(57)【要約】本発明は、組み換えタンパク質の生産用の遺伝子修飾動物に関する。特に、ブタ精嚢及び性副線を遺伝的に形質転換し、目的とするタンパク質を組み換えによって性的に成熟したブタの精液中に産生させる。複雑なタンパク質でさえも多量に生産され、精製することが可能である。本発明は又、哺乳動物の精嚢腺組織特異的なプロモーターであって、該プロモーターはそれと元来関連のないタンパク質をコードする配列を含む遺伝子構築物を作成するのに使用することが出来るもの、又は、該タンパク質をコードする配列の哺乳動物の精嚢及び／又は副組織における優先的な発現を促進するに充分な該プロモーターの一部に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びそれらの機能的断片から成る群から選択される、異種遺伝子の発現を実質的に調節する単離ＤＮＡ配列、又は、該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列。
【請求項２】
異種遺伝子の発現が哺乳動物の精嚢及びその副組織において行われる、請求項１記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項３】
哺乳動物の精嚢及びその副組織が、ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウマ、マウス、イヌ、又はネコ起源である、請求項２記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項４】
請求項１で定義される単離ＤＮＡ配列又は該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列を有する単離プロモーターに機能的に結合した異種ＲＮＡ又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項５】
請求項４に定義されたＤＮＡ構築物を含むゲノムを有する哺乳動物細胞。
【請求項６】
該細胞が精嚢又はその副組織由来である、請求項５記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウマ、マウス、イヌ、又はネコ細胞である、請求項５記載の哺乳動物細胞。
【請求項８】
ＲＮＡがアンチｍＲＮＡ又はリボザイムである、請求項４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
精嚢又はその副組織が請求項３に定義されたＤＮＡ構築物、その断片、又は該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列に機能的に結合した異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む非ヒト遺伝子修飾哺乳動物であって、自然に又は人工的に、精嚢細胞又はその副組織中に該異種タンパク質を発現するように生理的に誘導可能であり、それによって、該異種タンパク質が該形質転換又はキメラ動物によって産生される精液又は精液分泌物中に検出可能である、前記非ヒト遺伝子修飾哺乳動物。
【請求項１０】
該異種タンパク質の発現が非ヒト遺伝子修飾哺乳動物へのホルモン投与により人工的に誘導される、請求項９記載の非ヒト遺伝子修飾哺乳動物。
【請求項１１】
該動物がブタ、ウシ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウマ、マウス、イヌ、又はネコである、請求項９記載の非ヒト遺伝子修飾哺乳動物。
【請求項１２】
精嚢細胞又はその副組織細胞が請求項１に定義された単離ＤＮＡ配列、又は、該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列に機能的に結合した異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むゲノムを有している哺乳動物であって、該精嚢細胞又はその副組織細胞が自然に又は人工的に該異種タンパク質を発現するように生理的に誘導可能であり、それによって、該異種タンパク質が該哺乳動物によって産生される精液又は精液分泌物中に検出可能である、前記哺乳動物。
【請求項１３】
(a) 請求項４で定義されるＤＮＡ構築物を細胞内に導入し遺伝的形質転換細胞を形成し、及び、(b)
ステップ(a) の遺伝的形質転換細胞を自然に又は人工的に誘導して該異種タンパク質を発現させる、ステップを含む組み換えタンパク質の生産方法。
【請求項１４】
該細胞が精嚢又はその副組織由来である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ステップ(b)の該遺伝的形質転換細胞が更にインビトロで培養されるか、又は、哺乳動物内に存在する、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
該異種タンパク質が、該遺伝的形質転換細胞が培養される培養培地中、又は、該動物の精液中に産生される、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
請求項１で定義された単離ＤＮＡ配列の哺乳動物内における異種ＲＮＡ又はタンパク質の発現のための使用。
【請求項１８】
(a) シグナル配列、精嚢又は雄副腺内で排他的に発現可能にするプロモーターに機能的に結合した目的の異種タンパク質又はその一部をコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも一つの導入遺伝子をブタ細胞のゲノムに導入して、形質転換ブタ細胞を生成し、ここで、該導入遺伝子は該プロモーターが性的に成熟したブタ内で活性化され該ＤＮＡ配列が発現されるような様式で該ゲノム内に組み込まれており、及び、(b)
該形質転換ブタ細胞を性的に成熟した形質転換ブタに成長させる、ステップを含み、性的に成熟した該形質転換ブタの精液が該組み換えタンパク質を含む、ブタ精液内での組み換えタンパク質の生産方法。
【請求項１９】
該ブタ細胞が、卵母細胞、接合体、精子、又は体細胞である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該目的のタンパク質がホモ−又はヘテロ−ダイマーなタンパク質である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
該目的のタンパク質がホモ−又はヘテロ−ダイマーなタンパク質の少なくとも一つのサブユニットから構成されている、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
該目的のタンパク質が卵胞刺激ホルモンの少なくとも一つの機能サブユニットから構成されている、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該目的のタンパク質がエリスロポイエチンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
該サブユニットがα−又はβ−サブユニットである、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
該プロモーターが、ｐ２５、ｐ３４、カリクレイン、ＰＳＡ，ＳＢＰ−Ｃ，ＧＰ８，Ｊ３Ｐ８，ＰＳＰ−１，ＰＳＰ−２，ＰＳＰ−３，又は分泌タンパク質IVプロモーターである、請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
該プロモーターが配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び、配列番号４から成る群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
該ブタ細胞のゲノムが、あるタンパク質の一部又はサブユニットをコードする一つの導入遺伝子、及び、同タンパク質の別の一部又はサブユニットをコードするもう一つの導入遺伝子で遺伝的に形質転換されている、請求項１８記載の方法。
【請求項２８】
シグナル配列、精嚢又は雄副腺内で発現可能にするプロモーターに機能的に結合した目的のタンパク質又はその一部をコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも一つの導入遺伝子によって遺伝的に修飾されたゲノムを有する、形質転換ブタ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、ブタ精液における組み換えタンパク質の生産に関する。特に、本発明は、シグナルペプチド及び所望の組み換えタンパク質産物をコードするＤＮＡに機能的に結合した、少なくとも一つの精子特異的タンパク質プロモーターを含む導入遺伝子に関する。このような系がブタに遺伝子導入によって取り込まれると、組み換えタンパク質は該動物の精液中に発現される。本発明は更にまた、所望の組み換えタンパク質をその精液中に産生する形質転換動物（トランスジェニック動物）にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞培養発現系は、細菌、酵母又はバキュロウイルス発現系に比べていくつかの利点を有する。細菌では発現タンパク質の翻訳後修飾が行われず、酵母系では限られた様式でしか発現タンパク質の翻訳後修飾が行われない。真核細胞では、複雑なタンパク質修飾が行われ、それは、該タンパク質の適切な機能にとってしばしば必要なものである。
