(57)【要約】本発明は、酵素で処理されたチーズミルクからチーズを製造するためのプロセスおよびその結果生じる生成チーズの食品製品の成分としての使用法に関する。より詳しくは、本発明は、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼで処理されたチーズミルクからチーズを製造するためのプロセスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チーズ中のオイリングオフ効果を減少および/またはチーズ収率を増加するために、ホスホリパーゼA1およびホスホリパーゼA2ならびにそれらの組合せ品からなる群から選択されるホスホリパーゼ、ならびにリゾホスホリパーゼをチーズミルクに添加し、そして該チーズミルクからチーズを製造することを特徴とするチーズの製造方法。
【請求項２】
前記ホスホリパーゼAの量がミルク脂肪1g当たり酵素蛋白質0.003〜0.3mgの範囲内である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ホスホリパーゼAの量がミルク脂肪1g当たり酵素蛋白質0.01〜0.3mgの範囲内である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスホリパーゼAの量がミルク脂肪1g当たり酵素蛋白質0.03mgである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼが、チーズミルクの脂肪および/または蛋白質含有量の標準化中にチーズミルクに添加される請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼが、スターター培養物と同時に添加される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼが、チーズレンネットと同時に添加される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼの酵素蛋白質の含有量を、前記酵素がチーズミルク中で作用した後に、除去または減少する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼを、該酵素がチーズミルク中で作用した後に、不活性化する工程をさらに含む。ことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記チーズが、チーズカードのレンネット凝集によって製造されたレンネットカードチーズ、熟成チーズ、フレッシュチーズ、および酸凝集チーズからなる群から選択される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記チーズがカンペシーノ（Campesino）、チェスター（Chester）、ダンボー（Danbo）、ドラバント（Drabant）、ヘルゴート（Herregard）、マンチェゴ（Manchego）、プロボローネ（Provolone）、サン・ポーラン（Saint Paulin）、ソフトチーズ、スベシア（Svecia）、タレッジョ（Taleggio）、ホワイトチーズ、チェダー（Cheddar）、コルビー（Colby）、エダム（Edam）、マンステール（Muenster）、グリエール（Gryere）、エメンタール（Emmenthal）、カマンベール（Camembert）、パルメザン（Parmesan）、ロマーノ（Romano）、モッツァレラ（Mozzarella）、フェタ（Feta）；クリームチーズ、ヌーシャテル（Neufchatel）、クワルク（Quarg）、およびケソ・ブランコ（Queso Blanco）からなる群から選択される請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記チーズミルクがチーズの製造前に均質化工程にかけられる請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記チーズがデニッシュ・ブルー（Danish Blue）チーズである請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼの活性がホスホリパーゼA活性およびリゾホスホリパーゼ活性の両活性を有する単一酵素により提供される請求項１〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記チーズを食品製品に加工する工程をさらに含む、請求項１〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記食品製品が、ピザ、インスタント食品、トースト、バーガー、ラザニヤ、ドレッシング、ソース、チーズ粉、チーズフレーバー、およびプロセスチーズからなる群から選択される請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜14のいずれか１項の方法によって調製されるチーズ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素処理されたチーズミルクからチーズを製造するための方法のB法およびその結果生じる生成チーズを食品製品の成分として使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
チーズ製品において、脂肪相の状態はチーズの性質にとって重要である。脂肪相は、製造および熟成中のチーズの安定化のために特に重要であるが、また使用され、そのまま食され、あるいはインスタント食品、たとえばピザ、トースト、またはバーガーに使用されるための最終チーズのためにも重要である。
【０００３】
また、チーズ製品のオイリングオフ性質は、重要な性質パラメーターである。オイリングオフとは、貯蔵および融解時に遊離の油を生じる傾向のことである。過剰なオイリングオフは、チーズが使用される加熱製品、たとえばピザおよび関連食品に、最もしばしば関連する欠陥である（たとえば、Kindstedt J.S.; Rippe J. K. 1990, J. Dairy Sci. 73: 867-873を参照）。消費者の食事性脂肪水準に対する関心が高まるにつれて、この欠陥を制御/除去することは益々重要になっている。製品中の遊離の油/脂肪は、高い脂肪含有量と認識され、一般に望ましくない。
【０００４】
チーズ製造のための改良された方法、ことにチーズ中の脂肪の安定性を改良するためのプロセスが必要である。
