(57)【要約】本発明はキイロショウジョウバエＧＰＣＲ（ＤｍＧＰＣＲ）ポリペプチドおよびこうしたＤｍＧＰＣＲを同定するおよびコードするポリヌクレオチドを提供する。加えて、本発明は発現ベクター、宿主細胞およびその産生のための方法を提供する。本発明はまた、潜在的殺虫薬として有用な、他の種における相同体およびＤｍＧＰＣＲアゴニスト／アンタゴニストの同定のための方法も提供する。本発明はさらに、ＤｍＧＰＣＲを結合するための方法、ＤｍＧＰＣＲ発現および活性の変調剤を同定するための方法、ＤｍＧＰＣＲ抗体、ＤｍＧＰＣＲアンチセンスポリヌクレオチド、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーまたは変調剤で昆虫の集団を制御するための方法、および外部寄生虫に関連する疾患または状態を防止するまたは処置する方法を提供する。特に、この発明は、オーファンショウジョウバエ短神経ペプチドＦレセプターとその同族のペプチドリガンドのマッチングを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤｍＧＰＣＲ１およびＤｍＧＰＣＲ１結合パートナー間の結合および／または機能の変調剤を同定するための方法であって：
（ａ）推定変調剤化合物の存在下または非存在下、ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーと、ＤｍＧＰＣＲ１を含んでなる組成物とを接触させ；
（ｂ）ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーおよびＤｍＧＰＣＲ１間の結合を検出し；そして
（ｃ）該推定変調剤化合物の非存在下での結合または機能と比較して、該推定変調剤化合物の存在下での結合または機能が増加したかまたは減少したかどうかを決定する、
ここにおいて、該ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーは、配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列と、少なくとも７０％配列同一性の配列を有する、
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
該ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーが配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーが配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列と、少なくとも９５％配列同一性の配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーが配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
昆虫の集団を制御する方法であって、ＤｍＧＰＣＲ１の発現または活性を修飾するため、昆虫にＤｍＧＰＣＲ１ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの結合パートナーまたは変調剤を投与する、ここにおいて該結合パートナーは配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列と、少なくとも７０％配列同一性の配列を有する、ことを含んでなる、前記方法。
【請求項６】
該結合パートナーが配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％同一性の配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該結合パートナーが配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列と、少なくとも９５％同一性の配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該結合パートナーが配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
該昆虫がハエ、ショウジョウバエ、マダニ、ノミ、シラミ、ダニおよびゴキブリから成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
対象において外部寄生虫により引き起こされる疾患または状態を処置するまたは防止する方法であって、該対象に治療的に有効量のＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーを投与する、ここにおいて、該ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーは配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列と、少なくとも７０％同一性の配列を有する、ことを含んでなる、前記方法。
【請求項１１】
該ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーが配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％同一性の配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーが配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列と、少なくとも９５％同一性の配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
該ＤｍＧＰＣＲ１結合パートナーが配列番号１８６および配列番号１８７から成る群より選択される配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
該対象がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＤｍＧＰＣＲをＤｍＧＰＣＲ結合パートナーと結合する方法であって、
ＤｍＧＰＣＲを含んでなる組成物とＤｍＧＰＣＲ結合パートナーとを接触させ；そして
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーを該ＤｍＧＰＣＲと結合させる、
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
該ＤｍＧＰＣＲがＤｍＧＰＣＲ５（配列番号９）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーがドロタキキニン（ＤＴＫ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該ドロタキキニンが、ＤＴＫ−１（配列番号１６９）、Ｍｅｔ８−ＤＴＫ−２（配列番号１７０）、ＤＴＫ−２（配列番号１７１）、ＤＴＫ−３（配列番号１７２）、ＤＴＫ−４（配列番号１７３）およびＤＴＫ−５（配列番号１７４）から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該ＤｍＧＰＣＲがＤｍＧＰＣＲ７（配列番号１７）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーがロイコキニン（ＬＫ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該ロイコキニンがＬＫ−Ｉ（配列番号１７５）、ＬＫ−Ｖ（配列番号１７６）、ＬＫ−ＶＩ（配列番号１７７）およびＬＫ−ＶＩＩＩ（配列番号１７８）、キュレキニン（配列番号１７９）、モノアラガイ  リムノキニン（Ｌｙｍｎａｅａ  ｌｙｍｎｏｋｉｎｉｎ）（配列番号１８０）、ＤＬＫ−１（配列番号１８１）、ＤＬＫ−２（配列番号１８２）、ＤＬＫ−２ａ（配列番号１８３）から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該ＤｍＧＰＣＲがＤｍＧＰＣＲ８（配列番号１９）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーがアラトスタチンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該アラトスタチンがＡＳＴ−Ｃ（配列番号１８４）またはＤＳＴ−Ｃ（配列番号１８５）から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＤｍＧＰＣＲおよびＤｍＧＰＣＲ結合パートナー間の結合および／または機能の変調剤を同定するための方法であって：
推定変調剤化合物の存在下または非存在下、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーと、ＤｍＧＰＣＲを含んでなる組成物とを接触させ；
ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーおよびＤｍＧＰＣＲ間の結合を検出し；そして
該推定変調剤化合物の非存在下での結合と比較して、該推定変調剤化合物の存在下での結合が増加したかまたは減少したかどうかを決定する；
該推定変調剤化合物の非存在下での機能と比較して、該推定変調剤化合物の存在下での機能が増加したかまたは減少したかどうかを決定する、
ここにおいて、該ＤｍＧＰＣＲはＤｍＧＰＣＲ５（配列番号９）である、
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２６】
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーがドロタキキニンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該ドロタキキニンが、ＤＴＫ−１（配列番号１６９）、Ｍｅｔ８−ＤＴＫ−２（配列番号１７０）、ＤＴＫ−２（配列番号１７１）、ＤＴＫ−３（配列番号１７２）、ＤＴＫ−４（配列番号１７３）およびＤＴＫ−５（配列番号１７４）から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＤｍＧＰＣＲおよびＤｍＧＰＣＲ結合パートナー間の結合および／または機能の変調剤を同定するための方法であって：
推定変調剤化合物の存在下または非存在下、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーと、ＤｍＧＰＣＲを含んでなる組成物とを接触させ；
ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーおよびＤｍＧＰＣＲ間の結合を検出し；そして
該推定変調剤化合物の非存在下での結合と比較して、該推定変調剤化合物の存在下での結合が増加したまたは減少したかどうかを決定する；
該推定変調剤化合物の非存在下での機能と比較して、該推定変調剤化合物の存在下での機能が増加したまたは減少したかどうかを決定する、
ここにおいて、該ＤｍＧＰＣＲはＤｍＧＰＣＲ７（配列番号１７）である、
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２９】
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーがロイコキニンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該ロイコキニンがＬＫ−Ｉ（配列番号１７５）、ＬＫ−Ｖ（配列番号１７６）、ＬＫ−ＶＩ（配列番号１７７）およびＬＫ−ＶＩＩＩ（配列番号１７８）、キュレキニン（配列番号１７９）、モノアラガイ  リムノキニン（Ｌｙｍｎａｅａ  ｌｙｍｎｏｋｉｎｉｎ）（配列番号１８０）、ＤＬＫ−１（配列番号１８１）、ＤＬＫ−２（配列番号１８２）、ＤＬＫ−２ａ（配列番号１８３）から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＤｍＧＰＣＲおよびＤｍＧＰＣＲ結合パートナー間の結合および／または機能の変調剤を同定するための方法であって：
推定変調剤化合物の存在下または非存在下、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーと、ＤｍＧＰＣＲを含んでなる組成物とを接触させ；
ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーおよびＤｍＧＰＣＲ間の結合を検出し；そして
該推定変調剤化合物の非存在下での結合と比較して、該推定変調剤化合物の存在下での結合が増加したまたは減少したかどうかを決定する；
該推定変調剤化合物の非存在下での機能と比較して、該推定変調剤化合物の存在下での機能が増加したまたは減少したかどうかを決定する、
ここにおいて、該ＤｍＧＰＣＲはＤｍＧＰＣＲ８（配列番号１９）である、
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項３２】
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーがアラトスタチンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
該アラトスタチンがＡＳＴ−Ｃ（配列番号１８４）またはＤＳＴ−Ｃ（配列番号１８５）から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
昆虫の集団を制御する方法であって、ＤｍＧＰＣＲの発現または活性を修飾するため、昆虫にＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドの結合パートナーまたは変調剤を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項３５】
該昆虫がハエ、ショウジョウバエ、マダニ、ノミ、シラミ、ダニおよびゴキブリから成る群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーがドロタキキニンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
該ドロタキキニンが、ＤＴＫ−１（配列番号１６９）、Ｍｅｔ８−ＤＴＫ−２（配列番号１７０）、ＤＴＫ−２（配列番号１７１）、ＤＴＫ−３（配列番号１７２）、ＤＴＫ−４（配列番号１７３）およびＤＴＫ−５（配列番号１７４）から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーがロイコキニンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
該ロイコキニンがＬＫ−Ｉ（配列番号１７５）、ＬＫ−Ｖ（配列番号１７６）、ＬＫ−ＶＩ（配列番号１７７）およびＬＫ−ＶＩＩＩ（配列番号１７８）、キュレキニン（配列番号１７９）、モノアラガイ  リムノキニン（Ｌｙｍｎａｅａ  ｌｙｍｎｏｋｉｎｉｎ）（配列番号１８０）、ＤＬＫ−１（配列番号１８１）、ＤＬＫ−２（配列番号１８２）、ＤＬＫ−２ａ（配列番号１８３）から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーがアラトスタチンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
該アラトスタチンがＡＳＴ−Ｃ（配列番号１８４）またはＤＳＴ−Ｃ（配列番号１８５）から成る群より選択される配列と、少なくとも８０％配列同一性の配列を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該ＤｍＧＰＣＲ変調剤が抗ＤｍＧＰＣＲ抗体、ＤｍＧＰＣＲアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子量非ペプチド性模倣物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
該低分子量非ペプチド性模倣物がアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
対象において外部寄生虫により引き起こされる疾患または状態を処置するまたは防止する方法であって、該対象に治療的に有効量のＤｍＧＰＣＲ結合パートナーを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４５】
該対象が、伴侶動物、家畜動物、ウマまたはヒトである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
該結合パートナーがドロタキキニン、ロイコキニン、アラトスタチンまたは抗体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
該結合パートナーが抗体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
該抗体がキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一部、新規キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｇタンパク質共役型レセプター（ＤｍＧＰＣＲ）をコードしている核酸分子、新規ポリペプチド、ＤｍＧＰＣＲへ結合するおよび／またはＤｍＧＰＣＲの活性を変調する化合物をスクリーニングするためのアッセイ、ＤｍＧＰＣＲを結合するための方法、ＤｍＧＰＣＲをコードしているヌクレオチド配列の検出のための、ＤｍＧＰＣＲに対する抗体、プライマーおよびプローブのごとき試薬、本発明の抗体、プライマーおよびプローブを含んでいるキット、ＤｍＧＰＣＲ、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーおよびＤｍＧＰＣＲ変調剤を含んでいる組成物、並びにＤｍＧＰＣＲ結合パートナーまたは変調剤を使用する、昆虫集団を制御するための方法に関している。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ヒトおよびその他の生物形態は生きている細胞を含んでなる。それを通して生物体の細胞がお互いに連絡し、そしてそれらの環境から情報および刺激を得るメカニズムの中に、細胞表面上に発現された細胞膜レセプターがある。多くのこうしたレセプターが同定され、特徴付けされており、しばしば、構造的モチーフおよびシグナル伝達特性に基づいて、主レセプタースーパーファミリーへ分類されている。こうしたファミリーには、リガンド依存性（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ）イオンチャンネルレセプター、電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）イオンチャンネルレセプター、レセプターチロシンキナーゼ、レセプタータンパク質チロシンホスファターゼおよびＧタンパク質共役型（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ）レセプターが（非限定的に）含まれる。レセプターは、細胞外シグナルを細胞性生理学的応答へ翻訳するための最初の必須な連鎖である。
【０００３】
Ｇタンパク質共役型レセプター（即ち、ＧＰＣＲ）は、アミノ末端細胞外ドメイン、カルボキシ末端細胞内ドメイン、および細胞膜を７回通過する、曲がりくねった（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）構造により特徴付けられる、細胞表面レセプターの広大なスーパーファミリーを形成している。この故に、こうしたレセプターは、時に７膜貫通（７ＴＭ）レセプターとも称される。これらの７膜貫通ドメインは、アミノおよびカルボキシ末端ドメインに加え、３つの細胞外ループおよび３つの細胞内ループを規定する。レセプターの細胞外部分は、一つまたはそれより多くの細胞外結合パートナー（例えば、リガンド）を認識するおよび結合する役割を有しており、一方、細胞内部分は、下流のエフェクター分子を認識するおよび通信する役割を有している。
【０００４】
ＧＰＣＲは、カルシウムイオン、ホルモン、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、脂質、匂い物質および光子さえも含む、多様なリガンドを結合する。驚くことではなく、ＧＰＣＲは、多くの細胞型の普通の（および時折、異常な）機能において重要である。一般的には、Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１，１９６，１−１０；Ｂｏｈｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９９７，３２２，１−１８、を参照されたい。特異的リガンドがその対応するレセプターに結合した場合、リガンドは典型的にはレセプターを刺激し、レセプターの細胞内部分または領域に共役している、特異的ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド−結合制御タンパク質（Ｇタンパク質）を活性化する。次いで、Ｇタンパク質は、細胞内のエフェクター分子に、そのエフェクター分子を刺激するまたは抑制することにより、シグナルを伝達する。これらのエフェクター分子には、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼおよびイオンチャンネルが含まれる。アデニル酸シクラーゼおよびホスホリパーは、セカンドメッセンジャー分子ｃＡＭＰ、イノシトール三リン酸およびジアシルグリセロールの産生に関与している酵素である。細胞外リガンド刺激がＧタンパク質を通して細胞内変化に影響を及ぼすのは、この一連の事象を通している。各々のこうしたレセプターは、それ自身に特徴的な一次構造、発現パターン、リガンド結合プロフィールおよび細胞内エフェクターシステムを有している。
【０００５】
細胞およびそれらの環境間の伝達におけるＧタンパク質共役型レセプターの極めて重要な役割のため、こうしたレセプターは、調節（例えば、こうしたレセプターを活性化するまたは拮抗することにより）の魅力的な標的である。既知のリガンドを有しているレセプターに対し、リガンドの作用を促進するまたは抑制するため、アゴニストまたはアンタゴニストの同定が特に探求されてもよい。例えば、いくつかのＧタンパク質共役型レセプターは疾患病因における役割を有しており（例えば、ＨＩＶコレセプターとして働くある種のケモカインレセプターは、ＡＩＤＳ病因に役割を果たすことができる）、そして、レセプターの天然リガンドの知見がなくても治療介入の魅力的標的である。他のレセプターは、それ自身が治療介入の魅力的標的である、組織または細胞型におけるその発現パターンにより、治療介入の魅力的標的である。この後者のカテゴリーのレセプターの例には、自己免疫を抑制するために、または病原体または癌と闘う免疫応答を促進するために標的とすることが可能な、免疫細胞で発現されるレセプター；並びに精神分裂病、抑鬱症、双極性疾患または他の精神病障害の処置において適切な標的であると思われる、脳若しくは他の神経器官および組織で発現されるレセプターが含まれる。この後者のカテゴリーのレセプターはまた、レセプターを発現する細胞サブタイプを（例えば、蛍光活性化細胞選別を介して）同定するおよび／または精製するためのマーカーとしても有用である。
【０００６】
昆虫は、農業における、およびヒト家庭環境における主たる害虫として認識されている。昆虫はまた動物およびヒトに寄生し、こうした場合において外部寄生虫として示されている、罹患率および死亡率の原因となる。昆虫はまた、植物、動物およびヒトに対してウイルス性および寄生虫性の疾患を伝搬するための媒介動物としても働く。それ故、昆虫集団を制御するための、および病原性または伝染病種を忌避するおよび／または殺すための新規方法を発見するという、継続的なおよびやむにやまれぬ要求が存在している。昆虫を殺すまたは麻痺させることにより昆虫集団を制御する一つの方法は、昆虫に選択的に毒性であり、および他の無脊椎動物に毒性である可能性がある、殺虫薬として示される、化学剤の使用である。現在、農作物および家畜を含んだ農産物へ損害を与えている昆虫の制御のために、殺虫薬は莫大な価値を有している。殺虫薬はまた、芝生および庭園の害虫、ならびに刺すまたは咬みつく昆虫、ハエおよびゴキブリを含んだヒトに損傷を与えるまたはうるさい昆虫に対する制御のため、ヒト家庭状況においても使用される。殺虫薬はまた、家畜動物およびペットにおける、ノミ、シラミ、マダニ、ダニおよび咬みつきハエを含む外部寄生虫により起こされる疾患状態の処置または防止のためにも莫大な価値を有している。しかしながら、殺虫薬として使用されている現在の化学製品は最適ではない。いくつかは哺乳動物に対して実証できる毒性を有しており、一方、これらのいくつかに対する耐性がある種の標的種で生じている。それ故、新規作用機構を有する、新しい選択的殺虫薬に対する要求が存在する。
【０００７】
神経ペプチドリガンドを有する昆虫ＧＰＣＲの例が知られている（例えば、Ｌｉら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９１，１０，３２２１−３２２９；Ｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，９−１２；Ｍｏｎｎｉｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，１２９８−１３０２；Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｌｃら，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，１９９６，１６４，１８９−２６８；Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９９７，１８，１−５；Ｈａｕｓｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１００２−１０１０；Ｂｉｒｇｕｌら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９９，１８，５８９２−５９００；Ｔｏｒｆｓら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２０００，７４，２１８２−２１８９；およびＨａｕｓｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．，１９９８，２４９，８２２−８２８；Ｌａｒｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００１，２８６，８９５−９０１；Ｌｅｎｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００１，２８６，１１１７−１１２２；Ｋｕｂｉａｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００２，２９１，３１３−３２０；Ｓｔａｕｂｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９，３４４６−３４５１；Ｇａｒｃｚｙｎｓｋｉら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００２，２３，７７３−７８０），Ｈｏｌｍｅｓら，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，（５），４５７−４６５；Ｃａｚｚａｍａｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９，１２０７３−１２０７８；Ｃａｚｚａｍａｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００２，２９８，３１−３６；Ｒａｄｆｏｒｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，３８８１０−３８８１７；Ｐａｒｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９，１１４２３−１１４２８；Ｋｒｅｉｅｎｋａｍｐら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ２０６９３１２００（２００２年８月６日、オンライン公開）およびＭｅｒｔｅｎｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００２，２９７，１１４０−１１４８、最新の関連した特許出願：Ｅｂｅｎｓ，Ａｌｌｅｎ  Ｊａｍｅｓ，Ｊｒ．；Ｔｏｒｐｅｙ，Ｊｕｓｔｉｎ；Ｋｅｅｇａｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｐａｔｒｉｃｋ．キイロショウジョウバエＧタンパク質共役型レセプターの核酸およびポリペプチドおよび殺虫薬並びに医薬標的としてのそれらの使用、ＰＣＴ国際出願（２００１），４３ｐｐ．ＣＯＤＥＮ：ＰＩＸＸＤ２  ＷＯ  ０１７０９８１  Ａ２  ２００１０９２７  ＣＡＮ  １３５：２６８３２３  ＡＮ  ２００１：７１３５６４  ＣＡＰＬＵＳ。Ｋｒａｖｃｈｉｋ，Ａｎｉｂａｌ、ショウジョウバエＧタンパク質共役型レセプター、ＧＰＣＲタンパク質をコードしているゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子、並びに殺虫薬標的としてのそれらの使用、ＰＣＴ国際出願（２００１），３９２ｐｐ．ＣＯＤＥＮ：ＰＩＸＸＤ２  ＷＯ  ０１７０９８０  Ａ２  ２００１０９２７  ＣＡＮ  １３��：２６９０６８  ＡＮ  ２００１：７１３５６３  ＣＡＰＬＵＳを参照されたい）。
【０００８】
無脊椎動物（例えば、昆虫）に典型的に観察される、一般に４−１２アミノ酸長のペプチドの大きなファミリーは、ＦＭＲＦアミド関連ペプチド（即ち、ＦａＲＰ）として知られている神経ペプチドのクラスである。原型ＦＭＲＦアミド（ＦＭＲＦａ）ペプチドは、一般に（Ｆ，Ｙ）（Ｍ，Ｖ，Ｉ，Ｌ）Ｒ（Ｆ，Ｙ）ＮＨ２から成っているそのＣ末端の“ＦＭＲＦ”共通アミノ酸配列のため、そのように名付けられた。神経ペプチドとして、これらの分子は制御された神経筋活動に必要とされる生体の生物学的プロセスに関与している。いくつかの神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）および神経変調剤（ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（神経ペプチドを含んで）がレセプターのリガンドとして機能することが示されているけれども、現在まで、ＧＰＣＲのリガンドとしてのＦａＲＰ神経ペプチドは同定されていない。
【０００９】
保存されたＦＸＧＸＲ−アミドモチーフを含んでいるショウジョウバエペプチドは、哺乳動物タキキニンに構造的に相関しており、それ故にドロタキキニン（ｄｒｏｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ）と新しく名付けられた（Ｓｉｖｉｔｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５（３０），２３２７３−２３２８０）。ドロタキキニンは昆虫腸の収縮に強力な刺激効果を有している（同上）。
【００１０】
ロイコキニン（ｌｅｕｋｏｋｉｎｉｎ）は、腸運動力および細管液体分泌速度を刺激する、広範な昆虫ホルモンの群である。細管において、それらの主たる作用は、側底膜上のレセプターへ結合することによりクロリド透過性を上昇させることである。ロイコキニンは星細胞においてのみ、細胞内カルシウムイオンを上昇させることにより作用する（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９８，４３，Ｒ１０３９−Ｒ１０４９）。
【００１１】
アラトスタチン（ａｌｌａｔｏｓｔａｔｉｎ）は、多様な昆虫種において、変態および再生における中心的役割を果たすことが知られている幼若ホルモンの合成を含む、多様な機能を制御している昆虫神経ホルモンの重要な群である。最初のショウジョウバエアラトスタチン、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（即ち、ドロスタチン−３）（配列番号１６５）、はショウジョウバエ頭部抽出物から単離された（Ｂｉｒｇｕｌら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９９，１８，５８９２−５９００）。最近、４つのジョウバエアラトスタチンをコードするジョウバエアラトスタチン  プレプロホルモン遺伝子がクローン化された：Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（ドロスタチン−１）（配列番号１６３）、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（ドロスタチン−２）（配列番号１６４）、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（ドロスタチン−３）（配列番号１６５）およびＴｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＮＨ２（ドロスタチン−４）（配列番号１６６）（Ｌｅｎｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０００，２７３，１１２６−１１３１）。最初のショウジョウバエアラトスタチンレセプターはＢｉｒｇｕｌらによりクローン化され、Ｇｉ／Ｇｏ経路を経てドロスタチン−３により機能的に活性化されることが示された（Ｂｉｒｇｕｌら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９９，１８，５８９２−５９００）。第二の推定ショウジョウバエアラトスタチンレセプター（即ち、ＤＡＲＩＩ）は最近クローン化された（Ｌｅｎｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０００，２７３，５７１−５７７）。ＤＡＲＩＩレセプターｃＤＮＡ（寄託番号ＡＦ２５３５２６）は、最初のショウジョウバエアラトスタチンレセプターと強く相関しているタンパク質をコードしている。最近、アラトスタチンによるＤＡＲＩＩの機能的活性化が我々（Ｌａｒｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００１，２８６，８９５−９０１）および別の人（Ｌｅｎｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００１，２８６，１１１７−１１２２）により示された。最近、ショウジョウバエアラトスタチンタイプＣプレプロホルモン遺伝子がクローン化され、それはショウジョウバエアラトスタチン−Ｃをコードしている：Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ＯＨ（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００１，２８２，１２４−１３０）。成熟ペプチドは、Ｎ末端Ｇｌｎ環化の結果として形成されたＮ末端でのｐＧｌｕを有しなければならず、ｐＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ＯＨ（配列番号１８３）、およびタバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）タイプＣアラトスタチンと同様な、Ｃｙｓ６およ���Ｃｙｓ１３間のジスルフィド架橋、並びに、４位でのみ異なっている（Ｐｈｅ４対Ｔｙｒ４）配列、ｐＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ＯＨ（配列番号１８２）を得る（Ｋｒａｍｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，９４５８−９４６２）。Ｎｉｃｈｏｌｓらはショウジョウバエアラトスタチン−Ｃの筋肉収縮の強力で延長された抑制を示し、それをフラットライン（ｆｌａｔｌｉｎｅ）（ＦＬＴ）ペプチドと名付けた（Ｎｉｃｈｏｌｓら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００２，２３，７８７−７９４）。我々の知識では、現在まで昆虫アラトスタチンタイプＣに対するレセプターは同定されていない。
【００１２】
スルファキニンは昆虫Ｔｙｒ−硫酸化神経ペプチドのファミリーである。これらは脊椎動物ガストリンおよびコレシストキニンに類似した配列および機能（筋肉同化効果および消化酵素放出の刺激）を示す。二つのスルファキニン（ドロスルファキニンとも呼ばれる）をコードしている遺伝子、ＤＳＫＩ［Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−アミド］（配列番号１６０）およびＤＳＫＩＩ［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−アミド］（配列番号１６１）が、キイロショウジョウバエで同定されている（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，３，３４２−３４７；Ｎｉｃｈｏｌｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６３，１２１６７−１２１７０）。Ｃ末端ヘプタペプチド配列、Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−アミド（配列番号１６２）、は進化期間で広く分離した昆虫からの、これまで同定されたすべてのスルファキニンで同一である。広く多岐にわたる昆虫分類群における、硫酸化ｔｙｒ残基の存在を含むヘプタペプチド配列の保存は、おそらくこの筋肉同化“活性コア”の機能的重要性を反映している（Ｎａｃｈｍａｎ  ＆  Ｈｏｌｍａｎ，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｏｎ中，Ｍｅｎｎ，Ｋｅｌｌｙ  ＆  Ｍａｓｓｌｅｒ，編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ワシントン，Ｄ．Ｃ．，１９９１，ｐｐ．１９４−２１４）。最近、我々はドロスルファキニンレセプター（ＤＳＫ−Ｒ１と名付けられた）としてのショウジョウバエオーファンレセプター（ＤｍＧＰＣＲ９）を同定し、それをその活性化ペプチド、Ｍｅｔ５→Ｌｅｕ修飾ドロスルファキニン−１、Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−アミド（配列番号１５７）と適合させた（Ｋｕｂｉａｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００２，２９１，３１３−３２０）。新規デオーファン化ショウジョウバエＧＰＣＲには、ＰＲＸアミドペプチド、ＣＣＡＰ、コラゾニン、およびＡＫＨ（Ｐａｒｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９，１１４２３−１１４２８；Ｃａｚｚａｍａｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００２，２９８，３１−３６）；ロイコキニン（Ｒａｄｆｏｒｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，３８８１０−３８８１７）；ドロスタチン−Ｃ（Ｋｒｅｉｅｎｋａｍｐら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ２０６９３１２００（２００２年８月６日オンライン公開））；ＦＭＲＦアミド（Ｃａｚｚａｍａｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９，１２０７３−１２０７８）；および神経ペプチドＦ（Ｍｅｒｔｅｎｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００２，２９７，１１４０−１１４８）が含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
