(57)【要約】本発明は、ヒトホスファターゼポリペプチド、それらの断片およびホモログをコードする新規なポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、該ポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体および組換え方法および合成方法をも提供する。本発明は更に、これらのポリペプチドに関連する様々な疾患および／または障害、特に心血管性疾患および／または障害の診断、治療および／または予防に、これらの新規なヒトホスファターゼポリペプチドを適用することについての診断方法および治療学的な方法に関する。本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用薬および拮抗薬を同定するためのスクリーニング方法に関する。
2005506040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（ｑｑ）：
（a）配列番号1のポリヌクレオチド断片、または配列番号41にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-2966に含まれるcDNA配列のポリヌクレオチド断片；
（b）配列番号42のポリペプチド断片または配列番号41にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-2966に含まれるcDNA配列がコードするポリペプチド断片、をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号42のポリペプチドドメインまたは配列番号41にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-2966に含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドドメイン、をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号42のポリペプチドエピトープまたは配列番号41にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-2966に含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドエピトープ、をコードするポリヌクレオチド；
（e）生物学的活性を持つ、配列番号42のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは配列番号41にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-2966に含まれるcDNA配列；
（f）配列番号41の変異体であるポリヌクレオチド；
（g）配列番号41のアレル変異体であるポリヌクレオチド；
（h）開始コドンを除く配列番号42のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチドをコードした配列番号41のヌクレオチド473〜2464を含む、単離ポリヌクレオチド；
（i）開始コドンを含む配列番号109のアミノ酸1〜665に相当するポリペプチドをコードする配列番号41のヌクレオチド470〜2464を含む、単離ポリヌクレオチド；
（j）配列番号41の相補配列（アンチセンス）であるポリヌクレオチド；
（k）配列番号108のポリヌクレオチド断片、または配列番号108にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-3434に含まれるcDNA配列のポリヌクレオチド断片；
（l）（b）配列番号109のポリペプチド断片または配列番号108にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-3434に含まれるcDNA配列がコードするポリペプチド断片、をコードするポリヌクレオチド；
（m）配列番号109のポリペプチドドメインまたは配列番号108にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-3434に含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドドメイン、をコードするポリヌクレオチド；
（n）配列番号109のポリペプチドエピトープまたは配列番号108にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-3434に含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドエピトープ、をコードするポリヌクレオチド；
（o）生物学的活性を持つ、配列番号109のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは配列番号108にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-3434に含まれるcDNA配列；
（p）配列番号108の変異体であるポリヌクレオチド；
（q）配列番号108のアレル変異体であるポリヌクレオチド；
（r）開始コドンを除く配列番号109のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチドをコードする配列番号108のヌクレオチド541〜2532を含む、単離ポリヌクレオチド；
（s）開始コドンを含む配列番号109のアミノ酸1〜665に相当するポリペプチドをコードする配列番号108のヌクレオチド538〜2532を含む、単離ポリヌクレオチド；
（t）配列番号108の相補配列（アンチセンス）であるポリヌクレオチド；
（u）開始コドンを除く配列番号109のアミノ酸2〜302に相当するポリペプチドをコードする配列番号108のヌクレオチド541〜1443を含む、単離ポリヌクレオチド；
（v）開始コドンを含む配列番号109のアミノ酸1〜302に相当するポリペプチドをコードする配列番号108のヌクレオチド538〜1443を含む、単離ポリヌクレオチド；
（w）配列番号149のポリヌクレオチド断片、または配列番号149にハイブリダイズすることができるATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNA配列のポリヌクレオチド断片；
（x）配列番号150のポリペプチド断片または配列番号149にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-XXXXXに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチド断片、をコードするポリヌクレオチド；
（y）配列番号150のポリペプチドドメインまたは配列番号149にハイブリダイズすることができるATCC受託番号PTA-XXXXXに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドドメイン、をコードするポリヌクレオチド；
（z）配列番号150のポリペプチドエピトープまたは配列番号149にハイブリダイスすることができるATCC受託番号PTA-XXXXXに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドエピトープ、をコードするポリヌクレオチド；
（aa）生物学的活性を持つ、配列番号150のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは配列番号149にハイブリダイズすることができるATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNA配列；
（bb）配列番号149の変異体であるポリヌクレオチド；
（cc）配列番号149のアレル変異体であるポリヌクレオチド；
（dd）開始コドンを除く配列番号150のアミノ酸2〜607に相当するポリペプチドをコードする配列番号149のヌクレオチド631〜2448を含む、単離ポリヌクレオチド；
（ee）開始コドンを含む配列番号150のアミノ酸1〜607に相当するポリペプチドをコードする配列番号149のヌクレオチド628〜2448を含む、単離ポリヌクレオチド；
（ff）配列番号149の相補配列（アンチセンス）であるポリヌクレオチド；
（gg）配列番号151のポリヌクレオチド断片、または配列番号151にハイブリダイズすることができるATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNA配列のポリヌクレオチド断片；
（hh）配列番号152のポリペプチド断片または配列番号151にハイブリダイズすることができるATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチド断片、をコードするポリヌクレオチド；
（ii）配列番号152のポリペプチドドメインまたは配列番号151にハイブリダイズすることができるATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドドメイン、をコードするポリヌクレオチド；
（jj）配列番号152のポリペプチドエピトープまたは配列番号151にハイブリダイズすることができるATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドエピトープ、をコードするポリヌクレオチド；
（kk）生物学的活性を持つ、配列番号152のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは配列番号151にハイブリダイズすることができるATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNA配列；
（ll）配列番号151の変異体であるポリヌクレオチド；
（mm）配列番号151のアレル変異体であるポリヌクレオチド；
（nn）開始コドンを除く配列番号152のアミノ酸2〜150に相当するポリペプチドをコードする配列番号151のヌクレオチド92〜538を含む、単離ポリヌクレオチド；
（oo）開始コドンを含む配列番号152のアミノ酸1〜150に相当するヌクレオチド89〜538を含む、単離ポリヌクレオチド；
（pp）配列番号151の相補配列（アンチセンス）であるポリヌクレオチド；および、
（qq）（a）〜（pp）に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つにストリンジェントな条件でハイブリダイズする能力を持ち、且つＡ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列を持つ核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチド
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離核酸分子。
【請求項２】
ポリヌクレチド断片はヒトホスファターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項４】
ベクター配列を含む請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
以下の（a）〜（rr）：
（a）配列番号42またはATCC受託番号PTA-2966に含まれるコードされた配列のポリペプチド断片；
（b）生物学的活性を持つ、配列番号42またはATCC受託番号PTA-2966に含まれるコードされた配列のポリペプチド断片；
（c）配列番号42またはATCC受託番号PTA-2766に含まれるコードされた配列のポリペプチドドメイン；
（d）配列番号42またはATCC受託番号PTA-2766に含まれるコードされた配列のポリペプチドエピトープ；
（e）配列番号42またはATCC受託番号PTA-2766に含まれるコードされた配列の全長タンパク質；
（f）配列番号42の変異体；
（g）配列番号42のアレル変異体；
（h）配列番号42の種ホモログ；
（i）開始メチオニンを除く配列番号42のポリペプチドを含む配列番号42のアミノ酸2〜665を含むポリペプチド；
（j）配列番号42のアミノ酸1〜665を含むポリペプチド；
（k）ATC受託番号PTA-2966に含まれるcDNAがコードするポリペプチド；
（l）配列番号109またはATCC受託番号PAT-3434に含まれるコードされた配列のポリペプチド断片；
（m）生物学的活性を持つ、配列番号109またはATCC受託番号PTA-3434に含まれるコードされた配列のポリペプチド断片；
（n）配列番号109またはATCC受託番号PAT-3434に含まれるコードされた配列のポリペプチドドメイン；
（o）配列番号109またはATCC受託番号PTA-3434に含まれるコードされた配列のポリペプチドエピトープ；
（p）配列番号109またはATCC受託番号PTA-3434に含まれるコードされた配列の全長タンパク質；
（q）配列番号109の変異体；
（r）配列番号109のアレル変異体；
（s）配列番号109の種ホモログ；
（t）開始メチオニンを除く配列番号109のポリペプチドを含む配列番号109のアミノ酸2〜665を含むポリペプチド；
（u）配列番号109のアミノ酸1〜665を含むポリペプチド；
（v）ATCC受託番号PTA-3434に含まれるcDNAがコードするポリペプチド；
（w）配列番号150またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列のポリペプチド断片；
（x）生物学的活性を持つ、配列番号150またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列のポリペプチド断片；
（y）配列番号150またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列のポリペプチドドメイン；
（z）配列番号150またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列のポリペプチドエピトープ；
（aa）配列番号150またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列の全長タンパク質；
（bb）配列番号150の変異体；
（cc）配列番号150のアレル変異体；
（dd）配列番号150の種ホモログ；
（ee）開始メチオニンを除く配列番号150のポリペプチドを含む配列番号150のアミノ酸2〜607を含むポリペプチド；
（ff）配列番号150のアミノ酸1〜607を含むポリペプチド；
（gg）ATCC受託番号XXXXに含まれるcDNAがコードするポリペプチド；
（hh）配列番号152またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列のポリペプチド断片；
（ii）生物学的活性を持つ、配列番号152またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列のポリペプチド断片；
（jj）配列番号152またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列のポリペプチドドメイン；
（kk）配列番号152またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列のポリペプチドエピトープ；
（ll）配列番号152またはATCC受託番号XXXXXに含まれるコードされた配列の全長タンパク質；
（mm）配列番号152の変異体；
（nn）配列番号152のアレル変異体；
（oo）配列番号152の種ホモログ；
（pp）開始メチオニンを除く配列番号152のポリペプチドを含む配列番号152のアミノ酸2〜150を含むポリペプチド；
（qq）配列番号152のアミノ酸1〜150を含むポリペプチド；および、
（rr）ATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNAがコードするポリペプチド
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項６】
全長タンパク質はC末端またはN末端のいずれかからの連続的なアミノ酸欠失を含む、請求項５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
請求項５に記載の単離ポリペプチドと特異的に結合する単離抗体。
【請求項８】
請求項１５に記載の単離ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項９】
単離ポリペプチドの産生方法であって、（a）該ポリペプチドを発現する条件下で請求項８に記載の組換え宿主細胞を培養し；そして、（b）該ポリペプチドを回収することを含む、該方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって産生するポリペプチド。
【請求項１１】
医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法であって、哺乳動物の被験者に請求項５に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチドの治療学的に有効な量を投与することを含む、該方法。
【請求項１２】
被験者における病理学的な病気または病理学的な病気に対する感受性を診断する方法であって、
（a）請求項１に記載のポリヌクレオチド中の変異のあるなしを測定し；そして、
（b）該変異のあるなしに基づいて病理学的な病気または病理学的な病気に対する罹患率を診断する
ことを含む、該方法。
【請求項１３】
被験者における病理学的な病気または病理学的な病気に対する感受性を診断する方法であって、
（a）生物学的な試料中での請求項５に記載のポリペプチドの発現の存在またはその発現量を測定し；そして、
（b）該ポリペプチドの発現の存在またはその発現量に基づいて病理学的な病気または病理学的な病気に対する感受性を診断する
ことを含む、該方法。
【請求項１４】
改変されたホスファターゼ活性を持つ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、
a）請求項１に記載のヌクレオチド配列をシャッフルし；
b）得られるシャッフルされたヌクレオチド配列を発現させ；そして、
c）該非改変のヌクレオチド配列の遺伝子産物のホスファターゼ活性と比較して改変されたホスファターゼ活性について選択する
ことを含む、該方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法から産生するシャッフルされたポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
以下の（a）〜（v）：
（a）配列番号42のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（b）開始コドンを除く配列番号42のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチドをコードする配列番号41のヌクレオチド473〜2464を含む、単離ポリヌクレオチド；
（c）開始コドンを含む配列番号42のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチドをコードする配列番号41のヌクレオチド473〜2464を含む、単離ポリヌクレオチド；
（d）ATCC受託番号PTA-2966に含まれるcDNAクローンがコードするBMY_HPP5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号41の相補配列（アンチセンス）であるポリヌクレオチド；
（f）配列番号109のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（g）開始コドンを除く配列番号42のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチドをコードする配列番号41のヌクレオチド473〜2464を含む、単離ポリヌクレオチド；
（h）開始コドンを含む配列番号42のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチドをコードする配列番号41のヌクレオチド473〜2464を含む、単離ポリヌクレオチド；
（i）ATCC受託番号PTA-3434に含まれるcDNAクローンがコードするRET31ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（j）配列番号109の相補配列（アンチセンス）であるポリヌクレオチド；
（k）開始コドンを除く配列番号109のアミノ酸2〜302に相当するポリペプチドをコードする配列番号108のヌクレオチド541〜1443を含む、単離ポリヌクレオチド；
（l）開始コドンを含む配列番号109のアミノ酸1〜302に相当するポリペプチドをコードする配列番号108のヌクレオチド538〜1443を含む単離ポリヌクレオチド；
（m）配列番号150のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（n）開始コドンを除く配列番号150のアミノ酸2〜607に相当するポリペプチドをコードする配列番号149のヌクレオチド631〜2448を含む、単離ポリヌクレオチド；
（o）開始コドンを含む配列番号150のアミノ酸2〜607に相当するポリペプチドをコードする配列番号149のヌクレオチド628〜2448を含む、単離ポリヌクレオチド；
（p）ATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNAクローンがコードするBMY_HPP5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（q）配列番号149の相補配列（アンチセンス）であるポリヌクレオチド；
（r）配列番号152のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（s）開始コドンを除く配列番号152のアミノ酸2〜150に相当するポリペプチドをコードする配列番号151のヌクレオチド92〜538を含む、単離ポリヌクレオチド；
（t）開始コドンを含む配列番号152のアミノ酸2〜150に相当するポリペプチドをコードする配列番号151のヌクレオチド89〜538を含む、単離ポリヌクレオチド；
（u）ATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNAクローンがコードするBMY_HPP5ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（v）配列番号151の相補配列（アンチセンス）であるポリヌクレオチド
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる、単離核酸分子。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドはヒトホスファターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離核酸分子。
【請求項１８】
請求項１６に記載の単離核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換えベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項２０】
以下の（a）〜（z）：
（a）ホスファターゼ活性を持つ配列番号42のポリペプチド断片；
（b）ホスファターゼ活性を持つ配列番号42のポリペプチドドメイン；
（c）配列番号42の全長タンパク質；
（d）開始メチオニンを除く配列番号42のポリペプチドを含む配列番号42のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチド；
（e）配列番号42のアミノ酸1〜665に相当するポリペプチド；
（f）ATCC受託番号PTA-2966に含まれるcDNAがコードするポリペプチド；
（g）ホスファターゼ活性を持つ配列番号109のポリペプチド断片；
（h）ホスファターゼ活性を持つ配列番号109のポリペプチドドメイン；
（i）配列番号109の全長タンパク質；
（j）開始メチオニンを除く配列番号109のポリペプチドを含む配列番号109のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチド；
（k）配列番号109のアミノ酸1〜665に相当するポリペプチド；
（l）ATCC受託番号PTA-3434に含まれるcDNAがコードするポリペプチド；
（m）開始メチオニンを除く配列番号109のポリペプチドを含む配列番号109のアミノ酸2〜302に相当するポリペプチド；
（n）配列番号109のアミノ酸1〜302に相当するポリペプチド；
（o）ホスファターゼ活性を持つ配列番号150のポリペプチド断片；
（p）ホスファターゼ活性を持つ配列番号150のポリペプチドドメイン；
（q）配列番号150の全長タンパク質；
（r）開始メチオニンを除く配列番号150のポリペプチドを含む配列番号150のアミノ酸2〜607に相当するポリペプチド；
（s）配列番号150のアミノ酸1〜607に相当するポリペプチド；
（t）ATCC受託番号XXXXXに含まれるcDNAがコードするポリペプチド；
（u）ホスファターゼ活性を持つ配列番号152のポリペプチド断片；
（v）ホスファターゼ活性を持つ配列番号152のポリペプチドドメイン；
（w）配列番号152の全長タンパク質；
（x）開始メチオニンを除く配列番号152のポリペプチドを含む配列番号152のアミノ酸2〜150に相当するポリペプチド；
（y）配列番号152のアミノ酸1〜150に相当するポリペプチド；および、
（z）ATCC受託番号XXXXに含まれるcDNAがコードするポリペプチド
からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる、単離ポリペプチド。
【請求項２１】
タンパク質を請求項５に記載の単離ポリペプチドと一緒にインキュベートする工程を含む、タンパク質をリン酸化する方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法であって、該医学的な病気は増殖性障害である、該方法。
【請求項２３】
分子もしくは分子複合体は、
（a）表VIIIに従って図28に提示するBMY_HPP1モデル；
（b）表IXに従って図32に提示するBMY_HPP2モデル；
（c）表Xに従って図38に提示するBMY_HPP5モデル
からなる群の要素の構造座標を含む、該分子または分子複合体の３次元表示を得るためのコンピュータであって、
（a）該モデルの構造座標の組みによって定義される機械で読み取り可能なデータをコード化するデータ記憶物質を含む、機械で読み取り可能なデータ記憶媒体；
（b）該機械で読み取り可能なデータを処理するための、指令を記憶するための作業記憶；
（c）該機械で読み取り可能なデータを処理して該３次元表示を得るための該作業記憶および該機械で読み取り可能なデータ記憶媒体と連結させた、中央処理装置；および、
（d）該３次元表示を表示するための該中央処理装置と連結させた、ディスプレー
を含む、該コンピュータ。
【請求項２４】
（a）BMY_HPP1；
（b）BMY_HPP2；および、
（c）BMY_HPP5
からなる群から選ばれる要素の、改変された生物学的な性質、機能または活性を有する変異体を同定する方法であって、
（a）該モデルの構造座標に従って該ポリペプチドのモデルを用いて変異するアミノ酸を同定し；そして、
（b）該アミノ酸を変異させて、改変された生物学的な機能または性質を有する変異体タンパク質を作製する
工程を含む、該方法。
【請求項２５】
（a）BMY_HPP1；
（b）BMY_HPP2；および、
（c）BMY_HPP5
からなる群の要素の潜在的なモジュレーターとしての化合物を設計したりまたは選択する方法であって、
（a）該要素の構造座標を用いて該要素の構造的な特徴または化学的な特徴を同定し；そして
（b）該特徴に結びつく化合物を合理的に設計する
工程を含む、該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、2000年12月20日に出願された米国仮特許出願第60/256,868号、2001年3月30日に出願された米国仮特許出願第60/280,186号、2001年3月1日に出願された米国仮特許出願第60/287,735号、2001年6月5日に出願された米国仮特許出願第60/295,848号、および2001年6月25日に出願された米国仮特許出願第60/300,465号の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ヒトホスファターゼポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチド、その断片およびホモログを提供する。本発明はまた、ベクター、宿主細胞、抗体、並びに該ポリペプチドを産生するための組換え法および合成法をも提供する。本発明は更に、これらの新規なヒトホスファターゼポリペプチドを、これらポリペプチドに関連する様々な疾患および/または障害（特に、心血管の疾患および／または障害）の診断、治療および/または予防に応用するための診断方法および治療方法に関する。本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作動薬および拮抗薬を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００３】
（背景技術）
タンパク質のリン酸化は、多様な細胞プロセスを調節する基本的な機構である。大部分のタンパク質のリン酸化はセリンおよびトレオニン残基で起こるが、チロシン残基でのリン酸化は多数のオンコジーン産物および成長因子受容体が内因性タンパク質チロシンキナーゼ活性を有するという発見以来、多くの関心を引きつけている。成長因子シグナル伝達、細胞周期の進行および新生物の形質転換におけるタンパク質チロシンリン酸化の重要性は、今では十分に確立されている（ハンター(Hunter)らによるAnn. Rev. Biochem. 54: 987-930 (1985)、ウルリッヒ(Ullrich)らによるCell 61: 203-212 (1990), Nurse, Nature 344: 503-508 (1990)、カントレー(Cantley)らによるCell 64: 281-302 (1991）。
【０００４】
生物学的な研究により、様々な細胞タンパク質のチロシン残基上でのリン酸化がリン酸化反応と脱リン酸化反応との競争に関与する動的なプロセスであることが分かっている。タンパク質チロシンリン酸化の調節は、タンパク質チロシンキナーゼ(PTKアーゼ)およびタンパク質チロシンホスファターゼ(PTPアーゼ)の相反作用によって媒介される。チロシンリン酸化反応は、PTKアーゼによって触媒される。 チロシンリン酸化タンパク質は、PTPアーゼの作用によって特異的に脱リン酸化され得る。細胞内基質のタンパク質チロシンリン酸化のレベルは、PTKアーゼ活性およびPTPアーゼ活性のバランスによって決まる（ハンター(Hunter), T.らによるCell 58: 1013-1016 (1989)）。
【０００５】
該タンパク質チロシンキナーゼ(PTKアーゼ)は、多数の成長因子受容体および潜在的なオンコジーンを含む大ファミリーのタンパク質である（ハンクス(Hanks)らによるScience 241: 42-52 (1988)）。多数のPTKアーゼは、細胞周期の誘発に必要な開始シグナルと関連する（ウェーバー(Weaver)らによるMol. Cell. Biol. 11, 9: 4415-4422 (1991)）。PTKアーゼは共通する祖先を有するが、セリン／トレオニン−特異的タンパク質キナーゼと大きな違いを有する酵素の別ファミリーを含む。RTKアーゼの活性の変化を引き起こす機構は、膜貫通トポロジーを有する受容体タイプPTKアーゼの場合に最もよく理解される（ウルリッヒ(Ullrich)らによる(1990)、上記）。受容体タイプPTKアーゼのメンバーの細胞外ドメインに対する特異的なリガンドの結合は、チロシンキナーゼ活性の増大およびシグナル伝達経路の活性化を引き起こすそれらのオリゴマー化を誘発すると考えられる。 (ウルリッヒらによる(1990)、上記）。突然変異または過剰発現によるキナーゼ活性の調節解除は、細胞形質転換についての十分に確立された機構である（ハンター(Hunter)らによる(1985)、上記; ウルリッヒらによる(1990)、上記）。
【０００６】
該タンパク質ホスファターゼは、少なくとも２個の別個且つ特徴的なファミリー（ハンター, T.らによる(1989)、上記）、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼおよびタンパク質チロシンホスファターゼ（PTPアーゼ）から構成される。
【０００７】
タンパク質チロシンホスファターゼ（PTPアーゼ）は、２つのサブグループに分類されるタンパク質ファミリーである。第１のサブグループは、１個の保存的触媒ホスファターゼドメインを含む低分子量の細胞内酵素からなる。全ての公知の細胞内タイプPTPアーゼは、１個の保存的触媒ホスファターゼドメインを含む。該第１の群のPTPアーゼとしては、例えば（1）胎盤性PTPアーゼ1B（チャルボヌー(Charbonneau)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5252-5256 (1989);チェルノフ(Chernoff)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2735-2789 (1989)）、（2）T-細胞PTPアーゼ（クール(Cool)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5257-5261 (1989)）、（3）ラット脳PTPアーゼ（グアン(Guan)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1501-1502 (1990)）、（4）ニューロンホスファターゼ(STEP)（ロンブロソ(Lombroso)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7242-7246 (1991)）および（5）細胞骨格タンパク質に対する相同性の領域を含む細胞質ホスファターゼ（グー(Gu)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5867-57871 (1991)；ヤング(Yan)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5949-5953 (1991)）を含む。
【０００８】
このクラスの酵素は、CX5Rの活性部位モチーフを特徴とする。該モチーフ中、システインの硫黄は、P-O結合を切断しそして該ホスフェートを遊離させる求核体として作用し；アルギニンは、該ホスフェートと相互作用しそして求核体の攻撃を促進する。多数の場合に、該システインはヒスチジンに先行(precede)され、該アルギニンの後にセリンまたはトレオニンが続く。加えて、該システインに対して20以上のアミノ酸N-末端に位置するアスパラギン酸残基は、切断の間に一般的な酸として作用する（ファウマン(Fauman)による、1996）。
【０００９】
タンパク質チロシンホスファターゼの第２のサブグループは、高分子量の受容体と結合したPTPアーゼ（R-PTPアーゼと呼ばれる）からなる。R-PTPアーゼは、a）細胞内触媒領域、b）１個の膜貫通区域、およびc）推定リガント結合性細胞外ドメインからなる（ジェビンク(Gebbink)らによる、上記）。
【００１０】
R-PTPアーゼのc）推定リガント結合性細胞外「受容体」ドメインの構造およびサイズは、全く多岐にわたる。それに反して、ａ）R-PTPアーゼの細胞内触媒領域は非常に相同である。たった１つの触媒ホスファターゼドメインを有するR-PTPアーゼ（これは、HPTPベータと呼ばれる）の顕著な例外はあるが、全てのRPTPアーゼは２個のタンデムに複製された触媒ホスファターゼ相同性ドメインを有する（チャイ(Tsai)らによるJ. Biol. Chem. 266 (16): 10534-10543 (1991)）。
【００１１】
R-PTPアーゼの１例は、白血球共通抗原（LCA)である（ラルフ(Ralph), S. J.によるEMBO J. 6: 1251-1257 (1987)）。 LCAは、全ての白血球およびそれらの造血性前駆体の表面上で発現する高分子量糖タンパク質のファミリーである（トーマス(Thomas)によるAnn. Rev. Immunol. 7: 339-369 (1989)）。著しい大きさの類似度は、いくつかの種由来のLCAの配列を用いて検出される（チャルボヌー(Charbonneau)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7182-7186 (1988)）。LCAは、異なる命名（例えば、T200（トロウブリッジ(Trowbridge)らによるEur. J. Immunol. 6: 557-562 (1962)）、B細胞型についてはB220（コフマン(Coffman)らによるNature 289: 681-683 (1981)）、マウスアロタイプマーカーLy-5（コムロ(Komuro)らによるImmunogenetics 1: 452-456 (1975)）およびより最近ではCD45（コボルド(Cobbold)らによるLeucocyte Typing III, A. J. McMichael編らによるpp. 788-803 (1987)を含む）で文献に記載されている。
【００１２】
いくつかの研究により、CD45がT細胞活性化において重要な役割を果たしていることが示されている。これらの研究は、ワイス(Weiss) A.によるAnn. Rev. Genet. 25: 487-510 (1991)に総括されている。ある研究では、NSGによって変異誘発されそしてCD45を発現するそれらの不全を選択するT-細胞クローンはT-細胞受容体刺激に対する反応の障害を有する（ウェーバー(Weaver)らによる(1991)、上記）。これらのT-細胞クローンは、T-細胞抗原受容体によって伝達されるシグナルに対するそれらの応答（例えば、適当な標的の細胞溶解、増殖およびリンホカイン産生を含む）において機能的に不完全であった（ウェーバーらによる(1991)、上記）。
【００１３】
他の研究は、CD45のPTPアーゼ活性がpp561.sup.lck、リンパ球特異的PTKアーゼの活性化において機能することを示している（ムステリン(Mustelin)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6302-6306 (1989); オステルガード(Ostergaard)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8959-8963 (1989)）。これらの筆者は、CD45のホスファターゼ活性がC-末端チロシン残基の脱リン酸化によってpp56.sup.lckを活性化し、このことはT-細胞活性化に関連し得ると仮説した。
【００１４】
R-PTPアーゼの別例は、白血球共通抗原関連分子（LAR）である（ストレウリ(Streuli)らによるJ. Exp. Med. 168: 1523-1530 (1988)。LARは、最初にLCAのホモログとして同定された（ストレウリらによる、上記）。a）LAR分子の細胞内触媒領域が２個の触媒ホスファターゼ相同性ドメイン（ドメインIおよびドメインII）を含むが、変異性分析により、ドメインIのみが触媒ホスファターゼ活性を有し、一方でドメインIIは酵素学的に不活性であることが示唆されている（ストレウリによるEMBO J. 9 (8): 2399-2407 (1990)）。アミノ酸位置1379のチロシンをフェニルアラニンに変えた化学的に誘発されるLAR変異体は、温度感受性である（トサイ(Tsai)らによるJ. Biol. Chem. 266 (16): 10534-10543 (1991)）。
【００１５】
a）LARといくつかの構造モチーフを共有する細胞外ドメインを有する新規なマウスR-PTP（これは、mRPTP.mu.と示す）がクローニングされている（ゲビンク(Gebbink)らによる(1991)、上記）。加えて、これらの筆者はRPTP.mu.のヒトホモログをクローニングし、そして該遺伝子をヒト染色体18上に位置させた。
【００１６】
２つのショウジョウバエPTPアーゼ（これは、DLARおよびDPTPと呼ばれる）が、cDNAクローンの配列に基づいて予想されている（ストレウリらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8698-8702 (1989)）。別のショウジョウバエR−PTPアーゼ（これは、DPTP 99Aと呼ばれる）をコードするcDNAがクローニングされ、確認されている（ハリハラン(Hariharan)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11266-11270 (1991)）。
【００１７】
R-PTPアーゼの他の例としては、例えばR-PTPアーゼ−アルファ、ベータ、ガンマおよびゼータを含む（クルーガー(Krueger)らによるEMBO J. 9: 3241-3252 (1990)、サップ(Sap)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6112-6116 (1990)、カプラン(Kaplan)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7000-7004 (1990)、ジリック(Jirik)らによるFEBS Lett. 273: 239-242 (1990); マトー(Mathews)らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4444-4448 (1990)、オーギ(Ohagi)らによるNucl. Acids Res. 18: 7159 (1990)）。公開公報WO92／01050は、ヒトR-PTPアーゼ−アルファ、ベータおよびガンマを開示し、そしてこれら３つのR-PTPアーゼの保存ドメインおよびこのタンパク質ファミリーの他のメンバー中に見られる構造的相同性の性質について報告している。マウスR-PTPアーゼアルファは794個のアミノ酸を有し、一方でヒトR-PTPアーゼアルファは802個のアミノ酸を有する。R-PTPアーゼアルファは、他のチロシンホスファターゼの触媒ドメインに相同である細胞内ドメインを有する。142アミノ酸細胞外ドメイン（例えば、RPTPアーゼアルファのシグナルペプチドを含む）は、セリンおよびトレオニンの高い含有量（32％）および８個の潜在的なN-グリコシル化部位を有する。R-PTPアーゼアルファをコードするcDNAクローンが産生されており、そしてR-PTPアーゼアルファは真核生物宿主から発現する。ノーザン分析を用いて、様々な細胞および組織中でのR-PTPアーゼアルファの自然発現を同定した。R-PTPアーゼアルファに対するポリクローナル抗体は、R-PTPアーゼアルファの合成ペプチド（これは、R-PTPアーゼアルファの部分をコードするcDNAクローンを用いて形質移入した細胞中で130kDaタンパク質と同定される）を用いる免疫化によって産生される。
【００１８】
R-PTPアーゼの別例は、HePTPである（ジリック(Jirik)によるFASEB J. 4: 82082 (1990) Abstract 2253）。ジリックらは、LCAの２つのPTPアーゼドメインをコードするプローブを用いて胚芽腫セルライン、HepG2から得るcDNAライブラリーをスクリーニングし、そして新規なRPTPアーゼ（HePTPと命名）をコードするcDNAクローンを発見した。該HePTP遺伝子は、様々なヒトおよびマウスのセルラインおよび組織中で発現すると考えられる。
【００１９】
PTPアーゼの初期の精製、配列決定およびクローニング以来、別の潜在的なPTPアーゼが急速なペースで同定されている。同定された異なるPTPアーゼの数は着実に増加しており、このことによりこのファミリーはPTKアーゼファミリーと同じ位の大きさであり得ると推測される（ハンターらによる(1989)、上記）。
【００２０】
公知のPTPアーゼの触媒ドメインに中での保存アミノ酸配列が同定され、そして決定されている（クルーガーらによるEMBO J. 9: 3241-3252 (1990)およびイー(Yi)らによるMol. Cell. Biol. 12: 836-846 (1992)、これらは本明細書の一部を構成する）。これらのアミノ酸配列は、本明細書中で「コンセンサス配列」と示す。
【００２１】
イーらは、以下のPTPアーゼ：LCA、PTP1B、TCPTP、LAR、DLAR、並びにHPTP.アルファ、HPTP.ベータおよびHPTP.ガンマの触媒ホスファターゼドメイン配列をアラインした。このアラインメントは、「コンセンサス配列」（イーらによる上記、FIG. 2 (A),ライン1および2）：DYINAS/N（配列番号77）、CXXYWP（配列番号78）およびI/VVMXXXXE（配列番号79）を含む。
【００２２】
クーガーらは、PTP1Bの触媒ホスファターゼドメイン配列、TCPTP、LAR、LCA、HPTP.アルファ、ベータ、ガンマ、GAMMAデルタ、イプシロンおよびゼータ、並びにDLARおよびDPTPをアラインした。このアラインメントしては例えば、「コンセンサス配列」（クルーガーらによる上記、図7、ライン1および2）：D/NYINAS/N（配列番号80）、CXXYWP（配列番号81）およびI/VVMXXXXE（配列番号82）を含む。
【００２３】
チロシン残基の脱リン酸化は重要な調節機構として単独で機能し得ることが分かった。C-末端チロシン残基の脱リン酸化は、チロシンキナーゼのsrcファミリーの場合には、チロシンキナーゼ活性を活性化することが分かっている（ハンターらによるT. Cell 49: 1-4 (1987)）。チロシン脱リン酸化は、卵成熟促進因子(MPF)キナーゼの有糸分裂活性化における必須の(obligatory)工程であることが示唆されている（モルラ(Morla)らによるCell 58: 193-203 (1989)）。これらの観察は、チロシンホスファターゼ活性を調節する機構を理解するための当該分野における要求を指摘する。
【００２４】
ヒトホスファターゼの発現または活性のモジュレーター（インヒビターまたはアクチベーター）を用いて、異常なホスファターゼ発現またはホスファターゼ基質タンパク質のリン酸化の減少を特徴とする障害を有する被験者を処置することができる。それらの障害としては例えば、免疫、抗増殖性、増殖性（例えば、癌）、代謝性（例えば、糖尿病または肥満症）、骨（例えば、オステオポローシス）、神経および／または心血管の疾患および／または障害、加えてウイルス性病因を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
シグナル伝達、細胞周期の進行および細胞成長、並びに新生物形質転換の機構の重要な理解を得るために、PTPアーゼに関する構造−機能の関係についての更なる分析が必要であることは明らかである。
【００２６】
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、組換えベクターを含有する宿主細胞、並びにそれらベクターおよび宿主細胞の産生方法、加えて組換え法を用いたヒトホスファターゼポリペプチドまたはポリペプチドの産生におけるそれらの使用に関する。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生する合成法を提供する。ヒトホスファターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する疾患、障害および／または病気を検出する診断方法、並びに該疾患、障害および／または病気を処置する処置方法をも提供する。本発明は更に、該ポリペプチドの結合性パートナーを同定するスクリーニング法に関する。
【００２７】
(発明の概要）
本発明は、配列番号150として示されるアミノ酸配列またはATCC受託番号XXXXXXとして寄託されているcDNAクローンBMY_HPP1がコードするアミノ酸配列、を有するヒトBMY_HPP1ホスファターゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらからなる、単離核酸分子を提供する。
【００２８】
本発明は、配列番号152として示されるアミノ酸配列またはATCC受託番号XXXXXとして寄託されているcDNAクローンBMY_HPP2によってコードされるアミノ酸配列、を有するヒトBMY_HPP2ホスファターゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらからなる、単離核酸分子を提供する。
【００２９】
本発明は、配列番号42として示されるアミノ酸配列またはATCC受託番号PTA-2966（2001年1月24日に寄託）として寄託されているcDNAクローンBMY_HPP5（これは、7IC-5-E2とも呼ばれる）がコードするアミノ酸配列、を有するヒトBMY_HPP5ホスファターゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらからなる、単離核酸分子を提供する。
【００３０】
本発明は、配列番号109として示されるアミノ酸配列またはATCC受託番号PTA-3434（2001年6月7日に寄託）として寄託されているcDNAクローンRET31（これは、1hrTNF031および／またはクローン31とも呼ばれる）がコードするアミノ酸配列、を有するヒトRET31ホスファターゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらからなる、単離核酸分子を提供する。
【００３１】
本発明は、配列番号114として示されるアミノ酸配列またはATCC受託番号XXXXXXとして寄託されているcDNAクローンmRET31がコードするアミノ酸配列、を有するマウスRET31ホスファターゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらからなる、単離核酸分子を提供する。
【００３２】
本発明は、配列番号150として示されるアミノ酸配列またはATCC受託番号XXXXXとして寄託されているcDNAクローンBMY_HPP1がコードするアミノ酸配列、を有するヒトBMY_HPP1ホスファターゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらからなる、単離核酸分子を提供する。
【００３３】
本発明は、配列番号152として示されるアミノ酸配列またはATCC受託番号XXXXXとして寄託されているcDNAクローンBMY_HPP2がコードするアミノ酸配列、を有するBMY_HPP2をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらからなる、単離核酸分子を提供する。
【００３４】
本発明は、本発明の単離核酸分子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含有する宿主細胞、並びにそれらのベクターおよび宿主細胞を産生する方法、加えて組換え方法を用いたヒトホスファターゼポリペプチドまたはペプチドの産生におけるそれらの使用にも関する。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するための合成方法を提供する。ヒトホスファターゼポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する疾患、障害および／または病気を検出するための診断方法、並びにそれらの疾患、障害および／または病気を処置するための治療学的な方法をも提供する。本発明は更に、該ポリペプチドの結合性パートナーを同定するするためのスクリーニング方法に関する。
【００３５】
本発明は更に、本明細書に記載のポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を有する単離BMY_HPP1ヒトホスファターゼポリペプチドを提供する。
【００３６】
本発明は更に、本明細書に記載のポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を有する単離BMY_HPP2ヒトホスファターゼポリペプチドを提供する。
【００３７】
本発明は更に、本明細書に記載のポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を有する単離BMY_HPP5ヒトホスファターゼポリペプチドを提供する。
【００３８】
本発明は更に、本明細書に記載のポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を有する単離RET31ヒトホスファターゼポリペプチドを提供する。
【００３９】
本発明は更に、本明細書に記載のポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を有する単離RET31マウスホスファターゼポリペプチドを提供する。
【００４０】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42もしくは109のポリペプチド断片または配列番号149、151、7、9、41もしくは108にハイブリダイスすることができる寄託されたクローンに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチド断片、をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００４１】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42もしくは109のポリペプチドドメインまたは配列番号149、151、7、9、41もしくは108にハイブリダイズすることができる寄託されたクローンに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドドメイン、をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００４２】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42もしくは109のポリペプチドエピトープ、または配列番号149、151、7、9、41もしくは108にハイブリダイズすることができる寄託されたクローンに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチドエピトープ、をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００４３】
本発明は更に、生物学的活性を持つ、配列番号150、152、8、10、42もしくは109のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または配列番号149、151、7、9、41もしくは108にハイブリダイズすることができる寄託されたクローンに含まれるcDNA配列に関する。
【００４４】
本発明は更に、配列番号149、151、7、9、41または108の変異体であるポリヌクレオチドに関する。
【００４５】
本発明は更に、配列番号149、151、7、9、41または108のアレル変異体であるポリヌクレオチドに関する。
【００４６】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42または109の種ホモログをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００４７】
本発明は更に、配列番号149、151、7、9、41または108の相補配列（アンチセンス）であるポリヌクレオチドに関する。
【００４８】
本発明は更に、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つにストリンジェントな条件でハイブリダイスする能力を持ち、且つＡ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列を持つ核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチドに関する。
【００４９】
本発明は更に、ポリヌクレオチド断片はヒトホスファターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、配列番号150、152、8、10、42または109の単離核酸分子に関する。
【００５０】
本発明は更に、ポリヌクレオチド断片が配列番号150、152、8、10、42もしくは109として同定される配列または配列番号149、151、7、9、41もしくは108にハイブリダイズすることができる寄託されたクローンに含まれるcDNA配列がコードするポリペプチド、をコードするヌクレオチド配列を含む、配列番号149、151、7、9、41または108の単離核酸分子に関する。
【００５１】
本発明は更に、ポリヌクレオチド断片が配列番号149、151、7、9、41もしくは108の完全ヌクレオチド配列または配列番号149、151、7、9、41もしくは108にハイブリダイズすることができる寄託されたクローンに含まれるcDNA配列、を含む配列番号149、151、7、9、41または108の単離核酸分子に関する。
【００５２】
本発明は更に、ヌクレオチド配列がC-末端またはN-末端のいずれかからの連続的ヌクレオチド欠失を含む、配列番号1の単離核酸分子に関する。
【００５３】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42もしくは109または寄託されたクローンに含まれるコードされた配列のポリペプチド断片を含むアミノ酸配列を含有する、単離ポリペプチドに関する。
【００５４】
本発明は更に、生物学的活性を持つ、配列番号150、152、8、10、42もしくは109または寄託されたクローンに含まれるコードされた配列、のポリペプチド断片に関する。
【００５５】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42もしくは109または寄託されたクローンに含まれるコードされた配列、のポリペプチドドメインに関する。
【００５６】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42もしくは109または寄託されたクローンに含まれるコードされた配列、のポリペプチドエピトープに関する。
【００５７】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42もしくは109または寄託されたクローンに含まれるコードされた配列、の全長タンパク質に関する。
【００５８】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42または109の変異体に関する。
【００５９】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42または109のアレル変異体に関する。本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42または109の種ホモログに関する。
【００６０】
本発明は更に、全長タンパク質がC-末端またはN-末端のいずれかからの連続的アミノ酸欠失を含む、配列番号150、152、8、10、42または109の単離ポリペプチドに関する。
【００６１】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42または109の単離ポリペプチドと特異的に結合する単離抗体に関する。
【００６２】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該方法は配列番号150、152、8、10、42もしくは109のポリペプチドまたは配列番号149、151、7、9、41もしくは108のポリヌクレオチドの治療学的に有効な量を哺乳動物被験者に投与することを含む。
【００６３】
本発明は更に、被験者の病理学的な病気または病理学的な病気に対する感受性の診断方法に関するものであって、該方法は（a）配列番号149、151、7、9、41もしくは108のポリヌクレオチド中での変異の有無を測定し；そして、（b）該変異の有無に基づいて病理学的な病気もしくは病理学的な病気に対する感受性を診断する、工程を含む。
【００６４】
本発明は更に、被験者における病理学的な病気または病理学的な病気に対する感受性の診断方法に関するものであって、該方法は（a）生物学的な試料中での配列番号150、152、8、10、42または109のポリペプチドの発現の存在またはその量を測定し；そして、該ポリペプチドの発現の存在またはその量に基づいて病理学的な病気または病理学的な病気に対する感受性を診断する、工程を含む。
【００６５】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42または109のポリペプチドに対する結合性パートナーを同定するための方法に関するものであって、該方法は（a）配列番号150、152、8、10、42または109のポリペプチドを結合性パートナーと接触させ；そして、（b）該結合性パートナーが該ポリペプチドの活性に影響を及ぼすかどうかを測定する、工程を含む。
【００６６】
本発明は更に、配列番号149、151、7、9、41または108のcDNA配列に相当する遺伝子に関する。
【００６７】
本発明は更に、生物学的アッセイにおける活性を同定する方法に関するものであって、該方法は（a）細胞中で配列番号149、151、7、9、41または108を発現させ；（b）該上清を単離し；（c）生物学的アッセイにおける活性を検出し；そして、（d）該活性を有する上清中のタンパク質を同定する、工程を含む。
【００６８】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42または109の活性からなる群から選ばれる改変された活性を持つ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を作製するための方法に関するものであって、該方法は（a）配列番号149、151、7、9、41または108のヌクレオチド配列をシャフルし；（b）該得られるシャッフルされたヌクレオチド配列を発現させ；（c）該非改変ヌクレオチド配列の遺伝子産物の配列番号150、152、8、10、42または109の活性からなる群から選ばれる活性と比較して、配列番号150、152、8、10、42または109の活性からなる群から選ばれる改変された活性を選択する、工程を含む。
【００６９】
本発明は更に、シャッフリング方法によって得られるシャッフルされたポリヌクレオチド配列に関するものであって、該シャッフルされたＤＮＡ分子は配列番号150、152、8、10、42または109の活性からなる群から選ばれる活性のいずれか１つのインヒビターに対する耐性が増大した遺伝子産物をコードする。
【００７０】
本発明は更に、配列番号150、152、8、10、42または109として提示されるポリペプチド、加えてそのコードする核酸を用いて医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は異常なホスファターゼ活性に関する病気である。
【００７１】
本発明は更に、ホスファターゼの生物学的活性をモジュレートする化合物を同定する方法に関するものであって、該方法は（a）候補モジュレーター化合物を、配列番号150、152、8、10、42または109の１つ以上で記載される配列を有するホスファターゼと混合し；そして、（b）該候補モジュレーター化合物がホスファターゼの活性に及ぼす影響を測定する、工程を含む。
【００７２】
本発明は更に、ホスファターゼの生物学的活性をモジュレートする化合物を同定する方法に関するものであって、該方法は（a）候補モジュレーター化合物を配列番号150、152、8、10、42もしくは109に記載の配列を持つホスファターゼを発現する宿主細胞と混合し；そして、（b）該候補モジュレーター化合物が発現したホスファターゼの活性に及ぼす影響を測定する、工程を含む。
【００７３】
本発明は更に、ホスファターゼの生物学的活性をモジュレートする化合物を同定する方法に関するものであって、該方法は（a）候補モジュレーター化合物を本明細書に記載のベクターを含有する宿主細胞と混合し；そして、（b）該候補モジュレーター化合物が該細胞によって発現されるホスファターゼの活性に及ぼす影響を測定する、工程を含む。
【００７４】
本発明は更に、ホスファターゼの生物学的活性をモジュレートすることができる化合物をスクリーニングする方法に関するものであって、該方法は（a）本明細書に記載の宿主細胞を用意して；（b）モジュレーター化合物の非存在下でホスファターゼの生物学的活性を測定し；（c）該細胞を該モジュレーター化合物と接触させ；そして、（d）該モジュレーター化合物の存在下でのホスファターゼの生物学的活性を測定する工程を含み、ここで、モジュレート化合物の存在下およびモジュレート化合物の非存在下でのホスファターゼの活性の差異は該化合物のモジュレート効果を示す。
【００７５】
本発明は更に、本明細書に記載の方法によって同定されるヒトホスファターゼの生物学的活性をモジュレートする化合物に関する。
【００７６】
本発明は更に、コンピュータドッキングを含むコンピュータスクリーニング方法、およびBMY_HPP1の３次元座標（図28、表VIII）を用いる構造ベースの薬物設計の方法にも関する。コンピュータプログラムおよびアルゴリズムを用いるモジュレーターの構築または探索を含むBMY_HPP1モジュレーターの同定方法をも提供する。本発明の態様において、BMY_HPP1の潜在的なモジュレーターを設計するための方法を提供し、該方法は潜在的なモジュレーターを設計するかまたは選択するための該３次元構造を用いる工程のいずれかの組み合わせを含む。
【００７７】
本発明はまた、BMY_HPP1の相同モデルの構造座標をも提供する。該完全な座標を表VIIIに示し、図28に視覚化する。本発明に存在するモデルは更に、BMY_HPP1または改変された特異性を有する変異体における１つ以上の生物学的機能の刺激物質およびインヒビターまたは拮抗薬を設計するための基礎を提供する。
【００７８】
本発明は更に、コンピュータドッキングを含むコンピュータスクリーニング方法、およびBMY_HPP2の３次元座標（図32、表IX）を用いる構造ベースの薬物設計の方法にも関する。コンピュータプログラムおよびアルゴリズムを用いるモジュレーターの構築または探索を含むBMY_HPP2モジュレーターの同定方法をも提供する。本発明の態様において、BMY_HPP2の潜在的なモジュレーターを設計するための方法を提供し、該方法は潜在的なモジュレーターを設計するかまたは選択するための該３次元構造を用いる工程のいずれかの組み合わせを含む。
【００７９】
本発明はまた、BMY_HPP2の相同モデルの構造座標をも提供する。該完全な座標を表IXに示し、図32に視覚化する。本発明に存在するモデルは更に、BMY_HPP2または改変された特異性を有する変異体における１つ以上の生物学的機能の刺激物質およびインヒビターまたは拮抗薬を設計するための基礎を提供する。
【００８０】
本発明は更に、コンピュータドッキングを含むコンピュータスクリーニング方法、およびBMY_HPP5の３次元座標（図38、表X）を用いる構造ベースの薬物設計の方法にも関する。コンピュータプログラムおよびアルゴリズムを用いるモジュレーターの構築または探索を含むBMY_HPP5モジュレーターの同定方法をも提供する。本発明の態様において、BMY_HPP5の潜在的なモジュレーターを設計するための方法を提供し、該方法は潜在的なモジュレーターを設計するかまたは選択するための該３次元構造を用いる工程のいずれかの組み合わせを含む。
【００８１】
本発明はまた、BMY_HPP5の相同モデルの構造座標をも提供する。該完全な座標を表Xに示し、図38に視覚化する。本発明に存在するモデルは更に、BMY_HPP5または改変された特異性を有する変異体における１つ以上の生物学的機能の刺激物質およびインヒビターまたは拮抗薬を設計するための基礎を提供する。
【００８２】
本発明はまた、保存的活性部位領域の全てまたはいずれかの部分を含むBMY_HPP1の構造座標を含む、機械で読み取り可能な保存媒体をも提供する。これらのデータをコード化するそれら保存媒体は、コンピュータスクリーンまたは同様な視覚化装置上に、該領域もしくは同様な形の相同領域を含む分子または分子複合体の３次元的な図示を表示することができる。
【００８３】
本発明はまた、上記の領域の全てまたは部分と結合する化合物を設計し、評価しおよび同定するための方法をも提供する。該方法は３次元モデルの構築（相同モデリング）およびコンピュータ補助による薬物設計の方法を含み、該方法は、BMY_HPP1ポリペプチドの上記の領域と結合したりまたはモジュレートする化合物を同定するのに使用することができる。それらの化合物は、BMY_HPP1またはその相同体の潜在的なインヒビターである。
【００８４】
本発明はまた、保存的活性部位領域の全てまたはいずれかの部分を含むBMY_HPP2の構造座標を含む、機械で読み取り可能な保存媒体をも提供する。これらのデータをコード化するそれら保存媒体は、コンピュータスクリーンまたは同様な視覚化装置上に、該領域もしくは同様な形の相同領域を含む分子または分子複合体の３次元的な図示を表示することができる。
【００８５】
本発明はまた、上記の領域の全てまたは部分と結合する化合物を設計し、評価しおよび同定するための方法をも提供する。該方法は３次元モデルの構築（相同モデリング）およびコンピュータ補助による薬物設計の方法を含み、該方法は、BMY_HPP2ポリペプチドの上記の領域と結合したりまたはモジュレートする化合物を同定するのに使用することができる。それらの化合物は、BMY_HPP2またはその相同体の潜在的なインヒビターである。
【００８６】
本発明はまた、保存的活性部位領域の全てまたはいずれかの部分を含むBMY_HPP5の構造座標を含む、機械で読み取り可能な保存媒体をも提供する。これらのデータをコード化するそれら保存媒体は、コンピュータスクリーンまたは同様な視覚化装置上に、該領域もしくは同様な形の相同領域を含む分子または分子複合体の３次元的な図示を表示することができる。
【００８７】
本発明はまた、上記の領域の全てまたは部分と結合する化合物を設計し、評価しおよび同定するための方法をも提供する。該方法は３次元モデルの構築（相同モデリング）およびコンピュータ補助による薬物設計の方法を含み、該方法は、BMY_HPP5ポリペプチドの上記の領域と結合したりまたはモジュレートする化合物を同定するのに使用することができる。それらの化合物は、BMY_HPP5またはその相同体の潜在的なインヒビターである。
【００８８】
本発明はまた、表VIIIに記載するBMY_HPP1モデルの構造座標を含む分子もしくは分子複合体の３次元表示、または骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下であるような骨格原子を含む該分子もしくは分子複合体の相同体の３次元表示、を得るためのコンピュータをも提供する。
【００８９】
本発明はまた、機械で読み取り可能なデータをコード化するデータ記憶物質を含む機械で読み取り可能なデータ記憶媒体（ここで、該データは表VIIIに記載のBMY_HPP1モデルまたは該モデルの相同体についての構造座標の組みによって定義され、該相同体は骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下であるような骨格原子を含む）；該機械で読み取り可能なデータを処理するための指令を記憶するための作業記憶；該機械で読み取り可能なデータを処理して該３次元表示を得るための、該作業記憶および該機械で読み取り可能なデータ記憶媒体と連結させた中央処理装置；および、該３次元表示を表示するための該中央処理装置と連結させたディスプレーをも提供する。本発明はまた、機械で読み取り可能なデータ記憶媒体が、表VIIIに記載のBMY_HPP1または該分子の相同体（ここで、該相同体は骨格原子からの根平均２乗偏差は3.0Å以下である）についてのモデルの構造座標の組みによって定義されるコンピュータをも提供する。
【００９０】
本発明はまた、表VIIIに記載のBMY_HPP1の構造座標によって定義されるモデル、または該分子もしくは分子複合体の変異体もしくは相同体の全てもしくはそのいずれかの部分を含有するモデルをも提供する。
【００９１】
本発明はまた、改変された生物学的な性質、機能または反応性を有するBMY_HPP1の変異体を同定する方法をも提供するものであって、該方法は改変された生物学的な機能または性質を有するタンパク質変異体の設計のためのBMY_HPP1モデルまたは表VIIIに記載の該モデルの相同体の使用からなる群から選ばれる工程を含む。
【００９２】
本発明はまた、表VIIIに記載の構造座標を用いるBMY_HPP1の構造的な特徴および化学的な特徴を同定する方法をも提供するものであって、該方法は以下のいずれかの工程またはそれらの工程の組み合わせを含む：同定された構造的な特徴または化学的な特徴を用いて、潜在的なBMY_HPP1モジュレーターとしての化合物を設計しまたは選択する工程；３次元構造モデルを用いて、潜在的なBMY_HPP1モジュレーターとしての化合物を設計するかまたは選択する工程；潜在的なBMY_HPP1モジュレーターを製造する工程；および該BMY_HPP1とタンパク質との結合を特徴とするアッセイにおける潜在的なBMY_HPP1モジュレーターをスクリーニングする工程。本発明は更に、潜在的なBMY_HPP1モジュレーターをデータベースから選ぶ方法を提供する。本発明は更に、該潜在的なBMY_HPP1モジュレーターを新規に設計する方法を提供する。本発明は更に、該潜在的なBMY_HPP1モジュレーターを活性の公知モジュレーターから設計する方法を提供する。
【００９３】
本発明はまた、BMY_HPP1活性をモジュレートする化合物を同定する方法を提供するものであって、該方法は以下の工程のいずれかの組み合わせを含む：表VIIIに記載の構造座標によって定義されるBMY_HPP1の残基D161-Y162およびH189-C190-G193-R196によって定義される活性部位領域にまたはその近くに空間的に適合する被験化合物をモデル化するか、あるいはBMY_HPP1、変異相同体またはその部分の触媒的ドメインの３次元構造モデルに空間的に適合する被験化合物をモデル化する工程；特許請求の範囲に記載する該構造座標または該活性部位領域を用いて、構造的な特徴または化学的な特徴を同定する工程；該同定された構造的な特徴または化学的な特徴を用いて、基質、拮抗薬および作動薬を含む潜在的なBMY_HPP1モジュレーターとしての化合物を設計するかまたは選択する工程；BMY_HPP1の３次元構造モデルまたは触媒的ドメインを用いて、潜在的なBMY_HPP1インヒビターとしての化合物を設計するかまたは選択する工程；被験化合物とBMY_HPP1との結合を特徴とするアッセイにおいて潜在的なBMY_HPP1インヒビターをスクリーニングする工程；および／または、BMY_HPP1由来のアミノ酸の１つ以上（ここで、このものは表VIIIにしたがってBMY_HPP1について特許請求の範囲に記載する活性部位領域に相当する残基を含むが、これらに限定されない）を改変するかまたは置換する工程を含む。
【００９４】
本発明はまた、表IXに記載するBMY_HPP2モデルの構造座標を含む分子もしくは分子複合体の３次元表示、または骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下であるような該骨格原子を含む該分子もしくは分子複合体の相同体の３次元表示を得るためのコンピュータをも提供する。
【００９５】
本発明はまた、機械で読み取り可能なデータをコード化するデータ記憶物質を含む機械で読み取り可能なデータ記憶媒体（ここで、該データは表IXに記載のBMY_HPP2モデルまたは該モデルの相同体についての構造座標の組みによって定義され、該相同体は骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下であるような骨格原子を含む）；該機械で読み取り可能なデータを処理するための指令を記憶するための作業記憶；該機械で読み取り可能なデータを処理して該３次元表示を得るための、該作業記憶および該機械で読み取り可能なデータ記憶媒体と連結させた中央処理装置；および、該３次元表示を表示するための該中央処理装置と連結させたディスプレーをも提供する。本発明はまた、機械で読み取り可能なデータ記憶媒体が、表IXに記載のBMY_HPP2または該分子の相同体（ここで、該相同体は骨格原子からの根平均２乗偏差は3.0Å以下である）についてのモデルの構造座標の組みによって定義されるコンピュータをも提供する。
【００９６】
本発明はまた、表IXに記載のBMY_HPP2の構造座標によって定義されるモデル、または該分子もしくは分子複合体の変異体もしくは相同体の全てもしくはそのいずれかの部分を含有するモデルをも提供する。
【００９７】
本発明はまた、改変された生物学的な性質、機能または反応性を有するBMY_HPP2の変異体を同定する方法をも提供するものであって、該方法は改変された生物学的な機能または性質を有するタンパク質変異体の設計のための、BMY_HPP2モデルまたは表IXに記載の該モデルの相同体の使用からなる群から選ばれる工程を含む。
【００９８】
本発明はまた、表IXに記載の構造座標を用いるBMY_HPP2の構造的な特徴および化学的な特徴を同定する方法をも提供するものであって、該方法は以下のいずれかの工程またはそれらの工程の組み合わせを含む：同定された構造的な特徴または化学的な特徴を用いて、潜在的なBMY_HPP2モジュレーターとしての化合物を設計しまたは選択する工程；３次元構造モデルを用いて、潜在的なBMY_HPP2モジュレーターとしての化合物を設計するかまたは選択する工程；潜在的なBMY_HPP2モジュレーターを製造する工程；および該BMY_HPP2とタンパク質との結合を特徴とするアッセイにおける潜在的なBMY_HPP2モジュレーターをスクリーニングする工程。本発明は更に、潜在的なBMY_HPP1モジュレーターをデータベースから選ぶ方法を提供する。本発明は更に、該潜在的なBMY_HPP2モジュレーターを新規に設計する方法を提供する。本発明は更に、該潜在的なBMY_HPP2モジュレーターを活性の公知モジュレーターから設計する方法を提供する。
【００９９】
本発明はまた、BMY_HPP2活性をモジュレートする化合物を同定する方法を提供するものであって、該方法は以下の工程のいずれかの組み合わせを含む：表IXに記載の構造座標によって定義されるBMY_HPP2の残基D65、H94-C95、G98およびR101によって定義される活性部位領域またはその近くに空間的に適合する被験化合物をモデル化するか、あるいはBMY_HPP2、変異相同体またはその部分の触媒的ドメインの３次元構造モデルに空間的に適合する被験化合物をモデル化する工程；特許請求の範囲に記載する該構造座標または該活性部位領域を用いて、構造的な特徴または化学的な特徴を同定する工程；該同定された構造的な特徴または化学的な特徴を用いて、基質、拮抗薬および作動薬を含む潜在的なBMY_HPP2モジュレーターとしての化合物を設計するかまたは選択する工程；BMY_HPP2の３次元構造モデルまたは触媒的ドメインを用いて、潜在的なBMY_HPP2インヒビターとしての化合物を設計するかまたは選択する工程；被験化合物とBMY_HPP2との結合を特徴とするアッセイにおいて潜在的なBMY_HPP2インヒビターをスクリーニングする工程；および／または、BMY_HPP2由来のアミノ酸の１つ以上（ここで、このものは表IXにしたがってBMY_HPP2について特許請求の範囲に記載する活性部位領域に相当する残基を含むが、これらに限定されない）を改変するかまたは置換する工程を含む。
【０１００】
本発明はまた、表Xに記載するBMY_HPP5モデルの構造座標を含む分子もしくは分子複合体の３次元表示、または骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下であるような該骨格原子を含む該分子もしくは分子複合体の相同体の３次元表示を得るためのコンピュータをも提供する。
【０１０１】
本発明はまた、機械で読み取り可能なデータをコード化するデータ記憶物質を含む機械で読み取り可能なデータ記憶媒体（ここで、該データは表Xに記載のBMY_HPP5モデルまたは該モデルの相同体についての構造座標の組みによって定義され、該相同体は骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下であるような骨格原子を含む）；該機械で読み取り可能なデータを処理するための指令を記憶するための作業記憶；該機械で読み取り可能なデータを処理して該３次元表示を得るための、該作業記憶および該機械で読み取り可能なデータ記憶媒体と連結させた中央処理装置；および、該３次元表示を表示するための該中央処理装置と連結させたディスプレーをも提供する。本発明はまた、機械で読み取り可能なデータ記憶媒体が、表Xに記載のBMY_HPP5または該分子の相同体（ここで、該相同体は骨格原子からの根平均２乗偏差は3.0Å以下である）についてのモデルの構造座標の組みによって定義されるコンピュータをも提供する。
【０１０２】
本発明はまた、表Xに記載のBMY_HPP5の構造座標によって定義されるモデル、または該分子もしくは分子複合体の変異体もしくは相同体の全てもしくはそのいずれかの部分を含有するモデルをも提供する。
【０１０３】
本発明はまた、改変された生物学的な性質、機能または反応性を有するBMY_HPP5の変異体を同定する方法をも提供するものであって、該方法は改変された生物学的な機能または性質を有するタンパク質変異体の設計のための、BMY_HPP5モデルまたは表Xに記載の該モデルの相同体の使用からなる群から選ばれる工程を含む。
【０１０４】
本発明はまた、表Xに記載の構造座標を用いるBMY_HPP5の構造的な特徴および化学的な特徴を同定する方法をも提供するものであって、該方法は以下のいずれかの工程またはそれらの工程の組み合わせを含む：同定された構造的な特徴または化学的な特徴を用いて、潜在的なBMY_HPP5モジュレーターとしての化合物を設計しまたは選択する工程；３次元構造モデルを用いて、潜在的なBMY_HPP5モジュレーターとしての化合物を設計するかまたは選択する工程；潜在的なBMY_HPP5モジュレーターを製造する工程；および該BMY_HPP5とタンパク質との結合を特徴とするアッセイにおける潜在的なBMY_HPP5モジュレーターをスクリーニングする工程。本発明は更に、潜在的なBMY_HPP5モジュレーターをデータベースから選ぶ方法を提供する。本発明は更に、該潜在的なBMY_HPP5モジュレーターを新規に設計する方法を提供する。本発明は更に、該潜在的なBMY_HPP5モジュレーターを活性の公知モジュレーターから設計する方法を提供する。
【０１０５】
本発明はまた、BMY_HPP5活性をモジュレートする化合物を同定する方法を提供するものであって、該方法は以下の工程のいずれかの組み合わせを含む：表Xに記載の構造座標によって定義されるBMY_HPP5の残基D213、H243、C244およびR250によって定義される活性部位領域またはその近くに空間的に適合する被験化合物をモデル化するか、あるいはBMY_HPP5、変異相同体またはその部分の触媒的ドメインの３次元構造モデルに空間的に適合する被験化合物をモデル化する工程；特許請求の範囲に記載する該構造座標または該活性部位領域を用いて、構造的な特徴または化学的な特徴を同定する工程；該同定された構造的な特徴または化学的な特徴を用いて、基質、拮抗薬および作動薬を含む潜在的なBMY_HPP5モジュレーターとしての化合物を設計するかまたは選択する工程；BMY_HPP5の３次元構造モデルまたは触媒的ドメインを用いて、潜在的なBMY_HPP5インヒビターとしての化合物を設計するかまたは選択する工程；被験化合物とBMY_HPP5との結合を特徴とするアッセイにおいて潜在的なBMY_HPP5インヒビターをスクリーニングする工程；および／または、BMY_HPP5由来のアミノ酸の１つ以上（ここで、このものは表XにしたがってBMY_HPP5について特許請求の範囲に記載する活性部位領域に相当する残基を含むが、これらに限定されない）を改変するかまたは置換する工程を含む。
【０１０６】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は腎臓疾患である。
【０１０７】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は炎症性疾患である。
【０１０８】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は二重特異性ホスファターゼが直接的にまたは間接的に疾患の進行に関与している炎症性疾患である。
【０１０９】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は癌である。
【０１１０】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は神経障害である。
【０１１１】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は生殖障害である。
【０１１２】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は免疫学的な障害である。
【０１１３】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は筋変性障害である。
【０１１４】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は筋肉障害である。
【０１１５】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は肝臓障害である。
【０１１６】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は内分泌障害である。
【０１１７】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気は肺障害である。
【０１１８】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気はＴＮＦ−アルファに直接的または間接的のいずれかで関連する障害である。
【０１１９】
本発明は更に、医学的な病気を予防し、治療しまたは軽減する方法に関するものであって、該医学的な病気はＩＬ−１に直接的または間接的のいずれかで関連する障害である。
【０１２０】
（発明の詳細な記載）
以下に詳述する本発明の好ましい態様および本明細書に記載する実施例を参照すれば、本発明の理解がさらに容易になるだろう。「ホスファターゼ」および／または「ヒトホスファターゼ」についての全ての記載は、本明細書中で特に断わらない限り、BMY_HPP1、BMY_HPP2、BMY_HPP3、BMY_HPP4、BMY_HPP5、RET31、マウスRET31および／またはそれらの断片に適用されると解釈されるべきであろう。その上、BMY_HPP5はRET31ポリペプチドのスプライスバリアントであると考えられるので、「BMY_HPP5」についての全ての記載は、RET31に適用されると解釈されるべきであり、そして「RET31」についての全ての記載は「BMY_HPP5」に適用されると解釈されるべきであろう。
【０１２１】
本発明は、ホスホチロシンまたは二重特異性（(P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼとして知られるホスファターゼのクラスに対して実質的な相同性を有する新規なヒトホスファターゼをコードするヒトポリヌクレオチド配列を提供する。このクラスのホスファターゼのメンバーは、多数の疾患および／または障害に関与している。該疾患としては、骨障害（Yoon, HK., Baylink, DJ., Lau, KHによるAm. J. Nephrol., 20 (2): 153-62, (2000)）、病原体に耐性である疾患、生殖障害（Gloria, Bottini, F., Nicotra, M., Lucarini, N., Borgiani, P., La, Torre, M., Amante, A., Gimelfarb, A., Bottini, EによるDis. Markers., 12 (4): 261-9, (1996)）、神経障害（Shimohama, S., Fujimoto, S., Taniguchi, T., Kameyama, M., KimuraによるJ. Ann, Neurol., 33 (6): 616-21, (1993)）、前立腺癌（Nguyen, L., Chapdelaine, A.およびChevalier, S.によるClin. Chem. 36 (8 Pt 1) : 1450-5 (1990)）、免疫障害（特に、造血性細胞の発生、アポトーシス、活性化および非反応性に関する免疫障害）（Frearson, JA., Alexander, DRによるBioessays., 19 (5): 417-27 (1997)）などを含むが、これらに限定されない。
【０１２２】
本発明において、「単離された」という用語は、元の環境（例えばその物質が自然界に存在する場合は自然環境）から取り出された物質を指し、したがってこの物質は、「人の手によって」その自然状態から改変されている。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物の一部である場合や、ある細胞に含まれている場合もあるが、そのような場合でも、そのベクター、組成物またはその細胞が当該ポリヌクレオチドの元の環境ではないという理由で、「単離された」ということができる。「単離された」という用語は、ゲノムまたはcDNAライブラリー、全細胞または全mRNA調製物、ゲノムDNA調製物（電気泳動によって分離され、ブロットに移されたものを含む）、剪断された全細胞ゲノムDNA調製物、または本発明のポリヌクレオチド／配列の顕著な特徴が技術上証明されない他の組成物を指さない。
【０１２３】
具体的態様として、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも15、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも125、少なくとも500、または少なくとも1000個の連続するヌクレオチドであって、しかも300kb、200kb、100kb、50kb、15kb、10kb、7.5kb、5kb、2.5kb、2.0kbまたは1kb以下の長さである。さらにもう一つの態様では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示するコード配列の一部を含むが、イントロンの全部または一部を含まない。もう一つの態様では、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノム隣接遺伝子（すなわちゲノムにおいて関心ある遺伝子の5'側または3'側にあるもの）のコード配列を含まない。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、1000、500、250、100、50、25、20、15、10、5、4、3、2、または1個を越えるゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まない。
【０１２４】
本明細書にいう「ポリヌクレオチド」は、配列番号7、9、41、108、149、151に含まれる核酸配列、またはATCCに寄託されたクローンに含まれるcDNAが含んでいる核酸配列を持つ分子を指す。例えば本ポリヌクレオチドは、5'および3'非翻訳配列、シグナル配列付きまたはシグナル配列無しのコード領域、分泌タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を含むことができ、また、その核酸配列の断片、エピトープ、ドメインおよび変異体を含むこともできる。さらに、本明細書にいう「ポリペプチド」とは、広義のポリヌクレオチドから生成する翻訳されたアミノ酸配列を持つ分子を指す。
【０１２５】
本発明において、配列番号7、9、41、108、149、151として同定される全長配列は、多くの場合、１つ以上のクローンに含まれるオーバーラップ配列（コンティグ解析）によって作成された。配列番号Xの配列の全部または大半を含む代表的クローンはAmerican Type Culture Collection（「ATCC」）に寄託されている。表Ｉに示すように各クローンはcDNAクローンID（識別子）とATCC受託番号によって識別される。ATCCの所在地は米国バージニア州20110-2209マナッサス、ユニバーシティ・ブルバード10801である。このATCC寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従ってなされた。寄託されたクローンは、NotIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼ切断部位を使って、pSport1プラスミド（Life Technologies）に挿入されている。
【０１２６】
別段の表示がない限り、本明細書に記載のDNA分子を配列決定することによって決定されたヌクレオチド配列は全て自動DNAシークエンサー（例えばApplied Biosystems,Inc.の373型）を使って決定したものであり、本発明で決定されたDNA分子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は全て、上で決定したDNA配列を翻訳することによって予想したものである。したがって、自動化されたこのアプローチで決定されるDNA配列に関して当技術分野では知られているように、ここで決定されたヌクレオチド配列はいくつかのエラーを含んでいる可能性がある。自動操作で決定されたヌクレオチド配列は、配列決定したDNA分子の実際のヌクレオチド配列と典型的には少なくとも約90％一致し、より典型的には少なくとも約95％〜少なくとも約99.9％一致する。実際の配列は、当技術分野で周知の手動DNA配列決定法を含む他のアプローチによって、より正確に決定することができる。当技術分野では知られているように、実際の配列と比較して、決定されたヌクレオチド配列に一つの挿入または欠失があると、ヌクレオチド配列の翻訳にフレームシフトが起こり、その結果、決定されたヌクレオチド配列がコードする予想アミノ酸配列は、そのような挿入点または欠失点以降は、配列決定したDNA分子が実際にコードしているアミノ酸配列とは全く異なることになるだろう。
【０１２７】
本明細書に記載する情報、例えば配列番号7、9、41、108、149、151のヌクレオチド配列を利用し、標準的なクローニングおよびスクリーニング法、例えばmRNAを出発物質としてcDNAをクローニングする方法などを使って、ヒトホスファターゼポリペプチドをコードする本発明の核酸分子を取得してもよい。
【０１２８】
本発明の「ポリヌクレオチド」には、配列番号Xに含まれる配列、その相補鎖、またはATCCに寄託されたクローンに含まれるcDNAに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイスすることができるポリヌクレオチドも包含される。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、50％ホルムアミド、5×SSC（750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハート液、10％硫酸デキストラン、および20μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中、42℃で終夜インキュベートした後、フィルターを0.1×SSC中、65℃で洗浄することを指す。
【０１２９】
ストリンジェンシーを下げたハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子も考えられる。ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出のストリンジェンシーの変更は、主に、ホルムアミド濃度（ホルムアミドの割合を下げるとストリンジェンシーが低下する）、塩条件、または温度の操作によって達成される。例えば、ストリンジェンシーを下げたハイブリダイゼーション条件には、6×SSPE（20×SSPE＝3M NaCl、0.2M NaH2PO4、0.02M EDTA、pH7.4）、0.5％SDS、30％ホルムアミド、100μg/mlサケ精子ブロッキングDNAを含む溶液中、37℃で終夜インキュベートした後、1×SSPE、0.1％SDSにより50℃で洗浄することが含まれる。また、さらに低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに続いて行なう洗浄を、より高い塩濃度（例えば5×SSC）で行なうこともできる。
【０１３０】
上述した条件の変更は、ハイブリダイゼーション実験でのバックグラウンドを抑制するために使用される他のブロッキング試薬の添加および/または他のブロッキング試薬への置換によって達成できることに注意されたい。典型的なブロッキング試薬には、例えばデンハート試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性サケ精子DNAおよび市販の専売製剤などがある。一部のブロッキング試薬を添加するには、適合性の問題から、上述したハイブリダイゼーション条件の変更が必要になるかもしれない。
【０１３１】
もちろん、ポリA+配列（例えば配列表に示すcDNAの3'末端ポリA+領域(tract)）または相補的な一連の(stretch)T（またはU）残基だけにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の定義には含まれないだろう。というのも、そのようなポリヌクレオチドは、ポリ(A)区間またはその相補鎖を含む任意の核酸分子（例えばオリゴdTをプライマーにして作製された実質上任意の二本鎖cDNAクローン）にハイブリダイズするだろうからである。
【０１３２】
本発明のポリヌクレオチドは、無修飾RNAまたはDNAであっても修飾RNAまたはDNAであってもよい任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるRNA、ならびにDNAとRNA（これらは一本鎖でもあってもよいし、より典型的には、二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であってもよい）とを含むハイブリッド分子からなることができる。また、ポリヌクレオチドは、RNAもしくはDNAまたはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域からなることもできる。また、ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾塩基を含むか、または安定性を得るためにもしくは他の理由で修飾されたDNAもしくはRNA主鎖を含んでもよい。「修飾」塩基には、例えばトリチル化塩基、およびイノシンなどの異常塩基が含まれる。DNAおよびRNAには様々な修飾を施すことができるので、「ポリヌクレオチド」という用語は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態を包含する。
【０１３３】
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターによって互いに結合したアミノ酸からなることができ、遺伝子がコードする20種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは翻訳後プロセシングなどの自然のプロセスよる修飾、または当技術分野で周知の化学修飾技術による修飾を受けてもよい。そのような修飾は基本的教科書に十分に説明されており、モノグラフおよび多数の研究文献にはさらに詳細に説明されている。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含めて、ポリペプチドのどこに存在してもよい。同じタイプの修飾が、与えられたポリペプチドの数カ所に、同じ程度にまたは様々な程度に、存在するかもしれないことは理解されるだろう。また、与えられたポリペプチドは、数多くの修飾タイプを含むかもしれない。ポリペプチドは、例えばユビキチン結合の結果として分岐していてもよいし、分岐を持つまたは分岐を持たない環状ポリペプチドであってもよい。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは翻訳後の自然プロセスの結果生じる場合もあるし、合成法によって製造することもできる。修飾には、例えばアセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、PEG化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーRNAによるタンパク質へのアミノ酸の付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化などが含まれる（例えば「PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES」第2版,T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，ニューヨーク（1993）；「POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS」B.C.Johnson編，Academic Press，ニューヨーク，p.1-12（1983）；Seifterら，Meth Enzymol 182:626-646(1990)；Rattanら，Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992)などを参照されたい）。
【０１３４】
「配列番号X」はポリヌクレオチド配列を、また「配列番号Y」はポリペプチド配列を指し、どちらの配列も表Ｉで指定する整数によって識別される。
【０１３５】
「生物学的活性を持つポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおける測定で、成熟型を含む本発明ポリペプチドの活性に類似する活性であるが必ずしも同一ではない活性を、用量依存的にまたは用量非依存的に示すポリペプチドを指す。用量依存性が存在する場合、それは本ポリペプチドと同一である必要はなく、本発明のポリペプチドと比較して、所定の活性の用量依存性が、実質的に類似していればよい（すなわち候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドより高い活性を示すか、または本発明のポリペプチドと比較して約25分の1未満でない、好ましくは約10分の1未満でない、最も好ましくは約3分の1未満でない低い活性を示すだろう）。
【０１３６】
本明細書で使用する「生物」という用語は、本明細書に挙げる任意の生物を包含するが、好ましくは真核生物を、より好ましくは哺乳動物を、最も好ましくはヒトを指すものとする。
【０１３７】
本発明は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに（例えば受容体-リガンド相互作用をして）結合するタンパク質、核酸、または他の分子の同定を包含する。本発明のポリヌクレオチドは、相互作用トラップアッセイ（例えばMol Endocrinol.,9(10):1321-9,(1995)およびAnn.N.Y.Acad.Sci.,7;766:279-81,(1995)にOzenbergerとYoungが記載したアッセイなど）に使用することもできる。
【０１３８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドに相当する全長cDNAおよび/またはゲノムDNAを同定および単離するためのプローブとして、新規関連DNA配列をハイブリダイズし、発見するためのプローブとして、この配列または関連配列のポジショナルクローニング用のプローブとして、他の新規ポリヌクレオチドを発見する過程で既知配列を「サブトラクトアウト（subtract-out）」するためのプローブとして、遺伝子発現量を定量するためのプローブとして、そしてまたマイクロアレイ用のプローブとして有用である。
【０１３９】
さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8個またはそれ以上の膜ドメインを含んでよい。
【０１４０】
また、好ましい態様として、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの生物学的機能をさらに精緻化する方法も提供する。
【０１４１】
具体的に述べると、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使って、本発明のオルソログ、ホモログ、パラログ、変異体、および/またはアレル変異体を同定する方法を提供する。また、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使って、本発明の全コード領域、本発明の非コード領域、本発明の調節配列、および適宜、本発明の分泌型、成熟型、プロ型、プレプロ型を同定する方法も提供する。
【０１４２】
好ましい態様として、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドが本来持っているグリコシル化部位を同定し、次いで、例えばタンパク質フォールディングの強化、タンパク質凝集の阻害、細胞小器官への細胞内輸送の調節、タンパク質分解に対する耐性の増加、タンパク質抗原性のモジュレート、および細胞間接着の媒介などを含む数多くの望ましい特徴が得られるように、当該部位を改変、欠失および/または付加する方法を提供する。
【０１４３】
さらなる好ましい態様として、望ましい構造的、機能的および/または物理的特徴を持つ新しい変異体を創造し同定することを目指して、分子進化技術を使って本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを進化させる方法も提供する。
【０１４４】
さらに本発明は、機能の決定に現在利用することができる他の実験方法および手法にも相当する。これらの手法には、例えばアレイへのクローンのスポッティング、マイクロアレイ技術、PCRに基づく方法（例えば定量PCR）、アンチセンス法、遺伝子ノックアウト実験、その他、クローンからの配列情報を使ってプライマーまたはハイブリッドパートナーが構築されるような手法が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１４５】
本明細書で使用する用語「モジュレートする」とは、ある活性、DNA、RNAまたはタンパク質の量、質または効果を増大させたりまたは減少させることを意味する。
【０１４６】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
遺伝子番号1によってコードされるポリペプチドの特徴
配列番号1および3に記載のポリヌクレオチド配列（図1）によってコードされる配列番号2および4として提示されるこの遺伝子に相当するポリペプチド断片ＡおよびＢ、配列番号149に記載の全長ポリヌクレオチド配列（図20A〜D）によってコードされおよび／または寄託されたクローンBMY_HPP1に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる配列番号150として提示されるこの遺伝子に相当する予想全長ポリペプチド配列（図20A〜D）は、多数のホスファターゼに対して、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルで有意な相同性を持っている。該ホスファターゼとしては、例えばスキゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosacchromyces Pombe)タンパク質チロシンホスファターゼPYP3タンパク質（PYP3_SP；ジェンバンク受託番号gi|P32587；配列番号Y7）；マウスタンパク質チロシンホスファターゼ受容体タイプＯタンパク質（MM_RPTPO；ジェンバンク受託番号gi|NP_035346；配列番号Y8）；およびヒトタンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ｏタンパク質（HS_RPTPO；ジェンバンク受託番号gi| NP_002839；配列番号Y9）（これらは、BLASTPによって決定される）を含む。該ヒトホスファターゼポリペプチドとこれらのタンパク質とのアライメントを、図6A〜Dに提示する。該保存的触媒残基を示す。
【０１４７】
BMY_HPP1は、ヒトゲノムBACクローン（ジェンバンク受託番号AL360020）がコードする新規なリンタンパク質ホスファターゼである。予想全長BMY_HPP1ポリペプチド配列とは別に、BAC AL360020において２つの別々の相同領域が同定されている。BMY_HPP1の断片Aとしては、重要な保存的ホスファターゼ触媒残基：配列番号2（図1）のアミノ酸11でのアスパラギン酸（「D」）、配列番号2（図1）のアミノ酸40でのシステイン(「C」）および配列番号2（図1）のアミノ酸46でのアルギニン(「R」）を含む。BMY_HPP1の断片Bは、よりN-末端断片であり、このものはいずれの触媒残基を含むとは予想されていない。該予想全長BMY_HPP1ポリペプチドについての予想保存的ホスファターゼ触媒残基は以下の通りである：配列番号150（図20A-D）のアミノ酸14でのアスパラギン酸（「D」）、配列番号150（図20A-D）のアミノ酸42でのシステイン（「C」）および配列番号150（図20A-D）でのアミノ酸48でのアルギニン（「R」）を挙げられる。
【０１４８】
BMY_HPP1ポリペプチド断片および他のホスファターゼタンパク質を有する予想全長ポリペプチドのアラインメントは、保存されたホスファターゼ触媒残基を示す（図6A〜D）。
【０１４９】
ホスファターゼタンパク質の要素に対する強い相同性に基づいて、本発明のヒトBMY_HPP1ホスファターゼがコードするポリペプチドは、ホスファターゼタンパク質、好ましくは新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼの要素、特に好ましくは本明細書に記載する新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼとの少なくともある生物学的活性を有することが予想される。
【０１５０】
本発明は、ホスファターゼ関連障害（これは、糖尿病などの代謝性障害、加えて神経および／または心血管の疾患および障害を含むが、これらに限定されない）の治療、検出、軽減または予防のための、BMY_HPP1インビターおよび／またはBMY_HPP1活性のアクチベーターの使用を包含する。本発明はまた、BMY_HPP1インヒビターおよび／またはBMY_HPP1活性のアクチベーターの免疫抑制薬、抗炎症薬および／または抗腫瘍薬としての使用をも包含する。
【０１５１】
本発明は、キナーゼ活性が十分でない疾患を診断し、予後し、治療し、軽減しおよび／または予防するための治療学的なレジメにおける、BMY_HPP1ホスファターゼインヒビター（これは、アンチセンス核酸などの拮抗薬を含む）、加えて本明細書に記載する他の拮抗薬の使用を包含する。不十分なキナーゼ活性が原因で起こり得る疾患の限定されない１例はあるタイプの糖尿病であり、これはインシュリン受容体シグナル経路に関与する１つ以上のキナーゼが例えば、不十分な活性または不十分な発現を有し得る。
【０１５２】
その上、キナーゼ活性が過度に高い疾患および／または障害（例えば、キナーゼオンコジーン産物が過剰な活性および過剰な発現を有する癌）の診断、予後、治療、軽減および／または予防のための本明細書に記載の遺伝子治療学的レジメにおける、BMY_HPP1ホスファターゼアクチベーターの使用またはBMY_HPP1ホスファターゼ遺伝子もしくはタンパク質の使用を包含する。
【０１５３】
本発明はまた、BMY_HPP1タンパク質の触媒的に不活性な変異体（これは、その断片を含む）の使用（例えば、タンパク質療法）、または例えばホスファターゼ活性が過度に高い疾患および／または障害の診断、予後、軽減および／または予防における該コードするポリヌクレオチド配列の使用（例えば、遺伝子療法）をも含む。
【０１５４】
本発明はまた、診断における該BMY_HPP1ポリペプチド（これは、その断片および／または変異体を含む）に関する抗体の使用（例えば、生物マーカーおよび／または治療薬として）をも包含する。
【０１５５】
本発明は、細胞リンタンパク質またはリンペプチドのライブラリーと結合する基質トラップ(trapping)変異体としての該BMY_HPP1ホスファターゼの不活性な非触媒的変異体を使用して、該BMY_HPP1ポリペプチドの基質を同定することを包含する。
【０１５６】
本発明は、インビトロまたは「仮想的」（コンピューター）でのスクリーニング法を用いて、BMY_HPP1ホスファターゼ活のインヒビターまたはアクチベーターを同定するために、該BMY_HPP1ポリペプチドの使用を包含する。
【０１５７】
本発明の１態様は、該BMY_HPP1ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法は以下の工程を含む：i）分析的に検出可能な試薬を用いて標識化したBMY_HPP1ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターを、該インヒビターまたはアクチベーターとの複合体を形成するのに十分な条件で、該BMY_HPP1ホスファターゼと接触させ；ii）該複合体と同定する化合物を含有する試料とを接触させ；および、iii）該被験化合物が該複合体中の標識化された公知のBMY_HPP1ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターの量を改変する能力を検出することによって、インヒビターまたはアクチバーターとしての化合物を同定することを含む。
【０１５８】
本発明の別の態様は、BMY_HPP1ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法はi）該BMY_HPP1ホスファターゼと同定する化合物とを接触させ；およびii）該基質からホスファターゼを取り出す該BMY_HPP1ホスファターゼの能力を測定する工程を含む。
【０１５９】
本発明はまた、該BMY_HPP1ホスファターゼについてのリガンドを同定する方法をも包含し、該方法はi）結合が可能な条件で、該BMY_HPP1ホスファターゼを化合物群と接触させ；およびii）いずれかのリガンドと結合したタンパク質の存在を検出する工程を含む。
【０１６０】
上記の方法は、全細胞、サイトゾルの細胞画分、膜細胞画分、精製されたまたは部分的に精製された形態からなる群から選ばれる形態の該BMY_HPP1ホスファターゼを含むことが好ましい。本発明はまた、精製された、実質的に精製されたまたは精製されたいない状態での組換え的に発現したBMY_HPP1ホスファターゼにも関する。本発明は更に、当該分野で知られたりまたは本明細書中に記載するタンパク質、ペプチドまたは他の分子と融合したりまたは接合したBMY_HPP1ホスファターゼに関する。
【０１６１】
本発明はまた、上記の方法で同定された化合物および医薬的に許容し得る担体を含有する該BMY_HPP1ホスファターゼポリペプチドの医薬組成物をも包含する。
【０１６２】
該BMY_HPP1ポリペプチドをコードする定常状態のmRNAレベルを測定するために設計した発現プロファイリングは、精巣において有意に高い発現レベルを；脊髄において有意な程度を；膵臓、脳、下垂体、心臓および肺においてより低い程度で示した（図22に示す）。
【０１６３】
その上、該BMY_HPP1ポリペプチドの正常な組織における別の発現プロファイリングは、いくつかの小領域および他の中枢神経系組織（特に、脳の尾錠状核、海馬および側坐核）において強い発現を示した（図26に示す）。これらの領域は、いくつかの神経学的な障害（例えば、うつ病、双極性障害、精神分裂病、痴呆、認知障害および肥満症）に関与することが知られる。このデータは、神経性障害の処置における、BMY_HPP1活性のモジュレーターの役割を示唆する。加えて、BMY_HPP1は副腎、松果体および脳下垂体において（これは、内分泌性障害の処置におけるBMY_HPP1活性モジュレーターについての役割を示唆する）；心臓の心房において（これは、心不全または心臓の他の疾患の処置におけるBMY_HPP1活性モジュレーターの役割を示唆する）；および精巣において（これは、欠陥のあるかまたは不十分な精子形成が原因の男性不妊症の処置における（例えば、避妊薬）または精巣癌の処置におけるBMY_HPP1活性モジュレーターの役割を示唆する）、強く発現する。加えて、BMY_HPP1は同様にいくつかの組織にわたってより低いレベルで発現した。
【０１６４】
精巣組織において優勢に存在する発現と合わせて、二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、精巣障害、加えて生殖障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのにBMY_HPP1ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての潜在的な有用性を強調する。
【０１６５】
好ましい態様において、BMY_HPP1ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、その作動薬および断片を含む）は、精巣の障害または疾患：精子形成、不妊症、クラインフェルター症候群、XX男性、精巣上体炎、生殖器(genital)こぶ、性腺形成細胞不全症、睾丸停留、精索静脈瘤、線毛不動症候群およびウイルス性睾丸炎（これらに限定されない）を治療し、診断し、予後しおよび／または予防することを含む使用を有する。該BMY_HPP1ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの作動薬および断片を含む）はまた、精巣の発生、胚発生、生殖を調整するのに関する使用、並びに精巣増殖性障害（例えば、絨毛癌、非セミノーム性、セミノームおよび精巣胚細胞腫瘍を含む癌）を軽減し、治療しおよび／または予防する際の使用をも有する。
【０１６６】
同様に、精巣組織に優先して存在する発現はまた、代謝性疾患および障害を治療し、診断し、予後し、および／または予防するのにBMY_HPP1ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの潜在的な有用性を強調する。該疾患としては、例えば早発性早熟(premature puberty)、不完全早熟(incomplete puberty)、カルマン症候群、クッシング症候群、高プロラクチン血症、血色素症、先天性副腎過形成、FSH欠乏症および肉芽腫症を含むが、これらに限定されない。
【０１６７】
この遺伝子産物はまた、結合性薬物（例えば、男性避妊薬として有用である薬物（拮抗薬））を同定するために設計されたアッセイにおいても有用であり得る。精巣はまた、身体の他の組織において特に低レベルで発現する転写物の活性な遺伝子発現の部位でもある。従って、この遺伝子産物は、他のプロセス（例えば、いわゆるいくつかのあり得る標的適応症を挙げると、造血、炎症、骨形成および腎臓機能）において関連する機能的な役割を果たし得る他の特異的な組織または器官において発現し得る。
【０１６８】
骨髄、脳小領域および他の中枢神経系組織における局在化した発現と合わせて、二重特異性ホスファターゼタンパク質に対する強い相同性は、BMY_HHPP1ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが神経変性疾患状態、行動障害または炎症性病気を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。代表的な使用は、以下の「再生」および「過剰増殖性障害」の項目、実施例および本明細書の他所に記載する。要するに、該使用としては例えば、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、ハンチントン舞踏病、ツーレット症候群、髄膜炎、脳炎、脱髄性疾患、末梢性ニューロパチー、異常増殖、トラウマ、先天性奇形、脊椎損傷、虚血および梗塞、動脈瘤、出血、精神分裂病、躁病、痴呆、妄想症、強迫性障害、うつ病、パニック障害、学習障害、ALS、精神病、自閉症および改変行動(altered behavior)（これは、摂食、睡眠パターン、バランスおよび近くにおける障害を含む）の検出、治療および／または予防を含むが、これらに限定されない。加えて、脳の領域におけるこの遺伝子産物の発現の増大は、それが正常な神経機能の役割を果たしていることを示す。潜在的に、この遺伝子産物はシナップス形成、神経伝達、学習、認知、ホメオスタシスまたは神経分化または生存に関与する。更に、該タンパク質はまた、生物学的活性を測定するのに、腫瘍マーカーとしての抗体を産生するのに、同族リガンドまたは受容体を単離するのに、それらの相互作用をモジュレートする薬物を同定するのに、加えて栄養上のサプリメントとして使用するのに使用することができる。タンパク質、並びに該タンパク質に対する抗体は、上記の組織についての腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的としての有用性を示し得る。
【０１６９】
該BMY_HPP1ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）に従って、１つのグリコシル化部位を含むことが分かった。本明細書においてより具体的に記載する通り、タンパク質グリコシル化は、様々な機能：タンパク質フォールディングの増強、タンパク質凝集の抑制、細胞小器官への細胞内輸送の調節、タンパク質分解に対する耐性の増大、タンパク質抗原性の調節、および細胞間接着の媒介を保存すると考えられている。
【０１７０】
アスパラギングリコシル化部位は、共通パターン：N-{P}-[ST]-{P}（式中、Nはグリルコシル化部位である）を有する。しかしながら、潜在的なN-グリコシル化部位は共通配列Asn-Xaa-Ser/Thrに対して特異的であることがよく知られる。しかしながら、該共通トリペプチドの存在は、タンパク質のフォールディングがN-グリコシル化の調節に重要な役割を果たしている事実により、アスパラギン残基がグリコシル化されると結論づけるには十分ではない。AsnおよびSer/Thrの間のプロリンの存在は、N-グリコシル化を抑制するであろうことが分かった。このことは、グリコシル化部位の最近の統計学的な分析によって確認されており、これによりSer/ThrヘのプロリンC-末端を有する部位の約50％がグリコシル化されないことをも示す。アスパラギングリコシル化に関する別の情報は、以下の刊行物：Marshall R. D.によるAnnu. Rev. Biochem. 41: 673-702 (1972); Pless D. D., Lennarz W. J.によるProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 134 138 (1977); Bause E.によるBiochem. J. 209: 331-336 (1983) ; Gavel Y., von Heijne G.によるProtein Eng. 3: 433-442 (1990)；およびMiletich J. P., Broze G. J. Jr.によるJ. Biol. Chem. 265: 11397-11404 (1990)（これらは、本明細書の一部を構成する）で知ることができる。
【０１７１】
好ましい態様において、アスパラギングリコシル化部位ポリペプチド：LTPLRNISCCDPKA（配列番号158）を本発明に包含する。このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本明細書の他所に記載する免疫原性および／または抗原性エピトープとしてのこのBMY_HPP1アスパラギングリコシル化部位ポリペプチドの使用をも包含する。
【０１７２】
本発明のBMY_HPP1ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）に基づいていくつかのリン酸化部位を含むことが分かった。それらの部位のリン酸化は、BMY_HPP1ポリペプチドのいくつかの生物学的活性を調節し得る。例えば、特定の部位でのリン酸化は、他の分子（例えば、タンパク質、リガンド、基質、DNAなど）と会合したりまたは結合するタンパク質の能力を調節するのに関与し得る。この場合に、リン酸化は他のカリウムチャンネルアルファサブユニット、ベータサブユニットと会合するBMY_HPP1の能力、またはカリウムチャンネル機能を調節するその能力を調整し得る。
【０１７３】
BMY_HPP1ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）を用いて、４個のPKCリン酸化部位を含むことが予想された。インビボにおいて、タンパク質キナーゼCはセリンまたはトレオニン残基のリン酸化について優位性を示す。該PKCリン酸化部位は、共通パターン：[ST]-x-[RK]（式中、SまたはTはリン酸化の部位であり、そして「X」が介在アミノ酸残基である）を有する。PKCリン酸化部位に関する別の情報は、Woodget J. R., Gould K. L., Hunter T.によるEur. J. Biochem. 161: 177-184 (1986)、およびKishimoto A., Nishiyama K., Nakanishi H., Uratsuji Y., Nomura H., Takeyama Y., Nishizuka Y.によるJ. Biol. Chem.260: 12492-12499 (1985)（これらは、本明細書の一部を構成する）で知ることができる。
【０１７４】
好ましい態様において、以下のPKCリン酸化部位ポリペプチドを本発明に包含する：TLSFWSQKFGGLE（配列番号159）、VQNSRTPRSPLDC（配列番号160）、PLDCGSSKAQFLV（配列番号161）および／またはPTVYNTKKIFKHT（配列番号162）。 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所で記載するこれらBMY_HPP1 PKCリン酸化部位ポリペプチドの免疫原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１７５】
新規なヒトホスファターゼポリペプチドを示すヒトBMY_HPP1ポリペプチドの更なる確認において、該BMY_HPP1ポリペプチドがモチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）に従って、チロシン特異的タンパク質ホスファターゼ活性部位ドメインを含むことが分かった。
【０１７６】
チロシン特異的タンパク質ホスファターゼ(EC 3.1.3.48)(PTPase)は、チロシン残基に結合したホスフェート基の除去を触媒する酵素である。これらの酵素は、細胞の成長、増殖、分化および形質転換の制御において非常に重要である。PTPアーゼの多数の形態が確認されており、このものは２つの範疇：可溶性PTAアーゼおよびPTAアーゼドメインを含む膜貫通受容体タンパク質に分類することができる。
【０１７７】
最新の公知のPTPアーゼを、以下に示す：可溶性PTPアーゼPTPN1 (PTP-1B)、PTPN2 (T-細胞PTPアーゼ; TC-PTP)、PTPN3 (H1)およびPTPN4 (MEG)（これらは、N-末端バンド4.1様ドメインを含み、更に膜と細胞骨格との間の接合部で作用する）、PTPN5 (STEP)、PTPN6 (PTP-1C ; HCP; SHP)およびPTPN11 (PTP-2C ; SH-PTP3; Syp)（これらは、そのN-末端きわみ(extremity)でSH-2ドメインの２コピーを含む酵素)（例えば、ショウジョウバエタンパク質コルクスルー(corkscrew)(遺伝子csw)もまた本サブグループに属する）、PTPN7 (LC-PTP；造血性タンパク質チロシンホスファターゼ; HePTP)、PTPN8 (70Z-PEP)、PTPN9 (MEG2)、PTPN12 (PTP Gl ; PTP-P19)、酵母PTP1、酵母PTP2（これは、ユビキチン媒介性タンパク質分解経路に関与し得る）、分裂酵母pyplおよびpyp2（これは、有志分裂の開始を抑制する際に機能する）、分裂酵母pyp3（これは、cdc2の脱リン酸化に寄与する）、酵母CDC14（これは、染色体分離に関与し得る）、エルシニア病原性プラスミドPTPアーゼ（遺伝子yopH）、オートグラファ(Autographa)カリフォルニア核多面性ウイルス症(nuclear pohyhedrosis virus)19Kd PTPアーゼ、二重特異性PTPアーゼ、DUSP1 (PTPN10; MAPキナーゼホスファターゼ-1 ; MKP-1)（これは、Thr-183およびTyr-185でMAPキナーゼを脱リン酸化する）、DUSP2 (PAC-1)（これは、ThrおよびTyr残基上でのMAPキナーゼERK1およびERK2を脱リン酸化する核酵素）、DUSP3 (VHR)、DUSP4 (HVH2)、DUSP5 (HVH3)、DUSP6 (Pystl ; MKP-3)、DUSP7 (Pyst2; MKP-X)、酵母MSG5（MAPキナーゼFUS3を脱リン酸化するPTPアーゼ）、酵母YVH1、ワクシニアウイルスH1 PTPアーゼ−二重特異性ホスファターゼ。
【０１７８】
構造的に、全ての公知の受容体PTPアーゼは、可変長細胞外ドメイン、続いて膜貫通領域およびC-末端触媒細胞質ドメインから構成される。該受容体PTPアーゼのいくつかは、それらの細胞外領域中に、フィブロネクチンII型（FN-III)反復、免疫グロブリン様ドメイン、MAMドメインまたは脱炭酸酵素様ドメインを含む。 該細胞質領域は通常、PTPアーゼドメインの２コピーを含む。１つ目は酵素活性を有すると考えられ、２つ目は不活性であるが、該１つ目の基質活性に影響を及ぼすと考えられる。これらのドメインにおいて、該触媒システインは通常保存的であるが、いくつかの他のものは恐らく重要であろうが、保存的ではない。
【０１７９】
チロシンホスファターゼ(PTPase)は、約300個のアミノ酸からなる。２個の保存されたシステインが存在し、その２番目のものは活性に絶対に必要であることが分かった。更に、直ぐ近傍のいくつかの保存残基もまた重要であることが分かった。
【０１８０】
チロシン特異的タンパク質ホスファターゼについての共通配列は、以下：
[LIVMF]-H-C-x(2)-G-x(3)-[STC]-[STAGP]-x-[LIVMFY]
（式中、Cは活性部位残基であり、そして「X」はいずれかのアミノ酸である）
の通り、提示される。
【０１８１】
チロシン特異的タンパク質ホスファターゼドメインおよびタンパク質に関する別の情報は、以下の刊行物：Fischer E. H., Charbonneau H., Tonks N. K., Science 253: 401-406 (1991); Charbonneau H., Tonks N. K.によるAnnu. Rev. Cell Biol. 8: 463-493 (1992); Trowbridge I. S.によるJ. Biol. Chem. 266: 23517-23520 (1991); Tonks N. K., Charbonneau H.によるTrends Biochem. Sci. 14: 497-500 (1989)；およびHunter T.によるCell 58: 1013-1016 (1989)（これらは、本明細書の一部を構成する）を参照して知ることができる。
【０１８２】
好ましい態様において、以下のチロシン特異的タンパク質ホスファターゼ活性部位ドメインポリペプチドQEGKVIHCHAGLGRTGVLIAYLV（配列番号163）を、本発明に包含する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも提供する。本発明はまた、このチロシン特異的タンパク質ホスファターゼ活性部位ドメインポリペプチドの本明細書の他所に記載する免役学的なおよび／または抗原的なエピトープとしての使用をも包含する。
【０１８３】
好ましい態様において、以下のN-末端BMY_HPP1欠失ポリペプチドを本発明に包含する。
配列番号150のM1-L607、E2-L607、A3-L607、G4-L607、I5-L607、Y6-L607、F7-L607、Y8-L607、N9-L607、F10-L607、Gll-L607、W12-L607、K13-L607、D14-L607、Y15-L607、G16-L607、V17-L607、A18-L607、Sl9-L607、L20-L607、T21-L607、T22-L607、I23-L607、L24-L607、D25-L607、M26-L607、V27-L607、K28-L607、V29-L607、M30-L607、T31-L607、F32-L607、A33-L607、L34-L607、Q35-L607、E36-L607、G37-L607、K38-L607、V39-L607、A40-L607、I41-L607、H42-L607、C43-L607、H44-L607、A45-L607、G46-L607、L47-L607、G48-L607、R49-L607、T50-L607、G51-L607、V52-L607、L53-L607、154-L607、A55-L607、C56-L607、Y57-L607、L58-L607、V59-L607、F60-L607、A61-L607、T62-L607、R63-L607、M64-L607、T65-L607、A66-L607、D67-L607、Q68-L607、A69-L607、I70-L607、I71-L607、F72-L607、V73-L607、R74-L607、A75-L607、K76-L607、R77-L607、P78-L607、N79-L607、S80-L607、I81-L607、Q82-L607、T83-L607、R84-L607、G85-L607、Q86-L607、L87-L607、L88-L607、C89-L607、V90-L607、R91-L607、E92-L607、F93-L607、T94-L607、Q95-L607、F96-L607、L97-L607、T98-L607、P99-L607、L100-L607、R101-L607、N102-L607、I103-L607、F104-L607、S105-L607、C106-L607、C107-L607、D108-L607、P109-L607、K110-L607、A111-L607、H112-L607、A113-L607、V114-L607、T115-L607、L116-L607、P117-L607、Q118-L607、Y119-L607、L120-L607、I121-L607、R122-L607、Q123-L607、R124-L607、H125-L607、L126-L607、L127-L607、H128-L607、G129-L607、Y130-L607、E131-L607、A132-L607、R133-L607、L134-L607、L135-L607、K136-L607、H137-L607、V138-L607、P139-L607、K140-L607、I141-L607、I142-L607、H143-L607、L144-L607、V145-L607、C146-L607、K147-L607、L148-L607、L149-L607、L150-L607、D151-L607、L152-L607、A153-L607、E154-L607、N155-L607、R156-L607、P157-L607、V158-L607、M159-L607、M160-L607、K161-L607、D162-L607、V163-L607、S164-L607、E165-L607、G166-L607、P167-L607、G168-L607、L169-L607、S170-L607、A171-L607、E172-L607、I173-L607、E174-L607、K175-L607、T176-L607、M177-L607、S178-L607、E179-L607、M180-L607、V181-L607、T182-L607、M183-L607、Q184-L607、L185-L607、D186-L607、K187-L607、E188-L607、L189-L607、L190-L607、R191-L607、H192-L607、D193-L607、S194-L607、D195-L607、V196-L607、S197-L607、N198-L607、P199-L607、P200-L607、N201-L607、P202-L607、T203-L607、A204-L607、V205-L607、A206-L607、A207-L607、D208-L607、F209-L607、D210-L607、N211-L607、R212-L607、G213-L607、M214-L607、I215-L607、F216-L607、S217-L607、N218-L607、E219-L607、Q220-L607、Q221-L607、F222-L607、D223-L607、P224-L607、L225-L607、W226-L607、K227-L607、R228-L607、R229-L607、N230-L607、V231-L607、E232-L607、C233-L607、L234-L607、Q235-L607、P236-L607、L237-L607、T238-L607、H239-L607、L240-L607、K241-L607、R242-L607、R243-L607、L244-L607、S245-L607、Y246-L607、S247-L607、D248-L607、S249-L607、D250-L607、L251-L607、K252-L607、R253-L607、A254-L607、E255-L607、N256-L607、L257-L607、L258-L607、E259-L607、Q260-L607、G261-L607、E262-L607、T263-L607、P264-L607、Q265-L607、T266-L607、V267-L607、P268-L607、A269-L607、Q270-L607、I271-L607、L272-L607、V273-L607、G274-L607、H275-L607、K276-L607、P277-L607、R278-L607、Q279-L607、Q280-L607、K281-L607、L282-L607、I283-L607、S284-L607、H285-L607、C286-L607、Y287-L607、I288-L607、P289-L607、Q290-L607、S291-L607、P292-L607、E293-L607、P294-L607、D295-L607、L296-L607、H297-L607、K298-L607、E299-L607、A300-L607、L301-L607、V302-L607、R303-L607、S304-L607、T305-L607、L306-L607、S307-L607、F308-L607、W309-L607、S310-L607、Q311-L607、S312-L607、K313-L607、F314-L607、G315-L607、G316-L607、L317-L607、E318-L607、G319-L607、L320-L607、K321-L607、D322-L607、N323-L607、G324-L607、S325-L607、P326-L607、I327-L607、F328-L607、H329-L607、G330-L607、R331-L607、I332-L607、I333-L607、P334-L607、K335-L607、E336-L607、A337-L607、Q338-L607、Q339-L607、S340-L607、G341-L607、A342-L607、F343-L607、S344-L607、A345-L607、D346-L607、V347-L607、S348-L607、G349-L607、S350-L607、H351-L607、S352-L607、P353-L607、G354-L607、E355-L607、P356-L607、V357-L607、S358-L607、P359-L607、S360-L607、F361-L607、A362-L607、N363-L607、V364-L607、H365-L607、K366-L607、D367-L607、P368-L607、N369-L607、P370-L607、A371-L607、H372-L607、Q373-L607、Q374-L607、V375-L607、S376-L607、H377-L607、C378-L607、Q379-L607、C380-L607、K381-L607、T382-L607、H383-L607、G384-L607、V385-L607、G386-L607、S387-L607、P388-L607、G389-L607、S390-L607、V391-L607、R392-L607、Q393-L607、N394-L607、S395-L607、R396-L607、T397-L607、P398-L607、R399-L607、S400-L607、P401-L607、L402-L607、D403-L607、C404-L607、G405-L607、S406-L607、S407-L607、P408-L607、K409-L607、A410-L607、Q411-L607、F412-L607、L413-L607、V414-L607、E415-L607、H416-L607、E417-L607、T418-L607、Q419-L607、D420-L607、S421-L607、K422-L607、D423-L607、L424-L607、S425-L607、E426-L607、A427-L607、A428-L607、S429-L607、H430-L607、S431-L607、A432-L607、L433-L607、Q434-L607、S435-L607、E436-L607、L437-L607、S438-L607、A439-L607、E440-L607、A441-L607、R442-L607、R443-L607、I444-L607、L445-L607、A446-L607、A447-L607、K448-L607、A449-L607、L450-L607、A451-L607、N452-L607、L453-L607、N454-L607、E455-L607、S456-L607、V457-L607、E458-L607、K459-L607、E460-L607、E461-L607、L462-L607、K463-L607、R464-L607、K465-L607、V466-L607、E467-L607、M468-L607、W469-L607、Q470-L607、K471-L607、E472-L607、L473-L607、N474-L607、S475-L607、R476-L607、D477-L607、G478-L607、A479-L607、W480-L607、E481-L607、R482-L607、I483-L607、C484-L607、G485-L607、E486-L607、R487-L607、D488-L607、P489-L607、F490-L607、I491-L607、L492-L607、C493-L607、S494-L607、L495-L607、M496-L607、W497-L607、S498-L607、W499-L607、V500-L607、E501-L607、Q502-L607、L503-L607、K504-L607、E505-L607、P506-L607、V507-L607、I508-L607、T509-L607、K510-L607、E511-L607、D512-L607、V513-L607、D514-L607、M515-L607、L516-L607、V517-L607、D518-L607、R519-L607、R520-L607、A521-L607、D522-L607、A523-L607、A524-L607、E525-L607、A526-L607、L527-L607、F528-L607、L529-L607、L530-L607、E531-L607、K532-L607、G533-L607、Q534-L607、H535-L607、Q536-L607、T537-L607、I538-L607、L539-L607、C540-L607、V541-L607、L542-L607、H543-L607、C544-L607、I545-L607、V546-L607、N547-L607、L548-L607、Q549-L607、T550-L607、I551-L607、P552-L607、V553-L607、D554-L607、V555-L607、E556-L607、E557-L607、A558-L607、F559-L607、L560-L607、A561-L607、H562-L607、A563-L607、I564-L607、K565-L607、A566-L607、F567-L607、T568-L607、K569-L607、V570-L607、N571-L607、F572-L607、D573-L607、S574-L607、E575-L607、N576-L607、G577-L607、P578-L607、T579-L607、V580-L607、Y581-L607、N582-L607、T583-L607、L584-L607、K585-L607、K586-L607、I587-L607、F588-L607、K589-L607、H590-L607、T591-L607、L592-L607、E593-L607、E594-L607、K595-L607、R596-L607、K597-L607、M598-L607、T599-L607、K600-L607および／またはD601-L607。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチド配列をも提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらのＮ−末端BMY_HPP1欠失ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１８４】
