(57)【要約】  本発明の細胞検定を実施するための装置であって、少なくともひとつの検定部位を有し、この部位は、１対の刺激用電極と少なくともひとつの細胞を細胞外の流体媒体中に閉じ込めるための細胞閉じ込め用空洞を備え、この細胞閉じ込め用空洞および刺激用電極は、使用時に前記細胞または各細胞が、刺激用電極を横断して印加される電位差により発生させられる電場に曝されることが可能なように配置され、この刺激用電極は、前記電位差が前記細胞の場刺激を引き起こすと同時に、前記細胞外の流体媒体が結果として電気分解する水準以下になるような距離だけ離れて置かれていることを特徴とする。
2005517180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞検定を実施するための装置であって、
前記装置は、少なくともひとつの検定部位を有し、
前記部位は、１対の刺激用電極と少なくともひとつの細胞を細胞外の流体媒体中に閉じ込めるための細胞閉じ込め用空洞を備え、
前記細胞閉じ込め用空洞および前記刺激用電極は、使用時に前記細胞または各細胞が、前記刺激用電極を横断して印加される電位差により発生させられる電場に曝されることが可能なように配置され、
前記刺激用電極は、前記電位差が前記細胞の場刺激を引き起こすと同時に、前記細胞外の流体媒体が結果として電気分解する水準以下になるような距離だけ離れて置かれていることを特徴とする細胞検定を実施するための装置。
【請求項２】
前記刺激用電極は、１ｍｍ未満離れていることを特徴とする請求項１に記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項３】
前記検定部位の細胞閉じ込め用空洞において、流体で連通する流路をさらに有することを特徴とする請求項１または２に記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項４】
細胞検定を実施するための装置であって、
前記装置は、少なくともひとつの検定部位を有し、
前記部位は、１対の刺激用電極と細胞外の少なくともひとつの細胞を細胞外の流体媒体中に閉じ込めるための細胞閉じ込め用空洞を備え、
前記細胞閉じ込め用空洞および前記刺激用電極は、使用時に前記細胞または各細胞が、前記刺激用電極を横断して印加される電位差により発生させられる電場に曝されることが可能なように配置され、
前記装置は、前記細胞閉じ込め用空洞に流体で連通する少なくともひとつの流路をさらに備えることを特徴とする細胞検定を実施するための装置。
【請求項５】
前記電場は実質的に均一な電場の領域を含み、各閉じ込められた細胞は前記領域に曝されることが可能なことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項６】
細胞検定を実施するための装置であって、
前記装置は、少なくともひとつの検定部位を有し、
前記部位は、１対の刺激用電極と細胞外の少なくともひとつの細胞を閉じ込めるための細胞閉じ込め用空洞を備え、
前記細胞閉じ込め用空洞および前記刺激用電極は、使用時に前記細胞または各細胞が、前記刺激用電極により発生させられる実質的に均一な電場の領域に曝されることが可能なように配置されることを特徴とする細胞検定を実施するための装置。
【請求項７】
実質的に均一な電場の前記領域において、当該電場強度は、当該電場線を横断して１０パーセント未満だけ変化することを特徴とする請求項５または６に記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項８】
実質的に均一な電場の前記領域は、少なくとも２μｍの距離の間、前記電場線の方向に沿い、かつ／または横断して延びることを特徴とする請求項５乃至７に記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項９】
実質的に均一な電場の前記領域は、前記細胞閉じ込め用空洞の床により一方の側で境界をなすことを特徴とする請求項５乃至８のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１０】
実質的に均一な電場の前記領域は、少なくとも１ピコリットルの容積を占めることを特徴とする請求項５乃至９のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１１】
実質的に均一な電場の前記領域は、前記細胞閉じ込め用空洞の対向する側で細胞閉じ込め用空洞の床に垂直な方向に延びることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１２】
実質的に均一な電場の前記領域は、少なくとも２μｍの距離の間、細胞閉じ込め用空洞の床に垂直な方向に延びることを特徴とする請求項１１に記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１３】
前記刺激用電極は、溶液から電気メッキで形成されることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１４】
前記刺激用電極は、帯電可能な表面範囲増強物質でメッキされていることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１５】
少なくともひとつの細胞が、前記細胞閉じ込め用空洞に閉じ込められていることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１６】
前記細胞閉じ込め用空洞は、実質的に均一な電場の前記領域に関して、前記細胞または各細胞が所定の配向を取るよう助長するように成形されていることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１７】
複数の検定部位を有することを特徴とする請求項１乃至１６のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１８】
前記検定部位は、ひとつ以上のセンサー電極を備えることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置。
【請求項１９】
ひとつ以上の細胞に検定を実施することを特徴とする請求項１乃至１８のいずれかひとつに記載の細胞検定を実施するための装置の使用。
【請求項２０】
電場がひとつ以上の細胞を刺激するための、請求項１乃至１８のいずれかひとつに記載された細胞検定を実施するための装置の使用。
【請求項２１】
ひとつ以上の細胞を多孔化するための、請求項１乃至１８のいずれかひとつに記載された細胞検定を実施するための装置の使用。
【請求項２２】
複数の細胞を電気融合するための、請求項１乃至１８のいずれかひとつに記載された細胞検定を実施するための装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞検定を実施するための装置に関し、より詳しくは、電気的な細胞刺激を含む細胞検定を実施するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムの構造および機能解析、より最近では、プロテオミックスは、しばしば数多くの併行検定を可能とする高密度な微量検定装置形式と結びついて、主要な産業活動になっている。
【０００３】
しかしながら、例えば、タンパク質の機能性あるいは新薬の働きが研究される場である生物の細胞を、テストあるいはスクリーニングにかけるための微量検定形式に関する重要な活動は少ない。このような形式の潜在的な利点は、もっと汎用で採用されれば、臨床前あるいは臨床試用中での医薬化合物の発見における高い損耗率の減少となることである。
【０００４】
しかしながら、従来の細胞に基づいた検定装置は、細胞に実施可能なテストの型（あ  るいは機能性）の関係で相対的に制限されている。
【０００５】
例えば、オーロラ  バイオサイエンシズ(商標)は、人間のＴ細胞株を使用して３４  ５６ウェルのマイクロプレート中で高能率のＧＰＣＲ（Ｇ−タンパク質共役受容体）検  定法を生み出した（Hong Xing, Hung-Cung Tran, Thomas E. Knapp, Paul A. Negulesc  uおよびBrian A. Pollok； A Fluorescent Reporter Assay for the Detection of L  igands Acting Through G1 Protein Coupled Receptors, Journal of Receptor and Si  gnal Transduction Research, Vol. 20 (No.4), (2000年), 189-210頁）。
【０００６】
モレキュラデバイシズ（商標）は、９６あるいは３８４ウェルプレートに含まれる細胞から、細胞内カルシウムイオン濃度および膜電位における変化を測定するために使用されるフリップ検定法を生み出した。
【０００７】
ＷＯ０１/２５７６９は、イオンチャネルの電気生理的特性を判定かつ/または観測する基板について記載している。前記基板は、シールにおいて測定電極と基準電極を電気的に分離するために、前記シールがイオンチャネル含有細胞膜の部分に形成される、いわゆる「パッチクランプ」あるいは「電圧クランプ」技法を利用する。前記測定電極は、細胞膜のシールをされていない部分における電位を測定することが可能である。このことは、例えば、薬物へのイオンチャネル応答の研究を可能にする。
【０００８】
ＷＯ０１/２５７６９に記載されている基板は、複数の部位を有し、その各々は前記部位に結合した測定電極およびひとつ以上の基準電極を有する。基準電極は、電気化学的な（インピーダンス）測定に対して、単にセンサーとして作用する。前記部位は、ウェルに置かれた細胞に吸引を行う配管を有するウェルの形をとっており、これによりウェル内に細胞を配置して細胞膜にシールを形成する。
