(57)【要約】ω３−デサチュラーゼとΔ１２−デサチュラーゼをコードする単離ポリヌクレオチド、前記単離ポリヌクレオチドによりコードされる酵素、前記単離ポリヌクレオチドを含むベクター、前記単離ポリヌクレオチドを含み、前記単離ポリヌクレオチドによりコードされる酵素を発現するトランスジェニック宿主、前記デサチュラーゼ酵素の生産方法、及びポリ不飽和脂肪酸を生産するための前記酵素の使用方法を開示する。前記単離ポリヌクレオチドは真菌Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）に由来する。特に、ω３−デサチュラーゼは例えばアラキドン酸（ＡＡ）からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）への変換に使用することができる。Δ１２−デサチュラーゼは例えばオレイン酸（ＯＡ）からリノール酸（ＬＡ）への変換に使用することができる。ＥＰＡ又はＥＰＡから生産されたポリ不飽和脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品（例えば化粧品）に添加することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
デサチュラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメントであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２６及び配列番号４２から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列一致度をもつ前記単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメント。
【請求項２】
配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも５０％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメント。
【請求項３】
前記配列が配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択される請求項２に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記配列がポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードする請求項２又は３に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記配列がＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａに由来する請求項１又は２に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の前記単離ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチド。
【請求項７】
ポリ不飽和脂肪酸基質を前記基質のω３炭素で不飽和化し、配列番号２６を含むアミノ酸配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸一致度をもつ精製ポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが炭素原子数２０の脂肪酸基質を不飽和化する請求項７に記載の精製ポリペプチド。
【請求項９】
ポリ不飽和脂肪酸基質を前記基質のΔ１２炭素で不飽和化し、配列番号４２に対して少なくとも５０％のアミノ酸一致度をもつ精製ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが炭素原子数１８の脂肪酸基質を不飽和化する請求項９に記載の精製ポリペプチド。
【請求項１１】
（ａ）配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも５０％を含むか又はこれに相補的なヌクレオチド配列を単離する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、
（ｃ）段階（ａ）の前記単離ヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下に段階（ｂ）の前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含む、デサチュラーゼの生産方法。
【請求項１２】
１）配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも５０％に対応するか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列を、ｂ）調節配列に機能的に連結してなるベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞から構成される群から選択される真核細胞である請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記ベクターの前記単離ヌクレオチド配列の発現の結果として、前記宿主細胞の野生型では産生されないポリ不飽和脂肪酸を産生する前記宿主細胞が得られる請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１２に記載の前記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現の結果として、前記植物細胞、植物又は植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が産生される前記植物細胞、植物又は植物組織。
【請求項１７】
前記ベクターがリノール酸、エイコサテトラエン酸及びエイコサペンタエン酸から構成される群から選択されるポリ不飽和脂肪酸の産生を誘導する請求項１６に記載の植物細胞、植物又は植物組織。
【請求項１８】
請求項１２に記載の前記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現の結果として、前記トランスジェニック植物の種子中でポリ不飽和脂肪酸が産生される前記トランスジェニック植物。
【請求項１９】
請求項１６に記載の前記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は酸。
【請求項２０】
（ａ）配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも５０％を含むか又はこれに相補的なヌクレオチド配列を単離する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、
（ｃ）段階（ａ）の前記単離ヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下に段階（ｂ）の前記ベクターを宿主細胞に形質転換する段階と、
（ｄ）ω３−デサチュラーゼとΔ１２−デサチュラーゼから構成される群から選択される前記発現されたデサチュラーゼを脂肪酸基質に暴露することにより、前記基質を前記デサチュラーゼによって所望のポリ不飽和脂肪酸産物に触媒的に変換する段階を含む、ポリ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項２１】
前記発現されたデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、夫々前記基質がジホモγ−リノレン酸又はアラキドン酸であり、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がエイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現されたデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、前記基質ポリ不飽和脂肪酸がオレイン酸であり、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がリノール酸である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
（ｅ）段階（ｄ）の前記ポリ不飽和脂肪酸産物をデサチュラーゼとエロンガーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露することにより、段階（ｄ）のポリ不飽和脂肪酸産物を別のポリ不飽和脂肪酸産物に触媒的に変換する段階を、段階（ｄ）の後に更に含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、夫々前記産物ポリ不飽和脂肪酸がエイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸であり、前記別のポリ不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がリノール酸であり、前記別のポリ不飽和脂肪酸がγ−リノレン酸である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換するために前記別のポリ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼとエロンガーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階、を更に含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、前記最終ポリ不飽和脂肪酸がω３−ドコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、前記最終ポリ不飽和脂肪酸がジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ω３−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号２６及び配列番号４２から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸一致度をもつポリペプチドに脂肪酸基質を暴露することにより、前記脂肪酸基質をポリ不飽和脂肪酸に触媒的に変換する段階を含む、ポリ不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドがω３−デサチュラーゼであるとき、夫々前記脂肪酸基質がジホモ−γ−リノレン酸又はアラキドン酸であり、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がエイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、前記脂肪酸基質がオレイン酸であり、前記ポリ不飽和脂肪酸がリノール酸である請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２０に記載の方法により生産された前記産物ポリ不飽和脂肪酸、請求項２３に記載の方法により生産された前記別のポリ不飽和脂肪酸、及び請求項２６に記載の方法により生産された前記最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む組成物。
【請求項３３】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がエイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸である請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がリノール酸である請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、前記別のポリ不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸である請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、前記別のポリ不飽和脂肪酸がγ−リノレン酸である請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、前記最終ポリ不飽和脂肪酸がω３−ドコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
段階（ｄ）の前記発現されたデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、前記最終ポリ不飽和脂肪酸がジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ω３−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される請求項３２に記載の組成物。
【請求項３９】
予防又は治療を行うために十分な量の請求項３２に記載の前記組成物を患者に投与することを含む、少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸の摂取不足に起因する状態の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の合成に関与する酵素をコードする新規遺伝子の同定と単離に関する。本発明はこれらの遺伝子によりコードされる新規デサチュラーゼ酵素と、前記遺伝子及び／又は前記遺伝子によりコードされる酵素の使用方法にも関する。特に、本発明は新規ω３−デサチュラーゼ（本明細書ではΔ１７−デサチュラーゼとも言う）と新規Δ１２−デサチュラーゼをコードする真菌Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）に由来する遺伝子に関する。これらの酵素は脂肪酸基質内の特定位置間への炭素−炭素二重結合の導入を触媒する。例えば、本明細書に開示する新規ω３−デサチュラーゼはアラキドン酸（２０：４ｎ−６）からエイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）への変換（及び他の基質に関する他の不飽和化反応）を触媒する。同様に、本明細書に開示する新規Δ１２−デサチュラーゼはオレイン酸（１８：１ｎ−９）からリノール酸（１８：２ｎ−６）への変換を触媒する。こうして形成されたＰＵＦＡは医薬組成物、栄養組成物、動物飼料又は他の製品に添加することができる。
【背景技術】
【０００２】
デサチュラーゼは長鎖ポリ不飽和脂肪酸の生産に不可欠な類の酵素である。ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は全生命体の適正な機能に多数の役割を果たす。例えば、ＰＵＦＡは細胞の原形質膜の重要な成分であり、リン脂質形態で見い出される。ＰＵＦＡは哺乳動物プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン及びプスタグランジンの前駆物質でもある。更に、ＰＵＦＡは乳児脳の適正な発育と成熟哺乳動物の組織形成及び修復に必要である。ＰＵＦＡの生物学的意義に鑑み、ＰＵＦＡを効率的に生産する試みがなされている。
【０００３】
ＰＵＦＡ生合成には多数の酵素が関与しており、特にデサチュラーゼとエロンガーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅ）が挙げられる（図１参照）。エロンガーゼは脂肪酸基質への２炭素単位の付加を触媒する。従って、例えば、エロンガーゼ（図１では「ｅｌｏ」と総称する）はγ−リノレン酸（１８：３ｎ−６）からジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）への変換とステアリドン酸（１８：４ｎ−３）からエイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）への変換等を触媒する。
【０００４】
デサチュラーゼは基質の脂肪酸アルキル鎖内の炭素原子間への不飽和（即ち二重結合）の導入を触媒する。従って、例えば、リノール酸（１８：２ｎ−６）はΔ１２−デサチュラーゼの作用によりオレイン酸（１８：１ｎ−９）から生産される。同様に、γ−リノレン酸（１８：３ｎ−６）はΔ６−デサチュラーゼの作用によりリノール酸から生産される。
【０００５】
化学者は一般に「Δ」系ないしＩ．Ｕ．Ｐ．Ａ．Ｃ系命名法を好むが、本明細書では全般にわたって生理学者や生化学者に好まれる「ω」系命名法を使用してＰＵＦＡを明確に指定する。「ω」系では、鎖内の炭素数の数値指定によりＰＵＦＡを指定する。この後にコロンを記載し、更にその後に分子内の不飽和数の数値指定を記載する。その後に「ｎ−ｘ」指定を記載し、ここでｘは第１の不飽和が位置する分子のメチル末端からの炭素数である。各サブ配列不飽和（二重結合が２個以上の場合）は分子のカルボキシル末端に向かって３個の付加炭素原子に配置される。従って、本明細書に記載するＰＵＦＡは「メチレン中断型」ＰＵＦＡと言うことができる。他の何らかの指定が必要な場合には、「ω」系からの偏位で表記する。
【０００６】
必要に応じて、本明細書に記載するデサチュラーゼ酵素の作用も「ω」系を使用して指定する。従って、「ω３」デサチュラーゼは基質のメチル末端から３位と４位の２個の炭素間への二重結合の導入を触媒する。しかし、多くの場合には、基質のカルボキシル末端から数えることによりデサチュラーゼの活性を指定するほうが簡便である。従って、図１に示すように、Δ９−デサチュラーゼは基質のカルボキシル末端から９位と１０位の２個の炭素間への二重結合の導入を触媒する。要するに、「ω」なる用語を使用する場合には基質上の位置をメチル末端に対して指定し、「Δ」なる用語を使用する場合には基質上の位置をカルボキシル末端に対して指定する。
【０００７】
哺乳動物はΔ９位を越えて脂肪酸基質を（即ちカルボキシル末端から炭素原子９個を越えて）不飽和化することができない。従って、例えば哺乳動物はオレイン酸（１８：１ｎ−９）をリノール酸（１８：２ｎ−６）に変換することができず、リノール酸はΔ１２位に不飽和を含む。同様に、哺乳動物はα−リノレン酸（１８：３ｎ−３）（Δ１２とΔ１５に不飽和をもつ）を合成することができない。他方、例えば、哺乳動物はΔ６−デサチュラーゼの作用によりα−リノレン酸をステアリドン酸（１８：４ｎ−３）に変換することができる（図１参照。更に、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１３５９１；Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ３０９３，ｐａｇｅ  Ａ５３２（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９８，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，Ａｐｒｉｌ  １８−２２，１９９８）；及び米国特許第５，５５２，３０６号も参照））。
【０００８】
更に図１を参照し、哺乳動物、真菌類及び藻類では、こうして形成されたステアリドン酸はエロンガーゼの作用によりエイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）に変換される。このＰＵＦＡはその後、Δ５−デサチュラーゼによりエイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）に変換することができる。エイコサペンタエン酸は更にエロンガーゼによりω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）に変換することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
真菌類や植物等の他の真核生物は炭素Δ１２（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１１５１６及び米国特許第５，４４３，９７４号参照）と炭素Δ１５（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１１２４５参照）で脂肪酸基質を不飽和化する酵素をもつ。従って、動物の主要なポリ不飽和脂肪酸は食物及び／又はリノール酸もしくはα−リノレン酸の不飽和化と伸長から誘導される。これらの問題に鑑み、ＰＵＦＡ合成に関与する遺伝子を単離することは依然として大いに必要である。これらの遺伝子は哺乳動物で天然に産生されない脂肪酸を天然に産生する種に由来することが理想的である。微生物、植物又は動物系でこれらの遺伝子を発現させることにより、商業的量の１種以上のＰＵＦＡを生産できるようにこれらの系は改変されるであろう。従って、新規Δ１２及びΔ１７−デサチュラーゼ酵素、これらの酵素をコードする各遺伝子、並びにこれらの酵素の組換え生産方法が明白に必要である。更に、天然に存在するレベルよりも多量のＰＵＦＡを含有する油類も必要である。このようなΔ１２及びΔ１７−デサチュラーゼ酵素が得られるならば、哺乳動物でｄｅ  ｎｏｖｏ合成することができないＰＵＦＡの大量生産が可能になる。これらのＰＵＦＡは薬剤及び／又は栄養サプリメントとして使用することができる。
【００１０】
本明細書に引用する全特許、特許公開及び優先権文献はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１態様はデサチュラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はそのフラグメントに関し、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２６及び配列番号４２から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列一致度をもつ。
【００１２】
本発明は配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも５０％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列（又はそのフラグメント）にも関する。特に、配列は配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択することができる。配列はポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードすることができる。更に、ヌクレオチド配列はＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ等の真菌から単離することができる。
【００１３】
本発明の付加態様は上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチドに関する。
【００１４】
本発明は更にポリ不飽和脂肪酸基質を前記基質のω３炭素で不飽和化し、配列番号２６を含むアミノ酸配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸一致度をもつ精製ポリペプチドに関する。ポリペプチドは炭素原子数２０の脂肪酸基質を不飽和化することができる。
【００１５】
更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸基質を前記基質のΔ１２炭素で不飽和化し、配列番号４２に対して少なくとも５０％のアミノ酸一致度をもつ精製ポリペプチドに関する。ポリペプチドは炭素原子数１８の脂肪酸基質を不飽和化することができる。
【００１６】
本発明の別の態様は配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも５０％を含むか又はこれに相補的なヌクレオチド配列を単離する段階と、単離したヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、単離したヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階を含むデサチュラーゼの生産方法に関する。
【００１７】
本発明の別の態様は１）配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも約５０％に対応するか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列をｂ）調節配列に機能的に連結してなるベクターに関する。
【００１８】
更に、本発明の別の態様は上記ベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞から構成される群から選択される真核細胞とすることができる。宿主細胞については、ベクターの前記単離ヌクレオチド配列の発現の結果として、前記宿主細胞の野生型では産生されないポリ不飽和脂肪酸を産生する前記宿主細胞が得られる。
【００１９】
更に、本発明は上記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織に関し、ベクターの前記ヌクレオチド配列の発現の結果として、植物細胞、植物又は植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が産生される。植物細胞、植物又は植物組織におけるベクターは例えばリノール酸、エイコサテトラエン酸及びエイコサペンタエン酸から構成される群から選択されるポリ不飽和脂肪酸の産生を誘導することができる。更に、本発明は植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は酸に関する。
【００２０】
本発明は更に上記ベクターを含むトランスジェニック植物に関し、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として前記トランスジェニック植物の種子中でポリ不飽和脂肪酸が産生される。
【００２１】
本発明の別の態様は配列番号２５及び配列番号４１から構成される群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも約５０％を含むか又はこれに相補的なヌクレオチド配列を単離する段階と、単離したヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、単離したヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に形質転換する段階と、ω３−デサチュラーゼとΔ１２−デサチュラーゼから構成される群から選択される前記発現されたデサチュラーゼを脂肪酸基質に暴露することにより、基質を前記デサチュラーゼによって所望のポリ不飽和脂肪酸産物に触媒的に変換する段階を含む、ポリ不飽和脂肪酸の生産方法に関する。発現されるデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、夫々基質はジホモγ−リノレン酸又はアラキドン酸であり、産物であるポリ不飽和脂肪酸はエイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸である。発現されるデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、基質であるポリ不飽和脂肪酸はオレイン酸であり、産物であるポリ不飽和脂肪酸はリノール酸である。
【００２２】
前記方法は、ポリ不飽和脂肪酸産物をデサチュラーゼとエロンガーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露することにより、ポリ不飽和脂肪酸産物を別のポリ不飽和脂肪酸産物に触媒的に変換する段階を更に含むことができる。発現されるデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、夫々産物ポリ不飽和脂肪酸はエイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸であり、別のポリ不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸である。発現されるデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、産物ポリ不飽和脂肪酸はリノール酸であり、別のポリ不飽和脂肪酸はγ−リノレン酸である。
