(57)【要約】【課題】  測定対象スフィンゴ脂質の濃度測定のための質量分析における内部標準物質を提供する。【解決手段】  内部標準物質が、前記測定対象のスフィンゴ脂質と同じオリゴ糖鎖及び長鎖スフィンゴシン塩基と、該測定対象のスフィンゴ脂質とは異なる質量のアシル基とを有し、かつ該測定対象のスフィンゴ脂質と同じ化学的特性のスフィンゴ脂質である。またこの内部標準物質の調製方法及び使用方法である。
2005512061.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象のスフィンゴ脂質の濃度を決定するために質量分析において用いる内部標準物質において、前記内部標準物質が、
前記測定対象のスフィンゴ脂質と同じオリゴ糖鎖及び長鎖スフィンゴシン塩基と、該測定対象のスフィンゴ脂質とは異なる質量のアシル基とを有し、かつ該測定対象のスフィンゴ脂質と同じ化学的特性のスフィンゴ脂質であることを特徴とする
質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項２】
前記アシル基が前記測定対象のスフィンゴ脂質と同じ数の炭素原子を有しかつ同位体でラベル付けされていることを特徴とする
第１タイプの請求項１に記載の質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項３】
前記同位体によるラベル付けが、水素同位体または炭素同位体によることを特徴とする
第１タイプの請求項２に記載の質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項４】
前記スフィンゴ脂質が重水素化されたアシル基または１３Ｃをもつアシル基を有し、天然のスフィンゴ脂質と化学的に同一であると共に質量が異なることにより、質量分析により検知可能であることを特徴とする
第１タイプの請求項３に記載の質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項５】
[D4]C-16CTHを有することを特徴とする
第１タイプの請求項４に記載の質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項６】
前記スフィンゴ脂質の前記アシル基が奇数個の炭素原子を有することを特徴とする
第２タイプの請求項１に記載の質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項７】
前記内部標準物質の前記アシル基が、前記測定対象のスフィンゴ脂質のアシル基よりも１つ多いか１つ少ない炭素原子を有することを特徴とする
第２タイプの請求項６に記載の質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項８】
C-15、C-17、C-19、C-21、C-23及びC-25アシルスフィンゴ脂質のうち１または複数を有することを特徴とする
第２タイプの請求項６に記載の質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項９】
C-15CTH、C-17CTH、C-19CTH、C-21CTH、C-23CTH及びC-25CTHのうち１または複数を有することを特徴とする
第２タイプの請求項６に記載の質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項１０】
測定対象のスフィンゴ脂質のための内部標準物質の調製方法において、
質量分析により検出可能なラベルを付けたアシル基を前記測定対象のスフィンゴ脂質のリソ型に対して付加することを有することを特徴とする
内部標準物質の調整方法。
【請求項１１】
前記ラベルが前記リソ−スフィンゴ脂質に対して化学的に付加されることを特徴とする
請求項１０に記載の内部標準物質の調製方法。
【請求項１２】
前記ラベルがスフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼの逆反応を用いて酵素により前記リソ−スフィンゴ脂質に対して付加されることを特徴とする
請求項１０に記載の内部標準物質の調製方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の、または請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法により調製された内部標準物質を質量分析にて使用することを特徴とする使用方法。
【請求項１４】
エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析にて前記内部標準物質を使用することを特徴とする請求項１３に記載の使用方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載の、または請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法により調製された内部標準物質を用いて質量分析によりスフィンゴ脂質のレベルについて生化学的試料を解析することを特徴とする
リソソーム蓄積症の診断方法。
【請求項１６】
前記生化学試料が、血液、血しょう、組織または尿の試料であることを特徴とする
請求項１５に記載のリソソーム蓄積症の診断方法。
