(57)【要約】本発明は、粒子-会合していない核酸及び粒子-会合した核酸の両方が、血漿及び血清中に存在し、並びに病態の評価に使用することができるという発見に関する。
2005525124.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病態を患っていることが疑われるか又は患っていることがわかっている患者において病態を評価する方法であり：
(i)血液試料を、病態を患っていることが疑われるか又は患っていることがわかっている患者から得る工程；
(ii)血液試料から血漿又は血清を単離する工程；
(iii)血漿又は血清を、粒子と会合した核酸及び粒子-会合していない核酸を異なる相対濃度で含む2又はそれよりも多い画分に分離する工程；及び
(iv)1又はそれよりも多い画分中の核酸の量又は濃度又は特徴を決定し、並びに1又はそれよりも多い画分中の核酸の量又は濃度又は特徴を対照と比較することにより、病態を評価する工程を含む、方法。
【請求項２】
核酸は、mRNAである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
mRNAは、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNAである、請求項2記載の方法。
【請求項４】
mRNAが、血小板塩基性蛋白質mRNAである、請求項2記載の方法。
【請求項５】
mRNAは、ヒト胎盤性ラクトゲンmRNAである、請求項2記載の方法。
【請求項６】
mRNAは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットmRNAである、請求項2記載の方法。
【請求項７】
核酸は、DNAである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
DNAは、ミトコンドリアDNAである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
更に核酸を増幅する工程を含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
核酸が、PCR又は逆転写酵素PCRにより増幅される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
核酸は、リアルタイムPCR又はリアルタイム逆転写酵素PCRにより増幅される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
画分が、ろ過により分離される、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
フィルターサイズは、約5μm又はそれよりも小さい、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
フィルターサイズは、約0.22μmである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
フィルターサイズは、約0.45μmである、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
画分は、遠心により分離される、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１７】
遠心が、超遠心である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
病態が、癌、卒中及び外傷からなる群より選択される、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
癌が、肝細胞癌又は鼻咽喉癌である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
患者が妊娠しており、且つ患者又は患者の胎児の病態又は生理的状態を評価する方法が、患者又は患者の胎児の検出、モニタリング、予後又は処置を補助する、請求項1〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
肝細胞癌又は鼻咽喉癌を有する疑いがあるか、又は有することがわかっているか、又は有するリスクがある患者の病態を評価する方法であり：
(i)肝細胞癌又は鼻咽喉癌を有することが疑われるか又は有することがわかっている患者から血漿又は血清の試料を得る工程；及び
(ii)試料中のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)核酸の量を検出する工程を含む、方法。
【請求項２２】
外傷を患っている疑いがあるか、又は外傷を患っていることがわかっている患者の病態を評価する方法であり：
(i)外傷を患っている疑いがあるか、又は外傷を患っていることがわかっている患者から血漿又は血清の試料を得る工程；及び
(ii)試料中のミトコンドリア核酸の量又は濃度を検出する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、粒子と会合していない核酸及び粒子と会合している核酸の両方が血漿及び血清中に存在し、そして病態を評価するために使用することができることの発見に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
世界中の患者の疾患の検出、予後判定、診断、モニタリング及び治療を補助するために、患者における病態を簡単及び正確に評価する新規方法が必要である。
【０００３】
患者の血漿又は血清中の循環血核酸は、ある種の病態に関連があることが最近発見された(Lo YMDら、N. Eng. J. Med.、339:1734-8 (1998)；Lo YMDら、Lancet、350:485-7 (1997)；Lo YMDら、Am. J Hum Genet、62:768-75 (1998)；Chen XQら、Nat Med、2:1033-5 (1996)；Nawroz Hら、Nat Med、2:1035-7 (1996)；Lo YMDら、Lancet、351:1329-30 (1998)；Lo YMDら、Clin Chem、46:319-23 (2000))。現在、循環血核酸の特徴及び生物学的起源についてはほとんどわかっていない。しかし、アポトーシスを含む細胞死は主要な要因のひとつである可能性がある(Fournieら、Gerontology、39:215-21 (1993)；Fournieら、Cancer Lett、91:221-7 (1995))。理論に縛られずに、アポトーシスを受けている細胞は核酸をアポトーシス小体に配置するので、ヒト対象の血漿又は血清中の循環血核酸の少なくとも一部は、会合された粒子である可能性もある。本出願において、最初に、循環血核酸は、ヒト対象の血漿及び血清中において粒子-会合型及び粒子-非会合型の両方で存在することが明らかにされている。同じく対象の血漿又は血清中に存在する循環血核酸をそれらの粒子-会合型及び粒子-非会合型に分離することにより、病態を簡単及び正確に評価することができることも明らかにされている。
【発明の開示】
【０００４】
発明の簡単な概要
本発明は、病態に罹患した疑いのあるか又は罹患したことがわかっている患者において病態を評価する方法を提供する。本発明のひとつの態様において、本発明は、病態に罹患した疑いのあるか又は罹患したことがわかっている患者から血液試料を得ること、血液試料から血漿又は血清を単離すること、血漿又は血清を粒子-会合した及び粒子-会合していない核酸を異なる相対濃度で含む2又はそれよりも多い画分へ分離すること、並びに1又はそれよりも多い画分中の核酸の量又は濃度又は特徴を決定することにより病態を評価し、及び1又はそれよりも多い画分の核酸の量又は濃度又は特徴を対照と比較することを含む。
【０００５】
本発明のひとつの局面において、核酸はmRNAである。ひとつの態様において、mRNAは、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNAである。第二の態様において、mRNAは血小板塩基性蛋白質(PBP)mRNAである。第三の態様において、mRNAはヒト胎盤性ラクトゲン(hPL)mRNAである。第四の態様において、mRNAは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ-サブユニット(βhCG)mRNAである。
【０００６】
本発明の第二の局面において、核酸はDNAである。ひとつの態様において、DNAはミトコンドリアDNAである。
【０００７】
本発明の第三の局面において、病態に罹患したことが疑われるか又は罹患したことがわかっている患者において病態を評価する方法は、更に核酸を増幅する工程を含む。ひとつの態様において、核酸は、PCRにより増幅される。第二の態様において、核酸は、逆転写酵素PCRにより増幅される。第三の態様において、核酸は、リアルタイムPCRにより増幅される。第四の態様において、核酸は、リアルタイム逆転写酵素PCRにより増幅される。
【０００８】
本発明の第四の局面において、血漿又は血清は、ろ過により2又はそれよりも多い画分へ分離される。ひとつの態様において、フィルターサイズは、約5μm又はそれよりも小さい。第二の態様において、フィルターサイズは、約0.22μmである。第三の態様において、フィルターサイズは、約0.45μmである。
【０００９】
本発明の第五の局面において、血漿又は血清は、遠心により2又はそれよりも多い画分へ分離される。ひとつの態様において、遠心は、超遠心である。
【００１０】
本発明の第六の局面において、評価されるべき病態は、癌、卒中及び外傷からなる群より選択される。ひとつの態様において、癌は、肝細胞癌又は鼻咽喉癌である。
【００１１】
本発明の第七の局面において、患者は妊娠しており、及び患者又は患者の胎児の病態もしくは生理的状態を評価する方法は、患者又は患者の胎児の検出、モニタリング、予後判定又は処置を補助する。
【００１２】
本発明は、肝細胞癌又は鼻咽喉癌を有することが疑われるか又は有することがわかっているか又は有するリスクがある患者の病態を評価する方法も提供する。この方法は、肝細胞癌又は鼻咽喉癌を有することが疑われるか又は有することがわかっている患者から血漿又は血清の試料を得、並びに試料中のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)核酸の量を検出することを含む。
【００１３】
本発明は、外傷に罹患したことが疑われるか又は外傷に罹患したことがわかっている患者の病態を評価する方法も提供する。この方法は、外傷に罹患したことが疑われるか又は外傷に罹患したことがわかっている患者から血漿又は血清の試料を得ること、並びに試料中のミトコンドリア核酸の量又は濃度を検出することを含む。
【００１４】
理解されるように、本発明の方法は、患者からの試料を得る能動的な工程を伴わずに、患者から先に得られた試料(例えば、血液試料)について、もしくはそれらから単離された試料(例えば、血漿又は血清試料)について実行してもよい。従って本発明は、患者に直接行われる任意の工程を除外してもよい。
【００１５】
理解されるように、本発明の様々な方法、局面及び態様は、他の点で状況が明確に必要とする場合を除き、組合せることができる。
【００１６】
定義
語句「病態の評価」は、患者の病態を評価することを意味する。例えば、患者の状態の評価は、患者における疾患の存在又は非存在を検出することを含むことができる。一旦患者における疾患の存在が検出されたならば、患者の病態の評価は、患者における疾患の重症度を決定することを含むことができる。これは更に、例えば、寿命の推定又は処置計画のような疾患の予後判定を行うためにその決定を用いることを含む。患者の状態の評価は、患者が最早病態を有さないが、しかし過去にその病態に罹患したことの検出も含むことができる。その時点における病態の評価は、病態の再発の可能性を決定することもしくは患者の再発をモニタリングすることも含む。例えば、互いに数分以内、数時間以内、数日以内に生じる2つの急性虚血性事象を検出する。病態の評価は、患者の疾患徴候をモニタリングすることを含む。従って病態の評価は、患者における病態の検出、診断、モニタリングに加え、患者の予後判定又は処置計画を決定することを含む。病態を評価する方法は、リスクの層別化を補助する。
【００１７】
血漿は、抗凝固剤により処理した血液の遠心分離から生じた全血の画分を意味する。血清は、血液試料の凝固後に残る液体の水っぽい部分を意味する。
【００１８】
本発明において使用される語句「対照に対し1又はそれよりも多い画分において核酸の量又は濃度又は特徴を比較する」は、標準に対し1又はそれよりも多い画分中の核酸の量又は濃度又は特徴を比較することと同等である。語句「1又はそれよりも多い画分中の核酸の量又は濃度又は特徴を比較する」は、画分間比較を行うことを含むこともできる。循環血核酸は、粒子-会合型及び粒子-非会合型の両方中の健常者(healthy patient)及び病気の患者の両方の血漿又は血清中に存在する。健常対象におけるより早期に患者から採取した試料中の、又は別の罹患した個人から採取した試料中における、粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の相対濃度に対し、疾患を有することが疑われるか、疾患を有することがわかっているか又は疾患を有するリスクのある患者において粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の相対濃度を比較することにより、病態を評価することが可能である。画分間比較を行うことにより、病態を評価することも可能である。本発明の一部の態様において、対照は、第二の試料ではないが、しかし代わりに健常として又は様々な病態、例えば外傷及び癌に罹患したとして分類された様々な個人からのデータの平均である。集められたデータは、疾患の重症度、予後判定又は診断に対する、血液中の粒子と会合していない核酸の様々なレベル又は濃度に対応させることができる。例えば、本発明の方法を使用し、当業者は、個人の画分A中の粒子と会合していない核酸の量又は濃度を、対照と比較し、並びに試料を得た個人における疾患の存在又は非存在を決定することができる。当業者は、病型又は病期を決定するために、この比較を使用することもできる。当業者は、疾患重症度を決定するか又は患者寿命を推定するために、この比較を使用してもよい。当業者は、患者における病態のリスク層別化、モニタリング又は処置を補助するためにこの比較を使用することもできる。
【００１９】
