(57)【要約】哺乳類の冒された関節における関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊の治療または予防は、可変基が本明細書に与えられた意味を有する、一般式(I)の化合物を投与することにより達成される。好ましい一般式(I)の化合物は構造式(II)である。この治療は、上記の変性の初期に続いて起こる関節軟骨または軟骨下骨の傷害、損傷または消失を、緩和、減少、有効に治療、反転または予防する。
2005504781.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の一般式(I)
【化１】
2005504781.tif 000007
［式中、
Xは、CR8R9、S、O、NR12またはC(O)を表し；
Aは、CR10R11、またはXとラジカルR6およびR7が結合した原子との間の結合を表し；
ラジカルR1、R2、R3の第１は、
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲノアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイル、N-アルキルスルファモイル、N,N-ジアルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミドおよびアルキルスルホン-N-アルキルアミドからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよいアリール；または、
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲノアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイル、N-アルキルスルファモイル、N,N-ジアルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミドおよびアルキルスルホン-N-アルキルアミドからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよい、N、OおよびSから独立に選択される1、2または3個のヘテロ原子を有する、芳香族または非芳香族の、単環式または二環式の、ベンゾ付加していてもよい複素環基
を表し；
ラジカルR1、R2、R3の第2は、
ハロゲン、シクロアルキル、アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシおよびトリフルオロメチルからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよいアルキル；
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、ハロゲノアルコキシおよびヒドロキシからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよいシクロアルキル；
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲノアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイル、N-アルキルスルファモイル、N,N-ジアルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミドおよびアルキルスルホン-N-アルキルアミドからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよいアリール；または、
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲノアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイル、N-アルキルスルファモイル、N,N-ジアルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミドおよびアルキルスルホン-N-アルキルアミドからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよい、N、OおよびSから独立に選択される1、2または3個のヘテロ原子を有する、芳香族または非芳香族の、単環式または二環式の、ベンゾ付加していてもよい複素環基
を表し；
ラジカルR1、R2、R3の第３は、H、アルキル、ハロゲノアルキル、ヒドロキシアルキル、-CHO、-COOH、ハロゲン、シアノ、アルキルスルホニル、スルファモイルまたはB-Yを表し、ここで、
Bは、ヒドロキシまたはアルコキシにより置換されていてもよいアルキレンまたはアルケニレンを表し；
Yは、-COOH、SO3H、OPO(OH)2、OP(OH)2、-CHOまたはテトラゾリルを表すか；あるいは、
ラジカルR1、R2、R3の第２および第３は、これらが結合している原子と共に、飽和または不飽和シクロアルキルを表し；
R4-R11は、同一であっても異なっていてもよく、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、COOHまたはアシルオキシを表し、隣接するラジカルの場合は結合を表してもよく、またジェミナルなラジカルはそれらが結合するC原子と共にカルボニルまたはシクロアルキルを表してもよく；
R12は、水素、アルキルまたはフェニルを表す。］
の化合物、およびその光学異性体、生理的に許容される塩および誘導体の、関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防するための使用。
【請求項２】
ラジカルR1、R2、R3の第１および第２が独立に、置換されていてもよいアリールまたは芳香族複素環残基を表す、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ラジカルR1、R2、R3の第３が、COOHまたはB-Y
［ここで、YはCOOH、およびBはアルキレンを表す。］
を表す、請求項１記載の使用。
【請求項４】
ラジカルR1、R2、R3の第３が、COOHまたはB-Y
［ここで、YはCOOH、およびBはアルキレンを表す。］
を表す、請求項２記載の使用。
【請求項５】
上記の一般式(I)の化合物が、(Ia)
【化２】
2005504781.tif 000008
の[6-(4-クロロフェニル)-2,2-ジメチル-7-フェニル-2,3-ジヒドロ-1H-ピロリジン-5-イル]-酢酸、その生理的に許容される塩または生理的に加水分解されるエステルである、請求項１記載の使用。
【請求項６】
関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊が、関節軟骨および/または軟骨下骨の傷害、損傷または消失を含む、請求項１から５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
上記の変性または破壊の初期の治療のための、請求項１から５のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
現在または将来に上記の変性または破壊の状況にある状態の哺乳類を治療するための、請求項１から５のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
現在または将来に上記の状況にある哺乳類の状態が、
(A) 上記の哺乳類の関節の、股関節部形成異常の進行の測定を含む、臨床検査および評価による陽性の結果；
(B) 上記の哺乳類の１以上の関節に対する侵襲的手術法の実施；
(C) 放射線写真および磁気共鳴画像(MRI)を含む非侵襲的方法を用いる上記の哺乳類の１以上の関節の検査による陽性の結果；
(D) １以上の下記の物質に関して上記の哺乳類の体液または関節組織に対しておこなわれる生化学試験による陽性の結果：
(1) インターロイキン-1ベータ(IL-1β)の増加；
(2) 腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)の増加；
(3) IL-1βのIL-1受容体アンタゴニストタンパク質(IL-1Ra)に対する比の増加；
(4) p55 TNF受容体(p55 TNF-R)の発現の増加；
(5) インターロイキン-6 (IL-6)の増加；白血病阻害因子(LIF)の増加；
(6) インスリン様成長因子-1 (IGF-1)の不変または減少；
(7) トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)の減少；血小板由来成長因子(PDGF)の不変または減少；
(8) 塩基性線維芽細胞成長因子(b-FGF)の不変または減少；
(9) ケラタン硫酸の増加；
(10) ストロメリシンを含むマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の増加；
(11) ストロメリシンを含むマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)のメタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP)に対する比の増加；
(12) オステオカルシンの増加；
(13) アルカリホスファターゼの増加；
(14) ホルモンチャレンジに応答してのcAMPの増加；
(15) ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)の増加；
(16) 軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質の増加；
(17) タイプ-II特異的コラーゲンネオエピトープの存在；および
(18) コラゲナーゼの増加
の１以上により決定される、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
上記の治療または予防が上記の化合物を約1-10mg/kg/日の量で投与することを含む、請求項１から５のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
上記の治療または予防が、１以上の一般式(I)の化合物に加えて、基本的にポリ硫酸化グリコサミノグリカン(PSGAG)、グルコサミン、コンドロイチン硫酸(CS)、ヒアルロン酸(HA)、ポリ硫酸ペントサン(PPS)、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンからなる群より選択される１以上のメンバーを投与することを含む、請求項１から５のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
(A) １以上の請求項１で規定された一般式(I)の化合物；および
(B) 基本的に、(1)ポリ硫酸化グリコサミノグリカン(PSGAG)、グルコサミン、コンドロイチン硫酸(CS)、ヒアルロン酸(HA)、ポリ硫酸ペントサン(PPS)、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンからなる群より選択される１以上のメンバー
を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
上記の一般式(I)の化合物が、式(Ia)
【化３】
2005504781.tif 000009
の[6-(4-クロロフェニル)-2,2-ジメチル-7-フェニル-2,3-ジヒドロ-1H-ピロリジン-5-イル]-酢酸、その生理的に許容される塩または生理的に加水分解されるエステルである、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
哺乳類に、関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防するのに有効な量の、１以上の、請求項１から５のいずれか１項で規定された一般式(I)の化合物を投与することを含む、治療を必要とする哺乳類の１以上の関節における関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環付加したピロール化合物、および特にML3000、その塩または誘導体を、哺乳類の炎症を起こした関節における軟骨および/または軟骨下骨の傷害および消失を治療または予防する手段として、哺乳類において使用することに関する。このような軟骨および/または軟骨下骨の損傷は、哺乳類において生じる場合、変形性関節症およびその後遺症の過程の自然で起こる続発症である。この予想外の効果を達成する能力を、「軟骨保護」と呼ぶ。
【背景技術】
【０００２】
アセチルサリチル酸(ASA)、ジクロフェナク、インドメタシン、イブプロフェンおよびナプロキセンのような非ステロイド系消炎薬(NSAID)は、臨床で広く使用されている。薬理学の見地からいうと、これらはシクロオキシゲナーゼ(COX)の阻害剤として作用する。
【０００３】
薬理学的に同様に作用するピロリジンは、多くの文献により公知である。たとえば、消炎活性のあるピロリジンは、Arch. Pharm. 319, 65-69 (1986); 319, 231-234 (1986); 318, 661-663 (1985); 318, 663-664 (1985); 319, 500-505 (1986); 319, 749-755 (1986), 327, 509-514 (1994); 330, 307-312 (1997); ならびに、J. Med. Chem. 1987, 30, 820-823および1994, 37, 1894-1897に記載されている。
【０００４】
別のピロリジンは米国特許第5,260,451号（欧州特許第0397175号に相当）、ならびに、WO95/32970; WO95/32971; およびWO95/32972に記載されている。これらの化合物は構造式
【化１】
2005504781.tif 000003
【０００５】
により表され、環付加したジアリールピロール基および第３の酸性残基R3を共通して有する。上記の化合物は高い親油性、高いバイオアベイラビリティーおよび中程度の半減期を特徴とする(Drugs of the Future, 1995, 20(10): 1007-1009)。
