(57)【要約】本発明は、敗血症又は敗血症性ショックを治療するための医薬品組成物を製造するために、リポ多糖類(LPS)又はリポタイコ酸(LTA)に結合するペプチドを使用する方法であって、該ペプチドは、アポリポタンパク質CI(apoCI)のアミノ酸配列、又はapoCIのC末端ヘリックスのアミノ酸配列を少なくとも含むそれの一部分を含む方法に関する。ヒトapoCIの使用が、好ましい。該ペプチドは、敗血症を有する又は敗血症を進行するおそれがある患者に臨床的に投与されうる。血液中のapoCI含量の測定が、敗血症状況の進行の重大性を決定するために及び予後を作成するために、又は抗敗血症治療を監視するために利用されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症又は敗血症性ショックを治療するための医薬品組成物を製造するために、リポ多糖類(LPS)又はリポタイコ酸(LTA)に結合するペプチドを使用する方法であって、該ペプチドは、アポリポタンパク質CI(apoCI)のアミノ酸配列、又はapoCIのC末端ヘリックスのアミノ酸配列を少なくとも含むそれの一部分を含む、方法。
【請求項２】
該ペプチドが、ヒトapoCIのアミノ酸配列、又はヒトapoCIのC末端ヘリックスのアミノ酸を少なくとも含むそれの一部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ペプチドが、ヒトapoCI、又はアミノ酸MREWFSETFQKVKEKLKを少なくとも含むそれのフラグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該ペプチドが、アミノ酸配列TPDVSSALDKLKEFGNTLEDKARELIS RIKQSELSAKMREWFSETFQKVKEKLKIDSを有するヒトapoCIである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
医薬品組成物が、哺乳動物、特にヒト、又は家畜、例えば馬、牛、犬及び猫におけるグラム陰性細菌によって引き起こされる敗血症又は敗血症性ショックを予防し又は治療するために製造される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポ多糖類(LPS)に結合するペプチドを使用する方法。
【請求項６】
医薬品組成物が、哺乳動物、特にヒト、又は家畜、例えば馬、牛、犬及び猫におけるグラム陽性細菌によって引き起こされる敗血症又は敗血症性ショックを予防し又は治療するために製造される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポタイコ酸(LTA)に結合するペプチドを使用する方法。
【請求項７】
敗血症又は敗血症性ショックを予防し又は治療するための医薬品組成物であって、該組成物は、請求項１〜４のいずれか一項で定義されたペプチドならびに薬剤的に許容される担体を含む、医薬品組成物。
【請求項８】
例えば外科的処置又は弱められた免疫系の結果として、進行する敗血症の増加された危険にある哺乳動物、特にヒトを予防的に治療するための方法であって、哺乳動物に対して、請求項１〜４のいずれか一項で定義されたペプチドの有効量が投与される方法。
【請求項９】
敗血症又は敗血症性ショックを病む哺乳動物、特にヒトを治療するための方法であって、哺乳動物に対して、請求項１〜４のいずれか一項で定義されたペプチドの有効量が投与される方法。
【請求項１０】
敗血症又は敗血症性ショックを病む哺乳動物、特にヒトにおける敗血症又は敗血症性ショックの更なる進行について、敗血症状況の重大性を決定し及び予後を作成するための方法であって、哺乳動物の血液サンプル中のapoCI含量が決定される方法。
【請求項１１】
敗血症又は敗血症性ショックを治療されている、哺乳動物、特にヒトにおける敗血症又は敗血症性ショックの治療を監視するための方法であって、哺乳動物中の血液サンプル中のapoCI含量が決定される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の分野、より特には敗血症及び敗血症性ショックの予後、予防及び治療の分野である。本発明は、敗血症及び配血症性ショックの治療的予防及び処置の手段、ならびに配血症性状況の重大性を決定し且つ更なる経過のために予後を作成するための手段、及び敗血症及び敗血症性ショックの処置の経過の敗血症監視のための手段を提供する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症及び敗血症性ショック。
通常の細菌性炎症は高度に調節されたプロセスであり、それによって防御システムが細菌を除去する。弱められた防御を有するヒトでは、細菌は、増殖するための(事実上束縛されずに)及び血流へと突破するための機会を得る。血流中の細菌の存在は、敗血症と呼ばれる。敗血症は、血液において白血球(単球及びマクロファージ)による炎症メディエーターの生産を生じる。この反応は、細菌の迅速な且つ効率的な除去のために重要である。しかしながら、炎症性反応があまりにも長く続く場合、例えば疾病に関連付けられた免疫抑制により、これは結局、厳しい熱、自発的な血液凝固及び酸素欠乏による及び細菌生成物による組織の損傷を生じる。重大な場合では、器官(特に腎臓、心臓及び肝臓)が、機能を停止するかもしれず、そして患者はいわゆる敗血症性ショックになるかもしれず、患者はそれからその後死ぬかもしれない。
【０００３】
発生率。
米国のみで、年間500,000人を越える患者が敗血症性ショックを起こし、年に約1.5%の推定された発生率増加であり、費用は年に総計167億ドルになる(アンガス、2001年)。敗血症性ショックは、(使用される定義に依存して)事例の20〜80%で死を生じる。浸襲外科的技術、臓器移植又は炎症性疾病を有する患者における化学療法及び免疫抑制の適用の増加する使用は、敗血症例の増加する数の原因を構成する。改善された医療的ケアによる老人及び代謝性の、腫瘍性の及び免疫不全欠損を有する患者のより長い余命はまた、細菌感染の増加された危険にある人口をもたらす。
