(57)【要約】ペルオキシダーゼ酵素と反応性のある蛍光原基質から、蛍光を発生する方法を開示する。ペルオキシダーゼ酵素乃至ペルオキシダーゼ標識の分析試料のアッセイにおける該方法の用途を提示する。ペルオキシダーゼ酵素との反応のための蛍光原化合物、組成物およびキットを示し、また、蛍光性化合物生成の２種の様式を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ペルオキシダーゼと、下記式、
2005530501.tif 000019
（式中、Ｒ1は、過酸化物による攻撃に対して不活性であるように選択され、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜２０個の原子を含有する基であり、Ｒ2は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキルおよび置換されたアリールアルキル基から選択され、Ｒ3〜Ｒ10はいずれも、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜２０個の原子を含有する基である）で表される蛍光原基質とを供給し、
ｂ）ペルオキシダーゼと蛍光原基質とを反応させ、反応物中に蓄積して、それ以上反応することのない、蛍光発生物を生成し、
ｃ）蛍光発生物に好適な波長の光を照射して、蛍光発生物に蛍光を照射させる、
ことを含む蛍光発生方法。
【請求項２】
Ｒ1には、アリールエステル（−ＣＯＯＡｒ）、アルキル基Ｒが、ハロゲン原子、シアノおよびニトロ基から選択される電子吸引性基によって置換されているアルキルエステル（−ＣＯＯＲ）、アルキルチオエステル（−ＣＯＳＲ）、アリールチオエステル（−ＣＯＳＡｒ）、スルホンイミド（−ＣＯ（ＮＲ）ＳＯ2Ｒ’）、Ｘがハロゲン原子またはシアノ基である酸ハライド基−Ｃ（＝Ｏ）Ｘを含まないことを前提とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ1が、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボキシアミド、アルキルカルボキシルエステル、カルボキシルヒドラジド基、ケト基、−ＣＨＯ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ基および水素原子から選択される基である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
基Ｒ3〜Ｒ10が、相互に無関係に、水素原子、アルキル基、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アリール、アルケニル、アルキニル、ハロゲン原子、ヒドロキシ、メルカプト基、スルホネート、サルフェートおよびホスフェートから選択される基である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
基Ｒ3〜Ｒ10のいずれもが、水素原子である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
化学式Ｉで表される化合物が、少なくとも１個の水溶性を与える基を含有する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
水溶性を与える基が、カルボキシレート、スルホネート、サルフェート、フォスフェート、アンモニウムおよびホスホニューム基から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
化学式Ｉで表される化合物が、下記構造、
2005530501.tif 000020
を有する化合物１〜１１の群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ペルオキシダーゼと反応させるための過酸化物を供給することをも更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
過酸化物が、オキシダーゼ酵素とオキシダーゼ基質との反応によって生成する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｄ）蛍光発生物によって照射された蛍光を検出し、
ｅ）発生した蛍光量を、ペルオキシダーゼの量と関係づける、
上記工程を含む、ペルオキシダーゼ酵素のアッセイにおける請求項１に記載の方法の用途。
【請求項１２】
ペルオキシダーゼ酵素が、生体分子と抱合されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｄ）蛍光発生物によって照射された蛍光を検出し、
ｅ）発生した蛍光量をペルオキシダーゼの量に関係づけ、
ｆ）ペルオキシダーゼの量を分析試料の量に関係づける、
上記工程を含む分析試料のアッセイにおける請求項１に記載の方法の用途。
【請求項１４】
蛍光原基質を、該基質、過酸化物および強化剤を含有する薬剤組成物として供給する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
強化剤が、フェノール、芳香族アミン、アリールボロン酸およびアリールボロン酸エステルから選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
強化剤が、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４ジクロロフェノール、２−ナフトールおよび６−ブロモ−２−ナフトールから選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）ペルオキシダーゼと、下記式、
2005530501.tif 000021
（式中、Ｒ1は、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜２０個の原子を含有する基であり、Ｒ2は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキルおよび置換されたアリールアルキル基から選択され、Ｒ3〜Ｒ10はいずれも、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜２０個の原子を含有する基であり、かつ、Ｒ1〜Ｒ10は、下記式、
2005530501.tif 000022
で表される安定な蛍光性アクリジニウム生成物を生成するように選択される）で表される蛍光原基質とを供給し、
ｂ）ペルオキシダーゼと蛍光原基質とを反応させ、反応物中に蓄積して、それ以上反応することのない、安定な蛍光性アクリジニウムを生成し、
ｃ）蛍光発生物に好適な波長の光を照射して、蛍光発生物に蛍光を照射させる、
ことを含む蛍光発生方法。
【請求項１８】
Ｒ1は、求核性として作用する過酸化物によって置換されることができ、かつ、アリールエステル、アルキル基Ｒが、ハロゲン原子、シアノ基およびニトロ基、チオエステル、スルホンイミド、酸ハロゲン化物およびシアノ基から選択される電子求引性基をもって置換されている置換アルキルエステルから選択される脱離基を、内に含有する基であり、また、少なくともＲ3またはＲ10の一方が、ペルオキシダーゼ活性に適合する条件下で、アクリドン生成物を生成する化学ルミネセンス反応を、立体的に妨害するＨ以外の基である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
