(57)【要約】本発明は、一般式（Ｉ）[式中、Ｎ(Ｒ１)Ｒ２は、(２〜６Ｃ)ヘテロシクロアルキル環の一部を構成している]で表されるチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン誘導体又はその製薬上許容される塩に関する。本発明の化合物はＬＨ受容体活性化作用とＦＳＨ受容体活性化作用を有し、受胎能を調節する治療において使用することができる。
2005505555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2005505555.tif 000014
[式中、Ｒ１とＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒に、２〜６個の炭素原子を有し且つ場合によりＮ、Ｏ及び/又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を含む環を形成している]
によって表されるチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン誘導体又はその製薬上許容される塩。
【請求項２】
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(アゼチジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(モルホリン-４-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(チオモルホリン-４-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(ピペリジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(ピロリジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
又は、
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(ピペラジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
からなる群から選択される化合物。
【請求項３】
治療において使用するための請求項１又は２に記載されている化合物。
【請求項４】
製薬上許容される補助剤と混合された状態で請求項１又は２に記載されているチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン化合物又はその製薬上許容される塩若しくは溶媒和物を含有している医薬組成物。
【請求項５】
受胎能を調節するための薬物を製造するための請求項１又は２に記載されているチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン化合物又はその製薬上許容される塩若しくは溶媒和物の使用。
【請求項６】
治療を必要とする患者における受胎能障害を治療する方法であって、有効量の請求項１又は２に記載されている化合物を投与することによる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質ホルモン作動活性を有する化合物に関し、特に、黄体形成ホルモン(ＬＨ)作動活性と卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)作動活性の両方を有する化合物に関する。本発明は、さらに、前記化合物を含有する医薬組成物に関し、前記化合物の薬物療法における使用、特に、受胎能の調節手段としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
性腺刺激ホルモンは、代謝、体温調節及び生殖過程など、身体の様々な機能において重要な働きをしている。下垂体性性腺刺激ホルモンであるＦＳＨ及びＬＨは、例えば、卵胞の発育及び成熟の刺激において極めて重要な役割を果たしており、また、ＬＨは、排卵過程の誘発に関与している(Sharp, R.M. Clin. Endocrinol 33, 787-807, 1990；Dorrington 及び Armstrong, Recent Prog. Horm. Res 35, 301-342, 1979；Levy ら, Human Reproduction 15, 2258-2265, 2000)。
【０００３】
現在、ＬＨは、卵巣の刺激、即ち、体外受精(ＩＶＦ)のための卵巣の過剰刺激、及び、無排卵性の不妊症の女性における排卵の誘発(Insler, V., Int. J. Fertility 33, 85-97, 1988, Navot 及び Rosenwaks, J. Vitro Fert. Embryo Transfer 5, 3-13, 1988)、さらに、男性性機能不全症及び男性不妊症に関連して、臨床治療でＦＳＨと併用されている。
【０００４】
性腺刺激ホルモンは、生殖腺の特定の細胞型に作用して、卵巣と睾丸の分化及びステロイド合成を開始させる。これら下垂体ホルモン及び胎盤ホルモンの作用は、Ｇタンパク質共役型受容体の大きなファミリーのメンバーである特定の形質膜受容体によって介在される。それらは、７つの膜貫通ドメインを有する単一のポリペプチドから構成されていて、Ｇタンパク質と相互作用することが可能であり、それによって、アデニルシクラーゼを活性化させる。
【０００５】
治療目的に用いるための性腺刺激ホルモンは、ヒト尿源から単離することができるが、純度は低い(Morse ら, Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology 17, 143, 1988)。あるいは、それらは、組換え性腺刺激ホルモンとして調製することができる。これらのタンパク質に加えて、性腺刺激ホルモン受容体は、合成低分子量化合物によっても活性化又は不活性化することができる。二環式ヘテロ芳香族化合物が国際公開第00/61586号に記載されている。前記二環式ヘテロ芳香族化合物は、インビボ及びインビトロの実験により、ＬＨ作動薬として有用であることが示されている。
【０００６】
