(57)【要約】式(Ｉ)：【化１】2005537281.tif 000023[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１０、Ｍ、Ｑ、Ｔ、Ｕ、Ｙ、Ｖ、およびＷは、本明細書中で定義した通りである]の新規化合物、およびその薬学的に許容される塩；その製造方法、それらを含む組成物、および治療におけるその使用を提供する。本化合物は、一酸化窒素合成酵素阻害剤であり、そしてそれによる炎症性疾患および疼痛の処置もしくは予防に、特に有用である。
2005537281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(Ｉ)：
【化１】
2005537281.tif 000014
[式中、
Ｙは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＮＯ２、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨＯ、ＮＨＣＯＣＨ３、またはＮＨＳＯ２ＣＨ３を表し、
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されており；
Ｔ、Ｕ、およびＷは、独立して、ＣＸ、Ｎ、ＮＲ９、Ｏ、またはＳ(Ｏ)ｍを表し、
ただし、少なくとも１つのＴ、Ｕ、およびＷがヘテロ原子を表さなければならず、かつ
Ｔ、Ｕ、およびＷの１個以上がＮＲ９、Ｏ、またはＳ(Ｏ)ｍを表すことはなく；
ｍは、整数０、１、または２を表し；そして
それぞれのＸは、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ(Ｒ１１)２、ＮＯ２、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、またはＮＨＣＨＯを表し、
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されており；
Ｖは、ＮＲ４、Ｏ、ＣＨ２、Ｓ(Ｏ)ｎ  、ＯＣＨ２、ＣＨ２Ｏ、ＮＲ４ＣＨ２、ＣＨ２ＮＲ４、ＣＨ２Ｓ(Ｏ)ｎ、Ｓ(Ｏ)ｎＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、またはＣＨ＝ＣＨを表し；
ｎは、整数０、１、または２であり；
ＭはＣを表し、かつ
ＭがＶ中のＣＨ２部分に結合している場合は、ＭはまたＮを表し得；
Ｒ１０はＨまたはＭｅを表し；
Ｑは、(ＣＨ２)ｐ{ｐは、整数０、１、２、または３を表す}を表し；
Ｒ１は、フェニル、または Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択される１から３個のヘテロ原子を含む５員環もしくは６員環の芳香族性複素環式環を表し；
該フェニルもしくは芳香族性複素環式環は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、またはＮＲ５Ｒ６から独立して選択される１個以上の置換基によって、所望により置換されており；
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によって、さらに置換されており；
Ｒ２とＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、またはＣ３−６シクロアルキルを表し、
該アルキルは、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ｚ−ＮＲ７Ｒ８、フェニル、または Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択される１から３個のヘテロ原子を含む５員環もしくは６員環の芳香族性もしくは飽和複素環式環によって、所望により置換されており；
該フェニルもしくは芳香族性複素環式環は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、またはＮＯ２によって、所望によりさらに置換されており；
Ｚは、−ＣＯ−または結合を表し；
Ｒ４とＲ１１は、独立して、ＨまたはＣ１−２アルキルを表し；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、独立して、ＨまたはＣ１−４アルキルを表し；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、またはＣＦ３を表す]の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
ＶがＳ(Ｏ)ｎを表し、ｎが０を表す、請求項１に記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項３】
ＹがＣＮを表す、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
３−[[(１Ｓ)−２−アミノ−１−フェニルエチル]チオ]−５−メチル−２−チオフェンカルボニトリル、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、もしくはラセミ体である、請求項１に記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項５】
医薬として使用するための、請求項１から４の何れか１項に記載の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、もしくは担体と混合した、請求項１から４の何れか１項に記載の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
【請求項７】
一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有益であるヒトの疾患もしくは状態の処置もしくは予防のための医薬の製造における、請求項１から４の何れか１項に記載の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項８】
主として誘導型一酸化窒素合成酵素が阻害される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
炎症性疾患の処置もしくは予防のための医薬の製造における、請求項１から４の何れか１項に記載の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１０】
該疾患が炎症性腸疾患である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
該疾患がリウマチ性関節炎である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
該疾患が骨関節炎である、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
疼痛の処置もしくは予防のための医薬の製造における、請求項１から４の何れか１項に定義した通りの式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１４】
炎症性疾患の処置もしくは予防のための医薬の製造における、ＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせた、請求項１から４の何れか１項に定義した通りの式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１５】
