(57)【要約】タンパク質は、組織の修復、再生および／または再造形ならびに／あるいは薬物送達における使用のために、タンパク質または多糖物質中に組み込まれる。これらのタンパク質は、マトリクスの分解によって、酵素的な活性化および／または拡散によって放出されるように組み込まれ得る。実施例によって実証されるように、ある方法は、共有結合的方法または非共有結合的方法のいずれかによってマトリクスにヘパリンを結合させ、ヘパリン−マトリクスを形成する。次いで、ヘパリンは、タンパク質マトリクスにヘパリン−結合増殖因子を非共有結合させる。あるいは、融合タンパク質は、第ＸＩＩＩａ因子基質およびネイティブなタンパク質配列のような架橋領域を含めて構築され得る。マトリクスと生物活性因子と間の分解性結合の取り込みは、長期間の薬物送達が所望される場合（例えば、神経再生の場合）、特に有用であり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ペプチドであって、該融合ペプチドは、以下：
ＰＴＨを含む第１のドメインおよび
共有結合的に架橋可能な基質ドメインを含む第２のドメイン
を含む、
融合ペプチド。
【請求項２】
前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間の分解部位をさらに含む、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項３】
前記ＰＴＨが、ＰＴＨ  １−８４、ＰＴＨ  １−２８、ＰＴＨ  １−３４、ＰＴＨ  １−３１およびＰＴＨ  １−２５からなる群から選択される、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項４】
前記ＰＴＨがＰＴＨ  １−３４である、請求項３に記載の融合ペプチド。
【請求項５】
前記第２のドメインが、トランスグルタミナーゼ基質ドメインを含む、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項６】
前記第２のドメインが、第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインを含む、請求項５に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
前記第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインが、配列番号１２を含む、請求項６に記載の融合ペプチド。
【請求項８】
前記第２のドメインが、少なくとも１つのシステインを含む、請求項１に記載の融合ペプチド。
【請求項９】
前記分解部位が、酵素的分解部位または加水分解性分解部位である、請求項２に記載の融合ペプチド。
【請求項１０】
前記分解部位が、酵素的分解部位であって、該酵素的分解部位が、プラスミンおよびマトリクスメタロプロテイナーゼからなる群から選択される酵素によって切断される、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の融合ペプチドを含むキット。
【請求項１２】
フィブリノゲン、トロンビンおよびカルシウム供給源をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記キットが、架橋酵素をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
請求項１〜１０に記載の融合ペプチドを含む、細胞の増殖または内方増殖に適切なマトリクスであって、該融合ペプチドは該マトリクスに共有結合される、マトリクス。
【請求項１５】
前記マトリクスがフィブリンである、請求項１４に記載のマトリクス。
【請求項１６】
請求項１４に記載のマトリクスであって、該マトリクスは、ｎ個の求核基を含む第１の前駆体分子とｍ個の求電子基を含む第２の前駆体分子との間でマイケル型付加反応によって形成され、ここでｎおよびｍは少なくとも２であり、そしてｎ＋ｍの合計は少なくとも５である、マトリクス。
【請求項１７】
請求項１６に記載のマトリクスであって、前記求電子基は不飽和基に結合体化され、そして該求核基は、チオールおよびアミンからなる群から選択される、マトリクス。
【請求項１８】
前記マトリクスがポリエチレングリコールを含む、請求項１４に記載のマトリクス。
【請求項１９】
マトリクスを作製するための方法であって、該方法は、以下：
架橋されたマトリクスを形成し得る少なくとも１つのマトリクス材料を提供する工程であって、ここで該マトリクス材料は、タンパク質および合成材料からなる群から選択される、工程、
請求項１〜１０に記載の融合ペプチドを該マトリクス材料に添加する工程、および
該マトリクス材料を架橋し、その結果、該融合ペプチドが第２のドメインを通ってマトリクスに結合される工程
を包含する、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＰＴＨおよびマトリクスと結合相互作用させるアミノ酸配列を含む融合タンパク質またはペプチドに関し、そして組織修復および組織再生、ならびにＰＴＨの制御された放出における融合タンパク質またはペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）は、８４アミノ酸ペプチドであり、これは、上皮小体によって作られ、分泌される。このホルモンは、種々の組織（骨を含む）に対するその作用による血清カルシウムレベルの制御において主要な役割を果たす。ヒトにおいて種々の形態のＰＴＨを用いた研究は、骨に対して同化効果を示し、これは、骨粗鬆症および関連する骨障害の処置についてこれらＰＴＨを興味深いものにする（Ｃｈｏｒｅｖらに対する、米国特許第５，７４７，４５６号およびＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．に対するＷＯ００／１０５９６）。上皮小体ホルモンは、細胞表面レセプターへの結合によって細胞に対して作用する。このレセプターは、骨芽細胞（新規の骨を形成することを担う細胞）において見出されることが公知である。
【０００３】
ヒトホルモンのＮ末端３４アミノ酸ドメインは、全長ホルモンに生物学的に等価であることが報告されている。ＰＴＨ１−３４およびその作用様式は、米国特許第４，０８６，１９６号においてまず報告された。それ以来、研究が、ＰＴＨ１−３４およびネイティブなヒトＰＴＨ形態の他の短縮型バージョン（例えば、ＰＴＨ１−２５、ＰＴＨ１−３１およびＰＴＨ１−３８）に対して実施された（例えば、Ｒｉｘｏｎ  ＲＨら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９（８）：１１７９−８９（Ａｕｇ．１９９４）を参照のこと）。
【０００４】
ＰＴＨが骨リモデリングに影響する機構は、複雑であり、これは、矛盾する結果を導き、続いて、正確な機構に対する有意数の研究が、関与する。ＰＴＨが連続的様式で全身に投与された場合、骨密度が減少することが示された。対照的に、同じ分子が、拍動性様式において投与される場合、骨密度が増加されることが報告された（例えば、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．に対するＷＯ９９／３１１３７を参照のこと）。この明らかな矛盾は、ＰＴＨが、骨リモデリングおよび、続いて、骨密度の観察可能なパラメーターを調節する機構によって説明され得る。成熟骨内で、ＰＴＨレセプターは、骨芽細胞系統の細胞の表面上のみに存在することが示され、破骨細胞には存在しないことが示された。ＰＴＨが骨リモデリングにおいて果たす役割は、破骨細胞とは対照的に、骨芽細胞によって指向される。しかし、骨芽細胞系統の種々の段階の細胞は、これらがＰＴＨに結合した場合、異なる応答をする。従って、種々の方法を使用してＰＴＨが投与される場合に観察される劇的な変化は、同じ分子が、骨芽細胞系統内の異なる細胞に対して有する種々の効果を理解することによって説明され得る。
【０００５】
ＰＴＨが、間葉幹細胞に結合する場合、細胞が、前骨芽細胞に分化するように誘導される。従って、系にＰＴＨを添加することによって、前骨芽細胞の割合が増加する。しかし、これらの前骨芽細胞は、同様にＰＴＨレセプターを有し、これらの細胞上のレセプターに対するＰＴＨの続く結合は、異なる応答を導く。ＰＴＨが前骨芽細胞を結合する場合、骨吸収を導く２つの別々の結果を生じる。第１に、前骨芽細胞の骨芽細胞へのさらなる分化を阻害する。第２に、前骨芽細胞からのインターロイキン６（ＩＬ−６）の分泌を増加する。ＩＬ−６は、前骨芽細胞の分化の阻害と、前骨芽細胞の骨芽細胞への分化の増加と両方を行う。骨芽細胞系統内の細胞からのこの二重の応答は、骨リモデリングとＰＴＨ曝露との間の複雑な反応を提供する。ＰＴＨが、短い期間の間に周期的に投薬される場合、間葉幹細胞は、骨芽細胞に分化するように誘導される。次いで、短い投薬期間は、新規に形成された前骨芽細胞が、ＩＬ−６を産生するのを阻害し、破骨細胞の活性化を阻害する。従って、用量の間隔の間、これらの新規に形成された前骨芽細胞は、骨芽細胞にさらに分化し得、骨形成を生じる。一定容量のＰＴＨが適用される場合、前骨芽細胞は、ＩＬ−６の産生を開始する機会を有し、これによって破骨細胞を活性化し、それら自身を阻害し、反対の効果（骨吸収）を導く。
【０００６】
組織修復または再生のために、細胞は、創床に移動し、増殖し、マトリクス成分を発現するか、または細胞外マトリクスを形成し、そして最終組織形状を形成しなければならない。多様な細胞集団（しばしば、血管細胞および神経細胞を含む）は、しばしば、この形態学的応答に参加しなければならない。マトリクスは、大いに増強されることが示され、いくつかの場合において、この応答が起こるのに必須であることが見出された。アプローチは、天然起源または合成起源あるいは両方の混合物から発達中のマトリクスにおいてなされる。天然の細胞が内方増殖するマトリクスは、細胞感化によるリモデリングに供され、全ては、例えば、プラスミン（フィブリンを分解する）およびマトリクスメタロプロテイナーゼ（コラーゲン、エラスチンなどを分解）によるタンパク質分解に基づく。このような分解は、高度に局在化され、移動する細胞との直接の接触の際にのみ生じる。さらに、特定の細胞シグナル伝達タンパク質（例えば、増殖因子）の送達は、厳しく調節される。天然のモデルにおいて、マクロ孔質の細胞内方増殖マトリクスは、使用されないが、むしろ、細胞がマトリクスに移動する場合、局所的にそして必要に応じて、細胞が分解され得るミクロ孔質のマトリクスは使用される。免疫原性、高価な産生、限定された利用可能性、バッチ変化性およびバッチ精製に関する関心に起因して、合成前駆体分子に基づくマトリクス（例えば、改変されたポリエチレングリコール）は、人体中および／または人体における組織再生のために開発された。
【０００７】
多くの仕事が、ＰＴＨの全身効果の研究をなした、一方で、研究によって、ＰＴＨの局所（ｌｏｃａｌ  ｏｒ  ｔｏｐｉｃａｌ）投与は調査されなかった。ＰＴＨが、骨芽細胞系統に対する直接の同化効果を有するので、欠損部位内に適切に示される場合、骨密度に対する影響に加えて骨欠損を治癒する強い潜在能力を有するはずである。一旦欠損が前骨芽細胞で充填されると、ＰＴＨシグナルが止まる場合、新規に形成された前骨芽細胞が、骨芽細胞に分化し、創床に転換し始め、まず、網状骨組織に転換し、次いで、成熟骨構造に転換する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、組織修復、組織再生、およびリモデリングのためのマトリクスに結合され得る形態のＰＴＨを提供することである。
【０００９】
骨欠損を治癒するために患者に局所（ｔｏｐｉｃａｌ  ｏｒ  ｌｏｃａｌ）投与するために適切な形態でＰＴＨを与えることは、さらなる課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
