(57)【要約】本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体に媒介されるシグナリングを高い親和性および特異性で遮断するペプチドおよび他の化合物を識別する方法に関する。これら方法と一緒に開発される検定も開示する。【選択図】図１
2005506518.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング阻害剤を識別する方法であって、
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供すること；
（ｂ）該ペプチドライブラリーを、該Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合についてスクリーニングすること；
（ｃ）天然ペプチドの場合より高い親和性の、該Ｇタンパク質共役型受容体への結合を有する該ペプチドライブラリーのメンバーを選択すること；
（ｄ）候補化合物のライブラリーを提供して、該Ｇタンパク質共役型受容体への結合についてスクリーニングすること；
（ｅ）該候補化合物ライブラリーを、工程（ｃ）で選択される該ペプチドライブラリーのメンバーと競合した該Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合についてスクリーニングすること；そして
（ｆ）工程（ｃ）で選択されるペプチドの場合に等しいまたはそれより高い親和性の、該Ｇタンパク質共役型受容体への結合を有する該候補化合物ライブラリーのメンバーを識別すること
を含む前記方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）または工程（ｅ）のスクリーニングを、無傷のＧタンパク質共役型受容体への結合について調べることによって行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）または工程（ｅ）のスクリーニングを、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内フラグメントへの結合について調べることによって行う請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）のＧタンパク質共役型受容体結合性ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはそのフラグメントである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約７〜約７０アミノ酸の長さである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約７〜約５５アミノ酸の長さである請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約８〜約５０アミノ酸の長さである請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約９〜約２３アミノ酸の長さである請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約１１アミノ酸の長さである請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドが、Ｇαサブユニットカルボキシル末端ペプチドである請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｂ）のスクリーニングが、少なくとも２回連続した結合検定を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記連続した結合検定の少なくとも一つが競合的結合検定である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ｂ）のスクリーニングが競合的結合検定である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記競合的結合検定が、前記ペプチドライブラリーのメンバーと前記Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドとの共インキュベーションを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記競合的結合検定が、前記ペプチドライブラリーのメンバーと前記Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドとの共インキュベーションを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供することができる請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ｅ）の候補化合物が、検出可能シグナルを提供することができる請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記スクリーニングが酵素結合イムノソルベント検定法である請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合を、活性化リガンドと該Ｇタンパク質共役型受容体との相互作用によって生じるシグナルを測定することによって決定する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を決定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｇタンパク質共役型受容体の阻害を決定する請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドライブラリーが組合せペプチドライブラリーである請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記組合せペプチドライブラリーが、タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーが、マルトース結合性タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記工程（ｄ）の候補化合物ライブラリーが、工程（ｃ）で選択される化合物の構造に基づく候補化合物の焦点のライブラリーである請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記酵素結合イムノソルベント検定法が、
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体を固体支持体上に固定すること；
（ｂ）タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーを提供すること；
（ｃ）該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーと、該固定されたＧタンパク質共役型受容体とを、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドの存在下において、該Ｇタンパク質共役型受容体について該Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドと少なくとも同程度に高い結合親和性を有するタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーが、該固定されたＧタンパク質共役型受容体に結合するような条件下でインキュベートすること；
（ｄ）該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーの未結合メンバーを除去すること；
（ｅ）該結合したタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーと、該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーのタンパク質部分を特異的に認識する抗体とを、該抗体が、該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーに特異的に結合するような条件下でインキュベートすること；
（ｆ）未結合抗体を除去すること；そして
（ｇ）該結合した抗体を検出すること
を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーが、マルトース結合性タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーであり、前記抗体が、抗マルトース結合性タンパク質抗体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
酵素結合イムノソルベント検定法であって、
（ａ）Ｇタンパク質共役型受容体を固体支持体上に固定すること；
（ｂ）タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーを提供すること；
（ｃ）該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーと、該固定されたＧタンパク質共役型受容体とを、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドの存在下において、該Ｇタンパク質共役型受容体について該Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドと少なくとも同程度に高い結合親和性を有するタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーが、該固定されたＧタンパク質共役型受容体に結合するような条件下でインキュベートすること；
（ｄ）該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーの未結合メンバーを除去すること；
（ｅ）該結合したタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーと、該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーのタンパク質部分を特異的に認識する抗体とを、該抗体が、該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーに特異的に結合するような条件下でインキュベートすること；
（ｆ）未結合抗体を除去すること；そして
（ｇ）該結合した抗体を検出すること
を含む酵素結合イムノソルベント検定法。
【請求項３２】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーが、マルトース結合性タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーであり、前記抗体が、抗マルトース結合性タンパク質抗体である請求項３３に記載の酵素結合イムノソルベント検定法。
【請求項３３】
前記候補化合物ライブラリーがペプチドライブラリーである請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記候補化合物ライブラリーが低分子量分子ライブラリーである請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法によって識別される化合物。
【請求項３６】
請求項２９に記載の方法によって識別される化合物。
【請求項３７】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング阻害性ペプチドを識別する方法であって、
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供すること；
（ｂ）該ペプチドライブラリーを、該Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合についてスクリーニングすること；そして
（ｃ）天然ペプチドの場合より高い親和性の、該Ｇタンパク質共役型受容体への結合を有する該ペプチドライブラリーのメンバーを選択すること
を含む前記方法。
【請求項３８】
前記工程（ｂ）のスクリーニングを、無傷のＧタンパク質共役型受容体への結合について調べることによって行う請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記工程（ｂ）のスクリーニングを、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内フラグメントへの結合について調べることによって行う請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記工程（ａ）のＧタンパク質共役型受容体結合性ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはそのフラグメントである請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約７〜約７０アミノ酸の長さである請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約７〜約５５アミノ酸の長さである請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約８〜約５０アミノ酸の長さである請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約９〜約２３アミノ酸の長さである請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約１１アミノ酸の長さである請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドが、Ｇαサブユニットカルボキシル末端ペプチドである請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記工程（ｂ）のスクリーニングが、少なくとも２回連続した結合検定を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
前記連続した結合検定の少なくとも一つが競合的結合検定である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記工程（ｂ）のスクリーニングが競合的結合検定である請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
前記競合的結合検定が、前記ペプチドライブラリーのメンバーと前記Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドとの共インキュベーションを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記競合的結合検定が、前記ペプチドライブラリーのメンバーと前記Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドとの共インキュベーションを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供することができる請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記スクリーニングが酵素結合イムノソルベント検定法である請求項３７に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合を、活性化リガンドと該Ｇタンパク質共役型受容体との相互作用によって生じるシグナルを測定することによって決定する請求項３７に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を決定する請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記Ｇタンパク質共役型受容体の阻害を決定する請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ペプチドライブラリーが組合せペプチドライブラリーである請求項３７に記載の方法。
【請求項６０】
前記組合せペプチドライブラリーが、タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーが、マルトース結合性タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである請求項３７に記載の方法。
【請求項６３】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング阻害剤化合物を識別する方法であって、
（ａ）候補化合物のライブラリーを提供して、該Ｇタンパク質共役型受容体への結合についてスクリーニングすること；
（ｂ）高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドを提供すること；
（ｃ）該候補化合物ライブラリーを、該高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドと競合した該Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合についてスクリーニングすること；そして
（ｄ）工程（ｂ）のペプチドの場合に等しいまたはそれより高い親和性の、該Ｇタンパク質共役型受容体への結合を有する該候補化合物ライブラリーのメンバーを識別すること
を含む前記方法。
【請求項６４】
前記工程（ｃ）のスクリーニングを、無傷のＧタンパク質共役型受容体への結合について調べることによって行う請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記工程（ｃ）のスクリーニングを、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内フラグメントへの結合について調べることによって行う請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記工程（ｂ）のＧタンパク質共役型受容体結合性ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはそのフラグメントである請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約７〜約７０アミノ酸の長さである請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約７〜約５５アミノ酸の長さである請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約８〜約５０アミノ酸の長さである請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約９〜約２３アミノ酸の長さである請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記Ｇタンパク質サブユニットフラグメントが、約１１アミノ酸の長さである請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドが、Ｇαサブユニットカルボキシル末端ペプチドである請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である請求項６６に記載の方法。
【請求項７５】
前記工程（ｃ）のスクリーニングが酵素結合イムノソルベント検定法である請求項６６に記載の方法。
【請求項７６】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合を、活性化リガンドと該Ｇタンパク質共役型受容体との相互作用によって生じるシグナルを測定することによって決定する請求項６３に記載の方法。
【請求項７７】
前記Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を決定する請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｇタンパク質共役型受容体の阻害を決定する請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記工程（ａ）の候補化合物ライブラリーが、工程（ｂ）のペプチドの構造に基づく候補化合物の焦点のライブラリーである請求項６３に記載の方法。
【請求項８０】
前記工程（ａ）の候補化合物ライブラリーがコンビナトリーライブラリーである請求項６３に記載の方法。
【請求項８１】
前記コンビナトリーライブラリーが、異種低分子量分子ライブラリーである請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記異種低分子量分子コンビナトリーライブラリーが、薬物様分子を含む請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記異種低分子量分子コンビナトリーライブラリーが、焦点の低分子量分子ライブラリーである請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記焦点の低分子量分子ライブラリーが、薬物様分子を含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記焦点の低分子量分子ライブラリーのメンバーが、工程（ｂ）のペプチドの化学構造に基づいている請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
請求項３７に記載の方法によって識別されるＧタンパク質共役型受容体シグナリング阻害性ペプチド。
【請求項８７】
請求項６３に記載の方法によって識別されるＧタンパク質共役型受容体シグナリング阻害性化合物。
【請求項８８】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞中のＧタンパク質共役型受容体シグナリングを阻害する方法であって、該細胞に、請求項１に記載の方法によって識別される化合物を投与することを含む方法。
【請求項８９】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞中のＧタンパク質共役型受容体シグナリングを阻害する方法であって、該細胞に、請求項３７に記載の方法によって識別される化合物を投与することを含む方法。
【請求項９０】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞中のＧタンパク質共役型受容体シグナリングを阻害する方法であって、該細胞に、請求項６３に記載の方法によって識別される化合物を投与することを含む方法。
【請求項９１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナリングを阻害する方法であって、該Ｇタンパク質共役型受容体のその同族Ｇタンパク質への結合を妨げる該Ｇタンパク質共役型受容体と、ある化合物を接触させることを含む方法。
【請求項９２】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング修飾因子化合物を識別する方法であって、
（ａ）請求項４０に記載の方法によって識別されるペプチドであって、検出可能ペプチドシグナルを提供するように標識されている該ペプチドを提供すること；
（ｂ）候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング修飾因子化合物のライブラリーを提供すること；
（ｃ）該ペプチドと該Ｇタンパク質共役型受容体とを、該ペプチドが該Ｇタンパク質共役型受容体に結合するような条件下で接触させること；
（ｄ）未結合ペプチドを該Ｇタンパク質共役型受容体から除去すること；
（ｅ）該ペプチドに結合したＧタンパク質共役型受容体のシグナリング活性を測定し且つ該検出可能ペプチドシグナルを測定すること；
（ｆ）該候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング修飾因子化合物ライブラリーのメンバーと、該ペプチドに結合したＧタンパク質共役型受容体とを接触させること；
（ｇ）該ペプチドに結合したＧタンパク質共役型受容体のシグナリング活性を測定し且つ該検出可能ペプチドシグナルを測定すること；
（ｈ）該Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング活性が、該候補化合物との接触後に増加するかまたは減少するかどうか、およびＧタンパク質共役型受容体ペプチド結合が、該候補化合物との接触後に増加するかまたは減少するかどうか決定すること；そして
（ｉ）該ペプチドに結合したＧタンパク質共役型受容体との接触が、該Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合の増加およびＧタンパク質共役型受容体シグナリングの増加の両方を引き起こす化合物を識別し且つ該ペプチドに結合したＧタンパク質共役型受容体との接触が、該Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合の増加およびＧタンパク質共役型受容体シグナリングの減少の両方を引き起こす化合物を識別すること
