(57)【要約】親和性作用物質のアレイを作成するための試薬及び方法を開示する。また、親和性作用物質のアレイの使用方法を開示する。アレイは、ハイスループット薬物スクリーニング及び臨床診断用途に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体を提供する工程；
基体を、少なくとも第1及び第2の反応性官能基を有する第1の試薬に、第1の試薬が第1の官能基によって基体と作用的に結合するように接触させて、それによって単分子層を形成する工程；
単分子層との結合のための第1の官能基及び少なくとも第2の官能基を含む第2の試薬を単分子層に結合する工程；及び
抗タンパク質性試薬を単分子層に結合する工程を含む、基体の官能化方法。
【請求項２】
第1の試薬が基体に共有結合する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第1の試薬が、硫黄含有基、シロキサン、ホスフィン、リン酸；ホスホン酸；ヒドロキサム酸、カルボン酸、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される官能基により基体と結合する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第1の試薬が、硫黄含有基、エステル、活性化エステル、マイケル受容体、シロキサン、ハロゲン化シリル、ホスフィン、アミン、アジド、α，β-不飽和ケトン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、チオセミカルバジド、ヒドラジド、アミノオキシ基、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ヒドロキサム酸、及びカルボン酸からなる群より選択される1つ以上の官能基を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第2の試薬が、アルキル化、化学選択的連結、マイケル付加、有機金属反応、付加環化、又はアシル化反応により単分子層に共有結合的に付加される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
第2の試薬が、ホスフィン、アミン、アジド、α，β-不飽和ケトン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、チオセミカルバジド、ヒドラジド、アミノオキシ基、アルデヒド、又はハロゲン化アルキルの1つ以上を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
抗タンパク質性成分が、アルキル化、マイケル、シュタウディンガー連結、有機金属、付加環化、又はアシル化反応により単分子層に共有結合的に付加される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
基体が、金、白金、銀、銅、ガラス、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化タンタル、酸化チタン、酸化インジウムスズ、酸化マグネシウム、アルミナ、石英、シリカ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
基体が貴金属を含み、第1の試薬の第1の官能基が硫黄含有基である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
硫黄含有基がスルフヒドリル基又はジスルフィド基を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
基体がガラス又はケイ素を含み、第1の試薬の第1の官能基がシロキサン又はハロゲン化シリル基を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
第1の試薬の第2の反応性官能基が、1つ以上のアジド、アミン、マレイミド、ホスフィン、アミン、アジド、α，β-不飽和ケトン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、チオセミカルバジド、ヒドラジド、アミノオキシ基、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、カルボキシ、又は活性化エステル基を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
抗タンパク質性試薬が、ポリアルキレンオキシド基、ポリスルホン、多糖、又はホスホコリン基の少なくとも1つを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
抗タンパク質性試薬がポリエチレングリコール基を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
親和性作用物質を第2の試薬の第2の官能基に結合する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
残留している第2の官能基をクエンチする工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
親和性作用物質がタンパク質を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
親和性作用物質を第2の試薬の第2の官能基に結合する工程が共有結合を形成する工程を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
共有結合が、アルキル化、化学選択的連結、マイケル付加、有機金属反応、付加環化、及びアシル化反応からなる群より選択される反応により形成される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
共有結合がシュタウディンガー連結反応により形成される、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
第2の試薬の第2の官能基がビオチン基を含み、親和性作用物質がストレプトアビジンである、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
ビオチン化親和性作用物質をストレプトアビジンに結合する工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
ビオチン化親和性作用物質がビオチン化抗体である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
基体を提供する工程；
基体を反応性官能基及び抗タンパク質性官能基を有する非対称ジスルフィドに接触させ、それによって基体上に単分子層を形成する工程を含む、単分子層の形成方法。
【請求項２５】
非対称ジスルフィドが以下の式を有する、請求項24記載の方法。
2005535898.tif 000012
【請求項２６】
非対称ジスルフィドが以下の式を有する、請求項24記載の方法。
2005535898.tif 000013
【請求項２７】
基体を第2のジスルフィドに接触させ、それによって2つの対応するスルフィドを単分子層に導入する工程をさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
基体；
第1及び第2の末端を有する複数の第1の試薬（第1の試薬の第1の末端は基体と作用的に結合している）；
複数の第2の試薬（第2の試薬の各々は第1及び第2の末端を有し、第2の試薬の第1の末端は第1の試薬の第2の末端と作用的に結合している）；及び
第1の試薬の第2の末端と作用的に結合した第1の末端及び第2の末端を有し、かつ、抗タンパク質性官能基を含む第3の試薬を含む、有機薄膜アレイ。
【請求項２９】
基体が、金、白金、銀、銅、ガラス、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化タンタル、酸化チタン、酸化インジウムスズ、酸化マグネシウム、アルミナ、石英、シリカ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項28記載のアレイ。
【請求項３０】
第1の試薬が基体に共有結合している、請求項28記載のアレイ。
【請求項３１】
第1の試薬が、硫黄含有基、シロキサン、ホスフィン、ヒドロキサム酸、カルボン酸、及びそれらの組み合わせにより基体と結合している、請求項28記載のアレイ。
【請求項３２】
第1の試薬が、金属-リガンド結合、シロキサン結合、又はクーロン相互作用の少なくとも1つを含む少なくとも1つの相互作用により基体と結合している、請求項28記載のアレイ。
【請求項３３】
第2の試薬が第1の試薬に共有結合的に付加している、請求項28記載のアレイ。
【請求項３４】
第2の試薬が、アルキル化、化学選択的連結、マイケル付加、有機金属反応、付加環化、又はアシル化反応により第1の試薬に共有結合的に付加している、請求項33記載のアレイ。
【請求項３５】
第2の試薬がシュタウディンガー連結により第1の試薬に共有結合的に付加している、請求項33記載のアレイ。
【請求項３６】
第2の試薬が、アミド、エーテル、エステル、イミド、スルフィド、又は炭素-炭素結合により第1の試薬に共有結合的に付加している、請求項33記載のアレイ。
【請求項３７】
表面上に形成された個別のアレイ領域のアレイを有する基体；
第1及び第2の末端を有する複数の第1の試薬（第1の試薬の第1の末端は基体と作用的に結合している）；
複数の第2の試薬（第2の試薬の各々は第1及び第2の末端を有し、第2の試薬の第1の末端は第1の試薬の第2の末端と作用的に結合している）を含む、アレイデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、David Quincyの名の下で2002年8月16日に出願された「Biochip Surface Configurations and Methods and Compositions for Making the Same」と題する米国仮出願第60/403,971号（参照として本明細書に組み入れられる）の恩典を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、基体上に生物活性化合物のアレイを作成するための表面官能化のためのあるクラスの試薬及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
疾患状態の包括的な理解には、特定の疾患経路に関与するすべてのタンパク質の同定及び特性決定が要求される。タンパク質及びその相互作用についてのこの研究は、「プロテオミクス」と称される。分子生物学の進展により、現在の技術によってタンパク質の特性を決定できることより早く対象タンパク質を生成することができる。例えば、プロテオミクスの適用における慣用的なタンパク質同定方法は、タンパク質を単離するための二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）技術に続いて、次の質量分析による同定に依る。典型的には、2D-PAGEは、5000個もの異なるタンパク質を分離することができる。しかし、各タンパク質の同定は、個々の分離されたタンパク質の各々をポリアクリルアミドゲルから切断することを必要とする冗長な手間のかかるプロセスである。さらに、この方法は比較的感度が低い。例えば、銀染色を用いた場合、検出限界は約1ナノグラムのタンパク質である。
【０００４】
2D-PAGEのさらなる欠点には、再現性がないこと、スループットが低いこと、分解能が低いこと、及び感度がタンパク質に依存していることが含まれる。例えば、2D-PAGEは、一般的に、混合物中に存在するすべてのタンパク質を分解せず、2日間でわずかなゲル処理に系が限定される。さらに、高分子量、低分子量、及び膜結合タンパク質が実際より少なく示される。
【０００５】
タンパク質のハイスループット特性決定のためにタンパク質アレイを使用する試みがなされてきた。例えば、Wagnerらの米国特許第6,406,921号はタンパク質でコーティングされた基体の作成方法を開示し、Bamdadらの米国特許第5,620,850号は、金属イオンを結合するのに用いることができる複数のキレート化剤を含む表面の作成方法を開示している。次いで、結合した金属イオンを用いて生物分子（キレート化剤も含む）を捕捉すると報告されている。