【０００４】
リポ多糖類及びリポタイコ酸。
敗血症及び敗血症性ショックは、グラム陰性細菌(例えば、E. coli及びK. pneumoniae)、及び(より少ない程度に)グラム陽性細菌(S. aureus 及びS. epidermidis)に主に起因する。
【０００５】
リポ多糖類(LPS)は、グラム陰性細菌の外膜の最も重要な構成成分である。LPSは、グラム陰性細菌の最も反応的な成分である。LPSは、単核細胞(単球及びマクロファージ)を活性化し、その後これら細胞は、炎症メディエーター例えばサイトカイン(TNFα、IL-1β、IL-6)及び酸素ラジカルを生成する。この応答は、細菌感染を迅速に且つ有効に処理するために必要であり、且つ細菌の除去に重大な役割を果たす(ホイマン、2002年)。しかしながら、細菌が抑制無しに増殖し続けることを許す不十分な応答の場合、これらメディエーターは、ウサギ、猿及びマウスで実証されているように、病的状態そして結果的に死亡をもたらす代謝性変化の原因である。
【０００６】
グラム陽性細菌におけるLPSの等価物はリポタイコ酸(LTA)であり、これはLPSのそれと強い相同性を示す構造を有する。
【０００７】
現在の臨床的及び実験的治療。
敗血症の複雑さ及び免疫学的防御は、薬理学的処置の開発をより困難にする。標準の処置はしばしば、血圧及び器官の酸素供給を正常にするために、体液及び血圧の上昇剤(いわゆる昇圧剤)、及び細菌の増殖を阻害するための抗生物質の投与からなるが(ラコウ、1991年；コーヘン、1991年；ウィラー、1999年)、これら処置は高い死亡率を防ぐために十分ではない。
【０００８】
敗血症を治療するためのほとんどの適用される実験的計画は、例えばLPSを捕捉することを通じて、炎症応答を阻害するサイトカイン作用又は全体的免疫抑制をブロックすることを目指していた。
【０００９】
しかしながら、様々な臨床的研究は、LPSを中和する抗血清が敗血症性ショックに有効でないことを示した(コーヘン、1999年)。同様に、なかんずくTNFα(フィッシャー、1996年；クラーク、1998年)及びIL-1受容体(フィッシャー、1994年；オパル、1997年)への抗体を用いた実験的治療は、有効でないとわかった。
【００１０】
メタ分析によって、全体的免疫抑制が敗血症に起因する死亡率を増加させることが示された(クロニン、1995年)。ヒトにおける最近の研究は、LPSに対して減少された炎症性応答を生じるLPS受容体  Toll様受容体4(TLR4)における多型が、厳しい細菌性感染への増加された感受性に関連付けられることを示す(キーチル、2002年)。その上、炎症性サイトカインマクロファージ移動阻害因子（MIF：migration inhibitory factor）に障害のあるマウスは、細菌、例えばLeishmania major(サトスカール、2001年)及びSalmonella typhimurium (ケベルニック、2002年)を除去することが比較的出来ないことが知られている。
【００１１】
多くの提案が、敗血症又は敗血症性ショックを治療するためになされ、それらの全てはLPS結合性ペプチドが敗血症患者に投与されるという共通点を有する。これらのLPS結合性ペプチドの投与は典型的に、免疫系のLPS誘発された活性化の抑制を目的とする。投与されるべきペプチドは例えば、LBP(LPS結合性タンパク質；国際特許出願WO 95/25117号を参照)、apoA及びapoE(国際特許出願WO 98/07751号)、apoA1(国際特許出願WO 95/25786号；国際特許出願WO 99/16458号；国際特許出願WO 99/16459号；国際特許出願WO99/16408号；国際特許出願WO 99/16409号)、CAP18(ラーリック、1994年)、CAP37(米国特許US 6107460号；米国特許US 5650392号; 米国特許US 5627262号；米国特許US 5607916号)、CD14(国際特許出願WO 96/20956号)、プロフェニン(prophenin)(国際特許出願WO 95/34289号；国際特許出願WO 95/26747号)、ポリフェムシン(polyphemusin)(国際特許出願WO 02/00687号)及びLALFタンパク質(米国特許US 5747455号)から誘導されうる。しかしながら、現在まで、これら提案のすべては、敗血症及び敗血症性ショックのいずれについての有効的なアプローチを生じていない。
【００１２】
敗血症は、リポタンパク質代謝について大きな影響を有する。病院へ行く患者は、血液中の強く低下されたコレステロール値を示し、それは成功した抗菌的治療後に正常化する。イン  ビトロ(in vitro)及び実験動物での研究は、リポタンパク質が敗血症に対して保護を与えうるが、リポタンパク質の複雑性(組成、内在的特性を含む)は、それらの臨床的適用をより困難にすることを示した。また、リポタンパク質が保護的役割を果たすメカニズムは、いまだ未知である。タンパク質なしのトリグリセリドに富む脂質乳化物の注入は、保護を与えないことが報告され(ファン  デル  ポール、1995年)、これは、敗血症に大きな保護的役割を果たしうるものは正にリポタンパク質のタンパク質成分であることを示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、敗血症及び敗血症性ショックの予防又は有効な取扱(治療的処置)を提供し、それは、これまで提案された処置方法よりもより有効であり及び／又はそれらの不利点を避ける。
【００１４】
本発明の他の目的は、敗血症の患者において細菌の毒性成分、特にLPS及び／又はLTAによって誘発されるような炎症性反応が助長されうる手段及び方法を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる目的は、敗血症状況の重大性の信頼できる決定及び、敗血症又は敗血症性ショックの信頼できる予後を提供することである。
【００１６】
