(57)【要約】本発明は、核タンパク質フィラメント形成能（NPF）を有するタンパク質を用いた細胞のトランスフェクション方法に関し、ここで、トランスフェクションステップに影響する機能的構成成分でまずタンパク質を修飾し、トランスフェクションされる核酸はその修飾タンパク質と結合してフィラメント状の複合体を形成し、この複合体を最終的に細胞に添加する。本発明は、さらにＮＰＦからなるトランスフェクション試薬に関し、ここでNPF形成タンパク質がトランスフェクションのための機能的構成成分で修飾されている。さらに本発明は、ヒトおよび動物の遺伝子療法による治療のための医薬品を製造するための、本発明によるトランスフェクション試薬の使用に関する。本発明は、特に遺伝子療法における使用およびキット中の成分のようなトランスフェクション試薬の使用のための、対応する医薬品の調製にも関する。
2005505233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスフェクションの１つまたは複数のステップに影響する少なくとも１つの機能的構成成分でまずタンパク質を修飾し、次いでトランスフェクションされる核酸に修飾されたタンパク質を結合し、核酸およびタンパク質がフィラメント状の複合体を形成し、最終的に、この複合体をトランスフェクションされる細胞に添加することを特徴とする、核タンパク質フィラメント形成能を有する少なくとも１つのタンパク質による細胞のトランスフェクションのための方法。
【請求項２】
アミノ酸および／またはタンパク質ドメインの欠失または挿入によって前記タンパク質を修飾することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸および／または別の分子群の化学的変化によって前記タンパク質を修飾することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の分子の化学的結合によって前記タンパク質を修飾することを特徴とする、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記機能的構成成分が細胞表面への前記複合体の会合をもたらすことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記機能的構成成分が、細胞膜を通っての前記複合体の非エンドソーム通過をもたらすことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記機能的構成成分が前記複合体のエンドソーム／リソソームからの放出をもたらすことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記機能的構成成分が前記複合体の細胞核への輸送をもたらすことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
異なる機能をもついくつかの機能的構成成分で前記タンパク質を修飾し、および／または異なるタンパク質をそれぞれ異なる機能構成成分で修飾することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質に多数の機能的構成成分を結合することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ヌクレオシド三リン酸および／またはその非加水分解性類似体の添加によって、特にＡＴＰ（アデノシン三リン酸）および／またはＧＴＰ（グアノシン三リン酸）および／またはその非加水分解性類似体によって、前記複合体を安定化させることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
核酸の別の生物学的および／または化学的および／または物理学的なトランスフェクション方法、特にエレクトロポレーション法と組み合わせて使用することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
核タンパク質フィラメントを含有し、トランスフェクションされる核酸の少なくとも１つおよび核タンパク質フィラメント形成能を有する少なくとも１つのタンパク質からなるトランスフェクション試薬であって、核タンパク質フィラメント形成能を有する前記タンパク質が、トランスフェクションに影響を与える少なくとも１つの機能的構成成分で修飾されていることを特徴とするトランスフェクション試薬。
【請求項１４】
前記タンパク質が異なる機能をもついくつかの機能的構成成分で修飾されており、および／または異なるタンパク質がそれぞれ異なる機能的構成成分で修飾されていることを特徴とする、請求項１３に記載のトランスフェクション試薬。
【請求項１５】
前記タンパク質に多数の機能的構成成分が結合されていることを特徴とする、請求項１３または１４に記載のトランスフェクション試薬。
【請求項１６】
フィラメント形成タンパク質として、タンパク質ＲｅｃＡ、ＲａｄＡ、ＲＡＤ５１、ｈＤｍｃ１、ＳＡＳＰ、ＩＣＰ８、好ましくはＵｖｓＸ、特に好ましくはｈＲＡＤ５１の群から選択される１つのタンパク質、または列挙されたタンパク質の少なくとも２つからなる混合物を含有することを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載のトランスフェクション試薬。
【請求項１７】
前記機能的構成成分が細胞表面への試薬の会合をもたらすことを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれかに記載のトランスフェクション試薬。
【請求項１８】
前記機能的構成成分が細胞膜を通っての試薬の非エンドソーム通過をもたらすことを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれかに記載のトランスフェクション試薬。
【請求項１９】
前記機能的構成成分がエンドソーム／リソソームからの試薬の放出をもたらすことを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれかに記載のトランスフェクション試薬。
【請求項２０】
前記機能的構成成分が細胞核への試薬の輸送をもたらすことを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれかに記載のトランスフェクション試薬。
【請求項２１】
ヒトおよび動物の遺伝子療法による治療のための医薬品を製造するための、請求項１３〜２０のいずれかに記載のトランスフェクション試薬の使用。
【請求項２２】
請求項１３〜２１のいずれかに記載のトランスフェクション試薬を含有することを特徴とする、医薬品の調整。
【請求項２３】
少なくとも１つの核タンパク質フィラメント形成能を有するタンパク質、および請求項１３〜２０のいずれかに記載の少なくとも１つの機能的構成成分、ならびに以下の成分の少なくとも１つ：
ａ）ヌクレオシド三リン酸および／またはヌクレオシド三リン酸類似体
ｂ）少なくとも１つのトランスフェクションされる核酸
ｃ）助剤および添加剤
を包含する、核酸を細胞にトランスフェクションするのに適したキット。
【請求項２４】
細胞をトランスフェクション試薬でトランスフェクションし、潜在的な阻害剤または活性剤に曝露させることを特徴とする、請求項１３〜２０のいずれかに記載のトランスフェクション試薬の発現物質の活性剤または阻害剤を同定するための方法。
【請求項２５】
細胞を請求項１３〜２０のいずれかに記載のトランスフェクション試薬でトランスフェクションし、トランスフェクションされていない対照細胞と比較して生理学的な変化を測定することを特徴とする、生理学的に活性な核酸を同定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の非ウィルス性トランスフェクションの分野に関する。トランスフェクションなる用語は、一般に外来物質を細胞に導入することと解釈される。本発明は、核タンパク質フィラメント形成能を有する少なくとも１つのタンパク質を用いた細胞のトランスフェクションの方法にも関する。本発明はさらに、トランスフェクションされる少なくとも１つの核酸と、核タンパク質フィラメント形成能を有する少なくとも１つのタンパク質とで形成される核タンパク質フィラメント（ＮＰＦ）を含有する、トランスフェクション試薬に関する。さらに、本発明は、本発明にかかるトランスフェクション試薬の使用、特に遺伝子治療において使用するための本試薬の調剤、細胞へ核酸をトランスフェクションするためのキット及び本発明にかかるトランスフェクション試薬を使用する特別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
公知の非ウィルス性トランスフェクションは一連の制限を受けている。非ウィルス性核酸トランスフェクションでは主に、しばしば正または負に帯電した球状の核酸複合体の大きさ、および１つまたは複数のトランスフェクションステップの制御が十分にできないことが大きな問題となっている。後者の原因として、外側の細胞膜または内側の細胞内膜を貫通する能力の不足、酵素による分解に対する保護の不足、低い生物学的利用能、および細胞内の非生物学的分子によって引き起こされる、制御が十分にできない生物学的効果があげられる。多くの場合、核酸はきわめて広がった立体構造を含んでおり、酵素によって容易に分解可能であり、正または負に過剰に帯電していることによって基本的細胞構造と容易に会合しうる。それにともなって核膜通過能が不十分であるために、現在の核酸トランスフェクション技術は、例えばセルラインのような癌様に形質転換した細胞への使用にほぼ独占的に制限されているが、それはこのような形質転換細胞では、核膜が細胞分裂の間に一時的に溶解し、核内への侵入が可能になるためである。しかし形質転換細胞は一次細胞の本来の生理学的状態と比較可能ではないため、そのような形質転換細胞を用いた研究から、一次トランスフェクション細胞の反応を結論付けることはできない。
【０００３】
すでに一連のトランスフェクション試薬が知られており、それらのほとんどすべては核酸との静電気的な相互作用によって、しばしば直径が５０ｎｍより大きい球状の複合体を形成する（非特許文献１）。これらの複合体はほとんどの場合、高い荷電によって細胞表面に会合し、エンドサイトーシスによって取り込まれる。それらは破裂するまでのエンドソーム酸性化の緩衝化（例えば、ポリエチレンイミン、スターバーストデンドリマー（非特許文献２）またはクロロキンの添加による）、または膜活性化物質、脂質、または親油性ペプチドの作用のいずれかによって、エンドソームから出る。しかしこれらの複合体は次の細胞分裂に際してはじめて細胞核に達し、そこで核酸放出後に望まれた作用を展開することができる。
【０００４】
分裂依存性の核内移行の問題は、特に、シグナルマスキングおよび非特異的タンパク質結合の問題が考慮されれば、ＮＬＳペプチド（ＮＬＳ＝ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ＝核局在化シグナル）の使用によって、回避することができる（ＷＯ  ００／４０７４２）。
【０００５】
（米国特許  第５４６８６２９号）では、ｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）の細胞へのトランスフェクションのための、ＲｅｃＡ−タンパク質の使用および別のＲｅｃＡと機能的相同性をもつタンパク質の使用可能性が記載されている。ＲｅｃＡタンパク質は、明らかに触媒作用によって、細胞DNAと導入されたｓｓDNAとの相同組換え過程を、DNA鎖対合およびその後のDNA鎖交換反応に影響を与えることによって、サポートする。ここで使用される複合体は、最大７００ヌクレオチドのｓｓＤＮＡおよびＲｅｃＡタンパク質を含み、「RecAにコートされた」複合体と称される。このようなｓｓＤＮＡ−タンパク質複合体は、ＡＴＰ−γ−Ｓ及びＲｅｃＡ存在下のＤＮＡによって形成され、同時に安定したらせん状のシナプス前フィラメントが形成される。これらの複合体は、例えばセルライン、すなわち特に形質転換細胞のような、活発に細胞分裂している細胞のトランスフェクションにおいて使用される。
【０００６】
【非特許文献１】
タング（Ｔａｎｇ），Ｍ．Ｘ．、およびゾーカ（Ｓｚｏｋａ），Ｆ．Ｃ．著「陽イオンポリマーとＤＮＡの相互作用および得られる複合体の形態に対するポリマー構造の影響」、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１９９７年、第４巻、ｐ．８２３−８３２
【非特許文献２】
クコワスカ−ラタロ（Ｋｕｋｏｗｓｋa−Ｌａｔａｌｌｏ），Ｊ．Ｆ．、ビエリンスカ（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ），Ａ．Ｕ．、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ），Ｊ．、スピンドラー（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ），Ｒ．、トマリア（Ｔｏｍａｌiａ），Ｄ．Ａ．、およびベーカー（Ｂａｋｅｒ），Ｊ．Ｒ．Ｊｒ．著「スターバーストポリアミドアミンデンドリマーを用いた哺乳動物の細胞への遺伝子材料の効率的な輸送」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ   Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９６年、第９３巻、ｐ．４８９７−４９０２
【非特許文献３】
ビアンコ（Ｂｉａｎｃｏ），Ｐ．Ｒ．、トレーシー（Ｔｒａｃｙ），Ｒ．Ｂ．、およびコワルチェコウスキー（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ）、Ｓ．Ｃ．著「ＤＮＡ鎖交換反応タンパク質：生化学的および物理学的比較」、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、１９９８年、第３巻、ｐ．Ｄ５７０−６０３
【非特許文献４】
フェルドヘル（Ｆｅｌｄｈｅｒｒ），Ｃ．Ｍ．、およびアキン（Ａｋｉｎ），Ｄ．著「核孔複合体における輸送ゲートの位置」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、１９９７年、第１１０巻（Ｐｔ２４）、ｐ．３０６５−３０７０
【非特許文献５】
山田（Ｙａｍａｄａ），Ｍ．、および笠松（Ｋａｓａｍａｔｓｕ），Ｈ．著「シミアンウィルス４０の核ターゲティングにおける核孔複合体の役割」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９３年、第６７巻、ｐ．１１９−１３０
【非特許文献６】
ジ  カプア（Ｄｉ  Ｃａｐｕａ），Ｅ．、エンゲル（Ｅｎｇｅｌ），Ａ．、スタシアーク（Ｓｔａｓｉａｋ），Ａ．、およびコラー（Ｋｏｌｌｅｒ），Ｔ．著「電子顕微鏡によるｒｅｃＡタンパク質と二重鎖ＤＮＡとの間の複合体の特徴づけ」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９８２年、第１５７巻、ｐ．８７−１０３
【非特許文献７】
デルケイル（Ｄｅｌｃａｙｒｅ），Ａ．Ｘ．、サラス（Ｓａｌａｓ），Ｆ．、マートゥル（Ｍａｔｈｕｒ），Ｓ．、コバッツ（Ｋｏｖａｔｓ），Ｋ．、ロッツ（Ｌｏｔｚ），Ｍ．、およびレムハート（Ｌｅｍｈａｒｄｔ），Ｗ．著「エプスタイン・バーウィルス／補体Ｃ３ｄ受容体はインターフェロンα受容体である」、Ｅｍｂｏ  Ｊ、１９９１年、第１０巻、ｐ．９１９−９２６
【非特許文献８】
メンガウド（Ｍｅｎｇａｕｄ），Ｊ．、オハヨン（Ｏｈａｙｏｎ），Ｈ．、ゴウノン（Ｇｏｕｎｏｎ），Ｐ．、メージ（Ｍｅｇｅ），Ｒ．Ｍ．、およびコサート（Ｃｏｓｓａｒｔ），Ｐ．著「Ｅ−カドヘリンは、リステリア菌の上皮細胞へ侵入に必要な表面タンパク質であるインターナリンの受容体である」、Ｃｅｌｌ、１９９６年、第８４巻、ｐ．９２３−９３２
【非特許文献９】
ハルボトル（Ｈａｒｂｏｔｔｌｅ），Ｒ．Ｐ．、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ），Ｒ．Ｇ．、ハート（Ｈａｒｔ），Ｓ．Ｌ．、ラドホフ（Ｌａｄｈｏｆｆ），Ａ．、マッケイ（ＭｃＫａｙ），Ｔ．、ナイト（Ｋｎｉｇｈｔ），Ａ．Ｍ．、ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ），Ｅ．、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ａ．Ｄ．、およびクーテル（Ｃｏｕｔｅｌｌｅ），Ｃ．著「ＲＧＤーオリゴリシンペプチド：インテグリン介在性遺伝子輸送のための原型構造物」、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１９９８年、第９巻、ｐ．１０３７−１０４７
【非特許文献１０】
コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ），Ｌ．、ソーヤー（Ｓｅｗｙｅｒ），Ｇ．Ｊ．、ジャン（Ｚｈａｎｇ），Ｘ．Ｈ．、ガスタフソン（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ），Ｋ．、およびファブレ（Ｆａｂｒｅ），Ｊ．Ｗ．著「臓器移植におけるインテグリンをターゲットした非ウィルス性ＤＮＡベクターの輸送に重要な因子のインビトロ試験」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０００年、第６９巻、ｐ．１１６８−１１７６
【非特許文献１１】
