(57)【要約】エアロゾル化サブスタンスPを用いて主流煙または副流煙のタバコの煙の影響を緩和することができる。煙の機能的、構造的、遺伝的、臓器限定、および全身作用は、サブスタンスP処置によって緩和される。
2005537322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、タバコの煙によって引き起こされた障害を改善または予防する方法：
生物活性類似体が、[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスP、および[Sar9,Met(02)11]-サブスタンスPからなる群より選択される、タバコの煙に曝露されている、またはされるであろう被験者にエアロゾル吸入によってサブスタンスPまたはその生物活性類似体を投与する段階。
【請求項２】
被験者がタバコの煙に曝露されている、請求項1記載の方法。
【請求項３】
被験者がタバコの副流煙に曝露されている、請求項1記載の方法。
【請求項４】
被験者がサブスタンスPのエアロゾル吸入後にタバコの煙に曝露される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
サブスタンスPが0.1〜10 μMで投与される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
サブスタンスPが0.5〜5 μMで投与される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
タバコの煙がタバコの副流煙である、請求項4記載の方法。
【請求項８】
タバコの煙がタバコの主流煙である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
サブスタンスPが被験者の骨髄細胞における微小核形成を防止するために十分な量で投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
サブスタンスPが被験者の血液細胞において微小核形成を防止するために十分な量で投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
サブスタンスPが動肺コンプライアンスを増加させるために十分な量で投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
サブスタンスPが気道の上皮細胞の基底膜に対する障害を予防する、または障害を治療するために十分な量で投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
以下を含む、タバコの煙によって引き起こされた障害を改善または予防する方法：
生物活性類似体が、[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスP、および[Sar9,Met(02)11]-サブスタンスPからなる群より選択される、タバコ、葉巻タバコ、または他の喫煙製品のフィルターを通してサブスタンスPまたはその生物活性類似体を被験者に投与する段階。
【請求項１４】
サブスタンスPが被験者の骨髄細胞において微小核形成を防止するために十分な量で投与される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
サブスタンスPが被験者の血液細胞において微小核形成を防止するために十分な量で投与される、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
サブスタンスPが動肺コンプライアンスを増加させるために十分な量で投与される、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
サブスタンスPが気道の内皮細胞の基底膜に対する障害を予防または障害を治療するために十分な量で投与される、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
以下を含む、タバコの煙によって引き起こされた障害を改善または予防する方法：
生物活性類似体が、[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスP、および[Sar9,Met(02)11]-サブスタンスPからなる群より選択される、タバコの煙に曝露されている、または曝露されるであろう被験者にガムまたはトローチ剤によってサブスタンスPまたはその生物活性類似体を投与する段階。
【請求項１９】
被験者がタバコの煙に曝露されている、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