本発明のなお更なる目的は、敗血症の患者の病気の状況の信頼できる評価を提供し、従って病気の治療の効果が測定されうることである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
その目的のために、本発明は、敗血症又は敗血症性ショックを治療するための医薬品組成物を製造するために、リポ多糖類(LPS)又はリポタイコ酸(LTA)に結合するペプチドを使用する方法であって、該ペプチドは、アポリポタンパク質CI(apoCI)のアミノ酸配列、又はapoCIのC末端ヘリックスのアミノ酸配列を少なくとも含むそれの一部分を含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
特に、これは、ヒトapoCIのアミノ酸配列、又はヒトapoCIのC末端ヘリックスのアミノ酸を少なくとも含むそれの一部分を含むペプチドに関する。しかしながら、非ヒト哺乳動物のapoCI、又はその対応するフラグメントがまた使用されうる。たとえば家畜、例えば馬、牛、犬及び猫での適用のために、それぞれの哺乳動物のapoCIの使用が典型的に好まれるだろう。
【００１９】
しかしながら、本発明に従い最も好ましくは、該ペプチドが、ヒトapoCI、又はアミノ酸MREWFSETFQKVKEKLKを少なくとも含むそれのフラグメントであることである。
【００２０】
具体的には、該ペプチドは好ましくは、アミノ酸配列TPDVSSALDKLKEFGNTLEDKARELIS RIKQSELSAKMREWFSETFQKVKEKLKIDSを有するヒトapoCIである。しかしながら、フラグメント、例えばペプチドSAKMREWFSETFQKVKEKLKIDS又はペプチドMREWFSETFQKVKEKLKを使用することがまた可能である。
【００２１】
特にこれは、本明細書で定義されているリポ多糖類(LPS)に結合するペプチドを使用する方法であって、それによって哺乳動物、特にヒト、又は家畜、例えば馬、牛、犬及び猫におけるグラム陰性細菌によって引き起こされる敗血症又は敗血症性ショックを予防し又は治療するために医薬品組成物が製造される方法に関する。
【００２２】
しかしながら、本発明はまた、本明細書中に定義されているリポタイコ酸(LTA)に結合するペプチドを使用する方法であって、それによって医薬品組成物が、哺乳動物、特にヒト、又は家畜、例えば馬、牛、犬及び猫におけるグラム陽性細菌によって引き起こされる敗血症又は敗血症性ショックを予防し又は治療するために製造される方法を含む。
【００２３】
また、本発明に従い、敗血症又は敗血症性ショックを予防し又は治療するための医薬品組成物であって、該組成物が、本明細書中に定義されているペプチドならびに薬剤的に許容される担体を含む医薬品組成物が提供される。
【００２４】
さらに、本発明は、例えば外科的処置又は弱められたもしくは欠陥のある免疫系の結果として、進行する敗血症の増加された危険にある哺乳動物、特にヒトを予防的に治療するための方法であって、哺乳動物に対して、本明細書中で定義されているペプチドの有効量が投与される方法を提供する。
【００２５】
同様に、本発明は、敗血症又は敗血症性ショックを病む哺乳動物、特にヒトを治療するための方法であって、哺乳動物に対して、本明細書中で定義されているペプチドの有効量が投与される方法を提供する。
【００２６】
また、本発明は、敗血症又は敗血症性ショックを病む哺乳動物、特にヒトにおける敗血症又は敗血症性ショックの更なる進行について、敗血症状況の重大性を決定し及び予後を作成するための方法であって、哺乳動物中の血液サンプル中のapoCI含量が決定される方法を提供する。
【００２７】
同様に、本発明は、敗血症又は敗血症性ショックを治療されている、哺乳動物、特にヒトにおける敗血症又は敗血症性ショックの治療を監視するための方法であって、哺乳動物中の血液サンプル中のapoCI含量が決定される方法を提供する。
【００２８】
敗血症におけるapoCIの役割。
実施例１及び図１が示すように、我々は、敗血症の血液中のアポリポタンパク質CI(apoCI)のレベル(濃度)が強く低下し、このことは（多くの）他のアポリポタンパク質について妥当しない又はより少ない程度に妥当することを見出した。敗血症の血液中のこの低下したapoCI含量は、文献(バーラゲ、2001年)によって確認される。但し、著者は敗血症におけるapoCIのありうる役割について議論していない
【００２９】
ApoCIは、肝臓によって主に合成される最小のアポリポタンパク質(6.6 kDa、57アミノ酸)であり、及びフリーで及び結合されていない形の両方で、及びリポタンパク質(キロミクロン(chylomicrons)、VLDL、HDL)(ヨング、1996年) の構成成分として、かなり高い濃度(〜6 mg/dL)で血液中で循環する。apoCIのアミノ酸配列は知られている(表１を参照)。現在まで、apoCIの種々の変異体(「多型」)を生じる突然変異は知られるようになっていない。ヒトapoCIを過剰発現する形質転換マウスを使用して、我々は、apoCI過剰発現が血液中の増加された脂質レベルを生じる故に、apoCIが脂質代謝で役割を果たすことを実証した（ヨング、1996年、ヨング、1998年）が、敗血症におけるapoCIの役割は、たとえあるとしてもまだ知られていなかった。
【００３０】
我々は、敗血症に関連付けられたapoCI枯渇が細菌性感染の直接的な結果であるという仮説を展開した。低いapoCI濃度は、細菌の生成物、特にLPSへのapoCIの結合の結果であるかも知れず、それは血液からのapoCIの加速されたクリアランスをおそらく生じうる。
【００３１】
広範囲な文献研究によって、LPS結合性タンパク質は共通の特徴を有し、プラスに荷電されたアミノ酸及び疎水性アミノ酸の組み合わせの存在が必須であることがわかった。これらタンパク質のうちの2つは、リムルス抗LPS因子(LALF:limulus anti-LPS factor)(ホエス、1993年)、すなわちLPS活性を測定するために日常的に使用される「LALアッセイ」おける因子、及び多形核の細胞によって合成されるCAP18(ラーリック、1994年)である。
