(57)【要約】本発明は、ＨＩＶまたはＨＣＶなどの慢性ウイルスによる感染を受けている動物およびヒトを治療するための新規の遺伝子療法に関する。これは、慢性的感染を予防するためにも用いられる。この療法は、慢性ウイルスの標的細胞のゲノムに安定的に一体化されたヌクレオチド構造を利用し、このヌクレオチド構造は、原位置でウイルスの複製を阻害する二重鎖ＲＮＡを形成可能な単一の転写物または複数の転写物を産生することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性ウイルスの標的細胞、または前記ウイルスの前記標的細胞を産生可能なその前駆細胞のゲノムに対して、ヌクレオチド構造を安定的に一体化させることによって、動物またはヒトの細胞における慢性ウイルスの複製を阻害する方法であって、ヌクレオチド構造は、ウイルスの複製に不可欠な、ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記安定的一体化は、前記標的細胞または前記前駆細胞に、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたは単純ヘルペスウイルスからなる群から選択されたウイルス由来のウイルスベクターを形質導入することによって達成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記安定的一体化は、前記標的細胞または前記前駆細胞に、レンチウイルスまたはアデノ関連ウイルス由来のウイルスベクターを形質導入することによって達成されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記前駆細胞は、幹細胞であることを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ヒト免疫不全ウイルスの複製を阻害する方法であって、
ａ）造血幹細胞、リンパ系幹細胞、およびＴヘルパーリンパ球からなる群から選択された細胞を、ヒトから単離するステップと、
ｂ）前記細胞のゲノムに対して、複製に不可欠なヒト免疫不全ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造を、安定的に一体化させるステップと、
ｃ）前記細胞が単離されたヒトに、前記細胞を再導入するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルスの複製を阻害する方法であって、
ａ）肝細胞、肝臓幹細胞、間葉系成体前駆細胞、間葉系幹細胞または造血幹細胞を、ヒトから単離するステップと、
ｂ）前記細胞に対して、Ｃ型肝炎ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造を導入するステップと、
ｃ）前記細胞が単離されたヒトの肝臓に、前記細胞を再導入するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
慢性ウイルスの標的細胞である動物またはヒトの細胞であって、これに対して、複製に不可欠な前記慢性ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な単一の転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造が導入され、前記ヌクレオチド構造は、前記動物またはヒト細胞のゲノムに対して安定的に一体化されることを特徴とする細胞。
【請求項８】
慢性ウイルスの標的細胞を産生可能な動物またはヒトの前駆細胞であって、これに対して、複製に不可欠なウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な単一の転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造が導入され、前記ヌクレオチド構造は、前記動物またはヒト前駆細胞のゲノムに対して安定的に一体化されることを特徴とする前駆細胞。
【請求項９】
ヒト造血もしくはリンパ系幹細胞またはＴヘルパーリンパ球であって、これに対して、複製に不可欠なヒト免疫不全ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列と相同な二重鎖ＲＮＡを産生することができるヌクレオチド構造が導入され、前記ヌクレオチド構造は、前記動物またはヒト細胞のゲノムに対して安定的に一体化されることを特徴とするヒト造血もしくはリンパ系幹細胞またはＴヘルパーリンパ球。
【請求項１０】
動物またはヒト細胞を感染させることができる慢性ウイルスの遺伝子または遺伝子の一部と相同な、少なくとも４０のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構造を含むウイルスベクターであって、前記ヌクレオチド配列は、逆方向反復としても存在し、または前記ヌクレオチド配列は、２つのプロモーターによってフランキングされ、ヌクレオチド構造は、転写されるとき、前記配列およびその逆方向反復から、または２つのプロモーターによってフランキングされた前記配列から、二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生し、前記ウイルスベクターはさらに、前記ヌクレオチド構造を前記動物またはヒト細胞のゲノムに対して、安定的に一体化させることができることを特徴とするウイルスベクター。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列およびその逆方向反復は、イントロンによって分離されることを特徴とする請求項１０記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
同一の遺伝子の異なる部分と相同な、または前記ウイルスの異なる遺伝子もしくはその部分と相同なヌクレオチド配列を示す、少なくとも４０ヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド構造は、逆方向反復としても存在し、または前記ヌクレオチド構造は、２つのプロモーターによってフランキングされることを特徴とする請求項１０または１１記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
前記ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノ関連ウイルス由来であることを特徴とする請求項１０〜１２のうちいずれか１項に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
動物またはヒト細胞における慢性ウイルスの複製を阻害するための、請求項１０〜１３のうちいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項１５】
必要とする対象の細胞における慢性ウイルスの感染を治療する方法であって、前記感染を受けている患者における前記細胞、または前記細胞を産生可能なその前駆細胞を、前記細胞または前記前駆細胞のゲノムに対してヌクレオチド構造を安定的に一体化させる、療法上有効な量の試薬に、接触させるステップを含み、ヌクレオチド構造は、前記ウイルスの複製に不可欠な、前記ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができることを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記慢性ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスであって、前記細胞は、造血幹細胞、リンパ系幹細胞またはＴヘルパーリンパ球であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記慢性ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスであって、前記細胞は、肝細胞、肝臓幹細胞、間葉系成体前駆細胞、間葉系幹細胞または造血幹細胞であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬は、請求項１０〜１３のうちいずれか１項に記載のウイルスベクターを含むことを特徴とする請求項１５〜１７記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬との前記接触の前に、前記細胞または前駆細胞は、前記患者から単離され、ここにおいて、前記細胞または前駆細胞は、その後、前記患者に再導入されることを特徴とする請求項１５〜１８のうちいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＨＩＶおよび肝炎ウイルスなどの慢性ウイルスに対する療法に関する。特に、本発明は、ウイルス複製を阻害するとともに、新しいウイルス粒子の形成を防止するための、新しい遺伝子技術を基礎とする療法に関する。
【０００２】
発明の背景
慢性ウイルスは、病徴が生じる前に、感染された個体において長期の潜伏期間を有するウイルスである。慢性ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含む。特に、ＨＩＶおよびＨＣＶは、主要な地球規模の健康関心事である。ＨＩＶに感染した患者は、やがて特定の時点で免疫応答を失い、致命的な後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の典型的な症状が現れるであろう。ＨＣＶは、慢性肝臓感染症の病原であり、相当な割合の感染された個体において、致命的な肝硬変または肝臓癌を発症させる。今までのところ、これらの慢性ウイルスを保有する患者を治療することはできない。現在の抗ＨＩＶ療法は、いわゆる高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）によって新しいウイルス粒子の形成を防止するためのプロテアーゼおよび逆転写酵素阻害剤の使用に基づく。しかしながら、ＨＡＡＲＴは高価であるので、最も感染された国々によって入手されることができない。これらの阻害剤は、多くのマイナスの健康効果を有し、患者は、生涯薬剤を使用しなければならない。ＨＣＶ感染は、現在、アルファ−インターフェロンのみによって、またはこれとリバビリンとを組み合わせて処置されるが、成功率は低い。さらに、両薬剤のコストは、非常に高い。
【０００３】
したがって、研究の大部分は、ワクチンの開発に専念される。しかしながら、ＨＩＶおよびＨＣＶゲノムの高い変異率と、上述の療法を回避するウイルス変異体の迅速な出現とに起因して、新規の療法が緊急に必要とされている。
【０００４】
ＨＩＶは、レトロウイルス科のレンチウイルス亜科に属する。ウイルス粒子は、ヌクレオキャプシドに対して蛋白質で包膜された２つのゲノム単鎖ＲＮＡ分子からなる。糖蛋白質の突起を有する脂質包膜が、ヌクレオキャプシドを取り囲む。ビリオンは、ｇｐ１２０とＣＤ４受容体との結合によって、特異的なリンパ系細胞に進入する。全ての造血細胞の成熟段階は、特異的なモノクローナル抗体（分化クラスタ（clusters of differentiation, ＣＤ´ｓ））によって認識される膜分子の発現によって区別される。したがって、ＣＤ４受容体で飾られたＴヘルパー細胞が、主要な標的である。しかしながら、多数のその他の細胞種、たとえば単球、マクロファージ、樹状細胞、特定のＢ細胞、および造血幹細胞（ＨＳＣ´ｓ）も、いくつかのＣＤ４を発現するとともに、結果としてＨＩＶに感染され得る。入口では、ヌクレオキャプシドが、逆転写酵素（ヌクレオキャプシド中に包含される。）がゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ複製を産生する細胞質中で放出される。逆転写酵素およびＲＮＡｓｅＨ（ヌクレオキャプシド中に含有される。）は、ゲノムＲＮＡを産生する線形２本鎖ＤＮＡ複製物を産生し、これらは、核に対して標的にされ、この核において、これらは、ヌクレオキャプシド中に包含されるウイルスインテグラーゼによって核ＤＮＡにプロウイルスＤＮＡとして一体化される。
【０００５】
プロウイルスゲノムは、長末端反復（ＬＴＲ´ｓ）によってフランキングされる。５´ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の転写に不可欠なエンハンサーおよびプロモーター配列を含有する。３´ＬＴＲは、ウイルス転写のポリアデニル化に必要とされるポリアデニル化シグナルを含有する。プロウイルスは、３つの構造遺伝子、すなわちヌクレオキャプシド蛋白質をコード化するｇａｇ、ウイルス酵素をコード化するｐｏｌ、および膜糖蛋白質をコード化するｅｎｖを含有する。成熟した蛋白質が、一次翻訳産生物の蛋白質分解切断後に、形成される。さらに、プロウイルスは、ビリオン感染力、ウイルス集合および放出、ウイルスｍＲＮＡ転座、ならびにゲノム活性化に関与する調節蛋白質をコード化する別の５つの遺伝子を有する。ｒｅｖ、ｔａｔおよびｎｅｆ調節蛋白質は、早期に複数スプライシングされたｍＲＮＡ分子によってコード化されるが、その一方で、構造蛋白質およびその他の非構造蛋白質は、晩期に単一スプライシング（ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕ）および非スプライシングされていない（ｐｏｌおよびｇａｇ）ｍＲＮＡ分子によってコード化される。
【０００６】
