(57)【要約】  本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡの非特異的増幅を減少するための方法を提供する。この方法は、目的の標的ＤＮＡ配列を含むサンプルを提供する工程；そのサンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素と接触させる工程；およびそのサンプルを、その標的ＤＮＡ配列を増幅するために十分な時間の間かつその標的ＤＮＡ配列を増幅するために十分な条件下で、その酵素とともにインキュベートして、増幅された標的ＤＮＡ配列を形成する工程；を包含し、ここでこのインキュベーションは、ソルビトールの非存在下またはソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で観察される非特異的増幅の量に対して非特異的増幅を減少するために有効な量のソルビトールの存在下またはソルビトールおよびＤＭＳＯの存在下で、実施される。この方法は、（特に、臨床サンプル由来の）リボソームＤＮＡの増幅のために適切である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡの非特異的増幅を減少するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）目的の標的ＤＮＡ配列を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素と接触させる工程；および
（ｃ）該サンプルを、該標的ＤＮＡ配列を増幅するために十分な時間の間かつ該標的ＤＮＡ配列を増幅するために十分な条件下で、該酵素とともにインキュベートして、増幅された標的ＤＮＡ配列を形成する工程；
を包含し、
ここで該インキュベーションは、ソルビトールの非存在下で観察される非特異的増幅の量に対して非特異的増幅を減少するために有効な量のソルビトールの存在下で、実施される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ＤＭＳＯの非存在下で観察される前記増幅された標的ＤＮＡ配列の量に対して該増幅された標的ＤＮＡ配列の収量を増加するために有効な量のＤＭＳＯをさらに含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記ソルビトールが、０．０５Ｍ〜３Ｍの量で存在する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記ソルビトールが、０．１Ｍ〜２Ｍの量で存在する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記ソルビトールが、０．２Ｍ〜１Ｍの量で存在する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記ソルビトールが、０．２５Ｍ〜０．５Ｍの量で存在する、方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、０．５％〜８．０％の量で存在する、方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、１．０％〜６．０％の量で存在する、方法。
【請求項９】
請求項２に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、２．０％〜５．０％の量で存在する、方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、３．０％〜４．０％の量で存在する、方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、１．２５％の量で存在し、かつ前記ソルビトールが、０．１５Ｍの量で存在する、方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法であって、前記非特異的増幅が、前記ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で得られる非特異的増幅の量の９９％以上よりも少ない量まで減少される、方法。
【請求項１３】
請求項２に記載の方法であって、前記非特異的増幅が、前記ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で得られる非特異的増幅の量の９０％未満へと減少される、方法。
【請求項１４】
請求項２に記載の方法であって、前記非特異的増幅が、前記ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で得られる非特異的増幅の量の８０％未満へと減少される、方法。
【請求項１５】
請求項２に記載の方法であって、前記非特異的増幅が、前記ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で得られる非特異的増幅の量の７０％未満へと減少される、方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の方法であって、前記非特異的増幅が、前記ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で得られる非特異的増幅の量の６０％未満へと減少される、方法。
【請求項１７】
請求項２に記載の方法であって、前記非特異的増幅が、前記ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で得られる非特異的増幅の量の５０％未満へと減少される、方法。
【請求項１８】
請求項２に記載の方法であって、前記非特異的増幅が、前記ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で得られる非特異的増幅の量の４０％未満へと減少される、方法。
【請求項１９】
請求項２に記載の方法であって、前記非特異的増幅が、前記ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で得られる非特異的増幅の量の３０％未満へと減少される、方法。
【請求項２０】
請求項２に記載の方法であって、前記増幅された標的配列が、全増幅産物のうちの少なくとも５０％〜７０％を示す、方法。
【請求項２１】
請求項２に記載の方法であって、前記増幅された標的配列が、全増幅産物のうちの少なくとも７０％〜９０％を示す、方法。
【請求項２２】
請求項２に記載の方法であって、前記増幅された標的配列が、全増幅産物のうちの少なくとも９０％を示す、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、前記ＤＮＡが、リボソームＲＮＡをコードする、方法。
【請求項２４】
請求項２に記載の方法であって、前記ＤＮＡが、リボソームＲＮＡをコードする、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法であって、前記増幅が、核酸塩基配列を、ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｔｎｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ；ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体からなる群より選択される、方法。
【請求項２８】
請求項２に記載の方法であって、前記増幅が、核酸塩基配列を、ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項３０】
請求項２に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｔｎｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ；ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体からなる群より選択される、方法。
【請求項３１】
ポリメラーゼ連鎖反応においてリボソームＤＮＡを増幅する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）目的の標的リボソームＤＮＡ配列を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）該リボソームＤＮＡの少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅して、全増幅産物の混合物中に増幅されたリボソームＤＮＡを形成する工程；
を包含し、
ここで該増幅は、ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で観察される非特異的増幅の量に対して非特異的増幅を減少するために十分な量のソルビトールおよびＤＭＳＯの存在下で、実施される、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記ソルビトールが、０．０５Ｍ〜３Ｍの量で存在する、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記ソルビトールが、０．１Ｍ〜２Ｍの量で存在する、方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法であって、前記ソルビトールが、０．２Ｍ〜１Ｍの量で存在する、方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法であって、前記ソルビトールが、０．２５Ｍ〜０．５Ｍの量で存在する、方法。
【請求項３６】
請求項３１に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、０．５％〜８．０％の量で存在する、方法。
