(57)【要約】  電気泳動分離媒体中のフルオロフォア標識付き物質の検出を行う装置の性能は、電磁波検出手段（１９）の限界となったライン又はピクセルをより低いゲインで、又はより低い励起照射の強度で再スキャンすることにより改善される。前記のより低いゲイン又はより低い強度は、前記電磁波検出手段（１９）の限界とならないよう形成される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電磁波検出手段（１９）と制御手段（２５）とを備えたスキャナヘッド（９）により電磁波放射物質（１５）の領域（１１）をスキャンする方法であって、
前記制御手段（２５）が：
前記電磁波検出手段（１９）のゲインを制御し、及び／又は照射源（３）の強度を制御し；
検出された電磁波放射物質（１５）により放射されて電磁波検出手段（１９）により検出された放射線（３”）が一定の強度を越えたらこれをメモリ（２７）に記録し；
前記スキャナヘッド（９）によってスキャンされた前記一定の強度を越える強度の放射線を放射した検出電磁波放射物質（１５）を含むラインの位置をメモリ（２７）に記録するよう構成され、
前記方法が：
前記電磁波検出手段（１９）のゲインを第１の値に設定し；
電磁波放射物質の領域をラインごとにスキャンし、検出された電磁波放射物質（１５）から放射される電磁波の位置と強度を記録し；
前記電磁波検出手段（１９）のゲインをより低い第２の値に設定し、及び／又は前記照射源（３）の強度を下げ；
前記一定の強度を越える強度の電磁波（３”）を放射した検出電磁波放射物質（１５）の前記領域（１１）内のライン又はピクセルのみを再スキャンし；
検出電磁波放射物質（１５）から放射された電磁波の位置と強度を記録する各ステップから構成される方法。
【請求項２】
前記一定の強度を、前記電磁波検出手段（１９）の限界レベルに設定するステップを含む、請求項１にかかる方法。
【請求項３】
前記一定の強度を、前記電磁波検出手段（１９）の限界レベルよりも低い値に設定するステップを含む、請求項１にかかる方法。
【請求項４】
前記一定の強度が、前記電磁波検出手段（１９）の限界レベルの９９％から７５％の間である、請求項２にかかる方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一にかかる方法を実施するための装置であって、少なくとも１つの電磁波検出手段（１９−１９Ｂ）と制御手段（２５）とを含むスキャナヘッド（９）を備え、
前記制御手段（２５）が：
前記電磁波検出手段（１９−１９Ｂ）のゲインを制御し、及び／又は照射源（３）の強度を制御し；
検出された電磁波放射物質（１５）から放射されて電磁波検出手段（１９−１９Ｂ）により検出された放射線（３”）が一定の強度を越えたときにメモリ（２７）に記録し；
前記スキャナヘッド（９）によってスキャンされた、前記一定の強度を越える強度の放射線を放射した検出電磁波放射物質を含むラインの位置をメモリ（２７）に記録するよう形成され、
前記制御手段（２５）が、第１のゲインによって第１のラインごとのスキャンを実行し、当該スキャン中のどのライン又はピクセルが一定の強度を越える電磁波を放射した検出電磁波放射物質（１５）を含むかを特定し、より低いゲイン及び／又はより低い照射源の強度により前記第１のスキャンの間に一定の強度を越える電磁波を放射した検出電磁波放射物質（１５）を含むライン又はピクセルのみを対象に第２のスキャンを実行するよう形成されていることを特徴とする装置。
【請求項６】
前記第１のラインごとのスキャンが第１の電磁波検出手段（１９Ａ）で実行され、前記第２のスキャンが第２の電磁波検出手段（１９Ｂ）で実行され、
前記第２の電磁波検出手段（１９Ｂ）のゲインが、前記第１の電磁波検出手段によって生成される信号の強度に基づいて調整可能であることを特徴とする、請求項５にかかる装置。
【請求項７】
前記第１のラインごとのスキャンが第１の電磁波検出手段（１９Ａ）で実行され、前記第２のスキャンが第２の電磁波検出手段（１９Ｂ）で実行され、
前記第２の電磁波検出手段（１９Ｂ）のゲインが、前記第１の電磁波検出手段（１９Ａ）のゲインと異なっている、請求項５にかかる装置。
【請求項８】
請求項１から請求項４のいずれか一にかかる方法を実施する装置であって、ＣＣＤ検出器（１９Ｃ）と制御手段（２５）とを含むスキャナヘッド（９）を備え、
前記制御手段（２５）が：
前記スキャナヘッド（９）の移動を制御し；
前記ＣＣＤ検出器（１９Ｃ）の露出時間を制御し；
