(57)【要約】本発明は、緩徐な不活性化を示すA型K+ チャネル(slowly-inactivating A-type K+ channel)開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する過活動膀胱治療剤、およびslowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を指標として測定することを含む過活動膀胱治療剤のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩徐な不活性化を示すA型K+ チャネル(slowly-inactivating A-type K+ channel)開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する過活動膀胱治療剤。
【請求項２】
緩徐な不活性化を示すA型K+ チャネル(slowly-inactivating A-type K+ channel)開口作用を有する化合物が、N-(5,5-ジオキシド-10-オキソ-4,10-ジヒドロチエノ[3,2-c][1]ベンゾチエピン-9-イル)-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミドである請求項１記載の過活動膀胱治療剤。
【請求項３】
緩徐な不活性化を示すA型K+ チャネル(slowly-inactivating A-type K+ channel)開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩の治療有効量を投与することを含む過活動膀胱の治療方法。
【請求項４】
過活動膀胱治療剤の製造のための、緩徐な不活性化を示すA型K+ チャネル(slowly-inactivating A-type K+ channel)開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩の使用。
【請求項５】
緩徐な不活性化を示すA型K+ チャネル(slowly-inactivating A-type K+ channel)開口作用を指標として測定することを含む過活動膀胱治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過活動膀胱治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
過活動膀胱は尿意切迫感および頻尿の症状を呈している病的状態であり、切迫性尿失禁を併発している場合と併発していない場合があるが、これらの症状を説明できるような局所の病的要因または代謝系の要因がないとされている。蓄尿および排尿は、末梢および中枢神経系を含む複雑な反射経路の生理的制御を受けている［ユーロロジー（Urology）、50巻、サプルメント6A号、36-52頁（1997年）］。尿意切迫感とは急激かつ強力な尿意を指し、切迫性尿失禁は尿意切迫感による不随意な尿漏れを指す。
【０００３】
過活動膀胱に起因する尿意切迫感および切迫性尿失禁のような症状を有する患者には、多くの場合、膀胱内圧測定において排尿筋の不随意（無抑制）収縮が認められ、これは排尿筋過活動と呼ばれる。この排尿筋過活動が尿意切迫感と切迫性尿失禁の要因と考えられている。さらに、尿意切迫感は頻尿の要因ともなる。この排尿筋過活動は、２つのカテゴリーに分類される。患者に神経障害が認められる場合の神経因性膀胱（排尿筋過反射）、および患者に神経障害が認められない場合の不安定膀胱（排尿筋不安定症）である。不安定膀胱の要因はおそらくは神経因性膀胱もしくは排尿筋平滑筋自体の障害のいずれか（またはその両方）であると考えられている。神経因性膀胱と関係する神経障害にはパーキンソン病、脳卒中、糖尿病、多発性硬化症、末梢性神経障害および脊髄損傷などがある。
【０００４】
膀胱における充満感はAδ線維およびC線維の二種類の膀胱知覚求心性ニューロンを介して中枢神経系に伝えられるが、通常の状態では、C線維は関与していない（silentである）。他方、膀胱の知覚過敏などの状態の下ではC線維の感受性が増大していることが知られている［クリニカル・ジャーナル・オブ・ペイン（Clinical J. Pain）、16巻、S86-89頁（2000年）］。さらに、核上型脊髄損傷患者の過活動膀胱に、膀胱知覚求心路C線維を介した脊髄反射機構が関与していることが知られている［ジャーナル・オブ・ユーロロジー（J. Urol.）、157巻、585-589頁（1997年）］。
【０００５】
