(57)【要約】本発明は、ＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達を阻害する物質を同定するためのアッセイおよびその使用を提供する。
2005525824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）互いに作動可能に結合している、誘導性特異的プロモーター、対応する３’調節遺伝子配列およびレポーター遺伝子を含む構築体によって、安定にトランスフェクトされている細胞系を提供すること、
ｂ）候補化合物を提供すること、
ｃ）刺激された細胞系を得るために十分な時間、ａ）の細胞系と免疫グロブリンＧ複合体を接触させること、
ｄ）ｂ）の候補化合物を、ａ）の細胞系またはｃ）の刺激された細胞系に免疫グロブリンＧ複合体と同時またはすぐ後に添加すること、あるいはｂ）の候補化合物を添加しないこと、
ｅ）レポーター遺伝子および／またはその産物の発現を、候補化合物の存在下および非存在下で検出すること、そして候補化合物の非存在下および存在下において、レポーター遺伝子および／またはその産物の発現量における差違があるかどうかを決定すること、
ｆ）例えば医薬品として使用するために、ｅ）で検出される該候補化合物から物質を選択すること、
を含む、ＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達を阻害する物質を同定するためのアッセイ。
【請求項２】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ)−抗原複合体がＩｇＧ−Ｆ(ａｂ’)２ 複合体であることを特徴とする、請求項１記載のアッセイ。
【請求項３】
ａ）互いに作動可能に結合している、誘導性特異的プロモーター、対応する３’調節遺伝子配列およびレポーター遺伝子配列を含む構築体によって、安定にトランスフェクトされている細胞系、
ｂ）免疫グロブリンＧ-抗原複合体、および
ｃ）検出手段、
を含むキット。
【請求項４】
請求項１または２のいずれかに記載のアッセイによって同定される物質。
【請求項５】
医薬物質として使用するための請求項４の物質。
【請求項６】
自己免疫関連疾患またはアレルギー疾患を処置するための医薬製造のための、請求項４の物質の使用。
【請求項７】
請求項１記載のアッセイによって同定される物質を、少なくとも１つの医薬賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項８】
自己免疫関連疾患またはアレルギー疾患の処置方法であって、かかる処置を必要とする患者に、有効量の請求項４の物質または請求項７の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項９】
自己免疫関連疾患が特発性血小板減少紫斑病、全身性エリテマトーデス、免疫性溶血性貧血またはリューマチ性関節炎であり、アレルギー疾患がアレルギー性喘息であることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、安定にトランスフェクトされている細胞系を用いるＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達を阻害する物質を同定するためのアッセイおよびその使用に関する。
【０００２】
補体-およびＦｃγＲ-ノックアウトマウスに関する最近のデータから、あるいくつかの自己免疫疾患、例えば狼瘡、糸球体腎炎の原因論の理解におけるパラダイムの変化がおきた。今までに多くの自己免疫疾患が、部分的または完全に補体システムに依存するものと見なされてきたが、これらの最近の知見が、ＦｃγＲ類、特にＦｃγＲＩＩＩで開始される望ましくない誘発/シグナル伝達が、原因となって病因に関与しているという決定的な証拠を提供した。そのため、このシグナル伝達カスケードおよびその関係分子は、自己免疫疾患、例えば、狼瘡および糸球体腎炎および他の疾患の防止における薬理学的アプローチのための新規標的を含む可能性がある。
【０００３】
