(57)【要約】本発明はヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドに自己浸透信号を有する自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された融合ペプチド、その製造方法およびこれを含む経皮性体脂肪減量化粧品組成物に関する。ヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドにＴａｔペプチドが結合された融合ペプチドは高い安定性と優れた皮膚浸透性を有するので、優れた脂肪分解効果およびその効果の持続性を向上させた経皮性体脂肪減量剤を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式１で示されるヒトの副甲状腺ホルモンに由来するペプチドに自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された融合ペプチド（Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ）：
【化１】
2005506383.tif 000008
前記式で、［］Ｔａｔは自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドであって、Ｒ１はグルタミン、リシン、アルギニンおよびグリシンの側鎖からなる群より１種以上選択されたものであり、ｎは４〜１２の整数であり、
［］ｈＰＴＨＤＰはヒトの副甲状腺ホルモンに由来するペプチドであって、配列番号１に示されるペプチドのうち連続的な３〜３４個のアミノ酸からなるペプチドであり、Ｒ２は前記ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖であり、ｍは３〜３４の整数である。
【請求項２】
ｎは８〜１０である、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項３】
前記自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが、配列番号７のペプチド、配列番号８のペプチドおよび配列番号９のペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項４】
前記化学式１で［］ｈＰＴＨＤＰは、配列番号１に示されたペプチドのうち連続的な３〜１１個のアミノ酸からなるペプチドである、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項５】
前記化学式１で［］ｈＰＴＨＤＰは、配列番号２のペプチド、配列番号３のペプチド、配列番号４のペプチド、配列番号５のペプチドおよび配列番号６のペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項６】
固相ペプチド合成法で請求項１に記載のＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドを製造する方法。
【請求項７】
遺伝子組換え技法を利用した生物学的方法で請求項１に記載のＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドを製造する方法。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物を有効成分として含む経皮性体脂肪減量化粧品組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物を０．０００００１〜５．０重量％含む、請求項８に記載の経皮性体脂肪減量化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの副甲状腺ホルモンに由来するペプチドに自己細胞浸透性Ｔａｔペプチド（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が結合された融合ペプチド、およびこれを含む経皮性体脂肪減量化粧品組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの副甲状腺ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＰＴＨ）は人体の副甲状腺で生産される８４個のアミノ酸からなるペプチドホルモンであって、腎臓と骨でカルシウムの恒常性を調節する機能を有し、少量だけを人体に投与しても新陳代謝や骨の形成に影響を与える［ＭｏｒｅｌＦ．，  ｅｔ．  Ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，  １９８３  ３９，  ２７１；Ｎｏｒｍａｎ，  Ａ．  Ｗ．  ｅｔ．  Ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎａｌ  Ｒｅｖ．，  １９８２  ３，  ３３６］。その他にも副甲状腺ホルモンはカルシウム調節、血管収縮、リンパ液流、アドレナリン調節などの役割および脂肪分解を促進するが、特に副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列のうち１から３４までのアミノ酸からなるペプチドがヒトの脂肪細胞に作用して脂肪分解を促進するという研究結果が報告された［Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓ．  ｅｔ．  Ａｌ．，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．，  １９７３  ５，  ２９２，  Ｔａｎｉｇｕｓｈｉ  Ａ．，  ｅｔ．  Ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｉｐ．  Ｒｅｓ．，  １９８７  ２８，  ４９０］。副甲状腺ホルモンが脂肪細胞受容体に作用すればｃＡＭＰ生成が促進される調節メカニズムによって脂肪分解が促進されるという報告から、副甲状腺ホルモンに由来するペプチドが減量に効果があることが予想される。