(57)【要約】本発明は、タンパク質の所望のコンホメーションの収率を増加させる方法を提供する。特定の態様において、本発明は、組換えタンパク質調製と還元／酸化カップリング試薬を、所望の立体配置異性体の相対比率を増加させるのに十分な時間接触させることを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞に産生された組換えタンパク質調製と還元／酸化カップリング試薬を、約７〜約１１のｐＨで接触させ、そして所望のコンホメーションを持つ組換えタンパク質調製の分画を単離する
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
組換えタンパク質が少なくとも２つのドメインを含有する、請求項１の方法。
【請求項３】
タンパク質の少なくとも１つのドメインが安定なコンホメーションを有し、そしてタンパク質の少なくとも１つのドメインが不安定なコンホメーションを有する、請求項２の方法。
【請求項４】
組換えタンパク質が受容体の細胞外ドメインを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項５】
組換えタンパク質がＴＮＦ受容体の可溶性型である、請求項１の方法。
【請求項６】
組換えタンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項１の方法。
【請求項７】
組換えタンパク質調製がプロテインＡまたはプロテインＧカラムから精製されている、請求項６の方法。
【請求項８】
組換えタンパク質が、可溶性ＩＬ−４受容体、可溶性ＩＬ−１  ＩＩ型受容体、可溶性Ｆｌｔ３リガンド、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＣＤ３９、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＴＥＫ／Ｏｒｋ、ＩＬ−１５、可溶性ＩＬ−１５受容体、Ｏｘ４０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＩＬ、可溶性ＴＲＡＩＬ受容体、組織プラスミノーゲンアクチベーター、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１アンチトリプシン、カルシトニン、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、スーパーオキシドジスムターゼ、グルカゴン、エリスロポエチン、抗体、グルコセレブロシダーゼ、Ｆｃ融合タンパク質、グロビン、神経増殖因子、インターロイキン、およびコロニー刺激因子からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項９】
ｐＨが約７〜約１０である、請求項１の方法。
【請求項１０】
ｐＨが約７．６〜約９．６である、請求項９の方法。
【請求項１１】
ｐＨが約８．６である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
還元／酸化カップリング試薬がグルタチオンを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１３】
還元型グルタチオン対酸化型グルタチオンの比が約１：１〜約１００：１である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
還元／酸化カップリング試薬がシステインを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１５】
接触工程を約４〜約１６時間行う、請求項１の方法。
【請求項１６】
接触工程を約２５℃で行う、請求項１の方法。
【請求項１７】
接触工程を約４℃で行う、請求項１の方法。
【請求項１８】
接触工程を酸性化によって終了する、請求項１の方法。
【請求項１９】
単離工程が１又はそれより多くのクロマトグラフィー工程を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項２０】
タンパク質濃度が約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌである、請求項１の方法。
【請求項２１】
還元／酸化カップリング試薬中の還元性チオール対タンパク質中のジスルフィド結合の比が約３２０：１〜約６４，０００対１（還元性チオール：ジスルフィド結合）である、請求項１の方法。
【請求項２２】
無菌バルク型中に、所望のコンホメーションを持つ組換えタンパク質調製の分画を処方することをさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項２３】
無菌単位投薬型中に、所望のコンホメーションを持つ組換えタンパク質調製の分画を処方することをさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項２４】
所望のコンホメーションが、受容体の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンドに関して、より高い結合親和性を有する、請求項４の方法。
【請求項２５】
所望のコンホメーションが、ＴＮＦに関して、より高い結合親和性を有する、請求項５の方法。
【請求項２６】
ＴＮＦがＴＮＦ−アルファである、請求項２５の方法。
【請求項２７】
グリコシル化組換えタンパク質の所望のコンホメーションを促進する方法であって：
グリコシル化組換えタンパク質の少なくとも２つの立体配置異性体の混合物を含有するグリコシル化組換えタンパク質調製と、還元／酸化カップリング試薬を、所望の立体配置異性体の相対比率を増加させるのに十分な時間接触させ、そして
混合物中の所望の立体配置異性体の相対比率を決定する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２８】
グリコシル化組換えタンパク質が少なくとも２つのドメインを含有する、請求項２７の方法。
【請求項２９】
グリコシル化組換えタンパク質の少なくとも１つのドメインが安定なコンホメーションを有し、そしてグリコシル化組換えタンパク質の少なくとも１つのドメインが不安定なコンホメーションを有する、請求項２８の方法。
【請求項３０】
グリコシル化組換えタンパク質が受容体の細胞外ドメインを含んでなる、請求項２７の方法。
【請求項３１】
グリコシル化組換えタンパク質がＴＮＦ受容体の可溶性型である、請求項２７の方法。
【請求項３２】
グリコシル化組換えタンパク質がＦｃ融合タンパク質である、請求項２７の方法。
【請求項３３】
グリコシル化組換えタンパク質調製がプロテインＡまたはプロテインＧカラムから精製されている、請求項３２の方法。
【請求項３４】
グリコシル化組換えタンパク質が、可溶性ＩＬ−４受容体、可溶性ＩＬ−１  ＩＩ型受容体、可溶性Ｆｌｔ３リガンド、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＣＤ３９、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＴＥＫ／Ｏｒｋ、ＩＬ−１５、可溶性ＩＬ−１５受容体、Ｏｘ４０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＴＲＡＩＬ、可溶性ＴＲＡＩＬ受容体、組織プラスミノーゲンアクチベーター、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１アンチトリプシン、カルシトニン、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、スーパーオキシドジスムターゼ、グルカゴン、エリスロポエチン、抗体、グルコセレブロシダーゼ、Ｆｃ融合タンパク質、グロビン、神経増殖因子、インターロイキン、およびコロニー刺激因子からなる群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項３５】
ｐＨが約７〜約１０である、請求項２７の方法。
【請求項３６】
ｐＨが約８．６である、請求項３５の方法。
【請求項３７】
還元／酸化カップリング試薬が、グルタチオン、システイン、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、２−メルカプトエタノールおよびジチオニトロ安息香酸からなる群より選択される、請求項２７の方法。
【請求項３８】
還元／酸化カップリング試薬が還元型グルタチオンを含んでなる、請求項３７の方法。
【請求項３９】
還元型グルタチオンが約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
還元／酸化カップリング試薬が還元性システインを含んでなる、請求項３７の方法。
【請求項４１】
還元／酸化カップリング試薬中の還元性チオール対タンパク質中のジスルフィド結合の比が約３２０：１〜約６４，０００対１（還元性チオール：ジスルフィド結合）である、請求項３７の方法。
【請求項４２】
タンパク質濃度が約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌである、請求項２７の方法。
【請求項４３】
接触工程を約４〜約１６時間行う、請求項２７の方法。
【請求項４４】
接触工程を約２５℃で行う、請求項２７の方法。
【請求項４５】
接触工程を約４℃で行う、請求項２７の方法。
【請求項４６】
接触工程を酸性化によって終了する、請求項２７の方法。
【請求項４７】
決定工程が１又はそれより多くのクロマトグラフィー工程を含んでなる、請求項２７の方法。
【請求項４８】
決定工程が結合反応を含んでなる、請求項２７の方法。
【請求項４９】
所望の立体配置異性体を持つグリコシル化組換えタンパク質調製の分画を単離することを含んでなる、請求項２７の方法。
【請求項５０】
無菌単位投薬型中に、所望の立体配置異性体を処方することを含んでなる、請求項４９の方法。
【請求項５１】
所望の立体配置異性体が、受容体の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンドに関して、より高い結合親和性を有する、請求項３０の方法。
【請求項５２】
所望の立体配置異性体が、ＴＮＦに関して、より高い結合親和性を有する、請求項３１の方法。
【請求項５３】
ＴＮＦがＴＮＦ−アルファである、請求項５２の方法。
【請求項５４】
哺乳動物細胞に産生され、還元／酸化カップリング試薬と接触され、そして所望でないコンホメーションを持つタンパク質の分画から単離された組換えタンパク質を、無菌単位投薬型に処方することを含んでなる方法。
【請求項５５】
請求項５４の方法によって産生した、ＴＮＦＲ：Ｆｃの薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示が完全に本明細書に援用される、米国仮出願６０／２７１，０３３号、２００１年２月２３日出願、の優先権を主張する。
発明の分野
本発明はタンパク質処理および精製の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
背景
真核起源の多くのタンパク質の高レベル発現は、原核発現宿主において達成されてきている。こうした真核タンパク質は、原核宿主中で、しばしば誤ってフォールディングされ、そして不溶性封入体として集積する。生物学的に活性であるタンパク質を得るため、カオトロピック剤および還元性チオールを含む厳しい条件下で、封入体に捕捉されたタンパク質をほどき、そして再フォールディングしなければならなかった。