Ｆｃ受容体は、マクロファージ、マスト細胞、好中球およびナチュラルキラー細胞を包含する多様な細胞型で発現される。Ｆｃ受容体と抗体または抗体-抗原複合体とのクロスリンクによる誘発は、広範囲の細胞のエフェクター機能を媒介し、先天的および適応性の免疫系との間の関連を広く提供する。最近、このシステムの病理学上の重要性が、免疫グロブリン(ＩｇＧ)がその同系の抗原と結合する場合に、Ｆｃ受容体欠損マウスが炎症応答をおこし得なかったという予想外の発見により示された(例えば、Ravetch,J.V. 1997, Fc receptors, Curr. Opin．Immunol. 9:121-125を参照されたい。)。
著しく対照的に、補体成分が欠失した動物は、これらの実験的に誘導された抗体(細胞毒性)およびＩｇＧ-抗原複合体に対して正常な炎症応答を示し、多くの自己免疫疾患の病因についての古い免疫学的定理を否定する。
【０００４】
病因性ＩｇＧ抗体は、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少紫斑病、免疫性溶血性貧血、リウマチ性関節炎およびアレルギー性喘息を包含する自己免疫疾患において生じ、さらに(単独または別のファクターとの組合せで)このような疾患についての病因性誘発因子として考えられるものである。さらに、ＩｇＧＦｃ受容体を欠損するマウスは、全身性狼瘡、糸球体腎炎、特発性血小板減少紫斑病、溶血性貧血およびアレルギー性喘息のモデルにおける各種疾患から保護されることが実験的に示された。現在、ＦｃγＲＩＩＩ受容体は、特にこのような疾患プロセスにおいて重要な役割をはたすことが明確に確立されている。このような所見は、ＩＶＩＧ(静脈内免疫グロブリンＧ)で近年処置されているそれら全ての、難治性抗体媒介性自己免疫疾患の処置のための完全に新しいアプローチに対する根拠を形成する。ＩＶＩＧの作用メカニズムの詳細な理解は、いまだに活発に研究中であるが、高用量のＩＶＩＧが、細胞性ＦｃＲ類、とりわけＦｃγＲＩＩＩと相互作用し、それによって細胞の活性化を防止し得ることが考えられる。エフェクター応答に対して細胞毒性のある、免疫複合抗体を、カップリングする際のＦｃγＲＩＩＩ経路の特異性は、ＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達阻害剤が、低分子量化合物の全ての利点を有するＩＶＩＧに匹敵する類似した活性を持つということを強く示唆するものである。
【０００５】
我々は、ここに驚くべきことに、ＩｇＧ刺激（例えば、ＩｇＧ複合体による刺激）による誘発後に、ＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達の阻害剤(特に、低分子量阻害剤)のハイスループット・スクリーニングに特に有用である安定に遺伝子的に修飾された細胞系を見出し、確認した。
【０００６】
本発明は、１つの態様において、
ａ）互いに作動可能に結合している、誘導性特異的プロモーター、対応する３’調節遺伝子配列およびレポーター遺伝子を含む構築体によって、安定にトランスフェクトされている細胞系を提供すること、
ｂ）候補化合物を提供すること、
ｃ）刺激された細胞系を得るために十分な時間、ａ）の細胞系と免疫グロブリンＧ複合体を接触させること、
ｄ）ｂ）の候補化合物を、ａ）の細胞系またはｃ）の刺激された細胞系に免疫グロブリンＧ複合体と同時またはすぐ後に添加すること、あるいはｂ）の候補化合物を添加しないこと、
ｅ）レポーター遺伝子および／またはその産物の発現を、候補化合物の存在下および非存在下で検出すること、そして候補化合物の非存在下および存在下において、レポーター遺伝子および／またはその産物の発現量における差違があるかどうかを決定すること、
ｆ）例えば医薬品として使用するために、ｅ）で検出される該候補化合物から物質を選択すること、
を含む、ＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達を阻害する物質を同定するためのアッセイを提供する。
【０００７】
本発明のアッセイにおいて適切な細胞系は、ＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達経路が、免疫グロブリンＧ複合体を介して誘発され得る全ての細胞系を包含する。このように安定にトランスフェクトされている細胞系には、例えば、互いに作動可能に結合している、誘導性特異的プロモーター、対応する３’調節遺伝子配列およびレポーター遺伝子を用いて安定にトランスフェクトされているＤＣ１８マウス細胞系が含まれる。
