(57)【要約】本発明は、PDZ-1遺伝子およびNeuroD/BETA2遺伝子を発現させる内分泌膵臓細胞の培養物をGLP-1受容体アゴニストに接触させる段階を含む、培養膵臓細胞においてインスリン遺伝子発現を誘導するための方法を提供しており、その細胞は、細胞が培養物において他の細胞と接触しているような条件下で培養されており、それにより細胞においてインスリン遺伝子発現を誘導する。本発明はまた、β細胞機能の調節物質についての高処理量スクリーニング方法、本発明の方法により作製された細胞の安定的培養物、および本発明の方法を用いてヒト被検体を治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、培養内分泌膵臓β細胞においてインスリン遺伝子発現を誘導するための方法：
(i)β細胞が培養物中において他の細胞と接触しているような条件下で培養された内分泌膵臓β細胞に組換えNeuroD/BETA2ポリヌクレオチドおよび組換えPDX-1ポリヌクレオチドを発現させる段階；および
(ii)その細胞をGLP-1受容体アゴニストに接触させ、それによりβ細胞においてインスリン遺伝子発現を誘導する段階。
【請求項２】
GLP-1受容体アゴニストがGLP-1類似体である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
GLP-1受容体アゴニストが天然に存在するペプチドのアミノ酸配列を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
GLP-1受容体アゴニストがGLP-1、エキセンジン-3またはエキセンジン-4である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
細胞が懸濁液において凝集物として培養される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
β細胞がヒトβ細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
β細胞が組換え発癌遺伝子を発現させる、請求項1記載の方法。
【請求項８】
β細胞が1個より多い組換え発癌遺伝子を発現させる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
β細胞が組換えテロメラーゼ遺伝子を発現させる、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
β細胞がβlox5細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
請求項1記載の方法により作製された細胞を化合物に接触させる段階、および化合物のβ細胞機能への効果を測定する段階を含む、β細胞機能を調節する化合物を同定する方法。
【請求項１２】
β細胞が培養物において他の細胞と接触しており、β細胞が組換えPDX-1ポリヌクレオチドおよび組換えNeuroD/BETA2ポリヌクレオチドを発現させ、かつGLP-1受容体アゴニストの有効量に曝される場合β細胞においてインスリン遺伝子発現が刺激される、内分泌膵臓β細胞の安定的培養物。
【請求項１３】
GLP-1受容体アゴニストがGLP-1類似体である、請求項12記載の培養物。
【請求項１４】
GLP-1受容体アゴニストが天然に存在するペプチドのアミノ酸配列を有する、請求項12記載の培養物。
【請求項１５】
GLP-1受容体アゴニストがGLP-1、エキセンジン-3またはエキセンジン-4である、請求項14記載の培養物。
【請求項１６】
細胞が懸濁液において凝集物として培養される、請求項12記載の培養物。
【請求項１７】
β細胞がヒトβ細胞である、請求項12記載の培養物。
【請求項１８】
β細胞が組換え発癌遺伝子を発現させる、請求項12記載の培養物。
【請求項１９】
β細胞が1個より多い組換え発癌遺伝子を発現させる、請求項18記載の培養物。
【請求項２０】
β細胞が組換えテロメラーゼ遺伝子を発現させる、請求項12記載の培養物。
【請求項２１】
β細胞がβlox5細胞である、請求項12記載の培養物。
【請求項２２】
請求項12記載の培養物を化合物に接触させる段階、およびその化合物のβ細胞機能への効果を測定する段階を含む、β細胞機能を調節する化合物を同定する方法。
【請求項２３】
請求項1記載の細胞の有効量を糖尿病の被検体へ投与する段階を含む、グルコースに応答してインスリンを分泌する細胞を該被検体へ供給することにより該被検体を治療する方法。
【請求項２４】
以下の段階を含む、グルコースに応答してインスリンを分泌する細胞を糖尿病の被検体へ供給することにより該被検体を治療する方法：
(i)β細胞が培養物中において他の細胞と接触しているような条件下でβ細胞が培養された、組換えPDX-1ポリヌクレオチドおよび組換えNeuroD/BETA2ポリヌクレオチドを発現させる内分泌膵臓β細胞の培養物をGLP-1受容体アゴニストに接触させる段階；および
(ii)該β細胞を該被検体へ投与し、それによりグルコースに応答してインスリンを分泌する細胞を該被検体へ供給する段階。
【請求項２５】
糖尿病の被検体がヒトである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
被検体がI型インスリン依存性糖尿病をもつ、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
GLP-1受容体アゴニストがGLP-1類似体である、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
GLP-1受容体アゴニストが天然に存在するペプチドのアミノ酸配列を有する、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
GLP-1受容体アゴニストがGLP-1、エキセンジン-3またはエキセンジン-4である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
β細胞が懸濁液中において凝集物として培養される、請求項24記載の方法。
【請求項３１】
組換えPDX-1ポリヌクレオチドおよび組換えNeuroD/BETA2ポリヌクレオチドを含む内分泌膵臓β細胞。
【請求項３２】
β細胞がヒトβ細胞である、請求項31記載のβ細胞。
【請求項３３】
β細胞が組換え発癌遺伝子を発現させる、請求項31記載のβ細胞。
【請求項３４】
β細胞が1個より多い組換え発癌遺伝子を発現させる、請求項33記載のβ細胞。
【請求項３５】
β細胞が組換えテロメラーゼ遺伝子を発現させる、請求項31記載のβ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、2000年3月10日に出願された米国特許出願第09/522,376号に関連し、それは、完全にかつすべての目的のために、明確に、参照として本明細書に組み入れられている。
【０００２】
連邦政府後援による研究開発の下でなされた発明への権利に関する言明
本発明は、国立衛生研究所により授与された、助成金番号5 R01 DKK55283-02および5 R01 DK55065-02による政府援助でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
グルコース応答性インスリン分泌を示す細胞の移植は、糖尿病を治療する可能性をもっている。しかしながら、この方法は、膵臓のβ細胞によってのみ示されるため、その性質をもつ細胞の不十分な供給量により制限される。細胞移植のために用いられうるヒトβ細胞の増殖した集団の開発は、それゆえに、糖尿病研究の主要な目標である(D. R. W.グループ、「Conquering diabetes: a strategic plan for the 21st century」NIH Publication No. 99-4398(National Institutes of Health, 1999))。異種移植片としてブタの組織を使用すること(Grothら、J Mol Med 77:153-154 (1999))、成長因子および細胞外マトリックスでの一次ヒトβ細胞の増殖(Beattieら、Diabetes 48:1013-1019 (1999))、およびグルコース応答性インスリン分泌を示す不死化細胞株の作製(Levine, Diabetes/Metabolism Reviews 1:209-246 (1997))を含む、多数の代替方法がその目標を達成するために探究されている。
【０００４】
ブタの島を用いることに大きな関心が寄せられたが、それらは、インビトロで操作することは困難であり、内因性および外因性生体異物ウイルスが移植片レシピエントへ伝染することになることについて懸念が生じた(Weiss, Nature 391:327-328 (1998))。一次ヒトβ細胞については、肝細胞成長因子/散乱因子(「HGF/SF」)、加えて細胞外マトリックス(「ECM」)を用いて、細胞周期への移行を達成させうる(Beattieら、Diabetes 48:1013-1019 (1999), Hayekら、Diabetes 44:1458-1460 (1995))。しかしながら、この組み合わせは、結果として細胞の数において2 x 104〜3 x 104倍の増殖を生じるが、細胞の老化、および分化型機能、特に膵臓ホルモン発現の喪失により制限される(Beattieら、Diabetes 48:1013-1019 (1999))。
【０００５】
ヒト内分泌膵臓由来の不死化細胞株は、グルコース応答性インスリン分泌を示すβ細胞株を発生するように作製された
2005506072.tif 000002
。細胞株は、成人の島、胎児の島、および精製されたβ細胞を含む様々な源由来の細胞の初代培養物をSV40 T抗原およびH-rasval12のような強力な優性発癌遺伝子を発現させるウイルスベクターで感染させることにより作製される
2005506072.tif 000003
；
米国特許第5,723,333号も参照)。それらの発癌遺伝子の組み合わされた効果は、成長因子非依存性および細胞外マトリックス(ECM)非依存性の細胞周期への移行を誘発すること、加えて、一次細胞についての10〜15の集団倍加から発癌遺伝子発現細胞についてのおよそ150の倍加まで細胞の寿命を長くすることである(Halvorsenら、Molecular and Cellular Biology 19:1864-1870 (1999))。テロメラーゼのhTRT成分をコードする遺伝子のさらなる導入は、結果として不死化を生じ、細胞が無期限に増殖することを可能にする(Halvorsenら、Molecular and Cellular Biology 19:1864-1870 (1999))。
【０００６】
細胞株は無期限に増殖するが、それらは、成長刺激化一次β細胞と同様に、分化型機能を喪失する。それゆえに、細胞株のインスリン分泌β細胞への分化を刺激する方法が望まれている。そのような細胞は、その後、糖尿病についての治療として、インビボに移植されうる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
培養ヒトβ細胞におけるβ細胞分化の誘導は、ホメオドメイン転写因子NeuroD/BETA2およびPDX-1のそれらの下流、細胞-細胞接触、ならびにグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)受容体を含む、複数のシグナル伝達経路を刺激することにより達成された。それらの経路の相乗的活性化は、結果として、最初は検出可能な膵臓ホルモンを発現させていない培養ヒトβ細胞を、グルコース応答性インスリン分泌を示す完全に機能しうるβ細胞へ分化させた。さらに、これらの細胞は、インビボで移植され、インスリンのグルコース応答性発現が実証されうる。機能しうるヒトβ細胞の無制限の量をインビトロで増殖させうる能力は、糖尿病の治療のための決定的な細胞移植療法についての手段を提供する。
【０００８】