【００３２】
事実、apoCIは、疎水性アミノ酸と交互にされた、プラスに荷電された多くのリジン(各6個のアミノ酸に一つ)を含む。驚いたことに、ヒトapoCIは、LALF
2005537243.tif 000002
及びCAP18
2005537243.tif 000003
のLPS結合性配列と事実上同一であるそのC末端部分におけるペプチド配列
2005537243.tif 000004
を含む（ここで、太字及びイタリック体の記号は夫々、プラスに荷電されたアミノ酸及び疎水性アミノ酸を表す）。我々は、純粋な形で且つ血漿の成分としての両方で、apoCIがLPSに事実強く結合することを引き続き実証した(実施例２、並びに図２、３、４及び５を参照)。
【００３３】
我々は、示された数字の下で見つけられうるように(http://www.expasy.ch/sprot/)、、例えばヒト(SwissProt P02654)、ヒヒ(SwissProt P34929)、犬(SwissProt P56595)、ラット(SwissProt P19939)及びマウス(SwissProt P34928)で生じるapoCIのアミノ酸配列を比較した。表１を参照。
【００３４】
【表１】
2005537243.tif 000005
【００３５】
ヒトapoCI(KVKEKLK)において見つけられるような、表1において下線を引かれたコンセンサスLPS結合性配列は、動物の変異体において事実上修飾されずに生じることが見つけられた。ヒトapoCIは、apoCIのリポタンパク質との結合を容易にする、クラス2の2つの両親媒性へリックスを形成する。構造の相同性に基づいて、動物apoCIが同様の構造をとると考えられる。
【００３６】
apoCIの作用メカニズム。
以前に議論された、失敗の実験的な殺菌治療の期待外れの結果に基づき、我々はさらに、炎症性応答の治療的減少は、非効率的であるだけでなく、望ましくないものでさえあるという仮性を展開した。なぜならば、この方法では、原因となる細菌の増殖が阻止されないからである。敗血症の原因は非常に不均一であり且つ処置の時間が処置の成功の決定因かもしれないけれども、我々は、敗血症の初期段階における炎症性応答の助長が特に抗菌の有効性を増加させ、従って生存の機会を上昇させるようであると考える。
【００３７】
リポタンパク質の一部を形成しないタンパク質例えばCAP18、LALF、CAP37、プロフェニン（prophenin）及びポリフェムシン（polyphemusin）はまたLPSを結合することができるが、一方それらは、apoCIと対照的に血液中に高濃度で生じない。さらに、これらタンパク質はLPSに関連付けられた炎症カスケードの抑制を生じ、このことは我々の仮説によると、それは疾病の成り行き(course)に不利である。結果として、細菌感染症は、改善するというよりむしろ悪化するだろう。
【００３８】
驚いたことに、我々は、apoCIの両親媒性構造によって容易にされる血漿リポタンパク質へのその結合の故に、LPSのヒトapoCIへの結合が、血液中のLPSのかなりより長い滞留時間を生じることを今立証した(実施例４及び図６を参照)。また、我々は、マウスへのapoCIとともにLPSの投与は、LPSのみを投与されたマウスと比較して強く増加された炎症性応答を生じ、それは4倍増加されたTNFα生産から判ることを立証した（実施例５及び図７を参照）。apoCIがLPSとの方向相互作用を始めるという発見は、新規であり及び細菌性敗血症の内因的制御におけるapoCIの直接の役割を指す。
【００３９】
apoCIがリポタンパク質の構成成分(キロミクロン、VLDL及びHDL)であり、及び従って、血液からゆっくりと取り除かれる故に、我々は、LPSのapoCIへの結合が血液中のLPSの滞留時間を延ばし、その結果白血球の活性化が自然な方法でさらに刺激されると考える。その結果、炎症性サイトカイン(TNFα、IL-1β及びIL-6)の生成は増加し、及び従って、抗菌性炎症カスケードが強く余分に働くだろう。このメカニズムはまた、なぜリポタンパク質が敗血症に保護的役割を果たすかを部分的に説明しうる。従って、本発明の本質は、apoCI又は本明細書で定義されたその十分なフラグメントの投与を介して、LPS及びLPSを生産する細菌の両方の初期の中和を可能にする適時の余分な強力な炎症カスケードが得られ、その結果十分に発達した敗血症又は敗血症性ショックの段階が到達されないであろうことである。
【００４０】
臨床的適用性
apoCIの小さいサイズは、いわゆる固相ペプチド合成を介して、大規模スケールでのタンパク質の入手しやすさを可能にする。これは、LPSを結合し且つ白血球のLPS誘発された活性化を刺激するところのより小さなペプチド(apoCIのフラグメント)により大きな程度で妥当する。apoCIが内因的血漿タンパク質である故に、それは十分に許容され且つ何らかの(付加的な)免疫反応をも生成しない。(その理由のために、ヒトapoCIの使用はヒトで好ましく、一方、動物では、好ましくは、対応する動物のapoCIが使用されるだろう。)。
【００４１】
本発明によれば、apoCI又はその適切なフラグメントが、敗血症又は敗血症性ショックを制御し又は予防するために、活性物質として使用されることが注目される。本発明によれば、apoCIは別の物質のための担体として使用されない。本発明によれば、apoCI又はそのフラグメントは好ましくは、脂質との複合体中結合されていない遊離のペプチドとして使用される。
【００４２】
予後又は監視のためのapoCI含量の測定。
実施例１及び図１に示されているように、激しい敗血症を有する患者は、強く低下されたapoCIレベルを示す。与えられた実施例（激しい敗血症を有する入院した17人の患者）では、apoCIレベルは、平均1.6mg/dLであった。最終的に敗血症を克服した患者(47%：8/17)におけるapoCIレベルは、3日後に漸進的な上昇を示し、そして約4週間後に正常化された。対照的に、4週間以内に敗血症で結局死んだ患者(53%: 9/17) におけるapoCIレベルは、いかなる上昇をも示さなかった。これらデータは、血漿中のapoCI濃度の監視が、敗血症の患者の生存の機会についての予後の値を有し（図１も参照）及び抗敗血症の治療の効果を監視するために使用されうることを示す。