１つのドメインの上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）および別のドメインのマトリクスに共有結合的に架橋され得る基体ドメインを含む融合ペプチド、ならびにマトリクス、ならびにこのような融合タンパク質またはペプチドを含むキットが、本明細書中で開示される。融合タンパク質は、天然材料または合成材料に共有結合され、マトリクスを形成し、これは、骨欠損を治癒するために使用され得る。必要に応じて、マトリクスを形成するための全ての成分は、骨欠損に適用され、マトリクスは、適用部位で形成される。融合ペプチドは、マトリクスに組込まれ得、その結果、融合ペプチド全体または第１のドメインのそれぞれのＰＴＨ配列のみのいずれかで、マトリクスの分解によって、酵素作用によって、および／または加水分解作用によって、遊離される。融合ペプチドはまた、第１のドメインと第２のドメインとの間に分解可能な結合を含み得、この結合は、加水分解切断部位または酵素切断部位を含む。特に、融合ペプチドは、１つのドメインにＰＴＨ、第２のドメインでマトリクスに共有結合的に架橋され得る基体ドメイン、第１のドメインと第２のドメインとの間の分解部位を含む。好ましくは、ＰＴＨは、ヒトＰＴＨであるが、他の供給源由来のＰＴＨ（例えば、ウシＰＴＨ）は、適切であり得る。ＰＴＨは、ＰＴＨ１−８４（ネイティブ）、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１、もしくはＰＴＨ１−２５であり得るか、または前述の特徴に類似する特徴（すなわち、骨形成）を示すＰＴＨの任意の改変バージョンもしくは対立遺伝子バージョンであり得る。分解部位は、マトリクス内の種々の位置で変化する送達速度を可能にし、これは、その位置での、および／またはマトリクス内での細胞活性に依存する。さらなる利点としては、送達システム内でのより低い総薬物用量、より大きなパーセンテージの薬物が最大の細胞活性の時点で遊離されることを可能にする放出の空間制御が挙げられる。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
硬組織の修復、再生または再構築のため、特に、骨の成長のための、その中に放出可能に組み込まれたＰＴＨを有する天然および合成のマトリクスを使用する製品および方法が、本明細書中で記載される。天然マトリクスは、生体適合性かつ生分解性であり、そして移植時に、インビトロまたはインビボで形成され得る。ＰＴＨは、このマトリクスに組み込まれ得、そしてその完全な生体活性を保持する。ＰＴＨは、ＰＴＨがどのように放出されるか、およびＰＴＨが何時放出されるか、およびＰＴＨがどの程度放出されるかの制御を提供する技術を使用して、放出可能に組み込まれ得、その結果、このマトリクスは、制御放出ビヒクルとしてこのマトリクスを使用して、直接的または間接的に組織修復のために使用され得る。
【００１２】
（定義）
「生体材料」とは、一般的に本明細書中で使用される場合、材料に永久的または一時的に依存して、身体の任意の組織、器官または機能を評価、処置、増強または置換する生物学的系とインターフェースすることを意図される材料をいう。用語「生体材料」および「マトリクス」は、本明細書中で同義で使用され、そしてマトリクスの性質に依存して、水で膨潤され得るが、水中に溶解しない（すなわち、外傷のある硬組織または欠損硬組織の特定の支持機能を果たす特定の期間、身体中に留まるヒドロゲルを形成する）架橋ポリマーネットワークを意味する。
【００１３】
「ＰＴＨ融合ペプチド」とは、一般的に本明細書中で使用される場合、少なくとも第１および第２のドメインを含むペプチドをいう。一方のドメインは、ＰＴＨ（ネイティブ形態または短縮形態、特に、ＰＴＨ  １−３４）を含み、そして他方のドメインは、マトリクスに架橋されるための基質ドメインを含む。酵素的または加水分解的な分解部位はまた、この第１のドメインと第２のドメインとの間に存在し得る。
【００１４】
「強い求核試薬」とは、一般的に本明細書中で使用される場合、極性結合形成反応において電子対を求核試薬に供与し得る分子をいう。好ましくは、この強い求核試薬は、生理学的ｐＨにおいて、水より求核性である。強い求核試薬の例は、チオールおよびアミンである。
【００１５】
「共役不飽和結合」とは、一般的に本明細書中で使用される場合、単結合と交互の炭素−炭素多重結合、炭素−ヘテロ原子多重結合またはヘテロ原子−ヘテロ原子結合、あるいは官能基の高分子（例えば、合成ポリマーまたはタンパク質）への連結をいう。このような結合は、付加反応を受け得る。
【００１６】
「共役不飽和基」とは、一般的に本明細書中で使用される場合、単結合と交互の炭素−炭素多重結合、炭素−ヘテロ原子多重結合またはヘテロ原子−ヘテロ原子結合を有する分子または分子の領域であって、付加反応を受け得る多重結合を有する、分子または分子の領域をいう。共役不飽和基の例としては、ビニルスルホン、アクリレート、アクリルアミド、キノンおよびビニルピリジニウム（例えば、２−または４−ビニルピリジニウム）、ならびにイタコネートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
「合成前駆体分子」とは、一般的に本明細書中で使用される場合、天然に存在しない分子をいう。
【００１８】
「天然に存在する前駆体成分またはポリマー」とは、一般的に本明細書中で使用される場合、天然で見出され得る分子をいう。
【００１９】
本明細書中で一般的に使用されるような「官能化する」とは、官能基または官能的な部分の結合を生じる様式で分子を修飾することをいう。例えば、分子は、分子を強力な求核試薬または共役不飽和にする分子の導入によって官能化され得る。好ましくは、分子（例えば、ＰＥＧ）は、チオール、アミン、アクリレート、またはキノンになるように官能化される。タンパク質はまた、特に、遊離チオールを生成するためにジスルフィド結合の部分的還元または完全な還元によって効率的に官能化され得る。
【００２０】
本明細書中で一般的に使用されるような「官能性」とは、分子上の反応部位の数をいう。
【００２１】
本明細書中で一般的に使用されるような「分枝位置の官能性」とは、分子中の一つの位置から伸びるアームの数をいう。
【００２２】
本明細書中で一般的に使用されるような「接着部位または細胞結合部位」とは、分子（例えば、細胞の表面上の接着促進レセプター）が結合するペプチド配列をいう。接着部位の例としては、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列、およびラミニン由来のＹＩＧＳＲ（配列番号２）配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、接着部位は、マトリクスに架橋可能な基質ドメインを含むことによって生体材料に組み込まれる。
【００２３】
本明細書中で一般的に使用されるような「生物学的活性」とは、目的のタンパク質によって媒介される官能的な事象をいう。いくつかの実施形態において、これは、ポリペプチドと別のポリペプチドの相互作用を測定することによってアッセイされる事現を包含する。それはまた、目的のタンパク質が、細胞増殖、細胞分化、細胞死、細胞移動、細胞接着、他のタンパク質との細胞相互作用、酵素活性、タンパク質リン酸化もしくはタンパク質脱リン酸化、転写または翻訳に対して有する効果をアッセイすることを包含する。
【００２４】
本明細書中で一般的に使用されるような「感受性生物学的分子」とは、細胞中、もしくは体内で見出されるか、または細胞もしくは身体のための治療剤として使用され得る分子をいい、この治療剤は、その存在下で他の分子と反応し得る。感受性生物学的分子の例としては、ペプチド、タンパク質、核酸、および薬物が挙げられるが、これらに限定されない。生体材料は、感受性生物学的材料に不利に影響を与えることなく、感受性生物学的材料の存在下で生成され得る。
【００２５】
「再生」は、本明細書中で一般的に使用される場合、硬組織（特に、骨）のようなものの一部または全てが、成長して元にもどることを意味する
「多官能性」とは、本明細書中で一般的に使用される場合、１分子（すなわち、モノマー、オリゴマーおよびポリマー）あたりの求電子官能基および／または求核性官能基が１つより多いことをいう。
【００２６】
「自己選択的反応」とは、本明細書中で一般的に使用される場合、組成物の第１の前駆成分が、混合物中またはその反応部位中に存在する他の化合物よりも、その組成物の第２の前駆成分とより早く反応する（逆もまた同じ）ことを意味する。本明細書中で使用される場合、求核基は、求電子物質に優先的に結合し、そして求電子物質は、他の生物学的化合物よりも、強力な求核基に優先的に結合する。
【００２７】
「架橋」とは、本明細書中で一般的に使用される場合、共有結合の形成を意味する。しかし、非共有結合（例えば、イオン結合）、または共有結合と非共有結合との組み合わせの形成も言及し得る。
【００２８】
「ポリマーネットワーク」とは、本明細書中で一般的に使用される場合、モノマー、オリゴマーまたはポリマーの実質的に全てが、それらの利用可能な官能基を介する分子間共有結合によって結合されて１つの大きな分子を生じるプロセスの産物を意味する。
【００２９】
「生理学的」とは、本明細書中で使用される場合、生きている脊椎動物中に見出され得るような条件を意味する。特に、生理学的条件は、温度、ｐＨなどのようなヒト身体中の条件を言及する。生理学的温度は、３５℃と４２℃との間の温度範囲、好ましくは３７℃あたりを意味する。
【００３０】
「架橋密度」とは、本明細書中で一般的に使用される場合、それぞれの分子の、２つの架橋間の平均分子量（Ｍｃ）をいう。
【００３１】
「当量」とは、本明細書中で一般的に使用される場合、物質のｇあたりの官能基のｍｍｏｌをいう。
【００３２】
「膨潤」とは、本明細書中で使用される場合、バイオマテリアルによる水の取りこみによって容量および質量が増加することをいう。用語「水取りこみ」および「膨潤」は、本願を通して同意語として使用される。
【００３３】
「平衡状態」とは、本明細書中で一般的に使用される場合、ヒドロゲルが、水中の定常状態下で貯蔵された場合に質量の増加または損失を起こさない状態である。
【００３４】
（Ｉ．マトリクスおよびＰＴＨ）
（Ａ．マトリクス材料）
マトリクスは、前駆体分子をポリマーネットワークにイオン的に架橋するか、共有結合的に架橋するか、またはその組み合わせによって、あるいは、１つ以上のポリマー材料（すなわち、マトリクス）を膨潤させて、マトリクス内への細胞の内方増殖または移動を可能にするために十分なポリマー間間隔を有するポリマーネットワークを形成することによって、形成される。
【００３５】
１つの実施形態において、マトリクスは、タンパク質（好ましくは、マトリクスが移植される患者において天然に存在するタンパク質）から形成される。特に好ましいマトリクスタンパク質は、フィブリンであるが、他のタンパク質（例えば、コラーゲンおよびゼラチン）から作製されたマトリクスもまた、使用され得る。ポリサッカリドおよび糖タンパク質もまた、マトリクスを形成するために使用され得る。イオン結合また共有結合によって架橋可能な合成ポリマーを使用することもまた、可能である。
【００３６】
（フィブリンマトリクス）
フィブリンは、いくつかの生物学的適用に関して報告された、天然材料である。フィブリンは、Ｈｕｂｂｅｌｌらに対する米国特許第６，３３１，４２２号において、細胞内方増殖マトリクスのための材料として記載されている。フィブリンゲルは、その多くの組織に結合する能力および損傷治癒におけるその天然の役割に起因して、シーラントとして使用されている。いくつかの特定の適用としては、血管移植片付着、心臓弁付着、骨折における骨の配置、および腱修復のためのシーラントとしての使用が挙げられる（Ｓｉｅｒｒａ，Ｄ．Ｈ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，７：３０９−３５２（１９９３））。さらに、これらのゲルは、薬物送達デバイスとして、および神経再生のために、使用されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２６４：２８４−２９０（１９８７））。フィブリンは、組織の再生および細胞の内方増殖のための固体支持体を提供するが、これらのプロセスを直接増強するモノマーにおいて、活性な配列はほとんど存在しない。
【００３７】
フィブリノゲンがフィブリンに重合するプロセスもまた、特徴付けられている、最初に、プロテアーゼが、二量体フィブリノゲン分子を２つの対称的な部位に切断する。フィブリノゲンを切断し得るいくつかの可能なプロテアーゼが存在し（トロンビン、レプチラーゼ、およびプロテアーゼＩＩＩが挙げられる）、そして各々が、このタンパク質を異なる部位で切断する（Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，１９：２９１−３０７，１９９３）。一旦、フィブリノゲンが切断されると、自己重合工程が起こり、この工程において、フィブリノゲンモノマーが一緒になり、そして非共有結合で架橋したポリマーゲルを形成する（Ｓｉｅｒｒａ，１９９３）。この自己集合は、プロテアーゼ切断が起こった後に結合部位が曝露されるので起こる。一旦、これらの結合部位が曝露されると、分子の中心にあるこれらの結合部位は、フィブリノゲン鎖上の他の部位（これらは、ペプチド鎖の末端に存在する）と結合し得る（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，１９７５）。この様式で、ポリマーネットワークが形成される。次いで、第ＸＩＩＩａ因子（トロンビンタンパク質分解によって第ＸＩＩＩ因子から活性化されたトランスグルタミナーゼ）が、このポリマーネットワークに共有結合で架橋し得る。他のトランスグルタミナーゼが存在し、そして同様に、フィブリンネットワークへの共有結合架橋およびグラフトに関与し得る。