好ましい態様において、以下のC-末端BMY_HPP1欠失ポリペプチドを本発明に包含する。配列番号150のM1-L607, M1-G606, M1-P605, M1-K604, Ml-P603, M1-G602, M1-D601, M1-K600, M1-T599, M1-M598, M1-K597, M1-R596, M1-K595, M1-E594, M1-E593, M1-L592, M1-T591, M1-H590, M1-K589, M1-F588, Ml-1587, M1-K586, M1-K585, M1-L584, M1-T583, M1-N582, M1-Y581, M1-V580, M1-T579, M1-P578, M1-G577, M1-N576, M1-E575, M1-S574, M1-D573, M1-F572, M1-N571, M1-V570, M1-K569, M1-T568, M1-F567, M1-A566, M1-K565, Ml-1564, M1-A563, M1-H562, M1-A561, M1-L560, M1-F559, M1-A558, M1-E557, M1-E556, M1-V555, M1-D554, M1-V553, M1-P552, M1-I551, M1-T550, M1-Q549, M1-L548, M1-N547, M1-V546, M1-I545, M1-C544, M1-H543, M1-L542, M1-V541, M1-C540, M1-L539, Ml-1538, M1-T537, M1-Q536, M1-H535, M1-Q534, M1-G533, M1-K532, M1-E531, M1-L530, M1-L529, M1-F528, M1-L527, M1-A526, M1-E525, M1-A524, M1-A523, M1-D522, M1-A521, M1-R520, M1-R519, M1-D518, M1-V517, M1-L516, M1-M515, M1-D514, M1-V513, M1-D512, M1-E511, M1-K510, M1-T509, MI-1508, M1-V507, M1-P506, M1-E505, M1-K504, M1-L503, M1-Q502, M1-E501, M1-V500, M1-W499, M1-S498, M1-W497, M1-M496, M1-L495, M1-S494, M1-C493, M1-L492, Ml-1491, M1-F490, M1-P489, M1-D488, M1-R487, M1-E486, M1-G485, M1-C484, M1-I483, M1-R482, M1-E481, M1-W480, M1-A479, M1-G478, M1-D477, Ml-R476, M1-S475, M1-N474, M1-L473, M1-E472, M1-K471, M1-Q470, M1-W469, M1-M468, M1-E467, M1-V466, M1-K465, M1-R464, M1-K463, M1-L462, M1-E461, M1-E460, M1-K459, M1-E458, M1-V457, M1-S456, M1-E455, M1-N454, M1-L453, M1-N452, M1-A451, M1-L450, M1-A449, M1-K448, M1-A447, M1-A446, M1-L445, M1-I444, M1-R443, M1-R442, M1-A441, M1-E440, M1-A439, M1-S438, M1-L437, M1-E436, M1-S435, M1-Q434, M1-L433, M1-A432, M1-S431, M1-H430, M1-S429, M1-A428, M1-A427, M1-E426, M1-S425, M1-L424, Ml-D423, M1-K422, M1-S421, M1-D420, M1-Q419, M1-T418, M1-E417, M1-H416, M1-E415, M1-V414, M1-L413, M1-F412, M1-Q411, M1-A410, M1-K409, M1-P408, M1-S407, M1-S406, M1-G405, M1-C404, M1-D403, M1-L402, M1-P401, M1-S400, M1-R399, M1-P398, M1-T397, M1-R396, M1-S395, M1-N394, M1-Q393, M1-R392, M1-V391, M1-S390, M1-G389, M1-P388, M1-S387, M1-G386, M1-V385, M1-G384, M1-H383, M1-T382, M1-K381, M1-C380, M1-Q379, M1-C378, M1-H377, M1-S376, M1-V375, M1-Q374, M1-Q373, M1-H372, M1-A371, M1-P370, M1-N369, M1-P368, M1-D367, M1-K366, M1-H365, M1-V364, M1-N363, M1-A362, M1-F361, M1-S360, M1-P359, M1-S358, M1-V357, M1-P356, M1-E355, M1-G354, M1-P353, M1-S352, M1-H351, M1-S350, M1-G349, M1-S348, M1-V347, M1-D346, M1-A345, M1-S344, M1-F343, M1-A342, M1-G341, M1-S340, M1-Q339, M1-Q338, M1-A337, M1-E336, M1-K335, M1-P334, M1-I333, M1-I332, M1-R331, M1-G330, M1-H329, M1-F328, M1-I327, M1-P326, M1-S325, M1-G324, M1-N323, M1-D322, M1-K321, M1-L320, M1-G319, M1-E318, M1-L317, M1-G316, M1-G315, M1-F314, M1-K313, M1-S312, M1-Q311, M1-S310, M1-W309, M1-F308, M1-S307, M1-L306, M1-T305, M1-S304, M1-R303, M1-V302, M1-L301, M1-A300, M1-E299, M1-K298, M1-H297, M1-L296, M1-D295, M1-P294, M1-E293, M1-P292, M1-S291, M1-Q290, M1-P289, Ml-1288, M1-Y287, M1-C286, M1-H285, M1-S284, M1-I283, M1-L282, M1-K281, M1-Q280, M1-Q279, M1-R278, M1-P277, M1-K276, M1-H275, M1-G274, M1-V273, M1-L272, M1-I271, M1-Q270, M1-A269, M1-P268, M1-V267, M1-T266, M1-Q265, M1-P264, M1-T263, M1-E262, M1-G261, M1-Q260, M1-E259, M1-L258, M1-L257, M1-N256, M1-E255, M1-A254, M1-R253, M1-K252, M1-L251, M1-D250, M1-S249, M1-D248, M1-S247, M1-Y246, M1-S245, M1-L244, M1-R243, M1-R242, M1-K241, M1-L240, M1-H239, M1-T238, M1-L237, M1-P236, M1-Q235, M1-L234, M1-C233, M1-E232, M1-V231, M1-N230, M1-R229, M1-R228, M1-K227, M1-W226, Ml-L225, M1-P224, M1-D223, M1-F222, M1-Q221, M1-Q220, M1-E219, M1-N218, M1-S217, M1-F216, M1-I215, M1-M214, M1-G213, M1-R212, M1-N211, M1-D210, M1-F209, M1-D208, M1-A207, M1-A206, M1-V205, M1-A204, M1-T203, M1-P202, M1-N201, M1-P200, M1-P199, M1-N198, M1-S197, M1-V196, M1-D195, M1-S196, M1-D193, M1-H192, M1-R191, M1-L190, M1-L189, M1-E188, M1-K187, M1-D186, M1-L185, M1-Q184, M1-M183, M1-T183, M1-V181, M1-M180, M1-E179, M1-S178, M1-M177, M1-T176, M1-K175, M1-E174, M1-I173, M1-E172, M1-A171, Ml-S170, M1-L169, M1-G168, M1-P167, M1-G166, M1-E165, M1-S164, M1-V163, M1-D162, M1-K161, M1-M160, M1-M159, M1-V158, M1-P157, M1-R156, M1-N155, M1-E154, M1-A153, M1-L152, M1-D151, Ml-L150, M1-L149, M1-L148, M1-K147, M1-C146, M1-V145, M1-L144, M1-H143, M1-I142, Ml-1141, M1-K140, M1-P139, M1-V138, M1-H137, M1-K136, M1-L135, M1-L134, M1-R133, M1-A132, M1-E131, M1-Y130, M1-G129, M1-H128, Ml-L127, M1-L126, M1-H125, M1-R124, M1-Q123, M1-R122, Ml-1121, M1-L120, M1-Y119, M1-Q118, M1-P117, Ml-L116, M1-T115, M1-V114, M1-A113, M1-H112, M1-Alll, M1-K110, M1-P109, M1-D108, M1-C107, M1-C106, M1-S105, M1-F104, Ml-1103, M1-N102, M1-R101, M1-L100, M1-P99, M1-T98, M1-L97, M1-F96, M1-Q95, Ml-T94, M1-F93, M1-E92, M1-R91, M1-V90, M1-C89, M1-L88, M1-L87, M1-Q86, M1-G85, Ml-R84, M1-T83, M1-Q82, M1-I81, M1-S80, M1-N79, M1-P78, M1-R77, M1-K76, M1-A75, M1-R74, M1-V73, M1-F72, M1-I71, Ml-170, M1-A69, M1-Q68, M1-D67, M1-A66, M1-T65, M1-M64, M1-R63, M1-T62, M1-A61, M1-F60, M1-V59, M1-L58, M1-Y57, M1-C56, M1-A55, M1-I54, M1-L53, M1-V52, M1-G51, M1-T50, M1-R49, M1-G48, M1-L47, M1-G46, M1-A45, Ml-H44, M1-C43, M1-H42, M1-I41, M1-A40, M1-V39, M1-K38, M1-G37, M1-E36, M1-Q35, M1-L34, M1-A33, M1-F32, M1-T31, M1-M30, M1-V29, M1-K28, M1-V27, M1-M26, M1-D25, M1-L24, M1-I23, M1-T22, M1-T21, M1-L20, M1-S19, M1-A18, M1-V17, M1-G16, M1-Y15, M1-D14, M1-K13, M1-W12, M1-G11, M1-F10, M1-N9, M1-Y8および／またはM1-F7。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチド配列をも提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらのC-末端BMY_HPP1欠失ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１８５】
好ましい態様において、以下のポリペプチドを本発明に包含する：
MEAGIYFNFGWKDYGVASLTTIDMVKVMTFALQEGKVIHCHAGLGRTGVLI
AYLVFATRMTADQAIIVRAKRPNSIQTRGQLCVREFTQFLTPLRNISCCDPKA
HAVTLPQYIRQRHLLHGYEARLLHVPKIIHLVCKLLLDAENRPVMMKDVSEG
PLSAEIEKTMSEMVTMLDKELLRHDSDVSNPNPTAVAADFDNRGMISNEQQF
DPLWKRRNVCLQPLTHLKRRLSYSSDLKRAENLLEQGETQTVPAQILVGHKP
RQKLISHCYIPQSPEPDHKEALVRSTLSFWSQKFGGLEGLKDNGSPIHGRIIPKE
AQQSGAFADVSGSHSPGEPVSPFANVHKDPNPAHQQVHCQCKTHGVGSPGS
VQNSRTPRSPLDCGSSKAQFLVEHETQDSKDSEAASHSALQSELSAARRILAA
KALANLNEVEKEELKRKVEMWQKLNSRDGAWERICGERPFILCSLMWSWVE（配列番号153）。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドをも提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、このポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１８６】
好ましい態様において、以下のBMY_HPP1ホスファターゼ活性部位ドメインアミノ酸置換を本発明に包含する。ここで、配列番号150中、M1はA、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E2は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A3は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G4は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I5は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y6は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；F7は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N8は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F9は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G10は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Wl1は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはYのいずれかによって置換され；K12は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D13は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y14は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；G15は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V16は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；A17は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S18は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L19は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T20は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T21は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I22は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S, T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D23は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；M24は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V25は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；K26は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V27は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；M28は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T29は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F30は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A31は、C、D、E、F、G、H、I��K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L32は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Q33は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E34は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G35は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；K36は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V37は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；I38は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；H39は、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C40は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；H41は、A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, WまたはYのいずかによって置換され；A42は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G43は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L44は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G45は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R46は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T47は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G48は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V49は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；L50は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I51は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A52は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V, WまたはYのいずれかによって置換され；Y53は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；L54は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V55は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；F56は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；および／またはA57は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；加えて、それらのいずれかの組み合わせの置換を含む。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらのBMY_HPP1ホスファターゼ活性部位ドメインアミノ酸置換ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１８７】
好ましい態様において、以下のBMY_HPP1ホスファターゼ活性部位ドメイン保存アミノ酸置換を、本発明に包含する。配列番号150中、M1は、A、G、SまたはTのいずれかによって置換され；E2はDによって置換され；A3は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；G4は、A, M, SまたはTのいずれかによって置換され；I5は、A, VまたはLのいずれかによって置換され；Y6は、FまたはWのいずれかによって置換され；F7は、WまたはYのいずれかによって置換され；N8は、Qによって置換され；F9は、WまたはYのいずれかによって置換され；G10は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；Wl1は、FまたはYのいずれかによって置換され；K12は、RまたはHのいずれかによって置換され；D13は、Eによって置換され；Y14は、ＦまたはＷのいずれかによって置換され；G15は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；V16は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；A17は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；S18は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；L19は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；T20は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；T21は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；I22は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；D23は、Eによって置換され；M24は、A、G、SまたはTのいずれかによって置換され；V25は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；K26は、RまたはHのいずれかによって置換され；V27は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；M28は、A、G、SまたはTのいずれかによって置換され；T29は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；F30は、WまたはYのいずれかによって置換され；A31は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；L32は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；Q33は、Nによって置換され；E34は、Dによって置換され；G35は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；K36は、RまたはHのいずれかによって置換され；V37は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；I38は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；H39は、KまたはRのいずれかによって置換され；C40はCであり；H41は、KまたはRのいずれかによって置換され；A42は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；G43は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；L44は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；G45は、A、M、SまたはT;のいずれかによって置換され；R46は、KまたはHのいずれかによって置換され；T47は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；G48は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；V49は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；L50は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；I51は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；A52は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；Y53は、FまたはWのいずれかによって置換され；L54は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；V55は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；F56 は、WまたはYのいずれかによって置換され；および／またはA57は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され、加えてそれらのいずれかの組み合わせの置換を含む。BMY_HPP1ホスファターゼ活性部位ドメイン内の他の適当な置換は本発明によって包含され、このものは本明細書の他所に記載する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらのBMY_HPP1ホスファターゼ活性部位ドメイン保存アミノ酸置換ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１８８】
加えて、本発明はまた、BMY_HPP1ポリヌクレオチドの別に開始する出発コドン位置から得られるBMY_HPP1ポリペプチド（配列番号149）をも包含する。
【０１８９】
好ましい態様において、配列番号149のヌクレオチド31で始まる出発コドンから得られる以下のポリペプチドを本発明に包含する：
MQVQDATRRPSAVRFLSSFLQGRRHSTSDPVLRLQQARRGSGLGSGSATKLLSSSSLQVMVAV
SSVSHAEGNPTFPERKIUSTLERPTPKYTKVGERLRHVIPGHMACSMACGGRACKYENPARWSE
QEQAIKGVYSSWVTDNILAMARPSSELLEKYHIIDQFLSHGIKTIINLQRPGEHASCGNPLEQES
GFTYLPEAFMEAGIYFYNFGWKDYGVASLTTILDMVKVMTFALQEGKVAIHCHAGLGRTGVL
IACYLVFATRMTADQAIIFVRAKRPNSIQTRGQLLCVREFTQFLTPLRNIFSCCDPKAHAVTLPQ
YLIRQRHLLHGYEARLLKHVPKIIHLVCKLLLDLAENRPVMMKDVSEGPGLSAEIEKTMSEMV
TMQLDKELLRHDSDVSNPPNPTAVAADFDNRGMIFSNEQQFDPLWKRRNVECLQPLTHLKRR
LSYSDSDLKRAENLLEQGETPQTVPAQILVGHKPRQQKLISHCYIPQSPEPDLHKEALVRSTLSF
WSQSKFGGLEGLKDNGSPIFHGRIIPKEAQQSGAFSADVSGSHSPGEPVSPSFANVHKDPNPAH
QQVSHCQCKTHGVGSPGSVRQNSRTPRSPLDCGSSPKAQFLVEHETQDSKDLSEAASHSALQS
ELSAEARRILAAKALANLNESVEKEELKRKVEMWQKELNSRDGAWERICGERDPFILCSLMW
SWVEQLKEPVITKEDVDMLVDRRADAAEALFLLEKGQHQTILCVLHCIVNLQTIPVDVEEAFL
AHAIKAFTKVNFDSENGPTVYNTLKKIFKHTLEEKRKMTKDGPKPGL（配列番号175）。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドをも提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、このポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１９０】
好ましい態様において、配列番号149のヌクレオチド208で始まる出発コドンから得られる以下のポリペプチドを、本発明に包含する：
MVAVSSVSHAEGNPTFPERKRNLERPTPKYTKVGERLRHVIPGHMACSMACG
GRACKYENPARWSEQEQAIKGVYSSWVTDNILAMARPSSELLEKYHIIDQFLS
HGIKTIINLQRPGEHASCGNPLEQESGFTYLPEAFMEAGIYFYNFGWKDYGVA
SLTTILDMVKVMTFALQEGKVAIHCHAGLGRTGVLIACYLVFATRMTADQAI
IFVRAKRPNSIQTRGQLLCVREFTQFLTPLRNIFSCCDPKAHAVTLPQYLIRQR
HLLHGYEARLLKHVPKIIHLVCKLLLDLAENRPVMMKDVSEGPGLSAEIEKT
MSEMVTMQLDKELLRHDSDVSNPPNPTAVAADFDNRGMIFSNEQQFDPLWK
RRNVECLQPLTHLKRRLSYSDSDLKRAENLLEQGETPQTVPAQILVGHKPRQ
QKLISHCYIPQSPEPDLHKEALVRSTLSFWSQSKFGGLEGLKDNGSPIFHGRIIP
KEAQQSGAFSADVSGSHSPGEPVSPSFANVHKDPNPAHQQVSHCQCKTHGVG
SPGSVRQNSRTPRSPLDCGSSPKAQFLVEHETQDSKDLSEAASHSALQSELSAE
ARRILAAKALANLNESVEKEELIRRKVEMWQKELNSRDGAWERICGERDPFIL
CSLMWSWVEQLKEPVITKEDVDMLVDRRADAAEALFLLEKGQHQTILCVLH
CIVNLQTIPVDVEEAFLAHAIKAFTKVNFDSENGPTVYNTLKKIFKHTLEEKRK
MTKDGPKPGL（配列番号176）。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドをも提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、このポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１９１】
好ましい態様において、配列番号149のヌクレオチド352で始まる出発コドンから得られる以下のポリペプチドを、本発明に包含する：
MACGGRACKYENPARWSEQEQAIKGVYSSWVTDNILAMARPSSELLEKYHII
DQFLSHGIKTIINLQRPGEHASCGNPLEQESGFTYLPEAFMEAGIYFYNFGWK
DYGVASLTTILDMVKVMTFALQEGKVAIHCHAGLGRTGVLIACYLVFATRM
TADQAIIFVRAKRPNSIQTRGQLLCVREFTQFLTPLRNIFSCCDPKAHAVTLPQ
YLIRQRHLLHGYEARLLKHVPKIIHLVCKLLLDLAENRPVMMKDVSEGPGLS
AEIEKTMSEMVTMQLDKELLRHDSDVSNPPNPTAVAADFDNRGMIFSNEQQF
DPLWKRRNVECLQPLTHLKRRLSYSDSDLKRAENLLEQGETPQTVPAQILVG
HKPRQQKLISHCYIPQSPEPDLHKEALVRSTLSFWSQSKFGGLEGLKDNGSPIF
HGRIIPKEAQQSGAFSADVSGSHSPGEPVSPSFANVHKDPNPAHQQVSHCQCK
THGVGSPGSVRQNSRTPRSPLDCGSSPKAQFLVEHETQDSKDLSEAASHSALQ
SELSAEARRILAAKALANLNESVEKEELKRKVEMWQKELNSRDGAWERICGE
RDPFILCSLMWSWVEQLKEPVITKEDVDMLVDRRADAAEALFLLEKGQHQTI
LCVLHCIVNLQTIPVDVEEAFLAHAIKAFTKVNFDSENGPTVYNTLKKIFKHTL
EEKRKMTKDGPKPGL（配列番号177）。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドをも提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、このポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１９２】
好ましい態様において、配列番号149のヌクレオチド463で始まる出発コドンから得られる以下のポリペプチドを、本発明に包含する：
MARPSSELLEKYHIIDQFLSHGIKTIINLQRPGEHASCGNPLEQESGFTYLPEAF
MEAGIYFYNFGWKDYGVASLTTILDMVKVMTFALQEGKVAIHCHAGLGRTG
VLIACYLVFATRMTADQAIIFVRAKRPNSIQTRGQLLCVREFTQFLTPLRNIFSC
CDPKAHAVTLPQYLIRQRHLLHGYEARLLKHVPKIIHLVCKLLLDLAENRPV
MMKDVSEGPGLSAEIEKTMSEMVTMQLDKELLRHDSDVSNPPNPTAVAADF
DNRGMIFSNEQQFDPLWKRRNVECLQPLTHLKRRLSYSDSDLKRAENLLEQG
ETPQTVPAQILVGHKPRQQKLISHCYIPQSPEPDLHKEALVRSTLSFWSQSKFG
GLEGLKDNGSPIFHGRIIPKEAQQSGAFSADVSGSHSPGEPVSPSFANVHKDPN
PAHQQVSHCQCKTHGVGSPGSVRQNSRTPRSPLDCGSSPKAQFLVEHETQDS
KDLSEAASHSALQSELSAEARRILAAKALANLNESVEKEELKRKVEMWQKEL
NSRDGAWERICGERDPFILCSLMWSWVEQLKEPVITKEDVDMLVDRRADAA
EALFLLEKGQHQTILCVLHCIVNLQTIPVDVEEAFLAHAIKAFTKVNFDSENGP
TVYNTLKKIFKHTLEEKRKMTKDGPKPGL（配列番号178）。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドをも提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、このポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０１９３】
好ましい態様において、本発明は、開始する出発コドンを欠いたポリヌクレオチド、加えて得られるBMY_HPP1のコードされたポリペプチドを包含する。具体的には、本発明は配列番号149のヌクレオチド631〜2488に相当するポリヌクレオチド；配列番号150のアミノ酸2〜607に相当するポリペプチドを包含する。該コード配列を含有する組換えベクターおよび該ベクターを含有する宿主細胞をも包含する。
【０１９４】
本発明はまた、BMY_HPP1のアミノ酸M1〜E301（配列番号150）を示すBMY_HPP1ポリペプチドの３次元相同性モデルをも提供する。３次元相同性モデルは、相同タンパク質の公知の構造（Greerらによる1991、Leskらによる1992、Cardozoらによる1995、Yuanらによる1995）に基づいて構築することができる。配列番号150のアミノ酸残基M1〜E301に相当する該BMY_HPP1ポリペプチドの相同モデルは、laax、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ複合体（残基D11〜N321；タンパク質データバンクPDBエントリーラックスチェーン(entry laax chain)A；ジェンバンク受託番号gi|2981942；配列番号206）の相同構造に基づき、このものは本明細書の表VIIIに記載する構造座標の組みによって定義される。
【０１９５】
関心があるタンパク質についての利用可能な実験的な情報が存在しない場合に、相同モデルは有用である。３次元モデルは、相同タンパク質の公知の構造（Greerらによる1991、Leskらによる1992、Cardozoらによる1995、Saliらによる1995）に基づいて構築することができる。
【０１９６】
当該分野の当業者は、相同モデルがテンプレートまたは公知の構造がない場合には該タンパク質に類似する公知の構造のタンパク質に基づいて構築されることを理解するであろう。このことは、例えばFASTA（パーソン(Pearson)らによる1990）およびBLAST（アルチュール(Altschul)らによる1990）などのプログラムを用いて配列の対アラインメントによって達成することができる。配列類似度が高い（３０％より高い）場合には、これらの対比較法が適当であり得る。同様に、多重配列アラインメントまたはプロフィール−ベース法を用いて、多数の（構造的におよび生物学的に）関連するタンパク質のアラインメントに対するクエリー配列をアラインメントすることができる。配列類似度が低い場合には、より進歩した方法（例えば、タンパク質スレッディング(threading)などのフォールド認識）；Hendlichらによる1990）を使用する。ここで、ある配列と潜在的なテンプレートタンパク質の３次元型との適合性は知識に基づく可能性に基づいて評価する。最初の配列アラインメント後に、該クエリーテンプレートを場合によりマニュアル操作または他の特徴（モチーフ、２次構造の予想および許容される配列の保存）の取り込みによってアラインメントすることができる。次いで、構造的に保存された領域を同定し、このものを用いて、３次元モデルの骨格２次構造（サリ(Sali)らによる1995）要素を構築する。可変領域（このものは、「非保存領域」と呼ばれる）およびループを、知識ベースの方法を用いて加えることができる。可変領域およびループを有する完全なモデルを、力場計算を行なうことによって洗練することができる（Saliらによる1995、Cardozoらによる1995）。
【０１９７】
BMY_HPP1のタンパク質スレッディングおよび分子モデリングにより、BMY_HPP1 (残基M1〜E301）の一部が1aax、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ複合体（残基D11〜N321；タンパク質データバンク、PDB侵入(entry)1aax鎖A；ジェンバンク受託番号gi|2981942；配列番号206）のものと類似する３次元型を有することを示す。配列、構造および公知のホスファターゼサイン(signature)配列に基づくと、BMY_HPP1は新規なチロシン特異なホスファターゼである。
【０１９８】
BMY_HPP1について、対アラインメント法FASTA（パーソン(Pearson)らによる1990）および折り畳み認識法（タンパク質スレッディング）により、1axxチロシン特異的ホスファターゼの配列（残基D11〜N321；タンパク質データバンク、PDB侵入laax鎖'A；ジェンバンク受託番号gi|2981942 ; 配列番号206）とアラインさせたBMY_HPP1の一部（M1〜E301）についての一致する配列アラインメントを得た。BMY_HPP1とPDB侵入laaxとのアラインメントを、図27に記載する。本発明において、BMY_HPP1の相同モデルは、図27に記載する配列アラインメント（配列番号206の残基D11〜N321）から導いた。もっともらしい(plausible)側鎖の配向を含む全原子モデルを、プログラムLOOK（レビット(Levitt)による1992）を用いて得た。BMY_HPP1についての３次元モデルは表VIIIに記載の構造座標の組みによって定義され、このものを図28に示し、骨格２次構造とみなす。
【０１９９】
３次元構造における誤りを認識するために、構造ベースの平均場を用いて、タンパク質折り畳みの質を判断することができる（シップル(Sippl)による1993）。該方法を用いて、誤って折り畳まれた構造、並びに構造モデルの欠陥部分を認識することができる。該方法により、あるタンパク質折り畳みについてにエネルギー分布をｙ−軸に示し、そして該タンパク質折り畳み内の残基位置をｘ−軸に示すエネルギー図を得る。知識ベースの平均場(mean field)は、タンパク質データバンク（ベルンスタイン(Bernstein)らによる1977）由来のサブセットとして得る球状タンパク質の構造の組から導く力場計算を構成する。モデルの質を分析するために、該エネルギー分布をプロットし、テンプレートのエネルギー分布をモデルから得られるものと比較する。図29は、BMY_HPP1モデル（点線）と得られたモデルからの該テンプレート（1aax、チロシン特異的ホスファターゼ）についてのエネルギー図を示す。該モデルがC-末端領域においてわずかに高いエネルギーを有するが、一方でN-末端が「未変性様(native-like)」であると思われるのは、明らかである。このグラフは、BMY_HPP1の３次元構造座標が該ポリペプチドの正確で且つ有用な表示であることを確認するモチーフおよび配列アラインメントを示唆する。
【０２００】
用語「構造座標」とは、相同モデルの構築から得られるデカルト(Cartesian) 座標を意味する。
【０２０１】
当該分野の当業者は、タンパク質に関する構造座標の組みが３次元での形を定義する点の相対的な組みであることを理解するであろう。従って、完全に異なる座標の組みが似たりまたは同じ形を定義することは可能である。その上、異なるアラインメントテンプレート（すなわち、1axxの構造座標以外）を用いたりおよび／または相同モデルを得る際に異なる方法を用いて似た相同モデルの生成から生じる個々の座標のわずかな変化は、全体の形態に微小な影響を及ぼすであろう。座標の変化はまた、該構造座標の数学的な操作が原因でも生じ得る。例えば、表VIIIに記載し且つ図28に示す構造座標は、該構造座標の分割(fractionalization)；該構造座標の組みヘの整数の足し算もしくは引き算、該構造座標の逆転、または上記のいずれかの組み合せによって操作することができる。
【０２０２】
従って、様々なコンピュータによる分析は、分子またはその部分が同一のものであるとみなされる上記のBMY_HPP1の全てまたは一部と十分に似ているかどうかを決定するのに必要である。それらの分析は、最新のソフトウェアアプリケーション（例えば、ユーザーガイドに記載されているINSIGHTS（Accelrys Inc., San Diego, CA）バージョン2000、またはSYBYLソフトウェアサイト（Tripos Inc., St. Louis, MO）において入手することができるオンライン（www. accelrys. com）もしくはソフトウェアアプリケーションで実施することができる。
【０２０３】
プログラムINSIGHTII内の上書きツールを用いて、同じ構造の異なる構造および異なる立体配座の間での比較を行なうことができる。構造を比較するためにINSIGHTIIで使用する操作は、４つの工程：１）比較する構造をロードすること；２）これらの構造中での原子価を定義すること；３）フィッティングの操作を行なうこと；および４）該結果を分析すること、に分けられる。各構造は、名前によって同定する。１構造は標的（すなわち、該固定化構造）として同定され；第２の構造（すなわち、運動性構造）はソース構造として同定される。INSIGHTII内の原子価はユーザーの入力によって定義されるので、本発明の目的のために、我々は比較する２つの構造の間の全保存残基について、等価原子をタンパク質骨格原子（N、Cα、CおよびO）として定義するであろう。我々はまた、強固な(rigid)フィッティング操作のみを考慮する。強固なフィッティング法を用いる場合には、該作業(working)構造を翻訳して回転して、該標的構造との最適なフィットを得る。該フィッティング操作は該運動性構造に適用される最適な翻訳および回転を計算するアルゴリズムを使用し、その結果等価原子の特定の対についての該フィットの根平均２重偏差は絶対的な最小値となる。Åで示すこの数字は、INSIGHT1Iによって報告されている。本発明の目的のために、表VIIIに例示され且つ図28に示された構造座標によって記載される関連骨格原子について上書きした場合に、保存残基の骨格原子（N、Cα、CおよびO）の根平均２重偏差が3.0Å以下であるBMY_HPP1のいずれの相同モデルは、一致とみなす。該根平均２重偏差は2.0Å以下であることがより好ましい。
【０２０４】
相同性モデルによって具現化される本発明は、BMY_HPP1の生物学的な機能のモジュレーター、並びに改変された生物学的な機能および／または特異性を有する変異体の構造ベースの設計を可能とする。
【０２０５】
GCG（ジェネティックスコンピュータグループ、ウィスコンシン）におけるGAPプログラムを用いて決定される通り、BMY_HPP1の触媒的ドメインおよびヒトタンパク質チロシンオスファターゼ１B（PTP1B：PDBコードlaax）の間に18％の一致度が存在する。該構造をテンプレートとして用いて、BMY_HPP1の三次元モデルを得た。BMY_HPP1の場合に、機能的に重要な残基が他のホスファターゼ中で活性部位であることが分かっている該部位の近くの間隙に存在する。該活性部位残基は、H189-C190-G193-R196およびD161、並びにY162によって定義される。これらの残基の全てが、PTP1Bおよび他の公知のホスファターゼ中に保存されている（図27において、「*」と示す）。1aaxポリペプチドにおいて、システインをセリンに突然変異して構造分析を容易にした（Jia, Zらによる1995）。該活性部位残基は、触媒作用、並びに基質特異性および結合の機構において重要な役割を果たしている。
【０２０６】
本発明の好ましい実施態様において、該分子は表VIIIにより上記のBMY_HPP1アミノ酸または該分子の変異体の構造座標によって定義される活性部位領域を含む。該活性部位は、配列番号150の残基H189-C190-G193-R196およびD161、並びにY162によって定義される。図27に開示する配列アラインメントおよび表VIIIに開示する構造モデルに基づいて、D161は一般的な酸として、Y162はホスホチロシン基質と相互作用する基質特異性の重要な決定因子として、C190はリン酸ジエステル結合を切断する触媒的なシステイン求核体として及びR196は刊行物（FaumanおよびSaperによる1996）に記載されている切断のための結合を活性化する必須アルギニン(Argenine)として同定する。
【０２０７】
該活性部位領域の全てもしくはそのいずれかの部分を含有する分子、または該分子もしくは分子複合体の変異体もしくは相同体がより好ましい。該分子の変異体または相同体とは、BMY_HPP1アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下である分子を意味する。
【０２０８】
上記の残基として定義される該活性部位領域の全てもしくはそのいずれかの部分を含有する分子、または該分子もしくは分子複合体の変異体もしくは相同体が、より好ましい。該分子の変異体または相同体とは、該BMY_HPP1の活性部位領域の骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下である分子を意味する。
【０２０９】
用語「根平均２乗偏差」とは、平均値からの偏差の２乗の算術的な平均値の平方根を意味する。そのものは、傾向または対象からの偏差または変動を表す用語である。本発明の目的のために、「根平均２乗偏差」は、本明細書に記載の構造座標によって定義されるBMY_HPP1の骨格の関連部分からのタンパク質の骨格の変動を意味する。
【０２１０】
それらのBMY_HPP1相同モデル部分の構造座標は、機械で読み取り可能な保存媒体に保存される。それらのデータは、様々な目的（例えば、薬物発見、標的の優先順位決定および確認）のために使用することができる。
【０２１１】
したがって、本発明の実施態様において、表VIIIに記載する構造座標を用いてコード化し且つ図28において視覚化されたデータ記憶物質を含有する機械で読み取り可能なデータ記憶媒体を提供する。
【０２１２】
ある態様はWO 98/11134に開示されているシステム10を使用し、その開示は本明細書の一部を構成する。簡単に言えば、これらの態様の改変は、中央処理装置（「CPU」）、作業記憶（このものは、例えばRAM（ランダムアクセスメモリー）または「コア」メモリーであり得る）、大量(mass)記憶メモリー（例えば、１つ以上のディスクドライブまたはCD−ROMドライブ）、１つ以上の陰極線管（「CRT」）ディスプレー端子、１つ以上のキーボード、１つ以上の入力ラインおよび１つ以上の出力ライン（これらは全て通常の二方向システムバスによって相互接続している）を含むコンピュータを含む。
【０２１３】
入力ラインによってコンピュータに連結した入力ハードウェアは、様々な方法で実行することができる。本発明の機械で読み取り可能なデータを、電話回線または専用データ回線によって連結したモデムを用いて入力することができる。あるいはまたは別に、該入力ハードウェアはCD−ROMドライブまたはディスクドライブを含み得る。ディスプレー端末と組み合わせて、キーボードをまた、入力装置として使用することができる。
【０２１４】
出力回線によってコンピュータに連結した出力ハードウェアは同様に、通常の装置によって実行することができる。例えば、出力ハードウェアは、本明細書に記載する通り、例えばQUANTAなどのプログラムを用いて本発明の領域またはドメインの図示を表示するためのCRTディスプレー端末を含み得る。出力ハードウェアはまたプリンター（その結果、ハードコピー出力を得ることができる）またはディスクドライブ（これは、レーザー使用のためのシステム出力を保存する）を含むことができる。
【０２１５】
操作において、該CPUは、様々な出力装置および入力装置の使用を調和させ、大量保存からのデータアクセスを調和させ、および作業記憶ヘおよびそれからアクセスし、そしてデータ処理工程の順序を決める。多数のプログラムを用いて、本発明の機械で読み取り可能なデータを処理することができる。それらのプログラムについては、本明細書に記載する薬物発見のコンピュータ方法を参照して説明する。ハードウェアシステムの構成成分についての具体的な引用は、以下のデータ保存媒体の記載において適宜含める。
【０２１６】
本発明の目的として、機械で読み取りが可能なデータをコード化することができるいずれかの磁気的なデータ記憶媒体は、該システムの記憶要求を実行するのに十分であろう。該媒体は、通常のフロッピーディスクまたはハードディスクであり得て、このものは適当な基板（これは、通常のものであり得る）および一方または両側に適当な塗膜（これは、通常のものであり得る）を有し、磁区(magnetic domain)（この偏光(polarity)または配向(orientation)は例えば、磁気的に改変することができる）を含有する。該媒体はまた、ディスクドライブの主軸(spindle)または他のデータ記憶デバイスを収容するための開口部をも有し得る。
【０２１７】
媒体の塗膜の磁区は、システム（例えば、本明細書に記載するシステム）による命令実行のために、例えば通常の機械で読み取り可能なデータ（本明細書に記載するデータ）であり得る様式にコード化するように偏光させたりまたは方向づけることができる。
【０２１８】
適当な記憶媒体（これは、それら機械で読み取り可能なデータをコード化することもできる）または命令装置の組み（これは、例えば本明細書に記載のシステムなどのシステムによって実行することができる）の別例は、光学的に読み取り可能なデータ記憶媒体であり得る。該媒体は、通常のコンパクトディスク（CD-ROM）（これは、記憶だけを読む）または再書き込み可能な(rewritable)媒体（例えば、磁気−光ディスク）（これは、光学的に読み取ることができ、且つ磁気−光学的に書き込むことができる）であり得る。該媒体は、適当な基板（これは、通常のものであり得る）、および通常、基板の一方に適当な塗膜（これは、通常であり得る）を有することが好ましい。
【０２１９】
CD-ROM（これは、よく知られる）の場合には、該塗膜は反射性であって、そして機械で読み取り可能なデータをコード化するために多数のピットで刻印されている。該ピットの配置は、該塗膜の表面でレーザー光を反射させることによって読み取る。保護膜（これは、実質的に透明であることが好ましい）を、反射性塗膜の上面に与える。
【０２２０】
磁気−光ディスク（これは、よく知られる）の場合には、該塗膜はピットを有しないが、例えばレーザーによってある温度より上で加熱すると、多数の磁区（これは、偏光または配向を磁気的に変えることができる）を有する。該磁区の配向は、該塗膜から反射するレーザー光の偏光を測定することによって読み取ることができる。該磁区の配置構造は、上記の通り、該データをコード化する。
【０２２１】
従って、本発明によれば、BMY_HPP1相同モデル、その一部またはそれらの構造的に似たホモログの３次元構造を表示することができるデータは、機械で読み取り可能な記憶媒体に記憶され、このものは該構造の３次元図式表示を示することができる。それらのデータは、様々な目的（例えば、薬物の発見）のために使用することができる。
【０２２２】
第１に、本発明は、BMY_HPP1の生物学的機能を調整することができる化学物を設計し、選択し、および製造するための構造ベースのまたは合理的な薬物設計方法のBMY_HPP1（図20A〜D）の配列に基づく相同モデリングによる使用が可能である。該BMY_HPP1相同モデルとテンプレートホスファターゼの構造の比較により、BMY_HPP1の特異的な化学的モジュレーターを設計し、選択しまたは製造するための合理的なまたは構造ベースの薬物設計方法の使用が可能となる。
【０２２３】
従って、本発明はまた、３次元構造ベースの薬物設計の目的のために相同モデルを得る目的で、図20A〜Dの完全配列またはそれらの一部にも関する。
【０２２４】
本発明の目的のために、図20A〜Dの配列の変異体もしくはホモログまたはそれらのいずれかの一部を含む。好ましい態様において、該変異体またはホモログは、図20A〜Dにおけるアミノ酸残基（配列番号150）に対して少なくとも25％一致度、より好ましくは50％一致度、一層好ましくは75％一致度、および最も好ましくは90％の一致度を有する。
【０２２５】
BMY_HPP1の３次元モデル構造はまた、生物学的機能のモジュレーターを同定するための方法をも提供する。様々な方法またはそれらの組み合わせを用いて、これらの化合物を同定することができる。
【０２２６】
上で定義する該活性部位領域の構造座標を用いて、構造的な特徴および化学的な特徴を同定することもできる。次いで、同定された構造的な特徴または化学的な特徴を用いて、潜在的なBMY_HPP1モジュレーターとしての化合物を設計したりまたは選択することができる。構造的な特徴および化学的な特徴とは、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水結合相互作用および双極子相互作用を含むが、これらに限定されないことを意味する。別にまたは組み合わせて、該３次元構造モデルを用いて、潜在的なBMY_HPP1モジュレーターとしての化合物を設計したりまたは選択することができる。次いで、潜在的なBMY_HPP1モジュレーターとして同定された化合物を製造して、被験化合物とBMY_HPP1との結合を特徴としたり、または小分子の存在下でのBMY_HPP1失活を特徴とするアッセイにおいてスクリーニングすることができる。潜在的なBMY_HPP1モジュレーターのスクリーニングに有用なアッセイの例としては、例えばコンピュータアッセイで、インビトロアッセイでおよびハイスループットアッセイでのスクリーニング法を含むが、これらに限定されない。最後に、これらの方法は表VIIIによれば、BMY_HPP1から１つ以上のアミノ酸を改変したりまたは置換することをも含み得る。
【０２２７】
しかしながら、本明細書の開示に基づいて当該分野の当業者によって理解される通り、他の構造ベースの設計方法を使用することができる。様々なコンピュータによる構造ベースの設計方法が当該分野において開示されている。
【０２２８】
例えば、BMY_HPP1の配列および該BMY_HPP1構造（すなわち、表VIIIで提示する、BMY_HPP1の原子座標および／または活性部位領域の原子座標）を出力することができる多数のコンピュータモデリングシステムを利用することができる。次いで、該コンピュータシステムにより、潜在的なBMY_HPP1モジュレータが結合するこれらの領域の１つ以上についての構造上の詳細を得て、その結果、該潜在的なモジュレーターの相補的な構造上の詳細を決定することができる。これらのモデリングシステムの設計は通常、BMY_HPP1と物理的におよび構造的に会合することができる化合物に基づく。加えて、該化合物はBMY_HPP1と会合することができる立体配座を仮定することができなければいけない。いくつかのモデリングシステムにより、実際の製造および被験の前に、潜在的なBMY_HPP1モジュレーターの潜在的な阻害性または結合性の効果が評価されている。
【０２２９】
あるタンパク質標的と会合するための能力について化学物または断片をスクリーニングする方法もまた十分に知られる。これらの方法は、コンピュータスクリーン上での結合部位の視察によって開始する。次いで、選択した断片または化学物を、BMY_HPP1の活性部位領域中の１つ以上の位置および配向に位置させる。分子ドッキングは、例えばINSIGHTII、ICM (Molsoft LLC、La Jolla、CA)およびSYBYLなどのソフトウェアを用い、続いてエネルギーの最小化を行ない、そして標準的な分子力学力場（例えば、CHARMMおよびMMFF）を用いた分子動力学によって達成される。本発明に有用な化学断片または化学物の選択を助けるコンピュータプログラムとしては例えば、GRID（グッドフォード(Goodford)による1985）、AUTODOCK（グッドセル(Goodsell)による1990）およびDOCK（クンツらによる1982）を含むが、これらに限定されない。
【０２３０】
別法として、空の活性部位または場合により公知インヒビターのある部分を含む該部位のいずれかを用いて、新規な化合物を設計することができる。このタイプの設計方法としては、例えばLUDI（ボーム(Bohm)による1992）、LeapFrog（トリポス提携者(Tripos Associates), St. Louis MO）およびDOCK（クンツ(Kuntz)らによる1982）を含むが、これらに限定されない。例えば、DOCK（クンツらによる1982）などのプログラムは、該相同性モデルからの原子座標と一緒に用いてデータベースまたは視覚化データベースから潜在的リガンド（このものは、潜在的に活性部位領域と結合し、従って製造および被験のための適当な候補であり得る）を同定することができる。該コンピュータプログラムは、以下の工程の組み合わせを用いることができる：
（a）データベース由来の断片または化学物を選択すること、次いで該化学物を残基D161-Y162およびH189-C190-G193-R196によって定義されるBMY_HPP1活性部位中に１つ以上の配向で置くこと。該化学物および活性部位の構造的な特徴および化学的な特徴（これは、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水結合相互作用および双極子相互作用を含む）を確認すること；
（b）該ドッキングされた化学物と結合したりまたはそのものを置換し、そして該BMY_HPP1活性部位によって定義される領域に空間的に適合することができる分子断片についてデータベースを探索すること；
（c）ファンデルワールス相互作用、水素結合作用、電荷相互作用、または疎水結合相互作用を評価するスコアスキームの組み合わせを用いて、該ドッキングされた化学物および断片を評価すること；または、
（d）使用可能なデータベースとしては、例えばACD（Molecular Designs Limited）、Aldrich（Aldrich Chemical Company）、NCI（National Cancer Institute）、Maybridge（Maybridge Chemical Company Ltd）、CCDC（Cambridge Crystallographic Data Center）、CAST（Chemical Abstract Service）およびDerwent（Derwent Information Limited）を含む。
【０２３１】
好ましい化学物または断片の選択時に、各々およびBMY_HPP1との関連を視覚化し、次いで１つの潜在的なモジュレーターに整理する(assemble)ことができる。個々の化学物を整理するのに有用なプログラムとしては例えば、SYBYLおよびLeapFrog（Tripos Associates, St. Louis MO）、LUDI（ボーム(Bohm)による1992）、並びに3Dデータベースシステム（マーティン(Martin)による1992）を含むが、これらに限定されない。
【０２３２】
加えて、BMY_HPP1の３次元相同性モデルは、改変された生物学的活性を有する変異体の設計において役立つであろう。部位特異的変異誘発を用いて、天然のBMY_HPP1と比較して生物学的活性の程度が似るかまたは変えたタンパク質を得ることができる。本発明はまた、BMY_HPP1の変異体またはホモログの生成にも関する。表VIIIに記載する３次元構造座標および該BMY_HPP1モデルの視覚化、図28を用いる分子モデリングを用いて、生物学的活性、機能または反応性が似るかまたは改変されたBMY_HPP1の相同なまたは変異のポリペプチドを設計することができることは、明らかである。
【０２３３】
多数のポリヌクレオチド配列（例えば、EST配列）は公的に入手することができ、そして配列データベースによってアクセスすることができる。これらの配列のいくつかは配列番号149に関するものであり、このものは本発明の着想の前に、公的に入手することができる。それらの関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲内から具体的に除くことが好ましい。全ての関連する配列を例示することは、厄介であろう。従って、一般式a−bによって記載されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの１つ以上を本発明から除くことが好ましい。ここで、aとは配列番号149の1〜4379の間のいずれかの整数であり、bとは15〜4393の間の整数であり、aおよびbの両方が配列番号149に示されるヌクレオチド残基の位置に相当して、そしてbはa＋14以上である。
【０２３４】
遺伝子番号2によってコードされるポリペプチドの特徴
配列番号5（図2）に記載するポリヌクレオチド配列によってコードされおよび／または寄託されたクローンであるBMY_HPP2内に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号6（図2）として提示されるこの遺伝子に相当するポリペプチド断片は、多数のホスファターゼに対するヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルで有意な相同性を有する。該ホスファターゼとしては、例えばヒトCDC14（これは、細胞分裂周期が14であるS.セレビシアエ遺伝子Ａタンパク質としても知られる）ホモログＡ（HS_CDC14A；ジェンバンク受託番号gi| NP_003663；配列番号30）；ヒトS.セレビシアエCDC14ホモログ、遺伝子B（HS_CDC14B；ジェンバンク受託番号gi| NP_003662；配列番号31）；および酵母菌可溶性チロシン特異的タンパク質ホスファターゼCdcl4pタンパク質（SC_CDC14；ジェンバンク受託番号gi| NP_002839；配列番号32）（これらは、BLASTPによって決定される）を含む。これらのタンパク質とヒトホスファターゼポリペプチドとのアラインメントを図7に提示する。
【０２３５】
BMY_HPP2は、BLASTPによって決定される通り、ヒトCDC14Bに対するその相同性に基づいてリンタンパク質ホスファターゼであると予想される。BMY_HPP2は、ヒトCDC14AおよびCDC14Bの触媒ドメインに対して、および酵母菌CDC14（これは、BMY_HPP2のAA76での保存アスパラギン酸、AA106でのシステインおよびAA112でのアルギニンを含む）に対して有意な相同性を示す（図２に示す通り）。
【０２３６】
コードされたBMY_HPP2ポリペプチド配列の部分に相当するポリペプチド配列は、BAA91172（ジェンバンク受託番号gi7020545）として記載されている。しかしながら、BAA91172の概念的な翻訳は、ホスファターゼ相同性が該提示するポリヌクレオチドEST配列の5'末端の前で始まるオープンリーディングフレーム中に、加えて公知のホスファターゼに対して相同である該ポリペプチドの領域中に存在することを示す。従って、ジェンバンクの記録またはBAA91172として提示される配列は、このクローンが部分的にホスファターゼタンパク質をコードするといういずれの示唆をも与えない。
【０２３７】
ホスファターゼタンパク質の要素に対する強い相同性に基づいて、本発明のヒトBMY_HPP2ホスファターゼがコードするポリペプチドは、ホスファターゼタンパク質、好ましくは新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼの要素、特に好ましくは本明細書に記載する新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼとの少なくともある生物学的活性を有することが予想される。
【０２３８】
本発明は、ホスファターゼ関連障害（これは、糖尿病などの代謝性障害、加えて神経および／または心血管の疾患および障害を含むが、これらに限定されない）の治療、検出、軽減または予防のための、BMY_HPP2インビターおよび／またはBMY_HPP2活性のアクチベーターの使用を包含する。本発明はまた、BMY_HPP2インヒビターおよび／またはBMY_HPP2活性のアクチベーターの免疫抑制薬、抗炎症薬および／または抗腫瘍薬としての使用をも包含する。
【０２３９】
本発明は、キナーゼ活性が十分でない疾患を診断し、予後し、治療し、軽減しおよび／または予防するための治療学的なレジメにおける、BMY_HPP2ホスファターゼインヒビター（これは、アンチセンス核酸などの拮抗薬を含む）、加えて本明細書に記載する他の拮抗薬の使用を包含する。不十分なキナーゼ活性が原因で起こり得る疾患の限定されない１例はあるタイプの糖尿病であり、これはインシュリン受容体シグナル経路に関与する１つ以上のキナーゼが例えば、不十分な活性または不十分な発現を有し得る。
【０２４０】
その上、キナーゼ活性が過度に高い疾患および／または障害（例えば、キナーゼオンコジーン産物が過剰な活性および過剰な発現を有する癌）の診断、予後、治療、軽減および／または予防のための本明細書に記載の遺伝子治療学的レジメにおける、BMY_HPP2ホスファターゼアクチベーターの使用またはBMY_HPP1ホスファターゼ遺伝子もしくはタンパク質の使用を包含する。
【０２４１】
本発明はまた、BMY_HPP2タンパク質の触媒的に不活性な変異体（これは、その断片を含む）の使用（例えば、タンパク質療法）、または例えばホスファターゼ活性が過度に高い疾患および／または障害の診断、予後、軽減および／または予防における該コードするポリヌクレオチド配列の使用（例えば、遺伝子療法）をも含む。
【０２４２】
本発明はまた、診断における該BMY_HPP2ポリペプチド（これは、その断片および／または変異体を含む）に関する抗体の使用（例えば、生物マーカーおよび／または治療薬として）をも包含する。
【０２４３】
本発明は、細胞リンタンパク質またはリンペプチドのライブラリーと結合する基質トラップ(trapping)変異体としての該BMY_HPP2ホスファターゼの不活性な非触媒的変異体を使用して、該BMY_HPP2ポリペプチドの基質を同定することを包含する。
【０２４４】
本発明は、インビトロまたは「仮想的」（コンピューター）でのスクリーニング法を用いて、BMY_HPP2ホスファターゼ活のインヒビターまたはアクチベーターを同定するために、該BMY_HPP2ポリペプチドの使用を包含する。
【０２４５】
本発明の１態様は、該BMY_HPP2ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法は以下の工程を含む：i）分析的に検出可能な試薬を用いて標識化したBMY_HPP2ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターを、該インヒビターまたはアクチベーターとの複合体を形成するのに十分な条件で、該BMY_HPP2ホスファターゼと接触させ；ii）該複合体と同定する化合物を含有する試料とを接触させ；および、iii）該被験化合物が該複合体中の標識化された公知のBMY_HPP2ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターの量を改変する能力を検出することによって、インヒビターまたはアクチバーターとしての化合物を同定することを含む。
【０２４６】
本発明の別の態様は、BMY_HPP2ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法はi）該BMY_HPP2ホスファターゼと同定する化合物とを接触させ；およびii）該基質からホスファターゼを取り出す該BMY_HPP2ホスファターゼの能力を測定する工程を含む。
【０２４７】
本発明はまた、該BMY_HPP2ホスファターゼについてのリガンドを同定する方法をも包含し、該方法はi）結合が可能な条件で、該BMY_HPP2ホスファターゼを化合物群と接触させ；およびii）いずれかのリガンドと結合したタンパク質の存在を検出する工程を含む。
【０２４８】
上記の方法は、全細胞、サイトゾルの細胞画分、膜細胞画分、精製されたまたは部分的に精製された形態からなる群から選ばれる形態の該BMY_HPP2ホスファターゼを含むことが好ましい。本発明はまた、精製された、実質的に精製されたまたは精製されたいない状態での組換え的に発現したBMY_HPP2ホスファターゼにも関する。本発明は更に、当該分野で知られたりまたは本明細書中に記載するタンパク質、ペプチドまたは他の分子と融合したりまたは接合したBMY_HPP2ホスファターゼに関する。
【０２４９】
本発明はまた、上記の方法で同定された化合物および医薬的に許容し得る担体を含有する該BMY_HPP2ホスファターゼポリペプチドの医薬組成物をも包含する。
【０２５０】
該BMY_HPP2ポリペプチドをコードする定常状態のmRNAレベルを測定するために設計した発現プロファイリングは、肝臓および腎臓において有意に高い発現レベルを；脾臓において有意な程度を；および肺、精巣、心臓、腸、すい臓、リンパ節、脊髄および前立腺においてより低い程度を示した（図23に示す通り）。
【０２５１】
その上、全長BMY_HPP2ポリヌクレチド配列（配列番号151）を用いたLifeSeqデータベース（Incyte Pharmaceuticals社）のBLAST2探索は、該BMY_HPP2配列が肺ライブラリー（これは、肺気腫および他の肺疾患を有する患者を含む）において有意に発現することを決定する。該BMY_HPP2ポリヌクレオチドはまた、IL-1およびTNF-アルファを用いて刺激した大動脈細胞および内皮細胞において発現することも分かった。これらの発見は、肺疾患の発症、並びにIL-1およびTNF-アルファによる上方制御におけるBMY_HPP2ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの潜在的な関与を示唆する。
【０２５２】
加えて、正常な組織中でのBMY_HPP2ポリペプチドの発現プロファイリングの増大は、副腎中での最も高い発現のレベルを、松果体下垂体での低いが有意な発現のレベルを示すが、このことは内分泌疾患の処置におけるBMY_HPP2活性のモジュレートとしての機能を示唆する（図30に示す通り）。上記インサイトデータベース(Incyte database)由来の肺ライブラリーにおける発現パターンと一致するが、発現の高い相対的なレベルが肺の実質および気管支において（これは、肺疾患（例えば、喘息またはCOPD）の処置においてBMY_HPP2活性モジュレーターの機能を示唆する）；腎臓において（これは、腎臓障害の処置におけるBMY_HPP2活性モジュレータの機能を示唆する）；肝臓において（これは、肝臓障害（例えば、肝炎または肝硬変の処置におけるBMY_HPP2活性モジュレーターの機能を示唆する）；脈絡そう、冠動脈および肺動脈由来の血管において（これは、循環性障害（例えば、高血圧）の処置におけるBMY_HPP2活性モジュレーターの機能を示唆する）；脳の側坐核において（これは、情動性障害（例えば、双極性障害、精神分裂病およびうつ病）の処置におけるBMY_HPP2活性モジュレーターの機能を示唆する）も見られる。加えて、該BMY_HPP2は気管、胸部および子宮において非常に高く発現し、そしてヒトの体内の多数の他の組織において有意に発現する。
【０２５３】
副腎組織中に優位に存在する発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼの強い相同性は、ヒトBMY_HPP2ホスファターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの作動薬、拮抗薬および／または断片を含む）が内分泌性障害を治療し、診断し、予後し、軽減しおよび／または予防するのに有用であり得る。該障害としては、例えば副腎皮質性機能亢進、副腎皮質性機能不全、嗜眠、先天性副腎過形成、異常なACTH制御、異常なアドレナリン制御、P450C21、P450C18、P450C17およびP450C11ヒドロキシラーゼ並びに３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3-HSD)の欠失に関連する障害、多毛症、過少月経、ざ瘡、男性化、過少月経、雌性の偽雌雄同体(female pseudohermaphroditism)、異常な性的性質の発症の発生率に関係する障害、異常なコルチゾル分泌に関係する障害、高血圧症、低カリウム血症、生殖機能不全、異常なアンドロゲンの分泌に関係する障害、副腎多毛症(adrenal virilism)、副腎腺腫、副腎癌腫、異常なアンデロステロンの分泌に関係する障害、アルドステロン症、異常なステロイド生合成に関係する障害、異常なステロイド輸送に関係する障害、異常なステロイド分泌に関係する障害、異常なステロイド排出に関係する障害、アジソン症候群およびクッシング症候群を含むが、これらに限定されない。
【０２５４】
肝臓中での優位な発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、BMY_HPP2ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、加えてそれらの断片および変異体が肝臓の障害および癌の検出および処置に有用であろうことを示す。代表的な使用は、以下の「過剰増殖性障害(Hyperproliferative Disorders)」、「感染性疾患(Infectious Disease)」および「結合性活性(Binding Activity)」項目、並びに本明細書の他所に記載されている。要するに、該タンパク質は、肝芽腫、黄疸、肝炎、肝細胞前駆体細胞の分化が原因である肝臓代謝性の疾患および病気、肝硬変、肝臓のう腫、発熱性膿瘍、アメーバー性膿瘍、水胞体のう腫、のう胞腺癌、腺腫、巣状結節性過形成、血管腫、肝細胞癌、胆管癌および血管肉腫、肉芽腫性肝臓疾患、肝臓移植、高ビリルビン血症、黄疸、実質性肝臓疾患、門脈高血圧症、肝胆道疾患、肝実質、肝線維症、貧血症、胆石症、胆汁うっ帯(cholestasis)、四塩化炭素毒性、ベリリウム毒性、塩化ビニル毒性、総胆管結石切開、肝細胞壊死、アミノ酸の異常代謝、炭水化物の異常代謝、タンパク質の異常産生、糖タンパク質の異常産生、タンパク質の異常分解、糖タンパク質の異常分解、薬物の異常代謝、ホルモンの異常代謝、薬物の異常分解、薬物の異常分解、脂質代謝の異常調節、コレステロール代謝の異常調節、異常なグリコーゲン生成、異常なグリコーゲン分解、異常な解糖、異常な糖新生、高血糖、グルコース不耐性、高血糖、肝臓のグルコースとり込みの低下、肝臓のグリコーゲン産生の低下、インスリンに対する肝臓の耐性、門脈−全身性グルコースシャント(portal systemic glucose shunting)、末梢性インスリン耐性、ホルモン異常、全身性グルカゴンレベルの増大、全身性コルチゾールレベルの低下、全身性インスリンレベルの増大、低血糖症、糖新生の低下、肝臓のグリコーゲンの含有量の低下、グルカゴンに対する肝臓耐性、全身性の芳香族性アミノ酸レベルの増大、全身性の分枝アミノ酸レベルの低下、肝性脳症、肝臓におけるアミノ酸伝達の異常、肝臓におけるアミノ酸の酸化的脱アミノ化の異常、異常なアンモニア産生、異常なアルブミン分泌、低アルブミン血症、チトクロームb5機能の異常、p450機能の異常、グルタチオンS-アシルトランフェラーゼ機能の異常、コレステロール産生の異常および胆汁酸産生の異常の検出、治療、軽減および／または予防に使用することができる。
【０２５５】
その上、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの断片、作動薬および／または拮抗薬を含む）は、以下の肝臓性感染症を直接的にまたは間接的に治療し、予防し、診断しおよび／または予後することを含む使用を有する。該感染症としては例えば、敗血症感染が原因の肝臓疾患、菌血症が原因の肝臓疾患、肺炎球菌性肺炎感染が原因の肝臓疾患、毒素ショック症候群が原因の肝臓疾患、リステリア症が原因の肝臓疾患、レジオネラ病が原因の肝臓疾患、ブルセラ症感染が原因の肝臓疾患、淋菌感染が原因の肝臓疾患、エルシニア感染が原因の肝臓疾患、サルモネラ症が原因の肝臓疾患、ノカルジア症が原因の肝臓疾患、スピロヘータ感染が原因の肝臓疾患、梅毒トレポネーマ感染が原因の肝臓疾患、ブレリア・ブルグドルフェリ(Brrelia burgdorferi)感染が原因の肝臓疾患、レプトスピラ症が原因の肝臓疾患、コクシエラ・ブルネッティ(Coxiella burnetii)感染が原因の肝臓疾患、ロッキー山紅班熱リケッチア(Rickettsia richettsii)感染が原因の肝臓疾患、トラコーマ病原体感染が原因の肝臓疾患、オウム病クラミジア感染が原因の肝臓疾患、肝炎ウイルス感染が原因の肝臓疾患、エプスタイン・バーウイルス感染が原因の肝臓疾患、加えて上記または本明細書の他所に記載する原因病原体が関与するいずれかの他の疾患および／または障害を含むが、これらに限定されない。
【０２５６】
腎臓組織中での局在化された発現と合わせて、二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、BMY_HPP2ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが腎臓の疾患および／または障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。該疾患などとしては例えば、腎炎、腎不全、ネフローゼ症候群、尿路感染症、血尿、タンパク尿症、乏尿、多尿、夜尿症、浮腫、高血圧症、電解質障害(electrolyte disorders)、無菌性膿尿(sterile pyuria)、腎臓骨形成異常、大腎(large kidneys)、腎臓運搬欠損(renal transport defects)、腎結石症、高窒素血症、無尿、尿閉、尿の流れの緩徐化、大前立腺(large prostate)、横腹の圧痛(flank tenderness)、排尿後の充満した膀胱感覚(full bladder sensation)、遺尿症、排尿障害、細菌尿症、腎石、糸球体腎炎、血管炎、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura)、悪性高血圧症、円柱(cast)、尿細管間質性腎臓疾患、腎尿細管性アシドーシス、腎う腎炎、水腎炎(hydronephritis)、ネフローゼ症候群、挫滅症候群および／または腎仙痛、加えてウィルムス腫疾患、並びに先天性の腎臓異常症（例えば、馬蹄腎、多発性のう胞腎およびファンコーニ症候群(Falconi's syndrome)を含むが、これに限定されない。
【０２５７】
二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性、並びに脾臓組織中での局在化した発現、加えてIL-1およびTNF-アルファで刺激された内皮細胞中での発現は、BMY_HPP2ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが免疫疾患および／または障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得る。代表的な使用は、以下の「Immune Activity」、「Chemotaxis」および「Infectious Disease」の項目および本明細書の他所に記載されている。要するに、免疫組織中での強い発現は、肝細胞系譜（これは、血液幹細胞を含む）増殖、生存、分化および／または活性化を調節する際の機能を示す。
【０２５８】
BMY_HPP2ポリペプチドはまた、免疫学的障害の予防薬として有用であり得る。該障害としては例えば、関節炎、喘息、免疫不全症（例えば、AIDS、白血病、関節リウマチ、肉芽腫症、炎症性腸疾患、敗血症、ざ瘡、好中球減少、好中球増多、乾癬、過敏症（例えば、T−細胞媒介性細胞毒性）、移植した器官および組織に対する免疫応答（例えば、宿主対移植片病および移植片対宿主病）、または自己免疫障害（例えば、自己免疫不妊症、水晶体組織損傷、脱髄、全身性エリテマトーデス、薬剤誘発性溶血性貧血、関節リウマチ、シェーグレン病および強皮症）を含む。BMY_HPP2ポリペプチドは、サイトカイン産生、抗原提示または他のプロセス（例えば、追加免疫応答(boosting immune responses)など）を調節するのに有用であり得る。
【０２５９】
その上、該タンパク質は他の血液細胞の分化または挙動に影響を及すか、または損傷部位に肝細胞を補充する分泌因子であり得る。したがって、この遺伝子産物は幹細胞および様々な血液系統の拘束(committed)前駆体の増殖において、および様々な細胞タイプの分化および／または増殖において有用であろうと考えられる。その上、該タンパク質はまた、生物学的活性を測定するのに、組織マーカーとしての抗体を産生するのに、同族リガンドもしくは受容体を単離するのに、それらの相互作用を調整する薬物を同定するのに使用することもでき、加えて栄養サプリメントとしてのそのものの使用が可能である。タンパク質、並びに該タンパク質に関する抗体は、腫瘍マーカーおよび／または上記の組織についての免疫療法標的としての有用性を示し得る。
【０２６０】
インサイトライフセク(Incyte LifeSeq)データベース由来の電気的なノーザン(Northern's)から観察される肺ライブラリー中でのBMY_HPP2転写物の有意な発現は、肺疾患および障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのにおけるBMY_HPP2ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての潜在的な有用性を示唆する。該疾患などとしては例えば、ARDS、肺気腫、のう胞性線維症、間質性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、リンパ脈管筋腫症、間質性肺炎、好酸性肺炎、肉芽腫症、肺梗塞、肺線維症、じん肺症、肺胞出血、新生物、肺膿瘍、膿胸および肺感染症（例えば、免疫低下(immumocompromised)、HIVなど）に対する感受性の増大を含むが、これらに限定されない。
【０２６１】
その上、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの断片、作動薬および／または拮抗薬を含む）は、肺感染症を直接的にまたは間接的に治療し、予防し、診断しおよび／または予後することを含めた使用を有する。該感染症としては例えば、肺炎(pnemonia)、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎（例えば、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ハンタウイルスなどによって生じる）、肺炎マイコプラズマ、真菌肺炎（例えば、カリニ肺炎、ヒトプラスマカプスラーツム、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ種、クリプトコックス・ネオホルマンス、アスペルギルス種、接合菌などによって生じる）、レジオネラ病、クラミジア肺炎、ノカルジア(Nocordia)種感染症、寄生性肺炎（例えば、ふん線虫(Strongyloides)、トキソプラズマ・ゴンジ(Toxoplasma gondii)などによって生じる）、壊死性肺炎、加えて上記または本明細書の他所に記載の原因薬物が関与するいずれかの他の肺疾患および／または障害（例えば、非肺炎）を含むが、これらに限定されない。
【０２６２】
BMY_HPP2に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物の細胞周期の調節に関与することを示唆する証拠を提供した（実施例56）。細胞を有効な量の５つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのプールを用いて反応させることにより、サイクリンD発現／活性における有意な増加を生じた。これは、BMY_HPP2が少なくともサイクリンDの活性および／または発現を直接的にまたは間接的に調節するという確信する証拠を提供する。その上、該結果は、BMY_HPP2の生理学的な機能はサイクリンDの活性および／または発現の直接的なまたは間接的な負の調節であることを示唆する。
【０２６３】
好ましい態様において、BMY_HPP2ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これらは、それらの断片を含む）は、細胞周期欠損症、異常なリン酸化に関連する障害、異常なシグナル伝達に関する障害、増殖性障害および／または癌を処置し、診断しおよび／または軽減するのに有用である。
【０２６４】
その上、BMY_HPP2ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの断片を含む）は、細胞増殖を低下させ、速い増殖性の細胞の細胞増殖を低下させ、細胞周期のG1期における細胞数を増大させ、および細胞周期のS期に進行する細胞数を低下させるのに有用である。
【０２６５】
好ましい態様において、BMY_HPP2についての作動薬は細胞増殖を低下させ、速い増殖性細胞に細胞増殖を低下させ、細胞周期のG1期における細胞数を増大させ、および細胞周期のS期に進行する細胞数を低下させるのに有用である。
【０２６６】
その上、BMY_HPP2についての拮抗薬は細胞増殖を増大させ、速い増殖性細胞における細胞増殖を増大させ、細胞周期のG1期における細胞数を減少させ、および細胞周期のS期に進行する細胞数を増大させるのに有用である。それら拮抗薬は、それらの免疫応答などを追加免疫することによって、正常な細胞を不死化セルラインに形質転換し、肝細胞を増殖させたりおよび分裂させるために刺激し、化学的療法または他の治療学的なレジメを受けている癌患者の回復速度を増大させるのに特に有用であろう。
【０２６７】
該BMY_HPP2ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）に従って、１つのグリコシル化部位を含むことが分かった。本明細書においてより具体的に記載する通り、タンパク質グリコシル化は、様々な機能：タンパク質フォールディングの増強、タンパク質凝集の抑制、細胞小器官への細胞内輸送の調節、タンパク質分解に対する耐性の増大、タンパク質抗原性の調節、および細胞間接着の媒介を保存すると考えられている。
【０２６８】
アスパラギングリコシル化部位は、共通パターン：N-{P}-[ST]-{P}（式中、Nはグリコシル化部位である）を有する。しかしながら、潜在的なN-グリコシル化部位は共通配列Asn-Xaa-Ser/Thrに対して特異的であることがよく知られる。しかしながら、該共通トリペプチドの存在は、タンパク質のフォールディングがN-グリコシル化の調節に重要な役割を果たしている事実により、アスパラギン残基がグリコシル化されると結論づけるには十分ではない。AsnおよびSer/Thrの間のプロリンの存在は、N-グリコシル化を抑制するであろうことが分かった。このことは、グリコシル化部位の最近の統計学的な分析によって確認されており、これによりSer/ThrヘのプロリンC-末端を有する部位の約50％がグリコシル化されないことをも示す。アスパラギングリコシル化に関する別の情報は、以下の刊行物：Marshall R. D.によるAnnu. Rev. Biochem. 41: 673-702 (1972); Pless D. D., Lennarz W. J.によるProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 134 138 (1977); Bause E.によるBiochem. J. 209: 331-336 (1983) ; Gavel Y., von Heijne G.によるProtein Eng. 3: 433-442 (1990)；およびMiletich J. P., Broze G. J. Jr.によるJ. Biol. Chem. 265: 11397-11404 (1990)（これらは、本明細書の一部を構成する）で知ることができる。
【０２６９】
好ましい態様において、アスパラギングリコシル化部位ポリペプチド：GVQPPNFSWVLPGR（配列番号164）を本発明に包含する。このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本明細書の他所に記載する免疫原性および／または抗原性エピトープとしてのこのBMY_HPP2アスパラギングリコシル化部位ポリペプチドの使用をも包含する。
【０２７０】
本発明のBMY_HPP2ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）に基づいて、いくつかのリン酸化部位を含むことが分かった。それらの部位のリン酸化は、BMY_HPP2ポリペプチドのいくつかの生物学的活性を調節し得る。例えば、特定の部位でのリン酸化は、他の分子（例えば、タンパク質、リガンド、基質、DNAなど）と会合したりまたは結合するタンパク質の能力を調節するのに関与し得る。この場合に、リン酸化は他のカリウムチャンネルアルファサブユニット、ベータサブユニットと会合するBMY_HPP2の能力、またはカリウムチャンネル機能を調節するその能力を調整し得る。
【０２７１】
BMY_HPP2ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）を用いて、４個のPKCリン酸化部位を含むことが予想された。インビボにおいて、タンパク質キナーゼCはセリンまたはトレオニン残基のリン酸化について優位性を示す。該PKCリン酸化部位は、共通パターン：[ST]-x-[RK]（式中、SまたはTはリン酸化の部位であり、そして「X」が介在アミノ酸残基である）を有する。PKCリン酸化部位に関する別の情報は、Woodget J. R., Gould K. L., Hunter T.によるEur. J. Biochem. 161: 177-184 (1986)、およびKishimoto A., Nishiyama K., Nakanishi H., Uratsuji Y., Nomura H., Takeyama Y., Nishizuka Y.によるJ. Biol. Chem.260: 12492-12499 (1985)（これらは、本明細書の一部を構成する）で知ることができる。
【０２７２】
好ましい態様において、PKCリン酸化部位ポリペプチドHLVSLTERGPPHS（配列番号165）を本発明に包含する。 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所で記載するこれらBMY_HPP1 PKCリン酸化部位ポリペプチドの免疫原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０２７３】
新規なヒトホスファターゼポリペプチドを示すヒトBMY_HPP2ポリペプチドの更なる確認において、該BMY_HPP2ポリペプチドがモチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）に従って、チロシン特異的タンパク質ホスファターゼ活性部位ドメインを含むことが分かった。
【０２７４】
チロシン特異的タンパク質ホスファターゼ(EC 3.1.3.48)(PTPase)は、チロシン残基に結合したホスフェート基の除去を触媒する酵素である。これらの酵素は、細胞の成長、増殖、分化および形質転換の制御において非常に重要である。PTPアーゼの多数の形態が確認されており、このものは２つの範疇：可溶性PTAアーゼおよびPTAアーゼドメインを含む膜貫通受容体タンパク質に分類することができる。
【０２７５】
最新の公知のPTPアーゼを、以下に示す：可溶性PTPアーゼPTPN1 (PTP-1B)、PTPN2 (T-細胞PTPアーゼ; TC-PTP)、PTPN3 (H1)およびPTPN4 (MEG)（これらは、N-末端バンド4.1様ドメインを含み、更に膜と細胞骨格との間の接合部で作用する）、PTPN5 (STEP)、PTPN6 (PTP-1C ; HCP; SHP)およびPTPN11 (PTP-2C ; SH-PTP3; Syp)（これらは、そのN-末端きわみ(extremity)でSH-2ドメインの２コピーを含む酵素)（例えば、ショウジョウバエタンパク質コルクスルー(corkscrew)(遺伝子csw)もまた本サブグループに属する）、PTPN7 (LC-PTP；造血性タンパク質チロシンホスファターゼ; HePTP)、PTPN8 (70Z-PEP)、PTPN9 (MEG2)、PTPN12 (PTP Gl ; PTP-P19)、酵母PTP1、酵母PTP2（これは、ユビキチン媒介性タンパク質分解経路に関与し得る）、分裂酵母pyplおよびpyp2（これは、有志分裂の開始を抑制する際に機能する）、分裂酵母pyp3（これは、cdc2の脱リン酸化に寄与する）、酵母CDC14（これは、染色体分離に関与し得る）、エルシニア病原性プラスミドPTPアーゼ（遺伝子yopH）、オートグラファ(Autographa)カリフォルニア核多面性ウイルス症(nuclear pohyhedrosis virus)19Kd PTPアーゼ、二重特異性PTPアーゼ、DUSP1 (PTPN10; MAPキナーゼホスファターゼ-1 ; MKP-1)（これは、Thr-183およびTyr-185でMAPキナーゼを脱リン酸化する）、DUSP2 (PAC-1)（これは、ThrおよびTyr残基上でのMAPキナーゼERK1およびERK2を脱リン酸化する核酵素）、DUSP3 (VHR)、DUSP4 (HVH2)、DUSP5 (HVH3)、DUSP6 (Pystl ; MKP-3)、DUSP7 (Pyst2; MKP-X)、酵母MSG5（MAPキナーゼFUS3を脱リン酸化するPTPアーゼ）、酵母YVH1、ワクシニアウイルスH1 PTPアーゼ−二重特異性ホスファターゼ。
【０２７６】
構造的に、全ての公知の受容体PTPアーゼは、可変長細胞外ドメイン、続いて膜貫通領域およびC-末端触媒細胞質ドメインから構成される。該受容体PTPアーゼのいくつかは、それらの細胞外領域中に、フィブロネクチンII型（FN-III)反復、免疫グロブリン様ドメイン、MAMドメインまたは脱炭酸酵素様ドメインを含む。 該細胞質領域は通常、PTPアーゼドメインの２コピーを含む。１つ目は酵素活性を有すると考えられ、２つ目は不活性であるが、該１つ目の基質活性に影響を及ぼすと考えられる。これらのドメインにおいて、該触媒システインは通常保存的であるが、いくつかの他のものは恐らく重要であろうが、保存的ではない。
【０２７７】
チロシンホスファターゼ(PTPase)は、約300個のアミノ酸からなる。２個の保存されたシステインが存在し、その２番目のものは活性に絶対に必要であることが分かった。更に、直ぐ近傍のいくつかの保存残基もまた重要であることが分かった。
【０２７８】
チロシン特異的タンパク質ホスファターゼについての共通配列は、以下：
[LIVMF]-H-C-x(2)-G-x(3)-[STC]-[STAGP]-x-[LIVMFY]
（式中、Cは活性部位残基であり、そして「X」はいずれかのアミノ酸である）
の通り、提示される。
【０２７９】
チロシン特異的タンパク質ホスファターゼドメインおよびタンパク質に関する別の情報は、以下の刊行物：Fischer E. H., Charbonneau H., Tonks N. K., Science 253: 401-406 (1991); Charbonneau H., Tonks N. K.によるAnnu. Rev. Cell Biol. 8: 463-493 (1992); Trowbridge I. S.によるJ. Biol. Chem. 266: 23517-23520 (1991); Tonks N. K., Charbonneau H.によるTrends Biochem. Sci. 14: 497-500 (1989)；およびHunter T.によるCell 58: 1013-1016 (1989)（これらは、本明細書の一部を構成する）を参照して知ることができる。
【０２８０】
好ましい態様において、以下のチロシン特異的タンパク質ホスファターゼ活性部位ドメインポリペプチドGEAVGVHCALGFGRTGTMLACYL（配列番号166）を、本発明に包含する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをも提供する。本発明はまた、このチロシン特異的タンパク質ホスファターゼ活性部位ドメインポリペプチドの本明細書の他所に記載する免役学的なおよび／または抗原的なエピトープとしての使用をも包含する。
【０２８１】
好ましい実施態様において、以下のN-末端BMY_HPP2欠失ポリペプチドを、本発明に包含する。配列番号152のM1-K150、G2-K150、V3-K150、Q4-K150、P5-K150、P6-K150、N7-K150、F8-K150、S9-K150、W10-K150、V11-K150、L12-K150、P13-K150、G14-K150、R15-K150、L16-K150、A17-K150、G18-K150、L19-K150、A20-K150、L21-K150、P22-K150、R23-K150、L24-K150、P25-K150、A26-K150、H27-K150、Y28-K150、Q29-K150、F30-K150、L31-K150、L32-K150、D33-K150、L34-K150、G35-K150、V36-K150、R37-K150、H38-K150、L39-K150、V40-K150、S41-K150、L42-K150、T43-K150、E44-K150、R45-K150、G46-K150、P47-K150、P48-K150、H49-K150、S50-K150、D51-K150、S52-K150、C53-K150、P54-K150、G55-K150、L56-K150、T57-K150、L58-K150、H59-K150、R60-K150、L61-K150、R62-K150、I63-K150、P64-K150、D65-K150、F66-K150、C67-K150、P68-K150、P69-K150、A70-K150、P71-K150、D72-K150、Q73-K150、I74-K150、D75-K150、R76-K150、F77-K150、V78-K150、Q79-K150、I80-K150、V81-K150、D82-K150、E83-K150、A84-K150、N85-K150、A86-K150、R87-K150、G88-K150、E89-K150、A90-K150、V91-K150、G92-K150、V93-K150、H94-K150、C95-K150、A96-K150、L97-K150、G98-K150、F99-K150、G100-K150、R101-K150、T102-K150、G103-K150、T104-K150、M105-K150、L106-K150、A107-K150、C108-K150、Y109-K150、L110-K150、V111-K150、K112-K150、E113-K150、R114-K150、G115-K150、L116-K150、A117-K150、A118-K150、G119-K150、D120-K150、A121-K150、I122-K150、A123-K150、E124-K150、I125-K150、R126-K150、R127-K150、L128-K150、R129-K150、P130-K150、G131-K150、S132-K150、I133-K150、E134-K150、T135-K150、Y136-K150、E137-K150、Q138-K150、E139-K150、K140-K150、A141-K150、V142-K150、F143-K150および／またはQ144-K150。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチド配列をも提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、N-末端BMY_HPP2欠失ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０２８２】
好ましい態様において、以下のC-末端BMY_HPP2欠失ポリペプチドを、本発明に包含する：配列番号152のM1-K150、M1-T149、M1-R148、M1-Q147、M1-Y146、M1-F145、M1-Q144、M1-F143、M1-V142、M1-A141、M1-K140、M1-E139、M1-Q138、M1-E137、M1-Y136、M1-T135、M1-E134、Ml-1133、M1-S132、M1-G131、Ml-P130、M1-R129、M1-L128、M1-R127、M1-R126、Ml-1125、M1-E124、M1-A123、M1-I122、M1-A121、M1-D120、Ml-G119、Ml-A118、M1-A117、M1-L116、M1-G115、M1-R114、M1-E113、M1-K112、M1-V111、M1-L110、M1-Y109、M1-C108、M1-A107、M1-L106、M1-M105、M1-T104、M1-G103、M1-T102、M1-R101、M1-G100、M1-F99、M1-G98、M1-L97、M1-A96、M1-C95、M1-H94、M1-V93、M1-G92、M1-V91、M1-A90、M1-E89、M1-G88、M1-R87、M1-A86、M1-N85、M1-A84、M1-E83、M1-D82、M1-V81、M1-I80、M1-Q79、M1-V78、M1-F77、M1-R76、M1-D75、M1-I74、M1-Q73、M1-D72、M1-P71、M1-A70、M1-P69、Ml-P68、M1-C67、M1-F66、M1-D65、M1-P64、M1-I63、M1-R62、M1-L61、M1-R60、M1-H59、M1-L58、M1-T57、M1-L56、M1-G55、M1-P54、M1-C53、M1-S52、M1-D51、Ml-S50、M1-H49、M1-P48、M1-P47、M1-G46、M1-R45、M1-E44、M1-T43、Ml-L42、M1-S41、M1-V40、M1-L39、M1-H38、M1-R37、M1-V36、M1-G35、M1-L34、M1-D33、Ml-L32、M1-L31、M1-F30、M1-Q29、M1-Y28、M1-H27、M1-A26、M1-P25、M1-L24、M1-R23、M1-P22、M1-L21、M1-A20、M1-L19、M1-G18、M1-A17、M1-L16、M1-R15、M1-G14、Ml-P13、M1-L12、Ml-Vll、Ml-W10、Ml-S9、M1-F8および／またはM1-N7。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチド配列をも提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、該C-末端BMY_HPP2欠失ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０２８３】
好ましい態様において、以下のBMY_HPP2ホスファターゼ活性部位ドメインアミノ酸置換を、本発明に包含する。ここで、配列番号152中、M1は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G2は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V3は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；Q4は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P5は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P6は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N7は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F8は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され； S9は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；W10は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはYのいずれかによって置換され；V1は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；L12は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P13は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G14は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R15は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L16は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A17は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G18は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L19は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A20は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L21は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P22は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R23は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L24は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P25は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A26は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；H27は、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y28は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；Q29は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F30は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L31は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L32は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D33は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L34は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G35は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V36は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；R37は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；H38は、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L39は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V40は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；S41は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L42は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T43は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E44は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R45は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G46は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P47は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P48は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；H49は、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S50は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D51は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S52は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C53は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P54は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G55は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L56は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T57は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L58は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；H59は、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R60は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L61は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R62は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはY��いずれかによって置換され；I63は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P64は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D65は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F66は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C67は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P68は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P69は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A70は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P71は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D72は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Q73は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I74は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D75は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R76は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F77は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V78は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；Q79は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I80は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V81は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；D82は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E83は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A84は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N85は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A86は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R87は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G88は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E89は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A90は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V91は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；G92は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V93は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；H94は、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C95は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A96は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L97は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G98は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F99は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M,N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G100は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R101は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T102は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G103は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T104は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；M105は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L106は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A107は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C108は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y109は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；L110は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；および／または；V111は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換されるか；加えて、それらの組み合わせの置換を含む。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらのBMY_HPP2ホスファターゼ活性部位ドメインアミノ酸置換ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての置換をも包含する。
【０２８４】
好ましい態様において、以下のBMY_HPP2ホスファターゼ活性部位ドメイン保存アミノ酸置換を本発明に包含する。ここで、配列番号152中、M1は、A、G、SまたはTのいずれかによって置換され；G2は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；V3は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；Q4はNによって置換され；P5は、Pであり；P6はPであり；N7は、Qによって置換され；F8は、WまたはYのいずれかによって置換され；S9は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；W10は、FまたはYのいずれかであり；Vllは、A、IまたはLのいずれかによって置換され；L12は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；P13は、Pであり；G14は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；R15は、KまたはHのいずれかによって置換され；L16は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；A17は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；G18は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；L19は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；A20は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；L21は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；P22は、Pであり；R23は、KまたはHのいずれかによって置換され；L24は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；P25は、Pであり；A26は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；H27は、KまたはRのいずれかによって置換され；Y28は、FまたはWのいずれかによって置換され；Q29は、Nによって置換され；F30は、WまたはYのいずれかによって置換され；L31は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；L32は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；D33は、Eによって置換され；L34は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；G35は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；V36は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；R37は、KまたはHのいずれかによって置換され；H38は、KまたはRのいずれかによって置換され；L39は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；V40は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；S41は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；L42は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；T43は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；E44は、Dによって置換され；R45は、KまたはHのいずれかによって置換され；G46は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；P47は、Pであり；P48は、Pであり；H49は、KまたはRのいずれかによって置換され；S50は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；D51は、Eによって置換され；S52は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；C53は、Cであり；P54は、Pであり；G55は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；L56は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；T57は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；L58は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；H59は、KまたはRのいずれかによって置換され；R60は、KまたはHのいずれかによって置換され；L61は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；R62は、KまたはHのいずれかによって置換され；I63は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；P64は、Pであり；D65は、Eによって置換され；F66は、WまたはYのいずれかによって置換され；C67は、Cであり；P68は、Pであり；P69は、Pであり；A70は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；P71は、Pであり；D72は、Eによっ���置換され；Q73は、Nによって置換され；I74は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；D75は、Eによって置換され；R76は、KまたはHのいずれかによって置換され；F77は、WまたはYのいずれかによって置換され；V78は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；Q79は、Nによって置換され；I80は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；V81は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；D82は、Eによって置換され；E83は、Dによって置換され；A84は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；N85は、Qによって置換され；A86は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；R87は、KまたはHのいずれかによって置換され；G88は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；E89は、Dによって置換され；A90は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；V91は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；G92は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；V93は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；H94は、KまたはRのいずれかによって置換され；C95は、Cであり；A96は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；L97は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；G98は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；F99は、WまたはYのいずれかによって置換され；G100は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；R101は、KまたはHのいずれかによって置換され；T102は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；G103は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；T104は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；M105は、A、G、SまたはTのいずれかによって置換され；L106は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；A107は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；C108は、Cであり；Y109は、FまたはWのいずれかであり；L110は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；および／またはV111は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；加えて、それらの組み合わせのいずれかの置換を含む。BMY_HPP2ホスファターゼ活性部位ドメイン内の他の適当な置換は本発明によって包含され、このものは本明細書の他所に記載する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらのBMY_HPP2ホスファターゼ活性部位ドメイン保存アミノ酸置換ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０２８５】
好ましい態様において、本発明は、開始する出発コドンを欠いたポリヌクレオチド、加えて得られるBMY_HPP2のコードされたポリペプチドを包含する。具体的には、本発明は配列番号151のヌクレオチド92〜538に相当するポリヌクレオチド；配列番号152のアミノ酸2〜150に相当するポリペプチドを包含する。該コード配列を含有する組換えベクターおよび該ベクターを含有する宿主細胞をも包含する。
【０２８６】
本発明はまた、BMY_HPP2（配列番号152のアミノ酸残基M1〜K150）のポリペプチド配列のアミノ酸残基M1〜K150を示すBMY_HPP2ポリペプチドの３次元相同性モデル（図32を参照）をも提供する。３次元相同性モデルは、相同性タンパク質の公知の構造（Greerらによる1991、Leskらによる1992、Cardozoらによる1995、Yuanらによる1995）に基づいて構築することができる。該BMY_HPP2ポリペプチド配列（配列番号152）の相同性モデルは、ヒト二重特異性ホスファターゼのN-末端構造由来の1vhr（ワクシニアH1関連性ホスファターゼVN1）（残基N31〜K179；タンパク質データバンクPDBエントリー1vhrチェーンA(entry 1vhr chain)A；ジェンバンク受託番号gi|1633321；配列番号207）の相同性構造に基づいており、このものは本明細書の表IXに記載する構造座標の組みによって定義される。
【０２８７】
関心があるタンパク質についての利用可能な実験的な情報が存在しない場合に、相同モデルは有用である。３次元モデルは、相同タンパク質の公知の構造（Greerらによる1991、Leskらによる1992、Cardozoらによる1995、Saliらによる1995）に基づいて構築することができる。
【０２８８】
当該分野の当業者は、相同モデルがテンプレートまたは公知の構造がない場合には該タンパク質に類似する公知の構造のタンパク質に基づいて構築されることを理解するであろう。このことは、例えばFASTA（パーソン(Pearson)らによる1990）およびBLAST（アルチュール(Altschul)らによる1990）などのプログラムを用いて配列の対アラインメントによって達成することができる。配列類似度が高い（３０％より高い）場合には、これらの対比較法が適当であり得る。同様に、多重配列アラインメントまたはプロフィール−ベース法を用いて、多数の（構造的におよび生物学的に）関連するタンパク質のアラインメントに対するクエリー配列をアラインメントすることができる。配列類似度が低い場合には、より進歩した方法（例えば、タンパク質スレッディング(threading)などのフォールド認識）；Hendlichらによる1990）を使用する。ここで、ある配列と潜在的なテンプレートタンパク質の３次元型との適合性は知識に基づく可能性に基づいて評価する。最初の配列アラインメント後に、該クエリーテンプレートを場合によりマニュアル操作または他の特徴（モチーフ、２次構造の予想および許容される配列の保存）の取り込みによってアラインメントすることができる。次いで、構造的に保存された領域を同定し、このものを用いて、骨格２次構造（サリ(Sali)らによる1995）を構築することができる。ループを、知識をベースとする方法を用いて加え、そして力場計算を行なうことによって洗練することができる（Saliらによる1995, Cardozoらによる1995）。
【０２８９】
BMY_HPP2について、対アラインメント法FASTA（パーソン(Pearson)らによる1990）および折り畳み認識法（タンパク質スレッディング）により、ヒト二重性特異性ホスファターゼ（ワクシニアH1-関連性ホスファターゼVN1）のN-末端由来の1vhrの配列（残基N31〜K179；タンパク質データバンク、PDBエントリーlvhrチェーンA；ジェンバンク受託番号gi|1633321；配列番号207）とアラインさせたBMY_HPP2の一部（配列番号152のM1〜K150）についての一致する配列アラインメントを得た。BMY_HPP2とPDBエントリー1vhrとのアラインメントを、図31に記載する。本発明において、BMY_HPP2の相同性モデルは図31に記載する配列アラインメントから導き、従ってもっともらしい(plausible)側鎖の配向を含む全原子モデルを、プログラムLOOK（レビットによる1992）を用いて得た。BMY_HPP2についての３次元モデルは表IXに記載の構造座標の組みによって定義され、このものを図32に視覚化する。
【０２９０】
３次元構造における誤りを認識するために、構造ベースの平均場を用いて、タンパク質折り畳みの質を判断することができる（シップル(Sippl)による1993）。該方法を用いて、誤って折り畳まれた構造、並びに構造モデルの欠陥部分を認識することができる。該方法により、あるタンパク質折り畳みについてにエネルギー分布をｙ−軸に示し、そして該タンパク質折り畳み内の残基位置をｘ−軸に示すエネルギー図を得る。知識ベースの平均場(mean field)は、タンパク質データバンク（ベルンスタイン(Bernstein)らによる1977）由来のサブセットとして得る球状タンパク質の構造の組から導く力場計算を構成する。モデルの質を分析するために、該エネルギー分布をプロットし、テンプレートのエネルギー分布をモデルから得られるものと比較する。図33は、BMY_HPP2モデル（点線）と得られたモデルからの該テンプレート（1vhr、二重特異性ホスファターゼ）についてのエネルギー図を示す。該モデルおよびテンプレートが該アライン領域上で似たエネルギーを有することは明らかであり、このことはBMY_HPP2が「未変性様」立体配座であることを示唆する。このグラフは、BMY_HPP2の３次元構造座標が該ポリペプチドの正確で且つ有用な表示であることを確認するモチーフおよび配列アラインメントを示唆する。
【０２９１】
用語「構造座標」とは、相同モデルの構築から得られるデカルト(Cartesian) 座標を意味する。
【０２９２】
当該分野の当業者は、タンパク質に関する構造座標の組みが３次元での形を定義する点の相対的な組みであることを理解するであろう。従って、完全に異なる座標の組みが似たりまたは同じ形を定義することは可能である。その上、異なるアラインメントテンプレート（すなわち、1vhrの構造座標以外）を用いたりおよび／または相同モデルを得る際に異なる方法を用いて似た相同モデルの生成から生じる個々の座標のわずかな変化は、全体の形態に微小な影響を及ぼすであろう。座標の変化はまた、該構造座標の数学的な操作が原因でも生じ得る。例えば、表IVに記載し且つ図32に示す構造座標は、該構造座標の分割(fractionalization)；該構造座標の組みヘの整数の足し算もしくは引き算、該構造座標の逆転、または上記のいずれかの組み合せによって操作することができる。
【０２９３】
従って、様々なコンピュータによる分析は、分子またはその部分が同一のものであるとみなされる上記のBMY_HPP2の全てまたは一部と十分に似ているかどうかを決定するのに必要である。それらの分析は、最新のソフトウェアアプリケーション（例えば、ユーザーガイドに記載されているINSIGHTS（Accelrys Inc., San Diego, CA）バージョン2000で、および添付のユーザーガイドにおいて記載する通り、実施することができる。
【０２９４】
プログラムINSIGHTII内の上書きツールを用いて、同じ構造の異なる構造および異なる立体配座の間での比較を行なうことができる。構造を比較するためにINSIGHTIIで使用する操作は、４つの工程：１）比較する構造をロードすること；２）これらの構造中での原子価を定義すること；３）フィッティングの操作を行なうこと；および４）該結果を分析すること、に分けられる。各構造は、名前によって同定する。１構造は標的（すなわち、該固定化構造）として同定され；第２の構造（すなわち、運動性構造）はソース構造として同定される。INSIGHTII内の原子価はユーザーの入力によって定義されるので、本発明の目的のために、我々は比較する２つの構造の間の全保存残基について、等価原子をタンパク質骨格原子（N、Cα、CおよびO）として定義するであろう。我々はまた、強固な(rigid)フィッティング操作のみを考慮する。強固なフィッティング法を用いる場合には、該作業(working)構造を翻訳して回転して、該標的構造との最適なフィットを得る。該フィッティング操作は該運動性構造に適用される最適な翻訳および回転を計算するアルゴリズムを使用し、その結果等価原子の特定の対についての該フィットの根平均２重偏差は絶対的な最小値となる。Åで示すこの数字は、INSIGHT1Iによって報告されている。本発明の目的のために、表IXに例示され且つ図32に視覚化された構造座標によって記載される関連骨格原子について上書きした場合に、保存残基の骨格原子（N、Cα、CおよびO）の根平均２重偏差が3.0Å以下であるBMY_HPP2のいずれの相同モデルは、一致とみなす。該根平均２重偏差は2.0Å以下であることがより好ましい。
【０２９５】
相同性モデルによって具現化される本発明は、BMY_HPP2の生物学的な機能のモジュレーター、並びに改変された生物学的な機能および／または特異性を有する変異体の構造ベースの設計を可能とする。
【０２９６】
GCG（ジェネティックスコンピュータグループ、ウィスコンシン）におけるGAPプログラムによって決定される通り、BMY_HPP2の触媒ドメインおよびヒト二重特異性ホスファターゼVHR（ユバニヤマ(Yuvaniyama), J.らによる1996; PDBアイデンティファイヤー(identifier)lvhr）の間に23％の一致度が存在する。BMY_HPP2の場合に、機能的に重要な残基が残基D65、H94-C95-X-X-G98-X-X-R101（「活性部位」）からなる間隙中に存在する。これらの残基の全てが、1vhr（D92、H123-C124-X-X-G127-X-X-R130）に保存されている。図31に開示された配列アラインメント、並びに表IXに開示し且つ図32に視覚化された構造モデルに基づいて、文献（ファウマン(Fauman)およびサペル(Saper)によって総括された、1996）に記載されているとおり、D65は一般的な酸として同定され、C95はリン酸ジエステル結合を切断する触媒的なシステイン求核体として同定され、そしてR101は切断のための結合を活性化する必須アルギニン(Argenine)であると同定されている。
【０２９７】
本発明の好ましい実施態様において、該分子は表IXにより上記のBMY_HPP2アミノ酸または該分子の変異体の構造座標によって定義される間隙領域を含む。
【０２９８】
該間隙の全てもしくはそのいずれかの部分を含有する分子、または該分子もしくは分子複合体の変異体もしくはホモログがより好ましい。該分子の変異体またはホモログとは、BMY_HPP2アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下である分子を意味する。
【０２９９】
用語「根平均２乗偏差」とは、平均値からの偏差の２乗の算術的な平均値の平方根を意味する。そのものは、傾向または対象からの偏差または変動を表す用語である。本発明の目的のために、「根平均２乗偏差」は、本明細書に記載の構造座標によって定義されるBMY_HPP2の骨格の関連部分からのタンパク質の骨格の変動を意味する。
【０３００】
それらのBMY_HPP2相同モデル部分の構造座標は、機械で読み取り可能な保存媒体に保存される。それらのデータは、様々な目的（例えば、薬物発見）のために使用することができる。
【０３０１】
したがって、本発明の実施態様において、表IXに記載する構造座標を用いてコード化したデータ記憶物質を含有する機械で読み取り可能なデータ記憶媒体を提供する。
【０３０２】
ある態様はWO 98/11134に開示されているシステム10を使用し、その開示は本明細書の一部を構成する。簡単に言えば、これらの態様の改変は、中央処理装置（「CPU」）、作業記憶（このものは、例えばRAM（ランダムアクセスメモリー）または「コア」メモリーであり得る）、大量(mass)記憶メモリー（例えば、１つ以上のディスクドライブまたはCD−ROMドライブ）、１つ以上の陰極線管（「CRT」）ディスプレー端子、１つ以上のキーボード、１つ以上の入力ラインおよび１つ以上の出力ライン（これらは全て通常の二方向システムバスによって相互接続している）を含むコンピュータを含む。
【０３０３】
入力ラインによってコンピュータに連結した入力ハードウェアは、様々な方法で実行することができる。本発明の機械で読み取り可能なデータを、電話回線または専用データ回線によって連結したモデムを用いて入力することができる。あるいはまたは別に、該入力ハードウェアはCD−ROMドライブまたはディスクドライブを含み得る。ディスプレー端末と組み合わせて、キーボードをまた、入力装置として使用することができる。
【０３０４】
出力回線によってコンピュータに連結した出力ハードウェアは同様に、通常の装置によって実行することができる。例えば、出力ハードウェアは、本明細書に記載する通り、例えばQUANTAなどのプログラムを用いて本発明の領域またはドメインの図示を表示するためのCRTディスプレー端末を含み得る。出力ハードウェアはまたプリンター（その結果、ハードコピー出力を得ることができる）またはディスクドライブ（これは、レーザー使用のためのシステム出力を保存する）を含むことができる。
【０３０５】
操作において、該CPUは、様々な出力装置および入力装置の使用を調和させ、大量保存からのデータアクセスを調和させ、および作業記憶ヘおよびそれからアクセスし、そしてデータ処理工程の順序を決める。多数のプログラムを用いて、本発明の機械で読み取り可能なデータを処理することができる。それらのプログラムについては、本明細書に記載する薬物発見のコンピュータ方法を参照して説明する。ハードウェアシステムの構成成分についての具体的な引用は、以下のデータ保存媒体の記載において適宜含める。
【０３０６】
本発明の目的として、機械で読み取りが可能なデータをコード化することができるいずれかの磁気的なデータ記憶媒体は、該システムの記憶要求を実行するのに十分であろう。該媒体は、通常のフロッピーディスクまたはハードディスクであり得て、このものは適当な基板（これは、通常のものであり得る）および一方または両側に適当な塗膜（これは、通常のものであり得る）を有し、磁区（この偏光または配向は例えば、磁気的に改変することができる）を含有する。該媒体はまた、ディスクドライブの主軸または他のデータ記憶デバイスを収容するための開口部をも有し得る。
【０３０７】
媒体の塗膜の磁区は、システム（例えば、本明細書に記載するシステム）による命令実行のために、例えば通常の機械で読み取り可能なデータ（本明細書に記載するデータ）であり得る様式にコード化するように偏光させたりまたは方向づけることができる。
【０３０８】
適当な記憶媒体（これは、それら機械で読み取り可能なデータをコード化することもできる）または命令装置の組み（これは、例えば本明細書に記載のシステムなどのシステムによって実行することができる）の別例は、光学的に読み取り可能なデータ記憶媒体であり得る。該媒体は、通常のコンパクトディスク（CD-ROM）（これは、記憶だけを読む）または再書き込み可能な(rewritable)媒体（例えば、磁気−光ディスク）（これは、光学的に読み取ることができ、且つ磁気−光学的に書き込むことができる）であり得る。該媒体は、適当な基板（これは、通常のものであり得る）、および通常、基板の一方に適当な塗膜（これは、通常であり得る）を有することが好ましい。
【０３０９】
CD-ROM（これは、よく知られる）の場合には、該塗膜は反射性であって、そして機械で読み取り可能なデータをコード化するために多数のピットで刻印されている。該ピットの配置は、該塗膜の表面でレーザー光を反射させることによって読み取る。保護膜（これは、実質的に透明であることが好ましい）を、反射性塗膜の上面に与える。
【０３１０】
磁気−光ディスク（これは、よく知られる）の場合には、該塗膜はピットを有しないが、例えばレーザーによってある温度より上で加熱すると、多数の磁区（これは、偏光または配向を磁気的に変えることができる）を有する。該磁区の配向は、該塗膜から反射するレーザー光の偏光を測定することによって読み取ることができる。該磁区の配置構造は、上記の通り、該データをコード化する。
【０３１１】
従って、本発明によれば、BMY_HPP2相同モデル、その一部またはそれらの構造的に似たホモログの３次元構造を表示することができるデータは、機械で読み取り可能な記憶媒体に記憶され、このものは該構造の３次元図式表示を示することができる。それらのデータは、様々な目的（例えば、薬物の発見）のために使用することができる。
【０３１２】
第１に、本発明は、BMY_HPP2の生物学的機能を調整することができる化学物を設計し、選択し、および製造するための構造ベースのまたは合理的な薬物設計方法のBMY_HPP2（図21；配列番号152）の配列に基づく相同モデリングによる使用が可能である。
【０３１３】
従って、本発明はまた、３D構造ベースの薬物設計の目的のために相同性モデルを得る目的で、図21の完全配列またはそれらの一部にも関する。
【０３１４】
本発明の目的のために、図21の配列の変異体もしくはホモログまたはそれらのいずれかの一部を含む。好ましい態様において、該変異体またはホモログは、図21におけるアミノ酸残基に対して少なくとも25％の一致度、より好ましくは50％の一致度、一層好ましくは75％の一致度、および最も好ましくは90％の一致度を有する。
【０３１５】
BMY_HPP2の３次元モデル構造はまた、生物学的機能のモジュレーターを同定するための方法をも提供する。様々な方法またはそれらの組み合わせを用いて、これらの化合物を同定することができる。
【０３１６】
上で定義する該活性部位領域の構造座標を用いて、構造的な特徴および化学的な特徴を同定することもできる。次いで、同定された構造的な特徴または化学的な特徴を用いて、潜在的なBMY_HPP2モジュレーターとしての化合物を設計したりまたは選択することができる。構造的な特徴および化学的な特徴とは、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水結合相互作用および双極子相互作用を含むが、これらに限定されないことを意味する。別にまたは組み合わせて、該３次元構造モデルを用いて、潜在的なBMY_HPP2モジュレーターとしての化合物を設計したりまたは選択することができる。次いで、潜在的なBMY_HPP2モジュレーターとして同定された化合物を製造して、被験化合物とBMY_HPP2との結合を特徴としたり、または小分子の存在下でのBMY_HPP2失活を特徴とするアッセイにおいてスクリーニングすることができる。潜在的なBMY_HPP2モジュレーターのスクリーニングに有用なアッセイの例としては、例えばコンピュータアッセイで、インビトロアッセイでおよびハイスループットアッセイでのスクリーニング法を含むが、これらに限定されない。最後に、これらの方法は表IXによれば、BMY_HPP2から１つ以上のアミノ酸を改変したりまたは置換することをも含み得る。
【０３１７】
しかしながら、本明細書の開示に基づいて当該分野の当業者によって理解される通り、他の構造ベースの設計方法を使用することができる。様々なコンピュータによる構造ベースの設計方法が当該分野において開示されている。
【０３１８】
例えば、BMY_HPP2の配列および該BMY_HPP2構造（すなわち、表IXで提示する、BMY_HPP2の原子座標および／または活性部位領域の原子座標）を出力することができる多数のコンピュータモデリングシステムを利用することができる。次いで、該コンピュータシステムにより、潜在的なBMY_HPP2モジュレータが結合するこれらの領域の１つ以上についての構造上の詳細を得て、その結果、該潜在的なモジュレーターの相補的な構造上の詳細を決定することができる。これらのモデリングシステムの設計は通常、BMY_HPP2と物理的におよび構造的に会合することができる化合物に基づく。加えて、該化合物はBMY_HPP2と会合することができる立体配座を仮定することができなければいけない。いくつかのモデリングシステムにより、実際の製造および被験の前に、潜在的なBMY_HPP2モジュレーターの潜在的な阻害性または結合性の効果が評価されている。
【０３１９】
あるタンパク質標的と会合するための能力について化学物または断片をスクリーニングする方法もまた十分に知られる。これらの方法は、コンピュータスクリーン上での結合部位の視察によって開始する。次いで、選択した断片または化学物を、BMY_HPP2の１つ以上活性部位領域に位置させる。ドッキングは、例えばINSIGHTII、QUANTAおよびSYBYLなどのソフトウェアを用い、続いてエネルギーの最小化を行ない、そして標準的な分子力学力場（例えば、CHARMMおよびAMBER）を用いた分子動力学によって達成される。本発明に有用な化学断片または化学物の選択を助けるコンピュータプログラムとしては例えば、GRID（グッドフォード(Goodford)による1985）、AUTODOCK（グッドセル(Goodsell)による1990）およびDOCK（クンツらによる1982）を含むが、これらに限定されない。
