(57)【要約】  本発明は、新規単離ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにコード化される小分子標的ポリペプチドを提供する。新規小分子標的ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、または任意の誘導体、変異体、突然変異体または該ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体のフラグメントが、小分子標的ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体が広範な病状の検出および処置において利用される方法として開示される。より特異的には、本発明は、疾病と関連する治療抗体および治療小分子を同定する目的の様々なスクリーニング方法において組換え発現および／または内在性発現タンパク質を用いる方法を開示する。本発明は、治療方法、診断方法、およびこれら新規のヒト核酸およびタンパク質のいずれか1つと関与する疾病の診断、処置、および予防の研究方法をさらに開示する。
2005515758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列中の１またはそれ以上の保存的置換を含むアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項５】
該ポリペプチドが天然に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドおよび担体を含む組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物を１またはそれ以上の容器内に含む、キット。
【請求項８】
ヒト疾病と関連する症候群を処置するための薬物の製造における療法剤の使用であって、疾病が請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態から選択され、療法剤が請求項１に記載のポリペプチドを含むものである使用。
【請求項９】
試料中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を測定する方法であって、
（ａ）該試料を用意すること；
（ｂ）該試料をポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入すること；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定すること、
これにより、該試料中のポリペプチドの存在または量を測定すること、
を含む方法。
【請求項１０】
第１の哺乳類対象中の請求項１に記載のポリペプチドの発現の変化したレベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法であって、
ａ）第１の哺乳類対象由来の試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定すること；および
ｂ）ステップ（ａ）の試料中の該ポリペプチドの発現を該疾病を有さないかまたは素因を有さないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料中に存在するポリペプチドの発現と比較すること、
ここで、対照試料と比較して第１の対象中のポリペプチドの発現のレベルの変化が該疾病の存在または素因を示す、
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する物質を同定する方法であって、
（ａ）該ポリペプチドを該物質に導入すること；および
（ｂ）該物質が該ポリペプチドに結合するか否かを測定すること、
を含む方法。
【請求項１２】
物質が細胞受容体または下流エフェクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
病態の処置で使用する潜在的な治療物質を同定する方法であって、病態が請求項１に記載のポリペプチドの異常発現または異常生理的相互作用と関連する、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを発現しかつポリペプチドに帰する性質または機能を有する細胞を用意すること；
（ｂ）細胞を候補物質を含む組成物と接触させること；および
（ｃ）物質がポリペプチドに帰する性質または機能を変化させるか否かを測定すること；
これにより、物質の存在下で観察される変化が、細胞が物質の非存在下で組成物と接触させたときに観察されなければ、物質が潜在的治療物質として同定される、
を含む方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態の活性または潜在活性のモジュレーター、または素因をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物を請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態に対するリスクの増加した被検動物に投与すること、ここで該被検動物は請求項１に記載のポリペプチドを組み換え的に発現する；
（ｂ）該被検動物中の該ポリペプチドの活性をステップ（ａ）の化合物を投与後に測定すること；および
（ｃ）該被検動物中の該ポリペプチドの活性を該ポリペプチドを投与されていない対照動物中の該ポリペプチドの活性と比較すること、
ここで、該対照動物と比べて該被検動物中の該ポリペプチドの活性の変化は、試験化合物が請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態の活性または潜在活性のモジュレーターまたは素因であること示す、
を含む方法。
【請求項１５】
該被検動物が試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、または該導入遺伝子をプロモーターの制御下で野生型被検動物と比べて増加したレベルで発現し、かつ該プロモーターが該導入遺伝子の天然の遺伝子プロモーターでない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する方法であって、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞試料を、該ポリペプチドに結合する化合物とポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で接触させることを含む方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと関連する病態を処置または予防する方法であって、請求項１に記載のポリペプチドをかかる処置または予防が望まれる対象に対象中の病態を処置または予防するのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項１８】
対象がヒトである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
方法が哺乳類にポリペプチドを病態を改善するのに十分な量で投与することを含み、ポリペプチドが配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一なアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントを有するポリペプチドである、哺乳類中の病状を処置する方法。
【請求項２０】
配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項２１】
核酸分子が天然に存在する請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
核酸分子が配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択される核酸配列と単一ヌクレオチドにより異なる、核酸分子。
【請求項２３】
配列番号：２ｎ（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟型をコード化する単離核酸分子。
【請求項２４】
配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択される核酸を含む単離核酸分子。
【請求項２５】
該核酸分子が、厳密な条件下で配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項２０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
該核酸分子に作用可能に結合するプロモーターをさらに含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２９】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体。
【請求項３０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
抗体がヒト化抗体である請求項２９に記載の抗体。
【請求項３２】
試料中の請求項２０に記載の核酸分子の存在または量を測定する方法であって、
（ａ）該試料を用意すること；
（ｂ）該試料を該核酸分子に結合するプローブに導入すること；および
（ｃ）該核酸分子に結合する該プローブの存在または量を測定すること、
これにより、該試料中の核酸分子の存在または量を測定すること、
を含む方法。
【請求項３３】
核酸分子の存在または量が細胞タイプまたは組織タイプのマーカーとして用いられる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞タイプまたは組織タイプが癌性である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１の哺乳類対象中の請求項２０に記載の核酸分子の発現の変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法であって、
ａ）第１の哺乳類対象由来の試料中の核酸の発現のレベルを測定すること；および
ｂ）ステップ（ａ）の試料中の該核酸の発現のレベルを疾病を有さないかまたは素因を有さないことが知られる第２の哺乳類対象由来の対照試料中に存在する核酸の発現のレベルと比較すること；
ここで、対照試料と比較して第１の対象中の核酸の発現のレベルの変化は疾病の存在または素因を示す、
を含む方法。
【請求項３６】
方法が細胞をポリペプチドの発現を導く条件下で培養することを含み、該細胞が配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含む、請求項１に記載のポリペプチドを生成する方法。
【請求項３７】
細胞が細菌細胞である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が酵母細胞である請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
細胞が酵母細胞である請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
細胞が哺乳類細胞である請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
方法が細胞をポリペプチドの発現を導く条件下で培養することを含み、該細胞が配列番号：２ｎ−１（ここでｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含む、請求項２に記載のポリペプチドを生成する方法。
【請求項４２】
細胞が細菌細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
細胞が昆虫細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
細胞が酵母細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
細胞が哺乳類細胞である請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、小分子薬の標的でありおよび細胞、組織、器官または生物の生化学的または生理学的応答の刺激に関する特性を有する新規ポリペプチドに関する。より具体的には、新規ポリペプチドは、新規遺伝子の遺伝子産物であり、またはその特異的生物学的活性フラグメントまたは誘導体である。使用の方法は、診断および予後アッセイ手法並びに広範な病理学的状態を処置する方法を包含する。
【０００２】
（背景技術）
真核細胞は、通常の条件下では細胞の維持および増殖を達成するために精妙にバランスを受けている、生化学的および生理学的方法を特色とする。そのような細胞が脊椎動物のような多細胞生物、またはさらに特別には哺乳類のような生物の構成要素であるとき、生化学的および生理学的方法の調節には精緻な情報伝達経路を伴う。しばしば、そのような情報伝達経路は、細胞外の情報伝達タンパク質、情報伝達タンパク質に結合する細胞性受容体、および細胞内に局在する情報伝達構成要素に関与する。
【０００３】
情報伝達タンパク質は、内分泌性エフェクター、パラクリンエフェクターまたはオートクリンエフェクターに分類され得る。内分泌性エフェクターは特定の器官により循環系中に分泌される情報伝達分子であり、これは次いで遠隔の標的器官または標的組織へと輸送される。標的細胞は内分泌性エフェクターの受容体を含み、内分泌性エフェクターが結合すると情報伝達カスケードが誘導される。パラクリンエフェクターには、互いに近傍にある分泌細胞と受容細胞、例えば同じ組織または器官内の２つの異なるクラスの細胞が関与する。あるクラスの細胞がパラクリンエフェクターを分泌し、これが次いで、例えば細胞外液を介する拡散により、第２のクラスの細胞に到達する。第２のクラスの細胞はパラクリンエフェクターに対する受容体を含有しており、エフェクターの結合は情報伝達カスケードを誘導し、これが対応する生化学的または生理学的作用を誘起する。オートクリンエフェクターは、オートクリンエフェクターを分泌する同じタイプの細胞が受容体をも含有していること以外は、パラクリンエフェクターと高度の類似性を有している。かくして、オートクリンエフェクターは、同じ細胞上でまた同じ近接する細胞上で受容体に結合する。次いで、結合過程は特色的な生化学的または生理学的作用をひき起こす。
【０００４】
情報伝達過程は細胞および組織に対し、これらに限定されない例として、細胞または組織の増殖の誘導、成長または増殖の抑制、細胞または組織の分化または成熟の誘導、および細胞または組織の分化または成熟の抑制を含む多様な影響をひき起こし得る。
【０００５】
多くの病理学的状態には、重要なエフェクタータンパク質の発現の調節不全が関与している。特定のクラスの病態においては、調節不全は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の縮減または抑制レベルとして現れる。病理の他の種類では、非調節は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の増加または上方調節レベルとして明示される。臨床現場において、対象が興味のあるタンパク質エフェクターレベルの増加または過多によりもたらされる異常に罹患していることを疑うことがある。それ故に、そのような対象由来の生物学的試料中の興味のあるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、そしてそのレベルを非病態的状態に特色的なものと比較する必要がある。また、製造の産物としてタンパク質エフェクターを提供する必要性がある。その必要のある対象にエフェクターを投与することは、病理学的状態の処置に有用である。よって、興味あるタンパク質エフェクターの縮減または抑制レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法のための必要性がある。加えて、興味のタンパク質エフェクターの増加または上方調節レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法の必要性がある。
【０００６】
小分子標的は様々な疾病状態または病態に関与してきた。これらの標的は、標的機能を変える目的および望む結果を達成する目的の小分子により作用するタンパク質、特に酵素タンパク質であり得る。細胞、動物および臨床研究を実施して、小分子標的が様々な生理状態、薬理状態、または本来の状態に関与する状態の病因および病態への遺伝子の寄与を解明することができる。これらの研究はCuraGen  Corporationでコア技術を用いて、異なる遺伝子発現、タンパク質とタンパク質との相互作用、大スケールの発現遺伝子の配列決定、および１塩基多型（ＳＮＰ）または実験群と対照群由来の生物学的試料中および試料間のスプライスバリアント（これらに制限されない）のような遺伝子変異体を調べる。かかる研究のゴールは、結果を予防、処置、または状態を治すために治療処置の潜在的手段を想定することである。
【０００７】
哺乳類生物が正常状況または状態以外であるまたはリスクがあるとして診断された疾病、病態および他の異常な状況または状態を処置するために、新たな治療物質を同定することが重要である。かかる方法は少なくとも、影響組織または器官内の標的成分を同定すること、および標的の機能原因を調節する治療物質候補を同定するステップを含む。標的成分は、疾病または病態に関与する任意の生物学的巨大分子であり得る。普通は、標的は特異的機能原因を有するポリペプチドまたはタンパク質である。巨大分子の他のクラスは、核酸、多糖体、複合体脂質または糖脂質のような脂質であり得る；加えて、標的は、巨大分子のこれらのクラスの１より多くを含む半細胞性構造または細胞外構造であり得る。かかる標的が同定されると、それは物質または化合物の巨大群由来の好ましい治療物質候補を同定するためにスクリーニングアッセイにおいて利用され得る。
【０００８】
多くの場合、かかるスクリーニングアッセイの目的は小分子候補を同定することである；このことは、試験されるべき物質の群を発展させるための組合せ方法の使用により普通に取り組まれる。高処理量スクリーニング方法の実行は、化合物の巨大な組合せライブラリーでなされる際有益である。
【０００９】
(発明の要約)
本発明は、核酸配列およびそれらがコード化する新規ポリペプチドを含む。新規核酸およびポリペプチドは、本明細書においては、ＮＯＶＸまたはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３等、核酸およびポリペプチドと呼ばれる。これらの核酸およびポリペプチド、ならびに誘導体、相同体、類似体およびそれらのフラグメントが、配列番号：２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号：２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群を表す「ＮＯＶＸ」核酸として以後総称される。
【００１０】
ある態様において、本発明はＮＯＶＸアミノ酸の成熟型を含む単離ポリペプチドを提供する。ある実施例はＮＯＶＸアミノ酸配列の成熟型の変異体であり、ここで成熟型のアミノ酸のいずれかが、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更されないという条件で異なるアミノ酸に変更されている。アミノ酸は例えば、ＮＯＶＸアミノ酸配列またはＮＯＶＸアミノ酸配列の変異体であり、ここで選択された配列において特定されるいずれかのアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更されないという条件で異なるアミノ酸に変更されている。本発明はまた、これらのうちのいずれかのフラグメントを含む。別の態様において、本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドをコード化する単離核酸、またはフラグメント、相同体、類似体またはそれらの誘導体を含む。
【００１１】
本発明において、天然に存在するＮＯＶＸ配列の対立遺伝子変異体であるＮＯＶＸポリペプチドをまた含む。ある実施態様において、対立遺伝子変異体はＮＯＶＸ核酸配列と単一ヌクレオチドにより異なる核酸配列の翻訳物であるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＮＯＶＸポリペプチドは本明細書に記載される変異体ポリペプチドであり、ここで選択された配列中で特定されたいずれかのアミノ酸が変更されて保存的置換を提供する。ある実施態様において、本発明は試料中のＮＯＶＸポリペプチドの存在または量を測定する方法を開示する。本発明は：試料を用意すること；試料をポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入すること；およびＮＯＶＸポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定すること、それにより試料中のＮＯＶＸポリペプチドの存在または量を測定する、ステップを含む。別の実施態様において、本発明は、哺乳類対象中のＮＯＶＸポリペプチドの変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法を提供する。この方法は：第１の哺乳類対象由来の試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定すること；および第１のステップの試料中のポリペプチドの量を、疾病を有さないことまたは素因を有さないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料に存在するポリペプチドの量と比較すること、ここで対照試料と比較して第１の対象中のポリペプチドの発現レベルの変化は、疾病の存在または素因を示す、ステップを含む。
【００１２】
さらなる実施態様において、本発明はＮＯＶＸポリペプチドに結合する物質を同定する方法を含む。この方法は：ポリペプチドを物質に導入すること；および物質がポリペプチドに結合するか否かを測定するステップを含む。様々な実施態様において、物質は細胞受容体または下流エフェクターである。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は病態の処置において使用する潜在的治療物質を同定する方法を提供する。ここで、病態はＮＯＶＸポリペプチドの異常発現または異常生理的相互作用と関連する。方法は：ＮＯＶＸポリペプチドを発現およびポリペプチドに帰す性質または機能を有する細胞を用意すること；細胞を候補物質を含む組成物を接触させること；および物質がポリペプチドに帰する特性または機能を変化させるか否かを測定すること；それにより、物質の存在下で観察される変化が、細胞が物質を欠く組成物と接触されるときに観察されなければ、物質が潜在的治療物質として同定される。別の態様において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドと関連する病態の活性または潜在活性または素因のモジュレーターをスクリーニングする方法を記載する。この方法は、以下のステップを含む；試験化合物をＮＯＶＸポリペプチドと関連する病態のリスクの増加した被検動物に投与すること、ここで被検動物はＮＯＶＸポリペプチドを組み換え的に発現する。この方法は、ステップの化合物投与後の被検動物中のＮＯＶＸポリペプチドの活性を測定すること；および被検動物中のタンパク質の活性をポリペプチドを投与されていない対照動物のＮＯＶＸポリペプチドの活性と比較すること、ここで、対照動物に比べて被検動物中のＮＯＶＸタンパク質の活性の変化はＮＯＶＸポリペプチドと関連する病態の潜在活性、または素因のモジュレーターであることを示す。ある実施態様において、被検動物は、試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、または野生型被検動物と比べて増加したレベルでのプロモーターの制御下で導入遺伝子を発現する組換え被検動物であり、ここでプロモーターは導入遺伝子の天然の遺伝子プロモーターではない。別の態様において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節する方法を含み、方法はＮＯＶＸポリペプチドを発現する細胞試料をポリペプチドに結合する化合物と、ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で接触させることを含む。
【００１４】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドをコード化する単離核酸分子、フラグメント、相同体、類似体またはそれらのフラグメントを含む。好ましい実施態様において、核酸分子は天然に存在する対立遺伝子核酸変異体のヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、核酸は変異体ポリペプチドをコード化する。ここで、変異体ポリペプチドは天然に存在するポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。別の実施態様において、核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列と単一ヌクレオチドにより異なる。ある実施態様において、ＮＯＶＸ核酸分子は、配列番号：２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列に厳密な条件下でハイブリダイズする。別の態様において、本発明はベクターまたはＮＯＶＸヌクレオチド配列を発現する細胞を提供する。
【００１５】
ある実施態様において、本発明はＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節する方法を提供する。方法は：ＮＯＶＸポリペプチドを発現する細胞試料をポリペプチドに結合する化合物と、ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量で導入するステップを含む。別の実施態様において、本発明はＮＯＶＸアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化する核酸配列、またはＮＯＶＸアミノ酸配列の成熟型の変異体を含み、ここで、選択された配列の成熟型のいずれかのアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％より多くが変更されないという条件で、異なるアミノ酸に変更されている。別の実施態様において、本発明はＮＯＶＸアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含み、ここで選択された配列中の特定されたいずれかのアミノ酸が、配列中のアミノ酸の１５％より多くが変更されないという条件で、異なるアミノ酸に変更されている。
【００１６】
ある実施態様において、本発明はＮＯＶＸポリペプチドの少なくとも１部分をコード化するＮＯＶＸ核酸フラグメント、またはポリペプチドのいずれかの変異体を開示する。ここで、選択された配列のいずれかのアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１０％より多くが変更されないという条件で異なるアミノ酸に変更されている。別の実施態様において、本発明はＮＯＶＸ核酸分子のいずれかの相補体または天然に存在する対立遺伝子核酸変異体を含む。別の実施態様において、本発明は変異体ポリペプチドをコード化するＮＯＶＸ核酸分子を開示する。ここで、変異体ポリペプチドは天然に存在するポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。別の実施態様において、本発明はＮＯＶＸ核酸を開示する。ここで、核酸分子はＮＯＶＸ核酸配列と単一ヌクレオチドにより異なる。
【００１７】
別の実施態様において、本発明はＮＯＶＸ核酸を含み、ここでＮＯＶＸヌクレオチド配列中の１またはそれ以上のヌクレオチドは、ヌクレオチドの１５％より多くが変更されないという条件で異なるヌクレオチドに変更されている。ある実施態様において、本発明はＮＯＶＸヌクレオチド配列の核酸フラグメント、およびＮＯＶＸヌクレオチド配列中の１またはそれ以上のヌクレオチドがヌクレオチドの１５％より多くが変更されないという条件で、選択された配列からなる群から選択されたものから異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメントを含む。別の実施態様において、本発明は核酸分子を含み、ここで核酸分子は厳密な条件下でＮＯＶＸヌクレオチド配列またはＮＯＶＸヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする。ある実施態様において、本発明は核酸分子を含み、ここで配列はコード配列中のヌクレオチドの１５％より多くがＮＯＶＸヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントと異なるように変更される。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は試料中のＮＯＶＸ核酸の存在または量を測定する方法を含む。方法は：試料を用意すること；試料を核酸分子に結合するプローブに導入すること；およびＮＯＶＸ核酸分子に結合するプローブの存在または量を測定すること、それにより、試料中のＮＯＶＸ核酸分子の存在または量を測定するステップを含む。ある実施態様において、核酸分子の存在または量が細胞または組織タイプのマーカーとして用いられる。
【００１９】
別の態様において、本発明は第１の哺乳類対象中のＮＯＶＸ核酸分子の変化レベルと関連する疾病の存在または素因を測定する方法を開示する。方法は：第１の哺乳類対象由来の試料中のＮＯＶＸ核酸の量を測定すること；およびステップ（ａ）の試料中の核酸の量を、疾病を有さないことまたは素因を有さないことが知られている第２の哺乳類対象由来の対照試料に存在するＮＯＶＸ核酸の量と比較すること；ここで、対照試料と比較して第１の対象中の核酸のレベルの変化は疾病の存在または素因を示す、ステップを含む。
【００２０】
特に定義しない場合、ここに使用する技術および具体的用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味である。本明細書で説明されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許申請、特許、および他の参考文献は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。抵触がある場合には本明細書が、定義を含め優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示的なものであって限定することを意図しない。
本発明の他の特性および利点は以下の発明の開示および請求項より明らかであろう。
【００２１】
（図面の簡単な説明）
図１は、２．２Å分解でのトリプシンのＸ線結晶構造を示す（Gaboriaud, C. et. al, Jol. Mol. Biol., 1996, 259:9951010)(PDBは1TRNをコードする）。ＣＧ５９４８２−０２スプライスバリアントに存在しない配列が短い矢印で示されている。図１の図は、活性部位（長い矢印により示す）中のジイソプロピル−ホスホフルオリダート（diisopropylphosphofluoridate）阻害物質で外側に向く活性部位を示す。
図２は、活性部位の触媒作用の三連構造を形成する３残基を示す。
図３は、触媒作用三連構造のメカニズム案を表す。セリンヒドロキシル基のｐＫａは普通は質の悪い求核試薬とする約１３である。アスパラギン酸塩、ヒスチジンおよびセリンが、側鎖をより反応性にする、このｐＫａを低くすることを助ける水素結合の電荷リレー系で準備される。アスパラギン酸塩上のカルボキシ側鎖はヒスチジン由来のタンパク質をひきつけ、そして逆に、それが反応し次にポリペプチド基質を切断することを可能とするセリン水酸化物由来タンパク質を抽出する。
【００２２】
（発明の開示）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによりコードされたポリペプチドを提供する。本発明は、新規核酸配列、それらのコードされたポリペプチド、抗体、および他の関連化合物を含む。本明細書において、配列を「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と称する。別段の記述がない限り、「ＮＯＶＸ」は本明細書に開示される任意の新規配列を指すことを意味する。表１ＡにＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドの要約を示す。
【００２３】
【表１】
2005515758.tif 000003
【００２４】
【表２】
2005515758.tif 000004
【００２５】
【表３】
2005515758.tif 000005
【００２６】
【表４】
2005515758.tif 000006
【００２７】
表ＡはＮＯＶＸポリペプチドの既知のタンパク質ファミリーとの相同性を示す。従って、表Ａの第１欄で特定されるＮＯＶＸに対応する本発明に従う核酸およりポリヌクレオチド、抗体および関連化合物は、例えば、表Ａの第５欄に特定される既知タンパク質ファミリーに関連する病変および疾患に関係する治療的応用および診断的応用において有用である。
【００２８】
ＮＯＶＸ配列と連関する病理、疾患、障害および状態などは、限定しないが、例えば以下のものを含む：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、肥満に連関する代謝妨害、移植、副腎白質萎縮症、先天性副腎過形成、前立腺癌、糖尿病、代謝障害、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、不妊、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、移植片対宿主疾患、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、Albright遺伝性骨ジストロフィー（Ostoeodystrophy）、感染性疾患、食欲不振、癌連関悪液質、神経変性性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害であって自己免疫障害を含むもの、造血障害、および種々の異常脂血症、代謝症候群Ｘおよび慢性疾患、および様々な癌、並びに移植、および不妊。
【００２９】
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、前記タンパク質とのドメインおよび配列関連性の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを用いて、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定し得る。
【００３０】
表Ａの第５欄で特定されるタンパク質ファミリーの他の既知のメンバーと一致して、本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、そのようなタンパク質ファミリーの他のメンバーに相同性を示し、そしてそれらを特徴とするドメインを含有する。それぞれのＮＯＶＸについての配列関連性分析およびドメイン分析の詳細を実施例Ａに示す。
【００３１】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または促進する分子をスクリーニングするのに使用し得る。特に、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、表Ａに掲げたタンパク質ファミリーと関連する疾患を調整または阻害する低分子の同定用の標的として使用され得る。
【００３２】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、特定の細胞タイプを検出にも有用である。ＮＯＶＸそれぞれに対する発現分析の詳細を実施例Ｃに示す。従って、本発明に従うＮＯＶＸ核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、正常組織対疾患組織、例えば、種々のがん、において異なる発現を有する種々の疾患の検出における診断的応用および治療的応用を有する。
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドのさらに別の利用法が本明細書に開示される。
【００３３】
ＮＯＶＸクローン
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、上記該タンパク質と関連するドメインおよび配列の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドが所属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用し得る。
【００３４】
ＮＯＶＸ遺伝子およびそれらの対応するコードされたタンパク質は、例えば、タンパク質治療または遺伝子治療により、医学的状態を予防、処置または緩和するのに有用である。病態を、試料中の新規タンパク質の量を測定または新規遺伝子中の変異の存在を測定することにより診断し得る。ＮＯＶＸ遺伝子が最も高発現する組織に基づいて、それぞれのＮＯＶＸ遺伝子に対する特異的な使用を説明する。使用は、種々の疾患および障害を診断または処置するための産物を開発することを含む。
【００３５】
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、潜在的な診断応用および治療応用、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的核酸、またはタンパク質、診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことを含む。ここで核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的な治療応用を評価する：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬の標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療的、診断的、薬のターゲティング／細胞毒性性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子手術）に有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防衛兵器。
【００３６】
一つの特定の実施態様では、本発明は、(ａ)配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体、但し、成熟型中の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ変異体、但し、選択された配列で特定される任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；およびｅ）ａ）ないしｄ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択したアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを含む。
【００３７】
もう一つの特別な実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）を与えられたアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体であり、選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であり、選択された配列中の特定されるアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；および(ｅ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部分、または選択された配列の任意のアミノ酸が、配列においてアミノ酸残基の１０％未満が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、ポリペプチドの任意の変異体をコードする核酸のフラグメント；および(ｆ) 核酸分子のいずれかの相補的分子、からなる群より選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
【００３８】
なおもう一つの特別な実施態様では、本発明は単離核酸分子を含む。ここで該核酸分子は、(ａ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列；(ｂ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；(ｃ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択される配列を持つ核酸フラグメント；および(ｄ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメント、からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４０】
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(例えば、宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の工程により生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
【００４１】
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から約１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６，０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
【００４２】
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施態様において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、０.１ｋｂ以下、またはそれ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００４３】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
【００４４】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
【００４５】
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列を含む。本発明の一つの実施態様では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
【００４６】
もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
【００４７】
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
【００４８】
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。
【００４９】
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００５０】
誘導体および類似体は全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当分野において公知のコンピューター相同性プログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施態様において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が本発明のタンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
【００５１】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
