(57)【要約】生物学的試料中のカンナビノイドを検出する免疫測定法における使用に適した新規カンナビノール−ベースのトレーサーが本明細書に開示されている。これらのカンナビノール−ベースのトレーサーは特に連続流動置換免疫測定法に有用である。本明細書はまた新規トレーサーの合成法および、生物学的試料中のカンナビノイドの定性および定量のための蛍光免疫測定法におけるこれらのトレーサーの使用を記載している。
2005506520.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンナビノール分子またはその誘導体；
カンナビノール分子またはその誘導体と結合している標識
を含む合成トレーサー。
【請求項２】
標識が、カンナビノール分子またはその誘導体と、１、２、３、４、８、９および１０位からなる群から選ばれる位置で結合している、請求項１記載の合成トレーサー。
【請求項３】
標識が、フルオロフォア(fluorophore)、発色団、ハプテン、放射性標識、金属性コロイド、 酵素、化学ルミネセンス分子および生物発光分子からなる群から選ばれる、請求項２記載の合成トレーサー。
【請求項４】
フルオロフォアが、FIG.８に示される蛍光染料であり、
(a)mが、０、１、２、３および４からなる群から選ばれる整数であり;および
(b)Ｙが、スクシニミジル活性エステル(ＯＳu)およびエチレンジアミン(ＥＤＡ)からなる群から選ばれる化合物である、
請求項３記載の合成トレーサー。
【請求項５】
フルオロフォアが、FIG.９[式中、Ｙはスクシニミジル活性エステル(ＯＳu)およびエチレンジアミン(ＥＤＡ)からなる群から選ばれる化合物である]に示される蛍光染料である、請求項３記載の合成トレーサー。
【請求項６】
標識が、カンナビノール分子またはその誘導体と、１つまたはそれ以上の連結基を通して結合している、請求項２記載の合成トレーサー。
【請求項７】
トレーサーが、FIG.３、４、５、６および７[式中、
(a)Ｒは、伸長基であり;
(b)ＸおよびＺは、反応基であり;および
(c)＊は、標識である]
に示される一般式からなる群から選ばれる一般式で示される、請求項２記載の合成トレーサー。
【請求項８】
Ｒが、−(ＣＨ2)n−およびＣ(Ｏ)−(ＣＨ2)nＣＯからなる群から選ばれ;nは、０〜約１５の数を表す、請求項７記載の合成トレーサー。
【請求項９】
ＸもしくはＺ、またはその両方が、Ｏ、ＮＨ、ＣＯ、ＨＮＣＳＮＨ、ＣＨ2、Ｓ、ＳＯ2、イミノ、イミノカルボニル、カルボニル、カルボニミドイル、イミノスルホニル、スルホニル、イミノカルボニミドイル、チオカルボニルジイミノ、イミノカルボニルオキシ、イミノチオカルボニルオキシ、(スルホニルイミノカルボニル)ジイミノ、トリアジニルジイミノ、スクシニミジル活性エステル(ＯＳu)基およびエチレンジアミン(ＥＤＡ)からなる群から選ばれる、請求項７記載の合成トレーサー。
【請求項１０】
標識が、カンナビノール分子の９位で結合しており、トレーサーが、一般式：
【化１】
2005506520.tif 000004
[式中、＊は標識である]で示される、請求項２記載の合成トレーサー。
【請求項１１】
標識が、ＥＤＡ−Ｃy５である、請求項１０記載の合成トレーサー。
【請求項１２】
試料中のカンナビノイドおよびその代謝物の検出における請求項１〜１１のいずれか１項に記載の合成トレーサーの使用。
【請求項１３】
合成トレーサーが、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物と結合し得る抗体とともに用いられる、請求項１２記載の合成トレーサーの使用。
【請求項１４】
試料中のカンナビノイドまたはカンナビノイド代謝物を検出するための測定システムであって、システムが、
(a)請求項１〜１１のいずれか１項に記載の合成トレーサー；および
(b)トレーサーと、およびカンナビノイドまたはカンナビノイド代謝物と結合し得る認識分子
を含むことを特徴とする測定システム。
【請求項１５】
測定システムが、試料中のカンナビノイドまたはカンナビノイド代謝物が、認識分子と結合するためにトレーサーと競合するように設定されている、請求項１４記載の測定システム。
【請求項１６】
認識分子が、抗体、カンナビノイドの受容体、カンナビノイド代謝物の受容体、Δ9−ＴＨＣの受容体、Δ9−ＴＨＣ代謝物の受容体からなる群から選ばれる、請求項１４記載の測定システム。
【請求項１７】
認識分子がトレーサーと結合し、カンナビノイドまたはカンナビノイド代謝物が認識分子と結合するためにトレーサーと競合する、請求項１５記載の測定システム。
【請求項１８】
免疫測定法が、動力学的置換測定法として設定されている、請求項１５記載の測定システム。
【請求項１９】
抗体が、固体支持体に固定化されている、請求項１５記載の測定システム。
【請求項２０】
固体支持体が、樹脂、ビーズ、およびカラム壁からなる群から選ばれる、請求項１９記載の測定システム。
【請求項２１】
抗体が、Δ9−ＴＨＣおよびその代謝物と結合し得る、請求項１６記載の測定システム。
【請求項２２】
抗体が、カンナビノイドに対してまたはカンナビノイド代謝物に対してより、トレーサーに対してより低い結合親和性を有している、請求項１６記載の測定システム。
【請求項２３】
トレーサーが、カンナビノイドまたはカンナビノイド代謝物と比較して、抗体に対して約１４％〜約８５％の交叉反応性を有する、請求項２２記載の測定システム。
【請求項２４】
さらに、標識を検出するためのセンサーを含む、請求項１４〜２３のいずれか１項記載の測定システム。
【請求項２５】
試料中のカンナビノイドおよび／またはカンナビノイド代謝物の検出方法であって、方法が、工程：
(a)認識分子を請求項１〜１１のいずれか１項に記載の合成トレーサーに暴露し、認識分子−トレーサー複合体を形成させ；
