(57)【要約】サバイビン相互作用タンパク質１およびポリヌクレオチドならびにそのようなポリペプチドを組換え技術によって製造するための方法が開示される。ＴＰＲ−１リガンドのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを診断アッセイにおいて用いるための方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号２のポリペプチド配列、および
（ｅ）(a)〜(d)に記載のかかるポリペプチドのフラグメントおよび変異体
からなる群から選択されるＴＰＲ１ポリペプチドであり、
該(a)〜(d)のＴＰＲ１リガンドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＰ１受容体もしくはその変異体に特異的に結合する能力を有する。
【請求項２】
配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のポリペプチド配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
（ａ）配列番号１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１のポリヌクレオチドに対して少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１の配列または少なくとも15塩基長を有するそのフラグメントを有する標識されたプローブを用いた厳格なハイブリダイゼーション条件下でライブラリをスクリーニングすることにより得られる少なくとも100塩基長の塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｆ）(a)〜(e)のポリヌクレオチドのＲＮＡ等価体であるポリヌクレオチド、
（ｇ）(a)〜(f)のいずれかの前記ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド配列、および
（ｈ）(a)〜(g)のいずれかのポリヌクレオチドの変異体またはフラグメントであるか、あるいは前記のポリヌクレオチドに対してその全長にわたって相補的であるポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号１のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１のポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
該発現ベクターが適合性宿主細胞に存在する際、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを産生し得るポリヌクレオチドを含む発現システム。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを発現する、請求項６に記載される発現ベクターを含む組換え宿主細胞またはその膜。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法であって、請求項７に記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの産生に十分な条件下で培養して、該ポリペプチドを該培養培地から回収する工程を含む方法。
【請求項９】
免疫グロブリンのＦｃ領域と請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドとからなる融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドの機能または濃度を刺激または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ）該ポリペプチド(または該ポリペプチドを発現する細胞もしくは膜)またはその融合タンパク質に対する候補化合物の結合を、該候補化合物に直接的または間接的に結合している標識によって定量的または定性的に測定または検出すること、
（ｂ）該ポリペプチド(または該ポリペプチドを発現する細胞もしくは膜)あるいはその融合タンパク質に対する候補化合物の結合の競合を、標識された競合剤の存在下で測定すること、
（ｃ）該ポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを該候補化合物がもたらすか否かを、該ポリペプチドを発現する細胞または細胞膜に適切な検出システムを使用して試験すること、
（ｄ）候補化合物を、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドを含有する溶液と混合して混合物を作製し、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定し、そして、何らの候補化合物を含有しない対照混合物に対して、該混合物の活性を比較すること、または
（ｅ）細胞中における前記ポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたは前記ポリペプチドの産生に対する候補化合物の作用を、例えばＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出すること、
からなる群から選択される方法と、
（ｆ）生物工学的または化学的な標準的な技術に従って前記化合物を製造すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、以降、時にサバイビン相互作用タンパク質(Survivin Interacting Protein)または「ＴＰＲ１」と称する、新たに同定されたポリペプチド、およびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、診断ならび治療上潜在的に有用となるアゴニスト、アンタゴニストとなり得る化合物を同定する際のそれらの使用、ならびにかかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの製造とに関する。
【０００２】
（発明の背景）
創薬プロセスは現在、「機能ゲノム科学」、すなわちハイ・スループットのゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を取り入れ、根本的改革が進められている。この方法は、治療の標的として遺伝子および遺伝子産物を同定する手段として、迅速に、「ポジショナルクローニング」に基づいたより初期の方法の代わりになりつつある。生物機能または遺伝子の疾患である表現型を同定し、次いでこれに対する原因遺伝子がその遺伝子地図の位置に基づいて突き止められる。
【０００３】
機能ゲノム科学は、ハイ・スループットＤＮＡ配列決定技術、および現在入手可能な多くの分子生物学データベースから、潜在的に注目される遺伝子配列を同定するためにバイオインフォマティクスの様々なツールに大きく依存している。創薬の標的として、さらなる遺伝子およびその関連するポリペプチド／タンパク質を同定し、その特定を行うことが引き続き求められている。この領域における最近の進歩は、新しく同定されたタンパク質の機能に注目して、進歩したスクリーニングシステムを適用することによって主に進められている。このタイプのスクリーニングに関して興味深い適用は腫瘍のアポトーシスの分野においてである。
【０００４】
腫瘍細胞のアポトーシスは、例えば、よく知られているｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質において頻繁に見出される変異のような、重要な遺伝子における変異によって阻止され得る。アポトーシスを阻止する別の機構が、DeverauxおよびReed(Genes & Development、 1999)により総説される「アポトーシス阻害剤」(ＩＡＰ)のタンパク質ファミリーによって引き起こされている。このファミリーの１つのメンバーがサバイビン(Survivin)遺伝子によってコードされる。
【０００５】
ガンにおけるＩＡＰ関与に対する最も有力な証拠がサバイビンについて見出されている(AltieriおよびMarchisio(Laboratory Investigation、 999)の総説を参照)。成体の分化した組織では認められていないが、サバイビンは、形質転換された細胞株において、そして肺、結腸、膵臓、前立腺および乳房の最も一般的なヒトのガンのすべてにおいてインビボで顕著に発現している。サバイビンはまた、進行度が大きい非ホジキンリンパ腫(胚中心細胞性、免疫芽細胞性)の約50%において見出されているが、進行度が低いリンパ腫(リンパ球性)では見出されていない。サバイビンは、Ｆａｓ(ＣＤ９５)、Ｂａｘ、様々なカスパーゼおよび抗ガン薬によって誘導されるカスパーゼ活性およびアポトーシスを阻害する。
【０００６】
さらに、サバイビンは、細胞周期のＧ２／Ｍ期において40倍アップレギュレーションされ、細胞分裂の紡錘体(微小管)に結合するが、紡錘体におけるその役割は依然として不明である。アポトーシスおよび細胞分裂紡錘体チェックポイントのサバイビンによる連携した制御が存在し得る。サバイビン−微小管の相互作用の破壊は、サバイビンの抗アポトーシス機能を失わせ、カスパーゼ−３の活性を増大させる。サバイビンは、Ｇ２／Ｍ期におけるアポトーシスの不十分な(default)誘導に対抗して作用し得る。ガンにおけるサバイビンの過剰発現は、このアポトーシスチェックポイントを乗り越えることができ、そして形質転換された細胞の細胞分裂の異常な進行に加担し得る(Fengzhi 他、 Nature、 1998)。これに関連して、Ｆａｓにより媒介される細胞死を阻止するためにＣｄｋ４と相互作用する結果として、サバイビンにより、プロカスパーゼ３／ｐ２１複合体の形成が開始されることが最近示されたことに注目することは重要である(Suzuki他、 Oncogene、 2000)。従って、サバイビンは免疫系からの知られている腫瘍細胞逃避に関与し得る。サバイビンがその抗アポトーシス活性を媒介し得るその他の生化学的機能は、現在、様々なカスパーゼに対するその阻害的な結合を除き、明らかにされていない。したがって、本発明の１つの態様は、サバイビンと相互作用する新規なリガンドを定義していることにある。
【０００７】
ＴＰＲ−１は核膜孔複合体の核内のフィラメントに位置する270-kDのコイルドコイルタンパク質である。ＴＰＲ１が寄与するその構造及びその核膜孔の機能のメカニズムは現在知られていない(Bangs-P et al.: J. Cell. Biol., 1998, 28,; 143(7): 1801-12)。核膜孔複合体(NPC)は、細胞核及び細胞質の間の巨大分子の双方性の移動を仲介する非常に複雑な構造である。NPC組織の最近の見識によると、核包膜の二重膜に組み込まれた膨大な左右対称の骨格を特徴付ける。
【０００８】
