(57)【要約】β2ミクログロブリン/β2ミクログロブリン付随タンパク質複合体を含む試料において遊離β2ミクログロブリンを検出するために有用なイムノアッセイ法が提供される。MHC単量体またはMHC四量体を含む試料において遊離β2ミクログロブリンを検出するためのサンドイッチイムノアッセイ法および競合イムノアッセイ法もまた提供される。そのようなイムノアッセイ法を行うためのキットもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、β2ミクログロブリンおよびβ2ミクログロブリン付随タンパク質(β2m-AP)を含む複合体を含有する試料において、遊離β2ミクログロブリンの存在を検出する方法：
a)β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/β2m-AP複合体を実質的に結合しない固定化抗体またはその抗原結合断片に、固定化抗体またはその抗原結合断片がβ2ミクログロブリンに特異的に結合する条件下において、試料を接触させる段階；ならびに
b)β2ミクログロブリンに対する固定化抗体の特異的結合を検出し、それによって試料における遊離β2ミクログロブリンの存在を検出する、段階。
【請求項２】
β2ミクログロブリンがヒトβ2ミクログロブリンまたはマウスβ2ミクログロブリンである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
β2m-APが主要組織適合複合体(MHC)クラスI分子である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
MHCクラスI分子がヒトリンパ球抗原(HLA)分子またはマウスH2分子である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
HLA分子がHLA-A、HLA-B、またはHLA-C分子である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
マウスH2分子がH2-D、H2-K、またはH2-L分子である、請求項4記載の方法。
【請求項７】
MHCクラスI分子がMHCクラスIb分子である、請求項3記載の方法。
【請求項８】
MHCクラスIb分子がHLA-E、HLA-F、またはHLA-G分子である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
β2m-APが、鉄代謝に関与しているヘモクロマトーシス遺伝子産物、HFEである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
β2m-APがCD1a、CD1b、CD1dc、およびCD1eから選択される分化クラスター(CD)分子である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
固定化抗体が、C21.48AであるかまたはC21.48Aと実質的に同じ特異的結合活性をもつ抗体である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
β2ミクログロブリンに対する固定化抗体の特異的結合を検出する段階が以下の段階を含む、請求項1記載の方法：
固定化抗体に特異的に結合しているβ2ミクログロブリンを含むβ2ミクログロブリンを特異的に結合する第二抗体に、第二抗体が特異的に結合する条件下において、試料および固定化抗体またはその抗原結合断片をさらに接触させる段階；
固定化抗体に特異的に結合したβ2ミクログロブリンと該β2ミクログロブリンに特異的に結合した第二抗体とを含む固定化抗体を単離し、それによって単離された固定化抗体を得る段階；ならびに
単離された固定化抗体に会合した第二抗体を検出し、それによって試料における遊離β2ミクログロブリンの存在を検出する段階。
【請求項１３】
第二抗体が、遊離β2ミクログロブリン、β2ミクログロブリン/β2m-AP複合体、または遊離β2ミクログロブリンとβ2ミクログロブリン/β2m-AP複合体とを特異的に結合する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
第二抗体が、B1G6であるかまたはB1G6と実質的に同じ特異的結合活性をもつ抗体である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
第二抗体が、検出可能な標識を含み、かつ第二抗体を検出する段階が、検出可能な標識を検出する段階を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
固定化抗体に会合した第二抗体を検出する段階が、第二抗体に特異的に結合する試薬に、試薬が第二抗体に特異的に結合する条件下において、第二抗体を接触させる段階、および第二抗体に対する試薬の特異的結合を検出する段階を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
試薬が第三抗体である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
β2ミクログロブリンに対する固定化抗体の特異的結合を検出する段階が以下の段階を含む、請求項1記載の方法：
固定化抗体に特異的に結合していない材料から、固定化抗体に特異的に結合したβ2ミクログロブリンを含む固定化抗体を単離し、それによって単離された固定化抗体を得る、段階；
固定化抗体に特異的に結合しているβ2ミクログロブリンを含むβ2ミクログロブリンを特異的に結合する第二抗体に、第二抗体が特異的に結合する条件下において、単離された固定化抗体をさらに接触させる段階；および
単離された固定化抗体に会合した第二抗体を検出し、それによって試料における遊離β2ミクログロブリンの存在を検出する段階。
【請求項１９】
試料および固定化抗体またはその抗原結合断片を接触させる段階が、β2ミクログロブリン競合物質に試料および固定化抗体またはその抗原結合断片を接触させる段階をさらに含み；かつ
β2ミクログロブリンに対する固定化抗体の特異的結合を検出する段階が、固定化抗体に特異的に結合したβ2ミクログロブリン競合物質を検出し、それは試料における遊離β2ミクログロブリンを示しており、それによって試料における遊離β2ミクログロブリンの存在を検出する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
β2ミクログロブリン競合物質が、検出可能な標識を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
検出可能な標識が酵素、蛍光分子、発光分子、または放射性核種を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
検出可能な標識がアルカリホスファターゼを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階を含む、β2ミクログロブリン/主要組織適合複合体(MHC)クラスI分子複合体を含む試料においてMHCクラスI分子に結合していないβ2ミクログロブリンの存在を検出する方法：
a)β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/MHC分子複合体を実質的に結合しない固定化抗体またはその抗原結合断片に、抗体またはその抗原結合断片がβ2ミクログロブリンに特異的に結合する条件下において、試料を接触させる段階；および
b)β2ミクログロブリンに対する抗体の特異的結合を検出し、それによって試料におけるMHC分子に結合していないβ2ミクログロブリンの存在を検出する段階。
【請求項２４】
β2ミクログロブリンがヒトβ2ミクログロブリンまたはマウスβ2ミクログロブリンである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
MHCクラスI分子がヒトリンパ球抗原(HLA)分子である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
HLA分子がHLA-A、HLA-B、またはHLA-C分子である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
MHCクラスI分子がマウスH2分子である、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
マウスH2分子がH2-D、H2-K、またはH2-L分子である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
試料におけるβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体が以下を含む、請求項23記載の方法：
単量体が1つのβ2ミクログロブリンおよび1つのMHCクラスI分子を含む、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子単量体；
各重合体が、機能的に連結された少なくとも2つのβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子単量体を含む、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子重合体；または
β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子単量体とβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子重合体との組み合わせ。
【請求項３０】
β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子重合体が四量体を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
MHCクラスI分子がリンカー部分をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項３２】
試料において、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体がβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子重合体を含み、かつ重合体における各単量体が、リンカー部分を通じて少なくとも1つの他の単量体に機能的に連結している、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
リンカー部分がチオール反応基を含み、かつ単量体同士がジスルフィド結合を通じて機能的に連結している、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
リンカー部分が、特異的結合対の第二のメンバーと特異的に相互作用する特異的結合対の第一のメンバーを含む、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
試料において、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体がβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子重合体を含み、かつ重合体における各単量体が、特異的結合対の第一のメンバーと特異的結合対の第二のメンバーとの特異的相互作用を通じて機能的に連結している、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
特異的結合対がビオチンとアビジン、またはビオチンとストレプトアビジンを含む、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体におけるMHCクラスI分子が、ペプチド抗原結合ドメインを含む、請求項23記載の方法。
【請求項３８】
試料が、MHCクラスI分子におけるペプチド抗原結合ドメインに結合することができるペプチドをさらに含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
以下を含むキット：
a)β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体を実質的に結合せず、固相に固定化されている、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片；および
b)抗体またはその抗原結合断片により特異的に結合されうる、β2ミクログロブリン競合物質。
【請求項４０】
固定化抗体が、C21.48AであるかまたはC21.48Aと実質的に同じ特異的結合活性をもつ抗体である、請求項39記載のキット。
【請求項４１】
β2ミクログロブリン競合物質が、検出可能な標識を含む、請求項39記載のキット。
【請求項４２】
検出可能な標識が酵素、蛍光分子、発光分子、または放射性核種を含む、請求項41記載のキット。
【請求項４３】
検出可能な標識がアルカリホスファターゼを含む、請求項42記載のキット。
【請求項４４】
あらかじめ決められた量または濃度の遊離β2ミクログロブリンを含む少なくとも1つの標準をさらに含む、請求項39記載のキット。
【請求項４５】
以下を含むキット：
a)遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合する第一抗体またはその抗原結合断片であって、該第一抗体またはその抗原結合断片がβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体を実質的に結合しない、第一抗体またはその抗原結合断片；ならびに
b)遊離β2ミクログロブリン、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体、β2ミクログロブリンおよび第一抗体を含む複合体、もしくはそれらの組み合わせを特異的に結合する、第二抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４６】
第一抗体またはその抗原結合断片が固相に固定化されている、請求項45記載のキット。
【請求項４７】
第一抗体がC21.48AまたはC21.48Aと実質的に同じ特異的結合活性をもつ抗体である、請求項45記載のキット。
【請求項４８】
第二抗体がB1G6または実質的に同じB1G6の特異的結合活性をもつ抗体である、請求項45記載のキット。
【請求項４９】
遊離β2ミクログロブリン、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項45記載のキット。
【請求項５０】
あらかじめ決められた量または濃度の遊離β2ミクログロブリンを含む標準を、遊離β2ミクログロブリンとして含む、請求項49記載のキット。
【請求項５１】
少なくとも2つの異なる量または濃度の遊離β2ミクログロブリンを含む複数の標準のうちの1つを、標準として含む、請求項50記載のキット。
【請求項５２】
第二抗体またはその抗原結合断片が、検出可能な標識を含む、請求項45記載のキット。
【請求項５３】
検出可能な標識が酵素、蛍光分子、発光分子、または放射性核種を含む、請求項52記載のキット。
【請求項５４】
検出可能な標識がペルオキシダーゼを含む、請求項52記載のキット。
【請求項５５】
第二抗体を特異的に結合する第三抗体をさらに含む、請求項45記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般には、イムノアッセイ法、より具体的には、試料において遊離β2ミクログロブリンを検出するための方法、およびそのような方法を行うのに有用なキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景情報
脊椎動物免疫応答には、侵入する生物体を「殺す」ことができる細胞障害性T細胞(CTL)および抗体産生B細胞の刺激に寄与するヘルパーT細胞を含み、主に抗体を産生するためのBリンパ球(B細胞)の刺激を特徴とする体液性免疫応答と、主にエフェクターTリンパ球の活性化を特徴とする細胞性免疫応答との2つの備えが含まれる。体液性免疫は、一般に細菌のリポ多糖エンドトキシンのような毒素への曝露に応答して活性化されるのに対して、細胞性免疫応答は、一般にウイルスもしくは細菌の感染、または例えば組織移植による、非自己抗原への曝露に応答して活性化される。しかし、一般に体液性および細胞性免疫応答は、感染に応答して共に働く。
【０００３】
免疫応答の大きさは、進行を追跡することおよび感染の予後を決定することにおいて、臨床医を補助しうるため、免疫応答のレベルおよび持続を測定するための方法を開発することへ多くの努力がそそがれた。体液性応答については、血清において抗体が循環しているレベルを測定するための単純な方法が利用可能である。しかしながら、細胞性免疫応答の大きさを測定するための方法は、応答に関与しているT細胞を同定することを一般に必要とするため、手が加えられていない。
【０００４】
特定の抗原に対して応答性である個体においてT細胞の数を測定するための通常の方法は、限界希釈アッセイ法である。この方法において、CTLは、平均して単細胞が1個のウェルに存在するまで、マイクロタイタープレートにおいて連続的に希釈され、その後、細胞を増幅させるように刺激し、抗原に応答したときの細胞障害性活性について検査する。この方法は、CTLが細胞障害性活性を有することだけでなく、次の感染において重大な意味をもつ、CTLの増殖能も示しているため、有用である。残念ながら、限界希釈方法は、細胞が一般に細胞障害性活性を測定するのに十分な細胞数とするには、2、3週間、増殖させる必要があるため、時間がかかる。そのようであるため、方法は、大きな労働力を要し、行うのに費用がかかり、かつハイスループットアッセイ形式に容易には適応させえない。さらに、限界希釈アッセイ法は、その方法が、増幅する能力をもつCTLを同定するのみであるため、個体において特定のCTLの数を実際より少なく見積もる可能性がある。
【０００５】
抗原特異性CTLを同定するのに有用なもう一つの方法としては、抗原刺激されたCTLによるインターフェロンγのようなサイトカインの発現に依存する。この方法において、抗原刺激された細胞は透過処理され、細胞内免疫染色が、例えば、検出可能に標識された抗インターフェロンγ抗体を用いて行われる。この方法は、細胞増殖、すなわち、それゆえに、細胞培養段階の必要がなく、かつハイスループットアッセイ形式に容易に適応できることから、限界希釈方法を超える利点を有する。しかしながら、方法は、細胞に対して毒性があり、それゆえに、例えば、追加的な機能的検査を行うために、抗原特異的細胞を選択することが不可能である。
【０００６】