一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有益であるヒトの疾患もしくは状態を処置する、またはそのリスクを軽減する方法であって、該疾患もしくは状態に罹患している もしくはそのリスクが増大しているヒトに、請求項１から４の何れか１項に定義した通りの式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を、治療上効果的な量で投与することを含む方法。
【請求項１６】
炎症性疾患を処置する、またはそのリスクを軽減する方法であって、該疾患に罹患している もしくはそのリスクが増大しているヒトに、請求項１から４の何れか１項に定義した通りの式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、またはラセミ体を、治療上効果的な量で投与することを含む方法。
【請求項１７】
請求項１から４の何れか１項に定義した通りの式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、またはラセミ体を製造する方法であって、該方法が、
(ａ) 式(II)：
【化２】
2005537281.tif 000015
[式中、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｙ、およびＭは、請求項１で定義した通りであり；そして
Ｌ１は脱離基を表す]の化合物を、式(III)：
【化３】
2005537281.tif 000016
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１０、Ｑ、およびＶは、請求項１で定義した通りである]の化合物と反応させること；または
(ｂ) 式(IV)：
【化４】
2005537281.tif 000017
[式中、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｍ、Ｙ、およびＶは、請求項１で定義した通りである]の化合物を、式(Ｖ)：
【化５】
2005537281.tif 000018
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１０、およびＱは、請求項１で定義した通りであり；そして
Ｌ２は脱離基である]の化合物と反応させること；または
(ｃ) 式(VI)：
【化６】
2005537281.tif 000019
[式中、Ｒ１、Ｒ１０、Ｑ、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｍ、Ｙ、およびＶは、請求項１で定義した通りであり；そして
Ｌ３は脱離基である]の化合物を、式(VII)：
【化７】
2005537281.tif 000020
[式中、Ｒ２とＲ３は請求項１で定義した通りである]の化合物と反応させること；または
(ｄ) 式(VIII)：
【化８】
2005537281.tif 000021
[式中、Ｒ１、Ｒ１０、Ｑ、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｍ、Ｙ、およびＶは、請求項１で定義した通りであり；そして
Ｐは、アジド(Ｎ３)を表す]の化合物を還元すること；または
(ｅ) 式(VIII)：
【化９】
2005537281.tif 000022
[式中、Ｒ１、Ｒ１０、Ｑ、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｍ、Ｙ、およびＶは、請求項１で定義した通りであり；そして
Ｐはイミドを表す]の化合物を加水分解すること；および
望ましいならば、または必要であれば、得られた式(Ｉ)の化合物もしくはその別の塩を、その薬学的に許容される塩に変換すること；または
式(Ｉ)の化合物の１つを別の式(Ｉ)の化合物に変換すること；および
望ましいならば、得られた式(Ｉ)の化合物をその光学異性体に変換すること；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、新規のヘテロアリールアルキルアミン誘導体、その製造方法、それらを含む組成物、および治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
一酸化窒素は、哺乳動物の細胞中で、特定の一酸化窒素合成酵素の作用によって、Ｌ−アルギニンから生成される。これらの酵素は、２つの別個のクラス、すなわち構成型ＮＯＳ(constitutive NOS)(ｃＮＯＳ)と、誘導型ＮＯＳ(inducible NOS)(ｉＮＯＳ)に分類される。現在、２つの構成型ＮＯＳと、１つの誘導型ＮＯＳが、同定されている。構成型ＮＯＳのうち、内皮型酵素(ｅＮＯＳ)は、平滑筋弛緩、および血圧と血流の制御に関するが、神経型酵素(ｎＮＯＳ)は、様々な生物学的機能の制御に関すると見られている。誘導型ＮＯＳは、特に炎症性疾患の病状に関与している。従って、これらの酵素の制御は、広く様々な疾患状態の処置において、多くの可能性を提供する(J. E. Macdonald, Ann. Rep. Med. Chem., 1996, 31, 221 - 230)。
【０００３】
多くの努力が、１個以上の一酸化窒素合成酵素のアイソフォームの特異的阻害剤として作用する化合物を同定するための労力に費やされている。治療における該化合物の使用もまた、広く要請されている。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の開示
本発明に従って、式(Ｉ)：
【化１】
2005537281.tif 000003
[式中、
Ｙは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＮＯ２、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、ＮＨ２、ＮＨＣＨＯ、ＮＨＣＯＣＨ３、またはＮＨＳＯ２ＣＨ３を表し、
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されており；
Ｔ、Ｕ、およびＷは、独立して、ＣＸ、Ｎ、ＮＲ９、Ｏ、またはＳ(Ｏ)ｍを表し、
ただし、少なくとも１つのＴ、Ｕ、およびＷがヘテロ原子を表さなければならず、かつ
Ｔ、Ｕ、およびＷの１個以上がＮＲ９、Ｏ、またはＳ(Ｏ)ｍを表すことはなく；
ｍは、整数０、１、または２を表し；そして
それぞれのＸは、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ(Ｒ１１)２、ＮＯ２、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、またはＮＨＣＨＯを表し、
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されており；
Ｖは、ＮＲ４、Ｏ、ＣＨ２、Ｓ(Ｏ)ｎ  、ＯＣＨ２、ＣＨ２Ｏ、ＮＲ４ＣＨ２、ＣＨ２ＮＲ４、ＣＨ２Ｓ(Ｏ)ｎ、Ｓ(Ｏ)ｎＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、またはＣＨ＝ＣＨを表し；
ｎは、整数０、１、または２であり；
ＭはＣを表し、かつ
ＭがＶ中のＣＨ２部分に結合している場合は、ＭはまたＮを表し得；
Ｒ１０はＨまたはＭｅを表し；