(b)カンナビノイドまたはカンナビノイド代謝物を含有する疑いのある試料を、認識分子−複合体と接触させ;および
(c)認識分子からはずれたトレーサーを検出する
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
認識分子が固体支持体に固定化されている、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
試料を認識分子−トレーサー複合体と接触させる工程が、さらに、試料を非−平衡条件下連続的に認識分子−トレーサー複合体を通過させて流す工程を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
認識分子をトレーサーに暴露させる工程が、実質的に認識分子上の結合部位をトレーサーで飽和させることになる、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
はずれたトレーサーの量が、試料中のΔ9−ＴＨＣおよびその代謝物の濃度に正比例する、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
試料が、生物学的試料である、請求項２５〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
生物学的試料が、唾液、全血、血清、血漿、毛髪または尿からなる群から選ばれる、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
試料が、水性試料である、請求項２５〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
認識分子が、抗体、カンナビノイドを結合する受容体、カンナビノイド代謝物を結合する受容体、Δ9−ＴＨＣを結合する受容体、およびΔ9−ＴＨＣ代謝物を結合する受容体からなる群から選ばれる、請求項２５〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
固体支持体；
固体支持体に固定化された抗体；
抗体に結合した請求項１〜１１のいずれか１項に記載の合成トレーサー
を含むカラム。
【請求項３５】
固体支持体が、樹脂、ビーズ、およびカラム壁からなる群から選ばれる、請求項３４記載のカラム。
【請求項３６】
抗体が、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物と結合し得る、請求項３４記載のカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は規制物質の検出に関する。特に、生物学的試料中のカンナビノイドおよびテトラヒドロカンナビノイド(ＴＨＣ)の検出のための標識トレーサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
マリファナは、公知の向精神薬であり、カンナビノイドのかなりの量を産生するアサ科の植物から誘導される。特に、最も重要なカンナビノイドは、マリファナの主要生理学的活性成分であるΔ9−テトラヒドロカンナビノール(Δ9−ＴＨＣ)である。Δ9−ＴＨＣが規制物質であるのは、心臓血管系および中枢神経系に鎮静および抑制−様作用の両方があり、カンナビジオールとは反対に、マリファナの非−向精神薬成分であるからである。マリファナを吸うと、Δ9−ＴＨＣは急速に肺から吸収されて血流に入り、１１−ノル−Δ9−ＴＨＣを経て、第１次代謝物としての１１−ノル−Δ9−ＴＨＣ−カルボン酸を伴った一連の極性代謝物に代謝される。
【０００３】
よくあるカンナビノイドの濫用のために、生物学的標本中のこれらの規制薬物の存在を検出する非−侵襲的で迅速な試験法の必要性が増大している。現在、生物学的試料中のカンナビノイドは、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ガスクロマトグラフィー／質量分析(GC/MS)、放射性免疫測定法または酵素免疫測定法などの多数の技法によって検出されてきた。試験法の感度に依存して、カンナビノイド代謝物は、たまに喫煙する人で１０日、病みつきの喫煙者で３６日まで尿中に検出することができる(Wangら、U.S. Pat. No. 5,264,373, col 1, lines 36−37参照)。
【０００４】
近年、薬物監視のための唾液の使用に関する報告が多くなっている。Δ9−ＴＨＣの存在についての唾液試験は、薬物動態学的研究および長期にわたる薬物治療中の患者の管理に用いられてきた(Samynら、Forensic Science Review, vol.11, p.1, (1999)参照)。唾液試験は薬物の血中濃度を定量できないが(Grossら、"Validated Direct Blood 9−ＴＨＣ Radioimmunoassay Quantitation", J. Anal. Toxi. Vol.2, p.98 (1978)参照)、唾液中のΔ9−ＴＨＣの存在がカンナビノイドの最近の喫煙を検出し得ることから、唾液試験は特に重要である。Δ9−ＴＨＣの血中濃度はまた、唾液中のΔ9−ＴＨＣの濃度から推測することができる;血中濃度は通常唾液中の薬物濃度よりかなり高い(Idowuら、"A Review of the Use of Saliva in the Forensic Detection of Drugs and Other Chemicals", J. Forensic Science Society, vol.22, 1982, p.123参照)。
【０００５】
