(57)【要約】本発明は、生物学的活性ペプチドおよびそれを含有する産物を用いて、ミネラルのアベイラビリティを高めるすること、および骨格系を強化することに関する。ペプチドおよびそれを含有する産物は、例えば、骨のミネラル吸収に関連する種々の障害および疾患を予防および治療するのに有用である。高い短鎖ペプチド含量および高いカルシウム含量を有する産物が、本発明の使用において特に効果的であることがわかった。
2005517424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミネラルのアベイラビリティを高める産物の調製におけるカゼイン誘導の小分子ペプチドの使用。
【請求項２】
ミネラルのアベイラビリティを高める産物の調製におけるカゼイン誘導の小分子ペプチドの高含量を有する産物を用いることを特徴とする、請求項１の使用。
【請求項３】
ミネラルのアベイラビリティを高める最終産物の調製における、カゼイン誘導の小分子ペプチドの高含量および高カルシウム含量を有し、乳酸菌でのカゼイン含量出発材料の発酵によりつくられる産物の、請求項１の使用。
【請求項４】
ミネラルのアベイラビリティを高める最終産物の調製における、カゼイン誘導の小分子ペプチドの高含量および高カルシウム含量を有し、Lactobacillus helveticus 株 LBK-16H、DSM 13137 でのカゼイン含量出発材料の発酵によりつくり、選択的にカゼインおよび/または他のミルク産物および/またはラクトースを部分的にまたは完全に除去し、得られたペプチド含有の発酵産物をナノろ過することにより調製される産物の、請求項１の使用。
【請求項５】
ミネラルのアベイラビリティを高める産物の調製における、カゼイン誘導の小分子ペプチド、ミネラルおよび生きている乳酸菌を含有するサワー組成物の使用。
【請求項６】
カゼイン誘導の小分子ペプチドが短鎖ペプチドであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの産物の使用。
【請求項７】
ペプチドがジ-、トリ-、テトラペプチドであることを特徴とする、請求項６の産物の使用。
【請求項８】
高IIe-Pro-Pro および/または Val-Pro-Pro 含量および高カルシウム含量を用いることを特徴とする、請求項７の使用。
【請求項９】
産物がカルシウムのアベイラビリティを高めることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかの使用。
【請求項１０】
ミネラルのアベイラビリティを高める方法であって、個体にミネラルのアベイラビリティを高める小分子ペプチドまたはそれを含有する産物を、所望の効果を達成するのに十分な量で投与することによる方法。
【請求項１１】
骨粗しょう症を予防、軽減、治療する方法であって、その処置を必要とする個体に、ミネラルのアベイラビリティを高める小分子ペプチドまたはそれを含有する産物を、所望の効果を達成するのに十分な量で投与することによる方法。
【請求項１２】
カルシウムのアベイラビリティを高める方法であって、個体に、カゼイン誘導の小分子ペプチドの高含量および高カルシウム含量を有し、Lactobacillus helveticus 株 LBK-16H、DSM 13137 でのカゼイン含量出発材料の発酵により、選択的にカゼインおよび/または他のミルク産物および/またはラクトースを部分的にまたは完全に除去して、調製される産物を、所望の効果を達成するのに十分な量で投与することによる方法。
【請求項１３】
発酵産物をナノろ過にもかけることを特徴とする、請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的活性ペプチドおよびそれを含有する産物を用いて、ミネラルのアベイラビリティを高めること、および骨格系を強化することに関する。ペプチドおよびそれを含有する産物は、例えば、骨のミネラル吸収に関連する種々の障害および疾患を予防および治療するのに有用である。高い短鎖ペプチド含量および高いカルシウム含量を有する産物が、本発明の使用において特に効果的であることがわかった。
【背景技術】
【０００２】
食物中のタンパク質は、臓器系にとっての必須アミノ酸および窒素の供給源である。さらに、食物中のタンパク質は、臓器系の機能の有意な調節物質であり得るペプチドを含有する。生物学的活性ペプチドは、例えば、栄養物質の吸収 (ホスホペプチドおよびカソモルフィン)、ホルモンの分泌 (カソモルフィン)、免疫 (免疫ペプチド、カソキニン、カソモルフィン)に影響を与え得る。ミルク中のカゼインは、食物における生物学的活性ペプチドの最も有意な供給源である (Schlimme E. & Meisel H. Biologically active peptides derived from milk proteins. Structural, physiological and analytical aspects. Die Nahrung 1995; 39:1-20; Steijns J. Dietary proteins as the source of new health promoting biologically active peptides with special attention to glutamine peptide. Food Tech Europe 1996; March/April: 80-84)。
【０００３】
ホスホペプチドは、体内でミネラルの吸収に影響を与えることが知られている。ホスホペプチドは、αおよびβ-カゼインからトリプシンによるタンパク質分解により主に形成される。Lee の研究グループは、カゼイン 200 g/kg を含有する食事がホスホペプチドの形成を増加することを認めている (Lee Y et al. Phosphopeptides and soluble calcium in small intestine of rats given a casein diet. Br J Nutr 1980; 43:457-67)。しかし、カゼインが唯一の食物源であるとき、ホスホペプチドが形成されなかった。この科学者の結論によると、ホスホペプチドの形成には、カゼインだけでなく、デンプンや脂肪などの他の食物源も必要である。これは、他の栄養素が小腸においてタンパク質分解酵素の活性を増加することによるのであろう。
【０００４】