【０３２０】
好ましい化学物または断片の選択時に、それら各々とBMY_HPP2との関係を視覚化して、次いで１個の潜在的なモジュレーターにアセンブルすることができる。個々の化学物をアセンブルするのに有用なプログラムとしては例えば、SYBYLおよびLeapFrog (トリポスアソシエート(Tripos Associates), St. Louis MO)、LUDI (ボームによる1992)、並びに3D データベースシステム（マーティンによる1992）を含む。
【０３２１】
別法として、空活性部位または場合により公知のインヒビターのある部分を含めた該部位を用いて、新規な化合物を設計することができる。このタイプの設計法としては例えば、LUDI（ボームによる1992）およびLeapFrog（トリポスアソシエート、St. Louis MO）を含むが、これらに限定されない。
【０３２２】
加えて、BMY_HPP2はコンビナトリアル化学を含めた最新の方法に総合的に十分に適合する。
【０３２３】
DOCK（クルツらによる1982）などのプログラムは、相同性モデル由来の原子座標と一緒に用いて、データベースまたは視覚的なデータベース由来の潜在的なリガンド（これは、金属結合領域において潜在的に結合し、従って製造および被験のための適当な候補となり得る）を同定することができる。
【０３２４】
加えて、BMY_HPP2の３次元相同性モデルは、改変された生物学的活性を有する変異体の設計を助けるであろう。
【０３２５】
多数のポリヌクレオチド配列（例えば、EST配列）は公的に入手することができ、そして配列データベースによってアクセスすることができる。これらの配列のいくつかは配列番号151に関するものであり、このものは本発明の着想の前に、公的に入手することができる。それらの関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲内から具体的に除くことが好ましい。全ての関連する配列を例示することは、厄介であろう。従って、一般式a−bによって記載されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの１つ以上を本発明から除くことが好ましい。ここで、aとは配列番号151の1〜864の間のいずれかの整数であり、bとは15〜878の間の整数であり、aおよびbの両方が配列番号151に示されるヌクレオチド残基の位置に相当して、そしてbはa＋14以上である。
【０３２６】
遺伝子番号3によってコードされるポリペプチドの特徴
配列番号7（図3）に記載するポリヌクレオチド配列によってコードされおよび／または寄託されたクローンであるBMY_HPP3内に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号8（図3）として提示されるこの遺伝子に相当するポリペプチド断片は、多数のホスファターゼに対するヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルで有意な相同性を有する。該ホスファターゼとしては、例えばヒトタンパク質チロシンホスファターゼPTPCAAX1タンパク質（HS PTPCAAX1；ジェンバンク受託番号gi|AAB40597；配列番号33）；ヒトタンパク質チロシンホスファターゼPTPCAAX2（HS_PTPCAAX2；ジェンバンク受託番号gi|AAB40598；配列番号34）；マウスプレニル化タンパク質チロシンホスファターゼ（MM_PTPCAAX；ジェンバンク受託番号gi|JC5981；配列番号35）；およびショウジョウバエPRL-1タンパク質（DM_PRL1；ジェンバンク受託番号gi|AAF53506；配列番号36）（これらは、BLASTPによって決定される）を含む。これらのタンパク質とヒトホスファターゼポリペプチドとのアラインメントを図8に提示する。
【０３２７】
BMY_HPP3は、ショウジョウバエ、マウスおよびヒトのプレニル化ホスホチロシンホスファターゼ（PTPCAAXタンパク質）に対する類似度に基づいて、プレニル化されたリンタンパク質ホスファターゼであると予想される。保存された触媒残基において、図8に示す通り、保存アスパラギン酸（「D」）および保存求核性システイン（「C」）が存在する。C-末端において、コンセンサスプレニル化部位がBMY_HPP3に保存されており、このことにより、該タンパク質はファルネシル化またはゲラニル化によって翻訳後に改変され得ることを示唆する。
【０３２８】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、以下の核酸配列を含む：
ATGGCTAGAATGAACCTCCCTGCTTCTGTGGACATTGCATACAAAAATGT
GAGATTTCTTATTACACACAACCCAACCAATACCTACTTTAATAGATTCTT
ACAGGAACTTAAGCAGGATGGAGTTACCACCATAGTAAGAGTATGAAAA
GCAACTTACAACATTGCTCTTTTAGAGAAGGGAAGCATCCAGGTTCCGGA
CTGGCCTTTTGATGATGGTACAGCACCATCCAGCCAGATAATTGATAACTG
GTTAAAACTTATGAAAAATAAATTTCATGAAGATCCTGGTTGTTGTATTGC
AATTCACTGTGTTGTAGGTTTTGGGTGAGCTCCAGTTGCTAGTTGCCCTAG
CTTTAATTGAAGGTGGAATGAAATATGAAAATGTAGTACAGTTCATCAGA
TAAAAGTGACATGGAACTTTTAACAGCAAACAACTTTTGTATTTGGAGAA
ATATTGTCTTAAAATATGCTTGCACCTCAGAAATCCCAGAAATAACTGTTT
CCTTCAG（配列番号83）。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドをも提供する。
【０３２９】
本発明の好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む：
MARMNLPASVDIAYKNVRFLITHNPTNTYFNRFLQELKQDGVTTIVRVKATY
NIALLEKGSIQVPDWPFDDGTAPSSQIIDNWLKLMKNKFHEDPGCCIAIHCVV
GFGELQLLVALALIEGGMKYENVVQFIRKHGTFNSKQLLYLEKYCLKICLHLR
NPRNNCPLQ（配列番号84）。これらのポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドをまた提供する。
【０３３０】
ホスファターゼタンパク質の要素に対する強い相同性に基づいて、本発明のヒトBMY_HPP3ホスファターゼがコードするポリペプチドは、ホスファターゼタンパク質、好ましくは新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼの要素、特に好ましくは本明細書に記載する新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼとの少なくともある生物学的活性を有することが予想される。
【０３３１】
本発明は、ホスファターゼ関連障害（これは、糖尿病などの代謝性障害、加えて神経および／または心血管の疾患および障害を含むが、これらに限定されない）の治療、検出、軽減または予防のための、BMY_HPP3インビターおよび／またはBMY_HPP3活性のアクチベーターの使用を包含する。本発明はまた、BMY_HPP3インヒビターおよび／またはBMY_HPP3活性のアクチベーターの免疫抑制薬、抗炎症薬および／または抗腫瘍薬としての使用をも包含する。
【０３３２】
本発明は、キナーゼ活性が十分でない疾患を診断し、予後し、治療し、軽減しおよび／または予防するための治療学的なレジメにおける、BMY_HPP3ホスファターゼインヒビター（これは、アンチセンス核酸などの拮抗薬を含む）、加えて本明細書に記載する他の拮抗薬の使用を包含する。不十分なキナーゼ活性が原因で起こり得る疾患の限定されない１例はあるタイプの糖尿病であり、これはインシュリン受容体シグナル経路に関与する１つ以上のキナーゼが例えば、不十分な活性または不十分な発現を有し得る。
【０３３３】
その上、キナーゼ活性が過度に高い疾患および／または障害（例えば、キナーゼオンコジーン産物が過剰な活性および過剰な発現を有する癌）の診断、予後、治療、軽減および／または予防のための本明細書に記載の遺伝子治療学的レジメにおける、BMY_HPP3ホスファターゼアクチベーターの使用またはBMY_HPP3ホスファターゼ遺伝子もしくはタンパク質の使用を包含する。
【０３３４】
本発明はまた、BMY_HPP3タンパク質の触媒的に不活性な変異体（これは、その断片を含む）の使用（例えば、タンパク質療法）、または例えばホスファターゼ活性が過度に高い疾患および／または障害の診断、予後、軽減および／または予防における該コードするポリヌクレオチド配列の使用（例えば、遺伝子療法）をも含む。
【０３３５】
本発明はまた、診断における該BMY_HPP3ポリペプチド（これは、その断片および／または変異体を含む）に関する抗体の使用（例えば、生物マーカーおよび／または治療薬として）をも包含する。
【０３３６】
本発明は、細胞リンタンパク質またはリンペプチドのライブラリーと結合する基質トラップ変異体としての該BMY_HPP3ホスファターゼの不活性な非触媒的変異体を使用して、該BMY_HPP3ポリペプチドの基質を同定することを包含する。
【０３３７】
本発明は、インビトロまたは「仮想的」（コンピューター）でのスクリーニング法を用いて、BMY_HPP3ホスファターゼ活のインヒビターまたはアクチベーターを同定するために、該BMY_HPP3ポリペプチドの使用を包含する。
【０３３８】
本発明の１態様は、該BMY_HPP3ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法は以下の工程を含む：i）分析的に検出可能な試薬を用いて標識化したBMY_HPP3ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターを、該インヒビターまたはアクチベーターとの複合体を形成するのに十分な条件で、該BMY_HPP3ホスファターゼと接触させ；ii）該複合体と同定する化合物を含有する試料とを接触させ；および、iii）該被験化合物が該複合体中の標識化された公知のBMY_HPP3ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターの量を改変する能力を検出することによって、インヒビターまたはアクチバーターとしての化合物を同定することを含む。
【０３３９】
本発明の別の態様は、BMY_HPP3ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法はi）該BMY_HPP3ホスファターゼと同定する化合物とを接触させ；およびii）該基質からホスファターゼを取り出す該BMY_HPP3ホスファターゼの能力を測定する工程を含む。
【０３４０】
本発明はまた、該BMY_HPP3ホスファターゼについてのリガンドを同定する方法をも包含し、該方法はi）結合が可能な条件で、該BMY_HPP3ホスファターゼを化合物群と接触させ；およびii）いずれかのリガンドと結合したタンパク質の存在を検出する工程を含む。
【０３４１】
上記の方法は、全細胞、サイトゾルの細胞画分、膜細胞画分、精製されたまたは部分的に精製された形態からなる群から選ばれる形態の該BMY_HPP3ホスファターゼを含むことが好ましい。本発明はまた、精製された、実質的に精製されたまたは精製されたいない状態での組換え的に発現したBMY_HPP3ホスファターゼにも関する。本発明は更に、当該分野で知られたりまたは本明細書中に記載するタンパク質、ペプチドまたは他の分子と融合したりまたは接合したBMY_HPP3ホスファターゼに関する。
【０３４２】
本発明はまた、上記の方法で同定された化合物および医薬的に許容し得る担体を含有する該BMY_HPP3ホスファターゼポリペプチドの医薬組成物をも包含する。
【０３４３】
遺伝子番号4によってコードされるポリペプチドの特徴
配列番号9（図4）に記載するポリヌクレオチド配列によってコードされおよび／または寄託されたクローンであるBMY_HPP4内に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号10（図4）として提示されるこの遺伝子に相当するポリペプチド断片は、多数のホスファターゼに対するヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルで有意な相同性を有する。該ホスファターゼとしては、例えばマウス骨精巣タンパク質チロシンホスファターゼ（MM_OST-PTP；ジェンバンク受託番号gi|AAG28768；配列番号37）；およびラットタンパク質チロシンホスファターゼ（RN_PTP-OST；ジェンバンク受託番号gi|A55148；配列番号38）（これらは、BLASTPによって決定される）を含む。これらのタンパク質とヒトホスファターゼポリペプチドとのアラインメントを図9に提示する。
【０３４４】
BMY_HPP4は、ラット骨精巣受容体タンパク質−チロシン−ホスファターゼ前駆体（ジェンバンク受託番号1083770）およびマウス受容体タンパク質−チロシン−ホスファターゼ前駆体（ジェンバンク受託番号11066925）に対するその相同性に基づいてリンタンパク質ホスファターゼであると予想される。該BMY_HPP4ポリペプチドは、配列番号10（図4）のアミノ酸182に保存アスパラギン酸（「D」）を、配列番号10（図4）のアミノ酸216に触媒システイン（「C」）を、および配列番号10（図4）のアミノ酸227に保存アルギニン(「R」）を含むことが分かった。
【０３４５】
BMY_HPP4の予想されるエキソン構造を表Vに提示する。「開始」および「終わり」の表示は、それらがBAC AL 354751において示す通り、該BMY_HPP4の個々のヌクレオチド位置を意味する。番号付けはBAC AL354751の開始部で始め、BACのヌクレオチド71352はBMY_HPP4転写物（配列番号9；図4）のヌクレオチド1に等しい。
【０３４６】
ホスファターゼタンパク質の要素に対する強い相同性に基づいて、本発明のヒトBMY_HPP4ホスファターゼがコードするポリペプチドは、ホスファターゼタンパク質、好ましくは新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼの要素、特に好ましくは本明細書に記載する新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼとの少なくともある生物学的活性を有することが予想される。
【０３４７】
本発明は、ホスファターゼ関連障害（これは、糖尿病などの代謝性障害、加えて神経および／または心血管の疾患および障害を含むが、これらに限定されない）の治療、検出、軽減または予防のための、BMY_HPP4インビターおよび／またはBMY_HPP4活性のアクチベーターの使用を包含する。本発明はまた、BMY_HPP4インヒビターおよび／またはBMY_HPP4活性のアクチベーターの免疫抑制薬、抗炎症薬および／または抗腫瘍薬としての使用をも包含する。
【０３４８】
本発明は、キナーゼ活性が十分でない疾患を診断し、予後し、治療し、軽減しおよび／または予防するための治療学的なレジメにおける、BMY_HPP4ホスファターゼインヒビター（これは、アンチセンス核酸などの拮抗薬を含む）、加えて本明細書に記載する他の拮抗薬の使用を包含する。不十分なキナーゼ活性が原因で起こり得る疾患の限定されない１例はあるタイプの糖尿病であり、これはインシュリン受容体シグナル経路に関与する１つ以上のキナーゼが例えば、不十分な活性または不十分な発現を有し得る。
【０３４９】
その上、キナーゼ活性が過度に高い疾患および／または障害（例えば、キナーゼオンコジーン産物が過剰な活性および過剰な発現を有する癌）の診断、予後、治療、軽減および／または予防のための本明細書に記載の遺伝子治療学的レジメにおける、BMY_HPP4ホスファターゼアクチベーターの使用またはBMY_HPP4ホスファターゼ遺伝子もしくはタンパク質の使用を包含する。
【０３５０】
本発明はまた、BMY_HPP4タンパク質の触媒的に不活性な変異体（これは、その断片を含む）の使用（例えば、タンパク質療法）、または例えばホスファターゼ活性が過度に高い疾患および／または障害の診断、予後、軽減および／または予防における該コードするポリヌクレオチド配列の使用（例えば、遺伝子療法）をも含む。
【０３５１】
本発明はまた、診断における該BMY_HPP4ポリペプチド（これは、その断片および／または変異体を含む）に関する抗体の使用（例えば、生物マーカーおよび／または治療薬として）をも包含する。
【０３５２】
本発明は、細胞リンタンパク質またはリンペプチドのライブラリーと結合する基質トラップ変異体としての該BMY_HPP4ホスファターゼの不活性な非触媒的変異体を使用して、該BMY_HPP1ポリペプチドの基質を同定することを包含する。
【０３５３】
本発明は、インビトロまたは「仮想的」（コンピューター）でのスクリーニング法を用いて、BMY_HPP4ホスファターゼ活のインヒビターまたはアクチベーターを同定するために、該BMY_HPP4ポリペプチドの使用を包含する。
【０３５４】
本発明の１態様は、該BMY_HPP4ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法は以下の工程を含む：i）分析的に検出可能な試薬を用いて標識化したBMY_HPP4ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターを、該インヒビターまたはアクチベーターとの複合体を形成するのに十分な条件で、該BMY_HPP4ホスファターゼと接触させ；ii）該複合体と同定する化合物を含有する試料とを接触させ；および、iii）該被験化合物が該複合体中の標識化された公知のBMY_HPP4ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターの量を改変する能力を検出することによって、インヒビターまたはアクチバーターとしての化合物を同定することを含む。
【０３５５】
本発明の別の態様は、BMY_HPP4ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法はi）該BMY_HPP4ホスファターゼと同定する化合物とを接触させ；およびii）該基質からホスファターゼを取り出す該BMY_HPP4ホスファターゼの能力を測定する工程を含む。
【０３５６】
本発明はまた、該BMY_HPP4ホスファターゼについてのリガンドを同定する方法をも包含し、該方法はi）結合が可能な条件で、該BMY_HPP4ホスファターゼを化合物群と接触させ；およびii）いずれかのリガンドと結合したタンパク質の存在を検出する工程を含む。
【０３５７】
上記の方法は、全細胞、サイトゾルの細胞画分、膜細胞画分、精製されたまたは部分的に精製された形態からなる群から選ばれる形態の該BMY_HPP4ホスファターゼを含むことが好ましい。本発明はまた、精製された、実質的に精製されたまたは精製されたいない状態での組換え的に発現したBMY_HPP4ホスファターゼにも関する。本発明は更に、当該分野で知られたりまたは本明細書中に記載するタンパク質、ペプチドまたは他の分子と融合したりまたは接合したBMY_HPP4ホスファターゼに関する。
【０３５８】
本発明はまた、上記の方法で同定された化合物および医薬的に許容し得る担体を含有する該BMY_HPP4ホスファターゼポリペプチドの医薬組成物をも包含する。
【０３５９】
正常な組織におけるBMY_HPP4ポリペプチドの発現プロファイリングは、BMY_HPP4がいずれかの他の組織中よりも小脳中でより高いレベルで発現することを示した。このことは、神経学的な障害（例えば、うつ病、双極性障害、精神分裂病、痴呆および認知障害）の処置におけるBMY_HPP4活性のモジュレーターの役割を示唆する（図34に示す通り）。BMY_HPP4はまた、脳の他のサブ領域においてより低レベルで発現した。加えて、BMY_HPP4は松果体および下垂体中で有意なレベルで発現し、このことは内分泌性障害におけるBMY_HPP4活性のモジュレーターの役割を示唆した。
【０３６０】
小脳における局在化された発現と合わせて、二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、BMY_HHPP4ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが神経変性疾患状態、行動障害または炎症性病気を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。代表的な使用は、以下の「再生」および「過剰増殖性障害」の項目、実施例および本明細書の他所に記載する。要するに、該使用としては例えば、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、ハンチントン舞踏病、ツーレット症候群、髄膜炎、脳炎、脱髄性疾患、末梢性ニューロパチー、異常増殖、トラウマ、先天性奇形、脊椎損傷、虚血および梗塞、動脈瘤、出血、精神分裂病、躁病、痴呆、妄想症、強迫性障害、うつ病、パニック障害、学習障害、ALS、精神病、自閉症および改変行動(altered behavior)（これは、摂食、睡眠パターン、バランスおよび近くにおける障害を含む）の検出、治療および／または予防を含むが、これらに限定されない。加えて、脳の領域におけるこの遺伝子産物の発現の増大は、それが正常な神経機能の役割を果たしていることを示す。潜在的に、この遺伝子産物はシナップス形成、神経伝達、学習、認知、ホメオスタシスまたは神経分化または生存に関与する。更に、該タンパク質はまた、生物学的活性を測定するのに、腫瘍マーカーとしての抗体を産生するのに、同族リガンドまたは受容体を単離するのに、それらの相互作用をモジュレートする薬物を同定するのに、加えて栄養上のサプリメントとして使用するのに使用することができる。タンパク質、並びに該タンパク質に対する抗体は、上記の組織についての腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的としての有用性を示し得る。
【０３６１】
松果体および下垂体中での局在化された発現と合わせて、二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、BMY_HPP4ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが内分泌性疾患および／または障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。該疾患などとしては例えば、異常な成長ホルモンの産生および／または分泌、異常なプロラクチンの産生および／または分泌、異常な黄体形成ホルモンの産生および／または分泌、異常な卵胞刺激ホルモンの産生および／または分泌、異常な甲状腺刺激ホルモンの産生および／または分泌、異常な副腎皮質刺激ホルモンの産生および／または分泌、異常なバソプレッシンの分泌、異常なオキシトシンの分泌、異常な成長、異常な泌乳、異常な性的特性発生、異常なテストステロンの産生および／または分泌、異常なエストロゲンの産生および／または分泌、異常な水ホメオスタシス、生殖機能不全、アジソン病、甲状腺機能低下症、クッシング症候群、末端肥大症、巨人症、嗜眠、オステオポローシス、異常なカルシウムホメオスタシス、異常なカリウムホメオスタシス、生殖障害および発育性障害を含むが、これらに限定されない。
【０３６２】
遺伝子番号5によってコードされたポリペプチドの特徴
配列番号41（図5）に記載するポリヌクレオチド配列によってコードされおよび／または寄託されたクローンであるBMY_HPP5内に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号42（図5）として提示されるこの遺伝子に相当するポリペプチド断片は、多数のホスファターゼに対するヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルで有意な相同性を有する。該ホスファターゼとしては、例えばヒト二重特異性ホスファターゼ8（hs_dspp8；ジェンバンク受託番号gi|NP_004411；配列番号39）およびマウスニューロンチロシン／トレオニンホスファターゼ（r mm_nppl；ジェンバンク受託番号gi|NP_032774；配列番号40）（これらは、BLASTPによって決定される）を含む。これらのタンパク質とヒトホスファターゼポリペプチドとのアラインメントを図10A〜Bに提示する。
【０３６３】
図5A〜E（配列番号41）におけるBMY_HPP5 cDNAの決定されたヌクレオチド配列は、推定分子量が約73kDaである約665アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。予想されるBMY_HPP5ポリペプチドのアミノ酸配列は、図面5A〜E（配列番号42）に示す。図5A〜Eに示す該BMY_HPP5は、いくつかの公知のホスファターゼ、特に二重特性タンパク質ホスファターゼに対する有意な一致度および類似度を有することを決定した。具体的に、図5A〜Eに示す該BMY_HPP5タンパク質は、図12に示す通り、ヒト二重特異性ホスファターゼ8（HS_DSPP8；ジェンバンク受託番号gi|NP_004411；配列番号39）に対する約46％の一致度および58％の類似度；およびマウスニューロンチロシン／トレオニンホスファターゼ1（MM_NPP1；ジェンバンク受託番号gi|NP_032774；配列番号40）に対する約43％の一致度および56％の類似度であることを決定した。
【０３６４】
BMY_HPP5は、公知の二重特異性タンパク質ホスファターゼ（これは、ヒト二重ろくいせいタンパク質ホスファターゼ8（GI 4758212）およびマウスニューロンチロシン／トレオニンホスファターゼ1（GI 6679156）（図10A〜B）に対するその相同性に基づいて、リンタンパク質ホスファターゼをコードすることを予想する。該BMY_HPP5ポリペプチドは、保存された残基（これは、例えば配列番号42のアミノ酸212での触媒的アスパラギン酸（「D」）、アミノ酸244での保存システイン（「C」）およびアミノ酸249でのアルギニン（「R」）を含む）を含むと決定した（図5A〜E）。
【０３６５】
ホスファターゼタンパク質の要素に対する強い相同性に基づいて、本発明のヒトBMY_HPP5ホスファターゼがコードするポリペプチドは、ホスファターゼタンパク質、好ましくは新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼの要素、特に好ましくは本明細書に記載する新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼとの少なくともある生物学的活性を有することが予想される。
【０３６６】
ヒトホスファターゼポリペプチド、BMY_HPP5ポリペプチドをコードする定常状態のmRNAレベルを測定するために設計した発現プロファイリングは、精巣および脊髄において優位に高い発現レベルを；および骨髄、脳、肝臓および胸腺においてより低い程度を示した（図11を参照）。
【０３６７】
その上、正常なヒト組織中でのBMY_HPP5ポリペプチドの発現プロファイリングの増大は、副腎、松果体および下垂体中での最も高いレベルでの発現を示した。このことは、内分泌性障害の処置において有用であり得る（図35において示す通り）。BMY_HPP5はまた高レベルで、小脳において発現し（このことは、神経学的な障害（例えば、うつ病、双極性障害、精神分裂病、痴呆および認知障害）の処置におけるBMY_HPP5活性のモジュレーターの役割を示唆する）；前立腺で発現し（このことは、前立腺癌および前立腺肥大症の処置におけるBMY_HPP5活性のモジュレーターとしての役割を示唆する）；精巣において発現する（このことは、不完全であるかまたは不十分な精子形成によって生じる男性不妊症の処置におけるか、または精巣癌の処置においてBMY_HPP5活性のモジュレーター（避妊薬として）としての役割を示唆する）。BMY_HPP5はまた、多数の他の正常なヒト組織においても低いが有意なレベルで発現した。
【０３６８】
副腎組織中に優位に存在する発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼの強い相同性は、ヒトBMY_HPP5ホスファターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの作動薬、拮抗薬および／または断片を含む）が内分泌性障害を治療し、診断し、予後し、軽減しおよび／または予防するのに有用であり得る。該障害としては、例えば副腎皮質性機能亢進、副腎皮質性機能不全、嗜眠、先天性副腎過形成、異常なACTH制御、異常なアドレナリン制御、P450C21、P450C18、P450C17およびP450C11ヒドロキシラーゼ並びに３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3-HSD)の欠失に関連する障害、多毛症、過少月経、ざ瘡、男性化、過少月経、雌性の偽雌雄同体(female pseudohermaphroditism)、異常な性的性質の発症の発生率に関係する障害、異常なコルチゾル分泌に関係する障害、高血圧症、低カリウム血症、生殖機能不全、異常なアンドロゲンの分泌に関係する障害、副腎多毛症(adrenal virilism)、副腎腺腫、副腎癌腫、異常なアンデロステロンの分泌に関係する障害、アルドステロン症、異常なステロイド生合成に関係する障害、異常なステロイド輸送に関係する障害、異常なステロイド分泌に関係する障害、異常なステロイド排出に関係する障害、アジソン症候群およびクッシング症候群を含むが、これらに限定されない。
【０３６９】
下垂体組織中での優位な局在化された発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、BMY_HPP5ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが内分泌性疾患および／または障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。該疾患などとしては、例えば異常な成長ホルモンの産生および／または分泌、異常なプロラクチンの産生および／または分泌、異常な黄体形成ホルモンの産生および／または分泌、異常な卵胞刺激ホルモンの産生および／または分泌、異常な甲状腺刺激ホルモンの産生および／または分泌、異常な副腎皮質刺激ホルモンの産生および／または分泌、異常なバソプレッシンの分泌、異常なオキシトシンの分泌、異常な成長、異常な泌乳、異常な性的特性発生、異常なテストステロンの産生および／または分泌、異常なエストロゲンの産生および／または分泌、異常な水ホメオスタシス、生殖機能不全、アジソン病、甲状腺機能低下症、クッシング症候群、末端肥大症、巨人症、嗜眠、オステオポローシス、異常なカルシウムホメオスタシス、異常なカリウムホメオスタシス、生殖障害、発育性障害および低い偶発的な光レベルに関連する抑圧を含むが、これらに限定されない。
【０３７０】
精巣組織中での優位な局在化した発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、ヒトBMY_HPP5ホスファターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの拮抗薬および／または断片を含む）が生殖性障害（例えば、男性不妊症、性交不能および／または精巣癌）を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。この遺伝子産物はまた、結合性薬物（例えば、男性避妊薬として有用である薬物（拮抗薬））を同定するために設計されたアッセイにおいても有用であり得る。精巣はまた、身体の他の組織において特に低レベルで発現する転写物の活性な遺伝子発現の部位でもある。従って、この遺伝子産物は、他のプロセス（例えば、いわゆるいくつかのあり得る標的適応症を挙げると、造血、炎症、骨形成および腎臓機能）において関連する機能的な役割を果たし得る他の特異的な組織または器官において発現し得る。実際、特定のホスファターゼの発現の増大は、精巣癌の腫瘍マーカーとして同定されている（例えば、Koshida, K., Nishino, A., Yamamoto, H., Uchibayashi, T., Naito, K., Hisazumi, H., Hirano, K., Hayashi, Y., Wahren, B., Andersson, LによるJ. Urol., 146 (1) : 57-60, (1991)；およびKlein, EAによるUrol. Clin. North. Am., 20 (1) : 67-73, (1993)を参照）。
【０３７１】
あるいは、脊髄および脳組織中での有意な局在化された発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、ヒトホスファターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドが神経性疾患および／または障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得る。代表的な使用は、以下の項目「神経学的な疾患(Neurological Diseases)」および本明細書の他所に記載する。要するに、神経組織中での発現は、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、ハンチントン舞踏病、ツーレット症候群、髄膜炎、脳炎、脱髄性疾患、末梢性ニューロパチー、異常増殖、トラウマ、先天性奇形、脊椎損傷、虚血および梗塞、動脈瘤、出血、精神分裂病、躁病、痴呆、妄想症、強迫性障害、うつ病、パニック障害、学習障害、ALS、精神病、自閉症および改変行動(altered behavior)（これは、摂食、睡眠パターン、バランスおよび近くにおける障害を含む）における役割を示す。加えて、脳の領域におけるこの遺伝子産物の発現の増大は、それが正常な神経機能の役割を果たしていることを示す。潜在的に、この遺伝子産物はシナップス形成、神経伝達、学習、認知、ホメオスタシスまたは神経分化または生存に関与する。更に、該タンパク質はまた、生物学的活性を測定するのに、腫瘍マーカーとしての抗体を産生するのに、同族リガンドまたは受容体を単離するのに、それらの相互作用をモジュレートする薬物を同定するのに、加えて栄養上のサプリメントとして使用するのに使用することができる。タンパク質、並びに該タンパク質に対する抗体は、上記の組織についての腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的としての有用性を示し得る。
【０３７２】
その上、肝臓における組織分布は、このクローンのタンパク質産物が肝臓の障害および癌の検出および処置に有用であろうことを示す。代表的な使用は、以下の項目の「過剰増殖性疾患(Hyperproliferative Disorders)」および「結合活性」、並びに本明細書の他所に記載する。要するに、該タンパク質は肝芽腫、黄疸、肝炎、肝臓代謝性疾患および病気（これは、肝細胞前駆体細胞の分化に帰する）の検出、治療および／または予防に使用することができる。加えて、胎児中での発現は、発育性異常症、胎児性欠乏症、出生前障害、および様々な創傷治癒疾患および／または組織外傷における該タンパク質産物の有用な機能を示唆するであろう。
【０３７３】
その上、ヒトホスファターゼのポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの断片および作動薬を含む）は、特に腎臓性、神経性および生殖性システムの過剰な増殖性障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防することを含む使用を有し得る。それらの障害としては例えば、癌および転移反応を含み得る。
【０３７４】
該ヒトホスファターゼのポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの断片および作動薬を含む）は、免疫応答を直接的にまたは間接的に追加免疫することを含む使用を有し得る。
【０３７５】
該ヒトホスファターゼのポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの断片および拮抗薬を含む）は、ヒトホスファターゼ機能のモジュレーター（これは、抗体（検出または中和のための）を含む）、天然に存在するモジュレーターおよび小分子モジュレーターの同定を含めた使用を有し得る。該ヒトホスファターゼタンパク質のドメインに対する抗体は、患者における心血管性疾患および炎症性疾患の診断用薬物として使用することができ、シグナル伝達経路の活性化を追跡するのに有用であり、そして疾患状態におけるホスファターゼの関与についての生物マーカーとしておよびインビボでのホスファターゼのインヒビターの評価において使用することができる。
【０３７６】
ヒトホスファターゼのポリペプチドおよびポリヌクレオチドは別の使用を有しており、該使用はヒトホスファターゼ配列をプローブとして使用することによる該ヒトホスファターゼ遺伝子における突然変異を同定することによるか、またはヒトホスファターゼタンパク質もしくはmRNAの発現レベルを測定することによって、ヒトホスファターゼの過剰および／または過少発現に関連する疾患を診断することを含む。ヒトホスファターゼポリペプチドは、該タンパク質の活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするのに有用であり得る。ヒトホスファターゼペプチドはまた、特定の抗体の産生のためにおよび酵母２種ハイブリッドスクリーニングにおけるベイト(bait)として使用して、ヒトホスファターゼと特異的に相互作用するタンパク質を見出すことができる（本明細書の他所に記載する）。
【０３７７】
該コードされたポリペプチドはホスファターゼタンパク質（特に、二重特異性ホスファターゼ）との少なくともある生物学的活性を有し得ると考えられているが、本クローンの正確な生物学的機能を測定するいくつかの方法が当該分野で知られていたりまたは本明細書の他所に記載する。要するに、このクローンの機能は、マイクロアレイ方法論を適用することによって測定することができる。該ヒトホスファターゼポリヌクレオチドに対応する核酸、加えて本発明の他のクローンは、発現プロファイリングのためのマイクロチップ上にアレイすることができる。ポリヌクレオチドプローヌを用いて該スライドにハイブリダイスさせることによって、ある遺伝子の発現の変化は研究する条件に基づく本遺伝子の機能に別の洞察を与え得る。例えば、該使用したポリヌクレオチドプローブが正常な組織と比べて疾患した心臓組織から生じる場合に観察される発現レベルの増減は、心臓の機能を調節する機能を示唆し得る。ヒトBMY_HPP5ホスファターゼの場合に、精巣、脊髄、脳、肝臓、骨髄および胸腺組織を用いて、例えばプローブを製造するためのRNAを抽出することができる。
【０３７８】
加えて、該タンパク質の機能は、例えば定量的PCR方法を適用することによって評価することができる。リアルタイムの定量的PCRにより、例えばヒトホスファターゼ遺伝子全般の発生の発現の能力を示す。定量的PCR方法は、そういった実験を行なうのに必要とされる各々の発生的に重要な工程由来の組織の名目上の量のみを必要とする。従って、このポリペプチドの生物学的機能を洗練するための定量的PCR方法論の利用は本発明に包含する。ヒトホスファターゼの場合に、ヒトホスファターゼに関連する疾患相関は、正常な組織中でのヒトホスファターゼのmRNA発現レベルを、疾患組織（特に、疾患組織は精巣、脊髄、脳、肝臓、骨髄および胸腺組織から単離される）の場合と比較することによって、得ることができる。疾患組織におけるヒトホスファターゼの有意により高いかまたは低い発現は、ヒトホスファターゼが疾患の進行において機能することができて、そしてヒトホスファターゼポリペプチドに対する拮抗薬が該疾患を治療し、予防しおよび／または軽減する際に治療学的に有用であろうことを示唆し得る。あるいは、該疾患組織におけるヒトホスファターゼ発現の有意により高いかまたは低いレベルは、ヒトホスファターゼが疾患の進行について防御的な機能を果たしており、そしてヒトホスファターゼポリペプチドの作動薬が該疾患を治療し、予防しおよび／または軽減する際に治療学的に有用であり得ることを示唆し得る。本発明はまた、配列番号41（図4A〜D）に提示するポリヌクレオチド配列に相当する定量的PCRプローブを包含する。
【０３７９】
該タンパク質の機能はまた、酵母菌中での相補性アッセイを用いてアッセイすることもできる。例えば、ヒトホスファターゼの場合には、例えばプリン作動性受容体活性が欠失している酵母菌を形質転換し、そしてそれらの増殖する能力を評価することにより、該ヒトホスファターゼポリペプチドがプリン作動性受容体活性を有することを確信させる証拠を得るであろう。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの機能を評価するのに使用することができる別のアッセイ条件および方法は、当該分野において知られており、そのいくつかは本明細書の他所に開示する。
【０３８０】
あるいは、該コードされたポリペプチドの生物学的機能は、マウスおよび／またはラットにおける本ポリペプチドのホモログを破壊し、そしてえられた表現型を観察することによって測定することができる。該ノックアウト実験は当該分野において知られており、そのいくつかは本明細書の他所に開示する。
【０３８１】
その上、このポリペプチドの生物学的機能は、アンチセンスおよび／またはセンス方法論の適用、並びに得られたトランスジェニックなマウスおよび／またはラットの発生によって測定することができる。トランスジェニックなマウスまたはラットにおけるセンスまたはアンチセンスのいずれかの配向である遺伝子を発現することにより、ある遺伝子の比較的により高いかまたは低い発現レベルを生じ得る。遺伝子の内因性の発現レベルを変えることにより、ある表現型を観察することができるようになり、次いでこのものを用いて該遺伝子の機能に関する指標を導くことができる。該遺伝子は強い遍在性のプロモーターを使用することにより、いつでも該生物のあらゆる細胞中で過剰発現させたりまたは過少発現させることができたり、そのものを十分に確認された組織特異的プロモーター（例えば、腎臓、肺、脊髄または精巣組織に特異的なプロモーター）を用いて該生物の１つ以上の別々の部分中で発現することができ、あるいはそのものを誘発的におよび／または発生的に調節されたプロモーターを用いて発生の具体的な時期に発現させることができる。
【０３８２】
ヒトホスファターゼのトランスジェニックなマウスまたはラットの場合、正常な増殖条件において表現型が全く出現しない場合には、疾患状態（腎臓、肺、神経または生殖性の障害、加えて癌など）下の生物を観察することにより、該遺伝子の機能を理解することができる。従って、該ポリペプチドの生物学的機能を洗練する(refine)ためにトランスジェニックなマウスまたはラットの創製についてのアンチセンスおよび／またはセンス方法論の出願は、本発明に包含する。
【０３８３】
好ましい態様において、以下のN-末端欠失変異体を本発明に包含する：配列番号42中、M1-S665、A2-S665、H3-S665、E4-S665、M5-S665、16-S665、G7-S665、T8-S665、Q9-S665、I10-S665、Vll-S665、T12-S665、E13-S665、R14-S665、L15-S665、V16-S665、A17-S665、L18-S665、L19-S665、E20-S665、S21-S665、G22-S665、T23-S665、E24-S665、K25-S665、V26-S665、L27-S665、L28-S665、I29-S665、D30-S665、S31-S665、R32-S665、P33-S665、F34-S665、V35-S665、E36-S665、Y37-S665、N38-S665、T39-S665、S40-S665、H41-S665、I42-S665、L43-S665、E44-S665、A45-S665、I46-S665、N47-S665、I48-S665、N49-S665、C50-S665、S51-S665、K52-S665、L53-S665、M54-S665、K55-S665、R56-S665、R57-S665、L58-S665、Q59-S665、Q60-S665、D61-S665、K62-S665、V63-S665、L64-S665、165-S665、T66-S665、E67-S665、L68-S665、I69-S665、Q70-S665、H71-S665、S72-S665、A73-S665、K74-S665、H75-S665、K76-S665、V77-S665、D78-S665、179-S665、D80-S665、C81-S665、S82-S665、Q83-S665、K84-S665、V85-S665、V86-S665、V87-S665、Y88-S665、D89-S665、Q90-S665、S91-S665、S92-S665、Q93-S665、D94-S665、V95-S665、A96-S665、S97-S665、L98-S665、S99-S665, S100-S665, D101-S665, C102-S665, F103-S665, L104-S665, T105-S665, V106-S665, L107-S665, L108-S665, G109-S665, K110-S665, L111-S665, E112-S665, K113-S665, S114-S665, F115-S665, N116-S665, S117-S665, V118-S665, H119-S665, L120-S665, L121-S665, A122-S665, G123-S665, G124-S665, F125-S665, A126-S665, E127-S665, F128-S665,S129-S665, R130-S665, C131-S665, F132-S665, P133-S665, G134-S665, L135-S665, C136-S665, E137-S665, G138-S665, K139-S665, S140-S665, T141-S665, L142-S665, V143-S665, P144-S665, T145-S665, C146-S665, 1147-S665, S148-S665, Q149-S665, P150-S665, C151-S665, L152-S665, P153-S665, V154-S665, A155-S665, N156-S665, I157-S665, G158-S665, P159-S665, T160-S665, R161-S665, I162-S665, L163-S665, P164-S665, N165-S665, L166-S665, Y167-S665, L168-S665, G169-S665, C170-S665, Q171-S665, R172-S665, D173-S665, V174-S665, L175-S665, N176-S665, K177-S665, E178-S665, L179-S665, M180-S665, Q181-S665, Q182-S665, N183-S665, G184-S665, I185-S665, G186-S665, Y187-S665, V188-S665, L189-S665, N190-S665, A191-S665, S192-S665, N193-S665, T194-S665, C195-S665, P196-S665, K197-S665, P198-S665, D199-S665, F200-S665, 1201-S665, P202-S665, E203-S665, S204-S665, H205-S665, F206-S665, L207-S665, R208-S665, V209-S665, P210-S665, V211-S665, N212-S665, D213-S665, S214-S665, F215-S665, C216-S665, E217-S665, K218-S665, I219-S665, L220-S665, P221-S665, W222-S665, L223-S665, D224-S665, K225-S665, S226-S665, V227-S665, D228-S665, F229-S665, I230-S665, E231-S665, K232-S665, A233-S665, K234-S665, A235-S665, S236-S665, N237-S665, G238-S665, C239-S665, V240-S665, L241-S665, V242-S665, H243-S665, C244-S665, L245-S665, A246-S665, G247-S665, I248-S665, S249-S665, R250-S665, S251-S665, A252-S665, T253-S665, I254-S665, A255-S665, I256-S665, A257-S665, Y258-S665, I259-S665, M260-S665, K261-S665, R262-S665, M263-S665, D264-S665, M265-S665, S266-S665, L267-S665, D268-S665, E269-S665, A270-S665, Y271-S665, R272-S665, F273-S665, V274-S665, K275-S665, E276-S665, K277-S665, R278-S665, P279-S665, T280-S665, I281-S665, S282-S665, P283-S665, N284-S665, F285-S665, N286-S665, F287-S665, L288-S665, G289-S665, Q290-S665, L291-S665, L292-S665, A293-S665, Y294-S665, E295-S665, K296-S665, K297-S665, I298-S665, K299-S665, N300-S665, Q301-S665, T302-S665, G303-S665, A304-S665, S305-S665, G306-S665, P307-S665, K308-S665, S309-S665, K310-S665, L311-S665, K312-S665, L313-S665, L314-S665, P315-S665, L316-S665, E317-S665, K318-S665, P319-S665, N320-S665, E321-S665, P322-S665, V323-S665, P324-S665, A325-S665, V326-S665, S327-S665, E328-S665, G329-S665, G330-S665, Q331-S665, K332-S665, S333-S665, E334-S665, T335-S665, P336-S665, L337-S665, S338-S665, P339-S665, P340-S665, C341-S665, A342-S665, D343-S665, S344-S665, A345-S665, T346-S665, S347-S665, E348-S665, A349-S665, A350-S665, G351-S665, Q352-S665, R353-S665, P354-S665, V355-S665, H356-S665, P357-S665, A358-S665, S359-S665, V360-S665, P361-S665, S362-S665, V363-S665, P364-S665, S365-S665, V366-S665, Q367-S665, P368-S665, S369-S665, L370-S665, L371-S665, E372-S665, D373-S665, S374-S665, P375-S665, L376-S665, V377-S665, Q378-S665, A379-S665, L380-S665, S381-S665, G382-S665, L383-S665, H384-S665, L385-S665, S386-S665, A387-S665, D388-S665, R389-S665, L390-S665, E391-S665, D392-S665, S393-S665, N394-S665, K395-S665, L396-S665, K397-S665, R398-S665, S399-S665, F400-S665, S401-S665, L402-S665, D403-S665, I404-S665, K405-S665, S406-S665, V407-S665, S408-S665, Y409-S665, S410-S665, A411-S665, S412-S665, M413-S665, A414-S665, A415-S665, S416-S665, L417-S665, H418-S665, G419-S665, F420-S665, S421-S665, S422-S665, S423-S665, E424-S665, D425-S665, A426-S665, L427-S665, E428-S665, Y429-S665, Y430-S665, K431-S665, P432-S665, S433-S665, T434-S665, T435-S665, L436-S665, D437-S665, G438-S665, T439-S665, N440-S665, K441-S665, L442-S665, C443-S665, Q444-S665, F445-S665, S446-S665, P447-S665, V448-S665, Q449-S665, E450-S665, L451-S665, S452-S665, E453-S665, Q454-S665, T455-S665, P456-S665, E457-S665, T458-S665, S459-S665, P460-S665, D461-S665, K462-S665, E463-S665, E464-S665, A465-S665, S466-S665, I467-S665, P468-S665, K469-S665, K470-S665, L471-S665, Q472-S665, T473-S665, A474-S665, R475-S665, P476-S665, S477-S665, D478-S665, S479-S665, Q480-S665, S481-S665, K482-S665, R483-S665, L484-S665, H485-S665, S486-S665, V487-S665, R488-S665, T489-S665, S490-S665, S491-S665, S492-S665, G493-S665, T494-S665, A495-S665, Q496-S665, R497-S665, S498-S665, L499-S665, L500-S665, S501-S665, P502-S665, L503-S665, H504-S665, R505-S665, S506-S665, G507-S665, S508-S665, V509-S665, E510-S665, D511-S665, N512-S665, Y513-S665, H514-S665, T515-S665, S516-S665, F517-S665, L518-S665, F519-S665, G520-S665, L521-S665, S522-S665, T523-S665, S524-S665, Q525-S665, Q526-S665, H527-S665, L528-S665, T529-S665, K530-S665, S531-S665, A532-S665, G533-S665, L534-S665, G535-S665, L536-S665, K537-S665, G538-S665, W539-S665, H540-S665, S541-S665, D542-S665, I543-S665, L544-S665, A545-S665, P546-S665, Q547-S665, T548-S665, S549-S665, T550-S665, P551-S665, S552-S665, L553-S665, T554-S665, S555-S665, S556-S665, W557-S665, Y558-S665, F559-S665, A560-S665, T561-S665, E562-S665, S563-S665, S564-S665, H565-S665, F566-S665, Y567-S665, S568-S665, A569-S665, S570-S665, A571-S665, I572-S665, Y573-S665, G574-S665, G575-S665, S576-S665, A577-S665, S578-S665, Y579-S665, S580-S665, A581-S665, Y582-S665, S583-S665, C584-S665, S585-S665, Q586-S665, L587-S665, P588-S665, T589-S665, C590-S665, G591-S665, D592-S665, Q593-S665, V594-S665, Y595-S665, S596-S665, V597-S665, R598-S665, R599-S665, R600-S665, Q601-S665, K602-S665, P603-S665, S604-S665, D605-S665, R606-S665, A607-S665, D608-S665, S609-S665, R610-S665, R611-S665, S612-S665, W613-S665, H614-S665, E615-S665, E616-S665, S617-S665, P618-S665, F619-S665, E620-S665, K621-S665, Q622-S665, F623-S665, K624-S665, R625-S665, R626-S665, S627-S665, C628-S665, Q629-S665, M630-S665, E631-S665, F632-S665, G633-S665, E634-S665, S635-S665, I636-S665, M637-S665, S638-S665, E639-S665, N640-S665, R641-S665, S642-S665, R643-S665, E644-S665, E645-S665, L646-S665, G647-S665, K648-S665, V649-S665, G650-S665, S651-S665, Q652-S665, S653-S665, S654-S665, F655-S665, S656-S665, G657-S665, S658-S665および／またはM659-S665。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、ヒトBMY_HPP5ホスファターゼN-末端欠失ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用を包含する。
【０３８４】
好ましい態様において、以下のC-末端欠失変異体を本発明に包含する：配列番号42中、M1-S665、M1-V664, M1-E663, Ml-I662, M1-I661, M1-E660, M1-M659, M1-S658, M1-G657, M1-S656, M1-F655, M1-S654, M1-S653, M1-Q652, MI-S651, Ml-G650, M1-V649, M1-K648, M1-G647, M1-L646, M1-E645, M1-E644, M1-R643, M1-S642, M1-R641, M1-N640, M1-E639, M1-S638, M1-M637, M1-I636, M1-S635, M1-E634, M1-G633, M1-F632, M1-E631, Ml-M630, M1-Q629, M1-C628, M1-S627, M1-R626, M1-R625, M1-K624, M1-F623, M1-Q622, M1-K621, M1-E620, M1-F619, M1-P618, M1-S617, M1-E616, M1-E615, M1-H614, M1-W613, M1-S612, M1-R611, M1-R610, M1-S609, M1-D608, M1-A607, M1-R606, M1-D605, M1-S604, M1-P603, M1-K602, M1-Q601, M1-R600, M1-R599, M1-R598, M1-V597, M1-S596, M1-Y595, M1-V594, M1-Q593, M1-D592, M1-G591, M1-C590, M1-T589, M1-P588, M1-L587, M1-Q586, M1-S585, M1-C584, M1-S583, M1-Y582, M1-A581, M1-S580, M1-Y579, M1-S578, M1-A577, M1-S576, M1-G575, M1-G574, M1-Y573, M1-I572, M1-A571, M1-S570, M1-A569, M1-S568, M1-Y567, M1-F566, M1-H565, M1-S564, Mol-5563, Ml-E562, M1-T561, M1-A560, M1-F559, M1-Y558, M1-W557, M1-S556, M1-S555, M1-T554, M1-L553, M1-S552, M1-P551, M1-T550, M1-S549, M1-T548, M1-Q547, M1-P546, M1-A545, M1-L544, M1-I543, M1-D542, M1-S541, M1-H540, M1-W539, M1-G538, M1-K537, M1-L536, M1-G535, M1-L534, M1-G533, M1-A532, M1-S531, M1-K530, M1-T529, M1-L528, M1-H527, M1-Q526, M1-Q525, M1-S524, M1-T523, M1-S522, M1-L521, M1-G520, M1-F519, M1-L518, M1-F517, M1-S516, M1-T515, M1-H514, M1-Y513, M1-N512, M1-D511, M1-E510, M1-V509, M1-S508, M1-G507, M1-S506, M1-R505, M1-H504, M1-L503, M1-P502, M1-S501, M1-L500, M1-L499, M1-S498, M1-R497, MI-Q496, M1-A495, M1-T494, M1-G493, M1-S492, M1-S491, M1-S490, M1-T489, M1-R488, M1-V487, M1-S486, M1-H485, M1-L484, M1-R483, M1-K482, M1-S481, M1-Q480, M1-S479, Ml-D478, M1-S477, M1-P476, M1-R475, M1-A474, M1-T473, M1-Q472, M1-L471, M1-K470, M1-K469, M1-P468, Ml-1467, M1-S466, M1-A465, M1-E464, M1-E463, M1-K462, M1-D461, M1-P460, M1-S459, M1-T458, M1-E457, M1-P456, M1-T455, M1-Q454, M1-E453, M1-S452, M1-L451, M1-E450, M1-Q449, M1-V448, M1-P447, M1-S446, M1-F445, M1-Q444, M1-C443, M1-L442, M1-K441, M1-N440, M1-T439, M1-G438, M1-D437, M1-L436, M1-T435, M1-T434, M1-S433, M1-P432, M1-K431, M1-Y430, M1-Y429, M1-E428, M1-L427, M1-A426, M1-D425, M1-E424, M1-S423, M1-S422, M1-S421, M1-F420, M1-G419, M1-H418, M1-L417, M1-S416, M1-A415, M1-A414, M1-M413, M1-S412, M1-A411, M1-S410, M1-Y409, M1-S408, M1-V407, M1-S406, M1-K405, M1-I404, M1-D403, M1-L402, M1-S401, M1-F400, M1-S399, M1-R398, M1-K397, M1-L396, M1-K395, M1-N394, M1-S393, M1-D392, M1-E391, M1-L390, M1-R389, M1-D388, M1-A387, M1-S386, M1-L385, M1-H384, M1-L383, M1-G382, M1-S381, M1-L380, M1-A379, M1-Q378, M1-V377, M1-L376, M1-P375, M1-S374, M1-D373, M1-E372, M1-L371, M1-L370, M1-S369, M1-P368, M1-Q367, M1-V366, M1-S365, M1-P364, M1-V363, M1-S362, M1-P361, M1-V360, M1-S359, M1-A358, M1-P357, M1-H356, M1-V355, M1-P354, M1-R353, M1-Q352, M1-G351, M1-A350, M1-A349, M1-E348, M1-S347, M1-T346, M1-A345, M1-S344, M1-D343, M1-A342, M1-C341, M1-P340, M1-P339, M1-S338, M1-L337, M1-P336, M1-T335, M1-E334, M1-S333, M1-K332, M1-Q331, M1-G330, M1-G329, M1-E328, M1-S327, M1-V326, M1-A325, M1-P324, M1-V323, M1-P322, M1-E321, M1-N320, M1-P319, M1-K318, M1-E317, M1-L316, M1-P315, M1-L314, M1-L313, M1-K312, M1-L311, Ml-K310, M1-S309, M1-K308, M1-P307, M1-G306, M1-S305, M1-A304, M1-G303, M1-T302, M1-Q301, M1-N300, M1-K299, M1-I298, M1-K297, M1-K296, M1-E295, M1-Y294, M1-A293, M1-L292, M1-L291, M1-Q290, M1-G289, M1-L288, M1-F287, M1-N286, M1-F285, M1-N284, M1-P283, M1-S282, Ml-1281, Ml-T280, M1-P279, M1-R278, M1-K277, M1-E276, M1-K275, M1-V274, M1-F273, M1-R272, M1-Y271, M1-A270, M1-E269, M1-D268, M1-L267, M1-S266, Ml-M265, M1-D264, M1-M263, M1-R262, M1-K261, M1-M260, Ml-I259, M1-Y258, M1-A257, Ml-1256, M1-A255, M1-I254, M1-T253, M1-A252, M1-S251, M1-R250, M1-S249, MI-1248, M1-G247, M1-A246, M1-L245, M1-C244, M1-H243, M1-V242, M1-L241, M1-V240, M1-C239, M1-G238, M1-N237, M1-S236, M1-A235, Ml- K234, M1-A233, M1-K232, M1-E231, M1-I230, M1-F229, M1-D228, M1-V227, M1-S226, M1-K225, M1-D224, M1-L223, M1-W222, M1-P221, M1-L220, Ml-I219, M1-K218, M1-E217, M1-C216, M1-F215, M1-S214, M1-D213, M1-N212, M1-V211, M1-P210, M1-V209, M1-R208, M1-L207, M1-F206, M1-H205, M1-S204, M1-E203, M1-P202, M1-I201, M1-F200, M1-D199, M1-P198, M1-K197, M1-P196, M1-C195, M1-T194, M1-N193, M1-S192, M1-A191, M1-N190, M1-L189, M1-V188, M1-Y187, M1-G186, M1-I185, M1-G184, M1-N183, Ml-Q182, M1-Q181, M1-M180, M1-L179, M1-E178, M1-K177, M1-N176, M1-L175, M1-V174, M1-D173, M1-R172, M1-Q171, M1-C170, M1-G169, M1-L168, M1-Y167, M1-L166, M1-N165, M1-P164, M1-L163, M1-I162, M1-R161, M1-T160, M1-P159, M1-G158, M1-I157, M1-N156, M1-A155, M1-V154, M1-P153, M1-L152, M1-C151, M1-P150, M1-Q149, M1-S148, M1-I147, M1-C146, M1-T145, M1-P144, M1-V143, M1-L142, M1-T141, Ml-S140, M1-K139, M1-G138, M1-E137, M1-C136, M1-L135, M1 G134, M1-P133, M1-F132, M1-C131, M1-R130, M1-S129, M1-F128, M1-E127, M1-A126, M1-F125, M1-G124, M1-G123, M1-A122, M1-L121, Ml-L120, M1-H119, M1-V118, M1-S117, M1-N116, M1-F115, M1-S114, M1-K113, M1-E112, M1-L111, M1-K110, Ml-G109, M1-L108, M1-L107, M1-V106, M1-T105, M1-L104, M1-F103, M1-C102, M1-D101, M1-S100, Ml-S99, Ml-L98, Ml-S97, Ml-A96, M1-V95, M1-D94, M1-Q93, Ml-S92, M1-S91, M1-Q90, M1-D89, M1-Y88, M1-V87, M1-V86, M1-V85, M1-K84, M1-Q83, M1-S82, M1-C81, M1-D80, M1-I79, M1-D78, M1-V77, M1-K76, M1-H75, M1-K74, M1-A73, M1-S72, M1-H71, M1-Q70, M1-I69, M1-L68, M1-E67, M1-T66, M1-I65, M1-L64, M1-V63, M1-K62, M1-D61, M1-Q60, M1-Q59, M1-L58, M1-R57, M1-R56, M1-K55, M1-M54, Ml-L53, M1-K52, M1-S51, M1-C50, M1-N49, M1-I48, M1-N47, M1-I46, M1-A45, M1-E44, M1-L43, M1-I42, M1-H41, M1-S40, M1-T39, M1-N38, M1-Y37, M1-E36, M1-V35, M1-F34, M1-P33, M1-R32, M1-S31, M1-D30, M1-I29, M1-L28, M1-L27, M1-V26, M1-K25, M1-E24, M1-T23, M1-G22, M1-S21, M1-E20, M1-L19, M1-L18, M1-A17, M1-V16, M1-L15, M1-R14, M1-E13, M1-T12, M1-V11, M1-I10, M1-Q9, M1-T8および／またはM1-G7。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、ヒトBMY_HPP5ホスファターゼC-末端欠失ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０３８５】
本発明はまた、該ヒトBMY_HPP5ホスファターゼポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープをも包含する。
【０３８６】
本発明のヒトホスファターゼポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）に基づいて、いくつかのリン酸化部位を含むことが分かった。それらの部位のリン酸化は、ヒトホスファターゼポリペプチドのいくつかの生物学的活性を調節し得る。例えば、特定の部位でのリン酸化は、他の分子（例えば、タンパク質、リガンド、基質、DNAなど）と会合したりまたは結合するタンパク質の能力を調節するのに関与し得る。この場合に、リン酸化は他のポリペプチド、特にヒトホスファターゼの同族リガンドと会合するヒトホスファターゼポリペプチドの能力、またはある細胞シグナル経路を調節するその能力を調整し得る。
【０３８７】
具体的に、該BMY_HPP5ポリペプチドは該モチーフアルゴリズム（ジェネティックス・コンピュータグループ社）を用いて１個のチロシンリン酸化部位を含むと予想した。該部位は、チロシンアミノ酸残基上でリン酸化される。チロシンリン酸化部部位についてのコンセンサスパターンは、以下の通りである：[RK]-x(2)-[DE]-x(3)-Yまたは[RK]-x(3)-[DE]-x(2)-Y（式中、Yはリン酸化部位であり、そして「ｘ」は介在性アミノ酸残基である）。チロシンリン酸化部位について特異的な別の情報は、Patschinsky T., Hunter T., Esch F. S., Cooper J. A., Sefton B. M.によるProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 79: 973-977 (1982)；Hunter T., J. Biol. Chem. 257: 4843-4848 (1982)およびCooper J. A., Esch F. S., Taylor S. S., Hunter T.によるJ. Biol. Chem. 259: 7835-7841 (1984)（これらは本明細書の一部を構成する）において知ることができる。
【０３８８】
好ましい態様において、チロシンリン酸エステル化部位ポリペプチドNGCVLVHCLAGISRSATIAIAYI（配列番号103）を本発明に包含する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、該ヒトBMY_HPP5チロシンリン酸エステル化部位ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０３８９】
BMY_HPP1ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）を用いて、４個のPKCリン酸化部位を含むことが予想された。インビボにおいて、タンパク質キナーゼCはセリンまたはトレオニン残基のリン酸化について優位性を示す。該PKCリン酸化部位は、共通パターン：[ST]-x-[RK]（式中、SまたはTはリン酸化の部位であり、そして「X」が介在アミノ酸残基である）を有する。PKCリン酸化部位に関する別の情報は、Woodget J. R., Gould K. L., Hunter T.によるEur. J. Biochem. 161: 177-184 (1986)、およびKishimoto A., Nishiyama K., Nakanishi H., Uratsuji Y., Nomura H., Takeyama Y., Nishizuka Y.によるJ. Biol. Chem.260: 12492-12499 (1985)（これらは、本明細書の一部を構成する）で知ることができる。
【０３９０】
好ましい態様において、以下のPKCリン酸エステル化部位ポリペプチドを本発明に包含する：GTQIVTERLVALL（配列番号91）、LLESGTEKVLLID（配列番号92）、ELIQHSAKHKVDI（配列番号93）、VDIDCSQKWVYD（配列番号94）、DRLEDSNKLKRSF（配列番号95）、TTLDGTNKLCQFS（配列番号96）、PKKLQTARPSDSQ（配列番号97）、PSDSQSKRLHSVR（配列番号98）、SKRLHSVRTSSSG（配列番号99）、GDQVYSVRRRQKP（配列番号100）、RRQKPSDRADSRR（配列番号101および／またはSDRADSRRSWHEE（配列番号102）。 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、該ヒトBMY_HPP5ホスファターゼPKCリン酸エステル化部位ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０３９１】
該ヒトホスファターゼポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネッティックスコンピュータグループ社）に従って、６つのグリコシル化部位を含むことが分かった。本明細書においてより具体的に記載する通り、タンパク質グリコシル化は、様々な機能：タンパク質フォールディングの増強、タンパク質凝集の抑制、細胞小器官への細胞内輸送の調節、タンパク質分解に対する耐性の増大、タンパク質抗原性の調節、および細胞間接着の媒介を保存すると考えられている。
【０３９２】
アスパラギングリコシル化部位は、共通パターン：N-{P}-[ST]-{P}（式中、Nはグリコシル化部位である）を有する。しかしながら、潜在的なN-グリコシル化部位は共通配列Asn-Xaa-Ser/Thrに対して特異的であることがよく知られる。しかしながら、該共通トリペプチドの存在は、タンパク質のフォールディングがN-グリコシル化の調節に重要な役割を果たしている事実により、アスパラギン残基がグリコシル化されると結論づけるには十分ではない。AsnおよびSer/Thrの間のプロリンの存在は、N-グリコシル化を抑制するであろうことが分かった。このことは、グリコシル化部位の最近の統計学的な分析によって確認されており、これによりSer/ThrヘのプロリンC-末端を有する部位の約50％がグリコシル化されないことをも示す。アスパラギングリコシル化に関する別の情報は、以下の刊行物：Marshall R. D.によるAnnu. Rev. Biochem. 41: 673-702 (1972); Pless D. D., Lennarz W. J.によるProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 134 138 (1977); Bause E.によるBiochem. J. 209: 331-336 (1983) ; Gavel Y., von Heijne G.によるProtein Eng. 3: 433-442 (1990)；およびMiletich J. P., Broze G. J. Jr.によるJ. Biol. Chem. 265: 11397-11404 (1990)（これらは、本明細書の一部を構成する）で知ることができる。
【０３９３】
好ましい態様において、以下のアスパラギングリコシル化部位ポリペプチドを本発明に包含する：PFVEYNTSHILEAI（配列番号85）、EAININCSKLMKRR（配列番号86）、IGYVLNASNTCPKP（配列番号87）、LRVPVNDSFCEKIL（配列番号88）、EKKIKNQTGASGPK（配列番号89）および／またはSIMSENRSREELGK（配列番号90）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、該ヒトBMY_HPP5ホスファターゼアスパラギングリコシル化部位ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０３９４】
本発明は、ホスファターゼ関連障害（これは、糖尿病などの代謝性障害、加えて神経および／または心血管の疾患および障害を含むが、これらに限定されない）の治療、検出、軽減または予防のための、BMY_HPP5インビターおよび／またはBMY_HPP5活性のアクチベーターの使用を包含する。本発明はまた、BMY_HPP5インヒビターおよび／またはBMY_HPP5活性のアクチベーターの免疫抑制薬、抗炎症薬および／または抗腫瘍薬としての使用をも包含する。
【０３９５】
本発明は、キナーゼ活性が十分でない疾患を診断し、予後し、治療し、軽減しおよび／または予防するための治療学的なレジメにおける、BMY_HPP5ホスファターゼインヒビター（これは、アンチセンス核酸などの拮抗薬を含む）、加えて本明細書に記載する他の拮抗薬の使用を包含する。不十分なキナーゼ活性が原因で起こり得る疾患の限定されない１例はあるタイプの糖尿病であり、これはインシュリン受容体シグナル経路に関与する１つ以上のキナーゼが例えば、不十分な活性または不十分な発現を有し得る。
【０３９６】
その上、キナーゼ活性が過度に高い疾患および／または障害（例えば、キナーゼオンコジーン産物が過剰な活性および過剰な発現を有する癌）の診断、予後、治療、軽減および／または予防のための本明細書に記載の遺伝子治療学的レジメにおける、BMY_HPP5ホスファターゼアクチベーターの使用またはBMY_HPP5ホスファターゼ遺伝子もしくはタンパク質の使用を包含する。
【０３９７】
本発明はまた、BMY_HPP5タンパク質の触媒的に不活性な変異体（これは、その断片を含む）の使用（例えば、タンパク質療法）、または例えばホスファターゼ活性が過度に高い疾患および／または障害の診断、予後、軽減および／または予防における該コードするポリヌクレオチド配列の使用（例えば、遺伝子療法）をも含む。
【０３９８】
本発明はまた、診断における該BMY_HPP5ポリペプチド（これは、その断片および／または変異体を含む）に関する抗体の使用（例えば、生物マーカーおよび／または治療薬として）をも包含する。
【０３９９】
本発明は、細胞リンタンパク質またはリンペプチドのライブラリーと結合する基質トラップ変異体としての該BMY_HPP5ホスファターゼの不活性な非触媒的変異体を使用して、該BMY_HPP5ポリペプチドの基質を同定することを包含する。
【０４００】
本発明は、インビトロまたは「仮想的」（コンピューター）でのスクリーニング法を用いて、BMY_HPP5ホスファターゼ活のインヒビターまたはアクチベーターを同定するために、該BMY_HPP5ポリペプチドの使用を包含する。
【０４０１】
本発明の１態様は、該BMY_HPP5ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法は以下の工程を含む：i）分析的に検出可能な試薬を用いて標識化したBMY_HPP5ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターを、該インヒビターまたはアクチベーターとの複合体を形成するのに十分な条件で、該BMY_HPP5ホスファターゼと接触させ；ii）該複合体と同定する化合物を含有する試料とを接触させ；および、iii）該被験化合物が該複合体中の標識化された公知のBMY_HPP5ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターの量を改変する能力を検出することによって、インヒビターまたはアクチバーターとしての化合物を同定することを含む。
【０４０２】
本発明の別の態様は、BMY_HPP5ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法はi）該BMY_HPP5ホスファターゼと同定する化合物とを接触させ；およびii）該基質からホスファターゼを取り出す該BMY_HPP5ホスファターゼの能力を測定する工程を含む。
【０４０３】
本発明はまた、該BMY_HPP5ホスファターゼについてのリガンドを同定する方法をも包含し、該方法はi）結合が可能な条件で、該BMY_HPP5ホスファターゼを化合物群と接触させ；およびii）いずれかのリガンドと結合したタンパク質の存在を検出する工程を含む。
【０４０４】
上記の方法は、全細胞、サイトゾルの細胞画分、膜細胞画分、精製されたまたは部分的に精製された形態からなる群から選ばれる形態の該BMY_HPP5ホスファターゼを含むことが好ましい。本発明はまた、精製された、実質的に精製されたまたは精製されたいない状態での組換え的に発現したBMY_HPP5ホスファターゼにも関する。本発明は更に、当該分野で知られたりまたは本明細書中に記載するタンパク質、ペプチドまたは他の分子と融合したりまたは接合したBMY_HPP5ホスファターゼに関する。
【０４０５】
本発明はまた、上記の方法で同定された化合物および医薬的に許容し得る担体を含有する該BMY_HPP2ホスファターゼポリペプチドの医薬組成物をも包含する。
【０４０６】
好ましい態様において、本発明は、開始する出発コドンを欠いたポリヌクレオチド、加えて得られるBMY_HPP5のコードされたポリペプチドを包含する。具体的には、本発明は配列番号41のヌクレオチド473〜2464に相当するポリヌクレオチド；配列番号42のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチドを包含する。該コード配列を含有する組換えベクターおよび該ベクターを含有する宿主細胞をも包含する。
【０４０７】
本発明はまた、BMY_HPP5ポリペプチド（これは、BMY_HPP5のN157〜I300のアミノ酸（配列番号42）である）の３次元相同性モデル（図38を参照）をも提供する。３次元相同性モデルは、相同性タンパク質の公知の構造（Greerらによる1991、Leskらによる1992、Cardozoらによる1995、Yuanらによる1995）に基づいて構築することができる。該BMY_HPP5ポリペプチド（これは、配列番号42のアミノ酸残基N157〜I300に対応する）の相同性モデルは、ヒト二重特異性ホスファターゼ、MAPキナーゼホスファターゼ3（これは、PYST1とも呼ばれる）のN-末端由来の1vhr（残基A204〜L347；タンパク質データバンクPDBエントリー1mkpチェーンA；ジェンバンク受託番号gi|5822131；配列番号208）（スチュアート(Stewart)A. E.らによる1999）の相同性構造に基づいており、このものは本明細書の表Xに記載する構造座標の組みによって定義される。
【０４０８】
関心があるタンパク質についての利用可能な実験的な情報が存在しない場合に、相同性モデルは有用である。３次元モデルは、相同タンパク質の公知の構造（Greerらによる1991、Leskらによる1992、Cardozoらによる1995、Saliらによる1995）に基づいて構築することができる。
【０４０９】
当該分野の当業者は、相同モデルがテンプレートまたは公知の構造がない場合には該タンパク質に類似する公知の構造のタンパク質に基づいて構築されることを理解するであろう。このことは、例えばFASTA（パーソン(Pearson)らによる1990）およびBLAST（アルチュール(Altschul)らによる1990）などのプログラムを用いて配列の対アラインメントによって達成することができる。配列類似度が高い（３０％より高い）場合には、これらの対比較法が適当であり得る。同様に、多重配列アラインメントまたはプロフィール−ベース法を用いて、多数の（構造的におよび生物学的に）関連するタンパク質のアラインメントに対するクエリー配列をアラインメントすることができる。配列類似度が低い場合には、より進歩した方法（例えば、タンパク質スレッディング(threading)などのフォールド認識）；Hendlichらによる1990）を使用する。ここで、ある配列と潜在的なテンプレートタンパク質の３次元型との適合性は知識に基づく可能性に基づいて評価する。最初の配列アラインメント後に、該クエリーテンプレートを場合によりマニュアル操作または他の特徴（モチーフ、２次構造の予想および許容される配列の保存）の取り込みによってアラインメントすることができる。次いで、構造的に保存された領域を同定し、このものを用いて、骨格２次構造（サリ(Sali)らによる1995）を構築することができる。ループを、知識をベースとする方法を用いて加え、そして力場計算を行なうことによって洗練することができる（Saliらによる1995, Cardozoらによる1995）。
【０４１０】
BMY_HPP5について、対アラインメント法FASTA（パーソン(Pearson)らによる1990）および折り畳み認識法（タンパク質スレッディング）により、ヒト二重性特異性ホスファターゼMAPキナーゼホスファターゼ3（これは、PYST1とも呼ばれる）の配列（残基A204〜L347；タンパク質データバンク、PDBエントリーlmkpチェーンA；ジェンバンク受託番号gi|5822131；配列番号208）（スチュワート,A. E.による1999）とアラインさせたBMY_HPP5の一部（配列番号42のN157〜I300）についての一致する配列アラインメントを得た。BMY_HPP5とPDBエントリー1mkpとのアラインメントを、図37に記載する。本発明において、BMY_HPP5の相同性モデルは図37に記載する配列アラインメントから導き、従ってもっともらしい側鎖の配向を含む全原子モデルを、プログラムLOOK（レビットによる1992）を用いて得た。BMY_HPP5についての３次元モデルは表Xに記載の構造座標の組みによって定義され、このものを図38に視覚化する。
【０４１１】
３次元構造における誤りを認識するために、構造ベースの平均場を用いて、タンパク質折り畳みの質を判断することができる（シップル(Sippl)による1993）。該方法を用いて、誤って折り畳まれた構造、並びに構造モデルの欠陥部分を認識することができる。該方法により、あるタンパク質折り畳みについてにエネルギー分布をｙ−軸に示し、そして該タンパク質折り畳み内の残基位置をｘ−軸に示すエネルギー図を得る。知識ベースの平均場(mean field)は、タンパク質データバンク（ベルンスタイン(Bernstein)らによる1977）由来のサブセットとして得る球状タンパク質の構造の組から導く力場計算を構成する。モデルの質を分析するために、該エネルギー分布をプロットし、テンプレートのエネルギー分布をモデルから得られるものと比較する。図39は、BMY_HPP5モデル（点線）と得られたモデルからの該テンプレート（1mkp、二重特異性ホスファターゼ）についてのエネルギー図を示す。該モデルおよびテンプレートが該アライン領域上で似たエネルギーを有することは明らかであり、このことはBMY_HPP5が「未変性様」立体配座であることを示唆する。このグラフは、BMY_HPP5の３次元構造座標が該ポリペプチドの正確で且つ有用な表示であることを確認するモチーフおよび配列アラインメントを示唆する。
【０４１２】
用語「構造座標」とは、相同モデルの構築から得られるデカルト座標を意味する。
【０４１３】
当該分野の当業者は、タンパク質に関する構造座標の組みが３次元での形を定義する点の相対的な組みであることを理解するであろう。従って、完全に異なる座標の組みが似たりまたは同じ形を定義することは可能である。その上、異なるアラインメントテンプレート（すなわち、1mkpの構造座標以外）を用いたりおよび／または相同モデルを得る際に異なる方法を用いて似た相同モデルの生成から生じる個々の座標のわずかな変化は、全体の形態に微小な影響を及ぼすであろう。座標の変化はまた、該構造座標の数学的な操作が原因でも生じ得る。例えば、表Xに記載し且つ図38に示す構造座標は、該構造座標の分割；該構造座標の組みヘの整数の足し算もしくは引き算、該構造座標の逆転、または上記のいずれかの組み合せによって操作することができる。
【０４１４】
従って、様々なコンピュータによる分析は、分子またはその部分が同一のものであるとみなされる上記のBMY_HPP5の全てまたは一部と十分に似ているかどうかを決定するのに必要である。それらの分析は、最新のソフトウェアアプリケーション（例えば、ユーザーガイドに記載されているINSIGHTS（Accelrys Inc., San Diego, CA）バージョン2000で、および添付のユーザーガイドにおいて記載する通り、実施することができる。
【０４１５】
プログラムINSIGHTII内の上書きツールを用いて、同じ構造の異なる構造および異なる立体配座の間での比較を行なうことができる。構造を比較するためにINSIGHTIIで使用する操作は、４つの工程：１）比較する構造をロードすること；２）これらの構造中での原子価を定義すること；３）フィッティングの操作を行なうこと；および４）該結果を分析すること、に分けられる。各構造は、名前によって同定する。１構造は標的（すなわち、該固定化構造）として同定され；第２の構造（すなわち、運動性構造）はソース構造として同定される。INSIGHTII内の原子価はユーザーの入力によって定義されるので、本発明の目的のために、我々は比較する２つの構造の間の全保存残基について、等価原子をタンパク質骨格原子（N、Cα、CおよびO）として定義するであろう。我々はまた、強固な(rigid)フィッティング操作のみを考慮する。強固なフィッティング法を用いる場合には、該作業(working)構造を翻訳して回転して、該標的構造との最適なフィットを得る。該フィッティング操作は該運動性構造に適用される最適な翻訳および回転を計算するアルゴリズムを使用し、その結果等価原子の特定の対についての該フィットの根平均２重偏差は絶対的な最小値となる。Åで示すこの数字は、INSIGHT1Iによって報告されている。本発明の目的のために、表Xに例示され且つ図38に視覚化された構造座標によって記載される関連骨格原子について上書きした場合に、保存残基の骨格原子（N、Cα、CおよびO）の根平均２重偏差が3.0Å以下であるBMY_HPP5のいずれの相同モデルは、一致とみなす。該根平均２重偏差は2.0Å以下であることがより好ましい。
【０４１６】
相同性モデルによって具現化される本発明は、BMY_HPP5の生物学的な機能のモジュレーター、並びに改変された生物学的な機能および／または特異性を有する変異体の構造ベースの設計を可能とする。
【０４１７】
BMY_HPP5の触媒ドメインおよび３Dモデル生成のテンプレートとして使用した1mkpの間に40％の配列一致度が存在する。BMY_HPP5の場合に、機能的に重要な残基が残基D213、H243、C244、R250およびS251からなる間隙中に存在する。これらの残基の全てが、1mkp（構造決定研究のために、1mkp中のシステインをセリンに変異させた）に保存されている。図37に開示された配列アラインメント、並びに表Xに開示し且つ図38に視覚化された構造モデルに基づいて、文献（ファウマンおよびサペルによって総括された、1996）に記載されているとおり、D213は一般的な酸として同定され、C244はリン酸ジエステル結合を切断する触媒的なシステイン求核体として同定され、そしてR250は切断のための結合を活性化する必須アルギニン(Argenine)であると同定されている。他の重要な残基としては例えば、該酵素に基質特異性を与えるF287を含む。これらの残基の全てが保存されている。
【０４１８】
本発明の好ましい実施態様において、該分子は表Xにより上記のBMY_HPP5アミノ酸または該分子の変異体の構造座標によって定義される間隙領域を含む。
【０４１９】
該間隙の全てもしくはそのいずれかの部分を含有する分子、または該分子もしくは分子複合体の変異体もしくはホモログがより好ましい。該分子の変異体またはホモログとは、BMY_HPP5アミノ酸の骨格原子からの根平均２乗偏差が3.5Å以下である分子を意味する。
【０４２０】
用語「根平均２乗偏差」とは、平均値からの偏差の２乗の算術的な平均値の平方根を意味する。そのものは、傾向または対象からの偏差または変動を表す用語である。本発明の目的のために、「根平均２乗偏差」は、本明細書に記載の構造座標によって定義されるBMY_HPP5の骨格の関連部分からのタンパク質の骨格の変動を意味する。
【０４２１】
それらのBMY_HPP5相同モデル部分の構造座標は、機械で読み取り可能な保存媒体に保存される。それらのデータは、様々な目的（例えば、薬物発見）のために使用することができる。
【０４２２】
したがって、本発明の実施態様において、表Xに記載する構造座標を用いてコード化したデータ記憶物質を含有する機械で読み取り可能なデータ記憶媒体を提供する。
【０４２３】
ある態様はWO 98/11134に開示されているシステム10を使用し、その開示は本明細書の一部を構成する。簡単に言えば、これらの態様の改変は、中央処理装置（「CPU」）、作業記憶（このものは、例えばRAM（ランダムアクセスメモリー）または「コア」メモリーであり得る）、大量(mass)記憶メモリー（例えば、１つ以上のディスクドライブまたはCD−ROMドライブ）、１つ以上の陰極線管（「CRT」）ディスプレー端子、１つ以上のキーボード、１つ以上の入力ラインおよび１つ以上の出力ライン（これらは全て通常の二方向システムバスによって相互接続している）を含むコンピュータを含む。
【０４２４】
入力ラインによってコンピュータに連結した入力ハードウェアは、様々な方法で実行することができる。本発明の機械で読み取り可能なデータを、電話回線または専用データ回線によって連結したモデムを用いて入力することができる。あるいはまたは別に、該入力ハードウェアはCD−ROMドライブまたはディスクドライブを含み得る。ディスプレー端末と組み合わせて、キーボードをまた、入力装置として使用することができる。
【０４２５】
出力回線によってコンピュータに連結した出力ハードウェアは同様に、通常の装置によって実行することができる。例えば、出力ハードウェアは、本明細書に記載する通り、例えばQUANTAなどのプログラムを用いて本発明の領域またはドメインの図示を表示するためのCRTディスプレー端末を含み得る。出力ハードウェアはまたプリンター（その結果、ハードコピー出力を得ることができる）またはディスクドライブ（これは、レーザー使用のためのシステム出力を保存する）を含むことができる。
【０４２６】
操作において、該CPUは、様々な出力装置および入力装置の使用を調和させ、大量保存からのデータアクセスを調和させ、および作業記憶ヘおよびそれからアクセスし、そしてデータ処理工程の順序を決める。多数のプログラムを用いて、本発明の機械で読み取り可能なデータを処理することができる。それらのプログラムについては、本明細書に記載する薬物発見のコンピュータ方法を参照して説明する。ハードウェアシステムの構成成分についての具体的な引用は、以下のデータ保存媒体の記載において適宜含める。
【０４２７】
本発明の目的として、機械で読み取りが可能なデータをコード化することができるいずれかの磁気的なデータ記憶媒体は、該システムの記憶要求を実行するのに十分であろう。該媒体は、通常のフロッピーディスクまたはハードディスクであり得て、このものは適当な基板（これは、通常のものであり得る）および一方または両側に適当な塗膜（これは、通常のものであり得る）を有し、磁区（この偏光または配向は例えば、磁気的に改変することができる）を含有する。該媒体はまた、ディスクドライブの主軸または他のデータ記憶デバイスを収容するための開口部をも有し得る。
【０４２８】
媒体の塗膜の磁区は、システム（例えば、本明細書に記載するシステム）による命令実行のために、例えば通常の機械で読み取り可能なデータ（本明細書に記載するデータ）であり得る様式にコード化するように偏光させたりまたは方向づけることができる。
【０４２９】
適当な記憶媒体（これは、それら機械で読み取り可能なデータをコード化することもできる）または命令装置の組み（これは、例えば本明細書に記載のシステムなどのシステムによって実行することができる）の別例は、光学的に読み取り可能なデータ記憶媒体であり得る。該媒体は、通常のコンパクトディスク（CD-ROM）（これは、記憶だけを読む）または再書き込み可能な(rewritable)媒体（例えば、磁気−光ディスク）（これは、光学的に読み取ることができ、且つ磁気−光学的に書き込むことができる）であり得る。該媒体は、適当な基板（これは、通常のものであり得る）、および通常、基板の一方に適当な塗膜（これは、通常であり得る）を有することが好ましい。
【０４３０】
CD-ROM（これは、よく知られる）の場合には、該塗膜は反射性であって、そして機械で読み取り可能なデータをコード化するために多数のピットで刻印されている。該ピットの配置は、該塗膜の表面でレーザー光を反射させることによって読み取る。保護膜（これは、実質的に透明であることが好ましい）を、反射性塗膜の上面に与える。
【０４３１】
磁気−光ディスク（これは、よく知られる）の場合には、該塗膜はピットを有しないが、例えばレーザーによってある温度より上で加熱すると、多数の磁区（これは、偏光または配向を磁気的に変えることができる）を有する。該磁区の配向は、該塗膜から反射するレーザー光の偏光を測定することによって読み取ることができる。該磁区の配置構造は、上記の通り、該データをコード化する。
【０４３２】
従って、本発明によれば、BMY_HPP5相同モデル、その一部またはそれらの構造的に似たホモログの３次元構造を表示することができるデータは、機械で読み取り可能な記憶媒体に記憶され、このものは該構造の３次元図式表示を示することができる。それらのデータは、様々な目的（例えば、薬物の発見）のために使用することができる。
【０４３３】
第１に、本発明は、BMY_HPP5の生物学的機能を調整することができる化学物を設計し、選択し、および製造するための構造ベースのまたは合理的な薬物設計方法のBMY_HPP5（図5A〜D；配列番号42）の配列に基づく相同性モデリングによる使用が可能である。
【０４３４】
従って、本発明はまた、３D構造ベースの薬物設計の目的のために相同性モデルを得る目的で、図5A〜Dの完全配列またはそれらの一部にも関する。
【０４３５】
本発明の目的のために、図5A〜Dの配列の変異体もしくはホモログまたはそれらのいずれかの一部を含む。好ましい態様において、該変異体またはホモログは、図5A〜Dにおけるアミノ酸残基に対して少なくとも25％の一致度、より好ましくは50％の一致度、一層好ましくは75％の一致度、および最も好ましくは90％の一致度を有する。
【０４３６】
BMY_HPP5の３次元モデル構造はまた、生物学的機能のモジュレーターを同定するための方法をも提供する。様々な方法またはそれらの組み合わせを用いて、これらの化合物を同定することができる。
【０４３７】
上で定義する該活性部位領域の構造座標を用いて、構造的な特徴および化学的な特徴を同定することもできる。次いで、同定された構造的な特徴または化学的な特徴を用いて、潜在的なBMY_HPP5モジュレーターとしての化合物を設計したりまたは選択することができる。構造的な特徴および化学的な特徴とは、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水結合相互作用および双極子相互作用を含むが、これらに限定されないことを意味する。別にまたは組み合わせて、該３次元構造モデルを用いて、潜在的なBMY_HPP5モジュレーターとしての化合物を設計したりまたは選択することができる。次いで、潜在的なBMY_HPP5モジュレーターとして同定された化合物を製造して、被験化合物とBMY_HPP5との結合を特徴としたり、または小分子の存在下でのBMY_HPP5失活を特徴とするアッセイにおいてスクリーニングすることができる。潜在的なBMY_HPP5モジュレーターのスクリーニングに有用なアッセイの例としては、例えばコンピュータアッセイで、インビトロアッセイでおよびハイスループットアッセイでのスクリーニング法を含むが、これらに限定されない。最後に、これらの方法は表Xによれば、BMY_HPP5から１つ以上のアミノ酸を改変したりまたは置換することをも含み得る。
【０４３８】
しかしながら、本明細書の開示に基づいて当該分野の当業者によって理解される通り、他の構造ベースの設計方法を使用することができる。様々なコンピュータによる構造ベースの設計方法が当該分野において開示されている。
【０４３９】
例えば、BMY_HPP5の配列および該BMY_HPP5構造（すなわち、表Xで提示する、BMY_HPP5の原子座標および／または活性部位領域の原子座標）を出力することができる多数のコンピュータモデリングシステムを利用することができる。次いで、該コンピュータシステムにより、潜在的なBMY_HPP5モジュレータが結合するこれらの領域の１つ以上についての構造上の詳細を得て、その結果、該潜在的なモジュレーターの相補的な構造上の詳細を決定することができる。これらのモデリングシステムの設計は通常、BMY_HPP5と物理的におよび構造的に会合することができる化合物に基づく。加えて、該化合物はBMY_HPP5と会合することができる立体配座を仮定することができなければいけない。いくつかのモデリングシステムにより、実際の製造および被験の前に、潜在的なBMY_HPP5モジュレーターの潜在的な阻害性または結合性の効果が評価されている。
【０４４０】
あるタンパク質標的と会合するための能力について化学物または断片をスクリーニングする方法もまた十分に知られる。これらの方法は、コンピュータスクリーン上での結合部位の視察によって開始する。次いで、選択した断片または化学物を、BMY_HPP5の１つ以上活性部位領域に位置させる。ドッキングは、例えばINSIGHTII、QUANTAおよびSYBYLなどのソフトウェアを用い、続いてエネルギーの最小化を行ない、そして標準的な分子力学力場（例えば、CHARMMおよびAMBER）を用いた分子動力学によって達成される。本発明に有用な化学断片または化学物の選択を助けるコンピュータプログラムとしては例えば、GRID（グッドフォードによる1985）、AUTODOCK（グッドセルによる1990）およびDOCK（クンツらによる1982）を含むが、これらに限定されない。
【０４４１】
好ましい化学物または断片の選択時に、それら各々とBMY_HPP5との関係を視覚化して、次いで１個の潜在的なモジュレーターにアセンブルすることができる。個々の化学物をアセンブルするのに有用なプログラムとしては例えば、SYBYLおよびLeapFrog (トリポスアソシエート, St. Louis MO)、LUDI (ボームによる1992)、並びに3D データベースシステム（マーティンによる1992）を含む。
【０４４２】
別法として、空活性部位または場合により公知のインヒビターのある部分を含めた該部位を用いて、新規な化合物を設計することができる。このタイプの設計法としては例えば、LUDI（ボームによる1992）およびLeapFrog（トリポスアソシエート、St. Louis MO）を含むが、これらに限定されない。
【０４４３】
加えて、BMY_HPP5はコンビナトリアル化学を含めた最新の方法に総合的に十分に適合する。
【０４４４】
DOCK（クルツらによる1982）などのプログラムは、相同性モデル由来の原子座標と一緒に用いて、データベースまたは視覚的なデータベース由来の潜在的なリガンド（これは、金属結合領域において潜在的に結合し、従って製造および被験のための適当な候補となり得る）を同定することができる。
【０４４５】
加えて、BMY_HPP5の３次元相同性モデルは、改変された生物学的活性を有する変異体の設計を助けるであろう。
【０４４６】
多数のポリヌクレオチド配列（例えば、EST配列）は公的に入手することができ、そして配列データベースによってアクセスすることができる。これらの配列のいくつかは配列番号41に関するものであり、このものは本発明の着想の前に、公的に入手することができる。それらの関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲内から具体的に除くことが好ましい。全ての関連する配列を例示することは、厄介であろう。従って、一般式a−bによって記載されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの１つ以上を本発明から除くことが好ましい。ここで、aとは配列番号41の1〜5097の間のいずれかの整数であり、bとは15〜5111の間の整数であり、aおよびbの両方が配列番号41に示されるヌクレオチド残基の位置に相当して、そしてbはa＋14以上である。
【０４４７】
遺伝子番号6によってコードされるポリペプチドの特徴
炎症性疾患の発生は、内皮細胞にわたる循環性血液細胞の該組織中ヘの浸潤を特徴とする。多数の重要な事象が、この「ゲートウェイ(gateway)」機能を媒介する内皮細胞中で生じる。該内皮細胞は受容体およびケモカインを発現し、このものは白血球を繋ぎ止め(tether)、それらを活性化し、それらをしっかりと接着させ、そして内皮細胞接合部からのそれらの遊出を助ける。このプロセスは、早期の炎症性メディエータ（例えば、TNF-α）の産生によって開始する。該受容体およびケモカインの同調的な(coordinated)発現は、細胞内シグナル伝達分子（これは、キナーゼ、骨格(scaffolding)タンパク質および転写因子を含む）によって媒介される。したがって、これらの分子は、炎症性プロセスの発生にとって「マスタースイッチ(master switch)」となり得るシグナル伝達カスケードを形成し得る。 このカスケードの成分（例えば、転写因子NF-κB）が知られている。しかしながら、未だ同定されていない多数の他の成分が存在する。 TNF-α活性化内皮中で差次的に(differentially)発現する遺伝子の分析は、この「マスタースイッチ」カスケードの他の成分を同定する助けとなり得る。
【０４４８】
この最後に、TNF-αで刺激したヒト肺微小血管内皮細胞中で発現したRNAを分析して、調節事象に関与する遺伝子産物を同定した。休止細胞をTNF-αを用いて１時間刺激し、そして該RNAを該細胞から単離した。相補DNA（cDNA）は、該単離したRNAから作製した。TNF-αに対する反応において上方調節されたcDNAは、サブトラクティブハイブリダイズ法を用いて同定した。
【０４４９】
新規な二重特異性ホスファターゼ（DSP）、RET31（TNF-αクローン31で処理した内皮細胞中での調節(Regulated in Endothelial cells treated with TNF-a clone 31））（図13A〜F）は、TNF-αで処理した内皮基質ライブラリーから同定した。RET 31についての該二重特異性ホスファターゼ触媒(the dual specificity phosphatase catalytic）（DSPc）ドメインは、DSPc PFAM-HMM (PF00782)を用いて同定した。ホモログの探索により、RET31に対する広範な相同性を含む他の３つのDSPsを同定した（図14A〜C）。RET31、DUS8、DUSP6およびMAP-キナーゼホスファターゼ5は、これら４つのタンパク質を含むDSPcドメインと比較する多重配列アラインメント中で示される（図17）。
【０４５０】
RET31はTNF-αによって上方調節され、ノーザンブロット分析によって６時間で発現のピークに達することを確認した（図15）。RET31 mRNAは、ノーザンブロット分析によって脳、脾臓および末梢血管白血球中で視覚的に検出することができなかった。
【０４５１】
RET31は、本発明のBMY_HPP5ポリペプチドの新規なスプライス変異体であると考えられる。RET31についての配列は、BMY_HPP5の配列由来の5'末端において異なる。しかしながら、RET31およびBMY_HPP5の組織発現の比較により、それらの有意な一致度にも関わらず、有意な特異な発現を示した。具体的には、PCR分析（これは、本明細書の他所に記載する）によってBMY_HPP5の組織発現は、脳中で有意なレベルのRET31が存在することを示唆した。それらの異なる(disparate)発現プロフィルについての理由は明らかではないが、別々のプールのRNAの使用、または別のプローブの使用に関連し得る。
【０４５２】
RET31の有意なレベルを発現する全ての組織中に、１次のハイブリダイズバンド、および低分子量の２次バンドが存在した。これが、同じ遺伝子のスプライス変異体であるかどうか、またはホモログが存在するかどうかということは明らかではない。
【０４５３】
配列番号109（図13A〜F）に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされ；および／または寄託されたクローンRET31に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号108（図13A〜F）として提示される本遺伝子に相当するポリペプチドは、多数のホスファターゼに対するヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルで有意な相同性を有する。該ホスファターゼとしては例えば、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼDUS8タンパク質（このものはまた、hVH-5とも呼ばれる）（DUS8；ジェンバンク受託番号gi|U27193；配列番号110）；ヒト二重特異性MAPキナーゼDUSP6タンパク質（DUSP6；ジェンバンク受託番号gi|AB013382；配列番号111）；およびヒトmapキナーゼホスファターゼMKP-5タンパク質（MKP-5；ジェンバンク受託番号gi|AB026436；配列番号112）（これらは、BLASTPによって決定される）を含む。ヒトホスファターゼポリペプチドとこれらのタンパク質とのアラインメントを、図14A〜Cに提示する。
【０４５４】
該ヒトタンパク質チロシンホスファターゼDUS8タンパク質（これは、hVH-5とも呼ばれる）は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼを調節するタンパク質チロシンホスファターゼのサブセットのメンバーであると考えられる。hVH-5の触媒領域は、融合タンパク質として発現し、そしてこのものはｐ−ニトロフェニルホスフェートを加水分解し、そしてマイトジェン活性化タンパク質キナーゼを失活し、従ってhVH-5がホスファターゼ活性を有すると証明する。その上、hVH-5転写物の発現は、神経成長因子におけるPC12細胞中で誘発され、そして直近の遺伝子の特徴である様式でインスリン処置において誘発され、このことはシグナル伝達カスケードにおけるあり得る機能を示唆する（The J. Neurochem. 65 (4), 1823-1833 (1995)）。
【０４５５】
該二重特異性MAPキナーゼDUSP6は、染色体座位l2q21（すい臓癌における高頻度のアレル減少の領域の１つである）に対するコードするポリヌクレオチドのマッピング、加えていくつかのすい臓癌セルライン中での発現の減少に基づいて、すい臓発癌に関係すると考えられる（Cytogenet. Cell Genet. 82 (3-4), 156-159 (1998)）。
【０４５６】
該ヒトmapキナーゼホスファターゼMKP-5タンパク質は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK）スーパーファミリーのメンバーを負に調節する二重特異性タンパク質ホスファターゼのグループに属することを決定した。該グループは、３つの主なスーパーファミリー、MAPK／細胞外シグナル調節性キナーゼ（ERK)、ストレス活性化タンパク質キナーゼ（SAPK）／c-Jun N-末端キナーゼ（JPK）およびp38からなる。このグループのメンバーは、MAPKに対する顕著な基質特異性、異なる組織分布および細胞下局在化、および細胞外刺激によるそれらの発現の誘導能の異なるモデルを示す。MKP-5は、p38およびSAPK/JNKと結合するが、MAPK/ERKとは結合せず、そしてp38を失活するが、MAPK/ERKを失活しないことが分かった。p38は、MKP-5に対する好ましい基質であることを測定した。MKP-5 mRNAは、様々な組織および器官において広く発現し、そして培養細胞中でのその発現はストレス刺激によって誘発性であった。従って、MKP-5は、p38およびSAPK/JNKについて特異的な二重特異性ホスファターゼのタイプであると考えられている（J. Biol. Chem., 274 (28): 19949-56, (1999)）。
【０４５７】
決定された図13A〜FにおけるRET31 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号41）は、減少した分子量が約73kDAである約665アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。該予想されるRET31ポリペプチドのアミノ酸配列は、図13A〜F（配列番号42）に示す。図13A〜Fに示すRET31タンパク質は、いくつかの公知のホスファターゼ、特に二重特異性タンパク質ホスファターゼに対して有意な一致度および類似度を有すると決定した。具体的には、図13A〜Fに示す該RET31タンパク質は、ヒトタンパク質チロシンホスファターゼDUS8タンパク質（DUS8；ジェンバンク受託番号gi|U27193；配列番号110）に対して約50.3％の一致度および約56.8％の類似度；ヒト二重特異性MAPキナーゼDUSP6タンパク質（DUSP6；ジェンバンク受託番号gi|AB013382；配列番号111）に対して約36.5％の一致度および48.3％の類似度；およびヒトmapキナーゼホスファターゼMKP-5タンパク質（MKP-5；ジェンバンク受託番号gi|AB026436；配列番号112）に対して約34.3％の一致度および約47.2％の類似度を有することを示した（図12に示す通り）。
【０４５８】
ホスファターゼタンパク質の要素に対する強い相同性に基づいて、本発明のヒトRET31ホスファターゼがコードするポリペプチドは、ホスファターゼタンパク質、好ましくは新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼの要素、特に好ましくは本明細書に記載する新規なホスホチロシン／二重特異性（P-Tyr、P-SerおよびP-Thr）ホスファターゼとの少なくともある生物学的活性を有することが予想される。
【０４５９】
副腎組織中での優位な局在化された発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、ヒトmRET31ホスファターゼポリヌクレオチドが、内分泌性障害を治療し、診断し、予後し、軽減しおよび／または予防するのに有用であり得る。該障害としては、例えば副腎皮質性機能亢進、副腎皮質性機能不全、嗜眠、先天性副腎過形成、異常なACTH制御、異常なアドレナリン制御、P450C21、P450C18、P450C17およびP450C11ヒドロキシラーゼ並びに３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3-HSD)の欠失に関連する障害、多毛症、過少月経、ざ瘡、男性化、雌性の偽雌雄同体(female pseudohermaphroditism)、異常な性的性質の発症の発生率に関係する障害、異常なコルチゾル分泌に関係する障害、高血圧症、低カリウム血症、生殖機能不全、異常なアンドロゲンの分泌に関係する障害、副腎多毛症(adrenal virilism)、副腎腺腫、副腎癌腫、異常なアンデロステロンの分泌に関係する障害、アルドステロン症、異常なステロイド生合成に関係する障害、異常なステロイド輸送に関係する障害、異常なステロイド分泌に関係する障害、異常なステロイド排出に関係する障害、アジソン症候群およびクッシング症候群を含むが、これらに限定されない。
【０４６０】
精巣および前立腺組織中での局在化された発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、該ヒトRET31ホスファターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの拮抗薬および／または断片を含む）が男性生殖性障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得る。該障害としては例えば、不妊症、性交不能、前立腺癌、射精障害および／または精巣癌が挙げられる。この遺伝子産物はまた、結合性薬物（例えば、男性避妊薬として有用である薬物（拮抗薬））を同定するために設計されたアッセイにおいても有用であり得る。精巣はまた、身体の他の組織において特に低レベルで発現する転写物の活性な遺伝子発現の部位でもある。従って、この遺伝子産物は、他のプロセス（例えば、いわゆるいくつかのあり得る標的適応症を挙げると、造血、炎症、骨形成および腎臓機能）において関連する機能的な役割を果たし得る他の特異的な組織または器官において発現し得る。実際、あるホスファターゼの発現の増大は、精巣癌についての腫瘍マーカーとして同定されている（例えば、Koshida, K., Nishino, A., Yamamoto, H., Uchibayashi, T., Naito, K., Hisazumi, H., Hirano, K., Hayashi, Y., Wahren, B., Andersson, LによるJ. Urol., 146 (1) : 57-60, (1991)；および、Klein, EAによるUrol. Clin. North. Am., 20 (1) : 67-73, (1993)を参照）。
【０４６１】
卵巣および胎盤組織中での有意な局在化した発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、生殖性障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。
【０４６２】
好ましい態様において、RET31ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（このものは、それらの作動薬および断片を含む）は、子宮の疾患または障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防することを含む使用を有する。該疾患などとしては例えば、機能障害性子宮出血、無月経、本態性月経困難症、性機能不全、不妊症、骨盤炎症性疾患、子宮内膜症、胎盤性アロマターゼ欠損症、早発性月経閉止および骨盤機能不全を含むが、これらに限定されない。
【０４６３】
骨格筋組織中での有意な局在化した発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、筋肉疾患および／または障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。該疾患などとしては例えば、筋変性障害、多発性硬化症、萎縮症、チック(ticks)を含むが、これらに限定されない。
【０４６４】
あるいは、肝臓組織中での有意な局在化した発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、該ヒトポリヌクレオチドおよびポリペプチドが肝臓疾患および／または障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。代表的な使用は、以下の項目の「過剰増殖性障害」、「感染性疾患」および「結合性活性」、ならびに本明細書の他所に記載する。要するに、該タンパク質は以下の疾患の検出、治療および／または予防に使用することができる。該疾患としては例えば、肝芽腫、黄疸、肝炎、肝臓代謝性疾患および肝細胞前駆体細胞の分化に帰する病気、肝硬変、肝臓のう腫、発熱性膿瘍、アメーバー性膿瘍、水胞体のう腫、のう胞腺癌(cystadenocarcinoma)、腺腫、巣状結節性過形成、血管腫、肝細胞癌、胆管癌、血管肉腫および肉芽腫性肝臓疾患を挙げられる。加えて、該タンパク質産物は、発育性異常症、胎児性欠乏症(fetal deficiencies)、出生前(pre-natal)障害および様々な創傷治癒疾患、および／または組織外傷を処置するのに有用である。
【０４６５】
その上、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これらは、それらの断片および拮抗薬を含む）は、肝臓性感染症を直接的にまたは間接的に治療し、予防し、診断しおよび／または予後することを含む使用を有する。該感染症としては例えば、敗血症感染が原因の肝臓疾患、菌血症が原因の肝臓疾患、肺炎球菌性肺炎感染が原因の肝臓疾患、毒素ショック症候群が原因の肝臓疾患、リステリア症が原因の肝臓疾患、レジオネラ病が原因の肝臓疾患、ブルセラ症感染が原因の肝臓疾患、淋菌感染が原因の肝臓疾患、エルシニア感染が原因の肝臓疾患、サルモネラ症が原因の肝臓疾患、ノカルジア症が原因の肝臓疾患、スピロヘータ感染が原因の肝臓疾患、梅毒トレポネーマ感染が原因の肝臓疾患、ブレリア・ブルグドルフェリ(Brrelia burgdorferi)感染が原因の肝臓疾患、レプトスピラ症が原因の肝臓疾患、コクシエラ・ブルネッティ(Coxiella burnetii)感染が原因の肝臓疾患、ロッキー山紅班熱リケッチア(Rickettsia richettsii)感染が原因の肝臓疾患、トラコーマ病原体感染が原因の肝臓疾患、オウム病クラミジア感染が原因の肝臓疾患、加えて上記または本明細書の他所に記載する原因病原体が関与するいずれかの他の肝臓疾患および／または障害を含むが、これらに限定されない。
【０４６６】
胎盤組織中での有意な局在化した発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重ホスファターゼに対する強い相同性は、ヒトホスファターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドが様々な血管障害および病気を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。該障害などとしては例えば、微小血管疾患、血管漏出症候群(vascular leak syndrome)、動脈瘤、発作、塞栓症、血栓症、冠動脈疾患、動脈硬化症および／またはアテローム硬化症を含むが、これらに限定されない。更に、該タンパク質はまた、生物学的活性を測定するのに、腫瘍マーカーとしての抗体を産生するのに、同族リガンドまたは受容体を単離するのに、それらの相互作用を調整する薬物を同定するのに使用することもでき、加えて栄養サプリメントとしての使用が可能である。タンパク質、並びに該タンパク質についての抗体は、上記の組織についての腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的としての有用性を示し得る。
【０４６７】
すい臓組織中での優位な局在化した発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、該ヒトRET31ホスファターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これらは、それらの拮抗薬および／または断片を含む）がすい臓障害、加えて代謝性障害および胃腸障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。
【０４６８】
好ましい態様において、RET31ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これらは、それらの作動薬、拮抗薬および断片を含む）は、すい臓の疾患または障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防することを含む使用を有する。該疾患などとしては例えば、真性糖尿病、糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、成人発病型糖尿病、島細胞移植に関連する徴候、すい臓移植に関連する徴候、膵炎、すい臓癌、すい臓外分泌機能不全、アルコール誘発性膵炎、脂肪の消化不良、タンパク質の消化不良、高トリグリセリド血症、ビタミンb12吸収不良、高カルシウム血症、低カルシウム血症、高血糖、腹水、胸水、腹痛、すい臓壊死、すい臓偽のう胞、ガストリノーマ、すい臓島細胞過形成、多発性内分泌性異常増殖1型（男性1型）症候群(multiple endocrine neoplasia type 1 (men 1) syndrome)、膵島炎、切断術(amputations)、糖尿病ニューロパチー、すい臓自己免疫疾患、細胞機能の遺伝的欠損症、HNF-1異常症（以前のMODY3）、グルコキナーゼ異常症（以前のMODY2）、HNF-4異常症（以前のMODY1）、ミトコンドリアDNA異常、インスリン機能の遺伝的欠損症、インスリン耐性タイプ(type a insulin resistance)、ラブソン−メンデンハル(Rabson-Mendenhall)症候群、脂肪萎縮性糖尿病、膵切除、のう胞性線維症、血色素症、繊維結石(fibrocalculous)膵疾患、内分泌疾患、末端肥大症、クッシング症候群、グルカゴン産生腫瘍、クロム親和性細胞腫、甲状腺機能亢進症、ソマトスタチン産生腫瘍、アルドステロノーマ、薬物誘発性または化学誘発性糖尿病（該薬物は、ベコル(Vacor)、ペンタムジン(Pentamdine)、ニコチン酸、グルココルチコイド、甲状腺ホルモン、ジアゾキシド、アドレナリン作動性薬、チアジド、ジランチンおよびインターフェロンから選ばれる）、すい臓感染症、先天性(congential)風疹、サイトメガロウイルス、免疫媒介性糖尿病のまれな形態、「強直人間」症候群、抗インスリン受容体抗体、加えて時に糖尿病に関連する他の遺伝的症候群（例えば、ダウン症候群、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、ウォルフラム症候群、フリードライヒ運動失調、ハンチントン舞踏病、ローレンス・ムーン・ベイデル(Lawrence Moon Beidel)症候群、筋緊張性ジストロフィー、ポルフィリン症、プレーダー・ウィリィ症候群、および／または妊娠性糖尿病（GDM）を含むが、これらに限定されない。
【０４６９】
胸腺組織中での優位な局在化された発現と合わせて、ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、ヒトRET31ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これらは、それらの拮抗薬および／または断片を含む）が免疫障害および造血性障害を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。代表的な使用は、以下の項目の「免疫活性」、「走化性(Chemotaxis)」および「炎症性疾患」、並びに本明細書の他所に記載する。要するに、免疫組織中での強い発現は、肝細胞系統（これは、血液幹細胞を含む）の増殖；生存；分化；および／または活性化を調節する際の機能を示す。
【０４７０】
RET31ポリペプチドはまた、免疫学的障害の予防薬として有用であり得る。該障害としては例えば、関節炎、喘息、免疫不全症（例えば、AIDS、白血病、関節リウマチ、肉芽腫症、炎症性腸疾患、敗血症、ざ瘡、好中球減少、好中球増多、乾癬、過敏症（例えば、T−細胞媒介性細胞毒性）、移植した器官および組織に対する免疫応答（例えば、宿主対移植片病および移植片対宿主病）、または自己免疫障害（例えば、自己免疫不妊症、水晶体組織損傷、脱髄、全身性エリテマトーデス、薬剤誘発性溶血性貧血、関節リウマチ、シェーグレン病および強皮症）を含む。その上、該タンパク質は他の血液細胞の分化または挙動に影響を及すかまたは損傷部位に肝細胞を補充する分泌因子であり得る。したがって、この遺伝子産物は幹細胞および様々な血液系統の拘束前駆体の増殖において、および様々な細胞タイプの分化および／または増殖において有用であり得る。
【０４７１】
該RET31ポリペプチドは、サイトカイン産生、抗原提示または他のプロセス（例えば、免疫応答を追加免疫する場合）などを調整するのに有用であり得る。リンパ様起源の細胞の発現は、天然の遺伝子産物が免疫機能に関与するであろうことを示す。
【０４７２】
その上、該タンパク質は他の血液細胞の分化または挙動に影響を及すか、または損傷部位に肝細胞を補充する分泌因子であり得る。したがって、この遺伝子産物は幹細胞および様々な血液系統の拘束前駆体の増殖において、および様々な細胞タイプの分化および／または増殖において有用であろうと考えられる。その上、該タンパク質はまた、生物学的活性を測定するのに、組織マーカーとしての抗体を産生するのに、同族リガンドもしくは受容体を単離するのに、それらの相互作用を調整する薬物を同定するのに使用することもでき、加えて栄養サプリメントとしてのそのものの使用が可能である。タンパク質、並びに該タンパク質についての抗体は、腫瘍マーカーおよび／または上記の組織についての免疫療法標的としての有用性を示し得る。
【０４７３】
該ヒトホスファターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これらはそれらの断片および作動薬を含む）は、免疫反応を直接的にまたは間接的に追加免疫することを含む使用を有し得る。
【０４７４】
ホスファターゼ、特に二重特異性ホスファターゼに対する強い相同性は、該ヒトポリヌクレオチドおよびポリペプチドが様々な障害および病気、特に炎症性病気を治療し、診断し、予後しおよび／または予防するのに有用であり得ることを示唆する。該障害などとしては例えば、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬、喘息、虚血性再灌流(ischemiarepurfusion)、多発性硬化症、器官もしくは組織の移植の拒絶反応、慢性閉塞性肺疾患、炎症性腸疾患、クローン(Chrohn's)疾患、潰瘍性大腸炎、非急性呼吸窮迫症候群(inacute respiratory distress syndrome)、全身性エリテマトーデス、のう胞性線維症、自己免疫疾患、癌、腫瘍および新生物を含むが、これらに限定されない。
【０４７５】
該ヒトホスファターゼのポリヌクレオチドおよびポリペプチド（これは、それらの断片および拮抗薬を含む）は、ヒトホスファターゼ機能のモジュレーター（これは、抗体（検出または中和のための）を含む）、天然に存在するモジュレーターおよび小分子モジュレーターの同定を含めた使用を有し得る。該ヒトホスファターゼタンパク質のドメインに対する抗体は、患者における心血管性疾患および炎症性疾患の診断用薬物として使用することができ、シグナル伝達経路の活性化を追跡するのに有用であり、そして疾患状態におけるホスファターゼの関与についての生物マーカーとしておよびインビボでのホスファターゼのインヒビターの評価において使用することができる。
【０４７６】
ヒトホスファターゼのポリペプチドおよびポリヌクレオチドは別の使用を有しており、該使用はヒトホスファターゼ配列をプローブとして使用することによる該ヒトホスファターゼ遺伝子における突然変異を同定することによるか、またはヒトホスファターゼタンパク質もしくはmRNAの発現レベルを測定することによって、ヒトホスファターゼの過剰および／または過少発現に関連する疾患を診断することを含む。ヒトホスファターゼポリペプチドは、該タンパク質の活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするのに有用であり得る。ヒトホスファターゼペプチドはまた、特定の抗体の産生のためにおよび酵母２種ハイブリッドスクリーニングにおけるベイト(bait)として使用して、ヒトホスファターゼと特異的に相互作用するタンパク質を見出すことができる（本明細書の他所に記載する）。
【０４７７】
正常な組織および疾患組織中でのRET31ポリペプチドのタンパク質局在化の免疫組織化学分（実施例58を参照）により、RET31は染色が劣ることを示した喘息患者における同じものと比較して、正常な呼吸性上皮細胞体、I型およびII型の肺細胞、肺好中球、肺マスト細胞、肺マクロファージ中で強く発現した。これらの結果は、RET31ポリペプチドおよびポリヌクレチド（これらは、それらの断片を含む）が肺障害の処置について有用であり得ることを示唆する。疾患した肺組織中での染色の減少は、RET31が正常な細胞維持およびホメオスタシスにとって必須であり、そして形質転換されたかまたは速い増殖性の細胞中で下方調節されることを示唆する。従って、RET31ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの作動薬は、特に肺障害の処置に特に有用であり得る。
【０４７８】
正常な組織および疾患組織中での該RET31ポリペプチドのタンパク質局在化の免疫組織化学分析（例えば、実施例58を参照）により、RET31はまた、変性関節炎における軟骨細胞および縁の(rimming)造骨細胞中で、加えて肝細胞組織中で強く発現することを決定した。その上、メラニン細胞は乾癬を持つ皮膚の場合と同様に、強く陽性であった。これらの結果は、RET31がある疾患および／または障害の炎症性応答に関与し得ることを示唆する。 従って、RET31ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（これらは、それらの断片を含む）が炎症性障害、特に皮膚および骨の炎症性障害（例えば、乾癬および関節炎）の処置に有用であり得る。その上、RET31ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの拮抗薬は、炎症性障害、特に皮膚および骨の炎症性障害（例えば、乾癬および関節炎）の処置に有用であり得る。
【０４７９】
RET31ポリペプチドのホスファターゼ活性を評価するために設計したアッセイを実施して、RET31が本明細書の実施例57に記載する通り、本当にホスファターゼ活性を有することを証明した（図36を参照）。GSTのみはいずれの観察された活性を生じないが、該観察されたホスファターゼ活性はRET31に対して特異的であった。加えて、該観察されたホスファターゼ活性は、公知の活性部位インヒビター、バナジン酸によって特異的に抑制された。
【０４８０】
全長RET31ポリペプチド（配列番号109）をアッセイすることに加えて、配列番号109のM1〜T302のアミノ酸に相当するRET31のC-末端欠損をもアッセイした。該M1〜T302欠損変異体は、全長タンパク質に対してホスファターゼ活性が予期しない5倍の増大を有した。
【０４８１】
RET31ポリペプチドに似た配列を有するホスファターゼが、MKP7として報告されている（MasudaらによるJBC 276, 39002-39011；およびTanoueらによるJBC. 276, 26269-26639）。これらの筆者は、該ホスファターゼが細胞中でp38キナーゼおよびjnkキナーゼと結合し、そして脱リン酸化して、その結果これらのキナーゼの失活を生じるであろうことを報告している。p38キナーゼの活性化は、アポトーシスの誘発において重要であると知られる（HerlaarおよびBrownによるMolecular Medicine Today 5, 439-447）。p38が重要であることが報告されている１経路は、腫瘍細胞中でのパクリタキセル（タキソール（登録商標））誘発性のアポトーシスにおける場合であると報告されている（セイドマン(Seidman)らによるExperimental Cell Research 268, 8492）。同様に、Jnkキナーゼの活性化はまた、パクリタキセル誘発性アポトーシスの場合を含めた（LeeらによるJBC., 273, 28253-28260）アポトーシスの誘発において重要であると報告されている（チャング(Chang)およびカリン(Karin)によるNature 410, 37-40）。したがって、RET31のインヒビターは、p38およびJnkキナーゼの脱リン酸化を防止することによって、腫瘍細胞中でのこれらのキナーゼの活性化を増大させることによって、該細胞中でのアポトーシスを誘発させるであろう。このことは、化学療法薬（例えば、パクリタキセル）（このものは、p38および／またはJnkキナーゼを活性化してアポトーシスを誘発させることを助ける）と合わせた場合に、特に有利となろう。それらの使用はRET拮抗薬の新規な有用であって、これはマスダ(Masuda)らによって認められているが、タノウエ(Tanoue)らによっては認められていない。実際に、マスダ(Masida)らは、MKP7が腫瘍抑制遺伝子であり得て、その場合に、MKP7の抑制は悪性度を増大させるであろうことを教示している（該教示は、RET31インヒビターについて我々が意図する目的から離れている）。
【０４８２】
好ましい態様において、本発明は癌の処置におけるRET31のインヒビターの使用を包含する。本明細書に記載する教示により、RET31のインヒビターとしては、RET31活性の小分子インヒビター、RETがp38および／またはjnkキナーゼと結合するのを防止するインヒビター、RET31に対するアンチセンスオリグヌクレオチド、およびRET31についての抗体を含む。該RET31インヒビターは、RET31が正常な組織と比べて過剰発現する悪性疾患において特に有用であろう。単一薬物としてのRET31インヒビターの使用に加えて、RET31のインヒビターは、パクリタキセルおよび他の化学療法薬（これは、腫瘍細胞中でのjnkおよび／またはp38依存性アポトーシスを誘発する）と組み合せて、悪性疾患の処置のための特定の使用となろう。Jnkおよび／またはp38の活性化を誘発してアポトーシスを生じ得て、RET31のインヒビターと組み合せた使用となるであろう他の化学療法薬としては、RRR−α−トコフェノールコハク酸塩、DA-125、[(8S,10S)−8−(3−アミノプロパノイルアセチル)−10−[(2,6−ジデオキシ−2−フルオロ−α−L−タロピラノシル(talopyranosyl)オキシ]−7,8,9,10−テトラヒドロ−6,8,11−トリヒドロキシ−1−メチル−5,12−ナフタセン(naphthacene)−ジオン塩酸塩]、新規なアントラセン誘導体、シスプラチン、タモキシフェン、スリンダクスルホン、スリンダク(sulindac)、三酸化ヒ素、アクチモマイシンD、ドセタキセル(タキソテール)、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ノコダゾール(nocodazole)、コルヒチンおよび他の微小管妨害薬物を含むが、これらに限定されない。
【０４８３】
該コードされたポリペプチドはホスファターゼタンパク質（特に、二重特異性ホスファターゼ）との少なくともある生物学的活性を有し得ると考えられているが、本クローンの正確な生物学的機能を測定するいくつかの方法が当該分野で知られていたりまたは本明細書の他所に記載する。要するに、このクローンの機能は、マイクロアレイ方法論を適用することによって測定することができる。該ヒトホスファターゼポリヌクレオチドに対応する核酸、加えて本発明の他のクローンは、発現プロファイリングのためのマイクロチップ上にアレイすることができる。ポリヌクレオチドプローヌを用いて該スライドにハイブリダイスさせることによって、ある遺伝子の発現の変化は研究する条件に基づく本遺伝子の機能に別の洞察を与え得る。例えば、該使用したポリヌクレオチドプローブが正常な組織と比べて疾患した精巣組織から生じる場合に観察される発現レベルの増減は、精巣の機能を調節する機能を示唆し得る。ヒトRET31ホスファターゼの場合に、副腎、精巣、前立腺、卵巣、骨格筋、肝臓、胎盤、すい臓、胸腺、小腸、甲状腺、心臓、腎臓および／または肺組織を用いて、例えばプローブを製造するためのRNAを抽出することができる。
【０４８４】
加えて、該タンパク質の機能は、例えば定量的PCR方法を適用することによって評価することができる。リアルタイムの定量的PCRにより、例えばヒトホスファターゼ遺伝子全般の発生の発現の能力を示す。定量的PCR方法は、そういった実験を行なうのに必要とされる各々の発生的に重要な工程由来の組織の名目上の量のみを必要とする。従って、このポリペプチドの生物学的機能を洗練するための定量的PCR方法論の利用は本発明に包含する。ヒトホスファターゼの場合に、ヒトホスファターゼに関連する疾患相関は、正常な組織中でのヒトホスファターゼのmRNA発現レベルを、疾患組織（特に、疾患組織は副腎、精巣、前立腺、卵巣、骨格筋、肝臓、胎盤、すい臓、胸腺、小腸、甲状腺、心臓、腎臓および／または肺組織から単離される）の場合と比較することによって、得ることができる。疾患組織におけるヒトホスファターゼの有意により高いかまたは低い発現は、ヒトホスファターゼが疾患の進行において機能することができて、そしてヒトホスファターゼポリペプチドに対する拮抗薬が該疾患を治療し、予防しおよび／または軽減する際に治療学的に有用であろうことを示唆し得る。あるいは、該疾患組織におけるヒトホスファターゼ発現の有意により高いかまたは低いレベルは、ヒトホスファターゼが疾患の進行について防御的な機能を果たしており、そしてヒトホスファターゼポリペプチドの作動薬が該疾患を治療し、予防しおよび／または軽減する際に治療学的に有用であり得ることを示唆し得る。本発明はまた、配列番号108（図13A〜F）に提示するポリヌクレオチド配列に相当する定量的PCRプローブを包含する。
【０４８５】
該タンパク質の機能はまた、酵母菌中での相補性アッセイを用いてアッセイすることもできる。例えば、ヒトホスファターゼの場合には、例えば二重特異性ホスファターゼ活性が欠失している酵母菌を形質転換し、そしてそれらの増殖する能力を評価することにより、該ヒトホスファターゼポリペプチドが二重特異性ホスファターゼ活性を有することを確信させる証拠を得るであろう。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの機能を評価するのに使用することができる別のアッセイ条件および方法は、当該分野において知られており、そのいくつかは本明細書の他所に開示する。
【０４８６】
あるいは、該コードされたポリペプチドの生物学的機能は、マウスおよび／またはラットにおける本ポリペプチドのホモログを破壊し、そしてえられた表現型を観察することによって測定することができる。該ノックアウト実験は当該分野において知られており、そのいくつかは本明細書の他所に開示する。
【０４８７】
その上、このポリペプチドの生物学的機能は、アンチセンスおよび／またはセンス方法論の適用、並びに得られたトランスジェニックなマウスおよび／またはラットの発生によって測定することができる。トランスジェニックなマウスまたはラットにおけるセンスまたはアンチセンスのいずれかの配向である遺伝子を発現することにより、ある遺伝子の比較的により高いかまたは低い発現レベルを生じ得る。遺伝子の内因性の発現レベルを変えることにより、ある表現型を観察することができるようになり、次いでこのものを用いて該遺伝子の機能に関する指標を導くことができる。該遺伝子は強い遍在性のプロモーターを使用することにより、いつでも該生物のあらゆる細胞中で過剰発現させたりまたは過少発現させることができたり、そのものを十分に確認された組織特異的プロモーター（例えば、副腎、精巣、前立腺、卵巣、骨格筋、肝臓、胎盤、すい臓、胸腺、小腸、甲状腺、心臓、腎臓および／または肺組織に特異的なプロモーター）を用いて該生物の１つ以上の別々の部分中で発現することができ、あるいはそのものを誘発的におよび／または発生的に調節されたプロモーターを用いて発生の具体的な時期に発現させることができる。
【０４８８】
ヒトホスファターゼのトランスジェニックなマウスまたはラットの場合、正常な増殖条件において表現型が全く出現しない場合には、疾患状態（代謝性、生殖性、免疫性、造血性、心血管性、肝性または肺性障害、加えて癌など）下の生物を観察することにより、該遺伝子の機能を理解することができる。従って、該ポリペプチドの生物学的機能を洗練する(refine)ためにトランスジェニックなマウスまたはラットの創製についてのアンチセンスおよび／またはセンス方法論の出願は、本発明に包含する。
【０４８９】