発明の概要
本発明は、他の神経ペプチドＧＰＣＲに対して種々の程度の相同性を示す、本明細書においてＤｍＧＰＣＲ（キイロショウジョウバエＧタンパク質共役型レセプター）と称される、キイロショウジョウバエにおける新規ポリペプチドの驚くべき発見を含んでいる。本発明は、これらのこれまで知られていなかったＧタンパク質共役型レセプターをコードしている遺伝子、前記遺伝子によりコードされているＤｍＧＰＣＲポリペプチド；前記ポリペプチドに対する抗体；前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いているキット、および前記のものすべてを作製するおよび使用する方法を提供する。ＤｍＧＰＣＲは、例えば、神経ペプチド結合および／またはシグナル伝達の調節において、鍵となる成分としての役割を果たすことができる。ＤｍＧＰＣＲはそれ故、神経ペプチドまたはその他の剤による結合および／またはシグナル伝達を修飾および／または制御することが可能な新規剤の探索において有用である。本発明のこれらおよびその他の様相が以下に記載されている。
【００１４】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４のいずれかで示すようなアミノ酸配列を含んでなる精製されおよび単離されたＤｍＧＰＣＲポリペプチド、あるいはＤｍＧＰＣＲに対して特異的なエピトープを含んでなるその断片、を提供する。“に対して特異的なエピトープ”とは、以下に詳細に定義されるように、ＤｍＧＰＣＲに対して特異的である抗体により認識可能である、ＤｍＧＰＣＲレセプターの部分を意味している。本発明の一つの態様は、下記表４に見られる、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４に示すような完全アミノ酸配列を含んでなる、精製されおよび単離されたポリペプチドを含んでなる。これらのアミノ酸配列は、ＤｍＧＰＣＲをコードしているポリヌクレオチド配列（下記表４に見られる、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３）から推定した。本明細書において、単数形の用語“ＤｍＧＰＣＲ”とは、各々のポリヌクレオチド配列によりコードされた、以下に例示される１０アミノ酸配列の各々を包含することが意図されている。  
【００１５】
提供する配列は特定のショウジョウバエ配列であるが、本発明はその範囲内に、ＤｍＧＰＣＲのアリル変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）、脊椎動物および無脊椎動物形を含むことが意図されている。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含んでなる、精製されおよび単離されたポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせ、一本鎖または二本鎖にかかわらず）を提供する。こうしたポリヌクレオチドは、レセプターを組換え的に発現するために、そしてまた、細胞中のレセプターの発現を検出するために（例えば、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションアッセイを使用して）有用である。こうしたポリヌクレオチドはまた、培養細胞、組織または動物中での、ＤｍＧＰＣＲの発現の抑圧または調節のための、アンチセンスおよびその他の分子の設計において有用である。本発明のポリヌクレオチドの定義から特に除外されるのは、宿主細胞の全単離された、非組換え天然染色体である。本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在するＤｍＧＰＣＲ配列に対応する、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３に示すような任意の配列を有することができる。普遍的な遺伝子コードのよく知られた縮重のため、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４のいずれかで示すような配列を有するＤｍＧＰＣＲをやはりコードする、多くの他のポリヌクレオチド配列が存在することが認められるであろう。
【００１７】
本発明はまた、哺乳動物ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、精製されおよび単離されたポリヌクレオチドも提供し、ここにおいて、ポリヌクレオチドは下記のハイブリダイゼーション条件下：
ａ）５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％硫酸デキストランを含んでなるハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で１６時間のハイブリダイゼーション；そして
ｂ）０．１％ＳＳＣ、１％ＳＤＳを含んでなる洗浄溶液中、６０℃で、各々３０分の２回の洗浄
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１若しくは２３のいずれかに示すような配列を有するポリヌクレオチドまたはそれに相補的な非コード鎖へハイブリダイズする。
ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが他の核酸分子存在下で、前記遺伝子とのみ起こるようでなければならない。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。こうした条件は、２０の連続したヌクレオチドの中で１または２の不適正を有している核酸のハイブリダイゼーションを防止することができる。
【００１８】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。こうしたベクターは、例えば、それらの実用的な量を作り出すため、宿主細胞においてポリヌクレオチドを増幅するために有用である。いくつかの態様において、ベクターは発現ベクターであり、ここにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、発現制御配列を含んでなるポリヌクレオチドへ機能可能なように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されている。こうしたベクターは、本発明のポリペプチドの組換え産生に有用である。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターで（安定にまたは一過性に）形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。前に述べたように、こうした宿主細胞は、ポリヌクレオチドを増幅するために、およびポリヌクレオチドによりコードされたＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたはその断片を発現するためにも有用である。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチド（またはその断片）を産生する方法であって、栄養培地中で本発明の宿主細胞を増殖させ、そして細胞または培地から前記ポリペプチドまたはその変異体を単離する、工程を含んでなる、前記方法を提供する。ＤｍＧＰＣＲは７回膜貫通レセプターであるので、ある種の活性アッセイのごときいくつかの応用に対しては、単離は、その中に包埋されたポリペプチドを含んでいる細胞膜の単離を含むことができ、一方、他の応用に対しては、より完全な単離を望むことができることが認められるであろう。
【００２１】
細胞外エピトープは、ＤｍＧＰＣＲのごときレセプターへ結合する抗体および他の結合化合物を、発生させるおよびスクリーニングするために特に有用であることが認められるであろう。それ故、別の態様において本発明は、ＤｍＧＰＣＲのＮ末端細胞外ドメインのごとき、ＤｍＧＰＣＲの少なくとも一つの細胞外ドメイン（例えば、Ｎ末端細胞外ドメインまたは三つの細胞外ループ少なくとも一つ）を含んでなる、精製されおよび単離されたポリペプチドを提供する。本発明にまた含まれているのは、ＤｍＧＰＣＲの膜貫通ドメイン、ＤｍＧＰＣＲの膜貫通ドメインを連結している細胞外ループ、ＤｍＧＰＣＲの膜貫通ドメインを連結している細胞内ループ、ＤｍＧＰＣＲのＣ末端細胞質領域、およびそれらの融合物を含んでなる精製されたポリペプチドである。こうした断片は天然のレセプターの連続的な部分でもよい。しかしながら、本明細書で提供するようなＤｍＧＰＣＲ遺伝子およびタンパク質配列の知識は、天然のタンパク質において連続的ではない多様なドメインの組換えを可能にすることも認められるであろう。
【００２２】
さらに別に態様において、本発明は、本発明のＤｍＧＰＣＲに特異的な抗体を提供する。抗体特異性は、以下により詳細に説明されている。しかしながら、文献に以前に記載されている、およびＤｍＧＰＣＲと偶然に交差反応することが可能である（例えば、両方のポリペプチドにおける同様なエピトープの偶然の存在による）ポリペプチドから発生させることができた抗体は、“交差反応性”抗体と考えられることを強調すべきである。こうした交差反応性抗体は、ＤｍＧＰＣＲに“特異的”である抗体ではない。抗体がＤｍＧＰＣＲに特異的であるか、または別の既知のレセプターと交差反応的であるかどうかの決定は、当該技術分野でよく知られているウェスタンブロッティングアッセイのごとき、いくつかのアッセイのいずれかを使用して行われる。ＤｍＧＰＣＲを発現する細胞を同定するため、およびＤｍＧＰＣＲ−リガンド結合活性を変調するためにも、ＤｍＧＰＣＲの細胞外エピトープへ特異的に結合する抗体を使用することができる。
【００２３】
一つの変法において、本発明はモノクローナル抗体を提供する。こうした抗体を産生するハイブリドーマもまた本発明の側面として意図されている。
別の変法において、本発明はポリクローナル抗体を含んでなる、無細胞組成物を提供し、ここにおいて、抗体の少なくとも一つはＤｍＧＰＣＲに特異的な本発明の抗体である。動物から単離された抗血清は、水または他の希釈剤、賦形剤または担体に再懸濁された、抗血清の抗体分画を含んでなる組成物であるので、組成物の例である。
【００２４】
さらに別の関連する態様において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲに特異的である抗体に対して特異的な抗イディオタイプの抗体を提供する。
抗体は、化学的または組換え技術により単離することが可能な、比較的小さな抗原結合ドメインを含んでいることはよく知られている。こうしたドメインは、それ自身で有用なＤｍＧＰＣＲ結合分子であり、そしてまた毒素または他のポリペプチドへ融合することができる。それ故、さらに別の態様において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲ特異的抗体の断片を含んでなるポリペプチドを提供し、ここにおいて、断片およびポリペプチドはＤｍＧＰＣＲへ結合する。非制限的例として、本発明は、単鎖抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体である、ポリペプチドを提供する。
【００２５】
また本発明の範囲内であるのは、例えば、医薬として受容可能な担体で処方されている、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を含んでなる組成物である。
本発明はまた、本発明の抗体を使用する方法も提供する。例えば、本発明は、抗体がレセプターと結合する条件下、ＤｍＧＰＣＲとＤｍＧＰＣＲに特異的な抗体とを接触させる工程を含んでなる、ＤｍＧＰＣＲのリガンド結合を変調させるための方法を提供する。
【００２６】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４、または相同体またはその断片の群からの配列を含んでなるポリペプチドに対する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の免疫応答を誘導する方法を提供する。本方法は、免疫応答を誘導するために十分なポリペプチドの量を対象に投与することを含んでなる。
【００２７】
本発明はまた、ＤｍＧＰＣＲを結合する化合物を同定するためのアッセイも提供する。一つのこうしたアッセイは、（ａ）ＤｍＧＰＣＲを含んでなる組成物を、ＤｍＧＰＣＲを結合することが推測される化合物と接触させ；そして（ｂ）化合物およびＤｍＧＰＣＲ間の結合を測定する工程を含んでいる。一つの変法において、組成物は、その表面にＤｍＧＰＣＲを発現している細胞を含んでなる。別の変法において、単離されたＤｍＧＰＣＲもしくはＤｍＧＰＣＲを含んでなる細胞膜が用いられる。結合は、例えば、標識された化合物を使用することにより直接的に測定してよく、あるいは、化合物により誘導されたＤｍＧＰＣＲの細胞内シグナル伝達を測定する（またはＤｍＧＰＣＲシグナル伝達のレベルにおける変化を測定する）ことを含む、いくつかの技術により間接的に測定してもよい。
【００２８】
本発明はまた、ＤｍＧＰＣＲを結合パートナーと結合させる方法も提供する。本方法は、（ａ）ＤｍＧＰＣＲを含んでなる組成物を結合パートナーと接触させ；そして（ｂ）結合パートナーがＤｍＧＰＣＲへ結合するようにさせる、工程を含んでなる。例えば、ＤｍＧＰＣＲはＤｍＧＰＣＲ１（配列番号１）、ＤｍＧＰＣＲ５（配列番号９）、ＤｍＧＰＣＲ７（配列番号１７）またはＤｍＧＰＣＲ８（配列番号１９）であってもよい。結合パートナーは、例えば、ドロタキキニン、ロイコキニンまたはアラトスタチン−Ｃであってもよい。ドロタキキニン（ＤＴＫ）は、例えば、ＤＴＫ−１（配列番号１６９）、Ｍｅｔ８−ＤＴＫ−２（配列番号１７０）、ＤＴＫ−２（配列番号１７１）、ＤＴＫ−３（配列番号１７２）、ＤＴＫ−４（配列番号１７３）およびＤＴＫ−５（配列番号１７４）であってもよい。ロイコキニン（ＬＫ）は、例えば、ＬＫ−Ｉ（配列番号１７５）、ＬＫ−Ｖ（配列番号１７６）、ＬＫ−ＶＩ（配列番号１７７）およびＬＫ−ＶＩＩＩ（配列番号１７８）、キュレキニン（Ｃｕｌｅｋｉｎｉｎ）（配列番号１７９）、軟体動物ロイコキニン様ペプチド、リムノキニン（ｌｙｍｎｏｋｉｎｉｎ）（ＰＳＦＨＳＷＳａ）（配列番号１８０）およびショウジョウバエロイコキニン様ペプチドＤＬＫ−１（ＮＳＶＶＬＧＫＫＱＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８１）、ＤＬＫ−２（ｐＧｌｕ−ＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８２）およびＤＬＫ−２Ａ（ＱＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８３）であってもよい。アラトスタチン（ＡＳＴ）は、例えば、ＡＳＴ−Ｃ（配列番号１８４）またはＤＳＴ−Ｃ（配列番号１８５）であってもよい。他の結合パートナーには、非限定的に、配列番号１８６および配列番号１８７が含まれる。
【００２９】
本発明はまた、ＤｍＧＰＣＲおよびＤｍＧＰＣＲ結合パートナー間の結合の変調剤を同定するための方法も提供し、前記方法は、（ａ）推定変調剤化合物の存在下または非存在下、ＤｍＧＰＣＲ結合剤とＤｍＧＰＣＲを含んでなる組成物とを接触させ；（ｂ）結合パートナーおよびＤｍＧＰＣＲ間の結合を検出し；そして（ｃ）推定変調剤の非存在下での結合と比較された、推定変調剤の存在下での結合パートナーおよびＤｍＧＰＣＲ間の減少した若しくは増加した結合を考慮して、推定変調剤化合物または変調剤化合物を同定する工程を含んでなる。例えば、ＤｍＧＰＣＲはＤｍＧＰＣＲ１（配列番号１）、ＤｍＧＰＣＲ５（配列番号９）、ＤｍＧＰＣＲ７（配列番号１７）またはＤｍＧＰＣＲ８（配列番号１９）であってもよい。結合パートナーは、例えば、ドロタキキニン、ロイコキニンまたはアラトスタチン−Ｃであってもよい。ドロタキキニン（ＤＴＫ）は、例えば、ＤＴＫ−１（配列番号１６９）、Ｍｅｔ８−ＤＴＫ−２（配列番号１７０）、ＤＴＫ−２（配列番号１７１）、ＤＴＫ−３（配列番号１７２）、ＤＴＫ−４（配列番号１７３）およびＤＴＫ−５（配列番号１７４）であってもよい。ロイコキニン（ＬＫ）は、例えば、ＬＫ−Ｉ（配列番号１７５）、ＬＫ−Ｖ（配列番号１７６）、ＬＫ−ＶＩ（配列番号１７７）およびＬＫ−ＶＩＩＩ（配列番号１７８）、キュレキニン（Ｃｕｌｅｋｉｎｉｎ）（配列番号１７９）、軟体動物ロイコキニン様ペプチド、リムノキニン（ｌｙｍｎｏｋｉｎｉｎ）（ＰＳＦＨＳＷＳａ）（配列番号１８０）およびショウジョウバエロイコキニン様ペプチドＤＬＫ−１（ＮＳＶＶＬＧＫＫＱＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８１）、ＤＬＫ−２（ｐＧｌｕ−ＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８２）およびＤＬＫ−２Ａ（ＱＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８３）であってもよい。アラトスタチン（ＡＳＴ）は、例えば、ＡＳＴ−Ｃ（配列番号１８４）またはＤＳＴ−Ｃ（配列番号１８５）であってもよい。一つの変形において、組成物は、その表面にＤｍＧＰＣＲを発現している細胞を含んでなる。別の変形において、単離されたＤｍＧＰＣＲもしくはＤｍＧＰＣＲを含んでなる細胞膜が用いられる。結合は、例えば、標識された化合物を使用することにより直接的に測定してもよく、あるいは、化合物により誘導されたＤｍＧＰＣＲの細胞内シグナル伝達を測定してもよい（またはＤｍＧＰＣＲシグナル伝達のレベルにおける変化を測定する）ことを含む、いくつかの技術により間接的に測定することができる。例えば、機能は、アゴニスト誘導［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイにより、ｃＡＭＰアッセイ（ｃＡＭＰ産生の誘導または抑制）により、または蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を使用する細胞内カルシウムレベルを測定することにより測定することができる。
【００３０】
ＤｍＧＰＣＲ活性を刺激するＤｍＧＰＣＲ結合パートナーは、ＤｍＧＰＣＲシグナル伝達を促進するまたは延長するアゴニストとして有用であり、そしてこの方法で正常に活性化されたシグナル伝達経路を干渉する。リガンド仲介ＤｍＧＰＣＲシグナル伝達を遮断するＤｍＧＰＣＲ結合パートナーは、正常ＤｍＧＰＣＲシグナル伝達と干渉し、そしてレセプター仲介効果を減じるためのアンタゴニストとして有用である。加えて、ＤｍＧＰＣＲ変調剤、ならびにＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＤｍＧＰＣＲ活性が促進されたまたは減じられた段階または状態のための診断アッセイにおいて有用である。
【００３１】
別の様相において、本発明は外部寄生虫により引き起こされる疾患または異常な状態を処置するための方法を提供し、前記方法は、そのような処置を必要とする対象へ、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４から成る群より選択される外部寄生虫のポリペプチドの活性または発現を変調する物質を投与することを含んでいる。
【００３２】
外部寄生虫により引き起こされる疾患または障害の処置に有用な物質は、問題とする疾患または障害の処置に対応する活性のための一つまたはそれより多くのインビトロアッセイにおいて、陽性の結果を示すことができる。ポリペプチドの活性を変調させる物質には、非限定的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アゴニストおよびアンタゴニスト、および抗体が含まれる。
【００３３】
別の側面において、本発明は、外部寄生虫により引き起こされる疾患または障害の診断道具としての、試料中のポリペプチド検出のための方法を特色としており、ここにおいて前記方法は、（ａ）試料を、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４から成る群より選択されるポリペプチドをコードしている核酸標的領域へハイブリダイズする核酸プローブと接触させ、ここにおいて、前記プローブは、ポリペプチドその断片をコードする核酸配列、並びに／又は、配列の相補体および断片を含む、；そして（ｂ）状態の指標として、プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を検出する、工程を含んでなる。
【００３４】
本発明の核酸探査法に適した試験試料には、例えば、細胞または細胞の核酸抽出物、または生物学的液体が含まれる。上記の方法で使用される試料は、アッセイ型式、検出法および組織の性質、アッセイされるべき細胞または抽出物に基づいて変化するであろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は、当該技術分野ではよく知られており、利用される方法に適合する試料を得るために容易に適応させることが可能である。
【００３５】
いくつかの態様において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲの哺乳動物相同体のごとき相同体を提供する。ＤｍＧＰＣＲの哺乳動物相同体は、限定されるわけではないが、神経系、膵臓（および特に膵島組織）、下垂体、骨格筋、脂肪組織、肝臓、胃腸（ＧＩ）管および甲状腺を含んだ組織中で発現させることができる。
【００３６】
いくつかの態様において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲの哺乳動物相同体を同定する方法を提供し、前記方法は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３、またはその一部から選択される核酸分子で、哺乳動物の核酸データベースまたは核酸ライブラリーをスクリーニングし、そしてデータベースまたはライブラリーの一部が前記配列に相同的であるかどうかを決定する工程を含んでなる。
【００３７】
本発明の別の側面は、ＤｍＧＰＣＲの発現または活性を修飾するため、昆虫へＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドの結合パートナーまたは変調剤を投与することを含んでなる、昆虫集団を制御する方法を提供する。例えば、昆虫は、ハエ、ショウジョウバエ（ｆｒｕｉｔｆｌｙ）、マダニ（ｔｉｃｋ）、ノミ（ｆｌｅａ）、シラミ（ｌｉｃｅ）、ダニ（ｍｉｔｅ）およびゴキブリから成る群より選択することができる。
【００３８】
ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーは、ドロタキキニン（例えば、ＤＴＫ−１（配列番号１６９）、Ｍｅｔ８−ＤＴＫ−２（配列番号１７０）、ＤＴＫ−２（配列番号１７１）、ＤＴＫ−３（配列番号１７２）、ＤＴＫ−４（配列番号１７３）およびＤＴＫ−５（配列番号１７４））、ロイコキニン（例えば、ＬＫ−Ｉ（配列番号１７５）、ＬＫ−Ｖ（配列番号１７６）、ＬＫ−ＶＩ（配列番号１７７）およびＬＫ−ＶＩＩＩ（配列番号１７８）、キュレキニン（配列番号１７９）、軟体動物ロイコキニン様ペプチド、リムノキニン（ＰＳＦＨＳＷＳａ）（配列番号１８０）、ＤＬＫ−１（ＮＳＶＶＬＧＫＫＱＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８１）、ＤＬＫ−２（ｐＧｌｕ−ＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８２）およびＤＬＫ−２Ａ（ＱＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８３））、あるいはアラトスタチン（ＡＳＴ−Ｃ（配列番号１８４）またはＤＳＴ−Ｃ（配列番号１８５））であることができる。他の結合パートナーには、非限定的に、配列番号１８６および配列番号１８７が含まれる。ＤｍＧＰＣＲ変調剤は、抗ＤｍＧＰＣＲ抗体またはＤｍＧＰＣＲアンチセンスポリヌクレオチドであることができる。
【００３９】
本発明の別の態様は、宿主対象において外部寄生虫により引き起こされる疾患または状態を、防止するまたは処置する方法を提供し、前記方法は、ＤｍＧＰＣＲの発現または活性を修飾するため、ＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはポリペプチドの結合パートナーまたは変調剤を対象に投与することによる。
【００４０】
本発明の追加の特色および変法は、詳細な説明を含んだ本出願の全体から、当業者には明らかになるであろうが、すべてのこうした特色は本発明の側面として意図されている。同様に、本明細書に説明した本発明の特色は、追加の態様に結合し直すことが可能であり、特色の組み合わせが本発明の側面または態様として上に特別に述べられているかどうかに関わりなく、それらもまた本発明の側面として意図されている。また、決定的と本明細書に記載されているこうした制限のみが、そのように見るべきであり；決定的であると本明細書に記載されていない、制限を無しの本発明の変法は本発明の側面として意図されている。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、なかでも、キイロショウジョウバエＧタンパク質共役型レセプター（ＤｍＧＰＣＲ）またはその一部をコードしている単離されおよび精製されたポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含んでいるベクター、これらのベクターで形質転換された宿主細胞、ＤｍＧＰＣＲを作製する方法、前記ポリヌクレオチドおよびベクターを使用する方法、単離されおよび精製されたＤｍＧＰＣＲ、ＤｍＧＰＣＲ活性を変調する化合物をスクリーニングする方法、およびＤｍＧＰＣＲの哺乳動物、脊椎動物または無脊椎動物相同体を同定する方法を提供する。
【００４２】
本文書を通して多様な定義が行われる。ほとんどの単語は、当業者によりこれらの単語にあるとされるであろう意味を有している。本文書において以下にまたは別の所で特別に定義された単語は、全体としておよび当業者により典型的に理解されるような、本発明の文脈で提供する意味を有している。
【００４３】
配列の群が示された場合、それらの組み合わせおよび副次的組み合わせもまた特別に企図されることを理解すべきである。例えば、“配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３”の開示により、本発明は、限定されるわけではないが、配列番号１および３；１および５；１、３および５；などの組み合わせおよび副次的組み合わせを含んでいることを理解すべきである。
【００４４】
本明細書において使用されるおよび当該技術分野で理解されている用語“合成された”とは、酵素的に対立するものとして、純粋に化学的な方法により製造されたポリヌクレオチドを指している。“完全に”合成されたＤＮＡ配列とはそれ故、化学的手段により完全に製造されており、“部分的に”合成されたＤＮＡは、得られたＤＮＡの一部のみが化学的手段により製造されたものを包含する。
【００４５】
用語“領域（ｒｅｇｉｏｎ）”とは、生体分子の一次構造の物理的に近接した部分を意味している。タンパク質の場合、そのタンパク質のアミノ酸配列の近接した部分により定義される。
【００４６】
本明細書において、用語“ドメイン”とは、生体分子の既知のまたは推測される機能に寄与する、生体分子の構造的部分を指している。ドメインは、領域またはその一部と同一の広がりであってもよく、ドメインはまた、その領域のすべてまたは一部に加え、特定の領域と異なっている生体分子の一部を取り込むこともできる。ＧＰＣＲタンパク質ドメインの例には、非限定的に、ＧＰＣＲの同じ名前の領域と同一の広がりを持つ細胞外（即ち、Ｎ末端）、膜貫通および細胞質（即ち、Ｃ末端）ドメイン；ＧＰＣＲの７つの膜貫通セグメントの各々；並びに隣接する膜貫通セグメントを連結しているループセグメント（細胞外および細胞内ループの両方）の各々が含まれる。
【００４７】
本明細書において、用語“活性”とは、直接的にかまたは間接的に結合を示唆しているまたは明らかにしている；応答に影響を及ぼしている、即ち、ある暴露または刺激に応じた測定可能な効果を有している、多様な測定可能なしるし（ｉｎｄｉｃｉａ）、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの直接的な結合に対する化合物の親和性、または例えば、上流または下流タンパク質の量、またはある刺激または事象後における類似の機能の測定を含む、を指している。
【００４８】
本明細書において、用語“抗体”とは、完全で無傷の抗体、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよびそれらの他の断片を指すことを意味している。完全で無傷の抗体には、マウスモノクローナル抗体のごときモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体が含まれる。
【００４９】
本明細書において、用語“結合”とは、２つのタンパク質または化合物、または会合したタンパク質または化合物、またはその組み合わせ間の物理的または化学的相互作用を意味している。結合には、イオン的、非イオン的、水素結合、ファンデルワールス、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は直接でも間接でもよく、間接は別のタンパク質または化合物の効果を通してかまたはそれらの効果によっているものである。直接結合は、別のタンパク質または化合物の効果を通してかまたはそれらの効果により起こるものではなく、代わりに、他の実質的な化学的中間体が存在していない相互作用を指している。
【００５０】
本明細書において、用語“化合物”とは、任意の同定可能な化学物質または分子を意味しており、限定されるわけではないが、小分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸が含まれており、そしてこうした化合物は天然でも合成のものであってもよい。
【００５１】
本明細書において、用語“相補的な”とは、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン−クリック塩基対形成を指している。
本明細書において、用語“接触させる”とは、直接的か間接的に、化合物を本発明のポリペプチドまたはプリヌクレオチドの物理的近接内へ一緒に持って行くことを意味している。ポリペプチドまたはプリヌクレオチドは、かなり多くの緩衝液、塩、溶液などに存在することが可能である。接触させることは、例えば、化合物を、ＧＰＣＲまたはその断片をコードしている核酸分子またはポリペプチドを含んでいる、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたは遺伝子チップのごときマイクロアレイなどの中に化合物を置くことを含んでいる。
【００５２】
本明細書において、句“相同的ヌクレオチド配列”または“相同的アミノ酸配列”またはその変異体とは、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで、少なくとも明記されたパーセンテージの相同性により特徴付けられた配列を指している。相同的ヌクレオチド配列は、タンパク質のアイソフォームをコードしている配列を含んでいる。こうしたアイソフォームは、例えば、ＲＮＡの代替的スプライシングの結果として、同一生物体の異なった組織で発現することが可能である。あるいは、アイソフォームは異なった遺伝子によりコードすることが可能である。相同的ヌクレオチド配列は、限定されるわけではないが、哺乳動物を含む、昆虫以外の種のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる。相同的ヌクレオチド配列はまた、非限定的に、本明細書に示されたヌクレオチド配列の天然に存在するアリル（ａｌｌｅｌｉｃ）変異および突然変異も含んでいる。しかしながら、相同的ヌクレオチド配列は、他の既知のＧＰＣＲをコードしているヌクレオチド配列を含んでいない。相同的アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換をコードしているアミノ酸配列、ならびに神経ペプチド結合および／またはシグナル伝達活性を有しているポリペプチドを含んでいる。しかしながら、相同的アミノ酸配列は、他の既知のＧＰＣＲをコードしているアミノ酸配列を含んでいない。パーセント相同性は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴニズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９、その全体が本明細書において援用される）を使用し、デフォルト設定を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン８  Ｕｎｉｘ用，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，マディソン，ＷＩ）により決定することが可能である。
【００５３】
本明細書において、用語“単離された”核酸分子とは、その天然の環境から取り除かれている核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指している。単離された核酸分子の例には、限定されるわけではないが、ベクターに含まれている組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞に維持されている組換えＤＮＡ分子、部分的にまたは実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が含まれる。
【００５４】
本明細書において、用語“調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅｓ）”、“変調する（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）”または“修飾する（ｍｏｄｉｆｉｅｓ）”とは、特定の活性またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少を意味している。
【００５５】
本明細書において、用語“促進された活性（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）”とは、増加した活性を意味している。用語“減じられた活性（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）”とは減少した活性を意味している。
【００５６】
本明細書において、用語“オリゴヌクレオチド”とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用されるのに十分な数の塩基を有する、一連の連結されたヌクレオチド残基を指している。この短い配列は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列に基づいており（またはそれらから設計され）、特定の細胞または組織における同一の、類似のまたは相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの存在を、増幅する、確認するまたは明らかにするために使用される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチドそして約５０ヌクレオチドもの、好ましくは約１５から３０ヌクレオチドを有しているＤＮＡ配列の一部を含んでなる。それらは化学的に合成され、そしてプローブとして使用することができる。
【００５７】
本明細書において、用語“プローブ”とは、使用に依存して可変長の、好ましくは少なくとも約１０から約６，０００ものヌクレオチドの間の、核酸配列を指している。これらは同一の、類似のまたは相補的な核酸配列の検出に使用される。より長い長さのプローブは通常、天然のまたは組換え起源のものから得られ、高度に特異的でありそしてオリゴマーより遅くハイブリダイズする。これらは一本鎖または二本鎖であることができ、そしてＰＣＲ、ハイブリダイゼーション膜に基づいた、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するように、注意深く設計される。
【００５８】
ポリヌクレオチドを指す場合、“部分”または“断片”は、断片または部分が誘導される参照ポリヌクレオチドの少なくとも１４、１６、１８、２０、２５、５０または７５の連続したヌクレオチドを有しているポリヌクレオチド配列を含んでいる。ポリペプチドを指している場合、“部分”または“断片”とは、断片が誘導される参照ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０の連続したアミノ酸を有しているポリペプチドを指している。
【００５９】
用語“防止する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｇ）”とは、生物体が病気にかかるまたは異常な状態を発現する可能性を減少させることを指している。
句“昆虫集団を制御する（ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ）”またはその変形とは、集団における昆虫の数を増加させるまたは減少させることを指している。例えば、昆虫集団を制御する方法には、既定の昆虫集団において益虫の数を増加させる方法、および既定の昆虫集団において害虫の数を減少させる方法が含まれる。
【００６０】
用語“処置する”とは、治療効果を有し、そして生物体における異常状態を少なくとも部分的に軽減するまたは抑止することを指している。
本明細書において、用語“対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）”とは、昆虫、脊椎動物、無脊椎動物および哺乳動物を指している。
【００６１】
用語“治療効果”とは、異常なまたは正常な状態を起こしているまたは寄与している因子の抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）または活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を指している。治療効果は以下の一つまたはそれより多くのことを指している：（ａ）細胞の増殖、成長および／または分化における増加；（ｂ）細胞死の抑制（即ち、遅延または停止）；（ｃ）変性の抑制；（ｄ）状態に関係する一つまたはそれより多くの症状のある程度の軽減；並びに（ｅ）冒された細胞集団の機能の促進。異常なまたは正常な状態に対して有効性を示している化合物は、本明細書に記載したように同定することが可能である。
【００６２】
処置されるべき生物体の状態は、異常であるかまたは正常であることができる。用語“異常な状態”とは、生物体の正常な機能から逸脱した、生物体の細胞または組織における機能を指している。例えば、異常な状態は、細胞増殖、細胞分化、細胞シグナル伝達または細胞生存に関係することが可能である。
【００６３】
句“正常な状態”とは、生物体の細胞または組織における正常な機能を指している。例えば、正常な状態は、細胞増殖、細胞分化、細胞シグナル伝達または細胞生存に関係することが可能である。
【００６４】
用語“投与する”とは、生物体の細胞または組織内へ化合物を取り込ませる方法に関連している。状態は、細胞または組織が生物体の内部にまたは生物体の外側に存在する場合に、防止する、処置するまたは誘導することが可能である。生物体の外側に存在している細胞は、細胞培養皿で維持するまたは増殖させることが可能である。生物体内に宿っている細胞に対しては、化合物を投与するための多くの技術が当該技術分野に存在しており、経口、非経口、経皮、注射およびエアロゾル適用が含まれる（限定されるわけではない）。生物体の外側の細胞に対しては、化合物を投与するための複数の技術が当該技術分野に存在しており、細胞マイクロインジェクション技術、形質転換技術および坦体技術が（非限定的に）含まれる。
【００６５】