【０００９】
しかしながら、筋細胞や肥満細胞や神経細胞のような電気的に活性な細胞を研究するための細胞検定技法は、相対的にほとんど発展していない。このような細胞は、梗塞やパーキンソン病のような神経の不整を含む主要な病気に密接に関連している。例えば、ＷＯ９８/５４２９４では、各電極を横断して印加される電圧信号の検出および観測が個々の細胞の電気的性質に情報を提供できるように、多数の微小電極が細胞培養室に配置されている装置を記載している。ＷＯ９８/５４２９４における電極の構成は、細胞と電極表面との接触が良好である必要はあるが、電極が電流の注入により作用電位を引き起こすようになっている。また、ＷＯ９８/５４２９４でなされているインピーダンス測定では、細胞と感知する電極との電気的な接触が存在する必要がある。
【００１０】
ＷＯ０２/０８７４８では、生細胞の膜電位を電気刺激により操作する基板を提案している。この基板はマルチウェルプレートに基づくものである。多数の電極は前記ウェルに浸され、それゆえに１対の電極は各ウェルに導入される。狙いは、ウェルに保持されている細胞を、膜を横断する電位変化の光学的な分析を実施しながら、電気的に刺激することである。
【００１１】
しかしながら、ＷＯ０２/０８７４８で開示された基板の欠点は、細胞刺激を誘起するのに必要とされる電場がウェル内溶液の電気分解につながる可能性があることである。電気分解は、泡を形成して結果的に溶液を化学変化（例えば、ｐＨ）させる。このことは、ついで電気反応および実際に細胞の存続(例えば、エレクトロポーレーションにより)に影響を与えることが可能である。
【００１２】
電気分解の程度を制限するために、ＷＯ０２/０８７４８では、たった約1分間までの持続時間における刺激手順を提案している。前記刺激手順を形成する電気的なパルスもまた短く保たれ、極性は電荷の平衡を保つために反転されている。
【発明の開示】
【００１３】
（発明の要約）
本発明の目的は、高能率の検定スクリーニングを実施するために使用され、かつ／または広範囲な機能的細胞検定が用いられことを可能にする細胞検定、特に細胞の電気刺激を含む細胞検定を実施するための装置を提供することにある。
【００１４】
本発明の第１の態様は、細胞検定を実施するための装置を提供することであり、この装置は少なくとも１箇所の検定部位を有し、この部位は１対の刺激用電極と細胞外の流体媒体に少なくともひとつの細胞を閉じ込めるための細胞閉じ込め用空洞を備え、これらの細胞閉じ込め用空洞および刺激用電極は、使用時に、当該細胞あるいは各細胞が刺激用電極を横断して印加される電位差により生じる電場に曝され得るように配置され、この装置において刺激用電極は、電位差が当該細胞あるいは各細胞の場刺激を誘発することが可能で、かつ同時に細胞外の流体媒体が結果として電気分解する水準以下であることが可能な距離だけ離れていることを特徴とする。例えば、刺激用電極は１ｍｍ未満、４００、２００、１００または５０μｍ未満離れてもよい。
【００１５】
本発明者は、刺激用電極間の距離を減少することにより、付与の場を生成するのに必要な電位が減少し、従って、細胞外の流体媒体における電気分解の問題を回避することが可能か、あるいは大幅に減少させることが可能であることを覚った。これによれば、ＷＯ０２/０８７４８と比較して大幅に長期間、例えば、１分以上、そしていくつかの例では連続して２４時間の刺激手順を採用することができる。
【００１６】
水溶性媒体では、Ｈ+はＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極に相対的に約１．０Ｖ超えの電位で陽極において発生し、それに対しＯＨ-はこのような基準電極に相対的に約０．８３Ｖ超えの電位で陰極において発生する。高電位ではＨ2とＯ2もまた泡を生じて発生し、実際にＷＯ０２/０８７４８では、ｐＨの変化および泡の形成を記載している。しかしながら、本発明者は刺激用電極を小型化すると共に電極間の距離を減少することにより、電気分解による電気分解生成物(例えば、Ｈ+、ＯＨ-、Ｏ2またはＨ2)の生成を先導する水準以下で、電極に亘り電圧を同時に維持しながら、例えば、過分極化あるいは脱分極化により細胞の刺激を先導するように、十分に高い場強度を発生させることが可能であることを見出した。
【００１７】
泡の形成回避は、泡が流路に沿って流体の流れを阻止可能なので、微小流体素子の特徴（以下に記述）を組み込む装置において特に重要である。
【００１８】
心室の筋細胞の活性化に必要な閾値場強度は、約４０Ｖ／ｃｍである。他の細胞型に対しこの閾値場強度は異なる。閾値場強度は、細胞の生理的な状態の関数でもある（医薬品の作用後、脱分極化を先導するのに必要な閾値場強度は増加または減少する）。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態においては、刺激用電極を可能な限り細胞に近づけるが、実際に細胞表面に接触することはない。
【００２０】
ひとつの実施形態において、４０Ｖ／ｃｍの場強度は、２００μｍ離れた１対の刺激用電極を横断して０．８Ｖの電位差を印加することにより発生する。このような状況では、電気分解生成物を生成する水準以下に、この電圧を維持することができる。それゆえ、電場線に対して平行に刺激用電極間に、筋細胞（代表的な長さは１００から１５０μｍ）を配置することができ、かつ場刺激により脱分極化を促進することができる。したがって、分極化に異なる場強度を必要とする他の細胞型に対して、電極構成を調整することが可能である。
【００２１】
好ましくは、使用時に、当該閉じ込められた細胞または各閉じ込められた細胞（好ましくは、当該閉じ込められた細胞または各閉じ込められた細胞の実質的に全体）が前記刺激用電極により発生させられるほぼ均一な電場の領域に曝されるように、細胞閉じ込め用空洞および刺激用電極を配置する。
【００２２】
このようにして、均一な電場により細胞の実質的な部分、好ましくは全体を刺激することができる。このことは、細胞に印加される場が均一でないＷＯ０２／０８７４８に記載された例と対照をなす。また、調査中の細胞の相対的に小さなパッチ範囲内に囲まれたイオンチャネルの挙動を確認するパッチクランプ法とも対照をなす。
【００２３】
使用時に、当該閉じ込められた細胞あるいは各閉じ込められた細胞は、刺激用電極に接触しないのが好ましい。このことは当該細胞または複数の細胞がある電極に接触しているか、あるいはその電極により突き刺されているパッチクランプ法または電圧クランプ法（あるいは電流注入の他の方法、例えば、ＷＯ９８／５４２９４）と対照をなす。
【００２４】
電場刺激は、興奮閾値以上の膜電位の脱分極化に応じて作用電位を発生させる興奮可能な細胞能力に依存する。ひとつの細胞がある電極に接触またはその電極により突き刺されている場合（例えば、パッチクランプまたは電圧クランプの間）、典型的には約１メガオームの入力インピーダンスが生成され、心臓の筋細胞は約１０ｍＶの膜脱分極化を引き起こすのに約１ナノアンペアの注入電流を必要とし、これによって作用電位を発生させる。同様の状況において、他の電気的に活性な細胞型では、分極化を引き起こすのに１から１０ナノアンペアを必要とする可能性がある。しかしながら、本発明者は、細胞からの信号を長期間記録することを可能にして、電気的に興奮可能な細胞（心臓の筋細胞のような電気的に活性な細胞を含む）の分極化が、電極との接触あるいは電極による突き刺しなしに達成することができないことを見出した。このような分極化は、例えば、高い細胞外のカリウム（好ましくは、少なくとも５０または１００ミリモルのＫ+）や場刺激やそれらの組み合わせにより達成することが可能である。
【００２５】
本発明の関係において、刺激用電極は細胞閉じ込め用空洞に一体化されるのが好ましい。このような電極は、脱分極化を引き起こすのに使用することができる。このことは、極低（ピコリットル（ｐＬ）−ナノリットル（ｎＬ）尺）容積における個々の細胞の電気刺激を可能とする。使用時において、電極対の一方の電極（陽極）は他方の電極（陰極）に対して正の電位を有している。刺激用電極の極性は、実験進行の間に変更（お互いに相対的に逆にしたり、増加させたり、または減少させたり）してもよい。
【００２６】
それゆえ電気的活性または電気生理的活性を促進するように（例えば、電気的に活性な細胞における細胞膜の脱分極化または過分極化により）、刺激用電極を使用することができる。このような電気的な条件は、生理的な条件下あるいは既知または未知の薬物の存在時に発生する可能性がある。さらにまたは代わりに、刺激用電極を、（Ｉ）細胞をエレク
トロポーレーションすると共に、粒子や分子やイオンの導入を可能にし、かつ／または（II）電気融合が細胞を結合することを可能にするように、使用することができる。このよ
うにして、場刺激、エレクトロポーレーションおよび電気融合を、逐次または同時に実施することができる。
【００２７】
電気的に活性でない細胞を電圧に感受性のあるイオンに特有のチャネルに移すことにより、電気的に活性でない細胞を電気的に興奮可能な細胞に変えることができる。これら異種に発現された電圧に感受性のあるイオンチャネルは、膜脱分極化または過分極化において開き、このようにして蛍光的、電気的あるいは電気化学的に観測することが可能な十分な電流の流れを創る。このような細胞は、本発明の装置に幅広い適用を有する。
【００２８】
同時に、活性期間中の細胞代謝の反応は、細胞副産物の化学的、光学的あるいは電気化学的な検定により、そのままの場所で観測することが可能である。このような観測は、生理的条件下あるいは既知または未知の薬物の存在時に行われてもよい。
【００２９】