【請求項１７】
前記生化学試料が、新生児の踵からの採決試料であることを特徴とする
請求項１６に記載のリソソーム蓄積症の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析(マススペクトロスコピー)によるスフィンゴ脂質の測定を可能とすると共に、リソソーム蓄積症の診断のために供与されるスフィンゴ脂質の内部標準物質に関連する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ脂質は、グリコスフィンゴ脂質、スフィンゴリン脂質及びセラミド等の長鎖スフィンゴイド塩基をもつ脂質の一般名称である。共通構造として、スフィンゴ脂質はセラミド構造を有し、その構造中では、不均一鎖長の長鎖脂肪酸が酸アミド結合を介してスフィンゴイドのアミノ基へ結合している。
【０００３】
リソソーム蓄積症は、深刻な病症悪化へつながる可能性のある一般的障害の大きな一群である。テイサックス(Tay-Sachs)病、サンドホフ(Sandhoff)病、ファブリー(Fabry)病、ゴーシェ(Gaucher)病、クラッベ(Krabbe)病及びニーマン・ピック(Niemann Pick)病等を含む４０を超えるリソソーム蓄積症が知られており、個々のリソソーム蓄積症の頻度は比較的まれであるが、全てのリソソーム蓄積症の集積事例は、新生児７０００人中、約１人である。
【０００４】
各リソソーム蓄積症は、リソソームの発生機構若しくは機能に含まれるリソソーム酵素、輸送体またはタンパク質の欠損が原因である。この欠損により、リソソーム中で通常は分解される蓄積生成物が堆積することとなる。これらの蓄積生成物は、各欠陥において特徴的であり、そしてその堆積はリソソーム蓄積症へつながるプロセスにおける初期段階である。これらの蓄積生成物は、組織内の細胞中に堆積するのと同様に、血しょう、脳脊髄液及び尿等の堆積中にも現れる。血液または尿中の蓄積生成物の濃度は、病気の進行の好適な指標であり、あるいは、治療の可能な幾つかの病気においては、治療の進行状況の好適な指標となる。
【０００５】
従って、特定の蓄積生成物の濃度の精確な測定には、診断及び患者の観察において非常に価値がある。
【０００６】
グリコスフィンゴ脂質症は、リソソーム蓄積症の中の最も大きな群を構成する。この病気の一つがファブリー病であり、リソソーム加水分解酵素であるαーガラクトシダーゼＡ(Gal：α-galactosidase A)(EC.3.2.1.22)の欠損に起因するＸ連鎖リソソーム蓄積症である。この欠損により、末端のα−ガラクトシル(α-galactosyl)残留物を伴うグリコスフィンゴ脂質の蓄積がリソソーム内で進行する。
【０００７】
Fabry病における主要な蓄積生成物は、セラミド・トリヘクソシド(CTH：ceramid Trihexoside)またはグロボトリアオシルセラミド(GbOse３Cer, Gb3, GL-3：globotriaosylceramide)である。蓄積は、主として血管の内皮細胞、外皮細胞及び平滑筋細胞内で生じるが、他にも多くの種類の細胞に蓄積し、蓄積生成物は体液中にも存在する。組織、血しょうまたは尿中のCTHのレベルは、病気の経過を追跡するために、あるいは逆に治療を観察するために用いることができる。
【０００８】
CTHを直接測定するために幾つかの方法が用いられてきた。例えば、非特許文献１に記載のＴＬＣ法、非特許文献２に記載の免疫検知を伴うＴＬＣ法、非特許文献３に記載のグリコ脂質をニトロセルロース上へイムノブロッティングすることを伴うＴＬＣ法、非特許文献４に記載のポリビニリデンジフルオライド膜法がある。
【０００９】
その他には、オリゴ糖部分を解放して、非特許文献５に記載のようにＧＬＣにより測定する方法、非特許文献６及び７に記載のようにＨＰＬＣにより測定する方法がある。他の方法における時間のかかるステップの多くを省略したヴェロトキシン・サブユニットＢ(Verotosin subunit B)を用いたELISA法もまた開発された（非特許文献８）。
【００１０】
生化学試料中のグリコスフィンゴ脂質の直接検知及び特性解析のために、多様な質量分析が用いられてきた（非特許文献９〜１１）。
【００１１】
質量分析が他の方法より有利な点は、特異性、感度、高速測定、及び自動化性能である。スフィンゴ脂質を測定する質量分析法における主要な欠点は、内部標準物質を欠いていることである。内部標準物質は、この方法の定量のために必要である。内部標準物質とは、測定対象の試験化合物と化学的に同一か非常に近い化合物であるが、異なる質量を有しており、それにより試験化合物の存在下において質量分析により検出可能である。既知の量の内部標準物質が、解析対象の生化学試料に対して解析開始時に添加される。測定対象の化合物と同じ手順を採るのと同様に、その回収も同じようにすべきである。既知の量の内部標準物質と、生化学試料中の未知の量の試験化合物の解析応答を比較することにより、未知の量の試験化合物の濃度を精確に測定することができる。
【００１２】
適切な内部標準物質は、できるだけ試験化合物に近く類似しているべきであり、試験化合物と同じ機能と構造をもつべきである。２つのタイプの内部標準物質がある。第１のタイプは、測定対象の化合物を同一であるが、放射性同位体若しくは炭素に対する１３Ｃまたは水素に対する重水素等の非放射性同位体の導入により質量が異なる。第２のタイプは、僅かに構造が異なるために質量が異なるが、他の点では、試験化合物とできるだけ化学的に類似している。
