(57)【要約】本発明は、ＧＬＰ−１化合物が塩基性ポリペプチドと複合体を形成している組成物を含む。該組成物は、長時間作用を与え、かつ肺経由で投与できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含有する組成物であって、粒子がポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、およびヒストンよりなる群から選択される塩基性ポリペプチドと複合体を形成したＧＬＰ−１化合物を含有し、かつ組成物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率が約４：１と約１０：１の間であり、組成物中の粒子の平均数直径が１μｍと５μｍの間である組成物。
【請求項２】
ＧＬＰ−１化合物が、以下の式ＩＩＩ（配列番号：３）で示されるペプチドを含有する、請求項１記載の組成物：
式ＩＩＩ：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39
Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-
40  41  42  43  44  45
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
（式中、７位のXaaは、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、または α-メチル-ヒスチジンであり、
８位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
９位のXaaは、Glu、Asp、Lys、Thr、Ser、Arg、Trp、Phe、Tyr、または Hisであり、
１１位のXaaは、Thr、Ala、Gly、Ser、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、His、または Lysであり、
１４位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
１２位のXaaは、His、Trp、Phe、または Tyrであり、
１６位のXaaは、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、His、Phe、または Lysであり、
１７位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
１８位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Pro、Arg、または Lysであり、
１９位のXaaは、Tyr、Phe、Trp、Glu、Asp、Gly、Gln、Asn、Arg、Cys、または Lysであり、
２０位のXaaは、Leu、Ala、Gly、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp、Met、または Lysであり、
２１位のXaaは、Glu、Asp、または Lysであり、
２２位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
２３位のXaaは、Gln、Asn、Arg、Glu、Asp、His、または Lysであり、
２４位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Glu、Asp、または Lysであり、
２５位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
２６位のXaaは、Lys、Arg、Gln、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、または Hisであり、
２７位のXaaは、Glu、Asp、Ala、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、Leu、または Lysであり、
３０位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、または Lysであり、
３１位のXaaは、Trp、Phe、Tyr、Glu、Asp、Ser、Thr、Arg、または Lysであり、
３２位のXaaは、Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
３３位のXaaは、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp、Arg、または Lysであり、
３４位のXaaは、Lys、Arg、Glu、Asp、Asn、または Hisであり、
３５位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、His、または Lysであり、
３６位のXaaは、Arg、Lys、Glu、Asp、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、Gly、または Hisであり、
３７位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Gly-Pro、Gly-Pro-NH2、-NH2であるか、または欠失しており、
３８位のXaaは、Arg、Lys、Glu、Asp、Ser、または Hisであるか、または欠失しており、
３９位のXaaは、Arg、Lys、Glu、Asp、Ser、または Hisであるか、または欠失しており、
４０位のXaaは、Asp、Glu、Gly、または Lysであるか、または欠失しており、
４１位のXaaは、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp、Ala、または Lysであるか、または欠失しており、
４２位のXaaは、Pro、Lys、Glu、または Aspであるか、または欠失しており
４３位のXaaは、Glu、Asp、Pro、または Lysであるか、または欠失しており
４４位のXaaは、Glu、Asp、Pro、または Lysであるか、または欠失しており、および
４５位のXaaは、Val、Glu、Asp、Ser、または Lysであるか、または欠失しており、
またはそのC-1-6-エステル、またはアミド、またはC-1-6-アルキルアミド、またはC-1-6-ジアルキルアミドである。
ただし、37、38、39、40、41、42、43、または44位のアミノ酸が欠失している場合、その下流の各アミノ酸もまた欠失しており、さらに、
ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、エキセンディン３またはエキセンディン４における対応するアミノ酸と６アミノ酸より多く相異ならない）。
【請求項３】
ＧＬＰ−１化合物が以下の式ＩＶ（配列番号：４）で示されるペプチドを含有する、請求項１記載の組成物：
式ＩＶ：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
His-Xaa-Glu-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37
Ile-Ala-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R
（式中、８位のXaaは、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、または Thrであり、
１１位のXaaは、Asp、Glu、Arg、Thr、Ala、Lys、または Hisであり、
１２位のXaaは、His、Trp、Phe、または Tyrであり、
１６位のXaaは、Leu、Ser、Thr、Trp、His、Phe、Asp、Val、Glu、または Alaであり、
２２位のXaaは、Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys、またはシステイン酸であり、
２３位のXaaは、His、Asp、Lys、Glu、または Glnであり、
２４位のXaaは、Glu、His、Ala、または Lysであり、
２６位のXaaは、Asp、Lys、Glu、または Hisであり、
２７位のXaaは、Ala、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、または Lysであり、
３０位のXaaは、Ala、Glu、Asp、Ser、または Hisであり、
３３位のXaaは、Asp、Arg、Val、Lys、Ala、Gly、または Gluであり、
３４位のXaaは、Glu、Lys、または Aspであり、
３５位のXaaは、Thr、Ser、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Asp、Gly、Pro、His、または Gluであり、
３６位のXaaは、Arg、Glu、または Hisであり、
RはLys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、NH2、Gly、Gly-Pro、または Gly-Pro-NH2であるか、または欠失している。
ただし、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨにおける対応するアミノ酸と６アミノ酸より多く相異ならない）。
【請求項４】
ＧＬＰ−１化合物が以下の式ＩＶ（配列番号：５）で示されるペプチドを含有する、請求項１記載の組成物：
式ＩＶ：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37
Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-R
（式中、８位のXaaは、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、または Thrであり、
１２位のXaaは、 12 is His、Trp、Phe、または Tyrであり、
１６位のXaaは、Leu、Ser、Thr、Trp、His、Phe、Asp、Val、Glu、または Alaであり、
２２位のXaaは、Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys、またはシステイン酸であり、
２３位のXaaは、His、Asp、Lys、Glu、または Glnであり、
２６位のXaaは、Asp、Lys、Glu、または Hisであり、
３０位のXaaは、Ala、Glu、Asp、Ser、または Hisであり、
３５位のXaaは、Thr、Ser、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Asp、Gly、Pro、His、または Gluであり、
R は Lys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、NH2、Gly、Gly-Pro、または Gly-Pro-NH2であるか、または欠失している。
ただし、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨにおける対応するアミノ酸と６アミノ酸より多く相異ならない）。
【請求項５】
ＧＬＰ−１化合物が以下の式ＶＩ（配列番号：６）で示されるペプチドを含有する、請求項１記載の組成物：
式ＶＩ：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Lys-Xaa-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37
Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
（式中、８位のXaaは、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、または Thrであり、
２２位のXaaは、Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys、または システイン酸であり、
２３位のXaaは、His、Asp、Lys、Glu、または Glnであり、
２７位のXaaは、Ala、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、または Lysであり、
３０位のXaaは、Ala、Glu、Asp、Ser、または Hisであり、
RはLys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、NH2、Gly、Gly-Pro、または Gly-Pro-NH2であるか、または欠失している。
ただし、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨにおける対応するアミノ酸と６アミノ酸より多く相異ならない）。
【請求項６】
ＧＬＰ−１化合物が以下の式ＶＩＩ（配列番号：７）で示されるペプチドを含有する、請求項１記載の組成物：
式ＶＩＩ：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37
Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
（式中、７位のXaaは、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンまたは α-メチル-ヒスチジンであり、
８位のXaaは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンであり、
２２位のXaaは、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、システイン、またはシステイン酸であり、
RはNH2 または Gly(OH)である。
ただし、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨにおける対応するアミノ酸と６アミノ酸より多く相異ならない）。
【請求項７】
８位のＸａａが、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンである、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ＧＬＰ−１化合物が以下の式ＩＩ（配列番号：２）で示されるペプチドを含有する、請求項１記載の組成物：
式ＩＩ：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
His-Xaa-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39
Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-
40  41  42  43  44  45
Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
（式中、８位のXaaはSerまたはGlyであり、かつ９位のXaaはAspまたはGluである）。
【請求項９】
ＧＬＰ−１化合物が以下よりなる群から選択される、請求項１記載の組成物：Val8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-37)OH、Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH、およびGly8-His37-GLP-1(7-37)OH。
【請求項１０】
ＧＬＰ−１化合物が以下よりなる群から選択される、請求項９記載の組成物：Val8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、およびVal8-His37-GLP-1(7-37)OH。
【請求項１１】
ＧＬＰ−１化合物がＶａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨである、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
ＧＬＰ−１化合物が、Ａｒｇ３４- Ｌｙｓ２６-(Ｎ-ε-(γ-Ｇｌｕ(Ｎ-α-ヘキサデカノイル)))-ＧＬＰ−１(7-37)ＯＨおよびＡｒｇ３４- Ｌｙｓ２６-ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨよりなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
塩基性ポリペプチドが、ポリアルギニン、プロタミン、およびポリリジンよりなる群から選択される、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
塩基性ポリペプチドがプロタミンである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
組成物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する重量比が約５：１（ｗ／ｗ）と約１０：１（ｗ／ｗ）の間である、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
組成物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する重量比が約６：１（ｗ／ｗ）と約１０：１（ｗ／ｗ）の間である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
組成物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する重量比が約５：１（ｗ／ｗ）と約１０：１（ｗ／ｗ）の間である、請求項１４記載の組成物。