主要組織適合複合体(MHC)分子の四量体を利用して抗原特異性T細胞を検出する、ごく最近開発された方法は、T細胞分析に革命を起こした。MHC四量体複合体は、特定のペプチド抗原および蛍光色素のような検出可能な標識と共に、4つのMHC単量体、例えば、4つのMHCクラスI分子/β2ミクログロブリン単量体、の会合により形成される。そのようなMHCクラスI分子四量体複合体は、細胞障害性Tリンパ球(CTL)を含む、CD8+ T細胞のサブセット上のT細胞受容体の別個のセットに結合する。CTLは、エフェクターCD8+ T細胞であるが、必ずしも、CD8+ T細胞の抗原特異的プール全体を表してはいない。この点で、MHC四量体方法が、エフェクター機能を示さないナイーブおよびアネルギー性のCD8+ T細胞を含むすべての抗原特異的CD8+ T細胞を検出することができるのに対して、LDAおよびサイトカインアッセイ法の両方とも、CTLまたはCTLの亜集団を検出する。MHC四量体を末梢血リンパ球または全血と混合し、検出系としてフローサイトメトリーを用いることにより、ペプチドに特異的なすべてのT細胞の数およびそれの適合した対立遺伝子が提供される。そのようであるため、MHC四量体により、特定のペプチドに対する細胞性応答の測定が可能となる。
【０００７】
T細胞特異性を分析するためのMHC四量体の使用は、以前に用いられたT細胞アッセイ法を超える有意な利点を提供する。例えば、MHC四量体方法は定量的であり、放射性色素の使用を必要とせず、かつハイスループットアッセイ形式に容易に適応される。さらに、方法は迅速に行うことができ、かつ、それゆえに、新鮮な血液または組織試料の検査に用いることができる。MHC四量体複合体が蛍光標識を含む場合、T細胞を含む細胞集団は、例えば、他の細胞表面分子に特異的である1つまたは複数の他の蛍光で標識された分子でさらに染色し、フローサイトメトリーを用いて分析してもよく、従って、応答細胞は追加的に特徴付けされる。さらになお、MHC四量体分析は、標識された細胞に対する毒性はなく、かつ、それゆえに、四量体結合細胞は、フローサイトメトリーによって均一な集団に分類され、それらの機能的能力、例えば、抗原に応答して増殖する能力、を確認するための追加的アッセイ法により試験することができる。
【０００８】
MHC四量体分析の使用は、MHC-ペプチド複合体への結合の特異性に基づく個々のT細胞の同定を可能にする。四量体分析方法は、HIVのような急性ウイルス感染をもつヒトにおいてCD8+ T細胞応答を研究するために用いられていたが、それにより、応答の急性期の間の抗原特異的CD8+ T細胞の増加は、以前に考えられていたより、はるかに大きいことが明らかにされた。MHC四量体はまた、エプスタインバーウイルス単核球症、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザおよびはしかを含む他のウイルス感染において；寄生虫の感染、マラリアにおいて；乳癌、前立腺癌、黒色腫、大腸癌、肺癌および子宮頚癌を含む癌において；多発性硬化症および関節リウマチを含む自己免疫疾患において；ならびに移植において、CD8+ T細胞応答を正確にかつ効率的にモニターするために用いられた。
【０００９】
MHC四量体結合の特異性は、複合体全体(重鎖、β2ミクログロブリンおよびペプチド)の無傷性に依存している。重鎖、軽鎖およびペプチドの会合は、可逆性であり、MHC対立遺伝子についてのペプチドの親和性に依存する。複合体の解離は、それの構成要素の一つの解離生成物、β2ミクログロブリン(軽鎖)を測定することにより、測定されうる。しかしながら、解離を測定するのに有用であるために、遊離β2ミクログロブリンが、それを複合体において結合しているβ2ミクログロブリンから区別する方法において測定されなければならない。MHC四量体が臨床的または他のそのようなアッセイ法のための試薬として用いられる場合は、アッセイ法が標準化され、正確かつ精度の高い結果を提供することができるように、試薬における機能的MHC四量体の量が、既知または容易に測定されることが不可欠である。
【００１０】
MHC四量体から(およびMHC単量体から)のβ2ミクログロブリンの解離は、一般に、遊離β2ミクログロブリンの量が四量体(または単量体)を含む試料において測定される、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定された。本質的には、試料を適当なカラムに通過させ、カラムから溶出した画分を、例えば、UV吸光度によりモニターし、遊離β2ミクログロブリンの溶出時間に対応するピーク下の領域を適当なアルゴリズムを用いて測定する。残念ながら、遊離β2ミクログロブリンを測定するためのサイズ排除方法は、いくつかの欠点をもつ。例えば、単一の試料の分析は、約1〜2時間で行われるが、二連式の分析を含む多数の試料の分析は、連続的に行わなければならない。そのようであるため、多数の試料を分析するには、非常に長時間かかることがある。さらに、方法の変動性はむしろ高く、結果として相対的に精度の低いアッセイとなる。このように、MHCクラスI分子/β2ミクログロブリン複合体を含む試料において遊離のβ2ミクログロブリンの量を測定する便利かつ効率的な方法が必要である。本発明は、この必要性を満たし、さらなる利点を提供する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、β2ミクログロブリンとβ2ミクログロブリン付随タンパク質(β2m-AP)の複合体を含む試料において遊離β2ミクログロブリンの存在を検出する方法に関する。本発明の方法は、例えば、抗体またはその抗原結合断片がβ2ミクログロブリンに特異的に結合する条件下において、遊離のβ2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/β2m-AP複合体として存在する場合のβ2ミクログロブリンを実質的に結合しない抗体またはその抗原結合断片に、試料を接触させること；およびβ2ミクログロブリンに対する抗体の特異的結合を検出し、それにより、試料における遊離β2ミクログロブリンの存在を検出することにより行うことができる。
【００１２】
β2ミクログロブリンは、任意の生物体、特に、脊椎動物生物体由来であり、ヒトβ2ミクログロブリンまたはマウスβ2ミクログロブリンのような哺乳動物のβ2ミクログロブリンを含みうる。β2m-APは、β2ミクログロブリンポリペプチドと特異的に会合する任意の分子、例えば、主要組織適合複合体(MHC)クラスI分子でありうる。MHCクラスI分子は、MHCクラスIa分子、例えば、H2-D、H2-K、もしくはH2-L分子のようなマウスH2分子、またはHLA-A、HLA-B、もしくはHLA-C分子のようなヒトリンパ球抗原(HLA)、またはHLA-E、HLA-F、もしくはHLA-G分子のようなMHCクラスIb分子でありうる。β2m-APはまた、鉄代謝に関与するヘモクロマトーシス遺伝子産物、HFE、またはCD1a、CD1b、CD1dc、CD1dおよびCD1e分子のような分化クラスター(cluster of differentiation)(CD)分子でありうる。
【００１３】
本発明の方法において有用な抗体は、遊離β2ミクログロブリンを結合するが、β2m-AP、例えば、MHCクラスI分子と複合体であるβ2ミクログロブリンを結合しない。そのような抗体は、モノクローナル抗体C21.48Aにより例証され、C21.48Aと実質的に同じ特異的結合活性をもつ抗体でありうる。そのような抗体から引き出された抗体、例えば一本鎖抗体が用いられうるように、そのような抗体の抗原結合断片もまた、本発明の方法において用いられうる。望ましい場合には、抗体は、本発明のイムノアッセイを行うために用いられる条件下において一般に不溶性である固体支持体へ固定化されうる。
【００１４】
β2ミクログロブリンに対する抗体の特異的結合を検出することは、定量的または定性的でもよく、様々な方法で行うことができる。一つの態様において、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2m-APと複合体化されている場合のβ2ミクログロブリンを実質的に結合しない抗体(本明細書では「第一抗体」とも呼ばれる)と遊離β2ミクログロブリンとの特異的結合は、第二抗体を用いて検出される。この態様の一つの局面において、β2ミクログロブリンに対する第一抗体の特異的結合は、試料および第一抗体を、第一抗体に特異的に結合しているβ2ミクログロブリンを含むβ2ミクログロブリンを特異的に結合する第二抗体と、第二抗体が特異的に結合する条件下において、さらに接触させること；第一抗体に特異的に結合した遊離β2ミクログロブリンおよびそれらに特異的に結合した第二抗体を含む第一抗体を単離すること；ならびに単離された第一抗体および遊離β2ミクログロブリンと会合した第二抗体を検出することにより検出される。
【００１５】
この態様のもう一つの局面において、固定化抗体である遊離β2ミクログロブリンに対する第一抗体の特異的結合は、第一抗体に特異的に結合した遊離β2ミクログロブリンを含む第一抗体を、第一抗体に特異的に結合していない材料から単離すること；第一抗体に特異的に結合した任意の遊離β2ミクログロブリンを含む単離された第一抗体を、第一抗体に特異的に結合しているβ2ミクログロブリンを含むβ2ミクログロブリンを特異的に結合する第二抗体と、第二抗体が特異的に結合する条件下において、さらに接触させること；および、単離された第一抗体/遊離β2ミクログロブリン複合体と会合した第二抗体を検出することにより検出される。
【００１６】
本発明のそのような方法において有用な第二抗体は、第二抗体がまた、β2ミクログロブリンが上記の特性をもつ第一抗体により特異的に結合されている場合のβ2ミクログロブリンも特異的に結合するとの条件で、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合する、または遊離β2ミクログロブリンおよびβ2m-APと複合体化されている場合のβ2ミクログロブリンを特異的に結合する、任意の抗体でありうる。例えば、第二抗体は、β2ミクログロブリンに、それが遊離型であろうとβ2m-APとの複合体であろうとにかかわらず、特異的に結合する、モノクローナル抗体B1G6でありうる、または実質的に同じB1G6の特異的結合活性をもつ抗体でありうる。
【００１７】
第二抗体は、検出可能な標識、例えば、蛍光分子、放射性核種、発光分子、またはその種の他のものを含んでいてもよく、その場合、第二抗体を検出することは、検出可能な標識を検出することにより達成されうる。加えて、または代替的に、第一抗体およびβ2ミクログロブリンに特異的に結合した第二抗体を検出することは、第二抗体を、第二抗体に特異的に結合する試薬と、試薬が第二抗体に特異的に結合する条件下において、接触させること、および第二抗体に対する試薬の特異的結合を検出することにより行うことができる。そのような試薬は、第三抗体、Fc受容体、または第二抗体もしくはそれに連結された部分を特異的に結合する任意の他の試薬でありうる。
【００１８】
本発明の方法のもう一つの態様において、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/β2m-AP複合体として存在する場合のβ2ミクログロブリンを実質的に結合しない抗体(すなわち、「第一抗体」)への遊離β2ミクログロブリンの特異的結合は、β2ミクログロブリン競合物質の存在下において検出される。そのような方法は、例えば、試料、第一抗体、およびβ2ミクログロブリン競合物質を接触させること；および抗体に特異的に結合したβ2ミクログロブリン競合物質を検出することにより行われ、結合しているβ2ミクログロブリン競合物質の量は、試料における遊離β2ミクログロブリンを示している。β2ミクログロブリン競合物質は、検出可能な標識、例えば、蛍光分子、発光分子、放射性核種、もしくはアルカリホスファターゼのような酵素を含んでいてもよく、またはβ2ミクログロブリン競合物質の検出を容易にする任意の手段を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の方法において、第一抗体は、固定化される、または固体支持体へ固体化されることが可能であり、それにより、存在する場合は、第一抗体に特異的に結合した遊離β2ミクログロブリンまたはβ2ミクログロブリン競合物質、および存在する場合は、特異的に結合した第二抗体を含む第一抗体を単離することが容易となる。第一抗体は、第一抗体の固定化が接触段階の間もしくは後に行われる場合、固定化は特異的結合相互作用に影響を及ぼさないとの条件で、それを試料に接触させる前に；適切であれば、β2ミクログロブリン競合物質もしくは第二抗体が第一抗体および試料と接触している間を含む、それが試料と接触している間に、または特異的結合を検出する直前に、固定化されうる。
【００２０】
本発明はまた、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体を含む試料において、MHCクラスI分子へ結合していない遊離β2ミクログロブリンの存在を検出する方法に関する。そのような方法は、例えば、抗体がβ2ミクログロブリンに特異的に結合する条件下において、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体を実質的に結合しない抗体またはその抗原結合断片に、試料を接触させること；および遊離β2ミクログロブリンに対する抗体の特異的結合を検出することにより行うことができる。一つの態様において、抗体は固体支持体上に固定化され、それにより遊離β2ミクログロブリンに対する抗体の特異的結合を検出することを容易にする。
【００２１】
β2ミクログロブリンは、ヒトβ2ミクログロブリンまたはマウスβ2ミクログロブリンのような哺乳動物のβ2ミクログロブリンを含む、任意の生物体由来であり、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体は、1つのMHCクラスI分子重鎖と特異的に会合した1つのβ2ミクログロブリン軽鎖を含むβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子単量体；機能的に会合した少なくとも2つのβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子単量体を含むβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子重合体；または単量体と重合体との組み合わせを含む、任意の複合体でありうる。一つの態様において、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子重合体は、MHC四量体である。もう一つの態様において、重合体における1つまたは複数のMHCクラスI分子は、リンカー部分を含み、リンカー部分を含んでいる少なくとも1つの単量体を含む単量体からのMHCクラスI分子重合体の形成を促進する。
【００２２】
リンカー部分は、連結された単量体を含むMHC重合体が曝されることになっている条件下において安定であり、かつMHC重合体を構成するMHC単量体の機能、特に、ペプチド抗原を特異的に結合するMHC単量体の能力、を乱さない2つまたはそれ以上のMHC単量体の会合を促進する任意の分子でありうる。リンカー部分は、例えば、単量体がジスルフィド結合を通じて機能的に連結されるような、チオール反応基でありうる；または、特異的結合対の第一メンバーを含む単量体が、特異的結合対の第一メンバーと特異的に相互作用する特異的結合対の第二メンバーを含む単量体に機能的に連結されるような、もしくはそれぞれが特異的結合対の第一メンバーを含む2つまたはそれ以上の単量体が、特異的結合対の第二メンバーを通じてお互いに機能的に連結されるような、特異的結合対のメンバーでありうる。例えば、試料におけるβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体は、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子重合体であってもよく、重合体における各単量体は、ビオチンのような特異的結合対の第一メンバーの、特異的結合対の第二メンバー、例えばアビジンまたはストレプトアビジンに対する特異的相互作用を通して機能的に連結される。MHC重合体における単量体を含む、MHCクラスI分子単量体は、一般に、ペプチド抗原結合ドメインを含み、それに特異的に結合したペプチド抗原をさらに含みうる。
【００２３】
本発明はまた、β2ミクログロブリンとβ2m-APとの複合体、例えば、MHC単量体、二量体、三量体、四量体などを含む試料において遊離β2ミクログロブリンの存在を検出するために有用な1つまたは複数の試薬を含むキットに関する。一つの態様において、本発明のキットは、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体を実質的に結合しない抗体またはその抗原結合断片を含み、そしてそのうえ、抗体またはその抗原結合断片により特異的に結合されうるβ2ミクログロブリン競合物質を含んでいてもよい。抗体は、必要とされる特異性をもつ任意の抗体、例えば、モノクローナル抗体C21.48A、またはC21.48Aと実質的に同じ特異的結合活性をもつ抗体でありうる。
【００２４】
キットにおける抗体またはその抗原結合断片は、固体支持体上に固定化されうる、または固体支持体に固定化されうる形態とすることができ、その場合、キットは、望ましい場合には抗体が固定化されうる1種もしくは2、3種の固体支持体を含む、固定化を行うための試薬をさらに含みうる。キットのβ2ミクログロブリン競合物質は、例えば、蛍光分子、発光分子、放射性核種、もしくはアルカリホスファターゼのような酵素で検出可能に標識される、または容易に標識される形態とすることができ、その場合、キットは、β2ミクログロブリン競合物質を標識するための試薬をさらに含みうる。キットはまた、少なくとも1つの標準、例えば、1つまたは2、3のあらかじめ決められた量もしくは濃度の遊離β2ミクログロブリンを含んでいてもよく、このように、試料において遊離β2ミクログロブリンの量を定量するために有用なキットが提供される。
【００２５】
もう一つの態様において、本発明のキットは、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体を実質的に結合しない、第一抗体またはその抗原結合断片を含み、そしてそのうえ、遊離β2ミクログロブリン、または遊離β2ミクログロブリンおよびMHCクラスI分子と複合化されたβ2ミクログロブリンを特異的に結合し、かつさらに第一抗体と複合化された遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合する、第二抗体を含みうる。例えば、第一抗体は、C21.48A抗体、またはC21.48Aと実質的に同じ特異的結合活性をもつ抗体であり、第二抗体は、B1G6抗体、または実質的に同じB1G6抗体の特異的結合活性をもつ抗体でありうる。
【００２６】
本発明のキットの第一抗体もしくは第二抗体は、固体支持体に固定化されうる、または固体支持体へ容易に固定化されうる形態とすることができ、その場合、キットは、望ましい場合には1種または2、3種の固体支持体を含む、固定化を行うための試薬をさらに含みうる。キットの第二抗体は、検出可能に標識されていてもよく、または、例えば、第二抗体は、第一抗体に特異的に結合しているβ2ミクログロブリンに特異的に結合している場合を少なくとも含め、第二抗体もしくはそれに連結された部分を特異的に結合する第三抗体または他の試薬を用いて検出されうる。キットはまた、遊離β2ミクログロブリン、MHCクラスI分子と複合化されているβ2ミクログロブリン、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよく、キットが遊離β2ミクログロブリンを含む場合、遊離β2ミクログロブリンは、1つまたは2、3のあらかじめ決められた量もしくは濃度で存在し、標準として有用となりうる。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、β2ミクログロブリンとMHCクラスI分子のようなβ2ミクログロブリン付随タンパク質(β2m-AP)との複合体を含むまたは含むことが疑われる試料において、遊離β2ミクログロブリンを検出かつ定量するためのイムノアッセイ法を提供する。そのような方法を行うためのキットもまた提供される。本明細書に開示されるように、本発明のイムノアッセイ法は、強靱で、正確で、感度が高く、かつ再現性がある(実施例2および3を参照)。