【００１３】
多くの生化学化合物のための適切な内部標準物質が開発されている。例えば、特許文献１では、アシル・カルニチン(acyl carnitines)及びαアミノ酸のための同位体内部標準物質を開示する。また特許文献２では、脂肪酸代謝の代謝異常を検査するためにタンデム質量分析において用いられる１３Ｃ及び２Ｈ同位体によりラベル付けされた標準を開示する。しかしながら、スフィンゴ脂質等の、それらの化合物の複雑な構造故にさらに複雑な化合物については、利用できる内部標準物質がない。
【特許文献１】米国特許第２５８６０５号明細書
【特許文献２】国際公開第WO／０１４７４７号パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開第EP 1 067 196 A1号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第EP 0 940 409号明細書
【非特許文献１】ベルナ・エルら(Berna L et al.), (1999) 「アナリティカル・バイオケミストリ(Anal. Biochem.)」 269, p.304-311
【非特許文献２】ユ・エスシー、リングウッド・シーエー(Yiu SC, Lingwood CA.) (1992) 「アナリティカル・バイオケミストリ(Anal. Biochem.)」202, p.188-192
【非特許文献３】トウビン・エイチら(Towbin H et al.), (1984) 「ジャーナルオブイムノロジカルメソッド(J. Immunol. Methods)」 72, p.471-479
【非特許文献４】タキ・ティーら(Taki T et al.)), (1994) 「アナリティカル・バイオケミストリ(Anal. Biochem.)」 221, p.312-316
【非特許文献５】バンス・ディーイー、スウィリー・シーシー(Vance DE, Sweeley CC.) (1967) 「ジャーナルオブリピドリサーチ(J. Lipid. Res.)」 8, p.621-630
【非特許文献６】マッククルア・アールエイチら(McCluer RH et al.), (1989) 「メソッドインエンザイモロジー(Methods Enzymol.)」 172, p.538-575
【非特許文献７】シッフマン・アールら(Schiffman R et al.), (2000) 「プロシーディングオブナチュラルアカデミックサイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.）」 USA 97, p.365-370(米国)
【非特許文献８】ザイドナー・ケーエムら(Zeidner KM et al.), (1999) 「アナリティカル・バイオケミストリ(Analytical Biochemistry)」 267, p.104-113
【非特許文献９】ドモン・ビー、コステロ・シーイー(Domon B, Costello CE (1988) 「バイオケミストリ(Biochemistry)」 27, p.1534-1543
【非特許文献１０】グイタードら(Guittard et al.), (1999) 「ラピッドコミュニケーションマススペクトロメトリ(Rapid Commun. Mass Spectrom.)」 13, p.1838-1849
【非特許文献１１】ス、ツルク(Hsu and Turk (2001) 「ジャーナルオブアメリカンソサイエティマススペクトロメトリ(J. Am. Soc. Mass Spectrom. )」(米国)12, p.61-79
【非特許文献１２】ミリングトンら（Millington et al.), 「インターナショナルジャーナルオブマススペクトロメトリ(Int. J. Mass Spectrometry and Ion Processes)」, 111, p.212 1991
【非特許文献１３】イトら(Ito et al.), (1995) 「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリ(J. Biol. Chem.)」 Vol. 270, No. 41, p.24370-24374
【非特許文献１４】ミツタケら(Mitsutake. et al.), (1998) 「アナリティカル・バイオケミストリ(Anal. Biochem.)」 247, p.52-57
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の好適形態の目的は、従来技術の問題を解消若しくは軽減することであり、質量分析によりスフィンゴ脂質の測定を可能とするスフィンゴ脂質のための内部標準物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的の達成ために、本発明は、測定対象スフィンゴ脂質の濃度を決定するために質量分析で用いる内部標準物質を提供する。この内部標準物質は、測定対象スフィンゴ脂質と同じオリゴ糖鎖と長鎖スフィンゴシン塩基をもち、測定対象スフィンゴ脂質とは異なる質量のアシル基をもつが、測定対象スフィンゴ脂質と同じ化学特性のスフィンゴ脂質である。
