(57)【要約】本発明は、炭素４でのポリ不飽和脂肪酸の不飽和化（すなわち、Δ４−デサチュラーゼ）に関与する遺伝子の同定に関する。特に、Δ４−デサチュラーゼは、例えばアドレン酸のω６−ドコサペンタエン酸への変換及びω３−ドコサペンタエン酸のドコサヘキサエン酸への変換に使用され得る。前記酵素を用いて生成されるポリ不飽和脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品（例えば、化粧品）に添加され得る。
2005525780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列またはその断片であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する前記単離ヌクレオチド配列またはその断片。
【請求項２】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３６、配列番号４５及び配列番号５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列またはその断片。
【請求項３】
前記配列がモノ不飽和またはポリ不飽和脂肪酸を基質として使用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードする請求の範囲第１項または第２項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記配列が真菌及び藻類からなる群から選択される生物から誘導される請求の範囲第１項または第２項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号４５からなる群から選択され前記配列が真菌Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍから誘導され、配列番号３６からなる前記配列が真菌Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍから誘導され、配列番号５４からなる前記配列が藻類Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａから誘導される請求の範囲第４項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求の範囲第１項または第２項に記載のヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチド。
【請求項７】
ポリ不飽和脂肪酸を炭素４において不飽和化し、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、精製ポリペプチド。
【請求項８】
（ａ）ｉ）配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするフクレオチド配列、または
ｉｉ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３６、配列番号４５及び配列番号５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ、
（ｂ）ｉ）前記単離ヌクレオチド配列をｉｉ）プロモーターに作動的に結合して含んでいるベクターを構築するステップ、
（ｃ）デサチュラーゼを発現させるのに十分な時間及び条件下で前記ベクターを宿主細胞に導入するステップ
を含むデサチュラーゼの作成方法。
【請求項９】
（ａ）ｉ）配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
ｉｉ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３６、配列番号４５及び配列番号５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列及びこれに作動的に結合している
（ｂ）プロモーターを含むベクター。
【請求項１０】
請求の範囲第９項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求の範囲第９項に記載のベクターを含む植物細胞、植物または植物組織であって、前記ベクターのヌクレオチド配列を発現させると前記植物細胞、植物または植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が生成される前記植物細胞、植物または植物組織。
【請求項１２】
ポリ不飽和脂肪酸がω６−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される請求の範囲第１１項に記載の植物細胞、植物または植物組織。
【請求項１３】
請求の範囲第１１項に記載の植物細胞、植物または植物組織により発現される１つ以上の植物油または酸。
【請求項１４】
ベクターのヌクレオチド配列を発現させるとトランスジェニック植物の種子においてポリ不飽和脂肪酸が生成される請求の範囲第９項に記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項１５】
（ａ）ｉ）配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
ｉｉ）配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３６、配列番号４５及び配列番号５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列
を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ、
（ｂ）前記した単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築するステップ、
（ｃ）Δ４−デサチュラーゼを発現させるのに十分な時間及び条件下で前記ベクターを宿主細胞に導入するステップ、及び
（ｄ）発現させたΔ４−デサチュラーゼを基質のポリ不飽和脂肪酸に接触させて、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップ
を含むポリ不飽和脂肪酸の生成方法。
【請求項１６】
基質のポリ不飽和脂肪酸がアドレン酸またはω３−ドコサペンタエン酸であり、生成物のポリ不飽和脂肪酸がω６−ドコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸である請求の範囲第１５項に記載の方法。
【請求項１７】
更に、生成物のポリ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼに接触させて、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップを含む請求の範囲第１５項に記載の方法。
【請求項１８】
生成物のポリ不飽和脂肪酸がω６−ドコサペンタエン酸であり、別のポリ不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である請求の範囲第１７項に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）基質のポリ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼ及びエロンガーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素と接触させて、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップ、及び
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物のポリ不飽和脂肪酸を配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むΔ４−デサチュラーゼに接触させて、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を最終生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップ
を含むポリ不飽和脂肪酸の生成方法。
【請求項２０】
基質のポリ不飽和脂肪酸がリノール酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸及びエイコサペンタエン酸からなる群から選択される請求の範囲第１９項に記載の方法。
【請求項２１】
最終生成物のポリ不飽和脂肪酸がω６−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される請求の範囲第１９項に記載の方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１５項に記載の方法により生成した生成物のポリ不飽和脂肪酸及び請求の範囲第１７項に記載の方法により生成した別の生成物のポリ不飽和脂肪酸からなる群から選択されるポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つ含む組成物。
【請求項２３】
生成物のポリ不飽和脂肪酸がω６−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択されるポリ不飽和脂肪酸の少なくとも１つである請求の範囲第２２項に記載の組成物。
【請求項２４】
別のポリ不飽和脂肪酸がドコサヘキサエン酸である請求の範囲第２２項に記載の組成物。
【請求項２５】
組成物が乳児用調製乳、保健食品及び代用食品からなる群から選択される請求の範囲第２２項に記載の組成物。
【請求項２６】
ヒトまたは動物に投与される請求の範囲第２２項に記載の組成物。
【請求項２７】
経腸または非経口的に投与される請求の範囲第２６項に記載の組成物。
【請求項２８】
ポリ不飽和脂肪酸の摂取が不十分なために生ずる状態の予防または治療方法であって、患者に対して前記予防または治療に十分な量の請求の範囲第２２項に記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項２９】
デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列またはその断片であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の同一性を有する前記単離ヌクレオチド配列またはその断片。
【請求項３０】
配列番号５４のヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列またはその断片。
【請求項３１】
ポリ不飽和脂肪酸を炭素４において不飽和化し且つ配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の同一性を有する精製ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ不飽和脂肪酸の合成に関与する酵素（例えば、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍΔ４−デサチュラーゼ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍΔ４−デサチュラーゼ及びＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａΔ４−デサチュラーゼ）をコードする遺伝子の同定及び単離、並びにその使用に関する。特に、Δ４−デサチュラーゼは、アドレン酸（２２：４ｎ−６）のω６−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）への変換やω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）のドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ−３）への変換のような変換を触媒する。変換により生じた生成物はその後他のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生成における基質として使用され得る。生成物または他のポリ不飽和脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品（例えば、化粧品）に添加され得る。
【背景技術】
【０００２】
デサチュラーゼは多くの重要な機能を有する長鎖ポリ不飽和脂肪酸の生成において不可欠である。例えば、ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）はリン脂質の形態で存在する細胞の血漿膜の重要な成分である。ＰＵＦＡは、哺乳動物プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン及びプロスタグランジンへの前駆体としても機能する。
【０００３】
更に、ＰＵＦＡは発達中の乳児の脳の適切な発達や組織の形成及び修復のために必要である。ＰＵＦＡの生物学的重要性にてらして、ＰＵＦＡ及びＰＵＦＡを製造するための中間体を効率的に生成することが試みられている。
【０００４】
多数の酵素がＰＵＦＡ生合成に関与しており、中でもデサチュラーゼ及びエロンガーゼが注目されている（図１参照）。例えば、エロンガーゼ（ｅｌｏ）はγ−リノレン酸（ＧＬＡ）のジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）への変換及びステアリドン酸（１８：４ｎ−３）の（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）への変換を触媒する。リノール酸（ＬＡ，１８：２ｎ−９，１２または１８：２ｎ−６）はΔ１２−デサチュラーゼによりオレイン酸から生成される。ＧＬＡ（１８：３ｎ−６，９，１２）はΔ６−デサチュラーゼによりリノール酸から生成される。
【０００５】
動物はΔ９位以外を不飽和化できず、よってオレイン酸をリノール酸に変換できないことに注目すべきである。同様に、γ−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３ｎ−９，１２，１５）は哺乳動物により合成され得ない。しかしながら、γ−リノレン酸は哺乳動物及び藻類においてΔ６−デサチュラーゼによりステアリドン酸（ＳＴＡ，１８：４ｎ−６，９，１２，１５）に変換され（国際特許出願公開第９６／１３５９１号パンフレット及びＴｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，パート１，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ３０９３，ｐ．Ａ５３２（カリフォルニア州サンフランシスコで１９９８年４月１８日〜２２日に開催されたＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９８）、及び米国特許第５，５５２，３０６号明細書参照）、その後（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−８，１１，１４，１７）に延長され得る。このポリ不飽和脂肪酸（すなわち、２０：４ｎ−８，１１，１４，１７）はその後Δ５−デサチュラーゼによりエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ｎ−５，８，１１，１４，１７）に変換され得る。また、ＥＰＡ
はエロンガーゼによりω３−ドコサペンタエン酸に変換され得る。ω３−ドコサペンタエン酸のドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ−３）への変換に関わる酵素またはそのコード化遺伝子の単離は未だ報告されていない。この変換に関して２つの経路が提案されている（図１及びＨ．Ｓｐｒｅｃｈｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ，２：１３５−１３８（１９９９）参照）。その１つの経路では本発明のデサチュラーゼのような単一酵素のΔ４−デサチュラーゼが関与する。ｎ−６経路では、食事性リノール酸が哺乳動物において一連の不飽和化及び延長ステップを介してアドレン酸に変換され得る（図１参照）。アドレン酸からのω６−ドコサペンタエン酸の生成では上記したΔ６−デサチュラーセが媒介していると推定される。
【０００６】
真菌及び植物を含めた他の真核生物は炭素１２（国際特許出願公開第９４／１１５１６号パンフレット及び米国特許第５，４４３，９７４号明細書参照）及び炭素１５（国際特許出願公開第９３／１１２４５号パンフレット参照）で不飽和化する酵素を有する。従って、動物の主要なポリ不飽和脂肪酸は食餌から及び／またはリノール酸またはγ−リノレン酸の不飽和化及び延長から誘導される。これらの困難さから、元々これら脂肪酸を生成する種からＰＵＦＡ合成に関与する遺伝子を単離し、前記遺伝子を１つ以上のＰＵＦＡを大量に生産するように改変され得る微生物、植物または動物系において発現させることは特に興味深い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記にてらして、Δ４−デサチュラーゼ酵素、この酵素をコードする各遺伝子及びこの酵素を産生するための組換え方法が明らかに必要とされている。更に、天然に存在する以上の量のＰＵＦＡを含む油及び新規ＰＵＦＡを多く含む油が要望されている。こうした油はΔ４−デサチュラーゼ遺伝子を単離、発現させることにより作成され得る。
【０００８】
本明細書で挙げた米国特許明細書及び国際特許出願公開パンフレットは援用により本明細書に含まれるとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はデサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列またはその断片を包含する。前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。特に、本発明はデサチュラーゼ活性を有し、配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列またはその断片を包含する。
【００１０】
更に、本発明は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３６、配列番号４５及び配列番号５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列またはその断片を包含する。特に、本発明は配列番号５４のヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列またはその断片を包含する。
【００１１】
上記した配列はそれぞれ基質としてモノ不飽和またはポリ不飽和脂肪酸を用いる機能的に活性なデサチュラーゼをコードする。ヌクレオチド配列は例えば真菌また藻類から誘導され得る。特に、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号４５からなるヌクレオチド配列は、例えば真菌Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍから誘導され得る。配列番号３６からなる配列は例えば真菌Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍから誘導され得る。配列番号５４からなる配列は例えば藻類Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａから誘導される得る。本発明は上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製タンパク質及びその断片も包含する。
【００１２】
特に、本発明は、炭素４でポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し且つ配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドが含まれる。特に、本発明は、炭素４でポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し且つ配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドをも含む。
【００１３】
更に、本発明は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性（または、配列番号５５のアミノ酸配列に対して少なくとも３０％の同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、または配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３６、配列番号４５及び配列番号５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性（または、特に配列番号５４に対して少なくとも４０％の配列同一性）を有する、ヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ；ｉ）前記単離ヌクレオチド配列をｉｉ）プロモーターに作動的に結合して含んでいるベクターを構築するステップ；及びデサチュラーゼを発現させるのに十分な時間及び条件下で前記ベクターを宿主細胞に導入するステップを含むデサチュラーゼの生成方法を包含する。宿主細胞は、例えば真核細胞または原核細胞であり得る。特に、原核細胞は例えば大腸菌、シアノバクテリアまたは枯草菌であり得る。真核細胞は例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．またはＰｉｃｈｉａ ｓｐｐ．のような酵母細胞であり得る。
【００１４】
更に、本発明は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性（または、特に配列番号５５に対して少なくとも３０％のアミノ酸同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、または配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３６、配列番号４５及び配列番号５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性（または、特に配列番号５４に対して少なくとも４０％の同一性）を有する、ヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列及びこれに作動的に結合しているプロモーターを含むベクターも包含する。本発明はまた前記ベクターを含む宿主細胞をも包含する。宿主細胞は例えば真核細胞または原核細胞であり得る。好適な真核細胞及び原核細胞は上記した通りである。
【００１５】
更に、本発明は前記ベクターを含む植物細胞、植物または植物組織を包含し、該ベクターのヌクレオチド配列を発現させると前記した植物細胞、植物または植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が生成される。ポリ不飽和脂肪酸は例えばω６−ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される。本発明は、上記植物細胞、植物または植物組織により発現される１つ以上の植物油または酸をも包含する。
【００１６】
更に、本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物を包含し、該ベクターのヌクレオチド配列を発現させるとトランスジェニック植物の種子においてポリ不飽和脂肪酸が生成される。
【００１７】
本発明はまた、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性（及び、特に配列番号５５に対して少なくとも３０％ののアミノ酸配列同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、または配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３６、配列番号４５及び配列番号５４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％の配列同一性（及び、特に配列番号５４に対して少なくとも４０％の同一性）を有する、ヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を単離するステップ；前記した単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築するステップ；Δ４−デサチュラーゼを発現させるのに十分な時間及び条件下で前記ベクターを宿主細胞に導入するステップ；及び発現させたΔ４−デサチュラーゼを基質のポリ不飽和脂肪酸に接触させて、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップ；を含むポリ不飽和脂肪酸の生成方法（第１方法）を包含する。基質のポリ不飽和脂肪酸は例えばアドレン酸またはω３−ドコサペンタエン酸であり得、生成物のポリ不飽和脂肪酸は例えばω６−ドコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸であり得る。この方法は、更に生成物のポリ不飽和脂肪酸を別の酵素（例えば、Δ４−デサチュラーゼ、エロンガーゼまたは別のデサチュラーゼ）に接触させて、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップを含む（すなわち、第２方法）。追加ステップを含むこの方法（すなわち、第２方法）において、生成物のポリ不飽和脂肪酸は例えばω６−ドコサペンタエン酸であり得、別のポリ不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸であり得る。
【００１８】
また、本発明は、基質のポリ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼ及びエロンガーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素と接触させて、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップ；及び前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３７、配列番号４６及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むΔ４−デサチュラーゼに接触させて、前記生成物のポリ不飽和脂肪酸を最終生成物のポリ不飽和脂肪酸に変換させるステップ；を含むポリ不飽和脂肪酸の生成方法を包含する。
【００１９】
例えば、基質のポリ不飽和脂肪酸（例えば、エイコサペンタエン酸）をエロンガーゼまたはデサチュラーゼ（例えば、ＭＥＬＯ４、生合成経路において有用な他のエロンガーゼまたはデサチュラーゼ）に接触させて、前記基質を生成物のポリ不飽和脂肪酸（例えば、ω３−ドコサペンタエン酸）に変換させ得る。生成物のポリ不飽和脂肪酸はその後本発明のΔ４−デサチュラーゼに接触させることにより“最終”生成物のポリ不飽和脂肪酸（例えば、ドコサヘキサエン酸）に変換され得る（図１参照）。よって、Δ４−デサチュラーゼは“最終”所望生成物を生成するために方法の最後のステップで使用される。別の例として、リノール酸をΔ６−デサチュラーゼに接触させるとγ−リノレン酸（ＧＬＡ）が生成され、その後ＧＬＡをエロンガーゼ、次いでΔ５−デサチュラーゼに接触させるとアラキドン酸（ＡＡ）が生成され得る。ＡＡをその後エロンガーゼに接触させるとアドレン酸に変換され得る。最後に、アドレン酸をΔ４−デサチュラーゼに接触させるとω６−ドコサペンタエン酸に変換され得る（図１参照）。よって、本発明の方法は所望の生成物を得るためにΔ４−デサチュラーゼに加えてリノール酸基質と一連のデサチュラーゼ及びエロンガーゼの使用を含む。同様の方法により、基質ＰＵＦＡのγ−リノレン酸をドコサヘキサエン酸に変換させることができる。各種デサチュラーゼ及びエロンガーゼを使用すると最終的にω３−ドコサペンタエン酸が得られ、これを本発明の１つ以上のΔ４−デサチュラーゼに接触させるとドコサヘキサエン酸に変換される。考えられる基質には図１に示されているもの、例えばリノール酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アドレン酸、エイコサペンタエン酸及びエイコサテトラエン酸が含まれる。