WO 00/54601は、チーズの性質、ことに脂肪相の安定性を改良するための、a)ホスホリパーゼでチーズミルクを処理し、そして（b)前記チーズミルクからチーズを製造する工程を含む方法を開示している。ホスホリパーゼは、ホスホリパーゼA1、ホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼB、およびこれらの組合せ品からなる群から選択され、チーズ中のオイリングオフ効果を減少および/またはチーズ収率を増加するために十分な量で添加される。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、チーズ中のオイリングオフ効果を減少および/またはチーズ収率を増加するための有効量で、ホスホリパーゼAとリゾホスホリパーゼの組合せ品をチーズミルクに添加し、および該チーズミルクからチーズを製造することを含むチーズを製造するための方法に関する。
本発明は、さらにチーズ中のオイリングオフ効果を減少および/またはチーズ収率を増加するために、ホスホリパーゼA1およびホスホリパーゼA2ならびにこれらの組合せ品からなる群から選択されるホスホリパーゼ、ならびにリゾホスホリパーゼを、チーズミルクに添加し、および該チーズミルクからチーズを製造することを含むチーズを製造するための方法に関する。
【０００６】
ここにチーズの性質を改良するためのプロセスが提供され、ことにチーズおよびチーズミルクの脂肪安定性が本発明により改善される。操作の如何なる理論にも限定されるものではないが、チーズ製造中のチーズミルクへのホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼの添加は、前記処理チーズミルクから製造されたチーズの熱処理中の安定性を促進すると信じられている。本発明のプロセスにより、チーズ製造における収率を増加するための方法もまた提供される。
【０００７】
本発明は、さらにチーズ製品の製造におけるホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼの組合せ使用に関するものであり、ここにおいてホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼ処理は、該チーズ製造中にチーズミルクに対して実施される。本発明は、さらに入手できるチーズ、ことに本発明に記載されたプロセスのいずれかにより入手されるチーズにも関する。
【０００８】
本発明は、またチーズ中のオイリングオフ効果を減少および/またはチーズ収率を増加するために、ホスホリパーゼA1およびホスホリパーゼA2ならびにこれらの組合せ品からなる群から選択される精製ホスホリパーゼ、ならびにリゾホスホリパーゼを、チーズミルクに添加し、および該チーズミルクからチーズを製造することを含む、チーズを製造するための方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
チーズ中でのオイリングオフ効果を減少および/またはチーズ収率を増加するために、ホスホリパーゼAとリゾホスホリパーゼの組合せ品をチーズミルクに添加し、そして該チーズミルクからチーズを製造することを含むチーズを製造するための方法。ホスホリパーゼAは、好ましくはホスホリパーゼA1、ホスホリパーゼA2ならびにこれらの組合せ品なる群から選択されるものである。
ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼは、チーズ製造方法中にチーズミルクに添加される。ここに使用されている如く、術語「チーズミルク」は、それからチーズが調製されるミルク基材の組成物を意味する。
【００１０】
ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼは、チーズ製造方法中のいずれかの適切な段階で添加されるであろう。本発明の好ましい具体例において、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼは、チーズミルクの脂肪および/または蛋白質含有量の規格化中に、より好ましくは、チーズミルクがチーズバットに満たされると同時に、スターターカルチャがチーズミルクに添加されると同時に、およびチーズレンネットがチーズミルクに添加されると同時に添加される。
【００１１】
ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼは、チーズ製造方法中に同時にまたは順次添加されるであろう。1具体例において、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼは、プロセス中の異なる段階でチーズミルクに添加されるであろう。たとえば、ホスホリパーゼAは、リゾホスホリパーゼの前に添加される、またはリゾホスホリパーゼはホスホリパーゼAの前に添加される。好ましい具体例において、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼは、チーズ製造プロセス中に同時に添加される。
【００１２】
チーズミルクおよびチーズの製造：
本発明の文脈で、術語「チーズ」は、如何なる種類のチーズ、ならびにたとえばナチュラルチーズ、チーズ類似体およびプロセスチーズに関する。チーズは、業界で知られている如何なる適切なプロセス、たとえばレンネットを用いたチーズミルクの酵素的凝集により、または食品用酸もしくは乳酸菌生育により製造した酸を用いたチーズミルクの酸性凝集により得られるであろう。1具体例において、本発明のプロセスで製造されたチーズは、レンネットカードチーズである。レンネットは、商業的に入手できる。たとえば、Naturen（商標）(動物性レンネット)、Chymax（商標）(発酵産生キモシン)、Microlant（商標）(発酵産生微生物凝集剤)があり、全てデンマークのChr. Hansen A/S社から入手可能である。チーズミルクは、通常のチーズ製造方法にかけられるであろう。
【００１３】
プロセスチーズは、好ましくは、ナチュラルチーズまたはチーズを調理し、およびたとえば乳化塩（たとえばリン酸塩およびクエン酸塩）を用いて乳化したチーズ類似体から製造される。プロセスは、さらに香辛料/調味料の添加を含むであろう。術語「チーズ類似体」は、脂肪(たとえば、ミルク脂肪（たとえばクリーム）を組成物の一部として含む、およびさらに非ミルク構成成分、たとえば植物油を、組成物の一部として含む、チーズ様製品に関する。チーズ類似体の1例は、チーズ基材である。