プロウイルスは、抗原結合によって、またはその他のウイルスの感染によって活性化される。プロウイルスの活性化は、ｔａｔおよびｒｅｖ蛋白質を含む定常領域蛋白質をコード化する遺伝子の発現を生じさせる。ｔａｔは、５´ＬＴＲプロモーターをさらに強化し、その一方で、ｒｅｖは、構造蛋白質およびウイルス酵素の発現を促進させるであろう。ウイルスヌクレオキャプシドは、細胞質中で形成され、最終的に、ウイルス粒子は、ウイルス感染されたＣＤ４細胞から出芽するであろう。この過程において、ウイルスは、Ｔヘルパー細胞を殺し、これらは、閾値よりも高いＣＤ４受容体レベルを有する。その他の感染された細胞タイプは、事実上そのままである。
【０００７】
したがって、ＨＩＶ感染は、やがて特定の時点で、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の減少を生じさせ、ＡＩＤＳの典型的な症状が現れるであろう。未感染のＣＤ４Ｔリンパ球は、新しい抗原に応答する能力を失う。一般的な抗原レベルは、減少するであろう。胸腺におけるＴリンパ球の成熟は、阻害されるであろう。サイトカイン不均衡は、多くの免疫学上の異常を生じさせるであろう。ＡＩＤＳ患者は、最終的に、進行性の病原体感染症および極度の疲労が原因で死亡するであろう。
【０００８】
ＨＣＶは、フラビウイルス科に属する。ウイルス粒子は、ヌクレオキャプシドに対してＣ蛋白質によって包膜されたプラス鎖ゲノムＲＮＡ分子からなる。糖蛋白質の突起を有する脂質包膜は、ヌクレオキャプシドを取り囲む。ＲＮＡ分子は、単一の大きいポリ蛋白質をコード化し、これは、ウイルスおよび細胞プロテアーゼによって、１０の異なる成熟ウイルス細胞に、共翻訳して、かつ翻訳後に、切断され、これらは、アミノ基部に位置する構造蛋白質（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７）と、カルボキシル基に位置する非構造蛋白質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂ）とを有する。Ｃコード化領域と重複するポリ蛋白質と異なる読み取り枠から、別の非構造蛋白質（ｐ１６）がコード化される。ウイルス粒子は、肝細胞およびリンパ系細胞に関して屈性を有する。入口では、ヌクレオキャプシドが、細胞質中で放出され、ゲノムＲＮＡ分子が直接的に翻訳される。ウイルス複製は、感染された細胞の細胞質中で生じる。感染された個体の大部分は、慢性的に感染されるに至り、しばしば慢性肝炎を示す。慢性ＨＣＶ感染の過程は、個体間で劇的に異なり得る。あるものは、極小の肝臓疾患を有し、合併症を発症しない。その他は、感染後長年して、深刻な、しばしば致命的な、肝硬変および／または肝細胞癌を発症させる。肝硬変は、一時的に、肝移植の主な適応症である。ＨＣＶは、慢性段階の期間中の感染細胞における非常に低い力価での存在と、極めて高いゲノム可変性とを、特徴とする。これらの特徴は、有効な抗ＨＣＶ療法の欠点に著しく寄与する。
【０００９】
遺伝子療法は、魅力的な新規の抗ＡＩＤＳ療法として考えられてきた（Romano et al., Stem Cells, 17: 191-202, 1999; Engel and Kohn, Front. Biosci. 4: 26-33, 1999; Buchsacher and Wong-Staal, Human Gene Therapy 12: 1013-1019, 2001）。現在まで、その他の慢性ウイルスによって引き起こされる疾患に対する遺伝子療法は、提案されることはなかった。
【００１０】
感染細胞を除去する、またはウイルス複製によって干渉するための、ＨＩＶ感染に関する遺伝子療法に対しては、２つの一般的なアプローチが存在する。第１のアプローチは、ＨＩＶに対する患者の免疫応答を上昇させる試みと、ＨＩＶ感染細胞において毒素を発現する試みとを含む。報告された第２のアプローチは、現在のところ、主要な陰性ウイルス蛋白質のトランスジェニック発現（米国特許第５，９０８，９２３）と、標的ヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ（Singwi and Joshi, Front. Biosci. 5: 556-579, 2001; Singwi et al., Gene Therapy 6: 913-921, 1999）と、細胞内抗体（Marasco et al., Human Gene Therapy 9: 1627-1642, 1998; Mhasshilkar et al., Human Gene Therapy 10: 1453-1467, 1999）と、センスデコイＲＮＡ分子（Rosenzweig et al., J. of Virol.71: 2740-2746, 1997; Kohn et al., Blood 94: 368-371, 1999）、アンチセンスＲＮＡ分子（国際公開第９４／１６０６６号，ドイツ特許第４２２５０９４号，欧州特許第０３８６５６３号，Veres et al., J. of Virology 72: 1894-1901, 1998）およびＨＩＶ特異的リボザイム（国際公開第９４／２６８７７号，Rigden et al., Curr. Issues Mol. Biol. 2: 61-69, 2000）のような干渉ＲＮＡ分子（Lamothe and Joshi, Front. Biosci. 5: 527-555, 2000）とを含む。現在までのところ、患者の血液サンプルから単離した（ＨＩＶ感染）ヒト細胞系またはＣＤ３４＋３８細胞を用いて、in vitro実験しか実行されたことがなかった。今日、細胞中での遺伝子発現が、発現が阻害されるべき遺伝子の一部と一致するヌクレオチド配列を有する二重ＲＮＡ（たとえば短いＲＮＡｉ）を細胞に導入することによって阻害され得ることが確立された（たとえば、国際出願第９９／３２６１９号、および国際出願第９９／５３０５０号）。このような二重鎖ＲＮＡ分子は、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の細胞への導入によってin vivoで（すなわち細胞中で）産生され得るか（国際出願第００／６３３６４）、または内生のテンプレートから誘導され得るかいずれかである（国際出願第０１／３６６４６号）。
【００１１】
類似のアプローチが、植物などの他の生物系においてウイルス耐性を与えるために用いられた。植物において、リボザイム、アンチセンスおよびセンスデコイＲＮＡは、比較的低いレベルでウイルス耐性を与え、および／または、非能率的に、たとえば低い割合の形質転換された細胞（植物）のみが、所望の表現型を示す。これらの実験から、これらの分子によって与えられたＨＩＶ複製の阻害のレベルが低すぎて、潜伏段階においてＨＩＶプロウイルスＤＮＡ分子を完全に維持できないことが推論され得る。さらに、娘細胞に対する阻害二重鎖ＲＮＡ産生物の転写は生じるけれども、前述の方法による特異的な遺伝子の発現の阻害は、一時的な現象のままである。その結果、慢性ウイルスによる感染の場合、先行技術の方法は、効果的な療法上の処置をもたらさない。ビリオンは、娘細胞が効果的に防御されないので、阻害が減退するとすぐに結局再出現し、あるいは再活性化するであろう。
【００１２】
したがって、より頑強で、かつ効果的な、ＨＩＶの複製、およびＨＣＶを含むその他の慢性ウイルスの複製を阻害するための遺伝子療法が今もなお必要とされている。
【００１３】
発明の要約
本発明は、ヌクレオチド構造を、慢性ウイルスの標的細胞のゲノム、または前記ウイルスの前記標的細胞を産生可能なその前駆細胞のゲノムに対して安定的に一体化させることによって、動物またはヒトの細胞における慢性ウイルスの複製を阻害するための方法を提供し、ヌクレオチド構造は、ウイルスの複製に不可欠な、ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができる。したがって、本発明の実施形態はまた、前駆細胞（すなわち、造血幹細胞、リンパ系幹細胞またはＴヘルパー細胞（ナイーブ細胞およびメモリ細胞を含む。））がヌクレオチド構造を備えること、および前記前駆細胞が、ウイルスの標的細胞を産生することができる方法を含む。
【００１４】
ＨＩＶに限定される場合において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス複製を阻害する方法を提供し、この方法は、
ａ）造血幹細胞、リンパ系幹細胞およびＴヘルパーリンパ球からなる群から選択された細胞を、ヒトから単離するステップと、
ｂ）前記細胞のゲノムに対して、複製に不可欠な、ヒト免疫不全ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造を安定的に一体化させるステップと、
ｃ）前記細胞を単離したヒトに、前記細胞を再導入するステップとを含む。
【００１５】
代替的に、複製に不可欠なヒト免疫不全ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造は、ヒトから前記細胞を単離かつ再導入することなく、原位置で前記ヌクレオチド構造を導入することによって、前駆細胞に安定的に一体化される。
【００１６】
ＨＣＶに限定される場合において、本発明は、ＨＣＶ複製を阻害する方法を提供し、この方法は、
ａ）肝細胞、肝臓幹細胞、間葉系成体前駆細胞、間葉系幹細胞、または造血幹細胞を、ヒトから単離するステップと、
ｂ）前記細胞に対して、Ｃ型肝炎ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造を導入するステップと、
ｃ）前記細胞を単離されたヒトの肝臓に、前記細胞を再導入するステップとを含む。
【００１７】
さらに、本発明は、慢性ウイルスの標的細胞である動物またはヒト細胞を提供し、この細胞に対してヌクレオチド構造が導入され、このヌクレオチド構造は、前記細胞のゲノムに対して安定的に一体化されるとともに、複製に不可欠な、前記ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができることを特徴とする。
【００１８】
代替的に、慢性ウイルスの標的細胞を産生することができる動物またはヒトの前駆細胞が提供され、前記前駆細胞に対してヌクレオチド構造が導入され、このヌクレオチド構造は、前記前駆細胞のゲノムに対して安定的に一体化されるとともに、複製に不可欠な、前記慢性ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列に対してヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができることを特徴とする。
【００１９】
より具体的には、このような標的細胞は、ヒト造血幹細胞、リンパ球系幹細胞、またはＴヘルパーリンパ球（ナイーブもしくはメモリ細胞を含む。）であり、またはこのような標的細胞は、肝細胞、肝臓幹細胞、間葉系成体前駆細胞、または間葉系幹細胞であり、ヌクレオチド構造は、これらの細胞に対して導入され、前記細胞のゲノムに安定的に一体化されるとともに、複製に不可欠な、ヒト免疫不全ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のあるｄｓＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の一部は、動物またはヒトの細胞を感染することができる慢性ウイルスの遺伝子または遺伝子の一部とヌクレオチド配列相同性のある、少なくとも４０のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構造であって、ここにおいて、前記ヌクレオチド配列は、逆方向反復としても存在し、または前記ヌクレオチド配列は、２つのプロモーターによってフランキングされ、前記構造は、前記細胞のゲノムに対して安定的に一体化されることができるとともに、転写されるときに、前記配列およびそれの逆方向反復から、または２つのプロモーターによってフランキングされた前記配列から、ｄｓＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生する。好ましくは、このようなヌクレオチド構造において、ヌクレオチド配列およびそれの逆方向反復は、イントロンによって分離される。本発明の別の実施形態において、このようなヌクレオチド構造は、同一の遺伝子の異なる部分と、または前記ウイルスの異なる遺伝子またはその一部と相同な、少なくとも４０ヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列を含み、ここにおいて、前記ヌクレオチド構造は、逆方向反復としても存在し、または前記ヌクレオチド構造は、２つのプロモーターによってフランキングされる。
【００２１】
別の局面において、本発明は、慢性ウイルスの標的細胞である動物もしくはヒトの細胞またはその前駆細胞を産生する方法を提供し、前記方法は、動物もしくはヒトの細胞またはその前駆細胞を供給するステップと、前記供給された細胞のゲノムに対して、複製に不可欠な、前記ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造を安定的に一体化させるステップとを含む。
【００２２】
別の局面において、本発明は、必要とする対象の細胞における慢性ウイルスの感染を治療する方法を提供し、前記方法は、前記感染を受けている患者における前記細胞、または前記細胞を産生可能なその前駆細胞を、前記細胞または前記前駆細胞のゲノムに対してヌクレオチド構造を安定的に一体化させる療法上有効な量の試薬に、接触させるステップを含み、前記ヌクレオチド構造は、前記ウイルスの複製に不可欠な、前記ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができる。
