(57)【要約】生物学的物質からマクロライド、特にタクロリムスを取得する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロライドを取得する方法であって、マクロライド含有生物学的物質を疎水性抽出溶剤を用いて抽出して、上記疎水性抽出溶剤中、マクロライドの溶液を取得するステップを含み、ここで、上記の抽出されるマクロライド含有生物学的物質のｐＨが約５．５〜約１３である前記方法。
【請求項２】
前記疎水性抽出溶剤が、２５℃で液体であり、かつ、大気圧にて約１５０℃未満に沸点をもつ、ｎ−ブタノール、イソブタノール、酢酸若しくはギ酸のＣ2−Ｃ6直鎖及び分枝エステル、Ｃ3−Ｃ6直鎖若しくは分枝脂肪族ケトン、ハロゲン化メタン、ハロゲン化エタン、並びに芳香族炭化水素から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疎水性抽出溶剤が、ｎ−ブタノール、イソブタノール、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｔ−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、アセトン、ブチル・メチル・ケトン、メチル・イソブチル・ケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン、ジクロロエタン、及びトルエンから成る群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記疎水性抽出溶剤が、酢酸エチル、酢酸イソブチル又はその混合物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性抽出溶剤が、酢酸イソブチルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出が、約２℃〜約７０℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抽出が、約１５℃〜約３５℃の温度で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記の抽出される生物学的物質のｐＨが、約７．５〜約１３である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記のマクロライド含有生物学的物質が、ストレプトマイセス・ツクバエンシス、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス及びストレプトマイセス・リビダンスから選ばれる微生物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記のマクロライド含有生物学的物質が、醗酵培地全体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記マクロライドがタクロリムスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的物質のｐＨが、約７．５〜約１３である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疎水性抽出溶剤が、酢酸イソブチルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抽出後に以下のステップ：
前記の抽出されたマクロライド含有生物学的物質から前記のマクロライド含有溶液を分離し；
上記の分離したマクロライド含有溶液を濃縮し；
上記の濃縮したマクロライド含有溶液をシリカゲル・カラムに添加し、そして溶離剤を用いて溶離して、少なくとも１のマクロライド含有画分、すなわちマクロライド含有溶液を得；
上記のマクロライド含有溶液からマクロライドを結晶化させ；そして
上記結晶マクロライドを単離する、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記結晶化が、前記の少なくとも１のマクロライド含有画分、すなわちマクロライド含有溶液を濃縮し、そして上記濃縮した溶液を約２５℃以下の温度に冷却することによって達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記結晶化が、前記分離した溶液を結晶形成溶剤と混ぜ合わせることによって達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記結晶形成溶剤が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ｉ−プロパノール、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタン及び水から成る群から選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記結晶形成溶剤が、メタノール、エタノール、ｉ−プロパノール及び水から成る群から選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分離した溶液と結晶形成溶剤の組み合わせ物を、約２５℃以下の温度で、約１０〜約６０時間の放置期間維持する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
