(57)【要約】植物葉緑体中で特異的に会合して機能的タンパク質複合体を生成するポリペプチドを生成する方法を含む、植物葉緑体における1つまたは複数のポリペプチドを産生する方法が提供される。第1のリボソーム結合配列（RBS）が原核生物中のポリペプチドの翻訳を指示し、かつ第2のRBSが葉緑体中のポリペプチドの翻訳を指示するように、第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBSを含む（またはコードする）単離されたポリペプチドもまた、このようなポリヌクレオチドを含有するベクター、特に葉緑体ベクターおよび葉緑体/原核生物シャトルベクターと同様に提供される。葉緑体コドンに偏っている合成ポリヌクレオチドもまた提供される。上記のようなポリヌクレオチドまたはベクターを含むように遺伝的に改変されている植物細胞、ならびにこのような遺伝的に改変された細胞を含むか、またはそれから誘導されたトランスジェニック植物が提供される。記載される合成ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第1の組換え核酸分子をプラスチドに導入する工程を含む、プラスチド中でポリペプチドを産生する方法であって、
該第1の組換え核酸分子が、少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも1つのリボソーム結合配列（RBS）をコードする第1のヌクレオチド配列を含み、
異種ポリヌクレオチドが、少なくとも第1のポリペプチドをコードする少なくとも第1のヌクレオチド配列を含む合成ポリヌクレオチドであって、葉緑体のコドン使用頻度を反映するように偏っている少なくとも1つのコドンを第1のヌクレオチド配列中に含み、
RBSが、少なくとも1つのポリペプチドの発現を可能にする条件下で、プラスチド中でポリペプチドの翻訳を指示し、それによってプラスチド中でポリペプチドを産生する、方法。
【請求項２】
第1のポリヌクレオチドが、少なくとも1つのRBSを含む葉緑体プロモーターおよび5'非翻訳領域（5'UTR）を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
葉緑体プロモーターおよび5'UTRが、葉緑体のatpAプロモーター、psbAプロモーター、psbDプロモーター、またはrbcLプロモーターおよび5'UTRである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号:15、配列番号:42、または配列番号:47に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第1の組換え核酸分子がベクター中に含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ベクターが、葉緑体ゲノムデオキシリボ核酸（DNA）との相同組換えを受け得る葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列を含む葉緑体ベクターである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ベクターが原核生物の複製起点をさらに含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
少なくとも第1のポリペプチドをコードする少なくとも第1のヌクレオチド配列を含む合成ポリヌクレオチドが、葉緑体のコドン使用頻度を反映するように偏っている少なくとも1つのコドンを第1のヌクレオチド配列中に含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
第1のヌクレオチド配列中の各コドンが葉緑体のコドン使用頻度を反映するように偏っている、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
プラスチドが葉緑体である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
葉緑体が藻類に存在する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
藻類が微小藻類である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
微小藻類がクラミドモナス・ラインハルティである、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
藻類が大型藻類である、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
第1のポリヌクレオチドが、抗体または抗体のサブユニットをコードする、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
第1のポリヌクレオチドが、第1のポリペプチドおよび選択的に第2のポリペプチドをコードする、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
第1の組換え核酸分子および第2の組換え核酸分子が、葉緑体中で同時発現される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質複合体がヘテロ二量体である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
第1のポリペプチドが免疫グロブリン重鎖またはその可変領域を含み、かつ第2のポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖またはその可変領域を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
異種ポリペプチドが第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む融合タンパク質を含む、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが融合タンパク質を含み、それによって単鎖抗体を産生する、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
単鎖抗体が配列番号:16、配列番号:43、または配列番号:48に示されるアミノ酸配列を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
単鎖抗体が配列番号:15、配列番号:42、または配列番号:47に示されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項21記載の方法
【請求項２４】
第1のヌクレオチド配列が、第3のヌクレオチド配列を介して第2のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
第3のヌクレオチド配列がリンカーペプチドをコードする、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
異種ポリペプチドが免疫グロブリン可変領域、免疫グロブリン定常領域、またはそれらの組み合わせを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
異種ポリペプチドが、軽鎖可変領域に作動可能に連結された完全長の重鎖タンパク質を含む単鎖抗体を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
異種ポリヌクレオチドがレポータータンパク質をコードする、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
レポータータンパク質が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼを含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
レポーター遺伝子が、葉緑体のコドン使用頻度を反映するように偏っている少なくとも1つのコドンを第1のヌクレオチド配列中に含む、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
ポリヌクレオチド配列中の各コドンが、葉緑体のコドン使用頻度を反映するように偏っている、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
異種ポリヌクレオチドが、配列番号:1、配列番号:2をコードするヌクレオチド配列、配列番号:45、または配列番号:46をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
ルシフェラーゼが配列番号:46に示されるアミノ酸配列を有する、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
配列番号:45に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
配列番号:16、配列番号:43、配列番号:46、または配列番号:48に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３６】
葉緑体中でレポーターポリペプチドの発現を可能にする条件下で、植物細胞の葉緑体中に請求項28記載のポリヌクレオチドを導入する工程、およびレポーターポリペプチドの発現を検出する工程を含む、葉緑体遺伝子発現を検出する方法。
【請求項３７】
レポーター遺伝子発現が、異種タンパク質発現のための改善されたプロモーターまたは5'UTRを同定するために使用される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
プラスチドからポリペプチドを単離する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３９】
請求項38記載の方法によって得られる単離されたポリペプチド。
【請求項４０】
抗体、抗体融合物、またはレポータータンパク質である、請求項39記載のポリペプチド。
【請求項４１】
第1のポリペプチドのコード配列と第2のポリペプチドのコード配列との間に作動可能に連結されている内部リボソームエントリー部位をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項39記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
複製起点が大腸菌の複製起点である、請求項7記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドのATGコドンへの作動可能な連結を可能にするように配置されたクローニング部位をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項４４】
請求項1記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項４５】
植物細胞である、請求項44記載の細胞。
【請求項４６】
ポリヌクレオチドが葉緑体に存在する、請求項45記載の細胞。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドが発現可能なポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、請求項46記載の細胞。
【請求項４８】
発現可能なポリヌクレオチドが少なくとも第1のポリペプチドをコードする、請求項46記載の細胞。
【請求項４９】
発現可能なポリヌクレオチドが第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチドをコードする、請求項48記載の細胞。
【請求項５０】
発現可能なポリヌクレオチドが第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドをコードする、請求項48記載の細胞。
【請求項５１】
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが異なる、請求項50記載の細胞。
【請求項５２】
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが融合タンパク質を含む、請求項50記載の細胞。
【請求項５３】
発現可能なポリヌクレオチドが、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、またはその組み合わせに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項47記載の細胞。
【請求項５４】
請求項45記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項５５】
請求項44記載のトランスジェニック植物から得られた植物の細胞または組織。
【請求項５６】
請求項55記載のトランスジェニック植物の切り枝。
【請求項５７】
請求項55記載のトランスジェニック植物によって産生される種子。
【請求項５８】
植物が藻類である、請求項54記載のトランスジェニック植物。
【請求項５９】
植物が被子植物である、請求項54記載のトランスジェニック植物。
【請求項６０】
被子植物が穀物植物、マメ科植物、脂肪種子植物、または硬材樹である、請求項59記載のトランスジェニック植物。
【請求項６１】
植物が観賞植物である、請求項54記載のトランスジェニック植物。
【請求項６２】
請求項54記載のトランスジェニック植物から得られた植物材料を含む組成物。
【請求項６３】
葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受け得る葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列；
原核生物起点；および
第2のリボソーム結合配列（RBS）に作動可能に連結された第1のRBS
を含む葉緑体/原核生物シャトルベクターであって、
第1のRBSが、葉緑体中での作動可能に連結された発現可能なポリヌクレオチドの翻訳を指示し得、かつ第2のRBSが、原核生物中での作動可能に連結された発現可能なポリヌクレオチドの翻訳を指示し得る、ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一部、米国国立衛生研究所から授与された助成金GM54659号、米国エネルギー省から授与された助成金DE-FG03-93ER20116号、および米国海洋大気庁のカリフォルニア海洋補助金大学プログラム（California Sea Grant college program）によって授与された助成金NA06RG00142号の下で連邦政府の援助を伴ってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的に植物細胞葉緑体中でポリペプチドを発現させるための組成物および方法に関し、より詳細には、異種ポリペプチドをコードする、葉緑体コドンに偏っているポリヌクレオチド、ならびに、例えば、ポリペプチドサブユニットの特異的会合によって形成される抗体および抗体キメラのようなタンパク質複合体のポリペプチドを含む、異種ポリペプチドの頑強な発現を細菌および葉緑体中で可能にする発現ベクターに関する。
【０００３】
背景情報
分子生物学および遺伝子操作は、健常個体のためのサプリメントとして、または病理学的な障害を有する個体を処置するための治療剤として使用され得る、生物学的に活性な化合物の大量生産を期待できる。例えば、成長ホルモンは、遺伝子組換え方法を使用して製造され、その組換え成長ホルモンは、成長発達障害に苦しむ個体を治療するために使用されてきた。同様に、所望の特異的特性を有するモノクローナル抗体は、リンパ腫および乳癌のような癌を含む種々の障害のための治療剤としての用途を見い出している。
【０００４】
治療用生物学的製剤を製造するための遺伝子工学技術を使用することの主要な利点は、これらの方法が大量の所望のタンパク質の生成を可能にすることである。多くの場合において、例えば、治療剤としての使用のために、十分な量の生物材料を得るための他の唯一の方法は、薬剤を産生する生物の細胞から、天然に存在する生物材料を精製することによる。従って、遺伝子操作の出現以前には、成長ホルモンがウシのような動物の脳下垂体からそれを単離することによってのみ得ることができた。インスリンは生物学的製剤の別の例であり、これは、遺伝子操作以前には、ブタのような動物の膵臓からそれを単離することによってのみ、十分な量でかつ生物学的に活性な型で利用可能であった。
【０００５】
遺伝子操作は大量の生物学的材料（特にタンパク質および核酸）を産生するための手段を提供するが、現在利用可能な方法への制限が存在する。例えば、ヒトタンパク質は細菌細胞において大量に発現され得る。しかし、細菌は、抗体のようなより複雑なタンパク質の組立てに適切な環境を提供しない。ここでは、4つのポリペプチド鎖が、例えば、生物学的に活性なタンパク質を形成するために会合する。従って、細菌が生物学的材料を産生するために使用され得る場合であっても、規定された条件下でタンパク質を変性および再フォールディングするようなさらなる工程が、生物学的に活性な物質を得るために必要とされ得る。
【０００６】
組換えタンパク質はまた、例えば、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む真核生物細胞において産生され得、これらは、発現されたタンパク質を生物学的に活性な薬剤に加工するために必要とされる、必要な環境および補助的な因子を提供し得る。例えば、抗体は、互いと二量体を形成する重鎖および軽鎖を含み、さらに第2の重鎖および軽鎖の二量体を会合して活性抗体を形成する。このようなプロセスは、哺乳動物細胞のような真核生物細胞において起こり得る。しかし、真核生物細胞はまた、例えば、それが特定の部位において糖基を含むようにタンパク質をグリコシル化することによってそのタンパク質を修飾し得る。このような翻訳後修飾は有利な特性を生じ得るが、これらはまた、組換えタンパク質の有用性を制限する不都合を与え得る。例えば、グリコシル基は強力に抗原性であり得、個体への投与の際に、組換えタンパク質を不活性化し得る免疫応答の刺激を生じ得、かつ、いくつかの場合において、組換えタンパク質が投与されるもととなった状態より大きな害を個体に引き起こす有害な効果を生じ得る。
【０００７】
一般的に、組換えDNA法を使用して産生されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクター（ポリヌクレオチドの操作を容易にする核酸分子）中に含まれる。ベクターは、細菌のような原核細胞または哺乳動物細胞のような真核生物細胞に、関心対象のポリヌクレオチドを導入するために使用され得る。ベクターが含まれる宿主細胞に依存して、ベクターはまた、例えば、宿主細胞中でそのベクターの増幅を可能にする調節エレメントを含む。さらに、ベクターは、原核生物細胞と真核生物細胞の両方において移動を可能にするように設計されてきた。このようなシャトルベクターは有用であり得る。なぜなら、これらは、例えば、細菌において大量のベクター（およびそこに含まれるポリヌクレオチド）の生成を可能にし、次いで、これらのベクターは、コードされたポリペプチドが生物学的に活性なタンパク質の適切な組立てを可能にする条件下で産生され得るように、哺乳動物細胞に移動され得るからである。
【０００８】
このようなシャトルベクターは1つまたは数個の特定の細胞型に特異的なベクターを超える利点を提供するが、これらは、グリコシル化（これは真核生物細胞において起こり得る）のような翻訳後修飾によって引き起こされ得る潜在的な問題を未然に防ぐことはない。従って、生物学的に活性であるが、例えば、ヒトのような個体に投与された場合に強力な抗原性などの所望されない特性を有しないタンパク質を便利に産生するための方法についての必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、かつ、さらなる利点を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、部分的には、葉緑体コドン使用頻度を反映するようにポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を改変することによって植物中で異種ポリペプチドが頑強に発現され得るという決定に基づく。従って、本発明は、少なくとも第1のポリペプチドをコードする少なくとも第1のヌクレオチド配列を含む合成ポリヌクレオチドに関し、ここで、第1のヌクレオチド配列中の少なくとも1つのコドンは葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている。1つの実施態様において、第1のヌクレオチド配列中の各コドンは葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている。
【００１０】
この合成ポリヌクレオチドは、単一のポリペプチドをコードする単一のヌクレオチド配列を含み得るか、または第2のポリペプチドをコードする少なくとも第2のヌクレオチド配列をさらに含み得、ここで、第2のヌクレオチド配列のコドンの1つまたは複数もまた、葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏り得る。合成ポリヌクレオチドが2つまたはそれ以上のポリペプチドをコードする場合、コードするヌクレオチド配列は、単一のポリヌクレオチドがそこから転写されるように作動可能に連結され得、そしてコードされたポリペプチドは別々に発現され得るか、または第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む融合タンパク質が発現され得るように、さらに作動可能に連結され得る。1つの実施態様において、第1および第2のヌクレオチド配列は、第3のヌクレオチド配列（これは例えば、リンカーペプチドをコードし得る）を介して作動可能に連結される。このようなものとして、リンカーペプチドを介して第2のポリペプチドに連結された第1のポリペプチドを含む融合タンパク質は、合成ポリヌクレオチドから発現され得る。
【００１１】
本発明の合成ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは関心対象の任意のポリペプチドであり得、および一般的には、プラスチド、特に葉緑体中で通常発現されないポリペプチドである。例えば、コードされたポリペプチドは免疫グロブリン（Ig）ファミリーメンバー（例えば、Ig可変領域、Ig定常領域、Ig重鎖、Ig軽鎖、もしくはそれらの組み合わせ；またはT細胞レセプター（TCR）α鎖、TCR β鎖、もしくはそれらの組み合わせ；またはT細胞レセプターの可溶性型のような任意の可溶性レセプター、もしくは、例えばIG重鎖とのこのようなレセプターの融合物）の1つまたは複数の鎖であり得る。1つの実施態様において、合成ポリヌクレオチドは、Igファミリーメンバーの融合タンパク質（例えば、軽鎖可変領域に作動可能に連結された完全な重鎖を含む単鎖抗体）をコードする。このような融合タンパク質は、本明細書中では、配列番号:16に示されるアミノ酸配列を有する単鎖抗単純ヘルペスウイルス（HSV）抗体（これは、葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている配列番号:15に示されるヌクレオチド配列を有する合成ポリヌクレオチドによってコードされ得る）によって例示される。別の例では、葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている合成ポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質は、配列番号:43に示されるアミノ酸配列（これは、配列番号:42によってコードされる）を有する単鎖抗HSV Fv断片によって例示される。なお別の例において、葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている合成ポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質は、配列番号:48に示されるアミノ酸配列（これは、配列番号:48によってコードされる）を有するHSV8-lsc（ラージ単鎖（large single chain））抗体によって例示される。
【００１２】
本発明の合成ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはまた、レポーターポリペプチド（例えば、ルシフェラーゼポリペプチド）であり得る。このようなルシフェラーゼレポーターポリペプチドは、本明細書中では、リンカーペプチドを介して細菌ルシフェラーゼBサブユニットに作動可能に連結された細菌ルシフェラーゼAサブユニットを含むルシフェラーゼ融合タンパク質によって例示される。この融合タンパク質は配列番号:46に示されるアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列は配列番号:45に示されるヌクレオチド配列を有する合成ポリヌクレオチドによってコードされ得、このヌクレオチド配列は、葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている。従って、配列番号:46に示されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ融合ポリペプチドが提供される。レポーターポリペプチドをコードする、合成の葉緑体コドン使用頻度に偏ったポリヌクレオチド（例えば、融合細菌luxABポリペプチド（配列番号:46）をコードする例示したポリヌクレオチド（配列番号:45））が、例えば、葉緑体プロモーター、5'非翻訳領域（5'UTR）、3'UTR、プロテアーゼ欠損株などを同定するためのツールとして有用であり得、従って、葉緑体中で異種ポリペプチドの発現のさらなる改善を得るための手段を提供する。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも第1のポリペプチドをコードする少なくとも第1のヌクレオチド配列（第1のヌクレオチド配列中の少なくとも1つのコドンが葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている）を含む合成ポリヌクレオチドを、プラスチド中で少なくとも第1のポリペプチドの発現を可能にする条件下でプラスチドに導入することによって、プラスチド中で異種ポリペプチドを産生する方法に関する。合成ポリヌクレオチドは、少なくとも1つのリボソーム結合配列（RBS）、特にプラスチド中でのポリペプチドの翻訳を指示し得るRBSをコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。
【００１４】
本発明の方法に従って使用される合成ポリヌクレオチドは、葉緑体のコドン使用頻度を反映するように偏っている少なくとも1つのコドンを含む少なくとも第1のヌクレオチド配列を含む、任意の合成ポリヌクレオチドであり得る。このようなものとして、合成ポリヌクレオチドは、第2のポリペプチドをコードする少なくとも第2のヌクレオチド配列をさらに含み得、ここで、第1のヌクレオチド配列は、第2のヌクレオチド配列に作動可能に連結され得るがその必要はなく、かつ第2のポリペプチドは、葉緑体に対して異種であり得るが、その必要はない。合成ポリヌクレオチドが2つ（またはそれ以上）のポリペプチドをコードする場合、コードされるポリペプチドは、分離されかつ区別可能なポリペプチドとして、または第1および第2（またはそれ以上）のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現され得る。
【００１５】
1つの実施態様において、本発明の方法に従う合成ポリヌクレオチドから発現された融合タンパク質は、リンカーペプチドを介して第2のポリペプチドに連結された第1のポリペプチドを含む。このような方法は、本明細書中では、軽鎖可変領域に連結されているIgA重鎖を含む単鎖抗体を発現することによって例示され、この融合タンパク質は配列番号:16に示されるアミノ酸配列を有し、これは、葉緑体コドン使用頻度に関して偏っている配列番号:15に示されるヌクレオチド配列によってコードされ、ここで、発現された単鎖抗体は抗原結合特異性を維持している（配列番号:43に示されるアミノ酸配列（配列番号:42によってコードされる）を有する単鎖抗HSV Fv断片、および配列番号:48に示されるアミノ酸配列（配列番号:48によってコードされる）を有するHSV8-lsc抗体もまた参照されたい）。
【００１６】
本発明の方法はさらに、レポーターポリペプチド、特に、ルシフェラーゼBサブユニットに作動可能に連結されたルシフェラーゼAサブユニットを含むルシフェラーゼ融合タンパク質を発現することによって、本明細書中で例示される。この融合タンパク質は、配列番号:46に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号:45に示されるヌクレオチド配列によってコードされ、ここで、葉緑体中の異種ルシフェラーゼの発現がインビボまたはインビトロにおいて検出可能である。
【００１７】
本発明の方法は、植物の葉緑体を含む任意のプラスチドにおいて実施され得る。葉緑体を含む植物は、藻類（微小藻類または大型藻類）および高等植物を含む、天然に葉緑体を含む任意の植物であり得る。本発明の方法は、ポリペプチドを含む植物細胞（または単離された葉緑体）から発現された異種ポリペプチドを単離する工程をさらに含み得る。従って、本発明は、本発明の方法によって産生された異種ポリペプチドを提供する。
【００１８】
本発明はさらに、プラスチドを含む植物細胞を検出する方法に関する。このような方法は、例えば、葉緑体中でレポーターポリペプチドの発現を可能にする条件下で植物細胞のプラスチド（例えば、葉緑体）に本発明の合成ポリヌクレオチドを導入する工程（ここで、そのポリヌクレオチドはレポーターポリペプチドをコードする）、およびそのレポーターポリペプチドの発現を検出する工程によって実行され得る。そのレポーターポリペプチドは、所望されるような任意のポリペプチドであり得、かつ配列番号:46に示されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ融合タンパク質を発現することによって本明細書中で例示される。
【００１９】
本発明はまた、プラスチド中でポリペプチドを産生する方法に関する。このような方法は、例えば、少なくとも第1の組換え核酸分子をプラスチドに導入する工程によって実行され得、ここで、その第1の組換え核酸分子は、少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも1つのリボソーム結合配列（RBS）をコードする第1のヌクレオチド配列を含み、そしてそのRBSは少なくとも1つのポリペプチドの発現を可能にする条件下でプラスチド中でのそのポリペプチドの翻訳を指示し得、それによってそのプラスチド中でポリペプチドを産生する。プラスチドは任意のプラスチドであり得、例えば、葉緑体を含む。
【００２０】
本発明の方法に従って、第1のポリヌクレオチドの1つまたは複数のコドンが葉緑体のコドン使用頻度を反映するように偏り得る。1つの実施態様において、コードされたポリペプチドは抗体または抗体のサブユニットである。別の実施態様において、第1のポリヌクレオチドは第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドをコードし、例えば、第1のポリペプチドはIg重鎖またはその可変領域を含み、第2のポリペプチドはIg軽鎖またはその可変領域を含む。本発明の方法に従って発現されたこのような抗体は、配列番号:14に示されるアミノ酸配列（これは配列番号:13に示されるヌクレオチド配列によってコードされる）を有する抗破傷風毒素抗体によって例示される。なお別の実施態様において、第1のポリヌクレオチドは葉緑体コドン使用頻度について偏っている。本発明の方法に従って発現されたこのような抗体は、配列番号:16、配列番号:43、および配列番号:48の各々において示されるようなアミノ酸配列を有する抗HSV抗体によって例示され、このような抗体は、例えば、それぞれ配列番号:15、配列番号:42、配列番号:47に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２１】
別の実施態様において、第1のヌクレオチドは第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチドをコードし、ここで第1および第2（またはそれ以上）のポリペプチドは、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などのタンパク質複合体のサブユニットであり得るが必ずしもその必要はない。なお別の実施態様において、本発明の方法は少なくとも第2の組換え核酸分子をプラスチドに導入する工程をさらに含み得る。このような第2の組換え核酸分子は、少なくとも第2のポリペプチドをコードする少なくとも第2の異種ポリペプチドに作動可能に連結された少なくとも第1のRBSをコードする第1のヌクレオチド配列を含み得、ここで、第1のRBSはプラスチド、特に葉緑体中でのポリペプチドの翻訳を指示し得る。好ましくは、第1の組換え核酸分子および第2の組換え核酸分子はプラスチド中で同時発現される。
【００２２】
本発明の方法に従って、第1の組換え核酸分子はベクター中に含まれ得る。1つの実施態様において、そのベクターは葉緑体ベクターであり、これは、葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受け得る葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列を含み、第1の組換え核酸分子を含むベクターは葉緑体に導入される。このようなベクターは原核生物の複製起点をさらに含み得る。
【００２３】
本発明の方法は、プラスチドからポリペプチドを単離する工程をさらに含み得る。従って、本発明は、そのような方法によって得られる単離されたポリペプチド、例えば、葉緑体中で発現され、かつ葉緑体に関して異種である単離された抗体を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、特異的に会合してタンパク質複合体を形成するポリペプチドを産生する方法を含む、植物葉緑体中で1つまたは複数のポリペプチドを産生する方法に関する。このようなものとして、本発明の方法は、機能的なタンパク質複合体、例えば、第2の重鎖および軽鎖を伴う第1の重鎖および軽鎖を含む二価抗体を産生するための手段を提供する。本発明の方法は、例えば、少なくとも1つのポリペプチドをコードし；第2のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている第1のポリヌクレオチドを含む第1の組換え核酸分子を葉緑体に導入することによって実行され得る。第2のポリヌクレオチドは、第2のリボソーム結合配列（RBS）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のRBSをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、少なくとも1つのポリペプチドの発現を可能にする条件下で、第1のRBSは原核生物中でのポリペプチドの翻訳を指示し得、第2のRBSは葉緑体中でのポリペプチドの翻訳を指示し得、それによって葉緑体中でポリペプチドを産生する。本発明の方法は、葉緑体を含む任意の植物（または植物細胞）（単細胞植物および単細胞藻類ならびに多細胞植物および多細胞藻類を含む）を使用して実行され得る。
【００２５】
1つの実施態様において、本発明の方法において使用される第1のポリヌクレオチドは、第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチド、例えば、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド；または、第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、および第3のポリペプチド；などをコードし、これらのいずれかまたはすべては、同じかまたは異なってもよい。別の実施態様において、第1のポリヌクレオチドの1つまたは複数のコドンは、葉緑体のコドン使用頻度を反映するように偏っている。
【００２６】
本明細書中に開示されるように、微小藻類クラミドモナス・ラインハルティ（Chlamydomonas reinhardtii）の葉緑体のような植物葉緑体中で発現されるポリペプチドは正確に組立てられ、機能的なタンパク質複合体を形成するように葉緑体中で1つまたは複数の他の発現されたポリペプチドと会合し得る。従って、なお別の実施態様において、本発明の方法において有用な第1のポリヌクレオチドは、機能的タンパク質複合体を形成するように会合し得る1つまたは複数のポリペプチドサブユニットをコードし得る。そのタンパク質複合体は二量体、三量体、四量体などであり得、そしてそのサブユニットは同じか、異なるか、またはその組み合わせであり得る。例えば、タンパク質複合体が二量体である場合、それはホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。タンパク質複合体が三量体である場合、それはホモ三量体、ヘテロ三量体、または2つの同一のポリペプチドおよび1つの異なるポリペプチドからなる三量体であり得る。
【００２７】
本発明の方法は、抗体（これは、一般的に2つの重鎖および2つの軽鎖を含む複合体として天然に存在する）、細胞表面レセプター（例えば、T細胞レセプター、増殖因子レセプター、ホルモンレセプター、Gタンパク質共役レセプター（これはGタンパク質と結合する）など）のような機能的タンパク質複合体を産生するために特に有用である。葉緑体中で抗体のようなタンパク質を産生するために本発明の方法を使用する利点は、ポリペプチドが葉緑体中で発現後にグリコシル化されないことであり、かつそれゆえに、動物において惹起されたか、または真核生物細胞の細胞質中で発現された抗体と比較した場合に非常に減少した抗原性を有することである。本明細書中で開示されるように、葉緑体中で機能的タンパク質複合体を産生する方法は、規定されるような第1の組換え分子を使用して実行され得るか（ここで、第1のポリヌクレオチドは、複合体の2つまたはそれ以上のサブユニットをコードする）；または、規定されるように、第1の組換え核酸分子および第2の組換え核酸分子を使用して実行され得、この第1の核酸分子は複合体の1つのポリペプチドサブユニットをコードし、この第2の組換え核酸分子は、第1の組換え核酸分子と同じ規定された特性を有し、かつタンパク質複合体のさらなるポリペプチドサブユニットをコードする。
【００２８】
従って、本発明の方法は、第1の組換え核酸分子を使用して実行され得、ここでその第1のポリヌクレオチドは第1のポリペプチド（これは免疫グロブリン重鎖（H）またはその可変領域である）および第2のポリペプチド（これは免疫グロブリン軽鎖（L）またはその可変領域である）をコードする。所望される場合、内部リボソームエントリー部位をコードするヌクレオチド配列が第2の（下流の）コードされたポリペプチドの発現が容易にされるようにH鎖およびL鎖をコードするヌクレオチド配列間に配置され得る。葉緑体中でのコードされたH鎖およびL鎖の翻訳に際して、H鎖は一価抗体（すなわち、H:L複合体）を形成するようにL鎖と結合し得、2つのH:L複合体は二価抗体を産生するようにさらに結合し得る。
