(57)【要約】マクロポーラスゲル形態の分離媒体が開示される。当該分離媒体は、少なくとも１種のゲル形成ポリマーの水溶液をある温度に冷却し、該ある温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結されることによって得られるものであり、該ゲル形成ポリマーは、通常はその水溶液が０℃より低い範囲内の温度に冷却された際にあまりにも速くゲルを形成するのでクライオゲルを形成することができないポリマーからなる群から選択されるものであり、該ある温度への冷却は、該ポリマー溶液が凍結する前にゲルが形成するのを防止するために、該水溶液中の少なくとも１種のカオトロピック剤の存在下で行われる。多様な分離目的のための当該分離媒体の使用もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロポーラスゲル形態の分離媒体であって、
その特徴が、
当該分離媒体が、少なくとも１種のゲル形成ポリマーの水溶液をある温度に冷却し、該ある温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結されることによって得られるものであること、
該ゲル形成ポリマーが、通常はその水溶液が０℃より低い範囲内の温度に冷却された際にあまりにも速くゲルを形成するのでクライオゲルを形成することができないポリマーからなる群から選択されるものであること、および
該ある温度への冷却が、該ポリマー溶液が凍結する前にゲルが形成するのを防止するために、該水溶液中の少なくとも１種のカオトロピック剤の存在下で行われること、
である、前記分離媒体。
【請求項２】
少なくとも１種のポリマーが、アガロース、寒天、カラギーナン、デンプン及びセルロース並びにそれらのそれぞれの誘導体からなる群から選択される多糖、又は該多糖の混合物である、請求項１に記載の分離媒体。
【請求項３】
少なくとも１種のカオトロピック剤が、尿素、アルキル尿素、塩化グアニジン、ＬｉＣｌ、ＫＳＣＮ、ＮａＳＣＮ、酸及び塩基、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜２のいずれかに記載の分離媒体。
【請求項４】
クライオゲル化後のポリマーが、架橋された形態である、請求項１〜３のいずれかに記載の分離媒体。
【請求項５】
水溶液が、水と水混和性有機溶媒との混合物である、請求項１〜４のいずれかに記載の分離媒体。
【請求項６】
ポリマーが、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、グルタルジアルデヒド、アジドベンゾイルヒドラジド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド塩酸塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、ジメチルアジピミデート・２ＨＣｌ、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート及びスルホスクシンイミジル−（４’−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート、ジ−及びトリ−グリシジル化合物からなる群から選択される架橋剤によって架橋されるようになっている、請求項４に記載の分離媒体。
【請求項７】
リガンド、荷電基、及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーを分離媒体中に導入することによって修飾されている、請求項１〜６のいずれかに記載の分離媒体。
【請求項８】
リガンドが、ペプチド、金属キレート、糖誘導体、ボロネート誘導体、酵素基質およびそれらのアナログ、酵素インヒビターおよびそれらのアナログ、蛋白質インヒビター、抗体およびそれらのフラグメント、及びチオール含有物質からなる群から選択される、請求項７に記載の分離媒体。
【請求項９】
色素及びイオン交換基からなる群から選択されるメンバーを分離媒体中に導入することによって修飾されるようになっている、請求項７に記載の分離媒体。
【請求項１０】
分離媒体の密度を増加させるために、又はリガンドを分離媒体中に導入するために、分離媒体内に充填剤が存在することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の分離媒体。
【請求項１１】
充填剤が、粒子形態の金属、金属酸化物及びイオン交換物質からなる群から選択される、請求項１０に記載の分離媒体。
【請求項１２】
カラムに入れられたモノリスの形態である、請求項１〜１１のいずれかに記載の分離媒体。
【請求項１３】
粒子の形態である、請求項１〜１１のいずれかに記載の分離媒体。
【請求項１４】
ディスク又は膜の形態である、請求項１〜１１のいずれかに記載の分離媒体。
【請求項１５】
マクロポーラスゲル形態の分離媒体の製造方法であって、当該方法は、少なくとも１種のゲル形成ポリマーの水溶液をある温度に冷却し、該ある温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結されることによるものであり、
その特徴が、