PDX-1を発現させ、細胞と細胞の接触状態にあり、かつGLP-1受容体アゴニストと接触しているヒトβ細胞における転写因子NeuroD/BETA2の発現は、結果として、ある特定の望ましい特徴を生じた。例えば、驚くべきことに、その結果生じた細胞は、NeuroD/BETA2を発現させない細胞と比較して、高レベルのインスリンを産生する。さらに、NeuroD/BETA2を発現させている細胞は、細胞培養において高度に安定的であり、複数世代間の培養において増殖しうる。このように、本発明のいくつかの態様において、本発明は、培養内分泌膵臓細胞においてインスリン遺伝子発現を誘導するための方法を提供し、その方法は、(i)細胞が培養物において他の細胞と接触しているような条件下で培養された細胞において、組換え NeuroD/BETA2ポリヌクレオチドおよび組換えPDX-1遺伝子を発現させる段階；ならびに(ii)細胞をGLP-1受容体アゴニストに接触させ、それにより細胞においてインスリン遺伝子発現を誘導する段階からなる。いくつかの態様において、細胞は、最初は、インスリンおよびグルカゴンのような検出可能な膵臓ホルモンを少しも産生していない。
【０００９】
もう一つの局面において、本発明は、β細胞機能を調節する化合物を同定する方法を提供し、その方法は、上記の方法により作製された細胞を化合物と接触させる段階、および化合物のβ細胞機能への効果を測定する段階を含む。
【００１０】
もう一つの局面において、本発明は、内分泌膵臓細胞の安定的培養物を提供し、細胞は、培養物において他の細胞と接触しており、細胞は、組換え NeuroD/BETA2遺伝子および組換えPDX-1遺伝子を発現させ、かつGLP-1受容体アゴニストの有効量に曝された場合、細胞において、インスリン遺伝子発現が刺激される。
【００１１】
もう一つの局面において、本発明は、グルコースに応答してインスリンを分泌する細胞を被検体に供給することによる糖尿病の被検体を治療する方法を提供し、その方法は、以下の段階を含む：(i)細胞が培養物において他の細胞と接触しているような条件下で細胞が培養された、NeuroD/BETA2遺伝子およびPDX-1遺伝子を発現させる内分泌膵臓細胞の培養物をGLP-1受容体アゴニストと接触させる段階；ならびに(ii)細胞を被検体に投与し、それにより、被検体にグルコースに応答してインスリンを分泌する細胞を供給する段階。
【００１２】
いくつかの態様において、GLP-1受容体アゴニストは、GLP-1類似体である、または天然に存在するペプチドのアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、GLP-1受容体アゴニストは、GLP-1、エキセンジン(exendin)-3、またはエキセンジン-4である。
【００１３】
いくつかの態様において、細胞は、懸濁液における凝集物として培養される。
【００１４】
一つの態様において、細胞は、ヒト細胞である。もう一つの態様において、細胞は、βlox5細胞である。ヒト膵臓細胞である、βlox5細胞の寄託は、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209でのアクセッション番号PTA-3532により、2001年7月19日になされた。
【００１５】
いくつかの態様において、細胞は、組換え発癌遺伝子を発現させる。いくつかの態様において、細胞は、組換えテロメラーゼ遺伝子を発現させる。
【００１６】
いくつかの態様において、糖尿病の被検体は、ヒトである。いくつかの態様において、被検体は、I型インスリン依存性糖尿病である。
【００１７】
発明の詳細な説明
序論
もともとヒトβ細胞由来であったにもかかわらず、最初はほとんどβ細胞の特徴を示していない細胞株を用いて、完全なβ細胞機能がインビトロで誘導されるのに成功した。加えて、これらの細胞は、マウスへ移植され、グルコース応答性様式においてインスリンを産生することが示されている。βlox5細胞のような細胞におけるβ細胞分化の誘導は、3つの誘導因子、PDX-1、細胞-細胞の接触、およびエキセンジン-4のようなGLP-1受容体アゴニストを必要とする。しかも、PDX-1の発現、GLP-1アゴニストとの接触、およびβ細胞株における細胞と細胞の接触と組み合わせた、転写因子、NeuroD/BETA2の発現は、驚くべきことに、結果として、大いに増加したインスリン産生を生じる。さらに、PDX-1の発現、GLP-1アゴニストとの接触、および細胞と細胞の接触と組み合わせた、NeuroD/BETA2を発現させるβ細胞はまた、多くの世代を通して複製できる高度に安定した細胞培養物である。このように、本発明は、多くの世代に渡って、高レベルのインスリンを産生する細胞を作製する方法を提供する。
【００１８】
TRM-6(δ細胞系統)およびβlox5(β細胞系統)のような培養細胞株は、内分泌細胞の発生および機能のために必要とされる遺伝子の完全な相補体の同定を可能にする強力な道具である。さらに、複数の相互作用している誘導因子のための必要条件は、どのようにして異なるシグナル伝達経路が複雑な分化プログラムを制御するためにお互いに相互作用するかを研究するための機会を提供している。
【００１９】
機能しうるヒトβ細胞の無制限の源の有用性は、糖尿病について重要な含意をもっている。一つの単刀直入な適用は、無制限で均質の細胞の源から恩恵を受けるものと思われるβ細胞の生物学の局面を探究することにおいてである。新規の糖尿病薬についての高処理量スクリーニングは、そのような適用の一つである。本発明の細胞は、例えば、インスリン発現を増強させる低分子もしくは巨大分子のGLP-1受容体アゴニストまたは他の化合物についてスクリーニングするために用いられうる。加えて、本明細書に記載されるもののような細胞は、糖尿病についての細胞移植療法において用いられうる。PDX-1を発現し、かつ他の細胞に細胞と細胞の接触をしている細胞は、本明細書に記載されているように、GLP-1受容体アゴニストで刺激される。そのような細胞は、その後、適した哺乳動物宿主、好ましくはヒトへ移植される。そのような細胞は、インビボで、グルコース応答性インスリン分泌を示す。
【００２０】
一つの態様において、本発明の実施において有用な培養細胞は、最小で細胞を形質転換するが、増殖を刺激し、かつ細胞老化を回避する、SV40 T抗原およびHrasval12のような1つまたは複数の発癌遺伝子を発現させる。他の適する発癌遺伝子は、例えば、HPV E7、HPV E6、c-myc、およびCDK4を含む(米国特許第5,723,333号も参照)。加えて、細胞は、不死化を促進するために、hTRTのような哺乳動物のテロメラーゼをコードする発癌遺伝子で形質導入されうる。適する発癌遺伝子は、当業者により同定されうり、発癌遺伝子の一部分のリストは、Bishopら、RNA Tumor Viruses、1巻、pp. 1004-1005(Weissら編、1984)、およびWatsonら、Molecular Biology of the Gene(第4版、1987)に提供されている。いくつかの場合において、発癌遺伝子は、成長因子非依存性およびECM非依存性の細胞周期への移行を与える。しばしば、発癌遺伝子は、優性発癌遺伝子である。細胞は、発癌遺伝子RNAまたはタンパク質発現の分析により組換え発癌遺伝子発現について分析されうる。発癌遺伝子のゲノムへの組込みは、例えば、サザンブロット分析により確認されうる。いずれの適した発現ベクターでも細胞を形質導入するために用いられうるが、しばしば、発癌遺伝子は、ウイルスベクター、好ましくはレトロウイルスベクターを用いて細胞へ送達される(例えば、1つまたは複数の発癌遺伝子をコードするベクターの構築および膵臓内分泌細胞の形質導入を記載している、米国特許第5,723,333号を参照、Halvorsenら、Molecular and Cellular Biology 19:1864-1870 (1999)も参照)。
【００２１】
細胞株を作製するために用いられるベクターは、発癌遺伝子が、増殖後細胞においてcreリコンビナーゼのようなリコンビナーゼの発現により除去されうるように、lox部位のようなリコンビナーゼ部位を組込む(Halvorsenら、Molecular and Cellular Biology 19:1864-1870 (1999))。発癌遺伝子の除去は、哺乳動物の被検体へ移植されることになっている細胞にとって有用である。他のリコンビナーゼ系は、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)FLP/FRT、ラムダatt/Int、ザイゴサッカロマイセスルーキシ(Zygosaccharomyces rouxii)のRリコンビナーゼを含む。加えて、転移因子およびトランスポザーゼが用いられうる。発癌遺伝子の除去は、例えば、発癌遺伝子RNAもしくはタンパク質発現の分析により、またはサザンブロット分析により確認されうる。
【００２２】
本発明の培養細胞は、NeuroD/BETA2活性を有するNeuroD/BETA2、例えば、対立遺伝子、多型変異体および相同分子種の内因性または組換えのいずれかを発現する(例えば、米国特許第5,795,723号；Miyachi, T.ら、Mol. Brain Res. 69, 223-231 (1999)；Leeら、Science 268: 836-844 (1995)；Wilsonら、Nature 368, 32-38 (1994)；Nayaら、Genes Dev. 9:1009-1019 (1995)を参照)。ヒトNeuroD/BETA2対立遺伝子および変異体は、特に望ましい。組換えPDX-1は、上記のように、発現ベクター、例えば、レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを用いて、細胞へ送達される。
【００２３】
本発明の培養細胞はまた、PDX-1活性を有するPDX-1、例えば、対立遺伝子、多型変異体および相同分子種の内因性または組換えのいずれかを発現する(例えば、Sanderら、J. Mol. Med. 71:327-340 (1997)を参照)。PDX-1の内因性発現は、PDX-1遺伝子の膵臓β細胞発現に関与している肝細胞核因子3ベータのような転写因子を用いて、誘導されうる(例えば、Wuら、Molecular and Cellular Biology 17:6002-6013 (1997)を参照)。組換えPDX-1は、上記のように、発現ベクター、例えば、レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを用いて、細胞へ送達される。
【００２４】
細胞を形質導入するために用いられるベクターは、レトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む、いずれの適するベクターでもありうる。好ましくは、ベクターは、一過性形質転換に対立するものとして、細胞の安定的形質転換を与えるものである。
【００２５】
本発明は、組換え遺伝学の分野における日常的技術に頼っている。本発明における使用の一般的方法を開示する基本的なテキストは、
2005506072.tif 000004
を含む。
【００２６】
本発明の細胞へ投与される、GLP-1受容体アゴニストは、GLP-1、エキセンジン-3およびエキセンジン-4のような天然に存在するペプチド(例えば、米国特許第5,424,286号；米国特許第5,705,483号、米国特許第5,977,071号；米国特許第5,670,360号；米国特許第5,614,492号を参照)、GLP-1類似体(例えば、米国特許第5,545,618号および米国特許第5,981,488号を参照)、ならびに低分子類似体を含む。GLP-1受容体アゴニストは、米国特許第5,981,488号に記載されているように、活性について試験されうる。細胞は、本明細書に記載されているように、インスリンmRNA発現を誘導するのに効果的な時間および量において、GLP-1受容体アゴニストに接触させられる。典型的には、細胞は、GLP-1受容体アゴニストがインスリン遺伝子発現についてのスイッチとして働くと考えられているため、不連続の期間において、GLP-1受容体アゴニストに接触させられる。それゆえに、GLP-1受容体アゴニストの連続的投与は必要とされない。
【００２７】
本発明を作用の特定の理論に結びつけるつもりはないが、細胞と細胞の接触が結果として、Myc下方制御を生じている可能性があると考えられる。本明細書に実証されているように、膵臓細胞におけるc-Mycの下方制御は、細胞の分化およびインスリンの産生に関連している。それゆえに、Mycに拮抗する方法は、細胞の分化を誘導するために有用である。例えば、PDX-1発現、GLP-1アゴニストとの接触、およびMycアンタゴニストの接触または発現は、膵臓細胞においてインスリン発現を刺激するために用いられうる。いくつかの態様において、細胞はまた、最大限の細胞と細胞の接触を与えるために凝集物または類似した構造において培養される。いくつかの態様において、NeuroD/BETA2もまた細胞において発現される。