例えば、細胞が膜電位を伝えるフルオロフォア(蛍光物質)に浸されている間に、ひとつの細胞または複数の細胞が１対の刺激用電極により場刺激された手順を実行することが可能である。フルオロフォアからの信号における変化を測定することにより、この細胞におけるイオンチャネルの開閉を光学的に観測することが可能である。これは直接に測定してもよいし、「フリッカ−ノイズ」として測定してもよい。他の方法には、前記刺激用電極の一方または両方における電気的あるいは電気化学的な信号測定を含んでもよい。例えば、細胞に脱分極化または過分極化を引き起こさせ、このようにして作用電位を発生させるために必要な（ひとつの刺激用電極における）電流の流れと印加される閾値電位のどちらかまたは両方を、生理的条件下あるいはひとつの既知または未知の薬物の存在時に測定してもよい。このような測定は、細胞の電気生理的な状態を伝える。
【００３０】
刺激は検定測定中に細胞に影響を与え得るので、このような刺激モードを使用するテストは、「能動」細胞検定と称してよい。これは、細胞に影響を与える試みをほとんどしないか全くせず、それゆえに「受動」細胞検定と称される従来のパッチクランプ法と対照をなす。
【００３１】
例えば、本発明の装置は、細胞中または周りのＣａ2+の量あるいは位置が、例えば、電気刺激の前、間または後にＣａ2+に感受性のあるフルオロフォアにより測定あるいは観測される検定を実施するために利用してもよい。
【００３２】
しかしながら、当業者に知られている細胞活性を測定する他の化学的、光学的、電気化学的、電磁気的等の方法を、本発明の装置を使用して検定を実施するために利用してもよい。
【００３３】
「実質的に均一な電場」とは、好ましくは、当該電場強度が電場線を横断して１０％未満、より好ましくは、５か２か１または０．５％未満変化することを意味する。実質的に均一な電場の領域における電場線は、典型的にはほぼ真っ直ぐである。
【００３４】
実質的に均一な電場の領域は、好ましくは、少なくとも２μｍの距離に対して、電場線の方向に沿いかつ／または横断して延び、より好ましくは、少なくとも５，１０，２０，３０，５０，８０，１００，１５０，２００または４００μｍあるいは１ｍｍの距離に対して、電場線の方向に沿いかつ／または横断して延びるものである。典型的には、この領域は当該細胞閉じ込め用空洞の床により一方の側で境界となっている。領域は大きいほど、多くの細胞を前記閉じ込め用空洞に閉じ込め、実質的に同じ電場に曝すことができる。
【００３５】
ひとつの実施形態において、実質的に均一な電場の領域は少なくとも１ピコリットルの容積を占める（好ましくは、少なくとも５か１０か５０または１００ピコリットル）。しかしながら、この領域は、少なくとも５００ピコリットルあるいは１，２，３，５または１０ナノリットルを占めてもよい。細胞閉じ込め用空洞内の流体は、使用時にこの空洞中のより程度の大きい対流の動き、従って細胞の動き、が期待できるように検定中に（例えば、より詳細には以下に記述するようにピペット、分配器または流路により）更新される場合、一般的に、大きな容積が好まれる。容積が大きいと、細胞が実質的に均一な電場の領域に中断せずに曝されることを確実にするのを助ける。
【００３６】
しかしながら、調査中の細胞より小さい実質的に均一な電場の領域を生成すること、例えば、細胞の一部に局所分極化または過分極化を促進すること、も生理学上興味がある。生理条件下あるいは既知または未知の医薬化合物の添加後に、当該細胞に亘る脱分極化または過分極化の伝播を調査することができる。このような場合、刺激用電極が当該細胞に接触していなければとりわけ好ましい。前記電極も当該細胞より小さいのが好ましい。
【００３７】
ひとつの実施形態において、前記刺激用電極は、細胞閉じ込め用空洞の対向する側で、前記細胞閉じ込め用空洞の床に垂直な方向に（好ましくは電極が互いに実質的に平行に）延びる。このことは、実質的に均一な電場の領域の範囲と容積を増加させることに役立つ。細胞閉じ込め用空洞の床がｘ−ｙ面を定義するならば、前記刺激用電極はｚ方向に延びると言える。前記電極は、少なくとも２μｍ（好ましくは、５，１０，２０，３０，４０，５０または８０μｍ）の距離間、前記空洞の床に垂直な方向に延びることが可能である。前記刺激用電極は、前記細胞閉じ込め用空洞の床から延びるのが好ましい。
【００３８】
刺激用電極は、溶液、例えば、金やイリジウムや白金またはこれら２つ以上の合金等の貴金属より電気メッキにより形成してもよい。ひとつの実施形態において、実質的に２次元の「前駆体」電極（印刷してもよいし、細胞閉じ込め用空洞の床上に形成してもよい）は、細胞の対向する側に設けられている。電気メッキは、前記刺激用電極を形成するために、面外方向（典型的には前記閉じ込め用空洞の床に垂直）に前記前駆体電極を厚くするように用いられ、実質的に均一な電場の領域の厚さが増加する。
【００３９】
流体が前記空洞に含まれている場合、電極表面に近接する電気２重層に起因する分極化を減少させるため、刺激用電極のどちらかまたは両方の上に表面層を形成するのが望ましい。このことは、電流が前記電極間を流れ始める時に、静電放電を回避あるいは減少することに役立つ。
【００４０】
このような流体が電場の影響下で分解または変性する起こり得る傾向を減少させるように、電極表面層を利用してもよい。例えば、刺激用電極を修復付加層で覆ってもよく、この層は水の加水分解に対する過電位を減少し、よって電気分解を先導することなく前記電極を横断して高電圧を印加することを可能にする。
【００４１】
検定部位は、さらにひとつ以上のセンサー電極を備えてよい。典型的には、センサー電極は、刺激用電極により発生させられる実質的に均一な電場の領域に曝される当該細胞または各細胞における反応を測定する。使用時には、センサー電極は、細胞の表面に接触するか（この場合、インピーダンス電極と称す）あるいは接触しない（この場合、バイオセンサー電極と称す）。センサー電極を検定部位に一体化してよい。本発明の装置が、積層したフォトリソグラフ層を使用して作られているならば、異なる積層したフォトリソグラフ層上に形成される電極を誘電層（例えば、化学蒸着（ＣＶＤ）した窒化シリコンまたはポリイミド）により分離してよい。
【００４２】
例えば、場刺激やエレクトロポーレーションあるいは電気融合は、細胞膜のキャパシタンスまたは当該細胞あるいは各細胞の表面／容積比における変化を引き起こす可能性がある。このことは、センサー電極を細胞表面に接触させることにより得られるインピーダンス測定により観測することが可能である。
【００４３】
しかしながら、より一般的に細胞の電気化学を観測するために、センサー電極を使用してよい（バイオセンサーの適用を含む）。例えば、酵素による触媒反応を電気化学的検出手順（例えば、センサー電極は、電流測定または電位測定センサーとして機能することができる）に結合して、場刺激の進行中に乳酸塩とブドウ糖、グルタミン酸塩、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）のような代謝に必要な物質を観測することが可能である。このようにして、酵素乳酸塩酸化酵素（乳酸塩および酸素または他の電子受容体の存在下で電気活性化合物である過酸化水素を生成する）を細胞閉じ込め用空洞に導入してよく、それによって細胞を通しての代謝活動を観測することを可能にする。細胞の乳酸塩の生成に直接関係している過酸化水素の検出は、同様に、当業者に知られている酵素に結びついた反応を利用して、他の代謝に必要な物質を観測することが可能である。さらなる例において、イオン選択センサー電極を電位測定センサーとして電気化学的に使用して、Ｋ+，Ｎａ+およびＣａ2+のようなイオンを測定してもよい。
【００４４】
あまり望ましくなく、細胞が電極に接触している必要があるが、刺激用電極のどちらか一方あるいは両方を細胞のインピーダンス観測のために用いることができる。そして刺激・エレクトロポーレーション・電気融合はセンサー測定として同時に実施できない。このような場合においては、検定上の応答性を改善するために、導電性の重合体（例えば、ポリピロール）や非導電性の重合体（例えば、ポリフェノール)の電着あるいはチオールやタンパク質のようなアド層の付加により、刺激用電極の表面を修正するのが好ましい。
【００４５】
ひとつの実施形態において、刺激用電極の帯電可能な表面範囲は、導電性のポリピロール重合体や白金ブラックのような電荷可能範囲を高める物質で電極をメッキすることにより拡大される（従って、電極を通る電流は、付与の印加電圧に対して増加される）。
【００４６】
さらに、本発明者は、印加される電圧パルスの間に細胞に入る電流量が細胞閉じ込め用空洞内の細胞外の空間に関係していることを認識している。利用可能な細胞外の空間が少ないほど、（付与の印加された電圧に対して）細胞膜を通過する電荷はより多くなり、したがって陰極または陽極のいずれかに関し細胞の性質と配向性に応じて、脱分極化または過分極化のいずれかを引き起こす膜電位変化に寄与する。
【００４７】
このように好ましくは、細胞閉じ込め用空洞内の細胞外の空間は、当該空洞内に閉じ込めようとしている細胞の合計容積の２0倍未満（より好ましくは、１０か５か２倍未満）である。例えば、約３６ピコリットルの心臓の筋細胞を閉じ込めようとする細胞閉じ込め用空洞は、約４００ピコリットルまでの容積を有してよい。
【００４８】
細胞閉じ込め用空洞内の細胞外の空間を減少させることは、その中の測定量の希釈を減らし、かつ（当業者に知られている電気化学的方法や光学的方法や他の技法を使用する）細胞外の代謝に必要な物質およびイオンの測定において検定上の利点を与える。
【００４９】
典型的には、細胞閉じ込め用空洞はウェルの形状をしており、ウェルの先端は、使用時に、鉱物油や重合体や膜や半透過膜やその他いかなる物理的な防壁の層でもよい誘電層で閉じられている。この方法で前記ウェルを閉じることは、細胞外の空間の量を効果的に制限すると共に、蒸発を減少させることにも役立つ。
【００５０】