正常な女性では、下垂体性ＬＨ及びＦＳＨの放出は、排卵が起こる前の中間期サージにより特徴付けられる。排卵は、三種の異なった生理的現象、即ち、卵成熟、卵胞の破裂及び黄体形成によって特徴付けられる。インビボでの前記現象の誘発におけるＬＨサージの役割は明白であるが、ＦＳＨサージの役割はあまり明らかになっていない。しかしながら、最近、ＦＳＨが、ヒポキサンチンにより引き起こされる減数分裂の停止状態を確実に回復させる因子を卵丘細胞に産生させることによりインビトロで卵成熟を誘導することが示された(Lu ら, Mol. Cell. Endocrinol. 164, 191-196, 2000)。この因子は、減数分裂促進ステロール(ＭＡＳ)であると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
排卵の誘発においては、主要成分としてＬＨの作用を供するのが望ましい。本発明により、高められた受胎能のためのプロトコルにおいて用いたときに特に有利な特性を有する化合物が見いだされた。そのような化合物は、ＬＨ活性と共にＦＳＨ活性も示す。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明により、ＬＨ活性に加えて意外にもＦＳＨ活性も有する低分子量の化合物が提供される。一般に、それら化合物は、ピリミジン環の４位がフェニル基(ここで、前記フェニル基はメタ位が置換されている)で置換されているチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン化合物である。
【０００９】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【００１０】
【化１】
2005505555.tif 000003
[式中、Ｎ(Ｒ１)Ｒ２は、(２〜６Ｃ)ヘテロシクロアルキル環の一部を構成している]
によって表されるチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン誘導体又はその製薬上許容される塩である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
最も好ましい化合物は、
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(アゼチジン-l-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(モルホリン-４-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(チオモルホリン-４-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(ピペリジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(ピロリジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
及び、
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(ピペラジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド；
である。
【００１２】
式（Ｉ）の定義における用語「(２〜６Ｃ)ヘテロシクロアルキル環の一部を構成している」は、Ｒ１とＲ２が、それらが結合している窒素原子と一緒に、２〜６個の炭素原子を有し且つ場合によりＮ、Ｏ及び/又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を含む環を形成していることを意味する。そのような環の例は、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン及びチオモルホリンである。
【００１３】
上記式（Ｉ）の化合物は、ＬＨ作動活性及びＦＳＨ作動活性を示すことが明らかにされている。ヒトのＬＨ受容体又はＦＳＨ受容体でそれぞれ安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を用いるインビトロバイオアッセイにおいて、ＬＨ受容体についてのＥＣ５０は５×１０-８Ｍ未満であり、ＦＳＨについてのＥＣ５０は１０-５Ｍ未満であることが見いだされた。典型的には、ＦＳＨ活性は、ＬＨ作動刺激の約１％の活性〜ＬＨ作動刺激の約１０％の活性である。
【００１４】
本発明は、さらに、一般式（Ｉ）で表されるチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン誘導体化合物又はその塩を含有する医薬組成物である。
【００１５】
上記のように、本発明の化合物は治療において使用することができる。本発明のさらなる態様は、受胎能を調節するための薬物、好ましくは、排卵を誘導するための薬物を製造するための、一般式（Ｉ）で表されるチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン化合物の使用である。本発明の化合物は、ＬＨ受容体とＦＳＨ受容体の両方を活性化するために用いられる。従って、受胎能に問題のある女性を治療する方法において本発明の化合物を用いることができる。
【００１６】
治療での使用に関して、式（Ｉ）で表される化合物の塩は、その対イオンが製薬上許容される塩である。しかしながら、式（Ｉ）で表される塩基の酸付加塩も、例えば、製薬上許容される化合物の調製及び精製に用いることができる。製薬上許容される塩も許容されない塩も、全ての塩は本発明の範囲に包含される。
【００１７】
酸付加塩の例としては、塩酸、リン酸及び硫酸などの鉱酸から誘導される塩、好ましくは塩酸から誘導される塩、並びに、クエン酸、酒石酸、酢酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、フマル酸、グリコール酸及びコハク酸などの有機酸から誘導される塩などを挙げることができる。
【００１８】
式（Ｉ）で表される化合物又はその製薬上許容される塩(本明細書中では、有効成分とも称される)の適切な投与経路は、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射又は腹腔内注射、経口投与及び鼻腔内投与である。本発明化合物は、好ましくは、経口的に投与し得る。本発明の有効成分又はその医薬組成物の正確な用量と投与スケジュールは、必然的に、達成すべき治療効果(不妊の治療；避妊)に依存し、特定の化合物、投与経路、並びに、当該薬物を投与することになっている個々の患者の年齢及び状態に応じて変わり得る。