【０００３】
真核宿主における真核起源タンパク質の発現は、これらの問題を回避する。発現ベクターが適切に設計されていれば（例えば分泌シグナルペプチドを含むなど）、真核細胞株は、正しくプロセシングし、そして細胞外真核タンパク質を可溶性産物として分泌する傾向がある。
【０００４】
しかし、発現系およびベクターが真核宿主からの発現レベルを最大限にするように改善されてきているため、これらの宿主から発現され、そして分泌される組換えタンパク質のすべてが、所望の、最も活性であるコンホメーションにあるわけではない。本発明は、こうした発現の問題を克服し、そして生物学的に活性であるタンパク質の収率を最大にするよう設計される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要
本発明は、部分的に、真核宿主細胞に発現される組換えタンパク質調製のすべてが、天然三次コンホメーションにフォールディングされるのではないという発見に基づく。さらに、組換えタンパク質の領域またはドメインが適切にフォールディングされ、一方、他の領域またはドメインが所望でないコンホメーションを有する可能性があることが見出されてきている。したがって、１つの側面において、本発明は、組換えタンパク質の少なくとも２つの異性体の混合物を含有する組換えタンパク質調製と還元／酸化カップリング試薬を、所望のコンホメーション異性体の相対比率を増加させるのに十分な時間接触させ、そして混合物中の所望のコンホメーション異性体の相対比率を決定する方法を提供する。別の側面において、本発明は、哺乳動物細胞に産生された組換えタンパク質調製と還元／酸化カップリング試薬を、約７〜約１１のｐＨで接触させ、そして所望のコンホメーションを持つ組換えタンパク質調製の分画を単離することを含む。好ましい組換えタンパク質は、例えば真核細胞に産生されるものなどの、グリコシル化組換えタンパク質である。本発明はまた、生じた調製を無菌単位投薬型に処方する方法、および本発明の方法によって産生した組成物にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、活性組換えタンパク質の回収を増加させる方法を提供する。特に、本発明は、組換えタンパク質調製において、タンパク質の所望のコンホメーションを促進することを伴う。重要なことに、本発明は、厳しいカオトロープ処理（例えばＳＤＳ、グアニジウム塩酸または尿素などの強い変性剤など）の使用を必要とすることなく、タンパク質構造を改変する穏やかな方法を提供する。組換えタンパク質調製に対して、本発明の方法を用いると、調製において、より高い割合の、またはより高い相対比の、所望のコンホメーションを持つ組換えタンパク質が生じる。組換えタンパク質の所望のコンホメーションは、そのタンパク質の天然存在ドメインに最もよく似ていて、そして／または該ドメインの機能を再現するタンパク質の三次元構造である。こうした穏やかな方法は、組換えタンパク質を薬剤または生物製剤としてｉｎ  ｖｉｖｏで用いるよう意図する際に、特に好適である。
【０００７】
一般的に、組換えタンパク質が受容体タンパク質のドメインを含有する際、所望のコンホメーションは、受容体の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンドに関して、より高い結合親和性（そしてその結果、より低い解離定数）を有するであろう。例えば、ＴＮＦ結合分子の所望のコンホメーションは、ＴＮＦ（例えばＴＮＦ−アルファ）に関して、より高い結合親和性およびより低い解離定数を有するであろう。
【０００８】
さらに、組換えタンパク質の所望のコンホメーションは、好ましくは、所望でないコンホメーションより熱安定性である（同一溶液環境で測定した際）。熱安定性は、例えば融点転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（Ｔｍ）などのいくつかの方法のいずれで測定することも可能である。組換えタンパク質の所望のコンホメーションには、異なる配置のジスルフィド結合があることも、またはないことも可能であるが、好ましくは、該コンホメーションは天然ジスルフィド結合を含有する。組換えタンパク質の所望のコンホメーションは、他の三次構造特性を有することが可能である。例えば、所望のコンホメーションは、タンパク質の単量体、二量体、三量体、四量体、またはいくつかの他の高次の型であることが可能である。本発明の目的のため、タンパク質の「コンホメーション」は、その三次元構造である。同じ一次アミノ酸配列を持つポリペプチドの２つの異なる構造は、エネルギー最小値に相当する、異なるコンホメーションを有し、そして空間において原子が配向する方式においてのみ互いに異なる場合、互いに「配座異性体（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒｓ）」である。配座異性体は、相互転換可能である（結合破壊を排除した、結合周囲の回転の自由を指す）。同じ一次アミノ酸配列を持つポリペプチドの２つの異なる構造は、エネルギー最小値に相当する、異なるコンホメーションを有し、空間において原子が配向する方式においてのみ互いに異なり、そして共有結合を破壊することなしには相互変換不能である場合、「立体配置異性体（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒｓ）」である。本発明の実施において、立体配置異性体は、例えばジスルフィド結合を破壊して、そして所望によりジスルフィド結合を再形成することによって、相互変換可能である。
【０００９】
したがって、１つの側面において、本発明は、組換えタンパク質の少なくとも２つの立体配置異性体の混合物を含有するグリコシル化組換えタンパク質調製と、還元／酸化カップリング試薬を、所望の立体配置異性体の相対比率を増加させるのに十分な時間接触させ、そして混合物中の所望の立体配置異性体の相対比率を決定することを含む。別の側面において、本発明は、哺乳動物細胞に産生された組換えタンパク質調製と還元／酸化カップリング試薬を、約７〜約１１のｐＨで接触させ、そして所望のコンホメーションを持つ組換えタンパク質調製の分画を単離することを含む。好ましい組換えタンパク質は、真核細胞に産生されるものなどの、グリコシル化組換えタンパク質である。
【００１０】
本発明を用いて、ほぼいかなるタンパク質を処理して、所望のコンホメーションを促進することも可能である。タンパク質は、一般的に、少なくとも約１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも約７５アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約１００アミノ酸のポリペプチドと理解される。本発明の方法は、少なくとも約３システイン残基、より好ましくは少なくとも約８システイン残基、さらにより好ましくは少なくとも約１５システイン残基、さらにより好ましくは少なくとも約３０、さらにより好ましくは少なくとも約５０〜１５０システイン残基を有するタンパク質を処理する際に、特に使用を見出す。
【００１１】
一般的に、本発明の方法は、組換えタンパク質の産生法を改善するのに有用である。組換えタンパク質は、遺伝子操作のプロセスによって産生されるタンパク質である。用語「遺伝子操作」は、上昇したレベルか低下したレベルで遺伝子を発現し、そして／または遺伝子の突然変異型を発現する宿主細胞を生成するのに用いるいかなる組換えＤＮＡまたはＲＮＡ法も指す。言い換えると、細胞は、組換えポリヌクレオチド分子でトランスフェクションされているか、形質転換されているか、または形質導入されており、そしてそれによって細胞が所望のタンパク質の発現を改変するように、改変されている。遺伝子操作細胞および／または細胞株を遺伝子操作して、目的のタンパク質を発現する方法およびベクターは、当業者に公知であり；例えば、多様な技術がＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌら監修（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク，  １９８８および年４回改訂）およびＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に例示される。遺伝子操作技術には、限定されるわけではないが、発現ベクター、標的化相同組換えおよび遺伝子活性化（例えばＣｈａｐｐｅｌに対する米国特許第５，２７２，０７１号を参照されたい）および操作した転写因子によるトランス活性化（例えばＳｅｇａｌら，  １９９９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６（６）：２７５８−６３を参照されたい）が含まれる。
【００１２】
本発明は、グリコシル化されたタンパク質の産生を改善する際に特に使用を見出す。具体的には、真菌細胞系（例えば酵母、糸状真菌）および哺乳動物細胞系に分泌されるタンパク質はグリコシル化されるであろう。好ましくは、タンパク質は、細胞培養中で増殖するよう適応した哺乳動物産生細胞に分泌される。産業で通常用いられるこうした細胞の例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株（特にネズミ）、ＰＣ１２およびＷＩ３８細胞である。特に好ましい宿主細胞は、いくつかの複雑な組換えタンパク質、例えばサイトカイン、凝固因子、および抗体の産生に広く用いられる、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である（Ｂｒａｓｅｌら，  １９９６，  Ｂｌｏｏｄ  ８８：２００４−２０１２；Ｋａｕｆｍａｎら，  １９８８，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：６３５２−６３６２；ＭｃＫｉｎｎｏｎら，  １９９１，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ６：２３１−２３９；Ｗｏｏｄら，  １９９０，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４５：３０１１−３０１６）。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損突然変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂら，  １９８０，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）、ＤＸＢ１１およびＤＧ−４４は、選択されるＣＨＯ宿主細胞株であるが、これは、選択可能でそして増幅可能な、効率的ＤＨＦＲ遺伝子発現系が、これらの細胞において、高レベルの組換えタンパク質発現を可能にするためである（Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．，  １９９０，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：５２７−５６６）。さらに、これらの細胞は付着または懸濁培養として操作しやすく、そして比較的優れた遺伝的安定性を示す。ＣＨＯ細胞および該細胞で発現した組換えタンパク質は、詳細に性質決定されてきており、そして認可機関によって臨床製造における使用に認可されてきている。