状態はまた、対象生物体のシグナル伝達経路が修飾されている細胞の群へ化合物を投与することによっても、防止する、処置するまたは誘導することが可能である。生物体機能に対する、化合物投与の効果を次ぎにモニターすることが可能である。対象は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、伴侶動物（イヌまたはネコのごとき）、家畜動物（ニワトリ、ブタまたはウシのごとき）、ヤギ、ウマ、サル、類人猿またはヒトのごとき哺乳動物；蠕虫；または昆虫であることができる。
【００６６】
“増幅”とは、正常細胞と比較して、細胞中のＤＮＡまたはＲＮＡの数が増加されたことを意味している。“増幅”がＲＮＡを指す場合、いくつかの正常細胞中にはＲＮＡの基礎発現が存在しないので、ＲＮＡの検出可能な存在であることができる。発現の基礎レベルが存在する他の正常細胞において、これらの場合における増幅は、基礎レベルと比較して少なくとも１−２倍、および好ましくはそれ以上の検出である。
【００６７】
本明細書において、句“ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）なハイブリダイゼーション条件”または“ストリンジェント条件”とは、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列へはハイブリダイズするであろうが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指している。ストリンジェント条件は配列依存的であり、異なった環境では異なっているであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は定義されたイオン強度およびｐＨで、特異的配列の熱的融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度条件下）標的配列と相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列へハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在しているので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、典型的にはｐＨ７．０から８．３で約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）であり、そして温度は、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に対しては低くとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドに対しては低くとも約６０℃である条件であろう。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのごとき不安定化剤の添加によっても達成することができる。
【００６８】
アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右へ示されている。アミノおよびカルボキシ基は配列中には示されていない。ヌクレオチド配列は、一本鎖でのみ、５’から３’の方向で、左から右へ示されている。ヌクレオチドおよびアミノ酸はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨された型式で、または（アミノ酸に対して）３文字コードで示されている。
【００６９】
ポリヌクレオチド
本発明のゲノムＤＮＡは、本発明のポリペプチドのためのタンパク質コード領域を含んでなり、そしてまた、そのアリル変異体を含むことも意図されている。多くの遺伝子で、ゲノムＤＮＡがＲＮＡ転写産物へ転写され、それは一つまたはそれより多くのスプライシング工程をうけ、そこで転写産物のイントロン（即ち、非コード領域）が除去または“スプライスドアウト（ｓｐｌｉｃｅｄ  ｏｕｔ）”されることは広く理解されている。選択的メカニズムでスプライスされることが可能なＲＮＡ転写産物は、それ故、異なったＲＮＡ配列の除去にかけられるが、しかしなおＤｍＧＰＣＲポリペプチドをコードしており、当該技術分野で“スプライス変異体”と呼ばれ、それは本発明に包含される。本発明に包含されているスプライス変異体は、それ故、同一のゲノムＤＮＡ配列によりコードされているが，異なったｍＲＮＡ転写産物から生じる。アリル変異体は野生型遺伝子配列の修飾形であり、修飾は、染色体分離間の組換え、または遺伝子突然変異が発生する状態への暴露から生じている。野生型遺伝子と同様に、アリル変異体は天然に存在する配列である（インビトロ操作により発生する天然に存在しない変異体に対立するものとして）。
【００７０】
本発明はまた、ＤｍＧＰＣＲをコードしているＲＮＡポリヌクレオチドの逆転写を通して得られるｃＤＮＡも包含する（慣習的には、相補鎖の二次鎖合成が続いて、二本鎖ＤＮＡを提供する）。
【００７１】
ＤｍＧＰＣＲポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３のいずれかに示されている。本発明のＤＮＡは、ＤＮＡのためのワトソン−クリック塩基対形成規則に従ったコード鎖から明確に推定可能な配列を有する相補的分子（“非コード鎖”または“相補体”）と共に、二本鎖分子を含んでなることができる。また本発明に含まれるのは、普遍的核遺伝子コードのよく知られた縮重によって、本明細書に記載された特定のポリヌクレオチドとは配列が異なっている、本発明の特定のポリペプチドのいずれかをコードしている他のポリヌクレオチドである。
【００７２】
本発明はさらに、ＤｍＧＰＣＲ  ＤＮＡの種（哺乳動物のごとき）相同体を包含する。時には“オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）”と一般に呼ばれている種相同体は、本発明のＤＮＡと少なくとも３５％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を共有している。一般に、本発明のポリヌクレオチドに関するパーセント配列“相同性”は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させ、必要ならギャップを導入した後、特定のポリヌクレオチド配列に示したようなＤｍＧＰＣＲ配列中のヌクレオチドと同一である、候補配列中のヌクレオチド塩基のパーセンテージとして計算することができる。
【００７３】
本発明の別の様相は、哺乳動物、脊椎動物および無脊椎動物を含む他の動物において、ＤｍＧＰＣＲの相同体を同定するための、本明細書に開示したＤｍＧＰＣＲヌクレオチド配列の使用である。本明細書に開示した任意のヌクレオチド配列が、当業者にはよく知られているスクリーニング法を使用して、データベースまたは核酸ライブラリー（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのごとき）をスクリーニングするために、例えば、プローブとして使用することが可能である。
【００７４】
本発明により提供されたポリヌクレオチド配列情報は、当該技術分野でよく知られそして日常的に実施されている技術により、コードされたポリペプチドの大規模発現を可能にする。本発明のポリヌクレオチドはまた、サザンおよび／またはノーザンハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むよく知られた技術により、アリル変異体および種相同体のごとき、関連ＤｍＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの同定および単離を可能にする。関連ポリヌクレオチドの例には、アリル変異体を含むゲノム配列、ならびに一つまたはそれより多くのＤｍＧＰＣＲの生物学的、免疫学的および／または物理的特性を共有している、ＤｍＧＰＣＲに相同的なポリペプチドおよび構造的に関連したポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが含まれる。ＤｍＧＰＣＲに相同的なタンパク質をコードしている遺伝子はまた、サザンおよび／またはＰＣＲ分析により同定することが可能であり、そしてＧＰＣＲ障害の動物モデルにおいて有用である。ＤｍＧＰＣＲ  ＤＮＡの配列の知識はまた、サザンハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通して、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサーなどのごとき、ＤｍＧＰＣＲ発現制御調節配列をコードしているゲノムＤＮＡ配列の同定も可能にする。本発明のポリヌクレオチドはまた、ＤｍＧＰＣＲを発現する細胞の能力を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、疾患状態または複数の状態の根底にある、ＤｍＧＰＣＲを発現している外部寄生虫の存在を同定するために有用な、診断法の根拠も提供することができ、その情報は診断および治療戦略の選択の両方に有用である。
【００７５】
ＤｍＧＰＣＲポリペプチドをコードしている完全長ポリヌクレオチドの本明細書の開示は、当業者には、完全長ポリヌクレオチドのあらゆる可能な断片を容易に利用可能にしている。本発明はそれ故、ＤｍＧＰＣＲをコードしているポリヌクレオチドの少なくとも１４、そして好ましくは少なくとも１６、１８、２０、２５、５０または７５の連続したヌクレオチドを含んでなる、ＤｍＧＰＣＲコードポリヌクレオチドの断片を提供する。本発明の断片ポリヌクレオチドは、ＤｍＧＰＣＲコードポリヌクレオチドの配列に独特の配列を含むことができ、それ故、非常にストリンジェントなまたは中程度にストリンジェントな条件下でのみ（即ち、“特異的に”）、ＤｍＧＰＣＲをコードしているポリヌクレオチド（またはその断片）へハイブリダイズする。本発明のゲノム配列のポリヌクレオチド断片は、コード領域に独特な配列を含んでなるのみでなく、また、イントロン、調節領域および／または他の非翻訳配列に由来する完全長配列の断片も含んでいる。本発明のポリヌクレオチドに独特な配列は、他の既知のポリヌクレオチドとの配列比較を通して認識可能であり、そして、例えば、公開配列データベースで利用可能な、当該技術分野で日常的に利用されている整列プログラムの使用を通して同定することが可能である。こうした配列はまた、ポリヌクレオチドがハイブリダイズするであろうゲノムＤＮＡの断片の数を決定するためのサザンハイブリダイゼーションからも認識可能である。本発明のポリヌクレオチドは、放射活性、蛍光および酵素的標識を含んだ、それらの検出を可能にする型式で標識することが可能である。
【００７６】
断片ポリヌクレオチドは、完全長または断片ＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドの検出のためのプローブとして特に有用である。一つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを、ＤｍＧＰＣＲをコードしているポリヌクレオチドの存在を検出するために使用する、もしくはＤｍＧＰＣＲをコードしているポリヌクレオチド配列における変異を検出するために使用する、キットに含ませることが可能である。
【００７７】
本発明はまた、中程度にストリンジェントなまたは非常にストリンジェントな条件下、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３中のポリヌクレオチドの非コード鎖、または相補体へハイブリダイズする、ＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドをコードしているＤＮＡも包含する。
【００７８】
非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は以下のようである：５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％硫酸デキストランを含んでなるハイブリダイゼーション溶液中、４２℃でのハイブリダイゼーション、そして、０．１Ｘ  ＳＳＣ、１％ＳＤＳを含んでなる洗浄溶液中、６０℃で３０分の２回の洗浄。当該技術分野において、均等なストリンジェンシーを、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９４，ｐｐ．６．０．３−６．４．１０、により記載されているように、温度および緩衝液、または塩濃度の変動により達成することが可能であることが理解されている。ハイブリダイゼーション条件の修飾は、経験的に決定することが可能であり、またはプローブの長さおよびグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対形成のパーセンテージに基づいて正確に計算することが可能である。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク，１９８９，ｐｐ．９．４７−９．５１、に記載されているように計算することが可能である。
【００７９】
本発明に開示するヌクレオチド配列情報の知識を用い、当業者にはよく知られている多様な手段により、および、例えば、その全体が本明細書において援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、により記載されているように、異なった起源（即ち、異なった組織または異なった生物体）から、ＤｍＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配列を、当業者は同定する、および、得ることが可能である。
【００８０】
例えば、ＤｍＧＰＣＲをコードするＤＮＡは、本明細書に提供するＤｍＧＰＣＲ遺伝子配列情報から発生させたオリゴヌクレオチドプローブでのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングにより得ることができる。プローブは、当業者には知られたおよび、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより記載されているような慣習的ハイブリダイゼーションアッセイで使用される方法に従って、蛍光基、放射活性原子または化学発光基のごとき、検出可能な基で標識することができる。
【００８１】
前記のＤｍＧＰＣＲヌクレオチド配列のいずれかを含んでなる核酸分子は、あるいは、本明細書に提供するヌクレオチド配列から製造されたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の使用により合成することも可能である。Ｍｕｌｌｉｓらによる米国特許第４，６８３，１９５号およびＭｕｌｌｉｓらによる米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい。ＰＣＲ反応は、配列が前もって精製されていなくとも、および特定の試料中に単一コピーでのみ存在している場合においても、特定の核酸配列の濃度を選択的に増加させるための方法を提供する。本方法は一本鎖または二本鎖両方を増幅するために使用することが可能である。本方法の本質は、所望の核酸分子の鋳型依存性、ポリメラーゼ仲介複製のためのプライマーとして働く、二つのオリゴヌクレオチドプローブの使用を含んでいる。
【００８２】
幅広い多様な代替クローニングおよびインビトロ増幅方法論が、当業者にはよく知られている。これらの技術の例は、例えば、本明細書においてその全体が援用される、Ｂｅｒｇｅｒらの、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，サンディエゴ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）、に見いだせる。
【００８３】
本発明の核酸分子およびそれらから誘導された断片は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）のスクリーニングのため、および遺伝子地図作製のために有用である。
自動化配列決定法が、ＤｍＧＰＣＲのヌクレオチド配列を得るまたは検証するために使用することが可能である。本発明のＤｍＧＰＣＲヌクレオチド配列は、１００％正確であると信じられる。しかしながら、当該技術分野で知られているように、自動化法により得られたヌクレオチド配列は、いくつかのエラーを含んでいるであろう。自動化により決定されたヌクレオチド配列は、既定の核酸分子の実際のヌクレオチド配列と、典型的には少なくとも約９０％、より典型的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野でよく知られている手動の配列決定法を使用して、より正確に決定することができる。一つまたはそれより多くのヌクレオチドの挿入または欠失を生じる配列中のエラーは、突然変異の地点から出発する、予測されたアミノ酸配列が、核酸分子の実際のヌクレオチド配列から予測されるであろう配列と異なっている、翻訳のフレームシフトを生じることができる。
【００８４】
発現構築物およびベクター
本発明のポリヌクレオチドを取り込んでいる、プラスミドおよびウイルスＤＮＡベクターのごとき自己複製組換え発現構築物もまた提供する。ベクターは本明細書において、ＤｍＧＰＣＲをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するため、および／またはＤｍＧＰＣＲをコードするＤＮＡを発現するための両方に使用する。本発明のベクターには、限定されるわけではないが、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子、ウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡ断片（即ち、相同的組換えにより宿主ゲノム内へ組み込み可能な断片）が含まれる。ウイルス粒子には、限定されるわけではないが、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、スメリキフォレスト（Ｓｍｅｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスが含まれる。発現ベクターの例には、限定されるわけではないが、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれる。他の発現ベクターには、限定されるわけではないが、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ，ベセスダ，ＭＤ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【００８５】
ＤｍＧＰＣＲコードポリヌクレオチドが、内在性または外来性発現制御ＤＮＡ配列および転写ターミネーターへ機能可能であるように連結されている発現構築物もまた提供する。発現制御ＤＮＡ配列には、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび調節要素結合部位が一般的に含まれ、そして典型的には、発現構築物が利用される発現系に基づいて選択する。プロモーターおよびエンハンサー配列は一般に、遺伝子発現を増加する能力で選択するが、一方、オペレーター配列は一般に、遺伝子発現を調節する能力で選択する。本発明の発現構築物はまた、構築物を運んでいる宿主細胞の同定を可能にする、一つまたはそれより多くの選択可能マーカーをコードしている配列も含むことができる。発現構築物はまた、宿主細胞における相同的組換えを容易にするおよび／または促進する配列も含むことができる。本発明の構築物はまた、宿主細胞における複製に必要な配列も含むことができる。
【００８６】
発現構築物は、コードされたタンパク質の産生に利用することができるが、また、単にＤｍＧＰＣＲコードポリヌクレオチド配列を増幅するためにも利用することもできる。いくつかの態様において、ベクターは発現ベクターであり、ここにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、発現制御配列を含んでなるポリヌクレオチドへ機能可能であるように連結されている。いくつかの発現ベクターは、ＤｍＧＰＣＲをコードしているＤＮＡ配列が、適した宿主においてＤｍＧＰＣＲの発現を達成することが可能な適した制御配列へ機能可能であるように連結または結合されている、複製可能なＤＮＡ構築物である。ＤＮＡ領域は、それらがお互いに機能的に関連している場合、機能可能であるように連結または結合されている。例えば、プロモーターは、もしそれが配列の転写を調節するならば、コード配列へ機能可能であるように連結または結合されている。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としないがむしろ、通常、複製開始点、並びに形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子、により与えられる宿主中で複製するための能力のみを必要とする。発現ベクター中の制御配列の必要性は、選択された宿主および選ばれた形質転換法に依存して変化するであろう。一般に、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合をコードしている配列、および転写および翻訳の終結を制御する配列を含んでいる。
【００８７】
ベクターは、宿主生物体により認識されるプロモーターを含むことができる。本発明のプロモーター配列は、原核生物、真核生物またはウイルスであることができる。適した原核生物配列の例には、バクテリオファージラムダのＰＲおよびＰＬプロモーター（本明細書においてその全体が援用される、Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ａ．Ｄ．，編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９７３；本明細書においてその全体が援用される、Ｌａｍｂｄａ  ＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．Ｗ．，編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８０）；ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、および大腸菌のｌａｃＺプロモーター、およびＳＶ４０初期プロモーター（本明細書においてその全体が援用される、Ｂｅｎｏｉｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８１，２９０，３０４−３１０）が含まれる。追加のプロモーターには、限定されるわけではないが、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の末端反復配列、マロニーウイルス、サイトメガロウイルス最初期プロモーター、エプスタインバーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインが含まれる。
【００８８】
追加の調節配列もまた、本発明のベクター中に含ませることができる。適した調節配列の例には、例えば、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子の、およびバクテリオファージラムダの遺伝子ｃＩＩのシャイン−ダルガルノ配列が含まれる。シャイン−ダルガルノ配列は直接的にＤｍＧＰＣＲをコードしているＤＮＡが続くことができ、成熟ＤｍＧＰＣＲタンパク質の発現を生じる。
【００８９】
さらに、適した発現ベクターは、形質転換された宿主細胞のスクリーニングを可能にする、適切なマーカーを含むことができる。選択された宿主の形質転換は、当業者にはよく知られている、および、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前記文献）に記載されている多様な技術のいずれか一つを使用して実施する。
【００９０】
複製開始点もまた、外来性開始点を含むようなベクターの構築により、または宿主細胞染色体複製機構により提供することが可能である。ベクターが宿主細胞染色体内へ組み込まれるならば、後者が十分であることができる。あるいは、ウイルス複製開始点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択可能マーカーおよびＤｍＧＰＣＲ  ＤＮＡによる同時形質転換の方法により哺乳動物細胞を形質転換することが可能である。適したマーカーの例はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号）。
【００９１】
ＤｍＧＰＣＲをコードしているヌクレオチド配列は、連結のための平滑末端またはジグザグ（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、必要に応じて付着末端の埋め込み、望ましくない連結を避けるアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼによる連結、を含んでいる慣用的技術に従って、ベクターＤＮＡと組換えることができる。こうした操作のための技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前記文献）により記載されており、そして当該技術分野ではよく知られている。哺乳動物発現ベクターの構築のための方法は、例えば、Ｏｋａｙａｍａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８３，３，２８０；Ｃｏｓｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６，２３，９３５；Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３１２，７６８；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ  ９１／１８９８２、各々、その全体が本明細書において援用される、に記載されている。
【００９２】
宿主細胞
本発明の別の側面に従い、コードされたＤｍＧＰＣＲポリペプチドの発現を可能にする型式で本発明のポリヌクレオチド（または本発明のベクター）を含んでなる、原核生物および真核生物を含む、宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、環状プラスミドの一部として、または単離されたタンパク質コード領域またはウイルスベクターを含んでなる直線状ＤＮＡとして、宿主細胞内へ導入することができる。当該技術分野でよく知られそして日常的に実行されている、宿主細胞内へＤＮＡを導入するための方法には、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、核注射またはリポソーム、ミセル、ゴースト細胞およびプロトプラストのごとき坦体との融合が含まれる。本発明の発現系には、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、無脊椎動物、脊椎動物および哺乳動物細胞系が含まれる。
【００９３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターで（安定的にまたは一時的に）形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。前に述べたように、こうした宿主細胞は、ポリヌクレオチドを増幅するために、そしてまたポリヌクレオチドによりコードされているＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたはその断片を発現するために有用である。
【００９４】
本発明のいくつかの側面に従い、前記核酸分子のいずれかを含んでなる発現ベクターを有している形質転換宿主細胞を提供する。ヌクレオチド配列の発現は、発現ベクターが適切な宿主細胞内に導入された場合に起こる。本発明のポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、限定されるわけではないが、原核生物、酵母および真核生物が含まれる。もし原核生物発現ベクターが用いられるとすれば、適した宿主細胞は、クローン化配列を発現することが可能な任意の原核生物細胞であろう。適した原核生物細胞には、限定されるわけではないが、エシェリキア、バチルス、サルモネラ、シュードモナス、スロレプトミセスおよびスタフィロコッカス属の細菌が含まれる。
【００９５】
もし真核生物発現ベクターが用いられるとすれば、適した宿主細胞は、クローン化配列を発現することが可能な任意の真核生物細胞であろう。適した真核生物細胞には、限定されるわけではないが、非ヒト哺乳動物組織培養細胞およびヒト組織培養細胞が含まれる。宿主細胞には、限定されるわけではないが、昆虫細胞、ヒーラ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ヒト２９３細胞、およびマウス３Ｔ３線維芽細胞を含むことができる。細胞培養におけるこうした細胞の繁殖は日常的な方法となっている（例えば、その全体が本明細書において援用される、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ，編，１９７３、を参照されたい）。
【００９６】
加えて、酵母宿主を宿主細胞として用いることができる。酵母細胞の例には、限定されるわけではないが、サッカロミセス、ピキアおよびクルベロミセス属が含まれる。酵母宿主の例は、Ｓ．セレビジエおよびＰ．パストリスである。酵母ベクターは、２Ｔ酵母プラスミドからの複製開始点配列、自律的複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含むことが可能である。酵母および大腸菌両方における複製のためのシャトルベクターもまた本明細書に含まれている。
【００９７】
あるいは、昆虫細胞を宿主細胞として使用することができる。一つの態様において、本発明のポリペプチドはバキュロウイルス発現系を使用して発現する（Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８，６，４７，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏ’Ｒｉｅｌｌｙら（編），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２、および米国特許第４，８７９，２３６号、各々、その全体が本明細書において援用される、を参照されたい）。加えて、例えば、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、昆虫細胞での産生のために使用することが可能である。
【００９８】
さらに別の関連する態様において、本発明は、本発明の宿主細胞を栄養培地中で増殖させ、そして細胞または培地からポリペプチドまたはその変異体を単離する工程を含んでなる、ＤｍＧＰＣＲポリペプチド（またはその断片）を産生するための方法を提供する。ＤｍＧＰＣＲは７膜貫通レセプターであるので、特定の活性アッセイのごときいくつかの応用に対しては、単離は包埋されたポリペプチドを含んでいる細胞膜の単離を含んでいてもよく、一方、他の応用に対してはより完全な単離が望まれてもよいことが認められるであろう。
【００９９】
本発明の宿主細胞は、ＤｍＧＰＣＲに対して特別に免疫活性な抗体の開発のための、免疫原の貴重な供給源である。本発明の宿主細胞はまた、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの大規模産生のための方法においても有用であり、ここにおいて、細胞を適した培養培地中で増殖させ、所望のポリペプチド産物を細胞から、または細胞が増殖した培地から、当該技術分野で知られている精製法により単離する、例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィー、レセプターアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣなどを含む、慣用されたクロマトグラフィー法。さらに別の精製法には、所望のタンパク質が、特異的結合パートナーまたは剤により認識される特異的タグ、標識またはキレート形成部分有している融合タンパク質として発現されるおよび精製される方法が含まれる。精製されたタンパク質を切断して所望のタンパク質を得ることが可能であり、または無傷の融合タンパク質として残すことも可能である。融合組成物の切断は、切断プロセスの結果としての、追加のアミノ酸残基を有している所望のタンパク質の形を産生することができる。
【０１００】
ＤｍＧＰＣＲ  ＤＮＡ配列の知識は、内在性ＤｍＧＰＣＲの発現を許可または増加させるような細胞の修飾を可能にする。細胞がより高いレベルでＤｍＧＰＣＲを発現するように、全部または一部、天然に存在するＤｍＧＰＣＲプロモーターを全部または一部の異種プロモーターで置き換えることにより、増加した発現を提供するために細胞を修飾することが可能である（例えば、相同的組換えにより）。異種プロモーターは、それが内在性ＤｍＧＰＣＲコード配列へ機能可能であるように連結されている型式で挿入する。（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９４／１２６５０、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９２／２０８０８、およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９１／０９９５５、を参照されたい）。また、異種プロモーターＤＮＡに加え、増幅可能マーカーＤＮＡ（例えば、ａｄａ、ｄｈｆｒおよびカルバモイルリン酸シンターゼ、トランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼをコードしている多機能性ＣＡＤ遺伝子）、および／またはイントロンＤＮＡを異種プロモーターＤＮＡと一緒に挿入することができることも企図されている。もしＤｍＧＰＣＲコード配列へ連結されたら、標準選択法によるマーカー遺伝子の増幅は、細胞中でのＤｍＧＰＣＲコード配列の同時増幅を生じる。
【０１０１】
ノックアウト
本発明により提供されるＤＮＡ配列情報はまた、機能的ＤｍＧＰＣＲの発現ができない、またはＤｍＧＰＣＲの変異体を発現する対象の開発（例えば、相同的組換えまたは“ノックアウト”戦略；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，１２８８−１２９２を参照されたい、による）を可能にする。こうした対象（特に昆虫および蠕虫を含んで）は、ＤｍＧＰＣＲのインビボ活性およびＤｍＧＰＣＲの変調剤を研究するためのモデルとして有用であり、そしてまた、昆虫または蠕虫におけるＤｍＧＰＣＲの役割をさらに評価するためにも有用である。
【０１０２】
アンチセンス
また本発明により利用可能になるのは、ＤｍＧＰＣＲをコードしているポリヌクレオチドを認識しそしてハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである。完全長および断片アンチセンスポリヌクレオチドを提供する。本発明の断片アンチセンス分子には、ＤｍＧＰＣＲ発現制御配列またはＤｍＧＰＣＲ  ＲＮＡを特異的に認識しそしてハイブリダイズするものが含まれる（ＤｍＧＰＣＲをコードしているＤＮＡと他の既知の分子をコードしているＤＮＡの配列比較により決定されたような）。ＤｍＧＰＣＲコードポリヌクレオチドに独特な配列の同定は、公的に利用可能な配列データベースの使用により、および／または商業的に利用可能な配列比較プログラムの使用により、推論することが可能である。所望の配列の同定後、制限消化を通した単離および当該技術分野でよく知られている多様なポリメラーゼ鎖反応技術のいずれかを使用する増幅を実行することが可能である。アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤｍＧＰＣＲ  ｍＲＮＡを発現している細胞によるＤｍＧＰＣＲの発現を調節することに特に関連している。
【０１０３】
ＤｍＧＰＣＲ発現制御配列またはＤｍＧＰＣＲ  ＲＮＡへ特異的に結合することが可能なアンチセンス核酸（好ましくは、１０から２０塩基対オリゴヌクレオチド）を細胞内へ導入する（例えば、ウイルスベクターまたはリポソームのごときコロイド性分散系により）。アンチセンス核酸は、細胞中でＤｍＧＰＣＲ標的ヌクレオチド配列へ結合し、そして標的配列の転写および／または翻訳を妨げる。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本発明による治療使用のために特に企図される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その５’末端を、ポリ−Ｌ−リジン、トランスフェリンポリリジンまたはコレステロール部分によりさらに修飾する。転写かまたは翻訳レベルでのＤｍＧＰＣＲ発現の抑圧は、ＤｍＧＰＣＲの生物学的役割を研究するための細胞または動物モデルを発生させるために有用である。
【０１０４】
ＤｍＧＰＣＲをコードしている本発明のヌクレオチド配列から誘導された、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３、またはそれらへ相補的なまたは相同的な配列から成る群より選択されたヌクレオチド配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または断片は、多様な組織における遺伝子発現を探索するために有用である。例えば、組織は、慣習的なオートラジオグラフィー技術により検出可能な基を運んでいるオリゴヌクレオチドプローブで、生体内原位置で探索することが可能である。ヌクレオチド配列の調節領域へ指向されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるわけではないが、開始コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列などを含む、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３、またはそれらに対応するｍＲＮＡから成る群より選択することができる。
【０１０５】
転写因子
本発明において教示されるＤｍＧＰＣＲ配列は、天然の細胞および対象、並びにＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドで形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞におけるＤｍＧＰＣＲ発現を変調するための新規転写因子の設計を容易にする。例えば、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガー（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ）タンパク質（その亜鉛フィンガードメインを経てＤＮＡを結合する）は、異なった標的配列の認識を導く、構造上の変化に従うことが示されている。これらの人工亜鉛フィンガータンパク質は、高い親和性および低い解離定数で、特異的標的部位を認識し、そして遺伝子発現を変調する遺伝子スイッチとして働くことが可能である。本発明の特定のＤｍＧＰＣＲ標的配列の知識は、構造に基づいたモデル化とファージディスプレイライブラリーのスクリーニングとの組み合わせのごとき既知の方法を使用する、標的配列に特異的な亜鉛フィンガータンパク質の操作を容易にする（Ｓｅｇａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，２７５８−２７６３；Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４，５５２５−５５３０（１９９７）；Ｇｒｅｉｓｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７５，６５７−６６１；Ｃｈｏｏら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，２７３，５２５−５３２）。各々の亜鉛フィンガードメインは通常、三つまたはそれより多くの塩基対を認識する。１８塩基対の認識配列は、任意の既知ゲノムにおいてそれを独特にするために一般に十分な長さであるので、亜鉛フィンガーの６縦列反復から成っている亜鉛フィンガータンパク質は、特定の配列に対する特異性を確実にしていることが予測されるであろう（Ｓｅｇａｌら）。ＤｍＧＰＣＲ配列に基づいて設計された、人工亜鉛フィンガー反復は、ＤｍＧＰＣＲ発現を促進または抑制するために、活性化または抑制ドメインへ融合する（Ｌｉｕら）。あるいは、亜鉛フィンガードメインをＴＡＴＡボックス結合因子（ＴＢＰ）へ融合することが可能で、ここにおいて、転写活性化因子またはリプレッサーを作製するため、亜鉛フィンガーペプチドおよびＴＢＰ間には、異なった長さのリンカー領域が存在する（Ｋｉｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  １９９７，９４，３６１６−３６２０）。こうしたタンパク質およびそれをコードしているポリヌクレオチドは、インビボでＤｍＧＰＣＲ発現を変調する有用性を有している。新規転写因子は、転写因子を発現する構築物をトランスフェクトすることにより（遺伝子治療）、またはタンパク質を導入することにより、標的細胞へ搬送することが可能である。操作した亜鉛フィンガータンパク質はまた、アンチセンスまたは触媒ＲＮＡ法（ＭｃＣｏｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９６，９５２１−９５２６；Ｗｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２，３４４−３４８）の代替物として薬物療法学に使用するため、ＲＮＡ配列を結合するようにも設計できる。本発明は、本発明の遺伝子配列に基づいた、こうした転写因子を設計する方法、ならびに、その遺伝子相補体がこれらの配列を含む細胞（天然のまたは形質転換された）��おいて、ＤｍＧＰＣＲ発現を変調するために有用である、注文に応じて作られた亜鉛フィンガータンパク質、を企図している。
