(57)【要約】本発明は、セロトニン１Ｂ、２、４および６型受容体を介するシグナリングがＴ細胞活性化において重要であるので、そのようなシグナリングを阻害することを免疫応答を調節するために用いることができるという発見に関する。この免疫調節は、免疫疾患もしくは症状の処置に、そしてそのような疾患もしくは症状の潜在的治療法の開発に有用である。細胞周期を進んでいる細胞において、セロトニンシグナリングの阻害は該プロセスを阻害し、そして細胞にアポトーシスおよび形態変化を誘導することがさらに見出された。セロトニン作動性シグナリングを阻害することのこれらの効果は、選択的細胞致死をもたらすことに、そしてシグナリングを阻害する化合物を同定することに有用となりうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における免疫応答を調節する方法であって、該哺乳動物にセロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を投与することを含んでなり、それにより該哺乳動物における該免疫応答を調節する方法。
【請求項２】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項３】
該インヒビターが選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン４型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン６型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される請求項２の方法。
【請求項４】
該インヒビターがリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４、ＭＤＬ１１９３９、ＳＢ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである請求項３の方法。
【請求項５】
該インヒビターがセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である請求項１の方法。
【請求項６】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される請求項５の方法。
【請求項７】
該哺乳動物がヒトである請求項１の方法。
【請求項８】
哺乳動物における免疫応答を抑制する方法であって、哺乳動物にセロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの免疫応答抑制量を投与することを含んでなり、それにより該哺乳動物における該免疫応答を抑制する方法。
【請求項９】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される請求項８の方法。
【請求項１０】
該インヒビターが選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン４型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン６型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される請求項８の方法。
【請求項１１】
該インヒビターがリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４、ＭＤＬ１１９３９、ＳＢ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである請求項１０の方法。
【請求項１２】
該セロトニン受容体がセロトニン４型受容体であり、そしてさらに該免疫応答がＣＤ−８依存性である請求項９の方法。
【請求項１３】
該セロトニン受容体がセロトニン６型受容体であり、そしてさらに該免疫応答がＣＤ−４依存性もしくはＣＤ−８依存性である請求項９の方法。
【請求項１４】
該インヒビターがセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である請求項８の方法。
【請求項１５】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される請求項１４の方法。
【請求項１６】
該哺乳動物がヒトである請求項８の方法。
【請求項１７】
免疫細胞による免疫反応を抑制する方法であって、該細胞上のセロトニン受容体によって伝達されるセロトニンシグナルを阻害することを含んでなり、ここで、該シグナルを阻害することは該細胞の活性化を抑制し、そしてさらにここで、セロトニンシグナルを該阻害することは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と該免疫細胞とを接触させることを含んでなり、それにより該細胞による該免疫反応を抑制する方法。
【請求項１８】
該免疫細胞がＴ細胞およびＢ細胞から選択される請求項１７の方法。
【請求項１９】
セロトニンシグナリングによって活性化される免疫細胞によりもたらされる自己免疫疾患にかかっている哺乳動物における免疫応答を調節する方法であって、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を該哺乳動物に投与することを含んでなり、それにより該哺乳動物における該免疫応答を調節する方法。
【請求項２０】
該哺乳動物がヒトである請求項１９の方法。
【請求項２１】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される請求項１９の方法。
【請求項２２】
該インヒビターが選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される請求項１９の方法。
【請求項２３】
該インヒビターがリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４およびＭＤＬ１１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである請求項２２の方法。
【請求項２４】
該インヒビターがセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である請求項１９の方法。
【請求項２５】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される請求項２４の方法。
【請求項２６】
該自己免疫疾患が重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（デビック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーブス病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起障害、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛よりなる群から選択される請求項１９の方法。
【請求項２７】
該調節が抑制である請求項１９の方法。
【請求項２８】
免疫応答がＴ細胞上のセロトニン受容体の活性化によってもたらされる場合の哺乳動物における免疫応答を抑制する方法であって、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と該Ｔ細胞とを接触させることを含んでなり、それにより該哺乳動物における該免疫応答を抑制する方法。
【請求項２９】
該方法がボーラス注入として該インヒビターを投与することをさらに含んでなる請求項２８の方法。
【請求項３０】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される請求項２８の方法。
【請求項３１】
該インヒビターが選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される請求項３０の方法。
【請求項３２】
該インヒビターがリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４およびＭＤＬ１１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである請求項３１の方法。
【請求項３３】
該インヒビターがセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である請求項２８の方法。
【請求項３４】
該哺乳動物がヒトである請求項２８の方法。
【請求項３５】
活性化が免疫細胞上のセロトニン受容体の活性化によってもたらされる場合の哺乳動物における該免疫細胞の該活性化を抑制する方法であって、該哺乳動物にセロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を投与することを含んでなり、さらにここで、該免疫細胞は該インヒビターに接触させられ、それにより該免疫細胞の活性化を抑制する方法。
【請求項３６】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される請求項３５の方法。
【請求項３７】
該インヒビターが選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される請求項３６の方法。
【請求項３８】
該インヒビターがリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４およびＭＤＬ１１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである請求項３７の方法。
【請求項３９】
該インヒビターがセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である請求項３５の方法。
【請求項４０】
該哺乳動物がヒトである請求項３５の方法。
【請求項４１】
哺乳動物における二次免疫応答を抑制する方法であって、該哺乳動物にセロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を投与することを含んでなり、それにより該哺乳動物における該二次免疫応答を抑制する方法。
【請求項４２】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される請求項４１の方法。
【請求項４３】
該インヒビターが選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される請求項４２の方法。
【請求項４４】
該インヒビターがリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４およびＭＤＬ１１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである請求項４３の方法。
【請求項４５】
該インヒビターがセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である請求項４１の方法。
【請求項４６】
該哺乳動物がヒトである請求項４１の方法。
【請求項４７】
細胞がセロトニン受容体を介したセロトニンシグナリングの伝達を必要とする場合の哺乳動物における該細胞によってもたらされる疾患を処置する方法であって、該細胞上のセロトニン受容体とのセロトニン相互作用を阻害することを含んでなり、ここで、該阻害は該細胞にとって有害であり、その結果、該細胞は該疾患をもたらさない方法。
【請求項４８】
セロトニン相互作用の該阻害が、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターと細胞とを接触させることによりもたらされる請求項４７の方法。
【請求項４９】
該セロトニン受容体がセロトニン１型受容体、セロトニン２型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される請求項４８の方法。
【請求項５０】
該自己免疫疾患が多発性骨髄腫、重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（デビック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーブス病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起障害、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛よりなる群から選択される請求項４７の方法。
【請求項５１】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体であり、そしてさらに該疾患が多発性骨髄腫である請求項４７の方法。
【請求項５２】
細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、該細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、ここで、該阻害はアポトーシスを誘導し、そしてさらにここで、該細胞上のセロトニン受容体とのセロトニン相互作用を該阻害することは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と該細胞とを接触させることを含んでなり、それにより該細胞におけるアポトーシスを誘導する方法。
【請求項５３】
細胞死を誘導する方法であって、該細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、ここで、該阻害は該細胞の死を誘導し、さらにここで、該阻害は、該セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と該細胞とを接触させることを含んでなり、それにより該細胞の死を誘導する方法。
【請求項５４】
哺乳動物における自己免疫疾患を処置するのに有用な化合物を同定する方法であって、試験化合物とセロトニン受容体とを接触させることおよび該化合物と接触させた該セロトニン受容体とセロトニンとの結合のレベルを該化合物と接触させないそのほかの点では同一であるセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較することを含んでなり、ここで、該化合物と接触させない該そのほかの点では同一であるセロトニン受容体とのセロトニン結合の該レベルと比較して該化合物と接触させた該セロトニン受容体とのセロトニン結合のより低いレベルが、該化合物が該哺乳動物における該自己免疫疾患を処置するのに有用であることの指標となる方法。
【請求項５５】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される請求項５４の方法。
【請求項５６】
請求項５４の方法によって同定される化合物。
【請求項５７】
該哺乳動物がヒトである請求項５４の方法。
【請求項５８】
哺乳動物における同種移植反応を処置するのに有用な化合物を同定する方法であって、試験化合物とセロトニン受容体とを接触させることおよび該化合物と接触させた該セロトニン受容体とセロトニンとの結合のレベルを該化合物と接触させないそのほかの点では同一であるセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較することを含んでなり、ここで、該化合物と接触させない該そのほかの点では同一であるセロトニン受容体とのセロトニン結合の該レベルと比較して該化合物と接触させた該セロトニン受容体とのセロトニン結合のより低いレベルが、該化合物が該哺乳動物における該同種移植反応を処置するのに有用であることの指標となる方法。
【請求項５９】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される請求項５８の方法。
【請求項６０】
請求項５８の方法によって同定される化合物。
【請求項６１】
該哺乳動物がヒトである請求項５８の方法。
【請求項６２】
活性化がＴ細胞上のセロトニン受容体とセロトニンとの結合によってもたらされる場合の該Ｔ細胞の該活性化を抑制するのに有用な化合物を同定する方法であって、試験化合物とＴ細胞とを接触させることおよび該化合物と接触させた該Ｔ細胞の活性化のレベルを該化合物と接触させないそのほかの点では同一であるＴ細胞の活性化のレベルと比較することを含んでなり、ここで、該化合物と接触させない該そのほかの点では同一であるＴ細胞の活性化の該レベルと比較して該化合物と接触させた該Ｔ細胞の活性化のより低いレベルが、該化合物がＴ細胞の活性化を抑制するのに有用であることの指標となり、ここで、該活性化は該Ｔ細胞上のセロトニン２型受容体とのセロトニン結合によってもたらされる方法。
【請求項６３】
細胞上のセロトニン受容体を介するシグナリングに影響を与える化合物を同定する方法であって、化合物と細胞とを接触させることおよび該化合物と接触させる前の該細胞の形態と比較した該細胞における細胞形態の任意の変化を評価することを含んでなり、ここで、該化合物と接触させる前の該細胞の該形態と比較した該化合物と接触させた該細胞の該形態の変化が、該化合物が該細胞上のセロトニン受容体を介するシグナリングに影響を与えることの指標となり、それにより細胞上のセロトニン受容体を介するシグナリングに影響を与える化合物を同定する方法。
【請求項６４】
請求項６３の方法によって同定される化合物。
【請求項６５】
細胞における細胞周期プロセスに影響を与える方法であって、該細胞上のセロトニン受容体を介するシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、さらにここで、該細胞上のセロトニン受容体を介するシグナルの伝達を該阻害することは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と該細胞とを接触させることを含んでなり、それにより細胞周期プロセスに影響を与える方法。
【請求項６６】
セロトニン受容体を発現する細胞におけるアポトーシスに影響を与える方法であって、該受容体を介して伝達されるシグナルを阻害することを含んでなり、さらにここで、該阻害することは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と該細胞とを接触させることを含んでなり、それにより該細胞におけるアポトーシスに影響を与える方法。
【請求項６７】
セロトニン受容体を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、該受容体を介して伝達されるシグナルを阻害することを含んでなり、それにより該細胞におけるアポトーシスを誘導する方法。
【請求項６８】
哺乳動物における免疫応答を調節するためのキットであって、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を含んでなり、さらにその使用のためのアプリケーターおよび説明資料を含んでなるキット。
【請求項６９】
該セロトニン受容体がセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される請求項６８のキット。
【請求項７０】
該哺乳動物がヒトである請求項６９のキット。
【請求項７１】
セロトニン受容体を発現する細胞における細胞周期プロセスに影響を与えるためのキットであって、該セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を含んでなり、さらにその使用のためのアプリケーターおよび説明資料を含んでなるキット。
【請求項７２】
セロトニン受容体を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導するためのキットであって、該セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を含んでなり、さらにその使用のためのアプリケーターおよび説明資料を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミンもしくは５−ＨＴとも呼ばれる）は、多種多様な神経精神疾患の病態生理学および処置に強く関与するとされている神経伝達物質である。セロトニンは、セロトニン受容体分子（本明細書において「５−ＨＴ受容体」もしくは「５−ＨＴＲ」と称する）の多様なファミリーを通してその効果を示す。古典的に、セロトニン受容体ファミリーのメンバーは、薬理学的に、すなわち、様々なセロトニンアンタゴニストのそれらの特異性に従って７つのサブタイプに分類されている。従って、全ての５−ＨＴ受容体はセロトニンと特異的に結合するが、それらは薬理学的に異なり、そして別個の遺伝子によってコードされる。現在まで、１４の哺乳動物セロトニン受容体が同定され、そして配列を決定されている。さらに特に、これらの１４の別個の５−ＨＴ受容体は、５−ＨＴ１、５−ＨＴ２、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５、５−ＨＴ６および５−ＨＴ７と称する７つの薬理学的サブタイプに分類されている。これらのサブタイプのいくつかは、受容体が下記：５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ１Ｅ、５−ＨＴ１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３Ａ、５−ＨＴ３Ｂ、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５Ａ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７のとおり薬理学的に分類されるようにさらに細分される。しかしながら、受容体の核酸およびアミノ酸配列を比較すると、サブタイプ間の同一性パーセントは薬理学的分類と相関していない。
【０００２】
クローン化されている１４の異なる哺乳動物セロトニン受容体のうち、一つだけ除いた全部はＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーであり；すなわち、それらはグアニンヌクレオチド調節（Ｇ）タンパク質によって連結される異なる第二メッセンジャー経路に一般に共役している。例えば、セロトニン受容体５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂおよび５−ＨＴ１Ｄはアデニル酸シクラーゼを抑制し、そして５−ＨＴ２受容体はホスホリパーセＣ経路を活性化し、ポリホスホイノシチドの分解を刺激する。５−ＨＴ２受容体は、それらの７個の膜貫通立体配置およびＧタンパク質へのそれらの機能性連結によって区別されるロドプシン様シグナルトランスデューサーのファミリーに属する。
【０００３】
セロトニン受容体のサブタイプは、従来、それらの薬理学的結合プロフィール、第二メッセンジャーカップリング、そしてよりよく特性化されたセロトニン受容体で既知である生理学的役割に基づいて分類されている。５−ＨＴ受容体を特性化するために用いる該分野のデータの大部分は、単一の精製された受容体タンパク質もしくは遺伝子の性質に基づくのではなく、むしろモデル組織を用いる実験結果に基づく。
【０００４】
本明細書において他で先に記載するように、とりわけ、構造の相同性、第二メッセンジャー系活性化、およびある種のリガンドに対する薬剤親和性に基づく７つのサブタイプを包含する１４の別個のセロトニン受容体が同定されている。分子クローニングにより、５−ＨＴ受容体は少なくとも２つのタンパク質スーパーファミリー：７個の推定上の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を有するＧタンパク質関連受容体（５−ＨＴ１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、５−ＨＴ２）および４個の推定上のＴＭＤを有するリガンド依存性イオンチャンネル受容体（５−ＨＴ３）に属することが示されている。５−ＨＴ２サブファミリーは、３つのクラス：５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂおよび５−ＨＴ２Ｃにさらに分類される。５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ受容体アンタゴニストは、鬱病、不安症、精神病および摂食障害を処置することにおいて有用であると考えられる。５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ受容体は、全体で約５１％のアミノ酸相同性および膜貫通ドメインにおける約８０％の相同性を共有する。組換え哺乳動物細胞系における５−ＨＴ２Ａ受容体の研究により、該受容体は高いおよび低い２つの親和性状態を有することが示された。
【０００５】
５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ受容体は両方ともホスホリパーセＣに共役し、そしてホスファチジルイノシトール経路を通して応答をもたらす。アゴニストおよびアンタゴニストでの研究は多種多様な受容体応答を示し、受容体活性を支配する調節機構の幅広い多様性があることを示唆する。５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ受容体はまた、幻覚剤の作用部位としても関係づけられている。
【０００６】
中枢神経系（ＣＮＳ）において、セロトニンは学習および記憶、睡眠、体温調節、運動活動、疼痛、性的および攻撃的行動、食欲、神経内分泌調節、ならびに生体リズムに関与すると考えられる。セロトニンはまた、不安症、鬱病、強迫神経症、統合失調症、自殺、自閉症、片頭痛、嘔吐、アルコール依存症および神経変性疾患のような病態生理学的症状にも結び付けられている。
【０００７】
セロトニンは、哺乳動物ＣＮＳにおける多種多様な感覚、運動および行動機能を調節する。この生体アミン神経伝達物質は、基底核および辺縁系構造において最も高い密度で、ＣＮＳの全体にわたって突き出る脳幹のニューロンによって合成される（非特許文献１）。セロトニン作動性伝達は、不安症、睡眠調節、攻撃性、摂食行動および鬱病を包含する様々な行動および精神疾患と関連すると考えられる（非特許文献２および非特許文献３）。５−ＨＴがどのようにしてその多様な生理学的作用をもたらすかを理解することは、適切な５−ＨＴ受容体の同定および単離を必要とする。
【０００８】
最近、セロトニン受容体は免疫系の様々な細胞上に存在することがデータにより示されるのでセロトニンは免疫系において役割を果たし得ることが研究により示唆されている。「精神／肉体」の問題は、何世紀にもわたって異なる研究分野の人々を魅了している。激しい感情もしくはストレスと免疫系の間には関連があることが以前から理解されている。セロトニンは広く散在する神経伝達物質であり、そして気分障害および鬱病において主要な役割を果たすことが知られている。しかしながら、免疫応答を調節することにおけるその役割は認識されておらず、ましてやなおさら理解されていない。
【０００９】
子宮における胎児の生存は免疫学的矛盾であることが長い間既知である。胎児は、理論上は、母親によって同種移植片拒絶を受けるはずである。大部分の場合において、胎児は拒絶されず、従って矛盾する。どのようにして母親の免疫系が他の免疫応答の全てをそのままにしておきながら胎児に関する同種移植片拒絶を選択的に抑制するかを理解することは、免疫学の「聖杯」であった。プロセスを理解し、そしてそれを治療的に再現することができる場合、自己免疫疾患の可能性がある処置ならびに移植処置に付随して起こる拒絶症状を処置する注目すべき新しい方法を基本的に可能にする。しかしながら、本発明まで、自己免疫疾患および同種移植片拒絶の改善された治療の要求は満たされていない。本発明はこれらの要求を満たす。
【００１０】
１９９８年に、Ｍｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献４）は、難問の主要な部分を解決した。この研究グループは、「栄養膜およびマクロファージによって発現されるトリプトファン異化酵素、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の薬理学的インヒビターで妊娠しているマウスを処置すると、全ての同種受胎産物の迅速なＴ細胞誘導性拒絶が起こる。従って、トリプトファンを異化することによって、哺乳動物受胎産物はＴ細胞活性を抑制し、そして拒絶からそれ自体を守る。」ことを示した。言い換えれば、メスは妊娠したすぐ後に、代謝経路の第一段階上のトリプトファンをナイアシンの生産の方にいかせる酵素（ＩＤＯ）を生産する。これは、トリプトファンが、どうにかして、免疫応答を高めそして維持することにおいて重要な役割を果たすに違いないことおよび／もしくはキヌレニンを生産すること（ナイアシン経路の第一段階）が抑制効果を有することを明らかに意味する。ＩＤＯの誘導がＴ細胞増殖を抑制し、そして同種移植片受容において役割を果たすことができることは明らかになってきているが（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、なぜトリプトファン異化が免疫応答を抑制するかはまったく不明である。
【００１１】
トリプトファンは、細胞において新しいタンパク質を構築するために必要な１０個の必須アミノ酸の一つである。トリプトファンの異化は飢餓をもたらし、それ故に、認められるＴ細胞抑制の原因となることは、ありそうにないが、可能である。しかしながら、他の９個の必須アミノ酸のいずれもＴ細胞応答の制御に関与するとされていない。それにもかかわらず、トリプトファンレベルの局所的枯渇とＴ細胞機能の抑制の間には強い相関関係がある（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献１０）。
【００１２】
トリプトファンは、５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニンとしても知られている）を生産するための唯一の既知の起源である。局所的トリプトファンレベルの調節が、セロトニン作動性経路を介してＴ細胞反応性における認められる調節に関連することになる場合、明らかに、セロトニンはＴ細胞活性化において中心的役割を果たすはずである。しかしながら、セロトニンは生化学の歴史において最も広く研究された生物学的に活性の分子の一つであるが、Ｔ細胞活性化経路におけるその役割は本発明まで同定もしくは利用されていない。
【００１３】
分裂誘発的に刺激したリンパ球培養物にセロトニンを外因的に加えることの免疫調節効果に関する文献における報告がある。ある状況下で、セロトニンは、活性化Ｔ細胞を刺激することが示されており（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）、一方、大部分の研究室は、高濃度の加えられたセロトニンが増殖を抑制することを報告する（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。従って、先行技術は、セロトニンが免疫応答の調節において、もしあるとして、どのような役割を果たすかに関しては、よく見ても不確かである。
【００１４】
その間の何年かにわたって、１４種の既知の薬理学的に異なるセロトニン受容体のうち、リンパ球は静止細胞上に２ａ型、２ｂ型、２ｃ型、６型および７型を発現すること（非特許文献１７；非特許文献１８）ならびに１ａ型および３型受容体は活性化の際にアップレギュレーションされること（非特許文献１９：非特許文献２０；非特許文献１８）が示されている。リンパ球上のこれらの受容体の機能的役割は、これまで明確に特定されていないが、一般に、セロトニン受容体は、カチオンチャンネルである３型受容体を除いて、７個の膜貫通ドメインのＧ共役受容体であることが知られている（総説には、非特許文献２１を参照）。さらに特に、１型受容体はアデニル酸シクラーゼに作用し、ｃＡＭＰのダウンレギュレーションをもたらす（非特許文献２２）。例えば、フォルスコリンは、アデニル酸シクラーゼの薬理学的アゴニストおよびｃＡＭＰのアップレギュレーター、従ってＴ細胞活性化のインヒビターである。一方、Ｔ細胞のフォルスコリン抑制は、セロトニンの添加によりレスキューすることができる（非特許文献２３；非特許文献１９）。
【００１５】
１ａ型受容体と異なり、静止Ｔ細胞上に存在する６型および７型受容体は、セロトニンに応答してｃＡＭＰをアップレギュレーションすることによって作用する（非特許文献２４；非特許文献２５）。これは直感に反した配置であり、静止細胞上に存在する６および７型受容体はＴ細胞応答を遅らせるように作用するはずであり、一方、１ａ型は６および７型受容体から送られるシグナルを妨害するはずである。２ａおよび２ｃ型受容体はホスホリパーゼＣに正に共役し、そしてイノシトールリン酸および細胞内Ｃａ２＋の増加した蓄積をもたらし、それによりプロテインキナーゼＣシグナル伝達カスケードを作動させる（総説には、非特許文献２６を参照）。
【００１６】
免疫応答の機能的制御に関して、Ｇｅｒｓｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献２７）は、セロトニンがマウスにおけるＴ細胞性遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を高めるのに必要とされると仮定した。しかしながら、この研究の著者等は、セロトニンに対するＤＴＨ応答の依存性をこの生体アミンの血管作用特性に帰した。
【００１７】
コネティカット州ウェストヘーヴンのＭｉｌｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒからの一連の研究は、ヒトおよびマウスＴ細胞における５−ＨＴ１ａ受容体の存在および関与を示した（非特許文献２３；非特許文献１９；非特許文献２８）。これらの研究は、ＩＬ−２により刺激されるヒトＴ細胞増殖をトリプトファンヒドロキシラーゼ、すなわち、セロトニンへのトリプトファンの転化に関与する第一の酵素の阻害によって抑制できること、および５−ヒドロキシトリプトファン、すなわち、阻害される酵素の代謝生成物の添加により該抑制を無効にできることを立証した。さらに、５−ＨＴ１ａ特異的受容体アンタゴニストによりインビトロでヒトＴ細胞増殖を阻止することができた。マウスモデルでは、１ａ型受容体アンタゴニストが、２型受容体アンタゴニストはそうではないが、オキサザロンに対するインビボ接触過敏症応答を抑制できるが、抗体応答は抑制できないことを示した。
【００１８】
１ａ型および２型受容体アンタゴニストの両方を用いて、Ｌａｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献２９）は、セロトニンがＣＤ８＋Ｔ細胞から化学走化性因子、ＩＬ−１６を誘導できること、および２型受容体インヒビターの添加によってこの活性を特異的に阻害できるが、１ａ受容体のアンタゴニストではそうではないことを示した。従って、先行技術は、セロトニンが免疫系において役割を果たすことを示したが、その役割が何なのかは明らかでなく、そして受容体アンタゴニストの使用により免疫系を調節できることを示唆するものは何もなかった。
【００１９】
セロトニンが免疫応答において役割を果たし得ることを示唆する少数の参考文献がある。１９８９年に、著名な免疫学者、Ｐｈｉｌｉｐ  Ａｓｋｅｎａｓｅおよびその共同研究者は、５−ＨＴＲ２アンタゴニストがマウスにおける遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を抑制できることを示した（非特許文献１７）。Ａｍｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は、「遅れて作用するＤＴＨエフェクターＴ細胞は機能性５−ＨＴ２Ｒを発現するかもしれず、そしてＴ細胞がＤＴＨの炎症性リンフォカインに依存する性質を局所的にもたらすためにこれらの受容体はインビボ活性化を必要とするかもしれない」と推論した。おそらく、げっ歯動物の肥満細胞はセロトニンを含有するがヒト肥満細胞はそうではないので、その後これらのデータは孤立し、その結果、これらの結果はヒト免疫応答に適用されなかった。後に、Ａｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献３０）は、５−ＨＴＲ１ａアンタゴニストがインビボでマウスＤＴＨ応答を阻害できることを示し、そして酵素トリプトファンヒドロキシラーゼ（セロトニンへのトリプトファンの転化に関与する第一の酵素）の阻害がＴ細胞増殖を抑制できることを示した。この場合もやはり、これらの著者等は重要な断片の情報を提供したが、Ｔ細胞依存性応答の増大におけるセロトニンのさらに大きな役割を認識できなかった。
【００２０】
マクロファージおよびリンパ球がセロトニンに応答することができる受容体を発現する第一の証拠は、１９８４年に提示された（非特許文献３１）。その間の何年かにわったって、１４種の既知の薬理学的に異なるセロトニン受容体のうち、静止リンパ球は５−ＨＴ２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、６および７を発現すること（非特許文献１７；非特許文献１８）および５−ＨＴ１Ａおよび５−ＨＴ３受容体が活性化の際にアップレギュレーションされること（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献１８）が示されている。
【００２１】
リンパ球上のおよび免疫調節におけるセロトニン受容体の機能的役割は、もしあるとしても、これまで特定されておらず、一般に、セロトニン受容体は、カチオンチャンネルである３型受容体を除いて、７個の膜貫通ドメインを含んでなるＧ共役受容体であることが既知である（総説には、非特許文献２１を参照）。さらに特に、１型受容体はアデニル酸シクラーゼに作用し、ｃＡＭＰのダウンレギュレーションをもたらす（非特許文献２２）。
【００２２】
５−ＨＴ１Ａ受容体と異なり、静止Ｔ細胞上に存在する５ＨＴ６および５−ＨＴ７受容体は、セロトニンに応答してｃＡＭＰをアップレギュレーションすることによって作用する（非特許文献２４；非特許文献２５）。明らかに直感に反する配置において、静止細胞上に存在する５−ＨＴ６および５−ＨＴ７受容体はＴ細胞応答を遅らせるように作用するはずであり、一方、１ａ型は５−ＨＴ６および５−ＨＴ７受容体から送られるシグナルを妨害するはずである。５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ受容体はホスホリパーゼＣに正に共役し、そしてイノシトールリン酸および細胞内Ｃａ２＋の増加した蓄積をもたらし、それによりプロテインキナーゼＣシグナル伝達カスケードを作動させる（総説には、非特許文献２６を参照）。
【００２３】
セロトニンは、マウスにおけるＴ細胞性遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を高めるのに必要とされると以前に仮定された（非特許文献２７）。セロトニンに対するＤＴＨ応答の依存性は、この生体アミンの血管作用特性のためであると結論付けられた。セロトニンの免疫調節効果に関する文献には様々な報告がある。ある状況下では、外因性５−ＨＴは活性化Ｔ細胞を刺激することが示されており（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）、一方、大部分の研究室は、高濃度の外因性５−ＨＴが活性化Ｔ細胞の増殖を抑制することを報告する（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。従って、この神経伝達物質は免疫応答のアップおよびダウンレギュレーションの両方をすることが研究によって示唆されるので、もしあるとしても、どのような効果をセロトニンが免疫系に対して有することができるかは不明である。
【００２４】
免疫応答を調節する治療、特に他のものに影響を与えずに免疫応答のある面を調節する治療を開発する長い間の切実な要求がある。従って、免疫応答を調節するための可能性がある治療標的を同定することには大きな要求がある。本発明はこれらの要求を満たす。
【非特許文献１】
Ｓｔｅｉｎｂｕｓｃｈ，１９８４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ  ３：６８−１２５，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂ．Ｖ．
【非特許文献２】
Ｃｏｗｅｎ，１９９１，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｐｓｙｃｈ．，１５９：７−１４
【非特許文献３】
Ｌｕｃｋｉ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．＆  Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．，１６：８３−９３
【非特許文献４】
Ｍｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１１９１−１１９３）
【非特許文献５】
Ａｌｂｅｒａｔｉ−Ｇｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  １４：２５１−２５５
【非特許文献６】
Ｍｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１３６２−１３７３
【非特許文献７】
Ｗｉｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２０：４６９−４７３
【非特許文献８】
Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１８９−１９４
【非特許文献９】
Ｍｅｌｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６４−６８
【非特許文献１０】
Ｆｒｕｍｅｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３３：４２８−４３０
【非特許文献１１】
Ｆｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：１５４５−１５５２
【非特許文献１２】
Ｋｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．１４：７８３−７９６
【非特許文献１３】
Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８０：３９５−４００
【非特許文献１４】
Ｓｌａｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８４：２４０−２５２
【非特許文献１５】
Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：３７８−３８０
【非特許文献１６】
Ｍｏｓｓｎｅｒ  ＆  Ｌｅｓｃｈ，１９９８，Ｂｒａｉｎ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２４９−２７１
【非特許文献１７】
Ａｍｅｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３１７１−３１７９
【非特許文献１８】
Ｓｔｅｆｕｌｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｒａｉｎ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４：２１９−２２４
【非特許文献１９】
Ａｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１１７５−１１８３
【非特許文献２０】
Ｍｅｙｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１５１−１６０
【非特許文献２１】
Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｎｅｕｒｏ  Ｐｈａｒｍ．３８：１０８３−１１５２
【非特許文献２２】
Ｄｅ  Ｖｉｖｏ  ＆  Ｍａａｙａｎｉ，１９８６，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２３８：２４８−２５２