ローゼンクランツ（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ），Ａ．Ａ．、ヤハメネフ（Ｙａｃｈｍｅｎｅｖ），Ｓ．Ｖ．、ヤンス（Ｊａｎｓ），Ｄ．Ａ．、セレブリャコバ（Ｓｅｒｅｂｒｙａｋｏｖａ），Ｎ．Ｖ．、ムラベフ（Ｍｕｒａｖ'ｅｖ），Ｖ．Ｉ．、ピータース（Ｐｅｔｅｒｓ），Ｒ．、およびソボレフ（Ｓｏｂｏｌｅｖ），Ａ．Ｓ．著「受容体介在性エンドサイトーシスおよびトランスフェクトしたＤＮＡ構造物の核移行」、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、１９９２年、第１９９巻、ｐ．３２３−３２９
【非特許文献１２】
フィーロ（Ｆｅｅｒｏ），Ｗ．Ｇ．、リー（Ｌｉ），Ｓ．、ローゼンブラット（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ），Ｊ．Ｄ．、シリアンニ（Ｓｉｒｉａｎｎｉ），Ｎ．、モルガン（Ｍｏｒｇａｎ），Ｊ．Ｅ．、パートリッジ（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ），Ｔ．Ａ．、ホァン（Ｈｕａｎｇ），Ｌ．、およびホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ），Ｅ．Ｐ．著「筋原細胞への受容体介在性遺伝子輸送のためのリガンドの選択と使用」、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１９９７年、第４巻、ｐ．６６４−６７４
【非特許文献１３】
ミドウ（Ｍｉｄｏｕｘ），Ｐ．、メンデス（Ｍｅｎｄｅｓ），Ｃ．、レグラン（Ｌｅｇｒａｎｄ），Ａ．、レイモンド（Ｒａｉｍｏｎｄ），Ｊ．、メイヤー（Ｍａｙｅｒ），Ｒ．、モンシニ（Ｍｏｎｓｉｇｎｙ），Ｍ．、およびロシュ（Ｒｏｃｈｅ），Ａ．Ｃ．著「ラクトシル化ポリ−Ｌ−リジンによって介在性される肝癌細胞への特異的遺伝子輸送」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９３年、第２１巻、ｐ．８７１−８７８
【非特許文献１４】
フォミナヤ（Ｆｏｍｉｎａｙａ），Ｊ．、およびウェルズ（Ｗｅｌｓ），Ｗ．著「キメラ多領域タンパク質によって介在される標的細胞特異的ＤＮＡ輸送。新規な非ウィルス性遺伝子輸送システム」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９６年、第２７１巻、ｐ．１０５６０−１０５６８
【非特許文献１５】
大野（Ｏｈｎｏ），Ｋ．、澤井（Ｓａｗａｉ），Ｋ．、飯島（Ｉｉｊｉｍａ），Ｙ．、レビン（Ｌｅｖｉｎ），Ｂ．、およびメルエロ（Ｍｅｒｕｅｌｏ），Ｄ．「タンパク質ＡのＩｇＧ−結合ドメインを示すシンドビスウィルスベクターの細胞特異的ターゲティング」、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９７年、第１５巻、ｐ．７６３−７６７
【非特許文献１６】
シェーマン（Ｓｃｈｏｅｍａｎ），Ｒ．、ジュベール（Ｊｏｕｂｅｒｔ），Ｄ．、アリアッティ（Ａｒｉａｔｔｉ），Ｍ．、およびホートリー（Ｈａｗｔｒｅｙ），Ａ．Ｏ．著「ストレプトアビジンとの複合体をなすビオチン化トランスフェリンおよびビオチン化ポリリシンの効率性の高い輸送システムを用いた細胞への標的ＤＮＡ輸送に関する詳細検討」、Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ、１９９５年、第２巻、ｐ．５０９−５１６
【非特許文献１７】
サーデジ（Ｓｕｒｄｊｅ），Ｐ．、およびヤコブス−ロレナ（Ｊａｃｏｂｓ−Ｌｏｒｅｎａ），Ｍ．著「遺伝子のタンパク質コード領域のエピトープ標識法」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９４年、第１７巻、ｐ．５６０−５６５
【非特許文献１８】
エバン（Ｅｖａｎ），Ｇ．Ｉ．、ルイス（Ｌｅｗｉｓ），Ｇ．Ｋ．、ラムセイ（Ｒａｍｓａｙ），Ｇ．、およびビショップ（Ｂｉｓｈｏｐ），Ｊ．Ｍ．著「ヒトｃ−ｍｙｃ  原癌遺伝子産物に対して特異的なモノクローナル抗体の単離」、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９８５年、第５巻、ｐ．３６１０−３６１６
【非特許文献１９】
ソーレン（Ｔｈｏｒｅｎ），Ｐ．Ｅ．、ペルソン（Ｐｅｒｓｓｏｎ），Ｄ．、カールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ），Ｍ．、およびノルデン（Ｎｏｒｄｅｎ），Ｂ．著「アンテナペディアペプチドペネトラチンは脂質二重層を通過して移動する−最初の直接的観察」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｆｔ、２０００年、第４８２巻、ｐ．２６５−２６８
【非特許文献２０】
ワイスバート（Ｗｅｉｓｂａｒｔ），Ｒ．Ｈ．、ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ），Ｒ．、フー（Ｈｕｈ），Ｂ．、ザック（Ｚａｃｋ），Ｄ．Ｊ．、および西村（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ），Ｒ．著「生細胞を貫通する抗体を用いた一次ラット皮質ニューロンの新規なタンパク質トランスフェクション」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００年、第１６４巻、ｐ．６０２０−６０２６
【非特許文献２１】
ポーガ（Ｐｏｏｇａ），Ｍ．、ソーメッツ（Ｓｏｏｍｅｔｓ），Ｕ．、ハルブリンク（Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ），Ｍ．、バルナ（Ｖａｌｋｎａ），Ａ．、サール（Ｓａａｒ），Ｋ．、レザエイ（Ｒｅｚａｅｉ），Ｋ．、カール（Ｋａｈｌ），Ｕ．、ハオ（Ｈａｏ），Ｊ．Ｘ．、シュー（Ｘｕ），Ｘ．Ｊ．、ビッセンフェルド−ハイリン（Ｗｉｓｓｅｎｆｅｌｄ−Ｈａｉｌｉｎ），Ｚ．、ら著「細胞貫通性ＰＮＡ構造物はガラニン受容体レベルを調節し、生体内の疼痛伝達を緩和する」、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９８年、第１６巻、ｐ．８５７−８６１
【非特許文献２２】
プロボダ（Ｐｒｏｖｏｄａ），Ｃ．Ｊ．、およびリー（Ｌｅｅ），Ｋ．Ｄ．著「細菌孔形成溶血素および高分子のサイトゾル輸送におけるそれらの使用」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２０００年、第４１巻、ｐ．２０９−２２１
【非特許文献２３】
シュタインハウアー（Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ），Ｄ．Ａ．、ウォートン（Ｗｈａｒｔｏｎ），Ｓ．Ａ．、スケール（Ｓｋｅｈｅｌ），Ｊ．Ｊ．、およびワイリー（Ｗｉｌｅｙ），Ｄ．Ｃ．著「インフルエンザウィルス血球凝集素の融合ペプチド変異体の膜融合活性の研究」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９５年、第６９巻、ｐ．６６４３−６６５１
【非特許文献２４】
ザウナー（Ｚａｕｎｅｒ），Ｗ．、ブラース（Ｂｌａａｓ），Ｄ．、キュヒラー（Ｋｕｅｃｈｌｅｒ），Ｅ．、およびワグナー（Ｗａｇｎｅｒ），Ｅ．著「トランスフェクション複合体のライノウィルス介在性エンドソーム放出」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９５年、第６９巻、ｐ．１０８５−１０９２
【非特許文献２５】
ホン（Ｈｏｎｇ），Ｓ．Ｓ．、ゲイ（Ｇａｙ），Ｂ．、カラヤン（Ｋａｒａｙａｎ），Ｌ．、ダバウバレ（Ｄａｂａｕｖａｌｌｅ），Ｍ．Ｃ．、およびボウランガー（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ），Ｐ．著「組換えアデノウィルスペントンベースの細胞の取り込みおよび核輸送」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９年、第２６２巻、ｐ．１６３−１７７
【非特許文献２６】
ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ），Ｅ．著「非ウィルス性遺伝子輸送のための膜活性ペプチドの使用」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅ  Ｒｅｖ、１９９９年、第３８巻、ｐ．２７９−２８９
【非特許文献２７】
パック（Ｐａｃｋ），Ｄ．Ｗ．、プットナム（Ｐｕｔｎａｍ），Ｄ．、およびランガー（Ｌａｎｇｅｒ），Ｒ．著「遺伝子輸送のためのイミダゾール含有エンドソーム溶解性バイオポリマーのデザイン」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０００年、第６７巻、ｐ．２１７−２２３
【非特許文献２８】
リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ），Ｓ．、フェルッチ（Ｆｅｒｒｕｔｉ），Ｐ．、およびダンカン（Ｄｕｎｃａｎ），Ｒ．著「潜在的なエンドソーム溶解性ポリマーとしてのポリ（アミドアミン）類：インビトロ評価と健常動物および腫瘍を有している動物における体内分布」Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ、１９９９年、第６巻、ｐ．３９１−４０４
【非特許文献２９】
ワン（Ｗａｎｇ），Ｐ．、パレーゼ（Ｐａｌｅｓｅ），Ｐ．、およびオニール（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ），Ｒ．Ｅ．著「インフルエンザウィルス核タンパク質ＮＰ上のＮＰＩ−１／ＮＰＩ−３（カリオフェリンα）結合部位は非従来的な核局在化シグナルである」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９７年、第７１巻、ｐ．１８５０−１８５６
【非特許文献３０】
ノイマン（Ｎｅｕｍａｎｎ），Ｇ．、カストルッチ（Ｃａｓｔｒｕｃｃｉ），Ｍ．Ｒ．、および川岡（Ｋａｗａｏｋａ），Ｙ．著「インフルエンザウィルス核タンパク質の核内移行と核外移行」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９９７年、第７１巻、ｐ．９６９０−９７００
【非特許文献３１】
ボウリカス（Ｂｏｕｌｉｋａｓ），Ｔ．著「核内局在化シグナル（ＮＬＳ）」Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ、１９９３年、第３巻、ｐ．１９３−２２７
【非特許文献３２】
ボウリカス（Ｂｏｕｌｉｋａｓ），Ｔ．著「タンパク質リン酸化酵素およびサイクリンの核内移行」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９６年、第６０巻、ｐ．６１−８２
【非特許文献３３】
ボウリカス（Ｂｏｕｌｉｋａｓ），Ｔ．著「ＤＮＡ修復タンパク質の核内移行」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９７年、第１７巻、ｐ．８４３−８６３
【非特許文献３４】
エロウズ（Ｅｌｌｏｕｚｅ），Ｃ．、セルマン（Ｓｅｌｍａｎｅ），Ｔ．、キム（Ｋｉｍ），Ｈ．Ｋ．、チュイテ（Ｔｕｉｔｅ），Ｅ．、ノルデン（Ｎｏｒｄｅｎ），Ｂ．、モルテンセン（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ），Ｋ．、および高橋（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）、Ｍ．著「ＤＮＡ結合および不活性ヌクレオチドによるＲｅｃＡ−ＤＮＡ複合体のＲｅｃＡフィラメント解離のらせん状構造に対する影響における活性と不活性のヌクレオチド補助因子間の差異」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９９年、第２６２巻、ｐ．８８−９４
【非特許文献３５】
ナイト（Ｋｎｉｇｈｔ），Ｋ．Ｌ．、およびマクエンティー（ＭｃＥｎｔｅｅ），Ｋ．著「５'−ｐ−フルオロスルホニルベンゾイルアデノシンによる大腸菌由来のｒｅｃＡタンパク質のＡＴＰ結合部位におけるチロシン残基の親和標識」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９８５年、第２６０巻、ｐ．１０１７７−１０１８４
【非特許文献３６】
モジッグ（Ｍｏｓｉｇ），Ｇ．著「Ｔ４ファージ増殖における組換えの基本的役割」Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、１９８７年、第２１巻、ｐ．３４７−３７１
【非特許文献３７】
ザイツ（Ｓｅｉｔｚ），Ｅ．Ｍ．、ブロックマン（Ｂｒｏｃｋｍａｎ），Ｊ．Ｐ．、サンドラー（Ｓａｎｄｌｅｒ），Ｓ．Ｊ．、クラーク（Ｃｌａｒｋ），Ａ．Ｊ．、およびコワルチェコウスキー（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ），Ｓ．Ｃ．著「ＲａｄＡタンパク質はＤＮＡ鎖交換反応を触媒する古細菌ＲｅｃＡタンパク質相同体である」、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１９９８年、第１２巻、ｐ．１２４８−１２５３
【非特許文献３８】
ロカ（Ｒｏｃａ），Ａ．Ｉ．、およびコックス（Ｃｏｘ），Ｍ．Ｍ．著「ＲｅｃＡタンパク質：構造と機能」、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ、１９９０年、第２５巻、ｐ．４１５−４５６
【非特許文献３９】
カーリン（Ｋａｒｌｉｎ），Ｓ．、およびブロチール（Ｂｒｏｃｃｈｉｅｒｌ），Ｌ．著「タンパク質の構造および機能に関するＲｅｃＡ遺伝子の進化的保存」、Ｊ  Ｂａｃｔｒｏｒｉｏｌ、１９９６年、第１７８巻、ｐ．１８８１−１８９４
【非特許文献４０】
カリン（Ｋａｒｌｉｎ），Ｓ．、ウェインストック（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ），Ｇ．Ｍ．、およびブレンデル（Ｂｒｅｎｄｅｌ），Ｖ．著「ｒｅｃＡタンパク質配列の比較由来の細菌の分類」、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９９５年、第１７７巻、ｐ．６８８１−６８９３
【非特許文献４１】
サンドラー（Ｓａｎｄｌｅｒ），Ｓ．Ｊ．、サテン（Ｓａｔｉｎ），Ｌ．Ｈ．、サムラ（Ｓａｍｒａ），Ｈ．Ｓ．、およびクラーク（Ｃｌａｒｋ），Ａ．Ｊ．著「酵母菌のＲａｄ５１およびＤｍｃ１タンパク質に類似した推定上のタンパク質生成物を有する３つの始生代種由来のｒｅｃＡ様遺伝子」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９６年、第２４巻、ｐ．２１２５−２１３２
【非特許文献４２】
小川（Ｏｇａｗａ），Ｔ．、篠原（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ），Ａ．、鍋谷（Ｎａｂｅｔａｎｉ），Ａ．、池谷（Ｉｋｅｙａ），Ｔ．、ユー（Ｙｕ），Ｘ．、イーグルマン（Ｅｇｅｌｍａｎ），Ｅ．Ｈ．、および小川（Ｏｇａｗａ），Ｈ．著「真核生物におけるＲｅｃＡ様組換えタンパク質：ＲＡＤ５１遺伝子の機能および構造」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ、１９９３年、第５８巻、ｐ．５６７−５７６
【非特許文献４３】
ティヤガラジャン（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ），Ｂ．、パドゥア（Ｐａｄｕａ），Ｒ．Ａ．、およびキャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ），Ｃ．著「哺乳動物のミトコンドリアは相同性ＤＮＡ組換え活性を有する」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９６年、第２７１巻、ｐ．２７５３６−２７５４３
【非特許文献４４】
セルッティ（Ｃｅｒｕｔｔｉ），Ｈ．、オスマン（Ｏｓｍａｎ），Ｍ．、グランドーニ（Ｇｒａｎｄｏｎｉ），Ｐ．、およびヤーゲンドルフ（Ｊａｇｅｎｄｏｒｆ），Ａ．Ｔ．著「高等植物の色素体における大腸菌ＲｅｃＡタンパク質の相同体」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９２年、第８９巻、ｐ．８０６８−８０７２
【非特許文献４５】
バウマン（Ｂａｕｍａｎｎ），Ｐ．とウエスト（Ｗｅｓｔ），Ｓ．Ｃ．著「相同性組換えおよび二重鎖切断修復におけるヒトＲＡＤ５１タンパク質の役割」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ、１９９８年、第２３巻、ｐ．２４７−２５１
【非特許文献４６】
マッソン（Ｍａｓｓｏｎ），Ｊ．Ｙ．、デービス（Ｄａｖｉｅｓ），Ａ．Ａ．、ハジバゲリ（Ｈａｊｉｂａｇｈｅｒｉ），Ｎ．、バン  ダイク（Ｖａｎ  Ｄｙｃｋ），Ｅ．、ベンソン（Ｂｅｎｓｏｎ），Ｆ．Ｅ．、スタシアーク（Ｓｔａｓｉａｋ），Ａ．Ｚ．、スタシアーク（Ｓｔａｓｉａｋ），Ａ．、およびウエスト（Ｗｅｓｔ），Ｓ．Ｃ．著「減数分裂特異的リコンビナーゼｈＤｍｃ１は環状構造を形成し、ｈＲａｄ５１と相互作用する」、Ｅｍｂｏ  Ｊ、１９９９年、第１８巻、ｐ．６５５２−６５６０
【非特許文献４７】
グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ），Ｊ．、マクホフ（Ｍａｋｈｏｖ），Ａ、サンチャゴ−ララ（Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｌａｒａ），Ｌ、およびセトロウ（Ｓｅｔｌｏｗ），Ｐ．著「ＤＮＡと枯草菌由来のα／β型の小型酸溶解性胞子タンパク質間の相互作用の電子顕微鏡観察：タンパク質結合は協同的であり、ＤＮＡを硬化し、負の超らせんを誘導する」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、（１９９４年）、第９１巻、ｐ，８２２４−８２２８
【非特許文献４８】
リー（Ｌｅｅ），Ｃ．Ｋ．とナイプ（Ｋｎｉｐｅ），Ｄ．Ｍ．著「単純ヘルペスウイスルタンパク質ＩＣＰ８のＤＮＡ結合活性を試験するための免疫測定法」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、１９８５年、第５４巻、ｐ．７３１−７３８
【非特許文献４９】
ユー（Ｙｕ），Ｘ．、およびイーグルマン（Ｅｇｅｌｍａｎ），Ｅ．Ｈ．著「バクテリオファージＴ４ＵｖｓＸタンパク質により誘導されるＤＮＡ構造は、大腸菌ＲｅｃＡタンパク質により誘導される構造と同一のように見られる」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９９３年、第２３２巻、ｐ．１−４
【非特許文献５０】
ベトラム（Ｂｅｔｒａｍ）とガッセン（Ｇａｓｓｅｎ）著「遺伝子工学的方法」、グスタフ  フィッシャー（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｈｃｅｒ）出版、１９９１年、ｐ．２１２−２１３
【非特許文献５１】
カグノン（Ｃａｇｎｏｎ），Ｃ．、バルベルデ（Ｖａｌｖｅｒｄｅ），Ｖ．、およびマッソン（Ｍａｓｓｏｎ）、Ｊ．Ｍ．著「大腸菌の糖誘導性発現ベクターの新しいファミリー」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、１９９１年、第４巻、ｐ．８４３−８４７
【非特許文献５２】
アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ），Ｋ著「自由生存微生物におけるコドンプリファレンス」Ｍｉｃｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、１９９０年、５４、ｐ９８−２１０
【非特許文献５３】
シャガー（Ｓｃｈａｇｇｅｒ），Ｈ．、およびフォン  ヤゴウ（ｖｏｎ  Ｊａｇｏｗ），Ｇ．著「１〜１００ｋＤａの範囲のタンパク質を分離するためのトリシンナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動法」、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８７年、第１６６巻、ｐ．３６８−３７９。
【非特許文献５４】
プロウ（Ｐｌｏｗ），Ｅ．Ｆ．、ハース（Ｈａａｓ），Ｔ．Ａ．、ジャン（Ｚｈａｎｇ），Ｌ．、ロフタス（Ｌｏｆｔｕｓ），Ｊ．、およびスミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｊ．Ｗ．著「インテグリンへのリガンド結合」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０００年、第２７５巻、ｐ．２１７８５−２１７８８
【非特許文献５５】
バル（Ｂａｌ），Ｈ．Ｐ．、クロボチェク（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ），Ｊ．、ショーエン（Ｓｈｏｅｈｎ），Ｇ．、ルイグロック（Ｒｕｉｇｒｏｋ），Ｒ．Ｗ．、およびデューハースト（Ｄｅｗｈｕｒｓｔ），Ｓ．著「大腸菌からの可溶性５量体のアデノウィルスタイプ７ペントン精製およびインテグリン依存性遺伝子輸送システムの開発」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０００年、第２６７巻、ｐ．６０７４−６０８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、それによって細胞への取り込みの改良を可能にし、同時にトランスフェクション過程の制御を可能にする、あらゆる種類の細胞にあらゆる種類の核酸をトランスフェクションするための方法およびトランスフェクション試薬を提供することである。この目的のために、このトランスフェクション試薬はトランスフェクション過程中に十分に安定しており、目標区画においてトランスフェクションされた核酸が十分に放出されるのを保証しなければならない。
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
【０００８】
この課題は、本発明の方法によって解決される。その方法においては、トランスフェクションの１つまたは複数のステップに影響する少なくとも１つの機能的構成成分によってまずタンパク質を修飾する。次いでトランスフェクションされる核酸に修飾タンパク質を結合し、核酸およびタンパク質はフィラメント状の複合体を形成し、この複合体が最終的にトランスフェクションされる細胞に添加される。
【０００９】
さらに、この課題は、本発明のトランスフェクション試薬によって解決されるが、その場合には核タンパク質フィラメント形成能を有するタンパク質がトランスフェクションに影響する少なくとも１つの機能的構成成分によって修飾される。
【００１０】
１つまたは複数の同一または異なる追加の機能的構成成分によって、１つまたは複数の核タンパク質フィラメント（ＮＰＦ）を形成するタンパク質が修飾されることによって、複雑なトランスフェクション過程の個々のステップを、トランスフェクションされる核酸及び標的細胞に特有の、特に有効な方法で制御することができる。さらに、本発明による方法及びトランスフェクション試薬によって、公知の方法に対してトランスフェクション効率が明らかに向上する。
【００１１】
本発明によれば、NPF形成タンパク質が、特に、DNAの単なる保護以上の役割をする、機能群のモジュラー輸送システムとして、有利な方法で使用される。この複合体は、２つの点できわめて小さな空間サイズを示している。すなわち、フィラメント状であって、球状ではない点と、フィラメントごとに１個のみの核酸分子を含有する点である。輸送タンパク質ごとに少ないヌクレオチドという化学量論的比率につながるこの集合体によって、トランスフェクションに対する機能的シグナル密度が、球状の複合体よりもきわめて大きくなることが可能である。シグナル密度および様々なシグナルの組合せは、様々な機能を持つ輸送タンパク質および機能群を持たないタンパク質を混合することによって個別に調節可能であるため、本発明によるトランスフェクション試薬をモジュラーシステムとして様々なトランスフェクション条件に適応させることができる。さらに、小さな空間サイズおよび高いシグナル密度により、小さい分子に特有の内在性輸送システムを利用することも可能となる。そのフィラメント状の特徴、単純な構造、および調節可能なきわめて高いシグナル密度のために、本発明による方法、すなわち本発明によるトランスフェクション試薬により、例えば発現ベクターのような大きな核酸分子をも、内在性のメカニズムを利用して輸送することが可能になる。
【００１２】
例えば、追加の機能的構成成分をＮＰＦタンパク質に直接結合させ、またはスペーサー、すなわち機能を持たない分離ユニットを介して結合させることができる。このようなスペーサーは、ＮＰＦタンパク質と機能的構成成分との間に大きな距離をもたらし、これにより相互の立体障害が回避され、ＮＰＦタンパク質および機能的構成成分のよりよい空間的利用可能性が保証される。従って、本発明による試薬の構造により、機能的構成成分のマスキングが主として阻止される。
【００１３】
ＮＰＦ形成タンパク質は、核酸とともに、主として協同的結合によって核タンパク質フィラメントを形成し、その中でタンパク質と核酸がその大きさ、または直径が公知の球状のトランスフェクション試薬に比べ大幅に小さい複合体を形成する。このようなＮＰＦは、例えばＡＴＰ（アデノシン三リン酸）などのヌクレオシド三リン酸の存在下に、ＤＮＡ依存的ＡＴＰａｓｅであるＲｅｃＡファミリーのタンパク質によって形成され、例えば二本鎖ＤＮＡにおける３つの塩基当たり１個のタンパク質の密度で結合されている（非特許文献３）。この高いタンパク質密度により、酵素の作用可能部位が大幅に削減されるため、核酸の酵素加水分解に対して優れた保護が得られる。ＮＰＦは、複合体の十分な安定性を提供するだけでなく、例えば核において、輸送された核酸の十分な放出をも可能にする。ヌクレオシド三リン酸、例えば、ＡＴＰおよび／またはＧＴＰの、加水分解が不可能または困難な類似体、例えばＡＴＰ−γ−ＳまたはＧＴＰ−γ−Ｓなどの使用によって、ＲｅｃＡファミリーのようなＡＴＰ形成タンパク質によって形成されるＮＰＦがさらに安定化する可能性がある。
【００１４】
本発明によれば、ＮＰＦ形成能を有するタンパク質は誘導されたＮＰＦタンパク質をも包含する。例えば、融合タンパク質を製造することができる。さらに、ＮＰＦ形成タンパク質が本発明に必須の機能、核酸とＮＰＦの構造形成を維持できる限り、ＮＰＦ形成タンパク質を短縮または延長し、個々の部位またはアミノ酸を欠失、挿入、または化学的に修飾することができる。
【００１５】
本発明の特に有利な点は、もとからある核移行メカニズムの利用を可能にするＮＰＦの空間的構造である。トランスフェクション試薬の最大径は核孔の大きさによって規定され、きわめて長い核酸の場合にも限界を超えることはなく、すなわち、ＮＰＦはトランスフェクションされる核酸の長さに関係なくトランスフェクション試薬として使用することができる。核孔を通って輸送できる大きさの限界は、約２５ｎｍ（非特許文献４）または５０ｎｍ（ＳＶ４０−ウィルス）である（非特許文献５）。球状構造および／またはトランスフェクション構成成分ごとに非特異的にいくつもの核酸分子が結合する、従来のトランスフェクション試薬によって核膜通過が遮断されていた核酸は、本発明にかかるトランスフェクション試薬を使用することで、容易にそのような大きさの限界を下回ることができる。しかも、本発明によるトランスフェクション試薬の構造によってはじめて、使用されるＮＰＦ形成タンパク質に応じて１１ｎｍ以下の直径が可能となる。したがって、ＮＰＦタンパク質の使用によってフィラメント状に構成される構造は、数ｋｂの長さの長い核酸の輸送にも適している。したがって、本発明による方法および本発明によるトランスフェクション試薬は、大きなヌクレオチド配列の細胞のトランスフェクションのために特に好適である。好ましくは、本発明によるトランスフェクション試薬は、少なくとも７００個のヌクレオチドからトランスフェクションされる核酸を少なくとも１つ含有する。
【００１６】
本発明は、核酸のトランスフェクションのためにそれ自体で有利に使用し、または他のトランスフェクション方法および物質と組み合わせて使用することもできる。ＮＰＦ形成タンパク質の高い結合度合いは加水分解抵抗性を高め、ＮＰＦの小さな直径は、例えば核移行システムなど十分に小さな分子のみ利用できる内在性の細胞輸送系の利用を可能にする。さらに、細胞区画内、主に核内へトランスフェクションされる核酸の十分な放出が保証される。
【００１７】
本発明による「トランスフェクション試薬」なる用語は、トランスフェクションされる核酸をすでに含有する、核酸またはその誘導体の輸送媒体と理解される。本発明の趣旨におけるトランスフェクション試薬は、複雑なトランスフェクション過程の少なくとも１つの個別のステップを実行する。
【００１８】
本発明に関して「核タンパク質フィラメント」（ＮＰＦ）なる用語は、核酸類、または核酸誘導体と、非共有結合、主に協同的結合の結果として、好ましくは一つの核酸分子またはその誘導体を含むフィラメント状又は糸状の複合体を形成するタンパク質からなる分子構造を意味する。特に好ましくは、例えば、１本鎖または２本鎖ＤＮＡとＲｅｃＡから形成されるようならせん状の核タンパク質フィラメントである（非特許文献６）。
【００１９】
「トランスフェクションされる核酸」は、２本鎖または１本鎖ＤＮＡ、２本鎖または１本鎖のＲＮＡ、および１本鎖の末端を有する２本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または、加水分解抵抗性が高められたり（ペプチド核酸、PNA）、標的核酸への共有結合および／または修飾のために反応性分子群が導入されるなどした、化学的に修飾された核酸誘導体でありうる。トランスフェクション可能な核酸誘導体には、配列特異的に、または共有結合で結合したタンパク質によって修飾された核酸も含むものと理解される。本発明の好ましい核酸はＤＮＡ、特に２本鎖ＤＮＡである。ＮＰＦ形成タンパク質は、これまで主に１本鎖ＤＮＡとともに、例えば組換えのために使用された。しかし意外にも、本発明に関連して、多くのＮＰＦ形成タンパク質が適切な条件下において２本鎖ＤＮＡとも安定した複合体を形成し、本発明にしたがって２本鎖ＤＮＡのトランスフェクションにも使用できることがわかった。したがって、２本鎖ＤＮＡを有効にトランスフェクションする可能性において、本発明にはさらなる利点がある。
【００２０】
本発明の有利な具体例では、機能的構成成分によって修飾されたＮＰＦは、本来のＮＰＦ形成タンパク質またはその誘導体の修飾によって調製される。その場合の修飾はアミノ酸および／またはタンパク質ドメインの欠失または挿入によって行うことができる。修飾はアミノ酸および／または他の分子群の化学的変化によって、かつ／またはペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の分子をＮＰＦ形成タンパク質またはその誘導体へ化学的に結合させるによっても行うことができる。これらの修飾は、場合によりスペーサーを使用しながら行うことができる。
【００２１】
トランスフェクションの第１の障害物は、トランスフェクション複合体の細胞表面への会合である。したがって、本発明による方法およびトランスフェクション試薬の好ましい具体例では、複合体または試薬の細胞表面への会合をもたらす少なくとも１つの機能群で修飾されており、ＮＰＦ形成能を有する少なくとも１つのタンパク質を使用する。これは、１つのまたはほんのいくつかの細胞型に発現される、細胞型固有の表面構造への結合によって細胞特異的に行うことができ、または、例えば電荷相互作用によって非特異的に行うことができる。細胞表面の受容体、例えば、細胞への侵入のためのウィルスまたは細菌によって使われる受容体に結合する自然発生物質または合成的に調製される物質すべてを、細胞型特異的結合に使用することができる。その受容体には、例えば、エプスタインバーウィルス受容体ＣＤ２１（非特許文献７）またはリステリア菌受容体Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ（非特許文献８）がある。基質‐受容体結合を利用するほかの例は、多くの鉄を必要とする細胞におけるトランスフェリン受容体‐トランスフェリン、肝細胞におけるアジアログリコタンパク質受容体‐ガラクトース、例えば、ＲＧＤ（非特許文献９）またはモロシン（非特許文献１０）のようなインテグリン‐インテグリン結合ペプチド、または、例えばインスリン（非特許文献１１）、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子）またはインスリン様成長因子Ｉ（非特許文献１２）などのホルモン受容体に結合するホルモン、およびレクチンに結合するオリゴ糖（非特許文献１３）などである。同様に、細胞特異的抗体（非特許文献１４）、タンパク質Ａ、そのＩｇＧ−結合ドメイン（非特許文献１５）、およびストレプトアビジンと組み合わせたビオチン化タンパク質（細胞表面上においてビオチン化されたタンパク質またはビオチン化したモノクロナール抗体のいずれか）（非特許文献１６）が使用可能である。本発明に関しては、「エピトープ−標識」、すなわち一方ではエピトープ、つまり例えば、ＮＰＦ形成タンパク質またはその誘導体に結合され、または遺伝子工学によって融合されている、インフルエンザ血球凝集素（非特許文献１７）またはｃ−ｍｙｃ−タンパク質（非特許文献１８）の短いペプチドを認識し、他方では特異的な細胞表面構造を認識する二重特異性抗体の使用による細胞特異的トランスフェクションが特に適している。電荷相互作用による、トランスフェクション複合体の細胞非特異性相互作用においては、例えば正電荷を、例えば追加のアミノ酸（リシン、アルギニン；ヒスチジン）によって導入することができる。
【００２２】
本発明による方法およびトランスフェクション試薬の別の特に好ましい具体例では、機能的構成成分が複合体または試薬の細胞膜通過に、非エンドソーム通過をもたらすことが意図されている。非エンドソームの膜通過は、試薬が細胞質内で即座に利用可能であり、リソソームの加水分解活性の環境にはさらされないという利点を有する。このような膜通過は膜活性分子によって達成することができる。これらの分子は、例えばウィルス性ペプチド、例えばＨＩＶ−tａｔ、ＶＰ２２、ＨＢＶ表面抗原；例えばアンテナペディアのホメオドメイン（非特許文献１９）、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、ＨＯＸＡ−５など転写因子のペプチド；サイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２のペプチド；細胞シグナル配列、例えばカポジ線維芽細胞成長因子のペプチド、生細胞を貫通するモノクローナル抗体、例えばｍａｂ  ３Ｅ１０（非特許文献２０）、合成またはキメラペプチド、例えば両親媒性モデルペプチドまたは輸送体（非特許文献２１）など主に脂肪性または両親媒性である自然発生ペプチド、修飾ペプチド、または合成ペプチドでありうる。
【００２３】