【００２８】
典型的Mycアンタゴニストは、Myc転写物をターゲットするアンチセンス分子または核酸触媒(例えば、リボザイム)を含む。プロモーター(例えば、構成性または誘導性)を含む発現カセットは、アンチセンスRNAをコードするポリヌクレオチドへ実施可能に連結されうる。そのような構築物の発現は、結果として、c-Myc遺伝子産物の翻訳の減少を生じる。もう一つの例において、MAD1(Cultraroら、Curr. Topics Micro. Immunol. 224:149-158 (1997))のようなMyc機能に拮抗するポリペプチドが、細胞に発現されうる。3番目の例においては、c-mycに拮抗する低分子が膵臓細胞に接触させられる。
【００２９】
移植された細胞の免疫拒絶が、以前に、島移植の成功に対する主要な障害であった。いずれの万能ヒトドナーの細胞でも同種移植片として免疫系に認識されるものと思われる。しかしながら、同種移植片の拒絶についての療法における最近の進歩により、これは、さほど心配するものではないようになりうる(例えば、Kenyonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8132-8137 (1999))。移植可能な細胞の源として不死化した細胞株を用いることの利点は、それらが、宿主免疫応答の回避または抑制を含む、望ましい質を示すように操作されうることである。
【００３０】
細胞培養
本発明は、細胞培養の分野における日常的技術に頼っており、適する方法は、公知の方法論を用いて、当業者により決定されうる(例えば、Freshneyら、Culture of Animal Cells(第3版、1994)を参照)。一般的に、細胞培養環境は、細胞増殖、細胞密度および細胞接触のための支持体、気相、培地および温度のような因子の考慮を含む。
【００３１】
本発明の細胞は、最大限の細胞と細胞の接触を与える条件下で増殖する。例えば、いくつかの態様において、細胞と細胞の接触は、単層細胞培養において見出されるものより大きい程度まで起きている。好ましい態様において、細胞は、三次元の凝集物として懸濁液に増殖する。懸濁培養は、例えば、磁気スターラーもしくは大きい表面積のパドルをもつフラスコを用いることにより、または細胞が皿の底に付着するのを防ぐためにコーティングされたプレート上で、達成されうる。好ましい態様において、細胞は、それらが皿の底に付着するのを防ぐためにヒドロゲルでコーティングされたコスター(Costar)皿内で増殖する。
【００３２】
接着性条件下で培養される本発明の細胞のために、懸濁液において、プラスチックの皿、フラスコ、ローラーボトル、またはマイクロキャリアが使用される。他の人工的支持体は、ガラスおよび金属のようなものが使用されうる。支持体は、しばしば、エッチングにより、またはコラーゲン、コンドロネクチン、フィブロネクチンおよびラミニンのような物質でコーティングすることにより、処理される。培養容器の型は、培養条件に依存し、例えば、複数ウェルプレート、ペトリ皿、組織培養チューブ、フラスコ、ローラーボトルなどがある。
【００３３】
細胞は、細胞型に基づいて経験的に決定される最適の密度で増殖する。例えば、βlox5培養物についての典型的細胞密度は、1 x 103細胞/mlから1 x 107細胞/mlまで変動する。細胞は、細胞密度が最適より大きい場合、継代される。
【００３４】
培養細胞は、通常、適した温度、例えば、温度における領域の変動の原因となる、その細胞が得られたところの動物の体温を与えるインキュベーターで増殖する。一般的に、37℃が、細胞培養のために好ましい温度である。たいていのインキュベーターは、ほぼ大気中状態へ加湿される。
【００３５】
気相の重要な成分は、酸素および二酸化炭素である。典型的には、大気中の酸素圧が細胞培養に使用される。培養容器は、通常、ガス透過性キャップを使用することにより、または培養容器の密閉を防ぐことにより、ガス交換が可能になるようにインキュベーター雰囲気へとガス抜きされる。二酸化炭素は、細胞培地における緩衝液と共に、pH安定化に役割を果たし、典型的には、インキュベーターにおいて、1 %〜10 %の濃度で存在する。好ましいCO2濃度は、典型的には、5 %である。
【００３６】
既知組成細胞培地は、パッケージされている、あらかじめ混合された粉末またはあらかじめ滅菌された溶液として入手可能である。一般に使用される培地の例は、DME、RPMI 1640、DMEM、イスコブ(Iscove)の完全培地、またはマコイの培地(McCoy's Medium)を含む(例えば、GibcoBRL/Life Technologies Catalogue and Reference Guide; Sigma Catalogueを参照)。典型的には、低グルコースDMEまたはRPMI 1640が本発明の方法において使用される。既知組成細胞培地は、しばしば、5 %〜20 % 血清、典型的には加熱不活化された、例えば、ヒト、ウマ、子ウシおよびウシ胎児の血清を追加される。典型的には、10 % ウシ胎児血清が本発明の方法において使用される。培地は、通常、細胞を一つのpH、好ましくは7.2〜7.4に維持するために緩衝される。培地への他の追加は、例えば、抗生物質、アミノ酸、糖、および肝細胞成長因子/散乱因子のような成長因子を含む。
【００３７】
細胞におけるPDX-1のみの発現は、結果として、細胞増殖停止を生じ、それにより、細胞分裂およびインスリン産生細胞の連続培養の生産を妨げる。しかしながら、NeuroD/BETA2との共発現は、細胞増殖表現型停止を逆転させ、インスリン産生細胞の連続培養(すなわち、複数回の細胞分裂をもつ)を可能にする。いくつかの態様において、膵臓細胞は、インスリンを産生しながら、またはインスリンを産生する能力を保持しながら、少なくとも2回、および好ましくは少なくとも約5回または少なくとも約10回、分裂する。
【００３８】
薬学的組成物および投与
薬学的に許容される担体は、投与されることになっている特定の組成物(例えば、細胞または低分子)により、および組成物を投与するために用いられる特定の方法により、一部分決定される。従って、本発明の薬学的組成物の適する製剤の幅広い種類がある(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第17版、1989を参照)。
【００３９】
例えば、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および皮下の経路によるような非経口投与に適する製剤は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を予定されているレシピエントの血液と等張性にする溶質を含みうる水性および非水性の等張性滅菌注射溶液、ならびに沈殿防止剤、可溶化剤、濃化剤、安定化剤および保存剤を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。本発明の実施において、組成物は、例えば、腎臓の下への直接的外科的移植、門脈内投与、静脈注射、または腹腔内注射により投与されうる。
【００４０】
注射溶液および懸濁液は、滅菌した粉末、顆粒および錠剤から調製されうる。患者へ投与される用量は、本発明に関しては、時間が経てば、患者において有益な治療的応答をもたらすのに十分であるべきである。用量は、使用される特定の細胞の効力および患者の状態、加えて、治療されうる患者の体重または表面積により決定されるものである。用量のサイズはまた、特定のベクターの投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質および程度、または特定の患者に形質導入された細胞型により決定されるものである。
【００４１】
減少したもしくは異常なインスリン発現による疾患の治療または予防において投与される細胞の有効量を決定するにおいて、医者は、細胞毒性、移植反応、疾患の進行、および抗細胞抗体の産生を評価する。投与について、本発明の細胞は、患者の体重および全体の健康に向けられるような、様々な濃度での細胞型の副作用を考慮して、被検体へ正常化したグルコース応答性インスリン分泌および正常化したグルコースレベルを与えるのに効果的な量において投与されうる。投与は、単一または分割された用量により達成されうる。
【００４２】
β細胞機能の調節物質についてのアッセイ法
A. アッセイ法
本発明の培養細胞を用いるアッセイ法は、β細胞機能、例えば、インスリン産生および/またはグルコース応答性インスリン分泌の阻害剤ならびに活性化剤について試験するために用いられうる。そのような調節物質は、糖尿病および低血糖症のようなグルコース代謝を含む様々な疾患を治療するために有用である。機能不全の治療は、例えば、真性糖尿病(すべての型)；島細胞腫により引き起こされたインスリン過剰症、薬物関連の、例えば、スルホニル尿素もしくは過剰なインスリンの、インスリンまたはインスリン受容体の抗体などでの免疫疾患を含む(例えば、Harrison's Internal Medicine(第14版、1998)を参照)。
【００４３】
調節は、選択的にグルコースの投与と共に、インスリン遺伝子発現を測定すること、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法、PCR法、オリゴヌクレオチドアレイ法などを用いるインスリンmRNA発現の分析；および、例えば、ウェスタンブロット法、放射性免疫測定法、ELISAなどを用いるインスリンタンパク質発現(プレプロインスリン、プロインスリン、インスリン、またはc-ペプチド)の分析により、本発明の培養物を用いて試験される。インスリン調節の下流効果もまた、調べられうる。β細胞機能への化合物の機能的効果を決定するために、物理的または化学的変化が測定されうる。可能性のある阻害剤もしくは活性化剤で処理される試料またはアッセイは、調節の程度を調べるために、試験化合物なしの対照試料と比較される。
【００４４】
B. 調節物質
β細胞機能の調節物質として試験される化合物は、任意の低分子の化学物質、またはタンパク質、糖、核酸もしくは脂質のような巨大分子でありうる。典型的には、試験化合物は、小さい化学的分子およびペプチドである。最も多くの場合、水性または有機(特に、DMSOを主成分とする)溶液に溶解されうる化合物が用いられるが、本質的には、いずれの化学物質も、本発明のアッセイ法において可能性のある調節物質またはリガンドとして用いられうる。アッセイ法は、アッセイ段階を自動化すること、および、典型的には並行して実施されるアッセイ(例えば、ロボット式アッセイ法でのマイクロタイタープレート上でのマイクロタイター型式における)へ任意の簡便な源から化合物を供給することにより、大きな化学的ライブラリーをスクリーニングするように設計される。Sigma(St. Louis, MO)、Aldrich(St. Louis, MO)、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs Switzerland)などを含む化学物質の多くの供給業者があることは、認識されているものと思われる。
【００４５】
一つの好ましい態様において、高処理量スクリーニング方法は、多数の可能性のある治療用化合物(可能性のある調節物質またはリガンド化合物)を含むコンビナトリアルケミカルライブラリーまたはペプチドライブラリーを供給することを含む。そのような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」または「リガンドライブラリー」は、その後、望ましい特徴の活性を示すそれらのライブラリーメンバー(特定の化学種またはサブクラス)を同定するために、1つまたは複数のアッセイ法においてスクリーニングされる。このように同定された化合物は、通常の「リード化合物」としての役割を果たしうる、またはそれら自身、可能性のあるもしくは実際の治療用物質として用いられうる。
【００４６】