【００３８】
一旦、架橋フィブリンのゲルが形成されると、引き続く分解は、厳密に制御される。フィブリンの分解を制御する際に主要な分子の１つは、α２−プラスミンインヒビターである（Ａｏｋｉ，Ｎ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２１：２６７−２８６、１９７９）。この分子は、第ＸＩＩＩａ因子の作用を介してフィブリンのα鎖に架橋することによって、作用する（Ｓａｋａｔａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，６５：２９０−２９７，１９８０）。それ自体をゲルに付着させることによって、高濃度のインヒビターが、ゲルに局在し得る。次いで、このインヒビターは、プラスミノゲンのフィブリンへの結合を防止すること（Ａｏｋｉら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，３９：２２−３１，１９７８）、およびプラスミンを不活性化すること（Ａｏｋｉ，１９７９）によって作用する。α２−プラスミンインヒビターは、グルタミン基質を含む。正確な配列は、ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号１２）として同定されており、最初のグルタミンが、架橋のための活性アミノ酸である。
【００３９】
二ドメインペプチド（これは、第ＸＩＩＩａ因子基質配列および生物活性ペプチド配列を含む）がフィブリンゲルに架橋し得ること、およびこの生物活性ペプチドは、インビトロで、その細胞活性を保持することが、実証された（Ｓｃｈｅｎｓｅ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１０：７５−８１）。
【００４０】
（合成マトリクス）
身体への適用のための合成マトリクスを形成するための架橋反応としては、以下が挙げられる：（ｉ）不飽和二重結合を含む２つ以上の前駆体間でのフリーラジカル重合（例えば、Ｈｅｒｎら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３９：２６６−２７６（１９９８）に記載される）、（ｉｉ）例えば、アミン基を含む前駆体とスクシンイミジル基を含む前駆体との間でのような、求核置換反応（Ｒｈｅｅらに対する米国特許第５，８７４，５００号に開示される）、（ｉｉｉ）縮合および付加反応、ならびに（ｉｖ）強い求核試薬と共役不飽和基または結合（強い求電子試薬として）との間の、Ｍｉｃｈａｅｌ型付加反応。特に好ましいものは、求核性基としてのチオール基またはアミン基を有する前駆体分子と、求電子性基としてのアクリレート基またはビニルスルホン基を含む前駆体分子との間の反応である。求核性基として最も好ましいものは、チオール基である。Ｍｉｃｈａｅｌ型付加反応は、Ｈｕｂｂｅｌｌらに対するＷＯ００／４４８０８に記載されており、その内容は、本明細書中に参考として援用される。Ｍｉｃｈａｅｌ型付加反応は、感受性の生物学的物質の存在下でさえも、少なくとも第一および第二の前駆体成分の、生理学的条件下での、自己選択的様式でのインサイチュでの架橋を可能にする。前駆体成分の１つが少なくとも２つの官能基を有し、そして他の前駆体のうちの少なくとも１つが２つより多い官能基を有する場合、この系は、自己選択的に反応して、架橋した三次元生体物質を形成する。
【００４１】
好ましくは、共役不飽和基または共役不飽和結合は、アクリレート、ビニルスルホン、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、ビニルスルホン、２−ビニルピリジニウムもしくは４−ビニルピリジニウム、マレイミド、またはキノンである。
【００４２】
吸核性基は、好ましくは、チオール基、アミノ基、またはヒドロキシル基である。チオール基は、プロトン化されていないアミン基より実質的により反応性である。先に言及されたように、ｐＨは、この点に関して重要である：脱プロトン化チオールは、プロトン化チオールより、実質的により反応性である。従って、２つの前駆体成分をマトリクスに変換するための、共役不飽和（例えば、アクリレートまたはキノン）を含む、チオールとの付加反応は、しばしば、約８のｐＨで、最も迅速に、かつ自己選択的に、最良に実施される。約８のｐＨにおいて、目的のチオールの大部分は、脱プロトン化され（従って、より反応性であり）、そして目的のアミンのほとんどは、プロトン化された（従って、反応性が低い）ままである。チオールが、第一の前駆体分子として使用される場合、アミンに対するチオールについての反応性が選択的である共役構造が、非常に望ましい。
【００４３】
適切な第一および第二の前駆体分子としては、タンパク質、ペプチド、ポリオキシアルキレン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルピロリドン）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−アクリル酸）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレン−ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（アクリルアミド）、およびポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマーが挙げられる。特に好ましい前駆体分子は、ポリエチレングリコールである。
【００４４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、便利な構築ブロックを提供する。線状（すなわち、２つの末端を有する）または分枝鎖（すなわち、２つより多い末端を有する）のＰＥＧを、容易に購入または合成し得、次いで、このＰＥＧの末端基を官能基化して、強い求核試薬（例えば、チオール）または共役構造（例えば、アクリレートまたはビニルスルホン）のいずれかを導入し得る。これらの成分が、互いと、または対応する成分とのいずれかで、わずかに塩基性の環境で混合される場合、マトリクスは、第一の前駆体成分と第二の前駆体成分との間での反応によって、形成される。ＰＥＧ成分は、非ＰＥＧ成分と反応し得、そしていずれかの成分の分子量または親水性が、得られる生体物質の機械的特性、浸透性、および水含有量を操作するために、制御され得る。
【００４５】
これらの材料は、一般に、以下にさらに詳細に記載されるように、医用移植物において有用である。マトリクス（特に、インビボで分解することが望ましいマトリクス）の形成において、ペプチドは、非常に便利な構築ブロックを提供する。２つ以上のシステイン残基を含むペプチドを合成することは、簡単であり、次いで、この成分は、求核性基を有する第一の前駆体成分として、容易に働き得る。例えば、２つの遊離システイン残基を有するペプチドは、ＰＥＧトリビニルスルホン（そのアームの各々にビニルスルホンを有する３つのアームを有するＰＥＧ）と、生理学的ｐＨまたはそれよりわずかに高いｐＨ（例えば、８〜９）で混合される場合に、容易にマトリクスを形成する。ゲル化もまた、なおより高いｐＨにおいて良好に進行し得るが、潜在的に、自己選択性を犠牲にする。２つの液体前駆体成分が一緒に混合される場合、これらは、数分の時間で反応して、弾性ゲルを形成し、このゲルは、ペプチドを連結リンクとして有するネットワークの節を保有する、ＰＥＧ鎖のネットワークからなる。このペプチドは、このネットワークが細胞によって浸潤または分解され得る（タンパク質ベースのネットワーク（例えば、フィブリンマトリクス）においてなされるように）ようにするための、プロテアーゼ基質として選択され得る。好ましくは、ドメイン中の配列は、細胞移動に関与する酵素のための基質（例えば、コラゲナーゼ、プラスミン、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）またはエラスターゼのような酵素に対する基質）であるが、適切なドメインは、これらの配列に限定されない。１つの特に有用な配列は、酵素プラスミンに対する基質である（実施例を参照のこと）。ゲルの分解性は、架橋節として働くペプチドの細部の変化によって操作され得る。コラーゲナーゼによって分解可能であるが、プラスミンによっては分解可能ではないゲル、またはプラスミンによって分解可能であるが、コラーゲナーゼによっては分解可能ではないゲルを、作製し得る。さらに、酵素反応のＫｍまたはｋｃａｔ、あるいはその両方を変化させるように、アミノ酸配列を単に変化させることによって、ゲル分解を、このような酵素に応答してより速く、またはより遅くすることが、可能である。従って、細胞の通常の再モデル化特徴によって再モデル化され得る点で生体を模倣する、生体物質を作製し得る。例えば、このような研究は、重要なプロテアーゼプラスミンのための基質部位を示す。ペプチドでのＰＥＧのゲル化は、自己選択的である。
【００４６】
必要に応じて、生体機能性薬剤がマトリクスに組み込まれて、他の種（例えば、組織表面）に対する化学結合を提供し得る。マトリクスにプロテアーゼ基質を組み込むことは、このマトリクスがＰＥＧビニルスルホンから形成される場合に、重要である。ＰＥＧアクリレートおよびＰＥＧチオールの反応から形成されるマトリクス以外の、ＰＥＧビニルスルホンおよびＰＥＧチオールから形成されるマトリクスは、加水分解的に分解可能な結合を含まない。従って、プロテアーゼ基質の組み込みは、このマトリクスが体内で分解することを可能にする。
【００４７】
合成マトリクスは、形成する操作が単純である。２つの液体前駆体が混合される；一方の前駆体は、求核性基を有する前駆体分子を含み、そして他方の前駆体分子は、求電子性基を含む。生理学的食塩水が、溶媒として働き得る。最小の熱が、反応によって発生する。従って、ゲル化は、インビボまたはインビトロで、組織と直接接触して、都合の悪い毒性を有することなく、実施され得る。従って、テレキーリックに（ｔｅｌｅｃｈｅｌｉｃａｌｌｙ）修飾されたかまたはこれらの側鎖基において修飾されたかのいずれかの、ＰＥＧ以外のポリマーが、使用され得る。
【００４８】
ほとんどの治癒適応症について、マトリクス内への細胞の内方増殖または細胞の移動の速度は、マトリクスの適合された分解速度と組み合わせて、治癒応答の全体について重大である。加水分解的に分解不可能なマトリクスが細胞によって侵入される可能性は、主として、ネットワーク密度の関数である。分枝点または節の間に存在する空間が、細胞の大きさに対して小さすぎる場合、あるいはマトリクスの分解（これは、マトリクス内でのより多くの空間の作製を生じる）の速度が遅すぎる場合は、非常に制限された治癒応答が観察される。天然に見出される治癒マトリクス（例えば、フィブリンマトリクスであって、これは、体内の損傷に応答して形成される）は、細胞による侵入が非常に容易であり得る、非常に緩いネットワークからなることが公知である。浸潤は、細胞接着のためのリガンド（これは、フィブリンネットワークの一部として統合される）によって促進される。
【００４９】
合成親水性前駆体分子から作製されるマトリクスは、ポリエチレングリコールのように、ポリマーネットワークの形成後に、水性環境において膨潤する。十分に短いゲル化時間（７〜８の間のｐＨおよび３６〜３８℃の範囲の温度において３〜１０分の間）および定量的な反応を、体内でのマトリクスのインサイチュ形成の間に達成するために、前駆体分子の開始濃度は、十分に高くなければならない。このような条件下では、ネットワーク形成後の膨潤が起こらず、そして必要な開始濃度は、このマトリクスが水性環境において分解可能ではない場合に、細胞浸潤のためには密度が高すぎるマトリクスをもたらす。従って、ポリマーネットワークの膨潤は、分枝点の間の空間を拡大し、そして広くなることが重要である。
【００５０】
前駆体分子の出発濃度にかかわらず、同じ合成前駆体分子（例えば、４アームＰＥＧビニルスルホンおよびＳＨ基を有するペプチド）から作製されるヒドロゲルは、平衡状態において、同じ水含有量に膨潤する。このことは、前駆体分子の開始濃度がより高いほど、平衡状態に到達する場合のヒドロゲルの末端体積が高くなることを意味する。身体内で利用可能な空間が、十分な膨潤を可能にするためには小さすぎる場合、特に、前駆体成分から形成される結合が加水分解的に分解可能ではない場合、細胞浸潤の速度および治癒応答は、遅くなる。その結果として、身体における適用のための２つの矛盾した要件の間の最適条件が見出されなければならない。良好な細胞浸潤および引き続く治癒応答は、三官能性分枝鎖ポリマーと、少なくとも３アームの実質的に類似の分子量の第二の前駆体分子（これは、少なくとも二官能性分子である）との反応から形成される、三次元ポリマーネットワークを用いて観察された。第一の前駆体分子と第二の前駆体分子との官能基の当量比は、０．９と１．１との間である。第一の前駆体分子のアームの分子量、第二の前駆体分子の分子量、および分枝点の官能基は、得られるポリマーネットワークの水含有量が、平衡時の重量％と水の取り込みの完了後のポリマーネットワークの全重量の９２重量％との間であるように、選択される。好ましくは、水含有量は、水取り込み後のポリマーネットワークと水との総重量の、９３重量％と９５重量％との間である。水取り込みの完了は、平衡濃度に達する場合、または生体物質において利用可能な空間がさらなる体積増加を可能にしない場合のいずれかに、達成され得る。従って、可能な限り低い、前駆体成分の出発濃度を選択することが好ましい。このことは、膨潤性の全てのマトリクスについてあてはまるが、特に、細胞媒介分解を受け、そしてポリマーネットワーク中に加水分解的に分解可能な結合を含まないマトリクスについてあてはまる。