該ゲル形成ポリマーが、通常はその水溶液が０℃より低い範囲内の温度に冷却された際にあまりにも速くゲルを形成するのでクライオゲルを形成することができないポリマーからなる群から選択されること、および
該ある温度への冷却が、該ポリマー溶液が凍結する前にゲルが形成するのを防止するために、該水溶液中の少なくとも１種のカオトロピック剤の存在下で行われること、
である、前記製造方法。
【請求項１６】
少なくとも１種のポリマーが、アガロース、寒天、カラギーナン、デンプン及びセルロース並びにそれらのそれぞれの誘導体からなる群から選択される多糖、又は該多糖の混合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種のカオトロピック剤が、尿素、アルキル尿素、塩化グアニジン、ＬｉＣｌ、ＫＳＣＮ、ＮａＳＣＮ、酸及び塩基、並びにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
このように製造された分離媒体が、続いて架橋される、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
架橋が、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、グルタルジアルデヒド、アジドベンゾイルヒドラジド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド塩酸塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、ジメチルアジピミデート＊２ＨＣｌ、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート及びスルホスクシンイミジル−（４’−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート、ジ−及びトリ−グリシジル化合物からなる群から選択される架橋剤によって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
このように製造された分離媒体が、リガンド、荷電基、及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーを該分離媒体中に導入することによって修飾される、請求項１５〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
修飾が、色素及びイオン交換基からなる群から選択されるメンバーを分離媒体中に導入することによって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ゲル形成ポリマーとカオトロピック剤との水溶液の冷却が、分離媒体の密度を増加させるために、又はリガンドを分離媒体中に導入するために、溶液中の充填剤の存在下で行われる、請求項１５〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
充填剤が、粒子形態の金属、金属酸化物及びイオン交換物質からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
分離媒体が、カラムに入れられたモノリスの形態で製造される、請求項１５〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
分離媒体が、粒子形態で製造される、請求項１５〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
細胞をそれらの表面の特異的特性に従って細胞混合物から分離するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の分離媒体の使用。
【請求項２７】
低分子量産物を、該産物の電荷、疎水性、又は、分離媒体で利用できるリガンド、荷電基、及び疎水性基からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーに対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するための、請求項７および８のいずれかに記載の分離媒体の使用。
【請求項２８】
蛋白質を、該蛋白質の電荷、疎水性、又は、分離媒体で利用できるリガンド、荷電基、もしくは疎水性基に対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するための、請求項７および８のいずれかに記載の分離媒体の使用。
【請求項２９】
ウイルスをそれらの表面の特異的特性に従ってウイルス懸濁液から分離するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の分離媒体の使用。
【請求項３０】
プラスミドをそれらの表面特性に従ってそれらの粗懸濁液から分離するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の分離媒体の使用。
【請求項３１】
ａ）細胞をそれらの表面の特異的特性に従って細胞混合物から分離するため；