【請求項１８】
組成物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する重量比が約７：１（ｗ／ｗ）と約９：１（ｗ／ｗ）の間である、請求項１６または１７記載の組成物。
【請求項１９】
粒子の数平均直径が約３μｍと約５μｍの間である、請求項１から１２、１４、１６、または１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
粒子の数平均直径が約１μｍと約３μｍの間である、請求項１から１２、１４、１６、または１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
粒子の数平均直径が約４μｍと約５μｍの間である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
組成物中の粒子の９０％が１２μｍ未満である、請求項１から１２、１４、１６、または１７記載の組成物。
【請求項２３】
組成物中の粒子の９０％が９μｍ未満である、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
組成物中の粒子の９０％が７μｍ未満である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
組成物中の粒子が約０．５μｍから約１２μｍの範囲の数直径を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項２６】
組成物中の粒子が約１μｍから約５μｍの範囲の数直径を有する、請求項１から１２、１４、１６、１７、２１、２２、２３、または２４記載の組成物。
【請求項２７】
組成物中の粒子が約１μｍから約３μｍの範囲の数直径を有する、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
粒子がさらに二価金属イオンを含有する、請求項１から２７いずれか記載の組成物。
【請求項２９】
二価金属イオンが亜鉛である、請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
亜鉛が約２：１（亜鉛：ＧＬＰ−１化合物）未満のモル比である、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
亜鉛が約１：６から約１：１（亜鉛：ＧＬＰ−１化合物）のモル比である、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
粒子が乾燥粉末である、請求項１から３１いずれか記載の組成物。
【請求項３３】
乾燥粉末が、ラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、スターチ、ソルビトール、ジフォスファチジルコリン、レシチン、アルギニン、グリシン、およびロイシン、またはその組み合わせよりなる群から選択される添加剤をさらに含有する、請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
乾燥粉末の真の密度が約１．２５ｇ／ｃｃと１．４５ｇ／ｃｃの間である、請求項３２記載の組成物。
【請求項３５】
乾燥粉末がエアロサイザーを使用して測定した場合に約３μｍから約５μｍの空気力学的粒子サイズを有する、請求項３２記載の組成物。
【請求項３６】
乾燥粉末がレーザー回折により計測した場合に約４μｍから約１８μｍの幾何学的粒子サイズを有する、請求項３２記載の組成物。
【請求項３７】
以下のステップを含む、請求項１から３６いずれか記載の組成物を作る製法：
ａ）ＧＬＰ−１化合物を含有するＧＬＰ−１溶液を調製し、
ｂ）ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、およびヒストンよりなる群から選択される塩基性ポリペプチドを含有する塩基性ポリペプチド溶液を調製し、
ｃ）エタノール、プロパノール、イソプロパノール、メタノール、またはその混合物よりなる群から選択されるアルコールをＧＬＰ−１溶液および塩基性ポリペプチド溶液のいずれかまたは両方に添加し、
ｄ）ＧＬＰ−１溶液を塩基性ポリペプチド溶液と混合する。
【請求項３８】
アルコールがエタノールである、請求項３７記載の製法。
【請求項３９】
エタノールの最終濃度が約０．２と約１０％（ｖ／ｖ）の間である、請求項３８記載の製法。
【請求項４０】
エタノールの最終濃度が約５％（ｖ／ｖ）である、請求項３９記載の製法。
【請求項４１】
ＧＬＰ−１化合物および塩基性ポリペプチドの溶液のｐＨ範囲が約６と約１０の間である、請求項３７記載の製法。
【請求項４２】
組成物に亜鉛を添加するステップをさらに含む、請求項３７から４１のいずれかに記載の製法。
【請求項４３】
粒子を乾燥するステップをさらに含む、請求項３７記載の製法。
【請求項４４】
粒子が噴霧乾燥される、請求項４３記載の製法。
【請求項４５】
請求項３７から４４いずれか記載の製法により作られた、請求項１から３６いずれか記載の組成物。
【請求項４６】
塩基性ポリペプチドと複合体を形成したＧＬＰ−１化合物を含有する組成物を投与する方法であって、有効量の組成物をそれを必要とする患者に肺手段によって投与するステップ含む方法。
【請求項４７】
組成物が患者の下気道まで送達される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
組成物が肺胞に堆積する、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
組成物が患者の口を介して吸入される、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
送達された組成物の少なくとも約１０％が肺に堆積する、請求項４６記載の方法。
【請求項５１】
組成物が、肺投与に適し、かつ該組成物を患者の肺に堆積できる吸入機器から送達され、請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
機器が、噴霧器、定量吸入器、乾燥粉末吸入器、およびスプレーヤよりなる群から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
機器が、乾燥粉末吸入器である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
機器の作動が、約１００μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇの組成物を投与する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
機器の作動が、約２００μｇ／ｋｇから約４００μｇ／ｋｇの組成物を投与する、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
請求項１から３６のいずれかに記載の組成物を投与する方法であって、有効量の組成物をそれを必要とする患者に肺手段によって投与するステップ含む方法。
【請求項５７】
組成物が患者の下気道まで送達される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
組成物が肺胞に堆積する、請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
組成物が患者の口を介して吸入される、請求項５６記載の方法。
【請求項６０】
送達された組成物の少なくとも約１０％が肺に堆積する、請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
組成物が、肺投与に適し、かつ該組成物を患者の肺に堆積できる吸入機器から送達され、請求項５６記載の方法。
【請求項６２】
機器が、噴霧器、定量吸入器、乾燥粉末吸入器、およびスプレーヤよりなる群から選択される、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
機器が、乾燥粉末吸入器である、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
機器の作動が、約１００μｇ／ｋｇから約５００μｇ／ｋｇの組成物を投与する、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
機器の作動が、約２００μｇ／ｋｇから約４００μｇ／ｋｇの組成物を投与する、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
糖尿病、高血糖、肥満、過敏性腸症候群、心筋梗塞、および脳卒中よりなる群から選択される病気を処置する方法であって、塩基性ポリペプチドと複合体を形成したＧＬＰ−１化合物を含有する組成物の有効量をそれを必要とする患者に肺経路により投与することを含む方法。
【請求項６７】
病気が糖尿病である、請求項６６記載の病気を処置する方法。
【請求項６８】
病気が肥満である、請求項６６記載の病気を処置する方法。
【請求項６９】
有効量が０．００１と１ｍｇ／ｋｇの間である、請求項６６記載の病気を処置する方法。
【請求項７０】
有効量が０．００５と１ｍｇ／ｋｇの間である、請求項６９記載の病気を処置する方法。
【請求項７１】
有効量が０．０１と１ｍｇ／ｋｇの間である、請求項７０記載の病気を処置する方法。
【請求項７２】
有効量が０．０１と０．５ｍｇ／ｋｇの間である、請求項７１記載の病気を処置する方法。
【請求項７３】
糖尿病、高血糖、肥満、過敏性腸症候群、心筋梗塞、および脳卒中よりなる群から選択される病気を処置する方法であって、請求項１から３６記載の組成物いずれかの有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項７４】
投与が肺経路による、請求項７３記載の病気を処置する方法。
【請求項７５】
有効量が０．００１と１ｍｇ／ｋｇの間である、請求項７３記載の病気を処置する方法。
【請求項７６】
有効量が０．００５と１ｍｇ／ｋｇの間である、請求項７５記載の病気を処置する方法。
【請求項７７】
有効量が０．０１と１ｍｇ／ｋｇの間である、請求項７６記載の病気を処置する方法。
【請求項７８】
有効量が０．０１と０．５ｍｇ／ｋｇの間である、請求項７７記載の病気を処置する方法。
【請求項７９】
病気が糖尿病である、請求項７３記載の病気を処置する方法。
【請求項８０】
病気が肥満である、請求項７３記載の病気を処置する方法。
【請求項８１】
哺乳類における糖尿病、高血糖、肥満、過敏性腸症候群、心筋梗塞、および脳卒中よりなる群から選択される病気の処置において医薬を調製するための、請求項１から３６のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項８２】
病気が糖尿病である、請求項８１記載の組成物の使用。
【請求項８３】
病気が肥満である、請求項８１記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト医薬品の分野におけるものである。特に、本発明は、２型糖尿病のような疾患の処置に有用な、長時間作用するグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）粒子の分野における。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年にわたり、糖尿病の処置を改善するための研究が続けられている。糖尿病患者の約９０％が、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としてもまた知られる２型糖尿病を患っている。２型糖尿病患者は一般に、依然としてインシュリンを作るが、体の細胞が効果的にそのインシュリンを使用できない。これは基本的に、血中糖レベルの上昇に応答して産生されるインシュリンの量が、細胞にグルコースを効率的に取り込めるようにし、その結果血中糖レベルを減少させるには十分でないことによる。
【０００３】
通常、ＮＩＤＤＭを患う人々は、始めは経口薬剤を服用することにより自らの血中グルコースレベルを調節できる。しかしながら、経口薬剤は、２型患者で起こるβ細胞機能の進行性喪失を遅くらせることがなく、これらの型の薬剤は最終的に血中グルコースレベルを調節するのに十分でなくなる。前臨床および臨床研究データの大部分は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）が、ＮＩＤＤＭの処置として特に経口剤が効かなく成り始めた場合に非常に将来性があることを示唆している。ＧＬＰ−１は、インシュリン分泌の刺激、グルカゴン分泌の誘導、胃内容排出の阻害、グルコース利用の増強、および体重減少の阻害のような、多様な生物学的効果を誘導する。さらに、前臨床研究は、ＧＬＰ−１が疾患が進行するにつれて起こるβ細胞損傷を防ぐよう働き得ることを示唆している。おそらく、ＧＬＰ−１の最も顕著な特徴は、インシュリン治療またはインシュリン発現を増加させることで働くいくつかの経口治療の型を用いた場合に見られる低血糖の危険性が関連することなく、インシュリン分泌を刺激するその能力である。
【０００４】
ＮＩＤＤＭが進行するにつれて、正常に近い血糖コントロールを達成し、それにより長期化した高血糖に関連する合併症を最小限に抑えることが非常に重要になる。ＧＬＰ−１は最適な薬物のように思われる。しかしながら、ＧＬＰ−１（１−３７）の活性が乏しいこと、および二つの天然切断型ペプチド、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨおよびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２が、インビボで急速に排出され、インビボ半減期が非常に短いということから、ＧＬＰ−１ペプチドを含む治療の有用性は制限されている。さらに、現在のＧＬＰ−１ペプチド製剤は経口投与できず、インシュリンのように注射しなければならない。従って、ＧＬＰ−１を含む治療に関する医学上の利点が明らかなのにもかかわらず、一日に何度も注射が必要な薬物という結果を招く短い半減期が、商業的開発努力を妨げていた。
【０００５】
一般に、患者を注射治療に移行させることは大変難しい。適性なグルコース制御を維持するのに必要な頻回注射に関連する不快感のため、多くの糖尿病患者はどんな型の集中注射治療であっても受けたがらない。さらに、インシュリンを常用している糖尿病患者は、一般に血中グルコースを監視する必要があり、それはさらに針を刺すことを含む。この型の治療は精神的にも肉体的にも痛みを伴う。これは、患者が疾患の進行中ずっと経口薬剤のみを処置されていた場合に特に当てはまる。
従って、注射の回数を減らしグルコースモニタリングをなくすよう、注射時に長時間作用を与えるＧＬＰ−１製剤を開発する必要があるだけでなく、肺経路のようなかわりの手段により送達でき、持続性薬物動態プロファイルを与えるＧＬＰ−１製剤を開発する必要がある。
【０００６】
いくつかのタンパク質が肺を通して吸収され得ることが長年知られている；しかしながらこの提示にも関わらず、肺送達は、治療用ペプチドの送達手段として広くは受け入れられなかった。これは、ペプチドを送達したときに生体利用効率の劇的な減少が起こり得ること、および吸収された特定ペプチドの量が、時間を異にして投与した同一投与量と比較しても、極度に変動しやすいためである。効率的なペプチドの肺送達は、ペプチドを深い肺胞上皮まで送達する能力に依存する。肺深くまで到達する前にペプチドがどの程度まで除かれるかは、粒子の大きさおよび空気力学的性質のような特徴に依存する。
【０００７】
ＧＬＰ−１分子をプロタミンのような塩基性ポリペプチドと複合体としたり、これら複合体を独自の粒子に組み込むことにより、本発明は、ＧＬＰ−１化合物の急速なクリアランスおよび短い半減期、およびペプチドが肺経路を介して送達された場合に起こり得る無効果および生体利用効率の減少、に関する問題を解決する。さらに本発明のＧＬＰ−１粒子は、肺送達した場合持続放出性を有する。
【０００８】
天然ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨがプロタミンと共に沈殿し得ることは当業界において知られている。ＥＰ６１９３２２は、天然ＧＬＰ−１およびプロタミンの水溶性懸濁液を示し、発明者らはそれが皮下注射した場合に長時間作用を有することを示唆している。さらに、Pridalらは、プロタミン-ＧＬＰ−１結晶について議論し、これら結晶の長時間作用は皮下注射部位からのそれらの吸収速度が遅いためであると述べている。 Pridal, et al. (1996) Intln. J. Pharm. 136:53-59。しかしながらこの著者らは、プロタミンに対するＧＬＰ−１の比率を、結果得られる結晶が効率的な肺送達に特に適する訳ではない大きさとなるような比率で用いている。Kimらもまた、天然ＧＬＰ−１とプロタミンの沈殿について議論している。Kim, et al. (1995) Pharm. Res. 12:1284-1288。この文献は、様々な賦形剤の存在下における天然ＧＬＰ−１のプロタミンに対するイソフェン比率の決定のみに焦点を合わせている。
【０００９】
しかしながら、このＧＬＰ−１プロタミン技術は本発明に含まれる独自の粒子および組成物を説明しない。これらの粒子および組成物は、それらを従来の沈殿化混合物と区別する大きさ、溶解特性、形態、および集団平均空気力学的直径、および他の空気力学的性質を有する。さらに、プロタミンのような塩基性ポリペプチドと複合体を形成したＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類縁体、またはＧＬＰ−１誘導体を含有する独自の粒子の混合物を含有する、本発明の乾燥粉末製剤を開示または提案する従来の参考文献は存在しない。これら粒子は十分小さく、かつそれらが肺深くに到達するような空気力学的性質を有し、それにより生体利用効率および吸収変動性に関する問題を減少させる。最も重要なのは、本発明の粒子およびその製剤が、肺送達された場合に持続性薬物動態プロファイルを有することである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の要約