基Ｒ3〜Ｒ10が、夫々相互に無関係に、水素原子、アルキル基、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アリール、アルケニル、アルキニル、ハロゲン原子、ヒドロキシ、メルカプト基、スルホネート、サルフェートおよびホスフェートから選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ3またはＲ10の少なくとも一方が、ハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシ基である請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシダーゼ酵素の検出における蛍光原化合物、およびその使用方法に関する。本発明はまた、ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ標識の特異的結合パートナーに、特異的親和性を有する特異的結合対の一員に結合する分析試料（ａｎａｌｙｔｅ）を検出する上記方法の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなペルオキシダーゼ酵素は、多くの場合、生体分子や他の重要な分析試料、例えば、医薬品、ホルモン、ステロイドおよびがん標識のための酵素結合アッセイにおいて、標識またはラベルとして使用される。これらの酵素の検出は、検出可能な生成物を発生する基質の使用によって達成し得る。クロモゲン基質、例えば、ｏ−フェニレンジアミン、ＡＢＴＳまたはテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、有色反応生成物を生成し、蛍光原基質は蛍光発生物を生成し、一方、化学ルミネセンス基質は、検出可能生成物として光を発生する。これらの方法はいずれも、標本中の酵素の量、あるいは、酵素標識化分析試料か、または、分析試料用の標識化特異的結合パートナーの量を定量的に測定する安全、簡便でかつ鋭敏な方法を提供できる。
【０００３】
ａ．化学ルミネセンス・ペルオキシダーゼ基質。
本出願人の、米国特許第５、４９１、０７２号明細書、第５、５２３、２１２号明細書および第５、５９３、８４５号明細書には、ペルオキシダーゼ検出に、また、アッセイに用いるための、過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によって発光する化学ルミネセンス性Ｎ−アルキルアクリダンカルボン酸エステル、チオエステルおよびスルホンイミドが開示されている。米国特許第５、５４５、８３４号明細書には、スピロアクリダン化合物と過酸化水素との化学ルミネセンス性反応が記載されている。この反応は、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の添加によって強化される。
【０００４】
集合名詞としてルシフェリンと総称される、生物学的起原の各種化合物が、ペルオキシダーゼによって酸化される（Ｌ．Ｊ  ＫｒｉｃｋａおよびＧ．Ｈ．Ｇ．Ｔｈｏｒｐｅでの、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋ．Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ，編集．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９０年、７７〜９８頁に集約されている）。いくつかの例では、過酸化水素が使用されないが、その場合には酵素がオキシダーゼとして作用する。
【０００５】
ｂ．蛍光性ペルオキシダーゼ基質。
米国特許第６、０４０、１５０号明細書には、蛍光原基質とペルオキシダーゼとの反応から蛍光性の文献記載の化合物を生成する優れた方法が開示されている。該方法は、３−（４−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸を含む基質としてのフェノール性化合物の使用を含むものである。他のフェノール性蛍光原基質は、Ｚａｉｔｓｕ  ａｎｄ  Ｏｈｋｕｒａ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０９巻、１０９〜１１３頁（１９８０年）に開示され、また、２−（４−ヒドロキシフェニル）酢酸、ホモバニル酸およびチラミン（Ｙ．Ｌｉ，ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，（３４０巻）、１５９〜１６８頁、（１９９７年））も含まれる。他の業界既知の蛍光原ペルオキシダーゼ基質には、ｏ−フェニレンジアミン、およびＮ，Ｎ’−ジシアノメチル−ｏ−フェニレンジアミン（Ｌｉ，ら、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５３巻（４号）、４２８〜４３６頁（１９９６年））、ｐ−アミノフェノールのアミドおよびカルバメート誘導体（Ｍ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，ら、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｅｕｒｙ，Ａ．Ｒｏｄａ  ら、編集．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，５０８〜５１１頁、（１９９９年））、３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キノキサロンおよび関連誘導体（Ｌｉ，ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，３４０巻（１〜３号）、１５９〜１６８頁（１９９７年））、フルオレセイン、ローダミンおよび他のキサンティン染料の還元形態並びに後者のフッ素化誘導体（米国特許第６，１６２，９３１号明細書およびＰＣＴ特許ＷＯ９９／０１７６８号公報）がある。
【０００６】
ｃ．アクリジニウム標識物の蛍光性検出。
アクリジニウムエステルおよびアミドは、化学ルミネセンス業界では既知である。これらの化合物は、一般にアッセイにおいて検出される物質の標識に使用される。化学ルミネセンスによる検出は、標識と強アルカリ性過酸化水素溶液との反応を含む。アクリジニウム標識化合物の蛍光分析法的アッセイもまた開示されていて、これらと同様な化学ルミネセンス性化合物が、その固有の蛍光によって測定される（Ｄ．Ｏ．ＳｈａｈおよびＶ．Ａ．Ｓａｌｂｉｌｌａ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｊ．Ｆ．Ｃａｓｅ  ら、編集．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，２３５〜２３８頁、（２００１年））。
【発明の開示】
【０００７】
従って、本発明の目的は、ペルオキシダーゼ酵素用蛍光原基質を、ペルオキシダーゼ酵素と反応させることを含む蛍光性化合物の製造方法を提供することである。他の目的は蛍光原基質をペルオキシダーゼと反応させて、蛍光反応生成物を得ることによるペルオキシダーゼ酵素の検出方法と、従って蛍光反応生成物の検出方法を提供することにある。また、別の目的は、標識化分析試料、または標識化分析試料結合化合物が、ペルオキシダーゼ酵素によって、標識化され、また、ペルオキシダーゼ酵素が、蛍光原ペルオキシダーゼ基質と反応して蛍光反応生成物を発生するアッセイ手順における分析試料の検出方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ペルオキシダーゼ酵素と過酸化物との反応による蛍光発生用蛍光原化合物に関する。本発明方法の実施に有用な化合物は、使用方法による２種の類型の１つに属する。
本発明の１種の化合物は、化学式Ｉ、
2005530501.tif 000002
（式中、Ｒ1は、過酸化物による攻撃に対して不活性であるように選択され、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜２０個の原子を含有する基であり、Ｒ2は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキルおよび置換されたアリールアルキル基から選択され、Ｒ3〜Ｒ10はいずれも、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜２０個の原子を含有する基である）で表される。ここで意図した意味での、過酸化物による攻撃に不活性ではない基Ｒ1には、アリールエステル（−ＣＯＯＡｒ）、アルキル基Ｒが、例えば、ハロゲン原子、シアノおよびニトロ基のような電子吸引性基によって置換されているためにこれらの置換基が、−ＯＲ基の脱離能力を増大させる場合のアルキルエステル（−ＣＯＯＲ）、アルキルおよびアリールチオエステル（−ＣＯＳＲ，−ＣＯＳＡｒ）、スルホンイミド（−ＣＯ（ＮＲ）ＳＯ2Ｒ’）、Ｘがハロゲン原子およびシアノ基である−Ｃ（＝Ｏ）Ｘがある。基Ｒ1は、好ましくは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、カルボン酸、カルボン酸塩、カルボキシアミド、アルキルカルボキシルエステル、カルボキシルヒドラジド基、ケト基、−ＣＨＯ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ基および水素原子から選択される。基Ｒ3〜Ｒ10は、好ましくは、相互に無関係に、水素原子、アルキル基、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アリール、アルケニル、アルキニル、ハロゲン原子、ヒドロキシ、メルカプト基、スルホネート、サルフェートおよびホスフェートから選択される。