ｂ）低分子量産物又は蛋白質を、該産物の電荷、疎水性、又は、リガンド、荷電基及び疎水性基からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーに対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するため；
ｃ）ウイルスをそれらの表面の特異的特性に従ってウイルス懸濁液から分離するため；
又は
ｄ）プラスミドをそれらの表面特性に従ってそれらの粗懸濁液から分離するため；
の方法であって、
当該分離するための方法は、該細胞混合物、細胞懸濁液または粗ホモジネート、ウイルス懸濁液及び粗プラスミド懸濁液を、分離媒体にそれぞれ、細胞、低分子量産物または蛋白質、ウイルス及びプラスミドを吸着させるために該分離媒体に接触させ、次いで、該分離媒体からそれらを溶出することによるものであり、
その特徴が、
該分離媒体が請求項６及び７のいずれかに記載の通りであることである、
前記分離するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、分離媒体、その製造及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、マクロポーラスゲル(macroporous gel)形態の分離媒体、クライオゲル(cryogel)を形成するためにゲル形成ポリマーの水溶液をある温度（該ある温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結される）に冷却することによるその製造、及び該分離媒体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
生物科学での最近の進歩により、研究の関心は、個々の生体分子から、これらの生体分子がどのようにより複雑な構造に組織化され、これらの構造がどのように生細胞で機能するかという問題に、大いに焦点が変わった。個々の生体分子に関する研究の広範な経験により、１０６Ｄａ未満の分子量の分子物体の単離精製のための多数の非常に効率的な技術が開発された。反対に、ナノ粒子（プラスミド、細胞オルガネラ、ウイルス、蛋白質封入体、高分子アセンブリなど）という名でしばしば結び付けられる大きな物体の精製、並びに異なる種の細胞の分離は依然として挑戦すべきもののままである。大きな粒子サイズ（１００−１０００ｎｍ）、低い拡散速度、及び複雑な分子表面により、このような物体は、蛋白質高分子（普通、＜１０ｎｍ）から区別される。
【０００３】
超遠心やミクロ／限外濾過のような、ナノ粒子の単離のために伝統的に使用されるアプローチは、細胞残渣と標的ナノ粒子とのサイズや密度の類似性のせいで、スケール又は分解能が制限されている。水性２相系での分配は、ナノ粒子の単離のために代替的に使用できるが、標的産物を相形成ポリマーから分離する必要性があるという難点がある。
【０００４】
クロマトグラフィーマトリックスへの選択的吸着は、分解能のスケールアップとプロセスの一体化に関して多数の潜在的利点を提供する方法である。ほんの少数の市販のクロマトグラフィーマトリックス（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒｍａｃｉａからのセファクリルＳ−１００ＳＦ）が、粒子内孔内に直径４００ｎｍまでの球形粒子を収容すると主張していることに注目すべきである。
【０００５】
ナノ粒子や細胞は、大きなサイズのせいで、非常に低い拡散係数を有し、対流によってのみ孔内に強制的に入れられ得る。ビーズ状クロマトグラフィーマトリックスに関して、カラム中の対流の大部分は、ビーズの間のボイドを流れる。最近開発された孔サイズ８００ｎｍの超多孔性ビーズでさえ、流れの９５％までが、ビーズの周りのボイドを流れる。
【０００６】
９０年代初期に、Svec, F.およびFrechet, J. M. , Science 273: 205-211 (1996)は、クロマトグラフィーカラム内部での制御された重合によって製造される、成形された連続的クロマトグラフィー媒体、即ち、いわゆるマクロポーラスモノリスを使用することを提案した。典型的には、これらのモノリスは、スチレン又はアクリレートモノマーの重合によって製造され、７００−２０００ｎｍ（０．７−２μｍ）の範囲の直径を有するフロースルーの孔を含む。後に、２０−２００μｍほどの大きさの孔を有する連続的超多孔性クロマトグラフィー媒体が、Gustavsson, P. E.およびLarsson, P-0., J. Chromatog. A. 795: 199-210 (1998); Braas, GMF,ら, Trans. Inst. Chem. Eng. 78: 11-15 (2000)によってアガロースから製造された。これらの孔は、酵母細胞ほどの大きさの物体を容易に収容することができた。
【０００７】
独特の特性の組合せをもった新規クラスの材料として、クライオゲルが最近出現した。広範な種々の形態をもった高度に多孔性のポリマー材料は、クライオトロピックゲル化(cryotropic gelation)技術を用いて、実際的に任意のゲル形成前駆体からも製造することができた。
【０００８】