【００１６】
CTHは、図１に示した３つの成分すなわち、オリゴ糖鎖、長鎖塩基(LCB)のスフィンゴシン、及び脂肪酸（アシル基）から構成される。CTHのための内部標準物質を設計する際、発明者らは、オリゴ糖鎖及び長鎖塩基がCTHに特徴的であり、CTHの化学的特性を変えることなく変更することができないことを見出した。発明者らは、天然のCTHにおいては不均一であるアシル鎖が、第１タイプ及び第２タイプの内部標準物質を生成するためにマス標識（ラベル）を含めるべく置き換え可能であることを見出した。
【００１７】
本発明の好適例では、スフィンゴ脂質のための第１タイプの内部標準物質を提供する。これは、アシル基が、測定対象スフィンゴ脂質と同じ数の炭素原子をもつが、同位体でラベル付けされている。
【００１８】
好適には、同位体ラベルが水素同位体、特に重水素である。同位体ラベルはまた、１３Ｃでもよい。
【００１９】
好適には、本発明は、重水素化アシル基をもつスフィンゴ脂質を提供する。これらは、化学的には天然のスフィンゴ脂質と同じであるが質量が異なるので、質量分析によりこれらを検知可能である。
【００２０】
本発明の好適例によれば、[D4]C-16CTHを提供する。これは、血液中で大部分を占めるC-16CTHと化学的に同じであるので、第１タイプの内部標準物質である。
【００２１】
アシル基を含む天然化合物では、アシル基が一般的に偶数個の炭素原子をもつ。本発明の好適例は、スフィンゴ脂質のための第２タイプの内部標準物質を提供する。これは、アシル基が奇数個の炭素原子をもつ。好適には、アシル基が、測定対象スフィンゴ脂質よりも１つ多いか１つ少ない炭素原子をもつ。これらの奇数個の炭素原子をもつアシル基は、天然には生じないが、測定対象スフィンゴ脂質に化学的に非常に似ており、質量が１４毎のファクタで異なる。好適には１４だけ異なる。
【００２２】
例えば、人の血液CTHは、通常、偶数個の炭素原子をもつアシル基の混合物であるが、炭素原子１６個のC-16アシル基が大部分である。本発明は、炭素原子１７個のアシル基をもつC-17CTHを提供する。C-17CTHは天然には存在しないが、化学的には天然のC-16アシル基と非常に似ており、１４だけ質量が異なる第２タイプの内部標準物質である。
【００２３】
本発明はさらに、好適例としてC-15、C-19、C-21、C-23及びC-25のアシル基をもつスフィンゴ脂質を提供する。
【００２４】
特別な例として、本発明は、C-15CTH、C-17CTH、C-19CTH、C-21CTH、C-23CTH及びC-25CTHを提供する。
【００２５】
本発明の第２の形態においては、スフィンゴ脂質のための内部標準物質を調製する方法を提供する。
【００２６】
第１タイプ及び第２タイプの内部標準物質の双方を調製するために、質量分析により検出可能なラベルを付けたアシル基を、測定対象スフィンゴ脂質のリソ(lyso-)型へ付加する。
【００２７】
スフィンゴ脂質のリソ型は、N-脱アシル(deacylated)形式である。これは、通常、酸アミド結合を介してスフィンゴイドのアミノ基へ付いている脂肪酸アシル基を欠いている。
【００２８】
幾つかのリソ(lyso)−スフィンゴ脂質は、市販され入手可能である。例えば、米国カリフォルニア所在のCalbiochemにより製造されたリソ−CTHである。他のリソ−スフィンゴ脂質は、市販されていないか非常に高価であるので、発明者らは、スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼを用いて、リソ−スフィンゴ脂質を生成した（特許文献３参照）。
【００２９】
本発明の第２の形態の第１実施例においては、マス標識をリソ−スフィンゴ脂質へ化学的に付加してもよい。
【００３０】
リソ−スフィンゴ脂質からの第１タイプの内部標準物質の化学合成は、重水素化された偶数個鎖の脂肪族アシル基を、有機溶媒及び無水物の存在下でリソ−スフィンゴ脂質へ付加することを含む。
【００３１】
リソ−スフィンゴ脂質からの第２タイプの内部標準物質の化学合成は、奇数個鎖の脂肪族アシル基を、有機溶媒及び無水物の存在下でリソ−スフィンゴ脂質へ付加することを含む。
【００３２】
実施例は、リソ−スフィンゴ脂質からのC-17CTHの化学的調製を示す。このプロセスは、他のアシル基及び他のスフィンゴ脂質へ同等に適用できる。
【００３３】
本発明の第２の形態の第２の実施例においては、特定条件下においてスフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼの逆反応を行うことにより、マス標識が、リソ−スフィンゴ脂質に対して酵素的に付加されてもよい（特許文献４参照）。
【００３４】
実施例は、スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼを用いたリソ−スフィンゴ脂質からのC-17CTH及び[D4]C16-CTHの酵素的調製を示している。
【００３５】
本発明の第３の形態は、本発明の第１の形態による内部標準物質、あるいは本発明の第２の形態の方法により調製された内部標準物質の、質量分析における使用方法を提供する。
【００３６】
好適には、内部標準物質がエレクトロスプレイイオン化タンデム質量分析(ＥＳＩ-ＭＳ)で用いられる。