【００５１】
特に、加水分解的に分解不可能なゲルについて、ゲル化時間と低い出発濃度との間のバランスは、前駆体分子の構造に基づいて最適化されるべきである。特に、第一の前駆体分子のアームの分子量、第二の前駆体分子の分子量、および分枝の程度（すなわち、分枝点の官能性）は、これらに従って調節されなければならない。実際の反応機構は、この相互作用に対して、あまり影響を有さない。
【００５２】
第一の前駆体分子が、各アームの末端に官能基を有する３アームまたは４アームのポリマーであり、そして第二の前駆体分子が、線状二官能性分子であり、好ましくは、少なくとも２つのシステイン基を含むペプチドである場合、第一の前駆体分子のアームの分子量、および第二の前駆体分子の分子量は、好ましくは、そのネットワークの形成後に、分枝点の間の結合が、（結合が線状であり、分枝していない条件下で）１０〜１３ｋＤの範囲、好ましくは、１１ｋＤと１２ｋＤとの間の分子量を有するように選択される。このことは、第一の前駆体分子と第二の前駆体分子との合計の出発濃度が、（ネットワーク形成前の）溶液中の第一および第二の前駆体分子の全重量の、８〜１２重量％、好ましくは、９重量％と１０重量％との範囲にあることを可能にする。第一の前駆体成分の分枝の程度が８に増加され、そして第二の前駆体分子が依然として線状二官能性分子である場合、分枝点の間の結合の分子量は、好ましくは、１８〜２４ｋＤａの間の分子量に増加される。第二の前駆体分子の分枝の程度が、線状から３アームまたは４アームの前駆体成分に増加される場合、分子量（すなわち、結合の長さ）が、これに従って増加する。本発明の好ましい実施形態において、第一の前駆体分子として三官能性の３アームの１５ｋＤポリマー（すなわち、各アームが５ｋＤの分子量を有する）、および第二の前駆体分子として０．５〜１．５ｋＤの範囲、なおより好ましくは、１ｋＤの分子量の二官能性線状分子を含む、組成が選択される。好ましくは、第一および第二の前駆体成分は、ポリエチレングリコールである。
【００５３】
好ましい実施形態において、第一の前駆体成分は、官能基として、共役不飽和基または結合、最も好ましくはアクリレートまたはビニルスルホンを含み、そして第二の前駆体分子の官能基は、求核性基（好ましくは、チオール基またはアミノ基）を含む。本発明の別の好ましい実施形態において、第一の前駆体分子は、各アームの末端に官能基を有する、４アームの２０ｋＤ（各アームが、５ｋＤａの分子量）のポリマーであり、そして第二の前駆体分子は、１〜３ｋＤの範囲、好ましくは１．５ｋＤと２ｋＤとの間の分子量の、二官能性線状分子である。好ましくは、第一の前駆体分子は、ビニルスルホン基を有するポリエチレングリコールであり、そして第二の前駆体分子は、システイン基を有するペプチドである。両方の好ましい実施形態において、第一の前駆体分子と第二の前駆体分子との合計の出発濃度は、（ポリマーネットワーク形成前の）第一の前駆体分子および第二の前駆体分子ならびに水の全重量の、８〜１１重量％の範囲、好ましくは、９重量％と１０重量％との間であり、１０分未満のゲル化時間を達成するためには、好ましくは、５重量％と８重量％との間である。これらの組成物は、ｐＨ８．０および３７℃で、混合後約３〜１０分のゲル化時間を有する。
【００５４】
マトリクスが、加水分解的に分解可能な結合を含む場合、形成される（例えば、アクリレートとチオールとの間での好ましい反応による）ネットワークの密度は、細胞浸潤に関して、初期において特に重要であるが、水性環境において、結合が加水分解され、そしてネットワークが緩み、細胞浸潤を可能にする。ポリマーネットワークの全体の分枝の程度が増加すると、相互結合の分子量（すなわち、結合の長さ）が増加しなければならない。
【００５５】
（Ｂ．細胞付着部位）
細胞は、細胞表面において、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−オリゴ糖相互作用、およびタンパク質−多糖相互作用を介して、それらの環境と相互作用する。細胞外マトリクスタンパク質は、細胞に対する宿主の生物活性信号を提供する。この密なネットワークは、細胞を支持するために必要とされ、そしてマトリクス中の多くのタンパク質が、細胞の接着、拡散、移動および分化を制御することが示されている（Ｃａｒｅｙ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５３：１６１−１７７，１９９１）。特に活性であることが示された特定のタンパク質のいくつかとしては、ラミニン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノゲンおよびコラーゲンが挙げられる（Ｌａｎｄｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２：１８９−１９５，１９８９）。ラミニンの多くの研究が実施され、そしてラミニンが、インビボで神経の、そしてインビトロで神経細胞の、発達および再生において（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８５１−８６９，１９８７）、ならびに新脈管形成において、重要な役割を果たすことが示された。
【００５６】
細胞レセプターと直接相互作用し、そして接着、拡散またはシグナル伝達のいずれかを引き起こす、特異的配列のいくつかが、同定されている。
【００５７】
ラミニン（大きい多ドメインタンパク質）（Ｍａｒｔｉｎ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：５７−８５，１９８７）は、いくつかのレセプター結合ドメインを有する３つの鎖からなることが示された。これらのレセプター結合ドメインとしては、ラミニンＢ１鎖のＹＩＧＳＲ（配列番号２）配列（Ｇｒａｆら，Ｃｅｌｌ，４８：９８９−９９６，１９８７；Ｋｌｅｉｎｍａｎら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２７２：３９−４５，１９８９；およびＭａｓｓｉａら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：８０５３−８０５９，１９９３）、ラミニンＡ鎖のＬＲＧＤＮ（配列番号３）（Ｉｇｎａｔｉｕｓら，Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１１：７０９−７２０，１９９０）ならびにラミニンＢ１鎖のＰＤＧＳＲ（配列番号４）（Ｋｌｅｉｎｍａｎら，１９８９）が挙げられる。細胞に対するいくつかの他の認識配列もまた、同定されている。これらとしては、ラミニンＡ鎖のＩＫＶＡＶ  （配列番号５）（Ｔａｓｈｉｒｏら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６１７４−１６１８２，１９８９）およびラミニンＢ２鎖の配列ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ  （配列番号６）（Ｌｉｅｓｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４４：１４１−１４８，１９８９）が挙げられる。これらの特異的配列に結合するレセプターもまた、しばしば同定されている。この結合の大部分の原因であることが示された細胞レセプターのサブセットは、インテグリンスーパーファミリーである（Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ，Ｅ．，Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８７：１−５，１９９１）。インテグリンは、αサブユニットおよびβサブユニットからなる、タンパク質ヘテロダイマーである。以前の研究は、トリペプチドＲＧＤが、いくつかのβ１インテグリンおよびβ３インテグリンに結合すること（Ｈｙｎｅｓ，Ｒ．Ｏ．，Ｃｅｌｌ，６９：１−２５，１９９２；Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１２８０９−１２８１２，１９９１）、ＩＫＶＡＶ（配列番号５）が１１０ｋＤａレセプターに結合すること（Ｔａｓｈｉｒｏら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１６１７４−１６１８２，１９８９）；Ｌｕｃｋｅｎｂｉｌｌ−Ｅｄｄｓら，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７９：３７１−３７７，１９９５）、ＹＩＧＳＲ（配列番号２）が６７ｋＤａレセプターに結合すること（Ｇｒａｆら，１９８７）およびＤＧＥＡ（配列番号７）（コラーゲン配列）がα２，β１インテグリンに結合すること（ＺｕｔｔｅｒおよびＳａｎｔａｒｏ，Ａｍｅｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｄｙ，１３７：１１３−１２０，１９９０）を示した。ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ（配列番号６）配列に対するレセプターは、報告されていない。
【００５８】
さらなる好ましい実施形態において、細胞接着のためのペプチド部位は、マトリクスに組み込まれる。すなわち、細胞の表面の接着促進レセプターに結合するペプチドが、本発明の生体物質に組み込まれる。このような接着促進ペプチドは、上記のような群より選択され得る。特に好ましいものは、フィブロネクチン由来のＲＧＤ配列、ラミニン由来のＹＩＧＳＲ（配列番号２）配列である。細胞付着部位の組み込みは、合成マトリクスを用いる特に好ましい実施形態であるが、天然のマトリクスのいくつかにもまた含められ得る。組み込みは、例えば、システイン含有細胞付着ペプチドを、共役不飽和基を含む前駆体分子（例えば、ＰＥＧアクリレート、ＰＥＧアクリルアミド、またはＰＥＧビニルスルホン）と単に混合し、その数分後に、求核性基（例えば、チオール含有前駆体成分）を含む前駆体成分の残りのものと混合することによって、なされ得る。細胞付着部位がシステインを含まない場合、この部位は、システインを含むように化学的に合成され得る。この第一の工程の間、接着促進ペプチドは、共役不飽和で多重に官能基化された前駆体の１つの末端に組み込まれる；残りの複数のチオールが系に添加される場合、架橋したネットワークが形成される。ネットワークがここで調製される様式の別の重要な意味は、ペンダント生物活性リガンド（例えば、接着シグナル）の組込みの効率である。この工程は、定量的である。なぜなら、例えば、未結合リガンド（例えば、接着部位）は、マトリクスとの細胞の相互作用を阻害し得るからである。以下に記載されるように、このようなペンダントオリゴペプチドでの前駆体の誘導体化は、第一の工程で、チオールに対して化学量論的に大過剰（最小４０倍）のマルチアーム求電子前駆体で実施され、従って、全く定量的である。
【００５９】
望まれない阻害を防止することは別として、この達成は、生物学的になおより重要である：細胞の挙動は、リガンド密度の小さい変化に極端に感受性であり、そして組み込まれるリガンドの正確な知識は、細胞−マトリクス相互作用を設計および理解する助けになる。要約すると、マトリクス内に共有結合した接着部位の濃度は、細胞浸潤の速度に有意に影響を与える。例えば、所定のヒドロゲルについて、ＲＧＤ濃度範囲は、細胞の内方増殖および細胞の移動を、最適な様式で支持しながら、マトリクスに組み込まれ得る。ＲＧＤのような接着部位の最適な濃度範囲は、０．０４ｍＭと０．０５ｍＭとの間であり、そしてなおより好ましくは、特に、水の取り込みの終了後に平衡濃度と９２重量％との間の水含有量を有するマトリクスについて、０．０５ｍＭである。
【００６０】