【０００６】
同様の構造の別のピロリジンは、DE 198 45 446.6およびWO 01/05792に記載されている。さらに、米国特許第4,232,038号によれば、アルキルスルフィニルベンゾイルおよびアルキルスルホニルベンゾイル置換ピロリジンは、抗炎症、鎮痛および解熱特性を有すると言われている。DE 196 24 290.8およびDE 196 24 289.4によれば、このタイプのある種の化合物は脂肪減少作用を有する。
【０００７】
構造式(Ia)
【化２】
2005504781.tif 000004
【０００８】
のML3000（[2,2-ジメチル-6-(4-クロロフェニル)-7-フェニル-2,3-ジヒドロ-1H-ピロリジン-5-イル]-酢酸）は、COXおよび5-リポキシゲナーゼ(5-LO)の非抗酸化剤平衡型二元阻害剤である(3)。本薬物は、COX-1およびCOX-2の両方を阻害するCOXの非選択的阻害剤である。本薬物は鎮痛、解熱および抗炎症活性を有し、ラットにおけるカラギーナン誘導性の足の浮腫、およびラットアジュバント関節炎を含め、多くの動物モデルにおいて強い抗炎症作用を有することが示されている(4)。
【０００９】
変形性関節症(OA)はもっともよく見られる筋骨格の疾病である。これは主に股関節部および膝のような体重を支える滑膜性の関節を冒すが、指節間関節および脊髄のような他の関節をも冒す。この疾病の構造的変化には、関節軟骨の進行性の浸食、骨棘の形成、および疾病の臨床期において、さまざまな程度の滑膜の炎症が含まれる。これらの変化に伴って軟骨下骨の顕著な改造が生じるが、これは、いくつかの研究によれば、主として疾病の初期における過度の骨再吸収、その後の過度の骨形成、さらにそれに続く骨硬化および軟骨下骨の肥厚の増大によると考えられている。
【００１０】
変形性関節症(OA)にみられる構造的変化の発生および進行を起こすメカニズムは多様かつ複雑であり、多くは未知のままである。これらには、多くの形態学的変化が観察される軟骨のみでなく、さまざまな程度および悪化度の炎症性反応の部位である滑膜もまた関与する(1)。関節軟骨の消失を誘導し得る可溶性因子、たとえばインターロイキン-1 (IL-1)、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、およびプロスタグランジンのアップレギュレーションを含む軟骨マトリックスの異化の原因であると信じられている多くの経路がある。軟骨細胞の直接の傷害もまた、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)活性、たとえば、コラゲナーゼ、ストロメリシンおよびゼラチナーゼ、ならびにさまざまな炎症仲介物質の生産を促進する(2)。
【００１１】
いかなる関節においても、外傷性傷害のような傷害を受けた後の修復および正常化に必要な代謝プロセスが連続的に起こると考えなければならない。
【００１２】
したがって、軟骨保護薬として許容される化合物であるためには、それは第１に上記のような軟骨細胞代謝活性を維持すること、すなわち、治癒プロセスの一部である細胞の複製およびマトリックス成分の生合成を阻害または妨害しないことが可能でなくてはならない。この点に関して、当業者は、多くのNSAIDが細胞外マトリックスの主要な成分の生合成に対して著しい阻害活性を示すことを認めるであろう。
【００１３】
同時に、軟骨保護薬として許容されるためには、さまざまなサイトカイン、プロスタグランジンおよびプロテイナーゼのような仲介物質の軟骨に対する分解作用に対抗することができなくてはならない。そこで、効力の高い軟骨保護薬はその同化経路に対するプラスの効果、およびその異化プロセスを阻害する能力の両方で評価されるべきであるということが当業者に受け入れられてきた。典型的にモニターされた異化過程には、とりわけ、マトリックス分解酵素の放出および阻害、プロスタグランジンおよびロイコトリエン生合成に対する効果、および薬物のIL-1に仲介される関節軟骨の分解を阻害する能力が含まれる。
【００１４】
COX酵素を阻害する活性を有する、NSAIDのような多くの薬物が長年にわたって使用されてきた。これらは、痛みのような変形性関節症の症状を効果的に軽減するかもしれないが、これらのin vivoの実験的OAの進行を減少させる能力は限られていた(8,9)。シクロオキシゲナーゼ-1 (COX-1)およびCOX-2の両方の阻害活性を有する２つのNSAIDであるテニダップおよびカルプロフェンによる治療は抗OA効果を有することが示されたが(8,9)、ジクロフェナクまたはASAのような他のNSAIDは効果がないか(10)、OAの実験的イヌモデルにおいてはむしろ軟骨の損傷を促進することが示された(11)。同様に、ヒトにおいて、膝OAの患者における最近の研究は、X-線判定基準に基づいて、別のNSAIDであるチアプロフェン酸による５年にわたる治療は軟骨の損傷の進行を遅らせることができなかったこと、およびインドメタシンはその進行を促進さえしたことを示した(15)。
【００１５】
驚くべきことに、ML3000のようなある種の環付加したピロール化合物が実験的イヌOAにおける病変の発達を有意に減少させることが見いだされた。これらの化合物の保護効果は軟骨の病変の発達の減少において特に明白であった。この現象はPGE2およびLTB4の両方の生産の有意な阻害のみでなく、軟骨の分解に関与する２つの主要な異化因子、すなわち、IL-1βおよびコラゲナーゼ-1のその部位における減少とも関連する。
【発明の開示】
【００１６】
そこで、本発明は下記の一般式(I) により表される環付加したピロール化合物およびその光学異性体、生理的に許容される塩および誘導体の、関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防するための使用に関する。
【化３】
2005504781.tif 000005
【００１７】
［式中、
Xは、CR8R9、S、O、NR12またはC(O)を表し；
Aは、CR10R11、またはXとラジカルR6およびR7が結合した原子との間の結合を表し；
ラジカルR1、R2、R3の第１は、
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲノアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイル、N-アルキルスルファモイル、N,N-ジアルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミドおよびアルキルスルホン-N-アルキルアミドからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよいアリール；または、
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲノアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイル、N-アルキルスルファモイル、N,N-ジアルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミドおよびアルキルスルホン-N-アルキルアミドからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよい、N、OおよびSから独立に選択される1、2または3個のヘテロ原子を有する、芳香族または非芳香族の、単環式または二環式の、ベンゾ付加していてもよい複素環基を表し；
ラジカルR1、R2、R3の第2は、
ハロゲン、シクロアルキル、アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシおよびトリフルオロメチルからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよいアルキル；
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、ハロゲノアルコキシおよびヒドロキシからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよいシクロアルキル；
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲノアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイル、N-アルキルスルファモイル、N,N-ジアルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミドおよびアルキルスルホン-N-アルキルアミドからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよいアリール；または、
ハロゲン、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲノアルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、スルファモイル、N-アルキルスルファモイル、N,N-ジアルキルスルファモイル、アルキルスルホンアミドおよびアルキルスルホン-N-アルキルアミドからなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよい、N、OおよびSから独立に選択される1、2または3個のヘテロ原子を有する、芳香族または非芳香族の、単環式または二環式の、ベンゾ付加していてもよい複素環基を表し；
ラジカルR1、R2、R3の第３は、H、アルキル、ハロゲノアルキル、ヒドロキシアルキル、-CHO、-COOH、ハロゲン、シアノ、アルキルスルホニル、スルファモイルまたはB-Yを表し、ここで、
Bは、ヒドロキシまたはアルコキシにより置換されていてもよいアルキレンまたはアルケニレンを表し；
Yは、-COOH、SO3H、OPO(OH)2、OP(OH)2、-CHOまたはテトラゾリルを表すか；あるいは、
ラジカルR1、R2、R3の第２および第３は、これらが結合している原子と共に、飽和または不飽和シクロアルキルを表し；
R4-R11は、同一であっても異なっていてもよく、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、COOHまたはアシルオキシを表し、ここで、隣接するラジカルの場合は結合を表してもよく、または同一炭素原子上に２つの置換基があるラジカル（ジェミナルなラジカル）はそれらが結合するC原子と共にカルボニルまたはシクロアルキルを表してもよく；
R12は、水素、アルキルまたはフェニルを表す。］
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
「アルキル、アルコキシ等」の用語は、CH3、C2H5、n-プロピル、CH(CH3)2、n-ブチル、CH(CH3)-C2H5、イソブチル、C(CH3)3、n-ペンチルまたはn-ヘキシル、特に、CH3、C2H5またはCH(CH3)2のような、好ましくは、他に特に言及しない限り、1から8、特に１から６、より好ましくは１から４の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基を含む。ラジカルR1からR12の置換基としては、「アルキル、アルコキシ等」は好ましくは１から４の炭素原子を含む。
【００１９】
置換された「アルキル、アルコキシ等」は、特に、
ハロゲノアルキル、すなわち、フッ素、塩素、臭素および/またはヨウ素により部分的にまたは完全に置換されたアルキル、たとえば、CH2F、CHF2、CF3、CH2Cl、2-フルオロエチル、2-クロロエチルまたは2,2,2-トリフルオロエチルであって、ラジカルR1からR12の置換基としては、ハロゲノアルキルは好ましくはCHF2および特にCF3を意味する；
ハロゲノアルコキシ、すなわち、フッ素、塩素、臭素および/またはヨウ素により部分的にまたは完全に置換されたアルコキシ、たとえば、上記のハロゲノアルキル残基に対応するハロゲノアルコキシ残基であって、ラジカルR1からR12の置換基としては、ハロゲノアルコキシは好ましくはOCHF2および特にOCF3を意味する；
アルコキシアルキル、すなわち、アルコキシにより置換されたアルキル、たとえば、-CH2-OCH3または2-メトキシエチル；
ヒドロキシアルキル、すなわち、ヒドロキシにより置換（好ましくは１置換）されたアルキル、たとえば、ヒドロキシメチルまたは2-ヒドロキシエチル；
トリフルオロメチルアルキル、すなわち、トリフルオロメチルにより置換（好ましくは１置換）されたアルキル、たとえば、上でヒドロキシアルキルに関して記載された残基をヒドロキシ基の代わりにトリフルオロメチル基で置換したもの；
トリフルオロメトキシアルキル、すなわち、トリフルオロメトキシにより置換（好ましくは１置換）されたアルキル、たとえば、上でヒドロキシアルキルに関して記載された残基をヒドロキシの代わりにトリフルオロメトキシにより置換したもの；
シクロアルキルアルキル、すなわちシクロアルキルにより置換（好ましくは１置換）されたアルキル、たとえば、上でヒドロキシアルキルに関して記載された残基をヒドロキシの代わりにシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルにより置換したもの、
を含む。
【００２０】
「シクロアルキル」の用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等のような、好ましくは、他に特に言及されない限り、３から９，特に３から７，より好ましくは５から６炭素原子を有する、単環または二環アルキル基を含む。
【００２１】
「アルキレン」の用語は、メチレンおよびエチレンのような、好ましくは、他に特に言及されない限り、１から８，特に１から６，より好ましくは１から４炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖アルキレン基を含む。アルキレンがヒドロキシまたはアルコキシにより置換される場合は１置換が好ましい。
【００２２】
「アルケニレン」の用語は、エテニレンのような、好ましくは、他に特に言及されない限り、２から８，特に２から６，より好ましくは２から４炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の、一または多不飽和アルキレン基を含む。