好ましい態様において、以下のN-末端RET31欠失ポリペプチドを本発明に包含する：配列番号109中、M1-S665, A2-S665, H3-S665, E4-S665, M5-S665, I6-S665, G7-S665, T8-S665, Q9-S665, I10-S665, V11-S665, T12-S665, E13-S665, R14-S665, L15-S665, V16-S665, A17-S665, L18-S665, L19-S665, E20-S665, S21-S665, G22-S665, T23-S665, E24-S665, K25-S665, V26-S665, L27-S665, L28-S665, I29-S665, D30-S665, S31-S665, R32-S665, P33-S665, F34-S665, V35-S665, E36-S665, Y37-S665, N38-S665, T39-S665, S40-S665, H41-S665, I42-S665, L43-S665, E44-S665, A45-S665, I46-S665, N47-S665, I48-S665, N49-S665, C50-S665, S51-S665, K52-S665, L53-S665, M54-S665, K55-S665, R56-S665, R57-S665, L58-S665, Q59-S665, Q60-S665, D61-S665, K62-S665, V63-S665, L64-S665, I65-S665, T66-S665, E67-S665, L68-S665, I69-S665, Q70-S665, H71-S665, S72-S665, A73-S665, K74-S665, H75-S665, K76-S665, V77-S665, D78-S665, I79-S665, D80-S665, C81-S665, S82-S665, Q83-S665, K84-S665, V85-S665, V86-S665, V87-S665, Y88-S665, D89-S665, Q90-S665, S91-S665, S92-S665, Q93-S665, D94-S665, V95-S665, A96-S665, S97-S665, L98-S665, S99-S665, S100-S665, D101-S665, C102-S665, F103-S665, L104-S665, T105-S665, V106-S665, L107-S665, L108-S665, G109-S665, K110-S665, Llll-S665, E112-S665, K113-S665, S114-S665, F115-S665, N116-S665, S117-S665, V118-S665, H119-S665, L120-S665, L121-S665, A122-S665, G123-S665, G124-S665, F125-S665, A126-S665, E127-S665, F128-S665, S129-S665, R130-S665, C131-S665, F132-S665, P133-S665, G134-S665, L135-S665, C136-S665, E137-S665, G138-S665, K139-S665, S140-S665, T141-S665, L142-S665, V143-S665, P144-S665, T145-S665, C146-S665, I147-S665, S148-S665, Q149-S665, P150-S665, C151-S665, L152-S665, P153-S665, V154-S665, A155-S665, N156-S665, I157-S665, G158-S665, P159-S665, T160-S665, R161-S665, I162-S665, L163-S665, P164-S665, N165-S665, L166-S665, Y167-S665, L168-S665, G169-S665, C170-S665, Q171-S665, R172-S665, D173-S665, V174-S665, L175-S665, N176-S665, K177-S665, E178-S665, L179-S665, I180-S665, Q181-S665, Q182-S665, N183-S665, G184-S665, I185-S665, G186-S665, Y187-S665, V188-S665, L189-S665, N190-S665, A191-S665, S192-S665, Y193-S665, T194-S665, C195-S665, P196-S665, K197-S665, P198-S665, D199-S665, F200-S665, I201-S665, P202-S665, E203-S665, S204-S665, H205-S665, F206-S665, L207-S665, R208-S665, V209-S665, P210-S665, V211-S665, N212-S665, D213-S665, S214-S665, F215-S665, C216-S665, E217-S665, K218-S665, I219-S665, L220-S665, P221-S665, W222-S665, L223-S665, D224-S665, K225-S665, S226-S665, V227-S665, D228-S665, F229-S665, I230-S665, E231-S665, K232-S665, A233-S665, K234-S665, A235-S665, S236-S665, N237-S665, G238-S665, C239-S665, V240-S665, L241-S665, V242-S665, H243-S665, C244-S665, L245-S665, A246-S665, G247-S665, I248-S665, S249-S665, R250-S665, S251-S665, A252-S665, T253-S665, I254-S665, A255-S665, I256-S665, A257-S665, Y258-S665, I259-S665, M260-S665, K261-S665, R262-S665, M263-S665, D264-S665, M265-S665, S266-S665, L267-S665, D268-S665, E269-S665, A270-S665, Y271-S665, R272-S665, F273-S665, V274-S665, K275-S665, E276-S665, K277-S665, R278-S665, P279-S665, T280-S665, I281-S665, S282-S665, P283-S665, N284-S665, F285-S665, N286-S665, F287-S665, L288-S665, G289-S665, Q290-S665, L291-S665, L292-S665, D293-S665, Y294-S665, E295-S665, K296-S665, K297-S665, I298-S665, K299-S665, N300-S665, Q301-S665, T302-S665, G303-S665, A304-S665, S305-S665, G306-S665, P307-S665, K308-S665, S309-S665, K310-S665, L311-S665, K312-S665, L313-S665, L314-S665, H315-S665, L316-S665, E317-S665, K318-S665, P319-S665, N320-S665, E321-S665, P322-S665, V323-S665, P324-S665, A325-S665, V326-S665, S327-S665, E328-S665, G329-S665, G330-S665, Q331-S665, K332-S665, S333-S665, E334-S665, T335-S665, P336-S665, L337-S665, S338-S665, P339-S665, P340-S665, C341-S665, A342-S665, D343-S665, S344-S665, A345-S665, T346-S665, S347-S665, E348-S665, A349-S665, A350-S665, G351-S665, Q352-S665, R353-S665, P354-S665, V355-S665, H356-S665, P357-S665, A358-S665, S359-S665, V360-S665, P361-S665, S362-S665, V363-S665, P364-S665, S365-S665, V366-S665, Q367-S665, P368-S665, S369-S665, L370-S665, L371-S665, E372-S665, D373-S665, S374-S665, P375-S665, L376-S665, V377-S665, Q378-S665, A379-S665, L380-S665, S381-S665, G382-S665, L383-S665, H384-S665, L385-S665, S386-S665, A387-S665, D388-S665, R389-S665, L390-S665, E391-S665, D392-S665, S393-S665, N394-S665, K395-S665, L396-S665, K397-S665, R398-S665, S399-S665, F400-S665, S401-S665, L402-S665, D403-S665, I404-S665, K405-S665, S406-S665, V407-S665, S408-S665, Y409-S665, S410-S665, A411-S665, S412-S665, M413-S665, A414-S665, A415-S665, S416-S665, L417-S665, H418-S665, G419-S665, F420-S665, S421-S665, S422-S665, S423-S665, E424-S665, D425-S665, A426-S665, L427-S665, E428-S665, Y429-S665, Y430-S665, K431-S665, P432-S665, S433-S665, T434-S665, T435-S665, L436-S665, D437-S665, G438-S665, T439-S665, N440-S665, K441-S665, L442-S665, C443-S665, Q444-S665, F445-S665, S446-S665, P447-S665, V448-S665, Q449-S665, E450-S665, L451-S665, S452-S665, E453-S665, Q454-S665, T455-S665, P456-S665, E457-S665, T458-S665, S459-S665, P460-S665, D461-S665, K462-S665, E463-S665, E464-S665, A465-S665, S466-S665, I467-S665, P468-S665, K469-S665, K470-S665, L471-S665, Q472-S665, T473-S665, A474-S665, R475-S665, P476-S665, S477-S665, D478-S665, S479-S665, Q480-S665, S481-S665, K482-S665, R483-S665, L484-S665, H485-S665, S486-S665, V487-S665, R488-S665, T489-S665, S490-S665, S491-S665, S492-S665, G493-S665, T494-S665, A495-S665, Q496-S665, R497-S665, S498-S665, L499-S665, L500-S665, S501-S665, P502-S665, L503-S665, H504-S665, R505-S665, S506-S665, G507-S665, S508-S665, V509-S665, E510-S665, D511-S665, N512-S665, Y513-S665, H514-S665, T515-S665, S516-S665, F517-S665, L518-S665, F519-S665, G520-S665, L521-S665, S522-S665, T523-S665, S524-S665, Q525-S665, Q526-S665, H527-S665, L528-S665, T529-S665, K530-S665, S531-S665, A532-S665, G533-S665, L534-S665, G535-S665, L536-S665, K537-S665, G538-S665, W539-S665, H540-S665, S541-S665, D542-S665, I543-S665, L544-S665, A545-S665, P546-S665, Q547-S665, T548-S665, S549-S665, T550-S665, P551-S665, S552-S665, L553-S665, T554-S665, S555-S665, S556-S665, W557-S665, Y558-S665, F559-S665, A560-S665, T561-S665, E562-S665, S563-S665, S564-S665, H565-S665, F566-S665, Y567-S665, S568-S665, A569-S665, S570-S665, A571-S665, I572-S665, Y573-S665, G574-S665, G575-S665, S576-S665, A577-S665, S578-S665, Y579-S665, S580-S665, A581-S665, Y582-S665, S583-S665, C584-S665, S585-S665, Q586-S665, L587-S665, P588-S665, T589-S665, C590-S665, G591-S665, D592-S665, Q593-S665, V594-S665, Y595-S665, S596-S665, V597-S665, R598-S665, R599-S665, R600-S665, Q601-S665, K602-S665, P603-S665, S604-S665, D605-S665, R606-S665, A607-S665, D608-S665, S609-S665, R610-S665, R611-S665, S612-S665, W613-S665, H614-S665, E615-S665, E616-S665, S617-S665, P618-S665, F619-S665, E620-S665, K621-S665, Q622-S665, F623-S665, K624-S665, R625-S665, R626-S665, S627-S665, C628-S665, Q629-S665, M630-S665, E631-S665, F632-S665, G633-S665, E634-S665, S635-S665, I636-S665, M637-S665, S638-S665, E639-S665, N640-S665, R641-S665, S642-S665, R643-S665, E644-S665, E645-S665, L646-S665, G647-S665, K648-S665, V649-S665, G650-S665, S651-S665, Q652-S665, S653-S665, S654-S665, F655-S665, S656-S665, G657-S665, S658-S665および／またはM659-S665。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらのN-末端RET31欠失ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０４９０】
好ましい態様において、以下のC-末端RET31欠失ポリペプチドを本発明に包含する：配列番号109中、M1-S665, M1-V664, M1-E663, M1-I662, M1-I661, M1-E660, M1-M659, M1-S658, Ml-G657, M1-S656, M1-F655, M1-S654, M1-S653, M1-Q652, M1-S651, M1-G650, M1-V649, M1-K648, M1-G647, M1-L646, M1-E645, M1-E644, M1-R643, M1-S642, M1-R641, M1-N640, M1-E639, M1-S638, M1-M637, M1-I636, M1-S635, M1-E634, M1-G633, M1-F632, M1-E631, M1-M630, M1-Q629, M1-C628, M1-S627, M1-R626, M1-R625, M1-K624, M1-F623, M1-Q622, M1-K621, M1-E620, M1-F619, M1-P618, M1-S617, M1-E616, M1-E615, M1-H614, M1-W613, M1-S612, M1-R611, Ml-R610, M1-S609, M1-D608, M1-A607, M1-R606, M1-D605, M1-S604, M1-P603, M1-K602, M1-Q601, M1-R600, M1-R599, M1-R598, M1-V597, M1-S596, Ml-Y595, M1-V594, M1-Q593, M1-D592, M1-G591, M1-C590, M1-T589, M1-P588, M1-L587, M1-Q586, M1-S585, M1-C584, M1-S583, M1-Y582, M1-A581, M1-S580, M1-Y579, M1-S578, M1-A577, M1-S576, M1-G575, M1-G574, M1-Y573, Ml-1572, M1-A571, M1-S570, M1-A569, M1-S568, M1-Y567, M1-F566, M1-H565, M1-S564, M1-S563, M1-E562, M1-T561, M1-A560, M1-F559, M1-Y558, M1-W557, M1-S556, M1-S555, M1-T554, M1-L553, M1-S552, M1-P551, M1-T550, M1-S549, M1-T548, M1-Q547, M1-P546, M1-A545, M1-L544, M1-I543, M1-D542, M1-S541, M1-H540, M1-W539, M1-G538, M1-K537, M1-L536, M1-G535, M1-L534, M1-G533, M1-A532, M1-S531, M1-K530, M1-T529, M1-L528, M1-H527, M1-Q526, M1-Q525, M1-S524, M1-T523, M1-S522, M1-L521, M1-G520, M1-F519, M1-L518, M1-F517, M1-S516, M1-T515, M1-H514, M1-Y513, M1-N512, M1-D511, M1-E510, M1-V509, M1-S508, M1-G507, M1-S506, M1-R505, M1-H504, M1-L503, M1-P502, M1-S501, M1-L500, M1-L499, M1-S498, M1-R497, M1-Q496, M1-A495, M1-T494, M1-G493, M1-S492, M1-S491, M1-S490, M1-T489, M1-R488, M1-V487, M1-S486, M1-H485, M1-L484, M1-R483, M1-K482, M1-S481, M1-Q480, M1-S479, M1-D478, M1-S477, M1-P476, M1-R475, M1-A474, M1-T473, M1-Q472, M1-L471, M1-K470, M1-K469, M1-P468, Ml-1467, M1-S466, M1-A465, M1-E464, M1-E463, M1-K462, M1-D461, M1-P460, M1-S459, M1-T458, M1-E457, M1-P456, M1-T455, M1-Q454, M1-E453, M1-S452, M1-L451, M1-E450, M1-Q449, M1-V448, M1-P447, M1-S446, M1-F445, M1-Q444, M1-C443, M1-L442, M1-K441, M1-N440, M1-T439, M1-G438, M1-D437, M1-L436, M1-T435, M1-T434, M1-S433, M1-P432, M1-K431, M1-Y430, M1-Y429, M1-E428, M1-L427, M1-A426, M1-D425, M1-E424, M1-S423, M1-S422, M1-S421, M1-F420, M1-G419, M1-H418, M1-L417, M1-S416, M1-A415, M1-A414, M1-M413, M1-S412, M1-A411, M1-S410, M1-Y409, M1-S408, M1-V407, M1-S406, M1-K405, Ml-1404, M1-D403, M1-L402, M1-S401, M1-F400, M1-S399, M1-R398, M1-K397, M1-L396, M1-K395, M1-N394, M1-S393, M1-D392, M1-E391, M1-L390, M1-R389, M1-D388, M1-A387, M1-S386, M1-L385, M1-H384, M1-L383, M1-G382, M1-S381, M1-L380, M1-A379, M1-Q378, M1-V377, M1-L376, M1-P375, M1-S374, M1-D373, M1-E372, M1-L371, M1-L370, M1-S369, M1-P368, M1-Q367, M1-V366, M1-S365, M1-P364, M1-V363, M1-S362, M1-P361, M1-V360, M1-S359, M1-A358, M1-P357, M1-H356, M1-V355, M1-P354, M1-R353, M1-Q352, M1-G351, M1-A350, M1-A349, M1-E348, M1-S347, M1-T346, M1-A345, M1-S344, M1-D343, M1-A342, M1-C341, M1-P340, M1-P339, M1-S339, M1-L337, M1-P336, M1-T335, M1-E334, M1-S333, M1-K332, M1-Q331, M1-G330, M1-G329, M1-E328, M1-S327, M1-V326, M1-A325, M1-P324, M1-V323, M1-P322, M1-E321, M1-N320, M1-P319, M1-K318, M1-E317, M1-L316, M1-H315, M1-L314, M1-L313, M1-K312, M1-L311, M1-K310, M1-S309, M1-K308, M1-P307, M1-G306, M1-S305, M1-A304, M1-G303, M1-T302, M1-Q301, M1-N300, M1-K299, M1-I298, M1-K297, M1-K296, M1-E295, M1-Y294, M1-D293, M1-L292, M1-L291, M1-Q290, M1-G289, M1-L288, M1-F287, M1-N286, M1-F285, M1-N284, M1-P283, M1-S282, M1-I281, M1-T280, M1-P279, M1-R278, M1-K277, M1-E276, M1-K275, M1-V274, M1-F273, M1-R272, M1-Y271, M1-A270, M1-E269, M1-D268, M1-L267, M1-S266, M1-M265, M1-D264, M1-M263, M1-R262, M1-K261, M1-M260, M1-I259, M1-Y258, M1-A257, M1-I256, M1-A255, M1-I254, M1-T253, M1-A252, M1-S251, M1-R250, M1-S249, M1-I248, M1-G247, M1-A246, M1-L245, M1-C244, M1-H243, M1-V242, M1-L241, M1-V240, M1-C239, M1-G238, M1-N237, M1-S236, M1-A235, M1-K234, M1-A233, M1-K232, M1-E231, M1-I230, M1-F229, M1-D228, M1-V227, M1-S226, M1-K225, M1-D224, M1-L223, M1-W222, M1-P221, M1-L220, Ml-1219, M1-K218, M1-E217, M1-C216, M1-F215, M1-S214, M1-D213, M1-N212, M1-V211, M1-P210, M1-V209, M1-R208, M1-L207, M1-F206, M1-H205, M1-S204, M1-E203, M1-P202, M1-I201, M1-F200, M1-D199, M1-P198, M1-K197, M1-P196, M1-C195, M1-T194, M1-Y193, M1-S192, M1-A191, M1-N190, M1-L189, M1-V188, M1-Y187, M1-G186, Ml-1185, M1-G184, M1-N183, M1-Q182, M1-Q181, M1-I180, M1-L179, M1-E178, M1-K177, M1-N176, M1-L175, M1-V174, M1-D173, M1-R172, M1-Q171, M1-C170, M1-G169, M1-L168, M1-Y167, M1-L166, M1-N165, M1-P164, M1-L163, M1-I162, M1-R161, M1-T160, M1-P159, M1-G158, M1-I157, M1-N156, M1-A155, M1-V154, M1-P153, M1-L152, M1-C151, M1-P150, M1-Q149, M1-S148, M1-I147, M1-C146, M1-T145, M1-P144, M1-V143, M1-L142, M1-T141, M1-S140, M1-K139, M1-G138, M1-E137, M1-C136, M1-L135, M1-G134, Ml-P133, M1-F132, M1-C131, Ml-R130, Ml-S129, M1-F128, M1-E127, M1-A126, M1-F125, Ml-G124, Ml-G123, M1-A122, M1-L121, Ml-L120, M1-H119, M1-V118, M1-S117, M1-N116, M1-F115, M1-S114, Ml-K113, M1-E112, Ml-L111, M1-K110, M1-G109, MI-LI08, M1-L107, Ml-V106, M1-T105, M1-L104, Ml-F103, M1-C102, M1-D101, Ml-S100, Ml-S99, M1-L98, M1-S97, Ml-A96, Ml-V95, M1-D94, M1-Q93, Ml-S92, Ml-S91, Ml-Q90, M1-D89, M1-Y88, M1-V87, M1-V86, M1-V85, M1-K84, M1-Q83, M1-S82, M1-C81, M1-D80, M1-I79, M1-D78, M1-V77, M1-K76, M1-H75, M1-K74, M1-A73, M1-S72, M1-H71, M1-Q70, M1-I69, M1-L68, M1-E67, M1-T66, M1-I65, M1-L64, M1-V63, M1-K62, M1-D61, M1-Q60, M1-Q59, M1-L58, M1-R57, M1-R56, M1-K55, M1-M54, M1-L53, M1-K52, M1-S51, M1-C50, M1-N49, M1-I48, M1-N47, M1-I46, M1-A45, M1-E44, M1-L43, M1-I42, M1-H41, M1-S40, M1-T39, M1-N38, M1-Y37, M1-E36, M1-V35, M1-F34, M1-P33, M1-R32, M1-S31, M1-D30, M1-I29, M1-L28, Ml-L27, M1-V26, M1-K25, M1-E24, M1-T23, M1-G22, M1-S21, M1-E20, M1-L19, M1-L18, M1-A17, M1-V16, Ml-L15, M1-R14, M1-E13, M1-T12, M1-V11, Mol-110, Ml-Q9, M1-T8および／またはM1-G7。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらのC-末端RET31欠失ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０４９１】
本発明はまた、該ヒトRET31ホフェターゼポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープをも包含する。
【０４９２】
本発明のヒトホスファターゼポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）に基づいて、いくつかのリン酸化部位を含むことが分かった。それらの部位のリン酸化は、ヒトホスファターゼポリペプチドのいくつかの生物学的活性を調節し得る。例えば、特定の部位でのリン酸化は、他の分子（例えば、タンパク質、リガンド、基質、DNAなど）と会合したりまたは結合するタンパク質の能力を調節するのに関与し得る。この場合に、リン酸化は他のポリペプチド、特にヒトホスファターゼの同族リガンドと会合するヒトホスファターゼポリペプチドの能力、またはある細胞シグナル経路を調節するその能力を調整し得る。
【０４９３】
ヒトホスファターゼポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）を用いて、12個のPKCリン酸化部位を含むことが予想された。インビボにおいて、タンパク質キナーゼCはセリンまたはトレオニン残基のリン酸化について優位性を示す。該PKCリン酸化部位は、共通パターン：[ST]-x-[RK]（式中、SまたはTはリン酸化の部位であり、そして「X」が介在アミノ酸残基である）を有する。PKCリン酸化部位に関する別の情報は、Woodget J. R., Gould K. L., Hunter T.によるEur. J. Biochem. 161: 177-184 (1986)、およびKishimoto A., Nishiyama K., Nakanishi H., Uratsuji Y., Nomura H., Takeyama Y., Nishizuka Y.によるJ. Biol. Chem.260: 12492-12499 (1985)（これらは、本明細書の一部を構成する）で知ることができる。
【０４９４】
好ましい態様において、以下のPKCリン酸エステル化部位ポリペプチドを、本発明に包含する：GTQIVTERLVALL（配列番号116）、LLESGTEKVLLID（配列番号117）、ELIQHSAKHKVDI（配列番号118）、VDIDCSQKVVVYD（配列番号119）、DRLEDSNKLKRSF（配列番号120）、TTLDGTNKLCQFS（配列番号121）、PKKLQTARPSDSQ（配列番号122）、PSDSQSKRLHSVR（配列番号123）、SKRLHSVRTSSSG（配列番号124）、GDQVYSVRRRQKP（配列番号125）、RRQKPSDRADSRR（配列番号126）および／またはSDRADSRRSWHEE（配列番号127）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、該ヒトRET31ホスファターゼPKCリン酸エステル化部位ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０４９５】
該ヒトホスファターゼポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）によれば、6つのグリコシル化部位を含むことが分かった。本明細書においてより具体的に記載する通り、タンパク質グリコシル化は、様々な機能：タンパク質フォールディングの増強、タンパク質凝集の抑制、細胞小器官への細胞内輸送の調節、タンパク質分解に対する耐性の増大、タンパク質抗原性の調節、および細胞間接着の媒介を保存すると考えられている。
【０４９６】
アスパラギンリン酸化部位は、共通パターン：N-{P}-[ST]-{P}（式中、Nはグリコシル化部位である）を有する。しかしながら、潜在的なN-グリコシル化部位は共通配列Asn-Xaa-Ser/Thrに対して特異的であることがよく知られる。しかしながら、該共通トリペプチドの存在は、タンパク質のフォールディングがN-グリコシル化の調節に重要な役割を果たしている事実により、アスパラギン残基がグリコシル化されると結論づけるには十分ではない。AsnおよびSer/Thrの間のプロリンの存在は、N-グリコシル化を抑制するであろうことが分かった。このことは、グリコシル化部位の最近の統計学的な分析によって確認されており、これによりSer/ThrヘのプロリンC-末端を有する部位の約50％がグリコシル化されないことをも示す。アスパラギングリコシル化に関する別の情報は、以下の刊行物：Marshall R. D.によるAnnu. Rev. Biochem. 41: 673-702 (1972); Pless D. D., Lennarz W. J.によるProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 134 138 (1977); Bause E.によるBiochem. J. 209: 331-336 (1983) ; Gavel Y., von Heijne G.によるProtein Eng. 3: 433-442 (1990)；およびMiletich J. P., Broze G. J. Jr.によるJ. Biol. Chem. 265: 11397-11404 (1990)（これらは、本明細書の一部を構成する）で知ることができる。
【０４９７】
以下の好ましい態様において、以下のアスパラギングリコシル化部位ポリペプチドを本発明に包含する：PFVEYNTSHILEAI（配列番号128）、EAININCSKLMKRR（配列番号129）、IGYVLNASYTCPKP（配列番号130）、LRVPVNDSFCEKIL（配列番号131）、EKKIKNQTGASGPK（配列番号132）および／またはSIMSENRSREELGK（配列番号133）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、該ヒトRET31ホスファターゼアスパラギングリコシル化部位ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０４９８】
新規なヒトホスファターゼポリペプチドであるヒトRET31の確認において、該RET31ポリペプチドはクエリー配列としてDSPc PFAM HMM（PF00782）を用いたBLAST2アルゴリズムによって同定される二重特異性ホスファターゼ触媒的ドメインを含むことが分かった。
【０４９９】
該ヒトRET31ポリペプチドの触媒的な残基は、配列番号109（図13A〜F）のアミノ酸残基244に位置する活性部位システインによって表される。
【０５００】
好ましい態様において、以下のヒトRET31 DSPcドメインポリペプチドを本発明に包含する：
GPTRILPNLYLGCQRDVLNKELIQQNGIGYVLNASYTCPKPDFIPESHFLRVPV
NDSFCEKILPWLDKSVDFIEKAKASNGCVLVHCLAGISRSATIAIAYIMKRMD
MSLDEAYRFVKEKRPTISPNFNFLGQLLDYEKK（配列番号134）。
このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、このヒトRET31 DSPcドメインポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０５０１】
好ましい態様において、以下のヒトRET31DSPcドメインアミノ酸置換を本発明に包含する：配列番号109中、G158は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P159は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T160は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R161は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I162は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L163は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P164は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N165は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L166は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y167は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；L168は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G169は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C170は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Q171は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R172は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D173は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V174は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；L175は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N176は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、 WまたはYのいずれかによって置換され；K177は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E178は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L179は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I180は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Q181は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Q182は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N183は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G184は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I185は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G186は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y187は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；V188は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；L189は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N190は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A191は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S192は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y193は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；T194は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C195は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P196は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；K197は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P198は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、 WまたはYのいずれかによって置換され；D199は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F200は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I201は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P202は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E203は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S204は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；H205は、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F206は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L207は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R208は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V209は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；P210は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V211は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；N212は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D213は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S214は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F215は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C216は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E217は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；K218は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I219は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L220は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P221は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；W222は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはYのいずれかによって置換され；L223は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D224は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；K225は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S226は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V227は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；D228は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F229は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I230は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E231は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；K232は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A233は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；K234は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A235は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S236は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N237は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G238は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C239は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V240は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；L241は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V242は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；H243は、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；C244は、A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L245は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A246は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G247は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I248は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S249は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R250は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S251は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A252は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T253は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I254は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A255は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I256は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A257は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y258は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；I259は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；M260は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；K261は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R262は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；M263は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D264は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；M265は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S266は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L267は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D268は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E269は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；A270は、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y271は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；R272は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F273は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；V274は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、WまたはYのいずれかによって置換され；K275は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；E276は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；K277は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；R278は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P279は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；T280は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、WまたはYのいずれかによって置換され；I281は、A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；S282は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；P283は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N284は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F285は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；N286は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；F287は、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L288は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；G289は、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Q290は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L291は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；L292は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；D293は、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；Y294は、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、VまたはWのいずれかによって置換され；E295は、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；K296は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；および／またはK297は、A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WまたはYのいずれかによって置換され；加えて、それらの組み合わせのいずれかの置換を含む。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらヒトRET31 DSPcドメインアミノ酸置換ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０５０２】
好ましい態様において、以下のヒトRET31 DSPcドメイン保存アミノ酸置換を本発明の包含する：配列番号109中、G158は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；P159は、Pであり；T160は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；R161は、KまたはHのいずれかによって置換され；I162は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；L163は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；P164は、Pであり；N165は、Qによって置換され；L166は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；Y167は、FまたはWのいずれかであり；L168は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；G169は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；C170は、Cであり；Q171は、Nによって置換され；R172は、KまたはHのいずれかによって置換され；D173は、Eによって置換され；V174は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；L175は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；N176は、Qによって置換され；K177は、RまたはHのいずれかによって置換され；E178は、Dによって置換され；L179は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；I180は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；Q181は、Nによって置換され；Q182は、Nによって置換され；N183は、Qによって置換され；G184は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され； I185は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；G186は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；Y187は、FまたはWのいずれかであり；V188は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；L189は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；N190は、Qによって置換され；A191は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；S192は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；Y193は、FまたはWのいずれかであり；T194は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；C195は、Cであり；P196は、Pであり；K197は、RまたはHのいずれかによって置換され；P198は、Pであり；D199は、Eによって置換され；F200は、WまたはYのいずれかによって置換され；I201は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；P202は、Pであり；E203は、Dによって置換され；S204は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；H205は、KまたはRのいずれかによって置換され；F206は、WまたはYのいずれかによって置換され；L207は、A、IまたはVのいずれ賀によって置換され；R208は、KまたはHのいずれかによって置換され；V209は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；P210は、Pであり；V211は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；N212は、Qによって置換され；D213は、Eによって置換され；S214は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；F215は、WまたはYのいずれかによって置換され；C216は、Cであり；E217は、Dによって置換され；K218は、RまたはHのいずれかによって置換され；I219は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；L220は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；P221は、Pであり；W222は、FまたはYのいずれかであり；L223は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；D224は、Eによって置換され；K225は、RまたはHのいずれかによって置換され；S226は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；V227は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；D228は、Eによって置換され；F229は、WまたはYのいずれかによって置換され；I230は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；E231は、Dによって置換���れ；K232は、RまたはHのいずれかによって置換され；A233は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；K234は、RまたはHのいずれかによって置換され；A235は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；S236は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；N237は、Qによって置換され；G238は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；C239は、Cであり；V240は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；L241は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；V242は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；H243は、KまたはRのいずれかによって置換され；C244は、Cであり；L245は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；A246は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；G247は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；I248は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；S249は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；R250は、KまたはHのいずれかによって置換され；S251は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；A252は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；T253は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；I254は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；A255は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；I256は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；A257は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；Y258は、FまたはWであり；I259は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；M260は、A、G、SまたはTのいずれかによって置換され；K261は、RまたはHのいずれかによって置換され；R262は、KまたはHのいずれかによって置換され；M263は、A、G、SまたはTのいずれかによって置換され；D264は、Eによって置換され；M265は、A、G、SまたはTのいずれかによって置換され；S266は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；L267は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；D268は、Eによって置換され；E269は、Dによって置換され；A270は、G、I、L、M、S、TまたはVのいずれかによって置換され；Y271は、 FまたはWはいずれかであり；R272は、KまたはHのいずれかによって置換され；F273は、WまたはYのいずれかによって置換され；V274は、A、IまたはLのいずれかによって置換され；K275は、RまたはHのいずれかによって置換され；E276は、Dによって置換され；K277は、RまたはHのいずれかによって置換され；R278は、KまたはHのいずれかによって置換され；P279は、Pであり；T280は、A、G、MまたはSのいずれかによって置換され；I281は、A、VまたはLのいずれかによって置換され；S282は、A、G、MまたはTのいずれかによって置換され；P283は、Pであり；N284は、Qによって置換され；F285は、WまたはYのいずれかによって置換され；N286は、Qによって置換され；F287は、WまたはYのいずれかによって置換され；L288は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；G289は、A、M、SまたはTのいずれかによって置換され；Q290は、Nによって置換され；L291は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；L292は、A、IまたはVのいずれかによって置換され；D293は、Eによって置換され；Y294は、PまたはWのいずれかであり；E295は、Dによって置換され；K296は、RまたはHのいずれかによって置換され；および／またはK297は、RまたはHのいずれかによって置換されるか；加えて、それらの組み合わせのいずれかの置換を含��。該ヒトRET31 DSPcドメイン内の他の適当な置換を本発明に包含し、このものを本明細書の他所で記載する。ほんはつめいはまた、本明細書の他所に記載する通り、これらヒトRET31 DSPcドメイン保存アミノ酸置換ポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０５０３】
新規なヒトホスファターゼポリペプチドであるヒトRET31ポリペプチドの更なる確認において、該RET31ポリペプチドがモチーフアルゴリズム（ジェネティックスコンピュータグループ社）に従って、チロシン特異的タンパク質ホスファターゼ活性部位ドメインを含むことが分かった。
【０５０４】
チロシン特異的タンパク質ホスファターゼ(EC 3.1.3.48)(PTPase)は、チロシン残基に結合したホスフェート基の除去を触媒する酵素である。これらの酵素は、細胞の成長、増殖、分化および形質転換の制御において非常に重要である。PTPアーゼの多数の形態が確認されており、このものは２つの範疇：可溶性PTAアーゼおよびPTAアーゼドメインを含む膜貫通受容体タンパク質に分類することができる。
【０５０５】
最新の公知のPTPアーゼを、以下に示す：可溶性PTPアーゼPTPN1 (PTP-1B)、PTPN2 (T-細胞PTPアーゼ; TC-PTP)、PTPN3 (H1)およびPTPN4 (MEG)（これらは、N-末端バンド4.1様ドメインを含み、更に膜と細胞骨格との間の接合部で作用する）、PTPN5 (STEP)、PTPN6 (PTP-1C ; HCP; SHP)およびPTPN11 (PTP-2C ; SH-PTP3; Syp)（これらは、そのN-末端きわみ(extremity)でSH-2ドメインの２コピーを含む酵素)（例えば、ショウジョウバエタンパク質コルクスルー(corkscrew)(遺伝子csw)もまた本サブグループに属する）、PTPN7 (LC-PTP；造血性タンパク質チロシンホスファターゼ; HePTP)、PTPN8 (70Z-PEP)、PTPN9 (MEG2)、PTPN12 (PTP Gl ; PTP-P19)、酵母PTP1、酵母PTP2（これは、ユビキチン媒介性タンパク質分解経路に関与し得る）、分裂酵母pyplおよびpyp2（これは、有志分裂の開始を抑制する際に機能する）、分裂酵母pyp3（これは、cdc2の脱リン酸化に寄与する）、酵母CDC14（これは、染色体分離に関与し得る）、エルシニア病原性プラスミドPTPアーゼ（遺伝子yopH）、オートグラファ(Autographa)カリフォルニア核多面性ウイルス症(nuclear pohyhedrosis virus)19Kd PTPアーゼ、二重特異性PTPアーゼ、DUSP1 (PTPN10; MAPキナーゼホスファターゼ-1 ; MKP-1)（これは、Thr-183およびTyr-185でMAPキナーゼを脱リン酸化する）、DUSP2 (PAC-1)（これは、ThrおよびTyr残基上でのMAPキナーゼERK1およびERK2を脱リン酸化する核酵素）、DUSP3 (VHR)、DUSP4 (HVH2)、DUSP5 (HVH3)、DUSP6 (Pystl ; MKP-3)、DUSP7 (Pyst2; MKP-X)、酵母MSG5（MAPキナーゼFUS3を脱リン酸化するPTPアーゼ）、酵母YVH1、ワクシニアウイルスH1 PTPアーゼ−二重特異性ホスファターゼ。
【０５０６】
構造的に、全ての公知の受容体PTPアーゼは、可変長細胞外ドメイン、続いて膜貫通領域およびC-末端触媒細胞質ドメインから構成される。該受容体PTPアーゼのいくつかは、それらの細胞外領域中に、フィブロネクチンII型（FN-III)反復、免疫グロブリン様ドメイン、MAMドメインまたは脱炭酸酵素様ドメインを含む。 該細胞質領域は通常、PTPアーゼドメインの２コピーを含む。１つ目は酵素活性を有すると考えられ、２つ目は不活性であるが、該１つ目の基質活性に影響を及ぼすと考えられる。これらのドメインにおいて、該触媒システインは通常保存的であるが、いくつかの他のものは恐らく重要であろうが、保存的ではない。
【０５０７】
チロシンホスファターゼ(PTPase)は、約300個のアミノ酸からなる。２個の保存されたシステインが存在し、その２番目のものは活性に絶対に必要であることが分かった。更に、直ぐ近傍のいくつかの保存残基もまた重要であることが分かった。
【０５０８】
チロシン特異的タンパク質ホスファターゼについての共通配列は、以下：
[LIVMF]-H-C-x(2)-G-x(3)-[STC]-[STAGP]-x-[LIVMFY]
（式中、Cは活性部位残基であり、そして「X」はいずれかのアミノ酸である）
の通り、提示される。
【０５０９】
チロシン特異的タンパク質ホスファターゼドメインおよびタンパク質に関する別の情報は、以下の刊行物：Fischer E. H., Charbonneau H., Tonks N. K., Science 253: 401-406 (1991); Charbonneau H., Tonks N. K.によるAnnu. Rev. Cell Biol. 8: 463-493 (1992); Trowbridge I. S.によるJ. Biol. Chem. 266: 23517-23520 (1991); Tonks N. K., Charbonneau H.によるTrends Biochem. Sci. 14: 497-500 (1989)；およびHunter T.によるCell 58: 1013-1016 (1989)（これらは、本明細書の一部を構成する）を参照して知ることができる。
【０５１０】
好ましい態様において、チロシン特異的タンパク質ホシフェターゼ活性部位ドメインポリペプチドNGCVLVHCLAGISRSATIAIAYI（配列番号144）を本発明に包含する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所で記載する通り、このチロシン特異的タンパク質ホスファターゼ活性部位ドメインポリペプチドの免役原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０５１１】
該ヒトRET31ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列に加えて、本発明はまた該RET31ポリペプチドの単離マウスオルソログにも関する。
【０５１２】
配列番号114に記載のポリヌクレオチド配列（図16A〜C）によってコードされ、および／または寄託されたクローンmRET31に含まれるポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号113（図16A〜C）として提示されるマウスRET31遺伝子に相当するポリペプチドは、多数のホスファターゼに対して、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルで有意な相同性を持っている。該ホスファターゼとしては、例えば本発明のRET31タンパク質（配列番号109）；ヒトDUS8（DUS8；ジェンバンク受託番号gi|U27193；配列番号110）；ヒトDUSP6タンパク質（DUSP6；ジェンバンク受託番号gi|AB013382；配列番号111）およびヒトmapキナーゼホスファターゼMKP-5タンパク質（MKP-5；ジェンバンク受託番号gi|AB026436；配列番号112）（これらは、BLASTPによって決定される）を含む。ヒトホスファターゼポリペプチドとこれらのタンパク質とのアラインメントを図14A〜Cに示す。
【０５１３】
図16A〜Cにおける決定されたmRET31 cDNAのヌクレオチド配列（配列番号114）は、減少した約73kDaの分子量を有する、約660アミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。該予想されるmRET31ポリペプチドのアミノ酸配列を、図16A〜C（配列番号114）に示す。図16A〜Cにおける該mRET31タンパク質は、いくつかの公知のホスファターゼ、特に二重特異性タンパク質ホスファターゼに対して有意な一致度および類似度を有すると決定した。具体的には、図16A〜Cにおける該mRET31タンパク質は、本発明のヒトRET31タンパク質（配列番号109）に対して約90％の一致度および約92％の類似度；ヒトDUS8（DUS8；ジェンバンク受託番号gi|U27193；配列番号110）に対して約48.5％の一致度および約55.7％の類似度；ヒトDUSP6タンパク質（DUSP6；ジェンバンク受託番号gi|AB013382；配列番号111）に対して約37.4％の一致度および約49.7％の類似度；およびヒトmapキナーゼホスファターゼMKP-5タンパク質（MKP-5；ジェンバンク受託番号gi|AB026436；配列番号112）に対して約35.2％の一致度および約46.9％の類似度を有することを決定した（図12に示す）。
【０５１４】
該mRET31ポリヌクレオドの翻訳開始ヌクレオチド位置は、配列番号113のヌクレオチド369（図16A〜C)で始まることを決定し、そして該翻訳終止ヌクレオチドは配列番号113のヌクレオチド2348であることを決定した（図16A〜C)。
【０５１５】
好ましい態様において、以下のN-末端mRET31欠失ポリペプチドを本発明に包含する：配列番号114中、M1-S660, A2-S660, H3-S660, E4-S660, M5-S660, I6-S660, G7-S660, T8-S660, Q9-S660, I10-S660, V11-S660, T12-S660, E13-S660, S14-S660, L15-S660, V16-S660, A17-S660, L18-S660, L19-S660, E20-S660, S21-S660, G22-S660, T23-S660, E24-S660, K25-S660, V26-S660, L27-S660, L28-S660, I29-S660, D30-S660, S31-S660, R32-S660, P33-S660, F34-S660, V35-S660, E36-S660, Y37-S660, N38-S660, T39-S660, S40-S660, H41-S660, I42-S660, L43-S660, E44-S660, A45-S660, I46-S660, N47-S660, I48-S660, N49-S660, C50-S660, S51-S660, K52-S660, L53-S660, M54-S660, K55-S660, R56-S660, R57-S660, L58-S660, Q59-S660, Q60-S660, D61-S660, K62-S660, V63-S660, L64-S660, I65-S660, T66-S660, E67-S660, L68-S660, I69-S660, H70-S660, Q71-S660, S72-S660, T73-S660, K74-S660, H75-S660, K76-S660, V77-S660, D78-S660, I79-S660, D80-S660, C81-S660, N82-S660, Q83-S660, R84-S660, V85-S660, V86-S660, V87-S660, Y88-S660, D89-S660, H90-S660, S91-S660, S92-S660, Q93-S660, D94-S660, V95-S660, G96-S660, S97-S660, L98-S660, S99-S660, S100-S660, D101-S660, C102-S660, F103-S660, L104-S660, T105-S660, V106-S660, L107-S660, L108-S660, G109-S660, K110-S660, L111-S660, E112-S660, R113-S660, S114-S660, F115-S660, N116-S660, S117-S660, V118-S660, H119-S660, L120-S660, L121-S660, A122-S660, G123-S660, G124-S660, F125-S660, A126-S660, E127-S660, F128-S660, S129-S660, R130-S660, C131-S660, F132-S660, P133-S660, G134-S660, L135-S660, C136-S660, E137-S660, G138-S660, K139-S660, S140-S660, T141-S660, L142-S660, V143-S660, P144-S660, T145-S660, C146-S660, I147-S660, S148-S660, Q149-S660, P150-S660, C151-S660, L152-S660, P153-S660, V154-S660, A155-S660, N156-S660, I157-S660, G158-S660, P159-S660, T160-S660, R161-S660, I162-S660, L163-S660, P164-S660, N165-S660, L166-S660, Y167-S660, L168-S660, G169-S660, C170-S660, Q171-S660, R172-S660, D173-S660, V174-S660, L175-S660, N176-S660, K177-S660, D178-S660, L179-S660, M180-S660, Q181-S660, Q182-S660, N183-S660, G184-S660, I185-S660, G186-S660, Y187-S660, V188-S660, L189-S660, N190-S660, A191-S660, S192-S660, N193-S660, T194-S660, C195-S660, P196-S660, K197-S660, P198-S660, D199-S660, F200-S660, I201-S660, P202-S660, E203-S660, S204-S660, H205-S660, F206-S660, L207-S660, R208-S660, V209-S660, P210-S660, V211-S660, N212-S660, D213-S660, S214-S660, F215-S660, C216-S660, E217-S660, K218-S660, I219-S660, L220-S660, P221-S660, W222-S660, L223-S660, D224-S660, K225-S660, S226-S660, V227-S660, D228-S660, F229-S660, I230-S660, E231-S660, K232-S660, A233-S660, K234-S660, A235-S660, S236-S660, N237-S660, G238-S660, C239-S660, V240-S660, L241-S660, I242-S660, H243-S660, C244-S660, L245-S660, A246-S660, G247-S660, I248-S660, S249-S660, R250-S660, S251-S660, A252-S660, T253-S660, I254-S660, A255-S660, I256-S660, A257-S660, Y258-S660, I259-S660, M260-S660, K261-S660, R262-S660, M263-S660, D264-S660, M265-S660, S266-S660, L267-S660, D268-S660, E269-S660, A270-S660, Y271-S660, R272-S660, F273-S660, V274-S660, K275-S660, E276-S660, K277-S660, R278-S660, P279-S660, T280-S660, 1281-S660, S282-S660, P283-S660, N284-S660, F285-S660, N286-S660, F287-S660, M288-S660, G289-S660, Q290-S660, L291-S660, M292-S660, D293-S660, Y294-S660, E295-S660, K296-S660, T297-S660, I298-S660, N299-S660, N300-S660, Q301-S660, T302-S660, G303-S660, M304-S660, S305-S660, G306-S660, P307-S660, K308-S660, S309-S660, K310-S660, L311-S660, K312-S660, L313-S660, L314-S660, H315-S660, L316-S660, D317-S660, K318-S660, P319-S660, S320-S660, E321-S660, P322-S660, V323-S660, P324-S660, A325-S660, A326-S660, S327-S660, E328-S660, G329-S660, G330-S660, W331-S660, K332-S660, S333-S660, A334-S660, L335-S660, S336-S660, L337-S660, S338-S660, P339-S660, P340-S660, C341-S660, A342-S660, N343-S660, S344-S660, T345-S660, S346-S660, E347-S660, A348-S660, S349-S660, G350-S660, Q351-S660, R352-S660, L353-S660, V354-S660, H355-S660, P356-S660, A357-S660, S358-S660, V359-S660, P360-S660, R361-S660, L362-S660, Q363-S660, P364-S660, S365-S660, L366-S660, L367-S660, E368-S660, D369-S660, S370-S660, P371-S660, L372-S660, V373-S660, Q374-S660, A375-S660, L376-S660, S377-S660, G378-S660, L379-S660, Q380-S660, L381-S660, S382-S660, S383-S660, E384-S660, K385-S660, L386-S660, E387-S660, D388-S660, S389-S660, T390-S660, K391-S660, L392-S660, K393-S660, R394-S660, S395-S660, F396-S660, S397-S660, L398-S660, D399-S660, I400-S660, K401-S660, S402-S660, V403-S660, S404-S660, Y405-S660, S406-S660, A407-S660, S408-S660, M409-S660, A410-S660, A411-S660, S412-S660, L413-S660, H414-S660, G415-S660, F416-S660, S417-S660, S418-S660, E419-S660, E420-S660, A421-S660, L422-S660, D423-S660, Y424-S660, C425-S660, K426-S660, P427-S660, S428-S660, A429-S660, T430-S660, L431-S660, D432-S660, G433-S660, T434-S660, N435-S660, K436-S660, L437-S660, C438-S660, Q439-S660, F440-S660, S441-S660, P442-S660, V443-S660, Q444-S660, E445-S660, V446-S660, S447-S660, E448-S660, Q449-S660, S450-S660, P451-S660, E452-S660, T453-S660, S454-S660, P455-S660, D456-S660, K457-S660, E458-S660, E459-S660, A460-S660, H461-S660, I462-S660, P463-S660, K464-S660, Q465-S660, P466-S660, Q467-S660, P468-S660, P469-S660, R470-S660, P471-S660, S472-S660, E473-S660, S474-S660, Q475-S660, V476-S660, T477-S660, R478-S660, L479-S660, H480-S660, S481-S660, V482-S660, R483-S660, T484-S660, G485-S660, S486-S660, S487-S660, G488-S660, S489-S660, T490-S660, Q491-S660, R492-S660, P493-S660, F494-S660, F495-S660, S496-S660, P497-S660, L498-S660, H499-S660, R500-S660, S501-S660, G502-S660, S503-S660, V504-S660, E505-S660, D506-S660, N507-S660, Y508-S660, H509-S660, T510-S660, N511-S660, F512-S660, L513-S660, F514-S660, G515-S660, L516-S660, S517-S660, T518-S660, S519-S660, Q520-S660, Q521-S660, H522-S660, L523-S660, T524-S660, K525-S660, S526-S660, A527-S660, G528-S660, L529-S660, G530-S660, L531-S660, K532-S660, G533-S660, W534-S660, H535-S660, S536-S660, D537-S660, I538-S660, L539-S660, A540-S660, P541-S660, Q542-S660, S543-S660, S544-S660, A545-S660, P546-S660, S547-S660, L548-S660, T549-S660, S550-S660, S551-S660, W552-S660, Y553-S660, F554-S660, A555-S660, T556-S660, E557-S660, P558-S660, S559-S660, H560-S660, L561-S660, Y562-S660, S563-S660, A564-S660, S565-S660, A566-S660, I567-S660, Y568-S660, G569-S660, G570-S660, N571-S660, S572-S660, S573-S660, Y574-S660, S575-S660, A576-S660, Y577-S660, S578-S660, C579-S660, G580-S660, Q581-S660, L582-S660, P583-S660, T584-S660, C585-S660, S586-S660, D587-S660, Q588-S660, I589-S660, Y590-S660, S591-S660, V592-S660, R593-S660, R594-S660, R595-S660, Q596-S660, K597-S660, P598-S660, T599-S660, D600-S660, R601-S660, A602-S660, D603-S660, S604-S660, R605-S660, R606-S660, S607-S660, W608-S660, H609-S660, E610-S660, E611-S660, S612-S660, P613-S660, F614-S660, E615-S660, K616-S660, Q617-S660, F618-S660, K619-S660, R620-S660, R621-S660, S622-S660, C623-S660, Q624-S660, M625-S660, E626-S660, F627-S660, G628-S660, E629-S660, S630-S660, I631-S660, M632-S660, S633-S660, E634-S660, N635-S660, R636-S660, S637-S660, R638-S660, E639-S660, E640-S660, L641-S660, G642
S660, K643-S660, V644-S660, G645-S660, S646-S660, Q647-S660, S648-S660, S649-S660, F650-S660, S651-S660, G652-S660, S653-S660および／またはM654-S660。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所で記載する通り、これらのN-末端mRET31欠失ポリペプチドの免疫原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０５１６】
好ましい態様において、以下のC-末端mRET31欠失ポリペプチドを本発明に包含する：配列番号114中、M1-S660, M1-V659, M1-E658, M1-I657, M1-I656, M1-E655, M1-M654, M1-S653, M1-G652, M1-S651, M1-F650, M1-S649, M1-S648, M1-Q647, M1-S646, M1-G645, M1-V644, M1-K643, M1-G642, M1-L641, M1-E640, M1-E639, M1-R638, M1-S637, M1-R636, Ml-N635, M1-E634, M1-S633, M1-M632, Ml-1631, Ml-5630, M1-E629, M1-G628, M1-F627, M1-E626, Ml-M625, M1-Q624, M1-C623, Ml-S622, M1-R621, Ml-R620, M1-K619, M1-F618, M1-Q617, M1-K616, M1-E615, M1-F614, M1-P613, M1-S612, M1-E611, M1-E610, M1-H609, M1-W608, M1-S607, M1-R606, Ml-R605, M1-S604, M1-D603, M1-A602, M1-R601, M1-D600, M1-T599, M1-P598, M1-K597, M1-Q596, M1-R595, M1-R594, M1-R593, M1-V592, M1-S591, M1-Y590, M1-I589, M1-Q588, M1-D587, M1-S586, M1-C585, M1-T584, M1-P583, M1-L582, M1-Q581, Ml-G580, M1-C579, M1-S578, M1-Y577, M1-A576, M1-S575, M1-Y574, M1-S573, M1-S572, M1-N571, M1-G570, M1-G569, M1-Y568, M1-I567, M1-A566, M1-S565, M1-A564, M1-S563, M1-Y562, M1-L561, M1-H560, M1-S559, M1-P558, M1-E557, M1-T556, M1-A555, M1-F554, M1-Y553, M1-W552, M1-S551, M1-S550, M1-T549, M1-L548, M1-S547, M1-P546, M1-A545, M1-S544, M1-S543, M1-Q542, M1-P541, M1-A540, M1-L539, M1-I538, M1-D537, M1-S536, M1-H535, M1-W534, M1-G533, Ml-K532, M1-L531, M1-G530, Ml-L529, M1-G528, M1-A527, M1-S526, M1-K525, M1-T524, M1-L523, M1-H522, M1-Q521, M1-Q520, M1-S519, M1-T518, M1-S517, M1-L516, M1-G515, M1-F514, M1-L513, M1-F512, M1-N511, M1-T510, M1-H509, M1-Y508, M1-N507, M1-D506, M1-E505, M1-V504, M1-S503, M1-G502, M1-S501, M1-R500, M1-H499, M1-L498, M1-P497, M1-S496, M1-F495, M1-F494, M1-P493, M1-R492, M1-Q491, M1-T490, Mol-5489, M1-G488, M1-S487, M1-S486, M1-G485, M1-T484, M1-R483, M1-V482, M1-S481, M1-H480, M1-L479, M1-R478, M1-T477, M1-V476, M1-Q475, M1-S474, M1-E473, M1-S472, M1-P471, M1-R470, M1-P469, M1-P468, M1-Q467, M1-P466, M1-Q465, M1-K464, M1-P463, M1-I462, M1-H461, M1-A460, M1-E459, Ml-E458, M1-K457, M1-D456, Ml-P455, Mol-5454, M1-T453, M1-E452, M1-P451, M1-S450, M1-Q449, M1-E448, M1-S447, M1-V446, M1-E445, M1-Q444, M1-V443, M1-P442, M1-S441, M1-F440, M1-Q439, M1-C438, M1-L437, M1-K436, M1-N435, M1-T434, M1-G433, M1-D432, M1-L431, M1-T430, M1-A429, M1-S428, M1-P427, M1-K426, M1-C425, M1-Y424, M1-D423, M1-L422, M1-A421, M1-E420, M1-E419, M1-S418, M1-S417, M1-F416, M1-G415, M1-H414, M1-L413, M1-S412, M1-A411, M1-A410, M1-M409, M1-S408, M1-A407, M1-S406, M1-Y405, M1-S404, M1-V403, M1-S402, M1-K401, M1-I400, M1-D399, M1-L398, M1-S397, M1-F396, M1-S395, M1-R394, M1-K393, M1-L392, M1-K391, M1-T390, MI-S389, M1-D388, M1-E387, M1-L386, M1-K385, M1-E384, M1-S383, M1-S382, M1-L381, M1-Q380, M1-L379, M1-G378, M1-S377, M1-L376, M1-A375, M1-Q374, M1-V373, M1-L372, M1-P371, M1-S370, M1-D369, M1-E368, M1-L367, M1-L366, M1-S365, M1-P364, M1-Q363, M1-L362, M1-R361, M1-P360, M1-V359, M1-S358, M1-A357, M1-P356, M1-H355, M1-V354, M1-L353, M1-R352, M1-Q351, M1-G350, M1-S349, M1-A348, M1-E347, M1-S346, M1-T345, M1-S344, M1-N343, M1-A342, M1-C341, M1-P340, M1-P339, M1-S338, M1-L337, M1-S336, M1-L335, M1-A334, M1-S333, M1-K332, M1-W331, M1-G330, M1-G329, M1-E328, M1-S327, M1-A326, M1-A325, M1-P324, M1-V323, M1-P322, M1-E321, M1-S320, M1-P319, M1-K318, M1-D317, M1-L316, M1-H315, M1-L314, M1-L313, M1-K312, M1-L311, M1-K310, M1-S309, M1-D308, M1-P307, M1-G306, M1-S305, M1-M304, M1-G303, M1-T302, M1-Q301, M1-N300, Ml-N299, M1-I298, M1-T297, M1-K296, M1-E295, M1-Y294, M1-D293, M1-M292, M1-L291, M1-Q290, M1-G289, M1-M288, M1-F287, M1-N286, M1-F285, Ml-N284, M1-P283, M1-S282, M1-I281, M1-T280, M1-P279, M1-R278, M1-K277, M1-E276, M1-K275, M1-V274, M1-F273, M1-R272, M1-Y271, M1-A270, M1-E269, M1-D268, M1-L267, M1-S266, M1-M265, M1-D264, M1-M263, M1-R262, M1-K261, M1-M260, M1-I259, M1-Y258, M1-A257, M1-I256, M1-A255, M1-I254, M1-T253, M1-A252, M1-S251, M1-R250, M1-S249, Ml-1248, M1-G247, M1-A246, M1-L245, M1-C244, M1-H243, M1-I242, M1-L241, M1-V240, M1-C239, M1-G238, M1-N237, M1-S236, M1-A235, M1-K234, M1-A233, M1-K232, M1-E231, M1-I230, M1-F229, M1-D228, M1-V227, M1-S226, M1-K225, M1-D224, M1-L223, M1-W222, M1-P221, M1-L220, M1-I219, M1-K218, M1-E217, M1-C216, M1-F215, M1-S214, M1-D213, M1-N212, M1-V211, M1-P210, M1-V209, M1-R208, M1-L207, M1-F206, M1-H205, M1-S204, M1-E203, M1-P202, M1-I201, M1-F200, Ml- D199, Ml-P198, MI-Kl97, M1-P196, M1-C195, M1-T194, M1-N193, M1-S192, M1-A191, M1-N190, M1-L189, M1-V188, M1-Y187, M1-G186, M1-I185, M1-G184, M1-N183, M1-Q182, M1-Q181, M1-M180, M1-L179, M1-D178, M1-K177, M1-N176, M1-L175, M1-V174, M1-D173, M1-R172, M1-Q171, M1-C170, Ml-G169, M1-L168, Ml-Y167, M1-L166, M1-N165, M1-P164, M1-L163, Ml-1162, M1-R161, M1-T160, M1-P159, M1-G158, M1-I157, M1-N156, M1-A155, M1-V154, M1-P153, M1-L152, M1-C151, Ml-P150, M1-Q149, M1-S148, Ml-1147, M1-C146, M1-T145, M1-P144, M1-V143, M1-L142, M1-T141, M1-S140, M1-K139, M1-G138, M1-E137, M1-C136, Ml-L135, M1-G134, M1-P133, M1-F132, M1-C131, M1-R130, M1-S129, M1-F128, M1-E127, M1-A126, M1-F124, M1-G124, M1-G123, M1-A122, M1-L121, M1-L120, M1-H119, M1-V118, M1-S117, M1-N116, M1-F115, M1-S114, M1-R113, M1-E112, M1-L111, M1-K110, M1-G109, M1-L108, M1-L107, M1-V106, M1-T105, M1-L104, M1-F103, M1-C102, M1-D101, M1-S100, Ml-S99, M1-L98, M1-S97, Ml-G96, M1-V95, M1-D94, M1-Q93, M1-S92, Ml-S91, M1-H90, M1-D89, M1-Y88, M1-V87, M1-V86, M1-V85, M1-R84, M1-Q83, Ml-N82, M1-C81, Ml-D80, M1-I79, M1-D78, M1-V77, M1-K76, M1-H75, M1-K74, M1-T73, M1-S72, M1-Q71, M1-H70, M1-I69, M1-L68, M1-E67, M1-T66, M1-I65, M1-L64, M1-V63, M1-K62, M1-D61, M1-Q60, M1-Q59, M1-L58, M1-R57, M1-R56, M1-K55, M1-M54, M1-L53, M1-K52, M1-S51, M1-C50, M1-N49, M1-I48, M1-N47, Ml-146, M1-A45, M1-E44, M1-L43, M1-I42, M1-H41, M1-S40, M1-T39, M1-N38, M1-Y37, M1-E36, M1-V35, M1-F34, M1-P33, M1-R32, M1-S31, M1-D30, M1-I29, M1-L28, M1-L27, M1-V26, M1-K25, M1-E24, M1-T23, M1-G22, M1-S21, M1-E20, Ml-L19, M1-L18, Ml-A17, M1-V16, M1-L15, M1-514, M1-E13, M1-T12, Ml-Vl l, Ml-I10, M1-Q9, M1-T8および／またはM1-G7。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、これらC-末端mRET31欠失ポリペプチドの免疫原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０５１７】
新規なマウスRET31ホスファターゼポリペプチドの確認において、mRET31ポリペプチドはクエリー配列としてDSPc PFAM HMM (PF00782)を用いたBLAST2アルゴリズムによって同定される二重特異性ホスファターゼ触媒的ドメインを含むことが分かった。
【０５１８】
好ましい態様において、以下のマウスRET31 DSPcドメインポリペプチドを本発明に包含する：
GPTRILPNLYLGCQRDVLNKDLMQQNGIGYVLNASNTCPKPDFIPESHFLRVP
VNDSFCEKILPWLDKSVDFIEKAKASNGCVLIHCLAGISRSATIAIAYIMKRMD
MSLDEAYRFVKEKRPTISPNFNFMGQLMDYEKT（配列番号135）。
このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをまた提供する。本発明はまた、本明細書の他所に記載する通り、このマウスRET31 DSPcドメインポリペプチドの免疫原性および／または抗原性エピトープとしての使用をも包含する。
【０５１９】
本発明は、ホスファターゼ関連障害（これは、糖尿病などの代謝性障害、加えて神経および／または心血管の疾患および障害を含むが、これらに限定されない）の治療、検出、軽減または予防のための、RET31インビターおよび／またはRET31活性のアクチベーターの使用を包含する。本発明はまた、RET31インヒビターおよび／またはRET31活性のアクチベーターの免疫抑制薬、抗炎症薬および／または抗腫瘍薬としての使用をも包含する。
【０５２０】
本発明は、キナーゼ活性が十分でない疾患を診断し、予後し、治療し、軽減しおよび／または予防するための治療学的なレジメにおける、RET31ホスファターゼインヒビター（これは、アンチセンス核酸などの拮抗薬を含む）、加えて本明細書に記載する他の拮抗薬の使用を包含する。不十分なキナーゼ活性が原因で起こり得る疾患の限定されない１例はあるタイプの糖尿病であり、これはインシュリン受容体シグナル経路に関与する１つ以上のキナーゼが例えば、不十分な活性または不十分な発現を有し得る。
【０５２１】
その上、キナーゼ活性が過度に高い疾患および／または障害（例えば、キナーゼオンコジーン産物が過剰な活性および過剰な発現を有する癌）の診断、予後、治療、軽減および／または予防のための本明細書に記載の遺伝子治療学的レジメにおける、RET31ホスファターゼアクチベーターの使用またはRET31ホスファターゼ遺伝子もしくはタンパク質の使用を包含する。
【０５２２】
本発明はまた、RET31タンパク質の触媒的に不活性な変異体（これは、その断片を含む）の使用（例えば、タンパク質療法）、または例えばホスファターゼ活性が過度に高い疾患および／または障害の診断、予後、軽減および／または予防における該コードするポリヌクレオチド配列の使用（例えば、遺伝子療法）をも含む。
【０５２３】
本発明はまた、診断における該RET31ポリペプチド（これは、その断片および／または変異体を含む）に関する抗体の使用（例えば、生物マーカーおよび／または治療薬として）をも包含する。
【０５２４】
本発明は、細胞リンタンパク質またはリンペプチドのライブラリーと結合する基質トラップ変異体としての該RET31ホスファターゼの不活性な非触媒的変異体を使用して、該RET31ポリペプチドの基質を同定することを包含する。
【０５２５】
本発明は、インビトロまたは「仮想的」（コンピューター）でのスクリーニング法を用いて、BMY_HPP5ホスファターゼ活のインヒビターまたはアクチベーターを同定するために、該BMY_HPP5ポリペプチドの使用を包含する。
【０５２６】
本発明の１態様は、該RET31ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法は以下の工程を含む：i）分析的に検出可能な試薬を用いて標識化したRET31ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターを、該インヒビターまたはアクチベーターとの複合体を形成するのに十分な条件で、該RET31ホスファターゼと接触させ；ii）該複合体と同定する化合物を含有する試料とを接触させ；および、iii）該被験化合物が該複合体中の標識化された公知のRET31ホスファターゼインヒビターまたはアクチベーターの量を改変する能力を検出することによって、インヒビターまたはアクチバーターとしての化合物を同定することを含む。
【０５２７】
本発明の別の態様は、RET31ホスファターゼのアクチベーターまたはインヒビターとしての化合物を同定する方法に関するものであって、該方法はi）該RET31ホスファターゼと同定する化合物とを接触させ；およびii）該基質からホスファターゼを取り出す該RET31ホスファターゼの能力を測定する工程を含む。
【０５２８】
本発明はまた、該RET31ホスファターゼについてのリガンドを同定する方法をも包含し、該方法はi）結合が可能な条件で、該RET31ホスファターゼを化合物群と接触させ；およびii）いずれかのリガンドと結合したタンパク質の存在を検出する工程を含む。
【０５２９】
上記の方法は、全細胞、サイトゾルの細胞画分、膜細胞画分、精製されたまたは部分的に精製された形態からなる群から選ばれる形態の該RET31ホスファターゼを含むことが好ましい。本発明はまた、精製された、実質的に精製されたまたは精製されたいない状態での組換え的に発現したRET31ホスファターゼにも関する。本発明は更に、当該分野で知られたりまたは本明細書中に記載するタンパク質、ペプチドまたは他の分子と融合したりまたは接合したRET31ホスファターゼに関する。
【０５３０】
本発明はまた、上記の方法で同定された化合物および医薬的に許容し得る担体を含有する該RET31ホスファターゼポリペプチドの医薬組成物をも包含する。
【０５３１】
好ましい態様において、本発明は、開始する出発コドンを欠いたポリヌクレオチド、加えて得られるRET31のコードされたポリペプチドを包含する。具体的には、本発明は配列番号108のヌクレオチド541〜2532に相当するポリヌクレオチド；配列番号109のアミノ酸2〜665に相当するポリペプチドを包含する。該コード配列を含有する組換えベクターおよび該ベクターを含有する宿主細胞をも包含する。
【０５３２】
多数のポリヌクレオチド配列（例えば、EST配列）は公的に入手することができ、そして配列データベースによってアクセスすることができる。これらの配列のいくつかは配列番号108に関するものであり、このものは本発明の着想の前に、公的に入手することができる。それらの関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲内から具体的に除くことが好ましい。全ての関連する配列を例示することは、厄介であろう。従って、一般式a−bによって記載されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの１つ以上を本発明から除くことが好ましい。ここで、aとは配列番号108の1〜5436の間のいずれかの整数であり、bとは15〜5450の間の整数であり、aおよびbの両方が配列番号108に示されるヌクレオチド残基の位置に相当して、そしてbはa＋14以上である。
【０５３３】
多数のポリヌクレオチド配列（例えば、EST配列）は公的に入手することができ、そして配列データベースによってアクセスすることができる。これらの配列のいくつかは配列番号113に関するものであり、このものは本発明の着想の前に、公的に入手することができる。それらの関連するポリヌクレオチドは、本発明の範囲内から具体的に除くことが好ましい。全ての関連する配列を例示することは、厄介であろう。従って、一般式a−bによって記載されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの１つ以上を本発明から除くことが好ましい。ここで、aとは配列番号113の1〜2742の間のいずれかの整数であり、bとは15〜2756の間の整数であり、aおよびbの両方が配列番号113に示されるヌクレオチド残基の位置に相当して、そしてbはa＋14以上である。
【０５３４】
【表１】
2005506040.tif 000003
上述した各「遺伝子番号」に対応する情報を表Iに要約する。表Iに示す「cDNAクローンID」と、場合により、さらなる関連DNAクローンとから得た部分的に相同な（「オーバーラップ」）配列から、「NT配列番号X」として明記するヌクレオチド配列をアセンブルした。オーバーラップ配列を、冗長度の高い（通常、各ヌクレオチド位置につき数個のオーバーラップ配列）一つの連続した配列にアセンブルすることにより、配列番号Xとして明記する最終配列を得た。
【０５３５】
cDNAクローンIDは、「ATCC受託番号PTA-2766および寄託日」欄に記載する日に寄託され、同欄に記載する受託番号をそれぞれ与えられている。「ベクター」はcDNAクローンIDに含まれるベクターのタイプを表す。
【０５３６】
「クローンの総NT数」は、「遺伝子番号」によって識別されるクローンコンティグ中のヌクレオチドの総数を表す。寄託されたクローンは配列番号Xの配列の全部または大半を含むだろう。配列番号Xの推定開始コドン（メチオニン）のヌクレオチド位置を「ORFの開始コドンの5'NT」として明記する。
【０５３７】
上記メチオニンから始まる翻訳されたアミノ酸配列を「AA配列番号Y」として明記するが、他の読み枠も、既知の分子生物学技術を使って容易に翻訳することができる。これらの代替オープンリーディングフレームが産生するポリペプチドも特に本発明に包含される。
【０５３８】
配列番号Yのオープンリーディングフレーム内にあるアミノ酸の総数を「ORFの全AA」として明記する。
【０５３９】
配列番号X（Xは配列表に開示する任意のポリヌクレオチド配列を表しうる）および翻訳された配列番号Y（Yは配列表に開示する任意のポリペプチド配列を表しうる）は、当技術分野で周知のそして本明細書にさらに説明する種々の用途にとって、十分な正確性その他の適性を持っている。例えば配列番号Xは、配列番号Xに含まれる核酸配列または寄託されたクローンに含まれるcDNAを検出する核酸ハイブリダイゼーションプローブの設計に役立つ。これらのプローブは、生物学的試料中の核酸分子にもハイブリダイズし、よって本発明の種々の法医学的方法および診断方法を可能にするだろう。また、配列番号Yから同定されるポリペプチドを使って、例えば表Iに特定するcDNAクローンがコードするタンパク質およびポリペプチドを含むタンパク質に特異的に結合する抗体を作製してもよい。
【０５４０】
しかしながら、配列決定反応によって作成したDNA配列には配列決定エラーが含まれている可能性がある。このエラーは、作成したDNA配列中に、誤って同定されたヌクレオチドとして、またはヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在する。ヌクレオチドが間違って挿入されるか欠落すると、予想アミノ酸配列の読み枠にフレームシフトが起こりうる。これらの場合、たとえ作成したDNA配列が実際のDNA配列に対して99.9％を越える一致（例えば1000塩基を越えるオープンリーディングフレーム中に挿入または欠失が1塩基）を示したとしても、予想アミノ酸配列は実際のアミノ酸配列とは異なってしまう。
【０５４１】
したがって、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に精度が必要な用途のために、本発明は、配列番号Xとして明記する作成されたヌクレオチド配列および配列番号Yとして明記する翻訳された予想アミノ酸配列を提供するだけでなく、表Iに記載するように、ATCCに寄託された本発明のcDNAを含むプラスミドDNAの試料も提供する。寄託された各クローンのヌクレオチド配列は、寄託されたクローンを既知の方法に従って配列決定することにより、容易に決定することができる。そうすれば、そのような寄託物から、予想アミノ酸配列を検証することができる。さらに、ペプチド配列決定によって、または寄託されたcDNAを含む適当な宿主細胞中で当該タンパク質を発現させ、当該タンパク質を収集し、その配列を決定することによって、特定のクローンがコードするタンパク質のアミノ酸配列を直接決定することもできる。
【０５４２】
本発明は配列番号X、配列番号Yまたは寄託クローンに対応する遺伝子にも関係する。対応する遺伝子は、本明細書に開示する配列情報を使って、既知の方法で単離することができる。そのような方法には、開示した配列からプローブまたはプライマーを作製し、適当なゲノム材料源から対応する遺伝子を同定または増幅することが含まれる。
【０５４３】
本発明は、種ホモログ、アレル変異体および/またはオルソログも提供する。当業者は、本明細書に開示する配列またはATCCに寄託されたクローンから得られる配列を頼りに、当技術分野で周知の手法を使って、配列番号X、配列番号Yまたは寄託されたクローンに対応する遺伝子の全長遺伝子（全長のコード領域を含むが、これに限定されない）、アレル変異体、スプライス変異体、オルソログおよび/または種ホモログを取得することができるだろう。例えば、本明細書に記載する配列の5'領域、3'領域、または内部領域に対応する適当なプローブまたはプライマーを作製し、アレル変異体および/または所望するホモログに適した核酸源をスクリーニングすることにより、アレル変異体および/または種ホモログを単離し、同定することができる。
【０５４４】
本発明のポリペプチドは任意の適切な方法で作製することができる。そのようなポリペプチドには、単離された天然ポリペプチド、組換え生産されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法を組合わせて製造されたポリペプチドが包含される。そのようなポリペプチドを作製する手段は、当技術分野ではよく知られている。
【０５４５】
ポリペプチドはタンパク質の形態をとるか、またはより大きいタンパク質、例えば融合タンパク質（下記参照）の一部であることができる。分泌配列またはリーダー配列を含む追加アミノ酸配列、プロ配列、精製を助ける配列、例えば複数のヒスチジン残基、または組換え生産中の安定性を得るための追加配列を含めると有利である場合が多い。
【０５４６】
本発明のポリペプチドは好ましくは単離された形で提供され、また好ましくは実質的に精製される。組換え生産型のポリペプチドは、本明細書に記載する技術または当技術分野で知られる他の技術を使って、例えばSmithおよびJohnson,Gene 67:31-40(1988)に記載されている一段階法などによって、実質的に精製することができる。本発明のポリペプチドは、本明細書に記載するプロトコールまたは当技術分野で知られる他のプロトコール、例えば全長型のタンパク質に対して産生させた本発明の抗体などを使って、天然、合成または組換え供給源から精製することもできる。
【０５４７】
本発明は、配列番号Xとして明記される配列および/またはATCC受託番号Zに含まれた状態で提供されるcDNAを含む、あるいは同配列および/または同cDNAからなる、ポリヌクレオチドを提供する。本発明は、配列番号Yとして明記する配列および/またはATCC受託番号Zに含まれた状態で提供されるcDNAがコードするポリペプチドを含む、あるいは同配列および/または同ポリペプチドからなる、ポリペプチドも提供する。さらに本発明は、配列番号Yのポリペプチド配列および/またはATCC受託番号Zに含まれるcDNAがコードするポリペプチド配列を含むポリペプチド、または同ポリペプチド配列からなるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドも提供する。
【０５４８】
好ましくは、本発明は、配列番号Xとして明記する配列および/またはATCC受託番号 に含まれた状態で提供されるcDNAを含む、あるいは同配列および/または同cDNAからなる、ポリヌクレオチドであって、長さが5メガ塩基対、1メガ塩基対、0.5メガ塩基対、0.1メガ塩基対、50,000塩基対、20,000塩基対、または10,000塩基対であるポリヌクレオチド配列に等しいか、それより短いポリヌクレオチドに向けられる。
【０５４９】
本発明は、本明細書に開示する本発明ポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を持つポリヌクレオチドを包含する。そのような配列は、配列番号Xとして開示する配列、寄託物に含まれる配列、および/または配列番号Yとして開示する配列をコードする核酸配列に相補的であることができる。
【０５５０】
本発明は、本明細書に記載するポリヌクレオチドに、好ましくはストリンジェンシーを落とした条件で、より好ましくはストリンジェントな条件で、最も好ましくは高度にストリンジェントな条件で、ハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドも包含する。ストリンジェンシー条件の例を下記表IIに示す。高度にストリンジェントな条件は、例えば条件A〜Fと少なくとも同程度にストリンジェントな条件であり、ストリンジェントな条件は、例えば条件G〜Lと少なくとも同程度にストリンジェントであり、ストリンジェンシーを落とした条件は、例えば条件M〜Rと少なくとも同程度にストリンジェントである。
表II
2005506040.tif 000004
【０５５１】
‡：「ハイブリッド長」は、ハイブリッド形成ポリヌクレオチドのハイブリダイズした領域について予想される長さである。配列未知のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドは、本発明のハイブリッド形成ポリヌクレオチドのハイブリッドであると仮定する。配列既知のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合は、ポリヌクレオチドの配列を整列して、最適な配列相補性を持つ1つまたは複数の領域を同定することによって、ハイブリッド長を決定することができる。2つ以上のポリヌクレオチド配列を整列する方法および/または2つのポリヌクレオチド間の一致率を決定する方法は、当技術分野ではよく知られている（例えばDNA＊Starプログラム群のMegAlignプログラムなど）。
【０５５２】
†：ハイブリダイゼーションバッファーおよび洗浄バッファー中のSSC（1×SSCは0.15M NaClおよび15mMクエン酸ナトリウムである）は、SSPE（1×SSPEは0.15M NaCl、10mM NaH2PO4、および1.25mM EDTA、pH7.4）で置き換えることができる。ハイブリダイゼーションが完了した後、洗浄を15分間行なう。ハイブリダイゼーション液および洗浄液は、さらに5×デンハート試薬、0.5〜1.0％SDS、100μg/ml変性断片化サケ精子DNA、0.5％ピロリン酸ナトリウム、および50％までのホルムアミドを含んでもよい。
【０５５３】
＊Tb〜Tr：長さが50塩基対未満と予想されるハイブリッドの場合は、ハイブリダイゼーション温度を、ハイブリッドの融解温度Tmより5〜10℃低くするべきであり、その場合、Tmは次の等式に従って決定される。長さが18塩基対未満のハイブリッドの場合は、Tm（℃）＝2（A＋T塩基の数）＋4（G＋C塩基の数）。長さが18塩基対〜49塩基対のハイブリッドの場合は、Tm（℃）＝81.5＋16.6（log10[Na＋]）＋0.41（％G＋C）-（600/N）。この式で、Nはハイブリッド中の塩基の数であり、ハイブリダイゼーションバッファー中の［Na＋］はナトリウムイオン濃度（1×SSCの場合、［Na＋］＝0.165M）である。
【０５５４】
±：本発明では、任意の1つまたは複数のDNAまたはRNAハイブリッドパートナーを、PNA、修飾ポリヌクレオチドで置き換えることができる。そのような修飾ポリヌクレオチドは当技術分野では知られており、本明細書にも項を改めて、さらに詳しく説明する。
【０５５５】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションに関するストリンジェンシー条件のさらなる例は、参考文献として本明細書の一部を構成するSambrook,J.、E.F.FritschおよびT.Maniatis「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」（1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）の第9章および第11章、ならびにF.M.Ausubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（1995、John Wiley and Sons,Inc.）の2.10および6.3-6.4節などに記載されている。
【０５５６】
上記のようなハイブリッド形成ポリヌクレオチドは、それらがハイブリダイズする本発明のポリペプチドと少なくとも70％の配列一致度（より好ましくは少なくとも80％の一致度、最も好ましくは少なくとも90％または95％の一致度）を持つことが好ましく、配列一致度は、オーバーラップおよび一致度が最大になりかつ配列ギャップが最小になるように整列したハイブリッド形成ポリヌクレオチドの配列を比較することによって決定される。一致度の決定は当技術分野で周知であり、本明細書でも項を改めてさらに詳しく議論する。
【０５５７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列、ATCCに寄託されたクローン、および/または本発明のポリペプチドをコードするcDNAに対するPCR法の応用を包含する。核酸を増幅するためのPCR技術は米国特許第4,683,195号およびSaikiら，Science，239：487-491（1988）に記載されている。PCRには、例えば、テンプレート核酸の変性（二本鎖の場合）、標的に対するプライマーのアニーリング、および重合という各工程が含まれる。増幅反応でプローブされる核酸またはテンプレートとして使用される核酸は、ゲノムDNA、cDNA、RNA、またはPNAであることができる。PCRは、ゲノムDNA中の特定配列、特定のRNA配列、および/またはmRNAから転写されたcDNAを増幅するために使用することができる。具体的な方法パラメーターを含むPCR技術の一般使用法に関する参考書には、例えばMullisら,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.,51:263,(1987)、Ehrlich編「PCR Technology」（Stockton Press、ニューヨーク、1989）、Ehrlichら,Science,252:1643-1650,(1991)、およびInnisら編「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications」（Academic Press、ニューヨーク、1990）などがある。
【０５５８】
シグナル配列
本発明は、配列番号Yのポリペプチド配列、配列番号Xとして記載するポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、および/または寄託されたクローン中のcDNAがコードするポリペプチド配列を含むポリペプチドの成熟型、あるいは同ポリペプチド配列からなるポリペプチドの成熟型も包含する。本発明は、本発明の成熟型をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号Xのポリヌクレオチド、および/または寄託されたクローンのcDNAに含まれた状態で提供されるポリヌクレオチド配列なども包含する。
【０５５９】
シグナル仮説によれば、真核細胞によって分泌されるタンパク質はシグナル配列または分泌リーダー配列を持ち、この配列は、粗面小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の輸出が始まると、成熟タンパク質から切り離される。ほとんどの真核細胞は同じ特異性で分泌タンパク質を切断する。しかし、分泌タンパク質の切断が完全には均一でないために、あるタンパク質の成熟分子種が2種類以上生じる場合もある。さらに、分泌タンパク質の切断特異性は、最終的には、全タンパク質の一次構造によって決まること、すなわちそのポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが、古くから知られている。
【０５６０】
あるタンパク質がシグナル配列を持つかどうかを予測する方法ならびにその配列の切断点を予測する方法はある。例えば、McGeoch, Virus Res. 3:271-286(1985)の方法では、全（未切断）タンパク質の短いN末端荷電領域およびそれ以降の非荷電領域から得られる情報を利用する。von Heinje,Nucleic Acids Res. 14:4683-4690(1986)の方法では切断部位周辺の残基、典型的には残基-13〜+2（+1は分泌タンパク質のアミノ末端を示す）から得られる情報を利用する。これらの各方法では、既知哺乳類分泌タンパク質の切断点の予測精度は、75〜80％の範囲にある（von Heinje、前掲）。しかし、ある与えられたタンパク質に関して、これら2つの方法によって予想される切断点は、常に同じわけではない。
【０５６１】
シグナル配列の位置およびそれらの切断部位を同定するための確立された方法は、Henrik Nielsenら,Protein Engineering 10:1-6(1997)によって開発されたSignalPプログラム（v1.1）であった。このプログラムは、予測精度を上げるための追加パラメーターが用意されているものの、von Heinjeが開発したアルゴリズムに依拠している。
【０５６２】
最近になって、隠れマルコフモデルが開発され（H.Neilsonら,Ismb 1998;6:122-30）、最近のSignalP（v2.0）にはこのモデルが組み込まれている。この新しい方法により、シグナルペプチドと未切断シグナルアンカーとを識別することによって切断部位を同定する能力が高まる。本発明は、本明細書に開示する方法を本発明のポリペプチド配列に応用して、切断部位を含むシグナルペプチド位置を予測することを包含する。
【０５６３】
しかし、当業者には知られているように、切断部位は生物毎に異なる場合もあり、絶対確実な予測をすることはできない。したがって本発明のポリペプチドはシグナル配列を含んでいるかもしれない。シグナル配列を含む本発明のポリペプチドは、予想切断点の5残基以内（すなわち±5残基、好ましくは−5、-4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、+4、または+5残基に）にN末端を持つ。また、分泌タンパク質からのシグナル配列の切断が完全には均一でないために、2種類以上の分泌分子種が生じる場合があることも理解されるだろう。これらのポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは本発明に包含される。
【０５６４】
さらに、上記の解析によって同定されるシグナル配列は、必ずしも天然のシグナル配列を予測しているわけではないかもしれない。例えば、天然のシグナル配列は、予想シグナル配列のさらに上流にあるかも知れない。しかし予想シグナル配列は分泌タンパク質をERに導く能力をおそらく持っているだろう。それでもなお、本発明は、哺乳類細胞（例えば後述のCOS細胞）における配列番号Xのポリヌクレオチド配列および/または寄託されたクローンのcDNAに含まれるポリヌクレオチド配列の発現によって生成する成熟タンパク質を提供する。これらのポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは本発明に包含される。
【０５６５】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体
本発明は、本明細書の配列番号Xに開示するポリヌクレオチド配列、その相補鎖、および/または寄託されたクローンに含まれるcDNA配列の変異体（例えばアレル変異体、オルソログなど）も包含する。
【０５６６】
本発明は、配列番号Yに開示するポリペプチド配列および/またはその断片、配列番号Xに記載のポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチド、および/または寄託されたクローン中のcDNAがコードするポリペプチドの変異体も包含する。
【０５６７】
「変異体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その基本的性質は保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一般に、変異体は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに、全体として類似しており、多くの領域で同一である。
【０５６８】
したがって本発明は、一側面として、（a）配列表に示すアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドをコードする、配列番号Xに記載のヌクレオチド配列、またはATCC受託番号Zに含まれるcDNA、（b）配列表に示すアミノ酸配列を持つ成熟K+alphaM1関連ポリペプチドをコードする、配列番号Xに記載のヌクレオチド配列、またはATCC受託番号PTA-2766に含まれるcDNA、（c）配列表に示すアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードする、配列番号Xに記載のヌクレオチド配列、またはATCC受託番号Zに含まれるcDNA、（d）配列表に示すアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドの抗原性断片をコードする、配列番号Xに記載のヌクレオチド配列、またはATCC受託番号Zに含まれるcDNA、（e）配列番号Xに含まれるヒトcDNAプラスミドまたはATCC受託番号Zに含まれるcDNAがコードする全アミノ酸配列を含むヒトホスファターゼ関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（f）配列番号Xに含まれるヒトcDNAプラスミドまたはATCC受託番号Zに含まれるcDNAがコードするアミノ酸配列を持つ成熟ヒトホスファターゼをコードするヌクレオチド配列、（g）配列番号Xに含まれるヒトcDNAプラスミドまたはATCC受託番号Zに含まれるcDNAがコードするアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列、（h）配列番号Xに含まれるヒトcDNAプラスミドまたはATCC受託番号Zに含まれるcDNAがコードするアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドの抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、（i）上記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、または（h）に記載のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む、あるいは同ポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子を提供する。
【０５６９】
本発明は、例えば、上記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、または（h）に記載のヌクレオチド配列のいずれかと、少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％一致するポリヌクレオチド配列を含む、あるいは同ポリヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド配列にも向けられる。これらの核酸分子によってコードされるポリヌクレオチドも本発明に包含される。もう一つの態様として、本発明は、ストリンジェントな条件で、あるいはストリンジェンシーを下げた条件で、上記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、または（h）に記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、あるいは同ポリヌクレオチドからなる、核酸分子を包含する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、あるいはストリンジェンシーを下げた条件で、これらの核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドがコードするポリペプチドも、本発明に包含される。
【０５７０】
本発明は、もう一つの側面として、（a）配列表に示し表Iに記載するアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（b）配列表に示し表Iに記載するアミノ酸配列を持つ成熟ヒトホスファターゼ関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（c）配列表に示し表Iに記載するアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列、（d）配列表に示し表Iに記載するアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドの抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、（e）ATCC寄託物に含まれる表Iに記載のcDNAプラスミド中のヒトcDNAがコードする全アミノ酸配列を含むヒトホスファターゼ関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（f）ATCC寄託物に含まれる表Iに記載のcDNAプラスミド中のヒトcDNAがコードするアミノ酸配列を持つ成熟ヒトホスファターゼ関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、（g）ATCC寄託物に含まれる表Iに記載のcDNAプラスミド中のヒトcDNAがコードするアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードするヌクレオチド配列、（h）ATCC寄託物に含まれる表Iに記載のcDNAプラスミド中のヒトcDNAがコードするアミノ酸配列を持つヒトホスファターゼ関連ポリペプチドの抗原性断片をコードするヌクレオチド配列、（i）上記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、または（h）に記載のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む、あるいは同ポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子を提供する。
【０５７１】
本発明は、例えば、上記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、または（h）に記載のヌクレオチド配列のいずれかと、少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％一致するヌクレオチド配列を含む、あるいは同ヌクレオチド配列からなる、核酸分子にも向けられる。
【０５７２】
本発明は、限定を目的としない以下の例と、少なくとも80％、98％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％一致するアミノ酸配列を含む、あるいは同アミノ酸配列からなる、ポリペプチド配列も包含する：配列番号Yとして明記するポリペプチド配列、寄託クローンに含まれた状態で提供されるcDNAがコードするポリペプチド配列、および/または本発明が提供するポリペプチドのいずれかのポリペプチド断片。これらの核酸分子がコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。もう一つの態様として、本発明は、ストリンジェントな条件で、あるいはストリンジェンシーを下げた条件で、上記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、または（h）に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、あるいは同ポリヌクレオチドからなる、核酸分子を包含する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、あるいはストリンジェンシーを下げた条件で、これらの核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドがコードするポリペプチドも、本発明に包含される。
【０５７３】
本発明は、例えば、配列番号Yに示すポリペプチド配列、配列番号Xに示すヌクレオチド配列がコードするポリペプチド配列、cDNAプラスミドZ中のcDNAがコードするポリペプチド配列、および/またはこれらポリペプチドのポリペプチド断片（例えば本明細書に記載の断片）と、少なくとも80％、98％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％一致するアミノ酸配列を含む、あるいは同アミノ酸配列からなる、ポリペプチドにも向けられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、あるいはストリンジェンシーを下げた条件で、これらのポリペプチドをコードする核酸分子の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドがコードするポリペプチドも、本発明に包含される。
【０５７４】
本発明の基準ヌクレオチド配列と少なくとも例えば95％「一致する」ヌクレオチド配列を持つ核酸とは、その核酸のヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする基準ヌクレオチド配列の100ヌクレオチドにつき5つまでの割合で点突然変異を含んでもよいことを除いて、基準配列と一致することを意味する。言い換えると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を持つ核酸を得るには、基準配列中の5％までを欠失させるか、別のヌクレオチドで置換することができ、あるいは基準配列中のヌクレオチド総数の5％までのヌクレオチド数を基準配列中に挿入することができる。表Iに記載の全配列、ORF（オープンリーディングフレーム）、または本明細書に記載するように特定される断片を問い合わせ配列にすることができる。
【０５７５】
実際問題として、特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％一致するかどうかは、常法により、既知のコンピュータープログラムを使って決定することができる。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との全体にわたる最適な一致を決定するための好ましい方法（グローバル配列アラインメントともいう）は、Higgins,D.G.ら,Computer Applications in the Biosciences (CABIOS),8(2):189-191,(1992)のアルゴリズムに基づくCLUSTALWコンピュータプログラム（Thompson,J.D.ら,Nucleic Acids Research,2(22):4673-4680,(1994)）を使って決定することができる。配列アラインメントでは問い合わせ配列と対象配列はどちらもDNA配列である。RNA配列はUをTに変換することによって比較することができる。しかしCLUSTALWアルゴリズムは、RNA配列をDNA配列と比較する場合には、自動的にUをTに変換する。このグローバル配列アラインメントの結果は一致率で表される。ペアワイズアラインメントによって一致率を計算するためにDNA配列のCLUSTALWアラインメントで使用される好ましいパラメーターは次の通りである：行列（Matrix）＝IUB、k-タプル（k-tuple）＝1、トップ・ダイアゴナルの数（Number of Top Diagonals）＝5、ギャップ・ペナルティ（Gap Penalty）＝3、ギャップ・オープン・ペナルティ（Gap Open Penalty）＝10、ギャップ・エクステンション・ペナルティ（Gap Extension Penalty）＝0.1、スコアリング法（Scoring Method）＝パーセント（Percent）、ウィンドウ・サイズ（Window Size）＝5または対象ヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。マルチプルアラインメントの場合は以下のCLUSTALWパラメータが好ましい：ギャップ・オープニング・ペナルティ（Gap Opening Penalty）＝10、ギャップ・エクステンション・パラメータ（Gap Extension Parameter）＝0.05、ギャップ・セパレーション・ペナルティ・レンジ（Gap Separation Penalty Range）＝8、エンド・ギャップ・セパレーション・ペナルティ（End Gap Separation Penalty）＝オフ（Off）、アラインメント・ディレイのための一致率（%Identity for Alignment Delay）＝40％、残基特異的ギャップ（Residue Specific Gaps）＝オフ、親水性残基ギャップ（Hydrophilic Residue Gap）＝オフ、およびトランジション・ウェイティング（Transition Weighting）＝0。上述したCLUSTALWに関するペアワイズアラインメントおよびマルチプルアラインメントのパラメータは、AlignXソフトウェアプログラム（Vector NTIプログラム群、バージョン6.0）に用意されているデフォルトパラメータである。
【０５７６】
本発明は、内部欠失ではなく5'または3'欠失が原因で、対象配列が問い合わせ配列よりも短い場合に、一致率の結果に手作業による補正を加えることを包含する。ローカルペアワイズ一致率だけが必要な場合は、手作業による補正は必要ない。しかし、手作業による補正を加えて、グローバルポリヌクレオチドアラインメントからグローバル一致率を決定してもよい。グローバルポリヌクレオチドアラインメントに基づく一致率の計算は、局所的な一致ポリヌクレオチドだけでなく、ポリヌクレオチド分子全体の（すなわちオーバーラップしている領域だけでなく、ポリヌクレオチド突出部も含めた）一致率を反映するので、多くの場合、グローバルポリヌクレオチドアラインメントに基づく一致率の計算が好ましい。CLUSTALWプログラムは一致率を計算する際に対象配列の5'および3'トランケーションを考慮しないので、グローバル一致率の決定には、手作業による補正が必要である。問い合わせ配列と比較して5'または3'末端が欠けている対象配列の場合は、対象配列の5'および3'にある（一致/整列していない）問い合わせ配列の塩基数を問い合わせ配列の総塩基数のパーセントとして計算することにより、一致率を補正する。あるヌクレオチドが一致/整列しているかどうかはCLUSTALW配列アラインメントの結果によって決定する。次に、このパーセンテージを、指定したパラメータを使って上記CLUSTALWプログラムによって計算された一致率から差し引いて、最終的な一致率スコアを得る。この補正されたスコアは本発明の目的に使用することができる。一致率スコアを手作業で調節する目的には、CLUSTALWアラインメントで表示した場合に、問い合わせ配列と一致/整列していない、対象配列の5'および3'塩基の外側にある塩基だけを計算する。
【０５７７】
例えば、90塩基の対象配列を100塩基の問い合わせ配列と整列させて、一致率を決定する。欠失は対象配列の5'末端にあるため、CLUSTALWアラインメントは5'末端にある最初の10塩基の一致/整列を示さない。これらの10個の非対合塩基は配列の10％（5'および3'末端にある塩基の数/問い合わせ配列中の塩基の総数）に相当するので、CLUSTALWプログラムによって計算された一致率スコアから、10％を差し引く。仮に残りの90塩基が完全に一致していたとすると、最終一致率は90％になるだろう。もう一つの例として、90塩基の対象配列を100塩基の問い合わせ配列と比較する。今度は、欠失は内部欠失であって、対象配列の5'または3'には、問い合わせ配列と一致/整列していない塩基はないものとする。この場合、CLUSTALWによって計算された一致率は、手作業で補正されない。この場合も、問い合わせ配列と一致/整列していない対象配列の5'および3'にある塩基だけに関して、手作業で補正する。本発明の目的には、その他の手作業による補正は必要ない。
【０５７８】
2以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を整列し、整列した配列に関して一致率の値を得る上記の方法の他に、場合によっては、整列させる配列の既知の構造上の特徴、例えば各配列に関するSWISS-PROT名などを考慮するCLUSTALWアルゴリズムの修正版を利用することが望ましいかもしれない。そのような修正版CLUSTALWアルゴリズムの結果は、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して、より正確な一致率の値を与えるかもしれない。CLUSTALWのそのような修正版に関するサポートはCLUSTALWアルゴリズム内に用意され、バイオインフォマティクスの当業者には容易に理解されるだろう。