【０００９】
基が置換されたという場合は、問題の基の炭素骨格上の１個以上の水素原子が、異なる原子または基によって入れ換わることを意味する。通常、かかる用途に含まれると考えられる基には、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アルコキシ、アリールオキシ、トリアルキルシリルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルチオ、アリールチオ、メルカプト、ニトロ基、スルホネート、サルフェート、ホスフェート、ホスホネート、シアノ基、カルボキシレート、カルボキシエステル、カルボキシアミドおよびカルボキシアルデヒドがある。
【００１０】
一実施形態においては、化学式Ｉで表される蛍光原化合物は、置換基Ｒ3〜Ｒ10のいずれもが、水素原子を含有する。かかる群の化合物は下記に示す化学式、
2005530501.tif 000003
（式中、Ｒ1およびＲ2は、上述に定義したとおりである）を有する。
【００１１】
他の実施形態においては、化学式Ｉで表される蛍光原化合物は、少なくとも１個の、水溶性を与える基を含有する。好ましい基には、カルボキシレート、スルホネート、サルフェート、ホスフェート、アンモニウム基およびホスホニウム基がある。水溶性の基は、Ｒ1の位置、Ｒ2の位置またはＲ3〜Ｒ10の位置の任意の位置で置換され得る。
【００１２】
他の実施形態においては、化学式Ｉで表される蛍光原化合物は、アクリダン環上の２個の隣接する位置を結合鎖によって結合することによって、追加の環基となることができる。この追加の環は、４〜７員環、好ましくは５または６員環となる。この環は、飽和の原子、または二重結合、あるいはベンゼノイド環のような追加の不飽和結合となり得る。説明のため例示構造を、下記に示す。
2005530501.tif 000004
かかる追加の環は、上記の如く、他の置換基を含有することもできる。
【００１３】
他の実施形態として、化学式Ｉで表される蛍光原化合物は、下記化合物、
2005530501.tif 000005
2005530501.tif 000006
のうち１〜１１から選択される。
【００１４】
他の実施形態では、蛍光原基質が化学式ＩＩ、
2005530501.tif 000007
（式中、Ｒ1は求核性として作用する過酸化物によって移動し得る脱離基を内に含有する基であり、アリールエステル（−ＣＯＯＡｒ）、アルキル基Ｒが−ＯＲ基の脱離能力を増大する、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基のような電子求引性基で置換されている置換アルキルエステル（−ＣＯＯＲ）、チオエステル（ＣＯＳＲ，ＣＯＳＡｒ）、スルホンイミド（−ＣＯ（ＮＲ）ＳＯ2Ｒ’）、Ｘがハロゲン原子およびシアノ基である−（Ｃ（＝Ｏ）Ｘから選択される基であり、またＲ2は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキルおよび置換されたアリールアルキル基から選択され、また、Ｒ3〜Ｒ10は、夫々Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜２０個の原子を含有し、少なくともＲ3またはＲ10の一方が、ペルオキシダーゼ活性に適合する条件下で、アクリドン生成物を生成する化学ルミネセンス反応を、立体的に妨害する水素原子以外の基である）で表わされる。基Ｒ3〜Ｒ10は、好ましくは、夫々相互に無関係に、水素原子、アルキル基、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アリール、アルケニル、アルキニル、ハロゲン原子、ヒドロキシ、メルカプト基、スルホネート、サルフェートおよびホスフェートから選択される。好ましくは、Ｒ3またはＲ10の少なくとも一方は、ハロゲン原子、アルキルまたはアルコキシ基である。化学式ＩＩにおける隣接する置換基の対は、上記化学式Ｉに示したと同様に、環として相互に結合し得る。化学式ＩＩで表される化合物は、ペルオキシダーゼとの酵素反応の条件下で安定なアクリジニウム生成物を形成するが、ペルオキシダーゼ活性に適合する条件下でも、続いて生起する化学ルミネセンス反応の進行からは立体的に妨害される。これらに適合する化合物の類例は、米国特許第５，６７０，６４４号明細書および第５，７２３，２９５号明細書に記載されていて、引用文献として本願明細書に引用されており、アリールおよびアルキルエステル、チオエステル、スルホンアミドを包含している。
【００１５】
他の一連の蛍光原化合物は、下記化学式ＩＩＩ、
2005530501.tif 000008
（式中、Ｒ1は求核性として作用する過酸化物によって移動し得る脱離基を内に含有する基であり、アリールエステル（−ＣＯＯＡｒ）、アルキル基Ｒが−ＯＲ基の脱離能力を増大する、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基のような電子求引性基で置換されている置換アルキルエステル（−ＣＯＯＲ）、チオエステル（ＣＯＳＲ，ＣＯＳＡｒ）、スルホンイミド（−ＣＯ（ＮＲ）ＳＯ2Ｒ’）、Ｘがハロゲン原子およびシアノ基である−Ｃ（＝Ｏ）Ｘから選択される基であり、またＲ2はアルキル、置換されたアルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキルおよび置換されたアリールアルキル基から選択され、また、Ｒ3〜Ｒ10は、化学式Ｉの化合物が、上記化合物１２として表示した２，３，６−トリフロロフェニルＮ−メチルアクリダン−９−カルボキシレートを含んでいないことを条件として夫々Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜２０個の原子を含有する）で表わされる。Ｒ3〜Ｒ10の基は、好ましくは相互に無関係に、水素原子、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アリール、アルケニル、アルキニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ、メルカプト基、スルホネート、サルフェート、およびフォスフェートから選択される。化学式ＩＩＩにおける隣接する置換基の対は、化学式ＩとＩＩとに関して上記に説明したと同様に環として相互に結合できる。
【００１６】
他の実施形態として、本発明は、化学式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物をペルオキシダーゼ酵素と、および、任意に過酸化物と反応させて、蛍光発生物を生成することを含む蛍光発生方法に関する。このようにして生成した蛍光発生物は、好適波長の光に照射されて、蛍光を放射する蛍光発生物を生じる。蛍光の励起に好適な光の波長は、当業者に既知の方法、例えば、吸収スペクトルまたは蛍光励起スペクトルを記録することにより、実験的に決定される。励起が最大となるような波長または波長範囲を選択することが有利であるが、そうする必要はない。励起波長は、特に単色のレーザー光源を用いる場合には、光源の性質に基づいて選択できる。
【００１７】
本願方法は、２種の異なる反応様式を包含する。一実施態様では、化学式ＩまたはＩＩで表わされる蛍光原基質は、蛍光性である環酸化された（ｒｉｎｇ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ）アクリジニウム反応生成物に転化される。酵素反応条件下では、過剰の過酸化物が存在していても、それ以上反応が進まないので、この生成物は蓄積される。