【００２３】
更に、直前に記載の方法は前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換するために、前記別のポリ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼとエロンガーゼから構成される群から選択される１種以上の酵素に暴露する段階を更に含むことができる。段階（ｄ）の発現されるデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、最終ポリ不飽和脂肪酸はω３−ドコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される。他方、発現されるデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、最終ポリ不飽和脂肪酸はジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ω３−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される。
【００２４】
本発明の付加態様は配列番号２６及び配列番号４２から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸一致度をもつポリペプチドに脂肪酸基質を暴露することにより、前記脂肪酸基質をポリ不飽和脂肪酸産物に触媒的に変換する段階を含むポリ不飽和脂肪酸の生産方法に関する。ポリペプチドがω３−デサチュラーゼであるとき、夫々脂肪酸基質はジホモ−γ−リノレン酸又はアラキドン酸であり、産物ポリ不飽和脂肪酸はエイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸である。他方、ポリペプチドがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、脂肪酸基質はオレイン酸であり、ポリ不飽和脂肪酸産物はリノール酸である。
【００２５】
本発明の別の態様は上記方法により生産された前記「産物」ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により生産された「別の」ポリ不飽和脂肪酸、及び上記方法により生産された「最終」ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む組成物に関する。発現されるデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、産物ポリ不飽和脂肪酸はエイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸である。他方、発現されるデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、産物ポリ不飽和脂肪酸はリノール酸である。発現されるデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、別のポリ不飽和脂肪酸は夫々エイコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸である。しかしながら、発現されるデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、別のポリ不飽和脂肪酸はγ−リノレン酸である。発現されるデサチュラーゼがω３−デサチュラーゼであるとき、最終ポリ不飽和脂肪酸はω３−ドコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される。他方、発現されるデサチュラーゼがΔ１２−デサチュラーゼであるとき、最終ポリ不飽和脂肪酸はジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、アドレン酸（ａｄｒｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ω６−ドコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ω３−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から構成される群から選択される。
【００２６】
本発明の別の態様は予防又は治療を行うために十分な量の上記組成物を患者に投与することを含む、少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸の摂取不足に起因する状態の予防又は治療方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本明細書では以下の略語を使用する。
１８：１ｎ−９＝オレイン酸＝ＯＡ
１８：２ｎ−６＝リノール酸＝ＬＡ
１８：３ｎ−６＝γ−リノレン酸＝ＧＬＡ
１８：３ｎ−３＝α−リノレン酸＝ＡＬＡ
１８：４ｎ−３＝ステアリドン酸＝ＳＴＡ
２０：３ｎ−６＝ジホモ−γ−リノレン酸＝ＤＧＬＡ
２０：４ｎ−６＝アラキドン酸＝ＡＡ
２０：４ｎ−３＝エイコサテトラエン酸＝ＥＴＡ
２０：５ｎ−３＝エイコサペンタエン酸＝ＥＰＡ
２２：４ｎ−６＝アドレン酸
２２：５ｎ−３＝ω３−ドコサペンタエン酸＝ＤＰＡ
２２：６ｎ−３＝ドコサヘキサエン酸＝ＤＨＡ
ＰＵＦＡ＝ポリ不飽和脂肪酸。
【００２８】
本発明は真菌Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａないしＳ．ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）から単離したω３−デサチュラーゼ及びΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列と翻訳されたアミノ酸配列に関する。更に、本発明はこれらの遺伝子とこれらの遺伝子によりコードされる酵素の使用にも関する。例えば、前記遺伝子とその対応する酵素はリノール酸、エイコサペンタエン酸等のポリ不飽和脂肪酸の生産に使用することができる。これらの脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物及び他の有価製品に添加することができる。
【００２９】
本明細書に記載するポリヌクレオチドの単離源である真菌Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０から市販されている。この真菌は凍結状態で供給され、ＡＴＣＣ培地３０７コーンミール寒天（Ｄｉｆｃｏ  ＃０３８６）中で２４℃にて増殖させることができる。この真菌に関する詳細な情報については、Ｂｅａｋｅｓ  Ｇ．（１９８３）“Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｃｃｏｕｎｔ  ｏｆ  ｃｙｓｔ  ｃｏａｔ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｉｎ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｆｉｓｈ−ｌｅｓｉｏｎ（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ−ｐａｒａｓｉｔｉｃａ  ｃｏｍｐｌｅｘ．”Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ．６１，６０３−６２５；及びＷｉｌｌｏｕｇｈｂｙ  Ｌ．Ｇ．ら（１９８３）“Ｚｏｏｓｐｏｒｅ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｔｏ  ｆｉｓｈ”Ｔｒａｎｓ．Ｂｒ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．８０，４２１−４３５を参照されたい。
【００３０】
ω３−デサチュラーゼ遺伝子、Δ１２−デサチュラーゼ遺伝子及びこれらの遺伝子にコードされる酵素
本発明のω３−デサチュラーゼ及びΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子によりコードされる酵素は少なくとも２個の不飽和と炭素数１８以上の全長をもつＰＵＦＡの生産に不可欠である。単離したＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ  ω３−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号２５と図２に示す。この遺伝子は任意起源の全公知デサチュラーゼ遺伝子と配列が有意に相違する。コードされるω３−デサチュラーゼ酵素を配列番号２６と図３に示す。単離したＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ  Δ１２−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号４１と図６に示す。この遺伝子は任意起源の全公知デサチュラーゼ遺伝子と配列が有意に相違する。コードされるΔ１２−デサチュラーゼ酵素を配列番号４２と図７６に示す。
【００３１】
本発明の単離ω３−デサチュラーゼ遺伝子は酵母宿主に形質転換されると、ＤＧＬＡからＥＴＡ、ＡＡからＥＰＡ、及びアドレン酸からＤＰＡへの変換を容易に触媒するω３−デサチュラーゼ酵素を生産する（実施例５参照）。同様に、本発明の単離Δ１２−デサチュラーゼ遺伝子は酵母宿主に形質転換されると、ＯＡからＬＡへの変換を容易に触媒するΔ１２−デサチュラーゼ酵素を生産する（実施例９参照）。
【００３２】
本発明は本明細書に記載する配列番号２５及び配列番号４１に示すヌクレオチド（即ち夫々Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａのω３−デサチュラーゼ遺伝子とΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％を含むか、これと一致するか又はこれに相補的な（即ち前記配列と配列一致性をもつ）配列をもつヌクレオチド配列（及びこれにコードされる対応する蛋白質）も含むことに留意すべきである。（一致度百分率に関して５０％〜１００％の全整数も本発明の範囲に含むものとみなす。）このような配列は任意起源に由来することができ、天然源から単離してもよいし、半合成経路により生産してもよいし、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成してもよい。このような配列は真菌源及び他の非真菌源（例えば細菌、藻類、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、マウス又はヒト）から単離又は誘導することができる。
【００３３】
本発明は配列番号２５及び配列番号４１に示すヌクレオチド配列のフラグメント及び誘導体と、他の起源に由来し、上記相補性、一致性又は対応性をもつ前記配列のフラグメント及び誘導体も含む。上記配列の機能的等価物（即ち適宜ω３−デサチュラーゼ活性又はΔ１２−デサチュラーゼ活性をもつ配列）も本発明に含まれる。
【００３４】
本発明の趣旨では、ヌクレオチド配列の「フラグメント」とは特定ヌクレオチド配列のある領域に対応する少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８、より好ましくは少なくとも約１０、更に好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの連続配列として定義される。
【００３５】
配列一致度ないし一致度百分率は整列させた２種の配列間の正確にマッチする数を短いほうの配列で割って１００を掛けた数値である。核酸配列の近似アラインメントはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより得られる。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  Ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，米国により考案され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６６７６３（１９８６）により正規化されたスコアリングマトリックスを使用すると、このアルゴリズムを拡張してペプチド又は蛋白質配列で使用することができる。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）は「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションで核酸配列とペプチド配列の両者についてこのアルゴリズムを自動的に実行するコンピュータープログラムを提供している。この方法のデフォルトパラメーターはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（ＧＣＧから市販）に記載されている。同様に配列間の一致度又は類似度百分率を計算するのに適した他のプログラムも一般に当分野で公知である。
【００３６】
本発明はω３位でＰＵＦＡを不飽和化し、上記ヌクレオチド配列によりコードされる配列番号２６（図３）に示すアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似度又は一致度をもつ精製ポリペプチドも含む。（５０〜１００％の全整数の類似度又は一致度も本発明の範囲に含む。）
本発明はΔ１２位でＰＵＦＡを不飽和化し、上記ヌクレオチド配列によりコードされる配列番号４２（図７）に示すアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似度又は一致度をもつ精製ポリペプチドにも関する。（５０〜１００％の全整数の類似度又は一致度も本発明の範囲に含む。）
「一致度」なる用語は特定の比較窓又はセグメントにおける２種の配列のヌクレオチド毎のベースでの関連度を指す。即ち、一致度とは２種のＤＮＡセグメントの同一鎖（センス又はアンチセンス）間の同一、対応又は等価度として定義される。「配列一致度百分率」は２種の最適に整列させた配列を特定領域にわたって比較し、両者配列で塩基が一致する位置の数を測定してマッチする位置の数を求め、このような位置数を比較するセグメントの合計位置数で割って、その結果に１００を掛けることにより計算される。最適配列整列はＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法及び関連アルゴリズムを実行するコンピュータープログラム（例えばＣｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら，ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により実施することができる。（米国特許第５，９１２，１２０号参照。）
本発明の趣旨では、「相補性」とは２種のＤＮＡセグメント間の関連度として定義される。これは一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖と適当な条件下でハイブリダイズして二重螺旋を形成する能力を測定することにより決定される。「相補鎖」とは規範的な塩基対合原理に基づいて所定配列と対合する配列として定義される。例えば、一方のヌクレオチド鎖の配列Ａ−Ｇ−Ｔは他方の鎖のＴ−Ｃ−Ａに「相補的」である。
【００３７】
二重螺旋では一方の鎖にアデニンが現れ、他方の鎖にチミンが現れる。同様に、一方の鎖にグアニンが存在する場合には、他方にシトシンが存在する。２種のＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連度が大きいほど、２種のＤＮＡセグメントの鎖間にハイブリッドデュプレクスを形成する能力は高い。
【００３８】
２種のアミノ酸配列間の「類似度」とは両者配列における一連の一致する保存アミノ酸残基の存在として定義される。２種のアミノ酸配列間の類似度が高いほど、２種の配列の対応、同一又は等価度は高い。（２種のアミノ酸配列間の「一致度」とは両者配列における一連の厳密に同一ないし不変のアミノ酸残基の存在として定義される。）「相補性」、「一致度」及び「類似度」の定義は当業者に周知である。
【００３９】
「〜によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、ポリペプチド配列又はその一部は核酸配列によりコードされるポリペプチドからの少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、更に好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本発明はＰＵＦＡデサチュラーゼ活性をコードし、配列番号２５又は配列番号４１を含むヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸に適度にストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能な単離ヌクレオチド配列も含む。核酸分子の１本鎖形が適当な温度及びイオン強度条件下で別の核酸分子とアニールできるときに核酸分子は別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。温度及びイオン強度条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」には２種の核酸が相補的配列を含んでいることが必要である。他方、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間にミスマッチが生じる場合がある。核酸をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェンシーは核酸の長さと相補度に依存する。このような変数は当業者に周知である。より具体的には、２種のヌクレオチド配列間の類似度又は相同度が高いほどこれらの配列をもつ核酸のハイブリッドのＴｍ値は大きい。１００ヌクレオチド長を越えるハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。もっと短い核酸とのハイブリダイゼーションではミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。
【００４１】
本明細書で使用する「単離核酸フラグメント又は配列」とは場合により合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含む１本鎖又は２本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離核酸フラグメントはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１個以上のセグメントから構成され得る（特定ポリヌクレオチドの「フラグメント」とは特定ヌクレオチド配列のある領域に同一又は相補的な少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。）（通常はその５’−一リン酸形で存在する）ヌクレオチドはその１文字表記により次のように表す。「Ａ」はアデニル酸又はデオキシアデニル酸（夫々ＲＮＡ又はＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸又はデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸又はデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（Ａ又はＧ）、「Ｙ」はピリミジン（Ｃ又はＴ）、「Ｋ」はＧ又はＴ、「Ｈ」はＡ又はＣ又はＴ、「Ｉ」はイノシン、「Ｎ」は任意ヌクレオチドを表す。
【００４２】
「機能的に等価であるフラグメント又はサブフラグメント」及び「機能的に等価なフラグメント又はサブフラグメント」なる用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語はフラグメント又はサブフラグメントが活性酵素をコードするか否かに関係なく遺伝子発現を改変するか又は特定表現型を生産する能力を維持する単離核酸フラグメントの一部又はサブ配列を指す。例えば、フラグメント又はサブフラグメントをキメラ構築物の設計に使用し、形質転換植物で所望表現型を生産することができる。キメラ構築物は活性酵素をコードするか否かに関係なく核酸フラグメント又はそのサブフラグメントを植物プロモーター配列に対して適当な方向で連結することにより同時抑制又はアンチセンスで使用するように設計することができる。
【００４３】
「相同性」、「相同」、「実質的に類似｜及び「実質的に対応」等の用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語はフラグメント間で１個以上のヌクレオチド塩基が相違するが、遺伝子発現を媒介又は特定表現型を生産する能力は変わらない核酸フラグメントを指す。これらの用語は得られる核酸フラグメントの機能的性質が元の未改変フラグメントに対して実質に変わらない本発明の核酸フラグメントの変異（例えば１個以上のヌクレオチドの欠失又は挿入）も指す。従って、当業者が認識できる通り、本発明は特定例示配列以外の配列も含むものとする。
【００４４】
「遺伝子」とはコーディング配列に先行する調節配列（５’非コーディング配列）と後続する調節配列（３’非コーディング配列）を含めた特定蛋白質を発現する核酸フラグメントを指す。
【００４５】
「天然遺伝子」とはそれ自体の調節配列と共に天然に見い出される遺伝子を意味する。これに対して「キメラ構築物」とは通常は天然に見い出されない核酸フラグメントの組み合わせ指す。従って、キメラ構築物は異なる起源に由来する調節配列とコーディング配列を含むか、又は同一起源に由来するが、通常天然に見い出されるのとは異なる方法で配置された調節配列とコーディング配列を含むことができる（「単離」なる用語は配列をその天然環境から取出すことを意味する。）
「外来」遺伝子とは宿主生物に通常見い出されないが、遺伝子導入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は非天然生物又はキメラ構築物に挿入された天然遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」とは形質転換法によりゲノムに導入された遺伝子である。
【００４６】
「コーディング配列」とは特定アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」とはコーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内部、又は下流（３’非コーディング配列）に配置され、関連コーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性又は翻訳に作用するヌクレオチド配列を指す。調節配列としては限定されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化認識配列が挙げられる。
【００４７】
「プロモーター」とはコーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は近位及び遠位上流エレメントから構成され、後者エレメントはエンハンサーと呼ぶことが多い。従って、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することが可能なＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有エレメントでもよいし、プロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントでもよい。プロモーター配列は遺伝子の転写部分の内部に配置してもよいし、及び／又は転写配列の下流に配列してもよい。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来するものでもよいし、天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成してもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含むものでもよい。当業者に自明の通り、種々のプロモーターが種々の組織もしくは細胞型で、又は種々の発生段階で、又は種々の環境条件に応答して遺伝子の発現を指令することができる。殆どの細胞型で殆どの時点に遺伝子を発現させるプロモーターを一般に「構成的プロモーター」と言う。植物細胞で有用な種々の型の新規プロモーターが絶えず発見されつつあり、ＯｋａｍｕｒｏとＧｏｌｄｂｅｒｔ，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ  １５：１−８２に多数の例がまとめられている。更に、殆どの場合に調節配列の厳密な境界は完全に決定されていないので、所定変異のＤＮＡフラグメントが同一プロモーター活性をもつこともあると考えられる。
【００４８】
「イントロン」は蛋白質配列の一部をコードしない遺伝子の介在配列である。従って、このような配列はＲＮＡに転写されるが、その後、切出され、翻訳されない。この用語は切出されたＲＮＡ配列にも使用される。「エキソン」は転写される遺伝子の配列の一部であり、遺伝子から誘導される成熟メッセンジャーＲＮＡに見い出されるが、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部ではない。
【００４９】
「翻訳リーダー配列」とは遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列の間に配置されたＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流の完全にプロセスされたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は一次転写産物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性又は翻訳効率に作用し得る。翻訳リーダー配列の例は文献に記載されている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．とＦｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２２５）。
【００５０】
「３’非コーディング配列」とはコーディング配列の下流に配置されたＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列やｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に作用することが可能な調節配列をコードする他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは一般にｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に作用することを特徴とする。種々の３’非コーディング配列の使用がＩｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：６７１−６８０に例示されている。
【００５１】