【００２３】
この局面の１つの実施形態において、本発明は、前記慢性ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスであり、かつ前記細胞は、造血幹細胞、リンパ球形幹細胞またはＴヘルパーリンパ球であることを特徴とする方法を提供する。
【００２４】
この局面のさらに別の実施形態において、本発明は、前記慢性ウイルスがＣ型肝炎ウイルスであり、前記細胞が、肝細胞、肝臓幹細胞、間葉系成体前駆細胞、間葉系幹細胞または造血幹細胞である前記方法を提供する。
【００２５】
必要とする対象の細胞における慢性ウイルスの感染を治療する方法に関する１つの実施形態において、本発明は、前記試薬が本発明に従ったウイルスベクターを含む前記方法を提供する。
【００２６】
本発明に従った慢性ウイルスの感染を治療する方法は、種々の方法で実行され得る。たとえば、感染された細胞またはその前駆細胞を前記試薬に接触させる前に、細胞または前駆細胞を、前記患者から単離してもよく、その後、形質導入された細胞または前駆細胞を、前記患者に対して再導入する。
【００２７】
発明の詳細な説明
ここで用いる用語「幹細胞」は、体内の全ての特殊化した細胞の前躯体である細胞を示し、これは、骨髄中に存在し、かつ種々の血液および免疫系細胞を連続的に産生する血液幹細胞（造血細胞）と、新しい骨、軟骨および結合組織細胞の源である間葉系幹細胞と、種々の神経系組織を産生する神経系幹細胞とを含む。これらの全ての比較的特殊化した幹細胞の前駆体は、「多能性幹細胞（pluripotential stem cell, ＰＳＣ）」であり、これは、非対称の分裂によって分類する（すなわち、分裂の結果、１つの分化した娘細胞と１つの未分化の幹細胞とが生じる。）。比較的特殊化した幹細胞は、「多能性幹細胞(multipotential stem cells)」リンパ系前駆細胞および骨髄系前駆細胞を含む。リンパ系前駆細胞（幹細胞）は、前Ｂ細胞（Ｂリンパ球、たとえばプラズマ細胞およびメモリ細胞を生じさせる。）、および前Ｔ細胞（Ｔリンパ球（Ｔヘルパー細胞、細胞障害性Ｔ細胞、サプレッサＴ細胞、および大抵、ＮＫ細胞を含む。）を生じさせる。）を含む。骨髄系前駆細胞（幹細胞）は、ＧＭ幹細胞（顆粒球、単球、およびマクロファージを生じさせる。）、好酸球系幹細胞（好酸球の顆粒球を生じさせる。）、巨核球系幹細胞（血小板）および赤血球系幹細胞（網状赤血球および赤血球）を含む。その他の比較的特殊化した幹細胞は、分化した娘細胞、たとえば内皮前駆細胞、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、膵臓前駆細胞、造血前駆細胞、グリア前駆細胞、または肝細胞前駆細胞を生じさせる細胞である。
【００２８】
ここで用いる用語「前駆細胞」は、細胞分裂によって生じ、かつ多能性およびその他の幹細胞ならびにいくつかの特殊化した細胞を含む娘細胞の、直系の前駆体である細胞を示す。したがって、Ｔリンパ球の前駆細胞は、幹細胞の他に、ナイーブＴリンパ球もしくはメモリＴリンパ球、もしくはあらゆるＴリンパ球、または娘Ｔリンパ球を産生するあらゆる細胞であってもよい。
【００２９】
ここで用いる用語「安定的一体化」または「安定的に一体化される」は、宿主細胞のゲノムに対して、核酸構造を、長期に、または永久に組み込むことと定義され、かかる構造は、これに接触するに至った後、たとえば後述するようなベクターまたはその他の運搬系を用いることによって、導入される。このような組み込みは、相同組換えの結果であり、細胞分裂によって生じる全ての娘細胞に染色体組み込みされた構造を増殖する細胞を生じさせる。
【００３０】
ここで用いる用語「ヌクレオチド配列相同性」は、２つのポリヌクレオチドの間に相同性が存在することを示す。ポリヌクレオチドは、最大限に対応付けて並べたとき、２つの配列のヌクレオチド配列が同一である場合に、「相同な」配列を有する。２または複数のポリヌクレオチド間の配列比較は、一般的に、類似配列の局所領域を同定かつ比較するために、比較領域(comparison window)に渡って、２つの配列の部分を比較することによって実行される。比較領域は、一般的に、約２０〜２００の隣接するヌクレオチドである。ポリヌクレオチドに関する「配列相同性の割合」、たとえば、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９または１００パーセント配列相同性は、比較領域に渡って、２つの好ましく整列された配列を比較することによって実行されてもよく、ここにおいて、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の好ましい整列に関する（追加または削除を含まない）対照配列と比較して、追加または削除（すなわちギャップ）を含み得る。この割合は、次のようにして算定される。（ａ）両配列において同一の核酸基が生じる位置の数を決定し、適合する位置の数を得る。（ｂ）適合する位置の数を、比較領域における位置の全数で除算する。（ｃ）その結果を１００倍して、配列相同性の割合を得る。比較のための配列の好ましい整列は、既知のアルゴリズムのコンピュータ化された実施によって、あるいは検査によって行われてもよい。容易に利用可能な配列比較および複数配列整列アルゴリズムは、それぞれ、インターネットでともに利用可能なＢＬＡＳＴ（the Basic Local Alignment Search Tool）（Altschul, S.F. et al. 1990. J. Mol. Biol. 215: 403; Altschul, S.F. et al 1997. Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402）およびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。その他の適切なプログラムは、ウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージ（ジェネティクスコンピュータグループ(Genetics Computer Group)（ＧＣＧ）社製，マディソン，ＷＩ，米国）における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、およびＦＡＳＴＡを含む。
【００３１】
慢性ウイルスの複製の阻害は、ｄｓＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を転写において形成可能なヌクレオチド構造を導入することによって、遺伝子発現の配列特異的な阻害を産生する方法によって得られる。ヒトまたは動物細胞において相同なウイルス遺伝子の発現を阻害するプロセスが供給され、この遺伝子は、ウイルスの標的であるか、またはウイルスの標的細胞を産生することができる。このプロセスは、複製に不可欠であって、部分的にまたは完全に二重鎖であるＲＮＡ分子を形成し得る、ウイルスの配列と相同なヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構造の導入を含む。このようなヌクレオチド構造は、標的細胞に存在するとき、ＲＮＡサイレンシングと称されるプロセスにおいて（Ding S.W. 2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11: 152-156）、配列特異的な方法で相同なウイルス遺伝子の発現を阻害する。遺伝子発現の阻害は、相同なウイルス遺伝子からの蛋白質および／またはｍＲＮＡ産生物のレベルでの不存在（可観察な減少）を示す。特異性は、細胞の他の遺伝子に明白な影響なしに標的遺伝子を阻害する能力を示す。
【００３２】
一般的に、ウイルスの全ての遺伝子は、そのウイルスに不可欠である。しかしながら、ウイルス標的遺伝子のｄｓＲＮＡを用いたＲＮＡサイレンシングによる阻害は、ウイルス複製の阻害にしばしば不十分である。もし、ウイルスが、標的細胞を必要とする前に、宿主ＲＮＡサイレンシングを克服し、回避し、またはこれに負担をかけることができる場合、ウイルス複製は阻害されない。したがって、ウイルスが宿主ＲＮＡサイレンシングを克服し、回避し、またはこれに負担をかけることができる前に必要とされるウイルス標的遺伝子のみが、ウイルス複製に不可欠と考えられる。好ましくは、早期のウイルス遺伝子が、ウイルス複製を防止するために標的とされる。
【００３３】
阻害のために好適なものは、ウイルス遺伝子の部分と同一のヌクレオチド配列を含有するＲＮＡを形成することができるヌクレオチド構造である。また、標的ウイルス配列に関連する（すなわちウイルス配列と同一ではないが相同な）、挿入、除去および一点突然変異によるＲＮＡ配列は、阻害に効果的であることが発見された。これは、ウイルスがゲノム変異する傾向のある状況において、特に有益である。たとえウイルスのゲノム配列が変異を示したとしても、ヌクレオチド構造の阻害効果に適する。配列同一性は、本技術分野において知られている配列比較および整列アルゴリズム（Gribskov, M. and J. Devereux (Eds.), Sequence Analysis Primer, Stockton Press, New York, 1991、およびここで引用される文献を参照のこと）によって最適化され、ヌクレオチド配列間の相違の割合を、たとえば、初期パラメータを用いるＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムにおいて実行されるSmith-Watermanアルゴリズム（たとえば、ウィスコンシンコンピューティンググループ大学）を用いることによって、算定する。阻害ヌクレオチド配列と標的ウイルス遺伝子の部分との間において、９０％よりも高い配列同一性、または１００％の配列同一性が好ましい。代替的に、ヌクレオチド構造によってコード化されるＲＮＡ転写物の二重鎖領域は、変性において標的遺伝子転写物の部分とのハイブリダイゼーション（たとえば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０〜６５℃の温度の条件下で、１２〜１６時間のハイブリダイゼーション、その後洗浄）を可能とする（二重鎖）ヌクレオチド配列として機能的に定義され得る。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも４０のヌクレオチドでなければならず、好ましくは、より長い、たとえば５０、１００、２００、３００または４００のヌクレオチドである。ここで開示されるように、阻害ヌクレオチド構造と標的内生遺伝子との間における１００％の配列同一性は、本発明を実施するのに必要とされず、標的ウイルス配列がウイルスのゲノム変異に起因して変化する事象において得るのは難しい。したがって、本発明は、遺伝子変異、株多型または進化分岐に起因して予期され得る配列変異を許容することができるという好都合を有する。本発明において用いられるｄｓＲＮＡと、ウイルスの複製に不可欠であって、阻害されるべきウイルスの１または複数のヌクレオチド配列との間における配列相同性は、適切には８０％よりも高く、好ましくは９０％よりも高く、より好ましくは９５％よりも高く、さらに好ましくは、９８％よりも高く、かつもっとも好ましくは９９％よりも高い。
【００３４】
発現ＤＮＡ構造からの転写のために（トランスジェニックin vivo転写のために）、定常領域、たとえばプロモーター領域、エンハンサー領域、スプライスドナー領域、およびアクセプター領域、またはポリアデニル化領域が、ＤＮＡを転写するために用いられ得る。ＲＮＡ鎖は、ポリアデニル化されるかもしれないし、されないかもしれず、また、ＲＮＡ鎖は、細胞の翻訳装置によってポリペプチドに翻訳されることができるかもしれないし、できないかもしれない。好ましくは、これらの構造は、ポリペプチドに翻訳されない。発現構造の使用および産生は、本技術分野において知られている（国際公開第９７／３２０１６号、米国特許第５，５９３，８７４号、米国特許第５，６９８，４２５号、米国特許第５，７１２，１３５号、米国特許第５，７８９，２１４号、および米国特許第５，８０４，６９３号）。
【００３５】
本発明に従ったヌクレオチド構造は、標的細胞またはその前駆細胞の染色体ＤＮＡに対して、安定的に一体化される。このような安定的一体化は、いくつかの方法のうちの１つによって得られる。たとえば、核酸を細胞に導入する物理的な方法が用いられ得る。このような方法は、裸のＤＮＡ転移(naked DNA transfer)と称され、ヌクレオチド構造を含有する溶液の注入、ヌクレオチド構造を含有する溶液に細胞を浸すこと、またはヌクレオチド構造の存在下での細胞膜の電気穿孔を含む。裸のＤＮＡ転移に関して本技術分野において知られているその他の方法が用いられてもよく、たとえば、脂質仲介担体輸送、リン酸カルシウム法およびその類似方法のような化学的な仲介輸送が用いられる。裸のＤＮＡ転移によって、ヌクレオチド構造を、標的細胞またはその前駆細胞のゲノム中の特定部位に挿入することが可能である。これは、好ましくは非コーディングのヒト配列と相同な部分間でヌクレオチド構造を操作することによってなされる。このヌクレオチド配列は、その後、相同的組換えによってゲノム中の特定部位に挿入されるであろう。この機構を用いて、高度に転写され、かつ通常の細胞機能を妨害しないスポットにおいて、ヌクレオチド配列を挿入することができる。フランキング配列の長さおよび相同性が大きいほど、相同的組換えの対象とされた部位の有効性は高くなる。