【０００３】
昆虫細胞は、より高度な真核タンパク質の有望な形質転換ビークルであり、一般的に、ある程度のタンパク質修飾を行うが、これらの細胞を培養するコストは真核細胞を培養するのに比べてかなり高い。更に、宿主細胞は昆虫細胞によって最終的には溶解され、発現された形質転換体タンパク質と共に数千種類の宿主タンパク質が混ざって培養培地中に放出される。これによって、発現された形質転換体タンパク質の精製が困難となる。
【０００４】
様々なタンパク質をコードするＤＮＡの乳腺における組織特異的発現、及び、形質転換マウス及びヒツジの乳中における様々なタンパク質の産生が数多くの研究所から報告されている。例えば、シモンズ・エル・ピー他（Simmons, L. P., et al. (1987) Nature 328:530-532 ）は、５’ 配列の４ｋｂを含むβ−ラクトグロブリン（BLG）をコードする１６．２ｋｂゲノム断片、４．９ｋｂのBLG転写ユニット、及び７．３ｋｂの３’ 隣接 (flanking) 配列のマウス受精卵へのマイクロインジェクションについて報告している。これら著者によれば、ヒツジBLGは乳腺中で発現され、形質転換マウスの乳中に産生されたBLGは約３．０から約２３mg/ml
の範囲であった。
【０００５】
組織特異的様式での発現は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、マウス、及びブタ等のいくつかの種類の家畜において達成されており、その殆どは乳及び血液における組み換えタンパク質の産生によって行われた。米国特許第6,201,167 号明細書には、形質転換マウスの精液中における組み換えヒト成長ホルモン（ｈGH）の発現を調節する為に精嚢特異的プロモーターを使用することが記載されている。このアプローチは形質転換マウスの精液において組み換えタンパク質を生産する可能性を示しているが、限られた数のマウス起源プロモーターしか試験されていない。
【０００６】
プロモーターは、遺伝子の転写レベルを調節することによって該遺伝子の空間的及び時間的発現を調節する。植物又は動物であろうと、異なる遺伝子工学的に操作された生物に対する初期のアプローチでは、外来性遺伝子を誘導するために強力な構成的プロモーターが利用された。
【０００７】
真核細胞バイオテクノロジーにおける戦略がより洗練されてきた為に、特定の発生（発達）段階における特定の組織に導入遺伝子の発現を標的（ターゲット）する為の特異的プロモーターが要求されている。
【０００８】
組み換えＤＮＡ技術によって、医学又は農業において重要なタンパク質及び糖タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び発現が可能になった。このようなタンパク質には、例えば、インシュリン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子、リポコルチン、凝固因子VIII 及びIX 、エリスロポイエチン、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、ウロキナーゼ、及び抗体が含まれる。
【０００９】
しかしながら、これらの重要なタンパク質の多くは大きく（分子量は３０Kdを超える）で、分泌され、適切な折り畳みを維持するためにはスルフィジリル結合が要求され、グリコシル化されており、かつ、プロテアーゼに対して感受性である。その結果、所望の組み換えタンパク質が正確に処理されなかったり、適切なグリコシレーションを欠いていたり又は不適切に形成されたりするので、原核細胞におけるこのような産物の組み換え生産は、満足できるものではないことが判っている。従って、このような組み換えタンパク質を培養真核細胞で生産することが求められている。この技術は、経費がかかり、細胞培養方法の多様性の故にしばしば信頼性に欠けるものであることが示されている。例えば、平均収率は培養培地１ｌ当たり組み換えタンパク質１０mg
である。その結果、コストが典型的には組み換えタンパク質１グラム当たり１千ドルを超えるものとなる。
【００１０】
このようなルートが全体的にみれば再生可能であり、医学的に重要な殆どのタンパク質自体が体液中に分泌されるものであるので、固体組織から回収するのではなく、体液から回収することは望ましい。肝臓又はＢリンパ球から血流中への分泌は一つの可能なルートではあるが、血液の凝固特性及び生物学的活性ペプチド及び抗原性分子の存在がその後の処理にとって障害となることが示されている。
【００１１】
米国特許第6,201,167 号明細書には、ヒト成長ホルモン（ｈGH）をプロモーターｐ１２の調節下で精液中に産生する形質転換マウスが開示されている。この文献はマウス精液における組み換えタンパク質の生産を示しているが、マウスはただの実験モデルにすぎない。このような適用をマウスモデルと、殆どが非常に多量の精液を産生する家畜との間で転用することは、膨大な試験なしには不可能である。当業界においては、形質転換動物はその細胞内において、ＤＮＡメチル化又はゲノムからのＤＮＡ欠失のような、導入遺伝子の発現に影響を与え又はそれを阻害さえするメカニズムを有していることが知られている（Kappell
et al., (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:549） 。更に、異常な発現の原因となる位置効果及び未同定の調節要素も認められている（Wall
et al., 1996, Theriogenelogy, 45:61）。
【００１２】
米国特許第6,201,167 号明細書では、マウスよりはるかに大きく、そして、精嚢及び生殖副腺のレベルにおいて異なる生理的メカニズムを有する動物の精液中に、二量体（ダイマー）タンパク質のサブユニット又はペプチドが同時に産生されるかについて明確に確認されてはいない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
当業界における上記の状況を考慮すると、組み換えタンパク質を多量に生産する新たな手段を提供することが依然として非常に望まれているので、組織特異的な方法で目的の組み換えタンパク質の発現を調節する新たな調節核酸配列又はプロモーターを開発する余地が依存として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一つの目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びそれらの機能的断片から成る群から選択される、哺乳動物の精嚢（seminal vesicle）及びその副組織（acccessory tissue）における異種遺伝子の発現を調節する単離ＤＮＡ配列、又は、該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列、を提供することである。
【００１５】
哺乳動物は、ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウマ、マウス、イヌ、又はネコであり得る。
本発明によれば、上記単離ＤＮＡ配列又は該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列を有する単離プロモーターに機能的に結合した異種ＲＮＡ又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物が提供される。このＲＮＡはアンチｍＲＮＡ又はリボザイムであり得る。
【００１６】
本発明の別の目的は、請求項３に定義されたＤＮＡ構築物を含むゲノムを有する哺乳動物細胞を提供することである。この哺乳動物細胞は精嚢細胞又はその副組織由来の細胞であり、ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウマ、マウス、イヌ、又はネコ細胞由来である。
【００１７】
更に、本発明の別の目的は、精嚢又はその副組織が上記に定義されたＤＮＡ構築物、その断片、又は該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列に機能的に結合した異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む非ヒト形質転換又はキメラ哺乳動物であって、自然に又は人工的に、精嚢細胞又はその副組織中に該ＤＮＡ構築物を発現するように生理的に誘導可能であり、それによって、該異種タンパク質が該形質転換又はキメラ動物によって産生される精液又は精液分泌物中に検出可能である、前記非ヒト形質転換又はキメラ哺乳動物を提供することである。該ＤＮＡ構築物の発現はホルモン投与により人工的に誘導することが出来る。