【請求項３７】
請求項３１に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、１．０％〜６．０％の量で存在する、方法。
【請求項３８】
請求項３１に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、２．０％〜５．０％の量で存在する、方法。
【請求項３９】
請求項３１に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、３．０％〜４．０％の量で存在する、方法。
【請求項４０】
請求項３１に記載の方法であって、前記ＤＭＳＯが、１．２５％の量で存在し、かつ前記ソルビトールが、０．１５Ｍの量で存在する、方法。
【請求項４１】
請求項３１に記載の方法であって、前記増幅が、前記核酸塩基配列を、ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４２】
請求項３１に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項４３】
請求項３１に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｔｎｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ；ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体からなる群より選択される、方法。
【請求項４４】
組成物であって、
（ａ）リボソームＤＮＡをコードする配列を含む、核酸分子；
（ｂ）該リボソームＤＮＡと近接する核酸配列部分と相補的な配列を有する、少なくとも２つのプライマー；
（ｃ）核酸ポリメラーゼ活性を有する、少なくとも１つの酵素；および
（ｄ）ソルビトール；
を含む、組成物。
【請求項４５】
ＤＭＳＯをさらに含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
ＤＮＡの増幅のためのキットであって、該キットは、１つ以上の容器中に、
ポリメラーゼ活性を含む薬剤；
複数のデオキシヌクレオチド三リン酸；および
ソルビトール；
を含み、ここで該ソルビトールは、ソルビトールの非存在下で観察される非特異的増幅の量に対して非特異的増幅を減少するために有効な量で提供されている、キット。
【請求項４７】
ＤＭＳＯをさらに含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
請求項４６に記載のキットであって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼから選択される、キット。
【請求項４９】
請求項４６に記載のキットであって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｔｎｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ；ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体からなる群より選択される、キット。
【請求項５０】
請求項４７に記載のキットであって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼから選択される、キット。
【請求項５１】
請求項４７に記載のキットであって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｔｎｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ；ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体からなる群より選択される、キット。
【請求項５２】
サンプル中の細菌を検出する方法であって、該方法は、
核酸を含むサンプルを提供する工程；および
該核酸の少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅し、それにより、増幅産物を形成する工程；
を包含し、該核酸は、少なくとも１つのリボソームＤＮＡ配列を含み、該増幅は、ソルビトールの非存在下で観察される非特異的増幅の量に対して非特異的増幅を減少するために有効な量のソルビトールの存在下で、実施される、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、前記増幅工程が、ＤＭＳＯの非存在下で観察される非特異的増幅の量に対して非特異的増幅を減少するために有効な量のＤＭＳＯをさらに含む、方法。
【請求項５４】
請求項５２に記載の方法であって、前記増幅工程が、前記核酸配列を、ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項５６】
請求項５４に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｔｎｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ；ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体からなる群より選択される、方法。
【請求項５７】
請求項５３に記載の方法であって、前記増幅工程が、前記核酸配列を、ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項５９】
請求項５７に記載の方法であって、前記ポリメラーゼ活性を有する酵素が、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｔｎｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ；ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体からなる群より選択される、方法。
【請求項６０】
請求項５２に記載の方法であって、該方法は、
前記増幅産物の核酸配列を決定する工程；および
該増幅産物の核酸配列を、既知の細菌リボソームＤＮＡ配列と比較する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項６１】
請求項５３に記載の方法であって、該方法は、
前記増幅産物の核酸配列を決定する工程；および
該増幅産物の核酸配列を、既知の細菌リボソームＤＮＡ配列と比較する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項６２】
請求項６０に記載の方法であって、前記増幅産物の核酸配列を決定する工程の前に、該増幅産物が精製される、方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法であって、前記増幅産物の核酸配列を決定する工程の前に、該増幅産物が精製される、方法。
【請求項６４】
請求項５５に記載の方法であって、前記サンプルが、血液、尿、脳脊髄液、血清、唾液、粘液、皮膚切屑、胃分泌物、および便からなる群より選択される臨床サンプルである、方法。
【請求項６５】
請求項５３に記載の方法であって、前記サンプルが、血液、尿、脳脊髄液、血清、唾液、粘液、皮膚切屑、胃分泌物、および便からなる群より選択される臨床サンプルである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応における非特異的増幅を減少することに関する。具体的には、本発明は、標的分子の収量を増加するために有効な量で、ポリメラーゼ連鎖反応においてソルビトールおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の背景）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、特定のＤＮＡフラグメントの増幅および分析を可能にすることによって、分子生物学の分野を非常に進歩させた。原理上簡単であるが、ＰＣＲは、分析を挫折させ得るいくつかの型の人工産物を生じる傾向がある。例えば、観察されるフラグメントの非特異的増幅は、標的配列以外の配列に結合するプライマーのうちの一方または両方から生じ得、かつ所望される産物ではない１つ以上のＤＮＡフラグメントを生成し得る。
【０００３】
ＤＮＡの非特異的増幅は、しばしば、保存配列（例えば、リボソームＤＮＡ）の増幅において問題である。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、細胞中に存在する断然最も豊富なＲＮＡ種であり、代表的には、細胞中の全ＲＮＡのうちの８５％〜９０％を示す。ｒＲＮＡは、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）によりコードされる。ｒＲＮＡの各サブユニットは、別個のｒＤＮＡによってコードされるが、複数のｒＲＮＡ遺伝子が、ほとんどの生物中に存在する。真核生物のミトコンドリアおよび植物の葉緑体もまた、それ自体のｒＲＮＡ遺伝子を含む。
【０００４】
リボソームＲＮＡは、遺伝子分析、進化研究、および分類学的分類のためのハイブリダイゼーション研究において使用されている。しかし、ｒＲＮＡ配列は、広範に異なる生物において少なくとも部分的に類似しており、近縁生物由来のｒＲＮＡ遺伝子配列のうちのほぼすべてが、交差ハイブリダイズする。ＰＣＲ研究において、ｒＤＮＡ配列の特異的増幅は、その配列の関連性に起因して、困難である。しばしば、ＰＣＲにおけるｒＤＮＡの増幅は、非特異的増幅を生じ、分析を非常に複雑にする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明の方法のいくつかの実施形態に従って、ポリメラーゼ連鎖反応におけるＤＮＡの非特異的増幅を減少する方法が、提供される。この方法は、