【０１０６】
ポリペプチド
本発明はまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４のいずれかに示すようなアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを含んでいる、本発明のポリヌクレオチドによりコードされた、精製されたおよび単離されたＤｍＧＰＣＲポリペプチドも提供する。
【０１０７】
ＤｍＧＰＣＲのごときレセプターへ結合する抗体および他の結合化合物を作成する、およびスクリーニングするため、細胞外エピトープが特に有用であることが認められるであろう。それ故別の態様において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲのＮ末端細胞外ドメインのごとき、ＤｍＧＰＣＲの少なくとも一つの細胞外ドメイン（例えば、Ｎ末端細胞外ドメインまたは三つの細胞外ループの一つ）を含んでなる、精製されたおよび単離されたポリペプチドを提供する。また本発明の範囲内に含まれるのは、ＤｍＧＰＣＲの膜貫通ドメイン、ＤｍＧＰＣＲの膜貫通ドメインを結合している細胞外ループ、ＤｍＧＰＣＲの膜貫通ドメインを結合している細胞内ループ、ＤｍＧＰＣＲのＣ末端細胞質領域およびそれらの融合物から成る群より選択されるＤｍＧＰＣＲ断片を含んでなる、精製されたおよび単離されたポリペプチドである。こうした断片は、天然のレセプターの連続部分であってもよい。しかしながら、本明細書に提供されたようなＤｍＧＰＣＲ遺伝子およびタンパク質配列の知識は、天然のタンパク質においては連続的ではない、多様なドメインの組換えを可能にすることも認められるであろう。“ｔｍｔｒｅｓｔ．ａｌｌ”と称されているＦＯＲＴＲＡＮコンピュータープログラム（Ｐａｒｏｄｉら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１９９４，５，５２７−５３５）を使用して、ＤｍＧＰＣＲが膜内外に橋を架けている（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインを含むことが示された。
【０１０８】
本発明はまた、本発明の基準ポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％の同一性および／または相同性を有するポリペプチドも包含する。本発明の基準ポリペプチドに関するパーセントアミノ酸配列“同一性”は、最大パーセント配列同一性を達成するために、両配列を整列させ、そして必要ならギャップを導入した後、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、ＤｍＧＰＣＲ配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基パーセンテージとして、本明細書において定義される。パーセント配列“相同性”は、最大パーセント配列同一性を達成するために、両配列を整列させ、そして必要ならギャップを導入した後、そして配列同一性の一部としてどんな保存的置換も考慮して、ＤｍＧＰＣＲ配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基パーセンテージとして、本明細書において定義される。
【０１０９】
一つの様相において、パーセント相同性は、比較されている配列の同一アミノ酸残基で整列された、二つの配列のより小さなものにおけるアミノ酸残基のパーセンテージとして計算され、この場合、整列化を最大にするため、１００アミノ酸の長さに四つのギャップを導入することができる（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ中，第５巻，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ワシントン，Ｄ．Ｃ．，１９７２，ｐ．１２４，本明細書において援用される）。
【０１１０】
本発明のポリペプチドは、天然の細胞源から単離することができ、または化学的に合成することができ、そして、本発明の宿主細胞を含んでいる組換え法により産生することもできる。哺乳動物宿主細胞の使用は、本発明の組換え発現産物に最適な生物学的活性を与えることが必要とされるので、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、切り詰め（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびリン酸化）を提供することが期待される。ＤｍＧＰＣＲポリペプチドのグリコシル化および非グリコシル化形を、本発明は包含する。
【０１１１】
本発明はまた、変異体（または類似体）ＤｍＧＰＣＲポリペプチドも包含している。一つの例において、ＤｍＧＰＣＲアミノ酸配列に一つまたはそれより多くのアミノ酸残基が追加される、挿入変異体を提供する。挿入は、タンパク質の片方または両方の末端に位置することができ、またはＤｍＧＰＣＲアミノ酸配列の内部領域の位置に置くこともできる。片方または両方の末端に追加の残基を有する挿入変異体は、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは標識を含んでいるタンパク質を含むことが可能である。
【０１１２】
挿入変異体には、ＤｍＧＰＣＲアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片へ、一つまたはそれより多くのアミノ酸残基が付加されたＤｍＧＰＣＲポリペプチドが含まれる。
本発明の変異体産物はまた、追加のアミノ酸残基を有する、成熟ＤｍＧＰＣＲ産物、即ち、リーダーまたはシグナル配列が除去されているＤｍＧＰＣＲ産物も含んでいる。追加のアミノ末端残基は、別のタンパク質から誘導することができ、または特定のタンパク質に由来しているとは同定できない一つまたはそれより多くの残基を含むこともできる。位置−１に追加のメチオニン残基を有するＤｍＧＰＣＲ産物（Ｍｅｔ−１−ＤｍＧＰＣＲ）が企図されており、位置−２および１に追加のメチオニンおよびリジン残基を有する変異体（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−ＤｍＧＰＣＲ）も同様である。追加のＭｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ残基（または一般に一つまたはそれより多くの塩基性残基）を有するＤｍＧＰＣＲの変異体は、細菌宿主細胞での促進された組換えタンパク質産生に特に有用である。
【０１１３】
本発明はまた、具体的発現系の使用で生じる追加のアミノ酸残基を有するＤｍＧＰＣＲ変異体も包含する。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合生成物の一部として所望のポリペプチドを発現する商業的に入手可能なベクターの使用は、所望のポリペプチドからＧＳＴ成分の切断後に、位置−１に追加のグリシン残基を有している所望のポリペプチドを提供する。他のベクター系での発現から生じる変異体もまた企図されている。
【０１１４】
挿入的変異体にはまた、ＤｍＧＰＣＲのアミノ末端および／またはカルボキシ末端の片方または両方が別のポリペプチドへ融合されている融合タンパク質が含まれる。
別の側面において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチド中の一つまたはそれより多くのアミノ酸残基が除去された欠失変異体を提供する。欠失は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの一つ若しくは両方の末端で、またはＤｍＧＰＣＲの一つ若しくはそれより多くの非末端アミノ酸残基の除去でなし遂げることが可能である。欠失変異体は、それ故、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドのすべての断片を含んでいる。
【０１１５】
本発明はまた、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４のいずれかに示すような配列のポリペプチド断片も包含しており、ここにおいて、断片はＤｍＧＰＣＲポリペプチドの生物学的（例えば、リガンド結合および／または細胞内シグナル伝達）および免疫学的特性を維持している。本明細書に記載されているポリペプチドのいずれかの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０の連続するアミノ酸を含んでなる断片が、本発明に包含されている。ポリペプチド断片は、ＤｍＧＰＣＲおよびそのアリルおよび種相同体に独特な、または特異的な抗原性特性を示すことができる。望まれる生物学的および免疫学的特性を有している本発明の断片は、当該技術分野でよく知られそして日常的に実行されている方法のいずれかにより製造することができる。
【０１１６】
さらに別の態様において、本発明はＤｍＧＰＣＲポリペプチドの置換変異体を提供する。置換変異体には、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの一つまたはそれより多くのアミノ酸残基が除去され、そして代替残基により置き換えられているポリペプチドが含まれる。一つの態様において、置換は性質が保存的である；しかしながら、本発明は非保存的である置換も包含している。この目的のための保存的置換は、下記表１、２または３に示されるように定義することができる。
【０１１７】
変異体ポリペプチドには、本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの修飾により導入されている保存的置換が含まれる。アミノ酸は、物理的特性および二次および三次タンパク質構造への寄与に従って分類することが可能である。保存的置換とは、類似の性質を有する別のアミノ酸による一つのアミノ酸の置換であると、当該技術分野では認識されている。保存的置換の例はすぐ下の表１に示されている（１９９７年３月１３日に公開されたＷＯ  ９７／０９４３３、ページ１０（ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７，９／６／９６出願）、から）。
【０１１８】
【表１】
2005537465.tif 000002
【０１１９】
あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表２に示されているごとく、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，第２版；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，ＮＹ，１９７５，ｐｐ．７１−７７）により記載されているようにグループ分けすることが可能である。
【０１２０】
【表２】
2005537465.tif 000003
【０１２１】
さらに別の代案として、保存的置換の例が、下記、表３に示されている。
【０１２２】
【表３】
2005537465.tif 000004
【０１２３】
本発明のポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換以外の修飾を運ぶポリペプチドも含むように意図されていることを理解すべきである。例として、修飾は性質が共有結合性であることができ、そして例えば、ポリマー、脂質、他の有機および無機部分との化学結合を含んでいる。こうした誘導体はポリペプチドの循環半減期を増加させるために製造することができ、または望まれる細胞、組織または器官に対するポリペプチドの標的化能力を改良するために設計することができる。同様に、本発明はさらに、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールのごとき、一つまたはそれより多くの水溶性ポリマー付加物を含むように、共有結合で修飾されているＤｍＧＰＣＲポリペプチドを包含する。
【０１２４】
天然のＤｍＧＰＣＲのリガンド結合特性を示し、そして高レベルで発現される変異体、ならびに、構成的に活性なレセプターを提供する変異体は、本発明のアッセイに特に有用であり；変異体はまた、本発明のアッセイおよび異常なＤｍＧＰＣＲ活性を研究するための細胞、組織および動物モデルを提供することにおいても有用である。
【０１２５】
抗体
また本発明に包含されるのは、ＤｍＧＰＣＲに特異的な抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性／二特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および、本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含む化合物を含んでいる相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体）またはその断片である。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖを含んでいる抗体断片もまた本発明により提供される。本発明の抗体を記述するために使用される場合、用語“特異的”とは、本発明の抗体の可変領域が排他的にＤｍＧＰＣＲポリペプチドを認識するおよび結合することを示している（即ち、ＤｍＧＰＣＲおよび他の既知のＧＰＣＲポリペプチド間における局在化配列同一性、相同性または類似性の可能な存在にもかかわらず、結合親和性における測定可能な相違によって、他の既知のＧＰＣＲポリペプチドからＤｍＧＰＣＲポリペプチドを区別することができる）。特異的抗体はまた、抗体の可変領域外側の配列、そして特に、分子の定常領域との相互作用を通して、他のタンパク質（例えば、黄色ブドウ球菌プロテインＡまたはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用することができることが理解されるであろう。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、当該技術分野でよく知られそして日常的に実施されている。こうしたアッセイの包括的議論は、Ｈａｒｌｏｗら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８，６章、を参照されたい。抗体がＤｍＧＰＣＲポリペプチドに対して特異的である限り、本発明のＤｍＧＰＣＲポリペプチドの断片を認識するおよび結合する抗体もまた企図されている。本発明の抗体は、当該技術分野でよく知られそして日常的に実施されている任意の方法を使用して産生することが可能である。
【０１２６】
本発明は、本発明のＤｍＧＰＣＲに対して特異的である抗体を提供する。抗体特異性は以下により詳細に説明されている。しかしながら、文献に以前に記載されているポリペプチドから発生することが可能な、および偶然にＤｍＧＰＣＲと交差反応することが可能な（例えば、両方のポリペプチドにおける類似したエピトープの偶然の存在による）抗体は、“交差反応性”抗体と考えられることを強調すべきである。こうした交差反応性抗体は、ＤｍＧＰＣＲに対して“特異的”である抗体ではない。抗体がＤｍＧＰＣＲに対して特異的であるか、または別の既知のレセプターと交差反応性であるかどうかの決定は、当該技術分野でよく知られている、ウェスタンブロッティングアッセイのごとき、いくつかのアッセイのいずれかを使用して行う。ＤｍＧＰＣＲを発現する細胞を同定するため、そしてまた、ＤｍＧＰＣＲ−リガンド結合活性を変調するため、ＤｍＧＰＣＲの細胞外エピトープへ特異的に結合する抗体は有用である。
【０１２７】
一つの変形において、本発明はモノクローナル抗体を提供する。こうした抗体を産生するハイブリドーマもまた、本発明の側面として意図されている。さらに別の変形において、本発明はヒト化抗体を提供する。ヒト化抗体は、外部寄生虫により引き起こされる疾患または状態に対する、インビボ治療指示に有用である。
【０１２８】
別の変形において、本発明はポリクローナル抗体を含んでなる、無細胞組成物を提供し、ここにおいて、抗体の少なくとも一つはＤｍＧＰＣＲに特異的な本発明の抗体である。動物から単離された抗血清は、水または他の希釈剤、賦形剤または担体に再懸濁された、抗血清の抗体分画を含んでなる組成物であるので、組成物の例である。
【０１２９】
さらに別の関連する態様において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲに特異的である抗体に対して特異的な抗イディオタイプの抗体を提供する。
抗体は、化学的または組換え技術により単離することが可能な、比較的小さな抗原結合ドメインを含んでいることはよく知られている。こうしたドメインは、それ自身で有用なＤｍＧＰＣＲ結合分子であり、そしてまた毒素または他のポリペプチドへ融合することができる。それ故、さらに別の態様において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲ特異的抗体の断片を含んでなるポリペプチドを提供し、ここにおいて、断片およびポリペプチドはＤｍＧＰＣＲへ結合する。非制限的例として、本発明は、単鎖抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体である、ポリペプチドを提供する。
【０１３０】
非ヒト抗体は、当該技術分野で既知の方法のいずれかによりヒト化することができる。一つの方法において、非ヒトＣＤＲをヒト抗体または共通抗体フレームワーク配列内へ挿入する。次ぎに、さらなる変化を、親和性または免疫原性を返照するために抗体フレームワーク内へ導入することが可能である。
【０１３１】
本発明の抗体は、例えば、治療的目的（外部寄生虫ＤｍＧＰＣＲの活性を変調することにより）、外部寄生虫ＤｍＧＰＣＲを検出または定量するための診断目的、そしてＤｍＧＰＣＲの精製のために有用である。本明細書に記載されたいずれかの目的のための本発明の抗体を含んでなるキットも包含される。一般に、本発明のキットは、抗体が免疫特異的である、対照抗原も含んでいる。
【０１３２】
本発明はまた、本発明の抗体を使用する方法も提供する。例えば、本発明は、抗体がレセプターへ結合する条件下、ＤｍＧＰＣＲをＤｍＧＰＣＲに特異的な抗体と接触させる工程を含んでなる、ＤｍＧＰＣＲのリガンド結合を変調するための方法を提供する。本発明の抗体は、ＤｍＧＰＣＲのリガンド結合を変調するため昆虫へ抗ＤｍＧＰＣＲ抗体を投与することにより、昆虫集団を制御するために使用することができる。例えば、昆虫は、ハエ、ショウジョウバエ、マダニ、シラミ、ノミ、ゴキブリおよびダニから選択することができる。
【０１３３】
遺伝子操作
ＤｍＧＰＣＲを使用する遺伝子操作もまた、昆虫のごとき対象で有用である。遺伝子操作には、ＤｍＧＰＣＲ活性の回復、ＤｍＧＰＣＲ過剰発現およびＤｍＧＰＣＲの負の調節が含まれる。本発明はまた、機能喪失の突然変異のために失われたＤｍＧＰＣＲ活性を回復するための遺伝子操作も包含している。適切な細胞への機能的ＤｍＧＰＣＲ遺伝子の搬送は、ベクター、およびより特別にはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）の使用により生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）、生体内原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で、物理的ＤＮＡ移動法（例えば、リポソームまたは化学的処置）の使用により生体外で達成される。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，別冊，３９２（６６７９），２５−２０、を参照されたい。遺伝子治療技術のさらなる総説としては、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，１２７５−１２８１；Ｖｅｒｍａ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９９０，６８−８４；およびＭｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５７，４５５−４６０、を参照されたい。遺伝子操作（例えば、アンチセンス処置）が、ＤｍＧＰＣＲの発現を負に調節するために応用できることも企図されている。非制限例として、遺伝子操作は、一つまたはそれより多くのＤｍＧＰＣＲ遺伝子またはその断片をノックアウトするまたは下方調節することにより、昆虫集団を制御するために有用であることができる（前記または後記を参照されたい）。
【０１３４】
組成物
本発明の別の様相は、前記の核酸分子または組換え発現ベクターのいずれか、そして受容可能な坦体または希釈剤を含んでなる、殺虫および医薬組成物を含んでいる組成物に関している。坦体または希釈剤は医薬として受容可能であることができる。適した坦体は、その全体が本明細書において援用される、この分野における標準的な基準教科書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌ、の最も新しい版に記載されている。こうした坦体または希釈剤の例には、限定されるわけではないが、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれる。リポソームおよび固定油のごとき非水性媒体もまた使用することができる。処方は、通常使用される技術により滅菌する。
【０１３５】
また本発明の範囲内であるのは、例えば、医薬として受容可能な坦体で処方された、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を含んでなる組成物である。
本発明は、ＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチド、ＤｍＧＰＣＲポリペプチド、抗ＤｍＧＰＣＲ抗体、ＤｍＧＰＣＲ結合活性を有しているその断片または部分、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナー、またはＤｍＧＰＣＲ変調剤を含んでなる、殺虫組成物を提供する。
【０１３６】
キットおよび方法
本発明はまた、キットにも関しており、医薬および殺虫キットが含まれる。キットは、前記の核酸分子のいずれか、前記のポリペプチドのいずれか、または前記の本発明のポリペプチドへ結合する任意の抗体、ならびに陰性対照を含むことができる。キットは、例えば、使用説明書、固体支持体、定量に役立つ試薬などのごとき、追加の成分を含むことができる。
【０１３７】
キットは、ポリヌクレオチドかまたはコードされているタンパク質の発現を検出するように設計することができる。例えば、ＤｍＧＰＣＲ特異的ＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを有している容器、並びに、所望により、陽性および陰性対照を含む容器、および／または使用説明書を含む、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションキットを提供することが可能である。同様に、ＤｍＧＰＣＲ特異的配列に特異的なプライマーを有している容器、ＤＮＡ、および所望により、サイズマーカー、陽性および陰性対照を含む容器、および／または使用説明書を含む、ＰＣＲキットを提供することが可能である。
【０１３８】
ハイブリダイゼーション条件は、他の核酸分子存在下で、ハイブリダイゼーションが前記遺伝子とのみ起こるようでなければならない。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、高度に相補的な核酸配列のみがハイブリダイズする。こうした条件は、２０の連続したヌクレオチドの内で１または２の不適正を有している核酸のハイブリダイゼーションを妨げることができる。こうした条件は前に定義されている。
【０１３９】
本発明の核酸探索法に適した試験試料には、例えば、細胞若しくは細胞の核酸抽出物、または生物学的液体が含まれる。前記の方法で使用される試料は、アッセイ型式、検出法、およびアッセイされるべき組織、細胞または抽出物の性質に基づいて変化するであろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は、当該技術分野ではよく知られており、利用される方法に適合性である試料を得るために、容易に適応させることが可能である。
【０１４０】
別の側面において、本発明は、外部寄生虫により引き起こされる疾患または障害の診断道具として、試料中のポリヌクレオチド検出のための方法を提供し、ここにおいて、前記方法は以下の工程を含んでなる：（ａ）試料を、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４から選択される配列を有しているポリペプチドをコードしている核酸標的領域にハイブリダイゼーションアッセイ条件下でハイブリダイズする核酸プローブとを接触させ、前記プローブはポリペプチド、その断片をコードしている核酸配列、並びに配列の相補体およびその断片、を含んでなる；並びに（ｂ）疾患の指標として、プローブ：標的領域ハイブリッドの存在または量を検出する。
【０１４１】
あるいは、ＤｍＧＰＣＲタンパク質に特異的な抗体を有している容器、および所望により、陽性および陰性対照を含む容器、および／または使用説明書を有する免疫アッセイキットを提供することが可能である。
【０１４２】
また、天然のリガンドまたは変調剤（アゴニストまたはアンタゴニスト）のごとき、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーの同定において有用であるキットも提供する。障害または疾患の処置に有用な物質は、問題とする疾患または障害の処置に対応する活性のための一つまたはそれより多くのインビトロアッセイにおいて陽性結果を示しうる。ポリペプチドの活性を変調する物質には、非限定的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アゴニストおよびアンタゴニスト、および抗体が含まれる。
【０１４３】
本発明はまた、抗体がレセプターを結合する条件下、ＤｍＧＰＣＲをＤｍＧＰＣＲに特異的な抗体と接触させる工程を含んでなる、ＤｍＧＰＣＲのリガンド結合を変調するための方法も提供する。
【０１４４】
免疫応答を誘導する方法
本発明の別の側面は、対象において、本発明のポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法に関しており、それは対象に免疫を誘導するために十分なポリペプチドの量を投与することによっている。量は、対象の種、対象の大きさなどに依存するであろうが、当業者は容易に決定することが可能である。
【０１４５】
リガンドを同定する方法
本発明の別の側面は、ＤｍＧＰＣＲかまたはＤｍＧＰＣＲをコードしている核酸分子へ結合する化合物を同定することに関しており、ＤｍＧＰＣＲまたはそれをコードしている核酸分子を化合物と接触させ、そして化合物がＤｍＧＰＣＲまたはそれをコードしている核酸分子を結合したかどうかを決定することを含んでなる。結合は、非限定的に、例えば、全体が本明細書において援用される、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９９、に記載されている、ゲル−シフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、ファージに基づいた発現クローニング、クロマトグラフィーによる同時分画化、共沈殿、架橋、相互作用捕捉／ツーハイブリッド分析、サウスウェスタン分析、ＥＬＩＳＡなどを含む、当業者にはよく知られている結合アッセイにより決定することが可能である。スクリーニングされるべき化合物（ＤｍＧＰＣＲ、またはそれをコードしている核酸分子へ結合すると推測される化合物を含むことができる）には、限定されるわけではないが、細胞外、細胞内、生物学的または化学的起源の化合物が含まれる。
【０１４６】
本発明はまた、ＤｍＧＰＣＲを結合する化合物を同定するためのアッセイも提供する。一つのこうしたアッセイは、ＤｍＧＰＣＲを含んでなる組成物と、ＤｍＧＰＣＲを結合すると推測される化合物を接触させ、そして化合物とＤｍＧＰＣＲ間の結合を測定することを含んでなる。いくつかの態様において、組成物は、その表面にＤｍＧＰＣＲを発現している細胞を含んでなる。別の変形においては、単離されたＤｍＧＰＣＲまたはＤｍＧＰＣＲを含んでなる細胞膜を用いる。結合は、例えば、標識化合物を使用することにより直接的に測定することができ、または、化合物により誘導されたＤｍＧＰＣＲの細胞内シグナル伝達を測定する（または、ＤｍＧＰＣＲシグナル伝達のレベルの変化を測定する）ことを含む、いくつかの技術により、間接的に測定することができる。
【０１４７】
天然のリガンドおよび合成化合物を含む、特異的結合分子は、単離されたまたは組換えＤｍＧＰＣＲ産物、ＤｍＧＰＣＲ変異体またはこうした産物を発現している細胞を使用して、同定するまたは開発することが可能である。結合パートナーは、ＤｍＧＰＣＲ産物を同定するため、および既知の免疫学的方法を使用する、液体および組織試料中のＤｍＧＰＣＲ産物の検出および定量に有用である。結合分子はまた、ＤｍＧＰＣＲの生物学的活性、特にシグナル伝達に関与する活性を変調する（即ち、遮断する、抑制するまたは刺激する）ことにおいても明白に有用である。
【０１４８】
本発明により提供されるＤＮＡおよびアミノ酸配列情報はまた、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドが相互作用するであろう、結合パートナー化合物の同定を可能にする。結合パートナー化合物を同定する方法には、溶液アッセイ、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドが固定化されているインビトロアッセイ、および細胞に基づいたアッセイが含まれる。ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの結合パートナー化合物の同定は、ＤｍＧＰＣＲを発現している外部寄生虫に関連する病理学における治療的または予防的介入のための候補、および殺虫剤のための候補を提供する。
【０１４９】
本発明は、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーを同定するためのいくつかのアッセイ系を含んでいる。溶液アッセイにおいて、本発明の方法は、以下の工程を含んでなる：（ａ）ＤｍＧＰＣＲポリペプチドを一つまたはそれより多くの候補結合パートナー化合物と接触させ；そして（ｂ）ＤｍＧＰＣＲポリペプチドへ結合する化合物を同定する。ＤｍＧＰＣＲポリペプチドへ結合する化合物の同定は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチド／結合パートナー複合体を単離し、そしてＤｍＧＰＣＲポリペプチドから結合パートナー化合物を分離することにより達成することが可能である。結合パートナー化合物の物理的、生物学的および／または生化学的特性を特徴付ける追加の工程も、本発明の別の態様に包含されている。一つの側面において、ＤｍＧＰＣＲポリペプチド／結合パートナー複合体は、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドかまたは候補結合パートナー化合物に対して免疫特異的な抗体を使用して単離する。
【０１５０】
さらに別の態様において、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドかまたは候補結合パートナー化合物は、その単離を容易にする標識またはタグを含んでなり、そして結合パートナー化合物を同定するための本発明の方法は、標識またはタグとの相互作用を通してＤｍＧＰＣＲポリペプチド／結合パートナー複合体を単離する工程を含んでいる。この型のタグの例は、ニッケルキレート化を使用してそのように標識された化合物の単離を可能にする、一般に約６ヒスチジン残基の、ポリヒスチジン配列である。当該技術分野でよく知られそして日常的に使用されている、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，ロチェスター，ＮＹ）のごとき他の標識およびタグは、本発明により包含されている。本発明の標識にはまた、限定されるわけではないが、放射性標識（例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ）、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識および免疫原性標識が含まれる。
【０１５１】
インビトロアッセイのいくつかの態様において、本発明は以下の工程を含んでなる方法を提供する：（ａ）固定化されたＤｍＧＰＣＲポリペプチドを候補結合パートナー化合物と接触させ；そして（ｂ）ＤｍＧＰＣＲポリペプチドへの候補化合物の結合を検出する。別の態様においては、候補結合パートナー化合物を固定化し、そしてＤｍＧＰＣＲの結合を検出する。固定化は、支持体、ビーズまたはクロマトグラフィー樹脂への共有結合性結合、ならびに、抗体結合のごとき非共有結合性の高親和性相互作用、または固定化された化合物がビオチン部分を含む場合のストレプトアビジン／ビオチン結合の使用を含む、当該技術分野ではよく知られている方法を使用して達成する。結合の検出は、（ｉ）固定化されていない化合物上の放射活性標識を使用して、（ｉｉ）非固定化化合物上の蛍光標識を使用して、（ｉｉｉ）非固定化化合物と免疫特異的な抗体を使用して、（ｉｖ）固定化された化合物が結合されている蛍光支持体を励起する、非固定化化合物上の標識を使用して、ならびに当該技術分野でよく知られそして日常的に実施されている他の技術により達成することが可能である。
【０１５２】
本発明はまた、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの結合パートナー化合物を同定するための細胞に基づいたアッセイも提供する。一つの態様において、本発明は、細胞の表面上に発現されたＤｍＧＰＣＲポリペプチドを、候補結合パートナー化合物と接触させ、そしてＤｍＧＰＣＲポリペプチドへの候補結合パートナー化合物の結合を検出する、工程を含んでなる方法を提供する。別の態様において、検出は、分子の結合により起こされたカルシウム流動または細胞中の他の生理学的事象を検出することを含んでなる。
【０１５３】
本発明の別の態様において、ＤｍＧＰＣＲに対する適した結合親和性を有している化合物のための高スループットスクリーニングを用いる。簡単には、大量の異なった小さなペプチド試験化合物を固体支持体上に、または適切な緩衝液中に溶解されている遊離化合物として合成する。ペプチド試験化合物をＤｍＧＰＣＲと接触させ、そして洗浄する。結合されたＤｍＧＰＣＲを次いで、当該技術分野でよく知られている方法により検出する。本発明の精製ポリペプチドはまた、前記の結合アッセイで使用するため、プレート上に直接被覆することも可能である。加えて、非中和抗体を、タンパク質を捕捉するため、および固体支持体上にそれを固定化するために使用することが可能である。
【０１５４】
一般に、発現されたＤｍＧＰＣＲは、その定義されたリガンドと共に、ＨＴＳ結合アッセイのために使用することが可能である。同定したペプチドを、当業者にはよく知られている方法により、限定されるわけではないが、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓまたは３２Ｐを含む、適した放射性同位元素で標識する。あるいは、ペプチドは適した蛍光性誘導体を使用し、よく知られた方法により標識することができる（Ｂａｉｎｄｕｒら，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，１９９４，３３，３７３−３９８；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０）。組換えタンパク質を発現している細胞株から作製された膜調製試料中のレセプターに、特異的に結合された放射活性リガンドは、結合されていないリガンドから結合されたリガンドを分離するためのレセプター−リガンド複合体の濾過を含む、いくつかの標準法のＨＴＳアッセイで、検出することが可能である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，１９９１，１１，１４７−１８４；Ｓｗｅｅｔｎａｍら，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５）。あるいは、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）またはこうした分離が不必要であるＦｌａｓｈＰｌａｔｅフォーマット（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，８５−９１，Ｂｏｓｓｅら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９８，３，２８５−２９２）が含まれる。蛍光性リガンドの結合は、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、結合されたリガンドの直接分光蛍光分析、または蛍光偏光を含む、多様な方法で検出することが可能である（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，１９９７，２，１５６−１６０；Ｈｉｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，９２−９７）。
【０１５５】