クライオトロピックゲル化（クライオゲル化(cryogelation)又はクライオ構造化(cryostructuration)は、しばしば同義語として使用される）は、特定タイプのゲル形成であり、それは、潜在的にゲル化できる系の低温処理の結果として起こる。クライオゲル化の本質的特徴は、溶媒の強制的結晶化であり、これによって、クライオゲル化は、低温でゲル化が起こる際、例えば、溶媒のいかなる相転移も無く進行するゼラチン又はアガロース溶液のゲル化として、冷却誘導（chilling-induced）ゲル化とは区別される。
【０００９】
クライオゲル化のプロセスは、幾つかの独特の特徴を有する。
１．クライオトロピックゲル形成は、巨視的に凍結したサンプル中に存在する非凍結液体ミクロ相で進行するプロセスである。凍結点より低い適度の温度で、液体の一部は、最初の溶液に存在する全ての溶質を高濃度で非凍結蓄積（いわゆる低温濃縮(cryoconcentrating)）したままである。物理的ゲル化の化学反応又はプロセスは、最初よりも明らかにずっと高い濃度で非凍結ミクロ相において進行する。
【００１０】
２．非凍結液体中に溶解した物質の低温濃縮の結果として、凍結点より高い温度での伝統的ゲル化と比較して、ゲル化の臨界濃度の減少が起こる。
【００１１】
３．適度に凍結したサンプルにおけるクライオゲル化は、通常、凍結点より高い温度での伝統的ゲル化よりも速く進行する。
【００１２】
４．溶媒の凍結結晶は、クライオゲルが形成される際に細孔形成剤(porogen)の役割を演じ、相互連結したマクロ孔の系を生成する。マクロ孔サイズは、数百μｍ（φ）ほどの大きさであり得る。凍結を超える温度で同一前駆体から産生される伝統的な連続的単相ゲルとは反対に、クライオゲルはしばしばスポンジ状形態を有する。クライオゲル中の溶媒の大部分は、毛細管結合しており、機械的に容易に除去し得る。
【００１３】
５．クライオゲル化の温度依存性は、ゲル化を容易にする効果（低温濃縮）とそれを遅らせる因子（低温、液体ミクロ相での高粘度）との間の平衡によって、通常、最適条件を有する。
【００１４】
６．マクロ孔間におけるポリマー壁の弾性のせいで、クライオゲルは、機械的に強く、もろくはない。
【００１５】
７．クライオゲルの多孔性、機械的強度及び密度は、クライオゲル化の温度、サンプルが凍結状態に保たれる時間、及び凍結／解凍速度によって制御され得る。
【００１６】
一般的に、クライオゲルの製造は十分に記載されている。総説として、例えば、Kaetsu, I. , Adv. Polym. Sci. 105: 81 (1993); Lozinsky, V. I.およびPlieva, F. M. , Enzyme Microb. Tech- nol. 23: 227-242 (1998); 及び Hassan, Ch. M.およびPeppas, N. A., Adv. Polym. Sci. 151: 37 (2000)を参照せよ。
【００１７】
最も集中的に研究されたクライオゲルは、入手の容易性のために、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）から製造されるものである。即ち、ＰＶＡ水溶液を０℃より低い範囲内の温度に冷却するとき、ＰＶＡのゲル化と水の結晶化との比は、クライオゲルが容易に形成されるようなものである。それらと比較して、他の多価のゲル形成ポリマー、例えば、アガロース、寒天及びカラギーナンなどの多糖、並びにゼラチンなどの蛋白質ベースのポリマー（濃縮溶液）は、それらの水溶液が０℃より低い範囲内の温度に冷却された際にあまりにも速く（あるいは、例えば、アルブミンの溶液に関しては、あまりにも遅く）ゲルを形成するのでマクロポーラス分離媒体として使用することができるクライオゲルを形成することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、ゲル形成ポリマーの水溶液を０℃より低い範囲内の温度に冷却することによって、今まで可能であったものよりもより広い範囲のゲル形成ポリマーからマクロポーラスゲル形態の分離媒体を製造することができる方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、ゲル形成ポリマーからのクライオゲルの製造にさらなる多様性(variable)を導入する方法を提供することであり、この方法によって、ゲル化の速度を制御することができる。
【００２０】
本発明の更なる目的は、クライオゲルの製造にさらなる多様性を導入する方法を提供することであり、この方法によって、ゲル形成ポリマーから製造されるクライオゲルの特性を適合させることが容易となる。
【００２１】
本発明のなお別の目的は、マクロポーラスゲル形態の新規分離媒体、特に、以前はクライオゲルの製造に有効に使用することができなかったゲル形成ポリマーに基づく分離媒体を提供することである。
【００２２】
これらの目的及び他の目的は、本発明によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
発明の開示
