(57)【要約】本発明は、インターフェロンガンマ（IFNG）活性を有する新規なインターフェロンガンマポリペプチド変異体、それらの調製方法、ポリペプチド変異体を含む医薬組成物、および疾患の処置、特に特発性肺繊維症のような間質性肺疾患の処置におけるそれらの使用、に関する。これらの新規なポリペプチド変異体はすべて、huIFNGまたはその断片のアミノ酸配列と比較して置換S99Tを含む。この変異を行うことにより、97位に存在する天然N-グリコシル化部位の利用が有意に改善する。変異体は、例えば皮下投与されたときのその変異体のAUCを改善するために、さらなる修飾を含むことが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロンガンマ（IFNG）活性を示し、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するIFNGポリペプチド変異体、またはIFNG活性を示すその断片。
【請求項２】
配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する請求項1記載の変異体。
【請求項３】
1から15のアミノ酸残基がC-末で切断されている、配列番号：１に示されるアミノ酸配列の断片である請求項1記載の変異体。
【請求項４】
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号１５および配列番号:16からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する断片である、請求項２記載の変異体。
【請求項５】
グリコシル化されている請求項１から４までのいずれか記載の変異体。
【請求項６】
さらなる修飾を少なくとも一つ含み、かつIFNG活性を示す、請求項１から５までのいずれか記載の変異体。
【請求項７】
配列番号：１に示されるアミノ酸配列に対して1から10の修飾を含む、請求項６記載の変異体。
【請求項８】
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号１５および配列番号:16からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して1から10の修飾を含む、請求項６記載の変異体。
【請求項９】
修飾が置換である請求項７または８記載の変異体。
【請求項１０】
非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基が少なくとも一つ導入され、および/または少なくとも一つ除去されている、請求項６から９までのいずれか記載の変異体。
【請求項１１】
グリコシル化部位が少なくとも一つ導入されている請求項１０記載の変異体。
【請求項１２】
グリコシル化部位がN-グリコシル化部位である請求項１１記載の変異体。
【請求項１３】
（本明細書の実施例１において規定される）側鎖の少なくとも25％が表面に露出しているアミノ酸残基を含む位置にN-グリコシル化部位が導入されている、請求項１２記載の変異体。
【請求項１４】
（本明細書の実施例１において規定される）側鎖の少なくとも50％が表面に露出しているアミノ酸残基を含む位置にN-グリコシル化部位が導入されている、請求項１３記載の変異体。
【請求項１５】
N-グリコシル化部位が置換により導入されている請求項１３または１４記載の変異体。
【請求項１６】
K12S、K12T、G18S、G18T、E38N、E38N+S40T、K61S、K61T、N85S、N85T、K94N、Q106SおよびQ106Tから成る群より置換が選択される、請求項１５記載の変異体。
【請求項１７】
K12T、G18T、E38N+S40T、K61T、N85T、K94NおよびQ106Tから成る群より置換が選択される、請求項１６記載の変異体。
【請求項１８】
置換がE38N+S40Tである請求項１７記載の変異体。
【請求項１９】
システイン残基が少なくとも一つ導入されている請求項１０記載の変異体。
【請求項２０】
（本明細書の実施例１において規定される）側鎖の少なくとも25％が表面に露出しているアミノ酸残基を含む位置にシステイン残基が導入されている、請求項１９記載の変異体。
【請求項２１】
（本明細書の実施例１において規定される）側鎖の少なくとも50％が表面に露出しているアミノ酸残基を含む位置にシステイン残基が導入されている、請求項２０記載の変異体。
【請求項２２】
システイン残基が置換により導入されている請求項２０または２１記載の変異体。
【請求項２３】
N10C、N16C、E38C、N59C、N83C、K94C、N104CおよびA124Cから成る群より置換が選択される、請求項２２記載の変異体。
【請求項２４】
システイン残基が非ポリペプチド部分に共有結合している請求項１９から２３までのいずれか記載の変異体。
【請求項２５】
非ポリペプチド部分がポリマー分子である請求項２４記載の変異体。
【請求項２６】
ポリマー分子が直鎖または分岐ポリエチレングリコールである請求項２５記載の変異体。
【請求項２７】
N-グリコシル化部位が少なくとも一つ導入され、かつシステイン残基が少なくとも一つ導入されている、請求項１０記載の変異体。
【請求項２８】
請求項１３から１８までのいずれかにて規定される位置にN-グリコシル化部位が導入され、かつ請求項２０から２３までのいずれかにて規定される位置にシステイン残基が導入される、請求項２７記載の変異体。
【請求項２９】
K12T+N16C、K12T+E38C、K12T+N59C、K12T+N83C、K12T+K94C、K12T+N104C、K12T+A124C、G18T+N10C、G18T+E38C、G18T+N59C、G18T+N83C、G18T+K94C、G18T+N104C、G18T+A124C、G18N+S20T+N10C、G18N+S20T+N16C、G18N+S20T+E38C、G18N+S20T+N59C、G18N+S20T+N83C、G18N+S20T+K94C、G18N+S20T+N104C、G18N+S20T+A124C、E38N+S40T+N10C、E38N+S40T+N16C、E38N+S40T+N59C、E38N+S40T+N83C、E38N+S40T+K94C、E38N+S40T+N104C、E38N+S40T+A124C、K61T+N10C、K61T+N16C、K61T+E38C、K61T+N83C、K61T+K94C、K61T+N104C、K61T+A124C、N85T+N10C、N85T+N16C、N85T+E38C、N85T+N59C、N85T+K94C、N85T+N104C、N85T+A124C、K94N+N10C、K94N+N16C、K94N+E38C、K94N+N59C、K94N+N83C、K94N+N104C、K94N+A124C、Q106T+N10C、Q106T+N16C、Q106T+E38C、Q106T+N59C、Q106T+N83C、Q106T+K94CおよびQ106T+A124Cから成る群より選択される置換を含む、請求項２８記載の変異体。
【請求項３０】
E38N+S40T+N10C、E38N+S40T+N16C、E38N+S40T+N59C、E38N+S40T+N83C、E38N+S40T+K94C、E38N+S40T+N104CおよびE38N+S40T+A124Cから成る群より選択される置換を含む、請求項２９記載の変異体。
【請求項３１】
システイン残基が非ポリペプチド部分に共有結合している請求項２７から３０までのいずれか記載の変異体。
【請求項３２】
非ポリペプチド部分が請求項２５から２６までのいずれかにて規定されている、請求項３１記載の変異体。
【請求項３３】
G26F、G26N、G26Y、G26Q、G26V、G26A、G26M、G26I、G26K、G26R、G26T、G26H、G26CおよびG26Sから成る群より選択される置換を含む、請求項６から３２までのいずれか記載の変異体。
【請求項３４】
G26A、G26M、G26I、G26K、G26R、G26T、G26H、G26CおよびG26Sから成る群より選択される置換を含む、請求項３３記載の変異体。
【請求項３５】
置換G26AまたはG26Sを含む、請求項３４記載の変異体。
【請求項３６】
置換G26Aを含む請求項３５記載の変異体。
【請求項３７】
N-グリコシル化部位が少なくとも一つ除去され、かつシステイン残基が少なくとも一つ導入されている、請求項１０記載の変異体。
【請求項３８】
N-グリコシル化部位が少なくとも一つ除去され、除去されたN-グリコシル化部位に占められていた位置とは異なる位置にN-グリコシル化部位が少なくとも一つ導入され、かつシステイン残基が少なくとも一つ導入されている、請求項３７記載の変異体。
【請求項３９】
システイン残基が非ポリペプチド部分に共有結合している、請求項３７または３８記載の変異体。
【請求項４０】
非ポリペプチド部分が請求項２５から２６までのいずれかにて規定されている、請求項３９記載の変異体。
【請求項４１】
請求項１から４０までのいずれか記載のポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列。
【請求項４２】
請求項４１記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項４３】
請求項４１記載のヌクレオチド配列または請求項４２記載の発現ベクターを含む、グリコシル化可能宿主細胞。
【請求項４４】
CHO細胞またはBHK細胞である、請求項４３記載の宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１から４０までのいずれか記載のIFNGポリペプチド変異体を少なくとも70％含むIFNGポリペプチド変異体の集合体、またはそのようなIFNGポリペプチド変異体の集合体を含む組成物。
【請求項４６】
請求項１から４０までのいずれか記載のポリペプチド変異体、および製薬的に許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項４７】
医薬として使用される請求項１から４０までのいずれか記載のポリペプチド変異体または請求項４６記載の医薬組成物。
【請求項４８】
間質性肺疾患を処置する医薬を製造するための、請求項１から４０までのいずれか記載のポリペプチド変異体または請求項４６記載の組成物の使用。
【請求項４９】
間質性肺疾患が特発性肺繊維症である、請求項４８記載の使用。
【請求項５０】
間質性肺疾患を処置または予防する方法であって、それを必要とする哺乳類、特にヒトに、有効量の請求項１から４０までのいずれか記載のポリペプチド変異体または請求項４６記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項５１】
間質性肺疾患が特発性肺繊維症である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
アミノ酸配列：N-X-S（式中、Xはプロリン以外のアミノ酸残基である）であるインビボN-グリコシル化部位を少なくとも一つ含む親IFNGポリペプチドのインビボN-グリコシル化の程度を増大させる方法であって、そのN-X-Sアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基と置換してIFNG変異体を得ることを含む方法。
【請求項５３】
親IFNGポリペプチドが配列番号：１７に示されるアミノ酸配列を有する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
親IFNGポリペプチドが、1から15アミノ酸残基がC-末で切断されている配列番号：１７に示されるアミノ酸配列の断片である、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
該断片が、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２および配列番号：３３から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
(a) 請求項１から４０までのいずれか記載のIFNGポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列を含むグリコシル化可能宿主細胞を、ポリペプチド変異体の発現を誘導する条件下で培養し、
(b)任意に、該ポリペプチド変異体を非ポリペプチド部分と結合が起こるよう誘導する条件にインビトロで反応させ、そして
(c)該ポリペプチド変異体を回収する、
ことを含む、請求項１から４０までのいずれか記載のIFNGポリペプチド変異体を産生する方法。
【請求項５７】
(a) 請求項１から４０までのいずれか記載のIFNGポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列を含むグリコシル化可能宿主細胞を、ポリペプチド変異体の発現を誘導する条件下で培養し、
(b)該ポリペプチド変異体を非ポリペプチド部分と結合が起こるよう誘導する条件下にインビトロで反応させ、そして
(c)該ポリペプチド変異体を回収する、
ことを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
該変異体が請求項１９から４０までのいずれか記載のものである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
(a) 請求項１から４０までのいずれか記載のIFNGポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列を含むグリコシル化可能宿主細胞を、ポリペプチド変異体の発現を誘導する条件下で培養し、そして
(b)該ポリペプチド変異体を回収する、
ことを含む、請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
該ポリペプチド変異体が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号１５および配列番号:16から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する請求項６１記載の方法。
【請求項６１】
該変異体がさらなる修飾を少なくとも一つ含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
該変異体が請求項１１から１８まで、または３３から３６までのいずれか記載のものである、請求項６０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロンガンマ（IFNG）活性を有する新規なインターフェロンガンマポリペプチド変異体、それらの調製方法、該ポリペプチド変異体を含む医薬組成物、および疾患の処置、特に特発性肺線維症のような間質性肺疾患におけるそれらの使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
インターフェロンガンマ（IFNG）は、T細胞およびナチュラルキラー細胞より産生されるサイトカインであり、二つの非共有結合ポリペプチドサブユニットのホモダイマーとして存在する。各ダイマーの成熟型は143アミノ酸残基を含み（配列番号：１７に記載）、その前駆体形態は166アミノ酸残基を含む（配列番号：１８に記載）。
各サブユニットは、25位および97位の二つにN-グリコシル化可能部位を有する(Aggarwal et al., Human Cytokines, Blackwell Scientific Publications, 1992)。グリコシル化の程度に依存して、二量体型のIFNGの分子量は34-50kDaである(Farrar et al., Ann. Rev. Immunol, 1993, 11:571-611)。
野生型ヒトIFNG（huIFNG）の一次配列は、Gray et al. (Nature 298:859-863, 1982)、Taya et al. (EMBO J. 1:953-958, 1982)、Devos et al. (Nucleic Acids Res. 10:2487-2501, 1982)およびRinderknecht et al. (J. Biol. Chem. 259:6790-6797, 1984)により、並びにEP 0 077 670、EP 0 089 676およびEP 0 110 044において報告された。huIFNGの三次元構造は、Ealick et al. (Science 252:698-702, 1991)により報告された。
【０００３】
様々な天然型または変異型IFNGサブユニットポリペプチドが報告されており、それらにはCys-Tyr-Cys のN-末アミノ酸配列(配列番号：１７に対して(3)から(-1)位）を含むもの、 N-末メチオニン(配列番号：１７に対して1位）を含むもの、および127から134アミノ酸残基を含む様々なC-末切断型、が含まれる。1-15 アミノ酸残基は、分子のIFNG活性を消失させることなくC-末端から除去できることが知られている。さらに、huIFNGのC-末端の異形遺伝子性が、Pan et al. (Eur. J. Biochem. 166:145-149, 1987)により記載された。
HuIFNGムテインが、Slodowski et al. (Eur. J. Biochem. 202 :1133-1140, 1991)、Luk et al. (J. Biol. Chem. 265:13314-13319, 1990)、Seelig et al., (Biochemistry 27:1981-1987, 1988)、Trousdale et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 26:1244-1251, 1985)により、およびEP 146354において報告された。天然huIFNG変異体はNishi et al. (J. Biochem. 97:153-159, 1985)により報告された。
【０００４】
US 6,046,034 は、ジスルフィド橋形成を可能にしてIFNG変異体をホモダイマー型で安定化するためシステイン残基が４組まで組み込まれた、熱安定組換えhuIFNG (rhuIFNG)変異体を開示する。
WO 92/08737 は、野生型ヒトIFNGの全（1-143残基）または部分（1-132残基）アミノ酸配列のN-末端に付加されたメチオニンを含むIFNG変異体を開示する。EP 0 219 781 は、（配列番号：１７の）アミノ酸残基3-124を含む部分huIFNG配列を開示する。US 4,832,959 は、配列番号：１７と比較して三つのさらなるN-末アミノ酸残基(Cys-Tyr-Cys)を有するアミノ酸配列の残基1-127、5-146および5-127を含む部分huIFNG配列を開示する。US 5,004,689 は、3 N-末アミノ酸残基(Cys-Tyr-Cys)を除くhuIFNG をコードするDNA配列および大腸菌でのその発現を開示する。EP 0 446 582 は、N-末メチオニンを含まない大腸菌産生rhuIFNGを開示する。 US 6,120,762 は、（配列番号：１８に対して）その残基95-134を含むhuIFNGのペプチド断片をを開示する。
【０００５】
rhuIFNGの高レベル発現は、Wang et al. (Sci. Sin. B 24:1076-1084, 1994)により報告された。
rhuIFNGのグリコシル化変異は、Curling et al. (Biochem. J. 272 :333-337, 1990)およびHooker et al.(J. of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18: 287-295)により報告されている。
rhuIFNGのポリマー修飾は、Kita et al. (Drug Des. Deliv. 6 :157-167, 1990)により、およびEP 236987ならびにUS 5109120において報告された。
WO 92/22310は、インターフェロン、とりわけhuIFNGの、アシアログリコプロテイン結合誘導体を開示する。
IFNG融合タンパク質が記載されている。例えば、EP 0 237 019 は、インターフェロンβ活性を示す領域およびIFNG活性を示す一領域を有する単一鎖ポリペプチドを開示する。
EP 0 158 198 は、IFNG活性を示す領域およびIL-2活性を示す領域を有する単一鎖ポリペプチドを開示する。いくつかの参考文献、例えばLandar et al. (J. Mol. Biol., 2000, 299:169-179)に、単一鎖二量体IFNGタンパク質が記載された。
WO 99/02710 は、多くの中の一例でIFNGである単一鎖ポリペプチドを開示する。
【０００６】
WO 99/03887 は、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのPEG化変異体を開示し、ここでは、ポリペプチドの特定の領域に位置する非必須アミノ酸残基はシステイン残基と置換されている。IFNGは、成長ホルモンスーパーファミリーのメンバーの一例として示されているが、その修飾については詳しく議論されていない。
IFNGは間質性肺疾患（間質性肺繊維症 (IPF)としてもまた知られる）に対する処置が提案されており (Ziesche et al. (N. Engl. J. Med. 341:1264-1269, 1999およびChest 110:Suppl:25S, 1996)およびEP 0 795 332)、その目的のためIFNGはプレドニゾロンと組み合わせて使用可能である。IPFに加えて、肉芽腫性疾患(Bolinger et al, Clinical Pharmacy, 1992, 11:834-850)、ある種の微生物感染(N. Engl. J. Med. 330:1348-1355, 1994)、腎臓癌(J. Urol. 152:841-845, 1994)、骨粗鬆症 (N. Engl. J. Med. 332:1594-1599, 1995)、強皮症(J. Rheumatol. 23:654-658, 1996)、B型肝炎(Hepatogastroenterology 45:2282-2294, 1998)、C型肝炎(Int. Hepatol. Communic. 6:264-273, 1997)、敗血性ショック(Nature Medicine 3:678-681, 1997)、および慢性関節リウマチが、IFNGにより処置できる。
【０００７】
医薬化合物としてのrhuIFNGの使用は、とりわけある種のウィルス感染および腫瘍に対してはある程度成功している。rhuIFNGは通常非経口注射が可能であり、皮下注射が好ましい。最大血清濃度は7時間後に見られている。血漿中での半減期は静脈内投与後30分である。このため、rhuIFNGによる有効な処置には頻回注射が必要である。主な副作用は、熱、寒気、発汗、頭痛、筋肉痛および眠気より成る。これらの作用は、rhuIFNGを注射することに関係し、注射後初めの数時間以内に観察される。まれな副作用は、局所痛ならびに局所紅斑、肝酵素の上昇、可逆的顆粒球減少ならびに血小板減少、および心毒性である。
【０００８】
WO 01/36001はIFNGポリペプチドに連結した非ポリペプチド部分を含む新規なIFNG結合体を開示し、そのIFNGポリペプチドは、このような非ポリペプチド部分、例えばPEGに対する連結部位およびグリコシル化部位を導入および/または欠失して修飾されている。
IFNGのようなN-グリコシル化分子をグリコシル化可能宿主細胞にて生産する場合、すべてのN-グリコシル化可能部位が完全に利用される訳ではないことはよく知られている。これは、インビボN-グリコシル化の程度が様々なタンパク質の混合物が得られることが頻繁になることを意味し、結果としてその後の精製が必須となる。さらに、グリコシル化の程度が様々な同一のタンパク質を分離するのは時間がかかり面倒である。驚くことに、インビボN-グリコシル化部位に近接する一つまたはそれ以上のアミノ酸残基を置換することにより（該インビボN-グリコシル化部位が天然IFNGに存在するか、WO 01/36001に記載されるように導入されているかに関わらず）、得られる完全グリコシル化IFNG分子の画分を増加させることが可能であることが現在明らかになっている。特に、hIFNGの97、98、および99位における天然N-グリコシル化部位N-Y-SをN-Y-Tに変えることで、完全グリコシル化IFNG分子の画分が劇的に増加することが見出されている。
【０００９】
発明の簡単な説明
従って、第一の局面において本発明は、IFNG活性を示し、配列番号：１に記載されるアミノ酸配列を有するインターフェロンガンマ（IFNG）ポリペプチド([S99T]huIFNG)、またはIFNG活性を示すその断片に関する。
さらなる局面において本発明は、配列番号：１の断片（例えば配列番号：２−１６）の変異体を含む配列番号：１の変異体に関し、ここで該変異体は少なくとも一つさらなる修飾を含み、IFNG活性を示す。
さらなる局面において本発明は、本発明のポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列に関する。
さらなる局面において本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および本発明のヌクレオチド配列または本発明の発現ベクターを含むグリコシル化可能宿主細胞に関する。
【００１０】
本発明はまた、本発明のポリペプチ変異体を含む医薬組成物、本発明のポリペプチド変異体、または医薬として使用するための本発明の医薬組成物に関する。
本発明のさらなる局面は、間質性肺疾患処置のための医薬を製造するための本発明のポリペプチド変異体の使用または本発明の医薬組成物の使用に関する。
同様に、本発明はまた、間質性肺疾患を処置または予防する方法に関し、該方法は、それを必要とする哺乳類、特にヒトに、有効量の本発明のポリペプチド変異体または本発明の医薬組成物を投与することを含む。
本発明のさらなる局面は、IFNGポリペプチド変異体の集合体、またはIFNGポリペプチド変異体の集合体を含む組成物に関し、ここで該集合体は、本発明のIFNGポリペプチド変異体を少なくとも70％含む。
【００１１】
別の局面において本発明は、Xがプロリン以外のいずれかのアミノ酸残基であるアミノ酸配列：N-X-SのインビボN-グリコシル化部位を少なくとも一つ含む親IFNGポリペプチドの、インビボN-グリコシル化の程度を増加する方法に関し、該方法は、IFNG変異体を得るため該N-X-Sアミノ酸配列中のセリン残基をスレオニン残基と置換することを含む。
さらなる別の局面において本発明は、本発明のIFNGポリペプチド変異体を産生する方法に関し、該方法は、
(a)本発明のIFNGポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列を含むグリコシル化可能宿主細胞を、ポリペプチド変異体の発現を誘導する条件下で培養し、
(b)任意に、該ポリペプチド変異体を非ポリペプチド部分と結合が起こるよう誘導する条件下にインビトロで反応させ、そして
(c)該ポリペプチド変異体を回収することを含む。
本発明の他の局面は、以下の記載から明らかであろう。
【００１２】
発明の詳しい説明
定義
本出願および発明に関して、以下の定義が適用される：
「結合体」（互換的に「結合型ポリペプチド」または「結合型変異体」）なる用語は、一つまたはそれ以上のポリペプチド変異体のひとつまたはそれ以上の非ポリペプチド部分部分に対する共有結合的連結により形成される、（合成の、またはキメラの、という意味において）異種性の分子を意味する。共有結合的連結とは、ポリペプチド変異体と非ポリペプチド部分が直接にお互い共有結合するか、でなければ一つまたは複数の介在部分、例えば一つまたは複数の架橋、スペーサー、または連結部分を介して、間接的にお互い共有結合することを意味する。結合型ポリペプチド変異体は、適当な濃度および条件で可溶性、即ち血液のような生理液中で可溶性であることが好ましい。本発明の結合型ポリペプチド変異体の例としては、グリコシル化および/またはPEG化ポリペプチド変異体が含まれる。「非結合型ポリペプチド変異体」なる用語は、結合型ポリペプチド変異体のポリペプチド部分について使用される場合がある。
【００１３】
「非ポリペプチド部分」なる用語は、IFNGポリペプチド変異体の連結基に結合可能な分子を意味する。そのような分子の好ましい例として、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分または有機誘導化物質が含まれる。非ポリペプチド部分は、ポリペプチド変異体の連結基を介してそのポリペプチドに結合すると解されるであろう。IFNGポリペプチド変異体に連結する非ポリペプチド部分、例えばポリマー分子、の数が表現上示されている場合を除き、IFNGポリペプチド変異体に連結する、またはその他本発明において使用される「非ポリペプチド部分」の言及は常に、IFNGポリペプチド変異体に連結する一つまたはそれ以上の非ポリペプチド部分を意味する。