動物実験によると、ミルクカゼインから形成されたホスホペプチドは、腸において溶性カルシウムの量を増加し、もってカルシウムの吸収 (参照、例えば、Lee Y et al. Phosphopeptides and soluble calcium in small intestine of rats given a casein diet. Br J Nutr 1980; 43:457-67; Lee Y et al. Intestinal absorption of calcium in rats given diets containing casein or amino acid mixture: the role of casein phosphopeptides. Br J Nutr 1983; 49:67-76; Li Y et al. Indirect effect of casein phosphopeptidepeptides on calcium absorption in rat ileum in vitro. Reprod Nutr Dev 1989; 29:227-233; Mykkaenen HM, Wasserman RH. Enhanced absorption of calcium by casein phosphopeptides in rachitic and normal chicks. J Nutr 1980; 110:2142-2148; Tsuchita H at al. The effect of casein phosphopeptides on calcium utilization in young ovaryectomized rats. Z Ernahrungswiss 1993; 32:121-130; Yuan YV, Kitts DD. Calcium absorption and bone utilization in spontaneously hypertensive rats fed on native and heat-damaged casein and soya-protein. Br J Nutr 1994; 71:583-603) および臓器系のカルシウム含量 (Tsuchita H. et al. ibid.)を改善できる。しかし、すべての結果がこの論を支持しているわけでない (参照、例えば、Brommage R et al. Influence on casein phosphopeptides and lactulose on intestinal calcium absorption in adult female rats. Lait 1991; 71:173-180)。
【０００５】
ヒトにおけるカルシウム吸収に対するホスホペプチドの影響がいくつかの研究で調べられている。Hansenらのランダム交差試験において、22 健常成人に米または全穀物を基にする幼児食が 0、1 または 2 g のホスホペプチドおよび標識カルシウムとともに与えられた。カルシウムの吸収が放射同位元素の保持で確認され、ホスホペプチドにより米を基にする食物摂取の者で約 30% 増加したことが認められた。しかし、全穀物を基にする食物を摂取の者で、ホスホペプチドがカルシウム吸収を増加しなかった。この研究者によると、これは食物の高い fytate 含量によるのであろう (Hansen M et al. Casein phosphopeptides improve zinc and calcium absorption from rice-based but not from whole-grain infant cereal. J Pediatr Gastrolog Nutr 1997; 24:56-62)。Heaney らは、35 人の健常女性に 250 g の標識カルシウムおよび 87.5 mg のホスホペプチドまたはプラセボを食物とともに与えた。ホスホペプチドを摂取した者およびカルシウム吸収が低かった者において、カルシウム吸収が有意に改善された。カルシウム吸収が高かった者およびプラセボを摂取した者では、ホスホペプチドがカルシウム吸収を顕著に増加しなかった (Heaney RP et al. Effect of caseinophosphopeptide on absorbability of coingested calcium in normal postmenopausal women. J Bone Miner Metab 1994; 12:77-81)。
【０００６】
ホスホペプチドの使用は、例えば、乳児、高齢者、病人にとって、ミネラル、特にカルシウムの吸収が損なわれているか、その必要性が増加している疾患において利益になり得る。ホスホペプチドを食材に加えることは、カルシウム吸収を増加するための確実な方法である (Hansen M. et al. 1997, ibid.)。
【０００７】
生物学的活性ペプチドは、血圧に影響を与えるペプチドも含有している。ACE すなわちアンギオテンシン I を転換する酵素は血圧の調節における要の酵素である。これはアンギオテンシン I をアンギオテンシン II に転換する。後者は血管を強く収縮する。ACE 阻害剤は、この作用を防ぐことができ、血圧を下げる物質として働く。ACE 阻害剤として作用するペプチドはミルクカゼイン、魚、コーンのタンパク質中に存在する (Schlimme et al. 1995, ibid.)。文献に開示されている血圧作用ペプチドには、例えば、Asp-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His-Pro-Phe-Ala-Gln-Thr-Gln-Ser-Leu-Val-Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser and Leu-Leu-Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val (Yamamoto N et al. Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790. J Dairy Sci 1994; 77:971-922)、Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp (Maryama S et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of the C-terminal hexapeptide of αs1-casein. Agric Biol Chem 1987; 51:2557-61)、Phe-Phe-Val-Ala-Pro (Maryama S et al. Agric Biol Chem 1985; 49:1405)がある。
【０００８】
サワーミルク産物が血圧低下作用を有するペプチドを含有することも報告されている。ペプチドはミルク産物中に乳酸菌による加水分解、特に細胞外プロテイナーゼによるミルクタンパク質の加水分解の結果として形成されると考えられる。
【０００９】
Yamamotoらは、微生物 Lactobacillus helveticus CP790 に由来するプロテイナーゼの精製および特徴解明を記載している（ J. Biochem. 114 (1993) 740)。Yamamotoらはまた、αs1 およびβ カゼインをこのプロテイナーゼで分解し、得られたペプチドを ACE 阻害作用について調べている (J Dairy Sci 1994; ibid.)。全 25 ペプチドの検討で、これらは分子量および作用において非常に異なっていた。最も効果的なペプチドは、βカゼインから得られた 3 ペプチドであって、夫々 8、18、27 のアミノ酸を含有していた。Lactobacillus helveticus strain CP790 およびプロテイナーゼ活性を欠くその変種 CP791 で発酵せしめたミルクの ACE 活性を比較し、前者が自然的高血圧を起こす SHR ラットで有効であるが通常のラットでは有効でなく、また、後者は全く活性のないことも見出された。
【００１０】
Nakamuraらは、2 ACE 阻害剤の調製のおける Lactobacillus helveticus および Saccharomyces cerevisiae を含有するサワー剤の使用を発表している（J Dairy Sci 1995; 78: 777 - 783)。このサワー剤でスキムミルクが発酵され、ついで、ACE 阻害剤がクロマトグラフィ−で精製され、分析された。両活性化合物は トリペプチド、Val-Pro-Pro および IIe-Pro-Pro であった。