被験者がタバコの副流煙に曝露されている、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
被験者がガムまたはトローチ剤の投与後にタバコの煙に曝露される、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
サブスタンスPが0.1〜10 μMで投与される、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
サブスタンスPが0.5〜5 μMで投与される、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
タバコの煙がタバコの副流煙である、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
タバコの煙がタバコの主流煙である、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
サブスタンスPが被験者の骨髄細胞における微小核形成を防止するために十分な量で投与される、請求項18記載の方法。
【請求項２７】
サブスタンスPが被験者の血液細胞において微小核形成を防止するために十分な量で投与される、請求項18記載の方法。
【請求項２８】
サブスタンスPが動肺コンプライアンスを増加させるために十分な量で投与される、請求項18記載の方法。
【請求項２９】
サブスタンスPが気道の上皮細胞の基底膜に対する障害を予防する、または障害を治療するために十分な量で投与される、請求項18記載の方法。
【請求項３０】
サブスタンスPまたはその生物活性類似体を含むタバコのフィルター。
【請求項３１】
サブスタンスPまたはその生物活性類似体を含むガムまたはトローチ剤。
【請求項３２】
以下を含む、タバコの煙によって引き起こされた障害を改善または予防する方法：
生物活性類似体が、[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスP、および[Sar9,Met(02)11]-サブスタンスPからなる群より選択される、分泌型サブスタンスPまたはその生物活性類似体をコードするポリヌクレオチドをヒトまたは動物に投与する段階。
【請求項３３】
被験者がタバコの煙に曝露されている、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
被験者がタバコの副流煙に曝露されている、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
サブスタンスPが被験者の骨髄細胞における微小核形成を防止するために十分な量で分泌される、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
サブスタンスPが被験者の血液細胞において微小核形成を防止するために十分な量で分泌される、請求項32記載の方法。
【請求項３７】
サブスタンスPが動肺コンプライアンスを増加させるために十分な量で分泌される、請求項32記載の方法。
【請求項３８】
ポリヌクレオチドがウイルスベクターによって投与される、請求項32記載の方法。
【請求項３９】
ポリヌクレオチドが鼻から投与される、請求項32記載の方法。
【請求項４０】
ポリヌクレオチドが吸入によって投与される、請求項32記載の方法。
【請求項４１】
ポリヌクレオチドが肺に投与される、請求項32記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が特に参照として本明細書に組み入れられる、2002年8月27日に提出された米国特許仮出願第60/406,036号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌および肺疾患の分野に関する。特に、本発明は、タバコの煙の曝露によって引き起こされるそのような疾患に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
環境中の有毒物質は、曝露された個体の多くの生理系に有意な影響を及ぼす可能性がある。例えば、肺における免疫コンピテンスの有意な変化は、短期間であっても、曝露された宿主に関して重篤な結末を有する可能性があり、これは特に肺細胞の障害と組み合わさった場合には、感染物質に対する感受性に影響を及ぼす可能性がある。肺および免疫機能における主要な変化が長時間持続する場合、癌および他の病的状態が発生および／または進行する可能性が増加することがある。タバコの煙は直接または間接（すなわち、傍観者、副流煙、SSCS）であれ、そのような一つの環境有毒物質である。タバコの煙に対する直接および間接的な曝露はいずれも、肺に障害を与えることが知られており、個人を肺癌および肺気腫に発症しやすくする（1）。