【００３６】
代替的な運搬系は、リポソームの使用を含み、ここにおいて、ヌクレオチド構造は、カチオン両親媒性化合物で捕捉または包膜され、これに複合される。
【００３７】
標的細胞またはその前駆細胞においてヌクレオチド構造を導入するための好適な方法は、ウイルスベクター系の使用を含む。このために、ヌクレオチド構造は、ウイルスベクターＤＮＡ分子に対して操作され、ウイルス粒子中にパッケージングされる。ウイルス粒子は、その後、標的細胞またはその前駆細胞に対するヌクレオチド構造の効果的な導入を達成する。適切なウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、または単純ヘルペスウイルスなどのウイルスを含み、これらは、複製を不完全にされ、すなわち複製に不可欠なウイルスの遺伝子が除去される。
【００３８】
宿主細胞ＤＮＡに対する安定的一体化は、レトロウイルスの自然の特性であり、したがって、これらのベクターによって導入される遺伝子は、細胞の生命のために維持され得る。さらに、ベクターは、細胞分裂の結果生じる全ての娘細胞に存在するであろう。適切なレトロウイルスは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）を含む。ＭＬＶなどのウイルスを用いる利点は、このようなウイルスに対する免疫原性が先に存在しないこと、ウイルス遺伝子産生物に対する免疫応答が存在しないこと、およびビリオンが比較的容易に産生されることである。しかしながら、ウイルスは、感染のために分裂細胞を必要とし、宿主細胞ゲノムに対してランダムに一体化されることができ、これは、挿入突然変異によって潜在的な腫瘍形成を生じさせる。また、ＬＴＲｓは遺伝子発現に干渉し得ることが知られている。
【００３９】
適切なレンチウイルスは、ウシ免疫不全ウイルスおよびジェムブラナ病ウイルス(Jembrana disease virus)などのウシレンチウイルスと、ウマ伝染性貧血ウイルスなどのウマレンチウイルスと、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ヒョウレンチウイルスおよびピューマレンチウイルスなどのネコレンチウイルスと、ブラジルヤギレンチウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ヤギレンチウイルス、マエディビスナウイルス、ヒツジレンチウイルスおよびビスナウイルスなどのヒツジ／ヤギレンチウイルスと、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などのウイルスを含む霊長類レンチウイルス群とを含む。レンチウイルスの使用の利点は、分裂細胞が必要とされないこと、したがってこれらは非分裂細胞（たとえばメモリＴリンパ球、造血幹細胞、ニューロン）を形質導入するためにin vivo用途で用いられ得ることである。
【００４０】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、非分裂細胞を迅速に感染させるとともに、宿主細胞ゲノムに対して部位特異的な一体化を受け、結果として長期の形質導入を生じさせることから、好都合である。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、広い宿主範囲を有する非病原性の依存性パルボウイルスであり、宿主細胞ゲノムに対する、高いレベルの形質導入および安定的一体化を可能とする。
【００４１】
前述の運搬系は全て、宿主細胞ゲノムにおける安定的一体化が達成されるという条件で、本発明の方法において用いることができる。
【００４２】
より好ましくは、レンチウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、またはアデノウイルス−ＡＡＶハイブリッドベクターなどの組合せ由来のウイルスベクターが用いられる。ウイルスベクターを構築するとともに、ウイルス粒子にこれらをパッケージングする方法は、本技術分野における当業者によって知られている。
【００４３】
形質導入またはトランスフェクションされるべき標的細胞は、好ましくはウイルス感染の対象となる細胞である。もちろん、これらの細胞を形質導入するために用いられるウイルスは、これらの細胞を感染することができなければならない。レンチウイルスは、Ｔリンパ球を含むＣＤ４受容体を保有する細胞に感染することで知られており、原位置でＨＩＶ標的細胞を形質導入するのに適している。ＡＡＶ２型は、肝細胞を感染させ、したがって原位置で肝細胞を形質導入するのに適している。
【００４４】
代替的に、ウイルス攻撃の標的となる細胞を産生する幹細胞また前駆細胞が、本発明の方法において形質導入のために用いられる。ＨＩＶの場合において、造血またはリンパ系幹細胞、またはメモリもしくはナイーブＴヘルパーリンパ球が適している。ＨＣＶの場合において、肝臓幹細胞もしくは造血幹細胞、または間葉系幹細胞もしくは間葉系成体前駆細胞が適している。
【００４５】
多能性造血幹細胞は、幼体および成体の骨髄内の造血組織に存在する。約２０００個の細胞のうち１つが幹細胞である。この幹細胞は分裂し、骨髄系幹細胞またはリンパ系幹細胞のいずれかに対して分化し、そこから、成熟した血液および免疫系細胞に分化する。
【００４６】
骨髄系幹細胞は、顆粒球、肥満細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、赤血球および巨核球の前駆体である。赤血球(erythrocytes)は赤血球(red blood cells)になり、巨核球は血小板に変化する。一斉に、骨髄系幹細胞は、血液組織を形成し、いくつかの細胞タイプは、免疫の役割を果たす。たとえば、単球およびマクロファージは、リンパ球に対するファゴサイトーシスおよび抗原提示に重要な役割を果たす。顆粒球はまた、ファゴサイトーシス（好中球，好酸球）を示し、またはこれらは、抗菌化合物（好塩基球）を放出する。肥満細胞はまた、感染の部位において薬理学上活性のある化合物を放出する。樹状細胞は、Ｔリンパ球に対する抗原提示の重要な役割を果たす。
【００４７】
リンパ系幹細胞は、骨髄においてＢリンパ球に分化する。Ｂリンパ球は、抗原産生細胞であり、体液性防御応答の役割を果たす。骨髄において、Ｂ細胞は、免疫グロブリン遺伝子配列の規則正しい配列を受け、これらは抗原非依存的である。膜結合ＩｇＭおよびＩｇＤ分子を発現する成熟ナイーブＢ細胞は、骨髄を離れ、２次的なリンパ系組織に移動する。抗原との相互作用は、直接的に、または抗原提示細胞を介して、特異的なサイトカインによって仲介されたプロセスにおいて感染したＢ細胞のクローン選択を誘導し、このサイトカインは、活性化されたＴリンパ球（エフェクター細胞）によって分泌される。Ｂ細胞は、分裂かつ分化して、短命のプラズマ細胞または長命のメモリ細胞の集団を産生し、これらは、特異的な免疫グロブリンを分泌する。
【００４８】
リンパ系幹細胞はまた、骨髄から胸腺に移動し、ここでこれらは、Ｔリンパ球および（ナチュラルキラー）ＮＫリンパ球に分化する。胸腺成熟Ｔリンパ球およびＮＫ細胞は、末梢組織に活発に分散する。ＴおよびＮＫリンパ球は、細胞防御応答を担う。Ｔリンパ球は、抗原を認識し、これは、抗原提示細胞、癌細胞、ウイルス感染細胞または移植片の表面上でＭＨＣ分子とともに存在しなければならない。
【００４９】
ＣＤ４受容体を保有するＴリンパ球の亜母集団は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と関連する抗原を認識し、一般的には、Ｔヘルパー細胞として機能する。ナイーブＴヘルパーリンパ球は抗原認識によって活性化されるとともに、メモリおよびエフェクターＴヘルパーリンパ球を形成する。Ｔヘルパーリンパ球の活性化は、細胞分裂を生じさせるとともに、エフェクター細胞のクローンを生じさせる。このエフェクター細胞は、特異的なセットのサイトカインを分泌し、成熟Ｂリンパ球またはＴ細胞障害性リンパ球のような、メモリを産生する特異的な応答に関与する細胞、ならびにＮＫリンパ球、単球およびマクロファージのような、非特異的応答に関与するその他の細胞の活性化において、中心的な役割を果たす。
【００５０】
ＣＤ８を保有するＴリンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原を認識するとともに、Ｔ細胞障害性細胞として機能する。Ｔ細胞障害性リンパ球による抗原結合の後、Ｔヘルパーリンパ球によって産生されたＩＬ−２のようなサイトカインは、Ｔ細胞障害性リンパ球の、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ´ｓ）およびメモリＴ細胞障害性リンパ球への増殖および分化を誘導し、これらは、対応する抗原を保有する細胞の劣化を担う。
【００５１】
造血幹細胞の他、間葉系幹細胞および間葉系成体前駆細胞は、骨髄中に存在する。全てのこれらの幹細胞は、肝細胞に対して分化転換可能なようである。
【００５２】
したがって、本発明に従ったヌクレオチド構造の導入のために造血幹細胞を用いるとき、前記幹細胞由来の全ての細胞は、これらのゲノムにおいてヌクレオチド構造を有し、これらの細胞は、ＨＩＶ複製およびＨＩＶ粒子の更なる蔓延を遮断するであろう。また、これらは、ウイルス粒子の突発によって殺されず、したがって、ＡＩＤＳの症状は現れないであろう。成熟した白血球に関する１００日の平均寿命によって、比較的短い期間内に、全ての感染された、かつ未防御の細胞が、血流から消失し、一方で、これらは、トランスジェニック幹細胞から形成された細胞と置換される。もし、これらのトランスジェニック細胞において、プロウイルスが活性化するとともに、プロウイルスＤＮＡの転写物から遺伝子産生物の産生を開始すれば、ｄｓＲＮＡに折り込み可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができる本発明のヌクレオチド構造物は、細胞内および細胞質機構を誘導し、ここにおいて、相同なウイルスＲＮＡ分子は、ＲＮＡサイレンシングと称されるプロセスにおいて、特異的に低下する。続いて、ウイルス複製に不可欠な、１または複数のウイルス遺伝子の発現は阻害され、ウイルス粒子の再産生および粒子の最終突発はこれ以上生じないであろう。さらに、これらの細胞における本発明のヌクレオチド構造の存在は、細胞の通常の機能を低下させない。
【００５３】
Ｂリンパ球において潜伏形態で発生するＫＳＨＶおよびＥＢＶの治療のために、前記ウイルスの複製を阻害可能なｄｓＲＮＡを発現するヌクレオチド構造が、多能性造血幹細胞に対して導入される。
【００５４】
Ｃ型肝炎ウイルスは、肝臓の細胞に感染し、かつ在住するに至る。さらに、ＨＣＶはまた、特異的な血球において潜伏状態で在住するようである。ＨＣＶに関して、標的細胞は、肝細胞を意味する。これらの肝細胞の前駆細胞は、多能性肝臓幹細胞、または代替的には、間葉性幹細胞、間葉性成年前駆細胞もしくは造血幹細胞である。もちろん、ヌクレオチド構造を、これらの前駆細胞において、造血幹細胞についてここで記載されたものと同様に、導入することができる。本発明に従ったヌクレオチド構造の導入のために、およびヒトの肝臓に対して前記細胞を導入した後、前駆細胞を使用するとき、前記前駆細胞由来の全ての肝細胞は、これらのゲノムにおいてヌクレオチド構造を運び、これらの細胞は、ＨＣＶ複製およびＨＣＶ粒子のさらなる蔓延における障害の障害を引き起こすであろう。
【００５５】
ヒト造血幹細胞の形質導入は、本技術分野において知られている。Chatterjee et al. (Blood, 93: 1882-1894, 1999)は、ＡＡＶを用いるヒト骨髄系前駆細胞の形質導入のための機構を述べる。ＡＡＶは、パリンドローム逆繰返し配列を有する４．７ｋｂのＤＮＡゲノムを有する、単鎖の複製欠損性の非病原性ヒトパルボウイルスである。野生型ＡＡＶは、感染の成功のために、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ヘルパーウイルス共感染の不存在下において、ＡＡＶは、ヒト染色体１９のＡＡＶＳ１部位に対して、逆繰返し配列を介して一体化される。Ｐ５プロモーター領域を欠失したＡＡＶベクターは、ＡＡＶＳ１以外の染色体部位に一体化する。ＡＡＶベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩ依存性プロモーターからの有効な導入遺伝子発現を可能とする。Chatterjee et al.によるこの結果は、初期の骨髄赤血球前駆細胞が、ＡＡＶベクターによって遺伝子修飾に修正可能であることを示す。
【００５６】
ＡＡＶの他、レンチウイルスベクターおよびあまり伸張しないレトロウイルスベクターが、造血幹細胞の形質導入に有効である（Logan et al., Current Opinion in Biotechnology 2002, 13: 429-436）。
【００５７】