【００１１】
米国特許 5,449,661, Nakamuraらは、トリペプチド配列 Val-Pro-Pro を含有するペプチドの調製およびその高血圧の低下における使用を記載している。ペプチドが Lactobacillus helveticus 株 JCM-1004 によるスキムミルク粉の発酵により調製され、ついでクロマトグラフィ−で精製され、凍結乾燥される。
【００１２】
国際特許出願 WO99/16862, Yamamotoらは、大量のトリペプチド Val-Pro-Pro および/または IIe-Pro-Pro を生産でき、かつ高い細胞外プロテアーゼ活性をもつ Lactobacillus helveticus strain CM4、FERM BP-6060 を記載している。また、上記のトリペプチドおよび細菌を含有する発酵ミルク産物、およびトリペプチド配列を含有する産物を該細菌により発酵せしめることによる調製方法も記載している。
【００１３】
ACE 阻害剤として作用するペプチドは、ACE 阻害剤により刺激されるブラジキニンがマクロファージおよびリンパ球の活性を増加し得ることから、免疫に対する作用を有すると考えられている (Migliore-Samour D et al. Biologically 活性 milk peptides implicated in immunomodulation. J Dairy Res 1989; 56:357-362)。このペプチドのミネラル吸収に対する作用は、当技術分野において研究も発表もされていない。
【００１４】
骨の低いミネラルレベルに関連する障害または疾患がいつも珍しくなくなっている。これはすべての年齢群で存在する。問題は高齢群で最も深刻である。高齢群では、一般的に低い代謝、身体運動の不足、主要な食物、ビタミン、ミネラルの不十分な摂取、とりわけ低いカルシウム吸収が骨粗しょう症の原因となり得る。人口が高齢化するので、骨の低いミネラルレベルに関連する疾患および障害がさらに増加することが懸念されている。 カルシウム吸収は閉経後の女性でも低くなる。 栄養、運動、その他の生活習慣を変えると、問題が時とともに悪くなり、若い人口群に移行することも懸念される。カルシウム摂取は、例えば、ラクトース非耐容者、菜食主義者、体重調整者での推奨を下まわる。第２の危険群は、若い女性、授乳者、妊娠者などのカルシウムの必要性が増大している者を含む。
【００１５】
他のミネラルも種々にヒトの健康に影響する。例えば、マグネシウムは筋肉および神経のインパルスを伝導し、骨および歯についての形成材料として役立つ。マグネシウムはまた、免疫応答を改善することが認められている。マグネシウム不足は稀であるが、脱水がマグネシウム欠乏を招くことがある。カリウムの働きのひとつは液体バランスの調整と筋肉の収縮である。カリウムの不足は筋肉を弱くする。マグネシウムおよびカリウムの摂取は液体のバランスまたは脱水の異常に関与する疾患および運動後の選手の回復に重要である。
【００１６】
無機塩を含有する製剤形態でのミネラルの摂取は、あまり効率的でない。例えば、わずか約 40% 無機カルシウムが腸で吸収される。加えて、身体のミネラルバランスは敏感であり、大きく変りやすい。これが特定のミネラル自体を投与するのがよい選択肢でない理由である。例えば、カルシウムの過剰摂取は鉄などの他のミネラルの吸収を妨げることがある。このように、そのミネラルの含量、低いと見られる存在または吸収、増大する必要性を改善しながら、他のミネラルとのよいバランスを保持または改善することが重要である。ミネラル自体、薬剤または機能性物質としてミネラルの吸収に影響するペプチドの投与は価値あると考えられる。
【００１７】
医療処置の別法またはその追加として、予防手段および(再)ミネラル化として、骨格系を強化する他の方法を用いることもできる。ひとつのよい方法は身体運動の増加である。 新しい方法のひとつは、機能的栄養素を通常の食事の一部として用いることであり、これは消費者に歓迎される方法である。食材に生物学的活性物質を加えることは、安全な方法であり、例えば、コレステロールおよび血圧を下げる製品がすでに市場にある。
【００１８】
このように、ミネラルのアベイラビリティを高め、骨粗しょう症を予防、軽減、治療し、ミネラル吸収を改善し、骨代謝を支持する新しい方法が必要とされている。ミネラル吸収および骨形成を高める機能的産物は、市場での選択に非常に歓迎を受けるであろう 。この産物は、望ましくないまたは有害な物質を含まず、工業的な規模で容易に生産でき、そして消費者にアピールし、親しみやすく、例えば、通常の食事の部分として使用しやすいものであることが重要である。
【発明の開示】
【００１９】
発明の要旨
本発明の目的は、ミネラルのアベイラビリティを高め、 ミネラルのアベイラビリティに関連する障害、疾患、損傷を予防、軽減、治療し得る産物を利用可能にすることである。産物の、カルシウム吸収、破骨細胞形成の低下、造骨細胞形成の発達、健康な骨格系、および骨粗しょう症およびその前段階の予防および軽減に対する作用が特に重要である。
【００２０】
本発明により使用される産物は、 ミネラルのアベイラビリティを高めるペプチドを高含量で有する。好ましい実施態様において、産物はまた最適の塩類含量を有する。このことは、対応する型の既知産物に比して、１価カチオンの数が低く、有益な２価カチオンの数が高いことを意味する。
【００２１】
最も好ましい実施態様は、ミネラルのアベイラビリティを高めるペプチドの高含量および高カルシウム含量を有する産物を利用可能にする。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、ミネラルのアベイラビリティを高める物質として産物自体、または消費する機能的食材または薬剤の調製における使用のための産物を利用可能にすることである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、ミネラルのアベイラビリティを高めるためおよび/または骨を強化するための方法を提供することである。これには、その処置を必要とする個体にミネラルのアベイラビリティを高めるペプチドまたはそれを含有する産物を、所望の効果を得るのに十分な量で投与する。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、骨粗しょう症を予防、軽減、治療するための方法を提供することである。これには、その処置を必要とする個体にミネラルのアベイラビリティを高めるペプチドまたはそれを含有する産物を、所望の効果を得るのに十分な量で投与する。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、カルシウムのアベイラビリティを高めるための方法を提供することである。これには、高含量のカゼイン誘導の小分子ペプチドおよび高カルシウム含量を有し、かつ Lactobacillus helveticus strain LBK-16H, DSM 13137 でカゼイン含有出発材料を、選択的にカゼインおよび/または他のミルクタンパク質および/またはラクトーゼを部分的または完全に除去しながら、発酵さすことによりつくられる産物を、所望の効果を得るのに十分な量で投与する。
【００２６】
好ましい実施態様において、発酵された産物をナノろ過にもかける。.