【０００６】
正確かつ再現性あるスクリーニング結果を生ずる高品質のタンパク質アレイを提供するためには、多数の困難を克服しなければならない。典型的には、タンパク質は、水和状態に維持され、かつ、周囲温度で保持されなければならず、さらに支持材料の物理的及び化学的な特性に対して非常に感度が高い。したがって、液体-固体界面でタンパク質活性を維持するには、タンパク質の環境に対する感度に対処する、アレイの組み立ての新たな戦略が必要となる。
【発明の開示】
【０００７】
概要
小さな分子、ペプチド、タンパク質、核酸、及び他の生物活性分子などの親和性作用物質で誘導体化された基体を調製するための試薬及びそのような試薬の使用方法を本明細書中に開示する。本明細書中に開示される通り、最小かつ非特異的な結合を示す高密度で充填された親和性作用物質アレイを調製することができる。
【０００８】
方法の一態様では、少なくとも2つの反応性官能基を有する試薬で基体を官能化する。第1の反応性官能基は、試薬を基体にカップリングするために作用し、第2の反応性官能基は、親和性作用物質であるか、あるいは親和性作用物質を作用的に（operatively）結合するための部位を提供する。
【０００９】
方法の第2の態様では、アレイへの非特異的タンパク質付着を、そのような非特異的タンパク質付着を減少させる抗タンパク質性（protein resistant）成分の導入によって減少させる。したがって、一態様では、本開示は、減少した非特異的な結合を示す親和性作用物質のアレイを組み立てるための試薬及び技術を提供する。
【００１０】
詳細な説明
本発明の化合物、組成物、及び方法をより良く記載し、かつ、本発明の開示を実施するに際して当業者に指針を示すために、用語及び方法について以下の説明を提供する。本開示で用いられる用語は、特定の態様及び具体例のみを記載することが目的であり、限定することを意図していない。
【００１１】
A.  定義
本明細書中で用いられる「基体」との用語は、本明細書中に開示されるアレイ及びデバイスで用いられる本体、すなわち基礎材料をいう。
【００１２】
「アレイ」とは、二次元分布又はパターンをいう。
【００１３】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」との用語は、アミノ酸ポリマーをいうために互換可能的に用いられる。
【００１４】
「抗体」との用語は、天然の又は完全に若しくは部分的に合成により生成された免疫グロブリンを意味する。特異的な結合能力を維持するそのすべての誘導体が、上記用語に含まれる。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同な又はほぼ相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。これらのタンパク質は、天然供給源に由来することもできるし、あるいは部分的に又は完全に合成により生成することもできる。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであることができる。代表的な態様では、抗体は、グリコシル化抗体である。抗体は、ヒトクラス:IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEのいずれをも含む任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであることができる。代表的な態様では、抗体はIgGクラスである。
【００１５】
「抗体フラグメント」との用語は、全長より短い抗体の任意の誘導体をいう。代表的な態様では、抗体フラグメントは全長抗体の特異的な結合能力の少なくとも有意な部分を保持する。抗体フラグメントの具体例には、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv二重特異性抗体（diabody）、及びFdフラグメントが含まれるが、限定するものではない。抗体フラグメントは、任意の手段により生成することができる。例えば、抗体フラグメントは、完全な状態の抗体の断片化により酵素的又は化学的に生成することもできるし、抗体の部分配列をコードする遺伝子から組換えにより生成することもできる。または、抗体フラグメントは、完全に又は部分的に合成により生成することができる。抗体フラグメントは、場合によっては、単一の鎖抗体フラグメントである。または、フラグメントは、例えばジスルフィド結合により連結されている多数の鎖を含むことができる。フラグメントは、場合によっては、多分子複合体であることもできる。機能性抗体フラグメントは、典型的には少なくとも約50個のアミノ酸を含み、より典型的には少なくとも約200個のアミノ酸を含む。一本鎖Fvs（scFvs）は、ポリペプチドリンカーにより互いに共有結合している可変軽鎖（VL）及び可変重鎖（VH）のみからなる組換え抗体フラグメントである。VL又はVHのいずれがNH2末端ドメインであってもよい。ポリペプチドリンカーは、2つの可変ドメインが深刻な立体障害なしに架橋される限り、種々の長さ及び組成であることができる。典型的には、リンカーは、可溶性のために散在しているいくつかのグルタミン酸又はリシン残基を有するグリシン及びセリン残基のストレッチから主になる。
【００１６】
Fvフラグメントは、非共有結合的な相互作用によって一体的に保持されている1つのVH及び1つのVLドメインからなる抗体フラグメントである。本明細書中で用いられる「dsFv」との用語は、VH-VLペアを安定するために工学操作が施された分子間ジスルフィド結合を有するFvをいう。
【００１７】
F（ab'）2フラグメントは、pH4.0〜4.5において酵素ペプシンにより消化することによって免疫グロブリン（典型的にはIgG）から得られるフラグメントと本質的に同等である抗体フラグメントである。フラグメントは、組換えにより生成することができる。
【００１８】
Fab'フラグメントは、F（ab'）2フラグメント中の2つの重鎖片を繋いでいるジスルフィド架橋の還元から得られるフラグメントと本質的に同等である抗体フラグメントである。Fab'フラグメントは、組換えにより生成することができる。
【００１９】
Fabフラグメントは、酵素パパインによる免疫グロブリン（典型的にはIgG）の消化から得られるフラグメントと本質的に同等である抗体フラグメントである。Fabフラグメントは、組換えにより生成することができる。
【００２０】
「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸及び「非天然の」アミノ酸の双方をいう。アミノ酸残基もアミノ酸との用語に包含される。
【００２１】
「有機薄膜」は、基体上に直接形成された、又は基体上のコーティング上に形成された有機分子の薄層をいう。典型的には、本明細書中に開示される有機薄膜は、約0.5nm〜約50nmの厚さ、より典型的には約0.5nm〜約10nmの厚さである。有機薄膜は、基体への付着の前に組み立てることもできるが、典型的には、成分分子が基体に付着されるときに組み立てられる。有機薄膜は、場合によっては、結合した無機イオン及び薄膜に結合したキレート化金属を含む。有機薄膜は、均一又は不均一であることができ、1つ以上の単分子層からなることができる。複数の単分子層からなる薄膜の例は、脂質二重層である。しかし、典型的には、有機薄膜は単分子層である。場合によっては、有機薄膜は、2つ以上のタイプの有機薄膜を含むことができる。
【００２２】
典型的には、本明細書中に開示される有機薄膜は、親和性作用物質を薄膜に共有的又は非共有的に結合するのに好適な親和性作用物質又は官能基を含む。有機薄膜は、場合によっては、薄膜との分子の結合を減少させる官能基を有することもできる。典型的には、そのような官能基は、一般的にはタンパク質が堅く結合しないポリエチレングリコール（PEG）及びポリプロピレングリコール（PPG）を含むポリアルキレンオキシドなどの親水性基である。PEG及びPPGはそれぞれ、エチレングリコール及びプロピレングリコールのオリゴマーを含む。したがって、本明細書中で用いられるPEG及びPPGは、わずか2つのグリコールサブユニットを有するポリマーをいう。実施態様では、有機薄膜へのタンパク質の非特異的な結合を減じるため、PEGを有機薄膜の抗タンパク質性成分として用いた。いくつかの実施例では、用いたPEG成分は単分散していなかったので、言及したエチレングリコール単位の特定の数はPEG単位の多分散混合物を用いたときの平均の数をもいうことができる。有機薄膜の他の官能基は、薄膜を基体の表面又は基体上のコーティングに繋ぎとめるように作用する。
【００２３】
「単分子層」との用語は、有機薄膜又はその部分であることができる一分子の厚さを有する層をいう。単分子層は、規則正しいものであってもよいし、規則正しいものでなくてもよい。典型的には、単分子層は、規則正しく、高密度で充填されている。単分子層は、均一又は不均一であることができるが、単分子層の一方の面は、基体の表面又は基体上のコーティングに化学吸着又は物理吸着することができる官能基を含む。
【００２４】
第1の単分子層を第2の単分子層に変換することもできる。例えば、基体に化学吸着又は物理吸着している第1の末端を有する第1の単分子層中の成分分子を、1つ以上の第2の分子を第1の単分子層成分分子の複数の第2の末端に共有結合することにより官能化し、それによって第1の単分子層を新しい第2の単分子層に変換することができる。
【００２５】
B.  親和性作用物質のアレイ
本開示は、親和性作用物質のアレイ並びにそのようなアレイの作成及び使用方法に関する。典型的には、アレイは、親和性作用物質と対象の可溶性分子との相互作用の特性を決定をするために用いることができる親和性作用物質の二次元ディスプレイを形成する。
【００２６】
したがって、一態様では、開示した官能化された基体を親和性作用物質によってさらに官能化する。親和性作用物質は、官能化された基体に結合することができ、かつ、対象分子と共有的に又は非共有的に相互作用する任意の作用物質であることができる。典型的には、親和性作用物質は、対象の可溶性分子と結合又は相互作用する小さな分子、オリゴヌクレオチド、ペプチド、又はタンパク質である。同様に、対象の可溶性分子又は分析対象物は、小さな分子、オリゴヌクレオチド、ペプチド、又はタンパク質であることができる。親和性作用物質及び分析対象物の間の相互作用は任意の好適な方法により検出することができ、実施態様では、紫外及び可視吸収、化学発光、及び蛍光（寿命、偏光、蛍光相関分光法（FCS）、及び蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）を含む）を含む光学検出方法などの方法を用いた。
【００２７】
一態様では、親和性作用物質のアレイは、基体、基体表面の少なくとも一部分上に形成され、かつ、下にある有機薄膜に作用的に結合した（例えば、共有的に又は非共有的に結合した）少なくとも1つの親和性作用物質の複数のコピーを含む有機薄膜を含む。
【００２８】
一般的に、複数のタイプの親和性作用物質を同じアレイで用いる場合、異なるタイプの親和性作用物質を「パッチ」においてグループ分けして、アレイのあるパッチ中に局在している親和性作用物質が別のパッチ中に局在している親和性作用物質と異なるようにする。一態様では、本発明は、基体、基体表面のいくらかの又はすべての上の少なくとも1つの有機薄膜、及び有機薄膜により覆われている基体表面部分の上の個別の既知領域中に配置された複数のパッチ（パッチは各々、下にある有機薄膜上に固定化されたタンパク質を含む）を含む、糖タンパク質のアレイを提供する。アレイは、場合によっては、基体とコーティングとの間に中間層を含有する。
【００２９】
ほとんどの場合、アレイは少なくとも約10個のパッチを含む。代表的な態様では、アレイは少なくとも約50個のパッチを含む。別の代表的な態様では、アレイは少なくとも約100個のパッチを含む。代表的な代替の態様では、親和性作用物質のアレイは、103個、104個又は105個を超える数のパッチを含むことができる。
【００３０】
代表的な態様では、各々のパッチにより覆われる基体の表面積は約0.25mm2以下である。別の代表的な態様では、各々のパッチにより覆われる基体表面積は約1μm2及び約10,000μm2の間のである。別の代表的な態様では、各パッチは約100μm2〜約2,500μm2の基体表面積を覆う。代替の態様では、アレイ上のパッチはわずか約2,500nm2の基体表面積を覆うことができるが、そのような小さなサイズのパッチは、アレイが有用であるためには一般的に必要ではない。