Ｑは、(ＣＨ２)ｐ{ｐは、整数０、１、２、または３を表す}を表し；
Ｒ１は、フェニル、または Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択される１から３個のヘテロ原子を含む５員環もしくは６員環の芳香族性複素環式環を表し；
該フェニルもしくは芳香族性複素環式環は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、またはＮＲ５Ｒ６から独立して選択される１個以上の置換基によって、所望により置換されており；
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によって、さらに置換されており；
Ｒ２とＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、またはＣ３−６シクロアルキルを表し、
該アルキルは、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、−Ｚ−ＮＲ７Ｒ８、フェニル、または Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択される１から３個のヘテロ原子を含む５員環もしくは６員環の芳香族性もしくは飽和複素環式環によって、所望により置換されており；
該フェニルもしくは芳香族性複素環式環は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＣＮ、またはＮＯ２によって、所望によりさらに置換されており；
Ｚは、−ＣＯ−または結合を表し；
Ｒ４とＲ１１は、独立して、ＨまたはＣ１−２アルキルを表し；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、独立して、ＨまたはＣ１−４アルキルを表し；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、またはＣＦ３を表す]の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００５】
式(Ｉ)の化合物は、エナンチオマーの形態で存在し得る。全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、およびそれらの混合物は本発明の範囲に含まれると解されるべきである。
【０００６】
Ｕ、Ｔ、またはＷがＣＸを表し、ＸがＯＨを表す、式(Ｉ)の化合物は、別のケト互変異性体の形態で存在し得ることが認められる。同様に、Ｕ、Ｔ、またはＷがＣＸを表し、ＸがＮＨを表す式(Ｉ)の化合物は、別のイミノ互変異性体の形態で存在し得る。同様に、Ｕ、Ｔ、またはＷがＣＸを表し、ＸがＳＨを表す式(Ｉ)の化合物は、別のチオケト互変異性体の形態で存在し得る。全てのこのような可能性のある互変異性体の形態およびそれらの混合物は、本発明の範囲に含まれると解されるべきである。
【０００７】
式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される塩は、一酸化窒素合成酵素(ＮＯＳ)の阻害剤であるという利点を有する。特に、式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される塩は、誘導型一酸化窒素合成酵素のアイソフォーム(ｉＮＯＳ)の阻害剤であるという利点を有する。
【０００８】
本発明は、さらに、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、またはラセミ体の製造方法を提供する。
本発明に従って、医薬として使用するための、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有益である疾患もしくは状態を処置するもしくは予防する医薬の製造における、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、誘導型一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有益である疾患もしくは状態を処置するもしくは予防する医薬の製造における、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００１１】
本発明のより特定的な態様は、炎症性疾患を処置するもしくは予防する医薬の製造における、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
本発明のより特定的な態様は、疼痛を処置するもしくは予防する医薬の製造における、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００１２】
本発明に従って、一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有益である疾患もしくは状態を処置する、もしくはそのリスクを軽減する方法であって、該疾患もしくは状態に罹患しているもしくはそのリスクがあるヒトに、治療上効果的な量の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法もまた提供する。
【００１３】
より特定的には、炎症性疾患に罹患しているもしくはそのリスクがあるヒトにおいて、炎症性疾患を処置するもしくはそのリスクを軽減する方法であって、該ヒトに、治療上効果的な量の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法もまた提供する。
【００１４】
本発明の化合物はまた、第２の薬学的に活性な成分と組み合わせて；特にシクロオキシゲナーゼ阻害剤と組み合わせて；より特定的には誘導型シクロオキシゲナーゼのアイソフォーム(inducible isoform of cyclooxygenase) (ＣＯＸ−２)の選択的阻害剤と組み合わせて、有利に用いられ得る。従って、本発明のさらなる態様において、炎症、炎症性疾患、および炎症関連疾患を処置するための、ＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせた、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。そして、炎症、炎症性疾患、および炎症関連疾患に罹患しているもしくはそのリスクがあるヒトにおいて、炎症、炎症性疾患、および炎症関連疾患を処置する もしくはそのリスクを軽減する方法であって、該ヒトに、ＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせた式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を、治療上効果的な量で投与することを含む方法もまた提供する。
【００１５】
１つの具体的態様において、式(Ｉ)におけるＶは、Ｓ(Ｏ)ｎを表し、そしてｎは０を表す。
別の具体的態様において、式(Ｉ)におけるＹは、ＣＮを表す。
【００１６】
別の具体的態様において、式(Ｉ)におけるＲ１は、所望により置換されているフェニル または Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択される１から３個のヘテロ原子を含む５員環もしくは６員環の芳香族性複素環式環を表す。さらなる具体的態様において、式(Ｉ)におけるＲ１は、所望により置換されているフェニル、ピリジル、チエニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、またはチアゾリルを表す。さらにさらなる具体的態様において、式(Ｉ)におけるＲ１は、所望により置換されているフェニルを表す。