【００２３】
アシルオキシは、-OCORで、Rがアルキルまたはアリールを表すものを意味する。好ましい例はアセチルオキシおよびベンゾイルオキシである。
【００２４】
-COOアルキルは、CO-OCH3、CO-OC2H5、CO-OCH2-C2H5、CO-OCH(CH3)2、n-ブトキシカルボニル、CO-OCH(CH3)-C2H5、CO-OCH2-CH(CH3)2、CO-OC(CH3)3のようなアルコキシカルボニル、特にCO-OCH3、CO-OC2H5、CO-OCH(CH3)2またはCO-OCH2-CH(CH3)2を意味する。
【００２５】
-COOアルクフェニル（-COOAlkPhenyl）は、ベンジルオキシカルボニルのような、アルキル部分でフェニルにより置換されたアルコキシカルボニル基を意味する。
【００２６】
アルキルチオは、SCH3、SC2H5、SCH2-C2H5、SCH(CH3)2、n-ブチルチオ、1-メチルプロピルチオ、2-メチルプロピルチオ、SC(CH3)3のような、-S-アルキルを意味し、アルキルスルファニルまたはアルキルメルカプトとも呼ばれる。メチルチオが好ましい。
【００２７】
アルキルスルフィニルは、SO-CH3、SO-C2H5、n-プロピルスルフィニル、1-メチルエチルスルフィニル、n-ブチルスルフィニル、1-メチルプロピルスルフィニル、2-メチルプロピルスルフィニル、1,1-ジメチルエチルスルフィニルのような、-S(O)-アルキルを意味し、アルキルスルホキソとも呼ばれる。メチルスルフィニルが好ましい。
【００２８】
アルキルスルホニルは、SO2-CH3、SO2-C2H5、n-プロピルスルホニル、SO2-CH(CH3)2、n-ブチルスルホニル、1-メチルプロピルスルホニル、2-メチルプロピルスルホニル、SO2-C(CH3)3のような、-S(O)2-アルキルを意味し、アルキルスルホンとも呼ばれる。メチルスルホニルが好ましい。
【００２９】
スルファモイルは、-S(O)2NH2を意味し。アミドスルホニルまたはスルホン酸アミドとも呼ばれる。
【００３０】
N-アルキルスルファモイルは、１置換スルファモイル-S(O)2NH-アルキル、たとえば、-S(O)2NH-CH3を意味する。
【００３１】
N,N-ジアルキルスルファモイルは、N-結合アルキル残基が同一であっても異なっていてもよい２置換スルファモイル-S(O)2N-(アルキル)2、たとえば、-S(O)2N(CH3)2を意味する。
【００３２】
アルキルスルホンアミドは、NHSO2-CH3、NHSO2-C2H5、n-プロピルスルホンアミド、NHSO2-CH(CH3)2、n-ブチルスルホンアミド、1-メチルプロピルスルホンアミド、2-メチルプロピルスルホンアミド、NHSO2-C(CH3)3のような-NHS(O)2-アルキルを意味する。メチルスルホンアミドが好ましい。
【００３３】
アルキルスルホン-N-アルキルアミドは、N-およびS-結合アルキル残基が同一であっても異なっていてもよい-N(アルキル)S(O)2-アルキル、たとえば、N(CH3)SO2-CH3を意味する。
【００３４】
カルボニル、CHO、-COOH、-SO3Hは、それぞれ、>C=O、ホルミル、カルボキシ、カルボキシカルボニルおよびスルホを意味する。
【００３５】
「アリール」は、好ましくはナフチルおよび特にフェニルを意味する。
【００３６】
「ハロゲン」の用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子を含む。通常フッ素および塩素が好ましく、場合によっては臭素も好ましい。
【００３７】
「複素環残基」は、芳香族または非芳香族の、単環または二環式、および/またはベンゾ付加した、特に５または６員環複素環残基を含む。例としては、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、インドリル、キノリニル、特に、ピリジル、ピリミジルおよびイソキノリニルのような、窒素を含む複素環残基が挙げられる。芳香族残基にはまた、チエニル、ベンゾチエニル、フラニルおよび特にベンゾフラニルのような、酸素または硫黄原子を含む複素環残基も含まれる。また、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、イソキサゾリルおよびオキサゾリルのような、２以上の異なるヘテロ原子を含む複素環残基も含まれる。チエニル、ピリジルおよびチアゾリルは好ましい芳香族複素環残基である。非芳香族残基には、ピロリジニル、ピペリジニルおよびピペラジニルのような、窒素を含む複素環残基が含まれる。これには、モルホリニルのような２以上の異なるヘテロ原子を含む複素環残基も含まれる。
【００３８】
置換された残基、特にアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、好ましくは１、２または３置換である。
【００３９】
[α]-環付加物(annelland)は、６、または特に５員環の複素環式または特に脂環式であり、脂環式である場合には不飽和または特に飽和、および/または置換または無置換であってよい。
【００４０】
一般式(I)の[α]-環付加したピロール化合物には、特に、XがCR8R9を表し、AがXとラジカルR6およびR7を結合する原子との間の結合を表すもの（ピロリジン）；XがCR8R9を表し、AがCR10R11を表すもの（インドリジン）；XがNR12を表し、AがXとラジカルR6およびR7を結合する原子との間の結合を表すもの（ピロロ[1,2-a]イミダゾール）；XがSを表し、AがXとラジカルR6およびR7を結合する原子との間の結合を表すもの（ピロロ[2,1-b]チアゾール）；XがSを表し、AがCR10R11を表すもの（ピロロ[2,1-b]1,3-チアジン）；XがOを表し、AがCR10R11を表すもの（ピロロ[2,1-b]1,3-オキサジン）；XがOを表し、AがXとラジカルR6およびR7を結合する原子との間の結合を表すもの（ピロロ[2,1-b]オキサゾール）で、言及されなかった残基は上記の意味を有する化合物が含まれる。
【００４１】
[α]-環付加物が５員環不飽和残基である場合、特にR4およびR6は、たとえば、ピロリジン、ピロロ[2,1-b]イミダゾールおよびピロロ[2,1-b]チアゾールの場合のように、結合を表す。[α]-環付加物が６員環不飽和残基である場合、特にR4およびR6は、たとえばピロロ[2,1-b]1,3-チアジン、ピロロ[2,1-b]1,3-オキサジンまたは5,6-ジヒドロインドリジンの場合のように、また、場合によってはR8およびR10も、たとえばインドリジンの場合のように、結合を表す。
【００４２】
本発明の特定の実施形態によれば、特定の[α]-環付加物に結合していない場合、R4-R7は、同一であっても異なっていてもよく、水素またはアルキルを表す。本発明の別の特定の実施形態によれば、ラジカルR4、R5、R6およびR7の少なくとも１つがヒドロキシアルキル、特にヒドロキシメチルを表し、R4、R5、R6およびR7のうちの残りのラジカルは独立にHまたはアルキルを表す。この実施形態によれば、R4がヒドロキシアルキル、特にヒドロキシメチル、R5がHまたはアルキル、そしてR6、R7が独立にHまたはアルキルであるのが好ましい。本発明の別の特定の実施形態によれば、ラジカルR8およびR9のうちの一方がH、アルキル、ヒドロキシアルキルまたはアルコキシアルキルを表し、他方がヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシまたはアシルオキシを表す。あるいは、R8およびR9は、これらが結合するC原子と共にカルボニル基を表す。
【００４３】
6,7-ジヒドロ-5H-ピロリジン、すなわち、一般式(I)において、XがCR8R9を表し、AがXとラジカルR6およびR7を結合する原子との間の結合を表し、R4、R5、R6、R7、R8、R9が同一であっても異なっていてもよく、上記の意味を有し、好ましくは水素またはアルキルを表す化合物は特に有用である。R4からR9が水素である、またはラジカルR4からR9のうち少なくとも１つまたは２つ、たとえばR6および/またはR7がアルキル、特にメチルを表す、6,7-ジヒドロ-5H-ピロリジンは特に好ましい。
【００４４】
本発明の重要な態様によれば、一般式(I)において、ラジカルR1、R2、R3の第１および第２、好ましくはR1およびR2が独立に、特にハロゲン、アルキルおよびハロゲノアルキル、特にCF3からなる群より独立に選択される１以上の置換基により置換されていてもよい、アリールおよび芳香族複素環残基から選択されるΠ電子の豊富な系、特にフェニルを表し、R1が好ましくは無置換フェニルで、R2が好ましくは4-置換フェニルであるような化合物が特に有用である。
【００４５】
本発明の別の重要な態様によれば、一般式(I)において、ラジカルR1、R2、R3の第３、好ましくはR3が、COOHまたはB-Y（ここで、YはCOOHで、Bは好ましくはアルキレンを表す）のような酸性残基を表す、またはB-Y（ここで、Yは、テトラゾリルである）のような酸性残基の前駆体を表すような化合物が特に有用である。
【００４６】
構造式(Ia)
【化４】
2005504781.tif 000006
【００４７】
により表される[6-(4-クロロフェニル)-2,2-ジメチル-7-フェニル-2,3-ジヒドロ-1H-ピロリジン-5-イル]-酢酸 (ML3000)、その生理的に許容される塩および誘導体、たとえば生理的に加水分解されるエステルの使用が特に好ましい。
【００４８】
生理的に許容される塩には、酸または塩基付加塩が含まれる。
【００４９】
酸付加塩は、たとえば、一般式(I)の化合物と、塩酸、硫酸、硝酸またはリン酸のような無機酸との、または有機酸、特にカルボン酸、たとえば、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、アミグダリン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、またはスルホン酸、たとえば、メタンスルホン酸、フェニルスルホン酸およびトルエンスルホン酸等との塩である。
【００５０】
塩基付加塩は、たとえば、一般式(I)の化合物と、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような無機塩基との、またはモノ、ジ、またはトリエタノールアミン等のような有機塩基との塩である。
【００５１】
生理的に許容される誘導体には、特に、in vivoで一般式(I)の化合物またはその活性型（代謝産物）に再変換する、一般式(I)の化合物のプロドラッグが含まれる。例としては、ラジカルR1、R2、R3の第３が酸性残基を表す一般式(I)の加水分解可能なエステル、たとえば、それらのアルキル（ラジカルR1、R2、R3の第３が官能基COOアルキルを含む）、アラルキル（ラジカルR1、R2、R3の第３が官能基COOアルクアリール（COOAlkaryl）、たとえば、COOアルクフェニルを含む）、ピバロイルオキシメチル、アセトキシメチル、フタリジル、インダニルおよびメトキシメチルエステルが挙げられる。
【００５２】
特定の態様によれば、本発明は、一般式(I)の化合物から選択される軟骨保護薬の使用に関する。
【００５３】
本明細書において用いられる「軟骨保護薬」の用語は、その主な作用部位が軟骨である化合物を指すものと理解される。このような軟骨保護薬はまた、滑膜に関して抗炎症作用を有し、軟骨下骨および滑膜線維芽細胞のような他の結合組織における細胞の生合成にプラスの影響を与え、また炎症性細胞の遊走を仲介して炎症の過程を遅らせることができるとも理解される。
【００５４】
本発明は、哺乳類の１以上の関節における関節軟骨および/または軟骨下骨の障害、損傷または消失を受けているまたは将来受ける可能性のある哺乳類に適用することができる、治療の方法、およびそれに有用な医薬組成物、ならびにそれに適した包装を提供する。
【００５５】
他のNSAID、特に使用が確立されているものが、実際には変形性関節症の進行を悪化させる可能性があるのに対して、一般式(I)の化合物を用いることは、特に長期の適用が指示された場合に特に有利である。一般式(I)の化合物が、関与する哺乳類の関節において同時に炎症の過程に有害な影響を与えることなく、上記のような関節軟骨の損傷を治療または予防するのに有用であることは驚くべきことである。
【００５６】
一般式(I)の化合物の、最終的には関節軟骨および/または軟骨下骨の破壊および消失を招く病気のプロセスを逆転させる能力は、特に、関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊の初期にある哺乳類の安全で有効な治療に広範囲の結果をもたらす。
【００５７】
本明細書において、「哺乳類」の用語は、非常に多くの異なる品種のあるすべての哺乳類、好ましくはヒト、ネコ、イヌまたはウマを意味する。
【００５８】
本発明によれば、治療を必要とする哺乳類の１以上の関節における関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊の治療または予防は、上記の哺乳類に、上記の関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防するのに有効な量で、１以上の一般式(I)の化合物を投与することを含む。
【００５９】
特に、上記の治療または予防は、変性または破壊、たとえば特に上記の変性または破壊の上記の初期の後におこる関節軟骨および/または軟骨下骨の障害、損傷または消失を、緩和し、減少させ、有効に治療し、逆転させ、または予防することを含む。本明細書において本発明の軟骨保護化合物の投与に関して用いられる「治療または予防」という表現は、上記の投与の治療上の目的、および上記の投与により実際に達成された治療結果の両方を指すことを意図している。上で論じたように、上記の化合物の投与により達成される治療の程度は、緩和から病気の過程の有意な減少、および病気のプロセスの反転を含む、病気の有効な治療までの範囲がある。高い程度の治療上の有効性は、関節軟骨および/または軟骨下骨の変性の初期の後の、関節軟骨および/または軟骨下骨のすべての傷害、損傷または消失の予防をもたらす。
【００６０】
