(57)【要約】ＣＤ４４はヒアルロン酸のための受容体であり、細胞機能生理学、細胞移動及び腫瘍転移において複雑な作用を有する。本発明者らはこれまでに、マウス線維肉腫細胞におけるヒトＣＤ４４受容体の過剰発現はマウスにおける皮下腫瘍増殖を阻害することを見出した［Ｋｏｇｅｒｍａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９７；１５：１４０７−１６；Ｋｏｇｅｒｍａｎら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １９９８；１６：８３−９３］。ここにＣＤ４４の腫瘍増殖阻害効果は血管形成の阻止によって引き起こされることが証明される。さらに、本発明者らは、可溶性組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン（ＣＤ４４ＨＡＢＤ）が、ニワトリ及びマウスにおけるインビボの血管形成を阻害し、それによって様々な起源のヒト腫瘍増殖を阻止することを見出した。ＣＤ４４−ＨＡＢＤの抗血管形成効果はヒアルロン酸（ＨＡ）結合から独立している。なぜならＣＤ４４ＨＡＢＤの非ＨＡ結合性変異体は依然、抗血管形成特性を維持するためである。本発明は可溶性ＣＤ４４組換えタンパク質を血管細胞表面受容体のターゲティングに基づく血管形成阻害物の新規の種類として開示する。組換えＣＤ４４タンパク質並びにそれらのアナログを使用する血管形成の阻止及びヒト腫瘍の治療方法が開示されている。本発明のさらなる実施形態として、ＣＤ４４組換えタンパク質及びそれらのアナログを使用する新薬標的のためのスクリーニング方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管形成及び／又は内皮細胞増殖の阻害と関係がある状態を治療するための医薬品の製造のためのＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン（ＣＤ４４−ＨＡＢＤ）の非ＨＡ結合性バリアント、並びにそれらのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアント又はその断片を含む分子の使用。
【請求項２】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤがそれを非ＨＡ結合性にする変異を少なくとも１個含む請求項１に記載の使用。
【請求項３】
（１個以上の）変異がＦ３４Ａ、Ｆ３４Ｙ、Ｋ３８Ｒ、Ｋ３８Ｓ、Ｒ４１Ａ、Ｙ４２Ｆ、Ｙ４２Ｓ、Ｒ４６Ｓ、Ｅ４８Ｓ、Ｋ５４Ｓ、Ｑ６５Ｓ、Ｋ６８Ｓ、Ｒ７８Ｋ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｓ、Ｎ１００Ａ、Ｎ１００Ｒ、Ｎ１０１Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、Ｙ１０５Ｓ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｆ、Ｆ１１９Ａ及びＦ１１９Ｙ、好ましくはＲ４１Ａ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓより選択される請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６５％、最も好ましくは少なくとも７５％という配列番号：２の配列との相同性を有する請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
組換えバリアントがＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分とＧＳＴ部分とを有し、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分が非ＨＡ結合性型である請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項６】
ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインの非ＨＡ結合性バリアントを含む分子が、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：２）、イヌＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：４）、ニワトリＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：６）、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１Ａ（配列番号：８）、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ７８ＳＹ７９Ｓ（配列番号：１０）ＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（配列番号：１２）、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ(２１−１００)（配列番号：２３）及びＣＤ４４−ＨＡＢＤ(６１−１００)（配列番号：２６）を含む群より選択され、これらの配列がこれらの配列を非ＨＡ結合性にする少なくとも１個の修飾をさらに含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
分子がヒト、イヌ、ニワトリ、霊長類の動物、ラット又はマウスを起源とする分子である請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
治療される状態が、黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び網膜低酸素状態のような失明又は視覚障害を引き起こす眼疾患、慢性関節リウマチのような慢性炎症の状態、乾癬、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、並びに癌の増殖及び転移、並びに乳房、前立腺、結腸、肺、皮膚、肝臓、脳、卵巣、精巣、骨格、上皮、内皮、膵臓、腎臓、筋肉、副腎、腸、内分泌腺、口腔、頭部及び頸部、又はその他の固形組織起源の癌、又は任意の型の白血病、及び血管腫のようなあらゆる型の癌疾患及び腫瘍より選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
内皮細胞のターゲティングのためのＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン並びにそのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアント又は断片を含む分子の使用。
【請求項１０】
分子が化学療法特性及び／又は遺伝子治療特性を示す部分をさらに含む請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分、ＧＳＴ部分及び／又は化学療法特性を示す部分を含む組換え分子であって、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分は、Ｆ３４Ａ、Ｆ３４Ｙ、Ｋ３８Ｒ、Ｋ３８Ｓ、Ｒ４１Ａ、Ｙ４２Ｆ、Ｙ４２Ｓ、Ｒ４６Ｓ、Ｅ４８Ｓ、Ｋ５４Ｓ、Ｑ６５Ｓ、Ｋ６８Ｓ、Ｒ７８Ｋ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｓ、Ｎ１００Ａ、Ｎ１００Ｒ、Ｎ１０１Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、Ｙ１０５Ｓ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｆ、Ｆ１１９Ａ、Ｆ１１９Ｙ、好ましくはＲ４１Ａ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓより選択される変異型のうちの少なくとも１個により変異されている組換え分子。
【請求項１２】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分が配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：２３、配列番号：２６のアミノ酸配列のうちのいずれか１個の修飾されたバリアントにより規定される請求項１１に記載の組換え分子。
【請求項１３】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分が修飾型であるヌクレオチド配列：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１のうちのいずれかと少なくとも５５％の相同性、好ましくは６５％の相同性、より好ましくは７５％の相同性を有する配列、最も好ましくは修飾型であるヌクレオチド配列：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１のうちのいずれかである配列によりコードされる請求項１１又は１２に記載の組換え分子。
【請求項１４】
医学的使用のための請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換え分子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の少なくとも１個を少なくとも１個の薬学的に許容される担体又は賦形剤との混合物として、又はそれらと共に含む薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の薬学的な用量を投与することを含む患者における腫瘍又はその他の疾患の治療方法。
【請求項１７】
以下の工程を含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の結合パートナーのスクリーニング方法：
ａ）ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインを含む分子を準備する；
ｂ）可能性のある結合パートナーを前記分子と接触させる；及び
ｃ）前記可能性のある結合パートナーに対する前記分子の効果を決定する。
【請求項１８】
可能性のある結合パートナーがタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸、脂質、グリカン、配糖体及び糖類を含む群より選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
可能性のある結合パートナーが受容体分子、受容体分子の一部、細胞表面受容体分子もしくは受容体分子ではない細胞表面に位置する分子と結合する分子である請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法により見出された請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の結合パートナー。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子と請求項２０に記載の可能性のある結合パートナーを別々のバイアルに含む請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の製造のためのＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインを含む分子の使用に関する。さらに、本発明は、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインを含む分子と結合する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成による新たな血管の形成は、黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び網膜低酸素状態のような失明を引き起こす眼疾患、慢性関節リウマチのような慢性炎症の状態、乾癬、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、並びに癌の増殖及び転移を含む、種々の病理学的状態における中心的な出来事である。さらに、血管腫は、内皮細胞の調節されない増殖により引き起こされる。これらの疾患の多くが、慢性という性質を有し、現在のところ充分な医薬品を欠いているため、これらの疾患に対する治療方法及び薬物の研究は極めて重要となっている。この目的のため、血管形成を阻止する薬剤は、これらの一般的な血管形成（及び／又は内皮細胞）依存性疾患全てのための医薬品を構成する可能性を有している。