血漿又は血清中に存在する循環血核酸は、「粒子と会合した」及び「粒子と会合していない」のふたつの型で存在することができる。粒子と会合した核酸は、粒子の内側に含まれるか又は付着されるか又は粒子の表面へもしくは表面上に連結された核酸として定義される。用語「粒子」は、直径0.1μm〜5μmの有限サイズを有することが物理的手段により証明され得る物質、又は5μmフィルターを使用する前ろ過後に超遠心によりペレット化可能である物質として定義される。直径が5μmよりも大きいサイズは、無傷の細胞を含み、従って本発明からは除外される。粒子と会合した核酸のサイズを決定するために使用される物理的手段は、遠心、超遠心、沈降、ろ過、光学顕微鏡又は電子顕微鏡を含むが、これらに限定されるものではない。従って用語「粒子と会合した核酸」は、この核酸はサイズ0.1μm〜5μmの粒子結合している又は超遠心によりペレット化可能であるものという条件で、血漿又は血清中に存在する細胞外及び細胞内の両方の核酸を含む。例えば、細胞外核酸は、リボソーム、脂質又はプロテオリピドに複合してもよい。これらは、蛋白質と結合しているか又はアポトーシス小体内にあることができる。用語「粒子と会合した核酸」は、リボソーム、脂質又はプロテオリピドに複合されたそれらの細胞外核酸も含むことができる。本発明の目的のために、アポトーシス小体内の核酸は、結合した核酸複合体がサイズ0.1μm〜5μmである限りは、用語「粒子と会合した核酸」内に含まれる。従って、本発明の目的に関して、粒子と会合した核酸は、細胞残存物(巨核球から遊離されている血小板を含むが、これらに限定されるものではない。)内である血流中を循環している核酸、細胞残存物に複合された核酸、もしくはミトコンドリアを含むがこれらに限定されるものではない細胞小器官に会合された核酸、又はアポトーシス小体に会合された核酸、もしくはサイズ0.1μm〜5μmである他の粒子に結合された核酸である。粒子と会合していない核酸は、細胞残存物又はアポトーシス小体には複合されていないが、サイズが約0.1μmよりも小さい粒子には複合され得るような循環血核酸である。本発明の目的に関して、粒子-会合していない核酸は、5μmフィルターを通るろ過後の超遠心によりペレット化されないような循環血核酸も含む。
【００２０】
「核酸」は、1本鎖又は2本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、並びに特に限定されない限りは、天然のヌクレオチドと同様に機能することができる天然のヌクレオチドの公知のアナログを包含するであろう。
【００２１】
本願明細書において使用される語句「血漿又は血清の試料」は、対象から得られた血漿又は血清の試料を意味する。この試料は、疾患を伴うか又は疾患を有する疑いのある患者又は妊娠のような医学的注意が必要な生理学的状態(「患者」)から得た試料である「臨床検体」であることが多い。最初に患者から得られた試料は、血漿又は血清以外の追加成分を含有し得る。例えば、試料は、最初にその血漿又は血清成分に精製された全血試料であってよい。「新鮮な」血漿又は血清、又は凍結(保存し)及び引き続き解凍した血漿又は血清のいずれかを、本発明の方法に使用することができる。凍結(保存した)血漿又は血清は、解凍及び使用時まで、-20〜-70℃の貯蔵条件で最適に維持されなければならない。
【００２２】
用語「特異的にハイブリダイズする」又は「特異的なハイブリダイズをする」の単数及び複数での表記は、オリゴヌクレオチド(例えば、プライマー又は標識されたプローブ)と標的配列の間の相補的ハイブリダイゼーションを意味する。用語「特異的に」は、PCRポリメラーゼの所望のプライミング又はハイブリダイゼーションシグナルの検出を実現するように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを低下することにより、順応することができる小さいミスマッチを包含している。
【００２３】
用語「オリゴヌクレオチド」は、プライマー、プローブ、及び他の核酸断片のような、2又はそれよりも多いデオキシヌクレオチド又はリボヌクレオチドで構成された分子を意味する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、多くの要因及びそのオリゴヌクレオチドの最終的な機能もしくは用途により左右される。オリゴヌクレオチドの「付加」は、オリゴヌクレオチドの別の核酸分子への連結を意味する。典型的には、オリゴヌクレオチドの付加は、DNAリガーゼを使用するオリゴヌクレオチドのライゲーションにより実行される。
【００２４】
用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわち、適当な緩衝液中及び適当な温度での4種の異なるヌクレオシド三リン酸及び重合のための物質(例えばDNAポリメラーゼ又は逆転写酵素)の存在下での、DNA合成の開始点として作用することが可能である、天然又は合成のいずれかの、オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、好ましくは、1本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド配列である。プライマーの適当な長さは、プライマーの意図された用途に応じて決まるが、典型的には約15〜約30ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定したハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度が必要である。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型と特異的にハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。
【００２５】
「プローブ」は、標的核酸の部分配列に相補的な塩基対形成を通じて結合するオリゴヌクレオチドを意味する。当業者により、プローブは、典型的にはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じ、プローブ配列と完全な相補性を欠いている標的配列に実質的に結合することは理解されるであろう。これらのプローブは、典型的には直接標識されるか(例えば、同位体もしくは蛍光部分)又はジゴキシゲニンもしくはビオチンにより間接的に標識される。プローブの存在又は非存在に関するアッセイにより、標的の存在又は非存在を検出することができる。
【００２６】
核酸は、特定されたように、1本鎖もしくは2本鎖であるか、又は2本鎖化もしくは1本鎖化された両配列の一部を含む。1本鎖の叙述は、相補鎖の配列も定義し；従って、本願明細書に説明された配列は、この配列の相補物も提供する。この核酸は、DNA、ゲノム及びcDNAの両方、RNA又はハイブリッドであることができ、ここでこの核酸は、デオキシリボ-及びリボ-ヌクレオチドの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の組合せを含む。「転写物」は、典型的には天然のRNA、例えばプレ-mRNA、hnRNA、又はmRNAを意味する。本願明細書において使用される用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチド及びヌクレオシド及びヌクレオチドアナログ、並びにアミノ修飾されたヌクレオシドなどの修飾されたヌクレオシドを含む。加えて、「ヌクレオシド」は、天然でないアナログ構造を含む。従って、例えば、各々塩基を含むペプチド核酸の個々の単位が、本願明細書においては、ヌクレオシドと称される。
【００２７】
語句「選択的(又は特異的)にハイブリダイズする」は、その配列が、複雑な混合物(例えば、全細胞又はライブラリーDNAもしくはRNA)中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、二重鎖化、又はハイブリダイズを意味する。
【００２８】
用語「実質的に同一」は、2又はそれよりも多いヌクレオチド配列が、それらの配列の大半を共有していることを示している。一般に、これは、それらの配列の少なくとも約90％、及び好ましくはそれらの配列の約95％であろう。配列は実質的に同一である別の指標は、これらがストリンジェントな条件下で同じヌクレオチド配列にハイブリダイズするかどうかである(例えば、Sambrook及びRussell編集、「A Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第3版、第1-3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、2001年；及び、「Current Protocols in Molecular Biology」、Ausubel編集、John Wiley & Sons社、NY、1997年参照)。ストリンジェントな条件は、配列-依存型であり、及び異なる状況においては異なるであろう。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びpHで、特定の配列の融解温度(Tm)よりも約5℃(又はそれ未満)低いように選択される。DNA二重鎖のTmは、ヌクレオチドの50％が対形成する温度として定義され、並びにDNA融解時の分光学的吸光度上昇シフトの中間点に相当する。Tmは、二重ヘリックスからランダムコイルへの移行を示す。
【００２９】
典型的には「ストリンジェントな条件」は、塩濃度が、pH7で0.2xSSCであり及び温度は低くとも約60℃である条件であろう。例えば、本発明の核酸又はそれらの断片は、ストリンジェントな条件下で、本願明細書に開示された核酸を用いる、標準フィルターハイブリダイゼーションにおいて同定することができ、これはこの開示の目的のためには、温度が低くとも約60℃、通常約65℃、時には70℃で20分間の、又は同等条件での、0.2xSSC中での少なくとも1回の洗浄(通常2回)を含む。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)について、Tmよりも約5℃低いアニーリング温度は、低ストリンジェンシー増幅について典型であるが、プライマー長及びヌクレオチド組成に応じて、アニーリング温度は、約32℃〜72℃を変動することができ、例えば40℃、42℃、45℃、52℃、55℃、57℃又は62℃であるか、又は高ストリンジェンシーPCR増幅に関しては、プライマーTmの、又はそれよりもわずかに(最大5℃)高い温度が典型であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマー及び緩衝液の条件に応じて、約50℃〜約72℃の範囲であることができ、多くは72℃である(Ahsenら、Clin. Chem.、47:1956-61 (2001))。高及び低の両方のストリンジェンシー増幅の典型的サイクル条件は、90℃〜95℃で30秒〜2分間の変性相、30秒〜2分間維持されるアニーリング相、及び約72℃で1〜6分間の伸長相を含む。
【００３０】
2又はそれよりも多い核酸に関連して、用語「同一」又は「％同一性」は、同一であるか又は同一であるヌクレオチドの特定の割合を有する、2又はそれよりも多い配列又は部分配列を意味する(すなわち、比較ウインドウにわたり最大対応となるよう比較及び並置した場合の特定の領域、又は以下に説明するデフォルトのパラメータでのBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いるか、もしくは手作業の並置及び目視により測定された場合の指定された領域にわたり、約70％同一性、好ましくは75％、80％、85％、90％、又は95％同一性)。従ってこのような配列は、「実質的に同一である」と称される。この定義は、試験配列の相補体も意味する。好ましくは、この同一性は、少なくとも約15、20又は25個のヌクレオチド長である領域について、又はより好ましくは50〜100個のヌクレオチド長である領域について存在する。
【００３１】
配列比較について、典型的にはひとつの配列は、それに対し試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列は、コンピューターに入力され、部分配列の座標(coordinate)が必要であるならば指定され、及び配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータを使用することができるか、又は別のパラメータを指定することができる。その後配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータを基に、参照配列に対する試験配列に関する％配列同一性を計算する。
【００３２】
本願明細書において使用される「比較ウインドウ」は、その配列を、ふたつの配列が最適に並置された後に相接位置の同数の参照配列と比較することができるような、15〜600(一般には約20〜約200、又はより一般には約50〜約150)からなる群より選択される相接位置の数のいずれかひとつのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えばSmith及びWaterman(Adv. Appl. Math.、2:482 (1981))のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Needleman及びWunsch(J. Mol. Biol.、48:443 (1970))のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Pearson及びLipman(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:2444 (1988))の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行(Wisconsin Genetics Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTPASTA、Genetics Computer Group 575 Science Dr., Madison, WI)により、又は手作業による並置及び目視(例えば、「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubelら編集、1995年、補遺)参照)により、行うことができる。
【００３３】
