(57)【要約】本発明は、腫瘍およびその転移に抗する医薬に関し、それは選択的に骨組織に移動し、活性成分として、血清またはプラスマ中で骨シアロ蛋白またはそのフラグメントに結合する少なくとも１つの結合分子を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、血清またはプラスマ中で骨シアロ蛋白またはそのフラグメントに結合する少なくとも１つの結合分子を有し、選択的に骨組織に移動する腫瘍およびその転移に抗する医薬。
【請求項２】
前記活性成分が、抗体、あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡ基体上のアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）またはスピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）である
請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
糖化において化学的にあるいは自然に変異した骨シアロ蛋白に対応する分子に、前記活性成分が結合する
請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
前記結合分子が、腫瘍細胞からの骨シアロ蛋白に特異的に結合する抗体またはアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）である
請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
骨蛋白の正常な糖化ができないドナーの骨材料からの糖化が変異した骨シアロ蛋白に、前記結合分子が結合する
請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
翻訳後の糖化が、骨からの正常な骨シアロ蛋白と比較して、アミノ酸ＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：ＳＩＡＬ＿ＨＵＭＡＮ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２１８１５，信号配列含む）の領域において変異し、あるいは不完全である腫瘍細胞からのヒトの骨シアロ蛋白上に存在するエピトープに結合する、ヒトの骨シアロ蛋白（ｈＢＳＰ）に抗する抗体または複数の抗体を、活性成分として有する
請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
ｈＢＳＰエピトープに抗して生成され、アミノ酸配列ＴＧＬＡＡまたはＹＴＧＬＡＡおよび追加的に糖基を有する、抗体および／またはアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）を、活性成分として有する
請求項１に記載の医薬。
【請求項８】
ニワトリからのＩｇＹ抗体を活性成分として含む
請求項１に記載の医薬。
【請求項９】
ニワトリからのヒトのあるいはヒト化されたＩｇＹ抗体を活性成分として含む
請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
前記結合分子は、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体として、ＣＤ３のエピトープに対して好ましく特異的である追加的パラトープをも有する
請求項１に記載の医薬。
【請求項１１】
前記活性成分は、結合分子と細胞毒活性を有する残分の抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であるイムノトキシン（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）である
請求項１に記載の医薬。
【請求項１２】
前記抱合体は、リシン−Ａ鎖またはジフテリア毒素の結合しない（ｎｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）フラグメントを有する
請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
前記結合分子は、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）と結合している
請求項１に記載の医薬。
【請求項１４】
付着分子、薄膜が関連したプロテアーゼ、化学走性を介したレセプタ、ケモキン（ｃｈｅｍｏｋｉｎ）レセプタ、アポトーシス含有物質を有するグループから選択された、少なくとも１つの、抗体、配位子、または、抑制物質をさらに有する
請求項１に記載の医薬。
【請求項１５】
前記抑制物質が、少なくとも部分的にＢＳＰをブロックして、それによってＢＳＰの機能を変調（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する
請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
前立腺癌、乳癌、肺癌、腎臓癌および甲状腺癌と、血液系、リンパ系、心臓および循環系、神経系、気道、消化管、内分泌系、付属器を含む皮膚、運動系および腎臓を含む尿性器区域（ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ）の腫瘍の病気、を有するグループからの腫瘍の治療のための請求項１〜１５のいずれかに記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍および転移の治療および戦い（ｃｏｍｂａｔｉｎｇ）のための医薬に関し、それは特にしばしば骨の組織に定着する。
【背景技術】
【０００２】
現在、腫瘍および骨に広がる転移と戦うことが意図された多くの医薬が開発されている。しかし、医薬の全ての進歩にもかかわらず、骨転移は治せるあるいは治療できるとはみなされない。腫瘍細胞の表面抗原に抗する抗体によりそれらの転移と戦う試みがある。しかし、これにもかかわらず、骨転移は乳癌の場合の７３％で死因となり、前立腺癌の場合で６８％である。他の組織の腫瘍に対して次の数字があてはまる：頸部５０％、甲状腺４２％、膀胱４０％、肺３６％、卵巣９％、結腸６％。
【０００３】
いわゆる骨シアロ蛋白を発現する腫瘍細胞は、特に前立腺癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、甲状腺癌の場合に、また、それほどでなくても悪性および半悪性の腫瘍の場合に、骨の組織に定着してそこで転移を形成したがるという特性を有する。骨シアロ蛋白（ＢＳＰ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて相対質量が約８０ｋＤａを有するホスホリル化された骨糖蛋白である。ＢＳＰに対するｃＤＮＡは、約３３ｋＤａのペプチド配列をコード（ｃｏｄｅ）する（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，２３４７−５１；ＵＳ  ５  ３４０  ９３４）。ＢＳＰはいくつかの基質（ｍａｔｒｉｘ）蛋白の一つであり、骨、ぞうげ質、石灰化軟骨などの鉱化組織におけるその発生は限定されている。ＢＳＰは骨基質中の非コラーゲン（ｎｏｎ−ｃｏｌｌａｇｅｎｉｃ）蛋白全体の約１０〜１５％に相当する。それは、ルールとして、ぞうげ質、骨および軟骨の形成に貢献する細胞、例えば、骨芽細胞、発達している骨細胞、肥大性の軟骨細胞、ぞうげ芽細胞およびセメント芽細胞で表され、また、胎盤のトロホブラストおよびある種の癌細胞、例えば、肺癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、甲状腺癌および神経芽腫の初期および二次の腫瘍、多発骨髄種および骨転移によっても発現される。腫瘍によるＢＳＰの発現の程度は、癌の重大さに相関する（Ｗａｌｔｒｅｇｎｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトの乳癌および前立腺眼での内蔵転移と比較して骨転移における骨シアロ蛋白の増加した発現，ｉｎ  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２０００，１５（５），８３４−４３；Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトの初期乳癌において骨シアロ蛋白の発現が骨転移の進展と関連している，ｉｎ  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９６，１１，６６５−６７０；Ｗａｌｔｒｅｇｎｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，治療院に局限したヒト前立腺癌における骨シアロ蛋白の予後的価値，ｉｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１９９８，９０，１０００−１００８；Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，初期乳癌における骨シアロ蛋白の発現は低生存率と関連する，ｉｎ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９６，６９，３５０−３５３）。
【０００４】
試験管内で、それは生物学的アパタイトの結晶核を形成し、生体内において鉱化作用に貢献するので、ＢＳＰは付着分子として組織基質上の細胞の付着および散在（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）をもたらすと考えられる。眠らされた（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）マウスにおけるＢＳＰ遺伝子のスイッチオフ（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｆｆ）は、骨格の構築および機能の識別しうる崩壊へと導かない。腫瘍においてＢＳＰはマイクロ石灰化（ｍｉｃｒｏｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に参加すると考えられ（Ｃａｓｔｒｏｎｏｖｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，マイクロ石灰化に関連する乳癌は鉱化した悪性の細胞であることの証拠，ｉｎ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９８，１２，３０５−３０８）、腫瘍細胞の転移による骨の転移増殖に参加すると考えられる（Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，初期乳癌における骨シアロ蛋白の発現は低生存率と関連する，ｉｎ  Ｉｎｔ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９６，６９，３５０−３５３）。