【００２７】
（図面の簡単な説明）
図１は、ラットの骨密度に対する本発明により使用される産物の作用および種々の参照サンプルの作用を示す。
【００２８】
図２は、ラットの骨のミネラル含量に対する本発明により使用される産物の作用および種々の参照サンプルの作用を示す。
【００２９】
図３は、骨の形成に対する本発明により使用される種々の濃度の VPP (Val-Pro-Pro) の作用を示す。
【００３０】
図４は、骨の形成に対する本発明により使用される種々の濃度の IPP (IIe-Pro-Pro) の作用を示す。図３および４において、B = ベースライン、 C = 対照、-10、-8、-6、-4 = 各々 10-10、10-8、10-6、10-4 M の VPP または IPP ペプチド、 * (p < 0.05)、** (p < 0.01)、*** (p < 0.001) はベースラインとの統計学的に有意の差を示す。
【００３１】
図５は、副甲状腺ホルモン(PTH)の濃度に対する本発明により使用される産物の作用および参照サンプルの作用を示す。
【００３２】
図６は、血清カルシウムの濃度に対する本発明により使用される産物の作用および参照サンプルの作用を示す。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明によって、ミネラルのアベイラビリティを高めるペプチドまたはそれを含有する産物を用いて上記の目的を達成できることがわかった。 ジ-、トリ-、テトラペプチドおよびそれらの混合物が、とりわけミネラルのアベイラビリティを高めるペプチドである。これらのペプチドは、カゼインまたはカゼイン含有の出発材料から発酵により都合よく調製できる。特に好ましいのは、生物学的活性ペプチドを含有する産物を発酵によりつくり、ついで濃縮し、そして組成物をナノろ過により完成する方法である。好ましい実施態様は、詳しく下記するように、異なる型の出発材料を使用し、所望のように最終産物の組成を改変する優れた可能性を提供する。 
【００３４】
本発明は、ミネラルのアベイラビリティを高める産物の調製におけるカゼイン誘導の小分子ペプチドの使用に関する。
【００３５】
本発明はさらに、ミネラルのアベイラビリティを高める産物の調製におけるカゼイン誘導の小分子ペプチドの高含量を有する産物の使用に関する。
【００３６】
好ましくは、カゼイン誘導の小分子ペプチドは、ジ-、トリ-、テトラペプチドおよびそれらの混合物を含む。最も好ましくは、IPP、VPP、カルシウム の含量が高い。
【００３７】
本発明は、カゼイン誘導出発材料を乳酸菌で発酵せしめ、できれば得られた発酵ペプチド含有産物をナノろ過して、調製された高含量のカゼイン誘導の小分子ペプチドおよび高カルシウム含量を有する産物を、ミネラルのアベイラビリティを高める産物の調製において使用することに関する。
【００３８】
好ましい実施態様として、本発明は、カゼイン誘導ペプチド、ミネラル、生きている乳酸菌を、ミネラルのアベイラビリティを高める産物の調製において使用することに関する。
【００３９】
本発明はまた、個体にミネラルのアベイラビリティを高めるペプチドまたはそれを含有する産物を、所望の効果を得るのに十分な量で投与することにより、ミネラルのアベイラビリティを高めるためおよび/または骨を強化するための方法に関する。
【００４０】
個体は主にヒトである。本発明において使用される産物のポジティブ作用は動物、特にペットや産業的動物にももちろん有用である。動物の例には、イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、家禽類がある。
【００４１】
本明細書の範囲において、ミネラルのアベイラビリティを高めるとは、ミネラルの骨細胞に対する吸収および作用を特に含む総合的作用を意味する。 
【００４２】
本発明においてミネラルアベイラビリティを高める生物学的活性ペプチドは発酵によりつくり得る。発酵の出発材料は所望の生物学的活性ペプチドをそれ自体のペプチドまたはタンパク質の配列の部分として含有するいかなる産物でもあり得る。ミルクタンパク質、特にカゼインは、そのままで、または種々の調製形態で好ましく使用できる。適当な出発材料は、また好ましくは、種々のカゼイン含有ミルク産物、例えば、スキムミルクや種々の脂肪含量のミルクのそれ自体または対応するミルク粉の形態、およびサワーミルク産物、例えば、サワーミルク、バターミルク、ヨーグルト、凝固ミルク、未熟チーズなどを含む。 
【００４３】
発酵は、出発材料からミネラルのアベイラビリティを高める小分子ペプチドをつくり得る乳酸菌で実施し得る。適切な乳酸菌は、例えば、Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Streptococcus、Bifidobacterium genera に属する株から選び得る。最もタンパク質分解性の乳酸菌は Lactobacillus helveticus  であって、本目的に特に適していると考える。好ましい Lactobacillus helveticus 株は L. helveticus LBK-16H、DSM 13137 であり、特許公報 WO 01/32836 に詳細に記載されている。乳酸菌は純培養基または混合培養基で、単独で、または通常使用され市販されているサワー剤とともに使用できる。乳酸菌はまた他の微生物と一緒に使用できる。微生物を適当に選択して、最終産物の最良の味を得、また汚染のおそれを防ぐ。 
【００４４】
発酵条件を選択して、所望の効果を得るための十分な量の生物学的活性ペプチドをつくり得るように、使用の株についての要件に適合せしめる。適切な条件、例えば、温度、pH、通気の選択は、当業者のノウハウの部分である。例えば、温度は 30 〜 45 ℃である。
【００４５】
発酵は、生物学的活性ペプチドの所望の量が形成するまで続け得る。通常、約 20 〜 30 時間、好ましくは 22 〜 24 時間かかる。
【００４６】
種々のペプチドの混合物が発酵中に形成する。発酵を十分長く続けると、主に Val-Pro-Pro (VPP) や IIe-Pro-Pro (IPP) などの比較的小さいジ-およびトリ-ペプチドを得る。