【００１４】
「ポリマー分子」なる用語は、二つまたはそれ以上の単量体の共有結合によって形成される分子と規定され、ここではいずれの単量体もアミノ酸残基ではない。「ポリマー」は「ポリマー分子」なる用語と互換的に使われ得る。
「糖部分」なる用語は、N-またはO-グリコシル化のようなインビボまたはインビトログリコシル化によって付加された炭水化物分子を意味する。
「N-グリコシル化部位」は、N-X-S/T/C''の配列を有し、Xはプロリン以外のアミノ酸残基であり、Nはアスパラギンであり、S/T/Cはセリン、スレオニンまたはシステインであり、好ましくはセリンまたはスレオニン、より好ましくはスレオニンである。「O-グリコシル化部位」は、セリンまたはスレオニンのOH基である。
【００１５】
「連結基」なる用語は、ポリマー分子または糖部分のような適当な非ポリペプチド部分に結合可能なポリペプチドのアミノ酸残基の基を意味する。有用な連結基およびそれらの適合する非ポリペプチド部分は、以下の表より明らかである。
2005518183.tif 000002
【００１６】
インビボN-グリコシル化において、「連結基」なる用語はN-グリコシル化部位を構成する複数のアミノ酸残基を示すという特別な意味で用いられる（このN-グリコシル化部位はN-X-S/T/Cの配列を持ち、Xはプロリン以外のアミノ酸残基であり、Nはアスパラギンであり、S/T/Cはセリン、スレオニンまたはシステインであり、好ましくはセリンまたはスレオニン、より好ましくはスレオニンである）。N-グリコシル化部位のアスパラギン残基はグリコシル化において糖部分が連結する部分であるが、そのような結合はN-グリコシル化部位のその他のアミノ酸残基が存在しなければ起こり得ない。つまり、非ポリペプチド部分が糖部分であり結合がN-グリコシル化によってなされる場合、IFNGポリペプチドのアミノ酸配列の変化に関連して使用される「非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基」なる用語は、機能的N-グリコシル化部位がそのアミノ酸配列に導入されるか、該アミノ酸配列から除去されるか、または（例えば、すでにN-グリコシル化部位を構成するセリン残基をスレオニン残基と置換することにより、または逆も同様にして）機能的N-グリコシル化部位はそのアミノ酸配列に保持されるかたちで変化を受けるN-グリコシル化部位を構成する、一つ、二つまたはすべてのアミノ酸残基と解されるべきである。
【００１７】
本出願において、アミノ酸名および原子名（例えばCA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、Cなど）はthe Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org)に規定されるとおり使用され、それはIUPAC nomenclature (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (残基名、原子名など), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984)（Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)において訂正）)に基づいている。CAは時折Cαと、CBはCβと呼ばれる。「アミノ酸残基」なる用語は、アラニン（AlaまたはA）、システイン（CysまたはC）、アスパラギン酸（AspまたはD）、グルタミン酸（GluまたはE）、フェニルアラニン（PheまたはF）、グリシン（GlyまたはG）、ヒスチジン（HisまたはH）、イソロイシン（IleまたはI）、リジン（LysまたはK）、ロイシン（LeuまたはL）、メチオニン（MetまたはM）、アスパラギン（AsnまたはN）、プロリン（ProまたはP）、グルタミン（GlnまたはQ）、アルギニン（ArgまたはR）、セリン（SerまたはS）、スレオニン（ThrまたはT）、バリン（ValまたはV）、トリプトファン（TrpまたはW）、およびチロシン（TyrまたはY）残基からなる群のうちに含まれるアミノ酸残基を意味する。
本明細書中のアミノ酸残基の番号付けは、シグナルペプチドを除いた[S99T]huIFNG（即ち配列番号：１）のN-末からなされるか、または適当な場合には、シグナルペプチドを除いたhuIFNG（即ち配列番号：１７）のN-末からなされる。
【００１８】
アミノ酸の位置/置換を同定するために使用される用語は以下のように示される：G18は、配列番号：１または配列番号：１７に示されるアミノ酸配列における18位がグリシン残基に占められていることを意味する。G18Nは、18位のGly残基がAsnと置換されていることを意味する。複数の置換は「+」で示され、例えばG18N+S20Tは、18位のGly残基のAsnとの置換および20位のSer残基のThrとの置換を含むアミノ酸配列を意味する。択一的置換は「/」とともに示される。例えば、G18S/T は、以下の個々の置換に及ぶ: G18S および G18T。欠失はアスタリクスにより示される。例えば、G18* は18位のGly残基が欠失していることを意味する。挿入は以下のように示される： 18位のGly残基の後へのさらなるSer残基の挿入は、G18GSのように示される。置換および挿入の複合は、以下のように示される: 18位のGly 残基のSer残基との置換および18位のアミノ酸残基の後へのAla残基の挿入は、G18SAのように示される。
【００１９】
「ヌクレオチド配列」なる用語は、二つまたはそれ以上の核酸分子の連続したひと続きを意味する。ヌクレオチド配列はゲノム、cDNA、ＲＮＡ、半合成、合成由来のもの、またはそれらの組み合わせのものがあり得る。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」なる用語は一般に、例えばUS 4,683,195に記載されるように所望のヌクレオチド配列をインビトロで増幅する方法を呼ぶ。通常、PCR法はプラマー伸長合成の繰り返しサイクルに関与し、鋳型核酸に選択的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。
「細胞」、「宿主細胞」、「株化細胞」、および「細胞培養物」はここでは互換的に使用され、それらすべての語句は、一つの細胞の成長もしくは培養により得られる子孫を含むと解されなければならない。「形質転換」および「トランスフェクション」は、DNAを細胞に導入する工程を呼ぶために互換的に使用される。
【００２０】
「作動可能に結合された」とは、酵素的ライゲーションもしくはその他の手段により、その配列の正常な機能が発揮されるように互いに関連ある立体配置でなされた二つまたはそれ以上のヌクレオチド配列の共有結合を指す。例えば、先行配列または分泌リーダーをコードする配列は、ポリペプチドに対するヌクレオチド配列と結合した場合に分泌可能なタンパク質前駆体が発現されるならば、そのポリペプチドに対するヌクレオチド配列に作動可能に結合されている。プロモーターまたはエンハンサーは、あるコード配列の転写に影響する場合には、その配列に作動可能に結合されている。リボソーム結合部位は、トランスロケーションを促進するような位置にある場合、あるコード配列に作動可能に結合している。一般に、「 作動可能に結合された」とは結合されたヌクレオチド配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合には、連続しかつ読み枠内にあること意味する。結合は適切な制限酵素部位におけるライゲーションによってなされる。そのようは部位が存在しない場合には、標準的なDNA組換技術と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００２１】
「修飾」なる用語は、本明細書で使用されるときには、置換、挿入および欠失に及ぶ。
「変異」および「置換」なる用語は、本明細書では互換的に使用される。
「導入する」なる用語は、原則として既存のアミノ酸残基の置換を意味するが、しかしまたさらなるアミノ酸残基の挿入を意味する場合がある。
「除去する」なる用語は、原則として除去されるべきアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換することを意味するが、しかしまた（置換を伴わずに）除去されるべきアミノ酸残基を欠失することを意味する場合がある。
「非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基」なる用語は、そのアミノ酸残基が、非ポリペプチド部分が結合するか（導入されたアミノ酸残基である場合）、または結合したであろう（除去されたアミノ酸残基である場合）ものであることを意味する。
【００２２】
「一つの相違」または「〜と相違する」とは、具体的な突然変異と関連して使用されるとき、その具体的なアミノ酸の相違とは別の、更なる相違の存在を許容することを意味する。従って、グリコシル化部位の利用の最適化または非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基の除去および/または導入を目的とする本明細書に開示されるアミノ酸残基変化に加えて、IFNGポリペプチド変異体は、望むならばそのような変化に関しないその他の修飾を含むことができる。例えばC-末の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基の切断、N-末および/またはC-末における一つまたはそれ以上の追加残基の付加、例えばN-末へのMet残基の付加、N-末におけるアミノ酸配列Cys-Tyr-Cysの付加、および「保守的アミノ酸置換」、すなわち似た性質のアミノ酸、例えば小アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸および芳香族アミノ酸の群内で行う置換、がこれらに含まれ得る。本発明における保守的アミノ酸置換の例は、特に以下の表にあげられる群から選択することができる。
2005518183.tif 000003
「少なくとも一つ」なる用語は、非ポリペプチド部分、アミノ酸残基、置換などについて使用されるときには、一つまたはそれ以上を意味する。
【００２３】
「AUCsc」または「皮下投与時の曲線下面積」なる用語は、その通常の意味において、即ち血清-時間曲線においてIFNG活性に基づく面積として使用され、ここでIFNGポリペプチド変異体は、皮下投与、特にラットにおいて皮下投与されている。いったん実験的IFNG活性-時間ポイントが決定されると、AUCscはGraphPad Prism 3.01のようなコンピュータープログラムにより簡便に計算することができる。
【００２４】
「機能的インビボ半減期」なる用語は通常の意味で用いられ、すなわち、ポリペプチドの生物学的活性の５０％が体または対象臓器に残存する時点、またはポリペプチドの活性が最初の値の５０％である時点をいう。機能的インビボ半減期を測定する代わりに「血清半減期」を測定してもよく、これはポリペプチドの５０％が血漿もしくは血流中をクリアランスされずに循環している時点である。血清半減期の測定は機能的インビボ半減期を測定するよりも単純であり、血清半減期の大きさは大抵の場合機能的インビボ半減期の適当な指標である。血清半減期に代わる語句には、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」が含まれる。血清半減期は、ラットにおいて都合よく測定することができる（本明細書の材料と方法の節参照）。「血清半減期」なる用語は、本明細書において所定のIFNGポリペプチド変異体について使用されるときは、静脈内投与された試料について測定されなければならないことに留意する。「血清」なる用語は、通常の意味において、即ちフィブリノーゲンおよび他の凝固因子を除く血漿として使用される。
【００２５】
ポリペプチドは通常、細網内皮系（RES)、腎臓、脾臓または肝臓のうち一つまたはそれ以上の機能、または特異的または非特異的な蛋白分解によりクリアランスされる。「腎クリアランス」なる用語は、腎臓でおこるいずれのクリアランスをも意味する通常の意味で用いられ、それは例えば糸球体濾過、尿細管排泄または尿細管除去である。通常、腎クリアランスは、分子量、大きさ（糸球体濾過のカットオフに関連する）、対称性、形状/硬性、電荷、連結炭水化物鎖、およびそのポリペプチドに対する細胞受容体の存在を含む、そのポリペプチドの物理学的性質に依存する。約６７kDaの分子量は通常腎クリアランスのカットオフ値であると考えられる。腎クリアランスは適当なアッセイ、例えば確立されたインビボアッセイで測定できる。例えば、腎クリアランスは、標識（例えば放射性標識または蛍光標識）された結合型ポリペプチドを患者に投与し、その患者から採取された尿における標識活性を測ることにより測定できる。腎クリアランスの減少は、huIFNG、[S99T]huIFNGまたはActimmune（登録商標）のような参考分子と比較して測定する。残存する機能は、通常、抗ウィルス、抗増殖、免疫調節またはIFNG受容体結合活性から選択される。
【００２６】
機能的インビボ半減期または血清半減期について使用されるとき「増加した」なる用語は、静脈内投与し同等の条件下で測定した場合に、IFNG変異体の相当な半減期がグリコシル化huIFNG(配列番号：17)、グリコシル化[S99T]huIFNG(配列番号：1)またはActimmune（登録商標）(配列番号：34、大腸菌において産生)のような参考分子のそれと比較して、統計学上有意に増加していることを意味するため用いられる。従って、興味深いIFNGポリペプチド変異体は、上記の参考分子のいずれかと比較して増加した機能的インビボ半減期または増加した血清半減期を有するような変異体である。
さらにとりわけ興味深いIFNGポリペプチド変異体は、静脈内投与、特にラットにおいて静脈内投与したとき、該変異体の血清半減期（または機能的インビボ半減期）とグリコシル化型のhuIFNGまたは[S99T]huIFNGの血清半減期（または機能的インビボ半減期）の比率が少なくとも1.25、より好ましくは少なくとも1.75のように少なくとも1.50、例えば少なくとも2、より一層好ましくは少なくとも4のように少なくとも3、例えば少なくとも5であるような変異体である。
興味深いIFNG変異体の他の例は、静脈内投与、特にラットにおいて静脈内投与したとき、該変異体の血清半減期（または機能的インビボ半減期）とActimmune（登録商標）(配列番号：34 、大腸菌において産生)の血清半減期（または機能的インビボ半減期）の比率が少なくとも2、より好ましくは少なくとも4のように少なくとも3、例えば少なくとも5、より一層好ましくは少なくとも7のように少なくとも6、例えば少なくとも8、もっとも好ましくは少なくとも10のように少なくとも9であるような変異体である。
【００２７】
AUCscについて使用される「増加した」なる用語は、皮下投与したとき本発明のIFNG変異体についての曲線下面積が、同等の条件下で測定した場合に、グリコシル化huIFNG (配列番号：17)、グリコシル化[S99T]huIFNG (配列番号：1)またはActimmune（登録商標）(配列番号：34 、大腸菌において産生)のような参考分子のそれと比較して、統計学上有意に増加していることを意味するのに用いられる。従って好ましいIFNG変異体は、上記の参考分子いずれかと比較して増加したAUCscを有するような変異体である。当然、同じIFNG活性量の本発明のIFNG変異体および参考分子が投与されなければならない。結果的に、異なるIFNG分子間で直接比較するために、AUCsc値は標準化でき、即ちそれらはAUCsc /投与量で表すことができる。
【００２８】
特定の好ましいIFNG変異体は、特にラットにおいて（皮下）投与したとき、該変異体のAUCscとグリコシル化huIFNGまたはグリコシル化[S99T]huIFNGのAUCscの比率が、少なくとも1.5のように少なくとも1.25、例えば少なくとも2、より好ましくは少なくとも4のように少なくとも3、例えば少なくとも5または少なくとも6、より一層好ましくは少なくとも8のように少なくとも7、例えば少なくとも9または少なくとも10、最も好ましくは少なくとも14のように少なくとも12、例えば少なくとも16、少なくとも18または少なくとも 20、のような変異体である。
特定の好ましいIFNG変異体の他の例は、特にラットにおいて（皮下）投与したとき、該変異体のAUCscとActimmune（登録商標）のAUCscの比率が、少なくとも100、より好ましくは少なくとも200のように少なくとも150、例えば少なくとも250、より一層好ましくは少なくとも400のように少なくとも300、例えば少なくとも500、最も好ましくは少なくとも1000のように少なくとも750、例えば少なくとも1500または少なくとも2000、のような変異体である。
【００２９】
「Tmax,sc」なる用語は、血清-時間曲線でのIFNG活性において血清中で最も高いIFNG活性が観察される時間について使用される。好ましい本発明のIFNG変異体は、Actimmune（登録商標）と比較して、および/またはグリコシル化huIFNGと比較して、増加したTmax.scを有するような変異体である。さらにとりわけ、このような好ましい変異体は、(ラットにおける皮下投与後測定したとき)少なくとも250分のように少なくとも200分、例えば少なくとも300分、より好ましくは少なくとも400分のように少なくとも350分のTmax,scを有する。
【００３０】
「減少した免疫原性」とは、同等の条件下で測定した場合に、IFNGポリペプチド変異体が引き起こす免疫応答が参考分子、例えばhuIFNGまたはActimmune（登録商標）より測定可能なほど低いことを意味するものである。免疫応答は細胞または抗体仲介応答であり得る（さらなる免疫原性の解説は例えばRoitt: Essential Immunology (8th Edition, Blackwell)参照）。通常、減少した抗体反応性は減少した免疫原性の現れである。減少した免疫原性は、当業界にで既知の適した方法、例えばインビボまたはインビトロで測定できる。
【００３１】
本明細書において「増大したグリコシル化」、「増大したインビボN-グリコシル化の程度」または「増大したN-グリコシル化の程度」なる用語は、連結した炭水化物分子の増大したレベルを意味し、通常より多くの（またはよりよい）グリコシル化部位の利用の結果として得られる。huIFNGをCHO細胞で発現させたとき、約50％のIFNG分子しか両グリコシル化部位を利用せず、約40％が一つのグリコシル化部位を利用し（1N）、かつ約10％はグリコシル化されない（0N）ことがよく知られている(Hooker et al., 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287-295 and Sarenva et al., 1995, Biochem J., 308, 9-14)。増大したインビボN-グリコシル化の程度は、当業界にて既知の適した方法、例えばSDS-PAGEにより測定できる。増大したグリコシル化を測定するのに好都合なあるアッセイが、本明細書の材料と方法の節の「増大したグリコシル化の測定」と題される節に記載されている。
【００３２】
本明細書において使用されるとき「IFNGポリペプチド変異体の集合体」または「IFNGポリペプチド変異体の集合体を含む組成物」なる用語は、グリコシル化の程度が異なるIFNGポリペプチドを少なくとも二つ含む組成物に及ぶことを意味する。本発明は、集合体に存在する完全グリコシル化IFNG分子の量が増大しているIFNGポリペプチドの集合体を得るための手段を提供すると解されるであろう。
従って本発明はまた、本発明のIFNGポリペプチドの同種集合体（すなわちほとんどのIFNGポリペプチドが完全にグリコシル化している集合体）、または本発明のIFNGポリペプチドの同種集合体を含む組成物に関する。例えば、IFNGポリペプチドの集合体は、本発明のIFNGポリペプチドを少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％のように少なくとも75％、例えば少なくとも85％、より好ましくは少なくとも95％のように少なくとも90％、例えば少なくとも96％、より一層好ましくは少なくとも98％のように少なくとも97％、例えば少なくとも99％含み得る。
【００３３】
「IFNG活性を示す」なる用語は、ポリペプチド変異体が未変性huIFNGまたはrhuIFNGの機能の一つまたはそれ以上を有することを意味し、それにはインビトロまたはインビボで測定したときのIFNG受容体への結合能およびその受容体へのhuIFNG結合に際し伝えられるシグナルの伝達を引き起こす能力（即ちインビトロまたはインビボ生物活性）が含まれる。IFNG受容体は、Aguet et al. (Cell 55:273-280, 1988)およびCalderon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4837-4841, 1988)により説明されている。IFNG活性を試験するのに適したアッセイは、本明細書に開示される「一次アッセイ」と題されるアッセイである。 本明細書に記載される「一次アッセイ」を使用するとき、「IFNG活性を示す」ポリペプチド変異体は、rhuIFNGと比較して少なくとも5％の特異的活性を有する。どの具体的修飾を行ったかに依存して、例えば変異体がPEG化されているかそうでないかで、活性が広い範囲にわたることがあることは理解されるであろう。従って特異的活性の例は、rhuIFNGと比較したとき5％の低さから150％の高さの範囲にわたり得る。例えば、特異的活性はrhuIFNGの特異的活性と比較したとき、少なくとも15％(例えば15-125％)のように少なくとも10％(例えば10-125％)、例えば(20-125％のように)少なくとも20％、少なくとも25％(例えば25-125％)、少なくとも30％(例えば30-125％)、少なくとも35％(例えば35-125％)、少なくとも40％(例えば40-125％)、少なくとも45％(例えば45-125％)、少なくと50％(例えば50-125％)、少なくとも55％(例えば55-125％)、少なくとも60％(例えば60-125％)、少なくとも65％(例えば65-125％)、少なくとも70％(例えば70-125％)、少なくとも75％(例えば75-125％)、少なくとも80％(例えば80-125％)または少なくとも90％(例えば90-110％)であり得る。
【００３４】
「IFNGポリペプチド」はIFNG活性を示すポリペプチドであり、すなわち「IFNGポリペプチド」なる用語は、該IFNG分子が本明細書に規定されるIFNG活性を示す限り（この分子がhuIFNGであるかその切断型であるか、またはその変異体であるかに関わりなく）いずれのIFNG分子についても用いられる。「IFNGポリペプチド」なる用語は、本明細書中では場合により単量体または二量体型のポリペプチドについて使用される。例えば、具体的な置換が示されるときは、これらはhuIFNGポリペプチド単量体に対して示される。本発明のIFNG分子について述べるときは、これは通常二量体型である（つまり例えば記載のように修飾された二つのIFNGポリペプチド単量体を含む）。IFNGポリペプチドの二量体型は、二つの単量体の普通の会合により、または単一鎖二量体IFNGポリペプチドの形態で提供され得る。
「親」なる用語は、グリコシル化部位を有するよう本発明に従い改良されたIFNGポリペプチドを意味する。本発明に従い修飾される親ポリペプチドはIFNG活性を有するポリペプチドであればよく、従って例えば非ヒト哺乳動物由来のようにいずれ由来のものであってもよいが、親ポリペプチドは配列番号：１７に示されるアミノ酸配列を有するhuIFNGまたはその断片であることが好ましい。
【００３５】
「断片」は、完全長IFNGポリペプチド配列の一部（例えば配列番号：１７に示される完全長huIFNGポリペプチドの断片または配列番号：１に示される完全長[S99T]huIFNGポリペプチド変異体の断片）でIFNG活性を示すものあり、例えばそのC-末またはN-末切断版である。IFNGポリペプチド変異体断片の具体的な例には、1から15アミノ酸残基、例えば、1 アミノ酸残基 (配列番号：2)、2 アミノ酸残基 (配列番号：3)、3 アミノ酸残基 (配列番号：：:4)、4 アミノ酸残基 (配列番号：5)、5 アミノ酸残基 (配列番号：6)、6 アミノ酸残基 (配列番号：7)、7 アミノ酸残基 (配列番号：8)、8 アミノ酸残基 (配列番号：9)、9 アミノ酸残基 (配列番号：10)、10 アミノ酸残基 (配列番号：11)、11 アミノ酸残基 (配列番号：12)、12 アミノ酸残基 (配列番号：13)、13 アミノ酸残基 (配列番号：14)、14 アミノ酸残基 (配列番号：15)または15 アミノ酸残基 (配列番号：16) がC-末で切断され、かつ/または1から3 アミノ酸残基がN-末で切断された[S99T]huIFNGが含まれる。huIFNG断片の具体的な例には、1から15 アミノ酸残基、例えば 1 アミノ酸残基 (配列番号：19)、2 アミノ酸残基 (配列番号：10)、3 アミノ酸残基 (配列番号：21)、4 アミノ酸残基 (配列番号：22)、5 アミノ酸残基 (配列番号：23)、6 アミノ酸残基 (配列番号：24)、7 アミノ酸残基 (配列番号：25)、8 アミノ酸残基 (配列番号：26)、9 アミノ酸残基 (配列番号：27)、10 アミノ酸残基 (配列番号：28)、11 アミノ酸残基 (配列番号：29)、12 アミノ酸残基 (配列番号：30)、13 アミノ酸残基 (配列番号：31)、14 アミノ酸残基 (配列番号：32)または15 アミノ酸残基 (配列番号：33) がC-末で切断され、かつ/または1から3 アミノ酸残基がN-末で切断されたhuIFNGが含まれる。
【００３６】
上記のように、IFNGポリペプチド変異体は、該変異体がIFNG活性を示す限りS99T置換に加えてさらなる修飾を少なくとも一つ含むことができ、すなわちその変異体は[S99T]huIFNGの変異体または[S99T]huIFNGの断片の変異体であり得る。そのような変異体の具体的な例は、非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基が導入および/または除去された変異体である。[S99T]huIFNG（およびその断片）の変異体の他の例は、上記「発明の背景」の節に記載された変異体であり、例えばN-末付加Cys-Tyr-CysまたはMetを有する[S99T]huIFNG、およびUS 6,046,034に開示されるシステイン修飾変異体を含む。
通常本発明による変異体は、親IFNGポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と比較して本発明に従い修飾されているヌクレオチド配列によりコードされる。
しかしながら、変異体ポリペプチドが翻訳後プロセッシングの間にC-またはN-末切断、例えば細胞中、発現培地中、精製の間、などでのプロテアーゼによるC-またはN-末切断、を受ける場合があり、それにより生成する変異体ポリペプチドは当初産生された変異体ポリペプチドの切断版である（例えば完全長変異体が当初産生されるが、その完全長変異体ポリペプチドの翻訳後プロセッシングによりC-末切断変異体ポリペプチドが得られることがある）ので、これは常にはあてはまらない。この場合、「親」なる用語は、本発明に従い修飾される切断型と解釈されるべきである。
【００３７】
「変異体」なる用語は、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基において、典型的には1-15 アミノ酸残基（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15 アミノ酸残基)、例えば1-10 アミノ酸残基、1-5 アミノ酸残基または1-3 アミノ酸残基において、その親ポリペプチド（通常、配列番号：１７または配列番号19-33に示されるその切断型のいずれか）と相違するポリペプチドに及ぶ意味である。
「機能的部位」なる用語は、IFNGの機能または能力に必須、もしくはでなければ関与するひとつまたはそれ以上のアミノ酸残基を意味する。このようなアミノ酸残基は機能的部位に存在する。機能的部位は当業界において既知の方法にて決定でき、好ましくはIFNG受容体のような適当な受容体と複合体を形成したポリペプチドの構造解析により同定される。
【００３８】
「huIFNG」なる用語は、配列番号：１７に示されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトIFNGの成熟型を意味する。