そこで多様なペプチドを合成してスクリーニングした結果、副甲状腺ホルモンのアミノ酸配列９〜１９、１２〜１６および１２〜１４のペプチドが減量に効果があることが明らかになった（フランス特許出願第２７８８０５８号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／４０６１１、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｌ．，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｓ．  Ｐ．  Ｃ．  ２００１，  Ｄｅｃ，  ３０）。しかし、これらペプチドは水溶性であるため、皮膚からの吸収力が微弱であって、脂肪分解効果を大きく期待するのが難しいという短所を有していた。したがって、経皮吸収性を向上させ、生体内での体脂肪減量効果を極大化させた新たな経皮性体脂肪減量剤の開発が急務である。
【０００３】
このような、ペプチド減量剤の皮膚からの吸収を増加させるための一つの方法として、ペプチドの脂溶性を増加させるためにペプチドにパルミチン酸など長鎖の脂肪酸を合体する方法（フランス特許出願第２７８８０５８号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／４０６１１号）が提示されたが、その吸収増大の効果は大きく改善された水準ではなかった。
【０００４】
したがって、皮膚に刺激がなく、経皮吸収性が向上し、安定性が向上し、さらに生体内での体脂肪減量効果が極大化された新たな経皮性体脂肪減量剤の開発が求められている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来技術の問題点を解決するために、本発明は、非刺激性であり、外皮と内皮に容易にかつ安全に浸透しながら皮膚疾患を誘発せず、優れた脂肪分解効果を持続的に有する、ヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドに自己細胞浸透性を有するＴａｔペプチドが結合された融合ペプチドを提供することを目的とする。
【０００６】
本発明の他の目的は、ヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドに前記自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された融合ペプチドの製造方法を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、細胞浸透性が優れており、脂肪分解効果およびその持続性に優れた、ヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドに前記自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された融合ペプチドを有効成分として含む経皮性体脂肪減量化粧品組成物を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記のような目的を達成するために、本発明はヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドに自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された融合ペプチド（Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ）を提供する：
【０００９】
【化２】
2005506383.tif 000002
【００１０】
前記式で、［］Ｔａｔは自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドであって、Ｒ１はグルタミン、リシン、アルギニンおよびグリシンの側鎖からなる群より１種以上選択され、ｎは４〜１２の整数であり、
［］ｈＰＴＨＤＰはヒトの副甲状腺ホルモンに由来するペプチドであって、配列番号１に示されるペプチドのうち連続的な３〜３４個のアミノ酸からなるペプチドであり、Ｒ２は前記ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖であり、ｍは３〜３４の整数である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、下記の化学式１で示される、ヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドに自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合された融合ペプチド（Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ）を提供する。
【００１３】
【化３】
2005506383.tif 000003
【００１４】
前記式で、［］Ｔａｔは自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドであって、（）ｎ内の化学式はアミノ酸配列を示しており、Ｒ１はグルタミン、リシン、アルギニンおよびグリシンの側鎖からなる群より１種以上選択されたものであり、ｎは４〜１２の整数である。
【００１５】
前記式において、［］ｈＰＴＨＤＰはヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドであって、配列番号１に示されたペプチドのうち連続的な３〜３４個のアミノ酸からなるペプチドであり（ｍ＝３〜３４）、好ましくは配列番号１に示されたペプチドのうち連続的な３〜１１個のアミノ酸からなるペプチドであり（ｍ＝３〜１１）、例えば配列番号２のペプチドまたは配列番号３のペプチドの全部または一部を含むペプチドであり、さらに好ましくは配列番号３のペプチド（ｍ＝６）、配列番号５のペプチド（ｍ＝５）、または配列番号６のペプチド（ｍ＝３）であり、Ｒ２は前記ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖であり、ｍは３〜３４範囲の整数である。