【非特許文献２３】
Ａｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１８２６−１８３１
【非特許文献２４】
Ｒｕａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９３：２６８−２７６
【非特許文献２５】
Ｒｕａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８５４７−８５５１
【非特許文献２６】
Ｂｏｅｓｓ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３３：２７５−３１７
【非特許文献２７】
Ｇｅｒｓｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４２：７３２−７３８
【非特許文献２８】
Ａｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１８２６−１８３１
【非特許文献２９】
Ｌａｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１０−３１５
【非特許文献３０】
Ａｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４８９−４９８
【非特許文献３１】
Ｒｏｓｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１０：７２６
【発明の要約】
【００２５】
本発明は、哺乳動物における免疫応答を調節する方法を含む。該方法は、哺乳動物にセロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を投与することを含んでなり、それにより哺乳動物における該免疫応答を調節する。
【００２６】
一つの態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される。
【００２７】
別の態様として、インヒビターは選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン４型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン６型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
【００２８】
さらに別の態様として、インヒビターはリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４、ＭＤＬ１１９３９、ＳＢ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
【００２９】
一つの態様として、インヒビターはセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である。
【００３０】
別の態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される。
【００３１】
さらなる態様として、哺乳動物はヒトである。
【００３２】
本発明は、哺乳動物における免疫応答を抑制する方法を含む。該方法は、哺乳動物にセロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの免疫応答抑制量を投与することを含んでなり、それにより哺乳動物における免疫応答を抑制する。
【００３３】
一つの態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される。
【００３４】
別の態様として、インヒビターは選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン４型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン６型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
【００３５】
さらに別の態様として、インヒビターはリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４、ＭＤＬ１１９３９、ＳＢ  ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
【００３６】
さらなる態様として、セロトニン受容体はセロトニン４型受容体であり、そしてさらに免疫応答はＣＤ−８依存性である。
【００３７】
なおさらなる態様として、セロトニン受容体はセロトニン６型受容体であり、そしてさらに免疫応答はＣＤ−４依存性もしくはＣＤ−８依存性である。
【００３８】
一つの態様として、インヒビターはセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である。
【００３９】
別の態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される。
【００４０】
さらに別の態様として、哺乳動物はヒトである。
【００４１】
本発明は、免疫細胞による免疫反応を抑制する方法を含む。該方法は、細胞上のセロトニン受容体によって伝達されるセロトニンシグナルを阻害することを含んでなり、ここで、シグナルを阻害することは細胞の活性化を抑制し、そしてさらにここで、セロトニンシグナルを阻害することは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と免疫細胞とを接触させることを含んでなり、それにより細胞による免疫反応を抑制する。
【００４２】
一つの態様として、免疫細胞はＴ細胞およびＢ細胞から選択される。
【００４３】
本発明はまた、セロトニンシグナリングにより活性化される免疫細胞によってもたらされる自己免疫疾患にかかっている哺乳動物における免疫応答を調節する方法も含む。該方法は、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を哺乳動物に投与することを含んでなり、それにより哺乳動物における免疫応答を調節する。
【００４４】
一つの態様として、哺乳動物はヒトである。
【００４５】
別の態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される。
【００４６】
さらに別の態様として、インヒビターは選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
【００４７】
さらなる態様として、インヒビターはリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４およびＭＤＬ１１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
【００４８】
なおさらなる態様として、インヒビターはセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である。別の態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される。
【００４９】
別の態様として、自己免疫疾患は重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（デビック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーブス病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起障害、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛よりなる群から選択される。
【００５０】
さらなる態様として、調節は抑制である。
【００５１】
本発明は、免疫応答がＴ細胞上のセロトニン受容体の活性化によりもたらされる場合の哺乳動物における免疫応答を抑制する方法を含む。該方法は、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量とＴ細胞とを接触させることを含んでなり、それにより哺乳動物における免疫応答を抑制する。
【００５２】
一つの態様として、該方法はボーラス注入としてインヒビターを投与することをさらに含んでなる。
【００５３】
別の態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される。
【００５４】
さらに別の態様として、インヒビターは選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
【００５５】
さらなる態様として、インヒビターはリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４およびＭＤＬ１１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
【００５６】
別の態様として、インヒビターはセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である
さらに別の態様として、哺乳動物はヒトである。
【００５７】
本発明は、活性化が免疫細胞上のセロトニン受容体の活性化によってもたらされる場合の哺乳動物における免疫細胞の活性化を抑制する方法を含む。該方法は、哺乳動物にセロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を投与することを含んでなり、それにより免疫細胞の活性化を抑制する。
【００５８】
一つの態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される。
【００５９】
別の態様として、インヒビターは選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
【００６０】
さらに別の態様として、インヒビターはリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４およびＭＤＬ１１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
【００６１】
さらなる態様として、インヒビターはセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である。
【００６２】
なおさらなる態様として、哺乳動物はヒトである。
【００６３】
本発明はまた、哺乳動物における二次免疫応答を抑制する方法も含む。該方法は、哺乳動物にセロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を投与することを含んでなり、それにより哺乳動物における二次免疫応答を抑制する。
【００６４】
一つの態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体およびセロトニン２Ｃ型受容体よりなる群から選択される。
【００６５】
別の態様として、インヒビターは選択的セロトニン１Ｂ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ａ型受容体アンタゴニスト、選択的セロトニン２Ｂ型受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニン２Ｃ型受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
【００６６】
さらに別の態様として、インヒビターはリスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４およびＭＤＬ１１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
【００６７】
さらなる態様として、インヒビターはセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である。
【００６８】
なおさらなる態様として、哺乳動物はヒトである。
【００６９】
本発明は、細胞がセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を必要とする場合の哺乳動物における該細胞によりもたらされる疾患を処置する方法を含む。該方法は、細胞上のセロトニン受容体とのセロトニン相互作用を阻害することを含んでなり、ここで、該阻害は該細胞にとって有害であり、その結果、細胞は該疾患をもたらさない。
【００７０】
一つの態様として、セロトニン相互作用の阻害は、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターと細胞とを接触させることによりもたらされる。
【００７１】
別の態様として、セロトニン受容体はセロトニン１型受容体、セロトニン２型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される。
【００７２】
さらに別の態様として、疾患は多発性骨髄腫、重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（デビック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーブス病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起障害、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛よりなる群から選択される。
【００７３】
一つの態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体であり、そしてさらに疾患は多発性骨髄腫である。
【００７４】
本発明は、細胞におけるアポトーシスを誘導する方法を含む。該方法は、細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、ここで、該阻害はアポトーシスを誘導し、そしてさらにここで、細胞上のセロトニン受容体とのセロトニン相互作用を阻害することは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と細胞とを接触させることを含んでなり、それにより該細胞におけるアポトーシスを誘導する。
【００７５】
本発明はまた、細胞死を誘導する方法も含む。該方法は、細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、ここで、該阻害は該細胞の死を誘導し、さらにここで、該阻害は、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と細胞とを接触させることを含んでなり、それにより細胞の死を誘導する。
【００７６】
本発明は、哺乳動物における自己免疫疾患を処置するのに有用な化合物を同定する方法を含む。該方法は、試験化合物とセロトニン受容体とを接触させることおよび化合物と接触させたセロトニン受容体とセロトニンとの結合のレベルを化合物と接触させないそのほかの点では同一であるセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較することを含んでなり、ここで、化合物と接触させないそのほかの点では同一であるセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較して化合物と接触させたセロトニン受容体とのセロトニン結合の低いレベルは、化合物が哺乳動物における自己免疫疾患を処置するのに有用である表示である。一つの態様として、哺乳動物はヒトである。
【００７７】
本発明は、この方法によって同定される化合物を含む。
【００７８】
一つの態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される。
【００７９】
本発明は、哺乳動物における同種移植応答を処置するのに有用な化合物を同定する方法を含む。該方法は、試験化合物とセロトニン受容体とを接触させることおよび化合物と接触させた該セロトニン受容体とセロトニンとの結合のレベルを化合物と接触させないそのほかの点では同一であるセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較することを含んでなり、ここで、化合物と接触させないそのほかの点では同一であるセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較して化合物と接触させたセロトニン受容体とのセロトニン結合の低いレベルは、化合物が哺乳動物における同種移植応答を処置するのに有用である表示である。
【００８０】
本発明は、この方法によって同定される化合物を含む。
【００８１】
一つ態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される。
【００８２】
一つの態様として、哺乳動物はヒトである。
【００８３】
本発明は、活性化がＴ細胞上のセロトニン受容体とセロトニンとの結合によってもたらされる場合のＴ細胞の活性化を抑制するのに有用な化合物を同定する方法を含む。該方法は、試験化合物とＴ細胞とを接触させることおよび化合物と接触させたＴ細胞の活性化のレベルを化合物と接触させないそのほかの点では同一であるＴ細胞の活性化のレベルと比較することを含んでなり、ここで、化合物と接触させないそのほかの点では同一であるＴ細胞の活性化のレベルと比較して化合物と接触させたＴ細胞の活性化の低いレベルは、活性化がＴ細胞上のセロトニン２型受容体とのセロトニン結合によってもたらされる場合のＴ細胞の活性化を抑制するのに化合物が有用である表示である。
【００８４】
本発明はまた、細胞上のセロトニン受容体を介するシグナリングに影響を与える化合物を同定する方法を含む。該方法は、化合物と細胞とを接触させることおよび化合物と接触させる前の細胞の形態と比較した細胞における細胞形態の任意の変化を評価することを含んでなり、ここで、化合物と接触させる前の細胞の形態と比較した化合物と接触させた細胞の形態の変化は、化合物が細胞上のセロトニン受容体を介するシグナリングに影響を与える表示であり、それにより細胞上のセロトニン受容体を介するシグナリングに影響を与える化合物を同定する。
【００８５】
本発明は、この方法によって同定される化合物を含む。
【００８６】
本発明は、細胞における細胞周期プロセスに影響を与える方法を含む。該方法は、細胞上のセロトニン受容体を介するシグナルの伝達を阻害することを含み、さらにここで、細胞上のセロトニン受容体を介するシグナルの伝達を阻害することは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と細胞とを接触させることを含んでなり、それにより細胞周期プロセスに影響を与える。
【００８７】
本発明は、セロトニン受容体を発現する細胞におけるアポトーシスに影響を与える方法を含む。該方法は、受容体を介して伝達されるシグナルを阻害することを含んでなり、さらにここで、阻害することは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量と細胞とを接触させることを含んでなり、それにより細胞におけるアポトーシスに影響を与える。
【００８８】
本発明は、セロトニン受容体を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導する方法を含み、該方法は、受容体を介して伝達されるシグナルを阻害することを含んでなり、それにより該細胞におけるアポトーシスを誘導する。
【００８９】
本発明は、哺乳動物における免疫応答を調節するためのキットを含む。該キットは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を含んでなる。キットはさらにアプリケーターおよびその使用説明資料を含んでなる。
【００９０】
一つの態様として、セロトニン受容体はセロトニン１Ｂ型受容体、セロトニン２Ａ型受容体、セロトニン２Ｂ型受容体、セロトニン２Ｃ型受容体、セロトニン４型受容体およびセロトニン６型受容体よりなる群から選択される。
【００９１】
別の態様として、哺乳動物はヒトである。
【００９２】
本発明は、セロトニン受容体を発現する細胞における細胞周期プロセスに影響を与えるためのキットを含む。該キットは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を含んでなる。キットはさらにアプリケーターおよびその使用説明資料を含んでなる。
【００９３】
本発明は、セロトニン受容体を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導するためのキットを含む。該キットは、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を含んでなる。キットはさらにアプリケーターおよびその使用説明資料を含んでなる。
〔発明の詳細な記述〕
セロトニンファミリー受容体は、神経系においてそして本明細書に開示するように免疫系において重要な役割を果たす。本明細書に開示するデータは、セロトニン２型受容体の活性化に影響を与えることにより免疫応答を調節できることを示す。さらに特に、２Ｂ／２Ｃ型およびより少ない程度で２Ａ型セロトニン受容体とセロトニンとの結合の阻害は、哺乳動物においてＴ細胞活性化の減少もしくは抑制ならびにとりわけ一次および二次Ｔ細胞応答の両方の抑制をもたらす。Ｔ細胞応答のそのような抑制は、現在有効な処置がない、とりわけ、自己免疫疾患および同種移植片拒絶の処置の強力な治療法を提供する。
定義
本明細書において用いる場合、以下の用語の各々はこの節においてそれと関連する意味を有する。
【００９４】
冠詞「一つの（ａ）」および「一つの（ａｎ）」は、冠詞の一つもしくは一つより多くの（すなわち、少なくとも一つの）文法的目的語をさすために本明細書において用いる。例として、「一つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、一つの要素もしくは一つより多くの要素を意味する。
【００９５】
Ｔ細胞「活性化」は、該用語を本明細書において用いる場合、免疫応答を引き起こすことができる化合物、分子もしくは細胞（例えば、ＣｏｎＡもしくはＰＨＡのような分裂促進剤）と接触させた場合に、Ｔ細胞が、ＣＤ２５、すなわちＩＬ−２受容体のような表面マーカーを検出可能にアップレギュレーションし、ｐ５６ｌｃｋを含むリン酸化カスケードを開始し、サイトカインおよびインターロイキンの放出を引き起こし、他の方法の中で、発生期のＤＮＡ鎖への３Ｈ−チミジンの取り込みのレベルを評価することによって評価することができるＤＮＡ合成を増し、そして細胞を増殖させることを意味する。
【００９６】
本明細書において用いる場合、セロトニン「アゴニスト」は、哺乳動物に投与した場合に、問題となる組成物がない場合のセロトニンの生物学的活性と比較してセロトニンのレベルもしくは存在に起因する生物学的活性を検出可能に高めるか、増すかもしくは伸ばす問題となる組成物である。
【００９７】
セロトニン「アンタゴニスト」は、ヒトのような哺乳動物に投与した場合に、セロトニンのレベルもしくは存在に起因する生物学的活性を検出可能に阻害する問題となる組成物である。
【００９８】
セロトニン「逆アゴニスト」は、哺乳動物に投与した場合に、セロトニン作動性受容体によってもたらされるシグナルをその基礎レベル未満に検出可能に阻害する問題となる組成物である。例えば、アンタゴニストは、リガンドが受容体へのその正のシグナリング効果を出すのを妨げることができ、一方、逆アゴニスト（「負のアンタゴニスト」としても当該技術分野において知られている）は、受容体によってもたらされるシグナルをそれらの平衡レベル未満に阻害する。すなわち、セロトニン作動性受容体を介するシグナリングのある種のベースラインの検出可能なレベルは、リガンドのない場合でさえ存在することができ、そして逆アゴニストは、そのレベルをベースライン未満に下げることができる。
【００９９】
「選択的アゴニスト」もしくは「選択的アンタゴニスト」という用語は、これらの用語を本明細書において用いる場合、任意の他のセロトニン受容体ファミリーメンバーに対するより標的セロトニン受容体タイプに対する少なくとも約５倍大きい親和性を有する化学剤を意味する。
【０１００】
本明細書において用いる場合、疾病を「軽減する」ということは、疾病の一つもしくはそれ以上の症状の重症度を下げることを意味する。
【０１０１】
「同種移植」という用語は、本明細書において用いる場合、腫瘍組織適合複合体（ＭＨＣ）および／もしくはマイナー抗原のようなしかしこれらに限定されるものではない免疫学的マーカーの不一致が存在する場合の種内の任意の組織の移植を意味する。
【０１０２】
「同種移植応答」という用語は、本明細書において用いる場合、レシピエントに移植した非自己組織に対する任意の免疫応答を意味する。移植方法には、たとえば骨髄移植、臓器移植などの間に非自己細胞、組織もしくは臓器を投与することが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、もしくは非コーディング鎖に実質的に相同な配列をさす。本明細書において定義する場合、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列は、ＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分にのみ相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上に特定される調節配列に相補的であることができ、これらの調節配列はコーディング配列の発現を制御する。
【０１０４】
「増幅」は、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応によって、ポリヌクレオチド配列をコピーし、従って、多数のポリヌクレオチド分子に増やす任意の手段をさす。
【０１０５】
「アポトーシス」という用語は、本明細書において用いる場合、細胞死を引き起こす、細胞外もしくは細胞内シグナルによって誘導される、前から存在する細胞経路の活性化を含む能動プロセスを意味する。特に、細胞死は、損なわれていない膜を有する細胞における核の断片化、クロマチン凝縮などを伴う。
【０１０６】
「アプリケーター」という用語は、該用語を本明細書において用いる場合、哺乳動物に本発明のセロトニン２型受容体とのセロトニン相互作用のインヒビター（例えば、セロトニン２型受容体アンタゴニスト）を投与するための、皮下注射器、ピペットなどが包含されるがこれらに限定されるものではない任意の装置を意味する。
【０１０７】
「細胞周期プロセス」は、本明細書において用いる場合、細胞周期およびその様々な時期と関連する任意の細胞機能もしくはプロセスを意味する。従って、細胞周期プロセスは、細胞周期の任意の部分を通して細胞進行と関連するもの、またはそれをもたらすかもしくはそれに関与するものである。
【０１０８】
セロトニンシグナリングの阻害は、該用語を本明細書において用いる場合、細胞にとって「有害」であり、ここで、該阻害は細胞の生存能力の検出可能な減少をもたらす。細胞生存能力は、生体分子合成（例えば、タンパク質合成、核酸合成など）のレベルを評価すること、トリパンブルー排除、ＭＴＴ還元、ヨウ化プロピジウムの取り込み、細胞表面上のホスファチジルセリンの露出、ＤＮＡ断片化および／もしくはラダー形成などが包含されるがこれらに限定されるものではない当該技術分野において周知である標準的な方法を用いて評価することができる。
【０１０９】
「疾病（ｄｉｓｅａｓｅ）」は、動物がホメオスタシスを維持することができず、そして疾病が改善されない場合に動物の健康が悪化し続ける動物の健康状態である。それに反して、動物における「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」は、動物がホメオスタシスを維持することができるが、動物の健康状態が障害のない場合におけるより良好ではない健康状態である。処置されないままにしておいて、障害は、動物の健康状態のさらなる減少を必ずしも引き起こさない。
【０１１０】
「有効量」という用語は、本明細書において用いる場合、細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナリングの伝達における検出可能な減少をもたらすのに十分なインヒビターの量を意味する。セロトニンシグナルの伝達は、例えば、受容体とセロトニンとの結合のレベルを評価することおよび／もしくは細胞の活性化のレベルを評価することが包含される、本明細書において他で記述するもののようなしかしこれらに限定されるものではない、当該技術分野において周知である標準的な方法を用いて評価することができる。
【０１１１】
当業者は、該量が様々でありそして処置する疾病もしくは症状、処置する哺乳動物の年齢および健康および体調、疾病の重症度、投与する特定の化合物などのような多数の因子に基づいて容易に決定できることを理解する。一般に、投与量は１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの間に設定される。一つの態様として、薬剤は静脈内ボーラス注入によって投与する。このタイプのボーラス投与は、免疫学的に関係のある細胞の全てがそれらの受容体によりもたらされるシグナルを阻止するために十分な量の薬剤と出会うことを保証するために用いることができる。しかしながら、本発明は、この投与方法に限定されない。
【０１１２】
「相同な」は、本明細書において用いる場合、２個のポリマー分子間、例えば２個の核酸分子、例えば２個のＤＮＡ分子もしくは２個のＲＮＡ分子間、または２個のポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性をさす。２個の分子の両方のあるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められる場合、例えば、２個のＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンで占められる場合、それらはその位置で相同である。２つの配列間の相同性は一致するかもしくは相同な位置の数の直接関数であり、例えば、２つの化合物配列の半分の位置（例えば１０サブユニットの長さのポリマーの５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、９０％の位置、例えば１０個のうち９個が一致するかもしくは相同である場合、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。
【０１１３】
「免疫反応」という用語は、本明細書において用いる場合、免疫細胞を刺激することおよび／もしくは活性化することの検出可能な結果を意味する。
【０１１４】
「免疫応答」は、該用語を本明細書において用いる場合、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／もしくは抗原提示細胞のいずれかにおけるエフェクター機能の活性化および／もしくは実施をもたらすプロセスを意味する。従って、免疫応答には、当業者により理解されるように、ヘルパーＴ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答の任意の検出可能な抗原特異的もしくは同種活性化、抗体の生産、アレルギー反応のＴ細胞性活性化などが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１１５】
「免疫細胞」は、該用語を本明細書において用いる場合、免疫応答を高めることに関与する任意の細胞を意味する。そのような細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、抗原提示細胞などが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
「セロトニン２型受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビター」という用語は、本明細書において用いる場合、セロトニン２型受容体を介するシグナリングを検出可能に阻害する任意の化合物もしくは分子を意味する。そのような化合物には、セロトニン受容体アンタゴニスト、逆アゴニストなどが包含される。
【０１１７】
「説明資料」には、該用語を本明細書において用いる場合、本明細書に列挙する様々な疾病もしくは障害を軽減することもしくは処置することをもたらすキットにおける本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは化合物の実用性を伝えるために用いることができる公開、記録、図、もしくは任意の他の表現媒体が包含される。場合により、もしくは代わりに、説明資料は、哺乳動物の細胞もしくは組織における疾病もしくは障害を軽減する一つもしくはそれ以上の方法を記述することができる。キットの説明資料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは化合物を含有する容器に添付することができ、または核酸、ペプチドおよび／もしくは化合物を含有する容器と一緒に出荷することができる。あるいはまた、説明資料は、受取人が説明資料および化合物を協同的に使用するという意図で容器と別個に出荷することができる。
【０１１８】
「単離された核酸」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離されている核酸セグメントもしくはフラグメント、例えば、通常はフラグメントに隣接する配列、例えばそれが生来存在するゲノムにおけるフラグメントに隣接する配列から除かれているＤＮＡフラグメントをさす。該用語はまた、核酸に生来付随する他の成分、例えば、細胞においてそれに生来付随するＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはタンパク質から実質的に精製されている核酸に適用される。従って、該用語には、例えば、ベクターに、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるか、あるいは他の配列に関係なく別個の分子として（例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲもしくは制限酵素消化によって生成するゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組換えＤＮＡが包含される。それにはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも包含される。
【０１１９】
免疫応答を「調節すること」という用語は、本明細書において用いる場合、処置もしくは化合物のない場合の哺乳動物における免疫応答のレベルと比較してそして／またはそのほかの点では同一であるが処置していない哺乳動物における免疫応答のレベルと比較して哺乳動物における免疫応答のレベルの検出可能な増加もしくは減少をもたらすことを意味する。該用語は、生来のシグナルもしくは応答を乱すかもしくはそれに影響を与え、それにより哺乳動物、好ましくはヒトにおける有益な治療応答をもたらすことを包含する。
【０１２０】
「プライマー」は、指定されたポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズしそして相補的なポリヌクレオチドの合成の開始点を提供することができるポリヌクレオチドをさす。そのような合成は、合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼのような重合のための作用因子の存在下にポリヌクレオチドプライマーを置く場合に起こる。プライマーは、典型的には一本鎖であるが、二本鎖であることができる。プライマーは、典型的にはデオキシリボ核酸であるが、多種多様な合成のおよび天然に存在するプライマーが多数の用途に有用である。プライマーは、それが合成の開始部位として働くためにハイブリダイズするように設計される鋳型に相補的であるが、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。そのような場合、鋳型へのプライマーの特異的なハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば発色性、放射性もしくは蛍光成分で標識し、そして検出可能な成分として用いることができる。
【０１２１】
「組換えポリヌクレオチド」は、生来一緒に連結されない配列を有するポリヌクレオチドをさす。増幅されたもしくは組み立てられた組換えポリヌクレオチドを適当なベクターに含むことができ、そして適当な宿主細胞を形質転換するためにベクターを用いることができる。
【０１２２】
組換えポリヌクレオチドは、非コーディング機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）を同様に供給することができる。
【０１２３】
組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。遺伝子が組換えポリヌクレオチドを含んでなる場合の組換え宿主細胞において発現される遺伝子は、「組換えポリペプチド」を生産する。
【０１２４】
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドの発現の際に生産されるものである。
【０１２５】
「ベクター」は、単離された核酸を含んでなりそして細胞の内部に単離された核酸を送達するために用いることができる問題となる組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性もしくは両親媒性化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスが包含されるがこれらに限定されるものではない多数のベクターが当該技術分野において既知である。従って、「ベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスが包含される。該用語にはまた、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、細胞への核酸の導入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物も包含されると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１２６】
「発現ベクター」は、発現するヌクレオチド配列に操作可能に連結される発現制御配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターをさす。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性要素を含んでなり；発現のための他の要素は宿主細胞によってもしくはインビトロ発現系において供給することができる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを含むコスミド、プラスミド（例えば、裸のもしくはリポソームに含まれる）およびウイルスのような、当該技術分野において既知である全てのものが包含される。
【０１２７】
「セロトニンファミリー受容体」という用語は、セロトニン、アドレナリン作動性、ヒスタミン、メラトニン、もしくはドーパミン作動性受容体として分類することができる任意の受容体を意味する。すなわち、受容体はこれらの分子のいずれかと特異的に結合し、そして試料中の他の分子とは有意に結合しない。
【０１２８】
「セロトニン受容体」には、セロトニンと特異的に結合するポリペプチドが包含される。
【０１２９】
「セロトニンシグナル」は、該用語を本明細書において用いる場合、変化をもたらす、セロトニンとの受容体によりもたらされる相互作用、任意のセロトニン特異的受容体との特異的薬剤相互作用、もしくはその両方の結果としての任意の細胞内生化学経路の平衡における変化を意味する。
【０１３０】
同様に、「セロトニン受容体の活性化」は、本明細書において用いる場合、細胞上のセロトニン受容体とセロトニンとの結合が、そのような結合と関連する細胞内および細胞外事象の典型的なカスケードを誘導することを意味する。
【０１３１】
「受容体」は、リガンドと特異的に結合する化合物である。
【０１３２】
「特異的に結合する」という用語は、本明細書において用いる場合、サンプルに存在するセロトニンファミリータンパク質（すなわち、ドーパミン作動性タンパク質、アドレナリン作動性タンパク質、ヒスタミン、メラトニンおよびセロトニン）を認識しそして結合するが試料中の他の分子を実質的に認識もしくは結合しない受容体を意味する。
【０１３３】
疾病を「処置する」ことは、該用語を本明細書において用いる場合、疾病もしくは障害の頻度を減らし、疾病もしくは障害の一つもしくはそれ以上の症状のうちある症状が動物によって経験される頻度を減らすことを意味する。
記述
本発明は、哺乳動物における免疫応答を調節する新規な方法に関する。本発明は、特定のアンタゴニストを用いて細胞上のセロトニン２型受容体とセロトニンとの相互作用を阻害することおよび／もしくは逆アゴニストを用いてセロトニン２型受容体を通して伝達されるシグナル（一つもしくは複数）を阻害することが、Ｔ細胞の活性化を抑制できるという発見に関する。本発明は、セロトニン／受容体相互作用を阻害することによってＴ細胞活性化を妨げるか、もしくは抑制しそれによりそうでなければそのような相互作用によってもたらされる免疫応答を抑制する、既知であるかもしくは開発される、とりわけ、セロトニン２型受容体アンタゴニストを用いてセロトニン／セロトニン２型受容体相互作用を阻害することによって様々な免疫疾病、障害もしくは症状を抑制する方法を開示する。
Ｉ．方法
Ａ．免疫応答を調節する方法
本発明は、哺乳動物における免疫応答を調節する方法を含む。該方法は、そのような処置を必要とする哺乳動物にセロトニン受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターを投与することを含んでなる。これは、本発明の教示を備えた当業者によって認識されるように、セロトニンおよび５−ＨＴ受容体の相互作用を阻害することは受容体を含んでなるＴ細胞の活性化を抑制するかもしくは妨げるからである。Ｔ細胞の抑制は、今度は、本明細書に開示するデータによって十分に示されるように免疫応答の生成を妨げる。
【０１３４】
さらに特に、本発明は、そのような相互作用の様々なインヒビターを用いてセロトニン１Ｂ型、２型、４型および６型受容体とセロトニンとの相互作用を阻害することに関する。すなわち、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、セロトニン１Ｂ、２（Ａ、Ｂおよび／もしくはＣ）、４および６型受容体とセロトニンとの結合を阻害する化合物には、セロトニン受容体とのセロトニン相互作用を阻害する既知のもしくは開発されるいずれかの、抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、小分子、ペプチド模倣物および製薬学的化合物が包含されるがこれらに限定されるものではないことを理解する。
【０１３５】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて理解する。当業者は、本発明のインヒビターには、セロトニン受容体が細胞表面上でセロトニンに到達できることを妨げるかもしくは阻害する分子および化合物が包含されることを理解する。すなわち、本発明は、受容体が細胞の表面上に存在しないように受容体の発現を妨げるアンチセンスおよび／もしくはアンチセンス分子が本発明のイインヒビターであることができることを意図する。
【０１３６】