その一態様において、本発明は、塩基性ポリペプチドと複合体を形成したＧＬＰ−１化合物を含有する粒子を含む組成物を提供する。塩基性ポリペプチドは、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、およびヒストンより成る群から選択される。組成物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する質量比は、約４：１と約１０：１の間である。粒子の数平均直径は、１μｍと５μｍの間である。
【００１１】
好ましくは、ＧＬＰ−１化合物は、以下の式ＩＩＩ（配列番号：３）で示されるペプチドを含む：
式ＩＩＩ：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39
Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-
40  41  42  43  44  45
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
（式中、７位のXaaは、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、または α-メチル-ヒスチジンであり、
８位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
９位のXaaは、Glu、Asp、Lys、Thr、Ser、Arg、Trp、Phe、Tyr、または Hisであり、
１１位のXaaは、Thr、Ala、Gly、Ser、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、His、または Lysであり、
１４位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
１２位のXaaは、His、Trp、Phe、または Tyr
１６位のXaaは、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、His、Phe、または Lysであり、
１７位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
１８位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Pro、Arg、または Lysであり、
１９位のXaaは、Tyr、Phe、Trp、Glu、Asp、Gly、Gln、Asn、Arg、Cys、または Lysであり、
２０位のXaaは、Leu、Ala、Gly、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp、Met、または Lysであり、
２１位のXaaは、Glu、Asp、または Lysであり、
２２位のXaaはGly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
２３位のXaaは、Gln、Asn、Arg、Glu、Asp、His、または Lysであり、
２４位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Glu、Asp、または Lysであり、
２５位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
２６位のXaaは、Lys、Arg、Gln、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、または Hisであり、
２７位のXaaは、Glu、Asp、Ala、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、Leu、または Lysであり、
３０位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、または Lysであり、
３１位のXaaは、Trp、Phe、Tyr、Glu、Asp、Ser、Thr、Arg、または Lysであり、
３２位のXaaは、Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり、
３３位のXaaは、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp、Arg、または Lysであり、
３４位のXaaは、Lys、Arg、Glu、Asp、Asn、または Hisであり、
３５位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、His、または Lysであり、
３６位のXaaは、Arg、Lys、Glu、Asp、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、Gly、または Hisであり、
３７位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Gly-Pro、Gly-Pro-NH2、-NH2であるか、または欠失しており、
３８位のXaaは、Arg、Lys、Glu、Asp、Ser、または Hisであるか、または欠失しており、
３９位のXaaは、Arg、Lys、Glu、Asp、Ser、または Hisであるか、または欠失しており、
４０位のXaaは、Asp、Glu、Gly、または Lysであるか、または欠失しており、
４１位のXaaは、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp、Ala、または Lysであるか、または欠失しており、
４２位のXaaは、Pro、Lys、Glu、または Aspであるか、または欠失しており
４３位のXaaは、Glu、Asp、Pro、または Lysであるか、または欠失しており
４４位のXaaは、Glu、Asp、Pro、または Lysであるか、または欠失しており、および、
４５位のXaaは、Val、Glu、Asp、Ser、または Lysであるか、または欠失しており、
またはそのC-1-6-エステル、またはアミド、またはC-1-6-アルキルアミド、またはC-1-6-ジアルキルアミドであり、
さらに37、38、39、40、41、42、43、または44位のアミノ酸が欠失している場合、その下流の各アミノ酸もまた欠失していることが条件であり、
かつ、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、エキセンディン３またはエキセンディン４における対応するアミノ酸と６アミノ酸より多く相異ならないことが条件である）。
【００１２】
好ましくは、塩基性ポリペプチドは、ポリアルギニン、プロタミン、およびポリリジンより成る群から選択される。
好ましくは、組成物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率は、約５：１と約１０：１の間である。より好ましくは、組成物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率は、約６：１と約１０：１の間である。最も好ましくは、組成物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率は、約７：１と約９：１の間である。
好ましくは、粒子の数平均直径は、３μｍと５μｍの間であり、組成物中の粒子の９０％が１２μｍ未満である。好ましくは、粒子の９０％が９μｍ未満であり、より好ましくは、７μｍ未満である。
【００１３】
粒子の組成物はさらに、例えば亜鉛のような二価金属イオンを、約２：１（亜鉛：ＧＬＰ−１化合物）未満のモル比で含むことができる。
粒子の組成物は、懸濁液、溶液、または乾燥粉末であってよい。好ましくは、その組成部は噴霧乾燥である。乾燥粉末は、約３μｍから約５μｍの空気力学的粒子サイズを有し、真の密度は、約１．２５ｇ／ｃｃと約１．４５ｇ／ｃｃの間である。
【００１４】
本発明はさらに、ＧＬＰ−１化合物を含有するＧＬＰ−１溶液を調製し、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、プロタミン、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、およびヒストンより成る群から選択される塩基性ポリペプチドを含有する塩基性ポリペプチド溶液を調製し、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、メタノール、またはその混合物よりなる群から選択されるアルコールを、ＧＬＰ−１溶液および塩基性ポリペプチド溶液のいずれか、または両方に添加することにより、組成物を作製する製法を提供する。ＧＬＰ−１溶液は塩基性ポリペプチド溶液と混合される。任意で、その組成物の混合物に亜鉛を添加できる。
【００１５】
本発明はさらに、塩基性ポリペプチドと複合体を形成したＧＬＰ−１化合物を含む組成物の有効量を、肺手段により患者に投与する方法を提供する。組成物は、例えば噴霧器、定量吸入器、乾燥粉末吸入器、およびスプレーヤのような吸入機器から送達することができる。好ましくは、その機器は乾燥粉末吸入器である。
本発明はさらに、本明細書に記載される組成物を使用して糖尿病、高血糖、肥満、過敏性腸症候群、心筋梗塞、または脳卒中を処置する方法を提供する。
本発明はさらに、哺乳類における糖尿病、高血糖、肥満、過敏性腸症候群、心筋梗塞、および脳卒中の処置における医薬を調製するための組成物の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳しい説明
本明細書で使用するアミノ酸のための三文字省略コードは、ＰＣＴ実施規則の別表２、付属書類Ｃの表３に含まれる一覧および３７ＣＦＲセクション１．８２２（ｄ）（１）（２０００）に従う。
【００１７】
本発明のＧＬＰ−１ペプチドは、当業界で知られる様々な方法によって作ることができ、例えば固相合成化学、天然資源からのＧＬＰ−１分子の精製、組換えＤＮＡ技術、またはこれらの方法の組み合わせである。例えば、ＧＬＰ−１ペプチドを調製する方法は米国特許番号5,118,666、5,120,712、5,512,549、5,977,071および6,191,102に記載されている。
【００１８】
本発明に包含される粒子およびその組成物には、ＧＬＰ−１化合物を含有する複合体が含まれる。「ＧＬＰ−１化合物」なる用語は、二つの天然切断型ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨおよびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２、エキセンディン３、エキセンディン４、その類縁体およびその誘導体を意味する。当業界の慣習に従い、ＧＬＰ−１化合物のＮ末残基は7位として表す。
【００１９】
二つの天然切断型ＧＬＰ−１ペプチドは、式Ｉ（配列番号：１）：
配列番号：１
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37
Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa
（37位のXaaはGlyまたは-NH2である）
として表される。
【００２０】
本発明に包含されるＧＬＰ−１化合物は、該化合物がＧＬＰ−１受容体に結合し、シグナル伝達経路を開始し、その結果膵臓のβ細胞によるインシュリン分泌を刺激する能力（インシュリン分泌性作用）を有するように、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの断片に対して十分な相同性を有する。好ましくは、ＧＬＰ−１化合物は配列番号：１のアミノ酸配列を有するか、配列番号：１と１から２、３、４または５アミノ酸が異なるよう改変されている。
【００２１】
当業界で知られるいくつかのＧＬＰ−１化合物には、例えばGLP-1(7-34)およびGLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)、およびLys18-GLP-1(7-37)が含まれる。GLP-1(7-34)およびGLP-1(7-35)のようなＧＬＰ−１化合物が米国特許番号5,118,666に開示されており、これは引用により本明細書に含まれる。他の既知の生物学的活性のあるＧＬＰ−１類縁体が、米国特許番号 5,977,071（引用により本明細書に含まれる）; 米国特許番号. 5,545,618（引用により本明細書に含まれる）; 米国特許番号. 5,705,483（引用により本明細書に含まれる）; 米国特許番号 5,977,071（引用により本明細書に含まれる）; 米国特許番号. 6,133,235（引用により本明細書に含まれる）およびAdelhorst, et al., J. Biol. Chem. 269:6275 (1994)（引用により本明細書に含まれる）に開示されている。
【００２２】
ＧＬＰ−１化合物にはまた、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはその断片もしくは類縁体のＮ末および／またはＣ末に、一つまたはそれ以上のアミノ酸が付加されているポリペプチドが含まれる。好ましくは、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのＮ末に１から６のアミノ酸が付加され、かつ／またはＣ末に１から８のアミノ酸が付加されている。この型のＧＬＰ−１化合物が有するアミノ酸は、最大約３９であることが好ましい。「延長」ＧＬＰ−１化合物中のアミノ酸は、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ中の対応アミノ酸と同じ番号により示される。例えば、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのＮ末端に二つのアミノ酸を付加することにより得られるＧＬＰ−１化合物のＮ末アミノ酸は５位であり、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのＣ末端にアミノ酸を一つ付加することにより得られるＧＬＰ−１化合物のＣ末アミノ酸は３９位である。延長ＧＬＰ−１化合物の１−６のアミノ酸は、ＧＬＰ−１（１−３７）ＯＨの対応する位置のアミノ酸と同じか、またはその保守的置換であることが好ましい。延長ＧＬＰ−１化合物の３８−４５のアミノ酸は、エキセンディン３またはエキセンディン４の対応する位置のアミノ酸と同じか、またはその保守的置換であることが好ましい。エキセンディン３およびエキセンディン４のアミノ酸配列は、式ＩＩ（配列番号：２）：
配列番号：２
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
His-Xaa-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39
Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-
40  41  42  43  44  45
Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
（8位のXaaはSerまたはGlyであり、９位のXaaはAspまたはGluである）
に表される。
【００２３】
本発明において保守的置換とは、あるアミノ酸を同じ正味電荷およびおよそ同じ大きさと形態を有する別のアミノ酸と置き換えることである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖の炭素およびヘテロ原子の総数が約４より多く異ならない場合、およそ同じ大きさを有する。それらは、その側鎖の分岐の数が一つより多く異ならない場合、およそ同じ形態を有する。その側鎖にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、およそ同じ大きさおよび形態を有すると考えられる。
【００２４】
ＧＬＰ−１化合物の好ましい群は、以下の式ＩＩＩ（配列番号：３）で示されるＧＬＰ−１類縁体またはそのC-1-6-エステル、もしくはアミド、もしくはC-1-6-アルキルアミド、もしくは C-1-6-ジアルキルアミドを含む：
配列番号：３
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Xaa-Asp-Xaa-Xaa-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39
Ile-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-
40  41  42  43  44  45
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa
（式中、７位のXaaは、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-
ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンまたはα-メチル-ヒスチジンであり、
８位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、またはLysであり、