本発明のヌクレオチド構造による阻害の対象となるウイルスの標的遺伝子は、好ましくは、ウイルスの複製に不可欠な遺伝子である。ＨＩＶの場合、このような遺伝子は、ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ遺伝子である。ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ調節遺伝子は、ここからｔａｔおよびｒｅｖは、重複コード化ドメインを有するが、ウイルス構造蛋白質およびゲノムＲＮＡsのプロウイルス活性化および蓄積に不可欠である。ｔａｔ、ｒｅｖおよびｎｅｆ遺伝子は、早期の複数スプライシングｍＲＮＡ分子によってコード化される。ヌクレオチド構造における配列は、単一のＨＩＶ遺伝子、または複数のＨＩＶ遺伝子に由来し得る。単一の遺伝子しか有しないＨＣＶの場合において、標的の配列は、ウイルスゲノムのあらゆる部分にもなり得る。
【００５８】
ｄｓＲＮＡを形成可能な単一の転写物または複数の転写物の産生を達成するために、導入遺伝子カセット(transgene cassette)とも称されるヌクレオチドＤＮＡ構造は、好ましくは、逆極性のセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列の両方を含み（すなわち、アンチセンス配列は、センス配列の逆方向の相補体であるので。）、ここにおいて、センスおよびアンチセンス配列はともに、少なくとも４０のヌクレオチドの長さを有する。さらに、標的細胞において遺伝子発現を効果的に阻害する転写物を供給するために、導入遺伝子カセットのセンスまたはアンチセンス鎖のいずれかが、前記標的細胞の前記遺伝子、好ましくは標的ウイルス遺伝子と相補的であり、または相同なヌクレオチド配列を阻害する。４０のヌクレオチドの長さは、ｄｓＲＮＡが標的遺伝子発現を効果的に遮断するのに最低限必要なように記載された。したがって、標的細胞ゲノムに対して安定的に一体化され、遺伝子サイレンシングｄｓＲＮＡが転写されるＤＮＡ構造は、少なくとも約８０のヌクレオチドを含まなければならない。好ましくは、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００のヌクレオチドの長さを有する、より長く伸張したＤＮＡは、導入遺伝子カセットにおいて用いられなければならない。
【００５９】
宿主細胞ゲノムに安定的に一体化されるヌクレオチド構造から転写されたＲＮＡは、ｄｓＲＮＡまたはＲＮＡ二重鎖を形成しなければならない。したがって、適切には、ＲＮＡは、逆方向反復を含み、またはパリンドローム構造であるが、好ましくはアンチセンスおよびセンス配列を含む。ｄｓＲＮＡは、ヘアピン構造またはパンハンドル状の折りたたみ構造に形成されることができ、これによってセンスおよびアンチセンス領域は、イントロンまたはラリアット構造によって分離される（Moore et al. 1993 The RNA World, eds. Gesteland, R. F. & Atkins, J. F. Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY, pp. 303-357）。好ましくは、ＲＮＡ二重鎖を形成する２本のＲＮＡ鎖は、ループを形成するスペーサー領域によって、ともに保持される。より好ましくは、ＲＮＡ二重鎖を形成する２本のＲＮＡ鎖は、イントロンがスプライシングにより切除されるときに離されるスペーサー領域によって、ともに保持される。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、あらゆる長さのスペーサーヌクレオチド配列（たとえば、イントロン配列）を通して結合されることができる。もし、無傷のイントロン配列がスペーサーとして用いられるならば、このイントロンは、細胞核における内生的なプロセスによって、ｍＲＮＡ形成の期間中、除去され得る。センスおよびアンチセンス配列の順序は、必須ではないが、アンチセンス−センスの配向は、このような転写物が蛋白質をコード化する見込みのないという理由で好ましい。また、１および同じ構造において、１つ以上のセンス−アンチセンスの組合せを組み合わせることが可能である。単純な形態が、ｐｒｏｍ−ＡＳ−ｓｐａｃ−Ｓ−ｔｅｒｍと表されることができ、ここで、ｐｒｏｍは、プロモーターを示し、Ｓは、標的ウイルスＤＮＡ配列を示し、ＡＳは、Ｓに対して逆極性の標的ウイルスＤＮＡ配列を示し、ｓｐａｃは、スペーサー配列を示し、ｔｅｒｍは、転写終結区ＤＮＡ配列を示す。また、次の構造を用いることができる。ｐｒｏｍ−ＡＳ１−ｓｐａｃ−Ｓ１−ｓｐａｃ−ＡＳ２−ｓｐａｃ−Ｓ２−ｔｅｒｍ、またはｐｒｏｍ−ＡＳ２−ｓｐａｃ−ＡＳ１−ｓｐａｃ−Ｓ１−ｓｐａｃ−Ｓ２−ｔｅｒｍ。構造の組成のバリエーションは、前記構造の転写物が、ｄｓＲＮＡに部分的に、または完全に折り込み得る限り、可能である。
【００６０】
代替的に、ヌクレオチド構造は、２つの分離導入遺伝子カセットから構成されてもよく、ここにおいて、標的ウイルスＤＮＡ配列は、プロモーターに対して逆極性に存在する。短い記述法において、これらの構造は、ｐｒｏｍ１−Ｓ−ｔｅｒｍ１、およびｐｒｏｍ２−ＡＳ−ｔｅｒｍ２のようである。ｐｒｏｍ１およびｐｒｏｍ２は、同一または異なるプロモーターであってもよく、ｔｅｒｍ１およびｔｅｒｍ２は、同一または異なる転写終結区であってもよい。両構造は、同一のベクターにおける細胞に対して導入され得るが、２つの異なるベクターを用いて導入されてもよい。
【００６１】
代替的に、ヌクレオチドの構造は、転写方向に対して逆極性のプロモーターによってフランキングされた単一の標的ウイルスＤＮＡ配列から構成されてもよい。短い記述法において、このような構造は、ｐｒｏｍ１−Ｓ−ｐｒｏｍ２によって形成される。ｐｒｏｍ１およびｐｒｏｍ２は、同一または異なるプロモーターであってもよい。
【００６２】
転写プロモーターは、好ましくは、ＤＮＡウイルスに由来し、レトロウイルスおよびレンチウイルス、ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ならびにその類似物からの５´長末端反復を含む。これらのプロモーターおよび種々の他のものは、当業者によって容易に入手可能である。転写終結区として、ヒトまたは動物細胞において適用可能なあらゆる転写終結区を用いることができる。
【００６３】
有効な抗ＨＩＶ治療のために、基本的に以下のステップが行われなければならない。
１．幹細胞の単離
ＨＩＶ感染したヒトからヒト造血幹細胞の単離をする場合において、骨髄穿刺(bone marrow punctions)細胞を、ＨＩＶ血清反応陽性の患者から採取する。これらの穿刺細胞は、一般的に１ミリリットルあたり１０８個の細胞を包含し、これらのうち５０，０００個は、造血幹細胞である。標準の精製技術を用いて、穿刺の１ミリリットルあたり、５×１０５個量のＣＤ３４＋３８−細胞が単離され、原理的には、これらの細胞の１０のうち１は、ＨＳＣである。
２ａ．トランスジェニックカセットの構築
一般的に用いられる遺伝子操作技術に従って、前述のようなｄｓＲＮＡの転写および形成を可能とする１または複数のプロモーターおよび転写終結区を含むヌクレオチド構造を形成する。
２ｂ．幹細胞の形質導入
好ましくは、造血幹細胞およびリンパ系幹細胞について精製された細胞画分を、組換えによって形質導入する。このために、前述に従って準備されるようなヌクレオチド構造を、好ましくは、安定的一体化のために、標的細胞の染色体に対して、ウイルスベクターにおいて挿入する。幹細胞のトランスフェクションまたは形質導入を、本技術分野において既知の方法(たとえば、Halene & Kohn, Human Gene Therapy 11: 1259-1267, 2000; Buchsacher & Wong-Stall, Blood 95: 2499-2504, 2000; Buchsacher & Wong-Staal, Human Gene Therapy 12: 1013-1019, 2001)を用いて行う。
３．再導入
形質導入されたＨＩＶ在住造血幹細胞およびリンパ系幹細胞を、その後、患者の骨髄に再導入し、新しいＨＩＶ在住Ｔヘルパー細胞集団を設立し、ＡＩＤＳ症状から患者を防御するとともに、患者を非感染にならしめる。
【００６４】
当業者は、その他の慢性ウイルスによる感染の治療に関して、同様の設定で本発明を利用することができるであろう。
【００６５】
本発明は、慢性ウイルスによってすでに感染した動物またはヒトのための治療に適しているのみならず、このようなウイルスによる感染を阻害するために予防的に用いられてもよい。これは、慢性ウイルス感染について高いリスクを有する人々に特に勧められるであろう。
【００６６】
実施例
実施例１：ＨＩＶ−１Ｒｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆ遺伝子の分子クローン。
ｐＬａｉ（Peden K., et al., 1991. Virology 185: 661-672）を示す、ＨＩＶ−１の感染性ｃＤＮＡクローンの精製されたＤＮＡは、ＤＮＡに基づくＰＣＲを用いる、ＨＩＶ−１Ｒｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆ遺伝子のクローニングのために、テンプレートとして用いられる。４つのオリゴヌクレオチドが設計され、これらは、第１Ｒｅｖエキソンをフランキングする、ＷｄＶ００１：ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧ、およびＷｄＶ００２：ＧＡＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＴＧ、ならびに第２Ｒｅｖエキソンをフランキングする、ＷｄＶ００３：ＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧ、およびＷｄＶ００４：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＴＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＣである。オリゴヌクレオチドＷｄＶ００１およびＷｄＶ００４は、ＮｏｔＩ認識部位を含み、これは、ＬａｉＲｅｖＤＮＡ配列に存在しない。精製されたＬａｉＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ００１およびＷｄＶ００２、ならびにオリゴヌクレオチドＷｄＶ００３およびＷｄＶ００４を用いてＰＣＲを受けさせ、それぞれＲｅｖエキソン１およびエキソン２ｃＤＮＡ分子を産生した。両ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル精製し、混合し、オリゴヌクレオチドＷｄＶ００１およびＷｄＶ００４を用いて二回目のＰＣＲ増幅を受けさせた。３６６塩基対長のＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ(Promega)社製）に直接結合させ、組換えプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−Ｒｅｖを産生した。
【００６７】
同様に、４つのオリゴヌクレオチドを設計し、これらは、第１Ｔａｔエキソンをフランキングする、ＷｄＶ００５：ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣ、およびＷｄＶ００６：ＧＡＧＧＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＴＧ、ならびに第２Ｔａｔエキソンをフランキングする、ＷｄＶ００７：ＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＧＡＧＧ、およびＷｄＶ００８：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＴＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＧＡＣＴＣＣである。オリゴヌクレオチドＷｄＶ００５およびＷｄＶ００８は、ＮｏｔＩ認識部位を含み、これは、ＬａｉＴａｔＤＮＡ配列に存在しない。精製されたＬａｉＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ００５およびＷｄＶ００６、ならびにオリゴヌクレオチドＷｄＶ００７およびＷｄＶ００８を用いてＰＣＲを受けさせ、それぞれＴａｔエキソン１およびエキソン２ｃＤＮＡ分子を産生した。両ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル精製し、混合し、オリゴヌクレオチドＷｄＶ００５およびＷｄＶ００８を用いて２回目のＰＣＲ増幅を受けさせた。２７６塩基対長のＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社製)に直接結合させ、組換えプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−Ｔａｔを産生した。
【００６８】
２つのオリゴヌクレオチドを設計し、これらは、Ｎｅｆコード化配列をフランキングするＷｄＶ０１１：ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＴＡＧ、およびＷｄＶ０１２：ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧである。両オリゴヌクレオチドは、ＮｏｔＩ認識部位を含み、これは、ＬａｉＮｅｆＤＮＡ配列に存在しない。精製されたＬａｉＤＮＡを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０１１およびＷｄＶ０１２を用いてＰＣＲを受けさせ、ＮｅｆｃＤＮＡ分子を産生した。６５３塩基対長のＤＮＡフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社製）に直接結合させ、組換えプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−Ｎｅｆを産生した。