【００１８】
更に、本発明の別の目的は、精嚢細胞又はその副組織細胞が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びそれらの機能的断片から成る群から選択される単離ＤＮＡ配列、又は、該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列に機能的に結合した異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むゲノムを有している哺乳動物であって、該精嚢細胞又はその副組織細胞が自然に又は人工的に該ＤＮＡ構築物を発現するように生理的に誘導可能であり、それによって、該異種タンパク質が該哺乳動物によって産生される精液又は精液分泌物中に検出可能である、前記哺乳動物を提供することである。
【００１９】
本発明によれば、 (a) 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びそれらの機能的断片から成る群から選択される単離ＤＮＡ配列、又は、該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列を有する単離プロモーターに機能的に結合した異種ＲＮＡ又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を細胞内に導入し遺伝的形質転換細胞を形成し、及び、(b)
ステップ(a) の遺伝的形質転換細胞を自然に又は人工的に誘導して該異種タンパク質を発現させる、ステップを含む組み換えタンパク質の生産方法、が提供される。
【００２０】
遺伝的形質転換細胞は、更にインビトロで培養されるか、又は、生きている生物内で自然に生起するものであり得る。
【００２１】
該異種タンパク質は、該遺伝的形質転換細胞が培養される培養培地中、又は、該遺伝的形質転換細胞を有する動物の精液中に産生され得る。
【００２２】
本発明の更に別の目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びそれらの機能的断片から成る群から選択される単離ＤＮＡ配列、又は、該単離ＤＮＡ配列と少なくとも８０％のホモロジーを有するＤＮＡ配列のヒト又は動物内における異種ＲＮＡ又はタンパク質の発現のために使用することである。
【００２３】
本発明は、多量の組み換えタンパク質産物を遺伝的修飾動物の精液中に産生する方法を提供するものである。
【００２４】
本発明の一具体例によれば、発現系において、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、生殖菅（genital tract）特異的（タンパク質）プロモーター、又は、雄生殖組織において活性化される任意のプロモーターに、該生殖菅組織における所望のタンパク質の分泌及び成熟を可能にするシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を介して、機能的に結合している。好適には、発現系は更に、所望の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列の下流に３’ 非翻訳領域を含む。この非翻訳領域は発現系のｒＤＮＡ転写物を安定化することが出来る。必要に応じて、発現系は更にシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流に５’ 非翻訳領域を含むことが出来る。
【００２５】
導入遺伝子、又は、発現系は、ブタ宿主ゲノムに形質転換
(transgenically) によって導入される。その結果、構築物又は系の一つ又はそれ以上のコピーが形質転換動物のゲノム内に取り込まれる。発現系が存在することによって、雄ブタが組み換えタンパク質を産生し、その精液内又はそれと共に分泌することが可能となる。このような方法により所望のタンパク質を生産することが出来る。
【００２６】
本発明の目的において用語は以下のとおり定義される。
【００２７】
本明細書において「遺伝的修飾」とは、形質転換又はキメラ動物に用いられる。形質転換動物は、その全ての細胞において導入遺伝子を有する動物を意味し、キメラ動物は幾つかの細胞、細胞グループ、又は器官において導入遺伝子を有する動物を意味する。
【００２８】
本明細書において「遺伝子」とは、タンパク質（又は、ポリペプチド）の産生に関与するＤＮＡ配列を意味する。まず第一に、ポリペプチドにおけるアミノ酸の特異的な順序を指示する実際のコード配列を含む。真核細胞（哺乳動物のような有核細胞）においては、この配列は、イントロンと呼ばれる非コードＤＮＡ配列により散在されたエクソンと呼ばれる短いＤＮＡの伸長部に分布している場合がある。これらの配列（イントロン及びエクソン）は、プレーメッセンジャーＲＮＡに転写され、成熟ｍＲＮＡが遺伝子にコードされる実際のタンパク質に翻訳される前に、それからイントロンが最終的に除去される。
【００２９】
本明細書において「プロモーター」とは、転写の為の非コード調節配列を意味し、通常は、コード配列の開始近傍に位置し、遺伝子プロモーター又は調節配列とも呼ばれる。簡潔ではあるが基本的に正確な方法として、或る組織において或るコード配列が転写され最終的に遺伝子にコードされる実際のタンパク質に翻訳されるかを決定するのが、プロモーターと転写因子と呼ばれる特殊な様々なタンパク質との相互作用である。
【００３０】
本明細書において「ベクター」とは、プラスミド、コスミド、ウイルス、人工染色体、又はバクテリオファージに由来するか、又は化学的若しくは酵素手段によって合成された核酸、例えば、ＤＮＡを意味し、その中には、特定の遺伝子をコードする一つ又はそれ以上の核酸断片が挿入され、又はクローンされている。この目的の為に、ベクターは一つ又はそれ以上のユニークな制限酵素部位を有することが出来、特定の宿主又は生体内で複製して、クローン配列を再生産することが出来る。ベクターは直鎖状、環状、又は、超螺旋状の配置をとることが出来、他のベクター又は他の物質と或る目的の為に複合体を形成することも出来る。ベクターの成分としては、非制限的な例として、ＤＮＡ、切り出しタンパク質又は別の所望のタンパク質をコードする配列、並びに、転写、翻訳、ＲＮＡ安定、及び複製用の調節要素を含むＤＮＡ分子を有することが出来る。
【００３１】
本明細書において「異種タンパク質」とは、本発明のプロモーターとは元来関連しない、任意のタンパク質、ペプチド、ポリペプチドを意味する。しかしながら、異種タンパク質をコードする異種遺伝子は、組み換えが発現する動物又はヒトに起源を有するものであり得る。
【００３２】
本明細書において「機能的断片」とは、異種コード配列に対して精嚢腺及びその副組織を標的とした組織特異的発現を付与するに少なくとも充分である分子要素を有する核酸断片を意味する。例えば、非限定的な例として、該断片は、精嚢細胞において異種コード配列の発現を調節するために、本発明の非コード単離ＤＮＡ配列の３’ 末端から始まる１０００ｋｂの長さを有する。この１０００ｋｂ断片は、精嚢組織特異的プロモーターの調製に際して、他の種又は異なる起源の転写調節要素のような任意の他の調節要素に結合することが出来る。当業者であれば、このような他の調節要素を認識することが可能である。
【００３３】
本明細書において「機能的結合」とは、生殖菅特異的プロモーター又は生殖菅組織において特異的に活性化されるプロモーターが所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合して、該ＤＮＡ配列の発現及び雄生殖菅の副腺における該タンパク質の産生を調節可能にすることを意味する。
【００３４】
本明細書において「組み換えタンパク質」とは、本発明において精液が産生される動物の元来のゲノムにとって内在していないＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質又はペプチドを意味する。この用語はまた、本発明において精液が産生される動物の元来のゲノムに内在するが、本発明の形質転換動物が精液中に産生するのと同じレベルではその精液中に該タンパク質又はペプチドを生産することはないＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質又はペプチドを意味する。
【００３５】
本明細書において「生殖菅」とは、前立腺、精嚢、副睾丸、輸精菅、アンプル（ampule）、精菅(vas deferens) 、及び尿道球腺の全体又は一部を含む、生殖解剖学的雄系を意味するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明の好適実施例が示されている添付の図面を参照しながら、本発明を以下により詳細に説明する。しかしながら、本発明は多くの異なる形態で具体化することが出来、本発明は本明細書に記載された具体例に限定して解釈されるべきではなく、むしろ、これらの具体例は本開示が完全で完璧となり当業者に本発明の範囲を充分に伝えるために提供されるものである。