集合のメカニズム及びNPC構造中間体の特徴はまた、理解は不十分である。細胞分裂を起こす細胞では、核包膜は分散し、NPCサブユニットを含むその構成成分は、細胞質細胞分裂により分散される。細胞分裂の終わりには、それらの構成成分の全てが再利用され、２つの娘細胞の中で核包膜を形成する。
【０００９】
癌の事情において最も興味深いのは、アミノ末端ＴＰＲ 150-250アミノ酸はｍｅｔ、ｔｒｋおよびｒａｆプロトオンコジーンのキナーゼ・ドメインで発癌性融合物の中に発現するので、ＴＰＲ１は発癌性活動内関与する遺伝子の生成物として以前から定義されていることである。したがって、ｍｅｔ発癌遺伝子は、ＴＰＲ１配列をｍｅｔ(肝細胞増殖因子／散乱係数)レセプター・チロシン・キナーゼ・ドメインに直接的に融合されるそのアミノ末端に含むハイブリッド・タンパク質を産生するゲノム再構成により活性化されることが見出された。得られたＰ６５ＴＰＲ１−Ｍｅｔハイブリッド・タンパク質はチロシン・キナーゼ活性を有しており、インビボ(in vivo)ではリン酸化チロシンの構造をしており、さらに培地の中では線維芽細胞を形質転換させる(Rodrigues and Park: Oncogene, 1994, Jul; 9(7): 2019-27)。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、サバイビン相互作用タンパク質ＴＰＲ１に関し、特にはＴＰＲ１ポリペプチドおよびＴＰＲ１ポリヌクレオチド、組換え体、ならびにそれらの製造方法に関する。かかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、サバイビンに対する天然のリガンドであるので、ある種の疾患を処置する方法に関連して注目されている。指摘されているように、この分子は、抗アポトーシス活性における顕著な役割を有する。酵母ツーハイブリッド法(Ｙ２Ｈ)は、サバイビンと相互作用をおこすタンパク質を見いだすために用いられている。そのようなタンパク質は、サバイビンを媒体とする生存または細胞分裂の信号に関与する候補物である。全長サバイビンタンパク質はベイトとして用いられる。
【００１１】
このようにして、細胞核複合体タンパク質ＴＰＲ１をコードするｃＤＮＡは、サバイビン−相互作用パートナータンパク質をコードするとして定義された。
【００１２】
サバイビンは、肺、肝臓、結腸、胃、皮膚、膵臓、前立腺、卵巣および乳房の非常に一般的なヒトのガンにおいてインビボで顕著に発現している。サバイビンはまた、進行度が高い非ホジキンリンパ腫の約50％において見出されており、したがって、本発明の新しく記載される分子ＴＰＲ１との相互作用は、これらの疾患を妨げる注目される選択肢を提供する。従って、それらは以降「本発明の疾患」と呼ばれる。さらなる態様において、本発明は、本発明により提供される材料を用いてアゴニストおよびアンタゴニスト(例えば阻害剤)を同定する方法、ならびに同定された化合物を用いて、ＴＰＲ１の活性に関連した状態を処置する方法に関する。さらにさらなる態様において、本発明は、ＴＰＲ１の不適切な活性および濃度に付随する疾患を検出する診断アッセイに関する。
【００１３】
リガンドサバイビン相互作用の機能的な重要性は、調査したままであり、細胞分裂の後もしくはその間の核膜孔複合体の形成、安定化、会合、及び再会合におけるサバイビンの関与の可能性を指摘している。
【００１４】
ＴＰＲ１は、化学療法剤のようなアポトーシスシグナルまたは免疫脂肪のような生理学的死のシグナルに対する細胞(例えば腫瘍細胞)の耐性を示すその細胞のサバイビン調整生存シグナルの媒介として関与しうる。ＴＰＲ１は、また、基本的な細胞分裂のプロセスにも関与しているであろう。したがって、サバイビンを介して細胞分裂の機能にリンクしているであろう。
【００１５】
（発明の説明）
第一の態様において、本発明はＴＰＲ１ポリペプチドに関する。かかるポリペプチドには下記が含まれる：
（ａ）配列番号１の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２のポリペプチド配列を含むポリペプチド、
（ｄ）配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有するポリペプチド、
（ｅ）配列番号２のポリペプチド配列、および
（ｆ）配列番号２のポリペプチド配列と比較して、0.95、0.96、0.97、0.98または0.99の同一性指標を有するポリペプチド配列を有するか、またはそのようなポリペプチド配列を含むポリペプチド、
（ｇ）(a)〜(f)に記載のかかるポリペプチドのフラグメントおよび変異体。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、サバイビンに対するリガンドであると考えられ、従って、アポトーシスの不十分な誘導に対抗して作用することができる。さらに、サバイビンおよびそのリガンドＴＰＲ１はアポトーシスチェックポイントを制御することができ、そしてＴＰＲ１はサバイビンの抗アポトーシス活性の媒介因子であり得る。
【００１７】
ＴＰＲ１ポリペプチドは、免疫細胞のシグナルのような様々なアポトーシスシグナル、例えば化学療法剤または生理学的な死シグナルに対する腫瘍細胞の抵抗性をもたらし得る生存シグナルを腫瘍細胞が確立することに関与すると考えられる。
【００１８】
ＴＰＲ１の生物学的性質は、以降、「ＴＰＲ１の生物学的活性」または「ＴＰＲ１活性」と称する。好ましくは、本発明のポリペプチドは少なくとも１つのＴＰＲ１の生物学的活性を示す。
【００１９】
本発明のポリペプチドには、すべての対立遺伝子形態およびスプライス変異体を含む上記ポリペプチドの変異体もまた含まれる。かかるポリペプチドは、挿入、欠失、ならびに保存的または非保存的であり得る置換、あるいはそれらの任意の組合せによって基準ポリペプチドから変異している。特に好ましい変異体は、いくつかの、例えば、50〜30、30〜20、20〜10、10〜５、５〜３、３〜２、２〜１または１個のアミノ酸が任意の組合せで挿入、置換または欠失されている変異体である。
【００２０】
本発明のポリペプチドの好ましいフラグメントには、配列番号２のアミノ酸配列に由来する少なくとも30、50または100個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号２のアミノ酸配列から、少なくとも30、50または100個の連続したアミノ酸が短縮化または欠失しているアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。好ましいフラグメントは、ＴＰＲ１の生物学的活性をもたらす生物学的に活性なフラグメントである。これには、類似する活性または改善された活性を有するか、あるいは望ましくない活性が低下しているフラグメントが含まれる。また、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるそのようなフラグメントも好ましい。
【００２１】
本発明のポリペプチドのフラグメントは、対応する完全長型ポリペプチドをペプチド合成によって製造するために用いることができる。したがって、これらの変異体は本発明の完全長型ポリペプチドを製造するための中間体として用いることができる。本発明のポリペプチドは、「成熟型」タンパク質の形態であってもよく、あるいは前駆体または融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であってもよい。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を助ける配列、例えば反復するヒスチジン残基、あるいは組換え産生時の安定性に必要なさらなる配列を含有する付加的なアミノ酸配列を含むことは、しばしば、有益である。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、任意の好適な方法で、例えば、天然に存在する供給源から、または発現システム(下記参照)を含む遺伝子操作された宿主細胞から単離することによって、あるいは例えば、自動化されたペプチド合成機を使用する化学合成によって、かかるそのような方法の組合せによって調製することができる。かかるポリペプチドを調製するための手段は当該分野では十分に理解されている。
【００２３】
さらなる態様において、本発明はＴＰＲ１ポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドには下記が含まれる：
（ａ）配列番号１のポリヌクレオチド配列に対する同一性が少なくとも95％、96％、97％、98％または99％であるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１のポリヌクレオチドに対する同一性が少なくとも95％、96％、97％、98％または99％であるポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１のポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｉ）配列番号１のポリヌクレオチド配列と比較して、0.95、0.96、0.97、0.98または0.99の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を有するか、またはそのようなポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｊ）配列番号２のポリペプチド配列と比較して、0.95、0.96、0.97、0.98または0.99の同一性指標を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するか、またはそのようなポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに
上記ポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異体であるポリヌクレオチド、あるいは上記ポリヌクレオチドに対してその全長にわたって相補的であるポリヌクレオチド。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドの好ましいフラグメントには、配列番号１の配列に由来する少なくとも15、30、50または100個の連続した塩基を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、あるいは配列番号１の配列から、少なくとも30、50または100個の連続した塩基が短縮化または欠失している配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドの好ましい変異体には、スプライス変異体、対立遺伝子変異体、および１つまたは複数の単一塩基多型(ＳＮＰ)を有するポリヌクレオチドを含む多型体が含まれる。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号２のアミノ酸配列を含み、かついくつかの、例えば、50〜30、30〜20、20〜10、10〜５、５〜３、３〜２、２〜１または１個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されているポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドもまた含まれる。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるポリヌクレオチドを提供する。したがって、下記のＲＮＡポリヌクレオチドが提供される：