【００１９】
一般に、非経口投与の方が、吸着作用に依存性が高い他の投与方法に比較して必要とされる投与量が少ない。しかしながら、ヒトへの投薬は、好ましくは、体重１ｋｇあたり、０.０００１〜２５ｍｇを含む。所望の投与量は、単一の用量として、又は、投与すべき日に適切な時間間隔で投与される複数の分割された用量(subdoses)として供することができる。レシピエントが女性である場合、卵胞を支持するために月経周期を通して適当な日数をあけて投与し得るか、又は、排卵を誘発するために単一の用量として投与し得る。男性のレシピエントと女性のレシピエントでは、投与量も投与スケジュールも異なり得る。
【００２０】
ＩＶＦの場合のようにインビトロ又は生体外で用いる場合、本発明の化合物は、インキュベーション培地中で約０.０１〜５μｇ/ｍＬの濃度で用いる。
【００２１】
従って、本発明は、製薬上許容される補助剤と混合された状態で式（Ｉ）で表されるチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン化合物を含有し、さらに、場合により別の治療薬も含有している医薬組成物にも関する。そのような補助剤は、組成物中の別の成分と適合性であり且つレシピエントに対して有害でないという意味において「許容される」ものでなくてはならない。
【００２２】
医薬組成物には、経口投与、直腸内投与、鼻内投与、局所(経皮、口腔内及び舌下など)投与、膣内投与、及び、非経口(皮下、筋肉内、静脈内及び皮内など)投与に適した組成物が包含される。前記組成物は、調剤の技術分野でよく知られている何れかの方法で、例えば、Gennaro ら, Remington's Pharmaceutical Sciences(18th ed., Mack Publishing company, 1990, 特に、Part 8：Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture を参照されたい)に記載されている方法などの方法を用いて調製することができる。
【００２３】
そのような方法は、有効成分を何れかの補助剤と混合するステップを含む。補助剤は副成分とも称されるが、そのような補助剤には、当技術分野(Gennaro, 上掲)において慣習的である補助剤、例えば、増量剤、結合剤、希釈剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤及び湿潤剤などがある。
【００２４】
経口投与に適する医薬組成物は、丸薬、錠剤若しくはカプセル剤などの分離している投与単位として供し得るか、又は、散剤若しくは顆粒剤として供し得るか、又は、溶液剤若しくは懸濁液剤として供し得る。本発明の有効成分は、ボーラス剤又はペースト剤としても供し得る。本発明の組成物は、直腸内投与用の坐剤又は浣腸剤に調製することもできる。
【００２５】
非経口投与に適する組成物には、水性無菌注射液及び非水性無菌注射液などがある。そのような組成物は、単回投与量用又は複数回分の投与量用の容器、例えば、密閉されたバイアル瓶及びアンプルなどに入れて供することができ、また、使用する前に、例えば水などの無菌の液体担体を加えるだけでよい凍結乾燥状態で保存することができる。
【００２６】
経鼻吸入による投与に適する組成物又は製剤には、微粉、又は、定量加圧エーロゾル、ネブライザー若しくは吸入器により生成し得るミストなどがある。
【００２７】
本発明のチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン化合物は、さらに、放出速度調節用膜によって包まれている活性物質のコアからなる埋込可能な医薬デバイスの形態で投与することもできる。そのようなインプラントは皮下又は局所に適用されて、比較的長期間、例えば、数週間から数年にわたり、有効成分をほぼ一定の速度で放出する。埋込可能な医薬デバイスの調製方法自体は、例えば、欧州特許第0303306号(AKZO N.V.)に記載されているように、当技術分野では公知である。
【００２８】
上記のように、本発明の化合物は天然のＬＨと同じ臨床的な目的で使用することができるが、本発明の化合物は、ＦＳＨ活性も有し、改善された安定性特性を示し、且つ、別の方法で投与することができるという利点を有する。
【００２９】
式（Ｉ）で表される本発明化合物は、一般に、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド又はＴＨＦなどの適切な溶媒中で、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＰＥＡ)などの第三級塩基の存在下、室温で、式（ＩＩＩ）の(環状)第二級アミンを用いて、式中のＱがＣl又はＢrである式（ＩＩ）のハロゲン化物を求核置換することにより調製することができる。
【００３０】
【化２】
2005505555.tif 000004
式中のＱがＣl又はＢrである式（ＩＩ）の誘導体は、ジクロロメタン又はＴＨＦなどの適切な溶媒中で、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンなどの第三級塩基の存在下、式中のＱがＣl又はＢrである式(IV)のタイプの塩化アシルを用いてメタアニリン誘導体（Ｖ）を位置選択的にアシル化することにより調製することができる。
【００３１】
【化３】
2005505555.tif 000005
化合物（Ｖ）は、エタノールなどのプロトン性溶媒中で、塩酸の存在下、昇温条件下で、塩化スズ（ＩＩ）などの適切な還元剤を用いる当技術分野で公知の方法(J. Heilbron, J. Chem. Soc, 1279(1940))で誘導体（ＶＩ）中の窒素官能基を還元することにより得ることができる。
【００３２】
【化４】
2005505555.tif 000006
チエノピリミジン（ＶＩ）は、Ｏ-(ベンゾトリアゾール-１-イル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(ＴＢＴＵ)又はブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(ＰyＢrＯＰ)などのカップリング剤及びＮ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンなどの第三級塩基の影響下において、カルボン酸（ＶＩＩ）とｔ-ブチルアミンを縮合させることにより調製することができる。