カリウム・チャネル（K+ channel）は種々組織の細胞膜上に存在し、膜電位の調節を介して様々な生理作用に関与している。K+ チャネルは、電位依存性、Ca++感受性、およびその他のチャネルの性質により種々のタイプに分類される。緩徐な不活性化を示すA型K+ チャネル(slowly-inactivating A-type K+ channel)は、カプサイシン感受性脊髄後根神経節（DRG）神経細胞に発現しており［ジャーナル・オブ・ニューロフィジオロジー（J. Neurophysiol.）、75巻、2629-2646頁（1996年）］、C線維の興奮性を制御している［ジャーナル・オブ・フィジオロジー（J. Physiol.）、494巻、1-16頁（1996年）］。正常ラットの膀胱求心性神経C線維の活動電位は、slowly-inactivating A-type K+チャネルの効果により高い閾値を保っている。一方、慢性膀胱炎ラットにおいては、イオンチャネル特性が変化して、K+電流の減弱が起きている。このため膀胱炎時には、C線維の興奮性が上昇し、過活動膀胱が惹起されると考えられてきた［ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（J. Neurosci.）、19巻、4644-4653頁（1999年）］。また、脊髄損傷後の過活動膀胱を示しているラットにおいてはslowly-inactivating A-type K+ channel密度が減少して、C線維の興奮性が上昇している。
【発明の開示】
【０００６】
上記の知見により、我々は、脊髄損傷または膀胱炎などの神経因性膀胱のような種々病態から生じる過活動膀胱を、slowly-inactivating A-type K+ channel開口を介してC線維の興奮性を低下させることにより、治療できるという仮説を立てた。我々は、slowly-inactivating A-type K+ channelの開口活性を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩が、過活動膀胱の治療に有用であることを見いだし、本発明を完成した。
本発明の目的は、優れた過活動膀胱治療剤を提供することにある。
【０００７】
本発明は、
（１）slowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する過活動膀胱治療剤、および
（２）slowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を有する化合物が、N-(5,5-ジオキシド-10-オキソ-4,10-ジヒドロチエノ[3,2-c][1]ベンゾチエピン-9-イル)-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミドである（１）項記載の過活動膀胱治療剤に関する。
【０００８】
本発明は、
（３）slowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩の治療有効量を投与することを含む過活動膀胱の治療方法、および
（４）過活動膀胱治療剤の製造のための、slowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩の使用に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、
（５）slowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を指標として測定することを含む過活動膀胱治療剤のスクリーニング方法に関する。
本明細書における「slowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を有する化合物」は、その性質の一つとしてslowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を有していれば、新規であるか公知であるかを問わず、また化合物の構造等に限定されず、すべてのslowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を有する化合物を意味する。
【００１０】
本発明で使用されるslowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を有する化合物としては、(S)-(+)-N-(5,5-ジオキシド-10-オキソ-4,10-ジヒドロチエノ[3,2-c][1]ベンゾチエピン-9-イル)-3,3,3-トリフルオロ-2-ヒドロキシ-2-メチルプロパンアミド［(S)-(+)-N-(5,5-dioxido-10-oxo-4,10-dihydrothieno[3,2-c][1]benzothiepin-9-yl)-3,3,3-trifluoro-2-hydoxy-2-methylpropanamide］（化合物１）などがある。化合物１はWO98/46587に記載されている化合物1-25と同一化合物である。