（ａ）目的の標的ＤＮＡ配列を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）上記サンプルを、核酸ポリメラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素と接触させる工程；および
（ｃ）上記サンプルを、上記標的ＤＮＡ配列を増幅するために十分な時間の間かつ上記標的ＤＮＡ配列を増幅するために十分な条件下で、上記酵素とともにインキュベートして、増幅された標的ＤＮＡ配列を形成する工程；
を包含し、ここで上記インキュベーションは、ソルビトールの非存在下またはソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で観察される非特異的増幅の量に対して非特異的増幅を減少するために有効な量のソルビトールの存在下またはソルビトールおよびＤＭＳＯの存在下で、実施される。
【０００６】
また、ポリメラーゼ連鎖反応においてリボソームＤＮＡを増幅する方法も、いくつかの実施形態において提供される。この方法は、
（ａ）目的の標的リボソームＤＮＡ配列を含むサンプルを提供する工程；
（ｂ）上記リボソームＤＮＡの少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅して、全増幅産物の混合物中に増幅されたリボソームＤＮＡを形成する工程；
を包含し、ここで上記増幅は、ソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で観察される非特異的増幅の量に対して非特異的増幅を減少するために十分な量のソルビトールおよびＤＭＳＯの存在下で、実施される。
【０００７】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、サンプル中の細菌を検出する方法が提供される。この方法は、核酸を含むサンプルを提供する工程；および上記核酸の少なくとも１つの核酸塩基配列を増幅し、それにより、増幅産物を形成する工程；を包含し、上記核酸は、少なくとも１つのリボソームＤＮＡ配列を含み、上記増幅は、ソルビトールの非存在下で観察される非特異的増幅の量に対して非特異的増幅を減少するために有効な量のソルビトールの存在下で、実施される。上記増幅工程はまた、ソルビトールと組み合わせた、有効量のＤＭＳＯを含み得る。
【０００８】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ソルビトールは、０．０５Ｍ〜３．０Ｍの量で存在し得る。あるいは、ソルビトールは、０．０５Ｍ〜２Ｍの量で存在し得る。他の実施形態において、ソルビトールは、０．０５Ｍ〜１Ｍの量で存在し得る。他の実施形態において、ソルビトールは、０．０５Ｍ〜０．７５Ｍの量で存在し得る。他の実施形態において、ソルビトールは、０．１Ｍ〜０．４５Ｍの量で存在し得る。他の実施形態において、ソルビトールは、０．２Ｍ〜０．４Ｍの量で存在し得る。他の実施形態において、ソルビトールは、０．２５Ｍ〜０．３５Ｍの量で存在し得る。
【０００９】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＤＭＳＯは、０．５％〜８．０％の量で存在し得る。他の実施形態において、ＤＭＳＯは、１．０％〜６．０％の量で存在し得る。他の実施形態において、ＤＭＳＯは、２．０％〜５．０％の量で存在し得る。他の実施形態において、ＤＭＳＯは、３．０％〜４．０％の量で存在し得る。
【００１０】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＤＭＳＯが、１．２５％の量で存在し、かつソルビトールが、０．１５Ｍの量で存在する。
【００１１】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、非特異的増幅が、ソルビトールの非存在下またはソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下で得られる非特異的増幅の量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、または４０％、３０％またはそれ以上よりも少ない量まで減少される。
【００１２】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、増幅された標的配列は、全増幅産物のうちの少なくとも５０％〜７０％を示す。他の実施形態において、増幅された標的配列は、全増幅産物のうちの少なくとも７０％〜９０％を示す。他の実施形態において、増幅された標的配列は、全増幅産物のうちの少なくとも９０％を示す。
【００１３】
特定の実施形態において、本発明の方法は、リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡの非特異的増幅を減少するために適切である。
【００１４】
本発明の方法のいくつかの実施形態は、増幅産物が、篩い分け媒体または非篩い分け媒体を使用して、その後分離され得る。増幅産物の核酸配列は、事前分離を用いてかまたは事前分離を用いることなく、決定され得る。
【００１５】
リボソームＤＮＡを含むサンプルは、臨床サンプル（例えば、血液、尿、脳脊髄液、血清、唾液、粘液、皮膚、胃分泌液、および／または便）であり得る。  
【００１６】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、その増幅は、上記核酸塩基配列を、ポリメラーゼ活性を有する酵素と接触させることを包含する。例えば、そのポリメラーゼ活性を有する酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、他のＴｈｅｒｍｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択され得る。例えば、適切なポリメラーゼとしては、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ；ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体が挙げられる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明はまた、組成物を提供する。この組成物は、
（ａ）リボソームＤＮＡを含む、核酸配列；
（ｂ）上記リボソームＤＮＡと近接する核酸配列部分と相補的な配列を有する、少なくとも２つのプライマー；
（ｃ）核酸ポリメラーゼ活性を有する、少なくとも１つの酵素；および
（ｄ）ソルビトール、またはソルビトールおよびＤＭＳＯ；
を含む。
【００１８】
他の実施形態において、本発明は、リボソームＤＮＡの増幅のためのキットを提供する。このキットは、１つ以上の容器中に、ポリメラーゼ活性を含む薬剤；複数のデオキシヌクレオチド三リン酸；およびソルビトールを含み、必要に応じて、ＤＭＳＯを含む。このキットのポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ。他のＴｈｅｒｍｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来のＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種由来のＤＮＡポリメラーゼであり得る。例えば、適切なポリメラーゼとしては、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ；ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体が挙げられる。
【００１９】
（詳細な説明）
本明細書中に言及されている参考研究、特許、特許出願、ならびに科学文献および他の印刷刊行物（ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列に対する登録番号を含む）は、当業者の知見を確立し、その全体が本明細書中に参考として援用される。本明細書中に引用されるいずれかの参考文献と本明細書の詳細な教示との間に矛盾が生じる場合、本明細書が支配する。
【００２０】
本明細書中で使用される用語のほとんどは、当業者によってその用語に帰属される意味を有する。本明細書中に詳細に規定される用語は、全体として、代表的には当業者によって理解されるような、本発明の文脈において提供される意味を有する。当該分野で理解されている用語または句の定義と、本明細書中で詳細に教示される用語または句の定義との間に矛盾が生じる場合、本明細書が支配する。本明細書中で使用される見出しは、単に簡便さのために過ぎず、限定するものとしては全く解釈されるものではない。
【００２１】
当業者にとって公知である組換えＤＮＡ技術の一般的原理を示す標準的参考研究としては、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＪおよびＤ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）；Ｋａｕｆｍａｎら編，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９５；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１が挙げられる。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ＤＭＳＯ」とは、ジメチルスルホキシドを指す。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ソルビトール」とは、以下の構造式：