【００１３】
多数のコンホメーションを採用する可能性があり、そして／または１より多いドメインを含有するタンパク質の産生法を改善するため、本発明が穏やかでそして有効な方法であることが見出された。「ドメイン」は、特定の三次構造を採用し、そして／またはポリペプチド鎖のその領域に位置決定されることが可能な特定の活性を有する、ポリペプチド鎖の隣接する領域である。例えば、タンパク質の１つのドメインが、１つのリガンドに関して結合親和性を有し、そしてタンパク質の１つのドメインが、別のリガンドに関して結合親和性を有することが可能である。熱安定性の点で、ドメインは、タンパク質の協同アンフォールディング単位を指すことが可能である。１より多いドメインを含有するタンパク質は、１つのタンパク質として天然存在で見出されるか、または融合タンパク質として遺伝子操作されている可能性がある。さらに、ポリペプチドのドメインは、サブドメインを有することが可能である。
【００１４】
１つの側面において、本発明の方法は、タンパク質の少なくとも１つのドメインが安定なコンホメーションを有し、そしてタンパク質の少なくとも１つのドメインが不安定なコンホメーションを有する、組換えタンパク質調製に対して使用可能である。用語「安定な」および「不安定な」は、相対的な用語として用いる。安定なコンホメーションを持つタンパク質ドメインは、例えば、同一溶液中で測定した際、タンパク質の不安定なドメインより高い融点（Ｔｍ）を有するであろう。同一溶液中で測定した際、Ｔｍの相違が少なくとも約２℃、より好ましくは約４℃、さらにより好ましくは約７℃、さらにより好ましくは約１０℃、さらにより好ましくは約１５℃、さらにより好ましくは約２０℃、さらにより好ましくは約２５℃、そして最も好ましくは約３０℃である際、ドメインは別のドメインに比較して安定である。
【００１５】
本発明はまた、一般的に、Ｆｃドメイン、および別のドメインを有するタンパク質（例えば抗体、およびＦｃ融合タンパク質）にも適用可能である。例えば、以下に例示する限定されない態様の１つにおいて、ＴＮＦＲ：Ｆｃに関して、該分子のＦｃ部分のＴｍは６９．１℃および８３．４℃であり、一方、該分子のＴＮＦＲ部分のＴｍは５２．５℃（より所望のコンホメーションにおいて）〜４９．７℃（より所望でないコンホメーションにおいて）のＴｍの範囲である。
【００１６】
特に好ましいタンパク質は、生物製剤としても知られる、タンパク質に基づく薬剤である。好ましくは、タンパク質は、細胞外産物として発現される。本発明の方法を用いて産生可能なタンパク質には、限定されるわけではないが、ｆｌｔ３リガンド（完全に本明細書に援用されるＷＯ  ９４／２８３９１に記載されるようなもの）、ＣＤ４０リガンド（完全に本明細書に援用されるＵＳ  ６，０８７，３２９に記載されるようなもの）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子のリガンド（ＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、完全に本明細書に援用されるＷＯ  ９７／０１６３３に記載されるようなもの）、胸腺間質由来リンホポエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、完全に本明細書に援用されるオーストラリア特許第５８８８１９号に記載されるようなもの）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン様増殖因子類、副甲状腺ホルモン、インターフェロン類、神経増殖因子類、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子類、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、および細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋの多様なリガンド（ｅｐｈ関連キナーゼのリガンドまたはＬＥＲＫＳなど）が含まれる。本発明の方法にしたがって精製可能なタンパク質の説明は、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．ＩＩ（ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ監修，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  マサチューセッツ州ケンブリッジ，  １９９８）；Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク，  １９９３）；およびＴｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａ．Ｗ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  カリフォルニア州サンディエゴ，  １９９１）に見出すことが可能である。
【００１７】
前述のいかなるタンパク質の受容体、特に受容体の可溶性型の調製もまた、本発明を用いて改善可能であり、これらには、ＴＮＦＲの両方の型（ｐ５５およびｐ７５と称する）、インターロイキン−１受容体Ｉ型およびＩＩ型（完全に本明細書に援用される、ＥＰ  ０  ４６０  ８４６、ＵＳ  ４，９６８，６０７、およびＵＳ  ５，７６７，０６４に記載されるようなもの）、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−４受容体（完全に本明細書に援用されるＥＰ  ０  ３６７  ５６６およびＵＳ  ５，８５６，２９６に記載されるようなもの）、インターロイキン−１５受容体、インターロイキン−１７受容体、インターロイキン−１８受容体、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子の受容体、ＮＦ−カッパＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、完全に本明細書に援用されるＵＳ  ６，２７１，３４９に記載されるようなもの）、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４を含む）、およびＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などの死のドメインを含んでなる受容体が含まれる。
【００１８】
本発明の方法を用いて、その産生法を改善可能な他のタンパク質には、分化抗原クラスター（ＣＤタンパク質と称する）、例えばＬｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｋｉｋｕｔａｎｉら監修，日本・神戸，  １９９６）に開示されるもの、またはそれに続くワークショップで開示されたＣＤ分子が含まれる。こうした分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０；およびそのリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドおよびＣＤ４０リガンド）が含まれる。これらのいくつかは、４１ＢＢおよびＯＸ４０もまた含むＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり；リガンドはしばしば、ＴＮＦファミリーのメンバーであり（４１ＢＢリガンドおよびＯＸリガンドもメンバーである）；したがって、ＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーもまた、本発明を用いて産生可能である。
【００１９】
酵素的に活性であるタンパク質もまた、本発明にしたがって調製可能である。例には、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーメンバー、多様なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン類、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−アルファ変換酵素、および多数の他の酵素が含まれる。酵素的に活性であるタンパク質のリガンドもまた、本発明を適用することによって発現可能である。
【００２０】
本発明の組成物および方法はまた、免疫グロブリン分子またはその一部、およびキメラ抗体（例えばネズミ抗原結合領域にカップリングしたヒト定常領域を有する抗体）またはその断片を含む、他の種類の組換えタンパク質の調製にも有用である。免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡを操作して、一本鎖抗体、増進した親和性を持つ抗体、または他の抗体に基づくポリペプチドなどの組換えタンパク質をコード可能なＤＮＡを得ることが可能な、多くの技術が知られる（例えばＬａｒｒｉｃｋら，  １９８９，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４−９３８；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｒｏｂｅｒｔｓら，  １９８７，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４−３９７）。完全なヒト抗体（トランスジェニック動物を用いて調製し、そして所望によりｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに修飾するようなもの）と共にヒト化抗体の調製もまた、本発明で使用可能である。用語、ヒト化抗体はまた、一本鎖抗体も含む。例えばＣａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３  Ｂ１号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４  Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ  ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号；Ｑｕｅｅｎら、欧州特許第０  ４５１  ２１６  Ｂ１号；およびＰａｄｌａｎ，  Ｅ．Ａ．ら、ＥＰ  ０  ５１９  ５９６  Ａ１を参照されたい。本発明の方法はまた、抗体および細胞傷害性または発光物質を含んでなるコンジュゲートの調製中にも使用可能である。こうした物質には：メイタンシン誘導体（ＤＭ１など）；エンテロトキシン（ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン）；ヨウ素同位体（ヨウ素−１２５など）；テクニウム（ｔｅｃｈｎｉｕｍ）同位体（Ｔｃ−９９ｍなど）；シアニン蛍光色素（Ｃｙ５．５．１８など）；およびリボソーム不活性化タンパク質（ボウガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、またはサポリン−Ｓ６など）が含まれる。
【００２１】