より好ましくは、セロトニン１Ｂ、２、４もしくは６型受容体とのセロトニン相互作用のインヒビターは、とりわけ、リスペリドン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４、ＭＤＬ１１９３９、ＳＢ２１６６４１およびメチオテピンなどのような１、２、４および６型受容体アンタゴニストである。さらに、当該技術分野において既知である確立した薬理学的基準に従ってそれと決定される任意の１Ｂ、２、４もしくは６型受容体アンタゴニストは、本明細書の全体にわたって開示するとおりにそしてその中に十分に示しそして例示するとおりにＴ細胞活性化が抑制されるように受容体とセロトニンとの相互作用を阻害しそれにより免疫応答を抑制することができると日常実務者（ｒｏｕｔｉｎｅｅｒ）によって理解されるので、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、１Ｂ、２、４および６型受容体アンタゴニストには今後に見いだされるようなアンタゴニストが包含されることを理解する。従って、本発明は、本明細書に記載する特定の１Ｂ、２（Ａ／Ｂ／Ｃ）、４および６型受容体アンタゴニストに決して限定されず；むしろ、本発明には当該技術分野において既知であるかもしくは今後に開発されるアンタゴニストが包含される。
【０１３７】
セロトニン２型受容体アンタゴニストは、２Ａ型、２Ｂ型および２Ｃの各々のいずれか一つもしくはその任意の組み合わせに特異的であることができる。あるいはまた、本発明は、特異的ではなくそして２型受容体のいずれかとセロトニンとの結合に影響を与える２型受容体アンタゴニストを包含する。特異的および非特異的の両方のセロトニン２型受容体アンタゴニストには、リスペリドン、ミアンセリン、リタンセリン、ケタンセリン、メチセルギド、メトキシグラミン、シプロヘプタジン、クロザピン、ＳＢ２０６５５３、ＬＹ５３８５７、ＭＤＬ１１９３９、ＳＢ２４２０８４、メテルゴリン、Ｎ−デスメチルクロザピン、ピレンペロン、クロザピンＮ−オキシド、オクトクロテピン、ロキサピン、メスレルギン（ｍｅｓｕｌｅｒｇｉｎｅ）など、およびその任意の組み合わせが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１３８】
さらに、当業者は、本発明が既知であるかもしくは今後に同定されるいずれかの任意のセロトニン受容体を介して伝達されるセロトニンによりもたらされるシグナルの伝達を阻害することを包含し、ここで、セロトニンシグナルを阻害することは細胞増殖、分裂、生存能力、アポトーシスなどに影響を与え、そしてここで、細胞は免疫応答に関与するかもしくはそれをもたらすことを理解する。従って、本発明は、１Ｂ、２、４および６型セロトニン受容体を介するシグナル伝達の阻害に限定されず；むしろ、本発明には、阻害が免疫応答を抑制する場合のセロトニン受容体を介するシグナリングを阻害することが包含されるが、これに限定されるものではない。
【０１３９】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、そのような阻害は、とりわけ、セロトニン１型受容体とのセロトニン相互作用を阻害する既知であるか、もしくは開発されるいずれかの抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、小分子、ペプチド模倣物および製薬学的化合物を用いることによりもたらすことができることを理解する。すなわち、本発明は、１Ｂ型を優先的に阻害するＳＢ−２１６６４１、および１Ｄ型受容体を選択的に阻害するＢＲＬ−１５５７２（例えば、Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５６：３１２−３２０を参照）のようなしかしこれらに限定されるものではない、１型受容体を阻害する化合物を用いることを包含する。これは、本明細書において他で開示するデータによって示されるように、１Ｂ型受容体を介してもたらされるセロトニンシグナリングの阻害は、細胞増殖、そしてより好ましくは細胞サイズの検出可能な増加と関連付けることができるＤＮＡラダーにより示されるようなアポトーシスの抑制をもたらすからである。
【０１４０】
しかしながら、本発明は、これらもしくは任意の他のセロトニン受容体インヒビターに限定されない。さらに特に、本明細書において他で先に説明するように、これらの化合物は、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用を阻害した既知の化合物および今後に開発される化合物を包含する。既知のセロトニン受容体アゴニストおよびアンタゴニストのリストは、ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｃｒｉｓ．ｃｏｍで公的に利用可能であり、このサイトは、様々なセロトニン受容体の生物学的活性に影響を与える様々な化合物を説明するそれらの既知の特性のＧ．Ａ．Ｋｅｎｎｅｔによる詳細な総説を含んでなる（Ｋｅｎｎｅｔ，１９９７年５月に公開された、ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｃｒｉｓ．ｃｏｍ／ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ．ｈｔｍ）。
【０１４１】
当業者は、本明細書に開示する教示をいったん備えると、本発明が、受容体と特異的に結合する抗体を用いてセロトニン受容体とのセロトニン結合を阻害することを包含することを理解する。各受容体型と結合する抗体を包含する、セロトニン受容体と特異的に結合する抗体は、当該技術分野において周知であり、そして／もしくは当業者に既知である標準的な方法を用いて製造することができる。
【０１４２】
当業者はさらに、抗体をタンパク質として、タンパク質をコードする核酸、もしくは両方として投与できることを理解する。すなわち、細胞もしくは組織に抗体を包含するタンパク質を提供するための当該技術分野において周知である多数のベクターがある。従って、本発明は、セロトニン受容体と特異的に結合する抗体を投与しそれにより受容体とセロトニンとの結合を阻害することを含み、そして抗体を細胞に投与することができもしくは細胞に抗体をコードする核酸を投与することによって抗体を投与することができ、そして抗体のそのような投与は本発明に含まれる。
【０１４３】
さらに、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が、そうでなければ受容体を発現する細胞上のセロトニン受容体の発現を妨げることによるそうでなければセロトニン受容体を介して伝達されるセロトニンシグナルの伝達の阻害を包含することを理解する。例えば、当業者は、本発明が細胞にリボザイムもしくはアンチセンス核酸分子を投与しそれにより細胞におけるセロトニン受容体の発現を阻害することを含むことを理解し、ここで、細胞における対象のタンパク質の発現を阻害するためのそのような分子の設計および使用は、簡潔に下に記述するように当該技術分野において周知である。
【０１４４】
アンチセンス分子および遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｏｈｅｎ，１９８９，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照）。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２６２：４０）。細胞において、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし、二本鎖分子を形成し、それにより遺伝子の翻訳を阻害する。
【０１４５】
遺伝子の翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は当該技術分野において既知であり、そして例えばＭａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ（１９８８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：２８９）に記述されている。そのようなアンチセンス分子は、Ｉｎｏｕｅ（１９９３、米国特許第５，１９０，９３１号）に教示されているようにアンチセンス分子をコードするＤＮＡを用いて遺伝子発現によって細胞に与えることができる。
【０１４６】
あるいはまた、アンチセンス分子を合成的に製造し、そして次に細胞に与えることができる。約１０〜約１００、そしてより好ましくは約１５〜約５０ヌクレオチドの間のアンチセンスオリゴマーは、容易に合成され、そして標的細胞に導入されるので、それらが好ましい。本発明により意図される合成のアンチセンス分子には、未改変のオリゴヌクレオチドと比較して改善された生物学的活性を有する当該技術分野において既知であるオリゴヌクレオチド誘導体が包含される（引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる、Ｃｏｈｅｎ，上記；Ｔｕｌｌｉｓ，１９９１，米国特許第５，０２３，２４３号を参照）。
【０１４７】
リボザイムおよび遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用もまた、当該技術分野において周知である（例えば、引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる、Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７４７９−１７４８２；Ｈａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４９２９−４９３３；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第ＷＯ９２／０７０６５号；Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１６８，０５３号を参照）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと同様に他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の改変によって、ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチド配列を認識しそしてそれを切断するように分子を設計することができる（Ｃｅｃｈ，１９８８，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ，２６０：３０３０）。この方法の主な利点は、それらが配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化されることである。
【０１４８】
２つの基本的なタイプのリボザイム、すなわち、テトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５）およびハンマーヘッド型がある。テトラヒメナ型リボザイムは４塩基の長さである配列を認識し、一方、ハンマーヘッド型リボザイムは１１−１８塩基の長さの塩基配列を認識する。配列が長くなるほど、配列が標的ｍＲＮＡ種にのみ存在する可能性が大きくなる。その結果として、ハンマーヘッド型リボザイムは、特定のｍＲＮＡ種を不活性するのにテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、そして１８塩基の認識配列は、様々な関係のないｍＲＮＡ分子内に無作為に存在する可能性がある短い認識配列より好ましい。
【０１４９】
細胞表面上のセロトニン受容体とセロトニンとの結合を阻害するために細胞に抗体を投与することに加えて、本発明は、対象のセロトニン受容体と特異的に結合する抗体もしくは該抗体をコードする核酸を投与することを含み、ここで、分子はさらに、抗体がセロトニン受容体と結合しそして細胞表面でのその発現を妨げるように細胞内保持配列を含んでなる。「細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）」と呼ばれることが多いそのような抗体は当該技術分野において周知であり、そして例えばＭａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，００４，４９０号）およびＢｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ３８：１１−１７）に記述されている。従って、本発明は、受容体が細胞表面上に存在する場合に対象の受容体とセロトニンとの結合を阻害することを含んでなる方法（例えば、抗体、化合物、小分子、ペプチド模倣物、薬剤など）、ならびに受容体が細胞表面上に存在するのを阻害することを含んでなる結合することを阻害する方法（例えば、リボザイム、アンチセンス分子、細胞内発現抗体など）、ならびにセロトニンとセロトニン受容体間の細胞表面上のリガンド：受容体相互作用を阻害するための今後に既知になるような方法を含む。
【０１５０】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、セロトニン（１Ｂ、２、４もしくは６型）受容体とのセロトニン相互作用のインヒビターを任意の他のそのようなインヒビターと組み合わせて投与できることを理解する。さらに、本発明は、セロトニンインヒビター（例えば、抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、ペプチド模倣物、セロトニン受容体アンタゴニストなど）の少なくとも一つのインヒビターの投与を、遺伝子発現の調節因子（例えば、インターロイキン２の発現を阻害するグルココルチコイドなど）、既知の突然変異原であるアルキル化剤（例えばシクロホスファミド）、カルシニューリンおよびＪＮＫ／ｐ３８キナーゼ経路ならびにサイクリンキナーゼカスケードに作用するキナーゼおよびホスファターゼのインヒビター（例えば、シクロスポリンＡ、タクロリムス［ＦＫ５０６］、およびラパマイシン）、グアノシンヌクレオチド合成のインヒビターとして作用しそして同種移植片拒絶を防ぐためおよび進行中の拒絶を処置するために用いるデノボプリン合成のインヒビター（例えばミコフェノール酸モフェチル）、ならびに慢性関節リウマチに冒された患者を処置するために用いるデノボピリミジン合成のインヒビター（例えばレフルノミド）のようなしかしこれらに限定されるものではない別の免疫調節剤と（前に、同時に、そして／もしくは後に）組み合わせて投与できることを包含する。従って、本発明は、伝統的な免疫調節物質および化合物と合わせてセロトニン（１Ｂ、２、４および６型）受容体とのセロトニン相互作用の少なくとも一つのインヒビターを投与することを包含する。
【０１５１】
当業者は、いったん本発明の教示を備えると、免疫細胞（例えばリンパ球、さらに特にＴ細胞、または例えばＢ細胞もしくはマクロファージのような抗原提示細胞）上のセロトニン２型受容体とセロトニンとの結合が、次にＴ細胞活性化をもたらす受容体活性化に必要とされるので、セロトニン／受容体相互作用を阻害することが、そのような免疫細胞によってもたらされる免疫応答を調節することを理解する。さらに、本明細書に開示するデータは、セロトニン１Ｂ型、４型もしくは６型受容体を介するセロトニンシグナルの伝達の阻害もまた、その受容体を発現する免疫細胞の活性化を抑制すること、それらのセロトニン受容体とのセロトニン結合の阻害もまた細胞活性化を抑制し、従って、細胞による免疫応答も抑制し、そして次にその細胞によりもたらされる免疫応答を抑制することを示す。すなわち、免疫細胞上のセロトニン受容体によりもたらされる相互作用（一つもしくは複数）を阻害することは、影響を受ける免疫細胞によって引き起こされる免疫応答（すなわち、免疫反応）に影響を与え（例えば、受容体／リガンド結合によってもたらされる分裂誘発応答は、Ｔ細胞増殖が起こらないように抑制されそして／もしくはアポトーシスが起こることができるなど）、その結果、免疫にせよそうでないにせよ、その細胞による応答がアンタゴニストのない場合にその他の点では同一である細胞によってもたらされる免疫応答に対して検出可能に増加もしくは減少される。本明細書に開示するデータは、同種刺激によってであろうと分裂誘発刺激によってであろうと、活性化応答中の任意の時点で、５ＨＴ１Ｂ、２、４および６受容体によってもたらされるシグナルを阻害することが、応答の即時停止をもたらすことを明らかに示す。
【０１５２】
従って、本明細書に開示するデータは、セロトニン（１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および／もしくは６型）受容体とのセロトニン結合の阻害が免疫細胞の活性化を抑制し、それにより該細胞による免疫反応を抑制し、それは次にその細胞によりもたらされる免疫応答を抑制するので、哺乳動物、好ましくはヒトにおける免疫応答を阻害する方法を十分に裏付ける。
【０１５３】
同様に、本発明は、免疫細胞による免疫反応を抑制する方法を包含する。これは、本明細書の他でさらに十分に記載するように、免疫細胞上のセロトニン受容体とのセロトニン結合の阻害が、細胞の活性化を抑制し、それは次に、セロトニン結合の阻害のない場合のその細胞による免疫反応と比較した場合にそして／もしくはセロトニンのその受容体との結合が阻害されない場合のそのほかの点では同一である細胞の免疫反応と比較した場合に、その細胞による免疫反応を抑制するからである。
【０１５４】
同様に、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が、哺乳動物における免疫応答を調節する方法を含み、ここで、その免疫応答は、セロトニンシグナリングによって活性化される免疫細胞によりもたらされることを理解する。これは、本明細書の他で先に指摘するように、免疫細胞活性化が、セロトニンのその同族の１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および／もしくは６型受容体との結合を必要とし、その結果、そのような結合を阻害することは活性化を抑制し、それは次に細胞が免疫応答をもたらすのを妨げるからである。従って、当業者は、本明細書の他でさらに十分に記載するような様々な方法によって成し遂げることができるセロトニンシグナリングを阻害することが、そのようなシグナリングを必要とする免疫応答の発生を抑制することを理解する。
【０１５５】
さらに、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明がＴ細胞上のセロトニン受容体の活性化によってもたらされる免疫応答を抑制する方法を包含することを理解する。すなわち、本明細書の他で先に説明するように、免疫細胞、好ましくはＴ細胞上のセロトニン受容体、例えば１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型とのセロトニン結合の阻害は、細胞の活性化を抑制し、そして次にその細胞による免疫反応およびその細胞によりもたらされる免疫応答を抑制する。従って、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、そのような方法が本発明に包含されることを理解する。
【０１５６】
本発明はまた、哺乳動物、好ましくはヒトにおける免疫細胞の活性化を抑制する方法も含み、ここで、活性化は細胞上のセロトニン受容体の活性化によりもたらされる。この場合もまた、これは、本明細書において他でさらに十分に記載するように、本明細書に開示するデータが、免疫細胞上のセロトニン１Ｂ、２（Ａ／Ｂ／Ｃ）、４もしくは６型受容体を介するセロトニンシグナリングの阻害が細胞の活性化を抑制し、従って、その細胞によってそうでなければもたらされる免疫応答もまた阻害することを初めて示すからである。本明細書において他でさらに十分に記載するように、セロトニンシグナリングを阻害する方法は本明細書に記述されており、もしくは当該技術分野において周知であり、そして本発明に含まれる。
【０１５７】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本明細書に開示する方法が、哺乳動物に有益ではない任意の免疫応答を抑制するのに有用であることを理解する。そのような所望されない免疫応答には、二次免疫応答、自己免疫応答、同種移植片拒絶応答などが包含される、疾病、障害もしくは症状と関連する免疫応答が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１５８】
従って、本発明は哺乳動物における二次免疫応答を抑制する方法を含む。すなわち、二次免疫応答が、セロトニンシグナルを介する活性化を必要とする細胞によってもたらされる場合、セロトニンシグナルは、細胞上のセロトニン１Ｂ、２、４および６型受容体とセロトニンとの結合を阻害することによって、本明細書において他でさらに十分に開示するように阻害することができる。この阻害は次に細胞の活性化を抑制し、それは次に二次免疫応答、ＣＤ８＋細胞によってもたらされる応答、および／もしくはＣＤ４＋細胞によってもたらされる免疫応答のような、しかしこれらに限定されるものではない、細胞によってもたらされる免疫応答を抑制する。
【０１５９】
セロトニン受容体によってもたらされるシグナルを阻害する化合物もしくは分子（例えば、セロトニン受容体アンタゴニストもしくは逆アゴニストのような製薬学的化合物）は、細胞、組織もしくは動物にまたは細胞、組織上もしくは動物におけるセロトニン１Ｂ、２、４および／もしくは６型受容体とセロトニンとの相互作用を阻害するために投与することができる。インヒビターが抗体であろうとセロトニン１Ｂ、２、４および／もしくは６型受容体アンタゴニストであろうと、本明細書に記述するインヒビターの安全で且つ有効な投与の方法は当業者に既知である。例えば、セロトニンアンタゴニストの投与は、標準的な文献に記述されている。すなわち、多数のセロトニンに影響を与える作用因子の投与は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９６年版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ）に記載されており、この開示は、その全部が本明細書に記載されるように引用することにより組み込まれる。
【０１６０】
さらに、セロトニン受容体インヒビターを投与するためのパラメーターは、製薬分野において周知であり、本明細書に繰り返す必要はない。
【０１６１】
組成物はまた、細胞、組織もしくは動物における受容体発現もしくはタンパク質のレベルを減らすこともしくは増やすことが動物にとって有益であるように受容体の改変された発現によってもたらされる疾病、障害もしくは症状を処置するのにも有用である。すなわち、動物における疾病、障害もしくは症状が、セロトニン受容体の発現もしくはタンパク質レベルの改変されたレベルによってもたらされるかまたはそれと関連する場合、組成物を受容体のそのような発現もしくはタンパク質レベルを調節するために用いることができる。
【０１６２】
哺乳動物への投与には、化合物、セロトニン１Ｂ、２、４および／もしくは６型受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビター、ポリペプチド、またはそれをコードする核酸、および／またはその全部もしくは一部に相補的なアンチセンス核酸を任意の製薬学的に許容しうる担体、例えば、約７．８のｐＨのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水に懸濁することができる。
【０１６３】
有用な他の製薬学的に許容しうる担体には、グリセロール、水、食塩水、エタノールならびにリン酸塩および有機酸の塩のような他の製薬学的に許容しうる塩溶液が包含されるが、これらに限定されるものではない。これらおよび他の製薬学的に許容しうる担体の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９１，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）に記述されており、その開示は、その全部が本明細書に記載されるように引用することにより組み込まれる。
【０１６４】
製薬学的組成物は、滅菌した注入可能な水性もしくは油性の懸濁液もしくは溶液の形態で製造、包装もしくは販売することができる。この懸濁液もしくは溶液は、既知の技術に従って調合することができ、そして有効成分に加えて、本明細書に記述する分散剤、湿潤剤もしくは沈殿防止剤のような追加の成分を含んでなることができる。そのような滅菌した注入可能な製剤は、例えば、水もしくは１，３−ブタンジオールのような、無毒の非経口的に許容しうる希釈剤もしくは溶媒を用いて製造することができる。他の許容しうる希釈剤および溶媒には、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成のモノ−もしくはジ−グリセリドのような不揮発性油が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１６５】
本発明の方法に有用な製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、口腔内、眼、もしくは別の投与経路に適当な製剤で投与、製造、包装および／もしくは販売することができる。他の意図する製剤には、発射（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）ナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再密封した赤血球、および免疫に基づく製剤が包含される。
【０１６６】
本発明の組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、口腔内、もしくは眼投与経路が包含されるがこれらに限定されるものではない多数の経路によって投与することができる。投与の経路（１つもしくは複数）は当業者に容易に明らかであり、そして処置する疾病のタイプおよび重症度、処置する動物もしくはヒト患者のタイプおよび年齢などを包含する任意の数の因子により決まる。
【０１６７】
本発明の方法に有用な製薬学的組成物は、経口固体製剤、眼、座薬、エアロゾル、局所もしくは他の同様の製剤において全身的に投与することができる。ヘパラン硫酸もしくはその生物学的同等物のような化合物に加えて、そのような製薬学的組成物は製薬学的に許容しうる担体および薬剤投与を高めそして容易にすることが既知である他の成分を含有することができる。ナノ粒子、リポソーム、再密封した赤血球、および免疫に基づく系のような他の可能な製剤もまた、本発明の方法に従って受容体タンパク質および／もしくはそれをコードする核酸を投与するために用いることができる。
【０１６８】
本明細書に記述する方法のいずれかを用いて同定される化合物を調合し、そして免疫系症状（すなわち、自己免疫疾患および同種移植片拒絶）の処置のために哺乳動物に投与できることを今回記述する。
【０１６９】
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫、自己免疫疾患（下記参照）、実質臓器移植に起因する合併症、皮膚移植片拒絶、骨髄移植における対宿主性移植片病などのような多種多様な疾患の処置に有用な化合物を含んでなる製薬学的組成物の製造および使用を包含する。
【０１７０】
そのような製薬学的組成物は、被験体への投与に適当な形態の有効成分のみからなることができ、または製薬学的組成物は有効成分および一つもしくはそれ以上の製薬学的に許容しうる担体、一つもしくはそれ以上の追加の成分、またはこれらのいくつかの組み合わせを含んでなることができる。有効成分は、当該技術分野において周知であるように、生理学的に許容しうるカチオンもしくはアニオンとの組み合わせのような、生理学的に許容しうるエステルもしくは塩の形態で製薬学的組成物において存在することができる。
【０１７１】
本明細書において用いる場合、「製薬学的に許容しうる担体」という用語は、有効成分を組み合わせることができ、そして組み合わせの後に、被験体に有効成分を投与するために用いることができる化学組成物を意味する。
【０１７２】
本明細書において用いる場合、「生理学的に許容しうる」エステルもしくは塩という用語は、組成物を投与する被実体に有害でない、製薬学的組成物の任意の他の成分と適合する有効成分のエステルもしくは塩形態を意味する。
【０１７３】
本明細書に記述する製薬学的組成物の製剤は、既知であるかもしくは薬理学の技術分野において今後開発される任意の方法によって製造することができる。一般に、そのような準備方法は、有効成分を担体または一つもしくはそれ以上の他の補助成分と会合させ、そして次に、必要もしくは所望に応じて、生成物を所望の単回もしくは複数回投与単位に成形もしくは包装する工程を含む。
【０１７４】
本明細書に提供する製薬学的組成物の記述は、主としてヒトへの倫理的投与に適当な製薬学的組成物に関するが、そのような組成物は一般に全ての種類の動物への投与に適当であることが当業者によって理解される。組成物を様々な動物への投与に適当にするためのヒトへの投与に適当な製薬学的組成物の改変は汎用的であり、そして普通に熟練した獣医薬理学者は、もしあるとしても、普通の実験でそのような改変を設計しそして行うことができる。本発明の製薬学的組成物の投与を意図する被験体には、ヒトおよび他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１７５】
本発明の方法に有用な製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔、口腔、眼、鞘内もしくは他の投与経路に適当な製剤で製造、包装もしくは販売することができる。他の意図する製剤には、発射ナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再密封した赤血球、および免疫に基づく製剤が包含される。
【０１７６】
本発明の製薬学的組成物は、バルクで、単一の単位用量として、もしくは複数の単一単位用量として、製造、包装もしくは販売することができる。本明細書において用いる場合、「単位用量」は、有効成分の前もって決定した量を含んでなる製薬学的組成物の分離した量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与する有効成分の投与量に等しいか、またはそのような投与量の例えば１／２もしくは１／３のようなそのような投与量の都合のよい割合である。
【０１７７】
本発明の製薬学的組成物における有効成分、製薬学的に許容しうる担体、および任意の追加成分の相対量は、処置する被験体の同一性、大きさおよび症状により、そしてさらに組成物を投与する経路により異なる。例として、組成物は０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の間の有効成分を含んでなることができる。
【０１７８】
有効成分に加えて、本発明の製薬学的組成物は一つもしくはそれ以上の追加の製薬学的に有効な作用因子をさらに含んでなることができる。特に意図する追加の作用因子には、制吐薬ならびにシアン化物およびシアン酸塩スカベンジャーのようなスカベンジャーが包含される。
【０１７９】
本発明の製薬学的組成物の制御もしくは徐放性製剤は、従来の技術を用いて製造することができる。
【０１８０】
経口投与に適当な本発明の製薬学的組成物の製剤は、有効成分の前もって決定した量を各々が含有する、錠剤、硬もしくは軟カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤もしくはロゼンジが包含されるがこれらに限定されるものではない別個の固体用量単位の形態で製造、包装もしくは販売することができる。経口投与に適当な他の製剤には、粉末もしくは顆粒製剤、水性もしくは油性の懸濁剤、水性もしくは油性の液剤、または乳濁剤が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１８１】
本明細書において用いる場合、「油状の」液体は、炭素を含有する液体分子を含んでなりそして水より極性が低い性質を示すものである。
【０１８２】
有効成分を含んでなる錠剤は、例えば、場合により一つもしくはそれ以上の追加成分とともに、有効成分を圧縮もしくは成形することにより製造することができる。圧縮錠剤は、適当な装置において、場合により一つもしくはそれ以上の結合剤、潤滑剤、界面活性剤、および分散剤と混合して、混合粉末もしくは顆粒製剤のような自由に流れる形態の有効成分を圧縮することにより製造することができる。成形錠剤は、適当な装置において、有効成分、製薬学的に許容しうる担体、および混合物を湿らすために少なくとも十分な液体の混合物を成形することにより製造することができる。錠剤の製造に用いる製薬学的に許容しうる賊形剤には、不活性希釈剤、造粒（ｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ）および崩壊剤、結合剤、潤滑剤が包含されるが、これらに限定されるものではない。既知の分散剤には、ジャガイモ澱粉およびグリコール酸澱粉ナトリウムが包含されるが、これらに限定されるものではない。既知の界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが包含されるが、これに限定されるものではない。既知の希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムが包含されるが、これらに限定されるものではない。既知の造粒および崩壊剤には、コーンスターチ、アルギン酸が包含されるがこれらに限定されるものではない。既知の結合剤には、ゼラチン、アカシア、糊化済トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロールが包含されるが、これらに限定されるものではない。既知の潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１８３】
錠剤は被覆されていないことができ、もしくはそれらは被験体の胃腸管における遅延分解を成し遂げるために既知の方法を用いて被覆することができ、それにより有効成分の持続放出および吸収を与えることができる。例として、錠剤を被覆するためにモノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリルのような材料を用いることができる。さらに例として、浸透圧的制御放出錠剤を生成せしめるために米国特許第４，２５６，１０８号；第４，１６０，４５２号；および第４，２６５，８７４号に記述されている方法を用いて錠剤を被覆することができる。錠剤はさらに、製薬学的に洗練されたそして口当たりのよい製剤を提供するために甘味料、香料、着色剤、防腐剤、もしくはこれらのいくつかの組み合わせを含んでなることができる。
【０１８４】
有効成分を含んでなる硬カプセル剤は、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を用いて製造することができる。そのような硬カプセル剤は、有効成分を含んでなり、そしてさらに例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンのような不活性の固体希釈剤を包含する追加成分を含んでなることができる。
【０１８５】
有効成分を含んでなる軟ゼラチンカプセル剤は、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を用いて製造することができる。そのような軟カプセル剤は、ラッカセイ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油のような水もしくは油媒質と混合することができる有効成分を含んでなる。
【０１８６】
経口投与に適当な本発明の製薬学的組成物の液体製剤は、液体形態で、またあ使用する間に水もしくは別の適当な賦形剤での再構成が意図される乾式生成物の形態で製造、包装および販売することができる。
【０１８７】
液体懸濁剤は、水性もしくは油性賦形剤における有効成分の懸濁を成し遂げるために従来の方法を用いて製造することができる。水性の賦形剤には、例えば、水および等張食塩水が包含される。油状賦形剤には、例えば、扁桃油、油状エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油のような植物油、分留植物油、および流動パラフィンのような鉱油が包含される。液体懸濁剤はさらに、沈殿防止剤、分散剤もしくは湿潤剤、乳化剤、緩和剤、防腐剤、バッファー、塩類、香料、着色剤、および甘味料が包含されるがこれらに限定されるものではない一つもしくはそれ以上の追加成分を含んでなることができる。油状懸濁剤はさらに増粘剤を含んでなることができる。既知の沈殿防止剤にはソルビトールシロップ、食用硬化脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、およびナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体が包含されるがこれらに限定されるものではない。既知の分散もしくは湿潤剤には、レシチンのような天然に存在するリン脂質、脂肪酸と、長鎖脂肪族アルコールと、脂肪酸およびヘキシトールから得られる部分エステルと、または脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られる部分エステルとアルキレンオキシドとの縮合生成物（例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が包含されるがこれらに限定されるものではない。既知の乳化剤には、レシチンおよびアカシアが包含されるがこれらに限定されるものではない。既知の防腐剤には、メチル、エチル、もしくはｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸およびソルビン酸が包含されるがこれらに限定されるものではない。既知の甘味料には、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ショ糖およびサッカリンが包含される。油性懸濁剤の既知の増粘剤には、例えば、蜜蝋、固形パラフィンおよびセチルアルコールが包含される。
【０１８８】
水性もしくは油性溶媒における有効成分の液体液剤は、液体懸濁剤と実質的に同様に製造することができ、主な違いは、有効成分を溶媒に懸濁するよりむしろ溶解することである。本発明の製薬学的組成物の液体液剤は、液懸濁剤に関して記述する成分の各々を含んでなることができ、沈殿防止剤は、溶媒における有効成分の溶解を必ずしも助けない。水性溶媒には、例えば、水および等張食塩水が包含される。油性溶媒には、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油のような植物油、分留植物油、および流動パラフィンのような鉱油が包含される。
【０１８９】
本発明の製薬学的製剤の粉末および造粒製剤は、既知の方法を用いて製造することができる。そのような製剤は、被験体に直接投与することができ、例えば、錠剤を生成せしめるため、カプセルに詰めるためもしくはそれへの水性もしくは油性賦形剤の添加によって水性もしくは油性懸濁剤もしくは液剤を製造するために用いることができる。これらの製剤の各々はさらに、一つもしくはそれ以上の分散もしくは湿潤剤、沈殿防止剤および防腐剤を含んでなることができる。増量剤、甘味料、香料もしくは着色剤のような追加の賦形剤もまた、これらの製剤に含むこともできる。
【０１９０】
本発明の製薬学的組成物はまた、水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤の形態で製造、包装もしくは販売することもできる。油相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油のような植物油、流動パラフィンのような鉱油、またはこれらの組み合わせであることができる。そのような組成物はさらに、アカシアゴムもしくはトラガカントゴムのような天然に存在するゴム、ダイズもしくはレシチンリン脂質のような天然に存在するリン脂質、ソルビタンモノオレエートのような脂肪酸および無水ヘキシトールの組み合わせから得られるエステルもしくは部分エステル、ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキシドとそのような部分エステルとの縮合生成物のような一つもしくはそれ以上の乳化剤を含んでなることができる。これらの乳剤はまた、例えば、甘味料もしくは香料を包含する追加成分を含有することもできる。
【０１９１】
本発明の製薬学的組成物は、直腸投与に適当な製剤で製造、包装もしくは販売することができる。そのような組成物は、例えば、座薬、停留浣腸製剤、および直腸もしくは結腸洗浄用の溶液の形態であることができる。
【０１９２】
座薬製剤は、通常の室温（すなわち、約２０℃）で固体でありそして被験体の直腸温度（すなわち、健康なヒトでは約３７℃）で液体である非刺激性の製薬学的に許容しうる賦形剤と有効成分とを合わせることによって製造することができる。適当な製薬学的に許容しうる賦形剤には、ココアバター、ポリエチレングリコールおよび様々なグリセリドが包含されるが、これらに限定されるものではない。座薬製剤はさらに、酸化防止剤および防腐剤が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な追加成分を含んでなることができる。
【０１９３】
停留浣腸製剤または直腸もしくは結腸洗浄用の溶液は、製薬学的に許容しうる液体担体と有効成分とを合わせることにより製造することができる。当該技術分野において周知であるように、浣腸製剤は、被験体の直腸構造に適した送達装置を用いて投与することができ、そしてその内部に包装することができる。浣腸製剤はさらに、酸化防止剤および防腐剤が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な追加成分を含んでなることができる。
【０１９４】
本発明の製薬学的組成物は、膣投与に適当な製剤で製造、包装もしくは販売することができる。そのような組成物は、例えば、座薬、もしくはタンポンのような含浸もしくは被覆した膣に挿入可能な材料、洗浄製剤、またはゲルもしくはクリームまたは膣洗浄用の溶液の形態であることができる。
【０１９５】
化学組成物で材料を含浸もしくは被覆する方法は当該技術分野において既知であり、そして化学組成物を表面上に置くかもしくは結合させる方法、材料の合成中に材料の構造に化学組成物を導入する方法（すなわち、生理的に分解可能な材料でのような）、および後の乾燥の有無にかかわらず、吸収性材料に水性もしくは油性の溶液もしくは懸濁液を吸収する方法が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【０１９６】
洗浄製剤もしくは膣洗浄用の溶液は、有効成分を製薬学的に許容しうる液体担体と合わせることによって製造することができる。当該技術分野において周知であるように、洗浄製剤は、被験体の膣構造に適した送達装置を用いて投与することができ、その内部に包装することができる。洗浄製剤はさらに、酸化防止剤、抗生物質、抗真菌剤および防腐剤が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な追加成分を含んでなることができる。
【０１９７】
本明細書において用いる場合、製薬学的組成物の「非経口投与」には、被験体の組織の物理的突破を特徴とする投与および組織における突破による製薬学的組成物の投与の任意の経路が包含される。従って、非経口投与には、組成物の注入による、外科的切開を介した組成物の適用による、組織穿通性非外科的外傷を介した組成物の適用によるなどの製薬学的組成物の投与が包含されるが、これらに限定されるものではない。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎臓透析注入技術が包含されるが、これらに限定されるものではないと考えられる。
【０１９８】
非経口投与に適当な製薬学的組成物の製剤は、滅菌水もしくは滅菌等張食塩水のような製薬学的に許容しうる担体と組み合わせて有効成分を含んでなる。そのような製剤は、ボーラス投与もしくは連続投与に適当な形態で製造、包装もしくは販売することができる。注入可能な製剤は、アンプルにおけるもしくは防腐剤を含有する複数回投与容器におけるような単位剤形で製造、包装もしくは販売することができる。非経口投与のための製剤には、油性もしくは水性賦形剤における懸濁剤、液剤、乳剤、泥膏、および移植可能な徐放性もしくは生体分解性製剤が包含されるが、これらに限定されるものではない。そのような製剤はさらに、沈殿防止剤、分解防止剤もしくは分散剤が包含されるがこれらに限定されるものではない一つもしくはそれ以上の追加成分を含んでなることができる。非経口投与のための製剤の一つの態様として、有効成分は、再構成組成物の非経口投与の前に適当な賦形剤（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）での再構成のための乾燥（すなわち、粉末もしくは顆粒）形態で提供される。