【００１１】
【化１】
2005506296.tif 000002
【００１２】
本発明のスクリーニング方法において、slowly-inactivating A-type K+ channel開口作用の測定方法は特に限定されないが、例えば後記の試験例１および２に記載の方法などが挙げられる。
【００１３】
本発明で用いられる化合物の薬理作用を試験例により以下に説明する。
【００１４】
試験例１： DRG細胞におけるslowly-inactivating  K+電流増強効果
＜材料および方法＞
動物の準備
試験は成熟Sprague Dawley系雌性ラットを用いて行った。未同定のDRGニューロン群あるいは膀胱神経を支配する特定のDRGニューロン群を用いて、2系列の実験を行った。膀胱を神経支配するDRGニューロン群は、細胞単離7日前にハロタン麻酔下動物の膀胱壁に注入した蛍光色素の4%(w/w) ファースト・ブルー（Fast Blue） (ポリロイ社（Polyloy）, グロス・ウムスタット（Gross Umstat）,ドイツ（ Germany）)の逆行性軸索輸送によって標識した。色素は膀胱の背側表面の3〜6部位に28ゲージの注射針を用いて注入した（1部位当り5〜6 μL、総容量20〜30 μL）。各注入部位は、隣接組織が色素で汚染するのを最小限にするため生理食塩水で洗った。
【００１５】
＜細胞分離＞
DRGからの単離ニューロンはハロタン麻酔下動物から調製した。L6およびS1 DRGを動物より切り出し、0.3 mg/mL トリプシン（Type 3、シグマ社）、1 mg/mL コラゲナーゼ（Type 1、シグマ社）および0.1 mg/mLデオキシリボヌクレアーゼ（Type 4、シグマ社）を含む5mLのDMEM（シグマ社）を加え、35℃で25分間振盪浴槽中で単離した。次いでトリプシン活性を中和させるためにトリプシン阻害剤（Type 2a、シグマ社）を加えた。個々のDRG細胞体は分散させて分離し、ポリ-L-リジンで覆われた35 mmのペトリ皿上に撒いた。
【００１６】
＜電気的記録＞
色素標識された膀胱を支配する一次求心性ニューロンは、蛍光アタッチメント(UV-IAフィルター；励起波長、365 nm)付き倒立型位相差顕微鏡(ニコン社、東京、日本)を用いて特定した。培養皿中の各標識ニューロンに対し、室温(20゜C〜22℃)でギガオーム・シール・ホールセル記録法を実施した。通常、培養皿中には200〜300個の非標識ニューロンのうち、3〜7の標識細胞が含まれている。内液（KOHでpH 7.4に調整した）は以下の通り(mmol/L)： KCl 140、CaCl２ 1、MgCl２ 2、EGTA 11、HEPES 10、Mg-ATP 2、Tris-GTP 0.4。パッチ電極の抵抗は、内液で満たされた時に1〜4 MΩであった。ニューロンはNaCl 150、KCl 5、CaCl２ 2.5、MgCl２ 1、HEPES 10およびD-glucose 10（以上、mmol/L）を含む外液（NaOHでpH 7.4に調整した）で1.5 mL/minの流速で表面灌流した。全ての記録は、Axopatch-1D パッチクランプ増幅器(アクソン・インストルメンツ社（Axon Instruments）、フォスター・シティ（Foster City）、カルフォルニア州（CA）)を用いて行い、データはPCLAMPソフトウェア (アクソン・インストルメンツ社（Axon Instruments）)にて取得して解析した。
【００１７】
電位固定記録では、外向きK＋電流と内向きNa＋電流を測定した。K＋電流を単離するため、choline-Cl 150、KOH 5、CaCl２ 0.03、HEPES 10、Mg(OH)２3およびD-glucose10（以上、mmol/L）を含む外液（HClでpH 7.4に調整した）に変更した。
未同定DRGニューロンを用いた第1番目の一連の実験では、外向きK＋電流を、-90 mVの保持電位から、長さ800 msの+60 mVの脱分極処置で誘発し、さらに１秒間の-20 mVの条件付き前パルスの後、セカンド・パルスとして+60 mV まで同様の脱分極パルスを順次与えることにより誘発した。ファースト・ブルーで標識した膀胱求心性DRGニューロンを用いた第2番目の実験群では、-120mVの保持電位（slowly-inactivating  A-type K+電流が完全に活性化される条件）から活性化された外向きK＋電流から、-40 mVの保持電位（slowly-inactivating  A-type K+電流のほとんどが不活性化されている条件）から活性化された外向きK＋電流を差し引くことによりslowly-inactivating  A-type K+電流を分離した。化合物は低濃度から累積的に適用した。電流は最高点(ピーク)で測定し、対照(化合物適用前)で規格化した。