【０５７９】
変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両者に改変を含むことができる。サイレントな置換、付加または欠失をもたらすが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変化させない改変を含むポリヌクレオチド変異体は、特に好ましい。遺伝コードの縮重ゆえにサイレントな置換によって生成するヌクレオチド変異体は好ましい。さらに、5〜10、1〜5、または1〜2個のアミノ酸が任意の組合わせで置換、欠失または付加されている変異体も好ましい。ポリヌクレオチド変異体は、例えばコドン発現をある特定宿主に最適化するため（mRNA中のコドンを大腸菌などの細菌宿主が好むコドンに変化させるため）などの様々な理由で作製することができる。
【０５８０】
天然の変異体は「アレル変異体」と呼ばれ、ある生物のある染色体上の所定の座位を占める遺伝子のいくつかの代替的形態の一つを指す（Lewin,B.編「Genes II」John Wiley & Sons、ニューヨーク（1985））。これらのアレル変異体はポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドレベルで異なる場合があり、それらは本発明に包含される。あるいは、突然変異誘発技術または直接合成によって非天然変異体を作製してもよい。
【０５８１】
タンパク質工学の既知の方法および組換えDNA技術を使って変異体を作製することにより、本発明のポリペプチドの特徴を改善しまたは変化させることができる。例えば、生物学的機能を実質的に喪失させることなく、1つまたは複数のアミノ酸を、本タンパク質のN末端またはC末端から欠失させることができる。Ronら,J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993)の著者らは、3、8または27個のアミノ末端アミノ酸残基を欠失させた後でもヘパリン結合活性を持っている変異KGFタンパク質を報告した。また、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から8〜10個のアミノ酸残基を欠失させると、最高で10倍高い活性を示した（Dobeliら,J. Biotechnology 7: 199-216 (1988)）。
【０５８２】
さらに、変異体が、多くの場合、天然タンパク質の生物学的活性と類似する生物学的活性を保っていることは、十分な証拠によって証明されている。例えばGayleとその共同研究者ら（J. Biol. Chem., 268: 22105-22111 (1993)）は、ヒトサイトカインIL-1aの徹底的な突然変異解析を行なった。彼らはランダム突然変異誘発法を使って、分子の全長にわたって1変異体あたり平均2.5個のアミノ酸が変化しているIL-1a突然変異体を3,500個以上作製した。考え得る全てのアミノ酸位置で、複数の突然変異を調べた。この研究者らは「この分子の大部分は変化させても［結合活性または生物学的活性に］ほとんど影響がない」ことを見いだした。実際、調査した3,500を越えるヌクレオチド配列のうち、わずかに23種類のアミノ酸配列が、野生型とは有意に異なる活性を持つタンパク質を産生するに過ぎなかった。
【０５８３】
さらに、あるポリペプチドのN末端またはC末端から1つまたは複数のアミノ酸を欠失させることによって、1つまたは複数の生物学的機能の喪失または改変が起こったとしても、他の生物学的活性は依然として保たれるかもしれない。例えば、タンパク質の残基の過半数未満をN末端またはC末端から除去しても、当該タンパク質を認識する抗体を誘導しそして/またはその抗体を結合する欠失変異体の能力は、おそらく保たれるだろう。あるタンパク質のN末端残基またはC末端残基を欠く特定のポリペプチドがそのような免疫原活性を保っているかどうかは、本明細書に記載する常法や、当技術分野で知られる他の常法により、容易に決定することができる。
【０５８４】
あるいは、このような本発明ポリペプチドのN末端またはC末端欠失は、実際に、ポリペプチドの生物学的活性の1つまたは複数の有意な増加をもたらすかもしれない。例えば、多くのポリペプチドの生物学的活性は、一端または両端にある調節ドメインの存在によって支配されている。そのような調節ドメインは、活性化事象（例えばコグネイトリガンドまたは受容体への結合、リン酸化、タンパク質分解プロセシングなど）に代って、それらのポリペプチドの生物学的活性を効果的に阻害する。したがって、あるポリペプチドの調節ドメインを除去することにより、そのポリペプチドを、活性化事象の不在下で、効果的に、生物学的に活性な状態にすることができる。
【０５８５】
したがって、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すポリペプチド変異体を包含する。そのような変異体は、当技術分野で知られる一般則に従って、活性に対する影響がほとんど無いように選択される欠失、挿入、逆位、反復、および置換を含む。例えば、表現型上サイレントなアミノ酸置換の作製方法に関する指針はBowieら,Science 247: 1306-1310 (1990)に記載されている。この文献で、著者らは、変化に対するアミノ酸配列の許容度を研究するには、主に2つの戦略があることを示している。
【０５８６】
第1の戦略では、進化の過程で起こる自然淘汰によって、アミノ酸置換の許容度を調べる。異なる種のアミノ酸配列を比較することにより、保存されたアミノ酸を同定することができる。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質機能にとって、おそらく重要だろう。これに対し、自然淘汰が置換を許容しているアミノ酸位置は、これらの位置がタンパク質機能にとって不可欠でないことを示している。したがって、アミノ酸置換を許容する位置は、そのタンパク質の生物学的活性を保ったまま、改変することができるだろう。
【０５８７】
第2の戦略では、遺伝子工学を利用して、クローニングした遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入することにより、タンパク質機能にとって重要な領域を同定する。例えば、部位指定突然変異誘発法またはアラニンスキャニング突然変異誘発法（分子のあらゆる残基に単アラニン突然変異を導入する方法）を使用することができる（CunninghamおよびWells, Science 244: 1081-1085 (1989)）。次に、得られた突然変異体分子を、生物学的活性に関して試験することができる。
【０５８８】
著者らが述べているように、これら2つの戦略により、タンパク質はアミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることが明らかになった。さらに著者らは、タンパク質のあるアミノ酸位置で、どのアミノ酸変化が許容されそうであるかも示している。例えば（タンパク質の三次元構造内に）埋没したアミノ酸残基は、そのほとんどが、無極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は一般にほとんど保存されない。
【０５８９】
本発明は、一致度は低いが十分な類似性を持つために本発明のポリペプチドが発揮する機能と同じ機能を1つまたは複数発揮するポリペプチドを包含する。類似性は保存的アミノ酸置換によって決定される。そのような置換は、ポリペプチド中の与えられたアミノ酸を、類似する特徴（例えば化学的性質）を持つ別のアミノ酸に置き換える置換である。前掲のCunninghamらによれば、そのような保存的置換は表現型上サイレントであると思われる。表現型上サイレントでありそうなアミノ酸変化に関するさらなる指針は、Bowieら,Science 247: 1306-1310（1990）に記載されている。
【０５９０】
本発明の許容される保存的アミノ酸置換には、脂肪族または疎水性アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIleの置換、ヒドロキシル残基SerおよびThrの置換、酸性残基AspおよびGluの置換、アミド残基AsnおよびGlnの置換、塩基性残基Lys、ArgおよびHisの置換、芳香族残基Phe、TyrおよびTrpの置換、ならびに小サイズアミノ酸Ala、Ser、Thr、MetおよびGlyの置換が含まれる。
【０５９１】
加えて、本発明はまた、以下の表VIIに提示する保存的置換をも包含する。
【表２】
2005506040.tif 000005
【０５９２】
上記の使用に加えて、該アミノ酸置換はまた、タンパク質またはペプチドの安定性を増大し得る。本発明はまた、例えば該タンパク質配列またはペプチド配列中に１つ以上の非ペプチド結合（これは、ペプチド結合を置き換える）を含むアミノ酸置換を包含する。天然に存在するＬ−アミノ酸以外のアミノ酸残基（例えば、Ｄ−アミノ酸）、または非天然もしくは合成のアミノ酸（例えば、βまたはγアミノ酸）を含む置換をも含む。
【０５９３】
一致度と類似度はどちらも、以下の刊行物を参照することにより、容易に計算することができる： Lesk,A.M.編「Computational Molecular Biology」（Oxford University Press、ニューヨーク、1988）、Smith,D.W.編「Biocomputing: Informatics and Genome Projects」（Academic Press、ニューヨーク、1993）、Griffin, A. M.およびGriffin, H. G.編「Informatics Computer Analysis of Sequence Data, Part 1」（Humana Press、ニュージャージー、1994）、von Heinje, G.「Sequence Analysis in Molecular Biology」（Academic Press、1987）、ならびにGribskov, M.およびDevereux, J.編「Sequence Analysis Primer」（M Stockton Press、ニューヨーク、1991）。
【０５９４】
さらに本発明は、あるアミノ酸置換が機能の保存をもたらす確率に基づいたアミノ酸の置換も包含する。そのような確率は、関連する機能を持つ複数の遺伝子を整列し、適正な遺伝子機能に対する各置換の相対的ペナルティーを評価することによって決定される。そのような確率はしばしば行列の形で記載され、いくつかのアルゴリズム（例えばBLAST、CLUSTALW、GAPなど）により、類似率の計算に利用される。この場合、類似度とは、機能の喪失を伴わずにあるアミノ酸をもう一つのアミノ酸の代わりに使用することができる度合いを指す。そのような行列の一例はPAM250またはBLOSUM62行列である。
【０５９５】
上記の、規範にかなった化学的に保存された置換だけでなく、本発明は、一般的には保存的置換に分類されないが、一定の状況では化学的に保存されていると言える置換も包含する。例えばプロテアーゼ類の酵素触媒作用の解析により、いくつかの酵素の活性部位内にある一定のアミノ酸は、活性部位のユニークな微小環境ゆえに、強い摂動を受けたpKaを持つ場合があることが明らかにされている。pKaがそのような摂動を受けることにより、一部のアミノ酸は、酵素の構造と機能を保存したまま、他のアミノ酸の代わりを務めることができるようなる。摂動を受けたpKaを持つことが知られているアミノ酸の例は、リゾチームのGlu-35残基、キモトリプシンのIle-16残基、パパインのHis-159残基などである。機能の保存は、摂動を受けていない標準的なpKaと比較して、それらのアミノ酸が変則的なプロトン化または変則的な脱プロトン化を起こすことに関係する。pKaの摂動により、これらのアミノ酸は、酵素活性部位内のユニークなイオン化環境による一般酸塩基触媒作用に、積極的に参加することができるようになるのだろう。したがって、実例に見られるように、野生型のアミノ酸と同じ能力または類似する能力で、酵素の活性部位または活性キャビティの微小環境内で一般酸または一般塩基として働くことができるアミノ酸による置換は、事実上保存的アミノ置換として働くだろう。
【０５９６】
保存的アミノ酸置換の他に、本発明の変異体には、（i）1つまたは複数の非保存的アミノ酸残基による置換（置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものでも、遺伝暗号によってコードされないものでもよい）、または（ii）置換基を持つ1つまたは複数のアミノ酸残基による置換、または（iii）成熟ポリペプチドともう一つの化合物、例えばポリペプチドの安定性および/または溶解性を向上させる化合物（ポリエチレングリコールなど）との融合物、または（vi）ポリペプチドと追加アミノ酸、例えばIgG Fc融合領域ペプチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列などとの融合物も包含されるが、これらに限るわけではない。このような変異体ポリペプチドは、本明細書が教示する内容からみて、当業者の技術で可能であると考えられる。
【０５９７】
例えば、荷電アミノ酸が他の荷電または中性アミノ酸で置換されているポリペプチド変異体は改善された特徴を持つタンパク質、例えば凝集性の低いタンパク質などをもたらすかもしれない。医薬製剤の凝集は活性を低下させると共に、凝集物の免疫原活性により、クリアランスを増加させる（Pinckardら,Clin. Exp. Immunol. 2: 331-340 (1967)；Robbinsら,Diabetes 36: 838-845 (1987)；Clelandら,Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377 (1993)）。
【０５９８】
さらに本発明は、配列番号Xとして開示するポリヌクレオチド、寄託物に含まれる状態で提出されたクローンの配列、および/または配列番号Yとして開示するポリペプチドをコードするcDNAに分子進化（「DNAシャフリング(Shuffling)」）法を適用することによって作製されるポリペプチド変異体も包含する。DNAシャフリング技術は当技術分野では知られており、本明細書では項を改めてさらに詳しく説明する（例えばWPC, Stemmer, PNAS, 91: 10747, (1994)および本明細書の実施例）。
【０５９９】
本発明のさらにもう一つの態様は、少なくとも1つのアミノ酸置換を含有するが、含まれるアミノ酸置換が50個を越えない、より好ましくは含まれるアミノ酸置換が40個を越えない、より一層好ましくは含まれるアミノ酸置換が30個を越えない、さらに好ましくは含まれるアミノ酸置換が20個を越えないアミノ酸配列を持つ本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。もちろん、ペプチドまたはポリペプチドは、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1個を越えない少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する本発明のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を持つことが、極めて好ましく、その好ましさは上記の順に増加する。具体的態様として、本発明のアミノ酸配列またはその断片（例えば本明細書に記載する成熟型および/または他の断片）中の付加、置換および/または欠失の数は、1〜5、5〜10、5〜25、5〜50、10〜50、または50〜150であり、保存的アミノ酸置換が好ましい。
【０６００】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド断片
本発明は、本発明ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド断片ならびに該ポリヌクレオチドおよび/または断片がコードしているポリペプチドに向けられる。
【０６０１】
本発明において「ポリヌクレオチド断片」とは、寄託されたクローンに含まれる核酸配列の一部もしくは寄託されたクローンに含まれるcDNAによってコードされているポリペプチドをコードする核酸配列の一部である核酸配列、または配列番号Xに示す核酸配列の一部もしくは配列番号Xの相補鎖の一部である核酸配列、または配列番号Yのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一部である核酸配列、を持つ短いポリヌクレオチドを指す。本発明のヌクレオチド断片は好ましくは少なくとも約15nt、より好ましくは少なくとも約20nt、さらに好ましくは少なくとも約30nt、より一層好ましくは少なくとも約40nt、少なくとも約50nt、少なくとも約75nt、または少なくとも約150ntの長さである。例えば「少なくとも20nt長」の断片は、寄託されたクローンに含まれるcDNA配列または配列番号Xに示すヌクレオチド配列から選択される20個以上の連続する塩基を含むものとする。この場合、「約」は、具体的に記載した値、および一端または両端が数ヌクレオチド（5、4、3、2、または1ヌクレオチド）大きいまたは小さい値を包含する。これらのヌクレオチド断片は、本明細書で論じる診断プローブおよびプライマーとしての用途を含む（ただしこれらに限らない）用途を持っている。もちろん、さらに大きい断片（例えば50、150、500、600、2000ヌクレオチド）が好ましい。
【０６０２】
さらに、本発明のポリヌクレオチド断片の代表例としては、例えば配列番号Xもしくはその相補鎖、または寄託されたクローンに含まれるcDNAのヌクレオチド番号約1〜50、51〜100、101〜150、151〜200、201〜250、251〜300、301〜350、351〜400、401〜450、451〜500、501〜550、551〜600、651〜700、701〜750、751〜800、800〜850、851〜900、901〜950、951〜1000、1001〜1050、1051〜1100、1101〜1150、1151〜1200、1201〜1250、1251〜1300、1301〜1350、1351〜1400、1401〜1450、1451〜1500、1501〜1550、1551〜1600、1601〜1650、1651〜1700、1701〜1750、1751〜1800、1801〜1850、1851〜1900、1901〜1950、1951〜2000、もしくは2001〜末端に由来する配列を含む断片、あるいは同配列からなる断片が挙げられる。この場合、「約」は、具体的に記載した範囲、および一端または両端が数ヌクレオチド（5、4、3、2、または1ヌクレオチド）大きいまたは小さい範囲を包含する。これらの断片は、好ましくは、生物学的活性を持つポリペプチドをコードする。より好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、本明細書で論じるプローブまたはプライマーとして使用することができる。また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件またはストリンジェンシーを下げた条件でこれらの核酸分子にハイブリダイズするポリヌクレオチド、ならびにそれらのポリヌクレオチドがコードするポリペプチドも、本発明に包含される。
【０６０３】
本発明において「ポリペプチド断片」とは、配列番号Yに含まれるアミノ酸配列の一部もしくは寄託されたクローンに含まれるcDNAがコードするアミノ酸配列の一部であるアミノ酸配列を指す。タンパク質（ポリペプチド）断片は「独立（free-standing）」していてもよいし、その断片を一部または一領域（最も好ましくは単一の連続した領域）とする、より大きいポリペプチドに含まれていてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表例として、例えばコード領域のアミノ酸番号約1〜20、21〜40、41〜60、61〜80、81〜100、102〜120、121〜140、141〜160、もしくは161〜末端を含む断片、あるいはそれらからなる断片が挙げられる。さらに、ポリペプチド断片は、約20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、または150アミノ酸の長さを持つことができる。この場合、「約」は、具体的に記載した範囲または値、および一端または両端が数アミノ酸（5、4、3、2、または1アミノ酸）大きいまたは小さい範囲もしくは値を包含する。これらのポリペプチドがコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。
【０６０４】
好ましいポリペプチド断片として全長タンパク質が挙げられる。さらなる好ましいポリペプチド断片として、アミノ末端もしくはカルボキシ末端またはその両方から連続する一連の残基が削除されている全長タンパク質も挙げられる。例えば、1〜60個の範囲の任意の数のアミノ酸を、全長ポリペプチドのアミノ末端から欠失させることができる。同様に、1〜30個の範囲の任意の数のアミノ酸を、全長タンパク質のカルボキシ末端から欠失させることもできる。さらに、上記アミノ末端およびカルボキシ末端欠失の任意の組合わせも好ましい。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも好ましい。
【０６０５】
構造ドメインまたは機能ドメインを特徴とするポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片、例えばアルファヘリックスおよびアルファヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可撓領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数（high antigenic index）領域を含む断片なども好ましい。保存されたドメインに含まれる配列番号Yのポリペプチド断片は、特に本発明に包含される。さらに、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドも考えられる。
【０６０６】
他の好ましいポリペプチド断片は、生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片は、本発明のポリペプチドと類似する活性であるが必ずしも同一でない活性を示す断片である。断片の生物学的活性には、改善された望ましい活性、または低下した望ましくない活性を含めることができる。これらのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドも、本発明に包含される。
【０６０７】
好ましい態様として、本発明のポリヌクレオチド断片によってコードされるポリペプチドが示す機能的活性は、本発明の全長ポリペプチドに通常付随する1つまたは複数の生物学的活性であってよい。これらの生物学的活性の具体例としては、全長タンパク質に結合する抗体と同じ抗体の少なくとも1つに結合する断片の能力、全長タンパク質に結合するタンパク質と同じタンパク質の少なくとも1つと相互作用する断片の能力、全長タンパク質が誘発する免疫応答と同じ免疫応答の少なくとも1つを誘発する断片の能力（すなわち同じエピトープに特異的な抗体を免疫系に生成させる能力など）、全長タンパク質が結合するポリヌクレオチドと同じポリヌクレオチドの少なくとも1つに結合する断片の能力、全長タンパク質のリガンドに結合する断片の能力、および全長タンパク質と多量体を形成する断片の能力などが挙げられる。しかし、一部の断片が、全長タンパク質の生物学的活性とは直接的には関係のない望ましい生物学的活性を持ちうることも、当業者には理解されるだろう。本発明ポリペプチド（その断片、変異体、誘導体および類似体を含む）の機能的活性は、当業者が利用できる数多くの方法によって決定することができ、その一部については、本明細書に項を改めて説明する。
【０６０８】
本発明は、配列番号Yのアミノ酸配列を持つポリペプチドのエピトープ、またはATCC受託番号Zに含まれるポリヌクレオチド配列がコードするポリペプチド配列のエピトープ、または上に定義したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件もしくはストリンジェンシーを下げたハイブリダイゼーション条件で配列番号Xの配列もしくはATCC受託番号Zに含まれる配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするポリペプチド配列のエピトープを含む、あるいは同エピトープからなる、ポリペプチドを包含する。さらに本発明は、本発明のポリペプチド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば配列番号1に開示する配列など）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および上に定義したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件またはストリンジェンシーを下げたハイブリダイゼーション条件で相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列も包含する。
【０６０９】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、ポリペプチドのうち、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて、抗原活性または免疫原活性を持つ部分を指す。好ましい態様として、本発明は、エピトープを含むポリペプチド、ならびにそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。本明細書で使用する「免疫原エピトープ」という用語は、タンパク質のうち、動物の体内で抗体応答を誘発することが、当技術分野で知られる任意の方法、例えば後述する抗体の作成方法によって決定される部分であると定義される（例えばGeysenら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983)などを参照されたい）。本明細書で使用する「抗原エピトープ」という用語は、タンパク質のうち、抗体がその部分に免疫特異的に結合できることが、当技術分野で周知の任意の方法、例えば本明細書に記載するイムノアッセイなどによって決定される部分であると定義される。非特異的結合は免疫特異的結合から除外されるが、他の抗原との交差反応性は必ずしも免疫特異的結合から除外されない。抗原エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。
【０６１０】
エピトープとして機能する断片は、任意の従来法によって作製することができる（例えばHoughten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985)などを参照されたい。米国特許第4,631,211号にはさらに詳しく記載されている）。
【０６１１】
本発明では、抗原エピトープは、好ましくは少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、より好ましくは少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、最も好ましくは約15〜約30個の一続きのアミノ酸を含む。免疫原または抗原エピトープを含む好ましいポリペプチドは、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100アミノ酸残基の長さである。他の非排他的な好ましい抗原エピトープとしては、本明細書に開示する抗原エピトープ、ならびにその一部が挙げられる。抗原エピトープは、例えば、そのエピトープを特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を産生させるのに役立つ。好ましい抗原エピトープとしては、本明細書に開示する抗原エピトープ、ならびに2、3、4、5個またはそれ以上のこれら抗原エピトープの任意の組合わせが挙げられる。抗原エピトープはイムノアッセイにおける標的分子として使用することができる（例えばWilsonら,Cell 37: 767-778 (1984)；Sutcliffeら,Science 219: 660-666 (1983)を参照されたい）。
【０６１２】
また、免疫原エピトープを使って、当技術分野で周知の方法により、抗体を誘導することもできる（例えばSutcliffeら,前掲；Wilsonら,前掲；Chowら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914；およびBittleら,J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)を参照されたい）。好ましい免疫原エピトープとしては、本明細書に開示する免疫原エピトープ、ならびに2、3、4、5個またはそれ以上のこれら免疫原エピトープの任意の組合わせが挙げられる。抗体応答を誘発するには、1つまたは複数の免疫原エピトープを含むポリペプチドを、アルブミンなどの担体タンパク質と共に、動物系（ウサギまたはマウスなど）に提示するか、またはポリペプチドが十分な長さ（少なくとも約25アミノ酸）を持つのであれば、そのポリペプチドを担体なしで提示することができる。しかし、8〜10アミノ酸しか含まない免疫原エピトープでも、少なくとも（例えばウェスタンブロット法などで）変性ポリペプチド中の線状エピトープに結合する能力を持つ抗体を産生させるのには十分であることが明らかにされている。
【０６１３】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、例えばインビボ免疫法、インビトロ免疫法、ファージディスプレイ法などを含む当技術分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために使用することができる。例えばSutcliffeら,前掲；Wilsonら,前掲；およびBittleら,J.Gen.Virol.,66:2347-2354(1985)を参照されたい。インビボ免疫法を使用する場合は、動物を遊離のペプチドで免疫してもよいが、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または破傷風トキソイドなどの高分子担体にペプチドをカップリングすることにより、抗ペプチド抗体価を増強することもできる。例えばシステイン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）などのリンカーを使って担体にカップリングすることができ、他のペプチドは、より一般的なグルタルアルデヒドなどの結合剤を使って担体にカップリングすることができる。ウサギ、ラットおよびマウスなどの動物を、遊離のペプチドまたは担体とカップリングしたペプチドで、例えば約100μgのペプチドまたは担体タンパク質とフロイントアジュバントまたは免疫応答を刺激することで知られている他の任意のアジュバント免疫とを含むエマルジョンの腹腔内および/または皮内注射などによって、免疫する。例えば固体表面に吸着させた遊離のペプチドを使用するELISAアッセイなどによって検出することができる有用な力価の抗ペプチド抗体を得るには、数回の追加免疫注射を例えば約2週間の間隔で行なう必要があるかもしれない。免疫した動物から得られる血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば当技術分野で周知の方法に従って、固体支持体上のペプチドへの吸着などによる抗ペプチド抗体の選択と、選択された抗体の溶出とを行なうことによって向上させることができる。
【０６１４】
当業者には理解されるように、また上でも述べたように、免疫原エピトープまたは抗原エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド配列に融合させることができる。例えば本発明のポリペプチドを免疫グロブリン（IgA、IgE、IgG、IgM）の定常ドメイン、またはその一部（CH1、CH2、CH3またはその任意の組合わせもしくはその一部）に融合して、キメラポリペプチドを得ることができる。そのような融合タンパク質により、精製が容易になったり、生体内半減期が延びたりする。このことは、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインと、哺乳類免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々なドメインとからなるキメラタンパク質に関して示されている。例えばEP394,827；Trauneckerら,Nature,331:84-86(1988)などを参照されたい。IgGまたはFc断片などのFcRn結合パートナーに結合された抗原（例えばインスリン）に関して、上皮障壁を横切って起こる抗原の免疫系への送達の増進が証明されている（例えばPCT公開WO96/22024およびWO99/04813）。IgG部分のジスルフィド結合ゆえにジスルフィドで連結された二量体構造を持つIgG融合タンパク質は、単量体型ポリペプチドまたはその断片単独よりも効率よく他の分子を結合および中和することも見いだされている。例えばFountoulakisら,J.Biochem.,270:3958-3964(1995)を参照されたい。発現されたポリペプチドの検出および精製を助けるために、上記のエピトープをコードする核酸を、エピトープタグ（例えばヘマグルチニン（「HA」）タグまたはflagタグ）として、興味ある遺伝子と組換えることもできる。例えば、Janknechtらが記載した系では、ヒト細胞株中で発現させた非変性融合タンパク質を容易に精製することが可能である（Janknechtら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-897）。この系では、興味ある遺伝子を、その遺伝子のオープンリーディングフレームが6つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳時に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングする。このタグは当該融合タンパク質のマトリックス結合ドメインとして役立つ。この組換えワクシニアウイルスに感染させた細胞から得られる抽出物をNi2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムに負荷し、ヒスチジンタグを持つタンパク質をイミダゾール含有バッファーで選択的に溶出させることができる。
【０６１５】
遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および/またはコドンシャフリング（これらを総称して「DNAシャフリング」という）の技術により、本発明のさらなる融合タンパク質を作製することができる。DNAシャフリングは本発明ポリペプチドの活性を調整するために使用することができ、そのような方法を使って、変化した活性を持つポリペプチドならびに当該ポリペプチドの作動薬およびアンタゴニストを作製することができる。一般論として、例えば、米国特許第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号および第5,837,458号、Pattenら,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33(1997)；Harayama,Trends Biotechnol.16(2):76-82(1998)；Hanssonら,J.Mol.Biol.287:265-76(1999)；LorenzoおよびBlasco,Biotechniques 24(2):308-13(1998)を参照されたい（これらの特許および刊行物は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する）。一態様として、配列番号Xに相当するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの改変を、DNAシャフリングによって達成することができる。DNAシャフリングでは、相同組換えまたは部位特異的組換えによって2以上のDNAセグメントを集合させて、ポリヌクレオチド配列中に変異を作出する。もう一つの態様として、組換えに先だって、エラープローン（error-prone）PCR、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダム突然変異誘発処理にかけることにより、本発明のポリヌクレオチドまたはコードされているポリペプチドを変化させてもよい。もう一つの態様として、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの1つまたは複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などを、1つまたは複数の異種分子の1つまたは複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組換えてもよい。
【０６１６】
抗体
本発明のさらなるポリペプチドは、（特異的抗体-抗原結合をアッセイする、当技術分野で周知のイムノアッセイによって決定した場合に）配列番号Yのポリペプチド、ポリペプチド断片もしくは変異体および/または本発明のエピトープを免疫特異的に結合する抗体およびT細胞抗原受容体（TCR）に関する。本発明の抗体には、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート（heteroconjugate）抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、Fab発現ライブラリーが産生する断片、抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む）、および上述した抗体のエピトープ結合性断片などが含まれるが、これらに限るわけではない。本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位を含んでいる分子を指す。本発明の免疫グロブリン分子は、どのタイプ（例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgAおよびIgY）、どのクラス（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはどのサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。さらに、「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗体」（Mab）という用語は、完全な分子だけでなく、タンパク質に特異的に結合する能力を持つ抗体断片（例えばFabおよびF(ab')2断片など）も包含するものとする。FabおよびF(ab')2断片は完全な抗体のFc断片を欠き、完全な抗体よりも速く動物または植物の循環系から消失すると共に、非特異的組織結合も少ないだろう（Wahlら,J.Nucl.Med. 24:316-325(1983)）。したがってこれらの断片は、FABまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物と共に、好ましい。さらに本発明の抗体には、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体も包含される。
【０６１７】
抗体は、最も好ましくは、本発明のヒト抗原結合性抗体断片であり、これには、例えばFab、Fab'およびF(ab')2、Fd、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fvs（sdFv）、およびVLドメインかVHドメインを含む断片などが含まれる。一本鎖抗体を含む抗原結合性抗体断片は、可変領域を単独で、またはヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインの全部もしくは一部と組み合わせて含むことができる。また、可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインとの任意の組合わせを含む抗原結合性断片も、本発明に包含される。本発明の抗体は、鳥および哺乳動物を含むどの動物に由来してもよい。抗体は、好ましくは、ヒト、ネズミ（例えばマウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリの抗体である。本明細書にいう「ヒト」抗体にはヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を持つ抗体が包含され、後述するように、また例えばKucherlapatiらが米国特許第5,939,598号に記載しているように、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または1つもしくは複数のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックであって、内因性免疫グロブリンを発現させない動物から単離された抗体などが含まれる。
【０６１８】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性を持つことができる。多重特異性抗体は、本発明ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または本発明のポリペプチドと異種エピトープ（例えば異種ポリペプチドまたは固形支持材料など）との両方に特異的であることができる。例えばPCT公開WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tuttら,J.Immunol.147:60-69(1991)；米国特許第4,474,893号；第4,714,681号；第4,925,648号；第5,573,920号；第5,601,819号；Kostelnyら,J.Immunol. 148:1547-1553(1992)などを参照されたい。
【０６１９】
本発明の抗体は、それらが認識するまたは特異的に結合する本発明ポリペプチドのエピトープまたは一部という観点から説明または特定することができる。エピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書に記載するように、例えばN末端およびC末端位置、連続するアミノ酸残基数で表したサイズなどによって特定するか、または表および図に列挙することができる。本発明のエピトープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体を除外することもできる。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体を包含すると共に、その除外も考えられる。
【０６２０】
本発明の抗体は、その交差反応性という観点から説明または特定することもできる。本発明ポリペプチドの他の類似体、オルソログまたはホモログを結合しない抗体は、本発明に包含される。本発明のポリペプチドと少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも65％、少なくとも60％、少なくとも55％、および少なくとも50％一致するポリペプチドを結合する抗体も本発明に包含される。具体的態様として、本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウス、ラットおよび/またはウサギホモログおよびその対応するエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドとの一致度が（当技術分野で知られる本明細書に記載の方法で計算して）95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55％未満、および50％未満であるポリペプチドを結合しない抗体も、本発明に包含される。具体的一態様として、上記の交差反応性は、単一の特定抗原もしくは免疫原ポリペプチド、または本明細書に開示する2、3、4、5個またはそれ以上の特定抗原および/または免疫原ポリペプチドの組合わせに関する交差反応性である。さらに（本明細書に記載の）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを結合する抗体も、本発明に包含される。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性という観点から説明または特定することもできる。好ましい結合親和性としては、解離定数、すなわちKdが5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、または10-15M未満であるものが挙げられる。
【０６２１】
本発明は、競合的結合を決定するための当技術分野で知られる任意の方法、例えば本明細書に記載のイムノアッセイで決定した場合に、本発明エピトープへの抗体の結合を競合的に阻害する抗体も提供する。好ましい態様として、この抗体は、エピトープへの結合を、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％、競合的に阻害する。
【０６２２】
本発明の抗体は、本発明ポリペプチドの作動薬またはアンタゴニストとして作用しうる。例えば本発明は、本発明ポリペプチドとの受容体/リガンド相互作用を部分的または完全に破壊する抗体を包含する。本発明の抗体は、好ましくは、本明細書に開示する抗原エピトープまたはその一部を結合する。さらに本発明は受容体特異抗体とリガンド特異抗体の両方を特徴とする。本発明は、リガンド結合は妨げないが、受容体活性化を妨げる受容体特異抗体も特徴とする。受容体の活性化（すなわちシグナル伝達）は、本明細書に記載する技術または当技術分野で知られる他の技術によって決定することができる。例えば受容体活性化は、受容体またはその基質のリン酸化（例えばチロシンまたはセリン/スレオニン）を、免疫沈降とそれに続くウェスタンブロット解析とで、（例えば上述のように）検出することによって、決定することができる。具体的態様として、リガンド活性または受容体活性を、当該抗体が存在しない場合の活性の少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％阻害する抗体を提供する。
【０６２３】
本発明は、リガンド結合も受容体活性化も妨げる受容体特異抗体、ならびに受容体-リガンド複合体を認識し、好ましくは未結合の受容体と未結合のリガンドをどちらも特異的に認識しない抗体も特徴とする。また、リガンドを結合してリガンドが受容体に結合するのを妨げる中和抗体、ならびにリガンドを結合することによって受容体活性化を妨げるが、リガンドが受容体を結合するのは妨げない抗体も本発明に包含される。さらに、受容体を活性化する抗体も本発明に包含される。これらの抗体は、例えば受容体の二量化を誘導することなどによって、受容体作動薬として作用する、すなわちリガンドが媒介する受容体活性化の生物学的活性の全部または一部を増強もしくは活性化するかもしれない。これらの抗体は、本明細書に開示する本発明ペプチドの特定の生物学的活性を含む生物学的活性に関する作動薬、アンタゴニストまたはインバース作動薬として特定することができる。例えばPCT公開WO96/40281；米国特許第5,811,097号；Dengら,Blood 92(6):1981-1988(1998)；Chenら,Cancer Res. 58(16):3668-3678(1998)；Harropら,J.Immunol. 161(4):1786-1794(1998)；Zhuら,Cancer Res. 58(15):3209-3214(1998)；Yoonら,J.Immunol. 160(7):3170-3179(1998)；Pratら,J.Cell.Sci.111(Pt2):237-247(1998)；Pitardら,J.Immunol.Methods 205(2):177-190(1997)；Liautardら,Cytokine 9(4):233-241(1997)；Carlsonら,J.Biol.Chem.272(17):11295-11301(1997)；Tarymanら,Neuron 14(4):755-762(1995)；Mullerら,Structure 6(9):1153-1167(1998)；Bartunekら,Cytokine 8(1):14-20(1996)を参照されたい（これらは全て参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する）。
【０６２４】
本発明の抗体は、例えば、インビトロおよびインビボでの診断および治療法を含む、本発明ポリペプチドの精製、検出およびターゲティングなど（ただしこれらに限らない）に使用することができる。例えば本抗体は、生物学的試料中の本発明ポリペプチドの濃度を定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイに役立つ。例えばHarlowら「Antibodies: A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988）を参照されたい（この刊行物は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する）。
【０６２５】
以下に詳述するように、本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と組み合わせて使用することができる。本抗体はさらに、異種ポリペプチドにN末端またはC末端で組換え的に融合するか、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合による結合を含む）することができる。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおけるラベルとして有用な分子、および異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素などのエフェクター分子に、組換え的に融合または結合することができる。例えばPCT公開WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；米国特許第5,314,995号；およびEP396,387を参照されたい。
【０６２６】
本発明の抗体には、修飾された誘導体、すなわちその抗体が抗イディオタイプ応答を引き起こすのを妨げないような形で何らかのタイプの分子を共有結合することによって修飾された誘導体が包含される。例えば抗体誘導体には、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾された抗体が含まれるが、これらに限るわけではない。数多くの化学修飾はいずれも、例えば特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含む（ただしこれらに限らない）既知の技術によって行なうことができる。さらに誘導体は、1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【０６２７】
本発明の抗体は、当技術分野で知られる任意の適切な方法によって作製することができる。
【０６２８】
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナル抗体の作製方法は当業者に知られている（参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するHarlowら「Antibodies: A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988）参照）。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えばウサギ、マウス、ラットなど（ただしこれらに限らない）の様々な宿主動物に投与して、その抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができる。本発明のポリペプチドの投与には、免疫剤と、所望によりアジュバントとを1回または複数回注射する必要があるかもしれない。免疫学的応答を増加させるために、宿主の種に応じて、様々なアジュバントを使用することができ、例えばフロイントの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリムペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG（bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限るわけではない。このようなアジュバントも当技術分野ではよく知られている。本発明において「免疫剤」とは、本発明のポリペプチド（その断片、変異体および/または誘導体を含む）ならびに異種ポリペプチドとの融合物および本明細書に記載する他の形態のポリペプチドであると定義することができる。
【０６２９】
典型的には、免疫剤および/またはアジュバントを、複数の皮下または腹腔内注射によって、哺乳動物に注射するが、筋肉内注射および/または静脈内注射によって投与してもよい。免疫剤には、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは変異体を含めることができる。ポリペプチドの性質（すなわち疎水性率、親水性率、安定性、正味の電荷、等電点など）によっては、免疫する哺乳動物の体内で免疫原性を示すことが知られているタンパク質に免疫剤を結合することが有益であるかもしれない。そのような結合には、本発明のポリペプチドおよび免疫原タンパク質の両方に対して、共有結合が形成されるように、活性な化学官能基を誘導体化することによる化学的結合、または融合タンパク質に基づく方法もしくは当業者に知られる他の方法による結合が包含される。そのような免疫原タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、および大豆トリプシンインヒビターなどがあるが、これらに限るわけではない。免疫学的応答を増加させるために、宿主の種に応じて、様々なアジュバントを使用することができ、例えばフロイントの（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリムペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG（bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルブムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限るわけではない。アジュバントの他の例としてはMPL-TDMアジュバント（モノホスホリルリピドA、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫プロトコールは、当業者であれば、甚だしい実験を行なわなくても選択することができる。
【０６３０】
本発明の抗体はモノクローナル抗体を含んでよい。モノクローナル抗体は、例えばKohlerおよびMilstein,Nature,256:495(1975)ならびに米国特許第4,376,110号、Harlowら「Antibodies:A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988）、Hammerlingら「Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas」（Elsevier,ニューヨーク,1981）に記載されているようなハイブリドーマ法、または当業者に知られる他の方法を使って作製することができる。モノクローナル抗体の作製に使用することができる方法の他の例として、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら,1983,Immunology Today 4:72；Coleら,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030）およびEBVハイブリドーマ技術（Coleら,1985,「Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy」（Alan R.Liss,Inc.）の77〜96頁）などが挙げられるが、これらに限るわけではない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含むどの免疫グロブリンクラスであってもよく、またそれらのどのサブクラスであってもよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。インビボでは抗体価の高いmAbを産生させることができるので、現在のところ、これが好ましい製造方法になっている。
【０６３１】
ハイブリドーマ法では、典型的には、ヒト化マウス（ヒト免疫系を持つマウス）、ハムスターまたは他の適当な宿主動物を免疫剤で免疫して、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生する、または同抗体を産生する能力を持つ、リンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。
【０６３２】
免疫剤は、典型的には、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質を含むだろう。一般に、ヒト由来の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球（「PBL」）を使用し、非ヒト哺乳類細胞源が望ましい場合には脾細胞またはリンパ節細胞を使用する。次に、適当な融合剤、例えばポリエチレングリコールなどを使って、リンパ球を不死化細胞株と融合することにより、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」（Academic Press,1986）の59〜103頁）。不死化細胞株は通常、形質転換哺乳類細胞、特に齧歯類、ウシおよびヒト由来の骨髄腫細胞である。通常はラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない不死化細胞の成長または生存を阻害する1つまたは複数の物質を含む適当な培養培地で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を持っていない場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、通例、HGPRT欠損細胞の成長を妨げる物質ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むだろう（「HAT培地」）。
【０６３３】
好ましい不死化細胞株は、効率よく融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支え、HAT培地などの培地に対して感受性を示すものである。より好ましい不死化細胞株は、例えばSalk Institute Cell Distribution Center（カリフォルニア州サンディエゴ）およびAmerican Type Culture Collection（バージニア州マナッサス）などから入手することができるネズミ骨髄腫株である。本明細書全体から推察されるように、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生用として記載されている（Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeurら「Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications」（Marcel Dekker,Inc.,ニューヨーク,1987）の51〜63頁）。
【０６３４】
次に、ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地を、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、またはラジオイムノアッセイ（RIA）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）などのインビトロ結合アッセイによって決定する。そのような技術は当技術分野では知られており、当業者であれば実施することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonおよびPollart,Anal.Biochem.,107:220(1980)のスキャッチャード解析などによって決定することができる。
【０６３５】
望ましいハイブリドーマ細胞を同定した後、それらのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的方法によって増殖させることができる（Goding,前掲）。この目的に適した培養培地には、例えばダルベッコ変法イーグル培地およびRPMI-1640などがある。あるいは、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物の体内で腹水としてインビボで増殖させてもよい。
【０６３６】
サブクローンが分泌するモノクローナル抗体は、通常の免疫グロブリン精製法、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなどによって、培養培地または腹水から単離または精製することができる。
【０６３７】
当技術分野には様々なモノクローナル抗体製造法が存在するので、本発明がハイブリドーマにおけるその製造だけに限定されないことは、当業者には理解されるだろう。例えば、モノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号に記載されているような組換えDNA法によって製造することができる。この場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ただ一つの真核、ファージ、または原核クローンに由来する抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、通常の方法を使って（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖またはヒト、ヒト化抗体源もしくは他の抗体源に由来するそのような鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を持つオリゴヌクレオチドプローブを使用することなどによって）、容易に単離し、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源として役立つ。DNAを単離したら、それを発現ベクターに入れ、次にその発現ベクターを、本来なら免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞に導入して、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成することができる。また例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を相同なネズミ配列の代わりに使用すること（米国特許第4,816,567号；Morrisonら,前掲）または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することなどによって、DNAを改変してもよい。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに使用するか、またはキメラ二価抗体を作製するために本発明抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに使用することができる。
【０６３８】
抗体は一価抗体であってよい。一価抗体の製造方法は当技術分野では周知である。例えばある方法では、免疫グロブリン軽鎖および改変重鎖を組換え発現させる。重鎖は一般に、Fc領域中の一点で、重鎖の架橋が起こらないように切断される。別法として、架橋が起こらないように、関係するシステイン残基を別のアミノ酸残基に置き換えるか、または欠失させる。
【０６３９】
インビトロ法も一価抗体の製造に適している。抗体の消化によるその断片、特にFab断片の製造は、当技術分野で知られる常法によって達成することができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え技術、およびファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組合わせを含む、当技術分野で知られる多種多様な技術を使って、製造することができる。例えばモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、例えばHarlowら「Antibodies: A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988）；Hammerlingら「Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas」（Elsevier,ニューヨーク,1981）の563〜681頁などに記載されている当技術分野で知られた技術などを使って製造することができる（前記の刊行物は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する）。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって製造される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、単一のクローン、例えば真核、原核またはファージクローンから得られる抗体を指す用語であり、それを製造する方法を指す用語ではない。
【０６４０】
ハイブリドーマ技術を使って特異抗体を作製しスクリーニングする方法は、当技術分野では日常的かつ周知の方法であり、本明細書では実施例で詳しく論じる。限定を目的としない例として、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプチドを発現させる細胞で、マウスを免疫することができる。免疫応答が検出されたら、例えば抗原に特異的な抗体がマウスの血清に検出されたら、そのマウスの脾臓を収集し、脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を、任意の適切な骨髄腫細胞、例えばATCCから入手することができる細胞株SP20由来の細胞に、周知の技術によって融合する。限界希釈法によってハイブリドーマを選択し、クローニングする。次に、当技術分野で知られる方法により、本発明のポリペプチドを結合する能力を持つ抗体を分泌する細胞に関して、ハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫することにより、一般に高レベルの抗体を含む腹水を産生させることができる。
【０６４１】
したがって本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞（このハイブリドーマは、好ましくは、本発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、次に、その融合の結果生じたハイブリドーマを、本発明のポリペプチドを結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに関してスクリーニングすることによって作製される）を培養することを含むモノクローナル抗体の製造方法、ならびにその方法によって製造された抗体を提供する。
【０６４２】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって作製することができる。例えば本発明のFabおよびF(ab')2断片は、パパイン（Fab断片を製造する場合）またはペプシン（F(ab')2断片を製造する場合）などの酵素による免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって製造することができる。F(ab')2断片は可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含む。
【０６４３】
例えば、本発明の抗体は、当技術分野で知られている種々のファージディスプレイ法を使って作製することができる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を持っているファージ粒子の表面に、それら機能的抗体ドメインをディスプレイする。具体的一態様として、そのようなファージを利用することにより、（例えばヒトまたはネズミの）レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリーから発現した抗原結合ドメインをディスプレイすることができる。興味ある抗原を結合する抗原結合ドメインを発現させるファージは、抗原を使って、例えば標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉した抗原などを利用して、選択または同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、fdおよびM13を含む繊維状ファージであり、結合ドメインは、Fab、Fvまたはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインがファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質に組換え的に融合された状態で、ファージから発現される。本発明の抗体を作製するために利用することができるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmanら,J.Immunol.Methods 182:41-50(1995)；Amesら,J.Immunol.Methods 184:177-186(1995)；Kettleboroughら,Eur.J.Immunol.24:952-958(1994)；Persicら,Gene 187 9-18(1997)；Burtonら,Advances in Immunology 57:191-280(1994)；PCT出願PCT/GB91/01134；PCT公開WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；および米国特許第5,698,426号；第5,223,409号；第5,403,484号；第5,580,717号；第5,427,908号；第5,750,753号；第5,821,047号；第5,571,698号；第5,427,908号；第5,516,637号；第5,780,225号；第5,658,727号；第5,733,743号および第5,969,108号などに開示されている方法が挙げられ、これらはそれぞれ参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。
【０６４４】
上記の文献に記載されているように、ファージ選択後は、例えば後に詳述するように、そのファージから抗体コード領域を単離し、それを使って、ヒト抗体を含む抗体全体または他の任意の望ましい抗原結合断片を作製し、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌などの任意の望ましい宿主で、それらを発現させることができる。例えば、PCT公開WO92/22324；Mullinaxら,BioTechniques 12(6):864-869(1992)；Sawaiら,AJRI 34:2634(1995)；およびBetterら,Science 240:1041-1043(1988)（これらは参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する）に開示されているような当技術分野で知られる方法を使って、Fab、Fab'およびF(ab')2断片を組換え生産するための技術を利用することもできる。一本鎖Fvおよび一本鎖抗体を製造するために利用することができる技術の例としては、米国特許第4,946,778号および第5,258,498号；Hustonら,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)；Shuら,PNAS 90:7995-7999(1993)；ならびにSkerraら,Science 240:1038-1040(1988)に記載の技術が挙げられる。
【０６４５】
ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含む一部の用途には、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用することが好ましいかもしれない。キメラ抗体は、例えばネズミモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを持つ抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来している分子である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野では知られている。例えば、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するMorrison,Science 229:1202(1985)；Oiら,BioTechniques 4:214(1986)；Gilliesら,(1989) J.Immunol.Methods 125:191-202；米国特許第5,807,715号；第4,816,567号；および第4,816,397号などを参照されたい。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを持つ、所望の抗原を結合する非ヒト種由来の抗体分子である。抗原結合性を改変（好ましくは改善）するために、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、しばしば、CDR供与抗体由来の対応残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えばCDRとフレームワーク残基との相互作用のモデリングによって抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定すること、および配列比較によって異常なフレームワーク残基を同定することなどによって同定される（例えば、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するQueenらの米国特許第5,585,089号およびRiechmannら,Nature 332:323(1988)を参照されたい）。抗体は、例えばCDR移植（EP239,400；PCT公開WO91/09967；米国特許第5,225,539号；第5,530,101号；および第5,585,089号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェイシング（resurfacing）（EP592,106；EP519,596；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnickaら,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguskaら,PNAS 91:969-973(1994)）、および鎖シャフリング（米国特許第5,565,332号）などを含む、当技術分野で知られる様々な技術を使って、ヒト化することができる。一般に、ヒト化抗体には、ヒト以外の由来を持つ1つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート(import)」残基と呼ばれ、通常は「インポート」可変ドメインから採用される。ヒト化は、基本的にWinterとその共同研究者らの方法（Jonesら,Nature,321:522-525(1986)；Riechmannら,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyenら,Science,239:1534-1536(1988)）に従って、齧歯類のCDRまたはCDR配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行なうことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、ヒト可変ドメイン全体よりもかなり少ない残基が、非ヒト種の対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第4,816,567号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のCDR残基と、場合によっては一部のFR残基とが、齧歯類抗体中の類似する部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
【０６４６】
一般に、ヒト化抗体は、CDR領域の全てまたは実質上全てが非ヒト免疫グロブリンの同領域に一致し、FR領域の全てまたは実質上全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の同領域である少なくとも1つ（典型的には2つの）可変ドメインの実質上全てを含むだろう。ヒト化抗体は、好ましくは、免疫グロブリン定常領域（Fc）（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部も含むだろう（Jonesら,Nature,321:522-525(1986)；Riechmannら,Nature 332:323-329(1988)；およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)）。
【０６４７】
ヒト患者の治療的処置には、完全にヒトの抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使った上述のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で知られる種々の方法によって作製することができる。米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；ならびにPCT公開WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735、およびWO91/10741も参照されたい。これらはそれぞれ参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。ヒトモノクローナル抗体の作製には、ColeらおよびBoerderらの技術も利用することができる（Coleら「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」Alan R. Riss,(1985)；およびBoernerら,J.Immunol.,147(1):86-95,(1991)）。
【０６４８】
ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現させる能力はないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させることができるトランスジェニックマウスを使って作製することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムに、または相同組換えによって、マウス胚幹細胞に導入することができる。別法として、ヒト可変領域、定常領域および多様領域（diversity region）を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子と共に、マウス胚幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖および/または軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入とは別に、またはそれと同時に、非機能的にすることができる。特に、JH領域のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生を妨げる。改変された胚幹細胞を増殖させ、胚盤胞に顕微注入することにより、キメラマウスを作出する。次に、キメラマウスを交配して、ヒト抗体を発現させるホモ接合型の子孫を作出する。そのトランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えば本発明ポリペプチドの全部または一部で、通常どおりに免疫する。その抗原に対するモノクローナル抗体は、免疫したトランスジェニックマウスから、通常のハイブリドーマ技術を使って取得することができる。トランスジェニックマウスが保有しているヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、B細胞分化中に再配列し、次いでクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、このような技術を使って、治療的に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を作製することができる。このヒト抗体製造技術の概要については、LonbergおよびHuszar,Int.Rev.Immunol.13:65-93(1995)を参照されたい。このヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体製造技術ならびにそのような抗体を製造するためのプロトコールに関する詳細な議論は、例えばPCT公開WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；欧州特許第0 598 877号；米国特許第5,413,923号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,569,825号；第5,661,016号；第5,545,806号；第5,814,318号；第5,885,793号；第5,916,771号；および第5,939,598号など（これらは参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する）を参照されたい。また、上記の技術と同様の技術を使って、選択した抗体に対するヒト抗体が提供されるように、Abgenix,Inc.（カリフォルニア州フリーモント）、Genpharm（カリフォルニア州サンホゼ）およびMedarex,Inc.（ニュージャージー州プリンストン）などの会社と契約することもできる。
【０６４９】
同様に、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に非働化されているトランスジェニック動物、例えばマウスに、ヒト免疫グロブリン座を導入することによって、ヒト抗体を作製することができる。抗原投与すると、遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーの生成を含むあらゆる点でヒトに見られるものと極めて類似したヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,106号、および以下の科学文献に記載されている：Marksら,Biotechnol.,10:779-783(1992)；Lonbergら,Nature 368:856-859(1994)；Fishwildら,Nature Biotechnol.,14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.,14:826(1996)；LonbergおよびHuszer,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)。
【０６５０】
選択したエピトープを認識する完全にヒトの抗体は、「誘導選択（guided selection）」と呼ばれる技術を使って作製することができる。このアプローチでは、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使って、同じエピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択を誘導する（Jespersら,Bio/technology 12:899-903(1988)）。
【０６５１】
さらに、当業者に周知の技術を使って、本発明のポリペプチドに対する抗体を利用して、本発明のポリペプチドを「模倣（mimic）」する抗イディオタイプ抗体を作製することもできる（例えばGreenspanおよびBona,FASEB J.7(5):437-444(1989)およびNissinoff,J.Immunol.147(8):2429-2438(1991)を参照されたい）。例えば、本発明ポリペプチドに結合し、その多量体化および/またはリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体を使用することにより、ポリペプチドの多量体化および/または結合ドメインを「模倣」し、その結果として、ポリペプチドおよび/またはそのリガンドに結合し、それらを中和する抗イディオタイプを生成させることができる。そのような中和抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのFab断片は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療措置に使用することができる。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明ポリペプチドを結合することおよび/またはそのリガンド/受容体を結合することによって、その生物学的活性を遮断するために使用することができる。
【０６５２】
本発明の抗体は二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル（好ましくはヒトまたはヒト化）抗体である。本発明では、結合特異性の一方を本発明のポリペプチドに対する特異性とし、他方を他の任意の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異抗原、ウイルス由来のタンパク質、ウイルスがコードするエンベロープタンパク質、細菌由来のタンパク質、または細菌表面タンパク質などに対する特異性とすることができる。
【０６５３】
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野では知られている。従来より、二重特異性抗体の組換え生産は、2対の免疫グロブリン重鎖/軽鎖の同時発現に基づいており、この場合、2つの重鎖は異なる特異性を持つ（MilsteinおよびCuello,Nature,305:537-539(1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせにより、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、潜在的に10種類の抗体分子の混合物を産生し、そのうちの1つだけが正しい二重特異性構造を持つ。正しい分子の精製は、通常は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる。同様の方法が、WO93/08829（1993年5月13日公開）およびTrauneckerら,EMBO J.,10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０６５４】
所望の結合特異性（抗体-抗原結合部位）を持つ抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。この融合は、ヒンジ、CH2、およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域との融合であることが好ましい。軽鎖結合に必要な部位を含む第1重鎖定常領域（CH1）が融合物の少なくとも1つに存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物をコードするDNAと、所望により、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAとを、別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時トランスフェクトする。二重特異性抗体の作製に関するさらなる詳細については、例えばSureshら,Methods in Enzymology 121:210(1986)を参照されたい。
【０６５５】
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明に包含される。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合された2つの抗体からなる。そのような抗体は、例えば望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングする目的で（米国特許第4,676,980号）、そしてまたHIV感染症を処置する目的で（WO91/00360；WO92/00373；EP03089）、提案されている。これらの抗体は、例えば架橋剤を使用する方法など、合成タンパク質化学の既知の方法を使って、試験管内で製造することができると考えられる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使って、またはチオエーテル結合の形成によって構築することができる。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオラートおよび4-メルカプトブチルイミド酸メチル、ならびに例えば米国特許第4,676,980号などに開示されているものが挙げられる。
【０６５６】
抗体をコードするポリヌクレオチド
さらに本発明は、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドおよびその断片も提供する。本発明は、例えば上に定義したようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件またはストリンジェンシーを下げたハイブリダイゼーション条件で、（好ましくは本発明のポリペプチドに特異的に結合する）抗体、好ましくは配列番号Yのアミノ酸配列を持つポリペプチドに結合する抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０６５７】
これらのポリヌクレオチドは、当技術分野で知られる任意の方法によって取得し、そのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列がわかっている場合は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを、化学合成オリゴヌクレオチドから（例えばKutmeierら,BioTechniques 17:242(1994)に記載されているように）組み立てることができる。簡単に述べると、この方法では、抗体をコードする配列の一部を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドを合成し、それらのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ライゲートした後、ライゲートしたオリゴヌクレオチドをPCRによって増幅する。
【０６５８】
別法として、抗体をコードするポリヌクレオチドを、適切な核酸源に由来する核酸から生成させてもよい。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンを入手することはできないが、その抗体分子の配列がわかっている場合は、その免疫グロブリンをコードする核酸を化学合成するか、または適切な核酸源（例えば抗体cDNAライブラリー、またはその抗体を発現させる組織もしくは細胞、例えば本発明の抗体を発現させるように選択されたハイブリドーマ細胞などから作製されたcDNAライブラリー、またはそのような組織もしくは細胞から単離された核酸、好ましくはポリA+ RNA）から、その配列の3'および5'末端にハイブリダイズできる合成プライマーを使ったPCR増幅によって、またはその遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使ったクローニングを行なって、例えばその抗体をコードするcDNAクローンをcDNAライブラリーから同定することによって、取得することができる。その場合は、PCRによって生成した増幅された核酸を、当技術分野で周知の方法を使って、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０６５９】
抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されたら、当技術分野で周知のヌクレオチド配列操作方法、例えば組換えDNA技術、部位指定突然変異誘発、PCRなど（例えばSambrookら「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」（第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー,1990）およびAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons,ニューヨーク,1998）などに記載の技術を参照されたい）を使って抗体のヌクレオチド配列を操作することにより、異なるアミノ酸配列を持つ抗体を作製して、例えばアミノ酸の置換、欠失、および/または挿入を生じさせることができる。
【０６６０】
具体的一態様として、当技術分野で周知の方法により、例えば他の重鎖および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較して、配列超可変の領域を決定することにより、重鎖および/または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を検査して、相補性決定領域（CDR）の配列を同定することができる。定型的な組換えDNA技術を使って、1つまたは複数のCDRをフレームワーク領域内、例えばヒトフレームワーク領域に挿入して、上述のように非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は天然のまたはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域であってよい（ヒトフレームワーク領域のリストについては例えばChothiaら,J.Mol.Biol.278:457-479(1998)などを参照されたい）。フレームワーク領域とCDRの組合わせによって作製されたポリヌクレオチドは、好ましくは、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上述したように、1つまたは複数のアミノ酸置換をフレームワーク領域内に施すことができ、それらのアミノ酸置換は、好ましくは、抗体のその抗原に対する結合を改善する。また、そのような方法を使って、鎖間ジスルフィド結合に参加する1つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を施すことにより、1つまたは複数の鎖間ジスルフィド結合を持たない抗体分子を作製することもできる。ポリヌクレオチドに対する他の改変も技術上可能であり、本発明に包含される。
【０６６１】
また、適当な抗原特異性を持つマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物学的活性を持つヒト抗体分子由来の遺伝子と接合することによってキメラ抗体を製造するために開発された技術（Morrisonら,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:851-855(1984)；Neubergerら,Nature 312:604-608(1984)；Takedaら,Nature 314:452-454(1985)）も使用することができる。上述したように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来している分子、例えばネズミmAbに由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有するもの、例えばヒト化抗体である。
【０６６２】
あるいは、一本鎖抗体の製造に関して記載された技術（米国特許第4,946,778号；Bird,Science 242:423-42(1988)；Hustonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；およびWardら,Nature 334:544-54(1989)）を適合させて一本鎖抗体を製造することもできる。一本鎖抗体は、Fv領域の重鎖断片と軽鎖断片とをアミノ酸架橋によって連結して一本鎖ポリペプチドとすることによって形成される。大腸菌中で機能的Fv断片をアセンブルする技術も使用することができる（Skerraら,Science 242:1038-1041(1988)）。
【０６６３】
抗体製造法
本発明の抗体は、当技術分野で知られる任意の抗体合成法によって、特に、化学合成による方法か、好ましくは組換え発現技術による方法によって、製造することができる。
【０６６４】
本発明の抗体またはその断片、誘導体もしくは類似体（例えば本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の一本鎖抗体）の組換え発現には、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築する必要がある。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその一部（好ましくは重鎖または軽鎖可変ドメインを含むもの）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、組換えDNA法により、当技術分野で周知の技術を使って、抗体分子製造用のベクターを作製することができる。したがって本明細書には、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を製造する方法を記載する。抗体をコードする配列と適当な転写および翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターは、当業者に周知の方法を使って構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えなどが含まれる。したがって本発明は、プロモーターに作動可能な形で連結された本発明の抗体分子またはその重鎖もしくは軽鎖または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく（例えばPCT公開WO86/05807、PCT公開WO89/01036；および米国特許第5,122,464号を参照されたい）、重鎖または軽鎖全体を発現させるために、そのようなベクターに抗体の可変ドメインをクローニングしてもよい。
【０６６５】
発現ベクターを通常の技術によって宿主細胞に導入した後、トランスフェクトされた細胞を通常の技術で培養することにより、本発明の抗体を産生させる。したがって本発明は、異種プロモーターに作動可能な形で連結された本発明の抗体またはその重鎖もしくは軽鎖または本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現に関する好ましい態様として、後に詳述するように、重鎖および軽鎖をコードするベクターを宿主細胞中で同時発現させて、免疫グロブリン分子全体を発現させることができる。
【０６６６】
本発明の抗体分子を発現させるには、種々の宿主-発現ベクター系を利用することができる。そのような宿主-発現系は、興味あるコード配列を作製し、次いでそれを精製するために使用することができる媒体を表すが、さらに、適当なヌクレオチド配列で形質転換またはトランスフェクトされると、本発明の抗体分子をインサイチューで発現させうる細胞も表す。これらには、微生物、例えば抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌、枯草菌）；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセス、ピキア）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV；タバコモザイクウイルスTMV）に感染させた植物細胞系、もしくは抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを保有する哺乳類細胞系（例えばCOS、CHO、BHK、293、3T3細胞）などが含まれるが、これらに限るわけではない。組換え抗体分子の発現には、好ましくは大腸菌などの細菌細胞、より好ましくは真核細胞（特に組換え抗体分子全体を発現させる場合）を使用する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）などの哺乳類細胞を、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中初期（intermediate early）遺伝子プロモーター配列などのベクターと組み合わせると、有効な抗体用発現系になる（Foeckingら,Gene 45:101(1986)；Cockettら,Bio/Technology 8:2(1990)）。
【０６６７】
細菌系では、発現させる抗体分子の予定している用途に応じて、数多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を製造するために、そのようなタンパク質を大量に製造すべき場合は、精製が容易な高レベルの融合タンパク質産物を発現させるベクターが望ましいだろう。そのようなベクターには、例えば、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列をlacZコード領域と同じ読み枠でベクターに個別にライゲートすることができる大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら,EMBO J.2:1791(1983)）、pINベクター（InouyeおよびInouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985)；Van HeekeおよびSchuster,J.Biol.Chem.,24:5503-5509(1989)）などがあるが、これらに限るわけではない。pGEXベクターを使用して、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させることもできる。一般にこのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズへの吸着および結合と、それに続く遊離グルタチオン存在下での溶離によって、容易に精製することができる。pGEXベクターはトロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されているので、目的とするクローン化ポリペプチドをGST部分から遊離させることができる。
【０６６８】
昆虫系では、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）を使用することができる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中で生育する。抗体コード配列をこのウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中に個別にクローニングして、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０６６９】
哺乳類宿主細胞では、ウイルスに基づく数多くの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、興味ある抗体コード配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複合体（例えば後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列）にライゲートすることができる。次に、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えばE1またはE3領域）への挿入により、感染した宿主中で抗体を発現させることができる生存可能な組換えウイルスが生成することになる（例えばLoganおよびShenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355-359(1984)を参照されたい）。挿入した抗体コード配列の効率のよい翻訳には、明確な開始シグナルが必要かもしれない。これらのシグナルにはATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに開始コドンは、インサート全体が確実に翻訳されるように、所望のコード配列の読み枠と位相が一致していなければならない。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは様々な起源を持つことができ、天然由来であっても、合成物であってもよい。発現効率は、適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることによって向上させることができる（Bittnerら,Methods in Enzymol.153:51-544(1987)参照）。
【０６７０】
さらに、挿入された配列の発現を特定の望ましい形で調整する宿主細胞株、または遺伝子産物を特定の望ましい形で修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することもできる。そのようなタンパク質産物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能にとって重要であるかもしれない。宿主細胞はタンパク質の翻訳後プロセシングおよび翻訳後修飾に関してそれぞれに特徴的で特異的な機構を持っている。発現された外来タンパク質が確実に正しく修飾およびプロセシングされるように、適当な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的を達成するために、1次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳類宿主細胞には、例えばCHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、WI38、また特に、例えばBT483、Hs578T、HTB2、BT20およびT47Dなどの乳癌細胞株、ならびに例えばCRL7030およびHs578Bstなどの正常乳腺細胞株などがあるが、これらに限るわけではない。
【０６７１】
組換えタンパク質の長期高収量生産には、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現させる細胞株を作出することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用する代わりに、適当な発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるDNAおよび選択可能マーカーで、宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入後に、操作された細胞を栄養強化培地で1〜2日間生育させてもよく、次いで、選択培地に交換する。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは選択に対する耐性を付与して、細胞がプラスミドをその染色体中に安定に組み込んで増殖巣を形成するまで成長することを可能にする。次に、それらを細胞株にクローニングして、増殖させることができる。この方法は、抗体分子を発現させる細胞株の作製に、有利に利用することができる。そのような操作された細胞株は、抗体分子と直接または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価に、とりわけ役立ちうる。
【０６７２】
数多くの選択系を使用することができる。例えば、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ活性（Wiglerら,Cell 11:223(1977)）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskaおよびSzybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992)）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら,Cell 22:817(1980)）遺伝子を、それぞれtk−、hgprt−またはaprt−細胞で使用することができるが、これらに限るわけではない。また、拮抗代謝物質耐性を、以下の遺伝子に関する選択の根拠として使用することもできる：メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら,Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980)；O'Hareら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981)）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（MulliganおよびBerg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981)）；アミノグリコシドG-418に対する耐性を付与するneo（Clinical Pharmacy 12:488-505；WuおよびWu,Biotherapy 3:87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan,Science 260:926-932(1993)；MorganおよびAnderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993)；May,TIB TECH 11(5):155-215(1993)）；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerreら,Gene 30:147(1984)）。所望する組換えクローンの選択には、組換えDNA技術の技術分野で広く知られている方法をルーチン的に応用することができ、そのような方法は、例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons,ニューヨーク,1993）；Kriegler「Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual」（Stockton Press,ニューヨーク,1990）；Dracopoliら編「Current Protocols in Human Genetics」（John Wiley & Sons,ニューヨーク,1994)）の第12および13章；Colberre-Garapinら,J.Mol.Biol.150:1(1981)などに記載されている。
【０６７３】
抗体分子の発現レベルはベクター増幅によって増加させることができる（概要については、「DNA cloning」Vol.3（Academic Press,ニューヨーク,1987）のBebbingtonおよびHentschel著「哺乳類細胞でクローン化遺伝子を発現させるための遺伝子増幅に基づくベクターの使用（The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells」を参照されたい）。抗体を発現させるベクター系中のマーカーが増幅可能である場合は、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数が増加することになる。増幅される領域は抗体遺伝子と関係するので、抗体の産生量も増加するだろう（Crouseら,Mol.Cell.Biol.3:257(1983)）。
【０６７４】
宿主細胞には、一方のベクターが重鎖由来ポリペプチドをコードし、他方のベクターが軽鎖由来ポリペプチドをコードする2つの本発明発現ベクターを、同時にトランスフェクトしてもよい。これら2つのベクターには、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの発現量が等しくなるように、同じ選択可能マーカーを含めることができる。別法として、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、それらを発現させる能力を持つ単一のベクターを使用することもできる。そのような場合は、有毒な遊離の重鎖が過剰にならないように、軽鎖を重鎖の前に置くべきである（Proudfoot,Nature 322:52(1986)；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197(1980)）。重鎖および軽鎖のコード配列はcDNAまたはゲノムDNAを含んでよい。
【０６７５】
本発明の抗体分子が動物によって産生されるか、化学合成されるか、または組換え発現されたら、それを、当技術分野で知られる任意の免疫グロブリン分子精製法によって、例えばクロマトグラフィー（例：イオン交換、アフィニティー、特にプロテインA後の特定抗原用アフィニティー、およびサイズ分画カラムクロマトグラフィーなど）、遠心分離、溶解度差によって、または他の任意の標準的なタンパク質精製技術によって、精製することができる。さらに、精製が容易になるように、本発明の抗体またはその断片を、本明細書に記載するまたは当技術分野で知られる他の異種ポリペプチド配列に融合することもできる。
【０６７６】
本発明は、本発明のポリペプチド（またはその一部、好ましくは本ポリペプチドの10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100アミノ酸）に組換え的に融合または化学的に結合（共有結合と非共有結合の両方を含む）されて融合タンパク質を形成している抗体を包含する。融合は必ずしも直接的融合である必要はなく、リンカー配列を介した融合であってもよい。抗体は本発明のポリペプチド（またはその一部、好ましくは本ポリペプチドの10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100アミノ酸）以外の抗原に特異的であってもよい。例えば、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に本発明のポリペプチドを融合または結合することによってインビトロまたはインビボで本発明のポリペプチドを特定の細胞タイプにターゲティングするために、抗体を使用することができる。本発明のポリペプチドに融合または結合した抗体を、当技術分野で知られる方法を使ったインビトロイムノアッセイおよび精製方法に使用してもよい。例えば、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するHarborら（前掲）およびPCT公開WO93/21232；EP439,095；Naramuraら,Immunol.Lett.39:91-99(1994)；米国特許第5,474,981号；Gilliesら,PNAS 89:1428-1432(1992)；Fellら,J.Immunol.146:2446-2452(1991)などを参照されたい。
【０６７７】
さらに本発明は、可変領域以外の抗体ドメインに融合または結合された本発明のポリペプチドを含む組成物を包含する。例えば、抗体Fcドメインまたはその一部に、本発明のポリペプチドを融合または結合することができる。本発明のポリペプチドに融合される抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメイン、およびCH3ドメイン、またはドメイン全体もしくはその一部の任意の組合わせを含んでよい。本ポリペプチドを上記の抗体部分に融合または結合させて、多量体を形成させてもよい。例えば、本発明のポリペプチドに融合したFc部分は、Fc部分間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。ポリペプチドをIgAおよびIgMの一部に融合することにより、さらに高度な多量体型を作製することができる。抗体部分に本発明のポリペプチドを融合または結合する方法は、当技術分野では知られている。例えば米国特許第5,336,603号；第5,622,929号；第5,359,046号；第5,349,053号；第5,447,851号；第5,112,946号；EP307,434；EP367,166；PCT公開WO96/04388；WO91/06570；Ashkenaziら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535-10539(1991)；Zhengら,J.Immunol.154:5590-5600(1995)；およびVilら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11337-11341(1992)を参照されたい（これらは、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する）。
【０６７８】
上述のように、配列番号Yのポリペプチド、ポリペプチド断片、または変異体に相当するポリペプチドは、そのポリペプチドの生体内半減期を延長するために、または当技術分野で知られる方法を使ったイムノアッセイで使用するために、上記抗体部分に融合または結合することができる。さらに、配列番号Yに相当するポリペプチドは、精製を容易にするために、上記抗体部分に融合または結合することもできる。報告例の一つに、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインと、哺乳類免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の様々なドメインとからなるキメラタンパク質が記載されている（EP394,827；Trauneckerら,Nature 331:84-86(1988)）。また、（IgGにより）ジスルフィド結合した二量体構造を持つ抗体に融合または結合された本発明のポリペプチドは、単量体型の分泌タンパク質またはタンパク質断片単独よりも効率よく、他の分子を結合および中和するかもしれない（Fountoulakisら,J.Biochem.270:3958-3964(1995)）。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は治療および診断に有益であり、例えば薬物動態学的性質の改善をもたらすことができる（EP A 232,262）。また、融合タンパク質を発現させ、検出し、精製した後に、Fc部分を削除することが望ましい場合もあるだろう。例えば、融合タンパク質を免疫化の抗原として使用する場合には、Fc部分が治療および診断を妨げるかもしれない。例えば創薬では、hIL-5のアンタゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイを目的として、hIL-5などのヒトタンパク質がFc部分と融合されている（Bennettら,J.Molecular Recognition 8:52-58(1995)；Johansonら,J.Biol.Chem.,270:9459-9471(1995)）。
【０６７９】
さらに、本発明の抗体またはその断片は、マーカー配列、例えば精製を容易にするためのペプチドなどに融合することもできる。好ましい態様では、マーカーアミノ酸配列が、ヘキサヒスチジンペプチドである。これは、pQEベクター（QIAGEN,Inc.,カリフォルニア州91311チャッツワース・イートンアベニュー9259）をはじめとするベクター（その多くは市販されている）に用意されているタグである。例えばGentzら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)に記載されているように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の精製を便利にするものである。精製に役立つ他のペプチドタグには、例えば、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する「HA」タグ（Wilsonら,Cell 37:767(1984)）や、「flag」タグがあるが、これらに限るわけではない。
【０６８０】
さらに本発明は、診断薬または治療薬に結合した抗体またはその断片も包含する。抗体は、例えばある処置方法の効力を決定するための臨床試験の一部として腫瘍の発生または進行をモニターするなどの目的で、診断的に使用することができる。抗体を検出可能な物質にカップリングすることにより、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子断層撮影法を用いる陽電子放出金属、非放射性常磁性金属イオンなどが挙げられる。検出可能な物質は、当技術分野で知られている技術を用いて、抗体（またはその断片）に直接的に、または中間体（例えば当技術分野で知られているリンカーなど）を介して間接的にカップリングまたは結合することができる。例えば、本発明に従って診断薬として使用される抗体に結合させることができる金属イオンについては、米国特許第4,741,900号などを参照されたい。適切な酵素の例としてはセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の例としてはストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィロエリトリンが挙げられ、発光物質の例としてはルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、適切な放射性物質の例としては、125I、131I、111In、または99Tcなどが挙げられる。
【０６８１】
さらに、抗体またはその断片を、細胞毒（例えば細胞増殖抑制剤または殺細胞剤）、治療薬、または放射性金属イオン、例えば213Biなどのアルファ放射体などの治療成分に結合してもよい。細胞毒または細胞毒性剤には、細胞にとって有害な任意の薬剤が包含される。例としては、パクリタキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ならびにピューロマイシンおよびその類似体もしくはホモログが挙げられる。治療薬には、例えば代謝拮抗物質（例えばメトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロルエタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）およびロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロロマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシス-ジクロロジアミン白金（II)（DDP）、シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（かつてはダウノマイシンと呼ばれていた）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（かつてはアクチノマイシンと呼ばれていた）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（AMC））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）などが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０６８２】
本発明のコンジュゲートは、与えられた生物学的応答を改変するために使用することができ、治療薬または薬物部分は古典的な化学療法剤に限定されると解釈すべきではない。例えば、薬物部分は、望ましい生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質としては、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えばTNF-アルファ、TNF-ベータ、AIM I（国際公開第97/33899号参照）、AIM II（国際公開第97/34911号参照）、Fasリガンド（Takahashiら,Int.Immunol.,6:1567-1574(1994)）、VEGI（国際公開第99/23105号参照）、血栓剤（thrombotic agent）または抗血管新生剤、例えばアンギオスタチンまたはエンドスタチンなどのタンパク質；または生物学的応答調整剤、例えばリンフォカイン、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）、もしくは他の成長因子などを挙げることができる。
【０６８３】
抗体は固形支持体に結合してもよく、これらは標的抗原のイムノアッセイまたは精製にはとりわけ有用である。そのような固形支持体には、例えばガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０６８４】
そのような治療成分を抗体に結合する技術は周知である。例えばReisfeldら編「Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy」（Alan R.Liss,Inc.,1985）の243〜56頁、Arnonら著「癌治療における薬物の免疫ターゲティングのためのモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy）」；Robinsonら編「Controlled Drug Delivery」（第2版,Marcel Dekker,Inc.,1987）の623〜53頁、Hellstromら著「薬物送達のための抗体（Antibodies For Drug Delivery）」；Pincheraら編「Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinical Applications」（1985）の475〜506頁、Thorpe著「癌治療における細胞毒性剤の抗体担体：概説（Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review）」；Baldwinら編「Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy」（Academic Press,1985）の303〜16頁、「癌治療における放射性標識抗体の治療的使用の解析、結果および将来の展望（Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」；ならびにThorpeら,「抗体-毒素コンジュゲートの製造および細胞障害特性（The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates）」,Immunol.Rev.62:119-58(1982)などを参照されたい。
【０６８５】
あるいは、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する米国特許第4,676,980号にSegalが記載しているように、抗体を第2の抗体に結合して、抗体ヘテロコンジュゲートを形成させることもできる。
【０６８６】
単独で、または細胞毒性因子および/またはサイトカインと組み合わせて投与される抗体は、治療成分が結合されているものも、治療成分が結合されていないものも、治療薬として使用することができる。
【０６８７】
本発明のポリペプチドに対する抗体の用途
本発明の抗体は様々な実用性を持っている。例えばそのような抗体は、試料中の本発明ポリペプチドの存在を検出するかまたは定量するための診断アッセイに使用することができる。そのような診断アッセイには、少なくとも2つの工程が含まれるだろう。第1に、試料を抗体にさらす。この場合、試料は、組織（例えばヒト、動物などの組織）、生物学的液体（例えば血液、尿、喀痰、精液、羊水、唾液など）、生物学的抽出物（例えば組織または細胞ホモジネートなど）、タンパク質ミニチップ（例えばArenkov P.ら,Anal Biochem.,278(2):123-131(2000)などを参照されたい）、またはクロマトグラフィーカラムなどである。そして第2工程では、基質に結合した抗体の定量を行なう。あるいは、本方法はさらに、抗体を固形支持体に共有結合的に、また静電気的に、または可逆的に結合させる第1工程と、結合させた抗体を、上に定義し本明細書の他の項で定義する試料にさらす第2工程とを含んでもよい。
【０６８８】
当技術分野では、例えば不均一相または均一相で実施される競合結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどといった、種々の診断アッセイ技術が知られている（Zola「Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques」（CRC Press,Inc.,1987)のl47〜158頁）。診断アッセイに使用される抗体は、検出可能部分で標識することができる。検出可能部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する能力を持つべきである。例えば、検出可能部分は、2H、14C、32P、もしくは125Iなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリンなどの蛍光または化学発光化合物、またはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、もしくはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素であることができる。抗体を検出可能部分に結合する方法であって当技術分野で知られているものは、Hunterら,Nature,144:945(1962)；Dafvidら,Biochem.,13:1014(1974)；Painら,J.Immunol.Metho.,40:219(1981)；およびNygren,J.Histochem.And Cytochem.,30:407(1982)に記載されている方法を含めて、どれを使用してもよい。
【０６８９】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、そのようなポリペプチドを組換え細胞培養または天然供給源からアフィニティー精製するのに役立つ。この方法では、当技術分野で周知の方法を使って、特定のポリペプチドに対する抗体を、適当な支持体、例えばセファデックス樹脂または濾紙などに固定化する。次に、固定化された抗体を、精製しようとするポリペプチドを含む試料と接触させ、次いで、固定化された抗体に結合している所望のポリペプチド以外の、試料中に存在する実質上全ての物質を除去するのに適した溶媒で、支持体を洗浄する。最後に、所望のポリペプチドを抗体から遊離させるのに適した別の溶媒で、支持体を洗浄する。
【０６９０】
イムノフェノタイピング
本発明の抗体は、細胞株および生物学的試料のイムノフェノタイピングに利用することができる。本発明の遺伝子の翻訳産物は細胞特異的マーカーとして、さらに具体的には、特定の細胞タイプの様々な分化段階および/または成熟段階で差次的に発現される細胞マーカーとして、役立つかもしれない。特定エピトープまたはエピトープの組合わせに対するモノクローナル抗体は、マーカーを発現させる細胞集団のスクリーニングを可能にするだろう。モノクローナル抗体を使って、様々な技術を利用することにより、マーカーを発現させる細胞集団のスクリーニングを行なうことができ、そのような技術としては、抗体被覆磁気ビーズを使った磁気分離、固形マトリックス（すなわちプレート）に結合した抗体による「パンニング」、およびフローサイトメトリーなどが挙げられる（例えば米国特許第5,985,660号；およびMorrisonら,Cell,96:737-49(1999)を参照されたい）。
【０６９１】
これらの技術により、特定の細胞集団のスクリーニング、例えば血液悪性腫瘍に付随して見いだされるかもしれない細胞集団（すなわち急性白血病患者における微小残存病変（MRD））のスクリーニング、および移植片対宿主疾患（GVHD）を予防するための、移植における「非自己」細胞のスクリーニングなどが可能になる。あるいは、これらの技術により、ヒト臍帯血に見いだされるかもしれないような、増殖および/または分化を起こす能力を持つ造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングも可能になる。
【０６９２】
抗体結合に関するアッセイ
本発明の抗体は、当技術分野で知られる任意の方法により、免疫特異的結合についてアッセイすることができる。使用することができるイムノアッセイとして、例えばウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイ、その他の技術を使った競合アッセイおよび非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限るわけではない。そのようなアッセイはルーチンであり、当技術分野ではよく知られている（例えば、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,ニューヨーク,1994）などを参照されたい）。代表的なイムノアッセイを以下に簡単に説明する（ただしこれらは限定を目的とする説明ではない）。
【０６９３】
免疫沈降プロトコールでは、一般に、細胞集団を溶解バッファー中、例えばプロテインホスファターゼおよび/またはプロテアーゼ阻害剤（例えばEDTA、PMSF、アプロチニン、バナジン酸ナトリウムなど）を添加したRIPAバッファー（1％NP-40またはトリトンX-100、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2、1％トラジロール）中で溶解し、興味ある抗体を細胞溶解液に添加し、一定時間（例えば1〜4時間）4℃でインキュベートし、プロテインAおよび/またはプロテインGセファロースビーズを細胞溶解液に添加し、約1時間以上4℃でインキュベートし、ビーズを溶解バッファーで洗浄し、ビーズをSDS/試料バッファーに再懸濁する。特定の抗原を免疫沈降させる興味ある抗体の能力は、例えばウェスタンブロット解析によって評価することができる。抗体の結合が増加しバックグラウンドが減少するように調整することができるパラメータ（例えばセファローズビーズによる細胞溶解液の予備清澄化など）については、当業者はよく知っているだろう。免疫沈降プロトコールに関するさらなる説明については、例えばAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,ニューヨーク,1994）の10.16.1などを参照されたい。
【０６９４】
ウェスタンブロット解析では、一般に、タンパク質試料を調製し、そのタンパク質試料をポリアクリルアミドゲル（例えば抗原の分子量に応じて8％〜20％SDS-PAGE）で電気泳動し、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDFまたはナイロンなどのメンブレンに転写し、そのメンブレンをブロッキング溶液（例えば3％BSAまたは脱脂乳を添加したPBS）でブロックし、洗浄バッファー（例えばPBS-Tween 20）でメンブレンを洗浄し、ブロッキングバッファーに希釈した一次抗体（興味ある抗体）でメンブレンをブロックし、洗浄バッファーでメンブレンを洗浄し、酵素基質（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば32Pまたは125I）に結合した二次抗体（一次抗体を認識するもの、例えば抗ヒト抗体）をブロッキングバッファーに希釈したものでメンブレンをブロックし、洗浄バッファーでメンブレンを洗浄し、抗原の存在を検出する。検出されるシグナルが増加しバックグラウンドノイズが低下するように調整することができるパラメータについては、当業者はよく知っているだろう。ウェスタンブロットプロトコールに関するさらなる説明は、例えばAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,ニューヨーク,1994）の10.8.1などを参照されたい。
【０６９５】
ELISAでは、抗原を調製し、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングし、酵素基質（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）など検出可能な化合物に結合した興味ある抗体をウェルに加えて一定時間インキュベートし、抗原の存在を検出する。ELISAでは、興味ある抗体を検出可能な化合物に結合する必要があるわけではなく、そうする代わりに、検出可能な化合物に結合した二次抗体（興味ある抗体を認識するもの）をウェルに加えてもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合は、コーティングされたウェルに興味ある抗原を添加した後に、検出可能な化合物に結合した二次抗体を加えることができる。検出されるシグナルが増加するように調整することができるパラメータならびに当技術分野で知られるELISAの他の変法については、当業者はよく知っているだろう。ELISAに関するさらなる説明は、例えばAusubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,ニューヨーク,1994）の11.2.1などを参照されたい。
【０６９６】
抗原に対する抗体の結合親和性および抗体-抗原相互作用の解離速度（off-rate）は、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの一例は、標識した抗原（例えば3Hまたは125I）を興味ある抗体と共に、増加する一連の量の非標識抗原の存在下でインキュベートするラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する興味ある抗体の親和性と結合解離速度は、スキャッチャードプロット解析により、データから決定することができる。第二の抗体との競合も、ラジオイムノアッセイを使って決定することができる。この場合は、抗原を、標識した化合物（例えば3Hまたは125I）に結合した興味ある抗体と共に、増加する一連の量の非標識第二抗体の存在下でインキュベートする。
【０６９７】
抗体の治療的用途
本発明はさらに、開示する疾患、障害、または状態の1つまたは複数を処置するために本発明の抗体を動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトの患者に投与することを含む、抗体に基づく治療法に向けられる。本発明の治療化合物としては、例えば本発明の抗体（本明細書に記載するその断片、類似体および誘導体を含む）および本発明の抗体をコードする核酸（本明細書に記載するその断片、類似体および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限るわけではない。本発明の抗体は、本発明ポリペプチドの異常な発現および/または活性に関係する疾患、障害または状態（本明細書に記載する疾患、障害または状態のいずれか1つまたは複数を含むが、これらに限らない）の処置、抑制または予防に使用することができる。本発明ポリペプチドの異常な発現および/または活性に関係する疾患、障害または状態の処置および/または予防には、例えばそれらの疾患、障害または状態に関係する症状の軽減を包含するが、これに限るわけではない。本発明の抗体は、当技術分野で知られているまたは本明細書に記載する医薬的に許容できる組成物に入った状態で提供することができる。
【０６９８】
本発明の抗体を治療的に使用する方法を要約すると、体内で局所的にまたは全身的に本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合すること、または例えば補体によって（CDC）もしくはエフェクター細胞によって（ADCC）媒介される抗体の直接的細胞毒性による方法が挙げられる。これらのアプローチのいくつかについては、以下にさらに詳細に説明する。本明細書が教示する内容を利用すれば、当業者は、甚だしい実験を行なわずに、本発明の抗体を診断、モニタリングまたは治療目的に使用する方法を知ることになる。
【０６９９】
本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体と組み合わせて、あるいは例えば抗体と相互作用するエフェクター細胞の数またはその活性を増加させる働きをするリンホカインまたは造血成長因子（例えばIL-2、IL-3およびIL-7など）と組み合わせて、有利に利用することができる。
【０７００】
本発明の抗体は単独で投与してもよいし、他の種類の処置（例えば放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法および抗腫瘍剤）と組み合わせて投与してもよい。一般に、患者と同じ種に由来する産物または患者と同じ種類の種反応性（抗体の場合）を持つ産物を投与することが好ましい。したがって好ましい一態様として、ヒト抗体、断片、誘導体、類似体または核酸を、治療または予防のためのヒト患者に投与する。
【０７０１】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片を含む）に関するイムノアッセイにも、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片を含む）に関係する障害の治療にも、親和性が高くかつ/またはインビボで強力な阻害および/または中和作用を持つ抗体を使用することが好ましい。そのような抗体、断片または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片を含む）に対して親和性を持つ。好ましい結合親和性としては、解離定数すなわちKdが、5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、および10-15M未満であるものが挙げられる。
【０７０２】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、動物におけるアレルギー反応の阻害に役立つ。例えば、治療的に許容できる量の1つまたは複数の本発明の抗体、もしくは本抗体のカクテルを投与するか、またはそれらを様々な供給源から得た他の抗体と組み合わせて投与することにより、動物は抗原に対してアレルギー反応を誘発しなくなるかもしれない。
【０７０３】
また、ある生物の体内でアレルギーおよび/または免疫応答を誘発する潜在能力を持つ本発明のポリぺプチドに対する抗体をコードする遺伝子をクローニングし、その抗体遺伝子が発現されるように、その抗体遺伝子でその生物を（例えば構成的に、または誘導的に）形質転換することも考えられる。このようにして、その生物は、免疫/アレルギー反応性ポリペプチドの摂取または存在に起因するアレルギー反応に対して、効果的に抵抗性を持つようになるだろう。さらに、そのような本発明抗体の使用は、自己免疫疾患および/または障害の予防および/または改善にとりわけ有効であるかもしれない。というのも、そのような状態は、典型的には、抗体が内因性タンパク質に対して向けられる結果だからである。例えば、本発明のポリペプチドが自己抗原に対する免疫応答の調整を担っている場合は、本明細書に開示するプロモーターまたは当技術分野で知られる他のプロモーターのいずれかと、本発明のポリペプチドに対する抗体をコードするポリヌクレオチドとを含むコンストラクトで、その生物および/または個体を形質転換することにより、その生物が自己抗原に対する免疫応答を誘発するのを効果的に阻害することができるだろう。本発明の治療および/または遺伝子療法への応用については、本明細書に項を改めて詳細に説明する。
【０７０４】
別法として、本発明の抗体を植物で産生させ（例えば本発明のポリペプチドに対する抗体の遺伝子をクローニングし、植物体での前記抗体の構成的発現に適した、前記遺伝子を含むベクターで植物を形質転換する）、次に、その植物を動物に摂取させることにより、前記抗体が標的とする特定の抗原に対する一時的免疫をその動物に付与することもできるだろう（例えば米国特許第5,914,123号および第6,034,298号）。
【０７０５】
もう一つの態様として、本発明の抗体、好ましくはポリクローナル抗体、より好ましくはモノクローナル抗体、最も好ましくは一本鎖抗体を、ヒト、哺乳動物および/または他の生物における1つまたは複数の特定遺伝子の遺伝子発現を阻害する手段として使用することができる。例えばDow Agrosciences LLCの国際公開第00/05391号（公開日2/3/00）を参照されたい。本発明の抗体へのこのような方法の応用は当技術分野では知られており、本明細書の他の項でさらに詳しく説明する。
【０７０６】
さらにもう一つの態様として、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを多量体化するのにも役立つだろう。例えば、ある種のタンパク質は、多量体状態になると、生物学的活性が増加することがある（すなわち、当該タンパク質の有効濃度が増加して、局所的により多くのタンパク質を利用できるようになるために、そのような活性の増加が起こるのだろう）。
【０７０７】
抗体に基づく遺伝子治療
具体的一態様として、本発明ポリペプチドの異常な発現および/または活性と関係する疾患または障害を遺伝子治療によって処置、抑制または予防するために、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸を投与する。遺伝子治療とは、発現された核酸または発現可能な核酸の対象への投与によって行なわれる治療法を指す。本発明のこの態様では、核酸は、それらがコードしている治療効果を媒介するタンパク質を産生する。
【０７０８】
当技術分野で利用することができる遺伝子治療の方法はいずれも本発明に従って使用することができる。代表的方法を以下に説明する。
【０７０９】
遺伝子治療の一般概論については、Goldspielら,Clinical Pharmacy 12:488-505(1993)；WuおよびWu,Biotherapy 3:87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan,Science 260:926-932(1993)；ならびにMorganおよびAnderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993)；May,TIBTECH 11(5):155-215(1993)を参照されたい。組換えDNA技術の分野で広く知られている、使用することが可能な方法は、Ausubelら編「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons,ニューヨーク,1993）およびKriegler「Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual」（Stockton Press,ニューヨーク,1990）に記載されている。
【０７１０】
好ましい一側面として、本化合物は、抗体をコードする核酸配列を含み、当該核酸配列は、適切な宿主中で抗体またはその断片またはキメラタンパク質または重鎖もしくは軽鎖を発現させる発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能な形で連結されたプロモーターを持ち、当該プロモーターは誘導性または構成的であって、所望により、組織特異的である。もう一つの具体的態様として、抗体コード配列および他の望ましい配列の両側に、ゲノム内の所望の部位での相同組換えを促進する領域が配置されており、そのために抗体コード核酸の染色体内発現が可能になるような核酸分子を使用する（KollerおよびSmithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)；Zijlstraら,Nature 342:435-438(1989)）。具体的態様として、発現される抗体分子は、一本鎖抗体である。あるいは、核酸配列は、抗体の重鎖と軽鎖の両方またはそれらの断片をコードする配列を含む。
