(57)【要約】細胞、主として様々な起源の幹細胞の成長および分化に対する薬剤の影響を試験する方法および組成物が開示される。主として神経始原細胞への経路に沿った骨髄幹細胞の成長および分化を誘導する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補薬剤をその細胞成長誘導活性または細胞分化誘導活性について評価する方法であって、
（ａ）細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料で被覆された支持体表面を形成し、それに少なくとも１種類の生物活性薬剤を結合させ、少なくとも１個の露出されたＣＡＲ材料領域と少なくとも１個の露出された生物活性薬剤領域とを生じさせる工程であって、前記ＣＡＲ材料、前記少なくとも１種類の生物活性薬剤または両者の組合せが候補薬剤である工程；
（ｂ）前記支持体表面に、細胞が前記各領域の各々と接触するように細胞を添加する工程；および
（ｃ）前記各領域の各々の上での細胞成長および／または分化を検出または測定する工程
を含み、領域上の細胞成長または分化の存在が、前記領域中に存在する前記候補誘導薬剤が成長誘導活性または分化誘導活性を有することの指標となることを特徴とする評価方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのＣＡＲ領域は、（ａ）ポリエチレングリコール、（ｂ）グライム、（ｃ）グライム誘導体、（ｄ）ポリ−ＨＥＭＡ、（ｅ）ポリイソプロピルアクリルアミド、（ｆ）ヒアルロン酸、（ｇ）アルギン酸および（ｈ）（ａ）〜（ｇ）の任意の組合せからなる群から選択されるＣＡＲ材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの生物活性領域は、細胞外マトリックス分子または成長因子である生物活性薬剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物活性薬剤は、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、エラスチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、またＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）からなる群から選択される細胞外マトリックス分子であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物活性薬剤は細胞外マトリックス分子または他の細胞接着分子の接着ドメインであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出または測定する工程は前記細胞への抗体の結合を視覚化することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＣＡＲ領域は組織培養処理した表面に結合されたＣＡＲ材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＣＡＲ材料は、前記表面へ直接結合された中間層を介して表面へ結合されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記中間層は、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｄ−オルニチン、ポリ（ビニルアミン）またはポリ（アリルアミン）を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物活性薬剤を添加するのに先立って前記ＣＡＲ材料を穏やかな酸化剤で酸化することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物活性領域は成長因子を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの生物活性領域は複数のスポットの形態であり、各スポットがその上に堆積された少なくとも１つのタイプの生物活性分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの生物活性領域は複数のスポットの形態であり、各スポットが異なる濃度の、１つのタイプの生物活性分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの生物活性領域は前記表面上のグリッドパターン状のスポットの形態であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数のスポットは前記表面上のグリッドパターン中にあることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のスポットは前記表面上のグリッドパターン中にあることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物活性分子は細胞外マトリックス分子であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物活性分子は細胞外マトリックス分子であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの生物活性領域は複数のウェルの形態であり、各ウェルががその上に堆積された少なくとも１つのタイプの生物活性分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物活性分子は細胞外のマトリックス分子であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞は幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記幹細胞は多能性幹細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記幹細胞は始原幹細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記幹細胞は胚性幹細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記幹細胞は造血幹細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記幹細胞は骨髄由来幹細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記幹細胞は骨形成幹細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記幹細胞は神経始原細胞に分化することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）１または複数の細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）薬剤および神経始原細胞への幹細胞分化を誘導する１または複数の生物活性薬剤で被覆された表面を有する培養容器中で幹細胞を接触させる工程；および
（ｂ）前記幹細胞を、これらが神経始原細胞に分化することが可能になるのに十分な時間の間、培養する工程
を含むことを特徴とする神経始原細胞への幹細胞の分化を誘導または促進する方法。
【請求項３１】
（ｃ）前記分化を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物活性薬剤は細胞外マトリックス分子であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物活性薬剤はポリカチオン性ポリアミノ酸および細胞外マトリックス分子の組合せであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記組合せは（ａ）ポリ−オルニチンとラミニン；（ｂ）ポリ−オルニチンとフィブロネクチン；（ｃ）ポリ−オルニチンとＶＩ型コラーゲン；（ｄ）ポリ−オルニチンとビトロネクチン；（ｅ）ポリ−リジンとＶＩ型コラーゲン；（ｆ）ポリ−リジンとビトロネクチン；および（ｇ）ポリ−オルニチンとポリ−リジンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）表面を有する培養容器中で、幹細胞を異なる生物活性薬剤または異なる濃度の生物活性薬剤の並置領域の組み合わせと接触させる工程であって、この組み合わせが神経始原細胞への幹細胞分化を誘導することができる工程；および
（ｂ）前記細胞を、これらが神経始原細胞に分化することが可能になるのに十分な時間の間、培養する工程
を含むことを特徴とする神経始原細胞への幹細胞の分化を誘導または促進する方法。
【請求項３６】
（ｃ）前記分化を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生物活性薬剤は細胞外マトリックス分子であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）請求項３０に従って幹細胞の神経始原細胞への分化を誘導または促進して前記神経始原細胞を産生する工程；
（ｂ）必要に応じて、前記分化を検出する工程；および
（ｃ）前記神経始原細胞を富化または単離する工程
を含むことを特徴とする幹細胞から神経始原細胞の単離または富化された集団を産生する方法。
【請求項３９】
前記生物活性薬剤は細胞外マトリックス分子であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）請求項３５に従って幹細胞の神経始原細胞への分化を誘導または促進して前記神経始原細胞を産生する工程；
（ｂ）必要に応じて、前記分化を検出する工程；および
（ｃ）前記神経始原細胞を富化または単離する工程
を含むことを特徴とする神経始原細胞の単離または富化された集団を産生する方法。
【請求項４１】
前記生物活性薬剤は細胞外マトリックス分子であることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＣＡＲ材料は（ａ）ポリエチレングリコール、（ｂ）グライム、（ｃ）、グライム誘導体、（ｄ）ポリ−ＨＥＭＡ、（ｅ）ポリイソプロピルアクリルアミド、（ｆ）ヒアルロン酸、（ｇ）アルギン酸および（ｈ）（ａ）〜（ｇ）の任意の組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項３０、３５、３８または４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣＡＲ材料はヒアルロン酸であることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＡＲ材料は前記表面に結合された中間層に結合されることを特徴とする請求項３０、３５、３８または４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記中間層はポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄリジン、ポリ（ビニルアミン）およびポリ（アリルアミン）からなる群から選択されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞は幹細胞であることを特徴とする請求項３０、３５、３８または４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記幹細胞は骨髄幹細胞であることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記幹細胞は多能性幹細胞であることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出工程は、神経始原細胞へ分化した細胞中またはその細胞上のネスチンを検出または測定する工程を含むことを特徴とする請求項３１または３６に記載の方法。