【００１４】
本発明の方法により製造されたチーズは、全種類のチーズ、たとえば例としてカンペシーノ（Campesino）、チェスター（Chester）、ダンボー（Danbo）、ドラバント（Drabant）、ヘルゴート（Herregard）、マンチェゴ（Manchego）、プロボローネ（Provolone）、サン・ポーラン（Saint Paulin）、ソフトチーズ、Svecia、Taleggio、チーズカードのレンネット凝集により製造したレンネットカードチーズを含むホワイトチーズ；熟成チーズたとえばチェダー（Cheddar）、コルビー（Colby）、エダム（Edam）、マンステール（Muenster）、グリエール（Gryere）、エメンタール（Emmenthal）、カマンベール（Camembert）、パルメザン（Parmesan）およびロマーノ（Romano）；フレッシュチーズたとえばモッツァレラ（Mozzarella）およびフェタ（Feta）；酸凝集チーズたとえばクリームチーズ、ヌーシャテル（Neufchatel）、クワルク（Quarg）、カッテージ（Cottage）チーズおよびケソ・ブランコ（Queso Blanco）；ならびにパスタ・フィラータ（pasta filata）チーズである。1具体例は、本発明のプロセスによるピザチーズの製造に関する。
【００１５】
チーズ製造において、ミルク中のカゼインの凝集は、好ましくはいわゆるレンネットカードおよび酸カードチーズの2方法のいずれか1法で実施される。チーズ製造における、これら2種類のカードは、チーズの型の主要な2群をなす。フレッシュ酸カードチーズは、酸性化又は酸および熱の組合せ品経由でミルク、クリームまたはホエーの凝集により製造される各種のチーズに関するものであり、これらのチーズは、一旦熟成なしの製造が終了すれば直ぐ消費できる。フレッシュ酸カードチーズは、凝集が通常pH6.4〜6.6でレンネットの作用で誘導されるレンネットカードチーズ種（たとえばカマンベール（Camembert）、チェダー（Cheddar）、エメンタール（Emmenthal））とは一般に異なる。すなわち凝集は、通常カゼインの等電点、すなわちたとえばpH4.6または高い温度が用いられた時にはより高いpH、例としてリコッタ（Ricotta）ではpH6.0および80℃、の近くで起こる。本発明の好ましい具体例において、チーズはレンネットカードチーズの種類に属する。
【００１６】
モッツァレラ（Mozzarella）は、いわゆるパスタ・フィラータ（pasta filata）、すなわち延伸カードチーズの一員である。これらのチーズは、通常熱水中でのフレッシュカードの特徴的な可塑化および練り合わせ処理により特徴付けられ、製品チーズにその特徴的な線維質構造ならびに融解および延伸性質を付与する（たとえば、“Mozzarella and Pizza cheese”, Paul S. Kindstedt, Cheese： Chemistry, physics and microbiology, Volume 2: Major Cheese groups, second edition, page 337-341, Chapman & Hallを参照）。ここに使用されている如くピザチーズは、ピザに適したチーズを含み、通常パスタ・フィラータ（pasta filata）/延伸カードチーズである。1具体例において、本発明のプロセスは、パスタ・フィラータ（pasta filata）チーズ、たとえばモッツァレラ（Mozzarella）の製造に関していえば、さらに熱/延伸処理を含む。
【００１７】
本発明のさらなる具体例において、チーズミルクは、全体または部分において、乾燥ミルク画分、たとえば例として、全脂粉乳、スキムミルク粉乳、カゼイン、カゼイン塩、全乳蛋白質もしくはバターミルク粉、またはこれらのいずれかの組合せ品から調製される。
好ましい具体例において、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼが添加されるべき、チーズミルクは、クリームを含むかまたはクリームからなる。さらなる具体例において、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼが添加されるべき、チーズミルクは、バターを含むかまたはバターからなる。またさらなる具体例において、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼが添加されるべき、チーズミルクは、バターミルクを含むかまたはバターミルクからなる。
【００１８】
異なる動物種からのミルクは、チーズの製造に使用されるであろう。かくて、「ミルク」は、たとえば牛、羊、山羊、バッファロー、または駱駝の搾乳により得られる乳汁分泌物であろう。
【００１９】
チーズ製造用のミルクは、原乳組成物の全部または一部の除去および/またはそのような組成物の追加量の添加により望ましい組成物に規格化されるであろう。これは原乳が酪農工場に到着した時点で、原乳をクリームおよびスキムミルクに分離することで実施されるであろう。かくて、チーズミルクは、その望ましい最終組成物を得るように、原乳を分画し、および画分を再結合したりすることにより通常行われる如く調製されるであろう。分離は、連続遠心分離でスキムミルク画分を非常に低い脂肪含有量（すなわちたとえば、0.5%未満）およびクリームをたとえば脂肪分35%超にすることでなされるであろう。チーズミルクは、クリームおよびスキムミルクを混合することにより調製されるであろう。
【００２０】
ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼが添加されるべきチーズミルクは、たとえばリシチンの様なリン脂質を含む。チーズミルクは、本発明のプロセスにより製造されるべきチーズに対して適切であると判明している如何なる全脂肪含有量をも有するであろう。たとえば(乾燥物の)約25％の脂肪であり、たとえば10〜50％の脂肪範囲内であり、この内、たとえば約0.06％がリン脂質であり、たとえば全脂肪含有量の0.02〜5％(w/w)がリン脂質である。
【００２１】
チーズミルク中の細菌数を低く保つために通常の手段が採られるであろう。チーズミルク中の熱変性蛋白質は、ミルクの凝集に悪影響を与え、チーズの熟成を遅らせるので、スキムミルクの殺菌は通常好ましくない。スキムミルク画分の細菌数は、従って他の技術、たとえば精密濾過や遠心除菌により低くされるであろう。クリームは、好ましくは製品中の細菌数を低下させるために殺菌されるであろう。他の好ましい具体例において、チーズミルクは生の非殺菌ミルクである。