【０００３】
この種の疾患に対する薬物のための一つの興味深い標的は、ＣＤ４４であった（Ｎａｏｔら、Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７；７１：２４１−３１９）。ＣＤ４４は、細胞外マトリックスヒアルロン酸（ＨＡ）という大きなグリコサミノグリカンの細胞表面受容体である［Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ  １９９０；６１：１３０３−１３］。ＣＤ４４は、ＨＡとの接着、ＨＡへの遊走、ＨＡ分解及び腫瘍転移を含む様々な細胞機能及び生理学的作用において役割を果たしている。ＣＤ４４受容体は、細胞外ドメインの可変領域における複雑なオルタナティブスプライシングのパターンを示す［Ｓｃｒｅａｔｏｎら、ＰＮＡＳ  １９９２；８９：１２１６０−４］。ＣＤ４４は、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）と結合することができ、それによって細胞膜へＭＭＰ−９を局在させることができ、このことは、腫瘍細胞の侵襲及び転移を促進するその活性を一部説明し得る［Ｙｕ、１９９９＃３］。
【０００４】
前記のＣＤ４４及びその疾患との関係を開示している特許文献としては、米国特許第６０２５１３８号、米国特許第５９０２７９５号、米国特許第６１５０１６２号、米国特許第６００１３５６号、米国特許第５９９０２９９号及び米国特許第５９５１９８２号が挙げられる。
【０００５】
国際公開第９４／０９８１１号は、炎症の治療又は造血系起源の癌転移の検出におけるＣＤ４４の使用を記載している。固形腫瘍増殖又は血管形成を阻害するためのＣＤ４４の使用は開示されていない。国際公開第９９／４５９４２号は、癌及び血管形成依存性疾患を阻害するための、ＣＤ４４を含むＨＡ結合性のタンパク質及びペプチドの使用を開示している。ＣＤ４４は、ＨＡ結合性タンパク質の長いリストの一例として挙げられている。いずれの公報においても、ＣＤ４４の使用は、ヒアルロン酸との結合能に限定されている。
【０００６】
Ａｈｒｅｎｓら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００１；２０；３３９９−３４０８）は、可溶性ＣＤ４４が、腫瘍細胞表面ＣＤ４４のヒアルロン酸との結合を阻止することにより、黒色腫腫瘍増殖を阻害することを開示している。従って、この研究は、黒色腫腫瘍細胞増殖に対するＣＤ４４の直接的な効果に関するヒアルロン酸結合依存性のメカニズムを教示している。
【０００７】
Ａｌｐａｕｇｈら（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６１，１５０−１５８（２０００））は、筋上皮特異的ＣＤ４４及びその抗血管形成特性を開示している。この研究は、ＣＤ４４のＨＡ結合特性を扱っている。
【０００８】
Ｂａｊｏｒａｔｈ（ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：１０３−１１１（２０００））は、ＣＤ４４及びそのＨＡとの結合、細胞接着、並びにＣＤ４４シグナリングを開示している。さらに、よく確立されている非ＨＡ結合性変異Ｒ４１Ａ及びＲ７８Ｓ、並びにそれらのＣＤ４４のＨＡとの結合に対する影響を特に含むＣＤ４４突然変異誘発実験が開示されている。
【０００９】
従って、先行技術は、効果がＨＡ−ＣＤ４４相互作用依存性であることを明示するため、ＣＤ４４の可能性のある使用を開示している。結果的に、これまでにＣＤ４４由来ペプチドに割り当てられた全ての有用性は、ヒアルロン酸との結合能に直接依存している。
【００１０】
ヒアルロン酸は、高レベルに広範に体内に発現しているため、この細胞外成分の阻害に基づく治療は、腫瘍外部での不要な副作用のリスクが高い。さらに、体内のＨＡの総量が多いため、そのような戦略は、高用量のＨＡ阻止組換えタンパク質を必要とし、それが、副作用のリスクをさらに増加させるであろう。
【００１１】
従って、腫瘍を治療するための新規薬物を見出すこと、そして前記の副作用を回避する新薬標的を提供するための、ＣＤ４４と腫瘍増殖との関係に関する新規経路を見出すことが必要とされている。
【００１２】
さらに、癌のみならず、先に開示されたような一連の一般的な疾患のための医薬品を構成する可能性のある、血管形成の新規阻害剤を開発する必要が存在する。この目的のためには、ＣＤ４４と血管形成との関係、特に、脈管構造に対する、そして新たな血管の形成に対して依存性の様々な疾患に対する、ＣＤ４４の可能性のある直接効果を解明することが重要である。
【００１３】
発明の概要
Ｋｏｇｅｒｍａｎら［Ｋｏｇｅｒｍａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９９７；１５：１４０７−１６］は、ヒトＣＤ４４標準アイソフォーム（ｈＣＤ４４ｓ）を安定的に発現しているマウス線維肉腫細胞が、大きな皮下腫瘍においてｈＣＤ４４ｓ発現を喪失したことを見出した。これらの原発腫瘍由来のｈＣＤ４４ｓ陰性細胞を、二回目の腫瘍増殖のため新たなマウスの皮下に再導入したところ、得られた腫瘍は、ｈＣＤ４４ｓ陽性腫瘍より有意に短い潜伏期間を有していた。
【００１４】
観察されたｈＣＤ４４ｓ発現腫瘍のより長い潜伏期間から、本発明者らは、皮下腫瘍増殖におけるｈＣＤ４４ｓ過剰発現の阻害効果が、腫瘍血管形成の阻害に関係していると理解した。血管形成の誘導は、固形腫瘍及びそれらの転移の増殖及び持続にとって不可欠である。血管形成の非存在下では、腫瘍は、極小さいサイズを越えて増殖することができず、微小転移巣の形態で休眠し続ける［Ｈｏｌｍｇｒｅｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９５；１：１４９−５３］。本発明者らは、組換え可溶性ヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合（ＣＤ４４ＨＡＢＤ）ドメインが、ニワトリにおけるインビボの血管形成及びインビトロの内皮細胞増殖を阻害し、それによってニワトリ及びマウスにおけるヒト腫瘍増殖を阻止することをここで発見した。組換え細胞表面受容体ＣＤ４４が、インビボの血管形成及び腫瘍増殖、並びにインビトロの内皮細胞増殖を阻害することが見出されたため、本発明者らは、新規の型の血管形成阻害剤を記載する。さらに、本発明者らは、やはり血管形成を阻害することができるＣＤ４４の変異型を作出した。これらのＣＤ４４の変異体の利点は、ＨＡと結合しないことであり、これは、血管形成の阻害に関するメカニズムが、ＨＡとの結合に対して依存性でないことを証明している。重要なこととして、変異ＣＤ４４は体内のＨＡと結合しないため、医薬品としての全身投与のためのその使用は、血管形成に対してより特異的であり、従って、より低用量で使用され得、そして不要な副作用を引き起こすリスクがより低い。
【００１５】
従って、本発明は、血管形成の阻害と関係のある状態を治療するための医薬品の製造のための、明示された変異体を含む、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインの非ＨＡ結合性バリアント、並びにそれらのアナログ及び組換えバリアントを含む分子の使用に関する。さらに、本発明は、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインと結合し、従って血管形成の阻害及び細胞増殖のための可能性のある標的である分子のスクリーニング方法に関する。さらに、本発明は、そのスクリーニング方法を実施するためのキット、そしてその方法により見出された分子にも関する。また、本発明は、内皮細胞のターゲティングのための、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインの非ＨＡ結合性バリアント、並びにそれらのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアントを含む分子にも関する。
【００１６】
従って、様々な癌性状態のような血管形成に関係のある状態を治療するための薬物が、本発明者らにより提示された新規のメカニズムを活用し、本発明によって容易に提供される。さらに、そのスクリーニング方法によって、細胞増殖及び／又は血管形成に影響を与えるその他の分子が見出され得る。
図面の簡単な記述
図１は組換えのＧＳＴタンパク質及びＧＳＴ−ＣＤ４４タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。ゲルはクーマシーブリリアントブルーにより染色された。分子量マーカーが右側に示されている。
図２は組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがヒアルロン酸と結合することを示す。ａ、野生型ＣＤ４４ＨＡＢＤは、固定化されたＨＡと結合するが、Ｒ４１Ａ変異体、Ｒ７８ＳＹ７９Ｓ変異体又はＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ変異体は結合しない。ｂ、ＣＤ４４ＨＡＢＤはヒト大動脈内皮細胞のＨＡへの遊走を阻害するが、Ｒ４１Ａ  ＨＡ非結合性変異体には効果がない。ＨＡ結合を阻止するＣＤ４４に対するモノクローナル抗体Ａ３は、内皮細胞遊走も阻害する。
図３は組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ａ、血管形成がｂＦＧＦにより誘導された典型的な血管形成実験からのフィルターディスク及び関連ＣＡＭ。ｂ〜ｄ、血管形成は血管枝ポイントの数；平均血管形成指数±ＳＥＭとして査定された。＊（Ｐ＜０．０５）、有意な結果。
図４は組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリＣＡＭにおける黒色腫（ＳＭＭＵ−１、Ｍ２１）及び肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）の増殖を阻害することを示す。
図５は組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ａ、ＣＤ４４ＨＡＢＤ、ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ又は対照としてのＧＳＴにより処理されたヌードマウスにおけるｓ．ｃ．ＳＭＭＵ−１腫瘍の増殖曲線（各群ｎ＝８）。ｂ、１６日目の腫瘍重量（黒線は中央値を表している）。ｃ、示されたようにして処理された１６日目のマウスの代表的な写真。ｄ、高倍率視野（ＨＰＦ）１個当たりの腫瘍辺縁における血管密度。＊（Ｐ＜０．００５）、＊＊（０．０５）有意な結果。
図６ではＣＤ４４−ＨＡＢＤ融合タンパク質はヌードマウスにおけるヒト膵臓癌細胞の増殖を阻害する。ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ（四角）、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（三角）又は対照としてのＧＳＴ（菱形）により処理されたヌードマウスにおけるＢｘＰＣ−３膵臓腺癌腫瘍（ｎ＝６〜７）（ａ）。ｂ、実験終了時の平均ＢｘＰＣ−３腫瘍重量。グラフ内の値及びバーは平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。
図７では組換えＣＤ４４ＨＡＢＤは内皮細胞周期を特異的に阻止する。ＧＳＴ（黒）、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ（薄い影）又はＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（濃い影）により処理された場合の、Ｓ期の細胞の割合。ＨＵＶＥＣ、ヒト血管内皮細胞；ＣＰＡＥ、ウシ肺動脈内皮細胞；ＮＨＤＦ、正常ヒト皮膚線維芽細胞；ＭＣＦ−７、ヒト乳癌細胞。
図８は内皮細胞増殖に対するＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体の効果を示す。ＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体は、３ｍｕｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤ（変異の位置は、太字で示されている、図８Ａ）に由来し、組換えタンパク質は実施例１に記載されたようにして産生され精製された。ウシ肺内皮細胞（ＣＰＡＥ）が、１０％血清を含有している培地中で示されたタンパク質（最終濃度それぞれ１５μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌ）により４８時間処理された。細胞増殖は、顕微鏡写真（Ｂ）、又はＭＴＴ染色（Ｓｉｇｍａ）及び分光光度法（Ｃ）によりアッセイされた。