本発明に意図される抗体または抗体／細胞毒素または抗体／発光団コンジュゲートの例には、上述のタンパク質および／または以下の抗原のいずれか１つまたはその組み合わせを認識するものが含まれる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現される遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸および／または膵臓癌患者の血清に上昇したレベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳癌、結腸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、および／または腎臓癌細胞、並びに／あるいは黒色腫、神経膠腫または神経芽腫細胞、腫瘍の壊死コア上に発現される関連エピトープまたはタンパク質、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン類、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞内接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン（ｌｅｕｋｏｉｎｔｅｇｒｉｎ）、アドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（因子ＶＩＩａ組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ１、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ  １０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、ＩＦＮ−γ、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）。
【００２２】
多様な融合タンパク質調製もまた、本発明の方法を用いて調製可能である。こうした融合タンパク質の例には、免疫グロブリン分子の一部との融合体として発現されるタンパク質、ジッパー部分を持つ融合タンパク質として発現されるタンパク質、並びにサイトカインおよび増殖因子（すなわちＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３、ＭＧＦおよびＩＬ−３）の融合タンパク質などの新規多機能タンパク質が含まれる。ＷＯ  ９３／０８２０７およびＷＯ  ９６／４０９１８は、それぞれ免疫グロブリン融合タンパク質およびジッパー融合タンパク質を含む、ＣＤ４０Ｌと称する分子の多様な可溶性オリゴマー型の調製を記載し；これらの文献に論じる技術は、他のタンパク質に適用可能である。上記分子のいずれも、限定されるわけではないが、細胞性受容体分子の細胞外ドメイン、酵素、ホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン分子の一部、ジッパードメイン、およびエピトープを含む融合タンパク質として発現可能である。
【００２３】
組換えタンパク質調製は、細胞培養上清、細胞抽出物であることが可能であるが、好ましくは、これらから部分的に精製した分画である。「部分的に精製した」によって、ある単数または複数の分画法を行ったが、所望のタンパク質またはタンパク質コンホメーション以外のポリペプチド種（少なくとも１０％）が存在することを意味する。本発明の方法の１つの利点は、組換えタンパク質調製が、かなり高濃度である可能性があることである。好ましい濃度範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜１５ｍｇ／ｍｌ、そしてさらにより好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌである。
【００２４】
組換えタンパク質調製は、まず、ポリペプチドを発現するのに適した培養条件下で、組換え宿主細胞を培養することによって、調製可能である。ポリペプチドはまた、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する体細胞または生殖細胞によって特徴付けられる、トランスジェニック動物の産物として、例えば、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの構成要素として、発現することも可能である。次いで、既知の方法を用いて、こうした培養または構成要素から（例えば培地または細胞抽出物または体液から）、生じた発現ポリペプチドを精製するか、または部分的に精製することが可能である。分画法は、限定されるわけではないが、１又はそれより多くの工程のろ過、遠心分離、沈降、相分離、アフィニティー精製、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルなどの樹脂を用いる）、ＨＰＬＣ、または上記のいくつかの組み合わせを含むことが可能である。
【００２５】
例えば、ポリペプチドの精製は、ポリペプチドに結合するであろう剤を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）またはＣｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のようなアフィニティー樹脂上の１又はそれより多くのカラム工程；溶出を伴う１又はそれより多くの工程；および／または免疫アフィニティークロマトグラフィーを含むことが可能である。精製を容易にする型でポリペプチドを発現することも可能である。例えば、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のものなどの融合ポリペプチドとして発現することが可能である。こうした融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ（マサチューセッツ州ビバリー）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）、およびＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから、商業的に入手可能である。ポリペプチドは、エピトープでタグ化して、そして続いて、こうしたエピトープに対して向けられる特異的抗体を用いることによって、精製することも可能である。１つのこうしたエピトープ（ＦＬＡＧ（登録商標））は、Ｋｏｄａｋ（コネティカット州ニューヘブン）から商業的に入手可能である。組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体などのポリペプチド結合ポリペプチドを含んでなるアフィニティーカラムを利用して、発現ポリペプチドをアフィニティー精製することもまた可能である。他の種類のアフィニティー精製工程は、アフィニティー剤が、Ｆｃドメインを含有するタンパク質に結合する、プロテインＡまたはプロテインＧカラムであることが可能である。ポリペプチドは、慣用的な技術を用いて、例えば利用するアフィニティーマトリックスに応じて、高塩溶出緩衝液中で、そしてその後、使用のため、より低塩の緩衝液中に透析することによって、またはｐＨもしくは他の構成要素を変化させることによって、アフィニティーカラムからはずす（ｒｅｍｏｖｅ）ことが可能であるし、あるいはアフィニティー部分の天然存在基質を用いて、競合的にはずすことが可能である。以下に例示する本発明の１つの態様において、組換えタンパク質調製は、プロテインＡアフィニティーカラム上で部分的に精製されている。
【００２６】
前述の精製工程のいくつかまたはすべてを多様な組み合わせで使用して、本発明の方法において使用するための適切な組換えタンパク質調製を調製し、そして／または組換えタンパク質調製と還元／酸化カップリング試薬を接触させた後、組換えポリペプチドをさらに精製することもまた可能である。他の哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まないポリペプチドを「単離ポリペプチド」と定義する。
【００２７】
ポリペプチドはまた、既知の慣用的化学合成によっても産生可能である。合成手段によってポリペプチドを構築する方法は、当業者に既知である。合成的に構築したポリペプチド配列を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでグリコシル化可能である。
【００２８】
最終純度の所望の度合いは、ポリペプチドの意図される使用に応じる。例えば、ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで投与しようとするとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、他のポリペプチドに相当するポリペプチドバンドが検出不能であるように精製される。当業者は、差次グリコシル化、差次翻訳後プロセシング等のため、該ポリペプチドに相当する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化される可能性があることを認識するであろう。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一のポリペプチドバンドによって示されるように、実質的に均一に精製される。ポリペプチドバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色によって、そして／または（ポリペプチドが放射標識されている場合）オートラジオグラフィーによって、視覚化可能である。
【００２９】
「接触」によって、溶液中で、何かに供し、そして／または何かに曝露することを意味する。タンパク質またはポリペプチドを接触させ、一方で、固体支持体（例えばアフィニティーカラムまたはクロマトグラフィーマトリックス）にも結合させることが可能である。好ましくは、溶液は緩衝されている。所望のコンホメーションを持つタンパク質の収率を最大にするため、溶液のｐＨを選択して、タンパク質の安定性を保護し、そしてジスルフィド交換に関して最適であるようにする。本発明の実施において、溶液のｐＨは、好ましくは強い酸性ではない。したがって、好ましいｐＨ範囲は、ｐＨ５より大きく、好ましくは約ｐＨ６〜約ｐＨ１１、より好ましくは約ｐＨ７〜約ｐＨ１０、そしてさらにより好ましくは約ｐＨ７．６〜約ｐＨ９．６である。以下に例示する、ＴＮＦＲ：Ｆｃを用いた本発明の１つの限定されない態様において、最適ｐＨは約ｐＨ８．６であることが見出された。しかし、本発明の特定の態様の最適ｐＨは、当業者によって容易に実験的に決定可能である。
【００３０】
還元／酸化カップリング試薬は、還元剤（ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の供給源である。好ましい還元剤は未結合（ｆｒｅｅ）チオールである。還元／酸化カップリング試薬は、好ましくは、還元型（ｒｅｄｕｃｅｄ）および酸化型（ｏｘｉｄｉｚｅｄ）グルタチオン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオニトロ安息香酸、システインおよびシスチンからなる群由来の化合物で構成される。使用が容易で、そして経済的であるため、還元型グルタチオンおよび／または還元型システインが使用可能である。
【００３１】