【０００４】
C57Bl6マウスに環境中の炭化水素（すなわち、ジェット燃料）の低濃度を短期間（7日）曝露すると、肺および免疫系に強くかつ有意な変化が起こる（2〜12）。その上、炭化水素の曝露によって、肺の気管支肺胞液におけるサブスタンスPの枯渇が起こる（13）。サブスタンスPは、気道の反応性（14）および肺上皮細胞の完全性（15）に関係する分子である。
【０００５】
サブスタンスP（SP）は、ヒトを含むいくつかの種の気道における神経に局在する天然に存在する低分子量ペプチド（アミノ酸11個）である（16,17）。サブスタンスPは、NK-1タキキニン受容体を選択的に活性化する（18）。SPを注入または吸入によってインビボで投与しても、他のタキキニンとは対照的に気管支収縮を誘導しない（19）。内因性の肺SPがカプサイシンの注射によって枯渇している実験では（9）、呼吸器系に及ぼす炭化水素曝露の影響はより重度であることが観察された。特に、ジェット燃料に曝露された動物に投与されたエアロゾル化SPによって、結果としての病的な肺の影響（20）およびジェット燃料曝露の免疫毒性学的作用（4,7）の多くが逆転および／または予防された。曝露された動物を保護するためには、1 μM SPもの低い濃度を炭化水素曝露後に15分という短時間投与することで十分であった。
【０００６】
タバコの煙は、喫煙者および非喫煙者の双方に対して健康のリスクを与える。バーおよび公共の建物の出入り口のような煙の多い環境にいる人が受ける副流煙の煙は、肺の機能および構造の悪化を引き起こし、癌の前駆体である遺伝子の変化を引き起こしうる。
【０００７】
人の体に及ぼすタバコの煙の影響を改善する予防的および治療的治療が当技術分野において必要である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の簡単な概要
本発明の一つの態様において、タバコの煙によって引き起こされる障害を改善または予防する方法が提供される。サブスタンスPまたはその生物活性類似体を、タバコの煙に曝露されるまたは曝露されるであろう被験者にエアロゾル吸入によって投与する。生物活性類似体は、[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスP、および[Sar9,Met(02)11]-サブスタンスPからなる群より選択される。
【０００９】
本発明の第二の態様において、サブスタンスPまたはその生物活性類似体がタバコに取り付けたまたは取り付け可能なフィルターを通して投与される、タバコの煙によって引き起こされる障害を改善または予防する方法が提供される。
【００１０】
本発明の第三の態様において、サブスタンスPまたはその生物活性類似体がガムまたはトローチ剤によって投与される、タバコの煙によって引き起こされる障害を改善または予防する方法が提供される。
【００１１】
本発明の第四の態様は、サブスタンスPまたはその生物活性類似体を含むタバコのフィルターである。
【００１２】
本発明の第五の態様は、サブスタンスPまたはその生物活性類似体を含むガムまたはトローチ剤である。
【００１３】
本発明の第六の態様において、分泌型サブスタンスPタンパク質またはその生物活性類似体をコードするポリヌクレオチドがポリヌクレオチドによってヒトまたは動物に投与される、タバコの煙によって引き起こされる障害を改善または予防する方法が提供される。
【００１４】
発明の詳細な説明
サブスタンスPまたはその生物活性類似体のエアロゾル投与によって、タバコの煙によって破壊された様々なタイプの損傷を改善または予防できることは本発明者らの発見である。煙は主流煙または副流煙となりうる。サブスタンスPの正の作用が認められる損傷のタイプには、動肺コンプライアンス、気道の上皮細胞の基底膜構造、および微小核形成が含まれる。
【００１５】
エアロゾル化は、サブスタンスPを哺乳類被験者に投与する非常に有効な手段であることが判明している。しかし、当技術分野で既知であるように、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、および動脈内投与のような他の手段も代用手段として用いることができる。典型的に、これらは、注射によって行われるが、経皮吸収のような他の輸送手段も同様に用いることができる。さらに、輸送は、タバコ、葉巻タバコ、パイプ、もしくは他の喫煙製品のフィルターを通して、またはガムもしくはトローチ剤によって行ってもよい。当技術分野で既知であるそのような如何なる手段も応用することができる。
【００１６】
