(57)【要約】本発明は、メチオニンシンターゼmetH遺伝子をコードするヌクレオチド配列が発現される細菌を用いる発酵により、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを生産する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の硫黄含有ファインケミカルの発酵による生産方法であって、以下の工程：
a)  目的の硫黄含有ファインケミカルを産生するコリネ型細菌培養物を発酵させること、ただし、該コリネ型細菌はメチオニンシンターゼ（metF）活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列を発現するものであること、
b)  培地または細菌細胞中の硫黄含有ファインケミカルを濃縮すること、
c)  硫黄含有ファインケミカルを単離すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
硫黄含有ファインケミカルがL-メチオニンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
異種のmetFコードヌクレオチド配列が、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032株由来のmetFコード配列に対して100％未満の相同性を有する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記metFコード配列が以下の生物のいずれかに由来するものである、請求項3に記載の方法。
2005522218.tif 000260
【請求項５】
前記metFコード配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51もしくは53に示すコード配列、または、それに相同な、metF活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記metFコード配列がmetF活性を有するタンパク質をコードし、前記タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52もしくは54に示すアミノ酸配列、または、それに相同な、metF活性を有するタンパク質を表すアミノ酸配列を含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記コードmetF配列が、コリネ型細菌内で複製可能であるかまたは染色体に安定に組み込まれているDNAまたはRNAである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
a)  少なくとも1コピーのコードmetF配列を調節配列の制御下で担持するプラスミドベクターにより形質転換された細菌株を使用する、または
b)  コードmetF配列が細菌の染色体に組み込まれている細菌株を使用する、
請求項7に記載の方法。
【請求項９】
コードmetF配列が過剰発現される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、目的の硫黄含有ファインケミカルの生合成経路の少なくとも1つの別の遺伝子が増幅されているか、またはその活性が代謝的代謝産物によって影響されないように突然変異している細菌を発酵させる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
目的の硫黄含有ファインケミカルの生産を低下させる少なくとも1つの代謝経路が少なくとも部分的にスイッチオフされている細菌を発酵させる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
同時に、以下の遺伝子：
a)  アスパラギン酸キナーゼをコードするlysC遺伝子、
b)  グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap、
c)  3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk、
d)  ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc、
e)  トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi、
f)  ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA、
g)  シスタチオニンγ-シンターゼをコードする遺伝子metB、
h)  シスタチオニンγ-リアーゼをコードする遺伝子metC、
i)  セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA、
j)  O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY、
k)  ビタミンB12依存性メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH、
l)  ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC、
m)  ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB、
n)  セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE、および
o)  ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするhom遺伝子、
の中から選択される1つ以上の遺伝子が、過剰発現されるか、または、特に、対応するタンパク質の活性が、非突然変異タンパク質と比較して、影響されるにしてもより少ない程度に代謝的代謝産物によって影響されるように、突然変異しているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
同時に、以下の遺伝子：
a)  ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB、
b)  トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA、
c)  トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC、
d)  メソ-ジアミノピメリン酸D-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh、
e)  ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck、
f)  グルコース-6-リン酸6-イソメラーゼをコードする遺伝子pgi、
g)  ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB、
h)  ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA、
i)  ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB、および
j)  ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、
の中から選択される1つ以上の遺伝子が、発現率を変えることにより、または特異的な突然変異を導入することにより減衰されているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
コリネバクテリウム・グルタミカム菌種の微生物を使用する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
発酵ブロスからL-メチオニン含有動物飼料添加物を製造する方法であって、以下の工程：
a)  発酵培地においてL-メチオニン産生微生物を培養しかつ発酵させること、
b)  L-メチオニンを含有する発酵ブロスから水を除去すること、
c)  発酵中に形成された0〜100重量％のバイオマスを取り除くこと、および
d)  工程b)および／またはc)で得られた発酵ブロスを乾燥させて、所望の粉末または顆粒形態の動物飼料添加物を得ること、
を含んでなる方法。
【請求項１６】
請求項1〜14のいずれか1項に記載の定義に従う微生物を使用する、請求項15に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを、メチオニンシンターゼ（metH）遺伝子をコードするヌクレオチド配列を発現する細菌を用いて、発酵により製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチオニン、ホモシステイン、S-アデノシルメチオニン、グルタチオン、システイン、ビオチン、チアミン、リポ酸のような硫黄含有ファインケミカルは、細胞内で天然の代謝過程を経て生産されており、食品、動物飼料、化粧品、医薬品産業を含めてさまざまな産業分野で使用されている。これらの物質は集合的に「硫黄含有ファインケミカル」と呼ばれており、有機酸、タンパク質原性および非タンパク質原性のアミノ酸、ビタミンおよび補因子が含まれる。それらは、最も有利には、それぞれの場合に望まれる物質を大量に産生して分泌するように開発された細菌を培養することによって、大規模に生産される。この目的に特に適している生物は、非病原性のグラム陽性菌であるコリネ型（coryneform）細菌である。
【０００３】
アミノ酸がコリネ型の細菌株、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の発酵により製造されていることは公知である。その製造方法はきわめて重要であるため、絶えず改良が施されている。製造方法の改良は、発酵の技術的な面に関する対策（例えば、撹拌および酸素供給）、栄養培地の組成（例えば、発酵中の糖濃度）、産物を取得するための後処理（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）、あるいは微生物自体の固有の性能特性に関係している。
【０００４】
硫黄含有ファインケミカルの化合物群からの各種の望ましい化合物を産生するいくつかの突然変異株が、株選別により開発されている。突然変異誘発法、選別および突然変異体の選別を適用することで、前記微生物の性能特性を特定分子の生産に関して改良することができる。しかし、これは時間がかかり、しかも難しいプロセスである。この方法では、例えば、代謝拮抗物質または阻害剤（例えば、メチオニン類似体α-メチルメチオニン、エチオニン、ノルロイシン、n-アセチルノルロイシン、S-トリフルオロメチルホモシステイン、2-アミノ-5-ヘプレン酸（heprenoitic acid）、セレノメチオニン、メチオニンスルホキシイミン、メトキシン、1-アミノシクロペンタンカルボン酸）に耐性を示す菌株、または調節にとって重要な代謝産物に対して栄養要求性でありかつL-メチオニンのような硫黄含有ファインケミカルを産生する菌株が得られる。
【０００５】
また、個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅して、そのアミノ酸生産に及ぼす影響を調べることにより、L-アミノ酸を産生するコリネバクテリウム菌株を改良するために、ここ数年間にわたり組換えDNA技法が用いられている。
【０００６】
WO-A-02/10209には、少なくともmetH遺伝子が過剰発現されるL-メチオニン産生コリネ型細菌を用いてL-メチオニンを発酵生産するための方法、ならびにコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032株由来のmetHコード配列が開示されている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の簡単な説明
本発明の課題は、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの改良された発酵生産のための新規な方法を提供することである。
【０００８】
上記課題は、コリネ型細菌においてmetH活性を有するタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を発現させることを含む、硫黄含有ファインケミカルの発酵による生産方法を提供することにより達成されることが見出された。
【０００９】
本発明は、最初に、少なくとも1種の硫黄含有ファインケミカルの発酵による生産方法に関し、この方法は、以下の工程：
a)  目的の硫黄含有ファインケミカルを産生するコリネ型細菌培養物を発酵させること、ただし、該コリネ型細菌はメチオニンシンターゼ（metH）活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列を発現するものであること、
b)  培地または細菌細胞中の硫黄含有ファインケミカルを濃縮すること、
c)  硫黄含有ファインケミカル（好ましくは、L-メチオニンを含む）を単離すること、
を含んでなる。
【００１０】
上記のmetHをコードする異種ヌクレオチド配列は、好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032株由来のmetHコード配列に対して70％未満の相同性を有するものである。metHコード配列は表１に示す生物のいずれかに由来するものであることが好ましい。
【表１】
2005522218.tif 000002
【００１１】
ATCC: アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA）
PCC: シアノバクテリアのパスツール・カルチャー・コレクション（Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria. Paris France）
【００１２】
本発明に従って用いられるmetHコード配列は、好ましくは、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49もしくは51に示すコード配列、または、それに相同な、metH活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１３】
さらに、本発明に従って用いられるmetHコード配列は、好ましくは、metH活性を有するタンパク質をコードしており、前記タンパク質は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50もしくは52に示すアミノ酸配列、または、それに相同な、metH活性を有するタンパク質を表すアミノ酸配列を含んでなる。
【００１４】
前記のmetHコード配列は、コリネ型細菌内で複製可能であるかまたは染色体に安定に組み込まれるDNAまたはRNAであることが好ましい。
【００１５】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、
a)  少なくとも1コピーのmetHコード配列を調節配列の制御下で担持するプラスミドベクターにより形質転換された細菌株を使用すること、または
b)  metHコード配列が細菌染色体に組み込まれている細菌株を使用すること、
により実施することができる。
【００１６】
さらに、発酵のためにmetHコード配列を過剰発現させることが有利である。
【００１７】
また、目的の硫黄含有ファインケミカルの生合成経路、またはそれと関連した生合成経路もしくは他の代謝経路の少なくとも1つの別の遺伝子が増幅されている、および／または、目的の硫黄含有ファインケミカルの生産を低下させる少なくとも1つの代謝経路が少なくとも部分的にスイッチオフされている、そのような細菌を発酵させることが望ましい。
【００１８】
さらに、目的の硫黄含有ファインケミカルの生合成経路の少なくとも1つの別の遺伝子の活性が代謝的代謝産物によって不利に影響されない細菌を発酵させることが望ましい。
【００１９】
したがって、本発明の方法の別の実施形態によれば、同時に、以下の遺伝子：
a)  アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC、
b)  アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子asd、
c)  グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap、
d)  3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk、
e)  ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc、
f)  トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi、
g)  ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA、
h)  シスタチオニンγ-シンターゼをコードする遺伝子metB、
i)  シスタチオニンγ-リアーゼをコードする遺伝子metC、
j)  セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA、
k)  O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY、
l)  メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF、
m)  ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC、
n)  ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB、