【００３１】
アレイのパッチは、任意の幾何学的な形であることができる。例えば、パッチは矩形又は円形であることができる。アレイのパッチは不規則な形であることもできる。
【００３２】
アレイのパッチを分ける距離は変動することができる。例えば、アレイのパッチは隣のパッチから約1μm〜約500μm離れている。パッチが約10μmより大きい寸法を有する場合、典型的には、パッチを分ける距離はアレイ上のパッチの直径又は側辺の長さにほぼ比例する。パッチサイズがより小さい場合、パッチを分ける距離は典型的にはパッチの寸法よりも大きい。
【００３３】
アレイの代表的な態様では、アレイのパッチは、基体表面上の約1cm2以下の面積内にすべて含まれる。したがって、アレイの代表的な一態様では、アレイは、基体の表面上の約1cm2以下の総面積内に100個以上のパッチを含む。または、代表的なアレイは、約1cm2以下の総面積内に103個以上のパッチを含む。代表的なアレイは、さらに場合によっては、基体表面上の約1cm2以下の面積内に104個又は105個以上のパッチを含むことできる。本発明の他の態様では、アレイのすべてのパッチが基体表面上の約1cm2以下の面積内に含まれる。
【００３４】
一態様では、たった1つのタイプの親和性作用物質をアレイの各パッチ上に固定化する。アレイの代表的な態様では、あるパッチ上に固定化された親和性作用物質は、同じアレイの第2のパッチ上で固定化された親和性作用物質と異なる。そのような態様では、複数の異なる親和性作用物質がアレイの別々のパッチ上に存在することができる。別の態様では、単一のパッチが、同じ分析対象物に結合する2つ以上の親和性作用物質を含む。そのような親和性作用物質は、典型的には分析対象物の異なるエピトープに結合する。この態様で用いることができる１つのクラスの親和性作用物質は、ポリクローナル抗体である。
【００３５】
典型的には、アレイは少なくとも約10個の異なる親和性作用物質を含む。代表的な態様では、アレイは少なくとも約50個の異なる親和性作用物質を含む。別の代表的な態様では、アレイは少なくとも約100個の異なる親和性作用物質を含む。代替の代表的なアレイは、約103個より多くの異なる親和性作用物質又は約104個より多くの異なる親和性作用物質を含む。アレイは、さらに場合によっては、約105個より多くの異なる親和性作用物質を含む。
【００３６】
アレイの一態様では、アレイのパッチの各々が異なる親和性作用物質を含有する。例えば、約100個のパッチを含むアレイは約100個の異なる親和性作用物質を含むことができるであろう。同様に、約10,000個パッチのアレイは約10,000個の異なる親和性作用物質を含むことができるであろう。しかし、代替の態様では、各々の異なる親和性作用物質がアレイ上の1つ以上の別々のパッチ上に固定化される。例えば、各々の異なる親和性作用物質が、場合によっては、2〜6個の異なるパッチ上に存在することができる。したがって、アレイは、約3000個の親和性作用物質のパッチを含むことができるが、各々異なる作用物質が3個の異なるパッチ上に存在するので、約1000個の異なる親和性作用物質を含むだけである。
【００３７】
別の態様では、あるパッチの親和性作用物質は別のパッチの親和性作用物質とは異なるが、親和性作用物質は関連している。代表的な態様では、2つの異なる親和性作用物質は、同じタンパク質ファミリーのメンバーである。アレイ上の異なるタンパク質は、機能的に関連しているか、ある機能的に関連していると考えることができる。しかし、本発明のアレイの別の態様では、固定化されるタンパク質の機能は既知でなくてもよい。この場合、アレイの異なるパッチ上の異なる糖タンパク質は、典型的には、構造又は配列における類似性を共有しているか、あるいは構造又は配列における類似性を共有していると思われる。または、固定化されるタンパク質は、タンパク質ファミリーの異なるメンバーのフラグメントであることができる。
【００３８】
基体上の有機薄膜と作用的に結合することができる任意の親和性作用物質を開示したアレイ中で用いることができる。異なる親和性作用物質のクラスには、小さな分子、ペプチド、タンパク質、並びにDNA及びRNAを含む核酸が含まれるが、限定するものではない。場合によっては、アレイは異なるクラスの異なる親和性作用物質を含むことができる。
【００３９】
タンパク質を親和性作用物質として選択する場合、タンパク質は、受容体ファミリー（その例には、成長因子受容体、カテコールアミン受容体、アミノ酸誘導体受容体、サイトカイン受容体、及びレクチンが含まれる）；リガンドファミリー（その例には、サイトカイン及びセルピンが含まれる）；酵素ファミリー（その例には、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ras様GTPase、及びヒドロラーゼが含まれる）；及び転写因子（その具体例には、ステロイドホルモン受容体、熱ショック転写因子、亜鉛フィンガータンパク質、ロイシンジッパータンパク質、及びホメオドメインタンパク質が含まれる）などのタンパク質ファミリーのメンバーであることができる。一態様では、異なる固定化タンパク質はすべて、HIVプロテアーゼ又はC型肝炎ウイルス（HCV）プロテアーゼである。別の態様では、アレイ上の結合したタンパク質はすべて、ホルモン受容体、神経伝達物質受容体、細胞外マトリクス受容体、抗体、DNA-結合タンパク質、細胞内情報伝達調節因子及びエフェクター、アポトーシス関連因子、DNA合成因子、DNA修復因子、DNA組換え因子、又は細胞表面抗原である。
【００４０】
抗体及び抗体フラグメントは、開示されたアレイでの使用に特に有用な親和性作用物質である。抗体は、場合によっては、ポリクローナル又はモノクローナル抗体であることができる。標準的なハイブリドーマ技術を用いてタンパク質標的を含む特異的な標的に結合する抗体の産生及び単離は、当業者に既知である。さらに、多数の抗体が市販されている。または、抗体又は抗体フラグメントをバクテリオファージ中で発現することができる。バクテリオファージ選択方法を含むそのような抗体ファージディスプレイ技術は当業者に周知である。
【００４１】
C.  親和性作用物質のアレイを調製するための試薬及び技術
一態様では、本開示は、親和性作用物質のアレイの組み立てのための試薬及び技術を提供する。方法の一態様によれば、第1のヘテロ二官能性試薬を共有的に又は非共有的に基体と結合させ、それによって単分子層を形成する。第2のヘテロ二官能性試薬を単分子層にカップリングして反応性官能基のアレイを提供し、抗タンパク質性成分を含む第3の試薬を単分子層にカップリングすることにより、反応性官能基を含む有機薄膜が3つの試薬により形成される。親和性作用物質を有機薄膜にカップリングし、それによって親和性作用物質が有機薄膜に作用的にカップリングされた親和性作用物質アレイを形成することができるような反応性官能基を選択する。カップリングは、親和性作用物質を共有的に又は非共有的に結合することを伴う。非共有的な結合では、クーロン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、及び疎水性相互作用の1つ以上を用いることができるが、限定するものではない。
【００４２】
一態様では、親和性作用物質は、化学選択的連結反応により有機薄膜にカップリングされる。化学選択的連結反応は、一般的には、存在する他の官能基（特に多くの生物分子に見出される官能基）に対して直交型反応性（orthogonal reactivity）を有する官能基の間の反応をいう。したがって、化学選択的連結反応は、親和性作用物質が生物分子であるときに特に有用である。典型的には、生物分子とともに用いられる化学選択的連結反応では、1つ以上の非ネイティブな官能基を用いて反応がネイティブな官能基に対し直交であることを確実なものとする。化学選択的連結反応の一具体例は、シュタウディンガー連結である。その他の例は、ケトン及びアルデヒドの反応（ヒドラジド又はアミノオキシ化合物とケトン又はアルデヒドとを縮合して対応するヒドラゾン又はオキシムを生成することなど）を含む。別の例は、チオカルボキシレートとα-ハロカルボニル化合物と反応させてチオエステルを得る反応である。これらの反応型を用いて、生物分子以外の化合物を有機薄膜に付着することもできる。
【００４３】
本明細書中に開示される代表的な方法では、シュタウディンガー連結反応を用いて試薬又は親和性作用物質を有機薄膜に結合する。シュタウディンガー連結は、アミド結合形成反応として機能し、典型的には2つの反応性成分が関与する（第１のものは、典型的には、式Y-Z-PR2R3を有する（式中、ZはR1で置換されたアリール基であり、ここで、R1はPR2R3に対してアリール環上のオルト位であることが好ましい；ここで、R1は、アザ-イリド基をトラップする（例えば、安定化する）ための求電子性基（カルボン酸、エステル（例えば、アルキルエステル（例えば、低級アルキルエステル、ベンジルエステル）、アリールエステル、置換アリールエステル）、アルデヒド、アミド、例えば、アルキルアミド（例えば、低級アルキルアミド）、アリールアミド、ハロゲン化アルキル（例えば、ハロゲン化低級アルキル）、チオエステル、スルホニルエステル、アルキルケトン（例えば、低級アルキルケトン）、アリールケトン、置換アリールケトン、ハロスルホニル、ニトリル、ニトロなどを含むが、必ずしも限定するものではない）であり；R2及びR3は、一般的には、アリール基（置換アリール基又はシクロアルキル基（例えば、シクロヘキシル基）を含む）であり、ここで、R2及びR3は同じでも異なっていてもよく、同じであることが好ましい；Yは、H、抗タンパク質性基、親和性作用物質又は対象分子の共有的な付着を容易にする反応性基であり、ここで、Yはアリール基上の任意の位置（例えば、パラ、メタ、オルト）に在ることができ；ここで、代表的な反応性基には、カルボキル、アミン（例えば、アルキルアミン（例えば、低級アルキルアミン）、アリールアミン）、エステル（例えば、アルキルエステル（例えば、低級アルキルエステル、ベンジルエステル）、アリールエステル、置換アリールエステル）、チオエステル、ハロゲン化スルホニル、アルコール、チオール、スクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、ヨードアセトアミド、マレイミド、ヒドラジンなどが含まれるが、必ずしも限定するものではない）。代表的な親和性作用物質には、染料（例えば、フルオレセイン又は修飾フルオレセインなど）、抗体、毒素（細胞毒素を含む）、リンカー、ペプチドなどがさらに含まれる。代表的かつ好ましい、工学操作が施されたホスフィン反応体は、2-ジフェニルホルファニル-安息香酸メチルエステルである。
【００４４】
第2の試薬はアジドを含む。アジドを含み、本発明の使用に好適な分子及び本発明の使用に好適なアジド含有分子の生成方法は、当業者に周知である
【００４５】
一実施態様では、2-ジフェニルホルファニル-安息香酸メチルエステル誘導体を含む単分子層を金基体上で調製した。この態様によれば、第1の試薬である11-チオ-ウンデカンイオニック-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（11-thio-undecanionic-N-hydroxysuccinimide ester）をスルフヒドリル基を介して基体に結合した。第2の単分子層がアジド部分を含有する親和性作用物質のカップリングに好適である場合、得られた単分子層を化合物25で誘導体化し、それによって第1の単層から第2の単分子層を形成した。次いで、シュタウディンガー連結により、蛍光標識したアジドアラニン含有ペプチドを第2の単分子層とカップリングした。
2005535898.tif 000002
【００４６】
方法の別の態様では、生物分子のネイティブな官能基を用いてこれを有機薄膜に付着させる。例えば、1つ以上のシステイン残基を有するタンパク質をα-ハロカルボニル化合物などの試薬により選択的にアルキル化することができる。α-ハロカルボニル化合物を薄膜と結合させる場合、これはある種のタンパク質を薄膜に結合するのに有用な反応であることができる。
【００４７】