【００２８】
本発明は、β2ミクログロブリンとβ2m-APとの複合体を含む試料において、遊離β2ミクログロブリンの存在を検出する方法を提供する。本発明の方法は、例えば、抗体がβ2ミクログロブリンに特異的に結合する条件下において、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/β2m-AP複合体として存在する場合のβ2ミクログロブリンを実質的に結合しない抗体またはその抗原結合断片に、試料を接触させること；およびβ2ミクログロブリンに対する抗体の特異的結合を検出し、それにより、試料における遊離β2ミクログロブリンの存在を検出することにより行うことができる。考察の便宜上、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2m-APとの複合体として存在する場合のβ2ミクログロブリンを実質的に結合しない抗体またはその抗原結合断片は、本明細書では一般に、「第一抗体」と呼ぶ。
【００２９】
本発明の方法により、遊離β2ミクログロブリンに対する第一抗体の特異的結合は、第二抗体を用いて、例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)のようなサンドイッチアッセイ形式において検出されうる、または競合アッセイ法においてβ2ミクログロブリン競合物質を用いて検出されうる。第二抗体が、第一抗体と遊離β2ミクログロブリンの特異的結合を検出するために用いられる場合は、第二抗体は、第一抗体により特異的に結合されたβ2ミクログロブリン、すなわち、第一抗体/β2ミクログロブリン複合体を特異的に結合する能力に基づいて選択され、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合する能力、または遊離β2ミクログロブリンに加えてβ2m-APと複合体化されているβ2ミクログロブリンも特異的に結合する能力に基づいてさらに選択されうる。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「β2ミクログロブリン付随タンパク質」または「β2m-AP」という用語は、β2ミクログロブリンと特異的に会合する分子を意味する。β2m-APは、本明細書では、クラスIa分子およびクラスIb分子を含む、主要組織適合複合体(MHC)クラスI分子により例示される。MHCクラスIa分子は、H2-D、H2-K、およびH2-LのようなマウスH2分子、ならびにHLA-A、HLA-BおよびHLA-Cのようなヒトリンパ球抗原(HLA)分子により例示され、MHCクラスIb分子は、HLA-E、HLA-F、およびHLA-G分子により例示される。β2m-APはまた、例えば、鉄代謝に関与するヘモクロマトーシス遺伝子産物、HFE、またはCD1a、CD1b、CD1c、CD1d、およびCD1e分子のような分化クラスター(CD)分子でありうる。一般に、β2ミクログロブリンと特異的に会合する抗体は、本考察の目的にとって、β2m-APとみなされない。しかしながら、開示された方法は、β2ミクログロブリンおよび抗β2ミクログロブリン抗体を含む試料において遊離β2ミクログロブリンを検出するために容易に用いられうる。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、「複合体」という用語は、生理的条件下においてお互いに特異的に会合する、任意の2つの分子、特にタンパク質、を指すのに広く用いられる。「複合体」という用語はまた、2つまたはそれ以上の分子複合体の特異的会合を含む。特に、「複合体」という用語は、本明細書では、β2ミクログロブリンとβ2m-APとの会合、特にβ2ミクログロブリンと会合したMHCクラスI分子を含む複合体、を指すのに用いられ、また、β2ミクログロブリンのようなタンパク質とβ2ミクログロブリンに特異的に結合する抗体との間に形成される会合を指すのに用いられる。「MHC単量体」という用語は、本明細書では、より具体的には、MHCクラスI分子とβ2ミクログロブリンとの間に形成された複合体を指すのに用いられ、「MHC重合体」という用語は、本明細書では、2個またはそれ以上のMHC単量体を含む複合体を指すのに用いられる。MHC重合体は、MHC二量体、MHC三量体、MHC四量体などを含みうる(例えば、米国特許第5,635,363号を参照されたい、これは参照として本明細書に組み入れられている)。MHC重合体における単量体は、直接的に、例えばジスルフィド結合を通じて、または間接的に、例えば特異的結合対を通じて、連結されてもよく、また、例えば、単量体のMHCクラスI分子構成要素内へ操作されてもよく、ロイシンジッパーのような単量体の二次または三次構造間の特異的な相互作用を通じて会合されてもよい。MHC重合体はまた、一般に、MHCクラスI分子のペプチド結合部位(割れ目)に結合するペプチド抗原を含むことができ；重合体における1つまたは複数のMHC単量体のクラスI構成要素内へ操作されるペプチド配列、例えば、BirA酵素についてのビオチン化部位を含むシグナル配列、をさらに含むことができ；および検出可能な標識を含むことができる。
【００３２】
本発明の方法は、β2ミクログロブリンを含む複合体を含むまたは含むことが疑われる試料を含んだ試料において、遊離β2ミクログロブリンの存在または量を検出するために有用である。そのようであるため、本発明の方法は、例えば、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体の形成を、そのような分子を形成するように設計された反応において追跡するために用いることができ、このように、そのような反応の程度、および反応が完了または定常状態に達した時点を測定するための手段を提供する；または、規定時間において複合体の特定の量を含むことがわかっている試料において、時間が経つことによるそのような複合体の解離を測定するために用いることができる。
【００３３】
本発明の方法は、MHC四量体からのβ2ミクログロブリンの解離を検出するために特に有用である。MHC四量体は、特異的なペプチドと会合し、かつ蛍光色素を含む、4つのMHC単量体の複合体である(米国特許第5,635,363号)。MHCクラスI単量体は、2つのポリペプチド、約45,000ダルトン(Da)の分子量をもつMHCコード化多型膜貫通ポリペプチドおよび約12,000 Daの分子量をもつ非多型β2ミクログロブリンポリペプチドから構成される。重鎖は、N末端からC末端まで、α1、α2およびα3と呼ばれる3つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに小さい細胞質ドメインを含む；β2ミクログロブリンはα3ドメインと会合する。MHCクラスI単量体は、重鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをビオチン化されうるペプチド配列と置換することにより調製され、MHCクラスI四量体は、そのような単量体を、4つのビオチン部分を結合することができるストレプトアビジンに接触させることにより形成され(例えば、Altmanら、Science 274:94-96、1996；OggおよびMcMichael、Curr. Opin. Immunol. 10:393-396、1998を参照、それぞれは参照として本明細書に組み入れられている；米国特許第5,635,363号も参照)、商業的に入手可能である(Immunomics/Beckman Coulter, Inc.)。
【００３４】
MHC四量体は、細胞表面CD8へのHLA分子の結合を最小限にするために、HLA-A*0201、HLA-B*3501、HLA-A*1101、HLA-B*0801およびHLA-B*2705を含む、変異型クラスIa HLA分子を含む、MHCクラスIおよびクラスII分子を用いて調製された(OggおよびMcMichael、前記、1998)。名称「m」は、クラスIa分子が変異体であることを示すために用いられる；例えば、HLA-A*0201mは、A245V置換を導入することによりHLA-A*0201から作製される(例えば、Bodinierら、Nat. Med. 6:707-710、2000を参照)。変異型HLA分子を含むMHC四量体は、CD8細胞の一般集団への結合を大いに減少させたが、ペプチド特異的結合を保持し、このように、まれで特異的なT細胞(CD8+の1%未満；Altmanら、前記、1996)の正確な識別を促進させる。例えば、それぞれが特異的ペプチドに結合し、かつフィコエリトリン(PE)と結合している、4つのHLA-A*0201 MHCクラスIa分子から構成されるMHC四量体が調製された(「i TAg(商標)MHC四量体(Tetramer)」、Immunomics/Beckman Coulter, Inc.)。HLA-A0201対立遺伝子は、世界的な集団の約40%〜50%において見出され、CD8媒介型結合を最小限にするために改変された(Bodinierら、Nat. Med. 6:707-710、2000、参照として本明細書に組み入れられている)。これらの複合体は、CD8+ T細胞のサブセット上のT細胞受容体(TCR)の別個のセットに結合する(McMichaelおよびO'Callaghan、J. Exp. Med. 187:1367-1371、1998、参照として本明細書に組み入れられている)。i TAg(商標)MHC四量体複合体は、例えば、複合体における特定のペプチドおよびHLA分子に特異的であるヒトCD8+ T細胞を認識する。特異的結合は、機能的経路に依存しないため、これらの四量体により同定される集団は、機能的状態にかかわらず、すべての特異的なCD8+細胞を含む。
【００３５】
MHC四量体または他の重合体の単量体は、共に共有結合性にまたは非共有結合性に、かつ物理的会合もしくは化学結合を通じて直接的にまたは特異的結合対の使用を通じて間接的に、機能的に連結されうる。本明細書に用いられる場合、「機能的に連結される」または「機能的に会合される」という用語は、第一分子および少なくとも第二分子が、各分子が実質的に本来のまたは天然の機能を維持するように、共有結合性にまたは非共有結合性に共に連結されることを意味する。例えば、それぞれがペプチド抗原を特異的に結合しうる2つのMHC単量体が機能的に連結されてMHC二量体を形成している場合は、MHC二量体における各MHC単量体は、ペプチド抗原を特異的に結合するその能力を維持している。抗原性ペプチドをT細胞へ提示するMHC重合体の能力を実質的に低下させないまたは阻害しないとの条件で、任意の手段が、単量体を機能的に連結するために用いられてもよい。一般に、MHC単量体は、単量体の重鎖構成要素を通じて共に連結される。このように、単量体は、例えば、重鎖を構成するアミノ酸の反応性側鎖間に形成された鎖間のペプチド結合を通じて、重鎖におけるシステイン残基間に形成された鎖間のジスルフイド結合を通じて、または一般に、アミノ酸側鎖により提示される化学基間に形成されうる任意の他の型の結合を通じて、連結されうる。
【００３６】
MHC重合体の単量体を機能的に連結するための便利な手段としては、特異的結合対が利用される。本明細書に用いられる場合、「特異的結合対」という用語は、お互いに特異的に相互作用しうる2つの分子を指す。特異的結合対の2つの分子は、「特異的結合対のメンバー」または「結合パートナー」と呼ばれる。特異的結合対は、相互作用がイムノアッセイを行うのに一般に用いられる条件下において安定であるように、選択される。多数の特異的結合対が当技術分野においてよく知られており、例えば、抗FLAG抗体とFLAGペプチド(Hoppら、BioTechnology 6:1204(1988)；米国特許第5,011,912号)；グルタチオンとグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)；ニッケルイオンまたはコバルトイオンのような二価金属イオンとポリヒスチジンペプチド；またはその種の他のものを含む。
【００３７】
ビオチンとストレプトアビジンが、MHC四量体を調製するために用いられたが、ビオチンとアビジンもまた用いられうる。これらの特異的結合対は、単一のアビジンまたはストレプトアビジン分子が4つのビオチン部分を結合することができるという利点を与え、このように、MHC四量体を調製するための便利な手段を提供する。ビオチンは、MHC重鎖のリシン残基へ化学的に結合されてもよく、または酵素反応を用いて結合されてもよく、重鎖が酵素BirAについてのビオチン化部位を含むペプチドシグナル配列を含むように改変されている(Altmanら、前記、1996；OggおよびMcMichael、前記、1998を参照)。または、ビオチンは、MHC重鎖よりリシン残基が少ないβ2ミクログロブリンに連結されてもよく、またはたった1つの接近可能なリシン残基を含むように変異誘発された、変異体β2ミクログロブリンに連結されてもよい。
【００３８】
β2ミクログロブリン/β2m-AP複合体がMHC複合体、例えば、MHCクラスI単量体またはMHCクラスI四量体である場合は、複合体は、さらにペプチド抗原を含むことができ、ペプチド抗原はMHCクラスI分子のペプチド結合割れ目により特異的に結合される。MHCクラスI四量体は一般に、特定のT細胞を検出するために用いられるため、ペプチド抗原は、検出されるべきT細胞の特異性に基づいて選択される。MHC分子により結合され、T細胞へ提示されるペプチド抗原は、当技術分野においてよく知られており、例えば、MART1特異的ペプチド、HIVgag特異的ペプチド、HIVpol特異的ペプチドなどを含む(実施例1を参照；LangおよびBodinier、Transfusion 41:687-690、2001；Pittetら、Intl. Immunopharm.1:1235-1247、2001；米国特許第6,037,135号；国際公開公報第94/20127号；国際公開公報第97/34617号も参照)。
【００３９】
本発明は、β2ミクログロブリン/β2m-AP複合体を含むまたは含むことが疑われる試料において遊離β2ミクログロブリンの存在を検出するためのイムノアッセイを提供する。本発明のイムノアッセイは、第二抗体が第一抗体と遊離β2ミクログロブリンの特異的結合を検出するために用いられる「サンドイッチ」アッセイであってもよく、またはβ2ミクログロブリン競合物質の「第一」抗体による結合が試料における遊離β2ミクログロブリンの存在を示す競合アッセイであってもよい。
【００４０】
本発明の方法において有用な第一抗体は、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、例えばMHCクラスI分子との、複合体であるβ2ミクログロブリンを結合しない。そのような特異性について機構は提案されていないが、一つの可能性は、抗体が、β2m-APと会合している、三次元のβ2ミクログロブリン分子の表面上にあるβ2ミクログロブリンのエピトープを認識するということである。モノクローナル抗体C21.48Aは、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、MHCクラスI分子β2m-APとの複合体であるβ2ミクログロブリンを結合しない抗体の例である(Liabeufら、J. Immunol. 127:1542-1548、1981；Devauxら、Res. Immunol. 141:357-372、1990、それぞれは参照として本明細書に組み入れられている)。そのようであるため、C21.48Aが特異的に結合するエピトープに対して、またはC21.48A抗体に対して産生された抗イディオタイプ抗体に対して、産生される抗体が用いられうるように、C21.48AまたはC21.48Aと実質的に同じ特異的結合活性をもつ抗体が、本発明の方法またはキットにおける第一抗体として用いられうる。
【００４１】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、加えてそのような抗体の抗原結合断片を含むように本明細書では広く用いられる。本発明の特定の方法に依存して、様々な特異性をもつ抗体が有用でありうるが、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2m-APとの複合体である場合のβ2ミクログロブリンを結合しない、抗体またはその抗原結合断片(本明細書では一般に「第一抗体」とも呼ばれる)；およびサンドイッチ型イムノアッセイ法における第二抗体として有用である抗体のような、β2ミクログロブリンが第一抗体により特異的に結合されている場合を含む、β2ミクログロブリンが遊離型であろうと複合体化型であろうとにかかわらず、β2ミクログロブリンを結合する抗体を含む。
【００４２】
抗体に関して用いられる場合、「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」という用語は、抗体と特定のエピトープの相互作用が、少なくとも約1 x 10-6、一般には少なくとも約1 x 10-7、通常には少なくとも約1 x 10-8、および特に少なくとも約1 x 10-9または1 x 10-10またはそれ未満の解離定数をもつことを意味する。そのようであるため、β2ミクログロブリンエピトープに対して特異的結合活性を保持する抗体のFab、F(ab')2、FdおよびFv断片は、抗体の定義内に含まれる。「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」という用語は、特異的結合対のメンバーの相互作用、加えて、β2ミクログロブリンとMHCクラスI重鎖のようなβ2m-APとの間の相互作用を言及するのに、本明細書では同様に用いられる。
【００４３】
本明細書に用いられる場合の「抗体」という用語は、例えば、一本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体、加えてそれらの抗原結合断片を含む、天然に存在する抗体、および天然に存在しない抗体を含む。そのような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築してもよく、組換えで産生してもよく、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより得てもよい(Huseら、Science 246:1275-1281、1989を参照)。例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、CDRグラフト(CDR-grafted)抗体、一本鎖抗体および二機能性抗体を作製するこれらおよび他の方法は、当業者によく知られている(WinterおよびHarris、Immunol. Today 14:243-246、1993；Wardら、Nature 341:544-546、1989；HarlowおよびLane、Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988)；Hilyardら、Protein Engineering: A Practical approach (IRL Press 1992)；Borrabeck、Antibody Engineering、第2版、(Oxford University Press 1995))。