【０００５】
初期癌患者の血清中のＢＳＰ濃度のレベルは、これらの患者が骨転移を持つあるいは初期腫瘍から生じそうであるかどうかの診断に役立つ（Ｉｎａ−Ａｌｅｘａｎｄｒａ  Ｍｅｉｅｒ氏の学位テーマ，骨シアロ蛋白（ＢＳＰ）の測定のための放射免疫測定の進展（″Ｅｎｔｗｉｃｋｌｕｎｇ  ｅｉｎｅｓ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｚｕｒ  Ｂｅｓｔｉｍｍｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｂｏｎｅｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＳＰ）″），１９９６，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｆａｃｈｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ），Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ  Ｆｉｅｌｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＢ  Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）；Ｍａｒｋｕｓ  Ｋａｒｍａｔｓｃｈｅｋ氏の博士論文，ヒトの骨からの骨シアロ蛋白の単離、血清中のその測定に対する放射免疫測定の構成（″Ｉｓｏｌｉｅｒｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｂｏｎｅｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｕｓ  ｈｕｍａｎ  Ｋｎｏｃｈｅｎ，Ａｕｆｂａｕ  ｅｉｎｅｓ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｚｕｒ  ｄｅｓｓｅｎ  Ｍｅｓｓｕｎｇ  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ″），１９９６，Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ  Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ（ＦＢ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｄｅｒ  Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅｎ  Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）；Ｄｉａｌ  Ｉ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，初期乳癌患者の上昇した骨シアロ蛋白は骨転移の有力なマーカーである，ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＡＳＣＯ，１９９８，１７，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４６１；Ｄｉｅｌ  Ｉ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，初期乳癌患者の血清の骨シアロ蛋白は続く骨転移に対する予後的（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）マーカーである，ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９９，５，３９１４−１９；ＤＥ  １９８  １３  ６３３；ＤＥ  １９８  ２１  ５３３；ＷＯ  ９９／５０６６６）。
【０００６】
しかしながら、体液中で、遊離したＢＳＰは補体Ｈ因子によって高い親和力で捕捉結合される。さらに、ＢＳＰは種々のレセプタと結合できる。従って、ウサギの中でＢＳＰの種々のペプチド部分構造に抗する抗体が生成され（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトおよびある種の動物モデルの骨基質の非コラーゲン蛋白への抗血清およびｃＤＮＡプローブ（ｐｒｏｂｅ），Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ  Ｓｕｐｐｌ．，１９９５，２６６，６１−６５５）、組換えＢＳＰに抗する抗体が生成され（Ｓｔｕｂｂｓ  ＪＴ３ｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，自然および組換えシアロ蛋白の評価：鉱物に結合し、細胞に付着した領域の描写およびＲＧＤ領域の構造解析，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９７，１２（８），１２１０−２２）、また、骨から単離されたＢＳＰに抗する抗体が生成され、それら抗体はヒトの血清中でどのＢＳＰも識別することができなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通しての血清蛋白の分離の後でのみ、ＢＳＰはこれらのウエスタンブロットで検出できる。１５０ｋＤａの明らかにより大きなＨ因子分子が恐らくより小さなＢＳＰ（約６５ｋＤａ）を遮蔽（ｍａｓｋ）し、だから抗体が結合できない。さらに、Ｈ因子は血清中に過剰に存在する（０．５ｍｇ  Ｈ因子／ｍＬ、ＢＳＰの健康なヒトの場合の２０ｎｇ／ｍｌ血清未満および腫瘍患者の場合の最大１６０ｎｇ／ｍｌと比較して）。Ｈ因子は補体システムに属しており、補体の溶解（ｌｙｓｉｓ）への代わりのパスに制限をもたらすと知られていることから、Ｈ因子との結合のために、また、恐らくそれによってトロホブラストとＢＳＰが生成した腫瘍細胞は免疫システムの攻撃から保護されるために、試料調製を減らすことなく、体液中のＢＳＰを免疫学的に直接測定することは不可能であると主張されてきた（Ｆｅｄａｒｋｏ  Ｎ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，骨シアロ蛋白およびオステオポンチンと結合しているＨ因子は腫瘍細胞の補体を介した攻撃の逃避を可能にする，ｉｎ  Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００，２７５，１６６６６−１６６７２；ＷＯ  ００／０６２０６５）。さらに、ＢＳＰは、それ自身の識別配列（アルギニン−グリシン−アスパアラギン酸塩、ＲＧＤ）を通して、細胞表面のインテグリンレセプタに特異的に結合できる。ＢＳＰの発現の場合、腫瘍細胞は血液中および組織液中のＨ因子をそれらの細胞の表面に結合する、あるいは、それらの周りで高濃度にすると考えられる。そのようなＢＳＰの母体の血液の補体システムからの保護は、胎盤におけるトロホブラストに対してもなされると考えられる（Ｆｅｄａｒｋｏ  Ｎ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，骨シアロ蛋白およびオステオポンチンと結合しているＨ因子は腫瘍細胞の補体を介した（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）攻撃の逃避を可能にする，ｉｎ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００，２７５，１６６６６−１６６７２；ＷＯ  ００／０６２０６５）。さらにまた、ＢＳＰの機能が新脈管形成において疑われている。破骨細胞および骨芽細胞の骨基質への付着に従って、基質中のＲＧＤ識別配列の細胞壁上のアルファ（ｖ）ベータ（３）インテグリンレセプタへの結合を通して、内皮の細胞の付着、散在および配向が恐らくＢＳＰを介しているということも��た観察されている。即ち、腫瘍の周りでの血管形成は、腫瘍細胞でのＢＳＰの発現と平行して生じる（Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，骨シアロ蛋白はヒトの内皮の細胞の付着および転移を伝え、新脈管形成を促進する，ｉｎ  Ｃｒｉｃ．Ｒｅｓ．２０００，８６（８），８８５−９１）。
【０００７】
これらの特性は、このようにＢＳＰにあらゆる種類の医薬の出発点を作る。従って、ＲＧＤ配列を介してのＢＳＰの腫瘍および上皮細胞のビトロネクチンまたはインテグリンレセプタへの結合は、拮抗質によって制限されうる（ＵＳ  ６  ０６９  １５８；ＵＳ  ６  ００８  ２１３；ＵＳ  ５  ８４９  ８６５；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌｕｉｊｍ  ｅｔ  ａｌ．，骨シアロ蛋白ペプチドは試験管内での癌細胞の骨への付着の有力な抑制物質である，ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９６，５６，１９４８−１９５５）。ＥＰ  １  ０８４  ７１９  Ａ１は、損傷した骨および結合組織の修復の補助するための活性物質としてＢＳＰを有する薬学（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）組成物を教示する。ＷＯ  ９４／１３３１０は、活性成分として黄色ブドウ球菌の蛋白に結合するＢＳＰを有する組成物を教示する。ＷＯ  ００／３６９１９は、目的のある監視と、石灰化を促進する腫瘍および結合組織の細胞中のＢＳＰの発現の抑制のための調節要素を開示する。従って、一般に細胞の成長および細胞の移動を調整する物質は、診断および治療の観点から特に興味深い。しかし、癌成長を制御し、それによって初期および二次の腫瘍と転移増殖した器官が相互作用する、知られていない因子が未だ非常に多く存在する。ここで、重要なステップは、腫瘍細胞の侵入、付着、移動および細胞分割である。基質の金属結合プロテイナーゼ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）とともに、付着分子と化学走性因子が特別な役割を果たす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＢＳＰに抗する抗体と結合分子に基づく、骨転移と戦い、さらにこれを癒すための医薬は知られていない。腫瘍細胞のＢＳＰは正常で健康な細胞のＢＳＰとは異なることも知られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の主題は、活性成分として、血清またはプラスマ中で骨シアロ蛋白またはそのフラグメントに結合する少なくとも１つの結合分子を含み、選択的に骨組織に移動する、腫瘍およびその転移の治療のための医薬である。活性物質は、好ましくは、抗体、あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡ基体上のアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）またはスピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）（Ｎｏｘｘｏｎ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であり、さらに、糖化において化学的にあるいは自然に変異した骨シアロ蛋白に対応する分子に結合する。結合分子は、腫瘍細胞からの骨シアロ蛋白に特異的に結合する抗体またはアプタマーであってよく、あるいはまた、自然のＢＳＰレセプタまたはＨ因子分子の結合構造であってよい。結合分子は、骨蛋白の正常な糖化ができないドナーの糖化が変異した骨材料からの骨シアロ蛋白に結合し、あるいは、これに抗して生成されうる。