【００５２】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
【００５３】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
【００５４】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施態様において、プローブは検出可能な標識がつけられており、例えば、標識は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
【００５５】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
【００５６】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００５７】
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）に示すヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００５８】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
【００５９】
従って、もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施態様では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６５％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
【００６０】
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【００６１】
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【００６２】
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
【００６３】
第２の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardtの溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
【００６４】
第３の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
【００６５】
保存的突然変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当分野内で周知である。
【００６６】
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）とアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施態様では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）のアミノ酸配列と少なくとも約５０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）に少なくとも約９５％相同である。
【００６７】
配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
【００６８】
突然変異を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーを当分野内で定義された。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施態様では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）の突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
【００６９】
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
【００７０】
一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
【００７１】
干渉ＲＮＡ
本発明のある態様において、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉により減少され得る。当分野において良く知られている方法は、ＮＯＶＸ遺伝子の発現産物が５’非翻訳領域（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含むＮＯＶＸ遺伝子転写物の少なくとも１９〜２５ｎｔ長のセグメントに相補的であるｓｉＲＮＡヌクレオチド配列由来の特異的２本鎖により標的とされるところの遺伝子サイレンシングを仲介する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。例えば、ＰＣＴ出願、ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８、これらは全体として参考により本明細書により取り込まれる。標的遺伝子は、ＮＯＶＸ遺伝子、またはＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流のモジュレーターであり得る。ＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流のモジュレーターの非制限の例は、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子に結合する転写因子、ＮＯＶＸポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、およびＮＯＶＸ制御経路に関与するポリペプチドを含む。
【００７２】
本発明の方法によると、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、短い干渉ＲＮＡを用いてサイレンシングされる。本発明によるＮＯＶＸポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡを含む。かかるＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡは、ＮＯＶＸポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、Drosophila抽出のようなものだがこれに制限されない、細胞フリーシステムでのＮＯＶＸリボポリヌクレオチド配列のプロセッシングにより、またはＮＯＶＸ配列に対するヌクレオチド配列相同体の化学合成により、得られる。例えば、Tuschl, Zamore, Lehmann, Bartel and Sharp (1999), Genes & Dev. 13: 3191 3197を参照されたい。これは全体として参考により本明細書に取り込まれる。合成されると、通常の０．２μＭのスケールのＲＮＡ合成は、約１ｍｇのｓｉＲＮＡを提供し、それは２４穴組織培養プレートフォーマットを用いる１０００の形質導入実験に十分である。
【００７３】
最も効果的なサイレンシングは、２ｎｔの３’オーバーハングを有するようにペアーとされた、一般に２１ｎｔセンス鎖および２１ｎｔアンチセンス鎖で観察される。２ｎｔの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡ標的認識の特異性に対して別に僅かに帰する。特異性への貢献は、第１のペアー塩基に隣接する未ペアーのヌクレオチドに対して位置する。ある実施態様において、３’オーバーハングのヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。代わりの実施態様において、３’オーバーハングのヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。３’オーバーハングの２’−デオキシリボヌクレオチドを用いることは、リボヌクレオチドを用いるのと同様に効果的であるが、デオキシリボヌクレオチドはしばしば合成するのに割安であり、かつ最もよりヌクレアーゼ耐性であるように思われる。
【００７４】
本発明の熟慮された組換え発現ベクターは、両方の発現を（ＤＮＡ分子の転写により）可能とする形でＮＯＶＸ配列に隣接する作用可能に結合した制御配列を含む発現ベクターにクローン化されたＮＯＶＸ  ＤＮＡ分子を含む。ＮＯＶＸｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子は、第１のプロモーター（例えば、クローンＤＮＡの３’プロモーター配列）により転写され、およびＮＯＶＸｍＲＮＡのセンス鎖であるＲＮＡ分子は第２のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの５’プロモーター配列）により翻訳される。センス鎖およびアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイズして、ＮＯＶＸ遺伝子のサイレンシングのためのｓｉＲＮＡ構造物を生成する。または、２つの構造物を用いて、ｓｉＲＮＡ構造物のセンス鎖およびアンチセンス鎖を生成する。最終的に、クローンＤＮＡは、単一転写物が標的遺伝子または遺伝子由来のセンス配列および相補的アンチセンス配列を両方有する、２次構造を有する構造物をコード化することができる。この実施態様の実施例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は、標的遺伝子の全部分または一部分に相同である。別の実施例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物はｓｉＲＮＡである。ＮＯＶＸ配列に隣接する制御配列は、発現が独立して、または時間的方法または空間的方法で調節され得るように、同一であり得るかまたは異なり得る。
【００７５】
特定の実施態様において、ｓｉＲＮＡは、ＮＯＶＸ遺伝子鋳型を例えば核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩまたはヒトＲＮａｓｅ  Ｐ  ＰＮＡ  Ｈ１を含有するベクターにクローニングすることにより細胞内で転写される。ベクターシステムの１実施例は、GeneSuppressor［登録商標］ＲＮＡ干渉キット（Imgenexから市販されている）である。Ｕ６およびＨ１プロモーターはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターのタイプＩＩＩクラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドはいつもグアノシンである一方、Ｈ１プロモーターの＋１ヌクレオチドはアデノシンである。これらのプロモーターの終結シグナルは、５連続チミジンにより定義される。転写物は典型的に、第２のウリジンの後切断される。この位置での切断は、合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングに類似する発現ｓｉＲＮＡの３’ＵＵオーバーハングを生成する。４００ヌクレオチド長未満の配列はこのプロモーターにより転写され得る。それ故、それらは理想的には、例えば約５０ヌクレオチドＲＮＡステム−ループ転写物中のおよそ２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡの発現にふさわしい。
【００７６】
ｓｉＲＮＡベクターは、発現の長期ノックダウンが必要な合成ｓｉＲＮＡを超える利点を有するようである。ｓｉＲＮＡ発現ベクターで形質導入された細胞は、定常に長期ｍＲＮＡ阻害を経験し得る。対照的に、細胞該合成ｓｉＲＮＡで形質導入された細胞は典型的には、７日または細胞分割の１０ラウンド以内のｍＲＮＡ抑制から回復する。ｓｉＲＮＡ発現ベクターの長期遺伝子サイレンシング能力は遺伝子療法での応用法を提供する。
【００７７】
一般に、ｓｉＲＮＡはＤＩＣＥＲと呼ばれるＡＴＰ依存性リボヌクレアーゼにより長いｄｓＲＮＡから切り取られている。ＤＩＣＥＲは、エンドヌクレアーゼ特異的エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーのメンバーである。ｓｉＲＮＡは、細胞内タンパク質と共にエンドヌクレアーゼ複合体内に位置する。Drosophilaのインビトロの研究で、ｓｉＲＮＡ／タンパク質複合体（ｓｉＲＮＡ）が次に第２の酵素複合体に移される。それは、ＤＩＧＥＲとは異なるエンドヌクレアーゼを含有するサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を誘導するＲＮＡと呼ばれる。ＲＩＳＣは、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖によりコード化される配列を用いて、相補的配列のｍＲＮＡを発見しかつ破壊する。従って、ｓｉＲＮＡは、リボヌクレアーゼを制限するガイドとして振る舞い、２つのｓｉＲＮＡ鎖の１つに相補的なｍＲＮＡのみを切断する。
【００７８】
ｓｉＲＮＡにより標的とされるべきＮＯＶＸ  ｍＲＮＡは一般に、開始コドンの５０〜１００ｎｔ下流から始まる必要なＮＯＶＸ配列から選択される。または、開始コドンの近くの５’または３’ＵＴＲおよび領域は用いられ得るが、これらが制御タンパク質結合部位においてより豊富であり得るので、一般に避けられる。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡおよび／またはＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体の結合と干渉し得る。選択ｓｉＲＮＡ配列についての最初のＢＬＡＳＴ相同性検索は、利用可能なヌクレオチド配列ライブラリーに対してなされ、たった１つの遺伝子が標的とされることを確認する。ｓｉＲＮＡ２本鎖による標的認識の特異性は、ｓｉＲＮＡ２本鎖の対領域に位置する単一点変異が標的ｍＲＮＡの減少を消滅するのに十分であることを示す。Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20(23):6877 88を参照されたい。それ故熟慮して、必要な遺伝子を標的とする場合、ＳＮＰ、多型性、対立遺伝子変異体または種特異的バリエーションを提供する。
【００７９】
ある実施態様において、完全なＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ実験は適切な負の対照を含む。負の対照ｓｉＲＮＡは一般に、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡと同一のヌクレオチド組成物を有するが、ゲノムに対して相同である重要な配列を欠く。典型的には、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を混ぜるし、かつそれが他の遺伝子に対して相同性を欠くことを確認するための相同性検索を行う。
【００８０】
２つの独立ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて、標的ＮＯＶＸ遺伝子をノックダウンし得る。このことは、サイレンシング効果の特異性を制御するのを助ける。加えて、２つの独立遺伝子の発現は、等しい濃度の異なるＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ２本鎖、例えば、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡおよびＮＯＶＸ遺伝子またはポリペプチドのレギュレーターのためのｓｉＲＮＡを用いることにより同時にノックダウンされ得る。タンパク質と関連するｓｉＲＮＡの利用可能性は、標的ｍＲＮＡアクセス可能性より制限されていると信じられている。
【００８１】
標的ＮＯＶＸ領域は典型的には、１９（Ｎ１９）残基（例えば、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ）のスペーサー領域により分けられる２つのアデニン（ＡＡ）および２つのチミジン（ＴＴ）の配列である。望まれるスペーサー領域は、約３０％〜７０％のＧ／Ｃ含有率を有し、そしてより好ましくは５０％である。配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴが標的配列に存在しないと、選択的標的領域はＡＡ（Ｎ２１）となる。ＮＯＶＸセンスｓｉＲＮＡの配列は、（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１にそれぞれ対応する。後者の場合、ＴＴに対するセンスｓｉＲＮＡの３’末端の変換は、かかる配列がＮＯＶＸポリヌクレオチドを天然に生じないなら、実行され得る。この配列の変換の根拠は、センスおよびアンチセンス３’オーバーハングの配列組成に関して対称性２本鎖を生成することである。対称性３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡを切断するセンスおよびアンチセンス標的ＲＮＡのおよそ等しい率で形成されることを確認することを助ける。例えば、Elbashir, Lendeckel and Tuschl (2001). Genes & Dev. 15: 188 200を参照されたい。これは全体として参考により取り込まれるｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列のオーバーハングの修飾は、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖ガイド標的認識として標的ｍＲＮＡ認識に作用することを予想されない。
【００８２】
またはＮＯＶＸ標的ｍＲＮＡが適当なＡＡ（Ｎ２１）配列を含有しないと、配列ＮＡ（Ｎ２１）について検索し得る。さらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、アンチセンスｓｉＲＮＡの３’ヌクレオチドの配列が特異性に寄与しないと信じられているので、６’（Ｎ１９）ＴＴとして依然合成され。アンチセンスまたはリボザイム技術と違って、標的ｍＲＮＡの２次構造はサイレンシングに強い影響を有すると思われていない。Harborth, et al. (2001) J. Cell Science 114: 4557 4565を参照されたい。これは全体として参考により取り込まれる。
【００８３】
ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ２本鎖の形質導入は、標準的核酸形質導入法、例えばOLIGOFECTAMINE試薬（Invitrogenから市販）を用いて成し遂げられ得る。ＮＯＶＸ遺伝子サイレンシングについてのアッセイは一般に、形質導入後約２日で実行される。ＮＯＶＸ遺伝子サイレンシングが、野生型およびサイレンシング化されたＮＯＶＸフェノタイプの比較解析を可能とする形質導入試薬の非存在下で全く観察されない。特定の実施態様において、２４穴プレートの１穴に対して、約０．８４μｇのｓｉＲＮＡ２本鎖で一般的に十分である。細胞は前日に典型的にまかれ、そして約５０％の密集度で形質導入される。細胞培地および条件の選択は、当業者にとって日常的なことであって、細胞タイプで代えられる。形質導入効率は細胞タイプに依存し得るが、継代回数および細胞の密集度にも依存する。時間およびｓｉＲＮＡリポゾーム複合体（例えば、転倒混和対ボルテックス）の形成方法がまた決定的である。低い形質導入効率は、ＮＯＶＸサイレンシングの失敗の最も高頻度の原因である。形質導入効率は、用いられるべきそれぞれの新たな細胞株について注意深く調べられる必要がある。好ましい細胞は哺乳類由来のものであり、より好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類由来であり、そして最も好ましくはヒト由来である。治療的処置のため用いられる場合、細胞は優先的に自己のものであるが、自己でない細胞供給源がまた本発明の範囲内として熟慮される。
【００８４】
対照実験について、０．８４μｇの１本鎖センスＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡの形質導入は、ＮＯＶＸサイレンシングに作用せず、および０．８４μｇアンチセンスｓｉＲＮＡは０．８４μｇの２本鎖ｓｉＲＮＡと比較して弱いサイレンシング作用を有する。対照実験は、野生型およびサイレンシング化されたＮＯＶＸフェノタイプの比較解析を再び可能とする。転写効率を制御するため、普通のタンパク質の標的化は、例えば、ラミンＡ／Ｃの標的化またはＣＭＶ由来のＥＧＦＰ発現プラスミド（例えば、Clontechから市販）の形質導入で典型的に行われる。上記の例において、細胞中のラミンＡ／Ｃノックダウンのフラクションの測定は、免疫蛍光抗体法、ウェスタンブロット、ノーザンブロットのような技術またはタンパク質発現または遺伝子発現の他の類似のアッセイにより翌日測定される。ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnologyから得ることができる。
【００８５】
細胞中の標的ＮＯＶＸポリヌクレオチドの存在量および半減期（またはターンオーバー）に依存して、ノックダウンフェノタイプは、１〜３日後、またはさらに後に明らかになり得る。ＮＯＶＸノックダウンフェノタイプが観察されない場合、ＮＯＶＸポリヌクレオチドの欠乏が、免疫蛍光抗体法またはウエスタンブロッティングにより観察され得る。ＮＯＶＸポリヌクレオチドが３日後に依然大量であるなら、細胞は分けられて再形質導入のための新しい２４穴プレートに移される必要がある。標的タンパク質のノックダウンが観察されないなら、標的ｍＲＮＡ（ＮＯＶＸまたはＮＯＶＸ上流遺伝子または下流遺伝子）が形質導入ｓｉＲＮＡ２本鎖により効果的に破壊されたか否かを解析することが望まれる。形質導入後２日で、全ＲＮＡが調製され、標的特異的プライマーを用いて逆転写され、そしてｍＲＮＡの増幅を制御するために少なくとも１エクソとエクソンとの結合を覆うプライマー対でＰＣＲ増幅される。標的とされていないｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲはまた対照として必要とされる。標的タンパク質の依然検出不可能な欠乏であるｍＲＮＡの効果的な欠乏は、安定的ＮＯＶＸタンパク質の多量の貯蔵が細胞内に存在し得ることを示すことができる。十分長いインターバルでの複数回の形質導入は、標的タンパク質が最終的に、フェノタイプが明らかになる点に対して欠乏するまで必要であり得る。複数回の形質導入ステップが要求されると、細胞は形質導入後２〜３日で分けられる。細胞は分けられた後直ちに形質導入され得る。
【００８６】
本発明の工夫に富んだ治療方法は、増加または異常ＮＯＶＸ発現または活性を補うための治療としてＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡを投与することを熟慮する。ＮＯＶＸリボポリヌクレオチドを得て、ｓｉＲＮＡフラグメン内に処理されるか、またはＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡが上述のように合成される。ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡは、上述のように既知の核酸形質導入技術を用いて細胞または組織に投与される。ＮＯＶＸ遺伝子に特異的なＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡは減少するか、または減少ＮＯＶＸポリペプチド産物を導くＮＯＶＸ転写産物をノックダウンし、細胞または組織中の減少ＮＯＶＸポリペプチド活性を結果として生じる。
【００８７】
本発明はまた、分解タンパク質のｍＲＮＡ（タンパク質をコード化するｍＲＮＡ）を標的とするＲＮＡｉ構造物を個体に投与することを含む個体中におけるＮＯＶＸタンパク質の存在と関連する疾病または状態を処置する方法を包含する。特異的ＲＮＡｉ構造物はｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡないに処理される２本鎖遺伝子産物を含む。処置において、標的タンパク質は生成されず、処置の非存在下にある範囲に生成されない。
【００８８】
ＮＯＶＸ遺伝子の機能が既知のフェノタイプと相関しない場合、健康個体由来の細胞または組織の対照試料は、ＮＯＶＸ発現レベルを測定する参考標準を提供する。発現レベルは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等の記載されるアッセイを用いて測定される。細胞または組織の対象試料は、哺乳類、好ましくは疾病に罹患しているヒト対象から得られる。ＮＯＶＸリボポリヌクレオチドを用いて、ＮＯＶＸ遺伝子産物に特異的なｓｉＲＮＡ構造物を生成する。これらの細胞または組織は、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡのものを細胞または組織に投与することにより、細胞または組織への核酸の形質導入について記載された方法で処理され、かつＮＯＶＸポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現での変化は、記載のアッセイを用いて、対照試料と比べて対象試料において観察される。このＮＯＶＸ遺伝子ノックダウンアプローチは、処置された対象試料中のＮＯＶＸマイナス（ＮＯＶＸ）フェノタイプの迅速測定方法を提供する。従って処置対象試料において観察されるＮＯＶＸフェノタイプは、処置の間の疾病状態の経過のモニタリングのマーカーとして働く。
特定の実施態様において、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡは治療法において用いられる。ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡの生成方法および使用方法は当業者に既知である。技術の例を以下に提供する。
【００８９】
ＲＮＡ産物
ＮＯＶＸのセンスＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ発現ベクターでの転写のような既知の方法を用いて生成される。最初の実験において、センスおよびアンチセンスＲＮＡはそれぞれ約５００塩基長である。２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Tris-HCl（ｐＨ７．５）中の生成ｓｓＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（０．５μＭ）を９５℃で１分間加熱し、次に冷却して室温で１２〜１６時間アニーリングさせた。ＲＮＡを沈殿させて溶解バッファー（以下）に再懸濁させる。アニーリングをモニターするために、ＲＮＡをＴＢＥバッファーにおいて２％アガロースゲル中で電気泳動させて、そしてエチジウムブロマイドで染色する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989)を参照。
【００９０】
可溶化物の調製
無処理のウサギ網状赤血球可溶化物（Ambion）は、製造元の指示書により集められる。ｄｓＲＮＡはｍＲＮＡの添加に先立ち、可溶化物中で３０℃で１０分間インキュベートされる。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡは加えられ、そしてインキュベーションがさらに６０分間続けられる。２本鎖ＲＮＡおよびｍＲＮＡのＭ比は約２００：１である。ＮＯＶＸ  ｍＲＮＡは放射性標識され（既知の技術を用いる）そしてその安定性がゲル電気泳動によりモニターされる。
【００９１】
同一条件でなされる並行実験において、２本鎖ＲＮＡはまず３２Ｐ  ＡＴＰで放射性標識される。反応は、２ＸプロテイナーゼＫバッファーの添加により止められ、上述のように除タンパクされる（Tuschl et al., Genes Dev., 13:3191 3197 (1999)）。産物は、適当なＲＮＡ鎖を用いる１５％または１８％のポリアクリルアミドシークエンシングゲルでの電気泳動により分析される。放射性活性についてゲルをモニタリングすることにより、２本鎖ＲＮＡ由来の１０〜２５ｎｔＲＮＡの天然産物が測定され得る。
【００９２】
約２１〜２３ｂｐの２本鎖ＲＮＡのバンドはとらえにくい。ＮＯＶＸ転写を抑制するこの２１〜２３ｍｅｒの作用が、５０ｎｍｏｌの２本鎖２１〜２３ｍｅｒをそれぞれのアッセイで用いる上述の同一のウサギ網状赤血球アッセイを用いて、インビトロでアッセイする。これらの２１〜２３ｍｅｒの配列は次に、標準的核酸配列決定技術を用いて測定される。
【００９３】
ＲＮＡ調製
上で測定された配列に基づく２１ｎｔのＲＮＡは、促進ＲＮＡホスホラミダイトおよびチミジンホスホラミタイド（Proligo, Germany）を用いて化学的に合成される。合成オリゴヌクレオチドは除タンパクされてゲル精製され（Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, Genes & Dev. 15, 188 200 (2001)）、Sep Pak C18カートリッジ（Waters, Milford, Mass., USA）精製が続く（Tuschl, et al., Biochemistry, 32:11658 11668 (1993)）。
【００９４】
これらのＲＮＡ（２０μＭ）１本鎖は、アニーリングバッファー（１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  酢酸マグネシウム）中で１分間９０℃でインキュベートされ、１時間３７℃でのインキュベートが続く。
【００９５】
細胞培養
ＮＯＶＸを調節的に発現するための当分野で既知の細胞培養は、標準条件を用いて増殖される。形質導入前２４時間においておよそ８０％の密集度で、細胞はトリプシン処理されて、抗体を含まない新しい培地で１：５で希釈され（１〜３×１０５細胞／ｍｌ）、２４穴プレート（５００μｌ／穴）に移される。形質導入は市販のリポフェクタミンキットを用いて行われ、そしてＮＯＶＸ発現は正および負の対照をともなう標準技術を用いてモニターされる。正の対照は天然にＮＯＶＸを発現する細胞である一方で、負の対照はＮＯＶＸを発現しない細胞である。３’末端をオーバーハングする塩基対２１および２２ｎｔのｓｉＲＮＡは、可溶化および細胞培養での効果的な配列特異的ｍＲＮＡの分解を仲介する。インビトロ哺乳類培養での抑制の効果的な濃度は、２５ｎＭ〜１００ｎＭの間の最終濃度である。このことは、ｓｉＲＮＡが、通常のアンチセンスまたはリボザイム遺伝子標的実験で適用される濃度のいくつかのオーダーである濃度で効果的であることを示す。
【００９６】
上述の方法は、ＮＯＶＸ  ｓｉＲＮＡ配列の減少およびインビトロでの抑制のためのかかるｓｉＲＮＡの使用の両方のための方法を提供する。インビボ抑制は、よく知られたインビボ形質導入または遺伝子治療形質導入技術を用いて同一ｓｉＲＮＡで行われ得る。
【００９７】
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
【００９８】
一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
【００９９】
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
【０１００】
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、プソイドウラシル、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、２−チオウラシル、４−チオウラシル、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、５−メトキシウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５−メチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
【０１０１】
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
【０１０２】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
【０１０３】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
【０１０４】
一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１１０の整数である）)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【０１０５】
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
【０１０６】
種々の実施態様において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個の核酸塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
【０１０７】
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
【０１０８】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra and Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
【０１０９】
他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等に複合し得る。
【０１１０】
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２ｎ（ｎは１〜１１０の整数である）に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
【０１１１】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
【０１１２】
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施態様では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【０１１３】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施態様では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
【０１１４】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施態様では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
【０１１５】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２ｎ(ｎは１〜１１０の整数である)に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
【０１１６】
一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ｎは１〜１１０の整数である)に示すアミノ酸配列を有する。他の実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ｎは１〜１１０の整数である)に実質的に相同であり、配列番号２ｎ(ｎは１〜１１０の整数である)のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ｎは１〜１１０の整数である)のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２ｎ(ｎは１〜１１０の整数である)のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【０１１７】
２個またはそれ以上の配列間の相同性を測定すること
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の相同性の割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
【０１１８】
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１１０の整数である)に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０１１９】
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１２０】
キメラおよび融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ(ｎは１〜１１０の整数である)のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１２１】
一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０１２２】
もう一つの実施態様では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳類の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
【０１２３】
なおもう一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【０１２４】
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施態様では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
【０１２５】
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施態様では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
【０１２６】
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【０１２７】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施態様では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１２８】
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
【０１２９】
抗ＮＯＶＸ抗体
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体は本発明に含まれる。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ' およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
【０１３０】
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２ｎ(ｎは１〜１１０の整数である)に示すアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
【０１３１】
本発明の特定の実施態様において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数ＫＤが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＯＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
【０１３２】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
【０１３３】
当分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
【０１３４】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳類において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
【０１３５】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳類から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
【０１３６】
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
【０１３７】
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【０１３８】
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳類源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
【０１３９】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１４０】
ハイブリドーマが培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
【０１４１】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's Medium培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳類中で腹水としてインビボで増殖し得る。
【０１４２】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
【０１４３】
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の通常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の通常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
【０１４４】
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレーム枠領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１４５】
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
【０１４６】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
【０１４７】
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施態様はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
【０１４８】
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
【０１４９】
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳類宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳類宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
【０１５０】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０１５１】
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１５３】
二重特異性抗体の作成方法は当分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１５４】
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの通常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の通常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１５５】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の通常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