「rhuIFNG」なる用語は、配列番号：１７に示されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトIFNGの成熟型で、組換え手法により産生されているものに及ぶ意味である。
「[S99T]huIFNG」なる用語は、野生型ヒトIFNGの成熟型で、99位のセリン残基がスレオニン残基と置換されているものを意味する（配列番号：１に開示）。
「グリコシル化huIFNG」なる用語が本明細書中で用いられるときは、huIFNGポリペプチドがそのポリペプチドのグリコシル化可能な細胞中で産生され、それゆえ該huIFNGポリペプチドがその天然N-グリコシル化部位（配列番号：１７の25および97位）においてグリコシル化されることを意味する。
同様に、「グリコシル化huIFNG変異体」なる用語は、IFNGポリペプチド変異体がそのポリペプチド変異体のグリコシル化可能な細胞中で産生されることを意味する。
【００３９】
「Actimmune（登録商標）」なる用語が本明細書中で用いられるときは、遺伝子組換え大腸菌の発酵により得られる、IFNG（配列番号：34に開示）の140アミノ酸型（Actimmune（登録商標）は4アミノ酸残基がC-末で切断され、かつ N-末にMetを残基を一つ含む）を意味する。Actimmune（登録商標）についてのさらなる情報は、www.actimmune.comにおいて利用可能である。 
【００４０】
本発明のインターフェロンガンマポリペプチド変異体
最適化インビボグリコシル化部位を有する本発明のIFNG変異体
以前に示されているように驚くことに、huIFNGの97位に位置する天然N-グリコシル化部位のグリコシル化は増大できる、すなわち、huIFNG（またはその断片）の99位に位置するセリン残基をスレオニン残基と置換することにより完全にまたは実質的に完全にグリコシル化されたIFNG分子の画分を増加して得られることがわかっている。図１を検討すると、完全グリコシル化IFNGポリペプチドの度合いが有意に増加していることが明らかである。[S99T]huIFNG（配列番号：１）ポリペプチド変異体については、回収培地中に存在するポリペプチド変異体の約90％が両N-グリコシル化部位を利用したのに対し、回収培地中に存在するrhuIFNGは約60％しか完全にグリコシル化されていないことがわかる。
つまり、第一の局面において本発明は、IFNG活性を示し配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するIFNGポリペプチド変異体（即ち[S99T]huIFNG）、またはIFNG活性を示すその断片に関する。
【００４１】
上記で既に議論されているように、huIFNGのC-末切断型は活性を保持しており、かつある場合においてはhuIFNGと比較して活性が増加してさえいることが知られている。従って本発明の興味深い態様において本発明のIFNGポリペプチド変異体は、C-末で1-15アミノ酸残基が、典型的には1-10アミノ酸残基が切断されている配列番号：１の断片である。配列番号：１のC-末切断型の具体的な例は配列番号：２-１６に開示される。本発明のこの態様によるIFNGポリペプチド断片は、IFNG活性を示す。
この態様に従うグリコシル化IFNGポリペプチド変異体は、グリコシル化可能宿主細胞、好ましくは哺乳類宿主細胞、例えば「糖部分との結合」と題される節に示されるそれらのうちいずれか、において組変え手法により発現されなければならない。
【００４２】
前述のように、rhuIFNGをCHO細胞で発現させた場合、発現IFNGポリペプチドの集合体全体の約50-60％しか完全にグリコシル化されない。従って、本発明のIFNGポリペプチド変異体の主な長所の一つは、97位のインビボN-グリコシル化部位がより高度に利用され、従って結果としてhuIFNGと比較してより均一な集合体が得られることである。より均一な集合体のため、そのようなIFNGポリペプチド変異体の集合体を含む組成物（例えば回収培地）は、rhuIFNGと同じ厄介で時間のかかる精製を必要をしない。
従ってさらなる局面において本発明は、IFNGポリペプチド変異体の集合体またはIFNGポリペプチド変異体の集合体を含む組成物に関し、ここで該集合体は本発明のIFNGポリペプチド変異体を少なくとも約70％含む。好ましくはその組成物は、本発明のIFNGポリペプチド変異体を少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より一層好ましくは少なくとも85％、例えば約90％含む。
【００４３】
さらにとりわけ本発明は、IFNGポリペプチド変異体の集合体またはIFNGポリペプチド変異体の集合体を含む組成物に関し、ここで該集合体は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するIFNGポリペプチド変異体を少なくとも約70％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より一層好ましくは少なくとも85％、例えば約90％含む。
同様に本発明はまた、IFNGポリペプチド変異体の集合体またはIFNGポリペプチド変異体の集合体を含む組成物で、該集合体が、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15および配列番号:16から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するIFNGポリペプチド変異体断片を少なくとも約70％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より一層好ましくは少なくとも85％、例えば約90％含むものに関する。
【００４４】
rhuIFNGの97位のインビボN-グリコシル化部位を最適化するのに必要な前述のS99T変異に加えて、配列番号：１またはその断片に導入されている他のインビボグリコシル化部位が（例えば血清半減期を増加するため、および/またはAUCscを増加するために）最適化できる。通常インビボグリコシル化部位はN-グリコシル化部位であるが、本発明についてはO-グリコシル化部位もまた適切であると考えられる。この最適化は、修飾、好ましくは置換をグリコシル化部位、特にインビボN-グリコシル化部位に近接する位置で行うことにより成すことができる。典型的には、このようなインビボN-グリコシル化部位は導入されたインビボN-グリコシル化部位である。インビボN-グリコシル化部位を導入するのに適した位置の具体例は、WO 01/36001および以下に開示される。
【００４５】
グリコシル化部位に「近接する」アミノ酸残基は、大抵炭水化物が連結するグリコシル化部位のアミノ酸残基に対して4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、または+4位、好ましくは-1、+1、または+3位、特に+1または+3位に位置する。従って、（配列N-X-S/T/Cをもつ）インビボN-グリコシル化部位に近接するアミノ酸残基はそのN-残基に対して4、-3、-2、-1、+1、+2、+3または+4の位置に存在し得る。
N-残基に対して+2の位置が修飾されるとき、インビボグリコシル化部位を維持/導入するため該位置のアミノ酸残基はSer、ThrまたはCysのいずれかでなければならないので、限られた数の修飾しか可能でないことは理解されるであろう。
本発明の特定の好ましい具体例においては、インビボN-グリコシル化部位に対して+2の位置のアミノ酸残基の修飾は、問題のアミノ酸残基をThr残基と置きかえる置換である。一方、該アミノ酸残基が既にThr残基ならば、通常その位置において置換を行うことは好ましくないか、または必要でない。Xが修飾されるとき、XはProであるべきでなく、かつTrp、Asp、GluおよびLeuでないことが好ましい。さらに、導入されるアミノ酸残基は、Phe、Asn、Gln、Tyr、Val、Ala、Met、Ile、Lys、Gly、Arg、Thr、His、CysおよびSer、より好ましくはAla、Met、Ile、Lys、Gly、Arg、Thr、His、CysおよびSer、特にAlaまたはSerから成る群より選択されることが好ましい。
N-残基に対して+3の位置が修飾されるとき、導入されるアミノ酸残基はHis、Asp、Ala、Met、Asn、Thr、Arg、SerおよびCys、より好ましくはThr、Arg、SerおよびCysから成る群より選択されることが好ましい。このような修飾はX残基がSer残基である場合に特に適当である。
【００４６】
従って、天然に存在するインビボN-グリコシル化部位に関して、97位のN-グリコシル化部位は修飾、例えばE93、K94、L95、T96、Y98、V100およびT101（すなわちN97に対して4、-3、-2、-1、+1、+3または+4の位置)から成る群より選択される位置における置換、を行うことでさらに最適化することができることが考慮される。配列番号：１（またはその断片）の98位で行う置換の具体例には、Y98F、Y98N、Y98Q、Y98V、Y98A、Y98M、Y98I、Y98K、Y98G、Y98R、Y98T、Y98H、Y98CおよびY98S、好ましくはY98A、Y98M、Y98I、Y98K、Y98G、Y98R、Y98T、Y98H、Y98CおよびY98S、特にY98Sが含まれる。配列番号：１（またはその断片）の100位で行う置換の具体例には、V100H、V100D、V100A、V100M、V100N、V100T、V100R、V100S、またはV100C、特にV100T、V100R、V100SまたはV100Cが含まれる。
【００４７】
同様に、25位のインビボN-グリコシル化部位に関して、この部位は修飾、例えばD21、V22、A23、D24、G26、L28およびF29（すなわちN25に対して4、-3、-2、-1、+1、+3または+の位置)から成る群より選択される位置における置換を行うことでさらに最適化することができることが考慮される。配列番号：１（またはその断片）の26位で行う置換の具体例には、G26F、G26N、G26Y、G26Q、G26V、G26A、G26M、G26I、G26K、G26R、G26T、G26H、G26C and G26S、preferably G26A、G26M、G26I、G26K、G26R、G26T、G26H、G26CおよびG26S、より好ましくはG26AおよびG26S、特にG26Aが含まれる。配列番号：１（またはその断片）の28位で行う置換の具体例には、G28H、G28D、G28A、G28M、G28N、G28T、G28R、G28S、またはG28S、特に G28A、G28T、G28R、G28SまたはG28Cが含まれる。
97位のグリコシル化の最適化に関して示される修飾はいずれも、25位のグリコシル化の最適化に関して行う上記の修飾のいずれかと組み合わせることができるのは明らかである。
【００４８】
増加したAUCscおよび/または増加した血清半減期を有する本発明のIFNG変異体
さらなる局面において本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列有し、IFNG活性を示すIFNGポリペプチドの変異体に関する。
さらに本発明はまた、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15および配列番号:16から成る群より選択されるアミノ酸配列を有し、IFNG活性を示すIFNGポリペプチド断片の変異体に関する。
つまりこのような変異体は配列番号：１-１６と比較してさらなる修飾を少なくとも一つ含む。
【００４９】
[S99T]huIFNGポリペプチド変異体（またはその断片）の構造および機能の過剰な崩壊を避けるため、本発明に従い修飾されるアミノ酸残基の総数は典型的には15を超えない。大抵IFNGポリペプチド変異体は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列に対し1-10、例えば配列番号：１に示されるアミノ酸配列に対し1-8、2-8、1-5、1-3または2-5の修飾を含む。修飾は置換であることが好ましい。配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するIFNGポリペプチド変異体の断片の変異体についても同様の考慮が当てはまることは理解されるであろう。つまり、その変異体が配列番号：２-１６に開示されるいずれかの配列の変異体である場合、そのような変異体は、配列番号：２-１６に示される相当のアミノ酸配列に対して大抵15に満たない数の修飾、典型的には1-10の修飾を含み、それは例えば配列番号：２-１６に示される相当のアミノ酸配列に対して1-8、2-8、1-5、1-3または2-5の修飾である。
従って、通常このようなIFNGポリペプチド変異体（すなわちS99T置換に加えてさらなる修飾を少なくとも一つ含む変異体）は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列（またはその断片）と、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸残基が相違するアミノ酸配列を含む。
【００５０】
本発明のある好ましい態様においては、IFNG変異体は、非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基が（さらに）少なくとも一つ導入され、かつ/または少なくとも一つ除去されている。
非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基を除去または導入することにより、その分子が最適な非ポリペプチド部分と結合しやすくし、結合パターンを最適化し（例えばIFNGポリペプチド変異体表面上の非ポリペプチド部分の最適な分布を確実にし）、それにより、IFNG活性を示し、加えて現在入手可能なhuIFNGまたはrhuIFNG基盤分子と比較して一つまたはそれ以上の性質が改善されている新しい結合体分子を得るよう、ポリペプチドを特異的に改変することが可能である。例えば、連結基の導入により、IFNGポリペプチド変異体の適当な非ポリペプチド部分が結合する特定のアミノ酸残基の量が増加し、さもなければ変化し、それによってより有効で、特異的で、かつ/または多数の結合がなされる。一つまたはそれ以上の連結基を除去することにより、結合がおこると不都合なポリペプチドの部分、例えばポリペプチドの機能的部位に位置するまたはその近くのアミノ酸残基における非ポリペプチド部分との結合を回避することができる（なぜならそのような部位における結合は受容体による認識を損なうので、得られる結合型ポリペプチドの不活性化またはIFNG活性の減少をもたらす場合があるため）。さらに、別の連結基に近接する連結基を除去すると、そのような基に対する異種の結合が回避されるため、好都合である。興味深い具体例においてはIFNGポリペプチドの一つ以上のアミノ酸残基が変化を受けており、例えばその変化には、最適な非ポリペプチド部分との連結部位を含むアミノ酸残基の除去および導入が含まれる。この態様は、非ポリペプチド部分との結合を最適化するようIFNGポリペプチド変異体を特異的に設計することが可能な点で、特に興味深いと考えられる。
【００５１】
アミノ酸残基の除去および/または導入に加えて、ポリペプチド変異体は他の修飾、例えば非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基の導入および/または除去に関しない置換を含むことができる。このような修飾の例には、保守的アミノ酸置換および/またはN-末端におけるCys-Tyr-CysまたはMetの導入が含まれる。
【００５２】
二量体型のIFNGポリペプチド変異体に存在し結合に利用可能な連結基の正確な数は、結合によって達成されることが期待される効果に依存する。得られるべき効果は、例えば結合の性質および程度（例えば、非ポリペプチド部分自身、ポリペプチドに結合していることが望ましいまたは結合可能な非ポリペプチド部分の数、それらが結合されるべき場所、または結合が回避されるべき場所など）に依存する。
非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基は、それは除去されるかまたは導入されるかいずれかであるが、適した非ポリペプチド部分の性質、およびほとんどの場合、使用される結合方法に基づいて選択される。例えば、非ポリペプチド部分がポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキサイド由来分子のようなポリマー分子である場合、連結基として機能し得るアミノ酸残基は、システイン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアルギニンからなる群のうちから選択できる。特にシステインが好ましい。非ポリペプチド部分が糖部分である場合、連結基は例えばインビボグリコシル化部位であり、N-グリコシル化部位であることが好ましい。
【００５３】
非ポリペプチド部分に対する連結基が、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するIFNGポリペプチド（またはその断片）に導入されまたはそこから除去されるときは必ず、修飾されるポリペプチドの位置は適宜以下のように選択される：
その位置はIFNGポリペプチドの表面に存在することが好ましく、かつその側鎖の25％以上、好ましくは50％以上、が溶媒にさらされているアミノ酸残基により占められていることがより好ましく、そのような位置は二量体型のIFNGの三次元構造またはモデルに基づき決定され、その構造またはモデルは任意でさらに一つまたは二つのIFNG受容体分子を含むことがある。そのような位置は本明細書の実施例１にあげられている。
【００５４】
親IFNGポリペプチドの23のC-末アミノ酸残基のいずれかを、（特に非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基、例えばCys残基を導入することにより）修飾することもまた興味深く、なぜならこのような残基はIFNGポリペプチドの表面に位置すると信じられているからである。
加えて、IFNGポリペプチドのループ領域に位置するアミノ酸残基を一つまたはそれ以上修飾することも興味深いであろうが、これはなぜなら、これらのループ領域内のほとんどのアミノ酸残基が表面に露出し、かつ機能的部位から十分に離れて位置するので、非ポリペプチド部分、例えばポリマー分子、特にPEG分子、および/またはN-グリコシル化部位を分子の機能を損なうことなく導入できるからである。このようなループ領域はhuIFNGの三次元構造の検討により同定できる。該ループ領域を構成するアミノ酸残基は、残基N16-K37 (「A-B ループ」)、F60-S65 (「B-C ループ」)、N83-S84 (「C-D ループ」)およびY98-L103 (「D-E ループ」)である。
【００５５】
IFNG受容体結合部位を構成するアミノ酸残基は、Q1、D2、Y4、V5、E9、K12、G18、H19、S20、D21、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K34、K37、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119 である(本明細書の実施例2も参照）。一般に、非ポリペプチド部分に対する連結基（例えばさらなるN-グリコシル化部位および/またはシステイン残基）は、分子のこの部位には導入されない。
【００５６】
連結基の最適な分布を決定するため、IFNGポリペプチドの表面に位置するアミノ酸残基間の距離を、IFNG二量体ポリペプチドの三次元構造に基づいて計算する。詳細には、そのような連結基を含むアミノ酸残基のCB間の距離、またはあるアミノ酸残基の官能基（リジンについてNZ、アスパラギン酸についてCG、グルタミン酸についてCD、システインについてSG）と連結基を含む別のアミノ酸残基のCBの間の距離を測定する。グリシンの場合、CBの代わりにCAが用いられる。本発明のIFNGポリペプチド部分において、該距離のいずれかが8Å以上、特に異種性結合を避けるまたは減らすため、１０Å以上であることが好ましい。
【００５７】
また、IFNGポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、エピトープの一部を構成する一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、エピトープを破壊または不活化するよう好ましくは非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基との置換により除去されている点で配列番号：１のそれ（またはその断片）とは相違する場合がある。 [S99T]huIFNG、huIFNGまたはrhuIFNGのエピトープは、エピトープマッピングとしてもまた知られる当業界にて既知の方法を用いて同定できる（例えばRomagnoli et al., J. Biol Chem, 1999, 380(5):553-9、DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96:11-20、Van de Water et al., Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85(3):229-35、Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119(1):77-81、およびLane DP and Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5(2):268-71参照）。方法の一つは、（例えば9アミノ酸残基の）ランダムなオリゴペプチドを発現するファージディスプレイライブラリーを構築するものである。 [S99T]huIFNG、huIFNGまたはrhuIFNGに対し特異的な抗血清から得られるIgG1抗体は免疫沈降により精製され、反応性のあるファージはイムノブロッティングにより同定される。精製された反応性のあるファージのDNAをシークエンスすることにより、そのオリゴペプチドの配列を決定し、続いてIFNGの三次元構造におけるその配列の位置を決定することができる。それにより同定されたその構造上の領域は、非ポリペプチド部分に対する連結基の導入のための対象領域としてその後選択可能なエピトープを構成する。
【００５８】
機能的インビボ半減期および血清半減期は、例えばポリペプチド変異体の分子量に依存し、半減期を増加させるのに必要な連結基の数は、問題の非ポリペプチド部分の分子量に依存するであろう。ある具体例においては、本発明のIFNGポリペプチド変異体の分子量は少なくとも67kDaであり、特にLaemmli, U.K., Nature Vol 227 (1970), p680-85に従いSDS-PAGEにより測定した場合は少なくとも70kDaである。IFNGの分子量は約34-50kDaの範囲内であり、それゆえ所望の効果を得るのにさらに20-40kDaが必要である。これは例えば2から4の10kDaのPEG分子、またはさらなるインビボグリコシル化部位とさらなるPEG分子の組み合わせ、または本明細書に記載されるその他のものにより与ることができる。
好ましくは、本発明による結合型IFNGポリペプチド変異体は、1-10の（さらなる）非ポリペプチド部分、例えば1-8、2-8、1-5、1-3または2-5の（さらなる）非ポリペプチド部分を含む。典型的には、結合型変異体は、1-3の（さらなる）非ポリペプチド部分、例えば1、2、または3の（さらなる）非ポリペプチド部分を含む。
【００５９】
上記のように、生理的条件下においてはIFNGは二量体ポリペプチドとして存在する。ポリペプチドは通常ホモ二量体型である（例えば本明細書に記載されるように調製されたIFNGポリペプチド分子二つの会合により調製される）。しかしながら、所望のIFNGポリペプチド変異体が単一鎖型で調製される場合は、二つのIFNGポリペプチド単量体はペプチド結合またはペプチドリンカーを解して結合する。IFNGポリペプチド変異体を単一鎖型で提供すると二つの構成IFNGポリペプチドが異なってもよいという利点があり、これは例えばそれらのポリペプチドの非対称性突然変異生成を可能にするのに好都合であり得る。例えば、単量体の一つから受容体結合部位のPEG化部位を除去し、一方他方においては保持しておくことができる。それにより、PEG化後一つの単量体は無傷の受容体結合部位を有し、一方他方は完全にPEG化できる（従って分子量が有意に増加する）。
【００６０】
非ポリペプチド部分が糖部分である本発明のIFNG変異体
本発明のある好ましい態様においては、配列番号：１のIFNG変異体（またはその断片）は、グリコシル化部位が少なくとも一つ導入され、かつ/またはグリコシル化部位が少なくとも一つ除去されている。好ましくは、グリコシル化部位はインビボN-グリコシル化部位であり、即ち非ポリペプチド部分は糖部分、例えばO-結合またはN-結合糖部分、好ましくはN-結合糖部分である。
本発明のある興味深い具体例においては、該変異体はグリコシル化部位が少なくとも一つ導入され、特にそれはインビボN-グリコシル化部位である。グリコシル化部位の導入は置換により行われることが好ましい。
例えば、インビボN-グリコシル化部位は、配列番号：１のIFNGポリペプチド（またはその断片）の表面に露出するアミノ酸残基を含む位置に導入できる。該表面露出アミノ酸残基は、その側鎖の少なくとも25％以上、特に少なくとも50％以上が表面に露出していることが好ましい。このような位置の決定についての詳細は本明細書の実施例１にみられる。
【００６１】
N-グリコシル化部位は該部位のN-残基が該位置に位置するように導入される。同様に、O-グリコシル化はそのような部位を作り出すSまたはTが該位置に位置するように導入される。「その側鎖の少なくとも25％（または50％）が表面に露出」なる用語がインビボN-グリコシル化部位の導入と関連して用いられる時は、この用語は糖部分が実際に連結する位置におけるアミノ酸側鎖の表面接近性について述べている。多くの場合、糖部分が実際に結合するアスパラギン残基に対し＋2の位置にセリンまたはスレオニン残基を導入する必要があろうし、セリンまたはスレオニン残基が導入されるこれらの位置は覆い隠されてもよい（即ちそれらの側鎖の25％（または50％）に満たないしか分子表面に露出しなくてもよい）。
【００６２】
さらに、確実に有効にグリコシル化するため、インビボグリコシル化部位、特にN-グリコシル化部位のN残基またはO-グリコシル化部位のSまたはT残基は、IFNGポリペプチドの118N-末アミノ酸残基中に位置することが好ましく、より好ましくは97N-末アミノ酸残基中である。より一層好ましくは、インビボグリコシル化部位は、その部位を創るのに一つの突然変異しか必要でない位置（すなわち機能的グリコシル化部位を創るのに必要とされる他のアミノ酸残基がすでにその分子に存在している位置）に導入される。
【００６３】
例えば、（受容体分子と形成する構造で）IFNGポリペプチドの表面に露出しかつその側鎖の25％以上が表面に露出しているアミノ酸残基に占められている位置におけるさらなるN-グリコシル化部位の導入をもたらす置換は以下のものを含む：
Q1N + P3S/T、P3N+V5S/T、K6N+A8S/T、E9N+L11S/T、K12S/T、K13N+F15S/T、Y14N+N16S/T、G18S/T、G18N、G18N+S20T、H19N+D21S/T、D21N+A23S/T、G26N+L28S/T、G31N+L33S/T、K34N+W36S/T、K37S/T、K37N+E39S/T、E38N、E38N+S40T、E39N+D41S/T、S40N+R42S/T、K55N+F57S/T、K58N+F60S/T、K61S/T、K61N+D63S/T、D62N+Q64S/T、D63N、D63N+S65T、Q64N+I66S/T、S65N+Q67S/T、Q67N、Q67N+S69T、K68N+V70S/T、E71N+I73S/T、T72N+K74S/T、K74N+D76S/T、E75N+M77S/T、K80S/T、V79N+F81S/T、K80N+F82S/T、N85S/T、S84N+K86S/T、K87S/T、K86N+K88S/T、K87N+R89S/T、D90N+F92S/T、E93N+L95S/T、K94N、K94N+T96S、T101N+L103S/T、D102N+N104S/T、L103N+V105S/T、Q106S/T、E119N、E119N+S121T、P122N+A124S/T、A123N+K125S/T、A124N、A124N+T126S、K125N+G127S/T、T126N+K128S/T、G127N+R129S/T、K128N+K130S/T、R129N+R131S/T、K130N、K130N+S132T、R131N+Q133S/T、S132N+M134S/T、Q133N+L135S/T、M134N+F136S/T、L135N+R137S/T、F136N+G138S/T、R137N+R139S/T、G138N+R140S/T、R139N+A141S/T、R140およびR140N+S142T（置換は配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する[S99T]huIFNGに対して（または配列番号：２-１６に示されるアミノ酸配列を有するその対応する断片に対して）示される）。S/Tは、セリンまたはスレオニン残基、好ましくはスレオニン残基への置換を意味する。