本発明は、ゲル形成ポリマーの水溶液をある温度（該ある温度で、系中の溶媒は、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結される）に冷却した際にゲルが形成される速度は、該水溶液にカオトロピック剤を添加することによって制御された様式で減少させることができるという知見（該水溶液は、添加しないと、冷却した際、あまりにも速くゲルを形成するのでマクロポーラスクライオゲルを形成することができない）、および、このような添加は、分離媒体として有用なマクロポーラスゲルの製造を可能とするという知見に基づく。水溶液は、溶媒として水、又は水と水混和性有機溶媒との混合物からなり得る。
【００２４】
この知見に基づいて、本発明は、その１局面によれば、以下の分離媒体を提供する：
少なくとも１種のゲル形成ポリマーの水溶液をある温度に冷却し、該ある温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結されることによって得られるマクロポーラスゲル形態の分離媒体であり、
該ゲル形成ポリマーは、通常はその水溶液が０℃より低い範囲内の温度に冷却された際にあまりにも速くゲルを形成するのでクライオゲルを形成することができないポリマーからなる群から選択され、該ある温度への冷却は、該ポリマー溶液が凍結する前にゲルが形成するのを防止するために、該水溶液中の少なくとも１種のカオトロピック剤の存在下で行われる。
【００２５】
本発明の別の局面によれば、以下の方法が提供される：
少なくとも１種のゲル形成ポリマーの水溶液をある温度に冷却し、該ある温度で、系中の溶媒が、溶媒の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結されることによるマクロポーラスゲル形態の分離媒体の製造方法であり、
当該方法は、該ゲル形成ポリマーが、通常はその水溶液が０℃より低い範囲内の温度に冷却された際にあまりにも速くゲルを形成するのでクライオゲルを形成することができないポリマーからなる群から選択されること、および、該ある温度への冷却が、該ポリマー溶液が凍結する前にゲルが形成するのを防止するために、該水溶液中の少なくとも１種のカオトロピック剤の存在下で行われること、を特徴とする。
【００２６】
本発明で使用されるゲル形成ポリマーの例は、アガロース、寒天、カラギーナン、デンプン及びセルロース並びにそれらのそれぞれの誘導体からなる群から選択される多糖および該多糖の混合物である。
【００２７】
ゲル形成ポリマーは、単独で、又はそれらの２種以上の混合物として使用することができる。ゲル形成ポリマーと別のゲルを形成しないポリマー（例えば、架橋剤として作用するポリマー）との混合物もまた、意図され得る。
【００２８】
本発明によれば、該少なくとも１種のゲル形成ポリマーの水溶液の冷却は、少なくとも１種のカオトロピック剤の存在下で行われる。好ましくは、少なくとも１種のカオトロピック剤は、尿素、アルキル尿素、塩化グアニジン、ＬｉＣｌ、ＫＳＣＮ、ＮａＳＣＮ、酸及び塩基、並びにそれらの混合物からなる群から選択される。
【００２９】
酸及び塩基として、無機酸及び塩基並びに有機酸及び塩基を使用することができる。本発明における使用に考えられる酸及び塩基の例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、硫酸、硝酸、リン酸、アルキル及びアリールスルホン酸、アルキル及びアリールホスホン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及び水酸化リチウムである。これらの酸及び塩基は一般的に、強酸及び強塩基と考えられる。しかし、酢酸などのより弱い酸やアンモニアなどのより弱い塩基もまた、本発明における使用に考えられるが、それらをより多く添加する必要がある。
【００３０】
通常、カオトロピック剤は、水溶液に、溶液中０．０１Ｍ〜５Ｍの範囲内の濃度まで添加されるであろう。しかし、当業者に容易に理解されるように、各々の特定の場合に使用されるべき最適濃度は、決定的程度で、使用される特定のポリマー（単数又は複数）およびカオトロピック剤（単数又は複数）、ポリマー（単数又は複数）の濃度、所望のゲル形成速度、冷却温度などの因子に依存するであろう。
【００３１】
塩酸や水酸化ナトリウムに代表される強酸及び塩基は一般的に、０．０１Ｍ〜０．３Ｍの範囲内の濃度で使用され、酢酸などの弱酸は、０．５Ｍ〜１．５Ｍの濃度で使用され得るが、例えば、尿素やＫＳＣＮは、１〜５Ｍの濃度で使用される。
【００３２】
カオトロピック剤は、好ましくは、ゲル形成ポリマーの溶液に添加されるが、ゲル形成ポリマーが添加される前の水、又は、水中のゲル形成ポリマーの分散液（該分散液を溶解して該ポリマーを溶解する前またはその間）に添加してもよい。
【００３３】
ゲル形成ポリマー（単数又は複数）及びカオトロピック剤（単数又は複数）の溶液の冷却(chilling or cooling)は、一般的には、−５℃〜−４０℃、好ましくは−１０℃〜−３０℃の範囲内の温度で行われる。溶液中に存在する水は、水の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共にこれらの温度で部分的に凍結される。クライオゲル製造の当業者に一般的に認められているように、最適温度は、特定の場合における溶液中のポリマー（単数又は複数）およびカオトロピック剤（単数又は複数）の濃度、および、クライオゲルの目標特性（例えば、孔サイズ、孔間における壁の厚さ、及びゲルの機械的強度）に依存して変化するであろう。