タクロリムス含有生物学的物質からタクロリムスを取得する方法であって、以下のステップ：
ａ）タクロリムス含有生物学的物質、すなわちストレプトマイセス・ツクバエンシス、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス及びストレプトマイセス・リビダンスから成る群から選ばれる微生物の醗酵によって得られる醗酵培地全体を、ｎ−ブタノール、イソブタノール、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｔ−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチル・メチル・ケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン、ジクロロエタン及びトルエンから成る群から選ばれる疎水性抽出溶剤を用いて、約２℃〜約７０℃の温度、及び約５．５〜約１３のｐＨにて抽出して、疎水性溶剤中、タクロリムスの溶液を得；
ｂ）上記の抽出したタクロリムス含有生物学的物質から上記のタクロリムス含有溶液を分離し；
ｃ）上記のタクロリムス含有溶液を濃縮し；
ｄ）上記の濃縮したタクロリムス含有溶液を、シリカゲル・クロマトグラフィー・カラムに添加し、そして溶離剤を用いて上記カラムから溶離させて、少なくとも１のタクロリムス含有画分、すなわちタクロリムス含有溶液を得；
ｄ）少なくとも１のタクロリムス含有画分からタクロリムスを結晶化させ、それによって、結晶タクロリムスの沈殿物を形成させ；そして
ｅ）上記結晶タクロリムスを分離する、
を含む前記方法。
【請求項２１】
前記醗酵培地全体のｐＨが、約７．５〜約１３である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記疎水性抽出溶剤が、酢酸イソブチルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抽出が、約１５℃〜約３０℃の温度で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記結晶化が、前記の少なくとも１のタクロリムス含有画分を濃縮し、そして上記濃縮した画分を約２５℃以下の温度に冷却することによって達成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記結晶化が、前記の少なくとも１のタクロリムス含有画分を、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタン及び水から成る群から選ばれる結晶形成溶剤と混ぜ合わせることによって達成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
タクロリムス含有生物学的物質からタクロリムスを取得する方法における、タクロリムス含有生物学的物質、すなわち醗酵培地全体を、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｔ−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチル・メチル・ケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン及びトルエンから成る群から選ばれる疎水性抽出溶剤を用いて抽出するステップであって、ここで、上記のタクロリムス含有生物学的物質のｐＨが約５．５〜約１３である前記ステップ。
【請求項２７】
タクロリムス含有生物学的物質からタクロリムスを取得する方法であって、以下のステップ：
ａ）タクロリムス含有生物学的物質、すなわちストレプトマイセス・ツクバエンシス、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス及びストレプトマイセス・リビダンスから成る群から選ばれる微生物の醗酵によって得られる醗酵培地全体を、酢酸イソブチルを用いて、約２℃〜約７０℃の温度で抽出して、酢酸イソブチル中、タクロリムスの溶液を得；
ｂ）上記の抽出したタクロリムス含有生物学的物質から上記のタクロリムス含有溶液を分離し；
ｃ）上記のタクロリムス含有溶液を濃縮し；
ｄ）上記の濃縮したタクロリムス含有溶液を、シリカゲル・クロマトグラフィー・カラムに添加し、そして溶離剤を用いて溶離して、少なくとも１のタクロリムス含有画分、すなわちタクロリムス含有溶液を得；