「関節軟骨および/または軟骨下骨の変性の初期」という表現は、病気のプロセスを定義し、またその結果である、関節軟骨および/または軟骨下骨の最初の病理学的変化のまさに開始時を意味するものである。
【００６１】
軟骨は、いくつかの形態で、たとえばヒアリン軟骨、弾性軟骨および線維軟骨として存在する線維性結合組織である。これは、水、コラーゲンおよびプロテオグリカンからなり、これらが共に、堅いが弾力があり、かなりの衝撃吸収能力を有する独特の繊維強化水性ゲルを作っている結合組織である。関節軟骨は哺乳類の関節に見られる軟骨である。これは生きている細胞（軟骨細胞）からなり、この細胞が、一般的に細胞外マトリックスと呼ばれる間質物質を生産し、それに囲まれている。軟骨の細胞外マトリックスを生産する軟骨細胞は非常に活性であり、このマトリックスの完全な状態は、異化サイトカインIL-1α、βおよびTNFαの作用と、同化サイトカインIGFおよびTGFβの作用の間の平衡により維持されている。IL-1α、βおよびTNFαは、特異的マトリックス分解メタロプロテアーゼの生産を誘導することにより作用するが、IGFおよびTGFβは、成長因子として軟骨、コラーゲンおよびプロテオグリカンの高分子組立ブロックの生産を誘導することにより作用する。他のサイトカインおよびその阻害剤、ならびにメタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP)もまた、マトリックスホメオスタシスと呼ばれるこの平衡に影響を与える。
【００６２】
本明細書において用いられる「メタロプロテアーゼ」という用語は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)を意味し、特に、通常、関節軟骨の変性の間に濃度の上昇を示す酵素のファミリー、すなわちストロメリシン、コラゲナーゼ、およびゼラチナーゼを含む。コラゲナーゼは天然のコラーゲンの分解に広く関与している。ストロメリシンはプロテオグリカンの分解に広く関与している。ゼラチナーゼは変性したコラーゲンの分解に広く関与している。MMP特性を有する酵素であるアグレカナーゼもまた、軟骨変性の早期に存在する軟骨プロテオグリカン凝集体のタンパク質分解に関与するので、この用語の中に含まれる。変性の初期に関節軟骨中に存在する３つのコラゲナーゼは、コラゲナーゼ-1 (MMP-1)、コラゲナーゼ-2 (MMP-8)、およびコラゲナーゼ-3 (MMP-13)である。３つのストロメリシン、ストロメリシン-1 (MMP-3)、ストロメリシン-2 (MMP-10)、およびストロメリシン-3 (MMP-11)の中で、ストロメリシン-1のみが変性の初期に関節軟骨中に現れる。
【００６３】
変形性関節症は、滑膜性（可動性、内部が滑膜で覆われた）関節の不全であると定義されるので、このような関節において、骨が、関節腔を満たす透明なアルカリ性の粘質の液体である滑液を分泌する滑膜、および通常その点における滑膜の代わりに、関節を形成する骨の表面の間に介在する関節軟骨に囲まれているという事実がなければ、常に少なくとも２つの接触する可動性の骨の表面が見いだされることになる。
【００６４】
変形性関節症における最も初期の巨視的病理学的知見は、関節表面の習慣的に荷重のかかる領域における関節軟骨の軟化である。この領域は、哺乳類の膝関節の場合、特に膝関節の十字靭帯を横に切断することを含む変形性関節症のモデルにおいては、大腿顆および脛骨プラトーから構成される。変形性関節症の進行に伴って、軟骨表面の完全な状態は失われ、関節軟骨が薄くなり、原線維形成と呼ばれる過程において垂直の裂が軟骨の深部に広がる。関節の動きにより原線維を含む軟骨から切片が落ち、それにより下の（軟骨下）骨が露出し、次いで硬化を起こす。滑液により満たされた軟骨下嚢もまた発達する。関節の縁で骨棘（骨の棘突起）が形成する。
【００６５】
軟骨下骨の変化もまた、軟骨の変性および破壊の病理に役割を果たしている。哺乳類、特に前十字靭帯の横切断を実施したイヌの関節の研究により、軟骨下硬化およびオステオペニア、すなわち、軟骨下柱における骨の消失が明らかになった。これらの変化に続いて、軟骨下板の肥厚がある。軟骨下骨の消失は上に重なる関節軟骨にかかる機械的緊張を増大させ、その変性を招く。続いて起こる軟骨下板の肥厚は、内因性の修復メカニズムにマイナスの影響を与え、それにより軟骨の崩壊の進行に寄与する。
【００６６】
軟骨の細胞外マトリックスの崩壊は軟骨細胞の有糸分裂を伴い、次いでこれがクラスターを形成する。軟骨のグリコサミノグリカン成分の減少および釣り合いのとれないプロテオグリカンの枯渇がある。多くの領域において、厚く、ぎっしり詰まった平行なコラーゲン性の束の細胞外マトリックスを特徴とする線維軟骨が、ヒアリン軟骨に置き換わる。けれども、これらおよび上記の関節軟骨における病理学的変化は変形性関節症の後期に特徴的なものであり、十字欠損哺乳類、特にイヌの膝関節モデルにより示されるように、肥大、すなわち関節軟骨の肥厚がまず起こることを注意しておかなければならない。軟骨の肥厚は、関節軟骨における、水含有量の増加、プロテオグリカン合成の増加、およびプロテオグリカンの含有量および濃度の両方の増加の結果である。この関節軟骨の肥大性の修復の期間はしばらく持続するが、形成された修復軟骨組織は、正常なヒアリン軟骨が有する復元力および機械的圧力に対する耐性を欠く。結局、プロテオグリカンの生産は収まり、軟骨細胞はそれ以上その細胞外マトリックスを維持することができなくなる。この末期は関節軟骨の完全な厚さの消失という結果となる。
【００６７】
軟骨の傷害および消失を招く病理学的変化の初期は、マトリックス高分子の合成の増大を通じた修復の試みを伴う。けれども、修復軟骨の構造は、グリコサミノグリカン成分の変化した組成および分布ならびにそのヒアルロン酸成分と共に凝集する能力の変化のために、不完全である。これらの病理学的変化の間に放出される粒子もまた、滑膜の炎症性の変化の原因となる。けれども、この進行中の病理にもかかわらず、軟骨の傷害および消失の初期は痛みがほとんどない無症候である。したがって、適切な目的は、焦点の軟骨の消失が放射線写真により同定される前に、軟骨の傷害および消失の初期にある哺乳類被験体を特徴づける測定可能な変化を同定することのできる、細胞外マトリックス成分およびサイトカインを同定することである。この目的を達成することにより、顕著な軟骨変性が起こる前の初期の薬理学的関与の候補である哺乳類の診断上の分類が可能になる。
【００６８】
上記の関節軟骨における病理学的変化には、上記の病気のプロセスの開始以前に存在したものからの、関節軟骨の組成、形態および密度の変化が含まれ、その結果、強度、復元力、弾性、コンホメーションの完全性および安定性、生存能力、およびさまざまな種類の機械的圧力に耐える能力、特に機械的衝撃を吸収する能力を含む上記の関節軟骨の有益な特性の低下が起こる。組成におけるこれらの病理学的変化には、特に、関節軟骨に存在するグリコサミノグリカンおよびコラーゲン線維のタイプおよび量の変化が含まれる。
【００６９】
軟骨下骨における病理学的変化には、その硬化、その復元力および弾性の減少を伴う密度の増大、およびさまざまな種類の機械的圧力に耐える能力、特に機械的衝撃を吸収する能力の減少が含まれる。これらの病理学的変化には、特に、柱の肥厚を伴う柱の微小骨折の不適切な修復、ならびに骨芽細胞代謝物生産および分化した表現型における病理学的変化が含まれる。
【００７０】
滑膜炎、すなわち、滑膜の炎症は、軟骨の傷害および消失の病理に寄与する可能性がある。滑膜の炎症は、単核細胞による広範囲の滑液の浸潤、滑膜細胞過形成、およびリンパ様凝集を特徴とする。滑膜炎は、リウマチおよび他の炎症性関節症における軟骨の傷害に大きく寄与している。OAの初期における滑膜の炎症の役割はあまりよくわかっていないが、OAの臨床期に滑膜炎が存在する。
【００７１】
本発明の１つの態様によれば、一般式(I)の化合物の使用は、関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防することを目的とし、上記の変性または破壊は変形性関節症に伴うものである。特に、上記の使用は、それに関係する病理学的変化を治療または予防することを目的とする。そこで、本発明はまた、治療が関節軟骨および/または軟骨下骨に治療上有用な影響を伴うものである、変形性関節症の治療に関する。
【００７２】
関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防することはまた、１以上の一般式(I)の化合物に加えて、基本的に、ポリ硫酸化グリコサミノグリカン(PSGAG)、グルコサミン、コンドロイチン硫酸(CS)、ヒアルロン酸(HA)、ポリ硫酸ペントサン(PPS)、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンからなる群より選択される１以上のメンバーを投与することを含み得る。
【００７３】
さらに、本発明の一般式(I)の化合物は、当業者には明らかであり、通常本発明の治療薬が投与される環境により決定される他の治療上活性な成分と組み合わせてもよい。たとえば、関節が同時に微生物、たとえば、細菌、真菌、原生動物、ウイルス等に重篤に感染している場合には、本発明の活性成分は１以上の抗生物質、抗真菌薬、抗原性動物薬、抗ウイルス薬または同様の治療薬と組み合わせて投与されることが好ましい。また、本発明の活性成分は、NSAIDおよび他の炎症仲介物質の阻害剤と組み合わせて投与してもよい。このような阻害剤の別の分類およびその例には、たとえば、H1-受容体アンタゴニスト；キニン-B1-およびB2-受容体アンタゴニスト；PGD-、PGF-、PGI2-、およびPGE-受容体アンタゴニストのようなプロスタグランジン阻害剤；トロンボキサンA2 (TXA2)-阻害剤；PAF-受容体アンタゴニスト；さまざまな親水性基と結合したアウロチオ基の形の金；免疫抑制薬、たとえば、シクロスポリン、アザチオプリン、およびメトトレキセート；抗炎症糖質コルチコイド、たとえば、デキサメタゾン；広域駆虫抗生物質、たとえば、アベルメクチンおよびミルベマイシン；ペニシラミン；ヒドロキシクロロキン；抗痛風薬、たとえば、コルヒチン、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、たとえば、アロプリノール、および尿酸排泄薬、たとえば、プロベネシド、スルフィンピラゾン、およびベンズブロマロンが含まれる。
【００７４】
関節軟骨の変性の初期は老年の哺乳類の間では広く見られるので、一般式(I)の化合物を老年の哺乳類に多く見いだされる病気の状態、症候群および症状の治療を意図する治療薬と組み合わせて投与してもよいことは、当業者に理解されるであろう。このような治療薬およびそれらを治療に使用する状態には、たとえば、記憶の喪失および欠陥を防ぐ作用をする認識治療薬；および抗ジスキネジー/抗パーキンソン症候群薬、たとえば、セレゲリンが含まれる。このような治療薬の別の大きな分類には、高血圧、アンギナ、欝血性心不全、および心筋梗塞を含む心筋虚血を補う抗高血圧薬および他の心血管薬、たとえば、利尿薬、ヒドララジンのような血管拡張薬、プロプラノロールのようなβ-アドレナリン性受容体アンタゴニスト、僧帽弁閉鎖不全を有する老年の哺乳類を治療するために用いられるエナラプリル、および単独でおよび中性エンドペプチダーゼ阻害剤と組み合わせて用いられるエナラプリルのようなアンギオテンシン-II変換酵素阻害剤(ACE-阻害剤)、ロサルタンのようなアンギオテンシンII受容体アンタゴニスト、レニン阻害剤、ニフェジピンのようなカルシウムチャンネル遮断剤、メチルドーパのような交感神経遮断薬、クロニジンのようなα2-アドレナリンアゴニスト、プラゾシンのようなα-アドレナリン性受容体アンタゴニスト、およびロバスタチンまたはアトルバスタチンのようなHMG-CoA-レダクターゼ阻害剤（抗高コレステロール血症薬）が含まれる。このような治療薬のさらに別の分類には、さまざまな癌を治療するための抗腫瘍薬、特に、ビンブラスチンおよびビンクリスチンのようなビンカアルカロイドを含む抗有糸分裂薬；腎不全を治療するための治療薬；哺乳類における体重過剰の問題を治療するための抗肥満薬；広く哺乳類を苦しめる内寄生虫および外寄生虫の両方を治療するための駆虫薬；および哺乳類のさまざまなタイプの掻痒を治療するための止痒薬が含まれる。
【００７５】
本発明の抗炎症薬と併用することができる他のタイプの薬物には、成長ホルモン分泌促進薬；強い鎮痛薬；局所および全身麻酔薬；およびH2-受容体アンタゴニストおよび他の胃保護薬が含まれる。上記の治療薬の組み合わせのいくつかは、哺乳類のさまざまな急性の状態、たとえば、変性関節病と同時に起こる細菌感染を治療するために最も頻繁に用いられるであろうということは当業者の認めるところであろう。けれども、上記のような当業者が哺乳類における慢性の状態の治療にあまり興味を示さないとしても、同等である。
【００７６】
この目的で用いられる養生法によれば、一般式(I)の化合物を、高脂血症のような慢性の状態を治療するための規則正しいスケジュールに基づいて使用される他の投薬法と併用して投与することが含まれる。また、併用による投与は多くの異なる形をとることができ、それらも本発明の範囲に含まれることが想定される。たとえば、一般式(I)の化合物は、単純に、目的に合わせて組み合わされた１以上の他の治療薬と共に、併用されるすべての薬物を含む通常用いられる剤形、たとえば経口用錠剤に製剤される。製剤に熟練した当業者は、上記の薬物の異なる放出時間を有する制御放出製剤を作ることにより、異なる薬物の異なる半減期を調整して、比較的統一された投薬を達成することができる。剤形として用いられる薬剤入りの食料もまた、製剤の技術分野における公知の原理に従って調製することができ、併用される薬物は食物組成物の中に単純に混合されて存在する。本発明はまた、薬物の併用が、併用される薬物を同時に投与することにより達成される、共投与をも含む。このような共投与は異なる剤形および投与経路を用いるものであってもよい。本発明はさらに、併用される個々の薬物が哺乳類に同時に投与されなくても、関係する薬物の望まれる血漿レベルが治療される哺乳類において維持されるような、異なるが、規則正しく連続的な投与計画に従って上記の組み合わせを使用することも含む。上記の併用はすべて当業者が容易に考案し、投与することができるものである。
【００７７】
