(57)【要約】生物学的試料からの所望のあるいは望ましくない集団またはサブ集団を分離する方法、装置および組成物を本明細書中に開示する。選択手順は、約０．８ないし約１．２ミクロンの間を変動する好ましいサイズの強磁性、高密度粒子に基づく。標的集団またはサブ集団上の特異的な分子を認識し、それに結合する粒子に、特異的な結合剤は結合し、該粒子は試料に相対的に粒子の動きを促進するように、試料と混合され、試料中の非標的集団に非特異的に結合することなしに、標的集団またはサブ集団への結合を促進する。大きい粒子密度のため、結合集団は、重力によって、液体試料から分離される。代わりに、結合、標的集団を含む試料は、容器壁にわたり均等に分配することによって、すなわち非標的集団の非特異的トラッピングを制限することによって、粒子が試料から分離するように磁場に置く。
2005534306.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料から、細胞または細胞様物質の所定の標的集団またはサブ集団を選択する方法であって：
ａ．該標的集団またはサブ集団に特異的に結合する結合剤がそこに結合した複数の強磁性粒子を供し、該粒子は該粒子による選択を可能にするのに十分に該標的集団とは異なる密度を有し；
ｂ．該粒子が該試料の実質的部分を通過するように、該試料と該粒子を混合して、粒子−標的集団複合体の形成に十分な時間を可能にし；次いで
ｃ．磁場中に該試料を置くことによって、該粒子−標的複合体から、非標的集団またはサブ集団を含む該試料の少なくとも一部を分離することを特徴とする該方法。
【請求項２】
該分離工程が、該粒子を動かせる磁気配置にて、該試料を磁場中に置くことによって達成される請求項１記載の方法。
【請求項３】
封じ込め容器が該試料用に供され、該磁場が、該粒子−標的複合体が該封じ込め容器の壁に沿って、実質的に単一の層として形成することを可能にする該磁気配置にて作り出される請求項２記載の方法。
【請求項４】
消磁することによって、該磁場を除去するさらなる工程を含む請求項２記載の方法。
【請求項５】
該粒子−標的複合体の凝集が緩やかな渦形成を介して克服される請求項２記載の方法。
【請求項６】
該標的集団またはサブ集団が、該緩やかな渦形成を介して、該粒子−標的複合体から放出される請求項２記載の方法。
【請求項７】
該標的集団またはサブ集団の該放出が、マウスＩｇＧとのインキュベーションによって達成される請求項２記載の方法。
【請求項８】
該標的集団またはサブ集団が、該粒子−標的複合体から、当該分野で知られるいずれかの方法によって放出される請求項２記載の方法。
【請求項９】
該標的集団またはサブ集団が、細胞夾雑物または細胞成分を含む細胞様物質である請求項２記載の方法。
【請求項１０】
該標的集団またはサブ集団が、生物学的細胞である請求項２記載の方法。
【請求項１１】
該標的集団またはサブ集団が、ヒト癌細胞、ヒト白血球、ヒト血小板、およびヒト免疫細胞よりなる群のうちの少なくとも１つから選択される請求項２記載の方法。
【請求項１２】
該強磁性金属が、鉄、コバルト、ニッケルおよびその合金よりなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項１３】
該強磁性金属がニッケルである請求項２記載の方法。
【請求項１４】
該粒子が、約５０ナノメートルから該粒子−標的複合体を脱凝集させることができない直径までの直径範囲を有する請求項２記載の方法。
【請求項１５】
該直径が約５００ナノメートルないし約１５００ナノメートルである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該直径が約８００ナノメートルないし約１２００ナノメートルである請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
該粒子が、該標的生体材料より少なくとも２倍の該密度差を有する請求項２記載の方法。
【請求項１８】
該密度が、約７ｇ／ｃｃないし約９ｇ／ｃｃの間である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該密度が約９ｇ／ｃｃである請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
該混合が、該容量が少なくとも０．０１ｍｌである時に、該試料を該粒子と渦処理することによって達成される請求項２記載の方法。
【請求項２１】
該渦処理が、約２秒ないし約４分間である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該混合が、該試料容量が少なくとも０．５ｍｌである時に、該試料を該粒子と回転しながら混転することによって達成される請求項２記載の方法。
【請求項２３】
該混転が、約５回転／分ないし３０回転／分ほどである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該混合時間が約３０秒ないし約２０分の範囲内である請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
該混合時間が約１分ないし約５分である請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
該混合時間が約４分ないし約５分である請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
該磁気配置が、キャビティーを規定して該容器を収容するように配された２ないし６つの永久磁石または電磁石で形成される請求項２記載の方法。
【請求項２８】
該磁気配置が、該キャビティーを規定して該容器を収容するように配された３つの永久磁石で形成された請求項２記載の方法。
【請求項２９】
該磁気配置が、円柱状強磁性ヨーク内に収容される請求項２記載の方法。
【請求項３０】
該試料が、少なくとも約３秒間、該磁場に暴露される請求項２記載の方法。
【請求項３１】
該試料が、約１分ないし約５分間、該磁場に暴露される請求項２記載の方法。
【請求項３２】
該結合剤が、抗体、薬物、ホルモン、成長因子、レクチン、酵素および核酸配列のうちの少なくとも１つである請求項２記載の方法。
【請求項３３】
該結合剤が、細胞表面抗原に特異的に結合する抗体である請求項２記載の方法。
【請求項３４】
該抗体が、該粒子に連結したモノクローナル抗体である請求項２記載の方法。
【請求項３５】
該結合剤が、ビオチン標識され、ストレプトアビジンを介して該粒子に連結される請求項２記載の方法。
【請求項３６】
液体試料からの細胞または細胞様物質の所定の標的集団またはそのサブ集団を選択する方法であって：
ａ．標的集団またはサブ集団に特異的に結合する結合剤がそこに結合された複数の高密度粒子を供し、該粒子は、該粒子による選択を可能にするのに十分に該標的集団とは異なる密度を有し；
ｄ．該粒子が該試料の実質的部分を通過し、粒子−標的複合体の形成に十分な時間を可能にするように、該試料を該粒子と混合し；次いで
ｃ．該試料を沈降させることによって、該粒子−標的複合体から、非標的集団またはサブ集団を含む該試料の少なくとも一部を分離することを特徴とする該方法。
【請求項３７】
該粒子−標的複合体が該非標的集団を含有する該試料から分離される時に、該沈降が完了する請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該粒子−標的複合体に対する重力の効果によって、該沈降が決定される請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該粒子−標的複合体の浮力の効果によって、該沈降が決定される請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
該粒子−標的複合体の遠心の効果によって、該沈降が決定される請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
該標的集団またはサブ集団が、該緩やかな渦形成を介して、該粒子−標的複合体から放出される請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
該標的集団またはサブ集団の該放出が、マウスＩｇＧとのインキュベーションによって達成される請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
