(57)【要約】本発明は、タンパク質、特に免疫グロブリンに縮合したｌｅｗｉｓＹ改変体ムチンを使用する癌ワクチン免疫原性を改善するための組成物および方法を提供する。構築物が、アルファ  １，２−フコシルトランスフェラーゼおよびアルファ  １，３−フコシルトランスフェラーゼでのタンパク質（例えば、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１））のグリコシル化により生成され得る。本発明は、癌のような疾患を予防および処置する際のタンパク質ワクチンの組成物および方法ならびにそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを含む精製腫瘍ワクチンであって、該ポリペプチドが、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３フコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化される、ワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載の腫瘍ワクチンであって、前記ポリペプチドが、複数のＬｅｙエピトープを含む、ワクチン。
【請求項３】
請求項１に記載の腫瘍ワクチンであって、前記ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも１つの領域を含む、ワクチン。
【請求項４】
請求項１に記載の腫瘍ワクチンであって、前記ポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含む、ワクチン。
【請求項５】
請求項３または４に記載の腫瘍ワクチンであって、前記ポリペプチドが、野生型Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１ポリペプチドよりも多くのＬｅｙエピトープを含む、ワクチン。
【請求項６】
請求項１に記載の腫瘍ワクチンであって、前記ポリペプチドが、ダイマーである、ワクチン。
【請求項７】
第２のポリペプチドに作動可能に連結した第１のポリペプチドを含む精製腫瘍ワクチンであって、該第１のポリペプチドが、腫瘍関連炭水化物エピトープを含み、該第２のポリペプチドが、免疫応答刺激因子ポリペプチドを含む、ワクチン。
【請求項８】
請求項７に記載の腫瘍ワクチンであって、前記腫瘍関連炭水化物エピトープが、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、Ｌｅｗｉｓ  ＹおよびＬｅｗｉｓ  Ｂからなる群から選択される、ワクチン。
【請求項９】
請求項７に記載の腫瘍ワクチンであって、前記第１のポリペプチドが、複数の腫瘍関連炭水化物エピトープを含む、ワクチン。
【請求項１０】
第２のポリペプチドに作動可能に連結した第１のポリペプチドを含む精製腫瘍ワクチンであって、該第１のポリペプチドが、α１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化され、該第２のポリペプチドが、免疫応答刺激因子ポリペプチドを含む、ワクチン。
【請求項１１】
請求項７または１０に記載の腫瘍ワクチンであって、前記免疫応答刺激因子ポリペプチドが、Ｔ細胞刺激因子ポリペプチドである、ワクチン。
【請求項１２】
請求項１１に記載の腫瘍ワクチンであって、前記Ｔ細胞刺激因子ポリペプチドが、キーホールリンペットヘモシアニン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）およびスーパー抗原からなる群から選択される、ワクチン。
【請求項１３】
請求項１２に記載の腫瘍ワクチンであって、前記熱ショックタンパク質が、ＨＳＰ６０またはＨＳＰ７０である、ワクチン。
【請求項１４】
請求項１２に記載の腫瘍ワクチンであって、前記スーパー抗原が、ブドウ球菌エンテロトキシンである、ワクチン。
【請求項１５】
請求項７または１０に記載の腫瘍ワクチンであって、前記第１のポリペプチドが、複数のＬｅｙエピトープを含む、ワクチン。
【請求項１６】
請求項７または１０に記載の腫瘍ワクチンであって、前記第１のポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも１つの領域を含む、ワクチン。
【請求項１７】
請求項７または１０に記載の腫瘍ワクチンであって、前記第１のポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含む、ワクチン。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の腫瘍ワクチンであって、前記第１のポリペプチドが、野生型Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１ポリペプチドよりも多くのＬｅｙエピトープを含む、ワクチン。
【請求項１９】
請求項７または１０に記載の腫瘍ワクチンであって、該腫瘍ワクチンが、免疫グロブリンポリペプチドをさらに含む、ワクチン。
【請求項２０】
請求項１９に記載の腫瘍ワクチンであって、前記免疫グロブリンポリペプチドが、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの１つの領域を含む、ワクチン。
【請求項２１】
請求項１９に記載の腫瘍ワクチンであって、前記免疫グロブリンポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む、ワクチン。
【請求項２２】
請求項７または１０に記載の腫瘍ワクチンであって、該ワクチンが、ダイマーである、ワクチン。
【請求項２３】
精製腫瘍ワクチンであって、該ワクチンが、以下：
（ａ）第２のポリペプチドと作動可能に連結した第１のポリペプチドを含むアジュバントポリペプチドであって、該第１のポリペプチドが、ムチンポリペプチドであり、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３フコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化され、そして該第２のポリペプチドが、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１つの領域を含む、ポリペプチドならびに
（ｂ）免疫応答刺激因子ポリペプチド
を含む、ワクチン。
【請求項２４】
請求項２３に記載の腫瘍ワクチンであって、前記アジュバントポリペプチドが、前記免疫応答刺激因子ポリペプチドと作動可能に連結している、ワクチン。
【請求項２５】
請求項２３に記載の腫瘍ワクチンであって、前記アジュバントポリペプチドが、前記免疫応答刺激因子ポリペプチドと共有結合している、ワクチン。
【請求項２６】
請求項２３に記載の腫瘍ワクチンであって、前記第１のポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも１つの領域を含む、ワクチン。
【請求項２７】
請求項２３に記載の腫瘍ワクチンであって、前記第１のポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含む、ワクチン。
【請求項２８】
請求項２３に記載の腫瘍ワクチンであって、前記第１のポリペプチドが、複数のＬｅｙエピトープを含む、ワクチン。
【請求項２９】
請求項２５または２６に記載のワクチンであって、前記第１のポリペプチドが、野生型Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１ポリペプチドよりも多くのＬｅｙエピトープを含む、ワクチン。
【請求項３０】
請求項２３に記載の腫瘍ワクチンであって、前記第２のポリペプチドが、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの１つの領域を含む、ワクチン。
【請求項３１】
請求項２５に記載のワクチンであって、前記第２のポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む、ワクチン。
【請求項３２】
請求項２５に記載のワクチンであって、該アジュバントポリペプチドが、ダイマーである、ワクチン。
【請求項３３】
請求項２５に記載の腫瘍ワクチンであって、前記免疫応答刺激因子ポリペプチドが、Ｔ細胞刺激因子ポリペプチドである、ワクチン。
【請求項３４】
請求項３３に記載の腫瘍ワクチンであって、前記Ｔ細胞刺激因子ポリペプチドが、キーホールリンペットヘモシアニン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）およびスーパー抗原を含む群から選択される、ワクチン。
【請求項３５】
請求項３４に記載の腫瘍ワクチンであって、前記熱ショックタンパク質が、ＨＳＰ６０またはＨＳＰ７０である、ワクチン。
【請求項３６】
請求項３４に記載の腫瘍ワクチンであって、前記スーパー抗原が、ブドウ球菌エンテロトキシンである、ワクチン。
【請求項３７】
請求項１、７、１０または２４のいずれか１項に記載のワクチンをコードする、単離された核酸。
【請求項３８】
請求項３７に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項３９】
請求項３８に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項４０】
免疫化の必要のある被験体の免疫化方法であって、該方法が、該被験体に請求項１に記載の腫瘍ワクチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項４１】
処置の必要な被験体の癌を処置する方法であって、該方法が、該被験体に請求項１に記載の腫瘍ワクチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項４２】
請求項１に記載の腫瘍ワクチンであって、前記α１，２−フコシルトランスフェラーゼが、ＦＵＴ１またはＦＵＴ２である、ワクチン。
【請求項４３】
請求項１に記載の腫瘍ワクチンであって、前記α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、またはＦＵＴ９からなる群から選択される、ワクチン。
【請求項４４】
請求項１に記載の腫瘍ワクチンであって、前記α１，２−フコシルトランスフェラーゼが、ＦＵＴ１であり、前記α１，３−フコシルトランスフェラーゼが、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５またはＦＵＴ６からなる群から選択される、ワクチン。
【請求項４５】
免疫細胞活性化を増大させる方法であって、該方法が、該免疫細胞を、精製腫瘍ワクチンと接触させる工程を包含し、該腫瘍ワクチンが、ポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、α１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化され、その結果該細胞の活性が増大する、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記細胞が、Ｂ細胞およびＴ細胞からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、癌のような疾患を予防および処置する際のタンパク質ワクチンの組成物および方法ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