一般式(I)の化合物を本発明の方法および組成物の活性成分として用いる場合、これらを標準的な医薬品の剤形に組み入れることができる。したがって、本発明はまた、製薬上許容される担体、および、上記の関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防するのに有効な量の、上で定義した一般式(I)の化合物を含む医薬組成物に関する。たとえば、これらは、全身または局所投与、経口または非経口投与された場合に有用であり、この目的で、通常の医薬品添加物、希釈剤およびアジュバント、たとえば、水、ゼラチン、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ゴム、ポリアルキレングリコール等のような有機および無機不活性担体材料と組み合わされる。これらの製剤は固体の剤形、たとえば、錠剤、カプセルとして、および特に哺乳類にとって美味な食物と組み合わせた、または混合した形を採用することができる。あるいは、これらは液体の剤形、たとえば、溶液およびエリキシルとして投与することができる。加えることができる医薬品添加物およびアジュバントには、保存剤、抗酸化剤、抗菌剤および他の安定剤；湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤、および固化防止化合物；香料および着色添加物；圧縮性を改善する組成物、または活性成分を遅効性、徐放性または制御放出とするための組成物；および医薬品の浸透圧を変えるため、または緩衝液として作用するためのさまざまな塩が含まれる。うまく使用できた具体的な剤形には、静脈内注射用のML3000の5%混合ミセル溶液、3%の美味なペースト、および経口錠剤が含まれる。
【００７８】
治療上有効な量の、上で定義した一般式(I)の化合物は、上記の哺乳類に全身投与することができるが、この全身投与は、(1) 動脈内、皮内または経皮（皮下を含む）または脊髄内、特に鞘内、および最も一般的には筋内または静脈内送達、またはデポ製剤として送達するのに適した、水溶液、エマルションまたはサスペンションのような液体の剤形中に上記の化合物を含む医薬組成物の適当な身体組織または腔への注射または注入；(2) 固体の埋没物組成物として遅効性、徐放性、および/または制御放出送達するのに適した、たとえば、一般式(I)の軟骨保護化合物の固体の粒子が分散している、または液体の一般式(I)の軟骨保護化合物の小球または単離された小胞が閉じこめられている、生物適合性および生物侵蝕性の材料のマトリックスを含む固体の剤形に上記の化合物を含む医薬組成物の、適当な身体組織または腔への点滴；または(3)経皮送達、たとえば、経皮パッチまたは表皮下埋没物に適した、または、その経口送達に適した固体または液体の剤形中に上記の化合物を含む医薬組成物の摂取または投与を含む。
【００７９】
多くの本明細書に記載された剤形を、上記の剤形からの活性成分の制御放出、遅効性、および/または徐放性を与えるように製剤化することができる。
【００８０】
本発明によるML3000の有用な制御放出製剤は、5mg/kgの１回の経口投与の後に、１日中のほとんどの時間にわたって、100ng/mLよりも大きいML3000の血漿レベルを維持するものである。本発明によるML3000の好ましい経口制御放出製剤は、即効型製剤および制御放出製剤を同じ用量で投与した場合に、100ng/mLよりも大きい血漿ML3000濃度を、ML3000の即効型製剤が匹敵する血漿レベルを維持する時間よりも長い時間にわたって維持するようなものである。
【００８１】
2.5および5mg/kgの用量を含む即効型ML3000製剤は、血漿ML3000濃度を８時間にわたって、それぞれ100および200ng/mL以上に維持する。
【００８２】
全身投与のための好ましい経口製剤は、固体、たとえば、早く溶ける美味なウエハースのような美味な経口組成物、錠剤、カプセル、カプレット等、および液体、たとえば、溶液、サスペンション、エマルション等である。哺乳類への経口投与に特に適したタイプの医薬組成物は、治療される哺乳類の舌の裏側に送達するための経口ペースト、哺乳類の食物に混入して送達される顆粒の剤形、および噛みながら活性成分を消費する噛むことのできる剤形、または、噛んでいる物体から滲出することにより、治療される哺乳類による咀嚼の間に消費されない活性成分を送達することができる噛むことができる剤形が用いられ、含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
上記の治療上有効な量の、定義された一般式(I)の化合物はまた、上記の哺乳類に局所投与することができ、この場合、上記の局所投与は、(1) 上記の一般式(I)の化合物の下記の局所部位への遅効性放出、制御放出、および/または徐放性を与える成分を含む送達に適した；または上記の組成物が上記の化合物を貯蔵し、その後、遅効性、徐放性および/または制御放出するような、それらの送達のためのデポ製剤としての提供に適した液体の剤形の上記の一般式(I)の化合物を含む医薬組成物の、関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊の局所部位への注射または注入、；(2) 上記の組成物が必要に応じて上記の化合物の上記の局所部位への遅効性、徐放性および/または制御放出を与えるような、送達のための固体の埋設物としての提供に適した固体の剤形に上記の化合物を含む医薬組成物の点滴を含む。
【００８４】
局所投与は、一般式(I)の軟骨保護化合物を注射、注入、埋没、沈着、挿入または点滴する適当な関節組織に集中させる。このような投与は、関節内、軟骨内、肋骨内、靱帯内、髄内、筋内、骨内、骨盤内、脊髄内、胸骨内、滑液包内、足根内、鞘内、または静脈内を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
一般式(I)の軟骨保護化合物を含む液体の剤形の医薬組成物は、関節部位の中または非常に近接した部位に液体を注射することを可能にするという利点を有する。一般式(I)の化合物を関節の中に直接注射することにより、短い時間で上記の化合物の高い濃度を達成することが可能になり、上記の化合物の関節組織へのアクセスを実質的に増大し、それにより一般式(I)の化合物の治療活性を増大するのみでなく、同時に別の方法では生じ得る目的としない有害反応の発生を最小化する。その結果として、一般式(I)の化合物の高い局所濃度と、それに対応する低い全身への持ち越し濃度が得られる。
【００８６】
一般式(I)の軟骨保護化合物を含む医薬組成物が遅効性、制御放出、または徐放性製剤である場合にも、上記医薬組成物の注射が行われる。上記の組成物のこれらの製剤は、浸食されるマトリックスまたは一連のコーティングが、あらかじめ決定された速度または必要ならば変化する速度で一般式(I)の化合物を連続的に放出することを可能にするために用いられる、固体、半固体、ゲル、または他の液体/固体の組み合わせである。「持続放出」および「長時間作用型」ならびに他の用語は、これらの製剤を表すために用いられる。これらはすべて、マトリックス内に含まれる一般式(I)の化合物の遅い、および/または均一な調剤を得るために、さまざまな組み合わせの生物により浸食されるポリマー、たとえば、さまざまなセルロース系ポリマー、および天然材料、たとえば、コーンスターチおよびステアリン酸マグネシウムを用いる。これらの医薬組成物は、それに適した液体または懸濁液の場合には関節部位の中に注射することができ、または天然では固体である場合には他の手段により送達することができる。
【００８７】
関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防するために有効な量の一般式(I)の化合物は、治療される哺乳類に、１日あたり、上記哺乳類の体重キログラムあたりのミリグラムで表される量：“mg/kg/日”で投与される。本明細書において用いられる「１日あたり」という表現は、必ずしも、すべての個々の製剤を治療される哺乳類に毎日投与する必要があることを意味しない。「１日あたり」という表現は、単に投与される軟骨保護化合物の用量を測る総合的な単位の一部として用いられる最小で便利な、しかし任意の時間の区分の指示に過ぎない。用量、すなわち、関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防するための一般式(I)の化合物の治療上有効な量は、通常、約0.1mg/kg/日から約20.0mg/kg/日、好ましくは約0.1mg/kg/日から約12.0mg/kg/日、より好ましくは約0.5mg/kg/日から約10.0mg/kg/日、最も好ましくは、約0.5mg/kg/日から約8.0mg/kg/日の範囲である。ML3000の典型的な剤形および量は、体重の2.5〜5.0mg/kg/日の用量でのML3000の経口投与を含む。
【００８８】
当業者は、好ましい投与経路およびそれに対応する剤形および量を決定するのみでなく、薬物投与計画、すなわち、投与の頻度をも決定しなければならない。一般的に、１日１回(s.i.d.)投与および１日２回(b.i.d.)投与の間で選択されるのが最も好ましい。前者はより迅速で深い治療を提供し、後者はあまり深くないがより持続する治療を提供する。けれども、この一般化は、関与する特定のタイプの関節軟骨または軟骨下骨の変性または破壊、関与する特定の治療薬およびその薬物動態学、ならびに関与する特定の患者（哺乳類）のような重要な変化要素を考慮していない。市場に認可される製品のために、この情報の多くは、そのような認可を得るために実施された臨床研究の結果により既に提供されている。別の場合には、そのような情報は当業者の知識および技術を考慮した現在の明細書に含まれる教唆および指針に従って容易な方法で得ることができる。得られた結果はまた、同じアッセイにおける認可された製品の相当する評価から得られたデータと相互に関連することができる。
【００８９】
本発明によれば、適当な外側のカートンおよびその中に取り出し可能に入れられた内側の容器；上記の容器に入れられた適当な剤形の上記の一般式(I)の化合物；および、上記のカートンまたは上記のカートンに入った上記の容器に添付した、または上記のカートンまたは容器の一部に表示された、指示および情報の印刷物であって、この指示および情報は、その読者に理解できる言語で、上記の活性成分が、１以上の関節における関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊の状態にある哺乳類に投与された場合、関節軟骨または軟骨下骨の傷害、損傷または消失を緩和、減少、有効に治療、反転または予防するであろうと述べるものであるもの、を含む、治療を必要とする哺乳類の１以上の関節における関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防するための、商業的な使用に適したパッケージもまた提供される。好ましい実施形態において、上記のカートンおよび容器を含む上記のパッケージは、特に上記の指示および情報の印刷物を含めて、動物の治療のための薬物の販売および使用に関するすべての法令による要求に適合する。
【００９０】
本発明によれば、上記の適当な容器；上記の容器に入れられた一般式(I)の化合物の経口投与用の製剤；および上記の容器に添えられた上記の指示および情報の印刷物を含む、前段落に記載したタイプのパッケージが提供される。
【００９１】
本発明の方法は、さらに２つの基本的な段階：(I) 候補の哺乳類の状態が、現在または将来に、上記哺乳類の１以上の関節において関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊の状態にあることを確証することにより、上記の哺乳類が上記の治療を必要としていることを確かめ；その上で、(II) 上記の哺乳類に、一般式(I)の軟骨保護化合物を、上記の関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊を治療または予防するのに有効な量で投与することにより上記の状態を治療または予防することを含むものと規定される。段階(II)のさまざまな態様はすでに上で詳細に検討した。そこで、ここでは段階(I)の態様を詳細に検討する。
【００９２】
診断に関する限り、本発明の治療の候補である哺乳類の状態を、この哺乳類が現在または将来、上記哺乳類の１以上の関節において関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊の状態にあるか否かを確証することは目的にかなっている。本明細書において使用される「現在または将来」という表現は、下記の決定を行う方法によって、候補の哺乳類が現在上記の治療を必要としているか、または、近い未来において上記の治療を必要とする可能性が非常に高いもしくは必要とすることが予想されるかのいずれかであると同定することができることを意味する。治療の将来的な必要性は、当業者の経験から、関節軟骨および/または軟骨下骨の変性または破壊の状態に直接つながる陽性の因子の決定により確証される。たとえば、当業者は、臨床検査から哺乳類が初期の股関節部の形成異常を有することを確証し、この結論を、近い未来にその哺乳類の股関節部の形成異常が発達するであろうことを確立された測定方法により決定することができる放射線写真を用いた方法により確認する。
【００９３】
上記の哺乳類の、現在または将来、上記の変性または破壊の状態、特に上記の初期にあり、従って上記の治療を必要としている状態は、具体的には下記の方法により決定される。
【００９４】
(A) 候補の哺乳類の関節の臨床関節鏡による検査および評価による陽性の結果。初期のまたは自覚される股関節部の形成異常の診断についてはすでに論じた。他の臨床的症候および徴候には候補の哺乳類の関節の直接の検査から得られるものが含まれる。
【００９５】
(B) 候補の哺乳類の１以上の関節に対する侵襲的手術法の実施。これは、ほとんどの状況で治療が必要であると結論されるのに十分な理由となる。これは、哺乳類の関節に対する侵襲的な手術が、その習慣的な負荷に手術の前と同じくらい効果的に耐えるその関節の能力を必然的に下げるという事実によるものである。関節への機械的な圧力の増加は、当業者の経験によれば、直接関節軟骨および/または関節軟骨の変性の初期を導く。また、関節に対するこのような手術は、サイトカインおよび炎症を引き起こす原因となる他の因子を含む血液および他の液体の滲出を起こし、、それにより、軟骨および/または軟骨下骨を含む関節の固体組織へのそれらの移動および吸収を起こす。当業者は、これもまた関節軟骨および/または軟骨下骨の変性の初期を直接導き得ることを理解するであろう。