o)  セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE、および
p)  ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom、
の中から選択される1つ以上の遺伝子が過剰発現されるコリネ型細菌を発酵させる。
【００２０】
本発明の方法の別の実施形態によれば、同時に、上記のa)からp)の遺伝子の中から選択される1つ以上の遺伝子が、突然変異している、特に、対応するタンパク質の活性が、非突然変異タンパク質と比較して、影響されるにしてもより少ない程度に代謝的代謝産物によって影響されるように、また、特に本発明のファインケミカルの生産が悪影響を受けないように、突然変異しているコリネ型細菌を発酵させる。突然変異のため、該タンパク質はより高い活性（基質変換率）および／または基質特異性をもつ可能性があり、それゆえに目的のファインケミカルの生産が増大しうる。
【００２１】
本発明の方法の別の実施形態によれば、同時に、以下の遺伝子：
q)  ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB、
r)  トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA、
s)  トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC、
t)  メソ-ジアミノピメリン酸D-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh、
u)  ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck、
v)  グルコース-6-リン酸6-イソメラーゼをコードする遺伝子pgi、
w)  ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB、
x)  ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA、
y)  ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB、および
z)  ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA、
の中から選択される1つ以上の遺伝子が、特に、対応する遺伝子の発現率を低下させることにより、またはより低い活性（基質変換率）を有するタンパク質を発現することにより、減衰されているコリネ型細菌を発酵させる。
【００２２】
本発明の方法の別の実施形態によれば、同時に、上記のq)からz)の遺伝子の中から選択される1つ以上の遺伝子が、対応するタンパク質の酵素活性を部分的にまたは完全に低下させるように突然変異しているコリネ型細菌を発酵させる。
【００２３】
本発明の方法では、コリネバクテリウム・グルタミカム菌種の微生物を使用することが好ましい。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態では、少なくとも1種のメチオニン生合成阻害剤に耐性を示す微生物を使用する。かかる阻害剤はメチオニン類似体であり、例えば、α-メチルメチオニン、エチオニン、ノルロイシン、n-アセチルノルロイシン、S-トリフルオロメチルホモシステイン、2-アミノ-5-ヘプレン酸（heprenoic acid）、セレノメチオニン、メチオニンスルホキシイミン、メトキシン、および1-アミノシクロペンタンカルボン酸がある。
【００２５】
本発明はさらに、発酵ブロスからL-メチオニン含有動物飼料添加物を製造する方法に関し、この方法は、以下の工程：
a)  発酵培地においてL-メチオニン産生微生物を培養しかつ発酵させること、
b)  L-メチオニンを含有する発酵ブロスから水を除去すること、
c)  発酵中に形成された0〜100重量％のバイオマスを取り除くこと、および
d)  工程b)および／またはc)で得られた発酵ブロスを乾燥させて、所望の粉末または顆粒形態の動物飼料添加物を得ること、
を含んでなる。
【００２６】
本発明は同様に、上記の微生物から初めて単離されたmetHコード配列、それによりコードされるメチオニンシンターゼ、ならびに、これらのポリヌクレオチドおよびタンパク質のそれぞれの機能的な相同体に関する。
【００２７】
特に、本発明はまた、上記の方法を実施するために必要とされる発現構築物および微生物に関する。
【００２８】
したがって、本発明はまた、以下のものに関する：
−  lysC thr311ileまたはその機能的均等物（すなわち、匹敵するアスパラギン酸キナーゼ活性が野生型より増加しているlysC突然変異体）をコードするプラスミドpCIS lysC thr311ile； 
−  コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム菌種の微生物の中から選択される、プラスミドpCIS lysC thr311ileで形質転換された宿主生物（例えば、形質転換株LU1479 lysC 311ile）；
−  ストレプトマイセス・ケリコロール（Streptomyces coelicolor）metHをコードするプラスミドpC Phsdh metH Sc；
−  外因性metHをコードするプラスミドで形質転換された、特にプラスミドpC Phsdh metH Scで形質転換された上記の宿主生物；
−  少なくとも1種のメチオニン生合成阻害剤に耐性である上記の宿主生物（例えば、形質転換株LU1479 lysC 311ile ET-16）、場合により、外因性metHコード配列で形質転換されていてもよい（例えば、形質転換株LU1479 lysC 311ile ET-16 pC Phsdh metH Sc）。
【００２９】
発明の詳細な説明
a)  一般用語
メチオニンシンターゼ（略してmetHともいう；分類名：5-メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインS-メチルトランスフェラーゼ；EC 2.1.1.13）の生物活性を有するタンパク質は、補因子5-メチルテトラヒドロ葉酸（MTHF）、コバラミン（ビタミンB12）およびS-アデノシルメチオニンを用いて、ホモシステインをメチオニンとテトラヒドロ葉酸に変換することができるタンパク質を意味する。補因子5-メチルテトラヒドロ葉酸はこの反応に化学量論的に入り（MTHF 1モル／形成されるメチオニン1モル）、一方S-アデノシルメチオニンは文献に記載されるように化学量論以下で変換される。他方、コバラミンはこの変換反応に触媒的に関与する。metHタンパク質のさらなる詳細は、当業者に公知である（Banerjee R.V., Matthews R.G., FASEB J., 4:1450-1459, 1990; Ludwig ML., Matthews RG., Annual Review of Biochemistry. 66:269-313, 1997; Drennan CL., Matthews RG., Ludwig ML., Current Opinion in Structural Biology. 4:919-29, 1994）。当業者であれば、コバラミン依存性5-メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインS-メチルトランスフェラーゼの活性と、metEとしても知られるコバラミン非依存性5-メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸ホモシステインS-メチルトランスフェラーゼ（EC 2.1.1.14）の活性を区別することができる。metHの酵素活性は、Jarrett JT., Goulding CW., Fluhr K., Huang S., Matthews RG., Methods in Enzymology. 281:196-213, 1997に記載されるプロトコルを用いる酵素アッセイにより検出しうる。
【００３０】
本発明の範囲内において「硫黄含有ファインケミカル」という用語には、共有結合した少なくとも1個の硫黄原子を含みかつ本発明の発酵方法によって得ることができる化合物が含まれる。その非限定的な例はメチオニン、ホモシステイン、S-アデノシルメチオニン、特にメチオニンとS-アデノシルメチオニンである。
【００３１】
本発明の範囲内において「L-メチオニン」、「メチオニン」、ホモシステインおよびS-アデノシルメチオニンという用語には、対応する塩、例えばメチオニン塩酸塩またはメチオニン硫酸塩も含まれる。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」とは、一般にポリリボヌクレオチド（RNA）およびポリデオキシリボヌクレオチド（DNA）をさし、それぞれ非修飾型のRNAおよびDNAであっても、修飾型のRNAおよびDNAであってもよい。
【００３３】
本発明によれば、「ポリペプチド」とは、2個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されているペプチドまたはタンパク質を意味する。
【００３４】
「代謝的代謝産物」（metabolic metabolite）という用語は、生物の代謝において中間産物または最終産物として存在し、さらに、化学的ビルディングブロックとしてのその性質は別として、酵素とその触媒活性に調節作用を及ぼしうる化合物をさす。そのような代謝的代謝産物が酵素の活性に阻害的にも促進的にも作用しうることは文献から公知である（Biochemistry, Stryer, Lubert, 1995 W. H. Freeman & Company, New York, New York）。また、「代謝的代謝産物」の影響がUV照射、電離放射線、または突然変異誘発物質によるゲノムDNAの突然変異と、それに続く特定の表現型の選択といった方法により改変されている酵素を生物内で生産できることも、文献に記載されている（Sahm H., Eggeling L., de Graaf AA., Biological Chemistry 381(9-10):899-910, 2000; Eikmanns BJ., Eggeling L., Sahm H., Antonie van Leeuwenhoek., 64:145-63, 1993-94）。こうした改変された性質は特定の方法によっても得ることができる。当業者であれば、酵素遺伝子において、そのタンパク質をコードするDNAの特定のヌクレオチドを具体的にどのように改変すれば、発現DNA配列から得られるタンパク質が新しい性質（例えば、未改変タンパク質に対する代謝的代謝産物の調節作用が変化した性質）を持つようになるか、熟知していよう。
【００３５】
反応速度が低下するように、または基質に対する親和性が改変されるように、あるいは反応速度が変化するように、酵素の活性に影響を及ぼすことが可能である。
【００３６】
本明細書において「発現する」および「増幅」または「過剰発現」という用語は、微生物内での対応DNAによりコードされる1種以上の酵素の生産または該酵素の細胞内活性の増加を意味する。この目的のために、例えば、生物に遺伝子を導入したり、既存の遺伝子を別の遺伝子で置換したり、1以上の遺伝子のコピー数を増加したり、強力なプロモーターを使用したり、または高い活性を有する酵素をコードする遺伝子を使用したりすることが可能であり、これらの方法を適宜組み合わせてもよい。
【００３７】
b)  本発明のmetHタンパク質
本発明は、上記表1に具体的に開示した生物のmetH酵素の「機能的均等物」も包含する。
【００３８】
本発明の範囲内において、具体的に開示したポリペプチドの「機能的均等物」または類似体とは、基質特異性といった望ましい生物学的活性をさらに有する、具体的に開示したポリペプチドとは異なったポリペプチドのことである。
【００３９】
本発明によれば、「機能的均等物」とは、特に、上記の配列位置の少なくとも1つに、具体的に挙げたアミノ酸以外のアミノ酸を有するが、それにもかかわらず上記の生物活性の1つを有する突然変異体を意味する。したがって、「機能的均等物」には、1個以上のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位によって得られる突然変異体が含まれ、それらが本発明の特性プロファイルを有する突然変異体をもたらすかぎり、そのような修飾を配列のどの位置で行ってもよい。突然変異型ポリペプチドと未修飾ポリペプチドとが性質的に一致する（すなわち、同一の基質が例えば異なる速度で変換される）場合にも、機能的均等が存在する。
【００４０】
「機能的均等物」にはまた、他の生物から得られるポリペプチド、および天然に存在する変異体も当然含まれる。例えば、配列比較により相同な配列領域を見つけ出すことができ、また、本発明の具体的な指針に従って均等な酵素を取得することができる。
【００４１】
「機能的均等物」には同様に、例えば所望の生物学的機能を有する、本発明のポリペプチドの断片（好ましくは、個々のドメインまたは配列モチーフ）も含まれる。
【００４２】
「機能的均等物」はまた、上記のポリペプチド配列またはそれらから誘導される機能的均等物の1つと、これとは機能的に異なる少なくとも1つの別の異種配列とを、機能的なN-またはC-末端結合（すなわち、融合タンパク質部分の機能的損傷を無視しうる結合）で有する融合タンパク質である。そのような異種配列の例として、限定するものではないが、シグナルペプチド、酵素、免疫グロブリン、表面抗原、受容体または受容体リガンドなどがある。
【００４３】
本発明によれば、「機能的均等物」には、具体的に開示したタンパク質の相同体も含まれる。これらは、例えば全長にわたり、具体的に開示した配列の1つに対して少なくとも30％、または約40％、50％、好ましくは少なくとも約60％、65％、70％、もしくは75％、特に少なくとも85％、例えば90％、95％または99％、の相同性を有する（PearsonおよびLipman, Proc. Natl. Acad., Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448に記載のアルゴリズムを用いて算出）。相同性の程度は、修飾配列と未修飾配列間の同一性の程度を特に反映している。
【００４４】
本発明のタンパク質またはポリペプチドの相同体は、突然変異誘発、例えば、点突然変異またはタンパク質のトランケーションにより作製することができる。本明細書中で用いる「相同体」という用語は、タンパク質活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する該タンパク質の変異体にも関係する。
【００４５】
本発明のタンパク質の相同体は、トランケーション突然変異体のような突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。タンパク質変異体の多様なライブラリーは、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的連結により、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により作製することが可能である。潜在的相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製するために、多数の方法を使用することができる。縮重遺伝子配列の化学合成を適切なDNA合成機で行ってから、その合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結することができる。縮重遺伝子のセットを使用すると、所望のセットの潜在的タンパク質配列をコードする全配列を1つの混合物として提供することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に公知である (例えば、Narang, S.A., (1983) Tetrahedron 39:3; Itakuraら, (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakuraら, (1984) Science 198:1056; Ikeら, (1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。
【００４６】
さらに、タンパク質コドンの断片のライブラリーを用いることにより、本発明のタンパク質の相同体をスクリーニングして選択するための多様なタンパク質断片の集団を作製することができる。1つの実施形態では、コード配列断片のライブラリーを作製するために、コード配列の二本鎖PCR断片をヌクレアーゼで、分子あたり1回程度のニッキングが起こる条件下で処理し、その二本鎖DNAを変性し、該DNAを復元して種々のニック導入産物のセンス／アンチセンス対を含みうる二本鎖DNAを形成し、新たに形成された二本鎖からS1ヌクレアーゼ処理により一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結させることができる。この方法により、本発明のタンパク質の様々なサイズのN-末端、C-末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを作製することが可能である。
【００４７】
