍｇ／ｋｇ）をＰＲＯカテーテルとパルススプレー装置によって送達した。パルス体積を０．１ｍＬとし、５ｍｇ／ｍＬ  ＮＡＴ溶液を６分間（１０パルス／分）又は６０分間（１パルス／分）送達した。結果を表２に示す。
【００８６】
【表２】
2005530846.tif 000003
表２に示すように、ＮＡＴ３０ｍｇを６分間送達すると、３０分目の血管造影図では３匹の動物の平均血流スコアは２．７となり、それは４時間目まで持続した。これに対して、ＮＡＴ３０ｍｇの６０分間パルス注入送達ははるかに劣った。これらのデータを統計的に比較しなかったが、より迅速なパルス療法によるＮＡＴ送達が好ましいと考えられる。
【実施例４】
【００８７】
パルス体積の最適化
パルススプレー注入装置は、パルス体積０．１〜０．５ｍＬ／パルスを送達するようにプログラム可能である。パルス体積がブタモデルにおける血管造影結果に対して効果を有するかどうかを明らかにするために、パルス体積０．２ｍＬを体積０．４ｍＬと比較した。１０ｍｇ（７５ｋｇブタで０．１５ｍｇ／ｋｇに相当）の固定用量でＮＡＴを送達した。結果を表３に示す。
【００８８】
【表３】
2005530846.tif 000004
表３に示すように、３０分の平均血管造影スコアは、０．４ｍＬのパルス体積群がわずかに高かった。しかし、４時間目では、群平均は０．２ｍＬパルス体積がわずかに高かった。したがって、これらの試験からは一方のパルス体積が他方よりも優れるという結論を得ることはできない。
【００８９】
上記内容及び表の結果は、これらのＮＡＴ処理療法の実質的にすべてが本発明の送達方法による末梢血管閉塞の治療に有効であり、血栓溶解剤による現行の最適な処理であるウロキナーゼなどのプラスミノゲンアクチベータによる処理とこれらの結果が少なくとも同等であることを示唆している。
【００９０】
これらの結果によれば、ＰＲＯカテーテルとパルススプレー送達の組み合わせが優れた血管造影結果をもたらすと考えられる。これらの試験における動物の体重（７０〜１００ｋｇ）を考えれば、３０ｍｇの固定投与量は体重補正基準で０．３〜０．４ｍｇ／ｋｇにほぼ相当する。
【００９１】
ＮＡＴ固定投与量を１０ｍｇに削減すると、一部の動物における４時間目の群平均血管造影スコアが減少し、開通性が得られなかった。これは、１０ｍｇ用量のＮＡＴが、このモデルにおける生物学的活性の閾用量であると考えられることを示唆している。これらの試験における動物の体重（７０〜１００ｋｇ）を考えれば、１０ｍｇの固定投与量は体重補正基準で０．１〜０．１５ｍｇ／ｋｇにほぼ相当する。パルス体積を０．２ｍＬから０．４ｍＬに変更しても、血管造影開通性スコアはさほど影響を受けなかった。
【実施例５】
【００９２】
ヒトにおける安全で忍容性の良好な生物学的有効用量範囲の設定
高齢の末梢血管疾患（ＰＶＤ）患者におけるα２−マクログロブリンの血清中濃度又は生化学活性について満足のいく文献はない。α２−マクログロブリン濃度は安全性の極めて重要な決定因子であり、線維素溶解性メタロプロテイナーゼのインビボでの忍容性に関係している可能性が高いので、（試験薬剤としてＮＡＴを用いて）ＰＶＤ患者の疫学的横断研究を実施して血清α２−マクログロブリン濃度及び線維素溶解性メタロプロテイナーゼ結合能を評価した。
【００９３】
２個所のセンター（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、及びＲｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）から２１６人の患者を登録した。人口統計情報などの患者特性を収集し、血清を採取してα２−マクログロブリン、（非結合ＮＡＴを検出するＨＰＬＣアッセイによって個々の患者血清試料を滴定することによる）ＮＡＴ結合能、及び他の血清化学パラメータを測定した。主な最終目的は、α２−マクログロブリンの血清中濃度とインビトロで中和可能なＮＡＴ量（マイクログラム／ミリリットル血清：ＮＡＴ結合能）との関係を明らかにすることであった。
【００９４】
この研究における患者特性と、ＰＡＯにおける血栓溶解について公表された２つの最大の研究（すなわち、ＳＴＩＬＥ研究及びＴＯＰＡＳ研究）の患者特性を比較すると、この研究の患者集団が、以前のＰＡＯ血栓溶解研究を代表するものであることが示唆された。以前の研究の詳細については、それぞれ、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、２２０巻、２５１〜２６６ページ（１９９４）及びＯｕｒｉｅｌ等、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３３８巻、１１０５〜１１１１ページ（１９９８）を参照されたい。
【００９５】
ＮＡＴ結合能及び各患者の血漿体積推定値から、各患者に対するＮＡＴの推定最大用量（ＥＭＤ）を計算した。試験結果から、平均的な患者は、α２−マクログロブリンのＮＡＴ結合能力及び中和能力を超えずに（局所的又は全身的に送達された）投与量１．７ｍｇ／ｋｇを受容できると予測される。試験結果を図４に要約する。
【００９６】
図４では、２１６人の試験対象の各々に対してＮＡＴの推定最大用量を計算した。試験結果をヒストグラムとして示す。目視検査で釣鐘状分布を観測することができる。この試験の平均的な患者は、１．７ｍｇ／ｋｇのＮＡＴ（釣鐘状分布のピーク）を許容できると予測される。動物実験の投与量を参考のために示す（右側）が、試験集団の９９％のＮＡＴ推定最大用量を超えることがわかる。
【００９７】
したがって、本発明の０．０２５〜１．７ｍｇ／ｋｇの所定範囲は、循環中に遊離ＮＡＴが存在せずに、（血漿体積及びα２−マクログロブリンのＮＡＴ結合能に基づいて）投与患者が安全に受容することができる合理的推定値である。
【００９８】
結論として、例示した薬理研究の上記実施例１〜４の結果は、血栓がヒトの末梢動脈閉塞において頻繁に遭遇するサイズ及び期間と同等である血栓症動物モデルにおいて、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの血餅溶解剤としての生物学的効果を示唆している。動物モデルにおいて確認された投与量は、動物における潜在的毒性を顧慮又は評価せずに得られた。Ａｈｍｅｄ等及びＭａｒｋｌａｎｄ等（前出）によって示されたウサギ及びイヌの有効投与量（それぞれ、３．７及び４．０ｍｇ／ｋｇ）は、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの獣医学への使用を可能にするに相違ない。しかし、ヒトのデータをもとに考えると、用量３．７及び４．０ｍｇ／ｋｇの投与は、試験集団の９９パーセントで過剰投与になるであろう。したがって、公表された動物実験は、ヒトにおける線維素溶解性メタロプロテイナーゼの治療上の安全で生物学的に有効な使用を可能にするものではない。一方、実施例５のデータによって、ヒトにおけるそのような使用が確実に可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】バルーンカテーテルによってもたらされる傷害及び閉塞性血栓の形成前の、成体ブタの頚動脈の基準血管造影図である。
【図１Ｂ】４日目に本発明の方法によってＮＡＴを投与する前に撮影された同じ動物の血管造影図である。
【図１Ｃ】「ＰＲＯ」カテーテル（この装置図については図３を参照されたい）を通してＮＡＴ３０ｍｇを投与してから２時間後の血管造影図である。
【図２】血栓溶解剤を血管に局所送達するようになされた１タイプのカテーテル装置の図である。
【図３】血栓溶解剤を血管に局所送達する別のタイプのカテーテル装置の横断面図である。
【図４】末梢血管閉塞患者におけるＮＡＴの推定最大用量のヒストグラムである。
【図５】インビトロカテーテル血栓モデルにおけるＮＡＴの使用を示す図である。
【図６】多数の実験結果の要約を示すグラフである。得られた平均データによれば、ＮＡＴは、市販のカテーテル清掃用ウロキナーゼ製品であるアボキナーゼ（登録商標）、Ｏｐｅｎ  Ｃａｔｈ（登録商標）よりも最大４０％速く閉塞をインビトロで解消する。