【００４７】
発酵後、細胞懸濁液を回収する。これをそのまま使用するか、ペプチドを通常の方法で分離し、精製できる。細胞懸濁液をプレート上に広げるなどして一部または完全な蒸発または乾燥などにより濃縮し、乾燥および最終的な粉砕で、保存のよい乾燥粉末を得ることができる。
【００４８】
ナノろ過による細胞懸濁液のさらなる処理は、ミネラルのアベイラビリティを高めるペプチドおよび所望のミネラル組成物を最終産物においてつくることを可能にするよい方法である。
【００４９】
ある場合には、ナノろ過の前に発酵産物を前処理にかけて、例えば、カゼインまたはすべてのミルクタンパク質を除去することが適切でもある。前処理に適した方法は当技術分野で知られており、種々の沈降またはろ過方法などを含む。ひとつの有用な方法は、カゼインの沈降範囲への発酵産物の pH の調整であって、例えば、37 ℃で 4.6 であり、ついで沈降カゼインをカード分離機、カゼイン分離ふるい、デカンターで沈降などの適当な方法で分離できる。第２の方法は pH 3 〜 3.5 でのサワー産物の限外ろ過を含む。これにより、すべてのタンパク質を膜に保持し、ほとんどタンパク質のないホエーを浸透物として得る。ほとんどタンパク質のないペプチド含有のホエーをつくる共沈降は、CaCl2 添加、熱処理、酸添加などで行い得る。必要に応じて、可能性あるカゼインダストを遠心分離で除去する。ラクトースなどの他の物質もナノろ過の前に酵素加水分解または発酵などにより除去し得る。
【００５０】
適当な方法で前処理された発酵産物、上記のように得られたホエーなどは、ついで所望によりナノろ過にかける。ナノろ過膜は通常の NF 膜でよく、例えば、Nanomax-50 (Millipore) や Desal 5 (Desal Inc., USA) であり、条件を必要要件および膜製造業者の説明にしたがって選択する。得られる産物の組成、特に塩および糖の組成に、ナノろ過膜の型および工程条件の選択により有意に影響を及ぼすことが可能である。
【００５１】
ナノろ過を所望の乾燥含量または容量濃度比まで行う。通常できるだけ高くする。乾燥含量は 20 〜 40% の範囲であり、容量濃度比は約 5 〜 20 である。ホエー濃縮物を水に稀釈して、大量の塩および乳酸を濃縮物からナノろ過の際に除去できる。これは、濃縮物中の塩の量を所望のレベルにまで調整するのに簡単で効率的な方法である。
【００５２】
発酵で形成されたミネラルのアベイラビリティを高める小ペプチド、例えば、約 350 D のトリペプチド IPP および VPP は、ナノろ過膜に完全に保持される。ナノろ過法はまた、ラクトースを完全に除去する可能性を提供する; ラクトースをナノろ過前に酵素的に分解できる。これによりモノサッカライドを大量に除去する。ナノろ過において、乳酸、尿素などの小さい窒素化合物、１価の塩が膜を透過する。このように、ナノろ過によって、産物のペプチド含量が増す。濃縮により、２価イオン、特に所望のカルシウムおよびマグネシウムイオンの含量も増加し、一方、ナトリウム、カリウム、クロライドなどの１価イオン比率が下がる。特に、ナトリウムイオンは、体の液体バランスに対する顕著な作用を有することが知られており、この有害イオン数の減少は非常な利点である。ある種の２価イオン、特にカルシウムイオンは、例えば、骨のミネラル化を改善することが知られており、その高含量は非常に望ましい。
【００５３】
特定の選択したミネラルの産物中の含量を、適当な塩の形態で所望のミネラルを加えることなどで増加もできる。このようなミネラルは特にカルシウムおよびマグネシウムである。
【００５４】
表１は、発酵を基にする上記の２工程法の発酵およびナノろ過工程のナノろ過において形成された前調製物中に含有される成分の挙動を示す。使用された例示の組成物は、スキムミルクの Lactobacillus helveticus 株での発酵によりつくる。上記の説明に明示するように、他の産物も出発材料として使用できる。さらに、発酵条件、選択的ナノろ過処理、可能な他の前処理、追加の処理が結果に影響を及ぼす。最終産物 (およびナノろ過の結果) は当然ここに記載のものと変りまた異なり得る。
【００５５】
表１
生物学的活性ペプチドを含有するホエーの成分のナノろ過における挙動
膜: Nanomax 50、条件: 40 ℃、30 bar、容量濃度比 K=9、pH 4.6
【表１】
2005517424.tif 000003
【００５６】
本明細書の実施例２に記載のように調製された産物が本発明の目的に非常に適していることがわかった。 この産物の全組成が実施された比較試験で最適であることがわかった。多くの因子が産物の生理活性に影響を及ぼす; 例えば、異なる活性ペプチドの選択を提供する産物の伸長されたタンパク質分解、産物の優れたミネラル含量、産物中の生きている微生物細胞、産物の酸度。これらの全特性は適当な方法における調製法の相違するパラメーターより影響を受け、また最適となり得る。酵素活性や反応時間などのタンパク質分解条件は得られるペプチドの質および量に影響する。 ナノろ過によりこれらに影響を与え、特に産物のペプチド含量を有意に増すことも可能である。さらに、酸含量およびその比率を所望のレベルに容易に調整できる。特に、所望の２価イオンの含量を増加し、１価イオンの含量を減少できる。酸度および微生物細胞の数および型も当業者に既知の方法で容易に最大化できる。
【００５７】
上記の産物は、所望の作用を達成するように使用できる。産物を乾燥し、粉末または凍結乾燥物の形態で使用できる。この産物は機能的食材などの産物の調製でも好ましく使用できる。
【００５８】
「食材」なる概念は本明細書において広い意味を有し、固体、ゼリー、液体の形態であり得るすべての消費可能な産物を含み、そしてインスタント産物と生物学的活性ペプチドまたはそれを含有する産物が消費の際に産物の補助物または部分として加えられるような産物との両方を含む。 食材は、酪農産業、肉加工産業、食品産業、飲料産業、パン産業、菓子産業などの産物であり得る。典型的な産物はミルク産物であって、例えば、ヨーグルト、凝固ミルク、凝乳、サワーミルク、バターミルク、他のサワーミルク産物、未熟成チーズ、熟成チーズ、スナックバーの詰め物を含む。第２の重要な群は飲料であって、例えば、ホエー飲料、フルーツ飲料、ビールなどである。 