【００６９】
実施例２：ＧＦＰリポーターＤＮＡ構造の構築。
ｈｒＧＦＰコード化配列を、ｈｒＧＦＰコード化配列をフランキングするオリゴヌクレオチドＷｄＶ０２０：ＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧおよびＷｄＶ０２１：ＡＴＴＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣと、テンプレートとしてプラスミドｐＦＢ−ｈｒＧＦＰ（ストラタジーン(Stratagene)社製）の精製ＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。増幅されたＤＮＡフラグメントを、製造者の勧めに従って「ゲートウェイ(gateway)」（インビトロジェン(Invitrogen)社製）を用いて、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴにクローン化し、ｐＷｄＶ０８（センス，ｓ−ＧＦＰ）を産生した。
【００７０】
ヒトＥＦ１αプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０３４：ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＡＴＧＴＣＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣＡＧ（ＳｐｈＩ制限部位を有する。）およびＷｄＶ０３５：ＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧと、テンプレートとしてプラスミドｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。３００塩基対のアンチセンスｈｒＧＦＰ ＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０３６：ＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧおよびＷｄＶ０３７：ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＣＧＧＧＧＣＣＧＴＣＧ（ＢａｍＨＩ制限部位を有する。）と、テンプレートとしてプラスミドｐＷｄＶ０８のＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって産生した。両ＤＮＡフラグメントを、等モル比で混合し、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０３４およびＷｄＶ０３７を用いて、ＰＣＲによって再増幅した。ＤＮＡフラグメントを、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＵＣ１９（ストラタジーン社製）にクローン化し、ｐＷｄＶ０９を産生した。
【００７１】
ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０４０：ＣＣＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＴＴＴＡＣＴＴＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＣＴＣＣＣＡＣ、およびＷｄＶ０４１：ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣ（ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩ制限部位を含有する。）と、テンプレートとしてｐＰＵＲ（クローンテック(Clontech)社製）のＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって産生した。３００塩基対のセンスｈｒＧＦＰ ＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０３８：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＣＧＣＧＧＴＡＣＡＣＧＡＡＣＡＴＣＴＣ（ＢａｍＨＩ制限部位を有する。）、およびＷｄＶ０３９：ＧＣＡＡＧＴＡＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡと、テンプレートとしてプラスミドｐＷｄＶ０８のＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって産生した。両ＤＮＡフラグメントを、等モル比で混合し、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０３８およびＷｄＶ０４０を用いて、ＰＣＲによって再増幅した。ＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＷｄＶ０９にクローン化し、ｐＷｄＶ１０（アンチセンス−スタッファー−センス，ａｓｓ−ＧＦＰ）を産生した。
【００７２】
実施例３：ＨＩＶ−１Ｔａｔ、ＲｅｖおよびＮｅｆ遺伝子配列を含むセンスプラスアンチセンスＤＮＡ構造の構築。
アンチセンス−スタッファー−センス（ａｓｓ）ベクターの構築。
１）ａｓｓ−Ｔａｔ構造の構築
ＥＦ１ａプロモーター、ＧＡＴＥＷＡＹカセット、およびプラスミドｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（インビトロジェン社製）のＢＧＨポリアデニル化シグナルを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩでプラスミドを消化することによって除去した。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＸｈｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＰａｃＩおよびＳｐｈＩ制限部位を含有するマルチリンカーＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０２２：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＴＣＴＣＧＴＧＣＧＡＧ、ＷｄＶ０２３：ＧＣＡＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＧＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴＧＡＧＡＧＣＴＣＧＣＡＣＧＡＧＡＴＴＡＧＣＧＧＣＣ、ＷｄＶ０２４：ＣＧＣＣＴＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＴＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＣＧ、およびＷｄＶ０２５：ＡＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡＴＧＣＡＣＧＡＴＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＣＧＧＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＡＴＣを用いてＰＣＲによって産生した。
【００７３】
得られたＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴにクローン化し、ｐＷｄＶ０６．３（空の発現ベクター）を産生した。
【００７４】
ヒトＥＦ１αプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０４７：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣ（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有する。）およびＷｄＶ０４８：ＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＡＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧと、テンプレートとしてプラスミドｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴのＤＮＡとを用いてＰＣＲによって産生した。
【００７５】
３００塩基対のアンチセンスＴａｔＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０４９：ＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＴＡＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＴＣＧ、およびＷｄＶ０５０：ＡＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣ（ＮｏｔＩ制限部位を有する。）テンプレートとしてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＴａｔのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。両ＤＮＡフラグメントを、等モル比で混合し、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０４７およびＷｄＶ０５０を用いて、ＰＣＲによって再増幅した。ＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＷｄＶ０６．３にクローン化し、ｐＷｄＶ１６を産生した。
【００７６】
ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０５３：ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣ（ＮｏｔＩ制限部位を包含する。）およびＷｄＶ０５４：ＣＣＣＣＴＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣ（ＡｖｒＩＩ制限部位を含有する。）と、テンプレートとしてｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。ＤＮＡフラグメントを、ＡｖｒＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＷｄＶ１６にクローン化し、ｐＷｄＶ１７（ａｓ−Ｔａｔ）を産生した。
【００７７】
ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０５３：ＣＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣおよびＷｄＶ０５４：ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣ（ＰａｃＩ制限部位を含有する。）と、テンプレートとしてｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。
【００７８】
３００塩基対のセンスＴａｔＤＮＡフラグメントを、ヌクレオチドＷｄＶ０５１：ＧＴＣＣＴＡＧＧＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧ（ＡｖｒＩＩ制限部位を含有する。）、およびＷｄＶ０５２：ＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＡＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧと、テンプレートとしてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＴａｔのＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって産生した。
【００７９】
両ＤＮＡフラグメントを、混合し、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０５１およびＷｄＶ０５４を用いて、ＰＣＲによって再増幅した。ＤＮＡフラグメントを、ＡｖｒＩＩおよびＰａｃＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＷｄＶ１６にクローン化し、ｐＷｄＶ１８（ａｓｓ−Ｔａｔ）を産生した。
【００８０】
２）ａｓｓ−Ｒｅｖ構造の構築
ヒトｅＦ１αプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０４７：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣ（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有する。）およびＷｄＶ０５５：ＴＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧと、テンプレートとしてプラスミドｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。