（ａ）配列番号２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるＲＮＡポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むＲＮＡポリヌクレオチド、または
（ｄ）配列番号１のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるＲＮＡポリヌクレオチド、
ならびにそれらに対して相補的であるＲＮＡポリヌクレオチド。
【００２８】
配列番号１のポリヌクレオチド配列は、配列番号２のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１の配列をコードするポリペプチドと同一であってもよく、あるいは遺伝子暗号の縮退(縮重性)の結果として配列番号２のポリペプチドを同様にコードする、配列番号１以外の配列であってもよい。配列番号２のポリペプチドは、スペクトリン様ドメイン、コイルドコイル、グアノシン交換因子ドメインおよびプレクストリン相同性ドメインをコードするヒトＤｕｏ ｍＲＮＡとの相同性および／または構造的類似性を有するグアニン交換因子(ＧＥＦ)のファミリーの他のタンパク質との関連性を有し［Colomer, V.、 Engelender, S.、 Sharp, A.H.、 Duan, K.、 Cooper, J.K.、 Lanahan, A.、 Lyford, G.、 Worley, P.およびRoss，C.A.、 ハンチントン関連タンパク質１はｒａｃ１グアニンヌクレオチド交換因子ドメインによりＴｒｉｏ様ポリペプチドに結合する、Hum. Mol. Genet. 6(9)、 1519〜1525 (1997)］、そしてプロテインキナーゼ、ｒａｃグアニン交換因子、ｒｈｏグアニン交換因子およびスペクトリン様反復に対する類似性を示すヒトＴｒｉｏ ｍＲＮＡとの関連性を有する[Debant, A.、 Serra‐Pages, C.、 Seipel, K.、 O‘Brien, S.、 Tang, M.、 Park, S.H. およびStreuli, M.、 マルチドメインタンパク質ＴｒｉｏはＬＡＲ膜貫通チロシンホスファターゼに結合し、プロテインキナーゼドメインを含み、離れたｒａｃ特異的グアニンヌクレオチド交換因子およびｒｈｏ特異的グアニンヌクレオチド交換因子を有する、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(11)、 5466〜5471 (1996)]。
【００２９】
本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特に、それらの相同的なポリペプチドおよびポリヌクレオチドと類似する生物学的な機能／性質を有することが期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは少なくとも１つのＴＰＲ１活性を有する。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＨｅＬａ細胞(ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２)のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリから、そしてヒト胎児脳組織に由来するｃＤＮＡライブラリから標準的なクローニング技術およびスクリーニング技術を使用して得ることができる(例えば、Sambrook 他、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、 第２版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、 N.Y. (1989) 参照)。本発明のポリヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡライブラリなどの天然の供給源から得ることができ、あるいは周知の技術および市販の技術を用いて合成することができる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え製造のために使用する際には、該ポリヌクレオチドは、成熟型ポリペプチドのコード配列、それ自体、あるいはリーダー配列もしくは分泌配列、プレタンパク質配列もしくはプロタンパク質配列もしくはプレプロタンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするコード配列などの他のコード配列と読み枠を合わせた成熟型ポリペプチドのコード配列を含むことができる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードさせることができる。本発明のこの態様のいくつかの好ましい実施形態において、該マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen, Inc.)において提供され、そしてGentz他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 (1989) 86：821〜824 に記載されている、ヘキサ・ヒスチジン・ペプチド、あるいはＨＡタグである。該ポリヌクレオチドはまた、転写される非翻訳配列、スプライシングシグナルおよびポリアデニレーション・シグナル、リボソーム結合部位、ならびにｍＲＮＡを安定化させる配列などの５’および３’非コード配列を含有することができる。
【００３２】
配列番号１のポリヌクレオチド配列に対して同一であるか、または十分な同一性を有するポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーション・プローブとして、あるいは核酸増幅反応(例えばＰＣＲ)用のプライマーとして使用することができる。かかるプローブおよびプライマーは、本発明のポリペプチドをコードする完全長型ｃＤＮＡおよびゲノム・クローンを単離するために、ならびに配列番号１に対する高い配列類似性(概して少なくとも95％の同一性)を有する他の遺伝子(ヒト供給源に由来するパラログならびにヒト以外の種に由来するオルソログおよびパラログをコードする遺伝子を含む)のｃＤＮＡクローンおよびゲノム・クローンを単離するために使用することができる。好ましいプローブおよびプライマーは、一般には、少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも30塩基を含み、そして少なくとも100塩基ではなくとも、少なくとも50塩基を有し得る。特に好ましいプローブは30〜50塩基を有する。特に好ましいプライマーは20〜25塩基を有する。
【００３３】
ヒト以外の種に由来するホモログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１の配列またはそのフラグメントを有する、好ましくは少なくとも15塩基の標識されたプローブを用いて厳格なハイブリダイゼーション条件下でライブラリをスクリーニングする過程；および前記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長型ｃＤＮＡクローンおよびゲノム・クローンを単離する過程を含む工程によって得ることができる。かかるハイブリダイゼーション技術は当業者には十分に知られている。好ましい厳格なハイブリダイゼーション条件には、50％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(150ｍＭのＮａＣｌ、15ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、50ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ7.6)、５×デンハルト溶液、10％のデキストラン硫酸および20マイクログラム／ｍｌの変性させた剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液において42℃で終夜インキュベーションし、その後、0.1×ＳＳＣにおいて約65℃にてフィルターを洗浄することが含まれる。したがって、本発明はまた、配列番号１の配列またはそのフラグメントを有する、好ましくは少なくとも15塩基の標識されたプローブを用いて厳格なハイブリダイゼーション条件下でライブラリをスクリーニングすることによって得られるポリヌクレオチド、好ましくは少なくとも100塩基の塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む。
【００３４】
当業者は、多くの場合において、該ポリペプチドをコードする領域が５’末端に至るまで必ずしも完全に伸長していない点で、単離されたｃＤＮＡ配列が不完全であることを理解している。これは、本質的に「プロセシング能」(ポリメリゼーション反応の間、テンプレートに結合した状態を維持する酵素の能力の指標)が低い酵素である逆転写酵素が、第１鎖ｃＤＮＡ合成の際にｍＲＮＡテンプレートのＤＮＡコピーを完成させることができない結果である。
【００３５】
全長型ｃＤＮＡを得るために、あるいは短いｃＤＮＡを伸長させるために利用でき、かつ当業者に周知の方法がいくつかある。例えば、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅(ＲＡＣＥ)方法に基づく方法がある(例えば、Frohman他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、85、8998〜9002、1988を参照)。例えば、Marathon(商標)法(Clontech Laboratories Inc.)によって例示されるこの技術の近年の改変により、より長いｃＤＮＡに対する探索が著しく単純化されている。Marathon(商標)法では、選択された組織から抽出されたｍＲＮＡとその両脇に連結された「アダプター」配列とから、ｃＤＮＡが調整される。その後、核酸増幅(ＰＣＲ)を行い、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組合せを使用してｃＤＮＡの「失われている」５’末端を増幅する。その後、「ネスティッド(入れこ型)」プライマー、すなわち、増幅産物の内部にアニーリングするように設計されたプライマー(典型的には、アダプター配列においてさらに３’側にアニーリングするアダプター特異的プライマー、および既知の遺伝子配列においてさらに５’側にアニーリングする遺伝子特異的プライマー)を使用して、ＰＣＲ反応を繰り返す。その後、この反応の生成物はＤＮＡ配列決定によって分析することができる。生成物を既存のｃＤＮＡに直接結合して完全な配列を得るか、または５’プライマーを設計するための新しい配列情報を使用して別の完全長ＰＣＲを行うことによって、完全長型のｃＤＮＡを構築することができる。