【００１０】
特に好ましい実施形態において、医薬は活性成分として、翻訳後の糖化が、骨からの正常な骨シアロ蛋白と比較して、アミノ酸ＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：ＳＩＡＬ＿ＨＵＭＡＮ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２１８１５，信号配列含む）の領域において変異し、あるいは不完全である腫瘍細胞からのヒトのシアロ蛋白上に存在するエピトープに結合する、ヒトの骨シアロ蛋白（ｈＢＳＰ）に抗する抗体または複数の抗体を含む。本発明に係る医薬は、また、ｈＢＳＰエピトープに抗して生成され、アミノ酸配列ＴＧＬＡＡまたはＹＴＧＬＡＡおよび追加的に糖基およびキャリア分子を含む、抗体および／またはアプタマーを、活性成分として含んでもよい。活性成分は、好ましくはニワトリのＩｇＹ抗体である。ニワトリのＩｇＹ抗体は、対応するヒトのあるいはヒト化された抗体であってもよい。さらに好ましいのは、結合分子が、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体として、ＣＤ３のエピトープに対して好ましく特異的である追加的パラトープをも含む、医薬である。活性成分は、また、結合分子と細胞毒活性を有する残分の抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であるイムノトキシン（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）であってもよい。イムノトキシンは、例えば、リシン−Ａ鎖またはジフテリア毒素の結合しない（ｎｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）フラグメント含む抱合体であってよい。さらに、医薬が、免疫シンチグラフィに、あるいは骨転移の進行の局限化および測定に使用できるように、結合分子は放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）と結合していてもよい。
【００１１】
本発明の医薬は、また、付着分子、薄膜が関連したプロテアーゼ、化学走性を介したレセプタ、ケモキン（ｃｈｅｍｏｋｉｎ）レセプタ、アポトーシス含有物質を有するグループから、少なくとも１つの、抗体、配位子、または、抑制物質を含んでもよい。抑制物質は、それらが少なくとも部分的にＢＳＰをブロックして、その機能を変調（ｍｏｄｕｌａｔｅ）するように、選択されうる。その応用の範囲に関しては、本発明に係る医薬は、このように、前立腺癌、乳癌、肺癌、腎臓癌および甲状腺癌と、血液系、リンパ系、心臓および循環系、神経系、気道、消化管、内分泌系、付属器を含む皮膚、運動系および尿性器区域（ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ）の腫瘍の病気、を有するグループからの腫瘍の治療に、特に適している。
【００１２】
本発明のさらなる特徴および利点が、実施例と伴う図面を参照して、これから説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の主題は、活性成分として、抗体、配位子あるいは抑制物質などのＢＳＰに特異的な結合分子を含む、腫瘍の病気の治療のための医薬である。ある実施形態では、結合分子は、Ｈ因子の存在下でＢＳＰを識別する、抗体、あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡ基体上のアプタマーである。特に好ましい結合分子は、腫瘍細胞からのＢＳＰを特異的に識別する。医薬は次の物質で補強できる：付着分子と、薄膜が関連したプロテアーゼと、あるいは、例えばケモキンレセプタなどの化学走性を介したレセプタと、および、好ましくは、抗体、アプタマーあるいは自然あるいは人工のペプチドバンク（ｐｅｐｔｉｄｅｂａｎｋ）から得られる蛋白／ペプチドなどのアポトーシス含有物質と、相互作用する、抗体、配位子、または、抑制物質。特異的な蛋白（ペプチド）の、好ましくは自然の抽出物から、合成してあるいは組換えして生成された結合蛋白から、および、他のペプチド／蛋白バンクから得られる、好ましくは非特異的な分子との相互作用は、しかし、腫瘍細胞のアポトーシスの効果をもたらすのに十分ではない。適切な診断の後で、特異的な治療をすることができる。ここで、驚くことに、抗ＢＳＰの抗体あるいは結合蛋白の使用で、加速された腫瘍細胞の死（アポトーシス）が観察された。
【００１４】
特に、このような方法で治療できる腫瘍は、乳癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌および甲状腺癌と、血液系、リンパ系、心臓および循環系、神経系、気道、消化管、内分泌系、付属器を含む皮膚、運動系および腎臓を含む尿性器区域の腫瘍を含むグループである。
【００１５】
結合蛋白と抗体の投与は、ＢＳＰシステムおよびさらなる腫瘍表面が関係したプロテオム（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）クラスタの内容物の強化に基づいて、腫瘍の病気の新しい治療を与える。医薬は、初期および二次の腫瘍および分散する転移に抗する、即ち、癌成長および包括的な転移の抑制のための、ＢＳＰに特異的な抗体、アプタマー、配位子あるいは抑制物質の利用に基づいている。本発明に係る医薬は、特定の腫瘍細胞上における腫瘍細胞プロテオムの病気に特異的な配置により、オートクライン、パラクリンおよび内分泌のパスを通して、ＢＳＰが活動するのを測定することに基づいている。初期およびある二次の腫瘍は、その付着、移動および増殖の振る舞いにおいて制御されている。部分的に増加した、発現および調整された因子およびＢＳＰの存在の診断的測定を通して、腫瘍の転移を含めて、癌成長を決定的に抑制する、あるいは完全に防止することの可能性がもたらされる。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、腫瘍および転移の治療のための薬学組成物における、本発明に応じた抗体の利用に関する。本発明に応じた抗体と、その部分構造あるいは抱合体は、注入を通して、あるいは坐剤を通して適用でき、血液または組織液中において、遊離して循環しているあるいはＨ因子に結合したＢＳＰに結合し、中和することができる。補体活性化の代わりのパスに抗するＨ因子複合体の遠く証明されていない保護機能があると、これは阻害され、腫瘍細胞は免疫システムによって攻撃されうる。さらに、ＢＳＰの脈管形成の効果が阻害される。
【００１７】
Ｈ因子とＢＳＰの複合体に結合するために、抗体は、結合相手に遮蔽されていないＢＳＰのエピトープを識別しなければならない。そのような抗体の生産は、以前は可能ではなかった。本発明は、そのような抗体を可能にする。なぜならその抗体は、折り畳まれた（ｆｏｌｄｅｄ）骨シアロ蛋白（ＢＳＰ）のイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）に抗して検出され、腫瘍細胞からの組み込まれた骨シアロ蛋白によってのみ形成されるエピトープに結合するからであり、それの糖化は、骨からの正常な骨シアロ蛋白と比較して、アミノ酸配列ＴＧＬＡＡまたはＹＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５（信号配列有り）の領域において変異し、あるいは不完全であり、あるいは間違えている。通常は、蛋白上の翻訳後のあるいは複合の糖構造に抗する特定の抗体を得ることはできず、それはそのような糖構造が同様の方法で加えられ、多くの異なる蛋白を形成するからである。同様に、抗体は多くの異なる蛋白のある種の糖構造に抗して反応し、ルールとして、特異的ではなく、重要性もないと考えられる。これは、腫瘍細胞からの骨シアロ蛋白とは異なる。変えられた、あるいは間違えた糖構造は、骨シアロ蛋白の異なる折り畳みをもたらし、アミノ酸あるいはペプチド構造と、多くの残された糖残基の両方に関連する、新しいエピトープを形成する。しかしながら、これらのエピトープは変質した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）腫瘍細胞からのＢＳＰに特徴的である。
【００１８】
これらのエピトープに抗する抗体は、適用可能なら精製あるいは骨ＢＳＰのイソフォームへの吸収を通して、抗原として、糖化において化学的にあるいは自然に変えられたＢＳＰによって生産することができる。好ましくは、抗体は、抗原として腫瘍細胞からのＢＳＰの利用で生産することができる。腫瘍細胞からのＢＳＰは、困難があってのみ、十分な量を単離することができるので、腫瘍細胞の糖化において変異したＢＳＰの遺伝子操作された発現はより抜きの方法である。ある患者は骨材料の中に糖化において変異したＢＳＰを持つことが発見された。これは、これらの患者が、その多くは非常に高齢で深刻な骨粗しょう症を患っているが、少なくとも一部において正常に糖化されていないＢＳＰを生産することを意味する。このＢＳＰはまた、原理的に、本発明の抗体を得るための抗原に適している。部分的に糖化したイソフォームの単離は、ＢＳＰの腫瘍イソフォームと同等であるが、記載された手順と類似して実行できる（Ｋａｒｍａｔｓｃｈｅｋ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトの骨シアロ蛋白の向上した精製および均一な放射免疫測定の進展，ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９７，４３（１１），２０７６−８２）。
【００１９】