【００９６】
(C) 放射線写真および磁気共鳴画像(MRI)を含む非侵襲的な方法を用いた上記の哺乳類の１以上の関節の検査による陽性の結果。後者の技術は前者よりも軟組織を評価するのに優れている。MRIは、増加した軟組織コントラスト解像度を示す多平面の身体画像化の技術である。MRIは軟組織の変化を可視化することができるので、関節軟骨および軟骨下骨の変性における初期の変化の病理を画像化するのに適している。
【００９７】
(D) 下記の１以上の物質に関して、候補の哺乳類の体液または関節組織に対して行われる生化学試験による陽性の結果：インターロイキン-1ベータ(IL-1β)の増加；腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)の増加；IL-1βのIL-1受容体アンタゴニストタンパク質(IL-1Ra)に対する比の増加；p55 TNF受容体(p55 TNF-R)の発現の増加；インターロイキン-6 (IL-6)の増加；白血病阻害因子(LIF)の増加；インスリン様成長因子-1 (IGF-1)の不変または減少；トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)の減少；血小板由来成長因子(PDGF)の不変または減少；塩基性線維芽細胞成長因子(b-FGF)の不変または減少；ケラタン硫酸の増加；ストロメリシンの増加；ストロメリシンの、メタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP)に対する比の増加；オステオカルシンの増加；アルカリホスファターゼの増加；ホルモンチャレンジに携わるcAMPの増加；ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)の増加；軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質の増加；およびコラゲナーゼの増加。
【００９８】
IL-1αおよびIL-1βとして生じるIL-1は、哺乳類の関節における関節軟骨の傷害および消失を仲介する異化サイトカインである。これは、線維芽細胞に特徴的なタイプIコラーゲンの合成を促進する一方で、関節軟骨に見いだされるタイプIIコラーゲンの合成を抑制することにより；マトリックス分解に関与する酵素の生産を誘導することにより；および軟骨細胞の新しいプロテオグリカンを合成する能力を抑制することにより作用する。変性の初期における関節軟骨の軟骨細胞の表面上のIL-1受容体の数は、軟骨細胞表面が異化酵素の生産を引き出すために占められているので、正常に要求される数の４分の１にすぎない(1%対4%)。IL-1およびそのモジュレーターのIL-1Raは、同一の滑膜マクロファージにより自己分泌および傍分泌方式で生産され、IL-1 Raの生産は顆粒球滑膜マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)の存在下で増加する。けれども、IL-1およびIL-1 Raの効力の間には大きな相違が存在し、軟骨細胞および軟骨外植片において測定すると、IL-1の効果を消すためには、およそ130倍多いIL-1Raが必要である。IL-1とIL-1Raの間の不均衡は関節軟骨の変性をさらに悪化させる。
【００９９】
したがって、放射線写真により焦点の軟骨の消失が同定される前の軟骨の傷害および消失の初期にある哺乳類被験体のプロファイルを明らかにする測定可能な変化を同定するために、関節軟骨の変性の初期にある哺乳類におけるIL-1およびIL1Raのレベルおよびそれらの比、ならびにあまり悪くなっていない哺乳類における同じ値を測定することもまた適切な目的である。これらの結果は、顕著な軟骨の変性が起こる前の初期の薬理的関与の候補である哺乳類の診断的分類を可能にする。さらに、関節軟骨の変性の初期の関節の滑液および滑膜組織中に生じるIL-1αおよびIL-1β分泌マクロファージの比を検出することができ、これは正常な関節、すなわち関節軟骨の変性の初期にない関節から得た滑液および滑膜組織から単離された同様の細胞の比よりも有意に大きい。ここでもまた、これらの結果は顕著な軟骨の変性が起こる前の初期の薬理学的関与の候補である哺乳類の診断的分類を可能にする。
【０１００】
さらに、炎症の過程を開始および維持するサイトカインは、石灰化した区域を横切る微少な裂け目を通って軟骨の下層に達することができるようになるので、関節軟骨の総体的な変化が明らかになる前に軟骨下骨の変化が生じる。関与する軟骨細胞の代謝は反対に作用し、それに加えて関節軟骨の中間の区域の軟骨細胞は、炎症過程を開始および維持するものを含む多くのサイトカインを生産する。これらの軟骨細胞は、自己分泌方式で作用し、それによりそれら自体の細胞外マトリックスの破壊に寄与する。関節軟骨の水含有量の増加もまた、マトリックス全体への炎症性サイトカインの拡散を増大することにより、このプロセスを促進する。したがって、焦点の軟骨の消失を放射線写真により同定することができるようになる前に軟骨の傷害および消失の初期にある哺乳類被験体のプロファイルを明らかにする測定可能な変化を同定するために、関節軟骨の変性のプロセスの間の哺乳類、特にイヌの軟骨細胞、滑膜細胞、および/または軟骨下骨細胞により生産されるさまざまな炎症性サイトカインのレベル、およびあまり悪化していない哺乳類における同じ値を測定することは適切な目的である。これらの結果は顕著な軟骨の変性が生じる前の初期の薬理的関与の候補である哺乳類の診断的分類を可能にする。
【０１０１】
腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)は、関節軟骨の変性に関してはIL-1の10分の1の効力しか有さないが、特に十字靭帯を切断した哺乳類の膝関節において、反対側の手術をしていない膝と比較してその滑液中の濃度は顕著に増加する。このような膝関節に存在する関節軟骨から単離された軟骨細胞のp55 TNF受容体(TNF-R)の発現も増大する。したがって、TNFαは軟骨の傷害および消失の初期に起こる病理学的変化に役割を果たしているので、焦点の軟骨の消失を放射線写真により同定することができるようになる前の軟骨の傷害および消失の初期にある哺乳類被験体のプロファイルを明らかにする測定可能な変化を同定するために、関節軟骨の変性の初期にある哺乳類の関節におけるTNFαおよびTNF-Rのレベル、およびあまり悪化していない哺乳類における同じ値を測定することは同様に適切な目的であると思われる。これらの結果は顕著な軟骨の変性が生じる前の初期の薬理的関与の候補である哺乳類の診断的分類を可能にする。
【０１０２】
インターロイキン-6 (IL-6)は多機能サイトカインであるが、炎症に役割を果たし、損傷を受けたものからの関節および滑液において対照の肢と比べて高いレベルで見いだされる。IL-6はまた、軟骨細胞におけるTNF-Rの発現の増大および軟骨細胞によるプロテオグリカン生産の増加、ならびにグリコサミノグリカン放出の誘導に関与している。対照と比較した、関節軟骨の傷害および消失の初期にある哺乳類の関節の、関節、滑液および軟骨細胞におけるIL-6レベルの測定は、焦点の軟骨の消失が放射線写真による検査から明らかになる前に、薬理的治療の適切な候補である哺乳類を同定するための診断ツールとして用いることができる。
【０１０３】
白血病阻害因子(LIF)は単球、顆粒球、Ｔ細胞、線維芽細胞、および炎症の状態に関連する他の細胞型により生産される。滑膜細胞および軟骨細胞は、IL-1βおよびTNFαの存在下でLIFを合成および分泌する。そこで、初期の関節軟骨の傷害および消失の薬理学的治療のための哺乳類の候補を診断により選択するために用いることができる。
【０１０４】
哺乳類における関節軟骨の変性、傷害および消失は、上記の異化プロセスを駆動するサイトカインと軟骨における軟骨細胞の合成および増殖反応の維持に携わるサイトカインとの間の不均衡により引き起こされる。インスリン様成長因子(IGF-1)、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)、血小板由来成長因子(PDGF)、および線維芽細胞成長因子、たとえば塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)はすべて、軟骨細胞に関して有糸分裂誘発性であり、関節軟骨においてマトリックスの合成を促進する。
【０１０５】
インスリン様成長因子(IGF)は、タイプIおよびIIとして存在し、IGF-Iは軟骨合成の効力の高い仲介物質である。さらに、これは、IL-1βおよびTNFαの存在下でさえも、プロテオグリカンの分解を減少させ、合成を促進する。IGF-1の血清レベルは、高親和性結合タンパク質(IGF-BP)により維持され、IGF-1は骨および軟骨の両方の代謝回転に重要である。対照と比較したIGF-1のレベルは、関節軟骨の変性に対する初期の薬理学的治療のための哺乳類の候補の診断的評価を可能にする。
【０１０６】
トランスフォーミング成長因子(TGFβ)は軟骨細胞により生産され、軟骨および骨の両方の代謝回転の強いマイトジェンである。さらに、これはマトリックスの合成を促進し、抗炎症活性を有する。これはまた、プロテアーゼ阻害剤の生産を促進すること、ならびにコラゲナーゼおよびメタロプロテアーゼの放出を遮断することによりマトリックスの分解を阻害する。さらに、これは、哺乳類関節のさまざまな細胞によるコラーゲン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン活性化因子の阻害剤、およびメタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP)の生産を促進することにより軟骨の修復を促進する。関節軟骨の傷害および消失の初期における哺乳類の関節において、TGFβの滑液レベルは低い。したがって、対照と比較したTGFβのレベルは、関節軟骨の変性に対する初期の薬理的治療のための哺乳類の候補の診断的評価を可能にする。
【０１０７】
哺乳類の関節における進行性の変性、すなわち、関節軟骨の異化に伴って、軟骨の変性の発生および進行の両方のマーカーとして有用な多くの代謝産物が生産される。たとえば、IL-1αおよびIL-1βまたはTNFαによる軟骨の分解はグリコサミノグリカン(GAGS)を放出し、これを検査される哺乳類の滑液中で測定することができる。さらにGAGレベルは治療の後に変化するので、関節軟骨の代謝回転のマーカーとして滑液GAGレベルを使用して、薬理的関与の経過をモニターすることが可能である。
【０１０８】
関節軟骨の分解にはコラーゲンおよび他の軟骨成分が関与しているので、いくつかのコラーゲン生産物は哺乳類における軟骨の分解、特にイヌの関節軟骨の傷害および消失のマーカーとして用いられる。タイプII特異的コラーゲン崩壊産物、たとえば、20-30アミノ酸ネオエピトープを、滑液、血漿、血清または尿のような体液中に同定することができる。これらの体液中のネオエピトープの存在を、OAの開始および進行の指標として用いることができる。
【０１０９】
ケラタン硫酸は、その滑液中のレベルを初期の関節軟骨の傷害および消失のマーカーとして用いることができるエピトープ、5D4を有する特定のGAGである。反対に、多くのエピトープとして発現される別の特定のGAGであるコンドロイチン硫酸のレベルは軟骨の傷害および消失の初期にある哺乳類の関節軟骨における同化と関係している。これらのエピトープ、特に3B3、7D4および846の滑液中のレベルを、これらを認識する特異的モノクローナル抗体により決定することができる。3B3エピトープは、細胞外マトリックスの修復および改造の間に軟骨のコンドロイチン硫酸鎖上に発現され、その結果、その滑液中のレベルは、上記の5D4のそれと反比例する。関節軟骨の表面および上部中間層で新しく合成されるPGにおける3B3の発現は、3B3が軟骨の変性の初期にある哺乳類の関節軟骨における初期の変化と関係があることを意味する。したがって、検査される哺乳類の滑液中の3B3レベルの決定およびこれらのレベルの対照値との比較は、初期の薬理学的治療に適した候補である哺乳類の診断プロファイルの作成を可能にする。
【０１１０】
軟骨同化活性の別のマーカーは、タイプIIプロコラーゲンのプロペプチド(PIIP)である。タイプIIは、関節軟骨の主要なコラーゲンであって、軟骨細胞によりプロコラーゲンとして生産される。コラーゲン原線維形成の過程で、非コラーゲン性アミノプロペプチドおよびカルボキシプロペプチドが開裂して体液中に放出され、これらは関節軟骨の同化活性の反映として体液中で測定することができる。カルボキシ-PIIPのレベルは上昇し、その滑液レベルは軟骨の変化の放射線写真による証拠と相関する。したがって、滑液中のカルボキシ-PIIPレベルの測定および対照との比較は、初期の薬理学的治療のための哺乳類の候補の同定を可能にする。
【０１１１】
関節軟骨の変性の初期にある哺乳類の関節軟骨および関節液中のストロメリシン/TIMPの比の不均衡もまた、このような哺乳類の同定に有用である。傷害の後の関節の負荷の変化は、IL-1の影響下で軟骨細胞および滑膜細胞により生産される酵素であるストロメリシンの過剰な生産を引き起こす。ストロメリシンの濃度はまた、関係する損傷からより離れた軟骨中にある場合と比較して、原線維を含むコラーゲンにおいてより高い。ストロメリシンのレベルの増加は非常に短い時間しか起こらないが、関節への損傷が関節軟骨の最高水準域を超えて、軟骨下骨の中に達した場合、通常軟骨下骨の硬化が先に起こり、それに続いて関節軟骨の変性が起こる可能性が大きい。
【０１１２】