自己由来の腫瘍または同種異系由来の腫瘍から得られた全細胞溶解物を使用する癌ワクチンは、現在、よく特徴付けられた腫瘍関連抗原に標的化するために使用される。これらの腫瘍関連抗原は、しばしば、タンパク質または糖タンパク質であるが、炭水化物部分でもあり得る。炭水化物は、抗細菌性ワクチン療法について、その中でも最もよく研究された標的である。炭水化物部分に対する免疫応答は、主に抗体依存的であり、いくつかの細菌の莢膜多糖類に対する抗体は後の細菌による攻撃を防ぐことが示されている。同様に、腫瘍関連抗原に対する抗体が、循環する腫瘍細胞および微小転移巣を減少または除去することが可能であるかもしれない。非ヒト動物モデルおよび臨床試験により、腫瘍関連抗原に対する抗体は、腫瘍の再発からの防御を媒介し得ることが示されている。しかし、炭水化物は、弱い免疫原であり、一般的にＴ細胞によって認識されない。
【０００３】
ムチン（例えば、ＭＵＣ１）、および高度にＯ−グリコシル化されたドメイン（例えば、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１））を有するムチン様分子は、広くグリコシル化された高分子量（＞２００ｋＤ）タンパク質であり、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、およびα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼを含む多くのグリコシル化酵素の標的である。ムチンは、通常の細胞（例えば、白血球）において、および上皮起源の多くのヒト癌において豊富に発現される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、ＬｅｗｉｓＹ（Ｌｅｙ）炭水化物エピトープを含有する融合タンパク質は、ワクチンの免疫原性を増大させるという発見に、部分的に基づく。ムチンは、ＬｅｗｉｓＹエピトープを生成するフコシルトランスフェラーゼの標的であり、ワクチンにおいて特に有用である。
【０００５】
本発明は、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３フコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化されるポリペプチドを含む、精製した腫瘍ワクチンを特徴とする。このポリペプチドは、複数のＬｅｙエピトープを含む。例えば、このポリペプチドは、野生型のＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１ポリペプチドよりも多くのＬｅｙエピトープを含む。
【０００６】
別の局面において、本発明は、免疫応答刺激因子ポリペプチドを含む第２のポリペプチドと作動可能に結合した、腫瘍関連炭水化物エピトープを含む第１のポリペプチドを含有する、精製した腫瘍ワクチンに関する。第１のポリペプチドは、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３フコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化される。腫瘍関連炭水化物エピトープは、例えば、ＬｅｗｉｓＹ、ＬｅｗｉｓＡ、ＬｅｗｉｓＸ、およびＬｅｗｉｓＢである。第１のポリペプチドは、複数の腫瘍関連炭水化物エピトープを含む。あるいは、第１のポリペプチドは、ネイティブの（すなわち、野生型の）ポリペプチドよりも多くの腫瘍関連炭水化物エピトープを含む。ネイティブのポリペプチドは、腫瘍関連炭水化物エピトープを天然に発現するポリペプチドである。
【０００７】
別の局面において、本発明は、免疫グロブリンの少なくとも１つの領域を含む第２のポリペプチドと作動可能に結合した第１のポリペプチド、および免疫応答刺激因子ポリペプチドを含むアジュバントポリペプチドを含有する、精製された腫瘍ワクチンを提供する。この第１のポリペプチドは、ムチンポリペプチドであり、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦＵＴ１またはＦＵＴ２）およびα１，３フコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、またはＦＵＴ９）によりグリコシル化されている。このアジュバントポリペプチドは、免疫応答刺激因子ポリペプチドと作動可能に結合している（例えば、共有結合による）。
【０００８】
第１のポリペプチドは、ムチンポリペプチドである。このポリペプチドは、モノマーである。あるいは、このポリペプチドはダイマーである。このポリペプチドは、例えば、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１ポリペプチドである。このポリペプチドは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも一部（例えば、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分）を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、複数のＬｅｙエピトープを含む。
【０００９】
免疫応答刺激因子ポリペプチドは、Ｔ細胞刺激因子ポリペプチドである。Ｔ細胞刺激因子ポリペプチドは、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）へモシアニン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（例えば、ＨＳＰ６０またはＨＳＰ７０）、またはスーパー抗原（例えば、ブドウ球菌の内毒素）である。
【００１０】
本発明の精製した腫瘍ワクチンはまた、免疫グロブリンポリペプチドを含む。この免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖の一部を含む。あるいは、この免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む。
【００１１】
本発明はまた、腫瘍ワクチンをコードする核酸、これらの核酸を含むベクター、およびこれらのベクターを含む細胞を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、被験体に本発明に従う腫瘍ワクチンを投与することにより、被験体（例えば、哺乳動物）を免疫する方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、被験体に本発明に従う腫瘍ワクチンを投与することにより、被験体の癌の症状を予防または緩和する方法を提供する。癌は、例えば、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、頚癌または皮膚癌である。
【００１４】
本発明はさらに、細胞を本発明に従うワクチンに接触させることによって、免疫細胞の活性を増大させる方法を特徴とする。この細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。
【００１５】
別段定義されなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中で記載されるものと同様かまたは同じ方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）が、支配する。さらに、この材料、方法、および例は、単なる例示に過ぎず、限定することを意図しない。
【００１６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかである。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＬｅｗｉｓＹ（Ｌｅｙ）エピトープを有するムチン融合タンパク質が有効な癌アジュバントであるという発見に一部基づく。
【００１８】
黒色腫、神経芽腫、肉腫、小細胞肺癌、ならびに乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌および胃癌において、いくつかの炭水化物ベースの腫瘍関連抗原が同定されている。腫瘍関連炭水化物部分に対する高い力価の抗体応答を起こすために、本発明は、有力なアジュバント特性を有する多価結合体ワクチンを提供する。組換えムチンは、腫瘍関連炭水化物エピトープ（例えば、Ｌｅｙエピトープ）と、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、Ｔヘルパーリンパ球を誘導するペプチド配列とを共に多価発現するように設計した。ＬｅｗｉｓＹエピトープの密度により、特定のＴ細胞による認識が促進され、Ｔ細胞が誘導された。ムチン−Ｌｅｙ複合体を、ＭＨＣクラスＩＩ分子とＴ細胞レセプターとの間の架橋の形成を促進させるタンパク質と結合させ、Ｔ細胞とＢ細胞との間に偽性の結合を作製することにより、Ｔ細胞を独立して引きつける。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、以下の定義は、この場合の理解を容易にするために、提供される。この定義が、当業者に公知の意味から変化する程度まで、以下の定義が支配する。
【００２０】
「ムチン」とは、フコシルトランスフェラーゼ（例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３フコシルトランスフェラーゼ）、およびα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼの標的である、１種以上のＯグリコシル化ドメインを有する任意のポリペプチドを意味する。
【００２１】
「生物学的成分」とは、細胞、組織、細菌、ウイルス、または他の生物学的実体（ペプチド、タンパク質、脂質、糖質、ホルモン、またはこれらの組み合わせを含む）によって作製されるかまたはこれらと関連する、任意の化合物を意味する。
【００２２】
「アジュバント化合物」とは、抗原またはワクチンの免疫原性応答または免疫原性を増大させる任意の化合物を意味する。
【００２３】
「抗原」とは、免疫原性応答を誘導し得る任意の化合物を意味する。
【００２４】
「免疫グロブリン」とは、形質細胞によって分泌され、特定の抗原と結合することによって免疫応答において抗体として機能する任意のポリペプチドまたはタンパク質複合体を意味する。免疫グロブリンは、本明細書中で使用される場合、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含む。免疫グロブリンの領域は、Ｆｃ領域およびＦａｂ領域、ならびに重鎖または軽鎖の免疫グロブリンを含む。
【００２５】
「抗原提示」とは、１種以上の主要組織適合複合体クラスＩまたはクラスＩＩ分子と関連した、細胞表面上での抗原の発現を意味する。抗原提示は、当該分野で公知の方法によって測定される。例えば、抗原提示は、Ｇｉｌｌｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：２０２７  １９７８に記載されるインビトロ細胞アッセイを使用して測定される。
【００２６】
「免疫原性」とは、物質が免疫応答を刺激する能力を意味する。免疫原性は、例えば、その物質に対して特異的な抗体の存在を決定することによって測定される。抗体の存在は、当該分野で公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）によって検出される。
【００２７】
「免疫応答」または「免疫原性応答」とは、抗原によって誘導される細胞活性（例えば、抗体の生成、または抗原もしくは抗原フラグメントの提示）を意味する。
【００２８】
「タンパク質分解性分解」とは、ペプチド結合の加水分解によるポリペプチドの分解を意味する。用語「ペプチド」によって、特定の長さは示されない。タンパク質分解性分解は、例えば、ゲル電気泳動を使用して測定される。
【００２９】
「細胞」とは、抗原提示が可能な任意の細胞を含む。例えば、その細胞は、体細胞、Ｂ細胞、マクロファージまたは樹状細胞である。