並列的な方法で、天然又は非天然アミノ酸をペプチド又はタンパク質に導入して、タンパク質を有機薄膜に結合するための官能基を提供することができる。例えば、先に論じた通り、実施態様では、アジド含有アミノ酸をペプチドに導入し、次いでそのペプチドをシュタウディンガー連結プロトコルにより有機薄膜に付着させる。
【００４８】
一態様では、ニッケル、コバルト、鉄、及び銅などの金属をキレート化するN-ニトリロ三酢酸（NTA）誘導体又はイミド二酢酸（IDA）誘導体などのキレート剤で基体を官能化する。そのような誘導体を用いて、ヒスチジン標識したタンパク質を、例えば基体結合キレート化剤（NTA又はIDA誘導体など）及びヒスチジン標識の双方による相互ニッケルキレート化により、基体に非共有結合させる。ヒスチジン標識を有するタンパク質は当業者に既知である。Hochuli, et al., Biotechnology, 1988, 6, 1321を参照されたい。親和性作用物質を付着させるこの方法の別の態様では、最初の非共有的な結合に続いて、親和性作用物質と基体結合有機薄膜との間で共有結合を形成することができる。これは、例えば、アリールアジド、特にハロアリールアジド、例えば、ペンタフルオロフェニルアリールアジド、ベンゾフェノン、ジアゾ化合物、特にジアゾピルベートなどの光活性化可能な基を用いることにより達成することができる。さらなる好適な光活性化可能な基は、Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, 1996（参照として本明細書に組み入れられる）により教示されている。
【００４９】
第2の例において、第1の親和性作用物質は、多価タンパク質であり、基体結合有機薄膜と結合させる。すると、第1の親和性作用物質が、第1の親和性作用物質への結合のための部分及び対象分子と相互作用するための部分を有する第2の親和性作用物質のための付着部位として作用する。具体的な例において、第1の親和性作用物質は、基体結合有機薄膜上に提示されたビオチン誘導体を介して基体に結合したストレプトアビジンであり、第2の親和性作用物質は、ビオチン共役分子である。その場合、ストレプトアビジンは複数のビオチン結合部位を有するので、ビオチン共役分子はストレプトアビジンを介して有機薄膜に結合する。
【００５０】
方法の一態様は、1つ以上の場合によっては実施される「クエンチ」工程を含む。典型的には、クエンチ工程は、有機薄膜と結合している反応性官能基を不活性化するために実施される。実施態様では、システインを用いて薄膜と結合しているチオール反応性官能基をクエンチした。他の実施態様では、グリシンを用いて薄膜と結合しているアミノ反応性官能基をクエンチした。好適なクエンチ剤及び手順を当業者に既知である通りにして選択することができるが、典型的には、試薬又は親和性作用物質を有機薄膜に結合するのに用いられる官能基と同様の反応性を有する官能基を有するようなクエンチ試薬を選択することができる。
【００５１】
親和性作用物質のアレイの一態様では、特異的に配向した固定化抗体のアレイを提供する。抗体は、ビオチン分子を抗体に共役することにより固定化される。一例では、まず抗体グリコシル部分上のビシナルジオール官能基を酸化させて対応するアルデヒドを形成することにより、抗体をビオチン分子に共役させる。グリコシル部分のアルデヒドを、アミノオキシ基で官能化されたビオチン分子と反応させる。この反応によって、オキシム結合を介して共有結合した抗体-ビオチン化合物が生ずる。最後に、抗体-ビオチン化合物を、ストレプトアビジン化合物を含む有機薄膜に固定化する。
【００５２】
単分子層の組み立て及び有機薄膜への親和性試薬の共役に有用なさらなる試薬及び官能基は、Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, 1996（参照として本明細書に組み入れられる）に開示されたものから選択することができる。
【００５３】
基体を誘導体化するための開示した一態様を図1に示す。図1を参照にして、基体2を、少なくとも2つの官能基X及びYを有する試薬4で官能化する。
【００５４】
本明細書中に開示されるアレイを形成するために基体2として有用な材料のクラスには、無機材料、金属、及び有機ポリマーが含まれる。無機材料の例には、ケイ素、シリカ、石英、ガラス、多孔度制御ガラス(controlled pore glass)、炭素、アルミナ、酸化チタン、酸化タンタル、酸化インジウムスズ、ゲルマニウム、窒化ケイ素、ヒ化ガリウム、ゼオライト、マイカ、及びそれらの組み合わせが含まれる。有用な金属には、アルミニウム、銅、金、白金、チタン、それらのアロイ、及びそれらの組み合わせが含まれる。有用なポリマーの例には、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリビニルエチレン、ポリスチレン、ポリ（テトラ）フルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリビニルフェノール、ポリオキシメチレン、ポリメタクリルアミド、ポリイミド、及びそのような材料のコポリマーが含まれるが、限定するものではない。場合によっては、典型的には先に列記したものから選択される1つ以上の異なる材料で基体をコーティングする。例えば、コーティングは場合によっては金属フィルムであることができる。可能な金属フィルムには、アルミニウム、クロム、チタン、タンタル、ニッケル、ステンレス鋼、亜鉛、鉛、鉄、銅、マグネシウム、マンガン、カドミウム、タングステン、コバルト、及びそれらのアロイ又は酸化物が含まれる。代表的な態様では、金属フィルムは貴金属フィルムである。コーティングのために用いることができる貴金属には、金、白金、銀、及び銅が含まれるが、限定するものではない。電子ビーム又はイオンビーム蒸着を用いて、基体表面上に金の薄いコーティングを付与することができる。別の代表的な態様では、コーティングは貴金属のアロイを含む。金属フィルムは、約50nm〜約1,000nmの範囲の厚さを有し、より具体的には約100nm〜約500nmの厚さを有する。代替の態様では、コーティングは、ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化チタン、酸化タンタル、窒化ケイ素、水素化ケイ素、酸化インジウムスズ、酸化マグネシウム、アルミナ、ガラス、ヒドロキシル化表面、及びポリマーを含むことができる。
【００５５】
Xは、基体2上で試薬4の化学吸着又は物理吸着を生じさせ、それによって単分子層を形成させる任意の基であることができる。Xは、典型的には、基体2と化学的に反応する基であり、したがって、Xは、基体材料と適合するように選択される。例えば、基体が、酸化ケイ素、酸化インジウムスズ、酸化マグネシウム、アルミナ、石英、ガラスなどの酸化物であるか、あるいは酸化された表面層を有するケイ素又はアルミニウムなどの材料である場合、シラン及びシロキサンが基体の官能化に有用な基である。例えば、ハロシラン（モノハロシラン、ジハロシラン、及びトリハロシランを含む）を用いて、試薬をそのような基体に付着することができる。官能基を基体に付着するために用いることができる有用なシロキサンには、モノアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、及びトリアルコキシシランが含まれる。実施態様では、基体2が酸化ケイ素である場合、Xはトリエトキシシロキサンなどのシロキサンであった。
【００５６】
金属基体又は基体上の金属コーティングを誘導体化するために好適なX基の例には、硫黄含有化合物（チオール、チオエーテル（スルフィド）、イソチオシアネート、キサンタネート（xanthanates）、チオ酸、チオカルバメート、ジスルフィド（対称及び非対称ジスルフィドを含む）、ジチオ酸（対称及び非対称ジチオ酸を含む）、及び硫黄含有複素環など）；セレン含有分子（セレノール、セレン化物、及び二セレン化物（対称及び非対称ジセレン化物を含む）など）；窒素含有化合物（第1級、第2級、及びおそらく第3級アミン、アミノオキシド、ピリジン、イソシアネート、イソニトリル、ニトリル、及びヒドロキサム酸など）；リン含有化合物（ホスフィンなど）；及び酸素含有化合物（カルボキレート）、ヒドロキシル含有化合物（アルコールなど）、及びそれらの混合物を含む。
【００５７】
硫黄含有化合物が、銀、金、及び白金表面を官能化するために特に有用である。基体が銀、金、又は白金などの金属であるとき、チオール及びジスルフィドが、基体を官能化するための好ましい試薬である。実施態様では、チオール及びジスルフィドを用いて種々の試薬を金表面に付着した。
【００５８】
他の態様では、基体表面（又はその上のコーティング）は、酸化チタン、酸化タンタル、酸化インジウムスズ、酸化マグネシウム、又はアルミナなどの金属酸化物からなり、Xはカルボン酸である。または、デバイスの基体表面（又はその上のコーティング）が銅である場合、Xは典型的にはヒドロキサム酸である。
【００５９】
本発明で用いる基体がポリマーである場合、多くの場合、銅コーティングなどの基体上のコーティングがデバイス中に含まれる。次いで、コーティングのための適切な官能基Xをデバイスでの使用のために選択する。ポリマーの基体を含む代替の態様では、単分子層形成のため望ましい表面官能基を露出させるためにポリマーの表面をプラズマ改質することができる。例えば、欧州特許公開公報第780423号は、プラズマ曝露面上にアルケンX官能基を有する単分子層分子の使用を記載している。ポリマーからなる本発明のデバイスのためのさらなる別の可能性は、単分子層が形成されたポリマー表面を、適切に官能化された前駆体分子の共重合によって官能化することである。
【００６０】
別の可能性は、単分子層への導入前に、Xは、フリーラジカル生成又はフリーラジカル活性化部分であることができる。そのような官能基は、単分子層が形成された表面が水素化ケイ素表面である場合に特に適切である。可能なフリーラジカル生成部分には、過酸化ジアシル、過酸化物、及びアゾ化合物が含まれるが、限定するものではない。または、非置換アルケン（特にα,β-不飽和ケトン）、アルキン、シアノ化合物、及びイソニトリル化合物などの不飽和部分を、特にXとの反応が紫外線、赤外線、可視光線、又はマイクロ波照射を伴う場合に、フリーラジカル活性化部分としてＸに用いることができる。
【００６１】
代替の態様では、Xは、ビニル、スルホニル、ホスホリル、又は水素化ケイ素基であることができる。
【００６２】
試薬4中の基X及びYの間のリンカー基は、任意の好適な化学的に適合性のスペーサー基であることができる。一態様では、リンカー基は、単分子層6への試薬4の自己集合を促進するように及び／又は確実に単分子層が規則正しくなり、かつ、高密度で充填されるように選択される。Laibinis, et al. Science 1989, 245, 845 and Ulman, An Introduction to Ultrathin Organic Films: From Langmuir-Blodgett to Self-Assembly, Academic Press (1991)に記載されている通り、自己集合に寄与する因子は当業者に既知である。
【００６３】
典型的には、官能基X及びYの間の試薬4中のリンカー基は、場合によっては分枝状及び／又は酸素などのヘテロ原子を含む炭化水素鎖である。リンカー基が炭化水素鎖である場合、基は典型的には2〜約22個の炭素原子を含む。したがって、本明細書中で用いられる「炭化水素鎖」との用語は、典型的には、2〜約22個の炭素原子を典型的には含む炭素原子鎖をいう。鎖は、脂肪族及びアリール基を含むことができ、直鎖状、分枝鎖状、及び／又は環式の基を含むことができる。一実施態様では、X及びYの間のリンカー基を3炭素鎖であり、別の実施態様では、リンカー基は炭素11個の非分枝状炭化水素鎖であった。
【００６４】
一態様では、単分子層分子の性質に関わらず、単分子層成分分子の間に架橋を提供することが望ましいであろう。この場合、試薬中のリンカー基は、架橋を容易にするための官能基を含むことができる。一般的に、架橋は単分子層にさらなる安定性を与える。そのような方法は、当業者に熟知されている(例えば、Ulman, An Introduction to Ultrathin Organic Films: From Langmuir-Blodgett to Self-Assembly, Academic Press (1991)を参照されたい）。
【００６５】