【００１６】
前記ヒトの副甲状腺ホルモンのアミノ酸１〜３４番までの配列は次の通りであり、この配列はまた、配列番号１に示される。
【００１７】
配列番号１：
Ｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃ
本発明に用いられたヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチド（ｈＰＴＨＤＰ）は、下記の化学式２で示される：
【００１８】
【化４】
2005506383.tif 000004
【００１９】
ヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドは、配列番号１に示されたペプチドのうち連続的な３〜３４個のアミノ酸からなるペプチドであり（ｍ＝３〜３４）、好ましくは配列番号１に示されたペプチドのうち連続的な３〜１１個のアミノ酸からなるペプチドであり（ｍ＝３〜１１）、例えば配列番号２のペプチドまたは配列番号３のペプチドの全部または一部を含むペプチドであり、さらに好ましくは配列番号３のペプチド（ｍ＝６）、配列番号５のペプチド（ｍ＝５）、または配列番号６のペプチド（ｍ＝３）であり、Ｒ２は前記ペプチドの側鎖であり、ｍは３〜３４範囲の整数である。
【００２０】
より具体的には、ヒト副甲状腺ホルモン由来のペプチドは配列番号１番に示されたペプチドの全部または一部を含むか、アミノ酸１〜１０番である配列番号２のペプチド（ｈＰＴＨ１￣１０，Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｖｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ）、アミノ酸９〜１９番である配列番号３のペプチド（ｈＰＴＨ９−１９，Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）、アミノ酸１〜６番である配列番号４のペプチド（ｈＰＴＨ１−６，Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ）、アミノ酸１２〜１６番である配列番号５のペプチド（ｈＰＴＨ１２−１６，Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ）、またはアミノ酸１２〜１４番である配列番号６のペプチド（ｈＰＴＨ１２−１４，Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ）を含む。
【００２１】
最近、様々な人体の疾患が、細胞蛋白質の非正常的な活性に起因するという事実により、これら蛋白質の活性を調節することによって、致命的な人体疾患を治療可能な物質を開発することが全世界的に関心の対象となっている。しかし、ペプチドや蛋白質は、他の化合物に比べて生理作用に対する選択性と効用性が非常に優れていることにもかかわらず、細胞内部への直接伝達が難しいという短所を有しているため、効果的な薬物伝達手段としての実用化が難しいというのが実情であった。
【００２２】
前記のような問題を解決するために、最近は、重要な生理活性を有する様々な生体機能蛋白質を細胞内に効率的に浸透させる蛋白質浸透技術（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を利用することによって、人体疾患治療に必要な物質を、直接的かつ効率的に伝達または吸収させることができるようになった。前記蛋白質浸透技術としては、自己浸透信号（ｓｅｌｆ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を有するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓｔｙｐｅ−１）が有する蛋白質の一種であるＴａｔペプチドが、自発的に細胞膜を通過して容易に細胞内に浸透および移動する特性を利用する場合が代表的である。このような機能は、Ｔａｔペプチド配列の中間部位である蛋白質形質導入部位（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）の特性により現われ、まだその正確なメカニズムは知られていない状態である（Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，  Ｃ．  Ｏ．  （１９８８）  Ｃｅｌｌ  ５５，  １１８９−１１９３．  Ｇｒｅｅｎ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｐ．  Ｍ．  （１９８８）  Ｃｅｌｌ  ５５，  １１７９−１１８８．  Ｍａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｎａｔｈ，  Ａ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１，  ２４９５−２４９９．  Ｖｉｖｅｓ，  Ｅ．，  Ｂｒｏｄｉｎ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １６０１０−１６０１７）。
【００２３】
本発明者は前記のようなＴａｔペプチドの細胞浸透特性に注視して研究した結果、ヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドのような皮膚活性成分を、自己浸透信号を有するＴａｔペプチドに化学的に共有結合させることによって、その融合ペプチドを皮膚内細胞に直接的かつ効率的に浸透させる事実に基づいて本発明を完成した。
【００２４】
本明細書で用いられた自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドは、Ｔａｔペプチドそれ自体またはこれに由来するペプチドを意味しており、前記Ｔａｔペプチドまたはこれに由来するペプチドは、それのみで、またはこれと結合された物質と組合わせて細胞浸透性を有するペプチドを言う。