還元／酸化カップリング試薬は、所望のコンホメーションの相対比率を増加させるのに十分な濃度で存在する。還元／酸化カップリング試薬の最適濃度は、タンパク質の濃度および該タンパク質中のジスルフィド結合の数に応じる。例えば、２９のジスルフィド結合を持つタンパク質（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）を、２ｍｇ／ｍｌの濃度（およそ１４μＭタンパク質または４００μＭジスルフィド）で用いると、２ｍＭの還元型チオールを含む還元／酸化カップリング試薬がうまく働き、所望のコンホメーションの相対比率を増加させた。これは、未結合チオール約３５対ジスルフィド結合１の比に相当する。しかし、ジスルフィドあたり２０〜４００の未結合チオールの比も働くこともまた見出された。もちろん、特定の濃度で用いるチオールの量は、チオールの還元能力に応じて、いくぶん、異なる可能性があり、そして当業者によって容易に決定可能である。
【００３２】
したがって、一般的に、還元／酸化カップリング試薬由来の未結合チオール濃度は、約０．０５ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約２５ｍＭ、そしてさらにより好ましくは約０．２ｍＭ〜約２０ｍＭであることが可能である。
【００３３】
さらに、還元／酸化カップリング試薬は、還元型チオール構成要素よりおおよそ高いか、等しいか、または低い濃度で、酸化型チオールを含有することが可能である。例えば、還元／酸化カップリング試薬は、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンの組み合わせであることが可能である。実際の実施例を通じて、約１：１〜約１００：１（還元型チオール：酸化型チオール）の還元型グルタチオン対酸化型グルタチオンの比は、同等によく機能しうることが見出されてきている。あるいは、別の態様において、還元／酸化カップリング試薬は、システイン、またはシステインおよびシスチンの組み合わせであることが可能である。したがって、酸化型チオールが最初の還元／酸化カップリング試薬に含まれる場合、還元型チオール対酸化型チオールの比は、好ましい態様において、約１：１０〜約１０００：１、より好ましくは約１：１〜約５００：１、さらにより好ましくは約５：１〜約１００：１、さらにより好ましくは約１０：１であることが可能である。
【００３４】
組換えタンパク質調製と還元／酸化カップリング試薬との接触は、所望のコンホメーションの相対比率を増加させるのに十分な時間行う。比率のいかなる相対増加も所望であるが、好ましくは、所望でないコンホメーションを持つタンパク質の少なくとも１０％が、所望のコンホメーションを持つタンパク質に変換される。より好ましくは、タンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％および８０％さえ、所望でないコンホメーションから所望のコンホメーションに変換される。本発明の方法で達成されている典型的な収率は、４０〜８０％の範囲である。組換えタンパク質の部分的にまたは非常に精製された調製に対して接触工程を行う場合、接触工程は、約１時間〜約４時間と同程度に短く、そして約６時間〜約４日間と同程度に長く行うことが可能である。約４時間〜約１６時間または約１８時間の接触工程がよく働くことが見出されてきている。接触工程はまた、固相上またはろ過中または精製の別のいずれかの工程中などの、別の工程中にも行うことが可能である。
【００３５】
本発明の方法は、広い温度範囲に渡って行うことが可能である。例えば、本発明の方法は、約４℃〜約３７℃の温度で成功裡に行われてきているが、最適な結果はより低い温度で達成された。組換えタンパク質の部分的にまたは完全に精製された調製を接触させるための典型的な温度は、約４℃〜約２５℃（周囲温度）であるが、より低い温度およびより高い温度で行うこともまた可能である。
【００３６】
組換えタンパク質調製は、適切なように、多様な体積で、還元／酸化カップリング試薬と接触させることが可能である。例えば、本発明の方法は、分析実験室規模（１〜５０ｍｌ）、調製規模（５０ｍｌ〜１０ｌ）および製造規模（１０ｌより多い）で成功裡に行われてきている。したがって、本発明の方法は、再現性をもって、小規模および大規模両方で行うことが可能である。
【００３７】
好ましい側面において、接触工程は、例えば、ＳＤＳ、尿素およびグアニジウムＨＣｌなどのカオトロピック剤の有意な量を含まずに行う。有意な量のカオトロピック剤は、認識しうるアンフォールディングを観察するのに必要である。一般的に、１Ｍ未満、より好ましくは０．５Ｍ未満、さらにより好ましくは０．１Ｍ未満のカオトロープが存在する。カオトロープが意図的に添加されていない場合、溶液は本質的にカオトロープ（例えばＳＤＳ、尿素およびグアニジウムＨＣｌ）を含まず、そして微量レベル（例えば１０ｍＭ未満）のみが存在する可能性がある（例えば容器由来または細胞副産物として）。
【００３８】
ジスルフィド交換は、当業者に知られるいかなる方法で終了する（ｑｕｅｎｃｈ）ことも可能である。例えば、精製工程を通じて、還元／酸化カップリング試薬を取り除くか、またはその濃度を減少させるか、そして／または例えば溶液の酸性化によって、還元／酸化カップリング試薬を化学的に不活性化することが可能である。典型的には、反応を酸性化することによって終了する場合、還元／酸化カップリング試薬を含有する溶液のｐＨを、ｐＨ７未満に低下させるであろう。好ましくは、ｐＨをｐＨ６未満に低下させる。一般的に、ｐＨを約ｐＨ２および約ｐＨ７の間に減少させる。
【００３９】
タンパク質コンホメーションの決定、および混合物におけるタンパク質コンホメーションの相対比率の決定は、多様な分析および／または定性的技術のいずれかを用いて行うことが可能である。タンパク質コンホメーション間で活性に相違がある場合、混合物におけるコンホメーションの相対比率の決定は、活性アッセイ（例えばリガンドへの結合、酵素活性、生物学的活性など）によって行うことが可能である。例えば、以下に記載する限定されない態様の１つにおいて、固相ＴＮＦ結合アッセイを用いることによって、ＴＮＦＲ：Ｆｃの少なくとも２つの異なるコンホメーションを分離することが可能である。本質的にＩＬ−１Ｒに関して記載されるような該アッセイ（Ｓｌａｃｋら，  １９９３，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６８：２５１３−２５２４）は、生成されるリガンド−受容体結合会合、解離または阻害定数における変化によって、多様なタンパク質コンホメーションの相対比率間を区別可能である。あるいは、結合結果は、タンパク質の活性単位／ｍｇとして表すことが可能である。
【００４０】
２つのコンホメーションがクロマトグラフィー、電気泳動、ろ過または他の精製技術中に異なって分離されるならば、混合物におけるコンホメーションの相対比率は、こうした精製技術を用いて決定可能である。例えば、以下に記載する限定されない態様において、ＴＮＦＲ：Ｆｃの少なくとも２つの異なるコンホメーションが、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離可能であった。さらに、遠ＵＶ円二色性を用いて、タンパク質の二次構造組成が評価されてきているため（Ｐｅｒｃｚｅｌら，  １９９１，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｒｇ．  ４：６６９−６７９）、こうした技術は、タンパク質の別のコンホメーションが存在するかどうかを決定可能である。コンホメーションを決定するのに用いる、さらに別の技術は、蛍光分光法であり、これを使用して、トリプトファンおよびチロシン蛍光に割り当て可能な、三次構造における相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）相違を確かめることが可能である。コンホメーション相違、そしてしたがってコンホメーションの相対比率を決定するのに使用可能な他の技術は、凝集状態を測定するオンラインＳＥＣ、融点転移（Ｔｍ）および構成要素エンタルピー、並びにカオトロープ・アンフォールディングを測定する示差走査熱量測定である。
【００４１】
用語「単離」によって、混合物中の他の構成要素から、混合物中の少なくとも１つの構成要素を物理的に分離することを意味する。構成要素またはタンパク質の特定のコンホメーションの単離は、こうした構成要素を分離する傾向がある精製法いずれを用いて達成することも可能である。したがって、限定されるわけではないが、ＨＩＣ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびＳＥＣを含む、１以上のクロマトグラフィー工程を行うことが可能である。他の精製法は、いくつかのみを挙げると、ろ過（例えばタンジェンシャルフローろ過）、電気泳動技術（例えば電気泳動、電気溶出、等電点電気泳動）、および相分離（例えばＰＥＧ−デキストラン相分離）である。さらに、所望でないコンホメーションにあるタンパク質を含有する組換えタンパク質調製の分画を本発明の方法において再び処理して、所望のコンホメーションを持つタンパク質の収率をさらに最適化することが可能である。
【００４２】
例えば、処理後、以下の方法によって、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に関して、タンパク質試料を調製することが可能である。等体積の８５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５を処理試料に添加して、そして室温で平衡化する。ろ過（例えば０．２２μｍフィルターを用いる）後、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ブチル６５０−Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＬＬＣ、ペンシルバニア州モンゴメリービル）上、流速１５０ｃｍ／時間、および質量装填２．１ｍｇ・ｍｌ樹脂-1で、ＨＩＣクロマトグラフィーを行う。カラムは３カラム体積の４２５ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＰＯ4、ｐＨ６．５であらかじめ平衡化して、試料を装填し、そしてその後、３カラム体積の４２５ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＰＯ4、ｐＨ６．５で洗浄する。溶出は、全部で５カラム体積の、４２５ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＰＯ4、ｐＨ６．５から０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＰＯ4、ｐＨ６．５の勾配で行うことが可能である。溶出中に分画を収集可能である。カラムは、水３カラム体積、その後、０．１Ｍ  ＮａＯＨ  ３カラム体積で剥がすことが可能である。適宜、本発明の方法を用い、こうして、調製に存在する、最も活性があるコンホメーション（分画２）のＴＮＦＲ：Ｆｃを８５％より多く、９０％より多く、そしてさらに９５％より多く含有する、ＴＮＦＲ：Ｆｃ調製を得ることが可能である。したがって、分画２のこうした比率を含有するＴＮＦＲ：Ｆｃの、薬剤組成物を含む組成物もまた、本発明に提供する。
【００４３】