９位のXaaは、Glu、Asp、Lys、Thr、Ser、Arg、Trp、Phe、Tyr、またはHisであり、
１１位のXaaは、Thr、Ala、Gly、Ser、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、His、またはLysであり、
１４位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、またはLysであり、
１２位のXaaは、His、Trp、Phe、またはTyrであり、
１６位のXaaは、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、Trp、His、Phe、または Lysであり、
１７位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、またはLysであり、
１８位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Pro、Arg、またはLysであり、
１９位のXaaは、Tyr、Phe、Trp、Glu、Asp、Gly、Gln、Asn、Arg、Cys、またはLysであり、
２０位のXaaは、Leu、Ala、Gly、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp、Met、またはLysであり、
２１位のXaaは、Glu、Asp、またはLysであり、
２２位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、またはLysであり、
２３位のXaaは、Gln、Asn、Arg、Glu、Asp、His、またはLysであり、
２４位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Glu、Asp、またはLysであり、
２５位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、またはLysであり、
２６位のXaaは、Lys、Arg、Gln、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、またはHisであり、
２７位のXaaは、Glu、Asp、Ala、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、Leu、またはLysであり
３０位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、またはLysであり、
３１位のXaaは、Trp、Phe、Tyr、Glu、Asp、Ser、Thr、Arg、またはLysであり
３２位のXaaは、Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp、または Lysであり
３３位のXaaは、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp、Arg、または Lysであり、
３４位のXaaは、Lys、Arg、Glu、Asp、Asn、または Hisであり、
３５位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Arg、Trp、Tyr、Phe、Pro、His、または Lysであり、
３６位のXaaは、Arg、Lys、Glu、Asp、Thr、Ser、Trp、Tyr、Phe、Gly、または Hisであり、
３７位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、His、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Gly-Pro、Gly-Pro-NH2、-NH2であるか、または欠失しており、
３８位のXaaは、Arg、Lys、Glu、Asp、Ser、または Hisであるか、または欠失しており、
３９位のXaaは、Arg、Lys、Glu、Asp、Ser、または Hisであるか、または欠失しており、
４０位のXaaは、Asp、Glu、Gly、または Lys、欠失しており、
４１位のXaaは、Phe、Trp、Tyr、Glu、Asp、Ala、または Lysであるか、または欠失しており、
４２位のXaaは、Pro、Lys、Glu、または Aspであるか、または欠失しており、
４３位のXaaは、Glu、Asp、Pro、または Lysであるか、または欠失しており、
４４位のXaaは、Glu、Asp、Pro、または Lysであるか、または欠失しており、および、
４５位のXaaは、Val、Glu、Asp、Ser、または Lysであるか、または欠失している。
ただし、37、38、39、40、41、42、43、または44位のアミノ酸が欠失している場合、そのアミノ酸の下流の各アミノ酸もまた欠失している）。
【００２５】
ＧＬＰ−１化合物の別の好ましい群は、以下の式ＩＶ（配列番号：４）で示されるＧＬＰ−１類縁体を含む：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
His-Xaa-Glu-Gly-Xaa-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Xaa-Ala-Xaa-Xaa-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37
Ile-Ala-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-R
（式中、８位のXaaは、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、または Thrであり、
１１位のXaaは、Asp、Glu、Arg、Thr、Ala、Lys、または Hisであり、
１２位のXaaは、His、Trp、Phe、または Tyrであり、
１６位のXaaは、Leu、Ser、Thr、Trp、His、Phe、Asp、Val、Glu、または Alaであり、
２２位のXaaは、Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys、またはシステイン酸であり、
２３位のXaaは、His、Asp、Lys、Glu、または Glnであり、
２４位のXaaは、Glu、His、Ala、または Lysであり、
２６位のXaaは、Asp、Lys、Glu、または Hisであり、
２７位のXaaは、Ala、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、または Lysであり、
３１位のXaaは、Ala、Glu、Asp、Ser、または Hisであり、
３３位のXaaは、Asp、Arg、Val、Lys、Ala、Gly、または Gluであり、
３４位のXaaは、Glu、Lys、または Aspであり、
３５位のXaaは、Thr、Ser、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Asp、Gly、Pro、His、または Gluであり、
３６位のXaaは、Arg、Glu、または Hisであり、
RはLys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、NH2、Gly、Gly-Pro、または Gly-Pro-NH2であるか、または欠失している）。
【００２６】
ＧＬＰ−１化合物の別の好ましい群は、以下の式Ｖ（配列番号：５）で示されるＧＬＰ−１類縁体を含む：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Xaa-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Xaa-Glu-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37
Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa-Arg-R
（式中、８位のXaaは、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、または Thrであり、
１２位のXaaは、 12 is His、Trp、Phe、または Tyrであり、
１６位のXaaは、Leu、Ser、Thr、Trp、His、Phe、Asp、Val、Glu、または Alaであり、
２２位のXaaは、Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys、またはシステイン酸であり、
２３位のXaaは、His、Asp、Lys、Glu、または Glnであり、
２６位のXaaは、Asp、Lys、Glu、または Hisであり、
３０位のXaaは、Ala、Glu、Asp、Ser、または Hisであり、
３５位のXaaは、Thr、Ser、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Asp、Gly、Pro、His、または Gluであり、
R は Lys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、NH2、Gly、Gly-Pro、または Gly-Pro-NH2であるか、または欠失している）。
【００２７】
ＧＬＰ−１化合物の別の好ましい群は、以下の式ＶＩ（配列番号：６）で示されるＧＬＰ−１類縁体含む：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Xaa-Ala-Ala-Lys-Xaa-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37
Ile-Xaa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
（式中、８位のXaaは、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、または Thrであり、
２２位のXaaは、Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys、または システイン酸であり、
２３位のXaaは、His、Asp、Lys、Glu、または Glnであり、
２７位のXaaは、Ala、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、または Lysであり、
３０位のXaaは、Ala、Glu、Asp、Ser、または Hisであり、
RはLys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、NH2、Gly、Gly-Pro、または Gly-Pro-NH2であるか、または欠失している）。
【００２８】
ＧＬＰ−１化合物の別の好ましい群は、以下の式ＶＩＩ（配列番号：７）で示されるＧＬＰ−１類縁体を含む：
7   8   9   10  11  12  13  14  15  16  17
Xaa-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-
18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-
29  30  31  32  33  34  35  36  37
Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
（式中、７位のXaaは、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンまたは α-メチル-ヒスチジンであり、
８位のXaaは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンである。好ましくは８位のXaaはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはスレオニンであり、
２２位のXaaは、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、システイン、またはシステイン酸である。
RはNH2 または Gly(OH)である）。
【００２９】
式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩで示される最も好ましいＧＬＰ−１化合物には、その類縁体または断片のバックボーンが８位にアラニン以外のアミノ酸を含むＧＬＰ−１類縁体（８位類縁体）が含まれる。８位において好ましいアミノ酸は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンである。より一層好ましいのは、天然ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＧＬＰ−１（７−３７）ＮＨ２、またはエキセンディン４における対応アミノ酸と６アミノ酸より多く異ならない、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩで示されるＧＬＰ−１化合物である。最も好ましくは、天然ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＧＬＰ−１（７−３７）ＮＨ２、またはエキセンディン４における対応アミノ酸と異なるアミノ酸が１から５の間である、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩで示されるＧＬＰ−１化合物である。
【００３０】
他の好ましいＧＬＰ−１化合物は、８位のアミノ酸が好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、２２位がグルタミン酸、リジン、アスパラギン酸またはアルギニンであり、より好ましくはグルタミン酸またはリジンであることを除き、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの配列を有するＧＬＰ−１類縁体である。
【００３１】
他の好ましいＧＬＰ−１化合物は、８位のアミノ酸が好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、３０位がグルタミン酸、アスパラギン酸、セリンまたはヒスチジンであり、より好ましくはグルタミン酸であることを除き、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの配列を有するＧＬＰ−１類縁体である。
【００３２】
他の好ましいＧＬＰ−１化合物は、８位のアミノ酸が好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、３７位がヒスチジン、リジン、アルギニン、スレオニン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンであり、より好ましくはヒスチジンであることを除き、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの配列を有するＧＬＰ−１類縁体である。
【００３３】
他の好ましいＧＬＰ−１化合物は、８位のアミノ酸が好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、２２位がグルタミン酸、リジン、アスパラギン酸またはアルギニンであり、より好ましくはグルタミン酸またはリジンであり、２３位がリジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸およびヒスチジンであり、より好ましくはリジンまたはグルタミン酸であることを除き、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの配列を有するＧＬＰ−１類縁体である。
【００３４】
他の好ましいＧＬＰ−１化合物は、８位のアミノ酸が好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、またはメチオニンであり、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、２２位がグルタミン酸、リジン、アスパラギン酸またはアルギニンであり、より好ましくはグルタミン酸またはリジンであり、２７位がアラニン、リジン、アルギニン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはヒスチジンであり、より好ましくはアラニンであることを除き、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの配列を有するＧＬＰ−１類縁体である。
【００３５】
本明細書でＧＬＰ−１化合物を示すのに使用する命名法においては、置換アミノ酸およびその位置は親構造の前に示される。例えば、Val8-GLP-1(7-37)OHは、GLP-1(7-37)OHの８位に通常見られるアラニンがバリンと置き換えられているＧＬＰ−１化合物を表す。
【００３６】