サブスタンスP（RPKPQQFFGLM-NH2）（配列番号：1）またはその任意の生物活性類似体を、本発明の方法において用いることができる。これらには：[Met-OH11]-サブスタンスP、[Met-OMe11]-サブスタンスP、[Nle11]-サブスタンスP、[Pro9]-サブスタンスP、[Sar9]-サブスタンスP、[Tyr8]-サブスタンスP、[p-Cl-Phe7,8]-サブスタンスP、および[Sar9,Met(02)11]-サブスタンスPが含まれるがこれらに限定されない。後者の類似体が特に好ましい。本発明に従う生物活性類似体は、SP受容体（NK-1受容体）に結合することによってSPの競合的阻害として作用する類似体である。当技術分野で既知であり、市販されている（例えば、シグマ（Sigma）から）他の誘導体を用いることができる。さらに、サブスタンスP断片および誘導体化サブスタンスP断片も同様に用いてもよい。アミノ酸残基1〜8個、および好ましくはアミノ酸残基1〜3個の置換、欠失、または挿入によって、生物活性に関して一般的に試験されうる類似体が得られるであろう。さらに、同じアミノ酸骨格を保持しながらSP上の官能基を改変してもよい。この場合、日常的な試験によって、そのような改変のどれが生物活性に負の影響を及ぼすか否かが決定されるであろう。
【００１７】
エアロゾルによって投与されるサブスタンスPまたはその生物活性類似体の典型的な濃度範囲は、0.001〜10 μMである。0.05〜5 μMの範囲の濃度が特に有用である。これは、濃度約0.1〜10 μMの液体として都合よく投与することができる。これは濃度約0.1〜10 μMの葉巻タバコのフィルターによって投与してもよい。これはまた、ガムまたはトローチ剤によって約0.1〜10 μMの濃度で投与してもよい。
【００１８】
本発明のエアロゾルを投与するための適した装置には、ネブライザーと共に携帯型の「パッファー」装置が含まれる。上記のように、フィルターも同様に用いることができる。フィルターは、当技術分野で既知の任意の方法に従って作製することができる。フィルターには、例えば天然または合成フィルターを用いることができる。フィルターに、サブスタンスPを含浸することができる。本発明に従う治療にとって適した治療レジメには、エアロゾルによる毎日の治療が含まれる。他の治療様式には、連続経皮注入、静脈内注射、皮下注射、および経口投与が含まれる。サブスタンスPの投与に適した製剤は、薬学的に許容され、サブスタンスPがその生物活性を保持している任意の製剤である。一般的に、そのような製剤は、通常の生理食塩液に溶解したサブスタンスPである。
【００１９】
実施例
タバコの煙に対する曝露に起因する肺および免疫障害に及ぼすエアロゾル化サブスタンスP（SP）の短期間（15分）の低濃度（pM〜μM）処置の効果を評価するために行った実験において、タバコの煙に対する曝露によって、いくつかの方法によって評価した肺における病理的変化のみならずDNA微小核の形成が起こることが認められた。全ての場合において、SP治療によって、そのような肺障害の発生率／重症度が予防または減少する。さらに、実験的肺腫瘍モデルにおけるマウスのSP治療（予防的または治療的のいずれか）によって、肺腫瘍の発生率は減少して、動物の生存が延長する。このように、SP治療はタバコの煙に対する曝露に関連した病的な結果を予防および／または治療するために有用である。
【００２０】
SSCSに対する曝露後のエアロゾル化SPによるSSCS-曝露動物の治療も同様に、このタイプの環境有毒物質に対して保護する。SPによる同時治療も同様に保護的であり、この場合もSPは、タバコの煙に対する曝露に関連して予防および治療効果の双方を有することが証明された。上皮障害の阻害および正常な動肺コンプライアンスの維持によって測定したところ、SPが、SSCS暴露後の肺の細胞完全性および機能を維持することは明らかである。有意に、動肺コンプライアンスの喪失および肺気道における基底膜に対する障害は、タバコの煙に対する曝露の量および期間に相関し、肺気腫の発症および悪性疾患の誘導に相関する（19,24）。SP処置はまた、SSCS曝露動物から得た細胞において微小核誘導を防止する。そのような遺伝子障害は、発癌の初期段階に相関する（19,24）。最後に、SP処置は、肺腫瘍形成の阻害能（そしてこれまでの研究；7,10における損傷した免疫機能の回復能）、および肺の免疫防御メカニズムの活性化能（すなわち、PAMによるサイトカイン分泌）によって示されるように、肺の免疫系を活性化するように思われる。これらの後者の知見は、SPの抗腫瘍作用を部分的に説明するために役立つ可能性がある。実際に、SPは、生得の免疫系のみならず養子免疫系を活性化することが他の研究においても示されている（15）。
【００２１】
実施例1：エアロゾル化サブスタンスPはタバコの煙によって誘導された肺の細胞障害を減弱する