【００６４】
（受容体分子と形成する構造で）IFNGポリペプチドの表面に露出し、その側鎖の50％以上が表面に露出している位置におけるさらなるN-グリコシル化部位の導入をもたらす置換は以下のものを含む：
P3N+V5S/T、K6N+A8S/T、K12S/T、K13N+F15S/T、G18S/T、D21N+A23S/T、G26N+L28S/T、G31N+L33S/T、K34N+W36S/T、K37N+E39S/T、E38N、E38N+S40S/T、E39N+D41S/T、K55N+F57S/T、K58N+F60S/T、K61S/T、D62N+Q64S/T、Q64N+I66S/T、S65N+Q67S/T、K68N+V70S/T、E71N+I73S/T、E75N+M77S/T、N85S/T、S84N+K86S/T、K86N+K88S/T、K87N+R89S/T、K94N、K94N+T96S、T101N+L103S/T、D102N+N104S/T、L103N+V105S/T、Q106S/T、P122N+A124S/T、A123N+K125S/T、A124N、A124N+T126S、K125N+G127S/T、T126N+K128S/T、G127N+R129S/T、K128N+K130S/T、R129N+R131S/T、K130N、K130N+S132T、R131N+Q133S/T、S132N+M134S/T、Q133N+L135S/T、M134N+F136S/T、L135N+R137S/T、F136N+G138S/T、R137N+R139S/T、G138N+R140S/T、R139N+A141S/T、R140NおよびR140N+S142T（置換は配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する[S99T]huIFNGに対して（または配列番号：２-１６に示されるアミノ酸配列を有するその対応する断片に対して）示される）。S/Tは、セリンまたはスレオニン残基、好ましくはスレオニン残基への置換を意味する。
【００６５】
ただ一つのアミノ酸置換によってN-グリコシル化部位を導入する置換は以下のものを含む：K12S/T、G18S/T、G18N、K37S/T、E38N、M45N、I49N、K61S/T、D63N、Q67N、V70N、K80S/T、F82N、N85S/T、K87S/T、K94N、Q106S/T、E119N、A124N、K130N and R140N、in particular K12S/T、G18N、G18S/T、K37S/T、E38N、K61S/T、D63N、Q67N、K80S/T、N85S/T、K94N、Q106S/T、A124N、K130N、およびR140N (その側鎖の25％以上が表面に露出している位置 (受容体分子を含まない構造で))、またはより好ましくはG18N、E38N、D63N、Q67N、K94N、S99N、A124N、K130NおよびR140N（受容体分子を含まない構造でその側鎖の50％以上が表面に露出している位置)。
【００６６】
通常受容体結合部位を構成する領域にN-グリコシル化部位を導入することは好ましくない（特別な場合を除く（「受容体親和性の減少した変異体」と題される節参照））。従って、受容体親和性の減少が望まれるのでなければ、変異Q1N+P3S/T、E9N+L11S/T、G18N、G18N+S20T、H19N+D21S/T、D21N+A23S/T、G26N+L28S/T、K34N+W36S/T、K37N+E39S/T、E119NおよびE119N+S121Tは、通常行うべきでない。
【００６７】
本発明の特に好ましい変異体には、配列番号：１（または配列番号２-１６に示されるアミノ酸配列を有するその断片）の変異体が含まれ、該変異体はIFNG活性を示し、かつK12S、K12T、G18S、G18T、E38N、E38N+S40T、K61S、K61T、N85S、N85T、K94N、Q106SおよびQ106Tから成る群より選択される置換、より好ましくはK12T、G18T、E38N+S40T、K61T、N85T、K94NおよびQ106Tから成る群より選択される置換、より一層好ましくはK12T、G18T、E38N+S40T、K61TおよびN85T、特にE38N+S40Tから選択される置換を少なくとも一つ含む。
【００６８】
本発明の他の興味深い具体例においては、配列番号：１（または配列番号２-１６に示されるアミノ酸配列を有するその断片）の変異体は、グリコシル化部位が少なくとも二つ、特にN-グリコシル化が少なくとも二つ導入されている。N-グリコシル化部位を少なくとも二つ導入する少なくとも二つの修飾、特に置換は、K12S、K12T、G18S、G18T、E38N、E38N+S40T、K61S、K61T、N85S、N85T、K94N、Q106SおよびQ106Tから成る群より選択され、より好ましくはK12T、G18T、E38N+S40T、K61T、N85T、K94NおよびQ106Tから成る群より選択され、より一層好ましくはK12T、G18T、E38N+S40T、K61TおよびN85Tから成る群より選択される。さらなるN-グリコシル化を少なくとも二つ含む変異体をもたらすそのような置換の具体例には、以下のものが含まれる：K12T+G18T、K12T+E38N+S40T、K12T+K61T、K12T+N85T、G18T+E38N+S40T、G18T+K61T、G18T+N85T、E38N+S40T+K61T、E38N+S40T+N85TおおよびK61T+N85T。
【００６９】
置換の上記一覧から、118N-末アミノ酸残基内、特に97N-末アミノ酸残基内に位置する置換を選択することが好ましい。
【００７０】
本発明のIFNGポリペプチド変異体は、（配列番号：１またはその断片と比較して）各単量体につきさらなるインビボグリコシル化部位を一つだけ含む場合がある。しがしながら、血清半減期を増加するのに十分な大きさにするため、ポリペプチドは一つ以上のさらなるインビボN-グリコシル化部位、特に2-7または2-5のさらなるインビボN-グリコシル化部位、例えば2、3、4、または5のインビボN-グリコシル化部位を含むことが望ましい場合が多い。そのようなインビボN-グリコシル化は、上記一覧のいずれかに記載される一つまたはそれ以上の置換により導入されることが好ましい。
【００７１】
さらに、前述の修飾はいずれも、「インビボグリコシル化部位が最適化された本発明のIFNG変異体」と題される節に開示される修飾のいずれか、特に置換G26Aと組み合わせることができる。
【００７２】
非ポリペプチド部分がシステインを連結基として有する分子である本発明のIFNG変異体
本発明の別の好ましい態様において、配列番号：１（またはその断片）のIFNG変異体は、システイン残基が少なくとも一つ導入されている。例えば、システイン残基は、配列番号：１（またはその断片）のIFNG変異体の表面に露出したアミノ酸残基を含む位置に導入できる。該表面露出アミノ酸残基は、その側鎖の少なくとも25％以上、特に少なくとも50％以上が表面に露出していることが好ましい。このような位置の決定についての詳細は本明細書の実施例１にみられる。
【００７３】
例えば、（受容体分子と形成する構造で）IFNGポリペプチドの表面に露出し、その側鎖の25％以上が表面に露出している位置におけるシステイン残基の導入をもたらす置換は以下のものを含む：
Q1C、D2C、P3C、K6C、E9C、N10C、K13C、Y14C、N16C、G18C、H19C、D21C、N25C、G26C、G31C、K34C、N35C、K37C、E38C、E39C、S40C、K55C、K58C、N59C、K61C、D62C、D63C、Q64C、S65C、Q67C、K68C、E71C、T72C、K74C、E75C、N78C、V79C、K80C、N83C、S84C、N85C、K86C、K87C、D90C、E93C、K94C、T101C、D102C、L103C、N104CおよびE119C（置換は配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する[S99T]huIFNGに対して（または配列番号：２-１６に示されるアミノ酸配列を有するその対応する断片に対して）示される）。
【００７４】
（受容体分子と形成する構造で）IFNGポリペプチドの表面に露出し、その側鎖の50％以上が表面に露出している位置におけるシステイン残基の導入をもたらす置換は以下のものを含む：
P3C、K6C、N10C、K13C、N16C、D21C、N25C、G26C、G31C、K34C、K37C、E38C、E39C、K55C、K58C、N59C、D62C、Q64C、S65C、K68C、E71C、E75C、N83C、S84C、K86C、K87C、K94C、T101C、D102C、L103CおよびN104C（置換は配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する[S99T]huIFNGに対して（または配列番号：２-１６に示されるアミノ酸配列を有するその対応する断片に対して）示される）。
【００７５】
通常、受容体結合部位を構成する領域にシステイン残基を導入すること（そして続いてそのシステイン残基を非ポリペプチド部分と連結すること）は好ましくない（特別な場合を除く（「受容体親和性の減少した変異体」と題される節参照））。つまり、受容体親和性の減少が望まれるのでなければ、変異Q1C、E9C、G18C、H19C、D21C、G26C、K34C、K37CおよびE119Cは、通常行うべきでない。
より好ましくは、該システイン残基は、N10C、N16C、E38C、N59C、N83C、K94C、N104CおよびA124Cから成る群より選択される置換により導入される。
【００７６】
本発明の他の興味深い態様においては、配列番号：１（または配列番号２-１６に示されるアミノ酸配列を有するその断片）の変異体はシステイン残基が少なくとも二つ導入されている。少なくとも二つのシステイン残基を導入する少なくとも二つの修飾、特に置換は、好ましくはN10C、N16C、E38C、N59C、N83C、K94C、N104CおよびA124Cから成る群より選択できる。システイン残基が少なくとも二つ導入された変異体を生じるそのような置換の具体例には、以下のものが含まれる：
N10C+N16C、N10C+E38C、N10C+N59C、N10C+N83C、N10C+K94C、N10C+N104C、N10C+A124C、N16C+E38C、N16C+N59C、N16C+N83C、N16C+K94C、N16C+N104C、N16C+A124C、E38C+N59C、E38C+N83C、E38C+K94C、E38C+N104C、E38N+A124C、N59C+N83C、N59C+K94C、N59C+N104C、N59C+A124C、N83C+K94C、N83C+K94C、N83C+N104C、N83C+A124C、K94C+N104C、K94C+A124CおよびN104C+A124C。
【００７７】
導入されたシステイン残基は、PEGまたはより好ましくはmPEGのような非ポリペプチド部分と結合可能であることが好ましい。システイン含有ポリペプチド変異体とポリマー分子の結合はいずれの適した方法でも、例えば「ポリマー分子との結合」と題される節に記載されるように、例えば該節に述べられる一段階法を用いて、または段階的方法で、達成できる。IFNGポリペプチド変異体をPEG化する好ましい方法は、システイン反応PEGを用いてPEGをシステイン残基に共有結合的に連結するものである。異なる基（例えばオルソピリジル-ジスルフィド、マレイミド、およびビニルスルフォン）を有する特異性の高いシステイン反応PEGおよび大きさの異なるPEG(2-20 kDa、例えば 5 kDa、10 kDa、12 kDaまたは15 kDa)は、例えばShearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USAから市販されている。
【００７８】
前述の修飾はいずれも、「インビボグリコシル化部位が最適化された本発明のIFNG変異体」と題される節に開示される修飾のいずれか、特に置換G26Aと組み合わせることができることは理解されるであろう。
【００７９】
第一の非ポリペプチド部分が糖部分であり、第二の非ポリペプチド部分がシステインを連結基として有する分子である本発明のIFNG変異体
本発明のさらに好ましい態様において、配列番号：１のIFNG変異体（またはその断片）は、N-グリコシル化部位が少なくとも一つ導入され、かつシステイン残基が少なくとも一つ導入されている。このような変異体は、N-グリコシル化部位およびシステイン残基の導入に適した位置について述べている二つの前節に記載される残基をそれぞれ選択することにより調製できる。しかしながら、本発明のより好ましい具体例においては、該変異体は、K12T+N16C、K12T+E38C、K12T+N59C、K12T+N83C、K12T+K94C、K12T+N104C、K12T+A124C、G18T+N10C、G18T+E38C、G18T+N59C、G18T+N83C、G18T+K94C、G18T+N104C、G18T+A124C、E38N+S40T+N10C、E38N+S40T+N16C、E38N+S40T+N59C、E38N+S40T+N83C、E38N+S40T+K94C、E38N+S40T+N104C、E38N+S40T+A124C、K61T+N10C、K61T+N16C、K61T+E38C、K61T+N83C、K61T+K94C、K61T+N104C、K61T+A124C、N85T+N10C、N85T+N16C、N85T+E38C、N85T+N59C、N85T+K94C、N85T+N104C、N85T+A124C、K94N+N10C、K94N+N16C、K94N+E38C、K94N+N59C、K94N+N83C、K94N+N104C、K94N+A124C、Q106T+N10C、Q106T+N16C、Q106T+E38C、Q106T+N59C、Q106T+N83C、Q106T+K94CおよびQ106T+A124Cから成る群より選択される置換、より好ましくはE38N+S40T+N10C、E38N+S40T+N16C、E38N+S40T+N59C、E38N+S40T+N83C、E38N+S40T+K94CおよびE38N+S40T+N104Cから成る群より選択される置換を含む。
【００８０】
導入されたシステイン残基は、PEGまたはより好ましくはmPEGのような非ポリペプチド部分と結合可能であることが好ましい。システイン含有ポリペプチド変異体とポリマー分子の結合はいずれの適した方法でも、例えば「ポリマー分子との結合」と題される節に記載されるように、例えば該節に述べられる一段階法を用いて、または段階的方法で達成できる。適したポリマーはVS-mPEGまたはOPSS-mPEGである。
さらに、前述の修飾はいずれも、「インビボグリコシル化部位が最適化された本発明のIFNG変異体」と題される節に開示される修飾のいずれか、特に置換G26Aと組み合わせることができることは理解されるであろう。
【００８１】
受容体親和性の減少したIFNG変異体
IFNGポリペプチドの血清半減期を増加する一つの方法は、受容体仲介内部移行を減少させ、それにより受容体仲介クリアランスを減少させるものである。
受容体仲介内部移行はIFNG二量体のIFNG受容体複合体に対する親和性に依存し、従ってIFNG受容体複合体に対する親和性の減少したIFNG変異体は、内部移行しその後クリアランスされる程度がより低いと期待される。
IFNG二量体のその受容体複合体に対する親和性は、一つまたはそれ以上の修飾、特に置換を、IFNGポリペプチドの受容体結合部位において行うことにより減少できる。受容体結合部位を構成するアミノ酸残基は、本明細書の実施例２に規定される。実行可能な置換のクラスの一つは保守的アミノ酸置換である。別の具体例においては、修飾を行うことによりN-グリコシル化部位が導入される。
【００８２】
つまり、本発明の特定のさらに好ましい態様においては、配列番号：１のIFNG変異体（またはその断片）は、（本明細書中で規定される）受容体結合部位における修飾、例えば置換を少なくとも一つ含む。詳細には、IFNGポリペプチドは、該受容体結合部位にインビボN-グリコシル化を創る修飾、好ましくは置換を少なくとも一つ含む。例えば、このような置換は、Q1N+P3S/T、D2N+Y4S/T、Y4N+K6S/T、V5N+E7S/T、E9N+L11S/T、K12N+Y14S/T、G18N、G18N+S20T、H19N+D21S/T、S20N+V22S/T、D21N+A23S/T、V22N+D24S/T、D24N+G26S/T、G26N+L28S/T、L30N+I32S/T、K34N+W36S/T、K37N+E39S/T、K108N+I110S/T、H111N+L113S/T、E112N+I114S/T、I114N+V116S/T、Q115N+M117S/T、A118N+L120S/T、E119NおよびE119N+S121Tから成る群より選択でき、好ましくはQ1N+P3S/T、D2N+Y4S/T、E9N+L11S/T、K12N+Y14S/T、G18N、G18N+S20T、H19N+D21S/T、S20N+V22S/T、D21N+A23S/T、K34N+W36S/T、K37N+E39S/T、H111N+L113S/T、Q115N+M117S/T、A118N+L120S/T、E119NおよびE119N+S121Tよりなる群（その側鎖の少なくとも25％が表面に露出しているアミノ酸残基を含む位置におけるN-グリコシル化部位の導入）から選択でき、より好ましくはQ1N+P3S/T、D2N+Y4S/T、E9N+L11S/T、G18N、G18N+S20T、H19N+D21S/T、S20N+V22S/T、D21N+A23S/T、K34N+W36S/T、K37N+E39S/T、Q115N+M117S/T、A118N+L120S/T、E119NおよびE119N+S121Tよりなる群（その側鎖の少なくとも50％が表面に露出しているアミノ酸残基を含む位置におけるN-グリコシル化部位の導入）から選択でき、より一層好ましくはQ1N+P3T、D2N+Y4T、E9N+L11T、G18N+S20T、H19N+D21T、S20N+V22T、D21N+A23T、K34N+W36T、K37N+E39T、Q115N+M117T、A118N+L120TおよびE119N+S121Tから成る群より選択でき、最も好ましくはG18N+S20T、H19N+D21T、D21N+A23TおよびE119N+S121T、特にD21N+A23Tから成る群より選択できる。
【００８３】
そのような変異体は、huIFNGまたはActimmune（登録商標）と比較して受容体親和性が減少していると考えられる。
受容体親和性はいずれの適したアッセイでも測定でき、当業者には周知であろう。受容体結合親和性の測定に適したアッセイの一例は、Michiels et al. Int. J. Biochem. Cell Biol. 30:505-516 (1998)に記載されるBIAcore（登録商標）アッセイである 。上記に示されたアッセイを用いて、ここに記載される目的に有用と考えられるIFNG変異体は、結合親和性（Kd)がグリコシル化[S99T]huIFNGまたはActimmune（登録商標）のKd値の1-95％であるような変異体である。 例えば、IFNGポリペプチドのKd値は、グリコシル化[S99T]huIFNGまたはActimmune（登録商標）のKd値の1-25％のように1-75％または1-50％、例えば1-20％、または1-15％、1-10％または1-5％の低さであることさえある。
典型的には、受容体親和性の減少したそのようなIFNG変異体は、例えば本明細書に記載される「一次アッセイ」で試験した場合、IFNG活性が減少しているであろう。例えば、IFNGポリペプチド変異体は、Actimmune（登録商標）またはrhuIFNGの特異的活性の1-95％、例えば1-50％のように1-75％を示すことがあり、例えばActimmune（登録商標）またはrhuIFNGの特異的活性の1-20％または1-10％であることがある。
【００８４】
前述のように、そのようなIFNG変異体は受容体仲介クリアランスが減少しているため、血清半減期が増加することが考えられる。それゆえ、本発明のこの態様に従うIFNGポリペプチ変異体は、増加した血清半減期の定義との関連で本明細書中で前述された増加した血清半減期についての要求を満たすと考えられる。
受容体結合親和性を減少させる前述の修飾はいずれも、本明細書に開示される他の修飾、特に「最適化N-グリコシル化を有する本発明のIFNG変異体」、「非ポリペプチド部分が糖部分である本発明のIFNG変異体」、「非ポリペプチド部分がシステインを連結基として有する分子である本発明のIFNG変異体」および「第一の非ポリペプチド部分が糖部分であり、第二の非ポリペプチド部分がシステインを連結基として有する分子である本発明のIFNG変異体」と題される節に示される修飾のいずれか、例えばG26A、E38N+S40Tおよびそれらの組み合わせ、と組み合わせることができる。
【００８５】
結合方法
非ポリペプチド部分
上記にさらに記載されるように、非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、親油性化合物、糖部分（インビボN-グリコシル化による）および有機誘導剤から成る群より選択されることが好ましい。これらの試薬はすべて、結合体のポリペプチド部分に望ましい性質を与えることができ、それは特に増加したAUCsc、増加した血清半減期および/または減少した免疫原性である。ポリペプチド変異体は通常ただ一つのタイプの非ポリペプチド部分に結合するが、しかしまた二つまたはそれ以上の異なるタイプの非ポリペプチド部分とも結合でき、例えばポリマー分子と糖分子、親油基と糖部分、有機誘導物質と糖部分、親油基とポリマー分子などである。二つの異なるタイプの非ポリペプチド部分と結合するとき、これらは糖部分およびポリマー部分であることが好ましい。二つまたはそれ以上の異なる非ポリペプチド部分との結合は同時にまたは連続してなされ得る。以下の節「親油性化合物との結合」、「ポリマー分子との結合」、「糖部分との結合」および「有機誘導物質との結合」においては、特定のタイプの非ポリペプチド部分との結合が記載される。
【００８６】
親油性化合物との結合
ポリペプチド変異体および親油性化合物は、直接にまたはリンカーを用いて互いに結合する。親油性化合物は、飽和もしくは不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミンまたはカロテノイドのような天然の化合物か、または一つまたはそれ以上のアルキル、アリル、アルケニルまたは他の複数の不飽和化合物を伴う炭素酸、アルコール、アミンおよびスルホン酸のような合成化合物であり得る。ポリペプチド変異体と親油性化合物の間の結合は、任意でリンカーを介して、当業界にて既知の方法、例えばBodanszky in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976によりまたはWO 96/12505において記載される方法、によりなされ得る。
【００８７】
ポリマー分子との結合
ポリペプチド変異体に結合するポリマー分子はいずれの適したポリマー分子であってもよく、それは例えば天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマーで、典型的には分子量が2000-40,000 Daまたは2000-30,000 Daの範囲内のように300-100,000 Daまたは1000-50,000 Daの範囲内、例えば2000-20,000 Da、2000-10,000または1000-5000 Daの範囲内のものである。より具体的には、PEGのようなポリマー分子、特にｍPEGは典型的には分子量約2、5、10、12、15、20、30、40または50 kDa、特に分子量約5 kDa、約10 kDa、約12 kDa、約15 kDaまたは約20kDaである。
本明細書中でポリマー分子について使用されるとき「約」なる単語は、およその平均分子量を意味し、所定のポリマー調製物において通常ある一定の分子量分布が存在するであろうことを反映する。
ホモポリマーの例には、ポリオール（すなわちポリ-OH）、ポリアミン（すなわちポリ-NH2）およびポリカルボキシル酸（すなわちポリ-COOH）が含まれる。ヘテロポリマーは、一つまたはそれ以上の異なる結合基、例えばヒドロキシル基とアミン基を含むポリマーである。
【００８８】
適したポリマー分子の例には、ポリエチレングリコール（PEG）およびポリプロピレングリコール（PPG）のようなポリアルキレングリコール（PAG）を含むポリアルキレンオキサイド（PAO）、分岐PEG、ポリ-ビニルアルコール（PVA）、ポリ-カルボキシレート、ポリ-（ビニルピロリドン）、ポリエチレン-コ-マレイン酸アンヒドライド、ポリスチレン-コ-マレイン酸アンヒドライド、カルボキシメチル-デキストランを含むデキストラン、または免疫原性を減少させ、かつ/または機能的インビボ半減期および/または血清半減期を増加させるのに適した他のバイオポリマー、から成る群より選択されるポリマー分子が含まれる。ポリマー分子の別の例は、ヒトアルブミンまたは血漿中に豊富に存在する別のタンパク質である。一般的にポリアルキレン-グリコール由来ポリマーは、生物学的適合性があり、毒性、抗原性、免疫原性がなく、様々な水溶性の性質を有し、かつ生体より容易に排泄される。
PEGは、例えばデキストランのようなポリサッカライドなどと比較して架橋結合可能な反応基がほんの少ししかないため、好んで用いられるポリマー分子である。特に、単機能的PEG、例えばモノメトキシポリエチレングリコール（mPEG）は、その結合化学が比較的単純（ただ一つの反応基しかポリペプチド上の連結基と結合するのに利用可能でない）であるため重要である。結果的に、架橋結合の危険性が排除され、生成するポリペプチド結合体はより均一であり、かつポリマー分子のポリペプチドとの反応はより容易に制御できる。
【００８９】
ポリペプチド変異体に対しポリマー分子を共有結合させるため、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は活性化型、すなわち反応性官能基（それらの例には一次アミノ基、ヒドラジド（HZ）、チオール、コハク酸（SUC）、スクシニミジルコハク酸（SS）、スクシニミジルスクシナミド(SSA), スクシニミジルプロプリオネート（SPA）、スクシニミジルカルボキシメチレート（SCM）、ベンゾトリアゾールカルボネート（BTC）、N-ヒドロキシスクシニミド（NHS）、アルデヒド、 ニトロフェニルカルボネート（NPC）、およびトレシレート（TRES）が含まれる）とともに与えられなければならない。適切に活性化されたポリマー分子は、例えばShearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USAから市販されている。あるいは、ポリマー分子は当業界にて既知の常套的方法にて、例えばWO90/13540に開示されるように活性化できる。本発明において使用する活性化直鎖または分岐ポリマーの具体的な例は、Shearwater Polymers, Inc. 1997および2000カタログ(Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives、引用により本明細書に含まれる) に記載されている。活性化PEGポリマーの具体例には、以下の直鎖PEGが含まれる：NHS-PEG（例えばSPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、およびSCM-PEG)、ならびにNOR-PEG)、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、およびMAL-PEG、ならびにPEG2-NHSのような分岐PEGおよびUS 5,932,462およびUS 5,643,575（どちらも引用により本明細書に含まれる）に開示されるそれらのもの。さらに引用により本明細書に含まれる以下の出版物は、有用なポリマー分子および/またはPEG化化学を開示する：US 5,824,778、US 5,476,653、WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、US 4,902,502、US 5,281,698、US 5,122,614、US 5,219,564、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、US 5,736,625、WO 98/05363、EP 809 996、US 5,629,384、WO 96/41813、WO 96/07670、US 5,473,034、US 5,516,673、EP 605 963、 US 5,382,657、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503およびEP 154 316。