を含む前記方法。
【請求項９３】
前記ペプチドに結合したＧタンパク質共役型受容体の前記シグナリング活性を測定する方法が、
（ａ）イノシトールリン酸蓄積を測定すること；
（ｂ）細胞内Ｃａ２＋レベルを測定すること；
（ｃ）経内皮電気抵抗を測定すること；
（ｄ）ストレスファイバー形成を測定すること；
（ｅ）リガンド結合を測定すること；
（ｆ）受容体発現を測定すること；
（ｇ）受容体脱感作を測定すること；
（ｈ）キナーゼ活性を測定すること；
（ｉ）ホスファターゼ活性測定すること；
（ｊ）核転写因子を測定すること；
（ｋ）全ての遊走（走化性）を測定すること；
（ｌ）スーパーオキシド形成を測定すること；
（ｍ）酸化窒素形成を測定すること；
（ｎ）細胞脱顆粒を測定すること；
（ｏ）ＧＩＲＫ活性を測定すること；
（ｐ）アクチン重合を測定すること；
（ｑ）血管収縮を測定すること；
（ｒ）細胞透過性を測定すること；
（ｓ）アポトーシスを測定すること；
（ｔ）細胞分化を測定すること；
（ｕ）プロテインキナーゼＣのような、ＧＰＣＲ活性化で移動する（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅ）タンパク質の膜会合を測定すること；
（ｖ）プロテインキナーゼＣのような、ＧＰＣＲ活性化で移動するタンパク質のサイトゾル蓄積を測定すること；
（ｗ）ｓｒｃのような、ＧＰＣＲ活性化で移動するタンパク質のサイトゾル蓄積を測定すること；および
（ｘ）Ｒａｎのような、ＧＰＣＲ活性化で移動するタンパク質の核会合を測定することから成る群より選択される請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４から成る群より選択されるペプチドを含む、請求項１に記載の方法によって識別される化合物。
【請求項９５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４から成る群より選択される化合物。
【請求項９６】
請求項９４に記載の化合物をコードしているミニ遺伝子構築物。
【請求項９７】
請求項９５に記載の化合物をコードしているミニ遺伝子構築物。
【請求項９８】
治療的Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング修飾因子ペプチドを哺乳動物に与える方法であって、該哺乳動物に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４によるペプチドを発現する発現構築物を投与することを含む前記方法。
【請求項９９】
請求項９８にしたがって化合物を投与することを含む、過剰のＧタンパク質共役型受容体シグナリングが原因である疾患状態を処置する方法。
【請求項１００】
前記ペプチドを発現構築物によって供給する請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記化合物が非ペプチド薬である請求項１００に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．技術分野
本出願は、２００１年３月１４日出願の先行同時係属仮出願第６０／２７５，４７２号から優先権を主張する。本発明は、概して、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をモジュレーションする分野およびＧタンパク質共役型受容体阻害性化合物を識別し且つ製造する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景技術の説明
極めて多数の化学的メッセンジャーは、Ｇタンパク質共役型受容体に結合することによって細胞に作用する。それら受容体へのリガンド結合は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質によって細胞内応答へと伝達される。４種類の主なＧタンパク質クラス、すなわち、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｑおよびＧ１２が区別しうる。Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）には、ホルモン受容体、ウイルス受容体、成長因子受容体、ケモカイン受容体、感覚受容体および神経受容体のような広範囲の生物学的に活性な受容体が含まれる。これら受容体は、細胞外結合部位へのリガンドの結合によって活性化され、そして種々のＧタンパク質によってそれらの作用を媒介する。受容体とＧタンパク質との間に生じるこれら分子相互作用は、特異的細胞応答への環境シグナルの伝達の基礎となっている。Ｇタンパク質自体は、リガンド結合シグナルへの細胞応答の特異性および時間的特性を決定する場合に重要な役割を果たしている。
【０００３】
不活性状態において、Ｇタンパク質は、一つのα、一つのβおよび一つのγサブユニットと、結合したデオキシグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）とから成るヘテロ三量体である。αサブユニットへのデオキシグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合を生じる、受容体に触媒されるグアニンヌクレオチド交換は、Ｇタンパク質を活性化させる。Ｇα−ＧＴＰは、Ｇβγサブユニットから解離し、そのＧβγ二量体およびＧα−ＧＴＰサブユニットが各々、下流のエフェクターを活性化させる。ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解は、この複合体を失活させ、細胞応答を消失させる。
【０００４】
Ｇタンパク質共役型受容体は、細胞内側膜上にＧタンパク質結合性ドメインを形成する７個の膜貫通ヘリックスを有する。実験は、リガンド結合による受容体の活性化が、受容体のコンホメーションを変化させて、受容体の細胞内表面上のＧタンパク質結合性部位を隠していないことを示唆している。ヘテロ三量体Ｇタンパク質とＧＰＣＲとは、Ｇαサブユニットのカルボキシル末端におけるそれらの間の主な接触部位について多重部位様式で相互作用する。Hamm et al., Science 241:832-5,1988; Osawa and Weiss, J.Biol.Chem. 270:31052-8,1995; Garcia et al., EMBO J. 14:4460-9,1995; Sullivan et al., J.Biol.Chem. 269:21519-21525,1994; West et al., J.Biol.Chem. 260:14428-30,1985。
【０００５】
カルボキシル末端の１１アミノ酸は、受容体相互作用およびこの相互作用の特異性に最も重要であるが（Martin et al., J.Biol.Chem. 271:361-366,1996; Kostenis et al., Biochemistry 36:1487-1495,1997）、しかしながら、Ｇα上の他の領域も、受容体接触に関与している。更に、Ｇβγ二量体の部分は、ＧＰＣＲ結合に関連している。Onrust et al., Science 275:381-384,1997; Lichtarge et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7507-7611,1996; Mazzoni and Hamm, J.Biol.Chem. 271:30034-30040,1996; Bae et al., J.Biol.Chem. 272:32071-32077,1997 を参照されたい。Ｇαタンパク質のカルボキシル末端アミノ酸領域（およびヘテロ三量体Ｇタンパク質の他のＧＰＣＲ結合性領域）は、受容体に媒介されるＧタンパク質活性化の分子基準を与えるのみならず、受容体活性化の忠実度を決定する場合にも重要な役割を果たす。Conklin et al., Nature 363:274-276,1993; Conklin et al., Mol.Pharmacol. 50:885-890,1996。
【０００６】
Ｇタンパク質複合体は、このように、受容体から１種類またはそれを超える特定のエフェクターへとシグナルを中継する中間体としての、およびシグナルの継続時間を調節する時計としての複雑な役割を果たしている。Hamm and Gilchrist, Curr.Opin.Cell Biol. 8:189-196,1996。多数の受容体が、単一Ｇタンパク質サブタイプを活性化することができるが、ある場合には、単一受容体が、２種類を超えるＧタンパク質を活性化させ、それによって多数の細胞内シグナルを媒介することができる。しかしながら、他の場合には、受容体とＧタンパク質との相互作用は、特定のヘテロ三量体だけが結合しているような極めて選択的な方式で調節される。
【０００７】
Ｇタンパク質およびそれらの受容体は、極めて多数の異なった化学的リガンドによって媒介される極めて多数の細胞内シグナルに影響するので、疾患病理のモジュレーションにかなり可能性がある。多数の医学的に有意の生物学的過程は、Ｇタンパク質シグナル伝達経路およびそれらの下流のエフェクター分子によって影響される。Holler et al., Cell.Mol.Life Sci. 340:1012-20,1999 を参照されたい。したがって、Ｇタンパク質共役型受容体およびそれらのリガンドは、多数の医薬製品のための標的であり且つ熱心な薬物発見努力の焦点である。過去１５年間にわたり、ＧＰＣＲを標的とするほぼ３５０種類の治療薬が、首尾よく市場に導入されてきている。Ｇタンパク質に媒介されるシグナリングシステムの偏在する性状および極めて多数の病理学的状態へのそれらの影響ゆえに、これらシステムをモジュレーションする新しい方法を発見することが大いに望まれる。
【０００８】
ＧＰＣＲに影響を及ぼす最も容易に入手可能な薬物は、Ｇタンパク質共役型受容体とその１種類または複数の細胞外リガンドとの間の結合に拮抗することによって作用する。もう一方において、受容体サブタイプ選択的薬物は、入手するのが困難であった。リガンド結合を妨げるように薬物を設計する古典的アプローチへの障害は、慣用的なアンタゴニストが、受容体の酵素的切断およびつながれたリガンドの発生の独特の機構のために、プロテイナーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）のような若干のＧＰＣＲに無効であるということであった。他の場合、受容体の固有のまたは構成的活性は、直接的に病変をもたらし、したがって、リガンド結合論の拮抗作用が示される。これら理由のために、ＧＰＣＲ活性化およびシグナリングの結果を遮断するための代わりの標的が大いに望まれる。
【０００９】
新しい薬剤による阻害に可能性のある一つの代わりの標的は、原形質膜内部の受容体−Ｇタンパク質界面であった。Konig et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6878-82,1989; Acharya et al., J.Biol.Chem. 272:651924,1997; Verrall et al., J.Biol.Chem. 272:6898-902,1997。Ｇαのカルボキシル末端およびＧタンパク質ヘテロ三量体の他の領域は、受容体の細胞質表面における結合部位に当てはまる。Sondek et al., Nature 372:276-9,1994; Lambright et al., Nature 369:621-8,1994; Lambright et al., Nature 379:311-9,1996; Sondek et al., Nature 379:369-74,1996; Wall et al., Science 269:1405-12,1996; Mixon et al., Science 270:954-960,1995。これら結合性領域に該当するまたはこれら領域を模倣するペプチドは、受容体シグナリングを遮断することができるしまたは受容体の活性なアゴニスト結合コンホメーションを安定化させることができる。Hamm et al., Science 241:832-5,1988; Gilchrist et al., J.Biol.Chem. 273:14912-9,1998。例えば、桿体光受容体であるロドプシンの場合、Ｇα  Ｃ末端ペプチドであるＧα３４０−３５０は、受容体をその活性なメタロドプシンIIコンホメーションで安定化させる。Hamm et al., Science 241-832-5,1988; Osawa and Weiss, J.Biol.Chem. 270:31052-31058,1995。同様に、ＧαＳからの二つのカルボキシル末端ペプチド（３５４−３７２および３８４−３９４）は、Ｇαｉ２からの該当するペプチドではないが、β２アドレナリン受容体への高親和性アゴニスト結合を引き起こし且つＧαｓおよびアデニリルシクラーゼを活性化させるそれらの能力を阻害する。Rasenick et al., J.Biol.Chem. 269:21519-21525,1994。
【００１０】
概して、ＧＰＣＲは、活性化のためにアゴニスト結合を必要とする。しかしながら、受容体アミノ酸配列への修飾は、リガンドを必要とすることなく、活性状態コンホメーションを安定化させることができる。このようなリガンドに依存しない手段による安定化を、「構成的受容体活性化」と称する。突然変異受容体における構成的（またはアゴニストに依存しない）シグナリング活性は、充分に証明されているが、わずか数種類のＧＰＣＲだけが、野生型（または天然）の形でアゴニストに依存しない活性を示すことが分かっている。例えば、天然ドーパミンＤ１ＢおよびプロスタグランジンＥＰ１ｂ受容体は、構成的活性を有する（Tiberi and Caron, J.Biol.Chem. 269:27925-27931,1994; Hasegawa et al., J.Biol.Chem. 271:1857-1860,1996）。ヒトに疾患を引き起こす多数のＧＰＣＲ、例えば、甲状腺刺激ホルモンの受容体（Vassart et al., Ann.N.Y.Acad.Sci. 766:23-30,1995）は、アゴニストに依存しない活性を示すように突然変異されることが判明している。実験的には、いくつかの単一アミノ酸突然変異が、アゴニストに依存しない活性を生じていた。例えば、第三細胞質ループ中の単一部位で突然変異したβ２およびα２アドレナリン受容体は、構成的活性を示す（Ren et al., J.Biol.Chem. 268:16483-16487,1993; Samama et al., Mol.Pharmacol. 45:390-394,1994）。ある場合には、ＧＰＣＲのカルボキシ尾部中または細胞内ループ中の大きい欠失突然変異が、構成的活性をもたらしていた。例えば、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体の場合、カルボキシル末端の先端切断欠失（truncation deletion）（Nussenzveig et al., J.Biol.Chem. 268:2389-2392,1993; Matus-Leibovitch et al., J.Biol.Chem. 270:1041-1047,1995）またはトロンビン受容体の第二細胞外ループ中のより小さい欠失（Nanevicz et al., J.Biol.Chem. 270:21619-21625,1995）が、受容体を構成的に活性にする。
【００１１】
これら知見は、伝統的な受容体理論の修正をもたらした（Samama et al., J.Biol.Chem. 268:4625-4636,1993）。現在、受容体は、少なくとも二つのコンホメーション、すなわち、不活性コンホメーション（Ｒ）および活性コンホメーション（Ｒ＊）で存在しうると考えられ、そして大部分の受容体においてこれら二つの状態の間には、Ｒ＊よりＲが著しく好ましい平衡が存在すると考えられる。若干の天然受容体および上記の突然変異体の場合、充分に多数の受容体を活性なＲ＊状態にしてシグナリングを開始させるアゴニストの不存在下において平衡の移動が存在するということが報告されている。
【００１２】
負の拮抗作用は、ある薬物が、構成的活性を示す受容体に結合し且つこの活性を低下させる場合に示される。負の拮抗作用は、受容体を不活性状態にさせることによって作用すると考えられる（Samama et al., Mol.Pharmacol. 45:390-394,1994）。他の受容体システムで初めて記載されたが（Schutz and Freissmuth, J.Biol.Chem. 267:8200-8206,1992）、負の拮抗作用は、オピオイド受容体（Costa and Herz, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7321-7325,1989; Costa et al., Mol.Pharmacol. 41:549-560,1992）、β２アドレナリン受容体（Samama et al., Mol.Pharmacol. 45:390-394,1994; Pei et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2699-2702,1994; Chidiac et al., Mol.Pharmacol. 45:490-499,1994）、セロトニン２Ｃ型受容体（Barker et al., J.Biol.Chem. 269:11687-11690,1994）、ブラジキニン受容体（Leeb-Lundberg et al., J.Biol.Chem. 269:25970-25973,1994）およびＤ１Ｂドーパミン受容体（Tiberi and Caron, J.Biol.Chem. 269:27925-27931,1994）のようなＧＰＣＲについて生じることが分かっている。構成的に活性な受容体の概念は、病態生理学的状態を説明する洞察を与えるということが言える。例えば、高血圧症のような疾患過程における構成的に活性な受容体は、もはや、交感神経系の影響下にないことがありうる。高血圧症の場合、構成的に活性なＧＰＣＲは、脳、腎または末梢血管を含めたいずれか多数の部位で発現されることがありうる。望ましくない構成的活性を低下させる新たに認識されるクラスの薬物（負のアンタゴニストまたは逆アゴニスト）は、重要な新しい治療薬として作用することができる。したがって、天然のおよび突然変異したＧＰＣＲ双方の負のアンタゴニストを識別するための技術には、重要で予測可能な、更には、未だ実現されていない医薬用途がある。更に、構成的に活性なＧＰＣＲは腫瘍形成性であるので、これらＧＰＣＲについての負のアンタゴニストの識別は、抗腫瘍薬および／または抗細胞増殖薬の開発をもたらしうる。
【００１３】
Ｇαｔのこの同じ領域の突然変異誘発は、ロドプシンによるＧαｔ活性化に決定的なこの結合性領域中においていくつかの特定のアミノ酸残基を識別した。Martin et al., J.Biol.Chem. 271:361-6,1996。Ｇαｑからの３〜５個のカルボキシル末端アミノ酸の該当するＧαｉからの残基での置換は、Ｇαｉサブユニットによって排他的にシグナルを与える受容体が、キメラのαサブユニットを活性化させ且つＧαｑエフェクターであるホスホリパーゼＣβを刺激することを可能にした。Conklin et al., Nature 363:274-276,1993; Conklin et al., Mol.Pharmacol. 50:885-890,1996。これら研究はいずれも、Ｇαカルボキシルペプチド配列が、個々のＧタンパク質のシグナリング応答の特異性の原因となっているということを示唆している。数百種類がクローン化されているいろいろなＧＰＣＲとの特異的相互作用を媒介すると考えられる１６種類の独特のＧαサブユニット（Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、ＧαＯ１、ＧαＯ２、ＧαＺ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇα５、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１５／１６、ＧαＯＩＦおよびＧαｇｕｓｔ）が存在する。したがって、ＧＰＣＲを結合するＧタンパク質領域に該当するペプチドは、受容体−Ｇタンパク質相互作用の競合阻害剤として用いうると考えられる。Hamm et al., Science 241-832-5,1988; Gilchrist et al., J.Biol.Chem. 273-14912-9,1998。しかしながら、この好機を利用する薬物発見アプローチは入手可能ではない。Jones et al., Expert Opin.Ther.Patents 9(12):1641,1999。
【００１４】
最新の薬物発見法の重要な側面は、最新の高処理スクリーニング検定で用いるための強力なリード（lead）化合物の識別である。高処理スクリーニングを用いた製薬会社に立ちはだかる主な難題の一つは、極めて大きいコンビナトリーライブラリーから有用なリード化合物を識別することの難しさである。文字通り何十万もの化合物をスクリーニングする場合、（偽陽性を含めた）陽性と判定される化合物を特性決定することは、費用のかかる且つ時間を浪費する方法である。したがって、強力なリード化合物を識別することができ且つスクリーニング法での偽陽性の数を減少させることができる方法は、大いに望まれると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
発明の要旨
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング阻害剤を識別する方法であって、
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；（ｂ）このペプチドライブラリーを、そのＧタンパク質共役型受容体への高親和性結合についてスクリーニングし；（ｃ）天然ペプチドの場合より高い親和性の、そのＧタンパク質共役型受容体への結合を有するこのペプチドライブラリーのメンバーを選択し；（ｄ）候補化合物のライブラリーを提供して、そのＧタンパク質共役型受容体への結合についてスクリーニングし；（ｅ）この候補化合物ライブラリーを、工程（ｃ）で選択されるそのペプチドライブラリーのメンバーと競合したそのＧタンパク質共役型受容体への高親和性結合についてスクリーニングし；そして（ｆ）工程（ｃ）で選択されるペプチドの場合に等しいまたはそれより高い親和性の、そのＧタンパク質共役型受容体への結合を有するこの候補化合物ライブラリーのメンバーを識別することを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明は、更に、もう一つの態様において、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）法であって、（ａ）Ｇタンパク質共役型受容体を固体支持体上に固定し；（ｂ）タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーを提供し；（ｃ）このタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーと、この固定されたＧタンパク質共役型受容体とを、そのＧタンパク質共役型受容体結合性ペプチドの存在下において、そのＧタンパク質共役型受容体についてそのＧタンパク質共役型受容体結合性ペプチドと少なくとも同程度に高い結合親和性を有するタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーが、この固定されたＧタンパク質共役型受容体に結合するような条件下でインキュベートし；（ｄ）そのタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーの未結合メンバーを除去し；（ｅ）その結合したタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーと、そのタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーのタンパク質部分を特異的に認識する抗体とを、この抗体が、そのタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーに特異的に結合するような条件下でインキュベートし；（ｆ）未結合抗体を除去し；そして（ｇ）その結合した抗体を検出する工程を含む酵素結合イムノソルベント検定法を提供する。
【００１７】
なおもう一つの態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング阻害性ペプチドを識別する方法であって、（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；（ｂ）このペプチドライブラリーを、そのＧタンパク質共役型受容体への高親和性結合についてスクリーニングし；そして（ｃ）天然ペプチドの場合より高い親和性の、そのＧタンパク質共役型受容体への結合を有するこのペプチドライブラリーのメンバーを選択することを含む方法を提供する。
【００１８】