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、試薬のような多数の化学的「ビルディングブロック」を結合することによる、化学的合成または生物学的合成のいずれかにより作製される多様な化学的化合物の収集物である。例えば、ポリペプチドライブラリーのような直線状のコンビナトリアルケミカルライブラリーは、所定の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)についてあらゆる可能な方法において化学的ビルディングブロック(アミノ酸)のセットを結合することにより形成される。何百万という化学物質がそのような化学的ビルディングブロックの組み合わせの混合を通して合成されうる。
【００４７】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者によく知られている。そのようなコンビナトリアルケミカルライブラリーは、限定されるものではないが、ペプチドライブラリー(例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)およびHoughtonら、Nature 354:84-88 (1991)を参照)を含む。化学的多様性ライブラリーを作製するための他の化学もまた、用いられうる。そのような化学は、限定されるものではないが、以下のものを含む：ペプトイド(例えば、国際公開公報第91/19735号)、コードされたペプチド(例えば、国際公開公報第93/20242号)、ランダムバイオオリゴマー(例えば、国際公開公報第92/00091号)、ベンゾジアゼピン(例えば、米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー(Hobbsら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993))、ビニロガス(vinylogous)ポリペプチド(Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992))、グルコース足場をもつ非ペプチダールペプチドミメティックス(Hirschamnnら、J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992))、低分子化合物ライブラリーの類似性有機合成(Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994))、オリゴカルバメート(Choら、Science 261:1303 (1993))、ならびに/またはペプチジルホスホネート(Campbellら、J. Org. Chem. 59:658 (1994))、核酸ライブラリー(Ausubel, BergerおよびSambrook、すべて前記を参照)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば、米国特許第5,539,083号を参照)、抗体ライブラリー(例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)およびPCT/US96/10287を参照)、炭水化物ライブラリー(例えば、Liangら、Science, 274:1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号を参照)、有機低分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C & EN、1月18日、33ページ (1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号などを参照)。
【００４８】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は、商業的に入手可能である(例えば、357 MPS、390 MPS、Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA、433A Applied Biosystems, Foster City, CA、9050 Plus、Millipore, Bedford, MAを参照)。加えて、多数のコンビナトリアルライブラリー自体は、商業的に入手可能である(例えば、ComGenex, Princeton, N. J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなどを参照)。
【００４９】
アッセイ法は、固相または溶液相のアッセイ法でありうる。本発明の高処理量のアッセイ法において、たった1日で、数千の異なる調節物質またはリガンドまでスクリーニングすることが可能である。特に、マイクロタイタープレートの各ウェルは、選択された可能性のある調節物質に対して別々のアッセイを実施するために使用されうる、または、濃度もしくはインキュベーション時間の効果が観察されることになっている場合には、5ウェル〜10ウェルごとが単一の調節物質を試験しうる。このように、たった1つの標準マイクロタイタープレートで、約96個の調節物質についてアッセイできる。1536ウェルのプレートが使用される場合には、たった1つのプレートで容易に約100個〜約1500個の異なる化合物をアッセイできる。1日あたり多くのプレートをアッセイすることが可能である；約6,000個、20,000個、50,000個もしくは100,000個またはそれ以上までの異なる化合物についてのアッセイスクリーニングが、本発明の統合系を用いて可能である。
【００５０】
定義
本明細書に用いられる場合、以下の用語は、他に規定がない限り、それらに与えられた意味をもつ。
【００５１】
「イスリン遺伝子発現を誘発すること」とは、細胞または細胞の培養物において、インスリン遺伝子からの発現レベルを、陰性対照培養物と比較して少なくとも約10 %またはそれ以上、好ましくは、25 %、50 %、100 %、500 %、1000 %、5000 %またはそれ以上増加させることを指す。インスリン遺伝子発現は、当業者に公知の方法、例えば、インスリンRNA発現、プレプロインスリン、プロインスリン、インスリン、またはc-ペプチドの生成を、例えば、PCR、ハイブリダイゼーションおよび免疫測定法を用いて測定することにより、測定されうる。
【００５２】
「グルコースに応答してインスリンを分泌する」細胞は、陰性対照(非インスリン応答性細胞かまたはグルコースに曝されないインスリン応答性細胞かのいずれか)と比較して、対照細胞より少なくとも約10 %、好ましくは25 %、50 %、100 %、500 %、1000 %、5000 %またはそれ以上のグルコースに応答してのインスリン分泌の増加(上記のように測定される)を有する。
【００５３】
細胞が「培養物において他の細胞と接触している」ように「細胞を培養すること」とは、細胞と細胞の接触を可能にする培養条件を指す。そのような条件下において、すべてではないが多くの細胞が培養物の1個または複数個の他の細胞と接触している。そのような条件は、プレートもしくはビーズのような固体表面上で細胞を培養すること、または細胞と細胞の接触が単層培養における細胞増殖においてよりも多いように懸濁液中で細胞を培養することを含む。そのような条件の例は、三次元凝集物における細胞の増殖を含む。
【００５４】
「内分泌膵臓細胞」とは、成体または胎児の膵臓、好ましくは島細胞から最初に引き出された細胞を指す。「培養された」内分泌膵臓細胞は、初代培養物、および発癌遺伝子、例えば、SV40 T抗原、ras、またはテロメラーゼ遺伝子(例えば、hTRT)のような遺伝子で形質転換された細胞を指す。
【００５５】
「GLP-1受容体アゴニスト」は、GLP-1、GLP-1類似体、またはGLP-1受容体に結合する天然に存在するペプチド(例えば、エキセンジン-3またはエキセンジン-4)を指し、それらにより、受容体からのシグナル伝達を活性化する。
【００５６】
「培養すること」とは、エキソビボまたはインビトロで細胞を増殖させることを指す。培養細胞は、天然に存在しない細胞、例えば、発癌遺伝子またはNeuroD/BETA2および/もしくはPDX-1のような転写因子のような外因性遺伝子で形質導入された細胞でありうる。培養細胞はまた、天然に存在する単離物または初代培養物でありうる。
【００５７】
「膵臓ホルモン」とは、膵臓により合成されるホルモンを指し、例えば、インスリンおよびグルカゴンを含む。
【００５８】
「安定的」細胞株または培養物は、少なくとも約50回の細胞分裂の間、または約6ヶ月間、より好ましくは、少なくとも約150回の細胞分裂の間、または約10ヶ月間、およびより好ましくは、少なくとも約1年間のような長期の期間、インビトロで増殖することができるものである。
【００５９】
「β細胞機能を調節すること」とは、内分泌膵臓細胞のグルコース応答性インスリン分泌を増加させる(活性化する)または減少させる(阻害する)化合物を指す。グルコース応答性インスリン分泌は、当業者に公知の標準的方法を用いる、インスリンmRNA発現、プレプロインスリン生成、プロインスリン生成、インスリン生成およびc-ペプチド生成の分析を含む、多数の方法により測定されうる。調節の程度を調べるために、培養細胞は、可能性のある活性化剤または阻害剤で処理され、活性化剤または阻害剤の無しの対照試料と比較される。対照試料(阻害剤または活性化剤で処理されていない)は、100 %の相対的インスリン値を割り当てられる。阻害は、対照に対してのインスリン値が約90 %、好ましくは75 %、50 %、およびより好ましくは25 %〜0 %である場合、達成される。活性化は、対照に対してのインスリン値が110 %、より好ましくは125 %、150 %、および最も好ましくは少なくとも200 %〜500 %より高いまたは1000 %もしくはそれ以上である場合、達成される。
【００６０】
「形質導入」とは、トランスフェクション法、リポフェクション法、電気穿孔法、ウイルス形質導入法、マイクロインジェクション法、微粒子銃、受容体介在型エンドサイトーシス法などを含む、外因性核酸、例えば発現ベクターを細胞へ送達する任意の方法を指す。
【００６１】
糖尿病被検体は、Harrison's Internal Medicine、第14版、1998に記載されているように、一次および二次糖尿病、1型NIDDM一過性、1型IDDM、2型IDDM一過性、2型NIDDM、および2型MODYを含む任意の型の糖尿病に罹患している哺乳動物の被検体、しばしば、ヒトの被検体である。
【００６２】
遺伝子を「発現させること」とは、例えば、結果として遺伝子からのmRNAまたはタンパク質の生成を生じる、組換えまたは外因性遺伝子の発現を指す。組換え遺伝子は、ゲノム中へ、または染色体外エレメントに組み込まれうる。
【００６３】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子またはその断片由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドを指し、抗原を認識する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常部遺伝子、加えて、種々の免疫グロブリン可変部遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、免疫グロブリンクラス、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEも定義している。
【００６４】
典型的免疫グロブリン(抗体)構造的単位は、四量体を含む。各四量体は、2つの同一のポリペプチド対から構成され、各対は、1つの「軽」鎖(約25 kD)および1つの「重」鎖(約50 kD〜70 kD)を有する。各鎖のN末端は、主として抗原認識の責任を担う約100個〜110個またはそれ以上のアミノ酸の可変部を定義する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００６５】