【００３３】
【化５】
2005505555.tif 000007
水性ジオキサン中で、水酸化リチウム、水酸化カリウム又は水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下、昇温条件下(８０℃〜還流温度)で、エチルエステル（ＶＩＩＩ）の対応するカルボン酸（ＶＩＩ）へのけん化を行う。
【００３４】
【化６】
2005505555.tif 000008
二環式化合物（ＶＩＩＩ）は、Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンの存在下で塩化物（Ｘ）をメルカプト酢酸エチルで置換した後、中間体チオエーテル(IX)を塩基触媒による閉環反応に付すことにより形成させる。このタイプのチエノ[２,３-ｄ]ピリミジン環形成は、S.A. Abdel-Hady, M.A. Badawy, Y.A. Ibrahim, Sulfur Lett. 9, 101(1989) 及び S. Tumkevicius, Liebigs Ann., 1703(1995)に記載されている。
【００３５】
【化７】
2005505555.tif 000009
前記環化反応のための適切な条件は、還流温度における、トルエン/エタノール(１/１, v/v)中のＮ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン又はエタノール中のナトリウムエトキシドである。
【００３６】
【化８】
2005505555.tif 000010
必要とされるクロロイミン（Ｘ）は、例えば、A.A. Santilli, D.H. Kim 及び S.V. Wanser(J. Heterocycl. Chem. 8, 445, 1971)によって記述されたような文献記載の手順により合成することができる。この手順により、ラクタム（ＸＩ）を昇温条件下(８０℃〜還流温度)でＰＯＣl３で処理して塩化物（Ｘ）を得る。反応混合物に、例えばジオキサンなどの適切な溶媒を添加するか、及び/又は、ＰＣl５若しくはＮ,Ｎ-ジメチルアニリンのいずれかを添加することにより、反応時間を短縮し、塩化物（Ｘ）の収率を高めることができる。
【００３７】
【化９】
2005505555.tif 000011
ラクタム（ＸＩ）を得るための適切な合成経路には、エタノール中、昇温条件下(６０℃)での炭酸カリウムなどの塩基存在下におけるシアノ酢酸エチルと３-ニトロ-ベンズアルデヒド及びＳ-メチルイソチオ尿素の多成分縮合が含まれている。
【００３８】
【化１０】
2005505555.tif 000012
関連する手順が、S. Kambe, K. Saito 及び H. Kishi, Synthesis, 287(1979)；A.M. Abd-Elfattah, S.M. Hussain 及び A.M. El-Reedy, Tetrahedron 39, 3197(1983)；S.M. Hussain, A.A. El-Barbary 及び S.A. Mansour, J. Heterocycl. Chem. 22, 169(1985)に開示されている。
【００３９】
受容体の結合を測定する方法並びに性腺刺激ホルモンの生物学的な活性を測定するためのインビトロアッセイ及びインビボアッセイはよく知られている。一般に、発現された受容体を被検化合物と接触させて、結合又は機能的応答の阻害若しくは刺激を測定する。
【００４０】
機能的応答を測定するために、ＬＨ又はＦＳＨ受容体遺伝子、好ましくは、ヒトの受容体遺伝子をコードする単離されたＤＮＡを、適切な宿主細胞で発現させる。そのような細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞であり得るが、別の細胞も適している。好ましくは、前記細胞は哺乳動物由来のものである(Jia ら, Mol. Endocrin., 5, 759-776, 1991)。
【００４１】
組換えＬＨ又はＦＳＨ発現細胞系を構築する方法は当技術分野ではよく知られている(Sambrook ら, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 最新版)。受容体の発現は、所望のタンパク質をコードしているＤＮＡの発現により達成される。部位特異的突然変異誘発、追加配列の連結反応、ＰＣＲ及び適切な発現系の構築に関する技術は、全て、これまでに、当技術分野でよく知られている。所望のタンパク質をコードするＤＮＡの一部又は全体は、標準的な固相技術を用いて、好ましくは、連結反応を容易にするために制限部位を含むように、人工的に構築することができる。含まれているコード配列を転写及び翻訳するための適切な調節領域をＤＮＡコード配列に提供することができる。周知のように、現在は、細菌類などの原核生物の宿主、並びに、酵母菌、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び鳥類細胞などの真核生物の宿主などを包含する非常に広範囲の宿主に対して適合性を有する発現系を利用することができる。
【００４２】
上記受容体を発現する細胞を、次いで、被検化合物に接触させて、結合又は機能的応答の阻害若しくは刺激を観察する。
【００４３】
あるいは、発現された受容体を含んでいる単離した細胞膜を用いて、化合物の結合を測定することができる。
【００４４】
結合を想定するために、放射能標識化合物又は蛍光標識化合物を用いることができる。対照化合物として、ヒト組換えＬＨ又はヒト組換えＦＳＨを用いることができる。別の方法では、競合結合アッセイを行うこともできる。
【００４５】
別のアッセイでは、受容体の刺激により介在されるｃＡＭＰの蓄積を測定することにより、ＬＨ受容体作動性化合物又はＦＳＨ受容体作動性化合物のスクリーニングを行う。従って、そのような方法においては、宿主細胞の細胞表面上で上記受容体を発現させ、その細胞を被検化合物に接触させる。次いで、ｃＡＭＰの量を測定する。被検化合物が受容体に結合した時点で、阻害作用を示すか又は刺激作用を示すかに応じて、ｃＡＭＰのレベルは減少するか又は増加する。
【００４６】