なおもう一つの態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング阻害剤化合物を識別する方法であって、（ａ）候補化合物のライブラリーを提供して、そのＧタンパク質共役型受容体への結合についてスクリーニングし；（ｂ）高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドを提供し；（ｃ）この候補化合物ライブラリーを、この高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合性ペプチドと競合したそのＧタンパク質共役型受容体への高親和性結合についてスクリーニングし；そして（ｄ）工程（ｂ）のペプチドの場合に等しいまたはそれより高い親和性の、そのＧタンパク質共役型受容体への結合を有するこの候補化合物ライブラリーのメンバーを識別することを含む方法を提供する。
【００１９】
なおもう一つの態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体シグナリングを阻害する方法であって、Ｇタンパク質共役型受容体のその同族Ｇタンパク質への結合を妨げるそのＧタンパク質共役型受容体とある化合物を接触させることを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、なおもう一つの態様において、化合物であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４から成る群より選択される化合物を提供する。
【００２１】
なおもう一つの態様において、本発明は、治療的Ｇタンパク質共役型受容体シグナリング修飾因子ペプチドを哺乳動物に与える方法であって、その哺乳動物に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４によるペプチドを発現する発現構築物を投与することを含む方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
好ましい態様の詳細な記述
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）とその同族Ｇタンパク質との間の界面での結合を妨げることができる化合物を識別する方法に関する。これら化合物は、Ｇタンパク質に媒介されるシグナリングを阻害し、したがって、薬剤として、潜在的に有用な薬物の識別用のリード（ｌｅａｄ）化合物として、および薬物候補を識別する検定の成分として用いることができる。スクリーニングおよび薬物識別の方法は、Ｇタンパク質のＧＰＣＲ結合性領域の構造を模倣し且つ受容体−Ｇタンパク質相互作用を特異的に且つ高親和性で阻害できるペプチドを使用する。これら高親和性ペプチドは、発現構築物の場合、細胞中に供給されて、in vitro および in vivo の特異的受容体に媒介される細胞応答の遮断薬として作用することができるし、または患者に直接的に投与することができる。これらペプチドは、伝統的な医薬化合物を与えるためのスクリーニング、識別および選択の方法の根本原理にもなっている。具体的には、本発明は、特定のＧタンパク質について受容体−Ｇタンパク質界面を遮断する高親和性類似体ペプチドを識別すること、および高処理スクリーニングでこれら高親和性類似体を用いて、Ｇタンパク質またはＧタンパク質クラスについてＧＰＣＲシグナリングに同様に特異的に拮抗する他のペプチドまたは低分子量分子を識別することを可能にする。
【００２３】
低分子量分子は、類似の高処理スクリーニング法で用いられて、化合物を更に識別することができる。「低分子量分子」とは、ＧＰＣＲの界面領域に結合するまたは結合を妨げる、またはこのような作用の候補であるいずれかの非ペプチド有機化合物を意味する。受容体−Ｇタンパク質界面において支配されるこれらペプチドまたは低分子量分子は、本発明の方法を用いて、ＧＰＣＲを介するシグナリングを使用する生物学的過程を阻害するように設計することができる。このアプローチは、入手可能なアンタゴニストリガンドが存在しないＧタンパク質−ＧＰＣＲ相互作用、リガンドが知られていないオーファン受容体、突然変異体の構成的活性受容体、グレーヴズ病におけるＴＳＨ受容体のような抗体に架橋した不可逆活性受容体、およびプロテイナーゼ活性受容体（ＰＡＲ）に標的指向する場合に有用である。しかしながら、それは、いずれのＧＰＣＲ−Ｇタンパク質相互作用についても、より広範囲には、概して、受容体−タンパク質相互作用について等しく充分に役立つ。
【００２４】
この方法は、事実上、いずれのＧＰＣＲにも拮抗しうる高親和性化合物を識別するのに有用であるので、このアプローチは、特定のクラスのＧタンパク質が関係している機能不全または疾患を予防する、改善するまたは直すことができる化合物を識別する場合に有用である。この方法が有用である状態および疾患状態には、発作；心筋梗塞；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；低血圧症；高血圧症；狭心症；急性心不全；心筋細胞アポトーシス；癌；細菌、真菌、原生動物およびウイルスの感染のような感染、具体的には、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染；敗血症性ショック；痛み；慢性アレルギー性疾患；喘息；炎症性腸疾患；骨粗鬆症；慢性関節リウマチ；グレーヴズ病；術後イレウス；尿閉；精巣中毒症；潰瘍；肥満症；良性前立腺肥大；および不安、癲癇、精神分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、アルツハイマー病、せん妄、痴呆、薬物嗜癖、食欲不振、過食症、気分障害および睡眠障害を含めた精神病性および神経学的障害；喫煙中止、およびＧタンパク質共役型受容体阻害によって処置することができるいずれか他の疾患または状態が含まれるが、これに制限されるわけではない。この一連の様々な障害の処置は、いろいろなＧタンパク質が結合する受容体が、異なったＧＰＣＲまたは異なったクラスまたは群のＧＰＣＲを特異的に妨げることができる一連の類似体ペプチドを生じさせるように充分に異なるので、可能である。
【００２５】
本発明のスクリーニング法では、特定のスクリーニングで識別される配列は、全ての受容体に結合するのではなく、具体的な目的の受容体にだけ結合する。Ｇタンパク質とＧＰＣＲとの間の相互作用は、極めて特異的である。例えば、１個のアミノ酸の相違は、Ａ１アデノシンＧタンパク質共役型受容体−Ｇタンパク質界面を結合するＧαｉ１／２ペプチドの能力を実質的に減少させるまたは除去することができる。Gilchrist et al., J.Biol.Chem. 273:14912-14919,1998。Ｇタンパク質上のＧＴＰ／ＧＤＰ交換の上流調節およびＧタンパク質に媒介されるエフェクター活性化はどちらも、界面結合性化合物で阻害されることがありうる。したがって、高親和性類似体ペプチドは、一つのＧＰＣＲの特定の作用を特異的に妨げるように設計することができる。これら特異的に作用するペプチド類似体は、それ自体で医薬化合物としても、同じ特異的ＧＰＣＲ相互作用を有する他のペプチドおよび低分子量分子結合剤についての最新の高処理スクリーニングにおける強力なリード化合物としても有用である。
【００２６】
高処理スクリーニングは、主に医薬産業の中で開発されてきた最近の技術である。それは、新しい生物学的標的の豊富さおよび変化した商業環境において速やかに新規な薬物を産み出す医薬産業の要求に応えて生まれてきている。その開発は、新しい機器化の発明によって、新しい検定法によって、および極めて多数のデータポイントを効果的に処理することを可能にするデータベースの利用可能性によって助けられてきている。コンビナトリーケミストリー、合理的設計および実験室手順の自動化と組み合わされた高処理スクリーニングは、伝統的な一度に一化合物（one-compound-at-a-time）アプローチと比較して有意に加速された薬物発見法をもたらしてきている。
【００２７】
この薬物発見法の一つの決定的な側面は、強力なリード化合物の識別である。試験するための化合物の全くランダムな選択は、ある与えられた受容体に対する多くの活性化合物を生じるとは考えられない。典型的には、製薬会社は、１回のスクリーニングにつき１００，０００種類またはそれを超える化合物をスクリーニングして、約１００種類の可能性のあるリード化合物を識別する。実際には、これら化合物の内、平均して一つまたは二つだけがリード化合物系列をもたらす。したがって、製薬会社は、有用な化合物の探索において、ますます大きいデータセットを検定してきている。次に、化合物への接近容易性は、歴史的化合物集合のサイズおよび利用可能性に限界があるという問題を生じている。対照的に、大きいコンビナトリーケミストリーライブラリーは、要求があり次第であるが、かなりの技術的難しさおよび費用で合成することができる。ライブラリーサイズが拡大するにつれて、これら極めて大きいコンビナトリーライブラリーから所望の化合物を選択することが難しくなっている。文字通り何十万もの化合物をスクリーニングする場合、それは、（人工的および実在の）候補リード化合物を特性決定することを、費用のかかる且つ時間を浪費する方法にさせる。
【００２８】
ここに記載される薬物発見法への多段アプローチは、これら問題の多くに解決法を与える。本発明の一つの態様は、Ｇタンパク質／ＧＰＣＲ相互作用の高親和性競合阻害剤として作用するペプチドを識別するのに、Ｇタンパク質αサブユニットカルボキシル末端の性状を利用する。この方法は、しかしながら、いずれか特定のタンパク質−タンパク質、タンパク質−低分子量分子、タンパク質−核酸の相互作用または類似のものについて用いることができる。更に、Ｇαサブユニットのいずれかの領域またはＧβα二量体のいずれかの領域に基づくペプチドは、ＧＰＣＲ結合に関与していて、同様に用いることができる。多数のこのようなＧＰＣＲ結合性領域が、当該技術分野において知られている。高親和性の競合相手の識別は、具体的な高親和性リード化合物を、これに対して潜在的に有用な薬剤を調べるために与えることによって、高処理スクリーニングの欠点の多くを克服するスクリーニングおよび選択方法での最初の工程となる。この方法によって選択されるペプチドは、それらの結合性パートナーに天然タンパク質より１，０００倍までまたはそれを超えて高い親和性を有するので、この工程は、有用な医薬化合物を首尾よくスクリーニングし且つ識別するための一つの鍵である。
【００２９】
この方法の次の工程は、最初の工程で識別される高親和性リードペプチドに対する候補ペプチドまたは低分子量分子医薬化合物の高処理スクリーニングを行う。これらリードペプチド化合物は、所望の受容体への強力且つ特異的な結合剤であるので、競合阻害剤であり、したがってこのペプチドの結合を減少させる（それらの高親和性結合を妨げる）化合物について調べるスクリーニング検定は、有用な親和性で結合するそれら候補化合物の識別を容易にするであろう。それによって、薬物発見法の高処理スクリーニング工程は、偽陽性化合物、および結合剤として識別されるが低親和性でしか結合しない化合物の数が減少するまたは事実上排除されるので、極めて単純化される。成功の可能性が高いそれら化合物だけが、このスクリーニングによって識別されるので、有用で具体的な強力医薬化合物を識別するために特定決定され且つ更に研究される必要がある化合物はより少ない。更に、この方法は、目的の正確な部位への直接的結合によって化合物を識別するので、新たに識別される医薬化合物の結合機構および作用機構は、発見され且つ後で確証される必要がない。
【００３０】
これら識別される高親和性ペプチドは、ＧＰＣＲ逆アゴニストを識別するのに用いることもできる。これら高親和性ペプチドは、受容体を結合し且つそれを活性なまたは「Ｒ＊」コンホメーションで安定化させる。強力なアゴニストを識別するのに用いられるスクリーニングは、この結合と競合し且つＧＰＣＲをそのＲ＊状態で安定化させることもできる化合物を見つけ出す。もう一方において、逆アゴニストは、ＧＰＣＲを不活性なまたは「Ｒ」状態で安定化させる。したがって、高親和性ペプチドの解離またはＧＰＣＲへのその親和性の減少を検出するように設計されるスクリーニングは、逆アゴニストを識別するのに用いられる。
【００３１】
本明細書は、Ｇタンパク質共役型受容体とその同族Ｇαタンパク質との間の相互作用に関する例を提供するが、その方法論は、具体的には、ＧαまたはＧβγＧタンパク質サブユニットのいずれかの領域とＧＰＣＲとの間のいずれの相互作用も含めた大部分のタンパク質−タンパク質相互作用のペプチド阻害剤を識別するのに用いることができる。この方法によって選択される高親和性ペプチドは、高処理スクリーニングで用いられて、種々の具体的な生物学的過程のモジュレーターとして用いることができる低分子量分子を識別することができる。
【００３２】
極めて高い親和性ペプチドＧＰＣＲ遮断薬を生じるためには、野生型Ｇαカルボキシル末端ペプチドまたはその受容体結合コンホメーションでのいずれか他のＧＰＣＲ結合性ペプチドの三次構造を、例えば、ｔｒＮＯＥＳＹ（ＮＭＲ）を用いて研究することができる。Dratz et al., Nature, 363:276-280,1993。Ｇタンパク質領域のこれらタイプの研究に由来する構造データを、置換されたペプチド類似体の活性の分析と組み合わせて、ＧＰＣＲとペプチドの相互作用についての最小の構造的必要条件を決定する。次の実験システムは、受容体−Ｇタンパク質相互作用を決定するのに用いることができるシステムの例である。（ｉ）網膜桿体細胞中のロドプシン−トランスデューシン（Ｇαｔ）、（ii）Ｃ６グリオーム細胞中のβアドレナリン受容体−Ｇαｓ、（iii）チャイニーズハムスター卵巣細胞中のアデノシンＡ１受容体−Ｇα１、（iv）ラット海馬ＣＡ１錐体ニューロン（nevrons）中のＧＡＢＡＢ受容体−Ｇα１、（ｖ）ヒト胚性腎細胞中のムスカリンＭ２受容体−Ｇα１等。好都合であるまたは望まれるいずれのＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ群も、相互作用必要条件を決定するのに用いることができ、熟練者は、この種類の受容体結合における構造−活性関係を理解するための多数の方法を承知している。これら方法のいずれもが、これら方法での使用が考えられ、例示される態様の具体的な方法の代わりに置き換えることができる。
【００３３】
プラスミドディスプレイ方法は、タンパク質−タンパク質相互作用の競合阻害剤として役立ちうる特異的且つ強力なペプチドを識別する有効な手段を提供する。構造−活性研究から収集される情報を用いて、ＧαサブユニットまたはＧβγのクラスの各々のＧＰＣＲ結合性領域、例えば、Ｇαサブユニットカルボキシル末端に関係するいろいろなペプチドコーディング配列のライブラリーを作成することができる。ライブラリーが基づくことができる代表的な天然の配列には、下の表IIIに挙げられるものが含まれる。このライブラリーは、計算機で生じるランダム置換を配列内に含むペプチドを有利に含有し、極めて多数のペプチド配列を一度に調べることを可能にする。好ましくは、各々のライブラリー中のペプチド配列は、約５０％のアミノ酸残基が天然ＧＰＣＲ結合性領域に一致し且つ残りのアミノ酸残基がいずれかのアミノ酸からランダムに選択されるように構築される。これらペプチドのサイズは、約７〜約５５アミノ酸残基または約８〜約５０アミノ酸残基長さまたは約７〜約７０アミノ酸残基またはそれより長い、好ましくは、約９〜約２３アミノ酸残基であってよい。１１量体ペプチドが最も好適である。約１０％〜約９０％のアミノ酸残基が天然の配列から未変化のライブラリーを構築することができるが、しかしながら、約３０％〜約７０％が未変化であるのが好適であり、約５０％が最も好適である。
【００３４】
或いは、合成ペプチドライブラリーは、タンパク質のランダムに生じるオーバーラップ領域を用いて、ＧＰＣＲと相互作用することが知られているいずれかのタンパク質に基づくことができる。これらペプチドは、約７〜７０アミノ酸長さまたは約８〜５０アミノ酸長さまたは好ましくは、約９〜約２３アミノ酸長さ、最も好ましくは、約１１アミノ酸長さであってよい。これらペプチドをコードしているオリゴヌクレオチドは、有利には、ペプチドのＮ末端にあるリンカー配列と一緒に、ＬａｃＩ遺伝子の３’末端にクローン化されてよい。このリンカー配列は、成功したスクリーニングに必須ではないが、概して、好適である。制限酵素部位は、クローニング目的のためのペプチドコーディング配列のどちらの末端に置かれてもよい。ペプチドライブラリーの略図および一つのペプチド例については、下の表Ｉを参照されたい。用いることができる追加のペプチドは、下の表IIおよび表IIIに示される。実際のペプチド配列をコードしているオリゴヌクレオチドは、７０％の正しい塩基および各々１０％の残りの塩基で合成されて、ペプチド配列に沿ったいずれかの特定の位置に正しいアミノ酸を有する約５０％の可能性で、偏りのあるペプチドライブラリーをもたらす。いろいろな比率の塩基を用いて、配列中のいずれか特定の位置に所望の突然変異誘発率を達成することができる。
【００３５】
【表１】
2005506518.tif 000003
【００３６】
【表２】
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【００３７】
【表３】
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これらペプチドは、結合反応を実施することの便宜および効率のためにディスプレイシステムで有利に合成される。例えば、当該技術分野において知られているようなプラスミドまたはファージのディスプレイシステムを用いてよい。ペプチドディスプレイシステムが好適であるが、ＧＰＣＲとペプチドの有効な接触および結合の決定を可能にするいずれの方法を用いてもよい。
【００３８】
ペプチド展示（「プラスミド上のペプチド」）ライブラリーは、ＬａｃＩとｌａｃＯとの間の高親和性結合を利用する本発明で用いるのに好都合なシステムである。「プラスミド上のペプチド」展示は、二つの主な理由のために、本発明で用いるのに好適である。この技術は、実験室で容易に行われる。更に、提示用タンパク質のカルボキシル末端でのペプチドの融合は、スクリーニングの際にカルボキシル末端ペプチドの通常の提示を模倣する。アミノ末端または内部ペプチドを調べている場合、そのペプチドを、天然の提示を模倣する適当な位置でクローン化してよい。
【００３９】
カルボキシル末端ペプチドを調べるための「プラスミド上のペプチド」方法は、概して、次のように行う。当業者は、この一般的な説明および指針としての下の実施例を用いて、異なった条件に適応させるのに必要とされるようにこれら方法を修飾することができるであろう。ペプチドのライブラリーを、目的の天然ＧＰＣＲ結合性ペプチドに基づく縮重ＰＣＲによって生じ、ＬａｃＩのカルボキシル末端に融合させる。このペプチドライブラリーを、融合遺伝子を有するプラスミドベクターによって発現させる。このプラスミドは、Ｌａｃオペロン（ＬａｃＯ）も含有するので、大腸菌（Ｅ．coli）がＬａｃｌ融合タンパク質を転写し且つ翻訳する場合、それを、そのｌａｃＯ  ＤＮＡ結合性配列を介してコーディングプラスミドに四量体として結合し戻して、挿入された目的の配列をプラスミド上に展示する。したがって、転写および翻訳後、天然ペプチド配列に関係したいろいろなペプチドをコーディングしている異なった配列は、ｌａｃ１遺伝子のカルボキシル末端伸長として展示される。このようにして、受容体への結合についてスクリーニングすることができる安定なＬａｃＩ−ペプチド−プラスミド複合体が形成される。本明細書中にその開示が援用される、Gates et al., J.Mol.Biol. 255:373-386,1996 に記載された方法が適当である。代表的な方法については、実施例７および９を参照されたい。
【００４０】
これらペプチドを展示するのに用いられるＥ．coli 菌株は、ＡＲＩ８１４であったが、これは、次の遺伝子型を有する。Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ  ｌｏｎ−１１  ｓｕｌＡ１  ｈｓｄＲ１７  Δ（ｏｍｐＴ−ｆｅｐＣ）２６６  ΔｃｌｐＡ３１９：：ｋａｎ  ΔｌａｃＩ  ｌａｃＺＵ１１８。この菌株は、形質転換または形質導入によって導入される未修飾ＤＮＡの制限を妨げるｈｓｄＲ１７対立遺伝子を含有する。ｏｍｐＴ−ｆｅｐＣ欠失は、対の塩基性残基の間のペプチドを消化するＯｍｐＴプロテアーゼをコードしている遺伝子を除去する。ｌｏｎ−１１およびｃｌｐＡの突然変異も、ＡＴＰ依存性の細胞質プロテアーゼによるタンパク質分解を制限する。ｌａｃＩ遺伝子の欠失は、プラスミド上のｌａｃＯ部位への結合について融合構築物と競合すると考えられる野生型ｌａｃリプレッサーの発現を妨げる。ｌａｃＺ突然変異は、そのリプレッサーの不存在下においてβ−ガラクトシダーゼを作る細胞代謝供給源の浪費を妨げる。ｅｎｄＡ１突然変異は、親和性精製に有害な作用を有するヌクレアーゼを排除し、ｒｅｃＡ欠失は、ＲｅｃＡに触媒される相同的組換えによってプラスミドの多量体化を妨げる。この菌株は、その強い成長性および免疫担当細胞の高収率のために選択された。典型的には、１ｍｇのＤＮＡにつき２ｘ１０１０個コロニーの形質転換効率が達せられた。このＥ．coli 菌株は好適であるが、当業者は、記載された方法で用いるのに好都合である多数の代替物を承知している。したがって、当該技術分野において知られているいずれか適当な且つ好都合な細菌株は、本発明での使用が考えられる。
【００４１】
Ｌａｃｌ−ペプチド融合タンパク質ライブラリーは、リゾチームを用いた細胞壁の穏やかな酵素消化によって細菌から放出されることがありうる。細胞破片をペレット化後、この溶菌液は、親和性精製のために固定された受容体に直接的に加えることができるしまたは精製することなく用いることができる。これらペプチドのディスプレイライブラリーをスクリーニングして、特定のＧＰＣＲに高親和性で結合するそれらペプチドを識別する。この方法で、ＧＰＣＲを結合し且つ予め選択された具体的なＧタンパク質の活性化を妨げうる高親和性ペプチドをスクリーニングし且つ識別することが可能である。このライブラリーは、いずれか所望のＧＰＣＲに対してスクリーニングすることができる。コンビナトリーライブラリーは、特定のＧαまたはＧβγサブユニットに基づくペプチドを含有するので、そのサブユニットまたはサブユニットクラスに結合するまたはそれによってシグナリングを媒介するいずれのＧＰＣＲも用いることができる。カルボキシル末端配列または異なったＧタンパク質サブユニットの他の領域に基づいて、多数のライブラリーを、同じまたは異なったＧＰＣＲをスクリーニングするために構築することができる。
【００４２】
プラスミドディスプレイライブラリーをスクリーニングするために、目的のＧタンパク質共役型受容体は、有利に、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングするためにマイクロタイタープレート上に固定されてよい。次に、プラスミド標品（細菌溶菌液）をそのウェルに加えてよい。ライブラリープラスミド上に展示されたペプチドに受容体を結合させることを伴うこのスクリーニング手順は、時々、「パンニング」と称される。受容体を結合する配列は、ウェルに付着しているので、非結合性配列を洗浄工程によって除去することができる。次に、付着プラスミドを拡大させ且つ用いて、Ｅ．coli を形質転換することができる。「パンニング」処理は、概して、２〜８回繰り返す。しかしながら、概して、３〜４回連続したスクリーニングが充分であり且つ好適である。後の方のラウンドのパンニングでは、好ましくは、親ペプチド（野生型配列）をプラスミド標品と同時インキュベートして、受容体を結合させ且つ競合阻害剤として役立てる。この方法で、ディスプレイライブラリー上の高親和性配列だけを、固定された受容体によって捕捉する。同じ競合阻害を、天然ペプチドよりもむしろ、既に識別された高親和性ペプチドまたは低分子量分子を用いて有利に行ってよい。「パンニング」手順を大まかに記載している略図については図１を、具体的な態様については実施例７を参照されたい。高塩濃度は、Ｌａｃｌ−ｌａｃＯ複合体を不安定にし、ペプチドを正しくないプラスミドと会合した状態にさせることがありうるので、選択工程は、好ましくは、低塩緩衝液中で行われる。同じ理由のために、パンニング用緩衝液は、好ましくは、Ｌａｃｌをより堅固にｌａｃＯに結合させるラクトースを含有する。
【００４３】
本発明の選択法は、パンニングのラウンド毎にますます高い親和性結合を有するペプチド配列の識別を可能にする。例えば、パンニングされていないライブラリーの多様性は、下の表IVに与えられる配列のようになる、すなわち、極めてランダム化されていることがありうる。逐次的選択ラウンドの後、選択される付着ペプチドは、一層、下の表Ｖに与えられるもののようになると考えられる。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
【表５】
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Ｌａｃｌは、通常は四量体であるが、最低機能のＤＮＡ結合性種は二量体である。したがって、これらペプチドは、融合タンパク質上に多価で展示され、固定された受容体への協同的様式の結合をもたらす。この協同的結合は、極めて低い固有の親和性の結合イベントの検出を可能にする。この検定の感度は、最初の低親和性ヒットを識別することができるという点で有利であるが、不都合は、ＥＬＩＳＡでのシグナルが、結合したペプチドの固有の親和性と必ずしも相関しないということである。