【００２０】
本発明は、上記方法により生成した生成物のポリ不飽和脂肪酸及び上記方法により生成した別の生成物のポリ不飽和脂肪酸からなる群から選択されるポリ不飽和脂肪酸を少なくとも１つ含む組成物をも包含する。生成物のポリ不飽和脂肪酸は例えばω６−ドコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸であり得る。別のポリ不飽和脂肪酸は例えばドコサヘキサエン酸であり得る。
【００２１】
更に、本発明は、ポリ不飽和脂肪酸の摂取が不十分なために生ずる状態の予防または治療方法であって、患者に対して前記予防または治療に十分な量の組成物を投与することを含む前記方法を包含する。
【００２２】
（発明の詳細説明）
本発明は真菌Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ  ７０９１）、真菌Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ及び藻類Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ由来のΔ４−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド及び翻訳アミノ酸配列に関する。更に、本発明は前記遺伝子及びこの遺伝子によりコードされる酵素の使用を包含する。例えば、遺伝子及び対応酵素は医薬組成物、栄養組成物及び他の有用な製品に添加され得るポリ不飽和脂肪酸（例えば、ω６−ドコサペンタエン酸及び／またはドコサヘキサエン酸）の生成に使用され得る。
【００２３】
Δ４−デサチュラーゼ遺伝子及び酵素コード化治療
上記したように、本発明のΔ４−デサチュラーゼ遺伝子によりコードされる酵素は２２炭素以上の長さを有する高級不飽和ポリ不飽和脂肪酸の生成において必須である。作成したプラスミド（実施例ＩＩＩ参照）に基づいて異なっている単離Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍΔ４−デサチュラーゼのヌクレオチド配列を図３〜６に示し、対応の精製タンパク質のアミノ酸配列を図７〜１０に示す。別の単離Ｔ．ａｕｒｅｕｍヌクレオチド配列を図１８に示し（実施例ＶＩＩ参照）、コード化アミノ酸配列を図１９に示す。単離Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍΔ４−デサチュラーゼ配列のヌクレオチド配列を図１３及び１６に示し、コード化アミノ酸配列を図１４及び１７に示す。また、単離Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａΔ４−デサチュラーゼ配列のヌクレオチド配列を図２０に示し、前記ヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を図２１に示す。
【００２４】
本発明の遺伝子の重要さの例として、単離Δ４−デサチュラーゼ遺伝子はアドレン酸をω６−ドコサペンタエン酸に、またはω３−ドコサペンチエン酸をドコサヘキサエン酸に変換する。
【００２５】
本発明が、いずれも本明細書に記載されている配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６または配列番号１７（すなわち、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号３６（すなわち、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ  ２８２０９）のΔ４−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号４５（すなわち、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ  ７０９１）のΔ４−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）または配列番号５４（すなわち、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａのΔ４−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性からなる、対応する、同一または相補的な配列を有する単離ヌクレオチド配列（及び対応のコード化タンパク質）を包含することに注目すべきである。特にＩ．ｇａｌｂａｎａに関して、本発明は配列番号５４のヌクレオチド配列の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、更に好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％からなる、対応するまたは同一または相補的な配列を有するヌクレオチド配列（及び対応のコード化タンパク質）を包含する。同一％について４０〜１００％の範囲の整数はすべて本発明の範囲内であると見做される。前記配列は天然ソースから単離されるか、半合成経路により生成されるかまたは新規合成される任意のソースから誘導され得る。特に、前記配列は実施例に記載されている以外のソース（例えば、細菌、真菌、藻類、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、マウスまたはヒト）から単離または誘導され得る。
【００２６】
更に、本発明は本発明のヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３６、配列番号４５または配列番号５４）並びに他のソースから誘導され且つ上記相補性、同一性または対応を有する配列の断片及び誘導体をも包含する。完全長配列及び断片（すなわち、適切ならばΔ４−デサチュラーゼ活性を有する配列）の機能同等物も本発明に包含される。
【００２７】
本発明では、ヌクレオチド配列の「断片」は特定のヌクレオチド配列の領域に対応する大体約少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの隣接配列として定義される。
【００２８】
本発明は炭素４の位置でポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、上記ヌクレオチド配列によりコードされる上記タンパク質のアミノ酸配列［すなわち、（図７に示す）配列番号１８、（図８に示す）配列番号１９、（図９に示す）配列番号２０、（図１０に示す）配列番号２１、（図１７に示す）配列番号３７、（図１９に示す）配列番号４６及び（図２１に示す）配列番号５５］に対して少なくとも約５０％のアミノ酸類似性もしくは同一性、好ましくは少なくとも約６０％のアミノ酸類似性もしくは同一性、より好ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸類似性もしくは同一性、更に好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸類似性もしくは同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性もしくは同一性を有する精製ポレペプチドをも含む。特にＩ．ｇａｌｂａｎａΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列に関して、本発明は炭素４の位置でポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、配列番号５５のアミノ酸配列（すなわち、図２１に示すＩ．ｇａｌｂａｎａΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列）に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似性もしくは同一性、好ましくは少なくとも約５０％のアミノ酸類似性もしくは同一性、より好ましくは少なくとも約７０％のアミノ酸類似性もしくは同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性もしくは同一性を有する精製ポリペプチドを含む。３０〜１００％同一または類似性の範囲の整数はすべて本発明の範囲内に含まれる。
【００２９】
用語「同一性」は、特定の比較窓またはセグメントの範囲でのヌクレオチド−ヌクレオチド基準での２つの配列の相関性を指す。よって、同一性は２つのＤＮＡセグメント（または、２つのアミノ酸配列）の同じ鎖（センスまたはアンチセンス）間の同一、対応または同等の程度として定義される。「配列同一性の％」は、特定領域の範囲の２つの最適にアラインしている配列を比較し、両配列中に同一の塩基またはアミノ酸が存在する位置の数を調べて整合位置の数を求め、前記位置の数を比較するセグメント中の位置の総数で割り、結果に１００を掛けることにより計算される。配列の適正アラインメントはＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８５：２４４４（１９８８）の方法、及び関連アルゴリズム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら，ＣＡＢＩＯＳ．，５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（生物医学的情報の国立センター(National Center for Biomedical Information)；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（ウィスコンシン州マジソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（ウィスコンシン州マジソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐのウィスコンシン・ジェネティック・ソフトウェア・パッケージ・リリース(Wisconsin Genetics Software Package Release)７．０）を実行するコンピュータープログラムにより実施され得る。米国特許第５，９１２，１２０号明細書参照。
【００３０】
本発明において、「相補性」は２つのＤＮＡセグメント間の相関度として定義される。１つのＤＮＡセグメントのセンス鎖が適当な条件下で他のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズして二重らせんを形成する能力を測定することにより決定される。「相補的」は標準的塩基対規則に基づいて所与配列に対して対をなす配列として定義される。例えば、１つのヌクレオチド鎖中の配列Ａ−Ｇ−Ｔは他の鎖中のＴ−Ｃ−Ａに相補的である。
【００３１】
二重らせんにおいて、アデニンは１つの鎖中に見られ、チミンは他の鎖中に見られる。同様に、グアニンが１つの鎖中に存在する場合シトシンが他の鎖中に存在する。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の相関度が高いほど、これら２つのＤＮＡセグメントの鎖間でハイブリッド二重鎖を形成する能力が高い。
【００３２】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は両配列の一連の同一保存アミノ酸残基の存在として定義される。２つのアミノ酸配列間の類似度が高いほど、これら２つの配列の対応性、同一性または等価性が高い。２つのアミノ酸配列間の「同一性」は両配列中の一連のほぼ類似または不可変アミノ酸残基の存在として定義される。「相補性」、「同一性」及び「類似性」の定義は当業者に公知である。
【００３３】
「コードされる」はポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、前記ポリペプチド配列またはその一部は前記核酸配列によりコードされるポリペプチド由来の少なくとも３アミノ酸、より好ましくは少なくとも８アミノ酸、更に好ましくは少なくとも１５アミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明はまた、ＰＵＦＡデサチュラーゼ活性をコードし、上記ヌクレオチド配列を含むかまたは上記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸に中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る単離ヌクレオチド配列を包含する。核酸分子は、核酸分子の１本鎖形態が適正な温度及びイオン強度条件下で他の核酸分子にアニーリングし得るときに別の核酸分子にハイブリダイズし得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，第２版，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行参照）。温度及びイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「緊縮性」を決定する。「ハイブリダイゼーション」では、２つの核酸が相補配列を含むことが必要である。しかしながら、ハイブリダイゼーションの緊縮性に依存して、塩基間のミスマッチが生じ得る。核酸をハイブリダイズするための適当な緊縮性は核酸の長さ及び相補度に依存する。上記変数は当業界で公知である。より具体的には、２つのヌクレオチド配列間の類似または相同度が高いほど、前記配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値は高い。１００以上のヌクレオチド長を有するハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための式は誘導されている（上掲のＳａｍｂｒｏｏｋら参照）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上掲のＳａｍｂｒｏｏｋら参照）。
【００３５】
本明細書中、「単離核酸断片または配列」は場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含む一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離核酸断片はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。特定ポリヌクレオチドの「断片」は、特定のヌクレオチド配列の領域に対して同一または相補的な大体少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの隣接配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。（通常５’−モノホスフェートの形態で存在する）ヌクレオチドは以下のように１文字表記で表される：アデニレートまたはデオキシアデニレート（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対して）を“Ａ”、シチジレートまたはデオキシシチジレートを“Ｃ”、グアニレートまたはデオキシグアニレートを“Ｇ”、ウリジレートを“Ｕ”、デオキシチミジレートを“Ｔ”、プリン（ＡまたはＧ）を“Ｒ”、ピリミジン（ＣまたはＴ）を“Ｙ”、ＧまたはＴを“Ｋ”、Ａ、ＣまたはＴを“Ｈ”、イノシンを“Ｉ”、任意のヌクレオチドを“Ｎ”と略記する。
【００３６】
用語「機能的に同等である断片または細断片」及び「機能的に同等な断片または細断片」は本明細書中同義的に使用される。これらの用語は、断片または細断片が活性酵素をコードしてもしなくても遺伝子発現を変更する能力またはある表現型を発現する能力が保持されている単離核酸の配列またはその一部を指す。例えば、断片または細断片は所望表現型を形質転換植物において発現させるべくキメラ構築物の設計において使用され得る。キメラ構築物は活性酵素をコードしてもしなくても核酸断片またはその細断片を植物プロモーター配列に対して適当な方位で連結することにより共抑制またはアンチセンスに使用するために設計され得る。
【００３７】
用語「相同性」、「相同的な」、「実質的に類似」及び「実質的に対応」は本明細書中同義的に使用される。これらの用語は１つ以上のヌクレオチド塩基中の変化が核酸断片の遺伝子発現を媒介する能力またはある表現型を発現する能力に影響を与えない核酸断片を指す。これらの用語はまた、本発明の核酸断片の修飾、例えば生じる核酸断片の機能的特性を当初の非修飾断片に比して実質的に変えない１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入を指す。従って、当業者が自明のように、本発明は特定の例示配列より以上のものを包含すると理解されたい。
【００３８】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）及び後（３’非コード配列）の調節配列を含む特定タンパク質を発現する核酸断片を指す。
【００３９】
「天然遺伝子」はそれ自身の調節配列を有する天然に存在する遺伝子を指す。対照的に、「キメラ構築物」は通常天然に存在しない核酸断片の組合せを指す。従って、キメラ構築物は異なるソースから誘導される調節配列及びコード配列からなるか、または同一ソースから誘導されるが天然には通常見られるものとは異なる様式で配列されている調節配列及びコード配列からなり得る。用語「単離」は配列が天然環境から除去されることを意味する。
【００４０】
「外来」遺伝子は宿主生物中に通常存在しないが、遺伝子移入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は非天然生物に挿入される天然遺伝子またはキメラ構築物を含み得る。「導入遺伝子」は形質転換法によりゲノムに導入された遺伝子である。
【００４１】
「コード配列」は特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」はコード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、或いは関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化認識配列を含み得るが、これらに限定されない。
【００４２】
「プロモーター」はコード配列または機能ＲＮＡの発現をコントロールし得るＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は近位及びより遠位の上流成分から構成され、後者の成分はしばしばエンハンサーと称される。したがって、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの先天性成分またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるために挿入される異種成分であり得る。プロモーター配列は遺伝子の転写部分及び／または転写配列の下流にも位置し得る。プロモーターは天然遺伝子から完全に誘導され得、または天然に存在する各種プロモーターから誘導される各種成分から構成され得るかまたは合成ＤＮＡセグメントから構成され得る。当業者が理解しているように、各プロモーターは異なる組織または細胞型中、または異なる発達段階、または異なる環境条件に応答して遺伝子を発現させ得る。遺伝子を多くの宿主細胞タイプで高頻度で発現させるプロモーターは通常「構成的プロモーター」と称する。植物細胞において有用な各種タイプの新しいプロモーターが常に発見されている。多数の例がＯｋａｍｕｒｏ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，１５：１−８２（１９８９）に記載されている。更に、多くの場合調節配列の正確な境界が完全には規定されていないので、幾つかの変異のＤＮＡ断片は同一のプロモーター活性を有し得ることも認識されている。
【００４３】
「イントロン」はタンパク質配列の一部をコードしない遺伝子中の介在配列である。よって、その配列はＲＮＡに転写されるが、その後切除も翻訳もされない。この用語は切除されたＲＮＡ配列に対しても使用される。「エクソン」は転写される遺伝子配列の一部であり、遺伝子から誘導される成熟メッセンジャーＲＮＡ中に存在するが必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部ではない。
【００４４】
「翻訳リーダー配列」は遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流の完全にプロセッシングされるｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は一次転写物のｍＲＮＡへのプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を与えることがある。翻訳リーダー配列は公知である（Ｒ．Ｔｕｒｎｅｒ及びＧ．Ｄ．Ｆｏｓｔｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：２２５（１９９５））。
【００４５】
「３’−非コード配列」はコード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列及びｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列を含む。前記ポリアデニル化シグナルは通常ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラックの付加に影響を及ぼすことにより特徴づけられる。異なる３’非コード配列の使用はＩｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：６７１−６８０（１９８９）に例示されている。
【００４６】
「ＲＮＡ転写物」はＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写により生ずる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全相補性コピーであるときには、一次転写物と称され、または一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であり得、これは成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」はイントロンが存在せず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡ鋳型に対して相補的であり、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す。このｃＤＮＡは一本鎖であるかまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて二本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡはｍＲＮＡを含み、細胞またはインビトロでタンパク質に転写され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡは特定遺伝子転写物の一部、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列で相補性であり得る。「機能的ＲＮＡ」はアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されないが細胞プロセスに影響を有する他のＲＮＡを指す。用語「相補体」及び「逆相補体」はｍＲＮＡ転写物に関して本明細書中同義的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義するための意味を有する。
【００４７】
用語「内在性ＲＮＡ」は天然でも非天然（すなわち、組換え手段、突然変異等により導入される）でも本発明の組換え構築物での形質転換前に宿主のゲノム中に存在する核酸配列によりコードされるＲＮＡを指す。
【００４８】
用語「非天然」は人造であり、通常天然に存在するものではないことを意味する。
【００４９】
用語「作動的に結合」は１つの核酸配列の機能が他の配列により調節されるように１つの核酸断片への核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節し得るとき（すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）コード配列と作動的に結合している。コード配列は調節配列に対してセンスまたはアンチセンス方位で作動的に結合され得る。別の例で、本発明の相補的ＲＮＡ領域は標的ｍＲＮＡに対して５’に、標的ｍＲＮＡに対して３’に、または標的ｍＲＮＡ内に作動的に結合され得、また第一相補領域が標的ｍＲＮＡに対して５’、その祖補体は標的ｍＲＮＡに対して３’である。
【００５０】
本明細書中、用語「発現」は機能最終産物の産生を指す。遺伝子の発現には、遺伝子の転写、ｍＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳が含まれる。「アンチセンス抑制」は標的タンパク質の発現を抑え得るアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「共抑制」は同一または実質的に同一の外来または内在性遺伝子の発現を抑制し得るセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００５１】
「成熟」タンパク質は翻訳後プロセッシングされたポリペプチド、すなわち一次翻訳産物中に存在するプレ−またはプロ−ペプチドを除去したものを指す。「前駆体」タンパク質はｍＲＮＡの翻訳の一次産物を指す。この場合、プレ−またはプロ−ペプチドが依然として存在する。プレ−またはプロ−ペプチドは細胞内局在化シグナルであり得、これに限定されない。
【００５２】
「安定的形質転換」は遺伝的に安定な遺伝物を生ずるような核酸断片の宿主生物のゲノムへの移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は組込みまたは安定な遺伝物なしに遺伝子発現するような宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラへの核酸断片の移入を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と称する。コメ、トウモロコシまたは他の単子葉植物の細胞形質転換の好ましい方法では、粒子促進すなわち“遺伝子銃”形質転換方法の使用（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３２７：７０−７３（１９８７）；米国特許第４，９４５，０５０号明細書）、または導入遺伝子を含む適当なＴｉプラスミドを用いるアグロバクテリウム媒介方法（Ｙ．Ｉｓｈｉｄａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：７４５−７５０（１９９６））である。本明細書中、用語「形質転換」は安定的形質転換及び一過性形質転換の両方を指す。
【００５３】
本明細書中で使用される一般的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング方法は当業界で公知であり、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行（以下、Ｓａｍｂｒｏｏｋと呼ぶ）に詳しく記載されている。
【００５４】
用語「組換え体」は配列の２つのばらばらのセグメントの、例えば化学合成によるかまたは遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作により人工的に組合せたものを指す。