【請求項５０】
ネスチンはネスチンに対して特異的な抗体を使用して検出または測定されることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
候補薬剤をその細胞成長誘導活性または細胞分化誘導活性について評価するのに有用な物品であって、
（ａ）少なくとも１種類の生物活性薬剤を結合しているＣＡＲ材料で被覆された支持体表面を含み、これにより、得られた表面が少なくとも１個の露出されたＣＡＰ材料領域および少なくとも１個の露出された生物活性領域とを含み、ここで、ＣＡＲ材料、少なくとも１種類の生物活性薬剤または両者の組合せが候補薬剤である物品。
【請求項５２】
前記少なくとも１種のＣＡＲ材料は（ａ）ポリエチレングリコール、（ｂ）グライム、（ｃ）グライム誘導体、（ｄ）ポリ−ＨＥＭＡ、（ｅ）ポリイソプロピルアクリルアミド、（ｆ）ヒアルロン酸、（ｇ）アルギン酸および（ｈ）（ａ）〜（ｇ）の任意の組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項５１に記載の物品。
【請求項５３】
前記少なくとも１個のＣＡＲ領域は前記ＣＡＲ材料が結合された組織培養処理表面を含むことを特徴とする請求項５１に記載の物品。
【請求項５４】
前記少なくとも１つの生物活性領域は細胞外マトリックス分子または成長因子である生物活性薬剤を含むことを特徴とする請求項５１に記載の物品。
【請求項５５】
前記少なくとも１つの生物活性領域は、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、エラスチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、エンタクチン、プロテオグリカン、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）からなる群から選択される細胞外マトリックス分子を含むことを特徴とする請求項５３に記載の物品。
【請求項５６】
前記少なくとも１つのＣＡＲ領域は前記表面へ直接結合された中間層を介して表面に結合されることを特徴とする請求項５１に記載の物品。
【請求項５７】
前記中間層はポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄリジン、ポリ（ビニルアミン）またはポリ（アリルアミン）を含むことを特徴とする請求項５６に記載の物品。
【請求項５８】
前記生物活性領域は、骨形態形成タンパク質、表皮成長因子、エリスロポエチン、ヘパリン結合因子、肝細胞成長因子、インシュリン、インシュリン様成長因子ＩまたはＩＩ、インターロイキン、筋肉形態形成タンパク質、神経成長因子、血小板由来成長因子およびトランスフォーミング増殖因子αまたはβからなる群から選択される成長因子を含むことを特徴とする請求項５４に記載の物品。
【請求項５９】
前記少なくとも１つの生物活性領域は複数のスポットの形態であり、各スポットがその上に堆積された少なくとも１種類の生物活性分子を含むことを特徴とする請求項５１に記載の物品。
【請求項６０】
前記少なくとも１つの生物活性領域は複数のスポットの形態であり、各スポットは１種類の生物活性分子を異なる濃度で含むことを特徴とする請求項５１に記載の物品。
【請求項６１】
前記複数のスポットは、前記表面上のグリッドパターンとして配列されていることを特徴とする請求項５９または６０に記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の成長、分化その他の活性に及ぼす影響について細胞培養物中で薬剤を試験するために使用され得る方法に向けられる。また、本発明は、骨髄幹細胞を誘導して主として神経始原細胞（“ＮＰＣ”）に、培養物中で成長および分化させる特定の薬剤の使用に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
組織工学技術者の目標は、細胞を用いて生きた３次元組織および器官を造り出すことにより、これらの需要を満たすことである。多くの場合、そのアプローチは、細胞をうまく扱って、細胞を巨視的なスケールで組織化するための物理的な足場を用いて細胞に適当な大きさおよび／または形状の組織構造を形成させ、適当な細胞成長、移動および分化を刺激する分子的きっかけを与えるというものである。例えば、骨工学および血管工学などのいくつかの適用例では、供与材料は、刺激を受けて移動、増殖および分化し得る始原細胞であり、これは体内部位に埋め込まれた足場の中で適当な組織構造を形成させる。
【０００３】
幹細胞は、無期限の間分裂（自己複製）し、適切な条件下で生命体を構築する多くの異なる細胞タイプをもたらす（分化する）能力を有する細胞である。すなわち、幹細胞は、心臓細胞、皮膚細胞、神経細胞などのような、特有の形態や特殊化した機能を有する成熟細胞に成長する可能性を持っている。
【０００４】
胚性幹（ＥＳ）細胞は生命体のすべてのタイプの細胞に分化できる。他の幹細胞と異なり、それらは、３種類の主要な胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉または内胚葉の全てから誘導される細胞に分化できる。成人の生命体の各細胞タイプおよび組織タイプは、これらの主要な３種類の胚葉に起源を持つ。内胚葉は気道および消化管の内張りとなる上皮細胞の源であり、咽頭、食道、胃および腸並びに唾液腺、肝臓、膵臓および肺を含む多くの腺組織および器官を与える。中胚葉は、平滑筋細胞、結合組織および組織や器官を縫って走る様々な管の元となる。中胚葉は、心臓血管系の大半を形成し、骨髄や血球、骨格、横紋筋並びに生殖器官および排泄器官の源である。外胚葉は、表皮、感覚器官並びに脳、脊髄およびすべての末梢神経を含む全神経系を形成する。
【０００５】
骨髄、末梢血、脳、脊髄、歯髄、血管、骨格筋、皮膚および消化器系の上皮組織、角膜、網膜、肝臓および膵臓中で同定される体性幹細胞は、ＥＳ細胞よりも可能性が限定されており、通常、それらが起源とする組織の機能に関与する細胞に分化するにとどまる。例えば、脳から得た体性幹細胞（神経幹細胞）は、ニューロンとグリア細胞を生じさせ、皮膚から得た体性幹細胞は、基底細胞、扁平上皮細胞およびメラノサイトを生じさせ、そして、血液（または造血）幹細胞は、赤血球、白血球および血小板を生じさせる。
【０００６】
最近の研究では、同一または異なる胚葉に由来する組織に対応する細胞を含めた、ある条件下で無関係な組織の専門細胞に分化する可能性を持った体性幹細胞が同定されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。例えば、血液幹細胞（中胚葉起源）はある状況の下で骨格筋細胞（同じく中胚葉起源）およびニューロン（外胚葉起源）を生成することができる。
【０００７】
したがって、上記に基づけば、そのような体性幹細胞は、究極的には多くの疾病および欠乏症を治療するのに役立つ様々な子孫に分化する更新可能な細胞源として使用することができる。特に重要な１つの使用は、パーキンソン病（”ＰＤ”）のような神経学的疾病の治療である。不運なことに、神経幹細胞は脳内の深部に存在するため、これを得るためのアクセスが厳しく制限されており、特に潤沢に入手できる供給源ではない。反対に、骨髄（ＢＭ）幹細胞はより豊富であり、アクセス可能である。骨髄幹細胞が単なる骨髄吸引で獲得できるという容易は、これらを治療用として優れた候補にする。
【０００８】
ＢＭは多くの幹細胞タイプを含む。これらの中で最もよく知られているのは、造血幹細胞（ＨＳＣ）および骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）である。正常な哺乳動物では、ＨＳＣは血球を生じさせ、一方、ＭＳＣは、軟骨や骨、造血を支持するストローマ細胞および脂肪のような他の組織および部位に在る細胞タイプを生じさせる。最近の研究は、これらのＢＭ幹細胞は、ある条件下では、心筋細胞、肝細胞および骨格筋細胞のようなその他の細胞タイプに分化し得ることを示唆している。さらに、ＢＭ幹細胞はニューロンを生成する可能性を有することが示されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。Ｃｈｏｐｐのグループは、脳卒中を起こさせたラットを治療するためにヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）の使用を検討した。非特許文献８は、脳卒中後における神経学的機能の欠損に対する、静脈内投与されたｈＭＳＣｓの影響を試験した。虚血を伴う対照ラットと比較して、ｈＭＳＣによる治療は１４日間で顕著な機能回復をもたらした。このｈＭＳＣ治療からもたらされる神経学的な利益は、虚血組織における成長因子の増加、傷害周辺（ｐｅｎｕｍｂｒａｌ）領域でのアポトーシスの減少および脳室下（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）領域での内因性細胞の増殖に起因するようであった。同じグループによる最近の論文、非特許文献９は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）からの脳組織抽出物でコンディショニングされたヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）の培養物内で、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を含めた様々な成長因子の経時的プロフィールを調査した。このような培養物中でｈＭＳＣは、より多くのＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦを生産する応答を示し、これは移植されたｈＭＳＣが、部分的には神経保護と血管新生を促進し得る多くの成長因子を応答的に分泌することによって治療効果をもたらすという考えを裏付けるものである。
【０００９】
ＢＭ由来幹細胞を含めた、いくつかのタイプの幹細胞に由来する実験室成長細胞は、神経学的疾患に罹患する個体の脳内に移植するための望ましい移植可能な材料源かもしれない（非特許文献１０）。
【００１０】
幹細胞に分化を誘導するためには、（ａ）培養物中で非分化細胞の生存および／または自己更新を支援し、かつ、（ｂ）それらを刺激してニューロンのような所望の細胞系統に委ねられるようにする分子と細胞培養条件の正しい組合せを特定することが望ましい。そのあと、そのような細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏの適当な部位に挿入してその成長および分化プログラムを完成させることができる。
【００１１】
ＨＳＣから実質的に精製されたＭＳＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＰＣに分化できるが、ＨＳＣがＢＭ幹細胞の構成要素である場合、その時にはｉｎ  ｖｉｖｏでのみ、ＨＳＣのみがそのようなプログラムを受け得るようである。ＨＳＣがｉｎ  ｖｉｔｒｏでニューロン特性を発揮し得るかどうかを発見し、そして、そのような分化のための要因および条件を決定することが望ましいであろう。
【００１２】
ＨＳＣ（または他の幹細胞）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで特別の子孫に分化するプロセスは、成長因子、細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）分子および構成要素、環境上のストレッサーおよび直接の細胞間相互作用を含む多くの要因の作用を必要とする。しかし、特定の経路に沿った幹細胞分化を高めるかまたは指示する適切な薬剤は、予見困難であろう。