【０００８】
適切な誘導性特異的プロモーターには、ＦｃγＲＩＩＩの誘発にポジティブに応答し、そして適切な検出し得る系、例えば、レポーター遺伝子に結合される全てのＤＮＡ調節配列が包含される。誘導性プロモーターは、例えば、ｈＴＮＦαプロモーターであり、対応する３’調節遺伝子配列は、例えばｈＴＮＦα遺伝子からのものである。
適切なレポーター遺伝子は、その発現量が、例えば従来の方法によって検出できる遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子、分泌アルカリホスファターゼまたは蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ(=緑色蛍光タンパク質)などを包含する。
【０００９】
本発明のアッセイで使用される細胞系は、ｍＲＮＡレベルでＦｃγＲＩＩＩを発現し、適切な物質（刺激物）、例えばＩｇＧ複合体で刺激される場合にＴＮＦ−α分泌で強く応答することを特徴とする。
【００１０】
本発明の１つの実施態様において、候補化合物は、免疫グロブリンＧ複合体で刺激されるかまたはされない細胞系に添加されない。
【００１１】
本発明の別の実施態様において、スクリーニングアッセイは実施され、そのなかで安定にトランスフェクトされている細胞系は、例えば、ＩｇＧ−複合体で前もって刺激され、そして候補化合物は一定時間の後、例えばすぐ後に添加されて、その候補化合物がその阻害機能を誘起し得る。該候補化合物の存在および非存在下において、レポーター遺伝子および／またはその産物の発現は、先に記載したように検出され、その差違が決定されて、物質が選択され得る。
【００１２】
適切な候補化合物は、Ｆｃ-受容体に対するその影響が決定され得る化合物(ライブラリー類)を包含する。化合物（ライブラリー)は、例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、疑似体（mimetics）、小分子、例えば低分子量化合物(ＬＭＷ)を包含する。
【００１３】
本発明で使用される該細胞系が適切な物質、例えばＩｇＧ複合体で刺激された場合、ＴＮＦ−α分泌で強く応答するか、または候補化合物がＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達経路(＝物質)に対する阻害作用を有する場合にＴＮＦ−α分泌の低下に強く応答するために、適切な物質は、本発明のアッセイにおいてこれらの細胞を使用して同定されうる。
【００１４】
ＴＮＦ−α分泌が低下した場合、より少量のレポーター遺伝子および／または遺伝子産物が発現される。候補化合物と接触されない刺激された細胞系におけるレポーター遺伝子の発現と比較して、ある濃度で候補化合物と接触された細胞系におけるレポーター遺伝子の発現における特異的な発現低下は、該候補化合物がＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達を阻害すること、およびどのような程度に候補化合物がＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達を阻害するかを示す。
レポーター遺伝子および／またはその産物の発現量が検出される。「遺伝子産物」は、例えば、発現タンパク質、ポリペプチドまたはそれらのフラグメントである。 
【００１５】
該物質は、ステップｅ）で検出／決定されるレポーター遺伝子および／またはその産物の発現に影響する(阻害する)化合物である。本発明のアッセイにより同定される物質は、明細書中で「本発明の物質」と定義される。
本発明の物質は、選択された候補化合物のうちの１つであり、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、擬体、小分子、例えば低分子量化合物(ＬＭＷ)を包含し得る。
好ましくは、本発明の物質は、候補化合物の非存在における細胞系によって発現されるレポーター遺伝子の量と比較して、レポーター遺伝子の発現量を、例えば３５％あるいはそれ以上低下し得る候補化合物である。