【００３６】
本発明の組換えポリペプチドは、発現システムを含む遺伝子操作された宿主細胞からこの分野で周知の方法によって調製することができる。従って、さらなる態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの１つまたは複数を含む発現システムと、そのような発現システムで遺伝子操作されている宿主細胞と、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造とに関する。本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてかかるタンパク質を製造するために、無細胞翻訳システムを用いることもできる。
【００３７】
組換え製造のために、宿主細胞を遺伝子操作し本発明のポリヌクレオチドに対する発現システムまたはその一部を取り込ませることができる。ポリヌクレオチドは、Davis他、Basic Methods in Molecular Biology (1986)およびSambrook他(同上)などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法によって宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好ましい方法には、例えば、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレイプ負荷、バリスティック導入または感染が含まれる。
【００３８】
適当な宿主の代表的な例には、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、大腸菌、ストレプトミセス属ならびに枯草菌細胞などの細菌細胞；酵母細胞やアスペルギルス属細胞などの菌類細胞；ショウジョウバエ(Drosophila)Ｓ２細胞やSpodoptera Sf9細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が含まれる。
【００３９】
多様な発現システムを使用することができる。例えば、染色体、エピソームおよびウイルスに由来するシステム、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、バキュロウイルス、パポバウイルス(SV40など)、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスやレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター、ならびに、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝子エレメントから誘導されたものなどの、それらの組合せに由来するベクター(コスミドおよびファージミドなど)を使用することができる。該発現システムは、発現を生じさせるとともに、発現を調節するための制御領域を含有することができる。一般に、宿主内においてポリペプチドを産生させるためにポリヌクレオチドを維持し、または伝搬させ、または発現させることができるシステムまたはベクターはどれも使用することができる。適切なポリヌクレオチド配列を、例えば、Sambrook他(同上)に示されている技術などの様々なよく知られている日常的な技術のいずれかによって発現システムに挿入することができる。適切な分泌シグナルを所望するポリペプチドに組み込んで、翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔、ペリプラズム腔または細胞外環境に分泌させることができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよく、あるいは異種のシグナルであってもよい。
【００４０】
スクリーニングアッセイで用いるために本発明のポリペプチドを発現させる場合、該ポリペプチドを細胞の表面に産生させることが一般には好ましい。この場合細胞を集菌し、その後スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。該ポリペプチドが培地中に分泌される場合には、培地を回収してポリペプチドの回収および精製をすることができる。細胞内に産生された場合には、細胞を最初に溶解して、その後ポリペプチドを回収しなければならない。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロース・クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティ・クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィおよびレクチン・クロマトグラフィを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製することができる。最も好ましくは、ハイ・パフォーマンス液体クロマトグラフィが精製に用いられる。該ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製のときに変性する際には、タンパク質をリフォールディングさせるために周知の技術を用いて、活性な立体配座を再生させることができる。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、関連遺伝子における変異を検出することによって診断試薬として使用することができる。ｃＤＮＡ配列またはゲノム配列における配列番号１のポリヌクレオチドにより特定される遺伝子で、機能不全に関連している遺伝子の突然変異型を検出することによって、その遺伝子の過少発現、過剰発現あるいは変化した空間的または時間的な発現から生じる疾患の診断またはそのような疾患に対する感受性の診断の一助になり得るか、またはそのような診断を規定し得る診断ツールが提供される。遺伝子に変異を有する個体を、この分野で周知な様々な技術によってＤＮＡレベルで検出することができる。
【００４３】
診断に必要な核酸は、血液、尿、唾液、組織生検体または解剖体などの被験体の細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、検出のために直接使用することができ、あるいは分析に先立ち、ＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、または他の増幅法を使用して酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様の方法で使用することができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較して増幅産物のサイズにおける変化によって検出することができる。点変異は、増幅されたＤＮＡをＴＰＲ１の標識されたヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせることによって同定することができる。完全に一致する配列は、リボヌクレアーゼ(ＲＮａｓｅ)消化、あるいは融解温度の差によってミスマッチした二重鎖から区別することができる。ＤＮＡ配列の違いはまた、変性剤の存在下または非存在下でのゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の変化によって、あるいは直接的なＤＮＡ配列決定によって検出することができる(例えば、Myers他、Science、 (1985)230：1242)。特定の位置における配列の変化もまた、リボヌクレアーゼ保護またはＳ１保護などのヌクレアーゼ保護アッセイあるいは化学的な切断方法によって明らかにすることができる(Cotton他、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 (1985) 85： 4397〜4401)。
【００４４】
ＴＰＲ１ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むオリゴヌクレオチド・プローブのアレイを構築して、例えば、遺伝子変異の効率的なスクリーニングを行うことができる。かかるアレイは、高密度のアレイまたは格子状であることが好ましい。アレイ技術法は周知であり、一般的な適用性を有し、遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変動性を含む分子遺伝学における様々な問題を検討するために使用することができ、例えば、M. Chee他、Science、 274, 610〜613 (1996)およびそれに引用されている他の参考文献を参照する。
【００４５】
異常に、低下または増大しているポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現レベルの検出もまた、本発明の疾患に対する被験体の感受性を診断または決定するために使用することができる。発現の減少または増加は、ポリヌクレオチドを定量することに関してこの分野で周知の方法、例えば、核酸増幅、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護、ノーザン・ブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法のいずれかを使用してＲＮＡレベルで測定することができる。宿主に由来するサンプルにおける本発明のポリペプチドなどのタンパク質のレベルを決定するために使用することができるアッセイ手法は当業者には周知である。かかるアッセイ方法には、放射免疫アッセイ、結合タンパク質競合アッセイ、ウエスタン・ブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【００４６】
従って、別の態様において本発明は下記を含む診断キットに関する：
（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列またはそのフラグメントもしくはＲＮＡ転写物；
（ｂ）(a)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、
（ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２のポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいは
（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは配列番号２のポリペプチドに対する抗体。