【００４４】
望ましい特異性をもつ抗体は、周知の方法を用いて得られうる。例えば、C21.48Aと実質的に同じ特異的結合活性をもつ抗体は、Liabeufら(前記、1981)により記載される方法を用いて、または当技術分野において公知の別な方法で調製されうる(HarlowおよびLane、Antibodies: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988))。例えば、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体に結合しない抗体は、免疫原としてβ2ミクログロブリンまたはそのペプチド部分を用い、β2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体と結合する抗体を除去して得ることができる。例えば、MHC分子のようなβ2m-APに結合するβ2ミクログロブリンの空間的領域において存在するβ2ミクログロブリン分子のペプチド部分は、結晶学的データまたはタンパク質モデリング方法を用いて同定することができる(例えば、Shieldsら、J. Immunol. 160:2297-2307、1998；Pedersenら、Eur. J. Immunol. 25:1609、1995；Evansら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1994、1995；Garbocziら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:3429-3433、1992；Fremontら、Science 257:919、1992を参照、それぞれは参照として本明細書に組み入れられている)。
【００４５】
モデリング系は、例えば、結晶解析もしくは核磁気共鳴分析により得られた構造的情報、または一次配列情報に基づきうる(例えば、Dunbrackら、「Meeting review: the Second meeting on the Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction(CASP2)」(アシロマー(Asilomar)、カルフォルニア、1996年12月13日〜16日)、Fold Des. 2(2):R27-R42、1997；FischerおよびEisenberg、Protein Sci. 5:947-955、1996；米国特許第5,436,850号；Havel、Prog. Biophys. Mol. Biol. 56:43-78、1991；Lichtargeら、J. Mol. Biol. 274:325-337、1997；Matsumotoら、J. Biol. Chem. 270:19524-19531、1995；Saliら、J. Biol. Chem. 268:9023-9034、1993；Sali、Molec. Med. Today 1:270-277、1995a；Sali、Curr. Opin. Biotechnol. 6:437-451、1995b；Saliら、Proteins 23:318-326、1995c；Sali、Nature Struct. Biol. 5:1029-1032、1998；米国特許第5,933,819号；米国特許第5,265,030号を参照、それぞれは参照として本明細書に組み入れられている)。
【００４６】
β2ミクログロブリン/MHCクラスIa分子複合体の界面領域の結晶構造座標は、複合体においてMHC分子と相互作用するβ2ミクログロブリンのペプチド部分を同定するために用いることができ、かつ、それゆえに、遊離β2ミクログロブリンに特異的に結合するが、MHCクラスIa分子に結合したβ2ミクログロブリンには結合しない抗体を産生するために用いることができる。界面におけるタンパク質の構造座標はまた、そのような抗体を産生するために有用である可能性がある模倣体を同定するために低分子データベースをコンピューターを用いてスクリーニングするのに用いられうる。そのような模倣体は、標準方程式を用いたコンピューターフィッティング動力学的データにより同定されうる(例えば、Segel、Enzyme Kinetics(J. Wiley & Sons 1975)を参照、これは参照として本明細書に組み入れられている)。
【００４７】
結晶構造情報を用いて関連する構造を同定するために必要な作業を行うためのコンピュータープログラムがよく知られている。そのようなプログラムの例には、Catalyst Databases(商標)プログラム−BioByte Master File、Derwent WDIおよびACDのような化学データベースにアクセスする情報検索プログラム；Catalyst/HYPO(商標)プログラム−薬剤候補の構造による活性の変化が説明される化合物のモデルおよび仮説を作製する；Ludi(商標)プログラム−相補的な極性基および疎水性基を同定し組み合わせることにより、分子をタンパク質の活性部位へ嵌め込む；ならびにLeapfrog(商標)プログラム−使用者の制御下のパラメーターを有する遺伝的アルゴリズムを用いて新規なリガンドを「育てる(grows)」プログラムが挙げられる。
【００４８】
C21.48Aのような抗体を特異的に結合するβ2ミクログロブリンの提案されたペプチド部分の能力は、特異的に相互作用する能力について分子をスクリーニングするためのいくつかの方法のいずれかを用いて試験することができる。この方法は、例えば、コンピューター画面上のβ2ミクログロブリンのペプチド部分およびC21.48Aモノクローナル抗体の表示の視覚的観察から始めてもよい。そのモノクローナル抗体により特異的に結合される可能性がある、β2ミクログロブリンの選択されたペプチド部分は、その後、モノクローナル抗体の個々の結合部位内に、様々な配向で配置されてもよく、すなわち、ドッキングされてもよい。ドッキングは、QuantaおよびSybylのようなソフトウェアを用い、続いて、CHARMMおよびAMBERのような、標準分子力学力場でのエネルギー最小化および分子動力学を用いて達成されうる。
【００４９】
専門のコンピュータープログラムは、特に、所望の特異性をもつ抗体を産生するために有用なβ2ミクログロブリンのペプチド部分を選択するために有用でありうる。そのようなプログラムは、例えば、GRID(Goodford、J. Med. Cehm., 28:849-857、1985；Oxford University、オックスフォード、UKから入手可能)；MCSS(MirankerおよびKarplus、Proteins: Structure. Function and Genetics 11:29-34、1991、Molecular Simulations、バーリントン、MAから入手可能)；AUTODOCK(GoodsellおよびOlsen、Proteins: Structure. Function and Genetics 8:195-202、1990、Scripps Research Institute、ラホーヤ、CAから入手可能)；DOCK(Kuntzら、J. Mol. Biol. 161:269-288、1982、University of California、サンフランシスコ、CAから入手可能)を含み、それぞれは参照として本明細書に組み入れられている。
【００５０】
免疫原として用いられたβ2ミクログロブリンのペプチド部分が非免疫原性であれば、ウシ血清アルブミン(BSA)もしくはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)のような担体分子へハプテンを連結することにより、または融合タンパク質としてペプチド部分を発現させることにより、免疫原性とすることができる。担体分子へハプテンを連結するための様々な他の担体分子および方法は、当技術分野においてよく知られている(例えば、HarlowおよびLaneより、前記、1988を参照)。ポリクローナル抗体を、例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物において産生するための方法は、当技術分野においてよく知られている(例えば、Greenら、「Production of Polyclonal Antisera」、Immunochemical Protocols(Manson編、Humana Press 1992)、1〜5ページ；Coliganら、「Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters」、Curr. Protocols Immunol. (1992)、セクション2.4.1を参照)。
【００５１】
モノクローナル抗体もまた、当技術分野においてよく知られ、かつ日常的である方法を用いて得ることができる(KohlerおよびMilstein、Nature 256:495、1975；Coliganら、前記、1992、セクション2.5.1-2.6.7；HarlowおよびLane、前記、1988)。例えば、β2ミクログロブリンまたはそのエピトープの断片で免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、ハイブリドーマ細胞を生じるようにSP/02ミエローマ細胞のような適当なミエローマ細胞系へ融合することができる。クローン化ハイブリドーマ細胞系は、適切な特異性をもつモノクローナル抗体を分泌するクローンを同定するために、例えば、標識β2ミクログロブリンを用いてスクリーニングすることができ、望ましい特異性および親和性をもつ抗体を発現させるハイブリドーマが単離され、かつ抗体の連続的供給源として利用することができる。ポリクローナル抗体も同様に、例えば、免疫化された動物の血清から単離してもよい。そのような単離された抗体は、β2ミクログロブリン/β2m-AP複合体を特異的に結合できないことについてさらにスクリーニングしてもよい。そのような抗体は、本発明の方法を行うために有用であることに加えて、例えば、標準化キットを調製するためにも有用である。例えば、一本鎖抗体を発現させる組換えファージもまた、標準化キットを調製するために用いることのできる抗体を供給する。
【００５２】
モノクローナル抗体は、例えば、様々な十分確立された技術によりハイブリドーマ培養物から単離かつ精製してもよく、その技術は、例えば、Protein-A SEPHAROSEゲルでのアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを含む(Barnesら、Meth. Mol. Biol. 10:79-104(Humana Press 1992)；Coliganら、前記、1992、セクション2.7.1-2.7.12およびセクション2.9.1-2.9.3を参照)。モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボの増殖の方法は、よく知られている。例えば、インビトロの増殖は、ダルベッコ変法イーグル培地またはRPMI 1640培地のような適した培地において、選択的に、ウシ胎児血清のような哺乳動物血清または微量元素、および正常なマウス腹膜浸出物細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージのような増殖持続サプリメントを補充して行うことができる。インビトロでの産生は、相対的に純粋な抗体調製物を供給し、大量の所望の抗体を生じるようにスケールアップが可能である。ハイブリドーマ大量培養は、エアリフトリアクターにおける、連続性スターラーリアクターにおける、均質性懸濁液培養により、または固定化もしくは捕捉された細胞培養において行うことができる。インビボの増殖は、抗体産生腫瘍の増殖を引き起こすために、細胞クローンを、親細胞と組織適合性のある哺乳動物、例えば同系のマウスへ注射することにより行うことができる。選択的に、動物は、注射の前に、炭化水素、例えばプリスタンのような油で初回抗原刺激を行ってもよい。1〜3週間後、所望のモノクローナル抗体が動物の体液から回収される。
【００５３】
遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2m-APとの複合体であるβ2ミクログロブリンを結合しない抗体の抗原結合断片もまた、そのような抗体から引き出された抗体、例えば一本鎖抗体が用いられうるように、本発明の方法において用いられうる。抗体の抗原結合断片は、C21.48Aのような特定の抗体のタンパク質分解性加水分解により、または断片をコードするDNAの大腸菌(E. coli)における発現により、調製されうる。抗体断片は、通常の方法により、抗体全体のペプシンまたはパパイン消化により得てもよい。例えば、抗体断片は、ペプシンでの抗体の酵素的切断により作製され、F(ab')2と表される5S断片を供給する。この断片は、チオール還元剤、および選択的にジスルフィド結合の切断の結果として生じるスルフヒドリル基についてのブロック基、を用いてさらに切断され、3.5S Fab'一価の断片を生じる。または、ペプシンを用いる酵素的切断は、2つの一価のFab'断片およびFc断片を直接的に生じる(例えば、Goldenberg、米国特許第4,036,945号および米国特許第4,331,647号；Nisonhoffら、Arch. Biochem. Biophys. 89:230、1960；Porter、Biochem. J. 73:119、1959；Edelmanら、Meth. Enzymol. 1:422(Academic Press 1967)；Coliganら、前記、1992、セクション2.8.1-2.8.10および2.10.1-2.10.4を参照されたい)。
【００５４】
断片には、無傷の抗体により認識される抗原に特異的に結合するという条件で、一価の軽/重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術といった抗体を切断する他の方法もまた用いることができる。例えば、Fv断片は、非共有結合性会合であってもよい可変重(VH)鎖および可変軽(VL)鎖の会合を含む(Inbarら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69:2659、1972)。または、可変鎖は、分子間のジスルフィド結合により連結されうる、またはグルタルアルデヒドのような化学物質により架橋されてもよい(Sandhu、Crit. Rev. Biotechnol. 12:437、1992)。好ましくは、Fv断片は、ペプチドリンカーにより連結されたVH鎖およびVL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質(sFv)は、オリゴヌクレオチドにより連結されたVHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。構造遺伝子は、発現ベクターへ挿入され、その後、大腸菌のような宿主細胞へ導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドをもつ一本のポリペプチド鎖を合成する。sFvを作製するための方法は、よく知られている(例えば、Whitlowら、Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97、1991；Birdら、Science 242:423-426、1988；Ladnerら、米国特許第4,946,778号；Packら、Bio/Technology 11:1271-1277、1993；Sandhu、前記、1992を参照)。
【００５５】
抗体の抗原結合断片のもう一つの例は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチドは、対象となる抗体のCDRをコードするポリヌクレオチドを構築することにより得ることができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、抗体産生細胞から得られるRNAによりコードされる可変領域を合成するためにポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製することができる(例えば、Larrickら、Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106、1991を参照、これは参照として本明細書に組み入れられている)。
【００５６】
インビトロの使用にとって必要不可欠なものではないが、ヒト化モノクローナル抗体もまた、望ましい場合には、本発明の方法またはキットにおいて用いることができる。ヒト化モノクローナル抗体は、例えば、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖由来のマウス相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列をヒト可変ドメインへ移行させ、その後、マウスの対応物のフレームワーク領域においてヒト残基を置換することにより産生されうる。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための方法は知られており(例えば、Orlandiら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:3833、1989を参照)、ヒト化モノクローナル抗体を産生するための方法はよく知られている(例えば、Jonesら、Nature 321:522、1986；Riechmannら、Nature 332:323、1988；Verhoeyenら、Science 239:1534、1988；Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:4285、1992；Singerら、J. Immunol. 150:2844、1993；Sandhu、前記、1992)。
【００５７】
本発明の方法において有用な抗体はまた、例えば、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから単離されうるヒト抗体断片由来であってもよい(例えば、Barbasら、Methods: A Companion to Methods in Immunology 2:119、1991；Winterら、Ann. Rev. Immunol. 12:433、1994を参照)。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーを作製するために有用なクローニングベクターおよび発現ベクターは、商業的に入手可能である(Stratagene；ラホーヤ、CA)。さらに、抗体は、ヒトモノクローナル抗体由来であってもよく、抗原性攻撃に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されたトランスジェニックマウスから得ることができる(例えば、Greenら、Nature Genet. 7:13、1994；Lonbergら、Nature 368:856、1994；およびTaylorら、Int. Immunol. 6:579、1994を参照；Abgenix, Inc.；フリーモント、CAもまた参照)。