【００１８】
内向きNa＋電流は、-90 mVの保持電位から＋60 mV、800 msの長さの脱分極処置によって誘発した。電流は最高点(ピーク)で測定し、対照(化合物適用前)で規格化した。
未同定DRGニューロンを用いた実験で得られた結果を第１表〜第５表に、カプサイシン感受性膀胱求心性ニューロンを用いた実験で得られた結果を第６表に示す。第１表には保持電位が-90 mV時（slowly-inactivating  A-type K+電流活性化条件）または-20 mV時（slowly-inactivating  A-type K+電流不活性化条件）の電流変化に対する化合物1の作用を示す。第２表には20 mmol/Lテトラエチルアンモニウム（tetraethylammonium）存在下での化合物１の作用、第３表には5 μmol/Lベラパミル（verapamil）存在下での化合物１の作用、第４表には60 mmol/L テトラエチルアンモニウム（tetraethylammonium）存在下での化合物１の作用を示す。第５表には、Na+電流に対する化合物１の作用を示す。第1〜5表において、nは例数を表す。
【００１９】
【表１】
2005506296.tif 000003
【００２０】
第１表は、未同定DRG細胞を用いた、膜電位固定法（voltage clamp）で測定した電流に対する化合物１の作用を表している。保持電位（HP）-90 mVから活性化される電流はslowly-inactivating  A-type K+電流を含むK+電流を測定した成績であり、保持電位-20 mVから活性化される電流は遅延整流性K+電流を測定した成績である。第１表より、化合物１は化合物濃度1×10-7〜5×10-7 mol/Lをピークにして、slowly-inactivating  A-type K+電流を増強するが、遅延整流性K+電流には影響しない（影響が少ない）ことが示唆された。なお、化合物１の効果（値）は、薬物適用前の値を1とした時の相対値で示す。
【００２１】
【表２】
2005506296.tif 000004
【００２２】
第２表は、遅延整流性 K+ 電流の阻害剤（blocker）であるテトラエチルアンモニウム存在下での化合物１の作用を表している。遅延整流性 K+電流の阻害剤存在下でも、化合物１は同様の結果を示すことにより、化合物１のK+ 電流増強効果は遅延整流性 K+ channelを介したものではないことが示唆される。
【００２３】
【表３】
2005506296.tif 000005
【００２４】
第３表は、遅延整流性 K+電流の阻害剤（blocker）であるベラパミル（verapamil）存在下での化合物１の作用を示している。第３表においても第２表と同様の結果が得られていることにより、化合物１のK+電流増強効果は遅発整流性 K+ channelを介したものではないことが示唆される。
【００２５】
【表４】
2005506296.tif 000006
【００２６】
第４表は高濃度のテトラエチルアンモニウム（TEA）存在下での化合物１の作用を表している。高濃度のテトラエチルアンモニウム（TEA）は遅発整流性 K+電流の阻害剤（blocker）として作用する。第４表においても第２表と同様の結果が得られていることにより、化合物１のK+電流増強効果は遅発整流性 K+ channelを介したものではないことが示唆される。
【００２７】
【表５】
2005506296.tif 000007
【００２８】
第５表はDRG細胞におけるNa+電流に対する化合物１の作用を表している。化合物１はNa+電流には影響しないことが第５表より明らかである。
【００２９】
【表６】
2005506296.tif 000008
【００３０】
第６表は、ファースト・ブルーで標識されたカプサイシン感受性膀胱求心性ニューロン（C線維と推定されるニューロン）におけるslowly-inactivating  A-type K+電流（IK）および遅延整流性K+電流に対する化合物１の作用を表している。slowly-inactivating  A-type K+電流は、-120 mVの保持電位（slowly-inactivating  A-type K+電流が完全に活性化される条件）から活性化された外向きK+電流から、-40 mVの保持電位（slowly-inactivating  A-type K+電流のほとんどが不活性化される条件）から活性化された外向きK+電流を差し引くことにより単離した。第６表より、未同定DRGニューロンでの検討と同様に、化合物１はslowly-inactivating  A-type K+電流を増加させるが、遅延整流性K+電流には影響が少ないことが示された。