【００３４】
本発明の分離媒体の１実施態様によれば、ポリマーは、架橋した形態である。架橋は、一般的には、クライオゲルの形成後に行われるが、クライオゲルの形成中の架橋も可能である。
【００３５】
架橋は、本発明における使用のために考えられる架橋ポリマーの当該分野で一般的に公知の架橋剤によって達成され得る。即ち、ポリマーは、例えば、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、グルタルジアルデヒド、ジ−及びトリ−グリシジル化合物（例えば、ジグリシジル−１，２−シクロヘキサンジカルボキシレート、ジグリシジル−１，２，３，６−テトラヒドロフタレート、Ｎ，Ｎ−ジグリシジルアニリン、及びＮ，Ｎ−ジグリシジル−４−グリシジルオキシアニリン）、アジドベンゾイルヒドラジド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド塩酸塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、ジメチルアジピミデート・２ＨＣｌ、Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート及びスルホスクシンイミジル−（４’−アジドサリチルアミド）ヘキサノエートからなる群から選択される架橋剤によって架橋され得る。
【００３６】
本発明の分離媒体の別の実施態様によれば、分離媒体は、リガンド、荷電基、及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーを該分離媒体中に導入することによって修飾されている。
【００３７】
本発明の分離媒体中に導入されるリガンドは、広い制限内で変化し得る。好ましくは、リガンドは、ペプチド、金属キレート、糖誘導体、ボロネート誘導体、酵素基質およびそれらのアナログ、酵素インヒビターおよびそれらのアナログ、蛋白質インヒビター、レクチン、抗体およびそれらのフラグメント、及びチオール含有物質からなる群から選択される。リガンドは、リガンドと分離媒体との間の少なくとも１つの共有結合により、分離媒体に結合されている。粒子状構造物は、リガンド活性を示し得、提案したクライオゲルで利用することもできる。これらの粒子状構造物は、共有結合している必要はない。あるいは、例えば、静電的相互作用による可逆的固定化は、所望のリガンドの固定化に使用することができる。
【００３８】
本発明の分離媒体の更なる実施態様によれば、分離媒体は、色素（例えば、ＯＨ−またはＮＨ２−担持分離媒体にトリアジン基を介して共有結合したシバクロンブルー３ＧＡ）およびイオン交換基（例えば、エポキシ基含有分離媒体に共有結合したジメチルアミノエチル基）からなる群から選択されるメンバーを該分離媒体中に導入することによって、修飾されるようになっている。
【００３９】
本発明の分離媒体のなお更なる実施態様によれば、分離媒体中には、該分離媒体の密度を増加させてリガンドを該分離媒体中に導入するために、充填剤が存在する。
【００４０】
本発明のこの実施態様に従って使用される充填剤は、粒子形態の、金属及び金属酸化物（例えば、二酸化チタン、モリブデン粉末、二酸化ジルコニウム、酸化鉄、ステンレススチール粉末）、並びにイオン交換物質からなる群から選択され得る。
【００４１】
本発明のこの実施態様による分離媒体は、ゲル形成ポリマー（単数又は複数）及びカオトロピック剤（単数又は複数）の水溶液の、該溶液中の充填剤の存在下での冷却及び部分的凍結を行うことによって製造される。
【００４２】
充填剤は、形成された充填クライオゲルの全重量に対して計算して０〜５０重量％、好ましくは５〜２０重量％の量で使用され得る。
【００４３】
本発明の分離媒体は、カラムに入れられたモノリスの形態であり得る。この場合、ゲル形成ポリマーの溶液を冷却かつ部分凍結してクライオゲルを形成することは、カラム内で該溶液を用いて行われる。
【００４４】
この実施態様によれば、ゲル形成ポリマーは、水又はカオトロピック剤（単数又は複数）の水溶液に懸濁され、必要であれば、ポリマーが完全に溶解するまで撹拌しながら加熱される。次いで、カオトロピック剤（単数又は複数）は、十分な量が既に存在していなければ添加され、溶液がカラム中に注入される。次いで、カラムの内容物は、所定の温度（該所定の温度で、系中の水は、水の非凍結画分に濃縮された溶解物質と共に部分的に凍結される）で所定の時間、カラム内部で冷却され、その後、解凍される。カラムは水で濯がれ、可溶性画分が洗い出される。
【００４５】
あるいは、本発明の分離媒体は、粒子の形態で製造される。粒子形態のクライオゲルの製造は、文献に広範に記載されている。V. I. Lozinsky, Zubov A. L. , The plant for formation of spherical granules from material based on aqueous systems, ロシア連邦特許 2036095 (1992年10月20日)。
【００４６】
