(57)【要約】この方法は、結合アッセイを実行するためのものであり、（ｉ）結合錯体を形成するために、標的分子を捕捉パートナに接触させるステップと、標的分子が磁性体粒子上に固定化され、捕捉パートナが支持材に固定化され、錯体磁性体粒子の数を特定して、錯体化標的分子の量を特定するステップと、を有し、少なくともステップ（ｉ）が印加された磁場の存在下で実施されることを特徴とする。
2005504989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合アッセイを実行する方法であって、
（ｉ）結合錯体を形成するために、標的分子を捕捉パートナに接触させるステップと、標的分子が磁性体粒子上に固定化され、捕捉パートナが支持材に固定化され、および
（ii）錯体磁性体粒子の数を特定して、錯体化標的分子の量を特定するステップと、を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
標的分子が抗体であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
捕捉パートナは、抗体または抗原であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
捕捉パートナは、抗原であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか一に記載の方法であって、
捕捉パートナは、媒介抗体を介して支持材に固定化されたことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
標的分子は、ポリヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１または６に記載の方法であって、
捕捉パートナは、ポリヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれか一に記載の方法であって、
磁場を定常的に印加することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか一に記載の方法であって、
印加された磁場が変動することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
磁場は、矩形波、正弦波、または鋸状波などの外部信号を印加することにより変動することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
磁場は、矩形波を印加することにより変動することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか一に記載の方法であって、
磁場を集束させるための金属スタッドを含む電磁石を用いて、磁場が形成されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１１のいずれか一に記載の方法であって、
磁場は、コイル電磁石を用いて形成されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
複数のコイル電磁石が用いられることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１１のいずれか一に記載の方法であって、
磁性体粒子は、光学的な顕微鏡を用いて光学的に特定されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１４のいずれか一に記載の方法であって、
上記ステップ（ii）は、錯体がコイルおよび調整回路により形成された磁場に曝されたときの調整回路の共鳴周波数と、磁場に曝されていないときの共鳴周波数の差異における差異を測定することにより実施されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
上記ステップ（ii）は、結合アッセイを動的に分析できるように、アッセイ中の定期的な時間間隔で実施されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１７のいずれか一に記載の方法であって、
非結合磁性体粒子は、支持材の表面の上方に配置された磁石を用いて、支持材上の表面から排除されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
イムノアッセイにおいて捕捉パートナに対するアナライトの結合を改善するために印加された磁場を使用する方法において、
アナライトが磁性体粒子と結合し、捕捉パートナが支持材と結合することを特徴とする使用方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１８のいずれか一に記載の方法において、