【００３７】
エレクトロスプレータンデム質量分析は、高感度かつ明瞭であるので、異常の広範囲のスペクトルを検出できる。
【００３８】
本発明の第４の形態は、本発明の第１の形態による内部標準物質、あるいは本発明の第２の形態の方法により調製された内部標準物質を用いた質量分析により、生化学試料のスフィンゴ脂質のレベルを解析することを含むリソソーム蓄積症の診断または治療観察の方法を提供することである。好適には、生化学試料が、血液、血しょう、組織または尿の試料である。
【発明の効果】
【００３９】
新生児は、世界の全ての先進国において代謝異常について検査されており、そして発展途上国でも採用されつつある。タンデム質量分析の使用以前には、検査される異常の数が、ほとんどのプログラムにおいて６個未満に限定されていた。
【００４０】
検査される異常の数を増すために、タンデム質量分析が採用された。これにより、一滴の血液または少量の血しょう若しくは尿から多数の異常を検査することが可能となった。
【００４１】
新生児の検査のための試料を採取する標準的方法では、踵を少し刺して、全ての採血液を特殊なフィルタ紙またはグスリー・カード(Guthrie cards)上に一連のスポットとして吸収させる（非特許文献１２）。
【００４２】
本発明は、新生児からの踵採血検査のタンデム質量分析に用いることができる内部表運の更なるセットを提供することにより、リソソーム蓄積症の診断を可能とする。これらの内部標準物質はさらに、病気の診断のためにまたは治療効果を観察するために大人からの試料に対しても利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
以下、本発明を、図面を参照しつつ実施例を用いて説明する。
＜実施例＞
本発明は、ファブリー病を観察するためのCTHの合成及びその使用により以下に説明されるが、原理的には、グリコスフィンゴ脂質のリソソーム異化の全過程に対して適用することができる（図２参照）。
【００４４】
＜試料＞
インフォームドコンセントを得た上で、旧型ファブリー病の男性患者と、正常な対照から血しょう及び尿が採取された。
【００４５】
人の赤血球CTH、(Galα(1->4)Galα(1->4)Glc-セラミド、グロボトリアオシルセラミド、GbOse3Cer、Gb3、GL-3またはCTH)が、Sigma(英国ドーセット、プール所在)から取得された。
【００４６】
スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼ及びリソ−CTH（Galα(1->4)Galβ(1->4)Glc-スフィンゴシン）が、米国カリフォルニア所在のCalbiochemから取得された。
【００４７】
全ての化学試薬は、Sigmaから入手した分析用グレードである。
【００４８】
＜C-17CTHの化学合成＞
５０μgのリソ−CTHを、ガラス容器内のN２下で完全に乾燥した後、クロロホルム(１０mg/ml)中の１００μlのヘプタデカン酸無水物(heptadecanoic acid)中に解離させた。３００μlのピリジン(pyridine)を添加した後、この溶液を十分に撹拌し、室温に３０分放置した。余分なピリジンを全て除去するためにN２下で完全に乾燥させた後、クロロホルム(１００mg/ml)中の１００μlのヘプタデカン酸無水物と３００μlのピリジンとを反応混合物へ添加した。これを再び十分に混合して、室温に３０分放置した。反応混合物をＮ２下で乾燥し、非特許文献８に記載の通りにC-18固相抽出カートリッジ(英国ドーセット、プール所在Merck製、LiChrolute)を用いて脱塩した。
【００４９】
＜C-17CTH及び[D4]C16-CTHの酵素合成＞
５０μg(〜５０nmol)の人の赤血球CTHを、２０μlの酢酸ナトリウムの緩衝液中でpH５．０にて、１mUnitのスフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーセと共に、３７°Cで１６時間温置する。この方法は、非特許文献１３に実質的に記載されている。但し、トリトン(Toriton)X-100は、無脂肪酸１％BSA(w/v)により置き換えられる。この反応混合物を凍結乾燥し、５μlのクロロホルム／メタノール(１：２、v/v)中で脂質生成物を抽出した。酵素脱アシル化の程度は、５：４：１のクロロホルム：メタノール：酢酸(１０％）を移動相として用いたシリカゲル・プレート(Shilica Gel 60, Merck製)上のTLCにより判定された。グリコスフィンゴ脂質及びリソ−グリコスフィンゴ脂質は、ヨウ素蒸気により検出され、標準と比較されることにより識別された。リソ−CTHは、TLCプレートから掻き取られ、５００μlのクロロホルム：メタノール(２：１、v/v)による２回洗浄を用いてシリカから回収された。
【００５０】
第２の酵素ステップにおいては、精製された若しくは市販のリソ−CTH(７５nmol)を、２０mlの２５mMリン酸ナトリウム緩衝液中でpH６．５にて、７５nmolのヘプタデカン酸または［D4］-パルミチン酸と２００μUnitのスフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼと共に、３７°Cで２０時間温置する（無脂肪酸１％BSA(w/v)含む）。再アシル化反応の生成物は、上述の通りTLCを用いて解析され、リソ−CTHのCTHへの９０％を超える変換率が観察された。