【００２９】
本発明の方法はまた、第1の組換え核酸分子を植物の葉緑体中に導入すること（ここで、その第1の組換え核酸は、例えば、H鎖またはその可変領域をコードする）、および、第2のRBSをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のRBSをコードするヌクレオチド配列を含む、第2のポリヌクレオチドに作動可能に連結された、L鎖またはその可変領域をコードする第1のポリヌクレオチドを含む、第2の組換え核酸分子をその葉緑体中にさらに導入すること（ここで、コードされたポリペプチドが実質的に葉緑体中で同時発現するような条件下で、第1のRBSは原核生物におけるポリペプチドの翻訳を指示し得、かつ第2のRBSは葉緑体中でのポリペプチドの翻訳を指示し得、そして重鎖（H）および軽鎖（L）は会合してH:L複合体を形成し得、そしてH:L複合体はさらに会合して二価抗体を産生し得る）によって実施され得る。
【００３０】
本発明の方法の実施において、第1の組換え核酸分子はベクター中に含まれ得る。さらに、この方法が第2の（またはそれ以上の）他の組換え核酸分子を使用して実行される場合、第2の組換え核酸分子もまた、ベクター中に含まれ得、このベクターは第1の組換え核酸分子を含むものと同じベクターであり得るが必ずしもその必要はない。代替的に、植物細胞は、植物中の葉緑体がタンパク質複合体のサブユニットをコードする安定に組み込まれた組換え核酸分子を含むように遺伝子が改変され得、そして本発明の方法は、例えば、発現に際して機能的タンパク質複合体が産生されるようにタンパク質複合体の1つまたは複数の他のサブユニットをコードする第2の組換え核酸分子を含むベクターを植物の葉緑体に導入する工程を含み得る。
【００３１】
本発明の方法において有用なベクターは、葉緑体にポリヌクレオチドを導入するために有用である任意のベクターであり得る。特に、そのベクターは、葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受けるに十分な葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列を含み得る。そのような葉緑体ベクターは、ベクターの使用または操作を容易にする任意のさらなるヌクレオチド配列、例えば、1つまたは複数の、転写調節エレメント、または選択マーカー、またはクローニング部位など（それらの組み合わせを含む）を含み得る。1つの実施態様において、葉緑体ベクターであり得るこのベクターは転写プロモーターおよび植物葉緑体遺伝子の5'非翻訳領域（5'UTR）を含み、これは、本明細書中で規定されるように、第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBSをさらに含むか、またはそれを含むように改変され得る。別の実施態様において、葉緑体ベクターであり得るこのベクターは、原核生物の複製起点（ori）、例えば、大腸菌（E. coli）複製起点を含み、従って、原核生物宿主細胞ならびに葉緑体において継代および操作され得るシャトルベクターを提供する。本発明のシャトルベクターは、任意の関心対象のポリヌクレオチドを含み得、これは、合成の葉緑体コドン使用頻度に偏ったポリヌクレオチド、例えば、細菌luxAB融合タンパク質（配列番号:46）をコードする配列番号:45のような合成ポリヌクレオチドを含む。配列番号:46を発現するこのようなシャトルベクターは、調節エレメントまたは他の関心対象の配列が細菌中での発現について試験され得、次いでこれらのエレメントを含むベクターは、同じかもしくは他の合成のまたはそれに作動可能に連結された他のポリヌクレオチドを用いて葉緑体にシャトルされ得る所望の発現特性を有するという利点を提供し、ここで、コードされた異種ポリペプチドの改善された発現を得ることができる。
【００３２】
本発明の方法は、発現されたポリペプチドまたはタンパク質複合体を葉緑体から単離する工程をさらに含み得る。従って、本発明はまた、本明細書中に開示されたような方法によって産生された単離されたポリペプチドまたはタンパク質複合体を提供する。例えば、本発明は、植物の葉緑体中で発現され、かつそこから得られた単離された抗体を提供する。本発明の単離された抗体の利点は、抗体のポリペプチド成分がグリコシル化されておらず、それゆえに、その抗体は個体に投与された場合に減少した抗原性を有することである。さらに、このような本発明の抗体では、天然に存在する抗体に特徴的なエフェクター活性、例えば、補体結合活性が減少し得、従って、個体における診断目的に有用であり得る抗体を提供する。
【００３３】
本発明はまた、第2のリボソーム結合配列（RBS）に作動可能に連結された第1のリボソーム結合配列（RBS）を含む単離されたリボヌクレオチド配列に関し、ここで、第1のRBSおよび第2のRBSは約5〜25ヌクレオチド間隔が離れており、そしてリボヌクレオチド配列がポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される場合、第1のRBSは原核生物中のポリペプチドの翻訳を指示し、そして第2のRBSは葉緑体中のポリペプチドの翻訳を指示する。本発明の単離されたリボヌクレオチド配列は、一般的に約11〜50リボヌクレオチド長であり、約15〜40リボヌクレオチド長、または約20〜30リボヌクレオチド長であり得、不連続単位であり得るか、または異種RNA分子に作動可能に連結され得る。
【００３４】
本発明のリボヌクレオチド配列において作動可能に連結されている第1のRBSおよび第2のRBSは、一般的に、約5〜25ヌクレオチド、および通常約10〜20ヌクレオチド、例えば約15ヌクレオチド間隔が離れている。第1のRBSおよび第2のRBSの各々は、独立して、約3〜9ヌクレオチド、通常約4〜7ヌクレオチドからなり得、かつShine-Delgarno（SD）配列に特徴的な任意の配列（例えば、16S rRNAアンチSD配列の一部に相補的である5'-GGAG-3'を含む配列）を有し得る。葉緑体中での翻訳を指示する第2のRBSは、葉緑体遺伝子の5'UTR中に含まれ得、この遺伝子は、可溶性葉緑体タンパク質または膜結合葉緑体タンパク質をコードする葉緑体遺伝子であり得、ここで、5'UTRは、プロモーターを含む転写調節エレメントをさらに含み得る。
【００３５】
本発明のリボヌクレオチド配列は、第1および第2のRBSに作動可能に連結された開始AUGコドンをさらに含み得る。このような開始AUGコドンは、細胞中でポリペプチドの翻訳を容易にし得るKozak配列の隣接ヌクレオチド、例えば、ACCAUGGをさらに含み得る。本発明のリボヌクレオチド配列はまた、内因性開始AUGコドンを含み得るか、もしくは開始AUGコドンを含むように改変され得る、ポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドに作動可能に連結され得るか、または、本発明のリボヌクレオチド配列の構成成分であり得る開始AUGコドンを欠失し得る。
【００３６】
本発明の単離されたリボヌクレオチド配列は、化学合成され得るか、または酵素的方法を使用して、例えば、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）のテンプレートから、それぞれDNA依存性RNAポリメラーゼもしくはRNA依存性RNAポリメラーゼを使用して生成され得る。このようなDNAテンプレートは、化学合成され得るか、または天然に存在するDNA分子から単離され得るか、または必要とされる特性を有するように改変された天然に存在するDNA配列（例えば、開始ATGコドンの約5〜15ヌクレオチド上流に位置するRBSをコードするヌクレオチド配列を有し、かつ、第2のRBSが葉緑体中での翻訳を指示し得るように第1のRBSの上流にありかつそれから間隔が離れている第2のRBSを含むようにさらに改変されている原核生物遺伝子のDNA配列）に基づき得る。
【００３７】
従って、本発明はまた、本明細書中に規定されるような第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBSをコードするポリヌクレオチドに関する。そのポリヌクレオチドはDNAまたはRNAであり得、および一本鎖または二本鎖であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、第1のRBSおよび第2のRBSをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された開始ATGコドンを含み得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドが葉緑体または原核生物宿主細胞中で発現され得るように、ポリペプチドをコードし得る発現可能なポリヌクレオチドが第1のRBSおよび第2のRBSへ作動可能に連結することができるように配置されているクローニング部位を含み得る。コードされたポリペプチドの翻訳が、適切な条件下で第1のRBSおよび第2のRBSから開始され得るように、クローニング部位は、発現可能なポリヌクレオチドを第1および第2のRBSへ挿入または連結するのを容易にする任意のヌクレオチド配列であり得、例えば、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはリコンビナーゼ認識部位またはそれらの組み合わせであり得る。
【００３８】
本明細書中で規定されるように、第1および第2のRBSをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも1つのポリペプチド（ペプチドまたはポリペプチドのペプチド部分を含む）をコードし得る発現可能なポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る。このようなものとして、発現可能なポリヌクレオチドは第1のポリペプチドおよび1つまたは複数のさらなるポリペプチド（これは同じかまたは異なってもよい）をコードし得る。例えば、発現可能なポリヌクレオチドは第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドをコードし得、これらは互いに異なっている。さらに、このような第1および第2のポリペプチドは融合タンパク質として発現され得るか、または別個のポリペプチドとして発現され得、この場合において、内部リボソームエントリー部位をコードするヌクレオチド配列が、第1のポリペプチドのコード配列と第2のポリペプチドのコード配列との間に作動可能に連結され、従って、第2のポリペプチドの翻訳を容易にするが、必ずしもその必要はない。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドはまた、第1のクローニング部位および第2のクローニング部位によって隣接され得、従って、第2のポリヌクレオチドに容易に挿入され得るか、または連結され得るカセットを提供する。このような隣接する第1および第2のクローニング部位は同じかまたは異なってもよい、そして1つまたは両方が独立して1つまたは複数のクローニング部位、すなわちマルチクローニングサイトであり得る。
【００４０】
1つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、5'から3'の方向で作動可能に連結された、第2のRBSをコードするヌクレオチド配列、第1のRBSをコードするヌクレオチド配列、および開始ATG；および/またはこのようなポリヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、5'から3'の方向で作動可能に連結された、第2のRBSをコードするヌクレオチド配列、第1のRBSをコードするヌクレオチド配列、開始ATG、および少なくとも1つのクローニング部位；および/またはこのようなポリヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列を含む。なお別の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、5'から3'の方向で作動可能に連結された、第2のRBSをコードするヌクレオチド配列、第1のRBSをコードするヌクレオチド配列、および、第1のRBSをコードするヌクレオチド配列の3'側約3〜10ヌクレオチドに位置する少なくとも1つのクローニング部位；および/またはこのようなポリヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
本発明はまた、本明細書中に開示されるような、作動可能に連結された第1のRBSおよび第2のRBSをコードするポリヌクレオチド、および、葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受け得る葉緑体ゲノムデオキシリボ核酸（DNA）のヌクレオチド配列を含むベクターに関する。葉緑体ゲノムDNAのこのようなヌクレオチド配列は、一般的に、葉緑体遺伝子をコードしないサイレントなヌクレオチド配列であるが必ずしもそうである必要はなく、かつベクターが葉緑体ゲノムにおける対応するヌクレオチド配列との相同組換えを受け得るように十分な長さである。
【００４２】
本発明のベクターはまた、ベクターに所望の特性を付与する1つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列を含み得、例えば、ベクターの操作を容易にする配列を含む。このようなものとして、そのベクターは、例えば、1つまたは複数のクローニング部位、例えば、異種ポリヌクレオチドがベクターに挿入され得、かつ第1のRBSおよび第2のRBSに作動可能に連結され得るように配置されたマルチクローニングサイトであり得るクローニング部位である。このベクターはまた、原核生物の複製起点（ori）、例えば、大腸菌oriまたはコスミドoriを含み得、従って、所望されるように原核生物宿主細胞または植物の葉緑体中で継代され得るシャトルベクターを提供する。従って、1つの実施態様において、葉緑体/原核生物シャトルベクターが提供され、ここでそのシャトルベクターは以下を含む：1）葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受け得る葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列；2）原核生物複製起点；3）第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBS（第1の（または第2の）RBSは葉緑体中で作動可能に連結された発現可能なポリヌクレオチドの翻訳を指示し得、かつ第2の（または第1の）RBSは原核生物中で作動可能に連結された発現可能なポリヌクレオチドの翻訳を指示し得る）；および4）異種ポリヌクレオチドが第1のRBSおよび第2のRBSに挿入され得、かつ作動可能に連結され得るように配置された、作動可能に連結された発現可能なポリヌクレオチド、またはクローニング部位。
【００４３】
本発明のベクターは環状ベクターであり得るか、または直鎖状ベクター（これは、第1および第2の末端を有する）であり得る。本発明の直鎖状ベクターは、一方または両方の末端で1つまたは複数のクローニング部位を有し得、従って、ベクターを環状化するか、または、本発明のベクターと同じかもしくは本発明のベクターと異なる第2のベクターであり得る第2のポリヌクレオチドにベクターを連結するための手段を提供する。このクローニング部位は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位（またはその切断産物）、リコンビナーゼ部位、またはこのような部位の組み合わせを含み得る。
【００４４】
本発明のベクターは、1つまたは複数の発現制御エレメント、例えば、転写調節エレメント、付加的な翻訳エレメントなどをさらに含み得る。1つの実施態様において、そのベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがATGコドンに隣接して作動可能に連結され得るように、かつ転写に際して、原核生物中および葉緑体中で翻訳され得るRNAを含み得るように、第1のRBSおよび第2のRBSをコードする配列に作動可能に連結された開始ATGコドンを含む。従って、そのベクターはまた、そのようなATGコドンへの少なくとも1つの異種ポリヌクレオチドの作動可能な連結を可能にするように配置されているクローニング部位を含み得る。本発明のベクターはまた、第1のポリペプチドをコードする、第1のRBSおよび第2のRBSに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含み得、ここでそのコードするヌクレオチド配列は1つまたは複数のクローニング部位を含むように改変され、これには、例えば、ATGコドンの上流および近傍、ATGコドンの下流および近傍、ならびに/またはコードされたポリペプチドのC末端もしくはその近傍が含まれる。このようなベクターは、第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の置換によって、または、コードされたポリペプチドのN末端もしくはC末端の近傍の作動可能な連結におけるかのいずれかによって、第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそこに挿入するための便利な手段を提供し、その結果、第1および第2のポリペプチドを含む融合タンパク質が発現され得る。
【００４５】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む細胞に関する。本発明のベクターのための宿主細胞であり得る細胞は、例えば、大腸菌細胞のような細菌細胞；藻類もしくは単子葉植物もしくは双子葉植物のような植物細胞；昆虫細胞；または哺乳動物細胞のような脊椎動物細胞を含む原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。
【００４６】
一般的に、ベクター中に含まれ得る本発明のポリヌクレオチドは、発現可能なポリヌクレオチドに作動可能に連結され、それによってそのポリヌクレオチドを含む細胞は、発現可能なポリヌクレオチドによってコードされる1つまたは複数のポリペプチドの翻訳を可能にする発現系を提供する。このようにして、プラスチド、特に葉緑体のコドン使用頻度によってコドン使用頻度が偏り得る発現可能なポリヌクレオチドは、少なくとも第1のポリペプチド、例えば、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドをコードする。1つの実施態様において、発現可能なポリヌクレオチドは抗体をコードする。別の実施態様において、発現可能なポリヌクレオチドは葉緑体のコドン使用頻度に偏っており、例えば、発現可能なポリヌクレオチドは、配列番号:1、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:42、配列番号:45、または配列番号:47に示されるようなヌクレオチド配列を有する。
【００４７】
本発明はさらに、葉緑体ゲノムDNAに組み込まれた本発明のポリヌクレオチドを含む植物細胞を含むトランスジェニック植物に関する。従って、本発明は、このようなトランスジェニック植物から得られた植物細胞オルガネラまたは細胞または組織、例えば、トランスジェニック植物から単離された葉緑体、またはトランスジェニック植物から単離された葉もしくは花、トランスジェニック植物から単離された果実もしくは根茎、またはトランスジェニック植物の切り枝、またはトランスジェニック植物によって産生された種子を提供する。さらに、本発明は、本発明のトランスジェニック植物から、またはそのトランスジェニック植物から得られた植物細胞または植物組織から調製されたcDNAまたは葉緑体のゲノムDNAライブラリーを提供する。本発明のトランスジェニック植物は、任意の型の植物であり得、例えば、微小藻類または大型藻類であり得る藻類；単子葉植物；被子植物のような双子葉植物（例えば、穀物植物、豆類植物、脂肪種子植物、または硬材樹）（観賞植物を含む）が含まれる。
【００４８】
本発明はさらに、植物の葉緑体ゲノムDNAに組み込まれた本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝子が改変された本発明のトランスジェニック植物または植物細胞から得られた植物材料を含む組成物に関する。好ましくは、トランスジェニック植物または遺伝的に改変された植物細胞中における作動可能に連結された第1のRBSおよび第2のRBSをコードするポリヌクレオチドは、発現可能なポリヌクレオチドに作動可能に連結され、これは、葉緑体コドン使用頻度について偏り得るが、必ずしもその必要はない。このようにして、トランスジェニック植物から得られた細胞オルガネラ、細胞、または1つもしくはそれ以上の組織であり得る植物材料、例えば、トランスジェニック植物によって産生された葉緑体、または葉もしくは花、果実もしくは根茎、または種子は、ポリペプチドまたは発現可能なポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの供給源を提供する。例えば、発現可能なポリヌクレオチドが抗体、またはその抗原結合断片をコードする場合、植物材料、およびそれゆえに、その組成物は抗体の供給源を提供する。
【００４９】
本発明の組成物は、それが生きている被験体への投与、例えば、家畜またはペットであり得るか、またはヒトであり得る脊椎動物または他の哺乳動物への投与のために適切である形態であるように処方され得る。従って、発現可能なポリヌクレオチドによってコードされる（1つまたは複数の）ポリペプチドに依存して、本明細書中に開示されるような植物材料を含む組成物は、栄養補充物、治療剤などとして有用であり得る。例えば、発現可能なポリヌクレオチドが抗体またはその抗原結合断片をコードする場合、その組成物は、被験体（例えば、ヘルペスウイルスに曝露された個体または破傷風毒素に曝露された個体）の受動免疫のために有用であり得る。このようにして、本発明は、ヘルペスウイルス感染のような病理的な状態を改善するために有用な医薬を提供する。
【００５０】
本発明はまた、蛍光タンパク質またはその変異体もしくは変種をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、そのポリヌクレオチドのコドンは葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている。そのポリヌクレオチドはDNA配列またはRNA配列であり得、および一本鎖または二本鎖であり得、および一方または両方の末端にクローニング部位を含む直鎖状ポリヌクレオチドであり得る。そのポリヌクレオチドはまた、蛍光タンパク質が首尾よく原核生物中および葉緑体中で翻訳され得るように、約5〜25ヌクレオチド間隔が離れている第1のRBSおよび第2のRBSをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る。
【００５１】
本発明の蛍光タンパク質をコードする1つまたは複数のコドンは、例えば、3位にアデニンまたはチミジンを含むように偏り得、従って葉緑体中での蛍光タンパク質の翻訳を容易にする。例えば、その蛍光タンパク質は緑色蛍光タンパク質（GFP）（例えば、エクオレアクラゲ種によって産生されるもの）であり得る。このような本発明のポリヌクレオチドは、配列番号:2に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号:1に示されるポリヌクレオチド）によって例示される。従って、本発明はまた、このようなポリヌクレオチドによってコードされかつそれから発現される蛍光タンパク質（例えば、配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質）を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、少なくとも1つのポリペプチドをコードし、かつ葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている1つまたは複数のコドンを含む第1のポリヌクレオチド；および、第2のRBSをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている第1のRBSをコードするヌクレオチド配列を含む第2のポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子に関し、ここで、第1のRBSは原核生物中でのポリペプチドの翻訳を指示し得、かつ第2のRBSは葉緑体中でのポリペプチドの翻訳を指示し得る。第1のポリヌクレオチドは単一のポリペプチドをコードし得るか、または2つまたはそれ以上のポリペプチドをコードし得、これは別個のポリペプチドとして、または融合タンパク質として発現され得る。第1のポリヌクレオチドが2つまたはそれ以上のポリペプチドをコードする場合、コード配列間のヌクレオチド配列は、第2の（または他の）ポリペプチドの翻訳を容易にするように配置されている内部リボソームエントリー部位をコードし得るが、必ずしもそうである必要はない。本発明の組換え核酸分子はさらに、第3のポリヌクレオチドを含み得、これは第1および第2のポリヌクレオチドに作動可能に連結され得、かつ1つまたは複数のポリペプチドをコードし得るが、必ずしもそうである必要はない。
【００５３】
本発明はまた、葉緑体/原核生物シャトル発現ベクターを作製する方法に関する。このような方法は、例えば、原核生物の複製起点；第1のRBSをコードするヌクレオチド配列；および第2のRBSをコードするヌクレオチド配列；およびクローニング部位を含むヌクレオチド配列を、葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受けるに十分な葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列に導入することによって実行され得、ここで、その第1のRBSおよび第2のRBSは約5〜25ヌクレオチド間隔が離れており、そしてそのクローニング部位は、第1のRBSが原核生物中におけるポリペプチドの翻訳を指示し得、かつ第2のRBSが葉緑体中におけるポリペプチドの翻訳を指示し得るように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの第1のRBSおよび第2のRBSへの作動可能な連結を可能にするように配置されている。葉緑体/原核生物シャトル発現ベクターを作製する方法はまた、葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受けるに十分な葉緑体ゲノムデオキシリボ核酸（DNA）のヌクレオチド配列を、原核生物の複製起点、第2のRBSから約5〜25ヌクレオチド間隔が離れている第1のRBSをコードするヌクレオチド配列、ならびにポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの第1のRBSおよび第2のRBSへの作動可能な連結を可能にするように配置されたクローニング部位を含むように遺伝子改変することによって実行され得、その結果、第1のRBSが原核生物中におけるポリペプチドの翻訳を指示し得、かつ第2のRBSが葉緑体中におけるポリペプチドの翻訳を指示し得る。従って、本発明はまた、本明細書中に開示されるような方法によって産生される葉緑体/原核生物シャトルベクターを提供する。
【００５４】
本発明はさらに、ポリペプチドをコードする少なくとも第2のヌクレオチド配列に作動可能に連結された葉緑体RBSをコードする第1のヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチドに関し、ここで第1のヌクレオチド配列は第2のヌクレオチド配列に関して異種である。このような組換えポリヌクレオチドは、第2の（または他の）ポリペプチドをコードする、作動可能に連結された第3の（またはそれ以上の）ヌクレオチド配列をさらに含み得、従って、二シストロン性（または多シストロン性）ポリリボヌクレオチド配列をコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。作動可能に連結されたRBSをコードするヌクレオチドは、一般的に、開始ATGコドンに対して約20〜40ヌクレオチド5'（上流）に位置し、これは次に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。1つの実施態様において、第1のヌクレオチド配列は、RBSをコードする配列の約20〜40ヌクレオチド3'側に位置するATGコドンを含む。別の実施態様において、内部リボソーム結合配列は、同じかまたは異なってもよいポリペプチドをコードする2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列間に作動可能に連結される。
【００５５】
本発明はまた、クローニング部位に対して約20〜40ヌクレオチド5'側に位置するRBSをコードするヌクレオチド配列を含むベクターに関する。このクローニング部位は、ベクターへのヌクレオチド配列の挿入または連結を容易にする任意のヌクレオチド配列、例えば、1つもしくはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、1つもしくはそれ以上のリコンビナーゼ認識部位、またはこのような部位の組み合わせであり得る。好ましくは、そのクローニング部位はマルチクローニングサイトであり、これは、複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もしくはリコンビナーゼ認識部位、または少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位および少なくとも1つのリコンビナーゼ認識部位の組み合わせを含む。このベクターは、クローニング部位に対して5'側に隣接している開始ATGコドンまたはその一部をさらに含み得、従って、さもなくは開始ATGコドンを欠くコード配列のための翻訳開始部位を提供する。さらに、そのベクターは、クローニング部位に対して3'側に位置する葉緑体遺伝子3'非翻訳領域を含み得る。
【００５６】
発明の詳細な説明
本発明は、プラスチド、特に植物の葉緑体中で、機能的タンパク質複合体を含む機能的ポリペプチドを発現するための組成物および方法、ならびに、植物の葉緑体および原核生物間でのポリヌクレオチドの移動を容易にし、かつ葉緑体および原核生物中でのコードされたポリペプチドの発現を可能にする組成物を提供する。1つの実施態様において、本発明の方法は、正確に組立てられかつ抗原を特異的に結合するように機能する単鎖抗体を含む機能的抗体、ならびに、単鎖として発現され、かつ特異的に抗原と結合するホモ二量体を形成するように特異的に会合する、抗体およびその抗原結合断片を発現することによって例示される。
【００５７】
本発明の1つの方法に従って、抗体をコードするポリヌクレオチドは、葉緑体中で抗体の翻訳を指示するリボソーム結合配列（RBS）を含む5'非翻訳領域（5'UTR）に作動可能に連結される、別の実施態様において、抗体をコードするポリヌクレオチドは、第1のRBS（これは原核生物細胞中での翻訳を指示する）および第2のRBS（これは葉緑体中での翻訳を指示する）に作動可能に連結される。なお別の実施態様において、抗体をコードするポリヌクレオチドは、葉緑体コドン使用頻度に偏っている。
【００５８】
本発明の別の方法に従って、少なくとも第1のポリペプチドをコードする少なくとも第1のヌクレオチド配列を含む合成ポリヌクレオチド（ここで、第1のヌクレオチド配列中の少なくとも1つのコドンは、葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている）が、コードされたポリペプチドが発現される細胞に導入される。1つの実施態様において、第1のヌクレオチド中の各コドンは葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っており、別の実施態様において、合成ポリヌクレオチドは少なくとも第2のヌクレオチド配列を含み、これは、第1のヌクレオチド配列に作動可能に連結され得るが、必ずしもそうである必要はなく、かつ少なくとも第2のポリペプチドをコードする。ここで、このポリヌクレオチドの発現は、第1および第2（またはそれ以上の）ポリペプチドを含む融合タンパク質を生成し得るが、必ずしもその必要はない。従って、少なくとも第1のポリペプチドをコードする少なくとも第1のヌクレオチド配列を含む合成ポリヌクレオチド（第1のヌクレオチド配列中の少なくとも1つのコドンは葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている）が提供される。本明細書中で使用される場合、用語「合成ポリヌクレオチド」は、葉緑体コドン使用頻度について偏っていないポリペプチド中のコドンを、葉緑体コドン使用頻度について偏っているコドン（以下の表1を参照されたい）に変化させることによって改変された核酸分子を意味する。本明細書中で開示されるように、このような合成ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、葉緑体中で頑強に発現される。
【００５９】
他の実施態様において、本発明の方法を実施するための組成物が提供される。本発明によって提供される利点は、植物の葉緑体中での機能的ポリペプチドの頑強な発現を得るための能力を含み、ここで、そのポリペプチドはグリコシル化されておらず、それゆえに、被験体への投与の際の抗原性の減少、ならびに、発酵の設備の必要性およびそれに伴う費用なしで大量の機能的ポリペプチドを産生する能力を有する。
【００６０】
本発明の方法は、植物の葉緑体中で1つまたは複数のポリペプチドを発現する手段を提供し、それによって、そのポリペプチドは機能的タンパク質複合体を産生するために組立てられ得る。本明細書中に開示されるように、葉緑体中で発現されるポリペプチドが正確に組立てられるだけでなく、また、そのポリペプチドがタンパク質複合体のサブユニットを含む場合には、そのポリペプチドは機能的タンパク質複合体を産生するように特異的に会合し得る。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質複合体」とは、同じかまたは異なってもよい少なくとも2つのポリペプチドの特異的会合によって形成される組成物をいう。タンパク質複合体として機能するために特異的に会合するポリペプチドは周知であり、酵素、増殖因子、増殖因子レセプターおよびホルモンレセプターなどを含む。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「特異的に会合する」または「特異的に相互作用する」または「特異的に結合する」とは、生理的条件下で比較的安定である複合体を形成する2つまたはそれ以上のポリペプチドをいう。この用語は、例えば、機能的タンパク質複合体を形成するために相互作用する第1のポリペプチドサブユニットおよび第2のポリペプチドサブユニットの相互作用、ならびに、抗体およびその抗原の相互作用までを含む種々の相互作用に関連して本明細書中で使用される。特異的相互作用は少なくとも約1×10-6M、一般的に少なくとも約1×10-７M、通常少なくとも約1×10-8M、および特に少なくとも約1×10-9Mまたは1×10-10M以上の解離定数によって特徴付けられ得る。特異的相互作用は、一般的に生理学的条件下で安定であり、この条件には、例えば、植物または動物（脊椎動物または無脊椎動物であり得る）を含む生きている被験体の細胞または細胞下区画で生じる条件、ならびに生物体の細胞または組織を維持するために使用されるような細胞培養物で生じる条件が含まれる。2つの分子が特異的に相互作用するか否かを決定するための方法は周知であり、これには例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、ゲルシフト分析などが含まれる。
【００６２】
機能的タンパク質複合体を含む機能的ポリペプチドを産生するための本発明の方法の有用性は、機能的抗体の産生によって本明細書中で例示される。用語「抗体」は、抗原のエピトープを特異的に結合し得るポリペプチドまたはタンパク質複合体をいうために本明細書では広範に使用される。一般的に、抗体は、重鎖可変領域ドメインおよび軽鎖可変領域ドメイン、特に超可変領域の結合によって形成される少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む。本発明の方法に従って生成された抗体は、天然に存在する抗体、例えば、二価抗体に基づき得、これは、第1の重鎖および軽鎖の可変領域、ならびに第2の重鎖および軽鎖の可変領域（例えばIgGまたはIgAのアイソタイプ）によって、または第1の重鎖可変領域および第2の重鎖可変領域（VHH抗体；例えば、米国特許第6,005,079号を参照されたい）によって形成される2つの抗原結合ドメインを含み、あるいは、天然に存在しない抗体に基づき得、これには、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体、およびヒト化抗体、ならびに、抗体の抗原結合断片、例えば、Fab断片、Fd断片、Fd断片、Fv断片などが含まれる。
【００６３】
1つの実施態様において、本発明の方法は、軽鎖に作動可能に連結された重鎖を含む単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを使用することによって例証され、ここで、この抗体は破傷風毒素（配列番号:13および14を参照されたい）に特異的に結合する。別の実施態様において、本発明の方法は、軽鎖に作動可能に連結された重鎖を含む単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを使用することによって例証され、ここで、この抗体は1型および2型の単純ヘルペスウイルスに特異的に結合し、そしてこの抗体をコードするポリヌクレオチドは葉緑体コドン使用頻度に偏っている（配列番号:15および16；配列番号:42および43；ならびに配列番号:47および48を参照されたい；実施例3もまた参照されたい）。
【００６４】
本発明の方法を実施するために有用なポリヌクレオチドは、関心対象の抗体を産生する細胞から単離され得、例えば、免疫された被験体からまたは特定の抗原に曝露された個体からのB細胞は、ポリヌクレオチド合成の周知の方法を使用して新規合成され得るか、組換えにより産生され得るか、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができ（Huseら、Science 246:1275-1281（1989）（これは参照として本明細書に組み入れられる））、かつ、所望される場合、葉緑体コドン使用頻度に偏り得る（実施例1および表1を参照されたい）。例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、CDR移植抗体、単鎖抗体、および二機能性抗体をコードするポリヌクレオチドを作製するこれらの方法および他の方法は当業者に周知である（WinterおよびHarris、Immunnol. Today 14:243-246, 1993; Wardら、Nature 341:544-546, 1989; HarlowおよびLane、Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hilyardら、Protein Engeineering: A practical approach（IRL Press 1992）; Borrabeck、Antibody Engineering, 第2版（Oxford University Press 1995）これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる）。