【００３７】
本発明によって、精嚢、生殖腺、及び／又はそれらの副組織のレベルでの転写調節をを介して任意の動物の精液中における特異的な所望タンパク質又はポリペプチドの発現を可能にする新たなプロモーターが提供される。
【００３８】
更に本発明によって、形質転換哺乳動物を生み出すために有用な新たなプロモーター要素が開示される。本明細書において、ＰＳＰ１，ＰＳＰ２及びＡＱＮ−３と称されるこれらのプロモーターは、ブタ由来であり、近接する遺伝子又はコード配列が任意の哺乳動物の精嚢及びその副組織のみで発現するのを調節することが出来る。ＰＳＰ１の配列は配列番号１、ＰＳＰ２の配列は配列番号２、ＡＱＮ−３の配列は配列番号３、及びそれらの共通配列は配列番号４に記載されている。これらの配列は夫々８，９８０、１３，１２１６、及び１５，５７２塩基対ＤＮＡ断片に存在し、タンパク質コードＤＮＡ配列に対して、組織特異的発現を付与するに充分な全ての配列を含み、そして、幾つかの付加的で不必要なＤＮ配列を含む場合もある。こうして以下の哺乳動物の精嚢及び副組織プロモーターは利用可能である：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は、哺乳動物の精嚢又は副組織における導入遺伝子の優先的な発現を奏効するために充分な配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の一部又は変形。
【００３９】
本発明のような精嚢組織特異的プロモーターの一つの用途は、精液中に目的とする組み換えタンパク質、ペプチド又はポリペプチドを生産し、そこからそれらが抽出することが出来るようにするか、又は、精液それ自体の質に影響を与えるように試みることを目的として、形質転換非ヒト哺乳動物内での標的遺伝子の発現を調節ことである。例えば、これらプロモーターの一つは予防又は治療目的で使用され、従って抽出・精製される医薬用タンパク質又はペプチド因子をコードする遺伝子の発現を指示するために使用することができる。配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４の塩基対の全て又はその一部はこのような外来性又は内因性の遺伝子のセンス又はアンチセンス方向での発現を、天然遺伝子発現の過剰発現又は抑制の為に使用することができる。ＰＳＰ１，ＰＳＰ２及びＡＱＮ−３プロモーターに指示される遺伝子の起源は様々であり、例えば、非制限的な例としては、動物、植物、又は微生物タンパク質を挙げることが出来る。
【００４０】
本発明の精嚢御及び／又は副組織プロモーターは、更にまた、生殖腺又は副組織の生理に影響を与えずに、精液の質に影響を及ぼす標的遺伝子の発現を調節することに使用することが出来る。例えば、非制限的な例として、精子膜のような特異的産生物、又は、分解後に精液の質を損なうような精液産物の分解を保護するために、抗酸化ペプチド因子を形質転換精嚢細胞によって組み換え分泌させることができる。
【００４１】
特に、本発明の発現ベクター又は形質転換動物において、目的とするタンパク質をコードする配列はその５’ 末端側に、完全なブタＰＳＰ１，ＰＳＰ２及びＡＱＮ−３プロモーター、又は、該プロモーターの機能を確保した均等配列に対応する配列を有することが出来る。「均等配列」とは、好ましくは、ＰＳＰ１，ＰＳＰ２又はＡＱＮ−３プロモーターの３’ 末端から上流に少なくとも２ｋｂの長さを有し、特に、ＰＳＰ１，ＰＳＰ２又はＡＱＮ−３プロモーターの３’ 末端から上流に少なくとも１ｋｂの長さを有する断片に位置する発現要素を含む配列を指す。本発明の様々な具体例で有用な生殖菅特異的タンパク質プロモーターは、ｐ１２、ｐ２５、カリクレイン、ＰＳＡ、ＳＢＰ−Ｃ，ＧＰ８、Ｊ３Ｐ８，ＰＳＰ−１、ＰＳＰ−２，ＡＱＮ−３、及び、分泌タンパク質IV プロモーターである。生殖菅特異的タンパク質プロモーター又は生殖菅組織で特異的に活性化されるプロモーターはｃＤＮＡ又はゲノム配列由来であり得、好ましくは、ゲノムが起源である。
【００４２】
本明細書において定義される任意の細胞型を変更させて本発明の修飾核ＤＮＡを担持させることが可能である。本発明で考慮される細胞の型としては、例えば、胚細胞、幹細胞、創始細胞(founder cells) 、接合子、又は配合子である。遺伝的形質転換の標的となる細胞は、ペトリ皿における直接的なトランスフェクション又は生体内へのＤＮＡ構築物の注射によって、インビトロ及びインビボ条件で操作することが出来る。
【００４３】
標的ＤＮＡゲノムを挿入、欠失、及び／又は変異によって修飾する方法の例として、レトロウイルスによる挿入、人工染色体技術、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターによるランダム挿入、相同組み換え、遺伝子標的化（ターゲッティング）、移動可能な要素、及び／又は他の外来性ＤＮＡを導入する任意の方法がある。当業者に周知のほかの修飾技術としては、ＤＮＡ配列の欠損、及び／又は核ＤＮＡ配列の変更がある。
【００４４】
導入遺伝子の発現が、例えば、組み換えポリペプチドの産生のような、所望の表現型の生成に必要な場合には、該導入遺伝子は少なくとも、夫々、本発明の組み換え又は分泌組み換えＤＮＡに機能的に結合した５’ 及び好ましくは付加３’ の「発現調節配列」を含むものである。このような発現調節配列は、転写調節に加えて、少なくともそれらも転写される程度まで、ＲＮＡ安定化及びプロセッシングに寄与する。
【００４５】
このような調節配列は組み換え又は分泌組み換えＤＮＡの組織特異的又は細胞型特異的発現が生じるように選択することが出来る。一旦、組織又は細胞型が発現の為に選択されると、５’ 及び適宜３’ の発現調節配列が選択される。一般的に、このような発現調節配列は選択された組織又は細胞型で主として発現される遺伝子に由来するものである。好適には、これらの発現調節配列が得られる遺伝子は、他の組織及び／又は細胞型における導入遺伝子の組み換えＤＮＡの発現が形質転換動物にとって有害（不利）なものでなければ、該組織及び／又は細胞型における二次的発現は認められるものの、選択された組織又は細胞型でのみ実質的に発現される。特に好適な発現調節配列は、操作する動物種に内在するものである。しかしながら、ウシ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ウサギ、トリ、又は、更にヒト遺伝子等の他の種に由来する発現調節配列を使用することも出来る。幾つかの場合には、発現調節配列と組み換えＤＮＡ配列（ゲノム又はｃＤＮＡ）は同じ種、例えば、夫々、ブタ種、又は、他の任意の哺乳動物起源であり得る。このような場合、発現調節配列と組み換えＤＮＡ配列は互いにホモ（相同）である。或いは、発現調節配列と組み換えＤＮＡ配列（ゲノム又はｃＤＮＡ）は別の種から得られたもの、例えば、発現調節配列はブタ種由来で、組み換えＤＮＡ配列はヒト由来である。このような場合には、発現調節配列と組み換えＤＮＡ配列は互いにヘテロ（異種）である。以下では、内在性遺伝子からの発現調節配列を規定する。このような規定は、非内在性遺伝子、異種遺伝子、に由来する発現調節配列にも適用することができる。
【００４６】
他の転写調節要素を本発明のベクター又は構築物に取りこむことができる。他の５’ 及び３’調節要素を異なる配置で本発明の発現ベクターに取りこむことができる。一般的には、５’発現調節配列は翻訳開始配列上流の内在性遺伝子の転写部分（５’非翻訳領域又は５’ＵＴＲ）、及び、機能的プロモーターを含むその上流の隣接（flanking）配列を含んでいる。このような配列は典型的には、転写開始部位から一般的に約２５〜３０ヌクレオチド離れて位置するＴＡＴＡ配列又はボックスを含んでいる。ＴＡＴＡボックスはしばしば近位シグナルとも呼ばれている。多くの場合に、プロモーターには更に、近位シグナル（ＴＡＴＡボックス）の上流に一つ又はそれ以上の遠位シグナルを有しており、それらは転写を開始するのに必要である。このようなプロモーター配列は一般的には転写開始部位の上流に位置する最初の１００〜２００ヌクレオチド内に含まれているが、転写開始部位から更に遠くに位置することもある。このような配列は当業者に直ちに明らかであるか、又は、標準的な方法によって容易に同定することが出来る。
【００４７】
このような５’発現調節配列に加えて、付加５’隣接配列（以下、「遠位５’発現調節配列」と呼ぶ）も導入遺伝子に含まれると考えられる。このような遠位５’配列調節配列は一つ以上のエンハンサー及び／又は、内在性遺伝子の発現を促進する他の配列を含んでいると考えられ、その結果、遠位及び近位５’発現調節配列に機能的に結合した組み換え又は分泌組み換えＤＮＡ配列の発現を促進する。遠位５’発現調節配列の量は発現調節配列が由来する内在性遺伝子に依存する。任意の特定の内在性遺伝子に由来する遠位５’発現調節配列の適当な量は、最大の発現量を得る為に遠位５’発現調節配列の量を変化させることによって容易に決定することが出来る。一般的には、遠位５’発現調節配列は隣の遺伝子に伸長するほど大きくはなく、導入遺伝子レベルに悪影響を及ぼすＤＮＡ配列を含むことはない。
【００４８】