【００３０】
本発明は、ワクチンとして有用なムチンポリペプチドおよび免疫応答刺激因子ポリペプチドを含む、ムチン−免疫応答刺激因子融合タンパク質（本明細書では、「ムチン−ＩＲＳ融合タンパク質」という）を提供する。このワクチンは、被験体の癌を処置するために免疫する方法において、有用である。本発明の融合タンパク質は、腫瘍関連炭水化物エピトープを保持する。例えば、融合タンパク質は、Ｌｅｙ、Ｌｅｘ、Ｌｅａ、またはＬｅｂエピトープを保持する。好ましくは、融合タンパク質は、Ｌｅｙエピトープを含む。あるいは、融合タンパク質は、２種類以上の腫瘍関連炭水化物エピトープを保持する。
【００３１】
（融合タンパク質）
種々の局面において、本発明は、第２のポリペプチドに作動可能に結合した、糖タンパク質（例えば、ムチンポリペプチド）の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。「少なくとも一部」とは、ムチンポリペプチドが、少なくとも１つのムチンドメイン（例えば、Ｏ−結合グリコシル化部位）を含むことを意味する。好ましくは、ムチンポリペプチドは、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、またはα１，２フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３フコシルトランスフェラーゼの両方によってグリコシル化されている。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、非ムチンポリペプチドに作動可能に結合したムチンポリペプチドの少なくとも一部を含む。「ムチンポリペプチド」とは、ムチンドメインを有するポリペプチドをいう。ムチンポリペプチドは、１、２、３、５、１０、２０個以上のムチンドメインを有する。ムチンポリペプチドは、Ｏ−グリカンで置換されるアミノ酸配列によって特徴付けられる任意の糖タンパク質である。例えば、全てのムチンポリペプチドは、第２または第３アミノ酸がセリンまたはスレオニンである。ムチンポリペプチドは分泌タンパク質である。あるいは、ムチンポリペプチドは、細胞表面タンパク質である。
【００３２】
ムチンドメインは、スレオニン、セリンおよびプロリンのアミノ酸が豊富であり、それらのアミノ酸において、オリゴ糖類が、Ｎ−アセチルガラクトサミンを介してヒドロキシアミノ酸に結合する（Ｏ−グリカン）。ムチンドメインは、Ｏ−結合グリコシル化部位を含むか、あるいはＯ−結合グリコシル化部位からなる。ムチンドメインは、１、２、３、５、１０、２０、５０、１００以上のＯ−結合グリコシル化部位を有する。あるいは、ムチンドメインは、Ｎ−結合グリコシル化部位を含むか、あるいはＮ−結合グリコシル化部位からなる。ムチンポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％、９０％、９５％または１００％がグリカンに起因する。「非ムチンポリペプチド」とは、その質量の少なくとも４０％未満がグリカンに起因する、ポリペプチドをいう。ムチンポリペプチドは、ＭＵＣ遺伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２など）によってコードされる任意のポリペプチドである。あるいは、ムチンポリペプチドは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ、赤血球細胞グリコホリン、グリコカリシン（ｇｌｙｃｏｃａｌｉｃｉｎ）、グリコホリン、シアロホリン（ｓｉａｌｏｐｈｏｒｉｎ）、ロイコシアリン（ｌｅｕｋｏｓｉａｌｉｎ）、ＬＤＬ−Ｒ、ＺＰ３、およびエピグリカニン（ｅｐｉｇｌｙｃａｎｉｎ）である。好ましくは、ムチンはＰＳＧＬ−１である。
【００３３】
ムチンポリペプチドは、ムチンタンパク質の全ての部分または一部分を含む。あるいは、そのムチンタンパク質は、ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、そのムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ５７４６８に開示されるアミノ酸１９〜３１９）を含む。そのムチンポリペプチドはまた、ＰＳＧＬ−１のシグナル配列部分（例えば、アミノ酸１〜１８）、膜貫通ドメイン（例えば、アミノ酸３２０〜３４３）、および細胞質ドメイン（例えば、アミノ酸３４４〜４１２）を含む。
【００３４】
第１のポリペプチドは、一般にα１，２フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３フコシルトランスフェラーゼによりグリコシル化される。いくつかの局面において、その第１のポリペプチドはまた、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼまたは１，３Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、またはポリペプチドをグリコシル化することが当業者に公知の別の酵素によってグリコシル化される。適切なフコシルトランスフェラーゼとしては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２０２５、ＮＭ＿１７８０３２、ＮＭ＿０３１６３５Ｕ１７８９４、ＡＢ０１５６３４およびＡＦ１３４４１４が挙げられ、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００３５】
融合タンパク質において、用語「作動可能に連結される」は、アジュバントポリペプチドの第１および第２のポリペプチドが、第１のポリペプチドのＯ結合型グリコシル化を可能にする様式で（最も代表的には、ペプチド結合のような共有結合を介して）化学的に連結されていることを示すことが意図される。融合ポリペプチドをコードする核酸をいうために使用される場合、この用語、作動可能に連結されるは、アジュバントポリペプチドのムチンポリペプチドおよび非ムチンポリペプチドをコードする核酸が、互いにインフレームで融合されていることを意味する。非ムチンポリペプチドは、ムチンポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合されるか、またはムチンポリペプチドの内部アミノ酸に融合される。「内部アミノ酸」とは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にはないアミノ酸を意味する。
【００３６】
非ムチンポリペプチドは、免疫応答刺激因子（ＩＲＳ）ポリペプチドである。「免疫応答刺激因子」とは、免疫応答を増加する化合物を意味する。免疫応答刺激因子ポリペプチドとしては、Ｔ細胞刺激因子ポリペプチドが挙げられる。例示的なＴ細胞刺激因子ポリペプチドとしては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、およびスーパー抗原が挙げられる。
【００３７】
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、銅含有タンパク質であり、軟体動物の血液リンパから単離される。ＫＬＨは、５個の異なった凝集状態（ｐＨ７．４のＴｒｉｓ緩衝液中）で存在し、これは、中程度のｐＨで容易に解離する。サブユニット分子質量は、約４５０ｋＤａである。
【００３８】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、折り畳み、アセンブリ、膜を横切るトランスロケーションおよび分解の中間段階においてタンパク質に結合および安定化する分子シャペロンを含む。ＨＳＰ６０およびＨＳＰ７０は、好ましいＨＳＰである。
【００３９】
スーパー抗原は、一組のＴリンパ球と相互作用し、ＭＨＣクラスＩＩに制限されず、そしてプロセスされない形態でＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用し得る抗原を含む（一般的に、従来の抗原は、細胞のエンドサイトーシス経路を介して提示されなければならない）。スーパー抗原は、種々の群のＴ細胞を活性化し得る。スーパー抗原としては、ウイルスにコードされたスーパー抗原（例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルスＭｌｓ；狂犬病ウイルスヌクレオカプシドタンパク質；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連スーパー抗原）；発熱性毒素スーパー抗原（ＰＴＳＡｇｓ）（例えば、毒素ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）；ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；ブドウ球菌エンテロトキシンＢ；およびブドウ球菌猩紅熱毒素（ＳＰＥ）；および他の細菌スーパー抗原（例えば、ブドウ球菌剥脱性毒素；ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓマイトジェン；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａおよびｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓスーパー抗原、およびブドウ球菌Ｍプロテイン）が挙げられる。マウスＭｌｓ遺伝子産物もまた、スーパー抗原である。
【００４０】
あるいは、融合ポリペプチドは、アジュバントポリペプチドに連結する。アジュバントポリペプチドは、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、およびα１，３フコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化されるムチンポリペプチドであり、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１つの領域を含む。
【００４１】
ワクチンは、１つ以上のさらなる部分に連結される。例えば、ムチン−ＩＲＳタンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質（ムチン−免疫反応刺激因子融合タンパク質配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される）にさらに連結され得る。このような融合タンパク質は、ムチン−ＩＲＳ融合タンパク質の精製を容易にし得る。あるいは、ムチン−ＩＲＳ融合タンパク質は、固体支持体にさらに連結され得る。種々の固体支持体は、当業者に公知である。このような組成物は、抗血液型抗体の除去を容易にし得る。例えば、ムチン−ＩＲＳタンパク質は、例えば、金属化合物、シリカ、ラテックス、ポリマー材料から作製される粒子；マイクロタイタープレート；ニトロセルロースもしくはナイロンまたはそれらの組み合わせに連結される。
【００４２】
融合タンパク質は、異種シグナル配列（すなわち、ムチン核酸によってコードされるポリペプチドに存在しないポリペプチド配列）をそのＮ末端に含む。例えば、ネイティブのムチンシグナル配列が除去され、別のタンパク質由来のシグナル配列で置換される。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ポリペプチドの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増大される。