【００３１】
試験例２：DRG細胞における膜電位変化
＜材料および方法＞
動物の準備
試験は成熟Sprague Dawley系雌性ラットを用いて行った。未同定のDRGニューロン群および膀胱神経を支配する特定の膀胱支配DRGニューロン群は、細胞単離7日前にハロタン麻酔下動物の膀胱壁に注入した蛍光色素の4%(w/w) ファースト・ブルー（Fast Blue） (ポリロイ社（Polyloy）, グロス・ウムスタット（Gross Umstat）, ドイツ（Germany）)の逆行性軸索輸送によって標識した。色素は膀胱の背側表面の3〜6部位に28ゲージの注射針を用いて注入した（1部位当り5〜6 μL、総容量20〜30 μL）。各注入部位は、隣接組織が色素により汚染するのを最小限にするため生理食塩水で洗った。
【００３２】
＜細胞分離＞
DRGからの単離ニューロンはハロタン麻酔下動物から調製した。L6およびS1 DRGを動物より切り出し、0.3 mg/mL トリプシン（Type 3、シグマ社）、1 mg/mL コラゲナーゼ（Type 1、シグマ社）および0.1 mg/mLデオキシリボヌクレアーゼ（Type 4、シグマ社）を含むDMEM（シグマ社）5mLを加え、35℃で25分間振盪浴槽中で単離した。次いでトリプシン活性を中和させるためにトリプシン阻害剤（Type 2a、シグマ社）を加えた。個々のDRG細胞体は分散させて分離し、ポリ-L-リジンで覆われた35 mmのペトリ皿上に撒いた。
【００３３】
＜電気的記録＞
色素標識された膀胱を支配する一次求心性ニューロンは、蛍光アタッチメント(UV-IAフィルター；励起波長、365 nm)付き倒立型位相差顕微鏡(ニコン社、東京、日本)を用いて特定した。細胞分離6〜8時間以内に、培養皿中の各標識ニューロンに対し、室温(20゜C〜22℃)でギガオーム・シール・ホールセル記録法を実施した。通常、培養皿中には200〜300個の非標識ニューロンのうち、3〜7の標識細胞が含まれている。内液（KOHでpH 7.4に調整した）は以下の通り(mmol/L)： KCl 140、CaCl２ 1、MgCl２ 2、EGTA 11、HEPES 10、Mg-ATP 2、Tris-GTP 0.4。パッチ電極の抵抗は、内液で満たされた時に1〜4 MΩであった。ニューロンは、NaCl 150、KCl 5、CaCl２ 2.5、MgCl２ 1、HEPES 10およびD-glucose 10（以上、mmol/L）を含む外液（NaOHでpH 7.4に調整した）で1.5 mL/minの流速で表面灌流した。全ての記録は、Axopatch-1D パッチクランプ増幅器(アクソン・インストルメンツ社（Axon Instruments）、フォスター・シティ（Foster City）、カルフォルニア州（CA）)を用いて行い、データはPCLAMPソフトウェア (アクソン・インストルメンツ社)にて取得して解析した。
【００３４】
電流固定記録では、DRG細胞の膜電位を化合物適用の前後で測定した。膜電位は、コントロール（化合物適用前）で規格化した。
膜電位に対する化合物１の影響を第７表に示す。
【００３５】
【表７】
2005506296.tif 000009
【００３６】
第７表は、DRG細胞における膜電位に対する化合物１の作用を表している。化合物１がslowly-inactivating  A-type K+電流を増強、すなわち外向き電流を増加することにより過分極（膜電位のマイナス側への変化）を誘起することが示されている。この作用は、DRG細胞の興奮性を低下させることを示唆する。
【００３７】
以上の試験例１および試験例２の結果より、化合物１がslowly-inactivating  A-type K+電流の増強作用を有することが明らかとなった。
【００３８】
試験例３：神経因性膀胱の抑制作用
実験は、チェン（Cheng）らの方法[ブレイン・リサーチ（Brain Res.）、678巻、40-48頁（1995年）]に準じて行った。
実験には、雌性SD系ラット8〜10週令（日本エスエルシー社供給）を使用した。ラットは室温19〜25℃、湿度30〜70%、一日12時間照明（午前7時〜午後7時）の飼育室にて、金属ケージに5〜7匹ずつ収容し、市販の固形飼料と水を自由に摂取させて飼育した。
【００３９】
ラットに脊髄損傷を誘起した。ラットをジエチルエーテルで麻酔し、背側胸髄部分の皮膚を切開した。第7〜8胸椎部分の椎弓を切除した。第7〜8胸髄付近を5 mm程度切除し、止血のため切除部分の創腔に酸化セルロースを充填した。切開部分を手術用絹糸で縫合した。脊髄損傷手術後、完全に自律排尿が認められるまで、1日2回（8〜9時および18〜19時の間）、手圧排尿を約3週間行った。また、抗生物質アンピシリン(ampicillin、シグマ社製；150 mg/kg）の筋肉内投与を1日1〜2回、約2週間行った。