【００２４】
【化１】
2005512572.tif 000002
【００２５】
によって示される、グルコースに対応するポリオール（ポリヒドロキシアルコール）を指す。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「単離された核酸分子」とは、その分子のネイティブ環境から取り出されている核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「ＤＮＡ」とは、当該分野理解されるような種々の形態のデオキシリボ核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、単離された核酸分子、ベクターＤＮＡ、染色体ＤＮＡ）を指す。「核酸」とは、任意の形態のＤＮＡまたはＲＮＡを指す。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持されている組換えＤＮＡ分子、部分精製された核酸分子または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、「単離された」核酸分子は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でその核酸と天然で隣接する配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術により生成された場合には他の細胞物質も培養培地も概して実質的には含まず、または化学合成された場合には化学物質前駆体も他の化学物質も概して実質的には含まない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「ｒＤＮＡ」とは、リボソームＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を指す。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「核酸塩基配列」とは、連続する核酸塩基の配列を指す。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「非特異的増幅」とは、標的ＤＮＡであるＤＮＡ部分ではない、ＤＮＡ領域の増幅を指す。従って、非特異的増幅は、標的配列とは関連がないＤＮＡの領域の増幅；関連ＤＮＡ配列の増幅ではるが、増幅の標的とされているのとは異なるＤＮＡ領域由来のＤＮＡ配列の増幅；または標的配列の増幅ではあるが、標的配列に対する少なくとも１つのプライマーの不正確なアニーリングに起因して、意図される増幅フラグメントよりも多いかもしくは少ない核酸塩基を含む、標的配列の増幅であり得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「アニールする」とは、ヌクレオチド鎖が、ワトソン−クリック塩基対形成により決定されるその鎖間の相補性に実質的に基づいて互いに結合する、ヌクレオチド鎖間の特異的相互作用を指す。アニーリングが生じるために相補性が１００％である必要はない。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「増幅（すること）」とは、ポリメラーゼ連鎖反応において特定のヌクレオチド配列の量を酵素により増加することを指す。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「インキュベートすること」とは、一定期間にわたって制御された条件（例えば、温度）の状態を維持することを指す。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「変性」とは、ヌクレオチド鎖が、アニールした状態から分離することを指す。変性は、多数の因子（緩衝液のイオン強度、温度、または塩基対形成相互作用を破壊する化学物質を包含する）によって誘導され得る。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「十分な時間」とは、核酸の増幅のための時間に言及している場合には、使用される酵素が、デオキシヌクレオチド三リン酸が増幅している核酸へと重合するのを完了させる時間を指す。必要とされる時間の量は、当業者により周知であるいくつかの因子に依存して、変化する。ＰＣＲの一般的原理および増幅のためのストラテジーは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１、ならびにＴＨＥ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＣＨＡＩＮ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ，Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，Ｆ．ＦｅｒｒｅおよびＲ．Ａ．Ｇｉｂｂｓ編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４；ならびにＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（第３版），Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＪおよびＤ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）のような教科書において見出され得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「増幅するために十分な条件」とは、ＰＣＲ反応のための反応条件を指す。この反応条件とは、本明細書中により十分に記載されるような、その反応の化学成分、その反応サイクルにおいて使用される温度、その反応のサイクル数、およびその反応サイクルのステージの時間を包含する。
【００３７】
代表的には、緩衝化された水が、この反応のための環境として使用される。標準的ＰＣＲ反応の他の化学成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（「ｄＮＴＰ」）、オリゴヌクレオチドプライマー、二価金属イオン、およびＰＣＲ標的を含むと予期されるＤＮＡサンプルが挙げられる。
【００３８】
ＰＣＲのために使用される溶媒は、代表的には、緩衝化剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）と、非緩衝化塩（例えば、ＫＣｌ）とを含む。この緩衝化剤は、当該分野で公知の任意の緩衝剤であり得る。この緩衝化剤は、慣用的実験によってＰＣＲの結果を最適化するために変化し得る。当業者は、最適な緩衝化条件を容易に決定することが可能である。いくつかのＰＣＲ緩衝液は、使用される酵素に依存して最適化され得る。例としてであって、限定としてではないが、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼは、最適ＫＣｌ濃度５０ｍＭを有し、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメントは、最適ＫＣｌ濃度１０ｍＭを有し、そしてｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼおよびｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬは、最適ＫＣｌ濃度７５〜１００ｍＭを有する。
【００３９】
金属二価イオンは、上記ポリメラーゼが効率的を効率的に機能させるためにしばしば有利である。例えば、限定としてではないが、マグネシウムイオンにより、特定のＤＮＡポリメラーゼは効率的に機能可能になる。代表的には、ＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４が、最適なマグネシウムイオン濃度を供給するために反応緩衝液に添加される。最適なＰＣＲ増幅のために必要なマグネシウムイオン濃度は、使用される特定のプライマーとテンプレートとの組に依存し得る。従って、最適な増幅を達成するために添加されるマグネシウム塩の量は、しばしば経験的に決定され、そしてその量は、当該分野において慣用的実施である。一般的には、最適なＰＣＲのためのマグネシウムイオンの濃度は、１ｍＭと１０ｍＭとの間で変化し得る。ＰＣＲ反応におけるマグネシウムイオン濃度の代表的範囲は、１．０ｍＭと４．０ｍＭとの間であり、中間点である２．５ｍＭ付近で変化する。
【００４０】
デオキシヌクレオチド三リン酸（「ｄＮＴＰ」）は、核酸分子の増幅の構造ブロックであり、代表的には、標準的なＰＣＲ反応においては、各々濃度４０μＭ〜２００μＭのデオキシアデノシン三リン酸（「ｄＡＴＰ」）、デオキシグアノシン三リン酸（「ｄＧＴＰ」）、デオキシシチジン三リン酸（「ｄＣＴＰ」）、およびチミジン三リン酸（「ｄＴＴＰ」）にて供給される。他のｄＮＴＰ（例えば、デオキシウリジン三リン酸（「ｄＵＴＰ」）およびｄＮＴＰアナログ、および結合体化ｄＮＴＰ）もまた、使用され得、それらは、本明細書中で使用される用語「ｄＮＴＰ」により包含される。そのような濃度でｄＮＴＰを使用することは、本発明の方法に従うが、一方で、２００μＭよりも高濃度のｄＮＴＰが、有利であり得る。従って、本発明の方法のいくつかの実施形態において、ｄＮＴＰの濃度は、一般的には、各ｄＮＴＰが少なくとも５００μＭ〜各々２ｍＭである。さらなるいくつかの実施形態において、各ｄＮＴＰの濃度は、０．５ｍＭ〜１ｍＭである。
【００４１】