ｅ）上記の少なくとも１のタクロリムス含有画分を濃縮し；
ｄ）上記の濃縮した画分からタクロリムスを結晶化させ、それによって、結晶タクロリムスの沈殿物を形成させ、そして
ｄ）上記結晶タクロリムスを分離する、
を含む前記方法。
【請求項２８】
前記のタクロリムス含有生物学的物質のｐＨが、約５．５〜約１３である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記のタクロリムス含有生物学的物質のｐＨが、約７．５〜約１３である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抽出の温度が、約１５℃〜約３５℃である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
当該出願は２００２年２月１３日に出願された仮出願番号第６０／３５６，９５９号に関する合衆国法典第３５巻１．１１９条（ｅ）の利益を主張し、そして上記文献を本明細書中に援用する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、生物学的物質、特に醗酵培地からのマクロライド、例えばタクロリムスの抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
マクロライドは、置換基として１以上のデオキシ糖をもつ多員ラクトン環である。エリスロマイシン、アジスロマイシン及びクラリスロマイシンが静菌及び／又は殺菌活性を有するマクロライドである。
【０００４】
タクロリムス（ＦＫ５０６）は、マクロライド系抗生物質、すなわち免疫抑制剤でもある。シクロスポリンより強力であるタクロリムスは、Ｔ細胞に対する選択的な阻害効果を有する。
【０００５】
ある程度までの合成経路が知られているが、マクロライドは一般に醗酵によって得られる。本抽出方法は、先行技術に対するいくつかの利点を提供する。例えば、本方法（「全培地法」）のために、醗酵培地全体を開始材料として使用することができ、そして疎水性抽出溶媒の使用は、１ステップでの菌糸体の除去によりほとんどの水溶性不純物を残し、効率のよい抽出収率を結果的にもたらす。２５℃以上の温度での減圧下での濃縮と、減圧は、タクロリムスの沈殿又は分解なしに溶剤の高い蒸発速度をもたらす。本発明のさらなる利点は、当業者に明白である。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の概要
１の側面において、本発明は、マクロライド、特にタクロリムスを取得する方法に関し、上記方法は、マクロライド含有生物学的物質を、疎水性抽出溶剤によって抽出して疎水性抽出溶剤中、上記マクロライドの溶液を取得するステップを含む。特にここで、前記疎水性抽出溶剤は、２５℃で液状であり、大気圧において約１５０℃未満の沸点をもつ、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、酢酸若しくはギ酸のＣ2−Ｃ6直鎖若しくは分枝エステル、Ｃ3−Ｃ6直鎖若しくは分枝脂肪族ケトン、ハロゲン化メタン、ハロゲン化エタン及び芳香族炭化水素から成る群から選ばれる。そしてここで、前記の抽出される生物学的物質のｐＨは約５．５〜約１３である。
【０００７】
他の側面において、本発明は、マクロライド、特にタクロリムスを取得する方法に関し、上記方法は、マクロライド含有生物学的物質を、疎水性抽出溶剤によって抽出して疎水性抽出溶剤中、上記マクロライドの溶液を取得するステップを含む。特にここで、前記疎水性抽出溶剤は、２５℃で液状であり、大気圧において約１５０℃未満の沸点をもつ、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、酢酸若しくはギ酸のＣ2−Ｃ6直鎖若しくは分枝エステル、Ｃ3−Ｃ6直鎖若しくは分枝脂肪族ケトン、ハロゲン化メタン、ハロゲン化エタン及び芳香族炭化水素から成る群から選ばれる。そしてここで、前記抽出は、約２℃〜約７０℃、特に約１５℃〜約３５℃の温度で行う。
【０００８】
さらなる側面において、本発明は、マクロライド、特にタクロリムスを取得する方法に関し、上記方法は、マクロライド含有生物学的物質を、疎水性抽出溶剤によって抽出して疎水性抽出溶剤中、上記マクロライドの溶液を取得するステップを含む。特にここで、前記疎水性抽出溶剤は、２５℃で液状であり、大気圧において約１５０℃未満の沸点をもつ、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、酢酸若しくはギ酸のＣ2−Ｃ6直鎖若しくは分枝エステル、Ｃ3−Ｃ6直鎖若しくは分枝脂肪族ケトン、ハロゲン化メタン、ハロゲン化エタン及び芳香族炭化水素から成る群から選ばれる。そしてここで、前記抽出は、約２℃〜約７０℃、特に約１５℃〜約３５℃の温度で、かつ、約５．５〜約１３、特に約７．５〜約１３のｐＨで行う。