形成された磁場を集束させる金属スタッドを含む電磁石の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、標識体として磁性粒子を用いて、結合アッセイ、特に免疫学的測定法（イムノアッセイ）を実行する方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
免疫学的測定法とは、リガンド結合分析法であって、アナライトの特定の結合領域に対する抗体の特異的な認識を利用している。免疫学的測定法は、通常、リガンド（抗体、他のたんぱく質、ハプテンなど）を固相に固定化させることを含み、これは、特定すべきアナライトにより認識される。特異的に標識された検出剤を用いることにより、水性試料中のアナライトを検出し、定量化することができる。試料中に存在するアナライト量は、結合した標識検出剤の関数であって、競合アッセイに反比例し、非競合アッセイに正比例する。
【０００３】
ここ１０年間、免疫学的測定法のデザインおよびフォーマットに数多くの改良がなされ、その結果、感度が向上している。免疫反応をモニタするために用いられるさまざまな標識体を利用して、数多くの技術革新がなされてきた。元来、放射性同位体の標識体が用いられてきたが、近年、酵素と蛍光性／発光性の標識体に取って代わられてきた。このように置換されたことにより、同位体の安定期間に関する問題、標識された成分の貯蔵の問題、および取り扱いの煩雑さの数多くの問題が解消された。現在ある蛍光を利用した分析用イムノアッセイシステムは、高価で特殊化した装置を必要とし、携帯用システムとして構成することは現実的ではない。現在市販されている唯一の携帯システムは、着色標識体とともにディップスティック技術を用いる。これらは、主に妊娠検査に用いられ、検査結果は陽性または陰性のいずれかである。標本の実際の濃度を測定使用とする場合、これらは、一般に不向きである。
【０００４】
強磁性体粒子を標識体として用いることは、Krizらの２つの論文で記載されている（Biosensors and Bioelectronics, 1998; 13: 817-823、およびAnalytical Chemistry, 1996; 68: 1966-1970）。しかし、これらの技術においては、形成すべき試料の透磁性を測定するためのマクスウェルブリッジに配置された簡単な測定コイルを用いて、強磁性体粒子が検出される。そして物質内の粒子の数を特定する指標として、この透磁性を用いる。
【０００５】
欧州特許出願第EP-A-01303319.6は、本出願人による同時係属出願であって、その内容は、ここに一体のものとして参考に統合される。これは、標識体として磁性体粒子を用いる免疫学的測定法を開示し、この粒子は、共鳴振動数を測定することにより特定される。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、磁性体粒子を用い、反応期間中に磁場をかけた場合に、結合アッセイがより効率的に実施されるという、驚くべき知見に基づいている。
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、結合アッセイを実行する方法であって、（ｉ）結合錯体を形成するために、標的分子を捕捉パートナ（親和パートナ：affinity partner）に接触させるステップと、標的分子が磁性体粒子上に固定化され、捕捉パートナが支持材に固定化され、および（ii）錯体磁性体粒子の数を特定して、錯体化標的分子の量を特定するステップと、を有し、少なくともステップ（ｉ）が印加された磁場の存在下で実施されることを特徴とする。
【０００８】
本発明の方法を用いて、結合アッセイ、すなわちイムノアッセイの速度を促進させる。理論にとらわれることを望まず、これにより、各結合パートナを一体にして、接近させるという結果をもたらされるようであり、結合反応をより効率的に実現することができる。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
添付図面を参照しながら本発明を説明する。
【００１０】
本発明に係る方法は、特定のアナライトの存在または濃度を検出することが好ましい場合の任意の形態の結合反応に適用することができる。適当な結合反応は、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応である。この場合、標的分子および捕捉パートナ（親和パートナ）は、相補ＤＮＡ分子である。ポリヌクレオチドを用いて、他の薬剤に結合させてもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、いわゆるＤＮＡ結合たんぱく質と結合させるために用いられるアプタマであってもよい。好適には、結合反応は、特定の抗体／抗原の結合錯体が形成されるイムノアッセイである。ＤＮＡハイブリダイゼーション反応およびイムノアッセイを含む、結合アッセイを実施する一般的な方法は、当業者によれば明らかである。結合アッセイを実施するための適当な技術については、SambrookらのMolecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)）、およびAusubelらのCurrent Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley and Sons Inc.を参照されたい。