ＤｍＧＰＣＲの特異的リガンドを同定するために、他のアッセイを使用することができ、標的タンパク質への試験リガンドの直接結合を測定することを通して、標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイ、ならびに、イオンスプレー質量分光法／ＨＰＬＣ法または他の物理的および分析的方法を用い、親和性限外濾過を通して、標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイが含まれる。あるいは、こうした結合相互作用を、Ｆｉｅｌｄｓら（Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４０，２４５−２４６）およびＦｉｅｌｄｓら（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，１０，２８６−２９２）（両方が本明細書において援用される）、により記載されている酵母ツーハイブリッドシステムを使用して、間接的に評価する。ツーハイブリッドシステムは、二つのタンパク質またはポリペプチド間の相互作用を検出するための遺伝子アッセイである。それは、既知の目的のタンパク質へ結合するタンパク質を同定するため、または相互作用に決定的なドメインまたは残基を描写するために使用することが可能である。この方法論の変形が、ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子をクローンするため、タンパク質へ結合するペプチドを同定するため、および薬剤をスクリーニングするために開発された。ツーハイブリッドシステムは相互作用しているタンパク質対の能力を活用し、転写活性化ドメインを、レポーター遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）へ結合するＤＮＡ結合ドメインのごく近くへ持って行き、一般的に酵母で実行する。アッセイは、（１）第一のタンパク質へ融合されているＤＮＡ結合ドメイン、および（２）第二のタンパク質へ融合された活性化ドメイン、をコードしている二つのハイブリッド遺伝子の構築を必要とする。第一のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインはレポーター遺伝子のＵＡＳを標的とする；しかしながら、ほとんどのタンパク質は活性化ドメインを欠いているためレポーター遺伝子の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む第二のハイブリッドタンパク質は、ＵＡＳを結合しないので、それ自身ではレポーター遺伝子の発現を活性化できない。しかしながら、両方のハイブリッドタンパク質が存在している場合、第一および第二のタンパク質の非共有結合的相互作用が活性化ドメインをＵＡＳへ繋ぎ止め、レポーター遺伝子の発現を活性化する。例えば、第一のタンパク質が、別のタンパク質または核酸と相互作用することが知られているＤｍＧＰＣＲ遺伝子産物、またはその断片である場合、このアッセイは結合相互作用に干渉する剤を検出するために使用することが可能である。異なった試験剤を系に加えながら、レポーター遺伝子の発現をモニターする。阻害剤の存在は、レポーター信号の欠如を生じる。
【０１５６】
ＤｍＧＰＣＲ遺伝子産物の機能が未知であり、そして遺伝子産物を結合するリガンドが知られていない場合、酵母ツーハイブリッドアッセイをまた、遺伝子産物へ結合するタンパク質を同定するために使用することが可能である。ＤｍＧＰＣＲレセプターまたはその断片へ結合するタンパク質を同定するためのアッセイにおいて、ＤｍＧＰＣＲレセプター（または断片）およびＵＡＳ結合ドメインの両方をコードしている融合ポリヌクレオチド（即ち、第一のタンパク質）を使用することができる。加えて、活性化ドメインへ融合された、各々が異なった第二のタンパク質をコードしている多数のハイブリッド遺伝子を産生し、そして本アッセイでスクリーニングする。典型的には、第二のタンパク質は、全ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ融合ライブラリーの一つまたはそれより多くのメンバーによりコードされており、各々の第二のタンパク質コード領域は、活性化ドメインへ融合されている。このシステムは広範囲のタンパク質へ応用可能であり、そして第二の結合タンパク質の同一性または機能を知る必要さえない。このシステムは非常に感度が高く、そして他の方法では明らかにできない相互作用を検出することが可能である；一過性の相互作用でさえも転写の引き金を引くことができ、安定なｍＲＮＡを産生し、それは繰り返して翻訳されることが可能であり、レポータータンパク質を得る。
【０１５７】
他のアッセイを、標的タンパク質へ結合する剤を探索するために使用することができる。標的タンパク質への試験リガンドの直接結合を同定するための一つのこうしたスクリーニング法は、本明細書において援用される、米国特許第５，５８５，２７７号に記載されている。この方法は、タンパク質は一般に折り畳まれたおよび折り畳まれていない状態の混合物として存在し、そして連続的に二つの状態間を変化しているという原理に基づいている。試験リガンドが標的タンパク質の折り畳まれた形へ結合している場合（即ち、試験リガンドが標的タンパク質のリガンドである場合）、リガンドにより結合された標的タンパク質分子は、その折り畳まれた状態を維持している。それ故、リガンドの非存在下よりも、標的タンパク質を結合するリガンドの存在下ではより高い程度で折り畳まれた標的タンパク質として存在している。標的タンパク質へのリガンドの結合は、標的タンパク質の折り畳まれたおよび折り畳まれていない状態間を識別する任意の方法により決定することが可能である。標的タンパク質の機能は、実行されるべきこのアッセイのためには知る必要がない。実際、限定されるわけではないが、金属、ポリペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカリド、ポリヌクレオチドおよび小有機分子を含む任意の剤が、試験リガンドとしてこの方法により評価することが可能である。
【０１５８】
標的タンパク質のリガンドを同定するための別の方法が、Ｗｉｅｂｏｌｄｔら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６９，１６８３−１６９１）（本明細書において援用される）により記載されている。この技術は、標的タンパク質への結合について、溶液相で同時に、２０−３０の剤のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする。標的タンパク質へ結合する剤は、簡単な膜洗浄により他のライブラリー成分から分離する。フィルター上に保持さている、特異的に選択された分子を続いて標的タンパク質から遊離し、そしてＨＰＬＣおよび含気的に補助された熱スプレー（イオンスプレー）イオン化質量分析法により分析する。この方法は、標的タンパク質に対して最も強い親和性を有するライブラリー成分を選択し、小分子ライブラリーに対して特に有用である。
【０１５９】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドを結合可能な中和抗体が、ポリペプチドへの結合において試験化合物と特異的に競合する、競合スクリーニングアッセイを使用することを含んでなる。この型式においては、ＤｍＧＰＣＲと一つまたはそれより多くの抗原決定基を共有する、任意のポリペプチドの存在を検出するために、抗体を使用することが可能である。放射標識競合結合研究は、Ａ．Ｈ．Ｌｉｎら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９７，４１（１０），２１２７−２１３１）により記載されており、その開示は全体が本明細書において援用される。
【０１６０】
変調剤を同定するための方法
本発明はまた、ＤｍＧＰＣＲおよびＤｍＧＰＣＲ結合パートナー間の結合の変調剤を同定するための方法も提供し、前記方法は、（ａ）推定変調剤化合物存在下、ＤｍＧＰＣＲ結合パートナーと、びＤｍＧＰＣＲを含んでなる組成物とを接触させ；（ｂ）結合パートナーおよびＤｍＧＰＣＲ間の結合を検出し；そして（ｃ）推定変調剤非存在下での結合パートナーおよびＤｍＧＰＣＲ間の結合と比較して、推定変調剤存在下で減少したまたは増加した結合を考慮し、推定変調剤化合物または変調剤化合物を同定する、工程を含んでなる。
【０１６１】
ＤｍＧＰＣＲ活性を刺激するＤｍＧＰＣＲ結合パートナーは、不十分なＤｍＧＰＣＲシグナル伝達（例えば、ＤｍＧＰＣＲリガンドの不十分な活性の結果として）により特徴付けられる状態において、アゴニストとして有用である。リガンド仲介ＤｍＧＰＣＲシグナル伝達を遮断するＤｍＧＰＣＲ結合パートナーは、過剰なＤｍＧＰＣＲシグナル伝達により特徴付けられる状態において、ＤｍＧＰＣＲアンタゴニストとして有用である。加えて、一般にＤｍＧＰＣＲ変調剤、ならびにＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、外部寄生虫により引き起こされる疾患、またはＤｍＧＰＣＲ活性が促進されたまたは減じられた状態のための診断アッセイにおいて有用である。
【０１６２】
別の側面において、本発明は、疾患または状態を処置するための方法を提供し、前記方法は、こうした処置を必要とする対象に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４から選択される配列を有しているポリペプチドの活性または発現を変調する物質を投与することによっている。
【０１６３】
別の側面において、本発明は、ＤｍＧＰＣＲの発現または活性を修飾する結合パートナーまたは変調剤を昆虫集団に投与することにより、昆虫集団を制御するための方法を提供する。
【０１６４】
ＤｍＧＰＣＲ活性または発現を変調する（即ち、増加する、減少するまたは遮断する）剤は、推定変調剤とＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含んでいる細胞をインキュベートし、ＤｍＧＰＣＲ活性または発現に対する推定変調剤の効果を決定することにより同定することができる。ＤｍＧＰＣＲの活性を変調する化合物の選択性は、ＤｍＧＰＣＲに対するその効果と、他のＧＰＣＲ化合物に対するその効果を比較することにより評価することができる。選択的変調剤は、例えば、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたはＤｍＧＰＣＲコード核酸へ特異的に結合する、抗体および他のタンパク質、ペプチドまたは有機分子を含むことができる。ＤｍＧＰＣＲ活性の変調剤は、正常または異常なＤｍＧＰＣＲ活性が関与する、疾患および生理学的状態の処置に治療的に有用であろう。
【０１６５】
ＤｍＧＰＣＲポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにＤｍＧＰＣＲ変調剤はまた、外部寄生虫により引き起こされる疾患、または促進されたまたは減じられたＤｍＧＰＣＲ活性により特徴付けられる状態のための診断アッセイにおいても使用することが可能である。
【０１６６】
変調剤を同定する本発明の方法には、結合パートナー化合物を同定するために前に記載した方法のいずれかの変形、結合パートナー化合物が同定され、そして結合アッセイが候補変調剤の存在下および非存在下で実施される技術を含んでいる変形が含まれる。候補変調剤化合物非存在下での結合と比較して、候補変調剤存在下でＤｍＧＰＣＲポリペプチドおよび結合パートナー化合物間の結合が変化するこれらの例において、変調剤が同定される。ＤｍＧＰＣＲポリペプチドおよび結合パートナー化合物間の結合を増加させる変調剤は、促進剤または活性化剤と記載され、そしてＤｍＧＰＣＲポリペプチドおよび結合パートナー化合物間の結合を減少させる変調剤は、抑制剤と記載される。
【０１６７】
本発明はまた、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの生物学的活性（即ち、酵素活性、結合活性その他に影響する）と相互作用する、または抑制する化合物を同定するための高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）も包含している。ＨＴＳアッセイは、効率のよい型式で、多数の化合物のスクリーニングを可能にする。細胞に基づいたＨＴＳシステムを、ＤｍＧＰＣＲレセプター−リガンド相互作用を調べるために企図した。ＨＴＳアッセイは所望の特質を有している“ヒット（ｈｉｔ）”または“リード化合物（ｌｅａｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）”を同定するために設計し、それらから所望の特質を改良するために修飾を設計することが可能である。“ヒット”または“リード化合物”の化学修飾は、しばしば“ヒット”およびＤｍＧＰＣＲポリペプチド間の同定可能な構造／活性関連性に基づいている。
【０１６８】
本発明の範囲内に入る変調剤には、限定されるわけではないが、非ペプチド模倣体のごとき非ペプチド分子、非ペプチドアロステリックエフェクターおよびペプチドが含まれる。こうした試験に用いられるＤｍＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、溶液中で遊離の、固体支持体へ結合されている、細胞表面に運ばれているまたは細胞内部に位置されている、または細胞の一部に会合されていることができる。当業者は、例えば、ＤｍＧＰＣＲおよび試験されている化合物間の複合体の形成を測定することが可能である。あるいは、当業者は、試験されている化合物により起こされる、ＤｍＧＰＣＲおよびその基質間の複合体形成の減少を試験することが可能である。
【０１６９】
本発明の別の側面は、ＤｍＧＰＣＲの活性を変調する（即ち、増加させるまたは減少させる）化合物を同定する方法に関しており、ＤｍＧＰＣＲと化合物を接触させ、そして化合物がＤｍＧＰＣＲの活性を修飾したかどうか決定することを含んでなる。試験化合物存在下での活性を、試験化合物非存在下での活性と比較する。試験化合物を含んでいる試料の活性が、試験化合物を欠く試料の活性よりも高いとき、化合物は増加された活性を有するであろう。同様に、試験化合物を含んでいる試料の活性が、試験化合物を欠く試料の活性よりも低いとき、化合物は抑制された活性を有するであろう。
【０１７０】
本発明は、多様な活性アッセイのいずれかにおいて、ＤｍＧＰＣＲを使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。スクリーニングされるべき化合物には、限定されるわけではないが、細胞外、細胞内、生物学または化学起源の化合物が含まれる（ＤｍＧＰＣＲ活性を変調すると推測される化合物を含むことができる）。こうした試験に用いられるＤｍＧＰＣＲポリペプチドは、溶液中で遊離の、固体支持体へ結合されている、細胞表面に運ばれているまたは細胞内部に位置されているごとく、任意の形であることができる。当業者は、例えば、ＤｍＧＰＣＲおよび試験されている化合物間の複合体の形成を測定することが可能である。あるいは、当業者は、試験されている化合物により起こされる、ＤｍＧＰＣＲおよびその基質間の複合体形成の減少を試験することが可能である。
【０１７１】
本発明のＤｍＧＰＣＲポリペプチドの活性は、例えば、化学的に合成されたペプチドリガンドを結合するまたはそれにより活性化される能力を試験することにより決定することが可能である。あるいは、ＤｍＧＰＣＲの活性は、カルシウムイオン、ホルモン、ケモカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、ヌクレオチド、脂質、匂い物質および光子を結合するそれらの能力を試験することにより評価することが可能である。あるいは、ＤｍＧＰＣＲの活性は、限定されるわけではないが、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼおよびイオンチャンネルを含むエフェクター分子の活性を試験することにより評価することが可能である。それ故、ＤｍＧＰＣＲ活性の変調剤は、レセプターの結合特性、またはＧタンパク質仲介シグナル伝達のごとき活性、または膜局在化のごとき、ＤｍＧＰＣＲレセプター機能を変化させることができる。本方法の多様な態様において、アッセイはイオン流動アッセイ、酵母成長アッセイ、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイのごとき非加水分解性ＧＴＰアッセイ、ｃＡＭＰアッセイ、イノシトール三リン酸アッセイ、ジアシルグリセロールアッセイ、エクオリンアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、細胞内ＣＡ２＋濃度のＦＬＩＰＲアッセイ、有糸分裂誘発アッセイ、ＭＡＰキナーゼ活性アッセイ、アラキドン酸放出アッセイ（例えば、［３Ｈ］−アラキドン酸を使用して）、および細胞外酸性化速度のアッセイ、ならびに、当該技術分野で一般に知られている、ＤｍＧＰＣＲ活性についての他の結合または機能に基づいたアッセイ、の形をとることができる。これらの態様のいくつかにおいて、本発明は、Ｇ１６、Ｇ１５またはキメラＧｑｉ５、Ｇｑｓ５、Ｇｑｏ５、Ｇｑｚ５などのごとき当該技術分野で知られているＧタンパク質のいずれかの含有を包含している。ＤｍＧＰＣＲ活性は、当業者にはよく知られている、ＦａＲＰ活性をアッセイするために使用される方法論により決定することが可能である。本発明に従ったＤｍＧＰＣＲレセプターの生物学的活性には、限定されるわけではないが、天然のまたは非天然のリガンドの結合、ならびに当該技術分野で知られているＧＰＣＲの機能的活性のいずれか一つが含まれる。ＧＰＣＲ活性の非制限的な例には、Ｇタンパク質会合および／または多様なグアニジレートヌクレオチドのＧタンパク質結合に対する影響の発揮を含む、多様な形の膜貫通シグナル伝達が含まれる；ＧＰＣＲ活性の別の例は、既知のＧタンパク質とは異なる、アクセサリータンパク質またはポリペプチドの結合である。
【０１７２】
本発明の変調剤は、多様な化学構造を示し、それらは、天然ＤｍＧＰＣＲレセプターリガンドの非ペプチド模倣物、ペプチド、およびＤｍＧＰＣＲレセプターの非ペプチドアロステリックエフェクター、並びにＤｍＧＰＣＲレセプターの活性化剤または抑制剤（競合的、不競合的および非競合的）（例えば、抗体産物）として機能することができるペプチド、へ一般にグループ分けすることが可能である。本発明は適した変調剤の起源を制限することはなく、それらは植物、動物または鉱物抽出物のごとき天然源、またはライブラリー構築のためのコンビナトリアル化学法の産物を含む小分子ライブラリーのごとき非天然源、およびペプチドライブラリーから得ることができる。ＤｍＧＰＣＲレセプターのペプチド変調剤の例は以下の一次構造を示す：ＧＬＧＰＲＰＬＲＦアミド（配列番号４９）、ＧＮＳＦＬＲＦアミド（配列番号１３６）、ＧＧＰＱＧＰＬＲＦアミド（配列番号１０２）、ＧＰＳＧＰＬＲＦアミド（配列番号１０３）、ＰＤＶＤＨＶＦＬＲＦアミド（配列番号１５０）およびｐｙｒｏ−ＥＤＶＤＨＶＦＬＲＦアミド（配列番号１６７）。
【０１７３】
酵素的活性を試験するために、限定されるわけではないが、測光、放射測定、ＨＰＬＣ、電気化学などの他のアッセイを使用することが可能であり、それらは、例えば、その全体が本明細書において援用される、Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒ．ＥｉｓｅｎｔｈａｌおよびＭ．Ｊ．Ｄａｎｓｏｎ編，１９９２，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、に記載されている。
【０１７４】
ＧＰＣＲをコードしているｃＤＮＡの使用はよく知られている；高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）で、１日当たり数千の未知化合物を試験可能なアッセイが詳細に文書で提供されている。文献は、薬剤発見のためのＨＴＳ結合アッセイにおける放射標識リガンドの使用例で満たされている（総説として、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９１，１１，１４７−１８４；Ｓｗｅｅｔｎａｍら，Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１９９３，５６，４４１−４５５、を参照されたい）。組換え体レセプターは、より高い特異性（より高い相対純度）を準備できるので、結合アッセイＨＴＳに好ましく、非常に大量のレセプター物質を発生する能力を提供し、そして幅広い種類の型式で使用することが可能である（その全体が本明細書において援用される、Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０，９７３−９８０、を参照されたい）。
【０１７５】
多様な異種系が組換えレセプターの機能的発現に利用可能であり、当業者にはよく知られている。こうした系には、細菌（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２，１３，９５−９８）、酵母（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４）、いくつかの種類の昆虫細胞（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，１９９６，１６４，１８９−２６８）、両生動物細胞（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，８，６２９−６３４）およびいくつかの哺乳動物細胞株（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳその他；Ｇｅｒｈａｒｄｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９７，３３４，１−２３、を参照されたい）、が含まれる。これらの例は、線虫から得られる細胞株（ＰＣＴ出願ＷＯ  ９８／３７１７７）を含む、他の可能な細胞発現系を排除するものではない。
【０１７６】
本発明のいくつかの態様において、ＤｍＧＰＣＲを変調する化合物のためのスクリーニング法は、試験化合物をＤｍＧＰＣＲと接触させ、そして化合物およびＤｍＧＰＣＲ間の複合体の存在を検出するためのアッセイを行うことを含んでなる。こうしたアッセイにおいては、リガンドを典型的には標識する。適切なインキュベーション後、遊離リガンドを結合された形で存在するリガンドから分離し、そして遊離または非複合体化標識の量が、特定の化合物がＤｍＧＰＣＲへ結合する能力の指標である。
【０１７７】
組換え系で発現された異種レセプターの活性化は、多様な生物学的応答を生じることがよく知られており、それらは宿主細胞で発現されたＧタンパク質により仲介される。アゴニストによるＧＰＣＲの占拠は、Ｇαサブユニット上の結合部位で、結合ＧＤＰのＧＴＰによる交換を生じる；レセプターへのアゴニストの結合を測定するため、ＧＴＰの放射活性、非加水分解性誘導体、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを使用することが可能である（Ｓｉｍら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１９９６，７，７２９−７３３）。またこの結合は、既知のアゴニスト存在下、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合の減少により、レセプターへ結合するアンタゴニストの能力を測定するために使用することが可能である。それ故、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合に基づいたＨＴＳアッセイを構築することが可能である。
【０１７８】
異種ＧＰＣＲの機能的発現に必要とされるＧタンパク質は、宿主細胞の天然の構築物であることが可能であり、若しくはよく知られた組換え技術により導入することも可能である。Ｇタンパク質は無傷（ｉｎｔａｃｔ）でもキメラでもよい。しばしば、ほとんど普遍的に形質転換受容性のＧタンパク質（例えば、Ｇα１６）を、検出可能応答経路への任意の既定のレセプターと共役するために使用する。Ｇタンパク質活性化は、測定可能な応答へ結びつけることが可能である事象である、他の天然のタンパク質の刺激または抑制を生じる。
【０１７９】
こうした生物学的応答の例には、限定されるわけではないが、以下のものが含まれる：特別に操作されている酵母細胞における、制限栄養素非存在下で生存する能力（Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４）；蛍光色素により測定されるような細胞内Ｃａ２＋濃度の変化（Ｍｕｒｐｈｙら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．，１９９８，１，１９２−１９９）。蛍光変化もまた、膜電位または細胞内ｐＨにおけるリガンド誘導変化をモニターするために使用することが可能である；これらの目的のための、ＨＴＳに適した自動化システムが記載されている（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９６，１，７５−８０）。アフリカツメガエルから調製されたメラニン細胞は、異種ＧＰＣＲに応答した色素形成において、リガンド依存性変化を示す；この応答は、ＨＴＳ形式に適合している（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，８，６２９−６３４）。アッセイはまた、ｃＡＮＰ、ホスホイノシチドおよびアラキドン酸を含む、共通の二次メッセンジャーの測定にも利用可能である。
【０１８０】
これらのレセプターを用いているＨＴＳの方法は、永久的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を含んでおり、ここにおいて、アゴニストおよびアンタゴニストは、これらの細胞から調製された膜において、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合を特異的に変化させる能力により同定することが可能である。本発明の別の態様において、永久的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、有意な量の組換え体レセプタータンパク質を含む膜の調製のために使用することができる；これらの膜調製試料は、特定のレセプターに特異的な、放射標識リガンドを用いるレセプター結合アッセイにおいて使用されるであろう。あるいは、内部Ｃａ２＋濃度または膜電位レセプターを個々にまたは組み合わせて含んでいる永久的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞においての、内部Ｃａ２＋濃度または膜電位におけるリガンド誘導変化の蛍光モニタリングのごとき機能的アッセイは、ＨＴＳに有用であろう。等しく有用であるのは、 同様の型式における、ＨＥＫ２９３またはＣＯＳ細胞のごとき別の型の哺乳動物細胞であろう。当業者にはよく知られている、ショウジョウバエＳ２細胞、およびＨＴＳ型式でキイロショウジョウバエレセプターを発現している組換え酵母細胞（例えば、Ｐａｕｓｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，４８７−４９４）のごとき、永久的にトランスフェクトされた昆虫細胞株もまた、本発明に有用であろう。
【０１８１】
本発明は、ＤｍＧＰＣＲレセプターへのリガンド結合の抑制剤をスクリーニングするおよび同定する、多数のアッセイを企図している。一つの例において、ＤｍＧＰＣＲレセプターを固定化し、そして結合パートナーとの相互作用を、抑制剤化合物のごとき候補変調剤の存在下または非存在下で評価する。別の例において、ＤｍＧＰＣＲレセプターおよびその結合パートナー間の相互作用を、候補抑制剤化合物の存在下または非存在下の両方において、溶液アッセイで評価する。両方のアッセイにおいて、抑制剤を、ＤｍＧＰＣＲレセプターおよびその結合パートナー間の結合を減少させる化合物として同定する。別の企図されたアッセイには、ツーハイブリッドアッセイの変形が含まれており、ここにおいて、タンパク質／タンパク質相互作用の抑制剤は、１９９５年８月３日に公開されたＰＣＴ公報番号ＷＯ９５／２０６５２、に記載されているように、形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞における陽性信号の検出により同定する。
【０１８２】
本発明により企図される候補変調剤には、潜在的活性化剤かまたは潜在的抑制剤のライブラリーから選択される化合物を含んでいる。（１）化学ライブラリー。（２）天然物ライブラリー、および（３）ランダムなペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子を含んでなるコンビナトリアルライブラリー、を含む、小分子変調剤の同定に使用される、多数の異なったライブラリーが存在している。化学ライブラリーはランダム化学構造から成っており、そのいくつかは既知の化合物の類似体、または別の薬剤発見スクリーニングで“ヒット”または“リード”として同定された化合物の類似体であり、そのいくつかは天然物から誘導されており、そしてそのいくつかは方向性のない合成有機化学から生じている。天然物ライブラリーは、（１）土壌、植物または海生微生物からのブロスの発酵および抽出、または（２）植物または海生生物体の抽出により、スクリーニングのための混合物を作製するために使用される、微生物、動物、植物または海生生物体の収集物である。天然物ライブラリーには、ポリケチド、非リボソームペプチドおよびその変異物（天然には存在しない）が含まれる。総説としては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，６３−６８、を参照されたい。コンビナトリアルライブラリーは、混合物として、非常に多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物から構成される。これらのライブラリーは、慣習的自動化合成法、ＰＣＲ、クローニングまたは特許合成法により、比較的容易に調製される。特に目的とするのは、非ペプチドコンビナトリアルライブラリーである。さらに別の目的のライブラリーには、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、多平行合成収集物、リコンビナトリアル、およびポリペプチドライブラリーが含まれる。コンビナトリアル化学およびそれらにより作製されるライブラリーの総説としては、Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，８，７０１−７０７、を参照されたい。本明細書に記載した多様なライブラリーの使用を通した変調剤の同定は、“ヒット”の能力を中程度の活性に最適化するための、候補“ヒット”の修飾を可能にする。
【０１８３】
本発明により企図されるさらに別の候補抑制剤を設計することが可能であり、そして結合パートナーの可溶形、ならびに、キメラまたは融合タンパク質ような結合パートナーが含まれる。本明細書において、“結合パートナー”は、非ペプチド変調剤、ならびに天然リガンド以外の神経ペプチドのようなペプチド変調剤、抗体、抗体断片、および同定されたＤｍＧＰＣＲ遺伝子の発現産物に免疫特異的である抗体ドメインを含んでなる修飾化合物を広く包含している。
【０１８４】
本発明の別の態様において、本発明のポリペプチドを、相互作用している制御タンパク質の同定、特徴付けおよび精製のための研究道具として用いる。当該技術分野で既知の多様な方法により、本発明のポリペプチド内へ適切な標識を取り込ませ、そしてポリペプチドを、相互作用している分子を捕捉するために使用する。例えば、分子を標識ポリペプチドとインキュベートし、非結合ポリペプチドを洗浄して除去し、そしてポリペプチド複合体を定量する。異なった濃度のポリペプチドを使用して得られたデータを、ポリペプチドとタンパク質複合体の数、親和性および会合の値を計算するために使用する。
【０１８５】
標識されたポリペプチドはまた、限定されるわけではないが、抑制剤を含む、ポリペプチドが相互作用する分子の精製のための試薬としても有用である。親和性（アフィニティー）精製の一つの態様において、ポリペプチドをクロマトグラフィーカラムへ共有結合で結合する。細胞およびその膜を抽出し、そして多様な細胞副成分はカラムを通過させる。分子は、ポリペプチドへのそれらの親和性によりカラムへ結合する。ポリペプチド−複合体をカラムから回収し、解離させ、そして回収された分子をタンパク質配列決定にかける。このアミノ酸配列は次ぎに、捕捉された分子を同定するため、そして適切なｃＤＮＡライブラリーから、対応する遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドを設計するために使用する。
【０１８６】
あるいは、本発明のＤｍＧＰＣＲのリガンドと同様の特性を示すが、より小さくそしてヒトまたは動物体内で内在性リガンドよりも長い半減期を示す化合物を同定することができる。有機化合物を設計する場合、本発明に従った分子を“リード”化合物として使用する。既知の医薬として活性な化合物の模倣物の設計は、こうした“リード”化合物に基づいた医薬の開発においてよく知られた方法である。模倣の設計、合成および試験は、標的特性のために多数の分子を無作為にスクリーニングすることを避けるために一般に使用される。さらに、本発明のＤＮＡによりコードされた推定アミノ酸配列の分析から誘導される構造データは、より特異的であり、そしてそれ故より高い薬理学的効力を有する新規薬剤を設計するために有用である。
【０１８７】
本発明のタンパク質配列と、すべての利用可能なデータベースに存在する配列の比較は、Ｇタンパク質共役型レセプターの膜貫通部分との有意な相同性を示した。従って、他のタンパク質の膜貫通ドメインの利用可能な情報に基づいて、本発明のタンパク質の推定三次構造を展開するため、コンピューターモデル化を使用することが可能である。ＤｍＧＰＣＲの予測された構造に基づいて、新規リガンドを設計することが可能である。
【０１８８】
特定の態様において、本発明に従ったスクリーニング法により同定された新規分子は、低分子量有機分子であり、この場合においては、組成物または医薬組成物が、錠剤中でのごとく、そのものから経口摂取のために製造することが可能である。核酸分子、ベクター、ポリペプチド、抗体および本明細書に記載したスクリーニング法により同定された化合物を含んでなる組成物または医薬組成物は、限定されるわけではないが、経口、静脈内、皮膚、皮下、鼻孔内、筋肉内、または腹腔内を含む、任意の投与のために製造することができる。坦体または他の成分の性質は、特定の投与経路および投与されるべき本発明の特定の態様に依存するであろう。これに関連して有用である技術およびプロトコールの例は、なかでも、その全体が本明細書において援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｓｏｌ，Ａ（編），１９８０、にみることができる。
【０１８９】
これらの低分子量化合物の用量は、処置すべき疾患状態または状態および、処置すべき対象の体重および状態および化合物の投与経路のごとき他の臨床的因子に依存するであろう。動物を処置するためには、約０．５ｍｇ／体重ｋｇから５００ｍｇ／体重ｋｇの化合物を投与することが可能である。治療は、典型的にはより低い用量を投与し、望まれる治療結果が観察されるまで続ける。
【０１９０】
対象に投与すべき化合物の用量を決定する方法および生物体へ化合物を投与する様式は、１９９６年８月２３日に提出された米国特許出願番号０８／７０２，２８２および１９９６年８月１日に公開された国際特許公報番号ＷＯ  ９６／２２９７６（図面、図または表を含んで、両方ともその全体が本明細書において援用される）、に開示されている。当業者は、こうした記述が本発明に応用でき、そして容易に適合可能なことを認めるであろう。
【０１９１】
適切な用量は、処置している疾患の型、使用されている特定の組成物、および被験者のサイズおよび生理学的状態のごとき多様な因子に依存している。本明細書に記載されている化合物の治療的有効用量は、最初に細胞培養および動物モデルから推定することが可能である。例えば、細胞培養アッセイで決定されたＩＣ５０を最初に考慮に入れた循環濃度範囲を達成するように、動物モデルで用量を処方することが可能である。
【０１９２】
血漿、腫瘍および主たる器官における、薬剤および代謝物の血漿半減期および生体分布をまた、障害を抑制するために最も適切な薬剤の選択を容易にするため、決定することが可能である。こうした測定を実施することが可能である。例えば、ＨＰＬＣ分析を、薬剤で処置した動物の血漿に対して実施することが可能で、そして放射標識化合物の位置は、Ｘ線、ＣＡＴスキャンおよびＭＲＩのごとき検出法を使用して決定することが可能である。スクリーニングアッセイにおいて強力な抑制活性を示すが、乏しい薬物動態学的特性を有する化合物は、化学構造を変化させ、そして再試験することにより最適化することが可能である。これに関して、良好な薬物動態学的特性を示している化合物をモデルとして使用することが可能である。
【０１９３】
毒性研究もまた、血液細胞成分を測定することにより実施することが可能である。例えば、毒性研究は、以下のように、適した動物モデルで実施することが可能である：１）化合物をマウスに投与する（非処置対照マウスも使用しなければならない）；２）各々の処置群において、一匹のマウスから尾静脈を経て血液試料を定期的に得る；および３）試料は、赤および白血球細胞計数、血液細胞組成および多形核細胞に対するリンパ球のパーセントについて分析する。各々の投薬投与計画と対照の結果の比較が、毒性が存在するかどうかを示している。
【０１９４】
毒性研究の終了時に、動物を殺すことにより（好ましくは、米国獣医師医師協会ガイドライン、米国獣医師医師協会報告、安楽死についてのパネル、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９３，２０２，２２９−２４９、に従って）、さらなる研究を実施することが可能である。各々の処置群からの代表的動物は次ぎに、転移、異常な病気または毒性の直接証拠のために、肉眼的剖検で調べることが可能である。組織における肉眼的異常が注目され、組織を組織化学的に試験した。
【０１９５】
核酸分子、ポリペプチド、抗体、本明細書に記載したスクリーニング法により同定された化合物を含む、本化合物および方法は、多様な製薬的および農業的（例えば、殺虫剤）応用を有しており、そして、例えば、外部寄生虫により引き起こされる状態を処置するまたは防止するために、若しくは昆虫集団を調節するために使用することができる。
【０１９６】
本発明はまた、対象におけるＤｍＧＰＣＲ天然結合パートナー関連活性に作動する（刺激する）または拮抗する方法も包含しており、該被験者に該作動作用または拮抗作用を達成するために十分な量で、前に開示したポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含んでなる。本発明の一つの態様は、外部寄生虫により引き起こされる被験者においての疾患または状態を、本発明のタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストで処置するための方法であり、外部寄生虫ＤｍＧＰＣＲ関連機能を作動するまたは拮抗するために十分な量で、対象にアゴニストまたはアンタゴニストを投与することを含んでなる。
【０１９７】
以下の表４は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列を含んでいる。
【０１９８】
【表４ａ】
2005537465.tif 000005
【０１９９】
【表４ｂ】
2005537465.tif 000006
【０２００】
【表４ｃ】
2005537465.tif 000007
【０２０１】
【表４ｄ】
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【０２０２】
【表４ｅ】
2005537465.tif 000009
【０２０３】
【表４ｆ】
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【０２０４】
【表４ｇ】
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【０２０５】
【表４ｈ】
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【０２０６】
【表４ｉ】
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【０２０７】
【表４ｊ】
2005537465.tif 000014
【０２０８】
ブタペスト条約に従って、本発明のクローンをＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ，１８１５  Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，ペオリア，イリノイ６１６０４，Ｕ．Ｓ．Ａ、に寄託されている。受け入れ番号および寄託日は下記表５に提供されている。
【０２０９】
【表５】
2005537465.tif 000015