点突然変異またはトランケーションにより作製されたコンビナトリアルライブラリーから遺伝子産物をスクリーニングし、また、所定の性質を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングするための各種方法が先行技術から公知である。こうした方法を、本発明の相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により作製された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合させることができる。大きい遺伝子ライブラリーをハイスループット分析によりスクリーニングするための最も汎用されている方法は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換し、所望の活性の欠失が遺伝子（その産物が欠失された）をコードするベクターの単離を容易にする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリー中の機能性突然変異体の頻度を高める技法であるリカーシブアンサンブル突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis：REM）をスクリーニング試験と組み合わせて用いて、相同体を同定することができる (ArkinおよびYourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgraveら (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
【００４８】
c)  本発明のポリヌクレオチド
本発明はまた、上記のmetH酵素の1つをコードする核酸配列（一本鎖または二本鎖のDNAおよびRNA、例えばcDNA、mRNAなど）およびその機能的均等物（例えば、人工ヌクレオチド類似体の使用によっても得られる）に関する。
【００４９】
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的に活性な断片をコードする単離された核酸分子、ならびに、例えば本発明のコード核酸の同定または増幅のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる、核酸断片に関する。
【００５０】
さらに、本発明の核酸分子は該遺伝子のコード領域の3’および／または5’末端からの非翻訳配列を含むことができる。
【００５１】
「単離された」核酸分子は、その核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離されており、さらに、それが組換え法により調製されたものであれば、他の細胞性物質または培地を実質的に含まず、また、それが化学合成されたものであれば、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００５２】
本発明はさらに、具体的に記載したヌクレオチド配列またはその一部に相補的な核酸分子を包含する。
【００５３】
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞型および生物における相同配列の同定および／またはクローニングに使用することができるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。そのようなプローブおよびプライマーは通常、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約12個、好ましくは少なくとも約25個、例えば40個、50個または75個連続したヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を完成させる。
【００５４】
本発明のさらなる核酸配列は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49または51から誘導され、1個以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失によりそれと相違するが、所望の特性プロファイルを有するポリペプチドをなおもコードしている。これらは、例えばその全長にわたり、少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、80％または90％の配列位置、好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％または99％の配列位置において、上記配列と同一であるポリヌクレオチドであってよい。
【００５５】
本発明はまた、「サイレント」突然変異を含む核酸配列、または特定の源または宿主生物のコドン使用頻度に従って具体的に挙げた配列との比較において改変されている核酸配列、ならびに天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体を包含する。本発明は同様に、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、関係するアミノ酸が同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸で置換される）により得られる配列に関する。
【００５６】
本発明はまた、配列多型により、具体的に開示した配列に由来する分子に関する。こうした遺伝的多型は集団内の個体間の天然における変異のために存在しうる。これらの天然の変異は通常、1つの遺伝子のヌクレオチド配列に1〜5％の変化をもたらす。
【００５７】
本発明はさらに、上記コード配列とハイブリダイズする、つまりそれと相補的である核酸配列を含む。これらのポリヌクレオチドはゲノムまたはcDNAライブラリーのスクリーニングで見い出すことができ、適宜、適当なプライマーを用いるPCRによって増幅した後、例えば適当なプローブで単離することができる。これとは別に、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで適当な微生物を形質転換し、その微生物、それゆえに該ポリヌクレオチドを増やし、その後それらを単離することもできる。もう一つの方法としては、本発明のポリヌクレオチドを化学的経路により合成することが可能である。
【００５８】
ポリヌクレオチドと「ハイブリダイズする」ことができる性質とは、ほぼ相補的な配列とストリンジェント条件下で結合するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの能力を意味し、これらの条件下で非相補的パートナー間には非特異的結合が一切存在しない。そのためには、配列は70〜100％、好ましくは90〜100％相補的であるべきである。互いと特異的に結合できる相補的配列の性質は、例えば、ノーザンもしくはサザンブロット法、またはプライマー結合の場合のPCRもしくはRT-PCRにおいて利用される。この目的のためには、通常、長さが30塩基対以上のオリゴヌクレオチドを用いる。ストリンジェント条件は、例えば、ノーザンブロット法では、非特異的にハイブリダイズしたcDNAプローブまたはオリゴヌクレオチドを溶出するために、50〜70℃、好ましくは60〜65℃の洗浄溶液、例えば0.1％のSDSを含む0.1×SSCバッファー（20×SSC；3M NaCl, 0.3M クエン酸Na, pH7.0）の使用を意味する。この場合には、上述したように、高度の相補性を有する核酸のみが互いと結合した状態で存在する。ストリンジェント条件の設定は当業者に公知であり、例えば、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【００５９】
c)  metHコード遺伝子の単離
酵素メチオニンシンターゼ(EC 2.1.1.13)をコードするmetH遺伝子は、それ自体公知の方法で上記表１の生物から単離することができる。
【００６０】
上記表１の生物のmetH遺伝子または他の遺伝子を単離するためには、まず最初に、この生物の遺伝子ライブラリーを大腸菌（E. coli）に作製する。遺伝子ライブラリーの作製は公知の教本やマニュアルに詳しく記載されている。その例としては、Winnackerによる教本: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990)、およびSambrookらによるマニュアル: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)が挙げられる。よく知られた遺伝子ライブラリーは、Koharaら (Cell 50, 495-508 (198))によりλベクター内に作製された大腸菌K-12株W3110のものである。
【００６１】
大腸菌内に表１の生物からの遺伝子ライブラリーを作製するためには、コスミド、例えばコスミドベクターSuperCos I (Wahlら, 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164)、またはプラスミド、例えばpBR322 (BoliVal; Life Sciences, 25, 807-818 (1979))もしくはpUC9 (Vieiraら, 1982, Gene, 19: 259-268)を使用することができる。適当な宿主は、特に、制限および組換え欠損の大腸菌株である。その例は、Grantら (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)により記載された菌株DH5αmcrである。コスミドを用いてクローニングした長いDNA断片はその後、例えばSangerら (proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977)に記載されるように、配列決定用の共通のベクターにサブクローニングし、続いて配列決定に供することができる。
【００６２】
得られたDNA配列は、その後、公知のアルゴリズムもしくは配列解析プログラム、例えばStadenによるもの (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986))、Marckによるもの (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988))、またはButlerによるGCGプログラム (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998))を用いて研究することができる。
【００６３】
上記表１に示す生物からmetHをコードするDNA配列が見出された。特に、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49および51に示すDNA配列が見出された。さらに、前記DNA配列から、上記の方法を用いて、対応するタンパク質のアミノ酸配列が誘導された。配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50および52はmetH遺伝子産物の得られたアミノ酸配列を示す。
【００６４】
配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49および51に示す配列から、遺伝子コードの縮重のために得られるDNAコード配列も同様に本発明の主題である。同じく、本発明は、前記配列またはそれに由来する配列の一部とハイブリダイズするDNA配列に関する。
【００６５】
当業者は、ハイブリダイゼーションによってDNA配列を同定するための知識を、特に、Boehringer Mannheim GmbH (ドイツ、マンハイム, 1993年)からのマニュアル「The DIG System Users Guide fur Filter Hybridization」（フィルターハイブリダイゼーションのためのDIG系ユーザーガイド）およびLieblら (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260)に見い出すことができる。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってDNA配列を増幅するための知識は、特に、Gaitによるマニュアル「Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach」（オリゴヌクレオチドの合成：実践的アプローチ）(英国、オックスフォード、IRL Press, 1984年)およびNewtonとGrahamによるPCR (ドイツ、ハイデルベルグ、Spektrum Akademischer Verlag, 1994年)に見い出すことができる。
【００６６】
さらに、タンパク質のN-および／またはC-末端における変更は実質的にその機能を損なわず、その機能を安定化することさえあることが知られている。これに関する情報は、特に、Ben-Bassatら (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987))、O'Reganら (Gene 77: 237-251 (1989)、Sahin-Tothら (Protein Sciences 3: 240-247 (1994))、Hochuliら (Biotechnology 6: 1321-1325 (1988)) ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教本に見い出すことができる。
【００６７】
対応して配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50および52から得られるアミノ酸配列も本発明の一部である。
【００６８】
d)  本発明に従って用いる宿主細胞
本発明はさらに、本発明により定義された少なくとも1つのmetH遺伝子を担うか、または本発明のmetH遺伝子が発現もしくは増幅されるベクター、特にシャトルベクターまたはプラスミドベクターを含む、宿主細胞としての微生物、特にコリネ型細菌に関する。
【００６９】
これらの微生物は、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから、またはグリセロールやエタノールから、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを産生することができる。前記微生物はコリネ型細菌、特にコリネバクテリウム（Corynebacterium）属のものが好ましい。コリネバクテリウム属のうち、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）を挙げる必要があり、この菌種はそのL-アミノ酸産生能について当技術分野で知られている。
【００７０】
適切なコリネ型細菌株の例は、いくつか挙げると、コリネバクテリウム属のもの、特にコリネバクテリウム・グルタミカム菌種、例えば、
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC 13032、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）ATCC 15806、
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC 13870、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）FERM BP-1539、
コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium melassecola）ATCC 17965、
または、
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属のもの、例えば、
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）ATCC 14067、 
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC 13869 および
ブレビバクテリウム・ジバリカタム（Brevibacterium divaricatum）ATCC 14020;
または、これらに由来する菌株、例えば、
コリネバクテリウム・グルタミカム KFCC10065、 
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC21608、
であり、これらは目的のファインケミカルまたはその前駆体を同様に産生する。
【００７１】
略号KFCCはKorean Federation of Culture Collectionを意味し、略号ATCCはAmerican Type Strain Culture Collectionを意味し、略号FERMは日本の産業経済省の工業技術院生命工学工業技術研究所（National Institute of Bioscience and Human Technology）のコレクションを意味する。 
e)  本発明の発酵の実施
本発明によれば、コリネ型細菌は、表１の生物に由来するmetH遺伝子の過剰発現後に、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを有利な方法で産生することがわかった。
【００７２】
過剰発現を達成するために、当業者はさまざまな方法を単独でまたは組合せで用いることができる。こうして、適切な遺伝子のコピー数を増加させたり、構造遺伝子の上流に位置するプロモーターおよび調節領域またはリポソーム結合部位に突然変異を起こさせたりすることが可能である。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットも同様に作用する。誘導プロモーターは、発酵によるL-メチオニン産生の間の発現増加をさらに可能にする。また、mRNAの寿命をひき延ばす方法によっても発現の向上が望める。さらに、酵素タンパク質の分解を防止することによって酵素活性を高めることもできる。遺伝子または遺伝子構築物はさまざまなコピー数でプラスミド中に存在してもよいし、染色体に組み込まれて増幅されてもよい。もう一つの可能な選択肢は、培地組成および培養物の管理を変えることによって関連遺伝子の過剰発現を達成することである。
【００７３】