前記空洞は、検定の効率を増すために細胞が併行して刺激され、かつ検定されることが可能なように、複数の細胞を含んでもよい。例えば、少なくとも２か５か２０の細胞が当該空洞または各空洞に存在してもよいが、生物学的な代表をよく提供するには、少なくとも１００または２００の細胞が好ましい。検定が多数細胞の準備の上で実行される場合、生理学的な機能を可能とすることと両立して、閉じ込め容積は可能な限り小さいのが好ましい。
【００５１】
典型的な細胞の大きさは、５から２００μｍのオーダーである。したがって、細胞閉じ込め用空洞は、５００ピコリットル未満（好ましくは、２００か１００か５０または１０ピコリットル未満）の容積を占めてよく、かつ／または細胞閉じ込め用空洞の最小の大きさは、２００μｍ未満（好ましくは、１００か５０か２０か１０または５μｍ未満）でよい。細胞閉じ込め用空洞のこのような大きさは、単一細胞に検定を実施するのに好適である。しかしながら、とりわけ細胞閉じ込め用空洞に複数の細胞を閉じ込めることを意図している場合、あるいは使用時において、細胞閉じ込め用空洞における流体が更新される場合には、細胞閉じ込め用空洞は１００ナノリットル未満（好ましくは、５０か１０か５か３か２または１ナノリットル未満）の容積を占めてよい。
【００５２】
細胞閉じ込め用空洞は、当該細胞または各細胞が実質的に均一な電場の領域において所定の位置、かつ／または実質的に均一な電場の領域に関して配向性を取るように促進する形状にしてよい。例えば、伸長した直方体の閉じ込め空洞は、対応する細長い心臓細胞を配向させるために好ましい形状であろう。特に、刺激用電極が細長い断面のそれぞれの端に存在する場合には、前記心臓細胞を刺激電場に平行に位置するように配向させることができる。
【００５３】
本発明の装置は、複数の検定部位を備えることが好ましい。これにより多数の併行検定の実施が可能となる。例えば、多数検定装置は、少なくとも２部位、好ましくは、少なくとも５か１０か５０か１００か５００か１０００または５０００部位を備えてよい。
【００５４】
ひとつの好ましい実施形態において、本発明の装置は、当該検定部位または各検定部位の細胞閉じ込め用空洞と流体連通する少なくともひとつの流路を備え、これによって前記空洞を介する流体の流れを生成することができる。これにより栄養物を細胞閉じ込め用空洞に供給し、老廃物を除去することが可能となり、このようにして細胞生存能力を促進または維持する。前記流路を、テスト用に（例えば、細胞外の）流体を前記空洞から回収するために使用してもよい。さらに、前記流路を、テスト細胞を細胞閉じ込め用空洞に輸送するために使用することができる。
【００５５】
その上にあるいは代わりとして、本発明の装置は、物質を細胞閉じ込め用空洞に加えるために、ひとつの検定部位につき複数（好ましくは、２つか３つ）の物質配送路を備えてよい。前記配送路は、薬物を局所的に適用するために、能動細胞検定において使用してよく、これにより電気的に刺激された細胞の代謝の反応への薬物の瞬時の影響を測定することが可能となる。細胞閉じ込め用空洞における典型的に小さな細胞外の容積においては、多分必要とされるように、ミリ秒時間範囲での切替（スイッチング）が可能となる。
【００５６】
複数の配送路がある場合には、配送路は異なる方向から細胞閉じ込め用空洞に開放しているのが好ましい。これにより当該細胞または各細胞の異なる範囲が、例えば、層流により分離された異なる薬物濃度に曝されることが可能となる。
【００５７】
このような流路および配送路の適切な機能は、（上記方法で得られた）細胞外の流体媒体における電気分解の回避または減少により高められる。これは電気分解により形成された泡が流路および配送路を通る流れを阻止することができるからである。
【００５８】
本発明の第２の態様は、細胞検定を実施するための装置を提供するものであり、本装置は少なくともひとつの検定部位を有し、この部位は１対の刺激用電極と少なくともひとつ細胞を閉じ込めるための細胞閉じ込め用空洞を備え、この細胞閉じ込め用空洞と刺激用電極は、使用時に当該細胞または各細胞が刺激用電極により発生させられた電場に曝されることが可能なように配置されており、さらに本装置は、前記細胞閉じ込め用空洞と流体連通している少なくともひとつの流路を備えることを特徴とする。
【００５９】
本発明の第３の態様は、細胞検定を実施するための装置を提供するものであり、本装置は少なくともひとつの検定部位を有し、この部位は１対の刺激用電極と少なくともひとつ細胞を閉じ込めるための細胞閉じ込め用空洞を備え、この細胞閉じ込め用空洞と刺激用電極は、使用時に当該細胞または各細胞（好ましくは、当該細胞または各細胞の実質的に全体）が刺激用電極により発生させられる実質的に均一な電場の領域に曝されることが可能なように配置されていることを特徴とする。
【００６０】
第２および第３の態様に関係して、必須ではないが、前記電場を発生させるように前記刺激用電極を横断して使用時に印加される電位差が、当該細胞または各細胞の場刺激を誘起すると同時に、細胞外の流体媒体が結果として電気分解する水準以下であることが可能なように、前記刺激用電極は距離が離れて置かれていることが好ましい。
【００６１】
第１の態様における随意の特徴のいずれかひとつまたはいずれの組み合わせは、第２および第３の態様に適用してよい。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、先の態様のひとつに記載した細胞検定を実施するための装置を提供するものであり、本装置において前記細胞閉じ込め用空洞は、少なくともひとつの細胞（好ましくは、複数の細胞）を閉じ込めることを特徴とする。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、先の態様のひとつに記載した細胞検定を実施するための、先の態様のいずれかひとつの装置の使用を提供することを特徴とする。
【００６４】
前記細胞検定は、細胞反応への物質の効果を調査あるいは判定するテストとして定義できる。この物質は、薬物、ペプチド、タンパク質または糖タンパク質、糖または炭水化物、リガンド、重合体、液体の小滴、化学物質、他の細胞、ウィルス、微生物あるいは核酸またはポリヌクレオチドであってよい。前記細胞反応は、限定されるものではないが、以下のものであってよい。それは、細胞表面受容体またはイオンチャネル信号、細胞内イオン流、細胞内分子の動き、信号形質導入、遺伝子発現、副細胞の細胞小器官活性の変化、細胞形態、飲作用、内在化、分泌、細胞間界面での変質、アポトーシス、壊死あるいは細胞死である。
【００６５】
本発明のさらなる態様は、電場が複数の細胞を刺激するか、複数の細胞を多孔化するか、あるいは２つ以上の細胞を電気融合するための先の態様のいずれかひとつの装置の使用を提供することを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
本発明は、能動細胞準拠検定システムに関係するものであり、細胞内の電気的な特性を変更するか、または物理的な変化を促進するため、本システムを使用することができる。
【００６７】
前者の場合においては、場刺激として知られている工程は、（細胞を横断、より特定すると、細胞膜のひとつ以上の領域を横断して電圧を印加する結果から生じる）電気刺激の大きさおよび性質により反応するように細胞の電気的な特性を変更する。この反応は、イオンの輸送に関与する膜タンパク質の活性差から、結果的に生じることが示されている（Cheng, David Ker-Liang, Leslie TungおよびEric A. Sobie, Nonuniform responses of Transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells, Am. J. Physiol., 277, (1999年)、351−362頁）。異なるイオンは、（筋細胞の拍動または神経細胞の作用電位のような）電気生理的な反応を結果として生じる細胞の内または外へ移動するか、あるいは細胞膜中の受容体が刺激されるようになる可能性がある。
【００６８】
後者の場合においては、前記膜を横断する場の印加が細胞中の物理的な変化を引き起こす場合には、２つの例を引用することができる。ひとつ目の例では、２つの細胞は融合が促進される。２つ目の例では、粒子や分子またはイオンを細胞膜または細胞中の人為物を経由して細胞内に導入することが可能なように（エレクトロポーレーションとして知られる工程により）、細胞膜の透過性を変化させることができる。
【００６９】
以下の例において、本発明による細胞検定を実施するための装置の組立および細胞にテストを実施するための装置の使用について述べる。
【実施例１】
【００７０】
（装置の組立）
ポジ型フォトレジスト（製品名Ｓ１８１８）を、電子ビームで書いたクロムマスクを使用して、顕微鏡ガラスカバー片（２２×６４ｍｍ、厚さＮｏ．１：０．１３から０．１７ｍｍ）上にフォトリソグラフィ的にパターン化した。チタン層（１０ｎｍ）および第２の層（１００ｎｍ）である金をパターン化したガラス表面に蒸着した。続いて、前記ポジ型フォトレジストのＴｉ／Ａｕ被覆層を除去し、互いに２００μｍ離れ、各線が一端にボンディングパッドを有する２０μｍ幅のＴｉ／Ａｕ平行線前駆体電極を前記ガラス上に残した。
【００７１】
図１の（ｂ）は、電極線３およびボンディングパッド１１を有する顕微鏡ガラスカバー片４を模式的に示し、図２の（ａ）および（ｂ）は、図１の（ｂ）のカバー片を組み込んだ組立後の装置の、それぞれ模式的な平面図および側面図を示す。
【００７２】
ボンディングパッド１１は、光の透過が蛍光色素を励起させるか、あるいは細胞に強い光線を透すことを可能にする、中央の矩形窓１７を有するプリント回路基板（ＰＣＢ）１３の銅電極１６に、２００μｍ厚さの金線１２で接続されている。
【００７３】