更に、組織又は細胞型特異的発現を補填する為に、３’発現調節配列も構築物又は発現ベクターに含めることが出来る。このような３’発現調節配列には、所望の遺伝子由来の３’遠位及び３’近位発現調節配列が含まれる。３’近位発現調節配列には、組み換えＤＮＡ配列における翻訳停止シグナルの下流に位置する転写されるが翻訳されないＤＮＡ（３’非翻訳領域又は３’ＵＴＲ）が含まれる。このような配列は通常、ポリアデニレーション配列（内在性遺伝子又はＳＶ４０のような他の起源を有するもの）で終わり、その配列はＲＮＡ安定性に影響を与える。一般的に、３’ＵＴＲは３’調節配列が得られた遺伝子における翻訳停止シグナルの下流約１００〜５００ヌクレオチドを含む。遠位３’発現調節配列には、近位３’発現調節配列の下流の隣接ＤＮＡ配列が含まれる。遠位３’発現調節配列の一部は転写されるがｍＲＮＡの一部を形成はせず、一方、遠位３’発現調節配列のその他の配列は全く転写されない。このような遠位３’発現調節配列にはエンハンサー及び／又は発現を促進する他の配列を含んでいると考えられる。このような配列は効率的なアデニル化に必要であり、転写終結配列を含んでいる。
【００４９】
本発明の一具体例は、組み換えポリペプチドの分泌を可能にするＤＮ配列、即ち、形質転換動物内の一つ又はそれ以上の細胞型から、組み換えポリペプチドの分泌を指示する、導入遺伝子内に機能的に結合された機能的分泌シグナルペプチドをコードする「分泌ＤＮＡ配列」を提供するものである。一般的に、分泌ＤＮＡ配列は、組み換えＤＮＡ配列と機能的に結合したときに組み換えポリペプチドの分泌を引き起こすことが出来るシグナルペプチドをコードする任意のＤＮＡ配列と定義することが出来る。一般的な分泌ＤＮＡ配列は、形質転換動物と同じ種の分泌タンパク質をコードする遺伝子から得られる。このような分泌ＤＮＡ配列は好ましくは、組織特異的発現の標的とされる細胞型から分泌されるポリペプチド、例えば、精嚢又は副組織細胞中の発現及びそれからの分泌に必要な分泌精液タンパク質をコードする遺伝子に由来する。しかしながら、分泌ＤＮＡ配列はこのような配列に限定されるものではない。例えば、精嚢又は副組織細胞以外の分泌タンパク質をコードする相同遺伝子の天然シグナル配列のような、形質転換動物種の他の細胞型から分泌されるタンパク質の分泌ＤＮＡ配列も使用することが出来る。
【００５０】
本発明の別の具体例では、ブタ種の精嚢分泌細胞において機能する分泌シグナル配列をコードする分泌ＤＮＡ配列が提供される。それは、ブタ精嚢及び／又は副分泌細胞から組み換えポリペプチドの分泌を引き起こすために使用することが出来る。分泌ＤＮＡ配列は組み換えＤＮＡ配列に機能的に結合している。このような分泌ＤＮＡ配列の例として、ブタＰＳＰ１，ＰＳＰ２，ＡＱＮ−３，ＡＱＮ−１，ＡＷＮ、又はＤＱＨのシグナル分泌配列をコードするＤＮＡ配列を挙げることが出来る。シグナルペプチドの大きさは本発明によって重要ではない。発現されるブタ生殖菅組織において所望の組み換えタンパク質の分泌及び成熟を奏するのに該ペプチドが充分な大きさであるかが、要求される全てである。
【００５１】
分泌ＤＮＡ配列が組み換えＤＮＡ配列に結合する際の「機能的に結合」するとは、分泌ＤＮＡ配列（分泌シグナルペプチド配列をコードするコドンを含む）が組み換えＤＮＡ配列に共有結合で結合し、その結果、得られる分泌組み換えＤＮＡ配列が５’ から３’ に分泌シグナル配列及び組み換えポリペプチドをコードすることを意味する。従って、分泌配列及び組み換えＤＮＡ配列の読み取り枠（open
reading frame） が共有結合して、転写及び一次ＲＮＡ転写産物のプロセッシングの後に形成されたｍＲＮＡの５’ 末端から読み取り枠が存在する。ＲＮＡにおけるこの読み取り枠は分泌シグナル配列をコードする５’ 配列部分と組み換えポリペプチドをコードする３’ 配列部分を含んでいる。このように構築されたときに、分泌組み換えＤＮＡ配列の発現によって産生された組み換えポリペプチドは、標的細胞から分泌されることが可能な形態であり、該細胞は本明細書に記載のプロモーターの調節下で組み換えＤＮＡ配列を発現する。
【００５２】
本発明の別の具体例では、分泌組み換えＤＮＡが形質転換ブタ種の精嚢細胞において優勢に発現される。このような組織特異的発現は、精嚢特異的プロモーター又は発現調節ＤＮＡ配列を上記の分泌組み換えＤＮＡ配列に機能的に結合することによって得られる。このような精嚢特異的プロモーターには該種の精嚢又は副組織細胞において発現する遺伝子からの上記調節配列が含まれる。このような精嚢又は副組織特異的遺伝子にはＰＳＰ１，ＰＳＰ２及びＡＱＮ−３が含まれる。
【００５３】
本発明の別の具体例によれば、ヒトの精嚢又は副組織の遺伝子治療法が提供される。ベクター又はＤＮＡ構築物の精嚢組織又は附属組織へのインビボ又はエキソビボで組み込みこむことによって、例えば、ガンのような疾患を治療し、又は、これら組織における異なる標的細胞グループの生理を調節することが出来る。
【００５４】
本発明で記載された、目的の遺伝子の発現を調節する精嚢組織特異的プロモーターを含むベクターで形質転換した細胞又は発現ベクターは必要な患者の精嚢細胞に直接組み込まれる。例えば、本発明の範囲を制限するものではないが、細胞成長阻害因子は組み込まれることによって、アップ調節された細胞により直接分泌され、過増殖性になる。過増殖性疾患はこの様式で治療可能なひとつの細胞挙動である。この場合に、発現ベクターの一部が生物内に放出されても、用いられるプロモーターの組織特異性の為に隣接する遺伝子発現が精嚢及びその附属内のみに制限され、処置された生物又は患者の他の如何なる場所における調節外の発現を回避することが出来る。
【００５５】
翻訳後（ポストトランスレーション）修飾を受けた活性な組み換えタンパク質を生産するという問題は、本発明によって、ブタ生殖菅を発現組織として使用することによって解決することが出来る。精液は、幾つかの種類の動物においては容易に回収して多量に入手することが出来、生化学的に良く特徴付けがなされている。更に、この体液中には、数種類のタンパク質が高濃度で存在している。
【００５６】
本発明に従えば、形質転換ブタの精嚢腺を組み換えタンパク質の生産系として使用する。
【００５７】
このような問題は、本発明により形質転換動物の精液中に多量の組み換えタンパク質産物を生産する新たな効率的な手段を提供されることで解決する。
【００５８】
驚くべきことに、本発明者は制限するものではないが、例えば、二量体のような非常に複雑なタンパク質がブタの精嚢及び生殖副腺で生産されることを見出した。
【００５９】
より正確には、本発明は、方法、ＤＮＡ配列、組成物及び組み換えタンパク質を生産するブタに関する。より特異的には、本発明は、所望の組み換えタンパク質を生殖菅組織中に分泌及び成熟させることができるシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を介して、該所望の組み換えタンパク質又はその組み合わせをコードするＤＮＡ配列に機能的に結合した、生殖菅特異的タンパク質プロモーター又は生殖菅組織で特異的に活性化する任意のプロモーター配列を含む構築物の一つ又はそれ以上のコピーを形質転換によって取りこむ（導入する）ことに関連する。遺伝子構築物はクローニングに使用されるブタ胚、幹細胞又は成人細胞に取り込まれ、その後、組み換えタンパク質産物が発現され、形質転換ブタの精液中に又はそれと共に分泌される。
【００６０】
本発明では任意の動物を使用することが出来る。好適には、多量の精液を産生し、頻繁な射精期間を有する動物が好ましい。
【００６１】
本発明方法で生産することのできるタンパク質産物には、例えば、モノ−若しくはポリ−抗体、又はその誘導体、免疫グロブリン、サイトカイン、凝固因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、α―１アンチトリプシン、動物成長ホルモン、細胞表面タンパク質、インシュリン、インターフェロン、リパーゼ、抗ウイルスタンパク質、抗細菌タンパク質、バクテリオシン、ペプチドホルモン、リポコルチン、及びその他の組み換えタンパク質産物が含まれる。本発明の系で組み換えによって生産されるタンパク質として、特に、非限定的な例として、ヘテロニ量体であるＬＨ、ＴＳＨ、及びＦＳＨのようなニ量体タンパク質を挙げることが出来る。
【００６２】
所望の組み換えタンパク質は所望の又は天然のタンパク質のアミノ酸以外のアミノ酸を含む融合タンパク質として生産することも可能である。例えば、所望の組み換えタンパク質を安定化するため、又は、精液からの精製を促進するために、本発明の所望の組み換えタンパク質をより大きな組み換えタンパク質の一部として生産することが出来る。次に、この融合タンパク質を切断して所望のタンパク質を単離する。あるいは、所望の組み換えタンパク質は天然タンパク質の誘導体又は断片として生産されるか、又は、天然タンパク質に類似したアミノ酸配列を有するものとして生産される。これらいずれのものも正しいＤＮＡ配列を唯選択することによって容易に生産することが出来る。
【００６３】