【００２５】
具体的には、ＨＩＶ  Ｔｙｐｅ−１（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）のＴａｔペプチドの主要な特徴は、全蛋白質のうちＮ−末端におけるペプチド配列部位が浸透しようとする細胞の脂質膜を開ける信号を持っているということであり、その配列は次のようであり、この配列はまた、配列番号７に示される。
【００２６】
配列番号７：
Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（またはＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）
自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドは、リシン（以下、ＬｙｓまたはＫという）、アルギニン（以下、ＡｒｇまたはＲという）、グルタミン（以下、ＧｌｎまたはＱという）などのアミン基とカルボキシル基を有するアミノ酸から構成されているため、アルコールとの反応を通じてカルボキシル基とのエステル化反応で、ヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドに結合させることができる。本発明の代表的な自己細胞浸透性Ｔａｔペプチド（ｎ＝９）としては、配列番号７のＴａｔペプチド（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、配列番号８のＴａｔペプチド（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓまたはＫＫＫＫＫＫＫＫＫ）、配列番号９のペプチド（Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）などがあり、これらはｈＰＴＨＤＰと縮合反応で化学的に結合できる。
【００２７】
前記自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドは下記の化学式３で示される：
【００２８】
【化５】
2005506383.tif 000005
【００２９】
前記Ｒ１はグルタミン（Ｇｌｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ：Ｇｌｙ）の側鎖からなる群より選択された１種以上の置換基である。前記Ｔａｔペプチドは４〜１２個のアミノ酸からなるペプチドであり、さらに好ましくはリシンおよびアルギニンからなる群より選択された１種以上のアミノ酸からなるペプチドである。さらに、前記化学式３におけるｎは４〜１２の整数であり、さらに好ましくは８〜１０であり、最も好ましくは９である。
【００３０】
本発明は、自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドにヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチド（ｈＰＴＨＤＰ）を結合させた融合ペプチド（Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ）を製造する方法を提供する。
【００３１】
さらに詳しくは、本発明のＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドは下記のような方法で製造できる。
【００３２】
第一の方法は、組換え発現ベクターを利用する生物学的方法であって、（ａ）ＨＩＶ−１Ｔａｔ遺伝子が含まれている発現ベクターであるｐＳＶＣ２１から、自己浸透信号領域を有するＮ−末端部位（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）を６個のヒスチジンタグ（６Ｈｉｓ  ｔａｇ）が含まれた蛋白質発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）であるｐＥＴベクターに、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）技法を利用してＨＩＶ−１のＴａｔ遺伝子をクローン化し、融合蛋白質の形態に発現させることができるベクターを製造する段階と、そして（ｂ）前記ｐＥＴ−Ｔａｔ発現ベクターを利用して、大腸菌内での再結合Ｈｉｓ−Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰペプチドの形態に大量発現させた後、純粋分離精製する段階を含むＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドの製造方法である。
【００３３】
第二の方法は、ｐＥＴ−Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ発現ベクターに目標蛋白質、例えばカタラーゼまたはスーパーオキシドジスミュターゼ（ＳＯＤ）などを導入して、Ｈｉｓ−Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ目標蛋白質の融合蛋白質で大量発現させ、次いで純粋分離精製する段階を含むＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドの製造方法である。
【００３４】
第三の方法は、ペプチド合成用有機合成機器を利用して純粋なＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドを合成する方法である。このＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドの製造法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相ペプチド合成法で（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５，  ２１４９−２１５４（１９６３））、ＡＢＩ社のペプチド合成器を（Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａ）を利用してグルタミン（Ｇｌｎ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびグリシン（Ｇｌｙ）からなる群より１種以上選択したアミノ酸を有するＴａｔペプチドを含むＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドのアミノ酸のＣ−末端とＮ−末端の反応性を有するモノマーを縮合反応させて合成した。