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼでの消化により生成される多数の十分に特徴付けされた断片として存在する。このように、例えば、ペプシンは、ヒンジ部におけるジスルフィド結合より下の抗体を消化し、F(ab)'2、それ自身、ジスルフィド結合によりVH-CH1へ連結された軽鎖であるFabの二量体、を生成する。F(ab)'2は、ヒンジ部におけるジスルフィド結合を切断しうる穏やかな条件下において還元されうり、それにより、F(ab)'2二量体をFab'単量体に変える。Fab'単量体は、本質的に、ヒンジ部の一部をもつFabである(Fundamental Immunology (Paul編、第3版、1993)を参照)。様々な抗体断片が無傷の抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、そのような断片が化学的にかまたは組換えDNA方法を用いることによるかのいずれかで、新規に合成されうる。このように、本明細書に用いられる場合、抗体という用語はまた、抗体全体の改変により作製された抗体断片か、または組換えDNA方法を用いて新規に合成されたもの(例えば、単鎖Fv)、もしくはファージディスプレイライブラリーを用いて同定されたもの(例えば、McCaffertyら、Nature 348:552-554 (1990)を参照)かのいずれかを含む。
【００６６】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製について、当技術分野において公知のいずれの技術も用いられうる(例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozborら、Immunology Today 4:72 (1983); Coleら、pp. 77-96, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)を参照)。単鎖抗体の作製についての技術(米国特許第4,946,778号)は、本発明のポリペプチドに対する抗体を作製するのに適合しうる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような他の生物体が、ヒト化抗体を発現させるために用いられうる。または、ファージディスプレイ技術が、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーのFab断片を同定するために用いられうる(例えば、McCaffertyら、Nature 348:552-554 (1990); Marksら、Biotechnology 10:779-783 (1992)を参照)。
【００６７】
用語「免疫測定法」は、抗原を特異的に結合しうる抗体を用いるアッセイ法、例えば、ELISA、ウェスタンブロット法、RIA、免疫沈殿法などである。免疫測定法は、抗原を単離する、ターゲットする、および/または定量するための特定の抗体の特異的結合特性の使用を特徴とする。
【００６８】
「核酸」とは、一本鎖かもしくは二本鎖のいずれかの型における、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを指す。その用語は、既知のヌクレオチド類似体または改変されたバックボーン残基もしくは結合を含む核酸を含み、それらの核酸は、合成、天然に存在する、および天然に存在しないものであり、参照核酸と類似した結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドに類似した様式で代謝される。そのような類似体の例は、限定はないが、ホスホロチオアート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸(PNA)を含む。
【００６９】
他に規定がない限り、特定の核酸配列はまた、明確に示されている配列はもちろん、その保存的に改変された変異体(例えば、縮重したコドン置換)および相補的配列を暗黙のうちに含む。具体的に言うと、縮重したコドン置換は、1つまたは複数の選択された(またはすべての)コドンの第三位が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することにより達成されうる(Batzerら、Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと交換可能に用いられる。
【００７０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では交換可能に用いられる。その用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに加えて、1個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに適用する。
【００７１】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在する、および合成のアミノ酸、加えて、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるもの、加えて、後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基に結合しているα炭素をもつ化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムがある。そのような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチドバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造をもつが、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する化学物質を指す。
【００７２】
アミノ酸は、IUPAC-IUB生化学命名委員会により推奨されているそれらの一般に知られている3文字記号かまたは1文字記号のいずれかにより本明細書に示されうる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められた1文字コードにより示されうる。
【００７３】
「保存的に改変された変異体」とは、アミノ酸および核酸の両方の配列に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしていないところにおいて本質的に同一の配列、を指す。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の与えられたタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。このように、アラニンがコドンにより特定されているあらゆる位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなく、記載されている対応するコドンのいずれかに変化しうる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である、「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書でのあらゆる核酸配列はまた、あらゆる可能な核酸のサイレント変異を記載する。当業者は、核酸における各コドン(通常、メチオニンについての唯一のコドンであるAUG、および通常、トリプトファンについての唯一のコドンであるTGGを除く)が機能的に同一の分子を生じるように改変されうることを認識しているものと思われる。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、それぞれ記載された配列に潜在的に含まれている。
【００７４】
アミノ酸配列に関して、コードされた配列においてたった1個のアミノ酸もしくは小さいパーセンテージのアミノ酸を変化させる、付加する、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の配列への個々の置換、欠失または付加は、その変化が結果としてアミノ酸の、化学的に類似したアミノ酸との置換生じるところの「保存的に改変された変異体」であることを当業者は、認識しているものと思われる。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野においてよく知られている。そのような保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間の相同体および対立遺伝子を除外せず、それらに追加される。
【００７５】
以下の8群は、それぞれ、お互いについて保存的置換であるアミノ酸を含む：
1)  アラニン(A)、グリシン(G)；
2)  アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3)  アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4)  アルギニン(R)、リシン(K)；
5)  イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；
6)  フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；
7)  セリン(S)、スレオニン(T)；および
8)  システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照)。
【００７６】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイとして定義される。本明細書に用いられる場合、プロモーターは、ポリメラーゼII型プロモーターの場合におけるTATAエレメントのような、転写開始部位近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、選択的に、転写の開始部位から数千塩基対くらいに位置しうる、遠位のエンハンサーまたはリプレッサーのエレメントを含む。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境的および発生的条件下において活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的または発生的制御下において活性があるプロモーターである。用語「実施可能に連結された」とは、発現制御配列が第二配列に対応する核酸の転写を指示する、核酸発現制御配列(プロモーター、または転写因子結合部位のアレイのような)と第二の核酸配列との間の機能的連結を指す。
【００７７】
核酸の部分に関して用いられる場合の用語「異種性の」とは、核酸が、お互いとの同じ関連性において本来見出されない2個またはそれ以上の部分列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、新規の機能しうる核酸、例えば、一つの源由来のプロモーターおよび別の源由来のコード領域を生じるように配列される関連のない遺伝子由来の2個またはそれ以上の配列をもつように、組換え的に作製される。同様に、異種性タンパク質は、タンパク質が、お互いとの同じ関連性において本来見出されない2個またはそれ以上の部分列を含むことを示す(例えば、融合タンパク質)。
【００７８】
「発現ベクター」とは、宿主細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定された核酸エレメントをもつ、組換え的にまたは合成的に作製される核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の部分でありうる。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに実施可能に連結された転写されうる核酸を含む。
【００７９】
本発明の一つの態様において、発現ベクターは、ウイルスベクター、好ましくは、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターのような、宿主細胞ゲノムへ統合されるものである。本発明のウイルスベクターが由来しうるレトロウイルスの例は、トリ赤芽球症ウイルス(AMV)、トリ白血病ウイルス(ALV)、トリ骨髄芽球症ウイルス(ABV)、トリ肉腫ウイルス(ACV)、脾臓壊死ウイルス(SNV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)のようなトリのレトロウイルス；ウシ白血病ウイルス(BLV)のような非トリのレトロウイルス；ネコ白血病ウイルス(FeLV)またはネコ肉腫ウイルス(FeSV)のようなネコのレトロウイルス；マウス白血病ウイルス(MuLV)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、マウス肉腫ウイルス(MSV)、およびモロニーマウス肉腫ウイルス(MoMSV)のようなマウスのレトロウイルス；ラット肉腫ウイルス(RaSV)；ならびにヒトT細胞リンパ球指向性ウイルス1と2(HTLV-1, 2)およびサル肉腫ウイルス(SSV)のような霊長類レトロウイルスを含む。多くの他の適するレトロウイルスは、当業者に公知である。しばしば、ウイルスは、複製欠損性である、すなわち、宿主ゲノムへ組み込まれる能力はあるが、感染性ウイルスを供給する複製の能力はない。