【００４７】
任意のかかるキットにおいて、(a)、(b)、(c)または(d)は実質的な成分を構成することができることは理解される。かかるキットは、疾患または疾患に対する感受性、中でも特に本発明の疾患を診断する際に有用である。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチド配列は染色体局在化研究に有益である。該配列は、個々のヒト染色体における特定位置に対して特異的に標的化され、かつその特定の位置とハイブリダイゼーションし得る。本発明に従って関連する配列を染色体にマッピングすることは、そのような配列を遺伝子関連疾患と相関させる際の重要な最初の過程である。配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上における配列の物理的な位置を遺伝地図データと相関させることができる。かかるデータは、例えば、V.McKusickの「ヒトにおけるメンデル遺伝」において見出される(これはJohns Hopkins大学Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能)。遺伝子と、同じ染色体領域にマッピングされている疾患との関係が、その後、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）によって同定される。ゲノム配列（遺伝子フラグメントなど）に関する正確なヒト染色体局在化を放射ハイブリッド（ＲＨ）マッピングを使用して決定することができる(Walter，M.、 Spillett, D.、 Thomas, P.、 Weissenbach, J.およびGoodfellow, P.(1994)、ゲノム全体の放射ハイブリッドマップを構築する方法、Nature Genetics、 7、 22〜28)。多数のＲＨパネルをResearch Genetics(Huntsville、 AL、 米国)から得ることができる。例えば、GeneBridge4 RHパネル(Hum Mol Genet、 1996、 Mar；5(3)：339〜46、ヒトゲノムの放射ハイブリッドマップ。Gyapay G.、 Schmitt K.、 Fizames C.、 Jones H.、 Vega‐Czarny N.、 Spillett D.、 Muselet D.、 Prud’Homme JF、 Dib C.、 Auffray C.、 Morissette J.、 Weissenbach， J.、 Goodfellow, PN)。このパネルを使用して遺伝子の染色体上の位置を決定するために、93回のＰＣＲが、ＲＨ ＤＮＡについて目的とする遺伝子から設計されたプライマーを用いて行われる。これらのＤＮＡはそれぞれが、ハムスターのバックグラウンド(ヒト／ハムスターのハイブリッド細胞株)中に維持されたランダムなヒト・ゲノム・フラグメントを含有する。これらのＰＣＲにより、目的とする遺伝子のＰＣＲ産物の存在の有無を示す93のスコアが得られる。これらのスコアを既知の位置のゲノム配列に由来するＰＣＲ産物を使用して作製されたスコアと比較される。この比較は、http：／／www.genome.wi.mit.edu／において行われる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチド配列はまた組織発現研究に対する有益なツールである。かかる研究は、それらをコードするｍＲＮＡを検出することによって、コードされたポリペプチドの組織内の発現パターンに関する指標を与える、本発明のポリヌクレオチドの発現パターンの決定を可能とする。使用される技術は、当該分野では周知であり、ｃＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション(Schena他、Science、 270、 467〜470、 1995およびShalon他、 Genome Res、 6、 639〜645、 1996)などの、格子上に配置された様々なクローンに対するインサイチュー(in situ)・ハイブリダイゼーション技術、およびＰＣＲなどのヌクレオチド増幅技術を含む。好ましい方法では、Perkin Elmerから入手可能なTAQMAN(商標)法が使用される。これらの研究結果により、生物におけるポリペプチドの正常な機能の指標を得ることができる。加えて、ｍＲＮＡの正常な発現パターンと、同じ遺伝子の別の形態(例えば、潜在的または調節的な変異をコードするポリペプチドにおける変化を有するもの)によってコードされるｍＲＮＡの発現パターンとの比較研究により、本発明のポリペプチドの役割に対する有益な洞察がもたらされ得るか、または疾患におけるその不適切な発現の役割に対する有益な洞察がもたらされ得る。そのような不適切な発現は、時間的、空間的または単に量的な性質であり得る。
【００５０】
本発明のさらなる態様は抗体に関する。本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントあるいはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに対して免疫特異的である抗体を産生させるための免疫原として使用することができる。用語「免疫特異的」は、抗体が、先行技術における他の関連するポリペプチドに対するその親和性よりも実質的に大きい親和性を本発明のポリペプチドに対して有することを意味する。
【００５１】
本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、慣用的なプロトコルを使用して、該ポリペプチドまたはエピトープ保持したフラグメントまたは細胞を動物、好ましくは非ヒト動物に投与することによって得ることができる。モノクローナル抗体を調製する場合、継代的な細胞株培養物によって産生される抗体を提供するいかなる技術を使用することができる。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohler, G.およびMilstein, C.、 Nature (1975)、 256：495〜497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor他、 Immunology Today (1983)、 4：72)、およびＥＢＶハイブリドーマ技術(Cole他、 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、 77〜96、 Alan R. Liss, Inc.、 1985)が含まれる。
【００５２】
米国特許第4,946,778号に記載される技術などの一本鎖抗体の製造技術もまた、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造するために適応させることができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物を使用して、ヒト化抗体を発現させることができる。
【００５３】
上記の抗体を用いて、該ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定する、もしくはアフィニティ・クロマトグラフィによって該ポリペプチドを精製することができる。本発明のポリペプチドに対する抗体は、また、特に本発明の疾患を治療するために用いることができる。
【００５４】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドをワクチンとして使用することもできる。したがって、さらなる態様において、本発明は、哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方法に関する。この方法は、前記動物を疾患から、その疾患が個体において既に慢性化しているか否かに関わらず保護するために抗体応答および／またはＴ細胞免疫応答(例えば、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を含む)を生じさせるのに適する、本発明のポリペプチドを哺乳動物に接種することを含む。哺乳動物における免疫学的応答はまた、本発明にかかる疾患から前記動物を保護する抗体を産生させるようにかかる免疫学的応答を誘導するために、該ポリヌクレオチドの発現を支配し、かつ該ポリペプチドをコードするベクターによって本発明のポリペプチドをインビボで送達することを含む方法によって誘導され得る。そのようなベクターを投与する１つの方法は、粒子またはそれ以外のものの上へのコーティング物として所望する細胞中へのそれを促進することによる。かかる核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾型核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むことができる。用途によって、ワクチン、ポリペプチドまたは核酸ベクターは、通常、ワクチン配合物(組成物)として提供される。該配合物はさらに好適なキャリアを含むことができる。ポリペプチドは胃において分解されることもあるため、それは、好ましくは非経口で投与される(例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射)。非経口投与に好適な配合物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および配合物を接種者の血液と等張性にする溶質を含んでもよい、水性および非水性の無菌注射液；ならびに懸濁剤または増粘剤を含んでもよい、水性および非水性の無菌懸濁物が含まれる。該配合物は、単位用量容器または多回用量容器で、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れて提供することができ、そして使用直前に無菌の液体キャリアを添加することだけでよい、凍結乾燥状態で保存することができる。該ワクチン配合物はまた、水中油型システムおよび当該分野で既知のその他のシステムなどの、配合物の免疫原性を増強するアジュバント・システムを含むことができる。投与量は該ワクチンの比活性に依存するが、型どおりの実験によって容易に決定することができる。
【００５５】