【０１５６】
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
【０１５７】
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１５８】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変領域(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１５９】
３価以上の結合価をもつ抗体も考得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
【０１６０】
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
【０１６１】
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体依存性細胞溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１６２】
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１６３】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica charantia(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１６４】
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド誘導体(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１６５】
もう一つの実施態様では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１６６】
イムノリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl  Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
【０１６７】
特に有用なリポソームリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームリポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
【０１６８】
本発明のタンパク質に対して指向される抗体の診断応用
１実施態様では、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は限定しないが、エライザ（ＥＬＩＳＡ）および他の当業者既知免疫学的介在技法を含む。具体的実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、そのようなドメインを保有するＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易化される。かくして、ＮＯＶＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体、または相同物に特異的で合える抗体をまたここに提供する。
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して指向化された抗体を、ＮＯＶＸタンパク質の局在化及び／または定量に関する当業界内既知方法で使用し得る（例えば適当な生理学的試料内のＮＯＶＸタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施態様では、ＮＯＶＸ、その誘導体、フラグメント、類似体または相同物に特異的な抗体であって、抗体由来抗原結合ドメインを含むものは、薬理学的活性化合物として利用する（以後「治療剤」と称する）。
【０１６９】
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して特異的な抗体を（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために使用し得る。ＮＯＶＸポリペプチドへの抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産したＮＯＶＸ抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、抗原性ＮＯＶＸタンパク質の存在量または発現パターンを評価するために抗原性ＮＯＶＸタンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。ＮＯＶＸタンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
【０１７０】
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
【０１７１】
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的を、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
【０１７２】
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、特定の場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存するし、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週１回の範囲であり得る。
【０１７３】
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995、Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends,  Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa.,  1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker,  New Yorkに提供されている。
【０１７４】
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要なニつ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
【０１７５】
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ハイドロキシメチルセルローズまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
【０１７６】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)２)を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
【０１７８】
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳類のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳類の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
【０１７９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
【０１８０】
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
【０１８１】
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳類細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
【０１８２】
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
【０１８３】
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
【０１８４】
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
【０１８５】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
【０１８６】
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバクロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
【０１８７】
なおもう一つの実施態様では、本発明の核酸を、哺乳類の発現ベクターを用いて哺乳類細胞中で発現し得る。哺乳類の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳類細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０１８８】
もう一つの実施態様では、組換え哺乳類表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
【０１８９】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０１９０】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０１９１】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳類細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０１９２】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０１９３】
哺乳類細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
【０１９４】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施態様では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施態様では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０１９５】
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０１９６】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１１０の整数である)のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０１９７】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１１０の整数である)のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１１０の整数である)のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施態様では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
【０１９８】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
【０１９９】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０２００】
もう一つの実施態様では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０２０１】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
【０２０２】
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび脂肪油のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０２０３】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０２０４】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０２０５】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２０６】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０２０７】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０２０８】
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０２０９】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０２１０】
一つの実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０２１１】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
【０２１２】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０２１３】
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＮＯＶＸｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＮＯＶＸ活性を調整することができる。加えて、ＮＯＶＸタンパク質を用いて、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＮＯＶＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝的シンドロームＸならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＮＯＶＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を方法で使用して、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響させることができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０２１４】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
【０２１５】
一つの実施態様では、本発明は、膜結合型のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
【０２１６】
本明細書において使用する「低分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０２１７】
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当分野に見出し得る。
【０２１８】
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
【０２１９】
ある実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳類由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施態様では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２２０】
もう一つの実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＮＯＶＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶＸの標的分子は、非ＮＯＶＸ分子または本発明のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＮＯＶＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
【０２２１】
ＮＯＶＸタンパク質をあるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＮＯＶＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
【０２２２】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２２３】
なおもう一つの実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施態様では、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質がさらにあるＮＯＶＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
【０２２４】
なおもう一つの実施態様では、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
【０２２５】
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
【０２２６】
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施態様において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施態様では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
【０２２７】
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、ＮＯＶＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
【０２２８】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に有意に多い)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に有意に少ない)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
【０２２９】
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶＸと結合または相互作用をしてＮＯＶＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流の要素としてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅に関与する可能性が高い。
【０２３０】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
【０２３１】
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
【０２３２】
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１１０の整数である)であるＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＮＯＶＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
【０２３３】
略述すれば、ＮＯＶＸ遺伝子を、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を使用して、そのため増幅プロセスを複雑にする、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのが、増幅したフラグメントを生成する。
【０２３４】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳類由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
【０２３５】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＮＯＶＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
【０２３６】
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１,０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、そしてさらに好ましくは２,０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988を参照されたい。
【０２３７】
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
【０２３８】
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、in McKusick, MENDELIAN INHERITANCE IN MAN (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egeland, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
【０２３９】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
【０２４０】
組織タイピング
本発明のＮＯＶＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２４１】
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
【０２４２】
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に因る。
【０２４３】
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１,０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１１０の整数である)の配列のような予想するコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２,０００である。
【０２４４】
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を挙げ得る。本発明はまた、個体がＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
【０２４５】
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
【０２４６】
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
【０２４７】
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号２ｎ−１(ｎは１〜１１０の整数である)の核酸のような全長ＮＯＶＸ核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
【０２４８】
ＮＯＶＸタンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶＸｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２４９】
一つの実施態様では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
【０２５０】
もう一つの実施態様では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
【０２５１】
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶＸの量を測定する手段；および試料中のＮＯＶＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
【０２５２】
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
【０２５３】
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
【０２５４】
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施態様において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＮＯＶＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＮＯＶＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＮＯＶＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＮＯＶＸ遺伝子の染色体再編成、(v)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＮＯＶＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２５５】
特定の実施態様では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
【０２５６】
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
【０２５７】
さらに別の実施態様では、試料細胞由来のあるＮＯＶＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
【０２５８】
他の実施態様では、ＮＯＶＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
【０２５９】
なおもう一つの実施態様において、当分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
【０２６０】
ＮＯＶＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当分野の技術は、野生型ＮＯＶＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得る潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施態様では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
【０２６１】
なおもう一つの実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施態様によれば、あるＮＯＶＸ配列、例えば、野生型ＮＯＶＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
【０２６２】
他の実施態様では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得る変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施態様では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
【０２６３】
なおもう一つの実施態様では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施態様では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
【０２６４】
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２６５】
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施態様では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２６６】
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
【０２６７】
さらに、ＮＯＶＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２６８】
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶＸ活性(例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、障害を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。障害としては、限定しないが、表Ａに要約するような代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、慢性疾患および種々のがんに関連した代謝性シンドロームＸならびに消耗性疾患を挙げ得る。そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基く予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。
【０２６９】
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
【０２７０】
例示的実施態様として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認する。
【０２７１】
従って、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＮＯＶＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２７２】
臨床試験の作用モニタリング
ＮＯＶＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
【０２７３】
限定しない例として、ＮＯＶＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または低分子)を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＮＯＶＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
【０２７４】
一つの実施態様において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
【０２７５】
処置方法
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患のリスクにある(感受性)かまたは疾患を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。障害としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症(ＡＳＤ)、房室(Ａ−Ｖ)管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症(ＶＳＤ)、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、副腎白質萎縮症、先天性副腎過形成、前立腺がん、新生物、腺がん、リンパ腫、子宮がん、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、移植片対宿主病、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、アルブライト遺伝性骨ジストロフィーの処置ならびに類似の他の疾患、障害および異常を挙げ得、前列挙のこれらの疾患、障害および状態に限定しないが、より具体的には表Ａに要約されるもののような、ＮＯＶＸタンパク質の相同物と連関するそれらの疾患、障害または状態を含むものである。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
【０２７６】
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２７７】
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２７８】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２７９】
予防的方法
一つの態様では、異常なＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０２８０】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施態様では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０２８１】
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有すると思われる状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
【０２８２】
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施態様において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
【０２８３】
種々の特定の実施態様において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
【０２８４】
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は：代謝性障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を限定することなく、含み、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。
【０２８５】
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、限定しないがここに列挙のものを含む疾患、障害または状態などに罹患する対象の処置のための効験を有するであろう。
【０２８６】
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
本発明を、以下の実施例でさらに記載し、これらはクレームに記載の発明の範囲を限定しない。
【０２８７】
実施例
実施例Ａ：ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、および相同性データ
実施例１
ＮＯＶ１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１Ａに示す。
【表５】
2005515758.tif 000007
【０２８８】
表１Ａの続き
【表６】
2005515758.tif 000008
【０２８９】
表１Ａの続き
【表７】
2005515758.tif 000009
【０２９０】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表８】
2005515758.tif 000010
【０２９１】
ＮＯＶ１ａタンパク質のさらなる解析により、表１Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表９】
2005515758.tif 000011
【０２９２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１ａタンパク質の検索により、表１Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１０】
2005515758.tif 000012
【０２９３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１ａのタンパク質は、表１ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１１】
2005515758.tif 000013
【０２９４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１ａタンパク質は表１Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１２】
2005515758.tif 000014
【０２９５】
実施例２
ＮＯＶ２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２Ａに示す。
【表１３】
2005515758.tif 000015
【０２９６】
表２Ａの続き
【表１４】
2005515758.tif 000016
【０２９７】
表２Ａの続き
【表１５】
2005515758.tif 000017
【０２９８】
表２Ａの続き
【表１６】
2005515758.tif 000018
【０２９９】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１７】
2005515758.tif 000019
【０３００】
ＮＯＶ２ａタンパク質のさらなる解析により、表２Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１８】
2005515758.tif 000020
【０３０１】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２ａタンパク質の検索により、表２Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１９】
2005515758.tif 000021
【０３０２】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２ａのタンパク質は、表２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２０】
2005515758.tif 000022
【０３０３】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２ａタンパク質は表２Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２１】
2005515758.tif 000023
【０３０４】
実施例３
ＮＯＶ３クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３Ａに示す。
【表２２】
2005515758.tif 000024
【０３０５】
表３Ａの続き
【表２３】
2005515758.tif 000025
【０３０６】
表３Ａの続き
【表２４】
2005515758.tif 000026
【０３０７】
表３Ａの続き
【表２５】
2005515758.tif 000027
【０３０８】
表３Ａの続き
【表２６】
2005515758.tif 000028
【０３０９】
表３Ａの続き
【表２７】
2005515758.tif 000029
【０３１０】
表３Ａの続き
【表２８】
2005515758.tif 000030
【０３１１】
表３Ａの続き
【表２９】
2005515758.tif 000031
【０３１２】
表３Ａの続き
【表３０】
2005515758.tif 000032
【０３１３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表３１】
2005515758.tif 000033
【０３１４】
ＮＯＶ３ａタンパク質のさらなる解析により、表３Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表３２】
2005515758.tif 000034
【０３１５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３ａタンパク質の検索により、表３Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表３３】
2005515758.tif 000035
【０３１６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３ａのタンパク質は、表３ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表３４】
2005515758.tif 000036
【０３１７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３ａタンパク質は表３Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表３５】
2005515758.tif 000037
【０３１８】
実施例４
ＮＯＶ４クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４Ａに示す。
【表３６】
2005515758.tif 000038
【０３１９】
表４Ａの続き
【表３７】
2005515758.tif 000039
【０３２０】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表３８】
2005515758.tif 000040
【０３２１】
ＮＯＶ４ａタンパク質のさらなる解析により、表４Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表３９】
2005515758.tif 000041
【０３２２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４ａタンパク質の検索により、表４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表４０】
2005515758.tif 000042
【０３２３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４ａのタンパク質は、表４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表４１】
2005515758.tif 000043
【０３２４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４ａタンパク質は表４Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表４２】
2005515758.tif 000044
【０３２５】
実施例５
ＮＯＶ５クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表５Ａに示す。
【表４３】
2005515758.tif 000045
【０３２６】
表５Ａの続き
【表４４】
2005515758.tif 000046
【０３２７】
前記タンパク質配列の配列比較により、表５Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表４５】
2005515758.tif 000047
【０３２８】
ＮＯＶ５ａタンパク質のさらなる解析により、表５Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表４６】
2005515758.tif 000048
【０３２９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ５ａタンパク質の検索により、表５Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表４７】