【００４３】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の方法に従って（例えば、連結のための平滑末端または粘着末端（ｓｔａｇｇｅｒ  ｅｎｄ）、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合、粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）の充填、所望でない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することによって）インフレームでともに連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成される。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子フラグメント（これらのフラグメントは、後でキメラ遺伝子配列を生成するためにアニールされ、再増幅され得る）の間で相補的な突出部を生じるアンカープライマーを使用して行われる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。融合タンパク質コード核酸は、融合部分が、免疫グロブリンタンパク質にインフレームで連結されるように、そのような発現ベクターにクローニングされる。
【００４４】
ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドは、オリゴマー（例えば、二量体、三量体、または五量体）として存在し得る。好ましくは、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドは、二量体である。より好ましくは、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドは、二量体ＰＳＧＬ−１タンパク質、またはそれらの細胞外領域である。
【００４５】
第１のポリペプチド、および／または第１のポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知のムチンコード配列を用いて構築される。ムチンポリペプチドおよびムチンポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ５７４６８、ＮＰ６６３６２５およびＮＭ１４５６５０、ＣＡＤ１０６２５およびＡＪ４１７８１５、ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４、ＸＰ００６８６７およびＸＭ００６８６７およびＮＰ００３３１７７７およびＮＭ００９１５１を含み、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００４６】
そのムチンポリペプチド部分は、増大した糖質含有量を生じる（非変異配列に対して）、天然に存在するムチン配列（野生型）において変異を有する改変体ムチンポリペプチドとして提供される。例えば、改変体ムチンポリペプチドは、野生型ムチンと比較して、さらなるＯ結合型グリコシル化部位を含む。あるいは、その改変体ムチンポリペプチドは、野生型ムチンポリペプチドと比較して、増大した数のセリン、スレオニン、またはプロリン残基を生じるアミノ酸配列変異体を含む。この増大した糖質含有量は、当業者に公知の方法によって、ムチンのタンパク質：糖質の比を決定することによって評価される。
【００４７】
ムチンポリペプチド部分は、タンパク質分解に対してより耐性の（非変異配列に対して）ムチン配列を生じる、天然に存在するムチン配列（野生型）において変異を有する改変体ムチンポリペプチドとして提供される。
【００４８】
融合ポリペプチドの第１のポリペプチドは、全長ＰＳＧＬ−１を含む。あるいは、この第１のポリペプチドは、全長ＰＳＧＬ−１ポリペプチド未満（例えば、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分）を含む。例えば、４００アミノ酸長未満（例えば、３００、２５０、１５０、１００、５０、または２５アミノ酸長以下）の第１のポリペプチド。例示的なＰＳＧＬ−１ポリペプチドおよび核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ５７４６８；ＸＰ００６８６７；ＸＭ００６８６７；ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４を含む。
【００４９】
腫瘍ワクチン融合タンパク質はまた、第３の他のポリペプチド（例えば、免疫グロブリンポリペプチドまたは免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１つの領域）を含む。「少なくとも１つの領域」とは、免疫グロブリン分子の任意の一部（例えば、軽鎖、重鎖、ＦＣ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域またはそれらの任意のフラグメント）を含むことを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号に記載される。
【００５０】
免疫グロブリンポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、その免疫グロブリンポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチド未満（例えば、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ＦｖまたはＦｃ）を含む。好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含む。より好ましくは、免疫グロブリンポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含む。
【００５１】
本発明の別の局面において、この免疫グロブリンポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能より少ないエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体結合およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号を参照のこと）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。一実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対して低い親和性を有するかまたは全く親和性を有さない。代替的実施形態において、免疫グロブリンポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ１ｑに対して低い親和性を有するかまたは全く親和性を有さない。
【００５２】
（ムチン−ＩＲＳ融合タンパク質含有ワクチンの発現）
本発明の別の局面は、ムチンポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。種々の局面において、そのベクターは、ＩＲＳポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸に作動可能に連結されたムチンポリペプチドをコードする核酸を含む。さらに、そのベクターは、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、または類似の酵素をコードする核酸を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、別の核酸（これに対してそのベクターが連結される）を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、プラスミドとは、さらなるＤＮＡセグメントが連結される環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムに連結される。特定のベクターは、これが導入される宿主細胞において自己複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入される際に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書中において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、交換可能に使用される。しかし、本発明は、等価な機能を提供する、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【００５３】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に適切な形態で本発明の核酸を含み、これは、この組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含み、これは、発現される核酸配列に作動可能に連結されることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」とは、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞内に導入される場合には宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、その目的のヌクレオチド配列が、調節配列に連結されることを意味することが意図される。
【００５４】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＺＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節配列は、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるものおよび特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を方向付けるもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入され、それにより本明細書中に記載されるような核酸によりコードされる融合タンパク質またはペプチド（例えば、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチド、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドの変異形態など）を含むタンパク質またはペプチドを産生する。
【００５５】
本発明の組換え発現ベクターが、原核生物細胞または真核生物細胞のムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドの発現のために設計される。例えば、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドを含むワクチンは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現される。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）でさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写かつ翻訳される。
【００５６】