【００１１】
イムノアッセイに関して、磁性体粒子上に固定化された分子は、支持材の上に直接支持された捕捉パートナと結合することができる。択一的には、捕捉パートナは、例えば支持材上に固定化された分子に対する別の捕捉体を介して、間接的に支持材に結合してもよい。この例において、捕捉パートナは、支持材および磁性体粒子が接触する水性試料中に存在していてもよい。捕捉パートナは、支持材上の分子と、磁性体粒子上の分子とに結合することにより、支持材および粒子の間の架橋（bridge）として機能する。この実施形態は、以下に説明する実施例１で開示されている。当業者にとって変形例は自明である。
【００１２】
通常、利用される磁性体粒子は、強磁性体または他の磁性体粒子を同様に用いることができるが、常磁性体粒子である。常磁性体粒子は、商業的な提供者から入手可能であり、通常２．８μｍの直径を有し、適当なポリマ層で皮膜された常磁性体材料からなるコアを有し、その上に結合アッセイで用いられる分子が固定化される。
【００１３】
通常、各磁性体粒子は、単分子からなるので、形成される分子の濃度を直接的に計算することができる。磁性体粒子上に分子を固定化する方法は、当業者ならば自明である。しかし、必要ならば、粒子は１つ以上の分子を有していてもよい。磁性体粒子は、通常、約０．５μｍないし５μｍの直径を有し、より好適には１μｍないし３μｍの直径をする。一般に、５ｎｍないし３００ｎｍの範囲の直径を有するナノ粒子も同様に、本発明の範疇に含まれる。
【００１４】
結合アッセイは、好適な支持材上に固定化された捕獲パートナを用いて行われる。従来式の結合アッセイ、特にイムノアッセイに基づくと、好適な支持材は当業者にとって自明である。好適な支持材は、ガラス、セラミック、プラスティック、およびシリコン製の支持材である。好適な実施形態において、支持材は、ポリエステル系材料である。一般に、支持材は、平坦で平面的な表面を有し、その上に捕捉パートナが当業者により広く知られた従来式の方法を用いて固定化される。ただし、他の構成を同様に用いることができる。好適な実施形態において、支持材は、マイクロアレイの形態を有し、適当なマイクロアレイがGB-A-2324866に開示されており、その内容はここに一体のものとして参照して統合される。
【００１５】
この結合アッセイは、磁場をかけた状態で行われる。当業者に知られた装置、とりわけ電磁石またはソレノイドを用いて、磁場をかける。磁場は、定常的にかけてもよいし、矩形波、正弦波、または鋸状波などの外部信号を印加することにより、変動させてもよい。
【００１６】
驚くことに、磁場を変動させることにより、磁場を定常的にかける場合と比較して、その結果が改善されることを確認した。磁場を変動させると、とりわけ、反応時間が大幅に短縮され、加えられた磁場の強さが小さいときに磁性体粒子が確実に固定されずに移動するため、固定化された標的たんぱく質のより多くの結合部位を露出させる場合に生じるようなさらなる結合現象の傾向が改善される。
【００１７】
適当な磁場の周波数は、当業者が反復実験を行うことにより決定することができる。好適な周波数は、１Ｈｚ以下である。好適な実施形態において、磁場を集束させる金属スタッドを含むコイル電磁石を用いて磁場をかける。金属スタッドを含む好適な電磁石を図３に示す。支持材は、磁場を集束させるために、電磁石上のスタッドの上方に配置する必要がある。
【００１８】
本発明のさらなる好適な実施形態において、１つまたはそれ以上の平坦なコイルを用いて磁場をかける。コイルは、支持材の下側面、すなわち固定化された分子（捕捉パートナ）を有する裏面の上に配置してもよい。コイルは、当業者には理解されるように金属などの導電性材料を用いた厚膜技術または薄膜技術を用いて、支持材に固定される。各コイルの共鳴周波数は、直径、コイルの巻数、およびその構成材料により決まる。単一または複数のアナライト検出のために、１つのまたは複数個のコイルを支持材に対してパターン化することができる。生物学的分子（捕捉パートナ）は、支持材の裏面上のコイルの上に配置されるような位置に配置される。一連の結合現象は、磁性体材料、常磁性体材料、超常磁性体材料（ミクロンまたはナノメートルサイズの粒子）を含む支持材で生じる。
【００１９】