【００１３】
例えば、ヒト「白血病阻害因子」（ｈＬＩＦ）をヒトＭＳＣの培養物に加えた場合、これらの細胞は線維芽細胞の形態を進展させた（非特許文献４）。しかし、この同じタンパク質は、マウスＥＳ細胞を未分化状態に維持するのに不可欠なことも示されている（非特許文献４）。これは、特定の細胞タイプに対する特定の分子の影響を前もって知ることの困難さを示している。
【００１４】
Ｗｏｏｄｂｕｒｙらは、β−メルカプトエタノールを含む培地においてＭＳＣを培養することによりニューロンの分化を開始させた。しかし、１つの実験の中でも、そして、実験間でも分化を受ける細胞の数は著しく変動し、この分子は「最適な」分化をもたらさなかった。これらの細胞を成長因子、ｂＦＧＦで前処理すると、より一貫した結果が得られた。
【００１５】
【特許文献１】
米国特許第５，８２７，７３５号
【特許文献２】
国際公開第０１／２１６７号パンフレット
【特許文献３】
米国特許第４，８１６，３９７号
【特許文献４】
米国特許第４，８１６，５６７号
【特許文献５】
米国特許第４，７０４，６９２号（Ladner）
【特許文献６】
米国特許第４，８５３，８７１号
【特許文献７】
米国特許第４，９４６，７７８号
【特許文献８】
米国特許第５，２６０，２０３号
【特許文献９】
米国特許第５，４５５，０３０号
【特許文献１０】
米国特許第４，４９３，７９５号（Nestor et al.）
【非特許文献１】
Orlic et al. Nature 410:701-705 (2001)
【非特許文献２】
Gussoni et al. Nature 401:390-394 (1999)
【非特許文献３】
Bjornson et al., Science 283:534-537 (1999)
【非特許文献４】
Sanchez-Ramos et al. Exp. Neurol. 164 247-256 (2000)
【非特許文献５】
Woodbury et al. J Neurosci. Res. 62: 364-370 (2000))
【非特許文献６】
Mezey et al. Science 290: 1779-1782 (2000)
【非特許文献７】
Brazelton et al. Science 290: 775-1779 (2000)
【非特許文献８】
Li Y et al., Neurology, 2002, 59:514-523
【非特許文献９】
Chen X et al., J Neurosci Res, 2002, 69:687-691
【非特許文献１０】
ウェブアドレス：nih.gov/news/stemcell/scireport.htm（２００１年６月
【非特許文献１１】
Tabata T, Nature Rev Genet, 2001, 2:620-630
【非特許文献１２】
Scully KM et al., Science, 2002, 295:2231-2235
【非特許文献１３】
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【非特許文献１４】
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【非特許文献１５】
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【非特許文献１６】
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【非特許文献１７】
Cell Biology: A Laboratory Handbook "Volumes I-III (J.E. Celis, ed. (1994);
【非特許文献１８】
Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984);
【非特許文献１９】
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【非特許文献２０】
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【非特許文献２１】
Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., (1986))
【非特許文献２２】
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【非特許文献４２】
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【非特許文献４３】
Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879
【非特許文献４４】
Hartlow, E. et al., Antibodies -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
細胞培養条件をアッセイするための現在利用可能な方法は、細胞成長および分化に影響を及ぼすため、様々な濃度で様々な薬剤が及ぼす相対的な影響を容易かつ迅速に評価することができない。一般に、細胞は、組織培養プレートの隣接したウェルにおいて異なる成分を含む培地中で成育され、次いで、例えば、分化を示すマーカーの存在について試験される。例えば、形態学におけるわずかな変化を誘導するだけの細胞シグナリング因子のより微妙な影響は、試料が別個のウェルにある場合は容易には観察または識別できない。細胞培養条件を最適化するためには多くの薬剤を試験する必要があるので、広範囲な試験に頼らずに次善の因子を迅速に除去する方法があることは有益であろう。さらに、別個のウェルまたは容器中での培養は、それに影響を及ぼす可能性のある薬剤に向かって、またはそれを忌避するように細胞が移動するのを防ぐ。こうした移動は、望ましい表現型への分化に結びつく細胞間シグナリングを可能にするものかもしれない。様々なシグナリング因子に応じて、幹細胞成長および分化のより微妙でより劇的な変化を迅速かつ容易に観察および識別し得る一般的な方法を持つことは有用であろう（本明細書に記載するそのような方法は、より詳細には、米国仮出願６０／３３５，８９８号に基づき本明細書と同日付でＨｅｉｄａｒａｎらにより出願された同時係属中の米国特許出願番号          に記載されている。これらのすべては参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００１７】
さらに、ＨＳＣのＮＰＣへの分化を可能にする方法は、それが神経学的疾患の治療におけるこれら幹細胞の有用性を高めるので、望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、その一部としては、そのような分化を誘導する可能性を有する誘導性薬剤を評価し同定する方法の使用に基づいて、様々なタイプの幹細胞のＮＰＣへの分化を誘導する方法に向けられる。
【００１９】
さらに一般的には、本発明は、複数の可能な誘導性薬剤または異なる濃度の可能な誘導性薬剤を、単一細胞培養表面上で細胞成長および／または分化に関する効果について試験する方法を提供する。この方法は、可能な誘導性薬剤をその上に有する支持体表面を、少なくとも１つのＣＡＲ領域および少なくとも１つの生物活性領域（これらの用語は以下に定義される）の形態で形成すること、および、前記各領域上に細胞を配置し、前記各領域に接触し、それによって生物活性領域を構成する生物活性分子に曝露される細胞に関する効果を決定することを含んでいる。
【００２０】
上記に関連して、本発明は、細胞が領域間の違いまたは勾配に応答することができるように単一表面上または単一培養容器中に異なる生物活性領域を並置した組成物および方法に向けられる。例えば、並置された生物活性領域は、異なる生物活性薬剤、または同一の生物活性薬剤を異なる濃度で含むもことができ、これにより、特定の生物活性薬剤の濃度勾配が細胞の活性、例えば成長または分化に対する誘導するシグナルとして働き得る場合、細胞はそのような勾配に従って応答することができる。従来の細胞培養方法を使用する場合、本発明により達成されたこのような条件は、従来の培養表面または容器の中またはそれらの上では生じないものであった。したがって、このアプローチは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは重要であり得るが従来の細胞／組織培養環境では失われていたシグナルおよび相互作用の検出を可能にする。
【００２１】
細胞の分化、発生および機能に勾配が影響する例は、当分野、特に発生生物学においてよく知られている。非特許文献１１は、細胞と組織の組織化が「形態付与」シグナリング分子（これはモルフォゲンと呼ばれ、濃度依存的に発生場をパターン化する）の作用によってどのようにコントロールされるか説明した。モルフォゲンの濃度勾配は、発生パターンを予め表わす。哺乳類脳下垂体の発生（非特許文献１２）の間には、別個の組織化中心から発するシグナリング勾配に対向的に応答して別個の細胞タイプが現われている。これらのシグナルは、時間的および空間的に重複するパターンで相互作用的転写レギュレータの発現を誘導する。同時に、それらは始原細胞の増殖および別個の細胞タイプの誘導を相乗的に調節する。発生のオーケストレーションを単純化するために、生命体は、細胞集団を別個の機能的なユニットに分ける戦略を使用する。そこでは、モルフォゲン勾配の「解釈」によって細胞の分野が細分され、次いで、これらの細分は局所的な細胞間相互作用によって維持され、改良される（非特許文献１３）。一旦細胞集団が分けられると、しばしばそれらの間の境界に沿って専門細胞が誘導され得る。次いで、これらの境界細胞は、周囲の細胞のパターニングに影響を及ぼし、連続的に組織のより細かい細分化を引き起こすことができる。非特許文献１４は、肝臓において遺伝子がポルトセントラル（ｐｏｒｔｏｃｅｎｔｒａｌ）な勾配に沿ってどのように発現されるかを明らかにした。これらの適応性のある挙動に基づくと、勾配対コンパートメントタイプ勾配が認識された。これらの著者は、シグナル分子のポルトセントラルな勾配を２つの遺伝子特異的変数、すなわち、その調節因子に対する遺伝子の親和性、およびシグナル−形質導入経路における応答を決定する協働性の度合いに依存する入力と出力として用いるモデルを試験した。異なる条件下で安定した発現パターンを保証するのには、２以上の異なるシグナル勾配間での相互作用は必要かもしれない。上記タイプの全ての相互作用は、従来のシステムではｉｎ  ｖｉｔｒｏで模倣することが困難であるが、その相互作用は、単一の細胞培養表面中またはその表面上で前もって決定したやり方で並置されたＥＣＭコンポーネントのような生物学的に活性な分子の個別領域の有用性のその認識によって本発明が包含する活性タイプの例である。
【００２２】
したがって、本発明は、幹細胞をＥＣＭ分子に接触させ、この幹細胞を神経始原細胞様細胞に分化することを可能にし、次いでこの分化を検出することを含む、幹細胞の神経始原細胞への分化を誘導する方法を提供する。また、骨形成原細胞への分化を誘導する方法も含まれる。
【００２３】
ＮＰＣ分化の好ましい誘導剤は、ＥＣＭ分子または他の非ＥＣＭポリペプチドとポリペプチドとの以下の組合せである。ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）／ラミニン、ＰＬＯ／フィブロネクチン、ＰＬＯ／ＶＩ型コラーゲン、ＰＬＯ／ビトロネクチン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）／ＶＩ型コラーゲンおよびＰＬＬ／ビトロネクチンである。さらに、ＰＬＯ／ＰＬＬの組合せも有効であった。上記のもののポリ−Ｄアミノ酸異性体も使用できる。
【００２４】
１つの実施形態では、神経始原細胞への幹細胞の分化を誘導または促進する方法は