％配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムであり、これは各々、Altschulらの論文(Nuc. Acids Res.、25:3389-3402 (1977))及びAltschulらの論文(J.Mol. Biol.、215:403-410 (1990))に記載されている。BLAST及びBLAST 2.0は、ここに説明されたデフォルトのパラメータと共に使用され、ここに説明された核酸の％配列同一性を決定する。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、米国遺伝子情報センター(NCBI)により公開されている。このアルゴリズムは、データベース配列の同じ長さのワードと並置した場合にマッチする又は一部の正-値化された閾値スコアTを満足のいずれかするクエリー配列における長さWのショートワードを同定することにより、高スコアリング配列対(HSP)を最初に同定することに関係しているTは、隣接ワードスコア閾値と称される(Altschulら、前掲)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見つけるために検索を開始するための種として作用する。これらのワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限りは、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータM(マッチする残基の対に関するリワードスコア；常に＞0)及びN(マッチしない残基に関するペナルティスコア；常に＜0)を用い計算される。各方向へのワードヒットの延長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大の到達値から量Xだけ減少した場合；累積スコアが、1又はそれよりも多い負の-スコア化残基アラインメントの累積により、ゼロもしくはそれ以下になった場合；又は、いずれかの配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメータW、T及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列に関して)は、デフォルトとしてワード長(W)11、期待値(E)10、M＝5、N＝4及び両鎖比較を使用する。
【００３４】
BLASTアルゴリズムは、ふたつの配列の間の類似性の統計解析を行うこともできる(例えば、Karlin及びAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:5873-5787 (1993)参照)。BLASTアルゴリズムにより提供された類似性のひとつの測定は、最小合計尤度(P(N))であり、これはふたつのヌクレオチド配列間のマッチが偶然生じる尤度の指標を提供する。例えば、試験核酸の参照核酸との比較において、最小合計尤度が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、及び最も好ましくは約0.001未満である場合、この核酸は、参照配列に類似していると見なされる。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、循環血核酸は、健常対象及び罹患した患者の血漿又は血清中において粒子-会合型及び粒子-非会合型の両方で存在し、そして病態を評価するために使用することができるという驚くべき発見に関する。本発明のひとつの局面において、血漿又は血清の粒子-会合した及び粒子-会合していない核酸を異なる相対濃度で含む2又はそれよりも多い画分への分離、続いて、これらの画分からの核酸の抽出の後、患者及び対照からの血漿又は血清試料中に存在する粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の相対濃度を比較することができる。ふたつの試料の間の濃度差は、更に病態を評価するために使用することができる。本発明の方法は、妊婦又はその胎児のいずれかの疾患又は状態の評価のための、妊婦の血漿又は血清中の核酸の検出及び定量も提供する。
【００３６】
患者の血漿又は血清中を循環している核酸を画分に分離することを、病態の診断、検出、処置、予後判定及びモニタリングの補助に使用することができることは特に驚くべきことである。全核酸の増加したレベルは、ある種の疾患の指標となり得ることはわかっているが、循環血核酸を、粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の異なる濃度を伴う画分に分離することにより、病態を更に評価することができることは明らかにされていない。特に循環血核酸の合計レベルが疾患の指標ではないような病態について、粒子と会合していない画分中の核酸の相対濃度は、疾患の指標であることができ、そして更なる疾患の評価に使用することができることは示されていない。
【００３７】
患者集団の選択
本発明は、病態に罹患したことが疑われるか、罹患したことがわかっているか、又は罹患するリスクがある患者において病態を評価する方法を提供する。病態は、個人の血漿又は血清中を循環している粒子と会合していない核酸及び粒子と会合した核酸の増加により示されるいずれかの病態を含む。個人の血漿又は血清中を循環している粒子と会合していない核酸又は粒子-会合した核酸の増加した濃度により示された疾患は、異常なレベルの細胞死により特徴付けられる疾患、例えば、アポトーシスの不適切な活性化に関連した疾患を含むが、これらに限定されるものではない。アポトーシスの不適切な活性化は、例えば、後天性免疫不全症候群(AIDS)、神経変性疾患、子癇前症、アルツハイマー病及び虚血性損傷を含むが、これらに限定されるものではない様々な病的状態の原因となることができる。癌、子癇前症、外傷、心筋梗塞、卒中、及び加齢のような状態は、異常なレベルの細胞死により特徴付けることができる。標準の方法、例えば臨床検査、検査室的精密検査(laboratory workup)などを使用し、患者が、例えば、AIDS、神経変性疾患、虚血性損傷、外傷、癌などの異常なレベルの細胞死に関連した病態を患っているか又は罹患のリスクがあるかどうかを決定する。
【００３８】
本発明は、妊婦又は妊婦の胎児の病態を評価する方法も提供する。女性が妊娠していることの決定は、当該技術分野において公知の標準技術により行うことができる。
【００３９】
本発明は、肝細胞癌又は鼻咽喉癌を有する疑いのある、有することがわかっている又は有するリスクのある患者において、病態を評価する方法も提供する。肝細胞癌又は鼻咽喉癌の患者は、熟練した医師により同定可能な病理スペクトルを有することがある。肝細胞癌又は鼻咽喉癌の診断は、臨床的、放射線的、内視鏡、又は検査室的精密検査を基に行うことができる。
【００４０】
本発明は、患者における外傷を評価する方法を提供する。外傷は、年間数百万の命が奪われる世界的問題である。外傷による損傷後数日又は数週間後に死亡するヒトに相当する晩発性死亡は、通常敗血症又は多臓器不全症候群(MODS)の結果生じる。最初の傷害は、重度の外傷の後の全身性炎症反応の引き金をひき、及び続発する傷害、例えば、攻撃的蘇生法、手術、又は敗血症は、事実上肺、肝臓、腎臓、脳、胃腸管及び血液系に関連した臓器不全につながると考えられている。抗炎症的介入は、患者の生存率に関して失望する結果を生じることが多い。ひとつの可能性のある理由は、MODSの晩発性発症を防ぐために可能性のある効果的介入を適用することができるように、初期に高リスクの外傷性患者を正確に同定することが不可能であることである。本発明は、外傷を有することが疑われる、有することがわかっている又は有するリスクがある患者において病態を評価する方法を提供する。当該技術分野において公知の標準の臨床的、放射線的、又は検査室的精密検査を使用し、医師は、患者は、外傷を患っているか又は患っているリスクがあるという最初の決定を行い、及び外傷性状態の更なる評価のために本発明の方法を使用するであろう。
【００４１】
血液試料の採取
血液試料は、本発明において説明された患者から得られる。血液は、標準方法により、血清調製のための抗凝固剤を伴わないか、又はEDTA、クエン酸ナトリウム又はヘパリンのような抗凝固剤を伴う、採血チューブ、例えばシリコン処理したガラスチューブに採取される。好ましい態様において、全血からの血漿又は血清の分画は、凍結前に行われる。新鮮な血漿の分画は、標準方法により行うことができ、例えば、新鮮な血漿又は血清は、公知の方法に従う遠心分離により、全血液から分画することができる。好ましい態様において、アポトーシス小体が血漿又は血清から分画除去されないように、遠心分離は穏やかである。本発明の一部の態様、例えば、RT-PCRによるRNAの増幅について、ヘパリン処理された血液をヘパリナーゼで前処理することが好ましい。
【００４２】
核酸抽出
核酸は、血漿又は血清から、例えば、ゼラチン抽出、シリカ、ガラスビーズ又は珪藻土抽出、グアニジンもしくはグアニジニウム-ベースの抽出、化学抽出法、又はサイズ排除もしくはアニオン交換クロマトグラフィー法のような、当該技術分野において公知の標準抽出方法を用い抽出することができる(米国特許第6,329,179号及び国際公開公報第01/42504号参照)。核酸、例えばDNAは、「Blood and body fluid protocol」に従い、QlAamp Blood Kitを製造業者の指示に従い用い抽出することもできる(Chen XQら、Nat. Med.、2:1033-5 (1996))。
【００４３】
ひとつの方法において、核酸は、Fournieらの方法を改変した方法により、ゼラチンを用い血漿又は血清から沈殿される(Anal. Biochem.、158:250-256 (1986))。ゼラチン溶液は、ゼラチンを水と混合し、この混合物をオートクレーブにかけ、そしてこれを0.2μmのフィルターを通してろ過することにより調製される。得られる溶液は、ドライアイス／エタノール浴において逐次凍結され、室温で解凍される。0.3％ゼラチン溶液は、得られる溶液を用い調製される。血漿又は血清は、EDTA、滅菌水と混合され、及び乳化される。遠心分離後、水相を除去し、そして透明なチューブに移される。DNAは、0.3％ゼラチン溶液及びエタノールの添加、それに続く-20℃でのインキュベーションにより、沈殿される。
【００４４】
別の方法において、核酸は、濃縮法において抽出されるか、又は抽出された核酸は更に、プローブ特異的ハイブリダイゼーションを用い濃縮され、ここで該ハイブリダイゼーションプローブは、例えば、ナイロン又は磁気ビーズのような基体へ固定されており、そこから例えば望ましくない核酸のような夾雑している種は、例えば、ストリンジェントな洗浄のような、公知の方法を用い除去することができる。他の抽出方法は、磁界又は電界を使用することを含む。
【００４５】
更に別の方法において、核酸は、血清又は血漿を、温度約90℃〜約100℃で、最大約20分間加熱することにより、血清又は血漿から抽出することができる。
【００４６】
循環血核酸は、Boomらの方法又は適合された方法のような、ガラスビーズ、シリカ粒子又は珪藻土を用い、血漿又は血清から抽出することができる(Boomら、J. Clin. Microbiol.、29:1804-1811(1991)；Boomら、J. Clin. Microbiol.、28:495-503 (1989))。血漿又は血清は、公知の方法により作成されたシリカ懸濁液と混合される。その後この混合物は、遠心され、上清は吸引廃棄される。シリカ-DNAペレットの洗浄用緩衝液、エタノール及びアセトンによる洗浄後、これは乾燥され、次にこの試料は、プロテイナーゼKを含む又は含まないTE緩衝液により溶離される。溶離後、試料は遠心され、DNA-含有する上清が回収される。
【００４７】
熟練した医師は、他の公知の方法を用い、血漿又は血清からDNA又はRNAを抽出する方法を知っているであろう。血漿又は血清からDNA又はRNAを精製するあらゆる手段を、本発明の方法において使用することができる。
【００４８】
血漿又は血清の核酸の2又はそれよりも多い画分への分離
本発明の一部の態様において、核酸は、血漿又は血清試料の、異なる相対濃度の粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸を含有する2又はそれよりも多い画分への分離後、血漿又は血清から抽出される。分離前には、この血漿又は血清試料は、粒子と会合した種及び粒子と会合していない種の両方を含有するであろう。分離後、これらの画分は、異なる相対濃度の粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸を含有するであろう。血漿又は血清試料のこれらの画分への分離は、いずれかの分離技術により行うことができ、これは、粒子をそれらのサイズに関して又は超遠心後のそれらの挙動に関して分離することができるものを含む。
【００４９】
ひとつの方法において、抽出された核酸は、例えば、5μm、0.45μm又は0.22μmのフィルターサイズのような、異なる孔-サイズのフィルターによるろ過により分離される。粒子-会合した核酸、例えば、あるサイズのアポトーシス小体内の核酸は、あるサイズ以下の孔サイズを有するフィルターを通過することができないのに対し、粒子と会合していない核酸又はあるサイズ以下の粒子と会合した粒子と会合した核酸は、通過するであろう。例証目的で、0.22μmのフィルターサイズが、0.1μm〜5μmの範囲の粒子と会合した核酸(粒子と会合した核酸)を含有する血漿又は血清試料について使用される場合、このフィルターを通過する液体は、0.45μmフィルターを通る血漿又は血清試料よりもより低い濃度の粒子と会合した核酸を含むであろう。
【００５０】
別の方法において、強い遠心力又は超遠心が、血漿又は血清試料から粒子と会合した核酸をペレット化するために使用される。本発明の方法において、循環血核酸を粒子-会合した画分及び粒子と会合していない画分に分離することが可能である遠心力は、試料中に存在する事実上全ての粒子状物質をペレット化するのに十分な大きさである。70,000gから100,000gの遠心力を用い、最初に粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の両方を含有する血漿又は血清試料を、粒子と会合していない核酸の画分の濃度が増加されているものへ転換することができる。
【００５１】
粒子と会合した核酸の異なるサイズ種へのあらゆる分離法を、本発明の方法において使用することができる。他の方法は、当該技術分野において周知であり、及び蛍光活性化された細胞選別,磁気活性化された細胞選別、又はディファレンシャル沈降を含む。
【００５２】
核酸検出法
本発明の方法において検出された核酸は、典型的には約40ヌクレオチド長から数千ヌクレオチド長である。通常、核酸は、約80〜約200ヌクレオチドである。
【００５３】
核酸、例えばDNA又はRNAが、血漿又は血清から単離された後、これらの核酸は、当該技術分野において公知の方法を用い検出される。これらの核酸は、粒子と会合していない画分及び粒子と会合した画分の分離後に検出することができる。通常のDNA又はRNA検出法のいずれかを、核酸の、検出及び、例えば量又は濃度の定量のために使用することができる。好ましい態様においては、低コピー数の核酸を検出するいずれかの手段を用い、本発明の核酸が検出される。低コピー数の核酸を検出及び定量する手段は、分析のための生化学的方法、例えば電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、高拡散(hyperdiffusion)クロマトグラフィー、質量分析などを含む。これらの方法は、当該技術分野において周知であり、従って詳細には説明しない(例えば、米国特許第6,013,422号、第6,261,781号、第6,268,146号、又は第5,885,775号参照)。