【００５９】
本発明にしたがって、生物学的活性ペプチドまたはそれを含む産物を、ミネラルの吸収を高める所望の作用を得るのに十分な量で使用する。上記の２工程方法により得られた産物を用いるとき、使用の量は主にホエーの濃縮度に依存し、、最終産物の重量から計算して、例えば、0.1 〜 30% であり、好ましくは約 5 〜 15% である。
【００６０】
生物学的活性ペプチドまたはそれを含有する産物は、調製時の食品または最終の食品に加えることができる。問題の食品は、ミネラルのアベイラビリティを高めるペプチドまたはそれを含有する産物を、対応する食品中に含有される他の成分に加えて、含有し、そしてその通常の産物に味および挙動において完全に対応する。 
【００６１】
本発明を下記の実施例で詳細に記載する。これらの実施例は、本発明の説明のためであって、いかなる場合も本発明の保護範囲を制限するものではない。参考例および図面において X 記号のつけられた産物は、実施例２および５にしたがって調製する。
【００６２】
参考例１
種々の産物のタンパク質分解度およびミネラル含量
種々のサワーミルク産物のタンパク質分解度を決定するために、そのタンパク質含量(タンパク質)、全窒素含量 (Tot.N)、非タンパク質窒素含量(NPN; 尿素、アミノ酸、小さいペプチドなど)、滴定された遊離アミノ酸の量(Titr.f.aa)、pH を測定した。タンパク質分解度は、非タンパク質窒素の全窒素に対する比率(NPN / Tot.N)を計算しておおまかに決め得る; 滴定の遊離アミノ酸 mmol/g タンパク質の量は Titr.aa/Prot を計算して得ることができる。
【００６３】
結果を表２に示す。明らかに、Evolus 飲料は、日本のカルピス食品工業株式会社の市販カルピス、サワーミルク産物に比べて、タンパク質分解度が高く、短鎖ペプチドの数が多い。
【００６４】
表２：種々の産物のタンパク質分解度
【表２】
2005517424.tif 000004
【００６５】
種々のサワーミルク産物のミネラル含量を決定するために、そのナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム含量を測定した。血清中の高ナトリウム含量は多くの点で、例えば、電解質バランス、高血圧、心血管系疾患に有害であるので、食品中のナトリウムの低下は好都合である。他のミネラルについては、逆であり、その含量の増加が好都合である。測定は環境研究所 (Environment Centre, Helsinki)で行った。結果を表３に示す。Evolus 産物のミネラル含量は本発明の目的にとって最適である。
【００６６】
表３  
種々の産物のミネラル含量
【表３】
2005517424.tif 000005
【００６７】
参考例２
種々の産物の骨格系に対する作用
水、ミルク、サワーミルク、および２種の IPP および VPP ペプチド含量の飲料、日本のカルピル食品工業株式会社の市販カルピス、サワーミルク産物および実施例２の産物 X (Evolus, Valio Oy) の骨格系に対する作用を調べた。
【００６８】
６週齢の SH ラットを試験に用い、試験飲料のひとつを ad libitum 14 週間与えた。その後、ラットの骨を取りだし、骨のミネラル密度 (BMD) および骨のミネラル含量(BMC) を Dexa (dual energy X-ray absorptiometry) で測定した。Dexa は骨の密度を測定する低エネルギーＸ線に基づく技法である。結果を Fisher LSD 法 (Sahai H. and Ageel M. 2000. The analysis of variance: Fixed, random and mixed models, Birkhaeuser, Boston) で計算した。カルシウムおよびエネルギーの供給が試験の群間で異なるので、結果をその変数に関して標準化した。結果を表４ならびに図１および２に示す。図１は、Evolus 飲料を摂取したラットの骨密度が他の群の骨密度よりも高いことを示す。図２は、Evolus 飲料の骨ミネラル含量に対する顕著な高める作用を示す。骨のミネラル含量について統計的に有意の差異を、Evolus 飲料と水を摂取したラット間で、および Evolus 飲料とカルピスを摂取したラット間で認めた。この結果は、Evolus 産物が本発明の目的について最適の組成を有することを示す。
【００６９】
フィンランド特許出願 992360 は、対応する Evolus 産物の調製およびその血圧降下剤としての活性を記載している。公報に記載のように、最初の試験はラットでなされ、ついでヒトで反復された。血圧について、両試験は対応する明白な結果を示した。従って、現在進行のヒトにおけるミネラル吸収に関するさらなる試験が上記の動物試験と類似の結果をもたらすであろうと考え得る。
【００７０】
表４
種々の産物の骨格系に対する作用
【表４】
2005517424.tif 000006
【００７１】
参考例３
IPP、VPP および L. helveticus で形成されたペプチドフラクションの骨細胞形成に対する作用
本試験の目的は参考例２で得られた結果の原因となる活性因子を決定することである。試験において、L. helveticus でサワー付けされたミルク産物のペプチドフラクション、Neo サワーミルク(Valio Oy, Helsinki, Finland) のフラクション、および L. helveticus で形成された純粋のペプチド、IPP (イソロイシン-プロリン-プロリン) および VPP (バリン-プロリン-プロリン)を骨形成細胞に加えた。骨形成を試験中に蓄積されたカルシウム量で測定した。ベースライン群で放出されたカルシウムの平均量を値 100% とした。ベースライン(BL、負対照) および骨形成を増加する物質である BMP-4 (C, 骨形態形成タンパク質 4) を試験での対照に使用した。骨形成における VPP および IPP の作用を図３および４に示す。異なる VPP および IPP 含量でそれぞれ形成されたカルシウム含量 (-10、-8、-6、-4 = 10-10、10-8、10-6、10-4 M VPP または IPP ペプチド）である。 * (p < 0.05)、** (p < 0.01)、*** (p < 0.001) はベースラインからの統計的有意差を表す。