【０００９】
さらなる側面において、本発明は、マクロライド、特にタクロリムスを取得する方法に関し、上記方法は、マクロライド含有生物学的物質を、疎水性抽出溶剤によって抽出して疎水性抽出溶剤中、上記マクロライドの溶液を得、上記マクロライド含有溶液を濃縮し、前記濃縮溶液をカラム・クロマトグラフィーによって処理して少なくとも１のマクロライド含有画分、すなわちマクロライド含有溶液を得、そして上記溶液から上記マクロライドを結晶化させるステップを含む。特にここで、前記疎水性抽出溶剤は、２５℃で液状であり、大気圧において約１５０℃未満の沸点をもつ、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、酢酸若しくはギ酸のＣ2−Ｃ6直鎖若しくは分枝エステル、Ｃ3−Ｃ6直鎖若しくは分枝脂肪族ケトン、ハロゲン化メタン、ハロゲン化エタン及び芳香族炭化水素から成る群から選ばれる。そしてここで、前記抽出は、約２℃〜約７０℃、特に約１５℃〜約３５℃の温度で、かつ、約５．５〜約１３、特に約７．５〜約１３のｐＨで行う。
【００１０】
さらに他の側面において、本発明は、マクロライド、特にタクロリムスを取得する方法に関し、上記方法は、マクロライド含有生物学的物質を、疎水性抽出溶剤によって抽出して疎水性抽出溶剤中、上記マクロライドの溶液を得、上記抽出したマクロライド含有生物学的物質から上記マクロライド含有溶液を分離し、上記の分離したマクロライド含有溶液を濃縮し、前記濃縮溶液をカラム・クロマトグラフィーによって処理して少なくとも１のマクロライド含有画分、すなわちマクロライド含有溶液を得、場合により上記溶液を濃縮し、特に約２０℃以下の温度まで冷却することによって上記任意で濃縮した分離溶液から上記マクロライドを結晶化させ、そして上記結晶化マクロライドを単離するステップを含む。特にここで、前記疎水性抽出溶剤は、２５℃で液状であり、大気圧において約１５０℃未満の沸点をもつ、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、酢酸若しくはギ酸のＣ2−Ｃ6直鎖若しくは分枝エステル、Ｃ3−Ｃ6直鎖若しくは分枝脂肪族ケトン、ハロゲン化メタン、ハロゲン化エタン及び芳香族炭化水素から成る群から選ばれる。
【００１１】
さらに他の側面において、本発明は、マクロライド、特にタクロリムスを取得する方法に関し、上記方法は、マクロライド含有生物学的物質を、疎水性抽出溶剤によって抽出して疎水性抽出溶剤中、上記マクロライドの溶液を得、上記抽出したマクロライド含有生物学的物質から上記マクロライド含有溶液を分離し、上記の分離したマクロライド含有溶液を濃縮し、前記濃縮溶液をカラム・クロマトグラフィーによって処理して少なくとも１のマクロライド含有画分、すなわちマクロライド含有溶液を得、場合により上記溶液を濃縮し、上記濃縮した分離溶液と、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタン及び水から選ばれる結晶形成溶剤とを混ぜ合わせることによって上記任意で濃縮した分離溶液から上記マクロライドを結晶化させ、そして上記結晶化マクロライドを単離するステップを含む。特にここで、前記疎水性抽出溶剤は、２５℃で液状であり、大気圧において約１５０℃未満の沸点をもつ、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、酢酸若しくはギ酸のＣ2−Ｃ6直鎖若しくは分枝エステル、Ｃ3−Ｃ6直鎖若しくは分枝脂肪族ケトン、ハロゲン化メタン、ハロゲン化エタン及び芳香族炭化水素から成る群から選ばれる。
【００１２】
よりさらなる側面において、本発明は、マクロライド、特にタクロリムスを取得する方法に関し、上記方法は、ストレプトマイセス・ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）から選ばれる微生物から得られるマクロライド含有生物学的物質を、疎水性抽出溶剤によって抽出して疎水性抽出溶剤中、上記マクロライドの溶液を取得するステップを含む。ここで、前記疎水性抽出溶剤は、２５℃で液状であり、大気圧において約１５０℃未満の沸点をもつ、ｎ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、酢酸若しくはギ酸のＣ2−Ｃ6直鎖若しくは分枝エステル、Ｃ3−Ｃ6直鎖若しくは分枝脂肪族ケトン、ハロゲン化メタン、ハロゲン化エタン及び芳香族炭化水素から成る群から選ばれる。そしてここで、前記の抽出される生物学的物質のｐＨは約５．５〜約１３である。
【００１３】
さらに他の側面において、本発明は、タクロリムス含有生物学的物質からタクロリムスを取得する方法に関し、上記方法は以下のステップ：