【００８１】
３００塩基対のアンチセンスＲｅｖＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０５６：ＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣおよびＷｄＶ０５７：ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣ（ＮｏｔＩ制限部位を含有する。）と、テンプレートとしてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＲｅｖのＤＮＡとを、ＰＣＲによって産生した。両ＤＮＡフラグメントを、等モル比で混合し、ヌクレオチドＷｄＶ０４７およびＷｄＶ０５７を用いて、ＰＣＲによって再増幅した。ＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＷｄＶ０６．３にクローン化し、ｐＷｄＶ１９を産生した。
【００８２】
ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０５４：ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣ（ＮｏｔＩ制限部位を含有する。）およびＷｄＶ０６０：ＣＴＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧと、テンプレートとしてｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。
【００８３】
３００塩基対のセンスＲｅｖＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０５８：ＡＧＣＣＴＡＧＧＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣ（ＡｖｒＩＩ制限部位を含有する。）およびＷｄＶ０５９：ＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣＣＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＣと、テンプレートとしてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＲｅｖのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。両ＤＮＡフラグメントを、等モル比で混合し、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０５４およびＷｄＶ０５８を用いて、ＰＣＲによって再増幅した。ＤＮＡフラグメントを、ＡｖｒＩＩおよびＰａｃＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＷｄＶ１９にクローン化し、ｐＷｄＶ２０を産生した。
【００８４】
３）ａｓｓ−Ｎｅｆ構造の構築
ヒトｅＦ１αプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０４７：ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣ（ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有する。）およびＷｄＶ０６１：ＧＡＴＧＧＴＧＣＴＡＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧと、テンプレートとしてプラスミドｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。
【００８５】
３００塩基対のアンチセンスＮｅｆＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０６２：ＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＴＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡＧＧおよびＷｄＶ０６３：ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＡＧＴＡＧＣＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＣ（ＮｏｔＩ制限部位を含有する。）と、テンプレートとしてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＮｅｆのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。両ＤＮＡフラグメントを、混合し、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０４７およびＷｄＶ０６３を用いて、ＰＣＲによって再増幅した。ＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＷｄＶ０６．３にクローン化し、ｐＷｄＶ２１を産生した。
【００８６】
ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０５４：ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣ（ＰａｃＩ制限部位を含有する。）およびＷｄＶ０６６：ＧＡＴＧＧＴＧＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣ  と、テンプレートとしてプラスミドｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。
【００８７】
３００塩基対のセンスＮｅｆＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＷｄＶ０６４：ＡＧＣＣＴＡＧＧＡＣＡＡＧＴＡＧＣＡＡＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣ（ＡｖｒＩＩ制限部位を含有する。）およびＷｄＶ０６５：ＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＡＧＧＴＣと、テンプレートとしてプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＮｅｆのＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。
【００８８】
両ＤＮＡフラグメントを、等モル比で混合し、ヌクレオチドＷｄＶ０５４およびＷｄＶ０６４を用いて、ＰＣＲによって再増幅した。ＤＮＡフラグメントを、ＡｖｒＩＩおよびＰａｃＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＷｄＶ２１にクローン化し、ｐＷｄＶ２２を産生した。
【００８９】
アンチセンス−イントロン−センス（ａｉｓ）ベクターの構築
ヒトβ−グロブリンイントロン１の５´−スプライス部位と、免疫グロブリン遺伝子のヒト重鎖可変領域由来イントロンからの分枝および３´−アクセプタースプライス部位から構成されたキメライントロンフラグメントを含む１６８塩基対のＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位を有する２つのオリゴヌクレオチドＷｄＶ０７７：ＣＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴＣＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＧＡＣＡＧ（ＮｏｔＩ部位を含有する。）およびＷｄＶ０７８：ＡＧＣＡＴＡＣＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＧＴＧ（ＡｖｒＩＩ部位を含有する。）と、テンプレートとしてプラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ（プロメガ社製）のＤＮＡとを用いて、ＰＣＲによって産生した。ＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、アガロースゲルから単離し、同様に消化されたｐＷｄＶ１８、ｐＷｄＶ２０またはｐＷｄＶ２２にクローン化し、それぞれ、ｐＷｄＶ３５（ａｉｓ−Ｔａｔ）、ｐＷｄＶ３６（ａｉｓ−Ｒｅｖ）、およびｐＷｄＶ３７（ａｉｓ−Ｎｅｆ）を産生した。
【００９０】
実施例４：ＨＩＶ−１複製を阻害するＳｕｐＴ１およびＣ３３Ａ細胞におけるＨＩＶ−１由来センスプラスアンチセンスＤＮＡ構造の一時的発現。
ＳｕｐＴ１ヒト非ホジキンＴリンパ腫細胞（Smith S.D., et al., 1984. Cancer Research 44:5657）は、１０％ウシ胎仔血清（バイオクロームＫＧ(Biochrom KG)社製）および１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎｅ（インビトロジェン社製）を追加した２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（ギブコ社製）と、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンと、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ培地）において、３７℃で成長する。週２回、２×１０６細胞／ｍＬを含有する細胞培養物を、ＲＰＭＩ培地において１０倍希釈し、３７℃で継代培養する。
【００９１】
１０６細胞／ｍＬを含有する３ｍＬのＳｕｐＴ１細胞培養物を、１μｇのｐＬａｉＤＮＡで電気穿孔し、３７℃でインキュベーションする。電気穿孔の７日後、上清に存在するウイルスの量を、製造者のプロトコル（ベックマン−コールター(Beckman-Coulter)社製）に従って、ｐ２４（キャプシド）酵素結合免疫反応吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、定量化し、等分したものを接種物として用いるために、−７０℃で保存する（ＳｕｐＴ１適合Ｌａｉ）。
【００９２】
１０６細胞／ｍＬを含有する３ｍＬのＳｕｐＴ１細胞培養物を、４μｇのプラスミドＤＮＡで電気穿孔し、３７℃でインキュベーションする（Beerens, N. & Berkhout, B. 2002, Journal of Virology 76: 2329-2339）。電気穿孔の１日後、細胞培養物に、０．２μＬのＳｕｐＴ１適合Ｌａｉを接種し、合胞体形成を、感染の１４日後まで毎日監視する。合胞体は、対照プラスミド（空の発現ベクター、ｓＧＦＰ、ａｓｓ−ＧＦＰおよびａｓ−Ｔａｔ）で電気穿孔された培養物中で、感染の６日後に形成される。抗ＨＩＶプラスミド（ａｓｓ−Ｔａｔ、ａｓｓ−Ｒｅｖ、ａｓｓ−Ｎｅｆ、ａｉｓ−Ｔａｔ、ａｉｓ−Ｒｅｖおよびａｉｓ−Ｎｅｆ）で電気穿孔された細胞培養物中で形成された合胞体の数は、対照プラスミドで電気穿孔されたものよりも相当少ない。
【００９３】
Ｃ３３Ａ頸部癌細胞（Auersperg N., 1964. J. Natl. Cancer Inst. 32:135-163）は、０．１１ｇ／Ｌのピリドキシンナトリウムと、１０％ウシ胎仔血清（バイオクロームＫＧ社製）および１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎｅ（インビトロジェン社製）を追加したＭＥＭ非必須アミノ酸（ギブコ社製）と、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンと、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンとを有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ培地）において、３７℃で成長する。週２回、合流した細胞培養物を、ＤＭＥ培地において１０倍希釈し、３７℃で継代培養する。
【００９４】
３ｍＬの合流したＣ３３Ａ細胞培養物を、リン酸カルシウム法（Das, A.T., Klaver, B., Klasens, B.I.F., van Wamel,.L.B. & Berkhout, B. 1997, Journal of Virology 71: 2346-2356）を用いて、１μｇのｐＬａｉＤＮＡで共トランスフェクションし、３７℃でインキュベーションする。トランスフェクションの７日後、上清中のウイルスの量を、ｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて定量化し、等分したものを、接種物として用いるために、−７０℃で保存した（Ｃ３３Ａ適合Ｌａｉ）。
【００９５】