本発明の具体例において、チーズミルクはチーズ製造前、たとえばデニッシュ・ブルー（Danish Blue）チーズの製造時に、均質化プロセスにかけられるであろう。
【００２２】
酵素処理
本発明の方法中の酵素処理は、チーズミルク中にホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼを分散し、酵素反応が適切な温度で適切な保留時間で起こるようにして、実施されるであろう。ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼでの処理は、業界で良く知られている原理に従い選択された酵素に適するよう選ばれた条件下で実施されるであろう。
酵素処理は、何れかの適切なpH、たとえば2〜10の範囲内の、たとえば4〜9または5〜7のpHで、実施されるであろう。チーズ製造プロセス中に生じるチーズミルクの自然のpHで、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼを働かせることが好ましいであろう。
【００２３】
本方法は、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼが凝集温度、たとえば25〜45℃（たとえば少なくとも5分間、たとえば少なくとも10分間または少なくとも30分間、たとえば5〜60分間）で作用する様に実施されるであろう。
随意に、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼをチーズミルクに作用させた後、ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼ酵素蛋白質を除去、減少、不活性化、またはこれらのいずれかの組合せを行う。
【００２４】
ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼは、望ましい性質を有するチーズを製造するための適量を添加される。好ましくは、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼは、チーズでのオイリングオフ効果を減少しおよび/またはチーズ収率を増加するための有効量で添加される。ホスホリパーゼAの適量は、通常、ミルク脂肪1g当たり酵素蛋白質0.003〜0.3mgの範囲内であり、好ましくはミルク脂肪1g当たり酵素蛋白質0.01〜0.3mg、さらに好ましくはミルク脂肪1g当たり酵素蛋白質0.03mgである。
リゾホスホリパーゼの用量は、通常、ミルク脂肪1g当たり酵素蛋白質0.005〜0.5mgの範囲内であり、好ましくはミルク脂肪1g当たり酵素蛋白質0.01〜0.5mg、さらに好ましくはミルク脂肪1g当たり酵素蛋白質0.05mgである。
【００２５】
本発明の方法で使用される酵素
リン脂質たとえばレシチンまたはホスファチジルコリンは、外位置（sn-1）および中位置(sn-2)において2個の脂肪酸でエステル化され、ならびに第3位において燐酸でエステル化されたグリセロールからなり、燐酸は次にアミノアルコールにエステル化されるであろう。ホスホリパーゼは、リン脂質の加水分解に関与する酵素である。リゾリン脂質を形成するために1個の脂肪族アシル基（夫々、sn-1およびsn-2位において）を加水分解するホスホリパーゼA1およびA2を含む、数種類のホスホリパーゼ活性は識別可能である。リゾホスホリパーゼは、リゾリン脂質中に残存する脂肪族アシル基を加水分解する。
【００２６】
本発明の方法において使用される酵素は、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼを含む。術語ホスホリパーゼAは、ホスホリパーゼA1、ホスホリパーゼA2、ならびにホスホリパーゼA1とホスホリパーゼA2の組合せ品、たとえばホスホリパーゼA1活性を有する酵素およびホスホリパーゼA2活性を有する酵素の組合せ品、またはホスホリパーゼA1およびホスホリパーゼA2活性の両活性を有する単一酵素を含む。
【００２７】
ホスホリパーゼA1は、標準酵素EC分類法に従って、EC3.1.1.32と定義される。
公式名：ホスホリパーゼA1。
触媒される反応：ホスファチジルコリン＋H2O ⇔
2-アシルグリセロホスフォコリン＋脂肪族陰イオン。
コメント：EC3.1.1.4よりより広い特異性を有する。
【００２８】
ホスホリパーゼA2 は、標準酵素EC分類法に従って、EC3.1.1.4と定義される。
公式名：ホスホリパーゼA2。
代替名：ホスファチジルコリン2-アシルヒドロラーゼ。レシチナーゼa;
ホスファチダーゼ；またはホスファチドリパーゼ。
触媒される反応：ホスファチジルコリン＋H2O ⇔
1-アシルグリセロホスフォコリン＋脂肪族陰イオン。
コメント：ホスファチジルエタノールアミン、コリンプラスマローゲン、およびホスファチドに作用して、2-位置に付加した脂肪酸を取り除く。
【００２９】
リゾホスホリパーゼは、標準酵素EC分類法に従って、EC3.1.1.5と定義される。
公式名：リゾホスホリパーゼ。
代替名：レシチナーゼb; リゾレシチナーゼ；ホスホリパーゼB；またはPLB。
触媒される反応：2-リゾホスファチジルコリン＋H2O ⇔
グリセロホスフォコリン＋脂肪族陰イオン。
【００３０】
ホスホリパーゼA活性は、他の活性を有する酵素、たとえばホスホリパーゼA活性を有するリパーゼによっても同様に提供されるであろう。ホスホリパーゼA活性は、たとえばホスホリパーゼA副活性を有するリパーゼからであろう。本発明の他の具体例において、ホスホリパーゼA酵素活性は、本質的にホスホリパーゼA活性のみを有する酵素により提供され、その時にホスホリパーゼA酵素活性は副活性ではない。
【００３１】
ホスホリパーゼAは、如何なる起源のものでも良いであろう。たとえば、動物起源（たとえば、哺乳動物）、たとえば膵臓から（たとえば牛または豚の膵臓）、または蛇毒もしくは蜂毒からであろう。代替的に、ホスホリパーゼAは、微生物起源であろう。たとえば、糸状菌、酵母または細菌から、たとえばアスペルギルス（Aspergillus）属または種、たとえばアスぺルギルス・ニガー（A. niger）、ディクチオステリウム（Dictyostelium）、たとえばディクチオステリウム・ディスイウデウム（D.discoideum）;ムコール（Mucor）たとえばムコール・ジャバニクス（M.javanicus）、ムコール・ムセド（M.mucedo）、ムコール・スブチリシウム（M.subtillissimus）;ニューロスポラ（Neurospora）たとえばニューロスポラ・クラッサ（N.crassa）;リゾムコール（Rhizomucor）たとえばルゾムコール・プシルス（R.pusillus）；