【００１６】
該細胞系の刺激または誘発は、アッセイの感度(刺激されたもの対刺激されていないものの比）とって重要であり得る。好ましい実施態様において、ＩｇＧ−Ｆ(ａｂ’)２ 複合体、より好ましくはＩｇＧ２ａ-Ｆ(ａｂ’)２複合体は、刺激性免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)-抗原複合体として使用され得る。
【００１７】
別のパラメーター、例えば、接触時間、刺激、必要な細胞数、使用される溶媒は、例えば、類似の従来の方法に準じて至適化され得る。
【００１８】
別の態様において、本発明は、
ａ）互いに作動可能に結合している、誘導性特異的プロモーター、対応する３’調節遺伝子配列およびレポーター遺伝子を含む構築体によって、安定にトランスフェクトされている細胞系
ｂ）免疫グロブリンＧ-抗原複合体、および
ｃ）検出手段、
を含むキットを提供する。
【００１９】
要素ａ）およびｂ）は、適切な溶媒および／または緩衝溶液中で提供されうる。適切な検出手段には、従来の手段、例えば、常套的なものとして蛍光分光分析またはＥＬＩＳＡ技術を包含する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、医薬物質として使用するために本発明のアッセイによって同定されるＦｃγＲＩＩＩシグナル伝達を阻害する物質を提供する。
【００２１】
本発明の物質は、薬理学的活性を示し、それ故自己免疫関連疾患に対する医薬としての有用性を示し、該疾患には、これらに限定しないが、ＩＴＰ(=特発性血小板減少紫斑病）、全身性エリテマトーデス、免疫性溶血性貧血またはリウマチ性関節炎またはアレルギー疾患、例えばアレルギー性喘息、またはタイプＩアレルギーが包含される。
本発明の物質は、自己免疫関連疾患およびアレルギー疾患に対する治療上の活性を示し得る。
治療のための本発明の物質は、１以上の、好ましくは１つの本発明の物質、例えば２以上の本発明の物質の組合せ物を包含する。
【００２２】
別の態様において、本発明は医薬物質として使用するための物質を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、例えば、次のものに限定しないが、ＩＴＰ(=特発性血小板減少紫斑病）、全身性エリテマトーデス、免疫性溶血性貧血またはリウマチ性関節炎またはアレルギー疾患、例えばアレルギー性喘息、またはタイプＩアレルギーを包含する、自己免疫関連疾患処置のための医薬、例えば医薬組成物を製造するために本発明の物質の使用を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、自己免疫関連疾患およびアレルギー疾患の処置方法を提供するものであって、その処置には有効量の本発明の化合物を、例えば医薬組成物の形態で、かかる処置を必要とする患者に投与することを包含する。
【００２５】
処置には、治療および予防が包含される。
かかる処置のために、適当な用量は、もちろん、例えば、用いる本発明の物質の化学的性質および薬物動態データ、個々の宿主、投与様式および処置される症状の性質および重症度によって変化する。しかし、一般的に、比較的大型の哺乳動物、例えばヒトにおいて満足な結果を得るためには、指示される本発明の物質の一日用量は、約０.０１g〜約１.０ｇ範囲であり、例えば、１日４回までの分割用量で投与されるのが便利である。
【００２６】
本発明の物質は、従来のルート、例えば、経腸的に、例えば鼻、口内、直腸、経口投与を包含する；非経腸的に、例えば、静脈、筋肉内、皮下投与を包含する；または局所的、例えば、表皮(epicutaneous)、鼻腔内、気管内投与を包含するルートにより、例えば、被覆または非被覆錠剤、カプセル、注射用溶液または懸濁液の形態で、例えばアンプル、バイアルの形態で、クリーム、ゲル、ペースト、吸入粉末、泡沫、チンキ、リップスティック、滴剤、スプレーの形態で、または座薬の形態で投与され得る。
【００２７】
本発明の物質は、薬学的に許容される塩の形態、例えば酸付加塩または金属塩；または遊離形態；所望により、溶媒和物の形態で投与され得る。塩の形態での本発明の物質、所望により溶媒和物の形態での本発明の物質は、遊離形態での本発明の物質と同程度の活性を示し得る。