「ＲＮＡ転写産物」とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写により得られる産物を指す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるときには一次転写産物と言うが、一次産物の転写後プロセシングにより誘導されるＲＮＡ配列でもよく、その場合には成熟ＲＮＡと言う。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とはイントロンをもたないＲＮＡであり、細胞により蛋白質に翻訳できるものを指す。「ｃＤＮＡ」とはｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、逆転写酵素を使用してこの鋳型から合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは１本鎖でもよいし、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを使用して２本鎖に変換してもよい。「センス」ＲＮＡとはｍＲＮＡを含み、細胞内又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写産物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは標的一次転写産物又はｍＲＮＡの全部又は一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写産物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡは特定遺伝子転写産物のどの部分と相補的でもよく、即ち、５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロン、又はコーディング配列のいずれでもよい。「機能的ＲＮＡ」とはアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ又は翻訳できないが、細胞プロセスに作用する他のＲＮＡを指す。「相補鎖」及び「逆相補鎖」なる用語は本明細書ではｍＲＮＡ転写産物に関して同義に使用し、アンチセンスＲＮＡのメッセージを規定することを意味する。
【００５２】
「内因性ＲＮＡ」なる用語は天然であるか又は非天然である（即ち組換え手段、突然変異誘発等により導入される）かを問わずに本発明の組換え構築物による形質転換前に宿主のゲノムに存在する任意核酸配列によりコードされる任意ＲＮＡを指す。
【００５３】
「非天然」なる用語は通常天然に存在するものと一致しない人工性を意味する。
【００５４】
「機能的に連結」なる用語は一方の核酸配列の機能が他方により調節されるように単一核酸フラグメント上で核酸配列が関連することを指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節できるとき（即ちコーディング配列がプロモーターの転写制御下にあるとき）にプロモーターはコーディング配列に機能的に連結している。コーディング配列はセンス又はアンチセンス方向のいずれで調節配列に機能的に連結してもよい。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域を標的ｍＲＮＡの５’又は標的ｍＲＮＡの３’又は標的ｍＲＮＡの内部に直接又は間接的に機能的に連結してもよいし、第１の相補領域を標的ｍＲＮＡの５’に機能的に連結し、その相補鎖を３’に機能的に連結してもよい。
【００５５】
本明細書で使用する「発現」なる用語は機能的終産物の生産を意味する。遺伝子の発現には遺伝子の転写とｍＲＮＡから前駆物質又は成熟蛋白質への翻訳を含む。「アンチセンス阻害」とは標的蛋白質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写産物の生産を指す。「同時抑制」とは同一又は実質的に類似する外来又は内因性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写産物の生産を指す（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００５６】
「成熟」蛋白質とは翻訳後プロセシングしたポリペプチド、即ち一次翻訳産物に存在する任意のプレ又はプロペブチドを除去したポリペプチドを指す。「前駆物質」蛋白質とはｍＲＮＡの一次翻訳産物、即ちプレ及びプロペブチドがまだ存在するものを指す。プレ及びプロペブチドとしては限定されないが、細胞内局在シグナルが挙げられる。
【００５７】
「安定な形質転換」とは核ゲノムとオルガネラゲノムの両者を含む宿主生物のゲノムに核酸フラグメントを導入し、遺伝的に安定な遺伝形質を得ることを指す。これに対して、「一過性形質転換」とは核酸フラグメントを宿主生物の核又はＤＮＡ含有オルガネラに導入し、組込み又は安定な遺伝形質を含まずに遺伝子発現させることを意味する。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と言う。コメ、トウモロコシ及び他の単子葉植物の好ましい細胞形質転換法は粒子加速又は「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号）、又はトランスジーンを含む適当なＴｉプラスミドを使用するアグロバクテリウム仲介法（Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ．ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。本明細書で使用する「形質転換」なる用語は安定な形質転換と一過性形質転換の両者を指す。
【００５８】
本発明で使用する標準組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と言う）により詳細に記載されている。
【００５９】
「組換え」なる用語は例えば化学合成又は遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作により、元は分離している２つの配列セグメントの人工的組合せを指す。
【００６０】
「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は大量の特定ＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復サイクルから構成される（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。一般に、２本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２種のプライマーを低温でアニールした後、中間的温度で伸長させる。これらの３連続段階１組を１サイクルと言う。
【００６１】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は短時間で鋳型の反復複製によりＤＮＡを数百万倍に増幅するために使用される強力な技術である。（Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，ヨーロッパ特許出願第５０，４２４号；ヨーロッパ特許出願第８４，７９６号；ヨーロッパ特許出願第２５８，０１７号；ヨーロッパ特許出願第２３７，３６２号；Ｍｕｌｌｉｓ，ヨーロッパ特許出願第２０１，１８４号，Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈ，米国特許第４，５８２，７８８号；及びＳａｉｋｉら，米国特許第４，６８３，１９４号）。この方法はＤＮＡ合成をプライムするようｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した特定オリゴヌクレオチドのセットを利用する。プライマーの設計は分析しようとするＤＮＡ配列に依存する。この方法は鋳型を高温で溶融し、プライマーを鋳型内の相補的配列にアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼで鋳型を複製するサイクルを多数回（通常は２０〜５０回）行うことにより実施される。
【００６２】
ＰＣＲ反応産物はアガロースゲルで分離後に臭化エチジウム染色とＵＶ照射可視化より分析される。あるいは、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに加えて産物にラベルを取込ませてもよい。この場合には、ゲルをＸ線フィルムに露光することによりＰＣＲ産物を可視化する。放射性標識ＰＣＲ産物には個々の増幅産物レベルを定量できるという利点もある。
【００６３】
本明細書では「組換え構築物」、「発現構築物」及び「組換え発現構築物」なる用語を同義に使用する。これらの用語は当業者に周知の標準方法を使用して細胞のゲノムに挿入することができる遺伝子材料の機能単位を指す。このような構築物をそのまま使用してもよいし、ベクターに組込んで使用してもよい。ベクターを使用する場合には、ベクターの選択は当業者に周知の通り、宿主植物を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。本発明の単離核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を有効に形質転換し、選択し、増殖させるためにベクター上に配置する必要がある遺伝子要素は当業者に周知である。種々の独立した形質転換イベントの結果として各種レベル及びパターンの発現が生じる（Ｊｏｎｅｓら，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）ので、所望発現レベル及びパターンを示す系列を得るためには多重イベントをスクリーニングする必要があることも当業者に自明である。このようなスクリーニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、蛋白質発現のウェスタン分析、又は表現型分析により実施することができる。
【００６４】
ω３−デサチュラーゼ及びΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子の発現
ω３及びΔ１２デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子を一旦単離したら、その後、ベクター又は構築物を使用することにより（個々に又は組合せて）原核又は真核宿主細胞に導入することができる。ベクター（例えばバクテリオファージ、コスミド又はプラスミド）はデサチュラーゼ酵素の一方又は両方をコードするヌクレオチド配列と、宿主細胞で機能的であり且つヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現を誘導することが可能な任意プロモーターを含むことができる。プロモーターはヌクレオチド配列に機能的に連関又は機能的に連結している。（上述のように、調節配列（例えばプロモーター）がコーディング配列の転写又は発現に作用する場合にこの調節配列はコーディング配列に「機能的に連結している」と言う。）プロモーター（又は他の型の調節配列）はコーディング配列に直接連結している必要はない。適切なプロモーターとしては例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメロガロウイルス極初期、ホエイ酸蛋白質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターや、ガラクトースの存在下に活性化されるプロモーター（例えばＧＡＬ１及びＧＡＬ１０）が挙げられる。更に、他の蛋白質、オリゴ糖、脂質等をコードするヌクレオチド配列や、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ−４０Ｔ−抗原、オボアルブミン又はウシ成長ホルモンのポリＡシグナル）、抗生物質耐性マーカー、栄養素要求マーカー等の他の調節配列もベクターに加えてもよい。構築物に加える配列の選択は所望発現産物、宿主細胞の種類、及び非形質転換細胞から形質転換細胞を分離するために提案される手段に依存する。
【００６５】
上述のように、一旦ベクターを構築したら、次に例えばトランスフェクション、形質転換及びエレクトロポレーション等の当業者に公知の方法により選択宿主細胞に導入することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。その後、遺伝子の発現を可能にする適切な条件下で宿主細胞を培養して所望ＰＵＦＡを生産させた後、回収し、精製する。（天然又は組換えにより宿主細胞により生産され得る基質と、後から宿主細胞に導入するベクターに存在するＤＮＡ配列によりコードされ得る酵素を図１に示す。）
適切な原核宿主細胞の例としては例えば大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリア（例えばＳｐｉｒｕｌｉｎａ種、即ち藍藻）等の細菌類が挙げられる。適切な真核宿主細胞の例としては例えば哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙ、Ｃａｎｄｉｄａ種（例えばＹａｒｒｏｗｉａ（Ｃａｎｄｉｄａ）  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種又はＨａｎｓｅｎｕｌａ種）、又は真菌細胞（例えば糸状菌細胞、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）細胞を利用するのが好ましい。
【００６６】
宿主細胞での発現は一過的又は安定的に行うことができる。一過的発現は導入構築物が宿主細胞で機能的な発現シグナルを含むが、複製しないので宿主細胞に殆ど組込まれないか又は宿主細胞が増殖していない場合に生じ得る。一過的発現は目的遺伝子に機能的に連結した調節プロモーターの活性を誘導することによっても得られるが、このような誘導系は基底発現レベルが低いことが多い。安定的発現は宿主ゲノムに組込むことができるか又は宿主細胞で自律複製する構築物を導入することにより得られる。発現構築物に配置するか又は発現構築物と同時トランスフェクトする選択マーカーを使用して目的遺伝子の安定的発現を選択した後に、マーカーを発現する細胞を選択することができる。組込みの結果として安定的発現が得られる場合には、構築物の組込み部位は宿主ゲノム内にランダムに存在していてもよいし、宿主遺伝子座との組換えをターゲットするために十分な宿主ゲノムと相同性の領域を含む構築物を使用してターゲットしてもよい。内在遺伝子座に構築物をターゲットする場合には、転写及び翻訳調節領域の全部又は一部を内在遺伝子座により提供することができる。
【００６７】
トランスジェニック哺乳動物を使用して本発明の酵素を発現させ、最終的に目的ＰＵＦＡを生産させることもできる。より具体的に言うと、一旦上記構築物を作製したら、胚の前核に挿入すればよい。その後、胚をレシピエント雌に移植すればよい。あるいは、核導入法も利用できる（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２１３０−２１３３（１９７７））。その後、妊娠及び出産させることができる（例えば米国特許第５，７５０，１７６号及び米国特許第５，７００，６７１号参照）。その後、子孫からの乳汁、組織又は他の体液試料は非トランスジェニック動物に通常検出されるレベルとは異なるレベルのＰＵＦＡを含有しているはずである。後続世代をモニターし、改変又は増加濃度のＰＵＦＡが生産されているかどうかを調べ、従って所望デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子がそのゲノムに組込まれているかどうかを調べることができる。宿主として利用する哺乳動物は例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシから構成される群から選択することができる。もっとも、目的酵素をコードするＤＮＡをそのゲノムに組込む能力をもつものであれば任意の哺乳動物を使用することができる。
【００６８】
デサチュラーゼポリペプチドを発現させるには、目的デサチュラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的転写及び翻訳開始及び終結領域を機能的に連結する。転写及び翻訳開始及び終結領域は発現させようとするＤＮＡ、所望系で発現できることが分かっているか又はそう思われている遺伝子、発現ベクター、化学合成、又は宿主細胞中の内在遺伝子座等の種々の非排他的起源に由来する。植物組織及び／又は植物部分における発現は特に組織又は部分が種子、葉、果実、花、根等の早期収穫されるものである場合に所定効率を示す。米国特許第５，４６３，１７４号、４，９４３，６７４号、５，１０６，７３９号、５，１７５，０９５号、５，４２０，０３４号、５，１８８，９５８号及び５，５８９，３７９号に記載されているような特定調節配列を利用することにより植物でその位置に発現をターゲットすることができる。
【００６９】
あるいは、発現される蛋白質は産物を生産する酵素とすることができ、この産物は直接又は更に改変後に宿主植物からの液体フラクションに組込むことができる。デサチュラーゼ遺伝子又はアンチセンスデサチュラーゼ転写産物の発現は、植物部分及び／又は植物組織に見い出される特定ＰＵＦＡ又はその誘導体のレベルを変化させることができる。デサチュラーゼポリペプチドコーディング領域を単独又は他の遺伝子と共に発現させ、より高濃度の所望ＰＵＦＡを含有するか又はＰＵＦＡ組成が母乳により近似する組織及び／又は植物部分を作製することもできる（Ｐｒｉｅｔｏら，ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２４４９４）。
【００７０】
終結領域は開始領域を得た遺伝子の３’領域に由来するものでもよいし、別の遺伝子に由来するものでもよい。多数の終結領域が同一及び異なる属及び種から種々の宿主で満足できるとして知られている。終結領域は特定性質よりもむしろ便宜上から選択するのが一般的である。
【００７１】
上述のように、植物（例えばＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（大豆）又はＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（キャノーラ））又は植物組織を夫々デサチュラーゼ酵素の発現用宿主又は宿主細胞として利用し、デサチュラーゼ酵素をＰＵＦＡの生産に利用してもよい。より具体的に言うと、所望ＰＵＦＡを種子で発現させることができる。種子油の分離方法は当分野で公知である。即ち、ＰＵＦＡ源の提供に加え、デサチュラーゼ遺伝子と恐らく他のデサチュラーゼ遺伝子及びエロンガーゼ遺伝子の発現により種子油成分を操作し、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料及び化粧品に添加可能な種子油を提供することができる。この場合にも、プロモーターに機能的に連結した目的デサチュラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含むベクターをデサチュラーゼ遺伝子の発現に十分な時間と条件下に植物組織又は植物に導入する。ベクターは更に他の酵素（例えばΔ５−デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ及び／又はΔ１９−デサチュラーゼ酵素）をコードする１種以上の遺伝子も含むことができる。植物組織又は植物は酵素の作用を受ける該当基質（例えばアドレン酸又はＤＰＡ）を生産することができ、あるいはこのような基質を生産する酵素をコードするベクターを植物組織、植物細胞又は植物に導入することができる。更に、適当な酵素を発現する植物組織に適切な基質を噴霧してもよい。これらの種々の技術を使用して、植物細胞、植物組織又は植物の使用によりＰＵＦＡを生産することができる。本発明は更に上記ベクターを含むトランスジェニック植物も含み、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として例えばトランスジェニック植物の種子で所望ＰＵＦＡが生産されることにも留意すべきである。
【００７２】
単一植物プロトプラスト形質転換体又は種々の形質転換外植片からの植物の再生、発生及び培養も当分野で周知である（ＷｅｉｓｓｂａｃｈとＷｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，（１９８８））。この再生及び増殖法は一般に形質転換細胞を選択する段階と、通常の胚発生〜挿し木苗段階により個体化細胞を培養する段階を含む。トランスジェニック胚及び種子も同様に再生させる。得られたトランスジェニック挿し木苗をその後、土壌等の適当な植物生育培地に植え付ける。
【００７３】
目的蛋白質をコードする外来外因性遺伝子を含む植物の発生又は再生は当分野で周知である。再生した植物を自家受粉させて同型トランスジェニック植物を提供することが好ましい。あるいは、再生植物から得た花粉を栽培学的に重要な系列の種子成長植物と交配する。逆に、これらの重要系列の植物からの花粉を使用して再生植物に受粉させてもよい。当業者に周知の方法を使用して所望ポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物を栽培する。
【００７４】
植物組織から植物を再生させる方法は種々のものがある。特定再生方法は出発植物組織と再生させようとする特定植物種によって異なる。
【００７５】
主にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用して双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得る方法がワタ（米国特許第５，００４，８６３号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，５１８，９０８号）、大豆（米国特許第５，５６９，８３４号、米国特許第５，４１６，０１１号、ＭｃＣａｂｅら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３（１９８８），Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８））、アブラナ属（米国特許第５，４６３，１７４号）、落花生（Ｃｈｅｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１５：６５３−６５７（１９９６），ＭｃＫｅｎｔｌｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１４：６９９−７０３（１９９５））、パパイヤ、及びエンドウ（Ｇｒａｎｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１５：２５４−２５８，（１９９５））について報告されている。
【００７６】
エレクトロポレーション、粒子撃ち込み及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用する単子葉植物の形質転換も報告されている。形質転換と植物再生はアスパラガス（Ｂｙｔｅｂｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：５３５４，（１９８７））、オオムギ（ＷａｎとＬｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０４：３７（１９９４））、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：２０４（１９８８），Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３−６１８（１９９０），Ｆｒｏｍｍら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３（１９９０），Ｋｏｚｉｅｌら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１；１９４，（１９９３），Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５：５５０−５５７（１９９５））、オート麦（Ｓｏｍｅｒｓら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１５  ８９（１９９２））、オーチャードグラス（Ｈｏｒｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．７：４６９（１９８８））、コメ（Ｔｏｒｉｙａｍａら，ＴｈｅｏｒＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：３４，（１９８６）；Ｐａｒｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１１３５−１１４８，（１９９６）；Ａｂｅｄｉｎｉａら，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４：１３３−１４１（１９９７）；ＺｈａｎｇとＷｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：８３５（１９８８）；Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．７：３７９，（１９８８）；ＢａｔｔｒａｗとＨａｌｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．８６：１９１−２０２（１９９２）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９５７（１９９１））、ライ麦（Ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｎａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：２７４（１９８７））、サトウキビ（ＢｏｗｅｒとＢｉｒｃｈ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：４０９（１９９２））、ヒロハノウシノケグサ（Ｗａｎｇら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｔ  １０：６９１（１９９２））、及びコムギ（Ｖａｓｉｌら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７（１９９２）；米国特許第５，６３１，１５２号）で達成されている。
【００７７】
クローニングした核酸構築物の一過的発現に基づく遺伝子発現アッセイはポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション又は粒子撃ち込みにより核酸分子を植物細胞に導入することにより開発されている（Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：４５４−４５７（１９８８）；Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：５２３−５３２（１９８９）；ＭｃＣａｒｔｙら，Ｃｅｌｌ  ６６：８９５−９０５（１９９１）；Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：６０９−６１８（１９９２）；Ｇｏｆｆら，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２５１７−２５２２（１９９０））。
【００７８】
一過的発現系を使用して遺伝子構築物を機能的に分析することができる（一般にＭａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）参照）。当然のことながら、本発明の核酸分子の任意のものをベクター、プロモーター、エンハンサー等の他の遺伝子エレメントと共に永久的又は一過的に植物細胞に導入することができる。
【００７９】
上記方法に加え、巨大分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミド等）の構築、操作及び単離、組換え生物の作製並びにクローンのスクリーニングと単離に関する特定条件及び手順を記載した標準資料は当業者に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ，１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）参照）。
【００８０】
上記に鑑み、本発明はω３−デサチュラーゼ及び／又はΔ１２−デサチュラーゼ酵素の生産方法にも関し、前記方法は１）所望デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を単離する段階と、２）前記ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、３）デサチュラーゼ酵素の生産に十分な時間及び条件で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含む。
【００８１】