【００５４】
本発明の方法は、典型的には核酸の検出のための増幅法又はシグナル増幅法に頼っているが、常にではない。当業者は、試料中の標的配列の増幅は、各々十分な増幅を提供するような、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅、転写増幅、及び自己維持された(self-sustained)配列複製などの、いずれか公知の方法により実現され得ることを認めるであろう。
【００５５】
PCR法は、当該技術分野において周知である。PCRの方法及びプロトコールの総説については、例えば、Innisら編集の「PCR Protocols A Guide to Methods and Application」(Academic Press社、サンディエゴ、CA、1990)を参照のこと。PCR試薬及びプロトコールは、Roche Molecular Systems社のような、商業的業者から入手可能である。
【００５６】
検出された核酸は、DNA又はRNA分子であることができる。本発明の特定の態様において、RNA分子が検出される。検出されたRNA分子は、ゲノム配列から転写されたRNAであることもできるが、これは機能性ポリペプチドをコードすることはない。増幅の第一工程は、増幅される領域のDNAコピー(cDNA)の合成である。逆転写は、分離工程として、又は相同的逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)において、RNA増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応の改変において行うことができる。リボ核酸のPCR増幅に適した方法は、Romero及びRotbartの「Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications」、401-406頁、Persingら編集(Mayo Foundation、ロチェスター、MN、1993)；Rotbartらの、米国特許第5,075,212号、及びEggerらの論文(J. Clin. Microbiol.、33:1442-1447 (1995))に説明されている。
【００５７】
本発明の方法において使用されるプライマーは、好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドから約50ヌクレオチド長であり、より好ましくは約15ヌクレオチドから約30ヌクレオチド長である。
【００５８】
PCRにより試料中の標的核酸配列を増幅するためには、この配列は、増幅システムの成分にアクセス可能でなければならない。一般に、このアクセス可能性は、核酸の試料からの単離により確実にされる。生物学的試料から核酸を抽出する様々な技術は、当該技術分野において公知であり、及び先に説明されている。
【００５９】
PCRの各サイクルの第一の工程は、プライマー伸長により形成された核酸二重鎖の分離に関連している。一旦これらの鎖が分離された場合は、PCRの次工程は、分離鎖の標的配列に隣接するプライマーとのハイブリダイゼーションに関連している。その後これらのプライマーは伸長され、標的鎖の相補的コピーを形成する。PCR増幅の成功のために、これらのプライマーは、各プライマーが二重鎖配列に沿ってハイブリダイズする位置は、ひとつのプライマーから合成された伸長産物が、鋳型(相補体)から分離された場合、他方のプライマーの伸長の鋳型として役立つようにデザインされる。変性、ハイブリダイゼーション、及び伸長のサイクルは、所望の量の増幅された核酸(アンプリコン)を得るために必要なだけ数多く反復される。
【００６０】
PCR法の好ましい態様において、鎖分離は、二重鎖の変性を引き起こすが、ポリメラーゼの不可逆的変性を引き起こさないのに十分な時間の十分な高温(〜95℃)までの反応液の加熱により、実現される(米国特許第4,965,188号参照)。PCRにおけるプライマーの鋳型-依存型伸長は、適当な塩、金属カチオン、及びpH緩衝システムで構成される反応媒体中の、適量の4種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸(典型的にはdATP、dGTP、dCTP、及びdTTP)の存在中において、重合剤により触媒される。適当な重合剤は、鋳型-依存型DNA合成を触媒することがわかっている酵素である。本発明において、プライマー伸長の最初の鋳型は、典型的にはRNAから転写される第1鎖cDNAである。RNA鋳型からのcDNAの合成に適している逆転写酵素(RT)は、周知である。
【００６１】
PCRは、熱安定性の酵素による自動化されたプロセスとして最も頻繁に実行される。このプロセスにおいて、反応混合物の温度は、変性領域、プライマーアニーリング領域、及び伸長反応領域を通じ自動的に循環される。
【００６２】
本発明の核酸は、当業者に周知の他の標準技術を用い検出することもできる。検出工程には、典型的には増幅工程が先行するが、増幅は、本発明の方法には不要である。例えば、これらの核酸は、サイズ分画(例えば、ゲル電気泳動)により同定することができる。対照と比べた試料中の異なる又は追加のバンドの存在は、本発明の標的核酸の存在の指標である。あるいは、標的核酸は、周知の技術による配列決定により同定することができる。あるいは、標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、特異的断片の存在の検出に使用することができる。
【００６３】
以下に詳述されるように、本発明の方法により作成された増幅断片のサイズは、典型的には特定の疾患に関連した1本又はそれよりも多いバンドの存在を同定するために十分である。従って本発明の一部の態様において、所定の試料中で作成された増幅断片のサイズ分画(例えば、ゲル電気泳動)を用い、特定疾患に関連した断片を識別することができる。これは、典型的には関心のある試料を増幅するために使用されるものと同じプライマーによる対照の増幅により実行される。増幅配列をアガロース又はポリアクリルアミドゲル上を流し、核酸を例えば臭化エチジウム又は例えば周知の技術に従いSYBR green(商標)(Molecular Probes社)のような蛍光色素などの他の染色剤により染色した後(Sambrookら参照)、試料及び対照中のバンドパターンを比較する。対照と比較した試料中の異なる又は追加のバンドの存在は、疾患に関連したバンドの存在の指標である。
【００６４】
配列-特異的プローブハイブリダイゼーションは、細胞、生物学的液体などを含む試料中の所望の核酸を検出する周知の方法である。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、プローブは、実質的に相補的配列にのみ特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、配列ミスマッチの変動量に耐えるように緩和することができる。標的が最初に増幅されるならば、増幅産物の検出は、正確に増幅された標的のみの検出を確実にするために、この配列-特異的ハイブリダイゼーションを利用し、これにより偽陽性の機会を低下する。
【００６５】
多くのハイブリダイゼーション様式が、当該技術分野において周知であり、これは液相、固相、オリゴヌクレオチドアレイ様式、混合相、又はin situハイブリダイゼーションアッセイを含むが、これらに限定されるものではない。溶液(又は液)相ハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸及びプローブ又はプライマーの両方は、反応混合物中で相互作用するように、遊離している。PCR反応時の増幅産物の分析、例えば定量を可能にする、リアルタイムPCRシステムのような技術も、開発されている。この種の反応において、特異的オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションは、増幅プログラム時に、標的核酸の存在を同定するために生じる。オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、熱力学的に制御されたふたつの状態の遷移のために最高の特異性を確実にする。このアッセイ様式の例は、蛍光共鳴エネルギー転移ハイブリダイゼーションプローブ、分子ビーコン、分子スコーピオン(molecular scorpion)、及びエキソヌクレアーゼハイブリダイゼーションプローブである(Bustin SM.、J. Mol.Endocrin.、25:169-93 (2000)において検証)。
【００６６】
固相ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、標的又はプローブのいずれかは、溶液中の相補的核酸とのハイブリダイゼーションに利用可能である固相支持体に連結される。固相様式の例は、サザン又はノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット、アレイ、チップなどを含む。In situ技術は、染色体物質(例えば、中期又は間期細胞)中の標的核酸の検出に特に有用である。下記の記事は、様々なハイブリダイゼーションアッセイ様式の総説を提供する：Singerら、Biotechniques、4:230 (1986)；Haaseら、METHODS IN VIROLOGY、第VII巻、189-226頁(1984)；Wilkinson、IN situ HYBRIDIZATION、D.G. Wilkinson編集、IRL Press社、Oxford University Press、オックスフォード；並びに、NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION: A PRACTICAL APPROACH、Haines,B.D.及びHiggins, S.J.編集、IRL Press社(1987)。
【００６７】
ハイブリダイゼーション複合体は、周知の技術に従い検出され、並びに本発明の重要な局面ではない。標的に特異的にハイブリダイゼーションすることが可能である核酸プローブは、典型的にはハイブリダイズされた核酸の存在を検出するために使用されるいくつかの方法のいずれかひとつにより標識することができる。ひとつの一般的検出法は、3H、125I、35S、14C又は32Pなどにより標識されたプローブを使用するオートラジオグラフィーの使用である。放射性同位体の選択は、選択された同位体の合成の容易さ、安定性及び半減期に起因した、研究の優先性によって左右される。他の標識は、化合物(例えば、ビオチン及びジゴキシゲニン)を含み、これは、発蛍光団、化学発光物質、及び酵素により標識されたアンチリガンド又は抗体に結合する。あるいは、プローブは、発蛍光団、化学発光物質、又は酵素のような標識と直接複合することができる。標識の選択は、必要な感度、プローブとの複合の容易さ、安定性の必要用件、及び利用可能な装置に応じて決まる。
【００６８】
本発明のプローブ及びプライマーは、周知の技術を用い合成及び標識することができる。プローブ及びプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、Needham-VanDevanter, D.R.らの論文(Nucleic Acids Res.、12:6159-6168 (1984))に説明されたような、自動式合成装置を使用する、Beaucage, S.L.及びCaruthers, M.H.の論文(Tetrahedron Letts.、22(20):1859-1862 (1981))に最初に説明された、固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従い化学的に合成してよい。オリゴヌクレオチドの精製は、Pearson,J.D、及びRegnier, F.E.の論文(J. Chrom.、255:137-149 (1983))により説明されたような、例えば非変性アクリルアミドゲル電気泳動により又はアニオン交換HPLCにより実行することができる。
【００６９】
核酸配列の検出は、シグナル増幅技術によっても実現することができる。例えば、分枝したDNAアッセイは、標的配列に対して特異的プローブを使用し、標的の存在を同定する。このシグナルは、多くの蛍光検出DNA分子が、標的核酸にハイブリダイズすることを可能にするプローブに成された修飾により、増幅される(Chiron Diagnostics)。
【００７０】
粒子-会合した及び粒子-会合していない型で存在する核酸種は、本発明の方法においてマーカーとして検出及び使用することができる。好ましい態様において、マーカーであるヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNA、血小板塩基性蛋白質(PBP)mRNA、又はミトコンドリアDNAを、更に病態を評価するために使用することができる。GAPDH mRNA、PBP mRNA又はミトコンドリアDNAの検出のための本発明のプローブ及びプライマーは、周知の技術を用い合成することができ、当該技術分野において周知である(Perkin Elmer社、TaqManプローブ及び増幅プライマー)。
【００７１】
病態の評価
各画分中の粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の濃度が異なる核酸の2又はそれよりも多い画分への血漿又は血清の分離、それに続く公知の方法による各画分中の核酸の検出及び定量の後、病態が評価される。
【００７２】
1又はそれよりも多い画分中の核酸の量又は濃度を決定し、そして対照と比較することにより、病態は評価される。熟練した医師は、患者の病態を評価するために、この比較を使用することができる。例えば、ひとつの画分が、その場合上清が粒子-会合していない核酸のみを含有するような、超遠心により処理される場合、同じ方法で処理された対照中よりも試料中の粒子と会合していない核酸の異なる濃度は、患者の異常性を示している。患者及び対照間の粒子と会合していない核酸の濃度の差異の程度がより大きいと、この異常性がより大きい。熟練した医師は、患者及び対照における粒子と会合していない核酸の相対差を比較することにより、個人がその疾患を発症するリスクがあるかどうかを決定することができる。患者及び対照における粒子と会合していない核酸の相対差を比較することにより、熟練した医師は、患者における疾患を診断し、病期を決定し、又は疾患の予後を判定することができる。