さらに、連続流動免疫置換測定技術(F. S. Liglerら、Flow Immunosensor Method and Apparatus, U.S. Pat. No. 5,183,740)は、唾液および尿中の規制薬物の迅速検出を証明した(Hao Yuら、Use of the USDT Flow Immunosensor for Quantitation of Benzolecgonie in Urine, Biosensors and Bioelectronics, 732−734(1996); Nam, D.ら、Programme and Abstracts of TIAFT 2000 at Helsinki, 2000; Liang, G.ら、Proc. of ICADTS 2000, Jun. 22−26, 2000. U.S. Pat. No. 5,183,740および上記引用文献、それらに含まれる図もすべて含めて、ここに引用してすべての記載をこの明細書の記載とする)。
【０００６】
免疫測定法または免疫センサーを用いてΔ9−ＴＨＣを検出するために、通常、トレーサー分子がΔ9−ＴＨＣまたはその代謝物と競合させるために用いられる。トレーサー分子は通常、標識抗原またはリガンドであり、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物の抗体または受容体と同じ抗原またはリガンド結合部位に結合し得る。規制物質の検出において、多くの免疫測定法は、一般に、試料中の分析物の存在および／または量を検出するためのトレーサーとして、標識された禁止薬物それ自体(例えば、標識Δ9−ＴＨＣ)を用いてきた。
【０００７】
Δ9−ＴＨＣトレーサー合成中の出発物質として非−規制物質の最近の使用もまた、テトラヒドロカンナビノイドの蛍光分極免疫測定法と題する米国特許第5,264,373号にWangらによって報告されている。この特許で、Wangは、蛍光分極免疫測定法における使用のための標識ＴＨＣ−類似体ベースの誘導体の使用を開示している。
【０００８】
FIG.１は、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物の検出に用いられるトレーサーの種々の合成方法を一般的に示している。方法Ａは、出発物質として、規制物質、例えば、禁止薬物である９−カルボキシ(またはアルデヒド)−Δ9−ＴＨＣを用いる通常の方法の１つを示している。これらの出発物質はΔ9−ＴＨＣの９位の炭素の結合しているカルボキシ基に標識を結合させ、薬物−ベースのトレーサーを生成する。方法Ｂは、Δ9−ＴＨＣ−類似体を用いるトレーサーの別法の合成方法を示す。
【０００９】
連続流動置換測定法などのある種の免疫測定法において、効果的な置換を容易にするために、トレーサー分子に対する抗体の結合親和性が分析物に対する抗体の結合親和性より低いことが望ましい。Δ9−ＴＨＣ−ベースまたはΔ9−ＴＨＣ−類似体ベースのトレーサーの使用は、Δ9−ＴＨＣ分析物が効果的にΔ9−ＴＨＣ−ベースまたはΔ9−ＴＨＣ−類似体ベースのトレーサーと置換しないために問題がある。これがこの測定法の感度の低さにつながる。
【００１０】
従って、新規な試薬、特に、Δ9−ＴＨＣ検出に使用するための新規なトレーサーの必要性が存在している。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、カンナビノール−ベースのトレーサーを生成させるためにカンナビノール(６,６,９−トリメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ[b,d]ピラン−１−オール)と標識との結合から製造される新規な組合せのトレーサーを提供する。本発明の一態様において、標識はカンナビノール分子の１,２,３,４,８,９，および１０の位置に付加されていてもよい。
【００１２】
本発明の別の態様において、カンナビノール−ベースのトレーサーは、カンナビノイド、例えば、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物に結合し得る認識分子と結合して用いられ得る。これらの認識分子の例には、カンナビノイドを結合し得る抗体または受容体分子が含まれる。
【００１３】
本発明の好ましい態様において、カンナビノール−ベースのトレーサーが連続流動置換測定システム(continuous flow displacement assay system)に関連して用いられる。この例において、抗体または受容体分子は、試料中に存在するカンナビノイド(例えば、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物)に対する親和性より低い結合親和性でカンナビノール−ベースのトレーサーに結合するのが好ましい。
【００１４】
好ましい具体例の詳細な記載
FIG.２Ａは、本発明の具体例の１つによって、トレーサーの合成のための一般反応式を示す。Δ9−ＴＨＣまたはΔ9−ＴＨＣ−ベースの類似体を用いる代わりに、トレーサーをカンナビノールから合成する。FIG.２Ｂは、標識がカンナビノールの９位に結合している炭素に付加されていることを示すが、標識はまた、例えば、１、２、３、４、８、９および１０などのカンナビノール分子上の種々の位置に付加されていてもよい(FIG.２Ｂ)。種々の位置で標識されたカンナビノール−ベースのトレーサーをFIG.３−７およびFIG.１０に示す。
【００１５】