他の好ましいＧＬＰ−１化合物には以下のものが含まれる: Val8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-37)OH、Asp22-GLP-1(7-37)OH、Arg22-GLP-1(7-37)OH、Lys22-GLP-1(7-37)OH、Cys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Cys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Cya22-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Arg22-GLP-1(7-36)NH2、Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Cys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Cys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Cys22-GLP-1(7-36)NH2、Lys23-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys23-GLP-1(7-37)OH、His24-GLP-1(7-37)OH、Val8-His24-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His24-GLP-1(7-37)OH、Lys24-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys24-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys23-GLP-1(7-37)OH、Glu30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH、Asp30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Asp30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Asp30-GLP-1(7-37)OH、Gln30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Gln30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Gln30-GLP-1(7-37)OH、Tyr30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Tyr30-GLP-1(7-37)OH、Ser30-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ser30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Ser30-GLP-1(7-37)OH、His30-GLP-1(7-37)OH、Val8-His30-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His30-GLP-1(7-37)OH、Glu34-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu34-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu34-GLP-1(7-37)OH、Ala34-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ala34-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Ala34-GLP-1(7-37)OH、Gly34-GLP-1(7-37)OH、Val8-Gly34-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Gly34-GLP-1(7-37)OH、Ala35-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ala35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Ala35-GLP-1(7-37)OH、Lys35-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys35-GLP-1(7-37)OH、His35-GLP-1(7-37)OH Val8-His35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His35-GLP-1(7-37)OH、Pro35-GLP-1(7-37)OH、Val8-Pro35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Pro35-GLP-1(7-37)OH、Glu35-GLP-1(7-37)OH Val8-Glu35-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu35-GLP-1(7-37)OH、Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH、 Val8-His37-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-Glu23-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH、Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH、およびGly8-His37-GLP-1(7-37)OH。
【００３７】
より好ましいＧＬＰ−１化合物は、Val8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-37)OH、Lys22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH、Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH、Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH、Arg34-GLP-1(7-36)NH2、およびArg34-GLP-1(7-37)OHである。
【００３８】
本発明のＧＬＰ−１化合物にはまた、ＧＬＰ−１誘導体も含まれる。ＧＬＰ−１誘導体は、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類縁体のアミノ酸配列を有するが、さらにそのアミノ酸側鎖、α炭素原子、末端アミノ基、または末端カルボン酸基が一つまたはそれ以上化学修飾されている分子と規定される。化学修飾には、化学部分の付加、新規な結合の創出、および化学部分の除去が含まれるが、これらに限定されるものではない。アミノ酸側鎖の修飾には、リジンεアミノ基のアセチル化、アルギニン、ヒスチジン、またはリジンのN-アルキル化、グルタミンまたはアスパラギンカルボン酸基のアルキル化、およびグルタミンまたはアスパラギンの脱アミノ化が含まれるが、これらに限定されない。末端アミノ基の修飾には、デスアミノ、N-低アルキル、N-ジ-低アルキル、およびN-アシル修飾が含まれるが、これらに限定されない。末端カルボキシル基の修飾には、アミド、低アルキルアミド、ジアルキルアミド、および低アルキルエステル修飾が含まれるが、これらに限定されない。さらに、一つまたはそれ以上の側鎖または末端基は、タンパク質化学の当業者にとって既知の保護基によって保護できる。アミノ酸のα炭素はモノ-またはジ-メチル化されていてよい。好ましいＧＬＰ−１誘導体はArg34Lys26-(N-ε-(γ-Glu(N-α-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)である。
【００３９】
多くの公開された出願が、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類縁体、エキセンディン４およびエキセンディン４類縁体の誘導体について記載している。米国特許番号5,512,540、WO96/29342、WO98/08871、WO99/43341、WO99/43708、WO99/43707、WO99/43706、およびWO99/43705参照（引用により全体が本明細書に含まれる）。
【００４０】
「塩基性ポリペプチド」には、塩基性タンパク質またはポリアミンが含まれるが、それらに限定されない。塩基性タンパク質またはポリアミンの例は、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、プトレッシン、スペルミン、スペルミジン、およびヒストンである。好ましい塩基性ポリペプチドは、ポリアルギニン、プロタミン、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、およびポリオルニチンである。より好ましくは、ポリリジン、ポリアルギニン、およびプロタミンである。最も好ましくはプロタミンである。プロタミンは、精子細胞の核で核酸と塩様に組み合わさって存在する強塩基性タンパク質の群の一般名である。市販のプロタミンは成熟魚精子から単離することができ、通常硫酸塩として得られる。特定のプロタミンのペプチド組成物は、それが得られた魚のファミリー、属、または種に依存して様々であり得る。サケまたはマスから得られたプロタミンは、さらに分離可能な２、３、またはそれ以上の主要なタンパク質画分に分けることができる。この種々の親ペプチドは、アルギニンが２０より多い約３０アミノ酸より成る。プロタミンの平均分子量は、約４，３００である。市販のプロタミン硫酸塩はプロタミン約８０％である。
【００４１】
本明細書における「粒子」なる用語は、ＧＬＰ−１化合物および塩基性ポリペプチドを含有する固形物複合体を意味する。粒子は任意で二価金属イオンを含有することがある。粒子は、結晶もしくは非晶形物質、または結晶または非晶形物質の混合物を含有する。本明細書の結晶粒子は、基本的に個々のまたは塊の微結晶、棒、針または平板、またはその混合物を含有する。好ましくは、結晶粒子は平板様微結晶の小さな塊を含有する。最も好ましくは、結晶粒子は大きさおよび形態において均一（単一モード）であり、平板様微結晶の小さな塊として存在する。本発明の粒子は、約０．５μｍから約１２μｍの範囲の数直径を有する。粒子が約１μｍから約５μｍの範囲の数直径を有することが好ましい。より好ましくは、粒子は約１μｍから約３μｍの範囲の数直径を有する。組成物中の好ましい結晶粒子の数平均直径は、約１μｍから約５μｍである。より好ましくは、組成物中の好ましい結晶粒子の数平均直径は、約１μｍから約３μｍである。より好ましくは、組成物中の好ましい結晶粒子の数平均直径は、約３μｍから約５μｍである。より好ましくは、組成物中の好ましい結晶粒子の数平均直径は、約４μｍから約５μｍである。より好ましくは、その組成物中の粒子の９０％が１２μｍ未満である。より好ましくは、その組成物中の粒子の９０％が９μｍ未満であり、最も好ましくは、７μｍ未満である。直径は、コールターマルチサイザー II (Coulter Electronics Limited, Luton, Beds, England)を用いて測定した。コールターマルチサイザーは、電気的センシングゾーン法を用いている。粒子の大きさ、容積、および表面領域分布は、電解液に懸濁した非伝導性粒子により生じる電気抵抗における計測可能な変化に基づいて計算される。
【００４２】
本発明において非晶形粒子とは、沈殿物を含有するが、結晶状態および偏光顕微鏡により測定される定義可能な形態または構造の物質を欠く粒子を意味する。
【００４３】
本発明は、約４：１と約１０：１（重量対重量）（ｗ／ｗ）の間の比率、好ましくは約５：１と約１０：１（ｗ／ｗ）の間の比率、より好ましくは約６：１と約１０：１（ｗ／ｗ）の間の比率、そして最も好ましくは約７：１と約９：１（ｗ／ｗ）の間の比率（ＧＬＰ−１化合物：塩基性ポリペプチド）で一緒に加えられた、ＧＬＰ−１化合物および塩基性ポリペプチドより形成される粒子を包含する。
【００４４】
さらに本発明は、ある比率でＧＬＰ−１化合物と塩基性ポリペプチドを混合、沈殿化または結晶化することで形成された粒子が、別の比率でＧＬＰ−１化合物と塩基性ポリペプチドを混合、沈殿化または結晶化することで形成された粒子と混合されている、粒子調製物の混合物を包含し得る。
【００４５】
「溶解度」なる用語は、所定期間内にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解するであろう粒子形態のＧＬＰ−１化合物の量を意味する。乾燥粒子調製物をＧＬＰ−１化合物の最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁するか、あるいは実施例１および２に記載されるような濃縮ＧＬＰ−１粒子懸濁液をＧＬＰ−１化合物の最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようＰＢＳで希釈する。結果得られる懸濁液を室温で一時間穏やかに攪拌する。その後、ＵＶ吸収測定法により上清中のＧＬＰ−１化合物の濃度を計測することにより溶解度を測定する。本発明の粒子のＰＢＳにおける溶解度の範囲は、約０．５ｍｇ／ｍｌから約０．１ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００４６】
任意で、本発明の粒子はさらに亜鉛のような二価金属イオンを含むことがある。好ましくは、亜鉛は約２：１（亜鉛：ＧＬＰ−１化合物）未満のモル比で存在する。最も好ましくは、亜鉛は約１：６から約１：１（亜鉛：ＧＬＰ−１化合物）のモル比で存在する。亜鉛を添加すると、粒子の溶解度が０．２ｍｇ／ｍｌ未満に、場合によっては０．１ｍｇ／ｍｌ未満に減少する。
【００４７】
上記の粒子は懸濁液または乾燥粉末として調製できる。本発明の乾燥粉末は、ＧＬＰ−１化合物および塩基性ポリペプチドならびに任意で亜鉛の懸濁液または溶液から形成される。
【００４８】
懸濁液中の粒子の調製
本発明の粒子は、ＧＬＰ−１化合物溶液を塩基性ポリペプチド溶液と混合することにより調製できる。ＧＬＰ−１化合物溶液は、緩衝化溶液であることが好ましく、選択した緩衝剤にＧＬＰ−１化合物を溶解することにより調製する。緩衝剤の例には、ＴＲＩＳ、グリシン、アルギニン、およびリン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。好ましい緩衝剤はＴＲＩＳである。緩衝剤の濃度は、化学反応の結果としてさもなければ起こるであろう水素イオン濃度の変化が最小限となるような濃度でなければならない。ＧＬＰ−１溶液のｐＨは約ｐＨ６から約ｐＨ１０であり、好ましくは約ｐＨ７から約ｐＨ１０であり、より好ましくは約ｐＨ８から約ｐＨ１０であり、そして最も好ましくは約ｐＨ９から約ｐＨ１０である。ＧＬＰ−１化合物溶液のｐＨは、緩衝化ＧＬＰ−１溶液中に溶解し、かつ溶解したままであろうＧＬＰ−１化合物の量を最適化するように溶解された、ＧＬＰ−１化合物の等電点（ｐＩ）に基づいて調節できる。例えば、Val8-GLP-1(7-37)OHは、ＴＲＩＳ緩衝化溶液にｐＨを９．０に調節して溶解することが好ましい。
【００４９】
塩基性ポリペプチド溶液は、選択した緩衝剤に塩基性ポリペプチドを溶解することにより調製された緩衝化溶液であることが好ましい。緩衝剤の例には、ＴＲＩＳ、グリシン、アルギニン、およびリン酸塩が含まれるが、これらに限定されない。好ましい緩衝剤はＴＲＩＳである。緩衝剤の濃度は、化学反応の結果としてさもなければ起こるであろう水素イオン濃度の変化が最小限となるような濃度でなければならない。緩衝化塩基性ポリペプチド溶液のｐＨは約ｐＨ６から約ｐＨ１０であり、好ましくは約ｐＨ７から約ｐＨ１０であり、より好ましくは約ｐＨ８から約ｐＨ１０であり、そして最も好ましくは約ｐＨ９から約ｐＨ１０である。溶液中の塩基性ポリペプチドの濃度は約１．０から約２０．０ｍｇ／ｍｌである。しかしながら最終的には、塩基性ポリペプチドの濃度は、塩基性ポリペプチド溶液がＧＬＰ−１化合物溶液に添加された場合に、ＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する所望の比率が達成されるような濃度であろう。例えば、プロタミンはＴｒｉｓ緩衝化溶液にｐＨ９．０で溶解することが好ましい。
【００５０】
粒子形成を誘導し、かつ粒子の反応槽への付着を減らすため、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびメタノール、またはそれらの混合物より成る群から選択されるアルコールを、緩衝化ＧＬＰ−１化合物溶液、緩衝化塩基性ポリペプチド溶液または両溶液、のいずれかに添加する。緩衝化ＧＬＰ−１化合物溶液と緩衝化塩基性ポリペプチド溶液を混合すると、アルコールの最終濃度が約０．２から約１０％（容積対容積）（ｖ／ｖ）となることが好ましい。最も好ましいのは、約４％と５％（ｖ／ｖ）の間のエタノール濃度である。
【００５１】
本発明の粒子は、緩衝化ＧＬＰ−１化合物溶液を緩衝化塩基性ポリペプチド溶液と混合することにより調製する。はじめに非晶形沈殿物の懸濁液が形成される。しかしながら、本来結晶性粒子が望ましい場合、懸濁液を約１８から２４時間インキュベートする。インキュベーション温度は重要ではないが、ペプチドの変性を避け、形成する結晶性マトリックスを保存するため、その温度は約５℃と約３５℃の間であることが好ましい。好ましくは、その温度は約２５℃である。インキュベーションの時間の長さおよび温度は、非晶形粒子、結晶性粒子、または非晶形および結晶性粒子の混合物が望ましいか否かに依存して様々であり得る。
【００５２】
混合して一緒にしようとするＧＬＰ−１溶液および塩基性ペプチド溶液の量は、最終混合物中のＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率が約４：１から約１０：１（ｗ／ｗ）の範囲となるように、各溶液中のＧＬＰ−１化合物および塩基性ポリペプチドおよびアルコールの濃度に依存して調節できる。驚くべきことに、ＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する最終比率は、粒子形態および懸濁液中の粒子の最終生成量に影響する。