被検化合物に接触させた細胞において、例えば、ｃＡＭＰレベルなどを直接測定することの他に、受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションされ、さらに、その発現がｃＡＭＰレベルに応答するレポーター遺伝子をコードする第二のＤＮＡでもトランスフェクションされている細胞を用いることもできる。そのようなレポーター遺伝子は、ｃＡＭＰ誘導可能である可能性があるか、又は、新規ｃＡＭＰ応答配列に結合するように構築し得る可能性がある。一般に、レポーター遺伝子の発現は、ｃＡＭＰのレベルの変化に応答する任意の応答配列によって調節することができる可能性がある。適するレポーター遺伝子は、例えば、ＬacＺ、アルカリ性ホスファターゼ、ホタルルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質である。そのようなトランス活性化アッセイの原理は当技術分野ではよく知られており、例えば、Stratowa, Ch, Himmler, A 及び Czernilofsky, A.P., Curr. Opin. Biotechnol. 6, 574(1995)に記載されている。
【００４７】
ＬＨ受容体又はＦＳＨ受容体に対して活性を有する化合物を選抜するためには、ＬＨ又はＦＳＨを対照として使用した場合に、１０-５Ｍでの試験において最大活性の２０％を超える活性を示すことが必要である。別の基準としては、ＥＣ５０値が考えられるが、この値は、＜１０-５Ｍ、好ましくは、＜１０-７Ｍであることが必要である。
【００４８】
当業者は、望ましいＥＣ５０値が被検化合物に依存することを理解するであろう。例えば、１０-５Ｍより低いＥＣ５０値を示す化合物は、一般に、薬物の選択についての候補化合物とみなされる。この値は、１０-７Ｍより低いことが好ましい。しかしながら、ＥＣ５０値がもっと高い化合物であっても、特定の受容体に対して選択性を有していれば、同様に好ましい候補化合物であり得る。
【００４９】
ＬＨ受容体作動性化合物のスクリーニングは、マウスライディッヒ細胞バイオアッセイを用いて行うこともできる(Van Damme, M., Robersen, D. 及び Diczfalusy, E., Acta Endocrinol. 77: 655-671(1974), Mannaerts, B., Kloosterboer, H. 及び Schuurs, A., Neuroendocrinology of reproduction. R. Rolland ら, Eds., Elsevier Science Publishers B.V., 49-58(1987))。このアッセイにおいては、ＬＨ受容体の刺激を介したテストステロンの産生を雄マウスから単離したライディッヒ細胞中で測定することができる。
【００５０】
さらに、Nayudu, P. 及び Osborn, S.(J. Reproduction and Fertility 95, 349-362(1992))に従い、培養されたマウス卵胞を用いる生体外モデルで化合物のＦＳＨ作動活性を測定することもできる。従って、マウスの卵胞を単離し、ＦＳＨ作動性化合物の存在下で培養して、卵胞の成育を惹起する。卵胞の直径と培養培地中のエストラジオールを測定することにより卵胞の成育が示される。
【００５１】
化合物のＬＨインビボ活性を測定するために、未成熟マウスにおける排卵誘発について調べることができる。このアッセイでは、未成熟の雌マウスに前もって尿ＦＳＨを与え、約４８時間後、ＬＨ作動性化合物で処理する。ＬＨ作動性化合物で処理した後、前記動物を殺して、卵管内の卵子の数を顕微鏡を用いて数える。
【００５２】
化合物のＦＳＨインビボ活性を測定するために、０、８、２４及び３２時間目に、未成熟雌ラットをＦＳＨ作動性化合物で処理して、卵胞の成育を惹起する。実験を開始してから５２時間後に、前記動物にｈＣＧを注射して排卵を誘発する。実験を開始してから７２時間後に前記動物を殺して、卵管内の卵子の数を顕微鏡を用いて数える。さらに、卵巣の重さを測定する。
【００５３】
本発明の化合物は、現在ＬＨ又はｈＣＧが用いられている治療方法において、臨床的に適用することができる。そのようなものには、二次性徴発育不全性性機能低下症(hypogonadal hypogonadism)を患っている男性患者又は女性患者の間でのＬＨ置換、中間期投与による排卵の誘発(排卵誘発(ＯＩ))又は過排卵刺激(ＣＯＨ)又は黄体の刺激などがある。
【００５４】
以下に示す実施例は、本発明を例証するためのものであって、決して本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
（実施例）
【実施例１】
【００５５】
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(アゼチジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
（ａ）  ５-シアノ-４-(３-ニトロフェニル)-２-メチルチオ-６-オキソピリミジン
無水ＥtＯＨ(１５００ｍＬ)中のＳ-メチルイソチオ尿素スルフェート(６９.０ｇ)、３-ニトロベンズアルデヒド(７５.０ｇ)、シアノ酢酸エチル(５６.０ｍＬ)及び炭酸カリウム(７２.５ｇ)の混合物を６０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を氷浴中で０℃に冷却した。生じた沈澱物を濾過し、無水エタノールで洗浄し、熱水(１００℃)に溶解させた。得られた溶液を室温まで冷却し、２ＮのＨＣlでｐＨ２まで酸性化し、氷浴中で０℃に冷却した。生じた沈澱物を濾過し、冷水で洗浄した。沈澱物中の残留水を１,４-ジオキサンと一緒に同時蒸発させることにより除去した。
収量：  ５４.０ｍｇ；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝２８９.０；
ＴＬＣ：  Ｒｆ＝０.３，シリカゲル，ＤＣＭ/ＭeＯＨ＝９/１(ｖ/ｖ)。
【００５６】
（ｂ）  ６-クロロ-５-シアノ-４-(３-ニトロフェニル)-２-メチルチオ-ピリミジン
５-シアノ-４-(３-ニトロフェニル)-２-メチルチオ-６-オキソピリミジン(実施例１（ａ），２５.０ｇ)を乾燥１,４-ジオキサン(３００ｍＬ)に溶解させた溶液を撹拌しながら、それに、ＰＯＣl３(１００ｍＬ)を添加した。９０℃で３時間経過した後、得られた混合物を室温まで冷却し、減圧下に濃縮した。残渣を１,４-ジオキサン(１００ｍＬ)に溶解させ、得られた溶液を０℃に冷却した。氷水を注意深く加えた。生じた沈澱物を濾過し、水で洗浄した。沈澱物中の残留水を１,４-ジオキサンと一緒に同時蒸発させることにより除去した。