上記の形質導入遺伝子（transgene）は当業者に周知の方法で調製することが出来る。本発明の導入遺伝子は一旦ブタゲノムに組み込まれると、所望の組み換えタンパク質を優先的に活性化して次いで発現する。例えば、従来のリンカー、制限酵素部位、等を用いる様々なライゲーション技術を使用して良い結果が得られる。好適には、本発明の発現系はより大きなプラスミド、又は、コスミド、ＢＡＣ及びＰＡＣなどのほかのベクターの一部として調製される。このように調製することによって、当該技術分野で周知の様に、
正確な構造を効率的な方法でクローニングし選択することが出来る。優先的には、本発明の導入遺伝子はプラスミドの便利な制限部位の間に位置させることによって、所望の動物内に取り込む為にその他のプラスミド配列から容易に単離できるようにすることが出来る。
【００６４】
このような単離及び精製の後に、本発明の発現系又は構築物を、形質転換するブタの遺伝子プールに加える。構築物の一つ又はそれ以上のコピーをブタ胚のゲノムに標準的又は新規な形質転換技術によって取りこむことが出来る。このブタは５００ｍｌまでの精液／射精を生産することが示された。これは目的の組み換えタンパク質を精液中に生産するために選ばれた動物であることが示すものである。
【００６５】
形質転換により動物を改変する一つの方法は、導入遺伝子を受精した卵の前核内にマイクロインジェクトし、導入遺伝子の一つ又はそれ以上のコピーを発生するブタ動物の細胞内に保持させることである。通常は、形質転換ブタは、体細胞組織及び生殖組織の双方にクローンされた導入遺伝子の少なくとも一つのコピーを有しており、該遺伝子を生殖細胞系を介して次世代に伝える。組織のバイオプシーのサザーンブロット分析又はポリメラーゼ鎖反応技術による導入遺伝子配列の増幅によって、構築物の存在に関して形質転換操作をされた胚の子孫を試験することができる。このように形質転換された胚（胎児）のゲノム内にクローニングされた外来性の構築物の一つ又はそれ以上のコピーが安定的に組み込まれて残っていれば、この形質転換によって追加された構築物を担持する永続的な形質転換動物を確立することが可能である。
【００６６】
本発明の別の具体例によれば、ヘテロ−及びホモ−ニ量体タンパク質サブユニットの異なるタンパク質が、異なり及び／又は独立したタンパク質サブユニットを産生する導入遺伝子の共導入の後に、同じブタの精液の中に一緒に分泌される。例えば、二つの独立したタンパク質又はサブユニットをコードする２つの共に組み込まれた導入遺伝子のプロモーターは、それらが精嚢又は雄副性腺に特異的である限り、異なっていても同じでもよい。
【００６７】
形質転換によって改変された動物の子供（litters）は誕生後に、子孫のゲノム内に構築物が取り込まれたかについてアッセイされる。好ましくは、このアッセイは、子孫からの染色体物質における所望の組み換えタンパク質産物をコードするＤＮＡ配列又はそのセグメントに対応するプローブをハイブリダイズすることによって実施される。該構築物の少なくとも一つのコピーをゲノム内に有することが見出された子孫を育て成熟させる。これら子孫の雄種は所望のタンパク質をそれらの精液と共に産生するであろう。或いは、形質転換動物を生育して、所望のタンパク質をその精液内に産生させるに有用な他の形質転換された子孫を生ませる（生産する）ことが出来る。
【００６８】
発生する生物との関連で、外来性遺伝情報を導入しそれを発現させることによって、特定の遺伝子発現を調節する機構、及び、正常な発生及び病的状態におけるこのような発現の役割について調査研究が可能になる。クローン化された遺伝子の卵へのマイクロインジェクションを用いた形質転換マウス製造の最初の成功から（Gordon et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384）、数多くの調査研究がこの方法を用いて行われ、様々な発生プロセスが研究されてきた。遺伝子調節を研究するための形質転換マウスの使用は着実に増加してきており、形質転換家畜を製造する前にＤＮＡ構築物を評価する際に重要なものであると考えられている。しかしながら、これまでのことから、マウスは単にモデルに過ぎず、それで得られた結果は他の種、特にその生物の生理が著しく異なる場合には、体系的に関連付けることが出来ない。当業者であれば、ブタの精嚢及び副腺の生理はマウスのそれらとは異なるものであることを認識できる。
【００６９】
哺乳動物の雄の精液及びそのタンパク質の生化学的特質解明は未だ不完全である。しかしながら、この点に関して現在利用できるデータでも、哺乳動物の雄の異なる種間でのその量的及び質的な生化学的組成は全く異なるものであると言うには充分な量である。
【００７０】
形質転換動物バイオリアクター産業は、まず第一に、それらの産物を乳に発現させることに焦点を当ててきたが、少なくとも一つの他の機関が産物を血液又は尿中から単離する可能性を探求してきた（Swanson et al., 1992, Bio/Technology 10:557-559）。本発明は、哺乳動物の腺バイオリアクターの同じ利点（産物の直接的、非侵襲的な回収）を有する別の方法（即ち、バイオリアクターとして生殖菅又は副性腺の使用）を提供するものである。
【００７１】
本発明は、その範囲を制限するのではなく本発明の悦名の為に提供される以下の実施例を参照することによって更に容易に理解されよう。
【実施例１】
【００７２】
発現ベクターの調製
以下に記載のアッセイ用に、発現ベクター（又は導入遺伝子）基本要素はブタＰＳＰ−Ｉ（８ｋｂ＝「Ｇ長」プロモーター、７ｋｂ＝「Ｇ」プロモーター）（配列番号１）、ＰＳＰ−ＩＩ（「Ｊ３」プロモーター、13136bp）（配列番号２）、又はＡＱＮ−３（15572bp）(配列番号３)遺伝子である。該ベクターにコードされたタンパク質は通常のニ量体ブタＦＳＨの両方の鎖が単一タンパク質として産生される人工的融合ペプチドである。これは構築物において、「ＦＳＨｆ」と表記する。
【実施例２】
【００７３】
インビトロトランスフェクション及び生物学的アッセイ  
インビトロにおいてトランスフェクトした細胞細胞内でのプロモーターの転写活性化能を、トランスフェクションの４８時間後に細胞培地におけるＦＳＨ様生物学的活性の存在によって評価した。
【００７４】
この活性は、適当な陽性及び陰性コントロールと共に、ブタ及びウシの卵子（ova）を用いる定性的アッセイにおいて卵丘拡大(cumulus
expansion)を引き起こす馴らし培地(conditioned medium)の能力によって評価した。我々がクローン化したブタＰＳＰ−Ｉ及びＰＳＰ−ＩＩプロモーターを迅速に評価するために、ＰＳＰ−Ｉ又はＰＳＰ−ＩＩのいずれかのプロモーターからの大きなゲノム断片の調節下でブタ卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）をコードする発現ベクターを構築した。
【００７５】
これらの発現ベクターは、コントロールとしてＣＭＶプロモーター及び同じコード配列を使用ものと平行して試験した。リポフェクチン２０００TM によるトランスフェクションの為に、ブタ精嚢上皮細胞の初代培養物を精嚢特異的組織のモデルとして、及び、ブタ顆粒膜細胞を非特異的組織のモデルとして使用した。
【００７６】
トランスフェクトされた細胞の培養培地中のＦＳＨｆの存在は、定性的生物学的アッセイで確証した。このアッセイにおいて、未だ卵丘に囲まれているウシ又はブタの卵子を採取し、適当な温度のＣＯ２インキュベーター内にある成熟培地を含む６ウェル培養皿においた。形質転換の４８時間後に回収された馴らし培地に卵子を暴露した。純粋な５ng/ml の少量のＦＳＨの存在下で、卵丘は目視で明らかに拡大した。しかしながら、陽性コントロールとしては５００ng/mlの濃度を使用した。形質転換細胞からの馴らし培地を５％及び１０％の最終濃度で卵子成熟培地に添加した。非形質転換細胞からの培地は陰性コントロールとして使用した。
【００７７】
【表１】
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【実施例３】
【００７８】
マウスにおけるインビボでのトランスフェクション
８ｋｂのブタＰＳＰ−Ｉプロモーターを、ＤＮＡ及びExGenTM500を用いたＩＶ注射又は精嚢への直接注射によるマウスにおけるインビボでのトランスフェクションによって試験した。プロモーター活性はＲＩＡアッセイ及び卵丘拡大の両方による精液中のＦＳＨｆの存在によって検証した。
【００７９】
Ｊ３Ｐ３−ＦＳＨｆＤＮＡ構築物をフェルメンタス(Fermentas)
からのExGenTM500試薬（ＰＥＩ）と共に、マウスにおけるインビボトランスフェクションアッセイに使用した。トランスフェクションはＤＮＡ／ＰＥＩ混合物の尾静脈への静脈注射（ＩＶ）又は精嚢（ＳＶ）内腔への直接注射によって実施した。その２４時間後に精液を回収し、ブタＦＳＨの量を市販ＲＩＡアッセイで評価した。陰性コントロール（Neg
ctrl) ｓｖはＰＥＩ単独を精嚢に注射したマウスからの精液であった。
【００８０】