パターン化されたガラスカバー片の中央部分を覆うような大きさとした２００から４００μｍ厚さの矩形のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）シートを、（図１の（ａ）に表示した）種型を使用して成型した。ＳＵ−８、つまり高アスペクト比のネガ型ポトレジストで前記種型を微小加工した。成型工程では、ＰＤＭＳシート中に各スルーホールがひとつの検定部位に相当する四角断面の筒状スルーホールの矩形配列を生成した。曲がりくねった流路も、前記成型工程により、ウェルを連続して接続する前記シートの一方側上に形成した。
【００７４】
図１の（ｂ）に示すように、外面上に流路５を有するＰＤＭＳシート２におけるスルーホール１の列を、カバー片４上の近接する電極線３の各々の対と一直線に並べた。可撓性の管１４，１５を、流路５の入口と出口にそれぞれ接続した。管１５に接続された注射器（図示せず）は、管１４を通って貯蔵槽から流体を抜き出し、ウェルに入れるように負の圧力が掛けられることを可能とした。
【００７５】
次に細胞検定装置を形成するように、つまり、各スルーホールの一方の端が当該ウェルのガラス床で１対の前駆体電極で２００から４００μｍ深さのウェル（すなわち、細胞閉じ込め用空洞）を形成するように仕切るように、前記ＰＤＭＳシートを前記カバー片に密封した。
【００７６】
１０から２０μｍ厚さの刺激用電極を形成するように、電気メッキにより前駆体電極を後処理した。これは、（管１４，１５および流路５を通って各ウェルに引き込まれた）溶液から金、イリジウムまたは白金のいずれかで、１００ｎｍ厚さの金層に電気メッキすることにより達成された。結果として、図３に示すように、それぞれの電気メッキされた刺激用電極は、各ウェルの側面を１０から２０μｍの高さだけ延びる。図３は、細胞２３を含むひとつのウェル２２に亘る模式断面図である。このように電気メッキは、前記カバー片とＰＤＭＳシート間の境界において、洩れた流体がウェル内に入ったり、出たりすることに対して付加的な密封作用を与える。
【００７７】
さらに、図３に示すように、前記カバー片に平行に走る電場線２４を有する実質的に均一な電場の領域を、近接する電極対間で生成することが可能であり、この領域は、ほぼ前記ウェルの底から前記刺激用電極の先端へ延びる。それゆえ、使用時において、細胞はこの領域に完全に閉じ込められて、均一な電場に曝されることが可能である。
【００７８】
次に、（導電性または絶縁性）重合体または誘電膜をＣＶＤまたは他の蒸着法で蒸着するために、随意の後処理を電気メッキされた刺激用電極に実施した。このことは、前記電極の分極特性を変え、そのことにより細胞処理が大きな電圧降下または当該細胞を通過する高電流による損傷を受けたり、あるいは変化する危険率を減少させた。
【００７９】
帯電可能な範囲を拡大し、そしてこのようにして加水分解に対する電位を減少させるために、電極表面を導電性の重合体であるポリピロール、窒化シリコンまたは白金ブラックのいずれかでさらに被覆した。
【００８０】
（心臓の筋細胞の分離）
単一の心臓の筋細胞を、膠原質の消化（D.A. Eisner, C.G. Nichols, S.C. O'Neil, G.L. SmithおよびM. Valdeomillos, The effects of metabolic inhibition on intracellular calcium and pH in isolated rat ventricular cells, Journal of Physiology, 411, (1989年), 393-418頁）によりうさぎの心室から分離し、１２０ミリモルのＮａＣｌ、２０ミリモルのＮ−水酸化エチルピペラジン−Ｎ‘−２エタンスルホン酸ナトリウム、５．４ミリモルのＫＣｌ、０．５２ミリモルのＮａＨ2ＰＯ4、３．５ミリモルのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、２０ミリモルのタウリン、１０ミリモルのクレアチン、１００ミリモルのブドウ糖、０．１％のウシ血清アルブミンおよび０．１ミリモルのＣａＣｌ2を含む基本クレブス溶液中に保存した。ｐＨを１００ミリモルの水酸化ナトリウムで７．４に調整した。
【００８１】
単一細胞を吸引毛細管で選び、直接に細胞検定装置のそれぞれの空のウェルに置くか、あるいは細胞がそれぞれのウェルに到達するまで、流路５に（管１４を経て）吸引した。それから各細胞が前記ガラスの床に沈降するのにまかせた。２００から４００μｍの深さのウェルは、前記流路を通る流体の動きが電気刺激中に細胞から放出される細胞の副産物を洗い流す一方、筋細胞がウェルから洗い出されるのを防止するのに十分であった。ウェル内の蒸発または吸収された流体を、前記流路を経て置換することも可能である
【００８２】
続いて、カルシウムの流れ（カルシウムに感受性のある色素の発光の際の変化から分かる）と細胞刺激（細胞の短縮から分かる）とを関係付けるために、細胞を含む前記ウェルを高開口数×４０油浸漬レンズ２１（図２に図示）および蛍光顕微鏡で観察した。これらの技法を以下に詳細に記す。図４は、前記ウェルのひとつにおける筋細胞を示す。
【００８３】
（カルシウムの流れの評価）
膜透過エステル誘導体（アセトオキシメチルエステル）として、心臓の筋細胞にカルシウムに感受性のある色素フラ−２を導入した。細胞内で一度、脂肪親和性の残渣は、蛍光色素を活性化するように細胞内エステラーゼにより切断される。
【００８４】
ツアイスアキシオスコープ（商標）正立蛍光顕微鏡上に搭載した単色光分光器（ＴＩＬＬフォトニックス（商標））を使用して、細胞内蛍光色素を１００ミリ秒毎に３４０と３８０ｎｍで励起した。発光を４７０ｎｍの２色性ミラーと５１０ｎｍのガラスフィルターを介して、冷却したＣＣＤ（電荷結合素子）カメラのＣＣＤチップを通過させた。励起光の強度を中性密度フィルター（ＯＤ（光学密度）＝２）により調整した。細胞（細胞質や核質）内の異なる領域における両方の波長で前記発光を評価すると共に、カルシウムの細胞内濃度（[Ca2+]i）を前記３４０／３８０比で表示した。
【００８５】
電場で刺激されて自発的に鼓動している心臓における[Ca2+]i空間情報を、色コード化した３４０／３８０比画像上で検出した。細胞外のｐＨに感受性のあるフルオレセイン色素を１０ミリ秒毎に４９０ｎｍで励起し（線走査）、発光を２色ミラーと５２０ｎｍの障壁フィルターを介して、前記カメラを通過させた。
【００８６】
（細胞長の評価）
分離された心臓の筋細胞を赤外光で照明し、電場で刺激された収縮を黒白ＣＣＤカメラ（１２ビットで毎秒１０こま）でパソコンのハードディスクに記録した。細胞長の変化を細胞の長軸の変化としてデジタル動画上で測定し、時間に対してプロットした。細胞の外形を定義するために、付与シーケンスの灰色の明るさのこまにおいて、細胞外の空間を黒色にすると共に、細胞内の空間を白色にするように２値化した。比較として、収縮する細胞の動いている端を手で印をつけると共に、細胞端における目印と細胞中央の目印間の距離の変化を自動的に測定した。
【００８７】
（細胞刺激）
はじめに、変化する強度（２０から３００Ｖ／ｃｍ）で６ミリ秒続く単極性パルスを、変化する周波数（０．５から２．０Ｈｚ）で刺激用電極に伝達した。パルス発生器（デジタイマー（商標））を関数発生器で始動すると共に、刺激用電極上の電流において、細胞収縮の興奮に対する閾値を微小電極の構成と表面および電場における細胞の配向性に関係付けるために記録した。前記電極を再分極化させるために、比較できる強度と持続時間を有する対称の２極性パルスを含む刺激手順を、細胞興奮用の国産パルス発生器により伝達した。
【００８８】
（結果）
細胞長の可視化から分かるように、直接の場刺激（ペーシング）のために刺激用電極を使用するか、あるいはＣａ2+の洩れが細胞に入るのを可能とするために、筋細胞膜をエレクトロポーレーションするように刺激用電極を使用する。エレクトロポーレーションは、細胞長に沿って前後に行き交う高 [Ｃａ2+]iの波に随伴する自発的な波を引き起こす。
【００８９】
図５は、分離された微小滴においてペーシングされた筋細胞の収縮時間的経過を示す（すなわち、流路によって補給されていない微小滴）。約３分後に突然拍動が停止したのは、刺激用電極（この場合はメッキなし）の表面における水の加水分解によって誘発された細胞外のｐＨの低下によるものであった。続いて、電極間の電位は、２．０Ｖから２．２、２．５そして３．０Ｖへ上昇した。しかし、この電位の各増加は、減少する振幅の拍動をさらにいくつか引き起こすのみであった。このことは、細胞外のｐＨを一定に維持することの重要性を証明するものである。と言うのは、細胞が酸溶液に浸されている場合には、細胞の電気興奮性は大いに減少するからである。
【００９０】
分離された微小滴の酸性化を証明するために、本発明者はフルオレセインで細胞外のｐＨを観測した。図６は、０．２１から４．４７Ｖ／１００μｍまで上昇するピーク場強度に対し、対時間で陽極から１０μｍの距離で評価したフルオレセインの発光（Ｆ／Ｆ0比で表示、ここでＦは実験の間中に記録された蛍光であり、Ｆ0は時間＝０での蛍光である）を示す。図中の矢印は、電圧パルス化が開始した時を示す（パルス幅６ミリ秒、周波数０．６Ｈｚ）。
【００９１】
ｐＨ５．５から７．０の間におけるタンパク質分解酸の主要な種類は、ジおよびモノアニオンである。しかし、ジアニオンのみが４９０ｎｍ光で励起時に、高収率（０．９）で光を発する。モノからジアニオンへの遷移に要する６．７の弱酸の解離定数の逆数の常用対数（ｐＫａ）は、発光の減少がｐＨ７から６の範囲においてｐＨの低下と相関があることを可能にする。
【００９２】
ピーク電場が強度で０．２１Ｖ／１００μｍ（つまり、１０．５Ｖ／ｃｍ）から４．４７Ｖ／１００μｍ（２２３．５Ｖ／ｃｍ）に上昇するにつれ、測定されるｐＨが恒常的に低下した（すなわち、溶液は酸性化した）。高電圧では、パルス瞬時過渡現象（スパイク）が重なった。
【００９３】
図６と同じ実験配置に対して、５．３Ｖ／ｃｍのピーク場強度に対し、対時間で陽極から１０から６０μｍの距離で評価したフルオレセインの発光（Ｆ／Ｆ0比で表示）を示す。前記陽極からの距離（Ｈ+源）によりスパイクの高さは減少した。