【００５３】
例えば、一般的に個々のおよび塊の微結晶、棒、針、平板またはそれらの混合物を含む結晶性粒子が結果として生じる比率は、約５：１（ｗ／ｗ）（ＧＬＰ−１化合物：塩基性ポリペプチド）であるが、一方比率４：１（ｗ／ｗ）（ＧＬＰ−１化合物：塩基性ポリペプチド）ではさらに、微結晶、棒、針、および平板のより大きな塊が最終的に生じる。これらの型の結晶は注射可能型治療のための医薬組成物に製剤化できるが、より高いＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率から形成される、より小さな結晶ほどは、それらは一般的に肺送達に適していない。
【００５４】
約４：１と約５：１（ｗ／ｗ、ＧＬＰ−１化合物対塩基性ポリペプチド）の間の比率での粒子形成の生成量は、一般的に１００％に近い。しかしながら、結果として生成量は減少するが、ＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率を５：１（ＧＬＰ−１化合物：塩基性ポリペプチド）を上回るまで大きくすることがより一層好ましい。より高いＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率において最終的に得られる粒子は、典型的にはより小さく、従ってより肺送達に適している。
【００５５】
好ましくは、ＧＬＰ−１溶液中のＧＬＰ−１化合物および塩基性ポリペプチド溶液中の塩基性ポリペプチドの濃度は、ＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率が約６：１から約１０：１（ｗ／ｗ）、より好ましくは約７：１から約９：１（ｗ／ｗ）（ＧＬＰ−１化合物：塩基性ポリペプチド）の範囲であるよう調節する。これらの比率における粒子形成の生成量は９５％未満であり、通常９０％未満である。好ましくは、粒子の生成量は約８５％と約７５％の間である（実施例３参照）。例えば、沈殿化Val8-GLP-1(7-37)OHの生成量が減少する場合、即ちＧＬＰ−１の量と比較してより少ないプロタミンを加えた場合、大部分の粒子が約１μｍと約３μｍの間の直径を有するというように、粒子の大きさが減少する。
【００５６】
別の態様においては、生成量を改善し、かつＧＬＰ−１化合物粒子の溶解性を変化させるために、亜鉛のような二価金属イオンをＧＬＰ−１／プロタミン粒子の懸濁液に添加する（実施例１３参照）。本発明の粒子の溶解特性は、存在するＧＬＰ−１化合物の量に対して添加された亜鉛の量に依存して成立し得る。溶解特性を調節するこのような方法は有用であり、なぜなら粒子の溶解特性が送達部位での薬物放出速度を決定するためである。それ故、溶解特性を調節することによって薬物の薬物動態学的性質を調節できる。さらに、粒子の懸濁液を亜鉛溶液に浸すことにより、粒子形成を完成（即ちほぼ１００％）へもっていくことができる（実施例１３参照）。
【００５７】
亜鉛は塩として添加されることが好ましい。亜鉛塩の代表例には、酢酸亜鉛、臭化亜鉛、塩化亜鉛、フッ化亜鉛、ヨウ化亜鉛および硫酸亜鉛が含まれる。当業者は、本発明の粒子を作成するのに使用できる亜鉛塩がほかにも多く存在することを認識しているであろう。好ましくは、酸化亜鉛、酢酸亜鉛、または塩化亜鉛を使用する。ｐＨ約５と約６の間の緩衝化亜鉛溶液を、ＧＬＰ−１化合物／塩基性ポリペプチドの懸濁液に添加できることが好ましい。緩衝化亜鉛溶液にとって好ましい緩衝剤はグリシンである。ｐＨ約１と約２の間の酸性亜鉛溶液が粒子懸濁液に添加できることがより好ましい。亜鉛のＧＬＰ−１化合物に対する好ましい最終モル比は約２：１未満である。インキュベーションの時間は重要ではないが、一般的に懸濁液を亜鉛の存在下で約１８と約２４の間の時間、約５℃と約２５℃の間の温度でインキュベーションする。
【００５８】
従って、本発明の好ましい粒子は、ＧＬＰ−１化合物の塩基性ポリペプチドに対する比率が４：１（ｗ／ｗ）より大きく、好ましくは５：１より大きく、かつアルコールの濃度が約０．２％と約１０％（ｖ／ｖ）の間、好ましくは約４％と約５％（ｖ／ｖ）の間となるように、緩衝化ＧＬＰ−１化合物溶液を緩衝化塩基性ポリペプチド溶液およびアルコールと混合することによって調製する。はじめは粒子の生成量が約８０％と９５％の間であることが好ましい。粒子生成量を１００％へと後押しし、かつ粒子の溶解度を減少させるため、亜鉛を２：１（亜鉛：ＧＬＰ−１化合物）未満のモル比で添加する。
【００５９】
最終的に生じる粒子懸濁液は、塩基性ポリペプチドと複合体を形成したＧＬＰ−１化合物を含有する粒子、金属イオンと複合体を形成したＧＬＰ−１化合物を含有する粒子、および金属イオンおよび塩基性ポリペプチドの両方と複合体を形成したＧＬＰ−１化合物を比較的大量に含むのと同時に、粒子の生成量および各々添加された量に依存して、複合体を形成していないＧＬＰ−１化合物、複合体を形成していない塩基性ポリペプチド、および複合体を形成していない亜鉛を少量含む場合がある。
【００６０】
粒子懸濁液は、皮下または他の型の注射可能治療に適した組成物として使用できる。本発明の注射可能な医薬組成物は、製薬的に許容された保存剤を含有してよい。微生物混入を防ぐため、保存剤を本発明の医薬組成物に添加できる。保存剤の例には、ベンジルアルコール、フェノール、クロロクレゾール、m-クレゾール、o-クレゾール、p-クレゾール、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピロパラベン、ブチルパラベンおよびチモール、ならびにそれらの混合物が含まれる。より好ましい保存剤は、ベンジルアルコール、m-クレゾール、フェノール、メチルパラベンおよびそれらの混合物である。最も好ましい保存剤はm-クレゾールである。
【００６１】
あるいは、注射可能な組成物またはエアロゾルとして投与できるか、または粒子の乾燥粉末組成物へと噴霧乾燥できる溶液を形成するよう懸濁液を処理できる。溶液が望ましい場合、懸濁液のｐＨを調節することにより粒子の懸濁液を溶解できる。典型的には、ｐＨは粒子が溶解するまで減少させる。一般的に、6未満にｐＨを調節すると最終的に粒子が溶解する。より好ましいのはｐＨ５未満である。最も好ましいのはｐＨ４未満である。結果として投与直後に沈殿する溶液が形成される。沈殿物は溶液が生理的ｐＨにさらされたときに形成する。驚くべきことに、沈殿物の一部として再形成する粒子は、長時間作用を与える懸濁液中の粒子の溶解性を保持している。
本明細書に記載される粒子懸濁液または溶液は、エアロゾルとして肺経路を介して送達される組成物として使用できるか、またはその使用に適合できる。エアロゾルの肺投与のための様々な吸入機器が当業界にて知られている。これらの機器には、定量吸入器、噴霧器、スプレーヤ等が含まれる。
【００６２】
本発明の懸濁液または溶液は、定量吸入器（ＭＤＩ）で使用されるように製剤化することができる。ＭＤＩにおいては、推進剤、懸濁液または溶液、および何らかの賦形剤または他の添加剤が、液化圧縮ガスを含む混合物として容器中に含まれる。推進剤は、本目的で使用されるいずれの常套的物質であってもよく、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはヒドロカーボンであり、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノールおよび1,1,1,2-テトラフルオロエタン、HFA-134a (ヒドロフルロアルカン-134a)、HFA-227 (ヒドロフルロアルカン-227)等を含む。好ましくは、推進剤はヒドロフルオロカーボンである。懸濁液または溶液を推進剤中で安定化したり、活性剤を化学分解から保護したりする等のために、界面活性剤を選択することができる。適した界面活性剤には、ソルビタントリオレエート、大豆レシチン、オレイン酸などが含まれる。ある場合には、エタノールのような溶媒を使用して溶液エアロゾルを調製する。
【００６３】
本発明の懸濁液または溶液は、ジェット噴霧器または超音波噴霧器のような噴霧器で使用されるように製剤化することができる。典型的には、ジェット噴霧器においては、開口部からの高速空気ジェットを作り出すのに圧縮空気源を使用する。ガスが噴出し口を越えて拡散するので低圧領域が作り出され、このことが液体貯蔵部に接続されたキャピラリーチューブを介して懸濁液または溶液を引き出す。キャピラリーチューブからの液体蒸気は、チューブから出ると不安定なフィラメントおよび液滴へと細かく分かれ、エアロゾルを作り出す。所定のジェット噴霧器からの所望の動作特性を達成するため、各種の構造、流速、およびバッフル型が使用可能である。超音波噴霧器においては、振動機械エネルギーを作り出すのに高頻度電気エネルギーを使用し、典型的には圧電変換器を用いる。このエネルギーは、直接に、または結合（カップリング）流動体を介して、のいずれかにより製剤に伝達され、エアロゾルを作り出す。懸濁液または溶液はまた、賦形剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、界面活性剤、および安定化剤のような剤を含んでよい。安定化剤には、還元剤、バルクタンパク質、または炭水化物が含まれる。バルクタンパク質にはアルブミンが含まれる。典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコースなどが含まれる。界面活性剤は、エアロゾル形成における溶液の噴霧化によって起こるＧＬＰ−１化合物複合体の表面誘導凝集を減少させるか、または防ぐことができる。様々な常套的界面活性剤が使用可能であり、例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビタール脂肪酸エステルである。量は一般的に製剤の重量の０．００１と４％の間であろう。本発明のため特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０などである。
【００６４】
本発明の懸濁液または溶液は、圧力をかけて懸濁液または溶液を噴出し口から出すことにより、スプレーヤにおいて使用されるよう製剤化できる。噴出し口の大きさおよび構造、加える圧力、および液体供給速度は、所望のアウトプットおよび粒子の大きさを達成するように選択できる。電気スプレーが、例えばキャピラリーまたは噴出し口供給に関連する電場によって、生産可能である。懸濁液または溶液はまた、賦形剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、界面活性剤、および安定化剤を含んでもよい。
【００６５】
有利なことに、ＭＤＩ、噴霧器、またはスプレーヤにより送達された粒子は、粒子の大きさが約１０μｍ未満であり、好ましくは約１μｍから約５μｍの範囲である。
【００６６】
しかしながら、乾燥粉末吸入器における肺送達に適した粒子の乾燥粉末組成物を提供するため、本明細書に記載される粒子懸濁液または溶液をさらに処理することが好ましい。
【００６７】
噴霧乾燥粉末の調製
本発明の好ましい態様は、本明細書に記載される懸濁液または溶液中で塩基性ポリペプチドと複合体を形成したＧＬＰ−１化合物より形成される乾燥粉末である。乾燥粉末は、粒子懸濁液または溶解粒子溶液を噴霧乾燥することにより調製できることが好ましい。噴霧乾燥粉末は、Ｂｕｃｈｉ１９１ラブトップスプレー乾燥機を使用して調製することができる。懸濁液または溶液は、約１２０℃から約２００℃の間の注入温度で噴霧乾燥できる。乾燥工程中の放出温度は約５０℃と約１００℃の間である。吸引設定は約２０ｍｂａｒと約６０ｍｂａｒの間であり、窒素流量は約４００Ｌ／時間と約６００Ｌ／時間の間であり、供給は約３ｍＬ／分と約８ｍＬ／分の間である。粉末は収集機またはサイクロンにより回収できる。良い分散特性を有する粉末を得るため、注入乾燥温度は約２００℃である。他の噴霧乾燥パラメーターには、約６００Ｌ／時間の窒素流量、約８０％と約１００％の間の窒素吸引率、および約５ｍＬ／分の試料導入流速または供給が含まれる。
【００６８】
好ましくは、噴霧乾燥の前にＧＬＰ−１化合物の最終濃度が８ｍｇ／ｍｌ未満になるように粒子懸濁液または溶解粒子溶液を希釈する。希釈体は、水、緩衝剤、充填剤、担体、賦形剤、他の添加剤などであってよい。添加剤は、特定の粉末吸入器からの送達に必要な場合粉末を希釈するため、製剤の処理を促進するため、製剤に有利な粉末性質を与えるため、吸入機器からの粉末の分散を促進するため、製剤を安定化するため（例えば抗酸化剤または緩衝剤）、製剤に味を与えるため、等のために乾燥粉末に含めることができる。有利なことに、添加剤は患者の気道に悪影響を与えない。典型的な添加剤には、モノ、ジ、およびポリサッカライド；糖アルコールおよび他のポリオール、例えば、ラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、スターチ、またはそれらの組み合わせ; 界面活性剤、例えばソルビトール、ジフォスファチジルコリンまたはレシチン; アミノ酸、例えばアルギニン、グリシン、およびロイシンなどが含まれる。典型的には、充填剤のような添加剤は上記目的に効果的な量で存在し、大抵製剤の重さの約５０％から約９０％である。
【００６９】
驚くべきことに、噴霧乾燥の前に懸濁液または溶液中にアミノ酸を用いると分散が最大化され、かつ注入温度を２００℃から約１２０℃まで減少できる。この温度減少によりＧＬＰ−１化合物にかかる熱ストレスが減少し、安定性がよりよくなる。分散を最大化し乾燥工程中の注入温度の減少を許容するのに好ましいアミノ酸はグリシンおよびロイシンである。より好ましいのはロイシンであり、その比率は約３：１から約１：３（ｗ／ｗ）（ＧＬＰ−１化合物：ロイシン）の間である。
【００７０】
あるいは、乾燥、ろ過または凍結乾燥により乾燥粉末が得られる。ろ過による乾燥は、実施例２０に記載するように行うことができる。ＧＬＰ−１化合物粒子懸濁液は、ガラスフィルターを通してろ過しアルコールで洗浄することができる。粒子は室温で穏やかな陰圧下で乾燥する。凍結乾燥は、実施例２１に記載されるように行うことができる。ＧＬＰ−１化合物粒子懸濁液はアルコールドライアイス浴を使用して凍結できる。その後粒子を乾燥するのに十分な時間陰圧下で凍結懸濁液を乾燥する。
【００７１】
乾燥粉末は、乾燥粉末吸入器により肺経路を介して送達される組成物として使用できるか、またはその使用に適合できることが好ましい。肺経路による投与に有利なことに、乾燥粉末は、エアロザイザーで測定した場合に約１０μｍ未満、より好ましくは約１μｍから約５μｍ、最も好ましくは約３μｍから約５μｍの、好ましい空気力学的粒子サイズを有する。この好ましい粒子の大きさは患者の肺の肺胞への送達に効果的である。乾燥粉末は、粒子の大部分が所望の範囲の大きさ有するように製造された粒子により主として構成されることが好ましい。有利なことに、乾燥粉末の少なくとも約５０％が直径約１０μｍ未満である粒子でできている。乾燥粉末はまた、レーザー回折により測定した場合に約４μｍから約１８μｍの幾何学的粒子サイズを有するとして特徴づけることもできる。乾燥粉末の真の密度は約１．２５ｇ／ｃｃと１．４５ｇ／ｃｃの間である。ＰＢＳにおける乾燥粉末の溶解度は、約０．５ｍｇ／ｍｌから約０．０５ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、ヒトのような哺乳類において、糖尿病、高血糖、肥満 (WO 98/19698参照)、過敏性腸症候群 (WO 99/64060参照)を処置するために使用できるか、またはそれらを処置するための医薬としての使用のため製造できるか、あるいは心筋梗塞 (WO 98/08531参照)および脳梗塞( WO 00/16797参照)、および術後起こる異化変化 (米国特許番号6,006,753参照)、または関係ある病気に関する疾病率および死亡率を減少させるために使用することができる。非インシュリン依存性糖尿病の進展の危険性のある者もまた含まれる( WO 00/07617参照)。
【００７３】
ＧＬＰ−１を投与した場合に観察されている副作用には、吐き気および嘔吐が含まれる。これは投与後すぐに得られる化合物の初期のピークレベルのためと考えられている。短時間作用製剤に治療上の利点を与えるため、少なくとも食後のグルコース低下効果を達成するのに十分なだけ長く治療範囲内の血中レベルを与えるのに十分なほど高用量で注射しなければならない。これまで、これは相当高い薬物のピークレベルが達成されるようにＧＬＰ−１を投与することによってのみ達成されていた。
【００７４】
投与すると、粒子組成物は長期化したインビボ半減期および循環からのＧＬＰ−１化合物のゆっくりとしたインビボクリアランス与える。さらに、本発明に包含される粒子組成物は、サルにおける肺送達後長時間作用を示し、ＧＬＰ−１はかなり変化の少ない血漿プロファイルを８時間より長く維持する。本発明の粒子の肺送達は、投与に続く血漿中におけるＧＬＰ−１のするどいピークとは関係がなく、従って、吐き気や嘔吐のような副作用を回避する。さらに、ラットへの気管内注入により投与された粒子懸濁液は、ＧＬＰ−１化合物の血中レベルが投与後少なくとも６時間は比較的一定した検出可能なレベルになるという結果をもたらす（実施例１５および１６参照）。
【００７５】
本発明の組成物の用量は、特定の組成物におけるＧＬＰ−１化合物の効力および生物学的利用能に依存する。一般に、肺経路によって送達する場合、本発明の組成物は皮下によって送達された化合物の約１０％から約５０％の生物学的利用能を有するであろう。しかしながら、肺投与後の生物学的利用能をさらに増加するために、ジケトピペラジンのようなエンハンサーを添加することができる。
【００７６】