【００９０】
システイン残基との結合に特に好ましい活性化PEGポリマーの具体例には、以下の直鎖PEGが含まれる： ビニルスルフォン-PEG (VS-PEG)、好ましくはビニルスルフォン-mPEG (VS-mPEG); マレイミド-PEG (MAL-PEG)、好ましくはマレイミド-mPEG (MAL-mPEG)およびオルソピリジル-ジスルフィド-PEG (OPSS-PEG)、好ましくはオルソピリジル-ジスルフィド-mPEG (OPSS-mPEG)。典型的には、このようなPEGまたはmPEGポリマーの大きさは、約5 kDa、約10 kD、約12 kDaまたは約20 kDaである。
【００９１】
ポリペプチド変異体と活性型ポリマー分子との結合は常套的方法を使用することにより、例えば以下の引用（ポリマー分子の活性化に適した方法も記載している）に記載されるように実施される：Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington;  R.F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fun-da-mental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjuga-tion and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.)。システイン残基へのPEG化（上記参照）のため、大抵PEG化の前にIFNG変異体にジチオスレイトース（DDT)のような還元剤を処置する。その後脱塩のような常套的方法により還元剤を除去する。PEGのシステイン残基への結合は、典型的にはpH 6-9の適した緩衝液中、 4℃から25℃の様々な温度で16時間までにおこる。
【００９２】
使用される活性化方法および/または結合化学は、ポリペプチド変異体の連結基およびポリマーの官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドまたはスルフヒドリル）に依存することは当業者は認識しているであろう。PEG化は、ポリペプチド変異体上のすべての利用可能な連結基（すなわちポリペプチド表面に露出しているそのような連結基）と結合するようなされる場合、または特定の連結基、例えばN末アミノ基（US 5,985,265）に対してなされる場合がある。さらに、結合は一段階または段階的方法（例えばWO 99/55377に記載されるように）により達成できる。
【００９３】
PEG化は、連結するPEG分子の数、そのような分子の大きさおよび形（例えばそれらが直鎖であるか分岐しているか）、ならびにそのような分子が結合するポリペプチド変異体中の場所、に関して最適な分子を生成するように設計されると解される。例えば、使用されるポリマーの分子量は、達成されるべき所望の効果に基づいて選択することができる。例えば、結合の第一の目的が高分子量の結合体を生成すること（例えば腎クリアランスを減少させるため）ならば、望ましい分子量を得るのにできるだけ少ない数の高分子量ポリマー分子を結合することが大抵望ましい。高度のエピトープ保護が望ましいときは、これは、効果的にポリペプチドのすべてまたはほとんどのエピトープを保護するのに十分な程多数の低分子量ポリマー（例えば分子量約5,000Daの）を用いることにより得られる。例えば3から6のように2から8のそのようなポリマーを使用することができる。
タンパク質上のただ一つの連結基との結合に関しては（US 5,985,265に記載されるように）、ポリマー分子は、直鎖でも分岐していてもよいが、例えば約20kDaの高分子量を有することが好都合であろう。
【００９４】
通常、ポリマー結合は、すべての利用可能なポリマー連結基がポリマー分子と反応するような条件下で行われる。典型的には、最適な反応を得るため、活性化ポリマー分子のポリペプチド変異体に対するモル比は、1000対1、特に200対1、例えば10対1または5対1のように100対1である。しかしながら等モル比もまた用いることができる。
本発明に従いポリマー分子をリンカーを介してポリペプチド変異体に結合させることも考えられる。適したリンカーは当業者にはよく知られている。好ましい例は塩化シアヌルである（Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378.）。
結合に続いて、残りの活性化ポリマー分子を当業界にて既知の方法に従い、例えば第一アミンを反応混合物中に加えることによりブロックし、生成する不活性化ポリマー分子を適した方法により除去する。
【００９５】
糖部分との結合
糖部分の結合はインビボまたはインビトロで起こり得る。IFNG活性を有するポリペプチド（一つまたはそれ以上のグリコシル化部位を導入するよう修飾されたもの（「非ポリペプチド部分が糖部分である本発明のIFNG変異体」の節参照））をインビボグリコシル化するため、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列がグリコシル化可能真核生物発現宿主に挿入されなければならない。発現宿主細胞は、真菌（糸状菌または酵母）、昆虫または動物細胞から、または遺伝子組換え植物細胞から選択することができる。さらにグリコシル化は、本発明のポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列を遺伝子治療において使用するとき、ヒトの体内においてなされ得る。ある具体例においては、宿主細胞はCHO細胞、BHKまたはHEK細胞、例えばHEK293細胞、のような哺乳細胞、またはSF9細胞のような昆虫細胞、または酵母細胞、例えばSaccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris、または例えば以下にさらに記載されるような他の適したグリコシル化可能宿主、である。任意で、インビボグリコシル化によりIFNGポリペプチド変異体に結合した糖部分は、さらにグリコシルトランスフェラーゼを使用して、例えばNeose, Horsham, PA, USAにより市販されるglycoAdvance（登録商標） technologyを使用して、修飾される。それにより例えば、CHO細胞による発現およびインビボグリコシル化に続きグリコシル化IFNGポリペプチド変異体のシアリル化を増大することができる。
【００９６】
IFNGポリペプチドのアミノ酸残基に対するグリコシドのインビトロ共有結合は、炭水化物置換基の数または特徴を修飾または増加するのに使用できる。用いられる結合様式に依存して、糖はa)アルギニンおよびヒスチジン、b) 遊離カルボキシル基、 c)遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのそれら、d) 遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニン、チロシン、またはヒドロキシプロリンのそれら、e)芳香族残基、例えばフェニルアラニンまたはトリプトファンのそれら、f)グルタミンのアミド基、に連結できる。これらのアミノ酸残基は糖部分のための連結基の例を構成しIFNGポリペプチドにおいて導入および/または除去され得る。インビトロ結合の適した方法は、例えばWO 87/05330およびAplin et al., CRC Crit Rev. Biochem., pp. 259-306, 1981に記載される。タンパク質およびペプチド結合Gln残基への糖部分またはPEGの結合は、トランスグルタミナーゼ(TGases)によっても、例えばSato et al., 1996 Biochemistry 35, 13072-13080により、またはEP 725145において記載されるようにもまた実施できる。
【００９７】
有機誘導物質との結合
IFNGポリペプチド変異体の共有結合修飾はポリペプチド変異体の連結基を有機誘導物質と反応させることにより行うことができる。適した誘導物質および方法は当業界にて周知である。例えば、システイニル残基は最も一般的にはα-ハロアセテート（および対応アミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応してカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(4-イミドゾイル)プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロ水銀安息香酸、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応により誘導体化される。ヒスチジル残基はpH5.5-7.0でジエチルピロカルボナートとの反応により誘導体化されるが、これは、この物質がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。p-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である。この反応は好ましくは0.1Mカコジル酸ナトリウム中pH6.0で行う。リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの物質による誘導体化はリジン残基の電荷を逆転させる効果を持つ。α-アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、イミドエステル類、例えばメチル ピコリンイミダート、リン酸ピリドキサル、ピリドキサル、水素化クロロホウ素、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4-ペンタンジオンおよびグリオキシラートを用いたトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。アルギニル残基は1または幾つかの常套的試薬、なかでもフェニルグリオキサル、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKaのため、アルカリ条件下で反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬はリジンの基およびアルギニングアニジノ基と反応することができる。カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（R-N=C=N-R'）（ここでRおよびR'は異なるアルキル基である）、例えば1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【００９８】
機能的部位の遮断
過剰なポリマー結合はそのポリマーの結合したポリペプチドの活性を損なう場合があることが報告されている。この問題は、例えば結合前に機能的部位に位置する連結基を除去することにより、または機能的部位を遮断することにより取り除くことができる。これら最近の方策は本発明のさらなる態様を構成し、第一の方策は、例えば機能的部位に近接するリジン残基を除去することにより、および/または機能的部位を妨げない位置にシステイン残基および/またはインビボグリコシル化部位を導入することによるもので、上記に例示される。
より具体的には、第二の方策に従い、IFNGポリペプチド変異体の機能的部位がポリペプチド変異体の機能的部位に結合可能な補助分子により遮断される条件下で、ポリペプチド変異体と非ポリペプチド部分との結合を行う。好ましくは、補助分子はポリペプチド変異体の機能的部位を特異的に認識するもの、例えば受容体、である。あるいは、補助分子はポリペプチド変異体を認識する抗体、特にモノクローナル抗体でもよい。特に補助分子は中和モノクローナル抗体であり得る。
【００９９】
次に、ポリペプチド変異体は結合を行う前に補助分子と相互作用できる。これにより確実にポリペプチド変異体の機能的部位が覆い隠されまたは保護され、結果的にポリマーのような非ポリペプチド部分による誘導化に使用不可能となる。補助分子からそれを溶出するのに続き、非ポリペプチド部分とポリペプチド変異体の間の結合体は、機能的部位が少なくとも部分的に保存されて回収される。
ポリマー、親油性化合物、糖部分、有機誘導物質または他の化合物に対する機能的部位が遮断されたポリペプチド変異体のその後の結合は、通常の方法で、例えば上記「〜との結合」と題される節に記載されるように行う。
【０１００】
さらなる具体例においては、カラム充填材料、例えばSephadexまたはアガロースビーズ、のような固層に、または表面、例えば反応槽に、補助分子をまず共有結合する。その後、ポリペプチド変異体を補助分子を有するカラム材料上にロードし、当業界にて既知の方法で、例えば上記「〜との結合」と題される節に記載されるように結合を行う。この手順により、溶出によって結合型ポリペプチド変異体を補助分子から分離できる。結合型ポリペプチド変異体の深刻な分解をもたらさない物理化学的条件下、常套的技術により結合型ポリペプチド変異体を溶出する。結合型ポリペプチド変異体を含む流動層が、補助分子がまだ共有結合している固層から分離される。分離は他の方法でも成すことができる：例えば特異的結合剤（例えばストレプトアビジン）により認識可能な二次分子（例えばビオチン）で補助分子を誘導体化できる。特異的結合剤は固層に結合でき、よって、続く溶出後は補助分子-二次分子複合体は保持しているが結合型ポリペプチド変異体は保持しないであろう二次補助固層カラムに通すことにより、結合型ポリペプチド変異体を補助分子-二次分子複合体から分離できる。結合型ポリペプチド変異体はいずれの適切な方法でも補助分子から離すことができる。脱保護は、補助分子がそれが結合するポリペプチド変異体の機能的部位から離れる条件下に置くことで実現できる。例えば、抗体とポリペプチドの複合体を結合体化し、pHを酸からアルカリpHに調節することによりイディオタイプ抗体を脱離できる。
【０１０１】
標識ポリペプチド変異体の結合
別の態様においてIFNGポリペプチド変異体は、融合タンパク質として標識されて、即ち典型的には1-30、例えば1-20のアミノ酸残基より成るアミノ酸配列または一続きのペプチドと共に、発現する。早く簡単な精製が可能になる以外にも、標識は、標識IFNGポリペプチド変異体と非ポリペプチド部分の結合を実現するのに便利な手段である。特に、標識ポリペプチドをその標識を介して固定化できるマイクロタイタープレートまたは他の担体、例えば常磁性ビーズ、において結合を成功させるのに標識を使用できる。例えばマイクロタイタープレートにおける標識IFNGポリペプチド変異体との結合は、標識ポリペプチド変異体を培養ブロスから（原則として全く精製せずに）直接マイクロタイタープレートに固定でき、結合を行える点で有利である。それにより、（発現から結合までの）工程段階の総数を減らすことができる。さらに標識は、結合を受ける固定化ポリペプチド変異体への接近性を確実に改善するスペーサー分子として機能し得る。標識ポリペプチド変異体を用いた結合は、本明細書に開示される非ポリペプチド部分のいずれに対しても、例えばPEGのようなポリマー分子に対してなすことができる。
【０１０２】
用いられる特異的標識自身は、その標識がポリペプチド変異体と共に発現でき、かつ適した表面または担体材料に固定できる限り重要ではない。多くの適した標識が、例えばUnizyme Laboratories, Denmarkから、市販されている。例えば、標識は以下の配列のいずれかであり得る：
His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO:35)、
Met-Lys-His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO:36)、
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His (SEQ ID NO:37)、
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln (SEQ ID NO:38、
(すべて Unizyme Laboratories, Denmarkより入手可能)
または以下のいずれかであり得る：
EQKLI SEEDL (SEQ ID NO:39) (Mol. Cell. Biol. 5:3610-16, 1985に記載されるC-末標識)、
DYKDDDDK (SEQ ID NO:40) (C-またはN-末標識)、
YPYDVPDYA (SEQ ID NO:41)。
上記標識に対する抗体は、例えばADI, Aves Lab and Research Diagnosticsから市販されている。
後にポリペプチドから標識を切断するのは、市販の酵素を用いて成され得る。
【０１０３】
本発明のIFNGポリペプチド変異体の調製方法
IFNGポリペプチド変異体は、当業界にて既知のいずれの適した方法でも生産できる。そのような方法は、そのポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列を作成し、適した形質転換またはトランスフェクトされた宿主でこの配列を発現することを含む。しかしながら、本発明に係るポリペプチド変異体は、効率は低いものの、化学合成または化学合成の組み合わせまたは化学合成と組換えDNA技術の組み合わせによって生産することができる。
（単量体または単一鎖型の）IFNGポリペプチド変異体をコードする本発明のヌクレオチド配列は、配列番号：１７に示されるアミノ酸配列を有するhuIFNGまたはその断片のような親IFNGをコードするヌクレオチド配列を単離または合成し、その後このヌクレオチド配列を適当なアミノ酸残基の導入（即ち挿入または置換）または除去（即ち除去または置換）を惹起するように変化させることにより作成することができる。
そのヌクレオチド配列は、周知の方法により部位特異的突然変異誘発によって都合よく修飾される（例えばMark et al., ″Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene″, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984);およびUS 4,588,585参照）。
あるいは、そのヌクレオチド配列は化学合成によって調製され、それは例えばオリゴヌクレオチド合成機を使用し（ここでオリゴヌクレオチドは所望のポリペプチド変異体のアミノ酸配列に基づき設計される）、そして好ましくはその組換えポリペプチド変異体が産生されるであろう宿主細胞において好都合なコドンを選択することによる。例えば、所望のポリペプチド変異体の一部をコードしている幾つかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、PCR、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応（LCR）によって組み立てることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的組み立てのための5'または3'突出部を含んでいる。
【０１０４】
（合成、部位特異的突然変異または別の方法により）いったん組み立てられると、IFNGポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列は、組換えベクターに挿入され、かつ望ましい形質転換宿主細胞におけるIFNGポリペプチドの発現に必要な調節配列に作動可能に結合される。
全てのベクターおよび発現調節配列が等しく良好に機能し、本明細書に記載されるIFNGポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列を発現する訳ではないことは無論理解されるべきである。全ての宿主が同じ発現系で等しく良好に機能する訳でもない。しかしながら当業者は、これらのベクター、発現調節配列および宿主から、不必要な実験を行うことなく選択を行うことができる。例えばベクターの選択において、そのベクターは宿主中で複製するかまたは染色体中に組み込まれ得なければならないので、宿主を考慮せねばならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、および抗生物質マーカーのようなそのベクターによりコードされている他のタンパク質の発現もまた考慮すべきである。発現調節配列の選択にあたり、様々な因子もまた考慮すべきである。これらは、例えば配列の相対的強さ、その被調節可能性、および、特に可能性ある二次構造に関するポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列との適合性を含む。宿主は、選択したベクターとの適合性、該ヌクレオチド配列がコードしている生成物の毒性、それらの分泌特性、該ポリペプチドを正しく折り畳む能力、発酵または培養要件、および該ヌクレオチド配列がコードしている生成物の精製し易さを考慮して選択すべきである。
【０１０５】
この組換えベクターは、自律複製ベクター、即ち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであってよい。これに代わり該ベクターは、宿主細胞中に導入された時にその宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターである。
ベクターは好ましくは、IFNGポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の転写に必要なさらなるセグメントに作動可能に結合している発現ベクターである。このベクターは典型的にはプラスミドまたはウィルスDNAに由来する。本明細書に記載の宿主細胞での発現に適した多くの発現ベクターが市販されており、または文献に記載されている。真核生物宿主のための有用な発現ベクターは、例えば、SV40、牛乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現調節配列を含有するベクターを含む。具体的なベクターは、例えばpCDNA3.1(+)＼Hyg（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）およびpCI-neo（Stratagene, LaJola, CA, USA）である。細菌宿主のための有用な発現ベクターは、既知の細菌プラスミド、例えばpBR322、pET3aおよびpET12a（いずれもNovagen Inc., WI, USAより）を含む大腸菌由来のプラスミド、より広い宿主範囲のプラスミド、例えばRP4、ファージDNA、例えばファージλの多数の誘導体、例えばNM989、ならびに他のDNAファージ、例えばM13および繊維状一本鎖DNAファージを含む。酵母細胞のための有用な発現ベクターは、2μプラスミドおよびその誘導体、POT1ベクター（US4,931,373）、Okkels, Ann.New York Acad.Sci. 782, 202-207, 1996に記載されるpJSO37ベクター、およびpPICZ A、BまたはC（Invitrogen）を含む。昆虫細胞のための有用なベクターは、pVL941、pBG311 (Cate et al., “Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells”, Cell, 45, pp. 685-98 (1986)）、pBluebac 4.5およびpMelbac（いずれもInvitrogenより入手可能）を含む。
【０１０６】
本発明で使用するための他のベクターは、IFNGポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列のコピー数を増幅させるものを含む。このような増幅可能なベクターは当業界において周知である。それらは、例えば、DHFR増幅（例えば、Kaufman、米国特許第4470461号、Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)参照) およびグルタミンシンセターゼ (「GS」) 増幅(例えばUS5122464およびEP338841を参照）によって増幅させることのできるベクターを含む。
この組換えベクターはさらに、該ベクターを問題の宿主細胞中で複製することのできるDNA配列を含む。このような配列の例は（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）、SV40複製開始点である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターを複製することのできる適切な配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3および複製開始点である。
このベクターはまた、選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞の欠陥を補完する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）またはSchizosaccharomyces pombe TPI遺伝子（P.R.Russell, Gene 40, 1985, pp.125-130に記載）、または、薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンもしくはメトトレキサートに対する耐性を付与する遺伝子を含み得る。糸状菌のためには、選択マーカーはamdS、pyrG、arcB、niaDおよびsCを含む。
【０１０７】
「調節配列」なる用語は本明細書では、IFNGポリペプチド変異体の発現にとって必要または有利な全ての成分を包含すると規定される。各調節配列は、該ポリペプチド変異体をコードしている核酸配列に対して本来のまたは外来のものであってよい。そのような調節配列は、これらに限定される訳ではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含む。最低でも調節配列はプロモーターを含む。
本発明には多岐にわたる発現調節配列を使用できる。このような有用な発現調節配列は、前記発現ベクターの構造遺伝子に付随する発現調節配列、および、原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウィルスの遺伝子の発現を調節することが知られている任意の配列、ならびにそれらの様々な組み合わせを含む。
哺乳動物細胞における転写を指令するのに適した調節配列の例は、SV40およびアデノウィルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウィルス2主要後期プロモーター、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウィルス即時初期プロモーター（CMV）、ヒト延長因子1α（EF-1α）プロモーター、ショウジョウバエ最小熱ショック蛋白70プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（RSV）プロモーター、ヒトユビキチンC（UbC）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、SV40またはアデノウィルスE1b領域ポリアデニル化シグナルおよびKozakコンセンサス配列（Kozak,M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947-50）を含む。
【０１０８】
哺乳動物細胞における発現を改善するため、IFNGポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列の5'非翻訳領域に合成イントロンを挿入することができる。合成イントロンの一例は、プラスミドpCI-Neo（Promega Corporation, WI, USAより入手可能）由来の合成イントロンである。
昆虫細胞における転写を指令するのに適した調節配列の例は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、Autographa californica多角体病ウィルス塩基性蛋白プロモーター、バキュロウイルス即時初期遺伝子1プロモーターおよびバキュロウィルス39K遅延初期遺伝子プロモーター、ならびにSV40ポリアデニル化配列を含む。