収量：  ２６.０ｇ；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝３０７.０；
ＴＬＣ：  Ｒｆ＝０.５，シリカゲル，ヘプタン/ＥtＯＡc＝３/２(ｖ/ｖ)。
【００５７】
（ｃ）  エチル ５-シアノ-４-(３-ニトロフェニル)-２-メチルチオ-６-(エトキシカルボニルメチルチオ)-ピリミジン
２-メルカプト酢酸エチル(９.３ｍＬ)及び６-クロロ-５-シアノ-４-(３-ニトロフェニル)-２-メチルチオ-ピリミジン(実施例１（ｂ），２６.０ｇ)をＥtＯＨ(２５０ｍＬ)とＤＣＭ(２５０ｍＬ)の混合物に溶解させた溶液を撹拌しながら、それに、ＤＩＰＥＡ(１５.７ｍＬ)を添加した。室温で１時間経過した後、得られた混合物に０.１Ｎの水性ＨＣl(５００ｍＬ)を添加し、次いで、ＤＣＭ(５００ｍＬ)で３回抽出し、脱水し(ＭgＳＯ４)、減圧下に濃縮した。
収量：  ２８.０ｇ；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝３９０.４
ＴＬＣ：  Ｒｆ＝０.５，シリカゲル，ヘプタン/ＥtＯＡc＝３/２(ｖ/ｖ)。
【００５８】
（ｄ）  ５-アミノ-４-(３-ニトロフェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボン酸エチル
トルエン(１５０ｍＬ)とＥtＯＨ(１５０ｍＬ)の混合液中のエチル ５-シアノ-４-(３-ニトロフェニル)-２-メチルチオ-６-(エトキシカルボニルメチルチオ)-ピリミジン(実施例１（ｃ），２８.０ｇ)とＤＩＰＥＡ(３０ｍＬ)の混合物を還流温度(１００℃)で１６時間撹拌し、次いで、室温まで冷却し、減圧下に濃縮した。残留しているＤＩＰＥＡをトルエンと一緒に同時蒸発させることにより除去した。
収量：  ２８.０ｇ；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝３９１. ２；
ＴＬＣ：  Ｒｆ＝０.６，シリカゲル，ヘプタン/ＥtＯＡc＝３/２(ｖ/ｖ)。
【００５９】
（ｅ）  ５-アミノ-４-(３-アミノフェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボン酸エチル
１,４-ジオキサン(４００ｍＬ)中の５-アミノ-４-(３-ニトロフェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボン酸エチル(実施例1（ｄ），２８.０ｇ)と水性濃ＨＣl(１５ｍＬ)と塩化スズ（ＩＩ）(４１.０ｇ)の混合物にＥtＯＨ(４００ｍＬ)を添加した。得られた混合物を９０℃で１６時間撹拌し、次いで、室温まで冷却し、減圧下に濃縮した。残渣をＥtＯＡc(１０００ｍＬ)に懸濁させた。４Ｎの水性ＮaＯＨを添加して、ｐＨ１０〜１１とした。得られた混合物を激しく撹拌し、有機層を分離し、脱水し(ＭgＳＯ４)、減圧下に濃縮した。
収量：  ２１.０ｇ；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝３６１.０；
ＴＬＣ：  Ｒｆ＝０.６，シリカゲル，ヘプタン/ＥtＯＡc＝３/２(ｖ/ｖ)。
【００６０】
（ｆ）  ５-アミノ-４-(３-アミノフェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボン酸
５-アミノ-４-(３-アミノフェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボン酸エチル(実施例１（ｅ），２１.０ｇ)を１,４-ジオキサン(３００ｍＬ)と水(１００ｍＬ)の混合液に溶解させた溶液に水酸化カリウム(３２.４ｇ)を添加した。９０℃で１６時間経過した後、得られた混合物を１０℃に冷却し、激しく撹拌しながら、２Ｎの水性のクエン酸(３００ｍＬ)を添加した。生じた沈澱物を濾過し、水(１８０ｍＬ)で洗浄し、減圧下に乾燥させた。
収量：  １４.０ｇ；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝３３３.０；
ＴＬＣ：  Ｒｆ＝０.５，シリカゲル，ＤＣＭ/ＭeＯＨ＝９/１(ｖ/ｖ)。
【００６１】
（ｇ）  ｔ-ブチル ５-アミノ-４-(３-アミノフェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
５-アミノ-４-(３-アミノフェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボン酸(実施例１（ｆ），１４.０ｇ)、ＤＩＰＥＡ(１７.４ｍＬ)及びｔ-ブチルアミン(７.３ｇ)をＤＣＭ/ＤＭＦ(１/１，ｖ/ｖ，２５０ｍＬ)に溶解させた溶液に、ＴＢＴＵ(１６.１ｇ)を添加した。室温で３時間経過した後、得られた混合物を飽和水性ＮaＨＣＯ３(１００ｍＬ)で３回洗浄し、０.１Ｎの水性ＨＣl(１００ｍＬ)で洗浄し、次いで、水(１００ｍＬ)で洗浄した。有機層を減圧下に濃縮した。得られた粗生成物を、温無水ＥtＯＨ(３００ｍＬ)から結晶化させることにより精製した。
収量：  １０.５ｇ；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝３８８.２；
ＨＰＬＣ：  Ｒｔ＝３０.７２分，Ｌｕｎａ Ｃ-１８(２)，５μｍ，２５０×２.０ｍｍ，検出ＵＶ＝２１０ｎｍ，オーブン温度＝４０℃，流速＝０.２５ｍＬ/分，溶離液 水/ＡＣＮ/ＭeＯＨ＝９０/９.５/０.５から０/９５/５，実行時間＝５０分間。
【００６２】
（ｈ）  ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-ブロモアセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-アミノフェニル)-チエノ[２,３-ｄ]-ピリミジン-６-カルボキサミド(実施例１（ｇ），１.０８ｇ)及びＤＩＰＥＡ(２.４３ｍＬ)を乾燥ＤＣＭ(２０ｍＬ)に溶解させた溶液にブロモアセチルクロリド(６１５ｍｇ)を添加した。室温で３時間経過した後、得られた混合物をＤＣＭで希釈し、飽和水性ＮaＨＣＯ３で洗浄し、脱水し(ＭgＳＯ４)、減圧下に濃縮した。得られた粗生成物を、溶離液としてヘプタン/ＥtＯＡc＝３/２(ｖ/ｖ)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。