【０７１１】
患者への核酸の送達は、直接的に（この場合は患者を核酸または核酸運搬ベクターに直接曝露する）、または間接的に（この場合は、まずインビトロで細胞を核酸で形質転換した後、その細胞を患者に移植する）行なうことができる。これら2つのアプローチは、それぞれインビボ遺伝子療法またはエクスビボ遺伝子療法と呼ばれている。
【０７１２】
具体的一態様として、核酸配列をインビボに直接投与し、それをインビボで発現させることにより、コードされている産物を産生させる。これは、当技術分野で知られている数多くの方法のいずれかによって、例えばそれらを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、それらが細胞内に入るように投与すること（これは例えば、欠損もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルベクター（米国特許第4,980,286号）によって、または裸のDNAの直接注入によって、またはマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（例えば遺伝子銃；Biolistic、Dupont）を使って、または核内に進入することが知られているペプチドに連結して投与することによって、または受容体を介したエンドサイトーシスを受けるリガンドに連結して投与すること（例えばWuおよびWu,J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)）（この方法は受容体を特異的に発現させる細胞タイプをターゲットにするために使用することができる）によって行なう）などによって、達成することができる。もう一つの態様として、リガンドがエンドソームを破壊する融合誘導性ウイルスペプチドを含むために、核酸がリソソームによる分解を回避できるような核酸-リガンド複合体を形成させることもできる。さらにもう一つの態様として、特定受容体をターゲットにすることにより、細胞特異的な取り込みおよび発現が起こるように、核酸をインビボでターゲティングすることができる（例えばPCT公開WO92/06180；WO92/22635；WO92/20316；WO93/14188；WO93/20221などを参照されたい）。別法として、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによっって宿主DNAに組み込んで、発現させることもできる（KollerおよびSmithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)；Zijlstraら,Nature 342:435-438(1989)）。
【０７１３】
具体的一態様として、本発明の抗体をコードする核酸配列を含んでいるウイルスベクターを使用する。例えばレトロウイルスベクターを使用することができる（Millerら,Meth.Enzymol.217:581-599(1993)参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞DNAへの組込みに必要な成分を含んでいる。遺伝子治療に使用される抗体をコードする核酸配列は、患者への遺伝子の送達を容易にする1つまたは複数のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Boesenら,Biotherapy 6:291-302(1994)に見いだすことができる。この文献には、化学療法に対する抵抗性が高まった幹細胞を作出するために、レトロウイルスを使って造血幹細胞にmdrl遺伝子を送達することが記載されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示している他の文献には、Clowesら,J.Clin.Invest.93:644-651(1994)；Kiemら,Blood 83:1467-1473(1994)；SalmonsおよびGunzberg,Human Gene Therapy 4:129-141(1993)；ならびにGrossmanおよびWilson,Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114(1993)がある。
【０７１４】
アデノウイルスも、遺伝子治療に使用することができるウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸上皮に遺伝子を送達するための媒体として、とりわけ魅力的である。アデノウイルスは生来、呼吸上皮に感染して、そこに軽い疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の呼吸上皮以外の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスには、非分裂細胞に感染する能力を持っているという利点がある。KozarskyおよびWilson,Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503(1993)には、アデノウイルスに基づく遺伝子治療が概説されている。Boutら,Human Gene Therapy 5:3-10(1994)は、アデノウイルスベクターを使ったアカゲザル呼吸上皮への遺伝子の転移を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの他の使用例は、Rosenfeldら,Science 252:431-434(1991)；Rosenfeldら,Cell 68:143-155(1992)；Mastrangeliら,J.Clin.Invest.91:225-234(1993)；PCT公開WO94/12649；およびWangら,Gene Therapy 2:775-783(1995)に見いだすことができる。好ましい一態様として、アデノウイルスベクターを使用する。
【０７１５】
アデノ関連ウイルス（AAV）を遺伝子治療に使用することも提案されている（Walshら,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300(1993)；米国特許第5,436,146号）。
【０７１６】
遺伝子治療へのもう一つのアプローチでは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法によって、遺伝子を組織培養中の細胞に導入する。通常、この導入方法には、当該細胞への選択可能マーカーの導入が含まれる。次に、細胞に選択圧をかけて、導入した遺伝子を取り込みそれを発現させている細胞を単離する。次に、それらの細胞を患者に送達する。
【０７１７】
この態様では、核酸を細胞に導入した後で、得られた組換え細胞をインビボ投与する。そのような導入は、当技術分野で知られる任意の方法によって、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、上記核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクター、細胞融合、染色体による遺伝子導入、スフェロプラスト融合など（ただしこれらに限らない）によって行なうことができる。細胞に外来遺伝子を導入する技術は当技術分野では数多く知られており（例えばLoefflerおよびBehr,Meth.Enzymol.217:599-618(1993)；Cohenら,Meth.Enzymol.217:618-644(1993)；Cline,Pharmac.Ther.29:69-92m(1985)などを参照されたい）、受容細胞の必要な発育機能および生理的機能が破壊されない限り、本発明でも使用することができる。この技術は、核酸が細胞によって発現され、好ましくは遺伝されて、その細胞子孫によって発現されるように、核酸を安定に細胞に導入することができるべきである。
【０７１８】
得られた組換え細胞は、当技術分野で知られる様々な方法によって、患者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好ましくは、静脈内投与される。予想される細胞の使用量は、所望する効果、患者の状態などに依存し、当業者であれば決定することができる。
【０７１９】
遺伝子治療の目的で核酸を導入することができる細胞には、任意の望ましい入手可能な細胞タイプが包含され、例えば上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；種々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹または前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるものが挙げられるが、これらに限るわけではない。
【０７２０】
好ましい一態様として、遺伝子治療に使用される細胞は、患者にとって自己である。
【０７２１】
組換え細胞を遺伝子治療に使用する一態様では、抗体をコードする核酸配列を、それらが当該細胞またはその子孫によって発現されるように細胞に導入し、次にその組換え細胞をインビボ投与して、治療効果を得る。具体的一態様として、幹細胞または前駆細胞を使用する。本発明のこの態様では、単離してインビトロで維持することができる幹細胞および/または前駆細胞はいずれも潜在的に使用することができる（例えばPCT公開WO94/08598；StempleおよびAnderson,Cell 71:973-985(1992)；Rheinwald,Meth.Cell Bio.21A:229(1980)；ならびにPittelkowおよびScott,Mayo Clinic Proc.61:771(1986)などを参照されたい）。
【０７２２】
具体的一態様として、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、適当な転写誘導物質の有無を制御することによって核酸の発現が制御されるように、コード領域に作動可能な形で連結された誘導性プロモーターを含む。
【０７２３】
治療活性
本発明の化合物または医薬組成物は、ヒトでの使用に先だって、所望の治療活性または予防活性に関して、好ましくはインビトロで試験した後、インビボで試験される。例えば、化合物または医薬組成物の治療上または予防上の有効性を証明するためのインビトロアッセイには、細胞株または患者組織試料に対する化合物の効果が含まれる。細胞株および/または患者組織試料に対する化合物または組成物の効果は、当業者に知られている技術、例えばロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイなどを利用して決定することができる。本発明では、特定化合物の投与が適応となるかどうかを決定するために使用することができるインビトロアッセイとして、患者組織試料を培養し、化合物に曝露するか、または他の形で化合物を投与し、組織試料に対するその化合物の効果を観察するインビトロ細胞培養アッセイが挙げられる。
【０７２４】
治療的/予防的投与および組成物
本発明は、有効量の本発明化合物または本発明医薬組成物、好ましくは本発明の抗体を対象に投与することによる処置、抑制および予防方法を提供する。好ましい一側面として本化合物は実質的に精製されている（例えばその効果を制限する物質または望ましくない副作用を引き起こす物質を実質的に含まない）。対象は、好ましくは動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなど（ただしこれらに限らない）の動物であり、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０７２５】
化合物が核酸または免疫グロブリンを含んでいる場合に使用することができる製剤および投与方法については上述した。他の適切な製剤および投与経路を以下に記載するものから選択することもできる。
【０７２６】
例えばリポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、本化合物を発現させる能力を持つ組換え細胞、受容体を介したエンドサイトーシス（例えばWuおよびWu,J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部として核酸を構築することなど、様々な送達システムが知られており、それらの方法を本発明の化合物を投与するために使用することができる。導入方法としては、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路などが挙げられる（ただしこれらに限らない）。本化合物または組成物は任意の好都合な経路によって、例えば注入もしくはボーラス注射によって、または上皮もしくは皮膚粘膜ライニング（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身投与または局所投与であることができる。さらに、本発明の医薬組成物または化合物を、脳室内および髄腔内注射を含む適切な経路によって、中枢神経系に導入することが望ましい場合もあるだろう。脳室内注射は、例えばOmmayaレザバーなどのレザバーに接続した脳室内カテーテルによって、行ないやすくすることができる。例えば吸入器または噴霧器とエアゾル化剤を含む製剤とを使った肺投与も利用することができる。
【０７２７】
具体的一態様として、本発明の医薬化合物または組成物を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合があるだろう。これは、例えば手術中の局所注入によって、または手術後に創傷被覆材などと組み合わせた局所外用によって、または注射によって、またはカテーテルを使って、または坐剤を使って、またはシラスティック膜などの膜または繊維を含む多孔性、非多孔性またはゲル状の材料でできたインプラントによって行なうことができる（ただしこれらに限らない）。本発明のタンパク質（抗体を含む）を投与する場合は、好ましくは、そのタンパク質が吸収されない材料を使用するように注意しなければならない。
【０７２８】
もう一つの態様として、本化合物または組成物は小胞、特にリポソームに入れて送達することができる（Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treatら,「Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer」（Lopez-BeresteinおよびFidler編,Liss,ニューヨーク,1989）の353〜365頁；Lopez-Berestein,同上の317〜327頁を参照されたい。総論についても同書を参照されたい）。
【０７２９】
さらにもう一つの態様として、化合物または組成物を制御放出系に入れて送達することもできる。一態様として、ポンプを使用することができる（Langer,前掲；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwaldら,Surgery 88:507(1980)；Saudekら,N.Engl.J.Med.321:574(1989)参照）。もう一つの態様として、ポリマー材料を使用することもできる（LangerおよびWise編「Medical Applications of Controlled Release」（CRC Pres.,フロリダ州ボカラトン,1974)；SmolenおよびBall編「Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance」（Wiley,ニューヨーク,1984）；RangerおよびPeppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)参照；またLevyら,Science 228:190(1985)；Duringら,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howardら,J.Neurosurg.71:105(1989)も参照されたい）。さらにもう一つの態様として、制御放出系を治療標的、すなわち脳の近傍に置いて、必要量を全身投与の一部分だけにすることもできる（例えばGoodson「Medical Applications of Controlled Release」（前掲）第2巻、115〜138頁(1984)など）。
【０７３０】
他の制御放出系は、Langerによる総説（Science 249:1527-1533(1990)）で論じられている。
【０７３１】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である具体的一態様では、その核酸がコードしているタンパク質の発現を促進するために、当該核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えばウイルスベクターの使用によって（米国特許第4,980,286号参照）、または直接注入によって、またはマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（例えば遺伝子銃；Biolistic,Dupont）の使用によって、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることによって、または核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドに連結した状態で投与すること（例えばJoliotら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868(1991)）などによって、細胞内に核酸が導入されるように投与することにより、当該核酸をインビボ投与することができる。別法として、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって宿主DNA内に組み込んで発現させることもできる。
【０７３２】
本発明は医薬組成物も提供する。そのような組成物は、治療有効量の化合物と、医薬的に許容できる担体とを含む。具体的一態様として、「医薬的に許容できる」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に動物用、特にヒト用として記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と一緒に投与される希釈剤、佐剤、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような医薬担体は滅菌された液体、例えば水、および石油、動物、植物由来の油または合成油を含む油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであることができる。医薬組成物を静脈内に投与する場合、水は好ましい担体である。食塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体担体として、特に注射用溶液に使用することができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉（flour）、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。本組成物は、所望により、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤をさらに含むことができる。これらの組成物は溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性製剤などの形態を取ることができる。本組成物は、従来からの結合剤および担体、例えばトリグリセリドなどを使って、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、標準的な担体、例えば医薬用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。適切な医薬担体の例は「Remington's Pharmaceutical Sciences」にE.W.Martinが記載している。そのような組成物は、治療有効量の本化合物（好ましくは精製されたもの）を、患者に適切な投与を行なうための剤形が得られるように、適切な量の担体と共に含有するだろう。製剤は投与形式に適していなければならない。
【０７３３】
好ましい態様として、本組成物は、常法に従って、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化される。通例、静脈内投与用組成物は滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要に応じて、本組成物は可溶化剤、注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔剤も含んでよい。一般に、諸成分は個別にまたは一つに混合されて、単位剤形、例えば活性剤の量を表示したアンプルまたはサシェ（sachette）などの密封された容器に入った凍結乾燥粉末または無水濃縮物などとして供給される。組成物を注入によって投与する場合は、滅菌された医薬用水または食塩水が入っている注入ビンで調合することができる。組成物を注射によって投与する場合は、投与前に諸成分を混合することができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを用意することができる。
【０７３４】
本発明の化合物は、中性型または塩型として製剤化することができる。医薬的に許容できる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンによって形成されるもの、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンによって形成されるものが含まれる。
【０７３５】
本発明ポリペプチドの異常な発現および/または活性に関係する疾患または障害の処置、抑制および予防に有効であるだろう本発明化合物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。また、所望により、インビトロアッセイを利用して、最適用量範囲の確認に役立たせてもよい。製剤中に使用される正確な用量は投与経路および疾患または障害の深刻さにも依存するだろうから、医師の判断と各患者の条件に応じて決定されるべきである。有効量はインビトロまたは動物モデル試験系で得られる用量反応曲線から推定することができる。
【０７３６】
抗体の場合、患者への投与量は典型的には患者の体重1kgあたり0.1mg〜100mgである。患者への投与量は、好ましくは、患者の体重1kgあたり0.1mg〜20mg、より好ましくは患者の体重1kgあたり1mg〜10mgである。一般に、人体では、外来ポリペプチドに対する免疫応答ゆえに、ヒト抗体の方が他の種に由来する抗体よりも長い半減期を持つ。したがって、多くの場合、ヒト抗体は、その用量と投与頻度を減らすことが可能である。さらに、本発明抗体の用量および投与頻度は、例えば脂質化（lipidation）などの修飾によって抗体の取り込みおよび組織浸透性（例えば脳への浸透性）を増加させることにより、減らすことができる。
【０７３７】
本発明は、本発明医薬組成物の成分の1つまたは複数で満たされた1つまたは複数の容器を含む医薬パックまたは医薬キットも提供する。所望により、そのような容器には、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指定された形式で、ヒトへの投与を目的とする製造、使用または販売に関する当局の認可を反映した表示を添付することができる。
【０７３８】
抗体による診断および画像化
興味あるポリペプチドに特異的に結合する標識された抗体ならびにその断片および類似体は、本発明ポリペプチドの異常な発現および/または活性に関係する疾患、障害および/または状態を検出、診断またはモニターするために診断目的で使用することができる。本発明によれば、（a）1つまたは複数のある個体の細胞または体液における興味あるポリペプチドの発現を、興味あるポリペプチドに特異的な1つまたは複数の抗体を使ってアッセイすること、および（b）その遺伝子発現のレベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較することからなる、興味あるポリペプチドの異常な発現の検出が可能である。この場合、標準的発現レベルと比較して、アッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少は、異常な発現を示す。
【０７３９】
本発明は、ある障害を診断するための診断アッセイであって、（a）ある個体の細胞または体液における興味あるポリペプチドの発現を、興味あるポリペプチドに特異的な1つまたは複数の抗体を使ってアッセイすること、および（b）その遺伝子発現のレベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較することを含み、標準的発現レベルと比較した場合の、アッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す診断アッセイを提供する。癌の場合、ある個体から得た生検組織中に比較的多量の転写物が存在することは、その疾患の発症に対する素因を示すのかもしれない。あるいは、そのような存在は、実際に臨床症状が出現する前にその疾患を検出するための手段になるかもしれない。より確定的なこのタイプの診断により、医療従事者は、予防措置または積極的処置をより早く施し、よって癌の発症またはさらなる進行を防止することが可能になるだろう。
【０７４０】
本発明の抗体は、当業者に知られている古典的な免疫組織学的方法による生物学的試料中のタンパク質レベルのアッセイに使用することができる（例えばJalkanenら,J.Cell.Biol.101:976-985 (1985)；Jalkanenら,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987)）。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な、抗体に基づく他の方法には、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）などのイムノアッセイなどがある。適切な抗体アッセイラベルは当技術分野では知られており、例えばグルコースオキシダーゼなどの酵素ラベル、ヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）およびテクネチウム（99Tc）などの放射性同位体、ルミノールなどの発光ラベル、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光ラベル、ならびにビオチンなどが挙げられる。
【０７４１】
本発明の一側面は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける興味あるポリペプチドの異常な発現に関係する疾患または障害の検出および診断である。一態様として、診断は、a）興味あるポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識分子を対象に投与（例えば非経口投与、皮下投与、または腹腔内投与）すること、b）前記標識分子を、前記ポリペプチドが発現している対象内の部位に優先的に濃縮させるため（そして未結合標識分子をバックグラウンドレベルまで浄化させるため）に、投与に続いて、ある期間待つこと、c）バックグラウンドレベルを決定すること、およびd）対象内の標識分子を検出することからなり、そのため、バックグラウンドレベルを上回る標識分子の検出は、その対象が、興味あるポリペプチドの異常な発現に関係する特定の疾患または障害を持っていることを示す。バックグラウンドレベルは、例えば検出された標識分子の量を特定の系に関して先に決定された標準値と比較することなど、様々な方法によって決定することができる。
【０７４２】
対象のサイズおよび使用する撮像システムが、診断画像を得るのに必要な撮像成分の量を決定することは、当技術分野では理解されるだろう。放射性同位体成分を使用する場合、注射される放射能の量は、ヒト対象では、通常、99mTc約5〜20ミリキュリーの範囲になるだろう。標識された抗体または抗体断片は、次いで、特異的タンパク質を含む細胞部位に優先的に蓄積するだろう。インビボ腫瘍撮像法については、S.W.BurchielおよびB.A.Rhodes編「Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer」（Masson Publishing Inc.,1982）の第13章、S.W.Burchielら著「放射性標識抗体およびその断片の免疫薬物動態学（Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments）」に記載されている。
【０７４３】
標識分子を対象内の部位に優先的に濃縮させ、未結合標識分子をバックグラウンドレベルまで浄化させるための投与後の期間は、使用するラベルの種類および投与方法を含むいくつかの変数に依存して、6〜48時間または6〜24時間または6〜12時間である。もう一つの態様として、投与後の期間を5〜20日または5〜10日とする。
【０７４４】
一態様として、疾患または障害のモニタリングを、その疾患または障害の診断方法を、例えば最初の診断の1ヶ月後、最初の診断の6ヶ月後、最初の診断の1年後などに繰り返すことによって行なう。
【０７４５】
患者における標識分子の存在は、当技術分野で知られているインビボスキャニング法を使って検出することができる。これらの方法は使用する標識のタイプに依存する。当業者は、特定の標識を検出するのに適した方法を決定することができるだろう。本発明の診断法で使用することができる方法および装置には、例えばコンピュータ断層撮影（CT）、陽電子断層撮影（PET）、磁気共鳴撮像法（MRI）および超音波撮像法などの全身スキャンなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０７４６】
具体的一態様として、分子を放射性同位体で標識し、患者内の分子を放射線応答性手術器具（Thurstonら,米国特許第5,441,050号）を使って検出する。もう一つの態様では、分子を蛍光化合物で標識し、患者内の分子を蛍光応答性走査装置を使って検出する。もう一つの態様では、分子を陽電子放出金属で標識し、患者内の分子を陽電子断層撮影法を使って検出する。さらにもう一つの態様では、分子を常磁性ラベルで標識し、患者内の分子を磁気共鳴撮像法（MRI）を使って検出する。
【０７４７】
キット
本発明は上記の方法で使用することができるキットを提供する。一態様として、キットは、1つまたは複数の容器に、本発明の抗体、好ましくは精製された抗体を含む。具体的一態様として、本発明のキットは、キットに含まれる抗体と特異的に免疫応答するエピトープを持つ実質的に単離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットは、さらに、興味あるポリペプチドとは反応しない対照抗体を含む。もう一つの具体的態様として、本発明のキットは、興味あるポリペプチドに対する抗体の結合を検出する手段を含む（例えば抗体を検出可能な基質、例えば蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物と結合させるか、または第1抗体を認識する第2の抗体を検出可能な基質と結合させることができる）。
【０７４８】
本発明のもう一つの具体的態様として、キットは、増殖性および/または癌性ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスクリーニングに使用される診断キットである。そのようなキットは興味あるポリペプチドとは反応しない対照抗体を含んでもよい。そのようなキットは、少なくとも1つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫応答するエピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を含むことができる。さらに、そのようなキットは、前記抗体の抗原への結合を検出するための手段を含む（例えば抗体を、フローサイトメトリーによって検出することができるフルオレセインまたはローダミンなどの蛍光化合物と結合させることができる）。具体的態様として、本キットは、組換え生産または化学合成されたポリペプチド抗原を含んでもよい。本キットのポリペプチド抗原は固形支持体に取付けることができる。
【０７４９】
さらに具体的な一態様として、上述したキットの検出手段は、前記ポリペプチド抗原が取付けられた固形支持体を含む。そのようなキットはさらに、取付けられていないレポーター標識抗ヒト抗体を含んでもよい。この態様では、ポリペプチド抗原に対する抗体の結合を、前記レポーター標識抗体の結合によって検出することができる。
【０７５０】
さらなる一態様として、本発明は、本発明ポリペプチドの抗原を含む血清のスクリーニングに使用される診断キットを包含する。この診断キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫応答する実質的に単離された抗体、および前記抗体に対する前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の結合を検出する手段を含む。一態様として、抗体は固形支持体に取付けられる。具体的一態様として、抗体はモノクローナル抗体であってよい。本キットの検出手段は、第2の標識されたモノクローナル抗体を含んでよい。これに代えて、またはこれに加えて、検出手段は標識された競合抗原を含んでもよい。
【０７５１】
診断的構成の一つでは、試験血清を、本発明の方法によって得られる表面結合抗原を持つ固相試薬と反応させる。特異抗原を使って抗体を試薬に結合させ、未結合の血清成分を洗浄によって除去した後、試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させて、固形支持体に結合した抗抗原抗体の量に比例してレポーターを試薬に結合させる。結合していない標識抗体を除去するために試薬を再び洗浄し、試薬に結合しているレポーターの量を決定する。典型的には、レポーターは、適切な蛍光、発光または発色基質（Sigma,ミズーリ州セントルイス）の存在下で固相をインキュベートすることによって検出される酵素である。
【０７５２】
上記の固体表面試薬は、ポリマービーズ、ディップスティック、96穴プレートまたはフィルター材料などの固形支持体材料にタンパク質材料を取付けるための既知の技術によって製造される。これらの取付け方法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、および固形支持体の化学反応性基（例えば活性化されたカルボキシル、ヒドロキシル、またはアルデヒド基）への、典型的には遊離のアミノ基を介したタンパク質の共有結合が含まれる。別法として、ストレプトアビジン被覆プレートをビオチン化抗原と一緒に使用することもできる。
【０７５３】
従って、本発明はこの診断方法を行なうためのアッセイ系またはアッセイキットを提供する。本キットは一般に、表面に結合した組換え抗原を持つ支持体と、表面に結合した抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識抗ヒト抗体とを含む。
【０７５４】
融合タンパク質
本発明のポリペプチドはいずれも融合タンパク質の作製に使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、第2のタンパク質に融合すれば、抗原タグとして使用することができる。本発明のポリペプチドに対して産生させた抗体を使って本ポリペプチドに結合させることにより、前記第2タンパク質を間接的に検出することができる。さらに、ある種のタンパク質は、輸送シグナルに基づいて標的とする細胞の位置を定めるので、他のタンパク質に融合した場合は、本発明のポリペプチドをターゲティング分子として使用することもできる。
【０７５５】
本発明のポリペプチドに融合することができるドメインの例には、異種シグナル配列だけでなく、他の異種機能領域も含まれる。融合は必ずしも直接的融合である必要はなく、リンカー配列を介した融合であってもよい。
【０７５６】
さらに、本発明ポリペプチドの特徴が改善されるように、融合タンパク質を設計してもよい。例えば、宿主細胞からの精製またはその後の取り扱いおよび貯蔵中の安定性および持続性を改善するために、追加アミノ酸、特に荷電アミノ酸からなる一領域をポリペプチドのN末端に付加することができる。精製を容易にするためにペプチド部分をポリペプチドに付加してもよい。そのような領域は当該ポリペプチドの最終製造工程前に、除去することができる。また、そのようなペプチド部分の間にペプチド切断部位を導入することもでき、これをさらにプロテアーゼ活性にさらすことにより、本発明のタンパク質から前記ペプチドを除去することができる。ポリペプチドの取り扱いを容易にするためのペプチド切断部位を含むペプチド部分の付加は当技術分野ではよく知られており、日常的な技術である。
【０７５７】
さらに、本発明のポリペプチド（断片、特にエピトープを含む）は、免疫グロブリン（IgA、IgE、IgG、IgM）の定常ドメインまたはその部分（ドメイン全体およびその一部分を含む、CH1、CH2、CH3、およびそれらの任意の組合わせ）の一部と組み合わせて、キメラポリペプチドにすることもできる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、増加した生体内半減期を示す。既報の一例では、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインと哺乳類免疫グロブリンの重鎖または軽鎖定常領域の様々なドメインとからなるキメラタンパク質が記載されている（EP A 394,827；Trauneckerら,Nature 331:84-86(1988)）。（IgGにより）ジスルフィド結合した二量体構造を持つ融合タンパク質は、単量体型の分泌タンパク質またはタンパク質断片単独よりも効率よく、他の分子を結合および中和することもできる（Fountoulakisら,J.Biochem.270:3958-3964(1995)）。
【０７５８】
EP-A-O 464 533（対応カナダ特許第2045869号）には、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分と、別のヒトタンパク質またはその一部とを含む融合タンパク質が開示されている。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は治療および診断に有益であり、例えば薬物動態特性（EP-A 0232 262）などの向上をもたらすことができる。あるいは、融合タンパク質を発現させ、検出し、精製した後で、Fc部分を欠失させることが望ましいだろう。例えば、融合タンパク質を免疫用の抗原として使用する場合は、Fc部分が、治療および診断の障害となるかもしれない。例えば創薬では、hIL-5などのヒトタンパク質が、高スループットスクリーニングアッセイのためにFc部分に融合されて、hIL-5のアンタゴニストの同定に使用されている（D.Bennettら,J.Molecular Recognition 8:52-58(1995)およびK.Johansonら,J.Biol.Chem,270:9459-9471(1995)を参照されたい）。
【０７５９】
さらに、本発明のポリペプチドをマーカー配列（「タグ」ともいう）に融合することもできる。そのような「タグ」に特異的な抗体を入手することができるため、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は必要でなくなり、ゆえに、本発明の融合タンパク質の精製および/またはその同定がかなり容易になる。そのような精製は、抗タグ抗体、またはエピトープタグに結合する別のタイプのアフィニティーマトリックス（例えばフロー型カラムのマトリックスに取付けられた抗タグ抗体）を用いるアフィニティー精製の形を取ることができる。好ましい態様では、マーカーアミノ酸配列がヘキサヒスチジンペプチドである。これは、pQEベクター（QIAGEN,Inc.,カリフォルニア州91311チャッツワース・イートンアベニュー9259）をはじめとするベクター（その多くは市販されている）に用意されているタグである。例えばGentzら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)に記述されているように、ヘキサヒスチジンにより、融合タンパク質の精製が便利になる。「HA」タグはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する（Wilsonら,Cell 37:767(1984)）。
【０７６０】
本発明ポリペプチドの精製および/または同定に関して上述したタグの代わりに容易に使用することができる他の「タグ」が存在することは、当業者にはわかるだろう（Jones C.ら,J Chromatogr A.707(1):3-22(1995)）。例えばc-mycタグおよびそれに対する8F9、3C7、6E10、G4m B7および9E10抗体（Evanら,Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616(1985)）；単純疱疹ウイルス糖タンパク質D（gD）タグおよびその抗体（Paborskyら,Protein Engineering 3(6):547-553(1990)）、Flag-ペプチド、すなわちオクタペプチド配列DYKDDDDK（配列番号9）（Hoppら,Biotech.6:1204-1210(1988)））；KT3エピトープペプチド（Martinら,Science 255:192-194(1992)）；α-チューブリンエピトープペプチド（Skinnerら,J.Biol.Chem.266:15136-15166(1991)）；T7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ（Lutz-Freyermuthら,Proc.Natl.Sci.USA 87:6363-6397(1990)）、FITCエピトープ（Zymed,Inc.）、GFPエピトープ（Zymed,Inc.）、およびローダミンエピトープ（Zymed,Inc.）などが挙げられる。
【０７６１】
本発明は、最大9残基の反復する一連のアルギニンアミノ酸をコードする最大9コドンの、本発明ポリヌクレオチドのコード領域への結合も包含する。また本発明は、最大9残基の反復する一連のアルギニンアミノ酸による、本発明ポリペプチドの化学的誘導体化も包含する。このようなタグは、ポリペプチドに結合すると、さらなる誘導体化または操作を行なわなくても、化合物を細胞内部に進入させる普遍的パスとして働くことが最近明らかになった（Wender,P.ら,未公表データ）。
【０７６２】
本発明のポリペプチド（その断片および/または変異体を含む）が関わるタンパク質融合物は、限定を目的としない次の例に利用することができる：タンパク質の細胞内局在、免疫沈降によるタンパク質-タンパク質相互作用の決定、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製、タンパク質の機能的および/または構造的特徴づけ。本発明は、エピトープ融合タンパク質に関して上述した用途へのハプテン特異抗体の応用も包含する。例えば、本発明のポリペプチドを化学的に誘導体化して、ハプテン分子（例えばDNP(Zymed,Inc.)）を取付けることができる。このようなハプテンに対して特異的なモノクローナル抗体を入手することができるので、本タンパク質は例えば免疫沈降法などによって容易に精製することができるだろう。
【０７６３】
本発明のポリペプチド（その断片および/または変異体を含む）ならびにそのようなポリペプチド、断片および/または変異体に対する抗体を、既知の毒素および今後決定される毒素、例えばリシン、サポリン（Mashiba Hら,Ann.N.Y.Acad.Sci.1999;886:2335）、またはHC毒素（Tonukari NJら,Plant Cell.2000 Feb;12(2):237-248）などに融合してもよい。そのような融合物は本発明のポリペプチドに結合する能力を持つリガンドまたはタンパク質が存在する所望の組織に当該毒素を送達するために使用することができるだろう。
【０７６４】
本発明は、細胞内の特定位置、特定組織、および/または特定の種に毒素を送達するための、本発明のポリペプチド（その変異体および断片を含む）に対する抗体と前記毒素との融合物を包含する。そのような二機能性抗体は当技術分野では知られているが、P.J.Hudson,Curr.Opp.In.Imm.11:548-557(1999)には、他にも有利な融合物が、製造方法に関する引用を含めて記載されており、この刊行物は、そこに引用されている文献と共に、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する。この場合、「毒素」という用語は、任意の異種タンパク質、小分子、放射性核種、細胞毒性薬、リポソーム、接着分子、糖タンパク質、リガンド、細胞または組織特異リガンド、酵素、生物活性剤、生物学的応答調整因子、抗真菌剤、ホルモン、ステロイド、ビタミン、ペプチド、ペプチド類似体、抗アレルギー剤、抗結核剤、抗ウイルス剤、抗生物質、抗原虫剤、キレート剤、放射性粒子、放射性イオン、X線造影剤、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および遺伝物質を含むと広義に解釈してよい。本明細書に照らせば、当業者は、ある特定の「毒素」を本発明の化合物に使用することができるかどうかを決定することができるだろう。上に挙げた適切な「毒素」の例は単なる典型例であって、本発明で使用することができる「毒素」を限定するものではない。
【０７６５】
これら上記の融合物はいずれも本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使って製造することができる。
【０７６６】
ベクター、宿主細胞、およびタンパク質の製造
また本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および組換え技術によるポリペプチドの製造に関する。ベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであってよい。レトロウイルスベクターは複製能力を持っていてもよいし、複製欠損性であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に補完的宿主細胞内だけで起こるだろう。
【０７６７】
ポリヌクレオチドは、宿主内で増殖させるために選択可能マーカーを含むベクターに接合することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物として導入するか、または荷電脂質との複合体として導入する。ベクターがウイルスである場合は、適当なパッケージング細胞株を使ってインビトロでパッケージングした後、宿主細胞に形質導入することができる。
【０７６８】
ポリヌクレオチドインサートは、例えばファージラムダPLプロモーター、大腸菌lac、trp、phoAおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルLTRのプロモーターなど（ただしこれらに限らない）といった適当なプロモーターに作動可能な形で連結するべきである。他の適切なプロモーターは当業者には知られているだろう。発現コンストラクトはさらに転写開始部位と終結部位を含み、転写される領域には翻訳のためのリボソーム結合部位を含むだろう。これらのコンストラクトが発現させる転写物のコード部分は、好ましくは、最初に翻訳開始コドンを含み、翻訳されるポリペプチドの最後に適切に配置された停止コドン（UAA、UGAまたはUAG）を含むだろう。
【０７６９】
上記のように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも1つの選択可能マーカーを含むだろう。そのようなマーカーには、真核細胞培養の場合はジヒドロ葉酸レダクターゼ、G418またはネオマイシン耐性遺伝子、大腸菌および他の細菌で培養する場合は、テトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子などがある。適当な宿主の代表例には、大腸菌（E.coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris：ATCC受託番号201178））などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Dorosophila）S2細胞およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9細胞などの昆虫細胞；CHO、COS、293、ボーズ（Bowes）メラノーマ細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞などがあるが、これらに限るわけではない。上述の宿主細胞に適した培養培地および培養条件は当技術分野では知られている。
【０７７０】
細菌用として好ましいものには、QIAGEN,Inc.から入手することができるpQE70、pQE60、およびpQE9；Stratagene Cloning Systems,Inc.から入手することができるpBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；ならびにPharmacia Biotech,Inc.から入手することができるptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5などがある。好ましい真核ベクターには、Stratageneから入手することができるpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、およびpSG；ならびにPharmaciaから入手することができるpSVK3、pBPV、pMSG、pSVLなどがある。酵母系での使用に好ましい発現ベクターには、pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、およびPA0815（いずれもInvitrogen（カリフォルニア州カールスバッド）から入手可能）などがあるが、これらに限るわけではない。他の適切なベクターは当業者には明白だろう。
【０７７１】
宿主細胞へのコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、カチオン脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、その他の方法によって達成することができる。そのような方法は、Davisら「Basic Methods In Molecular Biology」(1986)など、多くの標準的実験書に記載されている。本発明のポリペプチドは実際には組換えベクターを持たない宿主細胞によって発現される場合もあると考えられる。
【０７７２】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって、組換え細胞培養から回収し、精製することができる。最も好ましくは高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）を使って精製する。
【０７７３】
本発明のポリペプチド、好ましくはその分泌型は、次のものから回収することもできる：直接単離されたものであるか、培養されたものであるかにかかわらず、体液、組織および細胞などの天然供給源から精製された産物；化学合成法の産物；ならびに組換え技術によって原核宿主または真核宿主、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳類細胞などから産生される産物。組換え生産法に使用する宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化される場合もあるし、グリコシル化されない場合もある。また本発明のポリペプチドは、場合によっては宿主によるプロセスの結果として、最初に修飾メチオニン残基を含んでもよい。例えば、どの真核細胞での翻訳後にも、翻訳開始コドンがコードするN末端メチオニンは一般に高い効率で除去されることが、当技術分野ではよく知られている。大半のタンパク質のN末端メチオニンは大半の原核生物でも効率よく除去されるが、一部のタンパク質の場合は、N末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存して、この原核生物除去プロセスが不十分である。
【０７７４】
一態様として、酵母ピキア・パストリスを使って、本発明のポリペプチドを真核生物系で発現させる。ピキア・パストリスはメタノールを唯一の炭素源として代謝することができるメチロトローフ酵母である。メタノール代謝経路における主要ステップは、O2を使ったメタノールのホルムアルデヒドへの酸化である。この反応は酵素アルコールオキシダーゼによって触媒される。メタノールを唯一の炭素源として代謝するために、ピキア・パストリスは、一つにはO2に対するアルコールオキシダーゼの親和性が比較的低いこともあって、高レベルのアルコールオキシダーゼを産生しなければならない。したがって、主要炭素源としてメタノールに依存する成長培地では、2つのアルコールオキシダーゼ遺伝子の一方（AOX1）のプロモーター領域の活性が著しく高い。メタノールの存在下でAOX1遺伝子から産生されるアルコールオキシダーゼはピキア・パストリスの全可溶性タンパク質の最高約30％を占める。Ellis,S.B.ら,Mol.Cell.Biol.5:1111-21(1985)；Koutz,P.J,ら,Yeast 5:167-77(1989)；Tschopp,J.F.ら,Nucl.Acids Res.15:3859-76(1987)参照。したがって、AOX1調節配列の全部または一部の転写調節を受ける異種コード配列、例えば本発明のポリヌクレオチドは、メタノールの存在下で生育するピキア酵母では、並はずれて高レベルに発現される。
【０７７５】
一例として、プラスミドベクターpPIC9Kを使って、本明細書に記載の本発明のポリペプチドをコードするDNAを、基本的にD.R.HigginsおよびJ.Cregg編「Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology」（The Humana Press,ニュージャージー州トトワ,1998）に記載されているように、ピキア酵母系で発現させる。この発現ベクターは、マルチクローニングサイトの上流に位置するピキア・パストリスアルカリホスファターゼ（PHO）分泌シグナルペプチド（すなわちリーダー）に連結された強力なAOX1プロモーターによる本発明タンパク質の発現および分泌を可能にする。
【０７７６】
当業者はすぐにわかるだろうが、pPIC9Kの代わりに、他の多くの酵母ベクター、例えばpYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalpha、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、およびPAO815なども、転写、翻訳、（所望により）分泌などのシグナル（必要に応じてインフレームのAUGを含む）が適切な位置にある限り、使用することができる。
【０７７７】
もう一つの態様として、異種コード配列、例えば本発明のポリヌクレオチドなどの高レベル発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを、例えばpGAPZまたはpGAPZalphaなどの発現ベクターにクローニングし、酵母培養物をメタノールの不在下で生育させることによって達成することもできる。
【０７７８】
本発明は、本明細書で論じるベクターコンストラクトを持つ宿主細胞を包含するだけでなく、内因性遺伝物質（例えばコード配列）が欠失するようにまたは置換されるように、そして/または、本発明のポリヌクレオチドと作動可能な形で結合した、内因性ポリヌクレオチドを活性化、改変および/または増幅する遺伝物質（例えば異種ポリヌクレオチド配列）を含むように操作された、脊椎動物由来の、特に哺乳動物由来の、1次、2次および不死化宿主細胞も包含する。例えば、当技術分野で知られている技術を使って、異種制御領域（例えばプロモーターおよび/またはエンハンサー）と内因性ポリヌクレオチド配列とを相同組換えによって作動可能な形で結合して、新しい転写単位を形成させることができる（例えば1997年6月24日発行の米国特許第5,641,670号；1998年3月31日発行の米国特許第5,733,761号；1996年9月26日公開の国際公開第96/29411号；1994年8月4日公開の国際公開第94/12650号；Kollerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)；およびZijlstraら,Nature 342:435-438(1989)などを参照されたい。各刊行物は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する）。
【０７７９】
また、本発明のポリペプチドは、当技術分野で知られる技術を使って化学合成することもできる（例えばCreighton「Proteins: Structures and Molecular Principles」（W.H.Freeman & Co.,ニューヨーク,1983）およびHunkapillerら,Nature,310:105-111(1984)などを参照されたい）。例えば、本発明のポリペプチド配列の断片に相当するポリペプチドは、ペプチド合成装置を使って合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体をポリペプチド配列中に置換または付加として導入することもできる。非古典的アミノ酸には、例えば一般的アミノ酸のD-異性体、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-アミノ酪酸、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアミン、β-アラニン、フルオロアミノ酸、β-メチルアミノ酸などのデザイナー（designer）アミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-メチルアミノ酸、およびアミノ酸類似体全般が含まれるが、これらに限るわけではない。さらに、アミノ酸はD（右旋性）でもL（左旋性）でもよい。
【０７８０】
本発明は、翻訳中または翻訳後に、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などによって、弁別的に修飾されるポリペプチドを包含する。数多くの化学修飾はいずれも、例えば臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝的合成など（ただしこれらに限らない）の既知の方法で行なうことができる。
【０７８１】
本発明に包含される他の翻訳後修飾には、例えばN結合型またはO結合型糖質鎖、N-末端またはC末端のプロセシング、アミノ酸主鎖への化学部分の結合、N結合型またはO結合型糖質鎖の化学修飾、および原核宿主細胞発現の結果として起こるN末端メチオニン残基の付加または欠失などがある。ポリペプチドは、タンパク質の検出および単離を可能にする酵素、蛍光、同位体ラベル、アフィニティーラベルなどの検出可能なラベル、エピトープタグ付ペプチド断片（例えばFLAG、HA、GST、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質など）の付加、ビオチンおよび/またはストレプトアビジンなどのアフィニティータグの結合、アミノ酸主鎖への化学部分の共有結合、ポリペプチド末端のNまたはC末プロセシング（例えばタンパク質分解プロセシング）、N末端メチオニン残基の欠失などによって修飾することもできる。
【０７８２】
本発明は、ポリペプチドの可溶性、安定性および循環時間の増加、または免疫原性の低下など、新たな利点を持つ本発明ポリペプチドの化学修飾誘導体も提供する（米国特許第4,179,337号参照）。誘導体化のための化学部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択することができる。ポリペプチドは分子内のランダムな位置で修飾するか、分子内の所定の位置で修飾することができ、ポリペプチドには1、2、3個またはそれ以上の化学部分を結合させることができる。
【０７８３】
本発明はさらに、好ましくは化学部分が親水性ポリマー残基である、本発明ポリペプチドの化学誘導体を包含する。代表的親水性ポリマー（誘導体を含む）として、反復単位が1つまたは複数のヒドロキシ基を含むポリマー（ポリヒドロキシポリマー）、例えばポリ(ビニルアルコール）；反復単位が1つまたは複数のアミノ基を含むポリマー（ポリアミンポリマー）、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびリポタンパク質、例えばアルブミンおよび天然リポタンパク質など；反復単位が1つまたは複数のカルボキシ基を含むポリマー（ポリカルボキシポリマー）、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸およびその塩、例えばアルギン酸ナトリウムおよびアルギン酸カルシウム、グリコサミノグリカンおよびその塩、例えばヒアルロン酸の塩、糖質のリン酸化および硫酸化誘導体、遺伝物質、例えばインターロイキン-2およびインターフェロン、およびホスホロチオエートオリゴマー；ならびに反復単位が1つまたは複数の糖部分を含むポリマー（多糖ポリマー）、例えば糖質などを挙げることができる。
【０７８４】
親水性ポリマーの分子量は様々であってよく、一般的には約50〜約5,000,000であり、約100〜約50,000の分子量を持つポリマーが好ましい。ポリマーは分岐していても分岐していなくてもよい。より好ましいポリマーは約150〜約10,000の分子量を持ち、200〜約8,000の分子量はさらに好ましい。
【０７８５】
ポリエチレングリコールの場合、取り扱いと製造が容易という点で、好ましい分子量は約1kDa〜約100kDaである（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製物中で、一部の分子は表示した分子量よりも重く、一部の分子は表示した分子量より軽いことを示している）。所望する治療プロフィール（例えば所望する徐放の持続時間、もしあれば生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、ポリエチレングリコールが治療用タンパク質または類似体に及ぼす他の既知の影響）によって、他のサイズも使用してよい。
【０７８６】
本発明のポリペプチドを誘導体化するために使用することができる他の好ましいポリマーには、例えば、ポリ(エチレングリコール)（PEG）、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリオキソマー、ポリソルベートおよびポリ(ビニルアルコール)などがあり、PEGは特に好ましい。PEGポリマーの中では、約100〜約10,000の分子量を持つPEGポリマーが好ましい。より好ましくは、PEGポリマーは約200〜約8,000の分子量を持ち、それぞれ2,000、5,000および8,000の分子量を持つPEG2,000、PEG5,000およびPEG8,000はさらに好ましい。上に例示したものに加えて、他の適切な親水性ポリマーも、本明細書に基づけば、当業者には明白だろう。一般に、使用するポリマーには、アルキル化またはアシル化反応によって本発明のポリペプチドを取付けることができるポリマーを含めることができる。
【０７８７】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、タンパク質の機能ドメインまたは抗原ドメインに対する影響を考慮して、タンパク質に取付けるべきである。当業者は多くの取付け方法を利用することができる。例えば参考文献として本明細書の一部を構成するEP 0 401 384（G-CSFへのPEGのカップリング）。Malikら,Exp.Hematol.20:1028-1035(1992)（トレシルクロリドを用いたGM-CSFのPEG化）も参照されたい。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミンまたはカルボキシル基などの反応性基により、アミノ酸残基を介して共有結合することができる。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子を結合させることができる基である。遊離のアミノ酸を持つアミノ酸残基としては、例えばリジン残基およびN末端アミノ酸残基を挙げることができ、遊離のカルボキシル基を持つものとしては、例えばアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびC末端アミノ酸残基を挙げることができる。スルフヒドリル基も反応性基としてポリエチレングリコール分子の取付けに利用してよい。治療目的には、N末端またはリジン残基への取付けなど、アミノ基への取付けが好ましい。
【０７８８】
N末端を化学修飾したタンパク質が特に望まれる場合もあるだろう。本組成物の実例としてポリエチレングリコールを用いる場合は、様々なポリエチレングリコール分子（分子量、分岐度などによる）、反応混合物中のポリエチレングリコール分子とタンパク質（ポリペプチド）分子の比率、実施するPEG化反応の種類、および選択したN末端PEG化タンパク質を取得する方法から選択することができる。N末端PEG化調製物を取得する方法（すなわち必要に応じてこの部分を他のモノPEG化部分から単離する方法）として、PEG化タンパク質分子の集団からN末端PEG化物質を精製することによる方法を挙げることができる。N末端での選択的なタンパク質化学修飾は、特定タンパク質において誘導体に関与しうる異なるタイプの1級アミノ基（リジン対N末端）の反応性の差異を利用する還元的アルキル化によって達成することができる。適当な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーによる実質上選択的なN末端でのタンパク質の誘導体化が達成される。
【０７８９】
上に例示した種々のポリマーがそうであるように、ポリマー残基は、例えば本発明ポリペプチドへのポリマー残基の連結に典型的に関与する官能基の他にも官能基を含む場合があると考えられる。そのような官能基には、例えばカルボキシル、アミン、ヒドロキシおよびチオール基などがある。ポリマー残基上のこれらの官能基は、所望により、そのような官能基と一般に反応し、体内の特定組織、例えば患部組織などへのターゲティングに役立ちうる物質と、反応させることができる。さらなる官能基と反応させることができる代表的物質には、例えばタンパク質（抗体を含む）、糖質、ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、レクチン、およびヌクレオシドなどがある。
【０７９０】
親水性ポリマーの残基の他にも、本発明のポリペプチドを誘導体化するために使用する化学物質として、糖残基を挙げることができる。誘導することができる代表的な糖類には、例えば、エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、フルクトース、ソルビトール、マンニトールおよびセドヘプツロースなどの単糖または糖アルコール（好ましい単糖はフルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、マンニトールおよびソルビトールである）；ならびにラクトース、ショ糖、マルトースおよびセロビオースなどの二糖などがある。他の糖類には、例えばイノシトールおよびガングリオシド頭部などがある。上に例示したものだけでなく、他の適切な糖類も、本明細書に基づけば、当業者には明白だろう。一般に、誘導体化に使用することができる糖類には、アルキル化またはアシル化反応によって本発明のポリペプチドに取付けることができる糖類が含まれる。
【０７９１】
さらに本発明は、例えば脂質（カチオン性、アニオン性、重合、荷電、合成、飽和、または不飽和脂質、およびそれらの任意の組合わせを含む）、安定化剤などによる本発明ポリペプチドの誘導体化も包含する。
【０７９２】
本発明は、例えば安定化機能を果たしうる（例えば溶解した状態でのポリペプチドの半減期を増加させる、ポリペプチドの水溶性を高める、ポリペプチドの親水性または疎水性を増加させるなどの働きをする）化合物による本発明ポリペプチドの誘導体化を包含する。安定化物質として有用なポリマーは、天然物、半合成物（修飾天然物）または合成物であってよい。代表的な天然ポリマーとしては例えば次に述べるような天然多糖が挙げられる：アラビナン、フルクタン、フカン（fucans）、ガラクタン、ガラクチュロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えばイヌリンなど）、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクトカロロース（galatocarolose）、ペクチン酸、ペクチン、例えばアミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストリン、デキストロース、グルコース、ポリグルコース、ポリデキストロース、プスツラン、キチン、アガロース、エラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンチンガム、デンプンおよび他の様々な天然ホモポリマーまたはヘテロポリマー、例えば以下のアルドース、ケトース、酸またはアミンの1つまたは複数を含むもの：エリトース（erythose）、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、デキストロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ショ糖、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクチュロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸、ならびにそれらの天然誘導体。したがって、適切なポリマーとしては、例えばアルブミンなどのタンパク質、ポリアルギネート、およびポリラクチドコグリコリドポリマーなどが挙げられる。代表的半合成ポリマーには、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、およびメトキシセルロースなどがある。代表的合成ポリマーには、例えばポリホスファゼン、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイトポリマー、ポリエチレン（例えばポリエチレングリコール（例えばBASF（ニュージャージー州パーシッパニー）から販売されているPluronic（登録商標）と呼ばれる種類の化合物を含む）およびポリエチレンテレフタレート）、ポリプロピレン（例えばポリプロピレングリコールなど）、ポリウレタン（例えばポリビニルアルコール（PVA）、ポリ塩化ビニル、およびポリビニルピロリドンなど）、ナイロンを含むポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ化炭化水素ポリマー、フッ化炭素ポリマー（例えばポリテトラフルオロエチレンなど）、アクリレート、メタクリレート、およびポリメチルメタクリレート、およびその誘導体などがある。安定化化合物としてポリマーを利用する本発明の誘導体化ポリペプチド���製造する方法は、本明細書の内容を、当技術分野で知られている情報、例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するUngerの米国特許第5,205,290号などに記載され言及されているような情報と合わせて考慮すれば、当業者には明白だろう。
【０７９３】
さらに本発明は、本発明ポリペプチドの追加修飾を包含する。そのような追加修飾は当技術分野では知られており、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する米国特許第6,028,066号に、誘導体化の方法などと共に詳述されている。
【０７９４】
本発明のポリペプチドは単量体でも多量体（すなわち二量体、三量体、四量体およびそれ以上の高次多量体）でもよい。したがって本発明は、本発明ポリペプチドの単量体および多量体、それらの製造、およびそれらを含む組成物（好ましくは治療薬）に関する。具体的態様として、本発明のポリペプチドは単量体、二量体、三量体または四量体である。さらなる態様として、本発明の多量体は少なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なくとも四量体である。
【０７９５】
本発明が包含する多量体はホモマーでもヘテロマーでもよい。本明細書で使用するホモマーという用語は、配列番号Yのアミノ酸配列または寄託されたクローンに含まれるcDNAがコードしているアミノ酸配列（本明細書に記載するこれらのポリペプチドに相当する断片、変異体、スプライス変異体、および融合タンパク質を含む）だけを含む多量体を表す。これらのホモマーは同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を持つポリペプチドを含みうる。具体的一態様として、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドだけを含む多量体である。もう一つの具体的態様として、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む多量体である。具体的態様として、本発明の多量体はホモ二量体（例えば同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むもの）またはホモ三量体（例えば同一のアミノ酸配列および/または異なるアミノ酸配列を持つポリペプチドを含むもの）である。さらなる態様として、本発明のホモ多量体は少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。
【０７９６】
本発明で使用するヘテロマーという用語は、本発明のポリペプチドに加えて1つまたは複数の異種ポリペプチド（すなわち異なるタンパク質のポリペプチド）を含む多量体を表す。具体的一態様として、本発明の多量体はヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。さらなる態様として、本発明のヘテロ多量体は、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘテロ三量体、または少なくともヘテロ四量体である。
【０７９７】
本発明の多量体は疎水結合、親水結合、イオン結合および/または共有結合の結果であることができ、かつ/または例えばリポソーム形成などによって間接的に連結される場合もある。したがって一態様として、本発明の多量体、例えばホモ二量体またはホモ三量体などは、本発明のポリペプチドが溶解した状態で互いに接触すると形成される。もう一つの態様として、本発明のヘテロ多量体、例えばヘテロ三量体またはヘテロ四量体などは、本発明のポリペプチドが溶解した状態で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触すると形成される。別の態様として、本発明の多量体は、本発明ポリペプチドとの共有結合および/または本発明ポリペプチド間の共有結合によって形成される。そのような共有結合には、ポリペプチド配列（例えば配列表に挙げたもの、または寄託されたクローンがコードするポリペプチドに含まれるもの）に含まれる1つまたは複数のアミノ酸残基が関与しうる。一例として、この共有結合は、天然（すなわち自然界に存在する）ポリペプチド中で相互作用するポリペプチド配列内のシステイン残基間の架橋である。もう一つの例では、共有結合が化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは、そのような共有結合には、本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に含まれる1つまたは複数のアミノ酸残基が関与してもよい。
【０７９８】
ある例では、共有結合が、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列の間にある（例えば米国特許第5,478,925号などを参照されたい）。具体的一態様では、共有結合が（本明細書に記載する）本発明のFc融合タンパク質に含まれる異種配列の間にある。もう一つの具体例では、本発明の融合タンパク質の共有結合が、共有結合した多量体を形成する能力を持つもう一つのタンパク質、例えばオステオプロテゲリン（例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する国際公開第98/49305号を参照されたい）などに由来する異種ポリペプチド配列の間にある。もう一つの態様として、2以上の本発明ポリペプチドをペプチドリンカーを介して接合する。例として、米国特許第5,073,627号（参考文献として本明細書の一部を構成する）に記載のペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられた複数の本発明ポリペプチドを含むタンパク質は、通常の組換えDNA技術を使って製造することができる。
【０７９９】
本発明の多量体ポリペプチドを製造するもう一つの方法では、ロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを使用する。ロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパードメインは、それらのドメインを含むタンパク質の多量体化を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは最初はいくつかのDNA結合タンパク質に同定されたが（Landschulzら,Science 240:1759,(1988)）、それ以来、多種多様なタンパク質に見いだされている。既知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化する天然ペプチドおよびその誘導体がある。本発明の可溶性多量体タンパク質を製造するのに適したロイシンジッパードメインの例は、参考文献として本明細書に組み込まれるPCT出願WO94/10308に記載されているものである。溶解した状態で二量体化または三量体化するポリペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞で発現させ、得られた可溶性多量体融合タンパク質を当技術分野で知られる技術を使って培養上清から回収する。
【０８００】
本発明の三量体ポリペプチドにより、生物学的活性の増加という利点が得られるかもしれない。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、優先的に三量体を形成するものである。一つの例は、参考文献として本明細書の一部を構成するHoppeら（FEBS Letters 344:191,(1994)）および米国特許出願第08/446,922号に記載されている肺サーファクタントタンパク質D（SPD）由来のロイシンジッパーである。本発明の三量体ポリペプチドの製造には、天然三量体タンパク質に由来する他のペプチドを利用してもよい。
【０８０１】
もう一つの例として、本発明のタンパク質は、Flag（登録商標）ポリペプチド配列を含む本発明の融合タンパク質に含まれるFlag（登録商標）ポリペプチド配列間の相互作用によって会合する。さらにもう一つの態様として、本発明の会合タンパク質は、本発明のFlag（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列と抗Flag（登録商標）抗体との相互作用によって会合する。
【０８０２】
本発明の多量体は、当技術分野で知られる化学技術を使って製造することができる。例えば、本発明の多量体に含めようとするポリペプチドを、リンカー分子および当技術分野で知られるリンカー分子長最適化技術を使って、化学的に架橋することができる（例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する米国特許第5,478,925号などを参照されたい）。さらに本発明の多量体は、当技術分野で知られる技術を使って、多量体に含めようとするするポリペプチドの配列内にあるシステイン残基間に1つまたは複数の分子間架橋を形成させることによって、製造することもできる（例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する米国特許第5,478,925号などを参照されたい）。さらに本発明のポリペプチドは、常法により、ポリペプチドのC末端またはN末端へのシステインまたはビオチンの付加によって修飾し、当技術分野で知られる技術を応用して、これら修飾ポリペプチドの1つまたは複数を含む多量体を生成させることもできる（例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する米国特許第5,478,925号などを参照されたい）。また、当技術分野で知られている技術を応用して、本発明の多量体に含めようとするポリペプチド成分を含むリポソームを製造してもよい（例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する米国特許第5,478,925号などを参照されたい）。
【０８０３】
別法として、当技術分野で知られる遺伝子操作技術を使って、本発明の多量体を製造することもできる。一態様として、本発明の多量体に含まれるポリペプチドを、本明細書に記載のまたは当技術分野で知られる他の融合タンパク質技術を使って組換え生産する（例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する米国特許第5,478,925号などを参照されたい）。具体的一態様として、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列にライゲートし、さらに、そのポリペプチドの翻訳産物を元のC末端からN末端（リーダー配列を除く）に向けて逆向きにコードする合成ポリヌクレオチドにライゲートすることにより、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドを作製する（例えば参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する米国特許第5,478,925号などを参照されたい）。もう一つの態様として、本明細書に記載のまたは当技術分野で知られる他の組換え技術を応用して、膜貫通ドメイン（または疎水ペプチドもしくはシグナルペプチド）を含み膜再構成技術によってリポソームに組み込むことができる本発明の組換えポリペプチドを製造する（例えば参考文献として本明細書の一部を構成する米国特許第5,478,925号などを参照されたい）。
【０８０４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドを、「人工」またはキメラプロモーターおよび転写因子に、作動可能な形で連結することもできるだろう。具体的には、人工プロモーターは、トランス作用転写因子によって認識されるシス作用DNA配列要素の任意の組み合わせを含むか、あるいはそのような組合わせからなることができるだろう。シス作用DNA配列要素およびトランス作用転写因子は哺乳動物で作動できることが好ましい。さらに、そのような「人工」プロモーターのトランス作用因子は、それ自体が「人工」またはキメラ設計であってもよく、前記「人工」プロモーターに対して活性化因子または抑制因子として作用することができるだろう。
【０８０５】
ポリヌクレオチドの用途
本明細書に記載する各ポリヌクレオチドは、試薬として、数多くの方法で使用することができる。以下の説明は代表例であると見なすべきであり、既知の技術を利用する。
【０８０６】
本発明のポリヌクレオチドは染色体同定に役立つ。現在利用できる実際の配列データ（リピート多型）に基づく染色体マーキング試薬はほとんどないので、新しい染色体マーカーは、今現在も必要とされている。本発明の各ポリヌクレオチドは染色体マーカーとして使用することができる。
【０８０７】
簡単に述べると、配列番号Xに示す配列からPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を作製することにより、配列を染色体にマッピングすることができる。コンピュータ解析を使ってプライマーを選択することにより、そのプライマーがゲノムDNA中の2以上の予想エクソンにまたがらないようにすることができる。次に、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞雑種のPCRスクリーニングに使用する。配列番号Xに相当するヒト遺伝子を含む雑種だけが増幅断片を与えるだろう。
【０８０８】
また、体細胞雑種は、ポリヌクレオチドを特定染色体にPCRマッピングする迅速な方法を提供する。1台のサーマルサイクラーを使って1日に3個以上のクローンを割り当てることができる。さらに、ポリヌクレオチドのサブローカリゼーション（sublocalization）も、特定染色体断片のパネルを使って達成することができる。使用することができる他の遺伝子マッピング法には、インサイチューハイブリダイゼーション、フローソーティングされた標識染色体によるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択などがある。
【０８０９】
ポリヌクレオチドの正確な染色体位置も、中期染色体スプレッドの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）を使って得ることができる。この技術ではわずか500〜600塩基程度のポリヌクレオチドを使用するが、2,000〜4,000bpのポリヌクレオチドが好ましい。この技術の概要については、Vermaら「Human Chromosomes：A Manual of Basic Techniques」Pergamon Press,ニューヨーク（1988）を参照されたい。
【０８１０】
染色体マッピングには、ポリヌクレオチドを個別に使用するか（単一の染色体またはその染色体上の単一の部位をマークするため）、またはパネルとして使用することができる（複数の部位および/または複数の染色体をマークするため）。好ましいポリヌクレオチドはcDNAの非コード領域に相当する。なぜならコード配列の方が遺伝子ファミリー内で保存されている可能性が高いため、染色体マッピング中にクロスハイブリダイゼーションが起こる可能性が高くなるからである。
【０８１１】
ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマッピングされたら、そのポリヌクレオチドの物理的位置を連鎖解析に使用することができる。連鎖解析により、染色体位置と特定疾患の表出との同時遺伝が確定される。疾患マッピングデータは当技術分野では知られている。マッピング解像度が1メガ塩基で、20kbにつき1遺伝子であると仮定すると、疾患に関係するある染色体領域に正確に局在するcDNAは、50〜500個の潜在的原因因子の一つでありうる。
【０８１２】
したがって、同時遺伝が確定されたら、罹患生物と非罹患生物の間で、ポリヌクレオチドおよび対応する遺伝子の相違を調べることができる。まず、染色体中の目に見える構造変化、例えば欠失または転座などを、染色体スプレッドで、PCRによって調べる。構造変化が存在しない場合は、点突然変異の存在を確かめる。罹患生物の一部または全部に観察されるが、正常生物には観察されない突然変異は、その突然変異が疾患の原因であるかもしれないことを示す。しかし、その突然変異を多型と区別するには、ポリペプチドおよび対応する遺伝子の完全な配列決定が必要である。新しい多型が同定されたら、この多型ポリペプチドを、さらなる連鎖解析に使用することができる。
【０８１３】
非罹患生物と比較した罹患生物における遺伝子発現の増加または減少を、本発明のポリヌクレオチドを使って評価することができる。これらの変化（発現の変化、染色体再編成、または突然変異）はいずれも診断マーカーまたは予後マーカーとして使用することができる。
【０８１４】
したがって本発明は、障害の診断に役立つ診断方法であって、細胞または体液における本発明ポリヌクレオチドの発現レベルを測定し、測定された遺伝子発現レベルを標準的レベルのポリヌクレオチド発現レベルと比較することを含み、標準と比較した場合の遺伝子発現レベルの増加または減少が障害を示す方法も提供する。
【０８１５】
「本発明ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する」とは、第1生物学的試料中の本発明ポリペプチドのレベルまたは本ポリペプチドをコードするmRNAのレベルを直接的に（例えば絶対タンパク質レベルまたはmRNAレベルを決定または推定することなどによって）、または相対的に（例えば第2生物学的試料中のポリペプチドレベルまたはmRNAレベルと比較することによって）、定性的または定量的に測定または推定することを意味する。好ましくは、第1生物学的試料中のポリペプチドレベルまたはmRNAレベルを測定または推定し、標準的ポリペプチドレベルまたはmRNAレベルと比較する。標準は、当該障害を持たない個体から得た第2の生物学的試料から採取するか、障害を持たない生物の集団から得られるレベルを平均することによって決定される。当技術分野では理解されるであろうように、標準的なポリペプチドレベルまたはmRNAレベルがわかったら、比較にはそれを標準として繰り返して使用することができる。
【０８１６】
「生物学的試料」とは、本発明のポリペプチドまたはmRNAを含む生物、体液、細胞株、組織培養または他の供給源から得られる任意の生物学的試料を意味する。上述のように、生物学的試料には、本発明のポリペプチドを含む体液（例えば喀痰、羊水、尿、唾液、母乳、分泌物、間質液、血液、血清、脊髄液などが挙げられるが、これらに限らない）、および本発明のポリペプチドを発現させることがわかった他の組織供給源が含まれる。生物から組織生検および体液を得る方法は当技術分野ではよく知られている。生物学的試料がmRNAを含むべき場合、組織生検は好ましい供給源である。
【０８１７】
上述の方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドが固形支持体に取付けられている診断方法および/またはキットに応用することができる。代表的な一方法として、支持体は、米国特許第5,837,832号、第5,874,219号および第5,856,174号に記載の.「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であることができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドが取付けられているそのような遺伝子チップは、試験対象から単離したポリヌクレオチドを使ってポリヌクレレオチド配列間の多型を同定するためにも使用することができる。そのような多型（すなわちそれらの存在ならびにそれらの位置）に関する知見は、増殖性の疾患および状態を含む多くの障害の疾患座位の同定に有益だろう。そのような方法は米国特許第5,858,659号および第5,856,104号に記載されている。上述の米国特許は参考文献として本明細書の一部を構成する。
【０８１８】
本発明は、化学的に合成された、またはペプチド核酸（PNA）として再現された、または当技術分野で知られる他の方法によって再現された、本発明のポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドを固形支持体または遺伝子チップ上に組み込む場合、PNAの使用は、好ましい形態として役立つだろう。本発明において、ペプチド核酸（PNA）とは、ポリアミド型のDNA類似体であり、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンのモノマー単位が市販されている（Perceptive Biosystems）。DNAの特定の成分、例えばリン、酸化リン、またはデオキシリボース誘導体は、PNA中には存在しない。P.E.Nielsen,M.Egholm,R.H.BergおよびO.Buchardt,Science 254,1497(1991)；ならびにM.Egholm,O.Buchardt,L.Christensen,C.Behrens,S.M.Freier,D.A.Driver,R.H.Berg,S.K.Kim,B.Norden,およびP.E.Nielsen,Nature 365,666(1993)に開示されているように、PNAは相補的DNA鎖に特異的かつ強固に結合し、ヌクレアーゼによって分解されない。実際、PNAはDNAそのものよりも強くDNAに結合する。これはおそらく、静電気的反発が2つの鎖間になく、ポリアミド主鎖の方が可撓性に富むからだろう。このため、PNA/DNA二本鎖は、DNA/DNA二本鎖よりも広範囲にわたるストリンジェンシー条件で結合し、マルチプレックスハイブリダイゼーションを行ないやすくする。PNA:DNAハイブリッドの結合特性は強くなっているので、DNAの場合よりも小さいプローブを使用することができる。また、PNA/DNAハイブリダイゼーションでは一塩基ミスマッチを決定することができる可能性が高いと思われる。なぜなら、PNA/DNA15マー中にミスマッチが一つあると融点（Tm）は8℃〜20℃低下するのに対して、DNA/DNA15マー二本鎖の場合はこの低下が4℃〜16℃だからである。また、PNAには荷電基が存在しないことから、ハイブリダイゼーションを低イオン強度で行ない、解析中に起こりうる塩の干渉を減らすことができる。
【０８１９】
上記に加えて、三重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAによる遺伝子発現の制御に、ポリヌクレオチドを使用することもできる。アンチセンス技術は、例えばOkano,J.Neurochem.56:560(1991)；「Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression」（CRC Press,フロリダ州ボカラトン,1988）などで論じられている。三重らせん形成は、例えばLeeら,Nucleic Acids Research 6:3073(1979)；Cooneyら,Science 241:456(1988)；およびDervanら,Science 251:1360(1991)などで論じられている。どちらの方法も、相補的DNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に頼っている。これらの技術では、好ましいポリヌクレオチドは通常20〜40塩基長であり、転写に関与する遺伝子の領域（三重らせん−Leeら,Nucl.Acids Res.6:3073(1979)；Cooneyら,Science 241:456(1988)；およびDervanら,Science 251:1360(1991)）またはmRNA自体（アンチセンス−Okano,J.Neurochem.56:560(1991)；「Oligodeoxy-nucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression」（CRC Press,フロリダ州ボカラトン,1988））に相補的である。三重らせん形成は、最適な場合、DNAからのRNA転写を遮断し、一方、アンチセンスRNAハイブリダイゼーションは、mRNA分子がポリペプチドに翻訳されるのを遮断する。どちらの技術もモデル系で有効であり、疾患を処置または予防するための努力として、アンチセンスまたは三重らせんポリヌクレオチドを設計するために、本明細書に開示する情報を利用することができる。
【０８２０】
本発明は、本発明のオリゴヌクレチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんオリゴヌクレオチド、リボザイム、PNAオリゴヌクレオチドおよび/またはポリヌクレオチドのいずれかの5'末端もしくは3'末端または任意の位置に作動可能な形で連結される核局在化シグナルの付加を包含する。例えば、参考文献として本明細書の一部を構成するG.Cutronaら,Nat.Biotech.,18:300-303,(2000)を参照されたい。
【０８２１】
本発明のポリヌクレオチドは遺伝子治療にも役立つ。遺伝子治療の目標の一つは、遺伝的欠陥を矯正する試みとして、欠陥遺伝子を持つ生物に正常な遺伝子を挿入することである。本発明に開示するポリヌクレオチドは、そのような遺伝的欠陥を極めて正確にターゲティングする手段となる。もう一つの目標は、宿主ゲノムには存在していなかった新しい遺伝子を挿入し、よって宿主細胞に新しい形質を与えることである。一例として、本発明のポリヌクレオチド配列を使って、その配列に相当するキメラRNA/DNAオリゴヌクレオチドであって、例えば全身注射すると、ある生物において宿主細胞ミスマッチ修復機構を誘導するように特別に設計されたものを構築することができる（Bartlett,R.J.ら,Nat.Biotech,18:615-622(2000)；この論文は参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成する）。このようなRNA/DNAオリゴヌクレオチドは、ある種の宿主株の遺伝的欠陥が矯正されるように、そして/またはその宿主に所望の表現型が導入（例えば、本発明のポリヌクレオチドに相当する内因性遺伝子に、疾患症状および/または障害の改善および/または防止をもたらしうる特定多型が導入）されるように設計することができるだろう。もう一つの選択肢として、本発明のポリヌクレオチド配列を使って、その配列に相当する二重鎖オリゴヌクレオチドであって、ある種の宿主株における遺伝的欠陥が矯正されるように、そして/またはその宿主に望ましい表現型が導入（例えば、本発明のポリヌクレオチドに相当する内因性遺伝子に、疾患症状および/または障害の改善および/または防止をもたらしうる特定多型が導入）されるように、特別に設計されたものを構築してもよい。そのような二重鎖オリゴヌクレオチドの使用方法は当技術分野では知られており、本発明によって包含される（参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するEP1007712を参照されたい）。
【０８２２】
本ポリヌクレチドはわずかな生物学的試料から生物を同定するためにも役立つ。例えば米国軍はその人員の同定に制限断片長多型（RFLP）を利用することを検討している。この技術では、個人のゲノムDNAを1つまたは複数の制限酵素で消化し、サザンブロット上でプローブして、人員を同定するためのユニークなバンドを得る。この方法には、失われたり、入れ替わったり、盗まれたりして肯定的な同定が困難になる可能性がある現行の「認識票（Dog Tag）」の弱点がない。本発明のポリヌクレオチドは新たなRFLP用DNAマーカーとして利用することができる。
【０８２３】
本発明のポリヌクレオチドは、ある生物のゲノムの選択した部分の実際のDNA配列を塩基単位で決定することによって、RFLPの代替物として使用することもできる。これらの配列は、選択した上記DNAを増幅し単離するためのPCRプライマーの作製に使用することができ、そのようにして得られたDNAを配列決定することができる。各生物はユニークなDNA配列セットを持つだろうから、この技術を使って、生物を同定することができる。ある生物に関してユニークなIDデータベースが確立されたら、その生物が生きていようと死んでいようと、極めて小さい組織試料から、その生物の肯定的な同定を行なうことができる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、形質転換または非形質転換細胞および/または組織の同定の他、多型マーカーとしても使用することができる。
【０８２４】
特定組織の供給源を同定することができる試薬も必要とされている。そのような必要は、例えば由来のわからない組織が与えられた時などに生じる。適当な試薬は、例えば本発明の配列から作製された特定組織に特異的なDNAプローブまたはプライマーを含むことができる。そのような試薬のパネルを使って、種および/または器官タイプによる組織の同定を行なうことができる。同様にして、これらの試薬を使って、組織培養物を汚染に関してスクリーニングすることもできる。さらに、上述のように、そのような試薬は、形質転換および/または非形質転換細胞および/または組織をスクリーニングおよび/または同定するためにも使用することができる。
【０８２５】
少なくとも、本発明のポリヌクレオチドは、サザンゲルでの分子量マーカーとして、また特定の細胞タイプにおける特定mRNAの存在に関する診断プローブとして、また新規ポリヌクレオチドを発見する過程で既知配列を「サブトラクトアウト（subtract-out）」するためのプローブとして、また「遺伝子チップ」または他の支持体に取付けるためのオリゴマーを選択し作製するために、またDNA免疫技術を使って抗DNA抗体を生じさせるために、また免疫応答を誘発するための抗原として、使用することができる。
【０８２６】
ポリペプチドの用途
本明細書に記載する各ポリペプチドは数多くの方法で使用することができる。以下の説明は代表例であると見なすべきであり、既知の技術を利用する。
【０８２７】
本発明のポリペプチドは、抗体に基づく技術を使って生物学的試料中のタンパク質レベルをアッセイするのに利用することができる。例えば、組織におけるタンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法で研究することができる（Jalkanen,M.ら,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen,M.ら,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987)）。タンパク質遺伝子発現の検出に有用な、抗体に基づく他の方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）などのイムノアッセイが挙げられる。適切な抗体アッセイラベルは当技術分野では知られており、例えばグルコースオキシダーゼなどの酵素ラベル、ヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）およびテクネチウム（99Tc）などの放射性同位体、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光ラベル、ならびにビオチンなどが挙げられる。
【０８２８】
生物学的試料中のタンパク質レベルのアッセイに加えて、撮像法によって生体内でタンパク質を検出することもできる。タンパク質のインビボ撮像用の抗体ラベルまたはマーカーとしては、X線撮影法、NMR、またはESRによって検出することができるものが挙げられる。X線撮影法の場合は、適切なラベルとして、検出可能な放射線を放出するが測定対象に明白な害は及ぼさないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位体が挙げられる。NMRおよびESRに適したマーカーとしては、検出可能な特徴的スピンを持ち（例えば重水素）、関連ハイブリドーマに与える栄養素を標識することによって抗体中に組み込むことができるものが挙げられる。
【０８２９】
適当な検出可能撮像成分、例えば放射性同位体（131I、112In、99mTcなど）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴法によって検出できる物質などで標識されたタンパク質特異的抗体または抗体断片を、哺乳動物に（例えば非経口的投与、皮下投与または腹腔内投与によって）導入する。対象のサイズおよび使用する撮像システムが、診断画像を得るのに必要な撮像成分の量を決定することは、当技術分野では理解されるだろう。放射性同位体成分を使用する場合、注射される放射能の量は、ヒト対象では、通常、99mTc約5〜20ミリキュリーの範囲になるだろう。標識された抗体または抗体断片は、次いで、特異的タンパク質を含む細胞部位に優先的に蓄積するだろう。インビボ腫瘍撮像法については、S.W.BurchielおよびB.A.Rhodes編「Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer」（Masson Publishing Inc.,1982）の第13章、S.W.Burchielら著「放射性標識抗体およびその断片の免疫薬物動態学（Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments）」に記載されている。
【０８３０】
したがって本発明は、（a）ある個体の細胞または体液における本発明ポリペプチドの発現をアッセイし、（b）その遺伝子発現のレベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較することを含み、標準的発現レベルと比較した場合の、アッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、障害を示すという方法を提供する。癌の場合、ある個体から得た生検組織中に比較的多量の転写物が存在することは、その疾患の発症に対する素因を示すのかもしれない。あるいは、そのような存在は、実際に臨床症状が出現する前にその疾患を検出するための手段になるかもしれない。より確定的なこのタイプの診断により、医療従事者は、予防措置または積極的処置をより早く施し、よって癌の発症またはさらなる進行を防止することが可能になるだろう。
【０８３１】
さらに本発明のポリペプチドは、疾患の処置、予防および/または診断に使用することができる。例えば、本ポリペプチド（例えばインスリン）の不在またはレベルの低下を補うこと、異なるポリペプチド（ヘモグロビンS、ヘモグロビンB、SOD、カタラーゼ、DNA修復タンパク質）の不在またはレベルの低下を補充すること、ポリペプチド（例えば癌遺伝子または腫瘍抑制因子）の活性を阻害すること、ポリペプチドの活性を（例えば受容体への結合によって）活性化すること、膜結合型受容体の活性を、遊離のリガンドに関してそれと競合させることによって低下させること（例えば炎症の軽減に使用される可溶性TNF受容体）、または所望の反応（例えば血管成長阻害、増殖細胞または増殖組織に対する免疫応答の増進）をもたらすことを目指して、患者に本発明のポリペプチドを投与することができる。
【０８３２】
同様に、本発明のポリペプチドに対する抗体も、疾患の処置、予防および/または診断に使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体を投与することにより、ポリペプチドを結合し、ポリペプチドの過剰産生を減少させることができる。また、抗体の投与により、例えば膜に結合したポリペプチド（受容体）への結合などによって、ポリペプチドを活性化することもできる。
【０８３３】
少なくとも、本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法により、SDS-PAGEゲルまたはモレキュラーシーブゲル濾過カラムで、分子量マーカーとして使用することができる。ポリペプチドは抗体を産生させるためにも使用することができ、その抗体を使って、宿主細胞の形質転換を評価する一方法として、組換え細胞からのタンパク質発現を測定することができる。さらに、本発明のポリペプチドは、下記の生物学的活性を試験するためにも使用することができる。
【０８３４】
遺伝子治療法
本発明のもう一つの側面は、障害、疾患および状態を処置または予防するための遺伝子治療法に関する。本遺伝子治療法は、本発明のポリペプチドを発現させるための、動物への核酸（DNA、RNAおよびアンチセンスDNAまたはRNA）配列の導入に関する。この方法には、プロモーターおよび標的組織による本ポリペプチドの発現に必要な他の任意の遺伝要素に作動可能な形で連結された、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが必要である。そのような遺伝子治療および遺伝子送達技術は当業者には知られており、例えば参考文献として本明細書の一部を構成するWO90/11092などを参照されたい。
【０８３５】
したがって、例えば、患者から得た細胞を、エクスビボで、本発明のポリヌクレオチドに作動可能な形で連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）を使って操作し、次に、操作された細胞をそのポリペプチドで処置しようとする患者に与えることができる。そのような方法は当技術分野では周知である。例えば、参考文献として本明細書の一部を構成するBelldegrunら,J.Natl.Cancer Inst.,85:207-216(1993)；Ferrantiniら,Cancer Research,53:107-1112 (1993); Ferrantiniら,J.Immunology 153:4604-4615(1994)；Kaido,T.ら,Int.J.Cancer 60:221-229(1995)；Oguraら,Cancer Research 50:5102-5106(1990)；Santodonatoら,Human Gene Therapy 7:1-10(1996)；Santodonatoら,Gene Therapy 4:1246-1255(1997)；ならびにZhangら,Cancer Gene Therapy 3:31-38(1996)などを参照されたい。一態様として、操作される細胞は、動脈細胞である。動脈細胞は動脈もしくは動脈を取り巻く組織への直接注射によって、またはカテーテル注入によって患者に再導入することができる。
【０８３６】
以下に詳述するように、ポリヌクレオチドコンストラクトは、動物の細胞に注射可能な物質を送達する任意の方法によって、例えば組織（心臓、筋、皮膚、肺、肝臓など）の間質腔への注射などによって送達することができる。ポリヌクレオチドコンストラクトは、医薬的に許容できる液体または水性担体に入れて送達することができる。
【０８３７】
一態様として、本発明のポリヌクレオチドを、裸のポリヌクレオチドとして送達する。「裸の」ポリヌクレオチド、DNAまたはRNAという用語は、細胞への進入を補助し、促進し、または容易にする作用を果たす送達ビヒクル、例えばウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含まない配列を指す。しかし、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法で製造することができるリポソーム製剤およびリポフェクチン製剤などに入れて送達することもできる。そのような方法は、例えば参考文献として本明細書の一部を構成する米国特許第5,593,972号、第5,589,466号、および第5,580,859号に記載されている。
【０８３８】
遺伝子治療法で使用される本発明のポリヌクレオチドベクターコンストラクトは、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含まないコンストラクトである。適当なベクターには、Stratageneから入手できるpWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTIおよびpSG；Pharmaciaから入手できるpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL；ならびにInvitrogenから入手できるpEF1/V5、pcDNA3.1、およびpRc/CMV2などがある。他の適切なベクターは当業者には明白だろう。
【０８３９】
当業者に知られている強力なプロモーターはいずれも本発明ポリヌクレオチド配列を発現させるために使用することができる。適切なプロモーターには、アデノウイルス後期プロモーターなどのアデノウイルスプロモーター、またはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターなどの異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（RSV）プロモーター；MMTプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどの誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロブリンプロモーター；単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスLTR；β-アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターなどがある。プロモーターは本発明のポリヌクレオチドの天然プロモーターであってもよい。
【０８４０】
他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入することの一つの大きな利点は、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性である。非複製DNA配列を細胞に導入して、所望のポリペプチドを最高6ヶ月の期間にわたって産生させうることが、研究によって示されている。
【０８４１】
本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、筋、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織などを含む動物内組織の間質腔に送達することができる。組織の間質腔には、細胞間液、器官組織の格子線維に囲まれたムコ多糖マトリックス、管壁または房壁の弾性線維、線維組織のコラーゲン線維、または筋細胞を包む結合組織内もしくは骨の陥凹内の同じマトリックスが含まれる。またこれは、循環系の血漿およびリンパ管のリンパ液によって占められた空間でもある。筋組織の間質腔への送達は、以下に述べる理由から好ましい。本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは、これらの細胞を含む組織への注射によって、便利に送達することができる。本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを、好ましくは、分化した永続的非分裂細胞に送達し、そこで発現させる。ただし、送達と発現は、非分化細胞または不完全に分化した細胞、例えば血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞などでも達成することができる。インビボ筋細胞はポリヌクレオチドを取り込んで発現させる能力が特に高い。
【０８４２】
裸の核酸配列を注射する場合、有効量のDNAまたはRNAは、約0.05mg/kg体重〜約50mg/kg体重の範囲だろう。好ましくは、投与量は約0.005mg/kg〜約20mg/kg、より好ましくは約0.05mg/kg〜約5mg/kgの範囲だろう。もちろん、この投与量が注射する組織部位によって変動することは、当業者には理解されるだろう。核酸配列の適切で有効な用量は当業者が容易に決定することができ、処置される状態および投与経路に依存するだろう。
【０８４３】
好ましい投与経路は、組織の間質腔への注射という非経口経路による投与である。しかし、例えば肺または気管支組織、喉または鼻の粘膜への送達には特にエアゾル製剤の吸入など、他の非経口経路も使用することができる。さらに、裸のDNAコンストラクトは、血管形成術中に、手術に使用しているカテーテルによって、動脈に送達することもできる。
【０８４４】
裸のポリヌクレオチドは、例えば送達部位への直接針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、いわゆる「遺伝子銃」を含む（ただしこれらに限らない）、当技術分野で知られる任意の方法によって送達される。
【０８４５】
コンストラクトは、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、沈殿剤などの送達ビヒクルを使って送達してもよい。そのような送達方法は当技術分野では知られている。
【０８４６】
一部の態様では、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトをリポソーム調製物中で複合体化させる。本発明で使用されるリポソーム調製物には、カチオン性（正に荷電）、アニオン性（負に荷電）および中性調製物が含まれる。しかし、カチオン調製物は特に好ましい。なぜなら、カチオン性リポソームとポリアニオン性の核酸との間に、強固な荷電複合体を形成させることができるからである。カチオン性リポソームは、機能的な形態のプラスミドDNA（Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7416(1987)；この論文は参考文献として本明細書の一部を構成する）、mRNA（Maloneら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6077-6081(1989)；この論文は参考文献として本明細書の一部を構成する）、および精製された転写因子（Debsら,J.Biol.Chem.,265:10189-10192(1990)；この論文は参考文献として本明細書の一部を構成する）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０８４７】
カチオン性リポソームは容易に入手できる。例えば、N[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム（DOTMA）リポソームは特に有用であり、GIBCO BRL（ニューヨーク州グランドアイランド）からリポフェクチン（Lipofectin）の商標で販売されている（参考文献として本明細書の一部を構成するFelgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7416(1987)も参照されたい）。他の市販のリポソームには、トランスフェクテイス（transfectace）（DDAB/DOPE）およびDOTAP/DOPE（Boehringer）などがある。
【０８４８】
他のカチオン性リポソームは、容易に入手できる物質から、当技術分野で周知の技術を使って製造することができる。例えば、DOTAP（1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)リポソームの合成については、PCR公開第WO90/11092号（参考文献として本明細書の一部を構成する）を参照されたい。DOTMAリポソームの製造は文献に説明されている。例えば、参考文献として本明細書の一部を構成するFelgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417を参照されたい。同様の方法を使って、他のカチオン性脂質材料からリポソームを製造することもできる。
【０８４９】
同様に、アニオン性および中性リポソームも、例えばAvanti Polar Lipids（アラバマ州バーミングハム）などから容易に入手できるか、または容易に入手できる材料を使って容易に製造することができる。そのような材料には、例えばホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）などがある。これらの材料はDOTMAおよびDOTAP出発物質と適当な比率で混合することもできる。これらの材料を使ってリポソームを製造する方法は当技術分野ではよく知られている。
【０８５０】
例えば市販のジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）を様々な組み合わせで使用して、コレステロールが添加されたまたはコレステロールが添加されていない通常のリポソームを製造することができる。したがって、例えば、DOPG/DOPC小胞は、各50mgのDOPGおよびDOPCを、超音波処理バイアルへの窒素気流下で乾燥させることによって製造することができる。この試料を減圧ポンプ下に一晩置いた後、翌日脱イオン水で水和する。次に、倒立カップ型（槽タイプ）プローブ（inverted cup (bath type) probe）を装着したHeat Systems350型ソニケーターを使用し、最大の設定で、槽を15℃で循環しながら、その試料を蓋付きバイアル中で2時間超音波処理する。もう一つの選択肢として、負に荷電した小胞を、マルチラメラ小胞を得るために超音波処理なしで製造するか、または離散したサイズを持つユニラメラ小胞を得るためにヌクレオポア膜を通した押出によって製造することもできる。当業者には他の方法も知られており、利用することができる。
【０８５１】
リポソームは、マルチラメラ小胞（MLV）、小さいユニラメラ小胞（SUV）または大きいユニラメラ小胞（LUV）からなることができ、SUVが好ましい。当技術分野で周知の方法を用いて、様々なリポソーム-核酸複合体が調製される。例えば、参考文献として本明細書の一部を構成するStraubingerら,Methods of Immunology,101:512-527(1983)を参照されたい。例えば、核酸を含むMLVは、ガラス管の壁にリン脂質の薄層を沈着させた後、封入しようとする物質の溶液でそれを水和することによって製造することができる。SUVは、MLVの超音波処理を延長して、ユニラメラリポソームの均一な集団を得ることによって製造される。予め形成しておいたMLVの懸濁液に、封入しようとする物質を添加した後、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使用する場合は、乾燥脂質薄膜を適当な溶液に、滅菌水または等張緩衝液（例えば10mM Tris/NaCl）などに再懸濁し、超音波処理した後、予め形成されたリポソームをDNAと直接混合する。正に荷電したリポソームがカチオン性DNAに結合するため、このリポソームとDNAとは極めて安定な複合体を形成する。SUVは小さい核酸断片に役立つ。LUVは当技術分野で知られる数多くの方法によって製造される。一般に使用される方法には、Ca2+-EDTAキレート化（Papahadjopoulosら,Biochim.Biophys.Acta,394:483(1975)；Wilsonら,Cell,17:77(1979)）；エーテル注入（Deamerら,Biochim.Biophys.Acta.443:629(1976)；Ostroら,Biochem.Biophys.Res.Commun.,76:836(1977)；Fraleyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348(1979)）；洗剤透析（Enochら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:145(1979)）；および逆相エバポレーション（REV）（Fraleyら,J.Biol.Chem.,255:10431(1980)；Szokaら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:145(1978)；Schaefer-Ridderら,Science,215:166(1982)）などがあり、これらの論文は参考文献として本明細書の一部を構成する。
【０８５２】
一般に、DNAとリポソームの比は約10：1〜約1：10だろう。好ましくは、この比は約5：1〜約1：5だろう。より好ましくは、この比は約3：1〜1：3だろう。さらに好ましくは、この比は約1：1だろう。
【０８５３】
米国特許第5,676,954号（参考文献として本明細書の一部を構成する）には、カチオン性リポソーム担体と複合体化した遺伝物質のマウスへの注射に関する報告がなされている。米国特許第4,897,355号、第4,946,787号、第5,049,386号、第5,459,127号、第5,589,466号、第5,693,622号、第5,580,859号、第5,703,055号、および国際公開第94/9469号（これらは参考文献として本明細書の一部を構成する）には、DNAを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に使用されるカチオン性脂質が記載されている。米国特許第5,589,466、第5,693,622号、第5,580,859号、第5,703,055号、および国際公開第94/9469号（これらは参考文献として本明細書に一部を構成する）には、DNA-カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法が記載されている。
【０８５４】
ある態様では、本発明のポリペプチドをコードする配列を持つRNAを含んでいるレトロウイルス粒子を使って、細胞を、エクスビボまたはインビボで操作する。レトロウイルスプラスミドベクターを得ることができるレトロウイルスには、例えばモロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０８５５】
レトロウイルスプラスミドベクターを使って、産生細胞株が形成されるように、パッケージング細胞株の形質導入を行なう。トランスフェクトすることができるパッケージング細胞の例には、参考文献としてそのまま本明細書の一部を構成するMiller,Human Gene Therapy,1:5-14(1990)に記載されているPE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14X、VT19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAml2、およびDAN細胞株などがあるが、これらに限らない。ベクターは、当技術分野で知られる任意の手段によって、パッケージング細胞に形質導入することができる。そのような手段には、例えばエレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO4沈殿などがあるが、これらに限らない。これに代わる一方法として、レトロウイルスをリポソームに封入するか脂質にカップリングし、それを宿主に投与してもよい。
【０８５６】
産生細胞株は、本発明のポリヌクレチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次に、そのようなレトロウイルスベクター粒子を使って真核細胞の形質導入を、インビトロで、またはインビボで、行なうことができる。形質導入された真核細胞は本発明のポリペプチドを発現させるだろう。
【０８５７】
他の一部の態様では、アデノウイルスベクターに含まれた本発明のポリヌクレオチドを使って、細胞を、エクスビボで、またはインビボで操作する。アデノウイルスは、本発明のポリペプチドをコードし、それを発現させるように、また同時に、正常な溶解性ウイルス生活環で複製する能力に関して不活化されるように、操作することができる。アデノウイルス発現は宿主細胞染色体へのウイルスDNAの組込みを伴わずに起こるので、挿入突然変異誘発に関する懸念が軽減される。さらに、アデノウイルスは長年にわたって生経腸ワクチンとして使用され、優れた安全性プロファイルを示している（Schwartzら,Am.Rev.Respir.Dis.,109:233-238(1974)）。最後に、アデノウイルスが媒介する遺伝子導入は、コトンラットの肺へのアルファ-1-アンチトリプシンおよびCFTRの導入を含む数多くの例で実証されている（Rosenfeldら,Science,252:431-434(1991)；Rosenfeldら,Cell,68:143-155(1992)）。さらに、アデノウイルスがヒト癌の原因物質であることを証明しようと試みた広範囲にわたる研究はいずれも陰性だった（Greenら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:6606(1979)）。
【０８５８】
本発明に役立つ適切なアデノウイルスベクターは、例えば参考文献として本明細書の一部を構成するKozarskyおよびWilson,Curr.Opin.Genet.Devel.,3:499-503(1993)；Rosenfeldら,Cell,68:143-155(1992)；Engelhardtら,Human Genet.Ther.,4:759-769(1993)；Yangら,Nature Genet.,7:362-369(1994)；Wilsonら,Nature,365:691-692(1993)；ならびに米国特許第5,652,224号などに記載されている。例えば、アデノウイルスベクターAd2は有用であり、ヒト293細胞中で生育することができる。これらの細胞はアデノウイルスのE1領域を含み、E1aおよびE1bを構成的に発現させる。発現されたE1aおよびE1bは、ベクターから削除されているこれらの遺伝子の産物を提供することにより、欠損アデノウイルスを補完する。Ad2だけでなく、アデノウイルスの他の変異体（例えばAd3、Ad5およびAd7）も本発明に役立つ。
【０８５９】
好ましくは、本発明で使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である。複製欠損性アデノウイルスは、感染性粒子を形成するのに、ヘルパーウイルスおよび/またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは細胞に感染する能力を持ち、プロモーターに作動可能な形で連結された興味あるポリヌクレオチドを発現させることができるが、ほとんどの細胞で、複製することができない。複製欠損性アデノウイルスは、以下の遺伝子の全部または一部の1つまたは複数に欠失を持ちうる：E1a、E1b、E3、E4、E2a、またはL1〜L5。
【０８６０】
他の一部の態様では、アデノ関連ウイルス（AAV）を使って、細胞を、エクスビボで、またはインビボで操作する。AAVは感染性粒子の産生にヘルパーウイルスを必要とする天然の欠損ウイルスである（Muzyczka,Curr.Topics in Microbiol.Immunol.,158:97(1992)）。また、非分裂細胞にそのDNAを組み込みうるいくつかのウイルスの一つでもある。300塩基対しかないAAVを含むベクターは、パッケージされ、組み込まれうるが、外因性DNAのためのスペースは約4.5kbに限られている。そのようなAAVを製造し、使用する方法は、当技術分野では知られている。例えば米国特許第5,139,941、第5,173,414、第5,354,678、第5,436,146、第5,474,935号、第5,478,745号、および第5,589,377号などを参照されたい。
【０８６１】
例えば、本発明での使用に適したAAVベクターは、DNA複製、キャプシド形成、および宿主-細胞統合に必要な全配列を含むだろう。本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドコンストラクトは、例えばSambrookら「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Press（1989））に記載されている方法など、標準的クローニング法を使ってAAVベクターに挿入される。次に、任意の標準的技術、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法などを使って、その組換えAAVベクターをパッケージング細胞にトランスフェクトし、それをヘルパーウイルスに感染させる。適切なヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。パッケージング細胞をトランスフェクトし感染させたら、それらは本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを含む感染性AAVウイルス粒子を産生するだろう。次に、これらのウイルス粒子を使って、エクスビボでまたはインビボで、真核細胞の形質導入を行なう。形質導入された細胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチドコンストラクトを含み、所望の遺伝子産物を発現させるだろう。
【０８６２】
もう一つの遺伝子治療法では、異種制御領域と内因性ポリヌクレオチド配列（例えば興味あるポリペプチド配列をコードするもの）とを相同組換えによって作動可能な形で結合させる（例えば、1997年6月24日に発行された米国特許第5,641,670号；1996年9月26日に公開された国際公開第96/29411号；1994年8月4日に公開された国際公開第94/12650号；Kollerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:8932-8935(1989)；およびZijlstraら,Nature,342:435-438(1989)を参照されたい）。この方法では、標的細胞中に存在するがその細胞では通常発現しないかまたは所望のレベルより低いレベルでしか発現しない遺伝子の活性化が起こる。
【０８６３】
ターゲティング配列に挟まれたプロモーターを含むポリヌクレオチドコンストラクトは、当技術分野で知られる標準的技術を使って作製される。適切なプロモーターは本明細書に記載するものである。ターゲティング配列は、内因性配列に対して、プロモーター-ターゲティング配列と内因性配列との相同組換えが可能になるほど十分な相補性を示す。ターゲティング配列は所望の内因性ポリヌクレオチド配列の5'末端に十分に近いので、相同組換えが起こるとプロモーターが内因性配列に作動可能に連結されるだろう。
【０８６４】
プロモーターおよびターゲティング配列はPCRを使って増幅することができる。増幅されたプロモーターは、好ましくは、5'末端および3'末端に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第1ターゲティング配列の3'末端は、増幅されたプロモーターの5'末端と同じ制限酵素部位を含み、第2ターゲティング配列の5'末端は増幅されたプロモーターの3'末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプロモーターおよびターゲティング配列を消化し、一つにライゲートする。
【０８６５】
プロモーター-ターゲティング配列コンストラクトは、裸のポリヌクレオチドとして、または上に詳述したトランスフェクション促進剤、例えばリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、全ウイルス、リポフェクション、沈殿剤などと組み合わせて、細胞に送達される。Pプロモーター-ターゲティング配列は、例えば直接針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、粒子加速装置など、任意の方法で送達することができる。これらの方法を以下に詳しく説明する。
【０８６６】
プロモーター-ターゲティング配列コンストラクトは細胞に取り込まれる。コンストラクトと内因性配列との間で相同組換えが起こり、内因性配列は前記プロモーターの制御下に置かれる。そして当該プロモーターが内因性配列を発現させることになる。
【０８６７】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、血管由来のタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドと共に投与することができる。血管由来のタンパク質には、例えば酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子、VEGF-1、VEGF-2（VEGF-C）、VEGF-3（VEGF-B）、表皮増殖因子アルファおよびベータ、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子アルファ、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子、および酸化窒素シンターゼなどがあるが、これらに限るわけではない。
【０８６８】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、そのタンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。通例、シグナル配列は、発現させようとするポリヌクレオチドのコード領域中、コード領域の5'末端近く、またはコード領域の5'末端に置かれる。シグナル配列は興味あるポリヌクレオチドに対して同種でも異種でもよく、またトランスフェクトされる細胞に対して同種でも異種でもよい。さらにシグナル配列は、当技術分野で知られる方法を使って、化学合成することができる。
【０８６９】
上記のポリヌクレオチドコンストラクトはいずれも、結果として1または複数の分子が治療効果をもたらすのに十分な量で発現する限り、どのような投与法で投与してもよい。これらの方法には、例えば直接針注射、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティック・インジェクター（biolistic injector）、粒子加速装置（すなわち「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー材料、浸透圧ポンプ（例えばAlzaミニポンプ）、経口用または坐剤用固形（錠剤または丸剤）医薬製剤、および手術中のデカンティング（decanting）または局所適用などがある。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓への裸のリン酸カルシウム沈殿プラスミドの直接注射、または門脈へのタンパク質被覆プラスミドの直接注射により、ラット肝臓での外来遺伝子の遺伝子発現が起こっている（Kanedaら,Science,243:375(1989)）。
【０８７０】
好ましい局所投与法は直接注射による方法である。好ましくは、送達ビヒクルと複合体化した本発明の組換え分子を動脈の当該領域に直接注射によって、または当該領域内に局所的に投与する。動脈の当該領域内に局所的に組成物を投与するとは、動脈内の数センチメーター、好ましくは数ミリメーターの領域に組成物を注射することを表す。
【０８７１】
もう一つの局所投与法は、手術創傷中または手術創傷付近で、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを接触させることである。例えば、患者に手術を施し、創傷内部の組織の表面をポリヌクレオチドコンストラクトで覆うか、または創傷内部の組織の領域にコンストラクトを注射することができる。
【０８７２】
全身投与に役立つ治療組成物には、本発明の標的送達ビヒクルに複合体化した本発明の組換え分子が含まれる。適切な全身投与用送達ビヒクルは、ビヒクルを特定部位にターゲティングするためのリガンドを含むリポソームを含む。
【０８７３】
好ましい全身投与法には、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮（局所）送達が含まれる。静脈内注射は当技術分野で標準的な方法を使って行なうことができる。エアロゾル送達も当技術分野で標準的な技術を使って行なうことができ（例えば、参考文献として本明細書の一部を構成するStriblingら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,189:11277-11281(1992)を参照されたい）。経口送達は、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを、動物の腸内の消化酵素による分解に耐えることができる担体に複合体化することによって行なうことができる。そのような担体の例には、当技術分野で知られているようなプラスチックカプセルまたは錠剤がある。局所送達は、本発明のポリヌクレオチドコンストラクトを、皮膚に浸透することができる親油性試薬（例えばDMSO）と混合することによって行なうことができる。
【０８７４】
送達しようとする物質の有効量の決定は、例えばその物質の化学構造および生物学的活性、その動物の年齢および体重、処置を必要としている正確な状態およびその重症度、ならびに投与経路などを含む数多くの要因に依存しうる。処置の頻度は、1回に投与するポリヌクレオチドコンストラクトの量、投与対象の健康状態および病歴など、数多くの要因に依存する。正確な量、投与回数および投与時期は、担当の医師または獣医が決定することになる。本発明の治療組成物は、どのような動物にも投与することができ、好ましくは哺乳動物および鳥類に投与することができる。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、ヒトは特に好ましい。
【０８７５】
生物学的活性
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または本発明の作動薬もしくは拮抗薬は、1つまたは複数の生物学的活性について試験するためのアッセイに使用することができる。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドが特定のアッセイで活性を示す場合、それらの分子はその生物学的活性に関係する疾患に関与しているかもしれない。したがって、そのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または作動薬もしくは拮抗薬は、その関連する疾患を処置するために使用することができるだろう。
【０８７６】
免疫活性
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、免疫細胞の増殖、分化または遊走（走化性）を活性化または阻害することより、免疫系の疾患、障害および/または状態の処置、予防および/または診断に役立ちうる。免疫細胞は、多能性幹細胞から骨髄系細胞（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）ならびにリンパ系細胞（Bリンパ球およびTリンパ球）を生成させる造血と呼ばれるプロセスを通して発達する。これらの免疫疾患、障害および/または状態の病因は、遺伝性、体細胞性（癌または一部の自己免疫疾患、障害および/または状態など）、後天性（例えば化学療法または毒素によるもの）、または感染性でありうる。さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬を、特定の免疫系疾患または障害のマーカーまたは検出因子（detector）として利用することもできる。
【０８７７】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、造血細胞の疾患、障害および/または状態の処置、予防、および/または診断に役立ちうる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、あるタイプ（または多くのタイプ）の造血細胞の減少と関係する疾患、障害および/または状態を処置または予防する目的で、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増進するために使用することができるだろう。免疫不全症候群の例には、例えば血液タンパク質の疾患、障害および/または状態（例えば無γグロブリン血症、異常γグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調症、分類不能型免疫不全症、ディジョージ症候群、HIV感染症、HTLV-BLV感染症、白血球接着不全症候群、リンパ球減少症、食細胞殺細菌機能不全、重症複合型免疫不全症（SCID）、ウィスコット-オルドリッチ病、貧血、血小板減少症、またはヘモグロビン尿症などがあるが、これらに限らない。
【０８７８】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、止血活性（出血の停止）または血栓溶解活性（凝固形成）を調整するために使用することができるだろう。例えば、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、止血活性または血栓溶解活性を増加させることによって、凝固疾患、障害および/または状態（例えば、フィブリノーゲン欠乏血症(afibrinogenemia)、因子欠乏症(factor deficiencies)、動脈性血栓症(arterial thrombosis)、静脈性血栓症(venous thrombosis)など）、血小板の疾患、障害および/または状態（例えば血小板減少症）、または外傷、手術もしくは他の原因に起因する創傷を治療または予防するために使用することができるだろう。あるいは、止血活性または血栓溶解活性を低下させることができる本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、凝固を阻害または溶解させるために使用することができるだろう。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または作動薬もしくは拮抗薬は、心発作(梗塞)、 卒中、瘢痕、線維素溶解、非制御の出血、非制御の凝固、非制御の補体の固定化および／または炎症の検出、予後、治療および／または予防においても有用であり得る。
【０８７９】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、自己免疫疾患、障害および/または状態の処置、予防および/または診断にも役立ちうる。多くの自己免疫疾患、障害および/または状態は、免疫細胞が自己を外来物質として不適切に認識することによって起こる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊につながる免疫応答を引き起こす。したがって、免疫応答、特にT細胞の増殖、分化または走化性を阻害する本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくはアンタゴニストの投与は、自己免疫疾患、障害および/または状態を予防する上で有効な治療法になりうる。
【０８８０】
本発明によって処置、予防および/または診断もしくは検出することができる自己免疫疾患、障害および/または状態の例には、アジソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多腺性内分泌障害、紫斑病、ライター症候群、スティフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎、ギラン・バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫性炎症性眼疾患などがあるが、これらに限るわけではない。
【０８８１】
同様に、アレルギー反応およびアレルギー状態、例えば喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸障害なども、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬によって処置、予防および/または診断することができる。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏、または血液型不適合の処置にも使用することができる。
【０８８２】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、臓器拒絶または移植片対宿主疾患（GVHD）の処置、予防および/または診断にも使用することができる。臓器拒絶は、免疫応答によって宿主免疫細胞が移植された組織を破壊することによって起こる。同様に、免疫応答はGVHDにも関与するが、この場合は外来の移植された免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答、特にT細胞の増殖、分化または走化性を阻害する本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬の投与は、臓器拒絶またはGVHDを予防する上で有効な治療法になりうる。
【０８８３】
同様に、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、炎症の調整にも使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、炎症反応に関与する細胞の増殖および分化を阻害しうる。これらの分子は、慢性および急性の炎症状態、例えば慢性前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎およびマラコプラキア、感染に伴う炎症（例えば敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症反応症候群（SIRS））、虚血-再灌流傷害、内毒素致死、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘発性肺障害、炎症性腸疾患、クローン病、またはサイトカイン（例えばTNFまたはIL-1）の過剰産生に起因する炎症などの処置、予防および/または診断に使用することができる。
【０８８４】
過剰増殖性障害