【００９４】
このように細胞外のｐＨは、１Ｖ／１００μｍ以下（しかしながら、ペーシングが発生するのに十分強い値である）のピーク場強度におけるテスト溶液では、単に変化しないでいた。このことは、連続したペーシングには十分高く、電気分解には十分低い電圧範囲において刺激用電極を動作させる重要性を示すものである。しかしながら、上述したように、電極上に好適なメッキを施すことにより、前記範囲の高電圧端を拡大することが可能である。
【００９５】
図８は、約６分後に拍動が止むまで０．９Ｖ／１００μｍのパルス振幅電場で刺激した、分離された微小滴中の細胞に対する時間的経過を示す。収縮は、時間に亘って低下する振幅を示したが、図５の細胞外のｐＨ低下で見られたような突然の停止を示さなかった。本発明者は、振幅の収縮の緩やかな減少は、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の可逆不可な消費により引き起こされると信じている。それゆえ、このことは、流路により栄養分を補充すると共に、老廃物を除去することの重要性を証明している。
【００９６】
異なる細胞の区画間における[Ｃａ2+]i循環についての情報を得るために、本発明者は、室温でペーシングされたフラ−２が負荷された細胞の発光を観測した。ペーシング経過中の細胞に影響を与えないために、細胞の微小滴におけるｐＨおよび栄養変化を十分に小さいことを確実にするように事前の注意を払った。周波数０．６Ｈｚでピーク振幅９Ｖ/１００μｍ、持続時間６ミリ秒でペーシングを与えると共に、３秒の興奮期間に対してペーシングを継続した。
【００９７】
図９は、興奮期間の以前、その期間およびそれ以後の[Ｃａ2+]iにおける色コード化された変化を示す。休止時（ｔ＝０、時間ゼロ（ｔ0））において蛍光色素は、細胞質内にほぼ均一に分布している。しかし、細胞質の濃度は２つの核で濃化するが、両方の細胞端で減少する。長手構造への親和性が、より高く観察される場合がある。興奮期間の開始後０．１秒において、[Ｃａ2+]iは両方の細胞端で高[Ｃａ2+]iを有すると共に、当該細胞の長軸に垂直に交互に１０μｍ幅のいくつかの帯で高と低の[Ｃａ2+]iを有して、不均一に上昇した。
【００９８】
心室の筋細胞の興奮中に取った共焦点線走査画像は、[Ｃａ2+]i変化の同様なパターンを示す。心臓の筋肉細胞において、作用電位と収縮（興奮―収縮結合、つまり、Ｅ−Ｃ結合）間における堅固な結合は、分化した細胞内のＣａ2+貯蔵区画、つまり、筋小胞体（ＳＲ）により調整される。貯蔵されたＣａ2+は、筋細胞膜の脱分極化中に自身活性化される電圧に感受性のあるＣａ2+チャネルを通り、細胞質ゾルを入れる細胞外のＣａ2+により活性化されたＣａ2+放出チャネル（リャノダインに感受性のあるＣａ2+チャネル）を通って、細胞小器官から離れる。放出されたＣａ2+は、筋細胞の短縮化（収縮期）を開始するように、収縮性の単繊維を活性化する。ＳＲ膜に常駐しているＣａ2+をポンプで送り込む分子（ＳＥＲＣＡポンプ）による再取り込みは、次の作用電位が別のＣａ2+サイクルを開始するまで、単繊維が弛緩できるように（弛緩期）、細胞質ゾルをＣａ2+から除去する。
【００９９】
図９に示す電気刺激後の最初のミリ秒以内における[Ｃａ2+]iの不均一な上昇は、細胞全体の同期した収縮を確保するように、[Ｃａ2+] iの全体的に均一な上昇を、雪崩のように時間により合計する起爆部位（Ｃａ2+スパーク）を多分示している。調整されたＣａ2+の放出の失敗は、いくつかの不整脈に対する分子上の根拠であり、そしてＥ−Ｃ結合に関与する分子は、医薬品の候補がこの種の不整脈により引き起こされる心臓病を治療するための標的である。
【０１００】
興奮期間の開始後０．２秒で、この帯は消えると共に、核のひとつは細胞質ゾルの大部分と比較して高い[Ｃａ2+] iを示した。
【０１０１】
長手構造において濃化した蛍光色素の発光変化は、この構造間で上記に従った。ここでの明度差は、[Ｃａ2+] iにおける差に起因するものではないが、細胞内構成物に対する蛍光色素の高い親和性により引き起こされる人工物に起因する。３.４秒において（つまり、興奮期間終了後０.４秒）、前記[Ｃａ2+] iはｔ0（休息）水準に到達した。
【０１０２】
図１０は、細胞の左核および中央（図９において正方形１および２で表示）における[Ｃａ2+]iの各時間的経過を細胞の左端の収縮の時間的経過と共に示す。収縮の開始は、[Ｃａ2+]iの最初の可視上昇より約１００ミリ秒遅く、その遅れは、高い温度で減少する可能性がある。
【０１０３】
これらの結果は、本発明の細胞検定装置を使用して、細胞から有益な測定を得ることが可能であることを示す。
【０１０４】
特に、精巧な光学顕微鏡と結合して実施した本画像システムの空間および時間における高解像度によれば、本発明の装置において電気シミュレーション中に個々の生細胞における前記[Ｃａ2+]iの変化の検定を光学的に実施することが可能になる。興奮可能な細胞における作用電位と[Ｃａ2+]iの上昇とが堅固に結びついてるため、誘発された一時的なＣａ2+の時間的経過および振幅は、潜在する作用電位に対応するパラメータに対して信頼の置ける指標である。このようにして、本発明の装置によれば、異なる刺激手順への細胞膜内のイオンチャネル活性の反応を明らかにすることが可能になる。前記パルス発生器においては、前記パルス振幅やパルス周波数やパルス幅を自動的に上昇または低下させるか、個々のパルス間あるいは単極または２極（対称または非対称）パルス間でパルスの極性を自動的に変化させて、手順を実行するプログラムを備えるのが好ましい。
【０１０５】
本発明の装置によれば、先に述べた刺激手順に応じて分子プローブ（Direction-8-ANEPPSまたはRH-237）のような電位に感受性のある色素により、膜電位変化を直接に検出することも可能になる。
【０１０６】
例えば、ブドウ糖欠乏の断続的な期間への細胞反応が調査可能なように、前記流路により刺激を受けた細胞の代謝状態を変更することが可能である。
【実施例２】
【０１０７】
（装置の組立）
細胞内または細胞外の蛍光並びに油や水浸漬レンズ（これにより、高開口数のレンズの使用および３００μｍ厚さまでの低作動距離が可能）により細胞形態の記録を可能にするように、顕微鏡カバー片（２０×４０ｍｍ、厚さＮｏ．１：０．１３から０．１７ｍｍ）を基板として使用した。本発明の装置の微小組立工程を図１１の（ａ）と（ｂ）に模式的に示す。
【０１０８】
微小電極およびμｍ大の細長い室（つまり、閉じ込め空洞）の壁に対するパターンを、オートキャドを使用して両方とも設計し、フィリップス社の電子ビームライターを使用して、２つのクロムメッキをしたマスクプレートとして形成した。フォトリソグラフィ的に微小電極の配列をパターン化するために、カバー片（図１１（ａ）（ｉ））を、先ず毎分４０００回転で薄いポジ型フォトレジストＳ１８１８でスピンコートし、クロロベンゼン中ですぐに１５分加熱して３０分間９０℃炉内で焼き、それから適宜なフォトマスク（図１１（ａ）（ｉｉ））を介して紫外線に曝した。次に、１０ｎｍ厚さのチタンの接着層を逐次電子ビームアシスト蒸着および１００ｎｍ厚さの電気的に安定な金のオーバーレイ層により、微小電極配列を形成した（図１１（ａ）（ｉｖ））。露出されていない金属メッキされた感光性樹脂を除去することにより、微小電極構造を実現した（図１１（ａ）（ｖ））。正立光顕微鏡上の倍率２０倍のレンズを使用して、金属パターン品質の目視検査を行った。
【０１０９】
続いて、微小室の壁を決める共に、図１１の（ｂ）に模式的に示すように生成されたリソグラフィ的に形成されているＰＤＭＳ上構造で、前記微小電極を修正した。先ず、９０℃にて炉内で３０分間焼かれる１０μｍ厚さまでのフォトレジスト層を形成するように、毎分１３００回転でポジ型レジスト（ＡＺ４５６２）を回転した。このフォトレジストの厚さは前記室の深さを決めた。前記適宜なフォトマスクを、マスク露光装置上の微小電極に一直線に並べ、前記パターンをフォトレジストに転写した（図１１（ｂ）（ｉｉ））。現像後、ＰＤＭＳをトルエンで１対４に希釈した液により、毎分１万回転で前記配列をスピンコートし、このＰＤＭＳを養生するために１２０℃にて炉内で約２分間焼いた（図１１（ｂ）（ｉｖ））。これによりこのＰＤＭＳは、種フォトレジストに成型され、全組立品をアセトン中で十分に洗浄した。この後半の段階で、室壁および微小電極の表面から、残渣レジストを全て除去した。フォトレジストの助けがなければ、室を覆うＰＤＭＳの薄膜は崩れると共に、容易に洗い流された。電極全体を覆うこのＰＤＭＳ膜は、こぼれた緩衝液による接続取り出し線の短絡を回避するための絶縁層として役立った。
【０１１０】
微小室を水の緩衝溶液で満たすために、前記ＰＤＭＳの疎水性表面をエタノールで濡らし、エタノールを徐々に水で置換した。前記室を適宜な緩衝液で満たした後、蒸発を避けるために３００μｍ厚さの鉱物油層で、この室を覆った。
【０１１１】
次に、実験１の図１の（ｂ）に関係して、上記したような方法で１枚のＰＣＢにパターン化した基板を接続した。
【０１１２】
図１２の（ａ）は、パターン化工程により形成された微小配列の模式図であり、ガラス片３１、金電極３２、ＰＤＭＳ室側壁３３および鉱物油３４を示す。
【０１１３】
（心臓の筋細胞分離）
これは、実験１に関係して、上記したように実施した。
【０１１４】
（筋細胞の選定と設置）
細胞懸濁液において、個々の大人の心室筋細胞を白金電極で０.５Ｈｚにて場刺激し、いくつかの基準のもとで微小配列に移した。この基準とは、つまり、前記筋細胞は規則的で均一な短縮により低振幅刺激（５Ｖ／ｃｍ）に忠実に反応していること、前記筋細胞は介在板領域において損傷の明らかな痕がなく、規則的でかつ明確に決まった縞パターンを有すると共に、幅２０から３０μｍで長さ１４０から１８０μｍであること、である。始めに、注射ポンプに接続した毛細管により、前記微小配列の先端上の微小滴に細胞をピペットで入れ、この細胞の長軸を細長い微小室にほぼ平行に並べた。疎水性のＰＤＭＳ表面から過剰の流体を除去することにより、筋細胞を電極間の前記室へ導いた。図１２の(ｂ)は、微小配列の室３６中に配置されると共に、微小電極３２に並べられた筋細胞３５を有する微小配列の顕微鏡写真を示す。