収量：  ９１０ｍｇ；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝５１０. ２；
ＴＬＣ：  Ｒｆ＝０.３，シリカゲル，ヘプタン/ＥtＯＡc＝３/２(ｖ/ｖ)。
【００６３】
（ｉ）  ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(アゼチジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
アゼチジン塩酸塩(１２０ｍｇ)及びＮ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン(０.２５ｍＬ)をＤＣＭ(５ｍＬ)に溶解させた溶液にｔ-ブチル ５-アミノ-４-(３-(２-ブロモアセトアミド)-フェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド(実施例１（ｈ），９１ｍｇ)を添加した。室温で１６時間経過した後、得られた混合物を飽和水性ＮaＨＣＯ３で洗浄し、脱水し(ＭgＳＯ４)、減圧下に濃縮した。得られた粗生成物を、Ｌｕｎａ Ｃ-１８カラムを用いるＨＰＬＣで勾配溶離(３０分間で、０.１％水性ＴＦＡ＋１０％水性ＡＣＮ/ＡＣＮ＝９０/１０〜１０/９０)により精製した。得られた標題化合物を、次いで、０.１％のＴＦＡを含む水から凍結乾燥させた。
収量：  ５６ｍｇ(ＴＦＡ塩)；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝４８５.２；
ＨＰＬＣ：  Ｒｔ＝１３.４５分，カラムＬｕｎａ Ｃ-１８(２)，３μｍ，１００×２.０ｍｍ，検出ＵＶ＝２１０ｎｍ，オーブン温度＝４０℃，流速＝０.２５ｍＬ/分，溶離液 リン酸緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ ２.１/水/ＡＣＮ＝１０/７０/２０から１０/１０/８０(ｖ/ｖ)，実行時間＝２０分間。
【実施例２】
【００６４】
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(モルホリン-４-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
ｔ-ブチル ５-アミノ-４-(３-(２-ブロモアセトアミド)-フェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド(実施例１（ｈ），１.０ｇ)をＴＨＦ(５０ｍＬ)に溶解させた溶液に、モルホリン(５.０ｍＬ)を添加した。室温で１６時間経過した後、得られた混合物を減圧下に濃縮した。残渣を、溶離液としてＤＣＭ/ＭeＯＨ＝９/１を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。得られた粗生成物を、Ｌｕｎａ Ｃ-１８カラムを用いるＨＰＬＣで勾配溶離(３０分間で、０.１％水性ＴＦＡ/水/ＡＣＮ＝３/９７/０から３/７/９０)によりさらに精製した。得られた純粋な標題化合物を、０.１％水性ＴＦＡと水の混合物から凍結乾燥させた。
収量：  ２１５ｍｇ(ＴＦＡ塩)；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝５１５.２；
ＨＰＬＣ：  Ｒｔ＝２０.６２分，Ｌｕｎａ Ｃ-１８(２)，５μｍ，１５０×２ｍｍ，検出ＵＶ＝２１０ｎｍ，オーブン温度＝４０℃，流速＝０.２５ｍＬ/分，溶離液 リン酸緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ ２.１/水/ＡＣＮ/ＭeＯＨ＝１０/７２/１７/１から１０/１８/６８/４(ｖ/ｖ)，実行時間＝４０分間。
【実施例３】
【００６５】
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(チオモルホリン-４-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-ブロモアセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド(実施例１（ｈ），１.０９ｇ)をＤＣＭ(５０ｍＬ)に溶解させた溶液に、チオモルホリン(２.１６ｍＬ)を添加した。室温で１６時間経過した後、得られた混合物をＤＣＭで希釈し、飽和水性ＮaＨＣＯ３で洗浄し、脱水し(ＭgＳＯ４)、減圧下に濃縮した。得られた粗生成物を、Ｌｕｎａ Ｃ-１８カラムを用いるＨＰＬＣで勾配溶離(３０分間で、０.１％水性ＴＦＡ＋１０％水性ＡＣＮ/ＡＣＮ＝１００/０から１０/９０)により精製した。得られた純粋な標題化合物を、１Ｎの水性ＨＣlで酸性化した水から凍結乾燥させた。
収率：  ８１６ｍｇ；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝５３１. ２；
ＨＰＬＣ：  Ｒｔ＝１４.７２分，カラムＬｕｎａ Ｃ-１８(２)，３μｍ，１００×２ｍｍ，検出ＵＶ＝２１０ｎｍ＋２５４ｎｍ，オーブン温度＝４０℃，流速＝０.２５ｍＬ/分，溶離液 リン酸緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ ２.１/水/ＡＣＮ/ＭeＯＨ＝１０/７２/１７/１から１０/１８/６８/４(ｖ/ｖ)，実行時間＝２０分間。
【実施例４】
【００６６】
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(ピペリジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
ｔ-ブチル ５-アミノ-４-(３-(２-ブロモアセトアミド)-フェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド(実施例１（ｈ），１.０ｇ)をＣＨ２Ｃl２(５０ｍＬ)に溶解させた溶液に、ピペリジン(３.０ｍＬ)を添加した。室温で１６時間経過した後、得られた混合物を減圧下に濃縮した。残渣を、溶離液としてＤＣＭ/ＭeＯＨ＝９/１を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。得られた粗生成物を、Ｌｕｎａ Ｃ-１８カラムを用いるＨＰＬＣで勾配溶離(３０分間で、０.１％水性ＴＦＡ/ＡＣＮ＝１００/０から１０/９０)によりさらに精製した。得られた純粋な標題化合物を、０.１％水性ＴＦＡと水の混合物から凍結乾燥させた。