（ａ）表面を有する培養容器中で、神経始原細胞への幹細胞分化を誘導することができる細胞外マトリックス分子に幹細胞を接触させること；および
（ｂ）神経始原細胞に分化することが可能になるのに十分な時間の間、幹細胞を培養すること
を含む。
【００２５】
この方法はさらに分化を検出するステップを含んでもよい。
【００２６】
また、神経始原細胞の単離または富化された集団を幹細胞から産生する方法であって、
（ａ）表面を有する培養容器中で、神経始原細胞への幹細胞分化を誘導することができる細胞外マトリックス分子に幹細胞を接触させること；
（ｂ）神経始原細胞に分化することが可能になるのに十分な時間の間、幹細胞を培養すること；
（ｃ）任意に、分化を検出すること；および
（ｄ）知られた手段を使用して神経始原細胞を富化または単離すること
を含む、方法も提供される。
【００２７】
上記方法において、表面は、好ましくは細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料またはそのような薬剤の層で被覆する。これは表面に直接結合させてもよいし、表面に結合された中間層への結合を介して間接的に結合させてもよい。
【００２８】
好ましいＣＡＲ材料は、（ａ）ポリエチレングリコール、（ｂ）グライム、（ｃ）グライム誘導体、（ｄ）ポリ−ＨＥＭＡ、（ｅ）ポリイソプロピルアクリルアミド、（ｆ）ＨＡ、（ｇ）ＡＡおよび（ｈ）（ａ）〜（ｇ）の任意の組合せを含む。最も好ましいのはＨＡである。
【００２９】
上記の中間の層はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−Ｄリジン（ＰＤＬ）、ポリ（ビニルアミン）（ＰＶＡ）およびポリ（アリルアミン）（ＰＡＡ）からなる群から選択することができる。ＰＥＩが好ましい。
【００３０】
上記の方法は、骨髄幹細胞（骨髄ストローマ細胞を含む）を含む幹細胞および多能性幹細胞を用いて行うことができる。これらの方法は長期細胞株であって、好ましくは、培養物中で成育できるだけでなく１種以上の誘導剤に応答して分化することができるものを含む任意の培養可能な細胞を使用しても実行できることが注意されるべきである。
【００３１】
ＮＰＣの分化を検出するためのステップは、培養物中でＮＰＣ経路に沿って分化するように刺激された細胞の表面内または表面上でネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）または他のＮＰＣのマーカーを観察するかまたは測定することを含む。好ましくは、ネスチンは特異的な抗ネスチン抗体を使用して測定する。
【００３２】
本発明はまた、候補薬剤を、その細胞成長誘導活性または細胞分化誘導活性について評価するのに有用な物品であって、
（ａ）少なくとも１種類の生物活性薬剤を結合しているＣＡＲ材料で被覆された支持体表面を含み、これにより、得られた表面が少なくとも１個の露出されたＣＡＰ材料領域および少なくとも１個の露出された生物活性領域とを含み、ここで、ＣＡＲ材料、少なくとも１種類の生物活性薬剤または両者の組合せが候補薬剤である物品に向けられる。
【００３３】
上記物品のうち少なくとも１個のＣＡＲ領域は、好ましくは、（ａ）ポリエチレングリコール、（ｂ）グライム、（ｃ）グライム誘導体、（ｄ）ポリ−ＨＥＭＡ、（ｅ）ポリイソプロピルアクリルアミド、（ｆ）ヒアルロン酸、（ｇ）アルギン酸および（ｈ）（ａ）〜（ｇ）の任意の組合せからなる群から選択されたＣＡＲ材料を含む。ＣＡＲ領域はＣＡＲ材料を結合させた組織培養で処理された表面でもよい。
【００３４】
物品は、好ましくは、ＥＣＭ分子または成長因子である生物活性薬剤を含む少なくとも１個の生物活性領域を有する。好ましいＥＣＭ分子はラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、エラスチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）、プロテオグリカンまたはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）である。
【００３５】
この物品において、ＣＡＲ領域は、追加の「中間材料」（これは表面へ直接結合され、好ましくは上に挙げた材料である）を介して表面に結合してもよい。
【００３６】
上記の方法および物品において、生物活性領域が成長因子を含む場合、成長因子は好ましくは骨形態形成タンパク質、表皮成長因子、エリスロポエチン、ヘパリン結合因子、肝細胞成長因子、インシュリン、インシュリン様成長因子ＩまたはＩＩ、インターロイキン、筋形態形成タンパク質、神経成長因子、血小板由来増殖因子、またはトランスフォーミング増殖因子αまたはβである。
【００３７】
上記物品において生物活性領域は、各スポットが少なくとも１種類の生物活性薬剤を含む複数のスポットの形態をとることができる。あるいは、上記少なくとも１個の生物活性領域は、各スポットが１種類の生物活性薬剤を異なる濃度で含む複数のスポットの形態をとることもできる。複数のスポットは、表面上にグリッドパターンで配列することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
従来の分子生物学的または細胞生物学的技術は、例えば、次の文献に開示されている。非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；および非特許文献２３。
【００３９】
「分化」という用語は、当技術分野ではよく知られており、本明細書で使用する場合は広義であり、より専門化されたまたは成熟したまたは関係した子孫細胞を生じる任意のおよび全てのタイプの幹細胞または始原細胞の可能性を含むように意図される。
【００４０】
「成長」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の数、細胞サイズ、または細胞器官のような細胞成分の量や濃度および／または細胞「突起」の長さの任意の増加を意味する。細胞「突起」は細胞質が延長したものであり、専門化された構造を含み得る。例には、軸索、樹状突起、仮足、繊毛、知覚末端および鞭毛が含まれる。
【００４１】
「誘導性薬剤」または「誘導薬剤」は、細胞の成長または分化を促進するように作用する物質である。
【００４２】
本明細書において、低親和性材料または薬剤は、「細胞接着抵抗」または「細胞接着抵抗性」（「ＣＡＲ」）材料または薬剤とも呼ばれる。これはそうしたものが存在すると、細胞接着または表面への付着が阻害されるかまたは妨げられるためである。これらの材料の特性に基づいて、ある種の巨大分子もＣＡＲ表面へそれほど多く結合しないようである。本発明によれば、誘導剤は、細胞培養装置または容器の表面または領域の形態で提供することもできる。細胞成長および／または分化は、表面をＣＡＲおよび／または生物活性にする、表面に与えられている性質によって促進または阻害され得る。低親和性材料またはＣＡＲ材料は一般に、細胞の付着または接着をできなくするか、または好ましくは阻害するものである。したがって、表面に結合されるかまたは表面上に被覆されたＣＡＲ材料は、細胞に対して低い親和性（＝接着抵抗性）の領域またはゾーンを作り、これらを規定する。適当なＣＡＲ材料は、以下のものに限定されないが、ポリエチレングリコール、グライムおよびそれらの誘導体、ポリ−ＨＥＭＡ、ポリ−イソプロピルアクリルアミドを含み、好ましくはヒアルロン酸（ＨＡ）およびアルギン酸（ＡＡ）を含めた多数の多糖類のうちの任意のものである。より好ましい実施形態では、ＨＡがＣＡＲ材料として使用される。一般に、高濃度の水酸基を含有する高度に親水性の物質は、ＣＡＲ材料として単独でまたは組合せのいずれかで使用できる。ＣＡＲ材料またはＣＡＲ表面は、（ａ）単独で、（ｂ）他のＣＡＲ材料との組合せで、または（ｃ）ＣＡＲ材料でない生物活性薬剤との組合せで、誘導剤として機能し得る。このような生物活性薬剤の効果は、本明細書に記載するか当技術分野でよく知られた方法およびアッセイを使用して、細胞成長または分化のような選択された細胞機能に対するそれらの影響について試験することができる。
【００４３】
「低親和性領域」またはＣＡＲ領域は、ＣＡＲ材料の載置、添加、スポットなどを施した支持体表面上の領域である。２つの領域が表面上で互いに隣接するか、または、第１の領域内もしくは該領域上の細胞が第２の並置された領域の信号または並置された領域間の濃度勾配に応答するのに十分なように互いに近接している場合、第１の領域は第２の領域に「並置」されている。並置された２つの領域は、他の表面が介在しないように直接の接触状態にあってもよいし、または互いに様々な距離で間隔を開けていてもよい。例えば、ＣＡＲ表面を覆う２つの生物活性領域は互いに接触してもよいし、または生物活性材料で覆われないＣＡＲ表面が両者を隔てていてもよい。
【００４４】
ＣＡＲ領域および生物活性領域の間のどのような幾何学的関係も本発明の範囲に含まれる。したがって、１つの好ましい表面は、ＣＡＲ層で均一に被覆され、その上に単一の薬剤または薬剤混合物を含む生物活性領域を、好ましくは共有結合的に結合されまたは非共有結合的に結合されて載置したものである。単一の薬剤を使用する場合、近隣の領域は異なる濃度のその薬剤を有することができる。生物活性領域は、間隔を置かずに互いに接触させてもよいし、またはそれらの間でＣＡＲ表面の未修飾の領域を有していてもよい。別の実施形態では、個別のＣＡＲ領域を表面上で分配する。これらのうちのいくつかは生物活性薬剤で修飾し、その結果、表面は、ＣＡＲのみの領域と（ＣＡＲ表面上の）生物活性領域を含む。そのような表面は、場合によっては、下にあるＣＡＲ材料がない状態の表面に結合されせた生物活性領域のみを含むものでもよい。そのような領域は、細胞培養または細胞アッセイで使用する任意の適当な表面上に調製することができ、シート、スライド、皿（例えばペトリ皿）、培養フラスコ、ウェルの数および幾何学的なレイアウトが任意である多重ウェルクラスタ皿を含む。好ましくは、９６ウェル、１９２ウェル、３８４ウェルなどを有する多重ウェルプレートである。
【００４５】
使用される特定のＣＡＲ材料または選択されるＣＡＲ材料の特定の濃度は、様々な程度で細胞接着を阻害し得る。例えば、ＡＡの０．５％（ｗ／ｖ）溶液で被覆されたポリスチレンは、３日後細胞接着を妨げることが分かった。０．１％（ｗ／ｖ）の溶液では、細胞接着は４時間の間はほとんど見られなかったが、３日間の培養後には実質的に増加した（非特許文献２４、その内容は参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）。
【００４６】
１つの実施形態では、アミンやイミンのような塩基性反応基を有する材料を、ＣＡＲ材料の下の支持体表面に直接結合させた中間層またはサブ層として使用することができる。本明細書で使用される場合、「中間層」または「サブ層」は支持体表面上に配置された材料の層であり、ＣＡＲ材料は好ましくはこれと反応して共有結合を形成する。市販材料の例はＰＥＩ、ＰＬＬ、ＰＤＬ、ＰＶＡおよびＰＡＡを含む。ＰＥＩは、支持体表面とイオン的に反応して表面にアミノ基をもたらすことができ、次いで、これはカルボジイミドカップリングを使用してＣＡＲ材料にカップリングすることができる。
【００４７】
本発明の別の態様において、ＣＡＲ材料は、中間層の必要なしで「組織培養処理した」支持体表面上に配置される。本明細書で使用される場合、「組織培養処理した」支持体表面は真空中のプラズマ放電またはコロナ放電で処理したものである。真空中のプラズマ放電のためには、支持体表面の成型された部分を真空チャンバーに置き、酸素を含むガス混合物をポンプで送り込む。不完全真空の所定条件下に、電気放電によって、支持体表面と反応する反応性プラズマを造り出す。このプロセスは、水酸基、カルボニル基およびカルボキシル基を含む負に帯電した官能基を表面上に造り出す。より複雑な組織培養処理表面を造り出すために他のガスの混合物を加えてもよい。例えば、Ｐｒｉｍａｒｉａ（商標）製品（ＢＤバイオサイエンス、ベッドフォード、ＭＡ）およびＣＥＬＬ＋（商標）製品（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、ニュートン、ＮＣ）の表面は、ＣＡＲ物質の付着を促進することができる正負両方の帯電官能基を含む。