該標的集団またはサブ集団が、当該分野で知られるいずれかの方法を介して、該粒子−標的複合体から放出される請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
該標的集団またはサブ集団が、細胞夾雑物または細胞成分を含む細胞様物質である請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
該標的集団またはサブ集団が生物学的細胞である請求項３７記載の方法。
【請求項４６】
該標的集団またはサブ集団が、ヒト癌細胞、ヒト白血球、ヒト血小板、およびヒト免疫細胞よりなる群のうちの少なくとも１つから選択される請求項３７記載の方法。
【請求項４７】
該直径が、約１００ナノメートルないし約１５００ナノメートルである請求項３７記載の方法。
【請求項４８】
該粒子が、該標的生体材料より少なくとも２倍以上の該密度差を有する請求項３７記載の方法。
【請求項４９】
該密度が、約７ｇ／ｃｃおよび約９ｇ／ｃｃの間である請求項３７記載の方法。
【請求項５０】
該密度が約９ｇ／ｃｃである請求項３７記載の方法。
【請求項５１】
該容量が少なくとも０．０１ｍｌである時に、該試料を該粒子と渦処理することによって、該混合が達成される請求項３７記載の方法。
【請求項５２】
該渦処理が約２秒ないし約４分である請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
該試料容量が少なくとも０．５ｍｌである時、該試料を該粒子と回転しながら混転させることによって、該混合が達成される請求項３７記載の方法。
【請求項５４】
該混転が約５回転／分ないし３０回転／分ほどである請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
該混合時間が約３０秒ないし約２０分の範囲内である請求項３７記載の方法。
【請求項５６】
該混合時間が約１分ないし約５分である請求項３７記載の方法。
【請求項５７】
該混合時間が約４分ないし約５分である請求項３７記載の方法。
【請求項５８】
該結合剤が、該抗体、薬物、ホルモン、成長因子、レクチン、酵素および核酸配列のうちの少なくとも１つである請求項３７記載の方法。
【請求項５９】
該結合剤が、該細胞表面抗原に特異的に結合する該抗体である請求項３７記載の方法。
【請求項６０】
該抗体が、該粒子に連結した該モノクローナル抗体である請求項３７記載の方法。
【請求項６１】
該結合剤が、ビオチン標識され、該ストレプトアビジンを介して、該粒子に連結される請求項３７記載の方法。
【請求項６２】
液体試料から、細胞または細胞様物質の所定の標的集団またはそのサブ集団を選択するための粒子の懸濁液であって、
ａ．約５０ナノメートルないし直径約２．５ミクロンのサイズ範囲を有する複数の粒子、ここに該粒子は該粒子による選択を可能にするのに十分に標的集団とは異なる密度差を有し；および
ｂ．該結合剤が該標的集団に特異的に結合するように該粒子に結合した結合剤を含む該懸濁液。
【請求項６３】
該粒子が強磁性物質から形成される請求項６２記載の粒子の懸濁液。
【請求項６４】
該強磁性金属が、鉄、コバルト、ニッケル、およびその合金よりなる群から選択される請求項６３記載の粒子の懸濁液。
【請求項６５】
該強磁性金属がニッケルである請求項６３記載の粒子の懸濁液。
【請求項６６】
該直径が約５００ナノメートルないし約１５００ナノメートルである請求項６２記載の粒子の懸濁液。
【請求項６７】
該直径が約８００ナノメートルないし約１２００ナノメートルである請求項６２記載の粒子の懸濁液。
【請求項６８】
該密度が約７ｇ／ｃｃおよび約９ｇ／ｃｃの間である請求項６２記載の粒子の懸濁液。
【請求項６９】
該密度が約９ｇ／ｃｃである請求項６２記載の粒子の懸濁液。
【請求項７０】
該結合剤が、抗体、薬物、ホルモン、成長因子、レクチン、酵素および核酸配列のうちの少なくとも１つである請求項６２記載の粒子の懸濁液。
【請求項７１】
該結合剤が細胞表面抗原に特異的に結合する抗体である請求項６２記載の粒子の懸濁液。
【請求項７２】
該結合剤がモノクローナル抗体である請求項６２記載の粒子の懸濁液。
【請求項７３】
該結合剤が、ビオチン標識され、ストレプトアビジンを介して、該粒子に連結される請求項６２記載の粒子の懸濁液。
【請求項７４】
液体試料から、細胞または細胞様物質の所定の標的集団またはそのサブ集団を選択するための装置であって：
ａ．標的集団またはサブ集団に特異的に結合する結合剤に結合した複数の強磁性粒子、ここに該粒子は、該粒子の選択を可能にするのに該標的集団とは十分に異なる密度を有し；
ｂ．該粒子が該試料の実質的部分を通過し、粒子−標的集団複合体の形成に十分な時間を可能にするように、該粒子と該試料を混合するための手段；および
ｃ．該試料を磁場中に置くことによって、該粒子−標的複合体から、非標的集団またはサブ集団を含む該試料の少なくとも一部を分離するための手段を含む該装置。
【請求項７５】
該分離工程用の手段が、該試料を該磁場中に該磁気配置にて置いて該粒子を動かすための手段によって達成される請求項７４記載の装置。
【請求項７６】
封じ込め容器用の手段が該試料に供され、該磁場が、該粒子−標的複合体が該封じ込め容器の該壁に沿って実質的に単一層として形成することができる磁気配置にて作られる請求項７５記載の装置。
【請求項７７】
消磁によって、該磁場を除去するさらなる工程を含む請求項７５記載の装置。
【請求項７８】
該粒子−標的複合体の該凝集を克服する手段が、該緩やかな渦形成手段を介する請求項７５記載の装置。
【請求項７９】
該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段が、該緩やかな渦形成用の手段を介する請求項７５記載の装置。
【請求項８０】
該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段が、該マウスＩｇＧとのインキュベーション用の手段を介する請求項７５記載の装置。
【請求項８１】
該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段が、当該分野で知られるいずれかの手段を介する請求項７５記載の装置。
【請求項８２】
該標的集団またはサブ集団のための手段が、細胞夾雑物を含む細胞様物質または該細胞成分の手段である請求項７５記載の装置。
【請求項８３】
該標的集団またはサブ集団のための手段が、生物学的細胞である請求項７５記載の装置。
【請求項８４】
該標的集団またはサブ集団のための手段が、該ヒト癌細胞、該ヒト白血球、該ヒト血小板、および該ヒト免疫細胞よりなる該群のうちの少なくとも１つから選択される請求項７５記載の装置。
【請求項８５】
該強磁性金属のための手段が、該鉄用の手段、該コバルト用の手段、該ニッケル用の手段、およびその該合金用の手段よりなる群から選択される請求項７５記載の装置。
【請求項８６】
該強磁性金属用の手段が、該ニッケル用の手段である請求項７５記載の装置。
【請求項８７】
該粒子用の手段が、約５０ナノメートルないし該粒子−標的を脱凝集できない直径までの直径範囲を有する請求項７５記載の装置。
【請求項８８】
該直径用の手段が、約５００ナノメートルないし約１５００ナノメートルである請求項８７記載の装置。
【請求項８９】
該直径用の手段が、約８００ナノメートルないし約１２００ナノメートルである請求項８７記載の装置。
【請求項９０】
該粒子用の手段が、該標的生体材料の少なくとも２倍以上の密度差を有する請求項８７記載の装置。
【請求項９１】
該密度用の手段が、約７ｇ／ｃｃおよび約９ｇ／ｃｃの間である請求項９０記載の装置。
【請求項９２】
該密度用の手段が、約９ｇ／ｃｃである請求項９０記載の装置。
【請求項９３】
該混合手段が、該試料が０．５ｍｌ未満である時に、該試料を該粒子と共に渦処理する手段によって達成される請求項７５記載の装置。
【請求項９４】
該渦処理手段が、約２秒ないし約４分である請求項９３記載の装置。
【請求項９５】
該混合手段が、該試料容量が少なくとも０．５ｍｌである時に、該試料を該粒子と回転しながら混転する手段によって達成される請求項７５記載の装置。
【請求項９６】
該混転手段が、約５回転／分ないし３０回転／分ほどである請求項９５記載の装置。
【請求項９７】
該混合時間手段が、約３０秒ないし約２０分の範囲内である請求項７５記載の装置。
【請求項９８】
該混合時間手段が、約１分ないし約５分である請求項７５記載の装置。
【請求項９９】
該混合時間手段が、約４分ないし約５分である請求項７５記載の装置。
【請求項１００】
該磁気配置用の手段が、該キャビティーを規定して該容器を収容するように配された該２ないし６つの永久磁石または該電磁石による請求項７５記載の装置。