【００１７】
１つの具体的態様において、式(Ｉ)におけるＴ、Ｕ、およびＷの１つはＳを表し、そして他の２つはＣＸを表し、そしてＭはＣを表す。
特定の具体的態様において、式(Ｉ)の化合物は、
【化２】
2005537281.tif 000004
に示した通りの絶対配置を有する。
【００１８】
本発明の特定の化合物は、３−[[(１Ｓ)−２−アミノ−１−フェニルエチル]チオ]−５−メチル−２−チオフェンカルボニトリル、およびその薬学的に許容される塩を含む。
【００１９】
別記しない限り、本明細書中で記載する“Ｃ１−４アルキル”という用語は、１から４個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキルを表す。このような基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、およびｔ−ブチルを含む。
【００２０】
別記しない限り、本明細書中で記載する“Ｃ３−６シクロアルキル”という用語は、３から６個の炭素原子を有するシクロアルキルを表す。このような基の例は、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルを含む。
【００２１】
別記しない限り、本明細書中で記載する“Ｃ１−４アルコキシ”という用語は、１から４個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシを表す。このような基の例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、およびｔ−ブトキシを含む。
別記しない限り、本明細書中で記載する“ハロゲン”という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを表す。
【００２２】
Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択される１から３個のヘテロ原子を含む５員環もしくは６員環の芳香族性複素環式環の例は、フラン、チオフェン、ピリジン、チアゾール、イミダゾール、オキサゾール、トリアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、およびピリミジンを含む。
【００２３】
Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択される１から３個のヘテロ原子を含む５員環もしくは６員環の飽和複素環式環の例は、ピロリジン、テトラヒドロフラン、ピペリジン、およびピペラジンを含む。
【００２４】
“所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されているＣ１−４アルキルもしくはＣ１−４アルコキシ”の例は、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３、ＣＦ３ＣＦ２、ＣＦ３ＣＨ２、ＣＨ２ＦＣＨ２、ＣＨ３ＣＦ２、ＣＦ３ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＦ３、およびＯＣＨ２ＣＦ３を含む。
【００２５】
本発明に従って、我々は、さらに、式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、またはラセミ体を製造する方法であって、該方法が、
(ａ) 式(II)：
【化３】
2005537281.tif 000005
[式中、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｙ、およびＭは、式(Ｉ)で定義した通りであり；そして
Ｌ１は脱離基を表す]の化合物を、式(III)：
【化４】
2005537281.tif 000006
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１０、Ｑ、およびＶは、式(Ｉ)で定義した通りである]の化合物と反応させること；または
【００２６】
(ｂ) 式(IV)：
【化５】
2005537281.tif 000007
[式中、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｍ、Ｙ、およびＶは、式(Ｉ)で定義した通りである]の化合物を、式(Ｖ)：
【化６】
2005537281.tif 000008
[式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１０、およびＱは、式(Ｉ)で定義した通りであり；そして
Ｌ２は脱離基である]の化合物と反応させること；または
【００２７】
(ｃ) 式(VI)：
【化７】
2005537281.tif 000009
[式中、Ｒ１、Ｒ１０、Ｑ、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｍ、Ｙ、およびＶは、式(Ｉ)で定義した通りであり；そして
Ｌ３は脱離基である]の化合物を、式(VII)：
【化８】
2005537281.tif 000010
[式中、Ｒ２とＲ３は式(Ｉ)で定義した通りである]の化合物と反応させること；または
【００２８】
(ｄ) 式(VIII)：
【化９】
2005537281.tif 000011
[式中、Ｒ１、Ｒ１０、Ｑ、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｍ、Ｙ、およびＶは、式(Ｉ)で定義した通りであり；そして
Ｐは、アジド(Ｎ３)を表す]の化合物を還元すること；または
【００２９】
(ｅ) 式(VIII)：
【化１０】
2005537281.tif 000012
[式中、Ｒ１、Ｒ１０、Ｑ、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｍ、Ｙ、およびＶは、式(Ｉ)で定義した通りであり；そして
Ｐはイミドを表す]の化合物を加水分解すること；および
望ましいならば、または必要であれば、得られた式(Ｉ)の化合物もしくはその別の塩を、その薬学的に許容される塩に変換すること；または
式(Ｉ)の化合物の１つを別の式(Ｉ)の化合物に変換すること；および
望ましいならば、得られた式(Ｉ)の化合物をその光学異性体に変換すること；
を含む方法を提供する。
【００３０】
方法(ａ)において、反応は、不活性な溶媒中で、式(III)の求核剤を、式(II)の求電子剤で処理することによって行われる。適切な脱離基Ｌ１は、スルホネートおよびハライドを含み、特にフルオライドもしくはクロライドである。反応は、一般的に、非求核性塩基、例えば水素化ナトリウムもしくは炭酸セシウムの存在下で行われる。適切な有機溶媒は、例えばＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、およびジメチルスルホキシドである。反応は、一般的に、０℃から溶媒の沸点の間の温度で行われる。
【００３１】