【００１８】
様式１
2005530501.tif 000009
様式２に示すような、蛍光原基質が９位への過酸化物の攻撃によって生起する迅速、かつ不可逆な化学ルミネセンス反応を生じさせないような化学式ＩまたはＩＩの場合に、この様式の反応が進行する。
【００１９】
様式２
2005530501.tif 000010
９位への置換は、続いて発生する蛍光性アクリジニウム反応生成物の不可逆的消費を促進し、化学ルミネセンスとアクリドン生成物を生ずるが、これは、化学式ＩＩＩの化合物から成るものである。例示的な化合物は、本出願人に属する米国特許第５，４９１，０７２号明細書、第５，５２３，２１２号明細書および第５，５９３，８４５号明細書ならびに米国特許第６，０３０，８０３号明細書に記載されていて、アリールエステル（−ＣＯＯＡｒ）、アルキルエステル（−ＣＯＯＲ）を含有するが、そのアルキル基Ｒは、ハロゲン原子、シアノ基およびニトロ基で置換されており、それにより、−ＯＲ基、チオエステル（−ＣＯＳＲ、ＣＯＳＡｒ）、スルホンイミド（−ＣＯ（ＮＲ）ＳＯ2Ｒ’）およびシアノ基の脱離能力を増大させている。
【００２０】
第２の反応様式は、蛍光原基質が化学式ＩＩＩであり、９位への過酸化物の攻撃に続いて、迅速かつ不可逆な化学ルミネセンス反応を生じさせる場合に可能となる。かかる基質の反応は、進行すると、様式１に示したような環酸化されたアクリジニウム化合物を形成する。良好な脱離基を含有する９位の置換基が存在し、立体障害となる基を含まないことで、上記様式２に描いた如く、アクリジニウム化合物の化学ルミネセンス反応を引き続いて生じることが容易になる。この様式においては、蛍光性のアクリジニウム化合物は、永久に蓄積することはないので、中間体のように見えるのは当然である。この一連の反応の最終生成物は、４３０〜４５０ｎｍで最大に発光する、それ自体蛍光性のアクリドンである。この様式で反応する化学ルミネセンス性化合物は、市販の化学蛍光性検出システム（イーシーエル・プラス・化学蛍光性システム、アメルズハム・ファルマシア・バイオテク）（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に用いられる基盤として役立っている。この製品に用いられるペルオキシダーゼ基質は、化学ルミネセンス性のアクリダン、２，３，６−トリフルオロフェニルＮ−メチル−アクリダン−９−カルボキシレートである。
2005530501.tif 000011
【００２１】
反応進行の間に、アクリドン生成物と共に測定可能な濃度の蛍光性アクリジニウムエステル中間体が生成していること、ならびに、２種の蛍光スペクトルは相互に異なるがオーバーラップしていることは、よく認識されているとは思えない。本出願人は、この挙動が、実際に多くの化学ルミネセンス性基質に見られること、ならびに、その全てが上記の如き第２様式の反応に従って作用することを見出した。中間体アクリジニウム化合物について、続いて生起する化学ルミネセンス性変換の実施を可能とする置換基を９位に保有するこの基質は、アクリジニウム化合物またはアクリドン生成物のいずれかの蛍光を検出することによって、蛍光性基質としてこれを検出し得る。本出願人は、更に、この２種のものの相対的な量は、反応過程を通じて変化を生じ、また、用いる酵素の量によって変化することを見出した。
【００２２】
この蛍光による挙動は、２通りの観点において反応の第１様式によって発生する蛍光とは基本的に異なる。アクリジニウム化合物は、最終製品アクリドンよりも短波長で励起され、アクリドン製品よりも長波長で、一般的には５００〜５２０ｎｍの波長を発光する。換言すれば、中間体アクリジニウムのストークス・シフトは、約１５０ｎｍであるのに対し、アクリドンのそれは５０ｎｍより小さい。更に重要なことには、化学ルミネセンスを発生し得るアクリダン蛍光原基質の基の反応の間に、一時的に生成したアクリジニウム化合物の蛍光の検出は、全く異なる時間的経過を示す。反応の最終製品の検出においては、信号は漸次上昇して最高水準となり、恒常値で留まる。中間体の検出では、最初ある時間上昇し、次いで衰弱する検出信号を生じる。
【００２３】
反応の第１様式を進める基質は、ｐＨと、過酸化物濃度の広い範囲に亘って反応する。ｐＨは、酵素の作用範囲によって制限されるだけである。ペルオキシダーゼ酵素は、約４〜１０のｐＨ範囲に亘って機能することが知られている。反応の第２様式で進行する基質は、その行動様式がｐＨおよび過酸化物濃度に左右される。高濃度の過酸化物および約７より高いｐＨ値では、中間体アクリジニウム化合物の消費が促進される。
【００２４】
過酸化物は、ペルオキシダーゼ酵素の主要な基質では有るけれども、本発明反応においては、過酸化物成分は任意の成分として記載される。過酸化物は、業界で既知である他のペルオキシダーゼ触媒での蛍光反応においては、一般的に必要な反応成分であると記載され、予備としての位置に記載されている。しかしながら、本出願人は、酵素の比較的高濃度な条件下では、蛍光原基質を、蛍光発生物に転化させる反応に、過酸化物は必要ではないことを見出した。
【００２５】
更に他の実施態様において、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素、または、ペルオキシダーゼ酵素と生体分子との抱合体の検出方法において、蛍光原基質へのペルオキシダーゼの作用による蛍光発生物生成方法の用途に関する。ペルオキシダーゼ、または、ペルオキシダーゼ抱合体は、蛍光原基質と反応して蛍光発生物を生成し、蛍光発生物は、光照射されて、蛍光を発光する。蛍光が検出されると、蛍光量、または、強度が、ペルオキシダーゼの量に関係ずけられる。
【００２６】
他の実施態様においては、本発明はペルオキシダーゼ酵素が、分析試料または、分析試料と特異的に結合している結合パートナーに結び付いている、手順中の分析試料のアッセイにおいて記載されているように、蛍光によるペルオキシダーゼ抱合体の検出方法の用途に関する。分析試料、または、分析試料結合パートナーに、ペルオキシダーゼを結合する方法には、直接的な共有結合性付着物（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）および、ハプテン／抗ハプテン結合対を含む間接的な方法がある。例えば、ビオチン標識の分析試料を、ストレプトアビジン、または抗ビオチン抗体に結合させたペルオキシダーゼの抱合体によって特異的に結合、または、捕獲できる。かかるアッセイ法においては、生成した蛍光発生物の量は、上述の如く、ペルオキシダーゼの量に関連付けられ、そのペルオキシダーゼの量が、分析試料の量に関連付けられる。例えば、該方法は、ハプテン、イムノアッセイ技術による抗原と抗体、ウェスタンブロッティングによるタンパク質、サザン−乃至ノーザン−ブロッティングによるＤＮＡおよびＲＮＡの検出に夫々用い得る。該方法はまた、ＤＮＡ配列測定適用におけるＤＮＡ検出に使用できる。
【００２７】
また、別の実施態様において、本発明は、過酸化物を検出するための、これらの方法の用途に関する。ペルオキシダーゼ酵素濃度の、実験で測定できるある限られた範囲に亘って、ペルオキシダーゼの一定量の反応速度および蛍光原基質の一定濃度は、反応に有効な過酸化物の量に比例する。指定した時間内に、異なる量の過酸化物が、異なる量の蛍光発生物を生じる。正確に測定し得る過酸化物濃度の範囲は、標準過酸化物の連続希釈液分析によって容易に決定できる。
【００２８】
また、別の実施態様において、本発明は、オキシダーゼ酵素又はデヒドロゲナーゼ酵素のような過酸化物を生成する酵素の検出のための、上記の方法の用途に関する。オキシダーゼ酵素に類する多くの酵素が、その基質を酸化する反応の副生物として、過酸化水素を生成することは、よく知られている。知られているオキシダーゼ酵素には、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、各種のアミノ酸オキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、および、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼがある。実際、オキシダーゼ酵素はオキシダーゼ酵素の基質と反応して、過酸化水素を発生する。好適な時間の後に、蓄積された過酸化水素は、ペルオキシダーゼと、および上述の蛍光によって検出される蛍光発生物を生成する、化学式Ｉで表わされる蛍光原基質と反応する。オキシダーゼおよびペルオキシダーゼの反応は、同時に、または連続的に進行し得る。