そのための知識は、特に、Martinら (Biontechnology 5, 137-146 (1987))、Guerreroら (Gene 138, 35-41 (1994))、TsuchiyaおよびMorinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Eikmannsら (Gene 102, 93-98 (1991))、欧州特許第0472869号、米国特許第4,601,893号、SchwarzerおよびPuhler (Biotechnology 9, 84-87 (1991))、Remscheidら (Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994))、LaBarreら (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))、特許出願 WO 96/15246、Malumbresら (Gene 134, 15-24 (1993))、日本の公開明細書 JP-A-10-229891、JensenおよびHammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))、Makrides (Microbiological Reviews 60 : 512-538 (1996))、ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教本に見い出すことができる。
【００７４】
したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を調節核酸配列の遺伝的制御下で含む発現構築物、ならびにそのような発現構築物の少なくとも1つを含むベクターに関する。かかる構築物は、好ましくは、特定のコード配列の5’側上流にプロモーター、3’側下流にターミネーター配列、適宜に、追加の調節エレメントを含み、それぞれがコード配列と機能的に連結される。「機能的な連結」（operative linkage）とは、調節エレメントのそれぞれがコード配列の発現においてその機能を適切に果たすことができるように、プロモーター、コード配列、ターミネーター、適宜に、追加の調節エレメントが連続的に配置されていることを意味する。機能的に連結可能な配列の例としては、活性化配列およびエンハンサーなどがある。さらなる調節エレメントには、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが含まれる。適当な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
【００７５】
人工の調節配列に加えて、天然の調節配列が実際の構造遺伝子の上流になおも存在していてもよい。遺伝的改変によって、この天然の調節が適宜に切り替わって、遺伝子発現を増加させたり低下させたりすることができる。しかし、遺伝子構築物は、もっと単純な設計のもの、すなわち、構造遺伝子の上流に追加の調節シグナルが一切挿入されず、天然のプロモーターが除かれていないものであってよい。その代わり、天然の調節配列に突然変異を起こすことにより、その調節がもはや起こらないようにして、遺伝子発現を増加または低下させる。遺伝子構築物は1以上のコピー数の核酸配列を含んでいてもよい。
【００７６】
有用なプロモーターの例は、コリネバクテリウム・グルタミカムのプロモーターからのddh、amy、lysC、dapA、lysAだけでなく、Bacillus Subtilis and Its Closest Relatives, Sonenshein, Abraham L., Hoch, James A., Losick, Richard; ASM Press, District of Columbia, WashingtonおよびPatek M. Eikmanns BJ., Patek J., Sahm H., Microbiology. 142 1297-309, 1996に記載されるようなグラム陽性菌プロモーターSPO2、またはグラム陰性菌に有利に適用されるcos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PRおよびλ-PLプロモーターである。誘導プロモーター、例えば光-および特に温度-誘導プロモーター（例えば、PrPlプロモーター）を使用することも好ましい。基本的には、あらゆる天然のプロモーターをそれらの調節配列と共に使用することが可能である。さらに、合成プロモーターも有利に使用することができる。
【００７７】
記載した調節配列は、核酸配列の特異的発現を可能にするためのものである。宿主生物に応じて、これは、例えば、遺伝子が誘導後にのみ発現または過剰発現されること、あるいは遺伝子が直ちに発現および／または過剰発現されることを意味しうる。
【００７８】
これに関連して、調節配列および調節因子は、発現に有益な作用を及ぼし、こうして発現を増加または低下させることが好ましい。したがって、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強い転写シグナルを用いることにより、調節エレメントを転写レベルで増強することが可能であり、有利である。しかし、このほかに、例えばmRNAの安定性を向上させることにより、翻訳を増強することも可能である。
【００７９】
発現カセットは、適当なプロモーター、適当なシャイン-ダルガルノ配列を、metHヌクレオチド配列および適当な終止配列に融合させることにより作製される。この目的のために、一般的な組換えおよびクローニング技術を使用するが、かかる技術は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, 1993, John Wiley & Sons, Incorporated, New York, New York、PCR Methods, Gelfand, David H., Innis, Michael A., Sninsky, John J., 1999, Academic Press, Incorporated, California, San Diego、PCR Cloning Protocols, Methods in Molecular Biology Ser., Vol. 192, 2nd ed., Humana Press, New Jersey, Totowa、T. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、ならびにT.J. Silhavy, M.L. BermanおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)およびAusubel, F.M.ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されている。
【００８０】
組換え核酸構築物または遺伝子構築物は、それを有利には宿主特異的ベクター（宿主における最適な遺伝子発現を可能にする）に挿入することによって、適切な宿主生物内で発現させる。ベクターは当業者に公知であり、例えば、「Cloning Vectors」(Pouwels P. H.ら, Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に見い出すことができる。「ベクター」という語は、プラスミドは別として、当業者に公知のあらゆる他のベクター、例えば、ファージ、トランスポゾン、ISエレメント、プラスミド、コスミド、および線状または環状DNAをも意味する。こうしたベクターは自律複製が可能であるか、または染色体に組み込まれて複製される。
【００８１】
本発明のmetH遺伝子は、一例としてエピソームプラスミドを用いて、それらを過剰発現させることにより増幅される。適当なプラスミドはコリネ型細菌内で複製するものである。多数の公知のプラスミドベクター、例えばpZ1 (Menkelら, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554)、pEKEx1 (Eikmannsら, Gene 102: 93-98 (1991))またはpHS2-1 (Sonnenら, Gene 107: 69-74 (1991))は潜在（cryptic）プラスミドpHM1519、pBL1またはpGA1に基づいている。その他のプラスミドベクター、例えばpCLiK5MCS、またはpCG4に基づくもの(US-A 4,489,160)またはpNG2 (Serwold-Davisら, FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990))またはpAG1 (US-A 5,158,891)も同様に使用することができる。
【００８２】
さらに、適当なプラスミドベクターは、遺伝子増幅法を染色体への組込みにより使用することを可能にするものであり、例えば、Remscheidら (Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994))がhom-thrBオペロンの複製および増幅に関して記載している。この方法では、完全な遺伝子を宿主（典型的には大腸菌）内で複製可能であるがコリネバクテリウム・グルタミカム内では複製できないプラスミドベクターにクローニングする。適当なベクターは、例えば、pSUP301 (Sirnonら, Bio/ Technology 1, 784-791 (1983))、pK18mobもしくはpK19mob (Schaferら, Gene 145, 69-73 (1994)、Bernardら, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993))、pEM1 (Schrumpfら, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516)、またはpBGS8 (Sprattら,1986, Gene 41: 337-342)である。次いで、増幅すべき遺伝子を含むプラスミドベクターを形質転換によって所望のC. グルタミカムに導入する。形質転換法は、例えば、Thierbachら (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988))、DunicanおよびShivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989))、ならびにTauchら (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994))に記載されている。
【００８３】
酵素の活性は、酵素反応の速度が部分的にまたは完全に低下するような、対応する遺伝子の突然変異によって影響される。そうした突然変異の例は当業者に公知である (Motoyama H., Yano H., Terasaki Y., Anazawa H., Applied & Environmental Microbiology. 67:3064-70, 2001、Eikmanns BJ., Eggeling L., Sahm H., Antonie van Leeuwenhoek. 64:145-63, 1993-94)。
【００８４】
さらに、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンの生産には、本発明のmetH遺伝子の発現および増幅に加えて、メチオニン生合成経路またはそれと関連した（すなわち、それと機能的に結びついた）生合成経路もしくは他の代謝経路（例えば、システイン、リシンもしくはトレオニンの代謝経路、特にアスパラギン酸セミアルデヒド合成、解糖、アナプレロティック反応(anaplerosis)、ペントースリン酸代謝、クエン酸回路またはアミノ酸輸送の経路）の1種以上の酵素を増幅することが有利でありうる。
【００８５】
したがって、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを生産するために、以下の遺伝子の1種以上を増幅することができる（すなわち、例えば、より高いコピー数で存在させるか、またはより高い活性もしくは特異性を有する酵素をコードさせる）。
【００８６】
- アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号281)；
- アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子asd (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号282)；
- グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)；
- 3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)；
- ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)；
- トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)；
- ホモセリン O-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号725)；
- シスタチオニンγシンターゼをコードする遺伝子metB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3491)；
- シスタチオニンγリアーゼをコードする遺伝子metC (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3061)； 
- セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1110)；
- O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号726)；
- メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2379)；
- ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号928)；
- ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号334, DNA-配列番号467, DNA-配列番号2767)；
- セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2818)；
- ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1306)。
【００８７】
したがって、コリネ型細菌において硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを生産するためには、同時に、以下の遺伝子の少なくとも1種に突然変異を起こさせて、特に、対応するタンパク質の活性が非突然変異タンパク質の活性と比べて代謝的代謝産物によってそれほど影響されないか、全く影響されないようにすることが有利でありうる。
【００８８】
- アスパラキン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号281)；
- ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)；
- ホモセリン O-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号725)；
- シスタチオニンγシンターゼをコードする遺伝子metB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3491)；
- シスタチオニンγリアーゼをコードする遺伝子metC (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3061)；
- セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1110)；
- O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号726)；
- メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子metF (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2379)；
- ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号928)；
- ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号334, DNA-配列番号467, DNA-配列番号2767)；
- セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2818)；
- ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号1306)。
【００８９】
さらに、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを生産するためには、本発明のmetH遺伝子の1つの発現および増幅に加えて、以下の遺伝子の1種以上を弱めること、特にその発現を低下させるか、またはそれらをスイッチオフすることが有利でありうる。
【００９０】
- ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3453)；
- トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2328)；
- トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3486)；
- メソ-ジアミノピメリン酸 D-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3494)；
- ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3157)；
- グルコース-6-リン酸 6-イソメラーゼをコードする遺伝子pgi (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号950)；
- ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2873)；
- ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3476)；
- ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3477)；
- ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3451)。
【００９１】
さらに、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを生産するためには、コリネ型細菌における本発明のmetH遺伝子の1つの発現および増幅に加えて、同時に、以下の遺伝子の少なくとも1種に突然変異を起こさせて、対応するタンパク質の酵素活性が部分的にまたは完全に低下するようにすることが有利でありうる。
【００９２】
- ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3453)；
- トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2328)；
- トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3486)；
- メソ-ジアミノピメリン酸 D-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3494)；
- ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3157)；
- グルコース-6-リン酸 6-イソメラーゼをコードする遺伝子pgi (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号950)；
- ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号2873)；
- ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3476)；
- ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3477)；
- ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA (EP 1 108 790 A2; DNA-配列番号3451)。
【００９３】
さらに、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを生産するためには、本発明のmetH遺伝子の発現および増幅とは別に、例えばファインケミカルの収量を低下させる望ましくない二次反応をなくすことが有利でありうる (Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (編), Academic Press, London, UK, 1982中のNakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms")。
【００９４】
本発明による微生物は、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンを生産するために連続的にまたは回分式で、すなわち流加回分法（fed batch）もしくは反復流加回分法で培養することができる。公知の培養方法は、Chmielによる教本 (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))、またはStorhasによる教本 (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に見い出すことができる。
【００９５】
用いる培地は、個々の菌株の要求を適当な方法で満たすものでなければならない。米国細菌学会 (Washington D. C., USA, 1981)による教本"Manual of Methods for General Bacteriology"には、各種微生物のための培地の説明が載っている。
【００９６】
本発明に従って使用される培地は通常、1種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類および／または微量元素を含有する。
【００９７】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類のような糖類である。非常に好ましい炭素源の例は、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンおよびセルロースである。糖類はまた、複合化合物、例えば糖蜜または糖精製の際の他の副産物として培地に添加することもできる。また、さまざまな炭素源の混合物を添加することも有利でありうる。その他の考えられる炭素源は、油および脂肪（例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、落花生油、およびヤシ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール、メタノール、およびエタノール）、ならびに有機酸（例えば、酢酸、および乳酸）である。
【００９８】
窒素源は通常、有機もしくは無機の窒素化合物または前記化合物を含む物質である。窒素源の例としては、アンモニアガスもしくはアンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウム
）、硝酸塩、尿素、アミノ酸、および複合窒素源（例えば、トウモロコシ浸出液、ダイズ粉、ダイズタンパク質、酵母エキス、肉エキスなど）がある。窒素源は単独で使用しても混合物として使用してもよい。
【００９９】
培地に含めることができる無機塩化合物としては、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩が挙げられる。
【０１００】
硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、四チオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物などの無機硫黄含有化合物、またはメルカプタン、チオールなどの有機硫黄化合物も硫黄含有ファインケミカル、特にメチオニンを生産するための硫黄源として使用することができる。
【０１０１】
リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩はリン源として使用することができる。
【０１０２】
金属イオンを溶解状態に保つために培地にキレート化剤を添加してもよい。特に好適なキレート化剤としては、カテコールまたはプロトカテキン酸のようなジヒドロキシフェノールおよびクエン酸のような有機酸がある。
【０１０３】
本発明に従って用いる発酵培地は、通常、ビタミンや成長促進物質のような他の成長因子を含んでいてもよく、これらには、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、およびピリドキシンが含まれる。成長因子や塩類は、多くの場合、酵母エキス、糖蜜、トウモロコシ浸出液といった複合培地成分に由来する。さらに、適当な前駆物質を培地に添加することも可能である。培地の正確な組成は個々の実験に大きく依存し、具体的なケースごとに決定される。培地の最適化に関する情報は、"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (P.M. Rhodes, P.F. Stanbury編集, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)に見い出すことができる。また、増殖培地は市販されており、例えば、Standard 1 (Merck)またはBHI (脳心臓浸出液, DIFCO)などを入手することもできる。
【０１０４】
全ての培地成分は、加熱（1.5バール、121℃で20分）または滅菌濾過のいずれかで滅菌する。各成分を一緒に滅菌してもよいし、必要ならば別々に滅菌してもよい。培地成分は全てを培養の開始時に存在させるか、所望により、連続的にまたは回分式に添加する。
【０１０５】
培養温度は一般には15〜45℃、好ましくは25〜40℃であり、一定に維持しても、実験中に変化させてもよい。培地のpHは5〜8.5の範囲、好ましくは約7.0にすべきである。培養中のpHは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、アンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸、硫酸などの酸性化合物を添加することで調整することができる。発泡は例えば脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いることで防ぐことができる。プラスミドの安定性を維持するために、抗生物質のような選択効果を有する適当な物質を培地に添加することが可能である。好気性条件を維持するには、酸素または酸素を含む混合気体（例えば、空気）を培養物に導入する。培養温度は通常20〜45℃とする。目的産物の生成が最大に達するまで培養を続ける。この目標は一般的に10〜160時間で達成される。
【０１０６】
このようにして得られた発酵ブロス（特にL-メチオニンを含むもの）は通常7.5〜25重量％の乾燥バイオマスを含有する。
【０１０７】
さらに、少なくとも発酵期間の終わりに、しかし発酵期間の少なくとも30％にわたって、糖を制限して発酵を行うことが有利である。このことは、この期間における発酵培地中の利用可能な糖の濃度を≧0〜3 g/lに維持するかまたは低下させることを意味する。
【０１０８】
その後、発酵ブロスをさらに処理する。必要に応じて、バイオマスを、遠心分離、濾過、デカンテーション、またはこれらの方法を組み合わせた方法などの分離法によって発酵ブロスから完全にまたは部分的に取り出してもよいし、また、前記ブロス中にそのまま完全に残しておいてもよい。
【０１０９】
続いて、発酵ブロスを濃縮するが、これには公知の方法、例えば、回転エバポレーター、薄膜エバポレーター、薄膜降下式エバポレーター、または逆浸透法、あるいはナノ濾過を用いることができる。次に、この濃縮した発酵ブロスを凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧顆粒化、その他の方法で後処理することができる。
【０１１０】
しかし、硫黄含有ファインケミカル、特にL-メチオニンをさらに精製することも可能である。そのためには、バイオマスを取り出した後、産物含有ブロスを適当な樹脂によるクロマトグラフィーにかけ、目的産物または混入汚染物質をクロマトグラフ樹脂上に完全にもしくは部分的に保持させる。こうしたクロマトグラフ工程は、必要ならば、同一のまたは異なるクロマトグラフ樹脂を用いて繰り返してもよい。当業者であれば、適切なクロマトグラフ樹脂の選択およびそれらの最も効果的な使用について熟知していよう。精製された産物は濾過または限外濾過により濃縮して、産物の安定性が最大となる温度で貯蔵することができる。
【０１１１】
単離された化合物の素性および純度は公知の方法により決定することができる。これらには、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、分光法、染色法、薄層クロマトグラフィー、NIRS、酵素検定、または微生物検定が含まれる。こうした分析方法は、Patekら (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhovaら (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; Schmidtら (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70; Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581およびpp. 581-587; Michal, G., (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 第17巻中のFallon, A.ら (1987) Applications of HPLC in Biochemistryに概説されている。
【０１１２】
以下の実施例は本発明をより詳しく説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：  pCLiK5MCSの構築
最初に、ベクターpBR322のアンピシリン耐性および複製起点を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、オリゴヌクレオチドp1.3 (配列番号53)およびp2.3 (配列番号54)を用いて増幅した：
p1.3 (配列番号53)
5’-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3’
p2.3 (配列番号54)
5’-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3’
【０１１４】
pBR322に相補的な配列に加えて、オリゴヌクレオチドp1.3 (配列番号53)は、5’-3’方向で、制限ヌクレアーゼSmaI、BamHI、NheIおよびAscIの切断部位を含んでおり、また、オリゴヌクレオチドp2.3 (配列番号54)は、5’-3’方向で、制限ヌクレアーゼXbaI、XhoI、NotIおよびDraIの切断部位を含んでいる。PCR反応は、標準方法、例えばInnisらの方法 (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990))に従ってPfu Turboポリメラーゼ (Stratagene, La Jolla, USA)を用いて実施した。得られた約2.1kbの大きさのDNA断片は、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って精製した。このDNA断片の平滑末端同士を、高速DNA連結キット (Roche Diagnostics, Mannheim)により製造業者の説明書に従って連結させた。この連結混合物を、Sambrookら (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載されるような標準方法により、コンピテント大腸菌XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)に形質転換した。プラスミドを担う細胞は、アンピシリン (50μg/ml)含有LB寒天培地 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレートすることで選択した。
【０１１５】
個々のクローンのプラスミドDNAは、Qiaprepスピンミニプレップキット (Qiagen, Hilden)を用いて製造業者の説明書に従って単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK1と名づけた。
【０１１６】
PCR反応用の鋳型としてpWLT1 (Lieblら, 1992)を用いて、オリゴヌクレオチドneo1 (配列番号55)およびneo2 (配列番号56)によりカナマイシン耐性カセットを増幅した：
neo1 (配列番号55):
5’-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3’
neo2 (配列番号56):
5’-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3’
【０１１７】
pWLT1に相補的な配列とは別に、オリゴヌクレオチドneo1は、5’-3’方向で、制限ヌクレアーゼXbaI、SmaI、BamHI、NheIの切断部位を含んでおり、また、オリゴヌクレオチドneo2 (配列番号56)は、5’-3’方向で、制限ヌクレアーゼAscIおよびNheIの切断部位を含んでいる。PCR反応は、標準方法、例えばInnisらの方法(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990))に従ってPfu Turboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, USA)を用いて実施した。得られた約1.3kbの大きさのDNA断片は、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って精製した。このDNA断片を制限ヌクレアーゼXbaIおよびAscI (New England Biolabs, Beverly, USA)で切断し、その後、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って再度精製した。同様に、ベクターpCLiK1を制限ヌクレアーゼXbaIおよびAscIで切断し、アルカリホスファターゼ (Roche Diagnostics, Mannheim)により製造業者の説明書に従って脱リン酸化した。濃度0.8％のアガロースゲルでの電気泳動後に、線状化されたベクター（約2.1kb）をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って単離した。このベクター断片と切断したPCR断片とを、高速DNA連結キット(Roche Diagnostics, Mannheim)により製造業者の説明書に従って連結させた。この連結混合物を、Sambrookら(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載されるような標準方法により、コンピテント大腸菌XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)に形質転換した。プラスミドを担う細胞は、アンピシリン(50μg/ml)およびカナマイシン(20μg/ml)を含むLB寒天培地 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレートすることで選択した。