【００５５】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は大量の特定ＤＮＡセグメントを合成する方法であり、一連の反復サイクルから構成される（コネチカット州ノアウォークに所在のＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。通常、二本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温度でアニーリングし、その後中間温度で延長する。前記した３つの連続ステップの１組を１サイクルと称する。
【００５６】
ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）はＤＮＡを短期間に鋳型の反復複製により数百万倍に増幅させるために使用される有力な方法である（Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈらの欧州特許出願第５０，４２４号明細書；欧州特許出願第８４，７９６号明細書；欧州特許出願第２５８，０１７号明細書、欧州特許出願第２３７，３６２号明細書；Ｍｕｌｌｉｓの欧州特許出願第２０１，１８４号明細書；Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，２０２号明細書；Ｅｒｌｉｃｈの米国特許第４，５８２，７８８号明細書；及びＳａｉｋｉらの米国特許第４，６８３，１９４号明細書）。この方法は特定のインビトロ合成したオリゴヌクレオチドの組をＤＮＡ合成を始めるために使用する。プライマーの設計は分析したいＤＮＡ配列に依存する。前記方法は鋳型を高温で溶融し、プライマーを前記鋳型内で相補配列にアニーリングし、その後前記鋳型をＤＮＡポリメラーゼを用いて複製する多くの（通常２０〜２５）サイクルにより実施する。
【００５７】
ＰＣＲ反応の産物をアガロースゲル上で分離した後臭化エチジウム染色し、ＵＶ透視で可視化することにより分析する。或いは、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに添加して産物中に標識を取り込むこともできる。この場合、ＰＣＲ産物はゲルをＸ線フィルムに曝すことにより可視化される。ＰＣＲ産物を放射線標識する更なる利点は、各増幅産物の量を定量化し得ることである。
【００５８】
用語「組換え構築物」、「発現構築物」及び「組換え発現構築物」は本明細書中同義的に使用される。これらの用語は当業界で公知の一般的方法を用いて細胞のゲノムに挿入され得る遺伝子材料の機能単位を指す。前記構築物はそれ自体であってもよく、またはベクターと組み合わせて使用され得る。ベクターを使用するとき、ベクターは当業者に公知のように宿主植物を形質転換するために使用する方法に応じて選択される。例えば、プラスミドベクターを使用し得る。当業者は、本発明の単離核酸断片を含む宿主細胞をうまく形質転換し、選択し、増殖させるためにベクターに存在させなければならない遺伝子成分を知っている。当業者は異なる独立形質転換事象により発現のレベル及びパターンが異なり（Ｊｏｎｅｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２４１１−２４１８（１９８５）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１８：７８−８６（１９８９））、よって所望の発現レベル及びパターンを示す株を得るためには多数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識している。前記スクリーニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型分析により実施され得る。
【００５９】
Δ４−デサチュラーゼ酵素の産生
Δ４−デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子が単離されたら、該遺伝子はベクターまたは構築物を用いて原核または真核宿主細胞に導入され得る。ベクター（例えば、バクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド）はΔ４−デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、及び宿主細胞において機能し、前記ヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現を引き出し得る調節配列（例えば、プロモーター）を含み得る。調節配列（例えば、プロモーター）は前記ヌクレオチド配列に作動可能に組み合わされているかまたは作動的に結合している。プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならばプロモーターはコード配列に作動的に結合していると言われる。好適なプロモーターの例には、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメガロウイルス最初期、ホエー酸性タンパク質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子由来のもの、及びガラクトース（例えば、ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０）の存在下で活性化されるプロモーターが含まれる。他のタンパク質、オリゴサッカライド、脂質等をコードするヌクレオチド配列もベクター及び他の調節配列、例えばＳＶ−４０Ｔ−抗原、卵白アルブミンまたはウシ成長ホルモンのポリ−Ａ−シグナルのようなポリアデニル化シグナルの中に含まれ得る。構築物中に存在させる配列は所望する発現産物及び宿主細胞の種類に応じて選択される。
【００６０】
上記したように、ベクターを構築したら、該ベクターは例えばトランスフェクション、形質転換及びエレクトロポレーションを含めた当業者に公知の方法により特定宿主細胞に導入され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，第２版，Ｖｏｌ．１〜３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行参照）。その後、宿主細胞を遺伝子を発現させて所望のＰＵＦＡを生成し得る適当な条件下で培養する。生成したＰＵＦＡはその後回収、精製される。
【００６１】
好適な原核宿主細胞の例には細菌、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、及びＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えばＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｐｐ．（すなわち、藍藻）が含まれる。好適な真核宿主細胞の例には哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞［例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．］、真菌細胞［例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍのような線状真菌細胞］が含まれる。好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ベーカー酵母）細胞を使用する。
【００６２】
宿主細胞での発現は一過的または安定的に実施され得る。一過性発現は、宿主細胞において機能的な発現シグナルを含むが宿主細胞において複製せずまたはまれにしか統合せず、宿主細胞を増幅させない導入構築物から生じ得る。一過性発現は、当該遺伝子に作動的に結合した調節可能なプロモーターの活性を誘導することによっても実施され得るが、前記した誘導システムは多くの場合低基礎レベルの発現しか示さない。好適な発現は、宿主ゲノムに組込まれ得るかまたは宿主細胞中で自律複製する構築物を導入することにより達成され得る。当該遺伝子の安定的発現は、発現構築物上に位置するかまたは発現構築物をトランスフェクトした選択マーカーを使用し、前記マーカーを発現する細胞を選択することにより選択され得る。組込みにより安定な発現が生ずるとき、構築物組込みの部位は宿主ゲノム内で無作為に生じ得、または宿主座との組換えを標的するのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含む構築物を使用することにより標的され得る。構築物を内在性座に標的するとき、転写及び翻訳領域の全部または一部は内在性座によりもたらされ得る。
【００６３】
当該酵素（すなわち、Δ４−デサチュラーゼ）及び最終的には当該ＰＵＦＡを発現させるためにトランスジェニック哺乳動物も使用され得る。より具体的には、上記構築物を作成したら、該構築物を胚の前核に挿入し得る。その胚はその後受容者の雌に移植され得る。或いは、核移植法も使用可能である（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：２１３０−２１３３（１９９７））。その後、妊娠及び誕生が起こり得る（例えば、米国特許第５，７５０，１７６号明細書及び同第５，７００，６７１号明細書参照）。子孫の乳、組織または他の流体サンプルは非トランスジェニック動物中に通常存在するレベルとは異なるレベルのＰＵＦＡを含むべきである。後続の世代は、改変または向上したレベルのＰＵＦＡの産生及び所望デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子のゲノムへの組込みについてモニターされ得る。宿主として使用される哺乳動物は例えばマウス、ラット、家兎、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシからなる群から選択され得る。しかしながら、哺乳動物が当該酵素をコードするＤＮＡをそのゲノムに組み込む能力を有するならば、いずれの哺乳動物も使用し得る。
【００６４】
デサチュラーゼポリペプチドを発現させるには、機能的転写及び翻訳開始及び停止領域をデサチュラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに作動的に結合させる。転写及び翻訳開始及び停止領域は、発現させるＤＮＡ、所望系において発現され得ると公知かまたは疑われる遺伝子、発現ベクター、化学合成または宿主細胞中の内在性座を含めた各種の非特定ソースから誘導される。植物組織及び／または植物部分での発現はある効果を呈し、この効果は組織または部分が種子、葉、果実、花、根等のような前に収穫されるものの場合に特に見られる。発現は、米国特許第５，４６３，１７４号明細書、同第４，９４３，６７４号明細書、同第５，１０６，７３９号明細書、同第５，１７５，０９５号明細書、同第５，４２０，０３４号明細書、同第５，１８８，９５８号明細書及び同第５，５８９，３７９号明細書に記載されているような特定の調節配列を用いて植物のその位置に標的され得る。或いは、発現タンパク質は、直接的または更なる修飾時に宿主植物由来の流体フラクションに組み込まれ得る産物を産生する酵素であり得る。デサチュラーゼ遺伝子またはアンチセンスデサチュラーゼ転写物の発現により、植物部分及び／または植物組織中に存在する特定ＰＵＦＡまたはその誘導体のレベルを変更し得る。デサチュラーゼポリペプチドコード領域は、高量の所望ＰＵＦＡを含む組織及び／または植物部分を作成するためにそれ自体または他の遺伝子を用いて発現され得、ＰＵＦＡ組成はヒト母乳に非常に似ている（Ｐｒｉｅｔｏらの国際特許出願公開第９５／２４４９４号パンフレット）。停止領域は開始領域を導いた遺伝子の３’領域または異なる遺伝子から誘導され得る。多数の停止領域が公知であり、同一または異なる属及び種由来の各種宿主において満足であることが判明している。停止領域は通常特殊性よりもむしろ便利さを考慮して選択される。
【００６５】
上記したように、植物（例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｍａｘ（大豆）またはＢｒａｓｓｉｃａ ｎｕｐｓ（カノラ））または植物組織も、ポリ不飽和脂肪酸の生成に利用され得るデサチュラーゼ酵素を発現させるために宿主または宿主細胞としても使用され得る。より具体的には、所望のＰＵＦＡを種子において発現させ得る。種子油の単離方法は当業界で公知である。すなわち、ＰＵＦＡソースを提供することに加えて、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料及び化粧品に添加することができる種子油を得るためにデサチュラーゼ遺伝子、恐らくは他のデサチュラーゼ遺伝子及びエロンガーゼ遺伝子を発現して種子油成分を操作し得る。プロモーターに作動的に結合したデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを植物組織または植物にデサチュラーゼ遺伝子を発現させるのに十分な時間及び条件下で導入する。ベクターは他の酵素、例えばΔ５−デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ及び／またはΔ１９−デサチュラーゼをコードする１つ以上の遺伝子をも含み得る。植物組織または植物は酵素が作用する関連する基質（例えば、アドレン酸またはω３−ドコサペンタエン酸）を生成し得、前記基質を産生する酵素をコードするベクターを植物組織、植物細胞または植物に導入し得る。更に、基質を適当な酵素を発現する植物組織に噴霧することもできる。こうした各種方法により、植物細胞、植物組織または植物を用いてＰＵＦＡ（例えば、ω６−ドコサペンタエン酸のようなｎ−６不飽和脂肪酸、またはドコサヘキサエン酸のようなｎ−３脂肪酸）を生成し得る。本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物をも包含し、該ベクターのヌクレオチド配列を発現させると例えばトランスジェニック植物の種子においてポリ不飽和脂肪酸が生成される。
【００６６】
単一植物プロトプラスト形質転換体または各種形質転換外植片からの植物の再生、発達及び栽培は当業界で公知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ，「植物分子生物学の方法(Methods for Plant Molecular Biology)」，カリフォルニア州サンジェゴに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８８年）発行）。この再生及び成長プロセスは通常形質転換細胞の選択、各細胞を通常の胚発達から根付いた小植物までの通常段階を経て培養するステップを含む。トランスジェニック胚及び種子も同様に再生される。生じたトランスジェニック根付いた根をその後土壌のような適当な植物成長培地に植える。
【００６７】
当該タンパク質をコードする外来の外因性遺伝子を含む植物の発達または再生は当業界で公知である。好ましくは、再生した植物を自家受粉すると、同型接合トランスジェニック植物が得られる。或いは、再生した植物から得た花粉を栽種的に重要な系の種子から成長させた植物と交配させる。逆に、再生植物を受粉するために前記した重要な系の植物からの花粉を用いる。所望のポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物を当業界で公知の方法を用いて栽培する。
【００６８】
植物細胞から植物を再生するには多くの方法がある。特定の再生方法は出発の植物組織及び再生しようとする特定の植物種に依存する。
【００６９】
双子葉植物を主にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いて形質転換し、トランスジェニック植物を得る方法は、ワタ（米国特許第５，００４，８６３号明細書；同第５，１５９，１３５号明細書；同第５，５１８，９０８号明細書）、大豆（米国特許第５，５６９，８３４号明細書；同第５，４１６，０１１号明細書；ＭｃＣａｂｅら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３（１９８８）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８７：６７１−６７４（１９８８））、アブラナ（米国特許第５，４６３，１７４号明細書）、落花生（Ｃｈｅｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１５：６５３−６５７（１９９６）；ＭｃＫｅｎｔｌｙら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１４：６９９−７０３（１９９５））、パパイヤ及びエンドウ豆（Ｇｒａｎｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１５：２５４−２５８（１９９５））について公知である。
【００７０】
単子葉植物のエレクトロポレーション、微粒子銃及びアグロバクテリウムを用いる形質転換は既に報告されている。形質転換及び植物再生はアスパラガス（Ｂｙｔｅｂｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：５３５４（１９８７））、大麦（Ｗａｎ及びＬｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４：３７（１９９４））、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：２０４（１９８８）；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：６０３−６１８（１９９０）；Ｆｒｏｍｍら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３（１９９０；，Ｋｏｚｉｅｌら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１９４（１９９３）；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５：５５０−５５７（１９９５））、オート麦（Ｓｏｍｅｒｓら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１５８９（１９９２））、カモガヤ（Ｈｏｒｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，７：４６９（１９８８））、コメ（Ｔｏｒｉｙａｍａら，ＴｈｅｏｒＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：３４（１９８６）；Ｐａｒｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２：１１３５−１１４８（１９９６）；Ａｂｅｄｉｎｉａら，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２４：１３３−１４１（１９９７）；Ｚｈａｎｇ及びＷｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７６：８３５（１９８８）；Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，７：３７９（１９８８）；Ｂａｔｔｒａｗ及びＨａｌｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，８６：１９１−２０２（１９９２）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７（１９９１））、ライムギ（Ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｎａら，Ｎａｔｕｒｅ，３２５：２７４（１９８７））、サトウキビ（Ｂｏｗｅｒ及びＢｉｒｃｈ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２：４０９（１９９２））、ヒロハノウシノケグサ（Ｗａｎｇら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６９１（１９９２））、及び小麦（Ｖａｓｉｌら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６６７（１９９２；米国特許第５，６３１，１５２号明細書）において実施されている。
【００７１】
クローン化核酸構築物の一過性発現に基づく遺伝子発現のアッセイは、核酸分子をポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションまたは微粒子銃により植物細胞に導入することにより開発された（Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：４５４−４５７（１９８８）；Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：５２３−５３２（１９８９）；ＭｃＣａｒｔｙら，Ｃｅｌｌ，６６：８９５−９０５（１９９１）；Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，６：６０９−６１８（１９９２）；Ｇｏｆｆら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：２５１７−２５２２（１９９０））。
【００７２】
一過性発現系は遺伝子構築物を機能的に分析するために使用され得る（包括的には、Ｍａｌｉｇａら，「植物分子生物学の方法(Methods in Plant Molecular Biology)」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）発行参照）。本発明の核酸分子は他の遺伝子成分（例えば、ベクター、プロモーター、エンハンサー等）と組み合わせて永久的または一過的に植物細胞に導入され得ると理解されたい。
【００７３】
上記した方法に加えて、実行者はマクロ分子（例えば、ＤＮＡ分子、プラスミド等）の構築、操作及び単離、組換え生物の作成、及びクローンのスクリーニング及び単離についての特定条件及び方法を記載している一般資料に通じている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行；Ｍａｌｉｇａら，「植物分子生物学の方法(Methods in Plant Molecular Biology)」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）発行；Ｂｉｒｒｅｎら，「ゲノム分析：遺伝子の検出(Genome Analysis: Detecting Genes)  １」，ニューヨークに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８８年）発行；Ｂｉｒｒｅｎら，「ゲノム分析：ＤＮＡの分析(Genome Analysis: Analyzing DNA)  ２」，ニューヨークに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９９８年）発行；Ｃｌａｒｋ編，「植物分子生物学：実験マニュアル(Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual)」，ニューヨークに所在のＳｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７年）発行）。
【００７４】
天然またはトランスジェニックにより宿主細胞により産生され得る基質及びその後宿主細胞に導入されるベクター中に存在するＤＮＡ配列によりコードされ得る酵素を図１に示す。
【００７５】
Δ４−デサチュラーゼ遺伝子の使用及び酵素コード化治療
上記したように、単離したデサチュラーゼ遺伝子及び該遺伝子によりコードされるデサチュラーゼ酵素は多くの用途を有する。例えば、前記遺伝子及び対応の酵素はポリ不飽和脂肪酸の生成において直接的及び間接的に使用され得る。例えば、Δ４−デサチュラーゼはω６−ドコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸を生成する際に使用され得る。「直接的」は酵素がある酸を組成物中に使用される別の酸に直接変換する（例えば、アドレン酸のω−ドコサペンタエン酸への変換）状況を包含することを意味する。「間接的」はデサチュラーゼによりある酸を別の酸（すなわち、経路の中間体）に変換し（例えば、アドレン酸のω６−ドコサペンタエン酸への変換）、その後後者の酸をデサチュラーゼまたは非デサチュラーゼ酵素を用いて別の酸へ変換する（例えば、Δ１９−デサチュラーゼによるω６−ドコサペンタエン酸のドコサヘキサエン酸への変換）状況を包含することを意味する。また、本発明は、ＰＵＦＡを非−Δ４−デサチュラーゼ酵素（例えば、エロンガーゼまたは別のデサチュラーゼ）により別のポリ不飽和脂肪酸に変換し、その後Δ４−デサチュラーゼを用いて最終生成物に変換する「間接的」状況をも含む。例えば、エイコサペンタエン酸をエロンガーゼによりω３−ドコサペンタエン酸に変換し、その後Δ４−デサチュラーゼによりドコサヘキサエン酸に変換してもよい。これらのポリ不飽和脂肪酸（すなわち、デサチュラーゼ酵素の活性により直接または間接的に生成されるもの）は、例えば栄養組成物、医薬組成物、化粧品及び動物飼料に添加され得、これらはすべて本発明に包含される。これらの使用を以下に詳記する。
【００７６】
栄養組成物
本発明は栄養組成物を包含する。本発明において、前記組成物には経腸または非経口消費を含めてヒトが消費するための食品または製剤が含まれ、これらは体内に取り込まれたとき（ａ）栄養を与えたり、組織を構築したり、エネルギーを補給するように機能する及び／または（ｂ）適正な栄養状態または代謝機能を維持、回復または支持する。
【００７７】
本発明の栄養組成物は本発明に従ってデサチュラーゼ遺伝子を用いて直接または間接的に生成される油または酸の少なくとも１つを含み、固体または液体のいずれの形態であってもよい。また、前記組成物は食用多量栄養素、ビタミン及びミネラルを特定用途のために所望する量含み得る。前記成分の量は組成物がある代謝状態（例えば、代謝疾患）を伴う場合のような特殊な要求を有する正常で健康な乳児、小児または成人で使用するかに応じて異なる。
【００７８】
組成物に添加され得る多量栄養素の例には食用脂肪、炭水化物及びタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。食用脂肪の例にはヤシ油、ルリヂサ油、真菌油(fungal oil)、クロフサスグリ油、大豆油、モノ−及びジグリセリドが含まれるが、これらに限定されない。炭水化物の例にはグルコース、食用ラクトース及び水解スターチが含まれるが、これらに限定されない。更に、本発明の栄養組成物中に使用し得るタンパク質の例には大豆タンパク質、電気透析ホエー、電気透析スキムミルク、乳漿またはこれらのタンパク質の加水分解物が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明の栄養組成物に添加され得るビタミン及びミネラルとしては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、クロリド、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ化物、並びにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ及びＢ複合体が例示され得る。他のビタミン及びミネラルも添加され得る。
【００８０】
本発明の栄養組成物に使用される成分は半精製でも精製でもよい。半精製または精製とは、天然材料の精製または合成により製造された材料を意味する。
【００８１】