【００２９】
本発明の他の実施態様として、蛍光原化合物は、ペルオキシダーゼ酵素との反応用の薬剤組成物中に供給するのが有利である。この薬剤組成物は、化学式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩで表わされる化合物と、過酸化物化合物とを含む水溶液を含有する。組成物は、ペルオキシダーゼの反応性を強化するために、フェノール性化合物で有り得る強化物質を更に含有することができる。他に添加される任意の成分には、界面活性剤、ペルオキシダーゼとの反応前に、過酸化物化合物が活性化するのを防ぐキレート剤、および、基質を可溶化するのに役立つ有機溶媒が有る。
【００３０】
本発明の実施に使用する薬剤および原料を、蛍光発生物を生成する検出反応によるアッセイ工程における任意の分析試料、加水分解酵素または加水分解酵素抱合体を検出するためのキットに包装することができる。本発明を、任意の実施形態で実現するために有用なキットは、１台以上のコンテナ中に、下記ａ）〜ｆ）のものを含有する。即ち、
ａ）緩衝液中の上記蛍光原化合物、
ｂ）検出されるべき分析試料が、過酸化物または過酸化物を発生する薬剤ではない場合の過酸化物、
ｃ）検出されるべき分析試料が、ペルオキシダーゼではないか、または、分析試料とペルオキシダーゼとの抱合体、若しくは、分析試料と特異的結合対を生成する薬剤とペルオキシダーゼとの抱合体ではない場合の、ペルオキシダーゼ酵素、
ｄ）任意に、強化性化合物、
ｅ）任意に、界面活性剤、
ｆ）ならびに、任意に、キレート剤、
を含有する。キット成分は、個々に包装するか、または、多種類の組み合わせで包装されるが、それは、下記に詳述する本発明反応の実施に関する多種類の様式を考慮すれば明らかである。
【００３１】
過酸化物の成分は、ペルオキシダーゼと反応し得る任意の過酸化物又はアルキルヒドロペルオキシドである。好適な過酸化物としては、過酸化水素、尿素過酸化物及び過硼酸塩がある。
【００３２】
蛍光原反応を行うことができるペルオキシダーゼには、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、例えばバナジウム・ブロモペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、カビペルオキシダーゼ、例えば、リグニンペルオキシダーゼ並びにアルトロマイセス・ラモサスからのペルオキシダーゼ及び白腐れ病に生じるＭｎ依存ペルオキシダーゼ及び大豆ペルオキシダーゼがある。鉄錯体、例えば、ヘム、ヘミンおよびその他類縁の鉄−ポルフィリン錯体やＭｎ−ＴＰＰＳ4を含む、酵素ではないがペルオキシダーゼ様活性を有する、他のペルオキシダーゼ模擬化合物が知られており、（Ｙ．−Ｘ．Ｃｉ，ら、Ｍｉｋｒｏｃｈｅｍ．Ｊ．，５２巻、２５７〜６２頁（１９９５年））、また、ここで用いられるペルオキシダーゼの意味合の範囲内にあることは、明白である。ペルオキシダーゼと生体分子との抱合体又は錯体もまた、抱合体ペルオキシダーゼ活性を示す場合に限り、蛍光発生方法に使用することができる。ペルオキシダーゼの１個又はそれ以上の分子に抱合され得る生体分子には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体フラグメント、抗体−ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、たんぱく質、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン及びビオチンがある。ペルオキシダーゼを包含し、又は合体させる錯体、例えば、リポソーム、ミセル、小胞及び生体分子へ結合する機能を有するポリマーもまた、本発明の方法に用いることができる。
【００３３】
反応混合物に、ある種の強化化合物を含有させることによって、酵素の反応性を促進する。これらの強化剤の内に含まれるものとしては、スタウト（Ｓｔａｕｔ）への米国特許第４，５２１，５１１号明細書に記載されているような、他のペルオキシダーゼ反応を強化することが知られているフェノール性化合物及び芳香族アミンである。その他のフェノール性強化剤は、Ｍ．Ｉｉ，Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．Ａｒａｍａｋｉ，Ｈ．Ｍａｓｕｙａ，Ｔ．Ｈａｄａ，Ｍ．Ｔｅｒａｄａ，Ｍ．Ｈａｔａｎａｋａ，Ｙ．Ｉｃｈｉｍｏｒｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９３巻（２号）、５４０〜５頁、（１９９３年）及び米国特許第５，１７１，６６８号明細書並びに第５，２０６，１４９号明細書に記載されており、これらは参考のために本明細書に取り入れられているものである。米国特許第５，５１２，４５１号明細書に開示され、参考のために本明細書に取り入れられている置換又は無置換のアリールボロン酸化合物及びそのエステル並びに無水物誘導体もまた、本発明に有用な強化剤の範囲内にあると考えられる。好適な強化剤を挙げると、これらに限定されるものではないが、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸、ｐ−イミダゾリルフェノール、アセトアミノフェン、２，４−ジクロロフェノール、２−ナフトール及び６−ブロモ−２−ナフトールがある。上掲の類別のものから、２種以上の強化剤の混合物もまた、使用することができる。
【００３４】
本発明の蛍光反応における添加剤としての非イオン界面活性剤の使用は、有用である。ペルオキシダーゼの使用による蛍光発生のための反応に、非イオン界面活性剤を含有させることにより、ペルオキシダーゼに関する分析感度の向上を図ることができる。本発明の実施上有用な非イオン界面活性剤として例示をすれば、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル及びポリオキシエチレン化ソルビトールエステルがある。
【００３５】
ＣＴＡＢのような第４級アンモニウム塩化合物を包含する陽イオン界面活性剤は、本発明のある種の化合物をペルオキシダーゼ及び過酸化物と反応させる場合、照射する蛍光の水準を高めるのに用いて有利である。
【００３６】
本発明の実施に有用なキレート剤には、例えば、ポリデンテートの陽イオン錯化剤、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびその塩、ならびに業界既知の他の試薬がある。
【００３７】
有機溶媒は、高度の水溶性を有し、一般的に処方内で約５容量％以下を有するものである。好適有機溶媒には、低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、２−プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコールおよび２−メトキシエタノールがあり、低分子量のエーテル、例えば、ＴＨＦ、ジオキサン、グリムおよびジグリム、アセトン、ＤＭＦ、アセトアミドおよびＤＭＳＯがある。
【００３８】
本発明の反応を、ペルキシダーゼで被覆した固形支持体、例えば、ビーズ、管、膜又はミクロウェルプレート（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の表面と接触できる水性緩衝液などの溶液中で実施する。好適緩衝液は、ｐＨを約４〜約１０の範囲内に維持可能な通常用いられる任意の緩衝液で、例えば、アセテート、ホスフェート、ボレート、カルボネート、トリス、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミンがある。これに関する本発明の好適実施方法は、特に使用しようとする目的での必要性によって決定される。
【００３９】