【０１９９】
製薬学的組成物は、滅菌した注入可能な水性もしくは油性の懸濁液もしくは溶液の形態で製造、包装もしくは販売することができる。この懸濁液もしくは溶液は既知の技術に従って調合することができ、そして有効成分に加えて、本明細書に記述する分散剤、湿潤剤もしくは沈殿防止剤のような追加成分を含んでなることができる。そのような滅菌した注入可能な製剤は、例えば水もしくは１，３−ブタンジオールのような無毒に非経口的に許容しうる希釈剤もしくは溶媒を用いて製造することができる。他の許容しうる希釈剤もしくは溶媒には、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成のモノ−もしくはジ−グリセリドのような不揮発性油が包含されるが、これらに限定されるものではない。有用な他の非経口的に投与可能な製剤には、微晶質形態において、リポソーム製剤において、もしくは生分解性ポリマー系の成分として有効成分を含んでなるものが包含される。徐放もしくは移植のための組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、やや溶けにくいポリマーもしくはやや溶けにくい塩のような製薬学的に許容しうるポリマーもしくは疎水性材料を含んでなることができる。
【０２００】
局所投与に適当な製剤には、塗布薬、ローションのような液体もしくは半液体の製剤、クリーム、軟膏もしくは泥膏のような水中油型もしくは油中水型乳剤、および液剤もしくは懸濁剤が包含されるがこれらに限定されるものではない。有効成分の濃度は、溶媒における有効成分の溶解限度と同じ高さであることができるが、局所的に投与可能な製剤は、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含んでなることができる。局所投与のための製剤はさらに、本明細書に記述する一つもしくはそれ以上の追加成分を含んでなることができる。
【０２０１】
本発明の製薬学的組成物は、口腔を通した肺投与に適当な製剤で製造、包装もしくは販売することができる。そのような製剤は、有効成分を含んでなりそして約０．５〜約７ナノメートル、好ましくは約１〜約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含んでなることができる。そのような組成物は、都合よく、粉末を分散させるために高圧ガスの流れを導くことができる乾燥粉末リザーバを含んでなる装置を用いるか、または密封容器において低沸点の高圧ガスに溶解もしくは懸濁した有効成分を含んでなる装置のような自己推進溶媒／粉末分散容器を用いる投与のための乾燥粉末の形態であることができる。好ましくは、そのような粉末、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメートルより大きい直径を有しそして粒子の数で少なくとも９５％が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含んでなる。より好ましくは、、粒子の少なくとも９５重量％が１ナノメートルより大きい直径を有し、そして粒子の数で少なくとも９０％が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは、糖のような固体の微粉希釈剤を含み、そして単位剤形で都合よく提供される。
【０２０２】
低沸点の高圧ガスには、一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体高圧ガスが包含される。一般に、高圧ガスは組成物の５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成し、そして有効成分は組成物の０．１〜２０％（ｗ／ｗ）を構成することができる。高圧ガスはさらに、液体の非イオン性もしくは固体の陰イオン性界面活性剤または固体の希釈剤（好ましくは有効性成分を含んでなる粒子と同じ次数の粒子サイズを有する）のような追加成分を含んでなることができる。
【０２０３】
肺送達用に調合する本発明の製薬学的組成物はまた、溶液もしくは懸濁液の液滴の形態で有効成分を提供することもできる。そのような製剤は、有効成分を含んでなる、場合により滅菌した、水性もしくは希アルコール溶液もしくは懸濁液として製造、包装もしくは販売することができ、そして任意の噴霧化もしくは微粒化装置を用いて都合よく投与することができる。そのような製剤はさらに、サッカリンナトリウム、揮発性油のような香料、緩衝剤、界面活性剤、もしくはメチルヒドロキシベンゾエートのような防腐剤が包含されるがこれらに限定されるものではない一つもしくはそれ以上の追加成分を含んでなることができる。この投与経路によって提供される液滴は、好ましくは約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の平均直径を有する。
【０２０４】
肺送達に有用であると本明細書に記述する製剤はまた、本発明の製薬学的組成物の鼻腔内送達にも有用である。
【０２０５】
鼻腔内投与に適当な別の製剤は、有効成分を含んでなりそして約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗粉末である。そのような製剤は、鼻から吸うようにして、すなわち、鼻孔近くに保った粉末の容器から鼻腔をとした迅速な吸入によって投与される。
【０２０６】
鼻投与に適当な製剤は、例えば、わずか約０．１％（ｗ／ｗ）程度〜１００％（ｗ／ｗ）程度もの有効成分を含んでなることができ、そしてさらに本明細書に記述する一つもしくはそれ以上の追加成分を含んでなることができる。
【０２０７】
本発明の製薬学的組成物は、口腔投与に適当な製剤で製造、包装もしくは販売することができる。そのような製剤は、例えば、常法を用いて製造する錠剤もしくはロゼンジの形態であることができ、そして例えば０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含んでなることができ、残りは経口的に溶解可能なもしくは分解可能な組成物、および場合により本明細書に記述する一つもしくはそれ以上の追加成分を含んでなる。あるいはまた、口腔投与に適当な製剤は、有効成分を含んでなる粉末またはエアロゾル化もしくは噴霧溶液もしくは懸濁液を含んでなることができる。そのような粉末、エアロゾル化もしくは噴霧製剤は、所望に応じて、好ましくは約１〜約２００ナノメートルの範囲の平均粒子もしくは液滴サイズを有し、そしてさらに本明細書に記述する一つもしくはそれ以上の追加成分を含んでなることができる。
【０２０８】
本発明の製薬学的組成物は、眼投与に適当な製剤で製造、包装もしくは販売することができる。そのような製剤は、例えば、水性もしくは油性の液体担体に有効成分の例えば０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）溶液もしくは懸濁液を含む点眼剤の形態であることができる。そのような点滴剤はさらに、緩衝剤、塩、または本明細書に記述する一つもしくはそれ以上の他の追加成分を含んでなることができる。有用な他の眼球的に投与可能な製剤には、微晶質形態においてもしくはリポソーム製剤において有効成分を含んでなるものが包含される。
【０２０９】
本明細書において用いる場合、「追加成分」には、一つもしくはそれ以上の下記のもの：賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒および崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味料；香料；着色料；防腐剤；ゼラチンのような生理的に分解可能な組成物；水性の賦形剤および溶媒；油性の賦形剤および溶媒；沈殿防止剤；分散もしくは湿潤剤；乳化剤；緩和薬；バッファー；塩；増粘剤；増量剤；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗真菌剤；分解防止剤；ならびに製薬学的に許容しうるポリマーもしくは疎水性材料が包含されるが、これらに限定されるものではない。本発明の製薬学的組成物に含むことができる他の「追加成分」は当該技術分野において既知であり、そして例えば引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎａｒｏ，ｅｄ．（１９８５，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に記述されている。
【０２１０】
典型的に、動物、好ましくはヒトに投与することができる本発明の化合物の投薬量は、処置する動物のタイプおよび疾病状態のタイプ、動物の年齢および投与の経路が包含されるがこれらに限定されるものではない任意の数の因子により異なる。
【０２１１】
化合物は、毎日数回程度頻繁に動物に投与することができ、あるいは、１日に１回、週に1回、隔週に1回、月に1回のような低い頻度で、または数ヶ月ごとに1回もしくはさらに年に1回もしくはそれ未満のようなさらに低い頻度で投与することができる。投与の頻度は当業者に容易に明らかであり、そして処置する疾病のタイプおよび重症度、動物のタイプおよび年齢などのような、しかしこれらに限定されるものではない任意の数の因子により決まる。好ましくは、化合物は、注入後少なくとも1日にわたって持続効果を与えるボーラス注入として投与されるが、そうである必要はない。ボーラス注入は腹腔内に与えることができる。
【０２１２】
初期応答を妨げるか、もしくは減らすことにより、二次応答の生成もまた抑制されるので、本発明は、Ｔ細胞応答の確立を防ぐことによって、二次応答を抑制する方法も提供することを当業者は理解する。
【０２１３】
同様に、当業者は、本発明が細胞によってもたらされる疾病を処置する方法を包含することを理解し、ここで、該細胞は、細胞上のセロトニン受容体を会したセロトニンシグナルの伝達を必要とする。これは、本明細書の他でさらに十分に記載するように、ある種の細胞はセロトニンシグナルを必要とし、その結果、シグナルの阻害はその細胞によってそうでなければもたらされるある種のプロセスを阻害する。細胞がセロトニンシグナルを受けることを必要とする疾病、障害もしくは症状に細胞が関与するか、関連するか、もしくはそれをもたらす場合、シグナルの阻害は、そのような疾病、障害もしくは症状における細胞の関与を阻害する。そのような症状、障害および疾病は、本明細書において他で記載する。
【０２１４】
本質的に、疾病、障害もしくは症状が、セロトニン１B、２、４もしくは６型受容体を介したセロトニンシグナリングを必要とする細胞によってもたらされることが当該技術分野において周知である方法、および／もしくは本明細書において他で開示および／もしくは例示するような方法を用いていったん決定されると、そのようなシグナリングは様々な方法によって阻害することができ、そしてそれにより疾病、障害もしくは症状を処置および／もしくは軽減することができる。必要なセロトニンシグナリングがいったん阻害されると、細胞はもはや疾病、障害もしくは症状をもたらさず、それによりその疾病、障害もしくは症状を処置および／もしくは軽減する。本発明の方法により処置することができる疾病には、重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（デビック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーブス病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起障害、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【０２１５】
従って、本発明は、移植した細胞もしくは組織上に存在する自己抗原および／もしくは非自己抗原のいずれかに対する異常なもしくは増加した免疫応答によってもたらされる自己免疫疾患および同種移植片拒絶の処置もしくは防止の方法を包含する。さらに、初期免疫応答を防ぐことにより、例えば、応答をもたらす細胞におけるセロトニンシグナリングを阻害することにより、本発明はまた、続いて起こるかもしれない任意の二次応答も阻止する。
【０２１６】
さらに、本発明は、二次免疫応答がすでに定着している疾病の処置を包含する。これは、全部ではないが大部分の自己免疫疾患は慢性症状であるからである。大部分の自己免疫疾患の病因はほとんど分からないが、ＣＤ４＋メモリーヘルパーＴ細胞および／もしくはＣＤ８＋メモリー細胞傷害性Ｔ細胞が関与することは明らかである。これらの二次Ｔ細胞は異なる細胞マーカーを有し、そして一次Ｔ細胞と質的に異なるようにふるまう（総説には、Ｄｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２０１−２２３を参照）。従って、本発明は、哺乳動物における免疫細胞の活性化を抑制する方法を含み、ここで、活性化は細胞上のセロトニン2型受容体の活性化によってもたらされる。該方法は、セロトニン２型受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を投与することを含んでなる。これは、本明細書の全体にわたって示すように、免疫細胞（例えばＴ細胞）上のセロトニン２型受容体とセロトニンとの相互作用の阻害は、免疫細胞の活性化を防ぎ、それにより細胞による免疫反応を抑制するからである。
【０２１７】
本発明の方法に従って処置することができる自己免疫疾患には、重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（デビック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーブス病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起障害、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０２１８】
本発明はさらに、哺乳動物における二次免疫応答を阻害する方法を含む。該方法は、セロトニン２型受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を投与することを含んでなる。これは、本明細書に他の所に開示するように、セロトニン2型受容体とセロトニンとの相互作用がとりわけセロトニン2型受容体アンタゴニストによって阻害される場合、一次および二次免疫応答の両方が抑制されるからである。すなわち、本発明は、免疫細胞上のセロトニン２型受容体とセロトニンとの相互作用を阻害することが免疫応答を防止もしくは抑制することを初めて示す。従って、本発明は、セロトニン2型受容体とセロトニンとの相互作用によるＴ細胞活性化でもたらされる極めて大量の自己免疫疾患および自己移植拒絶の処置の新規な特異的免疫調節療法を提供する。
【０２１９】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が劇症エイズにかかっている患者を処置することを含むと理解する。これは、疾病のこの最終段階の間に、患者のＣＤ４細胞計数は非常に低くそして患者は一般に日和見感染で死亡するからである。残存するＣＤ４細胞を調べると、非常に珍しいことが見出され、すなわち、残存するＣＤ４細胞の約５０％が活性化されている。これは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がそれ自身の複製を受けるためにT細胞の活発な増殖を必要とするからである。本明細書に開示するデータに基づき、そしていかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、エイズの末期でさえ、増殖は、セロトニン２型受容体によってもたらされるセロトニンシグナルを必要とすると思われる。細胞計数および本明細書に開示する他のデータにより示すように、５ＨＴ２Ｃシグナルを妨げることは、明らかに細胞死を誘導し、次に例えばＳａｎｓｅｒｔのボーラス用量を末期患者に投与することができる。従って、活性化ＣＤ４細胞の誘導されたアポトーシスによって、ウイルスリザーバを効果的に除くことができ、それにより患者は感染していないＣＤ４細胞の再増殖を潜在的に可能にし、従って、回復を成し遂げる。
Ｂ．有用な化合物を同定する方法
本発明は、セロトニンファミリー受容体とセロトニンとの相互作用を阻害する化合物を同定する方法を包含する。当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、セロトニンおよびセロトニンファミリー受容体の相互作用のレベルを評価することを、化合物と接触していないそれ以外の点で同一の細胞における同じパラメーター（１つもしくは複数）と比較した場合に、とりわけT細胞の活性化を評価することなどによって実施できることを理解する。当業者は、そのような化合物は、セロトニン受容体とセロトニンとの相互作用によってもたらされ、そして／もしくはそれと関連する疾病、障害もしくは症状を抑制するのに有用となりうることを理解する。当業者はさらに、本明細書に提供する開示に基づいて、セロトニンおよび特定のサブタイプもしくは複数のサブタイプのセロトニン受容体間の相互作用を減らし、一方、他のセロトニン受容体タイプとセロトニンとの相互作用は影響を受けないままにすることが有用であり得ることを理解する。
【０２２０】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が、哺乳動物における自己免疫疾患もしくは同種移植応答を処置するのに有用な化合物を同定する方法を含むことを理解する。該方法は、セロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とセロトニンとの相互作用を阻害する物質もしくは化合物を同定することを含んでなる。これは、本明細書において他で開示するように、セロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とセロトニンとの相互作用を阻害することが免疫細胞活性化を抑制しそれにより免疫応答を抑制することが見出されているからである。従って、本発明の教示を備えた当業者は、そのような相互作用を阻害する化合物が、そうでなければセロトニン／受容体相互作用によってもたらされる自己免疫疾患もしくは同種移植応答を処置するのに有用な潜在的治療法であることを理解する。
【０２２１】
該方法は、試験化合物とセロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とを接触させること、並びに試験化合物と接触させないそれ以外の点で同一のセロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とのセロトニン結合のレベルとセロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とセロトニンとの結合のレベルを比較することを含んでなる。日常業務者は、化合物と接触させないそのほかの点では同一であるセロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とのセロトニン結合の該レベルと比較して化合物と接触させたセロトニン受容体とのセロトニン結合のいっそう低いレベルは、化合物がセロトニン／受容体相互作用を阻害し、従って、哺乳動物における自己免疫疾患もしくは同種移植片応答を処置するのに有用であることを示す。当業者はまた、本明細書に提供する開示を考慮して、当該技術分野において既知である標準的な結合アッセイもしくは今後に開発されるものを、有用な化合物を同定するために試験化合物の有無でセロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とセロトニンとの結合を評価するのに使用できることも理解する。従って、本発明は、この方法を用いて同定される任意の化合物を含む。
【０２２２】
本発明はまた、活性化がＴ細胞上のセロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とのセロトニン結合によってもたらされるＴ細胞の活性化を抑制するのに有用な化合物を同定する方法も含む。さらに特に、該方法は、試験化合物と接触させたＴ細胞の活性化状態を評価すること、および化合物と接触させないそのほかの点では同一であるＴ細胞の活性化のレベルと該Ｔ細胞の活性化のレベルを比較すること含んでなる。化合物と接触させないそのほかの点では同一であるＴ細胞の活性化のレベルと比較して化合物と接触させたＴ細胞の活性化のいっそう低いレベルは、化合物がＴ細胞の活性化を抑制するのに有用であることの指標となる。これは、セロトニン／受容体相互作用が阻害されると、活性化が抑制され、それにより細胞による免疫応答を抑制するようにＴ細胞活性化がＴ細胞の表面上のセロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とのセロトニン相互作用を必要とすることを本発明が初めて開示するからである。明らかに、本明細書において他で示すように、Ｔ細胞上のセロトニン１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６型受容体とセロトニンとの相互作用を阻害する化合物は、自己免疫疾患および同種移植拒絶の処置に有用な重要な潜在的治療化合物である。
【０２２３】
セロトニンファミリー受容体を中和する化合物（すなわち、受容体結合を阻止する化合物）の例はＳＢ２０６５５３であり、この構造はＦｏｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１１０４−１１０７に記載されている。本明細書に提供するデータに示すように、免疫応答は、受容体を発現するリンパ球へのこのアンタゴニストの投与で効果的に抑制される。当業者は、自己免疫疾患もしくは高められた免疫応答が患者にとって有害である他の疾病を処置するために、セロトニンファミリー受容体結合を阻止することによる免疫応答の仲介にＳＢ２０６５５３のようなアンタゴニストが役立つことを理解する：
【０２２４】
【化１】
2005504724.tif 000002
【０２２５】
この化合物の性質は、Ｆｏｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：４９６６−４９７７によって記述されそして以下に示すような：
【０２２６】
【化２】
2005504724.tif 000003
【０２２７】
可変位置（Ｒ）で示す位置への修飾によって改変および改善できることもまた理解される。
【０２２８】
この構造のさらに別の態様として、より優れた効能を有するが有効な経口活性を欠くエーテル含有誘導体が、Ｆｏｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：４９６６−４９７７）によって記述されている。この誘導体の構造を以下に示す：
【０２２９】
【化３】
2005504724.tif 000004
【０２３０】
さらに、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、以下の実施例において開示するように、内因性セロトニン受容体発現を欠く細胞を、受容体をコードする単離された核酸を含んでなるベクターでトランスフェクションすることができ、それにより受容体の発現が細胞にもたらされることを理解する。次に、トランスフェクションした細胞を試験化合物と接触させ、それにより、化合物がセロトニン受容体との相互作用に影響を与えるかどうかの決定を可能にする。従って、本発明を備えた当業者は、受容体を発現するベクターを用いて発現可能なレベルの受容体を欠く細胞を選択的にトランスフェクションすることによって、セロトニン／受容体結合に選択的に影響を与える化合物を同定することができる。
【０２３１】
さらに、本発明は、セロトニン受容体を介するシグナル伝達を阻害する化合物のアッセイを包含し、ここで、そのようなアッセイは、細胞の物理的および／もしくは形態的特徴（１つもしくは複数）の変化の検出に基づく。すなわち、本明細書に提供する開示に基づき、当業者は、セロトニンシグナリングの阻害が細胞における検出可能な変化をもたらすかもしくはそれと関連することを理解する。さらに特に、本明細書において他で開示するデータによって示すように、細胞におけるセロトニン作動性シグナルを阻害することは細胞サイズおよび／もしくは形態の増加をもたらし、そしてアポトーシス、細胞死および／もしくは壊死と関連する細胞特徴の検出をもたらす。そのような変化は、顕微鏡検査（電子、光学など）、密度、形態を評価する任意の技術などが包含されるがこれらに限定されるものではない多量の技術を用いて容易に検出および定量することができる。そしてこれらのアッセイ方法の全ては、今後に開発される方法と同様に、本発明に含まれる。
【０２３２】
本明細書に開示する方法は、細胞におけるセロトニン作動性シグナリングを阻害する能力に関する物質の迅速なスクリーニングを可能にし、これらの化合物は、鬱病、嘔吐など、および自己免疫疾患、多発性骨髄腫、閉塞性気道疾患（例えば喘息）、同種移植片拒絶などのような、しかしこれらに限定されるものではない中枢神経系と関連する疾病、障害もしくは症状を処置するのに有用な化合物の開発が包含されるがこれらに限定されるものではない、セロトニン作動性シグナリングを阻害することが治療利益を与える方法における使用に重要な潜在的治療薬である。
Ｃ．Ｔ細胞上の異常なセロトニン２型受容体によりもたらされる哺乳動物における疾病、障害もしくは症状を処置もしくは軽減する方法
本発明は、セロトニンファミリー受容体の異常、すなわち、異常発現（ｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によってもたらされる疾病、障害もしくは症状を軽減する方法を含む。該疾病、障害もしくは症状は、セロトニン受容体の過剰もしくは不十分な発現と関連し、該方法は、その他の点では同一であるが正常な組織、すなわち、処置もしくは軽減する疾病、障害もしくは症状と関連する任意の検出可能な臨床パラメーターを示さない組織における受容体発現のレベルと比較して増加した受容体発現によってもたらされる疾病、障害もしくは症状に冒された患者に適切な受容体をコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を投与することを含んでなる。次に、これは受容体発現の減少をもたらし、それにより受容体の異常発現によってもたらされる疾病、障害もしくは症状を軽減する。そのような疾病、障害もしくは症状には、重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（デビック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーブス病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起障害、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０２３３】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が５ＨＴ受容体の過剰発現もしくは不十分な発現と関連するか、もしくはそれによってもたらされる症状を処置することを含むことを理解する。当業者は、そのような処置には、とりわけ、５ＨＴ  １A型受容体を不十分に発現する患者を処置することが包含されるがこれに限定されるものではないことを理解する。これは、受容体刺激が、５ＨＴ  ６型受容体のアップレギュレーションシグナルと競合する減少したｃＡＭＰシグナルをもたらすからである。従って、該症状は、２つの受容体のシグナル間の均衡をもたらすためにとりわけ５ＨＴ  ６受容体に対するアンチセンスを用いて細胞における５ＨＴ  ６型受容体の発現を減少し、それにより患者の症状を処置することによって処置することができる。
【０２３４】
さらに、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が、セロトニンファミリー受容体の増加もしくは減少した発現によってもたらされる疾病を処置する方法を包含することを理解する。これは、本明細書に開示するデータが、セロトニン受容体発現の増加もしくは減少したレベルと関連する／それによってもたらされるある種の疾病、障害もしくは症状があることを示すからである。本明細書に開示するデータは、５−ＨＴ２Ｂ／２Ｃ特異的アンタゴニストでセロトニンファミリー受容体の発現を中和することによって、リンパ球がさらに増殖しないように免疫応答が抑制されることを示す。この抑制は、自己免疫疾患の処置ならびに高められた免疫応答を伴う他の疾病の処置において有用である。従って、受容体発現を減らすこともしくは受容体結合を妨げることは、受容体の増加したレベルと関連するもしくはそれによってもたらされる症状を処置することができる。それ故、セロトニンファミリー受容体のレベルを減少する化合物を同定する方法は、受容体の増加した発現と関連する疾病、障害もしくは症状を処置および／もしくは軽減するのに役立つ。
【０２３５】
従って、セロトニンファミリー受容体の発現を阻害するアンチセンス核酸はまた、疾病、障害もしくは症状に冒されていない細胞および／もしくは患者における受容体の発現と比較した場合に受容体の増加した発現によってもたらされる疾病、障害もしくは症状の処置の薬剤の製造に用いることもできる。
【０２３６】
細胞における核酸の発現を阻害する技術は当該技術分野において周知であり、そして本明細書に開示するような方法を含む（例えば、抗体、アンチセンス核酸、リボザイムなどを用いる阻害）。セロトニンファミリー受容体をコードする核酸の発現を阻害するのに有用な他の技術には、受容体プロモーターの特定の配列を標的とするヌクレオチド試薬を用いることが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０２３７】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、活性化Ｔ細胞上に存在するセロトニン２型受容体の核酸発現を、細胞における受容体をコードする核酸の発現を妨げる核酸を用いて阻害もしくは阻止できることを理解する。本明細書において他でさらに十分に記載するように、いったんセロトニン受容体の核酸およびアミノ酸配列が分かると、細胞表面上の受容体の発現を阻害するために当該技術分野において周知である様々な方法を用いることができる。そのような方法には、抗体、リボザイムおよびアンチセンス分子が包含されるが、これらに限定されるものではない。いったん当業者が受容体治療標的をコードする核酸の配列を備えれば、そのような化合物の設計および使用は確立しており、従って、そのような方法は、それらが当該技術分野において周知であるので本明細書に列挙しない。例えば、アンチセンス分子およびリボザイムを設計することは、必要とされ得る他のセロトニンファミリー受容体の発現に影響を与えずにセロトニン２型受容体の発現を阻害することによってＴ細胞活性化を有効に抑制することができ、それにより、必要とされ得る他のセロトニン受容体とのセロトニン相互作用を非特異的に阻害する任意の有害な影響を防ぐことができる。
【０２３８】
受容体タンパク質の発現、ポリペプチドのレベル、もしくはその活性が増加しようと減少しようと、当業者は、本開示に基づいて、受容体発現を減少もしくは誘導する方法が、受容体を発現するかもしくはその発現を欠くいずれかの組換え細胞を投与することを含むことを理解する。
【０２３９】
本発明の別の態様として、受容体発現と関連するか、もしくはそれによってもたらされる免疫に基づく疾病、障害もしくは症状を患っている個体は、受容体発現を欠く細胞で欠損細胞を補うこと、補強することおよび／もしくは置換することによって処置することができる。細胞は、正常な同系の適合するドナーから得られる細胞もしくは処置する個体から得られる細胞から得ることができる。細胞は、受容体発現を阻害するように遺伝子的に改変することができる。
【０２４０】
欠損細胞を適合するドナーからの修復細胞もしくは正常細胞で置換することに加えて、本発明の方法はまた、動物において分泌されると有益な効果を有する所望のタンパク質の発現を容易にするために用いることもできる。すなわち、細胞を単離し、セロトニンファミリー受容体をコードする遺伝子を与え、そしてドナーにもしくは同系の適合するレシピエントに導入することができる。受容体の発現は治療効果を与える。
【０２４１】
本発明のこの態様は、セロトニンファミリー受容体の治療量を個体に投与する遺伝子治療に関する。
【０２４２】
本発明のある態様によれば、本発明のセロトニンファミリー受容体をコードする核酸、アンチセンス核酸もしくはノックアウト標的ベクターのいずれかでトランスフェクションした組換え細胞は、セロトニンファミリー受容体の発現もしくはその欠如を特徴とする疾病、障害もしくは症状を処置するために細胞治療法として用いることができる。
【０２４３】
本発明によれば、本発明のヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物を細胞に導入する。すなわち、本明細書において「組換え細胞」と称する細胞は、セロトニンファミリー受容体をコードする核酸もしくは組換え細胞によるそのような受容体発現を阻害する核酸を導入するために遺伝子的に改変され、それにより組換え細胞を投与するレシピエントに有益な効果をもたらす。本発明のある態様によれば、処置する同じ個体から、もしくは別の個体から、もしくは非ヒト動物から得られる細胞は、欠損遺伝子を置換するためにそして／もしくはその発現が個体に有益な効果を有する遺伝子を導入するためにもしくは個体に有益な効果を有することができる受容体発現を阻害するために遺伝子的に改変することができる。
【０２４４】
本発明のある態様として、疾病、障害もしくは症状を患っている個体は、セロトニン受容体をコードする核酸の正常な機能するコピーを含む遺伝子構築物を含有する単離された組換え細胞を与えることでセロトニンファミリー受容体をコードする欠損（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）もしくは欠損（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）核酸を補うこと、補強することおよび／もしくは置換することによって処置することができる。本発明のこの態様は、存在および／もしくは機能が欠けたセロトニンファミリー受容体をコードする核酸を個体に与える遺伝子治療に関する。細胞によって与えられるセロトニンファミリー受容体をコードする単離された核酸は、核酸が個体において発現されると、個体における疾病、障害もしくは症状を軽減するのに役立つかそうでなければ処置するタンパク質が生産されるので、個体の欠損受容体発現を補う。
【０２４５】
セロトニンファミリー受容体をコードする遺伝子構築物を細胞にトランスフェクションする全ての場合において、核酸は、組換え細胞における核酸の発現を得るために必要とされる適切なプロモーター／調節配列に操作可能に連結される。そのようなプロモーター／調節配列には、構成的および誘導性および／もしくは組織特異的および分化特異的プロモーターが包含されるがこれらに限定されるものではなく、そして本明細書において他で説明される。構成的プロモーターには、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスプロモーターが包含されるがこれらに限定されるものではない。さらに、ハウスキーピング遺伝子の発現を調節するもののようなハウスキーピングプロモーターもまた用いることができる。他のプロモーターには、グリア線維酸性タンパク質のプロモータのような、しかしこれに限定されるものではない、中枢神経系の細胞において優先的に発現されるものが包含される。さらに、プロモーター／調節要素は、遺伝子発現が誘導性であるように選択することができる。例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターを用いることができる（Ｆｒｅｕｎｄｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８３：１５９−１７３）。
【０２４６】
遺伝子構築物は、好ましくは、ベクターが細胞にトランスフェクションされると、コーディング配列が細胞によって発現されるように必須のプロモーター／調節配列に操作可能に連結された本発明のセロトニンファミリー受容体コーディング配列を含む遺伝子ベクターとして与えられる。コーディング配列は、細胞における配列の発現に必要なプロモーター／調節要素に操作可能に連結される。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくはそのハイブリッドまたはｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子であることができる。
【０２４７】
プロモーター／調節要素に操作可能に連結された受容体をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は、機能するエピソーム分子として細胞に存在し続けることができ、もしくはそれは細胞の染色体ＤＮＡに組込むことができる。遺伝物質を細胞に導入することができ、ここで、それはプラスミドの形態で別個の遺伝物質としてとどまる。あるいはまた、宿主細胞染色体に組込むことができる線状ＤＮＡを細胞に導入することができる。細胞にＤＮＡを導入する場合、染色体へのＤＮＡの組込みを促進する試薬を加えることができる。組込みを促進するのに有用なDNA配列はまた、ＤＮＡ分子に含むこともできる。あるいはまた、ＲＮＡを細胞に導入することができる。
【０２４８】
発現ベクターにおける遺伝物質を発現させるために、プロモーター／調節要素は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されなければならない。タンパク質生産を最大にするために、所望の細胞における遺伝子発現に適切なプロモーター／調節配列を選択することができる。さらに、細胞において最も効率よく転写されるコドンを選択することができる。当業者は、所望の細胞において機能する発現ベクターとして組換え遺伝物質を製造することができる。
【０２４９】
細胞における遺伝子欠損を修正する、そうでなければ遺伝物質が個体における遺伝子欠損を修正するように十分な量および／もしくは機能的条件で存在しないタンパク質をコードする、そして／またはそれと関連する特定の疾病、障害もしくは症状の処置もしくは防止に有益であるとして有用なタンパク質をコードする、そして細胞上のセロトニン受容体の発現を阻害する（例えば、ノックアウト標的ベクター、アンチセンス核酸など）組換え遺伝物質を細胞に与えることに加えて、遺伝物質はまた、そのような細胞をそのような終結が望ましくなれば選択的に終結させる手段を提供するために本発明において用いる組換え細胞に導入することもできる。破壊のために組換え細胞を標的とするそのような手段を組換え細胞に導入することができる。
【０２５０】
本発明によれば、組換え細胞に破壊を特に受けやすくする遺伝物質を与えることができる。例えば、細胞傷害性因子で特に標的とすることができる受容体をコードする遺伝子を組換え細胞に与えることができる。選択的細胞死を誘導するために用いることができる遺伝子の発現可能な形態を組換え細胞に導入することができる。そのような系において、遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する細胞は、特定の条件下でもしくは特定の因子の有無で選択的致死を受けやすい。例えば、ヘルペルウイルスチミジンキナーゼ（ｈｅｒｐｅｓ  ｔｋ）遺伝子の発現可能な形態を組換え細胞に導入しそして選択的細胞死を誘導するために用いることができる。ｈｅｒｐｅｓ  ｔｋ遺伝子を含む導入される遺伝物質が個体に導入されると、ｈｅｒｐｅｓ  ｔｋが生産される。移植した組換え細胞を殺すことが所望もしくは必要とされる場合、ｈｅｒｐｅｓ  ｔｋを生産する任意の細胞の選択的致死をもたらす薬剤ガンシクロビルを個体に投与することができる。従って、移植した組換え細胞の選択的破壊を可能にする系を提供することができる。
【０２５１】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が、セロトニンファミリー受容体を与えるかもしくは哺乳動物における受容体発現を阻害するいずれかのための組換え細胞の製造を包含することを理解する。すなわち、動物に受容体タンパク質を投与するためもしくは分子（例えば、ノックアウト標的ベクター、アンチセンス核酸、リボザイム、および受容体と特異的に結合する抗体など）を送達するために細胞を用いることができる。
【０２５２】
本発明はさらに、免疫学的に関連する疾病を処置するために用いることができる新しいセロトニン受容体アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングの標的として、対象の受容体を発現する組換え細胞を用いることを含む。従って、細胞を試験化合物と接触させることができ、そして細胞の活性化を化合物と接触させないそれ以外の点で同一である細胞の活性化と比較することができる。化合物と接触させない細胞の活性化と比較して化合物と接触させた細胞の活性化の高いもしくは低いレベルは、化合物がセロトニン受容体によってもたらされる活性化に影響を与え、そしてそれ故に免疫学的に関連する疾患を処置するために用いることができる潜在的なセロトニン受容体アゴニスト、逆アゴニストおよび／もしくはアンタゴニストであることを示す。
【０２５３】
動物へのセロトニンファミリー受容体の投与は、セロトニンもしくは受容体の他のリガンドの作用機構を調べるためのモデル系としてまたは受容体発現と関連する疾病、障害もしくは症状の診断および／もしくは治療法の開発に有用なモデル系を開発するために用いることができる。
【０２５４】
さらに、セロトニンファミリー受容体を発現する組換え細胞の投与によってもたらされる動物へのセロトニン受容体の送達はまた、セロトニン受容体のレベルを増加することが治療効果をもたらす疾病、障害もしくは症状を処置もしくは軽減するために用いることもできる。
【０２５５】
あるいはまた、発現がセロトニン受容体発現、活性および／もしくは細胞からの分泌を阻害もしくは減少する核酸を含んでなる組換え細胞の投与は、受容体発現、活性および／もしくは分泌と関連するか、もしくはそれによってもたらされる疾病、障害もしくは症状に有用な診断および／もしくは治療法の開発のモデルとして用いることができる。本発明は、組換え細胞が、受容体発現を阻害する分子を生産しそれにより動物のそのような分子を提供できることを含む。あるいはまた、いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、受容体を発現することができないことを除いて、その他の点で機能性の細胞である組換え細胞自体は、セロトニンシグナリング経路に供与されずに、その他の点で同一であるが非組換えの細胞の機能を果たすことができる。
【０２５６】
動物から得られる細胞、市販されているか、もしくは開発される確立した細胞系から得られる細胞の両方、またはインビトロで培養する一次細胞は、当業者に容易に利用可能な周知の技術を用いてトランスフェクションすることができる。従って、本発明は、ドナー動物から、もしくは患者動物自体から細胞を得ることに限定されない。むしろ、本発明は、組換え細胞がセロトニン受容体を発現するかもしくは組換え細胞がそのような受容体を発現しないかもしくはより低いレベルでそれを発現するように本発明の核酸を用いて設計することができる任意の細胞を用いることを含む。
【０２５７】
核酸は、遺伝子によってコードされるタンパク質を発現するかもしくはセロトニン受容体発現を阻害する分子を発現する遺伝子構築物を細胞に導入するために用いる標準的な方法を用いて細胞に導入することができる。ある態様として、細胞をリン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、電気穿孔、微量注入、リポソームによる導入、化学物質による導入、リガンドによる導入もしくは組換えウイルスベクター導入によりトランスフェクションする。
【０２５８】
単離された受容体ポリペプチド、受容体と特異的に結合する抗体、受容体に対するアンチセンス核酸、および／もしくは本発明の組換え細胞を動物に存在する受容体のレベルを増加もしくは減少するいずれかのために動物に投与する場合、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、動物に投与するポリペプチド、核酸、抗体、もしくは細胞の量が、受容体の発現レベルまたは動物の組織に存在する受容体ポリペプチドもしくは受容体をコードする核酸のレベルを評価することにより滴定できることを理解する。