【００５１】
内部標準物質の大規模な調製においては、反応生成物をC-18固相抽出カートリッジ(Lichrolute、Merck製)を用いて脱塩した。C-18固相抽出カートリッジは、先ず５mlのメタノールで開始され、次に５mlのH２Oが続いた。反応混合物は、このカートリッジへ直接添加され、そして酵素調製中に存在する塩と残留界面活性剤は、３mlのH２O、３mlの６０％メタノール及び３mlの７０％メタノールと共に連続的に行う洗浄により除去された。CTH内部標準物質は、２mlのメタノールに続いて２mlのクロロホルム：メタノール(２：１、v/v)を用いてカラムから抽出された。
【００５２】
＜解析のための血しょうからのCTHの抽出及び調製＞
１μgのCTH内部標準物質を１００μlの血しょうへ添加し、２mlのクロロホルム：メタノール(２：１、v/v)を添加し撹拌器で２０分振動撹拌することにより全脂質が抽出された。沈殿したタンパク質は、３０００g１０分の遠心分離により除去された。クロロホルム：メタノール(２：１、v/v)層は、ガラス容器へ移され、４００μlのH２Oが添加された。このガラス容器はさらに２０分振動撹拌された。２つの層は、１０分の遠心分離により分離された。そしてCTHを含む中性グリコ脂質が含まれている下層を、新たなガラス容器へ移し、N２下で乾燥させた。このCTHは、質量分析に先立ってクロロホルム中での再構成により脱塩され、C-18カラム(LiChrolute)及びアセトン：メタノール(９：１)での溶出によるクロマトグラフィを行った（非特許文献８の通り）。
【００５３】
＜エレクトロスプレイイオン化タンデム質量分析(ESI-MS)＞
グリコ脂質の質量分析は、トリプル・クアドロポーVGクアトロ I装置(triple quadropole VG Quattro I  instrument、英国アルトリンハム所在、MicroMass製)を用いて行った。この装置は、正イオン化モードで操作された。試料は、２５mm(i.d.)溶融シリカ移送ライン経由にてハーバードシリンジポンプ(Harvard syringe pump)を流量２５μl/分で用いてエレクトロスプレー源中へ直接注入された。キャピラリ電圧は、コーン電圧１７３Vと共に３．４３kVに維持された。エレクトロスプレー源の温度は常時８０°Cに保たれ、噴霧ガスとしてN２が流速３０リットル／時で用いられた。全てのCTHアイソフォーム(イソ型)の質量が、質量分析を質量範囲m/z７００〜１３００で走査モードにて操作することにより決定された。生成イオンは、アルゴンガスを衝突ガスとして用いた衝突解離に続いて、質量範囲m/z５０〜１２００で決定された。最適衝突エネルギーは、最適ガスセル圧３．２×１０−３mbarにて７０eVとなるように定められた。データは、m/z１６２．０の中性損失走査を用いて取得され、多チャンネル取得モードで走査されかつ各イオン種のドゥエル時間を１００m秒として操作した。定量解析においては、試料は、エレクトロスプレーイオン源及びCMA/200冷蔵自動サンプラーを用いて質量分析装置中へ注入された。
【００５４】
＜液体二次イオン化タンデム質量分析(LSI-MS)＞
個々のCTHアイソフォーム及び内部標準物質の構造を確認するために、液体二次イオン化源と共に操作するタンデム質量分析装置(LSI-MS)を用いてCTHアイソフォームを解析した。このイオン化モードでは、ESI源を用いては得られないCTHのセラミド主鎖についてのより精密なフラグメンテーションが得られた。そして、各CTHアイソフォーム中のアシル基の最終的な決定を可能とした。グリコ脂質の質量分析は、トリプル・クアドロポールVGクアトロ I装置(英国、アルトリンハム所在、MicroMass製)を用いて行われた。この装置は、LSIMS源(CsI)に適合され、正イオン化モードで加速電圧９kVにて操作した。MS/MS実験は、３０eVの衝突エネルギー及びガスセル圧３．２×１０−３mbar(アルゴン)を用いて行った。
【００５５】
＜結果＞
＜C17-CTHの化学合成及び酵素合成＞
人の赤血球は、アイソフォームの混合からなり、それらはアシル鎖の長さが異なる（図３ａ）。最も多いアイソフォームは、リグノセリン酸(C24：０)とネルボン酸(C24：１)とをこれらの適宜量の水酸化誘導体と共に含む。他の成分は、C24：２の酸、ベヘン酸(C22：０)、及びそのモノ不飽和誘導体(C22：１)並びにパルミチン酸(C16：０)アイソフォームである。スペクトル中のこれらのイオン全ては、モノ−ソディエイティド(mono-sodiated)CTHアイソフォームに帰することができ、このことは、この試料が非常に純粋で新しい標準物質を更正するために用いることができたことを示している。これらのイオンの質量は、スフィンゴシン部分がd-18：１であることを示唆する。スフィンゴシン部分の構造は、LSI-MS質量分析により確認され、それは、スフィンゴシンd-18：１からＨ２Ｏを引いたものに対応する２６４m/zの特徴的なフラグメントイオンを示した。
【００５６】