【００４３】
A．本発明に従い使用されるべきペプチド。
上記されたように、本発明はグラム陰性細菌の敗血症の治療的処置のためにLPSに結合するapoCI及びそれから得られるペプチドの適用を含む。しかしながら、apoCI及びそれから得られるペプチドがまた、リポタイコ酸(LTA) (グラム陽性細菌におけるLPSの毒性等価物)に結合する故に、本発明は一般に細菌の感染におけるapoCIの使用を含み、従ってグラム陽性細菌の敗血症におけるapoCIの使用もまた含む。
【００４４】
特に好ましい実施態様によれば、該ペプチドは、apoCIの全アミノ酸配列からなり（又はこの配列を含み）、特にアミノ酸配列TPDVSSALDKLKEFGNTLEDKARELISRIKQSELSAKMREWFSETFQKVKEKLKIDSに従う57個のアミノ酸からなるヒトapoCIのそれからなる。
【００４５】
他の好ましい実施態様によれば、該ペプチドは、ヒトapoCIの相同物のアミノ酸配列（例えばそれらが動物界(特に哺乳動物、例えば馬、牛、犬、ウサギ、ラット、マウスで)で生じる）である又は該アミノ酸を含む。
【００４６】
他の好ましい実施態様によれば、該ペプチドは、apoCIの少なくともC末端ヘリックスである又はC末端ヘリックスを少なくとも含む。ヒトapoCIでは、該C末端ヘリックスは、アミノ酸配列MREWFSETFQKVKEKを有するアミノ酸38〜52によって形成される。好ましくは、ヒトapoCIの有用なフラグメントは、アミノ酸MREWFSETFQKVKEKLKを少なくとも含む。適切なペプチドの例は、例えばペプチドMREWFSETFQKVKEKLK及びSAKMREWFSETFQKVKEKLKIDSである。これらペプチドは、apoCIのC末端ヘリックス及び全体の推定のLPS結合性配列KVKEKLKを含む。ヒトapoCIのフラグメントの代わりに、動物apoCIの対応するフラグメントが使用されうる。
【００４７】
本明細書に定義されたapoCI及びペプチドの本発明に従い重要な特性は、LPSへのそれらの結合に加えて、リポタンパク質へのそれらの結合である。
【００４８】
Ｂ．ペプチドを得ること。
完全ヒトapoCIタンパク質(アミノ酸1〜57)が、商業的に入手可能である(BIODESIGN International、メーン州、米国、及びINTRACEL Corporation、メリーランド州、米国)。また、血液から純粋なタンパク質としてヒトapoCIを単離するための手続きが記載されている(トウニエール、1984年；ジャクソン、1986年)。最後に、ヒト又は動物apoCIをコードするアデノウイルスの発現ベクターを構築する可能性があり、その結果、apoCIは、培養中の星状細胞腫細胞によって大規模に生産されうる(キプレオス、2001年)。apoCIが非常に小さなタンパク質であるので、固相ペプチド合成によって個々のアミノ酸からそれを得る可能性がまたある(クラーク−ルイス、1986年)。この技術はまた、本明細書で記載されているように、すべてのヒトapoCI類似物及び他のapoCI由来ペプチドの合成を可能にする。
【００４９】
C．投与形式及び経路。
ヒトapoCIは水溶性であり、従って水性溶液中(例えば、生理食塩溶液中)で静脈内に投与されうる。一回(ボーラス)注入が、連続的輸液と同じく可能性がある。
【００５０】
また、apoCIは脂質結合性特性を有し、このことは効率的な腸管外のエネルギー源として臨床的に日常的に使用される商業的に入手可能なトリグリセリド豊富な脂質乳化物(例えば、Intralipido（商標）、Intrafat（商標）及びLipofundin（商標）)の成分としての静脈投与をさらに可能にするする。この場合、また、ボーラス注入及び連続的輸液のいずれも可能性がある。
【００５１】
これはすべて同様に、本発明に従うペプチドに妥当する。
【００５２】
本発明に従うペプチドの及び特にapoCIの経口投与はまた、原則として可能である(ブクリン、2002年)。
【００５３】
これら種々の投与経路に適している薬剤的に許容される担体は、当業者に当然に知られている。
【００５４】
D．治療用量。
健康な個体におけるapoCIの血漿濃度は平均6mg/dLであり(カリー、1981年)、一方、我々は、敗血症の患者におけるapoCIが強く低下されることを実証した。0.05〜500mg/dL(好ましくは0.5〜50mg/dL)の血漿濃度が、治療的に有効でありうると予想される。
【００５５】
70kgの体重を想定して2.5Lの平均血漿容量に基づき、0.02mg/kg〜200mg/kg(好ましくは0.2mg/kg〜20mg/kg)の用量が、一回(ボーラス)注入の場合に有効でありうることが計算されうる。
【００５６】
輸液として投与される場合、用量は、血液からのapoCIのクリアランスの速度に強く依存し、その結果、用量は広い範囲、例えば0.01〜10mg/kg/分間内で変化しうる。
【００５７】
Ｅ．処置の予想される効果。
apoCIが、自由に循環するLPS及びLTAを結合し、及びそれらを血液中でより長く存在させ、その結果、LPS及びLTAは、増加された炎症抗菌性反応を誘発することができ、その結果、細菌及びLPSは、より速く且つより有効に中和されることが予想される。敗血症を進行することの増加された危険（例えば、大手術の場合、又は免疫不全症を有する）にある個体におけるapoCIの予防的適用、及び敗血症又は敗血症性ショックにおけるapoCIの適用の両方が、敗血症から生じる死の防止をもたらすであろう。
【００５８】
F．敗血症又は敗血症性ショックの予後及び監視。