【０１１５】
（微小配列の構成）
電気的に心室の筋細胞を刺激するために要する場強度において報告されたものは、５から５０Ｖ／ｃｍの範囲である（P. A. Gomes, R. A. BassaniおよびJ. W. M. Bassani, 2001年, Electric field stimulation of cardiac myocytes during postnatal development, IEEE Transaction on Biomedical Engineering, 48, 630-636頁）。しかしながら、約１Ｖ以上の電圧使用は、電圧近傍における局所電気分解につながると共に、結果的に浸漬溶液のｐＨを変化させるイオンの種類を発生させる。本発明の実験においては、平均寸法の心室の筋細胞（ほぼ、長さ１６０μｍ、幅２５μｍおよび高さ５μｍ）を２つの電極間に配置することが可能なように、電極を配置した。例えば、２００μｍ離れて配置された２つの微小電極を横断する０．５Ｖの電圧を印加することにより、各筋細胞を横断して２５Ｖ/ｃｍの場を直ちに実現することが可能である。
【０１１６】
先の報告は、筋細胞の長さに対して直交するより、むしろ平行に配向する場合に、電場が収縮を誘発するのに有効であることを示唆している（L. Tung, N. SlizおよびM. R. Mulligan, 1991年, Influence of electrical axis of stimulation on excitation of cardiac muscle cells, Circ. Res., 69, 722-730頁, およびS. B. Kinisley およびA. O. Grant, 1995年, Asymetrical electrically induced injury of rabbit ventricular myocytes, J. Mol. Cell, Cardiol., 27, 1111-1122頁）。このように、細長い室に平行に配向した場を発生させるために、長手の室壁間において隙間を横断するように電極を形成した（図１２の（ａ）および（ｂ）参照）。共通の基準電極として、前記配列の中央を横切る幅６０μｍの中央金電極を使用した。
【０１１７】
刺激用電極を前記基準電極の両側に組立て、２つの単一筋細胞の配置を中央の電極のどちらかの側において可能とするように、刺激用電極と基準電極の間隔をあけた。この配置は、筋細胞の大きな配列を刺激するように、再現することが可能であった。前記基準電圧は全ての室に共通であるのに対して、刺激の異なる場強度かつ／または周波数で個々の細胞を逐次刺激することを可能にするために、周辺の刺激用電極は各々アドレス可能とした。
【０１１８】
各刺激用電極と基準電極との隙間は２００μｍであり、この値は、場刺激に対する印加電位を最小化しながら、単一細胞検定に対する活動領域を提供するために十分大きかった。前記刺激用電極は、幅４０μｍ、長さ２０μｍおよび高さ１００ｎｍの寸法を有していた。このように、各刺激用電極の活性表面積は８００μｍ2であった。
【０１１９】
前記電極間の導電性容積を最小化することにより、場刺激に対する条件をさらに最適化した。この目的のため、室の高さを１０μｍかつ幅を４０μｍ、つまり、分離した大人の心臓の筋細胞の寸法よりただわずかに大きい寸法に制限した。制限された細胞外の空間は、前記電極間におけるイオン電流の流れを制限した。平均寸法の筋細胞が占める容積は約２０ピコリットルであった。
【０１２０】
２つの室容積で微小配列を形成した。各刺激用電極に近接すると共に前記中央の基準電極上方にＰＤＭＳの端壁を形成することにより、１００ピコリットルの室を生じさせた。図１１および１２には示していないが、側壁のように、前記端壁を同時に形成した。この端壁は流体の流失を防ぐように各室を密封した。
【０１２１】
前記端壁を省略することにより５ナノリットルの室を生じさせた。前記側壁は刺激用電極を越えて２ｍｍ延びたので、このことは極めて大きな室容積を付与した。
【０１２２】
刺激用電極と異なる空間に前記端壁を単に配置することにより、中間の室容積を生じさせることが可能になった。
【０１２３】
（光学顕微鏡法）
イオノプティックス（Milton, MA, USA）の蛍光―収縮性システムを使用して、同時に筋節長および細胞内Ｃａ2+濃度を観測した。２０マイクロモルのフルオ−３ＡＭ溶液（分子プローブ）中で３０分間培養することにより、心室の筋細胞にフルオ−３を搭載した。×６３シーアポクロマート水浸漬レンズ（開口数１．２）を備えたツアイス  アクシオバート２００（ツアイス社、ゲッティンゲン、ドイツ）に搭載されたＴＩＬＬ単色光分光器（T.I.L.L.社、マーチンスリード、ドイツ）により、５０５ｎｍで内部色素を励起した。５１０―２色性のミラーおよび５１５帯域通過フィルター（オメガオプティカル社、ブラットルボロ、バーモント州、米国）を介して、フルオ−３の発光をＰＭＴ（光電管）に向けた。６８０ｎｍの帯域通過フィルターにより透過したハロゲンランプの赤色光を、筋節長を記録するようにＣＣＤカメラに向けた。ＰＭＴおよびカメラの信号をイオンウイザードバージョン５．０ソフトウェアによりオンラインで表示し、さらなる評価のために保存した。場刺激中に細胞外のｐＨでの起こり得る変化を測定するために、槽に１０マイクロモルのＢＣＥＣＦ（フルオレセイン誘導体：分子プローブ）を添加し、フルオ−３用のように設定された同じフィルターを使用して、発光を記録した。漂白を避けるために、２００ミリ秒毎に５ミリ秒間５０５ｎｍでＢＣＥＣＦを励起した。両色素に対する励起光の強度を中性密度フィルター（ＯＤ＝２）により調整した。
【０１２４】
（共焦点顕微鏡法）
６０×蛍光の水浸漬対物レンズ（開口数：１．２）を使用して、ニコン倒立顕微鏡（エクリプス）に搭載されたバイオラドレイディアンス２０００共焦点スキャナー上に、細胞内フルオ−３の共焦点線走査画像を記録した。筋細胞の長軸に平行に走査線を向けて、発光を５００Ｈｚで記録した。線走査画像上にパルスの到達の印をつけるために、刺激用パルスの２５ミリ秒前に前記顕微鏡の光学路に並べられた持続時間２ミリ秒のＬＥＤ（発光ダイオード）閃光を始動した。
【０１２５】
微小室中の心室の筋細胞の容積を調査するために、別個の共焦点画像測定を実施した。同じ顕微鏡にｚ−積層（０.５μｍ間隔）を記録した。Ｃａ2+が飽和したフルオ−３を槽に添加し、７００ｍＷのミラレーザシステム（コーヒラントレーザズ社、米国）を使用して、細胞外の色素を８１０ｎｍで励起した。前記筋細胞の３次元図を構築すると共に、フイゲンスのソフトウェア（ビットプレイン、スイス）を利用して微小室中の細胞外の容積を計算するために、ｚ−積層を使用した。
【０１２６】
（電気刺激）
前記電極を横断して対称の２相矩形パルスを発生させた。各相において、振幅、持続時間、極性、周波数および前記２相間の遅れを個別に制御した。２０メガＨｚの４チャネル収集カード（ＰＣＩ−９８１２、アドリンク、台湾）に対応する電圧並びに一方の電極の電流応答を読み込むために、電圧―電流変換器を使用した。各パルス到達をオフライン事象の平均化用の蛍光痕跡上に印をつけるために、前記２相パルスに同期するＴＴＬ（トランジスタ−トランジスタ論理回路）信号をＰＭＴ電流読取器に供給した。微小室を電解液（緩衝液）で充満した後、心臓の筋細胞の添加に先立って、各室における微小電極間のイオン接続を確実にするように、個別の刺激用電極に誘発された電流を観測した。当該微小室に加えられた真の電荷の総量および電極表面の分極化の尺度を与えるために、測定された電流を積分した。
【０１２７】
非常に小さな室容積だと仮定すると、当該電極表面上で発生した電気分解生成物（例えば、Ａｕ+やＨ+）は、時間と共に急速に堆積する。Ｈ+イオンの堆積を調べるために、ｐＨに感受性のある色素ＢＣＥＣＦ（２０マイクロモル）を含有する１マイクロモルのＨＥＰＥＳ（４−２水酸化エチル１−ピペラジンエタンスルフォン酸）で緩衝された１００ピコリットルの前記電解液で、前記室を充満した。持続時間２ミリ秒で０．５Ｖ（２５Ｖ／ｃｍ）から２．５Ｖ（１２５Ｖ／ｃｍ）間の振幅の単極矩形パルスを１．５Ｈｚで前記統合電極に印加した。図１３に示すように、理論的に予知された閾値以上の電圧において、ｐＨは急速に低下するのが観察されたが、加水分解に対する理論上の閾値に近い刺激電圧（０．４Ｖ、つまり２０Ｖ／ｃｍ）を使用した場合には、ｐＨは変化しなかった。電極間距離２００μｍを横断して２．０Ｖ超え（１００Ｖ／ｃｍ）の振幅でパルスを与えた場合には、１．５Ｈｚで１０分の継続的なパルス付与内でｐＨは定常状態に達し、パルス停止後に元に戻らなかった。実験中、泡発生またはｐＨに依存した金の溶解の兆候は観察されなかった。平均長１６０μｍまでの単一の心臓の筋細胞において、安定なＣａ2+遷移物を生じさせないために必要な平均場強度は、２７Ｖ／ｃｍ±１０Ｖ／ｃｍであった。これは電気分解（４０Ｖ／ｃｍ超え）に必要な場強度より十分に低かった。これは、心臓の筋細胞膜をエレクトロポーレーション（筋細胞膜に結果として起こる不可逆な破壊、内部へのＣａ2+洩れおよび超拘縮を伴う）するために必要な５０Ｖ／ｃｍ超えの場強度未満でもあった。
【０１２８】
（筋細胞の同期活性化）
異なる刺激物プロファイルにおける閾値刺激電流を比較することにより、パルスの形態を最適化した。作用電位の「有るか無しか」の応答は、前記パルスの振幅を次第に増加させることにより、閾値を超えた刺激に対する限界を同定するのに役立った。電圧に感受性のある色素ジ−８−アネップスにより直接的、あるいはＣａ2+遷移物または細胞短縮を記録することにより間接的に、前記作用電位を測定した。最適化されたパルスプロファイルは、持続時間２ミリ秒で相あたり振幅０．５Ｖを有する対称な２相矩形刺激物を含む。前記電極間を通過する定常状態電流は、２ナノアンペア未満であり、電極の分極化は無視可能であった。