【００３２】
リゾプス（Rhizopus）たとえばリゾプス・アルヒツス（R.arrhizus）、リゾプス・ジャポニクス（R.japonicus）、リゾプス・ストロニフェル（R.stolonifer）;シュレロチィニア（Sclerotinia）たとえばシュレロチニア（S. libertiana）;トリコフィトン（Trichophyton）たとえばトリコフィトン・ルブルム（T.rubrum）;フェツエリニア（Whetzelinia）たとえばフェツエリニア・シロチオルム（W. scierotiorum）;バシルス（Bacillus）たとえばバシルス・メガテリウム（B.megaterium）、バスルス・ズブチリス（B.subtilis）;シトロバクター（Citrobacter）たとえばシトロバクター・フロインディー（C.freundii）;エンテロバクター（Enterobacter）たとえばエンテロバクター・エロゲネス（E.aerogenes）、エンテロバクター・クロアカー（E.cloacae）、
【００３３】
ドワードシーラ（Edwardsiella）、エドワードシーラ・タルバ（E.tarda）;エルウィニア（Erwinia）たとえばエルウィニア（W.herbicola）;エシィエリシア（Escherichia）たとえばエシェリシア（E.coli）;クレブシーラ（Klebsiella）たとえばクレブシーラ・ニューモニア（K.pneumoniae）;プロテウス（Proteus）たとえばプロテウス・ブルガリス（P.vulgaris）;プロビデンシア（ Providencia）たとえばプロビデンシア・スツアルティー（P.stuartii）;サルモネラ（Salmonella）たとえばサルもネラ・ティフィムリウム（S.typhimurium）;セラチア（Serratia）たとえばセラチア・リクエファシエンス（S.liquefasciens）、セラチア・マルセッセンス（S.marcescens）;シゲラ（Shigella）たとえばシゲラ・フレクスネリ（S.flexneri）;ストレプトマイセス（Streptomyces）たとえばストレプトマイセス・ビオレセオルバー（S.violeceoruber）;イェルシニア（Yersinia）たとえばイェルシニア・エンテロコリチカ（Y.enterocolltica）であろう。
【００３４】
かくて、ホスホリパーゼAは、糸状菌類、たとえば、ピレノミセテス（Pyrenomycetes）の種から、たとえばフザリウム（Fusarium）属、たとえばフザリウム・クルモルム（F.culmorum）、フザリウム・ヘテロスポルム（F.heterosporum）、フザリウム・ソラニ（F. solani）の菌株またはフザリウム・F.oxysporumの菌株に由来するであろう。スホリパーゼAは、またアスペルギルス（Aspergillus）属中の糸状菌株からでもあろう。たとえば、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フェティルス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ヤポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）からであろう。
【００３５】
好ましいホスホリパーゼAは、フサリウム（Fusarium）株、殊にフサリウム・オキシスポルム（F.oxysporum）,たとえばWO 98/26057に記述されている如きDSM 2672株、殊にWO 98/26057の請求項36および配列番号：2に記述されたものから誘導される。さらなる具体例において、ホスホリパーゼAは、WO 00/32758(デンマークのNovozymes  A/S)に開示されている如きホスホリパーゼである。
【００３６】
リゾホスホリパーゼ
本発明の酵素との関連でここに使用されている術語「リゾホスホリパーゼ」は、リゾホスホリパーゼ活性を有する酵素を含むことを意図する。
リゾホスホリパーゼ活性は、他の活性を有する酵素、たとえばリゾホスホリパーゼ活性を有するリパーゼによっても同様に提供されるであろう。リゾホスホリパーゼ活性は、たとえばリゾホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼからであろう。本発明の他の具体例において、リゾホスホリパーゼ酵素活性は、本質的にリゾホスホリパーゼ活性のみを有する酵素により提供される。この時に、リゾホスホリパーゼ酵素活性は、副活性ではない。本発明の1具体例において、リゾホスホリパーゼは、WO 98/26057に定義されている如くリゾホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼではない。
【００３７】
リゾホスホリパーゼは、如何なる起源のものでも良いであろう。たとえば、動物起源（たとえば、哺乳動物）、たとえば肝臓(たとえばラットの肝臓)からのものであろう。あるいは、リゾホスホリパーゼは、微生物起源、たとえば、糸状菌、酵母または細菌から、たとえばアスペルギルス（Aspergillus）属または種、たとえばアスペルギルス・フェチヅス（A.foetidus）、アスペルギルス・フミガツス（A.fumigatus）、アスペルギルス・ニヅランス（A.nidulens）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、アスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）;ボトリチス（Botrytis）たとえばボトリチス・シネラ（B.cinerea）;カンディダ（Candida）たとえばカンディダ・アルビカンス（C.albicans）;クリプトコッカス（Cryptococcus）たとえばクリプトコッカス・ネオフォルマンス（C.neoformans）、エシェリヒア（Escherichia）たとえばエシェリヒア・コリ（E.coli）、
【００３８】