【０１１８】
個々のクローンのプラスミドDNAは、Qiaprepスピンミニプレップキット(Qiagen, Hilden)を製造業者の説明書に従って用いて単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK2と名づけた。
【０１１９】
ベクターpCLiK2を制限エンドヌクレアーゼDraI (New England Biolabs, Beverly, USA)で切断した。濃度0.8％のアガロースゲルでの電気泳動後に、約2.3kbのベクター断片をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って単離した。このベクター断片を高速DNA連結キット(Roche Diagnostics, Mannheim)により製造業者の説明書に従って再連結させた。この連結混合物を、Sambrookら(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載されるような標準方法により、コンピテント大腸菌XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)に形質転換した。プラスミドを担う細胞は、カナマイシン(20μg/ml)を含むLB寒天培地(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレートすることで選択した。
【０１２０】
個々のクローンのプラスミドDNAは、Qiaprepスピンミニプレップキット(Qiagen, Hilden)を用いて製造業者の説明書に従って単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK3と名づけた。
【０１２１】
PCR反応用の鋳型としてpWLQ2 (Lieblら, 1992)を用いて、オリゴヌクレオチドcg1 (配列番号57)およびcg2 (配列番号58)により複製起点pHM1519を増幅した：
cg1 (配列番号57):
5’-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3’
cg2 (配列番号58):
5’-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3’
【０１２２】
pWLQ2に相補的な配列とは別に、オリゴヌクレオチドcg1 (配列番号57)およびcg2 (配列番号58)は、制限エンドヌクレアーゼNotIの切断部位を含んでいる。PCR反応は、標準方法、例えばInnisらの方法(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990))に従ってPfu Turboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, USA)を用いて実施した。得られた約2.7kbの大きさのDNA断片は、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って精製した。このDNA断片を制限エンドヌクレアーゼNotI (New England Biolabs, Beverly, USA)で切断し、その後、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って再度精製した。同様に、ベクターpCLiK3を制限ヌクレアーゼNotIで切断し、アルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics, Mannheim)により製造業者の説明書に従って脱リン酸化した。濃度0.8％のアガロースゲルでの電気泳動後に、線状化されたベクター（約2.3kb）をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って単離した。このベクター断片と切断したPCR断片とを、高速DNA連結キット(Roche Diagnostics, Mannheim)により製造業者の説明書に従って連結させた。この連結混合物を、Sambrookら(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載されるような標準方法により、コンピテント大腸菌XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)に形質転換した。プラスミドを担う細胞は、カナマイシン(20μg/ml)を含むLB寒天培地 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレートすることで選択した。
【０１２３】
個々のクローンのプラスミドDNAは、Qiaprepスピンミニプレップキット(Qiagen, Hilden)を用いて製造業者の説明書に従って単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK5と名づけた。
【０１２４】
pCLiK5を多重クローニング部位(MCS)だけ伸長させるために、制限エンドヌクレアーゼSwaI、XhoI、AatI、ApaI、Asp718、MluI、NdeI、SpeI、EcoRV、SalI、ClaI、BamHI、XbaIおよびSmaIの切断部位を含む、2つの本質的に相補的な合成オリゴヌクレオチドHS445 ((配列番号59)およびHS446 (配列番号60))を組み合わせて、それらを一緒に95℃に加熱した後、徐々に冷却することで二本鎖DNA断片を得た。
【０１２５】
HS445 (配列番号59):
5’-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3’
HS446 (配列番号60):
5’-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3’
【０１２６】
ベクターpCLiK5を制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびBamHI (New England Biolabs, Beverly, USA)で切断し、アルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))により製造業者の説明書に従って脱リン酸化した。濃度0.8％のアガロースゲルでの電気泳動後に、線状化されたベクター（約5.0kb）をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って単離した。このベクター断片と合成二本鎖PCR断片とを、高速DNA連結キット(Roche Diagnostics, Mannheim)により製造業者の説明書に従って連結させた。この連結混合物を、Sambrookら(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載されるような標準方法により、コンピテント大腸菌XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)に形質転換した。プラスミドを担う細胞は、カナマイシン(20μg/ml)を含むLB寒天培地 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレートすることで選択した。
【０１２７】
個々のクローンのプラスミドDNAは、Qiaprepスピンミニプレップキット(Qiagen, Hilden)を用いて製造業者の説明書に従って単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK5MCSと名づけた。
【０１２８】
Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467に従ってシークエンシング反応を実施した。シークエンシング反応物を分画化して、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて分析した。
【０１２９】
得られたプラスミドpCLiK5MCSを配列番号63として示す。
【０１３０】
実施例２：  pCLiK5MCS integrativ sacBの構築
PCR反応の鋳型としてpK19mob (Schaferら, Gene 145,69-73(1994))を用いて、オリゴヌクレオチドBK1732およびBK1733により枯草菌（Bacillus subtilis）のsacB遺伝子（レバンスクラーゼをコードする）を増幅した：
BK1732 (配列番号61):
5’-GAGAGCGGCCGCCGATCCTTTTTAACCCATCAC-3’
BK1733 (配列番号62):
5’-AGGAGCGGCCGCCATCGGCATTTTCTTTTGCG-3’
【０１３１】
pEK19mobsacに相補的な配列とは別に、オリゴヌクレオチドBK1732およびBK1733は制限エンドヌクレアーゼNotIの切断部位を含んでいる。PCR反応は、標準方法、例えばInnisらの方法(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990))に従ってPfu Turboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, USA)を用いて実施した。得られた約1.9kbの大きさのDNA断片は、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って精製した。このDNA断片を制限エンドヌクレアーゼNotI (New England Biolabs, Beverly, USA)で切断し、その後、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って再度精製した。
【０１３２】
同様に、ベクターpCLiK5MCS（実施例１に従って作製した）を制限ヌクレアーゼNotIで切断し、アルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))により製造業者の説明書に従って脱リン酸化した。濃度0.8％のアガロースゲルでの電気泳動後に、約2.4kbの大きさのベクター断片をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って単離した。このベクター断片と切断したPCR断片とを、高速DNA連結キット(Roche Diagnostics, Mannheim)により製造業者の説明書に従って連結させた。この連結混合物を、Sambrookら(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載されるような標準方法により、コンピテント大腸菌XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)に形質転換した。プラスミドを担う細胞は、カナマイシン(20μg/ml)を含むLB寒天培地 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレートすることで選択した。
【０１３３】
個々のクローンのプラスミドDNAは、Qiaprepスピンミニプレップキット(Qiagen, Hilden)を用いて製造業者の説明書に従って単離し、制限酵素消化により調べた。このようにして得られたプラスミドをpCLiK5MCS integrativ sacBと名づけた。
【０１３４】
Sangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467に従ってシークエンシング反応を実施した。シークエンシング反応物を分画化して、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて分析した。
【０１３５】
得られたプラスミドpCLiK5MCS integrativ sacBを配列番号64として示す。
【０１３６】
同様にして、metH遺伝子の発現または過剰発現に適した別のベクターを作製することが可能である。
【０１３７】
以下の実施例3〜8では、LU1479 lysC 311ile ET-16 pC Phsdh metH Scと称される、改良されたメチオニン産生株の段階的作製について説明する。
【０１３８】
実施例３：  C. グルタミカムLU1479株からのlysC遺伝子の単離
C. グルタミカムATCC13032（以後、LU1479という）において酵素アスパラギン酸キナーゼをコードするlysC野生型遺伝子の対立遺伝子交換を、ステム構築の第1段階で実施することにする。ヌクレオチド交換は、LysC遺伝子において311位のアミノ酸Thrが、生じるタンパク質ではアミノ酸Ileに交換されるように実施される。
【０１３９】
PCR反応の鋳型としてのLU1479染色体DNAから出発して、Pfu-Turbo PCRシステム(Stratagene USA)を製造業者の説明書に従って用いて、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号65および配列番号66により増幅を行った。C. グルタミカムATCC 13032の染色体DNAは、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828の方法により調製した。増幅された断片は、その5’末端でSalI制限切断部位に、その3’末端でMluI制限切断部位に接している。クローニングに先立って、増幅断片をこれら2種類の制限酵素で消化し、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により精製した。
【０１４０】
配列番号65
5’-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3’
配列番号66 
5’-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3’
【０１４１】
得られたポリヌクレオチドをSalIおよびMluI反応切断によりpCLIK5 MCS integrativ SacB（以後pCISという; 実施例2の配列番号64)にクローニングして、大腸菌XL-1 blueに形質転換した。プラスミドを担う細胞は、カナマイシン(20μg/ml)を含むLB寒天培地 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレートすることで選択した。プラスミドを単離し、予想されたヌクレオチド配列をシークエンシングにより確認した。プラスミドDNAの調製は、Quiagenの方法および材料を用いて行った。シークエンシング反応は、Sangerら. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467に記載されるとおりに実施した。シークエンシング反応物を分離し、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)を用いて評価した。得られたプラスミドpCIS lysCを配列番号77として示す。
【０１４２】
配列番号77の配列は下記の必須部分領域を含む：
【表２】
2005522218.tif 000003
【０１４３】
実施例４：  C. グルタミカムlysC遺伝子の突然変異誘発
C. グルタミカムlysC遺伝子（実施例3）の特定部位の突然変異誘発は、QuickChangeキット(Stratagene/USA)を製造業者の説明書に従って用いて実施した。プラスミドpCIS lysC、配列番号77において突然変異誘発を行った。thr311を311ileと交換するためにQuickchange法(Stratagene)を用いて以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
配列番号67
5’-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3’
配列番号68 
5’-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3’
これらのオリゴヌクレオチドプライマーをQuickchange反応で使用すると、lysC遺伝子の932位でヌクレオチドの交換（CがTと置き換わる）(配列番号75参照)が起こって、対応する酵素では311位でアミノ酸の置換(Thr→Ile) (配列番号76参照)が生じる。lysC遺伝子におけるアミノ酸置換Thr311ileは、大腸菌XL1-blueへの形質転換とプラスミドの調製後にシークエンシングを行って確認した。このプラスミドをpCIS lysC thr311ileと命名し、配列番号78として示す。
【０１４４】
配列番号78の配列は下記の必須部分領域を含む：
【表３】
2005522218.tif 000004
【０１４５】