【００１７】
定義
「ヒアルロン酸結合ドメイン」は、以後、ｈａｂｄと呼ばれる。
【００１８】
ｈａｂｄの「非ＨＡ結合性バリアント」とは、ＨＡと結合する能力を少なくとも部分的に喪失しているが、血管形成及び／又は内皮細胞増殖を阻害する能力は依然として有しているような、変異により、又はその他の任意の方式で修飾されたバリアントを意味する。
【００１９】
ＣＤ４４−ｈａｂｄを含む分子の「アナログ及び組換えバリアント」とは、ＣＤ４４−ｈａｂｄを含み、それにより少なくとも部分的にＣＤ４４−ｈａｂｄの特性を本質的に発揮する、融合タンパク質のような分子を意味する。
【００２０】
「血管形成及び／又は内皮細胞増殖の阻害に関係のある状態」とは、血管形成及び／又は内皮細胞増殖の阻害により治療又は影響され得るような状態及び疾患を意味する。
【００２１】
ＣＤ４４−ｈａｂｄを含む分子の「結合パートナー」とは、ＣＤ４４−ｈａｂｄ又はその変異体に対する親和性を有する分子を意味する。
【００２２】
「受容体分子、又は受容体分子の一部」とは、受容体として機能するか、又は受容体の一部である分子を意味する。
【００２３】
「修飾型バリアント」とは、本発明に関しては、欠失、挿入、置換のような正常ｗｔ分子に対する任意の修飾、それらのアナログ、断片又は組換えバリアントを意味する。
【００２４】
発明の詳細な説明
国際公開第９４／０９８１１号は、炎症の治療又は癌転移の検出におけるＣＤ４４の使用を記載している。著者らは、ＣＤ４４が炎症状態においてアップレギュレートされていること、及びＣＤ４４ペプチドがＴ細胞活性化を阻害し得ることを示している。ＣＤ４４による転移の阻害に関するデータ又は請求項は提示されておらず、腫瘍増殖又は血管形成を阻害するためのＣＤ４４の使用は、特許請求の範囲に記載されていない。国際公開第９９／４５９４２号は、癌及び血管形成依存性疾患を阻害するためのＣＤ４４を含むＨＡ結合性のタンパク質及びペプチドの使用を開示している。この公報は、Ｂ１６マウス黒色腫の肺転移及びルイス肺癌を阻害するため、軟骨リンクタンパク質の３８ｋＤａ断片であるメタスタチン、並びにこの断片に由来するＨＡ結合ペプチドを使用している。ＨＡ結合ペプチドの場合、ニワトリＣＡＭにおけるＢ１６黒色腫の増殖及びＨＡへの内皮細胞遊走が阻害された。いずれの公報においても、ＨＡ結合ペプチドの使用は、ヒアルロン酸との結合能と直接関係がある。
【００２５】
ＣＤ４４は、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）との結合能に対して依存性のメカニズムにより、血管形成を促進することが以前に示された（Ｙｕ及びＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９９９；１３：３５−４８；Ｙｕ及びＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２０００；１４：１６３−７６）。マウスＴＡ３乳癌細胞における可溶性ＣＤ４４（ｓＣＤ４４ｖ６−１０）の過剰発現は、ＭＭＰ−９の腫瘍細胞表面への結合を阻害し、それによって腫瘍増殖及び血管新生を阻止した（Ｙｕ及びＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ２０００）。ＭＭＰ−９は、発生途中の血管形成及び腫瘍に関与していることが以前に証明された（Ｖｕら、Ｃｅｌｌ  １９９８；９３：４１１−２２；Ｂｅｒｇｅｒｓら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００；２：７３７−４４；Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｃｅｌｌ  ２０００；１０３：４８１−９０）。インビトロの尿細管形成がＴＧＦβの阻止により阻害されたため、ＣＤ４４−ＭＭＰ−９複合体は潜在型ＴＧＦβの活性化にも関与している（Ｙｕ及びＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ、２０００）。
【００２６】
本発明者らにより使用されたＣＤ４４−ＨＡＢＤの変異体は、ＭＭＰ−９に対する極めて異なる結合親和性を示すが、それとは独立に同等に血管形成を阻害し、従って、ＭＭＰ−９結合が、本発明において開示された血管形成の阻害にとって重大である可能性は低い。さらに、本発明者らは、血管形成を直接阻害するＣＤ４４のメカニズムを記載する。さらに、本発明者らは、形質転換腫瘍細胞表面におけるＭＭＰ−９のＣＤ４４結合を抑止するという以前に提案されたメカニズムと比較して、別個の標的を正常内皮細胞に有するＣＤ４４のメカニズムを証明する。Ｇａｏら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９８；５８：２３５０−２）は、ラットＣＤ４４標準アイソフォーム及びＲ４４Ａ非ＨＡ結合性変異体の両方の過剰発現が、転移性肺コロニーの形成を劇的に低下させるが局所的な腫瘍増殖はそうでないため、ラットＤｕｎｎｉｎｇ  ＡＴ３．１前立腺癌細胞の転移能は、ＨＡ結合と独立であるが、腫瘍形成性はそうでないことを示している。これは、ＨＡとは別個の他のＣＤ４４結合パートナーが、転移に関与しているに違いないことを示唆している。いくつかを挙げるとすればＨＧＦ、ｂＦＧＦ、フィブロネクチン、オステオポンチン、セレクチンを含む、多数のＣＤ４４結合タンパク質が記載されている。しかしながら、これらのタンパク質のいくつかの結合は、我々の組換え融合タンパク質には存在しないＣＤ４４の翻訳後修飾及び／又はＣＤ４４内のオルタナティブエクソンの包含に対して依存性である。また、これらのＣＤ４４結合タンパク質の多くは体内に大量に存在しており、従って高い副作用リスクのため、これらと結合するＣＤ４４誘導体の医薬品としての有用性は低い。さらに、以前に記載されたタンパク質は、いずれも、血管細胞のターゲティングに特有のものではないし、内皮細胞の増殖に特異的に必要とされる経路を阻止するものでもない。従って、このリガンド及びこの経路の両方が、新規であるにちがいない。本発明は、ＣＤ４４の結合パートナー、並びに血管形成及び内皮細胞増殖の阻害に関連している経路を同定するための方法を開示する。
【００２７】
第一の面において、本発明は、血管形成及び／又は内皮細胞増殖の阻害と関係がある状態を治療するための医薬品の製造のための、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインの非ＨＡ結合性バリアント、並びにそれらのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアントを含む分子の使用に関する。
【００２８】
一つの実施形態において、ＣＤ４４−ＨＡＢＤは、それを非ＨＡ結合性にする変異を少なくとも１個含む。
【００２９】
好ましい実施形態において、（１個以上の）変異は、Ｆ３４Ａ、Ｆ３４Ｙ、Ｋ３８Ｒ、Ｋ３８Ｓ、Ｒ４１Ａ、Ｙ４２Ｆ、Ｙ４２Ｓ、Ｒ４６Ｓ、Ｅ４８Ｓ、Ｋ５４Ｓ、Ｑ６５Ｓ、Ｋ６８Ｓ、Ｒ７８Ｋ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｓ、Ｎ１００Ａ、Ｎ１００Ｒ、Ｎ１０１Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、Ｙ１０５Ｓ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｆ、Ｆ１１９Ａ、Ｆ１１９Ｙより選択される。好ましくは、変異は、Ｒ４１Ａ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓのうちの１個以上より選択される。また、３〜１１０アミノ酸長のＣＤ４４の断片をもたらす欠失変異も、本発明の目的にとって有用である可能性がある。しかしながら、所望の特性が達成される限り、１個以上の欠失、置換又は付加のような、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ又はその断片を少なくとも部分的に非ＨＡ結合性にする、野生型ＨＡ結合性ＣＤ４４に対する任意の変異が、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分に導入され得ることを、当業者は容易に理解する。
【００３０】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤとは、完全ヒトＣＤ４４分子のアミノ酸２１〜１３２をカバーするタンパク質であるか、又はヒトＣＤ４４のこの領域との高度の相同性を有するものである。ニワトリＣＤ４４−ＨＡＢＤは、アミノ酸レベルで５５％というヒトＨＡＢＤとの配列相同性を有する、本発明者らにより単離された最も類似性の低いＨＡＢＤである。従って、高度の配列相同性とは、少なくともおよそ５５％のアミノ酸相同性、望ましくは少なくとも６５％の相同性、最も望ましくは少なくとも７５％の相同性を意味する。
【００３１】
さらに、本発明に係る分子は、欠失させられた、又はその他の任意の方式で変化もしくは変異させられた型のＣＤ４４−ＨＡＢＤタンパク質に関する（その変化させられた型は、本明細書に記載された方法のいずれかにより測定されるような、最初のＣＤ４４−ＨＡＢＤタンパク質又は本明細書に明示されたＣＤ４４−ＨＡＢＤ変異体と本質的に同一の特性を示す）。
【００３２】
好ましい実施形態において、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインの非ＨＡ結合性バリアントを含む分子は、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：２）、イヌＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：４）、ニワトリＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：６）、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１Ａ（配列番号：８）、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ７８ＳＹ７９Ｓ（配列番号：１０）及びＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（配列番号：１２）を含む群より選択され、これらの配列がこれらの配列を非ＨＡ結合性にする修飾少なくとも１個をさらに含む。ＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ７８Ｓ、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｙ７９Ｓ、さらにＲ４１Ａ，Ｒ７８Ｓ変異又はＹ７９Ｓ変異を有するＧＳＴ−ＣＤ４４−ＨＡＢＤ融合タンパク質のような、その他のバリアントも可能である。
【００３３】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１Ａ、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ７８ＳＹ７９Ｓ及びＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓは、ＣＤ４４−ＨＡＢＤの変異型バリアントの好ましい例である（ここで最後の４個の文字／数字は変異の位置及び型を示す）。
【００３４】
ＧＳＴ−ＣＤ４４−ＨＡＢＤは、ＧＳＴ部分とＣＤ４４−ＨＡＢＤとの融合タンパク質である。その他の可能な融合タンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｈｉｓ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ＥＧＦＰを含む群より選択され得る。ＧＳＴとは、ＧＳＴ結合カラムで融合タンパク質を精製する目的のため、そして検出の目的のため、タグとして使用されているグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの略語である。ＧＳＴは、天然には２６ｋＤａタンパク質として存在する（Ｐａｒｋｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１３，２２１（１９９０）；Ｊｉ，Ｘ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，１０１６９（１９９２）；Ｍａｒｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１５３５３（１９９６））。