要するに、ゲル形成ポリマーとカオトロピック剤との水溶液は、液体ジェットヘッド中に圧縮され、そこでは、ジェットは、水非混和性溶媒の流れによって小滴に分裂させられる。小滴は、同一の溶媒を含有するカラム中に落下させられ、０℃より低い温度、例えば、−１０℃〜−３０℃に冷却される。小滴は、カラムに沿って沈殿する際に凍結し、コレクターに採取される。解凍および水での濯ぎ後、ビーズ状クライオゲルの形態の最終産物が得られる。
【００４７】
本発明の分離媒体はまた、ディスク又は膜の形態であり得る。この場合、ゲル形成ポリマーの熱溶液を冷却してクライオゲルを形成することは、特別の型枠または鋳型内で該溶液を用いて行われる。クライオゲルの上記ディスクは、特別のホルダー内で柱状構築物を形成するように組み立てられ得る。
【００４８】
本発明の更なる局面によれば、細胞をそれらの表面の特異的特性に従って細胞混合物から分離するための、本発明の分離媒体の使用が提供される。
【００４９】
本発明によれば、低分子量産物を、該産物の電荷、疎水性、又は、分離媒体で利用可能なリガンド、荷電基および疎水性基からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーに対するアフィニティに従って粗ホモジネートの細胞懸濁液から分離するための、本発明の分離媒体の使用もまた提供され、該分離媒体は、リガンド、荷電基、及び疎水性基からなる群から選択されるメンバーを該分離媒体に導入することによって修飾されている。
【００５０】
修飾された分離媒体の使用の１実施態様では、蛋白質を、該蛋白質の電荷、疎水性、又は、分離媒体で利用できるリガンド、荷電基、もしくは疎水性基に対するアフィニティに従って細胞懸濁液又は粗ホモジネートから分離するために、該媒体が使用される。
【００５１】
更に、本発明は、ウイルスをそれらの表面の特異的特性に従ってウイルス懸濁液から分離するための、本発明の分離媒体の使用を提供する。
【００５２】
本発明はまた、プラスミドをそれらの表面特性（例えば、電荷、構造的組織化(structural organization)及び塩基パッケージング(base packaging)）に従ってそれらの粗懸濁液から分離するための、本発明の分離媒体の使用を提供する。
【００５３】
本発明はまた、請求項３３に記載の分離方法を提供する。
【実施例】
【００５４】
今、幾つかの非限定実施例によって、本発明を更に説明する。
【００５５】
実施例１．カオトロピック物質を含有する水溶液中のゲル形成ポリマーからの超マクロポーラス(supermacroporous)連続的カラムの製造
下記の表に記載のそれぞれのポリマーを、異なる濃度で蒸留水に懸濁し、ポリマーが完全に溶解するまで、沸騰水浴上で撹拌しながら加熱した。次いで、計算量のカオトロピック剤を加え、粘性のある熱溶液をゆっくりとカラム（３０×１０ｍｍ内径）に注いだ。次いで、これらのカラムの内容物を、異なる温度（下記の表１参照）で１〜２４時間、カラム内部で凍結し、その後解凍した。このように製造された超マクロポーラス連続的カラムを水で濯ぎ、可溶性画分を洗い出し、これらのカラムを通過する水の流量を、１ｍ  Ｈ２Ｏの静水圧下で測定した。
【００５６】
結果を以下の表１で報告する。
【００５７】
【表１】
2005504972.tif 000002
【００５８】
実施例２．粒子含有粗細胞ホモジネートからの組換えＨｉｓ６タグ付き乳酸脱水素酵素の直接的捕捉
実施例１に従ってアガロースから製造した連続的カラムについて、２０ｍｌの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルと、４０ｍｇのホウ水素化ナトリウムを含有する２０ｍｌの０．６Ｎ  ＮａＯＨとの混合物を、流量２ｍｌ／分でカラムを通して一晩再循環させることによって、エポキシを活性化した。カラムを水で徹底的に洗浄し、過剰の試薬を除去した。２０ｍｌの２Ｍ炭酸カリウム中、２．５ｇのイミノ二酢酸（ＩＤＡ）を含有する溶液を、流量０．２ｍｌ／分でカラムを通して一晩再循環させた。カラムを、１Ｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、次いで、１Ｌの蒸留水で洗浄した。１５ｍｌの１Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ９．０）をカラムを通して一晩再循環させ、続いて、１Ｌの１Ｍ  ＮａＣｌおよび１Ｌの蒸留水で洗浄することによって、過剰の反応性基をブロックした。最後に、２０ｍｌの５ｍＭ  ＣｕＳＯ４（蒸留水に溶解）をカラムに通すことによって、Ｃｕ２＋をＩＤＡ修飾カラムに結合させた。
【００５９】
６個のヒスチジン残基のタグを担持する（好熱菌バシラス・ステアロサーモフィラス由来の）乳酸脱水素酵素（Ｈｉｓ６−ＬＤＨ）を発現する組換え大腸菌細胞を増殖させ、酵素産生を誘導した。遠心分離によって細胞を採取し、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．３で洗浄し、音波処理によって破壊した。
【００６０】