【００４６】
一つの好ましいＥＬＩＳＡは、シグナル強度が親和性とよりよく相関する場合、あるタンパク質、例えば、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）をコードしている遺伝子と、フレーム中のクローン集団からの目的の配列を融合することを行う。それら配列が、単量体融合タンパク質中に転移されたら、それらを、受容体に結合したタンパク質を検出するＥＬＩＳＡによる検定またはいずれか好都合な検定用に、Ｅ．coli 中で過剰発現させ且つ粗製溶菌液かまたは精製された融合タンパク質として用いることができる。バックグラウンドより上の少なくとも二つの標準偏差の吸光度を有するそれら試料は、高親和性結合性ペプチドを含有すると考えられてよい。しかしながら、検定パラメーターおよびオペレーターの要求に依って、いずれか所望の分画ポイントを用いてよい。精製された融合タンパク質は、天然ペプチド、Ｌａｃｌ−ペプチド融合タンパク質またはヘテロ三量体Ｇタンパク質を用いて、受容体上の結合部位について競合するそれらの能力を測定することによって更に調べることができる。競合的ＥＬＩＳＡの使用は、固定された受容体への個々の融合タンパク質の結合についてのＩＣ５０値を計算することを可能にする。
【００４７】
ペプチド融合タンパク質は、ＧＰＣＲへのより低い親和性ペプチド融合タンパク質の結合を妨げる融合タンパク質共インキュベーションを用いた競合的ＥＬＩＳＡフォーマットで分析することができる。ペプチド結合を妨げない、いずれか好都合なタンパク質、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質またはユビキチンを含めたものを用いてよいが、しかしながら、ＭＢ−Ｇαｔ３４０−３５０Ｋ３４１Ｒのようなマルトース結合性タンパク質融合タンパク質が好適である。
【００４８】
ｐＪＳ１４２中へのライブラリーのクローニングは、そのライブラリーのランダムコーディング領域の出発点付近にＢｓｐＥＩ制限部位を生じる。好都合には、ＢｓｐＥＩおよびＳｅａＩでの消化は、還元環境である細胞質にＭＢＰ融合タンパク質を向けるベクターであるｐＥＬＭ３中にサブクローン化されてよい９００塩基対ＤＮＡフラグメントの精製を可能にする。或いは、そのフラグメントは、酸化環境であるペリプラズムにＭＢＰ融合タンパク質を向けるベクターであるｐＥＬＭ１５中にクローン化されうる。ｐＥＬＭ３およびｐＥＬＭ１５は、それぞれ、商業的に入手可能な（New England Biolabs）ｐＭＡＬｃ２およびｐＭＡＬｐ２ベクターの簡単な修飾物である。ＡｇｅＩおよびＳｃａＩでのｐＥＬＭ３の消化は、ｐＪＳ１４２ライブラリーからのＢｓｐＥＩ−ＳｃａＩフラグメントの有効なクローニングを可能にする。所望の結果を達成するのに好都合であるいずれか適当な方法を用いてよい。これら方法の修飾は、当分子生物学業者が周知であり、ここでの使用が考えられる。
【００４９】
高親和性ペプチドが、ＧＰＣＲに競合的に結合し且つそのＧタンパク質認識を妨げるという証拠は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の存在下における競合的結合検定を用いて得ることができる。例えば、ロドプシンが、スクリーニングで用いられるＧＰＣＲである場合、ヘテロ三量体Ｇタンパク質トランスデューシン（Ｇｔ）を用いてよい。Ｇｔは、多数のエピトープを含むロドプシンを結合し、αサブユニットのミリストイル化およびγサブユニットカルボキシル末端のファルネシル化によって膜結合する。カルボキシル末端の天然ペプチド構築物および／またはヘテロ三量体Ｇｔによるペプチド類似体結合の不十分な競合は、それらペプチド類似体の高親和性結合を示す。パンニング、ペプチド合成および結合についての研究の類似の戦略は、いずれかのＧＰＣＲ、例えば、トロンビン受容体（ＰＡＲ１、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４）、ドーパミン受容体（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５）、バソプレッシン受容体（Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２）およびヒスタミン受容体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）を結合する高親和性ペプチドを、いずれかのＧαサブユニット、例えば、Ｇαｉ、ＧαｓおよびＧαｑについてのカルボキシル末端ペプチドライブラリーを用いて決定するのに用いることができる。より高い結合親和性を有するペプチド類似体が解明されたら、それらを利用して、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質相互作用を阻害することができる。
【００５０】
所望のＧＰＣＲに媒介されるシグナリングイベントの高親和性の特異的遮断を特徴とする、この方法によって選択されたペプチドは、伝統的な薬剤または遺伝子治療のような治療薬として用いられて、ＧＰＣＲの阻害によって利益を得ると考えられる障害を処置することができるし、または高親和性ペプチド類似体と競合することができる化合物の追加のライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。新しい低分子量分子ライブラリーに焦点を合わせた合成は、最適の構造を選択するようにスクリーニングされることがありうる初期リード化合物に構造的に関係したいろいろな化合物を提供することができる。第一工程で高親和性阻害ペプチドおよび次の工程で低分子量分子を与えるこの多段アプローチは、選択され且つ通常の高処理スクリーニング法で検定される必要があると考えられるより低い親和性の低分子量分子を排除することにより、人為的ヒット数を減少させる。更に、それは、受容体上のいずれかの部位への結合についてスクリーニングするよりもむしろ、受容体上の具体的な所望の部位に結合する分子、例えば、Ｇタンパク質結合／活性化部位の場合の分子についての探求に焦点を合わせている。この技術の他の利点は、それが、実行するのが簡単であり、多数の異なったクラスの受容体に従い、そして化合物の極めて大きいライブラリーを速やかにスクリーニングすることができるということである。
【００５１】
スクリーニング用の低分子量分子ライブラリーを選択し且つ合成するための当該技術分野において知られているいずれの方法も、本発明での使用が考えられる。スクリーニングされる低分子量分子は、コンビナトリーライブラリーの形で有利に集められる。例えば、βターン模倣ライブラリー等のような薬物様低分子量分子のライブラリーは、例えば、ChemDiv（http://www.chemdiv.com）、Pharmacopia（http://www.pcop.com）または Combichem（http://www.combichemlab.com）から購入されてよいしまたは合成されてよく、Tietze and Lieb, Curr.Opin.Chem.Biol. 2:363-371,1998；Carrell et al., Chem.Biol. 2:171-183,1995；米国特許第５，８８０，９７２号、米国特許第６，０８７，１８６号および米国特許第６，１８４，２２３号に記載されている。当該技術分野において知られているこれらライブラリーはいずれも、ランダムライブラリーまたは個々の化合物であるように、スクリーニングに適している。概して、親水性化合物は、一層容易に可溶性であり、一層容易に合成され、そして一層容易に配合されるので、好適である。約５００の平均分子量を有する化合物は、しばしば、最も有用であるが、しかしながら、この範囲外の化合物も、またははるかにこの範囲外でも、用いることができる。概して、約５．０のｃ  ｌｏｇＰスコアを有する化合物が好適であるが、しかしながら、これら方法は、全ての種類の化合物で有用である。Lipinski's "rule of five" のような簡単なフィルターは、予測値を有するので、生体内で利用可能であるそれら低分子量分子だけを用いることにより、本発明の戦略によって発見されるリードの質を改善するのに用いることができる。Lipinski et al., Adv.Drug Delivery Rev. 23:3-25,1997 を参照されたい。
【００５２】
これらペプチドまたは低分子量分子のスクリーニングは、好都合には、いずれの源からの受容体を用いて行ってもよい。概して、細胞から受容体を精製し且つ脂質小胞中でその受容体を再構成すること、または受容体を過剰発現する昆虫または哺乳動物の細胞から単離される膜を使用することが好都合である。ＰＡＲ１およびロドプシンは、好都合な受容体であるが、しかしながら、いずれの適当な受容体も、本発明での使用が考えられる。スクリーニングに用いられるこれら受容体は、天然源から精製されまたは受容体を過剰発現する細胞から精製されて、脂質小胞中で再構成されてよい。或いは、受容体を含有する膜を、天然に受容体を発現する細胞、例えば、ＰＡＲ１を発現するＳｆ９細胞から、または受容体を発現するように遺伝子操作された細胞、例えば、ＰＡＲ１を過剰発現する哺乳動物または昆虫の細胞から製造することができる。最初に、ペプチドまたは低分子量分子がそれに対してスクリーニングされるペプチド融合タンパク質または高親和性ペプチドの結合親和性を決定するのが有利である。これは、検定中の受容体およびペプチドＭＢＰペプチド融合タンパク質または低分子量分子の量を最適にさせる。
【００５３】
概して、受容体への結合についてペプチド融合タンパク質または高親和性ペプチドと競合する化合物を識別する一ウェル一化合物アプローチを用いてライブラリーを調べることは好都合である。概して、１ウェルにつき単一の化合物を、それら化合物およびそれらに対して調べられているペプチドへの受容体の親和性に依って、各々約１０ｎＭまたはいずれか好都合な濃度で用いる。化合物は、試験用にプールされていてよいが、しかしながら、このアプローチは、デコンボルーション（deconvalution）を必要とする。化合物は、調べられている化合物への受容体の親和性に依って、各々約１０ｎＭまたはいずれか好都合な濃度で、１ウェルにつき約１０〜約５０種類またはそれを超える化合物の群でプールされていてよい。ペプチドは、望ましくは、最初の段階でスクリーニングされるペプチドの層メンバーのゆえに、プールされるアプローチを用いてスクリーニングされる。ペプチドは、個々にもスクリーニングされてよいが、好ましくは、約１０４〜１０１２／ウェルのペプチドまたは約１０８〜１０１０／ウェルのペプチド、または最も好ましくは、約１０９／ウェルのペプチドのプールでスクリーニングされる。
【００５４】
ＥＬＩＳＡ、または蛍光検定若しくはラジオイムノアッセイのようないずれか他の好都合な検定を用いて、（１）各ウェル中の一つまたはそれを超えるペプチドが、高親和性ペプチド融合タンパク質または高親和性ペプチドによる結合量を減少させるかどうか、または（２）各ウェル中の一つまたはそれを超えるペプチドが、受容体に結合するかどうかを決定することができる。化合物は、一連の濃度でも調べることができるが、これは、概して、ペプチドまたはペプチド融合タンパク質の親和性が知られていない場合に好適である。ＥＬＩＳＡの場合、ＯＤ４５０が、対照ウェル（試験される化合物不含）の場合の半分または半分未満であるウェルは、概して、「陽性」であるとみなされ、更に研究されてよい。しかしながら、検定成分および検定の目的に依って、いずれか適当な分画ポイントを用いてよい。
【００５５】
高親和性ペプチド類似体に対するスクリーニングは、マイクロタイターウェル上に固定された所望のＧＰＣＲ、バイオチップまたはいずれか好都合な検定表面を用いて行うことができる。溶液中で行われる結合検定も適している。１種類、数種類または何千種類もの候補低分子量分子医薬化合物を、高親和性ペプチド類似体の存在下または不存在下における受容体への結合についてスクリーニングすることができる。これら検定は、好ましくは、高親和性結合性ペプチドの存在下で行って、高親和性結合性ペプチドに対する結合について首尾よく競合しうる候補化合物だけが、受容体によって確実に捕捉されるようにする。或いは、高親和性ペプチド類似体との競合的結合としてスクリーニングすることによって識別された有機化合物または低分子量分子は、一層高い親和性の追加の低分子量分子候補化合物についてスクリーニングする場合のリード化合物として用いることもできる。どちらのスクリーニング法でも、結合は、いずれか好都合な方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光検定またはラジオイムノアッセイによって検出することができる。
【００５６】
二段プロトコールを用いて、Ｇタンパク質シグナリングを遮断する化合物を識別することにより、強力で且つ強く結合する化合物だけが選択されるので、化合物の高処理スクリーニングおよび選択された化合物の特性決定は、時間も費用も有意に減少させる。Ｇタンパク質共役型受容体上の結合部位についてＧタンパク質と強く競合する高親和性ペプチドの識別の第一工程は、これを確実にするが、それは、高親和性ペプチドが、具体的な所望の結合特異性、細胞系内の機能を阻害する能力および in vivo の機能を阻害する能力について設計され且つ調べられるからである。
【００５７】
好ましくは、最も強く結合する且つ有効なペプチド類似体または低分子量分子だけを、第二または次のスクリーニング工程で用いる。この二段または多段プロトコールは、慣用的な高処理スクリーニング法で検出され且つ検定されると考えられるより低い親和性の低分子量分子を排除することにより、弱くしか結合しない化合物の識別および偽陽性の数を減少させる。この方法は、したがって、実行するのが簡単であり、費用がかからないし、少数の成分だけを含んで成り、多数の異なったクラスの受容体に従い、そして化合物の大ライブラリーを速やかにスクリーニングすることができる。この方法は、受容体作用の阻害剤、例えば、トロンビン受容体阻害剤、ドーパミン受容体阻害剤、ヒスタミン受容体阻害剤またはバソプレッシン受容体阻害剤として機能する新しいクラスの低分子量有機ペプチド模倣分子の有効な識別を可能にする。これら識別された化合物は、単一ＧＰＣＲ、ＧＰＣＲクラスに標的指向できるし、またはＧＰＣＲによって活性化される単一Ｇタンパク質経路を遮断することができる。
【００５８】
治療薬として用いるための選択された化合物（ペプチドかまたは低分子量分子）の徹底的な評価は、いずれか既知の方法によって続けられてよい。ｐＫａ、ｌｏｇＰ、サイズ、水素結合および極性のような化合物の性状は、有用な情報である。それらは、容易に測定されてよいしまたは例えば、２Ｄ関連表から計算されてよい。会合／解離速度定数は、適当な結合実験によって決定されてよい。吸収性および毒性のようなパラメーター、更には、生物学的活性の in vivo 確認も測定されてよい。
【００５９】
医薬製剤は、当該技術分野において周知の方法による本発明のスクリーニングによって識別されたペプチドまたは低分子量分子を、いずれか適当な医薬賦形剤または医薬賦形剤組合せと一緒に製剤化することによって製造される。製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、経口、直腸、膣、経皮、経粘膜、舌下等のようないずれかの経路による投与用に製造されてよいが、しかしながら、概して、静脈内経路がペプチド製剤に好適である。静脈内投与用には、いずれか適当なビヒクル、例えば、生理食塩水または加乳リンガー液を用いてよい。
【００６０】
ＧＰＣＲ関連疾患または状態の処置のための投薬量は、その障害の性質、関与するＧＰＣＲ、投与経路、患者の全身状態および健康に関連する因子、および処置する医師の判断などの多数の因子に依るであろう。当業者は、これら因子を充分に承知し、最適な結果を得るための投薬操作を常套的であると考える。概して、静脈内投与用の投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇであってよいが、しかしながら、この範囲は、患者の要求に依って拡大されることがありうる。このような拡大される範囲は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００６１】
或いは、本発明によるペプチドは、発現構築物の供給によって、in vivo または ex vivo で細胞に与えられてよい。遺伝子治療は、遺伝物質の直接的導入として in-vivo で行うことができる。この in vivo 遺伝子導入は、それらペプチドをコードしているオリゴヌクレオチドを、体内でそれらが見出されるうる部位の細胞に、例えば、腕の皮膚細胞に、または遺伝子導入ベクターの吸入後の肺上皮細胞に導入すると考えられる。或いは、患者から一時的に取り出された後、処置後に戻される生存しうる細胞（例えば、骨髄細胞）中への遺伝子の導入である ex-vivo 遺伝子導入を用いることもありうる。
【００６２】
遺伝子導入ベクターは、特定の組織または細胞に入るように遺伝子操作することができる。形質導入ターゲッティングは、遺伝子導入ベクターが特定の細胞表面受容体と相互作用することを可能にする。形質導入ターゲッティングは、腫瘍細胞のような、速やかに分裂している細胞に標的指向する遺伝子導入ベクターを用いることにより、細胞分裂速度を利用することもできる。転写ターゲッティングは、治療的遺伝子の転写に影響を及ぼす明らかな細胞プロモーターおよびエンハンサー要素を補充する。トランスフェクション効率は、特定の細胞に遺伝子を供給するのに役立つモノクロナル抗体、炭水化物リガンドおよびタンパク質リガンドでベクターを遺伝子操作することによっても増大する。
【００６３】
細胞内部で高親和性ペプチドを生じさせるのに用いられる遺伝子導入ベクターは、ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス）でありうる。代替物として、非ウイルスベクターを用いてもよく、これらには、裸のＤＮＡの注入、または正電荷脂質への付着によるＤＮＡかまたはペプチドの導入、または陽イオンリポソーム、エレクトロポレーションまたは弾道ＤＮＡ注入（ex-vivo 用途に限られる）、更には、分岐状ペプチドの導入のような方法が含まれる。
【００６４】
脳心筋炎ウイルス（ｐ−Ｔｅｔ−Ｔｉ−ＧＦＰ）からの内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）によって作動されるＧＦＰを同時発現する天然Ｃ末端配列のためのＴｅｔ誘導性レトロウイルスベクターを用いてよい。これらベクターは、それらが高親和性ペプチド配列をコードするように修飾することができる。更に、高親和性ペプチドは、空間的または時間的発現を考慮に入れた配列によって作動されることができる。in vitro 研究のために、ＧＰ−２９３（Clontech）のような汎親和性生産者系統からウイルス上澄みを血清不含培地中に集めてよい。ウイルス上澄みは、４℃において２２，０００ｒｐｍで２時間の超遠心分離によって濃縮されてよく、そしてそれらペレットを、元の容量の１／１００の血清不含培地中に少なくとも１０８ｉ．ｕ．（感染単位）の力価で再懸濁させ且つ−８０℃で貯蔵してよい。
【００６５】
マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来レトロウイルスベクターは、内皮細胞中への治療的遺伝子の安定な供給用に一般的に用いられるビヒクルである。in vivo のレトロウイルス研究のためには、Ｔｅｔ誘導性であり且つ脳心筋炎ウイルス（ｐＴｅｔ−ＧＦＰ）からの内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）によって作動されるＧＦＰを同時発現する複製能欠損マウスモロニーレトロウイルスベクター中に、高親和性ペプチドをサブクローン化する。次に、これら構築物を生産者系統中に一過性トランスフェクションさせて、１０６−１０−ｉ．ｕ．／ｍｌの細胞不含力価を生じることができる。必要ならば、水疱性口内炎ウイルスからのエンベロープ糖タンパク質であるＶＳＶ−Ｇを利用する汎親和性レトロウイルス発現系（ＧＰ−２９３；Clontech）を利用して、低いトランスフェクション効率を克服することができる。この革新的な細胞基剤遺伝子導入法を用いることにより、高親和性Ｃ末端ペプチドの安定な、長期のおよび局在性の遺伝子発現を得ることができる。
【００６６】
この方法によって識別される化合物が、in vivo の疾患症候群に関与するＧタンパク質シグナリングイベントをモジュレーションすることができるということを確証するために、選択的Ｇタンパク質シグナル伝達イベントの拮抗作用を確かめることができる。天然Ｇタンパク質結合と競合する化合物の能力を調べる一つの方法は、受容体を含有する細胞中の受容体−Ｇタンパク質界面を遮断するペプチドを発現させることを行う。種々のＧαサブユニットからのカルボキシル末端ペプチド配列（表VIを参照されたい）のような、ＧＰＣＲ結合性領域ペプチドをコードするプラスミド構築物は、in vivo、ex vivo または in vitro の細胞中でそれらを発現させるのに用いることができるので、選択的ＧＰＣＲ遮断の代謝作用は、定性的におよび定量的に研究することができる。このような研究は、それら化合物が有する結合が、in vivo で選択的Ｇタンパク質シグナルをモジュレーションするのに有用であるという証拠を与える。
【００６７】
ペプチドの発現は、好都合には、実施例２３に記載のような方法によるミニ遺伝子アプローチを用いて達成されるが、しかしながら、いずれの適当な方法を用いてもよい。いずれの所望のペプチド配列も、これら方法を用いて発現させることができる。当業者は、高親和性ペプチド類似体を含むタンパク質およびペプチドの構築物の構築、トランスフェクションおよび発現のための代替法を承知しており、このような方法は、それらについての使用が考えられる。
【００６８】
【表６】
2005506518.tif 000008
上で論じられたように、多くの受容体は、多数のＧタンパク質と相互作用し且つそれらを活性化させる。高親和性結合性カルボキシル末端ペプチドを細胞中に導入するミニ遺伝子戦略を用いると、個々のＧタンパク質との具体的なＧタンパク質共役型受容体相互作用を阻害することが可能であり、したがって、本発明の方法によって識別される化合物についての in vivo の特異的Ｇタンパク質遮断の実行可能性が示される。多数のＧタンパク質を活性化するそれら受容体について、その各々は、具体的な一連の応答を媒介する別個の一連のシグナリング経路を活性化するが（例えば、トロンビン受容体）、他に実質的に影響を与えることなく、一つの経路を阻害することができる。
【００６９】
受容体−Ｇタンパク質界面を遮断するペプチドを発現させることによって in vivo のＧタンパク質シグナル伝達イベントに選択的に拮抗するために、ミニ遺伝子プラスミドベクターは、種々のＧαサブユニットのＣ末端ペプチド配列を、哺乳動物細胞中へのそれらのトランスフェクション後に発現させるように設計された。ランダムな順番のＧαｉ１／２（ＧαｉＲ，表VIを参照されたい）のカルボキシル末端をコードしている対照ミニ遺伝子ベクターも作成した。細胞内シグナリング経路を in vivo で有効に遮断するミニ遺伝子アプローチに必要な一つの重要な要素は、所望のペプチドの適当量の発現である。したがって、ミニ遺伝子の発現は、ｍＲＮＡ、タンパク質または双方を検出する好都合な方法によって確かめられるべきである。当該技術分野において知られているいずれの好都合な方法も、用いることができる。
【００７０】
ＧＰＣＲ結合性ペプチドを発現するミニ遺伝子アプローチの細胞効力を決定するために、およびある与えられた受容体活性化シグナルに応答した一つのＧタンパク質経路の特異的阻害を他に影響を与えることなく示すために、化合物は、測定可能な細胞シグナリング終点を示すように設計されたシステムで有利に検定することができる。このようなシステムの一例は、内皮細胞中のトロンビン受容体ＰＡＲ１である。この受容体は、多数のＧタンパク質を活性化する。誘導されるＰＡＲ１遺伝子発現の転写分析；［Ｃａ２＋］を含めたエフェクター分子、ＭＡＰキナーゼ（「ＭＡＰＫ」）活性、アデニリルシクラーゼ活性およびイノシトールリン酸蓄積の生化学的分析；更には、細胞増殖および内皮透過性のような機能検定を含めた数種類のシグナリング終点は、この受容体におけるリガンド結合による異なったＧタンパク質の特異的活性化または活性化のモジュレーションを測定するのに利用可能である。シグナリング活性は、イノシトールリン酸蓄積を測定すること；細胞内カルシウム濃度レベルを測定すること；経内皮電気抵抗を測定すること；ストレスファイバー形成を測定すること；リガンド結合（アゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニスト）を測定すること；受容体発現を測定すること；受容体脱感作を測定すること；キナーゼ活性を測定すること；ホスファターゼ活性測定すること；核転写因子を測定すること；細胞遊走（走化性）を測定すること；スーパーオキシド形成を測定すること；酸化窒素形成を測定すること；細胞脱顆粒を測定すること；ＧＩＲＫ活性を測定すること；アクチン重合を測定すること；血管収縮を測定すること；細胞透過性を測定すること；アポトーシスを測定すること；細胞分化を測定すること；プロテインキナーゼＣのような、ＧＰＣＲ活性化で転移するタンパク質の膜会合を測定すること；プロテインキナーゼＣのような、ＧＰＣＲ活性化で転移するタンパク質のサイトゾル蓄積を測定すること；ｓｒｃのような、ＧＰＣＲ活性化で転移するタンパク質のサイトゾル蓄積を測定すること；およびＲａｎのような、ＧＰＣＲ活性化で転移するタンパク質の核会合を測定することを含めたいずれか好都合な方法によって測定することができる。トロンビンに誘導される細胞収縮の機構におけるＧα  Ｃ末端ミニ遺伝子の機能的作用は、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の変化によって測定されるが、Ｇタンパク質阻害を測定するのに用いることもできる。