【００６５】
ヒト化モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、マウス免疫グロブリン遺伝子の重鎖および軽鎖の可変鎖からのマウス相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト可変性ドメイン遺伝子に移動させること、次いで、マウスの対応物のフレームワーク領域にヒト残基を置換することによって得ることができる。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技術は公知であり（例えば、Orlandiら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:3833, 1989を参照されたい（これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる））、ヒト化モノクローナル抗体を産生するための方法も同様に公知である（例えば、Jonesら、Nature 321:522, 1986; Riechmannら、Nature 332:323, 1988; Verhoeyenら、Science 239:1534, 1988; Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:4285, 1992; Sandhu、Crit. Rev. Biotechnol. 12:437, 1992; およびSingerら、J. Immunol. 150:2844, 1993を参照されたい；これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる）。
【００６６】
本発明の方法はまた、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから単離されたヒト抗体断片をコードするポリヌクレオチドを使用して実施され得る（例えば、Barbasら、Methods: A Companion to Methods in Immunology 2:119, 1991; Winterら、Ann. Rev. Immunol. 12:433, 1994を参照されたい；これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる）。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーを産生するために有用なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Stratagene Cloning Systems（La Jolla, CA）から得ることができる。
【００６７】
ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから得ることができる。この技術において、ヒト重鎖およびヒト軽鎖の遺伝子座のヒトエレメントは、内因性の重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的化された破壊を含む胚性肝細胞株に由来するマウスの株に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成し得、およびこのマウスはヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用され得、このハイブリドーマから、本発明の方法を実施するために有用なポリヌクレオチドを得ることができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Greenら、Nature Genet. 7:13, 1994; Lonbergら、Nature 368:856, 1994; およびTaylorら、Intl. Immunol. 6:579, 1994によって記載されており；これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる。このようなトランスジェニックマウスは市販されている（Abgenix, Inc.; Fremont CA）。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドはまた、抗体の抗原結合断片をコードするものであり得る。例えば、Fv、Fab、Fab'、Fd、およびF(ab')2の断片を含む抗原結合抗体断片は当技術分野で周知であり、かつ抗体のタンパク質分解性加水分解によってもともと同定された。例えば、抗体断片は、慣習的な方法によって全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。ペプシンを用いる抗体の酵素的切断によって産生される抗体断片は、F(ab')2を示す5S断片を生成する。この断片は、チオール還元剤、および選択的に、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を使用してさらに切断され得、3.5S Fab'一価断片を産生する。代替的には、ペプシンを使用する酵素的切断は、2つの一価Fab'断片およびFc断片を直接的に産生する（例えば、以下を参照されたい：Goldenberg、米国特許第4,036,945号および同第4,331,647号（これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる）、およびそこに含まれる参考文献；Nisonhoffら、Arch. Biochem. Biophys. 89:230. 1960；Porter、Biochem. J. 73:119, 1959；Edelmanら、Meth. Enzymol. 1:422（Academic Press 1967）；Coliganら、Curr. Protocols Immunol., 1992, 2.8.1-2.8.10節および2.10.1-2.10.4節を参照されたい；これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる）。
【００６９】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチドは、例えば、抗体産生細胞のRNAからポリメラーゼ連鎖反応を使用して可変領域を合成することによって、関心対象の抗体のCDRをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得ることができる（例えば、Larrickら、Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる））。このような断片のサブユニットを含むこのような抗体断片をコードするポリヌクレオチドおよび、例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を結合させるペプチドリンカーは、化学合成方法によって、または日常的な組換えDNA法を使用して調製され得、これは、上記のように得ることができる全長の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドから開始する。
【００７０】
本発明は、部分的には、コード配列に関するリボソーム結合配列（RBS）の正確な位置付けが植物の葉緑体中での頑強な翻訳を生じるという決定（以下を参照されたい；実施例2もまた参照されたい）、および、生物体中で天然に産生される場合にタンパク質複合体を形成するために特異的に会合することが知られているポリペプチド（例えば、抗体）もまた、葉緑体中で正確に会合し得る（実施例3を参照されたい）という決定に基づく。葉緑体中でこのようなポリペプチドを発現する利点は、そのポリペプチドが、核遺伝子から発現されたポリペプチドによって典型的に横切られる細胞内区画を通して進行せず、それゆえに、グリコシル化のような特定の翻訳後修飾に供せられないということである。このようにして、本発明の方法によって産生されたポリペプチドおよびタンパク質複合体は、同じポリペプチドが真核生物の核に導入されたポリヌクレオチドから発現された場合よりもより抗原性が少ないことが期待され得る。
【００７１】
本発明の方法は、単鎖抗体のような機能的ポリペプチド、および二価抗体のようなタンパク質複合体（これは例えば、第2の重鎖および軽鎖と会合した第1の重鎖および軽鎖を含む）を産生するための手段を提供する。本明細書中で開示されるように、本発明の方法は、例えば、組換え核酸分子を葉緑体に導入することによって実行され得、ここで、その組換え核酸分子は、第2のポリヌクレオチド（これは、少なくとも1つのポリペプチドの発現を可能にする条件下で、第2のRBSをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のRBSをコードするヌクレオチド配列を含む）に作動可能に連結された第1のポリヌクレオチド（これは、少なくとも1つ（すなわち、1、2、3、4、またはそれ以上）のポリペプチドをコードする）を含む。このような条件は、組換え核酸分子の葉緑体への進入、および好ましくは、組換え核酸分子の葉緑体ゲノムへの組み込みを可能にするかまたはそれを容易にするものを含む。このような方法には、本明細書中に例示されるもの、ならびに、当技術分野において公知かつ日常的な他の方法が含まれる。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」とは、2つまたはそれ以上の分子が、それらが単一の単位として機能し、かつ一方の分子または両方の分子またはそれらの組み合わせに起因し得る機能をもたらすように、互いに関連して配置されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、転写または翻訳の調節エレメントに作動可能に連結され得る。この場合において、そのエレメントは、調節エレメントが、それが通常細胞中で付随しているポリヌクレオチド配列にもたらすのと同様の方法でポリヌクレオチドにその調節効果を付与する。第1のポリヌクレオチドコード配列はまた、キメラポリペプチドが、作動可能に連結されたコード配列から発現され得るように、第2の（またはそれ以上の）コード配列に作動可能に連結され得る（例えば、配列番号:30を参照されたい、これは、GFPをコードし、かつ葉緑体コドン使用頻度が偏ったポリヌクレオチド（すなわち、配列番号:1）がPsbD遺伝子に挿入され、その結果、GFPに融合したPsbD遺伝子産物を含む蛍光融合タンパク質が生成された部位を示す）。キメラポリペプチドは、2つ（またはそれ以上の）コードされたペプチドが単一のポリペプチドに翻訳された（すなわち、ペプチド結合を通して共有結合された）融合ポリペプチドであり得、例えば、軽鎖可変領域に（所望される場合、リンカーペプチドを通して）作動可能に連結された重鎖可変領域を含む単鎖抗体であるか；または、翻訳の際に、安定なタンパク質複合体を形成するように互いに特異的に会合し得る2つの別個のペプチド（例えば、機能的一価抗体を生じる四次構造を形成し、かつ機能的二価抗体を産生するためにさらに会合し得る抗体重鎖および抗体軽鎖）として翻訳され得る。このような融合タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドの例には、細菌ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードする配列番号:45、ならびに、単鎖抗HSV抗体をコードする配列番号:15、42、および47が含まれる。
【００７３】
用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」または「核酸分子」は、ホスホジエステル結合によって一緒に連結されている2つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味するために本明細書中で広範に使用される。このようなものとして、この用語はRNAおよびDNAを含み、これは、遺伝子もしくはその一部、cDNA、合成ポリデオキシリボ核酸配列などであり得、一本鎖もしくは二本鎖、ならびにDNA/RNAハイブリッドであり得る。さらに、本明細書中で使用される場合、この用語には、細胞から単離され得る天然に存在する核酸分子、ならびに、例えば、化学合成の方法、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような酵素的方法によって調製され得る合成ポリヌクレオチドが含まれる。本明細書中で使用される用語「合成ポリヌクレオチド」が、葉緑体コドン使用頻度を反映するように改変されたポリヌクレオチドに対して言及することを除いて、異なる用語は、例えば、組成物の異なる成分を区別するように議論の便宜のためのみに使用されることが認識されるべきである。
【００７４】
一般的に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、天然に存在するデオキシリボヌクレオチド（例えば、2'-デオキシリボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニン、もしくはチミン）またはリボヌクレオチド（例えば、リボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニン、もしくはウラシル）である。しかし、用途に依存して、ポリヌクレオチドはまた、天然に存在しない合成ヌクレオチドまたは改変された天然に存在するヌクレオチドを含むヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドアナログは当技術分野において周知であり、かつ市販されており（例えば、Ambion, Inc.; Austin TX）、このようなヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドも同様である（Linら、Nucl. Acids Res. 22:5220-5234, 1994; Jellinekら、Biochemistry 34:11363-11372, 1995; Pagratisら、Nature Biotechnol. 15:68-73, 1997、これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる）。ポリヌクレオチドのヌクレオチドを連結する共有結合は一般的にホスホジエステル結合である。しかし、ポリヌクレオチドが使用される目的に依存して、共有結合はまた、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合、または、合成ポリヌクレオチドを産生するためにヌクレオチドを連結するために有用な当業者に公知の任意の他の結合を含む、多数の他の結合のいずれかであり得る（例えば、Tamら、Nucl. Acids Res. 22:977-986, 1994; EckerおよびCrooke、BioTechnology 13:351360, 1995を参照されたい（これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる））。
【００７５】
天然に存在するヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドは、化学合成され得るか、または、組換えDNA法を使用して、テンプレートとして適切なポリヌクレオチドを使用して産生され得る。比較すると、ヌクレオチドアナログまたはホスホジエステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドは、一般的に化学合成されるが、T7ポリメラーゼのような酵素は、特定の型のヌクレオチドアナログをポリヌクレオチドに組み込むことができ、それゆえに、適切なテンプレートから組換えによってそのようなポリヌクレオチドを産生するために使用され得る（Jellinekら、前出、1995）。
【００７６】
用語「組換え核酸分子」は、ヒトの介入によって操作されるポリヌクレオチドに言及するために本明細書中で使用される。組換え核酸分子は、その産物が天然の細胞中に見い出されないような様式で連結される、2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含み得る。特に、2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が作動可能に連結され得、そして例えば、融合ポリペプチドをコードし得るか、またはコードヌクレオチド配列および調節エレメント、特に第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBSを含み得る。組換え核酸分子はまた、第1のコドン（これは、通常ポリヌクレオチド中に見い出される）が葉緑体コドン使用頻度に偏るように、または、関心対象の配列がポリヌクレオチド、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位もしくはスプライシング部位、プロモーター、DNA複製起点などに導入されるように、天然に存在するポリヌクレオチド、例えば、1つまたは複数のヌクレオチドの変化を有するポリヌクレオチドに基づくが、それとは異なるように操作され得る。
【００７７】
本明細書中に開示されるように、開始コドン（例えば、AUGコドン）の約20〜40ヌクレオチド上流（5'）のRBSの配置は、AUGコドンで開始するコード配列の頑強な翻訳を可能にする（実施例2を参照されたい）。このようにして、AUGコドンの約20〜40ヌクレオチド上流に配置されるRBSは、AUGコドンに対して「作動可能に連結されている」と見なされる。さらに、開始コドンから約5〜15ヌクレオチド上流に配置されているRBSが原核生物中でのコード配列の翻訳を指示し得、かつ、本明細書中に開示されるように、このようなRBSは、開始コドンの約20〜40ヌクレオチド上流に位置する第2のRBSに作動可能に連結され得、原核生物および葉緑体中での翻訳を指示し得る転写調節エレメントを生じることは周知である。このようにして、約5〜25ヌクレオチド間隔が離れている第1および第2のRBSは、互いに関して作動可能に連結されていると見なされる。用語「第1の」、「第2の」、「第3の」などは、RBSまたはポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどへの言及の際に本明細書中で使用される場合、議論の便宜のみのために使用されること、および、特に他に示されない限り、順序、重要性などを意味するものではないことが認識されるべきである。このようにして、本明細書中で、例えば、原核生物中での翻訳を指示し得る第1のRBSおよび葉緑体中での翻訳を指示し得る第2のRBSに対する言及がなされる場合に、「第1」および「第2」（など）の指定は、2つ（またはそれ以上）のエレメントを首尾よく区別するためのみになされる。
【００７８】
「翻訳を指示する」能力を有するRBSへの言及は、開始コドンで一般的に始まるコード配列に作動可能に連結された場合に、RBSが、翻訳が開始コドンで開始して起こり得るように、リボソームによって結合され得ることを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「開始コドン」とは、コード配列の第1のコドンであるリボヌクレオチド配列またはコードするデオキシリボヌクレオチド配列をいう。一般的に、開始コドンは「開始AUGコドン」（RNA中で）または「開始ATGコドン」（DNA中で）であり、メチオニンをコードするが、他のコドン（例えば、CUGを含む）もまた、開始コドンとして作用し得る。
【００７９】
ポリヌクレオチドをコードする1つまたは複数のコドンは、葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏り得る（実施例1）。大部分のアミノ酸は、2つまたはそれ以上の異なる（縮重した）コドンによってコードされており、そして種々の生物が特定のコドンを他に優先して利用することが十分に認識されるべきである。このような優先的なコドン使用頻度はまた、葉緑体中でもまた利用され、本明細書中では「葉緑体コドン使用頻度」といわれる。表1（以下）はC.ラインハルティについての葉緑体コドン使用頻度を示す。
【００８０】
用語「偏っている」は、コドンに対する言及において使用される場合、ポリヌクレオチド中のコドンの配列が、そのコドンが葉緑体中で優先的に使用されるもの（表1を参照されたい）であるように変化されたことを意味する。葉緑体コドン使用頻度に偏っているポリヌクレオチドは新規合成され得るか、または日常的な組換えDNA技術を使用して、例えば、部位特異的変異誘発法によって、遺伝子を改変し得、1つまたは複数のコドンが葉緑体コドン使用頻度に偏っているようにそれらのコドンを変化させる（実施例1を参照されたい）。本明細書中に開示されるように、葉緑体コドンの偏りは、異なる植物（例えば、タバコと比較する場合の藻類の葉緑体を含む）で様々に変動し得る。一般的に、本発明の目的のために選択される葉緑体コドンの偏りは（例えば、本明細書中で開示されるような合成ポリヌクレオチドを調製する場合を含む）、植物葉緑体の葉緑体コドン使用頻度を反映し、そして、コドンの第3の位置に関してA/Tに変動されているコドンの偏りを含む。例えば、ここで、第3の位置は約66％より大きいA/Tの偏り、特に約70％より大きいATの偏りを有する。このようにして、本発明の目的のために偏っている葉緑体コドンは、例えば、第3のコドン位置において34.56％のGCの偏りを有する、ニコチアナ・タバカス（Nicotiana tabacus）（タバコ）において観察される第3の位置の偏りを除外する（例えば、URL「kazusa.or.jp/codon/」および「chloroplast」リンクのワールドワイドウェブを参照されたい）。1つの実施態様において、葉緑体コドン使用頻度は、藻類の葉緑体コドン使用頻度、例えば、第3のコドン位置において約74.6％のATの偏りを有するC.ラインハルティのそれを反映するように偏っている。
【００８１】
（表１）クラミドモナス・ラインハルティにおける葉緑体コドン使用頻度
2005537784.tif 000002
＊1,000コドンあたりのコドン使用頻度
＊＊36の葉緑体コード配列（10,193コドン）において観察された回数
【００８２】
本発明の方法は、第1のポリペプチドおよび少なくとも第2のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して実行され得る。このようにして、そのポリヌクレオチドは、例えば、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチド；第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、および第3のポリペプチド；などをコードし得る。さらに、コードされたポリペプチドのいずれかまたはすべては同じかまたは異なってもよい。本明細書中で開示されるように、微小藻類クラミドモナス・ラインハルティの葉緑体において発現したポリペプチドは組立てられ、機能的ポリペプチドおよびタンパク質複合体を形成した（実施例1および3を参照されたい）。このようにして、本発明の方法は、例えば、二量体、三量体、および四量体を含む機能的タンパク質複合体を産生するための手段を提供し、ここで、その複合体のサブユニットは、同じかまたは異なってもよい（例えば、それぞれ、ホモ二量体またはヘテロ二量体）。葉緑体中で機能的ポリペプチドおよびタンパク質複合体を発現する方法は、抗体の産生によって、ならびに、レポータータンパク質の産生によって（緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼ（luxAB融合タンパク質；実施例1および4を参照されたい；配列番号:1および45もそれぞれまた参照されたい）を含む）、および葉緑体コドン使用頻度に偏ったポリヌクレオチドから発現された抗体の産生によって（実施例3を参照されたい；配列番号:15、42、および47もまた、参照されたい）、例示される。本明細書中で例示されるように、葉緑体は、軽鎖可変領域に連結された完全な重鎖を有する単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、組換え核酸分子を形質移入され、ここで、それらの重鎖ドメインの特異的相互作用を通して会合した2つの単鎖抗体を含むホモ二量体が産生された。これらの結果は、異種ポリペプチドが葉緑体中で四次構造を形成するように特異的に会合し得ることの最初の証拠を提供し、かつ、本発明の方法に従って、ヘテロポリマーの異なるポリペプチドの各々をコードする単一の組換え核酸分子を葉緑体に導入することによって、またはその各々がヘテロポリマーの1つ（またはそれ以上）のサブユニットをコードする2つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを導入することによって、ヘテロポリマーが産生し得ることを実証する。
【００８３】
本発明の方法は、葉緑体中での翻訳を指示するRBSをコードし、かつ好ましくは、原核生物中での翻訳を指示する作動可能に連結されたRBSをさらにコードするヌクレオチド配列を含む、第1の組換え核酸分子を使用して実施され得、このヌクレオチド配列は、少なくとも第1のポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。例えば、この組換え核酸分子は、免疫グロブリン重鎖（H）またはその可変領域（VH）をコードするポリヌクレオチドを含み得、および、免疫グロブリン軽鎖（L）またはその可変領域（VL）である第2のポリペプチドをさらにコードし得る。所望される場合、内部リボソームエントリー部位をコードするヌクレオチド配列が、第2の（下流の）コードされたポリペプチドの発現が容易にされるように、H鎖およびL鎖をコードするヌクレオチド配列間に配置され得る。葉緑体中でのコードされたH鎖およびL鎖の翻訳の際に、H鎖はL鎖と会合して一価抗体（すなわち、H:L複合体）を形成し得、および2つのH:L複合体はさらに会合して二価抗体を産生し得る。
【００８４】
本発明の方法はまた、例えば、H鎖またはVH鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第1の組換え核酸分子を植物の葉緑体に導入すること、および、L鎖またはVL鎖をコードするポリヌクレオチドを含む第2の組換え核酸分子をその葉緑体にさらに導入することによって実施され得、ここで、各組換え核酸分子は第2のRBSをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のRBSをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、第1のRBSは原核生物中でのポリペプチドの翻訳を指示し得、第2のRBSは葉緑体中でのポリペプチドの翻訳を指示し得、ここで、2つのRBSをコードするヌクレオチド配列はコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。葉緑体を含む植物細胞が、コードされたポリペプチドが同時発現されることを可能にする条件に曝露される場合、H鎖およびL鎖は会合してH:L複合体を形成し得、そのH:L複合体はさらに会合して二価抗体を形成し得る。
【００８５】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子は、コード配列、His-6タグなどのようなペプチドタグに作動可能に連結された配列をさらに含み得、このペプチドタグは、細胞中でのポリペプチドの発現の同定を容易にし得る。His-6のようなポリヒスチジンタグペプチドは、ニッケルイオン、コバルトイオンなどのような二価カチオンを使用して検出され得る。さらなるペプチドタグには、例えば、抗FLAG抗体を使用して検出され得るFLAGエピトープ（例えば、Hoppら、BioTechnology 6:1204（1988）；米国特許第5,011,912号を参照されたい（これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる））；c-mycエピトープ（そのエピトープに特異的な抗体を使用して検出され得る）；ストレプトアビジンまたはアビジンを使用して検出され得るビオチン；および、グルタチオンを使用して検出され得るグルタチオンS-トランスフェラーゼが含まれる。このようなタグは、例えば、実質的に精製されたポリペプチドを得ることが所望されている場合に、それらが作動可能に連結されたポリペプチドの単離を容易にし得るさらなる利点を提供し得る。
【００８６】
本発明の方法において有用な組換え核酸分子はベクターに含まれ得る。さらに、その方法が第2（またはそれ以上）の組換え核酸分子を使用して実行される場合、第2の組換え核酸分子はまた、ベクター中に含まれ得、そのベクターは、第1の組換え核酸分子を含むのと同じベクターであり得るが、必ずしもそうである必要はない。このベクターは、葉緑体にポリヌクレオチドを導入するために有用な任意のベクターであり得、好ましくは、葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受けるに十分な葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列を含み、例えば、ヌクレオチド配列は、約400〜1500以上の実質的に連続する葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチドを含む。ベクターとしての使用のための葉緑体ゲノムの領域を選択するための葉緑体ベクターおよび方法は周知である（例えば、Bock、J. Mol. Biol. 312:425-438, 2001を参照されたい；StaubおよびMaliga、Plant Cell 4:39-45, 1992; Kavanaghら、Genetics 152:1111-1122, 1999もまた参照されたい、これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる）。
【００８７】
C.ラインハルティの全体の葉緑体ゲノムはURL「biology.duke.edu/chlamy_genome/chloro.html」（「view complete genome as text file」リンクおよび「maps of the chloroplast genome」リンクを参照されたい）にてワールドワイドウェブ上で公的に利用可能であり、これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる（J. Maul、 J. W. Lilly、およびD. B. Stern、未公開結果；2002年1月28日修正；GenBankアクセッション番号AF396929として公開）。一般的に、葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列は、それが（調節配列またはコード配列を含む）遺伝子の一部、特に、相同組換え事象によって破壊された場合、葉緑体に関して（例えば、葉緑体ゲノムの複製について）、または葉緑体を含む植物細胞に関して有害な効果を産生する遺伝子の一部でないように、選択される。この点に関して、C.ラインハルティ葉緑体ゲノム配列を含むウェブサイトはまた、その葉緑体ゲノムのコード領域および非コード領域を示すマップを提供し、従って、本発明のベクターを構築するために有用な配列の選択を容易にする。例えば、本明細書中で開示される実験において使用された葉緑体ベクターp322は、約143.1kb位のEco（EcoRI）部位から約148.5kb位のXho（XhoI）部位までに達するクローンである（URL「biology.duke.edu/chlamy_genome/chloro.html」のワールドワイドウェブを参照し、「maps of the chloroplast genome」リンクおよび「140-150kb」リンクをクリックして参照されたい；URL「biology.duke.edu/chlamy/chloro/chloro140.html」のワールドワイドウェブでもまた直接アクセス可能；実施例1もまた参照されたい）。
【００８８】
本発明のベクターはまた、そのベクターの用途または操作を容易にする任意のさらなるヌクレオチド配列、例えば、1つまたは複数の転写調節エレメント、選択マーカーをコードする配列、1つまたは複数のクローニング部位などを含み得る。1つの実施態様において、葉緑体ベクターは原核生物の複製起点（ori）（例えば、大腸菌ori）を含み、従って、原核生物宿主細胞ならびに葉緑体において継代および操作され得るシャトルベクターを提供する。
【００８９】
本発明の方法は、微小藻類C.ラインハルティを使用することによって例示される。本発明の方法に従ってポリペプチドまたはタンパク質複合体を発現するための微小藻類の使用は、微小藻類の多数の集団（市販のものを含む（Cyanotech Corp.; Kailua-Kona HI））を増殖させ、従って、大量の所望の産物の産生、および所望される場合、その単離を可能にする。しかし、任意の植物の葉緑体中で、例えば、機能的哺乳動物ポリペプチド（タンパク質複合体を含む）を発現する能力は、このような植物の作物の産生を考慮し、それゆえに、大量のポリペプチドを首尾よく産生する能力を考慮している。従って、本発明の方法は、葉緑体を有する任意の植物を使用して実施され得、この植物には、例えば、大型藻類（例えば、海草および海藻）ならびに土壌中で成育する植物が含まれる。土壌中で成育する植物は、例えば、以下の植物である：トウモロコシ（Zea mays）、アブラナ（Brassica）種（例えば、B. napus、B. rapa、B. juncea）、特に種油の供給源として有用であるアブラナ種、アルファルファ（Medicago sativa）、イネ（Oryza sativa）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor、 Sorghum vulgare）、ミレット（例えば、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、キビ（Panicum miliaceum）、アワ（Setaria italica）、フィンガーミレット（Eleusine coracana））、ヒマワリ（Helianthus annuus）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）、コムギ（Triticum aestivum）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ピーナッツ（Arachis hypogaea）、ワタ（Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Ipomoea batatus）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Cofea種）、ココナッツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Ananas comosus）、柑橘類の木（Citrus種）、カカオ（Theobroma cacao）、チャ（Camellia sinensis）、バナナ（Musa種）、アボカド（Persea ultilane）、イチジク（Ficus casica）、グァバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifera indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidentale）、マカダミア（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、サトウキビ（Saccharum種）、オート、ウキクサ（Lemna）、オオムギ、トマト（Lycopersicon esculentum）、レタス（例えば、Lactuca sativa）、インゲン（Phaseolus vulgaris）、アオイマメ（Phaseolus limensis）、エンドウ（Lathyrus種）、およびCucumis属のメンバー（例えば、キュウリ（C. sativus）、カンタロープ（C. cantalupensis）、およびマスクメロン（C. melo））。アザレア（Rhododendron種）、アジサイ（Macrophylla hydrangea）、ハイビスカス（Hibiscus rosasanensis）、バラ（Rosa種）、チューリップ（Tulipa種）、ラッパスイセン（Narcissus種）、ペチュニア（Petunia hydrida）、カーネーション（Dianthus caryophyllus）、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima）、およびキクのような観葉植物もまた含まれる。本発明の方法を実施するために有用なさらなる観葉植物には、ホウセンカ、ベゴニア、テンジクアオイ、スミレ、シクラメン、バーベナ、ビンカ、マンジュギク、サクラソウ、セントポーリア、カッコウアザミ、アマランサス、キンギョソウ（Antihirrhinum）、オダマキ、フウキギク（Cineraria）、クローバー、コスモス、ササゲ、ダリア、チョウセンアサガオ、ヒエンソウ（Delphinum）、ガーベラ、グラジオラス、グロキシニ��、アマリリス、マツバギク（Mesembryanthemum）、サルメンバナ、およびヒャクニチソウが含まれる。本発明を実施する際に利用され得る針葉樹には、例えば以下が含まれる：マツ（例えば、テーダマツ（Pinus taeda）、スラッシュマツ（Pinus elliotii）、ポンデローサマツ（Pinus ponderosa）、ヨレハマツ（Pine contorta）およびモンテレーマツ（Pinus radiata））、ベイマツ（Pseudotsuga menziesii）；アメリカツガ（Tsuga ultilane）；ベイトウヒ（Picea glauca）；アメリカスギ（Sequoia sempervirens）；（本来の）モミ（例えば、ヨーロッパモミ（Abies amabilis）およびバルサムモミ（Abies balsamea））；ならびにヒマラヤスギ（例えば、ベイスギ（Thuja plicata）およびアラスカヒノキ（Chamaecyparis nootkatensis））。
【００９０】