優れた骨治癒の結果は、細胞の移動速度およびマトリクスの分解速度を速く維持することによって、達成され得る。マトリクスの設計（特に、共有結合したＰＴＨ１−３４）に関して、プロテアーゼ分解部位ＧＣＲＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣ（配列番号８）と架橋した、約２０，０００Ｄａの分子量を有する４アームポリエチレングリコール、および０．０５０ｍＭのＧＲＧＤＳＰ（配列番号９）は、特に良好な細胞内方増殖結果および骨欠損の治癒を与える。ＰＥＧおよびペプチドの出発濃度は、（膨潤前の）分子と水との総重量の１０重量％未満である。このゲルは、利用可能な一貫性を有し、そして骨芽細胞および前駆細胞がマトリクスに容易に浸潤することを可能にする。
【００６１】
マトリクス材料は、好ましくは、天然に存在する酵素によって生分解性である。分解速度は、架橋の程度およびマトリクス中のプロテアーゼインヒビターの含有によって操作され得る。
【００６２】
（Ｃ．架橋性基質ドメイン）
ＰＴＨ融合ペプチドは、架橋され得、そしてＰＴＨ融合ペプチドの架橋性基質ドメインを通じてマトリクスに共有結合し得る。基質ドメインの種類は、マトリクスの性質に依存する。フィブリンマトリクスへの組み込みについて、トランスグルタミナーゼ基質ドメインが特に好ましい。トランスグルタミナーゼ基質ドメインは、第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインであり得る。この第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、ＧＡＫＤＶ（配列番号１０）、ＫＫＫＫ（配列番号１１）、またはＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号１２）を含み得る。ＰＴＨとトランスグルタミナーゼ基質ドメインとの間のカップリングは、化学合成により実施され得る。
【００６３】
トランスグルタミナーゼ基質ドメインは、第ＸＩＩＩａ因子以外のトランスグルタミナーゼの基質であり得る。最も好ましい第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、アミノ酸配列ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号１２）（本明細書中では「ＴＧ」と称する）を有する。トランスグルタミナーゼを認識する他のタンパク質（例えば、フィブロネクチン）は、トランスグルタミナーゼ基質ペプチドにカップリングされ得る。
【００６４】
（表１：トラスグルタミナーゼ基質ドメイン）
【００６５】
【表１】
2005517658.tif 000002
合成前駆成分から形成されるマトリクスへのＰＴＨの組み込みについては、ＰＴＨ融合ペプチドまたは組み込まれる任意の他のペプチドは、架橋性基質ドメインとして、少なくとも１つのさらなるシステイン基（−ＳＨ）と共に（好ましくはＰＴＨのＮ末端に）合成されなければならない。システインは、ＰＴＨに直接結合され得るかまたはリンカー配列を通してであり得る。リンカー配列はさらに、酵素分解可能なアミノ酸配列を含み得、その結果、ＰＴＨは、実質的にネイティブ形態で、酵素によりマトリクスから切断され得る。遊離システイン基は、Ｍｉｃｈａｅｌ型付加反応において前駆成分の結合体化不飽和基と反応する。ＰＴＨ１〜３４の場合、ＰＴＨ１〜３４についての合成マトリクスへの束縛（ｂｏｎｄａｇｅ）は、少なくとも１つのシステインを含むＰＴＨ１〜３４のＮ末端にさらなるアミノ酸配列を結合することにより可能とされる。システインのチオール基は、合成ポリマーにおける結合体化不飽和結合と反応し、共有結合を形成し得る。おそらく、（ａ）システインのみがペプチドに結合され（ｂ）酵素分解可能な、特にプラスミン分解可能な配列は、システインとペプチドとの間のリンカーとして結合される。第１ドメインと第２ドメイン、システインとの間の配列ＧＹＫＮＲ（配列番号１５）は、連結をプラスミン分解性にする。
【００６６】
このように、ＰＴＨ融合ペプチドはさらに、接着部位、すなわち第２のドメイン（すなわち、因子Ｘｌｌｌａ基質ドメインまたはシステイン）と、ＰＴＨ、すなわち、第１ドメインとの間に、分解可能な部位を含むように、修飾され得る。これらの部位は、非特異的加水分解（すなわち、エステル結合）によって、分解可能であり得るか、またはそれらの部位は、特異的酵素的（タンパク質分解または多糖類の分解）分解のための基質になり得る。これらの分解可能な部位は、フィブリンゲルのようなマトリクスからＰＴＨのより特異的な放出の操作を可能にする。例えば、酵素活性に基づいた分解は、ＰＴＨの放出が、そのゲルを通る因子の拡散によってではなく、細胞工程によって制御されることを可能にする。分解可能な部位または結合部位は、マトリクスに浸入する細胞から放出される酵素によって切断される。
【００６７】
分解可能な部位によって、ＰＴＨは、第１ペプチド配列にほとんどまたは全く修飾を持たずに放出され、その結果、その因子のより高い活性を生じ得る。さらに、分解部位は、因子の放出が、幾つかの多孔性材料からの拡散ではなく、例えば局在化タンパク質分解のような細胞特異的工程によって制御されることを可能にする。これによって、因子はこの材料内の細胞の位置に依存して、同じ材料内に異なった割合で放出される。このことはまた、その放出が細胞工程によって制御されるので、必要な総ＰＴＨの量を減少させる。ＰＴＨおよびそのバイオアベイラビリティーの保存は、拡散制御放出装置の使用における、細胞特異的タンパク質分解活性を利用するための別の利点である。マトリクスに共有結合するＰＴＨを用いる骨欠損の強力な治癒のための１つの可能な説明において、ＰＴＨは長時間の間に（すなわち単一パルス量ではなく）、しかし持続的な様式ではなく、局所的に投与されることが重要であるとみなされる。このことは、マトリクスの酵素的切断または加水分解的切断による、緩やかな分解によって完遂される。このように、その分子は次に、持続時間に渡って生じる偽パルス効果を通して送達される。先祖細胞がマトリクスを浸潤するとき、その細胞はＰＴＨ分子に遭遇し、前骨芽細胞に分化し得る。しかしながら、その特定の細胞が、マトリクスから結合ＰＴＨを遊離し続けなければ、その細胞は、効果的に骨芽細胞に変換され、骨マトリクスを産生し始める。最終的に、そのペプチドの治療的効果は、欠損領域に局在し、その結果、拡大される。
【００６８】
タンパク質分解（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に使用され得る酵素は非常に多数である。タンパク質分解可能部位は、コラゲナーゼ、プラスミン、エラスターゼ、ストロメリシン、またはプラスミノーゲンアクチベーターのための基質を含み得る。例示的な基質は下記の表に示される。Ｐ１〜Ｐ５は、タンパク質分解が起こる部位からタンパク質のアミノ末端に向かうアミノ酸の１位〜５位を表す。Ｐ１’〜Ｐ４’は、タンパク質分解が起こる部位からタンパク質のカルボキシ末端に向かうアミノ酸の１位〜４位を表す。
【００６９】
（表２：プロテアーゼに対するサンプル基質配列）
【００７０】
【表２】
2005517658.tif 000003
2005517658.tif 000004
別の好ましい実施形態において、オリゴ−エステルドメインは、第１ドメインと第２ドメインとの間に挿入され得る。これは、乳酸のオリゴマーのようなオリゴ−エステルを用いて達成される。
【００７１】
非酵素的分解基質は、酸または塩基の触媒メカニズムによって、加水分解を行う任意の連結からなり得る。これらの基質は、乳酸またはグリコール酸のオリゴマーのようなオリゴ−エステルを含み得る。これらの物質の分解率は、オリゴマーの選択によって制御され得る。
【００７２】
（Ｄ．ＰＴＨ）
本明細書中に記載される場合、用語「ＰＴＨ」は、生物学的に分解可能な天然マトリクスまたは合成マトリクスに共有結合する場合、骨形成の特質を示す、ＰＴＨ１〜８４ならびにＰＴＨの全ての短縮されたバージョン、修飾を受けたバージョンおよび対立形質バージョンのヒト配列を含む。ＰＴＨの好ましい短縮化バージョンは、ＰＴＨ１〜３８、ＰＴＨ１〜３４、ＰＴＨ１〜３１またはＰＴＨ１〜２５である。最も好ましくは、ＰＨＨ１−３４である。好ましくは、ＰＴＨはヒトＰＴＨである、ウシＰＴＨのような、他の供給源由来のＰＴＨが適切であり得る。
【００７３】
（生物活性因子の取り込みおよび／または放出のための方法）
ＰＴＨのマトリクス内への取り込みに関する１つの好ましい実施形態において、マトリクスは、フィブリノゲンから形成されるフィブリン、カルシウム供給源およびトロンビンを含い、そしてＰＴＨ融合ペプチドは、凝固中にフィブリン内に取り込まれる。ＰＴＨ融合ペプチドは、２つのドメイン、すなわち、第１ドメインと第２ドメインを含む融合タンパク質として設計される。１つのドメイン、すなわち第２ドメインは、第ＸＩＩＩａ因子のような酵素のための基質である。第ＸＩＩＩａ因子は、凝固中に活性化されるトランスグルタミナーゼである。この酵素は、トロンビンによる切断によって第ＸＬＬＬａ因子から自然に形成され、グルタミン側鎖とリジン側鎖との間に形成されるアミド結合を通じて、互いにフィブリン鎖に結合する機能を有する。酵素はまた、凝固中にフィブリン（例えば、細胞結合部位）に他のペプチドを結合するように機能し、ただし、この細胞結合部位は、第ＸＩＩＩａ因子をまた含む。
【００７４】
特に、配列ＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号１６）は、第ＶＩＩＩａ因子の有効な基質として機能することが示さている。本明細書中に記載されるように、その配列がＰＴＨに直接結合する前か、またはＰＴＨ（第１ドメイン）とＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号１６）配列（第２ドメイン）との間の分解部位を含み得る。このように、ＰＴＨ融合ペプチドは、第ＸＩＩＩａ因子基質を通じて、凝固中にフィブリン内に取り込まれ得る。
【００７５】
（取り込みのための融合タンパク質の設計）
ＰＴＨを含む第１ドメイン、架橋酵素に対する基質ドメインを含む第２ドメインおよび必要に応じて第１ドメインと第２ドメインとの間にある分解部位を含むＰＴＨ融合ペプチドは、幾つかの異なるスキームを用いてフィブリンゲル内に取り込まれ得る。好ましくは、第２ドメインは、トランスグルタミナーゼ基質ドメインを含み、よりさらに好ましくは、第２ドメインは第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインを含む。最も好ましくは、第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、ＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号１６）を含む。このＰＴＨ融合ペプチドが、フィブリノゲンの重合の間、（すなわち、フィブリンマトリクスの形成の間）に存在する場合、その融合ペプチドは、マトリクス内に直接取り込まれる。
【００７６】
ＰＴＨ融合ペプチドの第１ドメインと第２ドメインとの間の分解部位は、先に記載されるように酵素的分解部位であり得る。好ましくは、この分解部位は、プラスミンおよびマトリクスメラロプロテイナーゼからなる群より選択される酵素によって切断可能である。この酵素的分解部位のＫｍおよびＫｃａｔの注意深い選択によって、タンパク質マトリクスの前または後のいずれかで、そして／あるいはマトリクスを分解するための類似の酵素または異なる酵素を利用することによって、分解は、生じるように制御され得、分解部位の配置は、各々のタイプのタンパク質および適用に対して変更される。このＰＴＨ融合ペプチドは、上記のフィブリンマトリクス内に直接架橋され得る。しかし、酵素分解部位を組み込むことは、タンパク質分解の間のＰＴＨの放出を変更する。細胞由来のタンパク質が、隔離された融合タンパク質に達する場合、これらは、新たに形成された分解部位において操作されたタンパク質を切断し得る。得られた分解産物は、遊離されたＰＴＨを含み、この遊離されたＰＴＨは、ここで、いかなる操作された融合配列も、いかなる分解フィブリンもほとんど含まない。
【００７７】
（ＩＩ．使用方法）
マトリクスは、組織の修復、再生、もしくは再構築のため、そして／またはＰＴＨの放出のために、移植の前または移植のときに使用され得る。いくつかの場合において、移植部位においてマトリクスを組織に適合させるために、投与の部位に架橋を誘導することが望ましい。他の場合において、移植の前に、マトリクスを調製することが便利である。
【００７８】
細胞はまた、移植の前または移植のときに、または移植の後においてさえ、マトリクスを形成するためのポリマーの架橋のときまたは架橋の後のいずれかで、マトリクスに添加され得る。これは、細胞増殖または内方増殖（ｉｎ−ｇｒｏｗｔｈ）を促進するために設計された間隙空間を作り出すために、マトリクスを架橋する事に加えて、またはマトリクスの架橋の代わりであり得る。
【００７９】