【配列表】
2005530846.tif 000005
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2005530846.tif 000007
2005530846.tif 000008
2005530846.tif 000009
2005530846.tif 000010
2005530846.tif 000011
【図１Ａ】
2005530846.tif 000012
【図１Ｂ】
2005530846.tif 000013
【図１Ｃ】
2005530846.tif 000014
【図２】
2005530846.tif 000015
【図３】
2005530846.tif 000016
【図４】
2005530846.tif 000017
【図５】
2005530846.tif 000018
【図６】
2005530846.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月11日(2005.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維素溶解性メタロプロテイナーゼの、ヒトの体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えない量を血管アクセス装置を介して投与することを含む、ヒト用留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅又は装置に付着した血餅を溶解する方法。
【請求項２】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼの、ヒトにおけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量を血管アクセス装置を介して投与することを含む、ヒト用留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅又は装置に付着した血餅をタンパク質分解する方法。
【請求項３】
０．１〜８０ｍｇ／ｍｌの線維素溶解性メタロプロテイナーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
０．１〜５０ｍｇ／ｍｌの線維素溶解性メタロプロテイナーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記血管アクセス装置がカテーテルである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記血管アクセス装置がシャントである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記血管アクセス装置がアクセスグラフトである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記血管アクセス装置が針である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記血管アクセス装置が液体組成物をヒト動脈又は静脈に導入するために使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記血管アクセス装置がヒト動脈又は静脈から血液を抜き取るために使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記血管アクセス装置が血液透析手順に関連して使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記血管アクセス装置が輸血手順に関連して使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記血管アクセス装置が化学療法に関連して使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
末梢動脈閉塞の治療に使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
前記血管アクセス装置が血液の抜き出しに関連して使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記血餅が留置血管アクセス装置の内面にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１７】
前記血餅が留置血管アクセス装置の外面にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
前記血餅が留置血管アクセス装置に付着している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１９】
前記血管アクセス装置が動脈中にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
前記血管アクセス装置が静脈中にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２１】
前記血管アクセス装置が「側穴」カテーテル装置を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２２】
前記血管アクセス装置が「圧力応答流出口」（ＰＲＯ）カテーテル送達装置を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２３】
線維素溶解性メタロプロテイナーゼ溶液をボーラス投与する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２４】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼが新規作用血栓溶解剤（ＮＡＴ）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２５】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼがフィブロラーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２６】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼを、ヒトの体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えなく、前記ヒトにおけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量、血管アクセス装置を介して投与することを含む、フィブリンを主体とする閉塞を有するヒト用留置血管アクセス装置の開通性を回復する方法。
【請求項２７】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼを、ヒトの体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えなく、前記ヒトにおけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量、血管アクセス装置を介して投与することを含む、フィブリンを主体とする閉塞を有するヒト用留置血管アクセス装置の機能を回復する方法。
【請求項２８】
留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅又は装置に付着した血餅の処置用医薬品の製造における、薬剤的に許容される溶液中の、ヒト対象の体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えない量の線維素溶解性メタロプロテイナーゼの使用。