【００４０】
脊髄損傷4〜5週間後、ラットに膀胱カテーテル手術を施した。ジエチルエーテル麻酔下に、腹部正中を切開して膀胱を露出した。組織を傷つけないよう、先端を鈍化させたポリエチレンチューブ(PE-50；ベクトン・ディッキンソン社)に生理食塩液（大塚製薬工場、徳島、日本）を満たし、膀胱頂部より挿入した。この膀胱カテーテルを手術用絹糸で固定、留置した。また、他端は皮下を通して背頸部より導出して栓を取り付け、皮膚に手術用糸で固定した。
【００４１】
膀胱カテーテル手術4〜6日後にシストメトリー試験を行った。ラットをボールマンケージ（夏目製作所社）に入れ、膀胱カテーテルに三方活栓を連結し、一方は圧トランスデューサー(日本光電社)を連結し、他方は生理食塩液注入用にインフュージョンポンプ（ハーバード・アパラタス社）に配置した50 mL注射筒（テルモ社）に連結した。圧トランスデューサーからの膀胱内圧信号を、接続したひずみ圧力アンプ（AP-601G；日本光電社）にて増幅し、これを収納したポリグラフシステム（RPM-6008；日本光電社）を介してサーマルアレイレコーダー（RTA-1200；日本光電社）上に記録した。測定準備終了60〜90分後、室温の生理食塩液を10 mL/hの流速で膀胱内に30分間持続注入し、排尿収縮が発現するのを確認した。30分後に再び30分間の生理食塩液注入を行い、膀胱内圧を測定し薬物投与前値とした。試験化合物（化合物１）は0.5 w/v%メチルセルロース水溶液で1 mg/mLとなるように懸濁させた。この懸濁液を0.5 w/v%メチルセルロース水溶液でさらに希釈し、目的濃度の投与用懸濁液または溶液を調製し、1 mL/kgの容量で経口投与した。投与後1、3、5時間を溶媒または薬物投与後の測定時点とし、各時点の前後15分間（薬物投与後45〜75分、165〜195分、285〜315分）に生理食塩液の膀胱内注入を行った。
【００４２】
通常の排尿機能の指標として排尿収縮を、神経因性膀胱の指標として排尿前収縮を測定した。各30分間の測定期間に観察されるすべての排尿収縮値の平均、各排尿収縮間に発現する最大排尿前収縮値の平均をそれぞれ、各時点の排尿収縮および排尿前収縮の大きさとした。なお、両収縮値については、チャート紙に記録された膀胱内圧波形からコンピューター(PC-9801NS/R；NEC社製)で制御したデジタイザー (KD3220；グラフテック社) で読み取り、Lotus 1-2-3 R2.5J (ロータス社製)上でWJ2形式ファイルとして保存した。 WJ2形式ファイルをExcel for Windows version 7.0 (マイクロソフト社製)に取り込んだ。排尿前収縮および排尿収縮の大きさは、薬物投与前の値を100としたときの相対値に換算し、群毎に平均±標準誤差を求めた。
【００４３】
化合物１の結果については、第８表に溶媒または薬物投与後の排尿前収縮の値（%）を、第９表に排尿収縮の値（%）を示す。
【００４４】
【表８】
2005506296.tif 000010
【００４５】
【表９】
2005506296.tif 000011
【００４６】
試験例３の結果によれば、化合物１は脊髄損傷ラットの排尿前収縮（排尿筋過活動）を抑制したが、排尿収縮（生理的な収縮）には影響が認められなかった。
【００４７】
試験例４：不安定膀胱抑制作用
実験はマルムグレン（Malmgren）らの方法[ジャーナル・オブ・ユーロロジー（J.  Urol.）、142巻、1134-1138頁（1989年）]に準じて行った。
実験には、雌性SD系ラット8〜10週令（日本エスエルシー供給）を使用した。ラットは室温19〜25℃、湿度30〜70%、一日12時間照明（午前7時〜午後7時）の飼育室にて、金属ケージに5〜7匹ずつ収容し、市販の固形飼料と水を自由に摂取させて飼育した。
ラットに部分的尿道閉塞を誘起した。ラットをペントバルビタール・ナトリウム（大日本製薬社、大阪、日本）50 mg/kg腹腔内投与で麻酔し、下腹部部分の皮膚および筋肉を正中切開した。ポリエチレンチューブ（PE-20；ベクトン・ディッキンソン社）を尿道に挿入した。尿道基部を剥離して二重結紮した後、ポリエチレンチューブを引き抜くことにより、尿道の部分的閉塞を誘起した。切開部分を手術用絹糸で縫合した。抗生物質アンピシリン（ampicillin、シグマ社製；150 mg/kg）の筋肉内投与を行った。
【００４８】
尿道閉塞手術後6週間経過し、膀胱が肥大したラットに膀胱カテーテル手術を施した。ペントバルビタール・ナトリウム麻酔下に、腹部正中を切開して膀胱を露出した。組織を傷つけないよう、先端を鈍化させたポリエチレンチューブ(PE-50；ベクトン・ディッキンソン社)に生理食塩液（大塚製薬工場社、徳島、日本）を満たし、膀胱頂部より挿入した。この膀胱カテーテルを手術用絹糸で固定、留置した。また、他端は皮下を通して背頸部より導出して栓を取り付け、皮膚に手術用糸で固定した。