酵母宿主細胞における使用に適した調節配列の例は、酵母α接合系のプロモーター、酵母燐酸トリオースイソメラーゼ（TPI）プロモーター、酵母解糖遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター、ADH2-4cプロモーター、および誘導性GALプロモーターを含む。
糸状菌宿主細胞における使用に適した調節配列の例は、ADH3プロモーターおよびターミネーター、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼリン酸トリオースイソメラーゼもしくはアルカリ性プロテアーゼ、A.niger α-アミラーゼ、A.nigerもしくはA.nidulansグルコアミラーゼ、A.nidulansアセトアミダーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼまたはリパーゼをコードしている遺伝子に由来するプロモーター、TPI1ターミネーターおよびADH3ターミネーターを含む。
細菌宿主細胞での使用のための適した調節配列の例は、lac系、trp系、TACまたはTRC系のプロモーター、およびファージλの主要プロモーター領域を含む。
【０１０９】
部位特異的突然変異誘発、合成または他の方法による調製の如何に拘わらず、本発明のヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含んでも、また含まなくてもよい。シグナルペプチドは、該ポリペプチドをそれが発現される細胞から分泌させようとする場合に存在する。このようなシグナルペプチドは、存在するとすれば、該ポリペプチド変異体の発現のために選択した細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、該ポリペプチドにとって同種（例えば、huIFNGに通常付随するもの）または異種（即ち、huIFNG以外の供給源に起源を持つもの）であってよく、または宿主細胞にとって同種または異種、即ち、その宿主細胞から通常発現されるシグナルペプチドであるか、または宿主細胞から通常発現されないものであってよい。したがって、シグナルペプチドは原核生物性、例えば大腸菌のような細菌由来のもの、または真核生物性、例えば哺乳動物または昆虫もしくは酵母細胞由来のものであってよい。
シグナルペプチドの存在または不在は、例えば、ポリペプチド変異体の産生に使用する発現宿主細胞、発現させるタンパク質（それが細胞内タンパク質であるか細胞外タンパク質であるか）、および分泌を得ることが望ましいかどうかに依存するであろう。糸状菌において使用するためには、シグナルペプチドは都合にあわせ、Aspergillus種のアミラーゼもしくはグルコアミラーゼをコードしている遺伝子、Rhizomucor mieheiのリパーゼもしくはプロテアーゼ、またはHumicola lanuginosaのリパーゼをコードしている遺伝子由来のものであってよい。シグナルペプチドは好ましくはA.oryzae TAKAアミラーゼ、A.niger中性α-アミラーゼ、A.niger酸安定性アミラーゼ、またはA.nigerグルコアミラーゼをコードしている遺伝子由来のものである。昆虫細胞において使用するためには、シグナルペプチドは都合により、昆虫遺伝子（WO90/05783参照）、例えばlepidopteran Manduca sexta脂肪動員ホルモン前駆体（US5023328参照）、ミツバチのメリチン（Invitrogen）、エクジステロイドUDPグリコシルトランスフェラーゼ（egt）(Murphy et al., Protein Expression and Purification 4, 349-357(1993)）またはヒト膵臓リパーゼ（hp1)(Methods in Enzymology 284, pp.262-272, 1997）由来のものであってよい。
哺乳動物細胞において使用するための好ましいシグナルペプチドは、huIFNGのそれまたはマウスIgκ軽鎖シグナルペプチド（Coloma,J(1992) J.Imm.Methods 152:89-104）である。酵母細胞において使用するための適したシグナルペプチドは、S.cereviciae由来のα因子シグナルペプチド（US4,870,008参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O. Hagenbuchle et al.,Nature 289, 1981, pp. 643-646参照）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A.Valls et al., Cell 48, 1987, pp.887-897参照）、酵母BAR1シグナルペプチド（WO87/02670参照）および酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3（YAP3）シグナルペプチド（M.Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp.127-137参照）であることが見出されている。
【０１１０】
細菌、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物、または他の適当な動物細胞もしくは株化細胞、ならびに遺伝子組換え動物もしくは植物を含む、任意の適した宿主を使用してIFNGポリペプチド変異体を産生できる。細菌宿主細胞の例は、Bacillusの菌株、例えばB.brevisまたはB.subtilis、PseudomonasまたはStreptomyces、のようなグラム陽性細菌、または大腸菌の菌株のようなグラム陰性細菌を含む。細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えばプロトプラスト形質転換（例えばChang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115参照）、コンピテント細胞の使用（例えばYoung and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829、またはDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221参照）、電気穿孔（例えばShigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751参照）、またはコンジュゲーション（例えばKoehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278参照）によって実施できる。
【０１１１】
適した糸状菌宿主細胞の例は、Aspergillusの菌株、例えばA.oryzae、A.nigerもしくはA.nidulans、FusariumまたはTrichodermaを含む。真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含むプロセスにより、自体既知の方法で形質転換できる。Aspergillus宿主細胞の形質転換に適した方法がEP238023およびUS5,679,543に記載されている。Fusarium種を形質転換させるのに適した方法はMalardier et al., 1989, Gene 78:147-156およびWO96/00787に記載されている。酵母は、Becker and Guarenteによる、Abelson,J.N.およびSimon,M.I. Ed.、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp182-187, Academic Press,Inc., New York；Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163；Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920に記載の方法を用いて形質転換できる。
適した酵母宿主細胞の例は、例えばS.cerevisiaeのようなSaccharomycesの菌株、Schizosaccharomyces、Klyveromyces、Pichiaの菌株、例えばP.pastorisもしくはP.methanolica、H.Polymorpha のようなHansenulaの菌株、またはYarrowiaの菌株を含む。酵母細胞を異種性DNAで形質転換しそこから異種性ポリペプチドを産生する方法はClontech Laboratories,Inc., Palo Alto, CA, USA（Yeastmaker（登録商標）酵母形質転換系キットのための製品プロトコル中）により、およびReeves et al., FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198、Manivasakam and Schiestl, Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21, No. 18, pp. 4414-4415並びにGaneva et al., FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164.により開示される。
【０１１２】
適した昆虫宿主細胞の例は、Lepidoptora株化細胞、例えばSpodoptera frugiperda（Sf9またはSf21）またはTrichoplusioa ni細胞（High Five）(US5,077,214）を含む。昆虫細胞の形質転換およびそこでの異種性ポリペプチドの産生はInvitrogenにより記載されるように実施できる。
適した哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）株化細胞（例えばCHO-K1; ATCC CCL-61）、ミドリザル株化細胞（COS)(例えばCOS1（ATCC CRL-1650）、COS7（ATCC CRL-1651)); マウス細胞（例えばNS/O）、新生児ハムスター腎（BHK）株化細胞（例えばATCC CRL-1632またはATCC CCL-10）、およびヒト細胞（例えばHEK293（ATCC CRL-1573）ならびに組織培養の植物細胞を包含する。さらなる適した株化細胞が当業界で知られており、American Type Culture Collection, Rockville, Marylandのような公的寄託機関から入手できる。また、CHO細胞のような哺乳動物細胞は、IFNGポリペプチド変異体のグリコシル化を改善するために、US5,047,335に記載のようにシアリルトランスフェラーゼ、例えば1,6-シアリルトランスフェラーゼを発現するよう改変することができる。
【０１１３】
外因性DNAを哺乳動物宿主細胞中に導入する方法は、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、電気穿孔、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、ウィルスベクター、およびLipofectamin 2000を用いるLife Technologies Ltd, Paisley, UKにより記載されるトランスフェクション法を含む。これらの方法は当業界にて周知であり、例えばAusbel et al.(eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USAに記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えば(Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Nigel Jenkins Ed., 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jersey, USAおよびHarrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997)に開示されている、確立された方法に従って実施する。
グリコシル化ポリペプチドを産生するため、真核生物宿主細胞、例えば上記タイプのもの、を使用する。
【０１１４】
本発明の製造方法では、当業界で既知の方法を用いてポリペプチド変異体の産生に適した栄養培地で細胞を培養する。例えば、ポリペプチド変異体が発現され、そして/または単離され得る条件下で、適した培地中で実施される実験室または工業的発酵槽内での振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、給餌バッチ、または固体状態発酵を含む）により、細胞を培養できる。この培養は、炭素並びに窒素源および無機塩類を含む適した栄養培地中で、当業界で既知の方法を用いて実施する。適した培地は商業的供給者から入手でき、または公開されている組成（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログにおいて）に従って調製できる。ポリペプチド変異体が栄養培地中に分泌されるならば、このポリペプチド変異体を培地から直接回収することができる。ポリペプチド変異体が分泌されない場合は細胞可溶化物から回収できる。
得られるポリペプチド変異体は当業界にて既知の方法によって回収できる。例えば、ポリペプチド変異体は、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む（但しこれらに限定されない）常套的方法によって栄養培地から回収できる。
【０１１５】
ポリペプチド変異体は、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば調製用等電点電気泳動）、差別的溶解度（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、SDS-PAGEまたは抽出（例えばProtein Purification, J.-C.Janson and Lars Ryden Ed., VCH Publishers, New York, 1989参照）を含む（但しこれらに限定されない）当業界で既知の様々な方法によって精製できる。IFNG活性を示すポリペプチドを精製する具体的な方法は、EP 0 110 044および審査係属中の日本特許出願番号 186995/84において開示される
【０１１６】
IFNGポリペプチド変異体の生物学的活性は当業界にて既知の適した方法により測定できる。そのようなアッセイは、EP 41313 B1に記載されるように、抗ウィルス活性、タンパクキナーゼの誘導、オリゴアデニレート2,5-A合成酵素またはホスホジエステラーゼ活性の抗体中和を含む。そのようなアッセイはまた免疫調節アッセイ（US 4,753,795参照）、成長阻害アッセイ、およびインターフェロン受容体発現細胞に対する結合測定を含む。具体的なアッセイは、本明細書の材料と方法の節に開示される。
【０１１７】
医薬組成物およびその使用
さらに、本発明は、特に炎症性疾患、例えば、特発性肺繊維症のような間質性肺疾患の処置または予防の改良された方法に関するが、また肉芽腫性疾患；癌、特に卵巣癌；感染、例えば肺非定型マイコバクテリア感染；骨疾患（例えば悪性骨石化症のような骨代謝疾患）；自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ；および他の疾患、例えば多耐性結核；クリプトコッカス髄膜炎、嚢胞性線維症、および肝繊維症、特にC型肝炎続発性の肝繊維症にも関し、該方法は、有効量の本発明のポリペプチド変異体または本発明の組成物をそれを必要とする哺乳類、特にヒトに、投与することを含み、その重要な長所は、より頻度が少なく、かつ／または煩わしさのより少ない投与でより有効な治療ができる点、および状況に応じて治療活性化合物との免疫反応の危険性が下がる点である。
【０１１８】
本発明の分子は、さらに製薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物として投与されるのが好ましい。「製薬的に許容される」なる用語は、担体または賦形剤が、それらが投与される患者において有害な作用を惹起しないことを意味する。このような製薬的に許容される担体および賦形剤は当業界ではよく知られている（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] ;および Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]）。
本発明の分子は「現状のままで」および/またはその塩の形態で使用できる。適した塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムとの塩、ならびに例えば亜鉛塩を含むが、これらに限定される訳ではない。これらの塩または複合体は結晶および/またはアモルファス構造として存在できる。
【０１１９】
本発明の変異体は、Actimmune（登録商標）のような既知の市販IFNG調製物による治療において用いられる量におおよそ匹敵する投与量で、またはEP 0 795 332に具体的に示されるように投与される。投与されるべき正確な量はその環境に依存する。通常、投与量は、処置の対象である状態または適応症の重症度または拡散を防ぐかまたは減少させることができなければならない。効果的な本発明の変異体または組成物の量は、特に、疾患、投与量、投与計画、ポリペプチド変異体または組成物が単独でまたは他の治療物質と一緒に投与されるか、組成物の血清半減期、および患者の全体的健康状態に依存することは当業者には明らかであろう。
【０１２０】
本発明はまた、本発明によるIFNGポリペプチド変異体、または本発明による医薬組成物の、医薬としての使用に関する。
さらに、本発明はまた、i)本発明によるIFNG変異体、またはii) 本発明の医薬組成物の、間質性肺疾患、特に特発性肺繊維症；癌、特に卵巣癌；感染、例えば肺非定型マイコバクテリア感染；骨疾患（例えば悪性骨石化症のような骨代謝疾患）；肉芽腫性疾患；自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ；多耐性結核；クリプトコッカス髄膜炎、嚢胞性線維症、および肝繊維症、特にC型肝炎続発性の肝繊維症、のような炎症性疾患の群から選択される疾患を処置するための医薬、医薬組成物またはキットの一部を製造するための使用にも関する。
任意でさらに糖質コルチコイドを含む該分子または調製物を送達する改良された方法もまた開示される。
好ましい投与量は、一回分につきポリペプチド成分が1から4、より好ましくは2から3マイクログラム/kg（患者体重）である。糖質コルチコイドは、一回分につき100から350、より好ましくは100から150マイクログラム/kg（患者体重）の投与量あることが好ましい。
【０１２１】
本発明はまた、上記i)またはii)の活性成分を含む第一の医薬組成物および少なくとも一の糖質コルチコイドを含む第二の医薬組成物を含む、間質性肺疾患の処置に適したキットの一部に関し、それらは各々任意で製薬的に許容される担体および/または賦形剤と一緒になることがある。
本発明の変異体は既知の方法で医薬組成物に製剤化できる。適した剤形は、Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W.MartinおよびUS 5,183,746.に記載される。
医薬組成物は、液体、ゲル、凍結乾燥、粉末、圧縮固体または他の適した形態を含む様々な形態に製剤化できる。好ましい形態は治療される特定の適応症に依存し、かつ当業者には明らかであろう。
【０１２２】
医薬組成物は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣、肛門、眼内、または他の許容される方法、例えばPowderJectまたはProLease技術を使用する方法、にて投与できる。製剤は、大量瞬時投与が可能であるが、当業界で周知の技術、例えばポンプまたは移植による注入により継続的に投与できる。ある例においては製剤は溶液または噴霧として直接に投与できる。好ましい投与の様式は処置される特定の適応症に依存しかつそれは当業者には明らかであろう。
本発明の医薬組成物は、他の治療物質とともに投与できる。これらの物質は、同じ医薬組成物の一部として含まれることができ、または、本発明のポリペプチド変異体とは別に、同時にまたは他の許容される処置計画に従って、投与することもできる。さらに、本発明のポリペプチド変異体または医薬組成物は、他の治療の補助剤（アドジャンクト）として使用することができる。特に、EP 0 795 332に記載される糖質コルチコイドとの組み合わせが考慮される。
【０１２３】
さらなる局面において本発明は、huIFNGまたはrhuIFNGに対する循環抗体を有する哺乳動物を処置する方法に関し、その方法には、IFNGの生物活性を有し該抗体と反応しないIFNG変異体を投与することが含まれる。化合物は好ましくは本明細書記載の変異体であり、哺乳動物は、好ましくはヒトである。処置される哺乳動物は、IFNGが有用な処置である上記に挙げられる疾患のいずれかに苦しんでいるであろう。さらに、本発明は、huIFNGまたはrhuIFNGに対する循環抗体を有する哺乳類の処置に用いられる医薬製品を製造する方法に関し、ここでIFNG生物活性を有し該抗体と反応しないIFNG変異体は、注射可能な製剤、または他の適した製剤へと製剤化される。「循環抗体」なる用語は、市販のIFNG調製物のいずれかを投与されたことに反応して哺乳動物中で形成される自己抗体を意味する。
【０１２４】
本発明のIFNGポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列の、遺伝子治療適用での使用もまた考えられる。特に、「非ポリペプチド部分が糖部分である本発明のIFNG変異体」と題される上記の節に記載されるIFNGポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列を使用することは重要であろう。ポリペプチド変異体のグリコシル化は従って遺伝子治療の経過中、すなわちヒト体内でのヌクレオチド配列の発現の後、になされる。
考えられる遺伝子治療適用には、ポリペプチドが効果的な治療を提供することが期待されるそれらの疾患の処置が含まれる。遺伝子治療を用いるIFNG変異体の局所送達は、非特異的投与に関して可能性のある毒性問題を回避しつつ、目標領域に治療物質を提供できる。
インビトロおよびインビボの両者の遺伝子治療方法論が考えられる。
【０１２５】
治療上利用可能な遺伝子を規定された細胞集団に移入するいくつかの方法が知られている。さらなる参考として、例えばMulligan, ″The Basic Science Of Gene Therapy″, Science, 260, pp. 926-31 (1993)を参照されたい。これらの方法は以下のものを含む：
直接的遺伝子移入（例えばWolff et al., ″Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In vivo″, Science 247, pp. 1465-68 (1990)により開示されている）；
リポソーム仲介DNA移入（例えばCaplen et al., ″Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis″ Nature Med., 3, pp. 39-46 (1995)、Crystal, ″The Gene As A Drug″, Nature Med., 1, pp.- 15-17 (1995)、Gao and Huang, ″A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian Cells″, Biochem.Biophys Res. Comm., 179, pp. 280-85 (1991)により開示されている）；
レトロウィルス仲介DNA移入（例えばKay et al., ″In vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs″, Science, 262, pp. 117-19 (1993)、Anderson, ″Human Gene Therapy″, Science, 256, pp.808-13(1992)により開示されている）；
DNAウィスル仲介DNA移入。このようなDNAウィルスには、アデノウィルス（好ましくはAd-2またはAd-5に基づくベクター）、ヘルペスウィルス（好ましくは単純疱疹ウイルスに基づくベクター）、およびパルボウィルス（好ましくは「欠陥」または非自律性パルボウィルスに基づくベクター、より好ましくはアデノ関連ウィルスに基づくベクター、さらに好ましくはAAV-2に基づくベクター）。例えばAli et al., ″The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy″, Gene Therapy, 1, pp. 367-84 (1994)、US 4,797,368、およびUS 5,139,941を参照されたい。
【０１２６】
非経口組成物
医薬組成物の一例は非経口投与用に設計した溶液である。多くの場合、医薬溶液製剤は即時使用に適した液体形態で提供されるが、係る非経口製剤は凍結または凍結乾燥形態でも提供できる。前者の場合、使用前にこの組成物を融解せねばならない。凍結乾燥調製物は一般に液体調製物より安定であるという事が当業者に認識されているため、より多岐にわたる貯蔵条件の下で該組成物中に含まれる活性化合物の安定性を増強するため、凍結乾燥形態がしばしば利用される。このような凍結乾燥調製物は、注射用滅菌水または滅菌生理食塩水のような一つまたはそれ以上の適当な製薬的に許容される希釈剤の添加により、使用前に再構成される。
非経口投与の場合、これらは、所望の純度を持つ該ポリペプチド変異体を、一つまたはそれ以上の当業界で典型的に使用される製薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤（これらは全て「賦形剤」と称する）、例えば緩衝物質、安定化物質、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および／または他の様々な添加剤と適宜混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液として保存用に調製される。
【０１２７】
緩衝物質は、生理的条件に近似する範囲のpHを維持する助けとなる。これらは典型的には約2mMから約50mMの範囲の濃度で存在する。本発明に使用するのに適した緩衝物質は、有機および無機酸ならびにその塩、例えばクエン酸緩衝液（例えばクエン酸一ナトリウム-クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えばコハク酸-コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸-水酸化ナトリウム混合物、コハク酸-コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば酒石酸-酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸-酒石酸カリウム混合物、酒石酸-水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えばフマル酸-フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸-フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム-フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えばグルコン酸-グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸-水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸-グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えばシュウ酸-シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸-水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸-シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば乳酸-乳酸ナトリウム混合物、乳酸-水酸化ナトリウム混合物、乳酸-乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば酢酸-酢酸ナトリウム混合物、酢酸-水酸化ナトリウム混合物など）を包含する。さらなる可能性はリン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびTrisのようなトリメチルアミン塩である。
【０１２８】
保存剤は微生物の増殖を遅延させるために添加でき、典型的には約0.2％から1％(w/v)の量を添加する。本発明での使用に適した保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば塩化、臭化またはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンといったアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび3-ペンタノールが含まれる。
【０１２９】
等張化剤は液体組成物の等張性を確保するために添加でき、多価糖アルコール、好ましくは三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールを含む。多価アルコールは他の成分の相対量を考慮に入れて0.1％および25％（重量）の間、典型的には1％から5％の量で存在できる。
【０１３０】
安定剤とは、機能の上で、増量物質から、治療物質を可溶化しまたは変性や容器壁への付着の防止を助ける添加物までの範囲の広い範疇の賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙）；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L-ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば乳糖、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールおよび同様のもの（イノシトールのようなシクリトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（即ち＜10残基）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコース；二糖類、例えば乳糖、マルトースおよび蔗糖；三糖類、例えばラフィノース、ならびに多糖類、例えばデキストランであってよい。安定剤は、典型的には活性タンパク質重量を基準として0.1から10,000重量部の範囲で存在する。
非イオン性界面活性剤またはデタージェント（「湿潤化剤」としても知られる）は、治療物質の可溶化を助けるため、そして治療用ポリペプチドを振動誘発凝集から保護するために存在させることができ、さらにこれは、該ポリペプチドの変成をもたらすことなく製剤を剪断表面応力にさらすことを可能にする。適した非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（20、80など）、ポリオキサマー（184、188など）、Pluronic（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Tween（登録商標）-20、Tween（登録商標）-80など）を含む。
さらなるその他の賦形剤は、充填物質または増量物質（例えば澱粉）、キレート化物質（例えばEDTA）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE）および補助溶媒を包む。
【０１３１】
活性成分はまた、例えばコアセルベート化技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ-(メチルメタキレート)マイクロカプセル中に、またはコロイドドラッグデリバリーシステム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に捕捉できる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences、上記、に開示されている。
インビボ投与に使用する非経口製剤は無菌でなければならない。これは例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成できる。
【０１３２】
本発明の好ましい態様においては、該医薬組成物はi)本発明のIFNG変異体、ii)pHを5.0から6.5の間に維持できる緩衝物質、特に有機酸の塩、iii)安定剤、特に有機糖または糖アルコール、iv)非イオン界面活性剤、およびv)滅菌水を含む。詳細には、緩衝物質は、酢酸、コハク酸およびクエン酸から成る群より選択され、安定剤は、マンニトールまたはソルビトールであり、非イオン界面活性剤はTween(登録商標）-20またはTween(登録商標）-80である。医薬組成物は保存剤を含まないことが好ましい。
【０１３３】
持続放出調製物
持続放出調製物の適当な例は、本変異体を含有する疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスはフィルムまたはマイクロカプセルのような適した形態を有する。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリ乳酸、L-グルタミン酸とエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレンビニルアセタート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばProLease（登録商標）技術またはLupron Depot（登録商標）（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドより成る注射可能なミクロスフェア）、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン-ビニルアセタートおよび乳酸-グリコール酸といったポリマーは、100日間またはそれ以上の長期間の分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短期間放出する。カプセル化したポリペプチドが体内に長時間とどまる場合、37℃で水分にさらされる結果これらは変性または凝集し、生物学的活性の喪失およびことによると免疫原性の変化を招く場合がある。関与している機構に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間S-S結合の形成であることが判明しているならば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分量の調節、適当な添加剤の使用、そして特別なポリマーマトリックス組成物の開発により、安定化を達成できる。
【０１３４】
経口投与
経口投与のためには、医薬組成物は固体または液体形態、例えばカプセル、錠剤、懸濁液、乳濁液、または溶液の形態であってよい。医薬組成物は、所定の量の活性成分を含む一投与量単位の形態で作られることが好ましい。ヒトまたは他の哺乳動物に適した一日の投与量は、患者の状態や他の因子に依存し広範にわたり得るが、当業者は日常的な方法で決定できる。
経口投与のための固体投与形態には、カプセル、錠剤、坐剤、散剤、または顆粒剤が含まれ得る。このような固体投与形態においては、活性化合物は少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えばショ糖、乳糖、または澱粉と混合できる。このような投与形態はまた、通常の慣行として、更なる物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑化物質も含むことができる。カプセル、錠剤、およびピルの場合、投与形態はまた、緩衝物質を含む。錠剤およびピルはさら、腸溶性コーティングして調製できる。
【０１３５】
変異体は、通常の投与のため、乳糖、スクロース、澱粉粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゲラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル-ピロリジン、および/またはポリビニルアルコールのようなアジュバントと混合し、錠剤化またはカプセル化できる。あるいは、それらは生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、油脂（例えばコーン油、ピーナッツ油、綿実油またはゴマ油）、トラガカント・ゴム、および/または様々な緩衝液に溶解できる。他のアジュバントおよび投与方法は医薬業界において周知である。担体または希釈剤は、時間遅延物質、例えばモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンを単独で、またはワックスまたは当業界にて周知の他の物質とともに含むことができる。
【０１３６】
医薬組成物は、滅菌のような常套的製薬的操作を受けることができ、かつ/または例えば本明細書中のほかの場所で開示される保存剤、安定剤、湿潤化物質、乳化剤、緩衝剤、増量剤などのような常套的アジュバントを含むことができる。
経口投与のための液体形態には、当業界で通常用いられる不活性な希釈液、例えば水、を含む、製薬的に許容される乳化液、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が含まれる。このような組成物はまた、湿潤化物質、甘味料、香味物質、および芳香物質を含むことができる。
【０１３７】
局所投与
局所投与に適した製剤には、経皮浸透に適した液体または半液体調製物（例えば塗布薬、ローション、軟膏、クリーム、またはペースト）および眼、耳または鼻への投与に適した液滴が含まれる。
【０１３８】
肺送達
ジェットまたは超音波のいずれかの噴霧器での使用に適した製剤は、典型的には、例えば溶液1 mLに対し結合体約0.01-25mgの濃度、好ましくは約0.1-10ng/mL、で水に溶解したポリペプチド変異体を含むであろう。その製剤はまた緩衝剤並びに単糖（例えばタンパク質安定化および浸透圧調節のため）、および/または濃度0.1-10 mg/mlの範囲のヒト血清アルブミンを含む。使用可能な緩衝剤の例は酢酸ナトリウム、クエン酸およびグリシンである。好ましくはその緩衝剤は、溶液のpHを3から9の範囲に調節するのに適した組成およびモル濃度を有する。一般的に、1 mMから50 mMの緩衝液モル濃度がこの目的に適している。利用可能な糖の例は、乳糖、麦芽糖、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、およびキシロースであり、通常製剤の重量の1％から10％の範囲の量である。
エアロゾル形成における溶液の噴霧化により引き起こされる表面誘導タンパク質凝集を減少させるため、または防ぐため、噴霧製剤はまた界面活性剤を含むことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル並びにアルコール、およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのような、様々な常套的な界面活性剤が使用可能である。量は一般的に製剤の重量の0.001％から4％の間の範囲である。本発明の目的のため特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。
本発明の液体粒子を適切に分散させる具体的な製剤および方法は、引用により本明細書に含まれるWO 94/20069、US 5,915,378、US 5,960,792、US 5,957,124、US 5,934,272、US 5,915,378、US 5,855,564、US 5,826,570およびUS 5,522,385に記載される。
【０１３９】
定量吸入装置で使用するための本発明の製剤は、一般的に微細粉末を含む。この粉末は、液体変異体製剤を凍結乾燥しその後製粉することで生産することができ、またヒト血清アルブミン（HSA）のような安定剤を含むことができる。典型的には0.5％(w/w)以上のHSAが添加される。さらに、要すれば一つまたはそれ以上の糖または糖アルコールをその調製物に添加できる。例としては、乳糖、麦芽糖、マンニトール、ソルビトール、ソルビトース、トレハロース、キシリトール、およびキシロースが含まれる。存在する変異体の約0.01から200％ (w/w)、好ましくはおよそ1から50％、の範囲の量で製剤に添加できる。そのような製剤はその後凍結乾燥され所望の粒子サイズに製粉される。
適切なサイズになった粒子はその後、界面活性剤に助けられ噴霧剤中に懸濁される。噴霧剤は本目的に用いられる常套的な物質のいずれでもよく、例えば、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2-テトラフルオロエタンなどを含むクロロフッ化炭素、ヒドロクロロフッ化炭素、ヒドロフッ化炭素または炭化水素、またはそれらの組み合わせである。適した界面活性剤はソルビタントリオレートおよび大豆レシチンを含む。オレイン酸もまた界面活性剤として有用である。この混合物はその後到送達装置に充填される。本発明における使用に適した市販の定量吸入器の例は、Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.製造のVentolin metered dose inhalerである。
【０１４０】
このような粉末吸入器のための製剤は、変異体を含有する微細乾燥粉末を含むであろうし、また、乳糖、ソルビトール、ショ糖またはマンニトールのような充填剤を、その装置からの粉末の散布を促進する量で、例えば製剤の重量の50％から90％で、含むことができる。粉末の粒子は、平均直径が10マイクロメーター以下、好ましくは0.5-5マイクロメーターの間、より好ましくは1.5-3.5マイクロメーターの間でかつ密度約1 g/cm2の粒子に相当する空気力学的性質を肺中で有するであろう。
ここに示される教示に従う使用に適した粉末吸入器の一例は、Fisons Corp., Bedford, Mass製造のSpinhaler powder inhalerである。
これらの装置のための粉末は、US 5,997,848、US 5,993,783、US 5,985,248、US 5,976574、US 5,922,354、US 5,785,049およびUS 5,654,007に開示される方法により生成でき、かつ/または送達できる。
【０１４１】
治療用製品の肺送達のために設計された機械的装置には、噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器が含まれ（但しこれらに限定されない）、それらはすべて当業者には周知である。本発明の実施に適した市販の装置の具体例は、Ultravent nebulizer（ Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri製造）、 Acorn II nebulizer（Marquest Medical Products, Englewood, Colorado製造）、Ventolin metered dose inhaler（Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina製造）、Spinhaler powder inhaler（Fisons Corp., Bedford, Massachusetts製造）、 Inhale Therapeutic Systems, Inc., San Carlos, Californiaの「スタンディングクラウド」 装置、AIR inhaler（Alkermes, Cambridge, Massachusetts製造）および AERx pulmonary drug delivery system（Aradigm Corporation, Hayward, California製造）である。
【０１４２】
本発明を以下の実施例によりにさらに説明する。これらの例は、いかなる意味においても、本明細書および特許請求の範囲の一般性を限定するものと解されるべきではない。
【実施例】
【０１４３】
材料と方法
材料
CHO-K1細胞 (American Type Culture Collectionから入手可能(ATCC #CCL-61))；
HeLa細胞 (American Type Culture Collectionから入手可能(ATCC #CCL-2))；
ISRE-Luc （Stratagene, La Jolla USAより入手）；
pCDNA 3.1/hygro （Invitrogen, Carlsbad USAより入手）；
制限酵素およびポリメラーゼ （New England Biolabs Inc., Beverly, USAより入手）；
DMEM 培地: Dulbecco's 改変イーグル培地 (DMEM)、10％ ウシ胎児血清、およびHygromycin B （Life Technologies A/S, Copenhagen, Denmarkより入手）；
LucLite substrate （Packard Bioscience, Groningen, The Netherlandsより入手）；
TopCount luminometer （ Packard Bioscience, Groningen, The Netherlandsより入手）；
ビオチン化ポリクローナル抗ヒトIFNG抗体、BAF285（R&D Systems Inc., Minneapolis, USAより入手）；
ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン、P0397（DAKO, Copenhagen, Denmarkより入手）；
TMB ブロッティング試薬 （KEM-EN-TEC, Copenhagen, Denmarkより入手）。
【０１４４】
インターフェロンアッセイの概略
IFNGはHeLa細胞上のIFNG受容体と相互作用しそれを活性化することが以前に報告されている。従って、インターフェロン刺激応答要素（ISRE）を含むプロモーターにおいて転写が活性化される。よって、HeLa細胞に存在するISRE結合ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ISRE-luc）を使用することで、インターフェロン受容体のアゴニストをスクリーニングすることができる。
一次アッセイ
HeLa細胞をISRE-LucおよびpCDNA 3.1/hygroで同時トランスフェクトし、ハイグロマイシンBを含有するDMEM培地にて選択することで点（細胞クローン）が作成される。IFNGの存在または不存在下に細胞クローンをルシフェラーゼ活性についてスクリーニングする。ルシフェラーゼ刺激活性の非刺激活性に対する比率が最も高い細胞クローンを以後のアッセイに使用する。
ポリペプチド変異体をスクリーニングするため、96ウエル培養プレートに15,000細胞/ウエルを播種し、DEME培地にて一晩インキュベートする。その翌日、細胞に種々の濃度のポリペプチド変異体および既知標品を加える。Actimmune（登録商標）を「既知標品」として用いた。Actimmune（登録商標）の1バイアルを5％ FBS含有DMEMで300 IU/mlに希釈し、使用するまで80℃で保存した。
プレートを5％ CO2雰囲気下に37℃にて6時間インキュベートし、次いでLucLite基質 (Packard Bioscience, Groningen The Netherlands )を各ウエルに加える。プレートをシールし、SPC（単一光子計数）モードにてTopCount照度計(Packard)で蛍光を測定する。
個々のプレートには、刺激対照としてIFNGとともにインキュベートされるウエル、および非刺激対照として通常培地を含有する他のウエルが含まれる。刺激および非刺激ルシフェラーゼ活性間の比率は、IFNG活性および実験間変動の両者についての内部基準として役立つ。各IFNG試料について、Actimmune（登録商標）標品に対してユニット数を計算し、AUとして示した。
【０１４５】
増大したグリコシル化の程度の測定
IFNG変異体単量体のグリコシル化の様々な程度を測定するため、標準的条件下SDS-PAGEゲルを泳動し、ニトロセルロース膜に転写する。ビオチン化ポリクローナル抗ヒトIFNG抗体(BAF285、R & D Systemsを)を一次抗体として、かつホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(P0397、DAKO)を二次抗体として用いて標準的手順に従いウェスタンブロテッィングを行い、その後TMBブロッティング試薬(KEM-EN-TEC, Copenhagen, Denmark)で染色する。染色した膜を目視検討することで、グリコシル化の程度が多様なIFNG変異体単量体の分布が得られる。
【０１４６】
AUCscの測定
AUCscは、（活性に基づき）等量の本発明のIFNGポリペプチド変異体のブロス200μlを、一度にラットに皮下投与して測定する。
これらの実験には、体重220-260グラムのメスSprag-Dawleyラットを使用する。IFNGポリペプチド変異体は、コハク酸ナトリウム(720 mg/l)、マンニトール（40 g/l)、ポリソルベート20 (100 mg/l)中、pH 6.0に製剤化する。
バックグラウンドではIFNG活性は検出できないことを確認するため、皮下投与前に尾静脈から血液試料一定量を採取する。投与後10 分、20 分、40 分、60 分、120 分、240 分、480 分、720 分、1440 分、1620 分、1920 分および2880 分 (場合により3600 分も)で、尾静脈から血液試料を採取する。血液試料を室温で20分間凝固させ、その後室温で20分間、5000gで遠心分離して、血清を調製する。その後血清を単離し、上記「一次アッセイ」を用いるIFNG活性の測定まで、-80℃で保存する。血清試料中のユニット数をラットにおけるPK実験により測定した場合には、Actimmune（登録商標）標品を5％ FBSおよび5％ラット血清含有DMEMで希釈したことに留意すべきである。
次いで、時間（分）に対する血清中のユニット数(AU/ml)をプロットし、GraphPad Prism 3.01を使用してAUCscを計算する。
本発明のIFNGポリペプチド変異体のAUCscの増加を、グリコシル化型のhuIFNGおよび/またはActimmune（登録商標）と比較し評価するため、同様の実験をグリコシル化型のhuIFNGおよび/またはActimmune（登録商標）に対し行う。 
【０１４７】
血清半減期
血清半減期は、（活性に基づき）等量の本発明のIFNGポリペプチド変異体のブロス200μlを、一度にラットに静脈内投与して測定する。
これらの実験には、体重220-260グラムのメスSprag-Dawleyラットを使用する。IFNGポリペプチド変異体は、コハク酸ナトリウム(720 mg/l)、マンニトール（40 g/l)、ポリソルベート20 (100 mg/l)中、pH 6.0に製剤化する。
バックグラウンドではIFNG活性は検出できないことを確認するため、静脈内投与前に尾静脈から血液試料一定量を採取する。投与後10 分、20 分、40 分、60 分、120 分、240 分、480 分、720 分、1440 分、1620 分、1920 分および2880 分で、残りの尾静脈から血液試料を採取する。血液試料を室温で20分間凝固させ、その後室温で20分間、5000gで遠心分離して、血清を調製する。その後血清を単離し、上記「一次アッセイ」を用いるIFNG活性の測定まで、-80℃で保存する。血清試料中のユニット数をラットにおけるPK実験により測定した場合には、Actimmune（登録商標）標品を、5％FBSおよび5％ラット血清含有DMEMで希釈したことに留意すべきである。
次いで、時間（分）に対する血清中のユニット数(AU/ml)をプロットし、WinNonLin Pro 3.3を使用して血清半減期を計算する。
本発明のIFNGポリペプチド変異体の血清半減期の増加をグリコシル化型のhuIFNGおよび/またはActimmune（登録商標）と比較し評価するため、同様の実験をグリコシル化型のhuIFNGおよび/またはActimmune（登録商標）に対し行う。 
【０１４８】
表面露出アミノ酸残基の決定
構造
X線結晶学により測定されたヒトhuIFNGの実験的三次元構造は、以下により報告されている：Ealick et.al. Science 252:698-702 (1991)（IFNGホモ二量体のC-アルファトレースについて報告）、Walter et.al. Nature 376:230-235 (1995)（可溶性IFNG受容体二分子と複合体を形成しているIFNGホモ二量体の構造について報告、）（この構造の座標は公にされていない）The coordinates of this structure have never been made publicly available）、Thiel et. al. Structure 8:927-936 (2000)（可溶性IFNG受容体二分子と複合体を形成し、IFNGホモ二量体と相互作用しない構造で第三の受容体分子を有するIFNGホモ二量体の構造について報告）。
【０１４９】
接触可能表面積（ASA）
コンピューター・プログラム・アクセス(B. Lee and F.M.Richards,  J. Mol.Biol. 55: 379-400 (1971))バージョン２(Copyright (c) 1983 Yale University)を使用し、構造体内の個々の原子の接触可能表面積（ASA）が計算される。この方法は通常、プローブサイズ1.4Å（オングストローム）を使用し、接触可能表面積（ASA）をプローブ中心から形成される領域として規定する。この計算の前に、この座標の組からすべての水分子、水素原子、およびタンパク質に直接関連していない他の分子を除去する。
【０１５０】
側鎖の分画ASA
側鎖原子の分画ASAは、側鎖内原子のASAの総和を、伸張ALA-x-ALAトリペプチドにおける残基タイプの側鎖原子のASA値で割ることにより計算される。Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J.Mol.Biol.220,507-530を参照。この例としては、CA原子はグリシン残基の側鎖の一部と見なされるが、残りの残基についてはそうではない。次の表に、側鎖の100％ASA標準を示す。
【０１５１】
2005518183.tif 000004
該構造体において決定されない残基は、それらが自由自在な領域に存在すると考えられるので、100％露出していると定義する。
【０１５２】
原子間距離の測定
原子間の距離は、分子グラフィックスソフト、例えばInsightII v. 98.0, MSI INCにより測定できる。
【０１５３】
受容体結合部位の決定
受容体結合部位には、受容体結合後その接触可能表面積が変化するすべての残基が含まれると定義する。これは、ASA計算を少なくとも二つ行うことにより決定できる；一つはリガンド/受容体複合体において単離されたリガンドについてであり、もう一つは完全リガンド/受容体複合体についてである。
【０１５４】
実施例１
表面露出しているアミノ酸残基の決定
用いられたX線構造体は、Thiel et.al. Structure 8:927-936 (2000)により報告される、可溶性IFNG受容体二分子と複合体を形成しIFNGホモ二量体と相互作用しない構造で第三の受容体分子有するIFNGホモ二量体のものである。この構造体は、二つの分子がAおよびBと呼ばれるIFNGホモ二量体より成る。構造体を構成するため、IFNG配列の前にM0と呼ばれるメチオニン残基がさらに付加されており、かつこの配列はC末で10残基が切断されている（Q133がこの構造分子の最後の残基である）。M0は、本実施例のすべての計算において該構造体から除かれる。二つのIFNG単量体の構造体は、残基120より後方は電子密度が非常に低く、T126残基までしかモデル化できなかった。それゆえ、残基S121からT126は本実施例の計算の前にこの構造体から除いた。CおよびDと呼ばれる二つの受容体断片はIFNGホモ二量体と直接相互作用し、Eと呼ばれる第三の受容体分子はIFNGホモ二量体と接触しないが、これらの計算には含まれていない。
【０１５５】
表面露出
分子AおよびBのホモ二量体で、両分子からM0およびS121からT126を除いたものについて分画ASA計算を行ったところ、両単量体の少なくとも一方において、以下の残基でその側鎖の25％以上が表面に露出していることがわかった：Q1、D2、P3、K6、E9、N10、K12、K13、Y14、N16、G18、H19、S20、D21、A23、D24、N25、G26、T27、G31、K34、N35、K37、E38、E39、S40、K55、K58、N59、K61、D62、D63、Q64、S65、Q67、K68、E71、T72、K74、E75、N78、V79、K80、N83、S84、N85、K86、K87、D90、E93、K94、N97、S99、T101、D102、L103、N104、H111、Q115、A118およびE119。