【請求項１０１】
該磁気配置用の手段が、該キャビティーを規定して該容器を収容するように配された該３つの永久磁石による請求項７５記載の装置。
【請求項１０２】
該磁気配置を収容する手段が、該円柱状強磁性ヨーク内である請求項７５記載の装置。
【請求項１０３】
該試料を該磁場に暴露する手段が、少なくとも約３秒間である請求項７５記載の装置。
【請求項１０４】
該液体試料を該磁場に暴露する手段が、約１分ないし約５分である請求項７５記載の装置。
【請求項１０５】
該結合剤用の手段が、該抗体、該薬物、該ホルモン、該成長因子、該レクチン、該酵素および該核酸配列用の手段のうち少なくとも１つである請求項７５記載の装置。
【請求項１０６】
該結合剤用の手段が、該細胞表面抗原に特異的に結合する該抗体用の手段である請求項１０５記載の装置。
【請求項１０７】
該抗体用の手段が、該粒子に連結された該モノクローナル抗体用の手段である請求項７５記載の装置。
【請求項１０８】
該結合剤用の手段が、該ストレプトアビジンを介して、該粒子の連結手段を有する該ビオチン標識された手段である請求項７５記載の装置。
【請求項１０９】
液体試料から、細胞または細胞様物質の所定の標的集団あるいはそのサブ集団を選択するための装置であって：
ａ．該標的集団とは十分に異なる密度を有して該粒子の選択を可能にする、該標的集団またはサブ集団に特異的に結合する結合剤に結合した複数の高密度粒子；
ｂ．該粒子が該試料の実質的部分を通過して、粒子−標的複合体の形成のための十分な時間を可能にする該粒子と該試料を混合する手段；および
ｃ．該試料を沈降させることによって、該粒子−標的複合体から、非標的集団またはサブ集団を含む該試料の少なくとも一部を分離する手段を含む該装置。
【請求項１１０】
完了沈降が該粒子−標的複合体が該標的集団を含有する該試料から分離される時である該完了沈降用の手段である請求項１０９記載の装置。
【請求項１１１】
該沈降が該粒子−標的複合体に対する重力の効果によって決定される該沈降用の手段である請求項１１０記載の装置。
【請求項１１２】
該沈降が該粒子−標的複合体に対する浮力の効果によって決定される該沈降用の手段である請求項１１０記載の装置。
【請求項１１３】
該沈降が該粒子−標的複合体に対する遠心の効果によって決定される該沈降用の手段である請求項１１０記載の装置。
【請求項１１４】
該緩やかな渦処理用の手段を介して、該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段である請求項１１０記載の装置。
【請求項１１５】
該マウスＩｇＧによるインキュベーション用の手段を介して、該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段である請求項１１０記載の装置。
【請求項１１６】
当該分野で知られるいずれかの方法を介する該粒子−標的複合体から該標的集団またはサブ集団を放出するための手段である請求項１１０記載の装置。
【請求項１１７】
該標的集団またはサブ集団用の手段が、細胞夾雑物を含む細胞様物質または該細胞成分用の手段である請求項１１０記載の装置。
【請求項１１８】
該標的集団またはサブ集団用の手段が生物学的細胞である請求項１１０記載の装置。
【請求項１１９】
該標的集団またはサブ集団用の手段が、該ヒト癌細胞、該ヒト白血球、該ヒト血小板、および該ヒト免疫細胞よりなる該群のうち少なくとも１つから選択される請求項１１０記載の装置。
【請求項１２０】
該直径用の手段が、約５００ナノメートルないし約１５００ナノメートルである請求項１１０記載の装置。
【請求項１２１】
該粒子用の手段が、該標的生体材料より少なくとも２倍以上の密度差を有する請求項１１０記載の装置。
【請求項１２２】
該密度用の手段が、約７ｇ／ｃｃおよび約９ｇ／ｃｃの間である請求項１１０記載の装置。
【請求項１２３】
該密度用の手段が約９ｇ／ｃｃである請求項１１０記載の装置。
【請求項１２４】
該混合手段が、該試料が０．５ｍｌ未満である時に、該試料を該粒子と共に渦処理するための手段によって達成される請求項１１０記載の装置。
【請求項１２５】
該渦処理手段が、約２秒ないし約４分である請求項１２４記載の装置。
【請求項１２６】
該混合手段が、該試料容量が少なくとも０．５ｍｌである時に、該試料を該粒子と回転しながら該混転するための手段によって達成される請求項１１０記載の装置。
【請求項１２７】
該混転手段が、約５回転／分ないし３０回転／分である請求項１２６記載の装置。
【請求項１２８】
該混合時間手段が、約３０秒ないし約２０分の範囲内である請求項１１０記載の装置。
【請求項１２９】
該混合時間が約１分ないし約５分である請求項１１０記載の装置。
【請求項１３０】
該混合時間手段が約４分ないし約５分である請求項１１０記載の装置。
【請求項１３１】
該結合剤用の手段が、該抗体、該薬物、該ホルモン、該成長因子、該レクチン、該酵素および該核酸配列用の手段のうち少なくとも１つである請求項１１０記載の装置。
【請求項１３２】
該結合剤用の手段が、該細胞表面抗原に特異的に結合する該抗体用の手段である請求項１１０記載の装置。
【請求項１３３】
該抗体用の手段が、該粒子に連結された該モノクローナル抗体用の手段である請求項１１０記載の装置。
【請求項１３４】
該結合剤用の手段が、該ストレプトアビジンを介して、該粒子の連結手段を有する該ビオチン標識された手段である請求項１１０記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
一般に、本発明は、細胞選択の分野におけるヒトおよび動物ヘルスケアのリサーチ、診断および治療的適用に特に有用である新規な粒子に関する。より具体的には、本発明は、細胞、細胞成分、細菌、ウィルス、毒素、核酸、ホルモン、蛋白質、受容体−リガンド複合体、他の複合体分子またはそのいずれかの組合せの選択を含む適用における、新規な強磁性高密度粒子（ＦＤＰ）、およびその調製および使用の方法に関する。加えて、該粒子は、分子生物および蛋白質精製手順において適用を有することもある。
【０００２】
背景分野
ヒトまたは動物対象からの液体中の細胞または細胞性様物質の集団またはサブ集団の、ポジティブ選択または欠乏を介する促進は、多くの適用に利用することができる。例えば、細胞療法の領域において、自家幹細胞移植前の腫瘍細胞の欠乏または同種間幹細胞移植前の特定の免疫細胞の欠乏は、患者にとって有益であり得る。診断において、特異的細胞の豊富化は、転移性疾患の初期診断に有用であり得る（例えば、米国特許第６，３６５，３６２号；０４／２００２；Terstappen, L.ら参照）。リサーチの場において、ポジティブおよびネガティブ選択手順の両方は、細胞ベースの研究にとって強力なツールであり、分子生物の場では、特異的遺伝子またはｍＲＮＡの検出が可能な選択ツールは、遺伝子発見にとって、およびリサーチツールとして非常に重要である。
【０００３】
慣用的細胞豊富化／欠乏および他の選択技術は、当該分野でよく知られる勾配遠心分離手順あるいは磁性引力または重力を介して細胞を分離する結合剤に連結される固相微粒子（本明細書中で、粒子と相互間的に使用される）のいずれかに基づいている。微粒子は、直径約５０ｎｍないし約５０ミクロンの間を変動し、滑らかな表面またはぎざぎざの表面のいずれかを有する。磁性選択技術は、コロイド超常磁性粒子（例えば、Immunicon CorporationまたはMiltenyi Biotechによって提供されるもの参照）およびミクロンサイズの粒子（例えば、Dynal Corporationによって提供されるもの）を含む。重力選択技術は、Eligix、Biotransplant, Inc.の子会社によって提供されるもののような、ミクロンサイズ高密度粒子（ＨＤＭ）を含んでいてもよい。
【０００４】
磁性選択：