本発明の栄養組成物の例には調製乳、保健食品(dietary supplements)（例えば、成人栄養食品及び油）、代用食品(dietary substitutes)及び再水和組成物が含まれるが、これらに限定されない。特に興味深い栄養組成物には乳児に対して経腸及び非経口栄養補給するために使用されるもの、特殊な乳児用調製乳、高齢者向けサプリメント、及び胃腸障害及び／または吸収不良を有する患者に対するサプリメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明の栄養組成物は、食事の追加を必要としないときでも食物に添加してもよい。例えば、組成物を任意のタイプの食物に添加することができ、その食物の例にはマーガリン、改質バター、チーズ、ミルク、ヨーグルト、チョコレート、キャンディー、スナック、サラダ油、料理油、料理脂、肉、魚及び飲料が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
本発明の好ましい実施態様では、栄養組成物は経腸栄養品、より好ましくは成人または小児用経腸栄養品である。この組成物はストレスを受けているかまたは慢性または急性の病状のために特殊な要求を有している成人または小児に投与され得る。前記組成物は本発明に従って生成されるポリ不飽和脂肪酸に加えて、上記した多量栄養素、ビタミン及びミネラルを含み得る。多量栄養素は人乳中に存在する多量栄養素に等しい量またはエネルギー基準（すなわち、カロリー基準）の量存在し得る。
【００８４】
液体または固体の経腸及び非経口栄養調製乳の調製方法は当業界で公知である（下記実施例も参照されたい）。
【００８５】
経腸調製乳は、例えば滅菌し、その後用時栄養補給（ready-to-feed，ＲＴＦ）基準で使用されるかまたは濃縮液体または粉末の形で貯蔵される。粉末は上記したように調製した調製乳を噴霧乾燥し、濃縮物を再水和して再構成することにより調製され得る。成人及び小児栄養調製乳は当業界で公知であり、市販もされている（例えば、オハイオ州コロンブスに所在Ａｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＲｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ製のＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）及びＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。本発明に従って生成される油及び酸はいずれの調製乳にも添加され得る。
【００８６】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態のときには約０．６〜約３ｋｃａｌ／ｍｌである。固体または粉末形態のときには、栄養サプリメントのエネルギー密度は約１．２〜９ｋｃａｌ／ｇ以上、好ましくは約３〜７ｋｃａｌ／ｇである。通常、液体製品のオスモル濃度は７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満でなければならない。
【００８７】
栄養調製乳は本発明に従って生成されるＰＵＦＡに加えて、上記した多量栄養素、ビタミン及びミネラルを含み得る。前記追加成分の存在により、ヒトが前記成分の最低１日必要量を摂取するのを助ける。ＰＵＦＡに加えて、亜鉛、銅、葉酸及び酸化防止剤を組成物に添加することも望ましいことがある。前記物質はストレスを受けた免疫系を増強し、組成物を服用しているヒトに対して更なる効果を与えるであろうと考えられる。医薬組成物は前記成分を補充してもよい。
【００８８】
より好ましい実施態様では、栄養組成物は酸化防止剤及び少なくとも１つのＰＵＦＡに加えて、少なくとも５重量％が非消化性オリゴサッカライドである炭水化物のソースを含む。より好ましい実施態様では、栄養組成物は更にタンパク質、タウリン及びカルニチンを含む。
【００８９】
上記したように、本発明に従って生成したＰＵＦＡまたはその誘導体は静脈栄養補給を受けている患者に対して、また栄養不良または他の状態もしくは病状を予防または治療するために代用食品またはサプリメント、特に乳児用調製乳に添加され得る。なお、ヒト母乳は約０．１５〜約０．３６％のＤＨＡ、約０．０３〜約０．１３％のＥＰＡ、約０．３０〜約０．８８％のＡＡ、約０．２２〜約０．６７％のＤＧＬＡ及び約０．２７〜約１．０４％のＧＬＡからなる脂肪酸プロフィールを有することに注目すべきである。よって、本発明に従って生成されるＡＡ、ＥＰＡ及び／またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような脂肪酸は例えば乳児用調製乳の組成を変化させてヒト母乳のＰＵＦＡ含量をよりうまく模倣したりまたはヒト母乳以外のミルク中に通常存在するＰＵＦＡの存在を変化させるために使用され得る。特に、医薬品または保健食品、特に母乳代用品またはサプリメント中に使用される組成物が１つ以上のＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡを含むことが好ましい。より好ましくは、油は約０．３〜３０％のＡＡ、約０．２〜３０％のＤＧＬＡ及び／または約０．２〜約３０％のＧＬＡを含む。
【００９０】
本発明には、トリグリセリド換算で約２〜約３０重量％の脂肪酸を含む非経口栄養組成物が包含される。好ましい組成物は全ＰＵＦＡ組成物の約１〜約２５重量％のＧＬＡを含む（米国特許第５，１９６，１９８号明細書）。場合により、他のビタミン、特にビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＬ−カルニチンのような脂溶性ビタミンを配合することができる。所望により、α−トコフェロールのような保存剤を約０．１重量％の量添加し得る。
【００９１】
更に、ＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの比率は特定の所与最終用途に適合され得る。母乳代用品またはサプリメントとして調製する場合、１つ以上のＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡはそれぞれ約１：１９：３０〜約６：１：０．２の比率で組成物中に存在させ得る。例えば動物の母乳の場合、ＡＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡの比率は１：１９：３０〜６：１：０．２の範囲であり、この範囲には中間比も含まれ、好ましくは約１：１：１、１：２：１、１：１：４である。宿主細胞において一緒に産生されるとき、ＧＬＡやＤＧＬＡのような前駆体基質のＡＡへの変換率、変換％を調節することによりＰＵＦＡ比を正確にコントロールできる。例えば、ＤＧＬＡからＡＡの変換率を５〜１０％とすると約１：１９のＡＡ：ＤＧＬＡ比が生じ、変換率を約７５〜８０％にすると約６：１のＡＡ：ＤＧＬＡ比が生ずる。従って、細胞培養系でも宿主細胞でも、ＰＵＦＡレベル及び比を調節するためにはデサチュラーゼ発現の時間、程度及び特異性並びに他のデサシュラーゼ及びエロンガーゼの発現の調節を使用することができる。その後、本発明に従って生成されるＰＵＦＡ（例えば、ＡＡ及びＥＰＡ）は他のＰＵＦＡ／酸（例えば、ＧＬＡ）と所望の濃度及び比率で混合され得る。
【００９２】
加えて、本発明に従って生成されるＰＵＦＡまたはこれを含む宿主細胞は、動物の組織または乳の脂肪酸組成をヒトまたは動物が消費するのにより望ましい組成に変化させるために動物飼料としても使用され得る。
【００９３】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載されている方法に従ってデサチュラーゼを用いて得られる酸及び／または油の１つ以上を含む医薬組成物を包含する。より具体的には、前記医薬組成物は１つ以上の酸及び／または油に加えて一般的な公知の非毒性医薬的に許容され得る担体、助剤またはビヒクル、例えばリン酸緩衝食塩液、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤またはエマルジョン（例えば、水／油エマルジョン）を含み得る。前記組成物は液体でも固体のいずれの形態もとり得る。例えば、組成物は錠剤、カプセル剤、摂取可能な液体または粉末、注射剤、または局所投与用軟膏またはクリームの形態をとり得る。適正な流動性は、例えば分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、界面活性剤を使用することにより維持され得る。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を配合することが望ましいことがある。不活性希釈剤に加えて、組成物は助剤、例えば湿潤剤、乳化懸濁剤、甘味剤、フレバー及びパフュームを配合することもできる。
【００９４】
懸濁液は、活性化合物に加えて懸濁剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガカントガム及びこれらの混合物）を含み得る。
【００９５】
錠剤やカプセル剤のような固体剤型は当業界で公知の方法を用いて製造され得る。例えば、本発明に従って生成したＰＵＦＡは慣用されている錠剤基材（例えば、ラクトース、スクロース及びコーンスターチ）と共に結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはアルギン酸）及び滑沢剤（例えば、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム）を用いて錠剤化され得る。カプセル剤は上記賦形剤を酸化防止剤及びＰＵＦＡと共にゼラチンカプセルに挿入することにより製造され得る。酸化防止剤及びＰＵＦＡ成分は上記したガイドラインの範囲で適合しなければならない。
【００９６】
静脈投与の場合には、本発明に従って生成したＰＵＦＡまたはその誘導体を市販されている製剤（例えば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（商標））中に配合し得る。典型的な成人正常血漿脂肪酸プロフィールは６．６４〜９．４６％のＡＡ、１．４５〜３．１１％のＤＧＬＡ及び０．０２〜０．０８％のＧＬＡからなる。これらのＰＵＦＡまたはその代謝前駆体を単独でまたは他のＰＵＦＡと一緒に投与すると、患者において正常な脂肪酸プロフィールが達成される。所望により、製剤の各成分を一回または複数回使用するために個別にキットの形態で提供してもよい。特定の脂肪酸の典型的な用量は１日あたり０．１ｍｇ〜２０ｇ（最高１００ｇまで）、好ましくは１日あたり１０ｍｇ〜１，２，５または１０ｇである。
【００９７】
本発明の医薬組成物の考えられる投与ルートの例には経腸（例えば、経口または直腸）及び非経口が含まれる。例えば、液体製剤は経口または直腸投与され得る。更に、均質混合物を水に完全に分散し、滅菌条件下で生理学的に許容され得る希釈剤、保存剤、緩衝剤または噴射剤と混合してスプレーまたは吸入剤を製造することができる。投与ルートは勿論所望する効果に依存する。例えば、組成物をザラザラした、乾燥したまたは老化した皮膚を治療したり病気または症状の影響を受けている皮膚または毛髪を治療するために使用するときには、該組成物を局所的に適用してもよい。
【００９８】
患者に投与する組成物の用量は当業者により決定され得、患者の体重、患者の年令、患者の免疫状態等のような各種因子に依存する。
【００９９】
組成物の剤型としては、液剤、分散液、乳濁液、またはその後再構成される滅菌粉末が例示され得る。
【０１００】
本発明は、本明細書に記載されている医薬及び／または栄養組成物を用いる各種疾患の治療をも包含する。特に、本発明の組成物は血管形成術後の再狭窄を治療するために使用され得る。更に、炎症、関節リウマチ、喘息及び乾癬の症状も本発明の組成物を用いて治療され得る。ＰＵＦＡがカルシウム代謝に関与し得るという証拠もある。よって、本発明の組成物は恐らく骨粗しょう症、腎結石及び尿路結石を治療または予防するために使用され得る。
【０１０１】
更に、本発明の組成物は癌の治療にも使用され得る。悪性細胞の脂肪酸組成が変化していることが分かっている。脂肪酸を添加すると、細胞の増殖を遅らせ、細胞死を引き起こし、化学療法剤に対する感受性を高めることが判明している。また、本発明の組成物は癌に関連する悪液質を治療するためにも有用であり得る。
【０１０２】
本発明の組成物は糖尿病を治療するためにも使用され得る（米国特許第４，８２６，８７７号明細書及びＨｏｒｒｏｂｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，５７（Ｓｕｐｐｌ．）：７３２Ｓ−７３７Ｓ参照）。脂肪酸代謝及び組成の変化は糖尿病動物で立証されている。
【０１０３】
また、デサシュラーゼ酵素を用いて直接または間接的に生成されるＰＵＦＡを含む本発明の組成物は湿疹の治療、血圧の低下及び数学試験の点数の向上にも使用され得る。更に、本発明の組成物は血小板凝集の抑制、血管拡張の誘導、コレステロールレベルの低下、血管壁平滑筋及び繊維組織の増殖の抑制（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，８３：８５−１０１（１９７６））、非ステロイド抗炎症薬の胃腸出血及び他の副作用の低下または予防（米国特許第４，６６６，７０１号明細書参照）、子宮内膜症及び月経前症候群の予防または治療（米国特許第４，７５８，５９２号明細書参照）、及びウイルス感染後の筋肉脳脊髄炎及び慢性疲労の治療（米国特許第５，１１６，８７１号明細書参照）に使用され得る。
【０１０４】
本発明の組成物の更なる用途には、ＡＩＤＳ、多発性硬化症及び炎症性皮膚疾患の治療における使用及び総合的健康の維持のための使用が含まれる。
【０１０５】
加えて、本発明組成物は化粧目的で使用され得る。混合物を形成するかまたは単一組成物として使用し得るように既存の化粧品組成物に添加することができる。
【０１０６】
獣医用途
上記した医薬組成物及び栄養組成物は、動物はヒトと同じ要求及び状態を多く経験するので動物（すなわち、家畜及び家畜以外の動物）及びヒトに関連して使用され得ることに注目すべきである。例えば、本発明の油または酸は動物飼料サプリメント、動物飼料代用品、動物ビタミンまたは動物局所軟膏に使用され得る。
【０１０７】
下記非限定的実施例を用いて本発明を説明する。
【０１０８】
（実施例Ｉ）
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ由来のデサチュラーゼを単離するための縮重オリゴヌクレオチドの設計及びｃＤＮＡライブラリーの構築
海生真菌Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３４３０４）の脂肪酸組成を分析して、ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の種類及び量を調べた。この真菌は大量の長鎖ＰＵＦＡ、例えばアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ｎ−６）及びエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ｎ−３）を含んでいた。しかしながら、Ｔ．ａｕｒｅｕｍはアドレン酸（ＡＤＡ，２２：４ｎ−６）、ω６−ドコサペンタエン酸（ω６−ＤＰＡ，２２：５ｎ−６）、ω３−ドコサペンタエン酸（ω３−ＤＰＡ，２２：５ｎ−３）のようなＰＵＦＡをも産生し、最高量の脂肪酸はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６ｎ−３）であった（図１参照）。よって、Δ６−、Δ５−及びΔ１７−デサチュラーゼに加えて、Ｔ．ａｕｒｅｕｍは多分、ＡＤＡをω３−ＤＰＡまたはω６−ＤＰＡをＤＨＡに変換するΔ１９−デサチュラーゼ及び／またはＡＤＡをω６−ＤＰＡまたはω３−ＤＰＡをＤＨＡに不飽和化するΔ４−デサチュラーゼを含んでいる。従って、目的はＴ．ａｕｒｅｕｍから予測デサチュラーゼ遺伝子を単離し、別の宿主における発現により酵素の機能性を証明することであった。
【０１０９】
機能性デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｔ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）細胞をＢＹ＋Ｍｅｄｉａ（ミシガン州デトロイトに所在のＤｉｆｃｏの＃７９０）中で光を当て、一定に撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら室温において４日間増殖させて、最大バイオマスを得た。前記細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心して収集し、氷冷ＲＮａｓｅ非含有水を用いて濯いだ。次いで、前記細胞をＦｒｅｎｃｈプレスにおいて１０，０００ｐｓｉで溶菌し、溶菌した細胞を直接ＴＥ緩衝フェノール中に集めた。細胞ライゼート由来のタンパク質をフェノール：クロロホルム（１：１，ｖ／ｖ）を用いる反復抽出後クロロホルム抽出することにより除去した。水性相からの核酸を−７０℃において０．３Ｍ（最終濃度）酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）及び１容量のイソプロパノールを用いて３０分間沈降させた。沈降した核酸を４℃において１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心することにより集め、５分間真空乾燥し、次いで室温において１Ｘ  ＤＮａｓｅ緩衝液（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ非含有）で１５分間処理した。５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を用いて反応を停止し、ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて製造業者のプロトコルに従って更に精製した。
【０１１０】
全ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡをオリゴｄＴセルロース樹脂を用いて単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＸＲライブラリー構築キット（カリフォルニア州ラホヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、その後ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（カリフォルニア州ラホヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）に指向的にクローン化した（５’ＥｃｏＲＩ／３’ＸｈｏＩ）。Ｔ．ａｕｒｅｕｍライブラリーは約７００ｂｐの平均インサートサイズを有するクローンを約２．５×１０６個を含んでいた。培養物を液体窒素中で粉砕することによりＰＵＦＡ産生Ｔ．ａｕｒｅｕｍ培養物由来のゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ抽出キット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【０１１１】
採用したアプローチは公知のデサチュラーゼに保存されるアミノ酸モチーフを表す縮重オリゴヌクレオチド（プライマー）を設計することであった。その後、前記プライマーをＰＣＲ反応に用いて、真菌由来の予測デサチュラーゼ遺伝子中に保存領域を含む断片を同定した。今までに同定されている真菌デサチュラーゼはＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ由来のΔ５−及びΔ６−デサチュラーゼ遺伝子（それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６７６５０及びＡＢ０２００３２）だけなので、植物及び動物由来のデサチュラーゼ配列を前記デサチュラーゼプライマーの設計中考慮した。特に、以下の生物由来の公知のΔ５−及びΔ６−デサチュラーゼ配列を縮重プライマーを設計するために使用した：クサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、ルリヂサ（Ｂｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、タマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、シーエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及びヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）。使用した縮重プライマーは、ＣＯＤＥＨＯＰ  Ｂｌｏｃｋｍａｋｅｒプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌ）を用いて以下の通りであった：
【０１１２】
【化１】
2005525780.tif 000003
【０１１３】
更に、２つ以上のプライマーを公知のΔ６−デサチュラーゼ中に存在する第２及び第３保存“ヒスチジン−ボックス”に基づいて設計した。これらは
【０１１４】
【化２】
2005525780.tif 000004
であった。
【０１１５】
オリゴヌクレオチド配列の縮重コードは、Ｂ＝Ｃ，Ｇ，Ｔ；Ｈ＝Ａ，Ｃ，Ｔ；Ｓ＝Ｃ，Ｇ；Ｒ＝Ａ，Ｇ；Ｖ＝Ａ，Ｃ，Ｇ；Ｙ＝Ｃ，Ｔ；Ｄ＝Ａ，Ｔ，Ｃ；Ｘ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔであった。
【０１１６】
（実施例ＩＩ）
真菌由来のデサチュラーゼを単離するための縮重オリゴヌクレオチドの使用
推定デサチュラーゼ遺伝子を単離するために、全ＲＮＡを塩化リチウム法（Ｈｏｇｅら，Ｅｘｐ．Ｍｙｃｏｌ．，６：２２５−２３２（１９８２））を用いて単離した。約５μｇをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（メリーランド州ロックビルに所在のＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ）を用いて逆転写して、第１鎖ｃＤＮＡを作成した。以下のプライマーの組合せを使用した：ＲＯ８３４／８３６、ＲＯ８３４／８３８、ＲＯ８３５／８３６、ＲＯ８３５／８３８及びＲＯ７５３／７５４を６０℃以下のアニーリング温度での異なる熱サイクルパラメーター及びＴａｑポリメラーゼを用いる幾つかのＰＣＲ反応で使用したが、バンドは生じなかった。
【０１１７】
デサチュラーゼ断片を単離するための追加の試みにおいて、縮重プライマーＲＯ８３４／８３８（ブロックメーカープログラムを用いて設計）及びＲＯ７５３／７５４を５０μｌの反応で使用した。以下の成分：第１鎖ｃＤＮＡ鋳型（２μｌ）、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、０．２ｐｍｏｌ（最終濃度）各プライマー及びｃＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）を混合した。熱サイクルは次のように実施した：まず９４℃×３０秒間の変性後、９４℃×３０秒間の変性、６０℃×３０秒間のアニーリング及び７２℃×１分間のサイクルを３５サイクル。その後、７２℃×７分間の最終伸長を行った。プライマーＲＯ８３４／８３８を用いると約１０００ｂｐの２つのかすかなバンドが検出され、プライマー対ＲＯ７５３／７５４を用いたときには８００〜９００ｂｐのかなり小さいがより強いバンドが検出された。反応物を１％アガロースゲルで分離し、除去し、ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて精製した。前記フラグメントの付着末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（メリーランド州ロックビルに所在のＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の仕様書に従って用いて充填し、これらのＤＮＡ断片をＰＣＲ−ブラントベクター（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。組換えプラスミドをＴＯＰ１０超コンピテント細胞（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、クローンを部分的に配列決定した。
【０１１８】
その後、クローン３０−３（ＲＯ８３４／８３８との反応）及びクローン１７−１（ＲＯ７５３／７５４との反応）の配列が重複して１３１３ｂｐ断片を作成することが分かった。前記断片を翻訳し、Ｔｆａｓｔａを用いてＧｅｎＢａｎｋデーターベースを検索した。最高のマッチングは、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号＃ＡＦ０６７６５４）（２０２アミノ酸において２７％相同）、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓΔ６−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ８７０９４）（１２１アミノ酸において３０％相同）、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０２９３１）（１３１アミノ酸において２６％相同）及びＭ．ａｌｐｉｎａΔ６−デサチュラーゼ（受託番号ＡＦ１１０５１０）（８６アミノ酸において３０％相同）であった。公知デサチュラーゼに対するアミノ酸相同度は合理的であるので、有力なデサチュラーゼをコードする完全長遺伝子を酵母で発現したときのその活性を調べるために探した。
【０１１９】
（実施例ＩＩＩ）
Ｔ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）由来の完全長遺伝子配列の単離
完全長遺伝子を見つけるために、２の別々のＰＣＲ反応を実施して、ｃＤＮＡライブラリー由来の推定デサチュラーゼの２つの末端を決定した。遺伝子の３’末端については、（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクター（カリフォルニア州ラホヤに所在のＳｔｒａｇｅｎｅ）の配列に基づいて設計した）ＲＯ８９８（配列番号７）（５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）を遺伝子特異的プライマーＲＯ９３０（配列番号８）（５’−ＧＡＣＧＡＴＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＣ）と一緒にＰＣＲ増幅反応に使用した。この場合、ＧＣリッチ配列（１３１３ｂｐ断片に対して６１％）で生ずるＰＣＲ増幅の問題を解消するためにＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲキット（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いた。ＰＣＲ熱サイクル条件は以下の通りであった：鋳型をまず９４℃で３分間変性した後、９４℃×３０秒間、５２℃×３０秒間及び７２℃×１分間を１サイクルとして３０サイクル、最後に７２℃×７分間の伸長サイクルを実施した。各プライマーは２０ｐｍｏｌ用いた。こうして得たＰＣＲ産物を１％アガロースゲルを用いて分離し、除去し、ゲルをＱｉａｇｅｎゲル抽出キット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて精製した。断片上の付着末端を、実施例ＩＩに記載されているようにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（メリーランド州ロックビルに所在のＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造業者の仕様書に従って充填し、ＰＣＲ−ブラントベクター（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。クローン９３−３配列はオリジナル１３１３ｂｐ断片と重複しており、オープンリーディングフレーム、停止コドン及びポリＡ尾部を含むことが判明し、これが遺伝子の３’末端であった。２つのプライマーをクローン９３−３配列に基づいて停止コドンの近くに次のように作成ＸｈｏＩ部位（下線）を有して設計した：ＲＯ９７３（配列番号９）（５’−ＧＡＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＣＧＴＧＡＧＧＴＣＣＴ−３’）及びＲＯ９７４（配列番号１０）（５’−ＧＡＣＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＧＡＣＧＡＧＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＴＴＧ−３’）。停止コドンを含むＲＯ９７３は高量（６０％）のＧＣを有し、十分に増幅し得ないので、２つのプライマーを意図的に選択した。一方、停止コドンの下流のＲＯ９７４は非常に少ない（４８％）量のＧＣを有していた。