ＩＶ注射及びＳＶ注射によってＤＮＡが運搬されたようである。更に、同じ構築物をＩＶ注射されたマウスの組織を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによってブタプロモーターＪ３Ｐ８がマウスにおいて組織特異的であることが示された。
【実施例４】
【００８１】
精嚢プロモーターを用いる形質転換マウスの製造
「Ｇ長−ＦＳＨ」構築物（ＰＳＰ−Ｉプロモーター）を用いて雄の創始者（founder）を製造した。７週間後に対象物は性的に成熟し、精液中のＦＳＨの存在を交尾させた雌の膣栓（vaginal
plug）から試験した。インビボトランスフェクション後のマウス精液におけるｐＦＳＨ  ＲＩＡは図１に示した。
【００８２】
「Ｇ長−ＦＳＨ」構築物はマウス胚の前核内にマイクロインジェクションした。雄形質転換創始者を同定し「ＪＲ」と標識した。性的成熟（７週齢）に達したときに該動物を交尾させ、膣栓を回収した。該栓をスライスし、生理的緩衝液中に回収日及びＲＩＡアッセイを実施した日に応じて様々な時間浸漬した。１週間後に生産は増加するようであるが（図２）、緩衝液中に存在するｐＦＳＨの量は浸漬期間により依存するようである。浸漬することによって、該緩衝液中に放出されるｐＦＳＨが増加するようである（図３）。
【実施例５】
【００８３】
マウス及びブタにおける組み換えｈＦＳＨ及びｐＦＳＨの生産
材料及び方法
組織特異的プロモーターのクローニング
プライマーは、公開されているブタＰＳＰ−ＩプロモーターｃDNA配列から設計し、ブタゲノムDNA鋳型及びExpand
High Fidelity 酵素混合物を用いるPCR反応で使用した。得られた３．３ｋｂ断片をpGEM-Teasy でクローン化し、対応する配列がエクソン１の末端からエクソン３の始めまでを含むPSP-I転写領域の最初の部分を含んでいることが示された。このプラスミドから、、エクソン１の末端及びイントロン１の最初の部分を含む１．３ｋｂのEcoR
I-BamH I断片を精製した。この断片をさらにPstIで消化し、１２０ｂｐ、５３２ｂｐ、及び６９６ｂｐの長さの３つの異なる断片を作成し、これらを混合してゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブを作成した。５３２ｂｐ断片配列の全てはブタスパームアドヘシン（spermadhesins）PSP-I,PSP-II及びAQN-3と非常に高い相同性が示すイントロン１の開始に由来していた。６９６ｂｐ断片の３’末端は他の公知のブタスパームアドヘシンに比べてPSP-Iにより特異性が高かった。従ってこれら３つ全ての断片の混合物は、一つ以上のブタスパームアドヘシンゲノムクローンとハブリダイズすることができるが、それでもなお、ＰＳＰ−Ｉとのより強いシグナルを生じることになる。３２Ｐ標識プローブはＴ７Quick
Prime キット（ファルマシア）を用いて作成した。
【００８４】
ライブラリースクリーニング
第一回目のスクリーニング用に、クローンテック(CLONTECH)ブタλゲノムライブラリーを１０枚の２３cm
x ２３cm プレート上に、１０５pfus/プレート（合計１０６pfus）で蒔いた。２０cm x ２０cm陽電荷ナイロン膜（Boehringer-Mannheim）
を用いて各プレートの二重プレートリフトを作成し、プレハイブリダイぜーション及びハイブリダイゼーション用のチャーチ（Church’s ）緩衝液を用いて２．０ｘ１０４cpm/cm２でプローブと反応させた。強度の異なる９つの陽性一致二重シグナルが同定された。各クローンについて、シグナルの中心から１ｃｍ２のプラグを切り出し、第二回目のスクリーニングにかけた。１２の候補の中で、ただ５つが第二回目のスクリーニングの後でも十分に強いシグナルを与えた。これらが第一回目のスクリーニングで同定されたプレートにちなんで、Ｇ，Ｊ１，Ｊ２，Ｊ３及びＩと名付けた。第二回目で単離されたプラークを取り出して第三回目にかけ、各クローンが精製されていることを確認した。
【００８５】
λクローンの特徴付け及び同定
転写開始シグナル（ＴＳＳ）の上流及び下流のゲノム配列の相対的なサイズを、クローニング部位の隣のλアーム配列、及びＰＳＰ−ＩＩ及びＡＱＮ−３でも完全保存されているＰＳＰ−Ｉイントロン１の開始部位配列に基づくプライマーを用いたＰＣＲ反応で評価した。１０ｋｂ以上の調節領域をを有する３つのクローン、Ｇ，Ｉ及びＪ３をさらなる研究の為に残した。それらの調節及び転写領域区域をＰＣＲでそれぞれ別個に、それらのサイズに応じてpGEM-Teasy 又はpCR-XL-TOPO 内にサブクローン化し、配列を決定した。転写領域から、各クローンがどのブタスパームアドヘシンゲノムクローン遺伝子に対応しているかを同定するデータが提供された。
【００８６】
Ｇ８及びＪ３Ｐ８プロモータープラスミド
クローンＧは、ＰＳＰ−Ｉであると同定され、そのＴＳＳ上流領域は１０ｋｂの長さであった。クローンＪ３はＰＳＰ−ＩＩであると同定され、、そのＴＳＳ上流領域は約１５．５ｋｂの長さであった。λクローンＧ及びＪ３からの完全なＴＳＳ上流領域を含むＰＣＲ断片をインビトロンInvitronTM TA-クローニングベクター pCR-XL-TOPO内にクローニングし、プラスミドｐＴＯＰＯ−ＧＰ及びｐＴＯＰＯ−Ｊ３Ｐを作成した。これらのプラスミドをニューイングランドバイオラボキット（New
England Biolabs kit) ＧＳＰ−１で処理し、公知配列であるトランスポゾンがランダムに挿入されたプラスミドをサブクローニングした。
【００８７】
多くのサブクローンにおけるトランスポゾンの相対的な配向及びおおよその挿入点を同定するために、元のＧＰ及びＪ３ＰＰＣＲクローンの末端及びＧＳＰ−１反応で使用したトランスポゾンの末端に基づくプライマーによるＰＣＲ分析を実施した。より短いプロモーター断片を含むプラスミドを調製する際に従った戦略を図４及び図５に示す。各ライブラリーから十分な数のサブクローンを分析し、ＴＳＳの上流約７ｋｂ及び８ｋｂの間に挿入点が位置するサブクローンを同定した。これらの選択されたサブクローンから、トランスポゾンの適当な末端に基づき作成したフォワードプライマー及び遺伝子５’ −ＵＴＲ配列を標的とするリバースプライマーを用いるＰＣＲによってＧＰ８及びＪ３Ｐ８と呼ばれるプロモーター断片を作成した。このリバースプライマーには開始ＡＴＧコドンの最初の二つ塩基が含まれている。フォワードプライマー及びリバースプライマーの双方はレアー切断(rare cutter)制限酵素部位を含む伸長された５’末端を有し、その後に各プロモーター断片を、AscI, SdaI, PmeI, PacI 及びFsI部位が遺伝子工学的ＭＣＳに追加された、ｐＧＥＭ−８Ｃと呼ばれる修飾ｐＧＥＭプラスミド内にクローニングすることを可能ならしめている。ＧＰ８プロモーター断片（図４）はAscI及び SdaI粘着末端でｐ８ＣＳ−ＳＴ２Ｇ−α内にクローニングされ、一方、Ｊ３Ｐ８（図５）は、AscI及び PacI粘着末端でクローニングされた。この結果、ベクターｐＧＰ８及びｐＪ３Ｐ８が得られた（図４，図５）。
【００８８】
ｐＦＳＨα及びｐＦＳＨβのクローニング及びインビトロ発現
ｐＦＳＨα及びｐＦＳＨβに対する完全なコード配列を含むブタゲノム断片を増幅するPCRプライマーを使用した。これらの断片は、単一方向のクローニングを可能にし真核発現に必要な要素である強力なプロモーター及びアデニレーションシグナル（polyA）を提供することのできるｐCR3.1−UniTAクローニングベクター（インビトロジェン）内にクローニングした。FSHβΔと呼ばれるFSHβミニ遺伝子を生成するために、１．５ｋｂイントロンから１ｋｂの中央断片を欠失させることによってｐCR3.1-FSHβベクターを更に修飾した。
【００８９】
ベクターｐCR3.1-FSHα及びｐCR3.1-FSHβΔをブタ顆粒膜細胞にトランスフェクションし、４８時間後に培地を回収した。生物学的に活性な二量体ｐFSHの存在をウシ卵母細胞の卵丘拡大に基づくインビトロ生物学的アッセイで確認した（Choi
et al., Teriogenology, 2001, 56:661-670）。
【００９０】
ｐFSH導入遺伝子用構築物
ｐFSHサブユニットゲノムコード配列がブタスパームアドヘシンプロモータークローンＧＰ８及びＪ３Ｐ８に結合されたDNA構築物を調製した。各サブユニット配列を、ｐＪ３Ｐ８へのクローニング用の制限酵素部位であるPcaI 及びFseIを含むように設計したPCRプライマーで増幅した。プライマーはベクターpolyAシグナルに結合したpFSHサブユニット配列を含むｐCR3.1-FSHベクター断片から増幅するように設計された。適当に処理されたｐＪ３Ｐ８内へのライゲーション後に、ブタ組織特異的プロモーターであるＪ３Ｐ８がFSHサブユニットに結合しその後に強力なpolyAシグナルが続く、ベクターｐJ3P8-pFSHα及びｐJ3P8-FSHβΔを得た。
【００９１】
G8プロモーター構築物に関しては、まず、p８CS-Sｔ２Gと呼ばれる予備プラスミドを作成した。このプラスミドは以前に記載したpGEM-8Cに基づいており、二つのスタファー（stuffer）DNA断片をスタファー１は制限酵素部位AscI