驚くことに、最終的な測定値を得るのではなく、動的な測定結果を得るために、この分析を行うことができる。永久磁石を用いて、これをスイッチのオン・オフさせることにより、動的な測定結果を得ることができる。
【００２０】
１つの実施形態において、２つの磁石を用い、一方を支持材の下側に配置して磁性体粒子を支持材の表面に引き寄せ、他方を支持材の上側に配置して非結合粒子を表面から引き離すシステムを用いて分析してもよい。粒子が同時に一方向に引っ張られるように、磁石を交互にスイッチングしてもよい。表面を調べ、存在する磁性体材料の量を測定するために、検出コイルを設けてもよい。上側磁石および下側磁石を装置の上に配置してもよく、これらの磁石により、粒子を支持材に近づけ、遠ざけることができる。磁場引力を得るために下側磁石を支持材により接近させた場合、上側磁石は支持材から遠ざけて配置され、磁力を生じない。反対の配向が得られるように、これらの磁石を移動させることができる。このように、変動磁場が分析組成物に印加される。上側磁石が最大磁場を有するとき、すなわち上側磁石が支持材に接近したとき、周波数の変化を測定することにより、測定すべき定量的結果を得ることができる。周波数の変化は、試料の平均周波数から、（アナライトのない）ブランクの平均周波数を差し引くことにより測定することができる。これを所定期間中、定期的間隔、例えば２分間隔で行われた場合、研究対象の各アナライトに対する検量線を得ることができる。
【００２１】
分析の最終ステップは、固相支持材に対する錯体中に捕捉される磁性体粒子の数を特定することである。磁性体粒子は、光学的手段、光学顕微鏡を用いて人手が計数することにより特定される。択一的には、そして好適には、磁性体粒子は、捕捉された磁性体粒子を含む錯体がコイルにより生じた磁場に曝されたとき、錯体が磁場に曝されないときの調整された回路の共鳴周波数における差異を測定することにより、磁性体粒子が特定される。本発明のこの態様は、同時係属出願EP-A-01303319.6に開示されている。
【００２２】
この分析は、任意の適当な装置で実施することができる。例えば、支持材は、診断分析を実施するときには磁石の上に配置されるテストストリップ（診断用ディップスティック）の一部であってもよい。択一的には、支持材を適当な封止された反応容器中に保持してもよい。磁性体粒子、常磁性体粒子、または超常磁性体粒子を反応容器中の適当な緩衝液中に懸濁させて、測定すべきアナライトを含む生物学的テストサンプルを、入口ポートを介して反応容器内に導入してもよい。適当な反応容器は、当業者には明らかである。
【００２３】
以下の実施例により、本発明が説明される。
【００２４】
＜実施例１：プラスティック製テストストリップの作製＞
用いられる支持材は、ポリエチレン・テレフタレート（ＰＴ）透明体、レーザ／コピータイプＡ（Rank Xerox, UK）であった。図１ａに示すように、長さ３０ｍｍ×幅５ｍｍのＰＴストリップをプラスティック製スティック（ACS, UK）に糊付けした。ＰＴスティックは、疎水性表面を最上部にくるよう配向した。加えた試薬がＰＴテストストリップの長さに沿って拡散するのを防止するために、プラスティック製スティックの方向において、図１ｂに示すように、ワックスラインがＰＴを横断するように引かれた。
【００２５】
＜磁力イムノアッセイ＞
ｐＨ７．２の０．１５Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を次のように作製した。４０ｇの塩化ナトリウム、７．２ｇの正リン酸二水塩水酸化ナトリウム、１ｇの塩化カリウム、および１ｇの二水素リン酸カリウムを５リットルの蒸留水に溶かした。ｐＨは、要請されたように７．２に調整された。
【００２６】
ウサギ抗ヒトトランスフェリン（Dako AIS, Denmark）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、に１：１０００で希釈した。ＰＢＳに希釈された１容量％グルタルアルデヒド。
ブロッキング溶液：１重量％ウシ属血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびＰＢＳに溶解した１重量Ｍグリシン。
ヒトトランスフェリン：１ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトホロトランスフェリンをＰＢＳ中に用意した。貯蔵溶液を１％のＢＳＡ／ＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍｌの最終濃度にした。
ヒツジ抗ヒトトランスフェリン：ヒツジ抗ヒトトランスフェリンを１％のＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した。
常磁性体粒子（ＰＭＰ）：Ｍ−２８０ダイナビード（Dynabeads）をコーティングしたストレプトアビジン、およびノルウェー国のDynalから市販された磁性体粒子コンセントレータ（ＭＰＣ）。