【００７１】
例えば、トロンビンに媒介されるＰＡＲ１遺伝子誘導は、Ｇαｉミニ遺伝子構築物を発現するヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）において阻害された。しかしながら、Ｇαｑミニ遺伝子構築物の発現は、トロンビンに媒介されるイノシトールリン酸蓄積に影響を与えた。Ｇαｑの発現は、トロンビンに誘導される細胞内Ｃａ＋＋上昇およびトロンビンに誘導されるＭＡＰＫ活性の双方も特異的に減少させた。
【００７２】
ＨＭＥＣ中でのＧαｉ機構のトロンビン活性化は、イソプロテレノール（Ｇαｓを介して作用する）に応答して増加したｃＡＭＰレベルを減少させる。イソプロテレノール単独に応答したｃＡＭＰレベル増加についての検定を、Ｇαｉを発現する細胞中におけるトロンビンプレインキュベーション後の増加と比較して、ＧＰＣＲ結合性ペプチドの発現がＧαｉシグナリングを遮断するということを示すことができる。
【００７３】
Gohla et al., J.Biol.Chem. 274:17901-17907,1999 による最近の研究は、トロンビン受容体が、Ｇα１２によるストレスファイバー蓄積を、ＥＧＦ受容体に依存しない方式で誘導するということを的確に示した。ストレスファイバー形成は、Ｒｈｏ依存性であると考えられる。Ｇ１２およびＧ１３は両方とも、Ｒｈｏシグナリング経路に関与していた。したがって、ＨＭＥＣ中でのＧα１２およびＧα１３  ＧＰＣＲ結合性ペプチドの発現を用いて、これらペプチドが、トロンビンに応答したストレスファイバーの出現を遮断しうるかどうかを決定した。
【００７４】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）サブファミリーは、増殖および分化に関与する多数の細胞シグナリングイベントを調節する。これは、ＧＰＣＲ結合性ペプチドが、特定のＧタンパク質に媒介される経路に影響を与えることができるかどうか決定することができる別の検定の根拠となっている。ＨＡ−ＭＡＰＫと一緒にＧＰＣＲ結合性ペプチドをコードしているミニ遺伝子でのＨＭＥＣ細胞のトランスフェクション後のＨＡ−ＭＡＰＫの免疫沈降は、ＧＰＣＲ結合性ペプチドを発現する細胞だけへの作用の測定を可能にする。
【００７５】
多くの研究は、Ｍ２ムスカリン受容体（ｍＡＣｈＲ）が、Ｇｉ／ＧＯファミリーに排他的に共役することを示している。Dell'Acqua et al., J.Biol.Chem. 268:5676-5685,1993; Lai et al., J.Pharm.Exp.Ther. 258:938-944,1991; Offermanns et al., Mol.Pharm. 45:890-898,1994; Thomas et al., J.Pharm.Exp.Ther. 271:1042-1050,1994 を参照されたい。Ｍ２ｍＡＣｈＲは、最後の５個のアミノ酸が、ＧαｉまたはＧαＯからの該当する残基で置換されている突然変異体Ｇαｑ＊＊に効率よく共役することができ、この受容体は、Ｇαｉ／Ｏサブユニットのカルボキシル末端によって特異的に認識されるドメインを含有するということが示唆される。Liu et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11642-11646,1995 を参照されたい。
【００７６】
ミニ遺伝子構築物を用いて発現されるカルボキシル末端Ｇαペプチドによる、Ｇタンパク質共役型受容体に媒介される細胞応答の阻害を調べるために、百日咳毒素感受性Ｍ２ｍＡＣｈＲによって調節される基本型の、直接的にＧβγで活性化されるチャンネル（ＧＩＲＫチャンネル）を、モデルとして選択した。このモデルの場合、Ｇαカルボキシル末端の重要性および下流のエフェクターシステムは、充分に確立されている。Krapivinsky et al., J.Biol.Chem. 270:29059-29062,1995; Krapivinsky et al., J.Biol.Chem. 273:16946-16952,1998; Sowell et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:7921-7926,1997 を参照されたい。内向き整流カリウム電流のＭ２ｍＡＣｈＲ活性化の阻害を調べて、Ｇαカルボキシル末端ペプチドミニ遺伝子で一過性トランスフェクションされた、または高親和性Ｇαペプチドに対するスクリーニングによって識別される医薬化合物で処理された細胞上のＧＰＣＲのアゴニスト刺激後の下流の機能性応答の阻害を示すことができる。
【００７７】
ＧＩＲＫチャンネルは、多数の興奮性細胞中の電気的活性をモジュレーションする。Breitwiese et al., J.Membr.Biol. 152:1-11,1996; Jan et al., Curr.Opin.Cell Biol. 9:155-160,1997; Wickman et al., Curr.Opin.Neurobiol. 5:278-285,1995 を参照されたい。このチャンネルは、Ｇβγとの直接的相互作用の結果として開口するので、ＩＫＡＣｈのホールセルパッチクランプ記録法を用いて、Ｇαカルボキシル末端ペプチドミニ遺伝子で一過性トランスフェクションされた、または高親和性Ｇαペプチドに対するスクリーニングによって識別される医薬化合物で処理された細胞上のＧＰＣＲのアゴニスト刺激後の下流の機能性応答の阻害を示すことができる。ＧＩＲＫ１／ＧＩＲＫ４を発現する細胞を、それらのリガンドアセチルコリン（ＡＣｈ）で洗い流すことは、内向き整流カリウム電流を活性化する。
【００７８】
in vivo の細胞結果を示すものであると認められる充分に確立された受容体モデルを用いると、このタイプのデータは、ある与えられたＧＰＣＲによって活性化される個々のＧタンパク質が、細胞性イベントを媒介する場合に特定の役割を有し、しかも個々のＧαサブユニットのＧＰＣＲ結合性領域を模倣しているリガンドによって特異的様式でモジュレーションされうるということを示すことができる。具体的には、多数のＧタンパク質を活性化するトロンビン受容体のような受容体について、その各々は、具体的な一連の応答を媒介する別個の一連のシグナリング経路を活性化し、本発明の方法を用いて一つの経路を遮断することは可能であるが、他は全て機能性のままである。逐次的な親和性精製および競合的結合によって in vitro で識別される高親和性ペプチド類似体は、Ｇタンパク質シグナリングの下流の結果を特異的に阻害することができる。
【００７９】
上記の検定は、ＧＰＣＲが、細胞内の多数のＧタンパク質を調節する場合でも、in vitro の競合的結合研究によって識別される化合物の、特定のＧＰＣＲ−Ｇタンパク質相互作用を選択的に妨げる能力を明確にする。更に、これらペプチドは、天然配列と極めて有効に競合する。更に、上記のおよび下の実施例に例示されるミニ遺伝子アプローチは、内皮透過性の増加の機構に関与することがありうるＧα１２およびＧα１３のような他のＧタンパク質の役割の系統的試験を可能にし、そしてＧαサブユニットモジュレーター化合物を選択し且つ識別するこのアプローチの実行可能性を明らかに示す。したがって、これらペプチドは、Ｇタンパク質シグナリング過剰を特徴とするいずれかの障害または症候群の処置において用いるのに適している。
【００８０】
もう一つの側面において、本発明は、本発明によって提供される物質を用いて、特定のオーファン受容体が共役しているＧタンパク質を識別する方法に関する。例えば、記載された方法を用いて、一連のＧαサブユニットペプチドを含むいずれかのＧＰＣＲを調べて、１種類または複数のＧタンパク質のどの種が受容体の作用を媒介するか決定することができる。実施例１５〜１８に記載の方法が適している。当業者は、他の検定、またはこれら検定を指針として用いた変更および修正を設計することができる。
【００８１】
次の非制限実施例は、本発明の若干の側面を詳しく説明するために与えられる。
【実施例１】
【００８２】
実施例１．ペプチドライブラリーの構築。
偏りのあるペプチドライブラリーの構築は、以前に記載されている。Martin et al., J.Biol.Chem. 271:361-366,1996; Schatz et al., Meth.Enzymol. 267:171-191,1996。ライブラリー構築に用いられたベクターは、ｐＪＳ１４２（図２を参照されたい）であった。このベクターは、偏りのある１１量体ペプチドコーディング配列とＬａｃＩとの間のリンカー配列、更には、ライブラリーオリゴヌクレオチドをクローニングするための制限部位を有していた。突然変異誘発ライブラリーをコードするのに合成されるオリゴヌクレオチドは、７０％の正しい塩基および各々１０％の他の塩基で各々の位置に合成した。この突然変異誘発率は、１１コドンのいずれかが適当なアミノ酸である約５０％の可能性と、それが別のアミノ酸である約５０％の可能性とが存在するような偏りのあるライブラリーをもたらす。更に、４種類のランダムＮＮＫ（但し、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを意味し、ＫはＧまたはＴを意味する）コドンのリンカーを、配列の５’末端に、合計１５個のランダムなコドンを作るように合成した。この方法を用いて、連結に用いられるベクター１マイクログラムにつき１０９を超える独立クローンを含むライブラリーを、Ｇαｔのカルボキシル末端配列（ＩＫＥＮＬＫＤＣＧＬＦ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）に基づいて構築した。このライブラリーを生じるのに用いられた核酸は、次であった。
【００８３】
【化１】
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式中、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／ＴおよびＫ＝Ｇ／Ｔ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８。
【実施例２】
【００８４】
実施例２．Ｇαサブユニットペプチドライブラリー作成用の配列。
ライブラリーは、実施例１の方法および下の表VIIに挙げられる配列を用いて作成した。
【００８５】
【表７】
2005506518.tif 000010
【実施例３】
【００８６】
実施例３．トロンビン受容体を発現する昆虫細胞からの膜の単離。
Ｓｆ９細胞（２ｘ１０８個細胞）を、１リットル回転フラスコ中の、０．１％ Pluronic Ｆ−６８（Life Technologies,Inc., Grand Island, NY）、１０％ウシ胎児血清および２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する２００ｍｌの Grace's 昆虫細胞培地（Life Technologies,Inc., Grand Island, NY）で、２７℃において２５時間培養した。Ｓｆ９細胞に、ＴｈＲ／ｐＢｌｕｅｂａｃ組換えウイルスを３〜５の感染多重度で感染させ、２７℃において４日間培養した。これら細胞を採取し、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄後、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中に再懸濁させた。次に、細胞を、低速で設定したハンドヘルドホモジナイザーで２０秒間均一にした。破壊された細胞を、１７，０００ｘｇで１５分間沈降させた。上澄みを捨て、そしてペレットを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４および１０％グリセロールから成る緩衝液中に再懸濁させた。膜標品中の受容体濃度は、１〜１０，０００ｐＭ／ｍｇであった。スクリーニングには、２００μｇ／ｍｌの最終濃度を用いた。これらトロンビン受容体の天然Ｇｑ−Ｃ末端ペプチドに結合する能力について、ＭＢＰ−Ｇｑ融合タンパク質を用いて調べた。（図７）。
【実施例４】
【００８７】
実施例４．トロンビン受容体を過剰発現する哺乳動物細胞からの膜の単離。
ＰＡＲ１受容体ｃＤＮＡ（２．１ｋｂインサート）を、ポリメラーゼ連鎖反応によって得、哺乳動物発現ベクターｐＢＪ５中にクローン化した。得られたプラスミドを、リン酸カルシウム共沈降法によってチャイニーズハムスター卵巣細胞中にトランスフェクションさせた。ＰＡＲ１でトランスフェクションされた細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地で成長させた。これら細胞を、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳを用いて脱離させ、ＰＢＳ中で２回洗浄した。ペレットは、膜標品用に速やかに用いるかまたは−２０℃で凍結貯蔵した。ペレットを、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ  ＰＭＳＦを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中において、Dounce ホモジナイザー（１０ストローク）を用いて均一にし、１０秒間音波処理した。核破片および無傷の細胞は、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去した。上澄みを、１２，０００ｘｇで３０分間沈降させ、得られたペレットを、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％スクロース、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、５０μｇ／ｍｌアンチパイン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、４０μｇ／ｍｌベスタチン、１００μｇ／ｍｌキモスタチン、０．５μｇ／ｍｌロイペプチンおよび０．７μｇ／ｍｌペプスタチン中に懸濁させた。これら膜を小分けし、−８０℃で凍結させた。
【実施例５】
【００８８】
実施例５．桿体外節の製造。
ウシ桿体外節（ロドプシン含有膜）は、Arsharky et al., J.Biol.Chem. 269:19882-19887,1994 によって記載のように、新鮮な網膜から弱赤色光下において製造した。網膜は、２００ｍＬの単離用緩衝液（９０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＮｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０μＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５）中３０％（ｗ／ｖ）スクロースで満たされ、氷上においてその溶液が解剖の間中に一定して中程度で撹拌されている解剖用ビーカー中に入れた。解剖後、その網膜溶液を暗所において氷上に１時間放置した。この網膜−スクロース溶液を、８本の５０ｍＬ試験管中に分配し、４℃において３０００ｘｇで４分間沈降させた。上澄みを８本の新しい遠心管中に傾瀉し、氷上においた。それら管の容量を、上端より１．５ｃｍ下まで単離用緩衝液で満たした後、１７，０００ｘｇで２０分間沈降させた（「スピン１」）。
【００８９】
それらペレットを、少容量の３０％スクロース中に再懸濁させ、８本の管から４本の管にまとめた。これら管を、上端より１．５ｃｍ下まで３０％スクロースで満たし、４℃において５０００ｘｇで４分間沈降させ、そして上澄みを４本の透明試験管中に傾瀉した。これら管を、上端より１．５ｃｍ下まで単離用緩衝液で満たし、４℃において１７，０００ｘｇで２０分間沈降させた（「スピン２」）。
【００９０】
段階的スクロース勾配を、６本の勾配試験管中において、下の表VIIIの溶液を用いて、上から下へ＃２、＃３、＃４の順番で作成した。
【００９１】
【表８】
2005506518.tif 000011
「スピン１」および「スピン２」からのペレットを、単離において、１ｍＬ／管の２６％スクロース緩衝液を用いて再懸濁させた。スラリーを製造後、各管を１ｍＬピペットで均一にし、それら管を一つにまとめた。このペレット溶液を、スクロース勾配上に注意深く加層し、勾配層に侵入しないようにした。これら勾配試験管に、スウィンギングバケットローター中、４℃において２４，０００ｘｇを３０分間を施し、その後、膜を含有する橙色層を、ペレットまたはペレット付近の暗色溶液を避けるように注意して集めた。それら膜を、６本の５０ｍＬ試験管中に分配し、氷上に置いた。次に、それら管を、上端より１．５ｃｍ下まで単離用緩衝液で満たし、４℃において１７，０００ｘｇで２０分間沈降させた。上澄みを捨て、そしてペレットを、５μｇ／ｍＬペプスタチンおよび１０μｇ／ｍＬ  Ｅ−６４を含有する１ｍＬの単離用緩衝液中に再懸濁させた。この懸濁液を、ホイルで包まれた１５ｍＬ円錐管中に−８０℃で、必要とされるまで貯蔵後、融解させ、ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中で均一にし、そして３０，０００ｘｇで３０分間沈降させた。上澄みを捨て、そしてペレットを再度、上記のように再懸濁させ且つ沈降させた。次に、ペレットを、尿素緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、７Ｍ尿素）中に再懸濁させ、均一にし、４５，０００ｋｇで４０分間沈降させた。これらペレットを、緩衝液Ａ（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μＭ  ＰＭＳＦ）中で再懸濁させ且つ均一にした後、３０，０００ｘｇで３０分間沈降させた。これらペレットを各々、１ｍＬの緩衝液Ａ中でピペッティングすることによって再懸濁させ且つ均一にし、そして検定で用いるために、ホイルで覆われた試験管中の１００μＬアリコート中に−８０℃で貯蔵した。スクリーニング用に、受容体を１０μｇ／ｍｌでウェルに加えた。結合検定は、実施例１５の場合のように行った。
【実施例６】
【００９２】
実施例６．昆虫細胞からのＰＡＲ１トロンビン受容体の精製および脂質小胞中への受容体の再構成。
Ｓｆ９細胞（２ｘ１０８個細胞）を、１リットル回転フラスコ中の、０．１％ Pluronic Ｆ−６８（Life Technologies）、１０％ウシ胎児血清および２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する Grace's 昆虫細胞培地（Life Technologies,Inc., Grand Island, NY）中で、２７℃において２５時間培養した。それら細胞に、ＴｈＲ／ｐＢｌｕｅｂａｃ（組換えウイルス）を３〜５の感染多重度で感染させ、２７℃で４日間培養した。これら細胞を採取し、２．７ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、そして使用されるまで−７０℃で貯蔵した。これら細胞を、溶菌緩衝液（２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０ｍｇ／ｍＬロイペプチン、１０ｍｇ／ｍＬアプロチニン、５０ｍＭ  ＮａＦ）中に再懸濁させ、洗浄した。それ以後の工程は全て、氷上において４℃またはそれ未満の冷緩衝液および遠心機ローターで行われるべきである。これら細胞を、最大速度で１分間均一にし、３０，０００ｘｇで４５分間沈降させた。ペレットを溶菌緩衝液中に再懸濁させ、均一化／洗浄工程を３回繰り返した。得られたペレットを、３０ｍＬの可溶化緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０ｍｇ／ｍＬロイペプチン、１０ｍｇ／ｍＬアプロチニン、５０ｍＭ  ＮａＦ、０．１％（ｗ／ｖ）ジギトニン、０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸Ｎａ）中に再懸濁させた後、１分間均一にした。その懸濁液を、４℃で９０分間撹拌後、３０，０００ｘｇで６０分間沈降させた。その上澄みを、０．２％ジギトニンを含有する可溶化緩衝液で平衡させた抗ＰＡＲ１単クローン性抗体カラム上に充填した。上澄みの適用後、そのカラムを、１０倍カラム容量の０．２％（ｗ／ｖ）Ｎａドデシルマルトシド含有１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄した。受容体は、１０ｍＭトリエチルアミン、ｐＨ１１．８を用いて溶離した。溶離した画分を、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．４を用いて直ちに中和した。プールされた画分を、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）Ｎａドデシルマルトシドを含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に対して透析した。アリコートを−８０℃で貯蔵した。
【００９３】
脂質小胞の製造には、２００μＬのホスファチジルセリン（ＣＨＣｌ３中の５０ｍｇ／ｍＬ；Matreya）を、ロータリーエバポレーター中で３０分間または乾燥Ｎ２流を用いて乾燥させた。２００μＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％（ｗ／ｖ）Ｎａドデシルマルトシド）の添加後、試験管をＮ２雰囲気下で密封し、浴ソニケーター中で３０分間音波処理した。脂質小胞中への受容体の再構成は、実施例５の場合のように製造された精製受容体を用いて同日に行った。精製受容体原液（２００μｇ／ｍＬ）を氷上で融解し、５０μＬを、適当なアゴニストペプチド（１００ｎＭ最終濃度）と一緒に４℃で２０分間インキュベートした。トロンビン受容体の場合、アゴニストは、トロンビン受容体アゴニストペプチド（１００ｎＭ最終濃度；CalbioChem）である。８０μＬの音波処理された脂質および５０μＬの緩衝液Ａの添加後、それら試料を、渦発生機を用いて混合し、氷上に１０分間置いた。次に、０．２％ＢＳＡで洗浄され且つ５ｍＬのＮａドデシルマルトシド不含緩衝液Ａで予め平衡にされた１ｍＬの Extracti-gelＴＭカラム上に、試料を充填した。再構成された小胞を、２．５ｍＬ  ＨＥＫ緩衝液でカラムから溶離した。
【００９４】
試料（１００〜２００μＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度分析用に集めた。各バッチの濃度は、概して、１０〜１０００μｇ／ｍｌであった。使用には、受容体をマイクロタイタープレート中に約１〜１００μｇ／ｍｌで入れた。精製され、再構成されたトロンビン受容体を、天然Ｇｑ−Ｃ末端ペプチドに結合するそれらの能力について、ＭＢＰ−Ｇｑ融合タンパク質を用いて調べた。（図３）。対照として、中空小胞の天然Ｇｑ−Ｃ末端ペプチドに結合する能力についても、ＭＢＰ−Ｇｑ融合タンパク質を用いて調べた。
【実施例７】
【００９５】
実施例７．ＧＰＣＲ結合性高親和性ペプチド類似体の識別（パンニング）。
エレクトロコンピテント（electrocompetent）細胞を、次のように生産した。ＡＲＩ８１４細菌の単一コロニーを、５ｍｌの滅菌ＳＯＰ（２０ｇ／Ｌ Bacto−トリプトン；１０ｇ／ＬBacto−酵母エキス；５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ；２．５ｇ／Ｌ無水Ｋ２ＨＰＯ４；１ｇ／Ｌ  Ｍｇ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）中において３７℃で一晩成長させた。この一晩成長から１ミリリットルを、５００ｍｌのＳＯＰに加え、そしてこの細菌を０．６〜０．８のＯＤ６００読みで成長させた。追加の洗浄工程は全て、低温中で行った。これら細胞を、氷水浴中に少なくとも１５分間入れた後、４℃において４０００ｘｇで１５分間の遠心分離を行い、次に５００ｍｌの１０％グリセロール中に再懸濁させた。氷上で３０分間撹拌後、細胞を５００ｍｌと２０ｍｌの１０％グリセロール中において、上のような沈降を伴って更に２回洗浄し、そして最後に、４℃において５０００ｘｇで１０分間沈降させ、１ｍｌの１０％グリセロール中に再懸濁させた。細胞は、後で使用するために、１００μＬずつのアリコート中でドライアイスおよびイソプロパノールを用いて速やかに凍結させた。
【００９６】