本発明はＰＵＦＡの生産方法にも関し、前記方法はデサチュラーゼが脂肪酸基質を所望ＰＵＦＡ産物に変換するように適切な脂肪酸基質を酵素に暴露する段階を含む。例えばＡＡ（２０：４ｎ−６）を本発明のω３−デサチュラーゼ酵素に暴露すると、それはＥＰＡ（２０：５ｎ−３）に変換される。こうして形成されたＥＰＡをエロンガーゼの作用によりＤＰＡ（２２：５ｎ−３）に変換することができ、その後、ＤＰＡをΔ４−デサチュラーゼによりＤＨＡ（２２：６ｎ−３）に変換することができる。
【００８２】
同様に、ＯＡ（１８：１ｎ−９）を本発明のΔｌ２−デサチュラーゼ酵素に暴露すると、それはＬＡ（１８：２ｎ−６）に変換される。こうして形成されたＬＡに次に適切なデサチュラーゼ及び／又はエロンガーゼを作用させると、図１に示すほぼ全てのＰＵＦＡに変換することができる。
【００８３】
本発明のデサチュラーゼ遺伝子とこれらの遺伝子によりコードされる酵素の使用
上述のように、単離デサチュラーゼ遺伝子とこれらの遺伝子によりコードされるデサチュラーゼ酵素は多くの用途がある。例えば、遺伝子と対応する酵素は単独又は組合せて間接又は直接的にＰＵＦＡの生産に使用することができる。例えば、ω３−デサチュラーゼはＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ等の生産に使用することができる。この関連で使用する場合、「直接」なる語は酵素が中間段階又は経路中間体を介さずに脂肪酸基質から所望脂肪酸産物への直接変換を触媒するために使用される状況（例えばＡＡからＥＰＡへの変換）を含む。こうして得られた産物をその後、組成物で使用する。「間接」とは本発明のデサチュラーゼがデサチュラーゼにより脂肪酸基質から別の脂肪酸（即ち経路中間体）への変換（例えばＡＡからＥＰＡへの変換）を触媒するために使用された後に、後者脂肪酸（ＥＰＡ）が別のデサチュラーゼ又は非デサチュラーゼ酵素の使用によりに所望脂肪酸産物に変換（例えばエロンガーゼによるＥＰＡからＤＰＡへの変換）される状況を含む。これらのＰＵＦＡ（即ち本発明のデサチュラーゼの活性により直接又は間接的に生産されたＰＵＦＡ）は例えば栄養組成物、医薬組成物、化粧品及び動物飼料に添加することができ、これらのいずれも本発明に含まれる。このような使用について以下に詳述する。
【００８４】
栄養組成物
本発明は栄養組成物を含む。本発明の趣旨では、このような組成物としては体内に取込まれると、（ａ）組織を滋養もしくは強化又はエネルギーを供給し、及び／又は（ｂ）十分な栄養状態又は代謝機能を維持、回復又は補助するにように作用するヒト消費用（経腸的及び／又は非経腸的消費を含む）任意食品又は製剤が挙げられる。
【００８５】
本発明の栄養組成物は本明細書に開示するデサチュラーゼ遺伝子の使用により直接又は間接的に生産された油、脂肪酸エステル又は脂肪酸を含む。組成物は固体形態でも液体形態でもよい。更に、組成物は特定用途に必要な量の食用多量養素、ビタミン及び／又はミネラルを加えてもよい。これらの成分の量は組成物を健常乳児、幼児又は成人に使用するのかあるいは代謝障害を患う個体等の特殊な要求性をもつ個体に使用するのかによって異なる。
【００８６】
組成物に添加できる多量養素の例としては（限定されないが）、食用脂肪、炭水化物及び蛋白質が挙げられる。このような食用脂肪の例としては（限定されないが）、ヤシ油、ルリヂサ油、真菌油、黒潮域魚油、大豆油並びにモノ及びジグリセリドが挙げられる。このような炭水化物の例としては（限定されないが）、グルコース、食用乳糖及び加水分解澱粉が挙げられる。更に、本発明の栄養組成物で利用可能な蛋白質の例としては（限定されないが）、大豆蛋白質、電気透析ホエイ、電気透析脱脂乳、ホエイ、又はこれらの蛋白質の加水分解物が挙げられる。
【００８７】
ビタミンとミネラルについては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、並びにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ及びＢ複合体を本発明の栄養組成物に添加できる。他の同様のビタミンとミネラルも添加できる。
【００８８】
本発明の栄養組成物で利用する成分は半精製又は精製物に由来する。半精製又は精製とは、天然材料の精製又はｄｅ  ｎｏｖｏ合成により製造した材料を意味する。
【００８９】
本発明の栄養組成物の例としては（限定されないが）、乳児用調製乳、栄養補助食品、代用食品及び再水和組成物が挙げられる。特に有利な栄養組成物としては（限定されないが）、経腸及び非経腸乳児用補給剤、特殊乳児用調製乳、高齢者用補給剤、及び胃腸障害及び／又は吸収不良者用補給剤が挙げられる。
【００９０】
本発明の栄養組成物は食事の補充を必要としない場合にも食品に添加できる。例えば、組成物は任意種の食品に添加することができ、（限定されないが）マーガリン、調整バター、チーズ、ミルク、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック菓子、サラダ油、調理用油、調理用脂肪、肉類、魚肉及び飲料が挙げられる。
【００９１】
本発明の好適態様では、栄養組成物は経腸栄養製剤であり、成人又は小児経腸栄養製剤がより好ましい。この組成物は慢性又は急性疾患状態によるストレスや特殊処置が必要な成人又は小児に投与することができる。組成物は本発明により生産されたＰＵＦＡに加え、上記のような多量養素、ビタミン及び／又はミネラルを加えてもよい。多量養素はヒト母乳に含まれる量と等価の量を添加するか又はエネルギー換算即ちカロリー当たりの換算で添加することができる。
【００９２】
経腸製剤は例えば滅菌後に即製（ＲＴＦ）式で利用してもよいし、濃縮液体又は粉末で保存してもよい。粉末は上記のように調製した製剤を噴霧乾燥して製造し、濃縮物を再水和して再構成することができる。成人及び小児栄養製剤は当分野で公知であり、市販されている（例えばＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）及びＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標）がＲｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏから市販されている）。本発明により生産された油又は酸をこれらの製剤の任意のものに添加することができる。
【００９３】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態の場合には約０．６ｋｃａｌ〜約３ｋｃａｌ／ｍｌとすることができる。固体又は粉末形態の場合には、栄養補給剤は約１．２〜＞９ｋｃａｌ／ｇ、好ましくは約３〜７ｋｃａｌ／ｇとすることができる。一般に、液体製剤の浸透圧は７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満とする。
【００９４】
栄養製剤には本発明により生産されたＰＵＦＡ以外に上記のような多量養素、ビタミン及びミネラルを加えることができる。これらの付加成分の存在は個体がこれらの成分の最小１日必要量を摂取するのを助ける。ＰＵＦＡの供給に加え、亜鉛、銅、葉酸及び酸化防止剤を組成物に加えると望ましい場合もある。これらの物質はストレス下の免疫系を強化するので、組成物を投与する個体に更に有利である。これらの成分は医薬組成物にも添加できる。
【００９５】
より好ましい態様では、栄養組成物は酸化防止剤と少なくとも１種のＰＵＦＡに加えて炭水化物源を含み、炭水化物の少なくとも５重量％は消化しにくいオリゴ糖である。より好ましい態様では、栄養組成物は更に蛋白質、タウリン及びカルニチンを含む。
【００９６】
上述のように、本発明により生産されたＰＵＦＡ又はその誘導体は代用食品又は補助食品、特に乳児用調製乳に添加し、点滴栄養患者や、栄養不良又は他の状態もしくは疾患状態の予防又は治療に用いることができる。背景として、ヒト母乳はＤＨＡ約０．１５％〜約０．３６％、ＥＰＡ約０．０３％〜約０．１３％、ＡＡ約０．３０％〜約０．８８％、ＤＧＬＡ約０．２２％〜約０．６７％、及びＧＬＡ約０．２７％〜約１．０４％の脂肪酸プロフィルをもつことに留意すべきである。従って、本発明により生産されたＡＡ、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡ等の脂肪酸は例えばヒト母乳のＰＵＦＡ含量をより忠実に再現するように乳児用調製乳の組成を変更したり、非ヒト哺乳動物乳に通常含まれるＰＵＦＡ含量を変えるために使用することができる。特に、薬剤又は食品補給剤、特に母乳代用剤又は補給剤に使用する組成物はＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの１種以上を含むことが好ましい。組成物はＡＡ約０．３〜３０％、ＤＧＬＡ約０．２〜３０％及び／又はＧＬＡ約０．２〜約３０％を含むことがより好ましい。
【００９７】
トリグリセリドとして計算した場合に脂肪酸約２〜約３０重量％を含む非経腸栄養組成物が本発明に含まれる。好適組成物は総ＰＵＦＡ組成の約１〜約２５重量％をＧＬＡとする。場合により、他のビタミン、特に脂溶性ビタミン（例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ）やＬ−カルニチンも加えてもよい。所望により、約０．１重量％のα−トコフェロール等の保存剤を加えてもよい。
【００９８】
更に、ＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの比は特定所期最終用途に合わせて調節することができる。母乳補給剤又は代用剤として処方する場合には、夫々約１：１９：３０〜約６：１：０．２の比でＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの１種以上を含む組成物が提供される。例えば、動物の母乳は１：１９：３０〜６：１：０．２のＡＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡ比をとることができ、約１：１：１、１：２：１、１：１：４の中間比をとることが好ましい。宿主細胞で一緒に生産させる場合には、ＧＬＡやＤＧＬＡ等の前駆物質基質からＡＡへの変換速度及び百分率を調節してＰＵＦＡ比を厳密に制御することが好ましい。例えば、ＡＡ対ＤＧＬＡ比を約１：１９にするには５％〜１０％のＤＧＬＡからＡＡへの変換率を使用することができ、ＡＡ対ＤＧＬＡ比を約６：１にするには約７５％〜８０％の変換率を使用することができる。従って、細胞培養系中であるか宿主動物中であるかに関係なく、デサチュラーゼ発現のタイミング、程度及び特異性と、他のデサチュラーゼ及びエロンガーゼの発現を調節してＰＵＦＡレベル及び比を調節することができる。本発明により生産されたＰＵＦＡ（例えばＡＡ、ＥＰＡ等）をその後、所望濃度及び比で他のＰＵＦＡ又は他の型の脂肪酸と配合してもよい。
【００９９】
更に、本発明により生産されたＰＵＦＡ又は本発明のデサチュラーゼ遺伝子を含み且つ発現するように形質転換した宿主細胞を動物飼料補給剤として使用し、動物の組織又は乳脂肪酸組成をヒト又は動物消費により望ましいものに変えることもできる。
【０１００】
医薬組成物
本発明は本明細書に記載する方法によりデサチュラーゼ遺伝子を使用して生産された酸及び／又はその結果として得られる油の１種以上を含む医薬組成物も含む。具体的には、このような医薬組成物はＰＵＦＡ及び／又は油の１種以上と医薬的に許容可能な標準周知非毒性キャリヤー、アジュバント又はビヒクル、例えばリン酸緩衝食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤又はエマルション（例えば水／油エマルション）を含むことができる。組成物は液体形態でも固体形態でもよい。例えば、組成物は錠剤、カプセル剤、摂取可能液剤もしくは散剤、注射剤、又は局所軟膏もしくはクリームの形態とすることができる。例えば分散液の場合には必要粒度を維持し、界面活性剤を使用することにより適正な流動性を維持することができる。例えば糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を加えると望ましい場合もある。このような不活性希釈剤以外に、湿潤剤、乳化懸濁剤、甘味料、調味料及び香料等のアジュバントを組成物に加えてもよい。
【０１０１】
懸濁液は活性化合物以外に例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル類、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天−寒天及びトラガカントガム又はこれらの物質の混合物等の懸濁剤を含むことができる。
【０１０２】
錠剤やカプセル剤等の固体剤形は当分野で周知の技術を使用して製造することができる。例えば、本発明により生産されたＰＵＦＡに乳糖、蔗糖及びコーンスターチ等の慣用錠剤基剤と結合剤（例えばアラビアガム、コーンスターチ又はゼラチン）、崩壊剤（例えばジャガイモ澱粉又はアルギン酸）及び滑沢剤（例えばステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム）を加えて錠剤化することができる。カプセル剤は酸化防止剤と該当ＰＵＦＡと共にこれらの賦形剤をゼラチンカプセルに封入することにより製造することができる。酸化防止剤とＰＵＦＡ成分は上記ガイドラインの範囲に納まるようにする。
【０１０３】
静脈内投与には、本発明により生産されたＰＵＦＡ又はその誘導体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（登録商標）等の市販製剤に配合すればよい。典型的な健常成人血漿脂肪酸プロフィルはＡＡ６．６４〜９．４６％、ＤＧＬＡ１．４５〜３．１１％、及びＧＬＡ０．０２〜０．０８％を含む。患者で正常な脂肪酸プロフィルに達するようにこれらのＰＵＦＡ又はその代謝前駆物質を単独又は他のＰＵＦＡと併用して投与することができる。所望により、製剤の各成分を個々に提供してもよいし、１回又は複数回使用するキット形態で提供してもよい。特定脂肪酸の典型的な用量は０．１ｍｇ〜２０ｇを１日１〜５回（１日１００ｇまで）投与し、１日約１０ｍｇ〜約１、２、５又は１０ｇ（１回又は複数回投与）が好ましい。
【０１０４】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては例えば経腸（例えば経口及び直腸）と非経腸が挙げられる。例えば、液体製剤を経口又は直腸投与することができる。更に、均一混合物を水に完全に分散し、滅菌条件下に生理的に許容可能な希釈剤、防腐剤、緩衝液又は推進剤と混合し、スプレー又は吸入剤を形成することができる。投与経路は当然のことながら所望効果に依存する。例えば、肌荒れ、乾燥又は老化した皮膚の治療や、皮膚損傷又は火傷の治療や、疾病又は障害により損傷した皮膚又は毛髪の治療に組成物を利用する場合には、局所塗布することができる。
【０１０５】
組成物の患者投与量は当業者が決定することができ、患者の体重、患者の年齢、患者の総合健康状態、患者の病歴、患者の免疫状態等の種々の因子により異なる。
【０１０６】
剤形としては、組成物は例えば液剤、分散液、懸濁液、エマルション又は後で再構成する滅菌粉末とすることができる。
【０１０７】
本発明は更に本明細書に記載する医薬及び／又は栄養組成物の使用による各種疾患の治療にも関する。特に、本発明の組成物は血管形成後再狭窄の治療に使用することができる。更に、炎症、関節リウマチ、喘息及び乾癬の症状も本発明の組成物で治療することができる。ＰＵＦＡはカルシウム代謝に関与していることも分かっているので、本発明の組成物は骨粗鬆症や腎臓又は尿管結石の治療又は予防にも利用できる。
【０１０８】
更に、本発明の組成物は癌の治療にも使用できる。悪性細胞は脂肪酸組成が変化していることが示されている。脂肪酸を加えるとその増殖を抑制し、細胞死をもたらし、化学治療剤感受性を増すことが示されている。更に、本発明の組成物は癌に伴う悪液質の治療にも有用であると思われる。
【０１０９】
本発明の組成物は糖尿病の治療にも使用することができる（例えば米国特許第４，８２６，８７７号とＨｏｒｒｏｂｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｖｏｌ．５７（Ｓｕｐｐｌ．）７３２Ｓ−７３７Ｓ参照）。糖尿病動物では脂肪酸代謝及び組成の変化が示されている。
【０１１０】
更に、デサチュラーゼ酵素の使用により直接又は間接的に生産されたＰＵＦＡを含む本発明の組成物は湿疹治療や血圧降下にも使用できる。更に、本発明の組成物は血小板凝固の抑制、血管拡張の誘導、コレステロールレベル低下、血管平滑筋及び繊維組織の増殖抑制（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８３，ｐ．８５−１０１，１９７６）、胃腸出血及び非ステロイド抗炎症薬の他の副作用の緩和又は予防（米国特許第４，６６６，７０１号参照）、子宮内膜症や月経前症候群の予防又は治療（米国特許第４，７５８，５９２号参照）、並びにウイルス感染後の筋肉脳脊髄炎及び慢性疲労の治療（米国特許第５，１１６，８７１号参照）にも使用できる。
【０１１１】
本発明の組成物の他の用途としてはＡＩＤＳ、多発性硬化症及び炎症性皮膚疾患の治療と、健康維持が挙げられる。
【０１１２】
更に、本発明の組成物は化粧目的にも利用できる。混合物を形成するように既存化粧品組成物に添加してもよいし、本発明により生産されたＰＵＦＡを化粧品組成物で単独「活性」成分として使用してもよい。
【０１１３】
獣医用途
動物は要求及び条件の多くがヒトと同一であるので、上記医薬及び栄養組成物は動物（即ち哺乳動物、鳥類、爬虫類、トカゲ等を含む家畜又は非家畜）でもヒトと同様に利用できることに留意すべきである。例えば、本発明の油又は脂肪酸は動物飼料添加物、動物代用飼料、動物ビタミン又は動物局所軟膏に利用することができる。
【０１１４】
以下、実施例により本発明を説明するが、これにより発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１１５】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）ｃＤＮＡライブラリーの構築
機能的デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ培養物をジャガイモデキストロース培地（Ｄｉｆｃｏ  ＃３３６，ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｐａｒｋｓ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で室温にて４日間絶えず撹拌しながら増殖させた。チーズクロス数層で濾過することにより菌糸体を回収し、乳鉢乳棒を使用して液体窒素中で培養物を粉砕した。β−メルカプトエタノールを加えたＲＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に細胞溶解液を再懸濁し、５５℃で３分間インキュベートした。これらの溶解液を注射器で繰返し吸引するか又は「Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ」（商品名）カラム（Ｑｉａｇｅｎ）でホモジナイズした。「ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉ」（商品名）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコール通りに使用して全ＲＮＡを最終的に精製した。
【０１１６】
オリゴｄＴセルロース樹脂を使用して各生物由来全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。次に「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＸＲ」（商品名）ライブラリー構築キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して２本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、２本鎖ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に配向性クローニングした（５’ＥｃｏＲＩ／３’ＸｈｏＩ）。Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａライブラリーは各々平均インサート寸法約７００ｂｐのクローン約２．５×１０６個を含んでいた。液体窒素中で培養物を粉砕することによりＳ．ｄｉｃｌｉｎａのゲノムＤＮＡを単離した後、「Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」（商品名）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコール通りに使用して精製した。
【実施例２】
【０１１７】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａにおけるコドン使用の決定
実施例１に記載したＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーからの３５０個のランダムｃＤＮＡクローンの５’末端を配列決定した。ＧＣＧプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を「ＦａｓｔＡ」（商品名）アルゴリズムと併用して配列を６個の読み枠に翻訳し、クエリー配列と同一型の１群の配列の類似性を特にＧｅｎＢａｎｋデータベース内で検索した。クローンの多くは公知遺伝子との蛋白質相同性により推定ハウスキーピング遺伝子として同定された。こうして８種のＳ．ｄｉｃｌｉｎａ  ｃＤＮＡ配列を選択した。更に、全長Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ  Δ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼ配列も使用した（下表１参照。）。次に、ＧＣＧ市販「ＣｏｄｏｎＦｒｅｑｕｅｎｃｙ」プログラムを使用することにより、これらの配列を使用して下表２に示すＳ．ｄｉｃｌｉｎａコドンバイアス表を作成した。
【０１１８】
【表１】
2005515776.tif 000002
【０１１９】
【表２】
2005515776.tif 000003
【実施例３】
【０１２０】
Ｓａｐｒｏｌｅｑｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）からω３−デサチュラーゼを単離するための縮重オリゴヌクレオチドの設計
Ｓａｑｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ等の真菌は図１に示すＰＵＦＡ生合成経路を介してアラキドン酸（ＡＡ）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等の多様なＰＵＦＡを産生する。Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）の脂肪酸組成を分析した処、合計脂質の１５．４２％がＡＡであり、合計脂質の１２．２％がＥＰＡであることが判明した（表５参照）。多量に存在する他の中間体はリノール酸（ＬＡ）だけであった。これはＳ．ｄｉｃｌｉｎａが非常に活性なΔ６及びΔ５−デサチュラーゼと共に、図１に示す経路を介して中間体にシャントするエロンガーゼももつことを示す。この生物ではＥＰＡの百分率が高いので、ＡＡ（２０：４ｎ−６）をＥＰＡ（２０：５ｎ−３）に変換することが可能な活性なω３−デサチュラーゼ（基質がＣ１８脂肪酸である場合には「Δ１５」デサチュラーゼに同義であり、基質がＣ２０脂肪酸である場合には「Δ１７」デサチュラーゼに同義であり、基質がＣ２２脂肪酸である場合には「Δ１９」デサチュラーゼに同義である）が存在すると予想される。
【０１２１】
上述のように、ω３−デサチュラーゼはＣ１８−アシル鎖のΔ１５位、Ｃ２０−アシル鎖のΔ１７位、及びＣ２２−アシル鎖のΔ１９位への二重結合の導入を触媒する酵素である。数種の植物由来ω３−デサチュラーゼが公知であるが、これらはＬＡ（１８：２ｎ−６）やＧＬＡ（１８：３ｎ−６）等のＣ１８脂肪酸基質にしか作用しない。これらの型のデサチュラーゼをΔ１５−デサチュラーゼと総称する。現時点ではコードされる酵素がＣ１８、Ｃ２０、及びＣ２２脂肪酸基質の不飽和化を触媒するω３−デサチュラーゼ遺伝子は１種類しか単離されていない。これはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来ｆａｔ−１である。米国特許第６，１９４，１６７号（発行日２００１年２月２７日）参照。
【０１２２】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからω３−デサチュラーゼを同定するために本実施例で使用したアプローチは他の公知ω３−デサチュラーゼに存在する保存モチーフを含む縮重オリゴヌクレオチド（プライマー）を使用してデサチュラーゼ遺伝子の領域をＰＣＲ増幅することであった。これらの縮重プライマーの設計には以下の生物に由来するω３−デサチュラーゼを使用した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＃Ｐ４６３１０）、Ｒｉｃｕｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＃Ｐ４８６１９）、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＃Ｐ４８６２１）、Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＃Ｐ４８６２０）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃Ｄ７９９７９）、Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃Ｕ５９４７７）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＡＦ２２２９８９）、Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｓｉ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃Ｕ１７０６３）、及びＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃Ｌ４１８０７）。一部のプライマーはこの酵素の活性部位の重要な成分である保存ヒスチジンボックスモチーフを含むように設計した。Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ．Ｅ．，ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ，Ｖ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｅ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，１２７８７−１２７９４参照。
【０１２３】
配列アラインメントはＣＬＵＳＴＡＬＷ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ）を使用して実施した。
【０１２４】
以下の縮重プライマーを設計し、種々の組合せで使用した。
蛋白質モチーフ１：ＮＨ３−ＴＲＡＡＩＰＫＨＣＷＶＫ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１１４４（フォワード）：５’−ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＡＡＧ−３’（配列番号１）。
蛋白質モチーフ２：ＮＨ３−ＡＬＦＶＬＧＨＤＣＧＨＧＳＦＳ−ＣＯＯＨ
このプライマーはヒスチジンボックス１（下線部）を含む。
プライマーＲＯ１１１９（フォワード）：５’−ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＧＧＣ  ＣＡＹ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＡＹ  ＧＧＣ  ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＴＣＧ−３’（配列番号２）。