プラスミドpCIS lysC thr311ileは、Lieblら (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303に記載されるようなエレクトロポレーションにより、C. グルタミカムLU1470に形質転換した。このプロトコルの改変がDE-A-10046870に記載されている。個々の形質転換体のlysC遺伝子座の染色体配置を、Sambrookら (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harborに記載されるようなサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションを用いて、標準方法により証明した。これは、形質転換体が相同的組換えによってlysC遺伝子座に組み込まれた形質転換プラスミドを有するものであることを確実にするために行った。こうしたコロニーを、抗生物質を含まない培地で一晩増殖させ、その後細胞をスクロースCM寒天培地（10％スクロース）にプレートして30℃で24時間インキュベートした。
【０１４６】
ベクターpCIS lysC thr311ile中に存在するsacB遺伝子はスクロースを毒性の産物に変換するので、第2の相同的組換え段階により野生型lysC遺伝子と突然変異型遺伝子lysC thr311ileとの間でsacB遺伝子が欠失されているコロニーのみが増殖を確立することができる。この相同的組換え段階においては、野生型遺伝子または突然変異型遺伝子のいずれかがsacB遺伝子と共に欠失されうる。sacB遺伝子が野生型遺伝子と一緒に除かれる場合に、突然変異型の形質転換体が生じる。
【０１４７】
増殖を確立したコロニーを取り上げて、カナマイシン感受性表現型について調べた。sacB遺伝子が欠失されたクローンは同時にカナマイシン感受性の増殖挙動を示すはずである。そのようなKan感受性クローンを振とうフラスコ内でそのリシン産生能について調べた（実施例6参照）。比較のために、未処理のLU1479株を増殖させた。リシン生産が対照を超えているクローンを選択し、染色体DNAを取得し、LysC遺伝子の一致する領域をPCR反応により増幅して配列決定を行った。増大したリシン合成の性質を有し、かつ932位でのlysCの突然変異が確認されたクローンをLU1479 lysC 311ileと命名した。
【０１４８】
実施例５：  エチオニン耐性C. グルタミカム株の作製
ステム構築の第2段階において、エチオニン耐性を誘導するために、得られたLU1479 lysC 311ile株（実施例4）を処理した（Kase, H. Nakayama K. Agr. Biol. Chem. 39 153-106 1975、コリネバクテリウム・グルタミカムのメチオニン類似体耐性突然変異株によるL-メチオニン生産）。すなわち、BHI培地(Difco)での一晩培養物をクエン酸バッファー(50mM pH 5.5)で洗浄し、N-メチルニトロソグアニジン（50mMクエン酸 pH5.5中10mg/ml）を用いて30℃で20分間処理した。化学的突然変異原N-メチルニトロソグアニジンで処理した後、細胞を洗浄し（50mMクエン酸バッファー pH5.5）、500mlに対して下記の成分を含む培地にプレートした：10g (NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.125g MgSO4*7H2O、21g MOPS、50mg CaCl2、15mg プロテオカテキュエート(proteocatechuate)、0.5mg ビオチン、1mg チアミン、5g/l D,L-エチオニン(ドイツSigma Chemicals)、pH7.0。さらに、この培地は0.5mlの微量栄養素塩溶液を含んでいた：10g/l FeSO4*7H2O、1g/l MnSO4*H2O、0.1g/l ZnSO4*7H2O、0.02g/l CuSO4、0.002g/l NiCl2*6H2O。塩はすべて0.1M HCl中に溶解させた。完成した培地を濾過滅菌し、無菌の50％グルコース溶液40mlを添加し、無菌の液状寒天を最終濃度1.5％となるまで添加して、この混合物を培養皿に注いだ。
【０１４９】
突然変異誘発処理を受けた細胞を、上記の培地を含むプレートに入れて30℃で3〜7日間インキュベートした。得られたクローンを単離し、選択培地で少なくとも1回単離してから振とうフラスコ内の培地IIでそれらのメチオニン産生能について試験した（実施例6参照）。
【０１５０】
実施例６：  LU1479 lysC 311ile ET-16株を用いたメチオニンの生産
実施例5で作製した菌株を、CM培地を含む寒天プレート上で30℃で2日間増殖させた。
【０１５１】
CM寒天：
10.0g/l D-グルコース、2.5g/l NaCl、2.0g/l 尿素、10.0g/l Bacto-ペプトン(Difco)、5.0g/l 酵母エキス(Difco)、5.0g/l ビーフエキス(Difco)、22.0g/l 寒天(Difco)、オートクレーブ滅菌（20分、121℃）。
【０１５２】
次いで細胞をプレートから掻きとって、生理食塩水に懸濁させた。主培養の場合は、100mlエルレンマイヤーフラスコ内の10mlの培地IIおよび0.5gのオートクレーブ滅菌CaCO3 (Riedel de Haen)に上記の細胞懸濁液を1.5のOD600nmに接種し、オービタルシェーカー上で200rpm、30℃で72時間インキュベートした。
【０１５３】
培地II：
40g/l      スクロース
60g/l      糖蜜 (糖含有率100%に基づく)
10g/l      (NH4)2SO4
0.4g/l     MgSO4*7H2O
0.6g/l     KH2PO4
0.3mg/l    チアミン*HCl
1mg/l      ビオチン       (NH4OHでpH8.0にした1mg/ml濾過滅菌ストック溶液から)  
2mg/l      FeSO4
2mg/l      MnSO4
NH4OHでpH7.8に調整してからオートクレーブ滅菌（20分、121℃）した。さらに、ストック溶液（200μg/ml、濾過滅菌）からのビタミンB12 (ヒドロキシコバラミン、Sigma Chemicals)を添加して最終濃度を100μg/lとした。
【０１５４】
培養ブロス中に生成されたメチオニンと他のアミノ酸を、Agilentからのアミノ酸測定法を用いてAgilent 1100シリーズLCシステムHPLCで測定した。カラム分離前のオルト-フタルアルデヒドによる誘導体化により、生成されたアミノ酸を定量化することができた。アミノ酸混合物はHypersil AAカラム(Agilent)で分離した。
【０１５５】
メチオニン産生能がもとの菌株LU1479 lysC 311ileより少なくとも2倍高いクローンを単離した。そのような1つのクローンをLU1479 lysC 311ile ET-16と命名して、後続の実験で使用した。
【０１５６】
実施例７：  ストレプトマイセス・ケリコロール（Streptomyces coelicolor）由来のmetHのクローニングおよびプラスミドpCPhsdh metH Scへのクローニング
a)  ストレプトマイセス・ケリコロール（Streptomyces coelicolor）ATCC BAA-471株（米国アトランタのAmerican Type Strain Culture Collection (ATCC)からカタログ番号BAA-471Dで入手可能）から染色体DNAを単離した。C. グルタミカムATCC 13032の染色体DNAをTauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828に記載の方法により調製した。
【０１５７】
約180塩基対の長さのDNA断片を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、例えばInnisら (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Pressに記載されるような標準方法によりホモセリンデヒドロゲナーゼ(HsDH)の非コード5’領域（プロモーター領域）から増幅したが、その際、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号69および配列番号70、鋳型としてC. グルタミカム染色体DNA、Pfu Turboポリメラーゼ(Stratagene)を使用した。この増幅断片は、その5’末端でXhoI制限酵素切断部位に、その3’末端でオリゴにより導入された相同領域に接しており、ストレプトマイセス・ケリコロール（Streptomyces coelicolor）metHに相同である。
【０１５８】
配列番号69
5’-GAGACTCGAGGGAAGGTGAATCGAATTTCGG-3’
および
配列番号70
5’-GTCCCGGGGAGAACGCACGATTCTCCAAAAATAATCGC-3’
【０１５９】
得られたDNA断片をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って精製した。
【０１６０】
b)  PCR反応用の鋳型としてのストレプトマイセス・ケリコロール（Streptomyces coelicolor）染色体DNA、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号71および配列番号72を用いて、GC-RICH PCRシステムズ(Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の説明書に従って用いてmetHの断片を増幅した。この増幅断片は、その5’末端でオリゴにより導入された領域に接しており、C. グルタミカムHsDHプロモーター領域に相同である。
【０１６１】
配列番号71
5’-GAATCGTGCGTTCTCCCCGGGAC-3’
および
配列番号72
5’-GTAGTTGACCGAGTTGATCACC-3’
【０１６２】
得られた約1.4kbのDNA断片をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って精製した。
【０１６３】
c)  さらなるPCR反応においては、上で得られた2つの断片を一緒に鋳型として用いた。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号71および配列番号70（それぞれの他方の断片に相同）により導入された領域のため、2つの断片はPCR反応中に互いにアニーリングし、また、用いたポリメラーゼのため、伸長して連続DNA鎖を形成する。標準方法を改変し、用いるオリゴヌクレオチドプライマー配列番号69および配列番号72のみを第2サイクルの開始時に反応混合物に添加するようにした。
【０１６４】
増幅された約1.6kbのDNA断片をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCRにより製造業者の説明書に従って精製した。その後、これを制限酵素XhoIおよびNotI (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、ゲル電気泳動により分離した。次いで、約1.6kbのDNA断片をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)によりアガロースから単離した。
【０１６５】
d)  まだ失われているmetH 3’領域を、鋳型としてストレプトマイセス・ケリコロール（Streptomyces coelicolor）染色体DNAから出発して、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号73および配列番号74を用いて、GC-RICH PCRシステムズ(Roche Diagnostics, Mannheim)により製造業者の説明書に従って増幅した。この増幅断片は、その3’末端で、オリゴにより導入されたEcoRV制限酵素切断部位に接している。
【０１６６】
配列番号73
5’-CCGGCCTGGAGAAGCTCG-3’
および
配列番号74
5’-GAGAGATATCCCTCAGCGGGCGTTGAAG-3’
【０１６７】
得られた約2.2kbのDNA断片をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)により製造業者の説明書に従って精製した。その後、これを制限酵素NotIおよびEcoRV (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、ゲル電気泳動により分離した。次いで、約2.2kbのDNA断片をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR (Amersham Pharmacia, Freiburg)によりアガロースから単離した。
【０１６８】
e)  ベクターpClik5MCS 配列番号63 (実施例1)を制限酵素XhoIおよびEcoRV (Roche Diagnostics, Mannheim)で切断し、電気泳動による分離後、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCRを用いて5kb断片を単離した。
【０１６９】
このベクター断片を2つの切断・精製したPCR断片と、高速DNA連結キット(Roche Diagnostics, Mannheim)を製造業者の説明書に従って用いて連結させ、この連結反応物を、Sambrookら (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載されるように、コンピテント大腸菌XL-1Blue (Stratagene, La Jolla, USA)に形質転換した。カナマイシン(20μg/ml)含有LB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にプレートすることにより、プラスミドを担う細胞を選択した。
【０１７０】
プラスミドDNAを、Quiagenの方法によりQuiagenから得られる材料を用いて調製した。シークエンシング反応はSangerら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467に記載されるように行った。シークエンシング反応物を分離して、ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)により評価した。
【０１７１】
得られたプラスミドpC Phsdh metH Sc (ストレプトマイセス・ケリコロール)を配列番号79として示す。
【０１７２】
配列番号79の配列は下記の必須部分領域を含む：
【表４】
2005522218.tif 000005
【０１７３】
実施例８：  プラスミドpC Phsdh metH Scによる菌株LU1479 lysC 311ile ET-16の形質転換
記載される方法(Lieblら (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303)を用いて、菌株LU1479 lysC 311ile ET-16 (実施例5)をプラスミドpC Phsdh metH Sc (実施例7)で形質転換した。形質転換混合物を、プラスミド含有細胞の選択を行うために20mg/lのカナマイシンを補充したCM培地にプレートした。得られたKan耐性クローンを拾い上げて単離した。これらのクローンのメチオニン産生能を振とうフラスコ実験（実施例6参照）で調べた。菌株LU1479 lysC 311ile ET-16 pC Phsdh metH Scは、菌株LU1479 lysC 311ile ET-16と比較して、顕著に多いメチオニンを産生した。
【配列表】
2005522218.tif 000006
2005522218.tif 000007
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月15日(2004.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の硫黄含有ファインケミカルの発酵による生産方法であって、以下の工程：
a)  目的の硫黄含有ファインケミカルを産生するコリネ型細菌培養物を発酵させること、ただし、該コリネ型細菌はメチオニンシンターゼ（metH）活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列を発現するものであること、
b)  培地または細菌細胞中の硫黄含有ファインケミカルを濃縮すること、
c)  硫黄含有ファインケミカルを単離すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
硫黄含有ファインケミカルがL-メチオニンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
異種のmetHコードヌクレオチド配列が、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032株由来のmetHコード配列に対して70％より低い相同性を有する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記metHコード配列が以下の生物のいずれかに由来するものである、請求項3に記載の方法。
2005522218.tif 000261
【請求項５】
前記metHコード配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49もしくは51に示すコード配列、または、それに相同な、metH活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記metHコード配列がmetH活性を有するタンパク質をコードし、前記タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50もしくは52に示すアミノ酸配列、または、それに相同な、metH活性を有するタンパク質を表すアミノ酸配列を含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記コードmetH配列が、コリネ型細菌内で複製可能であるかまたは染色体に安定に組み込まれているDNAまたはRNAである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