原核生物におけるタンパク質の発現は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて最も頻繁に行われる。融合ベクターは、多くのアミノ酸をそのベクター中にコードされるタンパク質に（通常は組換えタンパク質のアミノ末端に）加える。このような融合ベクターは、代表的に、３つの目的に寄与する：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増大するため；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性を上昇させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質溶解性切断部位は、融合部分と組換えタンパク質との接合部で導入され、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にし、その後、融合タンパク質の精製が続く。このような酵素およびそのコグネイト認識配列（ｃｏｇｎａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ標的の組換えタンパク質に対し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）ならびにｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、が挙げられる。
【００５７】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【００５８】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大にする１つの戦略は、タンパク質溶解的に組換えタンパク質を切断する能力が損なわれた宿主細菌においてタンパク質を発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別の戦略は、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変え、それによって各アミノ酸についての個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンとなるようにすることである（例えば、Ｗａｄａら，１９９２．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。このような本発明の核酸配列の変更は、標準的ＤＮＡ合成技術によって実行される。
【００５９】
別の実施形態において、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチド発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら，１９８７．Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．），ならびにｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００６０】
あるいは、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において発現される。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現のための利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【００６１】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方についての他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【００６２】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、相互交換可能に使用される。このような用語は、特定の目的細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫をも指すことが理解される。続く産生において、変異または環境的影響のいずれかに起因して特定の改変が起こり得るため、実際には、このような子孫は、親細胞と同一でない場合があるが、なお、本明細書中で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００６３】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞である。例えば、融合ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現される。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００６４】
ベクターＤＮＡは、従来的形質転換技術または従来的トランスフェクション技術を介して、原核細胞または真核細胞に導入される。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）の宿主細胞への導入のための、分野で認められた（ａｒｔ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ）種々の技術をいうことを意図する。これらの技術としては、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクトするための適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．  第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の研究室マニュアルにおいて見出される。
【００６５】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクトのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクト技術に依存して、細胞の小さい画分のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組込み得ることが公知である。これらの組込み物を同定し、選択するために、一般的に、選択マーカー（例えば、抗体に対する耐性）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーとしては、薬物に対する耐性を与える選択マーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート）が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸が、ムチン融合ポリペプチドを含有するワクチンをコードする同一ベクターにより宿主細胞に導入されるかまたは別のベクターにより導入される。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は、生存するのに対して、他の細胞は死滅する。）により同定される。
【００６６】
本発明の宿主細胞（例えば、培養された原核宿主細胞または真核宿主細胞）は、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドを産生する（すなわち、発現する）ために使用される。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用するムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。１つの実施形態において、その方法は、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドが産生されるような適した培地中での本発明の宿主細胞（ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）の培養を包含する。別の実施形態において、その方法はさらに、ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドの培地もしくは宿主細胞からの単離を包含する。
【００６７】
ムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドを含有するワクチンは、従来の条件（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動など）に従って単離され、かつ精製される。例えば、ワクチンは、溶液を、固定化したＡタンパク質またはＧタンパク質（これらは融合タンパク質のＦｃ部分に選択的に結合する）を含むカラムに通すことによって精製される。例えば、Ｒｅｉｓ、Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：３０９８〜３１０２（１９８４）；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８７／００３２９を参照のこと。融合ポリペプチドは、カオトロピック塩で処理することにより、または酢酸水溶液（１Ｍ）で溶出することにより溶出され得る。
【００６８】
あるいは、本発明に従うムチン−ＩＲＳ融合ポリペプチドは、当該分野で公知の方法を使用して化学的に合成される。ペプチド合成機を使用する合成を含めて、種々のタンパク質合成方法が当該分野で一般的である。ポリペプチドの化学的合成は、例えば、以下に記載される。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、Ｂｏｄａｓｎｓｋｙ、編  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９８；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：２４１〜２４７（１９８６）；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３０：７０５〜７３９（１９８７）；Ｋｅｎｔ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７〜９８９（１９８８）およびＫａｉｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１８７〜１９８（１９８９）を参照のこと。このポリペプチドは、標準的ペプチド精製技術を使用してそれらが化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないように精製される。用語「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、そのペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質からそのペプチドが分けられるペプチドの調製を含む。１つの実施形態において、用語「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、約３０％未満（乾重量による）の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製、さらにより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製、そして最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製を含む。
【００６９】
ポリペプチドの化学合成は、改変されたアミノ酸またはＤ―アミノ酸を含む非天然のアミノ酸および他の小さな有機分子の取り込みを促進する。ペプチド中の１つ以上のＬアミノ酸の対応するＤ−アミノ酸アイソフォームとの置換は、ペプチドの酵素的加水分解に対する抵抗を増加させ、かつ生物学的に活性なペプチドの１つ以上の特性（すなわち、レセプターの結合、機能的な潜在性または作用の持続性）を増強するために使用される。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙら，１９９３．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．３６：２５８５−２５９４；Ｋｉｒｂｙら，１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８０２−３８０８；Ｍｏｒｉｔａら，１９９４．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５３：８４−８８；Ｗａｎｇら，１９９３．Ｉｎｔ．Ｊ  Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４２：３９２−３９９；ＦａｕｃｈｅｒｅおよびＴｈｉｕｎｉｅａｕ，１９９２．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２３：１２７−１５９を参照のこと。