【００７２】
この結果は、純粋のペプチドが骨形成を顕著に増加することを明らかに示す。L. helveticus でサワー付けされたミルク産物のペプチドフラクションは骨形成に対して小さい作用を有する。Lactobacillus helveticus で酸味付けされたサワーミルクからの 10-5 および 10-3 稀釈ホエーで * (p < 0.05)、10-4 稀釈ホエーで ** (p < 0.01) であった。この作用はペプチドフラクションの IPP および VPP 含量で説明できる。Neo サワーミルクのフラクションは骨形成に対する作用がなかった。
【００７３】
参考例４
L helveticus でサワー付けされたミルク産物のカルシウム吸収に対する作用
本試験で、L. helveticus でサワー付けされたミルク産物(Evolus) および Neo サワーミルク（Valio Oy, Helsinki, Finland）の閉経期後の女性における間接的カルシウム吸収に対する作用を調べた。２０人が試験に参加し、別個の日に両産物を摂取した。この産物は 500 mg のカルシウムを含む。血液および尿のサンプルを試験日に採取した。カルシウムの吸収の測定を間接的に、主要な変数として血清中の副甲状腺ホルモン(PTH)および尿中のカルシウム（この量はカルシウム吸収中にすでに数時間で変化した)、および血清中の全カルシウム (S-Ca)およびイオン化カルシウム (iCa)を用いて行った。PTH で血液循環における十分なカルシウム含量を確認した。カルシウムの吸収が増加すればするほど、PTH が減少する。カルシウムの吸収は尿および血清におけるカルシウムを増加する。
【００７４】
この試験において、Evolus 産物の投与は、投与１時間後に Neo サワーミルクに比して有意に低下した。同様に、血清のカルシウム含量が Evolus 産物の投与後に顕著に増加した。他のマーカーは産物間に有意の変化を表さなかった。
【００７５】
血清中の PTH 価およびカルシウム含量を図５および６にそれぞれ示す。
結果は、カルシウム吸収が L. helveticus でサワーされたミルク産物で通常のサワー法で調製された Neo サワーミルクよりもよいことを明白に示す。
【実施例１】
【００７６】
本発明で使用される産物の調製
Lactobacillus helveticus 株 LBK 16-H を MRS ブロスで 37 ℃、24 時間生育し、再構築ミルク(10%) に接種して、接種物をつくった。２生育サイクル後、接種物 (15%) を、9 〜 10% スクムミルク粉末でつくられ、110 ℃で 10 分間殺菌された発酵培地に接種した。発酵を、37 ℃で 22 〜 24 時間連続的に強く攪拌して行った。産物は乾燥および/または粉砕形態で使用でき、または所望のペプチドを方法自体既知の方法で分離できる。
【実施例２】
【００７７】
本発明で使用される産物の調製
実施例１でサワーされた産物を下記のようにナノろ過した。
サワーミルクの pH を約 4.6 まで KOH で上げて、カゼインを diamond メッシュで除去した。残りのカゼインダストを遠心分離で除去した。GLL Conc. ラクターゼ (Biocon Ltd, Japan) をホエーに加え、5 ℃で 24 時間加水分解し、ラクトースをモノサッカライドに分解した。前処理されたホエーを Nanomax-50 膜 (Millipore)でナノろ過した。
【００７８】
ろ過を 40 ℃、圧 30 bar で行った。ホエーを容量濃度比 9 までろ過した。得られた濃縮物およびそれから形成された乾燥粉末の組成を表５に示す。
表５
最終濃縮物および乾燥粉末の組成
【表５】
2005517424.tif 000007
【００７９】
取り出したカゼインを中和してカゼイン塩とし、乾燥した。
【実施例３】
【００８０】
本発明で使用される産物の調製
実施例１に記載の発酵を、(a) 濃厚ミルクおよび (b) バターミルクをスキムミルクの代わりに用いて反復した。
【００８１】
実施例３(b) の産物の pH を約 4.5 まで上げ、カゼインをカード分離機で除去した。ラクターゼを bactofuge で除去されたホエーおよびダストに加えた。ホエーを NF 膜 (Desal-5, Desal Inc.) でナノろ過し、蒸発、乾燥した。得られたナノろ過濃縮物は表５に記載のものに非常に類似の組成であった。
【００８２】
取り出されたカゼインは、発酵サワーミルクのように多くの生物学的活性ペプチドを含有する大量のホエーを含む。カゼインをカードのままで用いた。カードに生物学的活性ペプチドを加えた。
【実施例４】
【００８３】
本発明で使用される産物の調製
Lactobacillus helveticus 株 LBK 16-H を MRS ブロスで 37 ℃、24 時間生育し、実施例１のように、接種物をつくった。再構築ミルク(10%) に接種して、接種物 (15%) を、酸沈降カゼイン (2.8%) およびグルコース (2.5%) の水溶液でつくられた発酵培地に接種した。pH を 6.7 に 10% KOH で上げてカゼインを溶解した。発酵を 37 ℃、22 〜 24 時間で行った。対応量の生物学的活性ペプチド VPP および IPP が、ミルクの発酵とともに産物中にできたが、カゼインからペプチドの分離はミルクからよりも容易であった。
【００８４】