2005515758.tif 000049
【０３３０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ５ａのタンパク質は、表５ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表４８】
2005515758.tif 000050
【０３３１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ５ａタンパク質は表５Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表４９】
2005515758.tif 000051
【０３３２】
実施例６
ＮＯＶ６クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表６Ａに示す。
【表５０】
2005515758.tif 000052
【０３３３】
表６Ａの続き
【表５１】
2005515758.tif 000053
【０３３４】
ＮＯＶ６ａタンパク質のさらなる解析により、表６Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表５２】
2005515758.tif 000054
【０３３５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ６ａタンパク質の検索により、表６Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表５３】
2005515758.tif 000055
【０３３６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ６ａのタンパク質は、表６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表５４】
2005515758.tif 000056
【０３３７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ６ａタンパク質は表６Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表５５】
2005515758.tif 000057
【０３３８】
実施例７
ＮＯＶ７クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表７Ａに示す。
【表５６】
2005515758.tif 000058
【０３３９】
表７Ａの続き
【表５７】
2005515758.tif 000059
【０３４０】
前記タンパク質配列の配列比較により、表７Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表５８】
2005515758.tif 000060
【０３４１】
ＮＯＶ７ａタンパク質のさらなる解析により、表７Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表５９】
2005515758.tif 000061
【０３４２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ７ａタンパク質の検索により、表７Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表６０】
2005515758.tif 000062
【０３４３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ７ａのタンパク質は、表７ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表６１】
2005515758.tif 000063
【０３４４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ７ａタンパク質は表７Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表６２】
2005515758.tif 000064
【０３４５】
実施例８
ＮＯＶ８クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表８Ａに示す。
【表６３】
2005515758.tif 000065
【０３４６】
表８Ａの続き
【表６４】
2005515758.tif 000066
【０３４７】
ＮＯＶ８ａタンパク質のさらなる解析により、表８Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表６５】
2005515758.tif 000067
【０３４８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ８ａタンパク質の検索により、表８Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表６６】
2005515758.tif 000068
【０３４９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ８ａのタンパク質は、表８ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表６７】
2005515758.tif 000069
【０３５０】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ８ａタンパク質は表８Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表６８】
2005515758.tif 000070
【０３５１】
実施例９
ＮＯＶ９クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表９Ａに示す。
【表６９】
2005515758.tif 000071
【０３５２】
ＮＯＶ９ａタンパク質のさらなる解析により、表９Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表７０】
2005515758.tif 000072
【０３５３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ９ａタンパク質の検索により、表９Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表７１】
2005515758.tif 000073
【０３５４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ９ａのタンパク質は、表９ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表７２】
2005515758.tif 000074
【０３５５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ９ａタンパク質は表９Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表７３】
2005515758.tif 000075
【０３５６】
実施例１０
ＮＯＶ１０クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１０Ａに示す。
【表７４】
2005515758.tif 000076
【０３５７】
表１０Ａの続き
【表７５】
2005515758.tif 000077
【０３５８】
ＮＯＶ１０ａタンパク質のさらなる解析により、表１０Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表７６】
2005515758.tif 000078
【０３５９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１０ａタンパク質の検索により、表１０Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表７７】
2005515758.tif 000079
【０３６０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１０ａのタンパク質は、表１０ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表７８】
2005515758.tif 000080
【０３６１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１０ａタンパク質は表１０Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表７９】
2005515758.tif 000081
【０３６２】
実施例１１
ＮＯＶ１１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１１Ａに示す。
【表８０】
2005515758.tif 000082
【０３６３】
ＮＯＶ１１ａタンパク質のさらなる解析により、表１１Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表８１】
2005515758.tif 000083
【０３６４】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１１ａタンパク質の検索により、表１１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表８２】
2005515758.tif 000084
【０３６５】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１１ａのタンパク質は、表１１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表８３】
2005515758.tif 000085
【０３６６】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１１ａタンパク質は表１１Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表８４】
2005515758.tif 000086
【０３６７】
実施例１２
ＮＯＶ１２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１２Ａに示す。
【表８５】
2005515758.tif 000087
【０３６８】
表１２Ａの続き
【表８６】
2005515758.tif 000088
【０３６９】
表１２Ａの続き
【表８７】
2005515758.tif 000089
【０３７０】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１２Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表８８】
2005515758.tif 000090
【０３７１】
ＮＯＶ１２ａタンパク質のさらなる解析により、表１２Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表８９】
2005515758.tif 000091
【０３７２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１２ａタンパク質の検索により、表１２Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表９０】
2005515758.tif 000092
【０３７３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１２ａのタンパク質は、表１２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表９１】
2005515758.tif 000093
【０３７４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１２ａタンパク質は表１２Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表９２】
2005515758.tif 000094
【０３７５】
実施例１３
ＮＯＶ１３クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１３Ａに示す。
【表９３】
2005515758.tif 000095
【０３７６】
表１３Ａの続き
【表９４】
2005515758.tif 000096
【０３７７】
ＮＯＶ１３ａタンパク質のさらなる解析により、表１３Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表９５】
2005515758.tif 000097
【０３７８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１３ａタンパク質の検索により、表１３Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表９６】
2005515758.tif 000098
【０３７９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１３ａのタンパク質は、表１３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表９７】
2005515758.tif 000099
【０３８０】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１３ａタンパク質は表１３Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表９８】
2005515758.tif 000100
【０３８１】
実施例１４
ＮＯＶ１４クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１４Ａに示す。
【表９９】
2005515758.tif 000101
【０３８２】
表１４Ａの続き
【表１００】
2005515758.tif 000102
【０３８３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１４Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１０１】
2005515758.tif 000103
【０３８４】
ＮＯＶ１４ａタンパク質のさらなる解析により、表１４Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１０２】
2005515758.tif 000104
【０３８５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１４ａタンパク質の検索により、表１４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１０３】
2005515758.tif 000105
【０３８６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１４ａのタンパク質は、表１４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１０４】
2005515758.tif 000106
【０３８７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１４ａタンパク質は表１４Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１０５】
2005515758.tif 000107
【０３８８】
実施例１５
ＮＯＶ１５クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１５Ａに示す。
【表１０６】
2005515758.tif 000108
【０３８９】
ＮＯＶ１５ａタンパク質のさらなる解析により、表１５Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１０７】
2005515758.tif 000109
【０３９０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１５ａタンパク質の検索により、表１５Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１０８】
2005515758.tif 000110
【０３９１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１５ａのタンパク質は、表１５ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１０９】
2005515758.tif 000111
【０３９２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１５ａタンパク質は表１５Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１１０】
2005515758.tif 000112
【０３９３】
実施例１６
ＮＯＶ１６クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１６Ａに示す。
【表１１１】
2005515758.tif 000113
【０３９４】
ＮＯＶ１６ａタンパク質のさらなる解析により、表１６Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１１２】
2005515758.tif 000114
【０３９５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１６ａタンパク質の検索により、表１６Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１１３】
2005515758.tif 000115
【０３９６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１６ａのタンパク質は、表１６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１１４】
2005515758.tif 000116
【０３９７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１６ａタンパク質は表１６Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１１５】
2005515758.tif 000117
【０３９８】
実施例１７
ＮＯＶ１７クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１７Ａに示す。
【表１１６】
2005515758.tif 000118
【０３９９】
表１７Ａの続き
【表１１７】
2005515758.tif 000119
【０４００】
前記タンパク質配列の配列比較により、表１７Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１１８】
2005515758.tif 000120
【０４０１】
ＮＯＶ１７ａタンパク質のさらなる解析により、表１７Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１１９】
2005515758.tif 000121
【０４０２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１７ａタンパク質の検索により、表１７Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１２０】
2005515758.tif 000122
【０４０３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１７ａのタンパク質は、表１７ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１２１】
2005515758.tif 000123
【０４０４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１７ａタンパク質は表１７Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１２２】
2005515758.tif 000124
【０４０５】
実施例１８
ＮＯＶ１８クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１８Ａに示す。
【表１２３】
2005515758.tif 000125
【０４０６】
表１８Ａの続き
【表１２４】
2005515758.tif 000126
【０４０７】
ＮＯＶ１８ａタンパク質のさらなる解析により、表１８Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１２５】
2005515758.tif 000127
【０４０８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１８ａタンパク質の検索により、表１８Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１２６】
2005515758.tif 000128
【０４０９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１８ａのタンパク質は、表１８ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１２７】
2005515758.tif 000129
【０４１０】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１８ａタンパク質は表１８Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１２８】
2005515758.tif 000130
【０４１１】
実施例１９
ＮＯＶ１９クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表１９Ａに示す。
【表１２９】
2005515758.tif 000131
【０４１２】
ＮＯＶ１９ａタンパク質のさらなる解析により、表１９Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１３０】
2005515758.tif 000132
【０４１３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ１９ａタンパク質の検索により、表１９Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１３１】
2005515758.tif 000133
【０４１４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１９ａのタンパク質は、表１９ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１３２】
2005515758.tif 000134
【０４１５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ１９ａタンパク質は表１９Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１３３】
2005515758.tif 000135
【０４１６】
実施例２０
ＮＯＶ２０クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２０Ａに示す。
【表１３４】
2005515758.tif 000136
【０４１７】
表２０Ａの続き
【表１３５】
2005515758.tif 000137
【０４１８】
ＮＯＶ２０ａタンパク質のさらなる解析により、表２０Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１３６】
2005515758.tif 000138
【０４１９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２０ａタンパク質の検索により、表２０Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１３７】
2005515758.tif 000139
【０４２０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２０ａのタンパク質は、表２０ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１３８】
2005515758.tif 000140
【０４２１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２０ａタンパク質は表２０Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１３９】
2005515758.tif 000141
【０４２２】
実施例２１
ＮＯＶ２１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２１Ａに示す。
【表１４０】
2005515758.tif 000142
【０４２３】
ＮＯＶ２１ａタンパク質のさらなる解析により、表２１Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１４１】
2005515758.tif 000143
【０４２４】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２１ａタンパク質の検索により、表２１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１４２】
2005515758.tif 000144
【０４２５】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２１ａのタンパク質は、表２１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１４３】
2005515758.tif 000145
【０４２６】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２１ａタンパク質は表２１Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１４４】
2005515758.tif 000146
【０４２７】
実施例２２
ＮＯＶ２２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２２Ａに示す。
【表１４５】
2005515758.tif 000147
【０４２８】
ＮＯＶ２２ａタンパク質のさらなる解析により、表２２Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１４６】
2005515758.tif 000148
【０４２９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２２ａタンパク質の検索により、表２２Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１４７】
2005515758.tif 000149
【０４３０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２２ａのタンパク質は、表２２ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１４８】
2005515758.tif 000150
【０４３１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２２ａタンパク質は表２２Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１４９】
2005515758.tif 000151
【０４３２】
実施例２３
ＮＯＶ２３クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２３Ａに示す。
【表１５０】
2005515758.tif 000152
【０４３３】
ＮＯＶ２３ａタンパク質のさらなる解析により、表２３Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１５１】
2005515758.tif 000153
【０４３４】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２３ａタンパク質の検索により、表２３Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１５２】
2005515758.tif 000154
【０４３５】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２３ａのタンパク質は、表２３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１５３】
2005515758.tif 000155
【０４３６】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２３ａタンパク質は表２３Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１５４】
2005515758.tif 000156
【０４３７】
実施例２４
ＮＯＶ２４クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２４Ａに示す。
【表１５５】
2005515758.tif 000157
【０４３８】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２４Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１５６】
2005515758.tif 000158
【０４３９】
ＮＯＶ２４ａタンパク質のさらなる解析により、表２４Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１５７】
2005515758.tif 000159
【０４４０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２４ａタンパク質の検索により、表２４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１５８】
2005515758.tif 000160
【０４４１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２４ａのタンパク質は、表２４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１５９】
2005515758.tif 000161
【０４４２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２４ａタンパク質は表２４Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１６０】
2005515758.tif 000162
【０４４３】
実施例２５
ＮＯＶ２５クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２５Ａに示す。
【表１６１】
2005515758.tif 000163
【０４４４】
表２５Ａの続き
【表１６２】
2005515758.tif 000164
【０４４５】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２５Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１６３】
2005515758.tif 000165
【０４４６】
ＮＯＶ２５ａタンパク質のさらなる解析により、表２５Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１６４】
2005515758.tif 000166
【０４４７】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２５ａタンパク質の検索により、表２５Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１６５】
2005515758.tif 000167
【０４４８】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２５ａのタンパク質は、表２５ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１６６】
2005515758.tif 000168
【０４４９】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２５ａタンパク質は表２５Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１６７】
2005515758.tif 000169
【０４５０】
実施例２６
ＮＯＶ２６クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２６Ａに示す。
【表１６８】
2005515758.tif 000170
【０４５１】
表２６Ａの続き
【表１６９】
2005515758.tif 000171
【０４５２】
ＮＯＶ２６ａタンパク質のさらなる解析により、表２６Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１７０】
2005515758.tif 000172
【０４５３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２６ａタンパク質の検索により、表２６Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１７１】
2005515758.tif 000173
【０４５４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２６ａのタンパク質は、表２６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１７２】
2005515758.tif 000174
【０４５５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２６ａタンパク質は表２６Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１７３】
2005515758.tif 000175
【０４５６】
実施例２７
ＮＯＶ２７クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２７Ａに示す。
【表１７４】
2005515758.tif 000176
【０４５７】
ＮＯＶ２７ａタンパク質のさらなる解析により、表２７Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１７５】
2005515758.tif 000177
【０４５８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２７ａタンパク質の検索により、表２７Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１７６】
2005515758.tif 000178
【０４５９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２７ａのタンパク質は、表２７ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１７７】
2005515758.tif 000179
【０４６０】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２７ａタンパク質は表２７Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１７８】
2005515758.tif 000180
【０４６１】
実施例２８
ＮＯＶ２８クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２８Ａに示す。
【表１７９】
2005515758.tif 000181
【０４６２】
ＮＯＶ２８ａタンパク質のさらなる解析により、表２８Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１８０】
2005515758.tif 000182
【０４６３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２８ａタンパク質の検索により、表２８Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１８１】
2005515758.tif 000183
【０４６４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２８ａのタンパク質は、表２８ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１８２】
2005515758.tif 000184
【０４６５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２８ａタンパク質は表２８Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表１８３】
2005515758.tif 000185
【０４６６】
実施例２９
ＮＯＶ２９クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表２９Ａに示す。
【表１８４】
2005515758.tif 000186
【０４６７】
前記タンパク質配列の配列比較により、表２９Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１８５】
2005515758.tif 000187
【０４６８】
ＮＯＶ２９ａタンパク質のさらなる解析により、表２９Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１８６】
2005515758.tif 000188
【０４６９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ２９ａタンパク質の検索により、表２９Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１８７】
2005515758.tif 000189
【０４７０】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２９ａのタンパク質は、表２９ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１８８】
2005515758.tif 000190
【０４７１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ２９ａタンパク質は表２９Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１８９】
2005515758.tif 000191
【０４７２】
実施例３０
ＮＯＶ３０クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３０Ａに示す。
【表１９０】
2005515758.tif 000192
【０４７３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３０Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表１９１】
2005515758.tif 000193
【０４７４】
ＮＯＶ３０ａタンパク質のさらなる解析により、表３０Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表１９２】
2005515758.tif 000194
【０４７５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３０ａタンパク質の検索により、表３０Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１９３】
2005515758.tif 000195
【０４７６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３０ａのタンパク質は、表３０ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１９４】
2005515758.tif 000196
【０４７７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３０ａタンパク質は表３０Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表１９５】
2005515758.tif 000197
【０４７８】
実施例３１
ＮＯＶ３１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３１Ａに示す。
【表１９６】
2005515758.tif 000198
【０４７９】
ＮＯＶ３１ａタンパク質のさらなる解析により、表３１Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表１９７】
2005515758.tif 000199
【０４８０】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３１ａタンパク質の検索により、表３１Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表１９８】
2005515758.tif 000200
【０４８１】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３１ａのタンパク質は、表３１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表１９９】
2005515758.tif 000201
【０４８２】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３１ａタンパク質は表３１Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２００】
2005515758.tif 000202
【０４８３】
実施例３２
ＮＯＶ３２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３２Ａに示す。
【表２０１】
2005515758.tif 000203
【０４８４】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３２Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２０２】
2005515758.tif 000204
【０４８５】
ＮＯＶ３２ａタンパク質のさらなる解析により、表３２Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２０３】
2005515758.tif 000205