【０２５９】
受容体発現のレベルを評価する方法（例えば、ウェスタンブロットもしくはＥＬＩＳＡのような免疫に基づく分析における抗−受容体抗体を用いる）ならびに／または細胞および／もしくは組織における受容体発現のレベルを評価する方法（例えば、ノーザンブロット分析を用いるなど）は本明細書に開示するかもしくは当業者に周知である。そのようなアッセイは、受容体発現のレベルを減少もしくは増加するために動物に投与する受容体ポリペプチド、核酸、抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、組換え細胞などの「有効量」を決定するために用いることができる。
Ｄ．セロトニン受容体を介したシグナル伝達を阻害することに関する方法
本発明は、セロトニン受容体を介したセロトニンシグナルの伝達を阻害することによって細胞周期プロセスに影響を与える方法を含む。すなわち、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、５−ＨＴ受容体を介して伝達されるセロトニンシグナルの除去もしくは阻害が細胞周期プロセスに影響を及ぼすことを理解する。これは、本明細書に開示するデータが、セロトニン作動性シグナルの阻害が細胞周期を通して循環する細胞に大きな影響がある、例えば、シグナルの除去がアポトーシスによる迅速な細胞死をもたらす（すなわち、細胞がアデキシンによって染色されるようになり、細胞表面上のＰＩの露出を示し、ＤＮＡ断片化が検出され、そして細胞は大きさが増し、改変された形態を示すなど）ことを十分に示すからである。以前の研究は、様々な神経疾患の処置のために、細胞周期を経ていない非分裂細胞、すなわち、神経もしくは筋肉細胞におけるセロトニン作動性シグナルを阻害することに集中していたのでこれらは意外な結果である。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、セロトニンシグナリングの様々なインヒビターの使用に関する先行技術研究は、ニューロンのようなしかしこれらに限定されるものではない、細胞周期を経ていない非分裂細胞を接触させることを含んでなり、細胞周期に対するセロトニンシグナリングの取り消しおよび／もしくは阻害の影響は観察、認識もしくは理解されず、そして実際にそうすることができなかった。従って、本明細書に開示するデータは、セロトニン受容体の阻害によって細胞周期に影響を与える新規な方法を初めて示す。
【０２６０】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、ある種の細胞がセロトニン受容体を含んでなること、およびそのような受容体を介したシグナリングが細胞周期を経ている細胞において不可欠であることを理解する。従って、本発明は、その受容体を介したセロトニン作動性シグナルの伝達を阻害することによって細胞周期プロセスに影響を与える方法を含む。当業者はさらに、本明細書において他で説明するアンタゴニストのようなしかしこれらに限定されるものではないセロトニン作動性シグナルの伝達を阻害するために用いることができる多量の化合物が利用可能であることを理解する。さらに、本発明は、セロトニン受容体を介してもたらされるセロトニン作動性シグナルの伝達を阻害する、今後に開発されるような化合物を含む。
【０２６１】
該方法はさらに、対象の細胞がセロトニン受容体を発現することが未知である場合に該細胞上のセロトニン受容体の存在を同定すること、そしてさらにどの化合物（１つもしくは複数）がその受容体を介したシグナリングを阻害するかを評価するためにそのような受容体を特性化することを含んでなる。薬理学的、組換えもしくは他の方法論を用いて、細胞上のセロトニン受容体の有無を評価する方法ならびにその受容体を介したシグナリングを阻害する化合物を同定する方法は、当該技術分野において周知であり、そして本明細書において他で例示する。本発明はまた、細胞上のセロトニン受容体の存在およびどの化合物（１つもしくは複数）が対象の受容体を介したシグナリングに影響を与えるかを同定するための今後に開発されるような方法も含む。
【０２６２】
本発明はまた、細胞におけるアポトーシスに影響を与える方法も含む。該方法は、細胞上のセロトニン受容体を介してそうでなければ伝達されるシグナルの伝達を阻害することを含んでなる。これは、本明細書において他で開示するデータが、細胞周期を経ている、例えば増殖および分裂している、細胞におけるセロトニン作動性シグナルの阻害がその細胞におけるアポトーシスをもたらすことを示すからである。従って、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、５−ＨＴ受容体を介したシグナルの伝達を阻害することがアポトーシスを誘導する新規な方法を提供することを理解する。
【０２６３】
本発明の方法は、分裂していないかもしくは細胞上のセロトニン受容体をもたないかもしくは異なるセロトニン受容体を有する隣接する細胞に影響を与えずに増殖する細胞の選択的アポトーシスを初めて可能にする点において有用である。すなわち、本発明の方法は、細胞周期プロセスを経過していないかもしくは標的細胞と同じタイプのセロトニン受容体をその表面上に発現しない細胞に影響を与えない。受容体を介したシグナリングを作動させるかもしくは中和する様々な化合物に対するそれらの薬理学的特異性に基づく７つの異なるサブタイプを含んでなる１４の異なるセロトニン受容体が存在するという点でこれは特に真実である。従って、いったん対象の細胞上に存在するセロトニン受容体が同定および特定化されると、当業者は、本明細書において他で開示する意外なデータに基づいて、セロトニン作動性受容体を保有しないかもしくはその受容体を介したシグナリングが対象の細胞におけるアポトーシスを誘導するために用いる化合物によって影響を受けないような標的細胞と異なる薬理学的サブタイプの受容体を発現する他の細胞における任意のセロトニン作動性シグナリングに影響を与えずに、その標的細胞におけるセロトニン作動性シグナリングを選択的に阻害することによって細胞のアポトーシスを誘導できることを理解する。
【０２６４】
当業者はまた、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が細胞におけるアポトーシスを誘導する方法を含むことを理解する。これは、本明細書において他で先に説明するように、セロトニンシグナリングが、シグナルの阻害が細胞におけるアポトーシスをもたらすことができるように細胞周期を通した細胞の進行に必要とされることが初めて示されているからである。さらに特に、セロトニンシグナリングを必要とする細胞上のセロトニン１Ｂ、２、４および／もしくは６型受容体とのセロトニン結合の阻害は、伝統的なアポトーシス経路を介した細胞死をもたらすことが示されている。
【０２６５】
さらに、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が細胞死を誘導する方法を含むことを理解する。すなわち、本明細書に開示するデータは、セロトニン１Ｂ、２、４もしくは６型受容体を発現する細胞におけるセロトニンシグナリングの阻害が細胞死をもたらすことを示す。従って、本明細書に提供する開示に基づいて、当業者は、セロトニン（１B、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４もしくは６型）受容体とのセロトニン結合を阻害することを含んでなる細胞死を誘導する方法が本発明によって含まれることを理解する。
ＩＩ．キット
本明細書において他で説明するように、セロトニン２型受容体とセロトニンとの相互作用を阻害することは次に免疫細胞の活性化を抑制し、それにより免疫応答を抑制するので、本発明はこの相互作用を阻害することに関する様々なキットを含む。従って、一つの態様として、本発明は哺乳動物における免疫応答を調節するキットを含む。該キットは、セロトニン２型受容体とセロトニンとの相互作用のインヒビターの有効量を含んでなる。そのようなインヒビターには、好ましくは、セロトニン２型受容体アンタゴニストが包含される。そしてキットはさらに、アプリケーターおよびその使用説明資料を含んでなる。
【０２６６】
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が哺乳動物における遺伝子治療へのアデノウイルスベクターに基づく方法の使用のためのアデノウイルスベクターの投与と関連する２型受容体によってもたらされるシグナルを阻害するのに有用なキットを含むことを理解する。遺伝子を送達する最も効率の良いベクターはアデノウイルスベクターであるが、体は遺伝子送達ベクターのその実用性を限定するベクターに対する免疫応答を引き起こし、そして発現の喪失につながるからである。従って、数週以内に、新しいベクター（およびそのなかに含んでなるもの）を与えたあらゆる細胞は取り除かれ、この技術を無効なものとする。本明細書に開示するデータは、アデノ関連免疫応答と一致する２型逆アゴニスト／アンタゴニストの投与が応答性細胞を効果的に取り除くことができ、ベクターに対する免疫応答を阻止し、そしてそれにより遺伝子治療を可能にすることを示唆する。
【０２６７】
本発明は、セロトニンファミリー受容体をコードする核酸、そのような受容体に特異的に結合する抗体ならびにそのような抗体をコードする核酸、そのような受容体をコードする核酸に相補的であるが転写に関してアンチセンスの向きの核酸のような化合物、および／ならびに本発明の組成物、アプリケーター、および本発明の方法を行うための化合物の使用を記述する説明資料を含んでなる様々なキットを含む。代表的なキットを以下に記述するが、他の有用なキットの内容は、本発明の開示をを考慮して当業者に明らかである。これらのキットの各々は、本発明内に含まれる。
【０２６８】
一つの態様として、本発明は、セロトニンファミリー受容体の異常発現によってもたらされる疾病を軽減するキットを含む。該キットは、本発明に開示する方法に従って用いられる。簡潔に言えば、該キットは、セロトニン受容体をコードする核酸に相補的な核酸（ここで、核酸は、受容体の発現を減らすために転写に関してアンチセンスの向きである）と、もしくはそのような受容体と特異的に結合する抗体もしくは抗体をコードする核酸（ここで、受容体の減少した発現、量もしくは活性は有益な効果をもたらす）と細胞を接触させるために用いることができる。さらに、キットは、アプリケーターおよびキットの使用説明資料を含んでなる。これらの説明書は、本明細書に提供する実施例を単に具体化する。
【０２６９】
キットは、製薬学的に許容しうる担体を含む。組成物は、本明細書において他で記載するような適切な量で与えられる。さらに、投与の経路および投与の頻度は、本明細書において他で先に記載するとおりである。
【０２７０】
本発明は、今回、以下の実施例に関して記述する。これらの実施例は、例示の目的のみに提供し、そして本発明はこれらの実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかになるあるとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
【実施例１】
【０２７１】
例１：セロトニン受容体および免疫調節
トリプトファンは、細胞において新しいタンパク質を構築するために必要な１０個の必須アミノ酸の一つである。トリプトファンの異化は飢餓をもたらし、それ故に、認められるＴ細胞抑制の原因となることは、ありそうにないが、可能である。しかしながら、他の９個の必須アミノ酸のいずれもＴ細胞応答の制御に関与するとされていない。
【０２７２】
トリプトファンは、２つの代謝最終結果を有することが一般に既知である。一方の経路において、トリプトファンはナイアシンに転化される。トリフトファンは、せいぜい、細胞において使用されるナイアシンの５０％を占めるのみである（大部分は食事補給によってもたらされ、従ってそれは律速ではない）。トイプトファンのもう一方の代謝最終結果は、セロトニンとしても知られている５−ヒドロキシトリプトアミン（５−ＨＴ）へのその転化である（図１参照）。一方、これはセロトニンの唯一の既知の供給源である。セロトニンは、おそらく間違いなく、古今を通じて一番の最も幅広く研究された生物学的に活性な化合物である。現在まで、免疫応答の増大におけるセロトニンの役割は、仮にあったとしても、ほとんど不明である。実際、学部生および大学院生の免疫学課程を教えるための標準的な専門書となる５つの主要な大学レベルの教科書は、血小板との関連におけるセロトニンおよび外傷の部位で血管収縮を誘導するその能力のみを記載するかもしくはそれがげっ歯類肥満細胞に含まれることを記載する（Ｓｈａｒｏｎ，１９９８，Ｂａｓｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ；Ｋｕｇｙ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ；Ｊａｎｅｗａｙ  ＆  Ｔｒａｖｅｒｓ，：Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ−ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【０２７３】
胚発生の点で、全てのリンパ球は神経冠から得られる。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、最も初期の始原免疫学的防御は、「神経インパルス」パラダイムに基づいており、従って、セロトニンにより制御され得る。やがて、自然は、この基本経路に多数の素晴らしくかつ複雑な層の調節を与えた。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、本明細書に開示するデータは、ＩＤＯ異化作用に関するトリプトファンの影響が、実際、セロトニン経路に対するその影響によることを示す。過去４０年にわたって生産された医学的に関連する文献の総説には、セロトニンがいくつかのＴ細胞活性に影響を与え得るという散発的な文献があるが、本発明まで、これまでのいかなる研究も、Ｔ細胞応答を高めるための基礎的な律速必要条件としてセロトニン受容体活性化をこれまで同定していないことを示す。
【０２７４】
開示するデータは、Ｔ細胞性免疫応答の調整および絶対制御における５−ＨＴの基本的な役割を示す。本明細書に開示する研究において、接着細胞集団を除いて精製されているヒト一次末梢血リンパ球もしくは同様に接着細胞から分離したマウス脾臓細胞のいずれかを用いた。従って、（ＣＤ３陽性）Ｔ細胞の半精製集団を得、そして続いてマイトジェン、例えばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）もしくはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）のいずれかの添加によってこれらの細胞を活性化した。これらの植物レクチンは、一次および二次活性化シグナルの両方に関与するＴ細胞表面受容体を架橋しそれにより強力な刺激シグナルを引き出すことによって作用するのでマイトジェンとして用いた。従って、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、これらのレクチンに対するＴ細胞応答を調節することができる場合に、これらの原理が他の免疫原に容易に適用できることを理解する。
【０２７５】
本明細書の他で先に示すように、ある状況下で、５−ＨＴは活性化Ｔ細胞を刺激することが示されており（Ｋｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．１４：７８３−７９６；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８０：３９５−４００）、一方、大部分の研究所は、高濃度の添加５−ＨＴが増殖を阻害することを報告する（Ｍｏｓｓｎｅｒ  ＆  Ｌｅｓｃｈ，１９９８，Ｂｒａｉｎ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２４９−２７１）。この明白な意見の相違を検討するために、Ｔ細胞の基本活性化経路に対するトリプトファンおよび５−ＨＴの両方の影響を評価した。
供給品および試薬
以下の化合物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した：トリプトファン、５−ヒドロキシ−トリプトファン、セロトニン−塩酸塩、フェネルジン、２−アミノ−２−ノルボルナンカルボン酸（ＢＣＨ）、Ｌ−ｐ−クロロフェニルアラニン、フルオキセチン、ｍ−ヒドロキシベンジルヒドラジン２塩酸塩（ＮＳＤ−１０１５）、（Ｓ）−プロプラノロール、（Ｓ）−および（Ｒ）−８−ＯＨ  ＤＰＡＴ−臭化水素酸塩、ＷＡＹ１００６３５、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４、メチセルギド−マレイン酸塩、２−メチル−５−ＨＴ、Ｒｏ０４６７９０、リスペリドン、３−トロパニル−インドール−３−カルボキシレート、クロザピン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＳＤＺ２０５５５７、アルファ−メチル−ＤＬ−チロシン−メチルエステル塩酸塩。
【０２７６】
以下の化合物はＴｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した：ＭＤＬ１１，９３９。ストック溶液は、典型的に、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）中に１ｍＭの濃度で作った。例外はリスペリドンおよびＭＤＬ１１，９３９であり、これらは最初に塩酸（最終容量の約１／１０）に可溶化し、次にＨＢＳＳで希釈し、そして水酸化ナトリウムでほぼ中性のｐＨに滴定した。Ｌ−ｐ−クロロフェニルアラニンは、その溶解度によって許容される最大濃度に達するように１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩにおいて５ｍＭ濃度で調製した。
【０２７７】
ＲＰＭＩ培地はＧｉｂｃｏ  ＲＢＬからであり、ＨＢＳＳ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒトＡ／Ｂ血清、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、Ｍ−ＣＳＦ、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フルオキセチンおよびＢＣＨ［２−アミノ−２ノルボルナンカルボン酸］はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からであった。全ての使い捨てプラスチックはＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）からであった。トリチウム化したチミジンはＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ（Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）から入手した。バキュテイナー収集セットおよびヘパリン添加収集バイアルはＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）からであった。全ての細胞は、他に示さない限り、５％  ＣＯ２において３７℃で増やした。
動物
６−８週齢のＪＢＡＬＢ／ｃ／ＢＹＪ（Ｈ−２ｄ）およびＣ５７／Ｂ６Ｊマウス（Ｈ−２ｂ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。
ＰＣＲプライマー
塩基配列決定プライマーは：Ｔ７  ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号：１５）、Ｂｇｈ  ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧ（配列番号：１６）であった。特異的５−ＨＴ受容体増幅に用いるプライマーは以下のとおりであった：１Ａ受容体：１ａｆ  ＣＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧ（配列番号：１７）、１ａｒ  ＧＡＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＧ（配列番号：１８）、予想される生成物サイズは２３４ｂｐである。２Ａ受容体：２ａｒ  ＡＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＧ（配列番号：１９）、２ａｆ  ＣＧＣＣＧＡＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣ（配列番号：２０）、予想される生成物サイズは２４７ｂｐである。２Ｂ受容体：２ｂｆ  ＡＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＣ（配列番号：２１）、２ｂｒ  ＴＧＴＣＣＴＴＴＣＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＣ（配列番号：２２）、予想される生成物サイズは２０６ｂｐである。２Ｃ受容体：２ｃｆ  ＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣ（配列番号：２３）、２ｃｒ  ＴＴＣＣＡＴＧＣＴＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＡ（配列番号：２４）、予想される生成物サイズは２５６ｂｐである。３Ａ受容体：３ａｆ  ＣＡＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＧＧ（配列番号：２５）、３ａｒ  ＴＧＡＣＣＡＣＡＴＡＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣ（配列番号：２６）、予想される生成物サイズは２１６ｂｐである。３Ｂ受容体：３ｂｆ  ＡＣＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣ（配列番号：２７）、３ｂｒ  ＧＣＴＣＴＣＣＡＴＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣ（配列番号：２８）、予想される生成物サイズは２７０ｂｐである。受容体４：４ｆ  ＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣ（配列番号：２９）、４ｒ  ＴＴＧＴＧＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＧＡＣＡ（配列番号：３０）、予想される生成物サイズは２８９ｂｐである。全てのプライマーはＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＴＸ）によって製造された。
逆転写およびＰＣＲ
健康なドナーからの全血をＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに記述されているようにフィコール勾配を用いて分画した。末梢血リンパ球を集め、そして６ウェルプレート上にウェル当たり２ｘ１０７細胞でプレーティングした。細胞をプラスチックに１．５時間接着させ、懸濁細胞を取り除き、新しい６ウェルプレート上にウェル当たり１０７細胞で再プレーティングした。接着および懸濁細胞の両方とも、ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌで）で刺激するかもしくは未処置のままのいずれかであった。ＣｏｎＡ刺激後４８時間で、細胞を採取し、そしてＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙミニプレップシステムを製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）に従って用いて全ＲＮＡを抽出した。（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）ＲＮＡサンプルをゲルの臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色によって定量し、そして１μｇの各ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡ合成は、オリゴＴ１２−１８プライマーもしくは受容体特異的リバースプライマーのいずれかを用いて、Ｑｉａｇｅｎ逆転写キットで製造業者の説明書に従って行った。得られるｃＤＮＡを、５−ＨＴ受容体特異的プライマーを用いる３５サイクルのＰＣＲ反応（ＳｉｇｍａからのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いる）において鋳型として用いた。５０マイクロリットルのＰＣＲ反応には、２５ピコモルの各特異的プライマーを用いた。ＰＣＲ条件は：４５秒間９５℃、４５秒間６１．５℃、４５秒間７２℃であった。３５ＰＣＲサイクルの後に７２℃で１０分の伸長工程を続けた。最終ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー）（ＢＭＡ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥからのＮｕＳｉｅｖｅ  ３：１プレキャストアガロースゲル）を用いて分析した。
【０２７８】
配列確認のために、ＰＣＲ生成物をＴＡ発現ベクター（ｐＣＲ３．１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｔａｄ，ＣＡ）に製造業者の説明書において推奨されるように直接クローン化した。ＴＯＰ１０Ｆ’細胞をＰＣＲ生成物を含有するライゲーション混合物で形質転換した後、細菌細胞を２５マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを有する寒天プレート上でプレーティングした。翌日、細菌細胞を迅速なＰＣＲに基づくスクリーニング方法によってインサートの存在に関してスクリーニングした。この方法は１日当たり数百個のクローンのスクリーニングを可能にする。
【０２７９】
簡潔に言えば、細菌クローンを２００マイクロリットルのパイプチップで触れ、次にチップを５０マイクロリットルの滅菌水にさっと浸し、そして９５℃で５分間沸騰させた。２５マイクロリットルの沸騰したサンプルをＴ７およびＢｇｈプラスミドプライマー（塩基配列決定プライマーを参照）を用いる３５サイクルのＰＣＲ反応の鋳型として用いた。次にＰＣＲ生成物をＴＡＥバッファーにおいて２％アガロースゲル上で分離した。陽性クローンを同定し、そしてプラスミドミニプレップを選択したクローンに対してのみ行った（Ｑｉａｇｅｎプラスミドミニプレップシステム、製造業者の説明書に従って）。ミニプレップから得られるプラスミドを、フォワード（Ｔ７）およびバックワード（Ｂｇｈ）プラスミドプライマーを用いてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａの塩基配列決定設備において配列を決定した。
マクロファージ培地馴化研究
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９，１４．１．３−１４．１．６節；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４−１９９７；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｍ，ｖｏｌ．１−３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）から改変したプロトコルを用いて、Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスから得られる単球を単離した。６−８週齢のＣ５７／Ｂ６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の後肢から大腿骨および頸骨を採取した。骨の遠心端を取り除き、骨髄栓（ｍａｒｒｏｗ  ｐｌｕｇ）をさらした。２２標準規格注射針（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）を用いて、２％  ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ培地で骨髄腔を洗い流した。次に間質細胞を取り除くために細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ(３．１．５節)に記述されているようにＡＣＫ（塩化アンモニウムカリウム溶解バッファー；０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）バッファーを用いて赤血球を溶解した。
【０２８０】
１０％  ＦＢＳ、５００ユニット／ｍｌのマウスＭ−ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ培地に細胞を１０７細胞／ｍｌで再懸濁し、そして３ｍｌ／ウェルの細胞懸濁液を６ウェル平底プレート上にプレーティングした。２４時間後に、非接着細胞（単球）を採取し、そして２００ユニット／ｍｌのＭ−ＣＳＦおよび１５％  ＦＢＳを補足した０．６５ｍｌのＲＰＭＩにおいて、２４ウェル平底プレート上にウェル当たり４０万個の細胞でプレーティングした。細胞を４時間増やした。６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃ／ＢＹＪからの脾臓を採取し、そして単一細胞懸濁液を作った。赤血球を上記のように取り除いた。接着細胞をナイロンウールカラム上で１．５時間のインキュベーションによって取り除き、そして懸濁細胞を集めた。次にＢＡＬＢ／ｃ細胞を０．６５ｍｌ（各ウェルの最終容量を１．３ｍｌにする）において１．２ｘ１０６細胞／ウェルでＣ５７／Ｂ６細胞（上記参照）上にプレーティングした。細胞を２．５日間増やした。適宜、このインキュベーションの初めにフルオキセチンもしくはＢＣＨを加えた。混合細胞培養物からの培地を採取し、細胞を除くために１２００ＲＰＭで遠心分離し、そして０．２２ミクロン注射器フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて濾過した。この濾過した培地を再度の細胞増殖をサポートするために用いた。
マウスＴ細胞の精製
ＢＡＬＢ／ｃもしくはｃ５７／Ｂｌａｃｋ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から脾臓を採取した。単一細胞懸濁液を得るためにスピン培地（２％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ならびに１％  Ｌ−Ｇｌｕ（グルタミン酸；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を補足したＲＰＭＩ１６４０倍地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））において脾臓をすりつぶした。細胞を１２００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、そして上清を取り除いた。赤血球（ＲＢＣ’ｓ）をＡＣＫバッファーで溶解した（Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９によってＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．１．３−３．１．５節に記述されているように）。
【０２８１】
残存する細胞をスピン培地に再懸濁し、そして接着細胞を取り除くためにナイロンウールカラム上に載せた。細胞をカラム上（５％  ＣＯ２、３７℃）で約２時間インキュベーションした。非接着細胞をスピン培地を用いてカラムから洗浄した。細胞を遠心分離し、そして感作培地（１０％ウシ血清、１％  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１％  Ｌ−Ｇｌｕ、ベータ−ＭＫＥを補足したＲＰＭＩ１６４０倍地）に再懸濁した。
マウス細胞分裂誘発刺激
６−８週齢のＢＡＬＢ−ｃ／ＢＹＪマウスからの一次脾臓Ｔ細胞をＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９，３．１．５および３．１２．２−３．１２．４節）に記述されているようにして得た。全ての薬剤は、細胞懸濁液の添加の前に、様々な濃度で９６ウェルＵ底プレート上で事前にプレーティングした。全ての実験条件は、少なくとも三重反復でアッセイした。精製した一次細胞をウェル当たり１００，０００細胞で薬剤を含んでなるウェルにおいてプレーティングした。他に示さない限り、ＣｏｎＡは、１μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞懸濁液に加えた。総容量は、ウェル当たり２００μｌであった。コントロールサンプルには、ＣｏｎＡ刺激を与えなかった。細胞を６０時間増やした。１μＣｉのトリチウム化したチミジンを各ウェルに加え、そして１２時間後、ＣｏｎＡの添加後７２時間で、半自動式ＰＨＤ（Ｂｒａｎｄｅｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）ハーベスターを用いてプレートを採取した。
マウス混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
ＭＬＲを本質的にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９，３．１２．６−３．１２．７節）に記述されているようにして行った。すなわち、Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスから得られる一次脾臓細胞を刺激物質として用いた。それらはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９，３．１．５節）に記述されているようにして精製し、そしてＨａｈｎｅｍａｎｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＰＨｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）血液銀行施設で放射線を照射した（３５Ｇｌｙ）。ＢＡＬＢｃ／ＢＹＪマウスから得られる一次脾臓細胞は、ナイロンウールカラムを用いて接着細胞から奪い、そして応答体として用いた。
【０２８２】
様々なインヒビターを９６ウェルＵ底プレート上に事前にプレーティングし、そして全ての実験条件を少なくとも三重反復でアッセイした。１０％  ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ培地における１００，０００個のＣ５７／Ｂ６細胞を各ウェルにプレーティングした。２００，０００個のＢＡＬＢｃ／ＢＹＪ細胞を刺激物質細胞上に２００μｌ／ウェルの最終容量にプレーティングした。バックグラウンドコントロールには、ＢＡＬＢｃ／細胞もＣ５７／Ｂ６細胞も与えなかった。１μＣｉのトリチウム化したチミジンを４日後に各ウェルに加え、そしてプレートを１２時間後に採取した。
ヒトＴ細胞の精製
全ての必要な詳しい情報に基づく懸案事項を満たした後に血液を様々な健康なドナーから得、標準方法に従ってフィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（Ｓｉｇｍａ）勾配を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＳ）を単離した。細胞をフィコール−血清界面から集め、そして残余のフィコールを除くために十分に洗浄した。細胞を洗浄し、そして次にスピン培地（２％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、および１％  Ｌ−Ｇｌｕを補足したＲＰＭＩ  １６４０倍地）に再懸濁した。接着細胞を除くために細胞をフラスコにおいて３７℃、５％  ＣＯ２で約４時間インキュベーションした。懸濁細胞を集め、そして感作培地（１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、ならびに１％  Ｌ−Ｇｌｕおよび−ＭＫＥを補足したＲＰＭＩ  １６４０倍地）に再懸濁した。
多発性骨髄腫細胞の顕微鏡染色の方法
薬剤処置
２．０ｘ１０５個のＲＰＭＩ−８２２６細胞を１０％  ＦＢＳを補足した全部で５ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０において、示す薬剤濃度の存在下で、６ウェル培養プレートで培養した。各ウェルを完全に採取し、そしてサイトスピン用に２つの同一のサンプルに分けた。
サイトスピン
各処置群からの１．０ｘ１０５個のＲＰＭＩ−８２２６細胞をサイト−漏斗に載せ、そして中位の加速で５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。次にスライドをＰＢＳにおける段階的なメタノールによって固定し（１００％、５分；８０％、５分；５０％、５分）、ＰＢＳにおいて５分間洗浄し、そして染色するまで４℃でＰＢＳ中に保存した。
組織化学
サイトスピンしたスライドをヘマトキシリンおよびエオシン、続いて核染色液ビス−ベンズアミドで染色し、すすぎ、そして標準的な染色プロトコルに従って標本にした。同じスライド視野の一致する画像を作製するためにスライドを明視野および蛍光灯の両方の下で視覚化した（例えば、図２８および２９を参照）。
ヒト細胞分裂誘発刺激
健康な志願者からの血液をバキュテイナー収集セットおよびヘパリン添加収集バイアルを用いて静脈穿刺を用いて採血した。血液を５０ｍｌの円錐管（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）において３０ｍｌの総容量にＨＢＳＳを用いて１：１に希釈した。単核細胞を単離するために、１０．５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を３０ｍｌの血液溶液の下に層にし、そして管を室温で１２００ＲＰＭで４５分間回転させた。軟膜からの細胞を集め、そしてＨＢＳＳにおける反復遠心分離を用いて残余のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅを洗浄して除いた。洗浄後に、２％  ＦＢＳを補足したＲＰＭＩにおいて細胞をｍｌ当たり５００万個の細胞で再懸濁した。接着細胞を除くために、懸濁液を６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）上で３ｍｌ／ウェルでプレーティングし、そして３７℃、５％  ＣＯ２で２時間インキュベーションした。このインキュベーション後に非接着細胞を採取し、計数し、そして１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）を補足したＲＰＭＩに再懸濁した。
【０２８３】
細胞分裂誘発刺激を本質的にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３．１２．２−３．１２．４節）に記述するように行った。全ての薬剤は、細胞懸濁液を９６ウェル丸底プレートの各ウェル上に加える前に事前にプレーティングした。全ての実験条件を少なくとも三重反復でアッセイした。１０％ヒト血清を補足したＲＰＭＩ細胞に懸濁した細胞を２００μｌの最終容量にウェル当たり１００，０００細胞でプレーティングした。ＣｏｎＡを１μｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。コントロールサンプルにはＣｏｎＡ刺激を与えなかった。プレートを３７℃および５％  ＣＯ２でインキュベーションした。６０時間後に各ウェルに１マイクロキューリーのトリチウム化したチミジンを加え、そして１２時間後にプレートを採取した。
ヒト混合リンパ球反応のプロトコル
二人の健康な関係のないドナーからの血液を上記のように採取した。末梢血単球細胞を他の所に前述のように単離した。両方のドナーで懸濁細胞から接着細胞を前述のように分離した。両方のドナー（ドナーＡおよびＢ）からの懸濁細胞を応答体として用いた。ドナーの各々からの残存する接着細胞を異なるドナーに対する刺激物質として用いた（接着性Ｂに対する懸濁液Ａおよび懸濁液Ｂに対する接着性Ａ）。刺激物質細胞に３５Ｇｙで放射線照射した。薬剤を三重反復で９６ウェルＵ底プレート上事前にプレーティングした。次に、１０％ヒト血清を補足したＲＰＭＩ中の２００，０００個の「刺激物質細胞」を各ウェル中にプレーティングした。次に、同じ培地における２００，０００個の「応答体」細胞を刺激物質上に２００μｌ／ウェルの最終容量でプレーティングした。バックグラウンドコントロールには刺激物質細胞も応答体細胞も与えなかった。プレートを３７℃および５％  ＣＯ２でインキュベーションした。４．５日後に各ウェルに１μＣｉのトリチウム化したチミジンを加え、そして１２時間後にプレートを採取した。
マウス同種移植モデル
使用されたインビボ検証スクリーニングは、Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００に記述されているような当該技術分野で認められているマウス同種拒絶モデルであった。このアッセイでは、完全ＭＨＣミスマッチ系を用い、ここで、５ｘ１０６個のＰ８１５細胞（［Ｈ−２ｄ］ＤＢＡ／２肥満細胞腫）を実験の０日にＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｈ−２ｂ）マウスの腹腔に注入した。これらのマウスは、典型的に、Ｐ８１５細胞に応答して強い細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を生成する。最初のＰ８１５細胞接種の後、マウスにＣＴＬ応答を発生させる（これは通常約１０−１４日かかる）。研究の６および８日に、試験薬剤のボーラス静脈内（ｉｖ）注射を投与した。次に図に示すように実験の１４日目にマウスを殺し；そして同種ＣＴＬ応答を前述のようにアッセイした（Ｔｒｅｔｉａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：９８４−９８８）。処置および未処置の動物からの一次脾臓細胞を直接ＣＴＬ読み出しに用いた。新しく得た一次脾臓細胞を［３Ｈ］標識した標的細胞（Ｐ８１５細胞）と１００：１、５０：１、２５：１および１２．５：１の比率で３７℃で３．５時間インキュベーションし、そしてＰＨＤハーベスターを用いて採取した。式％致死＝（Ｓ−Ｅ）／Ｓ（ここで、Ｓはエフェクター細胞のない場合に標的細胞によって保持されるＤＮＡの量でありそしてＥはエフェクター細胞の存在下で保持されるＤＮＡの量である（分当たりの計数；ｃｐｍで表される））を用いて特異的致死のパーセンテージを決定した。
【０２８４】
本明細書に開示するデータは、免疫系に対するトリプトファンによるもたらされる影響がセロトニンの代謝前駆体としてのトリプトファンの役割のためであることを初めて示す。さらに特に、トリプトファン輸送インヒビターもしくは選択的セロトニン再摂取インヒビター（ＳＳＲＩ）の影響を決定するために一連の研究を本明細書に開示するように行った。
【０２８５】
トリプトファンもしくはセロトニンのいずれかのＩＤＯによる異化作用を阻害することは、Ｔ細胞増殖を与える馴化培地の能力に同等な影響を有した。すなわち、研究の「馴化」期中に活性化マクロファージへのトリプトファン摂取を阻害するため（２−アミノ２−ノルボルナンカルボン酸、トリプトファン輸送インヒビターを用いる）もしくは研究の「馴化」期中に活性化マクロファージへのセロトニンの摂取を阻害するため（フルオキセチン［ＰｒｏｚａｃＴＭ］、選択的セロトニン再摂取インヒビターを用いる）に図１に示す実験を考案した。このアッセイは変動結果をもたらした：マクロファージは培地を枯渇させることがあり、そしてそうしないことがある（すなわち、時折、しかし常にとは限らないが、トリプトファンは馴化培地において増殖する新しいＴ細胞の能力を回復させることができる）。この変動性にもかかわらず、認められる総合的なパターンは、マクロファージによるトリプトファンもしくはセロトニン摂取のいずれかを阻止する場合に培地の「馴化効果」を阻止できることである。図１に示すアッセイにおいて、トリプトファンの添加は効果がなく、そしてセロトニンの添加はアッセイをほんのわずかに回復させた。それにもかかわらず、同様のアッセイは、トリプトファンおよびセロトニンの両方が、馴化培地において増殖するＴ細胞の能力を回復できることを示した。