方法(ｂ)において、式(IV)および式(Ｖ)の反応剤は、適切な不活性な溶媒(例えばテトラヒドロフラン)中で、例えば Mitsunobu 条件を用いてカップリングする。従って、例えば、反応剤を、ホスフィン誘導体およびアゾ誘導体で、適切な温度で、一般的に０℃から溶媒の沸点の間の温度で処理する。適切なホスフィン誘導体は、トリフェニルホスフィンおよびトリブチルホスフィンを含む。適切なアゾ誘導体は、アゾジカルボン酸ジエチル、アゾジカルボン酸ジイソプロピル、および１,１'−(アゾジカルボニル)ジピペリジンを含む。適切な脱離基Ｌ２はヒドロキシを含む。
【００３２】
あるいは、方法(ｂ)において、反応は、不活性な溶媒中で、式(IV)の求核剤を、式(Ｖ)の求電子剤で処理することによって行われる。適切な脱離基Ｌ２は、スルホネートおよびハライドを含み、特にクロライドまたはブロマイドである。反応は、一般的に、非求核性塩基、例えば水素化ナトリウムもしくは炭酸セシウムの存在下で行われる。適切な有機溶媒は、例えばＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、テトラヒドロフラン、およびジメチルスルホキシドである。反応は、一般的に、０℃から溶媒の沸点の間の温度で行われる。
【００３３】
方法(ｃ)において、式(VI)および式(VII)の化合物を、適切な不活性な溶媒(例えばジメチルスルホキシドもしくはテトラヒドロフラン)中で、一緒に反応させる。反応は、一般的に、塩基の存在下で行われる。塩基は、さらなる成分または過剰量の式(VII)のアミンの何れであってもよい。適切な脱離基Ｌ３は、アイオダイド(iodide)およびｐ−トルエンスルホネートを含む。
方法(ｄ)および(ｅ)において、反応は当業者に周知の標準的な条件を用いて行われる。
【００３４】
上記の方法において、アミンまたはヒドロキシルまたは他の可能性のある反応基を保護することが望ましい、または必要であることが、当業者に明らかである。適切な保護基および該基の付加および除去の方法の詳細は、標準的な教科書である“Protective Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition (1999) by Greene and Wuts を参照することよって分かる。
【００３５】
１つの望ましい具体的態様において、アミンを、カルバメート誘導体として、例えばｔ−ブチルオキシカルバメートとして保護する。
保護基の使用の特定の例は、実施例の章に示す。
【００３６】
本発明は、塩の、特に酸付加塩の形態の式(Ｉ)の化合物を含む。適切な塩は、有機酸および無機酸と形成される塩の両方を含む。該酸付加塩は、通常薬学的に許容されるが、薬学的に許容されない塩は、対象の化合物の製造および精製に有用であり得る。従って、望ましい塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から形成される塩を含む。
【００３７】
式(Ｉ)の化合物の塩は、遊離塩基またはその塩、エナンチオマー、もしくはラセミ体を、１当量以上の適切な酸と反応させることによって形成され得る。反応は、塩が不溶の溶媒もしくは媒体または塩が可溶である溶媒(例えば水、ジオキサン、エタノール、テトラヒドロフラン、またはジエチルエーテル)中で、または溶媒の混合物中で行い得、該溶媒は真空でもしくは凍結乾燥によって除去し得る。反応はまた、代謝プロセスであってもよく、またはイオン交換樹脂上で行ってもよい。
【００３８】
式(III)の化合物は、式(IX)：
【化１１】
2005537281.tif 000013
[式中、Ｒ２、Ｒ３、およびＱは、式(Ｉ)で定義した通りであり；そして
Ｇは、Ｈ、Ｃｌ、またはＮＣＨ３(ＯＣＨ３)を表す]の化合物を、
有機金属誘導体：Ｒ１Ｍ
[式中、Ｒ１は、式(Ｉ)で定義した通りであり；そして
Ｍは、金属性の基、例えばリチウムまたはマグネシウム−ハライドを表す]と反応させ、次に必要であれば還元することによって製造され得る。得られたＶが酸素を表す式(III)の化合物は、その後Ｖが硫黄を表す式(III)の化合物に変換され得る。
【００３９】
式(II)、(IV)、(V)、(VI)、(VIII)、および(IX)の化合物は、既知であるか、または当業者に直ちに明らかである慣用の方法によって製造され得るかの何れかである。
中間体化合物は、そのまま、または保護された形態で用いられ得る。保護基およびその除去方法の詳細は、“Protective Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition (1999) by Greene and Wuts の記載に見出され得る。
【００４０】
本発明の化合物およびその中間体を、その反応混合物から単離し、必要であれば、さらに標準的な方法を用いることによって精製し得る。
【００４１】
式Ｉの化合物は、エナンチオマーの形態で存在し得る。従って、全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、およびその混合物は、本発明の範囲に含まれる。様々な光学異性体は、慣用の方法、例えば分別結晶化またはＨＰＬＣを用いて、本化合物のラセミ混合物の分割によって単離され得る。
【００４２】
中間体化合物はまた、エナンチオマーの形態で存在し得、精製したエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、または混合物として用いられ得る。
【００４３】
式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、およびラセミ体は、動物において薬理学的活性を有することから、有用である。特に、本化合物は、一酸化窒素合成酵素の阻害剤として活性である。より特定的には、それらは、誘導型一酸化窒素合成酵素のアイソフォームの阻害剤であり、そしてこのことから、治療において、例えば抗炎症剤として有用であると予測される。それらはまた、神経型一酸化窒素合成酵素のアイソフォームの阻害剤として有用性を有し得る。一般的に、式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される塩は、内皮型アイソフォーム(ｅＮＯＳ)と比較して、ｉＮＯＳおよび／またはｎＮＯＳの阻害剤に良好な選択性を示すという利点を有する。
【００４４】
本化合物およびその薬学的に許容される塩を、一酸化窒素合成酵素の合成または過剰合成が寄与する部分のある疾患もしくは状態の処置または予防に使用するために適応する。特に、本化合物を、ヒトを含む哺乳動物において炎症状態の処置に使用するために適応する。
【００４５】
特に記載し得る状態は、
骨関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎、および他の関節炎の状態、炎症を起こした関節；
湿疹、乾癬、皮膚炎、または他の炎症性皮膚状態、例えば日焼け；
ブドウ膜炎、緑内障、および結膜炎を含む炎症性眼状態；
炎症が関与している肺疾患、例えば喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、ハト飼育者疾患(pigeon fancier's disease)、農夫肺、急性呼吸窮迫症候群；
菌血症、内毒血症(敗血症ショック)、アフタ性潰瘍、歯肉炎、不全麻痺(pyresis)、疼痛、髄膜炎、および膵炎；
炎症性腸疾患を含む胃腸管の状態、クローン病、萎縮性胃炎、変形性胃炎(gastritis varialoforme)、潰瘍性大腸炎、セリアック病、限局性回腸炎(regional ileitis)、消化性潰瘍、過敏性腸症候群、逆流性食道炎(reflux oesophagitis)、例えば Helicobacter pylori による感染に起因する、または非ステロイド性抗炎症剤での処置に起因する胃腸管の損傷；および