さらに、関節軟骨の変性の初期の検出に用いた十字欠損哺乳類モデルにおいて、ストロメリシン、IL-1α、IL-1β、および３つのオンコジーンタンパク質、c-MYC、c-FOS、およびc-JUNの合成に関与する細胞の数が増加する。滑膜において、これらは主に滑膜内層細胞の表面に見いだされるが、軟骨においては、これらの細胞は表面および中間相の軟骨細胞および脛骨プラトーの原線維を含む領域の細胞である。さらに、ストロメリシンおよびIL-1は脛骨プラトーの軟骨マトリックス中に拡散する。プロテオグリカンおよびタイプIXコラーゲンを含む結合組織の成分を分解するストロメリシンは、関節軟骨の変性の初期にある哺乳類の滑膜中で活発に合成され、軟骨の破壊に関与する主要なタンパク質分解酵素である。ストロメリシンmRNAのレベルの増加は、コラゲナーゼmRNAのレベルの増加と同様にそのような哺乳類の滑液中で検出可能である。IL-1の両方のイソ型、特にIL-1βのレベルの増加は、滑膜線維芽細胞のストロメリシンおよびコラゲナーゼの遺伝子発現の誘導を増大することにより、ストロメリシン合成の増加を促進する。同時に、IL-1はメタロプロテアーゼの組織阻害剤(TIMP)のmRNAを誘導せず、滑膜中のメタロプロテアーゼの検出レベルが劇的に増加するのに対して、この阻害剤のレベルは変化しない。
【０１１３】
メタロプロテアーゼは、細胞外マトリックス高分子の分解が起こる前に活性化されなければならないプロ酵素として軟骨細胞により分泌される。活性化にはプラスミノーゲン活性化因子/プラスミン系を含むセリンプロテアーゼが重要な役割を担う酵素カスケードが関与する。
【０１１４】
哺乳類の関節における関節軟骨の完全な状態は、それが被覆する骨床から受ける支持の適切さ、すなわち、下層の軟骨下骨の構造的特性に依存する。この骨床の変化は関節軟骨の分解的変化に先行する。これらの変化には、衝撃吸収能力の消失を伴う軟骨下骨の硬化が含まれる。これらの軟骨下骨の変化は、柱の微小骨折の不適切な修復およびその結果の関節への過剰な負荷により引き起こされる。軟骨下骨の柱の肥厚は、骨の金属密度および/または影響を受けた関節の体積の増加を導く骨の変化の一部である。これは骨芽細胞中の骨細胞欠損により引き起こされ、これらの軟骨下骨の骨芽細胞様細胞に表現型の特徴の変化をもたらす。
【０１１５】
これらの軟骨下骨の密度変化は骨の改造プロセスの不均衡の証拠であるばかりでなく、結果として生じる焦点の軟骨の消失の鍵となる要素である。骨硬化もこの骨の改造プロセスの調節不良が原因である。さらに、骨芽細胞代謝における部位に関連する相違が起こり、これが異なる軟骨分解分子の生産を導く。骨芽細胞代謝物におけるこれらの変化は、結果として軟骨細胞代謝の対応する変化を起こし、これらが上記のタイプのサイトカイン誘導活性の影響をより受けやすくする。この骨芽細胞の異常および差異化された表現型は、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、ホルモンのチャレンジ応答性cAMP、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)、およびインスリン様成長因子1 (IGF-1)の不一致の生産レベルを特徴とする。
【０１１６】
結果として生じる関節軟骨の変性への軟骨下骨活性の関与の別の証拠は、骨シンチグラフィーにより測定される関節空間の縮小である。これらの軟骨下骨活性における変化は、対応する特定の骨細胞代謝物、すなわち、オステオカルシンの変化を伴う。オステオカルシンは、ビタミンK依存の、骨における最も豊富な非コラーゲンタンパク質であるカルシウム結合骨タンパク質である。オステオカルシンのレベルの増加は、特に関節軟骨の変性の初期を含む、さまざまな病気の状態における骨の代謝回転のマーカーである。オステオカルシンの体液、特に滑液レベルはシンチグラフィーにより測定される軟骨下骨の変化に直接相関する。
【０１１７】
哺乳類における関節軟骨の変性の初期の指標としての軟骨下骨活性のマーカーに加えて、軟骨および滑膜活性からの代謝物もまた、上記の軟骨の変性の初期を示すマーカーとして有用である。たとえば、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質の血清レベルの増加の検出は、軟骨の代謝回転のマーカーとして用いられる。同様に、体液、特に血清中の高レベルのヒアルロン酸塩の検出は、滑膜の炎症のマーカーとして用いられる。どちらの場合にも、これらの代謝物マーカーの体液、特に血清レベルの増加は関節軟骨の変性の初期を示す。
【０１１８】
本明細書において用いられる「体液」という表現は、使用される検査装置またはアッセイの検出限界内であるのに十分な濃度でその体液中に検査される化合物を含み得る、臨床検体として用いることができる使用可能なすべての体液を含むことを意図する。そこで、体液は、血液全体、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑液、および介在性および他の細胞外液を含む。したがって、上記の測定は通常、候補の哺乳類から得られた検体（サンプル）を用いてin vitroで行われる。
【０１１９】
本発明の方法および組成物をさらに説明するために、本節において、上記の方法を実施する際に採用される典型的な方法の例を具体的に記載する。しかしながら、上記の実施例は説明のみを目的とするものであり、本発明を限定するものと理解されるべきではない。その目的では特許請求の範囲が本明細書に添付されている。
【実施例１】
【０１２０】
実験的変形性関節症(OA)のイヌモデルにおける病変の発達に対するML3000の治療有効性を研究した。具体的には、軟骨におけるコラゲナーゼ-1 (MMP-1)および滑膜におけるインターロイキン-1β(IL-1β)の合成、ならびに、一次骨芽細胞における、またはこれによる、アルカリホスファターゼ活性、IGF-1の生産、オステオカルシンの放出、PEG2およびuPAの活性に対するML3000の作用を測定した。
【０１２１】
実験群
体重がそれぞれ20-25kgの21匹の成体の雑種のイヌ（2-3歳）をこの研究に用いた。先に記載された方法で(5,6)、すべてのイヌに対して、刺創を通して右膝の前十字靭帯(ACL)の外科的切開をおこなった。手術の前に、動物にペントバルビタールナトリウム(25mg/kg)の静脈内投与により麻酔をかけ、挿管した。手術の後、イヌを大きな囲いの中で自由に運動できる飼育場で飼育した。
【０１２２】
イヌをランダムに３つの治療群に分けた。群１(n=7匹)は、偽薬（カプセルに入れたメチルセルロース）による治療を受けたイヌからなる(OAイヌ)；群２および３（群あたりn=7匹）には、それぞれ2.5および5mg/kgの総容量で、カプセルに入れたML3000を１日２回、手術の次の日から開始して８週間与えた。投薬は研究の間を通して週７日おこなった。すべてのイヌを手術の８週間後に殺した。
【０１２３】
それぞれの実験群のすべてのイヌについて研究を完了した。ML3000により治療したイヌの群において、胃腸管に関するものを含めて、薬物毒性の臨床的徴候は見られなかった。３つの実験群のすべてのイヌにおいて、日常的な活動のレベルは同様であり、研究期間中イヌの体重に変化はなかった。
【０１２４】
統計分析
値は平均±SEMとして表した。統計分析はMann-Whitney Uテストを用いておこなった。0.05未満のＰ値は有意であると見なした。
【０１２５】
肉眼的等級分け
殺した直後に、それぞれのイヌの右膝を解剖し、氷上に置き、滑液を吸引した。それぞれの膝を、先に記載された方法で(5,6)、骨棘の形成および軟骨の病変の存在を含む総合的な形態学的変化について２人の独立した観察者(DVJ、JCF)が盲検法で検査した。骨棘形成の程度を、それぞれの大腿顆の棘の最大幅(mm)を測定することにより等級分けした。内側および外側大腿顆および脛骨プラトーの軟骨の変化を、解剖顕微鏡(Stereozoom; Bausch & Lomb, Rochester, NY)を用いて別々に等級分けした。
【０１２６】
関節表面の変化の領域を測定して、mm2で表した。浸食の深さは、以下のような0-4の等級に分けた。すなわち、０＝表面が正常に見える、１＝最小限の原線維形成または表面のわずかに黄色がかった変色、２＝表面または中間層に拡がった浸食、３＝下層に拡がった浸食、および４＝軟骨下骨に拡がった浸食。
【０１２７】
骨棘。偽薬により治療したOAのイヌにおいて、骨棘は顆の93%に存在し、その幅は4.50±0.66mmと測定された。2.5mg/kg/日および5mg/kg/日のML3000により治療されたイヌにおいて、骨棘はそれぞれ93%および86%に存在した。２つの治療された群の骨棘の幅の測定値は、偽薬で治療されたOA群と比較してわずかに小さかったが(それぞれ3.57±0.56および3.86±0.66)、これらの差異は統計的な有意に達しなかった。
【０１２８】
軟骨。偽薬で治療したOAのイヌにおいて、中程度の悪化度および大きさの軟骨の病変が顆およびプラトーの両方に存在し、プラトーの方がより悪化した病変を有していた（図１）。ML3000により治療した両方の群の顆およびプラトーの病変の大きさは有意に減少した。2.5mg/kg/日の群において、大腿顆の病変の大きさは39% (P<0.05)、脛骨プラトーで45% (p<0.01)小さかった。5mg/kg/日で投与された群においても、大腿顆の病変の大きさは減少した(61%、P<0.04)が、脛骨プラトーに対する効果は2.5mg/kg/日の群においてみられたものとほぼ同じであった(54%、p<0.01)。両方の濃度のML3000は脛骨プラトーの病変の等級ををおよそ同じ程度まで、有意に減少させた。治療されたイヌの大腿顆の病変は、その等級が減少する傾向を見せたが、統計的な有意には達しなかった。
【０１２９】
滑膜。偽薬治療のOAのイヌからの滑膜は肥大しており、赤および黄色がかった変色を示し、また、多数の血管が含まれていた。ML3000により治療されたイヌにおいては、偽薬治療のOAのイヌに比べて、滑膜はより薄く、より少ない血管しか含まず、変色はより少なかった。
【０１３０】
組織学的等級分け
それぞれの大腿顆および脛骨プラトーの病変した領域からの軟骨の矢状切片について、先に記載された方法で(7,8)、組織学的評価をおこなった。検体を解剖し、TissuFix #2 (Laboratories Gilles Chaput, Montreal, Quebec,Canada)中で固定し、パラフィン中に埋めて組織学的評価に用いた。連続的な切片(5μm)をサフラニンOにより染色した。OAの病変の悪化度を、２人の独立した観察者(DJ、JF)が、Mankinら(12)の組織学的/組織化学的スケールを用いて0-14の等級に分けた。このスケールは、サフラニンOによる染色の消失（スケール0-4）、細胞の変化（スケール0-3）、血管による最高水準の侵襲（スケール0-1）および構造的変化（スケール0-6、０＝正常な軟骨構造および、６＝軟骨の軟骨下骨への浸食）に基づいてOAの病変の悪化度を評価する。この採点法はそれぞれの軟骨切片内の最も悪化した組織学的変化に基づいておこなわれた。
【０１３１】
内側および外側の膝隔室の溝からの滑膜の代表的検体もまた、下層の組織から切開された。検体をTissuFix #2中で固定し、パラフィン中に埋めて、切片(5μm)を作り、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。それぞれの隔室から２つの滑膜検体を検査し、検体全体を通して連続した選択を作ってそれぞれを別々に採点した。それぞれの検体からの最も高いスコアを記録した。平均を計算して膝全体を１つの単位と見なした。滑膜炎の悪化度を、２人の独立した観察者(DVJ、JCF)により、３つの組織学的基準によるスコアを加えて0-10 (13)のスケールで等級分けした。すなわち、滑膜内層細胞の過形成（スケール0-2）、絨毛過形成（スケール0-3）、および単核および多形核細胞による細胞浸潤の程度（スケール0-5）である。
【０１３２】
軟骨。偽薬治療したOAのイヌからの軟骨は、原線維形成および裂、過細胞充実性およびクローニング、およびサフラニンO染色の消失を含む形態学的変化を起こした。プラトーの病変に対する組織学的スコアは顆のそれよりも少し悪化度が高かった（図４）。ML-3000により治療したイヌにおいて、顆の病変は偽薬により治療したOAのイヌと比較して悪化度が小さく、最も高い薬物投与量(5mg/kg/日)により治療した群において統計的な有意が得られた。この組織学的スコアの減少は、構造的変化の悪化度およびサフラニンO染色の消失の減少による所が大きい。脛骨プラトーにおいて、ML3000の両方の用量(2.5および5mg/kg/日)において病変の悪化度に統計的に有意な減少(それぞれ、P<0.002およびP<0.02)が得られた。これは、細胞クローニングの減少に加えて、サフラニンO染色の消失および構造的変化の悪化度の減少の結果である。
【０１３３】
滑膜。偽薬治療したOAのイヌからの滑膜は厚く、多くの絨毛を有し、滑膜内層細胞の過形成を示した。ML3000により治療されたイヌにおいて、5mg/kg/日の群において絨毛過形成が有意に減少した。
【０１３４】
滑液におけるPGE2の測定
殺したときに採取された滑液を遠心分離し(14000g、15分、4℃)、上清をPGE2の測定に用いた。特異的酵素イムノアッセイ(EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)を用いてPGE2のレベルを測定した。
【０１３５】
偽薬により治療したOAのイヌからの滑液は、高レベルのPGE2 (652.8±149.9pg/ml)を含んでいた。2.5および5mg/kg/日のML3000による治療はこのレベルを著しく減少させた（図５）。
【０１３６】
滑膜外植片培養におけるLTB4の生産
すべてのイヌからの滑膜の代表的な検体を下層の組織から無菌状態で切開した。検体をDulbeccoの改変Eagle培地(DMEM; Gibco-BRL Life Technologies, Burlington, Ontario, Canada)中で数回すすぎ、150mgの組織を、1μg/mlのリポ多糖(LPS; Sigma-Aldrich Canada, Oakville, Ontario, Canada)の存在下で、DMEM培地中、増湿した5% CO2/95%空気の雰囲気中、37℃で48時間インキュベートした（２回繰り返して）。LTB4を以下のように培養した滑膜外植片から抽出した。すなわち、膜をEIA緩衝液中(1Mリン酸塩、pH7.4、1% BSA、4M NaCl、10mM EDTAおよび0.1%アジ化ナトリウム)でホモジナイズし、遠心分離した(30000g、20分、4℃)。上清を集めて、EIA (Cayman Chemical)を用いてLTB4のレベルを決定した。
【０１３７】