本発明はまた、所望により、タンパク質をさらに処方することも含む。用語「処方」によって、タンパク質が、最終使用者のため、緩衝液交換、滅菌、バルクパッケージングおよび／またはパッケージングされることが可能であることを意味する。本発明の目的のため、用語「無菌バルク型」は、微生物混入を含まないか、または本質的に含まず（食物および／または薬剤目的に適するような量まで）、そして定義される組成および濃度のものであることを意味する。用語「無菌単位投薬型」は、カスタマーおよび／または患者投与または消費に適した型を意味する。こうした組成物は、生理学的に許容しうる希釈剤、キャリアー、および／または賦形剤などの他の構成要素と組み合わせて、有効量のタンパク質を含んでなることが可能である。用語「薬学的に許容しうる」は、活性成分（類）の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性成分を意味する。投与に適した処方には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有可能な水性および非水性無菌注射溶液；並びに懸濁剤または粘稠化剤を含むことが可能な水性および非水性無菌懸濁物が含まれる。さらに、無菌バルク型および無菌単位型は、わずかな濃度（およそ１μＭ〜およそ１０ｍＭ）の還元／酸化カップリング試薬（例えばグルタチオン、システインなど）を含有することが可能である。ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに用いられる既知の方法にしたがって、処方することが可能である。これらは、単一の活性成分として、または既定の徴候に適した他の既知の活性成分と共に、薬学的に許容しうる希釈剤（例えば、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、およびリン酸緩衝溶液）、保存剤（例えば、チメロサル、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）および／またはキャリアーと混合して組み合わせ可能である。薬剤組成物に適した処方には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版，  １９８０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ペンシルバニア州イーストンに記載されるものが含まれる。さらに、こうした組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化しているか、そして／またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル類、デキストランなどのポリマー化合物に取り込まれているか、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多層小胞、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに取り込まれていてもよい。リポソーム処方に適した脂質には、限定なしに、モノグリセリド類、ジグリセリド類、スルファチド類、リゾレシチン、リン脂質類、サポニン、胆汁酸類等が含まれる。こうしたリポソーム処方の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；および米国特許第４，７３７，３２３号に開示されるように、当該技術分野の技術レベルの範囲内である。こうした組成物は、物理的状態、可溶性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を与えるであろうし、そしてしたがって、キャリアーの特性���選択された投与経路に応じるであろうように、意図される適用にしたがって選択される。使用に適した持続放出型には、限定されるわけではないが、緩慢溶解生体適合性ポリマー（米国特許第６，０３６，９７８号に記載されるアルギン酸微小粒子など）に被包されたポリペプチド、このようなポリマー（局所適用ヒドロゲル類を含む）と混合されたもの、およびまたは生体適合性半透性移植物中に入れられたものが含まれる。
【００４４】
本発明が記載されてきているが、以下の実施例は例示目的で提供され、そして限定目的でない。
（実施例１）
ＴＮＦＲ：Ｆｃ分画２および３の生物物理的評価
ＴＮＦＲ：Ｆｃは、分画１、分画２および分画３と称する３つの別個のピークとして、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）から溶出する（図１を参照されたい）。分画２が所望の分画である。分画３は、試料の２０〜６０％を含んでなる可能性があり、そして分画２と比較して、低いＴＮＦ結合活性およびＡ３７５生物活性を示すことが示されているため、特に興味深い分画であった。したがって、これら２つの分画間の相違を理解し、そしてどの要因が分画３の活性の損失に寄与しているのかを確かめるため、これが構造およびコンホメーションに関連することから、生物物理的研究を行った。本実施例において、円二色性、蛍光、オンラインＳＥＣ／ＵＶ／ＬＳ／ＲＩ、および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて、分画２および分画３を解析した。
【００４５】
材料および方法：
材料：出発材料はＴＭＳ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４％マンニトール、１％スクロース）中のＴＮＦＲ：Ｆｃであった。以下に記載する実験的研究のため、この材料のＨＩＣ溶出分画を分画２および３として単離した。
【００４６】
円二色性：近（２５０〜３４０ｎｍ）および遠（１９０〜２５０ｎｍ）領域において、研究を行った。近ＵＶ研究は、三次構造の相違を解明するために行い、一方、遠ＵＶ研究は、二次構造の相違を性質決定するために用いた。
【００４７】
近ＵＶ円二色性測定は、以下の濃度のＴＭＳ溶液中で行った。出発材料を６．２５ｍｇ／ｍｌに希釈し、一方、分画２および３は、それぞれ９．４および５．４ｍｇ／ｍｌの現存濃度で評価した。経路長０．１ｃｍの円二色性セルを用い、そして３４０〜２５０ｎｍでスキャンを行った。
【００４８】
遠ＵＶ円二色性測定は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に緩衝液交換したタンパク質を用いて行い、そして続いて、０．１ｃｍ経路長のセルを用いて、２５０〜１９０ｎｍまでスキャンして評価した。二次構造組成は、凸制約解析（ＣＣＡ）（Ｐｅｒｃｚｅｌら，  １９９１，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｒｇ．  ４：６６９−６７９）を用いて評価した。
【００４９】
蛍光分光法：およそ５０マイクログラム／ｍｌに希釈した後、２つの異なる励起波長を用いて、試料を調べた。チロシンおよびトリプトファン蛍光は、２７０ｎｍの励起で調べ、一方、トリプトファン蛍光は、２９５ｎｍの励起を用いて、それのみを評価した（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，  Ｊ．Ｒ．  “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”中，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８３．  ニューヨーク州ニューヨーク，  ３４２−３４３）。蛍光スキャンは、２７０ｎｍ励起の場合は３００〜４４０ｎｍに渡り、そして２９５ｎｍ励起の場合は３１０〜４４０ｎｍに渡った。各スペクトルに関して、４回の連続スキャンのシグナルを平均した。規準化したデータを報告して、試料から生じる頻度の相違を評価した。
【００５０】
オンラインＳＥＣ／ＵＶ／ＬＳ／ＲＩ：サイズ排除クロマトグラフィーを用いて溶出する構成要素の分子量を、一連の紫外（ＵＶ＠２８０ｎｍ）、光散乱（９０°）、および屈折率（ＲＩ）検出を用いて確かめた。この方法は、よく文書化されており（Ａｒａｋａｗａら，  １９９２，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０３：５３−５７およびＷｅｎら，  １９９６，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４０：１５５−１６６）、そしてグリコシル化されているタンパク質およびペプチドの非グリコシル化分子量を測定する利点を有する。ＢｉｏＳｉｌ−４００−５カラム（ＢｉｏＲａｄ）、流速１ｍｌ／分を用い、Ｉｎｔｅｇｒａｌ  ＨＰＬＣ系（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、ＳＥＣおよびＵＶデータを収集した。溶出緩衝液は１００ｍＭリン酸（ｐＨ６．８）および１００ｍＭ  ＮａＣｌからなった。ＤＡＷＮ  ＤＳＰ多角光散乱検出装置およびＯｐｔｉｌａｂ  ＤＳＰ屈折計は、どちらもＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．より購入した。装置定数を決定する較正標準には、ＢＳＡ二量体、ＢＳＡ単量体およびオボアルブミンを含んだ（図２）。
【００５１】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）：アップスキャンモードでＭｉｃｒｏＣａｌ  ＭＣ−２  ＤＳＣ装置を用いて、アンフォールディングの物理的特性を測定した。ｐＨ７．４の同一ＴＭＳ緩衝液に緩衝液交換することによって試料を調製した。試料は、約４ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有し、そして参照として緩衝液（タンパク質不含）に対して評価した。スキャン速度は６７℃／時間であり、２０℃〜９０℃の温度範囲であった。収集したスキャンを、続いて濃度規準化スキャンに変換し、濃度相違を考慮にいれつつ、アンフォールディング遷移のエンタルピーの振る舞いをよりよく比較した（データはｋｃａｌ／モルとして報告する）。
【００５２】
結果：
円二色性。平均残基楕円率に関して表した近ＵＶ円二色性測定を図２に示す。２７０ｎｍ付近の広い特徴における変化は、分画３のスペクトルにおける負の楕円率の比率がより大きいことによって示されるように、分画２および分画３間で明らかであった（図２Ａ中の矢印によって示される）。出発材料のスペクトルのふるまいは、分画２と緊密にマッチするが、２７０ｎｍ周辺の同一の領域でわずかな負の移動（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を示すことが注目された。この結果は、分画３が出発材料の少ない部分を構成し、そしてしたがって、この領域における全体の楕円率への寄与が非常に減少するが、同じ移動方向であるため、一定であるようであった。分画３のスペクトルは再現性があり、この試料で観察される移動が真のものであることが確認された。これを心に留め、そして円二色性スペクトルのこの領域において、ジスルフィドが広い負の楕円率特徴を生じる（Ｋａｈｎ，  Ｐ．Ｃ．，  １９７８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６１：３３９−３７８およびＫｏｓｅｎら，  １９８１，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：５７４４−５７５４を参照されたい）という知識を用いて、近ＵＶ円二色性スペクトルを曲線に当てはめて、この領域で観察される変化が、三次構造に関して、何を意味するのかを評価した。曲線に当てはめたデータの結果を図２Ｂに提示し、そしてこれは、分画３を分画２と比較した際、小さい赤色シフト（３ｎｍ）および増進した負の移動を示し、ジスルフィドを伴う三次構造変化を生じる寄与と一致した。
【００５３】