検出された電磁波放射物質（１５）から放射されて前記ＣＣＤ検出器（１９Ｃ）によって検出された放射線（３”）が一定の強度を越えたときにメモリ（２７）に記録し；
前記スキャナヘッド（９）によってスキャンされた、前記一定の強度を越える強度の放射線を放射した検出電磁波放射物質を含むラインの位置をメモリ（２７）に記録するよう形成され、
前記制御手段（２５）が、第１の露出時間で第１のラインごとのスキャンを実行し、そのスキャン中のどのライン又はピクセルが一定の強度を越える電磁波を放射した電磁波放射物質（１５）を含むかを特定し、前記第１のスキャンの間に一定の強度を越える電磁波を放射した検出電磁波放射物質（１５）を含むライン又はピクセルのみを対象に、より少ない露出時間で第２のスキャンを実行するよう形成されていることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電磁波放射物質、特に電気泳動分離媒体中のフルオロフォア標識付き物質を検出するための方法と装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えばＤＮＡ配列に関連して電気泳動分離媒体中のフルオロフォア（fluorophore：蛍光物質分子）標識付き物質を検出する際、ある段階で励起すると、前記物質から放射され検出される蛍光の強度に応じて検出器で生成される信号が、資料中にほんの僅かのフルオロフォア標識付きＤＮＡしかないことなどの理由で消えてしまうことがある。前記信号が消える原因は他にも考えられ、また、通常、低すぎて検査できないことなどがあり得る。
【０００３】
例えば断片分析（fragment analysis）などへの応用ではこれと反対の状況、すなわち蛍光の強度が高くなりすぎて検出器では対応できない、すなわち検出器の限界に達する（saturate）ことも知られている。
【０００４】
いずれの場合も、分離された物質に関する情報は失われることになる。これはＤＮＡ配列などの特定ができないことを意味する。
【０００５】
蛋白質と炭水化物は、フルオロフォア標識が付されて電気泳動分離媒体中で分離される他の２つの例である。
【０００６】
日本の特開平7-151687号公報の要約は、励起光の強度を監視することによって、蛍光検出式電気泳動装置での基本配列の読み違いを回避することについて述べている。放射光の異常な強度のために光検出器からの検出信号が予め定められた参照値よりも小さくなるとアラームが発せられる。他の従来技術による装置では、照射によってフルオロフォア標識付き物質から放射される蛍光の第１の画像が、第１の電圧設定（すなわち、ゲイン）での第１のスキャンの間に光電子倍増管を使用して取得され、その後、同一物質の第２の画像が、異なるＰＭＴ電圧とゲインでの第２のスキャンによって取得される。例えば、少量の蛍光を放射する試料の画像を捉えるため、1000ボルトの高ゲインの設定で第１のスキャンを実施することができる。蛍光を多量に放射する試料はこのゲインでは信号が飽和状態となり、限界に達して信号を定量化することが不可能となるため、次に、例えば400Ｖなどのより低い電圧により、すなわち低いゲインで限界を越えない信号が得られる第２のスキャンが必要となる。これによりセンサの動的領域は増大するが、スキャン時間は２倍になる。
【発明の概要説明】
【０００７】
本発明の目的は、上述した問題を解消することにある。
これは、本発明に係る方法の第１の実施の形態により、すなわち、まず高ゲインで画像をスキャンして限界に達したピクセルを検出し、その後、ピクセルが限界となったライン又はピクセルのみを再スキャンすることによって達成される。
【０００８】
上述した目的はまた、本発明に係る方法の第２の実施の形態により、すなわち、まず高ゲインで画像をスキャンして予め定められた強度値を越えるピクセルを検出し、限界に達した両エッジ（saturation edges）の中心を見出したり、あるいは先端が切られた両エッジ（truncated edges）にガウス曲線を当てはめたりすることによって限界のピーク（peak of saturation）を算出し、その後、演算された低ゲインで前記予め定められた強度値を越えたピクセルが発生したライン又はピクセルのみを対象に再スキャンすることによって達成される。
【０００９】