【００２８】
本発明の物質は、単独または１以上の他の医薬的に活性な物質を組み合わせて、本発明の医薬処置のために使用され得る。
組合せ物は、そのなかの２以上の医薬的に活性な物質が同じ製剤中に存在する固定された組合せ物；別々の製剤の形をした２以上の医薬的に活性な物質が、同じパッケージ内に、例えば同時投与のための指示書と共に販売されるキット；および医薬的に活性な物質が別々にパッケージされるが、同時または連続投与するための指示書と共に販売される自由な組合せ物、を包含する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、例えば適当な担体および／または希釈剤、例えば、増量剤、結合剤、崩壊剤、流動調節剤、滑沢剤、糖および甘味料、香料、保存剤、安定剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節のための塩類および／または緩衝液を包含する、少なくとも１つの医薬賦形剤との組合せにおいて、本発明の物質を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、別の医薬的に活性な物質を含む本発明の医薬組成物を提供する。
【００３１】
かかる組成物は、例えば、従来の方法に準じて、例えば、混合、造粒、被覆、可溶化または凍結乾燥工程によって製造され得る。単回用量形態は、例えば、約０.５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば、１ｍｇ〜約５００ｍｇを含有しうる。
【００３２】
（図面の説明）
図１：各種免疫グロブリン複合体(ＩｇＧアイソタイプを含む)によるＤＣ１８ Ｃ１０細胞の刺激；ｎｓｔ=刺激されない。
図２：ＩｇＧ２a複合体で刺激される、安定にトランスフェクトされているＤＣ１８ Ｃ１０細胞についての経時動態。
図３：ＩｇＧ２a複合体で刺激されたＤＣ１８ Ｃ１０細胞に対する、所定濃度(ｘ軸)での各種阻害剤の適用。
図４：適切な（robust）データ読取りに提供する細胞数(ｘ軸で示される)のタイトレーション。
【００３３】
次の実施例において、全ての温度は摂氏で表示し、未補正である。
下記略語を用いた：
ＣｓＡ＝Cyclosporin A（シクロスポリンＡ）。
ＤＮＰ−ＢＳＡ＝dinitrophenyl-bovine serum albumin(ジニトロフェニル-ウシ血清アルブミン)。
ＦＣＳ＝fetal calf serum（ウシ胎児血清）。
ＨＥＰＥＳ＝（N−(2-Hydroxyethyl)piperazine-N-(2-ethanesulfonic acid))
[N−(2-ヒドロキシル)ピペラジン-N-(2-エタンスルホン酸)]。
ｍｇＭ−ＣＳＦ＝mouse granulocyte monocyte-colony stimulating factor
(マウス顆粒球単球コロニー刺激因子)。
ＰＭＡ＝phorbol-12-myristate-13-acetate
（ホルボール-１２-ミリステート-１３-アセテート）
ＲＰＭＩ＝the Roswell Park Memorial Instituteの名前を取って命名した細胞培養培地。
ＴＮＰ＝trinitrophenyl(トリニトロフェニル)。
【００３４】
実施例１
トランスフェクト細胞系および細胞培養の製造:
ＤＣ１８細胞系は、例えば、Elbe A. et al., J.Immunol.153:2878-2889,1994; Prieschl E.E. et al., J.Immunol.157:2645-2653, 1996で特徴付けられる。
要約すると、細胞を、リンパ球−Ｍグラジエントを用いて、生存細胞を増やした後に皮膚および表皮細胞を含有するマウス胎児皮膚細胞懸濁液から単離/増殖させる。細胞を、RPMI 1640を用いる９６ウェルの丸底組織培養プレート中でウェルあたり２×１０５の密度で播種する。培地に、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ゲンタマイシン（５０μg/ml）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０.１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μＭ β-メルカプトエタノールおよび抗生−抗菌性溶液を添加した。培養培地を、ｍＧＭ−ＣＳＦ(１００Ｕ／ｍｌ)でさらに補充する。