ＰＭＰ用の洗浄緩衝液：１リットルの蒸留水に希釈された０．１６ｇの二水素正リン酸ナトリウム、０．９８ｇの二水素リン酸カリウム、および８．１０ｇの塩化ナトリウム。必要に応じて、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調整した。
ビオニチル化ロバ抗ヒツジ：常磁性体粒子をコーティングするためのビオニチル化ロバ抗ヒツジがＰＢＳに希釈される。
ＰＭＰのための最終的な懸濁緩衝液：ＰＢＳ／１重量％ウシ属血清アルブミン／４％のポリエチレングリコール（ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＰＥＧ）：１重量％ＢＳＡおよび４重量％ＰＥＧをＰＢＳに溶解させた。
英国リードのFarnell Electronic Company から市販されている、「ＰＬ」シリーズ二重出力研究用電源、ジュピタ５００機能ジェネレータおよび５０ｍｍ電磁石（１２Ｖ）。
【００２７】
磁場を集束しやすくするために、電磁石上に配置するためのスタッドを社内で作製した。
【００２８】
＜方法＞
ｉ．ストレプトアビジンＰＭＰの生成
各テストストリップのために、攪拌することにより、１０μｌＰＭＰを洗浄緩衝液のチューブ内で再懸濁させた後、２分間、磁性体粒子コンセントレータ（ＭＰＣ）内に配置する。これにより、磁性体粒子がＭＰＣ内の磁石によりチューブの側面に引き寄せられ、保持された。上清液を取り除いた。この処理を３回繰り返した。
【００２９】
ダイナルハンドブックで推奨されているように、コーティング処理を行った。ストレプトアビジン磁性体粒子をビオニチル化ロバ抗ヒツジ（１０７個の粒子あたりに１．５μｇ）に混合して、（ノルウェー国のDynalのDynal MX2 サンプルミキサを用いて）双方向攪拌しながら４℃で３０分間培養した。その後、コーティングされた常磁性体粒子を、ＭＰＣを用いて１％のＢＳＡ／ＰＢＳで４回洗浄した。
【００３０】
ii．磁力イムノアッセイ
固相洗浄処理：特に説明しなければ、「洗浄」なる用語を用いて、パストゥールピペットを用いて、３ｍｌの蒸留水で３回、３ｍｌのＰＢＳで１回、濯ぐことを意味する。
保存温度：特に説明しなければ、すべての保存は室温でなされた。
【００３１】
２５μｌのウサギ抗ヒトトランスフェリンを、１０μｌの１容量％グルタルアルデヒドと混合して、各テストストリップに塗布した。テストストリップを４℃で一夜培養した。洗浄後、テストストリップを１時間ブロッキング溶液内に培養した。テストストリップを洗浄した後、３０分間２０μｌのヒトトランスフェリンとともに培養した。洗浄後、３０μｌのヒツジ抗ヒトトランスフェリンを加え、３０分間各テストストリップ上で培養し、洗浄ステップを繰り返した。１０μｌのコーティングされた常磁性体粒子を各テストストリップに加え、電磁石上で培養した（下記参照）。最終的な洗浄ステップにおいて、パストゥールピペットを用いて、３ｍｌの蒸留水＋０．０２％のトゥイーン２０からなる洗浄を４回繰り返して、未結合の常磁性体粒子を取り除いた。
【００３２】
電磁石を用いて磁場をかける。この磁場は、定常磁場であってもよいし、矩形波、正弦波、または鋸状波などの外部信号を印加することにより、変動させてもよい。さらに、磁場を集束させるために、金属スタッドを電磁石の上に配置した（図３）。生物学的な結合作用の改善は、所定の時間、所定の磁場状態において、固相に結合する常磁性体粒子の数がより多いことで示唆された。以下の変数について調査した。
・定常的磁場
・矩形波
・正弦波
・鋸状波
・磁場の強さ
・電磁石への「スタッド」の追加
・ゼロ点からのずれ
常磁性体粒子の検出および定量化は、光学的顕微鏡を用いて行った。これを用いることで、磁力計を用いた場合に導入される潜在的な変数を排除した。
【００３３】
＜結果＞
常磁性体は、架橋剤としてアナライト（トランスフェリン）を用いて、コーティングされたプラスティック表面に結合することが、初期実験で検証された。表面に結合する粒子の数は、印加される磁場の強さに依存した。図４は、印加された定常磁場の強さが増大する結果として、結合する常磁性体粒子の増大する数を示す。
【００３４】
ホールプローブを用いて、磁場の強さを測定し、電磁石に印加される電圧と測定された磁場の強さに関連付けて、較正曲線を得た。これが図５に図示されている。印加される磁場の強さを変えることによる効果に関して実験したところ、さまざまな結果が得られた。３つのタイプの波形、矩形波、正弦波、および鋸状波について調査した。当初、波形の振幅が０ボルトから特定の磁場の強さに対応する電圧まで変動するように、周波数計を調整した。
【００３５】