【００７３】
例えば、一部の患者において、男女の患者の血漿又は血清中を循環している粒子と会合していない核酸の濃度は、対照と同じであろう。別の患者において、試料中の粒子と会合していない核酸の量又は濃度は、対照よりもわずかに高く、例えば、50％より高い。更に別の患者において、試料中の粒子と会合していない核酸の量又は濃度は、対照の濃度の二倍であろう。更に別の患者において、試料中の粒子と会合していない核酸の量又は濃度は、対照よりもはるかに高く、例えば8〜15倍高い。試料及び対照中の粒子と会合していない核酸の濃度間の相対差に応じ、患者に異なる入院期間又は異なる処置もしくはモニタリングプランを施すことができる。例えば、試料中の粒子と会合していない核酸の濃度が、対照のそれと等しい場合は、患者は、予後良好と判定され及び退院される。別の例において、試料中の粒子と会合していない核酸の濃度が、対照よりもごくわずかに高い場合は、患者は、退院してよいが、更なるモニタリングが施される。試料中の粒子と会合していない核酸の濃度が、対照のそれよりもはるかに高い、例えば、15から100倍高い場合は、患者は予後不良とされ、より積極的な処置が施される。
【００７４】
本発明のひとつの局面において、患者の血漿又は血清を循環している粒子と会合していない核酸の増加した濃度を使用し、患者における癌を評価することができる。血液試料は、癌を有することが疑われる、有することがわかっている又は有するリスクのある患者から得られる。血漿又は血清試料は、本発明の方法を用い、2又はそれよりも多い画分に分離され、ここで各画分は、他の画分(複数)とは粒子と会合した核酸の異なる相対濃度を有する。これらの画分中に存在する核酸は、公知の方法を用い抽出及び検出される。これらの各画分に相当する対応する核酸の濃度は、対照と比較される。好ましい態様において、GAPDH mRNAマーカーを使用し、疾患を評価することができる。患者及び対照からの試料中の核酸の相対差に応じ、癌を診断し、更に評価することができる。一部の態様において、鼻咽喉癌を診断し、更に評価することができる。別の態様において、肝細胞癌を診断し、更に評価することができる。
【００７５】
本発明の一部の態様において、2又はそれよりも多い画分中の核酸の分離は、鼻咽喉癌又は肝細胞癌を有する患者の更なる評価のためには必須ではない。これらの態様において、肝細胞癌又は鼻咽喉癌を有する患者からの血漿又は血清試料中の総GAPDH mRNA濃度を対照の血漿又は血清試料中の総GAPDH mRNA濃度と比較することにより、癌を検出し更に評価することができる。例えば、対照中よりも試料中のより大きい濃度のGAPDH mRNAは、患者の癌を示している。
【００７６】
本発明の別の局面において、妊婦の血漿又は血清中を循環している粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の異常な相対又は絶対濃度を使用し、患者又は患者の胎児の病態又は生理的状態を評価することができる。血液試料は、妊婦から得られ、画分に分離される。これらの画分は、本発明の方法により分離され、これにより画分は、粒子-会合した核酸及び粒子-会合していない核酸の異なる相対濃度を含むであろう。これらの画分からの核酸は、公知の方法を用い抽出され、そして検出され、そして測定される。これらの画分中の核酸の濃度は、互いに及び対照と比較される。一部の態様において、好ましいマーカーは、GAPDH mRNAである。これらの画分間の又は対照と比較した核酸濃度間の相対差に応じ、患者又は患者の胎児の病態又は生理的状態を診断し更に評価することができる。
【００７７】
本発明のひとつの局面において、患者の血漿又は血清中を循環している粒子と会合していない核酸の増加した濃度を用い、患者の外傷を比較することができる。血液試料は、外傷患者から得られる。血漿又は血清は、単離され、並びに粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の異なる相対濃度を伴う2又はそれよりも多い画分に分離される。核酸は、公知の方法を用いこれらの画分から抽出し、並びに検出し及び測定することができる。これらの画分中の核酸濃度は、対照と比較される。疾患を評価するために使用される好ましいマーカーは、GAPDH mRNA又はミトコンドリアDNAである。外傷患者及び対照の試料からのこれらの画分中の核酸濃度の相対差に応じて、更に外傷を評価することができる。例えば、外傷の重症度は、外傷患者からの主として粒子と会合していない核酸を伴う画分中の核酸濃度を対照と比較することにより決定することができる。一部の患者において、それらの血漿又は血清の粒子と会合していない核酸の濃度が、対照と比べ、4から6倍増加することは、その患者が軽度の損傷を患っていることを示すであろう。別の患者において、7から10倍の増加は、患者は、中等度の外傷を患っていることを示し、並びに他の患者において、11から15倍の増加は、患者が重症の損傷を患っていることを示す。
【００７８】
インフォマティクス
一般に、バイオインフォマティクスは、生物学的情報を管理するための、コンピューター及び統計の技術の研究及び適用である。健常及び罹患した個人の血漿又は血清中の粒子と会合した及び粒子と会合していない循環血核酸の濃度並びに病態を評価するためにその生物学的情報を使用する能力を含む生物学的情報を含むデータベースの構築及び検索するシステム及び方法の開発は、重要性が増している。
【００７９】
従ってひとつの態様において、本発明は、更なる医学的特徴決定のためのデータベースを集団化する方法を提供する。この方法は、特定の疾患を有することが疑われる、有することがわかっている又は有するリスクのある患者の血漿又は血清の粒子と会合した及び粒子と会合していない核酸濃度を伴うデータベースを集団化し、並びにソフトウェアプログラムを使用しこれらの濃度を対照と比較することを含む。本発明は、健常及び罹患した個人からのデータ並びに疾患の非存在又は存在、疾患の重症度、疾患の予後判定、疾患の適当な治療計画、又はリスクの層別化に対する、それらの血漿又は血清中の粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の濃度の対応する濃度を蓄積することにより対照を作成する方法も提供する。
【００８０】
別の態様において、本発明は、本発明の方法を自動化する装置、特定の疾患を有することが疑われる、有することがわかっている又は有するリスクのある患者の入力された血漿又は血清の核酸濃度を対照と比較することが可能であるコンピューター及びソフトウェアシステムにより構成された装置も提供する。この核酸濃度データは、コンピューターで読み取り可能な形で入力され、及びコンピューターで検索可能な形で保存される。本発明は、特定の疾患を有することが疑われる、有することがわかっている又は有するリスクのある患者の粒子と会合した及び粒子と会合していない血漿又は血清の核酸レベルの濃度を含むデータセットがエンコードされたコンピューターで読み取り可能な媒体も提供する。
【００８１】
個人の血漿又は血清中の粒子と会合した核酸及び粒子と会合していない核酸の濃度を定量するための本願明細書に説明された方法は、とりわけ病的な状態、疾患の素因、治療のモニタリング、予後判定、リスク層別化に相関することができる情報を提供する。本発明の方法により作成されたデータは手作業による検索及び解析に適しているが、好ましい態様において、高速コンピューターを使用する事前のデータの処理が利用される。
【００８２】
生体分子情報を索引付けし、そして検索する方法のアレイは、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第6,023,659号及び第5,996,712号は、1又はそれよりも多い蛋白質機能の階層に従い配列をカタログ化し検索する事態における、生体分子配列情報を保存するためのリレーショナルデータベースシステムを開示している。
【００８３】
本発明は、コンピューターデータ保存装置における血漿又は血清の核酸濃度の集合の保存及び検索のためのものも提供し、これは磁気ディスク、光学ディスク、磁気-光学ディスク、DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、RDRAM、DDR RAM、磁気バブルメモリー装置、並びにCPUレジスター及びオン-CPUデータ保存アレイなどの他のデータ保存装置を含む。
【００８４】
本発明は好ましくは、コンピューター処理された配列の解析、比較、又は相対定量法における検索及び処理に適したファイルフォーマットで本発明の方法から収集されたデータをエンコードしているビットパターンを含む、IBM互換型(DOS、Windows、Windows 95/98/2000、Windows NT、OS/2)又は他のフォーマット(例えば、Linux、SunOS、Solaris、AIX、SCO Unix、VMS、MV、Macintoshなど)、フロッピーディスク又はハード(固定型、Winchester)ディスクドライブなどの磁気ディスクも提供する。
【００８５】
本発明は、イーサーネットケーブル(同軸又は10BaseT)、電話線、ISDN線、無線ネットワーク、光ファイバー、又は他の適当な信号伝達媒体などの、データリンクを介して連結された複数のコンピューター装置で構成される、ネットワークも提供し、これにより少なくとも1種のネットワーク装置(例えば、コンピューター、ディスクアレイなど)は、本発明の方法により獲得されたデータをエンコードしているビットパターンを構成している磁気ドメイン(例えば、磁気ディスク)及び／又は電荷ドメイン(例えば、DRAMセルのアレイ)を含む。
【００８６】
本発明は、モデム、ISDNターミナルアダプター、DSL、ケーブルモデム、ATMスイッチなどの、電気通信装置上に電気信号を発生することを含む濃度データを伝達する方法も提供し、ここで信号は、本発明の方法から収集されたデータをエンコードしているビットパターン(非変換(native)又は暗号化されたフォーマット)を含む。
【００８７】
好ましい態様において、本発明は、罹患した個人の血漿又は血清中の粒子-会合した及び粒子-会合していない核酸濃度を対照と比較するためのコンピューターシステムを提供する。中央演算装置は、アッセイ結果の並置及び／又は比較のためにコンピュータープログラムをロードし及び実行するために初期化されることが好ましい。データは、I/O装置を介して中央演算装置に入力される。コンピュータープログラムの実行は、データファイルからのデータを検索する中央演算装置を生じる。
【００８８】
標的データ又は記録及びコンピュータープログラムは、典型的にはランダムアクセスメモリー(例えば、DRAM、SRAM、SGRAM、又はSDRAM)である、二次メモリーに移すことができる。例えば、中央演算装置は、通常のコンピューター(例えば、Intel Pentium、PowerPC、Alpha、PA-8000、SPARC、MIPS 4400、MIPS 10000、VAXなど)であり；プログラムは、市販の又は公開されたドメインの分子生物学ソフトウェアパッケージ(例えば、UWGCG Sequence Analysis Software、Darwin)であり；データファイルは、光学又は磁気ディスク、データサーバー、メモリー装置(例えば、DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、EPROM、バブルメモリー、フラッシュメモリーなど)であり；I/O装置は、ビデオ画面及びキーボード、モデム、ISDNターミナルアダプター、イーサーネットポート、パンチカードリーダー、磁気ストリップリーダー、又は他の適当なI/O装置を備えるターミナルであることができる。
【００８９】
本発明は好ましくは、以下を備える、先に説明されたような、コンピューターシステムの使用も提供する：(1)コンピューター；(2)本発明の方法により得られた核酸濃度の集合をエンコードしている保存されたビットパターン、これはコンピューターにおいて保存され得る、(3)比較対照；(4)比較のためのプログラム。本願明細書に説明された実施例及び態様は、単に例証目的であり、それらを考慮し様々な修飾又は変更が、当業者により示唆され、並びに本出願の精神及び範囲に含まれ、並びに添付された「特許請求の範囲」内とみなされることが理解される。本願明細書に引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体が本明細書に参照として組入れられている。
【実施例】
【００９０】
実施例
実施例1：健常者の血漿又は血清中の粒子と会合した及び粒子と会合していない循環血核酸の検出
17名の健常対象の血漿試料を、ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNA及びヒトβグロビンDNA濃度について分析した。17種の血漿試料中でも、14種は更に、ヒトミトコンドリアDNA濃度について分析した。17名の健常対象からの10名の血清試料は、GAPDH mRNA及びβ-グロビンDNA濃度について分析した。各試料からのアリコートを、5μm、0.45μm及び0.22μm孔サイズのフィルターを個別に通過させた後、定量分析した。図1Aのデータは、ろ過は、血漿及び血清試料中のGAPDH mRNA濃度に対し明らかに観察可能な作用を有することを示している(血漿及び血清の両試料についてFriedman検定、P＜0.001)。二つ一組での解析は更に、これらのフィルターサイズの各組において統計学的有意差が検出されることを示した(各組についてStudent Newman-Keuls検定、P＜0.05)。全般的に、血漿及び血清GAPDH mRNA濃度は、非ろ過群及び0.22μmろ過群由来の二つ一組の試料と比較した場合に、各々、中央値で15-倍(四分位数間領域：10-倍から24-倍)及び8.7-倍(四分位数間領域：6.6-倍から11.5-倍)減少した。従って本発明者らのデータは、ろ過可能なGAPDH mRNA種が、ヒト対象の血漿及び血清中に存在することを明らかに示している。図1Bのデータは、同様のろ過作用が、血漿試料中のミトコンドリアDNA濃度について得られたことを示している。ミトコンドリアDNA濃度中の有意差は、異なる孔-サイズでろ過した血漿試料の間で認められた(Friedman検定、P＜0.001)。二つ一組での解析は、組をなす比較のひとつ以外の全てについて有意差が検出されたことを示している(Student-Newman-Keuls検定、P＜0.05)。ろ過していない血漿及び5μmフィルターでろ過した血漿の間に有意差はなかった(Student-Newman-Keuls検定、P＞0.05)。全般的に、血漿ミトコンドリアDNA濃度は、非ろ過群及び0.22μmろ過群からの組をなす試料を比較した場合に、中央値で8.9-倍(四分位数間領域：2.8-倍から23.7-倍)減少した。これらの結果と対照的に、異なる孔-サイズでろ過した血漿及び血清試料間でβ-グロビンDNA濃度において統計学的有意差は存在しなかった(Friedman検定、血漿試料についてP＝0.455；及び、血清試料についてP＝0.516)(図1C)。GAPDH mRNAの粒子と会合した性質を調べること以外に、本発明者らは、血小板塩基性蛋白質(PBP)と称されるヒト遺伝子転写産物も分析した。17名の健常対象中の8名の血漿及び血清試料をこの分析に使用した。図1Dは、PBP mRNA濃度に対するろ過作用は、再度明確に観察されたことを示している。全般的に、血漿及び血清PBP mRNA濃度は、非ろ過群及び0.22-μmろ過群からの組をなす試料を比較した場合、各々、中央値で160-倍(四分位数間領域：41-倍から427-倍)及び38-倍(四分位数間領域：15.7-倍から52-倍)減少した。従ってこれらの結果は、血漿及び血清中のGAPDH mRNA、PBP mRNA及びミトコンドリアDNAの有意な割合は、粒子と会合されていることを示している。他方で、ほとんどの循環血β-グロビンDNAは、粒子と会合されていない。