【０４８６】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３２ａタンパク質の検索により、表３２Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２０４】
2005515758.tif 000206
【０４８７】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３２ａのタンパク質は、表３２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２０５】
2005515758.tif 000207
【０４８８】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３２ａタンパク質は表３２Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２０６】
2005515758.tif 000208
【０４８９】
実施例３３
ＮＯＶ３３クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３３Ａに示す。
【表２０７】
2005515758.tif 000209
【０４９０】
表３３Ａの続き
【表２０８】
2005515758.tif 000210
【０４９１】
ＮＯＶ３３ａタンパク質のさらなる解析により、表３３Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２０９】
2005515758.tif 000211
【０４９２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３３ａタンパク質の検索により、表３３Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２１０】
2005515758.tif 000212
【０４９３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３３ａのタンパク質は、表３３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２１１】
2005515758.tif 000213
【０４９４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３３ａタンパク質は表３３Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２１２】
2005515758.tif 000214
【０４９５】
実施例３４
ＮＯＶ３４クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３４Ａに示す。
【表２１３】
2005515758.tif 000215
【０４９６】
表３４Ａの続き
【表２１４】
2005515758.tif 000216
【０４９７】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３４Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２１５】
2005515758.tif 000217
【０４９８】
ＮＯＶ３４ａタンパク質のさらなる解析により、表３４Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２１６】
2005515758.tif 000218
【０４９９】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３４ａタンパク質の検索により、表３４Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２１７】
2005515758.tif 000219
【０５００】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３４ａのタンパク質は、表３４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２１８】
2005515758.tif 000220
【０５０１】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３４ａタンパク質は表３４Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２１９】
2005515758.tif 000221
【０５０２】
実施例３５
ＮＯＶ３５クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３５Ａに示す。
【表２２０】
2005515758.tif 000222
【０５０３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３５Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２２１】
2005515758.tif 000223
【０５０４】
ＮＯＶ３５ａタンパク質のさらなる解析により、表３５Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２２２】
2005515758.tif 000224
【０５０５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３５ａタンパク質の検索により、表３５Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２２３】
2005515758.tif 000225
【０５０６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３５ａのタンパク質は、表３５ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２２４】
2005515758.tif 000226
【０５０７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３５ａタンパク質は表３５Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２２５】
2005515758.tif 000227
【０５０８】
実施例３６
ＮＯＶ３６クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３６Ａに示す。
【表２２６】
2005515758.tif 000228
【０５０９】
表３６Ａの続き
【表２２７】
2005515758.tif 000229
【０５１０】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３６Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２２８】
2005515758.tif 000230
【０５１１】
ＮＯＶ３６ａタンパク質のさらなる解析により、表３６Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２２９】
2005515758.tif 000231
【０５１２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３６ａタンパク質の検索により、表３６Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２３０】
2005515758.tif 000232
【０５１３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３６ａのタンパク質は、表３６ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２３１】
2005515758.tif 000233
【０５１４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３６ａタンパク質は表３６Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２３２】
2005515758.tif 000234
【０５１５】
実施例３７
ＮＯＶ３７クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３７Ａに示す。
【表２３３】
2005515758.tif 000235
【０５１６】
表３７Ａの続き
【表２３４】
2005515758.tif 000236
【０５１７】
表３７Ａの続き
【表２３５】
2005515758.tif 000237
【０５１８】
表３７Ａの続き
【表２３６】
2005515758.tif 000238
【０５１９】
表３７Ａの続き
【表２３７】
2005515758.tif 000239
【０５２０】
表３７Ａの続き
【表２３８】
2005515758.tif 000240
【０５２１】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３７Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２３９】
2005515758.tif 000241
【０５２２】
ＮＯＶ３７ａタンパク質のさらなる解析により、表３７Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２４０】
2005515758.tif 000242
【０５２３】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３７ａタンパク質の検索により、表３７Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２４１】
2005515758.tif 000243
【０５２４】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３７ａのタンパク質は、表３７ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２４２】
2005515758.tif 000244
【０５２５】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３７ａタンパク質は表３７Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２４３】
2005515758.tif 000245
【０５２６】
実施例３８
ＮＯＶ３８クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３８Ａに示す。
【表２４４】
2005515758.tif 000246
【０５２７】
ＮＯＶ３８ａタンパク質のさらなる解析により、表３８Ｂに示す以下の特性が得られた。
【表２４５】
2005515758.tif 000247
【０５２８】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３８ａタンパク質の検索により、表３８Ｃに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２４６】
2005515758.tif 000248
【０５２９】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３８ａのタンパク質は、表３８ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２４７】
2005515758.tif 000249
【０５３０】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３８ａタンパク質は表３８Ｅに示すドメインを含有すると予想される。
【表２４８】
2005515758.tif 000250
【０５３１】
実施例３９
ＮＯＶ３９クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表３９Ａに示す。
【表２４９】
2005515758.tif 000251
【０５３２】
表３９Ａの続き
【表２５０】
2005515758.tif 000252
【０５３３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表３９Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２５１】
2005515758.tif 000253
【０５３４】
ＮＯＶ３９ａタンパク質のさらなる解析により、表３９Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２５２】
2005515758.tif 000254
【０５３５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ３９ａタンパク質の検索により、表３９Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２５３】
2005515758.tif 000255
【０５３６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３９ａのタンパク質は、表３９ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２５４】
2005515758.tif 000256
【０５３７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ３９ａタンパク質は表３９Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２５５】
2005515758.tif 000257
【０５３８】
実施例４０
ＮＯＶ４０クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４０Ａに示す。
【表２５６】
2005515758.tif 000258
【０５３９】
表４０Ａの続き
【表２５７】
2005515758.tif 000259
【０５４０】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４０Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２５８】
2005515758.tif 000260
【０５４１】
ＮＯＶ４０ａタンパク質のさらなる解析により、表４０Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２５９】
2005515758.tif 000261
【０５４２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４０ａタンパク質の検索により、表４０Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２６０】
2005515758.tif 000262
【０５４３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４０ａのタンパク質は、表４０ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２６１】
2005515758.tif 000263
【０５４４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４０ａタンパク質は表４０Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２６２】
2005515758.tif 000264
【０５４５】
実施例４１
ＮＯＶ４１クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４１Ａに示す。
【表２６３】
2005515758.tif 000265
【０５４６】
表４１Ａの続き
【表２６４】
2005515758.tif 000266
【０５４７】
表４１Ａの続き
【表２６５】
2005515758.tif 000267
【０５４８】
表４１Ａの続き
【表２６６】
2005515758.tif 000268
【０５４９】
表４１Ａの続き
【表２６７】
2005515758.tif 000269
【０５５０】
表４１Ａの続き
【表２６８】
2005515758.tif 000270
【０５５１】
表４１Ａの続き
【表２６９】
2005515758.tif 000271
【０５５２】
表４１Ａの続き
【表２７０】
2005515758.tif 000272
【０５５３】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４１Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２７１】
2005515758.tif 000273
【０５５４】
ＮＯＶ４１ａタンパク質のさらなる解析により、表４１Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２７２】
2005515758.tif 000274
【０５５５】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４１ａタンパク質の検索により、表４１Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２７３】
2005515758.tif 000275
【０５５６】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４１ａのタンパク質は、表４１ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２７４】
2005515758.tif 000276
【０５５７】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４１ａタンパク質は表４１Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２７５】
2005515758.tif 000277
【０５５８】
実施例４２
ＮＯＶ４２クローンを解析し、ヌクレオチドおよびコード化されたポリペプチド配列を表４２Ａに示す。
【表２７６】
2005515758.tif 000278
【０５５９】
表４２Ａの続き
【表２７７】
2005515758.tif 000279
【０５６０】
前記タンパク質配列の配列比較により、表４２Ｂに示す以下の配列関係が得られた。
【表２７８】
2005515758.tif 000280
【０５６１】
ＮＯＶ４２ａタンパク質のさらなる解析により、表４２Ｃに示す以下の特性が得られた。
【表２７９】
2005515758.tif 000281
【０５６２】
特許および特許公報で刊行された配列を含む所有権のデータベースであるＧｅｎｓｅｑデータベースにおけるＮＯＶ４２ａタンパク質の検索により、表４２Ｄに示すいくつかの相同タンパク質が得られた。
【表２８０】
2005515758.tif 000282
【０５６３】
公開配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４２ａのタンパク質は、表４２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質と相同性を有すると判明した。
【表２８１】
2005515758.tif 000283
【０５６４】
ＰＦａｍ解析により、ＮＯＶ４２ａタンパク質は表４２Ｆに示すドメインを含有すると予想される。
【表２８２】
2005515758.tif 000284
【０５６５】
実施例Ｂ：NOVXクローンの配列決定法および同定
1.GeneCalling（登録商標）技術：これはCuraGenで開発され、Shimketsら「Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query」Nature Biotechnology 17：198-803（1999）に記載の、2以上の試料間の遺伝子発現の差のプロファイリングを実施する特許方法である。cDNAは種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒト試料から得た。試料は全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、すなわちケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のcDNAを最大120対までの制限酵素で消化し、各対の制限酵素に特異的なリンカー-アダプター対を適当な末端に連結した。制限消化による特有のcDNA遺伝子断片の混合物が生じる。限定PCR増幅は、一方のプライマーはビオチニル化され、他方は蛍光標識されているリンカー・アダプター配列と相同なプライマーで実施する。二重標識された物質を単離し、蛍光標識された一本鎖をキャピラリーゲル電気泳動によって分離する。コンピューターアルゴリズムで各制限消化について実験群および対照群から得た電気泳動図を比較する。これとさらなる配列由来情報を用い、種々の遺伝子データベースを用いて発現に差のある各遺伝子断片の同一性を予測する。遺伝子断片の同一性はさらなる遺伝子特異的競合PCRによって、またはこの遺伝子断片の単離および配列決定によって確認する。
【０５６６】
2.SeqCalling（登録商標）技術：cDNAは種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒト試料から得た。試料は全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、すなわちケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のcDNAをCuraGen社の特許SeqCalling技術を用いて配列決定した。配列トレースは手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。すべての試料からのcDNA配列をともにアセンブルし、これは公開ヒト配列を含む場合もあり、バイオインフォマティックプログラムを用いて各アセンブリーの共通配列を得た。各アセンブリーはCuraGen社のデータベースに含まれている。配列は別の構成要素との同一性の程度が50bpにわたって少なくとも95%である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。各アセンブリーは遺伝子またはその一部に相当し、スプライシング型単一ヌクレオチド多型（SNP）、挿入、欠失およびその他の配列変異体などの変異体に関する情報を含む。
【０５６７】
3.PathCalling（登録商標）技術：NOVX核酸配列はツーハイブリッド・アプローチによるcDNAライブラリーの実験室スクリーニングから導かれる。全長DNA配列、または配列の一部のいずれかをカバーするcDNA断片が、双方とも配列決定される。インシリコ予測はCuraGenの特許配列データベースまたは公開されているヒト配列データベースで入手可能な配列に基づいたものであり、全長DNA配列またはそのある一部のいずれかが提供される。
【０５６８】
実験室スクリーニングは以下に要約した方法を用いて実施した：
cDNAライブラリーは種々のドナー由来の複数の組織種、正常状態および病的状態、生理的状態、ならびに発達段階に相当する種々のヒト試料から得た。試料は全組織、一次細胞または組織培養した一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は遺伝子発現を調節する生物因子または化学薬品、例えば、成長因子、すなわちケモカインまたはステロイドで処理しておいてもよい。次いで、このような由来のcDNAを適当なツーハイブリッド・ベクター（Gal4活性化ドメイン（Gal4-AD）融合物）へ指向的にクローニングした。次いで、かかるcDNAライブラリーならびにClontech（Palo Alto, CA）より市販のcDNAライブラリーを大腸菌（E.coli）からCuraGen社特許酵母株（その全文を出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第6,057,101号および6,083,693号に開示）へ移した。
【０５６９】
CuraGen社特許ヒト配列ライブラリーのGal4結合ドメイン（Gal4-BD）融合物を用いて複数のGal4-AD融合物cDNAライブラリーをスクリーニングし、その結果、その各々でGal4-AD融合物が個々のcDNAを含む酵母株二倍体を選択された。各試料をcDNA挿入境界で非特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて増幅した。かかるPCR産物を配列決定した;配列トレースは手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。すべての試料からのcDNA配列をともにアセンブルし、これは公開ヒト配列を含む場合もあり、バイオインフォマティックプログラムを用いて各アセンブリーの共通配列を得た。各アセンブリーはCuraGen社のデータベースに含まれている。配列は別の構成要素との同一性の程度が50bpにわたって少なくとも95%である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。各アセンブリーは遺伝子またはその一部に相当し、スプライシング型単一ヌクレオチド多型（SNP）、挿入、欠失およびその他の配列変異体などの変異体に関する情報を含む。
【０５７０】
物理的クローン：全オープンリーディングフレームをカバーする、スクリーニング手順により得たcDNA断片を、cDNAライブラリーの作製に用いたpACT2プラスミド（Clontech）に組み換えDNAとしてクローニングする。この組換えプラスミドを宿主へ挿入し、CuraGen社特許酵母株N106'およびYULH（米国特許第6,057,101号および第6,083,693号）の双方の結合によるスクリーニング手順の間に生じた酵母ハイブリッド二倍体によって選択する。
【０５７１】
4.RACE：cDNA末端の迅速増幅（RACE）などのポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術を用いて本発明のcDNAの予測配列を単離または完成した。通常、1以上のヒト試料から複数のクローンを配列決定して断片の配列を導く。種々のドナー由来の種々のヒト組織試料をRACE反応に用いた。これらの手順から得られた配列を、前節に記載のSeqCallingアセンブリープロセスに含めた。
【０５７２】
5.エクソン結合：本発明で同定されたNOVX 標的配列をエクソン結合プロセスに付して配列を確認した。PCRプライマーはフォワードプライマーについては入手可能な最も上流の配列で、リバースプライマーについては入手可能な最も下流の配列で開始することによって設計した。いずれの場合にも、特有かまたは選択性の高いのいずれかである好適な配列に出会うまで、あるいは、リバースプライマーの場合には、停止コドンに達するまで、それぞれの末端からコード配列に向かって内へ進んで配列を調べた。かかるプライマーは全長cDNAインシリコ予測、標的配列のDNAまたはタンパク質配列の一部（1以上のエクソン）に基づいて、あるいは予測されたエクソンの、他の種由来の密接に関連したヒト配列との翻訳後相同性によって設計した。次いで、これらのプライマーをヒトcDNAの以下のプール：副腎、骨髄、脳-扁桃体、脳-小脳、脳-海馬、脳-黒質、脳-視床、脳-全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫-Raji、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮を基にしたPCR増幅に用いた。通常、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングして重複性が高くなるまで配列決定する。エクソン結合から得られたPCR産物をInvitrogen製のpCR2.1ベクターにクローニングした。得られた細菌クローンはpCR2.1ベクターにクローニングされた全オープンリーディングフレームをカバーする挿入部分を有する。全クローンから得られた配列はそれら自身を用いて、CuraGen社のデータベースにあるその他の断片を用いて、および公開されているESTを用いてアセンブルした。断片およびESTはそのアセンブリーの別の構成要素とのその同一性の程度が50bpにわたって少なくとも95%である場合、アセンブリーの構成要素として含めた。さらに、配列トレースを手作業で評価し、必要に応じて修正のために編集した。これらの手順により本明細書で報告される配列が提供される。
【０５７３】
6.物理的クローン：相同性によってエクソンを予測し、標準的な遺伝子規則を用いてイントロン/エクソンの境界を決定した。エクソンをさらに選択し、複数のBLAST（例えば、tBlastN、BlastX、およびBlastN）検索、また、場合によっては、GeneScanおよびGrailを用いる類似性測定によって正確なものにした。遺伝子配列をさらに規定し、かつ、完成するために、利用可能な場合には、公開データベースおよび専売データベース双方由来の発現配列も加えた。次いで、明らかな不整合に関してDNA配列を手作業で修正した結果、全長タンパク質をコードする配列が得られた。
【０５７４】
全オープンリーディングフレームをカバーする、エクソン結合によって得られたPCR産物をInvitrogen製のpCR2.1ベクターにクローニングして発現およびスクリーニング目的に用いるクローンを準備した。
【０５７５】
実施例Ｃ：種々の細胞および組織におけるクローンの量的発現解析
種々のクローンの量的発現を、リアルタイム定量PCR（RTQ PCR）を用い、種々の正常および病理由来細胞、細胞株および組織由来のRNA試料を含むマイクロタイタープレートを用いて評価した。RTQ PCRはApplied Biosystems ABI PRISM（登録商標）7700またはABI PRISM（登録商標）7900 HT Sequence Detection Systemで実施した。試料の種々の収集物をプレート上でアセンブルし、パネル1（正常組織および癌細胞株を含む）、パネル2（正常および癌供給源組織に由来する試料を含む）、パネル3（癌細胞株を含む）、パネル4（正常組織由来の細胞および細胞株ならびに炎症症状と関連している細胞を含む）、パネル5D/5I（代謝病（metabolic disese）に重点をおいたヒト組織および細胞株を含む）、AI  包括的  パネル（正常組織、および自己免疫疾患および自己炎症性疾患（autoinflammatory diseases）由来の試料を含む）、パネルCNSD.01（正常脳および患部脳由来の試料を含む）およびCNS  神経変性  パネル（正常脳およびアルツハイマー病（Alzheimer's disease）の脳由来の試料を含む）と称した。
【０５７６】
全試料由来のRNAの完全性は、28Sおよび18SリボソームRNA染色強度比をガイド（2：1〜2.5：1 28s：18s）として用いるアガロースゲル電気泳動図の視覚的評価によって質に関して、および分解産物を示唆するであろう低分子量RNAの不在に関して制御する。試料は単一エクソンの長さにわたって増幅するよう設計したプローブおよびプライマーセットを用いる、逆転写酵素の不在下でのRTQ PCR反応実施によってゲノムDNA混入に対して制御する。
【０５７７】
最初に、このRNA試料を構成的発現遺伝子（例えば、β-アクチンおよびGAPDH）などの参照核酸に対して標準化した。標準化したRNA（5μl）をcDNAへ変換し、ワンステップRT-PCR Master Mix試薬（Applied Biosystems；カタログ番号4309169）および遺伝子特異的プライマーを製造者の使用説明書に従って用いるRTQ-PCRにより解析した。
【０５７８】
他の場合には、標準化していないRNA試料をSuperscript II（Invitrogen社;カタログ番号18064-147）およびランダム・ヘキサマーを製造者の使用説明書に従って用いて一本鎖cDNA（sscDNA）へ変換した。全RNAを最大10ug含む反応を20μlの容量で実施し、42℃で60分間インキュベートした。この反応は最終容量100μlにおいて50μgの全RNAまでスケールアップしてもよい。次いで、sscDNA試料を1×TaqMan（登録商標）Universal Master mix（Applied Biosystems;カタログ番号4324020）を製造者の使用説明書に従って用いて従前に記載の参照核酸に対して標準化した。
【０５７９】
プローブおよびプライマーはApplied BiosystemsのPrimer Expressソフトウェアパッケージ（アップルコンピューターのマッキントッシュパワーPC第1版）または標的配列インプットとして用いる類似のアルゴリズムに従って各アッセイ用に設計した。デフォルト設定を反応条件に用い、以下のパラメーターをプライマー選択の前に設定した：プライマー濃度=250nM、プライマー融解温度（Tm）範囲=58〜60℃、プライマーの最適Tm=59℃、最大プライマー差=2℃、プローブは5'Gを含まない、プローブTmはプライマーTmより10℃高くなくてはならない、アンプリコンサイズは75bp〜100bp。選択したプローブおよびプライマー（以下参照）をSynthegen（Houston, TX, USA）によって合成した。プローブをHPLCで2回精製して結合していない色素を除去し、質量分析によって評価し、レポーターおよびクエンチャー色素のプローブの5'および3'末端それぞれとの結合を確認した。最終濃度は、フォワードおよびリバースプライマーは各900nM、プローブは200nMとした
【０５８０】
PCR条件：RNA試料を扱う場合には、各組織および各細胞株由来の標準化RNAを96ウェルまたは384ウェルPCRプレート（Applied Biosystems）のいずれかの各ウェルにスポットした。PCRカクテルは単一の遺伝子特異的プローブおよびプライマーセット、または2つのマルチプレックス化したプローブおよびプライマーセット（標的クローンに特異的なセットおよび標的プローブについてマルチプレックス化した別の遺伝子特異的セット）のいずれかを含んでいた。PCR反応はTaqMan（登録商標）ワンステップRT-PCR Master Mix（Applied Biosystems，カタログ番号4313803）を製造者の使用説明書に従って用いて設定した。48℃で30分間の逆転写、次いで、以下の増幅/PCRサイクル：95℃10分間、その後95℃15秒を40サイクル、60℃で1分間を実施した。結果は、任意の試料とΔCT力について2で表される最低のCT値を持つ試料間のRNA濃度に差に関して、ログスケールを用いてCT値（任意の試料が蛍光の閾値を通過するサイクル）として記録した。次いで、相対発現パーセントがこのRNA差異の逆数をとり、100を掛けることによって得られる。
【０５８１】
sscDNA試料を扱う場合には、標準化したsscDNAをRNA試料について前記の通り用いた。1または2セットのプローブおよびプライマーを含むPCR反応を1×TaqMan（登録商標）Universal Master mix（Applied Biosystems；カタログ番号4324020）を製造者の使用説明書に従って用いて、前記の通り設定した。PCR増幅は以下のように実施した：95℃で10分、次いで95℃で15秒の40サイクル、60℃で1分。結果は前記のように解析し、処理した。
【０５８２】
パネル  1、1.1、1.2、および1.3D
パネル1、1.1、1.2および1.3Dのプレートには2の対照ウェル（ゲノムDNA対照および化学対照）および種々の試料由来のcDNAを含む94のウェルが含まれる。これらのパネルの試料は2つのクラス：培養細胞株由来の試料および一次正常組織由来の試料に分類される。細胞株は以下の種類の癌：肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、CNS癌、扁平上皮癌腫腫、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌に由来する。これらのパネルで用いる細胞株は培養細胞株の宝庫であるAmerican Type Culture Collection（ATCC）を通じて広く入手可能であり、ATCCの推奨する条件を用いて培養した。これらのパネルに見出される正常組織は単一の成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来する試料に含まれる。これらの試料は以下の器官：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪に由来する。
【０５８３】
パネル1、1.1、1.2および1.3Dの結果では、以下の略語が用いられる：
ca.=癌腫
*=転移により確立されたもの
met=転移
s cell var=小細胞変異体
non-s=non-sm=非小
squam=扁平上皮
pl. eff=pl effusion=胸膜浸出液
glio=神経膠腫
astro=星細胞腫
neuro=神経芽細胞腫
【０５８４】
一般  スクリーニング  パネル  v1.4、v1.5およびv1.6
パネル1.4、ｖ1.5、およびｖ1.6のプレートには2の対照ウェル（ゲノムDNA対照および化学対照）および種々の試料由来のcDNAを含む94のウェルが含まれる。パネル1.4、ｖ1.5、およびｖ1.6の試料は2つのクラス：培養細胞株由来の試料および一次正常組織由来の試料に分類される。細胞株は以下の種類の癌：肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、CNS癌、扁平上皮癌腫腫、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌に由来する。パネル1.4、ｖ1.5、およびｖ1.6で用いる細胞株は培養細胞株の宝庫であるAmerican Type Culture Collection （ATCC）を通じて広く入手可能であり、ATCCの推奨する条件を用いて培養した。パネル1.4、ｖ1.5、およびｖ1.6に見出される正常組織は2〜5の異なる成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来する試料のプールに含まれる。これらの試料は以下の器官：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪に由来する。略語はパネル1、1.1、1.2、および1.3Dについて記載した通り。
【０５８５】
パネル  2D、2.2、2.3および2.4
パネル2D、2.2、2.3および2.4のプレートには概ね2の対照ウェルおよび米国国立癌研究所（the National Cancer Institute）のCooperative Human Tissue Network（CHTN）またはNational Disease Research Initiative（NDRI）と密接な協力関係を持つ医師により入手したか、あるいはArdaisまたはClinomicsから得たヒト組織から単離した、RNAまたはcDNAから成る94の試験試料が含まれる。この組織はヒト悪性腫瘍に由来し、示される場合には、多くの悪性組織が腫瘍とまさに隣接した非癌性組織から得られた「対応縁部（mached margins）」を含む。これらを正常な隣接組織と称し、下記の結果では「NAT」と示す。腫瘍組織および「対応縁部」は2人の独立した病理学者によって（外科病理学者およびさらにNDRI/CHTN/Ardais/Clinomicsの病理学者によって）評価されている。悪性腫瘍のない組織（正常組織）由来の非対応RNA試料もArdaisまたはClinomicsより入手した。この分析により腫瘍の分化の程度に関する全体的な組織病理学的評価が提供される。さらに、ほとんどの試料が患者の臨床段階に関する情報を提供する最初の外科病理学報告書を包含する。これら対応縁部は外科手術域を取り囲む（すなわち、最も近くに隣接する）組織（表RRでは正常隣接細胞という語から「NAT」と表す）から採取されている。さらに、RNAおよびcDNA試料を高齢者または急死した被害者（事故など）に行なわれた検死解剖より得た種々のヒト組織から得た。これらの組織は病気にかかっていないと確認され、Clontech（Palo Alto, CA）、Research Genetics、およびInvitrogenなどの種々の商業ソースから購入した。一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ２．４は、パネル２Ｄのアップデートバージョンである。
【０５８６】
HASS  パネル  v 1.0
HASSパネルv 1.0プレートは93のcDNA試料および2の対照に含まれる。詳しくは、これらの試料のうち81が、血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素に異なる期間付された培養ヒト癌細胞株ならびにこれらの処置の対照に由来し、3試料がヒト一次細胞、9試料が悪性脳癌（4の髄芽細胞腫および5の膠芽細胞腫））、ならびに2が対照である。ヒト癌細胞株はATCC（American Type Culture Collection）より入手し、以下の組織群：乳癌、前立腺癌、膀胱癌腫、膵臓癌、およびCNS癌細胞株に分類される。これらの癌細胞はすべて標準の推奨される条件下で培養する。用いた処置（血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素）はこれまでに科学論文で公開されている。ヒト一次細胞はClonetics（Walkersville, MD）より入手し、Cloneticsの推奨する培地および条件で増殖させた。悪性脳癌試料は共同研究（Henry Ford Cancer Center）の一環として入手し、CuraGenが試料を受け取る前に病理学者によって評価されている。標準的な手順を用いてRNAをこれらの試料から調製した。ゲノム対照および化学対照ウェルについては既に記載した。
【０５８７】
ARDAIS  パネルv1.0
ARDAISパネルv1.0のプレートには概ね2の対照ウェルおよびArdais社と密接な協力関係を持つ医師により入手したヒト組織から単離したRNAからなる22の試験試料を含む。組織はヒト肺悪性腫瘍、（肺腺癌または肺扁平上皮癌腫）に由来し、示される場合には、多くの悪性組織は腫瘍とまさに隣接した非癌性組織から得られる「対応縁部」を含む。これら対応縁部は以下の結果では外科手術域を取り囲む（すなわち、最も近くに隣接する）組織（正常隣接細胞という語から「NAT」と呼ばれる）から採取されている。腫瘍組織および「対応縁部」は独立した病理学者によって（外科病理学者およびさらにArdaisの病理学者によって）評価されている。肺由来の非対応悪性および非悪性のRNA試料もArdaisより入手した。Ardaisからのさらなる情報により腫瘍分化の程度および段階に関する全体的な組織病理学的評価を提供される。さらに、ほとんどの試料が患者の臨床段階に関する情報を提供する最初の外科病理学報告書を包含する。
【０５８８】
パネル  3D、および3.1
パネル3Dおよび3.1のプレートは94のcDNA試料および2の対照試料に含まれる。詳しくは、これらの試料のうち92が培養ヒト癌細胞株に由来し、2試料がヒト一次小脳組織に由来し2が対照である。ヒト細胞株は概ねATCC（American Type Culture Collection）、NCIまたはドイツ腫瘍細胞バンク（German tumor cell bank）より入手し、以下の組織群：舌の扁平上皮癌腫、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌腫、肉腫、膀胱癌腫、膵臓癌、腎臓癌、白血病/リンパ腫、卵巣/子宮/子宮頸癌、胃癌、結腸癌、肺癌およびCNS癌細胞株に分けられる。さらに、2つの独立した小脳の試料がある。これらの細胞はすべて標準の推奨された条件下で培養し、標準的な手順を用いてRNAを抽出した。パネル３Ｄ、３．１、１．３Ｄおよび腫瘍学_細胞_株_スクリーニング_パネル_ｖ３．２中の細胞株は科学文献で用いられる最も一般的な細胞株である。
【０５８９】
パネル  4D、4R、および4.1D