【００７０】
ペプチド配列の中への共有結合性架橋の導入は、立体配置的にトポグラフィックにポリペプチド骨格を束縛し得る。この戦略は増加した潜在性、選択性および安定性を備えた融合ポリペプチドのペプチドアナログを開発するために使用される。環状ペプチドの立体配置的エントロピーがその線形の対応物より低いので、特異的な立体配置の受け入れが非環状アナログより環状アナログのためのエントロピーにおいてより小さな減少が生じ得、それにより、より好まれる結合のための自由エネルギーを生じる。大環状化は、ペプチドＮ末端とＣ末端との間のアミド結合、および側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間のアミド結合（例えば、ｐＨ  ８．５でＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６とともに）（Ｓａｍｓｏｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：５１８２−５１８５（１９９６））、あるいは２つのアミノ酸側鎖間のアミド結合の形成によりしばしば遂行される。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ，Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ，３９：５１−１２４（１９８８）を参照のこと。ジスルフィド架橋もまた、それらの柔軟性を減少させるために線形配列へ導入される。例えば、Ｒｏｓｅら，Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ，３７：１−１０９（１９８５）；Ｍｏｓｂｅｒｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１０６：５０５−５１２（１９８２）を参照のこと。さらに、システイン残基のペニシラミン（Ｐｅｎ、３−メルカプト−（Ｄ）バリン）との置換は、あるオピオイド−受容体相互作用の選択性を増加させるために使用された。ＬｉｐｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｇｕｔｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２８７−３２０（１９９５）。
【００７１】
（薬学的組成物）
本発明のワクチンおよび融合タンパク質および核酸は、薬学的組成物に処方され得る。これらの組成物は、上記の物質のうちの１つに加えて、薬学的に受容可能な賦形剤、キャリア、緩衝液、安定化剤または当業者に周知の他の物質を含み得る。このような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害するべきでない。キャリアまたは他の物質の正確な性質は、投与経路（例えば、経口、静脈内、皮内または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内またはパッチ経路）に依存し得る。
【００７２】
経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液体形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントのような固体キャリアを含み得る。液体薬学的組成物は、一般に、液体キャリア（例えば、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油）を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）が含まれ得る。
【００７３】
静脈内注射、皮内注射または皮下注射、あるいは罹患部位での注射のためには、活性成分は、非経口的に受容可能な水溶液の形態である。この水溶液は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する。当業者が、適切な溶液を、例えば、等張性ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム溶液注射、リンゲル液注射、乳酸付加リンゲル液注射）を使用して調製することは十分可能である。保存剤、安定化剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤は、所望される場合、含まれ得る。
【００７４】
それが、ポリペプチドであるか、ペプチドであるか、または核酸分子であるかに拘わらず、本発明に従って、他の薬学的に有用な化合物は、個体に与えられ、投与は、好ましくは、「予防的有効量」または「治療的有効量」（場合によって、治療であり得るが、予防は治療と考えられ得る）において好ましく、これは、個体に利益を示すに十分である。投与される実際の量、ならびに投与の割合および過程は、処置されるものの性質および重篤度に依存する。処置の処方（例えば、投薬量の決定など）は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、代表的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に公知の他の要因を考慮に入れる。上記で言及される技術およびプロトコルの例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．（編），１９８０において見いだされ得る。
【００７５】
あるいは、治療の標的化は、標的化システム（例えば、抗体または細胞特異的リガンド）を使用することによって、活性薬剤を特定の細胞の型により特異的に送達するために使用され得る。標的化は、種々の理由により望ましくあり得る：例えば、薬剤が受容できない程度に毒性である場合、またはそうでなければ、非常に高い投薬量を必要とする場合、またはそうでなければ標的細胞に入ることができない場合。
【００７６】
これらの薬剤を直接投与する代わりに、それらは、細胞に導入されるコード遺伝子（例えば、ウイルスベクター（ＶＤＥＰＴ技術の改変−以下を参照のこと）中の）からの発現によって、標的細胞中で生成され得る。このベクターは、処置されるべき特定の細胞に標的化され得るか、または調節エレメントを含み得、このエレメントは、標的細胞によって多かれ少なかれ選択的にスイッチが入れられる。
【００７７】
あるいは、この薬剤は、処置される細胞において生成されるかまたは処置される細胞に標的化される活性化薬剤によって活性形態に変換するために、前駆体形態において投与され得る。この型のアプローチは、ときおり、ＡＤＥＰＴまたはＶＤＥＰＴとして公知であり；前者は、活性化薬剤を細胞特異的抗体に結合体化することによって細胞に標的化することを含む一方で、後者は、ウイルスベクター中でコードＤＮＡからの発現によって、ベクターにおける活性化薬剤（例えば、ワクチンまたは融合タンパク質）を生成することを包含する（例えば、ＥＰ−Ａ−４１５７３１およびＷＯ９０／０７９３６を参照のこと）。
【００７８】
本発明の特定の実施形態において、ワクチンをコードする配列、またはその機能的改変体を含む核酸は、遺伝子治療によって、免疫細胞活性化を調節するために投与される。より特定の実施形態において、ワクチンもしくは融合タンパク質、またはその機能的誘導体をコードする核酸は、遺伝子治療によって投与される。遺伝子治療は、特定の核酸を被験体に投与することによって行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、そのコードされるペプチドを生成し、このペプチドは、次いで、疾患または障害の機能を調節することによって、治療効果を発揮するようにはたらく。当該分野で利用可能な遺伝子治療に関する任意の方法論は、本発明の実施において使用され得る。例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，１９９３．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  １２：４８８−５０５を参照のこと。
【００７９】
好ましい実施形態において、治療剤は、ワクチン、融合タンパク質、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログのうちのいずれか１以上を適切な宿主内で発現する発現ベクターの一部である核酸を含む。特定の実施形態において、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域に作動可能に連結されるプロモーターを含む。このプロモーターは、誘導性であっても構成性であってもよく、必要に応じて、組織特異性であってもよい。別の特定の実施形態において、コード配列（おび任意の他の所望の配列）が、ゲノム内の所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接する、従って、核酸の染色体内発現を提供する核酸分子が、使用される。例えば、ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５を参照のこと。
【００８０】
患者への治療剤核酸の送達は、直接的（すなわち、患者が核酸または核酸含有ベクターに直接曝される）または間接的（すなわち、細胞が、まずインビトロにおいて核酸で形質転換され、次いで、患者に移植される）のいずれかであり得る。これら２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療またはエキソビボ遺伝子治療として、それぞれ公知である。本発明の特定の実施形態において、核酸は、インビボで直接投与され、ここでこの核酸が発現されて、コードされる産物を生成する。このことは、当該分野で公知の多くの方法のいずれかによって達成され得る。これらの方法としては、例えば、以下が挙げられる：適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し、これを細胞内で生じるような様式で投与すること（例えば、欠損性のまたは弱毒化された、レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを使用して感染させる）；米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）；裸のＤＮＡを直接注射すること；微粒子銃を使用すること（例えば、「Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ（登録商標）；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，ＤｕＰｏｎｔ）；核酸を脂質でコーティングすること；会合した細胞表面レセプター／トランスフェクト剤を使用すること；リポソーム、微粒子またはマイクロカプセル中にカプセル化すること；核に入ることが公知のペプチドに連結させて投与すること；あるいはレセプター媒介性エンドサイトーシスを受ける傾向があるリガンドに連結させて投与すること（例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。これらの技術は、目的のレセプターなどを特異的に発現する細胞型を「標的化」するために使用され得る。