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、新生物を含む過剰増殖性の疾患、障害および/または状態を処置、予防および/または診断するために使用することができる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、直接的または間接的相互作用によって、その障害の増殖を阻害しうる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、過剰増殖性障害を抑制することができる他の細胞を増殖させうる。
【０８８５】
例えば、免疫応答を増加させること、特に過剰増殖性障害の抗原性を増加させること、またはT細胞を増殖、分化または動員することによって、過剰増殖性の疾患、障害および/または状態を処置、予防および/または診断することができる。この免疫応答は、既存の免疫応答を増進することによって、または新たな免疫応答を開始することによって、増加させることができる。あるいは、化学療法剤など、免疫応答を減少させることも、過剰増殖性の疾患、障害および/または状態を処置、予防および/または診断する方法になりうる。
【０８８６】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬によって処置、予防および/または診断することができる過剰増殖性の疾患、障害および/または状態の例として、以下の部位に位置する新生物が挙げられるが、これらに限るわけではない：結腸、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頚部、神経（中枢神経および末梢神経）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、尿生殖器。
【０８８７】
同様に、他の過剰増殖性疾患、障害および/または状態も、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬によって処置、予防および/または診断することができる。そのような過剰増殖性の疾患、障害および/または状態の例には、高γグロブリン血症、リンパ増殖性疾患、障害および/または状態、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ゴーシュ病、組織球症、および上に挙げた器官系における他の任意の過剰増殖性疾患ならびに新形成があるが、これらに限るわけではない。
【０８８８】
好ましい一態様では、本発明のポリヌクレオチドを利用して、本発明および/またはタンパク質融合物もしくはその断片を使った遺伝子治療により、異常な細胞分裂を抑制する。
【０８８９】
したがって本発明は、異常に増殖している細胞に、その発現を抑制する本発明のポリヌクレオチドを挿入することによって、細胞増殖性疾患、障害および/または状態を処置または予防する方法を提供する。
【０８９０】
本発明のもう一つの態様として、個体の細胞増殖性疾患、障害および/または状態を処置または予防する方法であって、1コピー以上の本発明の活性遺伝子を、異常に増殖している細胞または細胞群に投与することを含む方法を提供する。好ましい一態様として、本発明のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドをコードするDNA配列を効果的に発現させる組換え発現ベクターを含むDNAコンストラクトである。本発明のもう一つの好ましい態様として、レトロウイルスまたはより好ましくはアデノウイルスベクターを利用して、本発明のポリヌクレオチドをコードするDNAコンストラクトを、処置しようとする細胞に挿入する（参考文献として本明細書の一部を構成するGJ.Nabelら,PNAS 1999 96:324-326を参照されたい）。最も好ましい態様として、ウイルスベクターは欠損性であり、非増殖細胞を形質転換せず、増殖細胞だけを形質転換する。さらに、好ましい一態様として、単独で、または他のポリヌクレオチドと共に、もしくは他のポリヌクレオチドに融合された状態で、増殖細胞に挿入された本発明のポリヌクレオチドは、続いて、当該ポリヌクレオチドの上流にあるプロモーターに作用してコードされているタンパク質産物の発現を誘導する外部からの刺激（すなわち磁気、特別な小分子、化学薬品、または薬物投与など）によって調整することができる。したがって、本発明の有益な治療効果を、前記外部刺激に基づいて明確に調整（すなわち本発明の発現を増加、減少、または阻害）することができる。
【０８９１】
本発明のポリヌクレオチドは、腫瘍遺伝子または抗原の発現を抑制するのに役立ちうる。「腫瘍遺伝子の発現を抑制する」とは、遺伝子の転写の抑制、遺伝子転写物の分解（プレメッセージRNA）、スプライシングの阻害、メッセンジャーRNAの破壊、タンパク質の翻訳後修飾の防止、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常機能の阻害を表す。
【０８９２】
異常に増殖する細胞に局所投与するには、当業者に知られる任意の方法によって、例えば細胞のトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションによって、またはリポソームやリポフェクチンなどのビヒクルに入れて、または裸のポリヌクレオチドとして、または本明細書に記載する他の任意の方法によって、本発明のポリヌクレオチドを投与することができる。本発明のポリヌクレオチドは、例えばレトロウイルスベクター（Gilboa,J.Virology 44:845(1982)；Hocke,Nature 320:275(1986)；Wilsonら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:3014）、ワクシニアウイルス系（Chakrabartyら,Mol.Cell Biol.5:3403(1985)）、または当業者に知られている他の効率のよいDNA送達系（Yatesら,Nature 313:812(1985)）など、既知の遺伝子送達システムによって送達することができる。これらの文献は単なる代表例であり、参考文献として本明細書の一部を構成する。異常に増殖している細胞を特異的に送達またはトランスフェクトし、非分裂細胞には影響しないように、当業者に知られているレトロウイルスまたはアデノウイルス送達系（当技術分野で記載されているもの、および本明細書の他の項で説明するもの）を利用することが好ましい。というのも、レトロウイルスDNAの組込みが起こるには宿主DNA複製が必要であり、またレトロウイルスは、その生活環に必要なレトロウイルス遺伝子を欠くために自己複製できないだろうからである。本発明のポリヌクレオチドにそのようなレトロウイルス送達系を利用することにより、当該遺伝子およびコンストラクトは異常に増殖している細胞にターゲティングされ、非分裂正常細胞には影響しないだろう。
【０８９３】
本発明のポリヌクレオチドは、撮像装置を使って注射針を疾患部位に直接誘導することにより、内臓中または体腔中などの細胞増殖性障害/疾患部位に直接送達することができる。本発明のポリヌクレオチドは、外科的介入時に疾患部位に投与することもできる。
【０８９４】
「細胞増殖性疾患」とは、良性であれ悪性であれ、細胞、細胞群または組織の単発的または多発的な局所異常増殖を特徴とする、器官、体腔または身体部分の1つまたは任意の組合わせを冒すヒトまたは動物の任意の疾患または障害を意味する。
【０８９５】
本発明のポリヌクレオチドは、それが処置される細胞の増殖に対して生物学的阻害効果を持つ量である限り、どのような量を投与してもよい。さらに、2以上の本発明ポリヌクレオチドを同じ部位に同時に投与することもできる。「生物学的阻害」とは、部分的なまたは完全な成長阻害ならびに細胞の増殖または成長速度の低下を意味する。生物学的阻害用量は、組織培養における標的悪性細胞または異常増殖細胞成長、動物および細胞培養における腫瘍成長に対する本発明ポリヌクレオチドの効果を評価することによって、または当業者に知られる他の任意の方法によって、決定することができる。
【０８９６】
さらに本発明は、本明細書に記載する疾患、障害および/または状態の1つまたは複数を処置、予防および/または診断するために、哺乳動物、好ましくはヒトに抗ポリペプチドおよび抗ポリヌクレオチド抗体を投与することを含む、抗体に基づく治療法にも向けられる。抗ポリペプチドおよび抗ポリヌクレオチドポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造方法は本明細書の他の項に詳述する。そのような抗体は、当業者に知られているようなまたは本明細書に記載するような医薬的に許容できる組成物の形で提供することができる。
【０８９７】
本発明の抗体を治療的に使用する方法を要約すると、体内で局所的にまたは全身的に本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合すること、または例えば補体によって（CDC）もしくはエフェクター細胞によって（ADCC）媒介される抗体の直接的細胞毒性による方法が挙げられる。これらのアプローチのいくつかについては、以下にさらに詳細に説明する。本明細書が教示する内容を利用すれば、当業者は、甚だしい実験を行なわずに、本発明の抗体を診断、モニタリングまたは治療目的に使用する方法を知ることになる。
【０８９８】
特に、本発明の抗体、断片および誘導体は、本明細書に記載するような細胞増殖および/または分化の疾患、障害および/または状態を持つまたは発症する対象を処置、予防および/または診断するのに役立つ。そのような処置は、抗体、その断片、誘導体もしくはコンジュゲートを単回または複数回投与することを含む。
【０８９９】
本発明の抗体は、他のモノクローナルまたはキメラ抗体と組み合わせて、または、例えば抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加させる働きをする、リンホカインもしくは造血性増殖因子と組み合わせて、有利に利用することができる。
【０９００】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片を含む）に向けられたイムノアッセイにも、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片を含む）に関係する疾患、障害および/または状態の治療にも、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、その断片もしくは領域に対する高親和性かつ/または強力なインビボ阻害および/または中和抗体を使用することが好ましい。そのような抗体、断片または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片を含む）に対して親和性を持つだろう。好ましい結合親和性としては、解離定数すなわちKdが、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、および10-15M未満であるものが挙げられる。
【０９０１】
さらに本発明のポリペプチドは、本明細書の他の項で説明するように、単独で、タンパク質融合物として、または直接的もしくは間接的に他のポリペプチドと組み合わせて、増殖細胞または増殖組織の血管新生の阻害にも役立ちうる。最も好ましい態様として、前記抗血管新生効果は、例えば腫瘍関連マクロファージなどの造血性腫瘍特異細胞の阻害などにより、間接的に達成される（参考文献として本明細書の一部を構成するJoseph IBら,J Natl Cancer Inst,90(21):1648-53(1998)を参照されたい）。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する抗体も、血管新生の阻害を直接的に、または間接的にもたらすことができる（参考文献として本明細書の一部を構成するWitte Lら,Cancer Metastasis Rev.17(2):155-61(1998)を参照されたい）。
【０９０２】
本発明のポリペプチド（タンパク質融合物を含む）またはその断片は、アポトーシスの誘導による増殖細胞または増殖組織の阻害に役立ちうる。これらのポリペプチドは、例えば腫瘍壊死因子（TNF）受容体1、CD95（Fas/APO-1)、TNF受容体関連アポトーシス媒介タンパク質（TRAMP）およびTNF関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）受容体1および2などのデスドメイン受容体の活性化にあたって、増殖細胞および増殖組織のアポトーシスを誘導するように直接的または間接的に作用することができる（参考文献として本明細書の一部を構成するSchulze-Osthoff Kら,Eur J Biochem 254(3):439-59(1998)を参照されたい）。さらに、本発明のもう一つの好ましい態様として、前記ポリペプチドは単独で、またはアポトニン（apoptonin）、ガレクチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質などの小分子薬もしくは佐剤と共同して、他の機構により、例えばアポトーシスを活性化する他のタンパク質の活性化に関与することによって、または前記タンパク質の発現を刺激することによって、アポトーシスを誘導することもできる（例えばMutat.Res.400(1-2):447-55(1998)；Med Hypotheses.50(5):423-33(1998)；Chem.Biol.Interact.Apr 24;111-112:23-34(1998)；J Mol Med.76(6):402-12(1998)；Int.J.Tissue React.20(1):3-15(1998)を参照されたい。これらは全て参考文献として本明細書の一部を構成する）。
【０９０３】
本発明のポリペプチド（そのタンパク質融合物を含む）またはその断片は、増殖細胞または増殖組織の転移を阻害するのに役立つ。阻害は、ポリペプチドまたは本明細書の他の項で説明する当該ポリペプチドに対する抗体の投与の直接的結果として起こるか、または例えば転移を阻害することが知られているタンパク質、例えばアルファ4インテグリンの発現を活性化することなどによって間接的に起こりうる（例えば参考文献として本明細書の一部を構成するCurr Top Microbiol Immunol 1998;231:125-41を参照されたい）。本発明のそのような治療効果は、単独で、または小分子薬もしくは佐剤との組合わせで達成することができる。
【０９０４】
もう一つの態様として、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（例えば異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと結合したポリペプチドまたはポリペプチド抗体を含む組成物）を、本発明のポリペプチドを発現させる標的細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまたはポリペプチド抗体は、疎水相互作用、親水相互作用、イオン相互作用および/または共有結合によって、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと結合させることができる。
【０９０５】
本発明のポリペプチド、そのタンパク質融合物、またはその断片は、増殖細胞または増殖組織の免疫原性および/または抗原性を、直接的に（例えば本発明のポリペプチドが免疫応答を「ワクシネート（vaccinate）」して、増殖抗原および増殖免疫原に対して応答させるような場合）、または間接的に（例えば前記抗原および免疫原に対する免疫応答を増進することが知られているタンパク質（例えばケモカイン）の発現を活性化する場合）増進するのに役立つ。
【０９０６】
心血管障害
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくはアンタゴニストは、四肢虚血などの末梢動脈疾患を含む心血管疾患、障害および/または状態の処置、予防および/または診断に使用することができる。
【０９０７】
心血管疾患、障害および/または状態には、動動脈瘻、動静脈瘻、脳動静脈奇形、先天的心欠陥、肺動脈閉鎖、およびシミター症候群などの心血管異常が含まれる。先天的心欠陥には、大動脈縮窄症、三房心、冠状血管異常、十字交差心臓、右胸心、動脈管開存症、エプスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左室低形成症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位、両大血管右室起始症、三尖弁閉症、総動脈幹開存症、および大動脈肺動脈中隔欠損、心内膜床欠損症、ルタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室中隔欠損症などの心臓中隔欠損が含まれる。
【０９０８】
心血管疾患、障害および/または状態には、不整脈、カルチノイド心疾患、高心拍出量、低心拍出量、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血型心筋症、発作性呼吸困難、心臓性浮腫、心肥大、うっ血型心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂、心臓中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心嚢液貯留、心膜炎（収縮性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開術後症候群、肺性心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能障害、充血、心血管妊娠合併症、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核などの心疾患も含まれる。
【０９０９】
不整脈には、洞性不整脈、心房細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムス・ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、QT延長症候群、副収縮、ローン・ガノン・レヴァイン症候群、マハイム型副伝導路症候群、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、洞機能不全症候群、頻拍、および心室細動が含まれる。頻拍には、発作性頻拍症、上室性頻拍症、促進固有心室調律、房室結節リエントリー頻拍症、異所性心房頻拍症、異所性接合部性頻拍症、洞房結節リエントリー頻拍症、洞頻脈、トルサード・ド・ポアント、および心室頻拍症が含まれる。
【０９１０】
心臓弁疾患には、大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、心雑音、大動脈弁逸脱、僧帽弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁不全、僧帽弁狭窄、肺動脈閉鎖、肺動脈弁不全、肺動脈弁狭窄、三尖弁閉鎖症、三尖弁不全、および三尖弁狭窄が含まれる。
【０９１１】
心筋疾患には、アルコール性心筋症、うっ血型心筋症、肥大型心筋症、大動脈弁下狭窄、拘束型心筋症、シャガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、カーンズ症候群、心筋再灌流傷害、および心筋炎が含まれる。
【０９１２】
心筋虚血には、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化症、冠動脈血栓症、冠状動脈攣縮、心筋梗塞および気絶心筋などの冠動脈疾患が含まれる。
【０９１３】
心血管疾患には、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、杆菌性血管腫症状、ヒッペル・リンドウ病、クリッペル・トレノーニイ・ウェーバー症候群、スタージ・ウェーバー症候群、血管神経性浮腫、大動脈疾患、高安病、大動脈炎、ルリッシュ症候群、動脈閉塞性疾患、動脈炎、動脈内膜炎、結節性多発性動脈炎、脳血管疾患、障害および/または状態、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、皮膚紅痛症、痔核、肝静脈閉塞症、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞症、レイノー病、クレスト症候群、網膜静脈閉塞症、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張運動失調症、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、静脈瘤、静脈瘤性潰瘍、血管炎、および静脈不全などの血管疾患も含まれる。
【０９１４】
動脈瘤には、解離性動脈瘤、仮性動脈瘤、感染性動脈瘤、動脈瘤破裂、大動脈瘤、脳動脈瘤、冠動脈瘤、心臓動脈瘤、および腸骨動脈流が含まれる。
【０９１５】
動脈閉塞性疾患には、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋形成異常、腸間膜血管閉塞症、モヤモヤ病、腎動脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、および閉塞性血栓血管炎が含まれる。
【０９１６】
脳血管疾患、障害および/または状態には、頸動脈疾患、脳アミロイド血管障害、脳動脈流、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓症、脳血栓症、頸動脈血栓症、静脈洞血栓症、ワレンベルク症候群、脳出血、硬膜外血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血、脳梗塞、脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、脳室周囲白質軟化症、血管性頭痛、群発頭痛、片頭痛、および椎骨脳底動脈循環不全症が含まれる。
【０９１７】
塞栓症には、空気閉塞症、羊水閉塞症、コレステロール閉塞症、爪先チアノーゼ症候群、脂肪閉塞症、肺閉塞症、および血栓塞栓症が含まれる。血栓症には、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞症、頸動脈血栓症、静脈洞血栓症、ワレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が含まれる。
【０９１８】
虚血には、脳虚血、虚血性大腸炎、筋区画症候群、前（anterior）筋区画症候群、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が含まれる。血管炎には、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット症候群、チャウグ・シュトラウス症候群、皮膚粘膜リンパ節症候群、閉塞性血栓血管炎、過敏性血管炎、シェンライン・ヘノッホ紫斑、アレルギー性皮膚血管炎、およびウェゲナー（Wegener's）肉芽腫が含まれる。
【０９１９】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくはアンタゴニストは、危機的な四肢虚血および冠動脈疾患の処置にはとりわけ有効である。
【０９２０】
ポリペプチドは、当技術分野で知られる任意の方法を使って投与することができる。例えば送達部位への直接針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、バイオリスティック・インジェクター、粒子加速装置、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー材料、浸透圧ポンプ、経口用または坐剤用固形医薬製剤、および手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達などがある。そのような方法は当技術分野では知られている。本発明のポリペプチドは以下に詳述する治療薬の一部として投与することができる。本発明のポリヌクレオチドを送達する方法については、本明細書にさらに詳しく説明する。
【０９２１】
抗血管新生活性
血管新生に関する内因性刺激因子と阻害因子とのバランスは、自然の状態では、阻害効果が優勢になるようなバランスである（Rastinejadら,Cell 56:345-355(1989)）。創傷治癒、臓器再生、胚発生、および女性生殖プロセスなど、正常な生理条件下で新生血管形成が起こる稀な例では、血管新生が厳密に調節され、空間的かつ時間的に区切られる。例えば固形腫瘍成長を特徴づけるような病理学的血管新生の条件下では、これらの調節制御が機能しなくなる。調節を受けない血管新生は病的になり、数多くの腫瘍性および非腫瘍性疾患の進行を持続させる。固形腫瘍成長および転移、関節炎、一部のタイプの眼疾患、障害および/または状態、ならびに乾癬を含む多くの深刻な疾患が、異常な新生血管形成によって支配されている。例えばMosesら,Biotech.9:630-634(1991)；Folkmanら,N.Engl.J.Med.,333:1757-1763(1995)；Auerbachら,J.Microvasc.Res.29:401-411(1985)；Folkman,「Advances in Cancer Research」（KleinおよびWeinhouse編,Academic Press,ニューヨーク,1985）の175〜203頁；Patz,Am.J.Opthalmol.94:715-743(1982)；ならびにFolkmanら,Science 221:719-725(1983)による概説を参照されたい。多くの病理学的状態では、血管新生のプロセスが、その疾患状態の一因になっている。例えば、固形腫瘍の成長が血管新生に依存することを示唆するデータはかなり蓄積されている。FolkmanおよびKlagsbrun,Science 235:442-447(1987)。
【０９２２】
本発明では、本発明のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドならびに本発明の作動薬または拮抗薬の投与による、新生血管形成に関係する疾患、障害および/または状態の処置が可能である。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたは作動薬もしくはアンタゴニストを使って処置することができる悪性および転移状態には、例えば本明細書に記載の、そして当技術分野で知られている他の、悪性腫瘍、固形腫瘍、および癌が含まれるが、それらに限るわけではない（そのような障害の概要については、Fishmanら「Medicine」第2版,J.B.Lippincott Co.,フィラデルフィア(1985)を参照されたい）。したがって本発明は、血管新生関連疾患および/または障害を処置、予防および/または診断する方法であって、その必要がある個体に、治療有効量の本発明ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を投与することを含む方法を提供する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬は、癌または腫瘍を治療的に処置または予防するために、他の様々な方法で利用することができる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬で処置、予防および/または診断することができる癌には、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頚癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌などの固形腫瘍；原発腫瘍および転移；メラノーマ；膠芽腫；カポジ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行悪性腫瘍；および白血病などの血液系腫瘍が含まれるが、これらに限るわけではない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬は、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポジ肉腫などの癌を処置または予防するために、局所的に送達することができる。
【０９２３】
さらなる側面として、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬は、例えば膀胱内投与などによって、表在型の膀胱癌を処置するために利用することもできる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬は、腫瘍中に直接、または腫瘍部位の近くに、注射またはカテーテルによって送達することができる。もちろん、当業者には理解されるだろうが、適当な投与方法は処置しようとする癌によって様々だろう。他の送達方法は本明細書で論じる。
【０９２４】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬は、癌だけでなく、血管新生を伴う他の疾患、障害および/または状態の処置、予防および/または診断にも役立ちうる。これらの疾患、障害および/または状態には、次に挙げるものが含まれるが、これらに限るわけではない：良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；アテローム斑；眼の血管新生疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後部線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎および翼状片（異常な血管増殖）；慢性関節リウマチ；乾癬；遷延創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；肉芽形成；肥厚性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；トラコーマ；血管癒着；心筋血管新生；冠側副路；脳側副路；動静脈奇形；虚血性四肢血管新生；オスラー・ウェバー症候群；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病関節症；血管線維腫；線維筋形成異常；創傷肉芽形成；クローン病；およびアテローム動脈硬化症。
【０９２５】
例えば、本発明の一側面として、肥厚性瘢痕およびケロイドを処置、予防および/または診断する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を肥厚性瘢痕またはケロイドに投与するステップを含む方法が提供される。
【０９２６】
本発明の一態様では、肥厚性瘢痕またはケロイドの進行を防止するために、これらの損傷部に、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を直接注射する。この治療法は、肥厚性瘢痕およびケロイド（例えば熱傷）の発生をもたらすことが知られている状態の予防的処置に特に有用であり、この治療法は、増殖期が進行する期間を経た後（最初の傷害から約14日後）、肥厚性瘢痕またはケロイドが発生する前に開始することが好ましい。上述のように、本発明は、例えば角膜新生血管形成、新生血管緑内障、増殖性糖尿病性網膜症、水晶体後部線維増殖症および黄斑変性などを含む眼の新生血管疾患を処置、予防および/または診断する方法も提供する。
【０９２７】
さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（作動薬および/または拮抗薬を含む）を使って処置、予防および/または診断することができる新生血管形成を伴う眼の疾患、障害および/または状態には次に挙げるものが含まれるが、これらに限るわけではない：新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後部線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植片新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、脈絡膜または虹彩新生血管形成を伴う眼の腫瘍および疾患。例えばWaltmanら,Am.J.Ophthal.85:704-710(1978)およびGartnerら,Surv.Ophthal.22:291-312(1978)による概説を参照されたい。
【０９２８】
したがって、本発明の一側面として、角膜新生血管形成（角膜移植片新生血管形成を含む）などの眼の新生血管疾患を処置または予防するする方法であって、血管の形成が阻害されるように治療有効量の化合物（上述したような化合物）を角膜に投与するステップを含む方法が提供される。簡単に述べると、角膜は通常は血管を持たない組織である。しかしある種の病理学的状態では、毛細血管が角膜輪部の角膜周囲血管網から角膜中に伸びる。角膜が血管化すると、角膜は濁り、患者の視力低下が起こる。角膜が完全に混濁すると視力が完全に失われる場合もある。多種多様な疾患、障害および/または状態、例えば角膜感染症（例：トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセス（例：移植片拒絶およびスティーヴンス・ジョンソン症候群）、アルカリ熱傷、外傷、炎症（あらゆる原因によるもの）、中毒状態、栄養不足状態、およびコンタクトレンズ装着の合併症などが、角膜新生血管形成をもたらしうる。
【０９２９】
本発明の特に好ましい態様として、（眼用製剤に一般に使用される任意の保存剤および抗微生物剤と混合して）局所投与用に食塩水中に調製し、それを点眼剤として投与することができる。この溶液または懸濁液は純粋な形で製造し、毎日数回投与することができる。あるいは、上述のように製造した抗血管新生組成物を角膜に直接投与することもできる。好ましい態様として、角膜に結合する粘膜付着性ポリマーを使って抗血管新生組成物を製造する。さらなる態様として、抗血管新生因子または抗血管新生組成物を、従来のステロイド療法に補助剤として使用してもよい。局所治療法は、高い確率で血管新生応答を誘導することが知られている角膜損傷（化学熱傷など）に予防的にも役立ちうる。これらの場合は、後続の合併症を防ぐ助けとなるように、おそらくステロイドと組み合わせて、直ちに処置が実施されるだろう。
【０９３０】
他の態様として、上記の化合物は角膜支質に直接注射することもできる。好ましい注射部位は、個々の損傷部の形態によって様々であるだろうが、投与の目標は、前進する脈管構造の最前部（すなわち血管と正常な角膜の間に点在している部分）である。ほとんどの場合、これには、角膜を前進する血管から「保護」するための角膜縁周辺注射（perilimbic corneal injection）が含まれるだろう。この方法は、角膜新生血管形成を予防的に妨げるために、角膜傷害の直後に使用することもできる。この場合は、角膜損傷部とその望ましくない潜在的縁部血液供給の間に点在する角膜縁周辺（perilimbic cornea）への注射を行なうことができるだろう。そのような方法は、移植した角膜の毛細血管侵襲を防止するためにも同様の方法で利用することができる。徐放型の場合、注射は年に2〜3回でよいかもしれない。注射液には注射自体に起因する炎症を低下させるためにステロイドを加えることもできるだろう。
【０９３１】
本発明のもう一つの側面として、新生血管緑内障を処置または予防する方法であって、血管形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を眼に投与するステップを含む方法が提供される。一態様として、初期型の新生血管緑内障を処置または予防するために、化合物を眼に局所投与することができる。他の態様として、化合物が眼房水中に持続的に放出されるように、任意の位置に化合物を配置してもよい。本発明のもう一つの側面として、増殖性糖尿病性網膜症を処置または予防する方法であって、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を患者の眼に投与するステップを含む方法が提供される。
【０９３２】
特に好ましい本発明の態様として、網膜におけるポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬の局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体に注射することによって、増殖性糖尿病性網膜症を処置することができる。好ましくは、この処置は、光凝固術を必要とするいくつかの疾患に罹患する前に開始すべきである。
【０９３３】
本発明のもう一つの側面として、水晶体後部線維増殖症を処置または予防する方法であって、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を患者の眼に投与するステップを含む方法が提供される。化合物は局所投与、硝子体内注射および/または眼内レンズによって投与することができる。
【０９３４】
加えて、本ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を使って処置、予防および/または診断することができる疾患、障害および/または状態には、例えば血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム斑、遷延創傷治癒、肉芽形成、血友病関節症、肥厚性瘢痕、偽関節骨折、オスラー・ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管癒着などが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０９３５】
さらに、本ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を使って処置、予防および/または診断することができる疾患、障害および/または状態および/または状況には、例えば固形腫瘍、白血病などの血液系腫瘍、腫瘍転移、カポジ肉腫、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の血管新生疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、新生血管緑内障、水晶体後部線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎、遷延創傷治癒、子宮内膜炎、脈管形成、肉芽形成、肥厚性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管癒着、心筋血管新生、冠状動脈枝、脳側副枝（cerebral collaterals）、動静脈奇形、虚血性四肢血管新生、オスラー・ウェバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病関節症、血管線維腫、線維筋形成異常、創傷肉芽形成、クローン病、アテローム動脈硬化症、着床に必要な脈管形成を妨げることによる産児制限、病理学的結果として血管新生を伴う疾患、例えばネコひっかき病（ロッシェル・ミナリア・クイントーサ（Rochele minalia quintosa））、潰瘍（ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori））、バルトネラ症および杆菌性血管腫症状などが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０９３６】
産児制限方法の一側面として、着床を妨害するのに十分な量の化合物を、性交前または性交後および受精が起こる前または受精が起こった後に投与し、よって産児制限の有効な方法、場合によっては「性交後避妊（morning after）」法とする。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬は、月経の制御に使用するか、子宮内膜症の処置に際して洗浄液として、または腹腔内移植組織に対して投与することもできる。
【０９３７】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬は、縫合肉芽腫を防止するために、縫合糸に組み込むことができる。
【０９３８】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬は、多種多様な手術に用いることができる。例えば本発明の一側面として、腫瘍の摘出に先立って、正常な周辺組織を悪性組織から分離し、そして/または周辺組織への疾患の伝播を防ぐために、組成物（例えばスプレー状またはフィルム状のもの）を使ってある領域を覆ったり、その領域に噴霧したりすることができる。本発明の他の側面として、腫瘍を覆ったり、または所望の位置で血管新生を阻害したりするために、組成物（例えばスプレー状のもの）を内視鏡法によって送達することもできる。本発明のさらなる側面として、本発明の抗血管新生組成物でコーティングされている手術用メッシュを、手術用メッシュが使用されるかもしれない任意の手術に使用することができる。例えば、本発明の一態様として、抗血管新生組成物を担持している手術用メッシュは、構造物に支持体を与え、ある量の抗血管新生因子が放出されるように、腹部癌切除手術中に（例えば結腸切除に続いて）使用することができる。
【０９３９】
本発明のさらなる側面として、腫瘍摘出部位を処置する方法であって、摘出に続いて腫瘍の切除縁に、その部位での癌の局所的再発および新しい血管の形成が阻害されるように、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を投与することを含む方法が提供される。本発明の一態様として、抗血管新生化合物を腫瘍摘出部位に直接（例えば塗布、刷毛塗りまたは他の方法で腫瘍の切除縁を抗血管新生化合物をコーティングすることによって）投与する。あるいは、投与に先立って抗血管新生化合物を既知の外科用ペースト剤に組み込んでもよい。本発明の特に好ましい態様として、抗血管新生剤を肝悪性腫瘍切除後および神経外科手術後に適用する。
【０９４０】
本発明の一側面として、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬を、例えば乳房、結腸、脳および肝腫瘍などの多種多様な腫瘍の切除縁に投与することができる。例えば本発明の一態様として、抗血管新生化合物は、摘出に続いて神経腫瘍部位に、その部位での新しい血管の形成が阻害されるように、投与することができる。
【０９４１】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、拮抗薬および/または作動薬は、他の抗血管新生因子と共に投与することもできる。他の血管新生因子の代表例としては、抗浸潤因子（Anti-Invasive Factor）、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ1組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ2組織インヒビター、プラスミノゲン活性化因子インヒビター-1、プラスミノゲン活性化因子インヒビター2、および様々な形態の軽い「d族」遷移金属が挙げられる。
【０９４２】
軽い「d族」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブ、およびタンタル種などが含まれる。そのような遷移金属種は遷移金属錯体を形成しうる。上記遷移金属種の適切な錯体にはオキソ遷移金属錯体が含まれる。
【０９４３】
バナジウム錯体の代表例としては、バナジン酸錯体およびバナジル錯体などのオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナジン酸錯体には、例えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウムなどのメタバナジン酸錯体およびオルトバナジン酸錯体が含まれる。適切なバナジル錯体には、例えばバナジルアセチルアセトネートおよびバナジルサルフェート（バナジルサルフェート一水和物および三水和物などのバナジルサルフェート水和物を含む）などが含まれる。
【０９４４】
タングステンおよびモリブデン錯体の代表例にもオキソ錯体が含まれる。適切なオキソタングステン錯体としてはタングステン酸錯体および酸化タングステン錯体が挙げられる。適切なタングステン酸錯体には、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物、およびタングステン酸などがある。適切な酸化タングステンには、酸化タングステン(IV）および酸化タングステン(VI）などがある。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデン酸錯体、酸化モリブデン錯体、およびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデン酸錯体には、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物などがある。適切な酸化モリブデンには、酸化モリブデン(VI)、酸化モリブデン(VI)、およびモリブデン酸などがある。適切なモリブデニル錯体には、例えばモリブデニルアセチルアセトネートなどがある。他の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体には、例えばグリセロール、酒石酸および糖類などから誘導されるヒドロキソ誘導体が含まれる。
【０９４５】
多種多様な他の抗血管新生因子も本発明との関連で利用することができる。代表例としては、血小板因子4、硫酸プロタミン、硫酸キチン誘導体（ズワイガニの殻から製造されるもの）（Murataら,Cancer Res.,51:22-26,1991）；硫酸多糖ペプチドグリカン複合体（SP-PG）（この化合物の機能はエストロゲンなどのステロイドおよびクエン酸タモキシフェンの存在によって強化されうる）；スタウロスポリン；マトリックス代謝の調節因子、例えばプロリン類似体シスヒドロキシプロリン、d,L-3,4-デヒドロプロリン、チアプロリン、アルファ,アルファ-ジピリジル、フマル酸アミノプロピオニトリル、4-プロピル-5-(4-ピリジニル)-2(3H)-オキサゾロン；メトトレキセート；ミトキサントロン；ヘパリン；インターフェロン；2マクログロブリン-血清；ChIMP-3（Pavloffら,J.Bio.Chem.267:17321-17326,1992）；キモスタチン（Tomkinsonら,Biochem J.286:475-480,1992）；シクロデキストリンテトラデカサルフェート；エポネマイシン（Eponemycin）；カンプトテシン；フマギリン（Ingberら,Nature 348:555-557,1990）；金チオリンゴ酸ナトリウム（「GST」；MatsubaraおよびZiff,J.Clin.Invest.79:1440-1446,1987）；抗コラゲナーゼ-血清；アルファ2-アンチプラスミン（Holmesら,J.Biol.Chem.262(4):1659-1664,1987）；ビスアントレン（Bisantrene）（米国立癌研究所）；ロベンザリト二ナトリウム（N-(2)-カルボキシフェニル-4-クロロアントロニル酸二ナトリウム、別名「CCA」；Takeuchiら,Agents Actions 36:312-316,1992）；サリドマイド；血管形成阻害ステロイド；AGM-1470；カルボキシアミノイミダゾール；BB94などのメタロプロテイナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０９４６】
細胞レベルでの疾患
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または拮抗薬もしくは作動薬によって処置、予防および/または診断することができるであろう、細胞寿命の増加またはアポトーシスの阻害に関係する疾患には、癌（濾胞性リンパ腫、p53突然変異を伴う癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、例えば大腸癌、心臓腫瘍、膵癌、メラノーマ、網膜芽細胞腫、膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫および卵巣癌など、ただしこれらに限るわけではない）、自己免疫疾患、障害および/または状態（例えば多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎および慢性関節リウマチなど）ならびにウイルス感染症（例えばヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、移植片対宿主疾患、急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶などがある。好ましい態様として、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬物を使って、癌、特に上に挙げた癌の成長、進行および/または転移を阻害する。
【０９４７】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬によって処置、予防または診断することができるであろう、細胞寿命の増加に関係する他の疾患または状態には、例えば次に挙げるような悪性腫瘍および関連障害の進行および/または転移が含まれるが、これらに限るわけではない：白血病（急性白血病（例えば急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））ならびに慢性白血病（例えば慢性骨髄球性（顆粒性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えばホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍、例えば肉腫および癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫。
【０９４８】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬によって処置、予防および/または診断することができるであろう、アポトーシスの増加に関係する疾患には、AIDS；神経変性疾患、障害および/または状態（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性症および脳腫瘍またはプリオン関連疾患）；自己免疫疾患、障害および/または状態（例えば多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎および慢性関節リウマチ）、骨髄異形成症候群（例えば再生不良性貧血）、移植片対宿主疾患、虚血傷害（例えば心筋梗塞、脳卒中および再灌流傷害によって起こるもの）、肝傷害（例えば肝炎関連肝傷害、虚血/再灌流傷害、胆汁うっ滞（胆管傷害）および肝癌）；毒素誘発性肝疾患（例えばアルコールによって起こるもの）、敗血症性ショック、悪液質、および食欲不振などが含まれる。
【０９４９】
創傷治癒および上皮細胞増殖
本発明のさらにもう一つの側面によれば、例えば創傷治癒を目的として上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するために、また毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬を治療目的で利用する方法が提供される。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドならびに作動薬もしくは拮抗薬は、手術創傷、切除創傷、真皮および表皮の損傷を伴う深い創傷、眼組織創傷、歯組織創傷、口腔創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍、褥瘡性潰瘍、動脈潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、熱への曝露または化学薬品による熱傷、ならびに他の創傷治癒異常状態、例えば尿毒症、栄養不良、ビタミン欠乏症、ならびにステロイド、放射線療法、抗新生物薬および代謝拮抗物質による全身処置に伴う合併症、を含む創傷治癒の刺激に臨床上役立ちうる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、皮膚の喪失に続いて起こる皮膚の再建を促進するためにも使用することができるだろう。
【０９５０】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、皮膚移植片の創傷床（wound bed）への接着を増進するため、および創傷床からの再建を刺激するために使用することができるだろう。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、作動薬または拮抗薬を使って創傷床への接着を増進させることができるであろう移植片の一部を以下に列挙する：自家移植片、人工皮膚、異系同種移植片、自家真皮移植片、自家表皮移植片、無血管移植片、ブレア-ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、皮膚移植片、遅延移植片、真皮移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層植皮片、異種移植片、異目間移植片、同種移植片、増殖性移植片、表層移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ・チールシュ植皮片、大網移植片、パッチ移植片、茎状移植片、全層移植片、分層皮膚移植片、厚い分層移植片。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、皮膚強度を増加し、老化した肌の概観を改善するために使用することができる。
【０９５１】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、肝細胞増殖、ならびに肺、乳房、膵臓、胃、小腸および大腸における上皮細胞増殖の変化ももたらすと考えられる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、上皮細胞、例えば皮脂細胞（sebocyte）、毛包、肝細胞、II型肺細胞、ムチン産生杯細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓および胃腸路に含まれる他の上皮細胞ならびにその前駆細胞などの増殖を促進することができるだろう。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進しうる。
【０９５２】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、放射線処置、化学療法またはウイルス感染に起因する腸毒性の副作用を低下させるためにも使用することができるだろう。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、小腸粘膜に対して細胞保護効果を持ちうる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、化学療法およびウイルス感染に起因する粘膜炎（口腔潰瘍）の治癒も刺激しうる。
【０９５３】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、さらに、熱傷を含む全層および部分層皮膚欠損における皮膚の完全な再生（すなわち毛包、汗腺および脂腺の再増殖）、乾癬などの他の皮膚欠損の処置に使用することができるだろう。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、表皮水疱症（下層にある真皮への表皮の接着に欠陥があって、それがこれらの損傷部の再上皮化を加速することによって、痛みを伴う開いた水疱を頻繁に生じる）を処置するために使用することもできるだろう。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、胃および十二指腸潰瘍を処置し、粘膜層の瘢痕形成および腺粘膜および十二指腸粘膜層のより迅速な再生による治癒を助けるために、使用することもできるだろう。クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患は、それぞれ小腸または大腸の粘膜表面の破壊をもたらす疾患である。したがって本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、より迅速な治癒を助け、炎症性腸疾患の進行を防止する目的で、粘膜表面の再生を促進するために使用することができるだろう。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬による処置は、胃腸路全体にわたる粘液の産生に対して有意義な効果を持つと予想され、手術後にまたは摂取された有害物質から腸粘膜を保護するために使用することができるだろう。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、本発明ポリヌクレオチドの過少発現に関係する疾患を処置するために使用することができるだろう。
【０９５４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、種々の病理学的状態による肺への損傷を予防および治癒するために使用することもできるだろう。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬などの増殖因子は、急性または慢性肺損傷を予防または処置するために、肺胞および細気管支上皮の増殖および分化を刺激し、その修復を促進することができるだろう。例えば、進行性の肺胞喪失をもたらす肺気腫、ならびに細気管支上皮および肺胞の壊死を引き起こす吸入損傷、すなわち煤煙吸入および熱傷に起因するものは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬を使って、効果的に処置、予防および/または診断することができるだろう。また、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬を使って、II型肺細胞の増殖および分化を刺激することもできるだろう。これは、未熟児における硝子膜症などの疾患、例えば乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症などの処置または予防に役立ちうる。
【０９５５】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、肝細胞の増殖および分化を刺激することができ、よって、肝臓疾患および肝臓異常、例えば肝硬変によって起こる劇症肝不全、ウイルス性肝炎および有毒物質（すなわちアセトアミノフェン、四塩化炭素、および当技術分野で知られる他の肝毒素）によって起こる肝損傷を軽減または処置するために使用することができるだろう。
【０９５６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、糖尿病の処置またはその発症の予防に使用することができるだろう。新たにI型およびII型糖尿病と診断された患者で、一部の島細胞機能が残っている場合は、この疾患の永続的発現が軽減、遅延または予防されるように、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬を使って島機能を維持することができるだろう。また、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、島細胞機能を改善または増進するための島細胞移植に際して補助剤として使用することもできるだろう。
【０９５７】
神経疾患
本発明の組成物（例えばポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬）を使って処置、予防および/または診断することができる神経系の疾患、障害および/または状態には、例えば神経系傷害、ならびに軸索の離断、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄をもたらす疾患、傷害および/または状態が含まれるが、これらに限るわけではない。本発明にしたがって患者（ヒトおよび非ヒト哺乳類患者を含む）を処置、予防および/または診断しうる神経系損傷には、例えば次に挙げる中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系の損傷が含まれるが、これらに限るわけではない：（1）虚血性損傷。この場合は、神経系の一部における酸素の欠乏がニューロンの傷害または死を引き起こす。例えば脳梗塞もしくは脳虚血または脊髄梗塞もしくは脊髄虚血；（2）外傷性損傷。物理的損傷によって起こった損傷または手術に伴う損傷を含む。例えば神経系の一部を切断する損傷または圧迫損傷；（3）悪性損傷。この場合は、神経系関連悪性腫瘍または非神経系組織に由来する悪性腫瘍である悪性組織によって神経系の一部が破壊または傷害を受ける；（4）感染性損傷。この場合は、感染の結果として例えば膿瘍によって、またはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスもしくは単純ヘルペスウイルスによる感染、もしくはライム病、結核、梅毒に付随して、神経系の一部が破壊または傷害を受ける；（5）変性損傷。この場合は、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、または筋萎縮性側索硬化症（ALS）など（ただしこれらに限らない）に付随する変性プロセスの結果として神経系の一部が破壊または傷害を受ける；（6）栄養疾患、栄養障害および/または栄養状態に関係する損傷。この場合は、例えばビタミンB12欠乏症、葉酸欠乏症、ウェルニッケ病、タバコ・アルコール性弱視、マルキャファーヴァ・ビニャミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール性小脳変性など（ただしこれらに限らない）の栄養障害または代謝障害によって、神経系の一部が破壊または傷害を受ける；（7）全身性疾患、例えば糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身エリテマトーデス、癌腫、またはサルコイドーシスなど（ただしこれらに限らない）に付随する神経損傷；（8）例えばアルコール、鉛、または特定の神経毒などの有毒物質によって起こる損傷、ならびに（9）脱髄性損傷。この場合は、脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄症、横断性脊髄症または種々の病因、進行性多巣性白質脳症、および橋中央ミエリン溶解など（ただしこれらに限らない）によって、神経系の一部が破壊または傷害を受ける。
【０９５８】
好ましい一態様では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または作動薬もしくは拮抗薬を使って、脳低酸素症の有害な作用から神経細胞を保護する。この態様では、本発明の組成物を使って、脳低酸素症に関連する神経細胞傷害を処置、予防および/または診断する。この態様の一側面では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または作動薬もしくは拮抗薬を使って、脳虚血に関係する神経細胞傷害を処置、予防および/または診断する。この態様のもう一つの側面では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または作動薬もしくは拮抗薬を使って、脳梗塞に関係する神経細胞傷害を処置、予防および/または診断する。この態様のもう一つの側面では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または作動薬もしくは拮抗薬を使って、脳卒中に関係する神経細胞傷害を処置、予防および/または診断する。この態様のさらにもう一つの側面では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または作動薬もしくは拮抗薬を使って、心臓発作に関係する神経細胞傷害を処置、予防および/または診断する。
【０９５９】
神経系障害の処置または予防に役立つ本発明の組成物は、ニューロンの生存または分化を促進する生物学的活性について試験することによって選択することができる。例えば、本発明によれば、次に挙げる効果のいずれかを引き出す本発明の組成物は有用だろう（ただしこれらに限定するわけではない）：（1）培養時のニューロンの生存時間の増加、（2）培養時または生体内でのニューロンの発芽の増加、（3）培養時または生体内でのニューロン関連分子（運動ニューロンの場合は例えばコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）の産生量の増加、または（4）生体内でのニューロン機能不全症状の減少。このような効果は、当技術分野で知られる任意の方法によって測定することができる。限定を目的としない好ましい態様として、ニューロンの生存率の増加は、本明細書に記載する方法または当技術分野で知られる他の方法、例えばArakawaら（J.Neurosci.10:3507-3515(1990)）に記載の方法などを使って、ルーチン的に測定することができる。また、ニューロンの発芽の増加は、当技術分野で知られている方法、例えばPestronkら（Exp.Neurol.70:65-82(1980)）またはBrownら（Ann.Rev.Neurosci.4:17-42(1981)）に記載の方法などによって検出することができる。また、ニューロン関連分子の産生量の増加は、当技術分野で知られている技術を使用し、測定しようとする分子に応じて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイなどによって測定することができる。また、運動ニューロン機能不全は、運動ニューロン障害の身体的発現、例えば脱力、運動ニューロン伝導速度、または機能障害などを評価することによって測定することができる。
【０９６０】
具体的態様として、本発明に従って処置、予防および/または診断することができる運動ニューロンの疾患、障害および/または状態としては、例えば、運動ニューロンおよび神経系の他の成分に影響を及ぼしうる梗塞、感染、毒素への曝露、外傷、手術による損傷、変性疾患または悪性腫瘍、ならびにニューロンに選択的に作用する筋萎縮性側索硬化症などの疾患、障害および/または状態、例えば進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、小児および若年性筋萎縮、小児進行性球麻痺（ファチオーロンド症候群）、急性灰白髄炎およびポリオ後症候群、ならびに遺伝性知覚運動性ニューロパシー（シャルコー・マリー・トゥース病）などが挙げられるが、これらに限るわけではない。
【０９６１】
感染性疾患
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、感染因子の処置、予防および/または診断に使用することができる。感染性疾患は、例えば免疫応答を増進することによって、特にBおよび/またはT細胞の増殖と分化を増進することによって、処置、予防および/または診断することができる。免疫応答は既存の免疫応答を強化するか、新しい免疫応答を開始させることによって増進することができる。あるいは、必ずしも免疫応答を誘発せずに、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬が感染因子を直接阻害する場合もある。
【０９６２】
ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬によって処置、予防および/または診断することができる疾患または症状を引き起こしうる感染因子の一例である。ウイルスの例として次のDNAおよびRNAウイルスおよびウイルス科が挙げられるが、これらに限るわけではない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス、ブンヤウイルス科、カリシウイルス科、シルコウイルス科、コロナウイルス科、デングウイルス、EBV、HIV、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、帯状ヘルペスウイルスなど）、モノネガウイルス（Mononegavirus）（例えばパラミクソウイルス科、モルビリウイルス属、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えばA型インフルエンザ、B型インフルエンザ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（痘瘡またはワクシニアなど）、レオウイルス科（例えばロタウイルス）、レトロウイルス科（HTLV-I、HTLV-II、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えばルビウイルス）。これらの科に属するウイルスは、例えば次に挙げるような様々な疾患または症状を引き起こすことができる（ただしこれらに限るわけではない）：関節炎、気管支炎、細気管支炎、RSウイルス、脳炎、眼の感染症（例えば結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（A型、B型、C型、E型、慢性活動性、デルタ型）、B型日本脳炎、フニン、チクングニア、リフトバレー熱、黄熱、髄膜炎、日和見感染症（例えばAIDS）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、ムンプス、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えばカポジ、疣）、およびウイルス血症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、これらの症状または疾患のいずれの処置、予防および/または診断にも使用することができる。具体的態様として、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬を、髄膜炎、デング、EBV、および/または肝炎（例えばB型肝炎）の処置、予防および/または診断に使用する。もう一つの具体的態様では、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬を使って、1つまたは複数の他の市販の肝炎ワクチンに応答しない患者を処置する。さらにもう一つの具体的態様として、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬を使って、AIDSを処置、予防および/または診断する。
【０９６３】
同様に、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬によって処置、予防および/または診断することができる疾患または症状を引き起こしうる細菌因子または真菌因子としては、例えば次のグラム陰性菌、グラム陽性菌および細菌科ならびに真菌が挙げられるが、これらに限るわけではない：放線菌目（例えばコリネバクテリウム、マイクロバクテリウム、ノカルジア）、クリプトコッカス・ネオホルマンス（Cryptococcus neoformans）、アスペルギルス症、バチルス科（例えば炭疽菌、クロストリジウム）、バクテロイデス科、ブラストミセス症、ボルデテラ属、ボレリア属（例えばボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi））、ブルセラ症、カンジダ症、カンピロバクター、コクシジオイデス症、クリプトコックス症、デルマトサイコーシス（Dermatocycoses）、大腸菌（例えば毒素原性大腸菌および腸管出血性大腸菌）、腸内細菌科（クレブシエラ、サルモネラ（例えばチフス菌およびサルモネラ・パラチフィ)、セラチア、エルシニア）、エリジペロスリックス、ヘリコバクター、レジオネラ症、レプトスピラ症、リステリア菌、マイコプラスマ目、ライ菌、コレラ菌、ナイセリア科（例えばアシネトバクター、淋疾、髄膜炎菌）、ナイセリア・メニンギチジス、パスツレラ科感染症（例えばアクチノバチルス、ヘモフィルス（例えばB型インフルエンザ菌）、パスツレラ）、シュードモナス、リケッチア科、クラミジア科、梅毒、シゲラ属、ブドウ球菌、髄膜炎菌、肺炎球菌およびレンサ球菌（例えば肺炎レンサ球菌およびB群溶連菌）。これらの細菌および真菌科は、例えば次の疾患または症状を引き起こすことができるが、これらに限るわけではない：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えばAIDS関連感染症）、爪囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症、例えば百日咳または蓄膿症、敗血症、ライム病、ネコひっかき病、赤痢、パラチフス、食中毒、腸チフス、肺炎、淋疾、髄膜炎（例えばA型およびB型髄膜炎）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ、パラ結核症、結核、狼蒼、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リューマチ熱、猩紅熱、性感染症、皮膚病（例えば蜂巣炎、デルマトサイコーシス）、毒血症、尿路感染症、創感染。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、作動薬もしくは拮抗薬は、これらの症状または疾患のいずれの処置、予防および/または診断にも使用することができる。具体的態様として、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、作動薬もしくは拮抗薬を使って、破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および/またはB型髄膜炎を処置、予防および/または診断する。
【０９６４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬によって処置、予防および/または診断することができる疾患または症状を引き起こす寄生因子として、以下の科または綱が挙げられるが、これらに限るわけではない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Dientamoebiasis）、交疫、外部寄生生物、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫病、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、ならびにトリコモナス属および胞子虫類（例えば三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、および卵形マラリア原虫）。これらの寄生生物は、例えば疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸疾患（例えば赤痢、ジアルジア症）、肝疾患、肺疾患、日和見感染症（例えばAIDS関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラズマ症など（ただしこれらに限るわけではない）の様々な疾患または症状を引き起こしうる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬は、これらの症状または疾患のいずれを処置、予防および/または診断するためにも使用することができる。具体的態様として、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは作動薬もしくは拮抗薬を使って、マラリアを処置、予防および/または診断する。
【０９６５】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬による処置または予防は、好ましくは、有効量のポリペプチドを患者に投与することによって、または患者から細胞を取り出し、その細胞に本発明のポリヌクレオチドを供給し、操作された細胞を患者に戻すこと（エクスビボ治療法）によって行なわれるだろう。さらに本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染性疾患に対する免疫応答を生じさせるためのワクチンに、抗原として使用することもできる。
【０９６６】
再生
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使って細胞を分化させ、増殖させ、誘引して、組織の再生につなげることができる（Science 276:59-87(1997)）参照）。組織の再生は、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開または潰瘍）、加齢、疾患（例えば骨粗鬆症、変形性関節症、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、または全身性サイトカイン損傷による損傷を受けた組織を修復、置換、または保護するために使用することができるだろう。
【０９６７】
本発明を使って再生させることができるであろう組織には、器官（例えば膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋（平滑筋、骨格筋または真菌）、脈管構造（血管およびリンパ管を含む）、神経組織、造血組織、および骨格（骨、軟骨、腱、および靱帯）組織などが含まれる。再生は瘢痕を残さずに、または少ない瘢痕で起こることが好ましい。再生には血管新生も含まれうる。
【０９６８】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、治癒が困難な組織の再生を増進させうる。例えば腱/靱帯再生の増進は、損傷後の回復時間を速めるだろう。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、損傷を避ける目的で、予防的に使用することもできるだろう。処置、予防および/または診断することができるであろう具体的疾患には、腱炎、手根管症候群、および他の腱または靱帯欠損が含まれる。非治癒性創傷の組織再生のさらなる一例として、潰瘍、循環不全に関係する潰瘍、手術および外傷性創傷が挙げられる。
【０９６９】
同様に、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬を使って神経細胞を増殖および分化させることにより、神経および脳組織も再生させることができるだろう。この方法を使って処置、予防および/または診断することができるであろう疾患には、中枢神経系および末梢神経系の疾患、ニューロパシーまたは機械的および外傷性の疾患、傷害および/または状態（例えば脊髄傷害、頭部外傷、脳血管疾患、および脳卒中）が含まれる。具体的には、末梢神経傷害、末梢ニューロパシー（例えば化学療法または他の医療に起因するもの）、限局性ニューロパシー、および中枢神経系疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ・ドレーガー症候群）はいずれも、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬を使って処置、予防および/または診断することができるだろう。
【０９７０】
走化性
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は走化活性を持ちうる。走化性分子は細胞（例えば単球、線維芽細胞、好中球、T細胞、マスト細胞、好酸球、上皮および/または内皮細胞）を体内の特定の部位、例えば炎症、感染、または過剰増殖の部位に、誘引または動員する。そうすると、動員された細胞は、特定の外傷または異常を撃退および/または治癒することができる。
【０９７１】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、特定細胞の走化活性を増加させうる。その場合、これらの走化性分子は、体内の特定部位にターゲティングされる細胞の数を増加させることにより、炎症、感染、過剰増殖性疾患、障害および/または状態、または任意の免疫系障害を処置、予防および/または診断するために使用することができる。例えば走化性分子は、傷害を受けた部位に免疫細胞を誘引することによって、創傷および他の外傷または組織を処置、予防および/または診断するために使用することができる。本発明の走化性分子は線維芽細胞を誘引することもでき、これは創傷の処置、予防および/または診断に使用することができる。
【０９７２】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は走化活性を阻害する場合もあると考えられる。これらの分子も、疾患、障害および/または状態の処置、予防および/または診断に使用することができるだろう。したがって本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は走化性の阻害剤として使用することができるだろう。
【０９７３】
結合性活性
本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドに結合する分子またはそのポリペプチドが結合する分子の選別に使用することができる。本ポリペプチドと上記分子との結合は、本ポリペプチドまたは結合した上記分子の活性を活性化（作動薬）、増加、阻害（拮抗薬）、または低下させうる。そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）、または小分子などが挙げられる。
【０９７４】
上記の分子は、本ポリペプチドの天然リガンド、例えばそのリガンドの断片、または天然の基質、リガンド、構造的もしくは機能的ミメティックと密接な関係にあることが好ましい（Coliganら,Current Protocols in Immunology」1(2) Chapter 5(1991)参照）。同様に、上記の分子は、本ポリペプチドが結合する天然の受容体、または少なくとも、本ポリペプチドが結合することのできるその受容体の断片（例えば活性部位）と密接な関係にあってもよい。どちらの場合も、上記の分子は、既知の技術を使って合理的に設計することができる。
【０９７５】
これらの分子のスクリーニングでは、好ましくは、本ポリペプチドを分泌タンパク質として発現させるか細胞膜上に発現させる適当な細胞を作出する。好ましい細胞としては、哺乳動物由来の細胞、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌細胞が挙げられる。次に、好ましくは、本ポリペプチドを発現させる細胞（または発現したポリペプチドを含む細胞膜）を、上記の分子を含んでいる可能性のある試験化合物と接触させて、本ポリペプチドまたは上記分子の結合、またはその活性の刺激もしくは阻害を観察する。
【０９７６】
アッセイは、単に本ポリペプチドに対する候補化合物の結合を試験するものであって、結合を標識によって検出するアッセイ、または競合を伴うアッセイの場合は標識した競合剤によって検出するアッセイであることができる。さらに、アッセイは、候補化合物がポリペプチドへの結合によって生成するシグナルをもたらすかどうかを試験するアッセイであってもよい。
【０９７７】
あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固形支持体に固定されたポリペプチド/分子、化合物ライブラリー、または天然産物混合物を使って行なうこともできる。さらにアッセイは、単に、候補化合物を、ポリペプチドを含む溶液と混合し、ポリペプチド/分子の活性または結合を測定し、そのポリペプチド/分子の活性または結合を標準と比較するステップを含むアッセイであってもよい。
【０９７８】
好ましくは、ELISAアッセイにより、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使って、試料（例えば生物学的試料）中のポリペプチドのレベルまたは活性を測定することができる。抗体は、本ポリペプチドに直接的もしくは間接的に結合するか、または基質に関して本ポリペプチドと競合することによって、ポリペプチドのレベルまたは活性を測定することができる。
【０９７９】
さらに、本発明のポリペプチドが結合する受容体は、例えばリガンドパンニングおよびFACSソーティングなど、当業者に知られている数多くの方法によって同定することができる（Coliganら,Current Protocols in Immun.,1(2),Chapter 5,(1991)）。例えば発現クローニングを利用する。発現クローニングでは、本ポリペプチドに応答する細胞、例えばFGFファミリータンパク質に対する受容体を複数含むことが知られているNIH3T3細胞およびSC-3細胞などからポリアデニル化RNAを調製し、このRNAから作製したcDNAライブラリーをいくつかのプールに分割し、それらを使って、本ポリペプチドに応答しないCOS細胞または他の細胞をトランスフェクトする。ガラススライド上で生育したトランスフェクト細胞を、本発明のポリペプチドに、それらを標識した後で、ばく露する。ポリペプチドは、例えばヨウ素化または部位特異的プロテインキナーゼ認識部位の包含など、様々な手段で標識することができる。
【０９８０】
固定とインキュベーションに続いて、スライドをオートラジオグラフィー解析にかける。陽性プールを同定し、サブプール化と再スクリーニングを繰り返す方法で、サブプールを調製し、再びトランスフェクトすることにより、最終的に推定受容体をコードする単一のクローンを得る。
【０９８１】
受容体を同定するためのもう一つのアプローチとして、標識ポリペプチドを、受容体分子を発現させる細胞膜調製物または抽出物と光アフィニティー結合することもできる。架橋された材料をPAGE分析によって分割し、X線フィルムに露出する。本ポリペプチドの受容体を含む標識された複合体を切出し、ペプチド断片に分割し、タンパク質微量配列決定にかけることができる。微量配列決定によって得られたアミノ酸配列は、cDNAライブラリーをスクリーニングして推定受容体をコードする遺伝子を同定するための一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブの設計に使用されるだろう。
【０９８２】
さらに、遺伝子ファルイング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリングおよび/またはコドン鎖不リング（「DNAシャフリング」と総称する）の技術を利用して、本発明ポリペプチドの活性を調整し、よって本発明ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に作製することもできる。一般論として米国特許第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号および第5,837,458号、Patten,P.A.ら,Curr.Opinion Biotechnol.8:724-33(1997)；Harayama,S.Trends Biotechnol.16(2):76-82(1998)；Hansson,L.O.ら,J.Mol.Biol.287:265-76(1999)；ならびにLorenzo,M.M.およびBlasco,R.,Biotechniques 24(2):308-13(1998)を参照されたい（これらの特許および刊行物は参考文献として本明細書の一部を構成する）。一態様として、本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドの改変は、DNAシャフリングによって達成することができる。DNAシャフリングでは、相同組換えまたは部位特異的組換えによって2以上のDNAセグメントを所望のポリヌクレオチド配列に集合させる。もう一つの態様として、組換えに先だって、エラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法によるランダム突然変異誘発処理にかけることにより、本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドを変化させてもよい。もう一つの態様として、本発明ポリペプチドの1つまたは複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などを、1つまたは複数の異種分子の1または複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組換えてもよい。好ましい態様では異種分子はファミリーの構成要素である。さらなる好ましい態様では、異種分子は成長因子、例えば血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン様成長因子（IGF-I）、トランスフォーミング成長因子（TGF）-アルファ、表皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、TGF-ベータ、骨形成タンパク質（BMP）-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、アクチビンAおよびB、デカペンタプレジック（decapentaplegic＝dpp）、60A、OP-2、ドルサリン（dorsalin）、成長分化因子（GDF）、ノーダル（nodal）、MIS、インヒビン-アルファ、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ5、およびグリア由来好中球因子（GDNF）などである。
【０９８３】
他の好ましい断片は、本発明ポリペプチドの生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片は、本ポリペプチドと類似する活性であるが必ずしも同一でない活性を示す断片である。断片の生物学的活性には、改善された望ましい活性、または低下した望ましくない活性を含めることができる。
【０９８４】
さらに本発明は、本発明ポリペプチドの作用を調整する化合物を同定するための化合物スクリーニング方法を提供する。そのようなアッセイの一例は、線維芽細胞が通常増殖するであろう細胞培養条件下に、哺乳類線維芽細胞、本発明のポリペプチド、およびスクリーニングされる化合物、および3[H]チミジンを含む。スクリーニングされる化合物の不在下で対照アッセイを行ない、3[H]チミジンの取り込み量をそれぞれに決定することにより、その化合物が存在する場合の線維芽細胞増殖の量と比較して、その化合物が増殖を刺激するかどうかを決定することができる。線維芽細胞増殖の量は、3[H]チミジンの取り込み量を測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによって測定される。アゴニスト化合物もアンタゴニスト化合物も、この方法によって同定することができる。
【０９８５】
もう一つの方法として、本発明のポリペプチドに対する受容体を発現させる哺乳類細胞または膜調製物を、標識した本発明のポリペプチドと共に、化合物の存在下でインキュベートする。次に、この相互作用を増進または遮断する化合物の能力を測定することができる。あるいは、スクリーニングされる化合物と受容体との相互作用に続いて起こる既知の第2メッセンジャー系の応答を測定し、受容体に結合して第2メッセンジャー応答を誘発する化合物の能力を測定して、その化合物が潜在的アゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する。そのような第2メッセンジャー系には、cAMPグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、ホスホイノシチド加水分解などがあるが、これらに限るわけではない。
【０９８６】
上述したこれらのアッセイはいずれも診断マーカーまたは予後マーカーとして使用することができる。これらのアッセイを使って発見された分子は、処置、予防および/または診断を行なうために、または本ポリペプチド/分子を活性化または阻害することによって患者に特定の結果（例えば血管成長）をもたらすために、使用することができる。さらにこれらのアッセイにより、適切に操作された細胞または組織からの本発明ポリペプチドの産生を阻害または増進しうる薬剤を発見することもできる。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、（a）候補結合化合物をポリペプチドと共にインキュベートするステップ、および（b）結合が起こったかどうかを決定するステップを含む方法を包含する。さらに本発明は、作動薬/拮抗薬を同定する方法であって、（a）候補化合物を本ポリペプチドと共にインキュベートするステップ、（b）生物学的活性をアッセイするステップ、および（b）本ポリペプチドの生物学的活性が変化したかどうかを決定するステップを含む方法も包含する。
【０９８７】
また、本発明のポリペプチドを結合する分子を、本タンパク質のポリペプチド配列に含まれるベータプリーツシート領域を使って、実験的に同定することもできるだろう。したがって本発明は、その具体的態様として、ここに開示するポリペプチド配列中の各ベータプリーツシート領域のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは同アミノ酸配列からなるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドに向けられる。本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチド配列に含まれる任意の組合わせまたはその全てを含むポリペプチド、あるいはそれら任意の組合わせまたはその全てからなるポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドに向けられる。本発明のさらなる好ましい態様は、本発明のポリペプチド配列の一つに含まれるベータプリーツシート領域のそれぞれのアミノ酸配列を含む、または同アミノ酸配列からなる、ポリペプチドに向けられる。本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチド配列の一つに含まれるベータプリーツシート領域の任意の組合わせまたはその全てを含む、またはそれら任意の組合わせまたはその全てからなる、ポリペプチドに向けられる。
【０９８８】
標的送達
もう一つの態様として、本発明は、本発明ポリペプチドの受容体を発現させる標的細胞または細胞結合型の本発明ポリペプチドを発現させる細胞に組成物を送達する方法を提供する。
【０９８９】
本明細書で論じるように、本発明のポリペプチドまたは抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと、疎水相互作用、親水相互作用、イオン相互作用および/または共有結合的相互作用によって結合することができる。一態様として、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と結合させた本発明のポリペプチド（抗体を含む）を投与することにより、本発明の組成物を細胞に特異的に送達する方法を提供する。一つの例として、本発明は、標的細胞中に治療タンパク質を送達する方法を提供する。もう一つの例として、本発明は、一本鎖核酸（例えばアンチセンスもしくはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば細胞のゲノムに組み込まれるか、エピソームとして複製することができ、かつ転写されうるDNA）を標的細胞中に送達する方法を提供する。
【０９９０】
もう一つの態様として、本発明は、毒素または細胞毒性プロドラッグと結合した本発明のポリペプチド（例えば本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体）を投与することによって、細胞を特異的に破壊（例えば腫瘍細胞を破壊）する方法を提供する。
【０９９１】
「毒素」とは、内因性の細胞毒性エフェクター系を結合し、活性化する化合物、放射性同位体、ホロ毒素、修飾毒素、毒素の触媒サブユニット、または細胞中もしくは細胞表面上に通常は存在しない任意の分子もしくは酵素であって、所定の条件下で細胞の死を引き起こすものを意味する。本発明の方法で使用することができる毒素には、例えば、当技術分野で知られる放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性細胞毒性エフェクター系を結合する抗体（またはその補体結合性含有部分）などの化合物、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、RNアーゼ、アルファ毒素、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素A、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、アルファサルシンおよびコレラ毒素などがあるが、これらに限るわけではない。「細胞毒性プロドラッグ」とは、細胞中に通常存在する酵素によって細胞毒性化合物に変換される非毒性化合物を意味する。本発明の方法で使用することができる細胞毒性プロドラッグには、例えば、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンCのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体などがあるが、これらにかぎるわけではない。
【０９９２】
薬物スクリーニング
さらに、本発明のポリペプチドの活性を調整する分子を選別するために、本発明のポリペプチドまたはこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用することも考えられる。そのような方法では、本発明のポリペプチドを、拮抗薬または作動薬活性を持つと疑われる選択した化合物と接触させ、結合後のこれらポリペプチドの活性をアッセイする。
【０９９３】
この発明は、本発明のポリペプチドまたはその結合性断片を使って、様々な薬物スクリーニング技術のいずれかで行なわれる治療化合物のスクリーニングに、とりわけ有用である。そのような試験で使用されるポリペプチドまたは断片は、固形支持体に固定されていてもよいし、細胞表面に発現していてもよいし、溶解した遊離の状態にあってもよいし、細胞内に位置してもよい。薬物スクリーニングの一方法では、上記ポリペプチドまたは断片を発現させる組換え核酸で安定に形質転換された真核または原核宿主細胞を利用する。薬物は、そのような形質転換細胞に対して、競合結合アッセイでスクリーニングされる。例えば、被験薬剤と本発明のポリペプチドとの複合体の形成を測定することができる。
【０９９４】
したがって、本発明は、本発明のポリペプチドによって媒介される活性に影響を及ぼす薬物または他の任意の薬剤をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、そのような薬剤を本発明のポリペプチドまたはその断片と接触させること、およびその薬剤とポリペプチドまたはその断片との複合体の存在を、当技術分野で周知の方法によってアッセイすることを含む。そのような競合結合アッセイでは、選別する薬剤を通例、標識する。インキュベーション後に、結合型として存在するものから遊離の薬剤を分離する。遊離のラベルまたは複合体化していないラベルの量は、特定薬剤の、本発明ポリペプチドに結合する能力の尺度となる。
【０９９５】
もう一つの薬物スクリーニング技術は、本発明のポリペプチドに対して適切な結合親和性を持つ化合物の高スループットスクリーニングを可能にするものであるが、この技術は、参考文献として本明細書の一部を構成する欧州特許出願84／03564（1984年9月13日公開）に詳細に説明されている。簡単に述べると、多数の異なる小ペプチド試験化合物を、固形基材、例えばプラスチックピンまたは他の何らかの表面上で合成する。ペプチド試験化合物を本発明のポリペプチドと反応させ、洗浄する。次に、結合したポリペプチドを当技術分野で周知の方法によって検出する。精製されたポリペプチドを、上述の薬物スクリーニング技術に使用されるプレート上に直接コーティングする。また、非中和抗体を使ってペプチドを捕捉し、それを固形支持体上に固定化することができる。
【０９９６】
本発明では、本発明のポリペプチドを結合する能力を持つ中和抗体がポリペプチドまたはその断片への結合に関して試験化合物と特異的に競合する競合薬物スクリーニングアッセイを使用することも考えられる。この方法では、抗体を使って、本発明のポリペプチドと共通する1つまたは複数の抗原エピトープを持つ任意のペプチドを検出する。
【０９９７】
本発明のヒトホスファターゼポリペプチドおよび/またはペプチド、またはその免疫原性断片もしくはオリゴペプチドは、種々の薬物スクリーニング技術で治療薬または化合物をスクリーニングするために使用することができる。そのようなスクリーニングアッセイで使用される断片は、溶解した遊離の状態にあってもよいし、固形支持体に固定されていてもよいし、細胞表面に担持されていてもよいし、細胞内に存在してもよい。本イオンチャネルタンパク質と被験薬剤との結合複合体形成の活性の減少または消滅を測定することができる。したがって本発明は、複数の化合物を、本発明のホスファターゼポリペプチドまたは結合性ペプチド断片との特異的結合親和性に関して、スクリーニングまたはアッセイする方法であって、複数の化合物を用意し、ホスファターゼポリペプチドまたは結合性ペプチド断片を複数の化合物のそれぞれと、適切な条件下で、結合を可能とするのに十分な時間にわたって混合し、上記複数の試験化合物のそれぞれに対するホスファターゼポリペプチドまたはペプチドの結合を検出し、よってホスファターゼポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合する化合物を同定することを含む方法を提供する。
【０９９８】
本発明は、新規ヒトホスファターゼポリペプチドおよび/またはペプチドの活性を調整する化合物を同定する方法を提供する。この方法では、ホスファターゼの生物学的活性の潜在的または候補化合物または薬物モジュレーターを、ホスファターゼポリペプチドまたはペプチド、例えば配列番号42、109、150もしくは152に記載のホスファターゼアミノ酸配列と混合し、ホスファターゼポリペプチドまたはペプチドの生物学的活性に対する候補化合物または薬物モジュレーターの効果を測定する。そのような測定可能な効果には、例えば、物理的結合相互作用；適切なカルパイン基質をリン酸化する能力；天然およびクローン化ホスファターゼ発現細胞株に対する効果；およびモジュレーターの効果、またはホスファターゼが媒介する他の生理学的尺度などがある。
【０９９９】
本発明の新規ホスファターゼポリペプチドの生物学的活性を調整する化合物を同定するもう一つの方法では、ホスファターゼの活性の潜在的または候補化合物または薬物モジュレーターを、ホスファターゼポリペプチドを発現させる宿主細胞と混合し、ホスファターゼポリペプチドの生物学的活性に対するその候補化合物または薬物モジュレーターの効果を測定する。宿主細胞は、例えば誘導性発現によってホスファターゼポリペプチドを発現させるように誘導することができる細胞であってもよい。ホスファターゼポリペプチドに対する、あるモジュレーター候補の生理学的効果を測定することもできる。したがって、特定のホスファターゼモジュレーターに関する細胞アッセイは、ホスファターゼポリペプチドの物理的生物学的活性の直接的な測定または定量であってもよいし、あるいは生理学的効果の測定または定量であってもよい。そのような方法では、好ましくは、本明細書に記載のホスファターゼポリペプチドを使用するか、本明細書に記載の発現ベクターを含みホスファターゼポリペプチドが発現、過剰発現、またはアップレギュレートされた発現をする適切な宿主細胞中で過剰発現させた組換えホスファターゼポリペプチドを使用する。
【１０００】
本発明のもう一つの側面は、ホスファターゼポリペプチドの生物学的活性を調整する能力を持つ化合物に関するスクリーニングを行なう方法であって、ホスファターゼポリペプチドまたはその機能的ペプチドもしくは一部（例えば配列番号42、109、150または152）をコードする核酸配列を持つ発現ベクターを含む宿主細胞を用意すること；発現したホスファターゼポリペプチドの生物学的活性を、モジュレーター化合物の不在下で決定すること；細胞をモジュレーター化合物と接触させて、発現したホスファターゼポリペプチドの生物学的活性をモジュレーター化合物の存在下で決定することを含む方法を包含する。そのような方法では、モジュレーター化合物の存在下でのホスファターゼポリペプチドの活性と、モジュレーター化合物の不在下でのホスファターゼポリペプチドの活性との差異が、その化合物の調整効果を示す。
【１００１】
本発明のアッセイでは、基本的にあらゆる化学化合物を、潜在的モジュレーターまたはリガンドとして使用することができる。ホスファターゼモジュレーターとして試験される化合物は、任意の小さい化学化合物または生物学的物体（例えばタンパク質、糖、核酸、脂質）であることができる。試験化合物は典型的には小さい化学化合物およびペプチドであるだろう。一般に、潜在的モジュレーターとして使用される化合物は、水溶液または有機（例えばDMSO系）溶液に溶解することができる。アッセイは、アッセイステップを自動化し、任意の便利な供給源から化合物を用意することにより、大きな化合物ライブラリーをスクリーニングするように設計される。アッセイは典型的には、例えばロボットアッセイにより、マイクロタイタープレートでのマイクロタイター形式で、並行して行なわれる。化学化合物の供給者は、例えばSigma（ミズーリ州セントルイス）、Aldrich（ミズーリ州セントルイス）、Sigma-Aldrich（ミズーリ州セントルイス）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika（スイス・ブックス）など、数多く存在する。また化合物は当技術分野で知られる方法によって合成してもよい。
【１００２】
本明細書に記載する新規ホスファターゼポリヌクレオチドおよびポリペプチドのモジュレーターの検出には、特に高スループットスクリーニング法が考えられる。そのような高スループットスクリーニング法では、通例、多数の潜在的治療化合物（例えばリガンドまたはモジュレーター化合物）を含むコンビナトリアル化合物またはペプチドライブラリーを用意する。次に、そのようなコンビナトリアル化合物ライブラリーまたはリガンドライブラリーを、1つまたは複数のアッセイでスクリーニングすることにより、所望の特徴的活性を示すこれらのライブラリーの構成要素（例えば特定の化学種またはサブクラス）を同定する。そのようにして同定された化合物は通常のリード化合物として役立ちうるか、またはそれら自体を潜在的なまたは現実の治療薬として使用することができる。
【１００３】
コンビナトリアル化合物ライブラリーは、化学合成または生物学的合成により、数多くの化学構成単位（すなわちアミノ酸などの試薬）を組み合わせることによって製造された多様な化学化合物の集合である。一例として、線状コンビナトリアルライブラリー、例えばポリペプチドまたはペプチドライブラリーは、一組の化学構成単位を、与えられた化合物の長さ（すなわちポリペプチドまたはペプチド化合物中のアミノ酸数）に関して考え得る全ての方法で組み合わせることによって形成される。このような化学構成単位のコンビナトリアルな混合により、何百万という化学化合物を合成することができる。
【１００４】
コンビナトリアル化合物ライブラリーの作製およびスクリーニングは当業者にはよく知られている。コンビナトリアルライブラリーには、例えばペプチドライブラリー（米国特許第5,010,175号；Furka,1991,Int.J.Pept.Prot.Res.,37:487-493；およびHoughtonら,1991,Nature,354:84-88など）があるが、これらに限るわけではない。化学的多様性ライブラリーを作製するために他の化学も使用することができる。化学的多様性ライブラリー化学の例には、ペプトイド（PCT公開第WO91/019735号）、コードされたペプチド（PCT公開第WO93/20242号）、ランダムバイオオリゴマー（PCT公開第WO92/00091号）、ベンゾジアゼピン類（米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン類、ベンゾジアゼピン類およびジペプチドなどのダイバーソマー（diversomer）（Hobbsら,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6909-6913）、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaら,1992,J.Amer.Chem.Soc.,114:6568）、グルコーススキャフォールドを持つ非ペプチドペプトイドミメティック（Hirschmannら,1992,J.Amer.Chem.Soc.,114: 9217-9218）、小化合物ライブラリーの類似有機合成（Chenら,1994,J.Amer.Chem.Soc.,116:2661）、オリゴカルバメート（Choら,1993,Science,261:1303）および/またはペプチジルホスホネート（Campbellら,1994,J.Org.Chem.,59:658）、核酸ライブラリー（Ausubel,BergerおよびSambrook,全て前掲）、ペプチド核酸ライブラリー（米国特許第5,539,083号）、抗体ライブラリー（例えばVaughnら,1996,Nature Biotechnology,14(3):309-314およびPCT/US96/10287）、糖質ライブラリー（例えばLiangら,1996,Science,274-1520-1522および米国特許第5,593,853号）、小有機分子ライブラリー（例えばベンゾジアゼピン類、Baum C&EN,Jan.18,1993,33頁；および米国特許第5,288,514号；イソプレノイド類、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノン類およびメタチアザノン類、米国特許第5,549,974号；ピロリジン類、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物；米国特許第5,506,337号など）があるが、これらに限るわけではない。
【１００５】
コンビナトリアルライブラリーを作製するための装置は市販されている（例えば357MPS、390MPS、Advanced Chem Tech（ケンタッキー州ルイビル）；Symphony、Rainin（マサチューセッツ州ウォーバン）；433A、Applied Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティ）；9050Plus、Millipore（マサチューセッツ州ベッドフォード）。また、コンビナトリアルライブラリーも数多く市販されている（例えばComGenex（ニュージャージー州プリンストン）；Asinex（ロシア・モスクワ）；Tripos,Inc.（ミズーリ州セントルイス）；ChemStar,Ltd.（ロシア・モスクワ）；3D Pharmaceuticals（ペンシルバニア州エクストン）；Martek Biosciences（メリーランド州コロンビア）など）。
【１００６】
一態様として、本発明は、イオンチャネルを発現させる細胞または組織が固相基材に取付けられている高スループット形式の固相型インビトロアッセイを提供する。そのような高スループットアッセイでは、数千種類までのモジュレーターまたはリガンドを一日でスクリーニングすることが可能である。具体的には、マイクロタイタープレートの各ウェルを使って、選択した潜在的モジュレーターに対して個別のアッセイを行なうか、または濃度もしくはインキュベーション時間の影響を観察すべき場合には、5〜10ウェル毎に1つのモジュレーターを試験することができる。したがって、1枚の標準的マイクロタイタープレートでは、約96個のモジュレーターをアッセイすることができる。1536ウェルプレートを使用すれば、1枚のプレートで約100〜約1500種類の化合物を容易にアッセイすることができる。1日あたり数枚の異なるプレートをアッセイすることができるので、記載の統合システムを使用すれば、例えば約6000〜20000種類までの化合物のアッセイスクリーニングが可能である。
【１００７】
もう一つの側面として、本発明は、あるタンパク質、すなわちホスファターゼポリペプチドまたはペプチドに結合することができる小分子の検出または同定を伴うスクリーニングおよび小分子（例えば薬物）検出アッセイを包含する。高スループットスクリーニング法に適したアッセイは特に好ましい。
【１００８】
そのような結合型検出、同定またはスクリーニングアッセイでは、機能アッセイは通例、必要でない。必要なのは、標的タンパク質（好ましくは実質的に精製されたもの）と、タンパク質標的への結合に関してスクーニングもしくはアッセイしようとする化合物ライブラリーもしくは化合物パネル（例えばリガンド、薬物、小分子）または生物学的物体だけである。好ましくは、標的タンパク質に結合するほとんどの小分子は、タンパク質上の機能領域または機能部位への選択的な、より親和性の高い結合ゆえに、何らかの形で活性を調整するだろう。
【１００９】
そのようなアッセイの一例は、Pantolianoらの米国特許第6,020,141号および第6,036,920号に記載されている蛍光に基づく熱シフトアッセイ（3-Dimensional Pharmaceuticals,Inc.（3DP）、ペンシルバニア州エクストン）である。J.Zimmerman,2000,Gen.Eng.News,20(8)も参照されたい。このアッセイでは、発現された、そして好ましくは精製されたイオンチャネルポリペプチドに結合する小分子（例えば薬物、リガンド）を、タンパク質-薬物またはリガンド複合体の熱アンフォールディング曲線の解析による結合親和性の決定に基づいて検出することが可能である。所望により、この技術によって決定される薬物または結合分子を、本明細書に記載するような方法によってさらにアッセイして、その分子が標的タンパク質の機能もしくは活性に影響を及ぼすかどうか、または標的タンパク質の機能もしくは活性を調整するかどうかを決定することができる。
【１０１０】
生物学的結合またはリガンド結合活性を測定するためのホスファターゼポリペプチドまたはペプチドの精製には、標準的プロテアーゼ阻害剤の存在下で連続的に凍結融解サイクル（例えば1〜3回）を行なうことによって調製することができる全細胞溶解物を供給源とすることができる。ホスファターゼポリペプチドは標準的なタンパク質精製法、例えば後述する特異抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、またはやはり本明細書に記載する組換えホスファターゼポリペプチド分子に組み込まれたエピトープタグに特異的なリガンドによって、部分精製または完全精製することができる。次に、結合活性を記載のとおりに測定することができる。
【１０１１】
本明細書に記載の方法によって同定される、本発明のホスファターゼポリペプチドの生物学的活性または生理機能を調整または調節する化合物は、本発明の好ましい一態様である。そのような調整化合物は、処置を必要とする個体に、本明細書に記載の方法で同定された化合物の治療有効量を投与することによって、新規ホスファターゼポリペプチドが媒介する状態を処置するための処置および治療方法に使用することができると考えられる。
【１０１２】
さらに、本発明は、本発明のホスファターゼポリペプチドによって媒介される疾患、障害または状態の処置を必要とする個体を処置する方法であって、本明細書に記載の方法によって同定されるホスファターゼ調整化合物の治療有効量を、その個体に投与することを含む方法を提供する。
【１０１３】
アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）
具体的態様として、本発明のアンタゴニストは、配列番号Xに含まれる配列またはその相補鎖に相当するかつ/または寄託されたクローンに含まれるヌクレオチド配列に相当する核酸である。一つの態様として、アンチセンス配列は当該生物によって体内で生成され、もう一つの態様として、アンチセンス配列は別途投与される（例えばO'Connor,Neurochem.,56:560(1991)；「Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression」（CRC Press,フロリダ州ボカラトン,1988））。アンチセンス技術は、アンチセンスDNAもしくはRNAによる、または三重らせん形成による遺伝子発現の制御に使用することができる。アンチセンス技術は、例えばOkano,Neurochem.,56:560(1991)；「Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression」（CRC Press,フロリダ州ボカラトン,1988）などで論じられている。三重らせん形成は、例えばLeeら,Nucleic Acids Research,6:3073(1979)；Cooneyら,Science,241:456(1988)；およびDervanら,Science,251:1300(1991)などで論じられている。これらの方法は相補的DNAまたはRNAへのポリヌクレオチドの結合に基づいている。
【１０１４】
例えば、c-mycおよびc-mybアンチセンスRNAコンストラクトを使った非リンパ球性白血病細胞株HL-60および他の細胞株の成長の阻害が、先に記載されている（Wickstromら,(1988);Anfossiら,(1989)）。これらの実験は、細胞をオリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることにより、インビトロで行なわれた。インビボ用の同様の手法はWO91/15580に記載されている。簡単に述べると、与えられたアンチセンスRNAに関して、一対のオリゴヌクレオチドを、以下のように作製する。オープンリーディングフレームの最初の15塩基に相補的な配列に、5'端側にはEcoR1部位を、また3'端側にはHindIII部位を隣接させる。次に、オリゴヌクレオチド対を90℃で1分間加熱し、2×ライゲーションバッファー（20mMトリスHCl、pH7.5、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール（DTT）および0.2mM ATP）中でそれらをアニールさせ、レトロウイルスベクターPMV7（WO91/15580）のEcoR1/HindIII部位にライゲートする。
【１０１５】
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5'コード部分を使って、長さが約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計することができる。転写に関係する遺伝子の一領域に相補的になり、よって受容体の転写および産生が妨害されるように、DNAオリゴヌクレオチドを設計する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイズし、そのmRNA分子が受容体ポリペプチドに翻訳されるのを妨げる。
【１０１６】
一態様として、本発明のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって、細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部は転写されて、本発明のアンチセンス核酸（RNA）を生成する。そのようなベクターは、本発明のアンチセンス核酸をコードする配列を含むだろう。そのようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスRNAを産生する限り、エピソームの状態に留まっても、染色体に組み込まれてもよい。そのようなベクターは、当技術分野では標準的な組換えDNA技術の方法によって構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞での複製と発現に使用されるプラスミド、ウイルス、または当技術分野で知られる他のベクターであることができる。本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする配列の発現は、脊椎動物細胞、好ましくはヒト細胞で作用することが技術上知られている任意のプロモーターによることができる。そのようなプロモーターは誘導性であっても構成的であってもよい。そのようなプロモーターには、例えばSV40初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon,Nature,29:304-310(1981)）、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復配列（Yamamotoら,Cell,22:787-797(1980)）、ヘルペスチミジンプロモーター（Wagnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78:1441-1445(1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら,Nature,296:39-42(1982)）などがあるが、これらに限るわけではない。
【１０１７】
本発明のアンチセンス核酸は、興味ある遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましくはあるが、必要ではない。本明細書にいう「RNAの少なくとも一部に相補的な」配列とは、RNAとハイブリダイスして安定な二重鎖を形成させる能力を持つのに十分な相補性を有する配列を意味し、本発明の二本鎖アンチセンス核酸の場合は、二本鎖DNAの一方の鎖を調べるか、または三重鎖形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度にも、アンチセンス核酸の長さにも依存するだろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、本発明のRNA配列とのミスマッチをより多く含んでも、安定な二重鎖（場合によって三重鎖）を形成することができる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な方法を使って、許容できるミスマッチの程度を確かめることができる。
【１０１８】
メッセージの5'末端、例えば5'非翻訳配列からAUG開始コドンまで（AUG開始コドンを含む）に相補的なオリゴヌクレオチドは、最も効率よく翻訳を阻害するはずである。しかし、mRNAの3'非翻訳配列に相補的な配列も、同様にmRNAの翻訳を効果的に阻害することが示されている。一般論としてWagner,R.,Nature,372:333-335(1994)を参照されたい。したがって、本発明のポリヌクレオチド配列の5'非翻訳非コード領域または3'非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンス法に使用して、内因性mRNAの翻訳を阻害することができるだろう。mRNAの5'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、AUG開始コドンの相補鎖を含むべきである。mRNAコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり効率のよい翻訳阻害剤ではないが、本発明で使用することはできるだろう。mRNAの5'領域、3'領域またはコード領域のいずれにハイブリダイズするように設計したにせよ、アンチセンス核酸は、少なくとも6ヌクレオチドの長さを持つべきであり、6〜約50ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。具体的側面として、本オリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、または少なくとも50ヌクレオチドである。
【１０１９】
本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のDNAもしくはRNAまたはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾型であることができる。本オリゴヌクレオチドは、例えばその分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善する目的で、塩基部分、糖部分、またはリン酸エステル主鎖部分を修飾することができる。本オリゴヌクレオチドには、他の基、例えばペプチド（インビボで宿主細胞受容体を標的とするため）または細胞膜（例えばLetsingerら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556(1989)；Lemaitreら,Proc.Natl.Acad.Sci.,84:648-652(1987)；1988年12月15日に公開されたPCT公開第W088/09810号参照）または血液脳関門（例えば1988年4月25日に公開されたPCT公開第W089/10134号参照）を横切る輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えばKrolら,BioTechniques,6:958-976(1988)参照）または挿入剤（例えばZon,Pharm.Res.,5:539-549(1988)参照）などが付加されていてもよい。この目的を達成するために、オリゴヌクレオチドをもう一つの分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤などと結合することができる。
【１０２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンなど（ただしこれらに限るわけではない）を含む群から選択される少なくとも1つの修飾塩基部分を含んでもよい。
【１０２１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばアラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースなど（ただしこれらに限るわけではない）を含む群から選択される少なくとも1つの修飾糖部分も含んでよい。
【１０２２】
さらにもう一つの態様として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはその類似体など（ただしこれらに限るわけではない）を含む群から選択される少なくとも1つの修飾リン酸エステル主鎖を含む。
【１０２３】
さらにもう一つの態様として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α-アノマーオリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的RNAとの間に、通常のβ-ユニットとは対照的に、鎖が互いに並行に走る特殊な二本鎖ハイブリッドを形成する（Gautierら,Nucl.Acids Res.,15:6625-6641(1987)）。本オリゴヌクレオチドは、2-O-メチルリボヌクレオチド（Inoueら,Nucl.Acids Res.,15:6131-6148(1987)）またはキメラRNA-DNA類似体（Inoueら,FEBS Lett.215:327-330(1987)）である。
【１０２４】
本発明のポリヌクレオチドは、当技術分野で知られる標準的方法により、例えば自動DNA合成装置（例えばBiosearch、Applied Biosystemsなどから市販されているもの）を使って合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（Nucl.Acids Res.,16:3209(1988)）によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラスポリマー支持体を使って製造することができる（Sarinら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:7448-7451(1988)）。
【１０２５】
本発明のコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用することはできるだろうが、転写非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【１０２６】
本発明の潜在的アンタゴニストには触媒的RNA、すなわちリボザイムも包含される（例えば1990年10月4日に公開されたPCT国際公開WO90/11364；Sarverら,Science,247:1222-1225(1990)を参照されたい）。特異的認識配列でmRNAを切断するリボザイムを使って本発明のポリヌクレオチドに相当するmRNAを破壊することはできるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣接領域によって決まる部位でmRNAを切断する。唯一の必要条件は、標的mRNAが、2つの塩基からなる次の配列、すなわち5'-UG-3'を持つことである。ハンマーヘッドリボザイムの構築と製造は当技術分野ではよく知られており、HaseloffおよびGerlach,Nature,334:585-591(1988)に詳述されている。配列表に開示した各ヌクレオチド配列には極めて多数の潜在的ハンマーヘッドリボザイム切断部位が存在する。好ましくは、切断認識部位が本発明のポリヌクレオチドに相当するmRNAの5'末端近くに位置するように、すなわち効率が向上し、非機能的mRNA転写物の細胞内蓄積が最小限に抑えられるように、リボザイムを設計する。
【１０２７】
アンチセンス法の場合と同様に、本発明のリボザイムは（例えば安定性、ターゲティング性などが改善されるように）修飾オリゴヌクレオチドからなることができ、インビボで本発明のポリヌクレオチドを発現させる細胞に送達されるべきである。リボザイムをコードするDNAコンストラクトは、アンチセンスコードDNAの導入に関して上述した方法と同じ方法で細胞に導入することができる。好ましい送達法では、トランスフェクト細胞が内因性メッセージを破壊し翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、強力な構成的プロモーター、例えばpolIIIまたはpoIIプロモーターなどの制御下にリボザイムを「コード」しているDNAコンストラクトを使用する。リボザイムはアンチセンス分子とは異なり触媒分子であるので、アンチセンス分子より低い細胞内濃度でも有効である。
【１０２８】
拮抗薬/作動薬化合物は、新生物細胞および組織に対する本発明ポリペプチドの細胞成長および細胞増殖効果、すなわち腫瘍の血管新生の刺激を阻害し、よって例えば腫瘍形成または腫瘍成長における異常な細胞成長および細胞増殖を遅延または防止するために、使用することができる。
【１０２９】
本拮抗薬/作動薬は、過剰血管疾患を防止し、水晶体嚢外白内障手術後の上皮水晶体細胞の増殖を防止するためにも使用することができる。本発明ポリペプチドの有糸分裂促進活性の防止は、バルーン血管形成術後の再閉塞などの場合にも望ましいかもしれない。
【１０３０】
本拮抗薬/作動薬は、創傷治癒中の瘢痕組織の成長を防止するためにも使用することができる。
【１０３１】
本拮抗薬/作動薬は、本明細書に記載の疾患を処置、予防、および/または診断するためにも使用することができる。
【１０３２】
したがって本発明は、（a）本発明のポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子および/または（b）本発明のポリヌクレオチドに対するリボザイムを患者に投与することによって、本発明のポリヌクレオチドの過剰発現に関係する疾患、障害および/または状態、例えば本願に列挙した疾患、障害および/または状態など（ただしこれらに限らない）を処置または予防する方法を提供する。
【１０３３】
生物連関（Biotic Associations）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、直接的または間接的に他の生物との生物連関を開始および/または維持する生物の能力を増加させうる。そのような連関の性質は共生、非共生、内共生、巨視的共生（macrosymbiotic）および/または微視的共生（microsymbiotic）のいずれであってもよい。一般に、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、真菌、細菌、地衣類、菌根、シアノバクテリア、渦鞭毛藻類、および/または藻類の界、門、科、綱、属、および/または種の任意の構成要素との生物連関を形成する能力を増加させうる。
【１０３４】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/またはアゴニストもしくはアンタゴニストが、直接的または間接的に生物連関を開始および/または維持する宿主生物の能力を増加させうる機序は様々であるが、例えば、浸透圧を共生生物にとって望ましいレベルに調整すること、pHを共生生物にとって望ましいレベルに調整すること、有機酸の分泌を調整すること、特定のタンパク質、フェノール化合物、栄養素の分泌を調整すること、または宿主-共生生物相互作用に必要なタンパク質（例えば受容体、リガンドなど）の発現の増加などを挙げることができる（例えば参考文献として本明細書の一部を構成する「Microbial Signalling and Communication」（R. England, G. Hobbs, N. BaintonおよびD. McL. Roberts編, Cambridge University Press, ケンブリッジ, 1999）などを参照されたい）
【１０３５】
これに代わる一態様として、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、直接的または間接的に他の生物との生物連関を形成する宿主生物の能力を低下させる場合もある。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬が、直接的または間接的に他の生物との生物連関を開始および/または維持する宿主生物の能力を低下させる機序は様々であるが、例えば、浸透圧を望ましくないレベルに調整すること、pHを望ましくないレベルに調整すること、有機酸の分泌を調整すること、特定のタンパク質、フェノール化合物、栄養素の分泌を調整すること、または宿主-共生生物相互作用に必要なタンパク質（例えば受容体、リガンドなど）の発現の減少などを挙げることができる。当技術分野では他の機序も知られており、それらの機序も本発明に包含される（例えば参考文献として本明細書の一部を構成する「Microbial Signalling and Communication」（R. England, G. Hobbs, N. BaintonおよびD. McL. Roberts編, Cambridge University Press, ケンブリッジ, 1999）などを参照されたい）。
【１０３６】
特定の病原体との生物連関を維持する宿主の能力は、宿主の総合的健康および適応度に重要な意味を持っている。例えばヒト宿主は胃腸路、特に小腸および大腸の腸内細菌と共生関係にある。実際、遠位結腸の糞便中の細菌数は、しばしば糞便1ミリリットルあたり1012個近くになる。胃腸路中の腸内細菌叢の例は、α-溶血連鎖球菌、大腸菌、ビフォバクテリア（Bifobacteria）、嫌気性球菌、真正細菌、クロストリジウム、乳酸桿菌、および酵母の他、腸内細菌科、バクテロイデスに属するものである。これらの細菌は、とりわけ、宿主の消化系、特に宿主の腸では通例、分解されない食料を分解することによって、宿主が栄養素を同化するのを補助する。したがって、そのような生物連関を維持する宿主の能力を増進することは、宿主の適正な栄養補給を確保する助けとなるだろう。
【１０３７】
哺乳動物、特にヒトの腸内細菌集団の異常は、以下の障害と関連づけられている：下痢、イレウス、慢性炎症性疾患、腸閉塞、十二指腸憩室、胆石病、栄養不良。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、異常な腸内細菌叢集団と関係する上述の疾患および/または障害のいずれかを、直接的または間接的に、処置、検出、診断、予後判定および/または改善するのに役立つ。
【１０３８】
例えば、腸内細菌叢の組成は、年齢、人種、食餌、栄養不良、胃液酸度、胆汁酸塩分泌、腸運動性、および免疫機構をはじめとする様々な要因に基づく。その結果、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（その作動薬、拮抗薬および断片を含む）は、これらの要因の少なくとも1つまたは複数に直接的または間接的に影響を及ぼすことによって、生物連関を形成する宿主の能力を調整することができる。
【１０３９】
主要な腸内細菌叢は嫌気性生物からなるが、わずかながらも一部は好気性菌（例えば大腸菌）である。腹腔内感染症ではそのような好気性菌が素早く主要生物になる（感染症発病の初期に効果的に日和見性になる）ので、このことは重要である。したがって、本質的に好気性菌集団を抑制する必要が（免疫不全個体の場合は特に）ある。
【１０４０】
好ましい一態様として、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（その作動薬、拮抗薬、および断片を含む）は、特定の腸内共生生物との生物連関を、そのような生物の集団を抑制する目的で、阻害するのに役立つ。
【１０４１】
生物連関は胃腸路だけに存在するのではなく、外皮にも存在する。胃腸細菌叢とは異なり、皮膚細菌叢はほとんど同じくらいの好気性生物と嫌気性生物とからなっている。皮膚細菌叢の例は、グラム陽性球菌（例えば黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、ミクロコッカス、ミクロコッカス・セデンタリウス（M.sedentarius））、グラム陽性桿菌（例えばコリネバクテリウム属、コリネバクテリウム・ミヌチシマム（C.minutissimum）、ブレビバクテリウム属、プロピオン酸菌属、ざ瘡プロピオンバクテリウム）、グラム陰性桿菌（例えばアシネトバクター属）、および真菌（癜風菌（Pityrosporum orbiculare））の構成要素である。外皮に付随する細菌叢が比較的少ないのは、多くの生物が皮膚に接着できないことに基づいている。上述の生物はこのユニークな能力を獲得している。したがって本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、皮膚細菌叢の集団を直接的または間接的に調整することを含む用途を持ちうる。
【１０４２】
皮膚細菌叢の異常は、例えば以下に挙げるものを含む（ただしこれらに限らない）数多くの重要な疾患および/または障害と関係している：例えば膿痂疹、膿瘡、水胞形成性遠位指炎（blistering distal dactylitis）、膿疱、毛包炎、皮膚膿瘍、陥凹性角質溶解、腋窩菌毛、皮膚糸状菌症群、腋臭、紅色陰癬、チーズ様足臭（cheesy foot odor）、ざ瘡、癜風、脂漏性皮膚炎、およびピチロスポルム毛包炎。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、異常な皮膚細菌叢集団に関係する上述の疾患および/または障害のいずれかを直接的または間接的に処置、検出、診断、予後判定および/または改善するのに役立つ。
【１０４３】
他の生物連関も、そのような連関の異常成長に関係する疾患および障害を含めて、当技術分野では知られており、それらも本発明に包含される。例えば、参考文献として本明細書の一部を構成する「Infectious Disease」第2版, S. L. Gorbach, J. G. BartlettおよびN. R. Blacklow, W. B. Saunders Company, フィラデルフィア (1998)を参照されたい。
【１０４４】
フェロモン
もう一つの態様として、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、フェロモンを合成しかつ/または放出するという生物の能力を増進させうる。そのようなフェロモンは、例えば生物の行動および/または代謝を変化させうる。
【１０４５】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、フェロモンの生合成および/または放出、フェロモンに（例えば行動的におよび/または代謝的に）応答する生物の能力、および/またはフェロモンを検出する生物の能力を調整しうる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬によって生物から放出または誘導されるフェロモンおよび/または揮発性物質は、その生物に対して行動面での効果を持つ。
【１０４６】
他の活性
本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞成長を刺激する能力を持つため、様々な疾患状態、例えば血栓、動脈硬化、および他の心血管状態などによる虚血性組織の再脈管形成を刺激するための処置に使用することができる。これらのポリペプチドは、上述のように、血管新生および四肢の再生を刺激するために使用することもできる。
【１０４７】
本ポリペプチドは様々な生物の様々な細胞、例えば線維芽細胞および骨格筋細胞などに対して有糸分裂促進性を持ち、よって損傷した組織または患部組織の修復または置換を促進するので、本ポリペプチドは、傷害による創傷、熱傷、手術後組織修復、および潰瘍の処置に使用することもできる。
【１０４８】
本発明のポリペプチドは、ニューロンの成長を刺激するために使用すること、ならびにある種のニューロン傷害または神経変性状態、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病およびAIDS関連症候群などで起こるニューロン損傷を処置、予防および/または診断するために使用することもできる。本発明のポリペプチドは、軟骨細胞の成長を刺激する能力を持ちうる。したがって本発明のポリペプチドは、骨および歯根の再生を増進し、組織移植片または骨移植片を補助するために、使用することができる。
【１０４９】
本発明のポリペプチドは、ケラチノサイトの成長を刺激することによって、日焼けによる皮膚老化を防止するためにも使用することができる。
【１０５０】
本発明のポリペプチドは脱毛を防ぐためにも使用することができる。FGFファミリーの構成要素は毛髪形成細胞を活性化し、メラノサイトの成長を促進するからである。同様に、他のサイトカインと併用するなら、造血細胞および骨髄細胞の成長と分化を刺激するために、本発明のポリペプチドを使用することもできる。
【１０５１】
本発明のポリペプチドは、移植前の臓器を維持するために、または初代組織の細胞培養を支持するために使用することもできる。
【１０５２】
本発明のポリペプチドは、初期胚において中胚葉由来の組織を分化させるためにも使用することができる。
【１０５３】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、上述した造血系統だけでなく、胚幹細胞の分化または増殖も増加または減少させうる。
【１０５４】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、例えば体長、体重、毛色、眼の色、皮膚、脂肪組織のパーセンテージ、肌の色、背格好、および外形などの哺乳動物の特徴を調整するためにも使用することができる（例えば美容外科）。同様に、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、哺乳動物の代謝を調整して、異化、同化、プロセシング、資化、およびエネルギー貯蔵に影響を及ぼすためにも使用することができる。
【１０５５】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、バイオリズム、概日リズム、うつ（抑うつ性疾患、障害および/または状態を含む）、暴力をふるう傾向、痛みに対する耐性、生殖能力（好ましくはアクチビンまたはインヒビン活性によるもの）、ホルモンレベルまたは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認識特性に影響を与えることによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変化させるために使用することができる。
【１０５６】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、例えば貯蔵性、脂肪含量、脂質、タンパク質、糖質、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるために、食品添加物または保存剤として使用することもできる。
【１０５７】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、医薬組成物の効力を直接的または間接的に増加させるためにも使用することができる。そのような用途には、医薬品と共に、同時に投与を行なってもよいし、同じ投与経路または異なる投与経路で個別に投与を行なってもよい（例えば、一例として、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは静脈内投与し、前記医薬品は経口投与する）。
【１０５８】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび/または作動薬もしくは拮抗薬は、個体が大気圏外旅行、低重力環境、大気圏外放射線レベルへの長期間にわたるばく露、低酸素レベル、代謝活性の低下、大気圏外病原体へのばく露などに備えるために使用することもできる。そのような用途には、大気圏外事象前、大気圏外事象中、またはその両方に、投与を行なうことができる。さらにそのような使用は、例えば次に挙げる効果のいずれかなど、数多くの有益な変化を受容者にもたらしうる：造血細胞レベルの上昇、特に赤血球レベルの上昇（これは受容者が低酸素レベルに対処する際の助けになるだろう）；B細胞レベル、T細胞レベル、抗原提示細胞レベルおよび/またはマクロファージレベルの上昇（これは、受容者が例えば大気圏外病原体へのばく露に対処する際の助けになるだろう）；造血細胞産生の一時的（すなわち可逆的）阻害（これは受容者が大気圏外照射線レベルへのばく露に対処する際の助けになるだろう）；骨量の増加および/または安定性（これは受容者が低重力環境に対処する際の助けになるだろう）；および/または代謝作用の低下（これにより、受容者は、例えば次に挙げる手段（ただしこれらに限るわけではない）のいずれか一つにより、その大気圏外旅行期間を容易に延長できるようになるだろう：（i）基礎1日エネルギー所要量を低下させることによって受容者を助ける；（ii）酸化ストレスおよび/または代謝ストレスを低レベルにする（すなわち、正常な基礎エネルギーを獲得する際に受ける体内での酸化的/代謝的損傷のレベルを低下させることによって受容者が上昇した大気圏外放射線レベルに対処できるようにする）；および/または（iii）受容者がより低い代謝温度（すなわち低温および/または亜低温環境）で生活できるようにする。
【１０５９】
他の好ましい態様
本願発明の他の好ましい態様には、配列番号X（ここにXは表Iに定義する任意の整数である）のヌクレオチド配列中の少なくとも約50個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が含まれる。
【１０６０】
前記連続するヌクレオチドの配列が、配列番号Xのヌクレオチド配列のうち、表Iに配列番号Xに関して定義した「ORFの開始コドンの5'NT」の位置付近にあるヌクレオチドから始まって「ORFの3'NT」の位置付近にあるヌクレオチドで終わる位置範囲に含まれる核酸分子も好ましい。
【１０６１】
配列番号Xのヌクレオチド配列中の少なくとも約150個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も好ましい。
【１０６２】
配列番号Xのヌクレオチド配列中の少なくとも約500個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子はさらに好ましい。
【１０６３】
さらにもう一つの好ましい態様は、表Iに配列番号Xに関して定義した「ORFの5'NT」の位置付近にあるヌクレオチドから始まって「ORFの3'NT」の位置付近にあるヌクレオチドで終わる配列番号Xのヌクレオチド配列と、少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子である。
【１０６４】
さらにもう一つの好ましい態様は、配列番号Xの全ヌクレオチド配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子である。
【１０６５】
A残基のみまたはT残基のみからなるヌクレオチド配列を持つ核酸分子にストリンジェントな条件でハイブリダイズしない核酸配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズする、単離された核酸分子も好ましい。
【１０６６】
表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンを含むDNA分子であって、American Type Culture Collectionに寄託され、前記cDNAクローン識別子に関して表Iに示すATCC受託番号を与えられた物質に含まれているDNA分子、を含む組成物も好ましい。
【１０６７】