【００５８】
望ましい場合にはβ2ミクログロブリンを結合するが、β2m-APと複合体化されている場合のβ2ミクログロブリンを結合しない抗体は、固体支持体に固定化することができる。固体支持体は、本発明の方法が行われる条件下において、すなわち、一般にイムノアッセイが行われる条件下において、実質的に不溶性である任意の材料でありうる。さらに、材料は、抗体が支持体に固定化されることになる条件に対するそれの安定性に基づく固体支持体として選択される。このように、固体支持体は、ガラス、シリコン、ゼラチン、アガロース、金属、またはプラスチックもしくは他の重合体、例えば、ポリスチレン、ポリデキストラン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリルアミドなどの合成材料から構成されうる。
【００５９】
固体支持体が疎水性表面を有する場合は、固相イムノアッセイについて典型的であるが、抗体が表面との疎水性相互作用を通じて固定化されるように、単に抗体と表面を接触させることにより、支持体に固定化することができる。固体支持体はまた、抗体の支持体への結合を促進し、それにより抗体を固定化する反応基を含むように改変されうる。代替として、または加えて、例えば、結合対の第二のメンバーが支持体の構成要素であって、抗体を、特異的結合対のメンバーを含むように改変することにより、抗体は、支持体への固定化を促進するように改変できる。例えば、抗体は、例えば、磁気性酸化鉄ビーズに共有結合的に結合でき、そのビーズは、反応性アミン基もしくはカルボキシル基(Pierce Chemical Co.)、またはストレプトアビジン(Dynal Biotech)のような特異的結合対のメンバーを含むように改変できる。それにより抗体は固定化され、かつ、抗体および任意の特異的に結合したβ2ミクログロブリンを、混合物から、混合物を磁石に接触させることにより単離するための便利な手段が提供される(例えば、Bodinierら、Nat. Med. 6:707-710、2000を参照)。
【００６０】
第一抗体を固体支持体へ固定化するための手段には、MHC四量体または他の重合体を形成するためにMHC単量体を機能的に連結するための手段が含まれうる。遊離β2ミクログロブリンを結合するが、複合体のβ2ミクログロブリン構成要素は結合しない抗体において、その特異性が固定化しても実質的に変わらない条件で、第一抗体は、例えば、固体支持体の表面を形成する分子の反応基と抗体の反応基、例えば、抗体のアミノ酸残基のN末端アミノ基、C末端カルボキシル基もしくは反応性側鎖と固体支持体を構成している分子上の対応する反応基、との間に形成されたペプチド結合またはジスルフィド結合などにより、固体支持体の表面を形成する分子へ直接的に連結されうる。または、固体支持体の表面を形成する分子または抗体は、リンカー部分を含むように改変されてもよく、リンカー部分は、抗体を固体支持体の表面へ連結するための手段を提供する。
【００６１】
リンカー部分は、それが固体支持体の表面に結合することを可能にする第一反応基、および抗体特異性を実質的に変えることなく抗体が固体支持体へ固定化される(すなわち、機能的に連結される)ように、それが第一抗体を結合することを可能にする第二反応基を有する分子でありうる。このように、リンカー部分は、固体支持体の表面上に存在する機能性基およびそれに固定化される抗体に存在する機能性基と反応できるホモ二機能性試薬またはヘテロ二機能性試薬を含む任意の試薬でありうる。二機能性架橋剤の例には、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート、ジマレイミド、ジチオ-ビス-ニトロ安息香酸、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオールプロピオネート)、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートおよび6-ヒドラジノニコチミドを含む(Wong、「Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking」、(CRC Press 1991)；Hermanson、「Biocojugate Techniques」、(Academic Press 1995)も参照、それぞれは参照として本明細書に組み入れられている)。リンカー部分はまた、アミノ酸、ペプチド、または融合タンパク質として抗体と共に発現されうるポリペプチド、例えば、固体支持体上のチオール反応基と反応しうるチオール基を供給することができる、末端システイン残基または末端システイン残基を含むペプチドでありうる。第一抗体を固体支持体の表面へ連結するための手段を供給することに加えて、リンカー部分は、立体的束縛により抗体の特異性が影響されないように、スペーサー分子として機能しうる。
【００６２】
第一抗体が固体支持体へ固定化される場合は、1つもしくは複数の結合反応の前に、反応の間に、または反応の後に、固定化されうる。このように、第一抗体、すなわち、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2m-APと複合体化されたβ2ミクログロブリンを結合しない抗体は、それを試料に接触させる前に；特定のイムノアッセイ法において、β2ミクログロブリン競合物質もしくは第二抗体が第一抗体および試料に接触している間を含む、試料に接触している間に、固定化されうる；または、結合反応が完了しているもしくは定常状態に達した後で、かつ特異的結合を検出する前に、固定化されうる。第一抗体の固定化が、接触段階の間または後に行われる場合、固定化の手段は、イムノアッセイに関連性のある特異的結合相互作用、例えば、第一抗体と遊離β2ミクログロブリンとの特異的結合、または第一抗体とβ2ミクログロブリン競合物質との特異的結合、または第二抗体と第一抗体/β2ミクログロブリン複合体との特異的結合に影響を及ぼさないように選択される。
【００６３】
本発明の方法は、サンドイッチイムノアッセイまたは競合イムノアッセイを含む、イムノアッセイを行うために典型的に用いられる任意の条件下において行われる(実施例2参照)。そのようであるため、反応は、例えば、室温(約18℃〜23℃)を含む、約4℃〜37℃の温度で、約30分間〜24時間、例えば、約1時間または一晩(約12〜18時間)行ってもよい。反応はまた、一般に水溶液において行われ、水溶液は、反応中pHが維持され、望ましい場合には、比較的狭い範囲において、例えば、約pH 5、pH 7、またはpH 9の約1 pH単位内であるように、緩衝液を含んでいてもよく、およそ生理学的濃度の塩化ナトリウムまたは他の適する塩をさらに含んでいてもよい。
【００６４】
遊離β2ミクログロブリンに対する第一抗体の特異的結合を検出することは、定量的または定性的でもよく、様々な方法で行うことができる。一つの態様において、本発明の方法は、サンドイッチアッセイ形式で行われ、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2m-APと複合体化されている場合のβ2ミクログロブリンを実質的に結合しない第一抗体の結合は、遊離β2ミクログロブリンに対する第一抗体の特異的結合により形成された複合体を特異的に結合しうる第二抗体を用いて検出される。第二抗体はまた、必要はないが、第二抗体が第一抗体と遊離β2ミクログロブリンの複合体を特異的に結合することができるとの条件で、遊離β2ミクログロブリン、またはβ2ミクログロブリンおよびβ2m-APと複合体化されているβ2ミクログロブリンを特異的に結合する能力をもちうる。例えば、第二抗体は、遊離β2ミクログロブリンに、加えてβ2ミクログロブリン/MHCクラスI分子複合体にも特異的に結合する、モノクローナル抗体B1G6でありうる(Liabeufら、前記、1981)、または実質的に同じB1G6の特異的結合活性をもつ抗体でありうる。
【００６５】
本発明のサンドイッチアッセイ法の一つの局面において、遊離β2ミクログロブリンに対する第一抗体の特異的結合は、試料および第一抗体を、第一抗体に特異的に結合しているβ2ミクログロブリンを含むβ2ミクログロブリンを特異的に結合する第二抗体と、第二抗体が特異的に結合する条件下において、さらに接触させること；第一抗体に特異的に結合したβ2ミクログロブリンおよびそれらに特異的に結合した第二抗体を含む第一抗体を単離すること；ならびに単離された第一抗体およびβ2ミクログロブリンに会合した第二抗体を検出することにより、検出される。もう一つの局面において、遊離β2ミクログロブリンに対する第一抗体の特異的結合は、第一抗体に特異的に結合したβ2ミクログロブリンを含む第一抗体を、第一抗体に特異的に結合していない材料から単離すること；その後、第一抗体に特異的に結合した任意のβ2ミクログロブリンを含む単離された第一抗体を、第二抗体と、第二抗体が第一抗体およびβ2ミクログロブリンを含む複合体に特異的に結合する条件下において、接触させること、ならびに単離された第一抗体に会合した第二抗体を検出することにより検出される。
【００６６】
第一抗体を単離することは、任意の方法を用いて行うことができ、好ましくは、第一抗体を、直接的または間接的のいずれかで、固体支持体へ固定化することにより行われる。例えば、第一抗体は、96ウェルプレート内のウェル表面のようなプラスチック表面にそれを接触させることにより固定化してもよく、第一抗体は、プラスチック表面と疎水性的に相互作用し、それにより抗体を固定化する。ウェル(または他の表面形態)は、その後、固定化されていない抗体を除去するために洗浄でき、ウェルは、表面との、例えば試料中の、β2ミクログロブリンの非特異的結合を低減させるまたは阻害するために、ウシ血清アルブミンのようなブロッキング剤とさらに接触させてもよい(実施例2を参照)。
【００６７】
第二抗体が第一抗体およびβ2ミクログロブリンの複合体のみを特異的に結合する、すなわち、第二抗体が遊離β2ミクログロブリンまたはβ2ミクログロブリン/β2m-AP複合体を特異的に結合しない場合は、第一抗体/β2ミクログロブリン複合体の単離は、例えば、第二抗体を固定化することにより達成されうると認識される。本発明の方法がそのような第二抗体を用いて行われる場合、第二抗体は検出可能に標識されない。その代わりに、第一抗体を検出可能に標識することができ、または第一抗体を特異的に結合し、かつ検出可能に標識される第三抗体(またはFc受容体または第二抗体を特異的に結合する他の試薬)を検出段階に用いることができる。そのような第二抗体はまた、望ましい場合には、第一抗体および検出可能に標識されたβ2ミクログロブリン競合物質を含む複合体を単離するために用いられうる。
【００６８】
もう一つの態様において、本発明の方法は、競合アッセイ形式において行われ、遊離β2ミクログロブリンを特異的に結合するが、β2ミクログロブリン/β2m-AP複合体として存在している場合のβ2ミクログロブリンを実質的に結合しない「第一抗体」へのβ2ミクログロブリン競合物質の特異的結合は、試料中の遊離β2ミクログロブリンの存在または量を示している。本発明の競合アッセイ法は、例えば、試料、第一抗体およびあらかじめ決められた量のβ2ミクログロブリン競合物質を、抗体がβ2ミクログロブリンに特異的に結合する条件下において、接触させること；および抗体に特異的に結合したβ2ミクログロブリン競合物質を検出することにより行われ、結合しているβ2ミクログロブリン競合物質の量は、試料における遊離β2ミクログロブリンの存在、および所望される場合には、量を示している。
【００６９】
β2ミクログロブリン競合物質は、β2ミクログロブリンを正常に産生する生物体の細胞もしくは生物学的液体から単離される天然に存在するβ2ミクログロブリンであってもよく、またはクローニングされたコード化核酸分子から発現される組換えβ2ミクログロブリンであってもよい。天然に存在するまたは組換えβ2ミクログロブリンを含むβ2ミクログロブリンは、β2ミクログロブリンを発現させる任意の生物体、特に、哺乳動物を含む脊椎のある生物体から、例えば、ヒト細胞、マウス細胞などから単離されてもよく、または単離された核酸分子から発現されてもよい。β2ミクログロブリンをコードするクローニングされた核酸分子は、よく知られており、当業者にとって容易に入手可能である(例えば、GenBankアクセッション番号XM_007650、NM_004048およびNM_009735を参照)。β2ミクログロブリン競合物質を組換えポリペプチドとして発現させることの利点は、ペプチドタグもしくは他のペプチドを検出できる部分、またはリガンドもしくはその基質が、競合物質へ容易に導入されうることである。
【００７０】
抗イディオタイプ抗体もまた、本発明の方法またはキットにおいて、「β2ミクログロブリン競合物質」として用いられうる。抗イディオタイプ抗体は、本発明の方法またはキットにおいて用いられる第一抗体に対して産生でき、例えば、遊離β2ミクログロブリンおよび第一抗体と実質的に同じである、第一抗体との結合に対する反応性における親和力および動力学を有することに基づいて選択されうる；または、第一抗体と抗イディオタイプ抗体の反応性の動力学または親和力が、第一抗体と遊離β2ミクログロブリンのそれとは異なる場合は、その差は一貫しており、反応物の濃度を調製することのような日常的な方法を用いて、または結果を標準化するためのアルゴリズムを用いて修正されうる。例えば、β2ミクログロブリン競合物質が検出可能に標識されたポリペプチドであれば、検出可能部分、特に、酵素のように比較的大きい部分が、遊離(標識されていない)β2ミクログロブリンと比較して、標識されたβ2ミクログロブリン競合物質との第一抗体の特異的結合に影響を及ぼす可能性があるため、同様の考慮がなされる。
【００７１】
第二抗体またはβ2ミクログロブリン競合物質は、一般に、必ずしもではないが、遊離β2ミクログロブリンの定性的もしくは定量的検出を容易にする、検出可能な標識または他のタグを含む。検出可能標識またはタグは、そのような目的のために一般に用いられる任意の分子、例えば、蛍光分子、放射性核種、発光分子、化学発光分子、酵素、またはポリヒスチジンタグ、mycエピトープ、もしくはFLAG(商標)エピトープのようなペプチドでありうる。多くの場合、遊離β2ミクログロブリンの存在について検査される試料において、MHC四量体のようなβ2ミクログロブリン/β2m-AP複合体もまた、検出可能に標識されうることは、認識されるべきである。そのようであるため、本発明の方法が行われる特定の形式に依存して、複合体上の標識とは異なる、第二抗体(または関連性のあるところにおいては、β2ミクログロブリン競合物質)についての検出可能な標識を選択することが望ましい場合もある。例えば、蛍光性フィコエリトリン標識を含むMHC四量体が商業的に入手可能である(Immunomics)。従って、そのような四量体を含む試料が本発明の方法により検査される場合、β2ミクログロブリン競合物質または第二抗体は、例えば、好ましくは、フィコエリトリンとは異なる発光スペクトルをもつ蛍光分子で検出可能に標識される、または蛍光分子以外の部分で、例えば、酵素で標識される。
【００７２】
様々な検出可能な標識は、当技術分野において知られており、本発明の目的のために用いることができる。トリチウム、炭素-14、リン-32、ヨウ素-125、ヨウ素-131などのような放射性核種は、研究および臨床実験室において一般に利用可能である装置を用いて容易に検出可能である。さらに、抗体またはβ2ミクログロブリンポリペプチドのようなタンパク質へ放射性核種を連結するための方法は、よく知られている。例えば、ヨウ素-125またはヨウ素-131は、クロラミン-T法またはラクトペルオキシダーゼ法を用いて抗体へ連結されうる。可視または紫外の波長における光を吸収する色素生産性分子もまた用いることができ、例えば、キノリン色素、トリアリールメタン色素、フタレイン、昆虫色素、アゾ色素、アントラキノイド色素などである。検出可能な標識として有用な蛍光性化合物は、例えば、フィコエリトリン、ローダミン、フルオレセイン、およびウンベリフェロン、加えて、緑色蛍光タンパク質またはその誘導体型もしくは改変型のような蛍光性ポリペプチドを含む(例えば、Langoneら、Meth. Enzymol. 74:3-105、1981；米国特許第4,366,241号；米国特許第3,996,345号；米国特許第6,066,476号を参照)。
【００７３】
酵素触媒検出系は、特に感度の高い検出方法を提供しうる。酵素標識は、よく知られており、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを含む(例えば、米国特許第4,366,241号；米国特許第4,740,468号を参照)。抗体のようなポリペプチドへ酵素を連結するための方法および試薬もよく知られており、例えば、グルタルアルデヒド、p-トルエンジイソシアネート、様々なカルボジイミド試薬、p-ベンゾキノン、m-過ヨウ素酸塩、およびN,N1-o-フェニレンジマレイミドを含む。さらに、例えばβ2ミクログロブリンおよびアルカリホスファターゼを含む融合タンパク質は、組換えDNA方法を用いて発現かつ調製でき、このように、検出可能に標識されたβ2ミクログロブリン競合物質が供給される。
【００７４】
以下の実施例は、本発明を限定することではなく、説明することを意図とする。
【００７５】
実施例1
MHC四量体およびMHC単量体の安定性
この実施例は、前に記載された方法を用いて、MHC四量体およびMHC単量体の安定性の試験を提供する。
【００７６】
方法
四量体の安定性は、スーパーデックス(Superdex) 75 HR 10x30のカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により生化学的に試験された。この方法は、MHCクラスIa分子からの解離の指標である、遊離β2ミクログロブリンを検出する。ピーク下の領域を、ミレニアム(Millennium)ソフトウェアを用いて自動的に積分した。β2ミクログロブリンの溶出時間に対応するピーク下の領域を考慮に入れて、β2ミクログロブリン量を測定した。40、20、10、5または2.5μg/mlの異なる量の精製されたβ2ミクログロブリンを含む溶液(50μl注入)を流し、加えて、2つの内部標準を各時点において流した。
【００７７】
四量体はまた、フローサイトメトリー法を用いて機能的に試験された。四量体を試験するために用いられた細胞系は、HLA-A*0201/ペプチドの組み合わせに特異的なヒトTCR(VαVβ)をトランスフェクトした哺乳動物細胞であった。染色後の細胞をエピクスXL(EpicsXL)サイトメーターで分析した。そのような細胞系は、HIVpolおよびMart1四量体についてのみ利用可能であった。そのようであるため、HLA-A*0201/HIVgag四量体は、この研究の間、フローサイトメトリーにより試験できなかった。四量体の安定性に対する抗CD8-FITC抗体の影響を評価するために、CD8の存在および非存在下において、四量体を調製した。