大部分の場合において、細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を促進するためにマトリクスを移植することが望ましいものの、いくらかの場合において、細胞増殖の速度を抑制するために生物活性因子が使用される。特定の適用は、手術後の癒着の形成を抑制することである。
【００８０】
（ＩＩＩ．適用の方法）
好ましい実施形態において、この物質は、インサイチュまたは身体の中もしくは身体上でゲル化される。別の実施形態において、このマトリクスは、身体の外側で形成され得、次いで、予め形成された形状で適用される。マトリクス物質は、合成または天然の前駆体組成物から作製され得る。使用される前駆体組成物の種類とは無関係に、前駆体成分は、身体への混合物の適用の前に分離され、成分の重合またはゲル化を可能にする条件下での互いの混合または接触を防止されるべきである。投与より前の接触を避けるために、組成物を互いに分離させるキットが、使用され得る。重合を可能にする条件下での混合の際に、この組成物は、生体活性因子を補充された三次元ネットワークを形成する。前駆体組成物およびそれらの濃度に依存して、ゲル化は、混合の後、半瞬間的に生じ得る。このような迅速なゲル化は、注入（すなわち、注射針を通してのゲル化物質の押し込み）をほとんど不可能なものにする。
【００８１】
１つの実施形態において、このマトリクスは、フィブリノゲンから形成される。フィブリノゲンは、適切な温度およびｐＨにおいてトロンビンおよびカルシウム供給源と接触される場合、種々のカスケードを介してゲルと反応し、マトリクスを形成する。３つの成分（フィブリノゲン、トロンビン、およびカルシウム供給源）は、別々に保存されるべきである。しかし、３つの成分のうちの少なくとも１つが分離されている限り、他の２つの成分は、投与前に混合され得る。
【００８２】
第１の実施形態において、フィブリノゲンは、生理学的ｐＨ（ｐＨ６．５〜８．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜７．５の範囲）の緩衝溶液中で溶解され（これは、安定性を増加させるためのアプロチニンをさらに含み得る）、そして塩化カルシウム緩衝液（例えば、４０〜５０ｍＭの濃度範囲）中のトロンビン溶液とは別個に保存される。フィブリノゲンのための緩衝溶液は、ヒスチジン緩衝溶液であり得、これは、好ましい濃度は５０ｍＭであり、ＮａＣｌ（１５０ｍＭの好ましい濃度で）またはＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（好ましくは、３３ｍＭの濃度）をさらに含む。
【００８３】
好ましい実施形態において、融合タンパク質、フィブリノゲン、トロンビンおよびカルシウム供給源を備えるキットが、提供される。必要に応じて、このキットは、架橋酵素（例えば、第ＸＩＩＩａ因子）を備え得る。この融合タンパク質は、生体活性因子、架橋酵素のための基質ドメイン、およびこの基質ドメインと生体活性因子との間の分解部位を含む。この融合タンパク質は、フィブリノゲン溶液またはトロンビン溶液のいずれかの中に存在し得る。好ましい実施形態において、フィブリノゲン溶液が、この融合タンパク質を含む。
【００８４】
これらの溶液は、好ましくは、２方向（ｔｗｏ  ｗａｙ）シリンジデバイスによって混合され、このデバイスにおいて、混合は、混合チャンバおよび／または針および／または静的ミキサーを介して、両方のシリンジの内容物を押し込むことによって生じる。
【００８５】
好ましい実施形態において、フィブリノゲンおよびトロンビンの両方が、凍結乾燥形態で別個に保存される。これら２つのうちいずれかが、融合タンパク質を含み得る。使用前に、トリス緩衝液またはヒスチジン緩衝液がフィブリノゲンに添加され、この緩衝液は、アプロチニンをさらに含み得る。凍結乾燥トロンビンは、塩化カルシウム溶液中に溶解され得る。引き続いて、フィブリノゲン溶液およびトロンビン溶液は、別個の容器／バイアル／シリンジ本体中に配置され、２方向接続デバイス（例えば、２方向シリンジ）によって混合される。必要に応じて、容器／バイアル／シリンジ本体は、２分され、従って、シリンジ本体壁に対して垂直な調節可能区画によって隔てられた２つのチャンバを有する。これらのチャンバのうち１つは、凍結乾燥されたフィブリノゲンまたはトロンビンを含み、一方で、他方のチャンバは、適切な緩衝溶液を含む。プランジャーが押し下げられると、この区画は移動し、そしてフィブリノゲンチャンバ中に緩衝液を放出して、フィブリノゲンを溶解する。一旦、フィブリノゲンおよびトロンビンの両方が溶解されると、両方の２分シリンジ本体は、２方向接続デバイスに装着され、そして接続デバイスに装着された注射針を通して内容物を押し込むことによって、内容物が混合される。必要に応じて、この接続デバイスは、内容物の混合を改善するための、静的ミキサーを備える。
【００８６】
好ましい実施形態において、混合前に、フィブリノゲンは８倍希釈され、そしてトロンビンは２０倍希釈される。この比率は、約１分のゲル化時間を生じる。
【００８７】
別の好ましい実施形態において、このマトリクスは、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を受け得る合成前駆成分から形成される。求核性前駆成分（マルチチオール（ｍｕｌｔｉｔｈｉｏｌ））のみが、塩基性ｐＨでマルチアクセプター（ｍｕｌｔｉａｃｃｅｐｔｏｒ）成分（結合体化された不飽和基）と反応するので、混合前に別々に保存されるべき３つの成分は、以下である：塩基、求核成分およびマルチアクセプター成分。マルチアクセプター成分およびマルチチオール成分の両方が、緩衝液中の溶液として保存される。両方の成分が、細胞接着部位およびさらに生体活性分子を含み得る。従って、この系の第一組成物としては、例えば、求核成分の溶液が挙げられ得、そしてこの系の第二組成物としては、マルチアクセプター成分の溶液が挙げられ得る。これら２つの成分のいずれかまたは両方が、塩基を含み得る。別の実施形態において、このマルチアクセプターおよびマルチチオールは、第一組成物中に溶液として含まれ得るか、または第二組成物が塩基を含み得る。接続および混合が、フィブリノゲンについて以前に記載したのと同じ様式で生じる。二分シリンジ本体は、合成前駆成分について等しく適切である。フィブリノゲンおよびトロンビンの代わりに、マルチアクセプター成分およびマルチチオール成分は、チャンバの１つに粉砕形態で保存され、そして他方のチャンバは、塩基性緩衝液を含む。
【００８８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。組成物および方法が、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物および方法、ならびに本明細書中に記載される方法の工程または一連の工程に、バリエーションが適用され得ることが、当業者に明らかである。
【実施例】
【００８９】
（実施例１：共有結合したＴＧＰＴＨを含むマトリクス）
（ＴＧＰＴＨの合成）
完全タンパク質と類似の活性を示すＰＴＨ１〜３４マーペプチド、およびこの長さのタンパク質を、標準的な固相ペプチド合成法によって合成し得る。
【００９０】
全てのペプチドを、自動化ペプチド合成機を使用し、標準的な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化学を使用して、固体樹脂上で合成した。ペプチドを、ｃ１８クロマトグラフィーによって精製し、そして逆相クロマトグラフィーをＨＰＬＣを介して使用して純度を決定し、そして質量分析（ＭＡＬＤＩ）によって各生成物の分子量を同定した。この方法を使用して、以下のペプチド（本明細書中で「ＴＧＰＴＨ」という）を合成した：
【００９１】
【化１】
2005517658.tif 000005
（インビボの結果）
骨再生を増強するＴＧＰＴＨの活性を、ＴＩＳＳＵＣＯＬ（登録商標）マトリクスにおいて、ヒツジドリル穴欠損（ｓｈｅｅｐ  ｄｒｉｌｌ  ｈｏｌｌ  ｄｅｆｅｃｔ）において試験した。１２ｍｍの深さの８ｍｍの穴を、ヒツジの近位および遠位の大腿および上腕に作成した。これらの穴を、インサイチュ重合化フィブリンゲルで満たした。欠損を、空のままにし、ＴＩＳＳＵＣＯＬ（登録商標）で満たすか、またはＴＧＰＴＨを、重合化の前に４００μｇ／ｍＬでＴＩＳＳＵＣＯＬ（登録商標）フィブリンに添加した。ＴＩＳＳＵＣＯＬ（登録商標）が使用された各例において、これを、標準的な利用可能な濃度から４倍希釈し、１２．５ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲン濃度にした。
【００９２】
この欠損は、８週間で治癒し得た。この治癒期間の後、動物を屠殺し、骨サンプルを取り出してマイクロコンピュータトポグラフィー（μＣＴ）によって分析した。次いで、石灰化した骨組織で充填された欠損容積の割合を決定した。欠損が空のままの場合、フィブリンマトリクスの内部に石灰化した組織は形成しなかった。フィブリンゲルのみが添加された場合、同様に、実質的に骨は治癒されなかった。しかし、４００μｇ／ｍＬのＴＧＰＴＨを添加すると、石灰化した骨で欠損の３５％が充填され、治癒レベルは劇的に上昇した。
【００９３】
（実施例２：フィブリンマトリクスに結合した改変ＰＴＨ  １−３４での治癒応答）
（材料）
フィブリンマトリクス内に組み込まれ得る改変バージョンのＰＴＨ１−３４を、致命的な大きさのラット頭蓋欠損における治癒応答について試験した。
【００９４】
フィブリンゲルをＴＩＳＳＵＣＯＬ（登録商標）キット（Ｂａｘｔｅｒ  ＡＧ，ＣＨ−８６０４  Ｖｏｌｋｅｔｓｗｉｌ／ＺＨ）のフィブリン封入剤前駆体成分から作製した。フィブリノゲンを０．０３Ｍの滅菌Ｔｒｉｓ緩衝化溶液（ＴＢＳ、ｐＨ７．４）に希釈して約８ｍｇ／ｍＬの溶液を生成し、そして、トロンビンを５０ｍＭの滅菌ＣａＣｌ２溶液に希釈して２Ｕ／ｍＬ溶液を生成した。フィブリノゲンの最終濃度は、１：８オリジナルＴＩＳＳＵＣＯＬ（登録商標）処方物（約１００ｍｇ／ｍＬ）であり、そして１：１６０オリジナルＴＩＳＳＵＣＯＬ（登録商標）トロンビン濃度（約５００ＩＥ／ｍＬ）であった。次いで、前もって決定された量のＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４またはＴＧＰＴＨ１−３４をトロンビンに添加し、混合して均質な濃度を生成した。
【００９５】
フィブリンゲルを生成するために、希釈した前駆体をトロンビンを含むチューブ内にフィブリノゲンを注入することによって一緒に混合した。（以下に記載される）ヒツジドリル欠損の場合、次いで、直ちにこの混合物をヒツジ海綿骨内に形成されたドリル欠損内に注入し、ここで、１〜５分内にフィブリンゲルを形成した。動物実験の第１シリーズにおいて、皮質骨の治癒におけるＰＴＨ１−３４を含む融合タンパク質（ＮＱＥＱＶＳＰＬＹＫＮＲＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ、配列番号１８）の生理活性因子としての効力を、小動物モデルにおいて試験した。配列ＹＫＮＲ(配列番号１９)は、分解性の連鎖プラスミン（“ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４）を生じる。ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４は、化学合成により作製した。対イオンとしてＴＦＡを使用する逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム）を通して精製を完了し、ＴＦＡ塩である最終産物を得た。ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４の純度は９５％と決定した。
【００９６】
治癒応答を単治癒時間（３週間）および長治癒時間（７週間）の両方で調査し、治癒の亢進が観察され得るかどうかを決定した。
【００９７】
（ラットの致命的な大きさの頭蓋欠損）
ラットに麻酔し、頭蓋骨を露出した。頭蓋の外部表面の骨膜を撤回し、その結果、骨膜は治癒プロセスにおいて役割を果たさず、そして、単一の８ｍｍ円形欠損を生じた。８ｍｍより大きい欠損が自発的にそれ自身によって治癒されず、そして致命的な大きさの欠損であると以前に決定されたので、この欠損の大きさを選択した。次いで、この欠損を前もって形成したフィブリンマトリクスで充填し、そして動物を３および７週間治癒させた。次いで、この欠損領域を外植し、放射線学および組織学的に分析した。
【００９８】
（結果）
ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４を３週の時点で研究した場合、治癒のレベルは、フィブリンマトリクス単体で観察されるものと非常に類似した。他の潜在的なモルフォゲン（ｒｈＢＭＰ−２を含む）が３週までに強力な治癒効果を示したできるだけ早い時点として、３週の時点を選択した。対照的に、ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４についでの治癒効果は、この早い時点では観察され得なかった。しかし、より長い時点（７週）で分析される場合、フィブリンマトリクスに改変したＰＴＨ１−３４を添加する致命的な大きさのラット頭蓋欠損における治癒において、中程度用量に依存する改善が観察された。結果を表３に示す。高用量の改変ＰＴＨ１−３４を使用する場合、治癒応答は６５％まで上昇した。