1μg/mlのLPSにより治療したOAのイヌからの培養された滑膜は、有意な量のLTB4 (2.48±0.69pg/mg組織)を含んでいた。ML3000により治療された両方の群は、LTB4レベルの統計的に有意な減少を示した（図５）。
【０１３８】
免疫組織化学
軟骨および滑膜の検体について、先に記載された方法で(7,14)免疫組織化学分析をおこなった。簡単に述べると、検体を4%中性緩衝ホルマリン中で24時間固定した後、パラフィン中に埋めた。パラフィン中に埋めた検体の切片(5μm)をSuperfrost Plusスライド(Fisher Scientific, Nepean, Ontario, Canada)に載せ、トルエン中でパラフィンを除去し、連続的に勾配をつけたエタノール中で脱水し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS; Sigma-Aldrich Canada)中、37℃で60分間コンドロイチナーゼABC (0.25単位/ml)と共にプレインキュベートした。この後、検体をPBS中で洗浄し、次いで再び0.3%過酸化水素/PBS中で30分間洗浄した。スライドをさらに遮断溶液(Dako Diagnostics, Mississauga, Ontario, Canada)および5%スキムミルクと共に60分間インキュベートし、ブロットした後、コラゲナーゼ-1に対する１次モノクローナル抗体(100μg/ml、1:500希釈、Oncogene Research Products, Cambridge, MA)（軟骨）またはヒトIL-1βに対する１次抗体(1μg/ml、1:50希釈、Biosource International, Camarillo, CA)（滑膜）で覆い、増湿した容器に入れて室温で18時間置いた。
【０１３９】
それぞれのスライドをPBS (pH7.4)中で３回洗浄し、アビジン-ビオチン複合体法(Vectastain ABCキット；DAKO Diagnostics, Canada)を用いて染色した。この方法は、ビオチンコンジュゲート２次抗体の存在下で室温で30分間インキュベートした後、アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体を加えて30分間インキュベートすることを含む。すべてのインキュベーションは増湿した容器中で実施し、水酸化物過酸化物を含む3,3’-ジアミノベンジジン(DAKO Diagnostics Canada)を用いて発色させた。スライドをニュートラルレッド（軟骨）またはヘマトキシリン/エオシン（滑膜）により対比染色した。
【０１４０】
染色の特異性を決定するために、同じ実験プロトコールによる３つの対照方法を採用した。すなわち、1) 20倍モル過剰の組換えコラゲナーゼ-1またはIL-1βと共に吸収免疫血清(1時間、37℃)を使用すること；2) １次抗体の脱落；および3) １次抗体のオートロガス前免疫血清による置換。我々の研究に用いた精製された抗原はヒト組換えコラゲナーゼ-1 (Oncogene Research Products)またはヒト組換えIL-1β(Genzyme, Cambridge, MA, USA)であった。
【０１４１】
それぞれの軟骨のブロックから数個の切片を作り、それぞれの検体から作ったスライドに免疫組織化学分析をおこなった。それぞれの切片を光学顕微鏡(Leitz Orthoplan; Wild Leitz, St Laurent, Quebec, Canada)下で検査し、Kodak Ektachrome 64 ASAフィルム(Kodak, Rochester, NY)により写真撮影した。
【０１４２】
軟骨（図３）。偽薬治療したイヌにおいて、顆およびプラトーの両方において、軟骨検体の表面層の多数の軟骨細胞がコラゲナーゼ-1に対して陽性に染色した。ML3000治療したOAのイヌでは、顆およびプラトーの両方において、コラゲナーゼ-1に対する軟骨細胞スコアの有意な減少を示した。その効果は最高の用量の薬物により治療した群の方が少し大きいと判断された。
【０１４３】
滑膜（図３）。偽薬治療したOAのイヌからの滑膜サンプルの検査は、IL-1βに対して強い陽性に染色された多数の内層細胞の存在を示した。ML3000により治療されたイヌにおいて、IL-1βに対して陽性の染色を示す内層細胞の数が、用量に依存して有意に減少した。
【０１４４】
体型測定分析
軟骨。文献に記載された方法(7,14)を用いて、軟骨における異なる抗原の定量をおこなった。抗原の存在を、軟骨の上部（表面および上部中間層）区域において陽性に染色する軟骨細胞の数を決定することにより評価した。この区域において、軟骨を３つの顕微鏡の視野(×40; Leiz Diaplan)に分割し、平均した。評価の前に、それぞれの関節炎の検体に対して、完全な軟骨表面が検出され、体型測定分析の有効性のマーカーとして用いられることが確認された。軟骨細胞の総数および特定の抗原に対して陽性に染色する軟骨細胞の数を決定した。最終的な結果は、最大のスコアを100%とした、抗原に対して陽性に染色する軟骨細胞のパーセンテージ（細胞スコア）として表した。それぞれのスライドに二重盲検評価を行い、5%未満の変動を得た。内側および外側顆および脛骨プラトーから得られたデータは、統計分析の目的で独立であると見なされた。
【０１４５】
滑膜。滑膜の分析のために、我々の文献に記載した方法(8)を用いて、異なる検体の細胞スコアをそれぞれの切片について決定した。それぞれの検体を滑膜内層レベルで５つの顕微鏡視野(×40)に分割した。上で軟骨について記載した方法で、それぞれの視野で特定の抗原に対して陽性に染色する細胞のパーセンテージを評価した。細胞数スコアを、滑膜内層細胞および単核細胞浸潤について別々に、それぞれの領域の最大値を100%として求めた。
【０１４６】
骨芽細胞分析
脛骨の近位末端を下記の方法で取り出し、冷たい生理食塩水ですすぎ、解剖の開始前から終了までずっと氷の上に置いた。内側脛骨プラトーを摘出して、外植片および１次骨細胞培養を調製した。周縁皮質組織は含まないようにした。上に重なる軟骨をまず脛骨プラトーから取り除き、栓外植片を内側プラトーの中間部分から排他的に切開して取り出した。次に、軟骨下骨プレートから海綿質組織を切開して取り除いた。軟骨および海綿質を完全に除去するために、すべての操作は拡大顕微鏡下で実施した。
【０１４７】
(16)に記載された方法を少し改変して、サンプルを１次細胞培養を調製するために用いた。骨のサンプルを小片(2mm2)に切った後、37℃の血清を含まないHamのF-12/Dulbeccoの改変Eagle培地(DMEM; Sigma)中、1mg/mlのタイプIコラゲナーゼ(Sigma)の存在下で、20、20、および240分間、それらの逐次消化をおこなった。この処理により、皮質骨片から粘着性骨髄細胞および残った骨髄細胞の両方を除去した。
【０１４８】
同じ培地により洗浄した後、消化された骨片を20%ウシ胎児血清(FBS; Wisent, St.Bruno, Quebec, Canada)を含むBGJ培地中で培養した。この培地を、ペトリ皿に細胞が観察されるまで２日おきに変え、細胞が観察された時に培地を10% FBSを含む新鮮な培地に変えた。合流において、細胞は25,000細胞/cm2の比で一度培養され、24-ウェルプレート(Falcon, Lincoln Park, NJ)の中で５日間増殖させた後、アッセイをおこなった。これらの培養条件下で得られた細胞は、(16)に記載されるように、骨芽細胞様細胞表現型を示した。培養の最後の２日間、最大の刺激のために50nM 1,25(OH)2D3 (1,25-ジヒドロキシビタミンD)を存在させてまたは存在させずに、2%木炭除去(charcoal-stripped)FBSを含むHamのF-12/DMEM中で順化をおこない、(16)に記載されるように、アルカリホスファターゼ活性およびオステオカルシン分泌の最大の刺激を得た。インキュベーションの終わりに培地を集めて、アッセイをおこなうまで−80℃で凍結した。次に、細胞をpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水により２回洗浄して、４℃で撹拌しながらアルカリホスファターゼ緩衝液(100mMグリシン、1mM MgCl2、1mM ZnCl2、1% Triton X-100; pH10.5)中で60分間可溶化した。
【０１４９】
オステオカルシンの放出
オステオカルシンの放出を、2%木炭処理したFBSを含み、50nM 1,25(OH)2D3または媒体(0.1%エタノール)を加えた、(16)に記載される方法で骨芽細胞様細胞の培養の最後の２日に調製した順化したHamのF-12/DMEM (1:1)中で測定した。形成されつつあるオステオカルシンを特異的酵素イムノアッセイ(Biomedical Technologies, Stoughton, MA)を用いて測定した。このアッセイの検出限界は0.5ng/mlであり、2%木炭処理FBSは0.1ng/ml未満のオステオカルシンを含んでいる。結果を図６に示す。
【０１５０】
アルカリホスファターゼ活性
オステオカルシンの放出に用いた細胞で、上記のように細胞をアルカリホスファターゼ緩衝液中に可溶化した後、37℃で30分間、リン酸p-ニトロフェニル(12.5mMの最終濃度)から加水分解されたp-ニトロフェノールの放出として、細胞のアルカリホスファターゼ活性を測定した。アルカリホスファターゼはアリコートで直接決定された。タンパク質の測定は、Smith,P.K.; Krohn,R.I.; Hermanson,G.T.; Mallia,A.K.; Gartner,F.H.; Provenzano,M.D.ら、「ビシンコニン酸を用いるタンパク質の測定」、Anal. Biochem. 150, 1985, 76-85に記載されるビシンコニン酸法によりおこなった。結果を図７に示す。
【０１５１】
１次骨芽細胞中のuPAおよびIGF-1の評価
uPAおよびIGF-1の評価のために、密集骨芽細胞様細胞からの順化した培地に、PBSを含まず、1%インスリン-トランスフェリン-セレン混合物(ITS, Sigma)を含むHamのF-12/DMEMを培養の最後の２日間与えた。まず、uPAレベルを特異的酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA; American Diagnostica, Greenwich, CT)により測定した。次に、Leprince, P.; Rogister, B.; Moonen, G. A.; 「培養細胞からの血清を含まない順化された培地中のプラスミノーゲン活性化因子およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤の同時測定のための比色アッセイ」、Anal. Biochem, 177, 1989, 341-346に記載された方法を用いて、405nmで検出されるp-ニトロアニリンを放出する、特異的マトリックスDL-Val-Leu-Arg-p-ニトロアニリン(Sigma)の加水分解によって、uPAの活性を測定した。PAI-1レベルは、Amarican Diagnostica (Greenwich, CT)より入手可能な材料を用いてELISAにより測定された。IGF-1は、インスリンと交差反応しない高感度ELISA (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX)を用いて測定した。1% ITSを含む培地のみを用いて内部対照実験をおこない、得られたすべての値は検出限界未満でなければならない。細胞培養サンプルの順化された培地のために、３または４個の上清をプールし、凍結乾燥した後、pH7.4のPBS緩衝液に再構成する。次に、サンプルを、Mohan,S.; Bautista,C.M.; Herring,S.J.; Linkhart,T.A.; Baylink,D.J.;「骨細胞順化培地中のインスリン様成長因子-Iおよび-IIを測定する有効な方法の開発」Endocrinology, 126, 1990, 2534-42に記載される方法に従って処理する。結果を図８および９に示す。
【０１５２】
１次骨芽細胞中のPGE2の評価
１次骨芽細胞中のPGE2を、上に滑液について記載したものと基本的に同様の方法により測定した。結果を図10に示す。
【０１５３】
上記の結果から、COX/5-LOの平衡型二元阻害剤であるML3000は、in vivoのPGE2およびLTB4の生産を阻害するのと同時に、初期の実験的OAの発達を有意に減少させることができる。この薬物の保護効果は、主要なOAの病態生理学経路、すなわち、IL-1βおよびコラゲナーゼ-1の過剰な合成の顕著な阻害と大きく関係していると考えられる。これらの効果のいくつかはLTB4の過剰な生産の阻害と関連しているように見える。
【０１５４】
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【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】大腿顆および脛骨プラトーの軟骨の変化の肉眼的等級分けのリストを示す表である。
【図２】滑膜の組織学的等級分けのリストを示す表である。
【図３】変形性関節症のイヌにおけるコラゲナーゼ-1 (MMP-1)についての軟骨細胞のスコアおよびIL-1βについての滑膜細胞のスコアのリストを示す表である。
【図４】大腿顆および脛骨プラトーからのイヌ変形性関節症の軟骨の組織学的等級分けを示す図である。
【図５】変形性関節症のイヌの滑液中のPGE2および培養された滑膜外植片のLTB4のレベルを示す図である。
【図６】イヌ１次骨芽細胞によるオステオカルシンの放出を示す図である。
【図７】イヌ１次骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性を示す図である。
【図８】イヌ１次骨芽細胞によるIGF-1生産を示す図である。
【図９】イヌ１次骨芽細胞によるuPA活性を示す図である。
【図１０】イヌ１次骨芽細胞によるPGE2生産を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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