【００９１】
血漿中の核酸が粒子と会合していない型で存在するかどうかを調べるために、本発明者らは、超遠心を用い第二の実験シリーズを行った。別の10名の健常対象からの血漿試料を、GAPDH mRNA及びβ-グロビンDNA濃度について分析した。10種の血漿試料中でも、7種を更に、ミトコンドリアDNA濃度について分析した。各試料からのアリコートに、0.22-μmろ過工程又は99,960 X gの超遠心のいずれか、その後の定量分析を施した。先行する研究において、Yamamotoらは、70,000 X gの遠心力を用い、ウイルス粒子をペレット化した(Yamamoto Mら、J. Cli.n Microbial、33:1756-8 (1995))。従って本発明者らの研究において使用した更に強い遠心力(99,960 X g)は、事実上全ての粒状物質をペレット化すると予想される。図2A及び2Bのデータは、統計学的有意差が、非ろ過血漿、0.22-μmろ過血漿及び超遠心血漿中の、GAPDH mRNA及びミトコンドリアDNAの両濃度について存在したことを示している(GAPDH mRNA及びミトコンドリアDNAの両方についてFriedman検定、P＜0.001)。対のある比較は、非ろ過血漿及び0.22-μmろ過血漿の間(GAPDH mRNA及びミトコンドリアDNAの両方についてStudent Newman-Keuls検定、P＜0.05)、並びに非ろ過血漿及び超遠心血漿の間(GAPDH mRNA及びミトコンドリアDNAの両方についてStudent Newman-Keuls検定、P＜0.05)に有意差が存在することを示している。しかし0.22μmろ過した血漿試料及び超遠心血漿試料間に、GAPDH mRNA及びミトコンドリアDNAの両濃度について有意差はない(Student-Newman Keuls検定、GAPDH mRNA及びミトコンドリアDNAの両方について、P＞0.05)(図2A及び2B)。他方で、異なるように処理した血漿試料間のβ-グロビンDNA濃度の差異は、いかなる統計学的有意性にも達していない(Friedman検定、P＝0.122)(図2C)。従って例えこの超遠心工程後であっても、所定量のGAPDH mRNA及びミトコンドリアDNAが依然上清中に検出可能であることに注目すると興味深い。これらのシグナルは、当初のGAPDH mRNA及びミトコンドリアDNAの、各々、7.4％(四分位数間領域：4.3％から13％)及び15.4％(四分位数間領域：5.3％から39.3％)の中央値を表し、これは超遠心していない血漿試料中に存在し及び恐らく粒子と会合していない循環血核酸種を表している。
【００９２】
実施例2
臨床状態-肝細胞癌(HCC)の血漿中の循環血核酸の粒子と会合した及び粒子と会合していない性質の存在
16名のHCC患者からの血漿試料を分析した。図3Aは、粒子と会合したGAPDH mRNAが、HCC患者の血漿中に存在することを示している。実際、0.22-μmフィルターによるろ過は、血漿中のGAPDH mRNA濃度の中央値の9.3-倍(四分位数間領域：6.9-倍から31.1-倍)の低下を生じた。16例のHCC症例中の7例において、血漿βグロビンDNA定量に関連している追加実験に十分な血漿試料が収集された。ろ過を伴う又は伴わないの両方において、HCC患者と健常対象の間で血漿β-グロビンDNA濃度について、統計的有意差は認められなかった(Mann-Whitney順位和検定、ろ過した血漿試料についてP＝0.525；及び、ろ過していない血漿試料についてP＝0.418)(図3B)。従って、0.22μmフィルターによるろ過は、HCC患者における血漿GAPDH mRNA濃度の顕著な低下を生じた(図3A)。興味深いことに、本発明者らは、ろ過を伴う又は伴わない、HCC患者における血漿中のGAPDH mRNA濃度は、健常対象におけるそれらよりも有意に高いことも発見した(Mann-Whitney順位和検定、ろ過した血漿試料についてP＜0.05；及び、ろ過していない血漿試料についてP＜0.005)(図3A)。これらの結果は、HCC患者の血漿は、粒子と会合した及び粒子と会合していないmRNA種の両方の増加した濃度を含むことを示唆している。粒子と会合したmRNA種に関して、ひとつの可能性は、癌患者における新生物形成細胞のアポトーシスは、RNAをパッケージしたアポトーシス小体を血漿に放出することである。
【００９３】
実施例3
臨床状態-鼻咽喉癌(NPC)の血漿中の循環血核酸の粒子と会合した及び粒子と会合していない性質の存在
粒子と会合した核酸が他の癌にも存在するかどうかを調べるために、7名のNPC患者からの血漿試料を、GAPDH mRNA及びβ-グロビンDNA濃度について分析した。図4Aのデータは、粒子と会合したGAPDH mRNAは、NPC患者の血漿中に存在することを示している。0.22-μmフィルターによるろ過は、血漿中のGAPDH mRNA濃度の中央値の3.3-倍(四分位数間領域：3-倍〜7.5-倍)の低下を生じた。HCC患者同様、NPC患者の血漿GAPDH mRNA濃度は、ろ過を伴う又は伴わないの両方において、健常対照のそれよりも有意に高かった(Mann-Whitney順位和検定、ろ過した及びろ過していない血漿試料の両方についてP＜0.05)(図4A)。対照的に、ろ過を伴う又は伴わないの両方において、NPC患者と健常対象の間で血漿β-グロビンDNA濃度について、統計学的有意差は認められなかった(Mann-Whitney順位和検定、ろ過した血漿試料についてP＝0.065；及び、ろ過していない血漿試料についてP＝0.155)(図4B)。
【００９４】
実施例4
臨床状態-妊娠の血漿中の循環血核酸の粒子と会合した及び粒子と会合していない性質の存在
妊娠期間16週から20週の15名の妊婦からの血漿試料を、GAPDH mRNA及びβ-グロビンDNA濃度について分析した。図5Aのデータは、粒子-会合したGAPDH mRNAが、妊婦の血漿中にも存在することを明確に示している。0.22-μm孔サイズのろ過工程は、血漿中のGAPDH mRNA濃度の中央値の16.6-倍(四分位数間領域：14-倍から28.3-倍)の低下を生じた。HCC及びNPC患者とは異なり、妊婦の血漿GAPDH mRNA濃度は、ろ過を伴う又は伴わないの両方において、健常対象のそれよりも有意に低かった(Mann-Whitney順位和検定、ろ過した及びろ過していない血漿試料の両方についてP＜0.001)(図5A)。同様に、ろ過を伴う又は伴わないの両方において、妊婦と健常対象の間で血漿β-グロビンDNA濃度について、統計学的有意差は認められなかった(Mann-Whitney順位和検定、ろ過した血漿試料についてP＝0.265；及び、ろ過していない血漿試料についてP＝0.628)(図5B)。
【００９５】
粒子と会合したRNAが全妊娠期間を通じて存在するかどうかを決定するために、第1、第2及び第3妊娠期間の、各々、10、22及び4名の妊婦の血漿試料を、GAPDH mRNAについて分析した。図5Cのデータは、妊娠中全ての期間に、粒子と会合したGAPDH mRNAが、母親血漿中に存在することを示した。妊娠期間の全ての期間について、GAPDH mRNA濃度の有意な低下は、血漿試料が0.22-μmろ過処理を施された場合に観察された(Mann Whitney順位和検定、第1、第2及び第3妊娠期間についてP＜0.001)。
【００９６】
GAPDH mRNAとは異なり、ふたつの胎盤性mRNA種であるヒト胎盤性ラクトゲン(hPL)mRNA及びヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニット(βhCG)mRNAを、母親血漿におけるそれらの粒子と会合した性質について調べた。妊娠期間7週から14週の14名の妊婦から血漿試料を収集した。各試料のアリコートを、孔サイズ5μm及び0.45μmのフィルターを個別に通過させるか、又はろ過しないまま維持した。その後これらを、hPL、βhCG及びGAPDH mRNAについて、定量分析を施した。図6のデータは、血漿hPL(図6A)及びβhCG(図6B)mRNA濃度に対するろ過の有意な作用を示している(Friedman検定、hPL及びβhCG mRNAの両方についてP＜0.001)。二つ一組での解析は、5μm及び0.45μmのろ過群間で、統計学的有意差が検出されたことを示している(Dunn検定、hPL及びβhCG mRNAの両方についてP＜0.05)。全般的に、非ろ過群及び0.45-μmろ過群から、組をなす試料を比較した場合に、血漿hPL及びβhCG mRNAレベルは、各々、中央値で、3.9-倍(四分位数間領域：1.8-倍から5.5-倍)及び3.5-倍(四分位数間領域：2.8-倍から9.0-倍)減少した。図6Cは、対応する母親血漿試料のGAPDH mRNA濃度を示している。予想されるように、異なる処置群間で有意差が検出された(Friedman検定、P＜0.001)。二つ一組での解析は、5-μm及び0.45-μmろ過群間で有意差が検出されたことを示した(Dunn検定、P＜0.05)。従ってこれらのデータは、胎盤由来のmRNA、すなわち、hPL及びβhCG mRNAの有意な割合が、母親血漿中の細胞下粒子物質と会合されていることを明らかにしている。
【００９７】
実施例5
臨床状態-外傷の血漿中の循環血核酸の粒子と会合した及び粒子と会合していない性質の存在-GAPDH
Prince of Wales Hospitalの救急蘇生室に入院を必要とする外傷性損傷を有する患者から、血液試料を収集した。倫理的承認を、Chinese University of Hong Kongの治験倫理審査委員会(REC)から受けた。救急診療部で決定した解剖学的損傷の全体の程度を、損傷重症度スコア(ISS)(Baker SPら、J. Trauma、14:187-196 (1974))を用い他覚的に計算した。ISSに従い、外傷患者を3群に分けた：軽度の損傷(ISS＜9)、中程度の損傷(ISS＝9〜15)及び重度の損傷(ISS＞15)。損傷重症度スコアは、緊急治療室において検出された損傷のみを考慮し、及びコンピューター軸方向(axial)断層撮影所見は含まなかった。
【００９８】
血液試料5〜10mlを、EDTA-チューブに収集した。これらの試料を、4℃、1500gで遠心し、及び血漿を慎重にEDTA-含有チューブから除去し、手を加えていない(plain)ポリエチレンチューブに移した。血漿試料を除去した場合に、バッフィーコートが確実に乱されないように注意を払った。各血漿試料を、ふたつの画分に分割し：半分を、0.22μmフィルターでろ過し、残りの画分はろ過せずに維持した。
【００９９】
これらの血漿試料由来のRNAは、RNeasyミニキット(Qiagen社、ヒルデン、独国)を用いて抽出した。血漿600〜1000μlを、Trizol LS試薬(Invitrogen社)1.2ml及びクロロホルム0.2mlと混合した。この混合物を、11,900gで15分間遠心し、水相を、新たなチューブに移した。この水相1容量に70％エタノール1容量を添加した。その後混合物を、RNeasyミニカラムに載せ、製造業者の推奨に従い処理した。総RNAを、RNase-非含有水15μlで溶離し、その後DNase I(Invitrogen社)で処理し、RNAを、更に処理するまで、-80℃で貯蔵した。
【０１００】
リアルタイム定量的RT-PCR分析を、Applied Biosystem社7700配列検出器(フォスターシティ、CA、米国)を用いて行い、これは本質的に個別のPCR反応の進行を光学的にモニタリングする能力を有する、サーマルサイクラー／蛍光検出器と組合せられている。使用した増幅及び生成物報告システムは、5'ヌクレアーゼアッセイを基にしている(Holland P. M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:7276-7280 (1991))(Perkin-Elmer社より市販されているTaqManアッセイ)。このシステムにおいて、通常のPCRのようなふたつの増幅プライマー以外に、二重標識された蛍光原ハイブリダイゼーションプローブも含まれる(Livak KJら、Nat Genet.、9:341-342 (1995))。レポーターとしてのひとつの蛍光色素(FAM、すなわち、6-カルボキシフルオレセイン)を利用し及びその発光スペクトルは、第二の蛍光色素(TAMRA、すなわち、6-カルボキシテトラメチルローダミン)により消光される。PCRの伸長相時に、Taq DNAポリメラーゼの5'から3'-エキソヌクレアーゼ活性は、プローブからレポーターを切断し、その結果それを消光剤から放出し、518nmでの蛍光放出の増加を生じる。Applied Biosystem社7700配列検出器は、DNA増幅時に、96増幅ウェルの蛍光スペクトルを連続して測定することができ、並びにこのデータは、Macintoshコンピューター(Apple Computer社、キュパチーノ、CA、米国)に捕捉される。
【０１０１】
1工程リアルタイム定量的RT-PCRシステムを、血漿中のmRNA濃度の測定に使用した。このシステムにおいて、rTth DNAポリメラーゼは、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼの両方として機能した。GAPDH TaqManシステムは、増幅プライマーGAPDH-F、5'-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3'；GAPDH-R、5'-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3'で構成され；並びに、二重-標識された蛍光TaqManプローブは、GAPDN-P、5'-(FAM)CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC(TAMRA)-3'であった。ヒトGAPDH遺伝子のための配列データは、GenBank配列データベースから得た(寄託番号M33197)。