【００３５】
固相合成は、α−アミノ基が保護されたアミノ酸を、適当な樹脂（レジン）にカルボキシル末端でカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）させることで始まる。この時、α−アミノ基が保護されたアミノ酸をヒドロキシメチル樹脂やクロロメチルレイテッド樹脂にエステル結合でカップリングさせる。α−アミノ基を保護する基としては、Ｆｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ  ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）やＢｏｃ（ｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）を使用し、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ酸はＰｈａｒｍａｃｉａ社あるいはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社を通じて購入した。アミノ酸残基が反応性のあるアミノ酸は、例えばＡｒｇ残基のアミノ基やＧｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎの反応性残基が使用されたり、トリチル（Ｔｒｔ）、４−メトキシ−２，３、トリメチルベンゼンスルファニル（ＭＲＴ）、ターシャリ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）のような適当な基で保護されたＦｍｏｃ−アミノ酸を利用する。ペプチド合成は固体支持体レジンについているペプチド鎖のアミノ末端に、α−アミノ基が保護されたアミノ酸を活性化した後、順次カップリングさせる。合成が終わればレジンからペプチドを切断し、保護基はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のような試薬で除去する。ペプチドは、ＴＦＡ溶液からろ過や遠心分離またはジエチルエーテルで抽出して分離し、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）や他の方法で精製することができる。
【００３６】
本発明の製造方法によって製造された前記化学式１で示されるＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドは化学的な安定性、脂肪分解効果の持続性、および安全性が優れている経皮性体脂肪減量剤として用いることができる。これについての詳細な活性評価は実施例で述べる。
【００３７】
本発明は、前記化学式１で示される化合物を含有する経皮性体脂肪減量化粧品組成物を提供する。
【００３８】
本発明による組成物は、化学式１で示される化合物を０．０００００１〜５．０重量％を含有する。０．０００００１重量％未満である場合には、実質的な減量効果を期待するのが難しく、５．０重量％を超える場合には、化合物が製品の形状および製品の安定性によくない影響を与えることがあるためである。
【００３９】
本発明が適用できる化粧品の種類には特に制限がなく、通常の化粧品形状に全て適用することができる。例えば、本組成物は皮膚外用軟膏や、化粧水（ｔｏｎｅｒ）、ローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、美容液、パック、エマルジョン、オイルゲルなどの形状に製造することができる。ここで皮膚外用軟膏は、化学式１で示される化合物の有効成分の他に、ワセリン５０．０〜９７．０重量％、およびポリオキシエチレンオレイル−エーテルホスフェート０．１〜５．０重量％を含有するように製造され、柔軟化粧水はプロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類１．０〜１０．０重量％およびポリエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤０．０５〜２．０重量％を含有するように製造される。ローションおよび栄養クリームは、化学式１で示される化合物の有効成分以外に、スクアレン、ワセリン、オクチルドデカノールのようなオイル類５．０〜２０．０重量％、およびセタノール、ステアリルアルコール、パラフィンなどのワックス成分３．０〜１５．０重量％を含有し、美容液はグリセリン、プロピレングリコールなど多価アルコール類５．０〜３０．０重量％を含有する。マッサージクリームは、化学式１で示される化合物の有効成分以外に流動パラフィン、ワセリン、イソノニルイソノナノエートなどのオイルを３０．０〜７０．０重量％含有して製造され、パックはポリビニルアルコールを５．０〜２０．０重量％含有するピールオフ（ｐｅｅｌ  ｏｆｆ）パックまたは一般的な乳化型化粧品にカオリン、タルク、酸化亜鉛、二酸化チタンなどの顔料が５．０〜３０．０重量％含まれているウォッシュオフ（ｗａｓｈ  ｏｆｆ）パックの形状で製造される。
【００４０】
さらに、本発明の前記化学式１で示される化合物を含有する経皮性体脂肪減量化粧品組成物は、一般皮膚化粧品に配合される通常の成分、例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、顔料、防腐剤、香料などを必要なだけ適量配合することが可能である。
【００４１】