鋸状波によれば、すべての培養期間に対して、粒子の数が磁場の強さとともに増大するが、鋸状波を用いたとき、全体的には、結合する常磁性体粒子の数は最も少ない。鋸状波によれば、とりわけ培養期間がより長いとき、結合する常磁性体粒子の数は最も多くなる。磁場の強さは、鋸状波と比較して、効果はより小さいようだった。興味深いことに、正弦波の場合、特定の磁場になるまで結合数が増大するものの、さらに磁場が増大したとき結合数が減少した。電磁石上にスタッドを用いたとき、最良の結果が得られたが、ブランク数が高くなった。
【００３６】
印加された波形のずれがアッセイの重要な変数であることが分かった。結合粒子の数は、変動サイクルの全体にわたって磁場が正極性を有するとき、著しく増大した。
【００３７】
＜実施例２：ミクロンサイズの常磁性体粒子を用いたＣＫ−ＭＢアッセイ＞
クレアチンキナーゼＭＢサブユニット（ＣＫ−ＭＢ）に対する直接的な５分間アッセイの進展結果が調査された。捕獲抗体はマウス単クローン性抗体であって、検出抗体はヤギ多クローン性抗体である。このアッセイにおいて、ヤギ抗体は支持材に固定化されている。
【００３８】
固定化されるたんぱく質の量を最大化するように、支持材をコーティングする広範な条件を調査した。これらは以下のものを含む。
・４℃で一夜培養した。
・室温で４時間培養した。
・たんぱく質を加える前に、トランスイルミネータを用いて、１５分間、固相に光を照射した。
上記すべては、コーティング緩衝液中にグルタルアルデヒドを含む場合と含まない場合、さらに１／２００、１／５００、および１／１０００の抗体希釈率の範囲を用いた場合について行った。
【００３９】
支持材を作製した後、アッセイを２ステップ式（間接的に）、および１ステップ式（直接的）に行った。間接的アッセイにおいては、抗原および標識された抗体の添加を個別に行った。一方、直接的なアッセイにおいては、抗原と標識された抗体の培養を同時に行った。
【００４０】
初期調査においては、酵素標識された副次的な抗マウスＨＲＰを用いてアッセイが進行していることを示した。後に、これを抗マウスＣＫ−ＭＢコーティングされた常磁性体粒子と置き換え、次の２つの条件で磁場を集束させるためのスタッドを有する電磁石の上で培養した。
１．５分間の培養期間、定常磁場（５００ｍＡ／２８２ｍＴ）。
２．５分間の培養期間、１分間オン状態、１分間オフ状態（５００ｍＡ／２８２ｍＴ）。
【００４１】
＜結果＞
以下のステップ／条件を組み合わせることにより、図６に示すように（制御と比較して）良好な差別的な反応が得られた。
コーティング：スティックの活性表面をＵＶ光源に向けて、ＵＶ照射器上で５分間スティックに光を照射する。２５μｌのヤギ抗ＣＫ−ＭＢ（１／１０００）および１０μｌの１％グルタルアルデヒドを用いてコーティングする。室温で４時間培養する。
ブロッキング：５０μｌの１％ＢＳＡ／１Ｍグリシン／ＰＢＳ。
ＰＭＰ：  １：１０００（１００μｇ／Ｌ）のＣＫ−ＭＢを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／１Ｍグリシンで希釈する。１０μｌのコーティングされたＰＭＰを１０μｌＣＫ−ＭＢに混合する。抗体は、トリエタノールアミンを用いて架橋結合した。
アッセイ：電磁石上で培養する：１分間オン状態、１分間オフ状態で５分間。最大磁場（５００ｍＡ／２８２ｍＴ）。
２ｍｌのＰＢＳで２回、１ｍｌのｄＨ２Ｏで１回洗浄する。乾燥させて、磁力計の値を読む。
【００４２】
＜実施例３：ナノメータサイズの常磁性体粒子（磁性流体）を用いたＣＲＰアッセイ＞
ナノメータサイズの常磁性体粒子を、Ｃ反応性たんぱく質（ＣＲＰ）を測定するためのアッセイシステムで用いた。常磁性体粒子を顕微鏡で計数できないので、磁力計における磁性流体の磁性感度を調査するための初期実験を行った。これをミクロンサイズの常磁性体の感度と比較された。磁性流体は、所定質量の常磁性体材料に対して、磁力計においてより大きな感度を有することが確認された。
【００４３】
＜アッセイの進展結果＞
磁性流体が磁力計で検出されることを認識しつつ、５分間の競合的アッセイの進展結果を調査した。標識された抗原を用いた場合、アッセイは競合的でなければならない。このアッセイにおいて、抗ＣＲＰが支持材の上に固定化され、試料抗原と標識された抗原が、支持材上に固定化された限定的な数の抗体結合部位に対して競合する。
【００４４】
ＣＫ−ＭＢアッセイに関して、支持材にコーティングするための広範な条件を調査して、固定化されたたんぱく質の量を最大化させる。これらは、次のものを含む。
・４℃で一夜培養した。
・室温で４時間培養した。
・たんぱく質を加える前に、トランスイルミネータを用いて、１５分間、固相に光を照射した。
上記すべては、コーティング緩衝液中にグルタルアルデヒドを含む場合と含まない場合、さらに１／２００、１／５００、および１／１０００の抗体希釈率の範囲を用いた場合について行った。
【００４５】