本発明の方法を実施するために有用なマメ科植物には、マメおよびエンドウが含まれる。マメには、グアール、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、ガーデンビーン、ササゲ、ヤエナリ、アオイマメ、ソラマメ、ヒラマメ、ヒヨコマメなどが含まれる。マメ科植物には、アラキス（Arachis）（例えば、ピーナッツ）、ビシア（Vicia）（例えば、オオゴンハギ、ヘアリーベッチ、アズキ、ヤエナリ、およびヒヨコマメ）、ルピナス（Lupinus）（例えば、ルピナス、シャジクソウ）、ファセオラス（Phaseolus）（例えば、インゲンマメおよびアオイマメ）、ピサム（Pisum）（例えば、ソラマメ）、メリロタス（Melilotus）（例えば、クローバー）、メディカゴ（Medicago）（例えば、アルファルファ）、ロータス（例えば、ツメクサ）、レンズ（例えば、ヒラマメ）、およびクロバナエンジュが含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法における使用のための好ましい飼い葉および芝草には、アルファルファ、オーチャードグラス、ヒロハノウシノケグサ、ホソムギ、コヌカグサ（creeping bent grass）、およびコヌカグサ（redtop）が含まれる。本発明において有用な他の植物には、アカシア、アニス、チョウセンアザミ、キバナスズシロ、クロイチゴ、カノラ、シラントロ、クレメンタイン、キクヂシャ、ユーカリ、ウイキョウ、グレープフルーツ、ハネデュー、クズイモ、キウイフルーツ、レモン、ライム、マッシュルーム、ナッツ、オクラ、オレンジ、パセリ、カキ、プランテーン、ザクロ、ポプラ、ラディアータマツ（radiata pine）、赤チコリー、サザンパイン（Southern pine）、モミジバフウ、タンジェリン、トリチカレ、ブドウ（vine）、ヤムイモ、リンゴ、セイヨウナシ、マルメロ、チェリー、アンズ、メロン、アサ、ソバ、ブドウ（grape）、キイチゴ、ケノポジ、ブルーベリー、ネクタリン、モモ、プラム、イチゴ、スイカ、ナス、コショウ、カリフラワー、アブラナ属（例えば、ブロッコリー、キャベツ）、アルティラン・スプラウト（ultilan sprouts）、タマネギ、ニンジン、ニラ（leek）、ビート、ソラマメ、セロリ、ハツカダイコン、カボチャ（pumpkin）、エンダイブ、ヒョウタン、ニンニク、サヤインゲン（snap bean）、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、カブ、アルティレーン（ultilane）、チコリ、アメリカホドイモ、およびズッキーニが含まれる。
【００９１】
本発明の方法は、安定に組み込まれたポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変された葉緑体を含む植物を生成し得る（すなわち、トランスプラストーム；例えば、HagerおよびBock、Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:302-310, 2000を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる）；Bock、前出、2001もまた参照されたい）。組み込まれたポリヌクレオチドは、例えば、本明細書中に規定されるような第1および第2のRBSに作動可能に連結されたコードするポリヌクレオチドを含み得る。従って、本発明はさらに、トランスジェニック植物（トランスプラストーム植物）を提供し、これは、特異的に会合して機能的タンパク質複合体を形成し得るポリペプチドを含む、1つまたは複数の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数の葉緑体を含む。トランスプラストームを含むトランスジェニック植物は、核ゲノムに組み込まれたポリヌクレオチドを有するトランスジェニック植物を超える利点を提供する。例えば、大部分の農産物種において、葉緑体は、卵を通して厳格に母性遺伝する；花粉（精子）は葉緑体を欠く（例えば、HagerおよびBock、前出、2000を参照されたい）。このようにして、トランスプラストームを含むトランスジェニック植物は、そのトランスジェニック植物と近縁であり得る天然の植物を含む他の植物を他家受粉することができず、従って、環境中でのトランスジェニック植物の生長に伴ういかなる潜在的な生態学的リスクをも減少させる。
【００９２】
用語「植物」は、プラスチド（特に葉緑体）を含む真核生物をいうために本明細書中で広範に使用され、かつ、植物の切り枝、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官、植物種子、および小植物（plantlet）を含む、任意の発達段階のこのような生物体、または植物の一部を含む。植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造的かつ生理学的な単位である。植物細胞は単離された単一の細胞もしくは培養細胞の形態であり得、または、高度に組織化された単位の一部、例えば、植物組織、植物器官、もしくは植物であり得る。従って、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子を産生する細胞、または植物全体に再生され得る細胞または細胞の集合体であり得る。このようなものとして、複数の植物細胞を含み、かつ植物全体に再生され得る種子は、本開示の目的のための植物細胞と見なされる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または、構造的もしくは機能的単位に組織化される植物細胞の任意の他の群であり得る。植物の特に有用な部分には、収穫可能な部分および子孫植物の増殖のために有用な部分が含まれる。植物の収穫可能な部分は、植物の任意の有用な部分であり得、例えば、花、花粉、芽生え、塊茎、葉、茎、果実、種子、根などである。増殖のために有用な植物の部分には、例えば、種子、果実、切り枝、芽生え、塊茎、根茎などが含まれる。
【００９３】
トランスジェニック植物は、遺伝子改変した葉緑体を含む形質転換した植物細胞から産生され得る。本明細書中で使用される場合、用語「再生する」は、植物細胞；植物細胞の群；プロトプラスト；種子；またはカルスもしくは組織のような植物の一部から全体の植物を生長させることを意味する。プロトプラストからの再生は植物の種から種で異なる。例えば、プロトプラストの懸濁物が作製され得、そして特定の種において、胚形成がプロトプラスト懸濁物から、成熟および発芽の段階まで誘導され得る。培養培地は一般的に、増殖および再生のために必要な種々の成分（例えば、特定の植物種に依存して、オーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモン；グルタミン酸およびプロリンのようなアミノ酸を含む）を含む。効率的な再生は、部分的には、培地、遺伝子型、および培地の履歴に依存する。しかし、これらの変数が調節される場合、再生は再現可能である。
【００９４】
再生は、植物カルス、外植体、器官、または植物の一部から起こり得る。形質転換は、器官または植物部分の再生の文脈において実行され得る（Meth. Enzymol. 第118巻；Kleeら、Ann. Rev. Plant Physiol. 38:467, 1987を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる））。リーフディスク形質転換−再生法を使用して、例えば、ディスクは選択培地上で培養され、続いて約2〜4週間以内に苗条形成が起こる。発達したシュートはカルスから切除され、適切な根誘導用の選択培地に移植される。発根した小植物は根が現れてからできる限り速やかに土壌に移植する。小植物は成熟に達するまで必要に応じて別の鉢に植え替え得る。
【００９５】
栄養繁殖する農作物において、成熟トランスジェニック植物は、切り枝技術または組織培養技術を利用して、複数の同一の植物を産生するために増殖される。所望のトランスジェノート（transgenote）の選択がなされ、そして新規な種類が得られかつ商用目的のために栄養繁殖される。種子繁殖する農作物において、成熟トランスジェニック植物は、それ自体が交雑されてホモ接合性の純系の植物を産生し得る。得られる純系の植物は導入された異種ポリヌクレオチドを含む種子を産生し、増殖してそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する植物を産生し得る。このようにして、本発明はさらに、本発明の方法によって得られたトランスジェニック植物によって産生された種子を提供する。
【００９６】
所望される場合、異なる異種ポリペプチドを発現するように遺伝子改変されている葉緑体を含む本発明のトランスジェニック植物が交雑され得、それによって、2つまたはそれ以上の異なる導入遺伝子を含むトランスジェニック植物を得るための手段を提供する。植物を育種するための方法および所望の特性または他の関心対象の特性を有する植物を異種交配させるために選択するための方法は、当技術分野で周知である。
【００９７】
本発明の葉緑体またはトランスジェニック植物中で異種ポリペプチドまたはタンパク質複合体を産生する方法は、発現されたポリペプチドまたはタンパク質複合体を植物細胞葉緑体から単離する工程をさらに含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「単離された」または「実質的に精製された」は、言及されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、天然に付随しているタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、または他の物質を比較的含まない形態にあることを意味する。一般的に、単離されたポリペプチド（またはポリヌクレオチド）は試料の少なくとも20％を占め、および、通常は試料の少なくとも約50％、特に試料の少なくとも約80％、およびより特別には試料の約90％または95％以上を占める。
【００９８】
用語「異種」とは、本明細書中で使用される場合、比較的な意味において、言及されたヌクレオチド配列（またはポリペプチド）が参照の供給源以外の供給源由来であること、または、それが通常付随していない第2のヌクレオチド配列（もしくはポリペプチド）に連結されていること、または、参照の物質に通常付随しない形態にあるように改変されていることを意味する。例えば、抗体をコードするポリヌクレオチドは、植物葉緑体のヌクレオチド配列に関しては異種であり、同様に、例えば、第2のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1のヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子の成分は異種であり、同様に、葉緑体中に導入された変異ポリヌクレオチドは、その変異ポリヌクレオチドが通常葉緑体中に見い出されない場合、異種である。
【００９９】
ポリペプチドまたはタンパク質の複合体は、特定のポリペプチドまたはタンパク質の複合体に適切な任意の方法を使用して葉緑体から単離され得、この方法には、例えば、塩による分画方法およびクロマトグラフィー方法（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の複合体を特異的に結合するリガンドまたはレセプターを使用するアフィニティークロマトグラフィー方法）が含まれる。本発明の方法に従って産生されるポリペプチドまたはタンパク質の複合体が単離された形態にあるということの決定は、周知の方法を使用して、例えば、電気泳動を実行し、特定の分子を相対的に分離したバンドとして、または特定の複合体を一連のバンドの1つとして同定することによってなされ得る。従って、本発明はまた、本発明の方法によって産生された、単離されたポリペプチドまたはタンパク質の複合体を提供する。
【０１００】
本発明はまた、葉緑体中での異種ポリペプチドの頑強な発現を得るための、単独でまたは組み合わせて使用され得る組成物を提供する。1つの実施態様において、本発明は、第1のRBSおよび第2のRBSを含む（またはコードする）ヌクレオチド配列を提供し、ここで、その第1のRBSおよび第2のRBSは、一方のRBSが原核生物細胞中での翻訳を指示し、他方のRBSが植物葉緑体中での翻訳を指示するように間隔が離れている。1つの局面において、そのヌクレオチド配列はまた、開始コドン、例えば、第1のRBSおよび第2のRBSに作動可能に連結された開始AUG（もしくはATG）コドンを含み得（もしくはコードし得）、または、第1のRBSおよび第2のRBSへのコード配列の作動可能な連結を可能にするために配置されたクローニング部位を含み得る。別の局面において、そのヌクレオチドはベクター中に含まれ、そのベクターは、好ましくは、葉緑体ゲノムとの部位特異的相同組換えを受けるに十分な葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列を含む。なお別の局面において、そのベクターは原核生物の複製起点をさらに含むシャトルベクターである。
【０１０１】
別の実施態様において、コドンの選択は、コードするポリヌクレオチドを葉緑体のコドン使用頻度に偏らせるために利用され、従って、葉緑体中での1つまたは複数のコードされたポリペプチドの頑強な発現を得るための手段を提供する。葉緑体中でのポリペプチド発現を最適化するためのコドンの選択の有用性は、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）緑色蛍光タンパク質（GFP；実施例1）を使用して本明細書中で例示される。このようにして、本発明はまた、GFPをコードするポリヌクレオチド（そのポリヌクレオチドは葉緑体中での発現のためにコドンが最適化されている）を提供する。本明細書中で開示されるように、変種ポリヌクレオチドはGFPをコードし、これは、植物葉緑体を検出するため（葉緑体中での遺伝子発現を試験するためを含む）の試薬として有用にする量で発現される。ポリペプチドを発現するための葉緑体コドン最適化の一般的有用性は、ルシフェラーゼをコードする合成ポリヌクレオチドの調製によってさらに実証され（実施例4）、その発現は、インビボまたはインビトロで、および抗体をコードするポリヌクレオチドによって検出され得る（実施例3）。さらに、例示された組成物および方法は、機能的融合タンパク質（単鎖抗体およびレポーターポリペプチドを含む）が葉緑体中で頑強に発現され得ることを実証する（実施例3および4を参照されたい）。
【０１０２】
高等植物および藻類の葉緑体は、光合成原核生物の真核生物宿主への内部共生的な取り込みによっておそらく生じた。組み込みのプロセスの間、遺伝子は葉緑体から宿主の核に移動された（Gray、Curr. Opin. Gen. Devel. 9:678-687, 1999）。このようにして、葉緑体中での正確な光合成機能は、核にコードされたタンパク質とプラスチドにコードされたタンパク質の両方、ならびに、2つのゲノム間での遺伝子発現の協調を必要とする。植物において、核にコードされた遺伝子および葉緑体にコードされた遺伝子の発現は、発生的および環境的な因子に応答して実際に協調する。
【０１０３】
葉緑体において、遺伝子発現の調節は、一般的に転写後、およびしばしば翻訳開始の間に起こる。この調節は、葉緑体翻訳装置、ならびに核にコードされた調節因子に依存する（BarkanおよびGoldschmidt-Clermont、Biochemie 82:559-572, 2000；Zerges、Biochemie 82:583-601, 2000；BruickおよびMayfield、前出、1999を参照されたい）。葉緑体翻訳装置は、一般的には細菌のそれに似ている；葉緑体は70Sリボソームを含み；5'キャップを欠き、かつ一般的に3'ポリアデニル化テールを含まないmRNAを有し（Harrisら、Microbiol. Rev. 58:700-754, 1994）；かつ、葉緑体および細菌において翻訳はクロラムフェニコールのような選択剤によって阻害される。
【０１０４】
細菌中では、正確な翻訳の開始を媒介するRNAエレメントは、開始コドン、RBS、RBSと開始コドン間の規定された間隔、翻訳エンハンサー配列、第2のコドンにおける偏り、およびRNA接近可能性に影響する二次構造を含む（Gold、Ann. Rev. Biochem. 57:199-233, 1988）。葉緑体中では、リボソーム結合および正確な翻訳開始部位の選択が、少なくとも部分的にシス作用性RNAエレメントによって媒介される（BruickおよびMayfield、前出、1999を参照されたい）。細菌と同様に、葉緑体開始コドンは翻訳開始の効率に影響するが、開始部位の位置を決定せず（Chenら、Plant Cell 7:1295-1305, 1995）、このことは、さらなる決定要因が葉緑体の翻訳開始部位選択のために必要であることを示す。
【０１０５】
翻訳調節のメディエーターとして作用するいくつかのRNAエレメントが葉緑体mRNAの5'UTR中で同定されてきた（Alexanderら、Nucl. Acids Res. 26:2265-2272, 1998; HiroseおよびSugiura、EMBO J. 15:1687-1695, 1996; Mayfieldら、J. Cell Biol. 127:1537-1545, 1994; Sakamotoら、Plant J. 6:503-512, 1994; Zergesら、前出、1997、これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる）。これらのエレメントは核にコードされる因子と相互作用し得、一般的には、公知の原核生物調節配列には似ていない（McCarthyおよびBrimacombe, Trends Genet. 10:402-407, 1994）。
【０１０６】
コンセンサス原核生物RBSエレメントはShine-Dalgarno（SD）配列を特色とし、この配列は、3〜9ヌクレオチドを含む配列であり、一般的に、16S rRNAの3'末端に相補的な約4、5、または6ヌクレオチドを含む。翻訳開始の初期において、30Sリボソームサブユニットは16S rRNA中の相補的アンチSD配列によってSD配列でmRNAと結合する。原核生物mRNA中のSD配列が開始コドンの5〜15ヌクレオチド上流に位置するので、30Sリボソームサブユニットは、正確な開始コドンがリボソームP部位内に存在するように配置される。
【０１０７】
多くの葉緑体mRNAは、原核生物RBSエレメントに類似するエレメントを含む（Bonham-SmithおよびBourque、Nucl. Acids Res. 17:2057-2080, 1989; RufおよびKossel、FEBS Lett. 240:41-44, 1988、これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる）。しかし、葉緑体翻訳におけるこれらのRBS配列の機能的有用性は明らかではなかった。なぜなら、これらのエレメントは、原核生物において代表的には観察される開始コドンのさらなる上流にしばしば位置しているからである。いくつかの研究において、葉緑体mRNAの5'UTRにおける推定のRBSの変化が翻訳に影響を与えることが報告されたが（BettsおよびSpremulli、J. Biol. Chem. 269:26456-26465, 1994; Hiroseら、FEBS Lett. 430:257-260, 1998; HiroseおよびSugiura、前出、1996; Mayfieldら、前出、1994）、他の葉緑体mRNAにおける潜在的なRBSエレメントの変化は翻訳にほとんど影響を有しなかった（Fargoら、Mol. Gen. Genet. 257:271-282, 1998; KooおよびSpremulli、J. Biol. Chem. 269:7494-7500, 1994; Rochaix, Plant Mol. Biol. 32:327-341, 1996; Sakamotoら、前出、1994）。葉緑体RBSエレメントについてのコンセンサスが欠けていることにより、および、これらの推定のRBS配列を研究するために生成された変異が5'UTR中の他の重要な配列の背景を変化させたかもしれないことから、これらの結果の解釈は複雑化されている。
【０１０８】
葉緑体翻訳におけるRBSエレメントについての機能的役割は本明細書中で開示される（実施例2）。16S rRNAの3'末端に位置し、配列3'-CUUCCUCCAC-5'（配列番号:29）を有する葉緑体16S rRNAアンチSD配列への変異（葉緑体mRNAのSD配列との潜在的な塩基対合を除去した）は、C.ラインハルティ（実施例2）においていくつかの葉緑体にコードされる内在性膜タンパク質の翻訳を深刻に損なった。16S rRNAアンチSD変異を有するリボソームは、翻訳のために適格のままであった。可溶性葉緑体タンパク質の合成が大部分これらの変異によって影響されなかったからである。
【０１０９】
光化学系II反応中心D1タンパク質をコードする葉緑体psbA mRNAの5'UTRにおける潜在的なSDエレメントの分析は、開始AUGコドンの5'側（上流）27ヌクレオチドに位置する単一の原核生物様RBSエレメントの存在を示した。このRBSは、細菌におけるものと同様に、30SリボソームサブユニットがRBSエレメントと開始コドンの両方と同時に接触することを可能にするには、開始コドンの上流に遠く離れすぎている。RBSが開始コドンにより接近するように再配置された場合、それはもはや葉緑体中の翻訳開始を補助しなかったが、転写物を新たに大腸菌における翻訳に適格にした（実施例2）。前開始複合体はこのRBSエレメントにおいて形成し得るので、30Sリボソームサブユニットの真の（bona fide）認識部位の特徴を有する。しかしRBSエレメントは、核にコードされた翻訳アクチベータータンパク質を含むさらなる因子の非存在下では翻訳開始部位を正確に規定することができない（DanonおよびMayfield, 1991； Yohnら、1998a；Yohnら、1998b）。この結果は、光調節されるトランス作用因子と共同して翻訳開始を促進する葉緑体におけるRBSエレメントの機能によって例示されるように、psbA mRNAにおけるRBSと開始コドンとの間のさらなる距離が、さらなる翻訳因子を収容することを示す。
【０１１０】
従って、本発明は、第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBSを含む単離されたリボヌクレオチド配列を提供する。本明細書中に開示されるように、このような作動可能に連結された第1および第2のRBSは、リボヌクレオチド配列がポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される場合に、第1のRBSが原核生物中でのポリペプチドの翻訳を指示し得、および第2のRBSが葉緑体中でのポリペプチドの翻訳を指示し得るように、一般的に約5〜25ヌクレオチド間隔が離れている。RBSは葉緑体中での翻訳において活性であり、これは、開始AUGコドンの少なくとも約19ヌクレオチド上流（5'）に位置される場合に、ポリソーム形成を可能にすることを含むが、AUGに近接してRBSを配置することは、葉緑体中での翻訳活性の損失を生じる（図4を参照されたい）。図4に示されるように、psbA mRNAのRBS（SD配列）は-27位で開始する（すなわち、AUGコドンの上流-27位に続く）。AUGコドンに対して約19ヌクレオチドより近接にRBSを動かす欠失は、葉緑体中での翻訳の実質的損失およびポリソーム形成を生じたが、細菌中における翻訳活性の増大を生じた（実施例2を参照されたい、これはまた、AUGコドンから約15ヌクレオチドを超えるRBSに関して細菌中における翻訳活性の減少を示す。
【０１１１】
本発明の単離されたリボヌクレオチド配列は、一般的に、約11〜50ヌクレオチド長であり、および約15〜40ヌクレオチド長または約20〜30ヌクレオチドであり得る。このような長さは、約5〜25ヌクレオチド（一般的に約10〜20ヌクレオチド、および特に約15ヌクレオチド）間隔が離れた、約3〜9ヌクレオチド長、通常約4〜7ヌクレオチド長の2つのSD配列を考慮している。例えば、本発明のリボヌクレオチド配列は、約4ヌクレオチドの第2のRBS（例えば、GGAG）から5ヌクレオチド間隔が離れている4ヌクレオチドの第1のRBS（例えば、GGAG）を含むことができ、従って、13ヌクレオチド長のリボヌクレオチド配列を提供する。第1のRBSおよび第2のRBSの各々が、独立して、SD配列に特徴的な任意の配列を有し得る。本明細書中に開示されるように、植物葉緑体中で翻訳を指示するために有用なRBSは、16S rRNA（3'-CUUCCUCCAC-5'；配列番号:29）の3'末端の少なくとも3つ、特に4つ、5つ、または6つ、またはそれ以上のアンチSD配列に相補的であり、特に、アンチSD配列の中心の8ヌクレオチドに相補的である。例えば、
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を含むRBS配列（配列番号:29に相補的なヌクレオチドを斜字体で示す）は、コードされたポリペプチドに作動可能に連結された場合に、植物葉緑体中の翻訳を指示した。
【０１１２】
本発明の組成物を調製する際、または本発明の方法を実施する際に有用なRBSは化学合成され得るか、または天然に存在する核酸分子から単離され得る。例えば、葉緑体中での翻訳を指示するRBSは一般的に葉緑体遺伝子の5'UTR中に存在し、それゆえに、葉緑体遺伝子から単離され得る。さらに、遺伝子中のSD配列に通常付随するような、さらなるヌクレオチド配列を含むことに対する利点が存在し得る。例えば、5'UTRは、プロモーターのような転写調節エレメントを含み得、従って、植物葉緑体中で転写および翻訳され得る組換え核酸分子の構築を容易にする。さらに、本明細書中で開示されるように、膜結合D1（psbA）葉緑体タンパク質をコードする葉緑体遺伝子からのさらなる5'UTR配列の包含は、葉緑体中での膜の異種ポリペプチドの発現を生じた（実施例3）。このようにして、葉緑体中での翻訳を指示するRBSを含む本発明のリボヌクレオチドは、葉緑体遺伝子の5'UTR、例えば、可溶性タンパク質をコードする葉緑体遺伝子の5'UTR、または膜結合葉緑体タンパク質をコードする遺伝子の5'UTRをさらに含み得る。このような5'UTRは当技術分野で公知であり、ならびに、可溶性タンパク質をコードする葉緑体遺伝子によってコードされるもの（例えば、AtpA 5'UTR（配列番号:4）またはRbcL 5'UTR（配列番号:5））、および膜結合タンパク質をコードする葉緑体遺伝子によってコードされるもの（例えば、PsbD 5'UTR（配列番号:6）、またはPsbA 5'UTR（配列番号:7））を含む。さらに、16S rRNA 5'UTR（配列番号:8）が、例えば、作動可能に連結された異種ポリヌクレオチドの転写を指向するために使用され得、かつ、植物葉緑体中でポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの翻訳を指示するために特に有用であるRBSを生成するために、アンチSD配列に相補的な配列で改変され得る。
【０１１３】
本発明のリボヌクレオチド配列は、開始コドン、例えば、第1および第2のRBSに作動可能に連結された開始AUGコドンをさらに含み得る。このような開始AUGコドンは、Kozak配列、例えば、ACCAUGGまたはGCCAUGGまたはCC(A/G)CCAUGGなど（Kozak、J. Mol. Biol. 196:947-950, 1987を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる））の隣接するヌクレオチドをさらに含み得、この配列は、細胞中のコードされたポリペプチドの翻訳を容易にし得る。さらに、本発明のリボヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され得、ここで、そのポリヌクレオチドは、内因性開始コドンであり得るが必ずしもその必要はない開始コドンを含むか、または開始コドンを含むように改変され得る。
【０１１４】
本発明の単離されたリボヌクレオチド配列は化学合成され得、または、例えば、DNA依存性RNAポリメラーゼもしくはRNA依存性RNAポリメラーゼをそれぞれ使用して、DNAテンプレートもしくはRNAテンプレートから酵素的方法を使用して生成され得る。本発明のリボヌクレオチドをコードするDNAテンプレートは、化学合成され得るか、天然に存在するDNA分子から単離され得るか、または必要とされる特性を有するように改変されている天然に存在するDNA配列に由来し得る。例えば、原核生物遺伝子のDNA配列は、開始コドンの約5〜15ヌクレオチド上流に位置するRBSをコードするヌクレオチド配列を通常有する。このようなヌクレオチド配列は、日常的な組換えDNA方法を使用して単離および改変され、内因性原核生物RBSの上流（5'）に適切に位置する第2のRBSを含み得る。従って、本発明は、本明細書中に規定されるように、作動可能に連結された第1のRBSおよび第2のRBSをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１１５】
第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBSをコードするポリヌクレオチド（ここで、第1のRBSは原核生物中での翻訳を指示し得、かつ第2のRBSは葉緑体中での翻訳を指示し得る）はDNAまたはRNAであってよく、かつ、一本鎖または二本鎖であってよい。ポリヌクレオチドはまた、第1のRBSおよび第2のRBSをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された開始コドン（例えば、ATG）、すなわち、原核生物中での翻訳を指示する第1のRBSの下流（3'）、約3〜15ヌクレオチド（約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14ヌクレオチドを含む）に配置されたATGコドンを含み得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、ポリペプチドが葉緑体または原核生物宿主細胞中で発現され得るように、第1のRBSおよび第2のRBSに、および存在する場合にはATGコドンに、ポリペプチドをコードし得る発現可能なポリヌクレオチドの作動可能な連結を可能にするように配置されているクローニング部位を含み得る。
【０１１６】
本明細書中で使用される場合、用語「クローニング部位」は、第2のポリヌクレオチドへの第1のポリヌクレオチドの連結を容易にする任意のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列をいうために広範に使用される。一般的に、クローニング部位は、1つもしくは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（例えば、マルチクローニングサイト）、または、1つもしくは複数のリコンビナーゼ認識部位（例えば、loxP部位またはatt部位、またはこのような部位の組み合わせ）を含む。このクローニング部位は、第1および第2のポリヌクレオチドの作動可能な連結であり得る挿入または連結を容易にするために提供され得、例えば、関心対象のポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドに対する第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBSをコードする第1のポリヌクレオチドであり、このポリペプチドは、原核生物または葉緑体またはその両方において翻訳される。
【０１１７】
第1および第2のRBSをコードするポリヌクレオチドは、本明細書中で規定されるように、発現可能なポリヌクレオチドに作動可能に連結され得、このポリヌクレオチドは、ペプチドまたはポリペプチドのペプチド部分を含む、少なくとも1つのポリペプチドをコードし得る。このようにして、発現可能なポリヌクレオチドは第1のポリペプチドのみをコードし得るか、または、第1のポリペプチドと同じかもしくは異なり得る2つもしくはそれ以上のポリペプチドをコードし得る。例えば、発現可能なポリヌクレオチドは第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドをコードし得、これらは互いに異なり得、特に、抗体のような機能的ヘテロ二量体；酵素；T細胞レセプター、成長因子レセプター、カンナビノイドレセプターなどのような細胞表面レセプターを形成するために特異的に会合し得る第1および第2のポリペプチドである。このような第1および第2の（または他の）ポリペプチドは、融合タンパク質（例えば、L鎖に連結されたH鎖を含む単鎖抗体）として発現され得るか、または分離しかつ別個のポリペプチド（これは、機能的タンパク質複合体を形成するために特異的に会合する能力を有し得るが、必ずしもその必要はない）として発現され得る。ポリペプチドが分離した実体として発現される場合、第1のポリペプチドのコード配列と第2のポリペプチドのコード配列との間に作動可能に連結された、内部リボソームエントリー部位（IRES）をコードするヌクレオチド配列を含み、従って、第2の（または下流の）ポリペプチドの翻訳を容易にすることが有用であり得る。
【０１１８】
第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBSをコードするポリヌクレオチドは、本明細書中で規定されるように、線状のヌクレオチド配列であり得、および第1のクローニング部位によって一方の末端、および第2のクローニング部位によって第2の末端で隣接し得、従って、容易に第2のポリヌクレオチドに挿入され得るかまたは連結され得るカセットを提供する。隣接する第1および第2のクローニング部位は同じかまたは異なってもよく、かつ一方または両方が独立してマルチクローニングサイトを含み得る。そのポリヌクレオチドはさらに、関心対象の任意の他のヌクレオチド配列、例えば、作動可能に連結された開始ATGコドンを含み得る。
【０１１９】
本発明はさらに、本明細書中に規定されるような、第2のRBSに作動可能に連結された第1のRBSをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。そのベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞にポリヌクレオチドを導入するために有用である任意のベクターであり得、これにはクローニングベクターまたは発現ベクターが含まれる。1つの実施態様において、そのベクターは、葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受けるに十分な葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列、特に、葉緑体遺伝子をコードしていないサイレントなヌクレオチド配列を含む。このような葉緑体ベクターは当技術分野で周知であり、これには例えば、p322が含まれる（実施例1を参照されたい；Kindleら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:1721-1725, 1991（これは参照として本明細書に組み入れられる）；HagerおよびBock、前出、2000；Bock、前出、2001もまた参照されたい）。
【０１２０】
本発明のベクターはまた、そのベクターに所望の特性を付与する1つまたは複数のさらなるヌクレオチド配列（例えば、そのベクターの操作を容易にするクローニング部位のような配列、ベクターの複製またはそこに含まれるヌクレオチド配列の転写を指向する調節エレメント、選択マーカーをコードする配列などを含む）を含み得る。このようにして、ベクターは、例えば、異種ポリヌクレオチドがそのベクターに挿入され得、かつ第1のRBSおよび第2のRBSに作動可能に連結され得るように配置され得るが、必ずしもその必要はない、マルチクローニングサイトのような1つまたは複数のクローニング部位を含み得る。ベクターはまた、原核生物の複製起点（ori）（例えば、大腸菌oriまたはコスミドori）を含み得、従って、所望されるように、原核生物宿主細胞ならびに植物葉緑体中でのベクターの継代を可能にする。
【０１２１】
用語「調節エレメント」は、ポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳、またはそれが作動可能に連結されているポリペプチドの局在化を調節するヌクレオチド配列をいうために本明細書中で広範に使用される。RBSに加えて、発現制御配列は以下であり得る：プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始（スタート）コドン、イントロン切除および正確なリーディングフレームの維持のためのスプライシングシグナル、終止コドン、アンバーコドンもしくはオーカーコドン、IRES、またはポリペプチドを特定の位置に対して標的化する配列、例えば、細胞区画化シグナル（このシグナルは、ポリペプチドを、細胞質ゾル、核、原形質膜、小胞体、ミトコンドリア膜もしくは基質、葉緑体膜またはルーメン、内側トランスゴルジ槽、またはリソソームもしくはエンドソームに標的化するために有用であり得る）。細胞区画化ドメインは当技術分野で周知であり、例えば、ヒトII型膜結合タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸残基1〜81、またはシトクロムcオキシダーゼのサブユニットIVのプレ配列のアミノ酸残基1〜12を含むペプチドが含まれる（Hancockら、EMBO J. 10:4033-4039, 1991; Bussら、Mol. Cell. Biol. 8:3960-3963, 1988; 米国特許第5,776,689号もまた参照されたい、（これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる））。本発明の方法を使用して産生されたポリペプチドへの細胞区画化ドメインの包含は、個体における特定の細胞内区画にポリペプチドを標的化することが所望される場合に、タンパク質複合体を含み得るポリペプチドの使用を可能にし得る。
【０１２２】
本発明のベクターまたは他の組換え核酸分子は、レポーターポリペプチドまたは他の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含み得る。用語「レポーター」または「選択マーカー」とは、検出可能な表現型を付与するポリヌクレオチド（またはコードされたポリペプチド）をいう。レポーターは一般的に検出可能なポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼのような酵素をコードする。これらは、適切な作用因子（それぞれ、特定の波長の光またはルシフェリン）を接触された場合に、肉眼によってまたは適切な機器を使用して検出され得るシグナルを生成する（Giacomin、Plant Sci. 116:59-72, 1996; Scikantha、J. Bacteriol. 178:121, 1996; Gerdes、FEBS Lett. 389:44-47, 1996; Jefferson、EMBO J. 6: 3901-3907, 1997, fl-グルクロニダーゼもまた参照されたい）。選択マーカーは、一般的に、細胞中に存在するかまたは発現された場合に、マーカーを含む細胞に選択的な利点（または不利な点）（例えば、さもなくば細胞を殺傷する薬剤の存在下で成育する能力）を提供する分子である。
【０１２３】