【０１２０】
遺伝子の５’末端を単離するために上記と同じプロトコルに従って、（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）ベクターの配列に基づいて設計した）ＲＯ８９９（配列番号１１）（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）及び遺伝子特異的オリゴヌクレオチドＲＯ１００４（配列番号１２）（５’−ＴＧＣＣＴＡＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＡＧＴＴＣＣＧ−３’）をｃＤＮＡライブラリーの増幅のために使用した。増幅は１０ｐｍｏｌの各プライマー及びｃＤＮＡポリメラーゼキット（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いて実施した。反応条件は、９４℃×１分間の初期変性、９４℃×３０秒間及び６８℃×３分間を１サイクルさして３０サイクル、最後に６８℃×５分間の伸長サイクルであった。こうして得たＰＣＲ産物をＰＣＲ−ブラントベクター（カリフォルニア州カールドバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に上記と同じプロトコルに従ってクローン化した。組換えプラスミドをＴＯＰ１０超コンピテント細胞（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、クローンを配列決定した。クローン１００４−５はオープンリーディングフレーム及び数個の開始コドンを含み、本来の１３１３ｂｐ配列と重複しており、このことからこれが遺伝子の５’末端であることが分かる。
【０１２１】
完全長遺伝子を単離するために、推定デサチュラーゼの５’末端のプライマーを次のように作成したＥｃｏＲＩ（下線）を有して設計した：ＲＯ１０４６（配列番号１３）（５’−ＣＧＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＡＣＧＡＡＡＣＧＧＴＧ−３’）。
【０１２２】
完全長クローンを単離するために、ＲＯ１０４６／９７３及びＲＯ１０４６／９７４をライブラリーから単離したｃＤＮＡ及び標的としてのゲノムＤＮＡと一緒に使用した。ｃＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）及び−ＧＣ  Ａｄｖａｎｔａｇｅポリメラーゼ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）を、各標的を１０ｐｍｏｌのプライマーを以下の反応条件下で増幅させるために使用した：９４℃×１分間の初期変性後、９４℃×３０秒間及び６８℃×３分間を１サイクルとして３０サイクル、最後に６８℃×５分間の伸長サイクルを実施した。反応物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切断し、再環状化を防止するためにエビアルカリホスファターゼ（インディアナ州インディァナポリスに所在のＲｏｃｈｅ）で処理したＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ作成酵母発現ベクターｐＹＸ２４２（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。完全長配列の初期分析から、幾つかの塩基置換が認められた。クローン１１２−３及び１１２−５（それぞれ、ｐＲＴＡ７及び８と称する）は、プライマーＲＯ１０４６／９７４を用いてゲノムＤＮＡ及び−ＧＣ  Ａｄｖａｎｔａｇｅポリメラーゼとの増幅から誘導した。クローン１１０−３（ｐＲＴＡ５と称する）はＲＯ１０４６／９７３、ゲノムＤＮＡ標的及びｃＤＮＡポリメラーゼとの反応から誘導された。クローン１１１−１（ｐＲＴＡ６と称する）はＲＯ１０４６／９７４、ｃＤＮＡ標的及び−ＧＣ  Ａｄｖａｎｔａｇｅポリメラーゼキットの反応から単離した。これら４つのプラスミド、すなわちｐＲＴＡ５（配列番号１４）、ｐＲＴＡ６（配列番号１５）、ｐＲＴＡ７（配列番号１６）及びｐＲＴＡ８（配列番号１７）の配列を図３〜６に示す。プラスミドｐＲＴＡ７及びｐＲＴＡ８はバージニア州マナサスに所在のＢｏｕｌｅｖａｒｄ大学のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)に２００１年４月１９日に寄託し、それぞれＰＴＡ−３３０１及びＰＴＡ−３３００の受託番号を受けた。１５４８ｂｐ及び５１５アミノ酸の推定デサチュラーゼ（図７〜１０及び配列番号１８、１９、２０及び２１参照）は公知のデサチュラーゼの多くの特徴を有していた。酵素の５’末端に相当するアミノ酸はシトクロムｂ５に相同である。以下のアミノ酸にヒスチジンボックスがある：１７８−１８３−（Ｑ（ＨＤＧＳＨ（配列番号５９）；２１３−２１９−（Ｑ）ＨＬＶＧＨＨ（配列番号６０）；２６２−２６５−ＨＰＷＨ（配列番号６１）；２７１−２７５−ＨＫＦＯＨ（配列番号６２）；４５２−４５７（Ｈ）ＱＩＥＨＨ（配列番号６３）。これらのヒスチジンボックスの３つの前に少なくともＨまたはＱがあるが、これは普通でない。Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｅｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０２９３１１）は２つの類似ボックス［（Ｑ）ＨＶＩＧＨＨ（配列番号６４）及び（Ｈ）ＱＶＶＨＨ（配列番号６５）］を有しており、Ｍ．ａｌｐｉｎａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６７６５４）は（Ｑ）ＨＭＬＧＨＨ（配列番号６６）を有し、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．だけは１つの（Ｈ）ＱＶＴＨＨ（配列番号６７）���有している。各種推定デサチュラーゼの配列は互いに違っていた。幾つかの塩基の変化から、図１に示すようにアミノ酸の変化が生じた。これらの違いは天然の変異体であるか、最終増幅中にＰＣＲミスマッチにより導入され得るか、または初期ｃＤＮＡを作成したときのＰＣＲエラーであり得る。４つのプラスミドの間に７つのアミノ酸変化があるが、いずれも共有していなかった（図２Ａ及びＢ参照、下線または太字のアミノ酸）。これらの違いによりコード化酵素の活性が変化するであろう。
【０１２３】
【表１】
2005525780.tif 000005
【０１２４】
（実施例ＩＶ）
酵母における推定デサチュラーゼを含むプラスミドの発現
４つすべてのプラスミドをコンピテントなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株３３４に形質転換した。酵母形質転換はアルカリ−カチオン酵母形質転換キット（カリフォルニア州ビスタに所在のＢＩＯ  １０１）を用い、製造業者が特定する条件に従って実施した。形質転換体をロイシン欠乏媒体（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）でロイシン栄養要求性について選択した。前記クローンの特定デサチュラーゼ活性を検出するために、形質転換体を５０μＭの以下に示す特定脂肪酸基質の存在下で増殖させた：
ａ．リノール酸（１８：２ｎ−６）（α−リノレン酸への変換はΔ１５デサチュラーゼ活性を示し、γ−リノレン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す）、
ｂ．α−リノレン酸（１８：３ｎ−３）（ステアリドン酸への変換はΔ６デサチュラーゼ活性を示す）、
ｃ．アラキドン酸（２０：４ｎ−６）（エイコサペンタエン酸への変換はΔ１７−デサチュラーゼ活性を示す）、
ｄ．アドレン酸（２２：４ｎ−６）（ω３−ドコサペンタエン酸への変換はΔ１９−デサチュラーゼ活性を示し、ω６−ドコサペンタエン酸への変換はΔ４−デサチュラーゼ活性を示す）、
ｅ．ω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）（ドコサヘキサエン酸への変換はΔ４−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１２５】
ネガティブコントロール菌株は未改変ｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３３４であり、これを同様に増殖させた。
【０１２６】
３０℃において酵母ペプトンデキストロースブロス（ＹＰＤ）中で単一コロニーを一晩増殖させたものを接種後、培養物を激しく（２５０ｒｐｍ）撹拌し、２４℃においてロイシン欠乏培地５０ｍｌ中で５０μＭ（最終濃度）の各種基質の存在下で４８時間増殖させた。細胞をペレット化し、ペレットをメタノール中で撹拌し、クロロホルムをトリトリデカノイン（内部標準として）と共に添加した。混合物を室温において少なくとも１時間または４℃において一晩インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、粒状物及び残留水を除去するために無水硫酸ナトリウム（１ｇ）を用いてＷｈａｔｍａｎ濾紙を介して濾過した。有機溶媒を窒素流中４０℃において蒸発させた。次いで、ガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ）のために、抽出した脂質を閉管にメタノール中０．５Ｎ  水酸化カリウム（２ｍｌ）を添加することにより脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化した。サンプルを９５〜１００℃に３０分間加熱し、室温に冷却した。メタノール中１４％ボロントリフロリド（約２ｍｌ）を添加し、加熱を繰り返した。抽出した脂質混合物を冷却後、水（２ｍｌ）及びヘキサン（１ｍｌ）を添加して、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を抽出した。これをＧＣ分析のために使用した。変換率（％）を、生成した生成物を（生成した生成物＋添加した基質）の合計で割り、１００を掛けることにより算出した。
【０１２７】
結果は、ω３−ＤＰＡのＤＨＡへの変換及びＡＤＡのω６−ＤＰＡへの変換を示した。これはΔ４−デサチュラーゼ活性を表している（表２参照）。
【０１２８】
【表２】
2005525780.tif 000006
【０１２９】
特に、これはΔ４−デサチュラーゼ遺伝子をインビボ発現データで初めて立証したものである。４つのクローンの変換率はＡＤＡからのω６−ＤＯＡの生成に関して３．９１〜１０．９７％であり、ω３−ＤＰＡからのＤＨＡの生成に関して１０〜３６．３４％であった。クローンｐＲＴＡ７について基質２５μｍの変換率が低下していることからわかるように（３６．３４％対１０．９７％）、酵素はω６−ＤＰＡよりもむしろＤＨＡの産生においてより活性であると見られる。１００μｍ濃度の各基質では、変換率（表２参照）及び生成した生成物の量（データなし）が低下し、このことからデサチュラーゼステップが基質によりフィードバック制御されることが分かる。導入ω３−ＤＰＡ（２２：５ｎ−３）の量（総脂質の％として）はすべて４つのプラスミドで類似している（下表３参照）。しかしながら、全部の％としての生成量は２．７４％（ＰＲＴＡ５）〜８．１１％（ＰＲＴＡ７）の範囲で異なる。変換率及び生成率の違いは４つのプラスミドのコード化酵素の配列の違い、よってアミノ酸変異によるのであろう。
【０１３０】
【表３】
2005525780.tif 000007
【０１３１】
このデータから、これらのプラスミドが実際ＡＤＡのω６−ＤＰＡへの変換よりもω３−ＤＰＡのＤＨＡへの変換に対してより好ましい活性を有するΔ４−デサチュラーゼをコードすることが明白に分かる。
【０１３２】
（実施例Ｖ）
酵母におけるΔ４−デサチュラーゼとマウスエロンガーゼの発現
（最高の変換率を有していた）プラスミドｐＲＴＡ７及びｐＲＴＡ８はそれぞれｐＲＡＥ−８４（援用により本明細書に含まれるとする米国特許出願第０９／６２４，６７０号明細書）由来のマウスエロンガーゼを含むクローンであるｐＲＭＥＬＯ４と同時形質転換され得る。８７９塩基対のマウスエロンガーゼ（図１１（配列番号２２）及び図１２（配列番号２３）参照）はＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位で酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片としてクローン化され得る。この２９２アミノ酸のエロンガーゼはＰＵＰＡ経路の幾つかの延長ステップ、特にＡＡのＡＤＡへのステップ及びＥＰＡのω３−ＤＰＡへのステップを触媒する。ＡＤＡ及びω３−ＤＰＡはΔ４−デサチュラーゼの基質である。酵母形質転換体は、Δ４−デサチュラーゼ（ｐＲＴＡ７またはｐＲＴＡ８）及びｐＲＭＥＬＯ４（マウスエロンガーゼ）の選択のためにロイシン及びウラシル欠乏最小培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ−Ｕｒａ］）を用いて選択され得る。ロイシン及びウラシル欠乏２％ガラクトースを含む最小培地においてｐＲＭＥＬＯ４及びｐＲＴＡ７またはｐＲＴＡ８を含む酵母培養物を増殖、発現させると、外から付加したＡＡのＡＤＡへの延長及びω６−ＤＰＡへのΔ４不飽和化が生じ得る。更に、酵母最小培地にＥＰＡを付加すると、図１に示すように、エロンガーゼによるω３−ＤＰＡへの延長が生じ得、ω３−ＤＰＡはその後Δ４−デサチュラーゼにより不飽和化されてＤＨＡが生成され得る。このことは、ＡＡ及びＥＰＡを生成するためにエロンガーゼ及び他のデサチュラーゼを用いて既に立証されており（国際特許出願公開第００／１２７２０号パンフレット）、基質の延長及びその後の不飽和化が酵母や潜在的に他の生物のような生物においてインビボで起こり得ることを示す実験データも提示されている。更に、本発明のデータは、それぞれ前駆体ＡＡ及びＥＰＡからω６−ＤＰＡまたはＤＨＡのいずれかを生成するためのＰＵＦＡ生合成経路において別の酵素と共に働くΔ４−デサチュラーゼの能力を立証している。
【０１３３】
（実施例ＶＩ）
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ  ２８２０９）由来のΔ４−デサチュラーゼの同族体
実施例ＩＩと平行して、ＲＮＡをＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）ＡＴＣＣ  ２８２０９から酸フェノール方法により単離した。簡単に説明すると、Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍのペレットを冷脱イオン水で洗浄し、３００ｒｐｍで５分間再ペレット化した。ペレットを再懸濁するために約１０ｍｌのＴＢＳ（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％  ＳＤＳ）を使用した。次いで、酸フェノール（１０ｍｌ）を添加し、６５℃で１時間インキュベートした。ペレットを氷上で５分間置き、４℃において１０００×ｇで５分間遠心し、水性相を新しい管に移した。水性相に酸フェノール（１０ｍｌ）を更に添加し、前と同様に混合物を撹拌し、分離した。核酸を含む水性相を新しい管に移した。−７０℃において一晩沈降させるために酢酸ナトリウムｐＨ５．３（約１ｍｌ）及び氷冷エタノール（２５ｍｌ）を添加した。翌日、管を４℃において１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清をデカントした。ペレットを７０％エタノール（１０ｍｌ）で洗浄し、上記ステップと同様に遠心した。ペレットを乾燥し、ＲＮａｓｅ非含有脱イオン水（５００ｕｌ）に再懸濁した。ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて製造業者のプロトコルに従って更に精製した。
【０１３４】
ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（メリーランド州ロックビルに所在のＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｄｓ）でＳ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ由来のＲＮＡ（５ｕｇ）及びオリゴｄＴを用いて作成した。Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍは大量のＤＨＡを生成するので、ＤＨＡ生成のためにはΔ４−デサチュラーゼが必要であろう。同一実験で、プライマーＲＯ７５３（配列番号５）及びＲＯ７５４（配列番号６）を実施例ＩＩと同一反応において使用して、約８００塩基対のバンドを得た。前記したように、ＰＣＲ反応から作成したＤＮＡを１％ゲルにて分離し、除去し、精製し、ＰＣＲ−ブラントベクター（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。クローンｓａａ９及びｓａａ５から作成したＤＮＡ配列は重複しており、配列ｓａａ．ｃｏｎ（配列番号２４及び図１３）が生成した。ｐＲＴＡ７とアランインさせたアミノ酸配列（配列番号２５及び図１４）へのｓａａ．ｃｏｎ  ＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームの翻訳を図１５に示す。クローンｐＲＴＡ７由来のΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列は２４９アミノ酸にわたり翻訳されたｓａａ．ｃｏｎ配列と７９．１％同一性を有している。公知のΔ４−デサチュラーゼと高い同一性を有しているために、この配列は多分Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ由来のΔ４−デサチュラーゼの断片であろう。本実施例から、他の生物からΔ４−デサチュラーゼを単離するためにこの方法を使用し得るという証拠が与えられる。
【０１３５】
（実施例ＶＩＩ）
Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ  ２８２０９）及びＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ  ７０９１）由来のΔ４−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
５’末端及び３’末端を単離するために、実施例ＶＩに示した単離Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ断片の内部配列に基づいて新しいプライマーを設計した。遺伝子の５プライム末端に対して、ＲＯ１２４０（配列番号２６）（５’−ＣＣＣ  ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＡＡＣ−３’）、その後５プライム入れ子プライマーＲＯ１２３９（配列番号２７）（５’−ＣＧＧ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣ−３’）を使用した。３プライム末端に対して、遺伝子の他の末端を単離するための第２反応のためにＲＯ１２３６（配列番号２８）（５’−ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＡＧＴ−３’）、その後３プライム入れ子プライマーＲＯ１２３７（配列番号２９）（５’−ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＣＧＣ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  Ｇ−３’）を使用した。ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）レーディｃＤＮＡを反応の標的として使用した。この材料を作成するには、全ＲＮＡ（約５μｇ）をＤＮＡ標的を作成するための逆転写のためにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（商標）酵素（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キット（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に製造業者の指示に従って使用した。末端を最初に増幅するために、以下の熱サイクルプロトコルをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００において使用した。９４℃×２分間でまず溶融した後、９４℃×３０秒間及び７２℃×３分間を１サイクルとして５サイクル、９４℃×３０秒間、７０℃×３０秒間及び７２℃×３分間を１サイクルとして１０サイクル、９４℃×３０秒間、６８℃×３０秒間及び７２℃×３分間を１サイクルとして１０サイクル、最後に７２℃×１０分間の伸長サイクルを実施した。第１のＰＣＲ反応を１０ｐＭｏｌのＲＯ１２４０及び３０ｐＭｏｌのＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５プライムプライマー（配列番号３０）（５’−ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡ−３’）またはＲＯ１２３６及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）３プライムプライマー（配列番号３１）（５’−ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  Ｇ−３’）を用いて実施した。反応物は製造業者の指示に従ってＭｇＳＯ４を含むＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（商標）ＰＣＲｘ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｃｈ）を用い、最終容量５０ｕｌ中に１ｕｌのｃＤＮＡを含んでいた。１ｕｌの入れ子反応を初期反応物、１０ｐｍｏｌの入れ子プライマーＲＯ１２３９、及び３０ｐｍｏｌＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）入れ子５プライムプライマー（配列番号３２）（５’−ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’）またはＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）入れ子３プライムプライマー（配列番号３３）（５’−ＣＧＣ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧ−３’）及び入れ子プライマーＲＯ１２３７を用いて第１反応と同一条件を用いて実施した。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、５プライム反応で約８００塩基対及び３プライム反応で約６００塩基対のバンドを示した。その後、��ＣＲ−ブラント（カリフォルニア州カールズハッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（カリフォルニア州カールズハッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、配列決定すると、開始コドン及び停止コドンを含むオープンリーディングフレームが明らかとなった。クローニングのために付加した制限部位（それぞれ下線をつけたＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）を有するプライマーＲＯ１２４１（配列番号３４）（５’−ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＧＡＡ ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  Ｇ−３’）及びＲＯ１２４２（配列番号３４）（５’−ＧＴＡ  ＣＴＴ  ＡＡＧ ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  Ｃ−３’）を完全長遺伝子を単離するために使用した。上記したように、１０ｐｍｏｌのプライマーＲＯ１２４１及びＲＯ１２４２を標的としてのｃＤＮＡ（２ｕｌ）、製造業者のプロトコルに従ってＭｇＳＯ４を含むＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（商標）ＰＣＲｘ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔａｃｈ）と共に使用した。熱サイクルパラメーターは次の通りであった：まず９４℃×２分間の溶融後、９４℃×３０秒間及び７２℃×２分間を１サイクルとして５サイクル、９４℃×３０秒間及び７０℃×２分間を１サイクルとして５サイクル、９４℃×３０秒間、６５℃×３０秒間及び６８℃×２分間を１サイクルとして２０サイクル、その後６８℃×１０分間の伸長サイクル。反応の大きな産物をＱｉａＱｕｉｃｋゲル精製キット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、迅速結合キット（インディアナ州インディアナポリスに所在のＲｏｃｈｅ）を用いてｐＹＸ２４２  ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ直線化ＤＮＡに連結し、ｐＲＳＡ−１と称した。クローンｐＲＳＡ−１は１５３０ｂｐ（配列番号３６，図１６）の完全長遺伝子及び５０９アミノ酸（配列番号３７，図１７）のオープンリーディングフレームを含んでいた。プラスミドｐＲＳＡ−１はバージニア州マナサスに所在のＢｏｕｌｅｖａｒｄ大学のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに２００２年３月２７日に寄託され、ＰＴＡ−４１８６の受託番号を受けた。
【０１３６】
第２Δ４−デサュラーゼを、実施例ＩＩＩに記載されているようにｐＲＴＡ７（配列番号１６）の配列に基づくＲＯ１２０１（配列番号３８）（５’−ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＣＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＣＣ−３’）及びＲＯ１２０２（配列番号３９）（５’−ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＡＴＡ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＧ−３’）のプライマーの組合せを用いて単離した部分配列により同定した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ  ７０９１）（インド国バンガロールに所在のＢｉｏｃｏｎ  Ｉｎｄｉａ  Ｌｔｄ．）から実施例Ｉに記載されているように作成した。ＰＣＲ増幅は、単離Ｔ７０９１  ｇＤＮＡ（５μｌ）、ｃＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）（１．０Ｕ）及びプライマー（１０ｐｍｏｌ）を含む１００μｌ容量中で製造業者のプロトコルに従って実施した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００での熱サイクル条件は次の通りであった：９４℃×３分間の後、９４℃×３０秒間、６０℃×３０秒間及び７２℃×１分間を１サイクルとして３５サイクル。ＰＣＲの後に、７２℃×７分間の伸長サイクルを実施した。６００ｂｐ断片をゲル精製し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（メリーランド州ロックビルに所在のＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて充填し、ｐＣＲ−ブラントベクター（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）にクローン化し、組換えプラスミドをＴＯＰ１０超コンピテント細胞（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。クローンの配列決定から、ｐＲＴＡ７との高い相同性（１９６アミノ酸において８２．１％）が明らかとなった。