３ｍＬの合流したＣ３３Ａ細胞培養物を、リン酸カルシウム法を用いて、１μｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｇのｐＬａｉＤＮＡで共トランスフェクションし、３７℃でインキュベーションする。トランスフェクションの３日後、上清中のウイルスの量を、ｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて定量化する。抗ＨＩＶプラスミド（ａｓｓ−Ｔａｔ、ａｓｓ−Ｒｅｖ、ａｓｓ−Ｎｅｆ、ａｉｓ−Ｔａｔ、ａｉｓ−Ｒｅｖおよびａｉｓ−Ｎｅｆ）でトランスフェクションされた細胞の上清中のウイルスの量は、対照プラスミド（空の発現ベクター、ｓＧＦＰ、ａｓｓ−ＧＦＰおよびａｓ−Ｔａｔ）でトランスフェクションされた細胞の上清中のウイルスよりも相当少ない。
【００９６】
実施例５：ＨＩＶ−１由来センスプラスアンチセンス遺伝子配列を安定的に発現する２９３およびジャーカット(Jurkat)細胞系の産生。
ＦＲＴ組換え部位を含むＦｌｐ−Ｉｎ２９３ヒト胎児腎臓細胞（Graham et al., 1997. J. Gen Virol. 36: 59-74; インビトロジェン社から購入）は、ＤＭＥ培地において、３７℃で成長する。週２回、合流した細胞培養物を、ＤＭＥ培地中で１０倍希釈し、３７℃で継代培養する。
【００９７】
ＦＲＴ組換え部位を含むＦｌｐ−ＩｎジャーカットヒトＴ細胞白血病細胞（Weiss et al., 1984. J. Immunol. 133:123-128; インビトロジェン社から購入）は、ＲＰＭＩ培地において３７℃で成長する。週２回、２×１０６細胞／ｍＬを含有する合流した細胞培養物を、ＲＰＭＩ培地中で１０倍希釈し、３７℃で継代培養する。
【００９８】
プラスミドＤＮＡを、製造者の勧め（インビトロジェン社）に従って両細胞系のＦＲＴ組換え部位に組換えする。染色体ＤＮＡにおけるＦＲＴ組換え部位に安定的に一体化されたプラスミドＤＮＡを有する細胞バッチ培養物を、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを備えた適切な培地において成長かつ選択する。
【００９９】
実施例６：ＨＩＶ−１由来センスプラスアンチセンス遺伝子配列を安定的に発現するＦｌｐ−Ｉｎ２９３細胞は、ＨＩＶ−１感染に対して耐性を有する。
一体化したプラスミドを有する３ｍＬの密集ハイグロマイシン耐性およびＺｅｏｃｉｎｅ感受性のあるＦｌｐ−Ｉｎ２９３細胞培養物を、製造者の勧告（インビトロジェン社）に従ってリポフェクタミンを用いて１μｇのｐＬａｉＤＮＡでトランスフェクションし、３７℃でインキュベーションする。感染の７日後、上清中のウイルスの量を、ｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて定量化する。抗ＨＩＶプラスミド（ａｓｓ−Ｔａｔ、ａｓｓ−Ｒｅｖ、ａｓｓ−Ｎｅｆ、ａｉｓ−Ｔａｔ、ａｉｓ−Ｒｅｖおよびａｉｓ−Ｎｅｆ）を示す細胞の上清中のウイルスの量は、対照プラスミド（空の発現ベクター、ｓＧＦＰ、ａｓｓ−ＧＦＰおよびａｓ−Ｔａｔ）を含む細胞の上清中のウイルスよりも相当少ない。
【０１００】
実施例７：ＨＩＶ−１由来センスプラスアンチセンス遺伝子配列を安定的に発現するＦｌｐ−Ｉｎジャーカット細胞は、ＨＩＶ−１感染に対する耐性を有する。
Ｃ３３Ａ適合ＬａｉまたはＳｕｐＴ１適合Ｌａｉを、Ｆｌｐ−Ｉｎジャーカット細胞に接種し、感染過程を、ｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて感染後３０日間監視した。
【０１０１】
Ｃ３３Ａ適合ウイルスは、感染の１１日〜１４日後に、Ｆｌｐ−Ｉｎジャーカット細胞において複製を開始する。これらの細胞の上清中のウイルス粒子を、Ｆｌｐ−Ｉｎジャーカット細胞に再接種する。ウイルス複製は、感染の７日後に開始し、ジャーカット適合Ｌａｉ株を産生し、これは、さらなる感染実験に用いる。
【０１０２】
一体化されたプラスミドを有する３ｍＬのハイグロマイシン耐性およびＺｅｏｃｉｎｅ感受性のあるＦｌｐ−Ｉｎジャーカット細胞培養物に、１μＬのジャーカット適合Ｌａｉを接種し、３７℃でインキュベーションする。感染の１４日後、上清中のウイルスの量を、ｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて定量化する。抗ＨＩＶプラスミド（ａｓｓ−Ｔａｔ、ａｓｓ−Ｒｅｖ、ａｓｓ−Ｎｅｆ、ａｉｓ−Ｔａｔ、ａｉｓ−Ｒｅｖおよびａｉｓ−Ｎｅｆ）を含む細胞の上清中のウイルスの量は、対照プラスミド（空の発現ベクター、ｓＧＦＰ、ａｓｓ−ＧＦＰおよびａｓ−Ｔａｔ）を含む細胞の上清中のウイルスよりも相当少ない。
【０１０３】
感染の１４日後、１０μＬの各上清を、１０６細胞／ｍＬを含有する３ｍＬのジャーカット培養物に接種し、上清のウイルスの量を、感染の７日後にｐ２４ＥＬＩＳＡを用いて定量化する。抗ＨＩＶ構造を含む細胞培養物の上清は、対照プラスミドを含む細胞培養物とは対照的に、感染性ウイルス粒子を蓄積しない。
【配列表】
2005522217000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月24日(2005.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性ウイルスの標的細胞、または前記ウイルスの前記標的細胞を産生可能なその前駆細胞、好ましくは幹細胞のゲノムに対して、ヌクレオチド構造を安定的に一体化させることによって、動物またはヒトの細胞における慢性ウイルスの複製を阻害する方法であって、ヌクレオチド構造は、ウイルスの複製に不可欠な、ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記安定的一体化は、前記標的細胞または前記前駆細胞に、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたは単純ヘルペスウイルスからなる群から選択されたウイルス由来の、好ましくはレンチウイルス、アデノ関連ウイルスまたはアデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド由来のウイルスベクターを形質導入することによって達成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記安定的一体化は、前記標的細胞または前記前駆細胞に、レンチウイルスまたはアデノ関連ウイルス由来のウイルスベクターを形質導入することによって、ヒト第１９染色体のＡＡＶＳ１部位に対して達成されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ヒト免疫不全ウイルスの複製を阻害する方法であって、
ａ）造血幹細胞、リンパ系幹細胞、およびＴヘルパーリンパ球からなる群から選択された細胞を、ヒトから単離するステップと、
ｂ）前記細胞のゲノムに対して、複製に不可欠なヒト免疫不全ウイルス、好ましくはＨＩＶｔａｔ、ｒｅｖおよび／またはｎｅｆ遺伝子の１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造を、安定的に一体化させるステップと、
ｃ）前記細胞を単離したヒトに、前記細胞を再導入するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルスの複製を阻害する方法であって、
ａ）肝細胞、肝臓幹細胞、間葉系成体前駆細胞、間葉系幹細胞または造血幹細胞を、ヒトから単離するステップと、
ｂ）前記細胞に対して、Ｃ型肝炎ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造を導入するステップと、
ｃ）前記細胞を単離されたヒトの肝臓に、前記細胞を再導入するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
慢性ウイルスの標的細胞である動物またはヒトの細胞であって、これに対して、複製に不可欠な前記慢性ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な単一の転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造が導入され、前記ヌクレオチド構造は、前記動物またはヒト細胞のゲノムに対して安定的に一体化されることを特徴とする細胞。
【請求項７】
慢性ウイルスの標的細胞を産生可能である動物またはヒトの前駆細胞であって、これに対して、複製に不可欠なウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な単一の転写物または複数の転写物を産生することができるヌクレオチド構造が導入され、前記ヌクレオチド構造は、前記動物またはヒト前駆細胞のゲノムに対して安定的に一体化されることを特徴とする前駆細胞。
【請求項８】
ヒト造血もしくはリンパ系幹細胞またはＴヘルパーリンパ球であって、これに対して、好ましくはｔａｔ、ｒｅｖおよび／またはｎｅｆをコード化する、複製に不可欠なヒト免疫不全ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列と相同な二重鎖ＲＮＡを産生することができるヌクレオチド構造が導入され、前記ヌクレオチド構造は、前記ヒト細胞のゲノムに対して安定的に一体化されることを特徴とするヒト造血もしくはリンパ系幹細胞またはＴヘルパーリンパ球。
【請求項９】
動物またはヒト細胞を感染させることができる慢性ウイルスの遺伝子または遺伝子の一部と相同な、少なくとも４０のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド構造を含むウイルスベクターであって、前記ヌクレオチド配列は、好ましくは前着ヌクレオチド配列からイントロンによって分離される、逆方向反復としても存在し、または前記ヌクレオチド配列は、２つのプロモーターによってフランキングされ、ヌクレオチド構造は、転写されるとき、前記配列およびその逆方向反復から、または２つのプロモーターによってフランキングされた前記配列から、二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生し、前記ウイルスベクターはさらに、前記ヌクレオチド構造を前記動物またはヒト細胞のゲノムに対して、安定的に一体化させることができることを特徴とするウイルスベクター。
【請求項１０】
同一の遺伝子の異なる部分と、または前記ウイルスの異なる遺伝子もしくはその部分と相同なヌクレオチド配列を示す、少なくとも４０ヌクレオチド長の複数のヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド構造は、逆方向反復としても存在し、または前記ヌクレオチド構造は、２つのプロモーターによってフランキングされ、前記ベクターは、好ましくはレトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノ関連ウイルス由来であることを特徴とする請求項９記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
慢性ウイルスの前記遺伝子または遺伝子の一部は、早期ウイルス遺伝子であって、ウイルスベクターは、動物またはヒト細胞における慢性ウイルスの複製を阻害するために用いられることを特徴とする請求項９または１０記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
動物またはヒト細胞における慢性ウイルスの複製を阻害するための、請求項９〜１１の
うちいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項１３】
必要とする対象の細胞における慢性ウイルスの感染を治療する方法であって、前記感染を受けている患者における前記細胞、または前記細胞を産生可能なその前駆細胞を、前記細胞または前記前駆細胞のゲノムに対してヌクレオチド構造を安定的に一体化させる療法上有効な量の試薬に、接触させるステップを含み、ヌクレオチド構造は、前記ウイルスの複製に不可欠な、前記ウイルスの１または複数のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列相同性のある二重鎖ＲＮＡを形成可能な１つの転写物または複数の転写物を産生することができ、前記試薬は、好ましくは請求項９〜１１のいずれか１項に記載のベクターを含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記慢性ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスであって、前記細胞は、造血幹細胞、リンパ系幹細胞またはＴヘルパーリンパ球であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記慢性ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスであって、前記細胞は、肝細胞、肝臓幹細胞、間葉系成体前駆細胞、間葉系幹細胞または造血幹細胞であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記試薬との前記接触の前に、前記細胞または前駆細胞は、前記患者から単離され、ここにおいて、前記細胞または前駆細胞は、その後、前記患者に再導入されることを特徴とする請求項１３〜１５のうちいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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