【０１０２】
RT-PCRは、EZ rTth RNA PCRキットにおいて供給された成分(TaqManプローブ及び増幅プライマーを除く)、並びにTaqMan(商標) GAPDH Control Reagents (Applied Biosystems社)を用い、反応容量50μlで設定した。GAPDH TaqManプローブは、Applied Biosystems社により注文に合わせて合成された。PCRプライマーは、Genset Oligo社(シンガポール)により合成された。各反応液は、5X EZ緩衝液10μl；各プライマー200nM；100nM蛍光プローブ；3mM Mn(OAc)2；dATP、dCTP、dGTPの各300μM；dUTPの600μM；rTthポリメラーゼ5U；及び、AmpEraseウラシルN-グリコシラーゼ0.5Uを含んだ。抽出されたRNAの3μlを増幅に使用した。使用した正確な量を、引き続きの濃度計算のために記録した。RT-PCR夾雑に対する厳密な予防措置を用いた。全ての液体操作については、エアロゾル抵抗性ピペットチップ(aerosol-resistant pipette tip)を使用した。個別の領域を増幅反応の設定、RNA鋳型の添加及び増幅反応の実行に使用した。7700配列検出器は、増幅反応の完了後のその光学検出システムは反応チューブの再開封の必要性を予め避けるという保護の超過レベルを提供し、その結果キャリーオーバー夾雑の可能性を最小にした。加えて、TaqManアッセイも、ウラシルを破壊するウラシルN-グリコシラーゼを用いるプレ-増幅処理の形で夾雑防止する測定の更なるレベルを含んだ。増幅は、光反射を防ぐように製造業者により凍結された96-ウェル反応プレートにおいて行い、及び光散乱を防ぐようにデザインされたキャップを用いて封をした。各試料は、2つ1組で分析し、及び各分析毎に複数の陰性の水ブランクを含んだ。GAPDH定量のための検量線を、ヒト対照RNA(Applied Biosystems社)に連続希釈を施し、RT-PCRアッセイのためにRNA濃度15ng〜0.23pgの範囲で作成した。製造業者は、このRNA標準1pgは、GAPDH転写産物およそ100コピーを含むと推定している。
【０１０３】
GAPDHシステムに使用したサーマルプロファイルは以下であった：逆転写前に、ウラシルN-グリコシラーゼの存在下、50℃で2分間の反応、引き続き60℃で30分間の転写工程を開始した。PCRは、95℃での変性の5分後、94℃で20秒間の変性工程及び60℃で1分間のアニーリング／伸長工程を使用し、40サイクル行った。次に7700配列検出器により収集され及びMacintoshコンピューターに保存された増幅データを、Applied Biosystems社により開発された配列検出システム(SDS)ソフトウェアを用いて解析した。各2つ1組の平均量を更なる濃度計算に使用した。pg/mlで表された濃度は、下記式を用いて計算した：C＝Q X VRNA／VPCR X1／Vext(式中、C＝血漿中の標的濃度(pg/ml)；Q＝RT-PCRにおいて配列検出器により決定された標的量(pg)；VRNA＝抽出後得られたRNAの総容量、典型的には1回のQiagen抽出につき15μl；VPCR＝RT-PCRに使用したRNA溶液の容量、典型的には3〜5μl；Vext＝抽出された血漿容量、典型的には600〜800μlである)。
【０１０４】
Sigma Stat 2.03ソフトウェア(SPSS)を用い、PCR産物を含む統計解析を行った。
【０１０５】
このアッセイの直線性を評価するために、対照RNAの連続希釈を、GAPDH RT-PCRシステムにより解析した。RT-PCRシステムの感度は、対照RNA 0.23pg(すなわち、およそ23コピー)中に存在するGAPDH転写産物を検出するのに十分であった(図7A)。検量線は、相関係数0.995を示した(図7B)。RNA抽出及びRT-PCRの両工程の精度を評価するために、健常な個人から得た血漿試料からの10複製抽出を行い、及びこれらの抽出されたRNA試料に、リアルタイム定量的RT-PCR解析を施した。これらの複製解析のCt値の変動係数は、1.66％であった。閾値サイクル(CT)と称されるパラメータは、サイクル1から15までの計算された平均ベース-ライン蛍光を上回る10標準偏差で設定し、及び増幅に使用される出発標的コピー数に比例するものと定義した。常用対数スケールでプロットした投入標的量に対する閾値サイクル(CT)のプロットは、リアルタイム定量的RT-PCRの大きい動的範囲及び精度を明らかにした。
【０１０６】
外傷患者の血漿RNAの粒子と会合した性質を調べた。8名の外傷患者からの二つ一組の非ろ過及び0.22-μmろ過の血漿試料を、GAPDH mRNA濃度について分析した。図8に示したように、粒子と会合したGAPDH mRNAが、外傷患者において存在した。0.22-μmろ過工程は、血漿中のGAPDH mRNA濃度の中央値で70.1-倍(四分位数間領域：13.03-倍から112.8-倍)の低下を示した。ろ過した血漿試料中のGAPDH mRNAの濃度は、外傷患者において、対照対象よりも有意に高い(Mann-Whitney順位和検定、P＜0.05)のに対し、外傷群及び対照群の非ろ過血漿試料間には、GAPDH mRNA濃度における有意差は認められない(Mann-Whitney順位和検定、P＝0.962)こともわかった(図8)。外傷患者のろ過した血漿中のGAPDH mRNA濃度には、対照群のそれと比較した場合に、中央値の9.9倍の増加が存在する。本発明者らのデータは、粒子と会合していないGAPDH mRNA種は、健常対照群と比較した場合は、外傷患者の血漿中で上昇した。この上昇は、損傷した細胞が外傷後に主に粒子と会合していないRNAを放出したことに起因するであろう。
【０１０７】
損傷重症度スコア(ISS)を基に、ろ過した血漿試料が入手可能な17名の外傷患者を、重度の損傷(6名の患者)、中程度の損傷(5名の患者)、及び軽度の損傷(6名の患者)に類別した。図9Aのデータは、0.22-μmろ過した血漿中のGAPDH mRNA濃度は、正常対照と異なる損傷レベルの外傷患者の間で有意差があることを示している(Kruskal-Wallis検定、P＜0.001)。GAPDH mRNA濃度と損傷重症度の間の陽性相関が明らかにされた。軽度、中等度及び重症の損傷群の中央値GAPDH mRNA濃度は、正常対照と比較した場合に、各々、6-、17.4-及び20.6-倍増加した。これらのデータは更に、血漿中の粒子と会合していないGAPDH mRNA種は、外傷患者におけるリスク-層別化及び疾患のモニタリングに重要であることを示している。
【０１０８】
6名の重症の損傷を伴う外傷患者中で、事実上4名の患者が生存し及び2名の患者が死亡した。4名の生存患者中1名及び3名の後に死亡した患者中1名は、多臓器不全症候群(MODS)を発症した。彼らのろ過した血漿GAPDH mRNA濃度を、図9Bに示した。生存群と生存しなかった群の間には有意差がない(Mann-Whitney順位和検定、P＝0.133)が、生存しなかった群の中央値GAPDH mRNA濃度は、生存群と比較した場合に5.9-倍増加したことに注目することは興味深い。
【０１０９】
実施例6
臨床状態-外傷の血漿中の循環血核酸の粒子と会合した及び粒子と会合していない性質の存在-ミトコンドリアDNA
外傷患者の血液試料中の循環血血漿DNAは、損傷後早期に増加し、及びこれらの増加は、外傷後合併症に関連していることが明らかにされている(Lo YMDら、Clin. Chem.、46:319-323(2000))。損傷後最初の1時間に、血漿DNAレベルは、健常対照と比較し100-倍増加する。臓器不全(OF)、多臓器不全症候群(MODS)、及び急性肺損傷(ALI)を発症したもの並びに死亡したものにおいて、合併症を伴わない損傷を伴う患者と比較して、中央値レベルの10〜18-倍の増加が得られた。最適カットオフポイントで74％〜100％の感度及び特異性を有するにもかかわらず、循環血血漿DNAは、OFについて63％から77％の及びMODSについて33％から40％の陽性推定値(positive prediction value)を生じた(Rainer THら、Ann. NY Acad. Sci.、945:211-220(2001))。推定ガイドラインに血漿DNA及び他の変数(例えば、アスパラギン酸トランスアミナーゼ)の推定強度を組み合わせることにより、推定モデルは恐らく87％〜93％の全般的に正確な分類並びにOFについて85％及びMODSについて50％の陽性推定値を提供するであろう。
【０１１０】
各細胞は数百から数千のミトコンドリアを有し及び各ミトコンドリアはいくつかのミトコンドリアDNAコピーを有するので、外傷患者の血漿中のミトコンドリアDNAの放出は、正常対照のそれよりも有意に高いことも明らかにされている。外傷状態におけるミトコンドリアDNAの検出及び定量に関して、外傷状態の予後判定、モニタリング、評価及びリスク層別化に関する感度の良いマーカーとして利用することは有用であろう。
【０１１１】
血液試料は、Prince of Wales Hospitalの救急蘇生室に入院を必要とする外傷性損傷又は卒中を有する患者から収集した。倫理的承認を、Chinese Universityof Hong Kongの治験倫理審査委員会(REC)から受けた。救急診療部で決定した解剖学的損傷の全体の程度を、損傷重症度スコア(ISS)(Baker SPら、J. Trauma、14:187-196 (1974))を用い他覚的に計算した。ISSに従い、外傷患者を3群に分けた：軽度の損傷(ISS＜9)、中程度の損傷(ISS＝9〜15)及び重度の損傷(ISS＞15)。損傷重症度スコアは、緊急治療室において検出された損傷のみを考慮し、及びコンピューター軸方向断層撮影所見は含まなかった。
【０１１２】
血液試料5〜10mlを、EDTA-チューブに収集した。これらの試料を、1500gで10分間遠心し、そして血漿を慎重にEDTA-含有チューブから除去し、手を加えていないポリエチレンチューブに移した。血漿試料を除去した場合に、バッフィーコートが確実に乱されないように注意を払った。各血漿試料を、0.22μmフィルターでろ過した。その後試料を、更に処理するまで、-20℃で貯蔵した。
【０１１３】
これらの血漿試料由来のDNAは、製造業者の推奨に従い「血液及び体液プロトコール」を用い、QIAamp血液キット(Qiagen社、ヒルデン、独国)を用いて抽出した。血漿試料400μl〜800μlを、1カラム当たりのDNA抽出に使用した。
【０１１４】
ミトコンドリアDNA TaqManシステムは、増幅プライマーMit 3130F、5'-AGG ACA AGA GAA ATA AGG CC-3'、及びMit 3301R、5'-TAA GAA GAG GAA TTG AAC CTC TGA CTG TAA-3'からなり、これらは先に報告されている(Parfaitら、Biochem Biophys Res Commun.、247:57-59(1998))。Primer Expressソフトウェア(Applied Biosystems社)を使用し、TaqManプローブ配列、Mit 3153T、5'-FAM-TTC ACA AAG CGC CTT CCC CCG TAA ATG A-TAMRA-3'をデザインした。ミトコンドリアDNAセグメントの配列データは、GenBank配列データベース(寄託番号J01415)から得た。プライマー及びプローブ以外のPCRの全ての成分は、TaqMan PCR Core Reagent Kit (Applied Biosystems社)から供給された。PCRは、製造業者の指示に従い、反応容量50μLで設定した。本発明者らは、血漿DNAの5μLを、各反応混合物に添加し、これは10x緩衝液Aの5μL；各プライマー300nM；50nM TaqManプローブ；4mM MgCl2；200nMのdATP、dCTP、及びdGTPの各々；400nM dUTP；AmpliTaq Goldの1.25U；並びに、AmpEraseウラシルN-グリコシラーゼの0.5U。ミトコンドリアDNA定量の検量線は、プラスミドベクターにサブクローニングしたミトコンドリアDNAアンプリコンに連続希釈を施すことにより調製した(TOPO(商標)TAクローニング試薬セット、Invitrogen社)。検量線は、平行で、及び各分析につき2つ組で行い、ミトコンドリアDNAの100,000コピーから1コピーの濃度範囲であった。リアルタイム定量的PCRを、Applied Biosystems 7700配列検出器において行った。下記のサーマルプロファイルを使用した：50℃で2分間のインキュベーション、引き続きの95℃で10分間の最初の変性工程、並びに95℃で15秒及び55℃で1分間を45サイクル。各試料は、2つ組で分析した。各2つ組の平均量を使用し、更に濃度を計算した。コピー/mlで表された濃度は、下記式を用いて計算した：C＝Q X VDNA／VPCR X1／Vext(式中、C＝血漿中の標的濃度(コピー/ml)；Q＝PCRにおいて配列検出器により決定された標的量(コピー)；VDNA＝抽出後得られたDNAの総容量、典型的にはQiagen抽出1回につき50μl；VPCR＝PCRに使用したDNA溶液の容量、典型的には5μl；Vext＝抽出された血漿容量、典型的には600〜800μlである)。
【０１１５】
Sigma Stat 2.03ソフトウェア(SPSS)を用い、統計解析を行った。リアルタイム定量的PCRの動的範囲を決定するために、1反応当たり100,000コピーから1コピーと同等のミトコンドリアDNA濃度を表しているクローニングしたプラスミドDNAの連続希釈に、ミトコンドリアDNA TaqManシステムによる分析を施した。このアッセイは、5桁の大きさで直線性であり(図10)、その感度はミトコンドリアDNAの1コピーの検出を可能にしている。
【０１１６】
外傷患者における血漿ミトコンドリアDNAの粒子と会合した性質を調べた。37名の外傷患者からの対をなす非ろ過及び0.22-μmろ過血漿試料を、ミトコンドリアmRNA濃度について分析した。図11のデータは、粒子-会合したミトコンドリアDNAは、外傷患者の血漿中にも存在することを示している。0.22-μmろ過工程は、血漿中ミトコンドリアDNA濃度において中央値の266.7-倍(四分位数間領域；75.0-倍から558.4-倍)の低下を生じた。ろ過及び非ろ過の両血漿試料のミトコンドリアDNA濃度は、外傷患者において対照対象よりも有意に高いことも認められる(Mann-Whitney順位和検定、ろ過及び非ろ過血漿についてP＜0.05)。外傷患者のろ過及び非ろ過血漿中のミトコンドリアDNA濃度において、対照群と比較した場合に、各々、中央値の6.3-倍及び5.3-倍の増加が存在する。本発明者らのデータは、ろ過可能な及びろ過不可能な両方のミトコンドリアDNA種が、外傷患者の血漿中において、健常対照群と比較した場合に、上昇したことを示している。これらの上昇は、外傷後、損傷した細胞は、粒子と会合した及び粒子と会合していない両方のミトコンドリアDNAを循環血中に放出することに起因している。