本発明方法による照射光は、任意の好適な既知の方法、例えば、分光蛍光計、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラ、シンチレーション計数管、蛍りん光体スクリーン又は視覚的な方法によって検出することができる。各検出方法は異なるスペクトル感度を有する。人間の眼は緑色の光に最適の感度を有し、ＣＣＤカメラは赤色光に最大感度を示し、Ｘ線フィルムは、紫外線から青色光又は緑色光への感応が最大であることを利用可能である。検出装置の選択は、適用分野及びコスト、便利さ及び永久記録の作成が必要かどうかの考慮によって支配される。
【００４０】
上記、ならびにその他の利点は、以下の実施例の検討によって明らかとなるであろう。
【実施例】
【００４１】
アクリダンカルボン酸誘導体１〜１１を合成し、本発明方法に従って試験した。
2005530501.tif 000012
【００４２】
【表１】
2005530501.tif 000013
【００４３】
実施例１．ペルオキシダーゼ基質化合物１の合成。
文献に記載されているとおり、化合物１を、市販のアクリジン−９−カルボン酸から出発して、ＳＯＣｌ2を用いる酸クロリドへの転化、エタノールによるエステル化、Ｎ−メチルトリフラートによるＮ−メチル化および亜鉛／酢酸による還元、の一連の転化により、化合物１を調製した。別法として、対応するカルボン酸である化合物９から、標準的エステル化条件によって生成させることもできる。
【００４４】
実施例２．ペルオキシダーゼ基質化合物２の合成。
メチルＮ−メチルアクリダン−９−カルボキシラート（０．７２８ｇ、２．８ミリモル）を、２５ｍＬのメタノールと２ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2の溶液中に溶解し、ヒドラジン（１．９ｍＬ、６２ミリモル）を添加し、反応混合物を１日間還流した。沈殿物を収集し、メタノールおよびＣＨ2Ｃｌ2で順次洗浄し、次いで、ＣＨ2Ｃｌ2／ヘキサンから再結晶した。1Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3）∂３．３９（ｓ，３Ｈ），３．６９（ｄ，２Ｈ），４．８５（ｓ，１Ｈ），６．６５（ｂｒｓ，１Ｈ），６．９６−７．３５（ｍ，８Ｈ）．  
【００４５】
実施例３．ペルオキシダーゼ基質化合物３の合成。
Ｎ−メチルアクリジニウム・トリフラート（１．０ｇ、２．９ミリモル）を３０ｍＬのＴＨＦ中に懸濁し、アルゴン気流下、０℃に冷却した。ＴＨＦ（０．５モルの７ｍＬ）中、４−メトキシフェニルマグネシウム・ブロミドの溶液をピペットにて注入し、混合液を３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を１０〜２０％ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）／ヘキサンでシリカ上、クロマトグラフィにかけた。化合物３を、白色固体として８１８ｍｇ得た。1Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3）∂３．４１（ｓ，３Ｈ），３．７３（３，３Ｈ），５．１３（ｓ，１Ｈ），６．７４−７．２３（ｍ，１２Ｈ）．
【００４６】
実施例４．ペルオキシダーゼ基質化合物４の合成。
１．０ｇのアクリダン（５．５×１０-3モル）、２４．８ｍｇの酢酸パラジウム（１．１×１０-4モル）、１７．８ｍｇのトリ−ｔ−ブチルホスフィン（８．８×１０-5モル）、７９５ｍｇのナトリウムｔ−ブトキシド（８．２９×１０-3モル）および１．０６ｇの１−ブロモ−４−フルオロベンゼン（６．０×１０-3モル）を、丸底フラスコに仕込み、フラスコをアルゴン気体で吹き拂った。無水トルエン（１０ｍＬ）をフラスコに加え、黒色となった溶液をそのまま室温で１６時間撹拌した。  
【００４７】
９．０ｇのアクリダン（４．９６×１０-2モル）、４４６ｍｇの酢酸パラジウム（１．９８×１０-3モル）、３２１ｍｇのトリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン（１．５８×１０-9モル）、７．１６ｇのナトリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド（７．４×１０-2モル）および９．６ｇの１−ブロモ−４−フルオロベンゼン（０．０５４モル）を丸底フラスコに仕込み、フラスコをアルゴン気体で吹き拂った。９０ｍＬの無水トルエンをフラスコに加え、黒色となった溶液を、そのまま室温で２時間撹拌した。
【００４８】
上記反応混合物を合体し、ブフナー漏斗で濾過し、メチレンクロリドで洗浄した。次いで、濾液を真空中で濃縮し、残渣をメチレンクロリド内に取り入れ、再濾過した。薄層クロマトグラフィ分析によって、濾液のみが生成物を含有することが判明した。５０ｇのシリカゲルを濾液に加え、この溶液を濃縮乾燥した後、ヘキサン中５％の酢酸エチルによるシリカゲルのカラム塔頂に仕込んだ。カラムをヘキサン中５％酢酸エチルによって溶離したが、生成物がカラム上に沈殿しはじめたので、カラムを新鮮なＣＨ2Ｃｌ2で溶離した。生成物の２種の溜分を収集し、濃縮乾燥し、1Ｈ  ＮＭＲにより、両溜分が純粋な生成物を含有することが判明した。両溜分を合体し、求める生成物１４ｇを得た。1Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3）∂４．２２（ｓ，２Ｈ），６．１６−６．１９（ｄ，２Ｈ），６．８４−６．８８（ｔ，２Ｈ），６．９３−６．９８（ｔ，２Ｈ），７．１３−７．１６（ｄ，２Ｈ），７．２９−７．３１（ｄ，４Ｈ）．  
【００４９】
実施例５．ペルオキシダーゼ基質化合物５の合成。
３Ｌのフラスコに、２００ｇのアクリドン（１．０３モル）、４９．３ｇの６０％ＮａＨ／油の分散液（１．２３モル）および１ＬのＤＭＦを仕込んだ。混合物を加温し、アルゴン気流下、一夜撹拌をした。褐色になった溶液に、ベンジル・ブロミド（１８５ｇ、１．０８モル）を添加した。撹拌を続けながら、反応液を加温した。２時間後、内容物は殆ど固化した。更に１時間後、１Ｌのエーテルを添加し、混合物を吸引濾過して固体を除去し、別のエーテル１Ｌで洗浄した後、水３Ｌで注意深く洗浄した。第２の生成物を合体した濾液の蒸発・乾燥によって単離し、黄色固体を得た。この固体を１Ｌの水で洗浄し、風乾した後、４００ｍＬのアセトンで洗浄した。合計で、Ｎ−ベンジルアクリドンの収率は、２３４ｇ、８０％であった。
Ｎ−ベンジルアクリドン（２２９ｇ、０．８モル）を、４Ｌのジエチルエーテル中、１０４．７ｇのリチウム・アルミニウムヒドリド（２．７６モル）で還元した。次いで、灰色のスラリーを、アルゴン気流で吹き拂い、反応物を還流まで急速に加温し、混合物を室温で一夜、撹拌した。混合物を１００ｍＬの水で、次いで、１００ｍＬの１５％ＮａＯＨ水溶液と３１５ｍＬの水とで急冷した。懸濁した固体を、４ＬのＣＨ2Ｃｌ2で充分に洗浄した。濾液を濃縮乾燥してアクリダン２０４ｇを白色固体として得た（９６％）。1Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3）∂４．０８（ｓ，２Ｈ），５．１３（ｓ，２Ｈ），６．６５−６．６８（ｄ，２Ｈ），６．８５−６．９（ｔ，２Ｈ），７．０１−７．０６（ｔ，２Ｈ），７．１３−７．３４（ｍ，７Ｈ）．
【００５０】
実施例６．ペルオキシダーゼ基質化合物６の合成。
化合物６は、２００１年、１０月１８日公告の米国特許出願公告第２００１／００３１８６９号明細書に記載されている通りに調製した。化合物の調製は、その中で、１ｐと命名された化合物の合成に関連して記載されている。
【００５１】
実施例７．ペルオキシダーゼ基質化合物７の合成。
メチルトリフラートでのアクリジンのアルキル化により調製した、Ｎ−メチルアクリジニウム・トリフラート（５．０ｇ、１４．５ミリモル）を、アルゴン気流下に１００ｍＬの乾燥ＴＨＦに懸濁させ、３モルのメチルマグネシウム・ブロミド５．８ｍＬ（１７ミリモル）と、ヘキサン中で、一夜撹拌することによって処理した。溶液を濃縮乾燥した。５％酢酸エチル／ヘキサンで溶離した、シリカゲルカラム上でのクロマトグラフィ精製後、生成物を単離した。２．８２ｇ（９２．５％）の９−メチル化誘導体を、白色固体として得た。1Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3）∂１．３１−１．３３（ｄ，３Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．９４−４．０２（ｑ，１Ｈ），６．８９−６．９７（ｍ，４Ｈ），７．１７−７．２３（ｍ，４Ｈ）．