発酵溶液の pH を 4.6 に KOH で 37 ℃で上げ、それによりカゼインを沈降した。カゼインをカード分離機で分離し、得られたホエーを取り出した。ホエーはペプチド、乳酸、乳酸塩を含むがラクトースを含まない。ホエーのナノろ過により、それから大量の乳酸、１価塩、グルコースを除去できる。ナノろ過残留物を蒸発で濃縮物とし、乾燥で粉末にした。これにより、生物学的活性ペプチドを含有する十分濃縮された長期保存性の調製物を得た。
【実施例５】
【００８５】
サワーミルク産物の調製
ミネラルの吸収を高めるペプチドを含有するサワーミルクを、実施例１で得られたペプチドの 3.5% 濃縮物を市販のサワーミルクに加えて調製した。得られた産物の組成を表６に示す。表６は、第２の市販サワーミルク産物、AB サワーミルク、Valio Oy の組成との比較も示す。
【００８６】
表６
Evolus 産物および市販サワーミルク産物の組成
【表６】
2005517424.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、ラットの骨密度に対する本発明により使用される産物の作用および種々の参照サンプルの作用を示す。
【図２】図２は、ラットの骨のミネラル含量に対する本発明により使用される産物の作用および種々の参照サンプルの作用を示す。
【図３】図３は、骨の形成に対する本発明により使用される種々の濃度の VPP (Val-Pro-Pro) の作用を示す。
【図４】図４は、骨の形成に対する本発明により使用される種々の濃度の IPP (IIe-Pro-Pro) の作用を示す。
【図５】図５は、副甲状腺ホルモン(PTH)の濃度に対する本発明により使用される産物の作用および参照サンプルの作用を示す。
【図６】図６は、血清カルシウムの濃度に対する本発明により使用される産物の作用および参照サンプルの作用を示す。
【図１】
2005517424.tif 000009
【図２】
2005517424.tif 000010
【図３】
2005517424.tif 000011
【図４】
2005517424.tif 000012
【図５】
2005517424.tif 000013
【図６】
2005517424.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月24日(2003.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉱物のアベイラビリティを高める産物の調製における Ile-Pro-Pro および/または Val-Pro-Pro の使用。
【請求項２】
鉱物のアベイラビリティを高める産物の調製における Ile-Pro-Pro および/または Val-Pro-Pro の高含量を有する産物を用いることを特徴とする、請求項１の使用。
【請求項３】
鉱物のアベイラビリティを高める最終産物の調製における、カゼイン誘導の小分子ペプチドの高含量および高カルシウム含量を有し、乳酸菌でのカゼイン含量出発材料の発酵により調製される産物の、請求項２の使用。
【請求項４】
鉱物のアベイラビリティを高める最終産物の調製における、カゼイン誘導の小分子ペプチドの高含量および高カルシウム含量を有し、Lactobacillus helveticus 株 LBK-16H、DSM 13137 でのカゼイン含量出発材料の発酵によりつくり、選択的にカゼインおよび/または他のミルク産物および/またはラクトースを部分的にまたは完全に除去し、得られたペプチド含有の発酵産物をナノろ過することにより調製される産物の、請求項１の使用。
【請求項５】
鉱物のアベイラビリティを高める産物の調製における、カゼイン誘導の小分子ペプチド Ile-Pro-Pro および/または Val-Pro-Pro 、鉱物、生きている乳酸菌を含有するサワー組成物の使用。
【請求項６】
カゼイン誘導の小分子ペプチドが短鎖ペプチドの混合物を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかの産物の使用。
【請求項７】
ペプチドがジ-、トリ-、テトラペプチドであることを特徴とする、請求項６の産物の使用。
【請求項８】
高IIe-Pro-Pro および/または Val-Pro-Pro 含量および高カルシウム含量を用いることを特徴とする、請求項７の使用。
【請求項９】
産物がカルシウムのアベイラビリティを高めることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかの使用。
【請求項１０】
鉱物のアベイラビリティを高める方法であって、個体に IIe-Pro-Pro および Val-Pro-Pro およびその混合物よりなる群から選ばれる鉱物のアベイラビリティを高める小分子ペプチドまたは該ペプチドを含有する産物を、所望の効果を達成するのに十分な量で投与することによる方法。
【請求項１１】
骨粗しょう症を予防、軽減、治療する方法であって、その処置を必要とする個体に、IIe-Pro-Pro および Val-Pro-Pro およびその混合物よりなる群から選ばれる鉱物のアベイラビリティを高める小分子ペプチドまたは該ペプチドを含有する産物を、所望の効果を達成するのに十分な量で投与することによる方法。
【請求項１２】
カルシウムのアベイラビリティを高める方法であって、個体に、IIe-Pro-Pro および Val-Pro-Pro およびその混合物よりなる群から選ばれるカゼイン誘導の小分子ペプチドの高含量および高カルシウム含量を有し、Lactobacillus helveticus 株 LBK-16H、DSM 13137 でのカゼイン含量出発材料の発酵により、選択的にカゼインおよび/または他のミルク産物および/またはラクトースを部分的にまたは完全に除去して、調製される産物を、所望の効果を達成するのに十分な量で投与することによる方法。
【請求項１３】
発酵産物をナノろ過にもかけることを特徴とする、請求項１２の方法。
【国際調査報告】
2005517424.tif 000015
2005517424.tif 000016
2005517424.tif 000017
2005517424.tif 000018
2005517424.tif 000019
2005517424.tif 000020