【００３５】
従って、もう一つの実施形態において、組換えバリアントは、ＧＳＴ部分と、野生型又は変異型であるＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分とを有する融合タンパク質である。ＧＳＴ以外のタグも、全く可能である。
【００３６】
好ましくは、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインは、少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７５％という配列番号：２の配列との相同性を有する。最も好ましくは、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインは、配列番号：１の配列の修飾型バリアント（非ＨＡ結合性遺伝子産物）である。
【００３７】
治療される状態及び疾患は、黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び網膜低酸素状態のような失明又は視覚障害を引き起こす眼疾患、慢性関節リウマチのような慢性炎症の状態、乾癬、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、並びに癌の増殖及び転移、並びに乳房、前立腺、結腸、肺、皮膚、肝臓、脳、卵巣、精巣、骨格、上皮、内皮、膵臓、腎臓、筋肉、副腎、腸、内分泌腺、口腔、頭部及び頸部、又はその他の固形組織起源の癌、又は任意の型の白血病、及び血管腫のようなあらゆる型の癌疾患及び腫瘍より選択される任意のものであり得る。
【００３８】
本発明は、ヒト医学及び獣医学において使用され得る。例えば、本発明は、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシの動物、及び通常の動物園にいる全ての長命種のために使用され得る。好ましくは、本発明は、ヒトのために使用される。
【００３９】
さらにもう一つの面において、本発明は、ＧＳＴ部分とＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分とを含む組換え分子に関する。ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分は、例えば以下の変異のうちの１個以上を有する変異型であり得る：Ｆ３４Ａ、Ｆ３４Ｙ、Ｋ３８Ｒ、Ｋ３８Ｓ、Ｒ４１Ａ、Ｙ４２Ｆ、Ｙ４２Ｓ、Ｒ４６Ｓ、Ｅ４８Ｓ、Ｋ５４Ｓ、Ｑ６５Ｓ、Ｋ６８Ｓ、Ｒ７８Ｋ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｓ、Ｎ１００Ａ、Ｎ１００Ｒ、Ｎ１０１Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、Ｙ１０５Ｓ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｆ、Ｆ１１９Ａ、Ｆ１１９Ｙ。好ましくは、変異はＲ４１Ａ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓのうちの１個以上より選択される。しかしながら、所望の特性が達成される限り、１個以上の欠失、置換又は付加のような、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ又はその断片を少なくとも部分的に非ＨＡ結合性にする、野生型ＨＡ結合性ＣＤ４４に対する任意の変異が、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分に導入され得ることを、当業者は容易に理解する。
【００４０】
好ましい実施形態において、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：２３、配列番号：２６のアミノ酸配列、非ＨＡ結合性にする少なくとも１個の修飾をさらに含む上記配列を有するＣＤ４４−ＨＡＢＤの非ＨＡ結合性バリアントを含む。
【００４１】
最も好ましい実施形態において、ＣＤ４４−ＨＡＢＤは、ＣＤ４４のアミノ酸２３〜１３２の少なくとも３個の連続アミノ酸を含む。基本的には、３〜１１０アミノ酸サイズの全ての断片、例えばアミノ酸２３〜２５、２４〜２６、２５〜２７等、アミノ酸２３〜２６、２４〜２７等、２３〜２７等、２３〜２８等が、効果的である可能性がある。従って、当業者が容易に理解するように、本願の実施例セクションに例示された方法によりテストされるような所望の特性を示す限り、最初の分子の最大１１０アミノ酸の連続アミノ酸の全ての組み合わせが、本発明の目的にとって可能である。
【００４２】
もう一つの実施形態において、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分は、修飾型（非ＨＡ結合性の遺伝子産物又はペプチド）である、ヌクレオチド配列：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１のうちのいずれかと少なくとも５５％の相同性、好ましくは６５％の相同性、より好ましくは７５％の相同性を有する配列、最も好ましくは修飾型であるヌクレオチド配列：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１のうちのいずれかである配列によりコードされる。
【００４３】
もう一つの面において、本発明は、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン、並びにそのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアントを含む少なくとも１個の分子を、少なくとも１個の薬学的に許容される担体又は賦形剤との混合物として、又はそれらと共に含むことを特徴とする、血管形成及び／又は内皮細胞増殖を阻害するための薬学的組成物に関する。
【００４４】
薬学的組成物は、薬学分野の当業者に既知の様式で調製される。担体又は賦形剤は、活性成分のための媒体又は媒質としてはたらくことができる固体、半固体又は液体の材料であり得る。適当な担体又は賦形剤は、当技術分野において既知である。薬学的組成物は、経口使用又は非経口使用に適合化され得、錠剤、カプセル剤、坐剤、液剤、懸濁液剤等として患者へ投与され得る。
【００４５】
薬学的組成物は、例えば不活性希釈剤又は食用担体を用いて経口投与され得る。それらは、ゼラチンカプセルに封入されてもよいし、又は錠剤へと圧縮されてもよい。経口治療投与の場合、本発明に係る化合物は、賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、ロゼンジ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、カシェ剤（ｗａｆｅｒｓ）、チューインガム剤等として使用され得る。これらの調製物は、活性成分である本発明に係る化合物を少なくとも４重量％含有しているべきであるが、特定の型に応じて変動可能であり、好適には単位の４〜７０重量％であり得る。組成物に含有される活性成分の量は、投与に適した単位剤形が入手される程度のものである。
【００４６】
錠剤、丸剤、カプセル剤、ロゼンジ剤等は、以下の佐剤：微晶質セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンのような結合剤、デンプンもしくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル、コーンスターチ等のような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテックスのような滑沢剤、コロイド二酸化ケイ素のような流動促進剤、及びショ糖もしくはサッカリンのような甘味剤、又はペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ芳香剤のような芳香剤のうちの少なくとも１個を含有していてもよい。単位剤形がカプセル剤である場合、それは、上記の型に加え、ポリエチレングリコール又は脂肪油のような液体の担体を含有していてもよい。他の単位剤形は、単位剤形の物理的形態を修飾する他の異なる材料を、例えば剤皮として含有していてもよい。従って、錠剤又は丸剤は、糖、シェラック又はその他の腸溶性コーティング剤で剤被を施され得る。シロップ剤は、活性成分に加え、甘味剤としてのショ糖、並びに何らかの保存剤、着色剤及び芳香剤を含有していてもよい。これらの異なる組成物の調製に使用される材料は、薬学的に純粋であり、かつ使用される量において無毒であるべきである。
【００４７】
非経口投与の場合、本発明に係る化合物は、液剤又は懸濁液剤に組み込まれ得る。非経口投与とは、消化管を通らない、皮下、筋肉内、眼窩内、関節内、脊髄内、胸骨内、静脈内、鼻腔内、肺内のような他の何らかの経路を介した注射、尿路を介した注射、ウシの乳汁分泌管を介した注射、骨髄のような器官への注射等による投与等をさす。骨髄が、インビトロでも治療されてもよい。これらの調製物は、少なくとも０．１重量％の本発明に係る活性化合物を含有し得るが、およそ０．１〜５０重量％で変動し得る。そのような組成物に含有される活性成分の量は、適当な投薬量が入手される程度のものである。液剤又は懸濁液剤は、以下の佐剤：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール又はその他の合成溶媒のような無菌の希釈剤、ベンジルアルコール又はメチルパラベンのような抗菌剤、アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のような緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースのような張性の調整のための薬剤のうちの少なくとも１個を含んでいてもよい。非経口調製物は、ガラス又はプラスチックで作成されたアンプル、使い捨てシリンジ又は多投薬量容器に封入され得る。局所投与の場合、本発明に係る化合物は、液剤、懸濁液剤又は軟膏剤に組み込まれ得る。これらの調製物は、少なくとも０．１重量％の本発明に係る活性化合物を含有し得るが、およそ０．１〜５０重量％で変動し得る。そのような組成物に含有される活性成分の量は、適当な投薬量が入手されるようなものである。投与は、増強された皮膚の透過性をもたらす接触、圧力、マッサージ又は熱、温熱、又は赤外光を皮膚へ適用することにより促進され得る。Ｈｉｒｖｏｎｅｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６；１４：１７１０−１３は、適用された電場の駆動力を使用して、皮膚を介した薬物の輸送を増強する方法を記載している。好ましくは、イオン導入は、わずかに塩基性のｐＨで実行される。
【００４８】
さらにもう一つの面において、本発明は、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン、並びにそのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアントを含む分子を、薬学的な用量、投与することを含む、患者における癌性腫瘍又は血管形成及び／もしくは内皮細胞増殖と関係があるその他の疾患の治療方法に関する。
【００４９】
患者とは、ヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。ヒト患者が好ましい。
【００５０】
もう一つの実施形態において、本発明は、過度の血管の形成及び／又は調節されない内皮細胞増殖を特徴とするその他の疾患及び障害を治療するために使用されてもよい。これらには、以下に制限はされないが、糖尿病性網膜症又は黄斑変性症により引き起こされた成体の失明又は視覚障害、乾癬、及び様々な慢性炎症の状態、及び血管腫が含まれる。
【００５１】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤ又はそれらの断片は、当技術分野において既知の組換え発現又は化学合成の任意の方法によって入手され得る。それは、実施例１に記載されるように細菌細胞において発現させられ得る。それは、バキュロウイルスベクターへクローニングされ、昆虫細胞において発現させられてもよい。また、哺乳動物細胞又はその他の任意の発現系においても発現させられ得る。アフィニティタグをタンパク質産物に追加し、選択されたタグによるアフィニティークロマトグラフィーを使用してタンパク質を精製することができる。アフィニティタグは、当技術分野において周知であり、以下に制限はされないが、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、Ｓタグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグ、Ｅ２タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグを含む。タンパク質は、タグなしで発現させられ、イムノアフィニティ、イオン交換もしくはゲル濾過クロマトグラフィ、又はそれらの組み合わせにより精製されてもよい。さらに、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ、その断片又はそのアナログは、制限はされないが固相ペプチド合成を含む化学合成の既知の方法によって入手され得る。記載された方法のいずれかにより入手されたＣＤ４４−ＨＡＢＤは、本発明に含まれる。