C57Bl/6（B6、ジャクソン（Jackson）研究所）マウスを利用した。8〜12週齢、体重25〜35 gのマウスを用いた。雌性動物のみを利用した。動物は全て、アリゾナ大学健康科学センターの動物資源部の動物施設に収容した。動物は、AAALACによって承認されたプロトコールにおいて使用した。
【００２２】
エアロゾル曝露は、DeVilbiss Ultra-Nebネブライザー（モデル099HD、サマセット、ペンシルバニア州）を用いて行った。既に記述されているチューブ（12）と類似の投与チューブを個々の被験体において保持しながら、動物に鼻からによってのみ曝露した。チューブは、円錐形の鼻に適合して共通の曝露チャンバー（容積0.0027 m3、IN-TOX、アルバカーキ（Albuquerque）、ニューメキシコ州）に由来する受容アダプターに接続していた。グルーミングの際の有毒物質の摂取を最小限にして、職業的曝露をより厳密に模倣するために、鼻からのみの曝露を用いた。曝露の変数としての有毒物質源に対する距離を最小限にするために、曝露チャンバー上での24のアダプターの位置によって、動物の場所を毎日交代させた。曝露の濃度は、プレート重量の変化から7段階カスケードインパクター（IN-TOX）によって決定し、各暴露後直ちに測定した。カスケードインパクタープレートの重量を、電子分析天秤（メトラーインストルメントコーポレーション（Mettler Instrument Corp.）、ハイツタウン、ニュージャージー州）において測定した。試料は二つの最も重いプレート沈着物から採取して、これを各暴露後にガスクロマトグラフ（GC）分析のために用いた。GC分析は、エアロゾル対蒸気質量比（A/V）を決定するために偽曝露の際に同時に得られた炭素ビーズ吸着を有する総プレート沈着物を比較するために用いた。繰り返し試験を通して、A/Vは、1.2〜1.8（平均+1.5）の範囲で再現可能であることが判明した。燃料源とは反対の側の曝露チャンバーに、真空を適用した。用いていない曝露口は、曝露期間のあいだ密封した。相対湿度、温度、および大気圧の毎日測定を、曝露時によって行い、段階的減少技術によって有毒物質濃度における変動の有意な原因として除外した。これまでの実験から、1時間の曝露期間の曝露濃度が一定であること、および7日間に及ぶ曝露の変動が曝露濃度のSEMによって測定して10％未満であったことが証明された。偽曝露（対照）は、空気のみを曝露した動物からなった。
【００２３】
マウスを、既に記述したようにタバコの副流煙に曝露した（23）。簡単に説明すると、マウスを曝露室に入れて、1R4標準研究用巻きたばこからの副流煙に45分/日で7日間曝露した。巻きたばこに火をつけて環状クランプに上向きに置いて煙を漏斗に向けてチャンバーを通って分配させた（煙ったバーでのヒトの曝露を模倣するように設計された濃度で）。
【００２４】
サブスタンスP（SP）アゴニストである[Sar9,Met(O2)11-サブスタンスP]は、シグマケミカルズ（セントルイス、ミズーリ州）から得て、滅菌生理食塩液において溶解した後用いた。
【００２５】
マウスをSP類似体[Sar9,Met(O2)11-サブスタンスP]によって表記の用量で15分間処置した後、既に記述されたとおりにタバコの煙に曝露した（7,10）。遺伝子操作されたSP実験以外の全てのSP処置は、これまでに記述された曝露室を用いてエアロゾル経路によって行った。
【００２６】
組織および臓器のそれぞれに関して、可能であれば摘出後に微量天秤によって湿重量を測定した。臓器は、重量を測定する前に周辺組織および脂肪を注意深く除去した。臓器を単細胞浮遊液に処理した後（ホモジナイザーを用いて）、細胞数および生存率をトリパンブルー色素染色によって決定した。細胞浮遊液を密度勾配によって遠心後、細胞数および生存率を再度決定して、生存単核細胞を得たた。生存細胞のみを機能的アッセイにおいて用いた。
【００２７】
肺は、20 cm H2Oの一定圧で主動脈にイオン強度半分のカルノフスキー液を1時間注入することによって、形態学研究のために調製した。次に、固定組織を#4縫合糸で動脈のところで結紮した。南西部環境健康科学センター病理学中央研究所（The Pathology Core Laboratories of the Southwestern Environmental Health Science Center）が、病理変化に関して固定組織を評価した。固定組織を切片にして、脱水し、四酸化オスミウムにおいて後固定して、高解像度電子顕微鏡のために脱水してエポン-アラルダイトに抱埋した。切片をダイヤモンドナイフによって抱埋組織から切断して、200 μmの銅メッシュグリッドに載せて、クエン酸鉛および酢酸ウラニルによって二重染色した。フィリップスCM12電子顕微鏡を用いて組織を観察して写真を撮影した（最高倍率19,000倍）（21）。
【００２８】