当該分野でよく知られるように、いくつかのタイプの磁性粒子は、超常磁性および強磁性（を含むがこれらに限定されるものではない）に調製され得る。米国特許第５，４１１，８６３号および同第５，４６６，５７４号（それぞれ、０５／１９９５； Miltenyi, S.および１１／１９９５； Liberti, P.ら,）は、超常磁性粒子は生物学的選択適用のための選択の粒子であることを教示する。超常磁性物質は、ここ数年で、様々なヘルスケアおよびバイオプロセッシング適用において、磁性選択技術の重要要素となっている。超常磁性物質は、非常に磁力的に感受性であり、つまり、それらは磁場に置かれた時、強力に磁性になるが、磁場が除去されると、すぐにその磁性を失う。この特質によって、容易に細胞集団を単離し、磁場が除去される時に細胞を再懸濁することが可能になる。超常磁性は、結晶直径が臨界値を下回るほど減少した時に、強磁性物質において起こる。それらの直径に拘わらず（約２５ｎｍないし約１００ミクロン）、そのような物質は磁場に置かれた時にのみ磁性であるという特質を有する。超常磁性作用の基本は、そのような物質が、磁性領域のサイズ以下であると推定される約２０ないし２５ｎｍ以下のサイズ単位で、磁性物質を含有することである。磁性領域は、存在する永久磁石双極子の最小容量である。他方で、強磁性物質は、磁場に対して強力に感受性であり、磁場が除去される時、磁性特質を維持することができる。強磁性は、物質中の不対電子が結晶格子内に含有され、すなわち、不対電子の結合が可能になる時にのみ起こる。先行技術は、永久磁石を持つ強磁性粒子が、これらの粒子の懸濁液が、それらのお互いに対する高磁性引力のため、磁場への暴露に引き続き容易に凝集するため、生物学的物質選択での適用に対して、かなりの不利益を有すると教示する（例えば、米国特許第５，４１１，８６３号；０５／１９９５；Miltenyi, S.および同第５，４６６，５７４号；１１／１９９５；Liberti, P.ら参照）。この理由のため、強磁性粒子は、当該分野において、生物学的（細胞選択／核酸）適用に使用されてこなかった。
【０００５】
重力選択：
磁力よりもむしろ重力に基づく非標的集団から標的を分離する固相微粒子が記載されている（例えば、米国特許第５，５７６，１８５号；１１／１９９６； Coulter, W.らおよびZwerner,ら J. Imm. Methods (1997) 14:31-34）。現在、重力に基づき分離される粒子は、比較的高密度であり、約３ないし１０ミクロンの範囲内の直径を持つ大きさである。これらの粒子の既知の特徴は、粒子および細胞の間の密度差のため、回転しながらの混転によって、粒子が液体試料の実質的部分を通過することができることである。粒子は関心のある細胞を横切り、そうすることで、非標的細胞に非特異的に結合せずに、標的細胞集団に結合する。これにより、効率的な分離および非標的細胞の高回収が可能になる。非標的細胞の分離および回収は、超常磁性選択のみで発見されるものより優れている。これらの高密度粒子は、混合様式（上記記載）として、および細胞懸濁液の残部から細胞の所望の集団を分離する様式としての両方で、重力によって沈降するように構築される。事実、先の記載（例えば、米国特許第５，５７６，１８５号；１１／１９９６； Coulter, W.ら）は、重力選択におけるより小さい粒子の使用から離れて教示する。例えば、この特許の開示は、超常磁性粒子が試料中の懸濁液中に維持され、結果的に、試料懸濁液における重力沈降の非常に遅いまたは実質的な排除用に構築されるように意図される。典型的には、１５０ｎｍ未満の上手く覆われた物質は、６ヶ月およびさらにより長い期間、沈降の徴候を全く示さないだろう（米国特許第５，６２２，８３１号；０４／１９９７； Liberti, P.ら参照）。従って、超常磁性粒子は、重力選択技術または密度差混合において適用できない。両方の手順は、細胞を捕獲し重力によって沈降する時の粒子および標的生体材料の間の密度差が少なくとも２−３倍である時に、最適に機能する。
【０００６】
重力分離は、トラッピング、コロイド粒子を用いる時の磁性収集の時間、および／またはコロイド粒子を収集するのに必要な高磁性勾配による非特異的細胞喪失を含む超常磁性粒子を使用する磁気分離手順に固有ないくつかの欠点に取り組む。超常磁性コロイド粒子を使用する時、チャンバーの壁に標的細胞を保持するのに十分な磁力がないことが多い。これにより、非標的細胞は標的細胞で汚染されることになる。また、試料前処理がしばしば必要である（つまり、超常磁性粒子の添加前の密度勾配を介する赤血球の除去）。しかしながら、重力選択を使用することによって、試料前処理はしばしば排除され、非標的細胞の最小の細胞喪失が起こるが、慣用的技術の欠点は、粒子のサイズおよび重力混合の性質のため、低抗原密度を持つ細胞は容易に単離されず、すなわちその使用を制限するということである。
【０００７】
従って、細胞表面上の抗原密度の広範囲にわたり、試料中に残る集団に影響を及ぼさずに、細胞または細胞様物質の１またはそれ以上の集団を欠乏させるまたは選択する効果的な方法を有することが望ましいだろう。理想的には、方法は安価で、早く、高収率を可能にし、試料容量によって制限されないべきである。
【０００８】
発明の概要
本発明は、生物学的物質を選択するための改善された方法、装置、および組成物を提供する。この選択は、ある程度、混合および分離構成成分よりなる。本発明の目的のために定義された分離は、関与する粒子の物理的特質に依存するいずれのメカニズムも含む。例えば、これは、粒子の密度または磁性特質を含むだろう。具体的には、本発明は、十分に高密度な粒子の特質に基づく改善された選択手順を提供する。これらの粒子は、適した結合剤に結合した時、超常磁性粒子と比較して優れた磁性特質および無視できるキャリオーバのため、先行技術を超えるユニークな利点を提供する。これらの同一の粒子は、重力によって分離可能であり、より大きい粒子に似ているが、高密度標的に選択を制限しない利点を提供する。
【０００９】
本明細書中に開示される本発明を具体化する方法は、結合剤およびそれらの対応する認識部位を含む様々な反応で使用することができる。本明細書中で使用するように、細胞は、個々にまたは凝集体で同定可能な細胞性細菌、真菌を含み、前述のものに物理的特質において似ているように見えるまたは実質的に似ている細胞様物質を含む動物または植物細胞として定義される。細胞は、独立した単位として機能することが可能な生物体の最小の構造的凝集体である。例えば、細胞はヒト赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）集団、癌または骨髄および／または血液試料で見受けられる組織、細胞からの他の異常細胞であってもよい。適切にタグをつけられたまたは標識された細胞は、本発明の方法を通して機能すると予測される。
【００１０】
用語「結合剤」は、本明細書中で使用されるように、１またはそれ以上の（複数の）特異的な相補的分子を検出し、それと反応する（複数の）様々な分子を定義する。例は、次の具体的な相補的分子対を含むが、これらに限定されるものではない；抗体／抗原、薬物／薬物受容体、核酸／相補的核酸、レクチン／糖分子、またはホルモン／ホルモン受容体。
【００１１】
本発明の１つの好ましい具体例において、特定の直径サイズ範囲内の強磁性高密度粒子を使用して、非標識集団の非特異的喪失を引き起こさずに、特定の標的集団を効率良く選択することができることが分かった。所与の直径サイズ範囲内および所望の磁性状況下で、強磁性高密度粒子は、磁場の除去に際して磁性特質を維持するが、この様式で機能することができる。本発明によって提供される方法および手段の両方は、本発明の粒子と一緒に機能させる時、細胞の特定の集団の除去および特定の集団のポジティブ選択に有効である。本発明の方法、手段、および粒子は、粒子および標的生体材料の間の密度差を利用して、効率的に標的集団を捕獲する混合様式、および強磁性高密度粒子の磁性特質を利用して、容器の壁に標的集団を迅速にかつきつく保持し、すなわち、先行技術のコロイド超常磁性粒子で見られるような標的集団のキャリオーバなしに非標的集団の効果的な除去を可能にする分離様式の両方を使用する。
【００１２】
この選択を達成するために、本発明の好ましい具体例において、それに１またはそれ以上の結合剤を有する複数の強磁性高密度粒子を、関心のある生体材料標的を含有する液体試料と組み合わせる。比較的高密度な粒子が、結合剤によって標的されたものに結合しながら、生体材料を行き来するように、試料を混合させる。混合に引き続き、試料を、試料を含有する容器壁に沿って、粒子の分散でさえ促進させる磁場に置く。分離に引き続いて、残りの試料を除去する。全工程は、粒子によって標的されなかった試料中の関心のある残りの細胞の数を増やす。加えて、標的集団は、粒子に結合したまま（粒子は強磁性であるが）、容易に再懸濁し、洗浄し、引き続いて、当該分野で知られる方法によって、粒子から除去することができる。好ましい粒子は、直径約０．５ないし２ミクロンのサイズ範囲であり、限定されるものではないが、ニッケル、コバルト、または鉄のような磁性物質で作られるだろう。
【００１３】