本発明の化合物の生理活性を確認するため、経皮吸収実験、皮膚刺激性実験、脂肪分解効果および減量効果試験を行った結果、本発明の化合物は優れた経皮吸収力を有し、脂肪分解効果、減量効果などに優れていることが立証された。本発明の化合物はその非刺激性、優れた活性、皮膚吸収力を有し、優れた減量効果を有するので、クリーム、ローション、ゲルなどの化粧品に添加して使用することができる。
【００４２】
以下に示される実施例により、本発明を詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明が以下の実施例に限られるわけではない。
【００４３】
【実施例】
実施例１：Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチド（ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＫＨ）の製造
（１）Ｔａｔ−ＰＴＨＤＰ融合ペプチドの製造
本発明に用いられたＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドは、ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＧＫＨ配列を有する１２個のアミノ酸からなるペプチドであり、ペプチド自動合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａ）を利用して固相ペプチド合成法で合成した。０．２５ｍｍｏｌのパラヒドロキシメチルフェニルオキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂（レジン）を、標準反応容器（３８ｍＬ）に入れて、合成しようとするペプチドのカルボキシ末端のＦｍｏｃ−アミノ酸を入れて合成を始めた。１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−アミノ酸が入っているカートリッジをカルボキシル末端アミノ酸からアミノ酸末端のアミノ酸まで配列順にガイドウエイに配列する。この時、カートリッジの金属蓋を除去して、最初と最後にはアミノ酸が入っていない空のカートリッジを置いた。
【００４４】
ペプチド合成は、ＡＢＩ社で開発した標準スケールＦｍｏｃカップリングプロトコルによって施行前にパラメーターを編集し、自動合成メニューによって施行した（ＡＢＩ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｊａｎ，  １９９２参照）。標準スケールＦｍｏｃを使用する時は、デプロテクション（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を、Ｎ−メチルピロリシン（ＮＭＰ）で希釈した２０％ピペリシンを使用して２１分間行い、ＮＭＰで９分間洗浄してカップリングを７１分間実施した。カップリングには、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）を使用し、それからさらに、ＮＭＰで７分間洗浄した。
【００４５】
（２）前記Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドの分離および精製
合成が完了した後、ＡＢＩ社マニュアル（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｐ６−１９（１９９０））を参考として、Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して固体支持体から分離した。具体的には、合成終了後、ペプチドがついたレジンを丸底フラスコに入れて冷凍させ、それから結晶フェノール０．７５ｇ、１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）０．２５ｍＬ、チオアニソール０．５ｍＬ、蒸溜水０．５ｍＬ、およびＴＦＡ１０ｍＬを入れ、蓋を閉じて室温で１〜２時間反応させた。反応が終わった後、レジンと反応液を、焼結（ｓｉｎｔｅｒｅｄ）ガラス漏斗を通じて低真空でろ過し、レジンとペプチド溶液を分離した。フラスコとガラス漏斗を、５〜１０ｍＬジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗って、この溶液をペプチド溶液と混合し、５０ｍＬ以上の冷たいジエチルエーテルを添加してペプチドの沈殿物を得た。この沈殿物を低真空で漏斗でろ過して、漏斗上に集められた沈殿物を乾燥した後、３０％酢酸に溶かして凍結乾燥した。このようにして得られたペプチドを、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製した。この時、カラムはＣ１８ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用し、緩衝溶液Ａは１０％アセトニトリル＋０．０５％ＴＦＡを使用して平衡化させ、緩衝溶液Ｂは８０％アセトニトリル＋０．０５％ＴＦＡを使用してペプチドを溶出した。その結果、高純度に精製されたペプチドが得られており、合成収率は３０．５％程度であった。
【００４６】
実施例２：脂肪分解効果試験
前記実施例１で製造されたＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドの経皮性体脂肪減量剤としての有用性を測定するために、脂肪分解効果を実験した。
【００４７】
脂肪分解能（ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ）評価は、脂肪分解時に脂肪細胞がグリセロールを分泌するという性質を利用した。この試験では前脂肪細胞（ｐｒｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）である３Ｔ３−Ｌ１細胞を利用した。３Ｔ３−Ｌ１細胞を、２４−ウェルプレートに２μｇ／ｍＬのインシュリン、２μｇ／ｍＬのデキサメサゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、１１１μｇ／ｍＬのイソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）で処理した培地で４８時間培養した後、２μｇ／ｍＬのインシュリンで処理された培地に９日間培養した。このように培養された３Ｔ３−Ｌ１細胞が脂肪細胞に分化されて、脂肪が細胞内に充分に蓄積された後、ここに本発明の化学式１で示される化合物を適用して２４時間培養した。