プライマーＲＯ１１１８（リバース）：５’−ＧＡＧ  ＲＴＧ  ＧＴＡ  ＲＴＧ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＲ  ＲＴＧ  ＲＴＧ  ＧＲＹ  ＧＡＣ  ＲＴＧ−３’（配列番号３）。
蛋白質モチーフ３：ＮＨ３−ＰＹＨＧＷＲＩＳＨＲＴＨＨＱＮ−ＣＯＯＨ
このプライマーはヒスチジンボックス２（下線部）を含む。
プライマーＲＯ１１２１（フォワード）：５’−ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＣＡＹ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＴＣＧ  ＣＡＹ  ＣＧＣ  ＡＣＣ  ＣＡＹ  ＣＡＹ  ＣＡＧ  ＡＡＣ−３’（配列番号４）。
プライマーＲＯ１１２２（リバース）：５’−ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＲＴＧ  ＲＴＧ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＲＴＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＲＴＧ  ＧＴＡ  ＧＧＧ−３’（配列番号５）。
蛋白質モチーフ４：ＮＨ３−ＧＳＨＦ  Ｄ／Ｈ  Ｐ  Ｄ／Ｙ  ＳＤＬＦＶ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１１４６（フォワード）：５’−ＧＧＣ  ＴＣＧ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＳＡＣ  ＣＣＣ  ＫＡＣ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＧＴＣ−３’（配列番号６）。
プライマーＲＯ１１４７（リバース）：５’−ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＣＧＡ  ＧＴＭ  ＧＧＧ  ＧＴＷ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＣＧＡ  ＧＣＣ−３’（配列番号７）。
蛋白質モチーフ５：ＮＨ３−ＷＳ  Ｙ／Ｆ  Ｌ／Ｖ  ＲＧＧＬＴＴ  Ｌ／Ｉ  ＤＲ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１１４８（リバース）：５’−ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＧＡＫ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＧＡＷ  ＧＳＡ  ＣＧＡ  ＣＣＡ−３’（配列番号８）。
蛋白質モチーフ６：ＮＨ３−ＨＨＤＩＧＴＨＶＩＨＨＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ
この配列は第３のヒスチジンボックス（下線部）を含む。
プライマーＲＯ１１１４（リバース）：５’−ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＲＴＧ  ＲＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＲＴＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＲＴＧ  ＲＴＧ−３’（配列番号９）。
蛋白質モチーフ７：ＮＨ３−Ｈ  Ｌ／Ｆ  ＦＰ  Ｑ／Ｋ  ＩＰＨＹＨＬ  Ｖ／Ｉ  ＥＡＴ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ１１１６（リバース）：５’−ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＧＡＹ  ＧＡＧ  ＲＴＧ  ＧＴＡ  ＲＴＧ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＣＴＫ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＲ  ＲＴＧ−３’（配列番号１０）。
蛋白質モチーフ８：ＮＨ３−ＨＶ  Ａ／Ｉ  ＨＨ  Ｌ／Ｆ  ＦＰＱＩＰＨＹＨＬ−ＣＯＯＨ
このプライマーは第３のヒスチジンボックス（下線部）を含み、植物ω３−デサチュラーゼとＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ω３−デサチュラーゼとの相違を説明するものである。
プライマーＲＯ１１１８（リバース）：５’−ＧＡＧ  ＲＴＧ  ＧＴＡ  ＲＴＧ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＲ  ＲＴＧ  ＲＴＧ  ＧＲＹ  ＧＡＣ  ＲＴＧ−３’（配列番号１１）。
【０１２５】
配列番号１〜１１に使用した縮重コードはＲ＝Ａ／Ｇ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ；Ｍ＝Ａ／Ｃ；Ｋ＝Ｇ／Ｔ；Ｗ＝Ａ／Ｔ；Ｓ＝Ｃ／Ｇ  ；Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ；Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ；Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ；Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ；及びＮ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔである。
【実施例４】
【０１２６】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）からのω３−デサチュラーゼ遺伝子の同定と単離
（実施例１からの）Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリープラスミドＤＮＡ又はＳ．ｄｉｃｌｉｎａゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、実施例３に開示した縮重プライマーの各種セットをＰＣＲ増幅反応で使用した。種々の異なるＤＮＡポリメラーゼと反応条件もＰＣＲ増幅に使用した。これらの反応には「Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ」（商品名）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、又はｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、又はＴａｑ  ＰＣＲ−ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）を異なるアニール温度で使用した。
【０１２７】
プライマーＲＯ１１２１（フォワード）（配列番号４）及びＲＯ１１１６（リバース）（配列番号１０）を使用してＰＣＲ増幅した結果、公知ω３−デサチュラーゼに相同のフラグメントの増幅に成功した。ＲＯ１１２１（フォワード）プライマーは蛋白質モチーフ３に対応し、ＲＯ１１１６（リバース）プライマーは蛋白質モチーフ７に対応する。
【０１２８】
ＰＣＲ増幅はｃＤＮＡライブラリー鋳型３μｌに４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ９．２）、１５ｍＭ  ＫＯＡｃ、３．５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、３．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸各２００μＭ、各プライマー１０ｐｍｏｌ及び「Ａｄｖａｎｔａｇｅ」（商品名）ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）０．５μｌを加えて総容量５０μｌ中で実施した。増幅は次のように実施した。９４℃で３分間の初期変性後に９４℃で１分間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５サイクル実施した。７２℃で７分間の最終伸長サイクルを実施した後に４℃で反応を終了した。
【０１２９】
１％「ＳｅａＫｅｍ  Ｇｏｌｄ」（商品名）アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）で分解した単一の約４８０ｂｐ  ＰＣＲバンドが出現したので、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してゲル精製した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を製造業者の指示通りに使用してフラグメントのスタガード末端を「フィルイン」し、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、８個のクローンを配列決定し、データベース検索（Ｇｅｎ−ＥＭＢＬ）を実施した。
【０１３０】
クローン「ｓｄｄ１７−７−１」〜「ｓｄｄ１７−７−８」はいずれも約４８３ｂｐインサートを含むことが分かった。このフラグメントからの推定アミノ酸配列は（「ｔＦａｓｔＡ」検索によると）以下の蛋白質と最高一致度を示した。
１．Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種由来ω３（Δ１５）−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｄ１３７８０）と１６１アミノ酸オーバーラップで一致度３７．９％。
２．Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ色素体ω３−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ３０２０１７）と１１３アミノ酸オーバーラップで一致度４０．７％。
３．Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＦＡＤ８脂肪酸デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｄ６３９５３）と１２８アミノ酸オーバーラップで一致度３５．９％。
【０１３１】
公知ω３脂肪酸デサチュラーゼとのその配列相同性により、このＤＮＡフラグメントはＳ．ｄｉｃｌｉｎａに存在するω３−デサチュラーゼ遺伝子の一部である可能性が高いと思われた。
【０１３２】
上記ＤＮＡ配列を使用し、この遺伝子の３’及び５’末端を実施例１に記載のｃＤＮＡライブラリーから単離するためのオリゴヌクレオチドを設計した。遺伝子の３’末端を単離するために、以下のオリゴヌクレオチドを設計した。
【０１３３】
ＲＯ１１８８（フォワード）：５’−ＴＡＣ  ＧＣＧ  ＴＡＣ  ＣＴＣ  ＡＣＧ  ＴＡＣ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  Ｇ−３’（配列番号１２）。
【０１３４】
ＲＯ１１８９（フォワード）：５’−ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＧＣＧ  ＡＣＧ−３’（配列番号１３）。
【０１３５】
ＲＯ１１９０（フォワード）：５’−ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＧＴＡ  ＣＧＴ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＣＡＡ  Ｃ−３’（配列番号１４）。
【０１３６】
ＲＯ１１９１（フォワード）：５’−ＴＣＡ  ＡＧＧ  ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣ−３’（配列番号１５）．
これらのプライマー（配列番号１２〜１５）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクターオリゴヌクレオチド：ＲＯ８９８：５’−ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  Ｇ−３’（配列番号１６）と併用した。
【０１３７】
ＰＣＲ増幅は「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（商品名）ポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）又は「Ａｄｖａｎｔａｇｅ」（商品名）ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）又は「Ｐｌａｔｉｎｕｍ」（商品名）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を次のように使用して実施した。
【０１３８】
「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」ポリメラーゼでは、各プライマー１０ｐｍｏｌを実施例１からのｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ１μｌと併用した。増幅は次のように実施した。９４℃で３分間の初期変性後に９４℃で１分間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５サイクル実施した。７２℃で７分間の最終伸長サイクルを実施した後に４℃で反応を終了した。この増幅の結果、試験した他の２種類の条件に比較して最も明白なバンドが得られた。
【０１３９】
「Ａｄｖａｎｔａｇｅ」（商品名）ｃＤＮＡポリメラーゼ反応では、実施例１からのｃＤＮＡライブラリー鋳型１μｌに４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ９．２）、１５ｍＭ  ＫＯＡｃ、３．５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、３．７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸各２００μＭ、各プライマー１０ｐｍｏｌ及びｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）０．５μｌを加えて総容量５０μｌ中でＰＣＲ増幅を実施した。増幅はＴａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘについて記載したように実施した。
【０１４０】
「Ｐｌａｔｉｎｕｍ」（商品名）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ反応では、実施例１からのｃＤＮＡライブラリー鋳型１μｌに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ（終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸各２００μＭ、各プライマー１０ｐｍｏｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４，及びＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加えて総容量５０μｌ中でＰＣＲ増幅を実施した。増幅は次のように実施した。９４℃で３分間の初期変性後に９４℃で４５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分間を３０サイクル実施した。４℃で反応を終了した。
【０１４１】
全４セットのプライマーとベクタープライマーの組合せにより明白なバンドが生じた。組合せ（ＲＯ１１８８＋ＲＯ８９８）からのＰＣＲバンドは＞５００ｂｐであり、これをゲル精製し、別々にクローニングした。他のプライマー組合せから生じたＰＣＲバンドは＜５００ｂｐであった。これらのバンドをゲル精製し、まとめてプールし、上述したようにＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、クローンを配列決定し、分析した。
【０１４２】
約５００ｂｐインサートを含むクローン「ｓｄｄ１７−１６−４」及び「ｓｄｄ１６−６」と約４００ｂｐインサートを含むクローン「ｓｄｄ１７−１７−６」、「ｓｄｄ１７−１７−１０」、及び「ｓｄｄ１７−２０−３」はいずれも推定ω３−デサチュラーゼの３’末端を含むことが判明した。これらの配列は相互にオーバーラップすると共にこの推定ω３−デサチュラーゼ遺伝子の最初に同定されたフラグメントにもオーバーラップしていた。これらの全配列は「ＴＡＡ」停止コドンと真核遺伝子の３’末端に特徴的なｐｏｌｙ−Ａテールを含んでいた。この３’末端配列は他の公知ω３−デサチュラーゼと相同であり、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  Δ１５−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｄ１３７８０）と最高一致度であった（１３０アミノ酸オーバーラップで４１．５％）。
【０１４３】
この遺伝子の５’末端を単離するために、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクターオリゴヌクレオチドと併用した。
ＲＯ８９９：５’−ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ−３’（配列番号１７）。
ＲＯ１１８５（リバース）：５’−ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＴＧＣ−３’（配列番号１８）。
ＲＯ１１８６（リバース）：５’−ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  ＧＣ−３’（配列番号１９）。
ＲＯ１１８７（リバース）：５’−ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＡＣ−３’（配列番号２０）。
【０１４４】
３’末端単離について上述したように「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（商品名）ポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）又は「Ａｄｖａｎｔａｇｅ」（商品名）ｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）又は「Ｐｌａｔｉｎｕｍ」（商品名）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して増幅を行った。
【０１４５】
プライマー組合せ（ＲＯ１１８５又はＲＯ１１８６＋ＲＯ８９９）から生じたＰＣＲバンドは約５８０から約４４０ｂｐであり、これらをプールし、上述のようにＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングした。こうして作製されたクローンは「ｓｄｄ１７−１４−１」、「ｓｄｄ１７−１４−１０」、「ｓｄｄ１７−１８−２」、及び「ｓｄｄ１７−１８−８」を含み、いずれも公知ω３−デサチュラーゼと相同性を示した。
【０１４６】
更に、（ＲＯ１１８７＋ＲＯ８９９）から生じたバンドは約６８０ｂｐであり、これらを別々にクローニングし、同様に公知ω３−デサチュラーゼと相同性を示すクローン「ｓｄｄ１７−２２−２」及び「ｓｄｄ１７−２２−５」を作製した。これらの全クローンは相互にオーバーラップすると共に未知の推定ω３−デサチュラーゼの最初のフラグメントにもオーバーラップしていた。これらの配列はＡＴＧ’部位の後にオープンリーディングフレームを含んでおり、この遺伝子の開始部位であることを示した。これらのフラグメントはＣａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓに由来するΔ１５−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ２４５９３８）と最高一致度を示した（１４６アミノ酸オーバーラップで３９．７％）。
【０１４７】
以下のオリゴヌクレオチドを使用してＳ．ｄｉｃｌｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅によりこのω３−デサチュラーゼの全長を得た。
【０１４８】
ＲＯ１２１２（フォワード）：５’−ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＣＣＧ−３’（配列番号２１）。このプライマーは「ＡＴＧ」開始部位（２つ目の下線部）の後にω３−デサチュラーゼの５’配列を含む。更に、ＥｃｏＲＩ部位（１つ目の下線部）を開始部位の上流に導入して酵母発現ベクターｐＹＸ２４２にクローニングし易くした。
【０１４９】
ＲＯ１２１３（リバース）：５’−ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ−３’（配列番号２２）。このプライマーは遺伝子の「ＴＡＡ」停止コドン（２つ目の下線部）と停止コドンの下流配列を含む。遺伝子内の領域は非常にＧ＋Ｃリッチであるため、ＰＣＲ増幅用オリゴヌクレオチドの設計に加えることができなかったので、この配列を含めた。更に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（１つ目の下線部）を含めて酵母発現ベクターｐＹＸ２４２にクローニングし易くした。
【０１５０】
ＰＣＲ増幅は「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（商品名）ポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、各プライマー１０ｐｍｏｌ、及び実施例１からのｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ１μｌを使用して実施した。増幅は次のように実施した。９４℃で３分間の初期変性後に９４℃で１分間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５サイクル実施した。７２℃で７分間の最終伸長サイクルを実施した後に４℃で反応を終了した。
【０１５１】
こうして約１ｋｂのＰＣＲが得られ、このバンドを単離精製し、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。インサートを配列決定して遺伝子配列を確認した。クローン「ｓｄｄ１７−２７−２」をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化して全長インサートを遊離させ、このインサートを予めＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいた酵母発現ベクターｐＹＸ２４２にクローニングした。この構築物はｐＹＸ２４２にクローニングしたｓｄｄ１７の１０７７ｂｐを含んでいた。この構築物をｐＲＳＰ１９と命名し、発現研究のために酵母ＳＣ３３４に形質転換した。
【０１５２】
更に、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ  ω３遺伝子を別の酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。このために、実施例１で作製したｃＤＮＡライブラリーから下記のオリゴヌクレオチドを使用する（上述のような）ＰＣＲ増幅によりω３−デサチュラーゼ遺伝子を単離した。
【０１５３】
Ｒ０１２２１（フォワード）（配列番号２３）５’−ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＣＣＧ−３’。このプライマーは「ＡＴＧ」開始部位（２つ目の下線部）の後にω３−デサチュラーゼの５’配列を含む。更に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（１つ目の下線部）を開始部位の上流に導入してｐＹＥＳ２酵母発現ベクターにクローニングし易くした。
【０１５４】
Ｒ０１２２２（リバース）（配列番号２４）５’−ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ−３’。このプライマーは遺伝子の「ＴＡＡ」停止コドン（２つ目の下線部）と停止コドンの下流配列を含む。遺伝子内の領域は非常にＧ＋Ｃリッチであるため、ＰＣＲ増幅用オリゴヌクレオチドの設計に加えることができなかったので、この配列を加えた。更に、ＥｃｏＲＩ部位（１つ目の下線部）を含めてｐＹＥＳ２酵母発現ベクターにクローニングし易くした。
【０１５５】
こうして生じた約１ｋｂ  ＰＣＲバンドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、予め同一制限酵素で消化しておいたｐＹＥＳ２にクローニングした。得られた構築物（ｓｄｄ１７＋ｐＹＥＳ２）をｐＲＳＰ２０と命名し、同時発現研究に使用した。
【０１５６】
ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅により全長ｓｄｄ１７遺伝子も単離しようと試みた。しかし、得られたＰＣＲ産物は１０７７ｂｐ（約１．１５ｋｂ）より大きく、この産物を配列決定すると、ゲノム配列に小さいインサートが存在することが判明した。
【０１５７】
この推定ω３−デサチュラーゼの全長遺伝子（ｓｄｄ１７と言う）は１０７７ｂｐ長であり、図２（配列番号２５）に示す。
【０１５８】
配列番号２５の遺伝子は３５８アミノ酸残基の蛋白質（配列番号２６）（図３）をコードした。（「ｔＦａｓｔＡ」プログラムを使用して）ｓｄｄ１７の推定蛋白質配列を検索した処、蛋白質はＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種（ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．１３７８０）（図４）とＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３（ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ９０９１３）に由来するΔ１５−デサチュラーゼと最高一致度（２６９アミノ酸オーバーラップで４１％）をもつことが判明した。この蛋白質は数種の他の植物ω３−デサチュラーゼとも配列類似性があった。この推定蛋白質配列をＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（ＡＴＣＣ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｌ４１８０７）に由来するＦＡＴ１酵素と比較した処、３１０アミノ酸オーバーラップで一致度３１．６％に止まった（図５）。
【０１５９】
全ω３−デサチュラーゼと同様に、この酵素はその配列の５’末端内にチトクロームｂ５ドメインを含まない。チトクロームｂ５ドメインはΔ５及びΔ６−デサチュラーゼ等の大半の「フロントエンド」不飽和化酵素に存在する。本実施例に記載するω３−デサチュラーゼは全膜結合デサチュラーゼに存在する３個のヒスチジンリッチ配列を含む。これらの３個のドメインは配列番号２６の８９〜９３位（ＨＤＣＧＨ）、１２５〜１２９位（ＨＲＨＨＨ）、及び２８４〜２８８位（ＨＱＶＨＨ）に存在する。これらのヒスチジンリッチボックスは酵素の活性部位で二鉄−オキソ構造に配位すると考えられ、酵素活性に必要である。Ｓｔｕｋｅｙ，Ｊ．Ｅ．，ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ，Ｖ．Ｍ．＆  Ｍａｒｔｎ，Ｃ．Ｅ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，２０１４４−２０１４９参照。これらの特徴は二鉄−オキソ蛋白質の膜結合デサチュラーゼ／ヒドロキシラーゼファミリーのメンバーである「ＳＤＤ１７」蛋白質に一致する。この遺伝子のＧ＋Ｃ含量は６１．８％である。
【実施例５】
【０１６０】
パン酵母におけるＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ由来ω３−デサチュラーゼ遺伝子（「ｓｄｄ１７」）の発現