【０２１０】
本発明は、本発明を説明することが意図されている、以下の実施例によってさらに例示する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定していることを意図していないし、またこれらを本発明の範囲を限定しているとみなしてはならない。本発明が、特に本明細書に記載している以外の方法で実施できることが明らかになるであろう。本発明の多数の修飾および変形が、本明細書の教示を考慮すると可能であり、そして、それ故に、本発明の範囲内である。
【０２１１】
この特許文書に述べられた特許、出願、印刷された刊行物の各々は、本明細書において全体が援用されることが意図される。
【実施例】
【０２１２】
実施例
実施例１：ＤｍＧＰＣＲの同定
セレラ（Ｃｅｌｅｒａ）ゲノムキイロショウジョウバエデータベースを、予想されるタンパク質のデータベース、そして発生されるであろうｍＲＮＡを予測するため、多様な遺伝子発見ソフトウェアツールを使用してｍＲＮＡデータベース（“ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ”データベース）へ変換した。遺伝子発見ソフトウェアツールを分析するための方法は、当業者には知られている。
【０２１３】
いくつかのＣ．エレガンス（ｅｌｅｇａｎｓ）ＦａＲＰ  ＧＰＣＲのヌクレオチド配列を、前記ｍＲＮＡデータベースに対する検索配列として使用した。このデータベースは、ＦＡＳＴＡおよびギャップド（ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９、その全体が本明細書において援用される）を含む、多様なツールを使用して類似性の領域について検索した。
【０２１４】
簡単には、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴアルゴリズムは配列類似性を決定するために適している（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、その全体が本明細書において援用される）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ＮＩＨ．ｇｏｖ／）を通して、公的に利用可能である。このアルゴリズムは最初に、データベース中の同一の長さのワード（ｗｏｒｄ）を並列した場合、いくつかの正の値のしきい値スコアＴとマッチするかまたは満足する検索配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の短いワード長を同定することにより、ハイスコアリング配列対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）を同定することを含んでいる。Ｔは文字列スコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前記文献）。これらの最初の文字列ヒット（ｈｉｔ）は、それらを含んでいるＨＳＰを発見する検索を始めるためのタネ（ｓｅｅｄ）として働く。ワードヒットを各々の配列に沿って両方向に、蓄積的アラインメントスコアを増加させることが可能な限り伸張させる。両方向へのワードヒットの伸張は、１）その最大達成値から蓄積的アラインメントスコアが量Ｘだけ落ちる；２）蓄積的スコアが、一つまたはそれより多くの負にスコアリングする残基アラインメントの蓄積によりゼロまたはそれ以下になる；または３）どちらかの配列が末端に達した、場合に停止する。ＢｌａｓｔアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは感度およびアラインメントの速度を決定する。Ｂｌａｓｔプログラムはデフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１０９１５−１０９１９、その全体が本明細書において援用される、を参照されたい）、５０のアラインメント（Ｂ）１０の期待値（Ｅ），Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較、を使用している。
【０２１５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３−５７８７、その全体が本明細書において援用される）およびギャップドＢＬＡＳＴは、二つの配列間の、類似性の統計分析を実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される、類似性の一つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列のマッチが偶然に起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、ＤｍＧＰＣＲ核酸に対する試験配列の比較において、もし最小合計確率が約１より小さい、好ましくは約０．１より小さい、より好ましくは約０．０１より小さい、そして最も好ましくは約０．００１より小さいならば、ＤｍＧＰＣＲ遺伝子またはｃＤＮＡと核酸は類似していると考えられる。
【０２１６】
予測されたタンパク質に対応するｍＲＮＡは、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐデータベースを作るために使用された、予測されたｍＲＮＡのデータベースから回復された。これらは以下のヌクレオチド配列であると同定され：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３、各々が検索配列に対して統計的に優位な重複相同性を有している。ヌクレオチド配列、配列番号３、５、９、１１、１３および１５（ＤｍＧＰＣＲ２ａ、２ｂ、５ａ、５ｂ、６ａおよび６ｂに対応している）は、ＰＣＲクローニングおよび別の同定された配列の配列決定（示されていない）から得られた。これらの配列の各々は、ＤｍＧＰＣＲ遺伝子のスプライス変異体を表している。
【０２１７】
実施例２：ＤｍＧＰＣＲのクローニング
ｃＤＮＡ調製
ｃＤＮＡは成虫キイロショウジョウバエ  ポリＡ＋  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，パロアルト，ＣＡ）かまたは成虫キイロショウジョウバエ全ＲＮＡ（下記）から調製した。全ＲＮＡを得るには、キイロショウジョウバエ親ストック（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，バーリントン，ＮＣ）を冷やして麻痺させ、そして５から６の成体を、１０ｍｌのＨ２０、１０ｍｌのＦｏｒｍｕｌａ  ４−２４  Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｍｅｄｉｕｍおよび６から１０グレーンの活性乾燥酵母（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を含んでいる培養容器に加えた。ポリウレタンの泡栓を各々の容器の末端に置き、室温（ＲＴ）で４から６週間インキュベートした。成熟時、容器を冷やし、そして麻痺させたハエを、液体Ｎ２中に保持した５０ｍｌのポリプロピレンチューブに注いだ。凍結したハエは、液体Ｎ２存在下、乳鉢および乳棒ですりつぶすまで、−７０℃で保存した。粉末にした組織および幾分かの液体Ｎ２を、ドライアイス上で５０ｍｌのポリプロピレンチューブ内へデカントした。液体Ｎ２を蒸発させた後、粉末にした組織は−７０℃で保存した。
【０２１８】
ＲＮＡを調製するため、３００ｍｇの粉末にした組織をドライアイス上のポリプロピレンチューブ内へ置き、そして５ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸塩の０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ溶液、ｐＨ５．２溶液を加えた。ＲＮａｓｅ汚染の問題を減じるため、すべての溶液は、ＤＥＰＣで処理するか、またはＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏで調製し、そしてすべてのガラス器具は焼くか、または新品のプラスチック器具を使用した。チューブをボルテックスで混合し、次に氷の上に置いた。粉末にした組織は、２０、２１および２２ゲージ針を連続的に通過させることにより、均質化した。チューブを遠心分離し（１０００ｘｇで１０分）、次に、２．５から３ｍｌの上清を、１４ｘ９５ｍｍ  Ｕｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，パロアルト，ＣＡ）に含まれている８ｍｌの５．７Ｍ塩化セシウムの０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ溶液に層積した。試料は、Ｌ８−７０超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）中、２５０００ｒｐｍで１８時間、１８℃にて遠心分離した。上清をデカントし、そしてチューブを反転させて排水した。ＲＮＡペレットは２００μｌのＲＮａｓｅ−フリー  ｄＨ２Ｏ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，バレンシア，ＣＡ）に懸濁し、次に１００μｌのＲＮａｓｅ−フリー  ｄＨ２Ｏで２回すすいだ（総計、４００μｌ）。４４μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．２および１ｍｌの冷１００％エタノールの添加により、ＲＮＡを沈殿させた。−７０℃で一夜保存した後、チューブを１４０００ｒｐｍで１時間遠心分離し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心機５４０２）、７５％エタノールですすぎ（ＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏで調製した）、次にペレットをＲＮａｓｅ−フリー  ｄＨ２Ｏに溶解した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で決定された２６０または２８０ｎｍでの吸光度を、ＲＮＡ濃度および純度を見積もるために使用した。
【０２１９】
第一鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ酵素（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，ロックビル，ＭＤ）で供給された手順に従って調製した。５００ｎｇ（２μｌ）のポリＡ＋  ＲＮＡかまたは３μｇ（４μｌ）の全ＲＮＡをＲＮａｓｅ−フリー  ｄＨ２Ｏおよび２５０ｎｇ（２．５μｌ）のランダムプライマーを含んでいる微量遠心管に加えた。チューブ（１２μｌ）を７０℃で１０分インキュベートし、氷上で冷やし、次に、４μｌの５ｘ第一鎖緩衝液、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴおよび１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物を加えた。２５℃で１０分、４２℃で２分インキュベートした後、１μｌ（２００単位）のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを加え、そして４２℃で５０分、インキュベーションを続けた。酵素は、７０℃で１５分のインキュベーションにより不活性化した。ｃＤＮＡに相補的であるＲＮＡを除去するため、２μｌ（２単位）のＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，インディアナポリス，ＩＮ）を加え、続いて３７℃で２０分のインキュベーションを行った。ｃＤＮＡは−２０℃で保存した。
【０２２０】
ＰＣＲ反応
キイロショウジョウバエＧタンパク質共役型レセプター（ＤｍＧＰＣＲ）を増幅するため、標準５０／１００μｌＰＣＲ反応、またはＡｍｐｌｉｗａｘビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，ノーウォーク，ＣＴ）を使用するＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲ反応を使用した。プライマー（Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ウッドランド，ＴＸ）：１０μＭ濃度の５’および３’プライマー、１μＭ濃度の内部プライマー、を溶解するため、蒸留Ｈ２Ｏを使用した。各々のＰＣＲ反応液は、２から４単位のｒＴｔｈ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ、１．２から１．５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、２００μＭの各々のｄＮＴＰ、並びに２００または４００ｎＭの各々のプライマーを含んでいた。Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲに対しては、３２から３６μｌの“ローワァー（ｌｏｗｅｒ）”カクテル（ｄＨ２Ｏ、３．３ｘ  ＸＬ−緩衝液、ｄＮＴＰおよびＭｇ（ＯＡｃ）２）を２または４μｌの各々のプライマーに加えた（全量、４０μｌ）。Ａｍｐｌｉｗａｘビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）を加え、チューブを７５℃で５分インキュベートし、室温（ＲＴ）まで冷却し、次に、６０μｌの“アッパー（ｕｐｐｅｒ）”カクテル（ｄＨ２Ｏ、３．３ｘ  ＸＬ−緩衝液、ｒＴｔｈおよび鋳型）を加えた。ＰＣＲ増幅は、ＰＥＲＫＩＮ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ９６００熱サイクラー中で実施した。熱サイクルのための典型的プログラムには以下のサイクルが含まれていた：９４℃で１分、続いて３０サイクルの増幅（９４℃で０．５分、６０℃で０．５分、７２℃で２分）、続いて６０℃で６分。ＰＣＲ産物に３’Ａ−オーバーハングを作製するため（“テーリング（ｔａｉｌｉｎｇ）”）、１μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバット，ＣＡ）をＰＣＲ増幅の終了時点で加え、チューブを７２℃で１０分インキュベートした。反応混合物はＴＡＥ緩衝液（５）で調製した１％アガロースゲルで分析した。ＰＣＲ生成物は典型的には、ＱＩＡｑｕｉｃｋスパムカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して試製した。
【０２２１】
ライゲーションおよび形質転換
ＰＣＲ  ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へのすべてのＰＣＲ生成物のライゲーションおよびＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０Ｆ受容細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へのライゲートした生成物の形質転換は製造業者の説明書に従って行った。昆虫に対してスクリーニングされるべき形質転換体は、５０μｇアンピシリン／ｍｌを含んでいるＬＢブロス中で繁殖させた。挿入物を有するコロニーを煮沸−溶解プラスミドｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ法（５）により、または形質転換された細菌からプラスミドを直接的に増幅する“コロニーＰＣＲ”法（６）により同定した。
【０２２２】
ＤＮＡ配列決定
配列決定のためのＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎアニオン交換プラスミドキット（ＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ  ２０）を使用し、製造業者の説明書により、３７℃で一夜増殖した５ｍｌのＬＢ培養物からＤＮＡを単離した。４つのプライマー（Ｔ７、Ｍ１３リバース、“センス”および“アンチセンス”）が各々のＤＮＡの配列決定のために、典型的には使用された（表６）。ＢｉｇＤｙｅ（商標）終結試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ）かまたはＤＹＥｎａｍｉｃ（登録商標）ＥＴターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ピスカタウェー，ＮＪ）の、色素−ターミネーター配列決定化学を使用した。配列決定反応の準備は、製造業者の推奨に従った。プライマーおよび取り込まれなかったヌクレオチドはＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスパンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，アデルフィア，ＮＪ）を使用して除去した。配列決定反応はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７自動化ＤＮＡシークエンサーで分析した。ＤＮＡ配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ，アンアルボール，ＭＩ）、ＧＣＧグループの配列分析プログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．１，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），マディソン，ＷＩ）およびＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ５．５スートのプログラム（Ｉｎｆｏｎｎａｘ，ベセスダ，ＭＤ）を通して利用可能な機能を使用して組み立ておよび分析した。
【０２２３】
【表６】
2005537465.tif 000016
【０２２４】
本発明のＤｍＧＰＣＲのクローニングおよび配列決定の結果は以下のようである。
ＤｍＧＰＣＲ１
ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ３４６５１に対応するｃＤＮＡに設計されたＰＣＲプライマーが、ショウジョウバエ  ポリＡ＋  ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡからのＰＣＲ生成物を増幅するのに、成功裡に使用できた。得られた生成物をクローン化し、そして配列決定した。実験的に得られた配列は、予測された配列と同一であった。無傷のクローンが得られ、“ＤｍＧＰＣＲ１”と命名した。
【０２２５】
ＤｍＧＰＣＲ２
ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ６７５８５に対応するｃＤＮＡに設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲ生成物を増幅する最初の試みは失敗した。存在しているＣ．エレガンスレセプターおよび他の神経ペプチドレセプターとの予測される配列の並列は、予測される配列の５’末端が異常に長いことを示しており、そしてその面での遺伝子予測に誤りがあったことを示唆した。ガイドとしてゲノム配列を使用し、多様な代替５’ＰＣＲプライマーを設計し、そして検討した。全ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを使用する、これらのプライマーの一つが、正しいサイズの生成物を与えることに成功した。ＰＣＲ反応から誘導されたクローンの配列決定は、増幅された生成物が予測された５’および３’末端を含んでおり、そして、予測された配列では６アミノ酸の小さな伸長が失われていることを除いて、予測された配列と同一であった。クローンの比較はまた、二つのスプライシングアイソフォームが存在することを明らかにし、一つは予測された配列と類似しており（“ＤｍＧＰＣＲ２ａ”と命名した）、そして他方は、分子の細胞内Ｃ末端内へＴＭ  ＶＩＩを過ぎた直後に位置している２３アミノ酸の伸長が失われていた（“ＤｍＧＰＣＲ２ｂ”と命名した）。
【０２２６】
ＤｍＧＰＣＲ３
ＤｍＧＰＣＲ３予測タンパク質に対応する遺伝子はすでに文献に報告されている。この遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｍ７７１６８）は、ＮＫＤ、“発生的に制御されたタキキニンレセプター”として記述されている。Ｍｏｍｉｅｒ  Ｄ，ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７（２），１２９８−３０２。Ｍ７７１６８およびＰｎｕＦｌｙＰｅｐ６８５０５配列の比較は、予測された配列がｃＤＮＡとは著しく異なっていたことを示した。ｃＤＮＡはより長い５’末端を有し、５１アミノ酸をコードしているエキソンが失われており、そして３’末端が著しくより短かった。ＰＣＲプライマーは公開された配列から設計し、そしてＰＣＲ生成物は、全ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを使用して得られた。この生成物は報告されているＮＫＤ配列と構造が同一であった。
【０２２７】
ＤｍＧＰＣＲ４
ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ６７３９３に対応するｃＤＮＡを、ＤｍＧＰＣＲ４の増幅のためのＰＣＲプライマーを設計するために使用した。全ショウジョウバエｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリーを使用して、ＰＣＲ生成物を得、そしてクローン化した。ＰｎｕＦｌｙＰｅｐにより予測された配列とクローンの比較は、ＨＭＭＧｅｎｅにより予測された一つのエキソンがクローン化ＰＣＲ生成物のいずれにも存在しないことを除いて、配列は同一であったことを明らかにした。ＤｍＧＰＣＲ４は最近、Ｌｅｎｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２０００，２７３，５７１−５７７、によりクローン化されており、第二の推定アラトスタチンレセプターに分類されている。
【０２２８】
ＤｍＧＰＣＲ５
ＤｍＧＰＣＲ（ＦｌｙＰｅｐＣＧ７８８７）は不正確に、フレームシフト突然変異を含んでいる。ＰｎｕＦｌｙＰｅｐバージョン、‘タキキニン関連ペプチドのためのショウジョウバエレセプター’（Ｍ７７１６８）（Ｌｉ  ＸＪ，ら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９１，１０（１１），３２２１−３２２９）として文献に記載されているＰｎｕＦｌｙＰｅｐ６７５２２はその誤りを正しているが、いくつかの内部内列およびＣ末端を不正確に予測している。第一の様相において、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐタンパク質に対応して予測されたｃＤＮＡは公開された配列と同一であった。ＰＣＲプライマーは、キイロショウジョウバエ  ポリＡ＋  ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ混合物から、適切なサイズのＰＣＲ生成物を成功裡に増幅した。クローン化ＰＣＲ生成物の配列決定は、全体のスプライシングパターンは同一であったが、二つの配列決定エラーがＰｎｕＦｌｙＰｅｐ配列中に存在したことを明らかにした。これらのエラーはフレームシフト突然変異を生じ、代償的なフレームシフト突然変異が続き、実験的に決定されたおよび報告された配列間に、４６位のアミノ酸から始まる１３アミノ酸の相違を生じる。このクローンは‘ＤｍＧＰＣＲ５ａ’と命名された。
【０２２９】
加えて、ＤｍＧＰＣＲ５に対してスプライシングアイソフォームを観察した。この変異体は、Ｎ末端細胞外ドメインに余分な三つのアミノ酸をコードしていた。
ＤｍＧＰＣＲ６
ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１に対応するＧＰＣＲはすでに文献に‘神経ペプチドＹ’レセプター（Ｍ８１４９０、Ｌｉ  ＸＪ，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７（１），９−１２）として記載されている。ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ予測配列は、分子の両端でＭ８１４９０とは異なっていた。ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１は、Ｍ８１４９０と比較して、Ｎ末端に余分な１５アミノ酸を含んでいた。ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１の３’末端もまたＭ８１４９０とは異なっており、切り詰められておりそして保存ＴＭ  ＶＩおよびＴＭ  ＶＩＩ残基が含まれていなかった。
【０２３０】
最初のＰＣＲプライマーはＭ８１４９０の配列を使用して設計した。これらのプライマーおよび全ｍＲＮＡから誘導した鋳型を使用し、ＰＣＲ生成物が得られた。クローン化ＰＣＲ生成物の検討は、それがＭ８１４９０と同一のプロセッシングパターンを使用したことを明らかにした。このクローンは‘ＤｍＧＰＣＲ６ａ’と命名された。
【０２３１】
ＤｍＧＰＣＲ６ａのクローニングの間、追加のスプライシングアイソフォームを発見した。このアイソフォームは代替スプライスアクセプター部位の使用により発生され、多くの‘６ａ’形と同一配列を、しかし異なった読み取り枠を使用して、代わりになる分子の３’末端を発生させる。そのうえ、このクローンのオープンリーディングフレームは、本来の３’ＰＣＲプライマーを越えて広がっていた。３’末端のゲノム配列の検討は、多数の候補エキソンの可能性を明らかにした。多数のこれらの可能なエキソンに対応するＰＣＲプライマーを、ＰＣＲ生成物を増幅するであろう一つを発見するまで検討した。この生成物は‘６ｂ’と命名した。ゲノム配列の検討はまた、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１により予測されたイニシエーターＡＴＧはインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）の、余分の１５アミノ酸を含んでいるＭ８１４９０開始コドンを有すること、そしてＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１開始コドンが標準開始コドンであるらしいことを予測した。ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ１５７３１開始コドンを取り込んだ新規５’ＰＣＲプライマーを設計し、‘ＤｍＧＰＣＲ６ａＬ’および‘ＤｍＧＰＣＲ６ｂＬ’（‘ロング（ｌｏｎｇ）’）を増幅およびクローン化するために、二つの３’ＰＣＲプライマーと共に使用した。
【０２３２】
ＤｍＧＰＣＲ７
ＤｍＧＰＣＲ７遺伝子産物を増幅する最初の試みは成功しなかった。予想された配列（ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ６７８６３）と他のＧＰＣＲのアラインメントは、エラーが多分分子の３’末端の予測にあることを示唆した。予想された配列は、ほとんどの他のＧＰＣＲよりもかなり長い３’末端を有していた。ゲノム配列の検討は、適切なサイズの分子を生じたであろうインフレーム停止コドンを除去するスプライシングの予測にエラーの可能性があることを示唆した。３’ＰＣＲプライマーをイントロン内に設計した。そのうえ、予測開始コドンのすぐ上流のインフレームＡＴＧを利用するように、新規５’ＰＣＲプライマーを設計した。全ｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅は、期待されたサイズの生成物を生じた。
【０２３３】
ＤｍＧＰＣＲ７のＰｎｕＦｌｙＰｅｐおよびＷＯ  ０１／７０９８０バージョンは、両方ともＮ末端の二つのアミノ酸を失っている。前に指摘したように、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐおよびＦｌｙＰｅｐ  ＣＧ１０６２６バージョンはまたＣ末端が不適正であった。ＤｍＧＰＣＲ７遺伝子産物の不適正バージョンは推定ショウジョウバエロイコキニンレセプターであると予想された（例えば、Ｈｅｗｅｓ  ＆  Ｔａｇｈｅｒｔ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２００１，１１，１１２６−１１４２；Ｈｏｌｍｅｓら，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０００，９，４５７−４６５）；しかしながら、本発明に先だっては、この予測を確認した実験的証拠は存在しない。
【０２３４】
ＤｍＧＰＣＲ８
ＤｍＧＰＣＲ８は、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ予測配列に対して設計されたＰＣＲプライマーを使用して成功裡に増幅した。ポリＡ＋  ＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として使用した。配列決定した六つすべてが、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ予測配列と構造が同一であった。多型が＃６８位（ＤＮＡ配列）で注目され、クローンの半分がこの位置に“Ｃ”を、そして半分が“Ａ”を有していた。この変化は、アミノ酸変化、各々ＡｓｐまたはＧｌｕ、を生じた。Ｃｅｌｅｒａ配列は“Ａ”を示している、それゆえさらなる研究には、“Ａ”クローン（Ｇｌｕ）を任意に選んだ。正しい配向で得られた“Ａ”クローンはなく、それゆえサブクローニング工程は、本来のｐＣＲ３．１クローンから挿入物を除去するためにＰｍｅＩを利用し、配向を逆にするためにＰｍｅＩ消化ｐＣＲ３．１ベクターを使用した。
【０２３５】
ＰｎｕＦｌｙＰｅｐバージョンは正しい。ＷＯ  ０１／７０９８０バージョンは、しかしながら、約１７のＮ末端アミノ酸および約１５の内部アミノ酸が失われている。このレセプターは推定ソマトスタチン様レセプターとして分類した（例えば、Ｈｅｗｅｓ  ＆  Ｔａｇｈｅｒｔ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２００１，１１，１１２６−１１４２）。本発明に先だっては、この予測を確認した実験的証拠は存在しない。
【０２３６】
ＤｍＧＰＣＲ９
ＤｍＧＰＣＲ９はＰｎｕＦｌｙＰｅｐ予測配列に対して設計されたＰＣＲプライマー、およびポリＡ＋  ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ鋳型を使用してクローン化した。ゲノム構造は、ＰｎｕＦｌｙＰｅｐで正しく予測されていた。
【０２３７】
ＤｍＧＰＣＲ１０
ＤｍＧＰＣＲ１０（ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ７０３２５）のために設計されたプライマーでＰＣＲ生成物を発生させる最初の試みは成功しなかった。予想されたｃＤＮＡの検討は、予想された配列が、高度に保存されたＴＭ  ＶＩ中の“ＷＸＰ”モチーフもＴＭ  ＶＩＩ中の“ＮＰＸＸＦ”モチーフも含んでいない（いくつかの他の保存残基は存在していたが）点において異常であることを示した。最後のエキソンの下流８０ｋｂまでのゲノム配列は、どんな他の潜在的エキソンも示さなかった。ＤｍＧＰＣＲ１０のための無傷のクローンを得るための試みには着手しなかった。
【０２３８】
ＤｍＧＰＣＲ１１（アラトスタチン様ペプチドレセプター）
‘アラトスタチン様ペプチドレセプター’のためのＰＣＲ反応プライマーは、公開されている配列を使用して設計した。Ｂｉｒｇｕｌら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９，１８（２１），５８９２−５９００。ＰＣＲ生成物は、全ｍＲＮＡ調製試料から誘導されたｃＤＮＡを使用して得、そしてクローン化および配列決定した。最終ｃＤＮＡは、報告に記載されているものと同一のタンパク質をコードしていた。
【０２３９】
実施例３：ノーザンブロット分析
ノーザンブロットはＲＮＡの発現を検討するために実施することができる。前記のセンス配向オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス配向オリゴヌクレオチドを、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から成る群より選択されるヌクレオチド配列のＧＰＣＲ  ｃＤＮＡ配列の部分を増幅するためのプライマーとして使用する。
【０２４０】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｈｕｍａｎ  ＩＩ  ＃７７６７−１）からの複数のヒト組織ノーザンブロットをプローブとハイブリダイズする。前ハイブリダイゼーションは、５ＸＳＳＣ、１ｘ  デンハート試薬、０．１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２５０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、４２℃で４時間実施する。ハイブリダイゼーションは、約１．５ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌの標識プローブを添加した同一混合物中、４２℃で一夜実施する。
【０２４１】
プローブは、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりα−３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いて標識し、Ｎｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製し、ハイブリダイゼーション溶液へ加える。フィルターは、０．２ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、４２℃で数回洗浄する。フィルターをＫｏｄａｋ  ＸＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ロチェスター，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）に暴露し、−８０℃でスクリーンを増感させる。
【０２４２】
実施例４：真核動物細胞におけるＤｍＧＰＣＲの組換え発現
哺乳動物細胞におけるＤｍＧＰＣＲの発現
ＤｍＧＰＣＲタンパク質を産生するため、ＤｍＧＰＣＲコードポリヌクレオチドを、適した発現ベクターおよび標準遺伝子工学技術を使用して、適した宿主細胞で発現する。例えば、実施例１に記載したＤｍＧＰＣＲコード配列を市販の発現ベクターｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，サンディエゴ，ＣＡ）内へサブクローン化し、トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ  ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品に挿入して提供されたトランスフェクションプロトコールを使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内へトランスフェクトする。例えば、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）およびＣＯＳ細胞を含む、他の真核生物細胞株も同様に適している。安定的にＤｍＧＰＣＲを発現している細胞を、１００μｇ／ｍｌゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ラジョラ，ＣＡ）存在下で増殖させることにより選択する。所望により、ＤｍＧＰＣＲは標準クロマトグラフィー技術を使用して、細胞から精製することができる。精製を容易にするため、ＤｍＧＰＣＲアミノ酸配列の一部に対応する一つまたはそれより多くの合成ペプチド配列に対する抗血清を上昇させ、ＤｍＧＰＣＲを親和性で精製するために、前記抗血清を使用する。ＤｍＧＰＣＲはまた、タグ配列（例えば、ポリヒスチジン、ヘマグルチニン、ＦＬＡＧ）とともにインフレームで発現することができる。さらに、以下に記載されるアッセイのごとく、ＤｍＧＰＣＲポリペプチドの使用の多くは、宿主細胞からの精製を必要としないことが認められるであろう。
【０２４３】
２９３細胞におけるＤｍＧＰＣＲの発現
２９３細胞におけるＤｍＧＰＣＲの発現のため、ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、関連ＤｍＧＰＣＲコード配列を運んでいるプラスミドを調製する。ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａは、分泌のためのマウスＩｇＫ鎖リーダー配列、抗ｍｙｃ抗体による組換えタンパク質の検出のためのｃ−ｍｙｃエピトープ、ニッケルキレートクロマトグラフィーによる精製のためのＣ末端ポリヒスチジン、および安定なトランスフェクト体の選択のためのゼオシン耐性遺伝子を含んでいる。このＧＰＣＲ  ｃＤＮＡの増幅のためのフォワードプライマーは、日常的な方法により決定し、好ましくは、ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を導入するためのヌクレオチドの５’伸長およびＧＰＣＲ配列をマッチングするためのヌクレオチドを含んでいる。リバースプライマーも、日常的な方法により決定し、好ましくは、クローニングのためにＸｈｏＩ制限部位を導入するためのヌクレオチドの５’伸長、およびＤｍＧＰＣＲ配列の逆相補体に対応するヌクレオチドを含んでいる。ＰＣＲ条件は、アニーリング温度として５５℃である。ＰＣＲ生成物はゲル精製し、ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ部位内へクローン化する。
【０２４４】
ＤＮＡはＱｉａｇｅｎクロマトグラフィーカラムを使用して精製し、そして、ＤＯＴＡＰトランスフェクション培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，インディアナポリス，ＩＮ）を使用して、２９３細胞内へトランスフェクトする。一時的にトランスフェクトされた細胞を、抗Ｈｉｓおよび抗ＤｍＧＰＣＲペプチド抗体で探索したウェスタンブロットを使用して、トランスフェクション２４時間後の発現で試験する。恒久的にトランスフェクトされた細胞をゼオシンで選択し、繁殖させる。組換え体タンパク質の産生が、抗Ｈｉｓ、抗Ｍｙｃまたは抗ＧＰＣＲペプチドで探索したウェスタンブロットにより、細胞および培地の両方で検出される。
【０２４５】
ＣＯＳ細胞におけるＤｍＧＰＣＲの発現
ＣＯＳ７細胞におけるＤｍＧＰＣＲの発現のため、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチド分子を、ベクターＰ３−ＣＩ内へクローン化可能である。このベクターは、ｂＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化配列から上流に位置しているＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）プロモーター−イントロン、並びに複数のクローニング部位を含んでいる、ｐＵＣ１８由来プラスミドである。加えて、プラスミドは、安定な形質転換体の選択のために、薬剤メトトレキセート（ＭＴＸ）存在下での選択を提供する、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸リダクターゼ）遺伝子を含んでいる。
【０２４６】