【００８１】
本発明の実施における遺伝子治療に対するさらなるアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、ウイルス感染などのような方法によって遺伝子を細胞にインビトロで組織培養にて移入することを包含する。一般に、移入の方法は、選択マーカーを細胞に同時に移入することを包含する。次いで、細胞を選択圧（例えば、抗生物質耐性）下に配置して、移入された遺伝子に応じた細胞または移入された遺伝子を発現する細胞の単離を容易にする。これらの細胞は、次いで、患者に送達される。特定の実施形態において、得られる組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、目的の核酸配列を含むウイルスもしくはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子移入、核小核体媒介性遺伝子移入、スフェロプラスト融合、およびレシピエント細胞の必要な発生機能および生理学的機能が移入によって破壊されないことを確実にする類似の方法論を含む）によって細胞に導入される。例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，１９９３．Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：５９９−６１８を参照のこと。選択された技術は、細胞への核酸の安定な移入を提供し、その結果、その核酸が、細胞により発現されるべきである。好ましくは、移入された核酸は、細胞子孫により遺伝され、発現可能である。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態において、得られた組換え細胞は、当該分野で公知の種々の方法によって患者に送達され得る。これらの方法としては、例えば、上皮細胞の注射（例えば、皮下に）、患者への皮膚移植としての組換え皮膚細胞の適用、および組換え血球の静脈内注射（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）が挙げられる。使用が想定される細胞の総量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定され得る。
【００８３】
遺伝子治療が目的で核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の利用可能な細胞型を包含し、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）、異種遺伝子型（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｃ）、同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）または自家（ａｕｔｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。細胞型としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：分化した細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞および血球）、または種々の幹細胞もしくは前駆細胞、特に胚性心筋細胞、肝臓幹細胞（国際特許出願公開ＷＯ９４／０８５９８）、神経幹細胞（ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｌｌ  ７１：９７３−９８５）、造血幹細胞もしくは前駆細胞（例えば、骨髄細胞、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる）。好ましい実施形態において、遺伝子治療のために利用される細胞は、患者に対して自己である。
【００８４】
本発明のワクチンはまた、１以上のアジュバント化合物を含む。アジュバント化合物は、デポーとして機能することにより、ワクチンの長期放出を増強し得るという点で有用である。ワクチンに対する長期露出は、プロセシングおよび抗体応答の持続のために免疫系が抗原に提示される時間の長さを増大するはずである。アジュバント化合物はまた、例えば、免疫細胞を刺激または調節することによって、免疫細胞と相互作用する。さらに、アジュバント化合物は、微粒子としてワクチンを結合した後に、マクロファージ食作用を増強する（キャリア／ビヒクル機能）。
【００８５】
本発明において有用なアジュバント化合物としては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ（不完全ｓｅｐｐｉｃアジュバント）；Ｒｉｂｉアジュバントシステム（ＲＡＳ）；ＴｉｔｅｒＭａｘ；Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（ＳＡＦ）；アルミニウム塩アジュバント；ニトロセルロース吸着抗原；カプセル化された抗原もしくは捕捉された抗原；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）；およびＧｅｒｂ（登録商標）アジュバントが挙げられる。
【００８６】
（免疫方法）
本発明は、被験体を免疫する方法を提供する。被験体は、本発明のワクチンを被験体に投与することによって免役される。この被験体は、癌を発生させる危険性にあるか、または癌に罹っている。癌は、例えば、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、子宮頚癌（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）または黒色腫である。癌は、Ｌｅｙエピトープを有する。
【００８７】
癌細胞の細胞表面は、しばしば、非癌性細胞の表面には存在しない、特定の糖質、ポリペプチドおよび他の潜在的な抗体エピトープを含む。この抗原の不一致は、身体の免疫系が癌細胞を検出および応答することを可能にする。ムチンポリペプチドは、多くの癌と関連している。例えば、ＰＳＧＬ−１は、癌（肺癌および急性骨髄性白血病を含む（Ｋａｐｐｅｌｍａｙｅｒら，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００１，１１５（４）：９０３−９を参照のこと））と関連している。また、ＭＵＣ１特異的抗体は、乳癌、膵臓環、および結腸癌の患者由来の血清中で検出された。ムチンがヒト免疫系によって認識され得ることは明らかであり；従って、特異的抗原を発現する腫瘍細胞に対する免疫は、ムチン−ＩＲＳ融合タンパク質および腫瘍細胞特異的抗原を含むワクチンによって誘導される。腫瘍細胞に対する免疫は、腫瘍サイズの減少の程度、腫瘍血管新生の減少、被験体の生存の増加、または腫瘍細胞アポトーシスの増加によって測定される。
【００８８】
本発明のワクチンは、アジュバントポリペプチドを欠く他のワクチンより、優れた免疫防御特性および免疫治療特性を有する。ムチン−ＩＲＳ融合タンパク質含有ワクチンは、当該分野で公知の腫瘍抗原と比較して、増強した免疫原性、安全性、寛容性および有効性を有する。例えば、本発明のワクチンの増強した免疫原性は、免疫応答（例えば、抗体生成および／または分泌、活性化ならびにＴ細胞の増殖、およびサイトカイン発現（例えば、インターロイキンの生成））の刺激によって測定されるように、比較する非アジュバントポリペプチド含有ワクチンより、１．５倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上大きいものであり得る。
【００８９】
本明細書中に記載の方法は、癌の１以上の症状の重篤度の減少またはその緩和をもたらす。癌は、代表的には、標準的な方法論を使用して医師により診断またはモニターされる。癌は、例えば、身体検査、生検、血液検査、またはｘ線により診断される。
【００９０】
被験体は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタである。処置は、予防として施される。あるいは、処置は、治療として施される。
【００９１】
処置の有効性は、特定の障害を診断または処置するための任意の公知の方法と関連して決定される。この障害の１以上の症状の緩和は、化合物が臨床的利益を付与することを示す。「有効な」とは、その処置が、被験体の癌のサイズ、拡がり、または転移能を減少させることを意味する。処置が予防的に適用される場合、「有効な」とは、その処置が、腫瘍が癌を形成することを遅らせるかまたは防止するか、あるいは癌の症状を遅延させるか、予防するか、または緩和することを意味する。癌の評価は、標準的な臨床的プロトコルを使用して行われる。
【００９２】
（免疫細胞活性化を増大する方法）
本発明は、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）を活性化または刺激する方法を提供する。Ｔ細胞活性化は、カルシウム媒介性細胞内ｃＧＭＰの増加、またはＩＬ−２の細胞表面レセプターの増加によって規定される。例えば、Ｔ細胞活性化の増加は、Ｔ細胞とワクチンとを接触させた後の、ワクチン非存在下と比較した、カルシウム媒介性細胞内ｃＧＭＰおよび／またはＩＬ−２レセプターの増加によって特徴づけられる。細胞内ｃＧＭＰは、例えば、市販の試験キットを用いた競合的免疫アッセイまたはシンチレーション近接アッセイによって測定される。細胞表面ＩＬ−２レセプターは、例えば、ＩＬ−２レセプター抗体（例えば、ＰＣ６１抗体）への結合を決定することによって測定される。免疫細胞活性化はまた、当該分野で公知の方法により、Ｂ細胞増殖活性、ポリクローナル免疫グロブリン（Ｉｇ）生成、および抗原特異的抗体形成を測定することによって、決定され得る。
【００９３】
本発明は、以下の非限定的実施例においてさらに例示される。
【実施例】
【００９４】
（実施例１：アジュバントポリペプチドの生成）
（分泌ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂキメラのトランスフェクションおよび生成）
トランスフェクションカクテルを、３９μｌの２０％グルコース、３９μｇのプラスミドＤＮＡ、１２７μｌのｄＨ２Ｏ、および１５．２μｌの０．１Ｍ  ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を５ｍｌポリスチレン管中に混合することによって調製した。全てのトランスフェクション混合物において、１３μｇのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂプラスミドを使用した。種々のグリコシルトランスフェラーゼについて１３μｇのプラスミドを添加し、必要な場合、ＣＤＭ８プラスミドを添加して、合計３９μｇのプラスミドＤＮＡにした。混合物を、１０ｍｌの培養培地中、約７０％コンフルエントのその細胞に添加する前に、室温で１０分間放置した。７日後、細胞上清を回収し、細片を遠沈し（１４００×ｇ、１５分）、ＮａＮ３を最終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）になるように添加した。
【００９５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析のための分泌ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの精製）
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ融合タンパク質を、４℃において一晩転倒混和することによって、５０μｌのヤギ抗ｍＩｇＧアガロースビーズ（１００：１スラリー；Ｓｉｇｍａ）で、回収した上清から精製した。融合タンパク質を有するビーズを、ＰＢＳ中で３回洗浄し、その後の分析のために使用した。代表的には、サンプルを、５０μｌの２×還元サンプル緩衝液中に溶解し、１０：１のサンプルを、各ウェルにロードした。