選択マーカーは、そのマーカーを発現する原核生物細胞または植物細胞またはその両方を得るための手段を提供し得、それゆえに、本発明のベクターの成分として有用であり得る（例えば、Bock、前出、2001を参照されたい）。選択マーカーの例には、代謝拮抗物質耐性を付与するもの（例えば、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸還元酵素（Reiss、Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994））；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン、およびピューロマイシンに対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Herrera-Estrella、EMBO J. 2:987-995, 1983）；ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Marsh、Gene 32:481-485, 1984）、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするhisD（Hartman、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988）；細胞がマンノースを利用できるようにするマンノース-6-リン酸イソメラーゼ（国際公開公報第94/20627号）；オルニチンデカルボキシラーゼインヒビター、2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン（DFMO; McConlogue, 1987, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory編）に対する耐性を付与するオルニチンデカルボキシラーゼ；および、ブラスチシジン（Blasticidin）Sに対する耐性を付与するアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（Tamura、Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995）が含まれる。さらなる選択マーカーには、除草剤耐性を付与するもの、例えば、フォスフィノスリシンに対する耐性を付与するフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Whiteら、Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990; Spencerら、Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990）、グリフォセート耐性を付与する変異型EPSPV-シンターゼ（Hincheeら、BioTechnology 91:915-922, 1998）、イミダゾリンまたはスルホニル尿素耐性を付与する変異アセトラクテートシンターゼ（Leeら、EMBO J. 7:1241-1248, 1988）、アトラジンに対する耐性を付与する変異型psbA（Smedaら、Plant Physiol. 103:911-917, 1993）、または変異型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第5,767,373号を参照されたい）、またはグルホシネートのような除草剤に対する耐性を付与する他のマーカーが含まれる。選択マーカーには、真核生物細胞については、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）またはネオマイシン耐性、および大腸菌のような原核生物細胞についてはテトラサイクリン；アンピシリン耐性；および植物については、ブレオマイシン、ゲンタマイシン、グリフォセート、ハイグロマイシン、カナマイシン、メトトレキセート、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、およびスルホニル尿素耐性（例えば、Maligaら、Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, 39頁を参照されたい）を付与するポリヌクレオチドが含まれる。本発明の組成物または方法は、葉緑体中でのポリペプチドの発現を生じ得るので、植物細胞に選択的な利点を付与するポリペプチドが、細胞局在化モチーフをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、その結果、そのポリペプチドは、例えば、選択マーカーに起因する毒性効果が明らかな、細胞質ゾル、核、または他の細胞下オルガネラに移行される場合、有用でありうる（例えば、Von Heijneら、Plant Mol. Biol. Rep. 9:104, 1991; Clarkら、J. Biol. Chem. 264:17544, 1989; della Cioppaら、Plant Physiol. 84:965, 1987; Romerら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 196:1414, 1993; Shahら、Science 233:478, 1986; Archerら、J. Bioenerg Biomemb. 22:789, 1990; Scandalios、Prog. Clin. Biol. Res. 344:515, 1990; Weisbeekら、J. Cell Sci. Suppl. 11:199, 1989; Bruce、Trends Cell Biol. 10:440, 2000を参照されたい）。
【０１２４】
原核生物において本発明のシャトルベクターを継代する能力は、そのベクターを便利に操作することを可能にする。例えば、ベクターおよび推定の挿入された関心対象のポリヌクレオチドを含む反応混液は、日常的な方法を使用して、大腸菌のような原核生物宿主細胞に形質転換され得、増幅および収集され得、そして関心対象の挿入物および構築物を含むベクターを同定するために試験され得る。所望される場合、そのベクターは、例えば、挿入されたポリヌクレオチドの部位特異的変異誘発を実行すること、次いで、関心対象の変異されたポリヌクレオチドを有するベクターを再度増幅および選択することによってさらに操作され得る。次いで、このシャトルベクターは植物細胞葉緑体に導入され得、ここで、関心対象のポリペプチドが発現され得、かつ、所望される場合、本発明の方法に従って単離され得る。
【０１２５】
本発明のベクターを含むベクター中に含まれ得る、本発明のポリヌクレオチドまたは組換え核酸分子は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して植物葉緑体に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「導入する」は、原核生物細胞または植物細胞、特に植物細胞プラスチドを含む細胞にポリヌクレオチドを移動させることを意味する。ポリヌクレオチドは、当技術分野で周知である種々の方法によって細胞に導入され得、かつ、部分的には、特定の宿主細胞に基づいて選択され得る。例えば、そのポリヌクレオチドは、直接的な遺伝子移入方法（例えば、エレクトロポレーションまたはパーティクルガンを使用する微粒子発射媒介（微粒子銃）形質転換）、または「ガラスビーズ法」（例えば、Kindleら、前出、1991を参照されたい）を使用して、あるいは、花粉媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換、傷害を有するかもしくは酵素分解した未成熟胚、または傷害を有するかもしくは酵素分解した胚性カルスを使用する形質転換によって（Potrykus、Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 42:205-225, 1991を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる））、植物細胞に導入され得る。
【０１２６】
プラスチド形質転換は、植物細胞葉緑体にポリヌクレオチドを導入するための日常的かつ周知の方法である（米国特許第5,451,513号、同第5,545,817号、および同第5,545,818号；国際公開公報第95/16783号；McBridgeら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91:7301-7305, 1994を参照されたい（これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる））。葉緑体形質転換は、例えば、微粒子銃またはプロトプラストによる形質転換法（例えば、塩化カルシウムまたはPEGを媒介する形質転換）を使用して、適切な標的組織に所望のヌクレオチド配列に隣接する葉緑体DNAの領域を導入する工程を含む。葉緑体ゲノムDNAの1〜1.5kb隣接ヌクレオチド配列は、葉緑体ゲノムとのベクターの相同組換えを可能にし、およびプラストームの特異的領域の置換または修飾を可能にする。この方法を使用して、葉緑体の16S rRNA遺伝子およびrps12遺伝子（スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を付与する）における点変異が、形質転換のための選択マーカーとして利用され得（Svabら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530, 1990; StaubおよびMaliga、前出、1992）、かつ、標的葉の100粒子の銃撃あたり約1個の頻度で安定なホモプラズミック形質転換体を生じ得る。これらのマーカー間のクローニング部位の存在は、本発明のベクターを含む葉緑体ベクターを作製するための便利なヌクレオチド配列を提供する（StaubおよびMaliga、EMBO J. 12:601-606, 1993）。形質転換頻度の実質的な増加は、優勢な選択マーカーである細菌aadA遺伝子（スペクチノマイシンを無毒化する酵素、アミノグリコシド-3'-アデニルトランスフェラーゼをコードする（SvabおよびMaliga、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90:913-917, 1993））での、劣性rRNAまたはr-タンパク質抗生物質耐性遺伝子の置換によって得られる。形質転換後、約15〜20の細胞分裂周期が、一般的にホモプラスチジック（homoplastidic）状態に達するまでに必要である。遺伝子が、各植物細胞に存在する環状プラスチドゲノムの数千コピーのすべてに相同組換えによって挿入されているプラスチド発現は、全体で可溶性植物タンパク質の10％を容易に超え得る発現レベルを可能にする、核発現遺伝子を超えた莫大なコピー数の利点を利用する。
【０１２７】
エレクトロポレーションのような直接的な遺伝子移入方法もまた、植物プロトプラストに本発明のポリヌクレオチドを導入するために使用され得る（Frommら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:5824, 1985（これは参照として本明細書に組み入れられる））。高電場強度の電気的インパルスは、可逆的に膜を透過し、このことがポリヌクレオチドの導入を可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロトプラストは、細胞壁を修復し、分裂し、そして植物カルスを形成する。マイクロインジェクションは、PotrykusおよびSpangenberg（編）、Gene Transfer To Plants（Springer Verlag, Berlin, NY 1995）に記載されるように実行され得る。導入されたポリヌクレオチドを含む形質転換された植物細胞は、導入されたポリヌクレオチドに起因する表現型、例えば、レポーター遺伝子または選択マーカーの発現を検出することによって同定され得る。
【０１２８】
微粒子発射媒介形質転換もまた、植物細胞葉緑体にポリヌクレオチドを導入するために使用され得る（Kleinら、Nature 327:70-73, 1987（これは参照として本明細書に組み入れられる））。この方法は、塩化カルシウム、スペルミジン、またはポリエチレングリコールを用いる沈殿によって所望のポリヌクレオチドでコートされた金またはタングステンのような微粒子発射物を利用する。微粒子発射物の粒子は、BIOLISTIC PD-1000パーティクルガン（BioRad；Hercules CA）のようなデバイスを使用して植物組織に向かって高速に加速される。微粒子銃法を使用する形質転換のための方法は周知である（Wan、Plant Physiol. 104:37-48, 1984; Vasil、BioTechnology 11:1553-1558, 1993; Christou、Trends in Plant Science 1:423-431, 1996）。微粒子発射媒介形質転換は、例えば、ワタ、タバコ、トウモロコシ、ハイブリッドポプラおよびパパイヤを含む種々のトランスジェニック植物種を生成するために使用されてきた。重要な穀物農作物（例えば、コムギ、オートムギ、オオムギ、ソルガム、およびイネ）もまた、微粒子発射媒介送達を使用して形質転換されてきた（Duanら、Nature Biotech. 14:494-498, 1996: Shimamoto、Curr. Opin. Biotech. 5:158-162, 1994）。大部分の双子葉植物の形質転換は、上記の方法を用いて可能である。単子葉植物の形質転換もまた、例えば、上記のような微粒子銃法、プロトプラスト形質転換、部分的に透過した細胞のエレクトロポレーション、ガラス繊維を使用するDNAの導入、ガラスビーズ攪拌法（Kindleら、前出、1991）などを使用して形質転換され得る。
【０１２９】
本発明はまた、クローニング部位に対して約20〜40ヌクレオチド5'側に位置するRBSをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。そのクローニング部位は、ベクターへの異種ヌクレオチド配列の挿入または連結を容易にする任意のヌクレオチド配列であり得、例えば、1つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、1つまたは複数のリコンビナーゼ認識部位、またはこれらの部位の組み合わせである。好ましくは、そのクローニング部位はマルチクローニングサイトであり、これは、複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もしくはリコンビナーゼ認識部位、または少なくとも1つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位および少なくとも1つのリコンビナーゼ認識部位の組み合わせを含む。そのベクターは、クローニング部位の5'側に隣接する開始コドンまたはその一部をさらに含み得、従って、さもなくば開始ATGコドンを欠くか、または例えば、制限エンドヌクレアーゼによる切断に起因して部分的な開始コドンを含むコード配列についての翻訳開始部位（または潜在的な開始部位）を提供する。そのベクターはまた、クローニング部位に対して3'に位置する葉緑体遺伝子3'UTR、例えば、PsbA 3'UTR（配列番号:9）、RbcL 3'UTR（配列番号:10）、AtpA 3'UTR（配列番号:11）、tRNAARG3'UTR（配列番号:12）、またはPsbD 3'UTR（配列番号:30を参照されたい、1553位で開始；PsbD-GFP融合タンパク質をコードするGFP構築物についての挿入部位をまた示す）を含み得る。
【０１３０】
葉緑体/原核生物シャトル発現ベクターを作製する方法もまた提供される。本発明のシャトルベクターは、例えば、葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受けるに十分な葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列に導入されることによって作製され得る。ヌクレオチド配列は、原核生物複製起点；第1のRBSをコードするヌクレオチド配列；および第2のRBSをコードするヌクレオチド配列（ここで、この第1のRBSおよび第2のRBSは約5〜25ヌクレオチド間隔が離れている）；およびクローニング部位（ここで、このクローニング部位は、第1のRBSが原核生物中でのポリペプチドの翻訳を指示し得、かつ第2のRBSが葉緑体中でのポリペプチドの翻訳を指示し得るように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、第1のRBSおよび第2のRBSへの作動可能な連結を可能にするように配置されている）を含む。葉緑体/原核生物シャトル発現ベクターを作製する方法はまた、葉緑体ゲノムDNAのヌクレオチド配列を遺伝子改変することによって実行され得、このDNAは、葉緑体ゲノムDNAとの相同組換えを受けるに十分であり、原核生物の複製起点、第2のRBSから約5〜25ヌクレオチド間隔が離れている第1のRBSをコードするヌクレオチド配列、ならびに、第1のRBSが原核生物中でのポリペプチドの翻訳を指示し得、かつ第2のRBSが葉緑体中でのポリペプチドの翻訳を指示し得るように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、第1のRBSおよび第2のRBSへの作動可能な連結を可能にするように配置されたクローニング部位を含む。従って、本発明はまた、本明細書中に開示されるような方法によって作製される葉緑体/原核生物シャトルベクターを提供する。
【０１３１】
本発明はまた、組換え核酸分子を提供し、この分子は、ポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列に作動可能に連結された葉緑体RBSをコードする第1のヌクレオチド配列を含み、ここで、その第1のヌクレオチド配列は、第2のヌクレオチド配列に関して異種である。作動可能に連結されたRBSは、一般的に、開始コドンに対して約20〜40ヌクレオチド5'側（上流）に位置しており、これは、次に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される。1つの実施態様において、第1のヌクレオチド配列はRBSをコードするヌクレオチド配列の約20〜40ヌクレオチド3'側に位置するATGを含む。本発明の組換え核酸分子は、本明細書中に例示されるか、またはさもなくば当技術分野において公知であるように、他の調節エレメントまたはコードする関心対象のポリヌクレオチドをさらに含む。
【０１３２】
レポーター遺伝子は高等植物の葉緑体において首尾よく使用されており、高レベルの組換えタンパク質発現が報告されている。さらに、レポーター遺伝子は、C.ラインハルティの葉緑体において使用されてきたが、大部分の場合において、非常に少量のタンパク質が産生された。レポーター遺伝子は、多数の生物体において遺伝子発現をモニターする能力を非常に高める。高等植物の葉緑体において、β-グルクロニダーゼ（uidA、StaubおよびMaliga、EMBO J. 12:601-606, 1993）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（nptII、Carrerら、Mol. Gen. Genet. 241:49-56, 1993）、アデノシル-3-アデニルトランスフェラーゼ（aadA、SvabおよびMaliga、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90:913-917, 1993）、およびエクオレア・ビクトリアGFP（Sidorovら、Plant J. 19:209-216, 1999）がレポーター遺伝子として使用されてきた（Heifetz、Biochemie 82:655-666, 2000）。これらの遺伝子の各々が、それらを葉緑体遺伝子発現の有用なレポーターにする属性、例えば、分析の容易さ、感度、またはインサイチューで発現を試験する能力を有している。これらの研究に基づいて、他の異種タンパク質（例えば、草食動物に昆虫に対する耐性を付与するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）Cry毒素（Kotaら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96:1840-1845, 1999）、または強力な生物薬剤であるヒトソマトトロピン（Staubら、Nat. Biotechnol. 18:333-338, 2000））が高等植物の葉緑体中で発現された。
【０１３３】
いくつかのレポーター遺伝子が真核生物の緑藻、C.ラインハルティの葉緑体において発現されてきたが、成功の程度は変動していた。これらには、aadA（Goldschmidt-Clermont、Nucl. Acids Res. 19:4083-4089, 1991; ZergesおよびRochaix、Mol. Cell. Biol. 14: 5268-5277, 1994）、uidA（Sakamotoら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90:477-501, 1993、Ishikuraら、J. Biosci. Bioeng. 87:307-314 1999）、Renillaルシフェラーゼ（Minkoら、Mol. Gen. Genet. 262:421-425, 1999）およびアシネトバクター・バウマニイ（Acinetobacter baumanii）由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、aphA6（BatemanおよびPurton、Mol. Gen. Genet. 263:404-410, 2000）が含まれる。産生される組換えタンパク質の量は、uidA遺伝子のみについて報告され（Ishikawaら、前出、1999）、そして、ウェスタンブロット分析および活性測定に基づいて、非常に低い量が産生された。葉緑体中での異種ポリペプチドの発現を改善するために、C.ラインハルティの葉緑体ゲノムについて記載されたコドンの偏り（Nakamuraら、前出、1999）の効果が試験された。
【０１３４】
遺伝コードに固有な冗長性に起因して、6つまでのヌクレオチドトリプレットが同じアミノ酸をコードし得、そしてイソ受容tRNA（iso-accepting tRNA）は、しばしば、多遺伝子ファミリーによってコードされている。核tRNA遺伝子の完全な相補物が知られている線虫（Caenorhabditis elegans）においては、例えば、31のtRNAUCCGlyコード遺伝子が存在する（Duret、Trends Genet. 16:287-289, 2000）。この冗長性の結果は、多くの生物が明確なコドンの偏りを示すことであり、特定のコドンが他のコドンよりもより高い頻度で使用される。コドンの偏りの異種タンパク質発現に対する効果は、原核生物と真核生物の両方において十分に立証されており、ウイルス遺伝子さえ、それらの一時的なかつ組織特異的発現に影響し得るコドンの偏りを示す。代表的には、コドン使用頻度は、イソ受容tRNAのレベルと相関する。このようにして、高度に発現されたタンパク質をコードする遺伝子は、その同族tRNAのレベルが特に豊富であるコドンを利用する傾向がある（Duret、前出、2000；Kanayaら、Gene 238:143-155, 1999）。
【０１３５】
C.ラインハルティ葉緑体ゲノムは、強力なコドンの偏りを示し、第3の位置でアデニンまたはウラシル（またはチミン）が好まれる（Nakamuraら、前出、1999）。C.ラインハルティ葉緑体中での組換えポリペプチドの発現における葉緑体コドン使用頻度の役割は、GFPをコードし、かつ主要なC.ラインハルティ葉緑体によってコードされるタンパク質の葉緑体コドン使用頻度に偏っているポリヌクレオチドを新規合成することによって試験された（実施例1）。GFPの蓄積は、C.ラインハルティのRbcL 5'UTRおよび3'UTR（それぞれ、配列番号:5および10）の制御下で、コドンが最適化されたGFPカセット（GFPct；配列番号:1）を用いて形質転換されたC.ラインハルティにおいてモニターされ、かつ、最適化されていないGFPカセット（GFPncb；配列番号:3）を用いて形質転換されたC.ラインハルティにおけるGFPの蓄積と比較された。本明細書中に開示されるように、GFPctカセットを用いて形質転換されたC.ラインハルティ葉緑体は、GFPnct形質転換株よりも約80倍多く蓄積し、そして発現は環境条件のわずかな変化に基づくタンパク質合成の違いを報告するに十分に頑強であった（実施例1）。同様の結果はルシフェラーゼについても得られた。ここでは、細菌のルシフェラーゼBサブユニットにペプチドリンカーを介して融合された細菌のルシフェラーゼAサブユニットを含む融合ルシフェラーゼタンパク質（配列番号:46）をコードする、葉緑体コドンに偏っている合成ポリヌクレオチド（配列番号:45）が、ルシフェラーゼの頑強な発現を生じ、かつ、ルシフェラーゼ発現がインビボで検出され得るというさらなる利点を提供した（実施例4を参照されたい）。
【０１３６】
従って、本発明は、蛍光タンパク質またはその変異体もしくはその変種をコードする単離された合成ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドのコドンは、葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏っている）を提供する。合成ポリヌクレオチドはDNAまたはRNAであってよく、一本鎖または二本鎖であってよく、かつ一方または両方の末端にクローニング部位を含む線状ポリヌクレオチドであってよい。ベクター中に含まれ得るポリヌクレオチドはまた、蛍光タンパク質が原核生物中および葉緑体中で便利に翻訳され得るように、約5〜25ヌクレオチド間隔が離れている第1のRBSおよび第2のRBSをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る。
【０１３７】
表1は、藻類葉緑体遺伝子中で優先的に使用されるコドンを例示する。用語「葉緑体コドン使用頻度」は、このようなコドンをいうために本明細書中で使用され、かつ、同じアミノ酸をコードするが、葉緑体遺伝子中でコドンとして見い出される可能性が少ない縮重コドンに関して比較の意味において使用される。用語「偏っている」は、葉緑体コドン使用頻度への言及において使用される場合、1つまたは複数のコドンの1つまたは複数のヌクレオチドが変化して、葉緑体中で優先的に使用されるコドンを生じるようなポリヌクレオチドの操作をいう。葉緑体コドンの偏りは、本明細書中で、表1に示されるような藻類の葉緑体コドンの偏りによって例示される。葉緑体のコドンの偏りは、合成ポリヌクレオチドが発現される特定の植物に基づいて選択され得るが、必ずしもそうである必要はない。この操作は、例えば、部位特異的変異誘発のような方法による、増幅産物が葉緑体コドン使用頻度を反映するように偏るように変化させられる、ヌクレオチドについてミスマッチを有するプライマーを使用するPCRのような方法による、コドンに対する変化であり得るか、または、変化（偏り）が合成手順の結果として導入されるようなポリヌクレオチド配列の新規合成であり得る。
【０１３８】
ポリペプチドの効率的な翻訳を提供するための手段として葉緑体コドンの偏りを利用することに加えて、葉緑体ゲノムによって発現されないtRNAを発現させるために葉緑体ゲノム（例えば、C.ラインハルティの葉緑体ゲノム）を再操作する、葉緑体中のポリペプチドの効率的な翻訳を得るための代替的な手段が認識される。1つまたは複数の異種tRNA分子を発現するこのような操作された藻類は、葉緑体ゲノムに導入され、そこから発現される関心対象のすべてのポリヌクレオチドを修飾するための要件を取り除くという利点を提供する；その代わりに、遺伝子改変された葉緑体ゲノムを含むC.ラインハルティのような藻類は、本発明の方法に従ってポリペプチドの効率的な翻訳のために提供および利用され得る。高度に発現された遺伝子中でのtRNAの豊富さとコドン使用頻度の間の相関は周知である（Franklinら、Plant J. 30:733-744, 2002; Dongら、J. Mol. Biol. 260:649-663, 1996; Duret、Trends Genet. 16:287-289, 2000; Goldmanら、J. Mol. Biol. 245:467-473, 1995; Komarら、Biol. Chem. 379:1295-1300, 1998（これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる））。大腸菌において、例えば、十分に利用しないtRNAを発現するように株を再操作することは、これらのコドンを利用する遺伝子の発現の増強を生じた（Novyら、inNovations  12:1-3, 2001（これは参照として本明細書に組み入れられる））。内因性tRNAを利用して、部位特異的変異誘発が、合成tRNA遺伝子を作製するために使用され得、この遺伝子は、葉緑体ゲノム（例えば、C.ラインハルティ葉緑体ゲノム）中のまれなまたは使用されていないtRNA遺伝子を相補するために葉緑体に導入され得る。
【０１３９】
本発明の蛍光タンパク質をコードする1つまたは複数のコドンは、例えば、3位にアデニンまたはチミンを含むように偏り得、従って、葉緑体中での蛍光タンパク質の翻訳を容易にする。本明細書中で開示されるように、エクオレア・ビクトリアGFPをコードするポリヌクレオチドは、121の同義的なコドン変化を有するコード配列の新規合成によって偏られ、これには、葉緑体コドン使用頻度への適度なシフトを表す66の変化、および頻繁には使用されないコドンを葉緑体コドン使用頻度へシフトさせた54の変化が含まれる（実施例1）。このようにして、改変されたGFP（配列番号:2）をコードする、配列番号:1に示されるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの例を提供し、配列番号:2をコードするがより少なく偏っているコドンを有するポリヌクレオチドは、さらなる例を提供する。配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有する改変されたGFPもまた提供される。
【０１４０】
GFPは当技術分野で周知であり、北西太平洋（Pacific Northwest）クラゲ、エクオレア・ビクトリア、ウミシイタケ、レニラ・レニフォルミス（Renilla reniformis）、およびフィアリジウム・グレガリウム（Phialidium gregarium）から単離されてきた（Wardら、Photochem. Photobiol. 35:803-808, 1982; Levineら、Comp. Biochem. Physiol. 72B:77-85, 1982（これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる））。同様に、赤色蛍光タンパク質は公知であり、サンゴ、ディスコソマ（Discosoma）から単離されてきた（Matzら、Nature Biotechnol. 17:969-973, 1999（これは参照として本明細書に組み入れられる））。さらに、有用な励起スペクトルおよび発光スペクトルを有する種々のエクオレアのGFP関連タンパク質は、A.ビクトリアから天然に存在するGFPのアミノ酸配列を改変することによって操作されてきた（Prasherら、Gene 111:229-233, 1992; Heimら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91:12501-12504, 1994; 米国特許第6,319,669号; 国際出願番号第PCT/US95/14692号を参照されたい（これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる））。このようにして、このような蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列が葉緑体コドン使用頻度に偏り得、それゆえに、本発明の蛍光タンパク質のさらなる例を提供することが認識される。
【０１４１】
以下の実施例は本発明を例証することを意図するが、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１４２】
実施例1
葉緑体中での発現のためのポリペプチドコード配列の最適化
本実施例は、緑色蛍光タンパク質をコードする葉緑体コドンに偏ったヌクレオチドが藻類葉緑体中で効率的に発現されることを実証する（Franklinら、Plant J. 30: 733-744, 2002もまた参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１４３】
C.ラインハルティ株、形質転換、および増殖条件
すべての形質転換を、C.ラインハルティ株137c（mt+）で実行した。細胞を、TAP培地（GormanおよびLevine、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 54:1665-1669, 1965（これは参照として本明細書に組み入れられる））中で、40mM 5-フルオロデオキシウリジンの存在下で、後期対数期まで（約7日間）、23℃で、450ルクスの定常的な照射下で、100rpmに設定した回転振盪機上で増殖させた。50mlの細胞を、4,000×gで、4℃、5分間の遠心分離によって収集した。上清をデカントし、細胞を引き続く粒子射突による葉緑体形質転換（Cohenら、前出、1998）のために、4mlのTAP培地中に再懸濁した。すべての形質転換を、スペクチノマイシン（150μg/ml）選択下で実行し、そこで耐性は、プラスミドp228（Chlamydomonas Stock Center, Duke University）のスペクチノマイシン耐性リボソーム遺伝子を伴う同時形質転換によって付与された。
【０１４４】
GFPの発現のためのC.ラインハルティ形質転換体の培養を、特に言及しない限り、TAP培地（GormanおよびLevine、前出、1965）中で、23℃で、5,000ルクスの定常的な照射下で、100rpmに設定した回転振盪機上で実行した。培養を、収集の前少なくとも48時間、1×107細胞/mlの密度に維持した。
【０１４５】
プラスミド構築
すべてのDNAおよびRNAの操作を、本質的にSambrookら、前出、1989およびCohenら、前出、1998によって記載されるように実行した。GFP遺伝子のコード領域を、天然GFP（GFPncb）配列を含むプラスミドからPCRを介して増幅した（Tsien、Ann. Rev. Biochem. 67:509-544, 1998、これは参照として本明細書に組み入れられる）。PCRプライマーを、コード配列のすぐ外側に5'NdeI部位および3'XbaI部位を生成するように設計し、引き続くクローニングを容易にした。5'GFPncbについての配列は、
2005537784.tif 000004
であり；3'GFPctプライマーについての配列は
2005537784.tif 000005
であった。GFPct遺伝子のコード配列を、Stemmerら、Gene 164:49-53, 1995（これは参照として本明細書に組み入れられる）によって記載されるように、各40ヌクレオチド長のプライマーのプールから新規合成した。5'末端プライマーおよび3'末端プライマーは、それぞれ、NdeIおよびXbaIについての制限部位を含んだ。
【０１４６】
GFPct遺伝子およびGFPncb遺伝子を含む、得られた717bpのPCR産物を、製造業者のプロトコールに従ってプラスミドpCR2.1 TOPO（Invitrogen, Inc.）にクローニングし、プラスミドpCrGFPctおよびpCrGFPncbをそれぞれ生成した。rbcL 3'UTRを、PCRを介して、C.ラインハルティ葉緑体ゲノムDNAの1.6kb Hind III断片を使用して生成し、テンプレートとしてプラスミドpUC19にクローニングした。rbcL 3'UTRの5'末端およびpUC19ポリリンカーの一部に対応する、XbaI部位を含むPCRプライマーの配列は、
2005537784.tif 000006
であった。rbcL 3'UTRの3'末端に対応するPCRプライマーの配列は、
2005537784.tif 000007
であった。この配列は引き続くクローニングのためのBamHI制限部位を含む。得られた433bp産物をプラスミドpCR2.1 TOPOにクローニングし、プラスミドp3rbcLを生成した。
【０１４７】
rbcL 5'UTRを、PCRによって、C.ラインハルティゲノムDNAをテンプレートとして使用して生成した。翻訳開始部位に対して、-189位で開始するrbcL遺伝子の5'末端に相補的なPCRプライマーの配列は、
2005537784.tif 000008
であった。この配列はEcoRI制限部位を含む。rbcL 5'UTRの3'末端に相補的なPCRプライマーは翻訳開始部位で開始し、配列
2005537784.tif 000009
を有した。この配列はNdeI制限部位を含む。得られた241bp PCR産物をpCR2.1 TOPOベクターにクローニングし、プラスミドp5rbcLを生成した。
【０１４８】
プラスミドp5rbcLをBamHIおよびNdeIで消化し、得られた断片を、BamHIおよびNdeIで消化したpCrGFPctまたはpCrGFPncbのいずれかにライゲーションして、それぞれ、プラスミドp5CrGFPctおよびp5CrGFPncbを生成した。最後に、p5CrGFPctおよびp5CrGFPncbをBamHIおよびXbaIで消化し、得られた958bp断片をp3rbcLにライゲーションし、またBamHIおよびXbaIで消化して、プラスミドp53rGFPctおよびp53rGFPncbを生成した。
【０１４９】
p53rGFPctおよびp53rGFPncbの両方をNdeIおよびBamHIで消化し、1.2kb断片をpETl9b（Novagen）にライゲーションして大腸菌における発現のためのプラスミドpETGFPctおよびpETGFPncbをそれぞれ生成した。p53rGFPctおよびp53rGFPncbを、次にBamHIで消化し、1.43kb断片をC.ラインハルティ葉緑体形質転換ベクター、p322（Chlamydomonas Genetics Center, Duke Uiversity）にライゲーションして、プラスミドpExGFPctおよびpExGFPncbを形成した。
【０１５０】
p322ベクターは、143,073位で開始するEco（EcoRI）部位から148,561位で開始するXho（XhoI）部位までにわたるC.ラインハルティ葉緑体ゲノムDNA配列のヌクレオチド配列に基づく（URL「biology.duke.edu/chlamy_genome/chloro.html」のワールドワイドウェブ、および「view complete genome as text file」をクリックして参照されたい；約143.1kbのEco部位および約148.5kbのXho部位については「maps of the chloroplast genome」リンク、次いで「140-150kb」リンクもまた参照されたい）。Eco/Xho葉緑体ゲノム配列を、EcoRI/XhoI消化したpBSプラスミド（Stratagene Corp., La Jolla CA）に挿入した。p322中のBamHI部位は、葉緑体ゲノムDNA配列の146522位で開始する部位に対応する。
【０１５１】
サザンブロットおよびノーザンブロット