炎症に関する他の状態；
である。
【００４６】
本化合物はまた、癌の処置に有用であり得る。
本化合物はまた、急性疼痛、または持続性炎症性疼痛、または神経因性疼痛、または中枢起源の疼痛の処置および緩和に有用である。
【００４７】
我々は、炎症性腸疾患、リウマチ性関節炎、骨関節炎、慢性閉塞性肺疾患、疼痛、および癌の状態に、特に興味深い。
式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される塩はまた、さらに上記の疾患もしくは状態の処置もしくは予防に有用であり得る。例えば、本化合物は、アテローム性硬化症、嚢胞性線維症、敗血症ショックおよび／または毒素ショックに関連する低血圧症の処置、臓器移植治療における短期間免疫抑制に対するアジュバントとして免疫系の機能不全の処置に、糖尿病の発症の制御に、糖尿病における膵臓機能の維持に、糖尿病に関連する血管性合併症の処置に、およびサイトカイン(例えばＴＮＦまたはインターロイキン)との併用治療(co-therapy)に有用であり得る。
【００４８】
式(Ｉ)の化合物はまた、例えば心停止や卒中の場合における低酸素症、例えば虚血、低酸素症、低血糖、癲癇などの疾患や 外傷(例えば脊髄損傷や頭部損傷)における 神経変性 および／または 神経壊死を含む神経変性疾患、高圧酸素痙攣および毒、痴呆、例えば初老期痴呆や アルツハイマー病や ＡＩＤＳ関連痴呆、シドナム舞踏病、パーキンソン病、トゥーレット症候群、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、筋ジストロフィー、コルサコフ病、大脳血管障害に関係する痴愚、睡眠障害、 統合失調症、鬱病、疼痛、自閉症、季節性情動障害、時差ぼけ、鬱病、または月経前症候群(ＰＭＳ)に伴う別の症状、不安、および敗血症ショックの処置に有用であり得る。式(Ｉ)の化合物はまた、薬物中毒または薬物抵抗性、例えばアヘン剤やジアゼピンに対する抵抗性の予防や回復、薬物中毒の処置、偏頭痛や他の血管性頭痛、神経因性炎症の処置、胃腸運動障害の処置、および分娩の誘発において、活性を示すと期待され得る。
【００４９】
我々は、卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、偏頭痛、敗血症ショック、および疼痛の状態に、特に関心がある。
【００５０】
予防は、問題の疾患もしくは状態の病歴があるヒト、またはそうでなくとも発症のリスクが増大していると考えられるヒトの処置に、特に適切であると期待される。特定の疾患もしくは状態の発症のリスクがあるヒトは、一般的に、その疾患もしくは状態の家族の病歴があるヒト、または特にその疾患もしくは状態にかかりやすいと、遺伝子試験もしくはスクリーニングによって特定されたヒトを含む。
【００５１】
上記の治療的適応において、投与される用量は、用いられた化合物、投与方法、および望ましい処置に応じて、当然に変化する。しかし、一般的に、本化合物を、１日当たり１mgから２０００mgの間で、固体の形態の投与形で投与した場合に、満足のいく結果が得られる。
【００５２】
式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される誘導体は、それ自身、または該化合物が薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、もしくは担体と混合した適切な医薬組成物の形態で用いられ得る。投与は、経腸(経口、舌下、もしくは直腸を含む)、鼻腔の、吸入の、静脈の、局所の、もしくは他の非経腸の経路(これらに制限されない)によって行われ得る。適切な医薬組成物の選択および製造の慣用の手順は、例えば "Pharmaceuticals - The Science of Dosage Form Designs", M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 1988 に記載された。医薬組成物は、好ましくは、８０％未満の、より好ましくは５０％未満の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００５３】
本発明に従って、我々は、さらに、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、もしくは担体と混合した式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を提供する。
該成分を混合することを含む医薬組成物の製造方法を提供する。
【００５４】
式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される誘導体はまた、便宜的に、下記：ＮＳＡＩＤＳ、ＣＯＸ−２阻害剤、アセトアミノフェン、トラマドール、コルチコステロイド、グルコサミン、ドキシサイクリン、プラルナカサン(Pralnacasan)、ＭＭＰ阻害剤、またはＣｏｌｌ−３阻害剤の１つとの組み合わせで用いられ得る。式(Ｉ)の化合物および併用治療は、１回単位用量で投与するために 同じ医薬組成物に一緒に製剤化されるか、またはそれぞれの成分を個別に製剤化し、別個の投与形を同時にもしくは連続して投与するかの何れであってもよい。
【００５５】
本発明を下記の実施例によって説明するが、これは全く本発明を制限しない。
下記の略号：ＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド)、ＤＭＦ(Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド)、ＴＨＦ(テトラヒドロフラン)を用いる。
【実施例】
【００５６】
実施例１
３−[[(１Ｓ)−２−アミノ−１−フェニルエチル]チオ]−５−メチル−２−チオフェンカルボニトリル オキサレート
ａ) ３−ブロモ−５−メチル−２−チオフェンカルボニトリル
水(１０ml)中の３−ブロモ−５−メチル−２−チオフェンカルボアルデヒド (５００mg)の懸濁液に、ヒドロキシルアミン−Ｏ−スルホン酸(３３０mg)を加えた。混合物を５０℃で１２時間加熱し、冷却した。次に混合物を酢酸エチル(３×５０ml)で抽出した。合わせた有機層を洗浄(塩水)し、乾燥(ＭｇＳＯ４)し、濾過し、蒸発させ、副題化合物を褐色の固体として得た(４１０mg)。
1H NMR 300MHz (CDCl3)  6.79 (1H, s), 2.54 (3H, s).
【００５７】
ｂ) １,１−ジメチルエチル [(２Ｒ)−２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル]カルバメート
(Ｒ)−α−(アミノメチル)ベンゼンメタノール(１.７０ｇ)と、ビス(１,１−ジメチルエチル)カーボネート(２.９８ｇ)を、メタノール(２０ml)に溶解し、トリエチルアミン(４.３ml)を加えた。混合物を室温で４日間撹拌し、次に濃縮し、副題化合物を油状物として得た(２.６０ｇ)。
1H NMR 300MHz (CDCl3) 7.27-7.38 (5H, m), 4.92 (1H, m), 4.83 (1H, m), 3.50 (1H, m), 3.25 (1H, m), 1.45 (9H, s).