【００５２】
さらにもう一つの面において、本発明は、
ａ）ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン又はその断片を含む分子を準備する工程；
ｂ）可能性のある結合パートナーを前記分子と接触させる工程；及び
ｃ）前記可能性のある結合パートナーに対する前記分子の効果を決定する工程、を含む、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン、並びにそのアナログ、変異体及び組換えバリアントを含む分子の結合パートナーのスクリーニング方法に関する。
【００５３】
可能性のあるスクリーニング方法は、以下のものを含む。
（Ｉ）
ａ）ＨＡＢＤ、ＨＡＢＤアナログ又はそれらの変異体の、細胞、細胞溶解物、細胞画分、組織、生物、動物、又は生物もしくは動物の一部とのインキュベーション。
ｂ）例えば、アフィニティカラム、ゲル電気泳動、及び抗体又はタンパク質染色又は同位体又はＨＡＢＤもしくはＨＡＢＤに接続されたタグを検出するその他の手段を使用した任意の検出による、ＨＡＢＤ結合パートナーの精製及び検出。
ｃ）ゲル電気泳動（例えば、２Ｄ電気泳動）における局在化、質量分析、配列決定、抗体又はその他の同定手段の使用によるＨＡＢＤ結合パートナーの同定。
ｄ）インビトロもしくはインビボの、同定された結合パートナーに対するＨＡＢＤの効果の決定、又は前記可能性のある結合パートナーのその他の相互作用剤の効果の決定。
ｅ）細胞増殖及び／又は血管形成の新規の阻害剤を設計するための同定されたＨＡＢＤ結合パートナーの使用。
（ＩＩ）
ａ）ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ファージ、ペプチド、タンパク質、細胞もしくは生物のライブラリーの遺伝学的スクリーニングのベイトとしてのＨＡＢＤの使用、又はＨＡＢＤ、そのアナログもしくは変異体をベイトとして使用した、合成ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、ヘパラン硫酸もしくはプロテオグリカンのライブラリーのスクリーニング。
ｂ）選択マーカーによるＨＡＢＤ結合パートナーの検出。
ｃ）配列決定、ハイブリダイゼーション、制限分析、抗体、又はライブラリー内の段階的な排除、又はその他の同定手段によるＨＡＢＤ結合パートナーの同定。
ｄ）インビトロ又はインビボの、同定された結合パートナーに対するＨＡＢＤの効果の決定、又は前記可能性のある結合パートナーのその他の相互作用剤の効果の決定。
ｅ）細胞増殖及び／又は血管形成の新規の阻害剤を設計するための同定されたＨＡＢＤ結合パートナーの使用。
【００５４】
さらに、本発明のスクリーニング方法は、前記可能性のある結合パートナーのその他の活性化剤又は機能的阻止剤の効果を決定するために使用されてもよい。
【００５５】
さらに、ＨＡＢＤ変異体又は断片がスクリーニングに使用されてもよい。これは、抗血管形成分子を見出すための、より特異的な検索を提供するかもしれない。
【００５６】
一つの実施形態において、可能性のある結合パートナーは、タンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸、脂質、グリカン、配糖体及び糖類を含む群より選択される。
【００５７】
もう一つの実施形態において、可能性のある結合パートナーは、受容体分子、又は受容体分子の一部、又は細胞表面受容体分子もしくは受容体分子ではない細胞表面に位置する分子と結合する分子である。
【００５８】
さらにもう一つの実施形態において、可能性のある結合パートナーは、細胞外マトリックス、組織洞、リンパ管又は血管に局在している細胞外分子である。
【００５９】
さらにもう一つの面において、本発明は、前記の方法により見出されたＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインを含む分子の結合パートナーに関する。血管形成を促進又は阻害する分子であり、従って血管形成の新規阻害剤の開発のための可能性のある標的である前記結合パートナー、例えば、増殖因子受容体（例えば、ＶＥＧＦ受容体ファミリー、ＦＧＦ受容体ファミリー、ＥＧＦ受容体ファミリー、ＰＤＧＦ受容体ファミリー）のような可溶性血管形成因子の受容体、細胞外マトリックス（例えば、インテグリン、シンデカン、プロテオグリカン）の受容体、細胞−細胞接着受容体（例えば、カドヘリン、Ｉｇ様スーパーファミリー、セレクチン）を含む、通常、血管形成促進シグナリングを与える細胞表面受容体。その受容体は、内皮細胞へ血管形成促進シグナルを伝達するか、又は抗血管形成シグナリングを阻止するか、又は内皮細胞における抗血管形成シグナリングを促進する。シグナルを発生させるためのこの受容体の活性化は、細胞外リガンドとの結合、又は細胞内シグナリングイベントによる受容体の細胞質ドメインを標的とする活性化により起こる。又は、細胞表面にあるその受容体は、そのリガンドを細胞内受容体（例えば、核受容体）へ輸送し指向化する担体として機能する。これらは、いずれも、特許請求の範囲に記載されたスクリーニング方法により同定され得る、そして抗血管形成標的として利用され得る、可能性のある結合パートナーの例である。
【００６０】
さらにもう一つの面において、本発明は、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン、そのアナログ又は変異体又は一部を含む分子又は遺伝情報と、可能性のある結合パートナー又はその一部とを、別々のバイアルに含む、前記の方法を実施するためのキットに関する。
【００６１】
さらにもう一つの面において、本発明は、内皮細胞のターゲティングのための、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン、並びにそのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアント又はその断片を含む分子の使用にも関する。本発明のＣＤ４４−ＨＡＢＤ分子は、内皮細胞との結合能を示しているため、そのような細胞のターゲティングに使用され得る。
【００６２】
一つの実施形態において、その分子は、化学療法特性及び遺伝子治療特性を示す部分をさらに含む。これによって、本発明のＣＤ４４−ＨＡＢＤ分子の修飾型バリアントは、内皮細胞に対する抗腫瘍薬として使用され得る。当業者が理解するように、本発明のＣＤ４４−ＨＡＢＤ分子にカップリングされる機能は、抗内皮細胞増殖及び／又は遊走、アポトーシス促進、又は内皮細胞もしくはその他の血管細胞の必須機能の抑止のような、抗腫瘍以外の特性を有していてもよい。しかしながら、抗腫瘍特性を有する部分は、一つの好ましい実施形態である。
【００６３】
「化学療法特性を示す」とは、この特性を有する分子が、細胞もしくは組織のインビトロ組織培養物の使用、酵素活性、例えばキナーゼ、ホスファターゼ、グリコシル化、アセチル化、タンパク質分解、リンカーライゲーションもしくはその他の酵素活性のインビトロスクリーニング、プロトン移動、インビトロもしくはインビボのイオンポンプ機能のスクリーニング、及び／又は細胞増殖、アポトーシスもしくはその他の細胞死の手段、腫瘍の進行、転移、侵襲、血管形成及び／もしくは組織ホメオスタシスのインビボもしくはインビトロのスクリーニングにより測定されるような、標的とされた細胞の増殖を阻害し、かつ／又はそれらを死滅させる能力を有することを意味する。
【００６４】
化学療法特性及び／又は遺伝子治療特性を示す部分は、例えば、当業者に既知であろう遺伝子治療、様々な化学療法のための種々のウイルス、ｈａｂｄ、その変異体又は断片とカップリングされた裸のＤＮＡ、並びに制限はされないが脂質、ペプチド及びタンパク質を含むその他のＤＮＡ担体より選択され得る。
【００６５】
例えば、Ａｒａｐら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９：３７７−３８０）、Ｅｌｌｅｒｂｙら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９９，５；９：１０３２−１０３８）及びＴｒｅｐｅｌら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００，１１：１９７１−１９８１）は、内皮細胞のターゲティングのための、ドキソルビシン分子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃａ）のカップリング、アポトーシス誘導性ペプチドのカップリング及びウイルスのカップリングをそれぞれ開示している。これらの文献は、参照としてここに組み込まれる。
【００６６】
ウイルスのカップリングは、内皮ターゲティング分子が遺伝子治療に使用され得る方法に関する一例である。
【００６７】
従って、さらにもう一つの実施形態において、本発明は、ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン、並びにそのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアント又は断片と、化学療法特性及び／又は遺伝子治療特性を示す部分とを含む分子にも関する。
【００６８】
さらにもう一つの実施形態において、本発明は、医学的使用のための、前記定義のような化学療法特性を有する部分とカップリングされた本発明の分子に関する。
【００６９】
以下、例示のみを目的とし、決して本発明の範囲を制限するものではない実施例を参照しつつ、本発明を説明する。
【００７０】
実施例
実施例１−ＧＳＴ融合タンパク質としての野生型及び変異型のヒトＣＤ４４  ＨＡ結合ドメインの構築及び精製
ヒトＣＤ４４標準アイソフォームｃＤＮＡ［Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９１；１０：３４３−８］を使用して、オリゴヌクレオチド５’ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＴＴＧＡＡＴＡＴＧ３’（配列番号：１３）（内部ＥｃｏＲＩ切断部位を含有している）及び５’ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＧＴＡＧＴＣＡＧ３’（配列番号：１４）（内部ＳａｃＩ切断部位を含有している）により、アミノ酸２１〜１３２をカバーするヒアルロン酸結合ドメインをＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物を、ｐＧＥＸ−ＫＧベクター［Ｇｕａｎ及びＤｉｘｏｎ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９１；１９２：２６２−７］へクローニングした。ＣＤ４４ＨＡＢＤヒアルロン酸非結合性変異体の作製は、製造業者のプロトコル（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従い、部位特異的突然変異誘発により実施した。突然変異誘発オリゴ対Ｒ４１Ａ（５’ＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号：１５）、５’ＡＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号：１６））及びＲ７８ＳＹ７９Ｓ（５’ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＴＡＧ３’（配列番号：１７）、５’ＡＴＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＣ３’（配列番号：１８））を、それぞれＲ４１Ａ変異及びＲ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓ変異の野生型ＣＤ４４ＨＡＢＤへの導入のため使用した。
【００７１】