このアッセイは、テスト抗原を標識抗原（ＣＲＰ磁性流体）に混合させることにより行われる。これは、高いＣＲＰ濃度で、プール血清の１／５０希釈液および１／５００希釈液に対して行われた。磁性流体は、使用に際して１／３に希釈した。スタッドの存在下で、電磁石の上で５分間培養して、２８２ｍＴの磁場強度で磁場を収束させる。
【００４６】
＜結果＞
調査されたアッセイ条件の異なる組み合わせのすべてのうち、下記した条件が最良の結果をもたらした。これらの結果は、図７に図示されている。これらのアッセイを、異なる日において２度繰り返し、グラフはその２日における反応（Ｒ１およびＲ２）および平均値を示している。アッセイに用いられた条件は、次の通りである。
コーティング：スティックの活性表面をＵＶ光源に向けて、ＵＶ照射器上で１５分間スティックに光を照射する。ＰＢＳを抗ＣＲＰに１：５００で希釈する。２５μｌの抗ＣＲＰおよび１０μｌのＰＢＳを加える。室温で４時間培養する。
ブロッキング：１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中において室温で１時間ブロッキングする。
磁性流体：１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中においてＣＲＰ標準液を１：５００で希釈する。２５μｌのＣＲＰ磁性流体（１／３に希釈）を１０μｌのＣＲＰに混合させる。定常磁場、最大磁場強度（５００ｍＡ，２８２ｍＴ）で５分間、電磁石上で培養する。２ｍｌのＰＢＳで３回洗浄する。乾燥時、磁力計の値を読む。
【００４７】
＜実施例４：ＣＫ−ＭＢアッセイ−定量的測定＞
この実験は、さまざまなアナライト濃度に関する検量線を決定して、定量的測定結果を得るために行われる。
【００４８】
直径１．５ｃｍのポリエステル製ディスクを用いた。これを以下のように活性化した。
・１分間メタノールに浸し、１０分間ＵＶ照射する。
・メタノール洗浄する。
・重合化グルタルアルデヒド（５ｍｌの５％グルタルアルデヒド、５００μｌの０．１ＭＮａＯＨ）に３０分間浸す。
・１分間メタノールに浸す。
【００４９】
２％のメタノールと０．５％のグルタルアルデヒドを含むｐＨ９．７の０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液に、捕獲抗体（１／１０００ないし５．５６μｇ／ｍｌ）を添加した。これをディスクに（３５μｌ）塗布した。このディスクを室温で４時間培養して、ＰＢＳで洗浄し、１％のＢＳＡ／グリシン／ＰＢＳで１時間ブロック処理を行った。
【００５０】
常磁性体粒子は次のようにして作製した。
・ヤギＣＫ−ＭＢをｐＨ５．８の０．１Ｍナトリウムリン酸塩緩衝液で希釈する。
・ＰＭＰ２８０（試料あたり１０μｌ）を上述の緩衝液で２、３度洗浄する。
・３０μｌのヤギＣＫ−ＭＢと、１０μｌのＰＭＰ（ディスクあたり）を混合させ、ゆっくりと回転するダイナルサンプルミキサ（Dynal Sample Mixer）上で、室温で１０分間培養する。
・最終的には、１％ＢＳＡ＝０．１％トゥィーン２０を用いて、ＰＢＳで３度洗浄する。
【００５１】
次のＣＫ−ＭＢ溶液を用いた。
１．１／１０００（２５０ｎｇ／ｍｌ）
２．１／２０００（１２５ｎｇ／ｍｌ）
３．１／４０００（６２．５ｎｇ／ｍｌ）
４．１／８０００（３１．２５ｎｇ／ｍｌ）
５．１／１６０００（１５．６ｎｇ／ｍｌ）
６．１／３２０００（７．８ｎｇ／ｍｌ）
【００５２】
適当に希釈された０．９ｍｌのＣＫＭＢを反応容器中に注入して、（制御容器はＰＢＳ／ＢＳＡを受容し）、１００μｌの標識された（ＰＢＳに１／１０で希釈された）ＰＭＰが各反応容器に添加された（３通りのアッセイが行われた。）。溶液は攪拌され、周波数は即刻決定された（０時間）。上側磁石または下側磁石（支持表面の下側または上側）を用いて磁場がかけられ、このとき各磁石は、磁場をかけるために、支持材に近づいたり、遠ざかったりする。周波数は、下側磁石が支持材から最も離れた時点の２分ごとに決められる。
【００５３】
周波数の変動は、次の方程式に基づいて決定された。すなわち、
（試料の平均周波数測定値）−（ブランクの平均周波数測定値）の絶対値である。
この結果が図８および図９に図示されている。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１（ａ）および図１（ｂ）は、それぞれテストストリップの側面図および平面図であり、（１）は疎水性の上面を有するポリエチレン・テレフタレート製のストリップ、（２）はプラスティックスティック、（３）はワックスライン、（４）は試料／生物学的試薬を示す。
【図２】図２は、周波数発生器、電源、および電磁石を示す。
【図３】図３は、スタッドを含む電磁石を示す。
【図４】図４は、増大する磁場の強度が、支持材に結合する磁性体粒子の数に与える効果を示すグラフである。
【図５】図５は、検量線に関するグラフであって、所定の電圧に対する電磁石の磁場強度を示す。