抗体は、マウス、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒト、ロバあるいはウマの中で形成することができ、また、全ての哺乳類でも可能である。特に好ましいのはトリの免疫化であり、特にニワトリが好ましい。それは、大きな進化の差に起因して、ＢＳＰの腫瘍イソフォームに抗する抗体が特に容易に得られるからである。さらに、ＩｇＹ抗体の存在は、補体システムの活性化に導かず、それは、Ｈ因子とＢＳＰの間の可能な結合に起因して扱いにくくなりうる。本発明の抗体は、Ｈ因子と結合しているＢＳＰの腫瘍イソフォームを識別する。
【００２０】
従って、本発明の主題は、ＢＳＰのイソフォーム、腫瘍によって形成されたイソフォームに抗する特別な抗体と、抗体治療あるいはまた免疫シンチグラフィのためのそれら使用である。抗ＢＳＰ抗体によってもたらされる副次的効果として、抗体と細胞毒または放射性同位体の抱合体の利用における、骨基質および骨細胞に抗する免疫システムの活性化を通しての骨およびぞうげ質の直接および間接のダメージおよび／または直接の破壊が議論されてきている。さらに、免疫シンチグラフィは、骨基質に結合する抗ＢＳＰ抗体では、想像もできない。基質は放射能でマークされ、腫瘍の局限化は不可能となる。ヒトのＢＳＰに特異的な抗体は、特別な方法で、腫瘍の治療および局限化に適している。それらは、骨基質あるいは骨格およびぞうげ質の細胞を生成するＢＳＰに結合しないか、してもわずかな程度であるからである。
【００２１】
本発明の特に好ましい応用では、腫瘍ＢＳＰに特異的な抗体が腫瘍の治療に使用され、追加的にＨ因子との複合体中のＢＳＰを識別させる。そのような抗体は、本発明により入手可能である。腫瘍患者におけるそのような特異的な抗体の応用の後、血液および組織液中の遊離した腫瘍ＢＳＰおよびＨ因子に結合したＢＳＰはマークされ、これにより補体活性化に抗する保護が除去される。このように、腫瘍細胞は免疫システムによって破壊のために特異的にマークされ（例えば、補体カスケードの伝統的な（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）活性化を通して）、例えば、骨基質あるいはぞうげ質に抗する免疫システムの活性化を通しての副次的な効果がなくなってしまう。
【００２２】
本発明により可能となる腫瘍の治療と免疫シンチグラフィのために、例として、多クローン性抗体が利用でき、それは糖化において変異され、骨から単離された組換えＢＳＰあるいはＢＳＰでのニワトリの免疫化で生成することができる。抗体はそれから既知の方法で卵黄から単離され、親和力クロマトグラフィにより精製される。
【００２３】
本発明のさらなる応用は、ヒトの多クローン性の抗ＢＳＰ抗体がトランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）のヒト化した免疫システムを持つニワトリのタマゴから単離される。
【００２４】
さらに、マウスあるいはニワトリからの単クローン性抗体が適しており、それらは上述の条件を満たし、スクリーニングにより得ることができる。本発明の特異的な応用では、この目的のために、実施例によって説明される単クローン性の細胞系が利用される。さらに、例えば蛋白分解的に（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）、あるいは遺伝子操作により、抗体のフラグメントから得られるＦａｂフラグメントが適している。
【００２５】
腫瘍の治療のためには、細胞表面上のＢＳＰに結合した後の腫瘍細胞の直接破壊のために、細胞毒および放射性同位体との抱合体において、上述の抗体あるいは抗体フラグメントがさらに適している。
【００２６】
特に、Ｈ因子との複合体中のＢＳＰを識別し、骨基質中のＢＳＰに結合しない、ヒト化した多および単クローン性の抗体が適している。しかし、マウスとニワトリの抗体の適用で、ヒトの抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）あるいは抗ニワトリ抗体（ＨＡＣＡ）を通して期待される特定の治療上の効果がある。ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡは、生物の腫瘍抗原に対する免疫反応を誘起し、強めることができる。しかし、腫瘍マーカーの測定において、ＨＡＭＡとＨＡＣＡの干渉が生じ、それは試験管内の測定方法を崩壊させる。このように、腫瘍マーカーに対してみせかけの高い測定値が生じる。これは、適切な抗体を用いた免疫シンチグラフィあるいは免疫治療の後で発生し、試験管内での正確な腫瘍マーカーの測定は、ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡの吸収の後でのみなされる。
【００２７】
これらの効果は、ヒト化された抗体の利用を通して抑制されうる。多クローン性のヒト化した抗ＢＳＰ抗体は、例えば、トランスジェニックニワトリのＢＳＰでの免疫化によって得られ、そのニワトリに対して、胎芽の幹細胞の中で、免疫グロブリン（ＩｇＹ）のニワトリに特有のＦｃ部分に対する遺伝子領域がヒトに特有のものに交換される（ＵＳ  ５  ３４０  ７４０；ＵＳ  ５  ６５６  ４７９）。ヒト化された抗体はそれからニワトリのタマゴの中に沈積され、卵黄から単離可能である（Ｍｏｈａｍｅｄ  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，遺伝子操作したヒトの抗体のニワトリの卵黄への沈積，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，４：１１５−１２５）。
【００２８】
ヒト化した単クローン性の抗体の生産のために、標準的な方法に従って、マウスあるいはニワトリの適切な抗ＢＳＰ抗体とのハイブリドーマ細胞を得てもよく、また、これらの細胞中に含まれた遺伝子材料から、ヒト化された抗体が組換えを介して進展してもよい（ＵＳ  ５  ５８５  ０８９；ＵＳ  ５  ５６５  ３３２；ＵＳ  ５  ２２５  ５３９；ＵＳ  ５  ６９３  ７６１；ＵＳ  ５  ５８５  ０８９；ＵＳ  ５  ５３０  １０１）。
【００２９】
ＢＳＰは、完全な配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１あるいは部分配列ＩＤ  Ｎｏ．２とともに、その完全の中で、あるいは抗体の生成に特異的なエピトープで、使用することができる。
【００３０】
特異的な抗体の生成のための好ましいＢＳＰフラグメントは次の通りである。
【００３１】
【化１】
2005506959.tif 000002
【００３２】
ここで、マークされたＴは不完全に糖化されておらず、あるいはされており、あるいは他の形に糖化されている。ＸおよびＺは、３０のアミノ酸までのアミノ酸あるいはペプチド残基を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２において、次の差異が存在してもよい：位置１７９Ｇｌｙ→Ｖａｌ；位置２５２Ｖａｌ→Ａｌａ；位置２５４Ｇｌｕ→Ａｓｐ；位置２７９Ａｓｐ→Ｇｌｙ。
【００３３】
抗体の生成のために、通常はイムノゲンではないペプチドがキャリア蛋白ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に結合された。この結合は、ＮＢＳ（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）を通して、ペプチドの端部に加えられたシステインを介してあるいはカルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）により直接、なされた。
【００３４】
抗体は従来のプロセスで、好ましくはニワトリ、ウサギ、マウス、モルモットなどの免疫化を通して得られる。抗体を組換えて生成するなど、分子生物学的方法も使用できる。抗体は、それから精製され、ガレン製薬的に（ｇａｌｅｎｉｃａｌｌｙ）調製される。また、細胞調製、細胞抽出、および、特定の抗体を生成するための細胞を発現する人工的にトランスフェクションされた過度に発現した（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）ＢＳＰからの薄膜単離物も特に使用してもよい。
【００３５】
本発明の医薬は、適切なガレン製薬的適用形で投与することができ、特に、一治療単位あたり純粋な抗体あるいはＢＳＰ配位子で３００ｍｇ〜３０ｍｇの量で、繰り返しの注入および／または連続的輸液のための生理食塩水および／または輸液溶液中に溶解するために、滅菌アンプル中で、凍結乾燥した形態で、マンニトールあるいは類似の糖に吸収される（ｔａｋｅｎ  ｕｐ）。好ましくは、本発明の医薬は、医薬が系統的にあるいは局所的に、生物適合性の（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ミクロスフェアで、エアロゾルを通して、あるいは静脈または皮下の適用で投与される、ガレン製薬的適用形で用いられる。
【００３６】
種々のルーチンの手順で、アゴニストの投与上、対応するプレテオム分子に結合する腫瘍細胞が、抗アポトーシス的に（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）、付着的に（ａｄｈｅｓｉｖｅ）、有糸分裂的に（ｍｉｔｏｔｉｃ）、および化学走性的に、反応することを測定することができる。その保存、付着、有糸分裂あるいは移動の制約は、拮抗質あるいは抗体との先の培養を通してもたらされる。
【００３７】
ＢＳＰが発現している腫瘍細胞系の細胞培養にＢＳＰに抗する非常に純度の高い抗体を用いると、試験管モデルの場合、これらは腫瘍細胞のアポトーシスがもたらされる位置に存在したことが測定できた。従来の細胞培養プロセスの利用で細胞系を培養あるいは腫瘍細胞を除去しても、ＢＳＰがそれらの対応する細胞表面上に検出可能ならば、試験管内でのそれらの生き残り時間はＢＳＰ抗体の添加を通して著しく減じられる。それによって、非常に大きな数のこれら培養された細胞のアポトーシスが観察できる。生体モデルにおいても、驚くことに、アポトーシスによる腫瘍細胞の後退を観測できる。
【００３８】
さらに、ＢＳＰを発現する腫瘍細胞の細胞培養の実験では、特定のＢＳＰ抗体の使用が補体を介した細胞の溶解およびまた細胞を介した腫瘍細胞の溶解を開始する。
【００３９】
毛のないマウスと毛のないラットは不完全な免疫システムを有しているので、毛のないマウス／ラットのモデルのホスト体の中で、種の間で生じ、外からの細胞の拒絶へと導く知られた免疫反応なしに、転移の様子を研究することができる。それ自体知られた方法で、毛のないマウスはＢＳＰの発現が測定された腫瘍細胞あるいは腫瘍細胞系を接種され、これらの細胞に起因する転移に発生がＢＳＰ抗体での治療およびＢＳＰ配位子での治療とともに監視された。これによって、驚くことに、ＢＳＰ陽性と見いだされた腫瘍の場合、抗体の投与が腫瘍の成長の変調へと導くので、転移の形成は明らかに制限され、あるいは妨げられたことが見いだされた。同様に、驚くことに、免疫組織化学により解析された調製は、ＢＳＰの特定の分布と他の腫瘍の表面は、腫瘍およびそれを囲む組織において、プレテオムクラスターと関係していたことを示すことも見いだされた。これを通して、意図のある攻撃に対するさらなる可能性が認められた。