本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の疾患状態、特に、前述の本発明の疾患に関連する１つまたは複数の生物学的機能を有する。従って、該ポリペプチドの機能または濃度を刺激または阻害する化合物を同定することは有用である。従って、さらなる態様において、本発明は、該ポリペプチドの機能または濃度を刺激または阻害する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。かかる方法により、本明細書前記のような本発明のそのような疾患に対する治療目的および予防目的のために用いることができるアゴニストまたはアンタゴニストが同定される。化合物は、様々な供給源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリ、化学化合物のコレクション、および天然産物の混合物から同定することができる。このように同定される、かかるアゴニストまたはアンタゴニストは、場合によっては、ポリペプチド自体の、天然または修飾された基質、リガンド、受容体、酵素など；その構造的または機能的な模倣体(Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1(2)：５章(1991)を参照)あるいは小分子であってもよい。そのような小分子は、分子量が2,000ダルトン未満であることが好ましく、より好ましくは300〜1,000ダルトンであり、最も好ましくは400〜700ダルトンである。これらの小分子は有機分子であることが好ましい。
【００５６】
該スクリーニング方法は、候補化合物に直接的または間接的に連結されている標識を利用して、該ポリペプチド、あるいは該ポリペプチドまたはその融合タンパク質を表出している細胞または膜に対する候補化合物の結合を単に測定することでもよい。あるいは、スクリーニング方法は、標識された競合剤(例えばアゴニストまたはアンタゴニスト)に対抗して候補化合物がポリペプチドに競合的に結合することを(定性的または定量的に)測定または検出することを含み得る。さらにこれらのスクリーニング方法では、該ポリペプチドを表出している細胞に適切な検出システムを使用して候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害によって誘起されるシグナルをもたらすか否かを試験することもできる。一般には、活性化阻害剤が既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして候補化合物の存在下でのアゴニストによる活性化に対する作用が観測される。さらに、該スクリーニング方法は、候補化合物を、本発明のポリペプチドを含有する溶液と混合して、混合物を形成させる工程と、混合物におけるＴＰＲ１活性を測定する工程と、および混合物のＴＰＲ１活性を、候補化合物を含有しないコントロール混合物と比較する工程とを単に含み得る。
【００５７】
本発明のポリペプチドは、従来の低い容量のスクリーニング方法において、そしてまた高処理能(ハイ・スループット)スクリーニング(ＨＴＳ)形式において用いることができる。かかるＨＴＳ形式には、十分に確立された96穴マイクロタイター(micotiter)プレートおよびより最近には384穴マイクロタイター(micotiter)プレートの使用だけでなく、Schullek他、Anal Biochem.、 246, 20〜29 (1997)に記載のナノウエル法などの最近現れた方法もまた含まれる。
【００５８】
Ｆｃ部分およびＴＰＲ１ポリペプチドから生成される融合タンパク質などの融合タンパク質もまた、本明細書中前記ように、本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストを同定するための高処理能スクリーニングアッセイに使用することができる(D. Bennett他、 J Mol Recognition、 8：52〜58 (1995)；K. Johanson他、 J Biol Chem、 270 (16)：9459〜9471 (1995))。
【００５９】
スクリーニング技術
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび該ポリペプチドに対する抗体はまた、細胞内のｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生に対する添加された化合物の作用を検出するためのスクリーニング方法を形成するために使用することができる。例えば、当該分野で公知の標準的な方法によってモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を使用してポリペプチドの分泌または細胞結合濃度を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを構築することができる。これは、好適に操作された細胞または組織からのポリペプチドの産生を阻害または増強し得る薬剤(また、それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる)を発見するために使用することができる。
【００６０】
本発明のポリペプチドを用いて、当該分野で公知の標準的な受容体結合技術によって、存在する場合には膜結合型または可溶性の受容体を同定することができる。これらには、これらに限定されないものの、ポリペプチドを放射性同位体(例えば125Ｉ)で標識、化学修飾(例えばビオチン化され)、あるいは検出または精製に好適なペプチド配列に融合して、そして推定される受容体の供給源(細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液)とインキュベーションするリガンド結合およびクロスリンク・アッセイが含まれるが。他の方法には、表面プラズモン共鳴および分光測定法などの生物物理学的技術が含まれる。これらのスクリーニング方法はまた、それらが存在する場合にはポリペプチドのその受容体に対する結合と競合する該ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために使用することができる。かかるアッセイを行うための標準的な方法は当該分野では十分に理解されている。
【００６１】
本発明のポリペプチドのアンタゴニストの例には、抗体、あるいは、ある場合には、該ポリペプチド自体のリガンド、基質、受容体、酵素などに密接に関連するオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、場合により、例えば、該リガンド、基質、受容体、酵素などのフラグメント；あるいは本発明のポリペプチドに結合するものの、応答を誘発せず、その結果、ポリペプチドの活性が妨げられる、小分子が含まれる。
【００６２】
スクリーニング方法はまた、トランスジェニック技術およびＴＰＲ１遺伝子の使用を含んでもよい。トランスジェニック動物を構築する技術は十分に確立されている。例えば、受精した卵母細胞の雄性前核へのマイクロインジェクション、移植前または移植後の胚へのレトロウイルス移入、エレクトロポレーションなどにより遺伝子操作された胚性幹細胞の宿主胚盤胞への注入によってＴＰＲ１遺伝子を導入することができる。特に有用なトランスジェニック動物は、いわゆる「ノック・イン」動物であり、動物の遺伝子がその動物のゲノム内においてヒトの等価体によって置き換えられている。ノック・イン・トランスジェニック動物は、医薬探索のプロセスにおいて、化合物はヒトの標的に対して特異的であるという、標的の妥当性検証用に有用である。他の有用なトランスジェニック動物は、いわゆる「ノック・アウト」動物であり、内因性ＤＮＡ配列によってコードされている、本発明のポリペプチドに対する動物オルソログの発現が細胞内で部分的または完全に無効とされている。遺伝子のノック・アウトは、技術の限界の結果として、特異的な細胞または組織を対象とする、特定の細胞または組織においてのみ生じてもよく、あるいは動物内のすべての細胞または実質的にすべての細胞において生じ得る。トランスジェニック動物の手法はまた、導入遺伝子が発現されて大量の本発明のポリペプチドが得られる、動物全体の発現−クローニング・システムを提供する。
【００６３】
上記の方法において使用されるスクリーニングキットは、本発明のさらなる態様をなす。かかるスクリーニングキットは下記のものを含む：
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞、
（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜、または
（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、
そのようなポリペプチドは、好ましくは配列番号２のポリペプチドである。
【００６４】
かかるキット何れにおいても、(a)、(b)、(c)または(d)は実質的な構成要素を構成することは理解される。
【００６５】
（用語集）
下記の定義は、本明細書中で既に頻繁に使用されているいくつかの用語の理解を容易にするために提供される。
【００６６】
本明細書中に用いられる「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖、ならびにヒト化抗体、同様にＦａｂフラグメントをも包含し、Ｆａｂ発現ライブラリまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリの生成物を包含する。
【００６７】
「単離(された)」は、その自然の状態から「ヒトの手によって」変化していること、すなわち、自然界に存在する場合、その本来の環境から変化、または取り出されている、もしくはその両方であることを意味する。例えば、生きた生物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドはこの用語の本明細書中での用法に従うと、「単離」されている。さらに、形質転換、遺伝子操作、または何らかの他の組換え方法によって生物に導入されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その生物が生存または非生存かのいずれでも、前記生物内に依然として存在している場合でさえ、「単離」されている。
【００６８】
「ポリヌクレオチド」は、一般には、任意のポリリボヌクレオチド(ＲＮＡ)またはポリデオキシリボヌクレオチド(ＤＮＡ)をいうが、非改変型または改変型のＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖であり得るか、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されることはない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三重鎖領域をもいう。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１つまたは複数の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性またはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾(された)」塩基には、例えば、トリチル化された塩基、およびイノシンなどの非通常型の塩基が含まれる。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができる。従って、「ポリヌクレオチド」は、自然界に典型的に見出されるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドを包含する。