フサリウム（Fusarium）たとえばフサリウム・スポロトリチオイデス（F.sporotrichioides）、フサリウム・ベネナツム（F.venenatum）、フサリウム・ベルチシオイデス（F.verticillioides）;ヒポチマ（Hyphozyma）;クルイベロミセス（Kluyveromyces）たとえばクルイベロミセス・ラクチス（K. lactis）;マグネポルテ（Magnaporte）たとえばマグネポルテ・グリセア（M.grisea）;メタルヒジウム（Metarhizium）たとえばメタルヒジウム・アニソプリア（M.anisopliae）;ミコスフェアレラ（ Mycosphaerella）たとえばミコスフェアレラ・グラミニコラ（M.graminicola）;ニューロスポラ（Neurospora）たとえばニューロスポラ・クラッサ（N.crassa）;ぺニシリウム（Penicillium）たとえばぺニシリウム・ノタツム（P.notatum）;サッカロミセス（Saccharomyces）たとえばサッカロミセス・セルビシエ（S.cerevisiae）;
【００３９】
シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）たとえばシゾサッカロミセス・ポンベ（S.pombe）;トルラスポラ（ Torulaspora）たとえばトルラスポラ・デルブルッキー（T.delbrueckii）;ビブリオ（Vibrio）たとえばビブリオ・コレラ（V. cholerae）であろう。好ましいリゾホスホリパーゼは、たとえばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）クローンのDSM 13003もしくはDSM 13004に含まれているもの、又はアスペルギルス（Aspergillus）の株、殊にアスペルギルス・ニガー（A.niger）からのリゾホスホリパーゼLLPL-1またはLLPL-2から誘導される、またはたとえばWO 01/27251に記述されているエシェリヒア・コリ（E.coli）クローンのDSM 13082もしくはDSM 13083に含まれるおの、殊にWO 01/27251の請求項1および配列番号：2、4、6または8に記載されたアスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）からのリゾホスホリパーゼLLPL-1もしくはLLPL-2から誘導される。
【００４０】
ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼの両活性を有する酵素
本発明の好ましい具体例において、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼ活性は、ホスホリパーゼA活性およびリゾホスホリパーゼ活性の両活性を有する単一の酵素により提供される。たとえば、1具体例において単一酵素は、ホスホリパーゼA1活性およびリゾホスホリパーゼ活性の両活性を有し、他の具体例においては、単一酵素は、ホスホリパーゼA2活性およびリゾホスホリパーゼ活性の両活性を有し、さらなる具体例においては、単一酵素は、ホスホリパーゼA1活性、ホスホリパーゼA2活性およびリゾホスホリパーゼ活性を有する。
【００４１】
本発明はかくてまた、チーズ中のオイリングオフ効果を減少し、および/またはチーズ収率を増加するために、ホスホリパーゼA活性およびリゾホスホリパーゼ活性の両活性を有する酵素をチーズミルクに添加し、およびチーズミルクからチーズを製造することを含むチーズを製造するためのプロセスに関する。
ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼの両活性を有する酵素は、当業者に知られている。ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼの両活性を有する酵素は、たとえばSaitoら, Methods in Enzymology (1991)197,446-456およびLee ら, J.Biol.Chem.(1994)269,19725-19730により記述されている。
【００４２】
酵素源および処方
本発明のプロセスに用いられるホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼは、ここに言及された何れかの源から誘導または入手され得るであろう。術語「誘導された」は、この文脈において、酵素は天然に存在する、すなわち酵素のアミノ酸配列の同一性が天然酵素と同一である、生物から単離されたであろうことを意味する。術語「誘導された」は、また酵素が宿主生物中で組換え的に産生されたであろうことを意味する。組換え的に産生された酵素は、天然酵素と全く同じ同一性を有するか、または修飾されたアミノ酸配列を有する。たとえば欠失、挿入および/または置換されている1個またはそれ以上のアミノ酸を有する。すなわち天然アミノ酸配列の突然変異体および/または断片である組換え的に産生された酵素である。天然酵素の意味の中に、天然の変異株が含まれる。
【００４３】
さらに、術語「誘導された」は、たとえば糖鎖形成により合成的に製造された酵素を含むことを意味する。術語「誘導された」は、また生体内または試験管中で、たとえば糖鎖形成、リン酸化などにより、修飾された酵素をも包含する。さらに、この文脈で術語「入手され得る」は、酵素が天然酵素と同一なアミノ酸配列を有することを意味する。該術語は、天然に存在する生物から単離された酵素、または同種もしくは他種の生物内で組換え的に発現された酵素、あるいは合成的に、たとえばペプチド合成により産生された酵素を包含する。組換え的に産生された酵素に関して、術語「入手され得る」および「誘導された」は、酵素の同一性に関するものであって、酵素が組換え的に産生される宿主生物の同一性に関するものではない。
【００４４】
従って、ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼは、何れかの適切な技術の使用により微生物から得られるであろう。たとえば、ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼ酵素調製品は、業界で知られた方法により、適切な微生物の発酵および生じた発酵ブロスもしくは微生物からホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼ調製品を引き続き単離することにより得られるであろう。ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼは、また組換えDNA技術の使用によっても得られるであろう。
【００４５】