表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって表Iに示すATCC受託番号を与えられた寄託物に含まれているDNA分子のヌクレオチド配列中の少なくとも50個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も好ましい。
【１０６８】
前記少なくとも50個の連続するヌクレオチドの配列が、前記cDNAクローンがコードしている全オープンリーディングフレーム配列のヌクレオチド配列に含まれている、単離された核酸分子も好ましい。
【１０６９】
前記cDNAクローンがコードしているヌクレオチド配列中の少なくとも150個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も好ましい。
【１０７０】
さらにもう一つの好ましい態様は、前記cDNAクローンがコードするヌクレオチド配列中の少なくとも500個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子である。
【１０７１】
さらにもう一つの好ましい態様は、前記cDNAクローンがコードする全ヌクレオチド配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子である。
【１０７２】
さらにもう一つの好ましい態様は、配列番号Xのヌクレオチド配列（ここにXは表Iに定義する任意の整数である）、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示したATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているヌクレオチド配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも50個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子を生物学的試料中に検出する方法であって、前記試料中の少なくとも1つの核酸分子のヌクレオチド配列を、前記の群から選択される配列と比較し、前記試料中の前記核酸分子の配列が、前記選択した配列と少なくとも95％一致するかどうかを決定するステップを含む方法である。
【１０７３】
前記配列比較ステップが、前記試料中の核酸分子と前記の群から選択される前記配列を含む核酸分子との核酸ハイブリダイゼーションの程度を決定することを含む上記の方法も好ましい。同様に、前記配列比較ステップが、前記試料中のアミノ酸配列から決定されるヌクレオチド配列を、前記の群から選択される前記配列と比較することによって行なわれる上記の方法も好ましい。核酸分子はDNA分子またはRNA分子を含むことができる。
【１０７４】
さらにもう一つの好ましい態様は、生物学的試料の種、組織または細胞タイプを同定する方法であって、前記試料中に、配列番号Xのヌクレオチド配列（ここにXは表Iに定義する任意の整数である）、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示したATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているヌクレオチド配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも50個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子があれば、その核酸分子を検出するステップを含む方法である。
【１０７５】
生物学的試料の種、組織または細胞タイプを同定する方法は、少なくとも2つのヌクレオチド配列からなるパネルであってそのパネル中の少なくとも一つの配列が前記の群から選択される配列中の少なくとも50個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するパネル、の中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出するステップを含むことができる。
【１０７６】
表Iに示したタンパク質をコードする遺伝子の異常な構造または発現に関係する診断対象の病理学的状態を診断する方法であって、前記診断対象から得た生物学的試料中に、配列番号Xのヌクレオチド配列（ここにXは表Iに定義する任意の整数である）、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示したATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているヌクレオチド配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも50個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む核酸分子があれば、その核酸分子を検出するステップを含む方法も好ましい。
【１０７７】
病理学的状態を診断する方法は、少なくとも2つのヌクレオチド配列からなるパネルであってそのパネル中の少なくとも一つの配列が前記の群から選択される配列中の少なくとも50個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するパネル、の中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出するステップを含むことができる。
【１０７８】
また、単離された核酸分子を含む組成物であって、前記核酸分子のヌクレオチド配列が、少なくとも2つのヌクレオチド配列からなるパネルであってそのパネル中の少なくとも一つの配列が、配列番号Xのヌクレオチド配列（ここにXは表Iに定義する任意の整数である）、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示したATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているヌクレオチド配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも50個の連続するヌクレオチドの配列と少なくとも95％一致するパネル、を含む組成物も好ましい。これらの核酸分子はDNA分子またはRNA分子を含むことができる。
【１０７９】
また、配列番号Y（ここにYは表Iに定義する任意の整数である）のアミノ酸配列中の少なくとも約10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも好ましい。
【１０８０】
また、前記連続するアミノ酸の配列が、配列番号Yのアミノ酸配列のうち、表Iに配列番号Yに関して説明した「オープンリーディングフレーム（ORF）の全AA」の位置範囲に含まれるポリペプチドも好ましい。
【１０８１】
また、配列番号Yのアミノ酸配列中の少なくとも約30個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも95％一致するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも好ましい。
【１０８２】
配列番号Yのアミノ酸配列中の少なくとも約100個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも95％一致するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【１０８３】
配列番号Yの全アミノ酸配列と少なくとも95％一致するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【１０８４】
表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質の全アミノ酸配列中の少なくとも約10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【１０８５】
前記連続するアミノ酸の配列が、表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質のアミノ酸配列に含まれているポリペプチドも好ましい。
【１０８６】
表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも約30個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも95％一致するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも好ましい。
【１０８７】
表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも約100個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも95％一致するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも好ましい。
【１０８８】
表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも95％一致するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドも好ましい。
【１０８９】
配列番号Y（ここにYは表Iに定義する任意の整数である）のアミノ酸配列、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質の全アミノ酸配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体も好ましい。
【１０９０】
配列番号Y（ここにYは表Iに定義する任意の整数である）のアミノ酸配列、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質の全アミノ酸配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドを生物学的試料中に検出する方法であって、前記試料中の少なくとも1つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を、前記の群から選択される配列と比較し、前記試料中の前記ポリペプチド分子の配列が、前記少なくとも10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致するかどうかを決定するステップを含む方法も好ましい。
【１０９１】
前記試料中の少なくとも1つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を、前記の群から選択される配列と比較する前記ステップが、配列番号Y（ここにYは表Iに定義する任意の整数である）のアミノ酸配列、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質の全アミノ酸配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体への、前記試料中のポリペプチドの特異的結合の程度を決定することを含む、上記の方法も好ましい。
【１０９２】
また、前記配列比較ステップが、前記試料中のポリペプチド分子から決定されるアミノ酸配列を、前記の群から選択される前記配列と比較することによって行なわれる上記の方法も好ましい。
【１０９３】
また、生物学的試料の種、組織または細胞タイプを同定する方法であって、前記試料中に、配列番号Yのアミノ酸配列（ここにYは表Iに定義する任意の整数である）、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示したATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質の全アミノ酸配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子があれば、そのポリペプチド分子を検出するステップを含む方法も好ましい。
【１０９４】
生物学的試料の種、組織または細胞タイプを同定する上記の方法であって、少なくとも2つのアミノ酸配列からなるパネルであってそのパネル中の少なくとも一つの配列が上記の群から選択される配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致するパネル、の中のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を検出するステップを含む方法も好ましい。
【１０９５】
また、表Iに示したタンパク質をコードする遺伝子の異常な構造または発現に関係する、生物の病理学的状態を診断する方法であって、少なくとも2つのアミノ酸配列からなるパネル中のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を、前記診断対象から得た生物学的試料中に検出するステップを含み、前記パネル中の少なくとも1つの配列が、配列番号Y（ここにYは表Iに定義する任意の整数である）のアミノ酸配列、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質の全アミノ酸配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致する方法も好ましい。
【１０９６】
これらの方法はいずれの場合も、前記ポリペプチド分子を検出するステップに、抗体の使用が含まれる。
【１０９７】
配列番号Y（ここにYは表Iに定義する任意の整数である）のアミノ酸配列、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質の全アミノ酸配列、からなる群より選択される配列中の少なくとも10個の連続するアミノ酸の配列と少なくとも90％一致するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも95％一致するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も好ましい。
【１０９８】
また、単離された核酸分子であって、ポリペプチドをコードするそのヌクレオチド配列が、原核宿主におけるそのポリペプチドの発現に関して最適化されているものも好ましい。
【１０９９】
また、単離された核酸分子であって、前記ポリペプチドが、配列番号Y（ここにYは表Iに定義する任意の整数である）のアミノ酸配列、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質の全アミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むものも好ましい。
【１１００】
上記の単離された核酸分子のいずれかをベクターに挿入することを含む組換えベクターの製造方法も好ましい。また、この方法によって製造された組換えベクターも好ましい。上記ベクターを宿主細胞中に導入することを含む組換え宿主細胞の作出方法、ならびにこの方法によって作出された組換え宿主細胞も好ましい。
【１１０１】
また、この組換え宿主細胞を、前記ポリペプチドが発現されるような条件で培養し、前記ポリペプチドを回収することを含む、単離されたポリペプチドの製造方法も好ましい。また、この単離されたポリペプチドの製造方法であって、前記組換え宿主細胞が真核細胞であり、前記ポリペプチドが、配列番号Y（ここにYは表Iに定義する任意の整数である）のアミノ酸配列（配列番号Yの「ORFの全AA」の位置は表Iに定義する）、および表IのcDNAクローン識別子によって識別されるcDNAクローンであって前記cDNAクローンに関して表Iに示すATCC受託番号を持つ寄託物に含まれているcDNAクローンがコードしているタンパク質のアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質である方法も好ましい。この方法によって製造される単離されたポリペプチドも好ましい。
【１１０２】
また、タンパク質活性レベルを増加させる必要がある個体を処置する方法であって、そのような個体に、前記個体における前記タンパク質活性レベルを増加させるのに有効な量の本願に係る単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を含む医薬組成物を投与することを含む方法も好ましい。
【１１０３】
以上に本発明を概説したが、以下に例示する、限定を目的としない実施例を参照することにより、本発明がより容易に理解されるだろう。
【１１０４】
参考文献
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【１１０５】
実施例
好ましい態様の説明
実施例1  本発明の新規なBMY_HPPヒトホスファターゼの同定方法
本発明の新規なBMY_HPPリンタンパク質ホスファターゼをコードするポリヌクレオチド配列を、以下の方法の組み合わせによって同定する：
TBLASTNプログラム［アルシュル(Altschul)による1997］を用いて、相同ベースの探索を行ない、公知のリンタンパク質ホスファターゼをヒトゲノム(gDNA)配列およびEST配列と比較した。表IIIに示す（1×10-3以下のスコアを予想）公知のホスファターゼの１つ以上に対して有意な相同性を有するEST配列またはgDNA配列を、更なる分析のために保持した；
PFAMモチーフ（表IVに示す）を用いたヒデン・マルコフモデル（HMM）[バテマン(Bateman)による、2000番号9；Sonnhammerによる1997］を用い、Genewiseプログラムを用いてヒトゲノム配列を探索した。以下のモチーフのいずれかと有意なスコア（10以上）を有するESTまたはgDNAを、更なる分析のために保持した；
PFAMモチーフ（表IVに示す）を用いたHMM探索を用いて、ヒトゲノム配列［Burgeによる1997番号10］のGENSCAN分析によって同定した予想タンパク質配列を探索した。以下のモチーフとの有意なスコア（10以上）を有するgDNA配列を、更なる分析のために保持した。
表IV：リンタンパク質ホスファターゼを同定するためのRFAMモチーフ
2005506040.tif 000006
【１１０６】
新規なリンタンパク質をコードするバクテリア人工染色体(BACs)を上記の方法のいずれか１つによって同定する際に、全ての近いBACs（これは、Golden Path tiling map, UCSCによって同定）のGENSCAN分析を用いて同定した。イントロン／エキソン境界、転写物cDNA配列およびタンパク質配列は、GENSCANを用いて決定した。予想タンパク質配列を用い、本明細書に記載する通りBLASTPを用いて、最も密接に関連する公知のホスファターゼを同定した。
【１１０７】
BMY_HPP5の場合に、BMY_HPP5を公知のタンパク質ホスファターゼに対する相同性および中枢神経系中での有意な発現を有するIncyte EST（ID 4155374）として同定した。該Incyteクローン配列を用いて、別のcDNAの単離のためのオリゴヌクレオチドを設計した。該cDNAを回収し、配列決定し、そして全長Incyteテンプレート（EST配列の集合）（ID 1026659.7）と比較した。該BMY_HPP5 cDNAはIncyte 1026659.7に対して有意な一致度を有するが、5つのプライム(prime)および3つのプライム末端で相違しており、このことは同一遺伝子の別にスプライスした産物であり得ることを示唆する。
【１１０８】
実施例2  本発明の新規なヒトBMY_HPPホスファターゼのクローニング
当該分野で知られる様々な方法を、本発明の新規なBMY_HPP1ホスファターゼをクローニングするのに使用することができる。要するに、本発明のBMY_HPP遺伝子についての予想されるかまたは観察されるcDNA配列を用いて、5'末端上にビオチンを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができる（これらのオリゴの配列を表VIに提示する）。これらのオリゴ(oligos)を用いて、以下の配列に記載するcDNAクローンを単離する。
【１１０９】
1マイクロリットル（150ナノグラム）のビオチン化オリゴを、0.5ml PCRチューブに入った6マイクロリットル（6マイクログラム）の一本鎖共有結合閉環cDNAライブラリー（これらのライブラリーは、ライフテクノロジー社(Life Technologies)（Rockville, Maryland）から商業的に入手可能であるか、または当該分野で知られる通常の方法を用いて作製することができる）の混合物および7マイクロリットルの100％ホルムアミドに加えた。特定のBMY_HPP遺伝子について用いられる該cDNAライブラリーは、本明細書に記載の発現パターンの結果によって決定される。
【１１１０】
その混合物をサーマルサイクラーで95℃に2分間加熱した。
【１１１１】
加熱したプローブ/cDNAライブラリー混合物に14マイクロリットルの2×ハイブリダイゼーションバッファー（50％ホルムアミド、1.5M NaCl、0.04M NaPO4、pH7.2、5mM EDTA、0.2％SDS）を加え、42℃で26時間インキュベートした。
【１１１２】
1M NaCl、10mMトリス-HCl（pH7.5）、1mM EDTA（pH8.0）を含む溶液でハイブリダイゼーション混合物を220マイクロリットルに希釈し、125マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを加えることにより、ビオチン化オリゴと環状cDNAとのハイブリッドを単離した。この溶液を、5分ごとに混合してビーズを再懸濁させながら、42℃で60分間インキュベートした。
【１１１３】
ビーズを磁石で溶液から分離し、ビーズを200マイクロリットルの0.1×SSPE、0.1％SDS中、45℃で3回洗浄した。
【１１１４】
50マイクロリットルの0.1N NaOHを加え、室温で10分間インキュベートすることにより、一本鎖cDNAをビオチン化オリゴ/ストレプトアビジン磁気ビーズ複合体から遊離させた。
【１１１５】
6マイクロリットルの3M酢酸ナトリウム、15マイクログラムのグリコーゲンおよび120マイクロリットルの100％エタノールを加え、続いて遠心分離することによって、cDNAを沈降させた。
【１１１６】
cDNAを12マイクロリットルのTE（10mMトリス-HCl（pH 8.0）、1mM EDTA（pH 8.0））に再懸濁する。
【１１１７】
捕捉したDNA 5マイクロリットルを1.5マイクロリットルのスタンダードSP6プライマー（cDNAクローニングベクター上の配列に相同）(10マイクロモル濃度）および1.5マイクロリットルの10×PCRバッファーと混合することにより、一本鎖cDNAをサーマルサイクラーで二本鎖に変換した。その混合物を95℃に20秒間加熱した後、59℃まで降温した。この時点で、70℃に予熱しておいた15マイクロリットルの修復ミックス（修復ミックスは4マイクロリットルの5mM dNTP類（各1.25mM）、1.5マイクロリットルの10×PCRバッファー、9.25マイクロリットルの水、および0.25マイクロリットルのTaqポリメラーゼを含む）を加えた。その溶液を73℃まで昇温し、23分間インキュベートした。
【１１１８】
修復されたDNAを上記の通り沈降させ、マイクロリットルのTEに再懸濁した。
【１１１９】
2マイクロリットルの二本鎖cDNAを用いて、大腸菌DH12S細胞にエレクトロポレートによって形質転換する。
【１１２０】
得られたコロニーを、設計したプライマー対を使ったPCRでスクリーニングすることにより、適切なcDNA（表IVに提示し、使用可能であるプライマー配列）を同定した。
【１１２１】
次いで、PCRによって陽性であるそれらのcDNAクローンを評価して、インサートサイズを決定する。各々のBMY_HPP遺伝子についての２つのクローンを、当該分野で知られたり、および本明細書に記載する標準的な方法を用いてDNA配列を決定するのに選択する。
【１１２２】
本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは寄託されたクローンによってコードされたポリペプチドは、該完全コード領域（すなわち、全長遺伝子）の一部または不完全な翻訳(versions)であり得る。寄託されたクローンに存在し得ない遺伝子の5'または3'非コードおよび／またはコード領域の同定のためのいくつかの方法が、当該分野で知られる。以下の方法は、典型的であるが、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。これらの方法としては、フィルター探索(filter probing)、特定のプローブを用いるクローン濃縮(enrichment)および当該分野でよく知られる5'および3'「RACE」プロトコールに類似するかもしくは同一であるプロトコールを含むが、これらに限定されない。例えば、5'RACEに類似する方法を、目的の全長転写物の欠損した５％末端を得るのに利用することができる (Fromont-RacineらによるNucleic Acids Res. 21 (7): 1683-1684 (1993))。
【１１２３】
要するに、特定のRNAオリゴヌクレオチドを、おそらく全長遺伝子RNA転写物を含有するRNAの個体群の5'末端にライゲートさせる。ライゲートされたRNAオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライマーを含有するプライマーセットを用いて、所望する全長遺伝子の5'位置をPCR増幅する。次いで、該増幅産物を配列決定して、このものを用いて全長遺伝子を得ることができる。
【１１２４】
ポリ-A＋RNAを使用することができるが、この上記の方法は目的の供給源から単離した全RNAを用いて始める。次いで、該RNA製造物は、後のリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷RNA上での5'ホスフェート基を除去するのが必要であるならば、ホスファターゼを用いて処理することができる。次いで、このホスファターゼを失活させ、そして該RNAをタバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理して、メッセンジャーRNAの5'末端に存在するキャップ構造を除去する。本反応により、該キャップ切断したRNAの5'末端での5'ホスフェート基を遊離させる。
【１１２５】
この改変したRNA調製物を、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いた1本鎖cDNA製造のためのテンプレートとして用いる。該1本鎖製造反応を、ライゲートさせたRNAオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライマーを用いた所望する５‘末端のPCR増幅のためのテンプレートとして使用する。次いで、得られた産物を配列決定し、分析して、5'末端配列が所望する遺伝子に属することを確認する。その上、別の5'または3'コードまたは非コード領域を単離する可能性を増大させるために、RACEプロトコールを最適化することが有利でもあり得る。RACEプロトコールを最適化する様々な方法が当該分野で知られており、これらの方法をまとめた詳細な記載をB. C. SchaeferによるAnal. Biochem., 227: 255-273, (1995)で知ることができる。
【１１２６】
コードまたは非コード配列の同定についての5'または3'RACEを実施するための別の方法が、Frohman, M. A.らによるProc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85: 8998-9002 (1988)によって提示されている。要するに、5'または3'末端のいずれかを欠損したcDNAクローンを再構築して、それぞれ翻訳開始コドンまたは停止コドンにまで伸びた不存在塩基対を含めることができる。従って、ある場合に、cDNAは翻訳の開始が欠損している。この元の5'RACE方法の改良法を以下に簡単に記載する。ポリA＋および全RNAを、Superscript II (Gibco/BRL)および該cDNA配列に特異的なアンチセンスまたはI相補プライマーを用いて逆転写した。該プライマーを、マイクロコンコンセントレーター(Microcon Concentrator )(Amicon)を用いて、該反応液から除く。次いで、1本鎖cDNAをdTAPおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Gibco/BRL）を用いてテールする（tailed)。従って、PCR増幅反応に必要なアンカー配列を産生する。二本鎖を、PCR緩衝液中のdA-テール、Taq DNAポリメラーゼ(パーキン−エルマーセタス(Perkin-Elmer Cetus))、5'末端での３つの隣接制限部位（XhoIJ SailおよびClapi）を含有するオリゴ−dTプライマーおよびまさにこれらの制限部位を含有するプライマーから製造する。この二本鎖cDNAを、同一のプライマーおよびネステッド(nested)cDNA特異的アンチセンスプライマーを用いて40サイクルPCR増幅する。該PCR産物を臭化エチジウムアガロースゲル上でサイズ分離し、欠損タンパク質をコードするDNAの予想サイズを与える(product)cDNAを含有するゲル領域を除く。cDNAを磁気的PCR Prepキット(Promega) を用いて該アガロースから精製し、XhoIまたはSailを用いて制限消化し、そしてXhoIおよびEcoRV部位でプラスミド（例えば、pBluescript SKII (Stratagene)）にライゲートさせる。このDNAを細菌中に形質転換し、該プラスミドクローンを配列決定して、正確なタンパク質コードインサートを同定する。正確な5'末端は、この配列を推定上の同定したホモログおよび部分的なcDNAクローンとの重なりと比較することによって確認する。当該分野において知られる類似の方法および／または商業的なキットを用いて、3'末端を増幅させて回収する。
【１１２７】
いくつかの品質が調節されたキットを、購入のために商業的に入手することができる。全長遺伝子の回収のための5'および3'RACEの両方について、上記の方法に似た試薬および方法をGibco/BRL製のキット形態で供する。第２のキットはClontechから入手することができ、このものは関連する技術、SLIC (1本鎖cDNAへの1本鎖ライゲート(singlestranded ligation to single-stranded cDNA))（これは、DumasらによるNucleic Acids Res., 19: 5227-32 (1991)で開発されている）の改良である。方法上の主な相違点は、RNAは逆転写後にアルカリ加水分解され、そしてRNAリガーゼを用いて1本鎖cDNAへのアンカープライマーを含有する制限部位と結合させることである。これにより、過去に配列決定することが困難であるポリT伸張を生じるdA−テーリング反応の必要性が除かれる。
【１１２８】
RNAから5'または3'cDNAを得るための別の方法は、cDNAライブラリー二本鎖DNAを使用することである。非対称性PCR増幅されたアンチセンスcDNA鎖を、アンチセンスcDNA特異的プライマーおよびプラスミドアンカーのプライマーを用いて製造する。これらのプライマーを除去して、対称性PCR反応をネステッドcDNA特異的プライマーおよびプラスミドアンカーのプライマーを用いて行う。
【１１２９】
全長遺伝子を得る目的で5'または3’末端配列を得るためのRNAリガーゼプロトコール
目的の遺伝子を同定した後に、元のcDNAプラスミド中に存在し得ない遺伝子の5'または3'位置の同定のためのいくつかの方法を利用することができる。これらの方法としては例えば、フィルター探索、特定のプローブを用いたクローン濃縮、並びに5'および3'RACEに類似したり及び同一であるプロトコールを含むが、これらに限定されない。全長遺伝子がライブラリー中に存在し得たり、探索によって同定され得るが、5'または3'末端を得るための有用な方法は元のcDNAからの存在する配列情報を用いて、欠損した情報を得ることである。所望する全長遺伝子の欠損した5'末端を得るための5'RACEに類似する方法を利用することができる（この方法は、Fromont-RacineらによるNucleic Acids Res., 21 (7): 1683-1684 (1993)によって公開されている）。要するに、特異的なRNAオリゴヌクレオチドをおそらく30全長遺伝子RNA転写物を含有するRNAの個体群の5'末端にライゲートさせ、該ライゲートさせたオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを含有するプライマー組および目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライマー組を用いて、所望する全長遺伝子の5'位置をPCR増幅させ、次いでこのものを配列決定し用いて全長遺伝子を得ることができる。この方法は、所望の供給源から単離される全RNAを出発とし、ポリA RNAを使用することができるが、これはこの方法に必須ではない。次いで、RNA製造物を後のRNAリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷RNA上の5'ホスフェート基を除く必要があるならば、ホスファターゼを用いて処理することができる。使用する該ホスファターゼを失活させ、該RNAをタバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理して、メッセンジャーRNAの5'末端に存在するキャップ構造を除去する。本反応により、該キャップ切断したRNAの5'末端での5'ホスフェート基を遊離させる。次いで、この改変したRNA調製物を遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いた1本鎖cDNA製造のためのテンプレートとして用いることができる。次いで、該1本鎖製造反応を、ライゲートさせたRNAオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライマーを用いた所望する5'末端のPCR増幅のためのテンプレートとして使用することができる。次いで、得られた産物を配列決定し分析して、5'末端配列が所望する遺伝子に属することを確認する。
【１１３０】
本発明のヒトホスファターゼのいずれか1つをクローニングするための代表的なプライマーを、本明細書の表VIに、「左クローニングプライマー」、「右クローニングプライマー」、「内部RevCompクローニングプライマー」 および／または「内部クローニングプライマー」 として提示する。他のプライマーを上記のいずれかに置き換えることができ、このことは当該分野の当業者によって認められるであろう。
【１１３１】
全長BMY_HPP1の場合に、BMY_HPP1を同定されたBMY_HPP1断片BMY_HPP1_A（配列番号1）およびBMY_HPP1_B（配列番号3）のポリヌクレオチド配列を用いてクローニングして、5'末端にビオチンを有する以下のアンチセンス80bpを設計した。
2005506040.tif 000007
【１１３２】
1マイクロリットル（150ナノグラム）のゲル精製したビオチン化PCR断片を、0.5ml PCRチューブに入った6マイクロリットル（6マイクログラム）の一本鎖共有結合閉環脳、胎児の脳、骨髄、前立腺、脾臓、精巣および胸腺のcDNAライブラリーと、7マイクロリットルの100％ホルムアミドに加えた。その混合物をサーマルサイクラーで95℃に2分間加熱した。加熱したプローブ/cDNAライブラリー混合物に14マイクロリットルの2×ハイブリダイゼーションバッファー（50％ホルムアミド、1.5M NaCl、0.04M NaPO4、pH7.2、5mM EDTA、0.2％SDS）を加え、42℃で26時間インキュベートした。1M NaCl、10mMトリス-HCl（pH7.5）、1mM EDTA（pH8.0）を含む溶液でハイブリダイゼーション混合物を220マイクロリットルに希釈し、125マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを加えることにより、ビオチン化オリゴと環状cDNAとのハイブリッドを単離した。この溶液を、5分ごとに混合してビーズを再懸濁させながら、42℃で60分間加熱した。ビーズを磁石で溶液から分離し、ビーズを200マイクロリットルの0.1×SSPE、0.1％SDS中、45℃で3回洗浄した。
【１１３３】
50マイクロリットルの0.1N NaOHを加え、室温で10分間インキュベートすることにより、一本鎖cDNAをビオチン化プローブ/ストレプトアビジン磁気ビーズ複合体から放出させた。6マイクロリットルの3M酢酸ナトリウムを15マイクログラムのグリコーゲンと共に加え、その溶液を120マイクロリットルの100％エタノールでエタノール沈殿させた。DNAを12マイクロリットルのTE（10mMトリス-HCl（pH8.0）、1mM EDTA（pH8.0））に再懸濁した。捕捉したDNA 5マイクロリットルを1.5マイクロリットルの10μMスタンダードSP6プライマー（cDNAクローニングベクター上の配列に相同）および1.5マイクロリットルの10×PCRバッファーと混合することにより、一本鎖cDNAをサーマルサイクラーで二本鎖に変換した。その混合物を95℃に20秒間加熱した後、59℃まで降温した。この時点で、70℃に予熱しておいた15マイクロリットルの修復ミックス（修復ミックスは4マイクロリットルの5mM dNTP類（各1.25mM）、1.5マイクロリットルの10×PCRバッファー、9.25マイクロリットルの水、および0.25マイクロリットルのTaqポリメラーゼを含む）を加えた。その溶液を73℃まで昇温し、23分間インキュベートした。修復されたDNAをエタノール沈殿し、10マイクロリットルのTEに再懸濁した。2マイクロリットルを大腸菌DH12S細胞にエレクトロポレートし、得られたコロニーを、以下のプライマー対番号を使ったPCRでスクリーニングした。
2005506040.tif 000008
【１１３４】
BMY_HPP1ポリヌクレオチド配列を配列決定し、そしてこのものを図20A〜D（配列番号149）に提示する。
【１１３５】
全長BMY_HPP2の場合に、BMY_HPP1を同定したBMY_HPP2断片（配列番号5）のポリヌクレオチド配列を用いてクローニングして以下の5'末端上にビオチンを有するアンチセンス80bpオリゴを設計した。
2005506040.tif 000009
【１１３６】
1マイクロリットル（150ナノグラム）のゲル精製したビオチン化PCR断片を、0.5ml PCRチューブに入った6マイクロリットル（6マイクログラム）の一本鎖共有結合閉環脳、胎児の脳、骨髄、前立腺、脾臓、精巣および胸腺のcDNAライブラリーと、7マイクロリットルの100％ホルムアミドに加えた。その混合物をサーマルサイクラーで95℃に2分間加熱した。加熱したプローブ/cDNAライブラリー混合物に14マイクロリットルの2×ハイブリダイゼーションバッファー（50％ホルムアミド、1.5M NaCl、0.04M NaPO4、pH7.2、5mM EDTA、0.2％SDS）を加え、42℃で26時間インキュベートした。1M NaCl、10mMトリス-HCl（pH7.5）、1mM EDTA（pH8.0）を含む溶液でハイブリダイゼーション混合物を220マイクロリットルに希釈し、125マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを加えることにより、ビオチン化オリゴと環状cDNAとのハイブリッドを単離した。この溶液を、5分ごとに混合してビーズを再懸濁させながら、42℃で60分間加熱した。ビーズを磁石で溶液から分離し、ビーズを200マイクロリットルの0.1×SSPE、0.1％SDS中、45℃で3回洗浄した。
【１１３７】
50マイクロリットルの0.1N NaOHを加え、室温で10分間インキュベートすることにより、一本鎖cDNAをビオチン化プローブ/ストレプトアビジン磁気ビーズ複合体から放出させた。6マイクロリットルの3M酢酸ナトリウムを15マイクログラムのグリコーゲンと共に加え、その溶液を120マイクロリットルの100％エタノールでエタノール沈殿させた。DNAを12マイクロリットルのTE（10mMトリス-HCl（pH8.0）、1mM EDTA（pH8.0））に再懸濁した。捕捉したDNA 5マイクロリットルを1.5マイクロリットルの10μMスタンダードSP6プライマー（cDNAクローニングベクター上の配列に相同）および1.5マイクロリットルの10×PCRバッファーと混合することにより、一本鎖cDNAをサーマルサイクラーで二本鎖に変換した。その混合物を95℃に20秒間加熱した後、59℃まで降温した。この時点で、70℃に予熱しておいた15マイクロリットルの修復ミックス（修復ミックスは4マイクロリットルの5mM dNTP類（各1.25mM）、1.5マイクロリットルの10×PCRバッファー、9.25マイクロリットルの水、および0.25マイクロリットルのTaqポリメラーゼを含む）を加えた。その溶液を73℃まで昇温し、23分間インキュベートした。修復されたDNAをエタノール沈殿し、10マイクロリットルのTEに再懸濁した。2マイクロリットルを大腸菌DH12S細胞にエレクトロポレートし、得られたコロニーを、以下のプライマー対番号を使ったPCRでスクリーニングした。
【１１３８】
2005506040.tif 000010
【１１３９】
BMY_HPP2ポリヌクレオチド配列を配列決定し、そしてこのものを図21（配列番号151）に提示する。
【１１４０】
全長BMY_HPP5の場合に、BMY_HPP5をIncyteクローン4155374の配列を用いてクローニングして、以下のPCRオリゴを設計した。
2005506040.tif 000011
【１１４１】
ビオチン化ヌクレオチドは、オリゴ687の5'末端上に含まれた。PCRプライマー対を用いて、414bpビオチン化断片をテンプレートとしてIncyteクローンを用いて増幅させた。該断片をアガロースエレクトロポレートすることによってゲル精製し、そしてこのものを４℃で保存した。同一のPCRプライマー対を用いて、相同配列の存在についてcDNAライブラリーをスクリーニングした。陽性のPCR結果を、HPLCでサイズ分画した脳および精巣のライブラリーにおいて得た。1マイクロリットル（150ナノグラム）のゲル精製したビオチン化PCR断片を、0.5ml PCRチューブに入った6マイクロリットル（6マイクログラム）の一本鎖共有結合精巣のcDNAライブラリーと、7マイクロリットルの100％ホルムアミドに加えた。その混合物をサーマルサイクラーで95℃に2分間加熱した。加熱したプローブ/cDNAライブラリー混合物に14マイクロリットルの2×ハイブリダイゼーションバッファー（50％ホルムアミド、1.5M NaCl、0.04M NaPO4、pH7.2、5mM EDTA、0.2％SDS）を加え、42℃で26時間インキュベートした。1M NaCl、10mMトリス-HCl（pH7.5）、1mM EDTA（pH8.0）を含む溶液でハイブリダイゼーション混合物を220マイクロリットルに希釈し、125マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを加えることにより、ビオチン化オリゴと環状cDNAとのハイブリッドを単離した。この溶液を、5分ごとに混合してビーズを再懸濁させながら、42℃で60分間加熱した。ビーズを磁石で溶液から分離し、ビーズを200マイクロリットルの0.1×SSPE、0.1％SDS中、45℃で3回洗浄した。
【１１４２】
50マイクロリットルの0.1N NaOHを加え、室温で10分間インキュベートすることにより、一本鎖cDNAをビオチン化プローブ/ストレプトアビジン磁気ビーズ複合体から放出させた。6マイクロリットルの3M酢酸ナトリウムを15マイクログラムのグリコーゲンと共に加え、その溶液を120マイクロリットルの100％エタノールでエタノール沈殿させた。DNAを12マイクロリットルのTE（10mMトリス-HCl（pH8.0）、1mM EDTA（pH8.0））に再懸濁した。捕捉したDNA 5マイクロリットルを1.5マイクロリットルの10μMスタンダードSP6プライマー（cDNAクローニングベクター上の配列に相同）および1.5マイクロリットルの10×PCRバッファーと混合することにより、一本鎖cDNAをサーマルサイクラーで二本鎖に変換した。その混合物を95℃に20秒間加熱した後、59℃まで降温した。この時点で、70℃に予熱しておいた15マイクロリットルの修復ミックス（修復ミックスは4マイクロリットルの5mM dNTP類（各1.25mM）、1.5マイクロリットルの10×PCRバッファー、9.25マイクロリットルの水、および0.25マイクロリットルのTaqポリメラーゼを含む）を加えた。その溶液を73℃まで昇温し、23分間インキュベートした。修復されたDNAをエタノール沈殿し、10マイクロリットルのTEに再懸濁した。2マイクロリットルを大腸菌DH12S細胞にエレクトロポレートし、得られたコロニーを、プライマー対番号686/687を使ったPCRでスクリーニングした。BMY_HPP5ポリヌクレオチド配列を配列決定し、そしてこのものを図5A〜E（配列番号41）に提示する。
【１１４３】
実施例3  本発明の新規なヒトBMY_HPPホスファターゼポリペプチドの発現プロファイリング
予想するかまたは観察されるcDNA配列から設計されるPCRプライマー（これは、本明細書の他所に記載する）を、リアルタイムPCRアッセイに用いて、以下のプロトコールに記載のヒト組織のパネルにおけるBMY_HPP1、BMY_HPP2、BMY_HPP3およびBMY_HPP4の相対的な定常状態のmRNA発現レベルを測定する。一次鎖cDNAは商業的に入手可能なmRNA（クローンテック）から製造し、このものを商業主推奨プロトコールを使用するPE5700装置（アプライドバイオシステム社製、Foster City、CA）を用いたリアルタイム定量的PCRに適用した。この装置により、SYBR緑色、二本鎖に特異的なDNA結合色素の蛍光産出量による各サイクル間に増幅されたDNAの量を検出する。その標的についてのプライマー対の特異性は、反応の終点での温度変性プロフィルを実施することによって変えることができ、これは融点Tmを測定することによって存在する異なるDNA配列の数の指標を与える。１つのPCR産物を与える１つだけのプライマー対を考える。組織での存在量(abundance)の評価に及ぼす混入ゲノムDNAの影響は、逆転写酵素を用いるかおよび用いないで製造する1本鎖を用いてPCRを実施することによって制御することができる。逆転写酵素制御なしで増幅される物質の影響を無視することができる試料のみを考える。
【１１４４】
各チューブ中で使用するcDNAの量の小さな変化は、サイクロフィリン遺伝子（これは、全ての組織中で等量発現する）についてのプライマー対を用いたパラレル実験を行うことによって測定することができる。次いで、該データを用いて、各プライマー対を用いて得たデータを正規化(normalize)する。該PCRデータを、試験した組織中での転写物の量の差異の相対的な評価に変換した。
【１１４５】
各遺伝子についての発現プロファイリング分析のための代表的なプライマーを、本明細書に記載の表VIに提示する。各遺伝子についての発現プロファイリング分析のための代表的なプライマーを、本明細書の表VIに、「EPセンス」および「アンチセンスプライマー」として提示するが、これはまた 「左クローニングプライマー」、「右クローニングプライマー」、「内部RevCompクローニングプライマー」および／または「内部クローニングプライマー」の１つ以上を含み得る。当該分野の当業者によって認められるであろう他のプライマーを、上記のいずれかに置き換えることができる。
【１１４６】
BMY_HPP1の場合に、以下のプライマー対を用いて定量的PCRによるBMY_HPP1 mRNAの定常状態レベルを測定した：
センス：5'-TACAATTTCGGATGGAAGGATTAT-3'（配列番号154）
アンチセンス：5'-GCATGACAATGGATAGCTACTTT-3'（配列番号155）
【１１４７】
要するに、1本鎖cDNAを商業的に入手することができるmRNAから製造した。各アッセイで使用するcDNAの相対的な量を、全組織中で等量に発現する遺伝子のプライマー対、サイクロフィリンを用いるパラレル実験を実施することによって測定した。該サイクロフィリンプライマー対について、各試料中でのcDNAの量の小さな変化を検出し、これらのデータを新規なBMY_HPP1についてのプライマー対を用いて得たデータの正規化に使用した。該PCRデータを、試験した組織中での転写物量の差異の相対的な評価に変換し、該データを図22に提示する。BMY_HPP1に相当する転写物は、精巣中で非常に高く：脊髄中で有意な程度で；およびすい臓、脳、下垂体、心臓および肺中でより低い程度で発現した。
【１１４８】
BMY_HPP2の場合に、以下のプライマー対を用いて定量的PCRによるBMY_HPP2 mRNAの定常状態レベルを測定した：
センス：5'-GAGAAAGCAGTCTTCCAGTTCTAC-3'（配列番号156）
アンチセンス：5'-ATGGGAGCTAGAGGGTTTAATACT-3'（配列番号157）
【１１４９】
要するに、1本鎖cDNAを商業的に入手することができるmRNAから製造した。各アッセイで使用するcDNAの相対的な量を、全組織中で等量に発現する遺伝子のプライマー対、サイクロフィリンを用いるパラレル実験を実施することによって測定した。該サイクロフィリンプライマー対について、各試料中でのcDNAの量の小さな変化を検出し、これらのデータを新規なBMY_HPP2についてのプライマー対を用いて得たデータの正規化に使用した。該PCRデータを、試験した組織中での転写物存在量の差異の相対的な評価に変換し、該データを図23に提示する。BMY_HPP2に相当する転写物は、肝臓および腎臓中で非常に高く：脾臓中で有意な程度で；および肺、精巣、心臓、腸、すい臓、リンパ節、脊髄および前立腺中でより低い程度で発現した。
【１１５０】
BMY_HPP5の場合に、以下のプライマー対を用いて定量的PCRによるBMY_HPP5 mRNAの定常状態レベルを測定した：
センス：5'-ATGGGACCAACAAGCTATGC-3'（配列番号67）
アンチセンス：5'-TTATCAGGACTGGTTTCGGG-3'（配列番号68）。
【１１５１】
要するに、1本鎖cDNAを商業的に入手することができるmRNAから製造した。各アッセイで使用するcDNAの相対的な量を、全組織中で等量に発現する遺伝子のプライマー対、サイクロフィリンを用いるパラレル実験を実施することによって測定した。該サイクロフィリンプライマー対について、各試料中でのcDNAの量の小さな変化を検出し、これらのデータを新規なBMY_HPP5についてのプライマー対を用いて得たデータの正規化に使用した。該PCRデータを、試験した組織中での転写物存在量の差異の相対的な評価に変換し、該データを図11に提示する。BMY_HPP5に相当する転写物は、精巣および脊髄中で非常に高く；および骨髄、脳、胸腺および肝臓中でより低い程度で発現した。
【１１５２】
実施例4  本発明のBMY_HPPポリペプチドのホスファターゼ活性のアッセイ方法
本発明のBMY_HPPポリペプチドのホスファターゼ活性を、当該分野で知られたりおよび本明細書に記載する様々な生物学的なアッセイの利用によって評価することができる。
【１１５３】
パラ−ニトロフェニルホスフェートの加水分解
BMY_HPPタンパク質についてのホスファターゼ活性を、パラ−ニトロフェニルホスフェート、ホスファターゼの基質であると知られる化合物を加水分解する能力を、Krejsa, C.らによるJ. Biol. Chem. Vol. 272, p.11541-11549, 1997 (これは本明細書の一部を構成する）に記載する通り、測定することができる。該タンパク質を、60mM MES、pH 6.0、0.5％グリセロール、5mMジチオトレイトールおよび0.1％トリトンX−100を含有する溶液中の3mg／ｍLパラ−ニトロフェニルホスフェート中で15分間または所望することができる他の時間、インキュベートする。該反応液のpHを変えて、酵素アッセイの当該分野における当業者によって各々のBMY_HPPタンパク質についての最適なpHを得ることができる。該ホスファターゼ反応を3N NaOHの添加によって停止させて、最終的なNaOH濃度を0.7Mとする。該反応の産物を、405nmで該溶液の吸光度を読み取ることによって測定する。
【１１５４】
2次元ゲル電気泳動
本発明のBMY_HPPポリヌクレオチドを、宿主細胞中での発現に適当なベクター中にサブクローニングすることができる。代表的なベクターは当該分野で知られ、および本明細書に記載する。2-Dゲル電気泳動（IEF、続いてSDS-PAGE）を用いて、宿主細胞タンパク質のBMY_HPP依存性脱リン酸化をアッセイする。これらのタンパク質を質量分光分析または当該分野に知られる他のタンパク質配列決定方法によって同定することができる。
【１１５５】
要するに、2-次元ゲル分析法およびタンパク質を用いて細胞を標識化する方法は、当該分野でよく知られる。細胞を32Pオルトホスフェートを用いて標識化し、細胞タンパク質を2Dゲル上で分離し、それらの位置をオートラジオグラフィーによって測定する。目的のタンパク質を、スポットを摘出し、それらの配列を質量分析によって分析することによって同定する。以下の紙面および本明細書に記載する引用文献は、細胞を標識化する方法、２Dゲル上で該タンパク質を分析することおよび質量分析同定方法を記載する：Germer, C.らによるJ. Biol. Chem., Vol. 275, p.39018 - 39026, 2000。ホスファターゼによって影響を受ける基質を、野生型細胞を、該ホスファターゼの発現を欠損、アンチセンスまたは他の手法によって抑制する細胞と比較することによって同定する。リン酸化が増大するタンパク質は、直接的な基質であるか、またはホスファターゼによって間接的に制御されるであろう。逆に、活性なホスファターゼが過剰発現する細胞中で、リン酸化が減少するタンパク質は直接的な基質であるか、または該ホスファターゼによって間接的に制御されるであろう。
【１１５６】
実施例5  本発明のBMY_HPPホスファターゼポリペプチドの基質を同定する方法
基質の同定
本発明のBMY_HPPポリペプチドのタンパク質基質を、上記に記載する2-D電気泳動アッセイにおいて脱リン酸化されたタンパク質の回収によって同定することができる。リンペプチドをまた、BMY_HPPタンパク質の活性または発現が（例えば、BMY_HPP活性の抗体、アンチセンスもしくは二本鎖阻害性RNAによるか、または該活性の小分子インヒビターによる）減少する際のリン酸化が増大するタンパク質としても同定することができる。いずれかの場合において、質量分析を用いて該回収されたタンパク質を同定することができる。
【１１５７】
BMY_HPPポリペプチドについてのリンペプチド基質はまた、該タンパク質の触媒的な不活性体を有するリンペプチドライブラリーのインキュベート、該複合体の回収および標準的な方法（例えば、エドマン分解または質量分析）によるペプチド配列決定によって同定することができる。
【１１５８】
リンペプチド基質をまた、基質トラップ突然変異ホスファターゼ（活性部位突然変異に起因する触媒的に不活性であるもの）を発現させおよび野生型ホスファターゼと比べて基質トラップホスファターゼと優先的に結合するタンパク質を単離することによって同定することもできる。
【１１５９】
実施例6  本発明のRET31の同定方法
調節性事象に関与する遺伝子産物を同定する努力において、ヒト肺微小血管内皮細胞中で発現したRNAを分析した。休止細胞をTNF-αを用いて１時間刺激し、該RNAを該細胞から単離した。相補的RNA（cDNA）を、当該分野で知られる方法を用いて、単離されたRNAから作製した。TNF-αに対する応答において調節されないcDNAを、基質ハイブリダイゼーションを用いて同定した。RET31ポリヌクレオチドの一部に相当するクローンを同定し、このものを用いて全長（配列番号115）を同定した。更なる方法を、以下に提示する。
【１１６０】
HMVEC細胞培養
1ドナーからのヒト肺微小血管内皮細胞（HMVEC)の１次培養物を、クローンテック社（Walkersville, MD）から得た。該細胞を、5％胎児ウシ血清（ハイクローン(Hyclone)）を有する内皮細胞増殖培地−2キット（CC-3202）中で培養した。最初に、該細胞をT-25フラスコ中に播種し、約90％の集密に達した後に、そのものをトリプシン処理して、培地(80mL)中、1.2×106／フラスコで、T-225フラスコ中に移した。正常な増殖条件の場合には、該培地を48時間毎に変えた。細胞が約90％の集密に達した時に、それらを再び継代させて、培地(80mL)中、1.8×106／フラスコでT-225フラスコ中に播種した。
【１１６１】
RNA単離のためのHMVEC細胞処理
HMVECのサブ集密化（90％集密）T-225フラスコを、過剰量の培地を除去することによって、フラスコ当たり40mLの培地に調整した。HMVECは、未処置のままであるか（０時間）または10ng／mLのTNF-αを用いて1、6もしくは24時間処理した。該培地は、TNF-αの添加時には変えなかった。
【１１６２】
RNAの単離
示した時点で、該HMVECのフラスコを該フラスコから細胞を除去するために簡単にトリプシン処理し、そしてトリプシン処理を胎児ウシ血清を添加することによって終結させた。該細胞を該フラスコから除去し、該フラスコをPBSを用いてすすいだ。該細胞をペレットし、PBS中で１度すすぎ、再ペレットした。上清を除去し、該細胞ペレットをRNAの単離に使用した。ポリA＋RNAをFast Track 2.0（登録商標）（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて直接的に単離した。
【１１６３】
サブトラクションライブラリーの構築
PCR選択cDNAサブストラクションキット（登録商標）（Clontech, Palo Alto, CA）を用いて、商業主プロトコールに従って、未処置HMVECポリA＋RNA（テスター(tester)）および1時間TNF-α処理したHMVECポリA＋RNA(ドライバー(driver)）からサブストラクションライブラリーを得た。10個の二次的なPCR反応を合わせて、2％アガロースゲル上で操作した。約0.3kb〜10kbの範囲にわたる画分を、QIAgenゲルサブストラクションキット（QIAgen Inc., Valencia, CA）を用いてゲル精製し、そしてTAクローニングベクター、pCR2.1 (Invitrogen)中にインサートした。TOP 1OF'コンピテント大腸菌細胞（Invitrogen）を形質転換して、50マイクログラム／mLのアンピシリンを含有するLBプレート上に置いた。クローンを単離し、このものをアンピシリンの濃度と同様な濃度を含有するLBブロス中で増殖させた。プラスミドを、当該分野で知られるかまたは本明細書の他所に記載する方法を用いて配列決定した。
【１１６４】
上記の通り、該サブストラクションライブラリーを構築するための方法を使用し、続いてPCR−選択cDNAサブストラクションキット（(Clonetech; Protocol &num；PT1117-1；Version番号PR85431））（これは本明細書の一部を構成する）についての方法を行なった。この方法についての別の文献は、Diatchenko, L., et al., PNAS 93: 6025-6030 (1996)（これは、本明細書の一部を構成する）において知ることができる。
【１１６５】
実施例7  本発明のRET31のクローニング法
RET31の予想コード配列を含有するクローンを、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（RT／PCR）を用いて、6時間腫瘍壊死因子（TNF-α）で処理したヒト微小血管内皮細胞（HMVECs）から単離した。当該分野で知られる方法に従って、TNF-αで刺激したHMVEC細胞から単離した。プライマーセット（各々400mMの最終濃度）を用い、以下のプライマーおよび条件：
プライマーJNF388：CACACCACCATTACATCATCGTGGC（配列番号145）
プライマーJNF525：TGCTGCTCTGCTACCAACCC（配列番号146）
並びに、25.0μLの反応液中、200マイクロM dNTP's、1Xアドバンテージ2ポリメラーゼおよび2.0μL DNAを用いて3kb配列を増幅させた。該実験を以下の順序で35回サイクルした：94℃で30秒間、68℃で30秒間、次いで72℃で3.5分間。反応の完結後に、6.0μLの添加色素を加え、該全ての反応液を臭化エチジニウムを含有する1.2％アガロースゲル中でゲル電気泳動によって分離した。3kbバンドを該ゲルから切除し、QIAgenサブストラクションキット（QIAgen, Valencia, CA）を用いて精製した。この断片をpTAdvクローニングベクター（Clontech, Palo Alto, CA)）中にライゲートさせ、標準的な方法を用いて配列決定した。該RET31クローン（配列番号108；図13A〜F）は、予想RET31コード配列のヌクレオチド472〜3513に対応する約3kbを含む。該予想されるRET31コード配列（配列番号147）を、Incyte遺伝子クラスター1026659.7.から誘導した。
【１１６６】
該RET31ポリペプチドをコードする核酸配列に相当する核酸配列を、最初にTNF-α刺激したヒト肺内皮細胞（HMVEC）由来のサブストラクションライブラリーで同定した。このサブストラクションクローン配列は、示す通り、408bp部分的cDNA配列をコードした：
RET31サブストラクションクローン
ACAATGGAGTGGCTGAGCCTTTGAGCACACCACCATTACATCATCGTGGCAAATTAAAGAAGGAGGTGG
GAAAAGAGGACTTATTGTTGTCATGGCCCATGAGATGATTGGAACTCAAATTGTTACTGAGAGGTTGGT
GGCTCTGCTGGAAAGTGGAACGGAAAAAGTGCTGCTAATTGATAGCCGGCCATTTGTGGAATACAATAC
ATCCCACATTTTGGAAGCCATTAATATCAACTGCTCCAAGCTTATGAAGCGAAGGTTGCAACAGGACAA
AGTGTTAATTACAGAGCTCATCCAGCATTCAGCGAAACATAAGGTTGACATTGATTGCAGTCAGAAGGT
TGTAGTTTACGATCAAAGCTCCCAAGATGTTGCCTCTCTCTCTTCAGACTGTTTTCTCACTGT（配列番号115）。
【１１６７】
実施例8  ノーザンハイブリダイズを用いたRET31のmRNA発現プロファイルを測定する方法
腫瘍組織ノーザンブロット(MTN)をClontech Laboratories (Palo Alto, CA)から購入し、このものをP32-標識化したRET31を用いてハイブリダイズした。要するに、408bpのRET31画分（RET31／RsaI）を、RsaI制限エンドヌクレアーゼを用いてサブストラクションクローン（lhrTNF031）（配列番号115）から単離し、2.0％アガロースゲル上で操作し、そしてQIAgenゲル抽出キット（QIAgen, Valencia, CA）を用いて精製した。約30ngのRET31／RsaIを、ランダムに初回刺激を受けた(primed)DNA標識化キット（Roche, Indianapolis, IN）を用いて、放射標識化（6000Ci／mmol、P32-dCTP）した。取り込まれていないヌクレオチドを、NucTrapプローブ精製カラム（Stratgene, La Jolla, CA）を用いて除去した。放射標識化したRET31／RsaIを、ExpressHybハイブリダイズ溶液（Clontech）の1.5×106cpm／mLの比放射能で加え、そして65℃で終夜インキュベートした。ブロットを50℃で2.0XSSC／0.5%SDSに洗浄して、24時間および48時間フィルムに曝露させた。使用したMTN'sはヒトMTN（番号7760-1）、ヒトMTN II（番号7760-1）、ヒトMTN III（番号7760-1）およびヒト癌セルラインMTN（番号7757-1）であった。
【１１６８】
該結果は、RET31ポリペプチドが副腎、精巣および骨格筋中で優位に；肝臓、前立腺、卵巣中で有意な程度で；および胎盤、すい臓、胸腺、小腸、甲状腺、心臓、腎臓および肝臓中でより低い程度で発現することを示す（図15を参照）。
【１１６９】
実施例9  TNF-アルファがRET31 mRNA発現に及ぼす影響を評価するための方法
RET31発現のTNF-α依存性調節を確認するために、HMVEC細胞をTNF-αを用いて数時間処理し、そして引き続いてmRNAを収集し、そしてノーザンハイブリダイズによってプローブした。要するに、未処置のHMVEC、1時間TNF-α刺激したHMVEC、6時間TNF-α刺激したHMVEC、24時間TNF-α刺激したHMVECポリA＋RNA（各々2μg）を3.0％ホルムアルデヒドを含有する1.2％アガロース上で反応させ、そして標準的なブロット法（本明細書に引用するManiatisらを参照）を用いるHybond N＋核酸転移膜（Amersham, Piscataway, NJ）に移した。膜をStratalinker (Stratagene)を用いて自動架橋(cross-linked)させ、ExpressHybハイブリダイズ溶液中で1時間予めハイブリダイズし、そして多重組織ノーザンブロットを用いてパラレルでプローブした。
【１１７０】
ハイブリダイゼーション後に、膜を低ストリンジェントな溶液（2XSSC/0.05% SDS）を用いて室温で30分間、2回溶液を変えて、連続的に振り混ぜることによって洗浄した。次いで、膜を高いストリンジェントな溶液（0.1XSSC/0.1% SDS）を用いて50℃で30分間、溶液を1回変えて洗浄した。該膜を−70℃で10日間、X-線フィルムに増感用スクリーンを用いて曝露させた。
【１１７１】
該内皮細胞ブロットを、E-セレクチンおよびGAPDHについて再プローブした。
【１１７２】
該結果により、RET31がTNF-αによって上方調節され、ノーザンブロット分析によって6時間で発現のピークに達することを確認した（図18を参照）。
【１１７３】
実施例6
細胞レベルでのヒトホスファターゼポリペプチドの生理学的な機能を評価する方法
ヒトホスファターゼポリペプチドの生理学的な機能を、哺乳動物培養システム中での生理学的に増大したレベルでのヒトホスファターゼをコードする配列を発現することによって評価することができる。cDNAを、高いレベルのcDNA発現を導く(drive)強いプロモーターを含有する哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングする。選択のベクターとしては例えば、pCMV SPORT (Life Technologies)およびpCR3.1 (Invitrogen, Carlsbad CA)を含み、これらは共にサイトメガロウイルスを含む。組換えベクターの5〜10μgをヒトセルライン（内皮起源または肝細胞起源のものが好ましい）中に、リポソーム製剤またはエレクトロポレーションのいずれかを用いて一過性で転写する。マーカータンパク質をコードする配列を含有する別のプラスミド（1〜2μg）を同時導入する。マーカータンパク質の発現は、トランスフェクトされた細胞を非トランスフェクトされた細胞と区別する方法を提供し、そしてこのものは組換えベクターからのcDNA発現の信頼できる予言物である。選択するマーカータンパク質としては例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質を含む。フローサイトメトリー(FCM)、自動レーザー視覚性ベースの方法を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現するトランスフェクト細胞を同定し、そして該細胞のアポトーシス状態および他の細胞性質を評価する。FCMは、細胞死に先行するかまたは同時発生的である事象を診断する蛍光分子の取り込みを検出し、そして定量化する。これらの事象としては例えば、核DNA含有量の変化（これは、ヨウ化ピリジウムを用いてDNAを染色することによって測定される）；細胞のサイズおよび粒度(granularity)の変化（これは、前方光散乱(forward light scatter)および90°側面光散乱(90 degree side light scatter)によって測定される）；DNA製造の下方調節（これは、ブロモデオキシウリジンの取り込みの減少によって測定される）；細胞表面および細胞内タンパク質の発現の変化（これは、特異的な抗体との反応性によって測定される）；および原形質膜組成物の変化（これは、フルオロセリン接合アネキシンVタンパク質と細胞表面との結合によって測定される）を含む。フローサイトメトリーの方法は、Ormerod, M. G.による(1994) Flow Cvtometrv, Oxford, New York NY.に記載されている。
【１１７４】
遺伝子発現に及ぼすヒトホスファターゼポリペプチドの影響は、ヒトホスファターゼおよびCD64またはCD64-GFPをコードする配列を用いてトランスフェクトした細胞の非常に精製した個体群を用いて評価することができる。CD64およびCD64-GFPは、トランスフェクトした細胞の表面上で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。トランスフェクト細胞を、ヒトIgGまたはCD64に対する抗体のいずれかを用いて被覆した磁気ベッドを用いて非トランスフェクトした細胞と効率的に分離する。mRNAを、当該分野の当業者によってよく知られる方法を用いて該細胞から分離することができる。ヒトホスファターゼポリペプチドをコードするmRNAおよび目的の他の遺伝子の発現は、ノーザン分析またはマイクロアレー方法によって分析することができる。
【１１７５】
実施例7  ヒトホスファターゼポリペプチドと相互作用する化合物についてのスクリーニング法
以下のアッセイを、ヒトホスファターゼポリペプチドと結合したり、ヒトホスファターゼポリペプチドと相互作用する他の細胞タンパク質と結合する化合物、およびヒトホスファターゼポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するために設計する。
【１１７６】
それらの化合物としては、例えば他の細胞タンパク質を含むが、これらに限定されない。具体的には、それらの化合物としては例えば、可溶性ペプチドなどのペプチドを含むが、これらに限定されない。該可溶性ペプチドとしては例えば、Ｉｇ−尾部(tailed)融合ペプチド（これは、ヒトホスファターゼポリペプチド膜貫通受容体およびランダムペプチドライブラリーのメンバーを含む）（例えば、ラム(Lam), K. S.らによる1991, Nature 354: 82-84; ヒュートン(Houghton), R.らによる1991, Nature 354: 84-86を参照）（これは、Ｄ−および／またはＬ−立体配座のアミノ酸からなる）；リンホペプチド（これは、ランダムまたは部分的に縮重したリンペプチドライブラリーのメンバーを含むが、これらに限定されない）（例えば、ソングヤング(Songyang), Z.らによる1993, Cell 72: 767-778）；抗体（これは、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは１本鎖抗体、ＦＡｂ、F(ab').sub.2およびＦＡｂ発現ライブラリー断片およびそれらのエピトープ結合性断片を含むが、これらに限定されない）；および小有機または無機分子を含むが、これらに限定されない。
【１１７７】
例えば本明細書に記載のアッセイなどのアッセイによって同定された化合物は、例えばヒトホスファターゼポリペプチドの生物学的な機能を増大するのにおよび例えば腫瘍進行の症状を軽減するのに有用であり得る。例えば、腫瘍進行状態もしくはその障害がより低い総レベルのヒトホスファターゼの発現、ヒトホスファターゼポリペプチドおよび／または腫瘍進行状態もしくはその障害に関与する細胞中でのヒトホスファターゼポリペプチド活性から生じる場合には、該ヒトホスファターゼポリペプチドと相互作用する化合物は、結合したヒトホスファターゼポリペプチドの活性を強調したりまたは増幅する化合物を含むことができる。それらの化合物は、ヒトホスファターゼポリペプチド活性のレベルを有効に増大させ、従って腫瘍進行障害またはその状態の症状を軽減するであろう。ヒトホスファターゼポリプチド中の突然変異が有害な影響（これは、腫瘍の進行を引き起こす）を有する異常なヒトホスファターゼポリペプチドの産生を引き起こす場合には、結合したヒトホスファターゼポリペプチドの活性を抑制するヒトホスファターゼポリペプチドと結合する化合物を同定することができる。それらの化合物の有効性を試験するためのアッセイは、当該分野において知られており、そして本明細書に記載する。
【１１７８】
実施例8  ヒトホスファターゼポリペプチドと結合する化合物のインビトロスクリーニング法
インビトロシステムを、本発明のヒトホスファターゼポリペプチドと結合することができる化合物を同定するために設計することができる。同定される化合物は、例えば野生型および／または変異体ヒトホスファターゼポリペプチド（変異性体ヒトホスファターゼポリペプチドが好ましい）の活性をモジュレートするのに有用であり得て、該ヒトホスファターゼポリペプチドの生物学的な機能を増大させるのに有用であり得て、正常なヒトホスファターゼポリペプチド相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて使用することができたり、あるいはそれだけでそれら相互作用を破壊することができる。
【１１７９】
ヒトホスファターゼポリペプチドと結合する化合物を同定するのに使用するアッセイの原理は、２成分が相互作用したりおよび結合することができるのに十分な条件および時間で、ヒトホスファターゼポリペプチドと被験化合物との反応混合物を製造し、従って該反応混合物中で除去したりおよび／または検出することができる複合体を生成することである。これらのアッセイは、様々な方法で行なうことができる。例えば、それらのアッセイを行なうための方法は、固相にヒトホスファターゼポリペプチドもしくは被験物質を固着し、該反応の終了時に固相上に固着したヒトホスファターゼポリペプチド／被験化合物の複合体を検出することを含む。それらの方法の１実施態様において、ヒトホスファターゼポリペプチドを固体表面に固着させ、固着していない該被験化合物を直接にまたは間接に標識化することができる。
【１１８０】
実際に、ミクロタイタープレートを通常固相として使用することができる。該固着した成分を、非共有結合または共有結合によって固定化することができる。非共有結合は、該タンパク質の溶液を用いて該固体表面を簡単に覆い、そして乾燥することによって得ることができる。別法として、固定化させた抗体（これは、固定化するタンパク質にとって特異的なモノクローナル抗体が好ましい）を用いて、該タンパク質を該固体表面に固着させることができる。該表面を予め調製して保存することができる。
【１１８１】
該アッセイを行なうのに、該非固定化成分を該固着成分を含有する該被覆表面に加える。該反応が完結後に、形成したいずれの複合体が該固体表面上に固定化されたまま残る条件下で、未反応成分を除去（例えば、洗浄することによって）する。該固体表面上に固着された複合体の検出は、多数の方法において達成することができる。先の固定化成分を予め標識化する場合には、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が生成したことを示す。先の非固定化成分を予め標識化しない場合には、例えば固定化成分に特異的な標識抗体（該抗体は次いで、標識抗−Ｉｇ抗体を用いて直接的にまたは間接的に標識化することができる）を用いた間接的な標識を用いて、表面上に固着される複合体を検出することができる。
【１１８２】
別法として、反応を液相で行ない、該反応生成物を未反応成分から分離し、そして複合体を検出することができる。例えば、溶液中で生成するいずれかの複合体を固着させるためにヒトホスファターゼポリペプチドまたは被験化合物に特異的な固定化抗体、および固着する複合体を検出するために可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を用いる。
【１１８３】
実施例9  ヒトホスファターゼポリペプチド／細胞産物の相互作用を妨害する化合物の同定法
本発明のヒトホスファターゼポリペプチドは、インビボで１つ以上の細胞または細胞外のマクロ分子（例えば、タンパク質）と相互作用することができる。それらマクロ分子としては、例えばポリペプチド、特にリガンドおよび例えば、本明細書の他所に記載のスクリーニング方法によって同定される産物を含むが、これらに限定されない。本説明の目的のために、それら細胞および細胞外のマクロ分子を本明細書において「結合パートナー」と呼ぶ。本発明の目的のために、「結合パートナー」はまた、ポリペプチド、小分子化合物、多糖類、脂質および本明細書において引用するいずれかの他の分子または分子タイプをも包含できる。それらの相互作用を破壊する化合物は、ヒトホスファターゼポリペプチド、特に変異体ヒトホスファターゼポリペプチドの活性を調節するのに有用であり得る。それらの化合物としては、例えば抗体、ペプチドおよび本明細書に記載のその他などの分子を含むことができるが、これらに限定されない。
【１１８４】
ヒトホスファターゼポリペプチドおよびその細胞もしくは細胞外の結合性パートナーとの相互作用を妨害する化合物を同定するのに使用する該アッセイシステムの基本的な原理は、該２つの生成物が相互作用したりそして結合するのに十分な条件および時間で該ヒトホスファターゼポリペプチドと該結合パートナーを含有する反応混合物を製造し、従って複合体を得ることを含む。阻害活性について化合物を試験するために、該反応混合物を被験化合物のあるなしで調製する。該被験化合物は最初に該反応混合物に含ませるか、あるいはヒトホスファターゼポリペプチドおよびその細胞もしくは細胞外の結合パートナーの添加時に加えることができる。コントロール反応混合物を、被験化合物なしでまたはプラセボと一緒にインキュベートする。次いで、ヒトホスファターゼポリペプチドおよび細胞もしくは細胞外の結合パートナーの間のいずれかの複合体の生成を検出する。コントロール反応液中であるが、該被験化合物を含有する該反応混合物中ではない複合体の生成は、該化合物がヒトホスファターゼポリペプチドおよびその相互作用結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。加えて、被験化合物および正常なヒトホスファターゼポリペプチドを含有する反応混合物中での複合体の生成はまた、該被験化合物および変異体ヒトホスファターゼポリペプチドを含有する反応混合物中での複合体の生成と比較することもできる。この比較は、変異体との相互作用を破壊する化合物を同定することが望まれる場合に重要であり得るが、正常なヒトホスファターゼポリペプチドの場合は違う。
【１１８５】
該ヒトホスファターゼポリペプチドおよび結合パートナーとの相互作用を妨害する化合物についてのアッセイは、不均一なまたは均一な様式で行なうことができる。不均一なアッセイは、ヒトホスファターゼポリペプチドまたは結合パートナーのいずれかを固相に固着させること、および該反応の終了時に該固相上に固着された複合体を検出することを含む。均一なアッセイにおいて、全反応は液相中で行なう。いずれかの方法において、反応物の添加の順序を変えて、被験する化合物についての異なる情報を得ることができる。例えば、被験基質の存在下で該反応を行なうことによって、すなわちヒトホスファターゼポリペプチドおよび相互作用性の細胞もしくは細胞外の結合パートナーを加える前または同時に該被験基質を該反応混合物に加えることによって、例えばヒトホスファターゼポリペプチドおよび結合パートナーの間の相互作用を例えば競合によって妨害する被験化合物を同定することができる。別法として、予め生成した複合体を破壊する被験化合物、例えば該複合体からの成分の１つを置換するより高い結合定数を有する化合物を、複合体を生成させた後に該反応混合物に該被験化合物を加えることによって試験することができる。様々な様式を、以下に簡単に記載する。
【１１８６】
不均一なアッセイシステムにおいて、ヒトホスファターゼポリペプチドまたは相互作用性の細胞または細胞外の結合パートナーは固体表面上に固着し、一方で非固着種を直接的にまたは間接的に標識化する。実際には、ミクロタイタープレートを通常使用する。該固着種は、非共有結合または共有結合によって固定化することができる。非共有結合は、該ヒトホスファターゼポリペプチドまたは結合パートナーの溶液を用いて該固体表面を被覆し、そして乾燥することによって簡単に得ることができる。別法として、固着種に特異的な固定化抗体を用いて、該種を該固体表面に固着させることができる。該表面は予め調製して保存することができる。
【１１８７】
該アッセイを行なうために、該固定化種のパートナーを被験化合物と一緒にまたはなしで該被覆表面に曝露させる。該反応が完結後に、未反応成分を除去（例えば、洗浄することによって）すると、生成したいずれの複合体は該固体表面に固定化されたままとなろう。該固体表面に固着した複合体の検出は、多数の方法で達成することができる。非固定化種を予め標識化させる場合には、該表面上に固定化した標識の検出は、該複合体が生成したことを示す。非固定化種を予め標識化しない場合には、間接的な標識を用いて、例えば最初に非固定化種に特異的な標識抗体を用いて（該抗体は、次いで標識抗Ｉｇ抗体を用いて直接的にまたは間接的に標識化することができる）、該表面上に固着した複合体を検出することができる。反応成分の添加の順序に応じて、複合体の生成を抑制したりまたは予め生成した複合体を破壊する被験化合物を検出することができる。
【１１８８】
別法として、該反応を被験化合物のあるなしで液相中で行なうことができ、該該反応生成物を未反応成分から分離し、そして複合体を検出する。例えば、溶液中で生成したいずれかの複合体を固着させるために結合成分の１つに特異的な固定化抗体、および固着した複合体を検出するために他のパートナーに特異的な標識化抗体を用いる。また、液相への反応体の添加の順序に応じて、複合化を抑制したり、または予め生成した複合体を破壊する被験化合物を同定することができる。
【１１８９】
本発明の別の実施態様において、均一なアッセイを使用することができる。この方法において、ヒトホスファターゼポリペプチドおよび相互作用の細胞または細胞外の結合パートナー物との予め生成した複合体は、ヒトホスファターゼポリペプチドまたはそれら結合パートナーのいずれかを標識化する場合に製造されるが、該標識によって得られる信号は複合体の生成によりクエンチされる（例えば、ルエンステイン(Rubenstein)による米国特許第4,109,496号（これは、イムノアッセイについての本方法を使用する）を参照）。予め生成した複合体由来の種の１つと競合したりおよびそれを置換する被験物質の添加により、バックグラウンドより上の信号を生じる。この方法において、ヒトホスファターゼポリペプチドと細胞または細胞外結合性パートナーとの相互作用を破壊する被験物質を同定することができる。
【１１９０】
ある実施態様において、当該分野において知られる組換えＤＮＡ法を用いて、固定化のための該ヒトホスファターゼポリペプチドを製造することができる。例えば、ヒトホスファターゼポリペプチドコード領域は、該結合活性が得る融合産物中で保持されるような様式で、融合ベクター（例えば、pGEX-5X-l）を用いてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させることができる。相互作用性の細胞または細胞外の産物を、当該分野において通常実施されたりおよび上に記載の方法を用いて、精製したりそしてモノクローナル抗体を産生することができる。この抗体を、例えば当該分野において通常実施される方法によって、放射性同位体、例えば１２５Ｉを用いて標識化することができる。非均一なアッセイにおいて、例えばGST−ヒトホスファターゼポリペプチド融合産物を、グルタチオン−アガロースビーズに固着することができる。該相互作用性の細胞または細胞外の結合パートナー産物は、相互作用および結合が生じ得る様式で被験化合物のあるなしで加えることができる。該反応期間の最後に、未結合物質を洗浄して除き、該標識モノクローナル抗体を該システムに加えて、該複合化成分と結合させることができる。ヒトホスファターゼポリペプチドおよび相互作用性の細胞または細胞外の結合パートナーの間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズと会合したままの放射能の量を測定することによって検出することができる。該被験化合物による該相互作用の十分な抑制は、測定される放射能の低下を生じるであろう。
【１１９１】
別法として、GST−ヒトホスファターゼポリペプチド融合産物および相互作用性の細胞または細胞外の結合パートナー産物を、固体グルタチオン−アガロースビーズなしで液体中で一緒に混合することができる。該被験化合物を、ヘパリンパートナーが相互作用することができる間またはその後のいずれかに加えることができる。次いで、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに加え、非結合性物質を洗浄して除くことができる。また、結合パートナーとの相互作用の抑制の大きさは、該標識抗体を加え、そして該ビーズと会合した該放射能を測定することによって検出することができる。
【１１９２】
本発明の別の実施態様において、全長産物の一方または両方の代わりに、該ヒトホスファターゼポリペプチド産物の結合性ドメインに相当するペプチド断片および相互作用性の細胞または細胞外の結合パートナー（該結合パートナーが産物である場合）を用いて、これらと同じ技法を使用することができる。
【１１９３】
当該分野で通常実施されるいずれかの多数の方法を用いて、該タンパク質の結合部位を同定し、そして単離することができる。これらの方法としては、例えば該産物の１つをコードする遺伝子の１つの突然変異誘発、および免疫共沈降アッセイにおける結合の破壊についてのスクリーニング法を含むが、これらに限定されない。複合体における第２の種をコードする遺伝子内の補償的な(Compensating)突然変異を、選択することができる。それぞれの産物をコードする遺伝子の配列分析は、相互作用結合に関与する産物の領域に相当する突然変異を示すであろう。別法として、上記の本項に記載する方法を用いて、ある産物を固体表面に固着させ、その標識結合パートナー（これは、例えば、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いて処理した）と相互作用させたりそして結合させることができる。洗浄後、該結合性ドメインを含有する短い標識ペプチドは該固体物質と会合したままであり、このものを単離し、アミノ酸配列決定法によって同定することができる。また、細胞または細胞外の結合パートナーをコードする遺伝子を得た後に、短い遺伝子セグメントを操作して該産物のペプチド断片を発現させることができ、次いでそのものを結合活性について試験し、そして精製したりまたは産生することができる。
【１１９４】
実施例10  寄託された試料からの特定クローンの単離
与えられたcDNAクローンに関して表Ｉに記載したATCC受託番号を持つ試料に含まれる寄託物は、その与えられたクローンとは異なるcDNAをそれぞれに含む1または複数の他のプラスミドも含みうる。したがって、同じATCC受託番号を持つ寄託物は、表Ｉに示した各cDNAクローンのプラスミドを少なくとも1つは含んでいる。通例、表Ｉに記載した各ATCC寄託物試料は、（重量で）ほぼ等量の約1〜10プラスミドDNAの混合物を含み、各プラスミドDNAは異なるcDNAクローンおよび/または部分cDNAクローンを含むが、そのような寄託物試料は、2より多い、または2より少ない、cDNAクローンのプラスミドを含んでもよい。
【１１９５】
特定のクローンをそのクローンについて表Ｉに記載したプラスミドDNAの寄託試料から単離するには、2つのアプローチを使うことができる。第1に、配列番号1に対応するポリヌクレオチドプローブを使ってクローンをスクリーニングすることによって、プラスミドを直接単離する。
【１１９６】
具体的には、30〜40個のヌクレオチドを持つ特異的ポリヌクレオチドをApplied Biosystems DNA合成装置を使って、報告された配列に従って合成する。そのオリゴヌクレオチドを、常法により、例えばT4ポリヌクレオチドキナーゼを使って32P-(-ATPなどで標識し、精製する（例えばManiatisら「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1982）参照）。プラスミド混合物を、上に示したような適切な宿主（例えばXL-1 Blue（Stratagene））に、当業者に知られている技術、例えばベクター供給者が提供している方法、または上述の関連刊行物もしくは関連特許に記載されている方法を使って導入する。形質転換体を、1.5％寒天平板（適当な選択剤、例えばアンピシリンを含むもの）に、1平板あたり約150形質転換体（コロニー）の密度になるように播種する。細菌コロニースクリーニングの常法（例えばSambrookら「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」（第2版(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）の1.93〜1.104頁）または当業者に知られている他の技術に従って、これらの平板を、ナイロン膜を使ってスクリーニングする。
【１１９７】
もう一つの方法として、配列番号Xの両端（すなわち、表Ｉに定義したクローンの5'NTおよび3'NTを境界とする配列番号Xの領域内）に由来する17〜20ヌクレオチドの2つのプライマーを合成し、それらを使って、寄託されたcDNAプラスミドをテンプレートとして所望のcDNAを増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応は通常の条件で、例えば0.5μgの上記cDNAテンプレートを含む25μlの反応混合物中で、行なわれる。便利な反応混合物は1.5〜5mM MgCl2、0.01％(w/v)ゼラチン、各20μMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、各25pmolのプライマー、および0.25単位のTaqポリメラーゼである。Perkin-Elmer Cetus自動サーマルサイクラーで、35サイクルのPCR（94℃で1分間の変性、55℃で1分間のアニーリング、72℃で1分間の伸長）を行なう。増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって解析し、予想される分子量を持つDNAバンドを切り出して、精製する。そのDNA産物をサブクローニングし、配列決定する事により、そのPCR産物が選択した配列であることを証明する。
【１１９８】
実施例11  ポリペプチドの組織分布
本発明のポリヌクレオチドのmRNA発現の組織分布を、例えばSambrookらが記載したノーザンブロット解析のプロトコールを使って決定する。例えば、実施例10に記載の方法によって作製したcDNAプローブを、rediprime（商標）DNAラベリングシステム（Amersham Life Science）を使用して、製造者の説明書に従って、p32で標識する。標識した後、CHROMA SPIN0-100カラム（Clontech Laboratories,Inc.）を使用して、製造者のプロトコール番号PT1200-1に従って、プローブを精製する。次に、精製した標識プローブを使って、様々な組織をmRNA発現について調べる。
【１１９９】
ExpressHyb（商標）ハイブリダイゼーション溶液（Clonetech）を使用し、製造者のプロトコール番号PT1190-1に従って、様々な組織のmRNAが結合している組織ノーザンブロットを標識プローブで調べる。ノーザンブロットは、当技術分野で周知の様々なプロトコールを使って作製することができる（例えばSambrookら参照）。ハイブリダイゼーションと洗浄に続いて、ブロットをマウントして−70℃で終夜フィルムに露出し、標準的手順に従ってフィルムを現像する。
【１２００】
実施例12  ポリヌクレオチドの染色体マッピング
配列番号Xの5'末端の配列に従って、オリゴヌクレオチドプライマーセットを設計する。このプライマーは好ましくは約100ヌクレオチドに及ぶ。次に、このプライマーセットを使って、以下の条件でポリメラーゼ連鎖反応に使用する：95℃で30秒；56℃で1分；70℃で1分。このサイクルを32回繰り返した後、70℃で5分間を1サイクル行なう。個々の染色体または染色体断片を含む体細胞雑種パネル（Bios,Inc.）の他に、哺乳類DNA、好ましくはヒトDNAをテンプレートとして使用する。反応液を8％ポリアクリルアミドゲルおよび3.5％アガロースゲルで解析する。染色体マッピングは特定の体細胞雑種に約100bpのPCR断片が存在することによって決定する。
【１２０１】
実施例13  ポリペプチドの細菌発現
実施例10に概説したように、DNA配列の5'および3'末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使って本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅することにより、挿入断片を合成する。cDNAインサートの増幅に使用するプライマーは、好ましくは、増幅産物を発現ベクターにクローニングするために、BamHIおよびXbaIなどの制限部位をプライマーの5'末端に含むべきである。例えばBamHIおよびXbaIは、細菌発現ベクターpQE-9（Qiagen,Inc.カリフォルニア州チャッツワース）上の制限酵素部位と一致する。このプラスミドベクターは抗生物質耐性（Ampr）、細菌複製起点（ori）、IPTG調節性プロモーター/オペレーター（P/O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-ヒスチジンタグ（6-His）、および制限酵素クローニング部位をコードしている。
【１２０２】
pQE-9ベクターをBamHIおよびXbaIで消化し、細菌RBSから始まる読み枠を保ちつつ、増幅断片をpQE-9ベクターにライゲートする。次に、そのライゲーション混合物を使って大腸菌M15/rep4株（Qiagen,Inc.）を形質転換する。大腸菌M15/rep4株はlacIリプレッサーを発現させ、かつ、カナマイシン耐性（Kanr）を付与する複数コピーのプラスミドpREP4を含有する。LB平板上で成長するそれらの能力によって形質転換体を同定し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、制限分析によって確認する。
【１２０３】
所望のコンストラクトを含有するクローンを、Amp（100μｆg/ml）とKan（25μg/ml）を両方とも添加したLB液体培地で終夜（O/N）液体培養する。そのO/N培養物を使って、1:100〜1:250の比率で大きい培養に接種する。光学密度600（O.D.600）が0.4〜0.6になるまで細胞を生育させる。次にIPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）を最終濃度が1mMになるように加える。IPTGはlacIリプレッサーを不活化し、P/Oをきれいにして、遺伝子発現量の増加をもたらす。
【１２０４】
細胞をさらに3〜4時間生育する。次に、遠心分離（6000×gで20分）によって細胞を収集する。細胞ペレットを、カオトロピック試薬6M塩酸グアニジンに、4℃で3〜4時間撹拌することによって、可溶化する。遠心分離によって細胞破片を除去し、ポリペプチドを含む上清を、ニッケル-ニトリロ-三酢酸（「Ni-NTA」）アフィニティー樹脂カラム（前掲のQIAGEN,Inc.から入手可能）に負荷する。6×Hisタグを持つタンパク質は高い親和性でNi-NTA樹脂に結合し、簡単な一段階操作で精製することができる（詳細は「The QIAexpressionist」(1995,QIAGEN,Inc.,前掲）を参照されたい）。
【１２０５】
簡単に述べると、6M塩酸グアニジン（pH8）中のカラムに上清を負荷し、そのカラムをまず10体積の6M塩酸グアニジン（pH8）で洗浄し、次に10体積の6M塩酸グアニジン（pH6）で洗浄し、最後に6M塩酸グアニジン（pH5）でポリペプチドを溶出させる。
【１２０６】
次に、精製されたタンパク質を、リン酸緩衝食塩水（PBS）または50mM酢酸ナトリウム（pH6）バッファー＋200mM NaClに対して透析することによって再生する。あるいは、Ni-NTAカラム上に固定化している間にタンパク質をうまく再フォールディングさせることもできる。推奨する条件は次の通りである：プロテアーゼ阻害剤を含む500mM NaCl、20％グリセロール、20mMトリス塩酸（pH7.4）中の直線的な6M−1M尿素勾配を用いる再生。再生は1.5時間以上かけて行なうべきである。再生後に、250mMイミダゾールを加えることによって、タンパク質を溶出させる。イミダゾールは、PBSまたは50mM酢酸ナトリウム（pH6）バッファー＋200mM NaClに対する最終透析ステップによって除去される。精製されたタンパク質は4℃で保存するか、または−80℃で凍結する。
【１２０７】
実施例14  封入体からのポリペプチドの精製
大腸菌中で発現させたポリペプチドが封入体の形で存在する場合は、以下の代替方法を使って、そのポリペプチドを精製することができる。別段の指定がないか切り、以下のステップは全て4〜10℃で行なわれる。
【１２０８】
大腸菌発酵の生産相が完了したら、細胞培養を4〜10℃に冷却し、15,000rpmでの連続的遠心分離（Heraeus Sepatech）によって細胞を収集する。細胞ペースト単位重量あたりの予想タンパク質収量と、必要な精製タンパク質量に基づいて、適当な量（重量）の細胞ペーストを、100mMトリス、50mM EDTAを含むバッファー（pH7.4）に懸濁する。高剪断撹拌器を使って均一な懸濁液になるように細胞を分散させる。
【１２０９】
次に、その溶液をマイクロフルイダイザー（Microfuidics,Corp.またはAPV Gaulin,Inc.）に4000〜6000psiで2回通すことによって、細胞を溶解する。次に、ホモジネートをNaCl溶液と混合して0.5M NaClの最終濃度にした後、7000×gで15分間遠心分離する。得られたペレットを0.5M NaCl、100mMトリス、50mM EDTA、pH7.4で再び洗浄する。
【１２１０】
得られた洗浄済封入体を1.5Mグアニジン塩酸塩（GuHCl）で2〜4時間可溶化する。7000×gで15分間の遠心分離の後、ペレットを捨て、ポリペプチド含有上清を4℃で終夜インキュベートして、さらにGuHCl抽出させる。
【１２１１】
高速遠心分離（30,000×g）で不溶性粒子を除去した後、GuHCl抽出物を、激しい撹拌によって50mMナトリウム、pH4.5、150mM NaCl、2mM EDTAを含む20体積のバッファーとすばやく混合することにより、GuHCl可溶化タンパク質を再フォールディングさせる。再フィールディングした希釈タンパク質溶液を混合せずに4℃に12時間保った後、さらなる精製段階を行なう。
【１２１２】
再フォールディングしたポリペプチド溶液を清澄化するには、40mM酢酸ナトリウム（pH6.0）と平衡させた適当な表面積の0.16mm膜フィルター（例えばFiltron）を装着した接線ろ過ユニットを前もって用意しておき、それを使用する。ろ過した試料を陽イオン交換樹脂（例えばPoros HS-50,Perseptive Biosystems）にのせる。そのカラムを40mM酢酸ナトリウム（pH6.0）で洗浄し、同じバッファー中の250mM、500mM、1000mMおよび1500mM NaClで段階的に溶出する。溶出液の280nmでの吸光度を連続的にモニターする。画分を集め、SDS-PAGEでさらに分析する。
【１２１３】
次に、ポリペプチドを含有する画分をプールし、4体積の水と混合する。次に希釈した試料を、先に調製しておいた強陰イオン交換樹脂（Poros HQ-50,Perceptive Biosystems）と弱陰イオン交換樹脂（Poros CM-20,Perceptive Biosystems）との直列カラムのセットに負荷する。それらのカラムを40mM酢酸ナトリウム（pH6.0）と平衡させる。両カラムを40mM酢酸ナトリウム（pH6.0）、200mM NaClで洗浄する。次に、CM-20カラムを0.2M NaCl、50mM酢酸ナトリウム（pH6.0）から1.0M NaCl、50mM酢酸ナトリウム（pH6.5）までの範囲の10カラム体積の直線的勾配を使って溶出させる。流出液のA280を常にモニターしながら画分を集める。次に、ポリペプチドを含有する画分（例えば16％SDS-PAGEで決定）をプールする。
【１２１４】
得られたポリペプチドは、上記の再フォールディングステップおよび精製ステップ後に、95％を超える純度を示すべきである。5μgの精製タンパク質を負荷した場合、クーマシーブルー染色した16％SDS-PAGEゲルによって大きな汚染物質バンドが観察されてはならない。精製タンパク質はエンドトキシン/LPS汚染についても試験することができ、通例、LPS含量はLAL試験法で0.1ng/ml未満である。
【１２１５】
実施例15  バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニングおよび発現
この実施例では、ポリペプチドを発現させるために、プラスミドシャトルベクターpAc373を使って、ポリヌクレオチドをバキュロウイルスに挿入する。典型的バキュロウイルス発現ベクターは、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多核体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、その後ろに例えばBamHI、XbaIおよびAsp718などといった便利な制限酵素部位が続いている。ポリアデニル化が効率よく起こるように、シミアンウイルス40（「SV40」）のポリアデニル化部位がしばしば使用される。組換えウイルスの選択が容易なように、このプラスミドは、大腸菌由来のベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子を、弱いショウジョウバエプロモーターの制御下に、同じ向きで含んでおり、その後ろにポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続いている。挿入される遺伝子の両側には、クローン化ポリヌクレオチドを発現させる生存可能なウイルスが、野生型ウイルスDNAとの細胞媒介相同組換えによって生成するように、ウイルス配列が隣接している。
【１２１６】
当業者にはよくわかるだろうが、そのコンストラクトが転写、翻訳、分泌などのシグナルを、例えばシグナルペプチドや、必要に応じてインフレームAUGを含めて、適切な位置に持つ限り、上記のベクターの代わりに、pVL941およびpAcIM1など、数多くの他のバキュロウイルスベクターを使用することができる。そのようなベクターは、例えばLuckowら,Virology 170:31-39(1989)に記載されている。
【１２１７】
実施例10に概説したようにDNA配列の5'および3'末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使って、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅することにより、挿入断片を合成する。cDNAインサートの増幅に使用するプライマーは、好ましくは、増幅産物を発現ベクターにクローニングするために、プライマーの5'末端に制限部位を含むべきである。具体的には、寄託されたクローンに含まれているcDNA配列を、AUG開始コドンと、本明細書の他の項で同定する天然のリーダー配列（当てはまる場合）を含めて、実施例10に記載のPCRプロトコールを使って増幅する。天然のシグナル配列をタンパク質の製造に使用する場合、使用するベクターは第2のシグナルペプチドを必要としない。もう一つの選択肢として、Summersら「A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures」Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555（1987）に記載されている標準的方法を使って、バキュロウイルスリーダー配列を含むようにベクターを改変することができる。
【１２１８】
市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.,カリフォルニア州ラホーヤ）を使って1％アガロースゲルから増幅断片を単離する。次に、その断片を適当な制限酵素で消化し、再び1％アガロースゲルで精製する。
【１２１９】
プラスミドを対応する制限酵素で消化する。プラスミドは、所望により、ウシ腸ホスファターゼを使って、当技術分野で知られる常法により、脱リン酸化することができる。次に、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.,カリフォルニア州ラホーヤ）を使って1％アガロースゲルからDNAを単離する。
【１２２０】
断片と脱リン酸化したプラスミドとをT4 DNAリガーゼで一つにライゲートする。大腸菌HB101または他の適切な大腸菌宿主、例えばXL-1 Blue細胞（Stratagene Cloning Systems,カリフォルニア州ラホーヤ）などを、ライゲーション混合物で形質転換し、培養プレートに広げる。個々のコロニーから得たDNAを消化し、消化産物をゲル電気泳動で解析することによって、上記プラスミドを含む細菌を同定する。クローン化された断片の配列は、DNA配列決定によって確認する。
【１２２１】
Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),84:7413-7417(1987)に記載のリポフェクション法を使って、上記ポリヌクレオチドを含むプラスミド5μgを、市販の線状バキュロウイルスDNA（「BaculoGold（商標）バキュロウイルスDNA」,Pharmingen,カリフォルニア州サンディエゴ）1.0μgと同時にトランスフェクトする。1μgのBaculoGold（商標）ウイルスDNAと5μgのプラスミドとを、50μlの無血清グレース培地（Life Technologies Inc.,メリーランド州ゲーサーズバーグ）が入っているマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、リポフェクチン10μlとグレース培地90μlを加え、混合し、室温で15分間インキュベートする。次に、血清を含まないグレース培地1mlが入っている35mm組織培養プレートに接種したSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に、上記トランスフェクション混合物を滴下する。次に、そのプレートを27℃で5時間インキュベートする。次に、トランスフェクション溶液をプレートから取り除き、10％ウシ胎児血清を添加したグレース昆虫培地1mlを加える。次に、培養を27℃で4日間続ける。
【１２２２】
4日後に上清を集め、SummersおよびSmith（前掲）に記載されているように、プラークアッセイを行なう。青色のプラークを生じるgal発現クローンの同定と単離が容易になるように「Blue Gal」（Life Technologies Inc.,ゲーサーズバーグ）を含むアガロースゲルを使用する（このタイプの「プラークアッセイ」に関する詳細な説明は、Life Technologies Inc.（ゲーサーズバーグ）が配布している昆虫細胞培養とバキュロウイルス学に関するユーザーズガイドの9-10頁に記載されている）。適当なインキュベーション後に青色プラークをマイクロピペッター（例えばエッペンドルフ）の先端で拾う。次に、組換えウイルスを含有するその寒天を、200μlのグレース培地が入っている微量遠心管で再懸濁し、組換えバキュロウイルスを含有するその懸濁液を使って、35mmディッシュに接種したSf9細胞を感染させる。4日後に、これら培養皿の上清を収集し、4℃で保存する。
【１２２３】
ポリペプチドの発現を確認するために、10％熱不活化FBSを添加したグレース培地でSf9細胞を生育する。その細胞を、上記ポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに約2の感染多重度（「MOI」）で感染させる。6時間後に培地を除去し、メチオニンおよびシステインを欠くSF900II培地（Life Technologies Inc.,メリーランド州ロックビルから入手可能）に置換する。42時間後に5μCiの35S-メチオニンおよび5μCiの35S-システイン（Amershamから入手可能）を加える。細胞をさらに16時間培養した後、遠心分離によって収集する。上清中のタンパク質および細胞内タンパク質をSDS-PAGEと、それに続くオートラジオグラフィー（放射性標識した場合）によって解析する。
【１２２４】
精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定を使って、産生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定してもよい。
【１２２５】
実施例16  哺乳類細胞におけるポリペプチドの発現
本発明のポリペプチドは哺乳類細胞中で発現させることができる。典型的な哺乳類発現ベクターは、mRNAの転写の開始を媒介するプロモーター要素、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含有する。他の配列には、エンハンサー、コザック配列、およびRNAスプライシングの供与部位と受容部位とに挟まれた介在配列などがある。効率の高い転写は、SV40の初期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えばRSV、HTLVI、HIVIなどの長末端反復（LTR）、およびサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモーターを使って達成される。しかし細胞要素（例えばヒトアクチンプロモーター）を使用することもできる。
【１２２６】
本発明の実施に使用する適切な発現ベクターとしては、例えばpSVLおよびpMSG（Pharmacia,スウェーデン・ウプサラ）、pRSVcat（ATCC37152）、pSV2dhfr（ATCC37146）、pBC12MI（ATCC67109）、pCMVSport2.0およびpCMVSport3.0などのベクターが挙げられる。使用することができるであろう哺乳類宿主細胞には、例えばヒトのHela、293、H9およびJarkat細胞、マウスのNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞などがある。
【１２２７】
あるいは、本ポリヌクレオチドが染色体に組み込まれている安定細胞株中で、本ポリペプチドを発現させることもできる。dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシンなどの選択可能マーカーとの同時トランスフェクションにより、トランスフェクトされた細胞の同定および単離が可能になる。
【１２２８】
コードされているタンパク質を大量に発現させるために、導入された遺伝子を増幅することもできる。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、数百コピー、さらには数千コピーもの目的遺伝子を保持する細胞株を開発するのに役立つ（例えばAlt,F.W.ら,J.Biol.Chem.,253:1357-1370(1978)；Hamlin,J.L.およびMa,C.,Biochem.et Biophys.Acta,1097:107-143(1990)；Page,M.J.およびSydenham,M.A.,Biotechnology 9:64-68(1991)を参照されたい）。もう一つの有用な選択マーカーは酵素グルタミンシンターゼ（GS）である（Murphyら,Biochem J.227:277-279(1991)；Bebbingtonら,Bio/Technology 10:169-175(1992)）。これらのマーカーを使用して、哺乳類細胞を選択培地中で生育し、最も高い耐性を持つ細胞を選択する。それらの細胞株には増幅された遺伝子が染色体に組み込まれている。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞とNSO細胞は、しばしばタンパク質の生産に使用される。
【１２２９】
本明細書に概説するプロトコールに従って、本発明のポリヌクレオチドを増幅する。タンパク質の生産に天然のシグナル配列を使用する場合、ベクターは第2のシグナルペプチドを必要としない。もう一つの選択肢として、天然のシグナル配列を使用しない場合は、異種シグナル配列を含むようにベクターを改変することができる（例えばWO96/34891を参照されたい）。市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.,カリフォルニア州ラホーヤ）を使って、1％アガロースゲルから増幅断片を単離する。次に、断片を適当な制限酵素で消化し、再び1％アガロースゲルで精製する。
【１２３０】
次に、増幅断片を同じ制限酵素で消化し、1％アガロースゲルで精製する。次に、単離した断片と、脱リン酸化したベクターとを、T4 DNAリガーゼで一つにライゲートする。次に、大腸菌HB101またはXL-1 Blue細胞を形質転換し、プラスミドpC6に挿入された断片を含む細菌を、例えば制限酵素解析を用いて同定する。
【１２３１】
活性なDHFR遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換に使用する。5μgの発現プラスミドを、リポフェクチン（Filgnerら,前掲）を使って、0.5μgのプラスミドpSVneoと同時トランスフェクトする。プラスミドpSV2-neoは優性選択可能マーカー、G418を含む抗生物質群に対する耐性を付与する酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子を含有する。1mg/mlのG418を添加したアルファ-MEMに細胞を接種する。2日後に、細胞をトリプシン処理し、10、25または50ng/mlのメトトレキセートと1mg/mlのG418とを添加したハイブリドーマクローニングプレート（Greiner,ドイツ）中のアルファ-MEMに接種する。約10〜14日後に、単クローンをトリプシン処理し、次に様々な濃度のメトトレキセート（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM）を使用して、6ウェルペトリ皿または10mlフラスコに接種する。次に、最も高いメトトレキセート濃度で生育するクローンを、さらに高濃度のメトトレキセート（1μM、2μM、5μM、10mM、20mM）を含む新しい6ウェルプレートに移す。同じ操作を100〜200μMの濃度で生育するクローンが得られるまで繰返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えばSDS-PAGEとウェスタンブロットとによって、または逆相HPLC分析によって分析する。
【１２３２】
実施例17  タンパク質融合物
本発明のポリペプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これらの融合タンパク質は様々な用途に使用することができる。例えば、Hisタグ、HAタグ、プロテインA、IgGドメイン、およびマルトース結合タンパク質への本ポリペプチドの融合は、精製を容易にする（本明細書の実施例参照：EP A 394,827；Trauneckerら,Nature 331:84-86(1988)も参照されたい）。また、IgG-1、IgG-3およびアルブミンへの融合は生体内半減期を増加させる。本発明のポリペプチドに融合された核局在化シグナルは、そのタンパク質を特定の細胞内位置に誘導することができ、共有結合したヘテロ二量体またはホモ二量体は、融合タンパク質の活性を増加または減少させることができる。融合タンパク質は、2以上の機能を持つキメラ分子を作り出すこともできる。最後に、融合タンパク質は、融合タンパク質の溶解度および/または安定性を、非融合タンパク質と比べて増加させることができる。上述したタイプの融合タンパク質はいずれも、IgG分子へのポリペプチドの融合を概説する以下のプロトコールに変更を加えることによって製造することができる。
【１２３３】
簡単に述べると、IgG分子のヒトFc部分は、下記の配列の5'および3'末端をまたぐプライマーを使って、PCR増幅することができる。これらのプライマーは、発現ベクター（好ましくは哺乳類発現ベクター）へのクローニングを容易にする便利な制限酵素部位も持つべきである。クローニングされるポリヌクレオチドには停止コドンは含まれないことに注意されたい。そうしなければ、融合タンパク質が産生されないことになる。
【１２３４】
タンパク質の生産には天然のシグナル配列を使用することができる（当てはまる場合）。もう一つの選択肢として、天然のシグナル配列を使用しない場合は、異種シグナル配列を含むようにベクターを改変することができる（例えばWO96/34891および/または前掲の米国特許第6,066,781号を参照されたい）。
ヒトIgG Fc領域：
GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACC
GTGCCCAGCACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC
AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCG
TGGTGGTGGACGTAAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC
GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC
AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG
GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCT
CCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC
CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGC
CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG
CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC
GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT
GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC
CGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT（配列番号76）。
【１２３５】
実施例18  ポリペプチドからの抗体の作製
本発明の抗体は様々な方法で製造することができる（「Current Protocols」第2章参照）。そのような方法の一例として、本発明のポリペプチドを発現させる細胞を動物に投与して、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導する。好ましい一方法では、タンパク質の調製物を調製し、それを精製して、天然の夾雑物を実質的に含まないようにする。次に、より比活性の高いポリクローナル抗血清を産生させるために、そのような調製物を動物に導入する。
【１２３６】
最も好ましい方法では、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはそのタンパク質結合性断片）である。そのようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使って製造することができる（Koehlerら,Nature 256:495(1975)；Koehlerら,Eur.J.Immunol.6:511(1976)；Koehlerら,Eur.J.Immunol.6:292(1976)；Hammerlingら「Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas」（Elsevier,ニューヨーク,1981）の563〜681頁）。一般に、このような手法では、ポリペプチドによる、より好ましくはポリペプチド発現細胞による、動物（好ましくはマウス）の免疫が行なわれる。そのような細胞は任意の適当な組織培養培地で培養してよいが、細胞は、10％ウシ胎仔血清（約56℃で不活化したもの）ならびに約10g/lの非必須アミノ酸、約1,000U/mlのペニシリンおよび約100μg/mlのストレプトマイシンを添加したアール変法イーグル培地で培養することが好ましい。
【１２３７】
上記マウスの脾細胞を摘出し、適当な骨髄腫細胞株と融合する。本発明では任意の適切な骨髄腫細胞株を使用することができるが、ATCCから入手できる親骨髄腫細胞株（SP2O）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をHAT培地中に選択的に維持し、次に、Wandsらが記載しているように（Gastroenterology 80:225-232(1981)）、限界希釈法によってクローン化する。次に、そのような選択によって得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、本ポリぺプチドを結合する能力を持つ抗体を分泌するクローンを同定する。
【１２３８】
別法として、本ポリペプチドに結合することができる抗体は、抗イディオタイプ抗体を用いる二段階法で製造することもできる。そのような方法では、抗体自体が抗原であり、それゆえに第二の抗体に結合する抗体を得ることができるという事実を利用する。この方法では、タンパク質特異抗体を使って、動物、好ましくはマウスを免疫する。次に、そのような動物の脾細胞を使ってハイブリドーマ細胞を作製し、そのハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、上記タンパク質特異抗体に結合するというその能力を本ポリペプチドによって遮断することができる抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体は、上記タンパク質特異抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、動物を免疫してさらなるタンパク質特異抗体の形成を誘導するために使用することができる。
【１２３９】
本発明の抗体のFabおよびF(ab')2断片ならびに他の断片を本明細書に開示する方法に従って使用できることは理解されるだろう。そのような断片は通例、パパイン（Fab断片を製造する場合）やペプシン（F(ab')2断片を製造する場合）などの酵素を使って、タンパク質分解的切断によって製造される。別法として、タンパク質結合性断片は、組換えDNA技術の応用によって、または合成化学によって製造することもできる。
【１２４０】
ヒトでの抗体の生体内使用には「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましいかもしれない。そのような抗体は、上述のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子コンストラクトを使って製造することができる。キメラ抗体の製造方法は当技術分野では知られている（概観するには、Morrison,Science 229:1202(1985)；Oiら,BioTechniques 4:214(1986)；Cabillyら,米国特許第4,816,567号；Taniguchiら,EP171496；Morrisonら,EP173494；Neubergerら,WO8601533；Robinsonら,WO8702671；Boulianneら,Nature 312:643(1984)；Neubergerら,Nature 314:268(1985)を参照されたい）。
【１２４１】
さらに、もう一つの好ましい方法として、本発明のポリペプチドに対する抗体を植物内で産生させてもよい。具体的方法は、米国特許第5,959,177号および第6,080,560号に開示されており、これらの特許は参考文献としてそのまま本明細書に組み込まれる。これらの方法は、抗体を発現させる方法を記載しているだけでなく、外来の多量体型タンパク質（すなわち抗体など）を植物内で組み立てて、植物からそのような抗体を分泌させる手段も記載している。
【１２４２】
実施例19  小胞体における凝集の制御によるタンパク質発現の調節
ここで詳しく説明するように、タンパク質は、高等生物において、迅速な代謝変化から成長および分化まで、多様な細胞プロセスを調節している。特定タンパク質の産生量の増加は、ある種の疾患および/または疾患状態の予防に使用することができるだろう。したがってある生物における特定のタンパク質の発現を調整することができればかなり有益だろう。
【１２４３】
誘導性プロモーター、構成的に活性なプロモーター、または内因性プロモーターの制御下にある外来遺伝子を生物に導入する方法は、現在までに数多く開発されている。特に興味深いのは誘導性プロモーターである（M.Gossenら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,89:5547(1992)；Y.Wangら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:8180(1994),D.No.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346(1996)；およびV.M.Riveraら,Nature Med,2:1028(1996)、ならびに本明細書の他の箇所に開示する他の例を参照されたい）。一例として、エリスロポエチン（Epo）の遺伝子がマウスおよび霊長類に導入され、小分子発現誘導因子（例えばテトラサイクリンまたはラパマイシン）の制御下に置かれた（D.Bohlら,Blood,92:1512(1998)；K.G.Rendahlら,Nat.Biotech,16:757(1998)；V.M.Riveraら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:8657(1999)；およびX.Yeら,Science,283:88(1999)参照）。このようなシステムでは、誘導剤（すなわちテトラサイクリン、ラパマイシンなど）の添加により、その生物内で、目的遺伝子を効率よく誘導することができるが、その発現レベルは24時間でピークに達し、4〜14日後にはバックグラウンドレベルまで低下する傾向がある。したがって、制御された一過性発現はこれらの系では事実上不可能であるが、そのような制御は望ましいだろう。
【１２４４】
導入遺伝子（すなわち安定トランスフォーマントおよび一過性トランスフォーマントを含む）からのタンパク質の遺伝子発現レベルを制御する新しい代替方法が最近解明された（V.M.Riveraら,Science,287:826-830(2000)）。この方法は上述の系のようにmRNAレベルで遺伝子発現を制御しない。そうではなくて、この系は、活性な分泌型のタンパク質のレベルを制御する。誘導剤が存在しない状態では、タンパク質はER内で凝集し、分泌されない。しかし、誘導剤を添加すると、タンパク質の解離と、それに続いてERからの分泌が起こる。このような系では、低い基礎分泌量、誘導剤の存在下では迅速な高レベル分泌、そして誘導剤を除去すると迅速な分泌の停止が可能である。実際、タンパク質分泌は誘導後30分以内に最大レベルに到達し、誘導剤を除去すると1時間以内に分泌が素早く停止した。この方法は、膜タンパク質の産生レベルの制御にも応用することができる。
【１２４５】
詳細な方法はV.M.Riveraら,Science,287:826-830（2000）に記載されているが、簡単に述べると以下の通りである。
【１２４６】
本発明のポリヌクレオチド配列と、リガンド可逆的に（すなわち誘導剤の存在下で）自分自身と相互作用するドメインである1コピー以上（好ましくは少なくとも2、3、4コピー以上）の条件付き凝集ドメイン（conditional aggregation domain；CAD）とを使用し、当技術分野で知られる、また本明細書の他の項で論じる分子生物学的方法を使って、融合タンパク質コンストラクトを作製する。CADドメインは、ヒトFKBP12（Phe36→Met）タンパク質（V.M.Riveraら,Science,287:826-830,(2000)に開示されているもの）または同様のリガンド可逆的自己凝集特性を持つドメインを有する他のタンパク質から単離される突然変異型ドメインとすることができる。設計の原則として、融合タンパク質ベクターは、本発明のポリヌクレオチドとCADドメインの間に作動可能な形で連結されたフューリン切断配列を含むだろう。そのような切断部位により、ERから分泌された後、トランスゴルジに進入した時に、CADドメインの本発明のポリペプチドからのタンパク質分解的切断が可能になるだろう（J.B.Denaultら,FEBS Lett.,379:113,(1996)）。あるいは、代用する配列が内因的（例えばフューリン配列）または外因的（例えば分泌後、精製後、製造後など）に切断可能である限り、フューリン配列の代わりに任意のタンパク質加水分解的切断配列を使用できることは、当業者には理解されるだろう。融合タンパク質コンストラクトの各特徴の好ましい配列は、各特徴が他の特徴に作動可能な形で連結された状態で5'から3'の方向に、プロモーター、シグナル配列、(CAD)xドメインの「X」数、フューリン配列（または他のタンパク質分解配列）、および本発明のポリペプチドのコード配列だろう。プロモーターおよびシグナル配列が、他の配列とは独立して、本発明の内因性プロモーターまたはシグナル配列であるか、または異種シグナル配列およびプロモーターでありうることは、当業者には理解されるだろう。
【１２４７】
ER凝集の制御によるタンパク質分泌レベルの制御に関して本明細書に記載する具体的方法は限定を意図するものではなく、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（その変異体、ホモログ、オルソログ、および断片を含む）のいずれにも一般に適用できるだろう。
【１２４８】
実施例20  本発明のポリペプチドの特徴を向上させるためのタンパク質グリコシル化部位の改変
多くの真核細胞表面およびタンパク質は翻訳後プロセシングを受けて、N結合型およびO結合型糖質が組み込まれる（KornfeldおよびKornfeld（1985）Annu.Rev.Biochem.54:631-64；Rademacherら（1988）Annu.Rev.Biochem.57:785-838）。タンパク質グリコシル化は、例えばタンパク質フォールディングの強化、タンパク質凝集の阻害、細胞小器官への細胞内輸送の調節、タンパク質分解に対する耐性の増加、タンパク質抗原性の調整、および細胞間接着の媒介などを含む様々な機能を果たすと考えられる（FieldlerおよびSimons（1995）Cell,81:309-312；Helenius（1994）Mol.Biol.Of the Cell 5:253-265；Oldenら（1978）Cell,13:461-473；Catonら（1982）Cell,37:417-427；AlexamnderおよびElder（1984）Science,226:1328-1330；ならびにFlackら,(1994),J.Biol.Chem.,269:14015-14020）。高等生物の場合、グリコシル化の性質および程度は、受容体を介した取り込みおよびクリアランスが関わる機序により、タンパク質の循環半減期および生物学的利用能に著しい影響を及ぼしうる（AshwellおよびMorrell,(1974),Adv.Enzymol.,41:99-128；AshwellおよびHarford,(1982),Ann.Rev.Biochem.,51:531-54）。糖タンパク質上の様々な糖質構造の認識によって血清タンパク質のクリアランスに重要な役割を果たすと考えられる受容体系が同定されている（Stockert,(1995),Physiol.Rev.,75:591-609；Keryら,(1992),Arch.Biochem.Biophys.,298:49-55）。例えば、末端シアル酸残基の不完全な結合をもたらす製造方法は、糖タンパク質の生物学的利用能および半減期を短縮する手段になるかもしれない。逆に、末端シアル酸結合部位の飽和をもたらす発現方法は、タンパク質の生物学的利用能および半減期を長くするかもしれない。
【１２４９】
例えば医薬品として使用される組換え糖タンパク質の開発に際して、糖タンパク質の一次構造におけるグリコシル化部位の付加または欠失によって、組換えタンパク質の薬力学を調整することができると考えられていた（BermanおよびLasky（1985a）Trends in Biotechnol.,3:51-53）。しかし、研究の結果、N結合型グリコシル化部位の欠失はしばしば細胞内輸送を損ない、グリコシル化部位変異体の細胞内蓄積をもたらすことが報告された（MachamerおよびRose,(1988),J.Biol.Chem.,263:5955-5960；Gallagherら,(1992),J.Virology.,66:7136-7145；Collierら,(1993),Biochem.,32:7818-7823；Claffeyら,(1995),Biochemica et Biophysica Acta,1246:1-9；Dubeら,(1988),J.Biol.Chem.,263:17516-17521）。タンパク質のグリコシル化部位変異体を細胞内で発現させることはできるが、成長調整細胞培養培地から有用な量を回収することは困難であることが明らかになった。
【１２５０】
さらに、ある種におけるグリコシル化部位が、別の種のグリコシル化装置によってどの程度に認識されるかは、はっきりしない。グリコシル化はタンパク質代謝、特にタンパク質の分泌および/または発現に重要なので、グリコシル化シグナルが認識されるかどうかは、タンパク質が別の生物で内因的または組換え的に発現される能力（すなわち、大腸菌、酵母、またはウイルスにおけるヒトタンパク質の発現、またはヒトにおける大腸菌、酵母、またはウイルスタンパク質の発現）を、大きく決定しうる。したがって、タンパク質の機能、バイオプロセス精製および/または構造上の特徴（例えば本発明のポリペプチド）を改善するために、グリコシル化部位を付加、欠失または改変すること、そしておそらくは、ある種のグリコシル化部位を別の種のタンパク質に付加することが望ましいかもしれない。
【１２５１】
あるタンパク質内のグリコシル化部位の位置を特定するには、多くの方法を使用することができる。好ましい一方法は、翻訳されたタンパク質配列をPROSITEコンピュータプログラム（Swiss Institute of Bioinfomatics）にかけることである。グリコシル化部位が同定されたら、当技術分野で知られていて当業者が利用することのできる突然変異誘発法を使って、DNAレベルで、その部位を体系的に欠失させるか、または損なうことができるだろう。好ましくはPCRによる突然変異導入法を使用する（Maniatis「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Press,ニューヨーク州コールドスプリング（1982）参照）。また、同様の方法、好ましくはPCR法を使って、グリコシル化部位をDNAレベルで付加または改変することもできるだろう（前掲のManiatis参照）。次に、特定のタンパク質に関してグリコシル化部位を改変した結果（例えば溶解度、分泌能、活性、凝集、タンパク質分解耐性など）を、当技術分野で知られる方法を使って解析することができるだろう。
【１２５２】
当該分野の当業者は、タンパク質内のグリコシル化部位の位置を予想することができる他のコンピュータアルゴリズムの存在を認めるであろう。例えば、該モチーフコンピュータプログラム（ジェネティックスコンピュータグループサイトのプログラム）は、同様に本機能を与える。
【１２５３】
実施例21  本発明の生物学的活性/機能上の特徴を分子進化法によって強化する方法
生物学的に最も活性な既知タンパク質の多くは、ある生物内で、それぞれ所定の機能に関して著しく有効であるが、それらを遺伝子導入、治療および/または工業的応用には望ましくないものにするような特徴を持つことも多い。これらの特徴のなかでも、短い生理学的半減期は最も顕著な問題であり、この問題はタンパク質のレベルまたはタンパク質mRNAのレベルで存在する。例えば半減期を延ばしうることは、例えば遺伝子治療におけるタンパク質の使用、トランスジェニック動物の作出、タンパク質のバイオプロセスによる製造および精製、ならびに化学調整物質としてのタンパク質の使用などにとって、とりわけ重要だろう。したがって、動物起源の疾患を処置するための治療薬としてのそれらの実用性ならびに一般の工業的および医薬的用途へのタンパク質の利用可能性を増す特徴を有する、単離されたタンパク質の新規変異体を同定する必要がある。
【１２５４】
したがって本発明の一側面は、方向付けられた分子進化によって特定の本発明特徴を強化できることに関する。そのような強化は、例えば、キットの必須成分としての本発明の有用性、本発明の物理的属性、例えば溶解度、構造、またはコドン最適化、本発明の特定の生物学的活性、例えば付随する酵素活性、タンパク質の酵素反応速度、タンパク質のKi、Kcat、Km、Vmax、Kd、タンパク質-タンパク質活性、タンパク質-DNA結合活性、アンタゴニスト/阻害活性（直接的または間接的相互作用を含む）、アゴニスト活性（直接的または間接的相互作用を含む）、タンパク質の抗原性（例えばタンパク質の抗原性を増加または減少させることが望ましい場合）、タンパク質の免疫原性、自分自身とまたは他のタンパク質と二量体、三量体または多量体を形成するタンパク質の能力、本発明の抗原としての有効性、例えば疾患または疾患状態の予防的処置における使用または患部遺伝子をターゲットにするためのエフェクターとしての使用にとって有益だろう。さらに、タンパク質の特定の特徴を強化できることを応用して、特徴付けられた酵素の活性を、最初に特徴付けられた活性とは完全に無完全な活性に変化させることもできるだろう。他の望ましい本発明の強化は個々のタンパク質に特有であり、当技術分野では周知であって、本発明に包含されるだろう。
【１２５５】
例えば、操作されたホスファターゼは常時活性であり得る。あるいは、操作さ苣龁菣릂菣ꆂ苣벃苣꾁鿥ꪳ臣꺁뗧袐臣ꪁ臣뒠郥ꮁ臣뢸駦뮴胦ꞁ臣誂뻥讂胣뒛臣讂裥꺁뻤ꮁ臣蒁臣膀鏦鲽臣貂臣鮃苣閃苣뾂菣벂臣鮃苣閃苣뾂菣벂듦Ꞁ賥袼뻤袁臣膀菣겂菣覃臣꺁뗧袐胣ꪃ菣뢅賥膀藩Ꞻ臣覤賥ꪁ臣覼臣뢅黥蒚臣薿ꛨꪁꫨ肯鯥邭臣袂臣込臣龁臣ꆝ믤貁藥ꚁ迦辂臣辁臣节듦Ꞁ賥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀鏦鲽臣貂臣鮃苣閃苣뾂菣벂臣膀铦覤臣貂臣몟돨릉闧Ꞁ苣覜臣鞾苣芀臣貂苣鮃苣閃苣뾂菣벂臣뺁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨馁苣隻臣뾽铧꺁룤ꞁ苣膀菣릂菣ꆂ苣벃苣ꊃ苣ꖃ菣벃苣벃苣貐껥馁苣龁苣꺁苣꾂菣벃菣뎃苣ꮁ臣蒁臣覜铧ꞁ臣趂臣芀戼㹲邀볯銼볯隼胣㲑牢ਾ雦醐믤醁苣貂臣늀賥꾁闦릂菣莃菣讁苣讧裦閁苣讂胣肜裥꺁苣蚃菣鞃臣膀裨뎑臣讂臩鶼귥뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨ꮁ臣蒁臣覤闧鎽臣ꦃ苣隃菣ꪃ菣銂뷤붣臣讂臣ꢁ臣芁苣芀곦ꮁ胣肜苣趇ꛨꪁ苣蚃菣鞃臣膀郥骮臣袂臣ꢁ臣讂듦Ꞁ苣몤臣覤闧鎽苣뢁諦馁苣鎁臣ꞁ臣讂胣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣궨꣨꾁ꗦ膂臣趇ꛨꞁ臣讂胣ꢁ臣蚁臣节胣鶁臣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣膀鳦ꢔ臣ꪁ臣覤闧鎽苣膍裥ꮁ軦꒙臣趁苣뮁臣ꮁ臩麊髧ꞁ臣醁苣낁臣覂臣蒁臣膀藥ꚁ臣覤闧鎽苣銎駩鞁臣鞁臣蚁臣ꦁ苣袃菣뎃苣Ꞃ菣袃臣芁臣ꚁ臣ꪁ苣ꪁ臣讁苣ꞁ臣讂胣ꆬ臣膀鳦貾臣릂菣莃菣꾁胣袅臣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣鞾臣肜臩ꪁꓥ낕뷤銂뷤ꎁ臣膀룤風臣릂菣莃菣銂맧誂뿨馁臣ꢁ臣芁苣芀臣꺁髩膀胩骶臣ꚁꇨꪁ苣貂苣蒐苣ꒂ苣ꮃ臣膀뻤袁臣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣릂菣ꪃ菣뢂苣뎃苣벃苣鞢諥閁臣讂臣ꦁ胣薿ꛨꮁ뿥颁臣ꂊ럥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀戼㹲邀볯銼볯鞼胣㲑牢ਾꯩ蚈귥ꮁꫧ뚄ꓥ낕苣躰藥馁苣릖돦꾁胣랕맥ꮁ苣龁臣ꚁ胣낕ꓥ辁雩몙臣貂臣趁臣芀臣貂苣꺁雦閳臣肸菩ꮁ臣膀菣뎃菣ꂃꫧ뚄ꓥ낕胣貀苣ꦃ菣鞃菣벃菣趀䍐膀賥ꚭ髧膪蓧覤闧颪駧膀菩趽賦骮ꫧ뚄ꓥ낕ꫨ몙胣誁苣뎁뷥肊ꇨ蚈蟩ꞁ釥ꖟ臣隻臣릖돦貁郥뺁苣讂볯肜雦꺁ꫧ뚄ꓥ낕ꫨ몙돦ꮁ雩馁苣薌详蒚臣肸ꛨꮁ臣蒁臣꾁慍楮瑡獩胣䶌汯捥汵牡䌠潬楮杮䄺䰠扡牯瑡牯⁹慍畮污胣䎍汯⁤灓楲杮䠠牡潢⁲牐獥ⱳ菣ꖃ菣ꢃ菣꾂럥뎂菣ꮃ菣릂菣ꪃ菣낂ㄨ㠹⤲苣芏藧閁苣龁臣覼胣骀뻤膀臣꺁苣蚁臣릖돦꾁胣设臣낁苣뎃菣꾂돨꺁룤莿髧龩菨颠鿥뺁臣꾁苣뎃菣꾂돨꺁觧骮菣ꆃ苣뎃臣龩菨袼菣ꮃ菣覃菣ꒂ菣뾂菣醃苣ꪳ臣뒠郥覼苣貐껥馁苣龁苣꺁菣벃菣ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣貂臣趁臣芀臣讁臣膀臣貂苣꺁雦閳臣肜뿨膀觧誮臣뺁臣꾁볥隌臣貂臣릉뻥銂賦ꒁꯩ蚈귥覤闧鎽臣貐껥ꮁ뿥ꢔ臣貂苣袂臣ꮁ臣ꎁ臣芀戼㹲邀볯銼볯颼胣㲑牢ਾ菣뎃菣ꂃꫧ뚄ꓥ낕ꫨ몙돦꾁믤뺁臣ꮁ鳦节뫥辁迥ꖅ苣覂苣ꚁ臣讂雦閳臣芁苣芀胩设胣鎁苣꾁胣貀苣ꦃ菣鞃菣벃菣趀䍐袼潍牯ⱥ⹊苣ⲉ慎畴敲䈠潩整档潮潬祧ㄠ㨴㔴ⰸㄨ㤹⤶臣風볨閁苣ꚁ臣讂雦閳볯膀臣龁臣袈釥芁苣릉껥颠鿥ꮁ꿥鲿臣讂菣뎃菣ꂃ臣袐裦ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃臣ꦁ铧袼敄扲獹楨敲䬬䴮覂䜬湥ⱥ㘴ㄺ㔴ㄭ㈵⠬㤱㘸Ⱙ臣袂臣䢳汩ⱬ䕄苣ⲉ敍桴摯⁳湅祺潭⹬㔬㨵㔵ⴹ㘵ⰸㄨ㠹⤷臣風볨閁苣ꚁ臣讂雦閳볯ꮁ苣ꎁ臣財臣辂苣ꚁ臣龁胣ꦁ臣覂臣ꊂ菣궃菣膃臣节胣钁裦馁苣鎁臣貁臣趁苣膪蓧覤闧颪駧꺁菣馃菣ꮁ裥邙臣芁苣芀臣讁臣膀臣ꆁ苣꺁苣鞃菣벃菣ꞁ苣膀ꃧ뚩胨꾁胣膪蓧覤闧颪駧螎苣릊黦蒚臣뚈뻥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀藩ꂴ臣뮴胦ꮁ臣ꎁ臣覜鯧ꪁꫧ뚄ꓥ낕臣讁臣誂꣧ꞁ臣讂臣蒁臣论껥銂胨꺅臣讂臣膀臣貂臣膀臣誂苣醁蟩膦臣芁苣芀껥鮚胣뾽铧馁苣膪蓧覤闧颪駧꺁菣馃菣貁ꯩ馁臣讂臣膀鳦ꢔ臣膪蓧覤闧꺁鳦뺁臣蒁裥誛臣뮘귦뺁臣꾁飩뎮臣貂臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯閼볯醀戼㹲誸뿨꺁雦閳臣ꦃ菣肃菣ꪁꯩ蚈귥覤闧鎽臣鞃菣ꮃ苣鲽ꏨ馁苣꺁臣ꦁ臣覂苣覜諥ꞁ臣讂臣膀胣䒌䅎苣ꎃ菣ꪃ菣낂胣뺁臣꾁胣뮂苣랂菣ꮃ䍐袼敳畸污倠剃볯趀볯垈䍐匬整浭牥倬䅎ⱓㄹㄺ㜰㜴⠬㤱㐹覼臣벑臣貂苣견꺁雦閳臣躘苣讁臣閁苣龁胣䒂䅎苣ꎃ菣ꪃ菣낂臣貀雦醐믤醁苣貂臣蚈귥늀賥趀胣ꢂ苣붂菣랂菣閃菣뎃苣趀胣릖郥颻臣覂苣龁藩ꂴ胩隌胣貀苣뎃菣袃菣늀賥趀臣袂臣貀뫤ꖷ髧늀賥趀臣节釥낁苣ꚁ臣讂胣鶁臣袂臣ꪁ迥ꞅ郥꾁뷥肊ꇨ蚈蟩ꞁ臣ꖟ苣貂臣誁苣膀鳦몙飦ꞁ苣뾽铧馁苣芀臣꺁雦鞁臣붥臣鞁臣릖돦꾁胣邵黦ꢁ臣ꚁ铧颁苣邭귥ꮁ觨蒁觧뒾臣鶼臩閁苣讂臣醁臣ꪁ臣膀臣貂臣貐駦ꮁ胣꾉臣ꪁ臣릉뻥貁軦꒙臣貂苣ꢁ臣蚁苧ꞁ胣誻臣ꞁ臣릖돦꺁駩貕臣讅鳦閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣芁苣芀戼㹲邀볯銼볯邼胣㲑牢ਾ乄랂菣閃菣뎃苣꾁胣ꒂ菣鎃菣궃뗧鮏臣꺁軥蚐苣貀苣ꦃ菣鞃菣벃菣趀䍐꺁雦閳臣蒵臣袐苣鮁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀臣꺁ꫨ財苣钁裦馁苣芀鿥겜髧ꮁ臣膀乄苣벃苣䦼뛦隌臣袂臣ꚁ铧邈臣讂菣뎃菣ꂃ臣袶賥閁苣龁꿥ꆱ臩鶼귥꺁냥궖觧꺁菣벃菣讁苣몇駧鞁胣鶁臣ꦃ菣肃菣궖觧銂胣ꢂ菣벃菣궃菣뎃胣傍剃苣뮂菣隃菣벃迥鲿臣躰藥馁苣芀䍐趏뿥궸臣膀菣뎃菣ꂃ臣떂苣몂臣䒮䅎雦螉臣鶁臣뎂苣趃苣袃軩ꮁ菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣馁苣ꂁ臣ꞁ臣辁胣袈釥芁苣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁闧ꪁ苣颠鿥銈菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃藥鎽臣较苣隃菣肃菣벂菣랂菣뎃臣꾁胩设軦醿臣趁臣蒁ꃩ龟裢ꮁ鯧鎽臣讂믤꺁乄궖觧ꮁ苣较苣隃菣肃苣몂臣蚁苣芀臣覂臣膀臣꺁䍐ꊂ苣뎃菣ꪃ菣趏뿥ꮁ臣貀苣ꦃ菣鞃菣벃菣趀䍐趏뿥ꆝ믤銂뷤ꢔ臣讂臣ꞁ胣芁苣蚂苣궖觧ꮁ雩鞁臣膀䍐趏뿥꺁乄袐裦릂菣莃菣궸臣ꦃ菣肃菣ꪁꫧ뚄ꓥ낕臣躰藥閁苣膀迥鲿臣ꊂ菣벃菣뎃苣릂菣莃菣궸臣鲽鳥蒚菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣ꢃ뷤貁臣覂臣骤꟦ꮁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯隼볯醀戼㹲䐊䅎苣ꎃ菣ꪃ菣낂迥鲿臣龮ꇨꮁ臣膀꟦薀臣趏뿥ꆝ믤銂裥ꢔ臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂臣趂臣貁胣设臣낁乐十㤬㨱〱㐷ⰷㄨ㤹⤴臣꾁胣䒁䅎苣ꎃ菣ꪃ菣낂臣랅뷤蒚迥鲿鷦뚻臣風볨閁苣ꚁ臣讂胣鎁苣銂믤许臣ꆰ跥ꮁ뿨릁苣芀戼㹲邀볯銼볯銼胣㲑牢ਾ乄랂菣閃菣뎃苣趏뿥ꮁ臣醁苣䒋䅎鿥ꪳ苣뾪ꏨ馁苣芀ꫨ붣臣膀럦ꖅ臣ꚁ臣讂듧麃觧ꪳ胣隌귥ꦉ돨膀菣莃菣ꆂ菣膀苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣鞃菣ꒂ菣벃胣螃苣궂苣貃苣것苣膃菣膀乒ꪁ臣讁苣颍臣䒫䅎苣뺲ꏨ馁苣ꊽ臣芁臣ꚁ苣辁胣设臣낁楑条湥䤬据蒂牐浯来ⱡ潃灲ꪁ臣貁단늣臣ꚁ臣讂苣蚁臣䒪䅎닧붣苣莃菣꺁뷤ꢔ苣뒼臣ꚁ苣袂臣芀戼㹲邀볯銼볯鎼胣㲑牢ਾ乄몟돨銂닧붣臣龁苣膀臣貂苣䒒ꊂ菣벂袶賥ꮁ臣醁苣芀듧㊄胣㒜볎꺁乄몟돨銂츱沼臣龁苣り〮㄰颍뷤꺁乄苣벃苣䦼볯厈杩慭볯ꞁ胣ㆁ〰볎꺁〵䵭菣ꪃ苣ꦡ藩袼䡰⸷覼ㄯ䵭䴠䍧㱬畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯扵궸胣꒮룦ꞁ胣ㆁ鲀〲裥鎖뛦隌臣讂胣鞾苣貂臣㆟鲀〵灢臣궖觧꾁胣䒁㡅ꒂ苣뎃뫤鮏菣벃菣벃볯垈慨浴湡覼臣꺁鯩鞰돦開臣袂臣ꚁ臣貂苣銂薼뷤趞苧ꊂ苣궃菣릂苣ꮃ臣骀臣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣뺲ꏨ馁苣讁胣ꦁ뷥ꪁ裥邭蟩ꮂ菣袃苣閃臣䶮捩潲潣莿룧ꢙ볯䆈業潣覼苣뾽臣ꚁ닧붣臣讂臣膀臣龁臣ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃닧붣苣ꦃ菣袼楑条湥볯銂뷤ꢔ臣讂臣膀뷥肊ꇨ蚈蟩ꞁ鿧覂苣讂믤꺁雦閳苣뾽铧馁苣鎁臣貁臣趁苣ꂁ苣蚁胣䒂㡅ꒂ苣뎃뫤鮏菣벃菣벃苣뾽铧馁苣뒠郥꾁胣鶁臣骃菣醃菣讁苣ㆉ⁍慎汃苣뾽臣ꚁ〱胣㖜戰궖觧銂뫦몇臣鮁臣貾胣ꢂ苣躃菣ꮃ닦뾮苣財臣蚁臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯隼볯醀戼㹲ꆬ臣膀뻥覂苣龁닧붣雦螉苣膀洲꺁郥撄呎膀⸲洲⁍杍汃猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㈾⼼畳㹢胣㖁洰⁍䍋膀〱䵭菣ꪃ苣ꦡ藩袼䡰⸹覼臣袂臣コㄮ볯袃菣袃菣墳ㄭ〰苣ꮐ苣傀剃럦袐觧銂〱胣㎜渰⽧볎꺁鳦芵뿦ꚺ臣趆蟦膿臣讂臣ꢁ臣袂苣膀䍐ꊂ苣뎃菣ꪃ菣趏뿥ꮁ臣醁苣芀臣꺁駦릂臣꾁菣ꦃ苣麃菣銂諥袁臣蒁胣㲂⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢慔㱱甯‾乄鶃菣ꆃ菣ꦃ苣袼牐浯来覼臣趏뿥랷郥ꦉ〱츰沼臣龁苣㊊㔮跥趽臣늉郥ꞁ뷤ꢔ臣讂胣傂剃菣궃苣ꦃ菣꾁㐹蓢ꞁ〶꟧鮼㐹蓢ꞁ〳꟧膀〵胣㖜莄臣㎧銧胣誁苣뎁㈷蓢ꞁ〳꟧銂〳胣㒜떂苣꾂菣鮼뛧蒁臣㞦莄臣㖧裥鎖胣䶂⁊敒慳牥档볯麃苣膃菣벃苣莃菣麷苣뎃菣ꪃ菣뢂볯傉䍔ㄭ〵苣벃菣떂苣꾂菣벃苣뾽铧芀苣뮂菣隃菣벃迥鲿臣貮뫤鞁臣貾胣鞾苣貂臣鞃菣ꒂ菣벃菣릂铧ꦉ臣ㆮ볯㒚貸蟩늶苣膀⸰甸꺁郥鞃菣ꒂ菣벃苣ꮐ苣傀剃럦袐觧袼苣뮂菣隃菣벃迥鲿臣뾽铧鞁臣节臣ꢁ郥颁菣莃菣ꆂ菣랷郥ꦉ苣뾽铧覼臣躰藥鞁胣鎁臣랷郥ꦉ苣㆒떂苣꾂菣꺁䍐袼㐹蓢ꞁ〳꟧膀〵蓢ꞁ〳꟧膀臣袂臣㞳莄臣㎧銧볯ꮁ臣醁苣芀臣鎁臣蒁臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀苣ꎃ菣ꪃ菣낂迥鲿臣ꦈ铧馁苣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁ꃦ뢅藩鞈臣뺯뿥馁苣鞃菣ꒂ菣벃臣芁苣芀臣꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣鎽諦鎡裥躇臣ꖟ苣貂臣誁苣겜飦내鯦ꞁ苣肨迥馁苣릖돦銂뷤ꎁ臣꺿ꏩ뢠藩ꦡ鿥뺯臣覂臣ꎁ臣节苣蒁臣膀뿨ꂊ臣超裥銂볯设臣낁裥邙菩趽胣膪蓧覤闧릉闧ꦡ鿥뺯臣ꦁ苣颻諥馁苣龁苣ꮁ볯ꮐ苣ꞁ苣袂臣ꂁ苣蚁胣㲂牢ਾ胣醼볯隼볯醀戼㹲邵黦ꢁ臣ꚁ뻥覂苣讂胣랂菣莃菣ꮃ臣貂胣ꊂ苣뎃菣ꮃ臣貂胣鞢맥閁苣龁铧ꦉ臣膀뷥肊ꇨ蚈蟩ꞁ釥ꖟ臣릖돦袼뻤袁臣冰慩敧⁮䍐뺲ꏨ궂菣袃볯銂뷤ꎁ臣뺲ꏨ鞁臣貾胣ꦁ뷥ꪁ裥邙藩ꂴ苣뾽臣ꚁ苣궃菣讃菣낂臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣醼볯隼볯醀戼㹲䐊䅎苣ꎃ菣ꪃ菣낂臣覤돦꾁믤뺁臣ꮁ闦骤臣겅ꇨ閁苣ꚁ臣讂臣膀臣꺁苣蚁臣覤돦꾁뷥궥胨ꮁ臣躘苣讁臣芁苣膀鳦몙飦ꮁ賥ꮐ臣貂苣芀乄랂菣閃菣뎃苣閳臣膀桚潡苣貁꣨覼臣龁雦閳볯予捵⁬捁摩删獥Ⱞ㔲㘨㨩㌱㜰ㄭ〳ⰸㄨ㤹⤷볯銂뷤ꎁ臣膀触鮜臣膪蓧覤闧颪駧것菣ꮃ臣袐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