【００６９】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合(すなわちペプチド等配電子体)によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含むポリペプチドの何れをもいう。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと広く呼ばれる短い鎖、ならびに一般にはタンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方をいう。ポリペプチドは遺伝子によってコードされる20のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有することができる。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当該分野で周知の化学的な修飾方法のいずれかによって、修飾されたアミノ酸配列を含む。かかる修飾は、基本的な教本、より詳細な専門書ならびに数多くの研究文献に広く記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチド内の任意のところに存在させることができる。同じ型の修飾が所与ポリペプチド内のいくつかの部位に同じ程度または異なる程度で存在してもよいことが理解される。また、所与ポリペプチドは多くのタイプの修飾を含有することができる。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝が成されてもよく、そして分枝型または非分枝型の環状であり得る。環状、分枝状および分枝した環状ポリペプチドは、翻訳に続く天然のプロセスに起因しても、あるいは合成的方法によって作製されてもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、クロス・リンク形成、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩ・アンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファー・ＲＮＡ媒介付加、ならびユビキチン化が含まれる(例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties、 第２版、 T. E. Creighton、 W. H. Freeman and Company、 New York、 1993；Wold, F.、 翻訳後のタンパク質修飾：全体像および展望、 １〜12、 Post-translational Covalent Modification of Proteins、 B.C. Johnson編、 Academic Press、 New York、1983；Seifter他、 「タンパク質修飾および非タンパク質補助因子の分析」、 Meth Enzymol、 182、 626〜646、 1990；Rattan他、 「タンパク質合成：翻訳後修飾およびエージング」、Ann NY Acad Sci、 663、 48〜62、 1992)。
【００７０】
ポリペプチド配列の「フラグメント」は、基準配列よりも短いが基準ポリペプチドとなるポリペプチドと同じ生物学的な機能または活性を本質的に保持しているポリペプチド配列をいう。ポリヌクレオチド配列の「フラグメント」は配列番号１の基準配列よりも短いポリヌクレオチド配列をいう。
【００７１】
「変異体」は、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、基準ポリヌクレオチドに対して塩基配列に相違がある。変異体の塩基配列における変化により、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化してもよく、あるいは変化しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後述するとおり、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および短縮化をもたらし得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が基準ポリペプチドとは異なる。一般に、改変は基準ポリペプチドおよび変異体の配列が全体的に非常に類似し、そして多くの領域において同一であるように制限される。変異体ポリペプチドおよび基準ポリペプチドは、アミノ酸配列が、１つまたは複数の置換、挿入、欠失の任意の組合せによって異なりうる。置換または挿入されるアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸残基であっても、あるいはなくてもよい。典型的な保存的置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；ならびにＰｈｅおよびＴｙｒが含まれる。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子などの天然に存在するものであってもよく、あるいは天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、変異誘発方法によって、あるいは直接的な合成によって作製することができる。また、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＰリボシル化などを有するポリペプチドもまた変異体として含まれる。実施形態には、Ｎ末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびトレオニンのリン酸化、ならびにＣ末端グリシンの修飾が含まれる。
【００７２】
「対立遺伝子」は、ゲノム内の所与遺伝子座に存在する遺伝子の２つ以上の選択的な形態の１つをいう。
【００７３】
「多型」は、集団内のゲノムにおける所与の位置での塩基配列(関連する場合にはコードされるポリペプチド配列)の変動をいう。
【００７４】
「単一塩基多型」(ＳＮＰ)は、集団内においてゲノム内の１つの塩基位置における塩基変動の発生をいう。ＳＮＰは遺伝子内にまたはゲノムの遺伝子間領域内に存在し得る。ＳＮＰは対立遺伝子特異的増幅(ＡＳＡ)を使用してアッセイすることができる。該プロセスには少なくとも３つのプライマーが必要である。共通プライマーがアッセイされる多型に対して逆方向に相補となるように使用される。この共通プライマーは多型の塩基から50bpから1500bpの間で隔たったものとできる。それ以外の２つ(またはそれ以上)のプライマーは、最後の３’塩基が、多型を構成する２つ(またはそれ以上)の対立遺伝子の１つと一致するように変化している点を除いて互いに同一である。そして、それぞれ、共通プライマーおよび１つの対立遺伝子特異的プライマーを使用して、２つ(またはそれ以上)のＰＣＲ反応を、サンプルＤＮＡについて行う。
【００７５】
本発明において用いられる「スプライス変異体」は、同じゲノムＤＮＡ配列から一旦転写されたが、但し、択一的なＲＮＡスプライシングを受けたＲＮＡ分子から生成したｃＤＮＡを意味する。択一的なＲＮＡスプライシングは、一般にはイントロンを除くために一次ＲＮＡ転写物がスプライシングを受けているときに生じる。その結果、それぞれが異なるアミノ酸配列をコードし得る１つ以上のｍＲＮＡ分子が生じる。スプライス変異体の用語はまた、上記のｃＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質をも示す。
【００７６】
「同一性」は、その配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間における相互関係を反映する。一般に、同一性とは、比較されている配列の長さにわたって２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列のそれぞれの塩基毎またはアミノ酸毎の厳密な一致をいう。
【００７７】
「％同一性」−正確な一致が存在しない配列については、「％同一性」を決定することがある。一般に、対比すべき２つの配列を、最大の相関が配列間に得られるようにアラインメントされる。これには、アラインメントの程度を高めるために「ギャップ」をいずれか一方または両方の配列に挿入することが含まれ得る。％同一性は、比較されている配列のそれぞれの長さ全体にわたって決定することができる(いわゆる全体的アラインメント)：これは同じ長さまたは非常に類似する長さの配列の場合には特に好適である；あるいはより短い限定された長さにわたって決定することができる(いわゆる局所的アラインメント)：これは長さが等しくない配列の場合にはより好適である。
【００７８】
「類似性」は、２つのポリペプチド配列の間における関係に対する、より精巧な、さらなる尺度である。一般に「類似性」は、残基毎に基づき、(同一性に関してと、同様に)比較されている配列それぞれからの、相互に対をなす残基間における正確な一致だけでなく、正確な一致が存在しない場合にも、進化的な基準に基づいて、１つの残基は、他方に対する適当な置換であるかどうかをも考慮する、２つのポリペプチド鎖のアミノ酸間での比較を意味する。この蓋然性は付随した「スコア」を有し、２つの配列の「％類似性」はそれに基づき決定することができる。
【００７９】
２つ以上の配列の同一性および類似性を比較する方法は当該分野では周知となっている。従って、例えば、ウイスコンシン配列分析パッケージ(バージョン9.1；Devereux J. 他、 Nucleic Acids Res. 12、 387〜395、 1984；Genetics Computer Group (Madison、 Wisconsin、 米国)から入手可能)において利用可能なプログラム、例えば、BESTFIT およびGAP プログラムを使用して、２つのポリヌクレオチド間の％同一性ならびに２つのポリペプチド配列間の％同一性および％類似性を決定することができる。BESTFITでは、SmithおよびWatermanの「局所的相同性」アルゴリズム(J Mol Biol、 147、 195〜197, 1981、 Advances in Applied Mathematics、 2、 482〜489、 1981)を用いて、２つの配列間における類似性の最も良い１つの領域が見出される。BESTFITは、長さが類似していない２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列を比較することに対してより適している。該プログラムでは、より短い配列がより長い配列の一部を表すことが仮定されている。一方、GAPは、NeddlemanおよびWunschのアルゴリズム(J Mol Biol、 48、 443〜453、 1970)に従って２つの配列をアラインメントし、これにより「最大の類似性」を見出す。GAPは、ほぼ同じ長さであり、また、アラインメントが長さ全体にわたって期待される配列を比較することに対してより適している。好ましくは、各プログラムにおいて使用される「ギャップ加重(Gap Weight)」および「長さ加重(Length Weight)」のパラメーターは、それぞれ、ポリヌクレオチド配列の場合には50および３であり、ポリペプチド配列の場合には12および４である。好ましくは、比較されている２つの配列が最適にアラインメントした上で％同一性および類似性を決定される。