本発明の第２の具体例において、標的生体材料および粒子の間の少なくとも２倍の密度差によって、効率的な選択が可能になる。この選択の間の分離は、重力に基づき、より高密度な粒子が溶液の外に沈降することを可能にするが、液体試料中のより低密度な粒子を持つ浮力も網羅することができる。また、本発明の粒子に対する重力の効果は、当該分野で知られる遠心分離手順を介して起こり得る。
【００１４】
本明細書中に記載される本発明の方法、手段、および粒子組成物は、特定の集団の欠乏またはポジティブ選択に有効である。約０．５ミクロンないし重力選択が標的生体材料に対する低および高抗原密度の間で不均一であるサイズの直径範囲を持つ粒子。約０．５ミクロンないし約１．５ミクロンの間の好ましい直径は、選択された標的集団のためにより早く分離するだろう。非標的集団の非特異的喪失なしに、特定の標的集団の効率的な選択のために、本発明記載の最も好ましい粒子直径は、約１ミクロンである。これらの粒子は、特定の結合剤と連結した時、重力によって沈降して、認識部位の高密度および低密度の両方を持つ標的生体材料を分離するだろう。重力分離は、粒子を封じ込め容器の底部に収集させ、これにより、液体試料中に残る非標的集団の効果的な除去を可能にするが、当該分野で知られる方法を介して標的集団の効率的な単離も可能にする。
【００１５】
発明の詳細な記載
好ましい具体例によると、本発明は、液体試料中の標的集団またはサブ集団の迅速かつ効率的な選択のための方法、装置、および粒子組成物を網羅する。この選択は、標的生体材料上の低密度部位および高密度部位の両方を認識するだろう。
【００１６】
開示された発明は、様々な研究所および生体親和性反応を含む臨床手順において特定の用途を有する。そのような手順において、比較的高密度で、標的生体材料と比較して磁力的に応答性であり得る粒子が使用される。さらに、粒子は、テスト試料中の関心のある分子を結合することが可能な結合剤を構成する。開示される発明において、結合剤が（複数の）標的分子を認識した後、粒子−標的複合体が、強磁性高密度粒子および標的生体材料の間に形成される。標的集団またはサブ集団の選択は、効率的な混合および分離を介して達成される。
【００１７】
図１で示されるように、本発明記載の方法および装置の１つの具体例は、フローチャート（１０）に示される。装置は、下記に記載のように標的集団を含有する液体試料（１２）を含む。また、装置（１０）は製造され下記に記載されるように、高密度粒子（１１）の源を含む。粒子（１１）は、標的集団に特異的に結合することが可能な結合剤を含む。結合剤は、当該分野で知られるいずれかの方法によって、粒子（１１）に結合される。粒子（１１）は、混合段階（２０）において、液体試料（１２）の少なくとも一部と組み合わされる。容量に依存し、混合段階（２０）は、回転しながら（２１）か、あるいは渦処理する（２２）かのいずれかである。組合せは、複合体を形成していないいずれかの粒子と一緒に、ブロック（２４）によって図示されるように分離される粒子−標的複合体を形成することができる。
【００１８】
一旦、粒子（１１）が、液体試料（１２）と混合されると、それらは、沈降することによって（２６）か、あるいは磁場（２５）を介して誘発される動きによってのいずれかによって分離される。
【００１９】
装置（１０）は、液体試料（１２）および粒子（１１）を組み合わせて、次いで段階の間それらを動かす自動デバイスであってもよい。また、装置（１０）は、操作者が、混合（２０）、分離（２４）、沈降（２６）、または磁気誘発性の動き（２５）を介して、試験管または同様の容器を使用する場合、手動であってもよい。最後に、装置は、自動および手動の使用の組合せを用いて、半自動様式であってもよい。
【００２０】
本発明の方法部分には２つの原理具体例があり、これらは選択工程の分離構成においてのみ異なる。両方とも効率的な粒子混合を必要とするが、特定の好ましい具体例において、磁場を使用して、液体試料から標的物質を分離する。さらなる具体例は、本発明の個々の粒子およびその標的の間の密度差を使用して、非標的成分の液体試料において分離を実施する。例えば、分離は重力の効果または浮力の結果であり得る。
【００２１】
上記に記載のようなそのような生体親和性反応は、遺伝子プローブ分析の場合のように、細胞、細胞成分、細胞サブ集団（真核生物および原核生物）、細胞夾雑物、細菌、寄生虫、抗原、特異的な抗体、ビタミン、ウィルスおよび特異な核酸配列のような特異な生物学的因子であるものの代表的な広範囲の標的生体材料の決定のために、生物学的試料をテストするのに使用することができる。従って、本発明の方法を使用して、例としてであって制限するものではないが：Ｔ−細胞；Ｂ−細胞、白血球からのＣＤ４陽性細胞；白血球からのリンパ球；白血球からの顆粒球；白血球からの単球；正常な細胞からの腫瘍細胞および骨髄からの幹細胞またはロイコフォレシス生成物を含む細胞の分析または単離用の細胞選択を実施することができる。
【００２２】
細胞選択につき、液体試料は、例えば、上記に記載され、当業者によって考えられるように、全血またはその一部、骨髄、ロイコフォレシス生成物、髄液、尿、または集団またはサブ集団を含有する他の体液を含む生物学的液体であってもよい。
【００２３】
本発明の特定の好ましい具体例に従い機能するために、粒子は強磁性でなければならず、個々の標的生体材料より２倍以上大きい密度差を有して、適切な混合を確証するべきである。例えば、鉄、コバルト、ニッケル（およびこれらの金属の様々な合金）は、典型的な強磁性高密度粒子である。強磁性高密度粒子は金属であり、これは、外部の磁場の適用の際に永久磁化することができる。この外部の場は、典型的には、もう１つの永久磁石または電磁石によって適用される。直径約３０ｎｍ以上の金属性粒子は、典型的には、強磁性と考えられる。すなわち、最低制限粒子サイズは、直径５０ｎｍの範囲である。粒子直径の上限は、強磁性高密度粒子が磁場に置かれた後に単に混合することによって分散されない粒子直径として作業可能に規定される。好ましくは、直径サイズのこの上限は、約２．５ミクロンの範囲である。すなわち、本発明で機能する粒子は、直径約５０ｎｍないし直径２，５００ｎｍであり、より好ましくは、約５００ｎｍ−ないし１，５００ｎｍの範囲であり、最も好ましくは約８００ｎｍ−ないし１，２００ｎｍ（約０．８−１．２ミクロン）の範囲である。粒子の密度は、粒子が、混合の間、生体材料の標的集団を通過するように、すなわち、標的集団とほとんどないかあるいは全くない非標的集団の非特異的結合との結合へと導くように、標的生体材料のそれとは十分に異なっていなければならないことが理解されるだろう。非標的細胞集団の喪失が最小限、およそ１０％未満であることが本発明の特異的および有利な特徴である。粒子の密度は、好ましくは標的生体材料の少なくとも２倍以上であるべきだが、約１４ｇ／ｃｃ以上であるべきではない（血液細胞は、約１．０５ｇ／ｃｃの密度を有する）。標的集団に対する粒子密度のより好ましい範囲は、約７ｇ／ｃｃないし約９ｇ／ｃｃであり、最も好ましい粒子密度は、約９ｇ／ｃｃである。
【００２４】
本発明によると、当業者によってすぐに理解されるように、液体試料の容量は、実施される手順によって変動することがある。研究および診断的適用につき、１０マイクロリットルほどの小容量を使用することができるが、いくつかの診断的適用および臨床的適用につき、容量は、典型的には、約１ｍｌから最大で数リットルまで変動し得る。本発明の特に有利な特徴は、希釈された／加工された（遠心分離；勾配配置；重力）および非希釈された試料の両方を加工することができることである。試料（希釈されたまたは非希釈された）は、非希釈された全血からの白血球のサブセットの除去、または移植前のロイコフォレシス生成物からの腫瘍細胞または免疫細胞の除去を含むがこれらに限定されるものではない適用につき、単に、粒子に添加されるか、あるいは粒子が試料に添加される。
【００２５】
上記記載の密度差により、本発明の実施において、混合は、粒子を標的集団またはサブ集団をゆっくりと通過させ、非標的集団またはサブ集団への非特異的結合ほとんどなしあるいは全くなしで、認識部位に効率的に結合させる。これによって、高度に豊富化された標的集団またはサブ集団と共に、非標的集団またはサブ集団の非常に高い収率を得る。いずれかの混合工程は、粒子がそれらの標的集団を過ぎる効果的な動きを促進しなければならない。１つのそのような工程は、回転しながらの混転であるが、これに限定されるものではない。回転しながらの混転は、０．５ｍｌ以上の容量に適切であるが、より少なく容量に対しても容易に実施することができる。混合容器は、全く液体に満ちていて、はね返りを最小化してもよく、あるいは容器は部分的に満ちていてはね返りを許容してもよい。一般的に、約５回転／分ないし約３０回転／分のスピードで回転しながら回転する試験管ホルダーが好まれる。少なくとも１０ｕｌの容量につき、混合は、渦処理または約０．２ないし０．５ｍｌの好ましい容量での点頭によって達成できる。より大きい容量での渦処理は、標的集団に対する粒子の動きを本発明の範囲内に促進するいずれの混合工程として可能である。混合時間は、混合工程によって変動することがある。小さい容量につき、およそ秒ないし分の混合時間は適切であるが；より大きい容量につき、混合時間は約１ないし２０分の範囲であり、より好ましい混合は約１ないし約５分であり、最も好ましい混合時間は約４ないし５分の範囲である。混合時間は好ましい範囲外であってもよく、それでもなお本発明の範囲内にあることが理解されるだろう。