続けて図1を参照すると、試薬4で基体12を官能化することによって基体2上に形成された単分子層6を得て、をれをさらに試薬8及び10で誘導体化して単分子層14を得ている。したがって、単分子層6のY成分は、第2の組の試薬（例えば8及び10）の付着を担う官能基である。Yは、試薬8及び10と共有結合を形成するように機能するか、あるいは8及び10と非共有結合的に相互作用することができ、8及び10が単分子層6と作用的に結合することとなる。場合によっては、試薬8、10、又は双方が単分子層6から解離することができるように可逆的な共有結合を形成することができる。
【００６６】
8及び／又は10が単分子層6に共有結合的に付加し、それによって新たな単分子層を形成することができる場合、Yは、典型的には、それぞれ試薬8及び10上の官能基V及びV'と反応性であるか、またはV及びV'との反応のために容易に活性化される。
【００６７】
Yとしての使用に好適な官能基の例には、活性化カルボン酸（例えば、アシルイミダゾリド、アシルアジドを含む）及び活性化エステル（ペンタフルオロフェノール、p-ニトロフェノール、N-ヒドロキシスクシンイミド、及びスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）などの求電子試薬が含まれる。さらなる有用な求電子試薬には、α,β-不飽和カルボニル基（酸、アミド、エステル、ケトン、及びアルデヒドを含む）、α,β-不飽和スルホキシド、α,β-不飽和スルホンなどのマイケル受容体が含まれる。好ましいマイケル受容体には、マレイミド及びマレイミド誘導体が含まれる。Y基として有用な求電子試薬のさらなる例には、アルデヒド及びアルキル化剤（エポキシド、アジリジン、及びハロゲン化アルキル（ヨウ化、臭化、及び塩化アルキルなど、特にα-ハロアセチル基並びに第一級及び第三級ヨウ化、臭化、及び塩化アルキル）など）が含まれる。同様に、アルキルスルホン酸エステルなどのアルキル化剤も有用なアルキル化剤であり、その例には、メチレンスルホン酸エステル、トリフルオロメチレンスルホン酸エステル、及びp-トルエンスルホン酸エステルが含まれる。
【００６８】
Yとしての使用に好適な官能基のさらなる例には、ヒドロキシル、過酸化物、過酸、スルフヒドリル、チオ酸、セレノール、アミノ、アミノオキシ、ヒドラジド、及びチオセミカルバジド基などの求核基が含まれる。
【００６９】
用いることができる別のクラスの反応性Y基には、付加環化反応に関与する官能基が含まれる。有用な付加環化反応の例には、2+2、3+2、特に1,3-双極性付加環化、及び4+2付加環化反応が含まれるが、限定するものではない。例えば、Yは、ディールス-アルダー反応で用いられるジエノフィルであることができる。好適なジエノフィルの例は、電子欠乏性のアルケン、または逆要請型ディールス-アルダー反応では電子に富むアルケンを含む。反対に、電子に富むジエン又は電子欠乏ジエンは、それぞれディールス-アルダー及び逆要請型ディールス-アルダー付加環化反応で用いる。
【００７０】
アジド含有化合物をいくつかの異なるタイプの付加環化反応で用いることができる。例えば、Yがアジドを含む場合には、1,3-双極性付加環化反応を用いて化合物を単分子層6に結合することができ、それを好適なアルケン化合物と反応させて、窒素の熱除去後に、対応するアジリジン化合物を生じさせることができる。反対に、Yは、アジド含有化合物と反応するアルケン基を含むことができる。
【００７１】
アジドはまた、インサイチューで形成されるケテンとシュタウディンガー型付加環化で反応させるために用いることができ、該反応によりβ-ラクタム含有生成物が生じる。付加環化反応を用いて単分子層6を官能化するための好適な前駆体及び条件は、当業者が選択することができる。
【００７２】
単分子層6を共有結合的に官能化するために用いることができる別のクラスの反応には、有機金属反応が含まれる。特定の有機金属反応には、メタセシス反応が含まれるが限定するものではなく、例えば、一態様では、アルデヒド官能化又はアルケン官能化表面を、V及びV'がアルデヒド又はアルケン官能基を含む試薬8及び10と反応させることができる。そのようなメタセシス反応のための触媒及び条件の例は、当業者に既知である。そのような触媒のある種の例には、金属チタン、タングステン、モリブデン、又はルテニウムが含まれる。例えば、Ivin, K.J., Mol, J.C. Olefin Metathesis and Metathesis Polymerization; Academic Press:London, 1997を参照されたい。
【００７３】
Yがインサイチューで活性化される官能基である場合、Yの可能性には、アジド、ヒドロキシル、カルボキル、アミノ、アルデヒド、カルボニル、メチル、メチレン、アルケン、アルキン、カーボネート、ヨウ化アリール、又はビニル基などの部分が含まれるが、限定するものではない。そのような官能基の適切な活性化型は、当業者に既知である。例えば、Yがカルボキル基である場合、例えばYを活性化エステル（ペンタフルオロフェノール、p-ニトロフェノール、N-ヒドロキシスクシンイミド、又はスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）に変換することにより、アシル化のためにYをインサイチューで活性化することができる。さらに、そのような活性化されたエステルは、種々の好適な求核試薬（アミン、チオール、アルコールなど）と容易に反応する。一態様では、Yは、インサイチューで除去されて反応性官能基をアンマスクすることができる保護官能基であることができる。用いることができる好適な保護基は、当業者に既知である通りに選択、導入、及び除去することができ、Greene, T. W.; Wuts P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed.; Wiley-Interscience, 2002に開示される保護基を含む。一実施態様では、保護されたアルデヒドを用いて、マスクされたアルデヒドで官能化した基体を作成した。
【００７４】
代替の態様では、単分子層の官能基Yは、荷電された部分の群から選択される。可能な荷電されたY官能基には、ホスフェート、スルフェート、カルボキシレートなどが含まれるが、限定するものではない。試薬8、10、又は双方が単分子層の露出部分をコーティングするイオン性の基（ポリリシンなど）を含む場合、これらのような簡単な基をYに用いることができる。
【００７５】
続けて図1を参照すると、試薬8及び10を単分子層6に付着し、それによって第1の単分子層6の成分を含む第2の単分子層14を新たに形成している。試薬8は、単分子層6への付着のための第1の官能基V及び例えば親和性試薬を付着するために用いることができる第2の官能基Zを有する。試薬10は、単分子層6への付着のための官能基V'を含み、抗タンパク質性成分Wをも含む。官能基V及びV'は、同じ又は異なる官能基であることができる。場合によっては、試薬8及び10を2つの異なる工程で送達することができる。したがって、試薬8を試薬10の前又は後のいずれかで付着させることができる。一態様では、V及びV'は、場合によっては、例えばジスルフィド結合で共有結合され、官能基Z及びWをそれぞれ有する試薬8及び10が同じ工程で送達されるようになる。官能基V及びV'は、単分子層6上に提示された官能基Yを参照にして選択される。上記の通り、官能基Yについては、V及び／又はV'は、単分子層6への共有結合を形成するか、単分子層6と非共有的に結合することができる。一般的に、V及びV'は官能基Yに相補的であるように選択され、したがって、例えば、Yが求電子基である場合、V及びV'は典型的には求核基であり、反対に、Yが求核基である場合、V及びV'は典型的には求電子基である。
【００７６】
単分子層14上の官能基Zを用いて親和性作用物質を付着し、単分子層16（これに結合した親和性作用物質18を有する）を生じさせる。
【００７７】
図2は、本明細書中に開示されるアレイの図による表示20を含み、いくつかの代表的な反応性単分子層官能基をも示している。アレイ20を参照すると、基体22は任意の好適な基体であることができる。Xは、非共有的又は共有的に（可逆的に又は非可逆的に）試薬を基体22に結合するための官能基を表す。場合によっては、アレイ20中に示される1つ以上の官能基Ｘは直接的に又は間接的に互いに結合している。例えば、基Xは、ポリ-L-リシン骨格などのポリマー骨格による基体22との結合前に結合することができる。または、Xは、基体22との結合中又は結合後に1つ以上と反応することができるシロキサンなどの基である（又は基に由来する）ことができる。
【００７８】
Rは、上記の試薬4に関して論じたタイプのリンカー基などのリンカー基を表す。典型的には、Rは、非分枝状の炭化水素鎖などの実質的に非分枝状の鎖である。Rが炭化水素鎖を含む場合、鎖は典型的には2〜約22個の炭素原子を有し、より典型的にはRは3〜約18個の炭素原子を有する。実施態様では、用いた種々の炭化水素鎖は、3個、4個、10個、11個、及び12個の炭素原子を有する炭化水素鎖を含んでいた。
【００７９】
第2の試薬が基体と結合した単分子層と共有的又は非共有的に結合するとき、Yは、典型的には本明細書中に開示されるようにして形成された結合を表す。Yが共有結合を表す場合、Yは典型的には2つの官能基（第1のものは求電子性として記載することができ、第2のものは求核性として記載することができる）の反応により形成される。求電子及び求核基の有用な例には、図1に関して先に論じたものが含まれる。反応してYを形成することができ、かつ、典型的には求核性又は求電子性のいずれとも特徴付けらない他の官能基には、付加環化及び有機金属反応に関与する官能基が含まれる。
【００８０】
続けて図2を参照すると、構造24、26、28、30、及び32は、ガラス又はケイ素基体上に形成された単分子層に少なくとも第2の試薬を導入するための実施態様で用いられる代表的な単分子層の官能基を表す。例えば、構造24中のマレイミド官能基はマイケル反応で求電子試薬として用いることもできるし、ディールス-アルダー反応などの付加環化反応で用いることもできる。
【００８１】
構造26中のアジド部分は、還元されて対応するアミンとなることにより活性化されて求核試薬として機能するか、あるいは活性化、還元、及びアシル化をインサイチューでの単一工程で達成することができるシュタウディンガー連結反応で用いることができる。または、アジド官能基は、例えばインサイチューで形成されるケテン試薬と反応するために付加環化反応で直接用いることもできる。
【００８２】
構造28は、優れた求電子試薬であるブロモ酢酸エステル部分を含む（臭素は種々の求核試薬、特にチオラート）によって容易に求核置換される）。構造28を参照すると、Xは窒素又は酸素であることができる。
【００８３】
構造30は、種々の求核性試薬との反応のための求電子試薬として用いることができるアルデヒドを含む。アルデヒドと反応して共有結合を生成することができる種々の求核基が本発明で有用である。有用な反応性基には、例えば、アルコキシド、エノラート、カルバニオン等価物（グリニャール型反応性基など）、アルコール基（対応するアセタール又はヘミアセタールを生成するもの）、シアニド反応性基、アミン（第一級又は第二級アミンを含む）、ヒドラジン、リンイリド、ホスフィンオキシドアニオン、アミノオキシ試薬、ヒドラジドチオセミカルバジドなどが含まれる。または、アルデヒドは、アルデヒド-アルケンメタセシス反応などの有機金属反応で用いることができる。
【００８４】
構造32は、活性化エステルなどのアシル化基を表す。したがって、Xは、当業者に既知である通り、ハロゲン化物、N-ヒドロキシスクシンイミド、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール、p-ニトロフェノールなどの容易に置換される基である。
【００８５】
図3は、最初に非対称ジスルフィド33を用いて基体34を誘導体化することによる有機薄膜アレイの調製方法を図示している。ジスルフィド33は、2つの異なる置換基からなるという意で非対称である。この方法による付着によって、2つの異なる単分子層成分を含む単分子層35を生じる。場合によっては、1つ以上のさらなる対称又は非対称ジスルフィドを付着して、3つ以上の異なる単分子層成分又は非対称ジスルフィドにより与えられる比率が単に異なる2つの単分子層成分を含む単分子層を提供することができる。例えば、X基とY基との比が3対1であることを所望する場合、非対称ジスルフィド33の付着は、式X-R-S-S-R-Xを有する当量の非対称ジスルフィドの付着を伴なうことができる。単分子層35中のX及びYは、親和性作用物質及び抗タンパク質性成分として、あるいは親和性作用物質及び抗タンパク質性試薬を導入するための反応性官能基として機能する。場合によっては、X及びYがそのような反応性官能基である場合、それらは同じ又は異なる官能基であることができる。