前もって精製していない粗抽出物を、流量２ｍｌ／分（７５ｃｍ／時間）で、結合したＣｕ２＋イオンを有するＩＤＡ修飾アガロースモノリスカラムにかけた。２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．３でカラムを洗浄し、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する同じ緩衝液で溶出した。Ｈｉｓ６−ＬＤＨは、粗抽出物からほぼ定量的に捕捉され、通り抜け画分中に溶出した酵素活性の合計はわずかに４％であった。このことは、固有に非組換えの（そして、それ故、モノリスカラムに結合できない）乳酸脱水素酵素の混合のせいであり得た。結合した酵素は、約２カラム体積の少量の５０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に回収率８３％で溶出した。精製度は１．９であった。
【００６１】
実施例３．粒子含有粗細胞ホモジネートからの２級アルコール脱水素酵素の直接的捕捉
０．１Ｍ  ＮａＯＨと１ｇ／ｌのプロシオン・スカーレット（Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｓｃａｒｌｅｔ）Ｈ−２Ｇとを含有する４Ｍ  ＮａＣｌ溶液を、流量０．２ｍｌ／分でカラムを通して７２時間再循環させることによって、実施例１に従ってアガロースから製造した連続的カラムに、アフィニティリガンドであるプロシオン・スカーレットＨ−２Ｇを固定化した。最後に、１Ｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、次いで１Ｌの蒸留水でカラムを洗浄した。
【００６２】
絶対嫌気性好熱性生物Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  Ｂｒｏｃｋｉｉを、J. G. Zeuss, P. W. HeggeおよびM. A. Andersson (1979) Arch. Microbiol. 122: 41に従ってバッチで培養した。遠心分離によって細胞を採取し、３０ｍＭ  ＮａＣｌと２ｍＭ  ＭｇＣｌ２とを含有する２０ｍＭモルホリノプロパンスルホネート緩衝液、ｐＨ６．５（ＭＥＳ緩衝液）で洗浄し、音波処理によって破壊した。
【００６３】
前もって精製していない粗抽出物を、流量２ｍｌ／分（７５ｃｍ／時間）で、結合したプロシオン・スカーレットＨ−２Ｇを有するアガロースモノリスカラムにかけた。２級アルコール脱水素酵素は、粗抽出物からほぼ定量的に捕捉された。カラムをＭＥＳ緩衝液で洗浄した。結合した酵素は、ＭＥＳ緩衝液中、４カラム体積の０．５ｍＭ  ＮＡＤＰにおいて回収率６７％で溶出した。精製度は８．４であった。
【００６４】
実施例４．拡張ベッド(expanded bed)クロマトグラフィーのための、充填剤を有するマクロポーラスアガロースビーズ
低温顆粒化(cryogranulating)設定を用いて、ビーズ状アガロースクライオゲルを製造した。＋６５℃の２％（重量）アガロース水溶液を、濃（１０Ｍ）ＮａＯＨ溶液を用いてアルカリ濃度０．０８Ｍまで調整し、次いで、アルカリ耐性充填剤を、該粘性ポリマー溶液に分散した。製造するビーズの密度を増加させるために、二酸化チタン（ＴｉＯ２、密度４．２ｇ／ｃｍ３）、二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２、密度３．８ｇ／ｃｍ３）、モリブデン粉末（Ｍｏ、密度１０．２ｇ／ｃｍ３）又はタングステン粉末（Ｗ、密度１９．３２ｇ／ｃｍ３）のような充填剤を使用した。このように製造した懸濁液を、液体ジェットヘッド中に圧縮し、そこでは、ジェットは、水非混和性溶媒の流れによって小滴に分裂した。小滴は、表面張力のせいで球状の形態をとり、同一の溶媒（例えば、石油エーテル）でカラム中に落とされるが、−１０〜−３０℃の温度に冷却された。小滴は、カラムに沿って沈殿する際に凍結し、コレクターに採取された。凍結した顆粒を凍結したまま一定の時間保持してゲルを形成し、次いで解凍し、続いて水で洗浄した。ビーズ状充填アガロースクライオゲルの直径は、約６０−６００μｍであった。ゲルマトリックスは、１−４０μｍの孔を有しており高度にマクロポーラスである。充填アガロースクライオゲルのビーズは異なるサイズを有し、このことによって、カラムの下方から移動相をポンプで注入した際にこれらビーズが安定な拡張ベッドを形成することが可能となり、より小さな粒子は拡張ベッドの上部に蓄積し、より大きな粒子は拡張ベッドの下部に蓄積する。
【００６５】
これらのクライオゲルについてのベッド拡張の研究は、異なる線速度で、脱イオン水又は５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０を用いて、可動性アダプターを両端部に有し、かつ直径０．５ｍｍの８個の孔を有するテフロンディスクからなるフローディストリビュータをカラムの基部に有する内径１．０ｃｍのカラム中で行った。実験の開始時の沈殿したベッド高さは３−６ｃｍであった。拡張ベッドカラムを蠕動ポンプ（Ｌａｂｃｈｅｍ、スエーデン）に接続した。流量の各々の変化後、ベッドが安定化するのに１０分を要した。拡張ベッド高さは、液体線速度の関数として測定した。ビーズ状充填アガロースクライオゲルは、安定な拡張を与えた。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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