さらに、本発明の有利な具体例では、複合体または試薬のエンドソーム／リソソームからの放出をもたらす、少なくとも１つの本発明による機能的構成成分を使用している。細胞膜の通過は、例えばエンドサイトーシスによって行うことができる。エンドサイトーシスの後、核タンパク質複合体がエンドソームから放出される必要がある。このために、エンドソームを溶解する活性がある物質をすべて使用することができる。それらの物質は、例えば細菌またはウィルス由来のペプチド、その誘導体もしくは合成類似体、または当業者には公知の他の合成物質でありうる。細菌由来のエンドソーム溶解物質として挙げられるのは、例えば、ストレプトリシンＯ、ニューモリシン、ブドウ球菌α−トキシン、リステリオリシンＯである（非特許文献２２）。ウィルス性ペプチドは、例えばインフルエンザウィルスのＮ−末端血球凝集素ＨＡ−２−ペプチド（非特許文献２３）、ライノウィルスＨＲＶ２のＶＰ−１−タンパク質のＮ−末端（非特許文献２４）、またはアデノウィルスのキャプシド構成成分（非特許文献２５）である。合成物質として挙げられるのは、例えば両親媒性のペプチド（ＧＡＬＡ、ＫＡＬＡ、ＥＧＬＡ、ＪＴＳ１）（非特許文献２６）、またはイミダゾール修飾ポリマー（非特許文献２７）およびポリ−アミドアミン修飾ポリマー（非特許文献２８）である。
【００２４】
すべてのトランスフェクション試薬にとって特に障害物となるのは、通常は細胞分裂に依存して起こり、あるいは、細胞刺激後に起こる核内への移行である。したがって、本発明の特に有利な具体例では、細胞核へ複合体または試薬の輸送をもたらす機能的構成成分を用いることが意図されている。核移行にとって不可欠なのは、第一に核孔径の限定であり、第二に輸送用に使用されるシグナル分子である。本発明での核移行用のシグナルとしては、核受容体に結合する核リガンドが使用される。特に適した核リガンドはＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ、核局在化シグナル）または他の核移行システムの構成成分である。核局在化シグナルとして特に使用に好ましいのは、それ自体および／またはその側にある領域が正電荷の過剰をほとんど示さないか、全く示さないようなシグナルである。なぜなら、過剰帯電は非特異的な核酸の結合をまねき、その結果、シグナルをマスクしてしまうからである。ペプチドの総電荷が側にある陰荷電アミノ酸によって少なくともほぼ調整できる場合、いわゆる典型的ＮＬＳの増強された配列が好ましい。これらのアミノ酸はペプチド／タンパク質中のこれらの位置にもとから存在することもあり、または構造上の考慮に基づき同位置に導入することができる。いわゆる非典型的ＮＬＳも使用することができる。これは例えば、正電荷の大過剰を示さず、非典型的な輸送路を介して核に達する、インフルエンザウィルスの「核タンパク質」由来のＮＬＳ（（非特許文献２９）および、（非特許文献３０））、またはヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ａ１タンパク質由来のＭ９配列などである。本発明の具体例を実施するために使用できる完全ではないが優れたＮＬＳのレビューを、Ｔ．ボウリカス（Ｂｏｕｌｉｋａｓ）（非特許文献３１、３２、および３３）が示している。ほぼ中性電荷配列は、例えばそれにもともとあるか、または人工的に導入される陰電荷アミノ酸をそばに有するＳＶ４０ウィルスのラージＴ−抗原由来のＮＬＳを含む（（ＷＯ  ００／４０７４２）も参照）。
【００２５】
したがって、本発明の特別の利点は、分裂していない、または分裂活性の弱い真核生物の細胞、特に真核生物の一次細胞における、核酸のトランスフェクションが明らかに改善されることにある。これらの細胞こそが、例えば、血液検体または組織生検によって体から直接取り出され、専門家にとって決定的な意義があるため、その生物学的および医学的な情報価値は依然失われていない。ヒトゲノムのほぼ完全な解読の分析が期待されるとともに、細胞システムにおいて調査される遺伝子の特異的発現こそが、最終的に、十分に生理学的に関連性のある、可能な技術的適応性の明らかな証拠を与えると思われる。さらに、一次細胞のトランスフェクションは、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の非ウィルス性遺伝子療法の重要な前提である。
【００２６】
本発明の有利な具体例において、本発明による方法およびトランスフェクション試薬はそれぞれ、異なる機能をもついくつかの機能的構成成分で修飾された核タンパク質フィラメント形成能を有する少なくとも１つのタンパク質、および／または、異なる機能をもつタンパク質で修飾された異なるタンパク質を包含しうる。本発明によるトランスフェクション試薬は、上述したように、ＮＰＦ形成能を有する多数のタンパク質またはその誘導体によって、本来の、または機能的に修飾された形で実現する。ＮＰＦ形成能を有する１つのみまたはいくつかの異なるタンパク質を使用でき、これらはトランスフェクション特異的な要求に応じて、同じ機能または異なる機能をもつ、１つまたは複数の機能的構成成分で修飾することができる。意図している目標に応じて、使用者はこのようにして、さまざまなモジュールを集合させることができる。このことは、トランスフェクション方法をトランスフェクションすべき核酸および目的細胞に最適に適合させるために、同一、または異なった機能を持つ、修飾されていない、または修飾されたＮＰＦタンパク質が選択されうるモジュラーシステムを引き起こす。
【００２７】
本発明の特に有利な具体例では、タンパク質は多くの機能的構成成分を結合されていることが意図されている。これによって、全体的なシグナル密度をさらにいっそう上昇させることができ、トランスフェクション効率の改善およびトランスフェクションのよりよい制御が可能となる。
【００２８】
ＮＰＦ形成タンパク質の多くは、補助因子としてＡＴＰのようなヌクレオシド三リン酸の存在下にＮＰＦ構造を形成する。ヌクレオシド三リン酸の添加は、ＮＰＦの安定化をもたらす。したがって、本発明による方法では、ＮＰＦ構造は、ヌクレオシド三リン酸および／またはその非加水分解性類似体によって、特にＡＴＰ（アデノシン三リン酸）および／またはＧＴＰ（グアノシン三リン酸）および／またはその非加水分解性類似体によって、有利な方法で形成され、または安定化することができる。これは光化学反応後の共有結合によっても起こりうる。非加水分解性ヌクレオシド三リン酸類似体は、例えばＡＴＰ−γ−Ｓ（アデノシン５'−Ｏ−３−チオ三リン酸）およびＧＴＰγＳ（グアノシン５'−Ｏ−３−チオ三リン酸）（非特許文献３４）である。光化学的反応後のＮＰＦ−ＡＴＰaseを修飾する可能なＡＴＰ−類似体は、８Ｎ３ＡＴＰ（８−アジドアデノシン５'−三リン酸）または５'ＦＳＢＡ（５'−ｐ−フルオロスルホニルベンゾイルアデノシン）（非特許文献３５）。
【００２９】
本発明による方法の有利な具体例では、これを例えばリポソーム介在性導入法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、免疫穿孔法、弾道法、陽イオン脂質、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、またはｐＨ−感受性ヒドロゲルを用いた導入法など、生物学的に活性をもつ分子の他の生物学的および／または化学的および／または物理学的なトランスフェクション方法と組み合せて使用することができる。このような導入法、特にエレクトロポレーション法は、例えば細胞の細胞質への侵入などトランスフェクション過程の個々のステップを有利に補助することができる。
【００３０】
本発明による好ましいトランスフェクション試薬は、ＮＰＦ形成タンパク質としてタンパク質ＲｅｃＡ、ＲａｄＡ、ＳｃＲａｄ５１、ＲＡＤ５１、ｈＤｍｃ１、ＳＡＳＰ、ＩＣＰ８、好ましくはＵｖｓＸ、特に好ましくはｈＲＡＤ５１、または列挙したタンパク質の少なくとも２つからなる混合物、またはこれらのタンパク質の１つまたは複数の誘導体を含む。本発明の具体例のためのＮＰＦ形成タンパク質は、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＲｅｃＡ、および例えばバクテリオファージＴ４由来のＵｖｓＸ（非特許文献３６）、古細菌由来のＲａｄＡ（非特許文献３７）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＳｃＲａｄ５１、哺乳動物由来のＲＡＤ５１、および特にヒト由来のｈＲａｄ５１など、ウィルス、原核生物、および真核生物由来のその機能的相同体である。ＲｅｃＡに対する相同タンパク質は、少なくとも６０種類の細菌種（非特許文献３８）、（非特許文献３９）、（非特許文献４０）、始原菌（非特許文献４１）、検査されたすべての真核生物（非特許文献４２）のほか、ミトコンドリア（非特許文献４３）およびプラスチド（非特許文献４４）において検出されている。ＲｅｃＡおよびその相同体は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡとともに、直径約１１ｎｍのらせん状のＮＰＦを形成する。ＲｅｃＡの結合は協同的に行われ、ＤＮＡ−Ｈｅｌｉｘを部分的にほどく。ＲｅｃＡ、ＵｖｓＸ、ＳｃＲａｄ５１、およびｈＲａｄ５１は、二本鎖ＤＮＡの場合は、モノマー当たり３塩基対、一本鎖ＤＮＡの場合は、モノマー当たり３〜６個のヌクレオチドの量的関係で結合してＮＰＦを形成する（（非特許文献３）および（非特許文献４５））。２本鎖ＤＮＡと集積タンパク質環の直鎖状配列からなるフィラメントを形成する減数分裂特異的リコンビナーゼｈＤＭＣ１も好ましい（非特許文献４６）。さらに、桿菌種およびクロストリジウム種の胞子由来のＳＡＳＰタンパク質（小型酸溶解性胞子タンパク質）のグループも好ましい。ＳＡＳＰも２本鎖ＤＮＡに結合し、直径が約６．６ｎｍのらせん状のＮＰＦを形成する（非特許文献４７）。例えば、単純ヘルペス由来のタンパク質ＩＣＰ８などの１本鎖および／または２本鎖ＤＮＡフィラメントを形成しうるウィルス性タンパク質も、好ましいＮＰＦ形成タンパク質である（非特許文献４８）。
【００３１】
ＮＰＦ形成タンパク質ＵｖｓＸ、Ｒａｄ５１、およびＲｅｃＡと二本鎖ＤＮＡが完全に結合すると、３塩基対あたりこれらのタンパク質の１つのモノマーが結合するという化学量論が示された（非特許文献３）。例えば、ＵｖｓＸについては、このような完全な結合は、使用される結合バッファー、使用される核酸の高次構造、および温度に応じて、３〜５倍の過剰量のタンパク質を用いて達成することができ（非特許文献４９）、枯草菌由来のα／β型ＳＡＳＰでは、タンパク質：ＤＮＡ比が約５：１の場合に達成することができる（非特許文献４７）。本発明において、核酸とタンパク質の比率は出来る限り完全であることが特に好ましい。これは好ましいＮＰＦ形成タンパク質それぞれに対して決まっている。しかし、特定のＮＰＦ形成タンパク質に対しては、核酸が結合できる最大量を下回り、不十分であることも本発明において可能である。ＮＰＦ形成タンパク質に対して核酸の結合量が少ないのが好ましいのは、例えば、トランスフェクションのあるステップに、さらにＤＮＡ結合タンパク質が使用される場合、またはＮＰＦ形成タンパク質に対する核酸の結合が完全であるのを好まない特殊なときに、バッファーの条件を選択しなければならない場合である。
【００３２】
本発明によれば、ＮＰＦ形成タンパク質は、天然のＮＰＦ形成タンパク質およびその誘導体を含むと解釈される。ＮＰＦ形成タンパク質の誘導体を、当業者は、まず、組換えタンパク質の追加のアミノ酸配列またはタンパク質ドメインの欠失または挿入による修飾、および／または既存の分子群の化学的修飾による機能群の導入、および／またはタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または他の分子の化学的カップリングと理解する。
【００３３】
本発明によるトランスフェクション試薬は、ヒトおよび動物の遺伝子療法による治療のための医薬品の調製にも有利な方法で使用することができる。治療的に有用な核酸は、本発明によるトランスフェクション試薬の形で、一次細胞や複雑なトランスフェクション方法にも使用可能となる。
【００３４】
本発明の別の態様は、場合により通常の助剤および賦形剤とともに、本発明によるトランスフェクション試薬を含有する医薬品の調製に関する。
【００３５】
本発明の別の態様は、核酸の細胞へのトランスフェクションに適しており、少なくとも１つの本発明によるＮＰＦ形成タンパク質を含み、および少なくとも１つの本発明による機能的構成成分に加えて、以下の構成成分、すなわち、
ａ）ヌクレオシド三リン酸および／またはヌクレオシド三リン酸類似体
ｂ）少なくとも１つのトランスフェクションされる核酸
ｃ）助剤および添加剤
の少なくとも１つを包含するキットに関する。
【００３６】
かかるキットは、専門家のさまざまな需要に個別に適応させることができる。例えば、特定のＮＰＦ、特定のＮＰＦ修飾、または個々の助剤や添加剤を選択することによって、特定の核酸、目的細胞、安定性の要求に対して最適化することができる。タンパク質には機能的構成成分がすでに添加され、またはタンパク質または機能的構成成分がキット内に分離して含まれることも可能である。
【００３７】
本発明の別の態様は、細胞スクリーニング、特に、細胞分裂が不活発または活性が弱い細胞、一次細胞、および寿命が限られた他の細胞におけるトランスフェクション試薬の発現物質の活性化剤または阻害剤の同定のための細胞スクリーニングのための本発明によるトランスフェクション試薬の使用に関する。このようなスクリーニングは、製薬業における活性物質の発見において、有効または無効な標的タンパク質の活性化剤および阻害剤を同定するための基本的な方法である。これらのスクリーニング方法は主に、外来核酸がステイブルにトランスフェクションされた細胞が潜在的な阻害剤および／または活性化剤にさらされ、細胞の生理機能に対するその影響を、場合により比較細胞と比較して決定されるように設定される。本発明によるトランスフェクション試薬は、活性化剤／阻害剤の添加直前に、細胞分裂が不活性、またはほんの弱い活性しかない細胞、一次細胞、および寿命が限られた他の細胞に外来核酸を導入し、こうしてこれらの細胞を試験細胞として使用できるようにすることに適している。
【００３８】
本発明の別の態様は、生理学的に活性のある核酸の同定のための本発明によるトランスフェクション試薬の使用に関する。これは特に、科学及び薬学の専門団体によって利用可能であるゲノムデータの迅速かつ生理学的に関連のある評価にとって重要である。本発明によるトランスフェクション試薬によるトランスフェクションは細胞分裂および／またはエンドサイトーシスとは無関係であるので、トランスフェクションから分析までの時間が大幅に短縮される。これはかなり高い試験処理量を可能にする。トランスフェクションが困難な細胞や分裂活性のない細胞さえも、本発明によるトランスフェクション試薬によって使用できるようになる。こうして達成されるトランスフェクション、および対照細胞と比較した変化の生理学的評価により、生理学的に活性のある核酸の同定が可能となる。
【００３９】
略語：
ドゥーデンにおいて用いられる略語以外に、以下の略語を使用した：
ＡＭＰ−ＰＣＰ        アデニリル−（β，γ−メチレン）−ジホスホン酸塩
ＡＭＰ−ＰＮＰ        Ｓ'−アデニリルイミド−二リン酸塩
ＤＥＡＥ              ジエチルアミノエタン
ＤＮＡ                デオキシリボ核酸
ｄＹＴ                ２×ＹＴ培地
ＦＡＣＳｃａｎ        蛍光活性化セルスキャニング
ＦＣＳ                ウシ胎児血清
ＦＬ                  蛍光
ＦＳＣ                前方散乱
ＧＭＰ−ＰＮＰ        Ｓ'−グアニリルイミド−ジホスホン酸塩
ＧＴＰ                グアノシン三リン酸
Ｈ６                  ヒスチジン−六量体
Ｉｇ                  免疫グロブリン
ｋｂ                  キロベース
ｍｌ                  ミリリットル
ｍＭ                  ミリモラー
ｍｓｅｃ              ミリ秒
ＮＣＢＩ              国立バイオテクノロジー情報センター
ｎｇ                  ナノグラム
ｎｍ                  ナノモラー
ＰＢＳ                リン酸緩衝食塩水
ＰＣＲ                ポリメラーゼ連鎖反応
Ｐi                   リン酸二水素ナトリウム／リン酸水素二ナトリウム
ＲＮＡ                リボ核酸
ＲＰＭＩ              ロスウェルパーク記念研究所
ＳＤＳ                ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＶ４０              シミアンウィルス４０
ＴＡＥ                トリス酢酸エチレンジアミン４酢酸
Ｕ／ｍｇ              単位／ミリグラム
ｒｐｍ                毎分回転数
ZIバッファー        細胞注入緩衝液
μｇ                  マイクログラム
μｌ                  マイクロリットル
【実施例】
【００４０】
以下の実施例は本発明の詳細な説明であるが、例として表された材料および方法に本発明を限定することはない。
【００４１】
（実施例１）
ＮＰＦ形成タンパク質としての組換えＵｖｓＸの調製
ＮＰＦ形成タンパク質としては、タンパク質ＵｖｓＸＨ６、ＵｖｓＸＨ６−２、Ｈ６ＵｖｓＸ、およびＨ６ＵｖｓＸ−２を使用した（図１を参照）。
【００４２】
タンパク質の構造：
ＵｖｓＨ６（４００アミノ酸）：