血漿中のapoCIレベルは、任意の適切な様式で確立されうる。好ましくは、apoCIレベルは、サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法(サンドイッチELISA)を用いて決定される。この目的のために、例えば、96ウェルのプレート(培地結合性プレート；Costar)は、ヤギ中で生成されたヒトapoCIへのポリクロナール抗体(ヤギ-抗ヒトapoCI；Academy Bio-Medical Company、ヒューストン、米国; cat.31A-Glb) (の10,000倍希釈)でコーティングされる。次に、ヒト血漿又は血清が添加され(100,000〜300,000倍稀釈)、それによって、そこに存在するapoCIは、この第１の抗体によって定量的に結合される。apoCIは、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合される第2の抗体(HRP-ヤギ-抗ヒトapoCI； Academy Bio-Medical Company、ヒューストン、米国; cat. 31H-Glb) (15,000倍稀釈)によって認識される。HRPは次に、基質として3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を用いた染色反応によって定量化され、そして該染色強度が、純粋なヒトapoCI(Labconsult、ブリュッセル、ベルギー、cat. A50366H)を用いて構築される検量線と比較される。
【００５９】
勿論、当業者は、このapoCI決定の多くの変形を知る。従って、ELISA以外の分析技術（他の検出システム（酵素及び基質）等々）が使用されうる。
【００６０】
実施例
apoCI(及びそれから得られたペプチド)はグラム陰性の(及びグラム陽性の)敗血症における保護的役割を果たすという発見は、多くの実験によって支持される。その目的のために、
a.  敗血症の患者の血液；
b.  apoCIを合成しないマウス(apoc1-/-マウス)；
c.  ヒトapoCIを過剰発現する形質転換マウス(APOC1マウス)；
d.  ヒト血液から精製されたapoCI
が使用される。
該発見は、以下に与えられた実施例中に記載される。
【実施例１】
【００６１】
敗血症における生存の機会のためのapoCIレベルの予測値。
我々は、病院に入った4週間後に、17人の敗血症の患者の血漿中のapoCIレベルを測定した。その目的のために、上記Fで記載されたように、我々はヒトapoCI特異的サンドイッチELISAを使用した。
【００６２】
結果が、図1に示される。
【００６３】
激しい敗血症で病院に入った17人の敗血症の患者の血液サンプルが28日の期間にわたり採取された。血漿では、apoCI、トリグリセリド(TG)及び総コレステロール(TC)の含量が測定された。
【００６４】
図１Ａでは、apoCI含量が時間に対してプロットされる。図１Ｂでは、apoCI含量が、トリグリセリドに富むリポタンパク質の量についての尺度としてトリグリセリド含量について訂正され、及び図１Ｃでは、apoCI含量が、循環するリポタンパク質の総量についての尺度としてトリグリセリド及びコレステロールの両方について訂正された。敗血症を克服した患者(閉じた記号; n=9±SEM)と、30日以内に敗血症で死んだ患者(開いた記号; n=8±SEM)との間で区別された。点線は、健康な個体で見られる値を示す。
【００６５】
調査に含まれていた全ての患者は、血液中の強く低下されたapoCIレベル(約1.6mg/dL)を示した。4週間以内に敗血症の結果で死んだ患者は、敗血症を克服した患者(約1.9mg/dL)よりも入院時に、より低いapoCIレベル(約1.3mg/dL)を示した。apoCIレベルが、敗血症を克服した患者において4週間以内に事実上正常化した(約5mg/dL)一方、apoCIレベルは、敗血症で結局死んだ患者においていかなる上昇も示さなかった。
【００６６】
これらデータは、apoCIの血漿レベルが、敗血症における生存の機会のための予測値を有することを示す。また、それらは、apoCIが敗血症で死ぬ患者において不足し、そしてそれ故に、治療的使用を有しうるという我々の仮定を強調する。
【実施例２】
【００６７】
精製されたapoCIは、LPSに強く結合する。
本実施例では、精製されたヒトapoCIはLPSに強く結合し且つこの結合は電気泳動力（アガロースゲル電気泳動）に耐えることが示される。これは、LPSの自然に生じるミセル構造の損失に関与したことが見つけられた。
【００６８】
結果が、図２、３及び４に示される。
【００６９】
LPS Re595(Salmonella minnesota)は、(レンセン、1997年に)記載されているように125Iを用いて放射能的にラベル付けされ、そしてヒト血液から単離された、増加する量のヒトapoCIを用いてインキュベーションされた(30分、37℃)(トウニエール、1984年)。次に、インキュベーション容量が、アガロースゲルに移され(位置Rf 0)、その後、2時間、電気泳動フィールドが適用された(いわゆるアガロースゲル電気泳動)。電気泳動後に、125I-LPSがオートラジオグラフィーによって視覚化された。そのマイナス荷電によって、LPSは、正極(陽極)に移動する傾向があり、これはしかしながら、LPSがアガロース・マトリックスによって形成された比較的小さな孔を通過することができない大きなミセルの構造を形成するという点で抑制される。しかしながら、少量のapoCIの追加(LPSの1分子に関してapoCIの0.5分子のみ)は、正極へのLPSの移動を完了することを既に生じ、それはapoCIがLPSに結合し、それによって比較的小さいapoCI/LPS複合体を形成する(図２Ａ)ことを示す。
【００７０】
また、固定された量のapoCIの移動に対するLPSの増加する量の影響が、決定された。その目的のために、apoCIが、ヒトapoCI(Academy Bio-Medical Company、ヒューストン、米国；cat. 31H-G1b)に対して向けられたセイヨウワサビペルオキシダーゼを結合した抗体を用いたイムノブロッティングによって電気泳動後に、ゲル中で視覚化された。LPSのapoCIへの結合は、正極へのapoCIの加速された移動を生じ、それは、apoCIがLPSとの物理的な相互作用を有効に始めることを示す(図２Ｂ)。LPSのapoCIへの結合の親和性はLPSが用量依存性様式でapoCI特異的抗体を用いたアガロースゲルのイムノブロッティングの間にapoCIのデモンストレーションを防ぐ程に高いことがわかった(図２Ｂ)。