リソ−CTHに対するESI/MSスペクトルは、８０９．０m/zのイオンが大部分であった。これは、モノ−ソディエイティドGalα(1->4)Galβ(1->4)Glc-スフィンゴシン(d-18)に対応する（図３ｂ）。リソ−CTHのアシル化の生成物についてのESI-MSスペクトルは、１０６０．９m/zの分子イオンをもっており、C-17CTH(CTH d18：１ C17-1H２O)の形式と一致する（図３ｃ）。C17-CTHの構造は、LSI-MSにより確認された(図４)。フラグメンテーションのパターンは、１０３９．３m/z、５３４．３m/z並びに２６４．０m/zのイオンを含んでおり、セラミドCer(d18：１ C17-2H２O)の分子イオン及びその子イオン、並びにスフィンゴシン(d18：１)部分にそれぞれ対応する。
【００５７】
C-17CTHの化学合成における歩留まりは非常に低かった（１〜１０％）ため、C-17CTHを調製するために酵素物質を用いた。最初に、市販の赤血球CTHからスフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼの加水分解活性を用いることによりリソ−CTHを調製した(非特許文献１３)。リソ−CTHはTLCにより反応混合物から精製され、その構造はESI-MA及びLSI-MS/MSの組合せにより確立された。C17-CTHはリソ−CTHから酵素合成され、これは、酵素的に調製されるか市販されたものであり、スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼの逆反応を用いた（非特許文献１４に記載）。C17-CTHは、上述の酵素反応混合物から精製され、ESI/MSにより解析された。そのスペクトルは、化学合成された化合物について得られたものと同じであり（図３ｃ）、その構造は、化学合成された分子と同様にLSI-MSにより確認された。酵素アシル化反応の歩留まりは、TLCによりCTHに対するリソ−CTHの比から９０％を超えると決定された。
【００５８】
＜内部標準物質C-17CTHを用いた血しょう中のCTH測定＞
C-17CTH標準物質は、この標準物質の一定量を、異なる量の真のCTHと混合しその混合物をESI/MSにより解析することにより更正された（図５）。各アイソフォームについて適宜の範囲に亘って、応答比と真のCTH量との間の線形関係が観察された。これによりC-17CTHを、真のCTH異性体の量に関係付けて更正することが可能となる。血しょう中のCTHの濃度を測定すべくCTHC-17CTH標準物質を用いるために、１μgの標準物質を１００μlの血しょうへ添加し、全CTHを抽出し、ESI/MSにより解析した。単一の正常な血しょう試料中のCTHの比較分析（１２回）では、９．９％のばらつき係数が得られた。
【００５９】
この手順は、正常な対照血しょう中のCTH並びに旧型ファブリー病の男性患者からの血しょうを解析するために用いられた（図６）。  図７に示す通り、全ての型のCTHのレベルは、ファブリー病患者からの血しょう中で上昇している。C-16CTHのレベルは、全CTHの約５９％であるが、特に増大していた。このことは、それがこの患者群における結晶中の主要な蓄積生成物であることを示している。全CTH及び個々のアイソフォームのレベルが、m/z１６２．０の中性損失走査により多チャンネル取得モードでの操作で定量的に測定された（図５）。正常血しょう中の全CTHの平均レベルは８．４μg/ml(４．５〜１０．７の範囲、ｎ＝３８)であり、ファブリー病患者の血しょう中では２９．１μg/ml(１５．８〜４４．５の範囲、ｎ＝１３)であった。
【００６０】
＜C-16CTHの測定用の第１タイプ内部標準物質[D4]C-16CTHの酵素合成＞
[D4]C-16CTHはまた、酵素合成手順の第２ステップにおいてヘプタデカン酸を[D4]パルミチン酸に置き換えることにより酵素合成された。[D4]C-16CTHの構造は、C-17CTHと同様にESI-MS及びLSI-MSの組合せにより確認された。内部標準物質として[D4]C-16CTHを用いた単一の正常血しょう試料中のCTHの比較分析では７．９％のばらつき係数が得られ、内部標準物質としてC-17CTHを用いて決定された正常対照参照範囲内の値が得られた。
【００６１】
正常試料またはファブリー病試料中の全血しょうCTHについてのここでの値は、GLCによりまたはヴェロトキシンBを用いたELISA法（非特許文献８）により見出された値、０．９μg/ml(０．３〜１．５の範囲)よりもやや高い。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の第２の形態によるCTH内部標準物質の合成方法を示す図である。
【図２】スフィンゴ脂質のリソソーム異化のための過程を示す図である。
【図３】Ｃ-１７CTHの合成の質量分析を示す図である。
【図４】リソ−CTHのアシル化による生成物の構造を確認するESI/MSスペクトルを示す図である。
【図５】Ｃ-１７CTHの更正を示す図である。
【図６】正常な対照血しょうと、ファブリー病の患者からの血しょうにおけるCTHの解析を示す図である。
【図７】本発明の内部標準物質による内部標準物質を用いた質量分析により決定された、対照とファブリー病患者における全血しょうCTHレベルの差を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月15日(2004.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象のグリコスフィンゴ脂質の濃度の決定のための質量分析における内部標準物質の使用方法において、前記内部標準物質が、