【００５２】
実施例８．ペルオキシダーゼ基質化合物８の合成。
乾燥ＴＨＦ２００ｍＬ中、化合物５のＮ−ベンジルアクリダン（１０ｇ、３７ミリモル）の溶液を、不活性雰囲気下に、−７８℃まで冷却し、ヘキサン中２．５モルのｎ−ブチルリチウム２５．０ｍＬ（３７．５ミリモル）を、１５分間で滴下した。その溶液を１時間、−７８℃で撹拌し、次いで４５分間、室温に加温した。反応混合物を再び−７８℃に冷却し、約２００ｇの粉砕したドライアイスを加えて、沈殿を生じさせた。反応物を室温まで徐々に加温し、アルゴン気流下にて、一夜撹拌を継続した。混合物を蒸発した後、固体を３００ｍＬの水に懸濁させ、１２ＮのＨＣｌで酸性としてｐＨ３とした。固体を収集し、水洗してＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮してＮ−ベンジル−アクリダン−９−カルボン酸１１ｇを得た。1Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3）∂４．９９（ｓ，１Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），６．７２−６．７５（ｄ，２Ｈ），６．８８−６．９４（ｔ，２Ｈ），７．１０−７．１７（ｍ，４Ｈ），７．２２−７．３２（ｍ，５Ｈ）．
【００５３】
実施例９．ペルオキシダーゼ基質化合物９の合成。
実施例８に記載したように、ＴＨＦ中、ｎ−ＢｕＬｉでの処理後、粉砕ドライアイスの添加により、化合物１０、４９．６ｇ（２５．５ミリモル）のカルボキシル化を実施し、カルボン酸９を５５．５ｇ（９１％）の収量（収率）で得た。1Ｈ  ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ6）∂３．３３（ｓ，３Ｈ），４．９３（ｓ，１Ｈ），６．９１−７．２６（ｍ，８Ｈ）．
【００５４】
実施例１０．ペルオキシダーゼ基質化合物１０の合成。
実施例５に記載したとおり、市販のＮ−メチルアクリドン６０．２ｇを、ジエチルエーテル中ＬｉＡｌＨ4で還元した。収量・収率は４９．６ｇ、８８％であった。1Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3）∂３．３８（ｓ，３Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），６．８７−７．２２（ｍ，８Ｈ）．
【００５５】
実施例１１．ペルオキシダーゼ基質化合物１１の合成。
アクリジン（５．２ｇ、２９ミリモル）を、２００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、アルゴン気流下に放置した。亜鉛片（２．０９ｇ、３２ミリモル）および１．９ｍＬの酢酸（３３ミリモル）を加え、混合物を２日間撹拌した。固形物を濾過して取り、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した。空気乾燥後、固体を微粉末に粉砕し、２Ｎ−ＨＣｌ  ３００ｍＬを加えて３０分間撹拌、固体を再び濾別し、水、２−プロパノールおよびヘキサンで順次洗浄した。乾燥後、４．７１ｇの９，９’−ビアクリダニル（９０％）を得た。
【００５６】
９，９’−ビアクリダニル（１．０ｇ、２７．７ミリモル）、６２．２ｍｇの酢酸パラジウム（０．２７ミリモル）、４５ｍｇのトリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン（０．２２ミリモル）、０．８０ｇのナトリウムｔｅｒｔ−ブトキサイド（３当量）および０．９６ｇのブロモベンゼン（６．１ミリモル）を丸底フラスコに仕込み、フラスコをアルゴン気流で吹き払った。乾燥トルエン（３０ｍＬ）をフラスコに添加し、黒色となった溶液を、一夜室温で撹拌した。反応混合物を、１００ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に注入し、２０ｇのシリカを通して濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2を追加して洗浄した。溶媒を蒸発し、得た黄色固体を、１０％酢酸エチル／ヘキサンで、シリカ上、クロマトグラフィにかけた。化合物１１（１．２５ｇ、８８％）を、薄黄色固体として得た。1Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3）∂４．４１（ｓ，２Ｈ），５．９９−６．０２（ｄ，４Ｈ），６．６６−６．７８（ｍ，１２Ｈ），６．９４−７．０（ｍ，４Ｈ），７．３５−７．４８（ｍ，６Ｈ）．
【００５７】
実施例１２．試薬処方の調製。
化合物１〜１３の何れかを含有する強化試薬処方を、下記の塩基性または酸性処方として調製した。
2005530501.tif 000014
【００５８】
実施例１３．蛍光スペクトル。
１．０ｎｍ．の帯域に設置した励起および発光スリットにより、ジョビン・イボン／スペックス・フロロマックス−３（Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ／ＳＰＥＸ  Ｆｌｕｏｒｏ  Ｍａｘ−３）分光蛍光計を用いて蛍光スペクトルを得た。紫外線蛍光計キュベット（３．５ｍＬ容量、パーフェクター・サイエンティフィック（Ｐｅｒｆｅｃｔｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いた。
【００５９】
実施例１４．基質の評価。
化合物１〜１３の各々を、ＨＲＰとの反応による、蛍光発生物の製造について試験し、分光蛍光法分析によって測定した。化合物１を用いる代表的方法を下記に記載する。他の化合物にも本質的には同様の方法を用いた。
酸性処方におけるエチルＮ−メチルアクリダン９−カルボキシレート（化合物１）の０．０５ミリモルの溶液３ｍＬをピペットでキュベット中に取った。励起スペクトル（λem＝５２４ｎｍ）および発光スペクトル（λex＝３６４ｎｍ）を記録した。ＨＲＰ（１３．８フェムト・モル、４．６×１０-12モル）を添加し、完全に混合した。５２４ｎｍでの蛍光の増加を１５分に亘って記録した。励起スペクトル（λem＝５２４ｎｍ）および発光スペクトル（λem＝３５７ｎｍ）を、更に記録した。
【００６０】
【表２】
2005530501.tif 000015
【００６１】
実施例１５．背景の蛍光信号の測定。
実施例１２に記載した酸性または塩基性処方における、いずれかの各基質溶液３ｍＬを、ピペットでキュベット中に取った。ＨＲＰ（１３．８フェムト・モル、４．６×１０-12モル）を添加し、十分に混合した。蛍光の最大点増加量を、各基質につき、１５分後に記録した。背景信号値を、ｔ＝０分と、ｔ＝１５分との蛍光強度を比較することによって算出した。
【００６２】
【表３】
2005530501.tif 000016
【００６３】
実施例１６．Ｎ−メチルアクリダン（化合物１０）とＨＲＰとの反応生成物の蛍光スペクトル。
酸性処方におけるＮ−メチルアクリダンの０．０５ミリモル溶液３ｍＬをピペットでキュベット中に取った。ＨＲＰ（１３．８フェムト・モル、４．６×１０-12モル）を添加し、十分に混合した。発光スペクトル（３５７ｎｍでの励起）を、１．８時間経過後、４．５分間記録した。図１に、得られた一組の発光スペクトルを示す。酸性処方におけるＮ−メチルアクリジニウム・トリフラートの０．０５ミリモル溶液の発光スペクトル（３５７ｎｍでの励起）もまた、Ｎ−メチルアクリダン／ＨＲＰ溶液からの発光スペクトルとの比較のために示した。スペクトルの同一性によって、化合物１０の蛍光性アクリジニウム化合物への酵素変換が示された。
【００６４】
実施例１７．化合物１０からの蛍光発生物の生成速度。
図２は、実施例１６の反応溶液からの４９５ｎｍ（３５７ｎｍにおける励起）での蛍光強度を、時間の関数として描いたものである。蛍光強度は、２時間で最高に到達し、定常値を保った。
【００６５】
実施例１８．化合物１を用いての、ＨＲＰの蛍光検出感度。