【図６】図６は、ＣＫ−ＭＢに関するアッセイにおける結合を示すグラフである。
【図７】図７は、ＣＲＰに関するアッセイを示すグラフである。
【図８】図８は、時間に対する周波数変化を示す。
【図９】図９は、ＣＫ−ＭＢアナライトに関する検量線を示すグラフであって、アッセイ中の周波数変化を計算することにより確立される。
【符号の説明】
【００５５】
１  ストリップ、２  プラスティックスティック、３  ワックスライン、４  試料／生物学的試薬、
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月17日(2003.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合アッセイ中に動的な測定結果を得るための方法であって、
（ｉ）結合錯体を形成するために、標的分子を捕捉パートナに接触させるステップと、標的分子が磁性体粒子上に固定化され、捕捉パートナが支持材に固定化され、および
（ii）アッセイの終点に至り、これを任意に含む設定時間において、調整された回路の共鳴周波数の変化を測定することにより、錯体磁性体粒子の数を特定するステップと、を有し、
少なくともステップ（ｉ）が印加された磁場の存在下で実施されることを特徴とすることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
支持材が反応容器の中にあって、アッセイが液体懸濁液の中で実施されることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
錯体磁性体粒子は、検出コイルを用いて特定されることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか一に記載の方法であって、
標的分子は、抗体であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか一に記載の方法であって、
捕捉パートナは、抗体または抗原であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
捕捉パートナは、抗原であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか一に記載の方法であって、
捕捉パートナは、媒介抗体を介して支持材に固定化されたことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１ないし３のいずれか一に記載の方法であって、
標的分子は、ポリヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１または８に記載の方法であって、
捕捉パートナは、ポリヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか一に記載の方法であって、
磁場を定常的に印加することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか一に記載の方法であって、
印加された磁場が変動することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
磁場は、矩形波、正弦波、または鋸状波などの外部信号を印加することにより変動することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
磁場は、矩形波を印加することにより変動することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１３のいずれか一に記載の方法であって、
磁場を集束させるための金属スタッドを含む電磁石を用いて、磁場が形成されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１３のいずれか一に記載の方法であって、
磁場は、コイル電磁石を用いて形成されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
複数のコイル電磁石が用いられることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の方法であって、
磁性体粒子は、光学的な顕微鏡を用いて光学的に特定されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１ないし１７のいずれか一に記載の方法であって、
支持材表面の上方に配置された磁石を用いて、非結合磁性体粒子が支持材表面から除去されることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2005504989.tif 000034
2005504989.tif 000035
2005504989.tif 000036