トランスフェクションするために、融解したＡＲＩ８１４細胞のアリコート（４０μＬ）を、３本の冷却したミクロ遠心管各々に入れた。Ｇαｔの１１量体カルボキシル末端ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）に基づくペプチドディスプレイライブラリーは、実施例１にしたがって作成した。２マイクロリットルのライブラリープラスミドをそれら管に加え、混合した。第一ラウンドの「パンニング」には、２００μＬのプラスミドライブラリーを加えた。それ以後のラウンドには、３組のトランスフェクションを行った（受容体が入っているウェルからの付着プラスミド（＋）；受容体不含ウェルからの付着プラスミド（−）；およびインキュベートされなかったＰＲＥ試料）。下を参照されたい。各々のパンニングラウンドでは、より少ないライブラリーを用いた（ラウンド２：１００μｌ；ラウンド３：５０μｌ；ラウンド４：１０μｌ）。パンニングを完了後、Ｌａｃ１融合タンパク質のＤＮＡを溶離した。このＤＮＡ（５０μｌ）を用い、冷滅菌０．１ｃｍ電極間隙キュベットを用いて、エレクトロポレーションによってＥ．coli 細胞をトランスフェクションした。これらキュベットに、１．８ｋＶ、２５μＦ容量、４〜５ミリセカンドの時定数に設定された BioRad E.coli Pulsar を用いて、２００ｍΩにおけるPulser Controller 装置で１回パルス処理した。直ちに、１ｍＬのＳＯＣを加え、その混合物を、標識された１７ｘ１００ｍｍポリスチレン管に移した。その管を、３７℃で１時間振とうした。各組からアリコートを取り、１００μＬの未希釈〜１０−６希釈試料をＬＢ−Ａｍｐプレート上にプレーティングした。ＰＲＥプレートの計数は、ライブラリー多様性を示したが、（＋）および（−）プレートの比較は、パンニング手順によって特定のクローンが豊富になっていたかどうか示した。
【００９７】
（＋）受容体管中の残りの約９００μＬを、２００ｍＬのＬＢ−ＡＭＰ培地が入っている、３７℃に予熱された１Ｌフラスコに加え、３７℃において、ＯＤ６００＝０．５になるまで振とうしながら成長させた。次に、この細胞試験管を、氷水浴中に少なくとも１０分間入れ、それ以後の洗浄工程中に４℃またはそれ未満で冷却したまま維持した。これら細胞を、５０００ｘｇで６分間沈降させ、１００ｍＬ  ＷＴＥＫ緩衝液中に再懸濁させ、５０００ｘｇで６分間沈降させ、５０ｍＬ  ＴＥＫ緩衝液中に再懸濁させ、５０００ｘｇで６分間再度沈降させ、そして４ｍＬ  ＨＥＫ緩衝液中に再懸濁させた。細胞をクリオバイアル中に分割し、−７０℃で貯蔵した。一方の管を次のパンニングラウンドに用い、もう一方を予備として取っておいた。
【００９８】
パンニング処理は、図１に詳しく示されている。「パンニング」によるライブラリーのスクリーニングのために、実施例５にしたがって製造されたロドプシン受容体を、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび１ｍＭジチオトレイトール（ＨＥＫ／ＤＴＴ）を含有する冷３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中の、Immulon ４（Dynatech）マイクロタイターウェル（０．１〜１μｇ／ウェルのタンパク質）上に直接的に固定した。４℃で１時間振とう後、未結合膜フラグメントを、ＨＥＫ／ＤＴＴで洗い流した。それらウェルを、１００μＬのＨＥＬＫ中２％ＢＳＡ（３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；５０ｍＭ  ＫＣｌ；０．２Ｍα−ラクトース；ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＤＴＴ含有）で遮断した。ラウンド１と２には、遮断するのにＢＳＡを用い；後の方のラウンドでは、１％脱脂粉乳を用いた。第一ラウンドのパンニングには、９６ウェルプレートの約２４ウェルを用いた。それ以後のラウンドには、受容体を含む８ウェルと、受容体不含の８ウェルを作成した。
【００９９】
Ｇｔライブラリーを融解し（２ｍＬアリコート）、氷上で６ｍＬ溶菌緩衝液と混合した。溶菌緩衝液は、４．２５ｍＬ  ＨＥ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ：０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）；１ｍＬの５０％グリセロール；７５０μＬのＨＥ中１０ｍｇ／ｍＬプロテアーゼ不含ＢＳＡ；１０μＬの０．５Ｍ  ＤＴＴ；および６．２５μＬの０．２Ｍ  ＰＭＳＦを含有している。新たに製造されたリゾチーム溶液（１５０μＬの冷ＨＥ中１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム）を加え、試験管を静かに数回逆さにし、氷上において２分以下の間インキュベートした。溶菌の程度は、混合後に試験管の上部への気泡の移動が遅いのに注目することによって認められうる粘度の増加によって証明される。溶菌は、２ｍＬの２０％ラクトースおよび２５０μＬの２Ｍ  ＫＣｌ中で混合することによって停止した。直ちに、その管を４℃において１３，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上澄みを新しい管に移した。０．１％の少量のアリコート（ＰＲＥ試料）を、別の標識した管に取っておいた。遮断されたロドプシン受容体被覆プレートを、ＨＥＫＬ／１％ＢＳＡで４回すすぎ洗浄し、そして光活性化ロドプシン（表IX）については、氷上において室光に５分未満の間暴露してロドプシンを活性化し、または暗適応（不活性）ロドプシン（表Ｘ）については暗所に放置した。その直後、ペプチドライブラリーからの粗製細菌溶菌液（２００μＬ）を各ウェルに加え、４℃で静かに１時間振とうさせた。ラウンド２には、この同じ手順を行った。ラウンド３には、用いられる溶菌液の量を１００μＬに減少させた。それ以後のラウンドでは、溶菌液をＨＥＫＬ／ＢＳＡ中で１：１０に希釈した。全てのラウンドで、５〜１０μＬの２００μＭ天然ペプチドをウェルに加えて、より低い親和性で結合したペプチドを駆逐した。
【０１００】
細菌溶菌液とのインキュベーション後、それらウェルを、冷ＨＥＫＬ／１％ＢＳＡ中に４回洗浄した。音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（２００μＬのＨＥＫＬ／１％ＢＳＡ中０．１ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え、４℃で静かに３０分間振とうした。これらプレートを、冷ＨＥＫＬで４回、冷ＨＥＫで２回洗浄後、５０μＬ／ウェルのＨＥ中１ｍＭ  ＩＰＴＧ／０．２Ｍ  ＫＣｌを室温で３０分間激しく振とうしながら加えることによって溶離した。各群のウェル（（＋）または（−）受容体）からの溶離液を、必要に応じて一つまたはそれを超えるミクロ遠心管に一緒にした。前に取っておいたＰＲＥ試料の容量を、溶離液試料の容量に対合させ、それらと平行して沈殿させた。沈殿させるために、１／１０容量の５Ｍ  ＮａＣｌを、各々のこれら試料と混合後、１μＬの２０ｍｇ／ｍＬグリコーゲンをこれら試料と混合した。次に、等量のＲＴイソプロパノールを加え、充分に混合した。それら試料に、１３，０００ｘｇで１５分間の遠心分離を施し、上澄みを吸引した。そのペレットを、５００μＬの冷８０％エタノールで洗浄し、そして再度、１３，０００ｘｇで１０分間の遠心分離を施した。プラスミドＤＮＡのペレットは、ＰＲＥ試料については２００μＬおよび（＋）または（−）受容体試料については４μＬの滅菌二重蒸留水中に再懸濁させ、−２０℃で貯蔵した。
【０１０１】
光活性化ロドプシンおよび暗適応ロドプシンを両方とも、この方式でライブラリーをスクリーニングするのに用いた。下の表IXおよび表Ｘを参照されたい。光活性化ロドプシンを用いて得られた配列の内６種類は、ロドプシンを結合することにおいて、天然配列より１００〜１０００倍強力であったが、これは表IXに挙げられている。Ｇαｔライブラリーを用いて光活性化ロドプシンをパンニングした場合、Ｌ３４４、Ｃ３４７およびＧ３４８の残基は不変であった。更に、各々の最高親和性配列では、３４１位の塩基性残基（Ｒ３４１）が中性残基へと変化した。Ｇαｔライブラリーを用いて暗適応ロドプシンをパンニングした場合、Ｌ３４４、Ｃ３４７およびＧ３４８の残基は、もはや不変ではなかったし（６２．５％の配列中に存在するＬ３４４、２５％の配列中に存在するＣ３４７、７５％の配列中に存在するＧ３４８）、そして通常は、３４１位の残基（Ｒ３４１）が未変化であった。したがって、受容体のその不活性な暗適応状態でのコンホメーションは、光活性化受容体よりもそれが、一連の異なったペプチド類似体に結合することを可能にする。更に、光活性化受容体の場合、ペプチドの最後の７アミノ酸（３４４〜３５０）が最も重要であるが、最初の６アミノ酸（３４０〜３４５）は、暗適応ロドプシン結合に一層重要であると考えられる。
【０１０２】
【表９】
2005506518.tif 000012
【０１０３】
【表１０】
2005506518.tif 000013
【実施例８】
【０１０４】
実施例８．ＧｑペプチドライブラリーでのＰＡＲ１のスクリーニング。
実施例７の方法を用い、Ｇｑライブラリーを用いて、いろいろなＰＡＲ１受容体源をスクリーニングした。脂質小胞中で再構成された精製ＰＡＲ１（実施例６）、ＰＡＲ１を発現するＳｆ９昆虫細胞から製造された膜（実施例２）およびＰＡＲ１を過剰発現する哺乳動物細胞から製造された膜を用いた。これらスクリーニングの結果を、表XI、表XIIおよび表XIIIにそれぞれ示す。競合相手として用いられたペプチドは、ＬＱＬＮＬＫＥＹＮＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であった。
【０１０５】
【表１１】
2005506518.tif 000014
【０１０６】
【表１２】
2005506518.tif 000015
【０１０７】
【表１３】
2005506518.tif 000016
【実施例９】
【０１０８】
実施例９．ＧＰＣＲ結合性高親和性ペプチド類似体の識別（パンニング）。
実施例７の方法を、Ｇｑライブラリーでパンニングされた、組換え体の再構成されたβ２アドレナリン受容体を用いて繰り返した。パンニングスクリーニングおよび選択されたペプチドのＥＬＩＳＡ結合親和性の結果を、下の表XIVに示す。
【０１０９】
【表１４】
2005506518.tif 000017
【実施例１０】
【０１１０】
実施例１０．ＧＰＣＲ結合性高親和性ペプチド類似体の識別（パンニング）。
実施例７の方法を、Ｇｔライブラリーでのロドプシンスクリーニングを用いて繰り返した。パンニングスクリーニングおよび選択されたペプチドのＥＬＩＳＡ結合親和性の結果を、下の表XVに示す。
【０１１１】
【表１５】
2005506518.tif 000018
【実施例１１】
【０１１２】
実施例１１．追加のペプチド類似体。
チャイニーズハムスター卵巣で発現されるＰＡＲ１を、下の表XVIに示されている競合相手ペプチドを用いて、Ｇｔ、Ｇ１２およびＧ１３ライブラリーに対してスクリーニングした。追加のペプチド類似体を、Ｇ１１ライブラリーおよび競合相手としてのＬＱＬＮＬＫＥＹＮＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を用いて識別し、そして下の表XVIIに示されている、異なった源から入手されるＰＡＲ１受容体への高親和性結合についてスクリーニングした。
【０１１３】
【表１６】
2005506518.tif 000019
【０１１４】
【表１７】
2005506518.tif 000020
【実施例１２】
【０１１５】
実施例１２．ＬａｃＩ溶菌液の製造。
最終ラウンドのパンニングで、数種類のクローンを（＋）受容体プレートから選択し、ＬＢ−Ａｍｐ培地中で一晩成長させた。３００マイクロリットルの一晩培養物を、「ＥＬＩＳＡ溶菌液培養物」用にＬＢ−Ａｍｐ培地で３ｍＬに希釈した。別の３０μＬを、等量の５０％グリセロールに加え、標識されたミクロ遠心管に−７０℃で貯蔵した。残りの４．５ｍＬは、標準的なミニプレププロトコール（Qiagen SpinprepＴＭキット）を用いてＤＮＡを製造するのに用い、そしてライブラリーのランダム領域を終結するＴＡＡ停止コドンから下流の５６塩基対の部位のベクターに相同である１９塩基対リバースプライマー（ＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６５）を用いて配列決定した。このＤＮＡを−２０℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡ溶菌液培養物を、３７℃で１時間振とうさせた。発現は、３３μＬの２０％アラビノース（０．２％の最終濃度）を３７℃で２〜３時間振とうしながら加えることによって誘導した。次に、この培養物を、４０００ｘｇで５分間沈降させ、ペレットを３ｍＬの冷ＷＴＥＫ緩衝液中に再懸濁させ、４０００ｘｇで５分間再度沈降させ、そしてペレットを１ｍＬの冷ＴＥＫ緩衝液中に再懸濁させた。１．５ｍＬのミクロ遠心管に移した後、ペレットを１３，０００ｘｇで２分間沈降させ、上澄みを吸引した。細胞ペレットを１ｍＬの溶菌緩衝液（４２ｍＬのＨＥ、５ｍＬの５０％グリセロール、３ｍＬのＨＥ中１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、７５０μＬのＨＥ中１０ｍｇ／ｍＬリゾチームおよび６２．５μＬの０．２Ｍ  ＰＭＳＦ）中に再懸濁させ、氷上で１時間インキュベートした。１１０マイクロリットルの２Ｍ  ＫＣｌをこの溶菌混合物に加え、逆さにして混合後、４℃において１３，０００ｘｇで１５分間沈降させた。透明な粗製溶菌液（約０．９ｍＬの上澄み）を新しい試験管に移し、−７０℃で貯蔵した。
【実施例１３】
【０１１６】
実施例１３．ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質のＰＡＲ１受容体特異的結合。
一つ一つのクローンによってコードされるペプチドの結合性は、次のように検定した。Ｓｆ９昆虫細胞から製造される精製ＰＡＲ１受容体（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０％グリセロール中の１〜１０，０００ｐｇ／ｍＬ）を、実施例６にしたがって脂質小胞中で再構成させた。０．２〜２０，０００μｇ／ｍＬの連続希釈の受容体含有膜（＋／−受容体）を、マイクロタイタープレート上のウェルに加え、４℃で静かに１時間振とうした。洗浄後、実施例１２に記載の方法にしたがって、ＬａｃＩ−Ｇｑクローンから製造されるＬａｃＩ−Ｇｑ溶菌液の１：１〜１：１０，０００連続希釈をそれらウェルに加え、プレートを４℃で静かに１時間振とうし、洗浄した。抗ＬａｃＩ抗体（Stratagene）を加え（１：１０００）、プレートを４℃で静かに１時間振とうした。洗浄後、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Kierkegaard and Perry Laboratories）を加え（１：２５００）、プレートを４℃で静かに１時間振とうした。プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて発色させた後、ＯＤ４５０でのＥＬＩＳＡ読みを読み取った。ＥＬＩＳＡの一般的な方法は、図３に図示されている。これら結果は、図４を参照されたいが、ＬａｃＩ−Ｇｑ融合タンパク質が、トロンビン受容体を濃度依存方式で結合するということを示している。中空小胞を結合するＬａｃＩ−Ｇｑ融合タンパク質の能力は、トロンビン受容体で再構成された小胞より有意に低かった。
【実施例１４】
【０１１７】
実施例１４．高親和性ペプチドの存在下におけるスクリーニング。
光活性化ロドプシンへの親和性が、実施例７に記載のパンニング手順によって識別されるものより一層高いペプチドを識別するために、ラウンド３と４のライブラリーインキュベーションに高親和性ペプチドを含めた。ペプチド８（ＬＬＥＮＬＲＤＣＧＭＦ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）は、天然配列より１０００倍高い光活性化ロドプシンへの結合を示すペプチドとして最初のスクリーニングで識別されていた。Ｇαｔライブラリーのスクリーニングは、１０μＬの１００μＭ（１００ｎＭ最終濃度）ペプチド８をラウンド３と４のウェルに含めたことを除き、実施例７の場合のように行った。このスクリーニングは、極めて高い親和性でロドプシンを結合するし、しかもそれを、その活性型であるメタロドプシンIIで安定化させることもする数種類のクローンを示した。下の表XVIIIを参照されたい。表IXと表XVIIIを比較すると、スクリーニングでのペプチド８の使用が、３４１位での中性残基への変化を引き起こしたということが明らかである。Ｌ３４４、Ｃ３４７およびＧ３４８の残基は、ペプチド８をスクリーニングに含めていようといまいと、安定なままであった。ペプチド８の使用は、３４０位でのより高いイソロイシン発生率（天然ペプチドでの１７％対ペプチド８での７１％）および３４２位でのより低いグルタミン発生率（天然ペプチドでの６７％対ペプチド８での２９％）を生じた。このタイプの情報は、薬物または薬物スクリーニング用化合物として用いるための極めて強力な類似体ペプチドの発見に貢献するのみならず、Ｇαと受容体との間の接触部位の基礎となる構造骨組についての理解を促進する。
【０１１８】
この方法で識別される若干のクローンについて行った結合検定を、図５に示す。スクリーニング法でペプチド８を用いて識別されるペプチドは全て、光活性化ロドプシンに、ペプチド８の場合と等しいまたはより大きい親和性で結合した。最初のバー（ＨＡＰ＝ペプチド８）を残りのバーと比較されたい。
【０１１９】
【表１８】
2005506518.tif 000021
【実施例１５】
【０１２０】
実施例１５．ＭＢＰベクター中へのサブクローニングおよびＭＢＰ粗製溶菌液の製造。
ｐＥＬＭ３を、室温においてＡｇｅＩ（New England Biolabs）で消化し、そして切断されたベクターを、０．７％アガロースゲル上で未切断ベクターから分離した。ＤＮＡを精製し（Qiagen Extract-a-gel キット）、ＳｃａＩ（New England Biolabs）で消化した。５．６ｋｂのＭＢＰベクターフラグメントを、１％アガロースゲル上で分離し、上のように精製した。ペプチドライブラリーの最終親和性精製ラウンド中に、２００ｍＬの増幅培養物から一部分２０ｍＬを取っておいた後、細胞を採取した。この２０ｍＬ部分を、飽和まで、通常は一晩成長させ、これら細胞からＤＮＡを製造した（Qiagen ミディプレプキット）。ｐＪＳ１４２プラスミドＤＮＡを、ＢｓｐＥＩおよびＳｃａＩで消化した。０．９ｋｂのペプチドコーディングフラグメントを、３．１ｋｂおよび１．７ｋｂのベクターフラグメントから、１％アガロースゲル上で分離し、精製した。
【０１２１】
いろいろな比率（１：２、１：１、２．５：１、５：１、１０：１）の５．６ｋｂ  ＭＢＰベクターフラグメントおよびペプチドコーディング０．９ｋｂフラグメントを、０．４ｍＭ  ＡＴＰを含有するリガーゼ緩衝液中、１４℃において、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結させた。この連結は、温度を６５℃まで１０分間上昇させることによって停止した。バックグラウンドを低くするために、この連結混合物をＸｂａＩで消化後、１μＬのグリコーゲンを担体として用いたイソプロパノール沈殿を行った。８０％エタノールで１回洗浄後、ペレットを２０μＬの二重蒸留水中に再懸濁させた。ＡＲＩ８１４細胞を、実施例７に記載のように、１μＬの沈殿したＸｂａＩ消化連結配合物を用いて形質転換させた。これら細胞を１ｍＬのＳＯＣ中において３７℃で１時間振とうさせた後、１００μＬの懸濁液をＬＢ−Ａｍｐプレート上に塗抹した。粗製溶菌液は、ＬａｃＩ溶菌液について実施例９に記載されたように製造した。
【実施例１６】
【０１２２】
実施例１６．ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質精製。
単一のＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質クローンの一晩培養物（１ｍＬ）を、２００ｍＬのＬＢ−ＡＭＰ培地中に接種した。この培養物を、ＯＤ６００＝０．５になるまで３７℃で振とうさせた。タンパク質発現は、１５０μＬの１Ｍ  ＩＰＴＧ（０．３ｍＭ最終濃度）の添加によって、３７℃で２時間振とうを続けながら誘導した。次に、この培養物を、５０００ｘｇで２０分間沈降させ、５ｍＭカラム緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４；２００ｍＭ  ＮａＣＬ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１ｍＭ  ＤＴＴ）中に再懸濁させ、そして１６．２５μＬの０．２Ｍ  ＰＭＳＦを加えた。次に、再懸濁された細胞ペレットを、−７０℃で貯蔵した。この貯蔵されたペレットを冷水中で融解させ、氷浴中に入れた。ペレットを、Fisher Scientific ５５ Sonic Dismembrator（４０％定時、出力５、全１分間で５回反復）で１５秒未満の短パルスで音波処理した。音波処理されたペレットに、９０００ｘｇで３０分間の遠心分離を施し、その後、上澄みを取っておいて、カラム緩衝液を用いて１００ｍＬに希釈した。通常は、タンパク質濃度は約２．５ｍｇ／ｍＬであった。カラムは、７．５ｍｌのアミロース樹脂を BioRad 使い捨てカラムに注入し且つ８容量のカラム緩衝液で洗浄することによって調製した。希釈された粗製抽出物を、約１ｍＬ／分の勾配流によって充填し、カラムを８容量のカラム緩衝液で再度洗浄した。融合タンパク質を、１０ｍＬのカラム緩衝液中１０ｍＭマルトースで溶離し、Amicon centriplus ３０ＴＭカラムを用いて濃縮後、小分けし、−７０℃で貯蔵した。
【実施例１７】
【０１２３】
実施例１７．ライブラリー粗製溶菌液をＥＬＩＳＡによってスクリーニングする方法。
マイクロタイターウェルを、最終容量１００μＬの１ｍＭ  ＤＴＴ含有ＨＥＫ中０．１〜１．０μｇ／ウェルのロドプシン受容体で、４℃において１時間振とうしながら被覆した。次に、これらウェルを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、１００μＬの１ｍＭ  ＤＴＴ含有ＨＥＫ中２％ＢＳＡをウェルに加え且つ４℃で少なくとも３０分間振とうを続けることによって遮断した後、１ｍＭ  ＤＴＴ含有ＨＥＫで４回洗浄した。粗製溶菌液を、１ｍＭ  ＤＴＴ含有ＨＥＫ中で１：５０に希釈し、被覆されたウェルに加えた（１００μＬ／ウェル）。これらプレートを４℃で１時間振とうし、ＰＢＳ／０．０５％ TweenＴＭ２０  １ｍＭマルトースで４回洗浄後、０．０５％ TweenＴＭ２０および１ｍＭマルトースを含有するＰＢＳ中に１：１０００のウサギ抗ＭＢＰ抗体（New England Biolabs）１００μＬで、４℃において３０分間振とうしながらプローブした。更に洗浄後、それらウェルを、１％ＢＳＡおよび１ｍＭマルトースを含有するＰＢＳ中に１：７５００の西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ二次抗体１００μＬで、４℃において３０分間振とうしながらプローブした。このプレートを、０．０５％ TweenＴＭ２０および１ｍＭマルトースを含有するＰＢＳで４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（Ｂｉｏ−Ｆｘ；１００μＬ）を加え、２０〜３０分間発色させた。この反応を、１００μＬの２Ｎ硫酸の添加によって停止し、プレートをＯＤ４５０で読み取った。色反応が速く生じすぎた場合（１０分未満）、または負の対照ウェルのバックグラウンドが高すぎた場合（０．２を超える）、この検定を、１：１００または１：２００希釈の粗製溶菌液を用いて繰り返した。
【実施例１８】
【０１２４】
実施例１８．高親和性ロドプシン結合性ペプチドの結合検定。
ラウンド４のパンニングで識別されるペプチドコーディング配列の集団全体（実施例７を参照されたい）を、ｐＪＳ１４２からｐＥＬＭ３（New England Biolabs）に転移させた。このプラスミドは、イソプロピルβ−チオガラクトピラノシドによって誘導可能で且つ欠失したリーダー配列と一緒にＥ．coli ｍａｌＥ遺伝子を含有する、修飾ポリリンカーを含むｐＭａｌ−ｃ２誘導体であり、ＭＢＰ融合タンパク質の細胞質発現をもたらす。ＭＢＰ−カルボキシル末端ペプチド類似体融合タンパク質を、Ｅ．coli 中で発現させた。
【０１２５】
検定用に、暗所において、１μｇ／ウェルの実施例５に記載のＲＯＳ膜（ロドプシン）を、冷ＨＥＫ／ＤＴＴ中のマイクロタイターウェル上に直接的に４℃で１時間固定した。これらウェルをすすぎ洗浄し、ＨＥＫ／ＤＴＴ中１％ＢＳＡで４℃において１時間遮断し、再度すすぎ洗浄した。結合したロドプシンを、氷上で５分間の光への暴露によって活性化させた後、ＭＢＰ融合タンパク質を加えた（粗製細菌溶菌液を、１μＭジチオトレイトールを含むＨＥＫ中で１：５０に希釈した；精製タンパク質を０．２〜１２０ｎＭで用いた）。ＭＢＰ−Ｇαｔ３４０−３５０Ｋ３４１Ｒ（ｐＥＬＭ１７）融合タンパク質およびリンカー配列だけを含むＭＢＰ（ｐＥＬＭ６）は、対照ウェル中に５０ｎＭ最終濃度で存在した。３０分後、ウェルを洗浄し、ウサギ抗ＭＢＰ抗体（New England Biolabs）を加えた。この抗ＭＢＰ抗体は、粗製溶菌液には１：１０００希釈で、精製タンパク質には１：３０００希釈で用いた。３０分後、ウェルを再度洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体（粗製溶菌液には１：７５００希釈；精製タンパク質には１：１０，０００希釈；Kierkagaard & Perry Laboratories）を加えた。３０分後、このプレートを、０．０５％ TweenＴＭ２０含有ＰＢＳで４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（１００μＬ）を加え、約２０分間発色させた。この反応を、１００μＬの２Ｎ硫酸の添加によって停止した。結果を図６に示す。数値は、ＯＤ４５０での吸光度を示す。検定用の対照はｐＥＬＭ１７であったが、これは、ＭＢＰ融合タンパク質Ｇαｔ３４０−３５０Ｋ３４１Ｒをコードする。リンカー配列だけに融合したＭＢＰタンパク質を発現するｐＥＬＭ６は、負の対照として役立った。「溶菌液不含」対照ウェルを含めて、検定内のいずれか固有の非特異的結合を反映させた。図６を参照されたい。