タクロリムス含有生物学的物質、すなわちストレプトマイセス・ツクバエンシス、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス及びストレプトマイセス・リビダンスから選ばれる微生物による醗酵によって得られる醗酵培地全体を、疎水性抽出溶剤によって抽出して上記疎水性抽出溶剤中、タクロリムス溶液を得；
上記抽出したタクロリムス含有生物学的物質から上記タクロリムス含有溶液を分離し；
上記の分離したタクロリムス含有溶液を濃縮し；
【００１４】
前記濃縮溶液をカラム・クロマトグラフィーによって処理して少なくとも１のマクロライド含有画分、すなわちマクロライド含有溶液を得、場合により上記溶液を濃縮し、上記の任意で濃縮した分離溶液を冷却するか、あるいはそれをアセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタン及び水から選ばれる結晶形成溶剤と混合することによって、上記の任意で濃縮した分離溶液から上記タクロリムスを結晶化させることにより結晶化したタクロリムスの沈殿物を形成させ、そして
タクロリムスを単離する、
を含む。ここで、前記疎水性抽出溶剤は、ｎ−酢酸ブチル、酢酸イソブチル、ｔ−酢酸ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチル・メチル・ケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン及びトルエンから成る群から選ばれる。そしてここで、前記抽出は、約２℃〜約７０℃、特に約１５℃〜約３５℃の温度で、かつ、約５．５〜約１３、特に約７．５〜約１３のｐＨで行う。
【００１５】
よりさらなる他の態様において、本発明は、タクロリムス含有生物学的物質からタクロリムスを取得する方法に関し、上記方法は以下のステップ：
タクロリムス含有生物学的物質、すなわちストレプトマイセス・ツクバエンシス、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス及びストレプトマイセス・リビダンスから選ばれる微生物による醗酵によって得られる醗酵培地全体を、酢酸イソブチルによって、約２℃〜約７０℃、特に約１５℃〜約３５℃の温度で抽出して上記酢酸イソブチル溶剤中、タクロリムス溶液を得；
上記抽出したタクロリムス含有生物学的物質から上記タクロリムス含有酢酸イソブチル溶液を分離し；
【００１６】
上記の分離したタクロリムス含有酢酸イソブチル溶液を濃縮し；
前記濃縮溶液をカラム・クロマトグラフィーによって処理して少なくとも１のマクロライド含有画分、すなわちマクロライド含有溶液を得、場合により上記溶液を濃縮し、上記の任意で濃縮した分離溶液を約２０℃以下の温度まで冷却するか、あるいはそれをアセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタン及び水から選ばれる結晶形成溶剤と混合することによって、上記の任意で濃縮した分離溶液から上記タクロリムスを結晶化させることにより結晶化したタクロリムスの沈殿物を形成させ、そして
タクロリムスを単離する、
を含む。
【００１７】
本発明の詳細な説明
１の態様において、本発明は、マクロライド含有生物学的物質からマクロライド、好ましくはタクロリムス（別名ＦＫ５０６）を取得する方法であって、疎水性抽出溶剤を用いてマクロライド含有生物学的物質からマクロライドを抽出し、そこからマクロライドを取得することができる疎水性抽出溶剤中、マクロライドの溶液を取得するステップを含む前記方法を提供する。他の態様において、本発明は、その後にそこからマクロライドが単離される濃縮液を取得するためのその溶液の濃縮が続く、疎水性抽出溶剤を用いて生物学的物質を抽出してマクロライド溶液を取得することによる、マクロライド含有生物学的物質からマクロライド、好ましくはタクロリムスを取得する方法を提供する。
【００１８】
マクロライド含有生物学的物質は、醗酵又は培養などによりマクロライドを産生するマクロライド産生微生物、例えば細菌又は真菌から、又はその使用を通し得られる物質である。微生物の醗酵は、当業者に周知の方法によって実施することができ、そして例えば１０  Ｋｉｒｋ  Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３６１（Ｊａｃｑｕｉｌｉｎｅ  Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，ｅｄ．４thｅｄ．１９９３）中のＳｕｒｊｉｔ  Ｓ．Ｓｅｎｇｈａ，Ｆｒｅｍｅｎｔａｔｉｏｎに記載されている。
【００１９】
好ましいマクロライド含有生物学的物質は、米国特許番号第４，８９４，３６６号、同第５，１１６，７５６号、同第５，６２４，８４２号、同第５，４９６，７２７号及び同第５，６２２，８６６号に記載の通り、タクロリムス含有生物学的物質、特にタクロリムス産生微生物、例えばストレプトマイセス・ツクバエンシス、その新規及び突然変異株、ストレプトマイセス・ヒグロスコピクス、並びにストレプトマイセス・リビダンスを使用した醗酵によって取得することができる醗酵培地である。