フォワードプライマーは、日常的な方法により決定し、好ましくは、クローニングのためのＸｂａＩ制限部位を導入する５’伸長を含んでおり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から成る群より選択されるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドが続いている。リバースプライマーも、日常的な方法により決定し、そして好ましくは、ＳａｌＩクローニング部位を導入するためのヌクレオチドの５’伸長を含んでおり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から成る群より選択されるヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドが続いている。
【０２４７】
ＰＣＲ反応は９５℃で５分の最初の変性工程、次いで、９５℃で３０秒の変性、５８℃で３０秒のアニーリング、および７２℃で３０秒の伸長の３０サイクル、続いての７２℃で５分の伸長、から成っている。ＰＣＲ生成物はゲル精製し、ベクターＰ３−ＣＩのＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位内へライゲートする。増幅およびＤＮＡ精製のため、この構築物を大腸菌に形質転換する。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎクロマトグラフィーカラムで精製し、ＢＲＬからのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を使用し、製造業者のプロトコールに従ってＣＯＳ細胞内へトランスフェクトする。トランスフェクションして４８および７２時間後、組換え体タンパク質発現について、培地および細胞を試験する。
【０２４８】
ＣＯＳ細胞培養により発現されたＤｍＧＰＣＲは、約１０ｍｇタンパク質／ｍｌまで細胞増殖培地を濃縮し、そして例えば、クロマトグラフィーによりタンパク質を精製する。精製されたＤｍＧＰＣＲは、ＹＭ−１０メンブランを取り付けたＡｍｉｃｏｎ濃縮器で、０．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、−８０℃で保存する。
【０２４９】
昆虫細胞におけるＤｍＧＰＣＲの発現
バキュロウイルス系におけるＤｍＧＰＣＲの発現のため、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチド分子が、ＰＣＲにより増幅可能である。フォワードプライマーは、日常的な方法により決定し、好ましくは、ＮｄｅＩクローニング部位を付加する５’伸長を含んでおり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から成る群より選択されるヌクレオチド配列に対応するヌクレオチドが続いている。リバースプライマーも、日常的な方法により決定し、そして好ましくは、ＫｐｎＩクローニング部位を導入する５’伸長を含んでおり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から成る群より選択されるヌクレオチド配列の逆相補体に対応するヌクレオチドが続いている。
【０２５０】
ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで消化し、そしてベクターｐＡｃＨＴＬ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，サンディエゴ，ＣＡ）の対応する部位内へクローン化する。ｐＡｃＨＴＬ発現ベクターはオートグラファ  カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力な多核体プロモーター、および複数のクローニング部位から上流の６ＸＨｉｓタグを含んでいる。複数のクローニング部位に先行する、リン酸化のためのプロテインキナーゼ部位および組換え体タンパク質の切り出しのためのトロンビン部位もまた存在する。もちろん、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭ１のごとき、多くの他のバキュロウイルスベクターをｐＡｃＨＴＬ−Ａの代わりに使用することができる。必要とされる、インフレームＡＵＧおよびシグナルペプチドのごとき、転写、翻訳および輸送のための適切に位置されたシグナルをベクター構築物が含んでいる限り、ＧＰＣＲポリペプチドの発現のための他の適したベクターを使用することが可能である。こうしたベクターは、なかでも、Ｌｕｃｋｏｗら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９、に記載されている。
【０２５１】
Ｓｕｍｍｅｒｓら（Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ番号１５５５（１９８７））により記載されているような、標準バキュロウイルス発現法を使用して、ウイルスを増殖させ、そして単離する。
【０２５２】
一つの態様において、ＤｍＧＰＣＲ遺伝子を含んでいるｐＡｃＨＬＴ−Ａを、“ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ”トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，サンディエゴ，ＣＡ）を使用し、製造者により確立された方法を使用して、バキュロウイルス内へ導入する。個々のウイルス単離物を、感染２４時間後に３５Ｓ−メチオニンを用いて感染細胞を放射標識することにより、タンパク質産生について分析した。感染細胞は感染４８時間後に採取し、標識されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化する。高発現レベルを示しているウイルスを単離することが可能であり、そして規模を大きくした発現のために使用する。
【０２５３】
Ｓｆ９細胞におけるＤｍＧＰＣＲポリペプチドの発現のためには、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から成る群より選択されるヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチド分子は、バキュロウイルス発現のための前に記載したプライマーおよび方法を使用したＰＣＲにより増幅することが可能である。Ｓｆ９昆虫細胞中での発現のため、ＤｍＧＰＣＲ  ｃＤＮＡをｐＡｃＨＬＴ−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）内へクローン化する。挿入物は、内部ＮｄｅＩの除去後（バキュロウイルスでの発現のために前に記載したものと同一のプライマーを使用して）、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ部位内へクローン化する。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎクロマトグラフィーカラムで精製し、そしてＳｆ９細胞で発現させる。非精製プラークでの予備的ウェスタンブロット実験で、ＧＰＣＲ特異的抗体と反応する、期待されるサイズの組換えタンパク質の存在を試験する。これらの結果は、さらなる精製およびＨｉＧ５細胞で最適化された発現後に確認する。
【０２５４】
実施例５：相互作用捕捉／ツーハイブリッドシステム
ＤｍＧＰＣＲと相互作用しているタンパク質をアッセイするため、相互作用捕捉／ツーハイブリッドスクリーニング法を使用することが可能である。このアッセイは最初に、その全体が本明細書において援用される、Ｆｉｅｌｄｓら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４０，２４５、により記載されている。プロトコールは、その全体が本明細書において援用される、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９９、およびＡｕｓｕｂｅｌら，ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，第４版，Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９２、に発表されている。キットはＣｌｏｎｔｅｃｈ，パロアルト，ＣＡ（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３）から入手可能である。
【０２５５】
すべてまたは一部のＤｍＧＰＣＲおよび酵母転写因子ＧＡＬ４  ＤＮＡ−結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）をコードしているヌクレオチド配列の融合物を、標準サブクローニング技術を使用して、適切なプラスミド（即ち、ｐＧＢＫＴ７）に構築する。同様に、ＧＡＬ４活性ドメイン（ＡＤ）融合ライブラリーを、潜在的ＧＰＣＲ結合タンパク質のｃＤＮＡからの第二のプラスミド（即ち、ｐＧＡＤＴ７）中に構築する（ｃＤＮＡライブラリーを形成するプロトコールについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，ＮＹ，１９８９、その全体が本明細書において援用される、を参照されたい）。ＤＮＡ−ＢＤ／ＧＰＣＲ融合体構築物を配列決定により確認し、そしてその両方がツーハイブリッド分析の成功を妨げるであろう、自律性レポーター遺伝子活性化および細胞毒性を試験する。宿主細胞での発現および転写活性の欠如を確かにするため、同様な対照をＡＤ／ライブラリー融合構築物で実施する。標準法（Ａｕｓｕｂｅｌら，ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，第４版，Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９２、その全体が本明細書において援用される）に従って、酵母細胞を、ＧＰＣＲおよびライブラリー融合プラスミドの両方で形質転換する（約１０５形質転換体／ｍｇＤＮＡ）。ＤＮＡ−ＢＤ／ＧＰＣＲとＡＤ／ライブラリータンパク質のインビボ結合は、特異的酵母プラスミドレポーター遺伝子（即ち、ｌａｃＺ、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＬＥＵ２）の転写を生じる。レポーター遺伝子の発現をスクリーニングするため、酵母細胞を栄養欠損培地に置く。コロニーは、Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を補給した培地中での増殖させ、β−ガラクトシダーゼ活性を二重にアッセイする（β−ガラクトシダーゼ活性のためのフィルターアッセイは、その全体が本明細書において援用されるＢｒｅｅｄｅｎら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒＢ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｙａｔ．Ｂｉｏｌ．，１９８５，５０，６４３、に記載されている）。特異的ＤｍＧＰＣＲ／ライブラリータンパク質相互作用を確認するため、形質転換体から陽性ＡＤ−ライブラリープラスミドを救いだし、本来の酵母株ならびに非関連ＤＮＡ−ＢＤ融合タンパク質を含んでいる他の株内へ再導入する。ＧＡＬ４  ＡＤへ融合されたオープンリーディングフレームの存在を検証するため、およびＤｍＧＰＣＲ結合タンパク質の同一性を決定するため、挿入ＤＮＡを配列決定する。
【０２５６】
実施例６：ゲル電気泳動を使用する移動度シフトＤＮＡ結合アッセイ
ゲル電気泳動移動度シフトアッセイは、特異的タンパク質−ＤＮＡ相互作用を迅速に検出できる。プロトコールは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，ＮＹ，１９８９，およびＡｕｓｕｂｅｌら，ＳＨＯＲＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，第４版，Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９２、どちらもその全体が本明細書において援用される、のごときマニュアルで広く利用可能である。
【０２５７】
プローブＤＮＡ（＜３００ｂｐ）は、合成オリゴヌクレオチド、制限エンドヌクレアーゼ断片またはＰＣＲ断片から得られ、そして３２Ｐで末端標識されている。精製ＤｍＧＰＣＲの一部（約１５μｇ）または粗ＤｍＧＰＣＲ抽出物（約１５ｎｇ）を、放射性標識プローブＤＮＡ、非特異的坦体ＤＮＡ（約１μｇ）、ＢＳＡ（３００μｇ／ｍｌ）および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含んでいる１０−１５μｌの緩衝液（即ち、ＴＡＥまたはＴＢＥ、ｐＨ８．０−８．５）中で、一定温度（２２−３７℃の範囲の）で少なくとも３０分インキュベートする。反応混合物は次ぎにポリアクリルアミドゲルに負荷し、タンパク質−ＤＮＡ複合体から遊離のプローブＤＮＡの良好な分離が起こるまで、３０−３５ｍＡで走らせる。ゲルは次ぎに乾燥し、遊離ＤＮＡおよびタンパク質−ＤＮＡ複合体に対応するバンドをオートラジオグラフィーにより検出する。
【０２５８】
実施例７：ＤｍＧＰＣＲに対する抗体
ＤｍＧＰＣＲに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を発生させるため、そしてその有用な抗原結合断片、または“ヒト化”変異体を含むその変異体を発生させるために、標準技術を用いる。こうしたプロトコールは例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９），上記文献，およびＨａｒｌｏｗら（編），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，，コールドスプリングハーバー，ＮＹ，１９８８、に見ることができる。一つの態様において、組換えＤｍＧＰＣＲポリペプチド（またはこうしたポリペプチドを含んでいる細胞または細胞膜）を、抗体を発生させるための抗原として使用する。別の態様において、ＤｍＧＰＣＲの免疫原性部分に対応するアミノ酸配列を有する一つまたはそれより多くのペプチド（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多いアミノ酸）を抗原として使用する。ＤｍＧＰＣＲの細胞外部分に対応するペプチド、特に親水性細胞外部分が本発明に含まれている。抗原は、抗原産生を増加させるため、アジュバントと混合、またはハプテンへ連結することができる。
【０２５９】
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体
プロトコールの一つの例として、組換えＤｍＧＰＣＲまたはその合成断片を、モノクローナル抗体の発生にためにマウスを免疫するのに使用する（またはウサギのごときより大きな哺乳動物、ポリクローナル抗体のため）。免疫原性を増加させるため、ペプチドを、製造業者の推奨に従ってキーホールリンペット（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｙｍｐｅｔ）ヘモシアニン（Ｐｉｅｒｃｅ）とコンジュゲートする。最初の注射のためには、抗原をフロイント完全アジュバントで乳化し、そして皮下に注射する。２から３週間の間隔で、追加のＤｍＧＰＣＲ抗原の一部をフロイント不完全アジュバントで乳化し、そして皮下に注射する。最終追加免疫注射に先立って、ＤｍＧＰＣＲと免疫反応する抗体の存在を確認するため、免疫化マウスから血清試料を採取し、ウェスタンブロットによりアッセイする。免疫化動物からの血清は、ポリクローナル抗血清として使用することができ、またはＤｍＧＰＣＲを認識するポリクローナル抗体を単離するために使用することができる。あるいは、モノクローナル抗体の発生のため、マウスを殺しそしてその脾臓を除去する。
【０２６０】
モノクローナル抗体を発生させるには、脾臓を１０ｍｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０中に置き、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給した無血清ＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ，カナダ）中で脾臓を磨りつぶすことにより、単一細胞懸濁液を形成する。細胞懸濁液を濾過し、遠心分離により洗浄し、そして無血清ＲＰＭＩに再懸濁する。３匹の天然のＢａｌｂ／ｃマウスからとりだした胸腺細胞を同様の様式で調製し、そしてフィーダー層として使用する。融合に先立って３日間、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ローガン，ユタ）を含むＲＰＭＩ中で対数増殖期に維持したＮＳ−１骨髄腫細胞を遠心分離し、そして同様に洗浄する。
【０２６１】
ハイブリドーマ融合物を産生するため、免疫化マウスからの脾臓細胞をＮＳ−１細胞と混合し、そして遠心分離し、そして上清を吸引する。細胞ペレットは、チューブで捕捉することにより移動させ、そして２ｍｌの３７℃ＰＥＧ１５００（５０％  ７５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中、ｐＨ８．０）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）でペレットをかき混ぜ、続いて無血清ＲＰＭＩを添加する。その後、細胞を遠心分離し、１５％ＦＢＳ、１００μＭヒポキサンチンナトリウム、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭチミジン（ＨＡＴ）（Ｇｉｂｃｏ）、２５単位／ｍｌ  ＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１．５ｘ１０６胸腺細胞／ｍｌを含んでいるＲＰＭＩに再懸濁し、１０のＣｏｒｎｉｎｇ平底９６−ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，コーニング，ニューヨーク）に蒔いた。
【０２６２】
融合後２、４および６日に、１００μｌの培地を融合プレートのウェルから除き、新鮮培地に置き換える。８日目、ＤｍＧＰＣＲへ結合するマウスＩｇＧの存在を試験するＥＬＩＳＡにより融合をスクリーニングする。選択された融合ウェルは、抗ＤｍＧＰＣＲ抗体を産生するモノクローナル培養物が得られるまで希釈することにより、さらにクローン化する。
【０２６３】
抗ＤｍＧＰＣＲモノクローナル抗体のヒト化
本明細書に報告されたようなＤｍＧＰＣＲの発現パターン、および治療的介入のための標的としてのＧＰＣＲの証明された追跡記録は、ＤｍＧＰＣＲ抑制剤（アンタゴニスト）に対する治療的指示を示唆している。ＤｍＧＰＣＲ中和抗体は、ＤｍＧＰＣＲアンタゴニストとして有用な、治療剤の一つのクラスを含んでなる。以下は、本発明のモノクローナル抗体をヒト化するためのプロトコールである。
【０２６４】
ヒト化の原理は文献に記載されており、そして抗体タンパク質のモジュラー（ｍｏｄｕｌａｒ）配列により促進される。結合補体の可能性を最少にするため、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト化抗体を使用することができる。
【０２６５】
例えば、ヒト化のレベルは、ヒト抗体分子の定常ドメインを有する、目的の非ヒト抗体タンパク質の可変ドメインを含んでなるキメラ抗体を発生させることにより達成される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８９，４４，６５−９２、を参照されたい）。ＤｍＧＰＣＲ中和抗ＤｍＧＰＣＲ抗体の可変ドメインは、Ｂ細胞ハイブリドーマのゲノムＤＮＡから、または目的のハイブリドーマから単離されたｍＲＮＡからクローン化する。Ｖ領域遺伝子断片をヒト抗体定常ドメインをコードしているエキソンへ連結し、そして生じた構築物を適した哺乳動物宿主細胞（例えば、骨髄腫またはＣＨＯ細胞）で発現させる。
【０２６６】
さらにより高いレベルのヒト化を達成するには、非ヒトモノクローナル抗体遺伝子の抗原結合相補性決定領域（“ＣＤＲ”）をコードする可変領域遺伝子の部分のみを、ヒト抗体配列内へクローン化する。（例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１，５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２，３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９，１５３４−３６；およびＴｅｍｐｅｓｔら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，９，２６６−７１、を参照されたい）。必要に応じ、ＣＤＲ３領域を取り囲んでいる、ヒト抗体のβシートフレームワークをまた、本来のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインの３次元構造をより密接に反映するように修飾する。（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎ．，１９９１，４，７７３−７８３；おおびＦｏｏｔｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２２４，４８７−４９９、を参照されたい）。
【０２６７】
代わりのアプローチにおいて、非ヒト抗体の内部および接触残基のすべてを保持する一方、非ヒト抗体の選択された表面残基を改変することにより（例えば、部位特異的突然変異誘発により）、目的の非ヒトモノクローナル抗体の表面がヒト化される。Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９１，２８（４／５），４８９−９８、を参照されたい。
【０２６８】
ＤｍＧＰＣＲ発現またはリガンド仲介ＤｍＧＰＣＲシグナル伝達が有害である状態を、処置するまたは和らげるための治療薬として有用なヒト化ＤｍＧＰＣＲ中和抗体を作成するため、ＤｍＧＰＣＲ中和抗ＤｍＧＰＣＲモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマを使用し、前記のアプローチを用いる。
【０２６９】
実施例８：ＤｍＧＰＣＲ活性の変調剤を同定するアッセイ
以下に示したのは、ＤｍＧＰＣＲ活性の変調剤（アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定するためのいくつかの非制限的アッセイである。これらのアッセイにより同定可能である変調剤は、レセプターの天然のリガンド化合物；天然のリガンドの合成類似体および誘導体；天然の抗体からまたは抗体様コンビナトリアルライブラリーから誘導された抗体、抗体断片および／または抗体様化合物；および／またはライブラリーの高スループットスクリーニングにより同定された合成化合物；などである。ＤｍＧＰＣＲを結合するすべての変調剤が、組織試料においてＤｍＧＰＣＲを同定するために有用である（例えば、診断目的、病理学的目的などのために）。アゴニストおよびアンタゴニスト変調剤は、ＤｍＧＰＣＲ活性の異常なレベルにより特徴付けられる疾患状態を処置するため、各々、ＤｍＧＰＣＲ活性を上方調節および下方調節することに対して有用である。アッセイは単一の推定変調剤を使用して実施することができ、および／または候補アンタゴニストと組み合わせて既知のアゴニストを使用して実施することもできる（またはその逆）。
【０２７０】
ｃＡＭＰアッセイ
アッセイの一つの型において、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）のレベルを、候補変調剤化合物へ暴露されたＤｍＧＰＣＲトランスフェクト細胞中で測定する。ｃＡＭＰアッセイのためのプロトコールは文献に記載されている。（例えば、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９６８，３７，２７９；Ｆｒａｎｄｓｅｎら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９７６，１８，５２９−５４１；Ｄｏｏｌｅｙら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．，１９９７，２８３（２），７３５−４１；およびＧｅｏｒｇｅら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９７，２（４），２３５−４０、を参照されたい）。ＮＥＮ（商標）  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＰｒｏｄｕｃｔｓからのＡｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）  Ａｓｓａｙを使用する、こうしたアッセイのためのプロトコールの例が以下に示されている。
【０２７１】
簡単には、ＤｍＧＰＣＲコード配列（例えば、ｃＤＮＡまたはイントロンのないゲノムＤＮＡ）をｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のごとき市販の発現ベクター内へサブクローン化し、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬が供給されている場合にＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍにより提供されるトランスフェクションプロトコールのごとき、既知の方法を使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を一時的にトランスフェクトする。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、ｃＡＭＰが結合されている固体シンチレーション剤で被覆されている、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）アッセイキットからの９６−ウェルマイクロプレートに蒔く。対照として、いくつかのウェルに野生型（トランスフェクトされていない）ＣＨＯ細胞を蒔く。プレートの他のウェルには、検量線の作製に使用するために、いろいろな量のｃＡＭＰ標準溶液を加える。
【０２７２】
一つまたはそれより多くの試験化合物（即ち、候補変調剤）を各々のウェルの細胞に加え、水および／または化合物を含んでいない培地／希釈液が対照として働く。処理後、室温で正確に１５分間、茶房にｃＡＭＰを蓄積させる。［１２５Ｉ］−標識ｃＡＭＰを含んでいる溶解緩衝液の添加によりアッセイを終結させ、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）９６−ウェルマイクロプレートシンチレーションカウンターを使用して、プレートを計数する。溶解細胞からの（または基準からの）非標識ｃＡＭＰおよび［１２５Ｉ］−ｃＡＭＰの固定された量が、プレートへ結合されている抗体に対して競合する。検量線を構築し、そして同定すべき試料に対するｃＡＭＰ値が内挿により得られる。試験化合物への暴露に応答したｃＡＭＰレベルの変化は、ＤｍＧＰＣＲ変調活性の指標である。Ｇタンパク質のＧｓサブタイプへ共役されたレセプターのアゴニストとして働く変調剤は、ｃＡＭＰの産生を刺激し、ｃＡＭＰレベルの測定可能な３−１０倍の増加を導くであろう。Ｇタンパク質のＧｉ／ｏサブタイプへ共役されたレセプターのアゴニストは、フォルスコリン刺激ｃＡＭＰ産生を抑制し、５０−１００％のｃＡＭＰレベルの測定可能な減少を導くであろう。インバースアゴニストとして働く変調剤は、構成的に活性なまたは既知のアゴニストにより活性化されるレセプターで、これらの効果を逆転させるであろう。
【０２７３】
エクオリンアッセイ
別のアッセイにおいては、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）をＤｍＧＰＣＲ発現構築物および発光タンパク質エクオリンをコードする構築物で一時的に同時トランスフェクトする。補因子セレンテラジン存在下、アポアクオリンは細胞内（細胞質）遊離カルシウムの量に比例している測定可能な発光を放射するであろう。（一般的には、Ｃｏｂｂｏｌｄら，ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＣＡＬＣＩＵＭ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ中、“細胞質遊離カルシウムのエクオリン測定”，ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  Ｊ．Ｇ．およびＣｏｂｂｏｌｄ  Ｐ．Ｈ．，編，Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１；Ｓｔａｂｌｅｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，２５２，１１５−２６；およびＨａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ，第６版，ユージーン，ＯＲ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，１９９６を参照されたい）。
【０２７４】
一つのアッセイの例においては、ＤｍＧＰＣＲを市販の発現ベクターｐｚｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内へサブクローン化し、トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および製品挿入物で提供されるトランスフェクションプロトコールを使用し、タンパク質エクオリンをコードする構築物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ユージーン，ＯＲ）と共にＣＨＯ細胞内へ一時的に同時トランスフェクトする。
【０２７５】
細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，ガイサースバーグ，ＭＤ）中、３７℃で２４時間培養し、その時点で培地を、５μＭセレンテラジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ユージーン，ＯＲ）を含んでいる無血清ＭＥＭへ交換する。次ぎに培養をさらに３７℃で２時間続ける。続いて、ＶＥＲＳＥＮ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用してプレートから細胞を剥離し、洗浄し、そして無血清ＭＥＭ中、２００，０００細胞／ｍｌで再懸濁する。
【０２７６】
候補ＤｍＧＰＣＲ変調剤化合物の希釈液を無血清ＭＥＭで調製し、５０μｌ／ウェルで、不透明な９６−ウェルアッセイプレート内へ分配する。プレートは次ぎに、ＭＬＸマイクロタイタープレート発光計（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｌｍｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，シャンティイ，ＶＡ）上へのせる。装置は、５０μｌの細胞懸濁液を各々のウェル内へ分配し、一度に一つのウェル、そして直ぐに発光を１５秒読み取るようにプログラムされている。候補変調剤の用量応答曲線を、各々の光信号ピークに対する曲線の下部面積を使用して構築する。データは、一部位リガンドに対する方程式を使用して、ＳｌｉｄｅＷｒｉｔｅで分析し、そしてＥＣ５０値を得る。化合物により起こされた発光における変化は、変調活性の指標と考えられる。Ｇタンパク質のＧｓサブタイプへ共役されたレセプターのアゴニストとして働く変調剤は、１００倍までの発光の増加を与える。インバースアゴニストとして働く変調剤は、構成的に活性なまたは既知のアゴニストにより活性化されるレセプターで、これらの効果を逆転させるであろう。
【０２７７】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ
発光タンパク質ルシフェラーゼは、ＤｍＧＰＣＲ活性の変調剤をアッセイするための別の有用な手段を提供する。細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ７細胞）を、ＤｍＧＰＣＲ発現構築物（例えば、ｐｚｅｏＳＶ２中のＤｍＧＰＣＲ）、およびｃＡＭＰ−応答要素（ＣＲＥ）、ＡＰ−１またはＮＦ−カッパＢのごとき転写因子結合部位から下流にルシフェラーゼタンパク質のための遺伝子を含むレポーター構築物で一時的に同時トランスフェクトする。活性の指標と考えられる。Ｇタンパク質のＧｓサブタイプへ共役されたレセプターに結合するアゴニストは、ｃＡＭＰの増加を導き、それによりＣＲＥ転写因子を活性化してルシフェラーゼ遺伝子の発現を生じる。ルシフェラーゼの発現レベルは、シグナル伝達事象の活性化状態を反映している。一般的には、Ｇｅｏｒｇｅら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９７，２（４），２３５−２４０；およびＳｔｒａｔｏｗａら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９５，６，５７４−５８１、を参照されたい。ルシフェラーゼ活性は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（マディソン，ＷＩ）から商業的に入手可能であるルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して定量的に測定することができる。
【０２７８】
一つのアッセイの例では、トランスフェクション１日前に、ＣＨＯ細胞を１００，０００細胞／ウェルの密度で、２４−ウェル培養ディッシュに蒔き、そして１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）中、３７℃で培養する。細胞を、ＤｍＧＰＣＲ発現構築物およびルシフェラーゼ遺伝子を含んでいるレポーター構築物の両方で一時的に同時トランスフェクトする。レポータープラスミドＣＲＥ−ルシフェラーゼ、ＡＰ−１−ルシフェラーゼおよびＮＦ−カッパＢ−ルシフェラーゼはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョラ，ＣＡ）から購入することができる。トランスフェクションは供給元の指導書に従い、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して実施する。レポーター構築物単独でトランスフェクトされた細胞を対照として使用した。トランスフェクション２４時間後、細胞を、前もって３７℃に温めたＰＢＳで一回洗浄する。無血清ＭＥＭを次ぎに単独で（対照）または一つまたはそれより多くの候補変調剤と細胞に加え、そして細胞を３７℃で５時間インキュベートする。その後、細胞を氷冷ＰＢＳで一回洗浄し、そしてＰｒｏｍｅｇａにより供給されたルシフェラーゼアッセイキットからの溶解緩衝液の、ウェル当たり１００μｌの添加により溶解する。室温で１５分のインキュベーション後、１５μｌの溶解物を５０μｌの基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を不透明な、９６−ウェルプレート中で混合し、化学発光を直ちにＷａｌｌａｃｅモデル１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションおよび化学発光カウンター（Ｗａｌｌａｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ガイサースバーグ，ＭＤ）で読み取る。
【０２７９】
候補変調剤化合物存在下対非存在下での化学発光の相違は、変調活性の指標である。構成的に活性なまたはアゴニストにより活性化されたレセプターは、典型的には、レポーター遺伝子単独でトランスフェクトされた細胞と比較して、３−２０倍の化学発光の刺激を与えている。
【０２８０】
ＦＬＩＰＲを使用する細胞内カルシウム測定
細胞内カルシウムレベルの変化は、Ｇタンパク質共役型レセプター活性の、別の認識される指標であり、こうしたアッセイをＤｍＧＰＣＲ活性の変調剤をスクリーニングするために使用することが可能である。例えば、ＤｍＧＰＣＲ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、４ｘ１０４細胞／ウェルの密度で、プレート上の種々のウェルから放射される蛍光信号を区別するために特別に設計されたＰＡＣＫＡＲＤ黒壁、９６−ウェルプレートに蒔いた。細胞は、３６ｍｇ／Ｌ−ピルビン酸および１ｇ／Ｌグルコースおよび四つのカルシウム指示色素（Ｆｌｕｏ−３（商標）ＡＭ、Ｆｌｕｏ−４（商標）ＡＭ、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ−１（商標）ＡＭまたはＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）ＢＡＰＴＡ−１  ＡＭ）の内の一つ（各々４μＭの濃度で）、を含んでいる改良ダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中、３７℃で６０分インキュベートする。プレートを１回改良Ｄ−ＰＢＳで洗浄し、そして細胞膜から残存色素を除去するために３７℃で１０分インキュベートする。加えて、カルシウム応答の活性化の直前に、改良Ｄ−ＰＢＳによる一連の洗浄を実施する。
【０２８１】
カルシウム応答は、一つまたはそれより多くの候補レセプターアゴニスト化合物、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（１０μＭ；陽性対照）またはＡＴＰ（４μＭ；陰性対照）の添加により開始する。蛍光は、アルゴンレーザー（４８８ｎｍで励起）を備えたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅのＦＬＩＰＲにより測定する。（例えば、Ｋｕｎｔｚｗｅｉｌｅｒら，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，１９９８，４４（１），１４−２０、を参照されたい）。検出カメラのＦストップは２．５に設定され、そして暴露時間は０．４ミリ秒であった。細胞の基礎蛍光を候補アゴニスト、ＡＴＰ、Ａ２３１８７の添加２０秒前に測定し、そして基礎蛍光レベルを応答シグナルから差し引いた。カルシウムシグナルは約２００秒、２秒ごとに読み取って測定した。カルシウムイオノフォアＡ２３１８７およびＡＴＰはカルシウムシグナルをベースラインレベルより２００％増加させる。一般に、活性化ＧＰＣＲはカルシウムシグナルをベースラインレベルより１０−１５％増加させる。
【０２８２】
有糸分裂誘発アッセイ
有糸分裂誘発アッセイにおいて、ＤｍＧＰＣＲ仲介細胞分割を誘導するまたは抑制する候補変調剤の能力を決定する。（例えば、Ｌａｊｉｎｅｓｓら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．，１９９３，２６７（３），１５７３−１５８１、を参照されたい）。例えば、ＤｍＧＰＣＲを安定的に発現しているＣＨＯ細胞を５０００細胞／ウェルの密度で、９６−ウェルプレートに蒔き、そして１０％ウシ胎児血清を補給したＭＥＭ中、３７℃で４８時間増殖させ、この時点で細胞を無血清ＭＥＭで２回すすぐ。すすいだ後、８０μｌの新鮮ＭＥＭ、または既知の分裂促進因子を含んでいるＭＥＭを、無血清培地で希釈したいろいろな濃度の一つまたはそれより多くの候補変調剤または試験化合物を含む２０μｌ  ＭＥＭと共に加える。対照として、各々のプレートのいくつかのウェルには無血清培地のみを加え、いくつかは１０％ウシ胎児血清を含んでいる培地を加えた。トランスフェクトされていない細胞またはベクターのみでトランスフェクトされた細胞も対照として働くことができる。
【０２８３】
１６−１８時間培養後、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（２μＣｉ／ミリモル）をウェルに加え、そして細胞を３７℃でさらに２時間インキュベートする。細胞をトリプシン処理しそして細胞ハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ）でフィルターマット上に収集し；フィルターは次ぎにＢｅｔａｐｌａｔｅカウンターで計数する。無血清試験ウェル中の［３Ｈ］−チミジンの取り込みを、血清で刺激した細胞で達成された結果（陽性対照）と比較する。試験化合物の複数の濃度の使用は、非線形の、最小二乗適合方程式：Ａ＝ＢＸ［Ｃ／（Ｄ＋Ｃ）］＋Ｇ、式中Ａは血清刺激のパーセントであり；Ｂは最大効果マイナスベースラインせあり；ＣはＥＣ５０であり；Ｄは化合物の濃度であり；およびＧは最大効果である、を使用する用量−応答曲線の作製および分析を可能にする。パラメーターＢ、ＣおよびＧはシンプレックス最適化により決定する。