ＳＤＤ１７蛋白質により触媒される反応の基質特異性と分類を決定するために、ｓｄｄ１７をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＣ３３４）で異種発現させた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはＯＡ（１８：１ｎ−９）よりも脂肪酸を合成することができないため、バックグラウンド酵素活性が検出されないので、ＯＡよりも長い基質に及ぼす酵素活性を測定するために使用するのに理想的なシステムである。適切な脂肪酸基質を外部から宿主に供給し、細胞に取込ませ、形質転換ｓｄｄ１７遺伝子の発現された蛋白質に作用させることができる。
【０１６１】
「Ａｌｋａｌｉ−Ｃａｔｉｏｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」（商品名）キット（ＢＩＯ  １０１，Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してＳ．ｄｉｃｌｉｎａに由来する全長ω３−デサチュラーゼ（ｓｄｄ１７）をｐＹＸ２４２にクローニングしたクローンｐＲＳＰ１９をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＣ３３４）に形質転換した。形質転換細胞のロイシン栄養要求性をロイシン欠損培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）で選択した。これらのクローンの特異的デサチュラーゼ活性を検出するために、形質転換細胞をＬＡ（１８：２ｎ−６）、ＧＬＡ（１８：３ｎ−６）、ＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）、ＡＡ（２０：４ｎ−６）、及びアドレン酸（２２：４ｎ−６）各５０μＭの存在下に増殖させた。これらの外部から供給した脂肪酸基質が１個の追加的不飽和をもつ産物に変換されるならば、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに認められない特異的デサチュラーゼ活性が存在することを示す。
【０１６２】
ＬＡ（１８：２ｎ−６）からＡＬＡ（１８：３ｎ−３）への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０１６３】
ＧＬＡ（１８：３ｎ−６）からＳＴＡ（１８：４ｎ−３）への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０１６４】
ＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）からＥＴＡ（２０：４ｎ−３）への変換はΔ１７−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０１６５】
ＡＡ（２０：４ｎ−６）からＥＰＡ（２０：５ｎ−３）への変換はΔ１７−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０１６６】
アドレン酸（２２：４ｎ−６）からＤＰＡ（２２：５ｎ−３）への変換はΔ１９−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０１６７】
陰性対照株はｐＹＸ２４２ベクターで形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとした。実験培養物と対照培養物を同時に増殖させ、分析した。
【０１６８】
培養物は激しく撹拌し（２５０ｒｐｍ）、種々の基質（表３参照）５０μＭ（終濃度）の存在下に４８時間２４℃で増殖させた。細胞を遠沈させ、蒸留水で１回洗浄し、ペレットをメタノールに再懸濁し、（内部標準としての）トリトリデカノインと共にクロロホルムを加えた。これらの混合物を少なくとも１時間室温で又は４℃で一晩インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、Ｗｈａｔｍａｎフィルターと無水硫酸ナトリウム１ｇで濾過し、粒状物と残留水を除去した。有機溶媒を４０℃で窒素流下に蒸発させた。次にメタノール中０．５Ｎ水酸化カリウム２ｍｌを密閉試験管に加えることにより、抽出した脂質をガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ）のために脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換した。サンプルを９５℃〜１００℃まで３０分間加熱し、室温まで冷却した。メタノール中１４％三弗化ホウ素約２ｍｌを加え、加熱を繰返した。抽出した脂質混合物を冷却後、水２ｍｌとヘキサン１ｍｌを加え、ＧＣ分析のためにＦＡＭＥを抽出した。下式を使用して変換率を計算した。
変換率％＝［産物％］／［産物％＋基質％］Ｘ１００
【０１６９】
【表３】
2005515776.tif 000004
【０１７０】
表３はＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）由来のｓｄｄ１７にコードされる蛋白質産物の酵素活性を示す。この酵素はＣ２０及びＣ２２ω６脂肪酸基質の両者を不飽和化して対応するω３脂肪酸産物を生じることが可能な活性なω３−デサチュラーゼである。この酵素は加えたＡＡ基質の１３．８％を対応するＥＰＡ産物に変換し、Δ１７−デサチュラーゼ活性を示した。更に、この酵素はΔ１７−デサチュラーゼに予想されるようにＤＧＬＡにも作用してＥＴＡに変換した。しかし、本実施例では、加えたＤＧＬＡの５％しかＥＴＡに変換されず、ここで使用した条件下ではこの酵素はＤＧＬＡよりもＡＡに基質好性をもつことを示した。
【０１７１】
ＤＰＡやＤＨＡ等のＣ２２ω３脂肪酸は食事や医薬に重要な関係があるので、Ｃ２２脂肪酸基質に対するこの酵素の活性も調べた。表３から明らかなように、この酵素はアドレン酸等のＣ２２基質に活性であり、その４％をＤＰＡに変換した。対照培養物から明らかなように、非形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは外部から加えた基質から産物への非特異的変換は生じなかった。
【０１７２】
表４はこのω３−デサチュラーゼ（ＳＤＤ１７）がより低温（即ち１５℃）でも機能できることを実証する。ここでは外来基質５０μＭを形質転換細胞に加え、培養物を４８時間１５℃で増殖させた。上述のように脂肪酸分析を行った。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる１５℃での総基質取込みは２４℃でよりも少なかった（表３と表４を比較）。しかし、酵素による基質から産物への変換百分率は１５℃で増加した。より低濃度の外来脂肪酸基質の存在は酵素の活性を改善すると思われたので、高濃度の脂肪酸基質はこの酵素にフィードバック阻害の作用をする可能性がある。基質濃度と温度の変化がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるこのω３−デサチュラーゼの発現に及ぼす効果を調べるために更に試験することができる。
【０１７３】
【表４】
2005515776.tif 000005
【０１７４】
全公知ω３−デサチュラーゼと異なり、ｓｄｄ１７をコードする酵素は（試験条件下では）どのＣ１８ω６脂肪アシル基質もその対応するω３脂肪酸に不飽和化しなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてこの酵素はＡＡのみに作用してＥＰＡに変換すると考えられる。これはＡＡとＥＰＡには高い値を示すが、他のω３中間体には殆ど又は全く作用しないというＳ．ｄｉｃｌｉｎａの脂肪酸プロフィルに一致すると思われる（表５）。
【０１７５】
【表５】
2005515776.tif 000006
【０１７６】
このように、ｓｄｄ１７はＣ２０及びＣ２２脂肪酸基質を不飽和化することが可能な新規ω３−デサチュラーゼをコードする。ＳＤＤ１７蛋白質は異種系で容易に発現させることができるので、植物等の他の異種系で使用できると思われる。この酵素は他の公知ω３−デサチュラーゼと非常に異なり、Ｃ２０及びＣ２２脂肪酸基質の両者に活性を示すが、Ｃ１８基質には示さない。Ｃ２０及びＣ２２ω６脂肪酸基質に作用することが可能な唯一の他の公知デサチュラーゼであるＦＡＴ−１との一致度は３１．６％に過ぎない。従って、ｓｄｄ１７によりコードされる酵素は新規ω３−デサチュラーゼである。
【実施例６】
【０１７７】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ  ω３−デサチュラーゼと他の酵素の同時発現
実施例３に記載したようにｐＹＥＳ２酵母発現ベクターにクローニングしたｓｄｄ１７から構成されるｐＲＳＰ２０構築物を他のデサチュラーゼ及びエロンガーゼとの同時発現試験に使用した。ｐＹＸ２４２酵母発現ベクターにクローニングしたＳ．ｄｉｃｌｉｎａ由来Δ５−デサチュラーゼ遺伝子（配列番号２７）を含む構築物であるｐＲＳＰ３を酵母にｐＲＳＰ２０と同時形質転換した。形質転換プロトコールは実施例４に記載した通りとした。このΔ５−デサチュラーゼはＤＧＬＡからＡＡへ、及びＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒する。ロイシンとウラシルを欠損する最小培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ−Ｕｒａ］）で同時形質転換細胞を選択した。
【０１７８】
表６は基質ＤＧＬＡ（２０：３  ｎ−６）５０μＭを加えた場合にΔ５−デサチュラーゼが前記基質をＡＡ（２０：４，ｎ−６）に変換し、ω３−デサチュラーゼが更にＡＡをＥＰＡ（２４：５，ｎ−３）に不飽和化できたことを示す。基質の最終産物への変換率は５％であり、陰性対照にバックグラウンドは観察されなかった。
【０１７９】
【表６】
2005515776.tif 000007
【０１８０】
表６はｐＹＸ２４２にクローニングしたＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ種７０９１から得られたエロンガーゼ（配列番号２８）であるｐＲＡＴ−４−Ａ７とｐＲＳＰ２０の同時形質転換実験の結果も示す。このエロンガーゼ遺伝子は既存ＰＵＦＡへの更に２個超の炭素の付加を触媒する。基質ＧＬＡ（１８：３  ｎ−６）５０μＭを同時形質転換体に加えると、エロンガーゼはＧＬＡをＤＧＬＡに伸長させ、ＤＧＬＡはω３−デサチュラーゼにより更に不飽和化されてＥＴＡ（２０：４  ｎ−３）となった。基質の最終産物への変換率は１．４％であり、陰性対照にバックグラウンドは観察されなかった。
【０１８１】
このように、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ  ω３−デサチュラーゼは生産された産物を異種発現系で、ＰＵＦＡ生合成経路からの別の異種酵素により利用し、前記産物を予想されるＰＵＦＡに変換することもできた。
【０１８２】
ｐＹＥＳ２ベクターにクローニングした場合（ｐＲＳＰ２０）のｓｄｄ１７の発現（従って、活性）はｐＹＸ２４２ベクターにクローニングした場合（ｐＲＳＰ１９）よりも著しく低いことに留意すべきである。これは各ベクターに存在する発現プロモーターの相違により説明することができる。ｐＹＸ２４２プロモーターは構成的プロモーターであり、ｐＹＥＳ２におけるガラクトース誘導性プロモーターよりも著しく強力である。これらの２種の発現ベクターにクローニングした場合には他のデサチュラーゼで発現試験中にも同様の観察が得られた。
【０１８３】
ｐＲＳＰ２０の代わりにｐＲＳＰ９を他のデサチュラーゼ及びエロンガーゼと併用して更に同時発現実験を実施することができる。更に、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ  ω３−デサチュラーゼをΔ４−デサチュラーゼｐＲＴＡ７（配列番号２９）等の他の酵素と同時発現させることもでき、その場合には基質としてアドレン酸（２２：４  ｎ−６）を加えることができ、ω３−デサチュラーゼとΔ４−デサチュラーゼの協奏作用により最終産物ＤＨＡ（２２：６  ｎ−３）を生産することができる。
【実施例７】
【０１８４】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ  ＡＴＣＣ５６８５１からΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子を単離するための縮重プライマーの設計
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）の脂肪酸組成の分析によると、相当量のＬＡの存在が判明し、非常に活性なΔ１２−デサチュラーゼの存在が示唆された（表５）。Δ１２−デサチュラーゼはＯＡを基質として使用し、ＯＡからＬＡへの変換を触媒する（図１参照）。Δ１２−デサチュラーゼは植物、真菌及び昆虫のみに存在し、ヒトを含む哺乳動物には存在しない。従って、ＬＡはｉｎ  ｖｉｖｏ合成できないのでヒトにおける「必須」脂肪酸である。ＬＡを更に不飽和化及び伸長すると、ＧＬＡ、ＡＡ、及びＥＰＡ等の重要な細胞内化合物が生産される。
【０１８５】
本実験の目的はＳ．ｄｉｃｌｉｎａからΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子を単離し、酵母等の異種宿主系で酵素を発現させることによりその機能を確認することであった。採用したアプローチは公知Δ１２−デサチュラーゼからの保存アミノ酸モチーフを示す縮重プライマー（オリゴヌクレオチド）を設計することであった。これらのプライマーの設計に当たり、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ１１０５０９）、Ｍｕｃｏｒ  ｒｏｕｘｉｉ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ１６１２１９）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｘ９１１３９）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｌ２６２９６）、及びＢｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ０７４４３２４）からの配列情報を含む真菌及び植物起源の両者に由来する公知Δ１２−デサチュラーゼ配列情報を使用した。ＣＯＤＥＨＯＰ  Ｂｌｏｃｋｍａｋｅｒプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｑ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌ）を使用して配列情報を分析した。
【０１８６】
本実施例で使用した縮重プライマーは以下の通りであった。
蛋白質モチーフ１：ＮＨ３−Ｐ  Ｎ／Ｅ  ＦＴＩＫＥＩＲ  Ｄ／Ｅ  Ａ／Ｃ  ＩＰＡＨＣＦ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ９６７（フォワード）：５’−ＣＣＧ  ＳＡＧ  ＴＴＣ  ＡＣＳ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＧＡＳ  ＫＳＣ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＣ−３’（配列番号３０）。
蛋白質モチーフ２：ＮＨ３−ＭＰ  Ｈ／Ｆ  ＹＨＡＥＥＡＴ  Ｖ／Ｙ  Ｈ  Ｉ／Ｌ  ＫＫ  Ａ／Ｌ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ９６８（リバース）：５’−ＧＲＳ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＡＫ  ＧＴＧ  ＧＷＭ  ＳＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＧＷＲ  ＣＧＧ  ＣＡＴ−３’（配列番号３１）。
蛋白質モチーフ３：ＮＨ３−Ｐ  Ｌ／Ｖ  ＹＷ  Ａ／Ｉ  Ｃ／Ｍ／Ａ  ＱＧ  Ｖ／Ｉ  Ｖ  Ｌ／Ｇ／Ｃ  ＴＧＶＷ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ９６４（フォワード）：５’−ＣＣＳ  ＳＴＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＲＴＣ  ＧＴＣ  ＣＴＣ  ＡＣＳ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号３２）。
【０１８７】
この配列は公知植物Δ１２−デサチュラーゼにより類似している。
プライマーＲＯ９６５（フォワード）：５’−ＣＣＳ  ＳＴＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＲＹＳ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＲＴＣ  ＧＴＣ  ＫＧＹ  ＡＣＳ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号３３）。
【０１８８】
この配列は公知真菌Δ１２−デサチュラーゼにより類似している。
蛋白質モチーフ４：ＮＨ３−ＨＶＡＨＨ  Ｌ／Ｆ  ＦＳ  Ｔ／Ｑ  ＭＰＨＹＨＡ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ９６６（リバース）：５’−ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＧＴＧ  ＣＧＧ  ＣＡＴ  ＳＭＭ  ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＲ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＧＡＣ  ＧＴＧ−３’（配列番号３４）
オリゴヌクレオチドに使用した縮重コードはＲ＝Ａ／Ｇ；Ｙ＝Ｃ／Ｔ；Ｍ＝Ａ／Ｃ；Ｋ＝Ｇ／Ｔ；Ｗ＝Ａ／Ｔ；Ｓ＝Ｃ／Ｇ  ；Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ；Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ；Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ；Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ；Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔである。
【実施例８】
【０１８９】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）からのΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子の同定と単離
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子のフラグメントを単離するために、実施例１からのＳ．ｄｉｃｌｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用してＰＣＲを遂行した。プライマーは（ＲＯ９６４＋ＲＯ９６６）、（ＲＯ９６５＋ＲＯ９６６）、及び（ＲＯ９６７＋ＲＯ９６８）の組合せで使用した。「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（商品名）ポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１００μｌ容量中でＰＣＲを実施した。各プライマー１０ｐｍｏｌをｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ１μｌと併用した。増幅は次のように実施した。９４℃で４分間の初期変性後に９４℃で１分間、４７℃で１分間、７２℃で２分間を２５サイクル実施した。７２℃で５分間の最終伸長サイクルを実施した後に４℃で反応を終了した。
【０１９０】
（ＲＯ９６４＋ＲＯ９６６）又は（ＲＯ９６５＋ＲＯ９６６）を使用して増幅した結果、約６８８ｂｐ長の明白なバンドが得られた。（ＲＯ９６７＋ＲＯ９６８）を使用して増幅した結果、約６６０ｂｐの明白な単一バンドが得られた。これらのバンドを１％「ＳｅａＫｅｍ  Ｇｏｌｄ」（商品名）アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）で分解させ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してゲル精製した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の説明書通りに使用してフラグメントのスタガード末端を「フィルイン」した。次にＤＮＡフラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、クローンを配列決定し、データベース検索（Ｇｅｎ−ＥＭＢＬ）を行った。
【０１９１】
クローン「ｓｄｄ１２−１−８」、「ｓｄｄ１２−２−８」、及び「ｓｄｄ１２−５−ｌ」はいずれも相互にオーバーラップしているのが見い出され、「ＡＳＳＥＭＢＬＥ」（商品名）プログラム（ＧＣＧ）を使用してこれらのオーバーラップするフラグメントを整列させ、約９００ｂｐの単一融合フラグメントを作製した。この融合配列の推定アミノ酸で「ｔＦａｓｔＡ」検索した処、以下の蛋白質と最高の一致度が判明した。
【０１９２】
Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Δ１２−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ０７４３２４）と２９８アミノ酸オーバーラップで一致度４９％及びＳｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ  Δ１２−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ１９２４８６）と３３２アミノ酸オーバーラップで一致度４６．７％。
【０１９３】
公知Δ１２−デサチュラーゼとの高い一致度により、フラグメントはＳ．ｄｉｃｌｉｎａ  Δ１２−デサチュラーゼ遺伝子の領域であるとみなされた。このフラグメントを使用して遺伝子の５’及び３’末端をプルアップするためのプライマーを設計した。
【０１９４】
遺伝子の３’末端を単離するために、以下のオリゴヌクレオチドを設計した。
【０１９５】
ＲＯ９７５（フォワード）：５’−ＣＡＣ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＣＡＣ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＣＴＡ  ＣＧ−３’（配列番号３５）。
【０１９６】
ＲＯ９７６（フォワード）：５’−ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＣＡＧ  ＣＧＣ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＴＧＣ−３’（配列番号３６）。
【０１９７】
これらをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクターオリゴヌクレオチドＲＯ８９８：５’−ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  Ｇ−３’（配列番号１６）と併用した。
【０１９８】
ＰＣＲ増幅は「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（商品名）ポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を次のように使用して実施した。鋳型として実施例１からのｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ１μｌと共に各プライマー１０ｐｍｏｌを使用した。増幅は次のように実施した。９４℃で３分間の初期変性後に９４℃で１分間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５サイクル実施した。７２℃で７分間の最終伸長サイクルを実施した後に４℃で反応を終了した。
【０１９９】
プライマー組合せ（ＲＯ８９８＋ＲＯ９７５）は約３９０ｂｐのＰＣＲバンドを生じ、プライマー組合せ（ＲＯ８９８＋ＲＯ９７６）は約３００ｂｐ長のバンドを生じた。これらのバンドを精製し、上述のようにＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングした。クローン「ｓｄｄ１２−８−１２」及び「ｓｄｄ１２−９−４」を含む数個のクローンはΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子の３’末端を含むことが分かった。これらの配列は初期Δ１２−デサチュラーゼフラグメントとオーバーラップしており、ＴＡＡ停止コドンとｐｏｌｙ−Ａテールを含んでいた。「ｔＦａｓｔＡ」プログラムを使用して配列分析した処、クローン「ｓｄｄ１２−９−４」はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ由来Δ１２−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＢ０２００３３）と７３アミノ酸オーバーラップで一致度５４．５％であり、Ｍｕｃｏｒ  ｒｏｕｘｉｉ由来Δ１２−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ１６１２１９）と７２アミノ酸オーバーラップで一致度５６．９％であることが判明した。
【０２００】
この遺伝子の５’末端を単離するために、以下のオリゴヌクレオチドを設計し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクターオリゴヌクレオチドＲＯ８９９（配列番号１７）と併用した。
【０２０１】
ＲＯ９７７（リバース）：５’−ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＧＣ−３’（配列番号３７）。
【０２０２】
ＲＯ９７８（リバース）：５’−ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＣＧＡ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＴＧ−３’（配列番号３８）。
【０２０３】
「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（商品名）ポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）又は「Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ」（商品名）ｃＤＮＡ  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製品はこの生物に由来するデサチュラーゼの５’末端に一般に存在するＧＣリッチ領域に伴う潜在的ＰＣＲ増幅問題を回避するために使用した。「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（商品名）ポリメラーゼを使用するＰＣＲ増幅はこの遺伝子の３’末端の単離について記載したように実施した。
【０２０４】
「Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ」（商品名）キットを使用する場合には、熱サイクル条件を次のようにした。鋳型をまず９４℃で１分間初期変性した後に９４℃で３０秒、６８℃で３分間を３０サイクル実施し、最後に６８℃で５分間の伸長サイクルを実施した。各反応は（実施例１からの）ｃＤＮＡライブラリー鋳型１μｌ、各プライマー１０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ＧＣ  Ｍｅｌｔ  １Ｍ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、１５ｍＭ  ＫＯＡｃ、３．５ｍＭ  ＭＧ（ＯＡｃ）２、５％  ＤＭＳＯ、及び３７５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡで総容量５０μｌとした。