マウスを塩酸ケタミン（80 mg/kg）、キシラジン（10 mg/kg）、およびマレイン酸アセプロマジン（3 mg/kg）によって麻酔した。気管切開を行って、テフロン静脈内カテーテルを挿入し（20ゲージ、クリチコン（Critikon）、タンパベイ、フロリダ州）、これを気管内チューブとした。マウスに圧調節呼吸を行い（ケント・サイエンティフィック（Kent Scientific）、リッチフィールド、コネチカット州）、自発呼吸を抑制するためにガラミン・トリエチオダイド（8 mg/kg）の腹腔内注射を行った。空気の流れを、示差圧変換器にカップリングさせた呼吸流量計（フレイシュ#0000、インストルメンテーションアソシエーツ（Instrumentation Associates）、ニューヨーク、ニューヨーク州）によって測定した（バリダイン（Validyne）、ノースリッジ、カリフォルニア州）。気流および圧シグナルを用いて動肺コンプライアンス、総肺コンプライアンス、および肺抵抗を測定した。これらの肺機能パラメータは、改変PEDS-LAB（メディカルアソシエーテッドサービス（Medical Associated Services）、ハトフィールド、ペンシルバニア州）肺機能システムによって測定した。肺機能測定は、個々の動物の体重に対して標準化した（21）。
【００２９】
タバコの副流煙に対するヒトの曝露の「煙ったバー」のシナリオを模倣するようにデザインされた濃度の1R4標準研究用巻きたばこからのSSCSを、動物に45分/日で7日間曝露した（巻きたばこに火をつけて、環状のクランプに上向きに置いて、煙を漏斗に向けて曝露チャンバーを通して分配させた）。副流煙は、いぶったタバコの燃焼温度が低いために、ヒトの喫煙者が吸うタバコの主流煙と比較しても非常に毒性であると見なされる。曝露後、数匹のマウスに1 μMのエアロゾル化SPを15分間処置した。1週間の終了時に、動物を屠殺して、電子顕微鏡分析のために肺を摘出した。図1に示すように、SSCSに対する曝露によって、これまでの報告と同様に、肺における基底膜の破壊が起こった（21）。しかし、SPによる処置によって、SSCS暴露後の肺上皮のそのような悪化は減弱した（図2）。気道の構造は、基底膜に結合した気道上皮細胞を特徴とする。もう一つの基底膜は、気道上皮細胞を繋ぎ止める働きをする。SSCS電子顕微鏡写真の特徴は、気道の構造の基底膜領域における腫脹および気道上皮の表面上の毛様体の喪失である。図1（SSCS）において、矢印1個は、SSCS曝露による肺胞上皮細胞の破壊を示すが、矢印2個は気道構造における二つの基底膜領域の腫脹を示す。図4（SSCS）において、矢印は、細胞の腫脹を示し、気道細胞のあいだに容易に同定可能な細胞膜を認めなかった。図2（SSCS＋SP）において、矢印は無傷の気道上皮を示し、気道構造の基底膜に腫脹を認めない。図3（SSCS＋SP）において、矢印は、気道細胞間の同定可能な細胞膜を示している。細胞の肺組成物におけるこれらの変化は、表1に示した肺コンプライアンスデータにおいて反映されている。すなわち、SSCSに対する曝露によって、肺コンプライアンスに有意な変化が起こったが、これは煙の曝露直後のSP処置によって予防／逆転された。
【００３０】
（表１）サブスタンスPによる、タバコの煙の曝露による肺機能の病理変化の防止
2005537322.tif 000003
【００３１】
マウスに上記のようにSSCS+/-SPを1週間曝露した。この期間の終了時、動物を麻酔して動肺コンプライアンスを記述のように測定した。対照動物は、空気に曝露して生理食塩液を処置したマウスからなった。データは、平均値+/-SEMとして表記する。p値は、SSCS群からの有意差を示す。
【００３２】
実施例2−サブスタンスP療法はタバコの煙の曝露によるDNA損傷を予防する
微小核形成の測定は、Fenech（3）に記述されたとおりに行った。簡単に説明すると、動物をタバコの煙+/-SP処置に曝露した。生存単核細胞を末梢血および骨髄から単離して、マイトゲンであるPHAによって44時間刺激して、サイトカラシンBによって28時間処置した。細胞遠心調製物を作製して、細胞を固定した後、微小核形成に関して1000倍で分析した。それぞれの調製物に関して細胞少なくとも1000個を分析した。
【００３３】
タバコの煙に対する曝露によって、悪性の細胞のトランスフォーメーションを引き起こしうる遺伝子変化が起こる（21,22）。動物に上記のようにSSCSを曝露して、7日後に屠殺した。生存単核細胞を末梢血および骨髄から単離して、マイトゲンPHAによって44時間刺激して、サイトカラシンBによって28時間処置した。細胞遠心調製物を調製して、細胞を固定した後、微小核形成に関して1000倍で分析した。それぞれの調製物に関して細胞少なくとも1000個を分析した。表2に示すように、SSCS曝露によって、曝露された動物の末梢血および骨髄の双方から単離された細胞において微小核形成の約10倍増加が認められた（偽曝露対照動物と比較して）。微小核形成が肺上皮の障害と組み合わさって起こると、肺気腫および癌のような病態が起こりうる（21）。SSCS曝露の直後にSP処置を行うと、血液および骨髄細胞の双方において対照動物と同等の微小核形成レベルが得られた。