【００７８】
SECはまた、MHC単量体の解離を試験するために用いた。単量体の解離は、t°>4℃で観察した。この解離過程は、温度依存性、およびペプチド依存性(高親和性ペプチドは低親和性ペプチドと比較してより安定している)であった。単量体の解離は、遊離β2ミクログロブリンおよび重鎖(クラスIa分子)凝集体の検出を可能にするスーパーデックス200 HR 10x30カラムを用いて試験した。実験は、四量体と同様に行った。
【００７９】
結果
A. 四量体
1. 変異型HLA-A*0201/Mart1
すべてのフローサイトメトリー実験は、ヒトジャーカットT細胞白血病細胞系で行った。内在性Vβ8を欠損しているTCR欠損性ジャーカット細胞サブクローンを用いて、レトロウイルスベクターにおけるクローニングされたヒトTCRのα鎖およびβ鎖(MFGベクター系列；Dranoffら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90:3539、1993)を導入した。ジャーカット細胞系は、CD3+、CD4+、CD8+、Vβ6.7+である。TCRは、メランA(MelanA)「野生型」ペプチドを非常に低い親和性で認識したが、十量体および変異型ペプチド(26-35L、27Lとも呼ばれる)を良好に認識した。
【００８０】
安定性結果
抗CD8-FITCモノクローナル抗体を含む四量体、および抗CD8-FITCモノクローナル抗体を含まない四量体を調製し、研究した。3つの異なる温度(4℃、25℃、37℃)での四量体の安定性への影響を試験した。温度4℃は、実時間の安定性を示し、温度25℃および37℃は、加速的（accelerated）条件下での安定性を示す。CD8を含まない四量体は、4℃においてのみ研究し、CD8を含む四量体(最終産物)は、4℃、25℃および37℃において研究した。この研究に用いたMHC四量体(Immunotech/Beckman Coulter)の異なるロットを表1に示す。
【００８１】
（表１）研究に用いた四量体のロット番号
2005520156.tif 000002
【００８２】
6つの異なる四量体での0日目におけるジャーカット細胞を染色し、フローサイトメトリーにより得られた結果から用量反応曲線を作製し、0日目において抗CD8モノクローナル抗体を含む四量体と抗CD8モノクローナル抗体を含まない四量体との間で、シグナルに小さい差のみがみられることを明らかにした。変動係数のパーセンテージを計算し、表2に示す。異なる四量体について0日目に得た結果を統計的に解析し、変動係数が低いことを実証した。このことは、製造過程の高い再現精度を示唆する。
【００８３】
（表２）MFI四量体/MFI抗CD3-PEの比率
2005520156.tif 000003
【００８４】
4℃でのインキュベーションの180日後、CD8を含むまたは含まないMHC四量体の第一ロットで細胞を染色した場合、主要な変化は見出されなかった。この結果は、四量体が4℃において安定しており、抗CD3-PEで検出されるTCRの発現もまた非常に安定していた(%CV=6〜12%)ことを示している。結果を対照の%としてプロットした場合、すべての曲線が、約10%で見積もられる相対的に小さい差で類似していた。これらの結果は、CD8-FITCモノクローナル抗体の存在または非存在にもかかわらず、MHC四量体は、異なる濃度において同じように挙動することを示す。%対照を測定するために、0日目の比率が100%対照を表した；すべての他の時点(「X日目」)について、%は、0日目の値の%と比較され、以下のように計算された：{X日目(平均蛍光強度比率、MFI、四量体/MFI抗CD3) x 100}/(0日目MFI四量体/MFI抗CD-3)。
【００８５】
MHC四量体を25℃で15日間インキュベートした場合に、約20%のシグナルの損失が検出され、25℃でのインキュベーションの180日間後には、25%の損失が検出された。四量体の濃度の機能として対照(定義についての説明を参照)の%としてプロットされた場合、すべての曲線は、約30%で見積もられる0日目と180日目の間の差をもって類似していた。これらの結果は、様々なMHC四量体が試験の異なる濃度において同じように挙動することを示している。
【００８６】
より高い温度での四量体の安定性への影響が注目された。37℃で保存したMHC四量体では、7日後、フローサイトメトリーにより得られるシグナルが著しく損失し、15日後、シグナルは検出されなかった。標準偏差は、7日目に3つのロットで得られた比率を比較した場合、極めて高く、分解パターンが一様でないことを示唆した。しかしながら、四量体の濃度の関数として%対照を比較すると、標準偏差はより近くなった。興味深いことに、シグナルの損失は、サイズ排除クロマトグラフィーにより検出される遊離β2ミクログロブリンの発生、および分光測定法により測定される四量体溶液における凝集体の増加と相関した。4℃、25℃または37℃でインキュベートしたMHC四量体の0日目〜15日目の1μg/試験で得られた対照のパーセンテージを、遊離β2ミクログロブリンのレベルに対してプロットした場合、4℃および25℃でインキュベートした四量体からの結果は、相対的に群化され、四量体複合体内で単量体が解離しないことを示唆した。この結果は、時間の関数として1μg/試験での四量体で得られる染色の分析により確認され；4℃で保存した、CD8を含むまたは含まないMHC四量体は、安定していたが、25℃および37℃で保存した四量体は、温度に依存して染色強度の多少の損失を示した。抗CD8抗体の存在または非存在下における四量体の間には、主要な違いは見出されなかった。
【００８７】
2. 変異型HLA-A*0201/HIVpol
マウスTCRζ鎖へ融合された、ヒトTCRアルファ(Vα2.2)鎖およびβ(Vβ1)鎖それぞれの2つのハイブリッド構築物をトランスフェクトしたラット好塩基性白血病(RBL)細胞系である、80210細胞系(Engelら、Science 256:1318、1992)が、これらの研究に用いられた。この細胞の系は、CD3複合体の関連なしにTCRの発現を可能にする。ζ鎖は、細胞表面に発現する二量体を形成する。細胞系は、αβヘテロ二量体に加えて、ααおよびββホモ二量体を発現させる可能性があるが、それらの存在は、実証するのがむずかしい。この細胞系においてCD3もCD8もどちらの発現もない。ヒトTCR(Vα2.2/Vβ1)は、HLA-A*0201/HIVpolの組み合わせに対して特異的である。80210細胞系は、粘着性であり、刺激により脱顆粒する；サイトメトリーについて、抗TCR試薬とのインキュベーションにより散乱変化が観察された。
【００８８】
抗TCR Vβ1-PE(フィコエリトリン)モノクローナル抗体が、細胞系におけるTCRの発現レベルを調べるために飽和で用いられた。四量体は、TCR Vβ1強度と比較して同じ化学量論をもつTCRのαβ構成要素を認識するため、モノクローナル抗体抗TCR Vβ1-PEは、このアッセイのキャリブレーターとしての役割を果たす。染色された細胞は、エピクスXL(EpicsXL)サイトメーターで分析された。
【００８９】
抗CD8-FITCモノクローナル抗体を含むまたは含まないMHC四量体を調製し、CD8を含むまたは含まない四量体の安定性において3つの異なる温度(4℃、25℃、37℃)の影響を試験した。4℃は、実時間の安定性を示し、25℃および37℃は、加速的条件下における安定性を示す。表3は、研究に用いた四量体HLA-A*0201/HIVpolの異なるロットをまとめている。
【００９０】
（表３）研究に用いた四量体のロット番号
2005520156.tif 000004
【００９１】
6つの異なる四量体での0日目におけるRBL 80210細胞を染色し、フローサイトメトリーにより得られた用量反応曲線により、0日目において、抗CD8を含むMHC四量体と抗CD8を含まないMHC四量体との間に非常に近い一致が明らかにされた。抗CD8抗体を含まない四量体の第1ロットにわずかな差異が見出された。表4は、0日目において、かつ異なる濃度において、分析した四量体HIV/polのすべてのロットについての変動係数のパーセンテージを示す。最後の希釈度(1.25μg/ml%CV 10%)を除き、他の濃度の%CVは、3%と5%の間の範囲であり、製造過程の高い再現精度を示唆した。
【００９２】
（表４）MFI四量体/MFI抗Vβ1-PEの比率
2005520156.tif 000005
【００９３】
抗CD8抗体の存在または非存在下、4℃で保存した四量体間の異なる時点に得られた比率を比較した場合、結果は、幾分か異なった。しかしながら、異なる時点での濃度の関数として%対照を比較すると、抗CD8抗体を含む4℃で保存した四量体は、抗CD8抗体を含まない四量体より、比較的安定していた。時間の関数として1μg/試験での4℃を%対照と比較すると、主要な違いはみられなかった。6ヶ月後、これらの四量体に≦10%の損失があった。
【００９４】
25℃で得られるシグナルの変動もまた観察され、抗CD8抗体の存在および非存在下の両方において、37℃で保存した四量体への非常に強い影響が観察された。四量体の両方の型について、25℃において5ヶ月(150日)後、高い方の濃度についてはシグナルの50%、および低い方の濃度については70%の損失があった。37℃でインキュベートした四量体は、7日後、フローサイトメトリーにより得られるシグナルは著しく損失し、15日後、もはやシグナルは検出されなかった。MHC四量体Mart1のように、7日目に3つのロットで得られた比率を比較した場合、標準偏差は極めて高く、分解パターンが一様でないことを示唆した。
【００９５】
結果は、ゲル濾過クロマトグラフィーによる遊離β2ミクログロブリンの測定および凝集体形成の測定により確認された。4℃で保存した四量体の遊離β2ミクログロブリンの量は、一定のままであり、25℃および37℃でインキュベートしたMHC四量体では、CD8を含むまたは含まないのいずれにおいても、増加した。フローサイトメトリーによるシグナルの損失は、サイズ排除クロマトグラフィーにより検出される遊離β2ミクログロブリンのレベルと相関した。時間の関数として四量体の1μg/試験で染色された細胞を分析し、前の観察を確認した。4℃でインキュベートした四量体は安定していたが、25℃および37℃でインキュベートした四量体は、時間が経つにつれて機能を失った。しかしながら、CD8を含まない四量体と抗CD8を含む四量体との比較では、主要な違いはなかった。
【００９６】
HLA-A*0201/HIVpolの開放バイアル研究
抗CD8-FITC抗体を含むMHC四量体HLA-A*0201/HIVpolの1ロット(ロットM00-007)を上のように、開放バイアル研究において分析した。MFI四量体/MFIVβ1モノクローナル抗体の比率かまたは四量体濃度の関数における%対照のいずれかを0日目に得られる結果と比較した場合、10 ± 5.6%の変動を観察した。四量体は、6ヶ月後、染色強度の10%の損失で、十分働いた。これらの結果は、MHC四量体が、3ヶ月間の期間に渡って、バイアルの週1度の開放後、安定したままであり、密閉バイアルからその後の開放後、同一の染色強度を示したことを実証する。
【００９７】
3. 変異型HLA-A*0201/HIVgag
この研究において試験した四量体のロットを表5に示す。この四量体は、特異的な細胞系が入手できないため、生化学的技術によってのみ研究された。他の2つの四量体と同様に、サイズ排除クロマトグラフィーにより、四量体が37℃において非常により速く解離することが明らかにされた。遊離β2ミクログロブリンのレベルはプラトーに達する傾向があった；しかしながら、抗CD8 FITCモノクローナル抗体の存在または非存在下における四量体は、4℃において非常に安定していた。四量体の解離は、凝集体の発生およびPEシグナルの減少と相関した。CD8を含むまたは含まないのいずれにおいても、4℃でインキュベートしたMHC四量体に、凝集体は観察されなかった。
【００９８】
（表５）研究に用いた四量体のロット番号
2005520156.tif 000006
【００９９】
B. 単量体
MHC単量体は、MHC四量体を作製するために必須のサブユニットである。単量体は、1)特異的なリシンにビオチン部分を導入する酵素BirAにより認識される特異的配列をカルボキシ末端に含むMHCクラスIa重鎖、2)β2ミクログロブリン軽鎖、および3)特異的ペプチドから構成される。ペプチドまたはβ2ミクログロブリンのいずれかの欠損は、解離および重鎖の最終凝集を引き起こす。
【０１００】
2つの異なる分解現象を、単量体の単量体-解離および重鎖の脱ビオチン化について同定した。これらの2つの局面は、SDS-PAGEおよびSECを用いて研究した。単量体を調製し、それらの安定性を研究した(この研究に用いたロット番号を表6に示す)。単量体の安定性における3つの異なる温度(-80℃、4℃、および25℃)の影響が試験された。温度-80℃は、保存の実温度を示し、4℃および25℃は、加速的条件下での安定性を示す。
【０１０１】
（表６）研究に用いた単量体のロット番号
2005520156.tif 000007
【０１０２】
サイズ排除クロマトグラフィーによる遊離β2ミクログロブリンの測定は、単量体の解離の指標を提供する。結果より、-80℃、4℃および25℃で保存した単量体は安定していることが明らかにされた。15日後分析された試料においていくつかの変動が観察されたが、単量体の3つの異なるロットが同時に分析される場合、事例の大部分において、標準偏差が低い方であった。単量体および四量体における遊離β2ミクログロブリンレベルの比較は良く相関していた。しかしながら、4℃で保存した試料において、不規則さは、技術の不正確および操作中の誤りを反映している可能性がある曲線にみられる不規則さであるように思われた(±23%正確として計算した)。遊離β2ミクログロブリンのレベルは、4つの単量体について等価であった。
【０１０３】
結論
HLA-A*0201/HIVpol、HLA-A*0201/HIVgag、およびHLA-A*0201/Mart1についての四量体および単量体の安定性の研究から、いくつかの結論が導かれた。
【０１０４】
四量体
1. すべての3つのMHC四量体は、6ヶ月後、4℃において安定していた。
2. HLA-mA*0201/Mart1四量体について、CD8を含む四量体とCD8を含まない四量体の間には主要な違いはなかった。しかしながら、HLA-mA*0201/HIPpol四量体は、CD8を含まない場合、比較的安定性が低かった。
3. 25℃で保存したMHC四量体は、遅い解離を示した。HLA-A*0201/HIVpol四量体は、HLA-A*0201/HIVgagおよびHLA-A:0201/Mart1の四量体より、加速的温度において安定性が低かった。
4. 37℃で保存した四量体は、非常に速い分解を示し、7日後には、完全に分解された。
5. いくつかの変動にもかかわらず、3つの四量体の挙動は、4℃において研究された期間に渡って高く類似していた。しかしながら、HLA-A*0201/HIVpol四量体は、HLA-A*0201/Mart1およびHLA-A*0201/HIVgagの四量体と比較して、25℃において、わずかに安定性が低かった。
6. CD8を含むおよび含まないすべての四量体について得られたデータに基づき、HLA-A*0201/HIVpol四量体の第一ロットは、最終産物についての6ヶ月間の実時間の安定性を実証する目的で確証された。
7. すべての3つのロットにおける加速的データは、各特異性について密接に相関していた。
8. 異なる方法体系で得られた結果は良く相関していた；遊離β2ミクログロブリンのレベルは、37℃でのインキュベーション後MFIが減少した四量体において見出された。この観察は、特異的細胞系が入手できなかった四量体についての安定性の予測を可能にするため、実際的な意味がある。
9. PE凝集体形成の測定もまた、フローサイトメトリーにおけるシグナルの減少に相関していた。
10. 開放バイアル研究で得られた結果は、この手法が、染色細胞に対する四量体の能力に主要な改変を引き起こさなかったことを実証した。
【０１０５】
単量体
単量体は、ゲル濾過クロマトグラフィー実験およびSDS-PAGE結果により示されるように、-80℃、ならびに4℃および25℃において安定していた。単量体の脱ビオチン化は、-80℃、4℃または25℃のいずれで保存した試料においても検出されず、アビジンゲル精製が、単量体の分解に関与することが以前に見出されている、潜在性のプロテアーゼを除去したことを示唆した。
【０１０６】
実施例2
イムノアッセイの開発および特徴付け
遊離β2ミクログロブリンの測定は、単量体および四量体の解離の指標である。HLA-A*0201/HIVgag、HLA-A*0201/HIVpol、およびHLA-A*0201/Mart1複合体の開発中、遊離β2ミクログロブリンが、最終および中間産物の完全性と最良に相関するとして確立された。現在のところ、遊離β2ミクログロブリンは、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定されている。しかしながら、多数の試料が同時に処理される安定性研究において、ゲル濾過クロマトグラフィー(サイズ排除クロマトグラフィー；SEC)の使用は、計測に時間がかかり装置費用が高くなる、時間のせいで二連または三連の試験を見込めない、あまり正確ではない(CV 28%)またはあまり感度が高くない、および低レベルの単量体劣化だと正確に検出されない。さらに、SECは比較的大量の材料を必要とする。本明細書に開示されたイムノアッセイ法では、例えば、MHC単量体およびMHC四量体における遊離β2ミクログロブリンを測定するために、SECの使用を超える有意な利点が提供される。
【０１０７】
MHC単量体のβ2ミクログロブリン解離は、4℃より高い温度において観察され、温度依存性であり、かつペプチド依存性(高親和性ペプチドは、低親和性ペプチドと比較してより安定していた)である。MHC単量体の解離は、以前にSECにより研究され、遊離β2ミクログロブリンおよびMHCクラスIa重鎖の凝集の検出を可能にする(実施例1参照)。しかしながら、上で考察されているように、この技術は、いくつかの欠点を提示している。例えば、分析される試料の総数では通常、24〜48時間かかり、二連の分析を見込めない。さらに、SECの変動性はむしろ高い  −  計算された値の精度は、妥当性検証（validation）の間、23%に示された。これらの理由に対して、より簡単で、より速く、かつより正確な方法が開発された。
【０１０８】
酵素イムノアッセイ(EIA)を含むイムノアッセイ法が、試験された。2つの原理型のイムノアッセイ法、サンドイッチアッセイ法および競合アッセイ法が試験された。「古典的な」サンドイッチ法は、2つの異なるエピトープに対して産生される2つの異なるモノクローナル抗体を用いる。この方法は、非常に感度が高く、信頼性があることが多い。比較して、競合アッセイ法では、たった1つのモノクローナル抗体を用い、放射性同位元素で標識されうる、または酵素もしくは他の検出可能な標識に連結されうる抗原がトレーサーとして用いられる。この方法は信頼性があるが、サンドイッチイムノアッセイ法より感度が低い。
【０１０９】