【０１２９】
図１４は、代表的なシミュレーションおよび応答の推移を示す。上の推移は前記刺激用電極の一方上に記録された電流スパイク列を示す。下の推移は閾値を超える刺激後にのみ発生する同時発生する分子内Ｃａ2+遷移物を示す。最初のＣａ2+遷移物が発生するまで前記刺激物の振幅を増加させた。囲み図は、対応する電圧および帯電プロファイルと共に、拡大した時間尺における興奮の開始前の最後の電流スパイクを示す。Ｃａ2+に感受性のある色素フルオ−３でＣａ2+遷移物を記録した。
【０１３０】
興奮−収縮結合に関係した細胞内のＣａ2+の流れをさらに特徴付けるために、電気刺激されたＣａ2+遷移物を空間および時間の高解像度で、共焦点的に記録した。前記フルオ−３を搭載した細胞を微小室に置いた。共焦点線走査画像上に刺激用パルスの到達に印をつけるために、前もって２５ミリ秒間刺激用パルスに２ミリ秒のＬＥＤ閃光を始動するための事前パルスを加えた。細胞を０.５Ｈｚで刺激した。代表的な遷移物は、微小電極で電気刺激を加えた際に[Ｃａ2+]iの均一な上昇を示す図１５に与えられている。図１５に関係して、２相刺激物とペーシングされたフルオ−３（挿入図で図示）を搭載した細胞の長軸に、共焦点走査線を揃えた。得られた線走査画像は、興奮直後に[Ｃａ2+]iの均一な上昇を示す。前記[Ｃａ2+]iの上昇およびＣａ2+除去後の弛緩に応じた細胞短縮に注意されたい。１０μｍ幅の帯（図示）における蛍光プロファイル（太線）を、刺激装置電圧プロファイル（細線）と共に、時間に対してプロットした。
【０１３１】
細胞の長軸に沿った走査で明らかになったように、[Ｃａ2+]iの瞬時の均一な上昇は、大人の心室の筋細胞の両端における短縮化を誘発した。１走査当たり２ミリ秒の時間解像度において、刺激物の始動段階の同定は可能にならなかった（刺激の導通あるいは遮断）。５００オーム／ｃｍの細胞内／外の固有抵抗（S. Weidmann, 1970年, Electrical constants of trabecular muscle from mammalian heart, J. Physiol. 210, 1041-1054頁）および１マイクロファラッド／ｃｍ2の膜静電容量を仮定すると、たぶん数マイクロ秒で細胞膜の帯電は生じる。
【０１３２】
（刺激延長）
容積５ナノリットルおよび１００ピコリットルの微小室中で、大人の心室の筋細胞を継続的に刺激した。１Ｈｚで刺激された心臓の筋細胞からの筋節長の変化として、筋細胞の収縮性を測定した（１９から２１℃）。図１６の（ａ）は、図示した連続記録からの単一の遷移物である５ナノリットル室中で刺激された筋細胞から、相対的な筋節長を重ね合わせた記録を示す。右手側の値は定常状態の短縮の進展からの期間である。図１６(ｂ)は、１００ピコリットル室中で刺激された筋細胞に対する対応する記録を示す。５ナノリットル室中においては、細胞短縮の振幅は、継続的な刺激の間に少しだけ減少した（図１６の（ａ）参照）。しかしながら、制限された１００ピコリットル容積の室中においては、細胞短縮は６０分の継続的なペーシング後に止み、緩衝液の更新後に部分的に回復した（図１６の（ｂ）参照）。この２つの条件下における平均減少を表１に示す。
【０１３３】
【表１】
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【０１３４】
別個の実験において、制限された１００ピコリットルの容積の室中で継続的にペーシングされた大人の心室のフルオ−３で負荷した筋細胞から、Ｃａ2+遷移物を測定した。図１７の（ａ）は、度を上げたＣＣＤカメラで、５０Ｈｚにて記録した遷移物により引き起こされた蛍光を示す。５分間（＊印）、１０分間（＊＊印）または２０分間（＊＊＊印）、０．５Ｈｚ（白抜きの帯状線）および１．０Ｈｚ（黒塗りの帯状線）の交流周波数で、前記筋細胞を電気刺激した。心臓拡張の[Ｃａ2+]i信号は、ほとんど瞬時に、高周波数で高水準に適応したのに対して、Ｃａ2+の遷移物のピークは、前記高周波数において最初の５つの拍動後に定常状態に達した。低周波数に戻すと、前記心臓拡張の水準は低値に戻った。前記Ｃａ2+信号の振幅は、６０分までの刺激に亘ってゆっくりと減少した。この減少は、短縮信号の減衰未満であった（図１６の（ａ）および表１参照）。これは細胞内Ｃａ2+の減少を表す一方、色素漂白または色素損失／金属イオン封鎖が寄与している可能性もある。
【０１３５】
同様の反応は、細胞内のＡＴＰ欠乏を誘起するミトコンドリアの脱共役剤である１マイクロモルのＦＣＣＰ（トリフルオロカルボニルシアナイドフェニルヒドラゾン）の存在下で、ペーシングされた細胞中において観察された（図１７の(ｂ)参照）。０.５Ｈｚおよび１．０Ｈｚ（矢印部参照）の交流周波数で５０分継続的に刺激後において、細胞は、普通の振幅のＣａ2+遷移物によるひとつの刺激物にも、もはや反応しなかった。１０分後（矢の頭部参照）に、０.５Ｈｚで誘発されたＣａ2+遷移物は、ほぼ完全に消滅した。
【０１３６】
ＦＣＣＰを洗い流して緩衝液を交換した後に、低周波数のＣａ2+波が観察された（図１７の(ｂ)参照）。連続刺激間における５分間の休息期間後に、前記細胞は、筋細胞膜の完全性を示して興奮性を取り戻した。
【０１３７】
いずれにしても、連続刺激中における興奮性の喪失は、細胞外の酸性化によるというよりも、むしろ細胞の副生成物が細胞内外の空間に堆積することにより引き起こされたと思われる（図１３参照）。
【０１３８】
要約すると、前記実験は、配列形式において制限された容積以内で分離された細胞を刺激することの実施の可能性を例証するものである。
【０１３９】
本発明は、上述した例示の実施形態と合わせて記述されているが、この開示がなされた場合、当業者には多くの等価的な修正や変更は明らかである。従って、上述の本発明において示した実施形態は、例示したものであり、何ら限定するものではない。前記実施形態の種々の変更は、本発明の考えおよび範囲から逸脱しない限りにおいて可能である。
以上述べた開示内容は、参考として示したものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】（ａ）は、模式的に（ｂ）に示す重合体シート（例えば、ＰＤＭＳ）を形成するために使用されるＳＵ−８種型を示す図であり、（ｂ）もＰＤＭＳシートにスルーホールで配列された電極線を有するカバー片を模式的に示す図である。
【図２】（ａ）および（ｂ）は、組み立てた装置の実際の平面図と模式的な側面図をそれぞれ示す図である。
【図３】図２の（ａ）および（ｂ）の装置の細胞閉じ込め用空洞を通る模式的な断面図を示す図である。
【図４】図１の（ｂ）のＰＤＭシートにおけるスルーホールのひとつにより形成されたウェル内の筋細胞を顕微鏡で観察したものを示す図である。
【図５】分離された微小滴においてペーシングされた筋細胞の収縮時間的経過を示す図である。
【図６】図５の筋細胞に対して０．２１から４．４７Ｖ/１００μｍまで上昇するピーク場強度に対し、対時間で陽極から１０μｍの距離で評価したフルオレセイン発光（Ｆ／Ｆ0比で表示）を示し、電圧を上げると局所ｐＨが変化することを証明する図である。
【図７】図６と同じ実験配置に対して、５．３Ｖ/ｃｍのピーク場強度に対し、対時間で陽極から１０から６０μｍの距離で評価したフルオレセイン発光（Ｆ／Ｆ0比で表示）を示し、電圧を上げると局所ｐＨが変化することを証明する図である。
【図８】約６分後に拍動が止むまで０．９Ｖ／１００μｍのパルス振幅電場で刺激した、分離された微小滴中の細胞に対する時間的経過を示す図である。
【図９】細胞のペーシングが１００μｍの電極分離を横切る０．９Ｖのピーク振幅パルスにより与えられる３秒の興奮期間の以前、その期間およびそれ以後の[Ｃａ2+]iにおける色コード化された変化を示し、前記パルスは周波数０．６Ｈｚで６ミリ秒間継続する図である。
【図１０】図９の実験配置に対して、細胞の左核および中央（図９において正方形１および２で表示）における[Ｃａ2+]iのそれぞれの時間的経過を、細胞の左端の収縮の時間的経過と共に示す図である。
【図１１】（ａ）および（ｂ）は、別の装置に対する微小組立工程を模式的に示す図である。
【図１２】（ａ）は、図１１の（ａ）および（ｂ）の工程により形成したパターン化している微小配列の模式図であり、（ｂ）は微小配列の室に配置された筋細胞を有する微小配列の顕微鏡写真を示す。
【図１３】図１２の（ａ）および（ｂ）の微小配列のひとつの室に含まれる電解液に対して、表示した場強度における対時間のＢＣＥＣＦの蛍光性のプロットを示す図である。
【図１４】図１２の（ａ）および（ｂ）の微小配列のひとつの室に含まれる筋細胞に対する代表的なシミュレーション（上側）および反応（下側）の推移を示す図である。
【図１５】単一パルス時に対する高解像度電圧（細線）および蛍光性（太線）の推移を示す図である。
【図１６】（ａ）および（ｂ）は、５ナノリットル室と１００ピコリットル室において刺激された筋細胞から、それぞれ相対的な筋節の長さを重ね合わせた記録を示す図である。
【図１７】（ａ）は、５分間（＊印）、１０分間（＊＊印）または２０分間（＊＊＊印）、０．５Ｈｚ（白抜きの帯状線）および１．０Ｈｚ（黒塗りの帯状線）の交流周波数で電気的に刺激された筋細胞から、Ｃａ2+遷移物により生じた蛍光性を示す図であり、（ｂ）は、１μｍのＦＣＣＰの存在時に刺激された筋細胞に対して、対応する蛍光性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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