【００３４】
（表２）サブスタンスPによる、タバコの煙による微小核形成の阻害
2005537322.tif 000004
【００３５】
マウスに表1に記述するようにSSCS+/-SPを曝露した。7日終了時に、動物を安楽死させ、骨髄および末梢血から生存細胞を単離した。最小で1000個における微小核形成の発生率を記述のように評価した。データは、微小核を示した表記の組織における細胞の百分率として表す。データは平均値+/-SDとして表す。
*  対照群と比較してp＜0.05
【００３６】
実施例3−サブスタンスP処置は肺の免疫メカニズムを活性化して腫瘍の発生率を阻害する
微小核形成の誘導と組み合わせた肺上皮の障害によって、肺気腫および癌のような病態が起こりうる（21）。肺癌の発症に及ぼすSPの影響を調べるために実験的腫瘍モデルを用いて試験を行った。
【００３７】
ラット肺胞マクロファージ（PAM）を、病原体を含まない雄性フィッシャー344ラット（ハーラン、インジアナポリス、インジアナ）から単離した。ラットを塩酸ケタミン（80 mg/kg；パークデービス、モリスプレインズ、ニュージャージー州）、キシラジン（10 mg/kg；モベイコーポレーション（Mobay Corp.）、シャウニー、カンザス州）、およびマレイン酸アセプロマジン（3 mg/kg；ファーメンタアニマルヘルス社（Fermenta Animal Health Corp.）、カンザスシティ、ミズーリ州）の筋肉内投与によって麻酔した。気管切開を行って、テフロン#18ゲージカテーテル（クリチコン、タンパベイ、フロリダ州）を気管内チューブとして挿入した。ラットを腹部大動脈の瀉血によって屠殺した。肺を摘出して、37℃に加温した通常の滅菌生理食塩液の少量3 mlによって計6回洗浄した。洗浄した総細胞数およびPAMの分別血球数を、試料0.2 mlから血球計算盤の計数およびディフクイック（デイドディアグノスティクス、アグアダ、プエルトリコ）によって染色した細胞遠心調製物によって決定した。残っている洗浄液をプールして、400×gで10分間遠心して細胞沈降物を得た。生理食塩液上清をデカントして、ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したBRFF-RluE培地に細胞を再浮遊させた。次に、標準的な血球計算盤を用いて細胞を計数して12ウェルプレートに104個/mlの密度で播種した。37℃で1時間接着させた後、細胞を培地によって1回洗浄して非接着細胞を除去し、新鮮な培地によって培養した。これらの培養細胞をPAM源として用いた（25）。
【００３８】
肺胞マクロファージ（PAM）によるTNF-α分泌を、製造元の説明書に従ってELISA（R＆Dシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）によって測定した（25）。
【００３９】
B16腫瘍細胞（H-2b）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から得て、10％ウシ胎児血清（ハイクローン（Hyclone）、コロラド州）、抗生物質、非必須アミノ酸、およびグルタミンを添加したDMEM培地（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）において増殖させた。対数増殖期の細胞を全ての実験に用いた。B16腫瘍細胞（生理食塩液100 μl中に細胞0.5×106個）を同系B6マウスに静脈内注射する実験的肺転移モデルを用いた。注射7〜10日後、動物を屠殺して、両方の肺の表面上の肉眼的に顕著な（黒い）腫瘍を計数した。
【００４０】
スチューデントt-検定を用いて示したデータを分析した。p値0.05（またはそれより低い）を、最小の有意差として用いた。
【００４１】
表3に示すように、同系腫瘍細胞の静脈内注射によって、短期間（7〜10日）の後に多数の肺腫瘍コロニー（30〜242個）が認められた。しかし、腫瘍誘導時（実験1）または誘導後（実験2＆3）のいずれかに動物にエアロゾル化SPの処置を行うと、肺腫瘍形成の有意な阻害を認めた（58〜97％）。さらに、SP治療によって、動物の生存の延長も認められた（実験1；24％の増加）。
【００４２】
実施例4−内因性のサブスタンスP分泌