【０２８４】
レセプターへ結合するアゴニストは、細胞内への［３Ｈ］−チミジン取り込みを増加させることが期待され、血清への応答の８０％までを示している。レセプターへ結合するアンタゴニストは既知のアゴニストで観察された刺激を１００％まで抑制するであろう。
【０２８５】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイ
Ｇタンパク質共役型レセプターシグナルは細胞内Ｇタンパク質を突き抜け、その活性はＧＴＰ結合そして加水分解して結合されたＧＤＰを得ることを含んでいるので、候補変調剤存在下および非存在下での、非加水分解性ＧＴＰ類似体［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合の測定は、変調剤活性の別のアッセイを提供する。例えば、Ｋｏｗａｌら，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９８，３７，１７９−１８７、を参照されたい。
【０２８６】
アッセイに一つに例において、ＤｍＧＰＣＲ発現ベクターで安定的にトランスフェクトされた細胞を１０ｃｍ組織培養皿でサブコンフルエントまで増殖させ、５ｍｌの氷冷Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないリン酸緩衝化塩溶液で１回洗浄し、そして５ｍｌの同一緩衝液内へこすり落とす。細胞を遠心分離（５００ｘｇ、５分）してペレット化し、ＴＥＥ緩衝液（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ）に再懸濁し、液体窒素で凍結する。融解後、細胞をＤｏｕｎｃｅホモジナイザー（細胞プレート当たり１ｍｌのＴＥＥ）を使用してホモジナイズし、１，０００ｘｇで５分遠心分離して、核および破壊されなかった細胞を除去する。
【０２８７】
ホモジネート上清を、２０，０００ｘｇで２０分遠心分離して、膜分画を単離し、そして膜ペレットをＴＥＥで１回洗浄し、そして結合緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁する。再懸濁した膜は液体窒素で凍結でき、そして使用するまで−７０℃で保存する。
【０２８８】
前記のように調製され、そして−７０℃で保存された細胞膜のアリコートを融解し、ホモジナイズし、そして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μＭ  ＧＤＰおよび０．２ｍＭアスコルビン酸を含んでいる緩衝液で、１０−５０μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。９０μｌの最終容量で、ホモジネートを種々の濃度の候補変調剤化合物または１００μＭ  ＧＴＰと、３０℃で３０分インキュベートし、次ぎに氷上に置いた。各々の試料に、１０μｌのグアノシン  ５’―Ｏ−（３［３５Ｓ］チオ）三リン酸（ＮＥＮ、１２００Ｃｉ／ミリモル；［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ）を１００−２００ｐＭの最終濃度で加えた。試料は３０℃でさらに３０分インキュベートし、１ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を４℃で加え、濾過により反応を停止する。
【０２８９】
試料は、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂフィルターで濾過し、そしてフィルターを２０ｍｌの氷冷１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で洗浄する。フィルターを液体シンチレーション分光法により計数する。［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳの非特異的結合は、１００μＭ  ＧＴＰの存在下で測定しそして全体から差し引いた。化合物は、トランスフェクトされていない対照細胞と比較して、細胞中の［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ結合量を変調するものが選択された。アゴニストによるレセプターの活性化は、［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ結合における５倍の増加を与える。この応答はアンタゴニストにより阻止された。
【０２９０】
ＭＡＰキナーゼアッセイ
ＧＰＣＲを発現している細胞におけるＭＡＰキナーゼの評価は、ＤｍＧＰＣＲ活性の変調剤を同定するための別のアッセイを提供する。例えば、Ｌａｊｉｎｅｓｓら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．，１９９３，２６７（３）、１５７３−１５８１およびＢｏｕｌｔｏｎら，Ｃｅｌｌ，１９９１，６５，６６３−６７５、を参照されたい。
【０２９１】
一つの態様において、ＤｍＧＰＣＲで安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、アッセイ４８時間前に、７０，０００細胞／ウェルの密度で６−ウェルプレートへ蒔いた。この４８時間の間、細胞は１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＭＥＭ培地中、３７℃で培養する。細胞は刺激剤の添加１−２時間前に血清飢餓にする。
【０２９２】
アッセイのため、細胞を、培地単独または候補アゴニストかまたは２００ｎＭホルボールエステル−ミリストイルアセテート（即ち、ＰＭＡ、陽性対照）を含んでいる培地で処理し、そして細胞を種々の時間、３７℃でインキュベートする。反応を停止するため、プレートを氷上に置き、培地を吸引し、そして細胞を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んでいる、１ｍｌの氷冷ＰＢＳですすぐ。その後、２００μｌの細胞溶解緩衝液（１２．５ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．３、１２．５ｍＭグリセロリン酸、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭジチオスレイトール、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌペプスタチンＡおよび１μＭオカダ酸）を細胞に加える。細胞をプレートからこすり取り、そして２３  ３／４Ｇ針を１０回通過させることによりホモジナイズし、そしてサイトゾル分画を、２０，０００ｘｇで１５分の遠心分離により調製する。
【０２９３】
サイトゾルのアリコート（１−５μｇタンパク質を含んでいる５−１０μｌ）を１ｍＭ  ＭＡＰＫ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＰＲＴＰＧＧＲＲ（配列番号１６８）、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）および５０μＭ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮ、３０００Ｃｉ／ミリモル）と混合し、全容量２５μｌに、〜２０００ｃｐｍ／ピコモルの最終比活性へ希釈する。試料は３０℃で５分インキュベートし、そして２０μｌを２ｃｍ２四角のＷｈａｔｍａｎ  Ｐ８１ホスホセルロース紙にスポットすることにより反応を停止する。四角のフィルターは１％Ｈ３ＰＯ４を４回交換して洗浄し、四角を液体シンチレーション分光法にかけて、結合された標識を定量する。等量のサイトゾル抽出物をＭＡＰＫ基質ペプチドなしでインキュベートし、これらの試料からの結合標識を、基質ペプチドを含むマッチした試料から差し引かれた。各々のウェルからのサイトゾル抽出物は、別のポイントとして使用する。タンパク質濃度は、色素結合タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により決定する。レセプターのアゴニスト活性化は、ＭＡＰＫ酵素活性の５倍までの増加を生じると期待される。この増加はアンタゴニストにより阻止された。
【０２９４】
［３Ｈ］アラキドン酸放出
ＧＰＣＲの活性化はまた、細胞におけるアラキドン酸放出を増強することが観察されており、ＧＰＣＲ活性の変調剤のためのさらに別の有用なアッセイを提供する。例えば、Ｋａｎｔｅｒｍａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９９１，３９，３６４−３６９、を参照されたい。例えば、ＤｍＧＰＣＲ発現ベクターで安定的にトランスフェクトされているＣＨＯ細胞を１５，０００細胞／ウェルの密度で２４−ウェルプレートへ蒔き、そして１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＭＥＭ培地中、使用前に３７℃で４８時間増殖させる。各々のウェルの細胞は、０．５μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］アラキドン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．，２１０Ｃｉ／ミリモル）と、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５および０．５％脂肪酸−フリーウシ血清アルブミン中、３７℃で２時間のインキュベーションにより標識する。細胞は次ぎに、１ｍｌの同一緩衝液で２回洗浄する。
【０２９５】
候補変調剤化合物を１ｍの同一緩衝液で加え、単独でかまたは１０μＭ  ＡＴＰと、そして細胞を３７℃で３０分インキュベートする。緩衝液単独または偽トランスフェクトされた細胞を対照として使用する。各々のウェルからの試料（０．５ｍｌ）を液体シンチレーション分光法により計数する。レセプターを活性化するアゴニストは、［３Ｈ］アラキドン酸のＡＴＰ−刺激放出の増強を導くであろう。この増強はアンタゴニストにより阻止される。
【０２９６】
細胞外酸性化速度
さらに別のアッセイにおいて、ＤｍＧＰＣＲ活性の候補変調剤の効果は、試験化合物により誘導されるｐＨの細胞外変化をモニタリングすることによりアッセイする。例えば、Ｄｕｎｌｏｐら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９８，４０（１），４７−５５、を参照されたい。一つの態様において、ＤｍＧＰＣＲ発現ベクターでトランスフェクトされているＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、および１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補給したＭＥＭ中、４ｘ１０５細胞／カップで、１２ｍｍカプセルカップ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）に蒔いた。細胞は、この倍地中、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
【０２９７】
細胞外酸性化速度は、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒマイクロフィジオメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して測定する。カプセルカップをマイクロフィジオメーターのセンサーチャンバーに設置し、そしてチャンバーを、１００μｌ／分の流速で運転緩衝液（４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２６ｍＭ  ＮａＣｌを補給した重炭酸塩−フリーＭＥＭ）を潅流する。候補アゴニストまたは他の剤は運転緩衝液に希釈し、第二の液体通路を通して潅流する。各々６０秒のポンプサイクルの間、３８秒ポンプを動かし、そして残りの２２秒はオフにする。センサーチャンバー中の運転緩衝液のｐＨはサイクルの間、４３−５８秒で記録し、そして次のサイクルを始めるため６０秒で再始動させる。記録時間間の運転緩衝液の酸性化速度は、Ｃｙｔｏｓｏｆｔプログラムにより計算する。酸性化の速度の変化は、変調剤候補の添加後に得られた最も高い速度測定からベースライン値（変調剤候補の添加直前の４回の速度測定の平均）を差し引くことにより計算する。選択された装置は６１ｍＶ／ｐＨ単位を検出する。レセプターのアゴニストとして働く変調剤は、アゴニスト比存在下の速度と比較して、細胞外酸性化の速度に増加が生じた。この応答は、レセプターのアンタゴニストとして働く変調剤により阻止された。
【０２９８】
実施例９：ペプチドリガンドとＤｍＧＰＣＲのマッチング
細胞培養およびトランスフェクション
野生型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ロックビル，ＭＤ、から）またはＣＨＯ−１０００１Ａ細胞を、完全ＤＭＥＭ培地を与えるため、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補給したＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２含有空気の加湿雰囲気で培養する。細胞は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（商標）を使用し、本質的に製造業者による説明書に従って、ｐＣＲ３．１ベクター中のオーファンＧＰＣＲ  ＤＮＡでトランスフェクトした。簡単には、ＣＨＯ細胞を１０ｃｍの滅菌組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ，コーニング，ＮＹ）に蒔き、そしてそれらはトランスフェクションの日には約５０−６０％コンフルエントであった。プラスチックチューブ中、ＰＬＵＳ（２０μｌ／プレート）を、より早く０．７５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭに希釈されているｃＤＮＡプラスミド（５μｇ／プレート）へ加え、混合しそして室温で１５分インキュベートした。別に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（３０μｇ／プレート）を０．７５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭと混合し、前もって複合体形成されたＤＮＡ／ＰＬＵＳ混合物へ加え、室温で１５分インキュベートした。細胞上の培地を無血清トランスフェクション培地（プレインＤＭＥＭ、５ｍｌ／プレート）で置き換え、そしてＤＮＡ−ＰＬＵＳ−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ複合体を加え（プレート当たり１．５ｍｌ）そして穏やかに培地内へ混合し、続いて３時間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。次ぎに、培地に２０％ｆｂＳを含んでいる完全ＤＭＥＭ（６．５  ｍｌ  ｍｌ／プレート）を補給し、そしてインキュベーションを３７℃／５％ＣＯ２で２４から４８時間続けた。ＧＰＣＲでも使用された同一条件下でのトランスフェクション収率を見積もるため、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ、４μｇ／プレート）をＣＨＯ細胞における一時的ＧＦＰ発現のために使用した。
【０２９９】
膜調製
トランスフェクトされた細胞を、氷冷ダルベッコリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）、１０ｃｍプレート当たり５ｍｌ、で１回洗浄し、５ｍｌの同一緩衝液内へこすり落とした。複数のプレートからの細胞懸濁液を合併し、そして４℃にて、５００ｘｇで１０分遠心分離した。細胞ペレットを氷冷ＴＥＥ（２５ｍＭトリス、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で再構築した。都合のよい一部を液体窒素中ですばやく凍結し、−７０℃で保存した。融解後、細胞をホモジナイズし、そして核および破壊されていない細胞をペレット化するため、４℃、５００ｘｇで５分遠心分離した。上清は４７，０００ｘｇで３０分、４℃にて遠心分離した。膜ペレットはＴＥＥで１回洗浄し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（アッセイ緩衝液）に再懸濁し、一部をとりそして液体窒素中で凍結した。膜の一部を−７０℃で保存した。膜タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ（ロックフォード，イリノイ）からのＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔそして基準としてＢＳＡを使用して決定した。
【０３００】
［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ結合アッセイ
細胞膜の一部を融解し、ホモジナイズし、そして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んでいる緩衝液（アッセイ緩衝液）に希釈した。最初に、反応混合物は９６−ウェルポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ）中で調製した。各々のウェル中、ペプチド水溶液（２０μｌ、１０Ｘ）、または水対照（２０μｌ）、１８．２μＭ  ＧＤＰアッセイ緩衝液（０．１１ｍｌ、１０μＭ最終）、およびアッセイ緩衝液に懸濁した膜（５０μｌ、１０μｇ膜タンパク質）を混合し、氷上に置いた。リガンド−ＧＤＰ−膜混合物は、振盪プラットフォーム上、室温で２０分インキュベートし、次ぎに氷上に置いた。各々の試料に２０μｌのグアノシン−５’―Ｏ−（３［３５Ｓ］チオ）三リン酸（６００−１，２００Ｃｉ／ミリモル、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，ボストン，ＭＡ、から）を〜４０，０００ｃｐｍ／０．２ｍｌ、または０．１ｎＭの最終濃度で加えた。インキュベーション混合物を含むプレート（０．２ｍｌ／ウェル全量）は室温で４５分インキュベートした。反応混合物の一部、各々０．１７５ｍｌ、を洗浄緩衝液で前処理した（１００μｌ／ウェル）９６−ウェルＦＢ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ移し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ真空マニフォールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して真空濾過した。次ぎに膜を０．２５ｍｌ氷冷洗浄緩衝液／ウェル（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、真空濾過した。最後の洗浄後、Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｏｐｔｉ−ｐｈａｓｅシンチレーション液（２５μｌ／ウェル，Ｗａｌｌａｃ）を加え、そしてプレートをシールし、そしてＴｒｉｌｕｘ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用い、１分／ウェルで計数した。陽性対照として、ドーパミンタイプ２（ｒＤ２）レセプターを安定的に発現しているＣＨＯ細胞からの膜を、０．０２５％アスコルビン酸（１００μＭドーパミン最終）または坦体（０．００２５％アスコルビン酸最終）中の１ｍＭドーパミンで処理した。非特異的結合は、１００μＭ冷ＧＴＰγＳの存在下で測定され、全体から差し引かれた。各々の処置は三重に実施した。
【０３０１】
データ分析
［３５Ｓ］−ＧＴＰγＳ結合のリガンド誘導刺激は、リガンドが加えられていない基礎活性の何倍の増加として表されている。各々の処理はどれも三重に、またはある場合には二重に行われ、そして結合（ｃｐｍ）は平均＋／−標準偏差として計算した。レセプター／リガンド系の容量−応答曲線は、非線形最小二乗ＳＡＳモデルを使用して分析した、Ｙ＝ＢｍａｘＸ／（Ｋｄ＋Ｘ）。他の容量−応答曲線は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．サンディエゴ，ＣＡ）または次の方程式ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）、を使用して分析した。
【０３０２】
結果
元々、我々は、ＧＴＰγＳのアゴニスト誘導刺激が、多様な下流シグナル伝達の事象のさらなる活性化経路にかかわらず、ＤｍＧＰＣＲ活性化カスケードの初期の事象を反映するので、機能性アッセイとしてＧＴＰγＳアッセイを選んだ。これは、未知の機能および未知のシグナル伝達経路を有するオーファンＤｍＧＰＣＲのありうる活性化の評価のために特に有用であるように思われる。ＧＴＰγＳアッセイは、９６−ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ｇ／ＦＢフィルタープレートおよびＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ真空マニフォールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、ショウジョウバエＧＰＣＲをコードしているＤＮＡで一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から調製された膜で実施した。ＧＴＰγＳアッセイは、Ｇタンパク質のＧｑクラスへ共役したＧＰＣＲを不十分にしか認識しないことが知られているので、ショウジョウバエＧＰＣＲをコードしているＤＮＡで一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中のＧｑ−共役オーファンＧＰＣＲをうまく評価するために、ＦＬＩＰＲ読み取りに基づいたＣａ２＋動員アッセイを使用した。
【０３０３】
ＧＴＰγＳアッセイを使用し、ＤｍＧＰＣＲ１（ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ３４６５１）は、約２．５ｎＭの決定されたＥＣ５０値に反映されているように、二つのショウジョウバエＮＰＦ様ペプチド、ＡＱＲＳＰＳＬＲＬＲＦ−ＮＨ２（配列番号１８６）およびＰＩＲＳＰＳＬＲＬＲＦ−ＮＨ２（配列番号１８７）により活性化されることが観察された。ＤＰＫＱＤＦＭＲＦ−ＮＨ２（配列番号２６）およびＰＤＮＦＭＲＦ−ＮＨ２（配列番号２７）での活性化は、３７０ｎＭから５００ｎＭの範囲のＥＣ５０でのＧＴＰγＳ応答を生じた。Ｎａｍｂｕら（Ｎｅｕｒｏｎ，１９８８，１，５５−６１）により報告されているように、これら二つのペプチドは、９の他のＦａＲＰと一緒に、同一の前駆体遺伝子上にコードされている。より効率は悪いが（５から１０μＭの範囲のＥＣ５０）、ＧＴＰγＳ結合をまた刺激する、追加のＦａＲＰおよび他の神経ペプチドには以下のペプチドが含まれる：ＴＤＶＤＨＶＦＬＲＦ−ＮＨ２（配列番号２５）、ＴＰＡＥＤＦＭＲＦ−ＮＨ２（配列番号２８）、ＳＬＫＱＤＦＭＨＦ−ＮＨ２（配列番号２９）、ＳＶＫＱＤＦＭＨＦ−ＮＨ２（配列番号３０）、ＡＡＭＤＲＹ−ＮＨ２（配列番号３１）およびＳＶＱＤＮＦＭＨＦ−ＮＨ２（配列番号３２）。加えて、ＦＬＩＰＲアッセイは、１００−２００ｎＭのＥＣ５０で、コロラドポテトカブトムシペプチドが、ＡＲＧＰＱＬＲＬＲＦ−ＮＨ２（配列番号３３）、ＤｍＧＰＣＲ１レセプターとマッチしたことを同定した。我々のデータは、ＤｍＧＰＣＲ１は、二つの短いＮＰＦペプチド、配列番号１８６および配列番号１８７により強く活性化されるので、短い神経ペプチドＦレセプターとして分類されなければならないことを示している。
【０３０４】
ＧＴＰγＳ応答により示されたように、ＤｍＧＰＣＲ４（ＰｎｕＦｌｙＰｅｐ  ６７３９３）は、低ナノモル範囲のＥＣ５０で、キイロショウジョウバエアラトスタチン、ドロスタチン−３（ＳＲＰＹＳＦＧＬ−ＮＨ２（配列番号１６５））により、ならびに多様なジプロテラ  パンクタータ（Ｄｉｐｌｏｔｅｒａ  ｐｕｎｃｔａｔａ）（ゴキブリ）アラトスタチン、即ち；ＧＤＧＲＬＹＡＦＧＬ−ＮＨ２（配列番号３４）、ＤＲＬＹＳＦＧＬ−ＮＨ２（配列番号３５）、ＡＰＳＧＡＱＲＬＹＧＦＧＬ−ＮＨ２（配列番号３６）およびＧＧＳＬＹＳＦＧＬ−ＮＨ２（配列番号３７）（約２０−２８０ｎＭの範囲のＥＣ５０）活性化された。ＦＬＩＰＲにより１０μＭで試験された場合、同じペプチドは強いカルシウムシグナルを惹起した。ＤｍＧＰＣＲ４は最近Ｌｅｎｚら、前記文献、によりクローン化され、そして第二の推定アラトスタチンレセプター（ＤＡＲＩＩ）として分類された。しかしながら、レセプター活性化に関する薬理学的データは現在まで報告されていない。我々の知識によると、これは、多様なアラトスタチンがこのレセプターを活性化することのほんとに最初の実験的証拠である。
【０３０５】
ＧＴＰγＳ応答により示されたように、ＣＨＯ−１０００１Ａ細胞で一時的に発現された場合、ＤｍＧＰＣＲ５（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＸ１２８６２８）は、ドロタキキニン（ＤＴＫ）類、即ちＤＴＫ−１（ＡＰＴＳＳＦＩＧＭＲ−ＮＨ２）（配列番号１６９）、ＭＥＴ８−ＤＴＫ−２（ＡＰＬＡＦＹＧＭＲ−ＮＨ２）（配列番号１７０）、ＤＴＫ−２（ＡＰＬＡＦＹＧＬＲ−ＮＨ２）（配列番号１７１）、ＤＴＫ−３（ＡＰＴＧＦＴＧＭＲ−ＮＨ２）（配列番号１７２）、ＤＴＫ−４（ＡＰＶＮＳＦＶＧＭＲ−ＮＨ２）（配列番号１７３）およびＤＴＫ−５（ＡＰＮＧＦＬＧＭＲ−ＮＨ２）（配列番号１７４）により活性化された。用量−応答実験において、ＤＴＫ−１、Ｍｅｔ８−ＤＴＫ−２、ＤＴＫ−３およびＤＴＫ−５が、２５０−５００ｎＭ範囲のＥＣ５０で、そして約１．５倍基礎レベルより高い最大刺激でＧＴＰγＳ結合を刺激した。ＤＴＫ−２およびＤＴＫ−４は、低マイクロモル範囲のそれらのＥＣ５０により判断されるように、さほど強力ではなかった。カルシウム動員アッセイ（ＦＬＩＰＲ）において、ＤｍＧＰＣＲ５は、１−２０ｎＭ範囲のＥＣ５０で、同じＤＴＫに対するＣａ２＋応答を示した。さらに、ＤＴＫ−５、ＤＴＫ−２およびＭｅｔ８−ＤＴＫ−２がｃＡＭＰ（レポーター遺伝子に基づいた）アッセイで試験され、各々１９７ｎＭ、１．０６μＭおよび５８３μＭのＥＣ５０で、用量−応答形式でｃＡＭＰ放出を刺激した。これらのデータは、ＤｍＧＰＣＲ５がＧｓ（ｃＡＭＰ）およびＧｑ（Ｃａ２＋）−仲介シグナル伝達経路の両方に共役していることを示しており、脊椎動物タキキニンレセプターで報告されているシグナル伝達経路と類似している。
【０３０６】
ＤｍＧＰＣＲ６ａ（Ｍ８１１４９０）は、Ｌｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２、２６７、９−１２）によりＰＹＹレセプターとして報告されている。ＧＴＰγＳアッセイを使用し、表７に掲げたペプチドが、５μＭで試験して、ＤｍＧＰＣＲ６ａをコードしているＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜に対するＧＴＰγＳ結合を刺激した（基礎より１．７から４倍増加）。このレセプターを活性化させた昆虫およびＣ．エレガンスペプチドの一群に加え、ヒトＮＰＦＦ（ＦＬＦＱＰＱＲＦ−ＮＨ２（配列番号５９））がＤｍＧＰＣＲ６のリガンドであることが観察された（５μＭ  ＮＰＦＦによりＧＴＰγＳ結合が４倍増加）ことは注目に値する。
【０３０７】
ＤｍＧＰＣＲ６ａＬおよびＤｍＧＰＣＲ６ｂＬはＤｍＧＰＣＲ６ａ（Ｍ８１１４９０）のスプライス変異体である。後者はＬｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２、２６７、９−１２）によりＰＹＹレセプターとして報告されている。ＤｍＧＰＣＲ６ａＬおよびＤｍＧＰＣＲ６ｂＬ、はＣ末端にＡｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＲＦａ）配列を有するペプチドのみを認識するので、両方をＲＦ−ａｍｉｄｅレセプターと命名した。これらのＤｍＧＰＣＲが“見る”ことができないペプチドは、Ｃ末端にＲＦａ配列とは異なった配列（例えば、ＳＦａ、ＱＦａ、ＹＦａ、ＲＬａ、ＤＷａ、ＲＰａ、ＨＦａ、ＬＱａ、ＳＮａその他）を有している。カルシウム動員アッセイ（ＦＬＩＰＲ）において、ＤｍＧＰＣＲ６ａＬおよびＤｍＧＰＣＲ６ｂＬは、１０μＭで試験されたＦａＲＰの一群に対し非常に強いＣａ２＋応答を示した。下記表７に示された配列は、ショウジョウバエ、Ｃ．エレガンス、Ａ．ブタ回虫、軟体動物、Ｐ．レジヴィヴス（ｒｅｄｉｖｉｖｕｓ）、吸虫類、イセエビ、ヒトおよびヒルを含む多様な種へ属している、すべての同定された活性ＦａＲＰを示している。Ｃ末端“ＲＦ−ａｍｉｄｅ規則”の唯一の例外は、Ｃ末端にＧｌｎ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（ＱＦａ）配列を有する、ペプチドｐＧｌｕＤＲＤＹＲＰＬＱＦ−ＮＨ２（配列番号１２０）であった。興味深いことに、ＤｍＧＰＣＲ６ａＬおよびＤｍＧＰＣＲ６ｂＬはまた、ＲＦ−ａｍｉｄｅ配列をＣ末端に有する哺乳動物ペプチド、ＮＰＦＦ（ＦＬＦＱＰＱＲＦ−ＮＨ２（配列番号１５２））も認識した。（前記の結果において、ｐ−ＧｌｕまたはｐＱはピログルタミン酸を指すことに注意されたい）
ＦＬＩＰＲ分析により示されたように、ＣＨＯ−１０００１Ａ細胞において一時的に発現される、ＤｍＧＰＣＲ７（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＸ１２８６３６）はロイコキニン（ＬＫ）および関連ペプチド、即ち、ＬＫ−Ｉ（ＤＰＡＦＮＳＷＧａ）（配列番号１７５）、ＬＫ−Ｖ（ＧＳＧＦＳＳＷＧａ）（配列番号１７６）、ＬＫ−ＶＩ（ｐＧｌｕ−ＳＳＦＨＳＷＧａ）（配列番号１７７）、ＬＫ−ＶＩＩＩ（ＧＳＡＦＹＳＷＧａ）（配列番号１７８）、キュレキニン（ＮＰＦＨＳＷＧａ）（配列番号１７９）、軟体動物リムノキニン（ＰＳＦＨＳＷＳａ）（配列番号１８０）およびショウジョウバエロイコキニン様ペプチドＤＬＫ−１（ＮＳＶＶＬＧＫＫＱＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８１）、ＤＬＫ−２（ｐＧｌｕ−ＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８２）およびＤＬＫ−２Ａ（ＱＲＦＨＳＷＧａ）（配列番号１８３）、により活性化された。ＤｍＧＰＣＲ７は、共通Ｃ末端テトラペプチド配列、ＨＳＷＧａを有しているＬＫペプチドによりもっともよく活性化された。ＤＬＫ−１、ＤＬＫ−２、ＤＬＫ−２Ａ、ＬＫ−ＶＩおよびキュレキニンを含む、ペプチドのこの群による処置は、非常に強力な細胞内カルシウム放出を生じた（ピコモルから下位ナノモル範囲のＥＣ５０）。対照的に、Ｃ末端Ｓ／ＮＳＷＧａ（ＬＫ−Ｉ、ＬＫ−Ｖ）を有する他のバッタＬＫ、ならびにモノアラガイＬＫ（配列番号１８０）は、より低い効力を示し（ＥＣ５０  １５−３０ｎＭ）、そしてＹＳＷＧａ  Ｃ末端配列を有するＬＫ−ＶＩＩＩは一連の中で最も低い効力であった（１００−２００ｎＭ範囲のＥＣ５０）。これらのペプチドに対するＧＴＰγＳ応答（Ｇｑ／１１−共役レセプターの指標）は、ＤｍＧＰＣＲ７／ＣＨＯ細胞から調製された膜において検出できなかった。それ故、ＤｍＧＰＣＲ７はカルシウム−シグナル伝達ロイコキニンレセプター（もっともありそうであるのはＧｑ／１１−共役）として同定され、同族のリガンドとしてドロルコキニンとマッチした。  
【０３０８】
ＧＴＰγＳ応答により示されたように、ＣＨＯ−１０００１Ａ細胞において一時的に発現される、ＤｍＧＰＣＲ８（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＸ１２８６３８）は、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）アラトスタチン−Ｃ（ＡＳＴ−ＣまたはＭａｎｓｅ−ＡＣ）、（ｐＧｌｕ−ＶＲＦＲＱＣＹＦＮＰＩＳＣＦ−ＯＨ）（配列番号１８４）またはドロスタチン−Ｃ（ＤＳＴ−Ｃ）、またはフラットラインペプチド（ＦＬＴ）とも呼ばれている、（ｐＧｌｕ−ＶＲＹＲＱＣＹＦＮＰＩＳＣＦ−ＯＨ）（配列番号１８５）により活性化された。用量応答ＧＴＰγＳ結合実験において、高効率ＡＳＴ−ＣおよびＤＳＴ−Ｃ応答が検出された（低ナノモル範囲のＥＣ５０）。これらの活性は、細胞を百日咳毒素での前処理により完全に破壊され、レセプター活性化にＧｉ／Ｇｏが関与していることを示している。直接カルシウム動員アッセイ（ＦＬＩＰＲ）において、ＤｍＧＰＣＲ８は、ＡＳＴ−ＣまたはＤＳＴ−Ｃで挑んだ場合、どんな活性も示さなかった。しかしながら、ＤＳＴ−Ｃに対する強力なカルシウム放出活性が、ＤｍＧＰＣＲ８およびキメラＧタンパク質Ｇｑｉ５またはＧｑｏ５で同時トランスフェクトされたＣＨＯ−１０００１Ａ細胞で検出された（ＥＣ５０約３０ｎＭ）。一方、Ｇｑｚ５への共役は有効ではなく（ＥＣ５０２４４ｎＭ）、そしてＤｍＧＰＣＲ８およびＧｑｚ５で同時トランスフェクトした細胞で、カルシウム動員は観察されなかった。これらの結果は、ＤｍＧＰＣＲ８は、ＣＨＯ細胞において抑制レセプターであること、多分Ｇｉ／Ｇｏ型Ｇタンパク質へ共役することを示している。本結果は、明白にＤｍＧＰＣＲ８はＤＳＴ−Ｃ／ＦＬＴレセプターと同定する。
【０３０９】
ＤｍＧＰＣＲ９は、カルシウム動員アッセイにおけるその非常に強いシグナルに基づいて（低ナノモル範囲のＥＣ５０）、ＦＤＤＹ（ＳＯ３Ｈ）ＧＨＬＲＦ−ＮＨ２（配列番号１５７）とマッチしていた。ＤｍＧＰＣＲ９をコードしているＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から調製された膜で、このペプチドに対するＧＴＰγＳ応答が検出されなかったという事実は、ＤｍＧＰＣＲ９は最もありそうにはＧｑシグナル伝達経路と共役していることを示している。ＦＤＤＹ（ＳＯ３Ｈ）ＧＨＬＲＦ−ＮＨ２（配列番号１５７）は天然に存在するドロスルファキニン−１（ＤＳＫ−１）、ＦＤＤＹ（ＳＯ３Ｈ）ＧＨＭＲＦ−ＮＨ２（配列番号１５９）のＭｅｔ７→Ｌｅｕ７類似体である。それ故、ＤｍＧＰＣＲ９レセプターはスルファキニンレセプターとして帰属される。ＦＤＤＹ（ＳＯ３Ｈ）ＧＨＬＲＦ−ＮＨ２（配列番号１５７）の非硫酸化相対物であるＦＤＤＹＧＨＬＲＦ−ＮＨ２（配列番号１５８）は１０μＭで試験された場合、非常に弱いカルシウムシグナルのみしか示さず、そして他の１１７の試験されたＦａＲＰおよび関連するペプチドのどれもが、ＤｍＧＰＣＲ９レセプターでのＦＬＩＰＲまたはＧＴＰγＳアッセイでどんな活性も示さなかったので、このマッチは非常に特異的である。
【０３１０】
リガンドとそれらの関連するレセプターの表マッチングが下記の表７に示されている。
【０３１１】
【表７ａ】
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【０３１２】
【表７ｂ】
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【０３１３】
【表７ｃ】
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【０３１４】
【表７ｄ】
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【０３１５】
実施例１０：競合アッセイ
一ヨウ化ペプチドの調製
ペプチドを典型的なクロラミンＴ法を経てヨウ素化する。２ｍｌのガラスバイアルに、１０μｌの１ｍＭペプチド水溶液、１０μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９９）、１．０ｍＣｉ［１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム、および５μｌの２ｍｇ／ｍｌクロラミンＴ溶液（リン酸緩衝液中）を加えた。混合物を６０秒ボルテックスし、そして２５μｌの５ｍｇ／ｍｌメタバイスルファイトナトリウムのリン酸緩衝液溶液の添加により反応を停止した。混合物は次に、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８（０．４５ｘ１５ｃｍ）カラムに注入し、濃度勾配分離にかけることによる、ＨＰＬＣを行った。使用された濃度勾配は、時間ゼロでの７０％Ａおよび３０％Ｂから時間２５分での２０％Ａおよび８０％Ｂである（Ａ＝０．１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液；Ｂ＝０．１Ｍ酢酸アンモニウム、水４０％：ＣＨ３ＣＮ６０％，Ｖ：Ｖ）。流速は１．０ｍｌ／分である。試料は０．２５ｍｌの捕捉緩衝液（０．５％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％トリトンＸ１００および０．０５％トウィーン２０）に、ｔ＝８からｔ＝２０分まで３０秒間隔で集める。モノヨードペプチドは典型的には、ｔ＝１１分に溶出し、収量は０．７５ｍｌに約１００μＣｉである。
【０３１６】
結合アッセイ
使用された９６−ウェルプレートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）濾過プレート（ＦＢ不透明１．０ＹＭガラスファイバータイプＢ、カタログ番号ＭＡＦＢＮＯＢ５０）である。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）溶媒耐性マニホールド（カタログ番号ＭＡＶＭ０９６０Ｒ）を、終了時にアッセイ物を濾過するため、プレートとともに使用する。各々の複製は一つのウェルであり、１００μｌの容量で５μｇのタンパク質（前記のように調製）を含んでいる。各々の試験群は二つの複製を含んでいる。各々の試験化合物に対して、一つの群は［１２５Ｉ］ペプチドのみで（全結合）、そして一つは１μＭ（または示されたような）濃度の試験化合物および［１２５Ｉ］ペプチド（非特異的結合）で行う。各々の複製の試薬を添加する順序は：アッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）、［１２５Ｉ］ペプチド（アッセイ緩衝液中）、そして膜懸濁液（アッセイ緩衝液中）である。膜懸濁液の添加が結合反応を開始させ、それは室温で（２２℃）３０分行う。３０分のインキュベーション後、各々のプレートを濾過マニホールドに置き、そして真空にしてフィルターを通して液体を引っ張り（捨てる）、そしてタンパク質を各々のウェル中のフィルターに捕捉する。洗浄のため、真空を解除し、そして２００μｌのアッセイ緩衝液を各々のウェルへ加え、再び真空にする。この洗浄をさらに２回繰り返す（各々の複製に対して総計で３Ｘ洗浄）。洗浄後、各々のプレートの下面のプラスチックのおおいを除去し、そしてプレートを底が封ぜられたＭｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）シンチレーション計数カセット（カタログ番号１４５０−１０５）に置く。２５μｌのシンチレーション剤を各々のウェルに加え、そしてプレートを８０ｒｐｍの回転しんとう機に１時間置き、次に一夜放置する。次の日、プレートをＭｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）シンチレーションカウンターで計数する。平均非特異的結合を平均全結合から差し引くと、基準（ペプチドアミド）および未知物両方の特異的結合を得る。
【０３１７】
当業者が認めるであろうように、本発明の精神から離れることなく、前記の本発明の態様に対して、多くの変形および修飾を行うことができる。こうしたすべての変法は本発明の範囲内に含まれていることが意図されている。
【０３１８】
本明細書で引用した各々の刊行物の全開示は、本明細書において援用される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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