【００８０】
本発明のもう一つの態様において、ベクターは、例えば、組み込まれた発癌遺伝子を除去するためにリコンビナーゼで細胞を形質導入するための、アデノウイルスベクターのような一過性ベクターである。
【００８１】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が、明確にかつ個別的に示されて参照として組み入れられているかのように、参照として本明細書に組み入れられている。
【００８２】
実施例
以下の実施例は、例証としてのみ提供されるが、限定するものではない。当業者は、本質的に類似した結果を生じるために変化または改変されうる様々な非決定的なパラメーターを容易に認識しているものと思われる。
【００８３】
実施例I：不死化したヒト膵臓β細胞株の調製
ヒトβ細胞由来の細胞株を発生させるために、下記のように、島調製物を、レトロウイルス感染の前にフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)自己蛍光に基づきβ細胞について濃縮した(図1)。免疫組織化学的分析により、低FAD自己蛍光をもつ細胞は、ほとんどがαで少数のβ細胞を含んでいるが、高FAD自己蛍光をもつ細胞(四角の中で選択された細胞)は、96 %インスリン陽性細胞を含んでいることが示された。低FAD集団からの培地において、RIAによりインスリンは不可能であったが、グルカゴンが検出可能であり、一方、高FAD細胞からの培地において、グルカゴンは不可能であったが、インスリンは検出可能であった。
【００８４】
96 %純粋インスリン陽性集団をSV40 T抗原およびH-rasval12を発現させるLTPRRNLloxレトロウイルスベクターでの感染によりβlox5細胞株を作製するために用いた(Halvorsenら、Molecular and Cellular Biology 19:1864-1870 (1999))。この細胞株は、長期の寿命を示し、hTRTテロメラーゼ遺伝子を発現させるレトロウイルスベクターでの感染により不死化される(Halvorsenら、Molecular and Cellular Biology 19:1864-1870 (1999))。インスリンは、G418において選択後すぐ、低レベルで検出可能であったが、急速に失われた(図2A、レーン9)。さらになお、βlox5は、他の膵臓ホルモンを発現させない(図2C)。
【００８５】
細胞を単離するために、単細胞懸濁液を80 %純度の成人島調製物から調製した。50 μm〜100 μmの直径をもつ島をデトロン(dethrone)(60 μmol/L)での染色後実体鏡を用いる直視下において手で拾い取った。拾い取られた島を2.5 mM グルコースを含むRPMI中で一晩インキュベートし、その後、前に記載されているように、非酵素的解離溶液(Sigma Corp., St Louis, MO)を用い、60サイクル/分で37℃水浴において振盪して、単細胞へと解離した。その結果生じた単細胞懸濁液を蛍光標示式細胞分取器(Facstar Plus, Becton Dickinson, Mansfield MA)において分析し、粒子フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)自己蛍光(510 nm〜550 nm)を前方光散乱に対してプロットした。ラット島について前に記載されているように、FAD自己蛍光(510 nm〜550 nm)を前方光散乱に対してプロットした場合、2つの島細胞集団が明らかになった。
【００８６】
高度に自己蛍光である細胞を滅菌ハンクスBSSに分別し、洗浄し、そして、2 x 106細胞/mlの濃度で、5 mM グルコースおよび10 % FBSを含むRPMI中に再懸濁した。ペトリ皿中に50 μlの小滴を置き、静かに反転し、そして一晩インキュベートすることにより、細胞を細胞クラスターへと凝集させた。その後、HGF/SFの存在下においてHTB-9マトリックス上の成人島について前に記載されているように、細胞凝集物から単層が惹起された。2日〜3日後、細胞が分裂しているのが観察された時、それらを高力価レトロウイルスベクターで感染させた。
【００８７】
実施例II：βlox5細胞における成長因子の発現
β細胞の分化する機能を確立かつ維持することにおいて重要であるいくつかの転写因子の発現を調べた(図3)。最も有意なことには、PDX-1、β細胞発生および機能に必要とされるホメオドメイン転写因子は、RT-PCR(示されず)またはEMSA(図3A、レーン2)により示されるように、βlox5に発現していない。この結果は、PDX-1が発現し続ける成長刺激された一次細胞とは異なる(Beattieら、Diabetes 48:1013-1019 (1999))。BETA2、β細胞だけでなく神経発生においても重要なbHLH因子は、βlox5に発現していない。β細胞においてcAMP応答性に重要な役割を果たすCREBもまた、発現していない(図3D)。しかしながら、すべての内分泌細胞に発現しているPax6は、βlox5に高レベルで発現しており、一次内分泌細胞からの起源と一致していた。RIPE3bは、インスリンプロモーター内のエレメントに結合する因子であるが、まだ単離されていないのだが、EMSAにより検出されるように、存在している(示されず)。全体的にみて、β細胞機能を確立かつ維持することにおいて重要な役割を果たす転写因子のすべてではないが、いくつかは、βlox5細胞に発現している。
【００８８】
実施例III：βlox5細胞における組換えPDX-1の発現
以前に、細胞株、ヒト胎児島由来のTRM-6へのPDX-1の導入は、結果として、ソマトスタチン遺伝子発現における増加を生じたことが示された。PDX-1はまた、細胞と細胞の接触と相乗的に作用して、PDX-1を発現させていない細胞より約1,000倍上のソマトスタチン発現のレベルを、正常なヒトの島に見出されるものと同様のレベルまでさらに増加させた。βlox5が膵臓ホルモンを発現させるように誘導されうるかどうかを決定するために、組換えPDX-1をレトロウイルスベクターを用いてβlox5に発現させた。これは、結果として細胞に機能しうるPDX-1発現を生じたが(図3A、レーン3)、TRM-6と対照的に、βlox5は、βlox5におけるPDX-1発現が結果としてEMSAにおいてDNAを結合するそれの能力により証明されるように(図3A、レーン3)機能しうるタンパク質を生じたという事実にもかかわらず、PDX-1および細胞と細胞の接触に応答してホルモン発現における増加を示さなかった(図2A、レーン3、図2C、レーン3)。それゆえに、他の因子を、PDX-1を発現させているβlox5細胞においてホルモン発現を誘導するそれらの能力について調べた。アクチビンおよびベータセルリンは、細胞株および一次細胞において内分泌分化を誘導することができると報告されている(Mashimaら、Diabetes 48:304-309 (1999), Huotariら、Endocrinology 139, 1494-1499 (1998), Mashimaら、J Clin Invest 97:1647-1654 (1996), Yamaokaら、J Clin Invest 102:294-301 (1998))。しかしながら、それらは、βlox5細胞におけるホルモン発現に効果を生じなかった(データ示さず)。
【００８９】
実施例IV：PDX-1発現細胞のGLP-1での処理
GLP、プログルカゴン分子から切断される低分子ペプチドは、インスリン分泌促進物質である(Druckerら、Diabetes 47:159-169 (1998))。ドクトカゲ(Gila lizard)由来のGLP-1の相同体、エキセンジン-4は、最近、インビトロおよびインビボにおいて齧歯類β細胞の分化を刺激することが見出された(Xuら、Diabetes 48:2270-2276 (1999), Zhouら、Diabetes 48:2358-2366 (1999))。それゆえに、エキセンジン-4を、βlox5においてβ細胞分化を刺激するそれの能力について試験した。10 nmol エキセンジン-4を4日間、細胞へ投与し、その後、培地から除去した。
【００９０】
単独では、エキセンジン-4は、βlox5においてホルモン発現に効果を生じなかった(図2A、レーン8)。しかしながら、PDX-1を発現させているβlox5細胞をエキセンジン-4の存在下において三次元凝集物として懸濁培養において増殖させた場合、インスリンmRNAの実質的量が検出可能であった(図2A、レーン2)。エキセンジン-4、細胞と細胞の接触、およびPDX-1間の相互作用の性質は、その3つの誘導因子のいずれか1つまたは2つではホルモンmRNAが検出不可能であったという事実から明らかである(図2A)。定量的RT-PCRにより、誘導されたβlox5細胞におけるインスリンmRNAのレベルは、成人島において見出されるものと同じくらいであることが明らかにされた(図2B)。島アミロイドポリペプチド(IAPP)mRNA、インスリンと共分泌されるホルモンもまた、誘導されたβlox5細胞において発現していた(図2C、レーン2)。しかしながら、他の主な膵臓ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチンおよび膵臓ポリペプチド(PP)は、誘導されなかった(図2C)。
【００９１】
実施例V：PDX-1発現βlox5細胞における膵臓ホルモンの発現
β細胞発生に重要である転写因子の発現を、それらがPDX-1、細胞と細胞の接触、およびエキセンジン-4により誘導されたかどうかを決定するために調べた。BETA2は、すべての3つの誘導因子の組み合わせによってのみ誘導された(図3C)。興味深いことに、β細胞のcAMP応答において重要な役割を果たすCREBは、細胞と細胞の接触およびPDX-1とは無関係に、エキセンジン-4単独により誘導された(図3D)。GLP-1は、cAMPレベルを増加させることが報告されており、これは、GLP-1がインスリン分泌促進物質として作用する主要な機構であると考えられてきた(Serreら、Endocrinology 139:4448-4454 (1998))。これは、GLP-1受容体の活性化がCREB発現を誘導できるという最初の報告であり、GLP-1がcAMPシグナル伝達を促進することにおいて複数のレベルで作用しうることを示唆している。RIPE3bは、インスリン遺伝子発現に重要な役割を果たす因子であるが、まだクローニングされていないのだが、PDX-1、細胞と細胞の接触、またはエキセンジン-4に関係なく、βlox5に発現している(図3E)。
【００９２】
実施例VI：グルコース応答性
機能しうるβ細胞の証明は、血液グルコースに応答してインスリンを分泌する能力である。一次β細胞は、大量のインスリンを貯蔵し、かつ様々な生理学的刺激、最も有意には細胞外グルコースに応答してそれを分泌する。誘導されたβlox5細胞は、1.6 mM グルコースで1マイクログラムDNAにつき6ピコグラムのインスリン含有量を有する。細胞内インスリンは、免疫組織化学的方法により容易に検出できる(図4A〜図4C)。誘導されたβlox5細胞からの培地は、ウシインスリンと共遊走する成熟インスリンを含む(図4D)。グルコース感覚性装置の主な成分は、グルコキナーゼである(Matschinskyら、Diabetes 47:307-315 (1998))。誘導されたβlox5細胞は、グルコキナーゼmRNAを発現させるが、誘導されていない細胞は発現させない(図5A)。βlox5細胞がグルコース応答性インスリン分泌を示している程度を、グルコースの異なる濃度でβlox5細胞を培養して、RIAにより培地におけるインスリン放出を測定することにより、試験を実施した(図5B)。最大半減の分泌は、およそ11 mM、正常な成人の島と同程度で生じた。
【００９３】
実施例VII：インビボでのグルコース応答性細胞の移植