成熟サブスタンスP（SP）をコードするcDNA配列をGenBankから得て、コザック配列を有するIg-κ鎖リーダー配列を、プラスミドpSecTag2B（インビトロジェン（Invitrogen）、サンジエゴ、カリフォルニア州）から得た。SP配列の前にIg-κリーダー配列を付加して、5'末端にNheI部位をおよび3'末端にNotI部位を有することによって、SPの分泌型をコードする新しい遺伝子構築物を設計した。この構築物をpCI-neoプラスミド（プロメガ（Promega）、マディソン、ウィスコンシン州）のNheI/Not I部位にクローニングした。標準的な方法によってB16腫瘍細胞に遺伝子構築物をトランスフェクトして、安定なトランスフェクタントをインビボ実験のために選択した。分泌型SPは、製造元の説明書に従ってELISA（ケイマン（Cayman）、アナーバー、ミシガン州）によって測定した。SP遺伝子発現はまた、ストラタジーンインク（Stratagene, Inc.）（ラホヤ、カリフォルニア州）から購入したキットを用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって確認した。
【００４３】
興味深いことに、低レベル（75 pg/ml；表3実験4）でSPを内因性に分泌するように腫瘍細胞を遺伝子改変すると、マウスに投与した場合に形成される肺腫瘍コロニー数が減少した。この知見は、免疫系の活性化を含む可能性がある（4,7）。B16腫瘍細胞は通常、如何なる検出可能なSPも分泌しないことは注目すべきである。肺マクロファージ（PAM；表4）をSPのnMまたはμM濃度と共にインビトロでインキュベートしたところ、サイトカインであるTNF-αの分泌によって測定した細胞の活性化が起こったという知見は、この暗示と一致した。
【００４４】
（表３）サブスタンスP治療による実験的肺癌コロニー形成の減少
2005537322.tif 000005
【００４５】
上記のように肺癌を模倣するために、マウスに同系B16腫瘍細胞を静脈内注射した。7〜14日後、動物を屠殺して（生存を評価するために異なる群のマウスを維持した実験1を除く）、両方の肺における肺コロニーを計数した。実験1では、エアロゾル化SPを腫瘍誘導時に投与したが、実験2＆3では、エアロゾル化SPを腫瘍誘導後7日目に投与した。実験4は、遺伝子改変腫瘍細胞を用いて得られた結果を示す（詳細に関しては上記を参照されたい）。データは平均値+/-SDとして表記する。
* B16単独と比較してp＜0.05
【００４６】
（表４）サブスタンスP添加による肺マクロファージの活性化
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【００４７】
PAMは材料および方法に記述されるとおりに単離して、SPの表記の濃度の存在下で一晩インキュベートした。培養培地へのTNF-α分泌は、ELISAによって評価した。非刺激PAMによるサイトカイン分泌の基礎レベルは、細胞1×106個あたり8.3 pg/mlであった。
【００４８】
本発明は、本発明を行うための現在好ましい様式を含む特定の実施例に関して記述してきたが、当業者は、上記の系および技術には多数の変化および変更が存在し、それらも添付の請求の範囲に示される本発明の趣旨および範囲に含まれることを認識するであろう。
【００４９】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】タバコの煙に曝露された気道の電子顕微鏡写真（倍率〜8,000倍）。矢印1個は気道毛様体の喪失を示す。矢印2個は気道基底膜の腫脹を示す。タバコの煙の曝露は、タバコの副流煙45分/日の連続14日間曝露によって行った。
【図２】タバコの煙に曝露された気道の電子顕微鏡写真（倍率〜8,000倍）。矢印1個は気道毛様体を示す。矢印2個は気道基底膜の通常の外観を示す。タバコの煙の曝露は、タバコの副流煙45分/日の後にSar9,Met(O2)11-サブスタンスPの15分間エアロゾル投与を連続14日間行うことによって行った。
【図３】タバコの煙に曝露された気道の電子顕微鏡写真（倍率〜8,000倍）。矢印1個は気道細胞間の同定可能な細胞膜を示す。タバコの煙の曝露は、タバコの副流煙45分/日の後にSar9,Met(O2)11-サブスタンスPの15分間エアロゾル投与を連続14日間行うことによって行った。
【図４】タバコの煙に曝露された気道の電子顕微鏡写真（倍率〜8,000倍）。矢印は細胞の腫脹を示し、気道細胞間に容易に同定可能な細胞膜を認めない。タバコの煙の曝露は、タバコの副流煙45分/日の連続14日間曝露によって行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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