遠ＵＶ円二色性を用いて、タンパク質の二次構造組成が評価されてきている（Ｐｅｒｃｚｅｌら，  １９９１，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｒｇ．  ４：６６９−６７９）。ＣＣＡを用いた二次構造割り当てを行った。二次構造要素の合計で構成される、計算したスペクトルを実験で観察したスペクトルと比較して、そして優れた適合が示された。どちらの分画の二次構造も、実験の正確さの限界内（１０％以内）に匹敵した。したがって、この実験は、これらの２つの分画のいずれに関しても、二次構造に関するいかなる相違も区別しなかった。
【００５４】
蛍光分光法。有意な相違が近ＵＶ円二色領域に観察されることがわかったため、蛍光分光法を使用して、トリプトファンおよびチロシン蛍光に割り当て可能な、三次構造における相補的相違を確かめた。２つの励起波長を用いると、考慮される３つの場合（ＳＭ、分画２および３）すべてに関してスペクトルが重ねあわせ可能であり、３３８ｎｍ付近で蛍光最大値を持つことを決定可能であった。既定のタンパク質の三次元構造は、天然タンパク質の発光最大値に関与するため、これらの結果は、内在性フルオロフォア、トリプトファンおよびチロシンを持つ平均構造が乱されないことを示唆した。
【００５５】
オンラインＳＥＣ／ＵＶ／ＬＳ／ＲＩ。ＳＥＣを用いてオンラインで行った光散乱研究は、ＴＮＦＲ：Ｆｃの非グリコシル化ポリペプチド分子量（例えば１０２ｋＤ）と一致する主要溶出ピークの分子量を生じた。この技術を用いて評価した溶出種の組成には、明らかな相違があったが、分画３の溶出プロフィールを分画２と比較した際（図３ＡおよびＢ）、大部分の構成要素を含んでなる主要ピークは、それぞれ１０２．５±１．６ｋＤ（保持容量＝８．４ｍｌ）および１０１．９±２．１ｋＤ（保持容量＝８．３ｍｌ）であると測定された。図３において、正確さは、垂直な点線で囲んだ溶出ピークの端から端までの２３のスライスの標準偏差として表した。分画３の下降ショルダーの相当なシグナルによって、該ポリペプチド分子量が７８．１±３．７ｋＤである（この評価は８．８５ｍｌでラベルしたピーク周囲の８スライスを考慮した）という決定が可能になった。この構成要素の分子量決定に関連する正確さによって示されるように、このピークは、より大きい不均一性を示し、そしてその結果、主要ピークより大きい多分散が推測された。分画３はまた、ＴＮＦＲ：Ｆｃの主に二量体型の溶出体積と一致した（７．５付近）、有意な量の高分子量種も含有した。したがって、分画３が凝集体および分子の断片化部分を含む、いくつかの種で構成されることが決定された。
【００５６】
示差走査熱量測定。ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子のＴＮＦＲ部分のアンフォールディングにおいて有意な相違を生じる２つの分画に対して、ＤＳＣ測定を行った（図４）。ベースライン修正データでより明らかに示されるように（図４Ｂ）、５２．５℃のＴｍ（分画２）を４９．７℃のＴｍ（分画３）と比較した際、融点転移（Ｔｍ）には、より低い温度への２．８℃のシフトがある。転移は分画３に関してわずかにより広く、６．５℃の半値幅を有する分画２と比較して、転移最大値での半値幅は８℃であった。この低温転移は、ＴＮＦＲ：Ｆｃ単量体の熱アンフォールディング実験から、分子のＴＮＦＲドメインのためと同定されてきている。６９．１℃および８３．４℃の熱転移は、分子のＦｃ部分に割り当てられてきている。これらの後者の２つのアンフォールディング転移はよく並列され、そしてＴｍおよび構成要素エンタルピーに関して匹敵する。
【００５７】
考察：
試験した方法の中で、近ＵＶ円二色性およびＤＳＣ測定において、相違が観察された。示差走査熱量測定データは、分子の受容体部分に割り当て可能な構造の弛緩を支持し、Ｆｃ領域には変化はほとんど観察されなかった。近ＵＶ円二色性の結果は、ジスルフィドが分画３と関連する三次構造変化に関与することを示唆した。これらの変化は、埋め込まれたジスルフィドが溶媒により曝露されるようになった結果、生じる可能性があり、そして分画３のＨＩＣ溶出で観察される保持時間のわずかな増加によって示唆されるような、疎水性の増加を説明する可能性がある。コンホメーション構造において、こうした変化を示すであろう蛍光データには、識別可能な相違が見出されないことは興味深い。チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）の分布に関して、ＴＮＦＲ：Ｆｃの一次構造を考慮すると、ＴＮＦＲドメインの残基１０４のＣ末端部分から、ＦｃのＮ末端部分の残基２９６に伸長する領域（ＴＮＦＲ：Ｆｃの直線配列の４０％を含んでなる）がこれらの内在性フルオロフォアを欠いていることが明らかになる。したがって、データと一致する、１つのありうる説明は、Ｆｃヒンジ領域から離れた三次構造が比較的変化しない一方、ほぼ残基Ｃ１１５〜Ｃ２８１が、いくぶん、コンホメーション的に改変されうることである可能性がある。分子のこの領域は、おそらくチロシンおよびトリプトファンの局所構造に影響を与える構造変化をほとんど生じずに影響を受ける可能性がある、１０のありうるシステインを含んでなる。現在、この分子がどのようにフォールディングするかに関しては未知であり、そして既定のトリプトファンまたはチロシン残基からより離れたジスルフィドを構成するシステインが、観察された近ＵＶ円二色性結果を生じるが、チロシンおよびトリプトファンを含む近隣構造に対してほとんど影響を示さない、三次構造変化の論理的被疑対象でありうるようであろうことが注目される。この考え方は、チロシンおよびトリプトファンから生じる蛍光の正味の影響に認識しうる変化を引き起こさない、ＴＮＦＲアームの１つまたは両方の中の構造に何らかの異常な変化がある可能性を排除しない。蛍光データ（ジスルフィドに集中的である）が変化を示さず、そして近ＵＶ（ジスルフィド、チロシン、およびトリプトファンに感受性である）がジスルフィド構造修飾と一致する小さい負の移動を示すという事実は、ジスルフィドが分画２および３間の相違において役割を果たすことを暗示する。
【００５８】
分画３に関して生じた残りのデータを要約すると、分子量および二次構造に関連する側面は、分画２とは区別不能であることが見出された。
（実施例２）
グルタチオンを用いた、ＴＮＦＲ：Ｆｃ分画３に対するジスルフィド交換実験
この実験は、大規模産生実行に受け入れやすい方法で、ＴＮＲＦ：Ｆｃ分画３を分画２のコンホメーションに駆動する、多様な処理を評価するため、設計した。
【００５９】
材料および方法：
材料。出発材料はプロテインＡ溶出物としてのＴＮＦＲ：Ｆｃ、分画３の純粋ＨＩＣ溶出物、並びにＨＩＣ溶出物分画２および分画３の５０：５０混合物であった。緩衝液は、０．１Ｍクエン酸または０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／グリシン、ｐＨ７．６、ｐＨ８．６またはｐＨ９．６であった。ＴＮＦＲ：Ｆｃのタンパク質濃度は、０．２〜４．５ｍｇ／ｍｌであった。還元グルタチオンおよびグルタチオン（１０：１の比のＧＳＨ／ＧＳＳＧ）レドックス（ｒｅｄｏｘ）カップリング系を、０．１〜５ｍＭ  ＧＳＨで添加した。インキュベーション温度は、４℃、２２℃または３１℃で多様であった。
【００６０】
方法。１Ｍ酢酸を用いて、試料をｐＨ６に酸性化することによって、ジスルフィド交換を終了した。処理した組換えタンパク質調製は、分析ＨＩＣ、ＳＥＣ（保持時間、凝集物濃度）および固相ＴＮＦ結合アッセイによって特徴付けて、分画２の割合および収量を決定した。
【００６１】
結果および考察：
ｐＨおよびＧＳＨ濃度の関数としての処理効率。０．１ｍＭ  ＧＳＨ／ｐＨ７．６および０．１ｍＭ  ＧＳＨ／ｐＨ８．６両方で処理を行った際、分画３中のタンパク質の有意な％（少なくとも１０％）が分画２に変換された。しかし、０．１ｍＭ  ＧＳＨ／ｐＨ９．６；１ｍＭ  ＧＳＨ／ｐＨ７．６；１ｍＭ  ＧＳＨ／ｐＨ８．６；および１ｍＭ  ＧＳＨ／ｐＨ９．６で処理を行った際、効率は非常に改善された（４５％〜ほぼ７０％）。したがって、処理効率は、ｐＨおよび未結合チオール濃度に感受性であるが、これらの変数の広い範囲に渡って、効果的に実行可能である。
【００６２】
温度の影響。３つの異なる温度、４℃、２２℃および３１℃で、分画３を処理した。ＧＳＨ濃度は、１ｍＭ、およびｐＨ８．６で保持した。１６時間後、処理群はすべて、分画３から分画２への有意な変換を示したが、変換は、２つのより低い温度での際に、わずかにより効率的であるようであった。
【００６３】
クローンの影響。上述の結果に基づいて、標準化したプロトコルにおいて、すべてＴＮＦＲ：Ｆｃを産生する６つの異なる細胞株クローンを試験した。特に、０．４〜０．７ｍｇ／ｍｌのＴＮＦＲ：Ｆｃ（約ｐＨ４）を含有するプロテインＡ溶出を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ／グリシンを用いてｐＨ８．６に調整した（最終濃度０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／グリシン）。これらの溶液を１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２．５ｍＭ  ＧＳＨ／０．２５ｍＭ  ＧＳＳＧに調整し、そして室温で約１６時間インキュベーションした。ジスルフィド交換は、上述のように、酸性化によって抑制した。
【００６４】
６つの異なる各クローンはすべて、分画２の産生および収率に改善を示した。多様なクローンにおける処理によるＨＩＣ分画３の減少は、６４％、７２％、７７％、７８％、７８％および８３％であった。同一クローン中のＨＩＣ分画２の増加は、それぞれ、３７％、６４％、７８％、７０％、４４％および５４％であった。ＨＩＣ分画２の増加パーセントは、図５に示すように、結合単位の増加％とよく相関した。したがって、該方法は、一般的に、試験したすべてのクローンに渡って適用可能であるようであった。
【００６５】
結合アッセイ。ＴＮＦＲ：Ｆｃの３つの異なる調製を固相ＴＮＦ結合アッセイでアッセイした。試料１１−６および１２は、プロテインＡカラムからの溶出物であった。試料８０８５−４７もまた、プロテインＡカラムから溶出し、そしてその後、さらなるＨＩＣ精製工程に供した；この試料はもっぱら分画３を含有した。試料は、上述のようにジスルフィド交換の前後に、結合アッセイで調べた。以下の表１に示す結果は、すべての試料をグルタチオンで処理した後、リガンド結合活性が増加することを示す。
【００６６】
表１
ジスルフィド交換前後のＴＮＦＲ：ＦｃのＴＮＦ結合活性
【００６７】
【表１】
2005505494.tif 000002
【００６８】
（実施例３）
Ｌ−システインで処理したＴＮＦＲ：Ｆｃに対するジスルフィド交換実験
本実験は、ＴＮＦＲ：Ｆｃの還元／酸化カップリング試薬としてシステイン／シスチンを評価するように設計した。該方法は、大規模産生実行に受け入れやすい方法で、ＨＩＣ分画３の、分画２のコンホメーションへの変化を評価するのを可能にする。方法は、精製分画３、分画２および３の混合物に対して行うことが可能であり、そして／またはプロテインＡクロマトグラフィーなどの他の分離技術にしたがうことが可能であり、同様の結果を生じた。
【００６９】
材料および方法：
出発材料は、分画３の純粋ＨＩＣ溶出物としての、または分画２および３両方を含有するプロテインＡ溶出ＴＮＦＲ：ＦｃとしてのＴＮＦＲ：Ｆｃであった。緩衝液は、０．１Ｍクエン酸または０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５であった。ＴＮＦＲ：Ｆｃのタンパク質濃度は、２．５〜３ｍｇ／ｍｌであった。