上述した目的はさらに、本発明に係る装置の第１の実施の形態によっても達成され、当該装置は、高ゲインでラインをスキャンする手段と、スキャンされたライン内でピクセルが限界に達したかを特定する手段と、限界に達したピクセルの発生したラインを低ゲインで再スキャンする手段とから構成される。上述した目的はさらに、本発明に係る装置の第２の実施の形態によっても達成され、当該装置は、高ゲインでラインをスキャンする手段と、予め定められたピクセルの強度値を設定する手段と、スキャンされたライン内のピクセルが前記予め定められた強度値を越えたかを特定する手段と、ピーク値を算出して演算された低ゲインによりピクセルの強度が前記予め定められた強度値以上となったライン又はピクセルを再スキャンする手段とから構成される。
【００１０】
上述した目的は、以下に表示する本発明のその他の実施の形態によっても達成される。
添付の図面を参照して本発明をより詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
電磁波放射物質、特には電気泳動分離媒体中のフルオロフォア標識付き物質を検出するための本発明に係る装置の実施の形態の概要を図示する。
【００１２】
図示された本実施の形態は、分離媒体すなわち電気泳動ゲル中に物質が拡散したゲル電気泳動装置をスキャンすることに関する。
しかしながら本発明は、毛管電気泳動のスキャンやその他特に電磁波などの放射線が検出されるいかなるシステムに対しても同様に適用し得ることは理解されるべきである。
【００１３】
加えて、本発明は上述した直接検出方法だけでなく、間接検出方法、すなわち、例えばゲル内にまずフルオロフォア標識付き物質が分離され、その後、前記ゲルが例えば当該物質のオーダなどを検出するためのレーザスキャンにかけられる方法に対しても適用が可能である。
【００１４】
図１において、符号１は静止した照射源である。図示の実施の形態では、当該照射源はレーザ光線３を放射するレーザダイオードである。しかしながら、ハロゲンランプやその他の適切な電磁波源が照射源として使用することが考えられる。
【００１５】
レーザ光線３は、フルオロフォア励起周波数Ｅｘの電磁波を通過させるフィルタ５を通過し、可動式スキャナヘッド９の二色性ミラー７に向けられる。ミラー７は、フィルタを通過したレーザ光線３’をスキャン領域、すなわち、ここでは電気泳動ゲル１１に向けて反射する。従来からよく知られた方法により、ゲル１１は２つのガラス板１３ａ、１３ｂの間に配置されている。
【００１６】
詳細は表示していないが、ゲル１１は、フルオロフォア１５などの電磁波を放射する又は放射能力を有する物質で標識付けされて電界の影響下でゲル１１中の移動レーン（図示せず）に沿って移動する物質を分離するための電気泳動分離システムの一部である。
【００１７】
フルオロフォア１５がレーザ光線３’に照射されると、フルオロフォア１５は励起されて周波数Ｅｍの蛍光電磁波３”を放射する。この蛍光電磁波３”の一部がスキャナヘッド９（光電子倍増管チューブ（ＰＭＴ）１９に代表される光検出器などの電磁波検出手段を備える）のレンズ１７に入射し、二色性ミラー７、及び放射周波数Ｅｍの電磁波を通すフィルタ２１を通過し、ＰＭＴ１９内の１つ又はそれ以上の数の検出セル２３によって検出される。ＰＭＴ１９は、検出された放射蛍光電磁波３”の強度に応じて信号を発生するよう形成されている。
【００１８】
本発明に係るこの実施の形態では、スキャナヘッド９がゲル１１を横切るよう移動可能であり、ゲル１１に対して相対移動する間にゲル１１をスキャンする。固定式スキャナヘッドを備えてゲルの方を相対的に移動させることでもよい。あるいは、固定式スキャナヘッドと固定式のゲルとを備え、移動式レンズ及び／又はミラーを用いて両者間の相対移動を実現することも考え得る。スキャナヘッド９又はゲルの移動は制御手段２５により制御され、この制御手段はコンピュータ２５などのプログラム可能な制御手段であることが好ましい。
【００１９】
図には、単一の移動レーン中の単一のフルオロフォア１３の励起を概略表示しているが、本発明に係る装置の実用上の形態では、ゲル１１内の相互に平行な複数の移動レーンと、これに対応した数の光検出器１９とを設け得ることは理解されるべきである。
【００２０】
検出された蛍光の強度に応じて光検出器１９の検出器２３により発せられる信号は、好ましくは制御手段２５により実行されるソフトウェアによって分析され、放射された蛍光電磁波３”の強度が測定される。
【００２１】