【００４９】
膀胱カテーテル手術4〜6日後にシストメトリー試験を行った。ラットをボールマンケージ（夏目製作所社）に入れ、膀胱カテーテルに三方活栓を連結し、一方は圧トランスデューサー(日本光電社)を連結し、他方は生理食塩液注入用にインフュージョンポンプ（ハーバード・アパラタス社）に配置した50 mL注射筒（テルモ社）に連結した。圧トランスデューサーからの膀胱内圧信号を、接続したひずみ圧力アンプ（AP-601G；日本光電社）にて増幅し、これを収納したポリグラフシステム（RPM-6008；日本光電社）を介してサーマルアレイレコーダー（RTA-1200；日本光電社）上に記録した。測定準備終了60〜90分後、室温の生理食塩液を10 mL/hの流速で膀胱内に実験終了まで持続注入し、排尿収縮および排尿前収縮が発現するのを確認した。生理食塩液注入開始3時間後から30分間のチャートを薬物投与前値とした。試験化合物は0.5 w/v%メチルセルロース水溶液で1 mg/mLとなるように懸濁させた。この懸濁液を0.5 w/v%メチルセルロース水溶液でさらに希釈し、目的濃度の投与用懸濁液または溶液を調製した。1 mL/kgの容量で経口投与した。投与後1、3、5時間を試験化合物投与後の測定時点とし、各時点の前後15分間（薬物投与後45〜75分、165〜195分、285〜315分）を測定期間とした。
【００５０】
通常の排尿機能の指標として排尿収縮を、不安定膀胱の指標として排尿前収縮を測定した。各30分間の測定期間に観察されるすべての排尿収縮値の平均、各排尿収縮間に発現する最大排尿前収縮値の平均をそれぞれ、各時点の排尿収縮および排尿前収縮の大きさとした。なお、両収縮値については、チャート紙に記録された膀胱内圧波形からコンピューター(PC-9801NS/R；NEC社製)で制御したデジタイザー (KD3220；グラフテック社) で読み取り、Lotus 1-2-3 R2.5J (ロータス社製)上でWJ2形式ファイルとして保存した。 WJ2形式ファイルをExcel for Windows version 7.0 (マイクロソフト社製)に取り込んだ。排尿前収縮および排尿収縮の大きさは、薬物投与前の値を100としたときの相対値に換算し、群毎に平均±標準誤差を求めた。
第１０表に溶媒または化合物１投与後の排尿前収縮の値（%）を、第１１表に溶媒または化合物１投与後の排尿収縮の値（%）を示す。
【００５１】
【表１０】
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【００５２】
【表１１】
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【００５３】
試験例４の結果によれば、化合物１は、膀胱肥大ラットにおいて排尿時の収縮である排尿収縮には影響を与えなかった（通常の排尿には影響なし）が、正常排尿時以外の不規則な排尿筋不安定症である排尿前収縮を抑制した。
【００５４】
試験例３および試験例４において、本発明に用いた化合物は、排尿前収縮（排尿筋過過活動）を抑制し、過活動膀胱治療剤として有用であることが示された。したがって、slowly-inactivating  A-type K+ channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩は、過活動膀胱の治療剤として有用であることが示唆される。
【００５５】
試験例５：急性毒性試験
雄性dd系マウス（体重20±1g）を１群3匹用い、試験化合物を経口または腹腔内投与した。投与後7日目の死亡状況を観察し、最小致死量（MLD）値を求めた。
その結果、化合物１のMLDは、経口投与で＞1000mg/kgであった。
【００５６】
以上の試験例１〜５の結果により、slowly-inactivating  A-type K+ channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩は、過活動膀胱治療剤として有用である。
slowly-inactivating  A-type K+ channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩はそのままあるいは各種の製薬形態で使用することができる。本発明の製薬組成物は、活性成分として、有効な量のslowly-inactivating  A-type K+ channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を薬理学的に許容される担体と均一に混合して製造できる。これらの製薬組成物は、例えば経口または非経口（静脈内を含む）などの投与に対して適する単位服用形態にあることが望ましい。