サザンブロットおよびプローブとしての使用のためのDNAの32P標識を、Sambrookら、前出、1989に記載されるように実行した。サザンブロットに使用する放射活性プローブは、p322の2.2kb BamHI/PstI断片（プローブ5'p322）、p322の2.0kb BamHI/XhoI断片（プローブ3'p322）、およびp53rGFPct（プローブGFPct）またはp53rGFPncb（プローブGFPncb）からの717bp NdeI/XbaI断片を含んだ。これらの後者の2つのプローブを、ノーザンブロット上のGFPctおよびGFPncbのmRNAを検出するためにもまた使用した。ノーザンブロット分析において使用されたさらなる放射活性プローブには、psbA cDNAおよびrbcL cDNAが含まれた。ノーザンブロットおよびサザンブロットを、OPTIQUANTソフトウェアパッケージを備えたPackard Cyclone Storage Phosphor Systemを使用して可視化した。
【０１５２】
タンパク質発現、ウェスタンブロッティング、および蛍光ゲル
プラスミドpETGFPctおよびpETGFPncbを、大腸菌株BL21に形質転換し、そして6Hisタグ化GFPctまたはGFPncbタンパク質発現を、製造業者（Novagen）のプロトコールに従ってIPTGにより誘導した。Hisタグ化タンパク質の精製を、Ni-アガロースアフィニティークロマトグラフィー（Qiagen）を使用して実行した。ウェスタンブロッティングを、Cohenら（前出、1998）において記載されるように、マウス抗GFP一次抗体（Clontech）およびアルカリホスファターゼ標識抗マウス二次抗体（Sigma）を使用して実行した。蛍光ゲルを、ローディングの前にタンパク質を煮沸しないこと以外は、クーマシー染色またはウェスタン転写のために意図されるのと同様に泳動した。GFPを、485nm励起フィルターおよび535nm発光フィルターを備えたBerthold Night Owl CCDカメラ、モデルLB981（Chroma Corp.）を用いて観察することによりゲル中で可視化した。画像をWinLightソフトウェアを使用して生成した。
【０１５３】
GFPctおよびGFPncbについての励起スペクトルの生成
励起スペクトルを、アフィニティー精製したGFPctタンパク質またはGFPncbタンパク質を用いて、Perkin Elmer Luminescence Spectrometer モデルLS50上で生成した。分光計での読み取りの前に、組換えタンパク質を、50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM イミダゾール、pH 8.0中で希釈した。励起スペクトルを、350nmから550nmまで照射をスキャンすることによって生成した。それに対して、発光は510nmでモニターした。
【０１５４】
C.ラインハルティ葉緑体コドンの偏りにおけるGFP遺伝子の新規合成
C.ラインハルティ葉緑体中での発現のために頑強なレポーター遺伝子を発現させるために、緑色蛍光タンパク質遺伝子（そのコドン使用頻度はC.ラインハルティ葉緑体ゲノムのそれを反映するように最適化された）を合成した。天然のGFP（GFPncb）コード領域に対して2つのアミノ酸の変化を、そのタンパク質の蛍光および発現特性を増強させるために設計した。これらのアミノ酸の変化のうちの第1のもの（これは、GFPのスペクトルの性質に影響を与えることが期待されなかった）は、2位のアミノ酸のセリンからアラニンへの変化であり、開始コドンをより好ましい状況に配置するためであった。第2の変化である、65位のアミノ酸のセリンからスレオニンへの変化は、天然のGFPと比較して485nmでの励起の強度を増強させる（約6倍）ために作製されたが、同時に395nmでの励起は減少した（Heimら、Nature 373:663-664, 1995（これは参照として本明細書に組み入れられる））。この変化をGFPctコード配列に導入して、可視光を使用して蛍光検出を改善した。図1に示されるように、GFPncb遺伝子中に存在するがGFP遺伝子中には存在しないアミノ酸変化、Q80Rもまた存在した。この変化は、クローンの選択の前に、天然のGFP遺伝子のPCR増幅の間に導入された。このQ80R変異は、PCRを使用する天然のGFPコード配列の増幅に際して見い出される共通の変化であり、タンパク質機能に効果を有しない。このようにして、この変化は、整合性のためにGFPct遺伝子に含まれる。
【０１５５】
大腸菌で発現されたGFPctおよびGFPncbの特徴付け
GFPct遺伝子およびGFPncb遺伝子が機能的GFPタンパク質を産生することができたか否かを決定するために、pETGFPctまたはpETGFPncbのいずれかで形質転換した細胞から調製した大腸菌細胞溶解物を試験した。大腸菌溶解物のNiアフィニティークロマトグラフィーは、GFPについて正確な分子量のタンパク質を生じた。SDS-PAGEで分離した大腸菌産生タンパク質の直接的蛍光アッセイは、両方のタンパク質が青色光照射下で蛍光を発し、そして導入したアミノ酸変化と一致してわずかに異なる蛍光特性を示した。GFPctタンパク質に対するS65T変化は、485nmでの非常に増強されたレベルの蛍光を生じた（GFPncbタンパク質と比較して、大腸菌発現されたGFPctタンパク質の1/5のみの量をこのアッセイにおいて使用した）のに対して、395nm励起でのその蛍光は非常に減少した（図2を参照されたい）。天然GFPに対して惹起されたマウスポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット分析は、GFPctおよびGFPncbの両方について同様のシグナルを示した。この結果は、もしGFPctタンパク質のスペクトル的性質がGFPncbタンパク質に対して意図的に増強されたならば、特に重要である。従って、可視光（485nm）における励起に基づく蛍光検出がGFPct検出に好ましいのに対して、免疫標識は非差別的であり、C.ラインハルティ葉緑体中でのGFPctタンパク質およびGFPncbタンパク質の蓄積の直接的比較を可能にする。
【０１５６】
GFPctおよびGFPncbの形質転換体のサザンブロット分析およびノーザンブロット分析
GFPctおよびGFPncbのコード配列が機能的GFPタンパク質を産生し得たことを実証する際に、C.ラインハルティ葉緑体をpEGFPctおよびpEGFPncbで形質転換した。さらに、細胞を、スペクチノマイシンに対する耐性を付与する選択マーカープラスミド、p228で同時形質転換した。一次形質転換体をPCRによってスクリーニングし、続いてサザンブロット分析を行い、そしてホモプラズミック株（葉緑体ゲノムのすべてのコピーが、導入されたGFP遺伝子を含む）を単離するために選択のさらなる繰り返しを通して陽性形質転換体を取った。
【０１５７】
2つのホモプラズミックGFPct形質転換体である18.3および21.2、ならびに2つのホモプラズミックGFPncb形質転換体である5.8および12.1を、さらなる分析のために選択した（図3Aを参照されたい、これは、示される関連する制限部位を有するGFPct構築物およびGFPncb構築物を示す）。プラスミドpEGFPctおよびpEGFPncbの7.1kb Eco/Xho領域の葉緑体ゲノムへの正確な組み込みを、遺伝子のマップ上に示したプローブを使用して確認した（図3B）。野生型およびGFPctおよびGFPncbの形質転換体からのゲノムDNAをEcoRIおよびXhoIで消化し、アガロースゲル上で分画し、そしてサザンブロットに供した。rbcL 5'UTRはEcoRI制限部位を含むので（図3A）、EcoRI/XhoIを用いる形質転換体DNAの消化は、野生型DNAと比較して、5'または3'のいずれかのp322プローブにハイブリダイズするより小さな断片を生じるはずである。
【０１５８】
GFPctおよびGFPncbのC.ラインハルティ葉緑体形質転換体のサザンブロット分析は、トランスジェニック株がホモプラズミックであることを実証した。C.ラインハルティDNAをEcoRIおよびXhoIで同時消化し、フィルターを放射活性プローブを用いてハイブリダイズさせた。5' p322 32P標識プローブおよび3' p322 32P標識プローブは、それぞれ、GFPctおよびGFPncbの形質転換体中の、3.7kbおよび3.3kbのEcoRI断片にハイブリダイズした。しかし、これらの同じプローブは、予想されたように、形質転換していない野生型C.ラインハルティ株における5.7kbのEcoRI/XhoI断片にハイブリダイズした。DNAブロットを剥がし、GFPctおよびGFPncbに特異的なプローブで再プローブした。3.3kbのEcoRI/XhoI断片を、形質転換体5.8および12.1において、GFPncbプローブを使用して検出した（図4、中央のパネル）。同様のサイズの断片を、形質転換体18.3および21.2において、GFPctプローブを使用して検出した。シグナルは、野生型C.ラインハルティDNAにおいて、いずれのGFPプローブを使用しても検出されなかった。
【０１５９】
トランスジェニック株におけるGFP mRNAの蓄積
全RNAのノーザンブロット分析を、GFPct遺伝子およびGFPncb遺伝子がトランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体において転写されたか否かを決定するために使用した。野生型ならびにトランスジェニック系統5.8、12.1、18.3、および21.2から単離された全RNA10μgを、変性アガロースゲル上で分離し、そしてナイロンメンブレンにブロットした。2連のフィルターを、32P標識したpsbAまたはrbcL cDNAプローブのいずれかを用いてハイブリダイズした。各々の株はpsbAおよびrbcLのmRNAを同様のレベルまで蓄積し、このことは、等量のRNAを各レーンにロードしたこと、ならびに、葉緑体転写およびmRNA蓄積はトランスジェニック株において正常であることを実証した。
【０１６０】
フィルターを剥がし、GFPctおよびGFPncbに特異的なプローブで再プローブした。株5.8および12.1はGFPncb mRNAを蓄積したのに対して、株18.3および21.2はGFPct mRNAを蓄積した。予想されたように、GFPシグナルは、野生型細胞においては観察されなかった。4つすべてのcDNAプローブを、ほぼ同じ比活性まで標識したのに対して、GFPctシグナルおよびGFPncbシグナルは同様であり、両方のGFPプローブフィルターは、rbcLプローブと同様のシグナルを得るためにより長い露出（約4時間）を必要とした。これらの結果は、GFP mRNAが内因性rbcL mRNAのレベルのおよそ4分の1まで蓄積することを示す。
【０１６１】
トランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体におけるGFP蓄積の分析
トランスジェニック系統におけるGFPctタンパク質およびGFPncbタンパク質の蓄積のレベルを決定するために、GFPを蛍光およびウェスタンブロット分析の両方によって測定した。GFPctを発現するC.ラインハルティトランスジェニック株21.2、ならびに、両方ともGFPncbを発現する株5.8および12.1におけるGFP蓄積の比較。細胞を、連続的な光（5,000ルクス）、GFPの最大の蓄積を可能にすることが知られている条件の下で、1×107細胞/mlの密度まで増殖させた。全可溶性タンパク質をSDS-PAGEに供し、続いて抗GFP抗血清を用いるウェスタンブロットを行った。GFPncbトランスジェニック株5.8および12.1については20μgの全可溶性タンパク質をロードしたのに対して、GFPctトランスジェニック株21.2については250ng（1/80）〜20μg（1/1）の全可溶性タンパク質をロードした。
【０１６２】
6μgの全可溶性タンパク質（tsp）をSDS-PAGEによって分離し、そして得られたゲルをクーマシー染色、蛍光画像化、またはウェスタンブロット分析のいずれかに供した。クーマシー染色されたゲル（6μg全可溶性タンパク質、示されたC.ラインハルティ株から単離され、12％SDS-PAGEに供した）は、等量のタンパク質が各レーンにロードされたことを示した。蛍光ゲル（タンパク質は、試料をローディングの前に煮沸しなかったこと以外はクーマシー染色ゲルと同様に調製した；タンパク質はSDS-PAGEによって分離した）の励起を485nmに設定し、発光を535nmに設定した。485nm励起、535nm発光での画像は、GFPct形質転換体18.3および21.2についてのみのシグナルを示す。366nmで励起した場合には、いずれのGFP形質転換体についても蛍光シグナルが観察されなかった。このことは、GFPctタンパク質およびGFPncbタンパク質がトランスジェニックC.ラインハルティ株中の葉緑体において発現されたことを示す。
【０１６３】
同じ試料のウェスタンブロット分析は、蛍光分析と同様の結果を示し、GFPncb形質転換体においてはGFPは検出されず、GFPct株においては良好なシグナルが検出された（ニトロセルロースに転写され、そして抗GFP抗血清を用いてプローブされた、葉緑体発現されたGFPタンパク質のウェスタンブロット分析）。GFPct形質転換体とGFPncb形質転換体との間のGFP蓄積の違いをより正確に確認するために、滴定を実行した。GFPncb形質転換体5.8および12.1からの20μgのtspを、GFPct形質転換体21.2からのtspと共に分離した。GFPct株については、タンパク質濃度は20μg〜250μgの範囲であった。試料の比較は、21.2形質転換体におけるGFPct蓄積のレベルは、GFPncb形質転換体のいずれかにおいて見られるものよりも約80倍高かった。
【０１６４】
葉緑体遺伝子発現のレポーターとしての葉緑体に最適化されたGFPの使用
トランスジェニック系統におけるGFPct蓄積に対する異なる増殖条件の効果を試験して、GFPct遺伝子が葉緑体遺伝子発現のレポーターとして機能する能力を確証した。C.ラインハルティGFPctトランスジェニック株21.2を、収集の前に、1×106細胞/mlの密度で、5,000ルクス（高照度）または450ルクス（低照度）のいずれかでの定常的な照射下で維持した。ウェスタンブロット分析を各処理からの1μg tspに実施した。C.ラインハルティにおけるGFPctの蓄積に対する光強度の効果を試験した。収集に先立って、C.ラインハルティトランスジェニック系統21.2を、示された光強度での定常的な照射下に少なくとも48時間、1×106細胞/mlまたは1×107細胞/mlのいずれかで維持した。全可溶性タンパク質（1μg）を12％SDS-PAGEに供し、抗GFP一次抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【０１６５】
5,000ルクスの定常的照射下で1×106細胞/mlで維持された細胞は、低光束下で1×106細胞/mlの密度で維持された細胞の約10％のGFPctを蓄積した。第3のフラスコが5,000ルクスの定常的照射下で1×107細胞/mlの密度で維持された場合、GFPは再度高レベルにまで蓄積した。これは、高い細胞密度が、本質的に低照度環境を生成する増殖培養物中で光強度を減少させるように働くからである。これらの結果は、GFP遺伝子が、環境条件のわずかな変化に基づいてタンパク質合成の違いを報告するために使用され得ることを実証し、かつ葉緑体遺伝子発現のレポーターとしてのGFPct遺伝子の有用性を実証する。
【０１６６】
いくつかの異種遺伝子がC.ラインハルティにおける葉緑体遺伝子発現のレポーターとして利用されてきたが、それらの有用性は、低レベルのタンパク質発現に起因して制限されていた。C.ラインハルティ葉緑体における低レベルの異種タンパク質発現についてのいくつかの可能な説明が存在する。例えば、これらの遺伝子を駆動するために使用されるプロモーターが低レベルの転写を生じ得る。または、これらのレポーターmRNAのいくつかが固有に不安定であり得、低レベルのmRNA蓄積を生じ得る。別の可能性は、翻訳のために必要とされるRNAエレメントがこれらのキメラmRNAから欠けているかもしれないことである。C.ラインハルティ葉緑体における強力なコドンの偏りもまた、異種mRNAの翻訳を不可能にし得る。
【０１６７】
プロモーター活性およびmRNA安定性は葉緑体における遺伝子発現に非常に影響を与えるが、トランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体の分析は、高レベルのタンパク質合成を支持するために十分な異種mRNA蓄積を示してきた。さらに、大部分の場合において、C.ラインハルティ5'UTRおよび3'UTRがキメラ遺伝子の構築中に使用され、決定的なRNAエレメントがこれらのレポーターmRNAから欠ける可能性を低くした。本明細書中に開示されるように、変化したコドン使用頻度は、C.ラインハルティ葉緑体中での異種タンパク質の蓄積を増強するための手段として使用された。変化したコドン使用頻度法は、A.エクオレア緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用して例示された。
【０１６８】
GFPのGFPコード領域を、C.ラインハルティ葉緑体ゲノムからのタンパク質コード配列のコドン使用頻度に一致するように操作した。このGFPct遺伝子、ならびに天然のGFP遺伝子（GFPncb）の発現を、C.ラインハルティ葉緑体rbcL 5'および3'UTRの制御下に配置した。GFPncb遺伝子およびGFPct遺伝子の両方は転写され、かつトランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体と同様のレベルまで蓄積された。
【０１６９】
GFPctを発現するトランスジェニック株は、GFPncbを発現するものよりも約80倍多くのGFPを蓄積した。GFPct産生株21.2は、最適な増殖条件下で全可溶性タンパク質の約0.5％までGFPを蓄積した。このタンパク質発現のレベルは、全細胞タンパク質の蛍光アッセイによるGFP発現の分析を可能にする。rbcL 5'および3'UTRの制御下でのC.ラインハルティにおけるuidA（GUS）発現の以前の報告は、低レベルのタンパク質発現、可溶性タンパク質の約0.01％を示した；このGUS蓄積のレベルは、同じrbcL制御エレメントを使用して、GFPncb遺伝子を用いて得られるGFP蓄積のレベルと同様であった（Ishikuraら、前出、1999、比較的低レベルのrbcL-GUS mRNA蓄積も報告している）（本明細書中で開示されているように、低レベルのrbcL GFP mRNAと同様である）。
【０１７０】
GFPncb遺伝子と比較して、総計123コドンの変化がGFPct遺伝子に存在し、これは、121の同義的なコドン変化、およびアミノ酸置換を有する2つのコドンを含む（上記を参照されたい）。121の同義的なコドン変化のうち、66の変化が、より最適化されたコドン使用頻度に対する適度なシフトのみを表した。残りのコドンのうち54は、頻繁に使用されないコドンを頻繁に使用されるコドンで置き換える変化であった。コドンの最適化は、GFP遺伝子を通して完全に均一に分布されており、15個の変化がコード配列の最初の3分の1にあり、20個が2番目の3分の1に、および18個が最後の3分の1にある。
【０１７１】
C.ラインハルティ葉緑体において以前に発現された遺伝子（レニラルシフェラーゼ（Minkoら、前出、1999）、uidA（Sakamotoら、前出、1993）、aadA（Goldschmidt-Clermont、前出、1991）、およびaph A6のコード配列（BatemanおよびPurton、前出、2000）を含む）の分析は、これらのそれぞれの遺伝子の各々において、61、252、121、および65の好ましくないコドンを示した。これらのレポーター遺伝子中の好ましくないコドンの数は、それらの合計のコドンのパーセンテージとして表現され、それぞれ、20％、42％、46％、および25％の値が得られる。これは、好ましくないコドンが合計のコドンの23％を占めるGFPncb遺伝子と比較される。これらの結果は、C.ラインハルティ葉緑体中のこれらの他のレポーターの発現がコドン使用頻度を変化させることによって非常に増強され得ることを実証する。
【０１７２】
GFP配列の塩基組成は顕著に変化していたので、mRNAの構造に対するこれらの変化の効果がGFPctおよびGFPncbのmRNAについて試験された。この分析は、GFPct mRNAの翻訳の増強が、GFPncbのリボソームへのローディングを不可能にし得るmRNAの二次構造の何らかの効果でなく、コドン使用頻度の違いに起因することを裏付けた。GFPctおよびGFPncbのmRNAの最初の250ヌクレオチドは、RNAフォールディングプログラムmfold（Zuckerら、RNA Biochemistry and Biotechnology 11-43、BarciszewskiおよびClark、NATO ASI Series, Kluwer Acad. Publ. 1999; Mattewsら、J. Mol. Biol. 288:911-940, 1999）を使用して試験された。2つの遺伝子間で有意な二次構造の違いは予測されなかった（GFPctについて最も好ましい構造の自由エネルギーが-42kcal、およびGFPncb配列については同様に-38kcalであった）。
【０１７３】
本明細書中に開示された結果は、コドン使用頻度を最適化することが、C.ラインハルティにおける葉緑体遺伝子発現のレポーターとして使用された最適化されたGFPct遺伝子によって例示されるように、ポリペプチドの翻訳および発現を容易にし得ることを実証する。コドン最適化がC.ラインハルティにおける高レベルの組換えタンパク質発現を達成するために使用され得るという実証は、コドン最適化が、一般的に、植物葉緑体中での他の異種ポリペプチドの翻訳効率に寄与し得ることを示す。内因性rbcL mRNAと比較して相対的に低いレベルのGFP mRNA蓄積は、プロモーター活性およびGFPctのmRNA安定性を最適化することが、なおより高いかまたはより所望されるレベルまで、GFPctのシグナルを増強するための手段を提供し得ることを示す。このようにして、GFPct遺伝子は、植物葉緑体（C.ラインハルティ葉緑体を含む）中のGFPの転写、mRNA安定性、および翻訳を便利に最適化するために有用なツールを提供する。
【０１７４】
実施例2
植物葉緑体のリボソーム結合配列（RBS）の特徴付け
本実施例は、葉緑体中での翻訳を指示するリボソーム結合配列の同定および特徴付けを実証する。
【０１７５】
変異体の構築および特徴付け
部位特異的変異誘発を、以下のヌクレオチド：
2005537784.tif 000010
を使用するpsbA 5'UTRのPCR増幅によって生成した。
【０１７６】
プラスミド構築およびC.ラインハルティ形質転換を、Mayfieldら（前出、1994）によって記載されるように実行した。16S-1410/71および16S-1467/68変異体を、QUICK-CHANGE変異誘発キット（Qiagen）を使用して構築した。変異体をノーザンブロットおよびウェスタンブロット分析によって特徴付けした。RNA単離、ノーザンブロット分析、タンパク質単離、ウェスタンブロット分析、および（14C）-酢酸を用いるインビボパルス標識を、Cohenら（前出、1998）によって記載されるように実行した。
【０１７７】
「トウプリンティング（toeprinting）」分析のために、30Sリボソームサブユニットを、マイナーな改変を伴って、Harris（Microbiol. Rev. 58:700-754, 1989、これは参照として本明細書に組み入れられる）によって記載されたように単離した。野生型C.ラインハルティ細胞（2137a）をTKMDバッファー（25mM Tris-HCl (pH 7.8), 25mM KCl, 25mM MgOAc, 5mM DTT）中に再懸濁し、そして5000psiでフレンチプレスに1回通すことで破壊した。細胞滲出物を、40,000×g、4℃で30分間、Beckman JA-20ローター中で遠心分離した。30Sおよび50Sのリボソームサブユニットの1段階調製のために、上清の200のA260ユニットを100mM KClを含むTKMDバッファー中の10-30％直線状ショ糖勾配の上に配置した。この勾配を、Beckman SW28.1ローター中で、20時間、2℃で、22,500rpmにて遠心分離した。この勾配を、光学的スキャナーおよびフラクションコレクターを使用して、260nmでの休校度を読みとって処理した。30S画分および50S画分をプールし、800mM KClを含む高塩TKMDと1:1に希釈し、そして200,000×gで20分間、4℃にて、Beckman TLA-100ローター中で遠心分離した。ペレットを、100mM KClを含むTKMDバッファー中に再懸濁し、-70℃での保存のために液体窒素中で凍結させた。30Sサブユニットおよび50Sサブユニットの相互汚染の程度を、RNAブロット分析を使用してアッセイした（Cohenら、前出、1998）。
【０１７８】
開始複合体の形成を、小さな改変を伴って、Hartzら（J. Mol. Biol. 218:83-97, 1988）によって記載されたような伸長阻害によって、アッセイした。アニーリング混合物は、10μl反応混液中に、0.6pmolの5'-(32P)-末端標識オリゴヌクレオチドおよび0.2pmolの合成psbA Dl-HA転写物を含んだ。伸長阻害を、3.75mM dNTPおよび8×10-5〜2×10-3μMの高塩洗浄30Sリボソームサブユニットを加えることによって開始した。37℃、5分間のインキュベーション後、電荷を有しない大腸菌tRNA（tRNAfmet；Roche Diagnostics）を5μMの最終濃度で加えた。AMV逆転写酵素（0.5ユニット）を加え、反応を37℃でさらに15分間インキュベートした。反応物を8％シークエンシングゲル上で分析した。シークエンシング反応を、リボソームまたはtRNAの非存在下で、最終濃度200μMのdNTPを使用して、上記に記載されるように実行した。
【０１７９】
ゲルシフトアッセイ
約1μgのヘパリンアガロース精製タンパク質（Cohenら、1998）を0.4単位のPRIME RNase Inhibitor（5 Prime→3 Prime, Inc.）とともに、総量8μlの透析バッファー（20mM Tris-HCl (pH 7.5), 100mM KOAc, 0.2mM EDTA (pH 8.0), 2mM DTT, 20％グリセロール, 4mM MgCl2）中で、室温で10分間インキュベートした。反応物を、0.04pmolのインビトロ転写した（32P）標識psbA RNA（翻訳開始コドンに対して-90〜+171位にわたる）、20μgのコムギ胚芽tRNA（Sigma）、および3μgのFuD7（psbA mRNAを欠くC.ラインハルティ株）全RNAを加え、室温で10分間インキュベートした。いくつかの反応において、10pmolの非標識インビトロ転写psbA RNAをコンペティターとして加えた。RNA/タンパク質複合体を、5％非変性ポリアクリルアミドゲル中で分離した。
【０１８０】
葉緑体30Sリボソームサブユニットは、psbA 5'UTR中のShine-Delgarnoリボソーム結合配列を認識する
葉緑体mRNA翻訳のために必要とされるRNAエレメントを同定するために、5'UTR中に部位特異的変異を含む変種psbA遺伝子を、C.ラインハルティのpsbA-欠損株の葉緑体に導入した（Mayfieldら、前出、1994）。開始コドンの上流27ヌクレオチドに位置するpsbA 5'UTR中の潜在的なRBSを、葉緑体16S rRNA中のアンチSD配列を認識するその潜在能力に基づいて同定した。この配列の欠失（RBS-del）は、psbA mRNAがリボソームと結合することの失敗、および対応するD1タンパク質の合成の完全な喪失を生じた（Mayfieldら、前出、1994）。この結果は、そのエレメントがRBSとして機能し得ることを示したのに対して、その欠失はまた、多数の代替的なメカニズム（RBSに隣接する5'UTRを結合するトランス作用因子のための結合部位の直接的または間接的な破壊を含む）によってリボソーム結合をもたらしたかもしれない（Yohnら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95:2238-2243, 1998a; Yohnら、J. Cell Biol. 142:435-442, 1998b; DanonおよびMayfield、EMBO J. 10:3993-4001, 1991、これらの各々は参照として本明細書に組み入れられる；Fargoら、前出、1998もまた参照されたい）。
【０１８１】
RBSエレメント中のSD配列は、30S小サブユニットの16S rRNAの3'末端の相補的配列（アンチSD配列）に対合することによって、原核生物転写物からの翻訳の開始を促進する（Voorma、Translational Control, Hersheyら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press 1996、これは参照として本明細書に組み入れられる）。この相互作用は、原核生物転写物に加えられた精製された30Sリボソームサブユニットを使用してインビトロで測定された（Hartzら、前出、1991）。結合した30Sサブユニットは、mRNA上での下流のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長をブロックし、これは、リボソームの「トウプリント」を生じる。
【０１８２】
30SサブユニットがpsbA mRNAの5'UTR中のRBSを認識するか否かを決定するために、30Sリボソームサブユニットが、C.ラインハルティから単離された。30Sサブユニットは夾雑する50Sサブユニットを含んでいなかった。開始コドンの下流のpsbA mRNAの領域に相補的な5'-(32P)-末端標識オリゴヌクレオチドプライマーを、精製されたインビトロ合成psbA転写物にアニールした。32P-オリゴヌクレオチド/RNA複合体を、漸増する濃度の精製C.ラインハルティ30Sリボソームサブユニット、および大腸菌fMet tRNAとともにインキュベートした（実施例2を参照されたい）。プライマー伸長の間の中止部位が、結合したリボソームサブユニットに起因して存在する。シークエンシング反応を、結合したリボソームの位置を決定するために並行して実行した。30Sリボソームを含む反応において、トウプリント反応における中断は、Shine-Delgarno配列の3'側12ヌクレオチド（RBS中断）および開始コドンの3'側12ヌクレオチド（AUG中断）に存在した。プライマー伸長中断を、葉緑体30SリボソームサブユニットをpsbA mRNAの5'末端に対応するRNA転写物とともにインキュベートした場合に観察した。これらの中断は、推定のSD配列および開始コドンの両方の約12ヌクレオチド下流に存在し、これは、これらの2つの配列の両方で結合する30Sリボソームサブユニットに一致した。オオムギからのpsbA mRNAへの大腸菌 30Sサブユニットの結合もまた、C.ラインハルティからのpsbA mRNAのそれと同様の位置に配置されている潜在的なSD配列に対応するトウプリントを示した（KimおよびMullet、Plant Mol. Biol. 25:437-448, 1994、これは参照として本明細書に組み入れられる）。これらの結果は、推定のRBSエレメントが機能的RBSエレメントの特性を有することを示す。従って、インビトロ生化学データは、以前の研究からのインビボの遺伝的証拠の解釈を支持し、それはpsbA mRNA中のRBSエレメントが開始コドンの5'（上流）27塩基であることである(Mayfieldら、前出、1994)。
【０１８３】
16S rRNA中のアンチSD配列の変異は葉緑体mRNAのサブセットからの翻訳を阻害する
葉緑体リボソームがSD配列との相互作用を介してメッセージを認識することを実証するために、葉緑体16S rRNA中のアンチSD配列が変異された2つのホモプラズミックC.ラインハルティ株を構築した。16S rRNAの3'末端に位置するアンチSD配列中のヌクレオチドは、CCUCCからGGUCCに（16S rRNAのヌクレオチド1467および1468）、またはCCUCCからCCUGGに（16S rRNAのヌクレオチド1470および1471；配列番号:29もまた参照されたい）変化された。これらの変異体は、光合成の非存在下での生長を補助し得る完全培地の存在下で培養された場合に生存可能であり、葉緑体生合成の変化から生じるいかなる巨視的な形態学的な欠陥も示さなかった。16S-1467/68変異体株は、最小培地上で減少した速度で生長することができたのに対して、16S-1470/71変異体株は、最小培地上で生長することができなかった。このことは、これらの変異体中での光合成機能の、減少および除去をそれぞれ示す。
【０１８４】
これらの株における葉緑体にコードされるタンパク質の蓄積を、ウェスタンブロット分析によって調べた。野生型（wt）または変異体C.ラインハルティ株16S-1467/68および16S-1470/71から調製した等量の全タンパク質（クーマシーブルー染色によって測定）をSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロースにブロットし、そしてD1、D2、ATPアーゼ、またはLsuタンパク質に特異的なウサギポリクローナル抗血清で処理した。16S rRNAにおけるアンチSD配列の変異は、いくつかの葉緑体タンパク質の蓄積に影響を与えた。psbAにコードされるD1タンパク質は16S-1470/71変異体中で蓄積することに失敗し、16S-1467/68変異体中では野生型レベルの20％のみまで蓄積した。psbDにコードされるD2タンパク質は同様のパターンを示し、16S-1470/71変異体中では野生型の10％未満まで蓄積し、そして16S-1467/68変異体中ではその約25％まで蓄積した。葉緑体ATPaseの蓄積もまた、16S-1470/71変異体中では損なわれたが（野生型レベルの50％）、16S-1467/68変異体中では野生型に近いレベルまで存在した。逆に、可溶性の葉緑体にコードされるRubiscoの大サブユニット（Lsu）の蓄積は、いずれの16S 変異体株においても大部分は影響を受けなかった。
【０１８５】
変異体株においてD1タンパク質が蓄積することの失敗は、推定のRBSエレメントと16S rRNAとの間のShine-Delgarno相互作用が最適な翻訳のために必要であることを示した。これらの株においてD2が蓄積することの失敗は、翻訳のためにpsbA mRNAと同じアンチSD配列を必要とするpsbD mRNAの結果であり得るか、または、合成後のD2タンパク質の不安定化を生じるD1サブユニットの喪失に起因し得る。例えば、個々のPSIIサブユニットを合成することに失敗するC.ラインハルティの核変異体は、他のコアの葉緑体にコードされるPSIIポリペプチドを蓄積することに失敗するが、これらのタンパク質は、野生型と同じ速度で合成される（Ericksonら、EMBO J 5:1745-1754, 1986）。
【０１８６】
個々の葉緑体タンパク質の翻訳の速度を試験するために、野生型株、変異型16S rRNAを有する株、およびpsbA遺伝子を欠くC.ラインハルティ株を（14C）-酢酸でパルス標識した。16S-1470/71変異は、D1、D2、P5、およびP6タンパク質を含むほとんどすべての膜タンパク質のタンパク質合成の欠如を生じた。等量の全膜結合タンパク質または可溶性タンパク質（Cohenら、Meth. Enzymol. 297:192-208, 1998、これは参照として本明細書に組み入れられる；実施例2もまた参照されたい）は、クーマシーブルー染色によって決定されるように、（14C）-酢酸でパルス標識した野生型株および変異型C.ラインハルティ株から調製され、SDS-PAGEによって分離した。（14C）-標識されたタンパク質を、オートラジオグラフィーによって可視化した。16S rRNAアンチSD配列の変異は、いくつかの葉緑体にコードされるタンパク質のタンパク質合成の速度を減少させた。この結果は、D2蓄積の減少がD1蓄積の欠如に起因するものではなかったこと、およびアンチSD配列がpsbA翻訳のために必要とされたことを示す。ATPアーゼmRNAの翻訳もまた、この株中で減少されるが、他の膜タンパク質よりもより少ない程度である。それほど顕著でない効果が16S-1467/68変異体について観察され、これは、観察されたタンパク質の蓄積のレベルと一致した。いくつかの膜結合タンパク質は、野生型レベルで16S-1470/71株において継続して翻訳された。膜結合タンパク質との著しい対比において、可溶性タンパク質翻訳の速度の変化は、16S rRNA変異体においてほとんど観察されなかった。野生型の速度での可溶性タンパク質の合成は、16S rRNAのアンチSDエレメントの変化を有する葉緑体リボソームが機能的であり、かつ翻訳を補助することができることを実証した。これらの結果は、葉緑体中の可溶性タンパク質および膜タンパク質の発現の調節はRBS依存性メカニズムを介して差次的に調節され得ることを示す。
【０１８７】
psbAにコードされるD1タンパク質の発現は、独特な間隔の必要性を有するRBS中のSD配列の存在を必要とする
psbA mRNA翻訳におけるRBSの役割を、RBSがGGAGからCCAGに変化されたC.ラインハルティ株（RBS-Alt）を使用してさらに研究した。各株を完全（TAP）培地中で連続的な照射条件下で増殖させ（実施例2を参照されたい）、かつ等量の膜タンパク質（クーマシーブルー染色によって決定した）をSDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロースにブロットし、そしてD1タンパク質に特異的なウサギポリクローナル抗血清で処理した。D1タンパク質の不完全な変性の結果として、結合したクロロフィルから複数のバンドが生じた。RBS-Alt変異は、5'UTR中の他のエレメントの相対的な局在化を破壊することなく、psbA mRNAと16S rRNAの3'末端との間のSD塩基対合ポテンシャルを除去する（図4を参照されたい）。以前にRBS-delについて示されたように（Mayfieldら、前出、1994）、D1タンパク質はRBS-Alt中に蓄積することに失敗した。この結果は、GGAG配列が、本物のRBSについて予想されるように、psbA発現のために必要とされることを実証する。
【０１８８】
信じられているように、30SリボソームサブユニットがRBSと開始コドンの両方を同時に接触することができない場合、これらの配列が15ヌクレオチドより大きく離れていたならば（Chenら、Nucl. Acids Res. 22:4953-4957, 1994）、psbA mRNA中の推定のSD配列（これはpsbA開始コドンから27ヌクレオチドに位置している）が、正確な開始コドンで翻訳開始を指示することができないはずである。psbA mRNAのRBSの相対的位置がいかにして発現に影響を与えるかを試験するために、一連の欠失が5'UTRに導入され、開始コドンにより近接したRBSエレメントを配置する（図4）。RBSが開始コドンに漸進的により近接に移動されたので、D1タンパク質の蓄積はC.ラインハルティ細胞において減少した。RBSを原核生物RBSエレメント（RBS-15、RBS-11）のための最適な位置の近傍に配置した欠失は、C.ラインハルティ葉緑体におけるD1タンパク質の蓄積を生じなかった。さらに、伝統的な原核生物RBSエレメントの、開始コドンの7ヌクレオチド上流への付加（SD-Add）は、野生型psbA RBS配列の存在下でのD1の蓄積を増強することに失敗した。