【００７１】
特定の量のヒトapoCI(0.75ng/mL)は、増加するモル比でLPSとともにインキュベーションされ、その後apoCI濃度が、上記Fで記載されたようにヒトapoCI特異的サンドイッチELISAを用いて決定された。apoCI濃度が読まれたところからの染色反応のLPS誘発された阻害は、LPSの不存在下で最大染色のパーセンテージとして決定された(n=2±SEM) (図３)。再び、LPSのapoCIへの結合が、用量依存性様式でapoCI特異的抗体を用いたapoCIの反応を防ぐとわかった。LPSのapoCIへの200倍モル過剰の添加は、染色反応の40%より上、すなわちapoCI濃度のほとんど2倍の過小評価の阻害を生じた。apoCIIIはapoCIと等しいサイズ(79個のアミノ酸)及び構造(2つの両親媒性ヘリックス)を有するけれども、LPSは、同等のapoCIII特異的サンドイッチELISAを用いるapoCIIIの濃度の数量化に影響を有しなかった(図３)。
【００７２】
最後に、LPSのモノマー化速度へのapoCIの影響が研究された。蛍光(フルオレセインイソチオシアネート； FITC)ラベル付けされたLPSは、蛍光性をほとんど示さない。なぜならば、LPSのミセルの構造は、あまりにも緊密に互いにパックされた蛍光を発するFITC分子を生じ、蛍光消光の現象を生じるからである。FITC-LPS Re595 (100 ng)は、純粋なヒトapoCI(モル比1：1、1：5、1：10及び1：20で)でインキュベーションされ、その後、蛍光の発生が、蛍光計(fluorimeter)を用いて経時的に追跡された。ApoCIは、FITC蛍光における増加を用量依存性様式で強く増加させるとわかり、それはapoCIがLPSをモノマー化することができる（すなわち、それをミセルの形から自由にすること）ことを示す(図４Ａ)。対照的に、同等のサイズ及び構造を有するアポリポタンパク質CIII(apoCIII)は、ほとんど有効でないとわかった(図４Ｂ)。
【実施例３】
【００７３】
血漿apoCIは、LPSに結合する。
我々は、実施例２に記載されたように、FITC-LPSのモノマー化に対するネズミ血漿中のapoCIレベルの影響を決定した。その目的のために、FITC-LPSは、野生型のマウス、apoCIに障害のある遺伝的に修飾されたマウス(apocl-/-)、又はヒトapoCIヘミ接合体を発現する遺伝的に修飾されたマウス(APOC1+/0)若しくはホモ接合体(APOC1+/+)から単離された血漿を用いてインキュベーションされた。
【００７４】
結果が、図５に示される。
【００７５】
FITC-LPS Re595(100 ng)が、様々なマウスタイプの血液から単離された血漿(0.125%)を用いてインキュベーションされ、その後、蛍光の発生が蛍光計を用いて経時的に追跡された。マウス血漿中のヒトapoCIの発現は、FITC-LPSモノマー化のapoCI用量依存性増加を生じ、それは最大で32%であった。対照的に、FITC-LPSのモノマー化は、マウスapoCIの不存在により、60%だけ減少されるとわかった(n=4±SEM)。これは、ヒトapoCIのように、マウスapoCIがLPSをモノマー化することが出来ることだけでなく、特にapoCIの内因的存在はマウス血漿の総LPS脱解された能力に相当な部分貢献することを示す。
【実施例４】
【００７６】
ApoCIは、肝臓によるLPSの取り込みを防ぐことによって血液中のLPSの滞留時間を拡張する。
我々は、精製されたapoCIの非存在又は存在下で野生型マウスにLPSを静脈内に投与した。apoCIの追加は、HDLとの増加された相互作用を強く介して、血液中のLPSの滞留時間を拡張するとわかった。
【００７７】
結果が、図６に示される。
【００７８】
野生型(C57B1/6)マウスは麻酔され、そしてより下大静脈を介して、放射能的(125I)ラベル付けされたLPS Re595(10μg/kg)を、夫々apoCI(モル比LPS：apoCI=1：0.2、1：0.5、1：1及び1: 16) のなし及び有りとウシ血清アルブミン(モル比LPS：アルブミン=1：16)で夫々静脈内に注入された。血液サンプル及び肝臓組織の小片が、注入後、時間=2、5、10、20及び30分に採取された。この後に、マウスが犠牲にされた。次に、血清及び肝臓サンプル中のLPSの量が、放射線放射の量に基づいて定量化された。また、血清サンプルが、LPS：apoCI (1: 1)の注入の30分後に採取され、そして様々なリポタンパク質にわたる125I-LPSの分布を研究するためにアガロースゲル電気泳動に付された。リポタンパク質脂質は、スーダンブラック及びオートラジオグラフィーによる125I-LPSを用いて視覚化された。図６Ａ及び６Ｂでは、肝臓及び血清中の125I-LPSの量が夫々、時間に対する注入された用量のパーセンテージとしてプロット(n=3±SEM)される。図６Ｃは、リポタンパク質にわたる125I-LPSの分布を示す。apoCIの存在は、血液からLPSの減少を強く且つ用量依存的に阻害することが見つけられた。1:1のモル比で既に、肝臓によるLPSの取り込みが8倍減少された。それ故に、apoCIのLPSへの強い結合(実施例２を参照)は、血液においてまた関連しているとわかる。これは、HDLへの強く増加されたapoCIで仲介された結合を介して血液中のLPSの延長された滞留時間を生じ（図６Ｃ）、それによってなかんずく白血球との相互作用を改善し、及び結果的に、強く刺激された炎症性反応を生じる(実施例５を参照)。
【実施例５】
【００７９】
ApoCIは、マウスにおけるLPS誘発された炎症性応答を刺激する。