【００５７】
経口服用形態にある組成物の調製においては、何らかの有用な薬理学的に許容される担体が使用できる。例えば懸濁剤およびシロップ剤のような経口液体調製物は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを使用して製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤および顆粒剤などは、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、でん粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの表面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤およびカプセル剤は、投与が容易であるという理由で、最も有用な単位経口投与剤である。錠剤やカプセル剤を製造する際には固体の製薬担体が用いられる。
また、注射剤は、例えば蒸留水、塩溶液、グルコース溶液または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製することができる。この際、常法に従い適当な助剤を用いて、溶液、懸濁液または分散液として調製される。
【００５８】
slowly-inactivating  A-type K+ channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩は、上記製薬形態で経口的にまたは注射剤などとして非経口的に投与することができ、その有効用量および投与回数は、例えば投与形態、患者の年齢、体重、症状などにより異なるが、1〜900 mg／60 kg／日、好ましくは1〜200 mg／60 kg／日が適当である。
以下に、実施例によって本発明の様態を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
実施例１：  錠剤
常法により、次の組成からなる錠剤を調製した。
化合物１の250 gを、マンニトール1598.5 g、でん粉グリコール酸ナトリウム100 g、軽質無水ケイ酸10 g、ステアリン酸マグネシウム40 gおよび黄色三二酸化鉄1.5 gと常法により混合した。この混合物を用い、径8 mmの杵臼をもった打錠機（菊水社製、Purepress Correct-12型）で打錠を行って、錠剤（１錠あたり活性成分25 mgを含有する）を得た。
処方を第１２表に示す。
【００６０】
【表１２】
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【００６１】
実施例２：  カプセル剤
常法により、次の組成からなるカプセル剤を調製した。
化合物１の500 gを、ラクトース300 g、軽質無水ケイ酸100 gおよびラウリル硫酸ナトリウム100 gと常法により混合した。この混合物をカプセル充填機（Zanasi社製、LZ-64型）により、ハードカプセル1号に充填し（１カプセルあたり100 mg）、カプセル剤（１カプセルあたり活性成分50 mgを含有する）を得た。
処方を第１３表に示す。
【００６２】
【表１３】
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【００６３】
実施例３：  注射剤
常法により、次の組成からなる注射剤を調製する。
化合物１の1 gを精製ダイズ油100 gに溶解させ、精製卵黄レシチン12 gおよび注射用グリセリン25gを加える。この混合物を常法により注射用蒸留水で1000 mLとして練合・乳化する。得られた分散液を0.2μｍのディスポーザブル型メンブランフィルターを用いて無菌濾過後、ガラスバイアルに2 mlずつ無菌的に充填して、注射剤（１バイアルあたり活性成分2 mgを含有する）を得る。
処方を第１４表に示す。
【００６４】
【表１４】
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【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、slowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する膀胱過活動治療剤、およびslowly-inactivating A-type K+ channel開口作用を指標として測定することを含む過活動膀胱治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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