PDX-1を発現させているβlox5細胞を、Halvorsenら、Molecular and Cellular Biology 19:1864-1870 (1999)に記載されているように、組換えSV40 T抗原およびH-rasval12遺伝子を切除するためにcreを発現させているアデノウイルスベクターでトランスフェクションした。細胞を、上記のように、エキセンジン-4であらかじめ刺激しておいた。細胞を3ヶ月間、ヌードマウスの腎臓嚢下に移植した。約25グラムの体重であるマウスにおいて、百万個〜千万個の細胞を移植した。3ヶ月後、マウスをc-ペプチドのために血液を取り、移植片を回収した。c-ペプチドをRIAを用いる標準的手順に従って測定した(図6)。これらの細胞は、グルコース応答性インスリン分泌を示す。
【００９４】
実施例VIII：βlox5細胞における組換えNeuroD/BETA2およびPDX-1の発現
細胞と細胞の接触およびエキセンジン-4のようなアゴニストでの処理によるGLP-1受容体の活性化と共役した、βlox5細胞におけるPDX-1の発現が、細胞が分化し、かつグルコース感受性インスリン生成の能力があるようになるように誘導しうることは実証された(Dufayet de la Tourら、Mole. Endocrinology 15(3):476-483, 2001)。これに関連して、NeuroD/BETA2の関与をさらに決定するために、NeuroD/BETA2およびPDX-1の両方を発現させているβlox5細胞を確立した。組換えNeuroD/BETA2およびPDX-1を2つのレトロウイルスベクターを用いてβlox5細胞へ導入した。その後、クローンを選択し、NeuroD/BETA2およびPDX-1の両方の発現を確認した。NeuroD/BETA2およびPDX-1の両方を発現させているβlox5細胞によるインスリン生成は、RT-PCRにより検出された。
【００９５】
細胞を5.5 mM グルコースおよび10 % FBSを含むDMEMにおいて培養した。クローンの選択は、300 ug/ml ハイグロマイシンBを含む同じ培地おいて行われた。定性的RT-PCRは、Itkin-Ansariら、Mol. Endocrinol. 14:814-822 (2000)に従って行われた。
【００９６】
実施例IX：NeuroD/BETA2およびPDX-1の両方を発現させるβlox5細胞におけるインスリン生成の誘導
GLP-1受容体の活性化がβ細胞分化についての必要な誘導因子の一つであるという以前の発見に照らして、NeuroD/BETA2およびPDX-1の両方を発現させているβlox5細胞をまた、エキセンジン-4による刺激の前および後に、インスリン生成について試験した。細胞をアッセイの前に4日間、培地において10 nM エキセンジン-4で処理した。
【００９７】
上で言及されている前の研究の結果と同様に、エキセンジン-4処理単独では、再び、NeuroD/BETA2およびPDX-1の両方を発現させているβlox5細胞にインスリン生成を誘導することができなかった。インスリン生成は、エキセンジン-4処理により、しかしながら、これらのNeuroD/BETA2およびPDX-1発現βlox5細胞が懸濁培養で維持され、かつ三次元凝集物を形成している場合、明らかに検出可能になった。
【００９８】
細胞と細胞の接触を可能にする培養条件下においてエキセンジン-4により誘導されたインスリン生成のレベルを比較するために、PDX-1のみを発現させているβlox5細胞ならびにNeuroD/BETA2およびPDX-1の両方を発現させているβlox5細胞の試料を定量的RT-PCRを用いて分析した。PDX-1のみを発現させているβlox5細胞ならびにNeuroD/BETA2およびPDX-1の両方を発現させているβlox5細胞は、細胞と細胞の接触およびセキセンジン-4処理の極めて類似した条件下において、誘導されたインスリン生成のほぼ等しい量を示した。βlox5/PDX-1/BETA2細胞のインスリン含有量および分泌性特性は、βlox5/PDX-1細胞のそれらと類似している、すなわち、それぞれは、ヒトの島の約10 %のインスリン含有量および約10 mMのEC50を有する。PDX-1のみを発現させているβlox5細胞と対照的に、PDX-1およびNeuroD/BETA2を発現させているβlox5細胞は、細胞増殖停止を受けなかった。それどころか、PDX-1/NeuroD/BETA2細胞は、実質的な長さの期間、複数回の細胞分裂を通して、培養中に増殖することができた。
【００９９】
細胞凝集は、Itkin-Ansariら、前記、2000により記載されているように引き起こされた。定量的インスリンRT-PCRは、Beattieら、Diabetes, 48:1013-1019, 1999に記載されているように、ヒトインスリンcDNAを含むプラスミドを用いて作図された標準曲線から補間することによって実施された。
【０１００】
実施例X：細胞と細胞の接触は、βlox5およびTRM-6細胞株において、c-Mycタンパク質発現の下方制御と相関している
本発明者らは、ヒト細胞株TRM-6におけるδ細胞分化の誘導が細胞増殖の速度における減少と関連していることを見出した。細胞と細胞の接触およびホメオドメイン転写PDX-1因子の発現の両方は、結果として、増殖の減少を生じた。しかしながら、細胞分裂の抑制が起きる機構、およびそれが分化の過程において重要であるかどうかは、わかっていない。本発明者らは、細胞周期制御において役割を果たすc-Mycの発現を、三次元細胞凝集物と比較して単層培養において調べた。単層培養物および凝集物からの細胞全体の抽出物のウェスタンブロット分析により、単層培養と比較して凝集物として増殖した場合、TRM-6およびPDX-1を発現させているβlox5細胞の両方においてc-Myc発現の著しい減少が明らかにされた。
【０１０１】
ウェスタンブロット法について、TRM-6およびβlox5細胞の単層培養物および凝集物からの細胞全体抽出物(10 μgのタンパク質)、加えてMycER発現クローンの細胞全体抽出物を使用した。c-MycおよびMycERの発現は、1:250の希釈度において、ヒトc-Myc特異的モノクローナル抗体Myc-9E10(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)でのウェスタンブロット分析により測定された。単層を凝集物と比較する場合、タンパク質等価性を検証するために、同じ膜を抗アクチンウサギ抗体A2066(Sigma, Saint Louis, MO)で再探索した。ホスホ-CREB(Ser133)についてのウェスタンブロットは、1:500の希釈度において、ポリクローナル抗体(PhosphoPlusCREB(Ser133)抗体キット、Cell Signaling Technology, Berverly, MA)を用いて行われた。結合された抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ連結抗マウスIgまたは抗ウサギIg(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)およびECL(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)で検出された。
【０１０２】
実施例XI：βlox5/PDX-1およびTRM-6/PDX-1細胞株におけるMycER融合タンパク質の発現
細胞凝集物における減少したc-Myc発現が、細胞と細胞の接触により分化を促進することにおいて原因の役割を果たすという仮説を試験するために、本発明者らは、エストロゲン受容体とc-Myc間の融合タンパク質の誘導性性質を利用した(Eilersら、Nature 340:66-68 (1989))。MycERをレトロウイルス感染によりTRM-6およびβlox5に発現させ、続いて、ピューロマイシン選択を行った。選択されたβlox5およびTRM-6細胞は、ウェスタンブロット分析により示されるようにMycERを発現させていた。融合タンパク質は活性があるかどうかを測定するために、サイクリンEおよびサイクリンAの発現を、それらがc-Mycの既知の下流標的であることから、測定した。融合タンパク質を発現させている細胞への4-OHTMの添加は、RT-PCRにより実証されているように、βlox5/PDX-1/MycERにおけるサイクリンE mRNAの発現における減少を導いたが、サイクリンA発現には影響を及ぼさなかった。
【０１０３】
実施例XII：c-Myc誘導は、細胞増殖における増加を引き起こす
PDX-1および細胞と細胞の接触は、増殖関連核抗原Ki-67についての免疫染色法により示されるように、βlox5/PDX-1/MycER細胞において、細胞増殖における減少を引き起こした。単層培養において、βlox5細胞の77 %はKi67を発現させたが、βlox5/PDX-1/MycER凝集物における細胞の16 %のみがKi67陽性であった(各場合においてn = 300)。凝集物への4-OHTMの添加は、Ki67陽性細胞のパーセンテージを57 %まで増加させた。4-OHTMの非存在下において、凝集物における少しの細胞しかKi-67について陽性ではなかったが、4-OHTMの存在下においては、凝集物中の多くの細胞が陽性であった。これは、c-Mycが増殖停止を引き起こした細胞接触において原因の役割を果たしていることを示す。
【０１０４】
実施例XIII：c-Myc誘導は膵臓ホルモン発現を切断する
TRM-6およびβlox5細胞株における分化の誘導はc-Myc発現の下方制御を必要とするかどうかを決定するために、MycER融合タンパク質を発現させている細胞において、c-Myc活性を誘導することのホルモン発現への影響を試験した。4-OHTMまたは同量のエタノール担体を、ホルモン誘導のために必要とされる凝集の4日の期間の開始時に、TRM-6/PDX-1およびβlox5/PDX-1細胞へ添加した。加えて、βlox5/PDX-1へ、GLP-1受容体の活性化がその細胞株におけるβ細胞分化に必要であるために、GLP-1アゴニストエキセンジン-4の100 nMを添加した(Itkin-Ansariら、Molec. Endocrinol. 14:814-822 (2000))。
【０１０５】
4-OHTMの非存在下において、TRM-6凝集物は、凝集の4日間後、高レベルのソマトスタチンを発現させたが、βlox5凝集物は、高レベルのインスリンを発現させた。しかしながら、4-OHTMの存在下において、ソマトスタチンmRNAもインスリンmRNAのどちらも、それぞれ、TRM-6またはβlox5において存在しなかった。インスリンタンパク質(273±70.5 pmoles/L)は、4-OHTMの非存在下において、βlox5/PDX-1/MycER凝集物からの上清にELISAにより検出されたが、4-OHTMの存在下において、検出できなかった。データは、4つの独立した実験から得られた。c-Myc活性化が、異なる内分泌系列への切り替えとは全く異なって、ホルモン発現の切断を生じたかどうかを決定するために、他の主な膵臓ホルモン、ソマトスタチン、グルカゴンおよび膵臓ポリペプチドの発現を、4-OHTM処理されたβlox5/PDX-1/MycER細胞において測定し、存在しないことを見出した。
【０１０６】
実施例XIV：c-Mycによる分化の抑制は細胞死と関連していない
c-Mycは、細胞周期への移行の強力な刺激物質であるが、それはまた、インビトロおよびインビボでアポトーシスを誘導するように働きうる。インスリンプロモーターの制御下でc-Mycを発現させるトランスジェニックマウスにおいて、β細胞におけるc-Mycの長期の活性化は、大量の細胞死へと導いた(Knaackら、Diabetes 43:1413-1417 (1994))。研究された細胞株の両方ともSV40 T抗原を発現させており、従って、c-Mycによるアポトーシス誘導に必要とされるp53経路において攪乱されている。さらに、ハウスキーピング遺伝子ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ(PD)についてのmRNAのレベルは、c-Myc活性化と共に一定のままであり、大量の細胞死の発生に反対の主張をしていた。しかしながら、c-Mycの過剰発現が細胞死を導いているという可能性をありえないとするために、本発明者らは、4-OHTMの存在下および非存在下において、凝集した細胞の生存度を評価した。βlox5/PDX-1/MycER対照凝集物およびc-Mycを過剰発現させているその凝集物の両方は、生存可能であることが見出された。エチジウムホモダイマー-1(赤)の取り込みにより測定されているように、対照凝集物の中央のいくつかの細胞は死んでいた。本発明者らは、一般に、特に大きな凝集物について、これを観察し、それを虚血性壊死に帰する。同じ分析をTRM-6/PDX-1/MycER凝集物について行い、同じ結果を得た。