【００４０】
特に腫瘍細胞表面のプロテオムのさらなるクラスターに抗するように管理された、拮抗質の追加的な利用を通して、治療の概念の拡大がもたらされる。この効果の補強は、ＢＳＰ抗体と、以下と相互作用する抗体、配位子あるいは抑制物質との組み合わせを通して達成できる：（１）付着分子、（２）薄膜が関連したプロテアーゼまたは（３）例えばケモキンレセプタなどの化学走性を介したレセプタ、および、（４）好ましくは抗体あるいは自然または人工のペプチドバンクから得られる蛋白／ペプチドなどのアポトーシス含有物質。
【００４１】
これらの発見を確認するために、腫瘍細胞は、また、ＢＳＰで安定にトランスフェクションされることができる。これらの細胞の動物への注入の後で（ＢＳＰが過度に発現している場合）、そのような腫瘍細胞は選択的に骨基質に移動する。そのような変異された細胞は骨組織中に特に転移を形成し、それに基づいて、同様に治療の原理が証明できる。
【００４２】
以下の実施例を参照して本発明をさない詳細に説明する。
実施例１−ウエスタンブロットにおける腫瘍および骨特異のＢＳＰイソフォームの特性評価
ヒトの骨肉腫細胞系ＵＭＲ−７，ＭＨＨ−ＥＳ  １、乳癌細胞系ＭＣＦ−７（エストロゲンレセプタ陽性）および骨から精製されたヒトのＢＳＰ（Ｋ−ＢＳＰ）の血清を除去した上澄みが、１０％ジェル上で、還元および変性させる条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使って分離され、電気泳動的にニトロセルロースに移された。薄膜は単クローン性のマウスの抗体と培養された。ＢＳＰの検出はペルオキシダーゼに結合した山羊の抗ネスミ抗体を通じて、また、Ｘ線フィルムの化学発光的検出によりなされた。結果を図１に示す。左側にマーカーの分子量とパスを示した。単一および２個の矢印の頭は骨／骨肉腫のＢＳＰとＭＣＦ−７  ＢＳＰの異なるふるまいを示す。後者は追加的に高い分子量のバンド（三重の矢印）を含み、それは他のトラックには存在しない。このように、ある腫瘍細胞系からのＢＳＰは、骨からのＢＳＰおよび骨肉腫細胞系からのＢＳＰよりも明らかに高い分子量を有し、これによってこれを越えてさらに高い分子量の第２のイソフォームが観察できる。
【００４３】
実施例２−ＢＳＰおよびＢＳＰペプチド部分構造に対するニワトリの免疫による多クローン性抗体の生成
Ｋａｒｍａｔｓｃｈｅｋらによって記載された手順に従って患者から単離されたＢＳＰに対してニワトリとウサギが免疫化された（１９９７）。
タマゴの黄身と血清、多クローン性免疫グロブリンが単離され、ＢＳＰの様々なペプチド部分構造に対する結合がＥＬＩＳＡプロセスにより試された。表１はこのエピトープ地図の結果を示す。これにより、プロプレＢＰＳ（リーダー配列を含む）の全３１７のアミノ酸長のペプチド配列のペプチド部分構造が化学的に合成され、マイクロ滴定プレートに結合され、そのプレート上で抗体が培養された。抗ＩｇＹ免疫グロブリンあるいは抗ウサギＩｇＹ免疫グロブリンとともにペルオキシダーゼと共同での培養と、それに続く基質としての色素体の変性を通しての酵素反応の後に、結合試験がなされた。
【００４４】
【表１】
2005506959.tif 000003
【００４５】
結果は、得られたニワトリの抗体はＢＳＰのＣ末端配列に選択的に結合する一方、ウサギの抗体はより広い領域にわたって結合することを示す。
【００４６】
さらに、ＢＳＰのペプチド構造（１）とのウサギの免疫によって、このペプチド部分構造と選択的に反応するが、また、ヒトの骨ＢＳＰに特異的である多クローン性抗体（Ａ０００１）が得られた。
【００４７】
ＴｙｒＴｈｒＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｌａＩｌｅＧｌｎＬｅｕＰｒｏＬｙｓＬｙｓＡｌａＧｌｙＡｓｐ（位置１２４〜１３８）    （１）
【００４８】
しかし、後にキャリアとしてウシのサイログロブリンに結合する、例えば（２）などのペプチド部分構造（３）とのウサギの免疫で得られた多クローン性抗体（ＡＫ＿ｔＢＳＰ）は、合成したペプチド部分構造を反応するが、ヒトの骨ＢＳＰとは反応しない。これらの抗体は、驚くことに、腫瘍細胞からＢＳＰを排他的に識別する。
【００４９】
ＴｙｒＴｈｒＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｌａ（位置１２４−１３０）    （２）
ＴｈｒＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｌａ（位置１２５〜１３０）    （３）
【００５０】
研究のために、多クローン性抗体Ａ００２（Ｌ．Ｗ．Ｆｉｓｈｅｒから得た）およびＡ００３（ｖａｎ  Ｒｙｄｅｎ医師から得た）をさらに用いた。これらの抗体は、ペプチド部分結合（４）または（５）との免疫の後に得られた。
【００５１】
ＴｙｒＧｌｕＳｅｒＧｌｕＡｓｎＧｌｙＧｌｕＰｒｏＡｒｇＧｌｙＡｓｐＡｓｎＴｙｒＡｒｇＡｌａＴｙｒＧｌｕＡｓｐ（Ａ００２）    （４）
ＬｅｕＬｙｓＡｒｇＰｈｅＰｒｏＶａｌＧｌｎＧｌｙＧｌｙ    （５）
【００５２】
前者のペプチドＢＳＰ（位置２７８〜２９５）のＣ末端から生じ、インテグリン型のレセプタに対するＢＳＰのＲＧＤ（ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ）識別配列を含む。後者のペプチドはＢＳＰ初期構造のＮ末端から生じた。また、これらのペプチドはそれぞれの部分構造を選択的に識別し、ヒトの骨ＢＳＰと特異的に反応した。
【００５３】
実施例３−抗原として乳癌細胞からの組換えＢＳＰの取得
プラスミドＢ６−５ｇ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，ヒトの骨シアロ蛋白．推定された蛋白配列および染色体の局限化，ｉｎ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５（４），２３４７−５１）からヒトのＢＳＰに対する完全なｃＤＮＡ（シグナルペプチドを除く）がＰＣＲにより増幅され、エピソームの（ｅｐｉｓｏｍａｌ）真核細胞の発現ベクターｐＣＥＰ−Ｐｕ（Ｋｏｈｆｅｌｄｔ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，プロテオグリカンテスティカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｔｅｓｔｉｃａｎ）の細胞外のカルシウム結合モジュールの特性，ｉｎ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７，４１４（３），５５７−６１）中で複製された。プライマーは以下の（６）および（７）の通りだった。
【００５４】
Ｎｈｅ  Ｉ  ＢＳＰ（センス）：
５’ＧＣＣＣＧＣＴＡＧＣＣＴＴＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＡＴＣＧ−３’    （６）
Ｎｏｔ  Ｉ  ＢＳＰ（アンチセンス）：
５’−ＣＡＡＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＡＡＴＴＣ−３’’    （７）
【００５５】
プライマーとともに導入されたＮｈｅ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉの切り取り（ｓｌｉｃｉｎｇ）部位は、発現ベクターＰＣＥＰ−ＰＵにおける複製に必要であった。このベクターはさらに、蛋白の精製の促進のために、様々なタグ（ｔａｇ）、即ち、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｇ８Ｔのある多重複製部位の５’末端においてもたらされた。これらのタグは、プロテアーゼ（即ち第Ｘ因子またはエンテロキナーゼ）により蛋白の精製の後で分離できる。正しい読み取り枠が保持されたことが塩基配列決定により確認された。
【００５６】
発現構造物は、とりわけ次のヒトの細胞系へと安定なトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を伝えるリポソーム（Ｒｏｃｈｅ社のトランスフェクション試薬ＦＵＧＥＮＥＴＭ）として導入された：
−胚の腎臓細胞系ＥＢＮＡ−２９３
−骨肉腫細胞系ＳＡＯＳ−２およびＭＧ−６３
−ヒトの乳癌細胞系ＭＣＦ−７
【００５７】
組換え発現はＭＣＦ−７およびＥＢＮＡ−２９３中のみで得られた（図２参照）。骨肉腫細胞系はトランスフェクションを繰り返し試みても発現しなかった。
【００５８】
実施例４−変質した細胞および骨ＢＳＰからの組換えＢＳＰの糖化の解析
短命な細胞がトランスフェクションの後４８時間、２日間の間血清のない媒体中で培養された。ＦＣＳ中の蛋白が組換えＢＳＰの精製をより困難にしないように、ＢＳＰ発現細胞は、合流（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）の達成（ａｔｔａｉｎｍｅｎｔ）の後、血清のない条件下で培養された。これらの条件下では、ＥＢＮＡ−２９３細胞のみが２〜４よりも長く生き残ることができた。組換えＢＳＰの発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブトッロ法を通して監視された。
【００５９】
血清のない細胞培養の上澄み液の研究は、ＢＳＰおよび種々のタグの存在の両方に関して、これら全ての細胞系にウエスタンブロットの陽性信号の結果をもたらした。
【００６０】
トランスフェクションされたＭＣＦ−７細胞系の２．５リットルの血清のない培養上澄み液がＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭのカラムにより精製され、それから２５０μｇの均一なＨｉｓ−ｍｙｃ−ＥＫ−ＢＳＰが得られた。そのように精製された発現生成物は部分的に糖化（ｇｌｙｇｌｏｓｙｌａｔｅｄ）されたが、ＢＳＰ配列ＹＴ１２５ＬＰＡＡ中のトレオニンであるトレオニン１２５の糖化はなかった。
【００６１】
糖解析のために、Ｎ−グリカンが酵素的に（ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ）組換えＢＳＰまたは骨ＢＳＰからペプチドＮ−グリコシダーゼ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｒｏｃｈｅ社）により分離された。酵素は全てのＮ−グリカン型のアスパラギンからの触媒反応の（ｃａｔａｙｌｙｔｉｃ）分離をもたらした。消化のために、２０〜２００μｇのＢＳＰがエタノールおよび沈殿剤ペレット中で沈殿され、１％ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ中、室温で３０分間過剰の酵素とともに培養された。続いてＮ−グリコシダーゼによる３７℃で一晩の消化がなされた。Ｎ−グリカン溶液から塩分を除去するために、消化は１５０ｍｇ炭素カラム（Ｃａｒｂｏｇｒａｐｈ、Ａｌｌｔｅｃｈ社）を通してなされ、Ｎ−グリカンは２５％ａＣＮとともに０．０５％ＴＦＡ中に溶解した。