【００８６】
図3はまた、本明細書中に開示されるシュタウディンガー連結方法により形成される代表的な単分子層成分を示している。構造37を参照すると、Xは、単分子層又は有機薄膜を基体36に結合するために好適な官能基である。構造37で図示されている通り、Xは、典型的には炭化水素結合基に付着するが、他の結合基をそのような構造に用いることもできる。典型的には、選択された炭化水素鎖は2〜約22個の炭素原子を有し、したがって、「n」は2〜約22である。より典型的には、nは3〜約18である。Gは、親和性作用物質又は抗タンパク質性試薬を共有的又は非共有的に結合するのに有用な任意の基であることもできるし、親和性作用物質又は抗タンパク質性試薬を共有的又は非共有的に結合するために用いることができる別の反応性官能基であることもできる。
【００８７】
再び図3を参照すると、構造39及び41は、基体36上に形成された単分子層成分を表す。構造39を参照すると、基体36は、炭化水素鎖に結合したシロキサン官能基で官能化される。図示した炭化水素鎖は「n」個のメチレン基を含む（nは、典型的には2〜約22であり、より典型的には3〜約18である）。一実施態様では、nは11であった。炭化水素鎖を、シュタウディンガー連結プロトコルにより導入されるアミノアシルアリールホスフィンオキシド部分で官能化する。「m」個のエチレングリコール単位を含むポリエチレングリコール鎖に結合したアシルアミノ基が、炭化水素アミノアシル基に対してパラ位にある。エチレングリコール鎖は任意の長さであることができるが、mは、典型的には2〜約100、より典型的には2〜約70のエチレングリコール単位である。最も典型的には、mは約2〜約20である。一実施例は、mが6である構造39による単分子層成分を含むものであった。
【００８８】
続けて構造39を参照すると、Xは、単分子層成分に活性アシル化剤を与える基である。そのようなアシル化剤は、当業者に既知である通り、対応するカルボキシ基から調製される。典型的には、39は、Xがペンタフルオロフェノール、p-ニトロフェノール、N-ヒドロキシスクシンイミド、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドなどとなるような活性化エステル基である。さらなる好適なX基には、ハロゲン化物、イミダゾリド、無水物などが含まれる。構造41は、構造39と同様に、ガラス又はケイ素基体上に形成された単分子層成分を示す。しかし、41は抗タンパク質性成分として機能する。41を参照すると、「p」は2〜約100のエチレングリコール単位であり、より典型的には2〜約70のエチレングリコール単位である。最も典型的には、「p」は2〜約20エチレングリコール単位である。Rは、アルキル基、水素、又はヒドロキシル担持基を表す。典型的には、Rはメチル基又は水素のいずれかである。
【００８９】
図4は、基体を官能化するための別の態様を示す。この態様では、基体45は、ガラスであるか、酸化ケイ素コーティングを有し、3-マレイミドプロピル-1-シラン誘導体で誘導体化されて、一方の面にマレイミド（MAL）官能基を有することが示されている単分子層コーティング基体を得ている。マレイミド基を用いて、高い効率でスルフヒドリル含有試薬を付着することができる。図示した例では、第1端にスルフヒドリル基及び第2端にビオチン基を有するヘテロ二官能性試薬がマレイミド基を介して基体に付着されている。次いで、抗タンパク質性成分を含有する試薬が残りのマレイミド官能基を介して付着されている。
【００９０】
D.  開示されたアレイの用途
開示されたアレイは、可溶性分析対象物と配列した親和性作用物質との相互作用の特性を決定をするのに有用である。具体的には、アレイを用いて、対象の分子、特にタンパク質又は核酸などの対象生物分子に結合する親和性作用物質を同定することができる。アレイは、小さな分子及び生物分子アレイの双方を用いるハイスループット薬物スクリーニングに特に有用である。
【００９１】
非常に広範な検出方法が、可溶性分析対象物と開示された配列した親和性作用物質との相互作用の特性決定に適用可能である。例えば、アレイを、可視範囲における吸収、化学発光、及び蛍光（寿命、偏光、蛍光相関分光法（FCS）、及び蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）を含む）などの光学検出方法と連動したデバイスに導入することができる。さらに、PCT公開公報第WO96/26432号及び米国特許第5,677,196号（参照として本明細書に組み入れられる）に開示されているような光導波管などの一体型検出器、表面プラズモン共鳴、及び表面電荷センサーは、本明細書中に開示されるアレイの態様と適合性である。
【００９２】
アレイの固定化親和性作用物質と分析対象物との相互作用をモニタリングするために用いることができる代表的なタイプの蛍光検出ユニットは、Wagnerら（Wagner）の米国特許第6,406,921号に記載されている（参照として全部を本明細書に組み入れる）。図5は、アレイの固定化親和性作用物質と分析対象物との相互作用をモニタリングするために用いることができるこのタイプの蛍光検出ユニットの図である。図示した検出ユニットにおいて、アレイ54は、ベースプレート52上に位置している。100W水銀アークランプ62からの光が、励起フィルター60を通して、ビームスプリッター58に送られる。次いで、光は、Micro Nikkor 55mm 1:2:8レンズなどのレンズ56を通して、アレイ54に送られる。アレイからの蛍光発光が、レンズ56及びビームスプリッター58を通して送り返される。発光は、次に発光フィルター64を通り過ぎた後、Slowscan TE/CCD-1024SF&SB（Princeton Instruments）などの冷却CCDカメラ66によって受光される。カメラを作動可能に（operably）CPU68に接続し、逆にCPU68をVCR/モニター70に作動可能に接続する。
【００９３】
図6は、楕円偏光法に基づく代替の検出方法の図である。楕円偏光法により、試料に関する情報を反射光波の偏光状態に観察される変化から決定することが可能になる。分析対象物と基体上の固定化親和性作用物質の層との相互作用によって、厚さが変化し、表面から反射した平面偏光ビームの偏光状態が変わる。このプロセスは、所望する場合には画像モードで、水相からインサイチューでモニタリングすることができる。図6を参照すると、典型的な設備80では、単色光（例えば、He--Neレーザー、84から）を平面偏光し（偏光器86）、基体82上の試料表面上に送り、検出器92により検出する。補償器88が、楕円偏光反射ビームを平面偏光ビームに変化させる。対応する角度をアナライザー90により決定し、次いで、分析対象物と固定化タンパク質に結合した際に変化する楕円偏光パラメータPsi及びDeltaに変換する。追加情報は、Azzam, et al., Ellipsometry and Polarized Light, North-Holland Publishing Company: Amsterdam, 1977に見出すことができる。
【００９４】
E.  実施例
前述の開示を以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。数値（例えば、量、温度など）の精度を保証するよう努めたが、いくらかの誤差及び偏差は当然あるとみなされるべきである。別に示さない限り、部は重量部であり、温度は℃で表すか周囲温度であり、圧力は大気圧又は大気圧近辺である。
【００９５】
方法全般
ガラス及びケイ素基体材料を清浄した後、以下の手順に従って誘導体化した；30%H202（Aldrich、ウィスコンシン州ミルウォーキー）200mL及び濃NH40H（Aldrich）200mLをナノ純水（抵抗値18M?）1000mLを含有する65℃の浴に加えた。ガラス顕微鏡スライド（幅1"長さ3"、Fisher Scientific）又は1cm x 2cmケイ素ウエーハを保持しているテフロンラックを清浄浴に浸漬した。約15分間後、スライドラックを浴から取り出し、ナノ純水の300mL浴に緩やかに攪拌しながら10分間置き、続いてナノ純水の第2の300mL浴に緩やかに攪拌しながら10分間浸漬した。スライドをナノ純水の下で保存し、使用直前に600rpmでの3分間の洗浄サイクル、1500rpmでの10秒間の窒素パージ、続いてそれぞれ2500及び600rpmでの1.5及び20分間の2つの乾燥サイクルを用いるスピンリンス乾燥によって乾燥した。
【００９６】
実施例1
この実施例は、ジスルフィド薄膜前駆体を用いた金基体上のアミノ反応性有機薄膜金の形成を記載する。新たに調製したAu(111）チップを、非対称ジスルフィド化合物120（化合物120への合成経路は図7に図示され、以下に詳細に記載される）の1mM溶液に室温で1時間浸漬した。次いで、チップをエタノールでリンスした（3x10mL）。リンス後、コーティングしたチップを窒素流下で乾燥し、アミン含有試薬との反応のために直ぐに用いた。
2005535898.tif 000003
【００９７】
実施例2
この実施例は、アミノ反応性有機薄膜を官能化してビオチン官能化チップを形成することにを記載する。実施例1に従って調製されたアミノ反応性コーティングを有するチップを、Sigma-Aldrich（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から市販されている0.05% Tween-20（ポリオキシエチレン(20)モノラウリン酸ソルビタン)を含有する50mMリン酸緩衝液（pH7.5）中の(+)-ビオチニル-3,6-ジオキサオクタンジアミン又は(+)-ビオチニル-3,6,9,11-テトラオキサトリデカンジアミン（それぞれPierce, イリノイ州 Rockford及び Molecular BioSciences, コロラド州 Coloradoから市販されている）のいずれかの5mM溶液とともに10分間室温でインキュベートした。チップを500mMイオン強度PBS緩衝液（pH7.5）（全洗浄量30mL）で洗浄した。次いで、チップを37℃の1Mグリシン溶液に浸漬し、任意の残留アミノ反応性NHS基を不活性化した。
【００９８】
実施例3
この実施例は、酸化ケイ素基体のシラン化に用いられる一般的なプロトコルを記載する。この方法により付着される試薬は、Shaltout et al., Mat Res Soc. Symp. Proc. 1999, 576, 15-20のプロトコル（参照として本明細書に組み入れられる）に従って調製された11-アジドウンデシル-1-トリエトキシシラン及び3-マレイミドプロピル-1-トリエトキシシランを含んでいた。Shaltout手順を他のマレイミド誘導体の合成にも適用した。3-マレイミドプロピル-1-トリエトキシシラン試薬を以下のようにして付着させた。清浄な乾燥120mL PTFEバイアル（Savillex（ミネソタ州ミネトンカ））に乾燥トルエン（99.8%無水、Aldrichカタログ番号24,451-1、ウィスコンシン州ミルウォーキー）50mL及びヘキサン酸（Aldrichカタログ番号15374-5）1mLを加え、続いて生のシランを加えた。バイアルを回転し（swirled）、乾燥した清浄な酸化ケイ素ウエーハをシラン溶液に加えた。シラン化を振盪機（約100〜150rpm）で室温において24時間進行させた。ウエーハを乾燥トルエン及び無水エタノールでリンスし、次いで無水エタノール下で10分間音波処理した。音波処理したウエーハを窒素下で乾燥し、アルゴン下においてデシケーター中でフロロウェア容器中に保存した。シラン化したチップは約2〜3週間用いることができた。
【００９９】
実施例4
この実施例は、アミノ反応性及び抗タンパク質性成分を実施例3のプロトコルに従って調製された11-アジドウンデシル-1-トリエトキシシランで官能化した基体にカップリングするために用いられる一般的なシュタウディンガー連結プロトコルを記載する。抗タンパク質性シュタウディンガー試薬20及びアミノ反応性シュタウディンガー試薬30を以下に示す。参照として全部を本明細書に組み入れる米国特許第6,570,040号でのSaxon及びBertozziにより開示された方法に従って、シュタウディンガー試薬20及び30を調製した。