【００９６】
（上清中のＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ濃度を決定するためのＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３５９０，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に、５０μｌの５０ｍＭ  炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中、０．５μｇ／ウェルのアフィニティー精製ヤギ抗ｍＩｇＧ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）を室温で２時間コーティングした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）３００μｌを用いて４℃で一晩ブロッキングし、その後の洗浄の後、５０μｌのサンプル上清を添加し、培養培地で連続希釈した。洗浄した後、プレートを、５０μｌのヤギ抗ｍＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）（ブロッキング緩衝液中で１：１０，０００希釈）とともに２時間インキュベートした。発色溶液については、１錠の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）を、１１ｍｌの０．０５Ｍ  クエン酸／リン酸緩衝液（３μｌの３０％（ｗ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含有）中に溶解した。１００μｌの発色溶液を添加した。その反応を、２５μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止した。そのプレートを、４５０ｎｍおよび５４０ｎｍで自動化マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で読み取った。標準物質として、精製ｍＩｇＧ  Ｆｃフラグメント（Ｓｉｇｍａ）の培養培地中での希釈系列を、三連で使用した。
【００９７】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、５％  濃縮ゲルおよび８％の分離ゲルを用いてＬａｅｍｍｌｉの方法（１９７０）によって行い、分離したタンパク質を、以前に記載されたように（Ｌｉｕら，１９９７）、ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｃ  ｅｘｔｒａ膜に電気泳動的にブロットした。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）（３％  ＢＳＡを含む）中で一晩ブロッキングした後、膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、それらを、抗体とともに、１時間室温にてインキュベートした。全ての抗体を、ＴＢＳ−Ｔ中の３％  ＢＳＡで１：２００に希釈した。膜をＴＢＳ−Ｔで３回希釈し、その後、ＴＢＳ−Ｔ中の３％  ＢＳＡで１：２０００希釈した、二次西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化抗体であるヤギ抗ｍＩｇＭ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）またはヤギ抗ｍＩｇＧ３（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）とともに、室温で１時間インキュベートした。結合した二次抗体を、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、製造業者の説明書に従って、化学発光によって可視化した。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ自体を検出するために、ＨＲＰ標識ヤギ抗ｍＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を、上記のように、ＴＢＳ−Ｔ中の３％  ＢＳＡで１：１０，０００希釈で使用したが、二次抗体とはインキュベートしなかった。
【００９８】
（実施例２：Ｌｅｗｉｓ  Ｙ−ＰＳＧＬ−１ｍＩｇ−Ｔ細胞刺激因子−結合ワクチンの生成）
本明細書中に記載のデータを、以下の試薬および方法を使用して生成した。
【００９９】
（細胞培養）
ＣＯＳ−７  ｍ６細胞（Ｓｅｅｄ，１９８７）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、およびＳＶ４０ラージＴ抗原発現２９３ヒト胚性腎臓細胞株を、１０％  ウシ胎仔血清（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２５μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および２ｍＭ  グルタミン（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で培養した。細胞を２〜４日ごとに継代した。そのＨＨ１４ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ  ＨＢ−９２９９；米国特許第４，８５７，６３９号）を、１０％  ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／μｌのストレプトマイシン、および２ｍＭ  グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０（ＧｉｂｃｏＢｒｌ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。
【０１００】
（材料）
架橋剤Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ）（２２３２４，  ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ．ＩＬ  ６１１０５）。カップリング緩衝液：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２  Ｈｉ  ＴｒａｐＴＭ脱塩カラム（１７−１４０８−０１，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳＥ−７５１８４  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。ＨｉＰｒｅｐＴＭ  １６／６０  ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭ  Ｓ−２００カラム（１７−１１６６−０１，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳＥ−７５１８４  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。
【０１０１】
（ワクチン生成法）
Ｌｅｙ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂを、カップリング緩衝液で濃度２ｍｇ／ｍｌに再懸濁した。２００μｌの再懸濁Ｌｅｙ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂを、１０ｍｌの管に移した。２ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳを、１ｍｌの結合緩衝液に溶解し、１００μｌのＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ溶液を、Ｌｅｙ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂを含む試験管にすぐに移した。室温で２時間インキュベートする。脱塩カラムを１５ｍｌのカップリング緩衝液で平衡化する。３００μｌの反応溶液をＨｉＴｒａｐＴＭ脱塩カラムにＦＰＬＣシステムを用いてアプライする。カップリング緩衝液の０．５ｍｌのアリコートを溶出する。２８０ｎｍの吸光度により溶出したタンパク質をモニターする。マレイミド活性化Ｌｅｙ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂは、画分５〜６に溶出するはずである。５００μｌのカップリング緩衝液中に適量のＴ細胞刺激因子（キーホールリンペットヘモシアニン、熱ショックタンパク質、またはスーパー抗原）を室温で一晩溶解する。Ｔ細胞刺激因子溶液を、マレイミド活性化Ｌｅｙ置換ＰＳＧＬ１／ｍＩｇＧ２ｂを含むプールした画分に添加する。室温で３時間インキュベートする。８Ｍ  グアニジン溶液を、グアニジンの濃度が６Ｍに達するまで結合体化Ｔ細胞刺激因子−ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂタンパク質（カップリングタンパク質）を含む試験管に添加する。ＨｉＰｒｅｐＴＭ  １６／６０  ＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭ  Ｓ−２００カラムを１００ｍｌのＰＢＳで平衡化する。４．５ｍｌの反応容量を、ＦＰＬＣシステムでそのカラムにアプライする。１．０ｍｌアリコートのＰＢＳで溶出する。２８０ｎｍの吸光度により、タンパク質溶出をモニターする。カップリングタンパク質は、画分３５〜３８に溶出するはずである（図６および７を参照のこと）。水に対する透析によりＰＢＳを除去する。カップリングタンパク質を凍結し、凍結乾燥する。そのカップリングタンパク質をＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティング分析によって特徴付けする。
【０１０２】
（ワクチン試験方法）
マウスは、Ｌｅｙ置換ムチン／Ｉｇのみで、またはＩＲＳポリペプチド（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、熱ショックタンパク質、またはスーパー抗原）と結合されて、腹腔内投与により免疫される。コントロールワクチンは、単独またはＩＲＳポリペプチドと結合した、ムチン／Ｉｇであり、これは、Ｌｅｙ置換されておらず、または一価またはオリゴ価（ｏｌｉｇｏｖａｌｅｎｔ）のＬｅｙ置換を有する他のタンパク質である。ムチン／Ｉｇ上のＬｅｙの多価発現は、他のＬｅｙタンパク質よりもより効率的なＢ細胞刺激を促進する。Ｌｅｙに対する体液性応答が、第１の免疫、第２の免疫および第３の免疫の後に生じる。３回免疫されたマウス由来の脾臓細胞が、エキソビボで収集され、かつ再刺激される。細胞分裂（チミジン取り込みまたは当業者に公知の他の方法により測定されるような）およびサイトカイン生成（ＥＬＩｓｐｏｔ）が、測定される。応答細胞のＣＤ４／ＣＤ８フェノタイプがまた、評価される。
【０１０３】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と共に記載されてきたが、前述の説明は、例示することが意図されるのであって、本発明の範囲を制限しない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。他の局面、利点、および改変は、上記の特許請求の範囲の範囲内である。
【国際調査報告】
2005530494.tif 000002
2005530494.tif 000003
2005530494.tif 000004