【００８０】
配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた当該分野では知られている：例えば、BLASTファミリーのプログラム(Altschul SF他、J Mol Biol、 215、 403〜410、 1990；Altschul SF他、Nucleic Acids Res.、 25：389〜3402、 1997;これはNational Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda、 Maryland、 米国)から入手可能であり、www.ncbi.nlm.nih.govにおけるNCBIのホームページからアクセス可能である)、およびFASTA(Pearson WR、 Methods in Enzymology、 183、 63〜99、 1990；Pearson WRおよびLipman DJ、 Proc. Nat. Acad. Sci. USA、 85、 2444〜2448、 1988;これはウイスコンシン配列分析パッケージの一部として入手可能である)。
【００８１】
好ましくは、BLOSUM62アミノ酸置換行列(Henikoff SおよびHenikoff JG、 Proc. Nat. Acad. Sci. USA、 89、 10915〜10919、 1992) が、比較前にヌクレオチド配列がアミノ酸配列に最初に翻訳される場合をも含みポリペプチド配列比較において使用される。
【００８２】
好ましくは、プログラムBESTFITが、基準ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に関して、検討するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の％同一性を決定するために使用される。この場合、前記したように、検討と基準とする配列とは、最適にアラインメントされ、そしてプログラムのパラメーターは暫定の値に設定されている。
【００８３】
「同一性指標」は、候補配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)と基準配列とを比較するために使用することができる、配列関連性の尺度である。したがって、例えば基準ポリヌクレオチド配列と比較したときに、例えば0.95の同一性指標を有する候補ポリヌクレオチド配列は、該候補ポリヌクレオチド配列は基準配列の各100塩基あたり平均して５個までの相違を含んでもよい点を除いて基準配列と同一である。かかる相違は、少なくとも１つの塩基の欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群から選択される。これらの相違は、基準ポリヌクレオチド配列の５’または３’末端部位に、あるいはこれらの末端部位間における任意の位置で、基準配列内の塩基間に個々に、あるいは基準配列内に１つまたは複数の連続した群で点在して存在してもよい。すなわち、基準ポリヌクレオチド配列と比較したときに0.95の同一性指標を有するポリヌクレオチド配列を得るためには、既に記載のように、基準配列において塩基100個毎に平均して５個までが任意の組合せで欠失、置換または挿入されていてもよい。同じことが同一性指標の他の値、例えば0.96、0.97、0.98および0.99についても必要に応じて変更して適用される。
【００８４】
同様に、ポリペプチドの場合、基準ポリペプチド配列と比較したときに、例えば0.95の同一性指標を有する候補ポリペプチド配列は、基準配列の各100アミノ酸あたり平均して５個までの相違を該ポリペプチド配列が含んでよいことを除いて基準配列と同一である。かかる相違は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、保存的および非保存的な置換を含む置換、または挿入からなる群から選択される。これらの違いは、基準ポリペプチド配列のアミノ末端またはカルボキシ末端部位に、あるいはこれらの末端部位間の任意の位置に、基準配列内のアミノ酸間に個々に、あるいは基準配列内に１つまたは複数の連続した群中で点在して起きてもよい。すなわち、基準ポリペプチド配列と比較した際に0.95の同一性指標を有するポリペプチド配列を得るためには、既に記載のように、基準配列内のアミノ酸の100個毎に平均して５個まで任意の組み合せで欠失、置換または挿入がなされていてもよい。同じことが同一性指標の他の値、例えば、0.96、0.97、0.98および0.99についても必要に応じて変更して適用される。
【００８５】
塩基またはアミノ酸の相違数と同一性指標との関係は下記の式で表すことができる：
ｎa≦ｘa−（ｘa・Ｉ）
式中、
ｎaは塩基またはアミノ酸の相違数であり、
ｘaは配列番号１または配列番号２における塩基またはアミノ酸のそれぞれの総数であり、
Ｉは同一性指標であり、
・は乗算演算子に対する記号であり、
この場合、ｘaとＩとの非整数の積は最も近い整数に切り捨てられ、その後ｘaからその値を引く。
【００８６】
「ホモログ」は、基準配列に対する高度の配列関連性を有するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を示すために、当該分野で使用されている総称である。かかる関連性は、既に定義されているように２つの配列間の同一性および／または類似性の程度を決定することによって定量化することができる。この総称には、「オルソログ」および「パラログ」の用語が含まれる。「オルソログ」は、別の種中における該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的等価体であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。「パラログ」は、機能的に類似している同じ種内におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
【００８７】
「融合タンパク質」は、２つの関連しない融合された遺伝子またはそのフラグメントによってコードされるタンパク質をいう。その例が米国特許第5541087号、米国特許第5726044号に開示されている。Ｆｃ−ＴＰＲ１リガンドの場合、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンのＦｃ領域を用いることは、Ｆｃ−ＴＰＲ１リガンドまたはリガンドのフラグメントを機能的に発現させて、治療に使用する際のかかる融合タンパク質の薬物動態学的性質を改善するために、ならびに二量体のＴＰＲ１リガンドを生成させるためには好都合である。Ｆｃ−ＴＰＲ１リガンドのＤＮＡ構築物は、５’から３’の方向で、分泌カセット、すなわち、哺乳動物細胞からの細胞外への輸送を引き起こすシグナル配列、融合パートナーとして免疫グロブリンのＦｃ領域フラグメントをコードするＤＮＡ、およびＴＰＲ１リガンドをコードするＤＮＡまたはその断片を含む。ある用途では、融合タンパク質の残部には手を触れることなく、機能的なＦｃ側を変異させ、その固有的な機能的性質(補体結合、Ｆｃ受容体結合)を変える、あるいは発現後にＦｃ部分を完全に除くことを可能とすることが望ましい。
【００８８】
特許および特許出願に限らず、これらを含む、本明細書中で引用されている刊行物および参考文献の全ては、十分に述べているように、個々の刊行物または参考文献を、参照して組み込むために、明示的かつ個別的に示唆されているように、その全部を、参照することで、本明細書中に組み込まれる。本出願が優先権を主張する特許出願はいずれも、先に刊行物および参考文献に関して記載したと同様に、その全部を、参照することで、本明細書中に組み込まれる。
【００８９】
（実施例）
プラスミド構築
ｐＤＢＬｅｕ−サバイビンのクローニング：サバイビン遺伝子を、ＮｈｅＩおよびＳｔｕＩの制限部位を組み込んだ遺伝子特異的ＰＣＲプライマー対を用いてヒトＰＣ−３細胞のｃＤＮＡからクローン化し、サバイビンのコード配列を増幅した。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングによってｐＣＲＩＩベクター(Invitrogen)にクローン化した。インサートをＮｈｅＩ／ＳｔｕＩ制限によって単離し、Ｙ２ＨベクターのｐＤＢＬｅｕ(PROQUEST(登録商標)ツーハイブリッドシステム、GibcoBRL LIFE TECHNOLOGIES)にクローン化して、ｐＤＢＬｅｕ−サバイビンを作製した。これにより、全長のサバイビンペプチドに融合したＧａｌ４ＤＢドメインを発現させるための融合遺伝子構築物が作製された。すべてのベクターは配列決定により確認された。
【００９０】
サバイビン遺伝子をクローニングするためのＰＣＲプライマーは下記のプライマーであった：
ＮｈｅＩ−５’サバイビンプライマー：プライマー１
ＳｔｕＩ−３’サバイビンプライマー：プライマー２
サバイビンと相互作用するタンパク質の選択
ｐＤＢＬｅｕ−サバイビンをおとり構築物として使用する酵母ツーハイブリッドスクリーニング(Proquest、 Life Technologies)を、ヒトＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡ−Ｙ２Ｈライブラリとヒト胎児脳組織に由来するｃＤＮＡライブラリとを使用して行った(セレクションは、25ｍＭの３−アミノトリアゾールを含有する−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ最少培地において行われた)。ＴＰＲ１クローンが両方のライブラリから単離された。相互作用は、β−ガラクトシダーゼフィルターアッセイとウラシル、製造者のプロトコルに記載されるように、トリプトファンおよびロイシンを含まない培地によって確認された。
【００９１】
１つの陽性クローンが単離され、配列決定された。対応するサバイビン相互作用タンパク質リガンドをＴＰＲ１と名付けた。配列は配列番号１および配列番号２に開示されている。
【国際公開パンフレット】
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2005506060.tif 000003
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2005506060.tif 000044
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506060.tif 000045
【国際調査報告】
2005506060.tif 000046
2005506060.tif 000047
2005506060.tif 000048
2005506060.tif 000049