パネル4は96ウェルプレート（対照ウェル2、試験試料94）に、炎症症状に関連する種々のヒト細胞株または組織から単離したRNA（パネル4R）またはcDNA（パネル4D/4.1D）からなる試料を含む。結腸および肺（Stratagene, La Jolla, CA）ならびに胸腺および腎臓（Clontech）などの対照正常組織由来の全RNAを用いた。肝硬変（cirrhosis）患者より得た肝臓組織および狼瘡（lupus）患者より得た腎臓由来の全RNAはBioChain（BioChain Institute, Inc., Hayward, CA）より入手した。クローン病および潰瘍性大腸炎であると診断された患者由来のRNA調製用の腸組織はNational Disease Research Interchange（NDRI）（Philadelphia, PA）より入手した。
【０５９０】
星細胞、肺繊維芽細胞、皮膚繊維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、細気管支上皮、気管支上皮、皮膚微小血管内皮細胞、肺微小血管内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞はすべてClonetics（Walkersville, MD）より購入し、これらの細胞種用にCloneticsが提供する培地で増殖させた。これらの一次細胞種は指示された通り、種々のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせを用いて6および/または12〜14時間で活性化した。以下のサイトカインを用いた;約1〜5ng/mlのIL-1β、約5〜10ng/mlのTNFα、約20〜50ng/mlのIFNγ、約5〜10ng/mlのIL-4、約5〜10ng/mlのIL-9、約5〜10ng/mlのIL-13。内皮細胞は0.1%血清を含むCloneticsの基本培地での培養によって種々の期間飢餓とすることもあった。
単核球をFicollを用いてCuraGen社の社員の血液から調製した。LAK細胞をこれらの細胞からDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco/Life Technologies, Rockville, MD）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）およびインターロイキン2で4〜6日培養することで調製した。次いで、細胞を、10〜20ng/ml PMAおよび1〜2μg/ml イオノマイシン、5〜10ng/mlのIL-12、20〜50ng/mlのIFNγおよび5〜10ng/mlのIL-18で6時間活性化させた。場合によっては、単核球をDMEM 5% FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および約5μg/mlのPHA（フィトヘムアグルチニン）またはPWM（ポークウィードマイトジェン）を含む10mM Hepes（Gibco）で4〜5日間培養した。試料はRNA調製用に24、48および72時間で採取した。MLR（混合リンパ球反応）試料は二人のドナーより血液を採取し、Ficollを用いて単核球を単離し、単離した単核球をDMEM 5% FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール（5.5x10-5M）（Gibco）、および10mM Hepes （Gibco）に約2x106細胞/mlの最終濃度で1：1混合することで得た。MLRを培養し、試料をRNA調製用に1〜7日間の範囲の種々の時点で取り出した。
【０５９１】
単球は、CD 14 Miltenyiビーズ、ポジティブVS選択カラムおよびVario Magnetを製造者の使用説明書に従って用いて単核球から単離した。単球はDMEM 5%ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone, Logan, UT）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）、50ng/ml GMCSFおよび5ng/ml IL-4での5〜7日間の培養によって樹状細胞へ分化した。マクロファージはDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、10mM Hepes（Gibco）および10%AB型ヒト血清または約50ng/mlのMCSFで単球を5〜7日間培養して調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞はまた、100ng/mlのリポ多糖（LPS）で6および12〜14時間刺激した。樹状細胞も10μg/mlの抗CD40モノクローナル抗体（Pharmingen）で6および12〜14時間刺激した。
【０５９２】
CD4リンパ球、CD8リンパ球およびNK細胞もCD4、CD8およびCD56 Miltenyiビーズ、ポジティブVS選択カラムならびにVario Magnetを製造者の使用説明書に従って用いて単核球から単離した。CD45RAおよびCD45RO CD4リンパ球はCD8、CD56、CD14およびCD19 Miltenyiビーズおよびポジティブ選抜を用いてCD8、CD56、CD14およびCD19細胞の単核球を枯渇させて単離した。次いでCD45ROビーズを用いてCD45RO CD4リンパ球をCD45RA CD4リンパ球である残存する細胞とともに単離した。CD45RA CD4、CD45RO CD4およびCD8リンパ球を、DMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）に入れ、PBS中0.5μg/ml抗CD28（Pharmingen）および3ug/ml抗CD3（OKT3, ATCC）で一晩コーティングしておいたFalcon6ウェル組織培養プレートの上に106個細胞/mlでプレーティングした。6時間後及び24時間後に、RNA調製のためこの細胞を回収した。慢性的に活性化したCD8リンパ球を調製するため、本発明者らは単離したCD8リンパ球を4日間、抗CD28および抗CD3コーティングプレート上で活性化し、次いで細胞を回収し、これらをDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）、およびIL-2で拡大した。次いで、拡大したCD8細胞を再び抗CD3および抗CD28が結合したプレートで4日間活性化させ、前と同様に拡大した。第2の活性化の6および24時間後に、ならびに第2の拡大培養の4日後にRNAを単離した。単離したNK細胞はDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）およびIL-2で4〜6日間培養し、その後RNAを調製した。
【０５９３】
B細胞を得るために、扁桃をNDRIより入手した。扁桃を滅菌した解剖用鋏で細かく切断した後、篩にかけた。次いで扁桃細胞を沈降させ、DMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）で、106細胞/mlに再懸濁した。細胞を活性化させるため、本発明者らは5ug/mlのPWMまたは約10μg/mlの抗CD40（Pharmingen）ならびに5〜10ng/mlのIL-4を用いた。RNA調製用に24、48および72時間で細胞を回収した。
【０５９４】
一次および二次Th1/Th2およびTr1細胞を調製するため、6ウェルFalconプレートを10μg/ml抗CD28（Pharmingen）および2μg/ml OKT3（ATCC）で一晩コーティングし、次いでPBSで2回洗浄した。臍帯血CD4リンパ球（Poietic Systems, German Town, MD）をDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、10mM Hepes（Gibco）およびIL-2（4ng/ml）で105〜106細胞/mlで培養した。IL-12（5ng/ml）および抗IL4（1μg/ml）をTh1に直接用い、他方IL-4（5ng/ml）および抗IFNγ（1μg/ml）をTh2に直接用い、5ng/mlのIL-10をTr1に直接用いた。4〜5日後、活性化したTh1、Th2およびTr1リンパ球をDMEMで一度洗浄し、DMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、10mM Hepes（Gibco）およびIL-2（1ng/ml）で4〜7日間拡大した。この後、活性化したTh1、Th2およびTr1リンパ球を前記のように抗CD28/OKT3およびサイトカインで5日間再刺激したが、アポトーシスを防ぐため抗CD95L（1μg/ml）を添加した。4〜5日後、Th1、Th2およびTr1リンパ球を洗浄し、次いで再びIL-2で4〜7日間拡大した。活性化したTh1およびTh2リンパ球をこのように最大3サイクル間維持した。抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体が結合したプレートでの第2および第3の活性化、ならびにインターロイキン2での第2および第3の拡大培養への4日間の6および24時間後、RNAを一次および二次Th1、Th2およびTr1より調製した。
【０５９５】
以下の白血球細胞株：Ramos、EOL-1、KU-812はATCCより入手した。EOL細胞はさらに0.1mM dbcAMPで5x105細胞/mlにて、3日毎に培地を交換し、細胞濃度を5×105細胞/mlに調整しながら、8日間培養して分化させた。これらの細胞の培養には、本発明者らはDMEMまたはRPMI（ATCCの推奨するもの）を5% FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、10mM Hepes（Gibco）を添加して用いた。RNAは休止細胞または10ng/mlのPMAおよび1μg/mlのイオノマイシンで6および14時間活性化させた細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株CCD106および気道上皮腫瘍（airway epithelial tumor）株NCI-H292もATCCより入手した。双方ともDMEM 5%FCS（Hyclone）、100μM非必須アミノ酸（Gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（Gibco）、メルカプトエタノール5.5x10-5M（Gibco）、および10mM Hepes（Gibco）で培養した。CCD1106細胞は約5ng/ml TNFαおよび1ng/ml IL-1βで6および14時間活性化させ、他方、NCI-H292細胞は以下のサイトカイン：5ng/ml IL-4、5ng/ml IL-9、5ng/ml IL-13および25ng/ml IFNγで6および14時間活性化させた。
【０５９６】
これらの細胞株および血液細胞については、RNAはトリゾール（Gibco BRL）を用いて約107細胞/mlに溶解させることによって調製した。便宜には、1/10容量のブロモクロロプロパン（Molecular Research Corporation）をRNA試料へ加え、ボルテックス処理をして室温にて10分後、チューブをSorvall SS34 ローターにて14,000rpmで回転させた。水相を回収し、15ml Falcon Tubeの中に入れた。等量のイソプロパノールを加え、-20℃にて一晩静置した。沈殿したRNAをSorvall SS34ローターにて9,000rpmで15分間沈降させ、70%エタノールで洗浄した。ペレットを300μlのＲＮＡｓｅを含まない水に再び溶解し、35μlのバッファー（Promega）、5μl DTT、7μl RNAsinおよび8μlのDNアーゼを加えた。チューブを37℃で30分間インキュベートして混入しているゲノムDNAを除去し、フェノールクロロホルムで1回抽出し、1/10容量の3M酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノールで再び沈殿させた。RNAを沈降させ、RNアーゼを含まない水に入れた。RNAは-80℃で保存した。
【０５９７】
AI  包括的  パネル  v1.0
AI  包括的  パネル  v1.0のプレートには2の対照ウェルならびに、Backus HospitalおよびClinomics（Frederick, MD）より入手した外科および検死解剖ヒト組織から単離したcDNAを含む89の試験試料が含まれる。全RNAはCuraGenの施設内のBackus Hospitalより得た組織試料から抽出した。他の組織由来の全RNAはClinomicsより入手した。
【０５９８】
滑液、滑膜、骨および軟骨をはじめとする関節組織はBackus Hospitalで人工膝関節または人工股関節置換術を受けている患者より得た。単離したRNAが確実に最適な品質のものであり退化しないように組織試料は液体窒素中で直ちに急速冷凍させた。骨関節症および慢性関節リウマチの関節組織のさらなる試料をClinomicsより入手した。正常な対照組織はClinomicsより提供されたもので、外傷被害者の検死解剖の際に入手した。
【０５９９】
乾癬組織および隣接した対応組織の外科試料はClinomicsより全RNAとして提供された。25〜47歳の間の2名の男性および2名の女性患者を選択した。試料を単離する時に処方薬を服用していた患者はいなかった。
【０６００】
潰瘍性大腸炎およびクローン病の患者より得た患部結腸の外科試料および隣接する対応組織をClinomicsより入手した。41〜69歳の間の3名の女性および3名の男性クローン病患者より得た腸管組織を用いた。2名の患者は薬を処方されていなかったが、他の者はデキサメタゾン、フェノバルビタール、またはタイレノールを服用していた。潰瘍性大腸炎組織は3名の男性および4名の女性患者より得た。患者のうち4名はレヴィッド（lebvid）を、そして2名はフェノバルビタールを服用していた。
疾病のない、または肺気腫、喘息またはCOPDを患う外傷被害者より得た検死解剖肺組織由来の全RNAをClinomicsより購入した。40〜70歳の範囲の肺気腫患者および全員が喫煙者であり、この年齢範囲はタバコが関連している肺気腫の患者に主眼を置き、かつ、α-1抗トリプシン欠乏症の患者を避けるために選択した。喘息患者は36〜75歳にわたり、COPDも有するおそれのある患者を避けるため喫煙者を除外した。COPD患者は35〜80歳にわたり、喫煙者と非喫煙者の双方が含まれていた。ほとんどの患者がコルチコステロイドおよび気管支拡張薬を服用していた。
【０６０１】
AI  包括的  パネル  v1.0パネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている：
AI=自己免疫
Syn=滑液の
Normal=明白な疾病なし
Rep22/Rep20=個々の患者
RA=慢性関節リウマチ
Backus=Backus病院提供
OA=骨関節症
（SS）（BA）（MF）=個々の患者
Adj=隣接組織
Match control=隣接組織
- M=男性
- F=女性
COPD=慢性閉塞性肺疾患
【０６０２】
パネル  5Dおよび5I
パネル5Dおよび5Iのプレートには2の対照ウェルならびに代謝病に重点を置いてヒト組織および細胞株から単離した種々のcDNAが含まれる。代謝組織は妊娠糖尿病（Gestational Diabetes）研究に加わっている患者より得た。細胞はヒト間葉幹細胞由来の脂肪細胞の分化における様々の段階の間で得た。ヒト膵島も得た。
妊娠糖尿病研究では被検者は若い（18〜40歳）かまたは慣例の（選択性の）帝王切開をうけている妊娠糖尿病であるか、そうでない健常な女性である。乳児出産後の外科的切開が修復された/閉じられる際、各外科レベルの終了処理中に産科医が露出した代謝組織の小試料（<1cc）を摘出した。生検物質を摘出から5分以内に滅菌した生理食塩水ですすぎ、水分を吸い取って急速冷凍した。次いで組織を液体窒素で瞬間冷凍させ、滅菌したネジ蓋式のチューブに個別に保存し、発送用またはCuraGen社が回収するようにドライアイス上で維持した。注目する代謝組織としては子宮壁（平滑筋）、内臓脂肪、骨格筋（直筋）および皮下脂肪が挙げられる。患者の概要は以下の通り：
患者2：糖尿病のラテンアメリカ人、過体重、インスリンを常用していない
患者7-9：糖尿病でない白人で肥満（BMI>30）
患者10：糖尿病のラテンアメリカ人、過体重、インスリンを常用
患者11：糖尿病でないアフリカ系アメリカ人で過体重
患者12：糖尿病のラテンアメリカ人、インスリンを常用
【０６０３】
脂肪細胞の分化を、2つの複製しかないドナー3Uを除き、3連でOsirus（Clonetics/BioWhittakerの一部門）から得たドナー前駆細胞内で誘導した。Cloneticsの科学者らはCuraGenのためにMark F. Pittengerらに見出された公開プロトコール、Multilineage Potential of Adult Human mesenchymal Stem Cells Science Apr 2 1999：143-147に基づいてヒト間葉幹細胞（HuMSC）を単離し、増殖させ、分化させた。CloneticsはmRNA単離および二本鎖cDNA生成に好適なトリゾール溶解物または凍結ペレットを提供した。各ドナーの概要は以下の通り：
ドナー2および3U： 間葉幹細胞、未分化の脂肪
ドナー2および3AM：脂肪、分化途中の脂肪
ドナー2および3AD：脂肪、分化した脂肪
【０６０４】
ヒト細胞株は概ねATCC（American Type Culture Collection）、NCIまたはドイツ腫瘍細胞バンク（German tumor cell bank）より入手し、以下の組織群：腎臓近位尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝臓HepG2癌細胞、心臓一次間質細胞、および副腎皮質腺腫細胞に分類される。これらの細胞はすべて標準の推奨された条件下で培養し、標準的な手順を用いてRNAを抽出した。すべての試料はCuraGenで処理して一本鎖cDNAを得た。
【０６０５】
パネル5Iはこれまでに記載のすべての試料を含み、マイアミ医科大学（University of Miami School of Medicine）の糖尿病研究所（Diabetes Research Institute）から得た58歳の女性患者の膵島をさらに加えた。島組織は外部ソースで全RNAに処理され、パネル5Iに加えるためCuraGenに届けられた。
【０６０６】
5Dおよび5Iパネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている：
GO脂肪=大網脂肪
SK=骨格筋
UT=子宮
PL=胎盤
AD=分化した脂肪
AM=分化途中の脂肪
U=未分化の幹細胞
【０６０７】
パネル  CNSD. 01
パネルCNSD.01のプレートは2の対照ウェルおよびハーバード脳組織資源センター（Harvard Brain Tissue Resource Center）より得た検死解剖ヒト脳組織から単離したcDNAからなる94の試験試料が含まれる。脳は死後4〜24時間にドナーの頭蓋冠から摘出され、神経解剖学者によって区分化され、液体窒素蒸気中で-80℃にて凍結されている。すべての脳は神経病理学者によって区分化されて調べられ、明確に関連している神経病理学について診断が確認されている。
【０６０８】
疾病診断は患者の記録から取られている。パネルには以下の診断：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、進行性核上麻痺、鬱病の各々からの2つの脳、および「正常対照」が含まれる。これらの脳の各々の中には、以下の領域が示されている：帯状回、側頭極、淡蒼球、黒質、ブロードマン野4（一次運動帯）、ブロードマン野7（頭頂皮質）、ブロードマン野9（前前頭皮質）、およびブロードマン野17（後頭皮質）。すべての患者ですべての脳の領域が示されるわけではなく、ハンチントン舞踏病は一つには淡蒼球での神経変性を特徴とし、従ってハンチントン舞踏病と確認された患者からこの領域を得ることは不可能である。同様にパーキンソン病は黒質の変性を特徴とし、この領域を得るのが一層困難となる。正常な対照脳は神経病理学に関して調べられ、神経変性に一致する病理がないとわかったものである。
【０６０９】
CNSパネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている：
PSP=進行性核上麻痺
Sub Nigra=黒質
Glob Palladus=淡蒼球
Temp Pole=側頭極
Cing Gyr=帯状回
BA 4=ブロードマン野4
【０６１０】
パネル  CNS  神経変性  V1.0
パネルCNS  神経変性  V1. 0のプレートには2の対照ウェルならびにハーバード脳組織資源センター（Harvard Brain Tissue Resource Center）（McLean Hospital）およびヒト脳・脊髄液資源センター（Human Brain and Spinal Fluid Resource Center）（VA Greater Los Angeles Healthcare System）から入手した検死解剖ヒト脳組織から単離したcDNAからなる47の試験試料が含まれる。脳は死後4〜24時間にドナーの頭蓋冠から摘出され、神経解剖学者によって区分化され、液体窒素蒸気中で-80℃にて凍結されている。すべての脳は神経病理学者によって区分化されて調べられ、明確に関連する神経病理学について診断が確認されている。
【０６１１】
疾病診断は患者の記録から取られている。パネルには6のアルツハイマー病（AD）患者由来の脳、および8の死亡前に痴呆の徴候を示さなかった「正常対照」由来の脳を含む。8の正常対照脳は2種類：痴呆およびアルツハイマー病のような病状のない対照（対照）および痴呆はないが重篤なアルツハイマー病のような病状の徴候のある対照、（詳しくは0〜3段階のレベル3と評価される老人斑量；0=斑の徴候なし、3=重篤なAD老人斑量）に分けられる。これらの脳の各々の中には、以下の領域が示されている：海馬、側頭皮質（ブロードマン野21）、頭頂皮質（ブロードマン野7）、および後頭皮質（ブロードマン野17）。これらの領域はADにおけるすべての段階の神経変性を包含するよう選択した。海馬はADにおいて初期ならびに重篤な神経損失領域である；側頭皮質はADにおいて海馬の後に神経変性を示すと知られている；頭頂皮質はこの疾病の最終段階で適度の神経細胞死を示す；後頭皮質はADで残される、従ってAD患者内で「対照」領域として役割を果たす。すべての患者ですべての脳領域が示されているわけではない。
【０６１２】
CNS  神経変性  V1.0パネルで組織の同定に用いた標識では、以下の略語が用いられている：
AD=アルツハイマー病脳；検死解剖に際し患者は痴呆でADのような病理を示した
Control=対照脳；神経病理学を示さない痴呆でない患者
Control（Path）=対照脳；痴呆でないが重篤なADのような病理を示す患者
SupTemporal Ctx=上側頭皮質
Inf Temporal Ctx=下側頭皮質
【０６１３】
Ａ．ＣＧ１０５３２４−０１：ヒト核オーファン受容体ＬＸＲ−α様遺伝子
遺伝子ＣＧ１０５３２４−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４２８４を用いて評価し、表ＡＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＢ、ＡＣおよびＡＤに示す。
【０６１４】
【表２８３】
2005515758.tif 000285
【０６１５】
【表２８４】
2005515758.tif 000286
【０６１６】
表ＡＢの続き
【表２８５】
2005515758.tif 000287
【０６１７】
【表２８６】
2005515758.tif 000288
【０６１８】
【表２８７】
2005515758.tif 000289
【０６１９】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４２８４  この遺伝子の最も高発現は、乳癌Ｔ４７Ｄ細胞株で検出される（ＣＴ＝２９．９）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、膵臓、脳、大腸、肝臓、肺、乳および卵巣癌由来のいくつかの細胞株で検出される。それゆえ、この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的調節は、これら癌の処置で有用であり得る。
【０６２０】
加えて、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、膵臓、脂肪および胃で見られる。この遺伝子は、核オーファン受容体ＬＸＲ−αをコードする。ＬＸＲαは、胆汁酸合成の率を制限する酵素であるコレステロール７αヒドロキシラーゼの発現を制御することによるコレステロール異化の制御において主に働くと思われる。ＬＸＲは、ＦＸＲ、ＰＰＡＲ、およびＲＸＲタンパク質のような他の核ホルモンを含むネットワークの一部であり、かつステロール代謝経路を制御する遺伝子の転写調節の長所により脂質代謝において本質的に働く。これらの調節ネットワークの主要な下流標的のいくつかは、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、ＡＢＣＧ５、ＡＢＣＧ８、ＭＤＲ３／Ｍｄｒ２およびＳＰＧＰ／ＢＳＥＰを含むＡＢＣトランスポーターファミリーのメンバーを含む（Niesor et al., 2001, Curr Pharm Des 7(4):23159, PMID: 11254888; Fitzgerald et al., J Mol Med 2002 May;80(5):27181, PMID: 12021839）。Curagenで行ったGeneCalling研究において、ＬＸＲＡが肥満患者および／または糖尿病患者およびＸ症候群のＳＨＲモデルにおいてアップレギュレートされることがわかった。ＬＸＲＡ活性での減少は脂質生成を制限し、従って肥満および／または糖尿病を改善する。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるＬＸＲの治療的調節は、肥満および糖尿病のような代謝関連疾患の処置で有用であり得る。
【０６２１】
パネル５島概要：Ａｇ４２８４  この遺伝子の低レベルだが有意なレベルの発現は、ラテンアメリカ系のインスリン投与の糖尿病患者由来の脂肪試料でのみ見られる（ＣＴ＝３４．５）。それゆえ、この遺伝子の発現を用いて、このパネルで用いられる他の組織からこの試料を区別し得る。
【０６２２】
ＬＸＲαは、脂肪機能でいくつかの重要な働きをする。新たな研究は、核受容体が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での基本的なグルコース取り込みおよびグリコーゲン合成を増加することを示す。加えて、ＬＸＲαは、コレステロール合成および非エステル化脂肪酸の放出を増加する。最終的に、ＬＸＲα拮抗物質でのマウスの処置は、脂肪組織での増加脂肪分解と一致するグリセロールおよび非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の増加血清レベルを結果として生じる。ＮＥＦＡの高血清レベルは、２型糖尿病の病因に帰すると信じられている（Ross et al., 2002, Mol Cell Biol. 22(16):598999, PMID: 12138207; Boden G, Shulman GI, 2002, Eur J Clin Invest. 32 Suppl 3:1423, PMID: 12028371）。これらの知見は、ＬＸＲαの新たな代謝機能を示す。従って、ＬＸＲαの拮抗物質がＮＥＦＡの循環レベルを減少し得るし、それゆえ２型糖尿病の処置で有益であり得る。
【０６２３】
パネル５Ｄ概要：Ａｇ４２８４  この遺伝子の最も高発現は、小腸で検出される（ＣＴ＝３０．４）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、脂肪、骨格筋、小腸、および糖尿病患者と非糖尿病患者の両方の胎盤で見られる。加えて、この遺伝子の中レベルの発現はまた、腎臓で見られる。この遺伝子の有用性のさらなる考察のため、パネル１．４を参照されたい。
【０６２４】
Ｂ．ＣＧ１０５３５５−０１：ヒトアリール炭化水素受容体様遺伝子
遺伝子ＣＧ１０５３５５−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４２８５を用いて評価し、表ＢＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＧおよびＢＨに示す。
【０６２５】
【表２８８】
2005515758.tif 000290
【０６２６】
【表２８９】
2005515758.tif 000291
【０６２７】
表ＢＢの続き
【表２９０】
2005515758.tif 000292
【０６２８】
【表２９１】
2005515758.tif 000293
【０６２９】
表ＢＣの続き
【表２９２】
2005515758.tif 000294
【０６３０】
【表２９３】
2005515758.tif 000295
【０６３１】
表ＢＤの続き
【表２９４】
2005515758.tif 000296
【０６３２】
表ＢＤの続き
【表２９５】
2005515758.tif 000297
【０６３３】
【表２９６】
2005515758.tif 000298
【０６３４】
表ＢＥの続き
【表２９７】
2005515758.tif 000299
【０６３５】
【表２９８】
2005515758.tif 000300
【０６３６】
【表２９９】
2005515758.tif 000301
【０６３７】
【表３００】
2005515758.tif 000302
【０６３８】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４２８５  この遺伝子の最も高発現は、乳癌ＳＦ−２９５細胞株で検出される（ＣＴ＝２３）。この遺伝子の高レベルの発現はまた、膵臓、胃、大腸、肺、肝臓、腎臓、乳、卵巣、前立腺、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍由来の多くの癌細胞株で見られる。従って、この遺伝子の発現をこれら癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。
【０６３９】
この遺伝子は、炭化水素受容体（ＡｈＲ）をコードする。ＡｈＲは、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）のような毒性ハロゲン化芳香族毒、多核芳香族炭化水素、燃焼産物、およびフラボノイドおよびインドール−３−カルビノール（Ｉ３Ｃ）のような多くの植生化学物質に対する応答を仲介するリガンド活性化核転写因子である。核ＡｈＲ複合体は、ＡｈＲおよび核トランスポーター（Ａｒｎｔ）タンパク質を含有するヘテロ２量体であり、かつＡｈＲ振る舞いの分子メカニズムは、Ａｈ−応答性遺伝子の制御領域において、ダイオキシン応答性エレメント（ＤＲＥ）へのヘテロ２量体の結合と関連する。ＴＣＤＤ、「異物性ダイオキシン」は、幾つかの種および可能ならヒトでの複数部位発癌物質である一方、Ｉ３Ｃおよびフラボノイドを含む天然のＡｈＲは癌に対して保護する傾向がある。ＴＣＤＤおよび植生化学物質の両方がエストロゲン誘導乳癌および子宮内膜癌を防ぐ（Safe S., 2001, Toxicol Lett 120(13):17, PMID: 11323156）。従って、ＡｈＲの発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍の処置で効果的であり得る。
【０６４０】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管において高レベルから中レベルで発現する。ＡｈＲは、発達および解毒での機能を有する転写因子のＰＡＳ（Ｐｅｒ−Ａｈｒ−Ｓｉｍ）スーパーファミリーのメンバーである（Wilson CL, Safe S., 1998, Toxicol Pathol 26(5):65771, PMID: 9789953）。それは、核膜をクロスしかつＤＮＡに結合するＡＲＮＴ（核トランスロケーター）との活性複合体を形成する。加えて。ＴＣＤＤは、ＣＹＰ１Ｂ１およびグルタチオンＳトランスフェラーゼを含む複数遺伝子の発現を開始する既知のＡｈＲの活性リガンドである。ＡｈＲ−／−ＭＥＦを用いた研究は、恒常的ＡｈＲ活性がＣＹＰ１Ｂ１の基本的発現および半集蜜培養での脂肪合成の抑制を必要とすることを示した。ＡｈＲの活性化は、ＰＰＡＲγおよび脂肪合成を抑制する。ＡｈＲは、トリグリセリド合成の恒常的阻害物質であり、かつ脂肪細胞分化の初期制御である（Alexander et al., 1998, J Cell Sci 111 ( Pt 22):331122, PMID: 9788873）。さらに、異なる遺伝子発現のCuraGenのGeneCalling［登録商標］法を用いて、この遺伝子は、正常妊婦と比べてヒト妊娠期間の糖尿病の脂肪組織において１９倍アップレギュレートされることがわかった。さらに、この遺伝子のマウスオルソログは、糖尿病を誘発する肥満のマウスモデルにおいて変化した発現を有することがわかった。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【０６４１】
興味深いことに、この遺伝子は、成人の肺および肝臓（ＣＴ＝２９〜３１）と比較して胎児（ＣＴ＝２４〜２７）でずっと高レベルで発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の肝臓から胎児の肝臓を区別し得ることを示す。加えて、胎児組織でのこの遺伝子の相対的過剰発現は、タンパク質産物が胎児でこれら組織の成長または発達を増強し得るし、従ってまた、かつ成人の回復能力で働き得ることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、肺および肝臓関連疾患の処置で有用であり得る。
【０６４２】
加えて、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質、および脊髄の全領域で中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【０６４３】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ４２８５  この遺伝子の最も高発現は、脳腫瘍ＳＦ−２９５細胞株で検出される（ＣＴ＝２２．６）。パネル１．４で見られる発現パターンと一致して、この遺伝子の高レベルの発現は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍由来の多くの癌細胞株で見られる。加えて、この遺伝子の中レベルの発現はまた、内分泌機能／代謝機能を有する組織で見られるし、かつ中枢神経系の全領域でも見られる。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．４を参照されたい。
【０６４４】
腫瘍学_細胞_株_スクリーニング_パネル_ｖ３．２概要：Ａｇ４２８５  この遺伝子の最も高発現は、胃癌ＭＫＮ−４５細胞株で検出される（ＣＴ＝２５．８）。加えて、この遺伝子の高レベルから中レベルの発現は、舌、前立腺、外陰、類表皮、骨、線維肉腫、横紋筋肉腫、膀胱、膵臓、ウィルムス腫瘍、腎臓、Ｂ細胞およびＴ細胞リンパ腫および白血病、頚部、胃、大腸、肺および脳由来の多くの細胞株で見られる。それゆえ、この遺伝子の治療的調節は、これらの癌の処置で有用であり得る。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．４を参照されたい。
【０６４５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４２８５  この遺伝子の最も高発現は、ＰＭＡ／イオノマイシンで処理されたＬＡＫ細胞で検出される（ＣＴ＝２７．５）。この遺伝子は、健康および疾患での免疫応答の広範な有意な細胞タイプにおいて高レベルから中レベルで発現する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞、および大腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織のメンバーを含む。発現の遍在パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞タイプおよび組織のホメオスタシス過程で関与しうることを示す。このパターンは、一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４での発現プロフィールと一致し、かつ細胞生存および細胞増殖での遺伝子産物での働きも示す。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調製は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【０６４６】
パネル５島概要：Ａｇ４２８５  この遺伝子の最も高発現は、胎盤で検出される（ＣＴ＝２８）。加えて、この遺伝子の有意な発現はまた、代謝機能／内分泌機能を有する全組織で見られる。これらの結果は、パネル１．４およびパネル１．５で見られる発現パターンと一致する。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．４を参照されたい。
【０６４７】
パネル５Ｄ概要：Ａｇ４２８５  この遺伝子の最も高発現は、胎盤で検出される（ＣＴ＝２８）。加えて、この遺伝子の有意な発現はまた、代謝機能／内分泌機能を有する全組織で見られる。これらの結果は、パネル５島、パネル１．４およびパネル１．５で見られる発現パターンと一致する。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．４を参照されたい。
【０６４８】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ４２８５  この遺伝子の最も高発現は、腎臓癌２で検出される（ＣＴ＝２４．４）。この遺伝子の高発現はまた、黒色腫、および大腸、肺、膀胱、前立腺および腎臓由来の正常および癌試料で見られる。興味深いことに、この遺伝子の発現は、対応正常隣接組織と比較して、癌試料でより高い。それゆえ、この遺伝子の発現は、黒色腫、大腸癌、肺癌、膀胱癌、前立腺癌および腎臓癌の検出のための診断マーカーとして用いられ得る。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．４を参照されたい。
【０６４９】
Ｃ．ＣＧ１０５５２１−０１：ステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１０５５２１−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４２９０を用いて評価し、表ＣＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＣＢ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦおよびＣＧに示す。
【０６５０】
【表３０１】
2005515758.tif 000303
【０６５１】
【表３０２】
2005515758.tif 000304
【０６５２】
表ＣＢの続き
【表３０３】
2005515758.tif 000305
【０６５３】
【表３０４】
2005515758.tif 000306
【０６５４】
【表３０５】
2005515758.tif 000307
【０６５５】
表ＣＤの続き
【表３０６】
2005515758.tif 000308
【０６５６】
【表３０７】
2005515758.tif 000309
【０６５７】
表ＣＥの続き
【表３０８】
2005515758.tif 000310
【０６５８】
【表３０９】
2005515758.tif 000311
【０６５９】
【表３１０】
2005515758.tif 000312
【０６６０】
ＡＩ_包括的パネル_ｖ１．０概要：Ａｇ４２９０  この遺伝子の最も高発現は、正常骨で検出される（ＣＴ＝２７）。この遺伝子の中レベルの発現はまた、骨関節炎（ＯＡ）骨および隣接骨、ならびにＯＡ軟骨、およびＯＡ滑膜試料由来の試料で見られる。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、関節リウマチ患者由来の軟骨、骨、滑膜、および滑液細胞で見られる。低レベルの発現はまた、正常肺試料、肺気腫、アトピー性喘息、喘息、クローン病（正常対応対照および疾患）、潰瘍性大腸炎（正常対応対照および疾患）、および乾癬（正常対応対照および疾患）由来の試料で検出される。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、乾癬、アレルギー、喘息、炎症性腸疾患、関節リウマチおよび骨関節炎を含む自己免疫疾患および炎症性疾患と関連する症状／状態を改善し得る。
【０６６１】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ４２９０  このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質で若干アップレギュレートされることが分かる。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、神経細胞死を減少させ得るし、かつこの疾患の処置で有用であり得る。
【０６６２】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４２９０  この遺伝子の最も高発現は、脳腫瘍ＢＴ５４９細胞株で検出される（ＣＴ＝２２）。この遺伝子の高レベルの発現はまた、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍由来の癌細胞株の群で見られる。従って、この遺伝子の発現は、これら癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍の処置で効果的であり得る。
【０６６３】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、胎児の骨格筋、心臓、肝臓および消化管において中レベルで発現する。この遺伝子は、ステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）をコードする。ＳＣＤは、脂肪酸基質のδ９位置でのシス二重結合の挿入による不飽和脂肪酸の合成における率制限ステップを触媒する鉄含有酵素である。をれは、脂肪細胞分化および脂質合成において本質的であるとわかっている転写因子のＳＲＥＢＰおよびＣ／ＥＢＲαの両方により制御される。ＳＣＤは、トリグリセリド（ＴＧ）として貯蔵される不飽和脂肪酸の合成での鍵となる酵素であり、そしてＴＧ合成の誘導はＳＣＤの発現に高く依存する。異なる遺伝子発現のCuragenのGeneCalling法を用いて、ＳＣＤが肥満の２遺伝子モデルにおいてアップレギュレートされることがわかる。加えて最近、ＳＣＤがレプチン介在減量において働くとわかった。肥満マウスはレプチン減量で処置され、そして肝臓中のＳＣＤ１のレベルが減少する。それゆえ、ＳＣＤを直接的に阻害するためのＳＣＤの拮抗物質は、肥満および糖尿病の効果的な治療剤であり得る。
【０６６４】
興味深いことに、この遺伝子は、成人肝臓、肺、および骨格筋（ＣＴ＝２８〜３５）と比較して胎児でずっと高レベル（ＣＴ＝２５〜２９）で発現する。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の組織から胎児の組織を区別し得ることを示す。加えて、胎児の組織でのこの遺伝子の相対的過剰発現は、タンパク質産物が胎児においてこれら組織の成長または発達を増強し得るし、従ってまた、成人の回復能力で働き得ることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、肝臓、肺および骨格筋関連疾患の処置で有用であり得る。
【０６６５】
加えて、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質、および脊髄を含む調べられた中枢神経系の全領域において高レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【０６６６】