及びSdaIの間に、また、スタファー２は制限酵素部位PacI 及びFseIの間に導入されている。ついで、プラスミド及び断片の両方を制限酵素PacI及び
FseIで処理し、ゲル精製し、そして結合するという連続的な処理によって、スタファー２をpolyAシグナルに結合したｐFSHαを含むPCR断片と置換して、プラスミドp８CS-Sｔ２G-αを作成した。続いて、プラスミド及び断片の両方を制限酵素AscI及び
SdaIで処理し、ゲル精製し、そして結合するという連続的な処理によって、スタファー１をGP8プロモーター断片と置換して、プラスミドｐGP8-ｐFSHαを作成した（図４）。類似した操作に従い、プラスミドｐJ3P8-FSHβΔを作成した。制限酵素地図は図６及び図７に示されている。
【００９２】
遺伝子構築物のマウス及びブタへのマイクロインジェクション
受精した卵母細胞の前核内へDNA構築物を導入することによる形質転換マスウスの作成は、自体確立されたプロトコールに従って実施した（Hogen
et al. 1994）。簡潔に述べると、ドナーである雌（B6C/3F1 株、チャールズリバー、ワシントン、MA）を妊娠した雌血清ゴナドトロピン（PMSG,Vetrepharm,
London, ON, Canada）及びヒト絨毛性ゴナトトロピン（ｈCG,InterVet, Whitby, ON）を用いて過剰排卵させ、多産系雄と交尾させ、翌日に処理した。前核段階の胚を卵管から回収し、核の一つにDNA構築物をマイクロインジェクションした。インジェクトされた胚を、あらかじめ去勢した雄と交尾させて擬似妊娠状態の受容体（レシピエント）にある雌（CD1 株、チャールズリバー、ワシントン、MA）内に再度移植した。
【００９３】
ブタ胚は、それぞれ、１００kg 及び６ヶ月の体重及び年齢を有するランドレース・ヨークシャーXデュロック  ギルト（Landrace-Yorkshire X
Duroc gilts）の繰り返しにより産生した。これらの胚ドナーは以下のステップでシンクロナイズされ過剰排卵させられている。１７日間のオーラルのアルトノレジスト（AltrenogestTM
）処理(Regumate、ヘキストカナダ株式会社)、アルトノレジスト処理の最後に続く１日−１２００〜１４００IUの（PMSG,Vetrepharm, London,
ON, Canada）の注射、PMSG注射に続く７８時間後における１０００IUのｈCGの注射、ｈCG注射の２４〜３６時間後の人工授精、ｈCG注射の５２〜５７時間後の卵管からの胚の単離。胚の回収及び移送は、ウニベルシテ大学の動物ケア及び利用委員会（institutional
animal care and use committee） の認可に従い、全身麻酔下でギルト(gilt) を用いて腹中央部の腹壁切開（midventral
laparotomy）により実施した。０．４％（W/V） BSA（シグマ、Mississauga, On, Canada）及び５０mg/mlゲンタマイシン（シグマ、Mississauga,
On, Canada）を含む１５ml（２回）の暖かい（３７℃）リン酸生理食塩水（PBS）で胚を卵管から流した。前核を視覚化する為に、胚を15,000 x g で１０分間遠心した（Wall
et al., 1985）。前核段階の胚を同定し、核の一つを濃度４ng/μl のＤＮＡ溶液 でマイクロインジェクションした。生存している胚をレシピエントである雌の卵管内に再移植した。レシピエントはドナーと同様の方法で調製したが、人工受精は実施しなかった。腹中央部の腹壁切開をレシピエントに対して実施し、卵巣形態により排卵したと同定されたレシピエントの卵管に小さなカニュール及び少量のリン酸生理食塩水（PBS）を通して胚を注入した。
【００９４】
レシピエントの母から得られた子孫を、導入遺伝子についてＰＣＲ及びサザンブロットにより評価し、形質転換創始動物（transgenic founder animals）の可能性のあるものを同定した。
【００９５】
形質転換動物の同定
マウス尾組織を回収し、直ちに、50mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM
EDTA及び1%ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中の プロナーゼＫ（0.4mg/ml）で５５℃において一晩消化した。ブタ尾及び耳組織を回収し凍結させて実験室へ移送し、そこでマウス尾のように消化した。フェノール−クロロホルム抽出により高分子量ＤＮＡを単離し、９５％エタノール中で沈殿させた。ＤＮＡペレットを10mM
Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA 中で溶解し、使用するときまで４℃で保存した。
【００９６】
各導入遺伝子からの所定のサイズのDNA断片を特異的に増幅するように設計されたプライマーを用いて形質転換動物のPCR同定を実施した。増幅産物を１．０％アガロースゲル上の電気泳動で分離し、形質転換動物を示すべく期待されるバンドの存在を検出した。
【００９７】
確立された方法（Sambrook et al., 1989）を用いてサザン分析を実施した。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡを適当な条件下PstI
制限エンドヌクレアーゼで一晩消化した。ＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル上の電気泳動で分離し、ナイロン膜（ロッシュ、Laval, QC Canada）上に移した。移す前に、等量のレーン負荷及びＤＮＡ消化速度をアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色で評価した。これらの実験に使用したプローブは、ランダムプライミングによって調製した各導入遺伝子に特異的なＰ３２標識ＤＮＡ断片から成っていた。
【００９８】
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは４２℃において標準的なハイブリダイゼーション溶液中で上記プローブを用いて実施した。膜を０．５％ＳＤＳ，１％ＳＤＳ中、５５−６５℃にて１５分間２回洗浄した。ホスホイメージャー（Phosphoimager, Molecular Dynamics-Amersham Biosciences, Sunnnyvale,
CA USA）を用いて結合したプローブを検出した。
【００９９】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）による組み換えｐＦＳＨの検出
マウス膣栓抽出物及びブタ精液中のｐＦＳＨ濃度をＲＩＡで測定した。膣栓抽出物は形質転換及び非形質転換の雄とＰＭＳＧ−ｈＣＧでシンクロナイズされた雌を一晩一緒にし、翌朝、膣栓を回収することによって作成した。膣栓を生理的緩衝液中にいれ、膣栓中のＦＳＨが溶液内に拡散するようにした。
【０１００】
雄ブタの精液は手袋技術（gloved-hand technique）により回収し、８００ｇの遠心分離によって精液から精子を分離した。アッセイするときまで試料を-２０℃に置いた。第一ｐＦＳＨ抗体（Biogenesis,
Brentwood NH ESA）の供給会社が記載するような二重抗体ＲＩＡプロトコール又はＲＩＡキット（Biocode, Belgium）を使用してｐＦＳＨ濃度を測定した。
【０１０１】
【表２】
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【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
本発明は特定の具体例で説明されてきたが、本発明の更なる修飾が可能であり、本明細書は、一般的に、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野における公知又は慣用の範囲で行われ、これまでに本明細書中で記載された重要な特徴に適用され、請求の範囲に従うような、本開示からの逸脱を含む、本発明の如何なる変形、使用又は適用も包含することを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】インビボトランスフェクション後のマウス精液中におけるｐＦＳＨ  ＲＩＡ結果を示す。
【図２】マウス栓（プラグ）中におけるｐＦＳＨ産生レベルに対する年齢の効果を示す。
【図３】マウス栓（プラグ）中におけるｐＦＳＨ産生レベルに対する浸漬時間の効果を示す。
【図４】導入遺伝子GP8-pFSHαの調製戦略を示す。
【図５】導入遺伝子J3P8-pFSHβΔの調製戦略を示す。
【図６】導入遺伝子GP8-pFSHαの制限酵素地図を示す。
【図７】導入遺伝子3P8-pFSHβΔの制限酵素地図を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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