前記測定対象のグリコスフィンゴ脂質と同じオリゴ糖鎖及び長鎖グリコスフィンゴシン塩基と、該測定対象のグリコスフィンゴ脂質とは異なる質量のアシル基とを有し、かつ該測定対象のグリコスフィンゴ脂質と同じ化学的特性のグリコスフィンゴ脂質であることを特徴とする
質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項２】
前記内部標準物質が第１タイプであって、前記アシル基が前記測定対象のグリコスフィンゴ脂質と同じ数の炭素原子を有しかつ同位体でラベル付けされていることを特徴とする
請求項１に記載の質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項３】
前記同位体によるラベル付けが、水素同位体または炭素同位体によることを特徴とする
請求項２に記載の質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項４】
前記グリコスフィンゴ脂質が重水素化されたアシル基または１３Ｃをもつアシル基を有し、天然のグリコスフィンゴ脂質と化学的に同一であると共に質量が異なることにより、質量分析により検知可能であることを特徴とする
請求項３に記載の質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項５】
[D4]C-16CTHを有することを特徴とする
請求項４に記載の質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項６】
前記内部標準物質が第２タイプであって、前記グリコスフィンゴ脂質の前記アシル基が奇数個の炭素原子を有することを特徴とする
請求項１に記載の質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項７】
前記内部標準物質の前記アシル基が、前記測定対象のグリコスフィンゴ脂質のアシル基よりも１つ多いか１つ少ない炭素原子を有することを特徴とする
請求項６に記載の質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項８】
C-15、C-17、C-19、C-21、C-23及びC-25アシルグリコスフィンゴ脂質のうち１または複数を有することを特徴とする
請求項６に記載の質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項９】
C-15CTH、C-17CTH、C-19CTH、C-21CTH、C-23CTH及びC-25CTHのうち１または複数を有することを特徴とする
請求項６に記載の質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項１０】
前記質量分析が、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の質量分析における内部標準物質の使用方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の内部標準物質を用いて質量分析によりグリコスフィンゴ脂質のレベルについて生化学的試料を解析することを特徴とする
リソソーム蓄積症の診断方法。
【請求項１２】
前記生化学試料が、血液、血しょう、組織または尿の試料であることを特徴とする
請求項１１に記載のリソソーム蓄積症の診断方法。
【請求項１３】
前記生化学試料が、新生児の踵からの採血試料であることを特徴とする
請求項１２に記載のリソソーム蓄積症の診断方法。
【請求項１４】
測定対象のグリコスフィンゴ脂質の濃度を決定するために質量分析において用いる内部標準物質において、前記内部標準物質が、
前記測定対象のグリコスフィンゴ脂質と同じオリゴ糖鎖及び長鎖グリコスフィンゴシン塩基と、該測定対象のグリコスフィンゴ脂質とは異なる質量のアシル基とを有し、かつ該測定対象のグリコスフィンゴ脂質と同じ化学的特性のスフィンゴ脂質であることを特徴とする
質量分析に用いる内部標準物質。
【請求項１５】
請求項１４に記載の測定対象のグリコスフィンゴ脂質のための内部標準物質の調製方法において、
質量分析により検出可能なラベルを付けたアシル基を前記測定対象のグリコスフィンゴ脂質のリソ型に対して付加することを特徴とする
内部標準物質の調製方法。
【請求項１６】
前記ラベルを、リソ−グリコスフィンゴ脂質に対して化学的に付加することを特徴とする
請求項１５に記載の内部標準物質の調製方法。
【請求項１７】
前記ラベルを、スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼの逆反応を用いて酵素により前記リソ−グリコスフィンゴ脂質に対して付加することを特徴とする
請求項１５に記載の内部標準物質の調製方法。


【国際調査報告】
2005512061.tif 000010
2005512061.tif 000011
2005512061.tif 000012
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