【００４８】
別の実施形態では、ＰＥＩのようなサブ層または中間層を組織培養処理した支持体表面上に堆積させてもよい。
【００４９】
あるいは、ＣＡＲ材料は支持体表面の一部分の上にのみ載置またはスポットしてもよい。このような幾何学的構成は、支持体表面自体またはサブ層が誘導剤として機能するかどうかの決定を可能にする。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「生物活性薬剤」は、生理学的な細胞のプロセスに影響を及ぼし、かつ、細胞接着を許すかまたは増強する物質、典型的には分子である。「生物活性領域」は、添加された生物活性薬剤を含む支持体表面上のエリア、ゾーンまたは領域として定義される。生物活性薬剤は一般に、抗体およびＥＣＭ分子を含めた、ペプチド、ポリペプチド（天然または合成）、タンパク質を含むが、これらに限定されない。細胞または組織の任意の溶解物または抽出物も、生物活性薬剤として働き得る（但し、そのような調製物は事実上、生物活性薬剤の集合体である）。ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）およびＰＬＬなどのある種のポリアミノ酸は、互いに組み合わせて、または選択されたＥＣＭ分子と組み合わせて使用されたとき、ＮＰＣ分化の有効な誘導剤となる。好ましい組合せは次のとおりである：ＰＬＯ／ラミニン、ＰＬＯ／フィブロネクチン、ＰＬＯ／ＶＩ型コラーゲン、ＰＬＯ／ビトロネクチン、ＰＬＬ／ＶＩ型コラーゲンおよびＰＬＬ／ビトロネクチン。
【００５１】
ＥＣＭ分子（例えば、非特許文献２５参照。参照によって本明細書に組込まれる）は、当業者によく知られている。制限ではないＥＣＭ分子の例としてはフィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン類、ラミニン、エラスチン、様々なプロテオグリカン類、グリコサミノグリカン類などである。多数のＥＣＭ分子が市販されている。例えば、非常に一般に用いられているＥＣＭ材料であるＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、ＥＨＳマウス肉腫の腫瘍から作られており、ＢＤバイオサイエンス（ベッドフォード、ＭＡ）から入手可能である。
【００５２】
上述のように、生物活性薬剤は、ある細胞タイプについて特定の濃度で誘導剤として機能し得る。しかし、生物活性薬剤は細胞成長、細胞分化または他の細胞機能の抑制剤ともなり得る。
【００５３】
本発明の１つの実施形態では、生物活性薬剤が成長および／または分化を禁じるかどうか決めるために、表面の生物活性領域は同じ表面のＣＡＲ領域と比較される。１つの実施形態では、生物活性薬剤が誘導剤として機能し、一方、ＣＡＲ材料が細胞分化に効果を有しない。別の実施形態では、誘導剤か信号は、細胞が、生物活性薬剤の差または生物活性薬剤の濃度の差に応答することができるそのような一つの表面上で並置される、１つ以上の異なる生物活性領域の勾配の形になる。そのような誘導は典型的には細胞の活性に刺激的である。しかし、別の実施形態では、特定の生物活性薬剤または異なる生物活性領域の並置によって作成された勾配は、細胞成長または分化（または他の細胞の活性）の誘導を抑制するか妨げるように働く。
【００５４】
より大きな分子、典型的には、それら自身生物活性薬剤である巨大分子の断片またはドメインも本発明で意図されるような生物活性薬剤となり得る。好ましい断片は、リガンド結合ポリペプチドの細胞外ドメイン、例えば、ＥＣＭ分子のリガンド結合領域ドメインまたは断片または領域である。これらは「接着領域」（下に定義する）でもよい。細胞レセプターまたはレセプターに由来するそのようなリガンド結合領域に結合するリガンドは、細胞表面の膜内外タンパク質と結合する結果として、細胞接着を促進することにより、誘導剤として機能し得る。膜内外タンパク質は情報を伝達し、細胞の外から内部に分子を運ぶことができる。膜内外タンパク質の多くは、細胞外のリガンド結合ドメインと細胞内のシグナル調節ドメインによって特徴付けられるレセプターである。レセプターがリガンドを結合すると、レセプターのコンホメーションまたは他の分子に対する親和性の変化によって、酵素仲介された反応の細胞内カスケードが開始され、細胞外の結合イベントによって始められたシグナルの増幅が引き起こされる。このプロセスは「シグナルトランスダクション」と呼ばれる。典型的な哺乳類細胞の表面は、数十の異なるタイプのレセプターを含み、これらはそれぞれ特有のまたは共通のシグナルトランスダクション経路を誘発する能力を持っている。生存、増殖、分化およびアポトーシスを含む細胞の機能は、高度に動的なシステムにおける多数の同系統のレセプター分子と相互作用する多数のリガンド分子からの統合された信号によって管理されている。
【００５５】
多数のＥＣＭ分子の構造的／機能的な特性を理解するために用いられる技術により、レセプター結合機能は、より大きなレセプタータンパク質の小さな「接着ドメイン」にマッピングされている。本明細書で使用される場合、「接着ドメイン」は、約３個〜約２０個のアミノ酸の長さであり、その配列は、好ましくは異なるタンパク質の中に保存されている（非特許文献２６）。１つの原型接着ドメインは、トリペプチドであるアルギニン−グリシン−アスパルテート（ＲＧＤ）であり、これはＥＣＭ分子フィブロネクチンへの細胞接着のために必要な最小配列として最初に同定された。ＲＧＤは、その後ＥＣＭ分子のより広い配列への細胞接着に関係することが分かった。ＥＣＭ分子内の他の短い接着仲介ペプチドドメインが同定され特徴付けられている（非特許文献２６）。これらの接着ドメインペプチドは、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）と呼ばれる細胞表面接着レセプターのクラスと相互作用する。機能性インテグリンレセプターは、１６αチェーンおよび８βメンバーのファミリーから引き出されている２個のサブユニット、αチェーンおよびβチェーンを含み、これはレセプター−リガンド相互作用の特異性において大きな多様性を許す。インテグリンは、接着それ自体に加え、細胞挙動の多くの面を仲介する。適当な表面にペプチド接着ドメインを設けることによるインテグリン結合の操作は、培養物中の細胞成長および分化に影響し得る。
【００５６】
本発明に含まれる他の生物活性薬剤は、ＥＣＭまたは他の生物活性薬剤と相乗的に作用して接着、成長／増殖、分化または他の細胞の挙動に影響し得る成長因子である。成長因子は典型的には比較的可溶性（拡散性）であるペプチドまたはポリペプチドとして特徴付けられる。好ましい例は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ヘパリン結合因子（ＨＢＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インシュリン、インシュリン様成長因子ＩまたはＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、インターロイキン、筋形態形成タンパク質、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子αまたはβ（ＴＧＦα、ＴＧＦβ）、および当業者に知られた他の因子を含む。例えば、非特許文献２７参照（この内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００５７】
成長因子は従来の生化学方法を使用して組織から単離されるか、または、バクテリア、酵母または哺乳類細胞（または他の真核細胞）中での遺伝子組換え手段を用いて産生することができる。例えば、ＥＧＦはマウスの顎下腺から単離することができ、ＴＧＦ−βは遺伝子組換えにより産生されている（ジェネンテック、Ｓ．サンフランシスコ（ＣＡ））。また、多数の成長因子が、天然および組換え体の両方で、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス（ＭＯ））、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ロスアルトス，ＣＡ）、ジェンザイム（ケンブリッジ、ＭＡ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（ドイツ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス（ＭＮ））およびＧＩＢＣＯ（グランドアイランド（ＮＹ））などのベンダーから販売されている。
【００５８】
他の有用な生物活性薬剤分子は、多数のインターロイキン（これらはそれ自身成長因子でなくてもよい）のようなサイトカインおよびペプチドホルモンを含む。これらは当技術分野ではよく知られており、その大半は市販もされている。
【００５９】
１つの実施形態では、生物活性薬剤またはそれら薬剤の組合せをＣＡＲ表面上に堆積させ、好ましくはそれに接着させる。本発明の別の態様では、生物活性薬剤は、例えば、培地への補足剤として可溶性の形態で細胞溶液に加える。
【００６０】
１つ実施形態では、例えば、生物活性薬剤を評価する場合の対照として、細胞を標準の、成長因子を添加していない市販の血清含有成長培地に加える。あるいは、本明細書に記載するように補充を行った、血清を含まない培地を使用する。
【００６１】
本発明で使用するための適当な支持体表面は、セラミック、金属またはポリマーの表面を含むが、これらに限定されない。最も好ましいのはポリマー支持体表面である。適当な支持体表面は、上記の容器の形態（プラスチック皿、フラスコ、マイクロタイタープレート）並びにプラスチックチューブ、縫合糸、膜、フィルム、バイオリアクターおよび微粒子である。ポリマー表面は、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（スチレン）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ヘキサフルオロプロピレン）、ポリ（トリフルオロエチレン）、ポリ（フッ化ビニリデン）、ポリ（ジメチルシロキサン）および他のシリコーンゴムを含むことができる。グリセロールプロピルシランを結合したガラスを含むガラス支持体表面も考えられる。
【００６２】
１つの実施形態では、一旦ＣＡＲ領域が支持体表面上に形成されると、生物活性薬剤は当技術分野で知られている穏やかなバイオコンジュゲーション技術を用いてこれに固定することができる（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０）。
【００６３】
これを達成するために、生物活性薬剤は好ましくはＨＡに共有結合でカップリングされる。シス−ジオールのうちのいくつかをジアルデヒド基に変換するためにＨＡを穏やかな酸化剤を用いて部分的に酸化する。次いで、これらの機能的なアルデヒド基は、生物活性薬剤のアミノ基とシッフ塩基を形成することができる。穏やかな酸化剤の例は過マンガン酸カリウムまたは好ましくは過ヨウ素酸ナトリウムを含む。
【００６４】
好ましい実施形態において、生物活性薬剤は円形スポット、矩形スポット、卵形スポットまたは他の任意の形状のいずれかのスポットの形態で、１つ以上のＣＡＲ領域にカップリングされる。好ましくは、生物活性薬剤は「グリッドパターン」、すなわち、比較的一様に間隔を置いて水平および垂直に配置されたスポット内のＣＡＲ材料上に堆積される。
【００６５】
生物活性薬剤は、異なる濃度の同じ薬剤をそれぞれ有する多数の生物活性領域を作成するためにＣＡＲ材料を含む表面に共有結合的に結合されてもよい。別の実施形態では、各生物活性領域は異なる生物活性薬剤またはその組合せを含む。同一または多数の異なる生物活性薬剤がスポットされたグリッドその他のパターンの任意の組合せが意図されている。