アミノ酸１−３９１：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸１−３９１）、アミノ酸３９２−３９４：アミノ酸Ｇ３９２ＧＳ３９４のリンカー、アミノ酸３９５−４００：ニッケル−キレート−親和性クロマトグラフィによる精製のためのＨ３９５ＨＨＨＨＨ４００、アミノ酸置換：Ｌ４３→Ｐ。
【００４３】
ＵｖｓＨ６−２（４０３アミノ酸）：
アミノ酸１−３９１：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸１−３９１）、アミノ酸３９２−３９４：アミノ酸Ｓ３９２ＹＳ３９４のリンカー、アミノ酸３９５−４００：Ｈ３９５ＨＨＨＨＨ４００、アミノ酸４０１−４０３：アミノ酸Ｍ４０１ＹＳ４０３のＣ末端。
【００４４】
Ｈ６ＵｖｓＸ（４０４アミノ酸）：
アミノ酸１−４：アミノ酸Ｍ１ＳＹＳ４のＮ−末端、アミノ酸５−１０：Ｈ５ＨＨＨＨＨ１０、アミノ酸１１−１３：アミノ酸Ｓ１１ＹＧ１３のリンカー、アミノ酸１４−４０４：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸  １−３９１）、アミノ酸置換：Ｑ３４０→Ｌ。
【００４５】
Ｈ６ＵｖｓＸ−２（４０４アミノ酸）：
アミノ酸１−４：アミノ酸Ｍ１ＧＹＳ４のＮ−末端、アミノ酸５−１０：Ｈ５ＨＨＨＨＨ１０、アミノ酸１１−１３：アミノ酸Ｓ１１ＹＧ１３のリンカー、アミノ酸１４−４０４：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸  １−３９１）。
【００４６】
発現プラスミドのクローニング
適切な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞における上記タンパク質の発現のために、ｌａｃプロモーターの制御下にＵｖｓＸＨ６、ＵｖｓＸＨ６−２、Ｈ６ＵｖｓＸ、またはＨ６ＵｖｓＸ−２のコーディング配列を含有するプラスミドを構成した（ｐＥｘＨ−ＵｖｓＸＨ６、ｐＥｘＨ−ＵｖｓＸＨ６−２、ｐＥｘＨ−Ｈ６ＵｖｓＸ、およびｐＥｘＨ−Ｈ６ＵｖｓＸ−２、図１を参照）。これらのプラスミドは２つのＰＣＲ生成物の連結によって調製した。第１のＰＣＲ生成物はｐＭＣＳ５（ＭｏＢｉＴｅｃ（ドイツ、ゲッティンゲン））によって増幅した。ｐＭＣＳ５はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と同様に構成されており、ｌａｃＺαフラグメントのコーディング配列５'領域のみが異なる。したがって、ｐＭＣＳ５はｌａｃプロモーター、それに続くｌａｃオペレーターを有し、それによって、挿入されたコーディング配列は、活性があるｌａｃリプレッサーがないときに発現する。いつでも恒常的に発現させるために、ｌａｃオペレーターがＰＣＲ生成物内にもはや存在しないように増幅プライマーを選択した。その結果得られるＰＣＲ生成物は、制限サイトのための張り出しと、９９２〜６６４位のｐＭＣＳ５に対応した。９９２位（ｌａｃプロモーターに対する３'側）の前にはヌクレオチドＧＡＡＴＴＣ（ＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素切断部位）およびＴＧＴＧＴＧを添加し、６６４位の後ろにはヌクレオチドＡＣＴＡＧＴ（Ｓｐｅ  Ｉ制限酵素切断部位）およびＣＡＣＡＣＡを添加し、ＥｃｏＲ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉによる制限消化後の連結を可能にした。ＵｖｓＸＨ６、ＵｖｓＸＨ６−２、Ｈ６ＵｖｓＸ、およびＨ６ＵｖｓＸ−２のコーディング配列を、好ましい制限酵素切断部位、リボソーム結合部位、および追加のコドンを含有するプライマーで、Ｔ４−ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得た。ＰＣＲ生成物は、開始コドンの前の５'末端において、追加のヌクレオチド５'−ＣＡＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴ−３'、および終止コドンの後の３'−末端において追加のヌクレオチド５'−ＡＣＴＡＧＴＴＧＴＧＴＧ−３'を含有した。
【００４７】
精製：
１．５〜３  ｌのｄＹＴ／アンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）１：１０００培地に、ｐＥｘＨ−Ｈ６ＵｖｓＸを含むＤＨ５の一夜培養液を接種し、３７℃下に一夜、２５０ＲＰＭで増殖させた。７０００×ｇで収集した培養液は約７〜１５ｇの細菌沈降物を生じた。これを−２０℃下に１〜３日間凍結した。この沈降物を氷上で解凍し、１０〜２０ｍｌの冷却した開始バッファーに再懸濁した。リゾチーム（セルヴァ（Ｓｅｒｖａ）、１９０，０００ｕ／ｍｇ）１０ｍｇおよびグラスビーズ約４ｇを用いて、４℃下に１時間ゆっくり攪拌しながら溶解を行った。次いで、ＤＮＡｓｅＩ（セルヴァ（Ｓｅｒｖａ）、２ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加し、さらに３０分間インキュベートした。ライセートの遠心分離（４℃下、１１,０００×ｇで４５分）後、無菌フィルタ（孔径０．４５μｍ）を通じて上清をろ過し、Ｎｉ＋＋イオンをプレロードして、平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭキレートカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にロードした。その後の精製ステップは、ヒスチジン６量体を備えたタンパク質に対するファルマシア社のプロトコルに従って行った。異なる溶出画分の一定分量をＳＤＳ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ゲル上にロードした。最も純粋な画分を統合し、セントリプラス（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ）ＹＭ３０カラム（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））でそれぞれのプロトコルに従ってさらに濃縮した。その後、少なくとも１０００倍量のZIバッファーで２回の透析（透析チューブ：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：２５，０００）を４℃下にそれぞれ少なくとも１時間行い、次いで４℃下に一夜、ZIバッファー／５０％グリセリンで透析した。透析液を３０〜５０μｌの画分に分注し、−８０℃下に保存した。
【００４８】
使用バッファー：
ZIバッファー：７６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２。
開始バッファー：２０ｍＭ  Ｐｉ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ＝７．４。
洗浄バッファー：２０ｍＭ  Ｐｉ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０〜５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ＝７．４。
溶出バッファー：２０ｍＭ  Ｐｉ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００〜５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ＝７．４。
【００４９】
濃度測定：
ＵｖｓＸ−タンパク質の濃度は、Ｐｒｏｇｒａｍｍ  Ｇｅｎｅ  ＩｎｓｐｅｃｔｏｒＴＭ（テクストコ社（Ｔｅｘｔｏ，Ｉｎｃ．））で計算された吸光係数を用いて、ＯＤ２８０を測定することによって決定した。Ｈ６ＵｖｓＸの濃度は２．５〜３．５μｇ／μｌであった。
【００５０】
実験の概要
Ｎｉ＋＋セファロースで精製したＨ６ＵｖｓＸをそれぞれ２００ｎｇの１ｋｂのＰＣＲ断片と（１ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓの存在下および非存在下）でインキュベートした。
【００５１】
タンパク質結合によって生じるアガロースゲル中のＤＮＡのシフトは、Ｈ６ＵｖｓＸが濃度に依存して２本鎖ＤＮＡに結合し、この結合がＡＴＰ−γ−Ｓによって増強されることを示している。
【００５２】
ＡＴＰ−γ−Ｓの存在下では、ＡＴＰ−γ−Ｓの非存在下よりも臭化エチジウムで強く染色されるタンパク質−ＤＮＡ複合体が生じ、このことはヌクレオチド類似体による核タンパク質フィラメントの形態的変化を示唆している。
【００５３】
（実施例２）
機能的構成成分として核局在化シグナルをもつ、ＮＰＦ形成タンパク質としてのＵｖｓＸを用いた、トランスフェクション試薬の調製
実施例１に記載したタンパク質に由来して、さらに核局在化シグナルを含有する、融合タンパク質ＵｖｓＸＨ６Ｎ２、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２、Ｎ２Ｈ６ＵｖｓＸ、およびＮ２Ｈ６ＵｖｓＸ−２の発現を可能にするプラスミドを、実施例１のようにして調製した（図１を参照）。
【００５４】
タンパク質の構造：
ＵｖｓＨ６Ｎ２（４２６アミノ酸）：
アミノ酸１−３９１：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸１−３９１）、アミノ酸３９２−３９４：アミノ酸Ｇ３９２ＧＳ３９４のリンカー、アミノ酸３９５−４００：Ｈ３９５ＨＨＨＨＨ４００、アミノ酸４０１−４０３：アミノ酸Ｇ４０１ＧＳ４０３のリンカー、アミノ酸４０４−４１７：核局在化シグナルｎｌｓ−２（（ＷＯ  ００／４０７４２）のアミノ酸２−１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、アミノ酸４１８−４２１：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸３８８−３９１）のＣ末端、アミノ酸４２２−４２６：アミノ酸Ｋ４２２ＬＶＴＧ４２６からなるＣ末端、アミノ酸置換：Ｙ２３８→Ｖ。
【００５５】
ＵｖｓＨ６Ｎ２−２（４２０アミノ酸）：
アミノ酸１−３９１：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸１−３９１）、アミノ酸３９２−３９４：アミノ酸Ｓ３９２ＹＳ３９４のリンカー、アミノ酸３９５−４００：Ｈ３９５ＨＨＨＨＨ４００、アミノ酸４０１−４０３：アミノ酸Ｍ４０１ＹＳ４０３のリンカー、アミノ酸４０４−４１７：核局在化シグナルｎｌｓ−２（（ＷＯ  ００／４０７４２）のアミノ酸２−１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、アミノ酸４１８−４２０：アミノ酸Ｇ４１８ＹＰ４２０のＣ末端。
【００５６】
Ｎ２Ｈ６ＵｖｓＸ（４２０アミノ酸）：
アミノ酸１−３：アミノ酸Ｍ１ＳＹ３のＮ−末端、アミノ酸４−１７：核局在化シグナルｎｌｓ−２（（ＷＯ  ００／４０７４２）のアミノ酸２−１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、アミノ酸１８−２０：アミノ酸Ｌ１８ＹＳ２０のリンカー、アミノ酸２１−２６：Ｈ２１ＨＨＨＨＨ２６、アミノ酸２７−２９：アミノ酸Ｓ２７ＹＧ２９のリンカー、アミノ酸３０−４２０：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸  １−３９１）、アミノ酸置換：Ｑ３５６→Ｌ。
【００５７】
Ｎ２Ｈ６ＵｖｓＸ−２（４２１アミノ酸）：
アミノ酸１−４：アミノ酸Ｍ１ＧＹＰ４のＮ−末端、アミノ酸５−１８：核局在化シグナルｎｌｓ−２（（ＷＯ  ００／４０７４２）のアミノ酸２−１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、アミノ酸１９−２１：アミノ酸Ｓ１９ＹＳ２１のリンカー、アミノ酸２２−２７：Ｈ２２ＨＨＨＨＨ２７、アミノ酸２８−３０：アミノ酸Ｓ２８ＹＧ３０のリンカー、アミノ酸３１−４２１：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸  １−３９１）。
【００５８】
発現プラスミドのクローニング
適切な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞における発現のために、ｌａｃプロモーターの制御下にＵｖｓＸＨ６Ｎ２、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２、Ｎ２Ｈ６ＵｖｓＸ、またはＮ２Ｈ６ＵｖｓＸ−２のコーデング配列を含有するプラスミドを構築した（ｐＥｘＨ−ＵｖｓＸＨ６Ｎ２、ｐＥｘＨ−ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２、ｐＥｘＨ−Ｎ２Ｈ６ＵｖｓＸ、またはｐＥｘＨ−Ｎ２Ｈ６ＵｖｓＸ−２、図１を参照）。これらのプラスミドは、実施例１に記載したように、２つのＰＣＲ生成物の連結によって調製した（図１を参照）。
【００５９】
精製：
ＵｖｓＸＨ６Ｎ２の精製は、Ｈ６ＵｖｓＸについて実施例１に記載したように行った。
濃度：１０〜２０μｇ／μｌ。
【００６０】
実験の概要：
ＵｖｓＸＨ６Ｎ２は２本鎖ＤＮＡに結合する。その結合はＡＴＰ−γ−Ｓによって安定化する：
ＵｖｓＸＨ６Ｎ２のＤＮＡへの結合挙動に対する、様々なＡＴＰ−類似体の影響を調べるために、まず、１ｋｂのＤＮＡ断片および様々なＡＴＰ−類似体とタンパク質をインキュベートした。次いで、競合のために１．７ｋｂのＤＮＡ断片を添加した。ＡＴＰ−類似体の添加によってＤＮＡへのタンパク質結合の安定化が行われれば、平衡が生じない限り、競合ＤＮＡ断片にＵｖｓＸＨ６Ｎ２が結合する可能性は低いことが予想される。図３に見られるように、１ｋｂのＤＮＡ断片およびＵｖｓＸＨ６Ｎ２によって生じるタンパク質−ＤＮＡ複合体は、ＡＴＰ−γ−Ｓおよび１．７ｋｂのＤＮＡ断片存在下で、使用した他のすべてのＡＴＰ−類似体に比べ、安定であった。すなわち１．７ｋｂのＤＮＡ断片は、観察時間内において、遊離したＵｖｓＸＨ６Ｎ２−分子によって占有されないか、またはわずかにしか占有されないと思われる。
【００６１】
（実施例３）
修飾および非修飾ＮＰＦ形成タンパク質の混合によるトランスフェクション試薬の調製
実験の概要：
異なる割合のＨ６ＵｖｓＸおよびＵｖｓＸＨ６Ｎ２を１ｋｂのＤＮＡ断片とインキュベートした。２つのタンパク質が、それらの異なる分子量に基づき、ＤＮＡの移動度を様々な度合いで小さくする。（図４の２および３レーンを参照）。タンパク質をＤＮＡへ添加する前に混合すると、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２に対するＨ６ＵｖｓＸの割合に応じて中間複合体が生じ、これらはシャープなバンドを生じるとともに、同等の平均分子量を有する。これはＤＮＡが統計的に均一に両方のタンパク質で被覆されていることを示す。
【００６２】
（実施例４）
エレクトロポレーション法と組み合せた、ＵｖｓＸ−ＮＬＳによるセルライン（ＮＩＨ３Ｔ３）のトランスフェクション
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（接着性、７０〜８０％の集密まで培養）を、マウスＭＨＣクラスＩタンパク質Ｈ−２ＫＫの重鎖をコードするベクターをトランスフェクションした。１×１０６細胞に、予め結合バッファー（７６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝７．２１）中で、１４μｇのＵｖｓＸまたはＵｖｓＸ−ＮＬＳと、１ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓの存在下または非存在下に、室温下に３０分間予備インキュベートした２５ｎｇのベクターＤＮＡをエレクトロポレーションした。さらに、細胞をエレクトロポレーションバッファー（１０３ｍＭ  ＮａＣｌ、５．３６ｍＭ  ＫＣｌ、０．４１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２３．８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５．６４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１１．２ｍＭグルコース、０．４２ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３．２５μＭグルタチオン）中に総量１００μｌとして入れ、電極間隔２ｍｍのキュベットでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは２４０Ｖの電圧および４５０μＦの電気容量での指数関数的な放電によって行った。電圧降下の半減期は通常、１２ミリ秒であった。エレクトロポレーション直後、キュベットから培地（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ）を用いて細胞を回収し、３７℃下に１０分間インキュベートし、次いで予め保温した培地を含む培養シャーレに移した。６時間のインキュベーション後、細胞を収集し、ＰＢＳ中での２回の洗浄後、Ｃｙ５結合−抗Ｈ−２ＫＫ抗体でインキュベートし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ）により分析した。ヨウ化プロピジウム染色によって死細胞の数を測定した。エレクトロポレーションの６時間後、ベクターＤＮＡのみをトランスフェクションされた細胞の（平均０．２５％のバックグラウンドを除き）７．４％ないし８．７％がＨ−２ＫＫタンパク質を発現する。これに比べて、ベクターＵｖｓＸをトランスフェクションされた細胞の発現率は２．９％ないし３．８％であった。ベクターＵｖｓＸ−ＮＬＳのトランスフェクションにおける発現率は１９．２％ないし１８．９％である（図５ａ〜５ｄを参照）