a)  少なくとも1コピーのコードmetH配列を調節配列の制御下で担持するプラスミドベクターにより形質転換された細菌株を使用する、または
b)  コードmetH配列が細菌の染色体に組み込まれている細菌株を使用する、
請求項7に記載の方法。
【請求項９】
コードmetH配列が過剰発現される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、目的の硫黄含有ファインケミカルの生合成経路、またはそれと関連した生合成もしくは代謝経路の少なくとも1つの別の遺伝子が増幅されているか、またはその活性が代謝的代謝産物によって影響されないように突然変異している細菌を発酵させる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
目的の硫黄含有ファインケミカルの生産を低下させる少なくとも1つの代謝経路が少なくとも部分的にスイッチオフされている細菌を発酵させる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
同時に、以下の遺伝子：
a)  アスパラギン酸キナーゼをコードするlysC遺伝子、
b)  グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap、
c)  3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk、
d)  ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc、
e)  トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi、
f)  ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA、
g)  シスタチオニンγ-シンターゼをコードする遺伝子metB、
h)  シスタチオニンγ-リアーゼをコードする遺伝子metC、
i)  セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA、
j)  O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY、
k)  ビタミンB12依存性メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH、
l)  ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC、
m)  ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB、
n)  セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE、および
o)  ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするhom遺伝子、
の中から選択される1つ以上の遺伝子が、過剰発現されるか、または、特に、対応するタンパク質の活性が、非突然変異タンパク質と比較して、影響されるにしてもより少ない程度に代謝的代謝産物によって影響されるように、かつ／またはこれらのタンパク質がより高い活性および／または基質特異性をもつように、突然変異しているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
同時に、以下の遺伝子：
a)  ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB、
b)  トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA、
c)  トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC、
d)  メソ-ジアミノピメリン酸D-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh、
e)  ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck、
f)  グルコース-6-リン酸6-イソメラーゼをコードする遺伝子pgi、
g)  ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB、
h)  ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA、
i)  ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB、および
j)  ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、
の中から選択される1つ以上の遺伝子が、発現率を変えることにより、または特異的な突然変異を導入することにより減衰されているか、または活性の低下を示すタンパク質を発現するコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
コリネバクテリウム・グルタミカム菌種の微生物を使用する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
メチオニン生合成阻害剤に対して耐性を有する微生物を使用する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
lysC thr311ileまたはその機能的等価物をコードするプラスミドpCIS lysC thr311ile。
【請求項１７】
請求項16に記載のプラスミドで形質転換された宿主生物。
【請求項１８】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム菌種の微生物の中から選択される、請求項17に記載の宿主生物。
【請求項１９】
LU1479 lysC 311ileである、請求項18に記載の宿主生物。
【請求項２０】
ストレプトマイセス・ケリコロールmetHをコードするプラスミドpC Phsdh metH Sc。
【請求項２１】
外因性metHをコードするプラスミドで形質転換された、請求項17〜19のいずれか1項に記載の宿主生物。
【請求項２２】
請求項20に記載のプラスミドで形質転換された、請求項21に記載の宿主生物。
【請求項２３】
少なくとも1種のメチオニン生合成阻害剤に対して耐性を有する、請求項17〜19、21および22のいずれか1項に記載の宿主生物。
【請求項２４】
発酵ブロスからL-メチオニン含有動物飼料添加物を製造する方法であって、以下の工程：
a)  発酵培地においてL-メチオニン産生微生物を培養しかつ発酵させること、
b)  L-メチオニンを含有する発酵ブロスから水を除去すること、
c)  発酵中に形成された0〜100重量％のバイオマスを取り除くこと、および
d)  工程b)および／またはc)で得られた発酵ブロスを乾燥させて、所望の粉末または顆粒形態の動物飼料添加物を得ること、
を含んでなる方法。
【請求項２５】
請求項1〜15、17〜19、または21〜23のいずれか1項に記載の定義に従う微生物を使用する、請求項24に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月16日(2004.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-メチオニンおよびS-アデノシルメチオニンから選択される少なくとも1種の硫黄含有ファインケミカルの発酵による生産方法であって、以下の工程：
a)  目的の硫黄含有ファインケミカルを産生するコリネ型細菌培養物を発酵させること、ただし、該コリネ型細菌はメチオニンシンターゼ（metH）活性を有するタンパク質をコードする少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列を発現するものであり、該配列はコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032株由来のmetHコード配列に対して70％より低い相同性を有すること、
b)  培地または細菌細胞中の硫黄含有ファインケミカルを濃縮すること、
c)  硫黄含有ファインケミカルを単離すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
硫黄含有ファインケミカルがL-メチオニンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記metHコード配列がストレプトマイセス・ケリコロールATCC 10147由来である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記metHコード配列が以下の生物のいずれかに由来するものである、請求項1に記載の方法。
2005522218.tif 000262
【請求項５】
前記metHコード配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49もしくは51に示すコード配列、または、該コード配列に相同な、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032由来のmetHコード配列に対して70％より低い相同性を有しかつmetH活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記metHコード配列がmetH活性を有するタンパク質をコードし、前記タンパク質が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50もしくは52に示すアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列に相同な、metH活性を有するタンパク質を表すアミノ酸配列を含んでなり、該相同なアミノ酸配列がコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032由来のmetHコード配列に対して70％より低い相同性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記コードmetH配列が、コリネ型細菌内で複製可能であるかまたは染色体に安定に組み込まれているDNAまたはRNAである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
a)  少なくとも1コピーのコードmetH配列を調節配列の制御下で担持するプラスミドベクターにより形質転換された細菌株を使用する、または
b)  コードmetH配列が細菌の染色体に組み込まれている細菌株を使用する、
請求項7に記載の方法。
【請求項９】
コードmetH配列が過剰発現される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、目的の硫黄含有ファインケミカルの生合成経路、またはそれと関連した生合成もしくは代謝経路の少なくとも1つの別の遺伝子が増幅されているか、またはその活性が代謝的代謝産物によって影響されないように突然変異している細菌を発酵させる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
目的の硫黄含有ファインケミカルの生産を低下させる少なくとも1つの代謝経路が少なくとも部分的にスイッチオフされている細菌を発酵させる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
同時に、以下の遺伝子：
a)  アスパラギン酸キナーゼをコードするlysC遺伝子、
b)  グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap、
c)  3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk、
d)  ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc、
e)  トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi、
f)  ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA、
g)  シスタチオニンγ-シンターゼをコードする遺伝子metB、
h)  シスタチオニンγ-リアーゼをコードする遺伝子metC、
i)  セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA、
j)  O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY、
k)  ビタミンB12依存性メチオニンシンターゼをコードする遺伝子metH、
l)  ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC、
m)  ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB、
n)  セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE、および
o)  ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするhom遺伝子、
の中から選択される1つ以上の遺伝子が、過剰発現されるか、または、特に、対応するタンパク質の活性が、非突然変異タンパク質と比較して、影響されるにしてもより少ない程度に代謝的代謝産物によって影響されるように、かつ／またはこれらのタンパク質がより高い活性および／または基質特異性をもつように、突然変異しているコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
同時に、以下の遺伝子：
a)  ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB、
b)  トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA、
c)  トレオニンシンターゼをコードする遺伝子thrC、
d)  メソ-ジアミノピメリン酸D-デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh、
e)  ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck、
f)  グルコース-6-リン酸6-イソメラーゼをコードする遺伝子pgi、
g)  ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB、
h)  ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子dapA、
i)  ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB、および
j)  ジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、
の中から選択される1つ以上の遺伝子が、発現率を変えることにより、または特異的な突然変異を導入することにより減衰されているか、または活性の低下を示すタンパク質を発現するコリネ型細菌を発酵させる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
コリネバクテリウム・グルタミカム菌種の微生物を使用する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
メチオニン生合成阻害剤に対して耐性を有する微生物を使用する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
lysC thr311ileをコードするプラスミドpCIS lysC thr311ile（配列番号78）。
【請求項１７】
請求項16に記載のプラスミドで形質転換された宿主生物。
【請求項１８】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム菌種の微生物の中から選択される、請求項17に記載の宿主生物。
【請求項１９】
LU1479 lysC 311ileである、請求項18に記載の宿主生物。
【請求項２０】
ストレプトマイセス・ケリコロールmetHをコードするプラスミドpC Phsdh metH Sc（配列番号79）。
【請求項２１】
外因性metHをコードするプラスミドで形質転換された、請求項17〜19のいずれか1項に記載の宿主生物。
【請求項２２】
請求項20に記載のプラスミドで形質転換された、請求項21に記載の宿主生物。
【請求項２３】
少なくとも1種のメチオニン生合成阻害剤に対して耐性を有する、請求項17〜19、21および22のいずれか1項に記載の宿主生物。
【請求項２４】
発酵ブロスからL-メチオニン含有動物飼料添加物を製造する方法であって、以下の工程：
a)  発酵培地においてL-メチオニン産生微生物を培養しかつ発酵させること、
b)  L-メチオニンを含有する発酵ブロスから水を除去すること、
c)  発酵中に形成された0〜100重量％のバイオマスを取り除くこと、および
d)  工程b)および／またはc)で得られた発酵ブロスを乾燥させて、所望の粉末または顆粒形態の動物飼料添加物を得ること、
を含んでなる方法。
【請求項２５】
請求項1〜15、17〜19、または21〜23のいずれか1項に記載の定義に従う微生物を使用する、請求項24に記載の方法。
【国際調査報告】
2005522218.tif 000263
2005522218.tif 000264
2005522218.tif 000265
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