【００６２】
Ｏ−グリカンは、キット（Ｏグリカン放出キット、Ｇｌｙｃｏ社）を用いてヒドラジン分解によってＢＳＰから切り取られた（ｓｌｉｃｅｄ）。このために、約２００μｇの塩分のないＢＳＰが２４時間凍結乾燥され、アルゴン保護ガス下で５０μｌのヒドラジン試薬を添加され、６０℃で５時間分解および培養された。ヒドラジンは真空化で引かれた。続いて酢酸無水物でＮアセチル基の再Ｎアセチル化がなされた。
【００６３】
Ｎ−およびＯ−グリカンは、特定の末端グリコシダーゼで連続的に消化された、蛍光色素２アミノベンズアミド（Ｆｌｕｋａ社）および２位のＡＢがマークされた（２−ＡＢ  ｍａｒｋｅｄ）オリゴ糖でマークされ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により解析された。
【００６４】
解析の議論
ヒトのＢＳＰのアミノ酸配列は、位置８８（ＮＴＴ）、１６１（ＮＧＴ）、１６６（ＮＳＴ）および１７４（ＮＧＳ）の４つの潜在的Ｎアセチル化部位を含む。
【００６５】
Ｏ−糖化に対して、同等の意見が一致した配列（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は知られていない。全ての同定されたＮ−グリカン構造は、骨から単離されたＢＰＳ上および組換えＥＢＮＡ−２９３  ＢＳＰ上の両方に見つけられた。しかし、Ｎ−グリカンの総計におけるそれぞれの構造の百分率の割合には差があった。このように、骨のＢＳＰ  Ｎ−グリカンの主要部分は、トリアンテナリー（ｔｒｉａｎｔｅｎａｒｙ）構造（５８％）であり、ＥＢＮＡ細胞系ではテトラアンテナリー（ｔｅｔｒａａｎｔｅｎａｒｙ）構造（４８％）であった。
【００６６】
組換えＢＳＰのＯ−糖化部位の限局化のために、Ｏ−グリカンは、ノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとの蛋白の連続的消化によって、コア（ｃｏｒｅ）−ＧａＩＮＡｃまで、除去された。部分的に糖除去（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）蛋白は、それからトリプリンとＶ８プロテアーゼでの処理でペプチド断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）へと分解された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によりペプチドの質量が決定され、一部のペプチドはＰＳＤ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により塩基排列決定された。この方法により、組換えＢＳＰの８つのＯ−糖化部位について、５つはペプチド２１１−２９９（ＴＴＴＳＰ・・・ＱＶＹＲ）上、最大３つは配列ＴＧＬＡＡを有するＡＳ１２０およびＡＳ１３５間のペプチド上、と決定できた。もちろん、組換えＢＳＰにおいて、配列ＤＡＴＰＧＴＧにおけるトレオニンはＯ−糖化された。骨ＢＳＰに、第３のＯ−糖化がなされた。組換えＢＳＰに、第３の糖化部位はなかった。恐らく、この糖化部位はＴＧＬＡＡ−ＢＳＰ部分構造上にある。
【００６７】
実施例５−タマゴの黄身からの抗ＢＳＰ  ＩｇＹの生成
治療および免疫シンチグラフィのための抗ＢＳＰ  ＩｇＹを、より大量に精製するために、種々の方法が述べられている。ＡｋｉｔａおよびＮａｋａｉの方法（Ａｋｉｔａ  Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ株で免疫化されたニワトリのタマゴからの免疫グロブリンの生産のための４つの精製方法の比較，ｉｎ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９３，１６０（２），２０７−１４）は優先的に用いられている。
【００６８】
タマゴ生産に対し、１週間あたり４．５個の生産性を持ち、黄身１つあたり特定のＩｇＹを１０ｍｇ以上の生産する”Ｌａｈｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｅ”または”ＬａｈｍａｎｎＢｒｏｗｎ”などの生産性の高い種が用いられている。フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）中で、ヒトの骨から単離された、または組換えられたＢＳＰ抗源に免疫処理がなされ、フロイントアジュバントによって、約０．１ｍｇのＢＳＰの基本的な免疫処理の後で、ブースター注入が６週間毎に与えられる。通常は、これらのニワトリの約３０％が免疫処理に反応しない。タマゴが過酢酸を用いて外側から殺菌され、それから割られ、黄身が白身から分離された。それから黄身は、５〜１０倍の体積の氷で冷やされたｐＨが５と５．２の間の蒸留水とともに泡立てられ、２〜５℃で２〜６時間以上培養された。それによって、実質的にリポ蛋白である黄身は粒状となって沈殿した。水の上澄み液はそれからフィルターペーパーを通して綺麗に濾過された（例えばＷｈａｔｍａｎ１番）。
【００６９】
この上澄み液から、直接あるいは親和力クロマトグラフィを通して抗ＢＳＰ  ＩｇＹが均一的に精製できる。ＢＳＰは、化学的に共有結合で結合しており、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムを通して、臭化シアンによって活性化され、ヒトの骨から、あるいは組換えしたヒトの細胞系の培養上澄み液から、単離された。１ｇのＩｇＹを結合するのに、０．５ｇの固定されたＢＳＰ（約５ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭの共有結合で結合された）が必要である。
【００７０】
結合されたＩｇＹは酸勾配を介して溶出し、その後溶液は中和される。この溶液は、それから、塩分および濃縮した抗体を除去されなければならず、それはクロスフロー（ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ）法（例えばＡｍｉｃｏｎＴＭ、１００，０００ダルトンの収率のらせんフィルターＳＹ  １００）で大規模に可能である。
【００７１】
実施例６−ＢＳＰ  Ｈ因子複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合した抗ＢＳＰ  ＩｇＹの単離
多クローン性のニワトリの抗体の骨基質中のＢＳＰとのわずかな反応が、Ｈ因子との複合体中のＢＳＰと反応するこれらの抗体の選択を通して排除できる。この目的のために、Ｈ因子またはＢＳＰは、化学的に共有結合で結合しており、臭化シアンによって活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを通して、骨から単離され、あるいは、遺伝子操作され、その後、多くのＢＳＰあるいはＨ因子がカラムに適用され、結合されるので、基質中の全ての配位子が相手（ｐａｒｔｎｅｒ）と複合化する。濾過された黄身抽出物は、それからこの親和力カラムに適用され、実施例４のように、ＢＳＰ−Ｈ因子中の遊離したエピトープに特異的に結合する抗体の分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）が得られる。
【００７２】
実施例７−トランスジェニックニワトリ中でのヒトの抗ＢＳＰ抗体の生成
抗ＢＳＰ  ＩｇＹは、ヒトの治療あるいは診断において弱点がある。無関係な蛋白反応などの側面に影響が予期され、生物学的な半減期はヒトの抗体と比べてたった１２〜２４時間にしか至らない。ＩｇＹは補体システムを活性化しない。
【００７３】
ＢＳＰに抗するヒトの抗体は、特にトランスジェニックニワトリ中で生成でき、その中で、遺伝子ターゲッティングにより、抗体形成の責を負う遺伝子における鳥類の免疫グロブリンに対する定数領域がヒトの免疫クロブリンに対する定数領域で置き換えられた。適切なニワトリの幹細胞およびベクターシステムが米国特許５，３４０，７４０、５，６５６，４７９および５，４６４，７６４に記載されている。ＢＳＰとの免疫化の後で、そのようなニワトリはタマゴ中のヒトの抗体の生成物と反応する。
【００７４】
実施例８−ヒトの乳癌細胞系におけるＢＳＰの発現の免疫ブロット法解析
腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陽性）およびＴ−４７−Ｄ（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陽性）が、免疫沈殿バッファで抽出され、ＢＳＰがヒトのＢＳＰに抗するウサギの多クローン性抗体混合物Ａ０００１で沈殿された。沈殿物は変性の後でＳＤＳジェルに適用され、電気泳動にかけられ、蛋白はニトロセルロース薄膜に移動した。その後、続いて、抗ＢＳＰウサギ抗血清Ａ００１と単クローン性のマウスの抗ＢＳＰ抗体（ＢＳＰ１．２）で免疫着色し、それによって第２の抗体として、ウサギのＩｇＧおよびマウスのＩｇＧに抗するヤギの抗体のペルオキシダーゼ抱合体が採用された。Ａ、Ｂの両ブロットで、免疫沈殿ＢＳＰのバンドは７００００ダルトンにおいて明暸に識別できた。
【００７５】
腫瘍細胞の細胞表面上のＢＳＰの存在の有無を示すために、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７の細胞表面がビオチニル化され、免疫沈殿バッファで抽出され、ＢＳＰがヒトのＢＳＰに抗するウサギの多クローン性抗体混合物Ａ０００１で沈殿された。沈殿物は変性の後でＳＤＳジェルに適用され、電気泳動にかけられ、蛋白はニトロセルロース薄膜に適用された。それからこの薄膜上のビオチニル化された蛋白は、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）において、ペルオキシダーゼとストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ）の抱合体で証明された。
【００７６】
先立つ浸透（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｓａｔｉｏｎ）の有りおよび無しの両方で、系Ｔ−４７−ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１のヒトの乳癌細胞が、免疫蛍光法的に（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ）蛍光と共役した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ウサギの抗ブタＢＳＰ抗体とヤギの抗ウサギ抗体とでマークされた。浸透の後、蛍光的にマークされたＢＳＰは両細胞系で識別できる。浸透無しでは、Ｔ−４７−Ｄ細胞系のみで、ＢＳＰは免疫蛍光法により証明できた。