【０１２６】
高親和性ＭＢＰ融合タンパク質のＩＣ５０値は、ＭＢＰ−Ｇαｔ３４０−３５０Ｋ３４１Ｒの６μＭのＩＣ５０より３桁の大きさまで強力な、３．８〜４２ｎＭであった。最高の親和性配列全てにおいて、天然配列中では陽電荷残基である３４１位が、中性残基に変化した。Ｌｅｕ３４４、Ｃｙｓ３４７およびＧｌｙ３４８は、不変であることが判明したし、疎水性残基は、常に３４０位、３４９位および３５０位に位置していて、これら残基の臨界的性質が示された。
【実施例１９】
【０１２７】
実施例１９．高親和性ペプチドのロドプシンへの結合は、ヘテロ三量体Ｇｔによって競合的に阻害されうる。
ライブラリー（クローン８、９、１０、１８、２３、２４からの配列、更には、野生型ペプチド配列をコードするｐＥＬＭ１７、およびペプチド上に含有されるｐＥＬＭ６）からの高親和性ペプチドを含有するＭＢＰ融合タンパク質の結合を、ヘテロ三量体Ｇｔの存在下または不存在下において、ロドプシン（０．５μｇ／ウェルのロドプシン）を結合するそれらの能力について評価した。各々のクローンからの溶菌液（５０μｌ）を加え、明所でインキュベートした。４５分後、１μＭのヘテロ三量体Ｇｔを加え、その溶液を３０分間インキュベートした。抗ＭＢＰ抗体を加えた後、ヤギ抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ結合抗体および基質を加えた。発色させた。吸光度データを図７に示す。
【実施例２０】
【０１２８】
実施例２０．ＭＢＰクローンのＰＡＲ１への結合。
ＰＡＲ１を結合する高親和性ペプチドを識別するために、ＰＡＲ１を過剰発現する哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣）から製造された膜を、Ｇ１１ペプチドライブラリーでパンニングした。選択されたクローンのＥＬＩＳＡ結合親和性結果は、ＰＡＲ１かまたはＧｑ共役型ムスカリンＭ１受容体を発現するＳｆ９細胞から製造された膜へのそれらの結合について、図８に示されている。その結合を定量するために、二次抗体をＨＲＰに結合させたＥＬＩＳＡ法によって、精製ＭＢＰクローンを分析した。対照ＭＢＰ−Ｇｑ融合タンパク質についての結合を示す。図８を参照されたい。データは、二重に行われた二つの別々の実験の平均である。ＭＢＰクローンＰＡＲ−１３およびＰＡＲ−３４は両方とも、ＰＡＲ１への高親和性結合も特異性も示す。ＭＢＰクローンＰＡＲ−２３およびＰＡＲ−３３は、低親和性も低特異性も有すると考えられる。これら配列については、表XIIIを参照されたい。
【実施例２１】
【０１２９】
実施例２１．ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質の結合特異性。
Ｇ１１ライブラリーから選択されるＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質のＰＡＲ１結合性クローンを、ＨＥＫ／ＤＴＴ中で１：１００に希釈し、そしてＭ１受容体（Ｇｉに共役する）またはＰＡＲ１受容体を発現する細胞または受容体を発現しない細胞からの、実施例２にしたがって製造されるＳｆ９昆虫細胞膜への用量反応性結合について調べた。図９に示されるような増加する量の膜を、マイクロタイターウェル中に被覆し、インキュベートし、すすぎ洗浄した。ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質溶菌液を加え、インキュベート、すすぎ洗浄し、そして上記のようにＬａｃＩ抗体を用いて、受容体に結合したＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質を測定した。単一の代表的なクローンの結果は、図９に示されているが、選択されたペプチドのＰＡＲ１への特異性を示している。
【実施例２２】
【０１３０】
実施例２２．天然Ｇαｑ−マルトース結合性タンパク質−ペプチド融合タンパク質のＰＡＲ１への結合。
マイクロタイターウェルを、上の実施例６に記載のように、１００ｎｍｏｌｅトロンビン受容体活性化ペプチドの存在下において、精製され再構成されたＰＡＲ１で被覆した。精製されたマルトース結合性タンパク質−Ｇαｑ（ＭＢＰ−Ｇαｑ）を、図１０に示される濃度で加え、４℃において振とう機上で１時間インキュベートした。これらウェルをすすぎ洗浄後、上記のように、ウサギ抗マルトース結合性タンパク質抗体で、次にアルカリ性ホスファターゼ結合二次抗体でプローブした。基質を加え、約２０分間発色させた。４０５ｎｍでの吸光度を測定し、そして GraphPad Prism（バージョン２．０）を用いて、用量反応曲線を計算した。図１０中の結果を参照されたい。活性ＰＡＲ１へのＧαｑ結合について計算されたＩＣ５０は、２１４ｎＭであった。
【実施例２３】
【０１３１】
実施例２３．Ｇαペプチドミニ遺伝子構築物のためのオリゴヌクレオチドの設計。
Ｇαサブユニットの最後の１１アミノ酸をコードしているｃＤＮＡを、新たに遺伝子操作される５’末端および３’末端で合成した（Great American Gene Company）。この５’末端は、ＢａｍＨＩ制限酵素部位の後に、ヒトリボソーム結合共通配列（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７）、翻訳開始のためのメチオニンコドン（ＡＴＧ）、および翻訳の際のリボソーム結合部位およびタンパク質分解に対してナセント（ｎａｓｃｅｎｔ）ペプチドを保護するためのグリシンコドン（ＧＧＡ）を含有した。ＨｉｎｄIII制限酵素部位は、翻訳停止コドン（ＴＧＡ）の直後の３’末端に合成した。したがって、Ｇｉα１／２カルボキシル末端配列のための完全長さ５６ｂｐオリゴヌクレオチドは、
【０１３２】
【化２】
2005506518.tif 000022
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６８）であり、この相補鎖は、
【０１３３】
【化３】
2005506518.tif 000023
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９）であった。図１１を参照されたい。対照として、新たに遺伝子操作される５’末端および３’末端を含むランダムな順番のＧαｉ１／２カルボキシル末端（ＧαｉＲ）をコードしているオリゴヌクレオチドも合成した。このＤＮＡを滅菌ｄｄＨ２Ｏ中で希釈して、原液濃度を１００μＭとした。相補的ＤＮＡを、１Ｘ  ＮＥ緩衝液３（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ；New England Biolabs）中において８５℃で１０分間アニーリング後、徐々に室温に冷却させた。次に、このＤＮＡに、４％アガロースゲル電気泳動を施し、アニーリングされたバンドを切り取った。このバンドから、製造者のプロトコールにしたがってキットを用いて（GeneClean II Kit，Ｂｉｏ１０１）、ＤＮＡを精製した。各々の制限酵素での消化後、ｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドベクターに、０．８％アガロースゲル電気泳動を施し、適当なバンドを切り取り、上のようにＤＮＡを精製した（GeneClean II Kit，Ｂｉｏ１０１）。アニーリングされ／清浄にされたｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで予め切断された、切断され／清浄にされたｐｃＤＮＡ３．１プラスミドベクター（Invitrogen）中に室温で１時間連結させた。この連結反応には、数種類の異なった比率のインサート対ベクターｃＤＮＡ（２５μＭ：２５ｐＭ〜２５０ｐＭ：２５ｐＭのアニーリングされたｃＤＮＡ）をプレーティングした。連結反応後、これら試料を６５℃に５分間加熱して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを失活させた。この連結混合物（１μｌ）を、実施例７に記載のような５０μｌのコンピテント細胞中にエレクトロポレーションし、そして直ちに、それら細胞を１ｍｌのＳＯＣ（Gibco）中に入れた。３７℃で１時間振とう後、ミニ遺伝子プラスミドＤＮＡを含有するエレクトロポレーションされた細胞１００μｌを、ＬＢ／Ａｍｐプレート上に塗抹し、３７℃で１２〜１６時間インキュベートした。インサートが存在することを立証するために、コロニーをＬＢ／Ａｍｐ中で一晩成長させ、それらのプラスミドＤＮＡを精製した（Qiagen SpinKit）。このプラスミドＤＮＡを、Ｎｃｏｌ（New England Biolabs,Inc.）で室温において１時間消化し、１．５％（３：１）アガロースゲル電気泳動を行った。ベクター単独で３本のバンドを生じた。５６ｂｐのアニーリングされたオリゴヌクレオチドインサートが存在する場合、消化物パターンが３バンド（３３４５ｂｐ、１３５２ｂｐ、７３５ｂｐ）〜４バンド（３３４５ｂｐ、１０１１ｂｐ、７３５ｂｐ、３８０ｂｐ）になるようなバンドパターンの移動を引き起こす新しいＮｃｏＩ部位が存在する。図１２を参照されたい。正しい電気泳動パターンを有するＤＮＡを配列決定して、適当な配列を確認した。この方法を用いて、いずれかの高親和性ペプチドを挿入して、ミニ遺伝子構築物を作ることができる。
【実施例２４】
【０１３４】
実施例２４．ミニ遺伝子構築物からのペプチドの発現。
ＧＰＣＲ結合性ペプチドの発現は、種々のＧタンパク質αサブユニット（Ｇαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４）のカルボキシル末端配列に該当するミニ遺伝子インサートを含んだ構築物、更には、ランダムな順番のＧαｉ配列（ＧαｉＲ）を含有する対照ミニ遺伝子を用いて行った。ミニ遺伝子インサートＤＮＡは、５’および３’末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII制限部位を含む、各々のＧαのカルボキシル末端からのペプチド配列に該当する短い相補的オリゴヌクレオチドを合成することによって製造した。相補的オリゴヌクレオチドを、本明細書中にその開示が援用される、Gilchrist et al., J.Biol.Chem. 274:6610-6,1999 の方法にしたがって、アニーリングし、そして哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＢＡ３．１中に連結した。
【０１３５】
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞を、本明細書中にその開示が援用される、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harpor Laboratory Press, New York, vol.1-3(1989) の方法にしたがって、標準的なリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞中でのミニ遺伝子構築物の転写を確かめるために、全ＲＮＡを、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉまたはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでトランスフェクション後４８時間の細胞から、当該技術分野において知られている方法を用いて単離した。逆転写酵素ＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡを製造し、そして関係のあるＧαカルボキシル末端ペプチドインサートに特異的なプライマー（フォワード：５’−ＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０）；リバース：５’−ＧＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＣＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７１））を含む鋳型としてそのｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ分析を行った。Ｇαミニ遺伝子のこれらプライマーは、挿入されるペプチドコーディングオリゴヌクレオチドが存在する場合、４３４ｂｐフラグメントのみを増幅し；エンプティーｐｃＤＮＡ３．１ベクターでトランスフェクションされた細胞では、バンドが認められない。これらＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル上で分離した。単一の４３４ｂｐバンドの存在は、Ｇαカルボキシル末端ペプチドミニ遺伝子ＲＮＡが転写されたことを示した。図１３を参照されたい。対照実験は、Ｔ７フォワードプライマーを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターの存在を立証するのにベクターリバースプライマーで、そして全ＲＮＡの量を概算するのにＧ３ＤＰＨプライマー（Clonetech）で行った。
【０１３６】
ペプチドが、トランスフェクションされた細胞中で生産されたことを立証するために、既知の方法にしたがって、トランスフェクション後４８時間の細胞を溶解させ且つ均一にした。サイトゾル抽出物を、勾配逆相ＨＰＬＣによって次のように分析した。１００μＬのサイトゾル画分抽出物を、ｄｄＨ２Ｏ中０．１％ＴＦＡで平衡させたＣ４カラム（Vydac）上に充填した。ペプチドは、０〜６０％に４５分間にわたって増加するアセトニトリル勾配中０．１％ＴＦＡを用いて溶離した。ピークを集め、凍結乾燥させ、そしてイオン質量スプレー分析（University of Illinois-Urbana Champagne）を用いて分析した。Ｇαｉ１／２ペプチドベクター（ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ）でトランスフェクションされた細胞およびｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでトランスフェクションされた細胞からのピーク１の質量分析は、１４５０ダルトンペプチド（双方の１３アミノ酸ペプチド配列について予想される分子量）が、各々のサイトゾル抽出物中に存在したことを示した。ミニ遺伝子にコードされたペプチドは、サイトゾル中で見出される主要ペプチドであり、これらベクターが、適当なペプチド配列を大量に生じたことが強く示された。
【実施例２５】
【０１３７】
実施例２５．トロンビンに媒介されるイノシトールリン酸蓄積の界面Ｇタンパク質ペプチド阻害。
ＨＭＥＣを、トランスフェクションの２４時間前に、６ウェルプレート上に１ｘ１０５ウェルで播種してした。細胞を、実施例２１に記載のように、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲまたはｐｃＤＮＡ−Ｇｑで一過性トランスフェクションした。２４時間後、細胞を、４μＣｉ／ｍＬ［３Ｈ］−ミオイノシトールを含有する２ｍＬ培地中でインキュベートして、細胞イノシトール脂質の定常状態標識を得た。一過性トランスフェクションされた細胞を、トランスフェクション後４８時間のイノシトールリン酸（ＩＰ）蓄積について検定した。α−トロンビンで刺激する２時間前に、細胞を洗浄し、培地を５ｍＭ  ＬｉＣｌ含有培地に取り替えた。細胞を、１０ｎＭα−トロンビンで１０分間刺激した。イノシトールリン酸（ＩＰ）形成を、培地の吸引および氷冷メタノール（５％最終濃度）の添加によって止めた。
【０１３８】
過塩素酸で溶解した細胞を、４℃において２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＩＰを含有する上澄みを、１．６ｍｌ陰イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ  ＡＧ１−Ｘ８，ギ酸型，２００〜４００メッシュ）が入った Poly-Prep クロマトグラフィーカラム（Bio-Rad）を介して溶離した。過塩素酸で沈殿したペレット（ホスファチジルイノシトールおよび脂質を含有する）を、１ｍｌのクロロホルム−メタノール−１０Ｍ  ＨＣｌ（２００：１００：１，ｖ／ｖ／ｖ）中に再懸濁させた。これら上澄みを、３５０μＬのＨＣｌおよび３５０μＬのクロロホルムと混合し、２５００ｒｐｍで５分間沈降させて、相を分離した。下方の疎水性相を回収し、計数用バイアル中で乾燥させて、全ホスファチジルイノシトール中の放射能量を決定した。生じた［３Ｈ］−ＩＰの相対量は、次のように計算した。（［３Ｈ］−ＩＰ（ｃｐｍ）／［３Ｈ］−ＩＰ（ｃｐｍ）＋［３Ｈ］−イノシトール（ｃｐｍ））。各々の値を、ｐｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞で得られる基底値（トロンビン刺激なし）を用いて基準化した。図１４を参照されたい。示される結果は、三重に行われる少なくとも３回の独立した実験の基準平均±ＳＥＭである。＊＊の記号は、ｐ＜０．００５を示した。結果は、トロンビンの添加が、対照細胞（ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲ）でのＩＰ生産を増加させたことを示した。ＰｃＤＮＡ−Ｇｑでトランスフェクションされた細胞では、トロンビンに媒介されるＩＰ生産増加がなかったが、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉでトランスフェクションされた細胞では、正常な応答があった。これら結果は、Ｇｑ  Ｃ末端ペプチドが、ＨＭＥＣ中でのトロンビンに媒介されるＩＰ増加を阻害しうるということを示している。
【実施例２６】
【０１３９】
実施例２６．トロンビンに誘導されるＰ１加水分解および細胞内Ｃａ＋＋上昇の界面Ｇタンパク質ペプチド阻害。
Ｇαｑ  Ｃ末端ミニ遺伝子の発現が、細胞内［Ｃａ＋＋］ｉレベルに影響を与えうるかどうか決定するために、ＨＭＥＣを、エンプティーベクター（ｐｃＤＮＡ）、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｑまたはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲミニ遺伝子ＤＮＡ（１μｇ）でトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、トランスフェクションから４８時間後に、２４ウェルプレート中のカバーガラス上に低密集で播種した。それら細胞を２時間付着させた。培地を吸引し、そして各々のカバーガラスを、１０μＭ Oregon Green ４８８ＢＡＰＴＡ−１アセトキシメチルエステル（カルシウム感受性染料）および０．１％（ｖ／ｖ）Pluronic Ｆ−１２７と一緒にインキュベートし、３７℃で２０〜３０分間インキュベートさせた後、洗浄用緩衝液で２回すすぎ洗浄した。基底状態を確立した後、Ｃａ＋＋緩衝液中のトロンビン（約７０ｍＭ）を加えた。１０秒毎に記録を行い、トロンビンで刺激後１７０秒間続けた。ＮＩＨ Image を用いて画像を定量した。少なくとも７０種類の個々に記録された細胞からのデータを用いて、蛍光の変化（ｙ軸）を計算した。図１５Ａを参照されたいが、これは、トロンビン添加から３０秒後の増加中の蛍光（［Ｃａ＋＋］；レベル）を示している。図１５Ａの各々のバーは、７０種類を超える個々に記録された細胞の平均（（ＦＳ−ＦＢ／ＦＢ−１）±ＳＥＭを示す。＊＊の記号は、ｐ＜０．００５を示す。図１５Ｂは、トロンビンでの細胞刺激後の［Ｃａ＋＋］；蛍光変化の速度論を示す。示されているデータは、ｐｃＤＮＡまたはｐｃＤＮＡ−Ｇαｑでトランスフェクションされた細胞についての各々の記録点での平均（（ＦＳ−ＦＢ／ＦＢ−１）±ＳＥＭである。矢印は、トロンビンを加えた時点を示す。各々の時点は、１００種類を超える個々に記録された細胞を示す。
【０１４０】
図１５に示されるように、トロンビンの添加による細胞活性化後、細胞内［Ｃａ２＋］レベルに一過性増加があった。トロンビンの添加から３０秒後、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｑでトランスフェクションされた細胞では、ｐｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞と比較したところ、４４％減少したカルシウム応答があった（図１５Ａ）。トロンビン刺激後に測定される全時点を平均した場合、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｑでトランスフェクションされた細胞は、ｐｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞と比較して４５％減少した（図１５Ｂ）。ｐｃＤＮＡ−ＧαｉまたはｐｃＤＮＡ−Ｇαｉｒでトランスフェクションされた細胞では、トロンビンで刺激される細胞内［Ｃａ２＋］レベルへの作用が全くなかったので、この減少は特異的であると考えられる。したがって、Ｇαｑ  Ｃ末端ペプチドを発現する細胞は、トロンビンで活性化後の細胞内［Ｃａ２＋］レベルを刺激するそれらの能力が阻害されていると考えられ、Ｇαｑの発現によるこの下流の媒介物質の特異的遮断が示された。
【０１４１】
ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲ、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉ、ｐｃＤＮＡ−ＧｑまたはｐｃＤＮＡ−Ｇｓミニ遺伝子構築物を、ＨＭＥＣ中にトランスフェクションし、そして４８時間後のイノシトールリン酸（ＩＰ）蓄積を検定するのに用いた。２４時間後、細胞を２４ウェルプレート上に再度播種し、［３Ｈ］−ミオイノシトール（２μＣｉ／ｍｌ）で標識した。４８時間後、細胞をすすぎ洗浄し、トロンビン（１０ｎＭ）と一緒にまたは不含で１０分間インキュベートした。全ＩＰ蓄積を、上記のように DowexＴＭカラムを用いて検定して、［３Ｈ］ＩＰを分離した。生じた［３Ｈ］ＩＰの相対量は、次のように計算した。（［３Ｈ］ＩＰ（ｃｐｍ）／［３Ｈ］ＩＰ（ｃｐｍ）＋［３Ｈ］イノシトール（ｃｐｍ））。各々の値を、ｐｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞で得られる基底値（トロンビン刺激なし）によって基準化した。図１６を参照されたい。示される結果は、三重に行われる少なくとも３回の独立した実験の基準平均±ＳＥＭである。＊＊の記号は、ｐ＜０．００５を示した。
【実施例２７】
【０１４２】
実施例２７．トロンビンに誘導されるＭＡＰＫ活性の高親和性ＧＰＣＲ結合性ペプチドによる防止。
ヘマグルチニン（ＨＡ）−ＭＡＰＫ（１ｘ１０５／ｍＬ）を、実施例２１に記載の方法を用いて、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｑまたはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲミニ遺伝子構築物で、ＨＭＥＣ中にトランスフェクションした。３０時間後、細胞を血清欠乏に１８時間した後、１０ｎＭトロンビンで２０分間処理した。次に、細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ Triton Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸塩、０．１％  ＳＤＳ、１０％グリセロール、１０μｇ／ｍＬアプロチニンおよび１０μｇ／ｍＬロイペプチン）で溶解させ、そして１２ＣＡ５抗体（Roche Molecular Biochemicals; Indianapolis, IN）（４℃で１時間）および Protein Ａセファロースビーズ（４℃で１時間）を用いて、ＨＡ−ＭＡＰＫタンパク質を免疫沈降させた。免疫複合体をＲＩＰＡ緩衝液中で３回洗浄した。免疫沈降物のキナーゼ活性を、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）基質およびキナーゼ検定キット（Upstate Biotechnology,Inc., Lake Placid, NY）を用いて測定した。各々のＭＡＰＫ活性（ｎＭ／分／ｍｇ）を得、そのＭＡＰＫ活性の相対増加量（トロンビンに媒介される倍増加）を次のように計算した。（刺激された活性（ｎＭ／分／ｍｇ）−基底活性（ｎＭ／分／ｍｇ））／基底活性（ｎＭ／分／ｍｇ）。結果は、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして実施例１７に示される。＊の記号は、ｐ＜０．０５を示す。