製造業者の仕様書に従い、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ  ＴＸ）のＲＮＡｑｕｅｏｕｓキットを使用して、ニワトリＣＡＭ及びイヌ肝臓のＲＮＡをそれぞれの組織から精製した。ニワトリ及びイヌのＣＤ４４−ＨＡＢＤをコードするｃＤＮＡを、それぞれの種から、ＣＤ４４のヌクレオチド６３〜８１及び３５９〜３３０に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより入手した。プライマー対は、以下の通りであった：ニワトリについては５’−ＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＡ−３’（配列番号：１９）及び５’−ＴＴＧＧＣＴＣＡＣＡＴＧＣＴＴＴＧ−３’（配列番号：２０）、イヌについては５’−ＣＧＣＡＧＡＴＣＧＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＡ−３’（配列番号：２１）、５’−ＣＣＧＡＴＧＴＡＣＡＡＴＣＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号：２２）。配列番号３（イヌ）及び配列番号５（ニワトリ）に対応するｃＤＮＡを、Ｈｉｓタグとの融合体として大腸菌においてタンパク質を発現する細菌発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）へクローニングした。野生型ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ及びＲ４１Ａ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓ変異型ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤの発現を、ＯＤ６００＝０．７の時点で１ｍＭ  ＩＰＴＧにより２７℃で大腸菌ＢＬ２１株において誘導し、製造業者のプロトコルに従いグルタチオンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）を使用して精製した。得られたタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により分離された調製物のクーマシーブリリアントブルー染色により検出されたように、本質的に純粋であった（図１）。ニワトリ及びイヌのＣＤ４４ＨＡＢＤを、製造業者のプロトコルに従い、ＨＩＣＡＭ樹脂（Ｓｉｇｍａ）を使用して精製した。得られたタンパク質は、やはり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのクーマシーブリリアントブルー染色により判断されたように、本質的に純粋であり、汚染物質を含んでいなかった。
【００７２】
実施例２−組換え野生型ＣＤ４４ＨＡＢＤは、用量依存的にヒアルロン酸（ＨＡ）と結合することができ、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）のＨＡへの走触性を阻害することができるが、変異型はそうでない
１ｍｇ  ｍｌ−１の高分子量ヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳを使用して、室温（ＲＴ）で一夜、マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）（Ｎｕｎｃ）プレートをコーティングした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、ＲＴで２時間２％ＢＳＡによりブロッキングした。ＰＢＳで希釈された精製されたタンパク質をウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄の後、マウス抗ＧＳＴ抗体Ｂ−１４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＲＴで１時間インキュベートした後、さらに洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｄａｋｏ）と共にＲＴで１時間インキュベートした。ＨＡ結合をＯＰＤ発色性基質（Ｓｉｇｍａ）により可視化し、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。図２Ａに示されるように、野生型ＣＤ４４融合タンパク質は、濃度依存的にＨＡと結合するが、変異体はそうでなかった。
【００７３】
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓから入手し、１０％ＦＣＳ、２μｇ  ｍｌ−１マウスＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）及び５０μｇ  ｍｌ−１ゲンタマイシンが補足されたＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で増殖させた。細胞遊走アッセイを、トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）遊走チャンバー（孔径８ｍｍ；Ｃｏｓｔａｒ）において実施した。チャンバーの下室は、１μｇ  ｍｌ−１高分子量ヒアルロン酸（Ｓｉｇｍａ）を含有していた。ＣＤ４４ＨＡＢＤ、ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１Ａ又はＧＳＴ（１０μｇ  ｍｌ−１）を、下室に添加した。抗体阻害アッセイのため、細胞を、１０μｇ  ｍｌ−１抗ＣＤ４４  ｍＡｂ  Ａ３（Ｇｕｏら、１９９３，１９９４）と共に３０分間プレインキュベートした。大動脈内皮細胞を、トランスウェルチャンバーの上室に添加し、２．５時間、膜の下側へと遊走させた。遊走した細胞を固定し、０．５％クリスタルバイオレットにより染色した。洗浄後、膜を乾燥させ、結合した色素を、１０％酢酸により溶出させた。回収された溶出液の光学濃度を、６００ｎｍで分光光度的に読み取った。図２Ｂに示された結果は、野生型ＣＤ４４ＨＡＢＤは、ヒト大動脈内皮細胞のＨＡへの遊走を阻害したが、各非ＨＡ結合性Ｒ４１Ａ変異体はそうでなく、遊走が、ＣＤ４４のＨＡとの結合を特異的に阻止する抗体（Ａ３）によっても阻害されたことを証明している。
【００７４】
実施例３−組換えＣＤ４４融合タンパク質は、ＨＡ結合に対して非依存的にニワトリＣＡＭ内の血管形成を阻止する
１０日齢ニワトリ胚を、［Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９５；９６：１８１５−２２］に記載されたようにして調製した。血管形成アッセイのため、１００ｎｇ  ｍｌ−１  ＶＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ  ｍｌ−１  ＴＧＦα（Ｓｉｇｍａ）又は１μｇ  ｍｌ−１  ｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）を含浸させたフィルターディスクを、ＣＡＭ上に置いた後、毎日、１０μｇのＣＤ４４ＨＡＢＤ、ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ、又は対照としてのＧＳＴ及びＰＢＳ（各群ｎ＝６）を異所的に添加した。７２時間後、フィルターディスク及び周囲のＣＡＭ組織を、解剖顕微鏡において解剖し、血管形成を定量した。血管形成を、フィルターディスク直下のＣＡＭエリア内の血管分枝点の数として査定した。
【００７５】
ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ及びＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓによる処理は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ又はＴＧＦαの血管形成効果を完全に消失させたが、ＧＳＴ処理はそうでなく（図３ａ〜ｄ）、このことは、可溶性ＣＤ４４ＨＡＢＤが三つの別個の血管形成因子により誘導される血管形成を阻止することを示している。ＨＡ非結合性変異体が同等に血管形成を阻害する効果を有していたため、この阻害はＨＡ結合に対して非依存性である。
【００７６】
実施例４−組換えＣＤ４４ＨＡＢＤタンパク質はニワトリＣＡＭにおける異なる腫瘍細胞系の増殖を阻止する
ＳＭＭＵ−１ヒト黒色腫細胞は、原発腫瘍から最初に単離されたものであり、ＣＤ４４陰性である（Ｇｕｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９４；５４：１５６１−５）。ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌を、１０％ウシ胎仔血清及び５０ｍｇｍｌ−１ゲンタマイシンを含有しているＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。ＳＭＭＵ−１細胞及びＭ２１細胞は、１０％ウシ胎仔血清及び５０μｇｍｌ−１ゲンタマイシンを含有しているＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞をトリプシン処理によりプレートから剥離し、１０日齢ニワトリ胚のＣＡＭ上に１００万個の細胞を播いた。腫瘍を、ヒト又はニワトリのいずれか起源の融合タンパク質１０μｇを含むＰＢＳ  １００μｌ、又は媒体単独により２日毎に処理した。７日後、腫瘍を切除し、湿重量を決定した。図４に示されるように、テストされた腫瘍細胞系全ての腫瘍増殖が、有意に阻害された。
【００７７】
実施例５−組換えＣＤ４４融合タンパク質はヌードマウスにおける腫瘍増殖を阻害する
１×１０６個のＳＭＭＵ−１細胞を、６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃＡＢｏｍヌードマウス（Ｍ＆Ｂ）の背部に皮下注射した。翌日、マウスに、体重１ｋｇ当たり２．４ｍｇのＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ又はＧＳＴ単独を含むＰＢＳ  １００μｌを、腫瘍の近位に皮下注射した。その処理を２日毎に繰り返し、２週間後に動物を屠殺し、腫瘍を解剖し、重量に関して分析し、組織分析用に調製した。ＣＤ４４ＨＡＢＤ又は非ＨＡ結合性変異体ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓによるマウスの皮下処理は、ＧＳＴ処理対照と比較して、腫瘍増殖を有意に低下させた（図５ａ、ｃ、全ての時点においてＰ＜０．０５）。１６日目にマウスを屠殺した場合、ＣＤ４４ＨＡＢＤ及びＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓにより処理されたマウスは、ＧＳＴ処理マウスより平均して４５％小さい腫瘍負荷（それぞれ４７％及び４３％）を有していた（図５ｂ）。
【００７８】
免疫組織化学的分析のため、４μｍ厚さの組織切片を、ホルマリン固定されパラフィン包埋された類似サイズのＳＭＭＵ−１腫瘍から切り出した。組織切片における血管染色を、ヤギ抗マウスＰＥＣＡＭ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）一次抗体を使用して実施し、一次抗体結合を、アルカリホスファターゼ結合抗ヤギ二次抗体により検出し、ベクタステイン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して現像した。ＰＥＣＡＭ−１陽性血管の染色による腫瘍の免疫組織化学的分析は、ＣＤ４４ＨＡＢＤ及びＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９で処理された腫瘍が、腫瘍辺縁においても、より少なく血管新生されていることを示した（図５ｄ）。
【００７９】
実施例６−ＣＤ４４−ＨＡＢＤ融合タンパク質はヌードマウスにおけるヒト膵臓癌の増殖も阻害する