【００４８】
この時、対照群としては、試料を適用する代りに緩衝液だけを０．１ｍＬ添加し、比較群（ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、脂肪分解効果が優れた物質であると知られているイソプロテレノール（ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ）を利用した（Ｄａｗｎ  Ｌ．  Ｂｒａｓａｅｍｌｅ  ｅｔ．  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １４８３（２０００）２５１￣２６２）。その後、培養液５０μｌを混合して、３７℃で２４時間反応させ、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＢｅｃｋｍａｎＤＵ−７５００）を利用して、５４０ｎｍでの吸光度を測定して脂肪分解増加率を計算した。増加率を算定する式は、下記のようであり、その結果は表１の通りである。
【００４９】
増加率（％）＝Ａ−Ｂ／Ａ×１００
Ａ：増加剤が添加されていないものの５４０ｎｍでの吸光度
Ｂ：増加剤が添加されたものの５４０ｎｍでの吸光度
【００５０】
【表１】
2005506383.tif 000006
【００５１】
実験の結果、本発明に用いられた化学式１で示される化合物は、１０−５Ｍの濃度で４３％の増加率であり、ホルモン製剤であるイソプロテレノールと同様な脂肪分解効果を有していることが分かった。
【００５２】
実施例３：減量効果についての臨床実験
減量効果を知るために、大腿部に局部肥満またはセルライト（ｃｅｌｌｕｌｉｔｅ）がある１８〜４６才の健康な成人女性５名を対象として臨床実験を行った（Ｍｅｔｈｏｄｏｆ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｒｒｉｔａｎｔ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ３８（１８７）：ｐｐ１５００−１５４１）による。
【００５３】
試料は、前記実施例１で製造された融合ペプチドを水中油型乳化物（Ｏ／Ｗ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）として製造して試験した。一方の足には対照群（試料のない水中油型乳化物）を、他の足には本発明の化学式１で示される化合物を含む水中油型乳化物を一ヶ月間塗布した後、脂肪層の厚さを映像分析機で定量化した。
【００５４】
実験の結果、本発明に用いられた化学式１で示される化合物は１８％の脂肪層減少を示し、減量効果が優れていることが確認できた。
【００５５】
実施例４：経皮吸収（皮膚細胞内浸透）実験
前記化学式１で示される化合物の皮膚細胞内浸透は、通常、経皮吸収というので、本明細書でも経皮吸収と通称する。経皮吸収実験は、実施例１で製造された融合ペプチドを使用して実験した。（参考文献：ＬｅｈｍａｎＰＡ，  Ｓｌａｔｔｅｒｙ  ＪＴ，  Ｆｒａｎｚ  ＴＪ．  Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ：  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｖｅｈｉｃｌｅ，  ｌｉｇｈｔ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ，  ａｎｄ  ｄｏｓｅ，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  ９１；５６−６１，  １９８８）。
【００５６】
具体的には、８週令の雌ヌードマウスの背部位皮膚を１．７ｃｍ２の大きさに切って、前記融合ペプチドを塗布した。２４時間後、経皮吸収測定機器（Ｆｒａｎｚ  ｃｅｌｌ）を利用して、受容体溶液とマウスの背部位皮膚に吸収された物質を抽出して、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）と液体マスクロマトグラフィ（ＬＣ  ｍａｓｓ）で定量分析し、化学式１で示される本発明の化合物が経皮吸収された量を定量した。実験の結果、本発明に用いられた化学式１で示される化合物の経皮吸収率が優れていることが分かった。
【００５７】
実施例５：Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドのアレルギーテスト（ＬＬＮＡ）
化粧品原料としての化学式１で示される化合物に対する安全性実験としては、運搬媒介物としてエタノールを使用する実験法を選択した［参考文献：Ｋｉｍｂｅｒ  （１９９０）：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄ  ｅａｓｓａｙ，Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １０（３）；１７３−１８０］。化学式１で示される化合物を各々０．５％、１．０％溶液で製造した。具体的には、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の両耳に５０μｌずつ３日間塗った後、マウスから耳のリンパ節（ａｕｒｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）を分離した。リンパ節を粉砕して単一細胞状態にした後、放射性同位元素である［３Ｈ］−メチルチミジン（［３Ｈ］−ｍｅｔｈｙｌ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を添加して２４時間培養した後、β−シンチレーション計数器（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ  ６０００  ＴＡ，ＵＳＡ））を利用して細胞の増幅度（ｄｐｍ，  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）を測定した結果、本発明に用いられた化学式１で示される化合物は対照群に比べて低いアレルギー誘発可能性を示した。