【００３５】
ＤＣ１８クローン−遺伝子的に構築した細胞を次のように生成する:
ｈＴＮＦαプロモーター−ルシフェラーゼ−ｈＴＮＦα３’構築体を、安定な細胞系を生成するために使用する。細胞を、ＴＮＦαプロモーター−ルシフェラーゼ−ＴＮＦα３’末端構築体と共に至適条件(２００Ｖ，９６０μＦ)でエレクトロポーレーションによってトランスフェクトし、エレクトロポーレーション直後に培地（１０ｍｌ）に播種し、次の日にLymphoprepによって精製する。ウェルあたり１ｘ１０４生存細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中の各培地（１００ μｌ）＋ゲネチシン（geneticin)(Ｇ４１８)（２５０μg/ml）に播種する。２日後、新しい培地（１００μｌ）を加えた。２日ごとに、培養液（１００μｌ）を取出し、新しい培養（１００ μｌ）に置き換える。安定な各クローンを、従来の細胞培養方法およびシングルセルクローニングによって選択する。これは、７つの充分増殖した（outgrowing）クローンを生じ、そのうちの４つは、ＩｇＧ複合体での刺激に対応するルシフェラーゼ誘導によって、変動する程度 (６〜１０倍の間)で応答する。最良のレスポンダーを、１ラウンドのさらに制限された希釈クローニング(シングルセルクローニング)に供し、これをＤＣ１８ クローン１０(＝ＤＣ１８ Ｃ１０)と名付けた。このクローンを、以後の全試験のために選択する。
【００３６】
アッセイの刺激がＩｇＧによるために、培養期間中における前刺激を防止するために細胞を低濃度のＩｇＧ培地中で培養することがきわめて重要である。
【００３７】
実施例２
刺激条件およびデータ読取り: 
ＩｇＧサブタイプは、Pharmingen/Becton Dickinsonから、DNP-BSAはCalbiochemから、およびウサギ抗マウスＩｇＦ(ａｂ’)2フラグメントはJackson Laboratoriesから提供される。
ウェルあたり(Optiplate, Packard)、５０μｌの培地に１ｘ１０４細胞を播種する。候補化合物とのインキュベーションを４５分間行った後、ＤＮＰ−ＢＳＡ（１０μg/ml）またはウサギ抗マウスＩｇＦ(ａｂ’)2フラグメント（３０μg/ml）のいずれかで複合体化した各種サブタイプのネズミＩｇＧ（５μg/ml）により刺激する。刺激をその後４時間実施する。次いで、５倍濃縮したレポーター溶解緩衝液(Promega)(１３μｌ)を添加し、細胞を凍結(-８０℃)−解凍サイクルによって溶解する。データ読取りのために、ルシフェラーゼの基質(Promega)(５０μｌ)を添加し、ルシフェラーゼ活性をMicroBetaJet(Wallac)で測定する。
【００３８】
このクローンを用いる最初の実験は、全体的な再現性だけでなく、上清中のルシフェラーゼおよびＴＮＦαの誘導された最高値に関して、ＩｇＧ＋Ｆ(ａｂ’)2による複合体形成がＩｇＧ＋抗原(ＤＮＰ−ＢＳＡ）による複合体形成よりも優れているということを証明する。さらに、モノマーＩｇＧは、ＴＮＦα誘導を刺激しないが、それはＩｇＧに対する高親和性受容体、ＦｃγＲＩの発現が検出できないことと一致する。そのため、更なる全ての実験において、ＩｇＧ＋Ｆ(ａｂ’)2による刺激を行う。
【００３９】
マウスおよびヒトにおけるＦｃγＲＩＩＩは、ＩｇＧアイソタイプの相異によって異なる相互作用をするので、全ＩｇＧに代えて、ＩｇＧアイソタイプの複合体、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２a、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３の複合体によるＤＣ１８ Ｃ１０細胞の刺激を試験する。比較として、ＰＭＡ刺激、さらにＩｇＭおよびＩｇＥによる刺激を並行して行う。図１に示すように、最良の刺激（ＩｇＧについて）がＩｇＧ２aによって達成され、これを誘発性免疫グロブリンとして次の全ての試験に使用する。