【００６３】
核移行を調べるために、ＵｖｓＸ以外に別の生化学的成分がトランスフェクションに対する影響を示さないように、エレクトロポレーションの物理的方法を選択した。しかし、ＡＴＰ−γ−Ｓを含むＵｖｓＸのＤＮＡへの強固な結合は、電場における複合体の運動性を抑制するために、エレクトロポレーションの効率を約６０％低下させる。核移行シグナルを付加するだけで、この系におけるトランスフェクション直後の発現は平均５．７倍上昇する。ＵｖｓＸに比べてＵｖｓＸ−ＮＬＳによる発現の上昇は、機能的構成成分として核移行シグナルを使用する場合、核内へＵｖｓＸによってＤＮＡが輸送されることを示す。トランスフェクション直後の分析は、トランスフェクションと分析との間で分裂していない細胞も使用できることによって、大幅に改善される。
【００６４】
（実施例５）
エレクトロポレーション法と組み合せた、ＵｖｓＸスクランブル化ＮＬＳまたはＵｖｓＸ−ＮＬＳのセルライン（ＮＩＨ３Ｔ３）のトランスフェクション
ＵｖｓＸスクランブル化ＮＬＳの作製
トランスフェクションに対する核内移行シグナルの影響を調べるため、その正味電荷においてＮＬＳを含むＵｖｓＸタンパク質に対応するが、それ自体は機能的ＮＬＳを含有しないＵｖｓＸ誘導体を比較用に作製した。
【００６５】
部分的に相同のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＵｖｓＸ−遺伝子をプラスミドｐＥｘＨ−ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２（図１を参照）から増幅し、生じるタンパク質ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ｓｃのＣ末端において、アミノ酸配列ＥＥＤＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤ（「ｎｌｓ−２」、（ＷＯ  ００／４０７４２）のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸２−１５に対応）の代わりに、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（「スクランブル化」、すなわち混合ＮＬＳ配列）が発現させる。スクランブル化アミノ酸は、その構成において記載されたｎｌｓ−２に対応するが、その配列においては対応しない。したがって、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２およびＵｖｓＸＨ６Ｎ２ｓｃの正味電荷は同じであるが、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２のみが完全な核内移行シグナルを含有する。
【００６６】
タンパク質ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ｓｃを実施例１のタンパク質について記載したように精製した。
【００６７】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞（接着性、７０〜８０％の集密まで培養）に、蛍光マーカータンパク質をコードするベクターをトランスフェクションした。このために、最初に結合バッファー（実施例１を参照）中の２５ｎｇのベクターＤＮＡを、１．５ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓおよび示したタンパク質１６〜１８μｇで室温下に３０分間インキュベートした。タンパク質−ＤＮＡ複合体を、８０μｌのエレクトロポレーションバッファー（１４０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．２）中に再懸濁した、それぞれ３×１０５のＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。エレクトロポレーションは、電極間隔２ｍｍのキュベットで２４０Ｖの電圧および４５０μＦの電気容量での指数関数的な放電によって行った。電圧降下の半減期は通常、１２ミリ秒であった。ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）、５％ＦＣＳ、２ｍＭグルタマックス（Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む培地４００μｌの添加後、培養シャーレ（６穴プレート）中に細胞を１ｍｌの予め保温した培地とともに添加し、３７℃および５％ＣＯ２下にインキュベートした。６時間後、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳｃａｎ）を行った。
【００６８】
結果は図６のグラフに示されており、ベクターＤＮＡのみによりトランスフェクションされた細胞の９％がマーカータンパク質を発現する。それに対して、ベクター‐ＵｖｓＸ−ＮＬＳ（ＤＮＡ＋ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２）によりトランスフェクションされた細胞の発現率は、２１％である。これと比べ、ベクター‐ＵｖｓＸスクランブル化ＮＬＳ（ＤＮＡ＋ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ｓｃ）によるトランスフェクションの場合、細胞の発現率は４％でしかない。したがって、核内移行シグナルで修飾されたＵｖｓＸは、ＤＮＡのみとの比較、および非機能的核内移行シグナルによる修飾との比較において、効率を明らかに上昇させる。非機能的核内移行シグナルによる修飾のトランスフェクションは対照実験を示しているので、ＵｖｓＸの修飾によってトランスフェクション効率が５倍に上昇したことを意味している。本発明による方法またはトランスフェクション試薬によって、トランスフェクション効率が明らかに上昇する。さらに、ＮＰＦ形成タンパク質の修飾によって、トランスフェクション過程のねらった制御、ここでは例えば細胞核への入ることも、有利な方法で可能となる（実施例６も参照）。
【００６９】
（実施例６）
マイクロインジェクションと組み合せたセルライン（ＮＩＨ３Ｔ３）のトランスフェクション
１．７ｋｂの発現ベクターＤＮＡ断片１４０ｎｇを、上記のように最終量２０μｌで結合バッファーおよび１ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓ中で修飾ＵｖｓＸタンパク質９μｇと室温下に３０分間インキュベートした。注入マーカーとしては、注入直前に約１μｇ／μｌの濃度でＢＳＡ−Ｃｙ５を使用した。
【００７０】
前日にＣＥＬＬｏｃａｔｅカバーガラス（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上に半集密（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）に播種されたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、マイクロマニピュレーターおよびトランスジェクター（エッペンドルフ）を用いて、インバース蛍光顕微鏡（ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭＩＬ）下にフェムトチップ（エッペンドルフ）に入れたサンプルによってマイクロインジェクションした。
【００７１】
評価は蛍光顕微鏡（オリンパスＢＸ６０−蛍光顕微鏡、デジタルＳ／ＷカメラＳＰＯＴ−ＲＴ（ディアグノスティック  インスツルメンツ社（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＩＮｃ．）、評価ソフトウェア：Ｍｅｔａｖｉｅｗ画像システム（ユニバーサル  イメージング  コーポレーション（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））で、３７℃および５％ＣＯ２下、さらに５時間のインキュベーション後に行った。
【００７２】
図７は、マイクロインジェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を示す。写真１および２は、ＤＮＡおよびＵｖｓＸＨ６Ｎ２ｓｃを細胞質に注入された細胞を示し、写真３および４は、ＤＮＡおよびＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２が注入された細胞を示し、写真５および６は、ＤＮＡのみが注入された細胞を示す。発現は、タンパク質−ＤＮＡ複合体ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２が、核内移行シグナルで修飾されたＵｖｓＸタンパク質を含有した場合のみ観察された（図７、写真３）。マイクロインジェクションで、明らかに細胞質のみに注入され、核には注入されていない対照細胞（図７、写真５：ＤＮＡのみ、または図７、写真１：ＵｖｓＸスクランブル化ＮＬＳとＤＮＡ）では、きわめて長く露光しても、発現は確認されなかった。
【００７３】
（実施例７）
ＮＰＦ形成タンパク質としての組換えＳＡＳＰの作製
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＳＡＳＰタンパク質のクローニング、発現、および精製
ＳＡＳＰ（ｓｍａｌｌ  ａｃｉｄ−ｓｏｕｌｕｂｌｅ  ｓｐｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ＊）をコードする、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＳｓｐＣ遺伝子を、８個のオリゴヌクレオチドからコラナ（Ｋｏｈｏｒａｎａ）法（非特許文献５０）に従って合成し、プラスミドｐＡＲＡ１３のＮｃｏｌ切断部位とＢｇｌｌｌ切断部位（非特許文献５１）との間に連結した。これは、ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＮＰ＿３８９８７６のタンパク質配列をもとにした。ＤＮＡへの逆転写は、大腸菌において強く発現しており非特許文献５２に記載されている、遺伝子の使用頻度の高いコドン（codon preferences）を用いて行った。作製したプラスミドｐＡＲＡ１３−ＳＡＳＰを、Ｎ末端（Ｈ６−ＳＡＳＰ）またはＣ末端（ＳＡＳＰ−Ｈ６）のいずれかが６個のヒスチジンからなるポリヒスチジン配列を有するＳＡＳＰタンパク質をコードする、２つの別のプラスミドのクローニング用のテンプレートとして使用した（図８）。これらのプラスミドによって大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ノバーゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、ＬＢ／アンピシリン／グルコース（０．２％）上にプレーティングした。
【００７４】
Ｍ９最小培地（０．２％グルコース）２０ｍｌにそれぞれ個別のコロニーを接種し、３７℃および２２０ｒｐｍで一夜、増殖させた。翌日、ＯＤ６００約１．０で０．２％アラビノースで誘導をかけた後、さらに６時間増殖させた。未精製抽出物（ＰＢＳ／泳動バッファーに懸濁した０．５ｍｌペレット化培養液）を高分解能のＳＤＳゲル（（非特許文献５３）に従って）に泳動し、クーマシーブルーで染色した（図９Ａ）。
【００７５】
予備精製のために、２ｌのＭ９／グルコース１：２００に一夜培養液を接種した。再び、ＯＤ６００約１．０で０．２％アラビノースで誘導し、６時間増殖させた。次いで、細菌をペレット化し、−２０℃で凍結した。以下、ＳＡＳＰ−Ｈ６の精製を例示的に記載する。ペレット（約７ｇ）の解凍後、これらを完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（マンハイム、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社）を添加した開始バッファー（実施例１を参照）１４ｍｌ中に再懸濁し、３分間、氷上で２８０ワット（Ｌａｂｓｏｎｉｃ  Ｕ（ブラウンバイオテック、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ  ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｄｕｔｙ  ｐｕｌｓ：０．５秒）で超音波処理した。抽出物を４℃下に遠心分離した。さらに、精製はＵｖｓＸタンパク質について記載したように、ＨｉＴｒａｐキレーティングカラム（ウプサラ、アマシャム  ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ））によって行った。タンパク質が高濃度で含まれているイミダゾール２００ｍＭと５００ｍＭとの間の画分を統合し、セントリプラス（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ）カラム（ＹＭ−３、エシュボーム、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社）を用いて約３ｍｌに濃縮した。次いで、ＳＡＳＰタンパク質を１×ZIバッファー（実施例１を参照）に対して３回透析し、約５μｇ／μｌの濃度の分注物を−８０℃下に凍結した。
【００７６】
ＳＡＳＰタンパク質のＤＮＡ結合能の試験
１．７ｋｂのＤＮＡ断片それぞれ１２５ｎｇを、１×ZIバッファーまたは１／１０×ZIバッファー中で、異なる量のＳＡＳＰ−Ｈ６タンパク質と室温下に３０分間、予備インキュベートし、次いで０．８％ＴＡＥアガロースゲルで泳動した。
【００７７】
図９Ｂは、ＤＮＡが完全にタンパク質によって結合されていることを示す。ＤＮＡ−タンパク質バンドが拡散して見えるのは、おそらく泳動中にタンパク質がＤＮＡから分離することが原因であると思われる。
【００７８】
（実施例８）
修飾として核局在化シグナルをもつ、ＮＰＦ形成タンパク質としてのＳＡＳＰをもつトランスフェクション試薬の調製
機能的構成成分として核局在化シグナル（ＮＬＳ）をもつＳＡＳＰの調製のために、既存のクローンｐＡＲＡ１３−ＳＡＳＰ−Ｈ６（図８を参照）Ｃ末端に、核局在化シグナル（（ＷＯ  ００／４０７４２）による「ｎｌｓ−２」、アミノ酸２−１５、ＳＥＱ  ＩＱ  ＮＯ：９）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅によって添加した。その際に、上記のプラスミドをＰＣＲテンプレートとして使用した。作製したプラスミドｐＡＲＡ１３−ＳＡＳＰ−Ｈ６Ｎ２（図８を参照）を実施例７において記載されているように形質転換し、タンパク質ＳＡＳＰ−Ｈ６Ｎ２を適切に精製した。
【００７９】
ＳＡＳＰ−ＮＬＳタンパク質のＤＮＡ結合能の試験
１．７ｋｂのＤＮＡ断片それぞれ１２５ｎｇを、１×ZIバッファー中で異なる量のＳＡＳＰ−Ｈ６Ｎ２タンパク質と室温下に３０分間、予備インキュベートし、次いで０．８％ＴＡＥアガロースゲルで泳動した。
【００８０】
図１０Ｂは、ＮＬＳ修飾ＳＡＳＰもＤＮＡの移動度を小さくすることを示す。ＤＮＡ−タンパク質バンドは拡散性に見える。
【００８１】
（実施例９）
機能的構成成分として、細胞表面へ複合体が結合するインテグリン結合モチーフをもつトランスフェクション試薬の調製
インテグリンは細胞表面上の膜固着性の接着タンパク質であり、そのうちの一部は結合相手として３つのアミノ酸（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸、つまり「ＲＧＤ」モチーフ）からなるペプチドモチーフを認識する。その結合により細胞表面上でいくつかのインテグリン分子がクラスターを形成し、エンドサイトーシスが生じる（非特許文献５４）。ＲＧＤモチーフを用いて、ＮＰＦ形成タンパク質としてＵｖｓＸを修飾することによって、トランスフェクション試薬がインテグリンを介して特異的に細胞のエンドソーム区画に取り込まれることを達成することができる。
【００８２】
タンパク質の構造
使用したタンパク質Ｈ６ＵｖｓＸおよびＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２は、図１に示されており、実施例１および２に記載されているものと同一である。
【００８３】
タンパク質Ｈ６ＵｖｓＸ＊（ＲＧＤ２）は、化学的なカップリングによって調製した。ＲＧＤ２と呼ばれるペプチドは、アデノウィルスタイプ７のペントンベースタンパク質由来のノナペプチド（ＮＩＴＲＧＤＴＹＩ）であり（非特許文献５５）、Ｎ末端アミノ基にＵｖｓＸタンパク質における遊離システイン−ＳＨ基へのカップリングを可能にする化学的に活性な基（ＳＭＣＣ、スクシニミジル４［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロへキサン−１−カルボキシレート）があるように合成した。
【００８４】
カップリングのために、Ｈ６ＵｖｓＸ  ６ｎｍｏｌを７６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２中でペプチド６０ｎｍｏｌと３７℃下に１時間にわたりインキュベートし、次いで過剰なペプチドを取り除くために、ＭｉｃｒｏＣｏｎフィルタ（１０ｋＤａカットオフ）を用いて、インキュベーションバッファーでの複数回洗浄することによって精製した。カップリングの成功は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における泳動度の変化によって検出された。図１１は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で互いに独立して調製された２つのＨ６ＵｖｓＸ＊（ＲＧＤ２）を示す。カップリングされたペプチドは、分子量が上昇し、ＳＤＳゲルにおける泳動度の変化をもたらす。