我々は、精製されたapoCIの不存在又は存在において野生型のマウスにLPSを静脈内に投与した。apoCIの追加は、LPS誘発された炎症性応答を強く増加させるとわかった。
【００８０】
結果が、図７に示される。
【００８１】
野生型(C57B1/6)マウスが、apoCI(モル比LPS：apoCI = 1：5)なし及び有りで、LPS Re595(25μg/kg)を尾静脈経由で注射された。血液サンプルが、注射後、時t=0、30、60、90、120及び180分で採取された。サンプルでは、次にTNFαの量が、添付の指示書(Immunosource、ハレ、ベルギー、カタログ番号BMS607MST)に従いマウスTNFα特異的ELISAを用いて定量化され、そして次に血漿中のTNFαの量が時間に対してプロットされた。apoCIのLPSへの追加は、LPS誘発されたTNFαレベルの4倍増加(10.8±4.5対2.8±1.7 ng/mL)を生じ、一方、LPSなしのapoCIの等しい量は、TNFαを誘発する効果を有しない(n=6±SEM)。
【実施例６】
【００８２】
ApoCIは、ヒトにおけるLPS誘発された炎症性応答を刺激する。
我々は、心肺バイパスを用いた心臓手術の間に内毒素血症を進行した又はしなかった患者における血漿apoCIレベルと、手術の間のTNFαレベルとの間の相関を測定した。apoCIレベルは、進行した内毒素血症の場合、TNFα応答に強く正に関連づけられるとわかった。
【００８３】
結果が図８に示される。
【００８４】
心肺バイパスの間、一時的に、低い酸素圧力が、血液中で発生し、これは腸から血液へのLPSの漏れを通じて内毒素血症を伴う。我々は、心肺バイパスに関連する心臓手術を受けた160人の患者における手術前の血漿apoCIレベルと血漿TNFαレベルとの間の相関を調査した。血漿サンプルが、脂質パラメーター(apoCI、apoCIII、apoE、トリグリセリド及び総コレステロール)の測定の目的で手術前に採取された。また、血漿サンプルは、麻酔の誘導後(時間1)、大動脈クランプの除去後(時間２)及び体外の灌流の終了30分後(時間3)に採取された。時間1、2及び3で、TNFαレベルが測定され、時間2及び時間3の両方で内毒素血症を進行した(LPS>5 pg/mL)又は進行していない(LPS<5 pg/mL)患者の間での差があった。
R=スピアマンの順位相関係数。
*=統計的に有意(P<0.05)
【００８５】
強く有意な関連は、心肺バイパスを用いた心臓手術の間に内毒素血症を進行した患者におけるapoCIレベルとTNFαレベルとの間に存在し、しかし内毒素血症を進行しなかった患者では存在しないことが見つけられた。そのような相関は、他のアポリポタンパク質(apoCIII、apoE)又は中性脂質(トリグリセリドに富むリポタンパク質の量の尺度としてのトリグリセリド、及び循環リポタンパク質の総量の尺度としての総レステロール)については実証されず、このことは、効果が結果がapoCI特異的であることを示す。
【００８６】
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【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、敗血症患者の血漿中のapoCIレベルと、病院への入院後の時間の経過との間の関係を示す。該図は、敗血症の生存の機会のための、apoCIレベルの予測値を示す。
【図２】図２は、アガロース基体を通るapoCI及び／又はLPSの移動に対する電気泳動フィールドの影響を示す。該図は、LPS塊の細化、及びまた特異的抗体によるapoCIの減少された認識を生じる、apoCIとLPSとの間での物理的な相互作用を示す。
【図３】図３は、apoCIの濃度がそれによって決定されるELISAの間の、LPS:apoCIモル比と染色反応の阻害との間の関係を示す。該図は、特異的抗体のapoCIへの結合を防ぐことができる、apoCIとLPSとの間の強い相互作用を示す。
【図４】図４は、LPSの時間依存性脱塊に対するapoCI及びapoCIIIの影響を示す。該図は、LPSの用量依存性モノマー化は、apoCIによりミセル化され、一方、apoCIIIはほとんど有効でないことを示す。
【図５】図５は、LPSの時間依存性モノマー化に対するマウス血漿中のapoCI濃度の影響を示す。該図は、apoCIの不存在はLPSのモノマー化を強く阻害し、一方、ヒトapoCIの発現はLPSのモノマー化を用量依存的に増加させることを示す。
【図６】図６は、マウスにおける静脈注射後に放射能でラベル付けされたLPSの挙動に対するapoCI及びウシ血清アルブミンの影響を示す。該図は、apoCIが肝臓によるLPSの取り込みを強く減少することができ、一方、血液中のLPSの滞留時間が、LPSのHDLへのapoCI誘発された結合を通じてかなり増加することを示す。対照的に、ウシ血清アルブミンは有効でないとわかった。
【図７】図７は、LPS誘発された炎症性応答に対するapoCIの影響を示す。該図は、LPSのapoCIとの相互作用が、炎症性応答（すなわち、TNFα誘発)を強く増加させることを示す。
【図８】図８は、心肺バイパスを用いた心臓手術の間に、内毒素血症を進行する患者の血漿におけるapoCIレベルと手術前及び手術後のTNF-αレベルとの相関を示す。該図は、内毒素血症を進行する患者におけるapoCIレベルとTNFαレベルとの間の強く有意な正の関係があり、しかし、内毒素血症を進行しない患者において関係がないことを示す。そのような関係は、apoCIII又はapoEについては実証されえなかった。
【図１】
2005537243.tif 000006
【図２】
2005537243.tif 000007
【図３】
2005537243.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005537243.tif 000012
【図８】
2005537243.tif 000013
【国際調査報告】
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