この明細書で用いるとき、メルクインデックスそのままのカンナビノールは６,６,９−トリメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ[b,d]ピラン−１−オールとして定義する。FIG.２Ｂに示すように、カンナビノールは、間にあるピラン分子Ｂとともにベンゼン環ＡおよびＣを含む。この明細書で用いられるカンナビノール誘導体は、カンナビノールから誘導され、両方のベンゼン環ＡおよびＣを保持している分子として定義される。例えば、FIG.２Ａに示される９−カルボキシカンナビノールは、カンナビノール誘導体とみなされる。この明細書で用いるとき、カンナビノール−ベースのトレーサーは、カンナビノール分子またはカンナビノール誘導体と結合しているか付加されている標識を含むトレーサー分子である。標識は直接または間接的に(連結基を経て)、カンナビノールに結合または付加されている。
【００１６】
FIG.３および１０は、カンナビノール分子の９位に付加された標識(＊またはＣy５)を伴ったカンナビノール−ベースのトレーサーを示す。FIG.４は、カンナビノール分子の１位に付加された標識(＊)を伴ったカンナビノール−ベースのトレーサーを示す。 FIG.５は、カンナビノール分子の８または１０位のいずれかに付加された標識を表す一般式を示す。FIG.６は、カンナビノール分子の２または４位のいずれかに付加された標識を表す一般式を示す。FIG.７は、カンナビノール分子の３位、すなわち、３−ペンチル鎖の末端炭素に付加された標識を示す。標識はまた、カンナビノールの３位に付加されたペンチル鎖５個の炭素のいずれかを経て３位に付加されていてもよい。
【００１７】
これらの図において、ＸおよびＺは、例えば、Ｏ、ＮＨ、ＣＯ、ＨＮＣＳＮＨ、ＣＨ2、Ｓ、ＳＯ2などの反応基であってもよい。ＸおよびＺの他の例には、イミノ、イミノカルボニル、カルボニル、カルボニミドイル、イミノスルホニル、スルホニル、イミノカルボニミドイル、チオカルボニルジイミノ、イミノカルボニルオキシ、イミノチオカルボニルオキシ、(スルホニルイミノカルボニル)ジイミノ、トリアジニルジイミノ、エチレンジアミン(ＥＤＡ)またはスクシニミジル活性エステル(ＯＳu)基が含まれる。Ｒは伸長基、すなわち、標識をカンナビノール分子からさらにはなして伸ばす原子の基を表す。Ｒの例としては、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｃl、Ｂr、ＩまたはＦなどのヘテロ原子と結合した０〜約１５の炭素原子の基を含んでいてもよい。具体的なＲの例には、−(ＣＨ2)n−およびＣ(Ｏ)−(ＣＨ2)nＣＯ(式中、nは０〜約１５であってもよい)が含まれる。
【００１８】
カンナビノール−ベースのトレーサーの使用は、FIG.１３とともに実施例VIIに示すように、特に、置換−ベースの免疫測定法に用いられるとき、免疫測定法の感度を増加させることができる。構造的に、カンナビノールは、カンナビノールが２つのベンゼン環ＡおよびＢ(FIG.２Ｂおよび１４参照)を持っており、これに反して、Δ9−ＴＨＣまたはΔ9−ＴＨＣ類似体がベンゼン環１個だけしか(FIG.１４中Ａ')を持っていない点でΔ9−ＴＨＣとは異なる。それ自体カンナビノールの三次元構造はΔ9−ＴＨＣおよびΔ9−ＴＨＣ−類似体と著しく異なる。FIG.１４は、カンナビノール、Δ9−ＴＨＣおよびΔ9−ＴＨＣ−類似体と三次元構造を示す。
【００１９】
カンナビノール中のピラン分子Ｂの両側の２つのベンゼン環ＡおよびＣのために、その三−次元構造は単一のかつ殆ど平面という特徴がある。その平面は２つのベンゼン環ＡおよびＣおよびピラン分子Ｂからなる(FIG.１４参照)。これに反して、Δ9−ＴＨＣまたはΔ9−ＴＨＣ−類似体の三次元構造は、環Ｂ'およびＣ'が典型的なイス型配座にある２つの平面を有する分子によって特徴付けられる(FIG.１４)。第一の平面はベンゼン環Ａ'およびピラン分子(Ｂ)の一部からなる。第二の平面はシクロヘキサンまたは６員の炭素分子Ｃ'からなり、三次元で典型的なイス型配座を形成している。ピラン分子Ｂ'もまた典型的なイス型配座を形成している。カンナビノールおよびΔ9−ＴＨＣまたはΔ9−ＴＨＣ類似体の三次元構造の違いのために、Δ9−ＴＨＣに結合する抗体はカンナビノールと交叉反応するが、より低い結合親和性で交叉反応する。この低い交叉反応性が、例えば、置換ベースの免疫測定法などのある種の免疫測定法では望ましい。カンナビノール−ベースのトレーサーはΔ9−ＴＨＣによってよりたやすく置換され、それによって測定法により大きい感度をもたらす。
【００２０】
すなわち、本発明の１つの態様は、構造的に分析分子と類似し、好ましくはより低い結合親和性で、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物に結合し得る抗体と十分な交叉反応性を保持するトレーサー分子を含む。
【００２１】
本発明の好ましい具体例において、カンナビノール−ベースのトレーサーは置換測定法と関連して、カンナビノイド、例えば、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物を検出するために用いられる。この明細書で用いるとき、「検出」とは、試料中のΔ9−ＴＨＣまたはその代謝物(または両方)の定性または定量をいう。置換測定法において、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物の定性または定量(またはその両方)は、標識トレーサー分子が認識分子に結合し、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物が認識分子からはずれ得る、標識トレーサー分子の量によって測定される。認識分子の例には、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物を認識する抗体または受容体分子(例えば、カンナビノイド受容体)が含まれる。これらの認識分子は最初、通常の手段を用いて、固体相−マトリックスまたは固体支持体に固定化される。固体支持体または固体相−マトリックスは、樹脂、ビーズ、マイクロスフィア、カラム壁またはマイクロタイタープレートであってもよい。樹脂、ビースまたはマイクロスフィアの例には、セファロース、セファクリル(sephacryl)、シリカ、エムフェイス(Emphase)多孔性ビーズ、ダイナル(Dynal)ビーズ、常磁性ビーズ、および他の種類の反応性樹脂またはビーズが含まれる。ひとたび固体支持体または固体相−マトリックスに固定化されると、認識分子を、トレーサー分子に暴露することができ、カラムまたはバッチ方式のいずれかで結合する。好ましくは、トレーサー分子を認識分子と高濃度でインキュベートし、トレーサー分子が認識分子のすべてのリガンド結合部位に結合し、飽和するようにする。