通常そのような方法は、問題のホスホリパーゼAまたはリゾホスホリパーゼをコード化するDNA配列、および適切な発現シグナルと操作的に繋がっているので、酵素の発現を許しおよび培養菌から酵素を回収する条件下で培養培地にホスホリパーゼAまたはリゾホスホリパーゼを発現可能とするDNA配列を含む、組換えDNAベクターで形質転換された宿主細胞の培養を含む。DNA配列は、また宿主細胞のゲノム中に組み込まれるであろう。DNA配列は、ゲノム性、cDNAもしくは合成起源またはこれらの組合せ品であろうし、および業界で知られた方法に従って単離または合成されるであろう。
【００４６】
適切なホスホリパーゼは、商業的に入手可能である。実際的使用のための酵素の典型的な例として、膵臓より誘導されたホスホリパーゼA2、たとえばLecitase（商標）(Novozymes A/S社製)が、好んで使用される。適切なリゾホスホリパーゼは、たとえばWO 01/27251に記載されている如くアスペルギルス・ニガー（A. niger）中で組換え的に産生され得るアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）リゾホスホリパーゼLLPL-2である。
【００４７】
本発明のプロセスにおいて、ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼは精製されるであろう。ここで使用される如く、術語「精製された」は、それから酵素が誘導される生物に由来する成分を含有しないホスホリパーゼAまたはリゾホスホリパーゼ酵素蛋白質を含む。また術語「精製された」は、それから酵素が得られる天然生物に由来する成分を含まないホスホリパーゼAまたはリゾホスホリパーゼ酵素蛋白質をも含む。これはまた、「本質的に純粋な」ホスホリパーゼAまたはリゾホスホリパーゼと呼ばれ、天然に発生し、遺伝子的に修飾、たとえば1個またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失または置換あるいは挿入、を受けていないホスホリパーゼおよびリゾホスホリパーゼに対して殊に関連するであろう。
【００４８】
従って、ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼは精製されるであろう。すなわち他の蛋白質の存在は微量となる。表現「他の蛋白質」は、特に他の酵素に関する。ここに使用されている如く術語「精製された」は、他の成分、特に他の蛋白質および最も特にホスホリパーゼAまたはリゾホスホリパーゼの起源の細胞中に存在する他の酵素の除去に関する。ホスホリパーゼAまたはリゾホスホリパーゼは、「本質的に純粋」であろう、すなわち、酵素を産生する生物、すなわち、たとえば組み換え的に産生されたホスホリパーゼAまたはリゾホスホリパーゼのための宿主生物に由来する他の成分を含まないであろう。好ましくは酵素は少なくとも、75%(w/w)純粋、より好ましくは少なくとも80%、85%、90%、または少なくとも95%純粋でさえある。さらにより好ましい具体例においては、ホスホリパーゼAまたはリゾホスホリパーゼは、少なくとも98%純粋な酵素蛋白質調製品である。他の具体例において、ホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼはミルク中に天然には存在しない。
【００４９】
術語「ホスホリパーゼ」および「リゾホスホリパーゼ」は、酵素の触媒活性のために必要であろう如何なる補助化合物、たとえば適切な受容体または補因子をも含む。これらは、反応系中に天然に存在するかまたは存在しないであろう。
ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼは、問題の使用に適した如何なる形態、たとえば、乾燥粉もしくは粒状で、粉末飛散のない粒状、液体、安定化液体、または保護された酵素の形態で存在するであろう。粒は、たとえば米国特許4,106,991または米国特許4,661,452に開示されている如く製造されるであろうし、および業界で知られた方法で任意に被覆されるであろう。液状酵素調製品は、たとえば安定剤、たとえば糖、糖アルコールもしくは他のポリオール、乳酸もしくは他の有機酸、を確立した方法に従って添加することで安定化されるであろう。保護された酵素は、EP238,216に開示された方法に従って調製されるであろう。
【００５０】
本発明のプロセスによってチーズのレシチン含量は、ここに記載の如く、同様のチーズ製造プロセスではあるが、ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼの酵素的処理のない場合に比較して、少なくとも5%、たとえば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも50%、たとえば、5〜95%の範囲内で減少されるであろう。
牛乳では、レシチンは通常ミルクのリン脂質の95%超を構成するが、一方リゾレシチンはリン脂質の約1%である。リン脂質は通常牛乳の全脂質の1%未満を代表するにすぎないが、主として乳脂球膜に存在し、特に重要な役割を演じる。入手できるチーズのレシチン含有量は、本発明のプロセスによって、チーズのリン脂質の全含有量の90%より低く、たとえば80％より低く、たとえば60%または50%よりも低いであろう。レシチン濃度は、当業者によって知られた如何なる方法、たとえばHPLCにより測定されるであろう。
【００５１】
本発明は、さらにピザ、インスタント食品、プロセスチーズにおいてまたは他の食品製品の添加物として、本発明のプロセスによって製造されたチーズの使用法に関する。従って、本発明のプロセスに従って製造されたチーズは、プロセスチーズ、ピザ、バーガー、トースト、ソース、ドレッシング、チーズ粉またはチーズフレーバーの様なさらに加工された食品製品に使用されるであろう。
さらなる具体例において本発明のプロセスは、チーズをたとえば150〜350℃の範囲のような熱処理にかける工程をさらに含む。
本発明は、また入手され得る、殊に本発明のプロセスによって入手されたチーズにも関する。
【実施例】
【００５２】
本発明は、下記の例においてさらに説明されるが、これらは決して保護の範囲に限定しているものではない。
実施例１. ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼを添加して製造したチーズ
酵素調製
A:脂肪1g当たり0.03mgの酵素蛋白質ホスホリパーゼA（デンマークのNovozymes A/S社製Lecitase（商標）10L）。