【００８５】
実験の概要：
ＵｖｓＸ−ＮＬＳおよびＵｖｓＸ−ＲＧＤの２本鎖ＤＮＡへの結合および混合ＮＰＦの形成：
精製された１．６ｋｂのＰＣＲ  ＤＮＡ断片それぞれ１４０ｎｇの沈殿物を、７６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓ中で、Ｈ６ＵｖｓＸ＊（ＲＧＤ２）１５μｇとＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２  ４μｇとの混合物、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２  ４μｇのみ、およびＨ６ＵｖｓＸ＊（ＲＧＤ２）１５μｇのみと、最終量２０μｌ、室温下に３０分間インキュベートし、０．８％のＴＡＥ／アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。電気泳動は、１時間、１００Ｖで行った。
【００８６】
図１２は、２つの異なって修飾されたタンパク質がＤＮＡとＮＰＦを形成し、その泳動度が明らかに異なることを示す。２本鎖ＤＮＡ断片と、Ｈ６ＵｖｓＸ＊（ＲＧＤ２）およびＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２との混合物（レーン１）、またはＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２のみ（レーン２）、またはＨ６ＵｖｓＸ＊（ＲＧＤ２）のみ（レーン３）からなるＮＰＦをアガロースゲル中に電気泳動で分離した。存在するタンパク質の量が不足しているため、遊離ＤＮＡ断片も存在する。反応液中の両方のタンパク質は共にＤＮＡ断片に結合し、それぞれのタンパク質のみでＮＰＦを形成するときの間の分子量を有する混合ＮＰＦを生じる（レーン１）。このことから、ＵｖｓＸ−ＮＬＳおよびＵｖｓＸ−ＲＧＤは２本鎖ＤＮＡに結合し、混合ＮＰＦを形成しうると結論付けることができる。
【００８７】
（実施例１０）
インテグリン介在性エンドサイトーシスによる細胞内へのＮＰＦの特異的取り込み
タンパク質の構造
ＵｖｓＸおよびインテグリン結合ＲＧＤモチーフ由来の融合タンパク質の発現を可能にするプラスミドＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＮＩＴ−２（図１）を実施例１に示すように組換えて作製した。
【００８８】
アミノ酸１−３９１：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸１−３９１）、アミノ酸３９２−３９４：アミノ酸Ｓ３９２ＹＧ３９４のリンカー、アミノ酸３９５−４００：Ｈ３９５ＨＨＨＨＨ４００、アミノ酸４０１−４０３：アミノ酸Ｍ４０１ＹＳ４０３のリンカー、アミノ酸４０４−４１７：核局在化シグナルｎｌｓ−２（（ＷＯ  ００／４０７４２）のアミノ酸２−１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、アミノ酸４１８−４２０：アミノ酸Ｇ４１８ＹＰ４２０由来のＣ末端、およびアミノ酸４２１−４３２：ＲＧＤ−モチーフ「ＮＩＴ」：Ｎ４２１ＩＴＲＧＤＴＹＩＰＹＰ４３２。
【００８９】
実験の概要：
蛍光標識ＤＮＡおよびＵｖｓＸ誘導体由来のＮＰＦの結合：
ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ｄＵＴＰ（モレキュラー  プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社（米国、オレゴン州、ユージーン））をｄＴＴＰの代わりに含有する、精製された１．６ｋｂのＰＣＲ  ＤＮＡ断片それぞれ１μｇを、７６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓ中で、精製されたＵｖｓＸＨ６Ｎ２またはＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＮＩＴ−２  １００μｇと、最終量２００μｌで室温下に３０分間インキュベートした。次いで、ＮＰＦ反応物のそれぞれ１０μｌを、０．８％のＴＡＥ／アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。電気泳動を１時間、１００Ｖで行った。図１３は、ＤＮＡの移動度が完全に遅れていることを示す。したがって、タンパク質のＤＮＡ結合は、ＤＮＡの蛍光標識によっても妨げられない。
【００９０】
エンドサイトーシスによるＮＩＨ３Ｔ３細胞へのにおけるＮＰＦの取り込み：
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を６穴プレート（穴当たり３×１０５）に播種し、３７℃および５％ＣＯ２下に一夜インキュベートし、翌朝に予め保温したＦＣＳが入っていない培地で洗い、次いで２ｍｌのＦＣＳが入っていない培地を加えた。これにＮＰＦ反応物（上記参照）１９０μｌを添加し、室温下に３０分インキュベートし、上清を除去し、細胞を洗浄し、３ｍｌの培地（１０％ＦＣＳ含有）を添加した。さらに、インキュベーター内で３７℃、１時間のインキュベーション後、蛍光顕微鏡下に評価を行った。図１４ａおよび１４ｂには、それぞれ明視野（下）および明蛍光（上）における写真が示されている。
【００９１】
明視野には、エンドサイトーシスによって取り込まれたＤＮＡのために蛍光で光る小胞性の細胞内区画が見られる（図１４ａ、ｂ上）。
【００９２】
各穴から、何枚かずつの写真をとった。細胞数を計算し、少なくとも一つの蛍光性の小胞性区画を含有する細胞の割合（％）を測定した（図１５に示した）。それぞれの写真は平均３５の細胞を含んでいた。ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＩＴ−２の作用については、９枚の写真によって分析され、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２の作用については、５枚の写真によって分析された。
【００９３】
結果は、機能的構成成分としてのインテグリン結合モチーフによるＵｖｓＸの修飾（ＵｖｓｘＨ６Ｎ２−ＮＩＴ−２）が、対照（ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２）に比べ細胞へのトランスフェクション試薬の明らかに高いエンドサイトーシスによる取り込みをもたらすことを示している。
【００９４】
（実施例１１）
ＮＰＦ形成タンパク質としてｈＲａｄ５１を用いたトランスフェクション試薬の調製
ＮＰＦ形成タンパク質として、タンパク質ｈＲａｄ５１Ｈ６、およびｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２を使用した（図１６を参照）。
【００９５】
タンパク質の構造：
ｈＲａｄ５１Ｈ６（３５２アミノ酸）：
アミノ酸１−３３９：ヒトＲａｄ５１（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：Ｑ０６６０９、アミノ酸１−３３９）、アミノ酸３４０−３４３：アミノ酸Ｙ３４０ＳＹＧ３４３のリンカー、アミノ酸３４４−３４９：ニッケル−キレート−親和性クロマトグラフィによる精製のためのＨ３４４ＨＨＨＨＨ３４９、アミノ酸３５０−３５２：アミノ酸Ｍ３５０ＹＳ３５２のＣ末端。
【００９６】
ｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２（３６９アミノ酸）：
アミノ酸１−３３９：ヒトＲａｄ５１（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：Ｑ０６６０９、アミノ酸１−３３９）、アミノ酸３４０−３４３：アミノ酸Ｙ３４０ＳＹＧ３４３のリンカー、アミノ酸３４４−３４９：ニッケル−キレート−親和性クロマトグラフィによる精製のためのＨ３４４ＨＨＨＨＨ３４９、アミノ酸３５０−３５２：アミノ酸Ｍ３５０ＹＳ３５２のリンカー、アミノ酸３５３−３６６：核局在化シグナルｎlｓ−２（（ＷＯ  ００／４０７４２）のアミノ酸２−１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、アミノ酸３６７−３６９：アミノ酸Ｇ３６７ＹＰ３６９のＣ末端。
【００９７】
発現プラスミドのクローニング
適切な大腸菌の細胞における上記のタンパク質の発現のために、ｌａｃプロモーターの制御下にｈＲａｄ５１Ｈ６、またはｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２のコーディング配列を含有するプラスミドを構成した（ｐＥｘＨ−ｈＲａｄ５１Ｈ６、またはｐＥｘＨ−ｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２、図１６を参照）。出発プラスミドとして、ｐＥｘＨ−ＵｖｓＸＨ６−２、およびｐＥｘＨ−ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２を使用した（図１６を参照）。
ＵｖｓＸのコーディング領域をそれぞれＥｃｏＲ  ＶおよびＢｓｉＷ  Ｉで切断し、同様にして切断したｈＲａｄ５１のコーデング領域のＰＣＲ断片によって置き換えた。これは、好ましい制限酵素切断部位を含有するｈＲad５１特異的プライマーを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーから増幅させた。ＰＣＲ生成物は、開始コドンの前の５'末端において追加のヌクレオチド５'−ＣＡＣＡＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＴ−３'、および３'−末端においては、終止コドンの代わりに追加のヌクレオチド５'−ＴＡＣＴＣＧＴＡＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＧＴＧ−３'を含有した。
【００９８】
精製：
ｄＹＴ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）５ｍｌの予備培養液に、ｐＥｘＨ−Ｒａｄ５１Ｈ６またはｐＥｘＨ−Ｒａｄ５１Ｈ６Ｎ２をもつＤＨ５を接種し、３７℃下に５時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。ｄＹＴ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）１０ｌにこの予備培養液を接種し、さらに３７℃下に２４時間、２１０ｒＰＭで増殖させた。７０００×ｇで収集された培養株は約３０〜５０ｇの細菌沈降物を生じた。この沈降物を−２０℃下に１〜３日間、凍結させた。この沈降物を氷上で解凍し、１００ｍｌの冷却した開始バッファーに再懸濁した。その後、Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｌａｂｓｏｎｉｃ  Ｕを使用して超音波で細胞を可溶化した（大プローブ、パラメータ：３００Ｗ、毎秒０．５秒のパルス時間、超音波処理８分）。次いで、リゾチーム（セルヴァ（Ｓｅｒｖａ）、１９０，０００ｕ／ｍｇ）１０ｍｇを加えて４℃下に１時間インキュベートし、さらにＤＮＡｓｅＩ（セルヴァ（Ｓｅｒｖａ）、２ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加し、３０分間、ゆっくり攪拌しながらインキュベートした。遠心分離（４℃下、１８０００ｘｇで４５分）で溶解物を除いた後、無菌フィルタ（孔径０．４５μｍおよび０．２μｍ）を通じて上清をろ過し、Ｎｉ＋＋イオンをプレロードして、平衡した１ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭキレートカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にロードした。その後の精製ステップは、ヒスチジン６量体を備えたタンパク質に対する対応するそれぞれのファルマシア社のプロトコルに従って行った。異なる溶出画分の一定分量をＳＤＳ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ゲル上にロードした。それぞれ最も純粋な画分を統合し、さらに、セントリプラス（Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ）ＹＭ３０カラム（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））でそれぞれのプロトコルに従って濃縮した。その後、少なくとも１０００倍量のZIバッファーで２回の透析（透析チューブ：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ、ＭＷＣＯ：２５，０００）を４℃下にそれぞれ１時間行い、次いで４℃下に一夜、ZIバッファー／５０％グリセリンで透析した。透析液を３０〜５０μｌの画分に分注し、−８０℃下に保存した。図１７は精製されたｈＲａｄ５１−Ｈ６およびｈＲａｄ５１−Ｈ６Ｎ２タンパク質を示す。
【００９９】
使用バッファー：
実施例１に示す。しかし、異なる溶出バッファー：２０ｍＭ  Ｐｉ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００〜１０００ｍＭイミダゾール、ｐＨ＝７．４を用いた。
【０１００】
濃度測定：
ｈＲａｄ５１−タンパク質の濃度は、Ｐｒｏｇｒａｍｍ  Ｇｅｎｅ  ＩｎｓｐｅｃｔｏｒＴＭ（テクストコ社（Ｔｅｘｔｏ，Ｉｎｃ．））で計算された吸光係数を用いて、ＯＤ２８０を測定することによって決定した。
【０１０１】
ｈＲａｄ５１Ｈ６およびｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２の濃度は１１〜１３μｇ／μｌであった。
【０１０２】
実験の概要
ＮＬＳ修飾ｈＲａｄ５１の２本鎖ＤＮＡへの結合：
Ｎｉ＋＋セファロースで精製したｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２をそれぞれ１００ｎｇの０．９ｋｂのＰＣＲ断片とインキュベートした。
【０１０３】
タンパク質結合によってひき起こされるアガロースゲル中のＤＮＡのシフトは、ｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２が濃度に依存して２本鎖ＤＮＡを協同的に結合することを示している（図１７Ｂ）。ｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２の量が少ない場合でも、個々のＤＮＡ分子はｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２によって完全に結合され、したがって最大限に移動度が小さくなるため、タンパク質の量が上昇しても、ＤＮＡの移動度の抑制はそれ以上に増大しない。ｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２はｄｓＤＮＡに結合すると結論付けることができる。
【０１０４】
（実施例１２）
機能的構成成分として非エンドソーム膜通過シグナルおよび核局在化シグナルをもつＵｖｓＸを用いたトランスフェクション試薬の調製
実施例２に記載したタンパク質ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２に由来し、ヒトヘルペスウィルス１由来の外被タンパク質ＶＰ２２（遺伝子ＵＬ４９）の一部分を有する融合タンパク質ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０（図１を参照）の発現を可能にするプラスミドを、実施例１のように調製した。ここで使用したＶＰ２２ペプチドは、細胞膜を通る非エンドソーム通過のシグナルとして作用する。したがって、融合タンパク質ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０は、核内局在化シグナル（ＮＬＳ）に加えてさらに膜導入シグナルを含有する。
【０１０５】
タンパク質の構造：
ＵｖｓＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０（４７４アミノ酸）：
アミノ酸１−３９１：Ｔ４ファージ由来のＵｖｓＸ（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＡＡＤ４２６６９、アミノ酸  １−３９１）、アミノ酸３９２−３９４：アミノ酸Ｓ３９２ＹＧ３９４のリンカー、アミノ酸３９５−４００：Ｈ３９５ＨＨＨＨＨ４００、アミノ酸４０１−４０３：アミノ酸Ｍ４０１ＹＳ４０３のリンカー、アミノ酸４０４−４１７：核局在化シグナルｎｌｓ−２（（ＷＯ  ００／４０７４２）のアミノ酸２−１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、アミノ酸４１８−４２２：アミノ酸Ｇ４１８ＹＰＧＳ４２２、アミノ酸４２３−４７２：ヒトヘルペスウィルス１（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＮＰ＿０４４６５１、アミノ酸２５２−３０１）の外被タンパク質ＶＰ２２（遺伝子ＵＬ４９）の一部、アミノ酸４７３−４７４：アミノ酸Ｐ４７３Ｒ４７４のＣ末端。
【０１０６】
発現プラスミドのクローニング