【００２２】
その後、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物を含む疑いのある試料を、(バッチ方式)または流動通過(カラムまたは連続流動方式)で、認識分子−トレーサー複合体とインキュベートし、試料中のΔ9−ＴＨＣまたはその代謝物が複合体から標識トレーサーを置換するようにする。ついで、標識トレーサーの量が測定され、その量が試料中のＴＨＣまたはその代謝物と正比例する。
【００２３】
上記に暗示されるように、調製されたトレーサーの結合部位が、被験試料中の分析物より、選択された認識分子に対してより低い交叉反応性を有する限り、調製されたトレーサーの結合部位として標的分子または分析物(例えば、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物)それ自体は必要ない。さらに下記に詳細に記載するように、カンナビノール−ベースのトレーサーは、生物学的試料中のカンナビノイドの定性および／または定量を検出する免疫測定法に使用するのに理想的である。それらは特に、連続流動免疫置換測定法に有用である。
【００２４】
連続流動免疫置換測定法
連続流動置換免疫測定法において、分析物および抗体の動態学的性質は非常に重要な役割を果たす。分析物は免疫測定法で試験される物質である；例えば、分析物はΔ9−ＴＨＣまたはその代謝物であってもよい。抗体は分析物を認識する、すなわち、分析物に特異的に結合し得る。分析物の存在の決定を可能にするため、標識化合物であるトレーサーは抗体との結合に関して分析物と競合させられる。
【００２５】
典型的な連続流動置換免疫測定法は、Δ9−ＴＨＣまたはその代謝物に対する固−相固定化抗体を含む。抗体の抗原結合部位が標識合成トレーサーに暴露され、標識合成トレーサー−抗体複合体が形成される。抗体は抗体の抗原結合部位が標識合成トレーサーで飽和されるようにトレーサーに暴露される。ついで、分析物であるΔ9−ＴＨＣを含有する疑いのある生物学的試料が連続して固−相固定化抗体−標識合成トレーサー複合体を通過して行く。もし、試料中に分析物が存在すると、分析物は抗体に結合し、標識合成トレーサーと置換される。従って、結合点より下流での標識トレーサーの検出は、生物学的試料中の分析物の存在および含有量を示す(Liglerら、U.S. Pat. No. 5,183,740、記載のすべてをここに引用してこの明細書の記載とする)。
【００２６】
連続流動免疫置換測定法の開発の成功は、抗体から結合トレーサーのすばやい分離速度を達成し、それによって分析物の迅速な結合を可能にする抗体およびトレーサーの選択に基づく。一般に、理想的な連続流動置換免疫測定法は、抗体が分析物に対して高い親和性を有し、トレーサーに対してはより低い親和性を有する系を用いる。 トレーサーに対する抗体の親和性は、15−100%の交叉反応性の範囲のいずれかにあってもよい。好ましいカンナビノール−ベースのトレーサーは、実施例VIIに記載するように、抗体に対して約40−80%の交叉反応性を有する。さらに、認識分子からトレーサーを置換するための条件は、好ましくは、非−平衡条件または動力学的流動反応で行う。「非−平衡条件または動力学的流動反応」とは、試料が、トレーサーおよび分析物間の安定な平衡条件に達しない速度で認識分子−トレーサー複合体を流動通過することを意味する。
【００２７】
Δ9−ＴＨＣに対する抗体の多くは、またΔ9−ＴＨＣの重要な代謝物、例えば、Δ9−ＴＨＣ−９−カルボキシも認識するから、カンナビノール−ベースのトレーサーはまた、抗体がΔ9−ＴＨＣ類似体を認識し得るかぎり有用である。
【００２８】
抗体
Δ9−ＴＨＣまたはΔ9−ＴＨＣ−代謝物に対する抗体、例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、広範囲のΔ9−ＴＨＣまたはΔ9−ＴＨＣ−代謝物の同定のためのこの開示に記載された方法に採用または適用が可能である。抗体の例はFitzgerald Industries International, Inc. (Concord, Mass.) catalog #10−T43から入手できる。
【００２９】
標識
カンナビノール−ベースのトレーサーを標識付けする標識は、適切には、フルオロフォア、発色団、放射性標識、ハプテン、金属性コロイド、酵素または化学ルミネセンスまたは生物発光分子である。適切なフルオロフォアおよび発色団がR. P. Haugland, Molecular Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg., 1992に開示されており、ここに引用して明細書の記載とする。好ましいフルオロフォアの例には、フルオレセイン、ローダミンおよびスルホインドシアニン染料Ｃy５が含まれる(Mujumdar, R. B.ら、Bioconjugate Chemistry, vol. 4, p. 105 (1992)。他の蛍光染料の例はFIG.９および１０に示されている。
【００３０】