【００２６】
粒子に結合する標的細胞の捕獲に適した磁石が記載されている。一例として、その開示が引用によって本明細書中に組み込まれる米国特許第５，１８６，８２７号；０２／１９９３； Liberti, P.らを参照されたし。本発明の特定の好ましい具体例において、源を発生させる磁場は、２ないし６つの永久磁石または電磁石のセットを構成することができる。磁石はキャビティーを規定して、容器を収容するように配される。この具体例において、キャビティーの反対側に配置された磁石の極性および位置は、試験媒体容器内に高勾配磁場を発生させ、試料液体を磁場に暴露する融剤線を生成するものである。磁石は、好ましくは円柱状配置の強磁性ヨーク内に収容され、装置によって生成される場力を促進させるように働く。テスト媒体と接触している容器の壁の暴露された表面領域に対して、テスト媒体に添加された磁気粒子の量を調節し、磁場の融剤線と実質的に同一の広がりを持つように、そのような暴露された表面の配向を調節することによって、磁気粒子を実質的に単一の層内の容器壁の暴露された表面に沿って接着させることが可能である。このように操作することによって、固定化された磁気粒子中の非標的細胞のような非特異的に結合した物質の閉塞は、実質的に無いに等しい。上記で論議した好ましい具体例に加えて、非標的細胞の非特異的トラッピングを招かずに、容器壁に粒子を誘引するいずれの磁気配置も、本発明の範囲内である。磁気分離時間は、試料容量に依存し、約５秒ないし１０分の範囲を変動する。超常磁性粒子に基づく選択技術を超える強磁性高密度粒子を使用する本発明の有意な利点は、非常に短い磁気捕獲時間が可能であることが記されるべきである。これによって、非常に迅速な選択工程が可能になる。
【００２７】
所望のサイズ範囲のいずれの強磁性高密度粒子も本発明で使用できるが、適した粒子を作成する特定の方法は、下記に記載される。金属性粒子を作成する方法は、当該分野でよく知られている（例えば、Keklikianら, Coll. & Surf. A, 1994,92:267-275およびZach, M.P., Penner, R.M., Adv. Mat., 2000, 12:878参照）。
【００２８】
ニッケルを含有する強磁性高密度粒子の合成：
１．４．０ｇｍ水酸化ナトリウムを計量し、ビーカーがパラフィルムで覆われている間撹拌することによって、１００ｍｌビーカー中に完全に溶解する。
２．２．０４ｇｍ塩化ニッケルを計量し、２００ｍｌビーカー中の１００ｍｌの蒸留水中に溶解する。
３．２００ｍｌの蒸留水を、室温にて、清潔な反応容器に注ぐ。
４．塩化ニッケル溶液が２０分間混合された後、検査して、溶液の表面上に夾雑物が漂っているかどうかを決定する。もし夾雑物が存在すれば、液体を捨て、夾雑物を残す。
５．１４ｍｌトリエタノールアミンを測量する。フードの下で、トリエタノールアミンを塩化ニッケル溶液に添加する。アクアグリーンへの予測される色変化を観察する。
６．３８．５ｍｌのヒドラジンを測定する。
７．磁気攪拌機で撹拌し続けつつ、塩化ニッケル−トリエタノールアミン溶液に、水酸化ナトリウム溶液を添加する。暗黄緑色への色変化を観察する。
８．完全な混合の後、漏斗を介して、塩化ニッケル−トリエタノールアミン溶液を反応容器に注ぐ。反応容器は、物質を添加する穴を有する蓋を含有する。穴は、反応の間、蓋をされる。また、濃縮器は蓋に設けられ、外側へ穴が開いている。濃縮器の中には、室温の水が流れている。粒子の生成は、化学的フードの中で起こる。
９．測定されたヒドラジンを反応容器に添加する。漏斗を除去し、プラグで栓をする。
１０．熱を１０５℃まで上昇させ、撹拌する。
１１．反応容器を観察して、反応が激しすぎないか確認する。もし気泡が濃縮器へとあまりにも高く上昇するなら、約２００ｕｌのブチルアルコールを添加して気泡を減少させる。
１２．一旦、反応が起こると−約１０５℃にて、反応容器中の溶液は緑色から黒色へと変化するだろう。
１３．反応を完了まで進める（約２．５時間）
１４．過剰なヒドラジンの存在をチェックすることによって、反応が完了しているか確認する。攪拌機を止め、気泡のレベルが上昇するか否か決定する。もしレベルが上昇すれば、撹拌を再開して、素速く続けて、過剰なヒドラジンを消費する。もしレベルが上昇しなければ、反応は完了である。
１５．反応が完了すると、加熱を止め、撹拌し続けて、冷却を早める。
１６．粒子から上澄みを捨て、中和用に保存する。
１７．濯ぎ、粒子を蒸留水中で懸濁する。
１８．６回濯ぐ。
１９．アルミホイルで覆われたビーカー中に最終的な粒子ペレットを入れ、２５０℃のオーブンに４８時間置く。
２０．ビーカーをオーブンから除去し、粒子を放冷する。
【００２９】
上記に引き続き、次いでモノクローナル抗体のような結合剤を、吸収または共有結合によってのような当該分野で知られる方法によって、本発明の粒子に結合させてもよい。特に有用な粒子は、それに結合したヤギ抗マウス（ＧＡＭ）を有するものである。本発明の粒子を用いて、所望の分子に対するいずれの特異的な抗体も、ＧＡＭに容易に結合され得る。もう１つの共有結合的なアプローチは、特異的なビオチン標識された結合剤を結合させることができるストレプトアビジン粒子の使用である。図２は、標的細胞に結合し、乳癌患者の血液試料から得られた本発明の粒子（ＣＤ１５  ＦＤＰ）を示す。示されるように、どのＣＤ１５  ＦＤＰの結合も非標識赤血球と一緒には呈されなかった。
【００３０】
本発明の第２の具体例は、本発明の粒子の液体試料から標的集団を分離する沈降能力を使用する。本発明の目的のための沈降は、粒子−標的複合体および残りの試料に対する独立した力または外部の力の不均等な効果のため、液体試料の実質的な部分からの本発明の粒子の分離として定義される。例えば、粒子の重力または浮力のいずれかは、液体試料からの沈降を引き起こすだろう。
【００３１】
この具体例内で、また、本発明の粒子は、非強磁性高密度粒子を含む。本発明のこれらの粒子との重力沈降は、高および低密度認識部位の両方を有する標的生体材料の捕獲を可能にする。他の粒子による重力沈降は、先に記載されており（例えば、米国特許第５，５７６，１８５号；１１／１９９６； Coulter, W.ら参照）、ここに選択は、標的集団内のより高い抗原高密度細胞に制限される。驚くべきことに、本発明の粒子を使用すると、重力分離は、標的生体材料上の高密度抗原に制限されないが、標的集団のより広範で、より効率的な選択に繋がることが分かっている。
【００３２】
沈降のモードとしても含まれる遠心分離を使用して、適切な混合に引き続いて、本発明の粒子を分離することができる。本発明の粒子は、標的集団の分離のための遠心分離の比較的低時間およびスピードによる迅速かつ効率的な混合を供する利点を有する。
【００３３】
先に言及したように、本発明の方法、手段、および粒子は、標的集団を結合させ分離させるのに特に適している。一旦、適切な混合によって選択されれば、標的集団は、磁場における重力沈降または配置によって、液体試料から分離できる。いずれかの分離をもって、残りの試料は非標的集団と豊富化される。もし標的集団が望まれるならば、残りの試料を、高収率および純度の標的集団を残しつつ除去する。次いで、強磁性粒子−標的複合体に対する磁気効果は、緩やかな渦処理または、粒子−標的複合体を脱凝集できる当該分野で知られる消磁のいずれかの工程のいずれかによる磁場の除去によって排除することができる。最後に、標的集団は、再び緩やかな渦処理を介して、または粒子−標的複合体から粒子を放出するであろう当該分野で知られるいずれかの工程によって、粒子から放出され得る。例えば、標的集団は、ＧＡＭ粒子を用いる時、マウスＩｇＧによるインキュベーションによって放出され得る。
【００３４】
本発明を説明するように意図されているが、決してその範囲を制限するものではない次の実施例において、本発明はより詳細に記載されるであろう。
【実施例】
【００３５】
実施例１