【００５８】
ｃ) Ｓ−[(１Ｓ)−２−[[(１,１−ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]−１−フェニルエチル]ベンゼンカルボチオエート
ＴＨＦ(１００ml)中のトリフェニルホスフィン(５.７５ｇ)の溶液に、窒素下、０℃で、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(４.５５ml)を滴下した。混合物を０℃で４５分間撹拌し、次にＴＨＦ(５０ml)中の、チオ安息香酸(３.０５ml)と、段階(ｂ)の生成物(２.６０ｇ)の溶液を０℃で滴下した。添加完了後、混合物を室温で２４時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフィー(シリカ, 溶出液として１０％ジエチルエーテル／イソヘキサン)によって精製し、副題化合物を黄色の固体として得た(３.３０ｇ)。
1H NMR 300MHz (CDCl3) 7.95 (2H, m), 7.56 (1H, m), 7.28-7.44 (7H, m), 4.94 (1H, m), 4.75 (1H, bs), 3.70 (2H, m), 1.38 (9H, s).
【００５９】
ｄ) １,１−ジメチルエチル [(２Ｓ)−２−[(２−シアノ−５−メチル−３−チエニル)チオ]−２−フェニルエチル]カルバメート
Ｓ−[(１Ｓ)−２−[[(１,１−ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]−１−フェニルエチル]ベンゼンカルボチオエート(２１０mg)を、メタノール中 ７Ｍ アンモニア(１０ml)に溶解し、窒素下で２時間撹拌した。溶液を蒸発乾固し、残渣を乾燥ＤＭＦ(１０ml)に溶解した。この溶液に、段階(ａ)の生成物(１２０mg)を加え次に炭酸セシウム(１９５mg)を加えた。反応混合物を２４時間撹拌し、水に注ぎ、酢酸エチル(３×５０ml)で抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、乾燥した(ＭｇＳＯ４)。溶媒を蒸発させて除き、残渣をクロマトグラフィー(シリカ, 溶出液として２０％ 酢酸エチル／イソヘキサン)によって精製し、副題化合物を油状物として得た(６５mg)。
MS (APCI+ve) m/z 275 [M+H-BOC]+.
【００６０】
ｅ) ３−[[(１Ｓ)−２−アミノ−１−フェニルエチル]チオ]−５−メチル−２−チオフェンカルボニトリル オキサレート
メタノール(５ml)中の段階(ｄ)の生成物(６５mg)の溶液に、４ＭのＨＣｌのジオキサン溶液(５ml)を加えた。混合物を２０℃で２時間撹拌し、溶媒を真空で除去した。残渣を重炭酸ナトリウム水溶液と酢酸エチルの層間に分配した。水相を酢酸エチル(２×５０ml)で抽出し、合わせた抽出物を塩水で洗浄し、乾燥し(ＭｇＳＯ４)、濾過し、真空で濃縮した。残渣を酢酸エチルに溶解し、ジエチルエーテル中のシュウ酸の溶液を加えた。溶液を濾過し、乾燥し、表題化合物を白色の固体として得た(１１mg)。
MS (APCI+ve) m/z 275 [M(+H)]+.
1H NMR 400MHz (DMSO-d6) 7.38 (5H, m), 7.19 (1H, s), 4.74 (1H, m), 3.48 (1H, m), 3.28 (1H, m), 2.50 (3H, s).
【００６１】
スクリーン
本発明による化合物の薬理学的活性を、下記のスクリーンで試験した。
スクリーン１
式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、もしくは ラセミ体の活性を、一酸化窒素合成酵素阻害活性において、Foerstermann et al., Eur. J. Pharm., 1992, 225, 161-165 の手順に基づく手順によって、スクリーニングし得る。一酸化窒素合成酵素は、３Ｈ−Ｌ−アルギニンを３Ｈ−Ｌ−シトルリンに変える。３Ｈ−Ｌ−シトルリンは、カチオン交換クロマトグラフィーによって分離して液体シンチレーション計数によって定量化し得る。
【００６２】
誘発後に、酵素を、培養されたマウスのマクロファージ細胞株 J774A-1 (Imperial Cancer Research Fund の研究所から得た)から製造した。J774A-1 細胞を、１０％ ウシ胎児血清、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および抗生物質(１００単位／ml ペニシリン Ｇ、１００mg/ml ストレプトマイシン、および０.２５mg/ml アンホテリシン Ｂ)を加えた ダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ)中で培養する。細胞を３５mlの培地を含む２２５ｃｍ３フラスコ中で、３７℃で、５％ ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で普通に成長させる。
【００６３】
一酸化窒素合成酵素は、インターフェロン−ｇ(ＩＦＮｇ)およびリポポリサッカライド(ＬＰＳ)に対する応答で、細胞によって産生される。コンフルエントな培養フラスコの培地を除き、１mg/mlのＬＰＳと１０単位／mlのＩＦＮｇを含む２５ml(フラスコ当たり)の新しい培地に置き換える。培養１７〜２０時間後、培養培地のフラスコ表面から細胞のシートをかき取ることによって、細胞の収穫を行う。細胞を遠心分離(１０００Ｇ, １０分間)によって集め、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ ７.５, ２０℃)、１０％(v/v)のグリセロール、０.１％(v/v) Triton-X-100、０.１ｍＭのジチオトレイトール、およびロイペプチン(２mg/ml)、大豆トリプシン阻害剤(１０mg/ml)、アプロチニン(５mg/ml)、およびフッ化 フェニルメチルスルホニル(５０mg/ml)を含むプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む溶液を、細胞のペレットに加えることによってライセートを製造した。
【００６４】