ハプテンの例には、ビオチン、ジゴキシゲニンまたは、抗体、ストレプタビジンもしくは他のリガンド結合分子によって認識され得る他の適切なハプテンが挙げられる。酵素の例には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたは、色素、沈澱または蛍光を産生するレポーター分子を開裂し得る他の酵素が含まれる。
【００３１】
連結基
標識は、通常、連結基によってカンナビノール−ベースのトレーサーに結合していてもよい。連結基の例はＸ−Ｒ−Ｚ−＊(式中、＊は標識である)によって表される。
【００３２】
ＸおよびＺは、例えば、Ｏ、ＮＨ、ＣＯ、ＨＮＣＳＮＨ、ＣＨ2、Ｓ、ＳＯ2などの反応基であってもよい。ＸおよびＺの他の例には、イミノ、イミノカルボニル、カルボニル、カルボニミドイル、イミノスルホニル、スルホニル、イミノカルボニミドイル、チオカルボニルジイミノ、イミノカルボニルオキシ、イミノチオカルボニルオキシ、(スルホニルイミノカルボニル)ジイミノ、トリアジニルジイミノ、エチレンジアミン(ＥＤＡ)またはスクシニミジル活性エステル(ＯＳu)基が含まれる。Ｒは伸長基、すなわち、標識をカンナビノール分子からさらにはなして伸ばす原子の基を表す。Ｒの例としては、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｃl、Ｂr、ＩまたはＦなどのヘテロ原子と結合した０〜約１５の炭素原子の基を含んでいてもよい。具体的なＲの例には、−(ＣＨ2)n−およびＣ(Ｏ)−(ＣＨ2)nＣＯ(式中、nは０〜約１５であってもよい)が含まれる。
【００３３】
生物学的試料
カンナビノール−ベースのトレーサーは、これに限定されるものではないが、血液、血漿、血清、毛髪、唾液または尿を含む生物学的または水性試料中のＴＨＣまたはその代謝物の検出のために用いられ得る。唾液は、濫用薬物の検出および測定のための有用な試験材料として証明されてきた("Saliva as a Diagnostic Fluid", Ed by D. MalamudおよびL. Tabak, Annals of the New York Academy of Sciences, 1993, V. 694.)。例えば、唾液試料中のΔ9−ＴＨＣは、ＧＣ／ＭＳによって検出することができる(H. W. Peelら、Detection of Drugs in Saliva of Impaired Drivers", J. Forensic Sciences, JFSCA, V29, 185(1984)。
【００３４】
下記の実施例は、生物学的試料中のＴＨＣまたはその代謝物の検出のためのカンナビノール−ベースのトレーサーの合成および使用を説明するものである。化学的な出発物質は、リサーチ・トライアングル・インスティチュート(Research Triangle Institute (RTI), Research Triangle Park, NC)またはシグマ・ケミカルズ(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)から入手することができる。
【００３５】
実施例Ｉ
カンナビノールの２または４位が標識されたＣy５標識トレーサーの製造
FIG.１５は、カンナビノールの２または４位が標識されたＣy５標識トレーサーの製造方法を示す。工程１で、カンナビノール(25 mg)を、0.2N ＮaＯＨ(1 mL)に溶解させ、p−カルボキシベンジルジアゾニウム塩と室温(RT)にて30 min反応させた。得られた暗黄色溶液を1N ＨＣlにてpＨ３に調整し、反応性生物をＥtＯＡcで抽出し、Ｎa2ＳＯ4にて乾燥させた。残渣に存在する乾燥剤をろ取し、減圧下乾燥させた。乾燥残渣をついで、ＴＨＦ(0.5 mL)中に再溶解させ、シリカプレート(20×20 cm, 1000μM)、ＥtＯＡc／ヘキサン(1:1)で展開する薄層クロマトグラフィーを用いて精製した。上記の合成方法を用いて、約11 mgの２−置換および6 mgの４−置換カンナビノール誘導体をそれぞれ得、それらの化学構造式をFIG.１５に示す。
【００３６】
工程２において、得られた４−置換カンナビノール誘導体(6 mg)を、Ｎ,Ｎ'−ジスクシニミジルカルボネート(DSC, 8 mg)とピリジン(20 mg)およびアセトニトリル(2 mL)の存在下還流条件で６時間反応させた。得られたカンナビノールのスクシニミジル活性エステル(4 mg)を工程３でＰＢＳ緩衝液1 mL中(pＨ 9)Ｃy５ＥＤＡ溶液にRTにて添加した。得られた混合物をRTにて4時間攪拌し、ついで混合物を、直接Ｃ18プレート(20×20 cm, 1000μm)にスポットし、70/30(v/v)の割合のメタノールおよび水で展開させた。生成物のバンドを切り取り、メタノールで抽出した。得られたトレーサー溶液は、４位のＣy５−標識カンナビノールを含有しており、直接免疫測定法に用いることができる。
【００３７】
４−置換カンナビノール誘導体のための操作と同じ操作を用いて、カンナビノールの２位が標識されたカンナビノール−ベースのトレーサーが、出発物質として２−置換カンナビノール誘導体を用いて２工程で製造できる。上記の製造方法と同様にして製造され得られた、２または４位に付加された標識をもつカンナビノール−ベースのトレーサーは、FIG.５に示す一般式を有する。
【００３８】
実施例II
FIG.１１に示す好ましいトレーサーＧＷ２−２５の製造
好ましいトレーサーＧＷ２−２５は、カンナビノール分子の９位に付加された標識を有するトレーサーであり、下記のようにして合成された：カンナビノール−９−カルボキシのスクシニミジル活性エステル(1 mg)(Research Triangle Instituteから)を、ＰＢＳ緩衝液1 mL中(pＨ 9)Ｃy５ＥＤＡ(3 mg)溶液にRTにて添加した。得られた混合物をRTにて4時間攪拌し、ついで混合物を、直接Ｃ18プレート(20×20 cm, 1000μm)にスポットし、70/30(v/v)の割合のメタノールおよび水で展開させた。生成物のバンドを切り取り、メタノールで抽出した。FIG.１１にＧＷ６−２５として示す得られたトレーサーは、直接免疫測定法に用いることができる。