以下の残基は、両単量体の少なくとも一方においてその側鎖の50％以上が表面に露出していた：Q1、D2、P3、K6、E9、N10、K13、N16、G18、H19、S20、D21、A23、D24、N25、G26、T27、G31、K34、K37、E38、E39、K55、K58、N59、D62、Q64、S65、K68、E71、E75、N83、S84、K86、K87、K94、N97、S99、T101、D102、L103、N104、Q115、A118、E119。
【０１５６】
分子AおよびBのホモ二量体で、両分子からM0およびS121からT126が除かれ、かつ受容体分子CおよびDを含むものについて分画ASA計算を行ったところ、両単量体の少なくとも一方において、以下の残基でその側鎖の25％以上が表面に露出していることがわかった：Q1、D2、P3、K6、E9、N10、K13、Y14、N16、G18、H19、D21、N25、G26、G31、K34、N35、K37、E38、E39、S40、K55、K58、N59、K61、D62、D63、Q64、S65、Q67、K68、E71、T72、K74、E75、N78、V79、K80、N83、S84、N85、K86、K87、D90、E93、K94、N97、S99、T101、D102、L103、N104、E119。
以下の残基は、両単量体の少なくとも一方においてその側鎖の50％以上が表面に露出していた：P3、K6、N10、K13、N16、D21、N25、G26、G31、K34、K37、E38、E39、K55、K58、N59、D62、Q64、S65、K68、E71、E75、N83、S84、K86、K87、K94、N97、S99、T101、D102、L103およびN104。
上記の位置はすべて本発明に従い修飾の対象となる。
【０１５７】
二つのリストを比較すると、受容体結合後K12、S20、A23、D24、T27、H111、Q115およびA118が25％以上の側鎖のASAリストから除かれ、かつ、Q1、D2、E9、G18、H19、S20、A23、D24、T27、Q115、A118およびE119が受容体結合後に50％以上の側鎖のASAリストから除かれる。
構造体中において決定されない残基は完全に表面に露出しているものとして扱い、それはすなわち残基S121、P122、A123、A124、K125、T126、G127、K128、R129、K130、R131、S132、Q133、M134、L135、F136、R137、G138、R139、R140、A141、S142、Q143である。これらの残基はまた、本発明に従い連結基を導入するのための別個の対象を構成する（または、表面露出アミノ酸残基、例えば側鎖の25％以上または50％以上が露出しているもの、の群に所属するとみなすことができる）。
【０１５８】
実施例２
受容体結合部位の決定
上記のようにASA計算を行ったところ、複合体中の両単量体の少なくとも一方において、二量体単独における計算と比較してIFNG分子の以下の残基のASAが減少していることがわかる：Q1、D2、Y4、V5、E9、K12、G18、H19、S20、D21、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K34、K37、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119。
【０１５９】
実施例３
最適なコドンを使用したIFNG発現カセットの設計
成熟huIFNGおよびその天然シグナルペプチドをコードする完全長cDNAを含むDNA配列（GenBankアクセッション番号X13274）を、CHO細胞における高発現を容易にするよう修飾した。huIFNGヌクレオチド配列のコドンは、その使用コドンをヒトで頻繁に用いられるコドンに近づけるよう修飾した。その後、DNA制限酵素の認識部位を導入するため、配列中の一定のヌクレオチドを他のものと置換した。プライマーは、該遺伝子を合成できるよう設計した。
プラチナ Pfx-ポリメラーゼキット（Life Technologies）を使用するワンステップPCRおよび標準的な三工程PCRサイクリングパラメーターにより、プライマーを組合せて合成遺伝子とした。同じ条件のPCRにより組立てた遺伝子を増幅したが、それは配列番号：42に示される配列を有する。合成遺伝子をpcDNA3.1/Hygro (Invitrogen)のBamHI部位とXbaI部位との間にクローニングし、pIGY-22を得た。
Lipofectaim2000 (Life Technologies)をトランスフェクション試薬として用いて、CHO K1細胞にpIGY-22をトランスフェクトした。24時間後培養培地を回収し、IFNGの活性および濃度をElisaによりアッセイした。本明細書に記載される一次アッセイを用いたところ、活性は1.4 x 107 AU/mlであった。
【０１６０】
実施例４
部位特異的突然変異導入
グリコシル化変異体の作成
IFNGに変異を導入するため、古典的二段階PCRにより発現プラスミド(pIGY-22)にPCR導入改変を導入できるようオリゴヌクレオチドを設計した。
二つのベクタープライマーを特定の変異プライマーと共に使用した：ADJ013: 5'-GATGGCTGGCAACTAGAAG-3' （アンチセンス下流ベクタープライマー) (SEQ ID NO:43)およびADJ014: 5'-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3' (SEQ ID NO:44) (センス上流ベクタープライマー)。
ADJ013およびADJ014をベクタープライマーとして、ADJ093 (5'-GTTCAGGTCTGTCACGGTGTAATTGGTCAGCTT-3') (配列番号:45)およびADJ094 (5'-AAGCTGACCAATTACACCGTGACAGACCTGAAC-3') (配列番号:46)を変異プライマーとして、かつpIGY-22を鋳型として使用して、古典的二段階PCRによりS99T変異体を作成した。BamHIおよびXbaIを用いて447塩基対PCR産物をpcDNA3.1/Hygro (InVitrogen)にサブクローンし、プラスミドpIGY-48とした。
Lipofectaim2000 (Life Technologies)をトランスフェクション試薬として用いて、CHO K1細胞にpIGY-48をトランスフェクトした。24時間後培養培地を回収し、IFNG活性をアッセイした。本明細書に記載される一次アッセイを用いたところ、以下の活性が得られた。：5.1 x 106 AU/ml。
【０１６１】
ADJ013およびADJ014をベクタープライマーとして、ADJ091 (5'-CATGATCTTCCGATCGGTCTCGTTCTTCCAATT-3') (配列番号:47)およびADJ092 (5'-AATTGGAAGAACGAGACCGATCGGAAGATCATG-3') (配列番号:48)を変異プライマーとして、かつpIGY-48を鋳型として使用して、古典的二段階PCRによりE38N+S40T+S99T変異体作成した。BamHIおよびXbaIを用いて447塩基対PCR産物をpcDNA3.1/Hygro (InVitrogen)にサブクローンし、プラスミドpIGY-54とした。
Lipofectaim2000 (Life Technologies)をトランスフェクション試薬として用いて、CHO K1細胞にpIGY-54をトランスフェクトした。24時間後培養培地を回収し、IFNG活性をアッセイした。本明細書に記載される一次アッセイを用いたところ、活性は1.3 x 107 AU/mlであった。
上記と同様の標準的技術を用いて、多数の完全長IFNGグリコシル化変異体を調製した。
これら変異体は以下の表１にまとめられている。
【０１６２】
C末切断IFNG変異体の作成
pIGY-22、pIGY-48およびpIGY-54を鋳型として、Leu135のコドンの直下に停止コドンを含むC末切断IFNG変異体を一段階PCRにより作成し、そのPCR産物をBamHIおよびXbaIを用いてpcDNA3.1/Hygro (InVitrogen)にサブクローニングした。これら変異体の構築に使用されるプライマーは以下である：ADJ014 (上記参照、上流)および: 5'-GAGTCTAGATTACAGCATCTGGCTTCTCTT-3' (SEQ ID NO:49) (下流)。得られたプラスミドはpIGY-72 (Leu135以降が切断された野生型IFNG)、pIGY-73 (Leu135以降が切断されたS99T変異体)およびpIGY-74 (Leu135以降が切断されたE38N+S40T+S99T)。
【０１６３】
システイン含有IFNG変異体の作成
Stratagene's QuikChangeTMXL 部位特異的突然変異キットを使用し製造元の説明に従って、システイン残基を含むIFNG変異体を作成した。pIGY-48を鋳型として、各々システインが一つ導入されている七つのIFNG変異体を作成した: N10C+S99T、N16C+S99T、E38C+S99T、N59C+S99T、N83C+S99T、K94C+S99TおよびS99T+N104C。同様に、pIGY-54を鋳型として、各々システインが一つ導入されている六つのIFNG変異体を作成した: N10C+E38N+S40T+S99T、N16C+E38N+S40T+S99T、E38N+S40T+ N59C+S99T、E38N+S40T+ N83C+S99T、E38N+S40T+ K94C+S99TおよびE38N+S40T+S99T+N104C。
【０１６４】
実施例５
システイン含有変異体のPEG化
すべての緩衝液を使用前に脱酸素した。タンパク質濃度はA280を測定して評価した。
【０１６５】
OPSS結合化学を用いたPEG化
7.2 mlのIFNG変異体N16C+S99T(完全長)（1.3 mg/ml、5 mMコハク酸ナトリウム、4％マンニトール、0.01％ Tween 20、pH 6.0）を、室温で30分間0.5 M DTT（300μl）とインキュベートして還元した。緩衝液A(50 mMリン酸ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.1)中、IFNG変異体をNAP25ゲルろ過カラム(Pharmacia)に2.5mlづつ三等分して通し脱塩した。
各回ごとに3.5mlで溶出した。
mPEG-OPSS (10 KDa)を緩衝液Aに濃度2 mg/mlになるよう溶解し、還元および脱塩済IFNG変異体に等量加え、さらに室温で60分間穏やかに振盪しながらインキュベートした。
反応混合物11 mlをVivaspin20カラム(VivaScience)を用いて1-6 mlまで濃縮し、緩衝液Aで平衡化したSephacryl S-100カラム(Pharmacia)を用いたゲルろ過により、残存するmPEGを除去した。
Vivaspin 6 カラム(VivaScience)を用いて、5 mM コハク酸ナトリウム、4％マンニトール、pH 6.0へPEG化IFNG変異体を再びろ過し、Tween 20を0.01％まで加えた。本明細書記載の一次アッセイで測定すると、精製PEG化IFNG変異体の特異的活性は1.3 x 106 AU/mgであった(これは対応する非PEG化IFNG変異体の特異的活性の15％にあたる）。
【０１６６】
MAL結合化学を用いたPEG化
1.6 ml のIFNG変異体N59C+S99T(完全長)（1.5 mg/ml、5 mMコハク酸ナトリウム、4％ マンニトール、0.01％ Tween 20、pH 6.0を、0.5MDTT（64μl）と室温で30分間インキュベートして還元した。緩衝液A(50 mMリン酸ナトリウム、1 mM EDTA、pH 8.1)中、IFNG変異体をNAP25ゲルろ過カラム(Pharmacia)上で脱塩した。IFNG変異体を3.5mlで溶出した。  mPEG-MAL (5 KDa)を緩衝液Aに濃度0.5mg/mlになるよう溶解し、還元および脱塩済IFNG変異体に等量加え、さらに室温で120分間穏やかに振盪しながらインキュベートした。
硫酸アンムニウムを濃度0.9Mまで添加し、緩衝液 B (20 mM リン酸ナトリウム、0.9 M 硫酸アンモニウム, pH 6.6)で平衡化したResource（登録商標）フェニルカラム(Pharmacia) 1 ml上に、PEG化IFNG 変異体を加えた。カラムを5カラム容量の緩衝液Bで洗浄し、30カラム容量以上の0-50％比例勾配緩衝液C(20 mMリン酸ナトリウム、pH 6.6)で結合PEG化IFNG 変異体を溶出した。PEG化IFNG 変異体は約0.6Mの硫酸アンモニウムで溶出した。 
PEG化IFNG 変異体を含む画分を貯蔵し、Vivaspin 6 カラム(VivaScience)を用いて5 mM コハク酸ナトリウム、4％ マンニトール、pH 6.0へ再フィルタ処理し、0.01％までTween20を加えた。本明細書記載の一次アッセイで測定すると、精製PEG化IFNG変異体の特異的活性は2.4 x 106 AU/mgであった(これは対応する非PEG化IFNG変異体の特異的活性の15％にあたる）。
【０１６７】
実施例６
哺乳動物細胞におけるIFNGおよびIFNG変異体の発現
IFNGの一過性発現のため、培地（Dulbecco's MEM/Nut.-mix F-12 (Ham) L-グルタミン、15 mM Hepes、ピリドキシン-HCl (Life Technologies Cat # 31330-038)、1:10ウシ胎児血清(BioWhittaker Cat # 02-701F)および1:100ペニシリン・ストレプトマイシン (BioWhittaker Cat # 17-602E)含有）中で、95％コンフルエントまで細胞を成長させた。Lipofectamine 2000 (Life Technologies)を用いて製造元の説明に従い、IFNGコードプラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション24時間後、培養培地を回収し、IFNG活性についてアッセイした。さらに、利用されたグリコシル化部位の相対数を計るため、回収した培養培地を用いてウエスタンブロッティングを行った。
CHO K1細胞にIFNGコードプラスミドをトランスフェクションし、その後0.36mg/mlハイグロマイシン含有培地で細胞をインキュベートして、IFNGを発現する安定クローンを作成した。安定トランスフェクト細胞を単離し、限界希釈によりサブクローニングした。高レベルなIFNGを産生するクローンは。ELISAにより同定した。
【０１６８】
大規模生産
IFNGまたは変異体を発現する安定セルラインを、1700cm2 回転ボトルで、Dulbecco's MEM/Nut.-mix F-12 (Ham) L-グルタミン、15 mM Hepes、ピリドキシン-HCl (Life Technologies Cat # 31330-038)、1:10ウシ胎児血清(BioWhittaker Cat # 02-701F)および1:100ペニシリン・ストレプトマイシン (BioWhittaker Cat # 17-602E)中で密度100％まで成長させた。その後、培地をL-グルタミン含有UltraCHO(BioWhittaker Cat # 12-724Q)（1:500 EX-CYTE VLE (Serological Proteins Inc. # 81-129)および1:100 ペニシリン・ストレプトマイシン(BioWhittaker Cat # 17-602E)添加）300mlに交換した。48時間成長させた後、培地を同じ添加物を含む新鮮なUltraCHOと交換した。さらに48時間成長させた後、培地を、Dulbecco's MEM/Nut.-mix F-12 (Ham) L-グルタミン、ピリドキシン-HCl (Life Technologies Cat # 21041-025)（1:100 ITS-A (Gibco/BRL # 51300-044)、1:500 EX-CYTE VLE (Serological Proteins Inc. # 81-129)および1:100 ペニシリン・ストレプトマイシン(BioWhittaker Cat # 17-602E)添加）と交換した。その後、24時間ごとに培養培地を回収し、同じ添加物を含む新鮮な無血清培地300mlと交換した。細胞を除去するため、回収培地を0.22μmフィルターを通してろ過した。
【０１６９】
実施例８
精製
ろ過液を精密ろ過（0.22μm）し、その後Millipore TFF システムを用いて約1/15量まで限界ろ過した。同じ系で、10 mM Tris、pH7.6を使用して濃縮物を再びろ過した。濃度1.7Mまで硫酸アンモニウムを添加し攪拌後、Sorvall遠心分離機（GS3 ローター使用）で8000rpmで25分間遠心分離し沈殿物を除去した。
事前に10mM Tris、1.7M硫酸アンモニウム、pH7.6で平衡化した25ml Phenyl High Performance (Pharmacia)カラムに上清をアプライした。アプライ後、カラムを3カラム容量の10mM Tris、1.7M硫酸アンモニウム、pH7.6で洗浄し、その後100％10 mM Tris, pH 7.6までの比例勾配で10カラム容量以上で結合IFNG変異体を溶出した。溶出IFNG変異体とフロースルーを分画した。IFNG変異体に富む画分を貯蔵し、分子量カットオフ値10,000 DaのVivaflow200 システム(VivaScience)により再びろ過して、10 mM Tris、pH 9.0に緩衝液を交換した。
【０１７０】
その後、事前に10 mM Tris、pH 9.0に平衡化した18 ml Q-sepharose Fast Flow (Pharmacia)カラムにIFNG変異体をアプライした。アプライ後、カラムを3カラム容量の10 mM Tris、pH 9.0で洗浄し、結合IFNG変異体を0-100％ 10 mM Tris、0.5 M NaCl、pH 9.0の勾配で15カラム容量以上で溶出した。溶出IFNG変異体とフロースルーを分画した。IFNG変異体に富む画分を貯蔵し、分子量カットオフ値10,000 DaのVivaspin20 カラム(VivaScience)により再びろ過して、10 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0に緩衝液を交換した。
その後、事前に10 mMリン酸ナトリウム、pH7.0に平衡化した8 ml CHT セラミックヒドロキシアパタイトカラム(Biorad)に、IFNG変異体をアプライした。アプライ後、カラムを5カラム容量の10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0で洗浄し、結合IFNG変異体を0-60％ 500 mM リン酸ナトリウム、pH 7.0の勾配で30カラム容量以上で溶出した。溶出IFNG変異体とフロースルーを分画した。IFNG変異体を含む画分を貯蔵し、Vivaspin20 カラム(VivaScience)により緩衝液を5 mM コハク酸ナトリウム、4％ マンニトール、pH 6.0に交換し、その後Tween 20を濃度0.01％まで添加した。IFNG変異体はろ過滅菌し、-80℃で保存した。
【０１７１】
あるいは、IFNG変異体は以下の精製手順に従い精製できる。
ろ過液を精密ろ過（0.22μm）し、その後Millipore TFF システムを用いて約1/15量まで限界ろ過する。同じ系で、10 mM Tris、pH7.6を使用して濃縮物を再びろ過し、その後pHを9.0に調節し、精密ろ過により沈殿物を除去する。
事前に10 mM Tris、pH 9.0に平衡化した18 ml Q-sepharose Fast Flow (Pharmacia)カラムにIFNG変異体をアプライする。アプライ後、カラムを3カラム容量の10 mM Tris、pH 9.0で洗浄し、結合IFNG変異体を0-100％ 10 mM Tris、0.5 M NaCl、pH 9.0の勾配で15カラム容量以上で溶出する。溶出IFNG変異体とフロースルーを分画する。IFNG変異体に富む画分を貯蔵し、pHを7.6に調節する。硫酸アンモニウムを1.5Mまで添加し攪拌した後、遠心分離して沈殿物を除去する。
その後、事前に10mM Tris、1.5M硫酸アンモニウム、pH7.6で平衡化したPhenyl Sepharose High Performance (Pharmacia)にIFNG変異体をアプライする。アプライ後、カラムを3カラム容量の10mM Tris、1.5M硫酸アンモニウム、pH7.6で洗浄し、その後100％ 10 mM Tris, pH 7.6までの比例勾配で10カラム容量以上で結合IFNG変異体を溶出する。溶出IFNG変異体とフロースルーを分画する。IFNG変異体に富む画分を貯蔵し、硫酸アンモニウムを1.7Mに調節する。
【０１７２】
その後、事前に10 mM リン酸ナトリウム、1.7 M 硫酸アンモニウム、pH 7.6で平衡化したButyl Sepharose カラムにIFNG変異体をアプライする。アプライ後、10 mM リン酸ナトリウム、1.7 M 硫酸アンモニウム、pH 7.6でカラムを洗浄し、10 mM リン酸ナトリウム、pH 6.5を用いて一段階で結合IFNG変異体を溶出する。溶出IFNG変異体とフロースルーを分画する。
その後、IFNG変異体に富む画分を貯蔵し、事前に10 mMリン酸ナトリウム、pH6.5に平衡化したヒドロキシアパタイトカラムにアプライする。アプライ後、カラムを5カラム容量の10 mMリン酸ナトリウム、pH 6.5で洗浄し、結合IFNG変異体を0-100％ 500 mM リン酸ナトリウム、pH 6.5の比例勾配で30カラム容量以上で溶出する。溶出IFNG変異体とフロースルーを分画する。
IFNG変異体を含む画分を貯蔵し、緩衝液を5 mM コハク酸ナトリウム、4％ マンニトール、H 6.0に交換する。その後Tween 20を濃度0.01％まで添加する。IFNG変異体はろ過滅菌し、-80℃で保存する。
【０１７３】
変異体およびPEG化変異体の活性
上記の「一次アッセイ」を用いて、以下の活性データが得られた（一過性トランスフェクション後）：
表１  一過性トランスフェクション後の完全長および切断型rhuIFNGポリペプチド変異体の活性
2005518183.tif 000005
【０１７４】
上記の一次アッセイを用いて、以下の特異的活性データが得られた（精製後）：
表２  精製後の完全長rhuIFNGポリペプチド変異体の活性
2005518183.tif 000006
【０１７５】
見本として実際には反応液中にPEGを加えずに同じPEG化方法（上記実施例５参照）従ったPEG化産物の活性と比較して、多数のPEG化変異体の活性を測定した。結果は以下の表３にまとめてある：
表３  完全長rhuIFNGポリペプチドPEG化変異体の活性
2005518183.tif 000007
1）ODSS結合化学を使用。他のすべてのPEG化変異体についてはMAL結合化学を使用。
【０１７６】
表１に示される活性データは、CHO-K1細胞における特異的活性および発現レベルの組み合わせを反映することが強調されねばならない。それゆえ、すべての変異体がrhuIFNGに匹敵する発現レベル/特異的活性を示すと結論づけることができる。
表２に見られるように、システイン変異体は、すべてrhuIFNGと比較して特異的活性が減少しているのに対し、E38N、S40Tおよび/またはS99T変異を含む変異体は、rhuIFNGに匹敵する特異的活性を保持している。システイン変異体を5または10 kDaのPEGでPEG化するとさらに2-3倍特異的活性が減少した（表３）。何らかの具体的理論に限定しなければ、結合したPEG基の立体障害により引き起こされる受容体結合の減少により、特異的活性が減少したことが推測できるであろう。
【０１７７】
実施例１０
N-グリコシル化部位利用評価
利用されたグリコシル化部位の相対数を計るため、回収培養培地を使用してウェスタンブロッティングを行った（図１参照）。野生型rhuIFNG（完全長）については、50％が両グリコシル化部位を利用し（２N）、約40％が一つのグリコシル化部位を利用し（１N）、そして約10％はグリコシル化されなかった（0N）。これらのデータは、以前にHooker et al., 1998, J. Interferon and Cytokine Res. 18, 287-295およびSarenva et al., 1995, Biochem J., 308, 9-14により報告されたデータと一致する。
図１から明らかなように、S99T変異体（完全長）は、対応する野生型よりかなり効率よくその二つのグリコシル化部位を利用する。S99T変異体については、90％が両グリコシル化部位を利用し（２N）、約7％が一つのグリコシル化部位を利用し（１N）、そしてグリコシル化されなかったのは約3％であった（0N）。
さらに、38位に導入されたグリコシル化部位は、最適化していない変異体E38N（完全長）と比較すると変異体E38N+S40T（完全長）においてかなりよく利用されている。
これらのデータは、グリコシル化部位が天然のものか導入されたものかに関わらず、アスパラギン残基に対し+2の位置にセリン残基よりもスレオニン残基を導入することで、グリコシル化部位がよりよく利用されることを明らかに示している。
【０１７８】
実施例１１
薬物動態学研究
ラットにおける皮下投与のAUC（AUCsc）を、多くのIFNG変異体について本明細書中で前述されるように測定した。結果は表４および図２ならびに図３にまとめてある。
表４  ラットにおける皮下投与についての薬物動態データ
2005518183.tif 000008
1) 完全長
2) 完全長、5 kDa mPEGが導入したシステイン残基に結合。
3) 完全長、10 kDa mPEGが導入したシステイン残基に結合。
図２ならびに図３、および表４によると、変異体（PEG化変異体を含む）は、皮下投与した場合rhuIFNGと比較して、特に市販のActimmune（登録商標）と比較して、AUCが有意に高いことが明らかである。図３に関し、[E38N+S40T+S99T]変異体の投与量は、二つのPEG化変異体の投与量の2.5倍であることに留意すべきである。
これにより投与量を少なくできる可能性が広がり、よって副作用が少なくなり、かつ／または現在ほど頻繁に活性本体を投与しなくてもよく、従って患者のコンプライアンスが改善することは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】図１は、rhuIFNGの最適化グリコシル化変異体のウェスタンブロットである。左側ウェスタンブロット: レーン1: スタンダード、レーン2: Actimmune（登録商標）、レーン3: rhuIFNG、レーン4: [E38N]rhuIFNG。中央ウェスタンブロット: レーン1:スタンダード、レーン2: rhuIFNG、レーン3: [E38N+S40T]rhuIFNG。右側ウェスタンブロット:レーン1:スタンダード、レーン2: rhuIFNG、レーン3: [S99T]rhuIFNG、レーン4: [E38N+S40T+S99T]rhuIFNG。
【図２】図２は、ラットにおける皮下投与後のIFNG活性を血清-時間曲線で示す。●: Actimmune（登録商標）、■: rhuIFNG、▲: [E38N+S40T+S99T]rhuIFNG。  すべての化合物は同量投与された (1.15 x 107 AU/kg)。
【図３】図３は、ラットにおける皮下投与後のIFNG活性を血清-時間曲線で示す。●: [N16C+S99T]rhuIFNG (5 kDa mPEG 連結)、■: [N16C+S99T]rhuIFNG (10 kDa mPEG 連結)、▲: [E38N+S40T+S99T]rhuIFNG。   [E38N+S40T+S99T] 変異体は投与量1.15 x 107 AU/kgで投与し、 一方二つのPEG化変異体は投与量4.6 x 106 AU/kgで投与した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月4日(2003.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005518183000001.app
【国際調査報告】
2005518183.tif 000037
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2005518183.tif 000039
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