励起帯域フィルター（３８０ｎｍ）と、発光帯域フィルター（４６５または５３０ｎｍ）を用い、ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）フロロスキャン・アセント（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ・Ａｓｃｅｎｔ）微量力価感光板蛍光計（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）によって、蛍光検出限界を測定した。ブラックマイクロフルオルＢの（Ｂｌａｃｋ  Ｍｉｃｒｏ  ＦＬＵＯＲ  Ｂ）１２のウェル（ｗｅｌｌ）のあるストリップ（ｓｔｒｉｐ）（ダイナテク・ラボラトリーズ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用した。ＨＲＰを、タイプ１の水で連続的に希釈し、希釈したＨＲＰ１０μＬを、各ウェルにピペットで投入した。酸性処方でのエチルＮ−メチルアクリダン９−カルボキシレートの０．０５ミリモル溶液を調製し、１００μＬずつ、各ウェルにピペットで投入した。次いで、３８０ｎｍ〜５３０ｎｍのフィルター装置で、フロロスキャン・アセント上でストリップを読み取った。図３により、この基質で優れた感度が得られることが示された。
【００６６】
実施例１９．化合物２を用いての、ＨＲＰの蛍光検出感度。
ＨＲＰを、タイプ１の水中に、連続的に希釈し、１０μＬの希釈ＨＲＰを、各ウェルにピペットで投入した。塩基性処方でのＮ−メチルアクリダン９−カルボン酸ヒドラジドの０．０５ミリモル溶液を調製し、１００μｌを各ウェルにピペットで投入した。次いで、３８０〜４６５ｎｍフィルターを設置したフロロスキャン・アセント上で、ストリップを読み取った。図３は、該基質によって得られた優れた感度を示すものである。
【００６７】
実施例２０．化合物４を用いての、ＨＲＰの蛍光検出感度。
ＨＲＰを、タイプ１の水中に、連続的に希釈し、１０μＬの希釈ＨＲＰを、各ウェルにピペットで投入した。酸性処方でのＮ−（４−フルオロフェニル）アクリダンの０．０５ミリモル溶液を調製し、１００μｌを各ウェルにピペットで投入した。次いで、３８０〜４６５ｎｍフィルターを設置したフロロスキャン・アセント上で、ストリップを読み取った。図３は、該基質によって得られた優れた感度を示すものである。
【００６８】
実施例２１．化合物１２からの蛍光生成物の生成速度。
ｐＨ８．０の、０．０１モル、トリス緩衝液中０．３ミリモルの、２’，３’，６’−トリフルオロフェニル１０−メチルアクリダン−９−カルボキシレート（化合物１２）、０．１ミリモルの４−フェニルフェノール、０．５ミリモルの尿素過酸化物、１ミリモルのＥＤＴＡおよび０．０２５％のツィン２０を含有する薬剤３ｍＬをピペットでキュベットに投入した。ＨＲＰ（１３．８フェムト・モル、４．６×１０-12モル）を添加し、十分に混合した。１．８時間経過後、４．５分間、発光スペクトル（３５７ｎｍでの励起）を得た。得られた１組の発光スペクトルを図４に示す。スペクトルは、反応の進行を描いており、アクリジニウム蛍光の成長と、Ｎ−メチルアクリドンの蛍光が漸次優勢となることを示している。
【００６９】
実施例２２．アクリダン基質１３を用いて、化学ルミネセンスによるＨＲＰの検出。
ｐＨ８．０で０．０１モルのトリス緩衝液中、０．０５ミリモルの２’，３’，６’−トリフルオロフェニル  ３−メトキシ−１０−メチルアクリダン９−カルボキシレート（化合物１３）、０．１ミリモルの４−フェニルフェノール、０．５ミリモルの尿素過酸化物、１ミリモルのＥＤＴＡおよび０．０２５％のツィン２０を含有する薬剤を用いて、化学ルミネセンス性のＨＲＰ検出限界をラブシステムズ・ルミノスキャン（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ）微量力価感光板読取機上で測定した。各ウェル中に、該薬剤１００μＬを含有するホワイト・マイクロライト（Ｗｈｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ）１ＦＢの１２ウェル・ストリップ（ダイナテク・ラボラトリーズ）を、ＨＲＰ希釈液１０μＬと反応させた。光強度を、１０分で測定した。
【００７０】
実施例２３．アクリダン基質１３を用いて、蛍光によるＨＲＰの検出。
２次的な方式により、蛍光を発生する実施例２２の反応溶液を用いて、ＨＲＰの感度の良い検出を達成した。化学ルミネセンスを測定した後、ストリップを蛍光計に移設し、励起３８０ｎｍとして、５３０ｎｍで蛍光強度を測定した。図５は、この方法により、１アット・モル（１０-18モル）以下のＨＲＰでも検出できることを示している。その感度は、同一基質に関する化学ルミネセンス検出と同等であった。
【００７１】
実施例２４．化合物１４を用いるＨＲＰの蛍光検出。
ｐＨ８．０、０．０１モルのトリス緩衝液中、０．０５ミリモルの化合物１４、０．６ミリモルの尿素過酸化物、０．１ミリモルのｐ−フェニルフェノール、０．０２５％のツィン２０、１ミリモルのＥＤＴＡを含有する検出試薬４０μＬを、室温でＨＲＰ（１．４×１０-16モル）の１μＬと反応させた。アクリジニウムエステルの最終生成物生成を、分光光度法ならびに５００ｎｍでの蛍光による検出として、５分後に検出し、それが１時間に亘って増大し続けた。
2005530501.tif 000017
【００７２】
基質２，３，６−トリフルオロ−フェニル１，６−ジメトキシ−４，１０−ジメチルアクリダン−９−カルボキシレート（化合物１５）について、同様の実験をおこない、ＨＲＰとの反応により分光光度法および５００ｎｍでの蛍光により検出可能な蛍光性アクリジニウム最終生成物を得た。
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【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】化合物１０とＨＲＰとを含有する反応溶液から得た、一連の規則的系列の蛍光スペクトルを示す図である。該スペクトルは、アクリジニウム生成物の蛍光に対応している。比較のために、別個に調製したＮ−メチルアクリジニウムトリフラートのサンプルの蛍光スペクトルを示した。
【図２】図１に記載した反応から得た蛍光発生物の生成時系列を示す図である。発生光を３５７ｎｍでの励起と、４９５ｎｍでの蛍光照射検出によって追跡した。
【図３】本発明方法によって実施した蛍光原基質を用いるＨＲＰ検出の直線性を示すグラフである。溶液組成は、ｐＨ５のアセテート緩衝液１０ミリモル中、０．０５ミリモルの基質１または４と、０．１ミリモルの４−フェニルフェノール、０．５ミリモルの尿素過酸化物、１ミリモルのＥＤＴＡ、０．０２５％のツイン２０、および、ｐＨ８のトリス１０ミリモル中、０．０５ミリモルの基質２、０．１ミリモルの４−フェニルフェノール、０．５ミリモルの尿素過酸化物、１ミリモルのＥＤＴＡ、１０ミリモル中０．０２５％のツイン２０で、これを、指定定量のＨＲＰと反応させた。１５〜２０分の反応後、最高時の蛍光強度を測定した。強度マイナス背景の語は、ＨＲＰ不存在での背景蛍光（Ｂ）で、ＨＲＰ存在下での相対的光度単位の蛍光強度を補正したものである。この方法で、１アットモル以下のＨＲＰが、検出可能である。
【図４】化合物１２とＨＲＰとを含有する反応溶液から得られた、一連の規則的系列蛍光スペクトルを示すグラフである。このスペクトルは、アクリジニウムエステル中間体と、Ｎ−メチルアクリドン生成物との生成を示している。
【図５】蛍光および化学ルミネセンス検出に関する基質１３を含有する試薬組成物を用いた、ＨＲＰ検出の直線性を示すグラフである。ｐＨ８．０のトリス緩衝液１０ミリモル中０．０５ミリモルの化合物１３、０．１ミリモルの４−フェニルフェノール、０．５ミリモルの尿素過酸化物、１ミリモルのＥＤＴＡ、０．０２５％のツィン２０を含有する溶液を指定量のＨＲＰと反応させた。化学ルミネセンス強度を酵素添加後１０分で測定し、５１５ｎｍの蛍光を、酵素添加後３０分で測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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