顆粒球は、本発明の抗体標識された強磁性高密度粒子を用いて、全血から効率的に分離される。
ＣＤ１５は、白血球の主要なサブ集団である顆粒球の大部分（＞９９％）において存在する。抗−ＣＤ１５−ニッケル粒子を使用して、標的細胞の特異的選択および非特異的に、非標識細胞を除去する際の粒子の効果をテストした。ニッケル粒子を、抗−ＣＤ１５モノクローナル抗体(Beckman Coulter, Miami, FL)で、吸収によって標識した。ＣＤ１５−ニッケル粒子の２０重量％／容量の１００ｕｌを、１２ｘ７５ｍｍガラス試験管中の１ｍｌ全血に添加した。試料を、５分間、３０ｒｐｍにて回転しながら混合し、次いで、直ぐに、さらなる５分間、磁石中に置くことによって分離した。上澄みを除去し、顆粒球の欠乏につき、血液学分析器で分析した(Sysmex KX-21, Roche Diagnostics Corp.)。図３Ａは、全血中の白血球（白血球）集団を構成する３つの主要なサブ集団（リンパ球、単球および顆粒球）を示す。図３Ｂは、試料からの顆粒球のＣＤ１５−ニッケル粒子による効果的な選択を示す。リンパ球数（１．６ｘ１０３細胞／ｕｌ選択前−対−２ｘ１０３細胞／ｕｌ選択後）および赤血球数（４．８ｘ１０６／ｕｌ選択前および後）は変化せず、非標的細胞は非特異的に選択されなかったことを示した。
【００３６】
実施例２
白血球集団およびサブ集団を、異なる分子に特異的な複数の結合剤を用いて選択する。
本発明の強磁性高密度粒子は、関心のある全集団を効果的に選択するために、粒子に結合した１つの抗体または単一の粒子に結合した複数の抗体と使用することができる。この実施例において、実施例１で示されるように、ＣＤ１５−強磁性高密度粒子（１ｍｌ全血；５分間、３０ｒｐｍにて回転しながら混合；磁場で５分間分離）は、顆粒球につき効果的に選択した。再び、顆粒球の選択は、対照（図４Ａ）と比較して、白血球の喪失なしで（表１；図４Ｂ）９９％以上であり、非標的細胞の非特異的喪失なしの標的細胞の特異的選択を示した。ＣＤ１５は単球に発現するが、抗原密度／細胞は、顆粒球上の抗原密度より少なくともｌｏｇ低い。すなわち、ＣＤ１５は、単球の１７％を選択しただけであった。単球の選択を改善し、リンパ球を選択するために、第２の粒子を、ＣＤ１５−強磁性高密度粒子と組合せた。粒子は、単一の粒子上に、ＣＤ４５およびＣＤ４を含有した（ＣＤ４は単球上で発現することが知られている）。標準の混合／分離条件（ＣＤ１５に対する上記のように）に引き続き、ＣＤ１５粒子およびＣＤ４５／ＣＤ４粒子の組合せは、１０分間に、白血球の９９％以上を効果的に選択した（下記表１；図４Ｃ）。図４Ａは、選択前のリンパ球、単球および顆粒球の出発集団を示す。前方光拡散器−対−９０℃光拡散器によって分析した。分析を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ(Becton Dickinson)で実施した。
【００３７】
驚くべき事に、混合時間を徹底的に減少させる時、顆粒球選択はそれでもなお完了する（図７）。１５０ｕｌ全血試料において、混合時間を２分から約３秒に減少させると、単球は、５０ｕｌのＣＤ１５−強磁性高密度粒子の添加をもって完全に除去された。また、同一試料中の単球は、完全ではないが有意に減少した。さらに図７の最後のパネルで示されるように、ＣＤ１５−強磁性高密度粒子（ＣＤ１５−ＦＤＰ）の１／１０量で、単球は再び除去された。
【００３８】
【表１】
2005534306.tif 000003
【００３９】
実施例３
本発明の粒子は、コロイド超常磁性粒子と比較して、劇的に減少した混合時間および磁気分離を有する。
コロイド超常磁性粒子は効果的に所望の集団を選択するが、粒子の超常磁気性質のため、当該分野において、混合時間および磁気分離が比較的長いことが知られている。ＣＤ４５−超常磁性粒子を使用して、全血から白血球を選択した。製造者の指導によると、混合時間は１５分で、磁気分離時間は１５分であった。表２で選択される時間のパラメーターは、製造者の値の上および下である。
【００４０】
【表２】
2005534306.tif 000004
【００４１】
これらの結果（表２）は、ＣＤ４５−超常磁性粒子は白血球を効果的に選択するが、混合／分離時間が製造者が示唆する時間を下回る１０分に減少されると、選択はそれほど有効ではないことを示す。しかしながら、本発明の粒子を使用すると、選択は３０分および１０分の両方において有効であり、先行技術に基づけば、この結果は予期しないものであった。減少された選択時間は、ニッケル粒子の密度および強磁性性質の結果であり得る（表２）。さらなる研究は、選択の間の磁気分離時間は、１分ほど短いことを示す（図５）。図５Ａは、白血球の主な集団（リンパ球、単球および顆粒球）を示す。図５Ｂおよび５Ｃは、１ｍｌの全血とＣＤ４５ニッケル粒子との回転しながらの混合に引き続き、それぞれ５分間または１分間の磁気分離が白血球を選択するのに十分であることを示す。
【００４２】
実施例４
強磁性高密度粒子は、複数のサイズの超常磁性粒子と比較すると、減少された磁気分離時間を有する。
直径２００ｎｍないし４５００ｎｍの範囲の様々な超常磁性粒子および本発明の粒子の磁気分離時間は、表３にリストする。粒子を１ｍｌのリン酸緩衝食塩水中に希釈し、分光光度計キュベットに入れた。キュベットの各側面に隣接した磁石を有する修飾されたホルダーに、キュベットを入れた。粒子が磁石によってキュベットの側面に引かれると、光は６００ｎｍにて拡散し、ベースラインまで減少した。表３にリストされた時間は、ベースラインに達するのに要した時間である。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
実施例５
本発明の強磁性高密度粒子を、磁場への暴露に引き続いて再懸濁する。
開示された発明に記載された強磁性高密度粒子（１ｍｌのリン酸緩衝食塩水中に入れられた１００ｕｌ）は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎ４（Beckman Coulter, Miami, FL）を用いてサイズを計測した。磁場への暴露（点源または四極子）に引き続いて、第３の試料を渦処理によって再懸濁している間、第２の試料を単に反転させることによって再懸濁した。表４の結果は、単に反転させることは粒子を脱凝集するのに十分ではないが、渦処理すると粒子がそれらの元の非凝集した状態に戻ることを示す。従って、磁場は、超常磁性粒子に似た様式で、強磁性高密度粒子をもって、作業可能に克服され得る。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
約３−１０ミクロンの直径範囲の米国特許第５，７８６，１８５号；１１／１９９６； Coulter, W.らに開示のもののようなより大きい高密度粒子は、一旦磁場に置かれると、すぐに分散させることはできない（表５）。これらの粒子は、当該分野で知られる粒子サイズ計測器（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｎ４）を用いて粒子直径を決定するには大きすぎるが、それらの沈降特質は、磁場への暴露前および後に調べることができる。１００ｕｌの高密度粒子（ＩＮＣＯ  １２３；２０重量％／容量）を、１ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と混合し、重力によって沈降させた。第２の管を磁場に暴露し、磁性ペレットを単に反転させることによって再懸濁し、第３の管を磁場におき、ペレットを渦処理によって再懸濁した。表５において示されるように、約３ミクロンまたはそれ以上の直径を有する強磁性高密度粒子は、磁化されたままで、反転または渦処理によって分散させることはできない。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
実施例６
白血球選択は、強磁性高密度粒子の直径が減少するにつれて、抗原に富んだサブ集団に対して、より効率的になり、より選択的でなくなる。