本発明の第１の実施の形態では、制御手段２５は、光検出器１９のゲインを例えば1000Ｖなどの高レベルにセットするよう形成される。その後ゲルがラインごとにスキャンされ、ＰＭＴ１９で受信する信号の強度が制御手段２５によって監視される。あるスキャンラインの検出セル２３’が、ＰＭＴ１９に達する放射蛍光電磁波１５の強度が当該電磁波を検出するＰＭＴセル２３’の限度に達したことを示す限界信号（saturation signal）を発したら、当該ラインの位置がメモリ２７に蓄積される。高ＰＭＴゲインのスキャンが完了すると、制御手段２５は、例えば400Ｖなどの低レベルにＰＭＴのゲインを設定し直す。制御手段２５はその後、検出セル２３が限界信号を発したライン又はピクセルのみが再度スキャンされるようゲル１１の再スキャンを制御する。このスキャンによる信号は、制御手段によって前記第１のスキャンからの信号と組み合わせて使用され、前記ゲル内のフルオロフォアの相対的強度が見られるような合成画像又は記録が生成される。好ましくは、前記制御手段は、第２のスキャンの間に使用されたゲインの減少分を考慮して、第２のスキャンで再スキャンされたライン又はピクセルをプロットする際にこれを補正する。
【００２２】
再スキャンすべきラインの数がライン合計数の５％とすれば、一度ゲルをスキャンするのに必要な時間の９５％に当る時間の節約が得られる。換言すれば、ゲルをスキャンするのに従来技術で200秒（高ゲインのスキャンで100秒、低ゲインのスキャンで100秒）かかるとすれば、本発明によれば高ゲインのスキャンは100秒、低ゲインのスキャンは５秒（プラス、スキャン装置をラインからラインへ移動させる時間）で済み、時間セーブは９５秒に達する。
【００２３】
本発明の第２の実施の形態では、予め定められた最大信号強度レベルを設定可能なメモリが前記制御手段に設けられる。この予め定められたレベルは、高ゲインを使用する際にＰＭＴの限界に達するために必要な信号強度のいかなる比率、例えば９９％、９０％、８０％、７５％などの比率にも設定が可能である。この試料ゲルのスキャンは、上述した第１の実施の形態と同様な方法で進められるが、電磁波を検出するＰＭＴセル２３’によって検出されるＰＭＴ１９に到達する蛍光電磁波３”の強度が前記予め定められた最大信号強度を越えたことを示す信号をあるライン内のセル２３が発したときに、当該ラインの位置がメモリ２７に蓄積される点が異なる。高ＰＭＴゲインによって前記試料のスキャンが完了した後、制御手段２５は予測されるライン又はピクセルの強度を算出し（例えば、限界に達した両エッジの中心を見出すことにより、又は先端が切られた両エッジにガウス曲線を適用することにより）、これに基づいてＰＭＴ１９のゲインを例えば600Ｖなどの低いレベルに設定し直し、前記ライン又はピクセルを再スキャンするときにＰＭＴ１９の限界に達することを防止する。制御手段２５はその後、検出セル２３が予め定められた最大信号より大きな強度の信号を発したライン又はピクセルのみを再度スキャンするようゲル１１の再スキャンを制御する。
【００２４】
最も効果的な動的領域画像を生成するため、変動するＰＭＴ電圧において予め設定された閾値を越えたゲル試料の異なるライン又はピクセルをスキャンすることも可能である。
【００２５】
本発明に係る第３の実施の形態では、フルオロフォア標識付き物質を検出するための装置に、２つの電磁波検出手段１９Ａ、１９Ｂが設けられる。この装置では、第１の電磁波検出手段１９Ａを用いて第１のラインごとのスキャンが実行され、第２の電磁波検出手段１９Ｂを用いて第２のラインごとのスキャンが実行される。図２に示すように、両電磁波検出手段は同一のスキャナヘッド９内に収納可能である。代替として、これらが個別のスキャナヘッドに搭載されてもよい。第２の電磁波検出手段１９Ｂのゲインは、第１の電磁波検出手段によって生成された信号強度に基づいて制御手段により調節することが可能である。これにより、第１の電磁波検出手段によって限界信号が生成されたライン又はピクセルを再スキャンする際に限界に達することを防いでいる。図２の例で、右方向となる第１の方向にスキャンが実行されるとき、第１の電磁波検出手段１９Ａがあるラインの第１のスキャンを実行し、第２の電磁波検出手段１９Ｂが低ゲインで再スキャンを実行し、スキャンが異なる方向に実行されるときには、第２の電磁波検出手段１９Ｂがあるラインの第１のスキャンを実行し、第１の電磁波検出手段１９Ａが低ゲインで再スキャンを実行することも考えられる。
【００２６】
本発明に係る装置の第４の実施の形態では、前記第１のラインごとのスキャンが第１の電磁波検出手段で実行され、前記第２のスキャンが第２の電磁波検出手段で実行され、ここで前記第２の電磁波検出手段のゲインは、前記第１の電磁波検出手段のゲインとは異なっている。これにより、第１のスキャンは高ゲインで実行され、第２のスキャンは予め定められた低ゲインで実行され、当該低ゲインは一定に保たれる。従来技術と比較すれば、これは増加された動的領域を備えた装置を提供することになり、再スキャンのために使用される新たなゲインを計算するための制御手段の必要性を排除する。