【０１３７】
完全長遺伝子を単離するために、全ＲＮＡから単離したｍＲＮＡ及びオリゴｄＴセルロース樹脂を用いてｃＤＮＡライブラリーを構築した。次いで、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＸＲライブラ構築キット（カリフォルニア州ラホヤに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）ベクターに指向的にクローン化した（５’ＮｏｔＩ／３’ＥｃｏＲＩ）。Ｔ．ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ  ７０９１）ライブラリーは約１３００ｂｐの平均インサートサイズを有するクローンを約１．８９×１０８個含んでいた。
【０１３８】
５’配列及び３’配列を増幅するためにプライマーＲＯ１２１０（配列番号４０）（５’−ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ−３’）及びＲＯ１２１１（配列番号４１）（５’−ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＡＣＧ−３’）を設計した。ＲＯ１２１０／ＲＯ８９９（配列番号１１）及びＲＯ１２１１／ＲＯ８９８（配列番号７）を、本実施例においてオリジナル断片を単離するために上記したと同一の条件下でライブラリーからのｃＤＮＡ（５ｕｌ）及びｃＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いて作成した。断片のクローニング及び配列決定後、追加の内部プライマーＲＯ１２１４（配列番号４２）（５’−ＧＧＡ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＡＧＣ−３’）及びベクター由来のＲＯ８９８を用いて遺伝子の５’末端を同定した。反応物（５０μｌ）中に、各プライマー（１０ｐｍｏｌ）、標的としてのライブラリーＤＮＡ（５ｕｌ）及びＭｇＳＯ４を含むＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ８９ＰＣＲｘ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）を製造業者のプロトコルに従って使用した。サイクルプロトコルは次の通りであった：まず９４℃×５分間の溶融後、９４℃×４５秒間、５５℃×３０秒間及び６８℃×２分間を１サイクルとして３５サイクル、その後７２℃×７分間の伸長サイクル。
【０１３９】
Ｔ．ａｕｒｅｕｅｍ（ＢＩＣＣ  ７０９１）由来の完全長Δ４−デサチュラーゼを、クローニング目的で加えた制限部位ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ（下線）を含む５’プライマーＲＯ１２３３（配列番号４３）（５’−ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＧＡＡ ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  Ｇ−３’）及び３’プライマーＲＯ１２２４（配列番号４４）（５’−ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＣＴＣ ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＣＡ−３’）を用いて単離した。反応物（５０μｌ）中に、各プライマー（１０ｐｍｏｌ）、標的としてのライブラリーＤＮＡ（５ｕｌ）、製造業者のプロトコルに従ってＭｇＳＯ４を含むＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ８９ＰＣＲｘ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用した。サイクルプロトコルは次の通りであった：まず９４℃×５分間の溶融後、９４℃×４５秒間、５５℃×３０秒間及び６８℃×２分間を１サイクルとして３５サイクル、その後７２℃×７分間の伸長サイクル。１つのバンドがアガロースゲルで分離され、精製し、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断し、同一酵素で直線化したｐＹＸ２４２に結合した。ｐＲＴＡ１１と称される完全長クローンの配列分析（図１８）（配列番号４５）から、５１３アミノ酸のタンパク質（図１９）（配列番号４６）をコードする１５４２塩基対のオープンリーディングフレームが明らかとなった。プラスミドｐＲＴＡ１１はバージニア州マナサスに所在のＢｏｕｌｅｖａｒｄ大学のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに２００２年３月２７日に寄託され、ＰＴＡ−４１８７の受託番号を受けた。
【０１４０】
（実施例ＶＩＩＩ）
酵母における推定Δ４−デサチュラーゼｐＲＳＡ１及びｐＲＴＡ１１の発現
両プラスミドをコンピテントなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株３３４に形質転換し、５０μＭのＡＤＡまたはω３−ＤＰＡと一緒に実施例ＩＶに記載されているように増殖させた。表４に示すように、３３４（ｐＲＳＡ１）または（ｐＲＴＡ１１）をＡＤＡまたはω３−ＤＰＡと一緒に増殖させたときにはΔ４−不飽和化の生成物であるω６−ＤＰＡ及びＤＨＡが生成された。
【０１４１】
【表４】
2005525780.tif 000008
【０１４２】
基質の生成物への変換率％を表５に記載されているように計算すると、より高い変換率の点で好ましい基質はω３−ＤＰＡであり、これはＤＨＡを生成する。このデータから、上記プラスミドもΔ４−デサチュラーゼをコードすることが明らかである。
【０１４３】
【表５】
2005525780.tif 000009
【０１４４】
（実施例ＩＸ）
酵母におけるΔ４−デサチュラーゼ及びマウスエロンガーゼの同時発現
実施例Ｖに記載されているように、Ｔ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）Δ４−デサチュラーゼを（プラスミドｐＲＡＥ８４からｐＹＥＳ２に再クローン化した）マウスエロンガーゼｐＲＭＥＬＯ４と共に同時形質転換した。
【０１４５】
表６に、１０μＭの基質ＥＰＡ（２０：５ｎ−３）を添加したとき、エロンガーゼはＥＰＡに２つの炭素を付加してω３−ＤＰＡを生成することができ、デサチュラーゼはω３−ＤＰＡをＤＨＡに変換させた。対照の形質転換３３４（ｐＹＸ２４２／ｐＹＥＳ２）ではＤＨＡは生成しなかった。対照では少量のω３−ＤＰＡが見られたが、これは添加した基質ＥＰＡの汚染物質であった。よって、Ｔ．ａｕｒｅｕｍΔ４−デサチュラーゼは異種発現系において生成物を生成し得たが、これは所望のＰＵＦＡを生成するためのＰＵＦＡ生合成経路からの別の異種酵素（マウスエロンガーゼ）の生成物であった。このことから、Δ４−デサチュラーゼは実際酵母のような異種発現系においてＰＵＦＡ経路中他の異種酵素と一緒に働き得ることが示される。
【０１４６】
【表６】
2005525780.tif 000010
【０１４７】
（実施例Ｘ）
藻類Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ（ＣＣＭＰ  １３２３）からの新規デサチュラーゼ遺伝子の単離
藻類Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ（Ｉ．ｇａｌｂａｎａ）（ＣＣＭＰ  １３２３）の脂肪酸組成を調査して、この生物から産生されるポリ不飽和脂肪酸を調べた。この藻類は大量のω３−ドコサペンタエン酸（ω３−ＤＰＡ，２２：５ｎ−３）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡｍ２２：６ｎ−３）を含めた長鎖ＰＵＦＡを示した。実際、ＤＨＡは総脂質の１９％を占める高量で存在していた。よって、Ｉ．ｇａｌｂａｎａはω３−ＤＰＡをＤＨＡに変換し得るΔ４−デサチュラーゼを有していると予想された。従って、目的はＩ．ｇａｌｂａｎａから予測Δ４−デサチュラーゼを単離し、別の宿主での発現により酵素の機能性を証明することであった。
【０１４８】
Ｉ．ｇａｌｂａｎａの凍結ペレットをメイン州ウェスト・ブースベイに所在のＰｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ国立海水植物プランクトン培養センター（Provasoli-Guillard National Center for Cultuer of Marine Phytoplankton；ＣＣＭＰ）から入手した。前記ペレットを液体窒素中で粉砕し、全ＲＮＡをＩ．ｇａｌｂａｎａからＱｉａｇｅｎ  ＲＮａｓｅ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造業者の指示に従って抽出した。この全ＲＮＡからｍＲＮＡをオリゴｄＴセルロース樹脂を用いて単離した後、これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＸＲライブラリー構築キット（カリフォルニア州ラホーラに所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用した。こうして構築したｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）ベクターに指向的にクローン化した。Ｉ．ｇａｌｂａｎａライブラリーは約１３００ｂｐの平均インサートサイズを有するクローンを約９．４×１０４個／μｌ含んでいた。このライブラリーからの２０００個の一次クローンをＭ１３前進プライマー（配列番号４７）（５’−ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧ−３’）を用いて５’末端から配列決定した。配列決定はＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅ配列決定キット（カリフォルニア州に所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＭｅｇａＢａｓｅ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＮＡシーケンサー（ニュージャージー州ピスカタウェーに所在のＡｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。
【０１４９】
“ｉｓｏ２５−Ａ０９”と称されるこの新規Δ４−デサチュラーゼの３’末端を含む６４７ｂｐクローンを２０００ライブラリークローンの配列決定から得た。この断片は他の公知のΔ５及びΔ６デサチュラーゼと〜３０％のアミノ酸配列同一性を有していた。この断片は遺伝子の停止コドンを含んでいなかったので、この遺伝子の３’末端を含む別のクローンを、ｃＤＮＡライブラリー（鋳型）を３’−末端ベクタープライマーＲＯ８９９（配列番号１１）及びＲＯ１２７０（配列番号４８）（５’−ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＡＴ  ＧＡＴ  ＧＧ−３’）を用いてＰＣＲ増幅することにより得た。ＰＣＲ増幅はＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（ＨＦ）ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。増幅は、１μｌのｃＤＮＡライブラリー連結混合物、２０ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．４），５０ｍＭ  ＫＣｌ（最終濃度），２００μＭ  各デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート，１０ｐｍｏｌの各プライマー，１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び０．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（ＨＦ）ＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ緩衝液を含む総量５０μｌ中で実施した。増幅はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００装置を用いて次のように実施した：９４℃×２分間の溶融後、９４℃×３０秒間及び７２℃×３分間を１サイクルとして５サイクル、９４℃×３０秒間、７０℃×３０秒間及び７２℃×３分間を１サイクルとして１０サイクル、９４℃×３０秒間、６８℃×３０秒間及び７２℃×３分間を１サイクルとして２０サイクル、最後に７２℃×１０分間の伸長サイクル。この増幅から、ライブラリー中の低量のこの遺伝子に相当するバンドは観察できなかった。よって、このＰＣＲ反応物（２μｌ）を、上記と同じＰＣＲ成分下でのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  （ＨＦ）ＤＮＡポリメラーゼを用いる第２ＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。しかしながら、今回の増幅は以下のように実施した：９４℃×３分間の変性後、９４℃×４５秒間、５５℃×３０秒間及び６８℃×２分間を１サイクルとして３０サイクル。反応を４℃で停止した。こうして６７０ｂｐ  ＰＣＲバンドを得、これをゲル精製し、ＰＣＲ−ブラントベクター（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。組換えプラスミドをＴＯＰ１０超コンピテント細胞（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、クローンを配列決定し、分析した。こうして得たクローン“ｉｓｏ２５−Ａ０９−６”及び“ｉｓｏ２５−Ａ０９−１”はＴＡＡ停止コドン及びポリＡ尾部と共に遺伝子の３’末端を含んでいた。このクローンはオリジナル“ｉｓｏ２５−Ａ０９”断片と重複していた。
【０１５０】
この遺伝子の５’末端を単離するために、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）レディｃＤＮＡを反応のための標的として使用した。この材料を作成すべく、全ＲＮＡ（約５μｇ）をＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キット（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（商標）酵素（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って用いて逆転写して、ｃＤＮＡ標的を作成した。次いで、このｃＤＮＡを、３０ｐｍｏｌのＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）５’プライマー（配列番号３０）（５’−ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡ−３’）及び１０ｐｍｏｌの以下の遺伝子特異的プライマーのいずれか１つ
【０１５１】
【化３】
2005525780.tif 000011
を含むＰＣＲ反応の鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅は、ＲＡＣＥ−ｃＤＮＡ（１μｌ）、２０ｍＭ  トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．４），５０ｍＭ  ＫＣｌ（最終濃度），２００μＭ  各デオキシリボ核酸トリホスフェート，１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４及びＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．５μｌ）を含有するＰＣＲ緩衝液を含む総量５０μｌ中でＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州カールズバッドに所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。増幅はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９６００装置を用いて以下のように実施した：まず９４℃×２分間の溶融後、９４℃×３０秒間及び７２℃×３分間を１サイクルとして５サイクル、９４℃×３０秒間、７０℃×３０秒間及び７２℃×３分間を１サイクルとして１０サイクル、９４℃×３０秒間、６８℃×３０秒間及び７２℃×３分間を１サイクルとして２０サイクル、その後７２℃×１０分間の伸長サイクル。プライマーの組合せのすべてからバンドが生じ、このバンドをゲル精製し、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼで充填し、ＰＣＲ−ブラントベクターにクローン化し、ＴＯＰ１０超コンピテント細胞に形質転換した。“ｉｓｏ２５−Ａ０９−３３−５”、“ｉｓｏ２５−Ａ０９−３１−３”、“ｉｓｏ２５−Ａ０９−３０−１”及び“ｉｓｏ２５−Ａ０９−３２−３”のような上記クローンの配列決定から、この遺伝子の５’末端が“ＡＴＧ”開始部位、シトクロムｂ５ドメイン及び２つのヒスチジンボックスを含むことが分かった。これらのクローンは相互に重複しており、第３のヒスチジンボックスを含むオリジナル“ｉｓｏ２５−Ａ０９”断片とも重複していた。
【０１５２】
この遺伝子の完全長を単離するために、ゲノムＤＮＡ及び（ＲＡＣＥから）得られたｃＤＮＡを以下のプライマーを用いるＰＣＲ反応において鋳型として使用した。
【０１５３】
【化４】
2005525780.tif 000012
（この前進プライマーは酵母発現ベクターｐＹＸ２４２にクローン化するのに適したＥｃｏＲＩ部位（下線）及び“ＡＴＧ”開始部位（太字）を含んでいた）。
【０１５４】
【化５】
2005525780.tif 000013
（この逆プライマーはｐＹＸ２４２にクローン化するのに適したＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線）及び“ＴＡＡ”停止部位（太字）を含んでいた）。ＰＣＲ増幅は、ＲＡＣＥ−ｃＤＮＡ（１μｌ）またはゲノムＤＮＡ（２μｌ）、４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ９．２），１５ｍＭ  ＫＯＡｃ（最終濃度），３．５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２，５％  ＤＭＳＯ，３．７５μｇ／ｍｌのＢＳＡ，２００μＭ  各デオキシリボ核酸トリホスフェート，１Ｍ  ＧＣ−メルト及びＡｄｖａｍｔａｇｅ−ＧＣ  ｃＤＮＡポリメラーゼ（１μｌ）を含有するＰＣＲ緩衝液を含む容量５０μｌ中でＡｄｖａｎｃｅｄ−ＧＣ  ｃＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いて実施した。熱サイクルプロトコルは９４℃×１分間の初期変性、９４℃×３０秒間の変性及び６８℃×３分間のアニーリングを１サイクルとして３０サイクル、６８℃×５分間の最終伸長及び最後に４℃での停止を含めた。
【０１５５】
〜１．３５ｋｂバンドを得、これをゲル精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて２時間消化し、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（カリフォルニア州バレンシアに所在のＱｉａｇｅｎ）を用いて洗浄し、予めＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＹＸ２４２酵母発現ベクター（ウィスコンシン州マジソンに所在のＮｏｖａｇｅｎ）にクローン化した。この構築物は標識ｐＲＩＧ６であり、ＲＡＣＥ誘導ｃＤＮＡから単離した“ｉｓｏ２５−Ａ０９”完全長遺伝子及び及びｐＹＸ２４２ベクターから構成されていた。これを発現研究のために酵母ＳＣ３３４に形質転換した。
【０１５６】
ｐＲＩＧ６中に存在する“ｉｓｏ２５−Ａ０９”の完全長遺伝子は１３０２ｂｐ長（配列番号５４）（図２０）であり、４３３アミノ酸（配列番号５５）（図２１）のタンパク質をコードした。この遺伝子の推定タンパク質配列のｔＦａｓｔＡ検索により、該タンパク質がＩ．ｇａｌｂａｎａ由来のΔ５−デサチュラーゼ（援用により本明細書に含まれるとする米国特許出願第１０／０５４，３３４号明細書）と３０．６％同一性を有していることが分かった。また。この遺伝子の推定タンパク質はＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）由来のΔ４−デサチュラーゼに対して３０．８％同一であった（図２２）。更に、この遺伝子のＤＮＡ配列はＴ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）Δ４−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列に対して４２．３７％の配列同一性、Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ  ２８２０９）Δ４−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列に対して４３％の同一性及びＴ．ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ  ７０９１）Δ４−デサチュラーゼ配列をコードするヌクレオチド配列に対して３９．７％の同一性を示すことが判明した。Δ５−及びΔ６−デサチュラーゼのようなすべての前端不飽和化酵素(front-end desaturating enzyme)遺伝子のように、この遺伝子はその配列の５’末端内にシトクロムｂ５ドメインを含んでいる。このシトクロムｂ５は不飽和化のための即時電子ドナーとして機能すると考えられ、ＮＡＤＨ依存不飽和化を含めた多数の酸化−還元反応において機能している。この遺伝子はまた、すべて膜結合デサチュラーゼ中に存在する３つのヒスチジン−リッチモチーフを有していた。これらは、Ｎｏｓ．１５３〜１５８（ＨＭＧＧＨ）（配列番号７１）、Ｎｏｓ．１８８〜１９３（ＨＮＫＨＨ）（配列番号７２）及びＮｏｓ．３４７〜３５２（ＱＩＥＨＨ）（配列番号７３）に存在している。これらのヒスチジン−リッチボックスは酵素活性部位でジ鉄−オキソ構造を配位すると考えられ、酵素活性のために必要である。これらの特徴は、この遺伝子産物がジ鉄−オキソタンパク質（３）の膜結合デサチュラーゼ／ヒドロキシラーゼ類のメンバーであり且つ前端不飽和化酵素であることと一致している。この遺伝子のＧ＋Ｃ含量は６４．２％である。
【０１５７】
（実施例ＸＩ）
酵母におけるＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ（ＣＣＭＰ  １３２３）由来の新規デサチュラーゼであるｐＲＩＧ６の発現
基質特異性及びＩ．ｇａｌｂａｍａ由来の新規デサチュラーゼにより触媒される反応の種類を調べるために、ｐＲＩＧ６構築物を下記するようにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＣ３３４）において異種発現させた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはオレイン酸（ＯＡ，１８：１ｎ−９）以外の脂肪酸を合成できないので、ＯＡ以外の基質に対する酵素活性を測定するために使用するのに理想的である。なぜならば、バックグラウンド酵素活性は検出されないからである。よって、基質は宿主に対して外から供給され、細胞に吸収され、形質転換遺伝子の発現タンパク質により作用され得る。
【０１５８】
ｐＹＸ２４２にクローン化したＩ．ｇａｌｂａｎａ由来の完全長“ｉｓｏ−Ａ０９“デサチュラーゼから構成されるクローンｐＲＩＧ６をアルカリ−カチオン酵母形質転換キット（カリフォルニア州ビスタに所在のＢＩＯ  １０１）を用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＣ３３４）に形質転換した。プラスミドｐＲＩＧ６はバージニア州マナサスに所在のＢｏｕｌｅｖａｒｄ大学のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに２０００年４月５日に寄託され、ＰＴＡ−４２０９の受託番号を受けた。形質転換体をロイシン欠乏培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）においてロイシン栄養要求性について選択した。前記クローンの特定デサチュラーゼ活性を検出するために、形質転換体を５０μＭの以下にリストした特定脂肪酸基質の存在下で増殖させた：
ａ．リノール酸（ＬＡ，１８：２ｎ−６）；α−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３ｎ−３）への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性を示し、γ−リノレン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す。
ｂ．ジホモ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）；エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ，２０：４ｎ−３）への変換はΔ１７デサチュラーゼ活性を示し、アラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ｎ−６）への変換はΔ５デサチュラーゼ活性を示す。
ｃ．ω６−エイコサジエン酸（２０：２ｎ−６）；ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）への変換はΔ８−デサチュラーゼを示す。
ｄ．アドレン酸（２２：４ｎ−６）；ω６−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）への変換はΔ４−デサチュラーゼ活性を示す。
ｅ．ω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）；ドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ−３）への変換はΔ４−デサチュラーゼ活性を示す。
【０１５９】
ネガティブ対照菌株はｐＹＸ２４２ベクターを形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅであり、これらの培養物を同時に増殖し、分析した。
【０１６０】
培養物を激しく（２５０ｒｐｍ）撹拌し、５０μＭ（最終濃度）の各種基質の存在下で２４℃において４８時間増殖させた（表７）。細胞を遠心沈殿し、蒸留水で１回洗浄し、ペレットをメタノール中で撹拌した。クロロホルムをトリデカノイン（内部標準として）と共に添加した。これらの混合物を室温において少なくとも１時間または４℃において一晩インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙を介して無水硫酸ナトリウム（１ｇ）を用いて濾過して、沈殿及び残留水を除去した。有機溶媒を窒素流下４０℃において蒸発させた。次いで、抽出した脂質をガスクロマトグラフィー分析のために閉鎖管にメタノール中０．５Ｎ  水酸化カリウム（２ｍｌ）を添加することにより脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化した。サンプルを９５〜１００℃に３０分間加熱し、室温に冷却した。メタノール中１４％  ボロントリフロリド（約２ｍｌ）を添加し、加熱を繰り返した。抽出した脂質混合物を冷却した後、水（２ｍｌ）及びヘキサン（１ｍｌ）を添加してＦＡＭＥを抽出し、これをＧＣ分析に使用した。変換率％を式：