【０１８９】
psbA変異体株においてD1タンパク質を蓄積することの失敗はmRNA安定性の損失に起因しない
psbA 5'UTRにおける推定のSD配列に変異を有する株におけるD1蓄積の損失はリボソーム認識の損失によって説明され得るのに対して、代替的な説明が存在する。例えば、転写物を不安定化する変異は、しばしば、mRNA蓄積レベルの減少を生じ、これは、翻訳/タンパク質蓄積の減少をもたらし得る。psbA mRNAは、RBS配列に影響を与える部位特異的変異を含むC.ラインハルティ株に蓄積した。全RNAまたはリボソーム結合RNAプールからのpsbA mRNAは、psbAまたは16S rRNAに特異的な放射性標識されたプローブを用いて可視化された（等量のローディングを確実にするため）。相対的なpsbA mRNAレベルを16S rRNAの違いについて補正し、次いで野生型に関して規準化した。
【０１９０】
psbA 5'UTRにおけるSD配列への変異は、蓄積したpsbA mRNAの定常レベルにおける減少をもたらすが、蓄積したmRNAの相対レベルはD1蓄積の観察されたレベルと相関しなかった。例えば、psbA mRNAの50％の減少にも関わらず、D1タンパク質は、RBS-23変異体により高いレベルまで蓄積した。RBS-15株およびRBS-11株は、いかなるD1タンパク質も蓄積することができなかったか、または最小増殖条件下で増殖できなかったが、しかし、それにも関わらず、D1タンパク質を蓄積したRBS-19変異体と同じ量のpsbA mRNAを蓄積した。実際、RBS-del変異体およびRES-Alt変異体について観察されたように、野生型psbA mRNAレベルの10％のみの蓄積が、他のpsbA変異体において野生型レベルのD1タンパク質を観察するために十分であった（Mayfieldら、前出、1994）。このようにして、これらの変異に起因して観察される影響は、mRNAの安定性/蓄積の変化のためであり得る。
【０１９１】
D1タンパク質蓄積の損失はまた、psbA 5'UTRの変異/欠失が得られた転写物を翻訳不可能にする構造的変化を生じ得る場合に生じ得る。リボソームがSD配列を認識し得るか否かを決定するために、開始コドンに対するSD配列の相対的位置を変化させる変異の存在に関わらず、変異の各々からのリボソーム結合RNAは、ショ糖クッションの上の細胞抽出物の遠心分離によってmRNAから分離された。変化されたかまたは欠失されたRBSを含む株は、リボソームに結合した非常に減少したレベルのpsbA mRNAを有する。しかし、RBSエレメントを含んだ株の各々は、D1タンパク質を蓄積することに失敗する株においてさえ、リボソームとの有意な（野生型レベルの>50％）psbA mRNA結合を有した。D1タンパク質を蓄積することの失敗は、RBS-15変異体およびRBS-11変異体におけるリボソーム結合RNAが、主としてポリリボソームではなくモノリボソームに結合したRNAからなることを示す。
【０１９２】
開始コドンに対してより近傍にSD配列を配置する変異が、70Sリボソーム上での翻訳を意図的にではなく妨害しないことをさらに実証するために、野生型または変異型psbA 5'UTRの後ろに配置された細菌ルシフェラーゼコード領域を含むキメラ遺伝子を構築した。このキメラ遺伝子を大腸菌に形質転換し、そしてルシフェラーゼmRNAの翻訳をルシフェラーゼ活性によって測定した。大腸菌におけるルシフェラーゼ発現パターンはC.ラインハルティにおけるD1発現について観察されたものと逆であった。psbA SD配列を開始コドンに対してより近傍に配置する変異は細菌中での翻訳のために新たに適格であった。ビブリオ・ハルベイ（Vibrio harveyi）からの細菌ルシフェラーゼ遺伝子（lux AB）のコード領域は、野生型（wt）または変異体psbA 5'UTRのいずれかに融合され、野生型psbAプロモーターおよび3'UTRを含むプラスミドにライゲーションされた。このプラスミドを大腸菌株BL21（DE3）に形質転換し、ルシフェラーゼの翻訳を、ルシフェラーゼ基質n-デシルアルデヒドの存在下でビデオカメラ（WelshおよびKay、Curr. Opin. Biotech. 5:617-622, 1997、これは参照として本明細書に組み入れられる）を使用して光子計数によってモニターした。最適発現のパーセンテージ（RBS-11）を各株について決定した。ルシフェラーゼは、開始コドンの上流11〜15ヌクレオチドに位置するRBSを含む構築物から、細菌中で効率的に翻訳されたが、RBSが上流19ヌクレオチドより離れて位置した場合には乏しい翻訳であった。この結果は、細菌または葉緑体のいずれかにおいて同様のレベルで翻訳を駆動すると報告された、C.ラインハルティからのatpB mRNAの5'UTRについて報告されているものと対照的である（Fargoら、前出、1998）。
【０１９３】
C.ラインハルティにおけるpsbAおよびpsbDの転写物の5'UTR中の配列はmRNAプロセシングに影響を与え得る。psbA 5'UTRがRBS配列の4ヌクレオチド上流でインビボで切断され、この成熟化プロセスはリボソーム結合と相関し、そしてRBS配列の存在に依存する（BruickおよびMayfield、前出、1998）。psbA 5'末端の分析は、変異体由来のpsbA RBS配列がリボソーム結合の初期の段階に関与する因子によって認識されることのさらなる証拠を提供する。葉緑体psbA変異体のプライマー伸長分析は、psbA 5'UTRがRBS配列を含む各株において処理されるが、RBS-Alt変異体およびRBS-del変異体においては処理されないことを実証した（図4を参照されたい；Bruick、Graduate Thesis, The Scripps Research Institute, 1998もまた参照されたい）。これらの結果は、RBS-11株およびRBS-15株中のRBSエレメントが葉緑体中のリボソームサブユニットによって認識されたが、この認識は、それ自体、開始コドンにおける正確な翻訳開始を指示するに十分ではないことを示す。
【０１９４】
psbA 5'UTRへの欠失は核にコードされたトランス作用翻訳因子の結合を妨害しない
核にコードされたタンパク質複合体は、psbA 5'UTRを特異的に認識し、翻訳開始を刺激することによってD1タンパク質合成を劇的に増強する（DanonおよびMayfield、前出、1991；Yohnら、前出、1998a；Yohnら、前出、1998b）。psbA 5'UTR変異体のいずれかが、mRNAに結合するこの複合体の能力に影響を与えたか否かを決定するために、RNA結合アフィニティーを、変異体RNAの各々について、インビトロゲルシフト分析を使用して測定した。psbA特異的な複合体のpsbA 5'UTRへの結合のゲルシフト分析を実行した。野生型psbA 5'末端に対応する放射標識したRNA断片を、インビトロ転写し、ヘパリンアガロース精製タンパク質の存在下でインキュベートした。RNA/タンパク質相互作用は非変性PAGE上でRNAの遅延を生じた。250倍過剰の非標識コンペティターRNAもまた、同じ反応に加えた。各変異体からのpsbA 5'UTRに対応する過剰の非標識RNAを使用して、野生型psbA 5'UTRに対応する標識したRNAへのタンパク質複合体の結合を競合させた。各々の変異体psbA 5'UTRはタンパク質複合体によってインビトロで認識され、RBS-11 RNAのみは、タンパク質複合体の結合について野生型RNAと十分に競合することに失敗した。この結果は、これらの変異体の大部分の翻訳の損失は、これらの翻訳アクチベータータンパク質のための特異的結合部位の除去に起因するのではないことを示す。
【０１９５】
内部共生的原核生物から生じたので、葉緑体の転写的および翻訳的機構は一般的に細菌のそれと似ている。葉緑体プロモーターは、細菌のそれと類似したエレメントを含み、そしてプラスチドプロモーターは、大腸菌における転写を駆動し得る。葉緑体のリボソームは細菌のそれに明確に関連しており、そして葉緑体リボソームRNAおよびリボソームRNAはそれらの細菌の対応物と高度な相互作用を示す（Harrisら、前出、1994）。葉緑体mRNAもまた、それらはキャップされていない、一般的にポリアデニル化されていない、および、ポリシストロン性メッセージを含み得るという意味において原核生物mRNAに類似している。葉緑体における翻訳機構がその原核生物的な特徴を保持してきたのに対して、時間の経過とともに、多くの調節機構が核に引き渡されてきた。いかにして葉緑体の原核生物様成分が核から導入されたトランス作用性調節因子とともに組み込まれたかは大部分未知のままで残っている。
【０１９６】
葉緑体の翻訳機構の原核生物的な性質に起因して、Shine-Delgarno（SD）相互作用は、葉緑体翻訳の潜在的なレギュレーターとして初期に認識されていた。しかし、多くの場合において、同定可能なSD配列は、コンセンサスRBSエレメントと見なされるには開始コドンから遠すぎて配置されていた。細菌様コンセンサスSD配列が翻訳の損失を伴わず変異された変異誘発研究と合わせて、葉緑体翻訳におけるSD相互作用の重要性は却下された（Fargoら、1998；KooおよびSpremulli、1994；Rochaix、1996；Sakamotoら、1994）。
【０１９７】
一般的な葉緑体翻訳に対する、および、特にpsbA mRNAの翻訳に対する、SD相互作用の影響を試験するために、葉緑体16S rRNA中のアンチSD配列を変異させて、推定のSD配列との塩基対合ポテンシャルを除去した。得られるリボソームは可溶性葉緑体タンパク質を合成する能力を保持し、このことは、これらの16S変異がリボソーム活性または機能を一般的に抑制しなかったことを示す。しかし、大部分の、しかしすべてではない膜結合葉緑体タンパク質の合成は、16S rRNAのアンチSD領域に対する変異によって強く損なわれた。これらの結果は、葉緑体翻訳におけるアンチSD領域の重要性を確立し、そしてこのエレメントがプラスチド中での翻訳調節に適格であり得ることを示す。
【０１９８】
mRNA側からSD相互作用を試験するために、一連の変異を、psbA mRNA中の開始コドンの上流27ヌクレオチドに位置する潜在的なSD配列に導入した。この配列は、以前にpsbA mRNAのプロセシングおよび翻訳において重要なエレメントとして関連付けられてていた（BruickおよびMayfield、前出、1999；Mayfieldら、前出、1994）。本明細書中に開示されるように、psbA SDエレメントへの変異はmRNA/リボソーム結合を破壊し、psbA翻訳およびD1タンパク質蓄積を破壊した。16S変異分析およびトウプリンティングアッセイとまとめると、これらの結果は、Shine-Dalgarno相互作用がpsbA mRNAの翻訳を必要とし、かつ他の葉緑体mRNAのサブセットを必要とすることを実証する。
【０１９９】
psbA mRNA中でのSDエレメントと開始コドンとの間の異常な間隔を考慮して、葉緑体中のSD機能への位置的な効果を試験した。細菌コンセンサスのSDエレメントに近いpsbA SDエレメントを配置する一連の欠失は、葉緑体中でのD1翻訳の対応する減少を生じたが、これは、転写物を細菌中での翻訳に適格にした。この結果は、葉緑体および細菌が、SD相互作用に従う開始コドンを同定するための根本的に異なるメカニズムを使用することを示す。これらの結果はまた、psbA mRNA中のSDエレメントがSDエレメントについての原核生物コンセンサス中に存在しないこと、およびこれは、他のプラスチドmRNA中の細菌コンセンサス位置に配置された潜在的なSDエレメントの欠失が翻訳に効果を有しないことを実証する。
【０２００】
メッセージの安定性、リボソーム結合、および翻訳はしばしば詳細に連係するので、mRNAの5'UTRにおける変異の主要な効果を同定することは困難であり得る。psbD 5'UTR中の開始コドンの約30ヌクレオチド上流に位置するRBS様配列（AUGAG配列：PRB2）がメッセージ安定性エレメントとして働くことによって葉緑体中でのD2タンパク質合成に影響を与えることが示唆されてきた（Nickelsenら、Plant Cell 11: 957-970, 1999）。16S変異のpsbD翻訳の損失およびpsbAのSDエレメントに対するPRB2エレメントの位置に基づくと、PRB2は、おそらくpsbD mRNAのためのSDエレメントである。このエレメントを欠く変異体におけるpsbD mRNA安定性の減少は、psbA SDに影響を与える種々の変異について観察されるものと同様に、おそらく、さもなくば分解からmRNAを保護するリボソーム結合の損失を反映する（Wagnerら、J. Bacteriol. 176:1683-1688, 1994）。
【０２０１】
16S変異体中での膜タンパク質と可溶性タンパク質との間の翻訳の対比は、SD相互作用が葉緑体中での翻訳調節の差次的成分であり得ることを示す。膜タンパク質合成の試験は、少なくとも2つの膜結合タンパク質が16S変異体中で野生型レベルで翻訳されたことを示した。2つの16S変異体間の膜タンパク質の差次的な翻訳は、葉緑体mRNAがSDエレメントとしてわずかに異なる配列を使用し得ることを示し、そしてリボソームの2つの集団が葉緑体中に存在し得ることを示唆する。
【０２０２】
psbA mRNA中のRBSエレメントの位置は、RBSから開始コドンまでの初期の開始複合体の移動を促進するための葉緑体中での新規なメカニズムを暗示する。二次構造はいくつかの原核生物メッセージにおいて非定型的に配置されたRBSエレメント間の距離を短縮し得る。しかし、psbA RBSと開始コドンとの間のヌクレオチドは、psbA翻訳の損失なしで実質的に変化され得、かつこの領域は比較的構造化されないことが予測される。真核生物において翻訳の開始の間に観察されるスキャニングメカニズムはまた、葉緑体mRNAについて提案されたが、ヘリカーゼ活性のためのエネルギー源としてATPを必要とし、これは葉緑体翻訳になお帰せられない特徴である。代替的に、葉緑体mRNAは、RBS配列に結合した30Sサブユニットを開始コドンを有する記録簿（register）に持ち込むためにタンパク質因子を使用し得る。psbA mRNAの5'UTRに結合する1つの特異的タンパク質因子は、翻訳開始因子と相互作用することが知られている真核生物タンパク質とホモロジーを有する（Yohnら、前出、1998a）。このような真核生物様タンパク質は、正確な開始コドンに翻訳開始複合体を運び得、従って、葉緑体における翻訳レギュレーターとして機能する。RBSと開始コドンとの間で必要とされるさらなる間隔は、これらのタンパク質因子を収容し得る。なぜなら、本明細書中で試験された変異の大部分はインビトロでこれらの因子の結合を妨害したからである。類似の遠位のSD配列はまた、高等植物のpsbA 5'UTRにおいて同定されており、このことは、このようなSDエレメントが植物葉緑体mRNAに特徴的であることを示す。
【０２０３】
実施例3
葉緑体中での抗体の発現
本実施例は、単鎖抗体をコードする、葉緑体コドンに最適化されたポリヌクレオチドが葉緑体中で発現されること、およびその単鎖抗体が二量体に組立てられることを実証する。
【０２０４】
1型単純ヘルペスウイルス（HSV）および2型HSVに特異的に結合する単鎖抗体（HSV8；配列番号:16）をコードするポリヌクレオチド（配列番号:15）を、HSV8（配列番号:15）をコードするポリヌクレオチドをGFPコード配列について置換したこと以外は、pExGFP植物葉緑体ベクターを使用して、C.ラインハルティ葉緑体に形質転換した（実施例1を参照されたい）。2つの形質転換体（10.6および11.3）からの全可溶性タンパク質の試料を、還元剤ジチオスレイトール（DTT）の非存在下および存在下で収集し、Laemmliバッファー系を使用して10％ SDS-PAGEによって分離し、そしてウェスタンブロット分析のためにニトロセルロースフィルターに転写した（Cohenら、前出、1998）。作動可能に連結されたFLAGペプチドタグを含むHSV8抗体を、抗FLAGペプチドタグ抗体（M2モノクローナル抗体；Sigma）および抗マウスアルカリホスファターゼ結合体化抗体（Sigma）を使用して可視化した。
【０２０５】
2つの異なる形質転換体中で発現されたHSV8単鎖抗体は、予測された見かけの分子量（約65kDa）に移動した。顕著には、DTTの非存在下で単離されたHSV8抗体は二量体として移動した。これらの結果は、抗体二量体のようなタンパク質複合体が植物葉緑体中で組立てられ得ることを実証する。同様に、抗HSV抗体の単鎖Fv断片（配列番号:43）をコードする、葉緑体コドンに偏った合成ポリヌクレオチド（配列番号:42）を構築し、およびC.ラインハルティ中で発現させ、そして機能的単鎖抗体抗HSV Fv抗体を得た。
【０２０６】
コンビナトリアル抗体ライブラリーが大きな免疫グロブリンレパートリーの利用の問題を解決したのに対して、これらの複合体分子の効率的な産生は問題を残している。ここで、独特なラージ単鎖（lsc）抗体の効率的な発現が、単細胞の緑藻、クラミドモナス・ラインハルティにおいて実証される。高レベルのタンパク質の蓄積は、葉緑体コドンの偏りにおいてlsc遺伝子を合成することによって、ならびに、2つのC.ラインハルティ葉緑体プロモーターのいずれか、ならびに5'RNAエレメントおよび3'RNAエレメントを使用することによって達成された。単純ヘルペスウイルスのグリコプロテインDに対するこのlsc抗体は、藻類によって可溶性形態で産生され、インビボでより高次の複合体に組立てられる。ジスルフィド結合形成による二量体化は別として、抗体は検出可能な翻訳後修飾を受けない。さらに、この結果は、抗体の蓄積が、藻類を培養するために使用される特定の増殖レジメによって、および抗体遺伝子の発現を駆動するために使用される5'エレメントおよび3'エレメントの選択によって調節され得ることを実証する。これらの結果は、組換えタンパク質の発現プラットフォームとしての藻類の有用性を実証し、および、完全な重鎖タンパク質（Fcドメインを含む）を含む新しい型の単鎖抗体を記載する。
【０２０７】
現在、組換えタンパク質の産生のために利用可能な多数の異種タンパク質発現系が存在し、そしてこれらの系の各々は、タンパク質収量による明確な利点および操作の容易さおよび作業のコスト（1）を提供する。モノクローナル抗体（mAb）は発酵施設においてトランスジェニック哺乳動物細胞の培養によって主として産生される。高い資本コスト、および哺乳動物生産系の固有の複雑さが原因で、モノクローナル抗体の製造能力は、実質的にこれからの5年間にわたって必要量に届かない（2）。
【０２０８】
哺乳動物細胞培養を介するmAb製造における突出した不足の結果として、代替的な、コスト効果の高い、mAbを製造するための手段が、治療タンパク質開発の現在のペースを維持するために必要である。酵母および細菌の系は、培地成分によってより経済的ではあるが、正確にフォールディングした機能的分子を効率的に産生することができないこと、ならびにより複雑なタンパク質の乏しい収量を含む、いくつかの欠点を有する。伝統的な発酵に加えて、いくつかのグループがmAb産生のために陸上植物の生産性を利用することを探求している（3、4、5）。このような系において、植物それ自体がバイオリアクターとなり、葉または種子組織に沈着された抗体を有する。植物はバイオテクノロジー産業において前例のないスケールの経済性を提供するが（例えば、トウモロコシを数千エーカーも植えることができる）、このアプローチにも同様にいくつかの固有の欠点が存在する。第1に、最初の形質転換事象から、使用可能な量（mg〜g）の組換えタンパク質を手元に持つまでに必要な時間の長さは、トウモロコシのような種については3年間もの長さであり得る。食用の農産物中でのヒト治療剤の発現にまつわる第2の関心事は、バチルス・チューリンゲンシスの殺虫タンパク質を発現するトランスジェニックトウモロコシと、天然の在来種との間で起こったような（7）、周りの農作物への遺伝子流出（花粉を介する）についての潜在性（6）である。これらの関心事は、管理機関が、ヒト治療剤を発現するトランスジェニック食用植物（トウモロコシ、イネ、およびダイズのような）の露地栽培を禁止する可能性を引き起こす。
【０２０９】
治療剤タンパク質の発現のために葉緑体を操作するためのほんのわずかのみの試みが行われてきたが（8）、ある場合には、非常に高いレベルの組換えタンパク質発現がこのオルガネラにおいて達成された（9-12）。たとえ緑藻が、光および栄養によって調節される遺伝子発現から、光合成装置の組立ておよび機能にいたるまでのすべてを理解するためのモデル生物として働いてきたとしても、組換えタンパク質の発現のためのトランスジェニック藻類の生成についての報告はほんのわずかしか存在しなかった（13）。実施例1に開示されているように、C.ラインハルティ葉緑体ゲノムのコドンの偏りを反映するようにGFPレポーター遺伝子のコドン使用頻度を最適化することにより、GFP蓄積を、可溶性タンパク質の約80倍、0.5％まで増加させた（14もまた参照されたい）。
【０２１０】
本明細書中で開示されるように、ヒトモノクローナル抗体およびその断片は、トランスジェニック藻類葉緑体中で発現され得る。ラージ単鎖抗体遺伝子をC.ラインハルティ葉緑体コドンの偏りに操作し、そして発現を駆動するためのC.ラインハルティ葉緑体のatpAまたはrbcLプロモーター、および5'非翻訳領域を利用した。この抗体は単純ヘルペスウイルスのグリコプロテインDを指向し（15）、そして可撓性リンカーペプチドによって軽鎖の可変領域に融合された完全なIgA重鎖タンパク質を含む。lsc抗体はトランスジェニック葉緑体中に可溶性タンパク質として蓄積し、ELISAアッセイによって決定されるように、単純ヘルペスウイルスタンパク質を結合する。このラージ単鎖抗体は、インビボでより高次の構造（二量体）に組立てられ、そして二量体形成に付随するジスルフィド結合とは別に、明白な翻訳後修飾を含まない。これらの結果は、複雑な組換えタンパク質のための発現プラットフォームとしての藻類の有用性を実証する。
【０２１１】
方法
C.ラインハルティ株、形質転換、および成長ホルモン
記載されたように、すべての形質転換をC.ラインハルティ株137c（mt+）に実行した（14）。HSV8-LSCの発現のためのC.ラインハルティ形質転換体の培養をTAP培地（19）中で、23℃にて照射および細胞密度下で実行した。
【０２１２】
プラスミド構築
すべてのDNAおよびRNAの操作を本質的に記載されるように実行した（20；21；Mayfieldら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 100:438-442, 2003もまた参照されたい、これは参照として本明細書に組み入れられる）。HSV8-lsc遺伝子（配列番号:47）のコード領域を、（22）の方法に従っておよび記載されるように（14）新規合成した。得られた1893bpのPCR産物を、製造業者のプロトコールに従って、プラスミドPCR2.1 TOPO（Invitrogen Corp.）にクローニングした。atpAプロモーターおよびrbcLプロモーターおよび5'UTR、およびrbcL 3'UTRを、PCRを介して生成した（14）。
【０２１３】
サザンブロット分析およびノーザンブロット分析
サザンブロットおよびプローブとしての使用のためのDNAの32P標識を、記載されたように実行した（20）。サザンブロットに使用される放射性プローブは、p322の2.2kbのBamHI/PstI断片（プローブ5'p322）、p322の2.0kbのBamHI/XhoI断片（プローブ3'p322）、およびHSV8-lscからの1926bpのNdeI/XbaI断片を含んだ。ノーザンブロット分析において使用されるさらなる放射活性プローブはpsbA cDNAを含んだ。ノーザンブロットおよびサザンブロットを、Optiquantソフトウェアを備えたPackard Cyclone Storage Phosphor Systemを使用して可視化した。
【０２１４】
タンパク質発現、ウェスタンブロッティング、およびELISA
ウェスタンブロット分析のために、タンパク質をC.ラインハルティから記載されるように単離した（14）。Flagアフィニティー精製されたC.ラインハルティHSV8-lscを、完全プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット（Roche, Inc.）および最終濃度1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド MSFを含むTRIS緩衝生理食塩水（TBS; 25mM TRIS pH 7.4, 150mM NaCl）中で単離した。抽出物を、抗Flag M2アガロースビーズ（Sigma）を使用して、製造業者のプロトコールに従って精製した。ELISAアッセイを、100μlのHSVタンパク質でコートした96ウェルマイクロタイタープレート（Coastar）中、100μlの量で実行した。
【０２１５】
ELISAにおける使用のための試料を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS；137mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.8mM K2HPO4, 10mM Na2HPO4, pH 7.4）および5％脱脂粉乳からなるブロッキングバッファー中で希釈した。インキュベーションを、振動させながら4℃で8時間実行した。次いで、プレートをPBSおよび0.5％Tween20で3回すすぎ、次いで抗Flag抗体とともに4℃で8時間インキュベートした。プレートを再度3回すすぎ、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体（Santa Cruz Biotechnology）とともに4℃で8時間インキュベートした。プレートを再度PBSおよび0.5％Tween20で3回すすぎ、そして100μlのp-ニトロフェニルホスフェート（pNPP、Sigma）を使用して発色させた。反応を50μlの3N NaOHの添加によって停止した。
【０２１６】
タンパク質濃度をBioRadタンパク質アッセイ試薬を使用して決定した。ウェスタンブロットを、記載されるように（23）、マウス抗Flag一次抗体（Sigma）およびアルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗マウス二次抗体（Santa Cruz Biotechnology）を使用して実行した。
【０２１７】
結果
コドンの偏ったポリヌクレオチドを使用する、C.ラインハルティ葉緑体中でのラージ単鎖抗体遺伝子の新規合成
C.ラインハルティ葉緑体中の組換え抗体の頑強な発現を発生するために、単鎖抗体遺伝子が豊富に翻訳されるC.ラインハルティ葉緑体mRNAを反映するように最適化されたコドンを使用して合成した。この操作された抗体は、ファージ上で提示されたヒト抗体ライブラリーに由来し、かつ単純ヘルペスウイルスタンパク質でのパニングにより同定された（15）。この抗体（HSV8と呼ばれる）は、ウイルス表面抗原グリコプロテインD（16）を結合することが以前に示され、この抗体のFabおよびIgG1の両方のバージョンがインビボおよびインビトロでの効率的な中和抗体として作用する（15、16）。
【０２１８】
単純scfv抗体が細菌または酵母の系において作製され得るので、葉緑体中でより複雑な抗体であるがなお単一のmRNAから翻訳され得るものを合成する試みがなされた。柔軟なリンカーペプチドを介して軽鎖遺伝子の可変領域に融合された完全な重鎖を含む単鎖抗体を設計した。この独特な、ラージ単鎖（lsc）タンパク質の一次アミノ酸配列は配列番号:48に示され、これは配列番号:47によってコードされる。
【０２１９】
キメラC.ラインハルティ葉緑体ラージ単鎖抗体遺伝子の構築
組換え抗体を発現するトランスジェニック葉緑体を生成するために、コドンが最適化されたHSV8-lscコード領域、続いてrbcL 3'UTRに融合された、atpAまたはrbcLプロモーターのいずれか、および5'UTRを含むキメラ遺伝子を生成した（それぞれ図5Aおよび5B）。葉緑体ゲノムへの遺伝子の組み込みは、相同組換えによって起こり、および形質転換ベクターと葉緑体ゲノムとの間の配列相同性を必要とする（17）。C.ラインハルティ葉緑体形質転換ベクターp322（14）を使用した。図5Bに図示されるように、キメラ抗体遺伝子をp322のBamHI部位にライゲーションしてプラスミドp322/atpA-HSV8およびプラスミドp322/rbcL-HSV8を作製した。このp322/HSV8構築物を、粒子射突を介して（17）、スペクチノマイシン耐性を付与する16Sリボソーム遺伝子を含むプラスミドp228とともに、C.ラインハルティ葉緑体に同時形質転換した。
【０２２０】
HSV8-lscトランスジェニック葉緑体のサザンブロット分析
一次形質転換体を、スペクチノマイシンを含む培地上で選択し、そしてHSV8遺伝子組み込みについてサザンブロット分析によってスクリーニングした。HSV8陽性形質転換体を、ホモプラズミック株（葉緑体ゲノムのすべてのコピーが、導入されたHSV8-lsc遺伝子を含む）を単離するためのさらなる選択の繰り返しを通して取り出した。2つのホモプラズミック形質転換体が選択され、1つはHSV8-lscを駆動するatpAプロモーターを含む10-6-3であり、他方はHSV8-lscを駆動するrbcLプロモーターを含む20-4-4であった。野生型および2つのHSV8-lsc形質転換体からのゲノムDNAを、EcoRIおよびXhoIで消化し、アガロースゲル上で分離し、そしてサザンブロット分析に供した。C.ラインハルティDNAを実施例3に記載されるように調製し、EcoRIおよびXhoIで消化し、そしてフィルターを、図5Cの両側矢印によって示される放射活性プローブとハイブリダイズした。
【０２２１】
HSV8コード領域の32P標識されたNdeI/XbaI断片とのハイブリダイゼーションは、atpA-HSV8およびrbcL-HSV8の両方のトランスジェニック株において6.0kbバンドを同定したのに対して、野生型系統においては、予測されたように検出可能なバンドが観察されなかった。これらの同じブロットを、p322の5'末端からの32P標識された1.5kbのEcoRIからPstIまでの断片とハイブリダイズさせ、5.7kb断片を野生型試料において可視化したのに対して、わずかに大きな6.0kb断片を2つのトランスジェニック株において同定した。p322の3'末端からの32P標識されたBamHI/XhoI断片とのハイブリダイゼーションは、10-6-3および20-4-4において、それぞれ、2.5kbおよび2.0kbの可視化を生じたのに対して、野生型株は再度、5.7kbのバンドを示した。これらの結果は、HSV8遺伝子が、葉緑体ゲノムのp322サイレント部位に正確に組み込まれたこと、および葉緑体ゲノムのすべてのコピーがHSV8遺伝子を含んだことを実証する。
【０２２２】
トランスジェニック株におけるHSV8-lsc mRNAの蓄積
トランスジェニックC.ラインハルティ株において葉緑体で発現されたHSV8-lscもまた試験した。形質転換していない株（野生型）、およびatpA HSV8-lsc形質転換株（10.6.3）、およびrbcL形質転換株（20.4.4）から単離した全RNAを変性アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上にブロットした。このメンブレンを、メチレンブルーで染色するか、または、psbA cDNAプローブもしくはhsv8特異的プローブとハイブリダイズさせた。全RNAのノーザンブロット分析を、HSV8遺伝子がトランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体中で転写されたか否かを決定するために使用した。野生型および2つのトランスジェニック系統からの10μgの全RNAを変性アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上にブロットした。2連のフィルターを、メチレンブルーで染色し、かつ32P標識したpsbA cDNAプローブもしくはhsv8特異的プローブのいずれかとハイブリダイズさせた。リボソームRNAおよびpsbA mRNAは野生型では同様のレベルで蓄積し、そして各々のトランスジェニック株は、等量のRNAがロードされたことを示し、および導入遺伝子の導入が内因性mRNAの蓄積を変化させないことを示した。HSV8特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、10-6-3株および20-4-4株が正確なサイズのHSV8-lscを蓄積したのに対して、野生型レーンにおいては、予測されたように、HSV8シグナルは検出されなかったことを示した。
【０２２３】
トランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体中でのHSV8-lscタンパク質蓄積の分析
HSV8-lsc抗体レベルを、抗flag抗体を使用するウェスタンブロット分析によって測定して、HSV8-lscタンパク質がトランスジェニック系統中に蓄積したか否かを決定した。pETベクターからのHSV8-lscを発現する大腸菌株からの20μgの全タンパク質、およびC.ラインハルティ野生型および2つのトランスジェニック系統からの20μgの全タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、クーマシー blueで染色するか、または抗Flag抗血清を用いるウェスタンブロット分析に供するかのいずれかを行った。細菌発現については、コドンを最適化したHSV8-lsc遺伝子のNdeI/BamHI断片をpETベクターにライゲーションし、発現をIPTGの付加によって誘導した。クーマシー染色したゲルは、等量のタンパク質を各レーンにロードされたこと、および全体のタンパク質の蓄積がトランスジェニック系統において正常であったことを示した。抗Flag抗体を使用する同じ試料のウェスタンブロット分析は、HSV8-lscトランスジェニック株および大腸菌の両方において正確な分子量の頑強なシグナルを示したが、C.ラインハルティ野生型レーンにおいては、予測されたようにシグナルを示さなかった。
【０２２４】
大腸菌および葉緑体において発現されるHSV8-lsc抗体の特徴付け
C.ラインハルティ葉緑体に蓄積されたHSV8-lscが機能的であったか否かを確認するために、葉緑体で発現されたタンパク質を、細菌で発現されたHSV8-lscのそれとともに特徴付けした。HSV8-lscトランスジェニック細菌および藻類をTBS中に再懸濁し、そして細胞を超音波処理によって溶解した。可溶性タンパク質を、遠心分離によって不溶性タンパク質から分離した。可溶性画分および不溶性ペレットからの等量のタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、およびHSV8-lscタンパク質をウェスタンブロット分析によって可視化した。細菌中で産生された約60％のHSV8-lscが不溶性画分に位置したのに対して、葉緑体中で産生されたHSV8-lscは可溶性画分中に独占的に見い出された。
【０２２５】
葉緑体発現された抗体が任意の翻訳後修飾を含んだか否かを決定するために、その抗体をSDS-PAGEによって試験し、および還元ゲルおよび非還元ゲル上でウェスタンブロット分析を行った。C.ラインハルティトランスジェニック系統10.6.3からの可溶性タンパク質は、SDS-PAGE上での分離の前にβ-メルカプトエタノールで処理したか（+Bme）、または還元剤で処理しないか（Bmeなし）のいずれかであった。タンパク質をニトロセルロースメンブレンにブロットし、抗flag抗体を結合させた。非還元条件下では、抗体の2つの重鎖部分間に形成した任意のジスルフィド結合が完全に残っているはずであり、これは、抗体がより大きな種として移動することを可能にする。非還元条件下では、葉緑体発現されたHSV8-lscは約140kDa（二量体の予想サイズ）のより大きなタンパク質として泳動した。ジスルフィド結合を還元するためのBmeを用いる処理は、モノマーの予想サイズ（68kDa）での葉緑体HSV8-lscタンパク質の移動を生じる。
【０２２６】
他の翻訳後修飾が葉緑体発現されたタンパク質に存在し得るか否かを確認するために、細菌および葉緑体で発現されたタンパク質を質量分析装置によって特徴付けした。大腸菌および葉緑体で発現されたタンパク質からのペプチド断片の質量スペクトルは、ほぼ同一のパターンを有し、このことは、さらなる修飾が葉緑体タンパク質にはなされていないことを示す。
【０２２７】
葉緑体発現されたHSV8-lscがHSV8タンパク質を結合する能力を試験して、トランスジェニック葉緑体に蓄積しているHSV8-lscが機能的であることを確証した。HSV8-lscを、抗flagアフィニティー樹脂を使用してトランスジェニック葉緑体から精製した。図6に示されるように、葉緑体産生された抗体は、ELISAアッセイにおいて、頑強な様式でHSV8タンパク質を認識した。
【０２２８】
トランスジェニック藻類におけるHSV8-lscの調節
2つのトランスジェニック株、10-6-3および20-4-4における抗体の蓄積に対する異なる増殖レジメの効果を試験して、C.ラインハルティ葉緑体中でのHSV8-lscの発現が調節され得るか否かを決定した。各株の培養を、106または107細胞/mlに維持し、および12/12明暗サイクル（5000ルクス）または連続光（5000ルクス）下のいずれかで増殖させた。細胞を遠心分離によって収集し、20μgの可溶性タンパク質をSDS-PAGE上で分離し、そしてHSV8-lscを抗Flag抗体を用いるウェスタンブロッティングによって可視化した。
【０２２９】
HSV8-lscの蓄積は増殖条件に依存して顕著に変化する。rbcLプロモーター/5'UTRの制御下での株20-4-4における発現は、細胞密度に関わらず、暗期の終わりまたは明期に入った直後に抗体の蓄積の著しい増加を示した。相対的に、明暗サイクル中で106細胞/mlでの完全な定常レベルのHSV8-lsc産生を指向した株10-6-3におけるatpAプロモーター/5'UTRは、細胞が107細胞/mlで培養された場合に、明期に入った際のlscの蓄積のなお莫大な増大を示した。連続的な明条件で増殖した場合、両方の株は107細胞/mlよりも106細胞/mlでより高い蓄積を示した。これらの結果は、C.ラインハルティの葉緑体中でのHSV8-lscの蓄積が、細胞を培養するために使用される光レジメ、細胞が収集されるサイクル中の時期、および発現を駆動するために使用されるプロモーター/UTRに依存して最適化され得ることを実証する。
【０２３０】
ヒトモノクローナル抗体を緑藻の葉緑体中で発現させた。高レベルの組換えタンパク質発現が、豊富な葉緑体タンパク質のコドン使用頻度を反映するように抗体をコードする配列中のコドン使用頻度を最適化することによって、および葉緑体atpAプロモーターまたはrbcLプロモーターおよび5'UTRを使用するキメラ遺伝子の発現を駆動することによって達成された。ラージ単鎖（lsc）抗体は、柔軟なリンカーによって軽鎖の可変領域に融合された完全IgA重鎖を含み、かつ葉緑体中に完全な可溶性タンパク質として蓄積した。この抗体は、単純ヘルペスウイルスのグリコプロテインDに対して指向し、そして藻類発現抗体は、ELISAを通して決定されるように、ヘルペスタンパク質に結合した。このlsc抗体は、重鎖のFc部分を含み、これは、抗体の二量体化をもたらす分子内ジスルフィド結合形成に通常関与する部位である。葉緑体発現抗体は、Bmeによる還元に感受性である高次の複合体に組立てられた。このことは、葉緑体発現抗体がインビボで二量体を形成することを示す。葉緑体中で発現された組換えタンパク質中でのジスルフィド結合の形成は、タバコ葉緑体において発現されたヒトソマトトロピンについて示されており（8）、これは、藻類葉緑体中のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの存在のためにある程度予測されていた（18）。このlsc抗体はまた、N連結グリコシル化のための推定の部位を含む。葉緑体にコードされるタンパク質はグリコシル化されることが知られておらず、確かに、質量スペクトル分析に基づく葉緑体発現抗体のグリコシル化の証拠は存在しない。