ヌクレオチド三リン酸をＰＣＲの増幅フラグメントへと重合させる酵素は、当該分野で公知の任意のＤＮＡポリメラーゼ（熱安定性ポリメラーゼを包含する）であり得る。本発明において使用され得るポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｓｐ．のような生物に由来する、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。この酵素は、細菌から単離されても、組換えＤＮＡ技術により生成されても、または商業的供給源から購入されてもよい。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能であり、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ；ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ，Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント；ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ；およびｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬが挙げられる。他の適切なポリメラーゼとしては、Ｔｎｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント；Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＶｅｎｔおよびＶｅｎｔ  Ｅｘｏ−；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａ；Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔおよびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Ｅｘｏ−ならびにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来のＰｆｕ、ならびに上記の変異体、改変体、および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
オリゴヌクレオチドプライマーが、この反応に添加され、そして増幅フラグメントの５’末端および３’末端の境界を決める。一方のオリゴヌクレオチドプライマーは、変性したテンプレートＤＮＡのセンス（＋鎖）にアニールし、もう一方のオリゴヌクレオチドプライマーは、変性したテンプレートＤＮＡのアンチセンス（−鎖）にアニールする。代表的には、オリゴヌクレオチドプライマーは、長さが１２ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドであるが、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅される特定のテンプレート配列に依存して、それより短くても、またはそれより長くてもよい。そのプライマーの長さは、本発明の作動にとっては重要ではない。オリゴヌクレオチドプライマーは、目的のリボソームＲＮＡ遺伝子に隣接する特定のＤＮＡ部分にアニールして、それらのプライマーの相補的部位の間のＤＮＡ部分を特異的に増幅するように設計され得る。一般的には、オリゴヌクレオチドプライマーは、化学合成される。当業者は、目的の標的リボソームＲＮＡ遺伝子を増幅するための特異的プライマーを容易に設計し得る。さらに、リボソームＲＮＡ遺伝子領域を増幅するための既知の多くのプライマー配列が存在する。これらのうちのいずれも使用され得、そしてそれらは本発明の範囲内にある。
【００４３】
これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウラシル、ヌクレオシドアナログ（例えば、ロック核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミダイト）、ならびに化学物質部分（例えば、放射性核種（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、蛍光分子、副溝結合因子、または当該分野で公知である他の任意のヌクレオシド結合体）を含むかまたはそれらに結合体化したヌクレオシドから、構成され得る。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態において、発蛍光団が、ＰＣＲ反応の少なくとも１つのプライマーをタグ化するために使用される。いくつかの実施形態において、異なる標的フラグメントのためのプライマーが、異なる発蛍光団（差次的に色を有する産物を生成する）を用いてタグ化され得、そして同じ多重ＰＣＲ反応において使用され得、その後一緒に分析され得る。代表的には、順方向プライマーがタグ化されるが、逆方向プライマーがタグ化もまたタグ化され得る。発蛍光団の例としては、フルオレセイン（４９２ｎｍにて最大に吸収し、５２０ｎｍにて最大に発光する）；ＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（５５５ｎｍにて最大に吸収し、５８０ｎｍにて最大に発光する））；ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン（４９５ｎｍにて最大に吸収し、５２５ｎｍにて最大に発光する））；ＪＯＥ（２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（５２５ｎｍにて最大に吸収し、５５５ｎｍにて最大に発光する））、ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５８５ｎｍにて最大に吸収し、６０５ｎｍにて最大に発光する））；ＣＹ３（５５２ｎｍにて最大に吸収し、５７０ｎｍにて最大に発光する））；ＣＹ５（６４３ｎｍにて最大に吸収し、６６７ｎｍにて最大に発光する））；ＴＥＴ（テトラクロロ−フルオレセイン（５２１ｎｍにて最大に吸収し、５３６ｎｍにて最大に発光する））；およびＨＥＸ（ヘキサクロロ−フルオレセイン（５３５ｎｍにて最大に吸収し、５５６ｎｍにて最大に発光する））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
ＰＣＲ反応の他の公知の成分が使用され得、本発明の範囲内にある。そのような成分としては、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｔｗｅｅｎ−２０）ならびにヌクレオチド対のミスマッチを破壊する薬剤（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
このＰＣＲ反応はまた、増幅を最適にするために他の試薬の存在下で実施され得る。例えば、限定としてではないが、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ  Ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｋｉｔに含まれる）が、使用され得る。ＵＮＧは、ＰＣＲ産物がその後のＰＣＲ増幅において再増幅できないことを確実にするために、最初の工程としてＰＣＲ反応に含まれ得る。この原理は、細胞の制限−修飾系および除去−修復系と類似する酵素反応に基づく。ｄＵＴＰが組み込まれたそれまでのＰＣＲ増幅からのＰＣＲ産物は、分解される。ネイティブの核酸テンプレートは、影響を受けない。この方法は、ＰＣＲ混合物中のｄＴＴＰをｄＵＴＰに置換する工程、およびその後のＰＣＲ混合物すべてを、ＰＣＲ増幅する前にウラシルＮ−グリコシラーゼ酵素で事前処理する工程を包含する。ウラシルは、ＵＮＧを使用して初期産物から除去される。そして生じた脱塩基ポリヌクレオチドを、熱を用いて分解することによって、そのウラシルは排除される。
【００４７】
ＰＣＲ反応の時間、温度、およびサイクル数は、慣用的実験の事項として、特定の反応を最適化するために変化され得る。当業者は、ＰＣＲ反応のための種々のパラメータを決定する際の指針として、以下のことを認識する。当業者はまた、１つ以上の条件を変化させることが本発明の範囲内にあることを認識する。
【００４８】
ＰＣＲ反応の温度および時間は、３つのステージ（変性、アニーリング、および伸長）にて決定される。１回の変性、アニーリング、および伸長は、「サイクル」と呼ばれる。変性は、一般的には、ＤＮＡ鎖を分離させるがポリメラーゼの活性を破壊しない温度にて、実行される。一般には、熱安定性ポリメラーゼが使用される。しかし、易熱性ポリメラーゼが、ＰＣＲの変性工程の後にそれが補充される場合に使用され得る。熱安定性ポリメラーゼは、高温に耐え得、特定の活性レベルを維持し得る。代表的には、変性は、９０℃より高く１００℃未満の温度にて実行される。いくつかの実施形態において、変性は、９４℃〜９５℃の温度にて実行される。ＤＮＡの変性は、一般的には、少なくとも１秒間〜３０秒間実行される。いくつかの実施形態において、変性は、１秒間〜１５秒間実行される。他の実施形態において、変性は、１分間までかまたはそれ以上実行される。ＤＮＡの変性に加えて、いくつかのポリメラーゼ（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標））については、変性温度でのインキュベーションもまた、その酵素を活性化するために役立つ。従って、これらの酵素が使用される場合には、ＰＣＲの最初の工程（変性）を、後の変性工程よりも長くさせることが、有利であり得る。
【００４９】
アニーリングフェーズの間、オリゴヌクレオチドプライマーは、その相補性領域において標的ＤＮＡにアニールし、一旦ＤＮＡポリメラーゼがそのプライマー−テンプレート二重鎖に結合すると、そのＤＮＡポリメラーゼによって実質的に伸長される。  
【００５０】
従来のＰＣＲにおいて、アニーリング温度は代表的に、少なくとも安定なプライマー−テンプレート二重鎖の融点（Ｔｍ）であるかまたはそれより低く、ここで、Ｔｍは当業者に周知のいくつかの理論的方法のいずれかによって推定され得る。例えば、Ｔｍは以下の式により決定され得る：