【００２０】
同様に、マクロライド産生微生物の醗酵由来の醗酵培地のろ過によって得られた菌糸体及びろ液は、本発明の実施に有用な生物学的物質である。菌糸体を分けるために濾過又は精製されていないマクロライド産生微生物の醗酵由来の醗酵培地全体、すなわち「全培地」は、本発明の実施のための好ましいマクロライド含有生物学的物質である。培地全体を使用したとき、当該方法は「全培地法（ｗｈｏｌｅ−ｂｒｏｔｈ  ｍｅｔｈｏｄ）」と呼ばれうる。
【００２１】
前記のマクロライド含有生物学的物質は、マクロライド、特にタクロリムスのための溶剤である疎水性抽出溶剤を用いて抽出されるが、それは２５℃で水にごくわずかしか溶けない。好ましい疎水性抽出溶剤は、２５℃で液体であり、かつ、大気圧にて約１５０℃未満の沸点をもつ、酢酸又はギ酸のＣ2−Ｃ6直鎖及び分枝エステル、例えば酢酸イソブチル、Ｃ3−Ｃ6直鎖又は分枝脂肪族ケトン、ハロゲン化メタン、例えばジクロロメタン、ハロゲン化エタン、例えばジクロロエタン、及び芳香族炭化水素である。通常の酢酸ブチルアルコール及び酢酸イソブチルアルコールを疎水性抽出溶剤として使用することもできる。
【００２２】
疎水性抽出溶剤として好ましいものは、酢酸イソブチル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸ｔ−ブチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、ギ酸エチル、ブチル・メチル・ケトン（２−ヘキサノン）、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン及びトルエンである。
【００２３】
酢酸エチルと酢酸イソブチルは特に好ましい疎水性抽出溶剤である。
【００２４】
マクロライドの溶液を形成する抽出は、当業者にもルーチン作業者（ｒｏｕｔｉｎｅｒ）にも知られるような方法及び装置を使って実施されうる。選ばれる方法及び装置は、ただ十分な撹拌を提供し、並びに抽出されたマクロライド含有生物学的物質から溶液を分離させ得るか、又は抽出混合物を分離デバイスに移し得る必要がある。抽出は、約２℃〜約７０℃のいずれかの好都合な温度で実施されうる。好ましくは、抽出は、約１５℃〜約３５℃の温度で実施される。当業者は、マクロライド含有生物学的物質、疎水性抽出溶剤、装置、及び使用される温度に依存する抽出時間を最適化することを知っているであろう。抽出の終了時に、前記抽出混合物は、疎水性抽出溶剤中のマクロライドの溶液、並びに抽出された、マクロライド含有生物学的物質の残渣を含む。
【００２５】
好ましい態様において、前記抽出は、生物学的物質、例えば醗酵培地であって、まずいずれかの精製処理、例えば菌糸体を除去するろ過を受けていないものに対して実施される。この場合、前記抽出が全培地抽出と呼ばれる。
【００２６】
前記抽出は、約１〜約１３のいずれかのｐＨで実施されうる。好ましくは、前記抽出は、約５．５〜約１３、最も好ましくは約７．５〜約１３のｐＨで行われる。生物学的物質、特に醗酵培地のｐＨは、好適な無機機塩基、例えばほんのいくつか挙げると、ＮＨ4ＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ又はＣａ（ＯＨ）2を使って調整されうる。前記抽出が約５．５〜約１３のｐＨを有する生物学的物質に対して実施される場合、本発明者たちは、特にマクロライドの純度に関する特別な利点を観察した。好ましくは、前記ｐＨは、アルカリ性のｐＨ、特に約７．５〜約１３のｐＨである。
【００２７】
抽出に続いて、疎水性抽出溶剤中のマクロライドの溶液は、抽出混合物から分離され、そして好ましい態様において、濃縮液を取得するために濃縮される。前記分離は、当業者にもルーチン作業者にも周知の方法と装置、例えば分液漏斗によって分離させるデカンテーション、及び液−液遠心分離機を使用した遠心分離を使用して達成されうる。
【００２８】
抽出された、マクロライド含有生物学的物質から分離された、マクロライド含有溶液は、濃縮液を取得するために濃縮される。前記濃縮は、（当業者が平均７６０ｍｍＨｇについてのわずかな変化を認める）一般的な大気圧において、又は例えば真空ポンプ又は水流吸引器の助けにより達成される減圧においてでありうる。前記濃縮は、好ましくは約２５℃超の温度で実施される。前記濃縮は、マクロライド含有溶液の量が、最初の量の約０．２〜約２．０パーセント以下まで減少するまで実施され、濃縮されたマクロライド含有溶液（「濃縮液」）を提供する。精練されていないタクロリムスを、前記濃縮液から単離することができる。
【００２９】