【００５８】
実施例６：Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドの皮膚刺激性試験
前記化学式１で示される化合物の皮膚刺激性試験のために、モルモット（Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇ）を利用した貼布試験（ｐａｔｃｈ  ｔｅｓｔ）を行った［参考文献：▲１▼Ｄｒａｉｚｅ，  Ｊ．  Ｈ．  （１９５９）：  Ｄｅｒｍａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  ｏｆｆｉｃｉａｌｓ，  ＵＳ．  Ａｐｐｒａｉｓａｌｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ，  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ．，  ｐｐ４６−５９，  Ｔｅｘａｓ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｔｅｘａｓ．  ▲２▼Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ（１９７３）：  Ｍｅｔｈｏｄｏｆ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｒｒｉｔａｎｔ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ３８（１８７）：  ｐｐ１５００−１５４１］。試料は、前記化学式１で示される化合物を多様な濃度で水中油型乳化物として製造して試験した。
【００５９】
まず、試料塗布部位である背部位の毛を除去し、皮膚刺激を最少化するために２４時間環境適応させた。それから、試料塗布部位を設定（１．５ｃｍ×１．５ｃｍ）し、試料とガーゼをそこに当てて試料の蒸発および損失を防止するために固形材質の薄紙で密封した後、弾力性のある包帯で４８時間固定した。閉鎖貼布を除去した後、２時間、２４時間後（貼布後、５０時間、７２時間）に炎症の程度を判定し、炎症指数（ＰＩＩ：ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）と炎症度を表２に示した。
【００６０】
【表２】
2005506383.tif 000007
【００６１】
前記表２から、本発明に用いられた化学式１で示される化合物は皮膚に非常に安全であることが確認できた。
【００６２】
実施例７：Ｔａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチドの細胞毒性試験
化粧品に用いられる原料としての１次安全性を検証するために、化学式１で示される化合物に対してＶ７９−４細胞（チャイニーズハムスター、肺組織繊維芽細胞の連続細胞株）を培養してＭＴＴ試験［参考文献：Ｍｏｓｓａｍａｎ  Ｔ．  （１９８３）．  Ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ＆  ｓｕｒｖｉｖａｌ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＆  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５，  ５５−６３］を行って毒性を試験した結果、化学式１で示される化合物は０．１の濃度（％、ｗ／ｖ）以上では次第に非常に弱い毒性を示し、０．０１以下の濃度（％、ｗ／ｖ）ではほとんど毒性を示さないことが分かった。
【００６３】
【発明の効果】
本発明は、ヒトの副甲状腺ホルモン由来のペプチドに自己浸透信号を有する自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドが結合されたＴａｔ−ｈＰＴＨＤＰ融合ペプチド、そしてこれを含む経皮性体脂肪減量剤を提供する。本発明の減量剤は、自己細胞浸透性Ｔａｔペプチドの存在により、従来のｈＰＴＨＤＰに比べて皮膚に対する吸収力が優れており、非刺激性で優れた脂肪分解効果およびその効果の持続性を有する長所が
【国際公開パンフレット】
2005506383.tif 000009
2005506383.tif 000010
2005506383.tif 000011
2005506383.tif 000012
2005506383.tif 000013
2005506383.tif 000014
2005506383.tif 000015
2005506383.tif 000016
2005506383.tif 000017
2005506383.tif 000018
2005506383.tif 000019
2005506383.tif 000020
2005506383.tif 000021
2005506383.tif 000022
2005506383.tif 000023
2005506383.tif 000024
2005506383.tif 000025
2005506383.tif 000026
2005506383.tif 000027
2005506383.tif 000028
2005506383.tif 000029
2005506383.tif 000030
2005506383.tif 000031
2005506383.tif 000032
2005506383.tif 000033
2005506383.tif 000034
2005506383.tif 000035
2005506383.tif 000036
2005506383.tif 000037
2005506383.tif 000038
【国際調査報告】
2005506383.tif 000039
2005506383.tif 000040