至適データ読取り条件を決定するために、刺激の時間動態を、６時間の範囲にわたり行う。図２に示し得るように、最大の刺激を６時間の時点で達成する。しかしながら、非刺激対刺激の比は、すでに４時間で１０倍以上であったので、４時間という、より短い時間の刺激が、以後の全試験において、実行上の理由(薬物との前培養および測定を含むアッセイを１日以内で完了するため)により選択される。
【００４０】
実施例３
プロトタイプ阻害剤についてのスクリーニング:
プロトタイプ阻害剤(ポジティブコントロール)を探索するのに、あるシグナル伝達経路を阻害すると知られるいくつかの候補化合物を検討する。ＣｓＡ(Sandimmune; データは示していない)、FK506 (図３Ａ)またはWortmannin (PI3-キナーゼ阻害剤;図３Ｂ)のいずれも、ＩＣ５０濃度でのデータ読取りを有意に阻害しなかった。全く対照的に、市販されているerk1,2/jnk1,2 阻害剤であるアピゲニン（Apigenin）は、記載されているＩＣ５０濃度(参照、図３Ｃ)で、ＩｇＧ２a複合体誘発性ルシフェラーゼ誘導を阻害する。
ハイスループット・スクリーニングを至適化するために、適切な/有意なルシフェラーゼのデータ読取りを得るために必要とされる細胞数のタイトレーションを行った。図４からわかるように、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、ウエルあたり１０４ 個のＤＣ１８ Ｃ１０細胞が、適切かつ検出容易なデータ読取りのために十分である。
【００４１】
実施例４
アッセイプロトコルの確立:
アッセイプロトコルを、次のように確立する。
１）培養培地（４５μｌ）(Packard Optiplate）中の１０４ＤＣ１８ Ｃ１０細胞／ウェルを用い、化合物溶液/溶媒コントロール（５μｌ）を添加する。
２）４５分間、３７℃、加湿したインキュベーター中で、５％ＣＯ２によりインキュベーションを行う。
３）刺激を、マウスＩｇＧ２a抗-ＴＮＰ（５μg/ml）＋ウサギ抗-マウスＩｇ(Ｆａｂ’)2フラグメント（３０μg/ml）で行う。
４）４時間、３７℃、加湿したインキュベーター中で、５％ＣＯ２により、インキュベーションを行う。
５）５倍濃縮した溶解緩衝液(Promega)(１３μｌ）を添加する。
６）該混合物を、１時間、−８０℃で凍結し、細胞を再び溶融させて、細胞を溶解する(凍結溶融サイクルによって溶解する)。
７）ルシフェラーゼ試薬(Promega)(５０μｌ)を溶解した細胞に添加し、５秒間後、Wallac MicroBetaJetにおいて、５秒の測定時間でルシフェラーゼ活性の測定を行う。
【００４２】
ヒットの定義のためのカット・オフ点は、５μＭの物質濃度で３５％阻害に定めたが、異なるようにも（例えば６０％阻害）選択され得る。
細胞の取り扱いおよび測定を含めた全ての手順を、６〜７時間の範囲で行うことができ、このアッセイはハイスループット・スクリーニングのための取り扱いを容易にし得る。
このアッセイプロトコルを用いて、我々は、高／低値、溶媒の感受性をチェックすることによってアッセイを検証し、多種類の物質について多くの試行を行った。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、各種免疫グロブリン複合体(ＩｇＧアイソタイプを含む)によるＤＣ１８ Ｃ１０細胞の刺激を示す；ｎｓｔ=刺激されない。
【図２】図２は、ＩｇＧ２a複合体で刺激される、安定にトランスフェクトされているＤＣ１８ Ｃ１０細胞についての時間反応速度である。
【図３】図３は、ＩｇＧ２a複合体で刺激されたＤＣ１８ Ｃ１０細胞に対する与えられた濃度(ｘ軸)における様々な阻害剤の適用を示す。
【図４】図４は、適切なデータ読取りのために提供される細胞数(ｘ軸で示される)のタイトレーションを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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