アッセイのために、２５μｌの基質カクテル(５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ ７.５, ２０℃)、４００μＭのＮＡＤＰＨ、２０μＭのフラビン アデニン ジヌクレオチド、２０μＭのフラビン モノヌクレオチド、４μＭのテトラヒドロビオプテリン、１２μＭのＬ−アルギニン、および０.０２５ｍＣｉ  Ｌ−[３Ｈ]アルギニン)を、２５μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中の試験化合物の溶液を含む９６ウェル フィルター プレート(孔のサイズ：０.４５μＭ)に加える。反応は、５０μｌの細胞ライセート(上記で製造)を添加することによって始め、１時間室温でインキュベートした後、３ｍＭ ニトロアルギニンと２１ｍＭのＥＤＴＡの水溶液５０μｌを添加することによって終わらせた。
【００６５】
ラベルされたＬ−シトルリンを、ラベルされたＬ−アルギニンから、Dowex AG-50W を用いて分離した。１５０μｌの２５％ Dowex 50W (Ｎａ＋型)の水性のスラリーをアッセイに加え、その後全体を９６ウェルプレートでろ過した。７５μｌのろ液をサンプリングし、固形シンチラント(scintillant)を含む９６ウェルプレートのウェルに加えた。試料を乾燥させた後、Ｌ−シトルリンをシンチレーション計数によって定量した。
【００６６】
典型的な実験において、基礎活性(basal activity)は、試料７５μｌ当たり３００ｄｐｍであり、試薬コントロールでは１９００ｄｐｍに増大する。化合物の活性は、ＩＣ５０(アッセイ中５０％酵素阻害を示す薬物の濃度)として表し、アミノグアニジン[ＩＣ５０(５０％阻害濃度)が１０μＭ]は、手順を確かめるための標準として試験された。化合物は、濃度の範囲で試験され、ＩＣ５０値を得る阻害から計算される。１００μＭで少なくとも２５％まで酵素を阻害する化合物は、活性があるとして分類され、少なくとも１回再試験にかけられる。
【００６７】
上記のスクリーンにおいて、実施例１の化合物を試験し、１０μＭ未満のＩＣ５０値を得た。このことは、これらが有用な治療活性を示すことが期待されることを示している。
【００６８】
スクリーン２
リコンビナントのヒトのＮＯ合成酵素(ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ、およびｎＮＯＳ)を、E. coli 中で発現し、補因子(ＦＡＤ、ＦＭＮ、Ｈ４Ｂ)、プロテアーゼ阻害剤、リゾチウム、および界面活性剤 CHAPS を含む、Hepes 緩衝液(ｐＨ ７.４)中でライセートを製造した。これらの調製物を、適切な希釈で、様々なアイソフォーム(isoform)の阻害を評価するために用いた。Foerstermann et al.9の方法の適応を用いて、ＮＯＳの阻害を、Ｌ−[３Ｈ]−アルギニンからのＬ−[３Ｈ]−シトルリンの形成を測定することによって決定した。酵素アッセイを、３μＭの[３Ｈ]−アルギニン、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、およびＮＯＳ活性を維持するのに必要な他の補因子(ＦＡＤ、ＦＭＮ、Ｈ４Ｂ、カルモジュリン、Ｃａ２＋)の存在下で行った。様々なＮＯＳ阻害剤がゆっくりとした結合速度を示すか、または時間依存で酵素を不活性化することが報告されていることから、酵素と阻害剤を、アルギニンを添加して反応を始める前に、ＮＡＤＰＨの存在下で、６０分間プレインキュベートした。アッセイをクエンチする前に、インキュベーションをさらに６０分間続け、９６−ウェル形式での Dowex-50W 樹脂でのクロマトグラフィーによって、[３Ｈ]−シトルリンを未反応の基質から分離した。
【００６９】
上記のスクリーンで、実施例１の化合物を試験し、ｉＮＯＳ酵素に対して１０μＭ未満のＩＣ５０値を得た。このことは、これらが有用な治療活性を示すことが期待されることを示している。
【００７０】
スクリーン３
化合物はまた、下記のアッセイで示されるように、ヒト型の誘導型一酸化窒素合成酵素に対して活性を示す。
ヒトの結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１(European Collection of Animal Cell Culture - cell line number 90102540 から得られる)を、１０%(v/v) ウシ胎児血清と、２ｍＭのＬ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃で、５％ ＣＯ２中で、決まった方法で成長させた。
【００７１】
一酸化窒素合成酵素を、ヒトのリコンビナント γ−ＩＦＮ(１０００単位／ml)、ＴＮＦ−α(２００U/ml)、ＩＬ−６(２００U/ml)、およびＩＬ−１β(２５０U/ml)を含む培地の添加によって、細胞中で誘発した。３７℃で１８時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞を温リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。試験化合物の存在下 および非存在下で、１００μＭのＬ−アルギニンと １００μＭのベラパミル−ＨＣｌを含むＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃／５％ ＣＯ２で、さらに５時間細胞をインキュベートした。
【００７２】
亜硝酸塩の蓄積を、Griess 試薬 (１mlの２.５%(v/v) リン酸中の １０mg/mlのスルファニルアミド、１mgのＮ−(１−ナフチル)エチレンジアミン)を伴う培養培地を等体積混合することによって決定した。化合物の存在下での阻害を、未処理の細胞によって生産される亜硝酸塩のレベルに関して計算した。ＩＣ５０値を、化合物の濃度に対する％阻害の片対数プロットから見積もった。
【００７３】
このスクリーンにおいて、実施例１の化合物は、１００μＭ未満のＩＣ５０値を与えた。このことは、これらが有用な治療活性を示すことが予期されることを示している。
【国際調査報告】
2005537281.tif 000024
2005537281.tif 000025
2005537281.tif 000026
2005537281.tif 000027