【００７７】
実施例９−ＲＴ−ＰＣＲを介した腫瘍細胞におけるＢＳＰ発現の検出
腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陰性）、ＭＣＦ−７（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陽性）、Ｔ−４７−Ｄ（乳癌細胞系、エストロゲンレセプタ陽性）および参照細胞としてのヒトの線維芽細胞（ＨＧＦ）から、ｍＲＮＡが単離され、逆トランスクリプターゼによって相補的ｃＤＮＡが生成され、ＢＳＰの特異的なプライマー（ｐｒｏｍｅｒ）を持つＰＣＲにより、ＢＳＰ−ｃＤＮＡが増幅された。ＢＳＰ−ｍＲＮＡの発現は乳癌細胞系ＭＣＦ−７において特に高く、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＴ−４７−Ｄの細胞では少なく、また、参照細胞系においては検出できなかった。
【００７８】
実施例１０−ヒト化した単クローン性抗体の生成
単クローン性抗体ＢＳＰ１．２は、その腫瘍ＢＳＰとの特異的な結合に起因して、初期腫瘍および転移の治療に使用できる。それによって、抗体はある腫瘍の細胞の表面にＢＳＰ上に結合し、例えば補体カスケードの活性化を介して、細胞を破壊して免疫システムを刺激する。同様に、多クローンあるいは単クローン性抗ＢＳＰ  ＩｇＹもまた、治療に使用できる。この抗体が用いられると、ヒトの免疫システムはそれ自身の抗体−ヒトの抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＡＭＡ）あるいはヒトの抗ニワトリＩｇＹ抗体（ＨＡＣＡ）−の形成に作用する。ＨＡＭＡおよびＨＡＣＡは、腫瘍の抗原に対する生物の免疫反応を誘起あるいは強化できる。しかし、腫瘍マーカーの測定において、ＨＡＭＡとＨＡＣＡの干渉が生じ、それは試験管内の測定方法を崩壊させる。このように、腫瘍マーカーに対してみせかけの高い測定値が生じる。
【００７９】
このように、ヒト化された単クローン性抗体は、特に治療および免疫シンチグラフィに適している。単クローン性抗ＢＳＰ抗体を生成するハイブリドーマ細胞系から適切にヒト化された抗体をいかにして導くかについて、複数の方法が説明されている。
【００８０】
実施例１１−抗ＢＳＰ抗体と細胞毒（ｐｏｉｓｏｎ）および放射性同位体との抱合体
発明のさらなる応用では、抗ＢＳＰ抗体またはそれらのＦａｂフラグメントに、細胞毒および放射性同位体が化学的に共有結合で結合するだろう。ヨウ素１２５またはヨウ素１３１などの放射性同位体でマークされた抗体は、免疫シンチグラフィを介しての腫瘍限局化のためのより少量の適用に対して、また、腫瘍の直接破壊のためのより大量の適用に対して、安定である。そのような化学的な抱合体は、例えば抗体のヨウ素１２５あるいはヨウ素１３１でのヨウ素化により、生成できる（Ｇａｒｖｅｙ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，免疫学の方法３ｒｄｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｐｕｂｌ．，１７７，１７１−１８２）。放射能免疫治療および免疫シンチグラフィに対する安定な方法の概論はここに記載がある：Ｖｕｉｌｌｅｚ，放射能免疫ターゲッティング：診断および治療での使用，雄牛の癌中で．２０００，８７（１１），８１３−２７。
【００８１】
実施例１２−細胞表面でのＢＳＰの発現での腫瘍の治療
ＢＳＰが腫瘍細胞の表面で発現するか、生検材料から初めて測定された。腫瘍細胞の表面にＢＳＰが検出できた患者は、ニワトリやマウスの抗ＢＳＰ抗体、対応するヒト化された抗体、および、これらの抗体の細胞毒あるいは放射性同位体との抱合体による治療に適していると考えられる。
【００８２】
細胞の表面で発現した腫瘍マーカーに抗するように向けられた治療抗体での腫瘍の処置は、技術の状態（ｓｔａｔｅ）である。このように、ヒト化された抗体ヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）により、ヒトの上皮の成長因子のレセプタに抗して、冒されたのが約２５％の転移形態中においても、乳癌は成功裏に治療できる（Ｈｏｔａｌｉｎｇ  ＴＥ  ａｔ  ａｌ．，ヒト化された抗ＨＥＲ２抗体ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２が、抗体に依存し、細胞を介した（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）細胞毒性をＦｃｇＲ  ＩＩＩを介して伝える（要約），Ｐｒｏｃ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９６；３７：４７；Ｐｅｇｒａｍ  ＭＤ  ｅｔ  ａｌ．，ヒト化された抗ＨＥＲ２抗体のフェーズＩＩＩ治療院での試みにおける乳癌患者の抗体に依存し、細胞を介した細胞毒性（要約），Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７；３８：６０２）。
【００８３】
ヘルセプチンと同様に、適当な抗ＢＳＰ抗体は輸液として、例えば、第１の適用において９０分の輸液、後で３０分の輸液として、適用できる。輸液の頻度および抗体の量は血液中での抗体の半減期（ヒト化された抗体で約６日、ニワトリ抗体で２４時間未満）および体重に応じて決められる。
【００８４】
実施例１３−細胞あるいはＢＳＰ−Ｈ因子複合体に結合していない遊離ＢＳＰの中和による腫瘍の治療
上述の方法で、患者の腫瘍細胞が細胞表面上に検出できないＢＳＰを発現することが測定された。これらの腫瘍の場合、細胞が血液中あるいは組織液中にＢＳＰを放ち、補体カスケードの代わりのパスの不活性化のために、あるいは、骨組織中への移動のために、例えばＨ因子の結合を通してこれを用いると仮定される。この腫瘍タイプに対するさらなる可能な尺度は、血液血清中のＢＳＰの増加した濃度（＞２０ｎｇ／ｍｌ血清）である。これらの場合、抗ＢＳＰ抗体は遊離した腫瘍ＢＳＰまたはＨ因子との複合体中の腫瘍ＢＳＰの中和のために用いられうる。投与量は、血清中および組織液中に遊離して存在するＢＳＰの量に関して設定できる。治療のために、Ｈ因子との複合体中の遊離したＢＳＰのエピトープを識別できる、ニワトリおよびマウスの抗ＢＳＰ抗体、および、ヒト化された抗ＢＳＰ抗体が考えられる。また、蛋白分解の消化（Ｇａｒｖｅｙ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，免疫学の方法３ｒｄｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｐｕｂｌ．，１９７７，２５６−２６６）による標準的な手順に沿って調製できる、これらのＦａｂフラグメントも考えられる。また、遺伝子操作されたＦａｂフラグメントは、上記の抗ＢＳＰ抗体から誘導され、そのような治療に考慮されていく。
【００８５】
このように本発明は、アミノ酸ＴＧＬＡＡを含むアミノ酸１２０〜１３５（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ：ＳＩＡＬ＿ＨＵＭＡＮ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ２１８１５，信号配列なし）の領域において翻訳後のＯ−糖化を腫瘍ｈＢＳＰが含まないので、腫瘍細胞のｈＢＳＰのエピトープのみに特異的に結合するヒトの骨シアロ蛋白（ｈＢＳＰ）に抗する可能な抗体を作成する。骨からの正常なｈＢＳＰとは異なる。抗体は、補体Ｈ因子との複合体中における腫瘍遺伝子の血清ｈＢＳＰを識別でき、このように診断および治療の有用な機器を構成する。
【００８６】
実施例１４−ＢＳＰあるいは他の腫瘍細胞の表面のプロテオムのクラスタに抗する特異的な抗体の生成
上記蛋白に抗する特異的な抗体を生成するために、驚くことに、合成されたペプチドが通常の方法に従ってキャリア分子に結合され、マウスの中に注入されるときに、完全な分子の使用により、エピトープの特定のアミノ酸配列もまた特に免疫化のために適することが発見された。さらにまた、多発抗原ペプチド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）（配列は上記参照）は、それらの抗体を生成ために、リシンによってより大きな分子に、あるいはＢＳＰトランスフェクションされた細胞系に結合し、適している。さらなる方法として、安定なトランスフェクションされたＢＳＰが発現している細胞のイムノゲンの利用は、それ自身が驚くほど良好であることを証明し、それによって、薄膜隔離、完全あるいはフラグメントしたレセプタでの細胞抽出物、あるいは、凍結乾燥した全試料もまた用いられる。
【００８７】
マウス（ＮＺＷ  Ｘ  ＮＺＢ型）が単クローン性抗体の生成に用いられ、それはＩｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  ＡＧ社およびＩＰＦ  ＰｈａｒｍａＣｅｕｔｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ社のルーチンの方法でなされた。ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡで監視された抗体は、高いレベルでの精製の後、述べられた診断および治療のために用いることができる。
【００８８】
実施例１５−ＢＳＰの発現した細胞系におけるＢＳＰに特異的な抗体によるアポトーシスのイニシエーション
種々の細胞系の発現解析は、とりわけ前立腺腫瘍細胞系および乳腫瘍細胞系がＢＳＰを発現することを示した。この発現は、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで行われ、ウエスタンブロットおよびＦＡＣＳ解析により蛋白レベルで行われた。ＢＳＰに特異的な抗体でのこれらのＢＳＰの発現している腫瘍細胞系の処理は、培養された細胞においてプログラムされた細胞の死へ導き、それはとりわけスルーフローサイトメトリ（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によって検出できた。
【００８９】
実施例１６−動物モデルにおける骨転移の低減
ＢＳＰの発現した腫瘍細胞系を免疫欠乏性の毛のないマウス／毛のないラット（ｒａｔ）に適用すると、通常骨転移が生じる。同時に、ＢＳＰに特異的な抗体を投与すると、驚くことに、生じることが明白な骨転移の形成が明らかに低減され、それは組織の組織学的解析を通して証明できた。
【００９０】
１．材料および方法論