適切な大腸菌の細胞における発現のために、ｐＥｘＨＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２（実施例１および図１を参照）をＡｃｃ６５  ＩおよびＳｐｅ  Ｉによる制限消化によって切り開き、Ａｃｃ６５  ＩおよびＮｈｅ  Ｉで切断されたＰＣＲ生成物と結合した。このＰＣＲ生成物は、ヒトヘルペスウィルス１（ＮＣＢＩタンパク質目録番号：ＮＣ＿００１８０６、ヌクレオチド１０５４８６−１０６３９１の相補配列）の外被タンパク質ＶＰ２２（遺伝子ＵＬ４９）由来の最後の５０個のアミノ酸をコードする配列に加えて、５'末端において追加のヌクレオチド５'ＣＡＣＡＣＡＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣ−３'、および３'−末端において追加のヌクレオチド５'−ＣＣＴＡＧＧＴＡＡＴＡＡＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＴＧ−３'を含有した（図１を参照）。
【０１０７】
精製：
ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０の精製を、Ｈ６ＵｖｓＸについて実施例１に記載したように行った（図１８Ａを参照）。
濃度：１．８μｇ／μｌ。
【０１０８】
実験の概要：
さまざまな修飾ＵｖｓＸ（ＵｖｓＸ−ＮＬＳ−ＶＰ２２およびＵｖｓＸ−ＮＬＳ）の混合物の、２本鎖ＤＮＡへの結合：
精製された１．７ｋｂのＰＣＲ断片それぞれ１４０ｎｇを、精製されたＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０またはＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２の図１８Ｂに示された量と、９６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１８ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１．３ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓ中で、室温下に３０分間インキュベートし、次いですべての反応物を０．８％のＴＡＥ／アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。２つのタンパク質はその分子量およびその正味電荷において異なり、したがって電気泳動の間にＤＮＡの移動度の抑制が異なり、その際にＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０を含む複合体は、ゲル孔に残ったままであり、まったく移動することはない（図１８Ｂの１および７レーンを参照）。タンパク質をＤＮＡへの添加前に混合すると、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０に対するＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２の割合に応じて中間複合体が生じ、その移動度は、混合されていない複合体を用いた場合の移動度の間にある（図１８Ｂ）。これは、ＤＮＡが両方のタンパク質で覆われていることを示す。さまざまに修飾された、または、１つまたは２回修飾されたＮＰＦ形成タンパク質の混合も可能である。
【０１０９】
（実施例１３）
ＤＮＡおよびＵｖｓＸ−ＮＬＳ−ＶＰ２２とＵｖｓＸ−ＮＬＳの混合物の複合体によるセルライン（ＮＩＨ３Ｔ３）のトランスフェクション
実験の概要：
２．５×１０５細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を６穴プレートの各穴に播種し、翌日、蛍光レポータータンパク質を発現する遺伝子を含有するベクターをトランスフェクションした。これは、さらに、０μｇ〜１μｇの直鎖状または１μｇの環状ＤＮＡを、３６μｇのＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０と、または１９μｇのＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０と３９μｇのＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２の混合物と、結合バッファー（７６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓ、ｐＨ７．２１）中、室温下に３０分間、予備インキュベートし、１ｍｌのＲＰＭＩと共に、予めＰＢＳ／ＢＳＡで一度洗浄した細胞に添加した。インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ２下、１時間のインキュベーションした後、それぞれ１ｍｌのＲＰＭＩ／２０％ＦＣＳを添加し、さらにインキュベーターでインキュベートした。その後、４時間後または２４時間後に蛍光顕微鏡で細胞を分析した。
【０１１０】
直鎖状または環状のＤＮＡおよびＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０とＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２の混合物との複合体による処理後に、レポーター遺伝子を発現する細胞を観察した（図１９を参照）。その際に、トランスフェクションされた細胞の数は、用いたＤＮＡまたはＤＮＡ−タンパク質複合体の量とともに上昇した。
【０１１１】
それに対して、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０のみを含有するＤＮＡ複合体によって、すなわちＤＮＡの非存在下では、レポーター遺伝子の発現は得られなかった。
【０１１２】
したがって、膜活性ペプチド、ここではＶＰ２２によって、ＮＰＦ形成タンパク質、ここではＵｖｓＸを修飾することによって、細胞のトランスフェクションおよびここでは特に膜通過が促進されることがわかる。本発明による方法またはトランスフェクション試薬のモジュラーの特徴は、さまざまに修飾されたタンパク質の組み合せ、ここではＶＰ２２およびＮＬＳによる修飾によって強調される（図２０も参照）。ＶＰ２２で修飾されたＵｖｓＸは、非エンドソーム膜通過を可能にする一方で、ＮＬＳで修飾されたＵｖｓＸは、トランスフェクションされたＤＮＡを細胞質から細胞核へ誘導し、その後にそこで発現することができる。
【０１１３】
したがって、複雑なトランスフェクション過程の個々のステップは、特に有利な方法で、特異的に、柔軟に、高い効率をもって制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】発現プラスミドの概略図。  実施例に記載されたＮＰＦ形成タンパク質の構造および作製を示す概略図である。
【図２】ＵｖｓＸの２本鎖ＤＮＡへの結合。  ７６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０または１ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓ中で、Ｈ６ＵｖｓＸの示された量と精製された１ｋｂのＰＣＲ断片それぞれ２００ｎｇの反応混合物を示す図であり、それらは、最終量１５μｌで室温下に３０分間インキュベートされ、０．８％のＴＡＥ／アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色されたものである。
【図３】異なるＡＴＰ−類似体の存在下におけるＮＬＳ−修飾されたＵｖｓＸの２本鎖ＤＮＡへの結合。  精製された１ｋｂのＰＣＲ断片の２５０ｎｇを、最終量２０μｌで７６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．５または２ｍＭの示されたヌクレオチド類似体中で１５μｇのＵｖｓＸＨ６Ｎ２と室温下に３０分間インキュベートした。次いで、反応混合物を分け、半分（Ｂ）に１．７ｋｂのＰＣＲ断片２２０ｎｇを添加し、さらに室温下に３０分間インキュベートし、０．８％のＴＡＥ／アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。
【図４】ＵｖｓＸと修飾ＵｖｓＸの混合物の２本鎖ＤＮＡへの結合。  精製された１ｋｂのＰＣＲ断片それぞれ２００ｎｇを、精製されたＨ６ＵｖｓＸまたはＵｖｓＸＨ６Ｎ２の示された量とともに、７６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓ中で室温下に３０分間インキュベートし、次いですべての反応混合物を０．８％のＴＡＥ／アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。塩、微量のイミダゾール、グリセリンによってＤＮＡの電気泳動度がアーティファクトである可能性を排除するために、溶出バッファーまたは透析バッファーのサンプルが８および９レーンには含まれている。（最終濃度：５００ｍＭイミダゾールを含む１／１０ｖｏｌ溶出バッファー、５０％グリセリンを含む３／２０ｖｏｌ透析バッファー）。
【図５】エレクトロポレーションと組み合わせたＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションのＦＡＣＳｃａｎ分析。図５（ａ）は、ＤＮＡなしのエレクトロポレーションのＦＡＣＳｃａｎ分析を示す図である。図５（ｂ）は、ＵｖｓＸなしのベクターＤＮＡのエレクトロポレーションのＦＡＣＳｃａｎ分析を示す図である。図５（ｃ）は、ＵｖｓＸにパッケイジングされたベクターＤＮＡを入れたときのＦＡＣＳｃａｎ分析を示す図である。図５（ｄ）は、ＵｖｓＸ−ＮＬＳにパッケイジングされたベクターＤＮＡを入れたときのＦＡＣＳｃａｎ分析を示す図である。
【図６】エレクトロポレーション法と組み合わせたＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの別のＦＡＣＳｃａｎ−分析。ＵｖｓＸ−ＮＬＳ（ＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２）にパッケイジングされたベクターＤＮＡおよびＵｖｓＸ−「スクランブル化」−ＮＬＳ（ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ｓｃ）にパッケイジングされたベクターＤＮＡを入れたトランスフェクションのＦＡＣＳｃａｎ−分析の結果を示す棒グラフである。
【図７】マイクロインジェクションと組み合せたＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの蛍光顕微鏡分析。マイクロインジェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞における蛍光マーカータンパク質（左側）の発現が示されている。インジェクションマーカーとしては、適切な蛍光フィルタで可視化したＢＳＡ−Ｃｙ５を使用した（右側）。写真１および２は、ＤＮＡおよびＵｖｓＸＨ６Ｎ２ｓｃが細胞質に注入された細胞を示し、写真３および４は、ＤＮＡおよびＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２が、写真５および６は、ＤＮＡのみが注入された細胞を示す。
【図８】ＳＡＳＰ−タンパク質発現プラスミドの概略図。実施例７および８に記載されたＳＡＳＰ−タンパク質の構造および作製を示す概略図である。
【図９】（Ａ）ＳＡＳＰ−タンパク質の精製。（Ｂ）ＳＡＳＰ−タンパク質のＤＮＡ結合能。図９（Ａ）は、精製されたＳＡＳＰ−タンパク質を泳動したＳＤＳ−ゲルを示す図である。図９（Ｂ）は、ＤＮＡ−シフト−分析におけるＳＡＳＰ−タンパク質のＤＮＡへの結合を示す図である。
【図１０】（Ａ）ＳＡＳＰ−ＮＬＳ−タンパク質の精製。（Ｂ）ＳＡＳＰ−ＮＬＳ−タンパク質のＤＮＡ結合能。図１０（Ａ）は、精製されたＳＡＳＰ−ＮＬＳ−タンパク質（ＳＡＳＰ−Ｈ６Ｎ２）を泳動したＳＤＳ−ゲルを示す図である。図１０（Ｂ）は、ＤＮＡシフト分析におけるＳＡＳＰ−ＮＬＳ−タンパク質のＤＮＡへの結合を示す図である。
【図１１】ＲＧＤ−モチーフをもつペプチドとＨ６ＵｖｓＸのカップリング。ペプチドＲＧＤ２が化学的にカップリングされたまたはされていないＨ６ＵｖｓＸ−タンパク質の電気泳動分離を示す図である。２つの互いに独立して調整されたＨ６ＵｖｓＸ＊（ＲＧＤ２）のサンプルが示されている。各レーンには約１μｇのタンパク質を泳動した。
【図１２】さまざまに修飾されたＵｖｓＸ−タンパク質の２本鎖ＤＮＡへの結合。２本鎖ＤＮＡフラグメントと、Ｈ６ＵｖｓＸ＊（ＲＧＤ２）とＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２（レーン１）の混合物、またはＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２のみ（レーン２）、またはＨ６ＵｖｓＸ＊（ＲＧＤ２）のみ（レーン３）からなるＮＰＦをアガロース−ゲル中で分離した図である。
【図１３】ＵｖｓＸＨ６Ｎ２およびＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＮＩＴ−２の蛍光標識ＤＮＡへの結合のＤＮＡ−シフト−分析。ＤＮＡ−ＵｖｓＸＨ６Ｎ２およびＤＮＡ−ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＮＩＴ−２のＤＮＡ−シフトを示す図である。タンパク質は、実施例１０に記載したように、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−標識したＤＮＡフラグメントとインキュベートした。
【図１４】エンドサイトーシスによるＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮＰＦの取り込みの蛍光顕微鏡分析。図１４ａと図１４ｂは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の蛍光顕微鏡像を示す図である。それぞれ明視野（下）および明蛍光（上）が示されている。明視野には、エンドサイトーシスによって取り込まれた蛍光標識ＤＮＡのために蛍光を発する小胞性の細胞内区画が見られる。
【図１５】エンドサイトーシスによって取り込まれたＮＰＦを有する細胞の割合（％）。少なくとも１つの、蛍光を発する小胞性区画を有する細胞の割合（％）を示す棒グラフである。
【図１６】発現プラスミドの概略図。ｈＲａｂ５１−融合タンパク質を製造するための発現プラスミドの構造を示す概略図である。
【図１７】ＮＬＳ修飾ｈＲａｄ５１（ｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２）の２本鎖ＤＮＡへの結合。図１７（Ａ）は、ニッケル−キレート−親和性クロマトグラフィにより精製後のＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２（１２．７μｇ）およびｈＲａｄ５１Ｈ６（１１μｇ）を泳動したＳＤＳ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ゲルを示す図である。図１７（Ｂ）は、３８ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、８．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＡＴＰ、および２５％グリセリン中で、ｈＲａｄ５１Ｈ６Ｎ２の示された量と、精製された０．９ｋｂのＰＣＲ断片それぞれ１００ｎｇの反応混合物を、最終量３０μｌで３７℃下に１０分間インキュベートし、１％のＴＡＥ／アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した図である。
【図１８】様々な修飾ＵｖｓＸ（ＵｖｓＸ−ＮＬＳ−ＶＰ２２およびＵｖｓＸ−ＮＬＳ）の混合物の２本鎖ＤＮＡへの結合。図１８（Ａ）は、ＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０を泳動したＳＤＳ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ゲルを示す図である。図１８（Ｂ）は、精製された１．７ｋｂのＰＣＲ断面のそれぞれ１４０ｎｇを、精製されたＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０またはＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２の示された量とともに９６ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１８ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１．３ｍＭ  ＡＴＰ−γ−Ｓ中で室温下に３０分間インキュベートし、次いですべての反応混合物を０．８％のＴＡＥ／アガロース−ゲルで泳動し、臭化エチジウムで染色した。
【図１９】ＤＮＡおよびＵｖｓＸ−ＮＬＳ−ＶＰ２２とＵｖｓＸ−ＮＬＳの混合物の複合体で処理してトランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞。１μｇの発現ベクターＤＮＡおよび１９μｇのＵｖｓＸＨ６Ｎ２ＶＰ２２ｃ５０と３９μｇのＵｖｓＸＨ６Ｎ２−２の混合物からなる複合体による処理後２４時間のＮＩＨ３Ｔ３細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図２０】本発明による核タンパク質フィラメントに基づく方法及びトランスフェクション試薬の基本的構造を示す概略図。
【図１】
2005505233.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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