【０２３１】
生成したトランスジェニック株は、発現を駆動するために使用されるプロモーター、ならびに、細胞密度およびそれらが培養される光条件に依存して、抗体の差次的な蓄積を示した。抗体蓄積のこれらの大きな変動の理由は、おそらく、キメラmRNAの安定性および翻訳適格性、ならびに抗体タンパク質の代謝回転から生じるからである。これらの結果は、抗体の蓄積が増殖条件によって正方向に影響され得ること、および高レベルの抗体の蓄積（可溶性タンパク質の1％を超える）が、特異的プロモーターおよびUTRの組み合わせに適合する最適な増殖条件を単に利用することによって、藻類中で達成され得ることを示す。
【０２３２】
組換えタンパク質は種々のタンパク質発現系において産生され得る。モノクローナル抗体（mAb）のような複雑な治療タンパク質は、主としてトランスジェニック哺乳動物細胞の培養によって産生される。培養された哺乳動物細胞におけるmAb産生のコストは、平均で原材料のために約150ドル/グラムであるのに対して、植物の系においては、mAb産生は0.05ドル/グラムと見積もられている（1）。藻類の系におけるmAbの産生のためのコストは、藻類のための培地コストが全く妥当であれば（0.002ドル/リットル）、陸上植物におけるそれに匹敵すると予想される。さらに、藻類は、連続培養で増殖可能であり、かつそれらの増殖培地がリサイクル可能である。
【０２３３】
藻類でmAbを製造することの莫大なコストの利点は別として、藻類を組換えタンパク質産生の理想的な候補にしている多数の特異的な属性が存在する。第1に、トランスジェニック藻類は迅速に生成され得、最初の形質転換タンパク質の生成と製造容量へのスケールアップとの間に、数週間のみを必要とする。第2に、藻類の葉緑体および核ゲノムの両方が遺伝的に形質転換され得、単一の生物体（複数のタンパク質複合体（例えば、分泌抗体）が産生される場合の要件）において種々のトランスジェニックタンパク質を産生する可能性を開く。さらに、藻類は、コスト効果の高い様式で、数ミリリットルから500,000リットルまでの範囲にわたるスケールで増殖する能力を有する。これらの属性、および、緑藻がGRAS（一般的に安全と見なされる（generally regarded as safe））カテゴリーに入るという事実は、C.ラインハルティを、組換えタンパク質の発現のための他の系に対する特に魅力的な代替物にする。最後に、本実施例は藻類における抗体の産生に特に取り組むが、この系は、実質的にあらゆる組換えタンパク質の産生に受け入れ可能であるはずである。
【０２３４】
参考文献
以下の論文の各々は参照として本明細書に組み入れられる。
2005537784.tif 000011
【０２３５】
実施例4
葉緑体コドンに偏った細菌luxAB GENからのルシフェラーゼ融合タンパク質の発現
本実施例は、葉緑体コドンに偏った合成ポリヌクレオチドによってコードされるルシフェラーゼ融合タンパク質の葉緑体中での頑強な発現を確証する。
【０２３６】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、生細胞中での遺伝子発現を試験するために種々の生物体において首尾よく使用されてきたが、なお、葉緑体中での使用のために首尾よく開発されなくてはならない。実施例1において開示されるように、緑色蛍光タンパク質（gfp）は葉緑体コドンに偏ったポリヌクレオチドから発現され、葉緑体遺伝子発現のレポーターとして有用であった。gfpは高度な自己蛍光を示し得、かつ、比較的高いレベルの発現およびgfpタンパク質蓄積が葉緑体中での可視化のために必要であるので、葉緑体コドンに偏ったポリヌクレオチドによってコードされたルシフェラーゼレポータータンパク質が、2つのサブユニットの細菌ルシフェラーゼ、luxABを、C.ラインハルティ葉緑体コドンの偏りで単一の融合タンパク質として合成することにより開発された。本明細書中で開示されるように、葉緑体ルシフェラーゼ遺伝子、luxCtが、atpAプロモーターおよび5'UTRおよびrbcL 3'UTRの制御下で、C.ラインハルティ葉緑体中で発現された。luxCtは葉緑体遺伝子発現の感受性の高いレポーターであり、ルシフェラーゼ活性が、CCDカメラを使用してインビボでまたはルミノメーターを使用してインビトロで測定されることを可能にする。さらに、luxCtタンパク質の蓄積は、ウェスタンブロット分析によって測定されるように、インビボおよびインビトロの両方で決定される発光に比例する。これらの結果は、生細胞中での葉緑体遺伝子発現の多才なかつ感度の高いレポーターとしてのluxCt遺伝子の有用性を実証する。
【０２３７】
レポーター遺伝子は、多数の生物学的な生物体中での遺伝子発現をモニターするための能力を非常に増強する。高等植物の葉緑体において、β-グルクロニダーゼ（uidA、StaubおよびMaliga、1993）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（nptII、Carrerら、1993）、アデノシル-3-アデニルトランスフェラーゼ（aadA、SvabおよびMaliga、1993）、およびエクオレア・エクオレア（Aequorea aequorea）のgfp（Sidorovら、1999；Reedら、2001）がレポーター遺伝子として使用されてきた（Heifetz、2000）。いくつかのレポーター遺伝子がまた、真核生物である緑藻、C.ラインハルティの葉緑体において発現されており、これらには、aadA（Goldschmidt-Clermont, 1991; ZergesおよびRochaix, 1994）、uidA（Sakamotoら、1993、Ishikuraら、1999）、aphA6（BatemanおよびPurton、2000）、およびRenillaルシフェラーゼ（Minkoら、1999）が含まれる。不運にも、これらの最初のレポーター遺伝子カセットは非常に低いレベルのタンパク質蓄積を産生し、これらを遺伝子発現の定量分析のための不十分なレポーターとした。
【０２３８】
実施例1に開示されるように、高レベルのレポーター遺伝子発現はgfpレポーター遺伝子のコドン使用頻度を最適化することによって得られた（Franklinら、2002もまた参照されたい）。最適化されていないgfpで形質転換したC.ラインハルティの株におけるGFPの蓄積と、最適化したcgfpで形質転換した株におけるGFPの蓄積の比較は、C.ラインハルティ葉緑体におけるcgfpからのGFPの蓄積の80倍の増加を示した。これらの結果は、C.ラインハルティ葉緑体における高レベルのレポーター遺伝子発現を達成することが以前にできなかったことが、C.ラインハルティ葉緑体遺伝子において使用されるコドンの偏りに起因したことを実証した。
【０２３９】
gfpを用いて得られる結果を拡張するため、およびインビボでcGFP可視化し得るレポ−ターを得るために、C.ラインハルティ葉緑体コドンの偏りを有する細菌ルシフェラーゼ遺伝子を合成した。新規合成されたlux遺伝子は、ビブリオ・ハルベイの細菌luxAB遺伝子に基づいた（Baldwinら、1984、Johnsonら、1986）。ルシフェラーゼコード配列は、ルシフェラーゼAおよびBサブユニットが柔軟なペプチドリンカーを用いてAサブユニットおよびBサブユニットを連結することによって単一のコード領域として発現された（Kirchenerら、1989、Olssonら、1989、Almashanuら、1990）。葉緑体最適化ルシフェラーゼ（luxCt）遺伝子をatpAプロモーターおよび5'UTRおよびrbcL 3'UTRを含むカセット中に配置した。luxCt遺伝子を含むトランスジェニック系統は、それぞれ、ノーザンブロット分析およびウェスタンブロット分析によって判断されるように、luxCt mRNAおよびLUXCtタンパク質を蓄積した（以下を参照されたい）。luxCtを発現するトランスジェニック系統からの発光は、細胞がデカナール（細菌のルシフェラーゼの基質）で処理された場合にCCDカメラで容易に可視化されたのに対して、野生型細胞は、同じアッセイにおいて発光を示さなかった。ウェスタンブロット分析によって判断されるようなluxCtの発現は、CCDカメラを使用する発光アッセイによって、またはインビトロルミノメーターアッセイによって判断されるように、luxCtの発現に比例していた。トランスジェニック系統におけるルシフェラーゼ活性は、数オーダーの強度にわたって測定され得、このことは、生細胞における葉緑体遺伝子発現のレポーターとしてのluxCtの感度および有用性を実証する。
【０２４０】
方法
C.ラインハルティ株、形質転換、および増殖条件
形質転換を、C.ラインハルティ株137c（mt+）またはpsbA欠損株cc744（REF）で実行した。細胞を、TAP培地（GormanおよびLevine、1965）中の40mM 5-フルオロデオキシウリジンの存在下で、23℃にて定常的な4,000ルクス（高照度）の照射下で、100rpmに設定した回転振盪機上で、後期対数期まで（約7日間）増殖させた。50mlの細胞を、4,000×g、4℃、5分間の遠心分離によって収集した。上清をデカントし、細胞を、記載されたような（Cohenら、1998）引き続く粒子射突による葉緑体形質転換のために、4mlのTAP培地に再懸濁した。すべての形質転換をスペクチノマイシン（150μg/ml）選択下で実行し、ここでは、耐性はプラスミドp228（Chlamydomonas Stock Center, Duke University）のスペクチノマイシン耐性リボソーム遺伝子の同時形質転換によって付与された。luxCtの発現のためのC.ラインハルティ形質転換体の培養を、定常的な照射下、23℃でTAP培地（GormanおよびLevine、1965）中で実行した。
【０２４１】
プラスミド構築
DNAおよびRNAの操作を、本質的にSambrookら（1989）およびCohenら（1998）において記載されるように実行した。luxCt遺伝子のコード領域を、各々40ヌクレオチド長のプライマーのプールからStemmerら（1995）の方法に従って新規合成した。この組立てにおいて使用された5'および3'末端プライマーは、それぞれ、NdeIおよびXbaIについての制限部位を含んだ。次いで、luxCt遺伝子を含む、得られた2094bpのPCR産物をpCR2.1 TOPOプラスミド（Invitrogen Corp.）に製造業者のプロトコールに従ってクローニングし、プラスミドpluxCtを生成した。atpAプロモーターおよび5'UTRおよびrbcL 3'UTRを、記載されたように生成した（Mayfieldら、2002）。葉緑体形質転換プラスミドp322を記載されたように構築した（Franklinら、2002）。
【０２４２】
サザンブロット分析およびノーザンブロット分析
サザンブロットおよびプローブとしての使用のためのDNAの32P標識を、記載されたように（Sambrookら、1989；Cohenら、1998）実行した。サザンブロットに使用する放射活性プローブは、2kbのNdeI/XbaI luxCtコード領域（プローブluxCt）およびp322の2.0kb BamHI/XhoI断片（プローブ3'p322）を含んだ。0.9kbのEcoRI/XbaI luxCtプローブを、ノーザンブロット上のluxCt mRNAを検出するために使用した。ノーザンブロット分析において使用されたさらなる放射活性プローブには、rbcL cDNAが含まれた。ノーザンブロットおよびサザンブロットを、Optiquantソフトウェアを備えたPackard Cyclone Storage Phosphor Systemを使用して可視化した。
【０２４３】
タンパク質発現、ウェスタンブロット分析、および発光アッセイ
プラスミドpluxABおよびpluxCtを大腸菌株BL21に形質転換し、液体培地中で細胞を一晩増殖させた。ウェスタンブロット分析のために、タンパク質を、750mM Tris-Cl、pH 8.0、15％ショ糖（重量/体積）、100mM Bme、1mM PMSFを含むバッファーを使用して大腸菌またはC.ラインハルティから単離した。試料を30分間、13,000×g、4℃にて遠心分離し、得られる上清をウェスタンブロット分析に使用した。インビトロ発光アッセイにおける使用のためのC.ラインハルティタンパク質を、50mM Na2HPO4、pH 7.0、50mM Bme、400mM ショ糖バッファー中で調製し、この粗溶解物を30分間、13,000×g、4℃にて遠心分離し、得られる上清をルシフェラーゼアッセイにおいて使用した。96ウェルマイクロタイターアッセイは細菌ルシフェラーゼ法から適合された（LangridgeおよびSzalay、1994）。C.ラインハルティ可溶性タンパク質を試料あたり100μlまで、ルシフェラーゼ抽出バッファー中で希釈し、それに、125μlの500μM NADH、50mM Tris-Cl、pH 8.0、および50mM Na2HPO4、50mM Bme、1％ウシ血清アルブミンバッファー中0.025Uのジアフォラーゼを加えた。この得られた混合物に、125μlの200mMトリシン中100μM FMN、pH 7.0、および50mM NaHPO4、pH 7.4中で10秒間超音波処理した0.1％デカナール5μlを含む130μl溶液を加えた。相対光単位（rlu）での光子測定は、FMN/デカナール付加5秒後に、Criterion Hostソフトウェアを備えたLJL Biosystems Analyst ADルミノメーター（蛍光リーダー）を用いて開始した。タンパク質濃度をBioRadタンパク質アッセイ試薬を使用して決定した。
【０２４４】
ウェスタンブロットを、Cohenら（1998）において記載されるように、ウサギ抗luxAB一次抗体（REF）およびアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体（Sigma）を使用して実行した。クロロフィル蛍光をブロックするための700nm励起フィルターを備えたBerthold Night Owl CCDカメラ、モデルLB981（Chroma Corp.）を用いてコロニー発光を画像化した。30秒間〜5分間の露光時間は、大部分の場合にルシフェラーゼ発光を可視化するために十分であった。画像をWinLightソフトウェアを使用して生成した。
【０２４５】
結果
C.ラインハルティ葉緑体コドンの偏りでのluxAB遺伝子の新規合成
葉緑体中での遺伝子発現の高感度レポーターを開発するために、ルシフェラーゼ遺伝子を、C.ラインハルティ葉緑体の豊富に発現される遺伝子を反映するように最適化されたコドンを使用して合成した（実施例1；Franklinら、2002）。ルシフェラーゼ遺伝子、luxCt（図7）を、ビブリオ・ハルベイの細菌ルシフェラーゼAB遺伝子（luxAB；Baldwinら、1984）に基づいて設計した。葉緑体発現のために、luxABの2つのサブユニットを、Aサブユニットの終止コドンを除去すること、およびBサブユニットを柔軟なペプチド配列を用いて正確な読み枠で連結して単一の融合タンパク質を作製することによって、単一のコード配列に連結した。V.ハルベイluxAB配列をGenBankデータベースから入手し、そして一連のオリゴヌクレオチドをアミノ酸配列に基づいて設計したが、高度に発現されたC.ラインハルティ葉緑体遺伝子のそれを反映するようにコドン使用頻度を変化させた。この遺伝子を、Stemmerら（1995）の方法によって組立てた。PCR産物を大腸菌プラスミドにクローニングし、合成遺伝子をシークエンスし、そして部位特異的変異誘発によってエラーを修正した。引き続くクローニングを容易にするために、NdeI部位を開始コドンに配置し、そしてXbaI部位を終止コドンのすぐ下流に配置した。得られた遺伝子luxCtを大腸菌発現カセットにクローニングし、そしてルシフェラーゼ発現をCCDカメラを用いる発光画像化によってアッセイした。驚くべきことに、高度の発光を細菌luxAB遺伝子で形質転換した細菌中で検出することができたが、luxCt遺伝子を含む細菌において発光は検出されなかった（Kondoら、1993）。
【０２４６】
変異が大腸菌ベクターへのクローニングの間にluxCt遺伝子に不注意に導入されていないことを保証するために、大腸菌発現プラスミド中に含まれるluxCt遺伝子および細菌luxAB遺伝子の両方をシークエンシングした。所望の配列と比較してluxCt遺伝子中にはエラーは検出されなかったが、細菌においてluxABを発現するために使用されるプラスミドからのluxAB配列、およびGenBankデータベース（アクセッション番号E12410）に報告されるluxAB配列には多数の違いが同定された（Kondoら、1993）。いくつかの異なる細菌種からのluxABタンパク質（Johnsonら、1990）の、合成luxCtタンパク質とのアラインメントは、アミノ酸配列の多数の違いを同定したが、これらの違いのうち1つのみが保存性アミノ酸中に存在した。それゆえに、部位特異的変異誘発を使用して、204位の保存性グルタミンおよび隣接する205位のロイシンを回復させた。他のアミノ酸は変化しておらず、調査したluxABタンパク質のセット間には保存性のものはなかった。
【０２４７】
luxCt融合タンパク質遺伝子は細菌中で機能的ルシフェラーゼを産生する
合成luxCt遺伝子が機能的ルシフェラーゼを産生し得るか否かを決定するために、発光を、luxAB遺伝子またはluxCt遺伝子のいずれかを含む発現プラスミドで形質転換した大腸菌細胞中で測定した。ウェスタンブロット分析を、luxAB遺伝子またはluxCt遺伝子のいずれかを発現する細胞からの大腸菌粗溶解物を使用して実行した；20μlをSDS-PAGEに供し、そしてニトロセルロースにブロットした。ブロットに抗luxAB一次抗体を結合させ、続いてアルカリホスファターゼ結合体化抗ウサギ二次抗体を結合させ、そしてタンパク質をアルカリホスファターゼ活性染色によって可視化した。luxCtの単一の融合タンパク質（FP）のように、luxABのα（A）およびβ（B）サブユニットを同定した。さらに、ルシフェラーゼ発現を、寒天培地で一晩増殖させ、デカノール蒸気で処理した大腸菌で決定した。形質転換していない大腸菌細胞またはluxAB遺伝子もしくはluxCt遺伝子のいずれかを発現する細胞を、反射光を用いて撮影し（写真）、またはCCDカメラを用いる発光画像化によって可視化した（発光）。大腸菌細胞をデカナールで処理し、CCDカメラで画像化した場合に、両方のルシフェラーゼ株は発光したのに対して、形質転換していない大腸菌は、予測された通り、光シグナルを示さなかった。天然のluxABタンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット分析は、luxAB株における細菌ルシフェラーゼタンパク質のAサブユニットおよびBサブユニットの両方についてのシグナル、ならびにluxCt株における融合タンパク質に対応する単一バンドを示した。luxABのAタンパク質およびBタンパク質は、細菌中にluxCtの単一の融合タンパク質よりもより高いレベルで蓄積し、一方でこれらのタンパク質の発光シグナル（2:1、luxAB：luxCt）は、ルシフェラーゼタンパク質蓄積にほぼ比例していた。
【０２４８】
luxCt発現カセットの構築およびluxCt形質転換体のサザンブロット分析
luxCtコード配列が機能的ルシフェラーゼを産生したことを実証する際に、C.ラインハルティ葉緑体をluxCtカセットで形質転換した。葉緑体中でのルシフェラーゼ発現のために図8に示される発現カセットを構築した。luxCtコード配列をatpAプロモーターおよび5'UTRの下流、かつrbcL 3'UTRの上流に連結した（図8A）。次いで、キメラatpA/luxCt遺伝子を、唯一のBamHI部位で葉緑体形質転換プラスミドp322に連結し、プラスミドp322-atpA/luxCtを作製した（図8B）。
【０２４９】
野生型C.ラインハルティ細胞を、p322-atpA/luxCtプラスミドおよびスペクチノマイシンに対する耐性を付与する選択マーカープラスミドp228で形質転換した。一次形質転換体を、CCDカメラ上での発光アッセイによるluxCt遺伝子の存在についてスクリーニングし、陽性形質転換体をサザンブロット分析によって確認した。形質転換体をさらなる選択の繰り返しを通して取り出して、ホモプラズミック系統（葉緑体ゲノムのすべてのコピーが、導入されたluxCt遺伝子を含む）を単離した。
【０２５０】
2つのホモプラズミックluxCt形質転換体、10.6および11.5を、さらなる分析のために選択した。図8は、示される関連する制限部位を有するluxCt構築物を示す。葉緑体ゲノムへのプラスミドp322-atpA/luxCtのEco/Xho領域（8.7kb）の正確な組み込みを、図8に示されるように、luxCtのNdeI-XbaI断片、またはプラスミドp322のBamHI-XhoI断片のいずれかを使用して確認した。luxCt C.ラインハルティ葉緑体形質転換体のサザンブロット分析を実行した。C.ラインハルティDNAを実施例4に記載されるように調製し、EcoRIおよびXhoIで同時消化し、そしてサザンブロット分析に供した。フィルターを、図8Bに示される放射活性プローブを用いてハイブリダイズした。2つの形質転換体がluxCtハイブリダイズバンドを含んだのに対して、野生型株はこのluxCtコード領域プローブを使用してシグナルを示さなかった。2つのバンドは、トランスジェニック系統において同定された。なぜなら、luxCt遺伝子は遺伝子の中間に単一のEcoRI部位を含むからである。p322プラスミドからのBamHI-XhoI断片を用いるハイブリダイゼーションは、予測されたように、野生型において単一バンド、および2つの形質転換体において異なるサイズのバンドを同定した。これらのバンドの各々が、野生型および形質転換系統の両方について正確に予測されたサイズのものであった。これらの結果は、2つのトランスジェニック系統がホモプラズミックであることを実証する。
【０２５１】
トランスジェニック株におけるluxCt mRNAの蓄積
全RNAのノーザンブロット分析を使用して、luxCt遺伝子がトランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体中で転写されたことを確認した。野生型および2つのトランスジェニック系統から単離された10μgの全RNAを、変性アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレンにブロットした。2連のフィルターをメチレンブルーで染色するか、または32P標識luxCtプローブ、もしくはrbcL cDNAプローブを用いてハイブリダイズさせた。各々の株がrRNA（染色バンド）およびrbcL mRNAを同様のレベルまで蓄積した。このことは、等量のRNAが各レーンにロードされたこと、および葉緑体転写およびmRNA蓄積がトランスジェニック系統において正常であることを実証する。luxCt特異的プローブとのフィルターのハイブリダイゼーションは、両方のトランスジェニック系統が予測されたサイズのluxCt mRNAを蓄積するのに対して、野生型細胞においては、予測されたとおり、luxCtシグナルが観察されなかったことを示した。
【０２５２】
トランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体におけるluxCtタンパク質蓄積の分析
ウェスタンブロット分析を使用して、luxCtタンパク質がトランスジェニック系統において蓄積したことを確証した。野生型および2つのトランスジェニック系統からの20μgの全可溶性タンパク質（tsp）をSDS-PAGEによって分離し、そしてクーマシーで染色するか、またはウェスタンブロット分析に供するかのいずれかを行った。クーマシー染色されたゲルは、等量のタンパク質が各レーンにロードされたこと、およびトランスジェニック系統が野生型と比較して同様のセットのタンパク質を蓄積したことを示した。同じ試料のウェスタンブロット分析は、両方のluxCtトランスジェニック系統レーンにおいて融合タンパク質に対応する単一バンドを同定した。野生型C.ラインハルティレーンにおいては、予測されたようにシグナルが観察されなかった。
【０２５３】
生細胞における葉緑体遺伝子発現のレポーターとしてのluxCtの使用
C.ラインハルティ生細胞における葉緑体遺伝子発現のレポーターとしてのluxCt遺伝子の有用性を確認するために、発光を、寒天プレート上で増殖した野生型細胞およびトランスジェニック細胞について測定した。細胞を固形培地上にプレートし、7日間、連続光下で（1000ルクス）維持した。luxABの基質であるデカナールを、ペトリ皿のふたに塗布し、プレートをCCDカメラの下に配置した。トランスジェニック系統は、周辺光の下で可視化した場合に野生型細胞と同様に見られた。クロロフィル蛍光を除去するための5分間の暗適応後のCCDカメラを用いる画像化は、2つのトランスジェニック系統についての明るい発光シグナル、および野生型株についてシグナルがないことを示した。luxCtトランスジェニック系統からのシグナルは、インビボで小さな個々のコロニーでさえも可視化するに十分であった。
【０２５４】
luxCtカセットを野生型（137c）細胞に形質転換することに加えて、このカセットを、C.ラインハルティのpsbA欠損株に形質転換した（cc744、Chlamydomonas Genetics Center, http://www.botany.duke.edu/chlamy/）。再度、一次形質転換体をCCDカメラを用いる発光アッセイによってスクリーニングし、陽性トランスジェニック系統を、数度の選択の繰り返しを通して取り出し、ホモプラズミック系統を得た。cc744/luxCt株からの発光は137c/luxCt株からよりもはるかにより高かった。この増加した発光がルシフェラーゼ蓄積の増加と直接関連するか否かを同定するために、luxCtタンパク質蓄積およびルシフェラーゼ活性を、137cおよびcc744のトランスジェニック系統において測定した。野生型およびluxCtのトランスジェニック系統luxCt137cおよびluxCtcc744を寒天プレート上で増殖させ、デカナールで処理した。細胞を、反射光の下で撮影し（写真）、またはCCDカメラで可視化した（発光）。タンパク質を細胞から抽出し、そしてウェスタンブロット分析に供すか（ウェスタン抗luxAB）またはルミノメーターアッセイによって定量した（ルミノメーター）。ウェスタンブロット分析は、細胞が固形TAP培地上で光条件下で増殖した場合、137c系統と比較して約10倍多くのluxABタンパク質がcc744系統において蓄積したことを示した。CCDカメラ発光アッセイは、137c系統と比較してcc744系統において同様のシグナルの増加を示した。ルミノメーターを使用するルシフェラーゼ活性の定量は、cc744-luxCt系統が137c-luxCt系統よりも約11倍高いルシフェラーゼ活性を有することを示した。これらの結果は、luxCt遺伝子が葉緑体遺伝子発現の頑強なレポーターであること、およびインビボでのlux活性の測定は、ウェスタンブロット分析およびインビトロ発光アッセイの両方によって測定されたルシフェラーゼ蓄積に一致したことを実証する。
【０２５５】
いくつかの異種遺伝子は葉緑体遺伝子発現のレポーターとして利用されてきたが、それらの有用性は、乏しい感度またはインビボで可視化される能力がないことによって限定されてきた。ルシフェラーゼはレポーター遺伝子として多数の生物において使用されてきた（GreerおよびSzalay、2002；Langeridgeら、1994；Kondoら、1993；Kay、1993）。これは、その高レベルの感度に起因し、かつ、ルシフェラーゼが、その生物をほとんど混乱させることなく生細胞において容易に可視化され得るからである。本実施例は、単一の融合タンパク質として、2つのサブユニットの細菌ルシフェラーゼ、luxABを合成することによって、および、C.ラインハルティ葉緑体からの高度に発現される遺伝子を反映するようにこの合成ルシフェラーゼ遺伝子のコドン使用頻度を最適化することによって、葉緑体発現のためのルシフェラーゼレポーター遺伝子の構築を実証する。
【０２５６】
本実施例は実施例1の結果を拡張し、これは、コドン使用頻度が、葉緑体最適化コドンでgfpを合成することによって、C.ラインハルティ葉緑体中での異種タンパク質の発現に劇的に効果を有することを実証した（Franklinら、2002もまた参照されたい）。cgfpは、トランスジェニック葉緑体中で全可溶性タンパク質の0.5％まで蓄積し、葉緑体抽出物の蛍光分析によって可視化され得る。しかし、比較的高レベルのGFP蓄積でさえ、インビボでレポーターを可視化するのには不十分であった。ミトコンドリアに最適化されたgfp遺伝子を使用して、Komineらは、蛍光顕微鏡法を使用してトランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体中でのgfpの可視化を報告した（Komineら、2002）。しかし、非常に低いレベルのGFPタンパク質の蓄積がトランスジェニック系統について報告され、そしてmGFP株における蛍光のアウトプットは、形質転換していない株におけるバックグラウンド蛍光より上には現れなかった。
【０２５７】
タンパク質蓄積の改善における葉緑体に最適化されたgfpの成功に基づいて、比較的高レベルのGFPでさえインビボで葉緑体中で可視化することができないという事実と相まって、ルシフェラーゼ遺伝子は、高感度の活性なレポーターを得るために葉緑体最適化コドンにおいて合成された。このコドン最適化luxCt遺伝子の発現は、C.ラインハルティ葉緑体atpA 5'プロモーターおよびUTRならびにrbcL 3'UTRの制御下に配置された場合、luxCt mRNAおよびluxCtタンパク質がトランスジェニックC.ラインハルティ葉緑体に蓄積したことを示した。さらに、luxCtを発現するトランスジェニック株は、CCDカメラを使用するインビボでのルシフェラーゼアッセイによって容易に可視化されるのに十分なレベルのルシフェラーゼを蓄積した。luxCtタンパク質の蓄積は、ウェスタンブロット分析によって測定されたように、CCDカメラ発光アッセイまたはインビトロ発光アッセイによって測定されるように、ルシフェラーゼ活性に比例していた。
【０２５８】
C.ラインハルティは「緑色酵母」（多数の細胞プロセス、最も顕著には、鞭毛および光合成装置の生合成における細胞プロセスを分析するための使用を可能にしてきたこの生物の優秀な遺伝的特徴を与える十分にふさわしい用語である）といわれてきた。しかし、明確に欠けているものは、遺伝子発現（とりわけ、葉緑体での遺伝子発現）をアッセイするための容易な手段である。本発明の結果は、インビボでの葉緑体遺伝子発現のレポーターとしての最適化されたluxCt遺伝子の有用性を実証する。本発明の結果はまた、luxCtが、小さな細胞のコロニーにおいてさえ、遺伝子発現をモニターすることができる高感度なレポーターであり、このことが、luxCtを葉緑体遺伝子発現の任意の高スループット分析のための最適なレポーターにすることを実証する。
【０２５９】
参考文献
以下の論文の各々は参照として本明細書に組み入れられる。
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【０２６０】
本発明は上記の実施例を参照して記載されてきたが、改変および変形が本発明の趣旨および範囲に含まれることが理解される。従って、本発明は上記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】GFPct（配列番号:1）およびGFPncb（配列番号:3）コード領域の比較を示す。GFPct（配列番号:2）のアミノ酸配列はヌクレオチド配列の下に示される。変化したコドンをボックスで表し、コドン使用頻度の有意な改善を示すものに影を付している。最適化されたコドンは、C.ラインハルティ葉緑体ゲノム（Nakamuraら、Nucl. Acids. Res. 27:292, 1999）において1000コドンあたり10回より多く使用されるコドンとして定義された。アスタリスク（＊）はGFPctとGFPncbとの間での、2位および65位での2つのアミノ酸の変化を示す。
【図２】pET発現されたGFPctおよびGFPncbの特徴付けを示す。大腸菌中でのpET19bプラスミドから発現されたGFPctタンパク質およびGFPncbタンパク質は、Niアガロースアフィニティークロマトグラフィーを介して精製された（実施例1）。GFPctタンパク質またはGFPncbタンパク質（20μl）のいずれかを含む粗大腸菌溶解物は、煮沸することなく12％SDS-PAGEに試料を供し、かつゲル装置を分解するが、ゲルをガラスプレートに入れたままにすることによって調製された。蛍光ゲルは、示された励起（ex）フィルターおよび放射（em）フィルターを使用して可視化された。アフィニティー精製された5μgのGFPctタンパク質またはGFPncbタンパク質が12％SDS-PAGE上で分離され、Coomasieで染色された。アフィニティー精製された100ngのGFPctタンパク質またはGFPncbタンパク質が12％SDS-PAGEに供され、続いてウェスタンブロッティングおよび抗GFP一次抗体での検出が行われた。励起スペクトルがアフィニティー精製されたGFPctタンパク質（4μg）またはGFPncbタンパク質（20μg）について生成された。相対蛍光が350nmから550nmの励起で、510nmに固定された放射で記録された。GFPncb（点線）およびGFPct（実線）の励起スペクトルを示す；破線は両方の試料において見られる510nmの放射ピークを表す。
【図３】C.ラインハルティ葉緑体における発現のために使用されるGFPctおよびGFPncbのレポーター遺伝子のマップを示す。  図3Aは、rbcL 5'UTR（BamHI/NdeI；配列番号:5もまた参照されたい）を、GFPct（配列番号:1）またはGFPncb（配列番号:3）のいずれかのコード領域（NdeI/XbaI）およびrbcL 3'UTR（XbaI/BamHI；配列番号:10もまた参照されたい）から区切る関連する制限部位を示す。各断片のサイズは塩基対（bp）で示される。  図3Bは、rbcL 5'UTRおよびrbcL 3'UTRの制御下でのGFPctおよびGFPncbの遺伝子のC.ラインハルティ葉緑体ゲノムへの組み込みの部位を示す。C.ラインハルティ葉緑体DNAはEcoRIからXhoIまでの5.7kbの断片として示される。両側矢印はサザンブロット分析において使用されるプローブに対応する領域を示す。
【図４】野生型5'UTR（配列番号:34）の開始コドンに対して+3位から-36位に対応する変異型psbA 5'UTR（配列番号:35〜41）の直鎖状配列を示す。5'UTRはDl cDNAの上流に位置し、これは、野生型psbA遺伝子のイントロンがないコピーである。一次構造の変化には下線を付し、開始コドンにはボックスを付す。＊は5'UTRを切断するプロセシング事象からインビボで生じるmRNAの5'末端を示す（BruickおよびMayfield、Trends Plant Sci. 4: 190-195, 1998を参照されたい（これは参照として本明細書に組み入れられる））。
【図５】図5A〜5Cは、C.ラインハルティ葉緑体中での発現のためのHSV8-lsc遺伝子の制限地図を示す。HSV8-lscヌクレオチド配列（配列番号:47）およびアミノ酸配列（配列番号:48）は配列表に示される。  図5Aおよび5Bは、rbcL 5'UTR（BamHI/NdeI）、HSV8コード領域およびflagタグ（NdeI/XbaI）、ならびにrbcL 3'UTR（XbaI/BamHI；図5A）、ならびに、atpA 5'UTR（BamHI/NdeI）の関連する制限部位、HSV8コード領域およびflagタグ（NdeI/XbaI）、ならびにrbcL 3'UTR（XbaI/BamHI；図5B）を描写する関連する制限部位を示す。  図5Cは、C.ラインハルティ葉緑体ゲノム中への組み込みのためのプラスミドp322へのHSV8-lsc遺伝子の組み込みの部位を示す制限マップを示す。p322 DNAは44,877位から50,577位までに対応する、C.ラインハルティ葉緑体ゲノム中のEcoRIからXhoIまでの5.7kb領域を含む（「biology.duke.edu/chlamy_genome/chloro.html」のURLのワールドワイドウェブを参照されたい）。両側矢印はサザンブロット分析において使用されたプローブに対応する領域を示す。黒いボックスは、それぞれ、（左から右に）psbAエキソン5、ならびに、5SリボソームRNAおよび23SリボソームRNA遺伝子の小部分を示す。
【図６】ELISAによって得られる、HSV8ウイルスタンパク質に結合するHSV8-lscの特徴付けを示す。トランスジェニックC.ラインハルティ株からアフィニティー精製されたHSV8-lsc（10-6-3および16-3）は、ウイルス感染した細胞から調製されたHSVタンパク質に対するELISAアッセイにおいてスクリーニングされた。100、80、70、60、30、20、10、または5μlのFlag精製されたHSV8-lscは、一定量のウイルスタンパク質でコートされたマイクロタイタープレート中でインキュベートされた。これらのアフィニティー精製された抽出物中のタンパク質濃度は13ng/μlであった。このうちの約10％が、クーマシー染色によって判断されるようにHSV8-lscであった。等量の野生型C.ラインハルティタンパク質が陰性対照として使用された（濃度1μg/μl）。
【図７】luxAB（配列番号:44）およびluxCt（配列番号:46のアミノ酸残基2位〜695位）のコード配列の比較を示す。このアミノ酸配列は、ボックスを付し影を付したアミノ酸によって示される改変コドンと共に示される。最適化されたコドンは、C.ラインハルティ葉緑体ゲノム中の1000コドンあたり10回より多く使用されるコドンとして定義された（Nakamuraら、1999）。2つのタンパク質間のアミノ酸の違いはボックスを付し影を付していないアミノ酸によって示され、そして活性ルシフェラーゼを生じる2つのアミノ酸変化は、変化したアミノ酸の上の＊＊によって示される。
【図８】図8Aおよび8Bは、C.ラインハルティ葉緑体における発現のためのluxCt遺伝子のマップを示す。  図8Aは、atpA 5'UTR（BamHI/NdeI）、luxCtコード領域（NdeI/XbaI）、およびrbcL 3'UTR（XbaI/BamHI）を描写する関連する制限部位を図示する。  図8Bは、プラスミドp322とキメラluxCt遺伝子が挿入されたC.ラインハルティ葉緑体ゲノムとの間の相同領域を示すマップを示す。描かれたC.ラインハルティ葉緑体DNAは、葉緑体領域の逆方向反復領域に配置されたEcoRIからXhoIの5.7kb断片である。両端矢印はサザンブロットおよびノーザンプロット分析において使用されるプローブに対応する領域を示す。黒いボックスはlからr、psbAエキソン5、5s rRNA、および23s RNAの遺伝子をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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