我々の動物モデルに乳癌細胞系の注入およびぞれに続く抗ＢＳＰ抗体で生じる溶解性の病変の治療がなされた。ここで、それは腫瘍細胞からのヒトのＢＳＰに対して卓越した特異性を有するニワトリの多クローン性のＩｇＹ抗体の混合物を示し、それはまた、Ｈ因子の存在下でヒトの血清中でｈＢＳＰを量的に結合し、主としてｈＢＳＰのアミノ酸１２０〜１３５の領域のエプトープに結合し、それによって、腫瘍細胞からのｈＢＳＰの場合にこの領域の翻訳後の糖化が骨からの自然のＢＳＰと比較して変異する。
【００９１】
以前の研究において毛のないマウスの心臓内に適用された（Ｔ．Ａ．Ｇｕｉｓｅ，１９９７；ＰＴＨ−ｒＰおよび骨転移；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｏｃｉｅｔｙ）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（ＡＴＣＣ，ＨＢＴ−２６）が注入された。細胞系は転移したヒトの腺癌から得られ、さらにそれはエストロゲンレセプタを持たなかった。我々のケースでは、組織学的準備において細胞の同定を容易にする緑色の蛍光を出す蛋白（ＧＦＰ）でマークされた。実験動物として、免疫能力を低減した生後６〜８週間の毛のないラット（ＲＮＵ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｉｎｇ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が用いられ、従って注入されたヒトの細胞はそれとして、また戦ったものとして、識別されない。オスおよびメスの動物を用いた種々の細胞の量での我々の予備的研究は、オスのラットの場合、転移は、１０５のＭＤＡ−ＭＢ  ２３１細胞の注入に続いて約１カ月の後に溶解性の病変の形で見ることができたことを示した。
【００９２】
細胞（ＢＳＰパファ（ｐｕｆｆｅｒ）中１×１０５）は、（０．２ｍｌ；ｎ＝８）大腿骨（Ａ．ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）中で動脈内に注入された。この目的のために、この管の側枝はカニューレ挿入され、注入の後は導入した細胞は排出されるのを防止するために縛られた（ｂｏｕｎｄ  ｏｆｆ）。動物は副枝の形成によって管の損失を難なく埋め合わせした。それから癌細胞は、大腿骨、脛骨および腓骨の供給する（ｓｕｐｐｌｙｉｎｇ）ブランチの微細なブランチング中へ、血液とともに入った。ここで、流れの路（ｆｌｏｗ  ｐａｔｈ）の先端で、管外遊出およびそれに続く細胞の骨基質への付着が生じる。ここで恐らくＢＳＰとの相互作用も生じている。
【００９３】
続く転移成長の監視は、１０日を基礎にして従来の前面−後面および後面−前面からのＸ線イメージで、動物をエーテルで麻酔して、なされた。病変の範囲の長さおよび幅による病変の測定でおおよその定量がなされた。
【００９４】
２回のＸ線の陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）検査の後、動物は抗ＢＳＰ−Ａｋあるいは標準で治療された。治療は、上述の動物に対し、週に一度、皮下に１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度でなされた。
【００９５】
動物の追跡測定がコンピュータ断層撮影法および組織学（まだ完了していない）によってさらになされた。ＣＴは骨と欠損の３次元の画像再構成と、病変の大きさの正確な観測をさせた。観測時間の後で、動物は殺され、組織学的に研究された。ＧＦＰでのマーキングにより、骨部の準備で細胞は紫外光下で見ることができた。さらに、組織学的により直接的である、骨組織の続いている変質（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の情報を生成できた。
【００９６】
２．結果
結果は、一連の図４および５を伴う実施例により記録された。動物はＸ線（Ｓｉｅｍａｍｓ社，Ｏｐｔｉ  １５０／３０／５０  ＨＣ−１００）により施行（ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）の後で３ヵ月以上観察された。曲線の進展において、縦軸に示されたｍｍ２での病変の大きさの範囲表示が２つの示された動物に対して違っているという事実に注意が払われるべきである。全部で８匹の動物が扱われた。
【００９７】
動物９８７および９８８（図面参照）は、皮下の抗ＢＳＰ−Ａｋ（１０ｍｇ／ｋｇ）で週に１回治療された。全治療期間は約５０日であった。治療は２または３回のＸ線の陽性検査の後に開始した。動物９８７の場合、これは施行後４６日目に対応し、動物９８８の場合、これた施行後３２日目に対応する。
【００９８】
施行後２４日目からの急な病変の大きさの拡大は、動物９８８の場合、骨の進行した溶解が続き、それは３８日目からの脛骨の中間の三分の一における骨折と導いた。これは、治療が始まってから（３２日目から）発生した。最初の癒えている傾向は、骨折部位における仮骨（ｃｏｌｌｕｓ）形成という形で５２日目から示され、また、中央に近い脛骨および末端の大腿骨上の病変は小さくなった。病変の外側の境界は、始めのうちは明確に定められていたが、後に癒えている間に、徐々に明確でなくなってきた。骨の新しい形成が外側の周界から病変の中心へと始まった。仮骨形成の進行を通して正確なへりがもはや識別できなくなったので、８９日目からは病変の大きさの定量が困難となった。１２６日目の後は、完全な寛解と言うことができ、それは伴うイメージで示された（Ｘ線で識別できる溶解病変の完全な消失）。３次元のＣＴの画像再構成（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｓｏｍａｔｏ  Ｐｌｕｓ  ４，Ｖｏｌｕｍｅ  Ｚｏｏｍ）は、施行の３１日後と８０日後の脛骨の病変の変化を示す。明らかな骨組織の増加が見られた。
【００９９】
動物９８７もまた、３回の明確なＸ線の所見の後、４６日目から週に１回、１０ｍｇ／ｋｇ（皮下（ｓ．ｃ．））で治療された。ここで、末端の大腿骨での転移のみが現れ、それは８９日目（それは処置から４２日後）から既に癒えた。
【０１００】
他の動物は、同じ条件下で、週に５回まで１０ｍｇ／ｋｇ（皮下）で、また、週に２回まで１０ｍｇ／ｋｇ（静脈（ｉ．ｖ．））で、治療された。しかし、治療の間に注入されたＢＳＰ抗体に抗する免疫反応が誘導されると、治療中および治療完了後に病変の大きさの拡大が観察された。
【０１０１】
比較のために、動物が４０μＭｏｌ／ｋｇ（静脈）のアルキルホスホコリンＥｒ−ＰＣ３で週に２回治療された。これは、この濃度において、初期乳癌を悪化させ（陽性制御）、骨転移には何の効果も示さなかった（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）エルシルホスホコリン（ｅｒｕｃｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）は静脈注入可能なアルキルホスホコリンの基本型である．Ｄｒｕｇｓｏｆ  Ｔｏｄａｙ，３４（Ｓｐｐｌ．Ｆ），７３−８１）。ここで、治療の完了の後で、ある動物では変化は全く見られず、他の動物では、治療の開始と比較して、状況の悪化（進行）さえ見られた。
【０１０２】
本発明の主題は、このように、腫瘍に特異的なＢＳＰに抗するアプタマーあるいは同じ蛋白に対する他の配位子などの抗体または結合分子を含む医薬である。さらに、提案された医薬の応用の利用は、次の物質の使用を通して補強できる：付着分子と、薄膜が関連したプロテアーゼと、あるいは、例えばケモキンレセプタの化学走性を介したレセプタと、および、好ましくは抗体または天然あるいは人口のペプチドバンクから得られるは蛋白／ペプチドなどのアポトーシス含有物質と、相互作用する、抗体、配位子あるいは抑制物質。医薬や単独であるいは上述の物質と組み合わせて、特に腫瘍の病気、好ましくはその骨転移の治療ために、利用できる。
【０１０３】
本発明はさらに、転移を含めた癌成長を抑制するために、治療方法およびＢＳＰに抗する上記抗体あるいは同一のタンパクに対する他の配位子、またはそれらと次の補強する物質の組み合わせの医療上および商業上の使用に関する：付着分子と、薄膜が関連したプロテアーゼと、あるいは、例えばケモキンレセプタなどの化学走性を介したレセプタと、および、好ましくは抗体または天然あるいは人口のペプチドバンクから得られるは蛋白／ペプチドなどのアポトーシス含有物質と、相互作用する、抗体、配位子あるいは抑制物質。方法は、発現の病気に特有な配置を通して、ＢＳＰが、特定の腫瘍細胞上で活動できるということの観測に基礎を置いている。初期および二次的な腫瘍は、ＢＳＰにより、とりわけ転移および増殖の仕方において制御されている。これから、上記の方法／治療により、癌の成長および腫瘍の転移を決定的に邪魔することあるいは完全に抑制することの可能性がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ＢＳＰの腫瘍および骨特有のイソフォームのウエスタンブロットである。
【図２】単クローンのマウスの抗ＢＳＰ抗体を用いての発現構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）ＧＳＴ−ＥＫ−ＢＳＰおよびｈｉｓ６−ｍｙｃ−ＥＫ−ＢＳＰを有するトランスフェクションされていないＥＢＮＡ−２９３細胞（負制御）およびトランスフェクションされたＥＢＮＡ−２９３細胞の細胞培養上澄みのウエスタンブロットである。
【図３】フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ら（１９９１）による明らかにされていないＢＳＰのアミノ酸配列である。
【図４ａ】観測および治療期間にわたる、ラット９８８の脛骨の骨転移のｍｍ２で示した病変の大きさを示す曲線である。
【図４ｂ】治療の開始前、脛骨の病変の施行後３１日目のＸ線イメージである。
【図４ｃ】治療の開始後、骨の溶解がまだ続いている病変の施行後５２日目のＸ線イメージである。
【図４ｄ】後退している病変の施行後７３日目のＸ線イメージである。
【図４ｅ】癒えた病変の施行後１２６日目のＸ線イメージである。
【図４ｆ】施行後３１日目の病変のＣＴ再構成である。
【図４ｇ】施行後８０日目の後退している病変のＣＴ再構成である。
【図５ａ】観測および治療期間にわたる、ラット９８７の末端の大腿骨への骨転移のｍｍ２での病変の大きさの曲線である。
【図５ｂ】末端の大腿骨の病変の施行後５２日目のＸ線イメージである。
【図５ｃ】後退している病変および仮骨（ｃａｌｌｕｓ）形成からの施行後９６日目のＸ線イメージである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005506959.tif 000064
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