収量：  ８５１ｍｇ(ＴＦＡ塩)；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝５１３.２；
ＨＰＬＣ：  Ｒｔ＝３７.３分，Ｌｕｎａ Ｃ-１８(２)，５μｍ，１５０×２ｍｍ，検出ＵＶ＝２１０ｎｍ，オーブン温度＝４０℃，流速＝０.２５ｍＬ/分，溶離液 リン酸緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ ２.１/水/ＡＣＮ＝２０/６０/２０から２０/０/８０(ｖ/ｖ)，実行時間＝４０分間。
【実施例５】
【００６７】
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(ピロリジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
ｔ-ブチル ５-アミノ-４-(３-(２-ブロモアセトアミド)-フェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド(実施例１（ｈ），１.０ｇ)をＣＨ２Ｃl２(５０ｍＬ)に溶解させた溶液に、ピロリジン(３.０ｍＬ)を添加した。室温で１６時間経過した後、得られた混合物を減圧下に濃縮した。残渣を、溶離液としてＤＣＭ/ＭeＯＨ＝９/１を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。得られた粗生成物を、Ｌｕｎａ Ｃ-１８カラムを用いるＨＰＬＣで勾配溶離(３０分間で、０.１％水性ＴＦＡ/ＡＣＮ＝１００/０から１０/９０)によりさらに精製した。得られた純粋な標題化合物を、０.１％水性ＴＦＡと水の混合物から凍結乾燥させた。
収量：  ６１６ｍｇ(ＴＦＡ塩)；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝４９９.２；
ＨＰＬＣ：  Ｒｔ＝３７.５分，Ｌｕｎａ Ｃ-１８(２)，５μｍ，１５０×２ｍｍ，検出ＵＶ＝２１０ｎｍ，オーブン温度＝４０℃，流速＝０.２５ｍＬ/分，溶離液 リン酸緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ ２.１/水/ＡＣＮ＝２０/６０/２０から２０/０/８０(ｖ/ｖ)，実行時間＝４０分間。
【実施例６】
【００６８】
ｔ-ブチル ５-アミノ-２-メチルチオ-４-(３-(２-(ピペリジン-１-イル)-アセトアミド)-フェニル)-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド
ｔ-ブチル ５-アミノ-４-(３-(２-ブロモアセトアミド)-フェニル)-２-メチルチオ-チエノ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-カルボキサミド(実施例１（ｈ），１.０ｇ)をＣＨ２Ｃl２(５０ｍＬ)に溶解させた溶液に、ピペラジン(２.５ｇ)を添加した。室温で１６時間経過した後、得られた混合物を減圧下に濃縮した。残渣を、溶離液としてＤＣＭ/ＭeＯＨ＝７/１を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。得られた粗生成物を、Ｌｕｎａ Ｃ-１８カラムを用いるＨＰＬＣで勾配溶離(３０分間で、０.１％水性ＴＦＡ/ＡＣＮ＝１００/０から１０/９０)によりさらに精製した。得られた純粋な標題化合物を、０.１％水性ＴＦＡと水の混合物から凍結乾燥させた。
収量：  ７６６ｍｇ(ビスＴＦＡ塩)；
ＭＳ-ＥＳＩ：  [Ｍ＋Ｈ]＋＝５１４.４；
ＨＰＬＣ：  Ｒｔ＝３３.７分，Ｌｕｎａ Ｃ-１８(２)，５μｍ，１５０×２ｍｍ，検出ＵＶ＝２１０ｎｍ，オーブン温度＝４０℃，流速＝０.２５ｍＬ/分，溶離液 リン酸緩衝液 ５０ｍＭ ｐＨ ２.１/水/ＡＣＮ＝２０/６０/２０から２０/０/８０(ｖ/ｖ)，実行時間＝４０分間。
【実施例７】
【００６９】
ＣＨＯ-ＬＨ及びＣＨＯ-ＦＳＨインビトロ生物活性
ヒトの受容体で安定的にトランスフェクションされ、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を誘導するｃＡＭＰ応答配列(ＣＲＥ)／プロモーターでコトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞で、化合物のＬＨ作動活性について試験した。リガンドがＧタンパク質共役型ＬＨ受容体に結合することによりｃＡＭＰが増加し、それによって、ルシフェラーゼレポーター構築物の増強されたトランス活性化が惹起される。ルミネセンスカウンターを用いてルシフェラーゼシグナルを計量した。被検化合物について、ＥＣ５０値(最大刺激の半分(５０％)の刺激を引き起こす被検化合物の濃度)を計算した。この目的のために、ソフトウエアプログラム  ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ, バージョン３.０(GraphPad software Inc., San Diego)を用いた。同様にして、ルシフェラーゼレポーター遺伝子とヒトＦＳＨ受容体でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞で化合物のＦＳＨ作動活性について試験した。結果は表１に示してある。
【００７０】
インビボ生物活性
ＬＨ/ＦＳＨ受容体作動性化合物のインビボでの活性を測定するために、未成熟マウスにおける排卵誘発について調べた。このアッセイでは、未成熟の雌マウスに前もって尿ＦＳＨ(ヒュメゴン １２.５ＩＵ/動物)を与えた。約４８時間後、前記動物を５０ｍｇ/ｋｇの投与量レベルのＬＨ/ＦＳＨ作動性化合物で処理した。ＬＨ/ＦＳＨ作動性化合物での処理の２４時間後に前記動物を殺して、卵管内の卵子の数を顕微鏡を用いて数えた。結果は表１に示してある。
【００７１】
【表１】
2005505555.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2005505555.tif 000015
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【国際調査報告】
2005505555.tif 000037
2005505555.tif 000038