Ｔｍ＝（４℃×Ｇ塩基とＣ塩基との数）＋（２℃×Ａ塩基とＴ塩基との数）
代表的には、標準的ＰＣＲにおいて、アニーリング温度は、少なくとも安定なプライマー−テンプレート二重鎖の推定Ｔｍよりも５℃〜１０℃低い。アニーリング時間は、約３０秒と約２分との間である。しかし、本発明の方法の特定の実施形態において、高濃度のソルビトールは、試薬の粘度を増加し、そして特定の反応工程（例えば、プライマーのアニーリングおよびプライマー−テンプレート二重鎖へのポリメラーゼの結合）を遅くするようである。従って、本発明の方法の特定の実施形態において、アニーリング工程は、標準的ＰＣＲプロトコルにおいて使用される時間より長い時間の間（代表的には、少なくとも３分間、そして５〜６分間程度の長さまで）実施される。いくつかの実施形態において、アニーリング時間は１０分間まで増加され得る。
【００５１】
ソルビトールは、反応の粘度を増加するだけでなく、穏和なＤＮＡ変性剤でもある。従って、本発明の方法の特定の実施形態において、プライマーをテンプレートにアニーリングさせるために、標準的ＰＣＲ反応のため当業者によって使用される温度より低い温度を使用することが、有利であり得る。一般的に、本発明の特定の実施形態において、Ｔｍ（添加剤の非存在下で推定されるＴｍ）より１０℃低い温度が使用され得る。他の実施形態において、Ｔｍ（添加剤の非存在下で推定されるＴｍ）より２０℃低い温度が使用され得る。
【００５２】
代表的に、アニーリングフェーズの後に伸長フェーズが続く。「伸長」は、酵素が、適切にサイズ決めされたフラグメントへのプライマー伸長を完了し得るのに十分な時間の間、行われる。上記に考察されたように、高濃度のソルビトールの添加は、反応物の粘度を増加させて、本発明の方法の特定の実施形態において、従来にはない長い伸長時間（すなわち、当業者が標準的ＰＣＲ反応について計算する伸長時間と比較して長い、伸長時間の使用）を有利にさせる。さらに、アニーリングフェーズについて上に注記したように、ソルビトールは穏和な変性剤である。従って、本発明の方法のいくつかの実施形態において、標準的ＰＣＲ反応のため当業者によって使用される温度より低い伸長温度を使用することもまた、有利であり得る。従って、いくつかの実施形態について、伸長温度は、使用されるポリメラーゼの最適温度について報告された温度より低い。
【００５３】
使用されるＰＣＲ（変性、アニーリングおよび伸長）のサイクル数は、所望の増幅量を決定する。ＰＣＲはＤＮＡ分子の指数関数的な増幅である。従って、理論上、各々のＰＣＲサイクルの後、その前のサイクルで存在したフラグメント数の２倍の数が存在する。代表的には、２０〜３０サイクルのＰＣＲが行われる。より代表的には、２５〜３０サイクルが行われるが、サイクル数は特に限定はされない。
【００５４】
いくつかの実施形態について、最後のＰＣＲサイクルの最後のフェーズの後に特定の温度で反応物をインキュベートすることが有利である。いくつかの実施形態において、より長期の伸長フェーズが選択される。他の実施形態において、低温（例えば、４℃）でのインキュベーションが選択される。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＣＲは、特異的増幅された標的ＤＮＡ配列（例えば、リボソームＤＮＡ配列）の収量を増加させるために、ソルビトールのみの存在下、またはソルビトールおよび変性剤（例えば、ＤＭＳＯ）での存在下で実施される。特定のいかなる操作理論に拘束されることも望まないが、ソルビトールはＤＮＡを増幅する場合に特異的産物の収量およびアッセイ感度を増加させること、そしてＤＭＳＯの添加は特異的産物の収量をさらに向上させることが、考えられている。
【００５６】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、式ＣｎＯｎＨｎ＋２（ここで、２＜ｎ＜７である）を有するポリオールの立体異性体が、０．０５Ｍ〜３Ｍの量、０．０５Ｍ〜２Ｍの量、０．０５Ｍ〜１Ｍの量、０．０５Ｍ〜０．７５Ｍの量、または０．０５Ｍ〜０．４５Ｍの量で、使用され得る。本発明の方法のいくつかの実施形態において、ポリオールはソルビトールである。本発明の方法のいくつかの実施形態において、ソルビトールは、ソルビトール非存在下で観察される非特異的増幅量に対して非特異的増幅を減少するのに有効な量で、添加される。代表的には、ソルビトールは、０．０５Ｍ〜３Ｍの量で添加される。いくつかの実施形態において、ソルビトールは０．０５Ｍ〜２Ｍの量で添加される。他の実施形態において、ソルビトールは０．０５Ｍ〜１Ｍの量で添加される。他の実施形態において、ソルビトールは０．０５Ｍ〜０．７５Ｍの量で添加される。他の実施形態において、ソルビトールは０．０５Ｍ〜０．４５Ｍの量で添加される。本発明の方法の他の実施形態において、ソルビトールは０．１Ｍ〜０．４０Ｍの量で添加される。本発明の方法の他の実施形態において、ソルビトールは０．１５Ｍ〜０．３５Ｍの量で添加される。本発明の方法の他の実施形態において、ソルビトールは０．２Ｍ〜０．３Ｍの量で添加される。
【００５７】
ＰＣＲに変性剤を添加することもまた、特異的な標的の収量を増加させ得る。本発明の方法において使用するために適切な変性剤としては、ＤＭＳＯ、２−ピロリジンおよび１−メチル−２−ピロリジノンが挙げられるが、これらに限定されない。他の変性剤は、例えば、ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴＡＬＯＧ（２０００−２００１）Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４５０８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ６３１７８に、見出され得る。変性剤は、０．７５％〜７．０％（容量／容量）の量、１．０％〜６％（容量／容量）の量、１．５％〜５．０％（容量／容量）の量、または２．０％〜４．０％（容量／容量）の量で、添加され得る。本発明の方法のいくつかの実施形態において、代表的に、ＤＭＳＯは０．７５％〜７．０％（容量／容量）の量である。本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＤＭＳＯは１．０％〜６％（容量／容量）の量で添加される。本発明の方法の他の実施形態において、ＤＭＳＯは１．５％〜５．０％（容量／容量）の量で添加される。本発明の方法の他の実施形態において、ＤＭＳＯは２．０％〜４．０％（容量／容量）の量で添加される。
【００５８】
ポリオールおよび変性剤（例えば、ソルビトールおよびＤＭＳＯ）は、各々について上記に示された範囲にわたる組み合わせで、任意に組み合せて添加され得る。本発明の方法の特定の実施形態において、例えば、０．０５Ｍ〜３Ｍの量のソルビトールが、０．７５％〜７％（容量／容量）の量のＤＭＳＯと組み合せて添加される。本発明の方法の他の実施形態において、０．１Ｍ〜２Ｍの量のソルビトールが添加され、かつ１％〜６％（容量／容量）の量のＤＭＳＯが添加される。本発明の方法の他の実施形態において、０．１５Ｍ〜１Ｍの量のソルビトールが、１．２５％〜５％（容量／容量）の量のＤＭＳＯと共に添加される。本発明の方法の他の実施形態において、０．２Ｍ〜０．７５Ｍの量のソルビトールが、１．５％〜３％（容量／容量）の量のＤＭＳＯと共に添加される。実施例に示される本発明のいくつかの実施形態において、０．１５Ｍの量のソルビトールが添加され、かつ１．２５％（容量／容量）の量のＤＭＳＯが添加される。
【００５９】
より高濃度の（１Ｍより多い）ソルビトールを使用するＰＣＲを実施する場合、アニーリング時間を増加し、そして／またはアニーリング温度を低下して、ＰＣＲ反応および生成物収量を最適化することが、有利で有り得る。当業者は、添加するソルビトール量およびまたはＤＭＳＯ量を補完するために、アニーリング時間およびアニーリング温度についての反応条件を容易に最適化し得るはずである。一般的に、アニーリング温度は、Ｔｍ（添加剤の非存在下で推定されるＴｍ）より２０℃未満低い必要はない。さらに、一般的に、アニーリング時間（添加剤の非存在下で推定されるアニーリング時間）は、１０分間より長い必要はない。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ソルビトールおよびＤＭＳＯがＰＣＲに添加されて、広範な種々の生物（特に、細菌）由来のｒＤＮＡを増幅し得る。細菌ｒＤＮＡは、各々の種に対して独特である。従って、本発明の方法はまた、ｒＤＮＡの増幅を、増幅産物の配列決定と組み合せて包含する。このようにして得られた配列は、細菌のｒＤＮＡについて既知の配列と比較されて、サンプル中に存在する細菌種が正確に同定され得る。
【００６１】
本発明の方法の１つの実施形態において、ゲノムＤＮＡを含むサンプルを、緩衝化水、Ｍｇ２＋、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ｒＤＮＡの順方向プライマーおよびｒＤＮＡの逆方向プライマー、ならびにソルビトールまたはソルビトールおよびＤＭＳＯを含む、マスターＰＣＲ混合物に添加し、そして増幅を実施する。この増幅産物を、配列決定反応（例えば、１ステップ配列決定の混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより入手可能））に加え、そしてこの配列を、１６ｓ  ｒＤＮＡライブラリー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの独自のＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  １６ｓ  ｒＤＮＡ配列ライブラリー）と比較する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、このＰＣＲ産物を、配列決定の前に、非篩い分け（ｎｏｎ−ｓｉｅｖｉｎｇ）媒体を使用して分離する。他の実施形態において、このＰＣＲ産物を、配列決定の前に、篩い分け（ｓｉｅｖｉｎｇ）媒体中で分離する。