好ましい態様において、前記濃縮液はシリカゲル・カラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって処理される。適用されたクロマトグラフィー法は、米国特許番号第４，８９４，３６６号に記載のものであるかもしれず、上記文献の全体を本明細書中に援用する。
【００３０】
処理のために、濃縮液（濃縮されたマクロライド含有溶液）は、シリカゲル・カラムに添加される。添加のために、前記濃縮液は、溶剤、すなわちマクロライドのための溶剤、例えば酢酸エチルと組み合わされ、そしてシリカゲルと一緒にスラリーにされるかもしれない。溶剤は、スラリーから除かれ、前記マクロライドと前記濃縮液からの他の物質と一緒に添加されるシリカゲルを提供する。前記添加されたシリカゲルは、カラム上部に詰められ、所望であれば、添加溶離剤がカラムに通される。次に、前記カラムは溶離剤で抽出される。
【００３１】
前記溶離剤は、一定の組成であるイソクラティック（ｉｓｏｃｈｒａｔｉｃ）なものであるか、又は前記溶離剤の組成が溶出の間に変化するかもしれない。好ましい溶離剤は、酢酸エチルとヘキサンの混合物を含む。
【００３２】
溶離剤中のマクロライドの溶液である、少なくとも１のマクロライド含有画分を取得するために、画分がまとめられる。複数の、マクロライド含有画分が、１つのマクロライド含有画分に合わせられるかもしれない。マクロライド含有画分は、そこからマクロライドを結晶化させることができるマクロライドの濃縮溶液（濃縮画分）を取得するために、濃縮されるかもしれない。
【００３３】
前記マクロライドを、好ましくは濃縮された、マクロライド含有溶液から結晶化させる（沈澱させる）。そうして結晶化させた（沈澱させた）マクロライドは、例えばろ過又は遠心分離によって単離させることができる。結晶形成は、マクロライド含有溶液を冷やす、好ましくは約２０℃以下の温度に冷やすことによって達成され得る。同様に、好ましくは、結晶形成は、好ましくは濃縮した、マクロライド含有溶液と組み合わせた結晶形成溶剤の助けによって達成され得る。好ましい態様において、前記組み合わせ物は、その後、約２５℃以下の温度で、約１０〜約６０時間の保有期間維持される。典型的な待機時間は４８時間である。有用な結晶形成溶剤は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ヘプタン、及び水を含む。
【００３４】
特定の態様において、前記マクロライド含有溶液は、乾燥状態まで濃縮されて、さらなる冷却及び結晶形成溶剤の使用なしに、前記マクロライドが得られる。
【００３５】
本発明の実施は、以下の限定されない実施例においてさらに説明される。
【実施例】
【００３６】
実施例１
醗酵培地（５０ｍｌ）を５０ｍｌの酢酸イソブチルと混合した。前記混合物のｐＨを希硫酸溶液でｐＨ２に調整した。３０分間の撹拌の後、相を分離させた。前記分離させた酢酸イソブチル相（３９ｍｌ）を、減圧下、６０℃で乾燥状態まで濃縮した。得られた収率は８３％だった。
【００３７】
実施例２
醗酵培地（５０ｍｌ）を５０ｍｌの酢酸イソブチルと混合した。２５０ｍｇの硫酸マグネシウムと数滴の希釈したドデシル・トリメチル・アンモニウム・クロライド溶液を前記混合物に添加した。前記混合物のｐＨを希硫酸溶液でｐＨ４に調整した。３０分間の撹拌の後、相を分離させた。前記分離させた酢酸イソブチル相（４４ｍｌ）を減圧下、７０℃で乾燥状態まで濃縮した。得られた収率は８８％だった。
【００３８】
実施例３
醗酵培地（５０ｍｌ）を５０ｍｌの酢酸イソブチルと混合した。２５０ｍｇの硫酸マグネシウムと数滴の希釈されたドデシル・トリメチル・アンモニウム・クロライド溶液を前記混合物に添加した。前記混合物のｐＨを、希釈した水酸化ナトリウム溶液でｐＨ８に調整した。前記組み合わせ物を３５〜４０℃に加温した。３０分間の撹拌の後、相を分離させた。前記酢酸イソブチル相（４４ｍｌ）を減圧下、８２℃で乾燥状態まで濃縮した。得られた収率は９４％だった。
【００３９】
実施例４
醗酵培地（５０ｍｌ）を５０ｍｌの酢酸イソブチルと混合した。２５０ｍｇの硫酸マグネシウムと数滴の希釈したドデシル・トリメチル・アンモニウム・クロライド溶液を前記混合物に添加した。前記混合物のｐＨを希釈した水酸化ナトリウム溶液でｐＨ１０に調整した。前記組み合わせ物を１５℃に冷却した。３０分間の撹拌の後、相を分離させた。前記酢酸イソブチル相（４３ｍｌ）を減圧下、５５℃で乾燥状態まで濃縮した。得られた収率は９２％だった。
【００４０】
実施例５
醗酵培地（５０ｍｌ）を５０ｍｌの酢酸エチルと混合した。２５０ｍｇの硫酸マグネシウムと数滴の希釈したドデシル・トリメチル・アンモニウム・クロライド溶液を、前記混合物に添加した。前記混合物のｐＨを、希硫酸溶液でｐＨ４に調整した。３０分間の撹拌の後、相を分離させた。前記分離させた酢酸エチル相を減圧下、２９℃で乾燥状態まで濃縮した。得られた収率は９２％だった。
【国際調査報告】
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