B:乳脂肪1g当たり0.05mgのリゾホスホリパーゼ（WO 01/27251に記載の如く、アスペルギルス・ニガー（A.niger）中で組換え的に産生されたアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）リゾホスホリパーゼLLPL-2）。
C:上記AおよびBの組合せ品。
【００５３】
チーズ製造
全脂肪モッツァレラ（Mozzarella）チーズ製造のために、殺菌した非均質化クリーム（ノースカロライナ州立大学酪農工場）を使用して、殺菌した非均質化スキムミルク（ノースカロライナ州立大学酪農工場）を3.5%脂肪に規格化した。
0.1gのRhodia LH100および0.3gのRhodia TA061スターター培養物を50mLのスキムミルクに添加し、ゆっくり連続的に撹拌しながら35℃に平衡させて、スターター培養物を調製した。規格化したチーズミルクを35℃に平衡させて、3バッチに分割した。1.4%のスターター培養物を各バッチに添加し、同時に上述の酵素調製品A、BおよびCを、ゆっくり撹拌しながら、夫々のバッチに添加した。
【００５４】
pHが6.45〜6.50に達した時に、0.01%のレンネット（デンマークのChr. Hansens Lab.製発酵産生キモシンChymax)を、3分間、激しく撹拌しながら、各バッチに添加した。撹拌機を取り出し、ミルクを凝集させた。ナイフまたはスパチュラでカードに下方切り込みを入れて、適切な切断時間を決定した。次にスパチュラを切り込みの下に、切り込みの方向に垂直にカードに挿入し、カードを上方に持ち上げるのに用いた。カードを持ち上げて分離し、切断端の上表面に鋭角が維持された時に、カードは切断準備が出来たと判断した。切断は1/2インチのナイフを用いて行い、切断後5分間カードを静置した。
【００５５】
ゆっくりと時々撹拌しながら、温度を41℃まで上げ、pHが5.65〜5.70になるまで保った。次にホエーを排出し、カード小片をステンレススチール製のボウルに注いだ。ボウルを41℃の水浴に浮かせてカードの温度を保ち、過剰のホエーを、熱の維持のためにカードを覆うに十分なだけを残して、定期的に排出した。
pHが5.25〜5.3に達した時に、全てのホエーを排出し、カ−ドを脱イオン水に57℃で5分間浸した。カードを手で1分間伸ばし、必要ならカード温度を保つために57℃の水に戻した。伸ばしたカードを、冷却のために室温の水道水に10-15分間漬け、次に水分を吸い取り乾燥し、冷蔵した。
【００５６】
オイリングオフの測定
チーズを試料の均質化のために、20秒間ブレンダーで粉砕した。約3.0gを金属リング(直径2.2cm)に入れて成型し、Whatman #4の濾紙の中央に置き、90℃に設定したオーブンに5分間入れて融解した。各資料を夫々3回試験した。オイリングオフは、チーズの周りに融解中に展開した油の輪の面積とチーズの円の面積との差として、イメージ分析で測定した。オイリングオフの計算を以下に示した：
【００５７】
【数１】
2005517418.tif 000002
【００５８】
結果
結果(蛋白質、水分、脂肪およびオイリングオフ)を下表１に示す。
【表１】
2005517418.tif 000003
【００５９】
表1の結果から、ホスホリパーゼAの添加は、リゾホスホリパーゼの添加よりもチーズのオイリングオフの減少により高い効果を有することが分かる。両方の酵素を添加した時には、しかしながら2酵素の相乗効果を示して、オイリングオフはさらに低くなる。
【００６０】
実施例２. ホスホリパーゼAおよびリゾホスホリパーゼを作用させたミルク中での長鎖脂肪酸の生成
基質調製および酵素処理
クリームをスキムミルクを用いて脂肪含量25%に規格化した。ミルク試料を、表3に示した如く、ホスホリパーゼA（デンマークのNovozymes A/S社製Lecitase（商標） 10 L）、リゾホスホリパーゼ（WO 01/27251に記載の如く、アスペルギルス・ニガー（A.niger）中で組換え的に発現されたアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）リゾホスホリパーゼLLPL-2）、ならびにホスホリパーゼAとリゾホスホリパーゼの組合せ品で処理した。酵素は、必要ならば、水で予備希釈を行い、適切な濃度でクリームに添加した。試料を振盪を行わずに1.5時間、35℃で培養した。反応を、脂質抽出用の有機溶媒を添加して停止した。
【００６１】
脂質抽出
全乳脂質を、各試料に1mLの水、次いで9mLのクロロホルム/メタノール(2:1)を混合して抽出した。試料を1分間激しく混合し、次に5分間3000rpmで遠心分離した。6mLの下部CHCl3相を取り出し、真空下で濃縮した。試料に2mLのCHCl3を加えた。脂肪酸を固相抽出(SPE)によりさらに精製した。各CHCl3抽出物を、真空下でアミノプロピルSPEカラムにかけた。カラムを、4mLのCHCl3/イソプロパノール(2：1)で洗浄して中性脂質を除去した。脂肪酸を氷酢酸（2% v/v）で酸性化した4mLのジエチルエーテルで溶出した。エーテル抽出物をロータリーエバポレーターで濃縮し、1.0mLのメタノールを加えてHPLC分析用とした。
【００６２】
HPLC法
Phenomenex(米国加州Torrance)のLuna C8(150 x 4.6mm、5μ、100A)カラムならびにアセトニトリルおよび0.1%三弗化酢酸を含む水を移動相として、逆相クロマトグラフィーを実施した。傾斜溶離スキームについては表2を参照せよ。溶離脂肪酸の検出は、蒸発光散乱で行った。HPLC脂肪酸標準（リノレイン酸、パルミチン酸、オレイン酸、およびステアリン酸）は、牛乳の全脂質の出現率に基づいて選択された。原液は、100%メタノールに2〜10mg/mLの濃度範囲で日常的に調製した。HPLC校正物質は、100%メタノール中に適切な濃度で希釈することにより脂肪酸原液から調製した。
【００６３】
【表２】
2005517418.tif 000004
【００６４】
クリーム試料をホスホリパーゼAおよび/またはリゾホスホリパーゼで処理後生じた遊離長鎖脂肪酸の量を表3に示す。ホスホリパーゼAの量を0.04mg/g脂肪から0.18mg/g脂肪に増加しても、生じた遊離長鎖脂肪酸の量は著しくは増加しないことが分かる。ホスホリパーゼAとの組合せ品でリゾホスホリパーゼを添加した時には、生成脂肪酸の量は著しく増加する。
【００６５】
【表３】
2005517418.tif 000005
【国際調査報告】
2005517418.tif 000006
2005517418.tif 000007
2005517418.tif 000008