2005535898.tif 000004
シュタウディンガー試薬を酸素パージした（窒素散布による）3:1テトラヒドロフラン：ナノ純水（脱イオン水、18M?）4mLに溶解し、20mMの濃度を得た。11-アジドウンデシル-1-トリエトキシシランチップをテフロン容器中に置き、シュタウディンガー試薬溶液中に浸漬した。容器を振盪機上で24時間室温で振盪し、次いでチップを取り出し、各々30mLの3:1テトラヒドロフラン：ナノ純水、ナノ純水、及び無水エタノールで洗浄した。各チップを窒素下で乾燥し、さらに使用するまで保存した。シュタウディンガー連結の進行はIR分光法によりモニタリングすることができ、収率は定量的IR分光法により決定することができる。
【０１００】
実施例5
この実施例は、ビオチン誘導体40及び抗タンパク質性成分50による3-マレイミドプロピル-1-トリエトキシシラン基体の官能化を記載する。実施例3のプロトコルに従って調製されたマレイミド官能化チップを、緩衝液（20mMクエン酸塩、150mMナトリウム、5mM EDTA、0.05% Tween20緩衝液、pH6.5）中の化合物40の80μM溶液250μLでコーティングした。振盪機上でわずかに攪拌しながらチップを室温で30分間インキュベートした。チップを緩衝液（1XPBS中0.5Mナトリウム、0.05% Tween20、pH7.5）で洗浄し、次いで緩衝液（20mMクエン酸塩、150mMナトリウム、5mM EDTA、0.05% Tween20緩衝液、pH6.5）中の化合物50の80μM溶液150μLとともにわずかに攪拌しながら室温で30分間インキュベートした。チップを緩衝液（1XPBS中の0.5Mナトリウム、0.05% Tween20、pH7.5）で洗浄し、次いでシステインクエンチ溶液（0.1Mシステイン、20mMクエン酸塩、150mMナトリウム、5mM EDTA、1mMトリス-（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）、0.05% Tween20、pH6.5）中に37℃で30分間浸漬した。クエンチしたチップを緩衝液（1XPBS 中の0.5Mナトリウム、0.05% Tween20、pH7.5）30mL及びナノ純水30mLで洗浄した。チップをスピンドライし、直ぐに用いた。このプロトコルに従って調製したビオチン官能化チップはアルゴン下において4℃で最高で約3週間保存することができる。
2005535898.tif 000005
【０１０１】
実施例5で先に記載したようにして調製されたビオチン官能化表面を用いて、相互ストレプトアビジン結合により表面上で異なるビオチン誘導体化試薬を固定化することができる。以下の実施例は、4つの異なる抗体固定化の戦略を記載している。4つのタイプは、ランダムビオチン化IgG；配向IgG（Fcドメイン上の炭水化物上にビオチン化されている）；配向Fab'フラグメント（ヒンジ領域中でビオチン化される）、及びランダムビオチン化Fab'フラグメントである。これらのビオチン化抗体の調製方法を以下に記載する。
【０１０２】
実施例6
この実施例は、アルデヒドで官能化した有機薄膜の調製を記載する。エチレングリコール（28mL、31.4g、505mmol、1.05当量）をウンデシルアルデヒド60、トルエン（500mL）を含有する1L丸底フラスコに加え、続いてp-トルエンスルホン酸水和物（13.7g、72mmol、0.15当量）を加え、溶液を125℃に加熱した。溶液をDean-Starkトラップ下で3時間還流した。水約13mLをトラップ中に回収した後、溶液を室温まで冷却し、トルエンで希釈し、炭酸水素ナトリウム水溶液（1N、2x300mL）及びブライン（約400mL）で洗浄した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、真空中で濃縮して、褐色の油状物とした。粗材料を85〜88℃及び48mTorrで蒸留により精製した。化合物70を透明な液体（約110mL）として単離した。
2005535898.tif 000006
2005535898.tif 000007
11-トリエトキシシリルウンデシルエチレングリコールアセタール90をアルケンアセタール70（38mL、34.2g、161mmol）から調製し、100mL丸底フラスコに加えた。Pt(Ph3P)4(0.20g、0.161mmol、0.001当量）を加え、続いてPtオクタナール/オクタノール（2.5Pt溶液、1.25mL、0.161mmol、0.001当量）を加えた。トリエトキシシラン（29.75mL、26.5g、161mmol、1.0当量）を周囲温度でアルケン触媒溶液に加えると、わずかに発熱した。溶液を周囲温度で1.5時間攪拌し、次いで反応物を2時間105℃に加熱した。1HNMRスペクトル中のアルケン共鳴の消滅をモニタリングすることより、反応の完了を決定した。114〜130℃及び13mTorrで蒸留することにより、所望の生成物を得た。無色透明な液体が34mL得られた。
2005535898.tif 000008
【０１０３】
以下のようにしてシラン化を実施した。少量の乾燥トルエンで予めリンスしたガラスCopelandジャーに50mL乾燥トルエン及び0.5mLアルデヒドシランを加えた。ジャーを振盪機上に置いて溶液を混合し、5つの透明なガラス顕微鏡スライドをスロット内部に置いた。緩やかな攪拌を24時間実施した後、溶液をデカントし、50mL乾燥トルエンに換え、ジャーを5分間振盪した。この手順を2回繰り返した。最後のトルエンリンスをデカントした後、エタノール50mLを加え、ジャーを5分間振盪した。最初のエタノールリンスをデカントした後、さらなるエタノール50mLを加え、ジャーを10分間音波処理した。最後に、スライドをCopelandジャーから取り出し、窒素下で乾燥した。スライドを窒素下で保存してアルデヒドの酸化を回避した。
【０１０４】
アセタールシラン90でコーティングされたケイ素ウエハーを0.1M HCl溶液中に浸漬し、0.25時間、1時間、4時間、8時間、及び16時間攪拌した。酸浴から取り出すと、ウエーハを1M pH7 NaHCO3中に1分間浸漬し、取り出し、水に浸漬し、5分間攪拌し、次いで窒素ガス流を用いて乾燥した。
【０１０５】
脱保護反応をX線電子分光法（XPS、45℃取り出し角）で追跡することができる。287eVでC-O結合に対応するピークの消滅をモニタリングすることができ、脱保護反応はほぼ1時間で完了した。得られたアルデヒド官能化表面は、3'-アミノ官能化オリゴヌクレオチドで還元的アミノ化により誘導体化することができる。5μMオリゴヌクレオチドをアルデヒド官能化表面上にスポッティングし、表面を乾燥させた。スポッティングした表面を脱イオン水中0.2% SDSの溶液中で攪拌しながら室温で2分間リンスした。次いで、表面を新しい還元溶液（NaBH4 1.5g、無水エタノール133mL、及びPBS 450mL、pH7.2〜7.4)に浸漬し、室温で5分間ソークした。
【０１０６】
実施例7
この実施例は、11-トリエトキシシリルウンデシル-2-ブロモ酢酸の調製を記載する。10-ウンデセニルアルコール（100g、0.59モル）及びα-ブロモ酢酸（90g、0.65モル）を1L丸底フラスコに量り入れ、ジクロロメタン600mLに溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、133.3g、0.65モル）をジクロロメタン250mLに溶解し、何回かに分けて酸/アルコール混合物に加えた。白色沈殿物が直ぐに形成し、熱がいくらか発生した。混合物を一晩攪拌し、次いで沈殿物（ジシクロヘキシル尿素、DCU）を濾過により除去した。濾液を油状物まで濃縮し、ヘキサン500mL中に取ってより多くのDCUを沈殿させ、それを濾過により除去した。溶液を濃縮して無色油状物を得、生成物を蒸留して（74℃、約4.0mTorr）、無色の液体を得た（115.77g、収率68％）。
2005535898.tif 000009
【０１０７】
純度97%超のウンデセニルα-ブロモアセテート（20g、0.07モル）及びヘキサクロロ白金酸水素（1モル%）280mgを丸底フラスコに加えた。トリエトキシシラン（12.46g、76mmol）をAr下でシリンジにより加えた。混合物を予め加熱した（90℃）油浴中に置いた。反応の間に（12時間）、混合物は黒色に変化した。生成物を6.0mTorrで150℃にて蒸留するにより精製した。生成物を無色透明な液体として単離した（13.6g、収率43.5％）。
2005535898.tif 000010
【０１０８】
付着時間が2時間だけ（24時間の代わりに）であったこと及びすべてのジャーを暗所で保存することに注意したことを除き、アルデヒドシラン（実施例6）を用いた場合のように、ブロモアセタールシランを用いてシラン化を実施した。ブロモアセチルシランでコーティングされたスライドを暗所でデシケーター中に保存した。
【０１０９】
実施例8〜10の材料
MAB9647は、ヒトIL-8に対して生じたマウスIgG1であり、ATCC（バージニア州マナッサス）から得たハイブリドーマ細胞系HB-9647を用いてマウス腹水からCovance Inc.(ニュージャージー州プリンストン）によって産生されたものであり、Gタンパク質で精製されたものである。MAB208は、R&D Systems（ミネソタ州ミネアポリス）によってヒトIL-8に対して生じたマウスIgG1であり、マウス腹水からGタンパク質で精製されている（クローン番号6217.111、カタログ番号MAB208）。MAB602は、R&D SystemsによりヒトIL-2に対して生成したマウスIgG2Aであり、マウス腹水からGタンパク質で精製されたものである（クローン番号5355.111、カタログ番号MAB602）。IL-8アッセイ用の検出抗体として、R-フィコエリスリン（PE）共役マウス抗ヒトIL-8抗体を用いた（BD Pharmingen、カタログ番号20795A)。IL-2アッセイのため、2つの検出抗体：ヤギ抗ヒトIL-2抗体（R&D、カタログ番号AF-202-NA）及びR-PE-共役ロバ抗ヤギIgGF（ab')2（Jackson Immuno Research、カタログ番号705-116-147)を用いた。注記しない限り、化学薬品はSigma-Aldrich（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ペプシン-アガロースはPierce（イリノイ州ロックフォード）から購入した（製品番号20343）。PNGase FはNew England Biolabs（マサチューセッツ州ビバリー）から得た（製品番号P0704）。アルデヒド反応性プローブはMolecular Probes（オレゴン州ユージーン）から得た。ヒトインターロイキン-2（IL-2）はLeinco Technologies（ミズーリ州セントルイス）から購入し（製品番号011R455）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS; 11.9mMリン酸ナトリウム、137mM NaCl、2.7mM KC1、pH7.4）中で再構成した。C末端にXa因子切断部位を有する配列番号：1の成熟型のヒトインターロイキン-8
2005535898.tif 000011