【０１６１】
【数１】
2005525780.tif 000014
を用いて算出した。
【０１６２】
表７は、酵母において発現させた新規デサチュラーゼの基質特異性を示す。ここで、発現ｐＲＩＧ６クローンはω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）の１５．３％をドコサヘキサエン酸（２２：５ｎ−３）に変換させ得、このことから前記遺伝子がΔ４−デサチュラーゼであったことが分かる。更に、この酵素はアドレン酸（２２：４ｎ−３）の１１％をω６−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）に変換させ得、このこともΔ４−ドサュラーゼ活性を示していた。
【０１６３】
脂肪酸は酵母から抽出した総脂質の％として表される。ＧＣ／ＭＳを生成物を同定するために使用した。これらの条件下で、クローンは他のデサチュラーゼ活性を示さなかった。このことから、単離した遺伝子が新規Δ４−デサチュラーゼ遺伝子であることが確認された。ベクターを単独で使用したときにはバックグラウンド基質変換は検出されなかった。このデータから、この新規Δ−デサチュラーゼは異種系において発現され得、よってＤＨＡを含有するトランスジェニック油の生成において有用であることが分かる。
【０１６４】
【表７】
2005525780.tif 000015
括弧内の数字は酵母由来の総脂質の％として脂肪酸を示す。
【０１６５】
略号：
ＬＡ＝リノール酸（１８：２ｎ−６）、
ＧＬＡ＝γ−リノレン酸（１８：３ｎ−６）、
ＤＧＬＡ＝ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３ｎ−６）、
ＡＡ＝アラキドン酸（２０：４ｎ−６）、
ω６−ＥＤＡ＝ω−６エイコサジエン酸（２０：２ｎ−６）、
ＡＤＡ＝アドレン酸（２２：４ｎ−６）、
ω３−ＤＰＡ＝ω−３ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）、
ω６−ＤＰＡ＝ω−６ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）、
ＤＨＡ＝ドコサヘキサエン酸（２２：６ｎ−３）。
【０１６６】
栄養組成物
詳細説明に記載されているＰＵＦＡは各種栄養サプリメント、乳児用製剤、栄養代用品及び他の栄養溶液中に使用され得る。
【０１６７】
Ｉ．乳児用製剤
Ａ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）鉄入り調製豆乳：
使用：牛乳に対してアレルギーまたは感受性を有する乳幼児及び成人に対する飲料として。ラクトースが禁忌な疾患、すなわちラクターゼ欠乏、ラクトース不耐性及びガラクトース血症を有する患者に対する栄養補給。
【０１６８】
特徴：牛乳タンパク質アレルギーまたは感受性の症状を避けるために大豆タンパク質単離物；ラクトース関連下痢を避けるためにラクトースを含まない製剤；浸透性下痢の危険を減らすために低オスモル濃度（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）；炭水化物吸収を高め、ダメージを受けている腸の吸収能力を超える危険を減らすように設計された２つの炭水化物（コーンシロップ及びスクロース）；鉄欠乏の予防を助けるために１．８ｍｇ／１００ｃａｌの鉄（硫酸第一鉄として）；推奨レベルのビタミン及びミネラル；推奨レベルの必須脂肪酸を与えるために植物油；乳白色でミルクに似たコンシステンシー及び気持ちのよい香り。
【０１６９】
成分：（Ｐａｒｅｖｅ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖（スクロース）２．６％、大豆油２．１％、大豆タンパク質単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム１．５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ−及びジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１７０】
Ｂ．下痢のためのＩｓｏｍｉｌ（登録商標）  ＤＦ調製豆乳：
使用：小児及び幼児における下痢の食事管理のための短期間栄養補給として。
【０１７１】
特徴：特に下痢管理のために大豆繊維由来の食物繊維を追加添加するための主乳児用調製乳；臨床的に小児が中程度乃至重篤な下痢を起こしている間のゆるい水様便の期間を減らすことが判明している；乳児の栄養要求量を満たすために栄養的に完全である；Ｌ−メチオニンを添加した大豆タンパク質単離物はすべての必須アミノ酸についての乳児の要求量を満たすかまたは越える；ラクトース関連下痢を避けるためにラクトース非含有製剤；浸透性下痢の危険を減らすために低オスモル濃度（２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）；炭水化物吸収を高め、ダメージを受けている腸の吸収能力を超える危険を減らすように設計された２つの炭水化物（コーンシロップ及びスクロース）；アメリカ小児科アカデミーの栄養委員会(Committee on Nutrition of the American Academy of Pediatrics)が推奨し、Ｉｎｆａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａｃｔが要求しているビタミン及びミネラルレベルを満たすかまたは越える；鉄欠乏の予防を助けるために１．８ｍｇ／１００ｃａｌの鉄（硫酸第一鉄として）；推奨レベルの必須脂肪酸を与えるために植物油。
【０１７２】
成分：（Ｐａｒｅｖｅ）水８６％、コーンシロップ４．８％、糖（スクロース）２．５％、大豆油２．１％、大豆タンパク質単離物２．０％、ヤシ油１．４％、大豆繊維０．７７％、クエン酸カルシウム０．１２％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム０．１０％、塩化カリウム、第一リン酸カリウム、モノ−及びジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１７３】
Ｃ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）  ＳＦ  スクロース非含有の鉄入り調製豆乳：
使用：牛乳タンパク質に対してアレルギーまたは感受性またはスクロースに対して不耐性を有する乳幼児及び成人に対する飲料として。ラクトース及びスクロースが禁忌な疾患を有する患者に対する栄養補給。
【０１７４】
特徴：牛乳タンパク質アレルギーまたは感受性の症状を避けるために大豆タンパク質単離物；ラクトース関連下痢を避けるためにラクトースを含まない処方（炭水化物ソースはＰｏｌｙｃｏｓｅ（登録商標）  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒである）；スクロースに耐性できない患者のためにスクロースを含まない；浸透性下痢の危険を減らすために低オスモル濃度（１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）；鉄欠乏の予防を助けるために１．８ｍｇ／１００ｃａｌの鉄（硫酸第一鉄として）；推奨レベルのビタミン及びミネラル；推奨レベルの必須脂肪酸を与えるために植物油；乳白色でミルクに似たコンシステンシー及び気持ちのよい臭い。
【０１７５】
成分：（Ｐａｒｅｖｅ）水７５％、水解コーンスターチ１１．８％、大豆油４．１％、大豆タンパク質単離物４．１％、ヤシ油２．８％、改質コーンスターチ１．０％、第三リン酸カルシウム０．３８％、クエン酸カリウム０．１７％、塩化カリウム０．１３％、モノ−及びジグリセリド、大豆レシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラゲナン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１７６】
Ｄ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）鉄入り調製豆乳，用時栄養補給される，２０Ｃａｌ／ｆｌ  ｏｚ：
使用：大豆栄養補給が所望されるとき。
【０１７７】
成分：（Ｐａｒｅｖｅ）水８５％、コーンシロップ３．６％、糖（スクロース）２．６％、大豆油２．１％、大豆タンパク質単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ−及びジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１７８】
Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）乳児用調製乳：
使用：乳児用調製乳が必要な時；１才前に母乳の断乳を決断するとき、母乳への補充が必要なとき、または母乳を与えていないときの日常的な栄養補給として。
【０１７９】
特徴：良好な成長のために適切な品質及び量のタンパク質；ミルクに関連する腸出血ロスの危険を減らすために熱変性；容易に吸収される必須リノール酸を与える（二重ホモジナイズした）植物油のブレンド由来の脂肪；母乳に類似の比率のラクトースとしての炭水化物；発達中の臓器に対するストレスを最小限とするために低腎溶質負荷(renal solute load)；粉末、濃縮液体及び用時栄養補給形態。
【０１８０】
成分：（−Ｄ）水、脱脂乳、ラクトース、大豆油、ヤシ油、モノ−及びジグリセリド、大豆レシチン、アスコルビン酸、カラゲナン、塩化コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、ニコチンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１８１】
Ｆ．未熟児用Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）  ＮｅｏＣａｒｅ鉄入り調製乳：
使用：未熟児の退院後の特殊栄養要求量のため。Ｓｉｍｉｌａｃ  ＮｅｏＣａｒｅは巻き返し成長を促進し、発達をサポートするために必要な追加のカロリー、タンパク質、ビタミン及びミネラルを未熟児に与えるように開発された栄養的に完全な調製乳である。
【０１８２】
特徴：カロリー及びビタミン補給のための必要量を減らす。従来の調製乳（２０Ｃａｌ／ｆｚ  ｏｚ）よりも高カロリー（２２Ｃａｌ／ｆｚ  ｏｚ）；未熟児の特殊な消化要求量を満たすのを助けるために中鎖トリグリセリド（ＭＣＴｏｉｌ）を含む高吸収脂肪ブレンド；栄養サポートを開始する入院を延長するために１００カロリーあたり高レベルのタンパク質、ビタミン及びミネラル；改善された骨鉱化作用のためにより多くのカルシウム及びリン。
【０１８３】
成分：−Ｄ  コーンシロップ固体、脱脂乳、ラクトース、ホエータンパク質濃縮物、大豆油、高オレフィンサフラワー油、分画化ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、ヤシ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、塩化コリン、パルミチン酸アスコルビル、Ｌ−カルニチン、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、ニコチンアミド、混合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、ビタミンＡパルミテート、β−カロテン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１８４】
Ｇ．Ｓｉｍｉｌａｃ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｒｅ低鉄含量の母乳強化剤，用時使用される，２４Ｃａｌ／ｆｌ  ｏｚ：
使用：低出生時体重乳児に対して人乳と混合するかまたは人乳と一緒に供給するように設計。
【０１８５】
成分：−Ｄ  水、脱脂乳、水解コーンスターチ、ラクトース、分画化ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、ホエータンパク質濃縮物、大豆油、ヤシ油、第三リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノ−及びジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化コリン、ｍ−イノシトール、タウリン、ニコチンアミド、Ｌ−カルニチン、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、塩化カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二銅、リボフラビン、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、ビオチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンＤ３、亜セレン酸ナトリウム及びシアノコバラミン。
【０１８６】
本発明の各種ＰＵＦＡは上記した乳児用調製乳及び当業界で公知の他の乳児用調製乳に置換及び／または添加され得る。
【０１８７】
ＩＩ．栄養製剤
Ａ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）：
使用：ＥＮＳＵＲＥは、代用食品として食事と一緒または食事の間に適量使用される経口栄養サプリメントとして主に設計された低残分液体食である。ＥＮＳＵＲＥは、ラクトースもグルテンも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。主として経口サプリメントであるが、経管栄養補給することもできる。
【０１８８】
患者の条件：調整食を用いている患者；栄養的に危険な状態の高齢患者；不随意な体重減少を伴う患者；病気または手術からの回復期の患者；低残分食を必要とする患者。
【０１８９】
成分：−Ｄ  水、糖（スクロース）、マルトデキストリン（コーン）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレインサフラワー油、大豆タンパク質単離物、大豆油、カノラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工香料、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ゲランガム、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム。
【０１９０】
Ｂ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）  ＢＡＲＳ：
使用：ＥＮＳＵＲＥ  ＢＡＲＳは食事の間または食事と一緒に栄養補給の目的で使用される完全にバランスの取れた栄養物である。栄養分が高く、おいしく、他のスナックの代用品である。ＥＮＳＵＲＥ  ＢＡＲＳは＜１ｇ／バーのラクトースを含み、チョコレートファッジブラウニーフレバーはグルテンを含まない（ハニーグラハムクランチフレバーはグルテンを含む）。
【０１９１】
患者の条件：過剰のカロリー、タンパク質、ビタミン及びミネラルを必要とする患者；十分なカロリー及び栄養分を摂取しない患者に対して特に有用；咀嚼及びえん下ができる患者；ピーナッツアレルギーやナッツに対してアレルギーを有する患者には使用不可。
【０１９２】
成分：ハニーグラハムクランチ――高フルクトーンコーンシロップ、大豆タンパク質単離物、ブラウンシュガー、蜂蜜、マルトデキストリン（コーン）、クリスプライス［（粉砕したコメ）、糖（スクロース）、塩（塩化ナトリウム）及び麦芽］、オート麦ふすま、部分水素化綿実油及び大豆油、大豆ポリサッカライド、グリセリン、ホエータンパク質濃縮物、ポリデキストロース、フルクトース、カゼイン酸カルシウム、ココア粉末、人工フレーバー、カノラ油、高オレインサフラワー油、脱脂粉乳、ホエー粉末、大豆レシチン及びコーン油。ナッツ加工施設で製造。
【０１９３】
ビタミン及びミネラル：第三リン酸カルシウム、第二リン酸カリウム、酸化マグネシウム、塩（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、アスコルビン酸、ｏ−リン酸第二鉄、α−トコフェニルアセテート、ニコチンアミド、酸化亜鉛、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マンガン、リボフラビン、β−カロテン、ピリドキシン塩酸塩、モノ硝酸チアミン、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１９４】
タンパク質：ハニーグラハムクランチ――タンパク質ソースは７４％の大豆タンパク質単離物及び２６％の乳タンパク質の混合物である。
【０１９５】
脂肪：ハニーグラハムクランチ――脂肪ソースは部分水素化綿実油及び大豆油７６％、カノラ油８％、高オレインサフラワー油８％、コーン油４％及び大豆レシチン４％の混合物である。
【０１９６】
炭水化物：ハニーグラハムクランチ――炭水化物ソースは高フルクトースコーンシロップ２４％、ブラウンシュガー２１％、マルトデキストリン１２％、蜂蜜１１％、クリスプライス９％、グリセリン９％、大豆ポリサッカライド７％及びオート麦ふすま７％の混合物である。
【０１９７】
Ｃ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮ：
使用：ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮは、食事にカロリー、タンパク質、ビタミン及びミネラルを追加する必要がある患者に対して設計された濃厚な高タンパク質液体食である。代用食品として食事と一緒にまたは食事の間に適量経口栄養サプリメントとして使用され得る。ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮはラクトロスもグルコースも含まず、通常の手術または股関節骨折からの回復期の患者及び圧迫潰瘍の危険のある患者が使用するのに適している。
【０１９８】
患者の条件：カロリー、タンパク質、ビタミン及びミネラルを追加する必要がある患者、例えば通常の手術または股関節骨折からの回復期の患者；圧迫潰瘍の危険のある患者；及び低コレステロール食を使用している患者。
【０１９９】
特徴：飽和脂肪が少ない；一人分あたり６ｇの総脂肪及び＜５ｍｇのコレステロール；リッチでクリーミーな味；タンパク質、カルシウム、及び他の必須アミノ酸及びミネラルの優れたソース；低コレステロール食；ラクトースを含まず、簡単に消化。
【０２００】
成分：
バニラシュプリーム：−Ｄ  水、糖（スクロース）、マルトデキストリン（コーン）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレインサフラワー油、大豆タンパク質単離物、大豆油、カノラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−コフェリルアセテート、ゲランガム、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２０１】
タンパク質：タンパク質ソースは、２種の生物学的価値の高いタンパク質、すなわち８５％のカゼイン酸ナトリウム及びカルシウム及び１５％の大豆タンパク質単離物の混合物である。
【０２０２】
脂肪：脂肪ソースは３種の油、すなわち４０％の高オレインサフラワー油、３０％のカノラ油及び３０％の大豆油の混合物である。ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮ中の脂肪レベルはアメリカン・ハート・アソシエーション（ＡＨＡ）ガイドラインに適合している。ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮ中の脂肪６ｇは総カロリーの２４％にあたり、脂肪の２．６％は飽和脂肪酸、７．９％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来の総カロリーの＜３０％、飽和脂肪酸由来のカロリーの＜１０％、ポリ不飽和脂肪酸由来の総カロリーの＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２０３】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＨＩＧＨ  ＰＲＯＴＥＩＮはマルトデキストリン及びスクロースの組合せを含む。マイルドな甘味料及びフレーバー（バニラシュプレーム、チョコレートロイヤル、ワイルドベリー及びバナナ）に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモン及びオレンジ中のＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ  Ｐａｃｓはフレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０２０４】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：６０％のスクロース及び４０％のマルトデキストリン。
【０２０５】
チョコレート：７０％のスクロース及び３０％のマルトデキストリン。
【０２０６】
Ｄ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）  ＬＩＧＨＴ：
使用：ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴは食事と一緒または食事の間に経口栄養サプリメントとして使用するように設計された低脂肪液体食である。ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴはラクトースもグルテンも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。
【０２０７】
患者の条件：５０％未満の脂肪及びＥＮＳＵＲＥよりも２０％少ないカロリーを含むサプリメント中に過度の栄養を必要としている正常体重及び過体重の患者；適正に摂食せず、過度の栄養を必要としている健康な成人。
【０２０８】
特徴：脂肪及び飽和脂肪が少ない；一人分あたり３ｇの全脂肪及び＜５ｍｇのコレステロールを含む；リッチでクリーミーな味；カルシウム及び他の必須ビタミン及びミネラルの優れたソース；低コレステロール食；ラクトースを含まず、簡単に消化する。
【０２０９】
成分：
フレンチバニラ：−Ｄ  水、マルトデキストリン（コーン）、糖（スクロース）、カゼイン酸カルシウム、高オレインサフラワー油、カノラ油、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、第二リン酸カリウム、第二リン酸マグネシウム、天然及び人工フレーバー、第三リン酸カルシウム、セルロースゲル、塩化コリン、大豆レシチン、カラゲナン、塩（塩化ナトリウム）、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、ニコチンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、ビタミンＡパルミテート、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２１０】
タンパク質：タンパク質ソースはカゼイン酸カルシウム１００％である。
【０２１１】
脂肪：脂肪ソースは２種の油、すなわち高オレインサフラワー油７０％及びカノラ油３０％の混合物である。ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴ中の脂肪レベルはアメリカン・ハート・アソシエーション（ＡＨＡ）ガイドラインに適合している。ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴ中の脂肪３ｇは総カロリーの１３．５％にあたり、脂肪の１．４％は飽和脂肪酸、２．６％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来の総カロリーの＜３０％、飽和脂肪酸由来のカロリーの＜１０％、ポリ不飽和脂肪酸由来の総カロリーの＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２１２】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴはマルトデキストリン及びスクロースの組合せを含む。チョコレートフレバーはコーンシロップも含む。マイルドな甘味料及びフレーバー（フレンチバニラ、チョコレートシュプレーム、ストロベリースウィール）に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモン及びオレンジ中のＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ  Ｐａｃｓはフレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０２１３】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：スクロース５１％及びマルトデキストリン４９％。
【０２１４】
チョコレート：スクロース４７．０％、コーンシロップ２６．５％及びマルトデキストリン２６．５％。
【０２１５】
ビタミン及びミネラル：一人分のＥＮＳＵＲＥ  ＬＩＧＨＴ（８ｆｌ  ｏｚ）は２４個の主要ビタミン及びミネラルに関するＲＤＩの少なくとも２５％を与える。
【０２１６】
カフェイン：カフェインフレーバーは８ｆｌ  ｏｚあたり２．１ｍｇのカフェインを含む。
【０２１７】
Ｅ．ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）：
使用：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳはタンパク質は正常濃度であるが過剰のカロリー及び栄養分が必要であるときに使用するための高カロリーの低残分液体食である。代用食品として食事と一緒または食事の間に適量使用する経口栄養サプリメントとして主に設計されている。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳはラクトースもグルコースも含まない。主として経口栄養サプリメントあるが、経管栄養補給することもできる。
【０２１８】
患者の条件：限られた容量でタンパク質は正常濃度であるが過剰のカロリー及び栄養分が必要である患者；健康体重を得るかまたは保持することが必要な患者。
【０２１９】
特徴：リッチでクリーミーな味；必須ビタミン及びミネラルの良好なソース。
【０２２０】
成分：
バニラ：−Ｄ  水、コーンシロップ、マルトデキストリン（コーン）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、糖（スクロース）、大豆タンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ビタミンＡパルミテート、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０２２１】
タンパク質：タンパク質ソースは２種の生物学的価値の高いタンパク質、すなわちカゼン酸ナトリウム及びカルシウム８４％及び大豆タンパク質単離物１６％の混合物である。
脂肪：脂肪ソースはコーン油１００％である。