【００６６】
細胞（単数または複数）を、ＣＡＲ材料および／または生物活性薬剤を表示する表面上に堆積させてもよい。原核生物および真核細胞を含めたどのような細胞タイプも、本発明の方法に使用できるが、最も好ましいのは哺乳類細胞、特にヒト、ラット、マウスまたはウシの種からのものである。１つの好ましい実施形態では幹細胞が使用される。
【００６７】
「幹細胞」は、本明細書では、専門化され分化された細胞をも生じさせつつ、培養物中で連続的に分割する能力を有する細胞として定義される。それらは、分化していないかまたは比較的分化しておらず、成熟細胞または分化した細胞の形態学やマーカー特性を欠いている。幹細胞は、一般にその発生的または分化上の可能性によって特徴付けられる。したがって、真の「全能幹細胞」は、胚、胚外膜および組織、およびすべての後胚組織および器官となる能力を有する。
【００６８】
「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞またはＥＳＣとも呼ばれる）は、胚の組織から単離される一種の中立の全能幹細胞である。胚に注入すると、ＥＳＣは、機能的な配偶子だけでなく、すべての体細胞系統を生じることができる。未分化状態では、ＥＳＣはアルカリホスファターゼ陽性で、胚幹および胚生殖細胞に特徴的な免疫学的マーカーを発現し、テロメラーゼを発現し、そして、拡張された自己更新能力を保持する。分化に際して、ＥＳＣは、外胚葉起源、中胚葉起源および内胚葉起源の広範囲の細胞タイプになる。ＥＳＣは、マウス、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、ヒトを含む霊長類の胚の胚盤胞の内部細胞塊または生殖隆起から単離されている（例えば、非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３。これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる）。
【００６９】
生命体中の細胞の大多数は発生と分化のシーケンスを経る細胞の発達の結果であるが、少数の細胞はこの経路を外れて保存された幹細胞になり、必要に応じて生命体を「修理」する助けとなり得る幹細胞プールの継続的維持に寄与できるようである。そのような細胞をここでは「体性幹細胞」（ＡＳＣ）と呼ぶ。ＡＳＣは「全能幹細胞」としてだけでなく「始原幹細胞」としても知られている細胞を含む。「始原幹細胞」は特定の細胞系統にかかわり、それ自体としては、それらの各胚葉内の単一系統の子孫、例えば甲状腺（内胚葉起源）；筋肉、骨（中胚葉の起源）、ニューロン、メラノサイト、表皮の細胞（外胚葉の起源）を生じさせる細胞である。ＡＳＣは静止していて複製しないこともある。対照的に、細胞系統にかかわる始原幹細胞は、自己更新できるが、プログラム化された老化が現われる前に限定された寿命を有することもある。
【００７０】
始原幹細胞はさらに、「多能性」、「少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）」または「単能性」に分類することができる。本明細書で使用される場合、「多能性始原細胞」は、系統内の多数の細胞タイプを形成する。「単能性始原細胞」は単一のタイプの細胞を形成する。「少能性幹細胞」は系統内の可能な全てのタイプではないが１種類を超えるタイプの細胞を形成する。
【００７１】
説明のために、成熟中枢神経系（ＣＮＳ）は３つの主要な細胞タイプを含む：すなわちニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞である。単能性の神経始原細胞（ＮＰＣ）は専ら（かつ変わることなく）単一タイプのニューロンまたは星状膠細胞または乏突起膠細胞を生じる。少能性ＮＰＣは、（ａ）多数の異なるニューロン発現型のニューロン（例えば、知覚のニューロンまたはモータニューロン）を生じるが、星状膠は生じないか、または、（ｂ）１つのタイプのニューロンおよび１つのタイプのグリア細胞を生じるか、または、（ｃ）星状膠細胞および乏突起膠細胞を生じるがニューロンは生じない。対照的に、「多能性」ＮＰＣは、３つのＣＮＳ細胞系統すべての子孫細胞を生成する。
【００７２】
始原幹細胞の非制限的な例には、単能性な筋肉のマイオサテライト（ｍｙｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）筋芽細胞；脂肪組織の単能性脂肪芽細胞、単能性軟骨形成（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ）細胞、および軟骨膜および骨膜それぞれの骨形成細胞；脂肪組織の少能性脂肪線維芽細胞（ａｄｉｐｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）が含まれる。
【００７３】
ＮＰＣはまた、「神経始原細胞様細胞」（ＮＰＬＣ）とも呼ばれ、細胞内の中間フィラメントタンパク質であるネスチンの発現によって特徴付けられる。ラットネスチンに対して特異的なＭＡｂ、例えばＲＡＴ  ４０１（非特許文献３４）が生産されている。ポリクローナルなウサギ抗ネスチン抗血清はマウスネスチンを認識することが報告されている（非特許文献３５）。
【００７４】
「多能性幹細胞」は複数の胚の胚葉に由来する組織を生じさせることができる幹細胞である。多能性幹細胞は任意の特定の組織系統に拘束されず（「細胞系統中立」）、内胚葉起源および／または中胚葉起源および／または外胚葉起源の細胞を生じさせることができる。多能性の細胞は静止しているままでいられ、増殖を刺激することができ、細胞系統中立なまま広範囲な自己更新ができる。多能性幹細胞は、その寿命の範囲の中の任意の時に、単一のクローンから様々な細胞系統にかかわる始原細胞を生成することができる。細胞系統への関与は、１または複数の誘導剤の影響下に生じる。一旦、特定の細胞系統にかかわるように誘導されると、多能性の細胞は、その系統に特有の始原細胞の特性を備えるようになる。
【００７５】
本発明の方法の１つの実施形態では、ＣＡＲ材料および生物活性薬剤は、これらの幹細胞誘導剤として働く能力について試験される。
【００７６】
多能性幹細胞の非制限的な例には、ＣＮＳからの幹細胞、骨髄、末梢血および臍帯血からの造血幹細胞（ＨＳＣ）；およびＢＭからの骨髄ストローマ細胞が含まれる。本明細書で使用される場合、「骨髄幹細胞」という用語は、ＢＭに由来する全ての幹細胞を含む。
【００７７】
ＨＳＣはすべての血球タイプに分化することができる細胞である。また、ＨＳＣはｉｎ  ｖｉｖｏで肝臓細胞およびニューロン細胞を含む非血球タイプに分化することが示された。ＨＳＣは単一の表面マーカーまたはそれらの組合せを使用して、同定され、単離されおよび／または精製され得る。未分化ＨＳＣはｃ−キット、ＣＤ３４およびＭＨＣクラスＩ（例えば、マウスにおけるＨ−２Ｋ）を含むマーカーを発現し、知られている細胞系統マーカーを欠いている。これらの細胞は「Ｌｉｎ−陰性」または「Ｌｉｎ-」と呼ばれる。２種類のＨＳＣが知られている。長期的ＨＳＣは動物の生涯に渡って増殖する（自己更新を受ける）。短期のＨＳＣは限られた間増殖する。長期的ＨＳＣは、高レベルのテロメラーゼ活性を有する。テロメラーゼは、末端ヌクレオチドを付加することにより染色体（テロメア）の長さを維持することを助ける酵素である。テロメラーゼ活性の存在は未分化の分裂細胞の、および癌細胞の特性である。分化したヒト体細胞は検出できるテロメラーゼ活性を有しない。短期的ＨＳＣは、白血球の２つの主な細胞系統であるリンパ球および骨髄細胞の始原細胞に分化する。リンパ球前駆体は、とりわけ、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞に分化する。骨髄の前駆体は、単球およびマクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、巨大核細胞および赤血球に分化する。
【００７８】
本発明は、ＨＳＣ、好ましくは、長期ＨＳＣの使用を含む。好ましくは、ＢＭに由来したＨＳＣを使用する。ＢＭ細胞は未分画の形態で使用することもできる。他の実施形態では、ＢＭからのＨＳＣは部分的に、例えば、少なくとも約８０％純度、より好ましくは少なくとも約８５％純度、そしてさらに好ましくは少なくとも約９０％純度に精製される。
【００７９】
「骨髄ストローマ細胞」（ＭＳＣ）は、ＢＭからの非造血液幹細胞のサブクラスを指し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞を生じる。ＭＳＣは、プラスチック表面に接着するそのより大きな能力によって、ＨＳＣから分離することができる。
【００８０】
本発明は、幹細胞のクローン集団を含む任意の幹細胞または幹細胞集団の使用を含む。
【００８１】
本発明をラットＢＭ幹細胞の例をもって説明するが、全ての哺乳類のＢＭ幹細胞を包含することを意図している。哺乳類のＢＭ幹細胞およびそれらの子孫はヒト、ヒト以外の霊長類、ならびに、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウサギの種の適切な組織から単離することができる。
【００８２】
幹細胞を分離する方法は、当技術分野ではよく知られており、例えば、特許文献１；非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８に記載されている。
【００８３】
本発明はまた、成長誘導剤または特定の分化誘導剤の存在を、その幹細胞成長および系統コミットメントを誘発するそれらの能力によって検出する方法を提供する。
【００８４】
本発明の方法は知られている誘導剤を更に特徴づけるかまたは新しい誘導剤を同定するために使用することもできる。
【００８５】
本発明の方法の１つの実施形態では、複数の生物活性薬剤を、ＣＡＲ材料を結合して調製した表面上にスポットする。細胞をこの表面に置き、そして、適当なインターバルの後に視覚的に観察して生物活性領域またはＣＡＲ領域で細胞成長が生じたかどうか決定し、これにより、試験された生物活性薬剤の誘導剤としての有効性を迅速に確認する。
【００８６】
多数の異なる領域を同じ培養容器（例えば、単一のプレート、単一のウェルまたは多重ウェルプレート）中に作るこのアプローチの重要な利点は、細胞が、それらが好む培養容器内の位置に移動することが許されているという点である。例えば、特定のタイプの細胞は、適当な（１）生物活性剤または（２）ＣＡＲ材料または（３）生物活性剤とＣＡＲ材料の組合せ、または（４）特定の濃度の生物活性薬剤またはＣＡＲ材料有する領域を表示するスポットまたは領域に移動することができる。
【００８７】
細胞増殖は、当技術分野で知られている様々な技術、例えば、染色し、次いで顕微鏡で観察することによって、または比濁法、分光光度法（比色定量および特定波長での光吸光度の測定を含む）、自動細胞カウンターおよび／または自動プレートカウンターでの計数、全細胞のＤＮＡおよび／またはタンパク質の測定、電場のインピーダンス（例えば、コールターカウンター）、生物発光、二酸化炭素の生産、酸素消費、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生産その他によって評価することができる。
【００８８】