無傷のMHC単量体またはMHC四量体において複合化されたβ2ミクログロブリンからの干渉なしに、遊離β2ミクログロブリンの測定を可能とするためには、β2ミクログロブリンの重鎖への会合により遮蔽されたエピトープを認識する抗体が用いられる。C21.48Aモノクローナル抗体(mAb；Liabeufら、前記、1981)は、そのようなmAbの例である。Liabeufら(前記、1981)は、C21.48Aが、マウスIgG2b免疫グロブリンであり、遊離β2ミクログロブリンに結合するが、B1G6を含むいくつかの他のmAbと対照的に、細胞表面に会合しているβ2ミクログロブリンに結合しないことを示した。さらに、Devauxら(前記、1990)は、C21.48Aは、B1G6を含むいくつかの他のmAbと対照的に、MT4 T白血病性細胞系においてHIV 1複製周期に干渉することができなかったが、C21.48A mAbは、機能的効果が全くなかったことを示した。これらの2つの異なる研究は、C21.48A抗体が、HLAクラスI重鎖分子への結合に関与しているβ2ミクログロブリンエピトープに対して特異的であることを示している。
【０１１０】
B1.G6抗体およびC21.48A抗体を発現させるハイブリドーマ細胞系は、特許出願の係属中に長官(Commissioner)により決定された場合および特許期間中の要求に応じて、寄託物の利用を保証する条件下において、少なくとも30年間および寄託の分譲の最も最近の要求が寄託機関により受理された後少なくとも5年間の期間、承認された寄託機関であるパスツール研究所(the Institut Pasteur)、25/28 rue de Dr Roux, 75724 PARIS Cedex 15、のthe Collection Nationale De Cultures De Microorganismes(CNDC)に、ブダペスト条約の約定に従って、2002年3月5日、寄託されている。B1.G6抗体について、ハイブリドーマクローンB1.G6.31.29.1が、登録番号CNCM I-2813として寄託された。C21.48A抗体について、ハイブリドーマクローンC21.48A1.1が、登録番号CNCM I-2814として寄託された。寄託されたクローンの利用可能性は、寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される抗体と実質的に同じ特異性をもつものを同定するために、本明細書に開示された方法を用いてまたは当技術分野において公知の別の方法で作製されるものを含む、他の抗体の比較のための標準を提供することは、認識されるものと思われる。
【０１１１】
実行可能性調査中、EIAが、B1G6 mAbを用いてビオチン化単量体を定量するために用いられた。ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼがビオチン化産物を現すために用いられた。B1G6 mAbを用いるβ2ミクログロブリンを投薬するためのイムノアッセイは、商業的に入手可能である(Immunotech/Beckman Coulter)。B1G6 mAbは、重鎖とβ2ミクログロブリンとの間の相互作用の界面の外側に位置するエピトープを認識する(Liabeufら、前記、1981)。C21.48A mAbおよびB1G6 mAbは、遊離β2ミクログロブリンを測定するためのEIAを開発するために用いられた。
【０１１２】
材料および方法
試薬および抗体
ヒト組換えビオチン化HLA-A*0201単量体およびヒト組換えβ2ミクログロブリン(rβ2m)は、Immunomics(マルセイユ、フランス)の製造部門から得られた。尿から精製された天然のヒトβ2ミクログロブリン；精製されたB1G6 mAb(IgG2a；ロット番号F1317-2)；C21.48A mAbの腹水症液の硫酸アンモニウム沈澱物；ペルオキシダーゼを結合したストレプトアビジンおよびペルオキシダーゼ結合抗β2ミクログロブリンモノクローナル抗体B1G6は、Immunotechから得られた。
【０１１３】
組換えβ2ミクログロブリンのビオチン化
ヒトrβ2mは、ビオチン-ε-アミノ-カプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Roche Diagnostic、スイス)でビオチン化された。簡単には、50 mM ホウ酸塩における1 mg/mlでの1 mgのタンパク質、0.15 M NaCl(pH 8.8)を、10 mg/mlでの5.6μlのビオチン-ε-アミノ-カプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルとインキュベートした。反応混合物を20℃で20分間インキュベートし、100μlの1 M NH4Clで反応を停止させた。タンパク質および低分子量反応物を、4℃で16時間、PBSにおける透析により分離し、等分し凍結した。
【０１１４】
C21.48A mAb精製
C21.48A mAbをプロテインAを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製は、製造会社により提供された使用説明書に従って、Nu-PAGEゲルで還元および非還元条件下に制御した。
【０１１５】
抗β2ミクログロブリンmAbによるβ2ミクログロブリンの認識
96ウェルマイクロタイタープレートを、PBS中5μg/mlでのヒトrβ2mの100μlでコーティングし、PBS中の3% BSAでブロックした。アッセイ手順は以下のとおりであった：いくつかの濃度の抗β2ミクログロブリン抗体または対照抗体の100μl/ウェルを回転式振盪機上、室温(RT)で1時間インキュベートした。ウェルを、0.05% ツイーン80を含む9 g/l NaCl溶液の300μlで自動洗浄機(SLT；ザルツブルグ、オーストリア)を用いて3回リンスし、1/5000ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体の100μl/ウェルを添加した。プレートを回転式振盪機上、室温で30分間インキュベートし、3回洗浄し、TMBペルオキシダーゼ基質を添加した。呈色反応は、撹拌しながら、5分間、暗所で発色するようにさせておいた。その後、2 N H2SO4の50μl/ウェルの添加により、反応を停止させ、吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Device、UK)で450 nmにおいて測定した。基質の吸光度をすべての値から引き算した。すべての測定は、二連で行われた。
【０１１６】
ビオチン化単量体の抗β2ミクログロブリン抗体への結合
96ウェルマイクロタイタープレートを、PBS中5μg/mlでの抗β2ミクログロブリン抗体クローンB1G6またはC21.48Aの100μlでコーティングし、乾燥緩衝剤でブロックした。抗β2ミクログロブリン抗体(B1G6またはC21.48A)でコーティングした固相を用いてEIAを行った。100μl/ウェルのビオチン化単量体を回転式振盪機上、RTで1時間インキュベートした。ウェルを、0.05% ツイーン80を含む9 g/l NaCl溶液の300μlで自動洗浄機を用いて3回リンスし、100μl/ウェルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ溶液を添加した。プレートを回転式振盪機上、室温で30分間インキュベートし、3回洗浄し、TMBペルオキシダーゼ基質を添加した。呈色反応は、撹拌しながら、5分間、暗所で発色するようにさせておいた。2 N H2SO4の50μl/ウェルの添加により、反応を停止させ、吸光度をマイクロプレートリーダー(Molecular Device、UK)で450 nmにおいて測定した。基質の吸光度をすべての値から引き算した。すべての測定は、二連で行われた。
【０１１７】
イムノアッセイ手順
A. サンドイッチEIA
96ウェルマイクロタイタープレートを、PBS中5μg/mlでの抗β2ミクログロブリン抗体C21.48Aの100μlでコーティングし、乾燥緩衝剤でブロックした。異なる濃度のヒトrβ2mの100μl/ウェルを回転式振盪機上、RTで1時間インキュベートした。ウェルを、0.05% ツイーン80を含む9 g/l NaCl溶液の300μlで自動洗浄機を用いて3回リンスし、100μl/ウェルのペルオキシダーゼ結合B1G6 mAb溶液を添加した。プレートを回転式振盪機上、室温で1時間インキュベートし、3回洗浄し、TMBペルオキシダーゼ基質を添加した。呈色反応は、撹拌しながら、5分間、暗所で発色するようにさせておいた。2 N H2SO4の50μl/ウェルの添加により、反応を停止させ、吸光度をマイクロプレートリーダーで450 nmにおいて測定した。基質の吸光度をすべての値から引き算した。すべての測定は、二連で行われた。
【０１１８】
B. 競合EIA
96ウェルマイクロタイタープレートを、PBS中5μg/mlでの抗β2ミクログロブリン抗体C21.48Aの100μlでコーティングし、乾燥緩衝剤でブロックした。異なる濃度のヒトrβ2mまたは試料の10μl/ウェル、およびアルカリホスファターゼ結合β2ミクログロブリン溶液の200μl/ウェルを添加した。プレートを回転式振盪機上、RTで90分間インキュベートした。ウェルを、0.05% ツイーン80を含む9 g/l NaCl溶液の300μlで自動洗浄機を用いて3回リンスし、pNPP基質を添加した。呈色反応は、撹拌しながら、30分間、暗所で発色するようにさせておいた。1 M NaOHの50μl/ウェルの添加により、反応を停止させ、吸光度をマイクロプレートリーダーで405 nmにおいて測定した。基質の吸光度をすべての値から引き算した。すべての測定は、二連で行われた。
【０１１９】
結果
B1G6 mAbおよびC21.48A mAbによるβ2ミクログロブリンの認識
重鎖とβ2ミクログロブリン間の相互作用の界面の外側に位置するエピトープを認識する抗β2ミクログロブリンモノクローナル抗体B1G6、およびHLAクラスI重鎖分子への結合に関与しているエピトープを認識する抗β2ミクログロブリンモノクローナル抗体C21.48Aの、固相上にコーティングされたβ2ミクログロブリンを認識する能力を試験し、関連性のない抗体(TR10 mAb)による結合と比較した。用量反応曲線が、2つの抗β2ミクログロブリン抗体について観察されたが、関連性のない抗体とインキュベートしたウェルにおいてシグナルは得られなかった(図1)。
【０１２０】
B1G6 mAbおよびC21.48A mAbについて得られたシグナルにおける差は、固相によるβ2ミクログロブリンの画分の変化のせいである可能性が高かった；プラスチック表面上への受動的吸着によるタンパク質の固定化は、本ELISAプレートの場合のように、ランダムであること、および固定は、一般に、タンパク質と固相間の疎水性相互作用によることは、よく知られている。そのようであるため、受動的吸着は結果として、抗原性エピトープの損失もしくは変化、または立体障害を生じうる。重鎖とβ2ミクログロブリン間の界面相互作用が、X線結晶構造解析により明らかにされるように、基本的に、疎水性相互作用により支配されていることを考慮に入れれば、本結果は矛盾しない。
【０１２１】
反応条件
この研究に用いられるmAbの特性に基づき、ELISAスキームにおける各抗体の位置は、アッセイに影響を及ぼしうる。一つのシナリオにおいて、B1G6 mAbは、固相上にコーティングされ、C21.48Aはトレーサーである。このスキームにおいて、B1G6 mAbは、重鎖に会合したβ2ミクログロブリンを捕獲できる；C21.48A mAbは、β2ミクログロブリンに結合することができない。さらになお、単量体の画分が解離されている場合、遊離β2ミクログロブリンは検出されうる；しかしながら、過剰の本来の単量体は、B1G6 mAbの結合部位を飽和させ、それゆえに、試料中の遊離β2ミクログロブリンの量は、実際より少なく見積もられる可能性がある。
【０１２２】
代替のシナリオにおいて、C21.48A mAbは、固相上にコーティングされ、B1G6がトレーサーとして用いられる。このスキームにおいて、遊離β2ミクログロブリンのみが検出される；本来の単量体は、遊離β2ミクログロブリンの測定に干渉しない。しかしながら、このシナリオにおいて、ELISAは、本来の単量体により捕獲されるB1G6 mAbの損失を避けるために2段階で行われるべきである。第一インキュベーション段階は、試料の存在下においてのみ行われるべきであり、過剰の本来の単量体の洗浄および除去後のみ、第二の抗β2ミクログロブリン抗体B1G6が第二インキュベーション段階中に添加されるべきである。
【０１２３】
ビオチン化単量体の抗β2ミクログロブリンmAbへの結合
上に記載された別々の局面から、そしてこれらの抗体の特性を考慮に入れて、重鎖のC末端上のビオチンタグの、ペルオキシダーゼに連結されたストレプトアビジンを結合する能力を試験するように、固相上へ吸着された抗β2ミクログロブリン抗体の、溶液における異なるビオチン化単量体を認識する能力を試験した。いくつかの希釈度の5つの異なる精製されたビオチン化単量体を試験した(表7)；希釈溶液を、抗β2ミクログロブリン抗体または関連性のない抗体(抗IL-4R mAb)でコーティングしたマイクロタイタープレート上でインキュベートした。
【０１２４】
（表７）ビオチン化単量体
2005520156.tif 000008
【０１２５】
予想されたように、抗β2ミクログロブリンB1G6抗体でコーティングしたプレートについて、用量反応曲線が得られ、10ng/mlでプラトーに達した；C21.48A mAbまたは抗IL-4R mAbについてシグナルは得られなかった。C21.48A mAbでコーティングしたプレートにおけるシグナルの非存在は、ビオチン化単量体の結合の非存在のせいであり、プレートをコーティングする問題のせいではなかったことを実証するために、ビオチン/β2ミクログロブリン(1:1比)をもつビオチン化β2ミクログロブリンを調製した。このビオチン化β2ミクログロブリンの希釈溶液を調製し、3つの異なる抗体でコーティングしたマイクロタイタープレート上でインキュベートした。特異的抗体でコーティングしたプレートにおいて有意なシグナルが検出されたが、関連性のない抗体でコーティングしたプレートにおいてシグナルは検出されなかった。この結果は、C21.48A mAbでコーティングし、ビオチン化単量体とインキュベートしたプレートにおけるシグナルの非存在が、ビオチン化単量体とC21.48A mAb間の相互作用の非存在のせいであり、プレートに関する問題ではなかったことを確認している。
【０１２６】
これらの結果は、抗β2ミクログロブリン抗体B1G6により捕獲されたビオチン化単量体が、抗体による単量体の捕獲にもかかわらず、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼを結合することを実証している。立体障害は、この抗体について観察されなかった。さらに、この結果は、抗β2ミクログロブリン抗体C21.48Aが遊離β2ミクログロブリンを測定するために用いられうること、および本来の単量体がそのmAbに影響を及ぼさないことを実証している。
【０１２７】
遊離β2ミクログロブリンを測定するためのサンドイッチELISA
2段階免疫測定型アッセイ法が遊離β2ミクログロブリンを測定するために開発され、固相はC21.48A mAbでコーティングされ、かつペルオキシダーゼに結合されたB1G6 mAb抗体がトレーサーとして用いられた。アッセイ法は、表8に記載するように行われた。
【０１２８】
（表８）サンドイッチアッセイ手順の概要
2005520156.tif 000009
【０１２９】
C21.48A/B1G6-ペルオキシダーゼアッセイ法において、B1G6-ペルオキシダーゼの最良の濃度および標準曲線の動力学的範囲を決定するために、β2ミクログロブリンの段階希釈およびB1G6-ペルオキシダーゼの段階希釈を試験した。1μg/ml B1G6-ペルオキシダーゼにおいて高バックグラウンドが観察された(図2)。100ng/mlのB1G6-ペルオキシダーゼにおいて、β2ミクログロブリン濃度が1pg/mlより大きい場合、シグナルは、バックグラウンドより有意に高かった；10ng/mlのB1G6-ペルオキシダーゼにおいて、β2ミクログロブリン濃度が15pg/mlより大きい場合、シグナルは、バックグラウンドより有意に高かった(図2)。B1G6-ペルオキシダーゼが1ng/ml、0.1ng/mlおよび0.01ng/mlで用いられた場合、シグナルはより低かった。これらの結果は、極めて感度の高いアッセイが必要とされない限り、100ng/mlのB1G6-ペルオキシダーゼで得られる感度は高すぎることを示している。
【０１３０】
上の結果に基づいて、さらなる実験が、最終濃度1ng/mlのB1G6-ペルオキシダーゼのを用いて行われた。これらの条件下において、β2ミクログロブリン2.5ng/mlまで、直線的用量反応曲線が得られた；β2ミクログロブリンの最小限の検出可能な量は、試料において10pg/mlであった(「ゼロ」対照のSDの3倍；図3)。β2ミクログロブリンの10ng/mlと100ng/mlの間で、シグナルにおけるプラトーに達した。
【０１３１】
四量体および単量体試料において遊離β2ミクログロブリンを測定するための特異的ELISAが開発された。アッセイ法の正確度は、前に規定された条件を用いて、希釈およびスパイク実験において評価され、4つの異なる単量体試料および3つの異なる四量体試料における遊離β2ミクログロブリンの含有量を調べた(表9および表10)。
【０１３２】
（表９）ELISAアッセイ法による段階2倍希釈分析
2005520156.tif 000010
【０１３３】
（表１０）単量体および四量体試料を一定の濃度のβ2ミクログロブリンでスパイクした後の、ELISAによる段階2倍希釈試験
2005520156.tif 000011
【０１３４】
遊離β2ミクログロブリンを測定するための競合アッセイ法
β2ミクログロブリンを測定するための商業的に入手可能なキット(競合アッセイ法)は利用可能である(Immunotech)。このキットは、アルカリホスファターゼに直接的に結合したβ2ミクログロブリンを用いるイムノアッセイ競合アッセイ法を可能にし、試料において総β2ミクログロブリンを測定する。しかしながら、B1G6 mAbの特性により、MHC四量体またはMHC単量体試料において遊離β2ミクログロブリンを測定するために商業的入手可能なキットを用いることは不可能である。従って、本明細書に開示された競合アッセイ法は、市販用キットにおけるB1G6抗体が遊離β2ミクログロブリンのみを特異的に結合するC21.48A抗体に取り替えられることを除いては、アルカリホスファターゼ結合β2ミクログロブリンおよびβ2ミクログロブリン標準を含む、市販用キットの試薬を利用した。競合アッセイ法は、サンドイッチアッセイ法より感度が低い結果を与えることが予想されるが、競合アッセイ法は、サンドイッチELISAを行うために必要な多数の希釈を必要としないという利点を提供する。競合アッセイ手順は表11に示されている。
【０１３５】
（表１１）競合アッセイ手順の概要
2005520156.tif 000012
【０１３６】
マイクロタイタープレートにおけるC21.48A mAb濃度の最適化