【０２２２】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳはマルトデキストリン及びスクロースの組合せを含む。マイルドな甘味料及びフレーバー（バニラ、チョコレート、ストロベリー、コーヒー、バターピーカン及びエッグノッグ）に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモン及びオレンジ中のＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ  Ｐａｃｓはフレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０２２３】
バニラ、ストロベリー、バターピーカン及びコーヒーフレーバー：コーンシロップ３９％、マルトデキストリン３８％及びスクロース２３％。
【０２２４】
チョコレート及びエッグノッグフレーバー：コーンシロップ３６％、マルトデキストリン３４％及びスクロース３０％。
【０２２５】
ビタミン及びミネラル：一人分のＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ（８ｆｌ  ｏｚ）は２５個の主要ビタミン及びミネラルに関するＲＤＩの少なくとも１５％を与える。
【０２２６】
カフェイン：チョコレートフレーバーは８ｆｌ  ｏｚあたり３．１ｍｇのカフェインを含む。コーヒーフレーバーは微量のカフェインを含む。
【０２２７】
Ｆ．ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）  ＨＮ：
使用：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ  ＨＮは高いカロリー及びタンパク質を必要とするかまたは限定量のトレランスを有する患者に対して設計された栄養的に完全な高カロリー／高窒素液体食である。経口栄養補給または経管による完全栄養サポートのために使用され得る。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＬＵＳ  ＨＮはラクトースもグルテンも含まない。
【０２２８】
患者の条件：術後か負傷後のような多量のカロリー及びタンパク質を必要とする患者；限定容量のトレランス及び早期満腹を有する患者。
【０２２９】
特徴：栄養補給または完全栄養のため；経口または経管栄養補給；１．５ＣａＶｍＬ；高窒素；カロリー的に濃い。
【０２３０】
成分：
バニラ：−Ｄ  水、マルトデキストリン（コーン）、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、コーン油、糖（スクロース）、大豆タンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ニコチンアミド、カラゲナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ビタミンＡパルミテート、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０２３１】
Ｇ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）  ＰＯＷＤＥＲ：
使用：（水で再構成される）ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲは食事と一緒または食事の間に使用される経口栄養サプリメントとして主に設計された低残分液体食である。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲはラクトースもグルテンも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。
【０２３２】
患者の条件：調整食を食べている患者；栄養的に危険な状態にある高齢患者；病気／手術からの回復期の患者；低残分食を必要としている患者。
【０２３３】
特徴：便利で簡単に混合される；飽和脂肪が少ない；一人分あたり９ｇの総脂肪及び＜５ｍｇのコレステロール；ビタミン及びミネラルが豊富；低コレステロール食；ラクトースを含まず、簡単に消化。
【０２３４】
成分：−Ｄ  コーンシロップ、マルトデキストリン（コーン）、糖（スクロース）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、大豆タンパク質単離物、人工フレーバー、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、第三リン酸カルシウム、塩化カリウム、大豆レシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、塩酸チアミン、硫酸第二銅、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ビタミンＡパルミテート、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２３５】
タンパク質：タンパク質ソースは２種の生物学的価値の高いタンパク質、すなわちカゼン酸ナトリウム及びカルシウム８４％及び大豆タンパク質単離物１６％の混合物である。
脂肪：脂肪ソースはコーン油１００％である。
【０２３６】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲはコーンシロップ、マルトデキストリン及びスクロースの組合せを含む。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＯＷＤＥＲのマイルドな甘味料に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモン及びオレンジ中のＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ  Ｐａｃｓはフレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０２３７】
バニラ：コーンシロップ３５％、マルトデキストリン３５％及びスクロース３０％。
【０２３８】
Ｈ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）  ＰＵＤＤＩＮＧ：
使用：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＵＤＤＩＮＧは食事と一緒または食事の間に使用される非液体形態でバランスのとれた栄養を与える栄養分に富むサプリメントである。コンシステンシー調整食（例えば、ソフト、ピューレまたは完全な液体）のため、またはえん下困難な患者のために適当である。ＥＮＳＵＲＥ  ＰＵＤＤＩＮＧはグルテンを含まない。
【０２３９】
患者の条件：コンシステンシー調整食（例えば、ソフト、ピューレまたは完全な液体）を使用している患者；えん下困難な患者。
【０２４０】
特徴：リッチでクリーミーなおいしい味；必須ビタミン及びミネラルの良好なソース；冷凍する必要がなく便利；グルテンを含まない。
【０２４１】
５ｏｚあたりの栄養分プロフィール：カロリー２５０、タンパク質１０．９％、全脂肪３４．９％、炭水化物５４．２％。
【０２４２】
成分：−Ｄ  脱脂乳、水、糖（スクロース）、部分水素化大豆油、改質食用スターチ、硫酸マグネシウム、ナトリウムステアロイルラクチレート、第二リン酸ナトリウム、人工フレーバー、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、塩化コリン、ニコチンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃ  イエロー＃５、クエン酸カリウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ＦＤ＆Ｃ  イエロー＃６、葉酸、ビオチン、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２４３】
タンパク質：タンパク質ソースは脱脂乳１００％である。
【０２４４】
脂肪：脂肪ソースは水素化大豆油１００％である。
【０２４５】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＰＵＤＤＩＮＧはスクロース及び改質食用スターチの組合せを含む。マイルドな甘味料及びフレーバー（バニラ、チョコレート、バタースコッチ及びタピオカ）はフレーバー疲労を予防するのを助ける。製品は一人分あたり９．２ｇのラクトースを含む。
【０２４６】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：スクロース５６％、ラクトース２７％及び改質食用スターチ４９％。
【０２４７】
チョコレート：スクロース５８％、ラクトース２６％及び改質食用スターチ１６％。
【０２４８】
Ｉ．ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲ（登録商標）：
使用：ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲは食物繊維及び栄養分を多く取りたいヒトのために設計された繊維を含む栄養的に完全な液体食である。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲは低残分食を必要としないヒトに適している。経口または経管により栄養補給され得、規則的な食事への栄養補給としてまたは適量で代用食品として使用され得る。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲはラクトースもグルコースも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。
【０２４９】
患者の条件：食物繊維及び栄養分を多く取りたい患者。
【０２５０】
特徴：飽和脂肪が少量で、ビタミン及びミネラルが多い新しい調製乳；一人分あたり６ｇの全脂肪及び＜５ｍｇのコレステロールを含む；リッチでクリーミーな味；繊維の良好なソース；必須ビタミン及びミネラルの優れたソース；低コレステロール食；ラクトースもグルテンも含まない。
【０２５１】
成分：−Ｄ  水、マルトデキストリン（コーン）、糖（スクロース）、カゼイン酸カルシウム、オート麦繊維、高オレフィンサフラワー油、カノラ油、大豆タンパク質単離物、コーン油、大豆繊維、第三リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースガム、大豆レシチン、第二リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、天然及び人工フレーバー、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラゲナン、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、ニコチンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、ビタミンＡパルミテート、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２５２】
タンパク質：タンパク質ソースは２種の生物学的価値の高いタンパク質、すなわちカゼイン酸ナトリウム及びカルシウム８０％及び大豆タンパク質２０％の混合物である。
【０２５３】
脂肪：脂肪ソースは３種の油、すなわち高オレインサフラワー油４０％、カノラ油４０％及びコーン油２０％の混合物である。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲ中の脂肪レベルはアメリカン・ハート・アソシエーション（ＡＨＡ）ガイドラインに適合している。ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲ中の脂肪６ｇは総カロリーの２２％にあたり、脂肪の２．０１％は飽和脂肪酸、６．７％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来の総カロリーの≦３０％、飽和脂肪酸のカロリーの＜１０％、ポリ不飽和脂肪酸由来の総カロリーの≦１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２５４】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲはマルトデキストリン及びスクロースの組合せを含む。マイルドな甘味料及びフレーバー（バニラ、チョコレート及びバターピカン）に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモン及びオレンジ中のＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ  Ｐａｃｓはフレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０２５５】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：マルトデキストリン６６％、スクロース２５％、オート麦７％及び大豆繊維２％。
【０２５６】
チョコレート：マルトデキストリン５５％、スクロース３６％、オート麦繊維７％及び大豆繊維２％。
【０２５７】
繊維：ＥＮＳＵＲＥ  ＷＩＴＨ  ＦＩＢＥＲ中に使用される繊維混合物はオート麦繊維及び大豆ポリサッカライドから構成される。この混合物により、８ｆｌ．ｏｚカンあたり全部で約４ｇの食物繊維が与えられる。不溶性／溶解性性の比率は９５：５である。
【０２５８】
上記し、当業者に公知の各種栄養サプリメントを本発明により生成したＰＵＦＡで置換しても及び／または各種栄養サプリメントに本発明により生成したＰＵＦＡを補充してもよい。
【０２５９】
Ｊ．Ｏｘｅｐａ（商標）栄養品
ＯｘｅｐａはＡＲＤＳの危険があるかまたはその状態にある患者の食事管理のために設計された低炭水化物でカロリー的に濃い経腸栄養品である。エイコサペンタエン酸（漁油由来のＥＰＡ）、γ−リノレン酸（ルリヂサ油由来のＧＬＡ）及び高い酸化防止剤レベルを含む油ブレンドを含めた諸成分のユニークな組合せを有する。
【０２６０】
カロリー分布：
カロリー密度は、エネルギー必要量を満たすのに必要な容量を最小限とするために１．５Ｃａｌ／ｍｌ（３５５Ｃａｌ／８ｆｌ  ｏｚ）ほど高い。Ｏｘｅｐａ中のカロリー分布を表Ａに示す。
【０２６１】
【表８】
2005525780.tif 000016
【０２６２】
脂肪：Ｏｘｅｐａは一人分（８ｆｌ  ｏｚ）あたり２２．２ｇの脂肪を含む（９３．７ｇ／Ｌ）；脂肪ソースはカノラ油３１．８％、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）２５％、ルリヂサ油２０％、魚油２０％及び大豆レシチン３．２％の油混合物である；Ｏｘｅｐａの典型的な脂肪酸プロフィールを表Ｂに示す；Ｏｘｅｐａは表Ｂに示すようにポリ不飽和、モノ不飽和及び飽和脂肪酸をバランスよく含む；脂肪ブレンドの２５％を占める中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）は胆汁酸により乳化されることなく腸管に吸収されるので胃内容物排泄を助ける。
【０２６３】
Ｏｘｅｐａ（商標）栄養品の各種脂肪酸成分を本発明により生成したＰＵＦＡで置換しても及び／または本発明により生成したＰＵＦＡを補充してもよい。
【０２６４】
【表９】
2005525780.tif 000017
脂肪酸は全脂肪の約９５％に等しい。
【０２６５】
【表１０】
2005525780.tif 000018
【０２６６】
炭水化物：炭水化物含量は一人分（８ｆｌ  ｏｚ）あたり２５．０ｇである（１０５．５ｇ／Ｌ）；炭水化物ソースはマルトデキストリン（複雑な炭水化物）４５％及びスクロース（単純な炭水化物）５５％であり、これらはいずれも容易に消化、吸収される；Ｏｘｅｐａの高脂肪−低炭水化物含量は二酸化炭素（ＣＯ２）発生を最小限とするように設計されている。高いＣＯ２レベルは人工呼吸器を付けている患者において人工呼吸器の離脱を悪化させる恐れがある；低レベルの炭水化物はストレスによる過血糖を発症している患者にも有用であり得る；Ｏｘｅｐａはラクトースを含まない。
【０２６７】
食物炭水化物、タンパク質由来のアミノ酸及び脂肪のグリセロール部分は体内でグルコースに変換され得る。この過程で、グルコース依存組織（例えば、中枢神経系及び赤血球）の炭水化物要求量が満たされる。しかしながら、炭水化物を含まない食事はケトーシス、組織タンパク質の過剰異化作用、及び流体と電解質の損失を招くおそれがある。これらの影響は、カロリー摂取が十分ならば消化可能な炭水化物を１日５０〜１００ｇ摂取することにより防ぐことができる。Ｏｘｅｐａ中の炭水化物レベルはエネルギー要求量を満たしているならば糖新生を最小限とするのに十分でもある。
【０２６８】
タンパク質：Ｏｘｅｐａは一人分（８ｆｌ  ｏｚ）あたり１４．８ｇのタンパク質を含む（６２．５ｇ／Ｌ）；全カロリー／窒素比率（１５０：１）はストレスを受けている患者の要求量を満たす；Ｏｘｅｐａは同化作用及び呼吸器の問題を呈することなくやせた体を維持するのに十分なタンパク質を与える。高いタンパク質摂取は呼吸不全の患者には問題である。タンパク質はＣＯ２発生に対して殆ど影響を与えないが、高タンパク質食は換気ドライブを高める；Ｏｘｅｐａのタンパク質ソースはカゼイン酸ナトリウム８６．８％及びカゼイン酸カルシウム１３．２％である；Ｏｘｅｐａ中のタンパク質系のアミノ酸プロフィールは国立科学アカデミー(National Academy of Sciences)が設定している高品質タンパク質の基準を満たすかまたはその基準を超えている。
【０２６９】
＊  Ｏｘｅｐａはグルテンを含まない。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】脂肪酸生合成経路及びこの経路におけるΔ４−デサチュラーゼの役割を示す。
【図２Ａ】４種のプラスミド（配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１）より産生されるΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸比較を示す。
【図２Ｂ】４種のプラスミド（配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１）より産生されるΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸比較を示す。
【図３】プラスミドｐＲＴＡ５由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図４】プラスミドｐＲＴＡ６由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
【図５】プラスミドｐＲＴＡ７由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。
【図６】プラスミドｐＲＴＡ８由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。
【図７Ａ】プラスミドｐＲＴＡ５由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図７Ｂ】プラスミドｐＲＴＡ５由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。
【図８Ａ】プラスミドｐＲＴＡ６由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。
【図８Ｂ】プラスミドｐＲＴＡ６由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。
【図９Ａ】プラスミドｐＲＴＡ７由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図９Ｂ】プラスミドｐＲＴＡ７由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図１０Ａ】プラスミドｐＲＴＡ８由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。
【図１０Ｂ】プラスミドｐＲＴＡ８由来のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ  ３４３０４）のΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。
【図１１Ａ】本明細書に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｂ】本明細書に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｃ】本明細書に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｄ】本明細書に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｅ】本明細書に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｆ】本明細書に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｇ】本明細書に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｈ】本明細書に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１１Ｉ】本明細書に記載のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１２】マウス由来のエロンガーゼ遺伝子ＭＥＬＯ４によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１３】Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ  ２８２０９）由来のクローンｓａａ９及びｓａａ５から作成した推定Δ４−デサチュラーゼｓｓａ．ｃｏｎのＤＮＡ配列（配列番号２４）を示す（実施例ＶＩ参照）。
【図１４】Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ  ２８２０９）由来のｓｓａ．ｃｏｎ  ＤＮＡ配列によりコードされる推定Δ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号２５）を示す（実施例ＶＩ参照）。
【図１５】Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ  ２８２０９）由来のｓｓａ．ｃｏｎ  ＤＮＡのオープンリーディングフレームの翻訳から誘導されるアミノ酸（配列番号２５）とｐＲＴＡ７（配列番号６８）のアラインメントを示す（実施例ＶＩ参照）。
【図１６】Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ  ２８２０９）のｐＲＳＡ１由来のΔ４−デサチュラーゼのＤＮＡ配列（配列番号３６）を示す。
【図１７】Ｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ（ＡＴＣＣ  ２８２０９）由来のｐＲＳＡ１  ＳＮＡ配列によりコードされるΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。
【図１８】Ｔ．ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ  ７０９１）のｐＲＴＡ１１由来のΔ４−デサチュラーゼのＤＮＡ配列（配列番号４５）を示す（実施例ＶＩＩ参照）。
【図１９】Ｔ．ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ  ７０９１）由来のｐＲＴＡ１１  ＤＮＡ配列によりコードされる推定Δ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号４６）を示す（実施例ＶＩＩ参照）。
【図２０】クローンｐＲＩＧ６中に存在するＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ（ＣＣＭＰ  １３２３）由来のΔ４−デサチュラーゼのＤＮＡ配列（配列番号４６）を示す（実施例ＩＸ参照）。
【図２１】Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ（ＣＣＭＰ  １３２３）由来のｐＲＩＧ６  ＤＮＡ配列によりコードされるΔ４−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号５５）を示す。
【図２２Ａ】Ｉ．ｇａｌｂａｎａ（ＣＣＭＰ  １３２３）由来の新規Δ４−デサチュラーゼ（配列番号６９）とＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３  ４３０４）由来のΔ４−デサチュラーゼ（配列番号７０）の同一性％を示す。
【図２２Ｂ】Ｉ．ｇａｌｂａｎａ（ＣＣＭＰ  １３２３）由来の新規Δ４−デサチュラーゼ（配列番号６９）とＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３  ４３０４）由来のΔ４−デサチュラーゼ（配列番号７０）の同一性％を示す。
【配列表】
2005525780.tif 000019
2005525780.tif 000020
2005525780.tif 000021
2005525780.tif 000022
2005525780.tif 000023
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2005525780.tif 000049
2005525780.tif 000050
【図１】
2005525780.tif 000051
【図２Ａ】
2005525780.tif 000052
【図２Ｂ】
2005525780.tif 000053
【図３】
2005525780.tif 000054
【図４】
2005525780.tif 000055
【図５】
2005525780.tif 000056
【図６】
2005525780.tif 000057
【図７Ａ】
2005525780.tif 000058
【図７Ｂ】
2005525780.tif 000059
【図８Ａ】
2005525780.tif 000060
【図８Ｂ】
2005525780.tif 000061
【図９Ａ】
2005525780.tif 000062
【図９Ｂ】
2005525780.tif 000063
【図１０Ａ】
2005525780.tif 000064
【図１０Ｂ】
2005525780.tif 000065
【図１１Ａ】
2005525780.tif 000066
【図１１Ｂ】
2005525780.tif 000067
【図１１Ｃ】
2005525780.tif 000068
【図１１Ｄ】
2005525780.tif 000069
【図１１Ｅ】
2005525780.tif 000070
【図１１Ｆ】
2005525780.tif 000071
【図１１Ｇ】
2005525780.tif 000072
【図１１Ｈ】
2005525780.tif 000073
【図１１Ｉ】
2005525780.tif 000074
【図１２】
2005525780.tif 000075
【図１３】
2005525780.tif 000076
【図１４】
2005525780.tif 000077
【図１５】
2005525780.tif 000078
【図１６】
2005525780.tif 000079
【図１７】
2005525780.tif 000080
【図１８】
2005525780.tif 000081
【図１９】
2005525780.tif 000082
【図２０】
2005525780.tif 000083
【図２１】
2005525780.tif 000084
【図２２Ａ】
2005525780.tif 000085
【図２２Ｂ】
2005525780.tif 000086
【国際調査報告】
2005525780.tif 000087
2005525780.tif 000088
2005525780.tif 000089
2005525780.tif 000090