【０１１７】
重度、中等度及び軽度の損傷の、各々、27、18及び42名の外傷患者から得られた非ろ過血漿試料に加え、重度、中等度及び軽度の損傷の、各々、19、12及び24名の外傷患者から得られた0.22-μmろ過した血漿試料を、ミトコンドリアDNA濃度について分析した。非ろ過及びろ過の両方の血漿試料について、ミトコンドリアDNA濃度は、正常対照と異なる損傷レベルの外傷患者の間に有意差があった(Kruskal-Wallis検定、P＜0.001)(図12)。ろ過していない血漿試料について、軽度、中等度及び重症の損傷の群の中央値ミトコンドリアDNA濃度は、正常対照と比較した場合に、各々、9.9-、6.4-、6.4-及び11.4-倍増加した(図12A)。ろ過した血漿試料について、軽度、中等度及び重症の損傷の群の中央値ミトコンドリアDNA濃度は、正常対照と比較した場合に、各々、2.5-、6.4-及び9.9-倍上昇した(図12B)。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図1は、異なる孔-サイズのろ過処理後の健常対象の血漿／血清mRNA及びDNA濃度である：A、リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿／血清GAPDH mRNA濃度(pg/ml)(Y軸)を、処理分類(X軸)に対してプロットしている；B、リアルタイム定量的PCRにより決定された血漿ミトコンドリアDNA濃度(コピー/ml)(Y軸)を、処理分類(X軸)に対してプロットしている；C、リアルタイム定量的PCRにより決定された血漿／血清β-グロビンDNA濃度(ゲノム-当量/ml)(Y軸)を、処理分類(X軸)に対してプロットしている；D、リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿／血清PBP mRNA濃度(コピー/ml)(Y軸)を、処理分類(X軸)に対してプロットしている。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。
【図２】図2は、ろ過及び超遠心処理後の健常対象の血漿mRNA及びDNA濃度である：A、リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿GAPDH mRNA濃度(pg/ml)(Y軸)を、処理分類(X軸)に対してプロットしている；B、リアルタイム定量的PCRにより決定された血漿ミトコンドリアDNA濃度(コピー/ml)(Y軸)を、処理分類(X軸)に対してプロットしている；C、リアルタイム定量的PCRにより決定される血漿β-グロビンDNA濃度(ゲノム-当量/ml)(Y軸)を、処理分類(X軸)に対してプロットしている。未処理、処理せず；ろ過、0.22-μmろ過；超遠心、99,960xgで超遠心。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。
【図３】図3は、0.22-μmろ過処理を伴う又は伴わない、健常対象及び肝細胞癌(HCC)患者における血漿mRNA及びDNA濃度の比較である。処理分類は、X軸に示した。A、リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿GAPDH mRNA濃度(pg/ml)を、Y軸(常用対数スケール)上にプロットしている。B、リアルタイム定量的PCRにより決定された血漿β-グロビンDNA濃度(ゲノム-当量/ml)を、Y軸(常用対数スケール)上にプロットしている。白四角は、健常対象を示すのに対し、影付き四角は、HCC患者を示す。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。
【図４】図4は、0.22-μmろ過処理を伴う又は伴わない、健常対象及び鼻咽喉癌(NPC)患者における血漿mRNA及びDNA濃度の比較である。処理分類は、X軸に示した。A、リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿GAPDH mRNA濃度(pg/ml)を、Y軸(常用対数スケール)上にプロットしている。B、リアルタイム定量的PCRにより決定された血漿β-グロビンDNA濃度(ゲノム-当量/ml)を、Y軸(常用対数スケール)上にプロットしている。白四角は、健常対象を示すのに対し、影付き四角は、NPC患者を示す。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。
【図５】図5は、0.22-μmろ過処理を伴う又は伴わない、健常対象及び妊婦における血漿mRNA及びDNA濃度の比較である。処理分類は、X軸に示した。A、リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿GAPDH mRNA濃度(pg/ml)を、Y軸(常用対数スケール)上にプロットしている。B、リアルタイム定量的PCRにより決定された血漿β-グロビンDNA濃度(ゲノム-当量/ml)を、Y軸(常用対数スケール)上にプロットしている。C、様々な妊娠期間の健常対象及び妊婦の血漿mRNA濃度。リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿GAPDH mRNA濃度(pg/ml)(Y軸、常用対数スケール)を、分類に対してプロットした(正常対象及び第1、第2及び第3妊娠期の妊婦)(X軸)。白四角は、ろ過した血漿を示すのに対し、影付き四角は、非ろ過血漿を示す。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。
【図６】図6は、異なる孔-サイズでろ過処理した後の妊婦の血漿中の胎盤性-由来のmRNAの濃度である。この処理分類を、X軸上に示している。A、リアルタイム定量的RT-PCRにより決定される血漿hPL mRNA濃度(コピー/ml)を、Y軸上にプロットしている。B、リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿βhCG mRNA濃度(コピー/ml)を、Y軸上にプロットしている。C、リアルタイム定量的RT-PCR(pg/ml)により決定された血漿GAPDH mRNA濃度を、Y軸上にプロットしている。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。
【図７】図7は、リアルタイム定量的RT-PCRによるGAPDH mRNAの検出である。A、RT-PCRサイクル(X軸)に対するバックグラウンドに勝る蛍光強度の増幅プロット(Y軸)。各プロットは、対応するシンボルにより記された特定の投入標的量に対応する。B、投入標的量(X軸、常用対数スケール)に対する閾値サイクル(CT)のプロット(Y軸)。投入標的量は、ヒト対照RNAのpgとして表した。
【図８】図8は、0.22-μmろ過処理を伴う又は伴わない、健常対象及び外傷患者における、血漿mRNA濃度の比較である。リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿GAPDH mRNA濃度(pg/ml)(Y軸、常用対数スケール)を、処理分類(X軸)に対してプロットしている。白四角は、健常対照を示すのに対し、影付き四角は、外傷患者を示す。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。
【図９】図9は、0.22-μmろ過処理を伴う、対照対象及び異なる重症度レベルの外傷患者における血漿mRNA濃度の比較である。A、リアルタイム定量的RT-PCRにより決定されたろ過した血漿試料中の血漿GAPDH mRNA濃度(pg/ml)(Y軸、常用対数スケール)を、分類(健常対照対象及び異なる重症度レベルの外傷患者)(X軸)に対してプロットしている。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。B、重症の損傷を伴う外傷患者の0.22-μmろ過した血漿GAPDH mRNA濃度。リアルタイム定量的RT-PCRにより決定された血漿GAPDH mRNA濃度(pg/ml)(Y軸)を、分類(生存及び死亡)(X軸)に対してプロットしている。黒丸は、MODSを発症していない患者を表し、黒三角は、MODSを発症した患者を表している。
【図１０】図10は、リアルタイム定量的PCRによるミトコンドリアDNAの定量分析の検量線である。閾値サイクル(CT)(Y軸)を、投入標的量(X軸、常用対数スケール)に対してプロットしている。投入標的量は、ミトコンドリアDNAアンプリコンのコピー数として表されている。
【図１１】図11は、0.22-μmろ過処理を伴う又は伴わない、健常対象及び外傷患者における血漿ミトコンドリアDNA濃度の比較である。処理分類は、X軸に示している。リアルタイム定量的PCRにより決定された血漿ミトコンドリアDNA濃度(コピー/ml)を、Y軸(常用対数スケール)上にプロットしている。白四角は、健常対照を示すのに対し、影付き四角は、外傷患者を示す。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。
【図１２】図12は、0.22-μmろ過処理を伴う又は伴わない、健常対象及び異なる重症度レベルの外傷患者における血漿ミトコンドリアDNA濃度の比較を表している。分類(健常対照対象及び異なる重症度レベルの外傷患者)を、X軸上に示している。A、リアルタイム定量的PCRにより決定されたろ過していない血漿試料の血漿ミトコンドリアDNA濃度(コピー/ml)を、Y軸(常用対数スケール)に対してプロットしている。B、リアルタイム定量的PCRによるろ過した血漿試料の血漿ミトコンドリアDNA濃度(コピー/ml)を、Y軸(常用対数スケール)上にプロットしている。ボックス内の直線は、中央値を示す。ボックスは、25及び75パーセンタイルの間の間隔を示している。ひげは、10及び90パーセンタイルの間の間隔を示している。黒円は、10及び90パーセンタイルの外側のデータ点を示している。
【図１−１】
2005525124.tif 000003
【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月20日(2005.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
1工程リアルタイム定量的RT-PCRシステムを、血漿中のmRNA濃度の測定に使用した。このシステムにおいて、rTth DNAポリメラーゼは、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼの両方として機能した。GAPDH TaqManシステムは、増幅プライマーGAPDH-F、5'-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3'（配列番号１）；GAPDH-R、5'-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3'（配列番号２）で構成され；並びに、二重-標識された蛍光TaqManプローブは、GAPDN-P、5'-(FAM)CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC(TAMRA)-3'（配列番号３）であった。ヒトGAPDH遺伝子のための配列データは、GenBank配列データベースから得た(寄託番号M33197)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
ミトコンドリアDNA TaqManシステムは、増幅プライマーMit 3130F、5'-AGG ACA AGA GAA ATA AGG CC-3'（配列番号４）、及びMit 3301R、5'-TAA GAA GAG GAA TTG AAC CTC TGA CTG TAA-3'（配列番号５）からなり、これらは先に報告されている(Parfaitら、Biochem Biophys Res Commun.、247:57-59(1998))。Primer Expressソフトウェア(Applied Biosystems社)を使用し、TaqManプローブ配列、Mit 3153T、5'-FAM-TTC ACA AAG CGC CTT CCC CCG TAA ATG A-TAMRA-3'（配列番号６）をデザインした。ミトコンドリアDNAセグメントの配列データは、GenBank配列データベース(寄託番号J01415)から得た。プライマー及びプローブ以外のPCRの全ての成分は、TaqMan PCR Core Reagent Kit (Applied Biosystems社)から供給された。PCRは、製造業者の指示に従い、反応容量50μLで設定した。本発明者らは、血漿DNAの5μLを、各反応混合物に添加し、これは10x緩衝液Aの5μL；各プライマー300nM；50nM TaqManプローブ；4mM MgCl2；200nMのdATP、dCTP、及びdGTPの各々；400nM dUTP；AmpliTaq Goldの1.25U；並びに、AmpEraseウラシルN-グリコシラーゼの0.5U。ミトコンドリアDNA定量の検量線は、プラスミドベクターにサブクローニングしたミトコンドリアDNAアンプリコンに連続希釈を施すことにより調製した(TOPO(商標)TAクローニング試薬セット、Invitrogen社)。検量線は、平行で、及び各分析につき2つ組で行い、ミトコンドリアDNAの100,000コピーから1コピーの濃度範囲であった。リアルタイム定量的PCRを、Applied Biosystems 7700配列検出器において行った。下記のサーマルプロファイルを使用した：50℃で2分間のインキュベーション、引き続きの95℃で10分間の最初の変性工程、並びに95℃で15秒及び55℃で1分間を45サイクル。各試料は、2つ組で分析した。各2つ組の平均量を使用し、更に濃度を計算した。コピー/mlで表された濃度は、下記式を用いて計算した：C＝Q X VDNA／VPCR X1／Vext(式中、C＝血漿中の標的濃度(コピー/ml)；Q＝PCRにおいて配列検出器により決定された標的量(コピー)；VDNA＝抽出後得られたDNAの総容量、典型的にはQiagen抽出1回につき50μl；VPCR＝PCRに使用したDNA溶液の容量、典型的には5μl；Vext＝抽出された血漿容量、典型的には600〜800μlである)。
【国際調査報告】
2005525124.tif 000016
2005525124.tif 000017
2005525124.tif 000018
2005525124.tif 000019