【００６３】
非特異的増幅の減少は、当該分野で公知の任意の手段によって決定され得る。非限定的な例として、ゲル上で正確にサイズ決めされた産物の増加量の様式（ｏｂｓｅｒｖａｎｃｅ）は、強度を測定することによって視認され得、そして定量化され得る。さらに、ゲル上でバンドとして視認される、予想されてないサイズを有する他の非特異的産物は、強度が減少され得るかまたは取り除かれ得る。すなわち、ＰＣＲ反応において、ソルビトール非存在下、またはソルビトールおよびＤＭＳＯの非存在下では、非特異的増幅産物は、アガロースゲル上で強いバンドとして現われ得、そして不正確にサイズ決めされたフラグメントとして泳動し得る。一方、特異的増幅産物は正確にサイズ決めされたフラグメントとして現われ得るが、他の産物に対して強さが弱く現われる。ＰＣＲ反応にソルビトールを添加するかまたはソルビトールおよびＤＭＳＯを添加する場合、不正確にサイズ決めされた（非特異的）増幅産物は、より弱く現われる（かまたは、存在しない）が、正確にサイズ決めされた特異的産物は、いかなる非特異的増幅産物に対してよりも強く現われる。
【００６４】
本発明は、さらに以下の実施例を使用して説明され、これら実施例は、本発明のいくつかの実施形態の単なる例示である。これら実施例は、本発明の範囲を限定するようにはいかようにも解釈されるべきではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
１６ＳリボソームＤＮＡの非特異的増幅を減少するために適切な量のソルビトールについての滴定を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子について実施した。５０ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡを、ＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｇｅｎｅ  Ｋｉｔの増幅工程を使用するＰＣＲに供した。ここで、ＰＣＲ反応を以下のように設定する：（ａ）ネガティブコントロール：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌの滅菌脱イオン水；（ｂ）ポジティブコントロール：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌのポジティブコントロールＤＮＡ；（ｃ）サンプル：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌの５０ｎｇ  希釈Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ。さらに、各反応物はＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシルＮ−グリコシダーゼ（ＵＮＧ）を含んだ。代表的には、ＵＮＧを１反応あたり０．５〜２単位の量で添加し得る。初期の増幅を、以下のように実施した：５０℃を１０分間、９５℃を１０分間、その後、３５サイクルの「９５℃を３０秒間、６０℃を３０秒間および７２℃を４５秒間」；その後、７２℃で１０分間の最終伸長工程。そしてその後、反応物を直ちに分析したか、または−２０℃で維持した。このＰＣＲマスターミックスは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび最適な緩衝剤成分を含んだ。
【００６６】
ＰＣＲの完了時に、各反応物のうち５μｌを、ゲル中および泳動緩衝液中に臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）を含む、２％ＮｕＳｉｅｖｅ、０．５％ＳｅａＫｅｍアガロースゲル上で泳動し、そして紫外線によって可視化した。
【００６７】
図１を参照すると、これらの反応物は、ソルビトールを含まなかった（レーン２およびレーン３）；０．０５Ｍのソルビトールを含んだ（レーン４およびレーン５）；０．１０Ｍのソルビトールを含んだ（レーン６およびレーン７）；０．１５Ｍのソルビトールを含んだ（レーン８およびレーン９）；０．２０Ｍのソルビトールを含んだ（レーン１０およびレーン１１）；０．２５Ｍのソルビトールを含んだ（レーン１２およびレーン１３）；０．３０Ｍのソルビトールを含んだ（レーン１４およびレーン１５）；０．３５Ｍのソルビトールを含んだ（レーン１６およびレーン１７）；０．４０Ｍのソルビトールを含んだ（レーン１８およびレーン１９）；０．４５Ｍのソルビトールを含んだ（レーン２０およびレーン２１）；テンプレートＤＮＡを添加しなかった（レーン２２、レーン２３およびレーン２４）；５０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡテンプレートを含んだ（レーン２５）；ならびに１０ｎｇ／バンド／μLの５０〜２，０００ｂｐラダーを含んだ（レーン１およびレーン２６）。これらの結果を図１に示す。特に、０．１５Ｍの濃度のソルビトール（レーン８およびレーン９）は、約１４０ｂｐの非特異的バンドが存在しないことも示しつつ、特異的な標的ＤＮＡ（約１５００ｂｐ）の実質的な増加を示した。
【００６８】
（実施例２）
１６ＳリボソームＤＮＡの非特異的増幅を減少するために適切な量のＤＭＳＯについての滴定を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子について実施した。５０ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡを、ＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｇｅｎｅ  Ｋｉｔの増幅工程を使用するＰＣＲに供した。ここで、ＰＣＲ反応を以下のように設定した：（ａ）ネガティブコントロール：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌの滅菌脱イオン水；（ｂ）ポジティブコントロール：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌのポジティブコントロールＤＮＡ；（ｃ）サンプル：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌの５０ｎｇ  希釈Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ。さらに、各反応物はＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシルＮ−グリコシダーゼ（ＵＮＧ）を含んだ。代表的には、ＵＮＧを１反応あたり０．５〜２単位の量で添加し得る。初期の増幅を、以下のように実施した：５０℃を１０分間、９５℃を１０分間、その後、３５サイクルの「９５℃を３０秒間、６０℃を３０秒間および７２℃を４５秒間」；その後、７２℃で１０分間の最後の伸長工程。そしてその後、反応物を直ちに分析するか、または−２０℃で維持するかのいずれかを行った。このＰＣＲマスターミックスは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび最適な緩衝剤成分を含んだ。
【００６９】
ＰＣＲの完了時に、各反応物のうち５μｌを、ゲル中および泳動緩衝液中に臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）を含む、２％ＮｕＳｉｅｖｅ、０．５％ＳｅａＫｅｍアガロースゲル上で泳動し、そして紫外線によって可視化した。
【００７０】
図２を参照すると、これらの反応物は、ＤＭＳＯを含まなかった（レーン２）；０．２５％のＤＭＳＯを含んだ（レーン３およびレーン４）；０．５０％のＤＭＳＯを含んだ（レーン５およびレーン６）；０．７５％のＤＭＳＯを含んだ（レーン７およびレーン８）；１．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン９およびレーン１０）；１．５０％のＤＭＳＯを含んだ（レーン１１およびレーン１２）；２．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン１３およびレーン１４）；３．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン１５およびレーン１６）；４．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン１７およびレーン１８）；５．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン１９およびレーン２０）；６．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン２１およびレーン２２）；７．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン２３およびレーン２４）；８．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン２５およびレーン２６）；９．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン２７およびレーン２８）；１０．００％のＤＭＳＯを含んだ（レーン２９およびレーン３０）；テンプレートＤＮＡを添加しなかった（レーン３２、レーン３３およびレーン３４）；５０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡテンプレートを含んだ（レーン３５）；ならびに１０ｎｇ／バンド／μＬの５０〜２，０００ｂｐラダーを含んだ（レーン１、レーン３１およびレーン３６）。これらの結果を図２に示す。特に、１．００％および１．５％の濃度のＤＭＳＯ（レーン９および１１）は、約１４０ｂｐの非特異的バンドおよび他のバンドが存在しないことも示しつつ、特異的な標的ＤＮＡ（約１５００ｂｐ）の実質的な増加を示した。