【０２０５】
プライマー組合せ（ＲＯ８９９＋ＲＯ９７８）を使用して約３７１ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。このバンドを上述のようにＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。こうして得られた唯一のクローン「ｓｄｄ１２−１０−８」は遺伝子の推定ＡＴＧ開始部位を含んでいた。他のクローンはＡＴＧを他のコドンで置換させていた。「ｓｄｄ１２−１０−８」の推定アミノ酸配列の「ｔＦａｓｔＡ」分析によると、Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ  ｂａｌｓａｍｉｎａ由来Δ１２−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ１８２５２０）と７２アミノ酸オーバーラップで一致度４７．２％であり、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来Δ１２−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ２４５９３８）と７５アミノ酸オーバーラップで一致度４２．７％であることが分かった。
【０２０６】
以下のオリゴヌクレオチドを使用して実施例１のＳ．ｄｉｃｌｉｎａ  ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅によりこのΔ１２−デサチュラーゼの全長を得た。
【０２０７】
Ｒ０１０５１（フォワード）：５’−ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＧＡＣ  ＧＴＧ−３’（配列番号３９）。このプライマーは「ＡＴＧ」開始部位（２つ目の下線部）の後にΔ１２−デサチュラーゼの５’配列を含む。更にＥｃｏＲＩ部位（１つ目の下線部）を開始部位の上流に加えてｐＹＸ２４２酵母発現ベクターにクローニングし易くした。
【０２０８】
Ｒ０１０５７（リバース）：５’−ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＣ−３’（配列番号４０）。このプライマーは遺伝子のＴＡＡ停止コドン（２つ目の下線部）と、ｐＹＸ２４２酵母発現ベクターにクローニングし易くするために加えたＨｉｎｄＩＩＩ部位（１つ目の下線部）を含む。
【０２０９】
「Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ」（商品名）ポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）と「Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲ」（商品名）キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）の両者を使用して上述のようにＰＣＲ増幅を実施した。但し、この場合にはＳ．ｄｉｃｌｉｎａゲノムＤＮＡを増幅用鋳型として使用した。約１．１ｋｂのＰＣＲバンドが得られ、このバンドを単離精製し、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＴＯＰ１０細胞に形質転換した。インサートを配列決定して遺伝子配列を確認した。クローン「ｓｄｄ１２−ｇｇ−ｂ１」をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化して全長インサートを遊離させ、このインサートを予めＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいた酵母発現ベクターｐＹＸ２４２にクローニングした。この構築物はΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子の１１８２ｂｐとｐＹＸ２４２を含んでいた。構築物をｐＲＳＰ１１と命名した。次にｐＲＳＰ１１構築物を発現試験のためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＣ３３４）に形質転換した。
【０２１０】
この推定Δ１２−デサチュラーゼの全長遺伝子（ｓｄｄ１２と命名）は１１８２ｂｐ長であった（配列番号４１）（図６）。この遺伝子は３９３アミノ酸残基の蛋白質（配列番号４２）（図７）をコードする。ｓｄｄ１２の推定蛋白質配列の「ｔＦａｓｔＡ」検索によると、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ由来Δ１２−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｘ９７０１６）（図８）と最高一致度（３７９アミノ酸オーバーラップで４５．６％）をもち、Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ（ＦＡＤ２）由来Δ１２−デサチュラーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ１９２４８６）と３５３アミノ酸オーバーラップで一致度４９．６％であることが判明した。
【０２１１】
他のΔ１２−デサチュラーゼと同様に、この酵素もその配列の５’末端にチトクロームｂ５ドメインを含まない。この酵素は全膜結合デサチュラーゼに存在する３個のヒスチジンリッチ配列を含む。これらのヒスチジンボックスの位置と長さは他のデサチュラーゼで見られるものと同様である。これらは配列番号４２のアミノ酸位置１０８〜１１２（ＨＥＣＧＨ）、１４４〜１４８（ＨＲＲＨＨ）、及び３２６〜３３０（ＨＶＴＨＨ）に存在する。上述のように、これらのヒスチジンリッチボックスは酵素の活性部位で二鉄−オキソ構造に配位すると考えられ、酵素活性に必要である。
【実施例９】
【０２１２】
パン酵母におけるΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子（ｓｄｄ１２）の発現
このΔ１２−デサチュラーゼ（ＳＤＤ１２）により触媒される反応の基質特異性と分類を決定するために、ｓｄｄ１２をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＣ３３４）で異種発現させた。上述のように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはＯＡを越える脂肪酸を合成することができないため、バックグラウンド酵素活性が検出されないので、ＯＡよりも長い基質に及ぼす酵素活性を測定するために、それは理想的なシステムである。適切な脂肪酸基質を外部から宿主に供給し、これらの基質を細胞に取込ませ、形質転換ｓｄｄ１２遺伝子の発現したΔ１２−デサチュラーゼに作用させることができる。
【０２１３】
「Ａｌｋａｌｉ−Ｃａｔｉｏｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」（商品名）キット（ＢＩＯ  １０１）を製造業者の指示通りに使用してｐＹＸ２４２にクローニングしたＳ．ｄｉｃｌｉｎａ由来全長Δ１２−デサチュラーゼ（ｓｄｄ１２）を含むクローンｐＲＳＰ１１をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＣ３３４）に形質転換した。形質転換細胞のロイシン栄養要求性をロイシン欠損培地（ＤＯＢ−Ｌｅｕ）で選択した。これらのクローンの特異的デサチュラーゼ活性を検出するために、形質転換細胞をＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、及びＤＧＬＡ各５０μＭの存在下に増殖させた。
【０２１４】
ＯＡからＬＡ（１８：２ｎ−６）への変換はΔ１２−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０２１５】
ＬＡからＡＬＡ（１８：３ｎ−３）への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０２１６】
ＬＡからＧＬＡ（１８：３ｎ−６）への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０２１７】
ＧＬＡからステアリドン酸（１８：４ｎ−３）への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０２１８】
ＤＧＬＡからＥＴＡ（２０：４ｎ−３）への変換はΔ１７−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０２１９】
ＤＧＬＡからＡＡ（２０：４ｎ−６）への変換はΔ５−デサチュラーゼ活性の指標である。
【０２２０】
陰性対照株はｐＹＸ２４２ベクターで形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとした。実験培養物と対照培養物を同時に増殖させ、分析した。
【０２２１】
培養物は激しく撹拌し（２５０ｒｐｍ）、種々の基質（表７参照）５０μＭ（終濃度）の存在下に４８時間２４℃で増殖させた。細胞を遠沈させ、蒸留水で１回洗浄し、ペレットをメタノールに再懸濁し、（内部標準としての）トリトリデカノインと共にクロロホルムを加えた。これらの混合物を少なくとも１時間室温で又は４℃で一晩インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、Ｗｈａｔｍａｎフィルターと無水硫酸ナトリウム１ｇで濾過し、粒状物と残留水を除去した。有機溶媒を４０℃で窒素流下に蒸発させた。次にメタノール中０．５Ｎ水酸化カリウム２ｍｌを密閉試験管に加えることにより、抽出した脂質をガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ）のために脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換した。サンプルを９５℃〜１００℃まで３０分間加熱し、室温まで冷却した。メタノール中１４％三弗化ホウ素約２ｍｌを加え、加熱を繰返した。抽出した脂質混合物を冷却後、水２ｍｌとヘキサン１ｍｌを加え、ＧＣ分析のためにＦＡＭＥを抽出した。下式を使用して変換率を計算した。
変換率％＝［産物％］／［産物％＋基質％］Ｘ１００
表７は酵母で発現させた場合のΔ１２−デサチュラーゼの酵素活性を示す。ここでは、発現させた場合のｐＲＳＰ１１クローンはＯＡ基質の３５．８％をＬＡに変換することができ、Δ１２−デサチュラーゼ活性を示した。
【０２２２】
表７では、対象脂肪酸を酵母から抽出した総脂質の百分率として表す。ＧＣ／ＭＳを利用して産物を同定した。これらの条件下で、クローンは他のデサチュラーゼ活性を示さなかった。このことから、単離された遺伝子はΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子であることが確認された。ベクター単独で形質転換した宿主を使用した場合にバックグラウンド基質変換は検出されなかった。このデータはこのΔ１２−デサチュラーゼを異種システムで発現させることができ、従って、ＧＬＡ、ＡＡ、ＥＰＡ及びＤＨＡ等のトランスジェニックポリ不飽和化脂肪酸の生産に有用であることを示す。
【０２２３】
【表７】
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【０２２４】
栄養組成物
詳細な説明に記載したＰＵＦＡは種々の栄養補給剤、乳児用調製物、代用栄養剤及び他の栄養溶液で利用することができる。
【０２２５】
Ｉ．乳児用調製粉乳
Ａ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）鉄分配合調製豆乳：
用途：牛乳アレルギー又は過敏症の乳児、幼児及び成人用飲料。乳糖を避けなければならない疾患（ラクターゼ欠損症、乳糖不耐症及びガラクトース血症）の患者への栄養補給。
【０２２６】
特徴：
−牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物（コーンシロップと蔗糖）を使用。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）を配合。
−推奨値のビタミンとミネラルを配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
−乳白色、乳状コンシステンシー及びよい香り。
【０２２７】
成分：（パルベ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖質（蔗糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２２８】
Ｂ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＤＦ下痢用調製豆乳：
用途：乳幼児の下痢の食物管理用短期摂取食。
【０２２９】
特徴：
−特に下痢管理用として大豆繊維からの食物繊維を加えた最初の乳児用調製乳である。
−乳児の軽度から重度の下痢期間に水状軟便期間を短くすることが臨床的に判明した。
−乳児の栄養要件を満足するように栄養学的に完全である。
−Ｌ−メチオニンを添加した大豆蛋白単離物は乳児の全必須アミノ酸の必要値を満足するか又はこれを上回る。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物（コーンシロップと蔗糖）を使用。
−米国小児科学会栄養委員会により推奨され、乳児用調製乳法に規定されるビタミン及びミネラル値を満足するか又はこれを上回る。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）を配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
【０２３０】
成分：（パルベ）水８６％、コーンシロップ４．８％、糖質（蔗糖）２．５％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物２．０％、ヤシ油１．４％、大豆繊維０．７７％、クエン酸カルシウム０．１２％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム０．１０％、塩化カリウム、第一リン酸カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２３１】
Ｃ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＳＦ鉄分入り無蔗糖調製豆乳：
用途：牛乳蛋白アレルギーもしくは過敏症又は蔗糖不耐の乳児、幼児及び成人用飲料。乳糖と蔗糖を避けなければならない疾患の患者への栄養補給。
【０２３２】
特徴：
−牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした（炭水化物源はＰｏｌｙｃｏｓｅ（登録商標）グルコースポリマーである）。
−蔗糖不耐患者のために無蔗糖とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（１８０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）を配合。
−推奨値のビタミンとミネラルを配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
−乳白色、乳状コンシステンシー及びよい香り。
【０２３３】
成分：（パルベ）水７５％、加水分解コーンスターチ１１．８％、大豆油４．１％、大豆蛋白単離物４．１％、ヤシ油２．８％、改質コーンスターチ１．０％、第三リン酸カルシウム０．３８％、クエン酸カリウム０．１７％、塩化カリウム０．１３％、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラゲナン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２３４】
Ｄ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）２０即製鉄分配合調製豆乳、２０Ｃａｌ／液量オンス：
用途：大豆摂取を必要とする場合。
【０２３５】
成分：（パルベ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖質（蔗糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２３６】
Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）乳児用調製物：
用途：乳児用調製物を必要とする場合：１歳未満で授乳の中断を決定した場合、授乳の補完が必要な場合、又は授乳を採用しない際の日常食として。
【０２３７】
特徴：
−良好な成長に適した品質と量の蛋白質を配合すると共に、熱変性により乳関連腸内失血の危険を減らした。
−（二重均質化）植物油ブレンドに由来する脂肪を使用し、吸収し易い必須リノール酸を提供する。
−ヒト母乳に似た割合で乳糖として炭水化物を配合した。
−成長中の臓器へのストレスを最小限にするために低腎溶質負荷とした。
−粉末、濃厚液及び即製形態。
【０２３８】
成分：（−Ｄ）水、脱脂乳、乳糖、大豆油、ヤシ油、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、アスコルビン酸、カラゲナン、塩化コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２３９】
Ｆ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＮｅｏＣａｒｅ鉄分入り未熟児用調製物：
用途：退院後の未熟児の特殊栄養要件を満たす。Ｓｉｍｉｌａｃ  ＮｅｏＣａｒｅは成長の遅れを取り戻し、発育を助けるために必要な付加熱量、蛋白質、ビタミン及びミネラルを提供するために開発された栄養学的に完全な処方である。
【０２４０】
特徴：
−熱量とビタミン補給の必要を減らす。標準処方（２０Ｃａｌ／液量オンス）よりも高熱量（２２Ｃａｌ／液量オンス）。
−未熟児の特殊消化要件を満足し易くするために中鎖トリグリセリド（ＭＣＴｏｉｌ）を加えた高吸収脂肪ブレンドを配合。
−入院中に開始した栄養補給を延長するためにより高レベルの１００カロリー当たり蛋白質、ビタミン及びミネラルを配合。
−骨鉱化作用を改善するためにカルシウム及びリン量を高くした。
【０２４１】
成分：−Ｄコーンシロップ固形分、脱脂乳、乳糖、濃縮ホエイ蛋白、大豆油、高オレイン酸サフラワー油、分留ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、ヤシ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、塩化コリン、パルミチン酸アスコルビル、Ｌ−カルニチン、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、混合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、βカロチン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２４２】
Ｇ．Ｓｉｍｉｌａｃ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｒｅ即製低鉄分ヒト母乳強化剤、２４Ｃａｌ／液量オンス：
用途：ヒト母乳と混合するか又は出産時体重の少ない乳児にヒト母乳の代用として与える。
【０２４３】
成分：−Ｄ水、脱脂乳、加水分解コーンスターチ、乳糖、分留ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、濃縮ホエイ蛋白、大豆油、ヤシ油、第三リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化コリン、ｍ−イノシトール、タウリン、ナイアシンアミド、Ｌ−カルニチン、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、塩化カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二銅、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンＤ３、亜セレン酸ナトリウム及びシアノコバラミン。
【０２４４】
本発明の種々のＰＵＦＡは上記乳児用調製物及び当分野で公知の他の乳児用調製物に代用及び／又は添加することができる。
【０２４５】
ＩＩ．栄養製剤
Ａ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥは経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することを主目的とする低残渣液体食品である。ＥＮＳＵＲＥは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。主に経口補給剤であるが、経管供給することもできる。
【０２４６】
患者状態：
−調整食摂取患者。
−危険な栄養状態にある高齢患者。
−不随意体重減少患者。
−病気又は手術から回復中の患者。
−低残渣食が必要な患者。
【０２４７】
成分：−Ｄ水、糖質（蔗糖）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、大豆蛋白単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム。
【０２４８】
Ｂ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＢＡＲＳ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＢＡＲＳは食間又は食事と共に補充する完全にバランスのとれた補助栄養である。他のスナック菓子に代用する美味しく栄養分の高い代用食である。ＥＮＳＵＲＥ  ＢＡＲＳは１本当たり乳糖含有量が＜１ｇであり、チョコレートファッジブラウニーフレーバーは無グルテンである。（ハニーグラハムクランチフレーバーはグルテンを含む。）
患者状態：
−付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする患者。
−十分な熱量と栄養を取込めない者に特に有用である。
−噛む能力と飲込む能力のある者。
−落花生アレルギー又は任意型のナッツアレルギーのある者には使用できない。
【０２４９】
成分：ハニーグラハムクランチ−高果糖コーンシロップ、大豆蛋白単離物、ブラウンシュガー、蜂蜜、マルトデキストリン（トウモロコシ）、クリスプライス（米粉、糖質［蔗糖］、食塩［塩化ナトリウム］及び麦芽）、オート麦ぬか、部分加水分解綿実油及び大豆油、大豆多糖、グリセリン、濃縮ホエイ蛋白、ポリデキストロース、果糖、カゼイン酸カルシウム、ココア粉末、人工フレーバー、キャノーラ油、高オレイン酸サフラワー油、脱脂粉乳、ホエイ粉末、大豆レシチン及びコーン油。ナッツ加工施設で製造。
【０２５０】
ビタミン及びミネラル：第三リン酸カルシウム、第二リン酸カリウム、酸化マグネシウム、食塩（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、アスコルビン酸、オルトリン酸第二鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、酸化亜鉛、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マンガン、リボフラビン、βカロチン、塩酸ピリドキシン、一硝酸チアミン、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２５１】
蛋白質：ハニーグラハムクランチ−蛋白源は大豆蛋白単離物と乳蛋白のブレンドである。
大豆蛋白単離物                    ７４％
乳蛋白                            ２６％。
【０２５２】
脂肪：ハニーグラハムクランチ−脂肪源は部分加水分解綿実油及び大豆油、キャノーラ油、高オレイン酸サフラワー油、並びに大豆レシチンのブレンドである。
部分加水分解綿実油及び大豆油      ７６％
キャノーラ油                      ８％
高オレイン酸サフラワー油          ８％
コーン油                          ４％
大豆レシチン                      ４％。
【０２５３】
炭水化物：ハニーグラハムクランチ−炭水化物源は高果糖コーンシロップ、ブラウンシュガー、マルトデキストリン、蜂蜜、クリスプライス、グリセリン、大豆多糖及びオート麦ぬかの組合せである。
高果糖コーンシロップ              ２４％
ブラウンシュガー                  ２１％
マルトデキストリン                １２％
蜂蜜                              １１％
クリスプライス                      ９％
グリセリン                          ９％
大豆多糖                            ７％
オート麦ぬか                        ７％。
【０２５４】
Ｃ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮは食事に付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする者のための濃縮高蛋白液体食品である。経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮは無乳糖無グルテンであり、一般外科手術又は股関節骨折から回復中の者や、圧迫潰瘍の危険のある患者が使用するのに適している。
【０２５５】
患者状態：
−付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする患者、例えば一般外科手術又は股関節骨折から回復中の者、圧迫潰瘍の危険のある患者及び低コレステロール食患者。
【０２５６】
特徴：
−低飽和脂肪。
−１回分当たり総脂肪６ｇ、コレステロール＜５ｍｇを含有。
−濃厚でクリーミーな食感。
−優良な蛋白、カルシウム並びに他の必須ビタミン及びミネラル源。
−低コレステロール食用。
−無乳糖で消化し易い。
【０２５７】
成分：
バニラシュプリーム：−Ｄ水、糖質（蔗糖）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、大豆蛋白単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２５８】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム      ８５％
大豆蛋白単離物                          １５％。
【０２５９】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油及び大豆油の３種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油          ４０％
キャノーラ油                      ３０％
大豆油                            ３０％。
【０２６０】
ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮの脂肪値は米国心臓協会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮ中の脂肪６ｇは総熱量の２４％に相当し、脂肪の２．６％は飽和脂肪酸に由来し、７．９％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量＜３０％、飽和脂肪酸由来熱量＜１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２６１】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味とフレーバーバラエティ（バニラシュプリーム、チョコレートロイヤル、ワイルドベリー及びバナナ）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、フレーバー疲労を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２６２】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖                              ６０％