【０２８６】
Ｔ細胞における活性化応答を生成することにおけるセロトニンの総合的な役割に取り組むために次の一連の研究を考案した。最初に、活性化応答におけるセロトニンのデノボ合成の役割に関して、ならびにＴ細胞にセロトニンを外因的に加えることの影響を評価した。セロトニンへのトリプトファンの転化の代謝経路を図２に示す。この代謝転化に関与する第一の酵素はトリプトファンヒドロキシラーゼである。理論的には、セロトニンのデノボ合成が活性化応答を高めるために必要とされる場合、代謝転化経路における第一の酵素を阻害することは応答を抑制するはずである。さらに、阻害の特異性を示すために、欠けている酵素最終生成物の添加によって活性化応答を回復させることを用いることができる。
【０２８７】
図３に示す実験は、トリプトファンヒドロキシラーゼの阻害が、細胞分裂誘発シグナルに応答するＴ細胞の能力を損なうかどうかを評価するために考案された。古典的には、この酵素を阻害するためにパラ−クロロフェニルアラニン（ＰＣＰＡ）を用いる。図３に示す研究は、ＰＣＰＡの添加が細胞分裂誘発応答を用量依存的に阻害することおよび酵素の代謝最終生成物５−ヒドロキシ−トリプトファンの添加によってこの阻害を回復できることを示す。ＰＣＰＡのない場合、２５μＭの５−ヒドロキシトリプトファンの添加は、増殖応答を有意に高めた。
【０２８８】
これらのデータは、セロトニンのデノボ合成がＴ細胞活性化プロセスを前進できることを示唆するが、ＰＣＰＡの阻害の機構はこの解釈を困難にする。増殖する細胞に加えるＰＣＰＡは、アミノ酸類似体としてタンパク質生合成によって新たに生産されるタンパク質に入る。トリプトファンヒドロキシラーゼへのＰＣＰＡの取り込みは、その酵素活性を明らかに消すが、細胞内の他のタンパク質へのその取り込みの付随効果を予測することは困難である。
【０２８９】
次に、外因的に加えるセロトニンおよびトリプトファンの影響を評価し、そしてトリプトファン−セロトニン転化の異なる代謝妨害の影響を調べた。代謝妨害に関して、モノアミンオキシダーゼ酵素の妨害によって引き起こされる細胞内セロトニンの蓄積に応答する芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（セロトニンへの５−ＯＨトリプトファンの転化を触媒する酵素）の活性を止める非常に敏感なフィードバック機構がある（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６）。この研究には、モノアミンオキシダーゼのインヒビターとしてフェネルジン（Ｐｚ）を用いた。これらのデータを図４に示す。高用量のセロトニンおよびトリプトファン（４００μＭ）は細胞の最大刺激を高め、一方、モノアミンオキシダーゼインヒビター、Ｐｚの添加は刺激を完全に停止した。これらのデータは、セロトニンのデノボ合成が免疫応答を高めそして維持するのに必要とされるという考えと一致する。ある先行技術の研究は、５−ＨＴが活性化Ｔ細胞を刺激することを示し（Ｋｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、一方、大部分の研究所は、この濃度の加える５−ＨＴが増殖を阻害することを報告する（Ｍｏｓｓｎｅｒ  ＆  Ｌｅｓｃｈ，１９９８）。従って、Ｔ細胞の基本活性化経路に対するトリプトファンおよび５−ＨＴの両方の影響を調べた。
【０２９０】
Ｔ細胞活性化および増殖は非常に複雑であり、そして非常に制御されたプロセスである。Ｔ細胞活性化は、それがマイトジェンが用いられようと特定の抗原を用いて開始されようと、時間および活性化シグナル強度の関数として進む。活性化プロセスを細胞数（もしくはＤＮＡ合成活性）に対する時間の関数としてプロットすると、グラフはベル形曲線に似ている。一般に、細胞分裂誘発的に刺激した増殖アッセイは、開始シグナルの強さにより、４８〜６０時間の間に最高になり、水平状態に達し、そして次に元のベースラインまで迅速に減少する。実際、時間スケールを無視する場合、免疫応答を生成する曲線は、神経インパルスのものと非常によく似る。
【０２９１】
細胞分裂誘発刺激の実験設定は、通常、単一の最適化された濃度の活性化マイトジェンを使用しそして事前に指定されたエンドポイントでデータを再検討するように設計される。しかしながら、外因的に加える試薬が釣鐘曲線の形状を変えるがピーク活性化レベルを変えず、そして研究者が単一の時間点でアッセイを採取する場合、誤解を招く恐れがあり得る。釣鐘曲線の幅を短くする試薬の添加を考慮せよ。採取の時点で、短くされた釣鐘曲線はすでにそのエンドポイントに近づいており、一方、未処置の細胞はまだその水平状態期にある。研究者は、試験試薬がアッセイを阻害したと必然的に結論を下し、一方、細胞の最大応答は同等であることができ、応答の期間のみが変化している。
【０２９２】
一定の時間点（７２時間）で採取しながら、異なる強度の活性化シグナルの下での様々な化合物の影響を調べた。理論的に、最も強い開始シグナル強度、すなわち、使用する最も高い濃度のＣｏｎＡは、経時的に釣鐘曲線を前方へ移し、一方、より弱いシグナルは曲線を遅らせた。Ｔ細胞を刺激するために異なる濃度のＣｏｎＡを用いることにより、採取の時間を一定に保ちながら、活性化の「釣鐘曲線」における異なる点で化合物の影響を調べることができる。図５は、刺激したリンパ球に対する各試薬の影響を示す。最も弱いシグナル強度（０．１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ）で、トリプトファンは増殖応答を増大させ、そして増大のレベルは、最高レベルで増大がないようにＣｏｎＡの増加する濃度とともに減少する。セロトニンは、「釣鐘曲線」の最後の部分に対応する、最高用量のＣｏｎＡまでアッセイに影響がない。従って、いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、トリプトファンおよびセロトニンが、トリプトファンの活性化はセロトニンのものに遅れを取ることを除いて、活性化細胞に同様の効果を有することは明らかである。
【０２９３】
図５Ａおよび５Ｂにおけるフェネルジンの添加は、デカルボキシラーゼ酵素をフィードバック阻害することに予想されるように、用いる最高濃度の薬剤、すなわち、１０−１００μＭの間で有意な阻害を示す。しかしながら、最も高いＣｏｎＡ用量（１０μｇ／ｍｌ）で、フェネルジン阻害曲線はさらに高いＣｏｎＡ刺激で右に移行しそして完全な阻害は１００−４００μＭの間のフェニルジンで起こるので、いかなる阻害も認められなかった（図５Ｃ）。
【０２９４】
認められた阻害がＬ−芳香族酸デカルボキシラーゼを阻害しそれによりセロトニンへのトリプトファンの代謝転化を妨げるためである場合、アッセイへの外因性セロトニンの添加は阻害を取り除くがトリプトファンはそうではないはずである。図６では、ヒトＴ細胞を１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡを用いて刺激し、そして認められる阻害を止めるトリプトファンもしくはセロトニンのいずれかの能力を調べた。このアッセイに用いる条件下で、ＣｏｎＡ刺激細胞に加えたトリプトファンは増殖応答を高めたが、セロトニンはそうしなかった。フェネルジンで阻害した細胞へのセロトニンの添加は、アッセイをベースラインレベルに回復させ、一方、トリプトファンの添加はほんの少しの効果しかなかった（図６）。総合すれば、これらのデータは、セロトニンのデノボ合成がＴ細胞の機能的活性化に必要とされることと一致し、そしてそれを示す。
【０２９５】
免疫応答におけるセロトニン作動性受容体シグナリングの役割を評価するために、５−ＨＴ受容体系の明確なアゴニストおよびアンタゴニストを用いて免疫応答を区別をつけて操作するように実験を行った。さらに特に、リンパ球活性化プロセスにおける１型受容体の役割を調べた。
【０２９６】
これらのアッセイからのデータを図７Ａおよび７Ｂに示す。この図のパネルＡは、５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡでのヒトリンパ球の刺激を示し、一方、パネルＢはヒトリンパ球の同種刺激、すなわち、混合リンパ球反応に関するデータを示す。これらのデータにおいて明らかに示すことができるように、化合物ＳＢ２１６６４１を用いる５−ＨＴ  １Ｂ受容体シグナルの非常に選択的な阻害は、活性化応答の完全な阻害をもたらす。
【０２９７】
データはさらに、選択的５−ＨＴ  １Ｂアンタゴニスト（ＳＢ２１６６４１）の用量反応曲線が、部分的に、細胞活性化の方法のシグナル強度の強さに依存することを示す。すなわち、細胞外受容体を架橋するために植物レクチンＣｏｎＡを用いて、二次シグナル入力の必要を回避すると、５−ＨＴ  １Ｂ阻害は約２００ｎＭの見かけのＩＣ５０を有する一方、同種刺激（より弱いシグナル強度の）を用いると、同じ化合物は約５０ｎＭの見かけのＩＣ５０を有する。選択的１Ｂ／１Ｄアンタゴニストは、薬理学的に関係のある濃度でこれらのアッセイを有意に阻害したが、非常に選択的な１Ｄアンタゴニスト（ＢＲＬ１５５７２）は、増殖応答に影響がなかったことに注目すべきである。従って、本明細書に開示するデータは、免疫応答におけるヒト１Ｂおよび１Ｄ受容体間の機能的相違を区別し、そして５−ＨＴ  １Ｂ受容体シグナルの選択的取り消しがリンパ球活性化応答を完全に阻害することを示す。
【０２９８】
この同じ研究方針において、免疫応答を調節する２型セロトニン作動性受容体を標的とするアゴニストおよびアンタゴニストの能力を評価した。これらのデータを図８Ａおよび８Ｂに示す。同様に、ヒト混合リンパ球応答における同じ薬剤パネル、それぞれ、パネルＡおよびＢに対するヒトリンパ球の細胞分裂誘発刺激（ＣｏｎＡ）に対する薬剤効果の比較があった。これらの研究において、いくつかの試験薬剤、すなわち、メチオテピン（５−ＨＴＲ  １、２、６および７の一般的なアンタゴニスト）、ＬＹ５３８５７（５−ＨＴ  ２Ａ／２Ｂ／２Ｃ受容体の選択的インヒビター）およびはＳＢ２４２０８４（５−ＨＴ  ２Ｃ受容体の非常に選択的なインヒビター）は、薬理学的に関係のある濃度で活性化応答を阻害する。これらの様々な薬剤間の唯一の共通点は、５−ＨＴ  ２Ｃ受容体シグナルを阻害するそれらの能力である。従って、これらのデータは、５−ＨＴ  ２Ｃ受容体シグナルの選択的取り消しがヒトリンパ球の活性化プロセスを完全に阻害することを示す。
【０２９９】
図９Ａおよび９Ｂは、５−ＨＴＲ  ３、４、６および７からの受容体シグナリングを阻害もしくは作動させる影響を示す（５−ＨＴ  ５受容体は、この受容体系を標的とするために特異的に用いることができる利用可能なアゴニストもしくはアンタゴニストがないので調べなかった）。５−ＨＴ  ３受容体の作動も拮抗も、マイトジェンもしくは同種刺激のいずれかに応答するこれらの細胞の増殖能力に影響がない。４型受容体の作動および拮抗は両方とも応答を阻害する。これに関して、４型受容体に対するアンタゴニストは、受容体のダウンレギュレーションを誘導し、続いてこれらのシグナルの取り消しをもたらすことが一般に既知である。５−ＨＴ  ６および７受容体の特異的阻害は、これらのＣＤ４−依存性アッセイに影響がなかった。
【０３００】
最も劇的な影響は、１型および２型アンタゴニストの使用で見られたが、５ＨＴ３型受容体を刺激することならびに５ＨＴ  ６型受容体を選択的に阻害することの影響もまた調べられた。さらに特に、影響を評価するためにマウス混合リンパ球応答アッセイ（ＭＬＲ）を用いた。選択的６型アンタゴニスト、Ｒｏ  ０４−６７９は、アッセイの結果に影響がなく、一方、３型アゴニスト、５−メチルヒドロキシトリプタミンの使用でわずかな増大があり、これまで、細胞分裂誘発刺激および同種刺激間でインヒビターのふるまいにおける定性的相違は、以前にもしくは本明細書において他で開示されていない。
【０３０１】
これらのアッセイは、ＤＮＡの伸長する鎖、すなわち、ＤＮＡ合成への３Ｈ−チミジンの取り込みを以前に開示した。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、ある化合物が細胞を生存可能であるが増殖できない状態にすることによって作用し、そして別の化合物がアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導することによって作用する場合、ＤＮＡ合成をアッセイのエンドポイントとして用いると結果は同一である。
【０３０２】
細胞分裂誘発的に刺激されたリンパ球培養物に対するプロパノロール（一般的な５−ＨＴＲ  １アンタゴニスト）およびリスペリドン（一般的な５−ＨＴＲ  ２アンタゴニスト）の影響をさらに評価するために、アッセイが進むにつれて生存細胞の数を手動で計数した。これらの細胞計数を図１１に示す。細胞を刺激しない場合、生存細胞の数に検出可能な変化はなかった。細胞をＣｏｎＡで刺激すると、わずかな遅延期間が認められ、そして増殖期の開始をインヒビターがない場合に認められる刺激応答曲線と比較した。５ＨＴ  １型受容体アンタゴニストは、細胞が増殖するのを妨げる。明らかに、開始細胞数と比較して減少もしくは増加がない。これがアネルギー、活性化経路を開始することができないこと、もしくは両方のためであるかどうかは不明である。一方、リスペリドンは短時間の細胞増加とそれに続く培養における細胞の除去をもたらした。これらのデータは、細胞数の手動計数によってのみ得ることができ；ＤＮＡ合成アッセイは２つの化合物で同等の結果を示したことが強調されるべきである。従って、ここに示すデータに基づき、２型セロトニン受容体を阻害するアンタゴニストのクラスは、リンパ球活性化プロセスにとって律速であるようである。
【０３０３】
本明細書に開示するデータは、Ｔ細胞活性かシグナルが５−ＨＴ  １Ｂもしくは５ＨＴ２型受容体のいずれかを通して生成されるシグナルに最も応答することを示すので、３種の２型受容体のいずれが免疫系に最も大きな影響を有するかに関するデータを裏付けるために薬理学的研究を設計した。このため、任意の他の受容体系と交差反応しない様々な特異性を有する一連の５ＨＴ２アンタゴニストを評価した（図１２）。第一の化合物、ＬＹ５３８５７は、３種全ての２型受容体を標的とする。第二の化合物、ＳＢ２０６５５３は、５ＨＴ  ２Ｂおよび５ＨＴ  ２Ｃ受容体のみを選択的に標的とする。第三の化合物、ＭＤＬ１１９３９は、５ＨＴ２Ａ受容体のみを標的とする。第四の化合物、ＳＢ２４２０８４は、５ＨＴ２Ｃ受容体の非常に選択的なアンタゴニストである。全ての薬剤をアッセイの開示時（時間＝０）もしくは第二の活性化期の開始時（時間＝４８時間）のいずれかで投薬した。データは、５ＨＴ２Ｃ特異的アンタゴニストが完全な阻害プロフィールを保持することを本明細書において開示した（例えば図１２参照）。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、本明細書に開示するデータは、５ＨＴ２Ｃ受容体シグナルがリンパ球における活性化プロセス中に見られる律速シグナルであることを示す。
【０３０４】
従って、本明細書に開示するデータは、トリプトファンがＴ細胞活性化応答中にセロトニンに活発に転化されることを示す。さらに、薬理学的プロフィールは、５ＨＴ  １型受容体、最も顕著には１Ａ型受容体が、活性化応答を開始するようであることを示す。この結果は、５ＨＴ  １Ａ受容体が静止細胞上に存在せずＴ細胞活性化の際にのみアップレギュレーションされることを示す先行技術に照らせば意外である。１型受容体と異なり、５ＨＴ２型受容体は、活性化応答の初期および後期の両方でセロトニンによりもたらされるシグナリングを必要とするようである。応答の間の任意の時点でのこのシグナルの妨害は、活性化の即時停止をもたらす。さらに特に、本明細書に開示するデータは、５ＨＴ２Ｃ受容体を通したシグナリングが免疫応答を高めそして維持するのに絶対的に必要とされることを初めて示す。
【０３０５】
Ｍｅｌｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１１９１−１１９３）は、どのようにして胎児が何とか同種移植拒絶を生存するかという問題を調べた（胎児は半分母親そして半分父親であることを考えると）。受胎産物が子宮内で形成された約８日後に、酵素（インドールアミン２，３ジオオキシゲナーゼ、ＩＤＯ）がアップレギュレーションされる。この酵素は、トリプトファンおよびセロトニンのようなインドールアミンを異化することが既知である。受精と酵素のアップレギュレーションの間のこの時間的ずれは、Ｔ細胞応答の活性化を与えるために十分な時間である。言い換えれば、体は免疫応答が起こるのを可能にし、そして任意の損傷を与えることができる前に、ＩＤＯがアップレギュレーションされ、セロトニンの局所供給を突然取り消す。単一の仮説によって拘束されることを所望しないが、セロトニン作動性シグナルの突然の喪失は、活性化された一群の細胞におけるアポトーシスを誘導し、従って胎児に応答することができる細胞を機能的に取り除き、一方、静止細胞集団は損なわれずに任意の外来病原体に応答する準備ができている。インビトロデータのインビボ検証を設定するために、確固たる当該技術分野で認められている同種移植拒絶モデルが選択された。
【０３０６】
本明細書に開示するデータは、妊娠中に受胎産物に対する望まれない同種応答から防御するために生来用いられる潜在的機構を示唆するので、同種移植拒絶モデルにおける５−ＨＴＲ活性化の影響を調べ、Ｐ８１５細胞（ＤＢＡマウスにおける脂肪細胞腫から採取された迅速に増殖する細胞系）をＣ５７ＢＬ６マウスにおける強力な拒絶応答を生じさせるために用いた。これは、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）により記述されているものに基づく同種移植アレルギー拒絶の当該技術分野で認められているモデルである。このモデルでは、Ｐ８１５細胞（Ｈ−２ｄ）およびＣ５７ＢＬ６マウス（Ｈ−２ｂ）間で完全なＭＨＣミスマッチがあり、従って、攻撃的免疫応答を保証する。図１３に開示するデータは、６つの処置群を含む実験結果を示し、各群は３匹のマウスからなる。各マウスには、研究の０日に腹腔に注入する５ｘ１０６のＰ８１５細胞を与えた。第一群は未処置のコントロール群であり、これらは同種刺激に対するマウスのベースライン応答を定めるために用いた。これらのマウスは、任意のさらなる処置なしに、研究の１４日に他の処置群と同様に殺し、そしてそれらの脾臓細胞をＰ８１５細胞の標的特異的致死に関してアッセイした。
【０３０７】
未処置の群で認められる平均致死は、１００：１のエフェクター：標的比で約４５％であった。第二の群は、研究の６および８日に尾静脈ボーラス注入（２００μｇ／注入）によって投与する５ＨＴ−２アンタゴニスト、リスペリドンで処置した。薬剤投与のタイミングは、Ｔ細胞が薬剤処置の前に完全に活性化されたことを保証するように選択した。第三の群は、５ＨＴ−１アンタゴニスト、プロパノロールで処置した。全ての５ＨＴ受容体アンタゴニスト処置群は、リスペリドン処置群に記述するように処置した。第四の群は、シクロスポリンＡで慢性的に処置した。シクロスポリンＡは、研究の開始の2日前、すなわち、−２日に開始する１００μｇ／注入の投薬量でｉｐ投与し、そして注入を研究の期間にわたって毎日続けた。
【０３０８】
シクロスポリンＡは、Ｔ細胞が活性化応答を開始するのを効果的に防ぎ、そして現在、移植処置に起因する合併症を処置する最適な薬剤の一つである。第五および第六の群は、それぞれ５ＨＴ１および５ＨＴ２アンタゴニストであるＳＢ２０６５５３（非常に選択的な５ＨＴ−２Ｃアンタゴニスト）およびメチセルギド（ＳａｎｓｅｒｔＴＭとして臨床的に知られている）で処置した。本明細書に開示するデータによって示すように、シクロスポリンＡで処置したマウスは、予想されるように、同種移植片に対する細胞傷害性応答を発生しなかった（図１３）。プロパノロールで処置した群は、マウスを同種移植片拒絶応答から防御しなかった。この結果は、５ＨＴ１受容体が主に活性化応答の初期をもたらすことを示すことと一致した。
【０３０９】
リスペリドン、ＳＢ２０６５５３およびメチセルギドで処置した群は全て、同種移植片応答を様々な程度に阻害した。アンタゴニスト処置群において認められる免疫調節の性質の例示として、図１４は、Ｂ２０６５５３処置群内の各マウスの個々の応答を示す。3匹の処置マウスのうち2匹は、シクロスポリンＡ処置動物において認められるものと同等の程度に同種移植片応答を阻害した。薬剤処置に応答しなかった1匹のマウスは、尾静脈注入での最初の試みが失敗したので、薬剤の複数の注入を必要とした。このデータは、インビトロ用量−阻害曲線が、ほとんど「閾値タイプ」応答であるように、１００％阻害まで阻害なしに急速に進むことを示す。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、1匹の応答しないマウスは十分な用量の薬剤を与えられなかったこともしくは複数注入のストレスがマウスにおけるセロトニン応答を誘導したことが可能である。
【０３１０】
神経伝達物質として、セロトニンは、応答する細胞の表面上に提示される５ＨＴ受容体のタイプにより与えられた細胞に対するその示差的効果を示す。免疫応答は非常に制御され、そして提示抗原の性質および状況によりその応答の発現における微妙な変化を受ける。従って、あらゆる特定の理論によって拘束されることを所望せずに、セロトニンは免疫応答を調節することに重要な役割を果たすので応答する細胞が示差的な一連のセロトニン受容体を発現するかどうかを推測することができる。単球およびリンパ球は両方ともセロトニン特異的受容体を発現することは明らかである。しかしながら、先行技術の創設は、受容体発現パターンの分かりにくい見解を生み出す。表１は、セロトニン受容体および免疫系細胞に関する研究およびそれらの結論を示す。
【０３１１】
【表１】
2005504724.tif 000005
【０３１２】
最も初期の研究は、Ｔ細胞上の５ＨＴ２受容体の薬理学的存在を示し、一方、Ｍｉｌｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒから公開された次の論文は、５ＨＴ１Ａ受容体が存在するが５ＨＴ２受容体は存在しないというＲＴ−ＰＣＲの証拠を提示する。さらに、５ＨＴ１Ａ受容体は活性化Ｔ細胞上にのみ存在することを見出した。セルビア・クロアチアにおける研究所からの研究（Ｓｔｅｆｕｌｊ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）は、１４の既知の薬理学的に異なった受容体のうち１３に対するプライマーでの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用い、そして５ＨＴ１Ａも５ＨＴ２Ｃも存在しないことを見出した。Ｍａｒａｚａｚｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．によるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｓａからの最近の論文（２００１，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４３：１２３−１２６）は、５ＨＴ２Ｃの存在を示す。これらの研究は明らかに相互に一致しない。本明細書に開示するデータは、インビトロおよびインビボデータに関して一致する。従って、セロトニン受容体の配列特異的プライマーを用いる上記のアッセイにおいて使用したヒト細胞上の５ＨＴ受容体発現を調べるために考案した一連の研究を行った。
【０３１３】
これらの研究には、５ＨＴ１Ａ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂおよび４受容体に特異的なＰＣＲプライマーを作製した（実験の詳細ならびに個々のプライマー配列は、上記の方法の節を参照）。ヒト末梢血リンパ球は、細胞分裂誘発刺激およびヒトＭＬＲを行うために本明細書において他で開示するプロトコルに従って精製した。単球からなる抗原提示細胞をリンパ球から分離した。１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡでの刺激の前もしくは後のいずれかでこれらの細胞集団を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。個々の受容体の存在を調べるためにＲＴ−ＰＣＲを用いた。
【０３１４】
５ＨＴ１Ａ特異的プライマーを用いることで得られたデータは予期しなかった。予想されるフラグメントサイズは２３４ｂｐであった。このバンドは、活性化リンパ球集団においてのみかすかに認められ、そして図１５に示す画像を生成するためにゲルの写真を撮った後に検出することはできなかった。その代わりに、プライマー対によって増幅される主要生成物は、約３８７ｂｐに移動するバンドであり、一方、図１５に示す他の受容体からの他の増幅フラグメントは全て予想されるフラグメント長に正確に対応した。この３８７ｂｐのバンドは、既知の５ＨＴ１Ａ受容体多型のいずれかもしくは既知のスプライスバリアントのいずれかによっても説明することができない。
【０３１５】
図１５に示すＰＣＲ増幅と同時に、個々のｃＤＮＡライブラリーを受容体特異的プライマーでＰＣＲを用いて増幅し、そしてＤＮＡ塩基配列決定のために発現ベクター、すなわち、ＴＡ発現ベクター、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。
【０３１６】
本明細書に開示するＰＣＲデータは定量的ではないが、本明細書に示す全てのＰＣＲ反応にわたって条件を正規化しようと試みた。５ＨＴ１Ａ特異的プライマーを用いて図１５に示す主要バンドは、静止単球および活性化リンパ球におけるより静止リンパ球および活性化単球において定性的に強いようである。３８７ｂｐのバンドならびに予想されるサイズのフラグメントをＴＡベクターにクローン化した。塩基配列決定は、これらのＰＣＲ生成物を同定する。
【０３１７】
５ＨＴ２受容体に関して、５ＨＴ２Ａはリンパ球上に存在し、そしてバンドは、活性化細胞上より静止リンパ球において強いようである。５ＨＴ２Ｂ受容体は、静止単球およびリンパ球のいてのみ存在するようであり、そして細胞が活性化するようになると消失する。５ＨＴ２Ｃ受容体は静止および活性化リンパ球の両方の上に存在する。５ＨＴ３受容体の存在は検出されなかった。これは、文献参考文献および本明細書に開示する実験において得られる薬理学的データを考慮して意外な結果であった。あらゆる特定の理論によって拘束されることを所望せずに、本明細書において使用する示すプライマー対が対応するｃＤＮＡを増幅することができなかったような受容体ｍＲＮＡにおける予期せぬ多型もしくは他の違いがある可能である。このＲＴ−ＰＣＲは、異なる一組のプライマー対を用いて反復する。
【０３１８】
さらに、５ＨＴ４受容体の増幅における予想されるサイズの明瞭なバンドがこのアッセイにおいて検出された。このバンドは、静止リンパ球および活性化単球において出現する。上記のように、図１５に示すこれらのバンドの各をクローン化し、そして真偽のために配列を決定する。
【０３１９】
セロトニン作動性に基づく免疫療法は、生来用いられる。この戦略は、多発性硬化症、１型糖尿病、慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、ならびに多数の他の自己免疫疾患の処置を考案するために用いることができる。同じ薬剤戦略は、遺伝子的に一致しない実質臓器、血液および幹細胞移植の拒絶、並びに遺伝子治療ベクターに標的とする応答に関与する免疫応答を止めるために用いることができる。
【０３２０】
これらの疾病状態を処置するために用いる現在の治療は、有毒であるだけでなく、各日量で患者の全免疫系も阻害し、生涯にわたって免疫無防備状態にする。臓器は一時的に防御され続けるかもしくは再発は短期間回避されるが、患者は日和見感染を受けやすいままである。
【０３２１】
従って、本明細書に開示するデータは、新規な特異的治療方法を可能にする。本質的に、胎児−母親境界面の細胞は、セロトニンおよびトリプトファンのようなインドールアミンを局所的に分解する酵素（ＩＤＯ）を発現する。免疫細胞は、それらの細胞表面上の特定の受容体を介するセロトニンシグナリングを必要とし、従って、セロトニンの枯渇は、重要な活性化シグナル（１つもしくは複数）の突然の喪失およびＴ細胞の活性化組の結果して生じる機能性欠失をもたらし、従って同種胎児を防御する。
【０３２２】
関与する酵素は、妊娠期間の初期（おおよそ妊娠第一期）にのみ必要である。免疫応答の抑制は、酵素の活性の期間中に活性化される細胞のみに限定されることに注目することは重要である。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、他の感染もしくは疾病のない妊娠中に、唯一活性化される細胞は胎児を標的とするものであり；従って、これらは阻害されるべき唯一の細胞である。セロトニンシグナリングの一時的な除去は、妊娠の残りにわたって胎児に対する免疫応答を阻害するのに十分であるが、いったん酵素が働くのを止めそしてセロトニンレベルが局所的に回復されると、任意の他の免疫応答が進行することができる。
【０３２３】
あらゆる特定の理論によって拘束されることを所望せずに、セロトニン受容体薬剤治療は、セロトニンの枯渇を選択的に模倣することによって、同様にうまくいくことができる。セロトニンをその結合を防ぐために除く代わりに、受容体シグナルインヒビターは、同じ最終結果で、受容体結合部位で神経伝達物質をしのいで競合するか（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）もしくは受容体シグナルを非競合的に阻害することによって作用する。自己免疫疾患もしくは移植状態は、そうでなければ健康なヒトという点で妊娠と同様であり、唯一の活性化免疫細胞は、「自己」組織もしくは外来臓器を標的とするものである。パルス療法で投薬することができるセロトニンに基づく治療は、いったん薬剤のパルスが循環から取り除かれると、静止免疫系を応答の準備ができている状態にしたままで、これらの患者における活性化細胞を同様に標的とすることができる。
【０３２４】
治療処置計画を改善しようと試みて、新しい実験的治療を開発しそして試験する。ＣＤ４０／ＣＤ１５４共刺激経路を阻害する生物学的応用は、おそらく、現在まで評価されている実験系の全てのうち最も有望な活性を示している（Ｄｉｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．７８：３６３−３６６）。枯渇しない抗−ＣＤ１５４抗体は、アカゲザルにおける完全ＭＨＣ不一致の移植片生存を延長するために用いられている（Ｋｉｒｋ  ｅｔ  ａｌ，，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：６８６−６９３；Ｋｅｎｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：８１３２−８１３６）。抗体処置は、同種移植片生存を延長することに対するその治療効果の重要な特徴として活性化によって誘導される細胞死（ＡＩＣＤ）を明らかに利用する（Ｍａｒｋｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２４４６−２４５２）。さらに、抗−ＣＤ１５４抗体で誘導される寛容は、潜在的に攻撃的なＴ細胞の欠失を伴うだけでなく、移植片反応性Ｔ細胞の新しいコホートも阻害することが示されている（Ｇｒａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４７８３−４７８６）。しかしながら、抗−ＣＤ１５４抗体での研究の大部分は、同種移植片が動脈硬化のために最終的に拒絶を生じることを示す。実験動物において発生する移植動脈硬化は、明らかに、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の浸入に起因する（Ｈｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｏｌ．１６３：４８０５−４８１０）。最近のデータは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞がＣＤ１５４妨害によって効果的に標的とされないことを示唆する（Ｅｎｓｍｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６９：２６０９−２６１２）。ＣＤ８＋  ＣＴＬ応答はＣＤ４０リガンド妨害をすり抜けるにもかかわらず、抗−ＣＤ１５４モノクローナル抗体投与の治療効果は見事に他ならず、そして任意の主要な都合の悪い副作用がないようである（Ｋｅｎｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：８１３２−８１３６）。
【０３２５】
モノクローナル抗体は、新たな治療レジメンとして役割を果たしており、そして果たし続ける。これらの抗体は、現在開発中の全てのバイオテクノロジー薬剤の約１／４、そして現在使用されているかもしくは調べられているほぼ３０製品を占める（Ｂｒｅｅｖｅｌｄ，２０００，Ｌａｎｃｅｔ  ３５５：７３５−７４０）。しかしながら、モノクローナル抗体は本質的に限界に苦しむ。任意の比較的大きなタンパク質に当てはまることであるが、ヒト治療用途の商業生産および精製方法の費用は、（より伝統的な）小さな有機薬剤の製造の費用に対して、並外れて高い（Ｈｉｌｌｅｇａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１３８：Ｓ２４−３２）。モノクローナルの短期間の副作用は許容可能で且つ予測可能であるが、長期間の安全性は解明されていない。１週もしくはそれ以上のインビボ半減期はまれではないが、モノクローナル抗体は、慢性関節リウマチにおける滑液組織を効率よく浸透することができないような、組織浸透と関連する問題を有することが多い（Ｃｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｑ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４２：２２５−２４１）。簡潔に言えば、モノクローナル抗体は、未解決の医学上の問題のいくつかに即座の解決を与えるが、長期の解決ではない。主要な製薬会社によってしばしば注目されているように、最もよい薬剤は、依然として古典的な小さな有機分子である。
【０３２６】
「移植研究の聖杯は、短いパルスの治療によって寛容を誘導することであった」と言われている。（Ｐｒｏｆ．Ｈｅｒｍａｎ  Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｓｉｒ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｄｕｎｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫを参照）。ここで用いる論理的根拠は、活性化によって誘導される細胞死、ＡＩＣＤを利用する短いパルス治療を設計する戦略を考案することである。リンパ球上に存在する５−ＨＴ受容体の多様性は、活性化応答の正および負の調節の両方を与えるのに十分であるはずである。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、セロトニン系は始原防御系に相当しそして免疫応答の複雑な調節要素を与える多様な細胞決定基の関与が経時的にこの系に加えられたと推測することは魅力的である。実際、免疫応答の生成は、神経連結と異ならない、「免疫学的シナプス」を伴うという幅広い認識がある（Ｂｒｏｍｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎ，Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：３７５−３９６）。胎児拒絶を防ぐために生来用いられる機構は、種の繁殖を維持するために進化的時間スケール上の初期の事象でなければならなかった。セロトニン経路が始原防御経路である場合、自然は、妊娠中に胎児を守るために、トリプトファン枯渇によってセロトニンレベルを制御することを選択することは理にかなうかもしれない。
【０３２７】
「望まれていない」炎症応答を制御するためにセロトニン作動性受容体シグナルを標的とすることは、セロトニン受容体系の薬理学的−製薬学的に選択的なアンタゴニストに関する情報の膨大なデータベースを利用することができるという利点を与える。モノクローナル抗体に基づく治療の使用と異なり、この戦略は、免疫応答を生成することに関与する活性化Ｔ細胞（ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞の両方）の全てを機能的に取り除く手段を与える。
【０３２８】
免疫を制御するために自然の経路を用いる明らかな利点は、単一の処置が少なくとも数ヶ月の防御を与えることである。この防御の最長期間は分かっていない。次には、明らかな治療標的には、多発性硬化症および慢性関節リウマチのような病原性炎症応答を伴う大量の疾病が包含される。ＣＯＸ−２酵素インヒビター（ＣｅｌｅｂｒｅｘＴＭのような）の現在の使用と異なり、セロトニンに基づく治療は、応答を単に一時的に示すのではない疾病を生み出す原因となる細胞を機能的に取り除くように設計される。
【０３２９】
要約すると、セロトニン受容体アンタゴニストは、胎児生存の必要性のために考案されるか、もしくはそれから生じる免疫防御の強力な自然の始原機構をまねるように用いることができる。本明細書に開示するデータは、自己免疫疾患および移植免疫学における処置の目標は、免疫細胞の静止集団に悪影響を与えずに望まれていない免疫応答を阻害しようと同じように試みることであるので、これらの分野の処置の方法の開発のための手段を提供する。この治療戦略は、多発性硬化症、１型糖尿病、慢性関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎、ならびに多数の他の自己免疫疾患の処置に密接な関係を有する。この治療戦略はまた、遺伝的に不一致の実質臓器、血液および幹細胞移植、ならびに遺伝子治療に現在用いられるベクターを防御するために用いることもできる。
【実施例２】
【０３３０】
例２：５−ＨＴ受容体サブタイプｍＲＮＡの示差的発現
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙミニプレップを製造業者の説明書に従って用いて全細胞ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡサンプルをゲルのＥｔＢｒ染色によって定量し、そして各ＲＮＡサンプルの約１μｇをＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡ合成は、オリゴＴ１２−１８プライマーを用いて、Ｑｉａｇｅｎ逆転写酵素で製造業者の説明書に従って行った。得られるｃＤＮＡは、５−ＨＴ受容体特異的プライマーを用いるＰＣＲ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｉｇｍａ）において鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は：４５秒間９５℃、４５秒間６１．５℃、４５秒間７２℃であった。２５サイクルに後に１０分の伸長工程（７２℃）を続けた。ＰＣＲ生成物を３％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー）によって分析した。さらなる確認のために、放射性標識した受容体特異的内部オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＰＣＲ生成物をサザンブロットハイブリダイゼーションに供した。ＰＣＲ生成物をアガロースゲルからＨｙＢｏｎｄメンブレンに移し、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記述されているようにハイブリダイゼーションを行った。簡潔に言えば、１０Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１μｇ／ｍｌポリＡおよび１００μｇ／ｍｌのＳＳ  ＤＮＡを含有する６ＸＳＳＣにおいてメンブレンを事前にブロックした。ハイブリダイゼーション当たり２０ｐｍｏｌの放射性標識したプローブを加え、そして一晩インキュベーションした（７３℃）。翌日過剰のプローブを洗い流し、そしてメンブレンをＫｏｄａｋフィルムに感光させた。内部オリゴヌクレオチドは：１Ａ：ｃｔｇｃａｇａａｃｇｔｇｇｃｃａａｔｔａｔｃｔｔａｔｔｇｇｃｔｃｔｔｔ（配列番号：１）；１Ｂ：ｇｔｇｇａｇｔａｃｔｃａｇｃｔａａａａｇｇａｃｔｃｃｃａａｇａｇｇｇ（配列番号：２）；１Ｄ：ｃｔｃｔｃｔｔｔｔｔｃａａｃｃａｃｇｔｇａａａａｔｃａａｇｃｔｔｇｃｔ配列番号３：）；１Ｅ：ａｔｃｔａｇａｔｃａｃｃｃａｇｇａｇａａｃｇｔｃａｇｃａｇａｔｃｔｃｔａ（配列番号：４）；１Ｆ：ｇａｇｃａｇｃａａａｇａｃａｔｔａｔａｃｃａｃａａｇａｇａｃａａｇｃａａ（配列番号：５）；２Ａ：ｔｃｇｇｃｔｃｔｔｔｔｇｔｇｔｃａｔｔｔｔｔｃａｔｔｃｃｃｔｔａａｃｃａ（配列番号：６）；２Ｂ：ｃｔｃａａｃｇｃｃｔａａｃａｔｇｇｔｔｇａｃｔｇｔｇｔｃｔａｃａｇｔｔｔ（配列番号：７）；２Ｃ：ｔａａｃｔｇａｃａｔｔｔｔｃａａｔａｃｃｔｃｃｇａｔｇｇｔｇｇａｃｇｃｔ（配列番号：８）；３Ａ：ｇｇｇａｇｔｔｃａｇｃａｔｇｇａａａｇｃａｇｔａａｃｔａｃｔａｔｇｃａｇ（配列番号：９）；３Ｂ：ｔｔｃａａｔｃｔａｔｃａｇｃａａｃｔａｃｃｔｃｃａａａｃｔｃａｇｇａｃｃ（配列番号：１０）；４：ｃａｃｃａｔｔｃｔｔｔｇｔｃａｃｃａａｔａｔｔｇｔｇｇａｔｃｃｔｔｔｃ（配列番号：１１）；５：ｃｔｔｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａｇａｃｇｔａｃｔｃｔｇａｇｇ（配列番号：１２）；６：ａｔｃｃｔｃａａｃｃｔｃｔｇｃｃｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｇａｃ（配列番号：１３）；７：ｔｇａａａｇｇａａａａａｃａｔｃｔｃｃａｔｃｔｔｔａａｇｃｇａｇａａｃａ（配列番号：１４）であった。
【０３３１】
本明細書に開示する実験の結果は以下のとおりである。
【０３３２】
ヒトリンパ球における５−ＨＴ受容体特異的ｍＲＮＡの発現に関して、本明細書に開示するデータは、４８時間刺激した細胞に対する静止細胞における５−ＨＴ受容体のｍＲＮＡの有無を特性化する代わりに、活性化プロセスが進むにつれて受容体ｍＲＮＡレベルの動的な調節があるかどうかを示す。これらの研究では、研究の開示時（時間＝０）に細胞を５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡで処置した。時間点は０、０．５、２、４、６、１２、２４および４８時間で取った。各時間点には、オリゴ−ｄＴでプライミングするライブラリーを作製するために１μｇの全細胞ＲＮＡを用いた。これらのオリゴ−ｄＴライブラリーは、１４種の５−ＨＴ受容体の各々を増幅するために鋳型として用いた。増幅生成物の各々をクローン化しそして配列を決定する代わりに、生成物の真偽は、本明細書において他で開示するように受容体特異的内部オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、サザンブロットハイブリダイゼーションを用いて確認した。ゲノムＤＮＡ増幅を陽性コントロールとして用い；陰性コントロールは、ＤＮＡ汚染を制御するために逆転写工程なしに増幅したＲＮＡであった。
【０３３３】
この研究のデータを図１６に示す。様々なサンプルの時間点（刺激後の時間単位）をブロットの上下に示し、そして個々の５−ＨＴ受容体を左の方に各ブロットにおいて示す。「Ｍ」はマーカーレーンを示す。５−ＨＴ２Ｃ受容体に対して示すデータはサザンブロットではなく、それはＰＣＲ生成物が陽性コントロールと一緒に予測されるサイズで泳動することを示す臭化エチジウム染色したゲルであることに注目すべきである。
【０３３４】
図１６に示すデータは、セロトニン受容体特異的メッセージの各々の独自に調整された発現パターンを示す。５−ＨＴ  １Ｆもしくは３Ｂ受容体の発現の証拠はなく、それぞれのプライマーを再設計し、そしてそれでもやはりいかなる生成物も増幅しない。さらに長くブロットを感光すると、３Ａ受容体に対応するかすかであるが再現可能なバンドがある。