【０１０７】
実施例XV：c-Mycはインスリン発現に関与する転写因子の誘導に干渉しない
βlox5細胞におけるインスリン遺伝子発現の誘導は、多数の遺伝子、特にβ細胞分化の確立および維持に関与する転写因子の発現のパターンにおける変化を含む複雑な過程である。c-Myc活性化の影響が全体的であるかどうか、すなわち、βlox5において活性化されているβ細胞分化プログラム全体の抑制か、またはホルモンを含む遺伝子のサブセットに限定されるか、を決定するために、本発明者らは、β細胞分化において重要である転写因子のβlox5細胞における発現を研究した。インスリン遺伝子発現の制御に関与する遺伝子に集中させることにより、本発明者らはまた、c-Mycがインスリン遺伝子発現を抑制する機構への洞察を得るものと期待した。
【０１０８】
βlox5細胞は、誘導されていないおよび誘導された両方の状態において、Pax6およびRIPE3bを発現させる。BETA2/NeuroDは、細胞が誘導されている場合のみ存在している。CREBタンパク質のレベルは、β細胞分化の誘導と共に劇的に増加する。c-Myc活性化は、RT-PCRにより測定されるように、結果として、Pax6について、またはβlox5細胞が分化するように誘導された場合に起こるBETA2/NeuroD1遺伝子発現の誘導に伴うmRNAのレベルにおける変化を生じなかった。電気泳動移動度シフトアッセイ分析(EMSA)により示されるように、定量的ではないが、本発明者らは、4-OHTM有りおよび無しで培養されたβlox5/PDX-1/MycER凝集物由来の試料において、インスリンプロモーターへのPDX-1、BETA2/NeuroD1またはRIPE3bの結合を見出した。さらに、ウェスタンブロット法は、CREB発現がc-Myc活性化により影響を受けないことを実証した。それゆえに、c-Mycの影響は、β細胞において遺伝子のサブセットに対して選択的である。
【０１０９】
PDX-1およびRIPE3bについてのEMSAは、それぞれ、ヒトインスリンプロモーターA5およびC1エレメント由来のプローブを用いて行われた(Itkin-Ansari Pら、Molec. Endocrinol. 14:814-822 (2000); Germanら、Diabetes 44:1002-1004 (1995))。BETA2についてのEMSAは、ヒトインスリンプロモーターE2ボックス
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由来のプローブを用いて行われた。
【０１１０】
実施例XVI：c-Myc活性化はPDX-1の核から細胞質への転位置を刺激する
PDX-1は、β細胞分化の確立および維持において役割を果たす。βlox5およびTRM-6細胞株の両方において、それは、ホルモン発現の誘導に必要とされる。それゆえに、PDX-1は、ホルモン発現の抑制におけるc-Mycに対する下流標的であることの有力な候補であった。本発明者らが研究している細胞株において、PDX-1は、レトロウイルスベクターを用いて外因的に導入され、レトロウイルスLTRプロモーターから転写されるため、c-Mycが転写レベルで働いているという可能性は低い。それゆえに、本発明者らは、4-OHTMの存在下および非存在下において、βlox5/PDX-1/MycER細胞でのPDX-1細胞の位置を調べた。4-OHTM誘導されたc-Mycの活性化は、PDX-1の核から細胞質への転位置を引き起こした。しかしながら、4-OHTMに曝された多くの細胞は、核にPDX-1を発現させ続け、標的DNA配列に結合しているPDX-1がなお、EMSAにより検出されえた。これは、細胞が4-OHTMに曝される時間の長さ、またはPDX-1の位置および機能に影響を及ぼすp38(RK/SAPK2)のような他の経路によりうるものと思われる。
【０１１１】
PDX-1局在化はp38経路により影響を及ぼされることが報告されているため、p38の活性化状態を酵素のリン酸化/活性型に特異的なモノクローナル抗体を用いて研究した。対照および4-OHTM処理されたβlox5/PDX-1/MycER細胞において、活性p38は細胞質に存在していた。それゆえに、c-Myc活性化は、結果として、p38の発現または活性化に何の変化も生じず、c-MycのPDX-1局在化への影響は、異なる経路を含んでいる可能性がある、またはp38の下流である可能性があることを示唆した。
【０１１２】
実施例XVII：胎児および成人のヒト膵臓組織におけるc-Myc発現
細胞株に関する結果の関連性をインビボでの膵臓の増殖および分化へ拡大するために、本発明者らは、免疫組織化学法を用いて、ヒト胎児および成人の膵臓組織におけるc-Mycの発現を調べた。胎児の島様細胞クラスターにおいて、多くの細胞がc-Mycについて陽性に染色されたが、成人の膵臓において、よりずいぶん少ない数の陽性細胞しか見られなかった。興味深いことに、両方の場合において、染色は、主に細胞質であった。細胞株からの結果と一致して、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンまたは膵臓ポリペプチド陽性細胞を含むホルモンについて陽性に染色されたどの細胞も、c-Mycについて陽性ではなかった。増殖マーカーKi67およびc-Mycについての二重染色により、c-Myc陽性細胞のサブセットのみがKi-67について陽性であることが明らかにされた。しかしながら、Ki-67陽性細胞の大多数は、c-Myc染色をもち、膵臓細胞の増殖におけるc-Mycの必要性と一致していた。
【０１１３】
これらの研究は、c-Mycが、ヒト膵臓内分泌細胞における増殖と分化間の逆関係を制御することにおいて中心的役割を果たしていることを示している。インビボにおいて、連続的に分裂し、かつホルモンを発現させる膵臓内分泌細胞の例はない(Schwitzgebelら、Development 127:3533-3542 (2000))。インビトロにおいて、成長因子および細胞外マトリックスを用いて分裂するように一次ヒト膵臓内分泌細胞を刺激することは、ホルモン発現における急速な減退へと導き、細胞分裂が抑制される島様細胞クラスターへの細胞の凝集により部分的に回復されうる。
【０１１４】
この報告は、c-Myc発現と膵臓内分泌細胞分化間の因果関係を実証する最初のものである。本発明の範囲を限定することを意図するものではないが、これが起きる機構は複雑であるが、それは、少なくとも一部分は、PDX-1の細胞下局在化への影響により起こる。初期の結果では、BETA2、Pax6、CREBまたはRIPE3b転写因子の発現または機能において検出可能な変化を見出さなかった。
【０１１５】
上で記載されている成体マウス膵臓モデル(Pelengarisら、Curr Opin Genet Dev 10:100-105 (2000))を含むいくつかの設定において、調節が解除されたc-Myc発現は、アポトーシスを促進する。本発明者らの系において、アポトーシスは観察されなかった。c-Myc媒介型アポトーシス性応答は、p53分解タンパク質、Mdm-2を隔離するARFの誘導を経由するp53経路に依存していることが示唆されていた(Sherrら、Curr. Opin. Genet. Devel. 10:94-99 (2000))。本発明者らの細胞株は、p16/Rbおよびp53/p21経路の両方に干渉するSV40ラージT抗原を発現させる。損なわれたp53経路は、c-Mycアポトーシス活性を減衰させうり、それにより、内分泌分化へのそれの効果を現す。
【０１１６】
現研究が、c-Mycの下方制御が内分泌細胞分化が進行するのに必要とされることを直接的に実証する最初のものである。さらになお、結果は、内分泌細胞の分裂および分化の制御に関与する少なくとも2つの機構、すなわち、c-Mycに収束する、細胞接着およびPDX-1機能、があることを示唆する。細胞と細胞の接触は、β-カテニン経路を通してc-Mycを下方制御しうるカドヘリンを含む細胞接着分子を活性化する。E-カドヘリンは、膵臓内分泌細胞分化に重要であることが示されており、c-Mycを下方制御することによりそれが作用しているという可能性を提起している。c-Mycにより抑圧される多くの遺伝子は、トロンボスポンジンならびにインテグリンαLβ2(LFA-1)およびα3β1のような細胞接着に関与する分子をコードし、細胞と細胞の接触誘発性経路において、このプロトオンコジーンの役割を支援している。
【０１１７】
c-MycがPDX-1の細胞質への転位置を誘導するという発見は、c-Mycが膵臓内分泌細胞の増殖および分化に作用しうる機構への重要な糸口を提供する。本発明者らの系において、PDX-1は、ホルモン発現を誘導することにおいて役割を果たすだけでなく、それはまた、顕著な増殖停止を、特にβ細胞株βlox5において、生じる。PDX-1が細胞周期に作用する機構はわかっていないが、c-MycがPDX-1の細胞質への転位置を誘導するようにみえるという事実は、c-MycおよびPDX-1が、増殖および分化の両方を制御している経路において、いっしょに働いている可能性があることを示している。4-OHTMのβlox5/PDX-1細胞への連続性投与は、結果として、通常ほとんど完全な増殖停止を示しているそれらの細胞の急速な増殖を生じる。このように、細胞と細胞の接触およびPDX-1は、それぞれ、細胞周期への移行を抑制することおよび分化を促進することにおいて、二重の役割を果たす。
【０１１８】
前記の本発明は、理解の明快さを目的として、図解および実施例によりかなり詳細に記載されているが、添付された特許請求の範囲の真意または範囲から逸脱することなく、ある特定の変化および改変がそれらになされうることは、本発明の教示を鑑みれば当業者にとって容易に明らかであるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】βlox5細胞株を発生させるために用いられたヒトの島の単細胞懸濁液におけるFAD自己蛍光のフローサイトメトリー分析。
【図２】βlox5における膵臓ホルモン遺伝子発現のRT-PCR分析。試験される条件は、単層培養で増殖したβlox5細胞、PDX-1を発現させるレトロウイルスベクターに感染したβlox5細胞、三次元凝集物として増殖したβlox5細胞、およびエキセンジン-4で処理されたβlox5細胞である。図2(A)インスリン；図2(B)インスリン遺伝子発現の定量的RT-PCR分析；図2(C)他の膵臓ホルモン。エキセンジン-4(Sigma)は、10 nMの濃度で使用された。インスリン、ソマトスタチン、グルカゴンおよびIAPPについてのRT-PCRは、以前に記載されている(Itkin-Ansariら、投稿済み)。定量的RT-PCRは、ヒトインスリンcDNAを含むプラスミドを用いて作図された標準曲線から補間することによって実施された。
【図３】βlox5細胞において発現される転写因子の分析。図3(A)PDX-1の電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)。PDX-1についてのEMSAは、ヒトインスリンプロモーターA5エレメント由来のプローブを用いて行われた。図3(BとC)BETA2およびPax6のRT-PCR分析。図3(D)CREBのウェスタンブロット分析。図3(E)RIPE3bのEMSA。
【図４】誘導されたβlox5細胞におけるインスリンタンパク質。図4(A〜C)インスリン免疫組織化学法；図4(D)馴化培地のインスリンウェスタンブロット分析。
【図５】グルコース応答性インスリン分泌の分析。図5(A)グルコキナーゼについてのRT-PCR。図5(B)増加性濃度のグルコースを含む培地で増殖した誘導化βlox5細胞から分泌されたインスリンについての放射性免疫アッセイ。誘導化βlox5細胞は、追加のグルコースの単一の濃度を含むDMEで1時間、培養された。培地は回収されて、RIAによりインスリンについてアッセイされた。
【図６】誘導化βlox5細胞で移植されたヌードマウスにおけるc-ペプチドのRIA。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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