【請求項２９】
留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺の血餅又は装置に付着した血餅をタンパク質分解する医薬品の製造における、前記留置血管アクセス装置中若しくは装置周辺のアルファ−２マクログロブリン又は装置に付着したアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが前記血餅を容易に溶解するのに十分な量の、薬剤的に許容される溶液中の、アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼの使用。
【請求項３０】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼの濃度が０．１〜８０ｍｇ／ｍｌである、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼが０．１〜５０ｍｇ／ｍｌである、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記血管アクセス装置がカテーテルである、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３３】
前記血管アクセス装置がシャントである、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３４】
前記血管アクセス装置がアクセスグラフトである、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３５】
前記血管アクセス装置が針である、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３６】
前記血管アクセス装置が液体組成物をヒト動脈又は静脈に導入するために使用される、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３７】
前記血管アクセス装置がヒト動脈又は静脈から血液を抜き取るために使用される、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３８】
前記血管アクセス装置が血液透析手順に関連して使用される、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３９】
前記血管アクセス装置が輸血手順に関連して使用される、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４０】
前記血管アクセス装置が化学療法に関連して使用される、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４１】
前記血管アクセス装置が末梢動脈閉塞の処理に使用される、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４２】
前記血管アクセス装置が血液の抜き出しに関連して使用される、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４３】
前記血餅が留置血管アクセス装置の内面にある、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４４】
前記血餅が留置血管アクセス装置の外面にある、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４５】
前記血餅が留置血管アクセス装置に付着している、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４６】
前記血管アクセス装置が動脈内にある、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４７】
前記血管アクセス装置が静脈内にある、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４８】
前記血管アクセス装置が「側穴」カテーテル装置を含む、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項４９】
前記血管アクセス装置が「圧力応答流出口」（ＰＲＯ）カテーテル送達装置を含む、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項５０】
前記医薬品がボーラス投与用に調製される、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項５１】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼが新規作用血栓溶解剤（ＮＡＴ）を含む、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項５２】
前記線維素溶解性メタロプロテイナーゼがフィブロラーゼを含む、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項５３】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する量の、ヒト対象におけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量の、およびヒト対象の体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えない量の、フィブリンを主体とする閉塞を有する留置血管アクセス装置の開通性を回復する医薬品の製造における薬剤的に許容される溶液中の、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの使用。
【請求項５４】
アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する量の、ヒト対象におけるアルファ−２マクログロブリンの飽和レベルを大きく超えないが血餅を容易に溶解するのに十分な量の、およびヒト対象の体重１キログラム当たり１．７ミリグラムを超えない量の、フィブリンを主体とする閉塞を有する留置血管アクセス装置の機能を回復する医薬品の製造における薬剤的に許容される溶液中の、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの使用。
【請求項５５】
線維素溶解性メタロプロテイナーゼが５．０〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度である、請求項１、２、２６、２７、２８、２９、５３、及び５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
５．０〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度である、アルファ−２マクログロブリンと複合体を形成する線維素溶解性メタロプロテイナーゼの投与単位。
【請求項５７】
５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．０ｍｇ、３．０ｍｇ、及び４．０ｍｇからなる群から選択される請求項５６に記載の投与単位。
【請求項５８】
線維素溶解性メタロプロテイナーゼが新規作用血栓溶解剤（ＮＡＴ）である請求項５６に記載の投与単位。
【請求項５９】
線維素溶解性メタロプロテイナーゼがフィブロラーゼである請求項５６に記載の投与単位。
【請求項６０】
留置血管アクセス装置を請求項５６から５９のいずれか１項に記載の投与単位と接触させることを含む当該装置の開通性を回復する方法。
【請求項６１】
線維素溶解性メタロプロテイナーゼがアルファ−２マクログロブリンと共有結合する請求項６０に記載の方法。
【国際調査報告】
2005530846.tif 000020