【００３９】
実施例III
８または１０位が標識されたカンナビノール−ベースのトレーサーの製造
カンナビノール分子の８または１０位が標識されたカンナビノール−ベースのトレーサーは、８または１０−酸化カンナビノールをＣy５ＯＳuと反応させて合成することができ、８または１０−Ｃy５−標識カンナビノール−ベースのトレーサーを得た。８または１０−酸化カンナビノールは、Novak, J.ら、J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 12867(1983)(ここに、引用してすべて明細書の記載とする)に記載の方法によって製造することができる。
【００４０】
実施例IV
３位に標識を有するカンナビノール−ベースのトレーサーの製造
カンナビノール分子の３位の官能基化ペンチル鎖は、Singer, Mら、Synthesis, May 1994, p486−488(ここに、引用してすべて明細書の記載とする)に記載の方法を用いて合成することができる。ペンチル鎖に付加された官能基は、カルボニルまたはカルボキシ基であってもよく、ペンチル鎖のいずれかの炭素原子に付加することができる。ついで、カルボニルまたはカルボキシ基を、Ｃy５−ＥＤＡと、１,３−ジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させ、３位が標識されたカンナビノール−ベースのトレーサーを得る。
【００４１】
実施例Ｖ
１位に標識を有するカンナビノール−ベースのトレーサーの製造
１位が標識されたカンナビノール−ベースのトレーサーを得るために、カンナビノールをＢrＣＨ2ＣＯＯＨとＫ2ＣＯ3の存在下で反応させ、カンナビノールの１位の炭素原子に付加されたＯ−ＣＨ2ＣＯＯＨを有するカンナビノール誘導体を得る。ついで、１位にＯ−ＣＨ2ＣＯＯＨを有するカンナビノール誘導体を、Ｃy５−ＥＤＡと、１,３−ジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させ、１位が標識されたカンナビノール−ベースのトレーサーを得る。
【００４２】
実施例VI
カンナビノール−ベースのトレーサーとの比較に用いるための従来のトレーサーの製造
反応性エステル、１１−[(Ｎ−スクシニミジル)オキシカルボキシルメトキシイミノ]−δ−８−ＴＨＣ(4 mg)を、ＰＢＳ緩衝液(1 mL、pＨ 9)中Ｃy５ＥＤＡ(6 mg)溶液にRTにて添加した。得られた混合物をRTにて4時間攪拌し、ついで混合物を、直接Ｃ18プレート(20×20 cm, 1000μm)にスポットし、70/30(v/v)の割合のメタノールおよび水で展開させた。生成物のバンドを切り取り、メタノールで抽出した。得られたトレーサーが、FIG.１３にＧＷ２−８２として示すトレーサー分子である。
【００４３】
実施例VII
Δ9−ＴＨＣの連続流動免疫測定法の操作
a)連続流動免疫測定装置：
連続流動免疫置換測定法を行うのに必要なポンプ、バルブ、配管、取り換え可能なカラムおよび蛍光検出器を含む流動免疫測定法装置は、Lieglerら、U.S. Pat. No. 5,183,740に開示されており、これはすでに引用して明細書の記載としている。
【００４４】
ＴＨＣ標準曲線は、種々の濃度のΔ9−ＴＨＣ(例えば、0 ng/mL, 25 ng/mLおよび100 ng/mL)をマリファナを吸わない人の唾液に添加して作成した。化学品および緩衝液はシグマ・アルドリッチ・カンパニー(Sigma and Aldrich, Company)から入手した。
【００４５】
b)試薬の調製
唾液中の添加されたΔ9−ＴＨＣの存在の測定のために、特異的抗−ＴＨＣモノクローナル抗体(例えば、Fritzgerald Industries, Inc., Concord, Mass.からcat.#10−T43として入手可能)を、製造業者の標準プロトコルに従ってエンフェース(Emphase)多孔性ビーズに結合または固定した。抗体−結合ビースを、ついで、FIG.１０−１２に示す製造したＣy５−標識トレーサーで飽和させた。得られたトレーサー−抗体−樹脂複合体混合物を一夜４℃にて回転混合器を用いて回転混合させながら放置した。複合体樹脂を０.１M ＰＢＳ(10% MeOH)で安定的な基準線が得られるまで洗滌した。洗滌した樹脂を等容量の５０ mM ＰＢＳ(pH 7.4)中１５０ mMトレハロース緩衝液に添加した。ついで、樹脂を凍結−乾燥させ、使用時まで保存した。
【００４６】
(b)流動測定法
内直径２ mmおよび長さ１０ mmのミクロ−ポリスチレンカラムに製造した樹脂４ mgを充填した。充填したカラムを流動免疫測定装置の流動導管の１つに取り付けた。カラムはまたラブビューソフトウエア(Labview software, National Instruments, Inc.)で支持された自動システムで制御された適当な緩衝液で予−洗した。その後、ＴＨＣを添加した唾液試料５０ μlを、流速１００〜３００ μl／分で導管を通過させた。免疫測定像をFIG.１３に示す。
【００４７】