１×１０６個のＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）細胞を、６〜８週齢雌ＢＡＬＢ／ｃＡＢｏｍヌードマウス（Ｍ＆Ｂ，Ｒｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の背部に皮下注射した。腫瘍結節が出現した時点で、マウスに、腫瘍の近位に、２０μｇ（ＢｘＰＣ−３）又は５０μｇ（ＳＭＭＵ−１）のＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ又はＧＳＴを含むＰＢＳ  １００μｌを皮下注射により与え始めた。その処理を２日毎に繰り返し、対照腫瘍の大部分が直径２５ｍｍに達した時点で、動物を屠殺した。腫瘍体積を、式（幅２×長さ）×０．５２を使用して計算した。実験終了時、腫瘍を解剖し、重量に関して分析し、組織分析用に調製した。ＢｘＰＣ−３細胞は、徐々に増殖する腫瘍を与えた。ＧＳＴで処理された対照は、マウスが屠殺された５２日目に、０．２６７±０．０４２ｇという平均重量に達した（図６ａ〜ｂ）。ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ又はＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓによるマウスの処理は、ＢｘＰＣ−３腫瘍増殖を有意に阻害し、対照と比較してそれぞれ６０％（０．１０８±０．０２８ｇ）及び７０％（０．０８５±０．０１７ｇ）平均腫瘍重量を低下させた（Ｐ＜０．０５；ｎ＝６）。
【００８０】
実施例７−組換えＣＤ４４ＨＡＢＤはインビトロの内皮細胞増殖を特異的に阻害し、内皮細胞周期を阻止する
細胞周期分析のため、対数増殖期の初代ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ウシ肺動脈内皮（ＣＰＡＥ）細胞、初代ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ＭＣＦ−７細胞又はＳＭＭＵ１細胞を、３０μｇ／ｍｌ  ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ、ＧＳＴ又はＰＢＳの存在下で４８時間インキュベートした。細胞を３０μｇ／ｍｌブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）により６０分間パルス処理し、採集し、氷冷エタノールで固定した。次いで、細胞を、１：５０希釈の抗ＢｒｄＵ  ｍＡｂ  Ｇ３Ｇ４（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｉｏｗａ）によりＢｒｄＵに関して染色した後、ヨウ化プロピジウムによる染色と平行して、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）により染色した。次いで、細胞周期分布を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）により分析した。
【００８１】
ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ又はＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓへ曝されたヒト血管内皮細胞及びウシ肺動脈内皮細胞は、対照処理細胞（２５％；図７）と比較して、著しく低下したＳ期の細胞の量を示した（それぞれ５％及び６％）。さらに、ＣＤ４４ＨＡＢＤは、初代ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）又はテストされた腫瘍細胞全ての細胞周期に対しては有意な効果を及ぼさず、このことから、ＣＤ４４ＨＡＢＤによる細胞周期阻害が内皮細胞に特異的であることが示唆された。
【００８２】
実施例８−ＣＤ４４ＨＡＢＤ内の中央ドメインは内皮細胞増殖の阻害活性にとって重要である
内皮細胞増殖の阻害にとって重要なＣＤ４４ＨＡＢＤ内の領域の分析を開始するため、いくつかのＣＤ４４の欠失変異体をＰＣＲを使用して作成した。三重変異体ＣＤ４４ＨＡＢＤを鋳型として使用した。ＣＤ４４ＨＡＢＤに特異的なオリゴヌクレオチドを、ベクター特異的なプライマーと共にＰＣＲ増幅に使用し、産物をライゲートさせ、ＣＤ４４ＨＡＢＤのａａ２１〜６０、２１〜１００又は９３〜１３２をそれぞれ産生するベクターを得た。ｗｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤ及び３ｍｕｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤの配列が、欠失変異体２１〜１００、２１〜６０及び９３〜１３０と共に図８Ａに示されており、その配列は、配列番号２３（２１〜１００）、配列番号２４（２１〜６０）及び配列番号２５（９３〜１３２）として表に記載されている。内皮細胞増殖の阻害に関与しているＣＤ４４ＨＡＢＤ中央ドメインの配列は、配列番号２６に示されている。全ての組換えタンパク質が、実施例１に記載されたようにして細菌において産生され、精製された。
【００８３】
対数増殖期のウシ肺内皮細胞（ＣＰＡＥ）を、１０％血清を含有している培地中で示されたタンパク質（最終濃度それぞれ１５μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌ）により４８時間処理した。細胞増殖を、顕微鏡写真撮影（図８Ｂ）、又はＭＴＴ染色（Ｓｉｇｍａ）及び分光光度法（図８Ｃ）によりアッセイした。図８Ｃに示されるように、ＣＤ４４ＨＡＢＤ  ａａ２１〜１００、しかし２１〜６０又は９３〜１３０はそうでない。従って、内皮細胞増殖の阻害にとって重要な配列は、例えばＣＤ４４ＨＡＢＤのａａ６１〜１００（配列番号２６）の領域にマッピングされた配列を含む。しかしながら、完全ＣＤ４４ＨＡＢＤ内の隣接配列による寄付も、否定はされない。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】組換えのＧＳＴタンパク質及びＧＳＴ−ＣＤ４４タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。ゲルはクーマシーブリリアントブルーにより染色された。分子量マーカーが右側に示されている。
【図２ａ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがヒアルロン酸と結合することを示す。ａ、野生型ＣＤ４４ＨＡＢＤは、固定化されたＨＡと結合するが、Ｒ４１Ａ変異体、Ｒ７８ＳＹ７９Ｓ変異体又はＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ変異体は結合しない。
【図２ｂ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがヒアルロン酸と結合することを示す。ｂ、ＣＤ４４ＨＡＢＤはヒト大動脈内皮細胞のＨＡへの遊走を阻害するが、Ｒ４１Ａ  ＨＡ非結合性変異体には効果がない。ＨＡ結合を阻止するＣＤ４４に対するモノクローナル抗体Ａ３は、内皮細胞遊走も阻害する。
【図３ａ】組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ａ、血管形成がｂＦＧＦにより誘導された典型的な血管形成実験からのフィルターディスク及び関連ＣＡＭ。ｂ〜ｄ、血管形成は血管枝ポイントの数；平均血管形成指数±ＳＥＭとして査定された。＊（Ｐ＜０．０５）、有意な結果。
【図３ｂ】組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ｂ、血管形成は血管枝ポイントの数；平均血管形成指数±ＳＥＭとして査定された。＊（Ｐ＜０．０５）、有意な結果。
【図３ｃ】組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ｃ、血管形成は血管枝ポイントの数；平均血管形成指数±ＳＥＭとして査定された。＊（Ｐ＜０．０５）、有意な結果。
【図３ｄ】組換えヒトＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリ絨毛尿膜におけるインビボの血管形成を阻止することを示す。ｄ、血管形成は血管枝ポイントの数；平均血管形成指数±ＳＥＭとして査定された。＊（Ｐ＜０．０５）、有意な結果。
【図４ａ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリＣＡＭにおける肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）の増殖を阻害することを示す。
【図４ｂ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリＣＡＭにおける黒色腫（ＳＭＭＵ−１、Ｍ２１）及び肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）の増殖を阻害することを示す。
【図４ｃ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがニワトリＣＡＭにおける黒色腫（ＳＭＭＵ−１、Ｍ２１）の増殖を阻害することを示す。
【図５ａ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ａ、ＣＤ４４ＨＡＢＤ、ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ又は対照としてのＧＳＴにより処理されたヌードマウスにおけるｓ．ｃ．ＳＭＭＵ−１腫瘍の増殖曲線（各群ｎ＝８）。
【図５ｂ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ｂ、１６日目の腫瘍重量（黒線は中央値を表している）。
【図５ｃ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ｃ、示されたようにして処理された１６日目のマウスの代表的な写真。
【図５ｄ】組換えＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインがＣＤ４４陰性黒色腫増殖を阻害することを示す。ｄ、高倍率視野（ＨＰＦ）１個当たりの腫瘍辺縁における血管密度。＊（Ｐ＜０．００５）、＊＊（０．０５）有意な結果。
【図６ａ】ＣＤ４４−ＨＡＢＤ融合タンパク質は、ヌードマウスにおけるヒト膵臓癌細胞の増殖を阻害する。ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ（四角）、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（三角）又は対照としてのＧＳＴ（菱形）により処理されたヌードマウスにおけるＢｘＰＣ−３膵臓腺癌腫瘍（ｎ＝６〜７）（ａ）。
【図６ｂ】ＣＤ４４−ＨＡＢＤ融合タンパク質は、ヌードマウスにおけるヒト膵臓癌細胞の増殖を阻害する。ｂ、実験終了時の平均ＢｘＰＣ−３腫瘍重量。グラフ内の値及びバーは平均±ｓ．ｅ．ｍを表す。アステリスクはＰ＜０．０５を示す。
【図７】組換えＣＤ４４ＨＡＢＤは内皮細胞周期を特異的に阻止する。ＧＳＴ（黒）、ＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤ（薄い影）又はＧＳＴ−ＣＤ４４ＨＡＢＤＲ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（濃い影）により処理された場合の、Ｓ期の細胞の割合。ＨＵＶＥＣ、ヒト血管内皮細胞；ＣＰＡＥ、ウシ肺動脈内皮細胞；ＮＨＤＦ、正常ヒト皮膚線維芽細胞；ＭＣＦ−７、ヒト乳癌細胞。
【図８ａ】内皮細胞増殖に対するＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体の効果を示す。ＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体は、３ｍｕｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤ（変異の位置は、太字で示されている、図８Ａ）に由来し、組換えタンパク質は実施例１に記載されたようにして産生され精製された。
【図８ｂ】内皮細胞増殖に対するＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体の効果を示す。ＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体は、３ｍｕｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤ（変異の位置は、太字で示されている、図８Ａ）に由来し、組換えタンパク質は実施例１に記載されたようにして産生され精製された。ウシ肺内皮細胞（ＣＰＡＥ）が、１０％血清を含有している培地中で示されたタンパク質（最終濃度それぞれ１５μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌ）により４８時間処理された。細胞増殖は、顕微鏡写真（Ｂ）。