本発明の医薬組成物中のＧＬＰ−１化合物は、約０．００１ｍｇから約２ｍｇ（哺乳類の体重１ｋｇあたり）の用量範囲でこのような処置を必要とする哺乳類に投与できる。当業者は、患者、それらの病気、および投与方法および達成されるべき特定の血漿レベルに依存して、より小さい、またはより大きい用量もまた実施可能であることを認識しているであろう。好ましい用量範囲には、０．００１から１ｍｇ／ｋｇ、０．０１から１ｍｇ／ｋｇ、０．０１から０．１ｍｇ／ｋｇ、および０．２から０．８ｍｇ／ｋｇが含まれる。より好ましい用量範囲には、０．００１から１ｍｇ／ｋｇ、０．００５から１ｍｇ／ｋｇ、０．０１から１ｍｇ／ｋｇ、および０．０１から０．５ｍｇ／ｋｇが含まれる。
【００７７】
本発明の医薬組成物における粒子の質量に基づき、この処置を必要とする哺乳類、例えばヒトに対して約０．０１ｍｇから約２０ｍｇの全用量範囲で投与できる。当業者は、患者、それらの病気および投与方法に依存して、より小さい、またはより大きい全用量もまた実施可能であることを認識しているであろう。好ましい全用量範囲には、０．０１ｍｇから１０ｍｇ、０．１から１０ｍｇ、１から８ｍｇおよび２から６ｍｇが含まれる。
【００７８】
サルにおいて観察されたように、本発明に包含される粒子組成物は、肺送達された場合８時間より長い作用持続時間を有する。従って、肺経路を介して本発明の組成物を投与する方法は、最も好ましくは一日に一回適切な用量を投与することを伴う。投与は一日２回、または一日３回であってもよく、かつ食事に関連し得る。さらに、本発明の組成物を使用した処置方法は、一日１回、２回または３回投与し、続いて晩就寝前に投与することを含み得る。
【実施例】
【００７９】
実施例１
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１最終濃度４ｍｇ／ｍｌを達成するようＶａｌ８−ＧＬＰ−１を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して緩衝化Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ溶液１２．１ｍｌを調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．０に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
【００８０】
プロタミンの最終濃度０．６ｍｇ／ｍｌを達成するよう、プロタミン硫酸塩を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して緩衝化プロタミン硫酸塩溶液１０ｍｌを調製した。５Ｎ ＨＣｌでｐＨを９．０に調節した。無水エタノールを濃度５％（ｖ／ｖ）まで緩衝化プロタミン硫酸塩溶液に添加した（無水エタノール０．０５ｍｌを緩衝化プロタミン硫酸塩溶液１ｍｌに添加した）。その結果生じる溶液をろ過し、１ｍｌをＶａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ溶液１ｍｌに添加し、２５℃でインキュベートした。２４時間後、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１およびプロタミンを含有する粒子懸濁液が形成された。反応中のＶａｌ８−ＧＬＰ−１全量に対し上清中のＶａｌ８−ＧＬＰ−１量を計測して生成量を決定し、それはおよそ９０％から９５％であった。偏光顕微鏡は平板様結晶の小さい塊を含む粒子を示した。粒子の数平均直径は、コールターマルチサイザーＩＩ（Coulter Electronics Limited, Luton, Beds, England）で測定すると４．１μｍで、９０％が７．７μｍ未満であった。典型的には計測のため懸濁液を電解培地に２５０倍に希釈する。粒子は二本の電極の間に位置する小さい穴を通るときに数えられ大きさが決められる。抵抗における変化は粒子の容積に直接比例し、所定の大きさでのパルスの数は大きさ分布を生み出す。大きさは、検出されたのと同じ容積を有する同等の球の直径として計算される。器具は、球形粒子より構成される粒子サイズの基準により較正する。
【００８１】
実施例２
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
２ｇのＶａｌ８−ＧＬＰ−１を２３０ｍｌの２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して緩衝化Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．５に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。ＵＶ計測によりＶａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨは６．３ｍｇ／ｍｌと決定された。
【００８２】
緩衝化プロタミン硫酸塩溶液は、最終濃度３．０４ｍｇ／ｍｌとなるよう１．２１６ｇｍのプロタミン硫酸塩を４００ｍＬの水に溶解して調製した。およそのプロタミン濃度はプロタミン硫酸塩濃度の８０％である。それゆえ、プロタミン濃度はおよそ２．４ｍｇ／ｍＬである。最終プロタミン濃度をおよそ０．８５ｍｇ／ｍＬにするため、８５ｍＬのプロタミン硫酸塩溶液を、１２６ｍＬの水、および９．６ｍＬの０．５Ｍ ＴＲＩＳ緩衝溶液、および１９．２ｍＬの無水エタノールで希釈した。５Ｎ ＮａＯＨでｐＨを９．６に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
【００８３】
２５℃において、約２３０ｍＬのＶａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ溶液を約２３０ｍＬのプロタミン溶液と一緒にした。２４時間後、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１およびプロタミンを含有する粒子の懸濁液が形成された。偏光顕微鏡は平板様結晶の小さな塊を含む粒子を示した。粒子の数平均直径は、コールターマルチサイザーＩＩ（Coulter Electronics Limited, Luton, Beds, England）で測定すると３．４μｍであり、９０％が６．２μｍ未満であった。
【００８４】
実施例３
相異なる比率を用いて形成されるＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
実施例１に示すようにＶａｌ８−ＧＬＰ−１およびプロタミン溶液を別々に調製した。その後、相異なるＶａｌ８−ＧＬＰ−１：プロタミン比率を得るため相異なる容積の溶液を一緒にした。ＧＬＰ−１化合物とプロタミンの相異なる比率を使用することの粒子生成量における効果は以下の表に示される。
【表１】
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実施例１に記載されるように生成量を測定した。
【００８５】
実施例４
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１ポリ−Ｌ−アルギニン粒子
実施例１に示すようにＶａｌ８−ＧＬＰ−１溶液を調製した。
ポリ−Ｌ−アルギニンを最終濃度１．２ｍｇ／ｍＬを達成するよう２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して、６．８ｍＬのポリ−Ｌ−アルギニン溶液を調製した。５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．２に調節した。
【００８６】
無水エタノールをポリ−Ｌ−アルギニン溶液に濃度７％（ｖ／ｖ）まで添加した（０．０７ｍＬの無水エタノールを１ｍＬの緩衝化プロタミン硫酸塩溶液に添加した）。その結果生じる溶液をろ過し、１ｍＬのＶａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ溶液に添加し、２５℃でインキュベートした。２４時間後、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１およびポリ−Ｌ−アルギニンを含有する粒子の懸濁液が形成された。実施例１に記載されるように生成量を測定し、それは約９０％であった。偏光顕微鏡は平板様結晶の小さな塊を含む粒子を示した。粒子の数平均直径は、コールターマルチサイザーＩＩ（Coulter Electronics Limited, Luton, Beds, England）で測定すると２．７μｍであり、９０％が５．１μｍ未満であった。
【００８７】
実施例５
Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１約１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するようＶａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して、０．５ｍＬの緩衝化Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．５に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
エタノールを含有する１．２ｍｇ／ｍＬの緩衝化プロタミン硫酸塩溶液を実施例１に記載されるように調製し、０．５ｍＬを緩衝化Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１溶液０．５ｍＬに添加し、２５℃でインキュベートした。２４時間後、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１およびプロタミンを含有する粒子の懸濁液が形成された。
【００８８】
実施例６
Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１約８ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するようＶａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して、０．５ｍＬの緩衝化Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．３に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
エタノールを含有する１．２ｍｇ／ｍＬの緩衝化プロタミン硫酸塩溶液を実施例１に記載されるように調製し、０．５ｍＬを緩衝化Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１溶液０．５ｍＬに添加し、２５℃でインキュベートした。２４時間後、Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−ＧＬＰ−１およびプロタミンを含有する粒子の懸濁液が形成された。
【００８９】
実施例７
Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１約８ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するようＧｌｙ８−ＧＬＰ−１を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して、０．５ｍＬの緩衝化Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．３に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
エタノールを含有する１．２ｍｇ／ｍＬの緩衝化プロタミン硫酸塩溶液を実施例１に記載されるように調製し、０．５ｍＬを緩衝化Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１溶液０．５ｍＬに添加し、２５℃でインキュベートした。２４時間後、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１およびプロタミンを含有する粒子の懸濁液が形成された。
【００９０】
実施例８
Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１約８ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するようＶａｌ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して、０．５ｍＬの緩衝化Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．１に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
エタノールを含有する１．２ｍｇ／ｍＬの緩衝化プロタミン硫酸塩溶液を実施例１に記載されるように調製し、０．５ｍＬを緩衝化Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１溶液０．５ｍＬに添加し、２５℃でインキュベートした。２４時間後、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１およびプロタミンを含有する粒子の懸濁液が形成された。
【００９１】
実施例９
Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３６−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３６−ＧＬＰ−１約１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するようＶａｌ８−Ｇｌｕ３６−ＧＬＰ−１を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して、０．５ｍＬの緩衝化Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３６−ＧＬＰ−１溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．２に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
エタノールを含有する１．２ｍｇ／ｍＬの緩衝化プロタミン硫酸塩溶液を実施例１に記載されるように調製し、０．５ｍＬを緩衝化Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３６−ＧＬＰ−１溶液０．５ｍＬに添加し、２５℃でインキュベートした。２４時間後、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ３６−ＧＬＰ−１およびプロタミンを含有する粒子の懸濁液が形成された。
【００９２】
実施例１０
Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１約１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するようＧｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して、０．５ｍＬの緩衝化Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．２に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
エタノールを含有する１．２ｍｇ／ｍＬの緩衝化プロタミン硫酸塩溶液を実施例１に記載されるように調製し、０．５ｍＬを緩衝化Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１溶液０．５ｍＬに添加し、２５℃でインキュベートした。２４時間後、Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１およびプロタミンを含有する粒子の懸濁液が形成された。
【００９３】
実施例１１
Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１プロタミン粒子
Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１約１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するようＶａｌ８−Ｌｙｓ２２−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して、０．５ｍＬの緩衝化Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．５に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
エタノールを含有する１．２ｍｇ／ｍＬの緩衝化プロタミン硫酸塩溶液を実施例１に記載されるように調製し、０．５ｍＬを緩衝化Ｖａｌ８−Ｌｙｓ２２−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１溶液０．５ｍＬに添加し、２５℃でインキュベートした。はじめにＶａｌ８−Ｌｙｓ２２−Ｇｌｕ３０−ＧＬＰ−１およびプロタミンを含有する沈殿物が形成されたが、インキュベーション後沈殿物は溶液中に溶解した。
【００９４】
実施例１２
エキセンディン４プロタミン粒子
エキセンディン４約８ｍｇ／ｍＬの最終濃度を達成するようエキセンディン４を２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝溶液に溶解して、０．５ｍＬの緩衝化エキセンディン４溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを９．４に調節し、その結果生じる溶液をろ過した。