競合アッセイ法についてC21.48A抗体の最適な濃度を決定するために、96ウェルプレートのいくつかのウェルを異なる量のC21.48A mAbでコーティングした。PBS/3% BSAでのウェルの飽和後、アルカリホスファターゼ-β2ミクログロブリン結合体を添加した。増加させた濃度のC21.48A mAbで飽和させるためにシグナルを観察し、抗体の5μg/mlにおいて最大限であった。この結果に基づき、遊離β2ミクログロブリンの効果およびアッセイ法の感度を測定する実験のためにプレートを5μg/mlのC21.48A mAbでコーティングした。標準曲線範囲は、β2ミクログロブリンが1μg/mlと0.07μg/mlの間であると決定された(図4)。
【０１３７】
アッセイ法の正確度は、希釈およびスパイク実験において評価された。第一実験において、MHC単量体およびMHC四量体を含む遊離β2ミクログロブリンを、異なる濃度の組換えβ2ミクログロブリンでスパイクし、RTで1時間インキュベートし、競合アッセイ法により分析した。第二実験において、MHC単量体および四量体試料をPBS/1% BSA/10 mM NaN3で段階的に希釈し、競合アッセイ法により分析した。両方の実験において、回収率は優れていた(表12および表13を参照)。
【０１３８】
（表１２）競合アッセイ法を用いた段階2倍希釈分析
2005520156.tif 000013
【０１３９】
（表１３）一定濃度のβ2ミクログロブリンでスパイクした単量体および四量体試料
競合アッセイ法を用いた段階2倍希釈分析
2005520156.tif 000014
【０１４０】
サンドイッチELISAと競合アッセイ法間の相関
4つのMHC単量体および3つのMHC四量体について得られた遊離β2ミクログロブリンの濃度は、サンドイッチアッセイ法および競合アッセイ法を用いて比較された。2つのアッセイ法間に、ほとんど1の勾配をもつ、非常に良い相関が得られた。
【０１４１】
アッセイ法に用いられる標準β2ミクログロブリン
免疫測定アッセイ法の開発において重要な局面は、標準として用いられるべき分子の選択である。大腸菌において産生され、かつ折り畳まれ、かつ精製された組換えβ2ミクログロブリン(rβ2m)、および尿から精製された天然に存在するβ2ミクログロブリン(Immunotech)を含む、2つの分子が試験された。天然のβ2ミクログロブリンは、凍結乾燥して保存し、rβ2mは、-80℃において液体で保存した。天然のβ2ミクログロブリンを用いる利点は、濃度が国際標準分子(WHO国際生物標準研究所(WHO International Laboratory for Biological Standards)に対して較正され、かつ凍結乾燥して保存されることである。しかしながら、本明細書で検査されるMHC単量体および四量体のβ2ミクログロブリン構成要素はrβ2mである。従って、両方のβ2ミクログロブリン種を試験し、結果を比較した。
【０１４２】
2つの異なるバッチ、OD 280 nmにより測定されたβ2ミクログロブリンの、それぞれ、690μg/mlおよび614μg/mlを含む、ロット番号M-00-0519およびロット番号M-00-153、におけるrβ2mの量を調べた。これらの濃度は、β2ミクログロブリンのモル吸光係数を適用して、280 nmにおけるODにより測定された。並行して、総タンパク質の含有量を、標準としてBSA(ウシ血清アルブミン)で、クーマシーブルーを用いて測定した。結果を表14に示す。
【０１４３】
（表１４）β2ミクログロブリンの2つのロットの比較
2005520156.tif 000015
【０１４４】
ELISAおよび市販用キット(B1G6 mAb)で測定されたβ2ミクログロブリンの含有量は、C21.48A mAb、クーマシーブルー、または光学密度のいずれかを用いる競合アッセイ法で測定されたものより大きかった。このように、β2ミクログロブリンを過大に見積もるアッセイ法はどちらも、B1G6抗体を用いる。β2ミクログロブリンのロットM-00-153について、OD 280、C21.48Aを用いる競合アッセイ法、およびクーマシーブルーにより得られた値は非常に近かった。SDS-PAGEおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより純粋かつ均質の分子が明らかにされたため、タンパク質の純度によりこれらの差を説明することはできない。
【０１４５】
B1G6抗体がトレーサーとして用いられる、または固相においてコーティングされる場合に主要な差が観察され、B1G6 mAbが組換えβ2ミクログロブリンをより良く認識することを示唆した。しかしながら、MHC単量体および四量体試料における遊離β2ミクログロブリンのレベルを比較した場合、どちらのアッセイ法も良く相関した(y=1.0357x-03196; r2=0.9698)。これらの結果は、MHC単量体の解離から引き出されたβ2ミクログロブリンは正しく折り畳まれており、尿由来のβ2ミクログロブリンと同じ構造をもち、両方のアッセイ法について等しくよく認識されることを示した。結果はまた、β2ミクログロブリンが単独で折り畳まれる場合、B1G6抗体により認識されるエピトープがわずかに異なって折り畳まれ、結果として、その抗体により良く認識されることを示している。
【０１４６】
抗体がウエスタンブロットアッセイ法において用いられた場合、B1G6は、還元および非還元条件下において、非常に良くβ2ミクログロブリンを認識したが、C21.48A mAbは、β2ミクログロブリンの両方の種ともより少なく認識した。C21.48Aのエピトープは高次構造的なエピトープであり、B1G6により認識されるエピトープは分子の折り畳み中に改変されうる線状エピトープであることをこの結果は示している。そのような結果はまた、なぜ、B1G6 mAbを用いるアッセイ法がrβ2mの量を過大に見積もるかを説明している。
【０１４７】
競合およびELSAアッセイ法のSECとの相関
上記の遊離β2ミクログロブリンの測定の結果は、SEC(サイズ排除クロマトグラフィー)により測定された。SECにより測定されたβ2ミクログロブリンのレベルの、両方のイムノアッセイ法との間の相関を解析するために、MHC単量体およびMHC四量体試料、加えて精製されたβ2ミクログロブリンの異なる量を含む試料の遊離β2ミクログロブリンを測定するアッセイを並行して行った。SECと両方のEIAとの間に、非常に良い相関が観察された。線形回帰後の曲線の勾配は、ほとんど1であった(ELISA/SEC: y=0.927; r2=0.8113; 競合/SEC: y=0.6492; r2=0.849)。しかしながら、低い方の値についての比較はあまり良くなかった(図5)。
【０１４８】
サイズ排除クロマトグラフィーに関する主要な問題の一つは、アッセイの感度および低い方の値についての極めて高い変動である。この誤差は、ピーク下の積分領域のせいであり、積分における小さい変動が遊離β2ミクログロブリンの定量に強い影響を及ぼす。この影響は、図5において明らかに観察されうる。この場合、イムノアッセイ法とSECの間の変動性は、低い方の値においてより高い；しかしながら、最も高い値について良い相関があった。これらの結果は、本明細書に開示されたEIAが遊離β2ミクログロブリンの正確な測定を得るために使用できることを示している。
【０１４９】
結論
2つの異なる抗β2ミクログロブリンモノクローナル抗体、およびMHC単量体およびMHC四量体試料において遊離β2ミクログロブリンを測定するための2つの異なる免疫測定アッセイ法が特徴付けられた。抗β2ミクログロブリンB1G6 mAbおよび抗β2ミクログロブリンC21.48A mAbは入手可能である(Immunotech；BIODESIGNカタログ)。両方の抗体の特異性は、明らかに実証され(Liabeufら、前記、1981；Devauxら、前記、1990)、報告された観察は本結果に良く合っている；例えば、ビオチン化単量体は、C21.48Aコーティング化プレートに結合しなかったが、ビオチン化β2ミクログロブリンは同じプレートに良く結合した。
【０１５０】
これらの抗体の特性は、MHC単量体およびMHC四量体の解離から引き出されたもののような遊離β2ミクログロブリンを測定するための特異的ELISAならびに特異的競合アッセイ法を設計するために利用された。ELISAアッセイ法は、固相にコーティングされたC21.48A mAbおよびトレーサーとしてペルオキシダーゼに結合したB1G6 mAbを用いた；競合アッセイ法は、固相にコーティングされたC21.48A mAbおよびトレーサーとしてアルカリホスファターゼに結合したβ2ミクログロブリンを用いた。
【０１５１】
両方のイムノアッセイ法は、希釈およびスパイク実験により実証されているように、遊離β2ミクログロブリンについての精度が高く再現性のある測定を可能にした。ELISAの感度は、10pg/mlであると計算され、競合アッセイ法の感度は、0.5μg/mlであると決定され、アッセイ法間に非常に良い相関があった。イムノアッセイ法はまた、高い方の値についてサイズ排除クロマトグラフィーと良く相関した；しかしながら、遊離β2ミクログロブリンの低い方の値について、ゲル濾過クロマトグラフィーはそのアッセイ法とあまり合わなかった。
【０１５２】
大腸菌で産生されかつ単独で折り畳まれたrβ2mと天然のβ2ミクログロブリン間の比較により、B1G6抗体による認識における相違がまた明らかにされた。しかしながら、単量体の解離から引き出されたrβ2mは、ELISAおよび競合アッセイ法が類似した結果を与えることから、天然のβ2ミクログロブリンと同様に折り畳まれている可能性が高かった。これらの発見は、いったん天然のβ2ミクログロブリンに対して較正されたならば、rβ2mが標準として用いられうることを示している。
【０１５３】
実施例3
酵素イムノアッセイ法の妥当性検証
本発明のイムノアッセイ法に影響を及ぼしうる4つの異なるパラメーターが、イムノアッセイ法の妥当性を確認するために調べられた；1)抗β2ミクログロブリンコーティング化マイクロタイタープレート；2)オペレーター；3)プレートリーダー；および酵素反応を行うための温度。これらの4つのパラメーターが、アッセイの精度および再現精度、加えて正確度および強靱性の測定を可能にする6群(表15)を設計するために考慮に入れられた。ELISAおよびEIA試験に関するオペレーターの実験は、A>B>Cであった。妥当性検証研究の結果を表16〜表18に示す。表19では、妥当性検証研究に用いたMHC単量体およびMHC四量体、ならびにプレートの概要を示す。
【０１５４】
（表１５）妥当性検証研究に用いた試料
2005520156.tif 000016
【０１５５】
（表１６）妥当性検証研究に用いたマイクロタイタープレート
2005520156.tif 000017
【０１５６】
（表１７）イムノアッセイ法の妥当性を確認するための群の一覧
2005520156.tif 000018
【０１５７】
（表１８）結果
2005520156.tif 000019
2005520156.tif 000020
2005520156.tif 000021
【０１５８】
結果
再現精度
統計的解析
統計的解析のまとめを表19に示す。分散の一様性は、コクラン(Cochran)検定を用いて調べた。コクラン基準(C)が5%しきい値(C=0.368)においてより低い場合、すべての分散は一様としてみなされ、いずれの値も棄却されなかった。Cがしきい値5%と1%の間にある場合、最高の分散は「疑わしい」とみなされた。Cが1%しきい値においてより高い場合、最高の分散は「異常」とみなされた。2つの最後の場合、群におけるいくつかの点が異常である可能性があり、ディクソン(Dixon)検定が異常値を検出するために用いられた。この分析に従って、群IIおよび群IV、それぞれの試料M00-044において、加えて群IIIの試料M00-130において、異常値が検出された。最終結果は、これらの修正を考慮に入れる。ディクソン検定は、最高の分散をもつ群Vの試料M00-130の値内に異常値を同定することができなかった。分析された6つの異なる試料間で、精度CVの平均は、8.36%であり、再現精度CVの平均は、9.67%であった。両方の結果は優秀とみなされる。
【０１５９】
正確度
A. 希釈実験
試験の正確度は、希釈およびスパイク実験により計算された。結果は、下の表20〜表22に示し、表23にまとめる。
【０１６０】
統計的解析
希釈実験は、独立した希釈として行い、三連で分析した。4つの異なる希釈が分析され、3つの希釈が統計的解析のために考慮に入れられた。分散の一様性は、コクラン検定に従って検定した。分散は、一様とみなされた。分析された6つの異なる試料については、希釈研究として、精度CVの平均は、6.69%であり、再現精度CVの平均は、9.1%であった(表24および表25)。両方の結果は、妥当性検証プロトコールにおいて定義される基準に対応している。
【０１６１】
（表１９）統計的解析のまとめ
2005520156.tif 000022
5%レベルにおけるコクラン検定のしきい値  C(0.05、n=10、K=6)=0.368
1%レベルにおけるコクラン検定のしきい値  C(0.01、n=10、K=6)=0.423
【０１６２】
B. スパイク実験
異なる試料を、5μg/mlでの最終β2ミクログロブリン濃度でスパイクした。試料をRT(23℃)で1時間インキュベートし、その後、希釈して、EIA試験でβ2ミクログロブリン含有量についてアッセイした。群Vは、高バックグラウンド、異常値およびプレートにおける高いCVを生じる、自動洗浄機および自動マルチピペットに主要な問題が発生したため、統計的解析から排除された。
【０１６３】
異なる群において分析された各試料についての回収率の%を、表26に示す。スパイクしていない試料を希釈し、β2ミクログロブリンのレベルを測定した。同時に、単量体または四量体試料をスパイクし、希釈し、分析した。β2ミクログロブリンでスパイクした緩衝液のみを含む試料もアッセイに含まれた。この研究は、試料においてスパイクしたβ2ミクログロブリンの正確な濃度の測定を可能にした；%回収率は以下のように計算された。
2005520156.tif 000023
【０１６４】
コクラン検定は、分散が一様{C(0.05)=0.507およびC(0.01)=0.588に対してC=0.28}であることを示した。それぞれ、繰り返し精度のCVは、5.89であると計算され、再現精度のCVは7.5であった。両方の値は優秀であった。
2005520156.tif 000024
【０１６５】
（表２０）希釈実験の結果
2005520156.tif 000025
【０１６６】
（表２１）希釈実験の結果
2005520156.tif 000026
【０１６７】
（表２２）希釈実験の結果
2005520156.tif 000027
【０１６８】
（表２３）希釈実験のまとめ
2005520156.tif 000028
すべてのデータについての%CVの平均は、=0.67(n=6について)であると計算され、これは優れた精度である。プレート間の変動性を計算するために、同じ試料について2つの異なるプレートで得られた値を計算した。表24にこれらの比率をまとめる。同じ日に試験されたプレート間に非常に良い相関が観察された。全体的な比率は、5.98の%CVをもつ、n=18について0.999±0.059であることが見出された。
【０１６９】
（表２４）計算された比率
2005520156.tif 000029
【０１７０】
（表２５）統計的解析
2005520156.tif 000030
【０１７１】
（表２６）スパイク実験結果のまとめおよび統計的解析
2005520156.tif 000031
【０１７２】
感度
感度は、「ゼロ」標準を20回、測定することにより計算された。平均およびSDが計算された。これらの値から平均-3SDが計算され、得られた値は、対応する標準曲線へ補間された。結果を表27に示す。感度の平均は、0.0405μg/mlであった。
【０１７３】
（表２７）感度値のまとめ
2005520156.tif 000032
【０１７４】
標準曲線の比較
6つの異なる標準曲線が、それぞれ実験の1日で、3つの異なる温度(21℃、28℃、および31℃)において測定された。異なる標準曲線を比較するために、光学密度を、B/Bmax(Bは、各標準点について得られたシグナルである；Bmaxは、標準ゼロで得られたシグナルである)を計算することにより標準化した。結果を表28にまとめる。
【０１７５】
（表２８）標準曲線のまとめ
2005520156.tif 000033
【０１７６】
すべての標準曲線は重なった。その結果は、温度が曲線の勾配に影響を及ぼさず、また最終結果にも影響を及ぼさないことを示している。
【０１７７】
EIAおよびSECを用いて検出された遊離β2ミクログロブリンの相関
すべての単量体および四量体試料についての遊離β2ミクログロブリンにおける含有量は、EIAにより分析され、SEC(サイズ排除クロマトグラフィー；表29)により測定されたものと比較された。比較は、希釈実験から得られた濃度を考慮に入れて行われた。
【０１７８】
（表２９）試験したすべての試料についてEIAおよびSECで得られた値
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【０１７９】
データは、最小二乗法およびデミング(Deming)線形回帰法により分析された。結果を図6に示し、以下にまとめる。
【０１８０】
EIAとSEC間の相関パラメーターは以下のとおりであった。
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【０１８１】
結論
これらの結果は、EIAアッセイ法が強靱で、正確で、再現性があって、感度が高かったことを実証している。プレートの3つの異なるロットは、低いCV(<10%)により実証されているように一様であった。計算された値は、妥当性検証プロトコールにおいて定義された容認基準に合格した。下の表に、確立された基準および見出された値をまとめる。
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【０１８２】
本発明は、上の実施例に関して記載したが、改変および変更が本発明の趣旨および範囲内に含まれることは、理解されるものと思われる。従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】β2ミクログロブリンでコーティングしたプレート上での抗β2ミクログロブリン抗体(C21.48A mAb；B1G6 mAb)または関連性のない抗体(TR10 mAb；対照)のインキュベーション後に得られた用量反応曲線を示す。
【図２】ELISA較正アッセイの結果を示す。β2ミクログロブリンおよびペルオキシダーゼ標識B1G6 mAbの段階10倍希釈が調べられた。
【図３】ELISA標準曲線を示す。組換えβ2ミクログロブリンの段階2倍希釈がアッセイされた。線形回帰後の曲線の式が図に挿入されている。線形回帰曲線もまた加えられた。
【図４】表11に記載される競合アッセイ法に従ってアッセイされたβ2ミクログロブリンの標準曲線を示す。
【図５】サイズ排除クロマトグラフィー、ELISA、または競合アッセイ法によりアッセイされたMHC四量体試料における遊離β2ミクログロブリンのレベル間の比較を提供する。
【図６】最小二乗法およびデミング線形回帰法による、酵素イムノアッセイ法またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて得られた結果の分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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