【００７１】
（実施例３）
１６ＳリボソームＤＮＡの非特異的増幅を減少するための、ソルビトールおよびＤＭＳＯを添加する効果を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子について実施した。５ｐｇ、５０ｐｇまたは５００ｐｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡを、０．１５Ｍのソルビトール存在下、または０．１５Ｍソルビトール＋１．２５％（容量／容量）のＤＭＳＯの存在下で、ＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｇｅｎｅ  Ｋｉｔの増幅工程を使用するＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応を以下のように設定した：（ａ）ネガティブコントロール：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌの滅菌脱イオン水；（ｂ）ポジティブコントロール：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌのポジティブコントロールＤＮＡ；（ｃ）サンプル：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌの５０ｎｇ  希釈Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ。さらに、各反応物はＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシルＮ−グリコシダーゼ（ＵＮＧ）を含んだ。代表的には、ＵＮＧを１反応あたり０．５〜２単位の量で添加し得る。初期の増幅を、以下のように実施した：５０℃を１０分間、９５℃を１０分間、その後、３０サイクルの「９５℃を３０秒間、６０℃を３０秒間および７２℃を４５秒間」；その後、７２℃を１０分間の最後の伸長工程。そしてその後、反応物を直ちに分析するか、または−２０℃で維持するかのいずれかを行った。このＰＣＲマスターミックスは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび最適な緩衝剤成分を含んだ。
【００７２】
ＰＣＲの完了時に、各反応物のうち５μｌを、標準的なアガロースゲル（ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ホウ酸、ＥＤＴＡ）緩衝液中での１％アガロースゲル）上で泳動し、臭化エチジウムで染色し、そして紫外線によって可視化した。
【００７３】
図３を参照すると、これらの反応物は、５００ｐｇのＤＮＡテンプレートを含み、かつＤＭＳＯもソルビトールも含まなかった（レーン２、レーン３およびレーン４）；５００ｐｇのＤＮＡテンプレートと０．１５Ｍのソルビトールのみとを含んだ（レーン５、レーン６およびレーン７）；５００ｐｇのＤＮＡテンプレートと０．１５Ｍのソルビトールと１．２５％のＤＭＳＯとを含んだ（レーン８、レーン９およびレーン１０）；５０ｐｇのＤＮＡテンプレートを含み、かつＤＭＳＯもソルビトールも含まなかった（レーン１１、レーン１２およびレーン１３）；５０ｐｇのＤＮＡテンプレートと０．１５Ｍのソルビトールのみとを含んだ（レーン１４、レーン１５およびレーン１６）；５０ｐｇのＤＮＡテンプレートと０．１５Ｍのソルビトールと１．２５％のＤＭＳＯとを含んだ（レーン１７、レーン１８およびレーン１９）；５ｐｇのＤＮＡテンプレートを含み、かつＤＭＳＯもソルビトールも含まなかった（レーン２０、レーン２１およびレーン２２）；５ｐｇのＤＮＡテンプレートと０．１５Ｍのソルビトールのみとを含んだ（レーン２３、レーン２４およびレーン２５）；５ｐｇのＤＮＡテンプレートと０．１５Ｍのソルビトールと１．２５％のＤＭＳＯとを含んだ（レーン２６、レーン２７およびレーン２８）；テンプレートＤＮＡを添加しなかった（レーン３１、レーン３２およびレーン３３）；５０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡテンプレートを含んだ（レーン３４）；ならびに１０ｎｇ／バンド／μＬの５０〜２，０００ｂｐラダーを含んだ（レーン１、レーン２９、レーン３０およびレーン３５）。これらの結果を図３に示す。特に、この実験において、５ｐｇのポジティブコントロールＤＮＡテンプレート由来の特異的増幅産物がソルビトール添加、またはソルビトールおよびＤＭＳＯの添加によって検出されるように、感度の増加が見られる（レーン２３〜レーン２８）。
【００７４】
（実施例４）
１６ＳリボソームＤＮＡの非特異的増幅を減少するための、種々の量のソルビトールを添加する効果またはソルビトールおよびＤＭＳＯを添加する効果を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子について実施した。５ｐｇ、５０ｐｇまたは６６ｆｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡを、０．０５Ｍ、０．１５Ｍ、０．２５Ｍ、０．３５Ｍ、０．４５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍ、もしくは２．０Ｍのソルビトール存在下；０．１５Ｍのソルビトールおよび１．２５％（容量／容量）のＤＭＳＯの存在下；または添加剤の非存在下で、ＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｇｅｎｅ  Ｋｉｔの増幅工程を使用するＰＣＲに供した。ＰＣＲ反応を以下のように設定した：（ａ）ネガティブコントロール：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌの滅菌脱イオン水；（ｂ）ポジティブコントロール：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌのポジティブコントロールＤＮＡ；（ｃ）サンプル：５０μｌのＰＣＲマスターミックス、５０μｌの５０ｎｇ  希釈Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ。さらに、各反応物はＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ウラシルＮ−グリコシダーゼ（ＵＮＧ）を含んだ。代表的には、ＵＮＧを１反応あたり０．５〜２単位の量で添加し得る。初期の増幅を、以下のように実施した：５０℃を１０分間、９５℃を１０分間、その後、３０サイクルの「９５℃を３０秒間、５０℃（または５６℃）を２分間および７２℃を３分間」；その後、７２℃を１０分間の最後の伸長工程。そしてその後、反応物を直ちに分析するか、または−２０℃で維持するかのいずれかを行った。このＰＣＲマスターミックスは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび最適な緩衝剤成分を含んだ。
【００７５】
これらの反応を、表１に従って設定し、そして図４ａおよび図４ｂに示すようにローディングした。この実験において、標準的な熱サイクル条件を用いて実施した図１と比較して、ソルビトール濃度範囲の有効上限は、５６℃のアニーリング温度で、約０．４５Ｍから０．７５Ｍに増加した。産物の収量は、５０℃のアニーリング温度を使用すると一貫してそれより低く、そしてソルビトール濃度範囲の有効上限は、０．６５Ｍに増加する。
【００７６】
（表１）
【００７７】
【表１−１】
2005512572.tif 000003
【００７８】
【表１−２】
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【００７９】
【表１−３】
2005512572.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、アガロースゲル上で泳動されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするＰＣＲ増幅における、ソルビトール滴定を示す。所望される産物は、１５００ｂｐである。
【図２】図２は、アガロースゲル上で泳動されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするＰＣＲ増幅における、ＤＭＳＯ滴定を示す。所望される産物は、１５００ｂｐである。
【図３】図３は、アガロースゲル上で泳動された、ソルビトール（０．１５Ｍ）およびＤＭＳＯ（１．２５％）の組み合わせの存在下でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするＰＣＲ増幅を示す。所望される産物は、１５００ｂｐである。
【図４】図４は、アガロースゲル上で泳動された、種々の量のソルビトールの存在下、０．１５Ｍソルビトールおよび１．２５％  ＤＭＳＯの存在下、または添加剤非存在下でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするＰＣＲ増幅を示す。所望される産物は、１５００ｂｐである。パネル４ａは、レーン番号１〜３０を示し、パネル４ｂは、レーン番号３１〜６７を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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