【００７０】
Ｌ−システイン（０〜５０ｍＭで多様である）のレドックスカップリング系を利用した。該方法はまた、＋／−  Ｌ−システイン（０．０２５〜０．５ｍＭ）および＋／−  １ｍＭ  ＥＤＴＡも評価した。４、１５、および２２℃で、６、１８、および４８時間、インキュベーション温度を評価した。ジスルフィド交換は、ＮａＨ2ＰＯ4または０．８５Ｍクエン酸で、試料をｐＨ７に酸性化することによって終了した。処理した組換えタンパク質調製は、分画２および分画３の割合および収量を決定する分析ＨＩＣおよびＳＥＣ（保持時間、凝集物濃度）、システイン化（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ）並びに未結合スルフヒドラルアッセイによって性質決定した。
【００７１】
結果および考察：
Ｌ−システイン濃度（０〜５ｍＭ）の関数としての処理効率。４つの複製試料において、Ｌ−シスチンまたはＥＤＴＡの非存在下で、０．２５ｍＭ  Ｌ−システインで処理を行った場合、ＨＩＣ分画３中のＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質の有意な割合（平均１０％）が分画２に変換された（図６）。しかし、１ｍＭ  Ｌ−システインまたは５ｍＭ  Ｌ−システインで処理を行った際、効率は非常に改善された（４５％〜ほぼ７０％）（図６）。これらの反応条件におけるシスチンの影響は、ＥＤＴＡ存在で異なった（以下を参照されたい）。既定の細胞培養バッチ（４つの異なる細胞培養バッチ由来の試料を処理した）に関して、処理プロセスは再現可能であった。
【００７２】
より高いＬ−システイン濃度（５〜５０ｍＭ）の関数としての処理効率。より高い濃度のＬ−システイン（５、１５および５０ｍＭ  Ｌ−システイン）を用いてＴＮＦＲ：Ｆｃを処理すると、各場合で、出発材料からのＨＩＣ分画３の減少を生じたが、分画２の集積を促進するのに、５ｍＭ  Ｌ−システインが最も有効であった（図７）。より高い濃度のＬ−システインは、分子中のスルフヒドリル部分を有意に減少したか、または再酸化するのにあまりにも長時間を必要としたかいずれかであると推測される。
【００７３】
さらなるＬ−システイン供給の関数としての処理効率。ジスルフィド交換効率を増加させることを試みるため、ＴＮＦＲ：Ｆｃを５ｍＭ  Ｌ−システインで処理し、そして４℃で１８時間インキュベーションした。その後、さらなるＬ−システイン（０〜５ｍＭ）を添加し、そして試料を４℃でさらに２日間インキュベーションした。これらの条件下で、さらなるＬ−システイン供給によって、ＨＩＣ分画３対分画２の比に対する有意な影響は注目されなかった。
【００７４】
ＥＤＴＡ、シスチンおよびＬ−システインの影響。ＴＮＦＲ：Ｆｃに対する、Ｌ−システイン（５ｍＭ）と組み合わせたシスチン（０〜０．４ｍＭ）の影響を、１ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下または非存在下で評価した。１ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下での最適結果は、０．１〜０．２ｍＭの範囲のシスチン濃度で生じた。
【００７５】
銅、温度および時間の影響。ＴＮＦＲ：Ｆｃを、４℃および２２℃で、６または１８時間、５ｍＭ  Ｌ−システインで処理した。ＴＮＦＲ：Ｆｃ処理の完了を、銅添加後のＨＩＣによってアッセイした。インキュベーション６時間後、ジスルフィド交換は、２２℃より４℃でより完全であり、そして処理は４℃での１８時間後、明らかにより完全である（図８Ａおよび８Ｂ）。
【００７６】
分析規模対調製規模Ｌ−システイン処理効率の比較。小規模で最適化した処理条件に基づき、３ｍｌまたは２０ｌ量いずれかのＴＮＦＲ：Ｆｃ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５中、２．５ｍｇ／ｍｌ）を５ｍＭ  Ｌ−システイン（システインまたはＥＤＴＡの非存在下）で処理し、４℃で１８時間インキュベーションし、等体積の８５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５で希釈して、処理を抑制し、そしてＨＩＣ上でクロマトグラフした。調製規模ＴＮＦＲ：Ｆｃおよび分析規模ＴＮＦＲ：Ｆｃの対照試料は、それぞれ６３％および６８％の分画３を有した。上述の条件で処理した後、分画３は調製規模および分析規模両方で２８％に減少した。したがって、処理効率は、調製規模試料および分析規模試料で、それぞれ５６％および５９％であった（表２）。この実験は、該方法がより大きい規模の処理に受け入れやすいことを立証する。
【００７７】
表２
分析規模対調製規模ジスルフィド交換法
【００７８】
【表２】
2005505494.tif 000003
【００７９】
したがって、処理レドックス効率は、未結合チオール濃度、温度および時間に影響されるが、効率的に最適化し、そして広い範囲の変数に渡って行うことが可能である。処理プロトコルもまた、再現性をもって、小規模および大規模両方で実行可能である。
【００８０】
本発明は、本発明の個々の側面の単一の例示として意図する、本明細書に記載する特定の態様によって範囲を限定されるものでなく、そして機能的に均等な方法および構成要素が本発明の範囲内である。実際、当業者には、本明細書に示し、そして記載するものに加えて、前述の説明および付随する図から本発明の多様な修飾が明らかとなるであろう。こうした修飾は、付随する請求項の範囲内に属すると意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＴＮＦＲ：Ｆｃの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。ＴＮＦＲ：Ｆｃのこの調製は、示すように、ＨＩＣ中、分画２および分画３に集めた、３つの別個のピークとして溶出する。
【図２】分画２および３の円二色性解析。平均残基楕円率に関して表した近ＵＶ円二色性測定値を図２に示す。図２Ａはスペクトルデータを示し；分画３の線が、ジスルフィド寄与に帰する約２７０ｎｍの負の移動を強調する矢印に最も近く、そして分画２の線は、より濃い実線である。図２Ｂは、分画２（細い点線）および分画３（太い点線）の曲線に当てはめたデータを示す。
【図３】一連のオンラインサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、紫外（ＵＶ）、光散乱（ＬＳ）、および屈折率（ＲＩ）検出を用いた分子量測定（オンラインＳＥＣ／ＵＶ／ＬＳ／ＲＩ）。図３Ａは分画３であり、そして図３Ｂは分画２である。垂直な点線は、主ピークを取り巻く領域において、分子量測定にどこのスライスを評価したかを示す。
【図４】分画２および３の示差走査熱量測定解析。図４Ａは未修正データであり、そして図４Ｂはベースライン修正データを示す。熱融解転移を垂直な点線でラベルする。矢印はエンタルピー移動を示す。図４Ｂの水平な点線はベースライン参照として用いる。
【図５】分画２および結合活性の相関。６つの異なる細胞株からのＴＮＦＲ：Ｆｃの６つの異なる調製（ＡからＦと示す）を、分画２の比率の増加パーセント（黒いひし形）およびＴＮＦアルファ結合単位の増加パーセント（白いひし形）間の相関に関して試験した。
【図６】分画３を分画２に変換する際のシステイン濃度変化の影響。タンパク質試料を多様な濃度のシステイン（０．２５〜５．０ｍＭ）で処理し、そしてＨＩＣを用いて分画３の変化を評価した。４つの異なるロットのＴＮＦＲ：Ｆｃをｘ軸上に示すシステイン濃度で１８時間処理した。各ロットにおいて、分画２に変換された分画３のパーセントをｙ軸上にプロットする。
【図７】分画３の比率に対するシステイン濃度の影響。４つの異なるロット由来のタンパク質試料を多様な濃度のシステイン（０〜５０ｍＭ）で処理し、そして分画３が生じたレベルをＨＩＣで評価した。
【図８Ａ】ジスルフィド交換に対する温度の影響。タンパク質分画を、銅の存在下または非存在下で、多様な時間、室温または４℃で処理した。図８Ａは、６時間後のＨＩＣ分画３の変化を示し、そして図８Ｂは、１８時間後のＨＩＣ分画３の変化を示す。
【図８Ｂ】ジスルフィド交換に対する温度の影響。タンパク質分画を、銅の存在下または非存在下で、多様な時間、室温または４℃で処理した。図８Ａは、６時間後のＨＩＣ分画３の変化を示し、そして図８Ｂは、１８時間後のＨＩＣ分画３の変化を示す。
【図１】
2005505494.tif 000004
【図２】
2005505494.tif 000005
【図３】
2005505494.tif 000006
【図４】
2005505494.tif 000007
【図５】
2005505494.tif 000008
【図６】
2005505494.tif 000009
【図７】
2005505494.tif 000010
【図８Ａ】
2005505494.tif 000011
【図８Ｂ】
2005505494.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2005505494.tif 000013
2005505494.tif 000014
2005505494.tif 000015
2005505494.tif 000016
2005505494.tif 000017
2005505494.tif 000018
2005505494.tif 000019
2005505494.tif 000020
2005505494.tif 000021
2005505494.tif 000022
2005505494.tif 000023
2005505494.tif 000024
2005505494.tif 000025
2005505494.tif 000026
2005505494.tif 000027
2005505494.tif 000028
2005505494.tif 000029
2005505494.tif 000030
2005505494.tif 000031
2005505494.tif 000032
2005505494.tif 000033
2005505494.tif 000034
2005505494.tif 000035
2005505494.tif 000036
2005505494.tif 000037
2005505494.tif 000038
2005505494.tif 000039
2005505494.tif 000040
2005505494.tif 000041
2005505494.tif 000042
2005505494.tif 000043
2005505494.tif 000044
2005505494.tif 000045
2005505494.tif 000046
2005505494.tif 000047
2005505494.tif 000048
2005505494.tif 000049
2005505494.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505494.tif 000051
【国際調査報告】
2005505494.tif 000052
2005505494.tif 000053
2005505494.tif 000054
2005505494.tif 000055
2005505494.tif 000056