（表３：ラットの頭蓋欠損における改変ＰＴＨでの治癒応答）
【００９９】
【表３】
2005517658.tif 000006
これらの結果は、ＰＴＨ１−３４がフィブリンマトリクスに組み込まれる場合に、骨形成における適度な増加によって証明されるようにいくらかの活性を保持することを実証する。
【０１００】
（ヒツジ骨ドリル欠損）
ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４を、骨治癒に関するこのホルモンの効果を調べるために、長い骨欠損モデルにおいても同様に試験した。ヒツジドリル欠損モデルにおいて、約１５ｍｍの深さの８ｍｍの円柱状のドリル欠損を、大腿骨および上腕骨の近位領域および遠位領域の両方に配置した。欠損を長骨の骨端に配置したので、この欠損は、欠損の周縁に皮質骨の薄層を有する小柱骨に囲まれた。次いで、これらの欠損を、種々の用量のＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４またはＴＧＰＴＨ１−３４を含むインサイチュ重合化フィブリン（約７５０μＬ）で充填した。動物を８週間治癒させ、次いで屠殺した。欠損をμＣＴおよび組織学で分析した。
【０１０１】
実験のこのシリーズについて、３つの型の組成物を試験した。１番目に、ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４を大きな濃度範囲にわたって試験した。２番目に、分解部位を有さず、アミノ末端にトランスグルタミナーゼ配列のみを有する別の改変ＰＴＨ１−３４、ＴＧＰＴＨ１−３４（ＮＱＥＱＶＳＰＬＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮ  ＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ；配列番号１７）を使用した。したがって、ＴＧＰＴＨ１−３４は、フィブリンマトリクス自身の分解によってのみ遊離され得る。ＴＧＰＴＨ１−３４を作製し、ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４と同様に精製した。純度は９５％であると決定した。効力を比較するために、ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４と同様の濃度であったいくつかの濃度でＴＧＰＴＨ１−３４を試験した。最後に、ＴＧＰＴＨ１−３４またはＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４のいずれかを有する顆粒状の物質の存在下でマトリクスを作製した。この顆粒状の物質は、ゲル化の間にマトリクス中に包埋された標準的なリン酸三カルシウム／ヒドロキシアパタイト混合物であった。ＰＴＨ１−３４の効力に対するこれらの顆粒の添加の効果を調べた。コントロールとして、改変していないフィブリンを試験した。
【０１０２】
（結果）
改変したＰＴＨ１−３４分子のいずれかを長骨欠損内に配置した場合、フィブリンマトリクス（コントロール）単独の使用よりも、治癒応答における有意な改善が観察された。フィブリン単独の使用では、ほとんど治癒せず、最初の欠損の２０％のみが新しく形成された骨で充填された。
【０１０３】
ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４を、２０〜１０００μｇ／ｍＬの濃度系列で試験した。試験した各用量について、治癒応答における有意な増加が観察された。例えば、１００μｇ／ｍＬのＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４を使用した場合、治癒率はほぼ６０％まで増加した。
【０１０４】
実験の第２シリーズにおいて、ＴＧＰＴＨ１−３４を試験した。ＴＧＰＴＨ１−３４の使用はまた、骨治癒を増加させた。例えば、４００μｇ／ｍＬの使用は、治癒応答を４０％まで改善し、そして１００μｇ／ｍＬの使用は、骨治癒を６５％まで増加させた。従って、ＰＴＨ１−３４改変配列のいずれかの添加は、コントロールよりも強力な治癒応答を生じた。
【０１０５】
最後に、改変ＰＴＨ１−３４分子のいずれかをマトリクスに結合し、顆粒／マトリクス混合物を使用した場合、ＰＴＨ１−３４の効力は維持された。これは、ＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４（表４参照）およびＴＧＰＴＨ１−３４（表５参照）の両方について試験した。
【０１０６】
（表４：フィブリンマトリクス中に組み込まれたＴＧ−ｐｌ−ＰＴＨ１−３４によるヒツジドリル欠損の治癒；治癒時間８週間）
【０１０７】
【表４】
2005517658.tif 000007
（表５：フィブリンマトリクス中に結合したＰＴＨ１−３４によるヒツジドリル欠損の治癒；治癒時間８週間）
【０１０８】
【表５】
2005517658.tif 000008
組織学的評価は、細胞外マトリクスに支持される紡錐体および骨芽細胞前駆体細胞の最初の欠損における高い浸潤を示した。大きな丸い骨芽細胞を有する活性類骨は一般的であり、軟骨内の骨化組織（軟骨細胞）の徴候が観察された。８週までに、破骨細胞および再造形の正常な徴候が見出され得た。しかし、合成ＰＴＨへの連続的な曝露から得られた結果とは異なり、破骨細胞からの顕性応答は観察されず、そして新骨形成が欠損領域の内部または周辺での吸収よりも有意に多かった。外来物体炎症性反応は観察されなかった（すなわち、巨細胞は存在せず、低刺激性の単球はわずかに存在した）。顆粒は、鉱物粒子（ｍｉｎｅｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）を添加してもなおサンプル中に存在した。
【０１０９】
（実施例３：合成マトリックスのための前駆体成分の調製）
（ＰＥＧ−ビニルスルホンの調製）
市販の分岐（４アームＰＥＧ，分子量１４，８００，４アームＰＥＧ，分子量１０，０００および８アームＰＥＧ，分子量２０，０００；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）を、ＯＨ末端で官能基化した。アルゴン雰囲気下で、（予め、分子ふるいを通して乾燥させた）前駆体ポリマーのジクロロメタン溶液をＮａＨと反応させ、次いで水素の放出後、ジビニルスルホン（モル比：ＯＨ  １：ＮａＨ  ５：ジビニルスルホン  ５０）と反応させることによって、ＰＥＧビニルスルホンを生成した。この反応を、室温で３日間、アルゴン下で、絶え間なく攪拌しながら行った。この反応溶液を、高濃度の酢酸で中和した後、この溶液を、透明になるまで紙を通して濾過した。この誘導体化ポリマーを、氷冷ジエチルエーテル中で沈殿によって単離した。この生成物を、ジクロロメタン中に再溶解し、（十分に洗浄して）ジエチルエーテル中に２回再沈殿させ、全ての過剰なジビニルスルホンを除去した。最終的に、この生成物を、真空下で乾燥させた。この誘導体化を、１Ｈ  ＮＭＲで確認した。この生成物は、６．２１ｐｐｍ（２つの水素）および６．９７ｐｐｍ（１つの水素）で、特徴的なビニルスルホンピークを示した。末端基変換の程度は、１００％と実測された。
【０１１０】
（ＰＥＧアクリレートの調製）
アルゴン雰囲気下で、共沸的に（ａｚｅｏｔｒｏｐｉｃａｌｌｙ）乾燥させた前駆体ポリマーのトルエン溶液を、トリエチルアミンの存在下でアクリロイルクロライドと反応させて（モル比：ＯＨ  １：アクリロイルクロライド  ２：トリエチルアミン  ２．２）、ＰＥＧアクリレートを生成した。この反応を、室温で暗所で一晩攪拌して進行させた。生じた淡黄色の溶液を、中性のアルミナベッドを通して濾過し；この溶媒をエバポレートした後、反応生成物をジクロロメタンに溶解し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。
【０１１１】
【化２】
2005517658.tif 000009
（ペプチド合成）
全てのペプチドを、自動化ペプチドシンセサイザー（９０５０  Ｐｅｐ  Ｐｌｕｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＵＳＡ）を用いて、標準的な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化学を用いて、固体樹脂上で合成した。疎水性スカベンジャーおよび分割された保護基を、冷ジエチルエーテル中でのペプチドの沈殿および脱イオン水中への溶解によって、除去した。凍結乾燥後、これらのペプチドを、０．０３Ｍトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ，ｐＨ７．０）に再溶解させ、移動緩衝液としてＴＢＳ，ｐＨ７．０を用いたサイズ排除カラムにおけるＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ；Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を使用して、精製した。
【０１１２】
（共役付加反応によるマトリックス形成）
ＭＭＰ感受性ゲルを、タンパク質分解性の細胞遊走を可能にするペプチド連鎖求核およびＰＥＧ連鎖共役不飽和を伴う共役付加によって、形成した。ゲルの合成を、ビニルスルホン官能基化ＰＥＧ上に、チオールＰＥＧのマイケル型付加反応を、全面的に介して達成した。第一工程において、接着ペプチドを、マルチアームＰＥＧビニルスルホンにペンダント状に付着させ（例えば、ペプチド
【０１１３】
【化３】
2005517658.tif 000010
（配列番号２０））、次いで、この前駆体を、ジチオール含有ペプチド（例えば、ＭＭＰ基質
【０１１４】
【化４】
2005517658.tif 000011
（配列番号２１））と架橋した。３次元インビトロ研究のための代表的なゲル調製において、４アームＰＥＧビニルスルホン（分子量１５０００）を、ＴＥＯＡ緩衝液（０．３Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解し、１０％（ｗ／ｗ）溶液を生じた。ゲル細胞接着性を与えるために、溶解したペプチド
【０１１５】
【化５】
2005517658.tif 000012
（配列番号２０））（同一緩衝液）を、この溶液に添加した。接着ペプチドを、３７℃で３０分間反応させた。その後、架橋ペプチド
【０１１６】
【化６】
2005517658.tif 000013
（配列番号２１））を、上記の溶液に混合し、ゲルを合成した。このゲル化は、数分以内に起こったが、完全反応を保証するために、この架橋反応を３７℃で１時間行った。
【０１１７】
ＭＭＰ非感受性ゲルを、非タンパク質分解性の細胞遊走を可能にする、ＰＥＧ連鎖求核試薬およびＰＥＧ連鎖共役不飽和を伴う共役付加によって形成した。
【０１１８】
このゲルの合成もまた、ビニルスルホン官能基化ＰＥＧ上に、チオールＰＥＧのマイケル型付加反応を、全面的に介して達成した。第一工程において、接着ペプチドを、マルチアームＰＥＧビニルスルホンにペンダント状に付着させ（例えば、ペプチド
【０１１９】
【化７】
2005517658.tif 000014
（配列番号２０））、次いで、この前駆体を、ＰＥＧジチオール（ｍ．ｗ．３．４ｋＤ）と架橋させた。３次元インビトロ研究のための代表的なゲル調製において、４アームＰＥＧビニルスルホン（分子量１５０００）を、ＴＥＯＡ緩衝液（０．３Ｍ，ｐＨ８．０）に溶解し、１０％（ｗ／ｗ）溶液を得た。ゲル細胞接着性を与えるために、溶解したペプチド
【０１２０】
【化８】
2005517658.tif 000015
（配列番号２０））（同一緩衝液）を、この溶液に添加した。この接着ペプチドを、３７℃で３０分間反応させた。その後、このＰＥＧジチオール前駆体を上記の溶液と混合し、ゲルを合成した。このゲル化は、数分以内に起こったが、完全反応を保証するために、この架橋反応を３７℃で１時間行った。
【０１２１】
（縮合反応によるマトリックス形成）
ＭＭＰ感受性ゲルを、タンパク質分解性の細胞遊走を可能にする、ペプチドＸリンカー含有複合アミンと親電子的活性ＰＥＧとの縮合反応によって形成した。
【０１２２】
ＭＭＰ感受性ヒドロゲルもまた、２つのＭＭＰ基質を含むＭＭＰ感受性オリゴペプチドと３つのＬｙｓ（
【０１２３】
【化９】
2005517658.tif 000016