【０１４３】
１０ｎＭトロンビンの添加は、対照ベクターｐｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞においてＨＡ−ＭＡＰＫ活性を３．６６倍増加させた。同様に、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲでトランスフェクションされた細胞では、トロンビンに媒介されるＭＡＰＫ活性が本質的に相当量増加した（４．４６倍増加）。しかしながら、Ｇαｉ、Ｇαｑ、Ｇα１２またはＧα１３  ＧＰＣＲ結合性ペプチドをコードしているミニ遺伝子構築物でトランスフェクションされた内皮細胞は、ｐｃＤＮＡでトランスフェクションされた細胞と比較して、トロンビンに媒介されるＨＡ−ＭＡＰＫ活性の有意の減少を示した（それぞれ、５９％、５７％、５０％および７７％）。
【実施例２８】
【０１４４】
実施例２８．トロンビンに誘導される経内皮電気抵抗の減少。
経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を、Ｇαｑ、Ｇαｉ、ＧαｉＲミニ遺伝子構築物を発現するまたは発現しないＨＭＥＣの単層を越えて交流（５０μＡ；毎分２パルス）を通すことによって測定した。基底ＴＥＥＲは、ミニ遺伝子トランスフェクションではほとんど変化しなかった。しかしながら、１０ｎＭトロンビンの添加で、Ｇαｑミニ遺伝子を発現する細胞のＴＥＥＲは、１０ｎＭトロンビンの存在下のトランスフェクションされていない細胞と比較して減少した。図１８を参照されたい（多数の実験を代表するもの）。経内皮電気抵抗のトロンビンに応答した減少は、Ｇαｑのカルボキシル末端についてのミニ遺伝子でトランスフェクションされた内皮細胞において有意に減少したが、Ｇαｉ、ＧαｉＲまたはエンプティーベクターでトランスフェクションされた細胞では作用がなかった。これら結果は、Ｇαｑが、内皮細胞形状変化へのトロンビンの作用に部分的に関与しているということを示唆した。
【実施例２９】
【０１４５】
実施例２９．トロンビンに媒介されるストレスファイバー形成の阻害。
ＨＭＥＣ細胞を、各１μｇ／１００ｍｍディッシュのｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−Ｇα１２またはｐｃＤＮＡ−Ｇα１３ミニ遺伝子構築物でトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞のマーカーとして、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子を含有するｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ−１プラスミドを、ミニ遺伝子構築物と一緒に同時トランスフェクションした。４８時間後、細胞を１８時間血清欠乏にし、１０ｎＭトロンビンで２０分間処理した。トロンビンへの暴露後、それら細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％ Triton Ｘ−１００で透過性にし、そしてＦアクチンについて１ｍＭローダミン−ファロイジンで３０分間染色した。細胞を充分に洗浄し、VectashieldＴＭ抗退色封入剤（Vector Laboratories,Inc.）を用いて封入した。細胞は、微分干渉位相差検鏡用にも、６０ｘ油浸対物レンズを用いたエピフルオレセンス観察用にも装備された倒立顕微鏡（Diaphot ２００，Nikon,Inc.）で観察した。蛍光およびＤＩＣ画像を、この顕微鏡に接続された冷却インテグレーティングＣＣＤアレイ（integrating ＣＣＤ array）カメラ（Imagepoint, Photometric, Ltd.）で、各々の細胞視野について記録した。トロンビンに媒介されるストレスファイバー形成のＧα１２およびＧα１３ペプチドによる阻害を示す蛍光画像については、図１９を参照されたい。
【０１４６】
ｐｃＤＮＡでトランスフェクションされた血清欠乏細胞は、それらの縁に細い皮層Ｆアクチン端（rim）を示し、僅かなストレスファイバーしか含有しなかった（図１９、パネルＡ）。存在しているものは、目立たなかったが、見かけ上はランダムな配向であった。トロンビンへの２０分間暴露後のｐｃＤＮＡでトランスフェクションされたＨＭＥＣについて、アクチンは、典型的には、細胞の縦軸に沿った平行パターンで配置される顕著なストレスファイバー中に再編成されていた（図１９、パネルＢ）。極めて異なったパターンは、ｐｃＤＮＡ−Ｇα１２（図１９、パネルＣ）またはｐｃＤＮＡ−Ｇα１３（図１９、パネルＤ）ミニ遺伝子でトランスフェクションされた細胞について、トロンビンへの暴露後に認められた。ｐｃＤＮＡ−Ｇα１２およびｐｃＤＮＡ−Ｇα１３両方でトランスフェクションされた細胞では、トロンビン刺激は、ストレスファイバーの出現を引き起こさなかった。ｐｃＤＮＡ−Ｇα１３でトランスフェクションされた細胞の場合、周辺のアクチン端は、より細く且つ一層線状に見えて、細胞−細胞接合部の透明な輪郭を与えている。したがって、初期の報告に一致して、トロンビンは、内皮細胞中で迅速なストレスファイバー形成を誘導した。ｐｃＤＮＡ−Ｇα１２かまたはｐｃＤＮＡ−Ｇα１３ミニ遺伝子のトランスフェクションは、トロンビンに誘導されるストレスファイバー形成をもはや示さない細胞を生じた。ストレスファイバー形成が低分子量ＧＴＰアーゼＲｈｏに依存すると仮定するならば、これら結果は、Ｇα１２およびＧα１３が、Ｒｈｏシグナリングに密接に関連しているという他の知見と一致し、細胞内で発現された場合に、このＧタンパク質経路を特異的に遮断するＧＰＣＲ結合性ペプチドの能力を示している。
【実施例３０】
【０１４７】
実施例３０．無傷の単細胞中でのＧＰＣＲ結合性ペプチドによるＧタンパク質活性の阻害。
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞は、Ｍ２  ｍＡＣＲ（約４００ｆｍｏｌ受容体／ｍｇタンパク質）を安定して発現するが、これを、１０％ウシ胎児血清（Gibco）、ストレプトマイシン／ペニシリン（各１００Ｕ；Gibco）およびＧ４１８（５００ｍｇ／Ｌ；Gibco）を補足したＤＭＥＭ１（Gibco）中で成長させた。細胞は、３７℃において１０％ＣＯ２下で成長させた。電気生理学的研究のための全てのトランスフェクションにおいて、ＣＤ８リポーター遺伝子系を用い、抗ＣＤ８抗体（Dynal）を被覆されたDynabeadsＴＭを用いて、トランスフェクションされた細胞を可視化した。次の量のｃＤＮＡを用いて、細胞をトランスフェクションした。ｐＣ１−ＧＩＲＫ１（ラット）−１μｇ；ΠＨ３−ＣＤ＊（ヒト）−１μｇ；ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｑまたはｐｃＤＮＡ−Ｇαｓ−４μｇ。したがって、典型的には、一つの１０ｃｍディスクをトランスフェクションするのに用いられたｃＤＮＡの全量は、７μｇであった。ＧＩＲＫ１およびＧＩＲＫ４のｃＤＮＡは、F.Lesage および M.Lazdunski（Nice, Franc）から寄贈された。標準的なリン酸カルシウム法は、Schenborn et al., Meth.Mol.Biol. 130:134-145,2000 の方法にしたがって、ＨＥＫ細胞の一過性トランスフェクションに用いた。検定は全て、トランスフェクション後４８〜７２時間に行った。
【０１４８】
全細胞電流を、ＧＩＲＫ１、ＧＩＲＫ４のｃＤＮＡ、およびｐｃＤＮＡ−Ｇαｉか、ｐｃＤＮＡ−ＧαｓかまたはｐｃＤＮＡ−Ｇαｑで一過性トランスフェクションされた、安定してＭ２  ｍＡＣｈＲを発現するＨＥＫ２９３細胞から記録した。内向き整流Ｋ＋電流の測定のために、全細胞電流を、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ；２０ｍＭ  ＫＣｌ；２ｍＭ  ＣａＣｌ２；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；および１０ｍＭ Hepes−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４を含有した細胞外溶液を用いて記録した。パッチ用ピペットを満たすための溶液は、１００ｍＭグルタミン酸カリウム；４０ｍＭ  ＫＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＡＴＰ；１０ｍＭ Hepes−ＫＯＨ、ｐＨ７．４；５ｍＭ  ＮａＣｌ；２ｍＭ  ＥＧＴＡ；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；および０．０１ｍＭ  ＧＴＰを含んで成った。膜電流は、慣用的な全細胞パッチ法を用いて、電圧固定（voltage clamp）下で記録した。本明細書中にその開示が援用される、Bunemann et al., J.Physiol. 489:701-777,1995 および Bunemann et al., J.Physiol. 482:81-89,1995 を参照されたい。いろいろなトランスフェクションまたは培養条件による変動を最小限にするために、対照実験（ｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでのトランスフェクション）を平行して行った。パッチ用ピペットは、ホウケイ酸ガラス細管（ＧＦ−１５０−１０，Warner Instrument Corp.）から、水平引張装置（Ｐ−９５  Fleming & Poulsen）を用いて加工した。満たされたピペットのＤＣ抵抗は、３〜６ＭΩであった。
【０１４９】
膜電流は、パッチクランプ増幅器（Axopatch ２００，Axon Instruments）を用いて記録した。シグナルは、低減 Bessel フィルタを用いて濾波したアナログである（１〜３ｋＨｚコーナ周波数）。データは、電圧制御、データ捕捉およびデータ評価のために、ハードウェア／ソフトウェアパッケージ（ＭＦＫによるＩＳＯ２，Frankfurt/Main, Germany）を装備したＩＢＭ適合ＰＣを用いてディジタル方式で記憶した。内向き方向のＫ＋電流を測定するために、カリウム平衡電位を約−５０ｍＶに設定し、保持電位は−９０ｍＶであった。アゴニストに誘導される電流は、３００ｍｓｅｃ以内の溶液交換を可能にする電磁操作過融解装置を用いて、アセチルコリン（ＡＣｈ；１μＭ）の適用によって引き起こした。直線電圧傾斜（５０ｍｓ以内に−１２０ｍＶ〜＋６０ｍＶ）を、１０秒毎に加えた。非アゴニスト依存性電流を差し引くことにより、アゴニストに誘導される電流の電圧特性が解明されうると考えられる。機能的チャンネルを発現していないかもしれない細胞から電流を記録した実験を除外するために、基底の非アゴニスト依存性のＢａ２＋（２００μＭ）感受性内向き整流電流を示した細胞だけを、分析に用いた。データの分析用に、ＡＣｈに誘導される内向き整流Ｋ＋電流の最大電流密度（ピーク振幅）を−８０ｍＶで測定し、比較した。
【０１５０】
ＧＩＲＫ１／ＧＩＲＫ４およびｐｃＤＮＡ−ＧｉかまたはｐｃＤＮＡ−ＧｉＲ  ＤＮＡで一過性トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の１μＭ  ＡＣｈでの過融解は、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ  ＤＮＡでトランスフェクションされた細胞のＭ２  ｍＡＣｈＲアゴニストへの応答が劇的に損なわれていることを示した。図２０を参照されたいが、これは、異なったトランスフェクション条件についてＡＣｈで引き起こされる電流の最大振幅を示すデータを要約している。ＡＣｈによって引き起こされる最大電流は、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲでトランスフェクションされた細胞での２４．１＋／−８．８ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝１１）と比較したところ、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉでトランスフェクションされた細胞では３．７＋／−１．５ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝１４）であった。これは、Ｇαｉミニ遺伝子構築物が、アゴニストに媒介されるＭ２  ｍＡＣｈＲ  ＧＩＲＫ１／ＧＩＲＫ４応答を完全に遮断したが、対照ミニ遺伝子構築物（ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲ）は作用しなかったということを示している。図２０Ａを、図２０Ｂおよび２０Ｃと比較されたい。ＧαｑまたはＧαｓのＧαカルボキシル末端をコードしているミニ遺伝子構築物ｐｃＤＮＡ−ＧαｑまたはｐｃＤＮＡ−Ｇαｓでトランスフェクションされた細胞（図２０）は、対照ベクターでトランスフェクションされた細胞の場合と大差がなかった。これら知見は、Ｍ２  ｍＡＣｈＲで活性化されるＧタンパク質共役型内向き整流Ｋ＋電流応答のＧαｉミニ遺伝子発現による阻害の特異性を確証する。
【実施例３１】
【０１５１】
実施例３１．ヒト微小血管内皮細胞における選択的Ｇタンパク質シグナリング阻害。
Ｇタンパク質シグナリング最終作用のいろいろな尺度を、トロンビン受容体ＰＡＲ１を天然に発現するヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）で検定した。これら細胞を、６ウェルプレート上に１ｘ１０５個細胞／ウェルで播種し、そして２４時間後に、Effectene（Qiagen）を製造者のプロトコールにしたがって用いて、Ｇαカルボキシル末端ペプチドを含有するミニ遺伝子構築物（ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉまたはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲ；１μｇ／ウェル）で一過性トランスフェクションした。２４時間後、これら細胞を、３μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］−アデニンで３７℃において３０分間標識した。更に２４時間後、１ｍＭイソブチルメチルキサンチンを含有する血清不含培地で細胞をすすぎ洗浄した。ｃＡＭＰ蓄積を刺激するために、細胞を１μＭイソプロテレノールで３７℃において３０分間処理した。ｃＡＭＰ蓄積へのトロンビンの阻害作用を調べるために、細胞をトロンビン（５０ｎＭ）で１５分間前処理後、イソプロテレノールを加えた。これら反応は、培地の吸引後、氷冷５％トリクロロ酢酸の添加によって停止した。
【０１５２】
結果は、（ｃＡＭＰ／ｃＡＭＰ＋ＡＴＰ）Ｘ１０００として、図２１に与えられている。３回の別々の実験を二重に行った。＊＊の記号は、ｐ＜０．００５を示す。基底ｃＡＭＰレベルは、調べられた全ての条件について本質的に均等であった。イソプロテレノールで刺激されてβアドレナリン受容体を活性化する内皮細胞は、Ｇｓ経路によってそれらのｃＡＭＰレベルを増加させる。ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉまたはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでトランスフェクションされた細胞は、イソプロテレノールに媒介されるｃＡＭＰ蓄積において、それぞれ８２倍、６４倍および７７倍増加で、ほとんど差を示さなかった。内皮細胞をトロンビンと一緒に予めインキュベート後にイソプロテレノールを加えた場合、ｃＡＭＰレベルの減少は、Ｇｉ経路のトロンビン活性化によって認められた。ｐｃＤＮＡでトランスフェクションされ且つトロンビンと一緒に予めインキュベートされた内皮細胞は、イソプロテレノールだけで刺激された細胞にまさる、ｃＡＭＰレベルの３９％減少を示した。同様に、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでトランスフェクションされ且つトロンビンと一緒に予めインキュベートされた細胞は、イソプロテレノールだけで刺激された細胞にまさる、４３％の減少を示した。しかしながら、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉでトランスフェクションされ且つトロンビンと一緒に予めインキュベートされた細胞は、イソプロテレノールだけで刺激された細胞と比較したところ、ｃＡＭＰレベルが僅か０．１％しか減少しなかった。したがって、Ｇαｉ  Ｃ末端ペプチドを発現する細胞は、トロンビンで活性化後にアデニルシクラーゼを阻害することができないと考えられ、トロンビンに媒介されるＧｉシグナリングは、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉミニ遺伝子の発現によって特異的に遮断されたことが示される。
【実施例３２】
【０１５３】
実施例３２．逆アゴニストを識別するスクリーニング法。
尿素洗浄された、ロドプシン受容体を含有する桿体外節膜を、実施例７に記載のように、マイクロタイターウェル上に固定し且つ遮断する。この受容体は光活性化されている。標識された天然Ｇαｔカルボキシル末端ペプチドを、各々のウェルに加え、４℃で１時間静かに振とうさせる。これらウェルを洗浄して、未結合ペプチドを除去する。実施例７に記載の方法にしたがって製造されるＧαｔカルボキシル末端ペプチドからの（標識された）粗製細菌溶菌液（２００μＬ）を、各々のウェルに加え、４℃で振とうしながら１時間インキュベートする。
【０１５４】
次に、これらウェルを洗浄して、未結合標識を除去する。上澄みまたはウェルに結合した標識を、ＥＬＩＳＡによって定量して、ライブラリーペプチドの不存在下でインキュベートされた対照ウェルと比較される、ライブラリーペプチドとのインキュベーション後の受容体からの標識天然ペプチドの解離を検出する。
【実施例３３】
【０１５５】
実施例３３．低分子量分子ライブラリースクリーニング法。
低分子量分子ライブラリーを、ＧＰＣＲに媒介されるＧタンパク質シグナリングの阻害について次のようにスクリーニングする。実施例２にしたがって昆虫細胞から製造されるＰＡＲ１トロンビン受容体を、実施例１４に記載の方法にしたがって、マイクロタイターウェル上に固定し、遮断し、洗浄する。Chem Div（San Diego, CA）から購入された低分子量分子ライブラリーを、９６ウェルまたは３８４ウェルプレート中にＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質（０．１〜１０００ｎＭ）と同時に加え、４℃で１時間振とうさせる。初期スクリーニングは、約１〜１０００ｐＭの低分子量分子で行う。これらウェルを、０．０５％ TweenＴＭ２０および１ｍＭマルトースを含有する冷ＰＢＳ中で４回洗浄する。ウェルに付着するマルトース結合性タンパク質の量を、ライブラリー化合物不含でインキュベートされた対照ウェルに対して、実施例１４に記載の抗ＭＢＰ抗体で定量する。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、ＧＰＣＲ結合性ペプチドを分離し且つ識別するのに用いられる親和性スクリーニング法の根本原理を示す略図である。
【図２】図２は、ベクターｐＪＳ１４２の略図である。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡ手順を示す略図である。
【図４】図４は、ＰＡＲ１受容体へのＬａｃＩペプチド融合タンパク質の結合データを与える。ｐＥＬＭ６は、ＭＢＰベクター単独であり；ｐＥＬＭ１７は、ＭＢＰ−天然Ｇｔ３４０−３５０ペプチド融合タンパク質である。
【図５】図５は、ペプチド８のクローンへの高親和性クローンの結合を比較する棒グラフである。
【図６】図６は、高親和性ロドプシン結合性ペプチドを識別する競合的結合検定の結果を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ヘテロ三量体Ｇｔによるロドプシンへの高親和性ペプチドの競合的阻害を示す棒グラフである。
【図８】図８は、精製されたＭＢＰ−Ｃ末端融合タンパク質を用いてヒトトロンビン受容体（ＰＡＲ１）を過剰発現するＣＨＯ細胞をパンニングすることによるＥＬＩＳＡ結果を示す。ＭＢＰ−Ｇ１１＝ｘｘｘｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）ＬＱＬＮＬＫＥＹＮＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；ＰＡＲ−１３＝ＶＲＰＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）ＬＱＬＮＲＮＥＹＹＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；ＰＡＲ−２３＝ＬＳＲＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）ＬＱＱＫＬＫＥＹＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；ＰＡＲ−３３＝ＬＳＴＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）ＬＨＬＮＬＫＥＹＮＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；ＰＡＲ−３４＝ＬＰＱＭ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）ＱＲＬＮＶＧＥＹＮＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；ＰＡＲ−４５＝ＳＲＨＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）ＬＲＬＮＧＫＥＬＮＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）。
【図９】図９は、ｌａｃＩ−Ｇｑ溶菌液で検定されたＳＦ９膜（ＰＡＲ１受容体）の用量反応曲線を示す。
【図１０】図１０は、脂質小胞中で再構成されたＰＡＲ１への天然Ｇｐペプチド−マルトース結合性タンパク質の結合を示す濃度反応曲線である。
【図１１】図１１は、代表的なｃＤＮＡミニ遺伝子構築物を示す略図である。
【図１２】図１２は、ミニ遺伝子ベクターのＮｃｏＩ消化物のアガロースゲルである。列１は１ｋｂのＤＮＡラダーであり；列２はｐｃＤＮＡ３．１であり；列３はｐｃＤＮＡ−Ｇαｉであり；列４はｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲであり；そして列５はｐｃＤＮＡ−Ｇαｑである。
【図１３】図１３は、トランスフェクションされた細胞中でのペプチドミニ遺伝子ＲＮＡの転写を示すＰＣＲ産物のアガロースゲルである。列１はサイズマーカーを含有し、列２は、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲでトランスフェクションされた細胞からのＰＣＲ産物を含有し、列３は、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉでトランスフェクションされた細胞からのＰＣＲ産物を含有し、そして列４は、であるｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクションされた細胞からのＰＣＲ産物を含有する。
【図１４】図１４は、基底値に対して基準化された、トロンビン刺激後の相対的［３Ｈ］イノシトールリン酸生産を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、細胞内カルシウム濃度増加のＧＰＣＲ結合性ペプチド阻害を示すデータを示す。図１５Ａは、トロンビン添加から３０秒後の蛍光（［Ｃａ＋＋］；レベル）増加を示す。図１５Ｂは、トロンビンでの細胞刺激後の［Ｃａ＋＋］蛍光変化の速度論を示す。
【図１６】図１６は、トロンビンに誘導されるホスホイノシトール（Ｐ１）加水分解のＧＰＣＲ結合性ペプチド阻害を示すデータを示す。
【図１７】図１７は、ＧＰＣＲ結合性ペプチドを発現する細胞中でのＭＡＰＫ活性のトロンビンに媒介される相対的比率増加を示す棒グラフである。
【図１８】図１８は、Ｇαｑ、Ｇαｉ、ＧαｉＲまたはエンプティーベクターを発現する細胞中でのトロンビンに誘導される経内皮電気抵抗の減少を示す。
【図１９】図１９は、Ｆアクチンについて染色された一連の細胞の写真であり、ｐｃＤＮＡ−Ｇ１２またはｐｃＤＮＡ−Ｇ１３ミニ遺伝子構築物を発現する細胞中におけるトロンビンへの暴露後のストレスファイバー形成の阻害を示す。
【図２０】図２０は、Ｇαｉペプチド発現によるＭ２ｍＡＣｈＲ応答の遮断を示すデータを示す。
【図２１】図２１は、Ｇαカルボキシル末端ペプチドインサートを含有するミニ遺伝子構築物を発現する細胞中でのＧタンパク質に媒介される選択的アデニリルシクラーゼ阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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