【０３３５】
１Ａおよび２Ａ受容体に関するデータについては、様々な異なる固体から採血した血液を用いてそしていっそう長い期間にわたって研究を繰り返した。５−ＨＴ  １Ａは、刺激後約５４時間で現れる。この時間点は、アッセイの最高値および活性の下向きの開始と一致する。２Ａ受容体の２回のＰＣＲ増幅（各２５サイクル）を用いて、予想されるサイズのＲＴ−ＰＣＲ生成物が検出され；しかしながら、ＰＣＲ生成物は、１回のみのＰＣＲ（２５サイクル）を行う場合にはサザンブロッティングを用いて検出されなかった。他のアッセイデータにおいて、５−ＨＴ  ２Ａは、調節されたバンドとして生じる（刺激の開始のすぐ後にアップレギュレーションされ、そして２回目の細胞分裂のすぐ前に再び現れる）。これらのデータは、５−ＨＴ  ２Ａ  ｍＲＮＡがリンパ球に存在することを示唆する。５−ＨＴ  ２Ａ生成物の同一性は、サザンブロットハイブリダイゼーションによって確かめられている。
【０３３６】
さらに、本明細書に開示するデータは、ヒトおよびマウスリンパ球に対するセロトニン作動性受容体アゴニストおよびアンタゴニストの薬理学的ふるまいを示す。図１７は、ヒトリンパ球の細胞分裂誘発刺激に対する一段のクラス１特異的薬剤の結果を示し、そして同等の結果がマウス系内で認められた。総合的に、応答の最も著しい阻害は、５−ＨＴ  １Ｂ受容体シグナルの選択的取り消しに関して認められた。しかしながら、１Ｂおよび１Ｄシグナルの同時阻害は、両方の薬剤に対する１Ｂ受容体の結合反応速度論は同等であるが、同じ阻害曲線をもたらさない（５−ＨＴＲ薬剤に関する詳細は、ｗｗｗ．ｔｏｃｒｉｓ．ｃｏｍを参照）。
【０３３７】
図１７に示すデータは、様々な薬剤の３Ｈ−チミジンの取り込みに対する影響を示す。これは、細胞のＣＤ４＋サブセットにおいて起こるＤＮＡ合成の反映であるはずである。従って、これらのデータは、ヘルパーＴ細胞に対するインビトロ薬剤効果に相当する。
【０３３８】
最後に、研究はＣＤ８−依存性同種移植片モデルを用いてインビボで行い、ここで、Ｐ８１５細胞（ＤＢＡマウスにおける肥満細胞腫から採取した迅速に増殖する細胞）を増やしそしてＣ５７ＢＬ６マウスにおける強い拒絶応答を生み出すために用いた。この研究では、マウスに研究の０日にそれらの腹腔に注入する５ｘ１０６のＰ８１５細胞を与えた。第一群は、同種刺激に対するマウスのベースライン応答を得るために用いる未処置のコントロール群（投薬を受けていない動物）であった。陽性コントロールは、任意のさらなる処置なしに同種細胞で処置した。これらのマウスは、Ｐ８１５細胞に対して誘導される同種応答を評価するために用いた。
【０３３９】
全ての処置群を研究の１４日に殺し、そしてそれらの脾臓細胞のＰ８１５細胞の標的特異的致死に関してアッセイした（陽性コントロール群で認められる平均総合致死は、１００：１のエフェクター：標的比で約４５％であった）。セロトニン特異的化合物を研究の５および７日に尾静脈注入（３００μｇ／注入）によって投与した。薬剤投与のタイミングは、Ｔ細胞が薬剤処置の前に活性化されたことを保証するように選択した。
【０３４０】
図１８Ａに示すデータは、処置マウスの単一群を用いて得られる代表的研究である。アッセイの読み出しは、標的細胞のトリチウム化されたチミジンのＣＰＭ保持である。言い換えれば、標的をチミジンで放射性標識し、そしてエフェクター細胞と一緒にインキュベーションする。これらの細胞は活性化ＣＴＬによって首尾よく溶解されると、それらのＣＰＭは相応して減少する。本明細書に開示するデータによって示すように（図１８Ａ）、メチセルギド処置は同種致死応答を阻害した。
【０３４１】
全処置研究を図１８Ｂに示す。第一のコントロール群は、シクロスポリンＡで慢性的に処置した（ｎ＝３）。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、研究の開始の２日前に、すなわち、−２日に開始して１００μｇ／注入の投薬量でｉｐ投与し、そして注入は研究の期間にわたって毎日続けた。シクロスポリンＡは、Ｔ細胞が活性化応答を開始するのを有効に防ぎ、そして現在、移植処置に起因する合併症を処置するための最適な薬剤の一つである。賊形剤コントロールは、セロトニン作動性薬剤処置とまったく同じように処置したバッファーのみである。このグラフの各棒は、個々の動物から得られるデータに相当する。従って、シクロスポリンＡ処置が同種応答を妨げ、一方、賊形剤処置は影響がない（予想されるように）ことを明らかに理解することができる。メチセルギド（１型部分アゴニスト／２型アンタゴニスト）阻害プロフィールは、２Ｂ／２Ｃ型選択的インヒビター（ＳＢ２０６５５３）のプロフィールのように、顕著であった。
【０３４２】
ヘルパーＴ細胞でのインビトロ結果に基づく、これらの意外なデータは、選択的１Ｂ／１Ｄインヒビターおよび選択的５−ＨＴ  ６インヒビターで得られるデータであった。１Ｂ／１Ｄインヒビターは、インビトロでヘルパーＴ細胞の最も強力で且つ有効なインヒビターであったが、ＣＤ８−依存性応答に関してインビトロで認められる明らかな効果はなかった。１Ｂ／１Ｄアンタゴニストで妥当な生物学的利用能があるかどうかは不明である。さらに、他のデータは、本明細書において他で開示するインビトロデータと一致して、選択的１ＢアンタゴニストがＣＤ８−依存性同種移植片応答の有効なインヒビターであることを示す。一方、６型インヒビターは、ヘルパーＴ細胞のインビトロ増幅を高めるが、インビボＣＤ８−依存性同種応答を阻害することができた。
【実施例３】
【０３４３】
例３：喘息を包含する閉塞性気道疾患におけるセロトニンの役割
本明細書において他で開示するデータは、アレルギー喘息応答の免疫成分が既知の神経伝達物質、セロトニンによって調節されることを初めて強く示す。免疫応答を調節することにおけるセロトニンの役割はこれまで未知であった。本明細書に開示するデータは、免疫応答におけるセロトニンの役割をヒト喘息患者を処置する新規な治療方法を開発するために使用できることを示す。
【０３４４】
神経科学および免疫学の分野における最近の進歩は、神経および免疫系が、進化の過程の早い時点で相互から分かれたことを信じる強い根拠を与える。さらに、本明細書において他で先に開示するデータは、セロトニンが免疫応答を調節することにおいて重要な役割を果たすことを示す。これらのデータは、セロトニンによりもたらされるシグナルが、アレルギー喘息の免疫学的成分の生成における律速であることを示す。この発見は、ヒト喘息およびいくつかの他の閉塞性気道疾患の新規の有用な処置を示唆する。
【０３４５】
一つの態様として、本明細書に開示する実験は、樹状細胞（ＤＣ）上およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット上に存在するセロトニン特異的受容体のパターンの同定を示す。これらは、アレルギー性免疫応答を高めることに関与する主要な細胞である。１４の既知の薬理学的に異なったセロトニン作動性受容体のどれが細胞上に存在するかを同定するためにＲＴ−ＰＣＲを用いる。セロトニンは、いくつかの精神疾患において、嘔吐の制御において、情緒的疾患の発生において、そして片頭痛と関連する疼痛の制御において主要な役割を果たすので、個々の５−ＨＴ受容体を選択的に調節する薬剤パネルを開発するために用いる膨大な一団の製薬学的研究が当該技術分野においてこれまで行われている。従って、活性化応答の生成において律速である特定のセロトニン作動性シグナルを同定するためにＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の樹状細胞によってもたらされる活性化の機能性インビトロアッセイにおいて個々の受容体の役割を分析するために用いることができるこの一団の十分に特性化されたセロトニン受容体特異的薬剤が利用可能である。さらに、実験は、以前のアッセイによって同定される潜在的治療薬の実用性を立証するための気道過敏性のインビボモデルの使用を示す。これらの実験は、アレルギー応答を高めることに関与する調節プロセスの基本認識および閉塞性気道疾患を患っている患者を処置する新しい治療戦略の開発に役立つはずである。本明細書に開示する戦略は、シグナルを阻害することのように病的プロセスもしくは応答をもたらす細胞がシグナルによりもたらされるシグナルを必要とする他の疾病もしくは症状を処置するための薬剤の同定に有用である。
【０３４６】
本明細書において他で開示するデータは、セロトニンが喘息の肺における抗原提示の潜在的メディエーターであることを示す。さらに、免疫学における最近の進歩は、Ｔ細胞と抗原提示細胞間の基本的相互作用／連絡が神経のシナプス接合部と同様であることを該分野が理解するのに役立っている（最近の総説にはＢｒｏｍｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：３７５−９６を参照）。実際、免疫系および神経系は、多数の独特な特徴を共有する。例えば、神経筋接合部に存在する十分に特性化された糖タンパク質、アグリンは、免疫学的シナプスの重要なモジュレーターとして最近同定されている（Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１６８１−１６８６）。Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、アグリンがＴ細胞受容体複合体の集団化に関与できることを示唆する。
【０３４７】
その一方で、免疫応答の生成における重要な糖タンパク質であることが既知であるクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、神経シナプスにおいて重要な役割を果たすことが最近示されている（Ｈｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：２１５５−２１５９）。Ｈｕｈ  ｅｔ  ａｌ．は、ＭＨＣクラスＩが発生中および成熟神経系における活性依存性リモデリングおよび接続の可塑性に関与することを示した。さらに、Ｌ１神経接着タンパク質は、Ｔ細胞活性化応答における重要なタンパク質であることが現在示されている（Ｂａｌａｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：９３８−４３）。緊急反応のその寄与のために最初に特性化された、ドーパミンおよびノルエピネフリンのような主要な神経伝達物質もまた、リンパ球上のそれらの同族受容体の発現を通して免疫応答を調節する（Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１１３−１１９；Ｋｏｈｍ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：５３９−５４２；Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ９：２３−３３）。総合すると、これらのデータは、免疫系および神経系が進化的時間スケールのいくぶん早期に相互から分かれたことを示唆する。さらに、セロトニンが免疫応答を高めることにおいて律速的役割を果たすことを示す、本明細書において他で開示するデータは、肺樹状細胞の表面上のセロトニン応答受容体の存在および肺における喘息応答を開始することにおけるセロトニンの重要な調節役割を示す。
【０３４８】
吸入された抗原に出会うと、気道樹状細胞（ＤＣ）は、肺の流入領域リンパ節に移動し、共刺激リガンドの発現をアップレギュレーションし、そしてナイーブＣＤ４＋  Ｔリンパ球と相互作用し、一次免疫応答を開始する（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，１９９９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２５５−８１）。このデータは、樹状細胞／リンパ球相互作用がセロトニン作動性シグナリングに応答して調節されることを示唆する。樹状細胞上の５−ＨＴ受容体の有無についてほとんど知られていないが、本明細書において他で開示するデータは、それらの存在を強く示唆する。従って、樹状細胞をＲＴ−ＰＣＲによってセロトニン作動性受容体の発現に関して調べる。本明細書に開示するデータは、初期検査のための未熟マウス骨髄樹状細胞の使用を示す。ＬＰＳおよびＩＬ−４の存在下で成熟している樹状集団に対する未熟細胞における様々な５−ＨＴ受容体のｍＲＮＡレベルを比較した。さらに、静止／ナイーブおよび活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞集団上に存在する受容体配置を検出する。ヒト末梢血リンパ球に関して本明細書において他で先に開示するデータは、ＣｏｎＡのような活性化シグナルに応答してアップおよびダウンレギュレーションされる様々な異なる５−ＨＴ受容体の存在を示す。
【０３４９】
細胞上に存在する５−ＨＴ受容体（１つもしくは複数）、次に樹状細胞およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット上の存在する５−ＨＴ受容体を選択的に標的とするために適切なセロトニン作動性受容体調節因子が同定される。ＤＣは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における抗原提示細胞として用いる。３Ｈ−チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成をモニターすることに加えて、アッセイは１型および２型マーカー（それぞれ、ＩＬ−１２およびＩＬ−４）の生産をモニターする。
【０３５０】
オボアルブミンにより誘導される気道過敏性（ＡＨＲ）のインビボマウスモデルを本明細書において用いる。このアッセイは、喘息の完全な動物モデルにおけるセロトニン作動性シグナルを選択的に阻止する影響を特性化する。また、発現される５−ＨＴＲの異なる対立遺伝子を有するマウスを、最終的に、重要な５ＨＴ受容体の共通遺伝子系統を用いることによって、異なるＡＨＲパターンに関して試験する。
【０３５１】
本明細書において他で先に開示するデータは、様々な異なったセロトニン特異的受容体が静止リンパ球上に存在することおよびそれらの発現パターンが活性化の際に変化することを示す。５−ＨＴ  ２Ｃ受容体から生じるシグナルは、マウスおよびヒトＣＤ４＋ヘルパー細胞の両方ならびにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の活性化の律速であるようである。１Ｂ／１Ｄ受容体の選択的阻害は、ヒトおよびマウスヘルパーＴ細胞の両方の増殖に強力な影響を有するが、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化には影響がない。一方、５−ＨＴ６受容体の選択的阻害は反対の影響を有する。
【０３５２】
喘息応答に関して、樹状細胞はアレルゲンの最も有望な抗原提示細胞である。次に、これらの細胞はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を活性化し、Ｔｈ２型応答を誘導する。本明細書において他で開示する実験は、ＤＣおよびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の両方上のセロトニン作動性受容体の発現パターンを特性化する。本明細書において他で先に開示するデータは、５−ＨＴ  １Ｂおよび１Ｄ受容体がＣＤ４＋Ｔ細胞上の存在するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上に存在しないことを示す。データは、Ｔ細胞性アレルギー応答の活性化および維持に絶対的に必要とされる特異的５−ＨＴシグナルがあることを示唆する。本明細書において他で開示するデータは、適切な受容体シグナルを選択的に取り消すことによって、アポトーシスを活性化Ｔ細胞集団において誘導することができ、レパートリーからのこれらの細胞の機能的枯渇をもたらすことを示した。これは、好酸球および肥満細胞の脱顆粒につながるフィードバック経路を破壊しそして喘息応答における「短絡」を引き起こすはずである。
【０３５３】
喘息応答中にＩＬ−４およびＩｇＥの生産を導く原因となる、未熟および成熟ＤＣ上の５−ＨＴ受容体の分布ならびにＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット上の受容体の分布を特定する。現在、これらの細胞タイプのいずれか上のセロトニン特異的受容体の分布に関する利用可能な情報はない。これは、本明細書において他で開示するデータの直接的拡張であり、そしてＣＤ８依存性に対してＣＤ４依存性免疫応答を示差的に導く原因となるシグナリングプロセスを理解する根拠を与える。
【０３５４】
上記のように、未熟骨髄樹状細胞ならびにＬＰＳおよびＩＬ−４のいずれかの存在下でもしくはＬＰＳおよびＩＬ−１２の存在下で成熟している樹状細胞において発現される５ＨＴ受容体は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞において発現される受容体のように同定される。これらの研究は、樹状細胞およびヘルパーＴ細胞の濃縮に、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）によって供給されるキットを用いて、負の選択技術を用いてＢＡＬＢｃマウスで行う。樹状細胞集団には、マウス造血前駆細胞を骨髄採取（大腿骨および頚骨を用いる）から単離し、５％  ＦＢＳおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで洗浄する。遠心分離後に、有核細胞を洗浄培地と５％正常ラット血清に５ｘ１０７細胞／ｍｌで再懸濁する。４℃で１５分間のインキュベーション後に、樹状細胞前駆体を濃縮するために（ＳｔｅｍＳｅｐＴＭキットを用いて）細胞懸濁液を製造業者の説明書に従って処理する。Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１０３６−１０４１）によって記述されている方法に従って樹状細胞前駆体を１０００ユニット／ｍｌのマウス組み換えＧＭ−ＣＳＦにおいて５日間培養する。これらの細胞の成熟は、Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９によって記述されている方法に従って行う。
【０３５５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮には、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ細胞分離系もまた製造業者によって提供されるプロトコルを用いて使用する。簡潔に言えば、全マウス脾臓細胞懸濁液をこの方法に用いる。Ｆｃ受容体への非特異的結合は、マウス細胞調製に正常ラット血清を用いて阻止する。ナイーブＴ細胞集団には、特異的ビオチニル化抗体を最初に加える。サンプルを氷上で１０−３０分間インキュベーションした後、適切なリンパ球濃縮混合物（ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋など）を加え（氷上の３０分）、続いて磁気コロイド懸濁液を加える（氷上で３０分）。このインキュベーション中に、望まれていない細胞は、磁気ビーズに連結した四量体抗体に結合する。次に細胞−抗体複合体を事前に洗浄した分離カラム（製造業者によって提供される磁石の内部に置く）上に載せる。カラムを３Ｘカラム容量で洗浄し、そしてここで所望の細胞集団を含有する素通り画分を集める。濃縮細胞の典型的な純度は、細胞サブタイプの大部分で９０−９９％である。回収された濃縮細胞の純度は、必要に応じて、ＭＣＰ  Ｈａｈｎｅｍａｎｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのコアフローサイトメトリー設備を用いてＦＡＣＳ分析によって確かめる。ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ精製系は、１．５ｘ１０１０個までの総細胞を分画するために用い、従って、サブセット特異的ｃＤＮＡライブラリーを生成するために必要な十分な量の細胞を与える。
【０３５６】
全細胞ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙミニプレップを製造業者の説明書に従って用いて抽出する。ＲＮＡサンプルをゲルのＥｔＢｒ染色によって定量し、そして各ＲＮＡサンプルの約１μｇをｃＤＮＡ合成に用いる。ｃＤＮＡ合成は、オリゴＴ１２−１８プライマーを用いて、Ｑｉａｇｅｎ逆転写酵素で製造業者の説明書に従って行う。得られるｃＤＮＡは、５−ＨＴ受容体特異的プライマーを用いるＰＣＲ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｉｇｍａ）において鋳型である。ＰＣＲ条件は：４５秒間９５℃、４５秒間６１．５℃、４５秒間７２℃である。３５ＰＣＲサイクルの後に１０分の伸長工程（７２℃）を続けた。ＰＣＲ生成物は３％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー）によって分析する。さらなる確認のために、放射性標識した受容体特異的内部オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＰＣＲ生成物をサザンブロットハイブリダイゼーションに供する。
【０３５７】
ＰＣＲ生成物をアガロースゲルからＨｙＢｏｎｄメンブレンに移し、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記述されているようにハイブリダイゼーションを行う。簡潔に言えば、１０Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１μｇ／ｍｌポリＡおよび１００μｇ／ｍｌのＳＳ  ＤＮＡを含有する６ＸＳＳＣにおいてメンブレンを事前にブロックする。ハイブリダイゼーション当たり２０ｐｍｏｌの放射性標識したプローブを加え、そして一晩インキュベーションする（７３℃で）。翌日、過剰のプローブを洗い流し、そしてメンブレンをＫｏｄａｋフィルムに感光させる。
【０３５８】
典型的なｃＤＮＡライブラリーには、０．５〜２μｇの全細胞ＲＮＡが必要とされる。マウス脾臓細胞からのＲＮＡ回収は、１ｘ１０６細胞から約３．５μｇである（脾臓当たり３５０μｇ）。１個のマウス脾臓は、一つのサブセットの細胞のｃＤＮＡライブラリーの完成した組を作るのに十分である（これは、この実験の完了に全部で少なくとも７−１０匹のマウスという結果になる）。
【０３５９】
選択的５−ＨＴ受容体シグナルの機能依存性は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のインビトロ活性化において評価する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの成熟樹状細胞を上記のように精製し、そしてＢＡＬＢｃマウスから得られるリンパ球を同種異系的に刺激するために用いる。細胞活性化は、新たに合成されるＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの結果として測定する。ＩＬ−４およびＩＬ−１２のレベルは、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、製造業者の説明書に従う）によって無細胞組織培養上清から決定する。
【０３６０】
セロトニン作動性アゴニストおよびインヒビターを製造業者（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｃｏｏｋｓｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＩ）から選択する。受容体特異的モジュレーターを時間０（アッセイの開始時）もしくは時間＝４８のいずれかでアッセイに加える。一般に、活性化シグナルを開始する送達と１回目の細胞分裂の開始の間には２日の遅延がある。本明細書において他で先に開示するデータは、薬剤が、ｔ＝０もしくはｔ＝４８時間で加えたかどうかによりアッセイの結果に根本的に異なる影響を有することを示す。検討する薬剤添加の他の変数は、時間０で加え、次に時間＝２時間で洗浄して除く薬剤の影響である。これは、５−ＨＴ特異的アゴニストの多くの影響を試験するのに特に重要である。大部分のアゴニストは長期接触したままの場合、受容体を脱感作する（明白な阻害をもたらす）。薬剤は、最初に０．１、１、１０および１００マイクロモルの濃度範囲で試験する。
【０３６１】
ＢＡＬＢｃリンパ球を得るために、脾臓をＢＡＬＢｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から採取する。単一細胞懸濁液を得るためにスピン培地（２％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）および１％  Ｌ−Ｇｌｕ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を補足したＲＰＭＩ１６４０倍地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））において脾臓をすりつぶす。細胞を１２００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、そして上清を取り除く。赤血球（ＲＢＣ’ｓ）をＡＣＫバッファーで溶解する（Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９によってＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．１．３−３．１．５節に記述されているように）。残存する細胞をスピン培地に再懸濁し、そして接着細胞を取り除くためにナイロンウールカラム上に載せる。細胞をカラム上（５％  ＣＯ２、３７℃）で約２時間インキュベーションする。非接着細胞をスピン培地を用いてカラムから洗浄して除き、遠心分離し、そして感作培地（１０％ウシ血清、１％  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１％  Ｌ−Ｇｌｕ、ベータ−ＭＫＥを補足したＲＰＭＩ１６４０倍地）に再懸濁する。
【０３６２】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、本質的にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３．１２．６−３．１２．７節，１９９９）に記述されているように行う。すなわち、Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスから得られる濃縮した成熟樹状細胞を刺激物質として用いる。ＢＡＬＢｃ／ＢＹＪから得られる一次リンパ球細胞を応答体として用いる。薬剤を９６ウェルＵ底プレート上に事前にプレーティングする。全ての実験条件を少なくとも三重反復でアッセイする。１０％  ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ培地における１００，０００個のＣ５７／Ｂ６細胞を各ウェルにプレーティングする。２００，０００個のＢＡＬＢｃ／ＢＹＪ細胞を刺激物質細胞上に２００μｌ／ウェルの最終容量にプレーティングする。バックグラウンドコントロールには、ＢＡＬＢｃ／細胞もＣ５７／Ｂ６細胞も与えなかった。１μＣｉのトリチウム化したチミジンを４日後に各ウェルに加え、そしてプレートを１２時間後に採取した。
【０３６３】
これらのアッセイから得られるデータ点は、ＪＭＰ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ  ＧＵｉｄｅ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いるマンホイットニーＵ検定、一対データのウイルコクソンの符号付き検定、スチューデント検定およびスピアマンのロー相関によって評価する。
【０３６４】
最後に、本明細書に記述するアッセイは、インビトロ同種刺激アッセイから得られるデータを確認する手段を提供する。ＢＡＬＢｃマウスにおける気道過敏性（ＡＨＲ）モデルを薬剤活性を確認するために用いる。基本的な点で、このモデルは、マウスをミョウバン中のオボアルブミン（ＯＶＡ）で２週の経過にわたって免疫することによって準備する。これは一次免疫応答を開始する。この応答の真っ最中に、肺におけるＤＣによる抗原の提示を導くためにＯＶＡのエアロゾルを用い、そして応答をＴｈ２型応答に向ける。いったんマウスが感作されると、喘息様応答を引き起こすためにメタコリンの用量を投与する。
【０３６５】
Ｒｏ  ０４−６７９０  −−  ５ＨＴ６受容体の選択的アンタゴニスト。この受容体によってもたらされるシグナルは、アデニルシクラーゼに正に連結される。従って、５ＨＴ６受容体の刺激は、細胞ｃＡＭＰの増加をもたらし、それはＴ細胞活性化経路を阻害する。このシグナルを中和することは、この妨害を軽減し、そして免疫応答を促進することができる。
【０３６６】
１−（１−ナフチル）ピペラジン  −−  ５ＨＴ１クラスの受容体の選択的アゴニスト。これらの受容体は、アデニルシクラーゼに負に連結される。これらの受容体の刺激は、ｃＡＭＰの細胞レベルの減少をもたらし、それにより免疫応答を助長することができる。
【０３６７】
トロポセトロン  −−  ５ＨＴ３受容体の選択的アンタゴニスト。この受容体の刺激は、細胞へのＣａ２＋の流れを助け、それにより免疫応答を促進するはずである。このシグナルの拮抗作用は、活性化応答を阻害することができる。
【０３６８】
ＷＡＹ１００６３５  −−  ５ＨＴ  １Ａ受容体の選択的アンタゴニスト。前述のように、１型受容体はアデニルシクラーゼに負に連結する。インビトロで、この薬剤は、活性化応答を有意に阻害する。この薬剤の阻害効果は、活性化応答の初期に投与する場合に最も顕著である。
【０３６９】
ＳＢ２−６５５３  −−  ５ＨＴ  ２Ｂ／２Ｃ受容体の選択的アンタゴニスト。５ＨＴ２型受容体は、プロテインキナーゼＣの活性化に正に連結される。本明細書において他で開示するインビトロデータは、活性化応答中の任意の時点での５ＨＴ  ２Ｂ／２Ｃシグナルの取り消しが、増殖の即時停止をもたらすことを示す（明らかに、そしてあらゆる特定の理論によって拘束されることを所望せずに、プログラムされた細胞死を誘導することによって）。
【０３７０】
ＳＢ２４２０８４  −−  ５ＨＴ  ２Ｃ受容体の選択的アンタゴニスト。この化合物は、２Ｃ受容体単独よりむしろ２Ｂおよび２Ｃ受容体を阻害することによってなんらかの利点が得られるかどうかを決定するために選択されている。
【０３７１】
薬剤は、尾静脈注入によってＰＢＳ中３００μｇ／用量で投与し、この用量および投与の経路は、本明細書において他で先に開示するデータに基づく。一組のマウスにはメタコリンの投与の３日前に薬剤を与え、そして一組のマウスにはメタコリンの投与の３時間後に薬剤を与える。薬剤添加の時間点は、Ｔ細胞が薬剤投与の時点で完全に活性化されることを保証するように選択した。理想的には、活性化Ｔ細胞集団を取り除き、免疫学的レパートリーに機能的空きを生成せしめる。研究を４つの主要な群に分ける。各々３匹ずつのマウスからなる第一の２群は、賦形剤コントロールとして用いる。薬剤試験群には、薬剤当たり５匹のマウスを用いる。従って、各群は３０匹ずつのマウスからなる。各群におけるマウスの数は、ＪＭＰ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ  Ｇｕｉｄｅ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いてマンホイットニーＵ検定、一対データのウイルコクソンの符号付き検定、スチューデント検定およびスピアマンのロー相関によって評価し、それによりデータの統計的有意性を保証する。
【０３７２】
Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６０：１１５０−１１５６）によって記述されているように、ＢＡＬＢｃマウスを０．２ｍｌの食塩水中のＯＶＡ（１０μｇ，Ｓｉｇｍａ  Ｇｒａｄｅ  ＩＩＩ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と１ｍｇ  Ａｌ（ＯＨ）３で２週のクールにわたってｉ．ｏ．で２回免疫した。二回目の免疫の７−１０日後に、マウスを６％  ｗｔ／ｖｏｌのエアロゾル化したＯＶＡ（超音波ネブライザーによって送達する）にさらす。エアロゾルアレルゲンに毎日６０分間７日にわたってマウスをさらすことは気道感作をもたらす。
【０３７３】
ＲＴ−ＰＣＲプライマーは、様々なセロトニン受容体サブタイプを検出するために本明細書において他で記述するとおりであり、そしてＲＴ−ＰＣＲを本明細書において他で記述するように行う。
【０３７４】
喘息罹患率および死亡率は、少数民族の子供において偏って高い。喘息の遺伝的および環境的要因について不適切な認識がある。ＥＴＳ（間接喫煙）は喘息の早期発症の一因となりそして喘息重症度の危険因子であることが知られている（Ｍａｌｖｅａｕｘ  ａｎｄ  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ−Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，１９９５）。本明細書に開示するデータは、リンパ球へのアレルギーシグナルおよび肺平滑筋への気管支収縮シグナルの伝達において重要であることが既知であるある種の遺伝子産物の役割を理解するために、ヒト喘息の特徴の多くを共有するヒト喘息の当該技術分野で認められているマウスモデルにおける遺伝因子の研究に寄与する。喘息のこのマウスモデル系は、マウスの遺伝的背景によって強く影響され、そしてそのようなものとして、マウスそして最終的にヒトの両方において起こる疾病に必要な遺伝成分を解明することができる。
【０３７５】
モデル系としてマウスを用いて、アレルゲンにさらすことのアレルギー性および閉塞性結果をいくつかの遺伝子的に操作した動物において評価することができる。得られるデータは、アレルゲン感作の初期におけるヒスタミンの新しい役割および長期の二次応答におけるヒスタミンの役割もまた明らかにすることができる。子供における喘息の爆発的な割合、例えば、喘息は、現在、貧困にあえぐ都市近郊の有色の子供の欠席の主要原因であることを考えると（Ｋｉｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ９２：２４−２６）、アレルゲン感作動の初期および結果として起こる気道疾患のあらゆるより良い理解は、薬剤開発の新しい標的、もしくはそのような治療のタイミングにおける少なくとも改善をもたらすことができる。抗ヒスタミン剤は、末期の喘息症状を改善することで他の薬剤よりかなり弱いので、疾病の初期におけるそれらの役割はわずかであることができ；そのような効果は、遺伝子操作および誘導方式が制御される動物モデルにおいて最もよく研究される。
【実施例４】
【０３７６】
例３：セロトニン受容体に関する多発性骨髄腫細胞におけるアポトーシス誘導
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、毎年約１５，０００の新しい症例が診断される、米国において第二の最も一般的な血液悪性腫瘍である。該疾病は進行性でありそして典型的には致命的であり、西洋諸国における悪性白血球疾患による全ての死亡の１５％そして全ての癌死亡の２％を占める。多発性骨髄腫の病態生理学の理解におけるかなりの進歩にもかかわらず、該疾患の分子的機序は理解しにくいままである。
【０３７７】
臨床的に、多発性骨髄腫は、モノクローナル免疫グロブリンフラグメントを分泌する、悪性形質細胞の骨髄浸潤を特徴とするＢ細胞新生物である。患者は、典型的に、破骨細胞骨再吸収を刺激し且つ骨芽細胞リモデリングを阻害する骨髄腫細胞の能力のために、結果として起こる高カルシウム血症と一緒に複数の部位で溶解性骨病変を示す。疾病自体は３つの異なる段階：成熟した非増殖悪性細胞が優勢である不活性期；わずかなパーセンテージの分化の程度が低い増殖性の形質芽球細胞が現れる活性期；および未成熟形質芽球細胞の髄外増殖が優勢である劇症期を進む。これらの異なる疾病期の存在は、多発性骨髄腫病原中の段階的悪性トランスフォーメーションの最近の提示を支持する。
【０３７８】
核型変化が実質的に全てのＭＭ症例において検出され、転座は、様々な相手遺伝子との免疫グロブリン重鎖遺伝子座の不法のスイッチ再編成を最も一般的に伴う。癌遺伝子（ｃ−ｍｙｃ、ｒａｓ）、癌抑制遺伝子（ｐ１６、ｐ１５）およびアポトーシスの調節因子（ＢＣＬ−２、Ｆａｓ）の異常発現もまた、悪性形質芽球クローンへの濾胞中心Ｂ細胞のトランスフォーメーションに寄与すると考えられる事象の複雑なカスケードに関与していると関係づけられている。
【０３７９】
骨髄腫細胞が得られる最初のクローンは、胚中心後（ｐｏｓｔ−ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ）Ｂ細胞であると考えられる。幅広く超突然変異を受ける再編成した免疫グロブリン遺伝子の発現は、最初の発癌性事象が、通常の長寿命の形質細胞分化の後に起こるかもしくはそれを妨げないことを示唆する。多発性骨髄腫の著しい特徴は、疾病の主な経過中にトランスフォームした形質芽球細胞が骨髄に存在する傾向であり、ここで、微環境は適切なサイトカイン（すなわち、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）ならびにゆっくり分裂する腫瘍細胞集団の増殖および生存のための接着分子を提供することができる。しかしながら、疾病の劇症期において、骨髄腫細胞は間質非依存性を発生し、そして形質芽球の髄外増殖が結果として起こる。
【０３８０】
ＭＭは、個々の患者において異なる生物学、予後、臨床経過および治療介入に対する応答を有する疾病と最もよく考えられる。安定な悪性形質細胞集団の樹立をもたらす事象だけでなく、この細胞集団をクローン的に増やすシグナルおよびこれらの細胞が髄外疾病を樹立することにおける間質依存性を免れるために必要な因子の理解は、疾病進行の基礎をなす中心的機構を理解するために重要である。
【０３８１】
ＭＭ細胞が形質依存性を免れそして骨髄の外側でクローン的に増える場合、これらの細胞が生存および増殖に必要な要素の全てを生産しなければならないことは理にかなう。さらに、これらの細胞が依然としてセロトニン作動性シグナリング経路に依存する場合、ＭＭ細胞は、それら自身のセロトニンを合成しそして放出する能力を獲得した可能性が最も高い。本明細書に開示するデータは、ＭＭ細胞の構成的活性化に必要な必須のシグナル（セロトニン作動性シグナル）を突然取り消しそれによりアポトーシスを誘導するために５ＨＴアンタゴニスト（１つもしくは複数）を使用するＭＭ患者を処置するための新規な治療戦略を提供する。
【０３８２】
要約すると、ＭＭは成熟（最終分化）Ｂ細胞の癌性症状である。このタイプのＢ細胞は、通常、循環系内に存在するはずである。ＭＭの特徴の一つは、これらの（癌性）Ｂ細胞が骨髄に戻り、そこで実質的な損傷を与えることである。あらゆる特定の理論によって拘束されることを所望せずに、「完全に発生した」癌細胞になるプロセスは、別個の段階で起こる。Ｂ細胞癌が冒された個体において発生するにつれて、癌性Ｂ細胞は、それらの局所環境に関係のない生存形態を生じる。現在、骨髄移植以外に、ＭＭ患者を処置する有効な手段はない。大部分の患者は、最初、デキサメタゾンのようなコルチコステロイドの処置レジメンに応答するが、ほとんど全ての症例において、疾病は、これらの薬剤に対する完全耐性を生じる。ほとんどの場合、多発性骨髄腫の診断は、死期の告知と同じである。本明細書に開示する方法は、細胞の増殖非依存性およびシグナルが阻害されると細胞が死ぬように細胞周期応答がセロトニン受容体を介したシグナリングを必要とするという発見を利用する。
【０３８３】
すなわち、この分野における最近の発展と総合すれば、本明細書において他で開示するデータは、免疫および神経系が進化発生中に相互から分かれたことを強く示す。さらに、免疫学的に関連する細胞の活性化経路は、セロトニンによって誘導されるシグナリングに依存するようである。従って、これらのデータは、あらゆる特定の理論によって拘束されることを所望せずに、これらの癌細胞がセロトニンの外部供給源に依存することができず、従って、それら自身のセロトニン貯蔵をもたらす合成機構を作動させたはずであることを示唆する。全ての活性化もしくは増殖細胞は、それらの完全性を維持するために増殖／活性化関連シグナルの忠実度およびタイミングに依存することが確立している。特に癌細胞における、律速シグナルの突然の取り消しは、プログラムされた細胞死（アポトーシス）の活性化をもたらす。本明細書に開示するデータに基づき、そしてあらゆる特定の理論によって拘束されることを所望せずに、３つの最も可能性が高い律速シグナル源は（従って、３つの最も可能性が高い標的）は、５ＨＴ１、５ＨＴ２および／もしくは５ＨＴ４受容体である。この研究は、これらの受容体シグナルの選択的な非競合的アンタゴニスト（もしくはアンタゴニストのカクテル）の使用によってこれらのシグナルを取り消すことのＭＭ細胞への影響を調べることを意図する。
【０３８４】
以下の実験は、インビトロ系における、セロトニン（５−ＨＴ）によって誘導されるシグナルへの多発性骨髄腫細胞（悪性形質細胞）の依存性を示す。ヒト多発性骨髄腫細胞系、ＲＰＭＩ８２２６は、用いるインビトロ系であった。最初に、培養するＲＰＭＩ８２２６細胞細胞に対する多数の５−ＨＴ受容体調節因子の影響をモニターするために生存および細胞増殖のアッセイを用いた。骨髄腫細胞系の増殖および生存に影響を与えた化合物を同定した後、受容体調節因子のいくつかがＲＰＭＩ８２２６細胞における細胞死を誘導する機構を特性化するために実験を考案した。特に、影響を受けた細胞をアポトーシスの特徴に関してアッセイした（形態、ＤＮＡ断片化、および細胞外ホスファチジルセリン発現）。
【０３８５】
本明細書に開示するデータが示すように、骨髄腫細胞がセロトニン受容体によるシグナリングに依存することは明らかである。最も顕著であるのは、５−ＨＴ  １Ｂ受容体シグナルの取り消しの影響である。５−ＨＴ  １Ｂ受容体からのシグナルのない場合、骨髄腫細胞は激しい細胞死を受けた。形態学的に、この細胞死は、細胞は核凝縮し、それらの核を凝縮し、そして膜気泡を形成する伝統的なアポトーシスと異なっていた。その代わりに、５−ＨＴ  １Ｂシグナルの取り消しの際に、細胞は急激に膨らみ、破裂し、そして培養物は３時間以内に実質的に１００％死亡していた。しかしながら、さらなる特性化の際に、これらの細胞は、アポトーシスに典型的なおよび／もしくはそれと関連する特性（すなわち、ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化および細胞表面上のホスファチジルセリン発現）を示した。従って、これらのデータは、セロトニンシグナルの取り消しがアポトーシスおよび／もしくはアポトーシス様プロセスによって細胞死をもたらすことを示す。
細胞系
ヒト形質細胞腫（多発性骨髄腫）細胞系、ＲＰＭＩ８２２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１．５ｇ／Ｌ重炭酸塩および２０％  ＦＢＳ（熱不活性化していない）を補足したＲＰＭＩ１６４０において培養した。
細胞増殖アッセイ
細胞増殖は、３つの方法によってアッセイし、トリパンブルー排除は培養における生存細胞の数を定量するために用い；３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリムブロミド（ＭＴＴ）還元はミトコンドリア活性（従って細胞生存能力）をアッセイするために用い；そして３Ｈ−チミジンの取り込みは、活性のあるＤＮＡ合成をアッセイするために用いた。
５−ＨＴ受容体調節のインビトロ試験
以下の５−ＨＴ受容体調節化合物を記述する密度でそして示す濃度範囲にわたってインビトロ培養するＲＰＭＩ８２２６細胞に対するそれらの影響に関して試験した。
【０３８６】
【表２】
2005504724.tif 000006
【０３８７】
ＤＮＡ断片化