参考文献： 
1. Miyazaki et al., 2001, J Lipid Res. 42(7):101824. PMID: 11441127. 
2. Kim et al., 2000, J Lipid Res. 41(8):13106. PMID: 10946019 
3. Kim et al., 1998, Cell. 93(5):693704. PMID: 9630215. 
4. Miyazaki et al., 2000, J Biol Chem. 275(39):301328. PMID: 10899171. 
5. Kim YC, Ntambi JM., 1999, Biochem Biophys Res Commun. 266(1):14. Review. PMID: 10581155. 
6. Miyazaki et al., 2001, J Biol Chem. 276(42):3945561. PMID: 11500518. 
7. Cohen et al., 2002, Science. 297(5579):2403. PMID: 12114623 
【０６６７】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４２９０  この遺伝子の最も高発現は、ＴＮＦα＋ＩＬ−１βで処理された小気道上皮で検出される（ＣＴ＝２７）。この遺伝子の発現は、休止小気道上皮においてより刺激された小気道上皮でより高い。それゆえ、この遺伝子の発現を用いて、これら２つの試料を区別し得る。
【０６６８】
加えて、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、活性化極性、未感作およびメモリーＴ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞、ＰＷＭ／ＰＨＡ−Ｌで刺激されたＰＢＭＣ、RamosＢ細胞、Ｂリンパ球、好酸球、単球、マクロファージ、内皮細胞、気管支上皮、冠状動脈ＳＭＣ、星状膠細胞、好塩基球、粘膜表皮細胞、肺および皮膚の線維芽細胞、および腎臓および大腸により代表される正常組織で見られる。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調節は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【０６６９】
パネル５島概要：Ａｇ４２９０  この遺伝子の最も高発現は、肝臓ＨｅｐＧ２細胞株で検出される（ＣＴ＝２８．３）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、脂肪、膵島細胞、間葉系幹細胞および腎臓で見られる。興味深いことに、この遺伝子の発現は、脂肪細胞の分化を誘導し得る。それゆえ、この遺伝子の発現は、分化のマーカーとして用いられ得る。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．４を参照されたい。
【０６７０】
パネル５Ｄ概要：Ａｇ４２９０  この遺伝子の最も高発現は、肝臓ＨｅｐＧ２細胞株で検出される（ＣＴ＝２８．３）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、脂肪、膵島、間葉系幹細胞および腎臓で見られる。興味深いことに、この遺伝子の発現は、分化した脂肪で誘導される。この発現パターンは、パネル５島で見られる発現と一致する。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．４および５島を参照されたい。
【０６７１】
Ｄ．ＣＧ１０７２３４−０２およびＣＧ１０７２３４−０３：加水分解酵素様遺伝子
物理的クローンの全長ＣＧ１０７２３４−０２および物理的クローンの全長ＣＧ１０７２３４−０３の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ６９３５を用いて評価し、表ＤＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＤＢに示す。
【０６７２】
【表３１１】
2005515758.tif 000313
【０６７３】
【表３１２】
2005515758.tif 000314
【０６７４】
表ＤＢの続き
【表３１３】
2005515758.tif 000315
【０６７５】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ６９３５  この遺伝子の発現は、肺癌細胞株由来の試料で最も高い（ＣＴ＝３２）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこの試料と他の試料とを区別し得るし、かつ肺癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、肺癌の処置で効果的であり得る。
【０６７６】
Ｅ．ＣＧ１１３１４４−０２：ＣｔＢＰ（Ｄ−異性体特異的２−ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ）様遺伝子
遺伝子ＣＧ１１３１４４−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５０５２およびＡｇ５０７８を用いて評価し、表ＥＡおよびＥＢに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＥＣ、ＥＤおよびＥＥに示す。
【０６７７】
【表３１４】
2005515758.tif 000316
【０６７８】
【表３１５】
2005515758.tif 000317
【０６７９】
【表３１６】
2005515758.tif 000318
【０６８０】
表ＥＣの続き
【表３１７】
2005515758.tif 000319
【０６８１】
表ＥＣの続き
【表３１８】
2005515758.tif 000320
【０６８２】
【表３１９】
2005515758.tif 000321
【０６８３】
表ＥＤの続き
【表３２０】
2005515758.tif 000322
【０６８４】
【表３２１】
2005515758.tif 000323
【０６８５】
腫瘍学_細胞_株_スクリーニング_パネル_ｖ３．１概要：Ａｇ５０５２／Ａｇ５０７８  ２つの異なるプローブとプライマーのセットでの２度の実験は、この遺伝子がこのパネルで遍在性に発現されるべきことを示す。最も高発現は、大腸癌細胞株および膵臓癌細胞株で見られる（ＣＴ＝２６〜２７）。
【０６８６】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５０５２  最も高発現は、ＩＦＮ−γで処理された肺線維芽細胞で見られる（ＣＴ＝２７）。この遺伝子はまた、健康および疾患での免疫応答での有意な細胞タイプの広範で中レベルで発現する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞、および大腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織のメンバーを含む。発現の遍在パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞タイプおよび組織のホメオスタシス過程で関与しうることを示す。このパターンは、腫瘍学_細胞_株_スクリーニング_パネル_ｖ３．１での発現プロフィールと一致し、かつまた、細胞生存および細胞増殖での遺伝子産物の働きを示す。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調製は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【０６８７】
パネル５島概要：Ａｇ５０５２  この遺伝子の最も高発現は、脂肪で見られる（ＣＴ＝３０）。この遺伝子は、脂肪、骨格筋および胎盤由来のものを含む、多くの代謝性試料での発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、この遺伝子産物が肥満および糖尿病を含む代謝性疾患の病因および／または処置で関与しうることを示す。
【０６８８】
Ｆ．ＣＧ１２５１９７−０３：リゾホスホリパーゼ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１２５１９７−０３の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５９５７を用いて評価し、表ＦＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＦＢに示す。
【０６８９】
【表３２２】
2005515758.tif 000324
【０６９０】
【表３２３】
2005515758.tif 000325
【０６９１】
パネル５島概要：Ａｇ５９５７  この遺伝子の最も高発現は、腎臓細胞株で見られる（ＣＴ＝３３）。
【０６９２】
Ｇ．ＣＧ１３４４３９−０１：ＦＬＪ２０８３７ＦＩＳ、クローンＡＤＫＡ０２６０２様遺伝子
遺伝子ＣＧ１３４４３９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７４０５を用いて評価し、表ＧＡに記載した。
【０６９３】
【表３２４】
2005515758.tif 000326
【０６９４】
Ｈ．ＣＧ１３７１０９−０１：リン脂質輸送ＡＴＰａｓｅ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１３７１０９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４９１７を用いて評価し、表ＨＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＨＢに示す。
【０６９５】
【表３２５】
2005515758.tif 000327
【０６９６】
【表３２６】
2005515758.tif 000328
【０６９７】
表ＨＢの続き
【表３２７】
2005515758.tif 000329
【０６９８】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４９１７  この遺伝子の最も高発現は、慢性的に活性化されたＴｈ２細胞で見られる（ＣＴ＝２７）。この遺伝子はまた、健康および疾患での免疫応答での有意な細胞タイプの広範で中レベルで発現する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞、および大腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織のメンバーを含む。発現の遍在性パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞タイプおよび組織のホメオスタシス過程で関与し得るし、また細胞生存および細胞増殖で遺伝子産物の働きを示す。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調製は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【０６９９】
Ｉ．ＣＧ１３７３３０−０１：ＴＧＦ−β受容体タイプＩ前駆体様遺伝子
遺伝子ＣＧ１３７３３０−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７００１を用いて評価し、表ＩＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＩＢおよびＩＣに示す。
【０７００】
【表３２８】
2005515758.tif 000330
【０７０１】
【表３２９】
2005515758.tif 000331
【０７０２】
表ＩＢの続き
【表３３０】
2005515758.tif 000332
【０７０３】
【表３３１】
2005515758.tif 000333
【０７０４】
表ＩＣの続き
【表３３２】
2005515758.tif 000334
【０７０５】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７００１  最も高発現は、胎児の脳で見られる（ＣＴ＝３２．３）。この遺伝子は、このパネルの癌で顕著に発現し、細胞成長および／または細胞増殖で関与しうる。
【０７０６】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７００１  最も高発現は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βで処理された小気道上皮で見られる（ＣＴ＝３３．８）。それゆえ、低分子療法の使用を介した、この遺伝子によりコード化されたタンパク質の発現または活性の調節は、喘息、ＣＯＰＤ、および肺気腫の処置で有用であり得る。
【０７０７】
Ｊ．ＣＧ１３７３３９−０１：上皮成長因子受容体前駆体様遺伝子
遺伝子ＣＧ１３７３３９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ１３３３およびＡｇ７２８０を用いて評価し、表ＪＡおよびＪＢに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＪＣ、ＪＤ、ＪＥ、ＪＦ、ＪＧ、ＪＨ、ＪＩ、ＪＪおよびＪＫに示す。
【０７０８】
【表３３３】
2005515758.tif 000335
【０７０９】
【表３３４】
2005515758.tif 000336
【０７１０】
【表３３５】
2005515758.tif 000337
【０７１１】
【表３３６】
2005515758.tif 000338
【０７１２】
表ＪＤの続き
【表３３７】
2005515758.tif 000339
【０７１３】
【表３３８】
2005515758.tif 000340
【０７１４】
表ＪＥの続き
【表３３９】
2005515758.tif 000341
【０７１５】
【表３４０】
2005515758.tif 000342
【０７１６】
表ＪＦの続き
【表３４１】
2005515758.tif 000343
【０７１７】
【表３４２】
2005515758.tif 000344
【０７１８】
表ＪＧの続き
【表３４３】
2005515758.tif 000345
【０７１９】
表ＪＧの続き
【表３４４】
2005515758.tif 000346
【０７２０】
【表３４５】
2005515758.tif 000347
【０７２１】
表ＪＨの続き
【表３４６】
2005515758.tif 000348
【０７２２】
【表３４７】
2005515758.tif 000349
【０７２３】
表ＪＩの続き
【表３４８】
2005515758.tif 000350
【０７２４】
表ＪＩの続き
【表３４９】
2005515758.tif 000351
【０７２５】
【表３５０】
2005515758.tif 000352
【０７２６】
表ＪＪの続き
【表３５１】
2005515758.tif 000353
【０７２７】
表ＪＪの続き
【表３５２】
2005515758.tif 000354
【０７２８】
【表３５３】
2005515758.tif 000355
【０７２９】
アーディスパネルｖ１．０概要：Ａｇ１３３３  最も高発現は、肺癌細胞株で見られる（ＣＴ＝２０．１３）。加えて、この遺伝子は、ＮＡＴでの発現と比較して、肺癌で過剰発現する。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこの試料と他の試料とを区別し得るし、かつ肺癌のマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、肺癌の処置で効果的であり得る。
【０７３０】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ１３３３  この遺伝子の最も高発現は、胎盤で見られる（ＣＴ＝２１．４）。この遺伝子は、脳腫瘍細胞株、大腸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株で見られる高発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０７３１】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、および成人の骨格筋および胎児の骨格筋、心臓、および肝臓で高レベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０７３２】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含む、ＣＮＳで高レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０７３３】
ＨＡＳＳパネルｖ１．０概要：Ａｇ１３３３  同一プローブとプライマーのセットでの２度の実験は、成人の神経膠試料で見られるこの遺伝子の最も高発現（ＣＴ＝２０．９）と優位に一致する。加えて、この遺伝子の発現は、これら細胞株で見られる正常な低レベルの遺伝子発現と比較して、酸素濃度の減少によりＬｕＣＡＰ、Ｔ２４およびＭＣＦ７細胞で誘導される。このことは、この遺伝子の発現がまた膀胱癌、乳癌および前立腺癌の低酸素領域で増加し得ることを示す。
【０７３４】
この遺伝子はまた、髄芽腫試料において低レベルでおよび神経膠腫試料において中レベルで発現する。従って該遺伝子はマーカーとして用いられるし、かつ抗体または低分子薬の使用を通じたこの遺伝子によりコード化されるタンパク質の調節は、治療に用いられ得る。
【０７３５】
パネル１概要：Ａｇ１３３３  最も高発現は、前立腺癌細胞株で見られる（ＣＴ＝１９）。加えて、この遺伝子は、このパネルの多くの試料で発現する。この遺伝子の有用性の考察のため、パネル１．４を参照されたい。
【０７３６】
パネル１．２概要：Ａｇ１３３３  同一プローブとプライマーでの２度の実験は、胎盤での最も高発現（ＣＴ＝２４〜２５）と優位に一致する結果を生じる。このパネルでの結果は、パネル１．４と一致する。この遺伝子の有用性のさらなる考察のため、該パネルを参照されたい。
【０７３７】
パネル１．３Ｄ概要：Ａｇ１３３３  この遺伝子の最も高発現は、骨格筋で見られる（ＣＴ＝２６）。加えて、この遺伝子は、胎児の骨格筋において、成人の骨格筋での発現と比較して非常に高レベルで発現する（ＣＴ＝３１）。この知見は、この遺伝子の発現を用いて成人の骨格筋から胎児の骨格筋を区別し得ることを示す。加えて、胎児の骨格筋でのこの遺伝子の相対的過剰発現は、タンパク質産物が胎児の筋肉成長または発達を増強し得るし、従ってまた、成人の回復能力で働き得ることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるタンパク質の治療的調節は、筋肉関連疾患の処置で有用であり得る。さらに特異的に、この遺伝子によりコード化されるタンパク質での弱い筋肉または障害性筋肉の処置は、筋肉塊または筋肉の機能を回復し得る。
【０７３８】
全体として、このパネルでの発現は、パネル１．４での発現、このパネルの癌細胞株での顕著な発現と一致する。この遺伝子の有用性の考察のため、パネル１．４を参照されたい。
【０７３９】
パネル２．２概要：Ａｇ１３３３  同一プローブとプライマーでの２度の実験は、優位な一致となる結果を生じる。この遺伝子の最も高発現は、肝臓癌で見られる（ＣＴ＝２５〜２９）。この遺伝子は、パネル２．４と一致して、ＮＡＴでより腎臓癌でのより高いレベルの発現と共に、このパネルで広く発現する。この遺伝子の有用性の考察のため、該パネルを参照されたい。
【０７４０】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ１３３３  この遺伝子の発現は、ＩＬ−９で処理されたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞で最も高い（ＣＴ＝２６．５）。この遺伝子の発現は、処理および無処理ケラチノサイト、肺および皮膚線維芽細胞、およびＨＰＡＥＣ由来の試料集団と関連する様に思われる。従って、この遺伝子は、肺および／または皮膚の炎症状態に関与し得る。
【０７４１】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ１３３３  同一プローブとプライマーのセットでの２度の実験は、優位な一致となる結果を生じる。最も高発現は、腎臓癌由来の試料で見られる（ＣＴ＝２６）。加えて、この遺伝子は、正常隣接組織での発現と比較して腎臓癌および肺癌で過剰発現する。顕著な発現はまた、黒色腫で検出される。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌のマーカーとして用いられ得るし、かつ発現または機能の調節は、処置で有用であり得る。
【０７４２】
Ｋ．ＣＧ１３８１３０−０１：ｃＧＭＰ刺激３’，５’−サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１３８１３０−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４２０３を用いて評価し、表ＫＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＫＢに示す。
【０７４３】
【表３５４】
2005515758.tif 000356
【０７４４】
【表３５５】
2005515758.tif 000357
【０７４５】
パネル５島概要：Ａｇ４２０３  最も高発現は、骨格筋および胎盤を含む他の代謝組織で見られる低発現だが有意な発現と共に、脂肪で見られる（ＣＴ＝３２）。したがって、この遺伝子産物は、肥満および糖尿病を含む代謝性疾患の病因および／または処置において関与しうる。
【０７４６】
Ｌ．ＣＧ１３８３７２−０２：マレイルアセト酢酸イソメラーゼ
物理的クローンの全長ＣＧ１３８３７２−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５９１３を用いて評価し、表ＬＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＬＢ、ＬＣおよびＬＤに示す。
【０７４７】
【表３５６】
2005515758.tif 000358
【０７４８】
【表３５７】
2005515758.tif 000359
【０７４９】
表ＬＢの続き
【表３５８】
2005515758.tif 000360
【０７５０】
【表３５９】
2005515758.tif 000361
【０７５１】
表ＬＣの続き
【表３６０】
2005515758.tif 000362
【０７５２】
【表３６１】
2005515758.tif 000363
【０７５３】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５９１３  同一プローブとプライマーのセットでの２度の実験は、優位な一致となる結果を生じる。最も高発現は、脳腫瘍細胞株で見られる（ＣＴ＝３０）。
【０７５４】
この遺伝子は、脳腫瘍細胞株、大腸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株で見られる中発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０７５５】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、副腎、骨格筋、および成人の肝臓および胎児の肝臓での低レベルだが有意なレベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０７５６】
パネル５島概要：Ａｇ５９１３  低発現だが有意な発現は、肝臓細胞株および骨格筋で見られる。
【０７５７】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ５９１３  最も高発現は、大腸癌で見られる（ＣＴ＝３２．５）。加えて、この遺伝子は、正常隣接組織での発現と比較して、大腸癌、腎臓癌、および肺癌で過剰発現する。従って、この遺伝子の発現は、これら癌のマーカーとして用いられ得るし、かつこの遺伝子産物の機能の調節は、これらの癌の処置で有用であり得る。
【０７５８】
Ｍ．ＣＧ１３８４６１−０１：新規細胞内ニトロ還元酵素様遺伝子
遺伝子ＣＧ１３８４６１−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４９６２を用いて評価し、表ＭＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＭＢおよびＭＣに示す。
【０７５９】
【表３６２】
2005515758.tif 000364
【０７６０】
【表３６３】
2005515758.tif 000365
【０７６１】
表ＭＢの続き
【表３６４】
2005515758.tif 000366
【０７６２】
【表３６５】
2005515758.tif 000367
【０７６３】
表ＭＣの続き
【表３６６】
2005515758.tif 000368
【０７６４】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ４９６２  この遺伝子の発現は、甲状腺に制限される（ＣＴ＝２６．５）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこの試料と他の試料とを区別し得るし、かつ甲状腺組織のマーカーとして用いられ得る。このタンパク質の発現または機能の調節は、甲状腺疾患の処置で有用であり得る。
【０７６５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４９６２  この遺伝子は、腎臓で検出可能なレベルで発現するのみである（ＣＴ＝３０．１）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの他の試料から腎臓由来試料を区別し得るし、かつ腎臓組織のマーカーとして用いられ得る。加えて、この遺伝子の発現または機能の治療標的化は、腎臓機能を調節し得るし、かつループスおよび糸球体腎炎を含む腎臓に作用する炎症性疾患または自己免疫疾患の処置で重要であり得る。
【０７６６】
Ｎ．ＣＧ１３８５２９−０１：ＳＡタンパク質（媒体−アシルＣｏＡ鎖合成）様遺伝子
遺伝子ＣＧ１３８５２９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４９６３を用いて評価し、表ＮＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＮＢ、ＮＣ、ＮＤおよびＮＥに示す。
【０７６７】
【表３６７】
2005515758.tif 000369
【０７６８】
【表３６８】
2005515758.tif 000370
【０７６９】
【表３６９】
2005515758.tif 000371
【０７７０】
表ＮＣの続き
【表３７０】
2005515758.tif 000372
【０７７１】
【表３７１】
2005515758.tif 000373
【０７７２】
表ＮＤの続き
【表３７２】
2005515758.tif 000374
【０７７３】
【表３７３】
2005515758.tif 000375
【０７７４】
表ＮＥの続き
【表３７４】
2005515758.tif 000376
【０７７５】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ４９６３  このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質で若干アップレギュレートされることが分かる。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、神経細胞死を減少させ得るし、かつこの疾患の処置で有用であり得る。
【０７７６】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ４９６３  同一プローブとプライマーのセットでの２度の実験は、胎児の腎臓での最も高発現（ＣＴ＝３０）と共に、優位な一致となる結果を生じる。この遺伝子は、ヒト腎臓でも発現し、かつ遺伝性高血圧のげっ歯類モデルにおいて血圧制御で働き得るＳＡタンパク質の相同体である（Samani NJ. Biochem Biophys Res Commun 1994 Mar 15;199(2):8628）。加えて、この遺伝子は、胎児の肺において、成人の対応物（ＣＴ＝３５）での発現と比較して過剰発現（ＣＴ＝３０）するように思われる。従って、この遺伝子の発現を用いて、この組織に胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得る。加えて、この遺伝子の発現または機能の調節は、この器官の疾患の処置で有用であり得る。
【０７７７】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、胎児の肝臓、骨格筋、胎児および成人の心臓での中レベルから低レベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０７７８】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで低レベルだが有意なレベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調症、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０７７９】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４９６３  この遺伝子の最も高発現は、胸腺で見られる（ＣＴ＝３２．４）。低発現だが有意な発現はまた、ＩＦＮγで処理されたＨＵＶＥＣ、ＩＬ−１３およびＩＬ−１４で処理されたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、無処理ＨＰＡＥＣ、および肺線維芽細胞、正常肺および腎臓で見られる。従って、この遺伝子産物は、Ｔ細胞成熟において重要な働きをし得る。この遺伝子の発現または機能の治療的調節を利用して免疫機能（Ｔ細胞成熟）を調節し得るし、かつ器官移植、ＡＩＤＳ処置または化学療法後の免疫再構成に重要であり得る。
【０７８０】
パネル５島概要：Ａｇ４９６３  同一プローブとプライマーでの２度の実験は、脂肪および腎臓細胞株における低レベルでのこの遺伝子の発現を示す（ＣＴ＝３４．５）。
【０７８１】
Ｏ．ＣＧ１３８５６３−０１：コリン／エタノールアミンキナーゼ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１３８５６３−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４９７２およびＡｇ５９３７を用いて評価し、表ＯＡおよびＯＢに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＯＣ、ＯＤおよびＯＥに示す。
【０７８２】
【表３７５】
2005515758.tif 000377
【０７８３】
【表３７６】
2005515758.tif 000378
【０７８４】
【表３７７】
2005515758.tif 000379
【０７８５】
表ＯＣの続き
【表３７８】
2005515758.tif 000380
【０７８６】
【表３７９】
2005515758.tif 000381
【０７８７】
表ＯＤの続き
【表３８０】
2005515758.tif 000382
【０７８８】
【表３８１】
2005515758.tif 000383
【０７８９】
表ＯＥの続き
【表３８２】
2005515758.tif 000384
【０７９０】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ４９７２／Ａｇ５９３７  ２つの異なるプローブとプライマーのセットでの２度の実験は、非常によく一致する結果を生じる。この遺伝子の最も高発現は、胃癌細胞株（ＣＴ＝２６）および小脳（ＣＴ＝２９）で見られる。この遺伝子は、真核細胞メンバーの大量のリン脂質である、ＰｔｄＥｔｎ生合成の第１段階を触媒するエタノールアミンの相同体をコード化する。この遺伝子は、脳腫瘍細胞株、大腸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株で見られる中発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０７９１】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、胎児および成人の骨格筋および心臓で中レベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０７９２】
加えて、この遺伝子は、胎児の肝臓組織（ＣＴ＝２９〜３１）において、成人の対応物での発現（ＣＴ＝３２〜３５）と比較して非常に高レベルで発現する。従って、この遺伝子の発現を用いて、この組織の胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得る。加えて、この遺伝子の治療的調節は、この組織の疾患の処置で有用であり得る。
【０７９３】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで高レベルから中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０７９４】
腫瘍学_細胞_株_スクリーニング_パネル_ｖ３．１概要：Ａｇ４９７２  この遺伝子の最も高発現は、パネル１．５での発現と一致し、小脳で見られる（ＣＴ＝２９）。加えて、この遺伝子は、このパネルの癌細胞株試料で広く発現する。
【０７９５】
パネル５島概要：Ａｇ４９７２／Ａｇ５９３７  ２つの異なるプローブとプライマーのセットでの２度の実験は、非常によく一致する結果を生じる。この遺伝子の最も高発現は、腎臓で見られる（ＣＴ＝２９〜３２）。この遺伝子は、他のパネルでの発現と一致して、このパネルで広く発現する。中レベルの発現は、脂肪、胎盤および骨格筋を含む代謝組織で見られる。代謝性疾患でのこの遺伝子の有用性の考察のため、パネル１．５を参照されたい。
【０７９６】
Ｐ．ＣＧ１４００４１−０１：ピリドキサール−依存性デカルボキシラーゼ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４００４１−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４９７９を用いて評価し、表ＰＡに記載した。
【０７９７】
【表３８３】
2005515758.tif 000385
【０７９８】
Ｑ．ＣＧ１４００６１−０１：ＩＭＰデヒドロゲナーゼ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４００６１−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４９８０を用いて評価し、表ＱＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＱＢおよびＱＣに示す。
【０７９９】
【表３８４】
2005515758.tif 000386
【０８００】
【表３８５】
2005515758.tif 000387
【０８０１】
表ＱＢの続き
【表３８６】
2005515758.tif 000388
【０８０２】
【表３８７】
2005515758.tif 000389
【０８０３】
表ＱＣの続き
【表３８８】
2005515758.tif 000390
【０８０４】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４９８０  この遺伝子の最も高発現は、精巣で見られる（ＣＴ＝３３）。低レベルだが有意なレベルの発現は、膵臓癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、肺癌細胞株、および胃癌細胞株由来の細胞株で見られる。この遺伝子は、グアニンヌクレオチドの新規合成での律速酵素であるイノシン−５−プライム−モノリン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤ−１）の相同体をコード化する。この酵素の阻害は、腫瘍細胞株に対する抗癌活性を表すことが分かっている（Jager W. Curr Med Chem 2002 Apr;9(7):7816）。従って、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、これらの癌の処置で効果的であり得る。
【０８０５】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４９８０  この転写物の発現は、ＩＬ−４により刺激されたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞で独占的に発現する（ＣＴ＝３４．９）。この細胞株は、ムチンを産生するヒト気道上皮細胞株からもたらされる。粘液の過剰産生は、気管支喘息およびＣＯＰＤ試料の重要な特徴である。気道上皮（ＮＣＩ−Ｈ２９２）のモデルとしてしばしば用いられるこの粘膜表皮細胞株での転写物の発現は、この転写物が気道上皮の増殖または活性で重要であることを示す。それゆえ、転写物によりコード化されるタンパク質でデザインされた治療は、ＣＯＰＤ、喘息、アレルギー、肺気腫の肺上皮における炎症により引き起こされる症状を改善または除去し得る。
【０８０６】
Ｒ．ＣＧ１４０３３５−０１：尿素輸送体アイソフォームＵＴＡ−３様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４０３３５−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５０２１を用いて評価し、表ＲＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＲＢおよびＲＣに示す。
【０８０７】
【表３８９】
2005515758.tif 000391
【０８０８】
【表３９０】
2005515758.tif 000392
【０８０９】
表ＲＢの続き
【表３９１】
2005515758.tif 000393
【０８１０】
【表３９２】
2005515758.tif 000394
【０８１１】
表ＲＣの続き
【表３９３】
2005515758.tif 000395
【０８１２】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５０２１  推定尿素輸送体であるこの遺伝子の最も高発現は、胎児の腎臓で見られる（ＣＴ＝２９．３）。加えて、この遺伝子は、胎児の腎臓において、成人の対応物での発現と比較して過剰発現するように思われる。従って、この遺伝子の発現を用いて、この組織の胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、この器官の疾患の処置で有用であり得る。
【０８１３】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５０２１  この遺伝子の最も高発現は、パネル１．５および新規尿素輸送体としてのこのタンパク質の特性と一致して、腎臓で見られる（ＣＴ＝３１）。中レベルの発現はまた、胸腺および大腸で見られる。従って、この遺伝子の発現または機能の治療標的化は、腎臓機能を調節し得るし、かつループスおよび糸球体腎炎を含む腎臓に作用する炎症性疾患または自己免疫疾患の処置で重要であり得る。
【０８１４】
Ｓ．ＣＧ１４０３５５−０１：ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４０３５５−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５０２２を用いて評価し、表ＳＡに記載した。
【０８１５】
【表３９４】
2005515758.tif 000396
【０８１６】
Ｔ．ＣＧ１４０６９６−０１およびＣＧ１４０６９６−０２：ＡＡＡ  ＡＴＰａｓｅスーパーファミリー様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４０６９６−０１および変異体ＣＧ１４０６９６−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５０３７を用いて評価し、表ＴＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＴＢおよびＴＣに示す。