分化は発現分析（例えばｍＲＮＡ発現）、免疫学的分析および組織化学的分析、またはそれらの組合せによって評価することができる。例えば、特定の生物活性薬剤、ＣＡＲ材料またはそれらの組合せが細胞分化を誘導するかどうか決定するためには、ある遺伝子に対応する核酸の発現を分析すればよい。そのような分析のための方法は当技術分野においてよく知られており、増幅法（例えばポリメラーゼ連鎖反応、ストランド置換増幅など）およびノーザン分析（非特許文献１５）のようなプローブ配列とのハイブリダイゼーションを含む。ノーザンブロットは、既知の（または未知の）遺伝子の発現を検討する。あるいは、本明細書で開示されたように、ｃＤＮＡライブラリーを生成するか、または、例えば、幹細胞中、幹細胞に由来する細胞中において、既知の（または未知の）ＣＡＲ材料および／または生物活性薬剤へ暴露した前後で発現された遺伝子のディファレンシャルディスプレイを観察することができる。例えば、ノーザンブロットを使用して、多能性幹細胞クローン中の筋肉生成（ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）の誘導の尺度としてミオゲニンとＭｙｏＤｌ遺伝子のｍＲＮＡ転写の存在が評価されている（例えば、特許文献２参照。その内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００８９】
さらに、抗原（その発現は細胞の発現型または分化段階の特性である）への抗体の結合の評価を使用して分化を評価する。本明細書で使用する場合、「抗体」は任意の免疫グロブリン分子（Ｉｇ）またはその抗原結合性（または、エピトープ結合性）断片である。この用語は、ポリクローナル、モノクローナルおよびキメラ抗体分子（後者は特許文献３および特許文献４に記載されている）並びに単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ分子としても知られている）（非特許文献３９；非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２；非特許文献４３；特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９）を包含する。
【００９０】
本発明の方法は、幹細胞、幹細胞の分化した子孫細胞、またはそのような幹細胞または子孫を含む組織を認識しこれに結合するのに十分な検出可能な標識抗体を用いる免疫アッセイを使用して細胞試料を検査することを含む。
【００９１】
ポリクローナル抗体を生産する方法は、当技術分野においてよく知られている。（例えば、特許文献１０参照）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはそこから誘導されるＦａｂ鎖は、従来方法およびハイブリドーマ技術を使用して調製できる。例えば、非特許文献４４参照（その内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００９２】
１つの実施形態では、注目のエピトープを発現する分化した細胞の存在は、そのエピトープに対する検出可能な標識１次抗体によって検出されるか、または、好ましくは、非標識１次抗体および１次抗体のＩｇアイソタイプに特異的な、検出可能な標識２次抗体によって検出されるであろう。細胞に結合された検出可能な標識抗体の存在は、特定タイプの標識に特異的な任意の適当な方法を使用して測定される。細胞に結合されたこの抗体の存在は分化を示す。結合した抗体の測定を可能にする方法の使用を、本明細書では「抗体の可視化」とも呼ぶ。
【００９３】
最も一般的に使用される抗体標識は、放射性核種、酵素、紫外線に暴露された時蛍光を発する蛍光剤、ルミネッサー（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）などである。標識として有用な多数の適当な蛍光剤が知られており、これは、フルオレスセイン、ローダミン、オーラマイン（ａｕｒａｍｉｎｅ）、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、およびルシファーイェローを含む。タンパク質にこれらの標識を複合体化させる方法はよく知られている。好ましい放射性核種は、3Ｈ、14Ｃｒ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57ＣＯ、59Ｆｅ、125Ｉおよび131Ｉからなる群から選ばれる。
【００９４】
酵素標識も同様に有用であり、現在利用されている比色定量法、分光光度法または蛍光測定法のうちのいずれによってでも検出することができる。酵素は、カルボジイミド類、ジイソシアネート類、グルタルアルデヒドなどのような橋掛け分子との反応によって抗体または粒子と複合化させる。多数の酵素が、免疫アッセイのための検出できる標識として知られているが、好ましい酵素は、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ウレアーゼおよびアルカリホスファターゼである。
【００９５】
培養物中の細胞は、分化マーカーに対する抗体で処理して細胞分化が生じたかどうか決定することができる。細胞をニューロン、骨細胞およびその他であるとして同定する抗体が知られている。特定の細胞タイプを示すマーカーを検出するのに有用な抗体の非制限的な例には、下記のものが含まれる：筋肉（例えば、ミオゲニン［Ｆ５Ｄ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（ＤＳＨＢ）］、肉腫性ミオシン［ＭＦ−２０（ＤＳＨＢ）］、速骨格筋［ＭＹ−３２およびシグマ］、ミオシン重鎖［Ａ４．７４］（ＤＳＨＢ）、平滑筋［平滑筋アルファアクチンおよびＩＡ４（シグマ）］、軟骨（ＩＩ型コラーゲン［ＣＩＩＣ１およびＤＳＨＢ］、骨（骨シアロタンパク質［ＷＶＩＤＩおよびＤＳＨＢ］、内皮細胞（内皮細胞表面マーカー［Ｈ−Ｅｎｄｏ、精確型］）を示す中胚葉マーカー；内胚葉のマーカー（α−フェトプロテイン［ＨＡＦＰ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ］、上皮細胞［ＨＡ４ｃＩ９、ＤＳＨＢ］）および外胚葉マーカー（例えば、神経始原細胞［ＦＯＲＳＥ−Ｉ、ＤＳＨＢ］、ネスチン［ＲＡＴ−４０１、ＤＳＨＢ］ニューロン［８Ａ２、ＤＳＨＢ］）、ニューロフィラメント［ＲＴ９７、ＤＳＨＢ］。
【００９６】
組織化学は細胞形態学および分化を評価するために使用することができる。そのような特性はニューロンの発現型の表示としては丸い中央領域およびクモのような細胞突起または細胞内繊維を備えた長い多角形の細胞；肝臓細胞を示すものとしては、中央の核および核周辺の小胞を備えた小さな丸い多核または２核細胞の存在；骨格筋を示す多核の線形および枝分かれ構造の存在を含み、アルカリホスファターゼ活性は骨分化を示し得る。硝酸銀を使用したカルシウム沈殿も骨分化を同定するために使用できる。
【００９７】
本発明の方法は、他の細胞培養パラメーターおよび条件に関してより均一な環境を形作る一つの支持体表面上に２種の誘導剤を提示する場合、この薬剤間の微妙な違いを検出するのに役立つ。これは、他の変数を一定に維持しつつ、複数の誘導剤またはそれらの組合せの影響下での成長および／または細胞の分化の比較を可能にする。これは、どの薬剤または薬剤の組合せが、所望の結果、例えば、ある経路に沿ったまたは特定の段階への、ある量の成長または分化、をもたらすかを決定することが可能になる。
【００９８】
好ましい実施形態では、ＢＭ幹細胞をＥＣＭ分子と接触させ、これにより幹細胞をＮＰＣに分化させる。
【００９９】
別の実施形態では、ＨＡを培養皿表面に結合し、ＨＡ層の上にＥＣＭ分子を堆積させる。幹細胞、好ましくはＢＭ幹細胞をこの材料に加えてＮＰＣに分化させる。後者はネスチン（この細胞タイプについてのマーカー）に対する抗体を使用して視覚化できる。
【０１００】
上記方法の別の実施形態では、修飾済表面との接触およびこれに続く分化に先立って、ＢＭに由来するＨＳＣを使用して少なくとも約９０％の純度の細胞集団を産生する。
【０１０１】
さらに別の実施形態では、ＮＰＣマーカー、例えばネスチン、に特異的な抗体を使用する免疫学的に基準とされる方法を含む従来法を使用して、分化したＮＰＣを富化または単離する。
【０１０２】
以上、本発明について一般的に述べてきたが、本発明は、以下の実施例を参照することにより容易に理解されるであろう。ここで、これらは例として挙げるものであり、特に断らない限り、本発明を限定するようには意図するものではない。
【実施例１】
【０１０３】
骨髄に由来する幹細胞は、神経始原細胞に分化する。
【０１０４】
この実施例は、固定した酸化ＨＡに吸収されたＥＣＭ分子を結合した表面で幹細胞を培養した場合に、骨髄幹細胞集団（これは約１０％より少ないＭＳＣで汚染されている）のＮＰＣへの分化を示す。この実施例はまた、これらの条件（ＨＡ表面のみで培養された同じ細胞と比較する場合、それにはＥＣＭ分子を添加しない）下でのそのようなＨＳＣの増殖が増加することを示す。
【０１０５】
ＢＭをＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットの大腿骨から採取し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の中に懸濁させた。細胞をスクリーンを通して、凝集物を除去または分解させ、遠心分離によって集めた。赤血球を低張塩化アンモニウムよって溶解し、有核細胞を遠心分離によって集めた。これらの細胞を、ペニシリンとストレプトマイシンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の１０％ＦＢＳ５ｍｌに再懸濁させた。細胞は血球計数器によって計数した。細胞（およそ１０8）を、さらに２０ｍｌの培地中に希釈し、接着性細胞を結合させるためにＦａｌｃｏｎＴ２５組織培養フラスコ中で一夜インキュベートした。この培養物からの非接着細胞を、ＥＣＭ分子および様々な表面で試験するために採取した。細胞は、以下のように準備した５個の６０ｍｍポリスチレン皿中に分割した：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤバイオサイエンス、ベッドフォード、ＭＡ）の１：４、１：１６および１：６４希釈液（および非希釈液）を０．４５ｍｍの直径を有する高密度複製ツールを備えたＢｉｏｍｅｋ  ２０００ロボットワークステーションを使用して、皿の各々にスポットした。スポットはグリッドパターンの中で配列させた。次のタイプの皿／表面を使用した：
ｌ．  Ｆａｌｃｏｎ１００７細菌学等級ポリスチレン（ＢＤバイオサイエンス、ベッドフォード、ＭＡ）
２．  Ｆａｌｃｏｎ３００７組織培養処理ポリスチレン
３．  メタノールに溶かしたニトロセルロースでＦａｌｃｏｎ１００７皿を被覆し一夜乾燥させた（よりタンパク質接着性の表面の提供）もの
４．  ニトロセルロースで被覆したＦａｌｃｏｎ３００７皿（＃３を参照）
５．  ＨＡで被覆したＦａｌｃｏｎ１００７皿。ＨＡは、５０ｍＭナトリウム過ヨウ素酸塩中室温で一夜酸化してシスジオールをアルデヒド基に酸化させた。
【０１０６】
培養２日後に、プレートをＰＢＳで洗浄し未接着細胞を除去し、残る接着細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定細胞はＰＢＳ中の、１％トライトンＸ−１００と５％新生児のヤギ血清で室温で３０分間可浸透化した。次いで、マウス抗ラットネスチン  ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ＃５５６３０９）の１：４００希釈液中で１時間、細胞をインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中０．１％トライトンＸ−１００で３回洗浄し、ローダミンを結合させたヤギ抗マウス免疫グロブリン抗血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＰ  １８１Ｒ）の１：１００希釈液とともにさらに３０分インキュベートした。細胞をＰＢＳＴで３回洗い、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）にマウントした。エピフルオレッセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）照明を備えた倒立顕微鏡Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００を使用して細胞を観察した。スポットカメラおよび付属するソフトウェアを使用して画像を収集した。