実験処置の後に細胞（８ｘ１０５）を冷えたＰＢＳで洗浄し、そして遠心分離（５００ｘ  ｇ、５分）によってペレットにした。細胞ペレットを溶解バッファー（１％  ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５）において氷上で５分間インキュベーションした。溶解物を約１，６００ｘ  ｇで５分間遠心分離した。５０μＬの溶解バッファーを上清に加えた。抽出物を１％  ＳＤＳにし、そして５μｇ／μＬのＲＮアーゼＡで２時間処理し（５７℃）、続いて２．５μｇ／μＬのプロテイナーゼＫで２時間処理した（３７℃）。ＲＮＡおよびタンパク質の消化後、半分容量の１０Ｍ酢酸ナトリウムを加え、そして２．５容量のエタノールを用いてＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノールにおいて洗浄し、風乾させ、そしてＴＥバッファーに溶解した。ＤＮＡフラグメントは、Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１６２−１６６）から適用したプロトコルを用いて１．５％アガロースゲルにおける電気泳動によって分離した。
フローサイトメトリー
各実験条件に前もってさらした細胞を共染色することによって初期のアポトーシス細胞が検出された。簡潔に言えば、本明細書において他で記載するような様々な濃度の各実験もしくはコントロールアポトーシス誘導因子の存在下で時間的経過の間細胞をインキュベーションする。インキュベーション後に、細胞を冷えたＰＢＳで洗浄し、アネキシンＶ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ  ４８８およびヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色し、そして二色フローサイトメトリーによって分析した。アネキシンＶ＋およびＰＩ―細胞を初期のアポトーシス細胞とみなした。骨髄腫細胞の既知の最終分化因子（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）、ＨＭＢＡ（ヘキサメチレン−ビス−アセトアミド）およびトポイソメラーゼインヒビター、カムトテシンをそれぞれ５ｍＭおよび２μＭでアポトーシスの陽性コントロールとして用いた。
【０３８８】
ヒト多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６５に対する５−ＨＴ受容体調節因子の影響を調べるために細胞増殖の３つの別個の指標を用いた。細胞を４つの別個の密度でプレーティングし、そして各種濃度のＬＹ５３５８７（５−ＨＴ２Ａ／２Ｂ／２Ｃ受容体のアンタゴニスト）で処理した。トリパンブルー色素の排除を細胞生存の指標として用いた。次に、加える薬剤の濃度に対して細胞数をプロットした。
【０３８９】
ＭＴＴ還元もまた細胞生存（さらに特に、ミトコンドリア活性）の指標として用いた。次にＯＤ５７０での吸光度値を薬剤濃度に対してプロットした。最後に、ＤＮＡ合成を３Ｈ−チミジンの取り込みの測定によってアッセイし、そして分当たりの計数（ＣＰＭ）を薬剤濃度に対してプロットした。３つ全てのアッセイは、明らかな用量応答曲線を生成した。さらに、曲線の形状は、用いるアッセイに依存しなかった（すなわち、細胞集団に対する薬剤の影響をアッセイすることにおいていずれの方法も別のものより優れなかった）（図１９Ａ、１９Ｂおよび２０Ａ−Ｄを参照）。
【０３９０】
５−ＨＴ２受容体の異なるサブタイプに対するアンタゴニストの影響を、３Ｈ−チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成を測定することで調べた（図２１）。
【０３９１】
様々な他の５−ＨＴ受容体調節化合物もまた、ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対するそれらの影響に関してアッセイした。細胞増殖もまた、ＤＮＡ合成の代理マーカーとして、チミジンの取り込みのモニタリングによって測定した。図２２は、賦形剤処置コントロールに対する増殖パーセントとして表す、これらの５−ＨＴ受容体アンタゴニストもしくはアゴニストの各々の影響を示す。５−ＨＴ１Ｂ受容体での拮抗作用は、最も広い濃度範囲にわたって骨髄腫細胞の最も顕著な阻害をもたらした。５−ＨＴ１Ｂ／Ｄ特異的アンタゴニストでの細胞の処置は、細胞増殖を阻害することに５−ＨＴ１Ｂアンタゴニスト単独ほど効率がよくなかった。
【０３９２】
５−ＨＴ受容体の様々なアゴニストおよびアンタゴニストの低用量力価をヒト多発性骨髄腫ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対して試験した（図２３、２４および２５）。これらのデータから示すことができるように、低用量の非常に選択的な５−ＨＴ１Ｂアンタゴニスト（ＳＢ２１６６４１）は、癌細胞の増殖を完全に阻害した。さらに、メチオテピン（一般的な５−ＨＴＲ  １、２、６および７アンタゴニスト）もしくは非常に選択的な５−ＨＴ２ＣアンタゴニストＳＢ２４２０８４で増殖の強い阻害が認められた。従って、本明細書に開示するデータは、多発性骨髄腫の増殖を５−ＨＴ  １Ｂ受容体シグナルもしくは５−ＨＴ  ２Ｃ受容体シグナルのいずれかの選択的取り消しによって明らかに阻害できることを示す。
【０３９３】
５−ＨＴ受容体シグナリングの取り消しがＲＰＭＩ８２２６細胞における細胞死を誘導する機構をさらに探求した。特に、アポトーシスの特徴事象のいずれが、５−ＨＴ１Ｂ／Ｄ細胞シグナル取り消しの際に起こる細胞死の間に起こるかを決定した。トリパン排除細胞計数データによって示されるように、ＲＰＭＩ８２２６細胞系における細胞死を誘導することが既知である５−ＨＴ受容体アンタゴニストを、死にかけている細胞におけるヌクレオソーム間分裂を誘導するそれらの能力に関してアッセイした。
【０３９４】
この実験の結果を図２６に例示する。本明細書に開示するデータは、ある割合の骨髄腫細胞（約３０％）においてアポトーシスを誘導することが既知である最終分化因子、ＨＭＢＡ（ヘキサメチレン−ビス−アセトアミド）が、非常に弱いＤＮＡラダーを示すことを示す。しかしながら、１Ｂ／Ｄ、２Ａ／Ｂ／Ｃおよび２Ｂ／Ｃ受容体に特異的な薬剤での５−ＨＴ受容体シグナリングの取り消しは、いくつかの化合物で２４時間程度の初期に明らかなＤＮＡラダリングをもたらした。
【０３９５】
５−ＨＴ（１Ａ）、５−ＨＴ（１Ｂ）および５−ＨＴ（１Ｂ／Ｄ）での処置後のアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムでの細胞の共染色もまた、シグナル取り消しの際に起こる細胞死亡を特性化するために用いた。アネキシンＶは、生存細胞の内膜単分子層上にのみ発現される膜脂質、ホスファチジルセリンに特異的に結合する。しかしながら、アポトーシスの際に、ホスファチジルセリンはもはや内膜単分子層に局在せず、そしてアポトーシスにおける非常に初期の事象の一つのマーカーとして用いることができる。一方、色素ヨウ化プロピジウムは、いったん膜が傷つけられると細胞質および核に近づくが、これは後期のアポトーシスもしくは壊死と関連する事象である。従って、起こっている細胞死がアポトーシスのためであることを示すアネキシン＋であるがＰＴ―である細胞の集団を同定するために二色フローサイトメトリーを用いた。
【０３９６】
本明細書に開示するフローサイトメトリーデータの分析は、アッセイの時間点で、細胞が、５−ＨＴ（１Ｂ）アンタゴニストでのＲＰＭＩ８２２６細胞の処置の際に用量および時間依存的にアポトーシスを起こすようになるが、５−ＨＴ（１Ａ）もしくは５−ＨＴ（１Ｂ／Ｄ）特異的アンタゴニストを用いた場合ではそうではないことを明らかに示す（図２７）。すなわち、１Ｂ／Ｄ型アンタゴニストでの細胞の処置は、アネキシンによって染色される細胞の移動を引き起こす。さらなる処置は、ヨウ化プロピジウムでの細胞の増加した染色を示し、細胞が死亡しているだけでなく、溶解されるかもしくは壊死であることを示した。
【０３９７】
本明細書に開示するデータ（例えば図２８および２９）は、多発性骨髄腫細胞における５−ＨＴ１Ｂ受容体シグナル（図２８）もしくは５−ＨＴ２Ｃ受容体シグナル（図２９）のいずれかの取り消しが、これらの顕微鏡写真に示される凝縮および断片化したクロマチン構造から明らかなように古典的なアポトーシスをもたらすことを決定的に示す。これらの結果は、ＲＰＭＩ−８２２６細胞の増殖が、５ＨＴ（１Ｂ）および５ＨＴ（２Ｃ）受容体の両方によるシグナリングに依存し、そして用いる特定の５ＨＴ受容体アンタゴニスト、すなわち、ＳＢ２４０２０８４（２Ｃ）もしくはＳＢ２１６６４１（１Ｂ）での２つの受容体のいずれかでのシグナルの取り消しが、トポイソメラーゼＩインヒビター、カンプトテシンによって誘導されるものと匹敵するプログラムされた細胞死を誘導したことを示唆する。しかしながら、２つの化合物によって誘導されるアポトーシスの程度および時間経過は異なった。これらの結果は、いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、２つのセロトニン受容体サブタイプのアポトーシス誘導における潜在的なメカニズムの相違を示唆する。
【０３９８】
本明細書に開示するデータは、悪性形質細胞が５−ＨＴ受容体によって伝達されるシグナルに依存すること、および個々の受容体でのシグナルの取り消しは顕著に異なる応答をもたらすことを強く示唆する。さらに、単一の受容体シグナルの阻害は、受容体の組み合わせの阻害とは異なる応答をもたらす。悪性形質細胞におけるこれらの５−ＨＴ受容体によって伝達される必須シグナルの阻害は、本発明の以前には、これらの処置に対する有効な処置が当該技術分野において利用可能でなかった多発性骨髄腫の有効な処置を供給することができる。
【０３９９】
さらに、本明細書において他で開示するデータは、セロトニン作動性シグナリングに関与するか、もしくはそれによってもたらされる様々な細胞プロセスを明らかに示す。さらに特に、データは、５−ＨＴＲ１Ｂもしくは１Ｂ／１Ｄ受容体の阻害が、多発性骨髄腫の当該技術分野で認められているモデルである細胞系（ＲＰＭＩ８２２６）におけるアポトーシスをもたらすことを示す。従って、本発明は、細胞増殖および細胞のアポトーシスのような、しかしこれらに限定されるものではない細胞プロセスに影響を与える方法を含む。これは、本明細書に示すように、様々な非神経細胞がそれらの表面上にセロトニン受容体を含んでなり、セロトニン作動性シグナルが、細胞生存に不可欠であるシグナリングを妨害されると、細胞は影響を受け、そして最終的に５−ＨＴシグナリングの欠如は細胞死を引き起こすからである。
【０４００】
従って、本発明は、細胞表面上のセロトニン受容体によってそうでなければ伝達されるセロトニンシグナルの伝達を阻害することによって対象の標的細胞における細胞死もしくは細胞増殖の阻害をもたらす有効な方法を提供する。従って、対象の細胞上のセロトニン受容体の存在は、当該技術分野において周知でありそして／もしくは本明細書に教示する方法を用いて容易に決定することができる。さらに、その細胞へのセロトニンシグナルの取り消しが、ＲＰＭＩ８２２６細胞に関して本明細書に示すように、細胞にとって有害であるかどうかを決定することができ、そしてシグナルを特異的に阻害するためにセロトニンシグナリングの様々なインヒビターを用いることができ、それにより、セロトニン受容体を発現しないか、もしくは標的細胞の表面上に発現されるものと異なるセロトニン受容体を発現するいずれかの他の細胞に影響を与えずに、細胞を殺すかまたはその機能、増殖および／もしくは分裂を阻害する。
【０４０１】
本明細書において他で開示する意外な結果は、あらゆる特定の理論によっても拘束されることを所望するものでないが、おそらく、セロトニン作動性シグナリングの阻害に関する以前の研究は、細胞が増殖もしくは分裂せずそして細胞周期を構成的に経ていない神経および／もしくは筋肉細胞において行われたので、先行技術によって示唆されなかった。むしろ、５−ＨＴＲアンタゴニストと筋肉および神経細胞を接触させることは、細胞脱分極をもたらし、そして免疫応答を調節するための免疫細胞に対するその影響を包含する細胞周期プロセスに対するセロトニン作動性シグナリングを阻害することの影響は、これまで完全に予期されず、前例がなく、そしてこれまで気づかれなかった。したがって、細胞上に存在するセロトニン受容体によるシグナリングが細胞増殖および／もしくは生存に必要とされるという本発明の発見は、セロトニン受容体を含んでなる細胞の増殖を阻害することが治療利益を与えることができる疾病もしくは症状における使用のための治療法の開発の重要な新規な手段を提供する。
【実施例５】
【０４０２】
例４：セロトニン受容体によるシグナル伝達の阻害によってもたらされる細胞変化に関するアッセイ
本明細書において他で開示するデータは、セロトニン受容体によるシグナルの伝達を阻害することが、細胞における検出可能な変化を誘導するか、もたらすことができ、もしくはそれと関連することを初めて示す。さらに特に、ある種のセロトニンアンタゴニストと接触させた細胞は、変化した細胞形態および／もしくは光学顕微鏡検査を包含する当該技術分野において既知である様々な方法によって検出可能な他の改変された物理的特性を示した。
【０４０３】
簡潔に言えば、細胞を５−ＨＴアンタゴニスト（例えば、選択的１Ｂ型インヒビターＳＤ２１６６４１）とインキュベーションし、そして処置の影響を２４時間後に評価した。細胞形態の変化、例えば細胞サイズの増加が容易に検出された（図３０）。これらのデータは、当該技術分野において周知であるかもしくは今後に開発される方法を用いて、細胞形状、形態などの変化を評価することによってセロトニンシグナル阻害の影響をアッセイできることを示す。例えば、細胞変化の検出は光学装置（電子および光学顕微鏡検査ならびに蛍光活性化セルソーティングなど）、もしくは細胞サイズ、密度、形態などの変化を評価および検出する任意の他の装置を用いて評価することができる。そのような装置は、当該技術分野において周知であり、そして本明細書には詳述しない。
【０４０４】
本明細書に引用する一つ一つの特許、特許出願および公開の開示は、引用することによりそれらの全部が本明細書に組み込まれる。
【０４０５】
本発明は、特定の態様に関して開示されているが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真の精神および範囲からそれずに当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の請求項は、全てのそのような態様および同等なバリエーションを包含すると解釈されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０４０６】
本発明を説明する目的で、本発明のある態様を図面に示す。しかしながら、本発明は、図面に示す態様の正確な配置および手段に限定されない。
【図１】細胞分裂誘発性活性化シグナルに対するリンパ球の増殖応答へのマクロファージ馴化培地の影響を示す図である。
【図２】セロトニン合成および分解の主要な代謝経路を示す図である。化合物名を構造の左側に示し、一方、個々の反応を触媒する酵素を右側に示す。
【図３】ヒトリンパ球の細胞分裂誘発性刺激へのトリプトファンヒドロラーゼインヒビター（パラ−クロロフェニルアラニン、ＰＣＰＡ）の影響を示す図である。すなわち、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡの添加によって刺激した。
【図４】ＣｏｎＡで刺激するヒトＰＢＬの活性化へのセロトニン、トリプトファンもしくはフェネルジンの影響を示す図である。グラフ上に示す時点でアッセイを採取した。試薬は４００μＭの濃度で加えた。
【図５】３個のパネルを含んでなる図５は、異なる濃度のＣｏｎＡでのヒトＴ細胞の細胞分裂誘発性刺激へのトリプトファン（ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）およびフェネルジン（Ｐｚ）の影響を示す図である。すなわち、図５Ａは０．１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡでの影響を示し；図５Ｂは１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡでの影響を示し、そして図５Ｃ１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡでの影響を示す。各々のパネルにおける点線は、試薬を加えないＣｏｎＡのベースライン刺激レベルをさす。
【図６】活性化リンパ球のフェネルジン誘導阻害へのトリプトファンおよびセロトニン添加の影響を示す図である。個々の試薬（Ｐｚ、Ｔｒｐおよび５−ＨＴ）は、１００μＭの濃度で加えた。
【図７Ａ】ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）で刺激されたヒトリンパ球の活性化に対する５−ＨＴＲ１受容体に選択的であることが既知である一団のアゴニストおよびアンタゴニストを滴定する用量反応効果を示す図である。細胞は、ＣｏｎＡ刺激を開始した７２時間後に採取した。この研究に使用する薬剤は以下の明確な特性を有する：（Ｒ）８−ＯＨ  ＤＰＡＴ：５−ＨＴ１Ａ受容体の選択的アゴニスト；ＷＡＹ  １００６３５：５−ＨＴ１Ａ受容体の選択的アゴニスト；プロプラノロール：一般的な５−ＨＴ１受容体アンタゴニストならびにベータ−アドレナリン作動性アゴニスト；Ｌ６９４２４７：選択的１Ｂ／１Ｄアゴニスト；ＧＲ５５５６２：選択的１Ｂ／１Ｄアンタゴニスト；ＳＢ２１６６４１：選択的１Ｂアンタゴニスト；およびＢＲＬ１５５２２：選択的１Ｄアンタゴニスト；ＢＲＬ５４４４３：選択的１Ｅ／１Ｆアゴニスト。
【図７Ｂ】ヒトリンパ球の同種異系刺激（そうでなければ、混合リンパ球反応として知られている）に対する５−ＨＴＲ１受容体に選択的であることが既知である一団のアゴニストおよびアンタゴニストを滴定する用量反応効果を示す図である。細胞は、ＣｏｎＡ刺激を開始した１２０時間後に採取した。この研究に使用する薬剤は以下の明確な特性を有する：（Ｒ）８−ＯＨ  ＤＰＡＴ：５−ＨＴ１Ａ受容体の選択的アゴニスト；ＷＡＹ  １００６３５：５−ＨＴ１Ａ受容体の選択的アゴニスト；プロプラノロール：一般的な５−ＨＴ１受容体アンタゴニストならびにベータ−アドレナリン作動性アゴニスト；Ｌ６９４２４７：選択的１Ｂ／１Ｄアゴニスト；ＧＲ５５５６２：選択的１Ｂ／１Ｄアンタゴニスト；ＳＢ２１６６４１：選択的１Ｂアンタゴニスト；およびＢＲＬ１５５２２：選択的１Ｄアンタゴニスト；ＢＲＬ５４４４３：選択的１Ｅ／１Ｆアゴニスト。
【図８Ａ】ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）で刺激されたヒトリンパ球の活性化に対する、５−ＨＴＲ２受容体に選択的であることが既知である一団のアゴニストおよびアンタゴニストの滴定の用量反応効果を示す図である。細胞は、ＣｏｎＡ刺激を開始した７２時間後に採取した。この研究に使用する薬剤は以下の明確な特性を有する：ＤＯＩ：５ＨＴ２アゴニスト（この化合物に受容体を長時間さらすことは、それらのダウンレギュレーションをもたらす）；ＬＹ  ５３８５７：選択的５ＨＴ２Ａ／２Ｂ／２Ｃアンタゴニスト；ＭＤＬ  １１９３９：選択的５ＨＴ２Ａアンタゴニスト；ＳＢ  ２０６５５３：選択的５ＨＴ２Ｂ／２Ｃアンタゴニスト；ＳＢ  ２４２０８４：選択的５ＨＴ２Ｃアンタゴニスト；メチセルギド：部分的１型アゴニスト／２型アンタゴニスト；メチオテピン（Ｍｅｔｈｉｏｔｈｅｐｉｎ）：一般的な１、２、６および７型アンタゴニスト。
【図８Ｂ】ヒトリンパ球の同種異系刺激（そうでなければ、混合リンパ球反応として知られている）に対する５−ＨＴＲ２受容体に選択的であることが既知である一団のアゴニストおよびアンタゴニストを滴定する用量反応効果を示す図である。細胞は、ＣｏｎＡ刺激を開始した１２０時間後に採取した。この研究に使用する薬剤は以下の明確な特性を有する：ＤＯＩ：５ＨＴ２アゴニスト（この化合物に受容体を長時間さらすことは、それらのダウンレギュレーションをもたらす）；ＬＹ  ５３８５７：選択的５ＨＴ２Ａ／２Ｂ／２Ｃアンタゴニスト；ＭＤＬ  １１９３９：選択的５ＨＴ２Ａアンタゴニスト；ＳＢ  ２０６５５３：選択的５ＨＴ２Ｂ／２Ｃアンタゴニスト；ＳＢ  ２４２０８４：選択的５ＨＴ２Ｃアンタゴニスト；メチセルギド：部分的１型アゴニスト／２型アンタゴニスト；メチオテピン（Ｍｅｔｈｉｏｔｈｅｐｉｎ）：一般的な１、２、６および７型アンタゴニスト。
【図９Ａ】ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）で刺激されたヒトリンパ球の活性化に対する５−ＨＴＲ３、４、６もしくは７受容体のいずれかを標的とすることが既知である一団のアゴニストおよびアンタゴニストを滴定する用量反応効果を示す図である。細胞は、ＣｏｎＡ刺激を開始した７２時間後に採取した。この研究に使用する薬剤は以下の明確な特性を有する：ＳＲ  ５７２２２Ａ：５ＨＴ３アゴニスト；トロポセトロン（Ｔｒｏｐｏｓｅｔｒｏｎ）：選択的５ＨＴ３アンタゴニスト（制吐薬として臨床的に認可されている）；ＲＳ  ６７３３３：選択的５ＨＴ４アゴニスト（長期間の接触の際に受容体をダウンレギュレーションする）；ＳＢ  ２０４０７０：選択的５ＨＴ４受容体アンタゴニスト；Ｒｏ  ０４７６９０：選択的５ＨＴ６アンタゴニスト；ＳＢ  ２６９９７０：選択的５ＨＴ７アンタゴニスト。
【図９Ｂ】ヒトリンパ球の同種異系刺激（そうでなければ、混合リンパ球反応として知られている）に対する５−ＨＴＲ３、４、６もしくは７受容体のいずれかを標的とすることが既知である一団のアゴニストおよびアンタゴニストを滴定する用量反応効果を示す図である。細胞は、ＣｏｎＡ刺激を開始した１２０時間後に採取した。この研究に使用する薬剤は以下の明確な特性を有する：ＳＲ  ５７２２２Ａ：５ＨＴ３アゴニスト；トロポセトロン：選択的５ＨＴ３アンタゴニスト（制吐薬として臨床的に認可されている）；ＲＳ  ６７３３３：選択的５ＨＴ４アゴニスト（長期間の接触の際に受容体をダウンレギュレーションする）；ＳＢ  ２０４０７０：選択的５ＨＴ４受容体アンタゴニスト；Ｒｏ  ０４７６９０：選択的５ＨＴ６アンタゴニスト；ＳＢ  ２６９９７０：選択的５ＨＴ７アンタゴニスト。
【図１０】５ＨＴ１Ｒアゴニストの作用に対する５ＨＴ３Ｒアゴニストおよび選択的５ＨＴ６Ｒアンタゴニストの影響を調べるマウス混合リンパ球反応アッセイ（ＢＡＬＢ／ｃ対Ｃ５７ＢＬ６）を示すグラフである。
【図１１】ヒトリンパ球活性化の細胞分裂誘導性刺激の間に起こる細胞数に対する５ＨＴ１型受容体アンタゴニストおよび５ＨＴ２型受容体アンタゴニストの影響を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡで刺激した。細胞は、インヒビターの添加の前にフィコール勾配上で再精製した。生存細胞を計数するためにトリパンブルー排除を用いた。
【図１２Ａ】ヒトリンパ球（１μｇ／ｍｌでＣｏｎＡ刺激、そして細胞を７２時間で採取した）の細胞分裂誘発性刺激に対する、非常に選択的な５ＨＴ２型受容体アンタゴニスト、ＬＹ  ５３８５７の影響を示す図である。結果は、時間＝０もしくはアッセイの開始後４８時間でインヒビターを加える影響を示す。
【図１２Ｂ】ヒトリンパ球（１μｇ／ｍｌでＣｏｎＡ刺激、そして細胞を７２時間で採取した）の細胞分裂誘発性刺激に対する、非常に選択的な５ＨＴ２型受容体アンタゴニスト、ＳＢ  ２０６５５３の影響を示す図である。図は、時間＝０もしくはアッセイの開始後４８時間でインヒビターを加える影響を示す。
【図１２Ｃ】ヒトリンパ球（１μｇ／ｍｌでＣｏｎＡ刺激、そして細胞を７２時間で採取した）の細胞分裂誘発性刺激に対する、非常に選択的な５ＨＴ２型受容体アンタゴニスト、ＭＤＬ  １１９３９の影響を示す図である。結果は、時間＝０もしくはアッセイの開始後４８時間でインヒビターを加える影響を示す。
【図１２Ｄ】ヒトリンパ球（１μｇ／ｍｌでＣｏｎＡ刺激、そして細胞を７２時間で採取した）の細胞分裂誘発性刺激に対する、非常に選択的な５ＨＴ２型受容体アンタゴニスト、ＳＢ  ２４２０８４の影響を示す図である。図は、時間＝０もしくはアッセイの開始後４８時間でインヒビターを加える影響を示す。
【図１３】シクロスポリンＡに対するセロトニン受容体アンタゴニストの影響を調べるマウス同種異系モデルの結果を示すグラフである。本明細書に開示するデータは、ｐ８１５標的細胞に対して処置したマウスからの脾臓細胞を用いる細胞傷害性Ｔ細胞致死（ｋｉｌｌｉｎｇ）アッセイから得られる。
【図１４】マウス同種異系モデルにおける５ＨＴ２Ｒ選択的アンタゴニスト、ＳＢ２０６５５３の影響を示す図である。３匹のＳＢ  ２０６５５３で処置したマウスをＳＢ＃２２６ｈ、ＳＢ＃２２６ｉおよびＳＢ＃２２６ｊと称した。処置したマウスのうち２匹は、同種異系応答が完全に抑制された。マウスのうち１匹のみ（ＳＢ＃２２６ｊ）は、処置の結果として実質的にいかなる免疫学的影響も示さなかった。しかしながら、ＳＢ＃２２６ｊは、薬剤を投与するために度重なる尾静脈注射を必要とした。よく注意して注射する場合でさえ、尾静脈注射は技術的に困難であることができ、そして１回目の試みで必ずしも起こるとは限らない。
【図１５】静止および活性化リンパ球および単球のＲＴ−ＰＣＲプライミングを示すゲルを表す画像である。（＋）レーンは、ｃＤＮＡライブラリーを作製する前にＣｏｎＡで４８時間細胞分裂誘発的に刺激した細胞を示す。（−）レーンは静止細胞を示す。
【図１６】１４種の異なるセロトニン受容体の各々の発言を示すサザンブロットを表す画像であり、ここで、ブロットは以下のような適切な内部オリゴヌクレオチドで調べた：１Ａ：ｃｔｇｃａｇａａｃｇｔｇｇｃｃａａｔｔａｔｃｔｔａｔｔｇｇｃｔｃｔｔｔ（配列番号：１）；１Ｂ：ｇｔｇｇａｇｔａｃｔｃａｇｃｔａａａａｇｇａｃｔｃｃｃａａｇａｇｇｇ（配列番号：２）；１Ｄ：ｃｔｃｔｃｔｔｔｔｔｃａａｃｃａｃｇｔｇａａａａｔｃａａｇｃｔｔｇｃｔ配列番号３：）；１Ｅ：ａｔｃｔａｇａｔｃａｃｃｃａｇｇａｇａａｃｇｔｃａｇｃａｇａｔｃｔｃｔａ（配列番号：４）；１Ｆ：ｇａｇｃａｇｃａａａｇａｃａｔｔａｔａｃｃａｃａａｇａｇａｃａａｇｃａａ（配列番号：５）；２Ａ：ｔｃｇｇｃｔｃｔｔｔｔｇｔｇｔｃａｔｔｔｔｔｃａｔｔｃｃｃｔｔａａｃｃａ（配列番号：６）；２Ｂ：ｃｔｃａａｃｇｃｃｔａａｃａｔｇｇｔｔｇａｃｔｇｔｇｔｃｔａｃａｇｔｔｔ（配列番号：７）；２Ｃ：ｔａａｃｔｇａｃａｔｔｔｔｃａａｔａｃｃｔｃｃｇａｔｇｇｔｇｇａｃｇｃｔ（配列番号：８）；３Ａ：ｇｇｇａｇｔｔｃａｇｃａｔｇｇａａａｇｃａｇｔａａｃｔａｃｔａｔｇｃａｇ（配列番号：９）；３Ｂ：ｔｔｃａａｔｃｔａｔｃａｇｃａａｃｔａｃｃｔｃｃａａａｃｔｃａｇｇａｃｃ（配列番号：１０）；４：ｃａｃｃａｔｔｃｔｔｔｇｔｃａｃｃａａｔａｔｔｇｔｇｇａｔｃｃｔｔｔｃ（配列番号：１１）；５：ｃｔｔｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａｇａｃｇｔａｃｔｃｔｇａｇｇ（配列番号：１２）；６：ａｔｃｃｔｃａａｃｃｔｃｔｇｃｃｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｇａｃ（配列番号：１３）；７：ｔｇａａａｇｇａａａａａｃａｔｃｔｃｃａｔｃｔｔｔａａｇｃｇａｇａａｃａ（配列番号：１４）。
【図１７】様々な５−ＨＴクラス１選択的薬剤の機能的性質を示すグラフである。８−ＯＨ  ＤＰＡＴは１Ａ選択的アゴニストであり；ＷＡＹ  １００６３５は選択的１Ａアンタゴニストであり；プロプラノロールは一般的な５−ＨＴ１受容体アンタゴニスト（ならびにベータ−アドレナリン作動性アゴニスト）であり；ＳＢ２１６６４１は選択的１Ｂアンタゴニストであり；Ｌ６９４２４７は選択的１Ｂ／１Ｄアゴニストであり；ＧＲ５５５６２は選択的１Ｂ／１Ｄアンタゴニストであり；ＢＲＬ５４４４３は選択的１Ｅ／１Ｆアゴニストである。薬剤は、本明細書の他で記述するようにヒトリンパ球の５ｍｇ／ｍｌのＣｏｎＡ刺激の時間＝０で加えた。
【図１８Ａ】本明細書の他で記述するマウス同種異系モデルを用いて得られたデータを示すグラフである。簡潔に言えば、示すデータは、単一の代表的な研究を用いて得られた。示す２つの陽性コントロールは、認められる誘導された細胞傷害性致死活性を示し、一方、ナイーブコントロールにはＰ８１５細胞を一度も与えておらず、従って、アッセイのバックグラウンドの基準を与える。メチセルギドで処置した（ＭＳ）マウスは、誘導される致死応答の完全な阻害を示す。
【図１８Ｂ】本明細書の他で記述するとおりのマウス同種異系モデルを用いて得られたデータを示すグラフである。データは、複数のアッセイのプールした結果を表し、一方、阻害パーセントを計算するために１００：１のエフェクター：標的比データを用いた。各個々の棒は、単一のマウスから集めたデータを表す。
【図１９Ａ】１６時間後の時点におけるＲＰＭＩ８２２６細胞生存に対する５−ＨＴ２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストＬＹ５３５８７の影響を示すグラフである。
【図１９Ｂ】４８時間後の時点におけるＲＰＭＩ８２２６細胞生存に対する５−ＨＴ２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストＬＹ５３５８７の影響を示すグラフである。
【図２０Ａ】１６時間後の時点におけるＲＰＭＩ８２２６細胞におけるミトコンドリア活性の５−ＨＴ２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を示すグラフである。
【図２０Ｂ】４８時間後の時点におけるＲＰＭＩ８２２６細胞におけるミトコンドリア活性の５−ＨＴ２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を示すグラフである。
【図２０Ｃ】１６時間後の時点におけるＲＰＭＩ８２２６細胞におけるＤＮＡ合成の５−ＨＴ２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を示すグラフである。
【図２０Ｄ】４８時間後の時点におけるＲＰＭＩ８２２６細胞におけるＤＮＡ合成の５−ＨＴ２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を示すグラフである。
【図２１】ＲＰＭＩ８２２６細胞におけるＤＮＡ合成の５−ＨＴ２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を示すグラフである。
【図２２】ＲＰＭＩ８２２６細胞増殖に対する様々な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの影響を示すグラフである。
【図２３】５−ＨＴＲ１受容体を標的とする様々な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの影響を示すグラフである。アッセイの読み出しは、ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞の細胞増殖である。
【図２４】５−ＨＴＲ２受容体を標的とする様々な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの影響を示すグラフである。アッセイの読み出しは、ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞の細胞増殖である。
【図２５】５−ＨＴＲ３、４、６もしくは７受容体を標的とする様々な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの影響を示すグラフである。アッセイの読み出しは、ＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫細胞の細胞増殖である。
【図２６】５−ＨＴＲ２Ａ／２Ｂ／２Ｃを包含する様々な作用因子で処置したＲＰＭＩ８２２６細胞におけるアポトーシスと関連する古典的なＤＮＡ断片化を示すゲルを表す画像である。
【図２７】パネルＡ−Ｆを含んでなる図２７は、アネキシン（縦座標に沿って）およびヨウ化プロペジウム（ＰＩ）（横座標に沿って）で全て染色した、様々な濃度のカンプトセシン、選択的５−ＨＴＲ１Ｂ／Ｄ／型アンタゴニストで処置したＲＰＭＩ８２２６細胞、もしくは未処置のコントロール細胞のＦＡＣＳプロフィールを示す画像である。
【図２８】２μＭのカンプトセシンで（左側）および５−ＨＴ１Ｂ受容体シグナルを阻害するために５０μＭのＳＢ  ２１６６４１で処置した（右側）９時間処置後のＲＰＭＩ−８２２６細胞のヘマトキシリン・エオシン（上側）およびビス−ベンズアミド（下側）で染色した一致する画像を示す４画像である。広範囲に及ぶアポトーシスを示す、広域のクロマチンの凝縮および核の断片化が両方の処置群において明らかである。
【図２９】５−ＨＴ２Ｃ受容体シグナルを阻害するために５０μＭのＳＢ  ２４２０８４で処置した（右側）および賦形剤コントロール（左側）で９時間処置後のヘマトキシリン・エオシン（上側）およびビス−ベンズアミド（下側）で染色したＲＰＭＩ−８２２６細胞の一致する画像を示す。生存細胞を示す、均質なクロマチン染色がコントロールサンプルにおいて明らかであり、一方、ＳＢ２４２０８４で処置した細胞は、アポトーシス細胞を示す凝縮しそして断片化したクロマチンを示した。
【図３０】パネルＡ−Ｄを含んでなる図３０は、セロトニン作動性シグナリングの阻害の際に細胞における検出可能な変化を示す顕微鏡写真である。細胞を選択的１B型アンタゴニスト（ＳＢ２１６６４１）の存在下でインキュベーションし、そして細胞形態の変化を２４時間の処置後に示す。
【図１】
2005504724.tif 000007
【図２】
2005504724.tif 000008
【図３】
2005504724.tif 000009
【図４】
2005504724.tif 000010
【図５Ａ−Ｃ】
2005504724.tif 000011
【図６】
2005504724.tif 000012
【図７Ａ】
2005504724.tif 000013
【図７Ｂ】
2005504724.tif 000014
【図８Ａ】
2005504724.tif 000015
【図８Ｂ】
2005504724.tif 000016
【図９Ａ】
2005504724.tif 000017
【図９Ｂ】
2005504724.tif 000018
【図１０】
2005504724.tif 000019
【図１１】
2005504724.tif 000020
【図１２Ａ】
2005504724.tif 000021
【図１２Ｂ】
2005504724.tif 000022
【図１２Ｃ】
2005504724.tif 000023
【図１２Ｄ】
2005504724.tif 000024
【図１３】
2005504724.tif 000025
【図１４】
2005504724.tif 000026
【図１５】
2005504724.tif 000027
【図１６】
2005504724.tif 000028
【図１７】
2005504724.tif 000029
【図１８Ａ】
2005504724.tif 000030
【図１８Ｂ】
2005504724.tif 000031
【図１９Ａ】
2005504724.tif 000032
【図１９Ｂ】
2005504724.tif 000033
【図２０Ａ】
2005504724.tif 000034
【図２０Ｂ】
2005504724.tif 000035
【図２０Ｃ】
2005504724.tif 000036
【図２０Ｄ】
2005504724.tif 000037
【図２１】
2005504724.tif 000038
【図２２】
2005504724.tif 000039
【図２３】
2005504724.tif 000040
【図２４】
2005504724.tif 000041
【図２５】
2005504724.tif 000042
【図２６】
2005504724.tif 000043
【国際公開パンフレット】
2005504724.tif 000044
2005504724.tif 000045
2005504724.tif 000046
2005504724.tif 000047
2005504724.tif 000048
2005504724.tif 000049
2005504724.tif 000050
2005504724.tif 000051
2005504724.tif 000052
2005504724.tif 000053
2005504724.tif 000054
2005504724.tif 000055
2005504724.tif 000056
2005504724.tif 000057
2005504724.tif 000058
2005504724.tif 000059
2005504724.tif 000060
2005504724.tif 000061
2005504724.tif 000062
2005504724.tif 000063
2005504724.tif 000064
2005504724.tif 000065
2005504724.tif 000066
2005504724.tif 000067
2005504724.tif 000068
2005504724.tif 000069
2005504724.tif 000070
2005504724.tif 000071
2005504724.tif 000072
2005504724.tif 000073
2005504724.tif 000074
2005504724.tif 000075
2005504724.tif 000076
2005504724.tif 000077
2005504724.tif 000078
2005504724.tif 000079
2005504724.tif 000080
2005504724.tif 000081
2005504724.tif 000082
2005504724.tif 000083
2005504724.tif 000084
2005504724.tif 000085
2005504724.tif 000086
2005504724.tif 000087
2005504724.tif 000088
2005504724.tif 000089
2005504724.tif 000090
2005504724.tif 000091
2005504724.tif 000092
2005504724.tif 000093
2005504724.tif 000094
2005504724.tif 000095
2005504724.tif 000096
2005504724.tif 000097
2005504724.tif 000098
2005504724.tif 000099
2005504724.tif 000100
2005504724.tif 000101
2005504724.tif 000102
2005504724.tif 000103
2005504724.tif 000104
2005504724.tif 000105
2005504724.tif 000106
2005504724.tif 000107
2005504724.tif 000108
2005504724.tif 000109
2005504724.tif 000110
2005504724.tif 000111
2005504724.tif 000112
2005504724.tif 000113
2005504724.tif 000114
2005504724.tif 000115
2005504724.tif 000116
2005504724.tif 000117
2005504724.tif 000118
2005504724.tif 000119
2005504724.tif 000120
2005504724.tif 000121
2005504724.tif 000122
2005504724.tif 000123
2005504724.tif 000124
2005504724.tif 000125
2005504724.tif 000126
2005504724.tif 000127
2005504724.tif 000128
2005504724.tif 000129
2005504724.tif 000130
2005504724.tif 000131
2005504724.tif 000132
2005504724.tif 000133
2005504724.tif 000134
2005504724.tif 000135
2005504724.tif 000136
2005504724.tif 000137
2005504724.tif 000138
2005504724.tif 000139
2005504724.tif 000140
2005504724.tif 000141
2005504724.tif 000142
2005504724.tif 000143
2005504724.tif 000144
2005504724.tif 000145
2005504724.tif 000146
2005504724.tif 000147
2005504724.tif 000148
2005504724.tif 000149
2005504724.tif 000150
2005504724.tif 000151
2005504724.tif 000152
2005504724.tif 000153
2005504724.tif 000154
2005504724.tif 000155
2005504724.tif 000156
2005504724.tif 000157
2005504724.tif 000158
2005504724.tif 000159
2005504724.tif 000160
2005504724.tif 000161
2005504724.tif 000162
2005504724.tif 000163
2005504724.tif 000164
2005504724.tif 000165
2005504724.tif 000166
2005504724.tif 000167
2005504724.tif 000168
2005504724.tif 000169
2005504724.tif 000170
2005504724.tif 000171
2005504724.tif 000172
2005504724.tif 000173
2005504724.tif 000174
2005504724.tif 000175
2005504724.tif 000176
2005504724.tif 000177
2005504724.tif 000178
2005504724.tif 000179
2005504724.tif 000180
2005504724.tif 000181
2005504724.tif 000182
2005504724.tif 000183
2005504724.tif 000184
2005504724.tif 000185
2005504724.tif 000186
2005504724.tif 000187
2005504724.tif 000188
2005504724.tif 000189
2005504724.tif 000190
2005504724.tif 000191
2005504724.tif 000192
2005504724.tif 000193
2005504724.tif 000194
2005504724.tif 000195
2005504724.tif 000196
2005504724.tif 000197
2005504724.tif 000198
2005504724.tif 000199
2005504724.tif 000200
2005504724.tif 000201
2005504724.tif 000202
2005504724.tif 000203
2005504724.tif 000204
2005504724.tif 000205
2005504724.tif 000206
2005504724.tif 000207
2005504724.tif 000208
2005504724.tif 000209
2005504724.tif 000210
2005504724.tif 000211
2005504724.tif 000212
2005504724.tif 000213
2005504724.tif 000214
2005504724.tif 000215
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504724.tif 000216
【国際調査報告】
2005504724.tif 000217
2005504724.tif 000218
2005504724.tif 000219
2005504724.tif 000220