３つの異なる粒子（直径、＞３．５ミクロン；２．４ミクロンおよび１．４５ミクロン）を抗−ＣＤ４５、パン白血球マーカーで標識した。白血球選択を、次の様式で、全血の１ｍｌ試料で実施した：１００ｕｌの各粒子溶液を３つの異なるガラス試験管（容量５ｍｌ）に添加した。管をペレットに分離し、粒子および上澄みを除去した。１ｍｌの全血を各管に添加した。管に蓋をし、５分間、３０ｒｐｍにて回転しながら混合した。管をロッカーから除去し、すぐに５分間、四極子磁石(Immunicon Corp. Huntingdon Valley, PA)に置いた。磁気分離の終わりにて、試料を除去し、血液学分析器(Sysmex KX-21, Roche Diagnostic Corp.)を用いて、白血球の存在につき分析した。結果（表６）は、白血球のＣＤ４５-粒子との選択は粒子サイズによって決まることを示す。全血中の白血球集団は、３つの主な集団よりなる：リンパ球、単球および顆粒球。３つの白血球集団上のＣＤ４５抗原密度は、規模の約１桁にわたり変動する。さらなる分析は（図６）、異なる直径の粒子と見受けられた選択における差は、抗原密度と相関していることを示した。
【００４９】
驚くべきことに、本発明の粒子は、全３集団につき選択するが（図６Ｃ）、米国特許第５，５７６，１８５号および同第６，０７４，８８４号(それぞれ、１１／１９９６； Coulter, W.らおよび０６／２０００ Siiman, O.ら)に記載されるもののようなより大きい粒子はリンパ球を効果的に選択するが、リンパ球より有意に低いＣＤ４５抗原密度を有する顆粒球を選択することはできない（図６Ｂ）。これらの細胞とでは、リンパ球−対−顆粒球のＣＤ４５抗原密度の割合は、１０対１である。すなわち、抗原密度の高−対−低割合が少なくとも約１０対１である時、本発明の強磁性高密度粒子は、リンパ球および顆粒球の両方を欠乏するだろうが、より大きい粒子はリンパ球のみを欠乏する。
【００５０】
【表６】
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【００５１】
実施例７
大きい強磁性高密度粒子は、好ましくは、同一の抗体に対して、高および低抗原密度の混合物を有する集団から、高抗原高密度細胞を除去する。
細胞を除去する能力は、抗原密度および粒子直径によって決まるため（実施例６参照）、より大きい粒子を使用して、より抗原高密度標的を選択することができる。特定の抗原に対する密度の範囲を有する細胞の集団内において、高抗原密度細胞の相対的な除去を可能にする直径を持つ粒子を選ぶことが可能である。例えば、ＰＣ３細胞、ＡＴＣＣから入手可能な前立腺癌細胞線は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現する。２つのサブ集団は、ＥｐＣＡＭ抗原密度に基づき識別可能である。比較的低いＥｐＣＡＭ抗原密度にて、ＥｐＣＡＭを発現するＰＣ３細胞を入手することが望ましかった。出発ＰＣ３集団は、それぞれ高抗原密度につき７０，０００−８０，０００分子／細胞および低抗原密度につき１５，０００−２０，０００分子／細胞を有する２５％高ＥｐＣＡＭ密度細胞および７５％低ＥｐＣＡＭ密度細胞で構成された。これらの細胞を約２．５ミクロン以上の直径を有する粒子で処理し、それに結合した抗−ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体に連結させた。混合および磁気分離に引き続いて、液体試料に残っている得られた細胞サブ集団は、９８．５％低ＥｐＣＡＭ抗原密度細胞で構成された（図示せず）。
【００５２】
実施例８
本発明の強磁性高密度粒子を使用して、遺伝子発見研究で使用される細胞の集団を選択的に豊富化することができる。
癌の初期検知用のより良い診断ツールを得るために、癌細胞の遺伝子プロファイル（つまり循環中の上皮癌細胞）を決定し、正常な／良性の細胞遺伝子プロファイルから癌細胞遺伝子プロファイルを識別できることが重要である。しばしば、液体試料（つまり、正常な／癌細胞の遺伝子プロファイルを決定するのに使用される全血）は、白血球でひどく汚染されている。従って、しばしば白血球より１００万倍低いレベルで存在する癌細胞を欠乏せずに、汚染する白血球を効果的に選択する必要性が当該分野に存在する。超常磁性粒子を超える強磁性高密度粒子のより大きい磁気誘引特質、および標的細胞の最小のキャリオーバのため、強磁性高密度粒子技術はこの適用に特に適している。ＣＤ４５−強磁性高密度粒子を使用して、８２０白血球／ｍｌないし４４白血球／ｍｌの特定の試料の白血球汚染を効果的に選択した。別個の実験において、上皮癌細胞を、ＣｅｌｌＰｒｅｐ／Ｃｅｌｌ  Ｓｐｏｔｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ(Kagan,ら, J. Clinical Ligand Assay, 2002, 25:105-110)によって検出されるように、前立腺癌患者からの７．５ｍｌ全血試料から豊富化した。試料は、血液の４０前立腺癌細胞／７．５ｍｌを有した。ＣＤ４５−強磁性高密度粒子による８０％白血球選択に引き続き、試料は血液の３５前立腺癌細胞／７．５ｍｌを有し、白血球減少は癌細胞の数を有意に改変しなかったことを示す（図示されず）。
【００５３】
実施例９
ＣＤ１５と複合化された高密度粒子は、細胞を含有するＣＤ１５抗原の非常に迅速な選択を提供する。
ＣＤ１５に対して抗原を含有する細胞の選択に、全血を使用した。様々な時間、１５０ｕｌの全血を５０ｕｌのＣＤ１５−ＦＤＰで混合した。高速渦処理または上下にピペッティングすることによって混合した後、試料を約１分間、磁場に置いた。血液学分析器(Sysnex KX-21, Roche Diagnostic Corp.)での分析は、約２秒ないし約２分の混合時間に対して、ＣＤ１５抗原を含有する顆粒球につき、＞９９％選択であった。特異的な細胞集団のそのような高速選択は、当該分野において示されていない（図７）。
【００５４】
実施例１０
本発明の高密度粒子は、重力によって分離するだろう。
重力、粒子分離用の２つの原理具体例のうちの１つは、白血球に対して効率的な選択を示した（表７）。十分な混合に引き続いて、高密度粒子、直径約１ミクロンを、（４ないし５分）間、重力によって沈降させた。表７はこの分離の結果を示す。一般に、重力分離は磁気分離より長い時間を要するが、両方の分離手順は、赤い細胞数に対する無いに等しい影響での選択後、同等量の白血球を得る（データ示さず）。
【００５５】
【表７】
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【００５６】
本発明は、その好ましい具体例に基づいて記載してきたが、本発明はそれによって限定されるものではなく、続く請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなしに、本明細書中に記載されるように、本発明の数多くの変化および修飾を考えることができることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本発明記載の高密度粒子による選択の２つの具体例の模式的ブロック図である。
【図２】図２は、乳癌患者から採取した血液中の強磁性高密度粒子とそれに結合した抗−ＣＤ１５抗体の混合からの顕微鏡分析（４００ｘ）によって観察された結果を示す。強磁性高密度粒子は癌細胞（標的集団）に結合するが、非標的集団と観察される結合はない。
【図３】図３は、血液学分析器で分析された血液の免疫磁気細胞選択の結果を示す。非処置血液試料は、顆粒球がリンパ球および単球と共に白血球の主なサブ集団であることを示す（パネルＡ）。抗−ＣＤ１５抗体を含有する強磁性高密度粒子は、非標的細胞集団からの喪失なしに標的顆粒球を特異的に除去する（パネルＢ）。
【図４】図４は、強磁性高密度粒子選択前（パネルＡ）、次いで、抗−ＣＤ１５を含有する強磁性高密度粒子による選択後（パネルＢ）、および抗−ＣＤ４５／４および抗−ＣＤ１５を含有する強磁性高密度粒子による選択後（パネルＣ）の血液試料のフロー血球計算の結果を示す。
【図５】図５は、開示されるように、本発明を用いて、全血試料と抗−ＣＤ４５を含有する強磁性高密度粒子による磁気分離の時間経過を示す。パネルＡは、非処理全血試料のプロファイルを示す。パネルＢは、強磁性高密度粒子による５分間磁気分離後のプロファイルを示す。パネルＣは、１分間の強磁性高密度粒子による磁気分離後に得られたプロファイルを示す。
【図６】図６は、血液試料中の白血球の選択に対する粒子サイズの効果を示す。パネルＡは、選択なしの全血の白血球プロファイルを示す。パネルＢは、抗−ＣＤ４５に連結した大きい（＞３０００ｎｍ）磁気粒子による選択後の白血球プロファイルを示す。パネルＣは、抗−ＣＤ４５に連結したより小さい１４００ｎｍ直径粒子による選択の結果を示す。
【図７】図７は、対照と比較した標的顆粒球選択に対するいくつかの混合時間の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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