（配列番号：２２））ならびに市販（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）の二官能性二重エステル（ｄｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｓｔｅｒ）ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ−ＨＢＳ−ＣＭ−ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ）との間の縮合反応を誘導することによって、生成した。第一工程において、接着ペプチド（例えば、ペプチド
【０１２４】
【化１０】
2005517658.tif 000017
）（配列番号：２０）を、ＮＨＳ−ＨＢＳ−ＣＭ−ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳの小画分と反応させ、次いでこの前駆体を、３つのεアミン（および１つの第一級アミン）を有するペプチド
【０１２５】
【化１１】
2005517658.tif 000018
（配列番号：２２）と混合することによって、網目構造に架橋させた。３次元インビトロ研究のための代表的なゲル調製において、両成分を、ｐＨ７．４の１０ｍＭ  ＰＢＳに溶解して１０％（ｗ／ｗ）溶液を生じ、そして少なくとも１時間以内にヒドロゲルを形成した。
【０１２６】
細胞または組織のような生物学的物質中に存在するアミンはまた、二官能性の活性化二重エステルと反応するので、マイケル型反応によって形成される現在のヒドロゲルとは対照的に、このアプローチにおける所望の自己選択性は保証されない。このことはまた、求電子機能性を有する他のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）またはＰＥＧニトロフェニルカーボネート）に対しても当てはまる。
【０１２７】
非タンパク質分解性の細胞遊走を可能にする、ＰＥＧ−アミン架橋および親電子的に活性なＰＥＧとの縮合反応によって、ＭＭＰ非感受性のヒドロゲルを形成した。ヒドロゲルはまた、市販の分岐ＰＥＧ−アミン（Ｊｅｆｆａｍｉｎｅｓ）と同様の二官能性の二重エステルＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ−ＨＢＳ−ＣＭ−ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳ）との間の縮合反応を行うことによって形成された。第１段階において、接着ペプチド（例えば、ペプチド
【０１２８】
【化１２】
2005517658.tif 000019
）（配列番号２０）をＮＨＳ−ＨＢＳ−ＣＭ−ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳの小画分と反応させ、次いで、この前駆体を多分岐（ｍｕｌｔｉａｒｍ）のＰＥＧ−アミンと混合することによって網目構造と架橋させた。三次元インビトロ研究のための代表的なゲル調製物において、両方の成分を１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、１０％（ｗ／ｗ）溶液を得、そして１時間以内にヒドロゲルを生成した。再度、細胞または組織のような生物学的物質中に存在するアミンはまた、二官能性の活性化二重エステルと反応するので、マイケル型反応によって形成される現在のヒドロゲルとは対照的に、このアプローチにおける所望の自己選択性は保証されない。このことはまた、求電子機能性を有する他のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）またはＰＥＧニトロフェニルカーボネート）に対しても当てはまる。
【０１２９】
（実施例４：合成酵素分解可能なマトリクスによる骨再生）
２つの異なる開始濃度の酵素分解可能なゲルを使用した。これらの各々において、ＲＧＤの濃度および活性因子（１００μｇ／ｍＬでのＣｐｌＰＴＨ）を一定に保った。分子量２０ｋＤ（各分岐の分子量は５ｋＤ）の４つのビニルスルホン末端基で官能基化されたＰＥＧから分岐した４つの分岐および以下の配列Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ）−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号２１）のジチオールペプチドから重合網目構造を形成した。両方の前駆成分を０．３Ｍのトリエタノールアミンに溶解した。官能基化ＰＥＧ（第１の前駆分子）およびジチオールペプチド（第２の前駆分子）の開始濃度を変化させた。１つの場合において、この濃度は組成物（第１および第２の前駆成分＋トリエタノールアミン溶液）の総重量の１２．６重量％であった。１２．６重量％は、第１の前駆成分のみに基づいて計算した場合、１０重量％溶液に対応する（１００ｍｇ／ｍＬ第１の前駆分子）。第２の開始濃度は、組成物（第１および第２の前駆成分＋トリエタノールアミン溶液）の総重量の９．５重量％であり、これは、総重量の第１の前駆成分のみに基づいて計算した場合、７．５重量％に対応する（７５ｍｇ／ｍＬ第１の前駆分子）。このことは、ビニルスルホンとチオールとの間のモル比が維持されるようにジチオールペプチドの量が変化したという結果を有する。
【０１３０】
１２．６重量％の開始濃度から開始したゲルは、重合網目構造＋水の総重量の８．９重量％の濃度まで膨潤し、従って、マトリクスは、９１．１の含水量を有した。９．５重量％の開始濃度から開始したゲルは、重合網目構造＋水の総重量の７．４重量％の最終濃度まで膨潤し、従って、マトリクスは、９２．６の含水量を有した。
【０１３１】
この変化の効果を調べるために、これらの物質をヒツジドリル欠損中で試験した。ここで、７５０μＬの欠損をヒツジ大腿骨および上腕骨の骨幹の海綿骨内に配置し、インサイチュゲル化酵素ゲルで充填した。以下の量の石灰化組織が得られた（μＣＴによって決定し、各群はＮ＝２）：
ゲルの開始濃度        石灰化組織
１２．６％            ２．７％  
９．５％          ３８．４％  
ゲルをより低密度にし、そして細胞浸透をより容易にすることによって、活性因子の添加により生じる治癒応答は、より強いものであった。８．５重量％より低い最終固体濃度を有することの効果は、これらの結果から明らかである。
【０１３２】
次いで、明確に、マトリクスの設計は、創傷欠損における治癒を可能にするのに重要である。これらのヒドロゲルの各々は、ポリエチレングリコールの巨大な鎖からなり、末端連結されて、マトリクスを形成した。しかし、それらがどのように、酵素分解部位、リンカーおよび幾つかの他の変数の密度を介して連結されたかの詳細は、機能的治癒応答を可能にするのに重要であった。これらの差は、ヒツジ穿孔欠損モデルにおいてかなり明確に観測された。
【０１３３】
（実施例５．合成加水分解可能マトリクスによる骨形成）
ＰＴＨ１−３４融合ペプチドを、合成ゲル、およびフィブリンマトリクスについて正確に記載されたヒツジ穿孔欠損モデルにおいて試験した。ヒドロゲルネットワークを、アクリル化４アームポリエチレングリコール（ＭＷ  １５，０００（Ｐｅｇ４*１５Ａｃｒ））と、ＭＷ  ３４００の線状ポリエチレングリコールジオールとを一緒に混合することにより作製した。Ｍｉｃｈａｅｌ型反応を介して、２つの成分が０．３Ｍトリエタノールアミンの緩衝液（ｐＨ８．０）中で混合される場合、このｐＨにおいて形成される得られるチオレートは、次いで、結合体化した不飽和のアクリレートと反応し、共有結合を生成し得た。多機能前駆体を一緒に混合する（例えば、合わされた多機能性は、５以上である）ことによって、ヒドロゲルが、形成される。さらに、生体活性因子は、同一の反応スキームを介して、マトリクスに付加され得る。この場合、生体活性因子（細胞接着動機、または形態学またはマイトジェン因子が挙げられる）は、システイン、チオール含有アミノ酸を配列に付加することによって、マトリクスに結合され得る。ここで、本発明者らは、細胞接着配列であるＲＧＤ、より具体的には、ＲＧＤＳＰ（配列番号２３）ならびにＰＴＨ１−３４配列にシステインを付加し、そして両方を、架橋剤中のアクリレートを介して、マトリクスに結合した。続いて、これらの新たに形成されたヒドロゲルは、次いで、チオール付近に多数のエステルを有し、このエステルは、加水分解的に不安定であることが示された。この不安定性は、ゲルがゆっくりと分解し、そして新たに形成された組織によって置換されることを可能にする。
【０１３４】
これらの粒子状ゲルは、マトリクスに共有結合したＲＧＤおよびＰＴＨにより加水分解可能であり、これらを、ヒツジ穿孔欠損モデルにおいて試験し、マトリクス結合Ｃ−ＰＴＨ１−３４の骨成長を増強させる能力を試験した。増強量を決定するために、０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬおよび４００μｇ／ｍＬのＰＴＨ１−３４融合ペプチドを、マトリクスに付加した。これを行った後、骨形成の増加を、ＰＴＨ１−３４の付加により観測した。各試験において、治癒応答を、８週間の同じ時点で測定した。これを空のままで残っている欠損と比較した。ＰＴＨ融合タンパク質を有さない合成加水分解可能マトリクスを、使用した場合、治癒応答は、約４０％であると測定された。このことは、４０％の元の欠損容積が、新たに形成された組織で満たされたことを意味する。次いで、４００μｇ／ｍＬの改変されたＰＴＨ１−３４融合ペプチドを使用した場合、治癒応答は、約６０％まで増加した。比較において、この欠損が、空のままである場合、約１０％が、石灰化組織で満たされた。このデータを以下の表６に示す。
【０１３５】
表６．改変されたＰＴＨの有無による、合成マトリクスによる治癒応答。
【０１３６】
【表６】
2005517658.tif 000020
空の欠損と比較して、加水分解可能なｐｅｇゲル単独の付加は、骨治癒において多大な効果を有し、石灰化組織の量を３００％増加した。ＰＴＨ１−３４をこのマトリクスに連結した場合、治癒は、マトリクスが単独で使用される場合より５０％高いレベルにまでさらに増加し、欠損が空のままである場合に得られる治癒レベルより５００％高かった。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、プラスミン分解ペプチド含有フィブリンゲルおよび遊離ペプチドの蛍光検出クロマトグラムである。組込まれたα２ＰＩ１−７−ＡＴＩＩＩ１２１−１３４ペプチド（−）、組込まれたペプチドを含む分解されたフィブリンゲルに添加された同じ遊離ペプチド（・・・）、および遊離ペプチド単独（−−）を用いる、分解されたフィブリンゲルのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。Ｎ−末端ロイシン残基を、ダンシル化（ｄＬと略される）した。遊離ペプチドは、凝固の間にフィブリンゲルに組込まれたペプチドより長い時間で溶出し（これは、より低い分子量に対応する）、このことは、分解されたフィブリンに対する共有結合、従って、第ＸＩＩＩａ因子活性の作用による共有結合的組込みを示す。
【図２】図２は、ｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１）の、外来性第ＸＩＩＩ因子が加えられたフィブリンゲルへの取込みのグラフである。１Ｕ／ｍＬが加えられる場合、組み込みレベルは、増加し、その結果、２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノゲンより上が達成され得た。
【図３】図３は、ビドメイン（ｂｉｄｏｍａｉｎ）ペプチドのｄＬＮＱＥＱＶＳＰＬＲＧＤ（配列番号１）の、未希釈フィブリングリューへの組み込みのグラフである。３つの別個のキットを試験し、そして各場合において高レベルの組み込みが観察され得、２５ｍｏｌペプチド／ｍｏｌフィブリノゲンに達した。最大組み込みに必要な外来性ペプチドの濃度は、おそらく生成される高密度のフィブリンマトリクス内の拡散限界に起因して、少なくとも５ｍＭであった。この組み込みレベルは、非常に一貫しており、各キットは、類似の組み込みプロフィールを提供した。
【配列表】
2005517658.tif 000021
2005517658.tif 000022
2005517658.tif 000023
2005517658.tif 000024
2005517658.tif 000025
2005517658.tif 000026
【図１】
2005517658.tif 000027
【図２】
2005517658.tif 000028
【図３】
2005517658.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月25日(2005.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005517658000001.app
【国際調査報告】
2005517658.tif 000030