【０１０７】
図１Ａ〜１Ｂは、酸化したＨＡに結合されたＥＣＭ材料としてのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の１：１６希釈液上でのラットＢＭ幹細胞の成長を表す。図１Ａに示す位相差顕微鏡写真中で、細胞は、ＨＡのみで覆われたエリア上でよりもＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を示すプレートの領域上で高密度に成長するのを見ることができる。図１Ｂは、ネスチンでの可視化によって検出される、ＮＳＣへのＢＭ細胞の分化を示す。同様の結果（図示せず）がＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の１：４希釈液を使用して得られた。
【０１０８】
したがって、ＮＰＣへのＢＭ幹細胞の分化はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の１：４または１：１６希釈液によって誘導された。細胞のより大きなパーセンテージが１：４希釈で分化された。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のより高濃度の領域で増殖の増加が見られた。ＨＡのみで被覆した領域上で若干の細胞増殖は観察されたが、それはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）被覆した領域におけるほど高くはなかった。更に、プレートのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）領域への細胞の移動があるように見えた（図１Ａにおいて特に顕著）。全体として、ＮＰＣへのＢＭ幹細胞の分化はＥＣＭ分子が存在しない状態では検出できなかった。
【０１０９】
【表１】
2005506839.tif 000002
【実施例２】
【０１１０】
ポリアミノ酸とＥＣＭ分子の組合せで処理されたＢＭ幹細胞のＮＰＣ分化の誘導
ＢＭ幹細胞のＮＰＣへの分化を刺激する、ＥＣＭ分子と組み合わせたポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）およびポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）の能力を評価するために研究を行った。９６穴マイクロプレート中、ポリスチレン表面へ結合されたＨＡ層上に生物活性領域を作った。因子１（ＰＬＯまたはＰＬＬ）および因子２（ＥＣＭタンパク質または１つのケースではＰＬＬ）と呼ぶ薬剤を、水素化ホウ素の存在下に５０μｇ／ｍｌの最終濃度で記載されるような過ヨウ素酸塩によってＨＡを酸化したウェルに加えた。未反応材料を洗い流した。実施例１と同様にして、ＢＭ幹細胞（上記参照）をウェルに加え、培養し、処理した。試験された組合せおよび結果を、表１に示す。
【０１１１】
ポリペプチド（ポリアミノ酸）とＥＣＭ分子の以下の組合せが、ＮＰＣ分化の有効な誘導剤となるという結論が得られた：ＰＬＯ／ラミニン、ＰＬＯ／フィブロネクチン、ＰＬＯ／ＶＩ型コラーゲン、ＰＬＯ／ビトロネクチン、ＰＬＬ／ＶＩ型コラーゲンおよびＰＬＬ／ビトロネクチン。さらに、ＰＬＯ／ＰＬＬの組合せが有効であった。
【実施例３】
【０１１２】
ＭＣ３Ｔ３細胞の成長を促進する際のＥＣＭ分子の役割
この実施例は、どのタイプおよび濃度の生物活性薬剤が骨始原細胞（骨形成幹細胞）の細胞増殖および分化を引き起こすかを迅速かつ容易に確認する本発明の方法の使用を示す。
【０１１３】
この実施例で使用するネズミＭＣ３Ｔ−３Ｅｌ細胞はネズミ頭蓋冠由来骨芽細胞（Ｊｐｎ．  Ｊ：  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  ２３，８９９（１９８１））のクローン細胞系統から得たものである。細胞を１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したα−ＭＥＭ培地において培養し、培養中１１日後に定着ステップを介して、実施例１と同様にラット骨ＢＭ細胞に処理した。細胞は、最初は比較的低密度で平板培養した。アルカリホスファターゼ酵素活性の存在は、メーカーの指示によってＳｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（セントルイス（ＭＯ））製の市販キットを使用して比色分析により検出した。
【０１１４】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ニート、１：４、１：１６および１：６４）の４種の異なる希釈液をスポットした酸化ＨＡの上でのＭＣ３Ｔ３の増殖を、培養５日後に評価した。２つの最も高いＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）濃度では接着および成長は乏しかった。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の１：１６および１：  ６４の希釈液では、細胞はよく結合し、成長し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）スポット上でコンフルーエントな単層に成長した。ＥＣＭを欠くプレートの領域で、若干の成長が示されたが、それは著しく低かった。
【０１１５】
Ｉ型コラーゲン（ＢＤバイオサイエンス、ベッドフォード、ＭＡ）の異なる希釈液上でのＭＣ３Ｔ３細胞の成長も試験した。上記の成長結果と同様に、ＥＣＭ材料の濃度がより高い方が細胞増殖はより少ないことが明白であった。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の１：４希釈によって誘導されるよりもＩ型コラーゲンの１：４希釈液の方がより多くの付着および成長が見られた。細胞付着および成長はＩ型コラーゲンの１：１６および１：６４希釈液がより大きかった。
【実施例４】
【０１１６】
ＭＣ３Ｔ３細胞の成長および分化を使用したＥＣＭ分子のスクリーニング
この実施例は、どのタイプおよび濃度の生物活性薬剤が細胞分化を促進するかをＭＣ３Ｔ３細胞を使用して迅速かつ容易に確認するための本発明方法の使用を示す。実施例３からのＭＣ３Ｔ３細胞およびプレートを使用したが、さらに６日間、すなわち合計１１日間の培養期間インキュベートした。その時点で、細胞をホルムアルデヒドで固定し、アルカリホスファターゼの生産を視覚化するために処理し、より骨様の発現型へのＭＣ３Ｔ３細胞の分化が示された。
【０１１７】
図２Ａ〜２Ｃは、培養物中での１１日後の分化が、ＥＣＭ分子を欠いたプレートの領域でのみ生じたことを示す。ＥＣＭ分子を欠く、酸化したＨＡの表面でのみ、アルカリホスファターゼに陽性な細胞への分化があった。実施例３に記載したように、より大きな細胞増殖は、ＥＣＭ（ここではＭａｔｒｉｇｅｌ（商標））存在下でのみ示された。したがって、ＥＣＭ分子は、骨形成幹細胞（ここではＭＣ３Ｔ３細胞系統）の骨様発現型への分化を阻害するように思われる。
【０１１８】
上に引用した文献は、個別に組み込まれたか否かに関わらず、すべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
以上、本発明について十分に説明してきたが、本発明の精神および範囲から外れず、かつ、過度の実験をせずに、広範囲の等価なパラメーター、濃度および条件で同じことが実行できることは当業者に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１Ａ】細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料、ＨＡ（酸化した形態）で被覆されたポリスチレン表面上、および酸化したＨＡ表面に共有結合的に結合したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（図中、ＭＧで略す）のスポット上でのラットＢＭ細胞の成長を示す写真である。ここで使用するＭＧは１：１６希釈液である。図１Ａは、ＭＧ上、またはより密度は低いが酸化したＨＡ上で成長する細胞の位相差顕微鏡写真である。ＭＧスポットの輪郭が識別でき、細胞はスポットの端でより密である。
【図１Ｂ】細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）材料、ＨＡ（酸化した形態）で被覆されたポリスチレン表面上、および酸化したＨＡ表面に共有結合的に結合されたＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（図中、ＭＧで略す）のスポット上でのラットＢＭ細胞の成長を示す。ここで使用するＭＧは１：１６希釈液である。図１Ｂはラットネスチンに特異的なネズミモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を有する同じ細胞を示す。ネスチン陽性細胞はこの写真で暗く染色される。ネスチンの存在は、ローダミンで標識された第二の抗体（抗マウス免疫グロブリン）を使用する、免疫蛍光検査法によって視覚化される。ＭＧとして１：４の希釈液を用いても同様の結果が得られた。
【図２Ａ】酸化したＨＡ表面（但しＭＧ表面ではない）におけるＭＣ３Ｔ３細胞、骨形成幹細胞様細胞系統の分化を示す。ラットＭＣ３Ｔ３細胞を、酸化したＨＡ上に１１日間培養し、その上にＭＧの様々な希釈液をスポットした。細胞はホルムアルデヒドで固定し、アルカリホスファターゼ、すなわち、より骨らしい発現型に分化した細胞によって産生される酵素、を視覚化するように処理した。酸化したＨＡ領域にはアルカリホスファターゼ陽性な細胞が多数の位置でパッチ状に存在したが、ＥＣＭスポット上では細胞成長がより速いにも拘らずアルカリホスファターゼ陽性細胞は観察されなかった。予めスポットしたＥＣＭタンパク質は、ＭＧの形態においてはＭＣ３Ｔ３細胞の骨分化を阻害する。
【図２Ｂ】酸化したＨＡ表面（但しＭＧ表面ではない）におけるＭＣ３Ｔ３細胞、骨形成幹細胞様細胞系統の分化を示す。ラットＭＣ３Ｔ３細胞を、酸化したＨＡ上に１１日間培養し、その上にＭＧの様々な希釈液をスポットした。細胞はホルムアルデヒドで固定し、アルカリホスファターゼ、すなわち、より骨らしい発現型に分化した細胞によって産生される酵素、を視覚化するように処理した。酸化したＨＡ領域にはアルカリホスファターゼ陽性な細胞が多数の位置でパッチ状に存在したが、ＥＣＭスポット上では細胞成長がより速いにも拘らずアルカリホスファターゼ陽性細胞は観察されなかった。予めスポットしたＥＣＭタンパク質は、ＭＧの形態においてはＭＣ３Ｔ３細胞の骨分化を阻害する。
【図２Ｃ】酸化したＨＡ表面（但しＭＧ表面ではない）におけるＭＣ３Ｔ３細胞、骨形成幹細胞様細胞系統の分化を示す。ラットＭＣ３Ｔ３細胞を、酸化したＨＡ上に１１日間培養し、その上にＭＧの様々な希釈液をスポットした。細胞はホルムアルデヒドで固定し、アルカリホスファターゼ、すなわち、より骨らしい発現型に分化した細胞によって産生される酵素、を視覚化するように処理した。酸化したＨＡ領域にはアルカリホスファターゼ陽性な細胞が多数の位置でパッチ状に存在したが、ＥＣＭスポット上では細胞成長がより速いにも拘らずアルカリホスファターゼ陽性細胞は観察されなかった。予めスポットしたＥＣＭタンパク質は、ＭＧの形態においてはＭＣ３Ｔ３細胞の骨分化を阻害する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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