エタノールを含有する１．２ｍｇ／ｍＬの緩衝化プロタミン硫酸塩溶液を実施例１に記載されるように調製し、０．５ｍＬを緩衝化エキセンディン４溶液０．５ｍＬに添加し、２５℃でインキュベートした。はじめにエキセンディン４およびプロタミンを含有する沈殿物が形成されたが、インキュベーション後沈殿物は溶液中に溶解した。
【００９５】
実施例１３
プロタミン−亜鉛粒子
最終濃度１０ｍｇ／ｍＬを達成するよう酸化亜鉛を０．５Ｎ ＨＣｌに溶解し、酸性酸化亜鉛ストック溶液を調製した。ろ過溶液のｐＨは１と２の間であった。
酸性酸化亜鉛ストック溶液を実施例２の粒子懸濁液にモル比１：１（亜鉛：Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１）で添加し、５℃で１８時間インキュベートした。ＵＶ吸収により計測すると生成量は１００％であった。偏光顕微鏡は平板様結晶の小さな塊を含む粒子を示した。粒子の数平均直径は、コールターマルチサイザーＩＩ（Coulter Electronics Limited, Luton, Beds, England）で測定すると３．６μｍであり、９０％が９．０μｍ未満であった。
【００９６】
実施例１４
粒子の溶解度スクリーニング
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１の最終濃度がおよそ１ｍｇ／ｍｌとなるように、実施例２の粒子懸濁液をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈した。希釈懸濁液を室温で１時間穏やかに攪拌した。ＵＶ吸収計測を用いた上清中のＶａｌ８−ＧＬＰ−１の濃度より溶解度を測定した。亜鉛に浸さない粒子懸濁液の溶解度はおよそ０．２ｍｇ／ｍｌであった。
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１の最終濃度がおよそ１ｍｇ／ｍｌとなるように、実施例１３の粒子懸濁液をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈した。希釈懸濁液を室温で１時間穏やかに攪拌した。ＵＶ吸収計測を用いた上清中のＶａｌ８−ＧＬＰ−１の濃度より溶解度を測定した。緩衝剤を伴って、または伴わずに亜鉛に浸した後の粒子懸濁液の溶解度はおよそ０．１ｍｇ／ｍＬ未満であった。
【００９７】
実施例１５
可溶性Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１とＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛粒子懸濁液の比較
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨを滅菌水に溶解して１０ｍｌのＶａｌ８−ＧＬＰ−１を調製した。溶解を助けるため２Ｎ ＮａＯＨの液滴を添加した。溶液の最終ｐＨは８．５であり、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ濃度は０．３３ｍｇ／ｍＬであった。その結果生じるＶａｌ８−ＧＬＰ−１溶液をその後ろ過した。
実施例１３に記載されるように亜鉛に浸したＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン懸濁液を調製し、その後Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１の最終濃度が３．３３ｍｇ／ｍＬとなるよう２０ｍＭ ＴＲＩＳで希釈した。
【００９８】
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン懸濁液は、気管内注入により用量０．５および５ｍｇ／ｋｇでラットに投与した。Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１溶液は、皮下注射により用量０．５ｍｇ／ｋｇでラットに投与した。血漿濃度レベルをｐｇ／ｍＬで測定するため、投与後すぐ、投与後１０分、３０分、１時間、および２時間後に血液試料を回収した。血漿試料のアッセイには放射性免疫アッセイを使用した。データは以下の表に示す。
【表２】
2005506956.tif 000003
NS = 試料なし。
【表３】
2005506956.tif 000004
NR = 結果なし、NC =計算せず。
【表４】
2005506956.tif 000005
NR = 結果なし、 NS =試料なし、 NC = 計算せず。
【００９９】
実施例１６
可溶性Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛粒子懸濁液とプロタミンを含まないＶａｌ８−ＧＬＰ−１粒子懸濁液の比較
実施例１３に記載するように亜鉛に浸したＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン懸濁液を調製し、その後Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１の最終濃度が３．３３ｍｇ／ｍＬとなるよう２０ｍＭＴＲＩＳで希釈した。
プロタミンを用いずに対照Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１粒子懸濁液を調製した。
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン懸濁液は、気管内注入により用量５ｍｇ／ｋｇでラットに投与した。プロタミンを含まないＶａｌ８−ＧＬＰ−１粒子懸濁液は、気管内注入により用量５ｍｇ／ｋｇでラットに投与した。血漿濃度レベルをｐｇ／ｍＬで測定するため、投与後、投与後３０分、２時間、および６時間に血液試料を回収した。用量５ｍｇ／ｋｇのＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子製剤は、結果的に６時間通して測定可能な濃度であった。データは以下の表に示す。
【表５】
2005506956.tif 000006
【表６】
2005506956.tif 000007
NR = 結果なし
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子懸濁液（５ｍｇ／ｋｇ）の一回投与に続くラットにおける薬物動態学的パラメーターは、曲線下面積（ＡＵＣ）が２９９（ｎｇ／ｍＬ）ｈｒであり、達した最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）は４９．９ｎｇ／ｍＬで、Ｃｍａｘに達した時間（Ｔｍａｘ）は２時間であった。
【０１００】
実施例１７
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛粒子懸濁液の噴霧乾燥
実施例１３に記載されるようにＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子懸濁液を調製し、Ｂｕｃｈｉ１９１ラブトップ噴霧乾燥機を使用して噴霧乾燥した。注入温度２００℃で懸濁液を噴霧乾燥した。乾燥工程中の流出温度はおよそ１１０℃であった。吸引設定は約５０ｍｂａｒであり、窒素流量は６００Ｌ／時間であり、供給は約５ｍＬ/分であった。粉末は回収器によって回収した。粉末は、エアロサイザーで計測すると２．５μｍの数平均空気力学粒子サイズを有する粒子を含有し、粒子の９０％は３．５μｍ未満である。噴霧乾燥粉末の真の密度は１．３０ｇ／ｃｃであった。ＰＢＳにおける粉末の溶解度は０．１ｍｇ／ｍｌ未満であり、熱重量解析（ＴＧＡ）によって測定すると含水量は７．３％であった。フーリエ変換インフラレッド（ＦＴＩＲ）分光法により測定したところ、ペプチド構造は噴霧乾燥工程を通して変化しなかった。
【０１０１】
実施例１８
ＤＰＰＣ存在下におけるＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛粒子懸濁液の噴霧乾燥
ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を最終濃度５．２ｍｇ／ｍＬを達成するように無水エタノールに溶解して、ＤＰＰＣストック溶液を調製した。実施例１３に記載されるＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛粒子懸濁液１１．１ｍＬに８７ｍＬのＤＰＰＣストック溶液を添加することにより、１００ｍｌのＤＰＰＣ＋Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛粒子懸濁液を調製した。ＤＰＰＣの最終濃度は４．５ｍｇ／ｍＬであり、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１の最終濃度は０．４５ｍｇ／ｍＬであった。結果的に比率はＤＰＰＣ９０％に対しＶａｌ８−ＧＬＰ−１ １０％（ｗ：ｗ）であった。注入温度１５０℃で懸濁液を噴霧乾燥した。乾燥工程中の流出温度はおよそ１１０℃であった。電子顕微鏡走査により、本噴霧乾燥粉末には二つの型の粒子が存在することが明らかとなった。粉末は、実施例１７で調製した粉末において観察されたフレーク様粒子と同様の粒子を含有した。しかしながら本粉末は、おそらくＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子およびＤＰＰＣを含有する、より球形に近い粒子もまた含有する。
【０１０２】
実施例１９
ロイシン存在下における噴霧乾燥Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛粒子懸濁液
ロイシンを最終濃度２ｍｇ／ｍＬを達成するように滅菌水に溶解して、ロイシンストック溶液を調製した。実施例１３に記載されるように調製したＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子懸濁液に、３：１から１：３（ｗ／ｗ）（Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１対ロイシン）の比率でロイシンストック溶液を添加した。噴霧乾燥の前に粒子懸濁液にロイシンが存在することにより一貫した粉末分散性が維持される一方、注入温度を２００℃から１２０℃に減少することができ、これはＧＬＰ−１化合物にかかる熱ストレスを減少させる。
【０１０３】
実施例２０
ろ過による乾燥
実施例１３に記載されるようにＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛粒子懸濁液を調製し、その後穏やかな陰圧下でＫＩＭＡＸガラスフィルター（６０ｍＬ−４０Ｍ）を通してろ過した。水性母体液がフィルターを通った後、無水エタノールで回収した固体を４−５回洗浄した。その後その固体を乾燥させるため、室温で穏やかな陰圧下に放置した。ＴＧＡで測定したところ含水量は約１１％であった。エアロサイザーを用いて測定すると粉末の数平均直径は２．３μｍであり、粒子の９０％未満が４．７μｍであった。
【０１０４】
実施例２１
凍結乾燥
実施例１３に記載されるようにＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛粒子懸濁液を調製した。粒子が形成したのち、メタノールドライアイス浴を用いて懸濁液を瞬時に凍結した。その後凍結懸濁液を穏やかな陰圧下で２４時間乾燥した。エアロサイザーを用いて計測すると粉末の数平均直径は２．８μｍであり、粒子の９０％が５．２μｍ未満であった。
【０１０５】
実施例２２
噴霧乾燥粉末の溶解度測定
実施例１７に記載されるようにＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子噴霧乾燥粉末を調製し、その後ＰＢＳに再懸濁し、１時間穏やかに攪拌した。その後懸濁液を遠心分離し、上清中のＶａｌ８−ＧＬＰ−１濃度をＵＶ吸収によって計測した。Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン亜鉛噴霧乾燥粉末の溶解度は、噴霧乾燥前の懸濁液のものと比較して変化していなかった。
【０１０６】
実施例２３
インビボサル研究
実施例１５に記載されるようにＶａｌ８−ＧＬＰ−１の溶液を調製し、４匹の異なるカニクイザル（８６１３１、９１０７１、９１８１１、９１９０１）に１００μｇ／ｋｇで皮下投与した。様々な時間点で採取した血漿試料を試験するのに放射性免疫試験を用いた。
データは以下の表に示される。
【表７】
2005506956.tif 000008
BQL= 検出限界以下
実施例１７に記載されるように噴霧乾燥粒子を調製し、５匹の異なるカニクイザル（８６１３１、９１０７１、９１８１１、９１９０１、９０４７１）に肺投与により送達した。エアロゾル濃度は２００μｇ／ｋｇであった。吸入用量は、個々のサルの呼吸容積を測定し、エアロゾル濃度をかけることにより計算する。堆積用量は吸入用量の２５％と見積もられる。様々な時間点で採取した血漿試料を、免疫反応性Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１を特異的に検出する放射性免疫試験により評価した。データは以下の表に示される。
【表８】
2005506956.tif 000009
BQL= 検出限界以下
２００μｇ／ｋｇのＶａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粒子の乾燥粉末エアロゾル暴露後および続く１００μｇ／ｋｇのＶａｌ８−ＧＬＰ−１溶液の皮下投与後の、カニクイザルの薬物動態学的パラメーターは以下の表に示す。
【表９】
2005506956.tif 000010
【０１０７】
実施例２４
粒子の溶解
最終濃度約２ｍｇ／ｍＬを達成するようにＶａｌ８−ＧＬＰ−１を滅菌水に溶解してＶａｌ８−ＧＬＰ−１溶液を調製した。１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを１２に調節した。およそ５分後、５Ｎ ＨＣｌによりｐＨを７．１に調節し、結果生じる溶液をろ過した。
最終濃度約４ｍｇ／ｍＬを達成するようにプロタミン硫酸塩を滅菌水に溶解してプロタミン硫酸塩溶液を調製した。
Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ溶液の一部をプロタミン溶液の一部と一緒にした。沈殿物が形成し、ｐＨを４．０に調節した。結果は透明の溶液であった。
【０１０８】
実施例２５
グリシン存在下における粒子の溶解
最終濃度１Ｍを達成するようグリシンを滅菌水に溶解し、グリシン溶液を調製した。グリシン溶液８ｍＬを実施例２４に記載されるように調製したＶａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ溶液４ｍＬおよび実施例２４に記載されるように調製したプロタミン溶液２０ｍＬと一緒にした。グリシンの最終濃度は１００ｍＭであり、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの最終濃度は約１ｍｇ／ｍＬであった。結果生じる混合物のｐＨは６．６であった。５Ｎ ＨＣｌでｐＨを４．２に調製し、最終的に透明な溶液を得た。
【０１０９】
実施例２６
噴霧乾燥溶液
実施例２４および２５において調製した溶液を、Ｂｕｃｈｉ１９１ラブトップ噴霧乾燥機を用いて噴霧乾燥した。注入温度は１５０℃であり、乾燥工程中の流入温度はおよそ９０℃であった。吸引は１００％であり、窒素流量は６００Ｌ／時間であり、供給は５．３ｍＬ／分であった。続いてＰＢＳを噴霧乾燥粉末に添加すると、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミン粉末は懸濁液のままであり、一方プロタミンを用いずに調製したＶａｌ８−ＧＬＰ−１粉末は溶液に溶解した。実施例２５に記載されるように調製した溶液から生じる噴霧乾燥粉末は、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミングリシン粉末を含有した。本粉末の約１４．５ｍｇを２ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。懸濁液を室温で1時間穏やかに攪拌した。上清中のＶａｌ８−ＧＬＰ−１濃度はＵＶ吸収計測により測定した。Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１プロタミングリシン粉末の溶解度はおよそ０．３ｍｇ／ｍＬであった。
【０１１０】
実施例２７
実施例１５に記載されるようにＶａｌ８−ＧＬＰ−１の溶液を調製し、3匹の正常非糖尿病ビーグル犬に皮下投与した。実施例１７に記載されるように噴霧乾燥粒子を調製し、同じ3匹のビーグル犬に肺投与により送達した。Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１分子を含まない偽空気暴露を対照として使用した。グルコースを速度１８ｍｇ／ｋｇ／分で静脈内に注入した。3匹の各犬に対し、相異なる３日において３つの異なる投与計画に従って投与した：a）一日目に、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１分子を含まない偽空気を暴露；ｂ）二日目に、平均吸入用量１．５４ｍｇ／ｋｇでＶａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ乾燥粉末製剤を吸入投与（最終的に予想堆積肺用量が３６２μｇ／ｋｇとなる）；そしてｃ）三日目に、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの溶液製剤を用量２００μｇ／ｋｇで皮下投与。血漿グルコースを測定するため、定期的に血液試料を採取した。インビボ比較犬研究の結果は以下の表に示す。
【表１０】
2005506956.tif 000011
【国際公開パンフレット】
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