【図８ｃ】内皮細胞増殖に対するＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体の効果を示す。ＣＤ４４ＨＡＢＤ欠失変異体は、３ｍｕｔ  ＣＤ４４ＨＡＢＤ（変異の位置は、太字で示されている、図８Ａ）に由来し、組換えタンパク質は実施例１に記載されたようにして産生され精製された。ＭＴＴ染色（Ｓｉｇｍａ）及び分光光度法（Ｃ）によりアッセイされた。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号１３及び１４はＰＣＲプライマーの配列である。
配列番号１５〜１８は変異型プライマーの配列である。
配列番号１９〜２２はＲＴ−ＰＣＲ−プライマーの配列である。
配列番号２３〜２５は欠失変型体の配列である。
【配列表】
2005525995.tif 000002
2005525995.tif 000003
2005525995.tif 000004
2005525995.tif 000005
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2005525995.tif 000007
2005525995.tif 000008
2005525995.tif 000009
2005525995.tif 000010
【図１】
2005525995.tif 000011
【図２ａ】
2005525995.tif 000012
【図２ｂ】
2005525995.tif 000013
【図３ａ】
2005525995.tif 000014
【図３ｂ】
2005525995.tif 000015
【図３ｃ】
2005525995.tif 000016
【図３ｄ】
2005525995.tif 000017
【図４ａ】
2005525995.tif 000018
【図４ｂ】
2005525995.tif 000019
【図４ｃ】
2005525995.tif 000020
【図５ａ】
2005525995.tif 000021
【図５ｂ】
2005525995.tif 000022
【図５ｃ】
2005525995.tif 000023
【図５ｄ】
2005525995.tif 000024
【図６ａ】
2005525995.tif 000025
【図６ｂ】
2005525995.tif 000026
【図７】
2005525995.tif 000027
【図８ａ】
2005525995.tif 000028
【図８ｂ】
2005525995.tif 000029
【図８ｃ】
2005525995.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月27日(2003.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管形成及び／又は内皮細胞増殖の阻害と関係がある状態を治療するための医薬品の製造のためのＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン（ＣＤ４４−ＨＡＢＤ）の非ＨＡ結合性バリアント、並びにそれらの非ＨＡ結合性アナログ、組換えバリアント及び変異型バリアント又はその断片を含む分子の使用。
【請求項２】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤがそれを非ＨＡ結合性にする変異を少なくとも１個含む請求項１に記載の使用。
【請求項３】
（１個以上の）変異がＦ３４Ａ、Ｆ３４Ｙ、Ｋ３８Ｒ、Ｋ３８Ｓ、Ｒ４１Ａ、Ｙ４２Ｆ、Ｙ４２Ｓ、Ｒ４６Ｓ、Ｅ４８Ｓ、Ｋ５４Ｓ、Ｑ６５Ｓ、Ｋ６８Ｓ、Ｒ７８Ｋ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｓ、Ｎ１００Ａ、Ｎ１００Ｒ、Ｎ１０１Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、Ｙ１０５Ｓ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｆ、Ｆ１１９Ａ及びＦ１１９Ｙ、好ましくはＲ４１Ａ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓより選択される請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６５％、最も好ましくは少なくとも７５％という配列番号：２の配列との相同性を有する請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
組換えバリアントがＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分とＧＳＴ部分とを有し、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分が非ＨＡ結合性型である請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
【請求項６】
ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインの非ＨＡ結合性バリアントを含む分子が、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：２）、イヌＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：４）、ニワトリＣＤ４４−ＨＡＢＤ（配列番号：６）、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１Ａ（配列番号：８）、ヒトＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ７８ＳＹ７９Ｓ（配列番号：１０）ＣＤ４４−ＨＡＢＤ−Ｒ４１ＡＲ７８ＳＹ７９Ｓ（配列番号：１２）、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ(２１−１００)（配列番号：２３）及びＣＤ４４−ＨＡＢＤ(６１−１００)（配列番号：２６）を含む群より選択され、これらの配列がこれらの配列を非ＨＡ結合性にする少なくとも１個の修飾をさらに含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
分子がヒト、イヌ、ニワトリ、霊長類の動物、ラット又はマウスを起源とする分子である請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
治療される状態が、黄斑変性症、糖尿病性網膜症及び網膜低酸素状態のような失明又は視覚障害を引き起こす眼疾患、慢性関節リウマチのような慢性炎症の状態、乾癬、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、並びに癌の増殖及び転移、並びに乳房、前立腺、結腸、肺、皮膚、肝臓、脳、卵巣、精巣、骨格、上皮、内皮、膵臓、腎臓、筋肉、副腎、腸、内分泌腺、口腔、頭部及び頸部、又はその他の固形組織起源の癌、又は任意の型の白血病、及び血管腫のようなあらゆる型の癌疾患及び腫瘍より選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
内皮細胞のターゲティングのためのＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメイン並びにそのアナログ、組換えバリアント及び変異型バリアント又は断片を含む分子の使用。
【請求項１０】
分子が化学療法特性及び／又は遺伝子治療特性を示す部分をさらに含む請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
（ｉ）ＧＳＴ部分、（ｉｉ）化学療法特性を示す部分、（ｉｉｉ）遺伝子治療特性を示す部分及び（ｉｖ）ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｈｉｓ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ及びＥＧＦＰから選択されるタグから選択される部分、及びＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分を含む組換え分子であって、ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分は、Ｆ３４Ａ、Ｆ３４Ｙ、Ｋ３８Ｒ、Ｋ３８Ｓ、Ｒ４１Ａ、Ｙ４２Ｆ、Ｙ４２Ｓ、Ｒ４６Ｓ、Ｅ４８Ｓ、Ｋ５４Ｓ、Ｑ６５Ｓ、Ｋ６８Ｓ、Ｒ７８Ｋ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｆ、Ｙ７９Ｓ、Ｎ１００Ａ、Ｎ１００Ｒ、Ｎ１０１Ｓ、Ｙ１０５Ｆ、Ｙ１０５Ｓ、Ｓ１１２Ｒ、Ｙ１１４Ｆ、Ｆ１１９Ａ、Ｆ１１９Ｙ、好ましくはＲ４１Ａ、Ｒ７８Ｓ、Ｙ７９Ｓより選択される変異型の如き、それを非ＨＡ結合性にする少なくとも１個の変異型により変異されている組換え分子。
【請求項１２】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分が配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：２３、配列番号：２６のアミノ酸配列のうちのいずれか１個の修飾されたバリアントにより規定される請求項１１に記載の組換え分子。
【請求項１３】
ＣＤ４４−ＨＡＢＤ部分が修飾型であるヌクレオチド配列：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１のうちのいずれかと少なくとも５５％の相同性、好ましくは６５％の相同性、より好ましくは７５％の相同性を有する配列、最も好ましくは修飾型であるヌクレオチド配列：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１のうちのいずれかである配列によりコードされる請求項１１又は１２に記載の組換え分子。
【請求項１４】
医学的使用のための請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組換え分子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の少なくとも１個を少なくとも１個の薬学的に許容される担体又は賦形剤との混合物として、又はそれらと共に含む薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の薬学的な用量を投与することを含む患者における腫瘍又はその他の疾患の治療方法。
【請求項１７】
以下の工程を含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の結合パートナーのスクリーニング方法：
ａ）ＣＤ４４ヒアルロン酸結合ドメインを含む分子を準備する；
ｂ）可能性のある結合パートナーを前記分子と接触させる；及び
ｃ）前記可能性のある結合パートナーに対する前記分子の効果を決定する。
【請求項１８】
可能性のある結合パートナーがタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸、脂質、グリカン、配糖体及び糖類を含む群より選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
可能性のある結合パートナーが受容体分子、受容体分子の一部、細胞表面受容体分子もしくは受容体分子ではない細胞表面に位置する分子と結合する分子である請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法により見出された請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子の結合パートナー。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子と請求項２０に記載の可能性のある結合パートナーを別々のバイアルに含む請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
Ｂａｊｏｒａｔｈ（ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：１０３−１１１（２０００））は、ＣＤ４４及びそのＨＡとの結合、細胞接着、並びにＣＤ４４シグナリングを開示している。さらに、よく確立されている非ＨＡ結合性変異Ｒ４１Ａ及びＲ７８Ｓ、並びにそれらのＣＤ４４のＨＡとの結合に対する影響を特に含むＣＤ４４突然変異誘発実験が開示されている。しかし、これらの全ての場合において非ＨＡ結合ＣＤ４４変異体はＨＡ結合特性についてのネガティブコントロールとして用いられており、非ＨＡ結合変異体にはいかなる生物学的活性も特徴付けられていない。


【国際調査報告】
2005525995.tif 000031
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