をコードするDNA配列及び配列番号：2のプロテインキナーゼA部位（GIEGRRRASV）をオリゴヌクレオチドの遺伝子組み立てにより作成した。この構築物をpET24a（Novagen、ウィスコンシン州マディソン）のNdeI及びXhoI部位に挿入して、C最末端にHis(6)標識をさらに付加した（LEHHHHHH（配列番号：3）；ここで、LEコドンはXhoI部位を含む)。次いで、このプラスミドを用いて、1mM IPTGをOD0.6で添加することによりEZMix修飾テリフィックブロス（Terrific Broth）（Sigma、ミズーリ州セントルイス）;カタログ番号T-9179）中で増殖し、かつ、BioFlo 3000発酵槽（New Brunswick Scientific、ニュージャージー州エジソン）中で30℃において4時間増殖したBL21 DE3細胞（Novagen）中でIL-8を直接発現させた。細胞を遠心分離により回収し、50mlあたり完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠(Roche Applied Science; カタログ番号1697498)を1個含む5ml緩衝液/g（300mM NaCl、50mMリン酸ナトリウム、5mMベータ-メルカプトエタノール、5mMイミダゾールを有する（pH8.0））に再懸濁し、マイクロ流動化装置（microfluidizer）を用いて溶解した。IL-8の可溶性画分を、TALON Superflowビーズ（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）；カタログ番号8908-2）を用いて金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、続いてSuperdex 75 分取グレードカラム（Amersham Biosciences)を用いてPBS中のゲル濾過により精製した。3K MWCO膜を有するモデル8400攪拌限外濾過細胞（Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード；カタログ番号5124）を用いてIL-8含有画分を0.4〜0.5mg/mlまで濃縮し、次いで貯蔵のために10%グリセロールを有するPBS中に透析した。同定及び正しい2次構造を質量分析、ELISA、及び円偏光二色性（スペクトル偏光計（Spectrapolarimeter） J-810、Jasco、メリーランド州イーストン、www.jascoinc.com）により確認した。
【０１１０】
実施例8
この実施例は、ビオチン化Fab'フラグメントの調製を記載する。IgG'の保存されたN-結合グリコシル化を抗体から以下の反応条件下で除去した（50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)中の1〜4mg/ml抗体、10〜20U/μl PNGase F（New England Biolabsから得たもの、それらの単位の定義を用いる）、37℃で24〜48時間）。脱グリコシル化後、抗体を20mM酢酸ナトリウム（pH4.5）中で緩衝液交換した（限外濾過又は透析を用いる）。ペプシン分解用の条件は以下の通りであった（30容量%ペプシンアガロース（固定床容量、20mM NaOAc（pH4.5）中で洗浄されたビーズ）、0.5〜2mg/ml IgG、20mM NaOAc、260mM KC1、0.1% Triton X-100、pH4.5）。先に最適化された時間量（MAB9647では12時間;MAB208では4.5時間;MAB602では3.5時間）の間、反応物を攪拌しながら37℃でインキュベートした。ペプシン処理後、樹脂を0.1M NaOAc（pH4.5）で洗浄することにより、フラグメントをペプシンアガロースから回収した。次いで、ペプシン切断の生成物を濃縮し、0.1M Na2HPO4、5mM EDTA、pH6.0中に交換し、次いで同じ緩衝液中で20mM 2-メルカプトエチルアミン（MEA）で90分間37℃で処理した。次いで、MEAを、10kDカットオフ膜を用いて0.1M Na2PO4、5mM EDTAに対して6時間4℃で透析することにより除去し、次いで残留MEAを脱塩カラム（PD-10、Amersham-Pharmacia、ニュージャージー州Piscataway）上で試料を流すことにより除去した。この工程の直後、減少したF（ab)'を20mM N-エチルマレイミド又はマレイミド活性化ビオチン（Pierce製品番号21901)により室温で2時間処理し、次いで未導入のNEM又はビオチンマレイミドを透析により除去した。試料を濃縮し、Superdex-75ゲル濾過カラム（Amersham-Pharmacia）を用いたFPLCによってFab'フラグメントを他のフラグメントから精製した。NEM処理したFab'フラグメントの場合、ランダムビオチン化は以下に記載する通りとした。FPLC精製Fab'フラグメントの試料を非還元タンパク質ローディング緩衝液（62.5mM Tris HCl、25%グリセロール、2%SDS、0.01%ブロモフェノールブルー）で1:1に希釈し、4〜20%勾配SDSポリアクリルアミドゲル（製品番号161-1123、Biorad、カリフォルニア州Hercules）上にロードした。SDS-PAGEをLaemmli(1970)に従って実施した。各々の場合において、Fab'に対応する約50kDのバンドが観察され、観察可能な汚染物質のみが軽鎖及び切断された重鎖のサイズに対応した。これらの汚染物質は、高分解能ゲル濾過カラム中でFab'ととも一緒に移動したので、軽鎖及び切断された重鎖（これらの鎖では、通常はそれらを結合しているジスルフィド結合が還元され、アルキル化されている）の間の非共有的であるがさもなければ構造的にネイティブな複合体におそらく対応する。これらのフラグメントは、重鎖及び軽鎖の間のスルフィド結合が抗原結合部位中にないので、官能性である可能性が高い。それらのフラグメントは精製タンパク質の約20%に対応し、それらのFab'フラグメントのいくつかは80%超の活性であった。
【０１１１】
この研究で用いたすべての捕捉剤のビオチン化を、HRPが共役したストレプトアビジン（SA）プローブを使用するウエスタンブロット分析（データは示していない）により立証した。さらに、ビオチン化の程度をSA樹脂プルダウンアッセイ（データは示していない）を用いて評価した。これらの反応の各々において、ビオチン化は60%以上であった。表面固定化前に非ビオチン化タンパク質を除去する試みはしなかった。
【０１１２】
実施例9
この実施例は、カルボビオチン化のプロトコルを記載する。IgG(3〜5mg/ml）をカップリング緩衝液（0.1M NaOAc pH5.5）中に透析し、次いで暗所で20mMメタ過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）とともに0℃で1時間インキュベートし、炭水化物中のビシナルジオールを酸化してアルデヒドとした。次いで、30mMグリセロールを10分間添加することより反応物をクエンチし、濾過して可溶性の塩を除去し、次いでカップリング緩衝液に対して6時間透析した。アルデヒド反応性プローブ（ARP、N-(アミノオキシアセチル）-N'-(Dビオチニル)ヒドラジン、トリフルオロ酢酸塩、Molecular Probes、オレゴン州ユージーン）を1mg/mlで加え、室温で2時間インキュベートし、その後、試料をPBSに対して激しく透析した。
【０１１３】
実施例10
この実施例は、IgG及びFab'フラグメント分子のランダムビオチン化を記載する。IgG及びNEM処理したFab'フラグメントをアミン反応性プローブであるEZ Link（登録商標）スルホ-NHS-ビオチン（Pierce）で修飾した。反応は、1XPBS中のタンパク質に対して20倍モル過剰のビオチン化試薬により室温で2時間実施した。次いで、Tris（pH7.4）を添加して最終濃度10mMにすることにより、ビオチン化試薬をクエンチした。次いで、遊離のビオチンプローブを除去するために1000倍過剰のPBSに対して5回試料を透析した。透析後、ビオチン化タンパク質をゲル上で分析し、UltraLink（登録商標）プラス固定化ストレプトアビジンゲル（Pierce）上でビオチン化の程度を試験した。典型的には、60%〜100%のタンパク質がビオチン化される（データは示していない）。
【０１１４】
実施例11
この具体例は、表面プラズモン共鳴（SPR）を用いて、金基体上で形成された薄膜に結合した親和性作用物質の表面被度及び活性を測定することを記載する。すべてのSPRアッセイは、金コーティングしたガラス表面上に形成されたビオチン化された自己集合単分子層を解析するBIAcore 3000中で行った。実施例1のプロトコルに従い、非対称アルカンジスルフィド化合物10を用いて表面を調製した。調製された表面は、その露出面上にN-ヒドロキシスクシンイミド及びメトキシ基を含んでいた。次いで、この単分子層を(+)-ビオチニル-3,6-ジオキサオクタンジアミン(トリエチレングリコールアミノビオチン)試薬と反応させて、ビオチン化表面を得た。表面上のビオチン基により、ストレプトアビジン（SA）の結合が可能になる。すべてのアッセイは0.05% Tween-20を有するPBS中25℃で実施した。SAを20μl/分の流量で0.1mg/mlで表面上にロードした。典型的には、320μlをロードして飽和SA表面を達成し、それによってJung et al., Langmuir 14: 5636-5648 (1998)に従って計算された表面被度3.7〜4.0pmol/cm2が得られた。SA付着後、飽和が観察されるまで、20μl/分の流量で20〜100nMの種々の捕捉試薬をロードした。特に述べない限り、分析対象物の結合では流量80μL/分を用いた。分析対象物の結合の上限を決定するために、広範な範囲にわたる種々の分析対象物濃度をアッセイした。比較のため、分析対象物のSAへの非特異的な結合を、研究したすべての分析対象物濃度で独立して試験した。
【０１１５】
実施例12
この具体例は、非対称NHSジスルフィド120の合成を記載する。図7を参照すると、非対称ジスルフィドの両「アーム」のために臭化アルケニル化合物100を出発材料として用いる。抗タンパク質性アームを生成するため、100をアルコキシドトリエチレングリコールモノメチルエーテル（NaHによる脱プロトン化により生成される）と反応させて、収率60％で化合物102を得た。化合物102にラジカル付加を施して、末端チオアセチル化合物104を収率88％で得た。アセチル基を酸性条件下（4N HCl/ジオキサン、75℃で4時間）で除去するとチオール106（95%）が得られ、これを2',2'-ジピリジルジスルフィドで処理して、対応する2'-ピリジル混合ジスルフィド108を収率98％で得た。
【０１１６】
混合ジスルフィド120のNHS「アーム」は、テトラエチレングリコールとともにNaOH水溶液中で24時間還流することにより100から調製して、収率42％で化合物110を得た。末端アルコール110をNaHで処理し、t-ブチルブロモアセテートでアルキル化すると、末端エステル化合物112が収率42％で得られた。化合物112を、チオ酢酸のフリーラジカル付加によってチオアセチル化合物114に収率87％で転換した。2N HCl水溶液で75℃において48〜60時間処理することによってアセチル及びt-ブチル保護基を除去することにより、チオール116が収率80％で生成された。
【０１１７】
次いで、化合物108及び116をAmberlite CG-50（約pH3〜4）の存在下で室温にて約12〜約16時間合わせると非対称ジスルフィド118を得、これをN-ヒドロキシスクシンイミドとDCC触媒で縮合することにより所望の化合物120に転換した。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】開示した表面官能化方法の一態様を示す。
【図２Ａ】開示したアレイの一態様を表す図である。
【図２Ｂ】そのようなアレイの調製に用いられる単分子層成分の例を提供する。
【図３Ａ】単分子層を調製するための非対称ジスルフィド試薬の使用方法を示す。
【図３Ｂ】シュタウディンガー連結により調製された単分子層成分の例を示す。
【図４】新規なアレイを調製するプロセスの一例を示す。
【図５】アレイのタンパク質と分析対象物との相互作用をモニタリングするために用いることができる蛍光検出ユニットの図である。
【図６】分析対象物とアレイの親和性標識との間の相互作用をモニタリングするために用いることができる楕円偏光検出ユニットの図である。
【図７】N-ヒドロキシスクシンイミド及びポリエチレングリコール基を有する非対称ジスルフィドの合成を示す。
【図１】
2005535898.tif 000014
【図２】
2005535898.tif 000015
【図３】
2005535898.tif 000016
【図４】
2005535898.tif 000017
【図５】
2005535898.tif 000018
【図６】
2005535898.tif 000019
【図７】
2005535898.tif 000020
【国際調査報告】
2005535898.tif 000021
2005535898.tif 000022
2005535898.tif 000023
2005535898.tif 000024