FIG.１３は、連続流動置換測定法におけるカンナビノール−ベースのトレーサー(ＧＷ６−２５)の感度とΔ9−ＴＨＣ−ベースのトレーサー(ＧＷ５−５１、ＧＷ２−８２およびＧＷ６−１０)の感度の比較の結果の例を示す。カラムからの流出を検出し得る蛍光量の増加によってわかるように、ＴＨＣ含有試料をカラムを通過させた時、ＧＷ６−２５は効果的にカラム上の抗体からはずれる。Δ9−ＴＨＣ−ベースのトレーサーと比較したとき、 ＧＷ６−２５は、25 ng/mLおよび100 ng/mLのΔ9−ＴＨＣ濃度において、Δ9−ＴＨＣの検出に高感度を示す。カンナビノール−ベースのトレーサー、ＧＷ６−２５を使用すると、ＴＨＣ 100 ng/mLにおいて約２〜約２０倍感度が増大し、Δ9−ＴＨＣ 25 ng/mLiにおいて、約１.５〜約８倍感度が増大する。
【００４８】
実施例VIII
具体的なトレーサーに対する抗体の結合親和性がより低いことは、試料中の分析物と比較してトレーサーに対する抗体の交叉反応性の％によって測定することができる。実施例VIIに記載の方法と同様にして、例えば、Δ9−ＴＨＣに対する固定化抗体はカンナビノール−ベースのトレーサー(FIG.１０に示す)に結合した。Δ9−ＴＨＣ(非標識)、Δ8−ＴＨＣ(非標識)、非標識９−カルボキシ−Δ9−ＴＨＣ(ＴＨＣＡ)、カンナビジオール(非標識)または非標識カンナビノールを25 ng/mLで含有する種々の試料を、抗体−トレーサー複合体を有する種々のカラムを通過させて、交叉反応の量を測定した。ついで、置換されたトレーサーの量を種々の試料間で比較した。
【００４９】
結果を下記のＴable１に示す:
Ｔable１
2005506520.tif 000003
【００５０】
Δ9−ＴＨＣを基準として用いると(すなわち、Δ9−ＴＨＣを交叉反応100%に設定)(1602/1602))、９−カルボキシ−Δ9−ＴＨＣは、約540%(8700/1602)の交叉反応性％であり、カンナビノールは、約79%(1266/1602)の交叉反応性％である。もし、９−カルボキシ−Δ9−ＴＨＣを基準として用いると(すなわち、９−カルボキシ−Δ9−ＴＨＣを交叉反応100%に設定(8700/8700))、カンナビノールの交叉反応性％は、約14.5%(1266/8700)である。もし、Δ8−ＴＨＣを基準として用いると(すなわち、Δ8−ＴＨＣを交叉反応100%に設定(1488/1488))、カンナビノールの交叉反応性％は、約85%(1266/1488)である。
【００５１】
本発明を数種の好ましい具体例に関連させて上記に記載したが、当業者は、本発明の主旨および範囲内でそれらの具体例に種々の変更をなすことおよび種々の均等物が本発明の主旨または範囲から外れることなく置換され得ることが理解されるであろう。さらに、上記の実施例は説明のためだけのものであり、本発明を限定するものでない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＴＨＣ免疫試験法のトレーサーの従来の製造方法を示す。方法Ａは、出発物質として９−カルボキシ−Δ9−ＴＨＣを使用し、Δ9−ＴＨＣ−ベースのトレーサーを得る。方法Ｂは、非−規制物質を使用し、Δ9−ＴＨＣ類似体−ベースのトレーサーを得る。
【図２Ａ】本発明の具体例の１つによってカンナビノール−ベースのトレーサー合成の一般的な方法を示す。
【図２Ｂ】カンナビノールの化学構造式を示す。
【図３】本発明の具体例の１つによって、標識が９位に付加されたカンナビノール−ベースのトレーサーを示す。
【図４】本発明の具体例の１つによって、標識が１位に付加されたカンナビノール−ベースのトレーサーを示す。
【図５】本発明の具体例の１つによって、標識がカンナビノールの８または１０位に付加されたカンナビノール−ベースのトレーサーを示す。
【図６】本発明の具体例の１つによって、標識がカンナビノールの２または４位に付加されたカンナビノール−ベースのトレーサーを示す。
【図７】本発明の具体例の１つによって、標識がカンナビノールのペンチル側鎖を経て３位に付加されたカンナビノール−ベースのトレーサーを示す。
【図８】本発明のトレーサー合成に使用され得る通常の蛍光標識の例を示す。
【図９】本発明のトレーサー合成に使用され得る通常の蛍光標識の例を示す。
【図１０】本発明の具体例の１つによって、標識がカンナビノールの９位に付加されたカンナビノール−ベースのトレーサーを示す。
【図１１】従来のΔ9−ＴＨＣ−ベースのトレーサーを示す。
【図１２】従来のΔ9−ＴＨＣ−ベースのトレーサーを示す。
【図１３】FIG.１１からの好ましいトレーサー、ＧＷ６−２５、FIG.１１および１２からの従来のトレーサーＧＷ５−５１、ＧＷ２−８２によるΔ9−ＴＨＣの流動免疫試験法の比較を示す。
【図１４】Δ9−ＴＨＣ、Δ9−ＴＨＣ類似体およびカンナビノールの三次元構造を示す。
【図１５】２位または４位に標識が付加されたカンナビノール−ベースの分子の製造方法を示す。
【図１】
2005506520.tif 000005
【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2005506520.tif 000009
【図１５】
2005506520.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2005506520.tif 000011
2005506520.tif 000012
2005506520.tif 000013
2005506520.tif 000014
2005506520.tif 000015
2005506520.tif 000016
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506520.tif 000040
2005506520.tif 000041
【国際調査報告】
2005506520.tif 000042
2005506520.tif 000043
2005506520.tif 000044
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