マルトデキストリン                ４０％。
【０２６３】
チョコレート：
蔗糖                              ７０％
マルトデキストリン                ３０％。
【０２６４】
Ｄ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＬＩＧＨＴ
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴは経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用することを目的とする低脂肪液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０２６５】
患者状態：
−ＥＮＳＵＲＥよりも脂肪が５０％少なく、熱量が２０％少ない補給剤で付加栄養を必要とする正常体重又は超過体重患者。
−食事が適正ではなく、付加栄養を必要とする健康な成人。
【０２６６】
特徴：
−低脂肪及び低飽和脂肪。
−１回分当たり総脂肪３ｇ、コレステロール＜５ｍｇを含有。
−濃厚でクリーミーな食感。
−優良なカルシウム並びに他の必須ビタミン及びミネラル源。
−低コレステロール食用。
−無乳糖で消化し易い。
【０２６７】
成分：
フレンチバニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、カゼイン酸カルシウム、高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、第二リン酸カリウム、第二リン酸マグネシウム、天然及び人工フレーバー、第三リン酸カルシウム、セルロースゲル、塩化コリン、大豆レシチン、カラゲナン、食塩（塩化ナトリウム）、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２６８】
蛋白質：蛋白源はカゼイン酸カルシウムである。
カゼイン酸カルシウム                  １００％。
【０２６９】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油とキャノーラ油の２種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油          ７０％
キャノーラ油                      ３０％。
【０２７０】
ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴの脂肪値は米国心臓協会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴ中の脂肪３ｇは総熱量の１３．５％に相当し、脂肪の１．４％は飽和脂肪酸に由来し、２．６％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量＜３０％、飽和脂肪酸由来熱量＜１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２７１】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。チョコレートフレーバーはコーンシロップも含有している。マイルドな甘味とフレーバーバラエティ（フレンチバニラ、チョコレートシュプリーム、ストロベリースワール）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、フレーバー疲労を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２７２】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖                              ５１％
マルトデキストリン                ４９％。
【０２７３】
チョコレート：
蔗糖                              ４７．０％
コーンシロップ                    ２６．５％
マルトデキストリン                ２６．５％。
【０２７４】
ビタミン及びミネラル：ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴの８液量オンス缶は２４種の主要ビタミン及びミネラルのＲＤＩの少なくとも２５％を提供する。
【０２７５】
カフェイン：チョコレートフレーバーは８液量オンス当たりカフェイン２．１ｍｇを含有している。
【０２７６】
Ｅ．ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳは通常蛋白濃度で付加熱量及び栄養を必要とする場合に使用する高熱量低残渣液体食品である。経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することを主目的とする。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳは無乳糖無グルテンである。主に経口栄養補給剤であるが、経管供給することもできる。
【０２７７】
患者状態：
−量を制限しながら通常蛋白濃度で付加熱量及び栄養を必要とする患者。
−体重増加又は健康体重の維持を必要とする患者。
【０２７８】
特徴：
−濃厚でクリーミーな食感。
−良好な必須ビタミン及びミネラル源。
【０２７９】
成分：
バニラ：−Ｄ水、コーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、糖質（蔗糖）、大豆蛋白単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０２８０】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム      ８４％
大豆蛋白単離物                          １６％。
【０２８１】
脂肪：脂肪源はコーン油である。
コーン油                              １００％。
【０２８２】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート、イチゴ、コーヒー、バターピーカン及びエッグノッグ）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２８３】
バニラ、イチゴ、バターピーカン、及びコーヒーフレーバー：
コーンシロップ                    ３９％
マルトデキストリン                ３８％
蔗糖                              ２３％。
【０２８４】
チョコレート及びエッグノッグフレーバー：
コーンシロップ                    ３６％
マルトデキストリン                ３４％
蔗糖                              ３０％。
【０２８５】
ビタミン及びミネラル：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳの８液量オンス缶は２５種の主要ビタミン及びミネラルのＲＤＩの少なくとも１５％を提供する。
【０２８６】
カフェイン：チョコレートフレーバーは８液量オンス当たりカフェイン３．１ｍｇを含有している。コーヒーフレーバーは微量のカフェインを含有している。
【０２８７】
Ｆ．ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）ＨＮ
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ  ＨＮは熱量及び蛋白必要値が高いか又は耐容量の低い者を対象とした栄養学的に完全な高熱量高窒素液体食品である。経口補充用として使用してもよいし、完全経管栄養補充用として使用してもよい。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ  ＨＮは無乳糖無グルテンである。
【０２８８】
患者状態：
−手術又は外傷後のように熱量及び蛋白必要値が高い患者。
−耐容量が低い早期満腹患者。
【０２８９】
特徴：
−補助又は完全栄養。
−経口又は経管供給。
−１．５ＣａＶｍＬ。
−高窒素。
−高熱量密度。
【０２９０】
成分：
バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、コーン油、糖質（蔗糖）、大豆蛋白単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、カラゲナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０２９１】
Ｇ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲ（水で再構成）は経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用することを主目的とする低残渣液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０２９２】
患者状態：
−調整食摂取患者。
−危険な栄養状態にある高齢患者。
−病気／手術から回復中の患者。
−低残渣食が必要な患者。
【０２９３】
特徴：
−混合し易く簡便。
−低飽和脂肪。
−１回分当たり総脂肪９ｇ、コレステロール＜５ｍｇを含有。
−高ビタミン及びミネラル。
−低コレステロール食用。
−無乳糖で消化し易い。
【０２９４】
成分：−Ｄコーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、大豆蛋白単離物、人工フレーバー、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、第三リン酸カルシウム、塩化カリウム、大豆レシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、塩酸チアミン、硫酸第二銅、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２９５】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム      ８４％
大豆蛋白単離物                          １６％。
【０２９６】
脂肪：脂肪源はコーン油である。
コーン油                              １００％。
【０２９７】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲはコーンシロップとマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲのマイルドな甘味にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、フレーバー疲労を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２９８】
バニラ：
コーンシロップ                    ３５％
マルトデキストリン                ３５％
蔗糖                              ３０％。
【０２９９】
Ｈ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＵＤＤＩＮＧ
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＵＤＤＩＮＧは食事と共にもしくは食間に使用する非液体形態でバランスのとれた栄養を提供する濃厚栄養補給剤である。コンシステンシー調整食（例えば軟食、ピューレ又は全液）や、飲込み障害のある者に適している。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＵＤＤＩＮＧは無グルテンである。
【０３００】
患者状態：
−コンシステンシー調整食（例えば軟食、ピューレ又は全液）摂取患者。
−飲込み障害のある患者。
【０３０１】
特徴：
−濃厚でクリーミーな良好な食感。
−良好な必須ビタミン及びミネラル源。
−冷蔵不要で簡便。
−無グルテン。
【０３０２】
５オンス当たり栄養プロフィル：熱量２５０、蛋白１０．９％、総脂肪３４．９％、炭水化物５４．２％。
【０３０３】
成分：
バニラ：−Ｄ脱脂乳、水、糖質（蔗糖）、部分水素化大豆油、改質食物澱粉、硫酸マグネシウム、ラクチル酸ステアロイルナトリウム、第二リン酸ナトリウム、人工フレーバー、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、塩化コリン、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃイエロー＃５、クエン酸カリウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、ＦＤ＆Ｃイエロー＃６、葉酸、ビオチン、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０３０４】
蛋白質：蛋白源は脱脂乳である。
脱脂乳                            １００％。
【０３０５】
脂肪：脂肪源は水素化大豆油である。
水素化大豆油                      １００％。
【０３０６】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＵＤＤＩＮＧは蔗糖と改質食物澱粉の組合わせを含有している。マイルドな甘味とフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート、バタースコッチ及びタピオカ）によりフレーバー疲労を防止する。製品は１個当たり乳糖９．２ｇを含有している。
【０３０７】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖                              ５６％
乳糖                              ２７％
改質食物澱粉                      １７％。
【０３０８】
チョコレート：
蔗糖                              ５８％
乳糖                              ２６％
改質食物澱粉                      １６％。
【０３０９】
Ｉ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲは強化食物繊維及び栄養を利用できる者を対象とした栄養学的に完全な繊維含有液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲは低残渣食を必要としない者に適している。経口又は経管供給することができ、通常食の栄養補給剤として又は適量を代用食として使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０３１０】
患者状態：
−強化食物繊維及び栄養を利用できる患者。
【０３１１】
特徴：
−低飽和脂肪、高ビタミン及びミネラルの新規改良処方。
−１回分当たり総脂肪６ｇ、コレステロール＜５ｍｇを含有。
−濃厚でクリーミーな食感。
−良好な繊維源。
−優良な必須ビタミン及びミネラル源。
−低コレステロール食用。
−無乳糖無グルテン。
【０３１２】
成分：
バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、オート麦繊維、高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油、大豆蛋白単離物、コーン油、大豆繊維、第三リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースゲル、大豆レシチン、第二リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、天然及び人工フレーバー、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラゲナン、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０３１３】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム      ８０％
大豆蛋白単離物                          ２０％。
【０３１４】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油及びコーン油の３種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油          ４０％
キャノーラ油                      ４０％
コーン油                          ２０％。
【０３１５】
ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲの脂肪値は米国心臓協会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲ中の脂肪６ｇは総熱量の２２％に相当し、脂肪の２．０１％は飽和脂肪酸に由来し、６．７％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量≦３０％、飽和脂肪酸由来熱量≦１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量≦１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０３１６】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味とフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート及びバターピーカン）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、フレーバー疲労を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０３１７】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
マルトデキストリン                ６６％
蔗糖                              ２５％
オート麦繊維                        ７％
大豆繊維                            ２％。
【０３１８】
チョコレート：
マルトデキストリン                ５５％
蔗糖                              ３６％
オート麦繊維                        ７％
大豆繊維                            ２％。
【０３１９】
繊維：ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲで使用される繊維ブレンドはオート麦繊維と大豆多糖から構成される。このブレンドの結果、８液量オンス缶当たり約４ｇの総食物繊維が得られる。不溶性繊維と可溶性繊維の比は９５：５である。
【０３２０】
上記各種栄養補給剤は当業者に公知であり、本発明により生産されたＰＵＦＡに代用及び／又は補充することができる。
【０３２１】
Ｊ．Ｏｘｅｐａ（登録商標）栄養製剤
ＯｘｅｐａはＡＲＤＳ患者又はその危険のある患者の食事管理を目的とする低炭水化物高密度熱量経腸栄養製剤である。エイコサペンタエン酸（魚油由来ＥＰＡ）、γ−リノレン酸（ルリヂサ油由来ＧＬＡ）及び高レベル酸化防止剤を含有する特許付与された油ブレンドを含む特殊な成分組合せをもつ。
【０３２２】
熱量分布：熱量密度はエネルギー要求を満たすために必要な容量を最小にするように高く、１．５Ｃａｌ／ｍＬ（３５５Ｃａｌ／８液量オンス）である。Ｏｘｅｐａの熱量分布を表Ａに示す。
【０３２３】
【表８】
2005515776.tif 000009
【０３２４】
脂肪：
−Ｏｘｅｐａは８液量オンス缶当たり２２．２ｇ（９３．７ｇ／Ｌ）の脂肪を含有している。
−脂肪源はキャノーラ油３１．８％、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）２５％、ルリヂサ油２０％、魚油２０％、及び大豆レシチン３．２％からなる油ブレンドである。Ｏｘｅｐａの典型的な脂肪酸プロフィルを表Ｂに示す。
−Ｏｘｅｐａは表ＶＩに示すようにバランスのとれた量のポリ不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸を提供する。
−脂肪ブレンドの２５％に相当する中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）は胆汁酸により乳化されずに腸管に吸収されるので胃を空にし易い。
【０３２５】
Ｏｘｅｐａ（登録商標）栄養製剤の各種脂肪酸成分は本発明により生産されたＰＵＦＡに代用及び／又は補充することができる。
【０３２６】
【表９】
2005515776.tif 000010
脂肪酸は総脂肪の約９５％である。
【０３２７】
【表１０】
2005515776.tif 000011
【０３２８】
炭水化物：
−炭水化物含量は８液量オンス缶当たり２５．０ｇ（１０５．５ｇ／Ｌ）である。
−炭水化物源はマルトデキストリン（複合炭水化物）４５％と蔗糖（単純糖）５５％であり、いずれも消化吸収し易い。
−Ｏｘｅｐａは二酸化炭素（ＣＯ２）生産を最小にするように高脂肪低炭水化物である。ＣＯ２レベルが高いと、人工呼吸器依存患者の呼吸器取りはずしが難しくなる可能性がある。低レベル炭水化物はストレス性高血糖症を発症した患者にも有用であると思われる。
−Ｏｘｅｐａは無乳糖である。
【０３２９】
食物炭水化物、蛋白由来アミノ酸及び脂肪のグリセロール部分は体内でグルコースに変換することができる。この過程を通してグルコース依存組織（例えば中枢神経系や赤血球）の炭水化物必要量は満たされる。しかし、炭水化物を除去した食事ではケトーシス、組織蛋白の過剰異化、体液及び電解質の損失を生じる恐れがある。これらの影響は熱量摂取量が十分であるならば、食用炭水化物を毎日５０〜１００ｇ摂取することにより防ぐことができる。エネルギー必要量を満足しているならばＯｘｅｐａの炭水化物レベルは糖新生を最小にするにも十分である。
【０３３０】
蛋白質：
−Ｏｘｅｐａは８液量オンス缶当たり１４．８ｇ（６２．５ｇ／Ｌ）の蛋白質を含有している。
−総熱量対窒素比（１５０：１）はストレス負荷患者の必要量を満たす。
−Ｏｘｅｐａは呼吸問題を生じずに同化とやせ細った体格の維持を助長するために十分な蛋白を提供する。高蛋白摂取量は呼吸不全患者で問題となる。蛋白はＣＯ２生産に殆ど影響しないが、高蛋白食は換気欲求を増す。
−Ｏｘｅｐａの蛋白源はカゼイン酸ナトリウム８６．８％とカゼイン酸カルシウム１３．２％である。
−Ｏｘｅｐａの蛋白系のアミノ酸プロフィルは米国科学アカデミーにより設定された高品質蛋白標準を満たすか又はそれを上回る。
【０３３１】
＊Ｏｘｅｐａは無グルテンである。
【図面の簡単な説明】
【０３３２】
【図１】種々のＰＵＦＡの生産に至る生合成経路を示す模式図である。
【図２】新規ω３−脂肪酸デサチュラーゼをコードするＳ．ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）由来遺伝子ｓｄｄ１７のヌクレオチド配列（配列番号２５）。
【図３】図２に示すヌクレオチド配列によりコードされるω３−デサチュラーゼ（ＳＤＤ１７）のアミノ酸配列（配列番号２６）。
【図４】図３に示すＳＤＤ１７デサチュラーゼとＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種由来の公知Δ１５−デサチュラーゼ（ＳＹＣＤＥＳＢ）のアミノ酸配列比較。
【図５】図３に示すＳＤＤ１７デサチュラーゼとＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来の公知Δ１７−デサチュラーゼ（ＣＥＬＥＦＡＴ）のアミノ酸配列比較。
【図６】新規Δ１２−脂肪酸デサチュラーゼをコードするＳ．ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）由来遺伝子ｓｄｄ１２のヌクレオチド配列（配列番号４１）。
【図７】図６に示すヌクレオチド配列によりコードされるΔ１２−デサチュラーゼ（ＳＤＤ１２）のアミノ酸配列（配列番号４２）。
【図８】図７に示すＳＤＤ１２デサチュラーゼとＧ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ由来の公知Δ１２−デサチュラーゼ（ＧＨＯ６ＤＥＳ）のアミノ酸配列比較。
【図９Ａ】明細書を通じて使用する配列番号と対応するアミノ酸又はヌクレオチド配列のリストである。
【図９Ｂ】明細書を通じて使用する配列番号と対応するアミノ酸又はヌクレオチド配列のリストである。
【図９Ｃ】明細書を通じて使用する配列番号と対応するアミノ酸又はヌクレオチド配列のリストである。
【図９Ｄ】明細書を通じて使用する配列番号と対応するアミノ酸又はヌクレオチド配列のリストである。
【図９Ｅ】明細書を通じて使用する配列番号と対応するアミノ酸又はヌクレオチド配列のリストである。
【図９Ｆ】明細書を通じて使用する配列番号と対応するアミノ酸又はヌクレオチド配列のリストである。
【配列表】
2005515776.tif 000012
2005515776.tif 000013
2005515776.tif 000014
2005515776.tif 000015
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2005515776.tif 000023
2005515776.tif 000024
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2005515776.tif 000026
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2005515776.tif 000028
2005515776.tif 000029
2005515776.tif 000030
2005515776.tif 000031
2005515776.tif 000032
2005515776.tif 000033
2005515776.tif 000034
2005515776.tif 000035
2005515776.tif 000036
2005515776.tif 000037
2005515776.tif 000038
2005515776.tif 000039
【図１】
2005515776.tif 000040
【図２】
2005515776.tif 000041
【図３】
2005515776.tif 000042
【図４】
2005515776.tif 000043
【図５】
2005515776.tif 000044
【図６】
2005515776.tif 000045
【図７】
2005515776.tif 000046
【図８】
2005515776.tif 000047
【図９Ａ】
2005515776.tif 000048
【図９Ｂ】
2005515776.tif 000049
【図９Ｃ】
2005515776.tif 000050
【図９Ｄ】
2005515776.tif 000051
【図９Ｅ】
2005515776.tif 000052
【図９Ｆ】
2005515776.tif 000053
【国際調査報告】
2005515776.tif 000054
2005515776.tif 000055
2005515776.tif 000056