【００２７】
本発明に係る装置の第５の実施の形態では、スキャナヘッド９がＣＣＤ（電荷結合素子）検出器１９Ｃと制御手段２５を備える。前記ＣＣＤ検出器は、複数の電荷結合要素を備え、その各々は電磁波の励起源に露出されるとその露出された放射線の強度に応じて電荷を生成する。各要素の電荷はシリアルに（すなわち、要素ごと、ラインごとに）出力され、画像中の１つのピクセルとして表示することができる。前記制御手段２５は、目標の第１のラインごとのスキャンがＣＣＤの第１の露出時間によって実行され、これによってスキャン中のどのライン又はピクセルが一定の強度を越える電磁波を放射する電磁波放射物質１５を構成するかを特定し、その後、第１のスキャンの間に一定の強度を超える電磁波を放射した電磁波放射物質１５を構成するライン又はピクセルのみをより少ない露出時間を用いて第２のスキャンが実行される。この少ない露出時間は、ＣＣＤ検出器１９Ｃの限界到達を防ぐために十分に短くなるよう前記制御装置によって設定が可能である。本実施の形態は、本発明の第３の実施の形態で述べた装置と同様に配置された２つのＣＣＤ検出器を備えるよう変形することが可能である。
【００２８】
本発明の更なる実施の形態では、目標全体の第１の露出がＣＣＤ検出器によって高ゲインで行われ、ＣＣＤ要素の電荷が画像処理装置にダウンロードされてシリアルに読み取られる。スキャンにおいてライン又はピクセルのいずれかが予め定められた強度を超える電磁波を放射する検出電磁波放射物質を含んでいれば、これらのライン又はピクセルの位置が記録され、第２の完全なスキャンが実行される。この第２のスキャンに続き、前記ＣＣＤ要素の電荷がシリアルにダウンロードされるが、但し、第１のスキャンで予め定められた強度を越えた電磁波を放射した電磁波放射物質を含むライン又はピクセルの電荷のみが読み取られる。その他のライン又はピクセルからの電荷は捨てられ、これによってこれらを読み取るために使用する時間を節約している。更なる時間を節約するため、ライン又はピクセルを全てシリアルにダウンロードすることなく、予め定められた強度を越えた電磁波を放射した電磁波放射物質を含む最後のライン又はピクセルに関する電荷がダウンロードされた直後にダウンロードを停止することができる。それ以降のライン又はピクセルの電荷は捨てられる。
【００２９】
本発明の更に他の実施の形態では、予め定められた一定の強度を超える電磁波を放射する電磁波放射物質を検出する第１のスキャンに続く第２のスキャンの間に検出器のゲインを低減する代わり、励起照射の強度を低下させる。これは励起照射の電源の供給電力を低くすることにより（この場合、異なるレベルの照射強度において記録された画像又は信号の間の比較を可能とするよう、励起照射強度を測定する手段を備えることが好ましい）、または励起照射と励起される電磁波放射物質との間の通路に既知強度の中立フィルタを配置することにより達成される。
【００３０】
本発明の更に他の実施の形態では、検出器のゲインと励起照射強度との双方が独立して調整可能である。
【００３１】
当然ながら、本発明はこれまでに具体的に記載され図面に表示された実施の形態に限定されるものではなく、請求の範囲に規定する一般的な発明の概念の範疇で多くの変形と改造が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明に係る装置の１つの実施の形態を示す概略図である。
【図２】本発明に係る装置の他の実施の形態を示す概略図である。
【図３】本発明に係る装置のさらに他の実施の形態を示す概略図である。
【符号の説明】
【００３３】
１．照射源、  ３、３’、３”．レーザ光線（蛍光電磁波）、  ５．フィルタ、  ７．二色性ミラー、  ９．スキャナヘッド、  １１．スキャン領域（電気泳動ゲル）、  １３ａ、１３ｂ．ガラス板、  １５．電磁波放射物質（フルオロフォア）、  １７．レンズ、  １９、１９Ａ、１９Ｂ．電磁波検出手段（光電子倍増管チューブ（ＰＭＴ））、  １９Ｃ．ＣＣＤ検出器、  ２１．フィルタ、  ２３、２３’．検出セル（検出器）、  ２５．制御手段（コンピュータ）、  ２７．メモリ。
【図１】
2005512049.tif 000003
【図２】
2005512049.tif 000004
【図３】
2005512049.tif 000005
【国際調査報告】
2005512049.tif 000006
2005512049.tif 000007
2005512049.tif 000008