【０８１７】
【表３９５】
2005515758.tif 000397
【０８１８】
【表３９６】
2005515758.tif 000398
【０８１９】
表ＴＢの続き
【表３９７】
2005515758.tif 000399
【０８２０】
【表３９８】
2005515758.tif 000400
【０８２１】
表ＴＣの続き
【表３９９】
2005515758.tif 000401
【０８２２】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５０３７  この遺伝子の最も高発現は、脳腫瘍細胞株で見られる（ＣＴ＝２９．４）。この遺伝子は、脳腫瘍細胞株、大腸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株で見られる中発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。 この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０８２３】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、胎児の心臓、および成人の骨格筋および心臓において低レベルだが有意なレベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０８２４】
加えて、この遺伝子は、胎児の肺組織（ＣＴ＝３１．５）において、成人の対応物での発現（ＣＴ＝３５．２）と比較して非常に高レベルで発現する。従って、この遺伝子の発現を用いて、これら組織の胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得る。
【０８２５】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０８２６】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５０３７  最も高発現は、イオノマイシンで処理したRamosＢ細胞由来の試料で見られる（ＣＴ＝３０）。この遺伝子は、無処理Ramos細胞、およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株由来の処理および無処理試料の集団でも見られる顕著な発現と共に、このパネルで広く発現する。
【０８２７】
Ｕ．ＣＧ１４０７４７−０１：二重特異性ホスファターゼ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４０７４７−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５０３８を用いて評価し、表ＵＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＵＢおよびＵＣに示す。
【０８２８】
【表４００】
2005515758.tif 000402
【０８２９】
【表４０１】
2005515758.tif 000403
【０８３０】
表ＵＢの続き
【表４０２】
2005515758.tif 000404
【０８３１】
【表４０３】
2005515758.tif 000405
【０８３２】
表ＵＣの続き
【表４０４】
2005515758.tif 000406
【０８３３】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５０３８  最も高発現は、骨格筋で見られる（ＣＴ＝２６）。加えて、中レベルの発現は、膵臓、甲状腺、副腎、下垂体、脂肪、胎児の骨格筋、および成人および胎児の肝臓および心臓で見られる。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０８３４】
加えて、この遺伝子は、胎児の肺組織（ＣＴ＝２６．３）において、成人の対応物での発現（ＣＴ＝３１．４）と比較して非常に高レベルで発現する。従って、この遺伝子の発現を用いて、この組織の胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得る。
【０８３５】
この遺伝子の高レベルから中レベルの発現はまた、脳腫瘍細胞株、大腸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株で見られる。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０８３６】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで低レベルだが有意なレベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０８３７】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５０３８  この遺伝子の広範な発現は、休止好中球で見られるこの遺伝子の最も高発現（ＣＴ＝２５）と共に、このパネルで見られる。この発現は、ＴＮＦα＋ＬＰＳで活性化された好中球で減少する。この発現プロフィールは、この遺伝子によりコード化されるタンパク質が、休止好中球により産生されるが、活性化好中球では産生されないことを示す。それゆえ、遺伝子産物は、これらの炎症性細胞の活性化を減少させ得るし、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、関節リウマチ、エリテマトーデス、または乾癬患者の症状を改善または除去するタンパク質療法として有用であり得る。加えて、この遺伝子産物の低分子または抗体拮抗物質は、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全患者の免疫応答を増加させる作用があり得る。
【０８３８】
Ｖ．ＣＧ１４１１３７−０１：長鎖アシルｃｏＡチオエステラーゼ２様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４１１３７−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５０４４を用いて評価し、表ＶＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＶＢ、ＶＣおよびＶＤに示す。
【０８３９】
【表４０５】
2005515758.tif 000407
【０８４０】
【表４０６】
2005515758.tif 000408
【０８４１】
【表４０７】
2005515758.tif 000409
【０８４２】
表ＶＣの続き
【表４０８】
2005515758.tif 000410
【０８４３】
【表４０９】
2005515758.tif 000411
【０８４４】
表ＶＤの続き
【表４１０】
2005515758.tif 000412
【０８４５】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ５０４４  このパネルは、アルツハイマー病でのこの遺伝子の差のない発現を示す。しかしながら、このプロフィールは、脳における中レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。中枢神経系疾患でのこの遺伝子の有用性の考察のため、パネル１．５を参照されたい。
【０８４６】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５０４４  この遺伝子の最も高発現は、卵巣癌細胞株で見られる（ＣＴ＝３０）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこの試料と他の試料とを区別し得るし、かつ卵巣癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、卵巣癌の処置で効果的であり得る。
【０８４７】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含む、調べられたＣＮＳの全領域で低レベルだが有意なレベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調症、多発性硬化症、脳卒中および転換のような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０８４８】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５０４４  この遺伝子の最も高発現は、腎臓で見られる（ＣＴ＝３０．５）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの他の試料から腎臓由来試料を区別し得るし、かつ腎臓組織のマーカーとして用いられ得る。加えて、この遺伝子の発現または機能の治療標的化は、腎臓機能を調節し得るし、かつループスおよび糸球体腎炎を含む腎臓に作用する炎症性疾患または自己免疫疾患の処置で重要であり得る。
【０８４９】
Ｗ．ＣＧ１４１２４０−０１：ＡＴＰ合成Ｆ鎖、ミトコンドリア様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４１２４０−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５０４５を用いて評価し、表ＷＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＷＢおよびＷＣに示す。
【０８５０】
【表４１１】
2005515758.tif 000413
【０８５１】
【表４１２】
2005515758.tif 000414
【０８５２】
表ＷＢの続き
【表４１３】
2005515758.tif 000415
【０８５３】
【表４１４】
2005515758.tif 000416
【０８５４】
表ＷＣの続き
【表４１５】
2005515758.tif 000417
【０８５５】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５０４５  この遺伝子は、腎臓での最も高発現（ＣＴ＝２９．４）と共に、このパネルで広く発現する。この遺伝子は、脳腫瘍細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株で見られる中発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０８５６】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、脂肪、膵臓、甲状腺、胎児の肝臓、および成人および胎児の骨格筋および心臓で中レベルから低レベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０８５７】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで低レベルだが有意なレベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０８５８】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５０４５  この遺伝子の最も高発現は、腎臓で見られる（ＣＴ＝３０．１）。この遺伝子は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および肺および皮膚の線維症由来の試料を含む、このパネルの多くの試料において低レベルだが有意なレベルで広く発現する。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの他の試料から腎臓由来試料を区別し得るし、かつ腎臓組織のマーカーとして用いられ得る。加えて、この遺伝子の発現または機能の治療標的化は、腎臓機能を調節し得るし、かつループスおよび糸球体腎炎を含む腎臓に作用する炎症性疾患または自己免疫疾患の処置で重要であり得る。
【０８５９】
Ｘ．ＣＧ１４１３５５−０１およびＣＧ１４１３５５−０２：ＧＴＰＡＳＥ  ＲＡＢ３７様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４１３５５−０１および物理的クローンＣＧ１４１３５５−０２の全長の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５０４８を用いて評価し、表ＸＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＸＢ、ＸＣおよびＸＤに示す。ＣＧ１４１３５５−０２は、遺伝子配列の予測を示すＣＧ１４１３５５−０１遺伝子の物理的クローンの全長を表すことに注意されたい。
【０８６０】
【表４１６】
2005515758.tif 000418
【０８６１】
【表４１７】
2005515758.tif 000419
【０８６２】
表ＸＢの続き
【表４１８】
2005515758.tif 000420
【０８６３】
【表４１９】
2005515758.tif 000421
【０８６４】
表ＸＣの続き
【表４２０】
2005515758.tif 000422
【０８６５】
【表４２１】
2005515758.tif 000423
【０８６６】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５０４８  最も高発現は、小脳および大腸癌細胞株で見られる（ＣＴ＝２７）。顕著な発現はまた、１つの卵巣癌細胞株および肺癌細胞株でみられる。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルの小脳および大腸癌細胞株試料と他の試料とを区別し得る。加えて、この遺伝子は、卵巣癌、肺癌、および大腸癌、ならびに自閉症および失調症のような病態の部分の小脳を有するＣＮＳ疾患で関与する。
【０８６７】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ５０４８  顕著なレベルの発現は、休止１次および２次Ｔ細胞、休止好中球、ＴＮＦαで処理された皮膚線維芽細胞、および休止ＮＫ細胞で見られる。この遺伝子は、肥満細胞の脱顆粒で重要な働きをし得る、推定Ｒａｂ３７分子をコード化する（Masuda ES. FEBS Lett 2000 Mar 17;470(1):614）。従って、このタンパク質およびＲａｂ３７の相同体の発現プロフィールに基づき、このタンパク質の発現または機能の調節は、アレルギー、喘息、関節炎、乾癬、ＩＢＤ、およびループス、ならびに任意のＴ細胞介在性疾患の処置において治療的処置として有用であり得る。
【０８６８】
パネル５島概要：Ａｇ５０４８  この遺伝子の検出可能な発現は、このパネルの１つの脂肪試料に制限される（ＣＴ＝３４）。
【０８６９】
Ｙ．ＣＧ１４２０７２−０２：カテプシンＬ前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ１４２０７２−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７０５３を用いて評価し、表ＹＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＹＢに示す。
【０８７０】
【表４２２】
2005515758.tif 000424
【０８７１】
【表４２３】
2005515758.tif 000425
【０８７２】
表ＹＢの続き
【表４２４】
2005515758.tif 000426
【０８７３】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７０５３  この遺伝子の最も高発現は、乳癌ＢＴ５４９細胞株で検出される（ＣＴ＝２７．２）。この遺伝子の高レベルから中レベルの発現はまた、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍由来の多くの細胞株で見られる。従って、この遺伝子の発現は、これら癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍の処置で効果的であり得る。
【０８７４】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、副腎、甲状腺、心臓、肝臓および消化管で中レベルから低レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【０８７５】
加えて、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む、調べられた中枢神経系の全領域で低レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【０８７６】
Ｚ．ＣＧ１４２１０２−０１：ペプチジルプロリルアイソフォームＡ様遺伝子
遺伝子ＣＧ１４２１０２−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７４１０を用いて評価し、表ＺＡに記載した。
【０８７７】
【表４２５】
2005515758.tif 000427
【０８７８】
ＡＡ．ＣＧ５７７６０−０２：プロスタグランジンＨ２Ｄイソメラーゼ前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ５７７６０−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７０１９を用いて評価し、表ＡＡＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＡＢに示す。
【０８７９】
【表４２６】
2005515758.tif 000428
【０８８０】
【表４２７】
2005515758.tif 000429
【０８８１】
表ＡＡＢの続き
【表４２８】
2005515758.tif 000430
【０８８２】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７４１０  この遺伝子の最も高発現は、脳（海馬；ＣＴ＝１００．０）および脳（扁桃；ＣＴ＝７９．０）で見られる。加えて、この遺伝子はまた、大腸癌細胞株（ＣＴ＝２９．３）；脳（視床；ＣＴ＝２７．４）；脊髄（ＣＴ＝３９．２）；およびＣＮＳ癌細胞株（ＣＴ＝２４．８）で中レベルで発現する。この遺伝子産物の調節は、神経性の病態および癌の処置で有用であり得る。
【０８８３】
ＡＢ．ＣＧ５９３６１−０１：潜在的リン脂質輸送体ＡＴＰＡＳＥ  ＶＡ様遺伝子
遺伝子ＣＧ５９３６１−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７３３を用いて評価し、表ＡＢＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＢＢに示す。
【０８８４】
【表４２９】
2005515758.tif 000431
【０８８５】
【表４３０】
2005515758.tif 000432
【０８８６】
表ＡＢＢの続き
【表４３１】
2005515758.tif 000433
【０８８７】
パネル１．２概要：Ａｇ７３３  最も高発現は、気管で見られる（ＣＴ＝２３５）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこの試料と他の試料とを区別しうるし、かつこの組織のマーカーとして用いうる。
【０８８８】
中レベルから低レベルの発現は、骨格筋、甲状腺、副腎、膵臓、および成人および胎児の肝臓および心臓を含む代謝組織で見られる。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０８８９】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０８９０】
この遺伝子は、このパネルの癌細胞株でも見られる中発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０８９１】
ＡＣ．ＣＧ５９４４４−０１：ＳＡタンパク質様遺伝子
遺伝子ＣＧ５９４４４−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ３４４１を用いて評価し、表ＡＣＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＣＢ、ＡＣＣおよびＡＣＤに示す。
【０８９２】
【表４３２】
2005515758.tif 000434
【０８９３】
【表４３３】
2005515758.tif 000435
【０８９４】
【表４３４】
2005515758.tif 000436
【０８９５】
表ＡＣＣの続き
【表４３５】
2005515758.tif 000437
【０８９６】
【表４３６】
2005515758.tif 000438
【０８９７】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ３４４１  このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質で若干アップレギュレートされることが分かる。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、神経細胞死を減少させ得るし、かつこの疾患の処置で有用であり得る。
【０８９８】
パネル４Ｄ概要：Ａｇ３４４１  この遺伝子の最も高発現は、胸腺で検出される。それゆえ、この遺伝子は、Ｔ細胞成熟で重要な働きをする。この遺伝子によりコード化されるタンパク質に対してデザインされた低分子療法、または抗体療法を利用して、免疫機能（Ｔ細胞成熟）を調節し得るし、器官移植、ＡＩＤＳ処置、または化学療法後の免疫回復で重要であリ得る。
【０８９９】
加えて、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、樹状細胞、大腸、肺、正常腎臓およびループス腎臓および肝硬変で検出される。加えて、この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、樹状細胞、大腸、肺、正常腎臓およびループス腎臓および肝硬変で検出される。
【０９００】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ３４４１  この遺伝子の最も高発現は、腎臓癌２で検出される（ＣＴ＝２８．８）。この遺伝子の中レベルから低レベルの発現はまた、転移性黒色腫、前立腺癌および腎臓癌で見られる。興味深いことに、この遺伝子の発現は、腎臓癌試料で、隣接正常組織より高い。従って、この遺伝子の発現は、腎臓癌を検出するマーカーとして用いられ得る。加えて、この遺伝子の治療的調節は、腎臓癌の処置で有用であり得る。
【０９０１】
ＡＤ．ＣＧ５９４８２−０２：トリプシンＩ前駆体
物理的クローンの全長ＣＧ５９４８２−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７１１８を用いて評価し、表ＡＤＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＤＢ、ＡＤＣおよびＡＤＤに示す。
【０９０２】
【表４３７】
2005515758.tif 000439
【０９０３】
【表４３８】
2005515758.tif 000440
【０９０４】
【表４３９】
2005515758.tif 000441
【０９０５】
表ＡＤＣの続き
【表４４０】
2005515758.tif 000442
【０９０６】
【表４４１】
2005515758.tif 000443
【０９０７】
表ＡＤＤの続き
【表４４２】
2005515758.tif 000444
【０９０８】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７１１８  このパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質で若干ダウンレギュレートされると思われる。それゆえ、この遺伝子またはタンパク質産物のアップレギュレーション、またはこの受容体の特異的作用物質での処置は、痴呆、記憶喪失、およびこの疾患と関連する神経細胞死の治療において有用であり得る。
【０９０９】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７１１８  この遺伝子、推定トリプシンの最も高発現は、膵臓で見られる（ＣＴ＝１７）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこの遺伝子と他の遺伝子とを区別し得るし、かつこの器官のマーカーとして用いられ得る。加えて、この遺伝子によりコード化されるトリプシンの治療的調節は、膵炎を含む膵臓関連疾患の処置で有用であり得る。
【０９１０】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７１１８  最も高発現は、無処置ケラチノサイトで見られる（ＣＴ＝３２．６）。それゆえ、低分子療法の適用を介したこの転写物によりコード化されるタンパク質の発現または活性の調節は、乾癬の処置および創傷治癒で有用であり得る。
【０９１１】
加えて、この遺伝子の低レベルから中レベルの発現はまた、サイトカインで処理された皮膚線維芽細胞、ＨＰＡＥＣ、休止および活性化ＨＵＶＥＣ細胞、ＩＬ−２処理休止ＮＫ細胞、および２方法ＭＬＲで検出される。それゆえ、この遺伝子によりコード化されるトリプシンの治療的調節は、エリテマトーデス、喘息、肺気腫、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、骨関節炎、および乾癬のような内皮細胞に関与する自己免疫疾患および炎症性疾患の処置で有用であり得る。
【０９１２】
ＡＥ．ＣＧ８９７０９−０１およびＣＧ８９７０９−０２およびＣＧ８９７０９−０３およびＣＧ８９７０９−０４：タンパク質キナーゼ様遺伝子
遺伝子ＣＧ８９７０９−０１および変異体ＣＧ８９７０９−０２、ＣＧ８９７０９−０３、およびＣＧ８９７０９−０４の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ５７６３を用いて評価し、表ＡＥＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＥＢ、ＡＥＣおよびＡＥＤに示す。
【０９１３】
【表４４３】
2005515758.tif 000445
【０９１４】
【表４４４】
2005515758.tif 000446
【０９１５】
【表４４５】
2005515758.tif 000447
【０９１６】
表ＡＥＣの続き
【表４４６】
2005515758.tif 000448
【０９１７】
【表４４７】
2005515758.tif 000449
【０９１８】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ５７６３  このパネルは、個々の独立した群の脳における有意なレベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。しかしながら、この遺伝子の差のある発現は、アルツハイマー病の死後脳とこの実験の痴呆のない対照のものとの間で検出されない。中枢神経系疾患の処置でのこの遺伝子の潜在的有用性の考察のためパネル１．５を参照されたい。
【０９１９】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．５概要：Ａｇ５７６３  この遺伝子の最も高発現は、脳（小脳）で検出される（ＣＴ＝２６．４）。この遺伝子の高レベルの発現はまた、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質、および脊髄を含む、調べられた中枢神経系の全領域で見られる。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【０９２０】
この遺伝子の中レベルの発現はまた、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍由来の癌細胞株の群で見られる。従って、この遺伝子の発現は、これら癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍の処置で効果的であり得る。
【０９２１】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管で中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【０９２２】
この遺伝子は新規タンパク質キナーゼをコードする。CuragenでのPathCallingスクリーニングにおいて、この遺伝子は、エストロゲン関連核受容体β（ＥＲＲＢ２）の内部因子として同定された。ＥＲＲＢ２は順に、代謝の重要な転写因子であるＦＯＸＯ１Ａ（ＦＫＨＲ）と相互作用する。この結果は、新規タンパク質キナーゼがＥＲＲＢ２およびＦＫＨＲのリン酸化状態、およびそれゆえ活性を制御し得る。それゆえ、この遺伝子の阻害は、糖尿病状態と関連すると知られているＥＲＲＢ２およびＦＨＫＲの過剰活性を弱める。従って、この遺伝子によりコード化されたタンパク質キナーゼの拮抗物質は、糖尿病の処置で有益であり得る。
【０９２３】
パネル５島概要：Ａｇ５７６３  この遺伝子の最も高発現は、膵臓で検出される（ＣＴ＝２９．９）。パネル１．５との一致に加えて、この遺伝子は、代謝性組織で広く発現する。この遺伝子の有用性のさらなる考察のためパネル１．５を参照されたい。
【０９２４】
ＡＦ．ＣＧ９０８７９−０１：タンパク質キナーゼＤ２様遺伝子
遺伝子ＣＧ９０８７９−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ８０５およびＡｇ３７７０を用いて評価し、表ＡＦＡおよびＡＦＢに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＦＣ、ＡＦＤ、ＡＦＥ、ＡＦＦおよびＡＦＧに示す。
【０９２５】
【表４４８】
2005515758.tif 000450
【０９２６】
【表４４９】
2005515758.tif 000451
【０９２７】
【表４５０】
2005515758.tif 000452
【０９２８】
表ＡＦＣの続き
【表４５１】
2005515758.tif 000453
【０９２９】
【表４５２】
2005515758.tif 000454
【０９３０】
表ＡＦＤの続き
【表４５３】
2005515758.tif 000455
【０９３１】
【表４５４】
2005515758.tif 000456
【０９３２】
表ＡＦＥの続き
【表４５５】
2005515758.tif 000457
【０９３３】
【表４５６】
2005515758.tif 000458
【０９３４】
表ＡＦＦの続き
【表４５７】
2005515758.tif 000459
【０９３５】
表ＡＦＦの続き
【表４５８】
2005515758.tif 000460
【０９３６】
【表４５９】
2005515758.tif 000461
【０９３７】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ８０５／Ａｇ３７７０  異なるプローブとプライマーのセットでの２回の実験は、優位な一致となる結果を生じる。これらのパネルは、個々の独立した群の脳における低レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質で若干ダウンレギュレートされると思われる。それゆえ、この遺伝子またはタンパク質産物のアップレギュレーション、またはこの受容体の特異的作用物質での処置は、痴呆、記憶喪失、およびこの疾患と関連する神経細胞死の治療において有用であり得る。
【０９３８】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ３７７０  この遺伝子の最も高発現は、胃癌細胞株で見られる（ＣＴ＝２６．７）。この遺伝子は、脳腫瘍、大腸癌、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、および黒色腫の癌細胞株で見られる高発現から中発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０９３９】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、および成人の骨格筋および胎児の骨格筋、心臓、および肝臓で中レベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０９４０】
加えて、この遺伝子は、胎児の肺組織（ＣＴ＝２８．５）で、成人の対応物での発現（ＣＴ＝３２）と比較してずっと高レベルで発現する。従って、この遺伝子の発現を用いて、この組織の胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得る。
【０９４１】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳで中レベルから低レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０９４２】
パネル１．３Ｄ概要：Ａｇ８０５  最も高発現は、胎児の腎臓においてである（ＣＴ＝２８．２）。この遺伝子は、このパネルの多くの試料での中発現から低発現と共に、このパネルで広く発現する。この遺伝子の発現および有用性のさらなる考察のため、パネル１．４を参照されたい。
【０９４３】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ８０５／Ａｇ３７７０  異なるプローブとプライマーのセットでの２度の実験は、活性化２次Ｔｈ２細胞および２方法ＭＬＲで見られるこの遺伝子の最も高発現（ＣＴ＝２７．６〜２８）とよく一致する。この遺伝子はまた、健康および疾患での免疫応答での有意な細胞タイプの広範で中レベルで発現する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞、および大腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織のメンバーを含む。発現の遍在パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞タイプおよび組織のホメオスタシス過程で関与しうることを示す。このパターンは、一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４での発現プロフィールと一致し、かつ細胞生存および細胞増殖での遺伝子産物での働きも示す。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調製は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【０９４４】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ３７７０  最も高発現は、腎臓癌で見られる（ＣＴ＝２９．５）。加えて、この遺伝子は、肺癌、大腸癌および腎臓癌で、対応正常隣接組織より高く発現する。顕著な発現は、前立腺癌および黒色腫でも見られる。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌のマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子産物の発現または機能の治療的調節は、肺癌、大腸癌、前立腺癌、黒色腫および腎臓癌の処置で有用であり得る。
【０９４５】
ＡＧ．ＣＧ９６３３４−０２：二重特異性チロシンリン酸化制御キナーゼ１Ａ様遺伝子
遺伝子ＣＧ９６３３４−０２の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ７４１３を用いて評価し、表ＡＧＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＧＢ、ＡＧＣおよびＡＧＤに示す。
【０９４６】
【表４６０】
2005515758.tif 000462
【０９４７】
【表４６１】
2005515758.tif 000463
【０９４８】
【表４６２】
2005515758.tif 000464
【０９４９】
表ＡＧＣの続き
【表４６３】
2005515758.tif 000465
【０９５０】
【表４６４】
2005515758.tif 000466
【０９５１】
表ＡＧＤの続き
【表４６５】
2005515758.tif 000467
【０９５２】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ７４１３  この遺伝子は、ＣＮＳで低レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調症、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０９５３】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．６概要：Ａｇ７４１３  この遺伝子の検出可能な発現は、２つの脳腫瘍細胞株試料に制限される。従って、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、脳腫瘍の処置で効果的であり得る。
【０９５４】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ７４１３  この遺伝子の最も高発現は、休止好中球で見られる（ＣＴ＝３２．９）。低発現だが有意な発現は、Ｔ細胞、ＬＡＫ細胞、ＬＰＳで刺激された単球およびマクロファージ、肺および皮膚線維芽細胞、および正常腎臓および胸腺由来の試料を含む、このパネルの全試料で見られる。
それゆえ、この遺伝子または該タンパク質産物の治療的調節は、エリテマトーデス、喘息、肺気腫、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、骨関節炎、および乾癬のような自己免疫疾患および炎症性疾患の処置で有用であり得る。加えて、この遺伝子産物の低分子または抗体拮抗物質は、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全患者の免疫応答を増加するのに効果的であり得る。
【０９５５】
ＡＨ．ＣＧ９６７１４−０１：ＵＤＰ−グルコース輸送体関連アイソザイム１様遺伝子
遺伝子ＣＧ９６７１４−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４０７４を用いて評価し、表ＡＨＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＨＢおよびＡＨＣに示す。
【０９５６】
【表４６６】
2005515758.tif 000468
【０９５７】
【表４６７】
2005515758.tif 000469
【０９５８】
表ＡＨＢの続き
【表４６８】
2005515758.tif 000470
【０９５９】
【表４６９】
2005515758.tif 000471
【０９６０】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４０７４  この遺伝子の最も高発現は、乳癌Ｔ４７Ｄ細胞株で検出される（ＣＴ＝２６）。この遺伝子の高レベルの発現はまた、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍由来の細胞株の群で見られる。従って、この遺伝子の発現は、これら癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、膵臓癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、黒色腫および脳腫瘍の処置で効果的であり得る。
【０９６１】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管で中レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子活性の治療的調節は、肥満および糖尿病のような内分泌／代謝関連疾患の処置で有用となり得る。
【０９６２】
加えて、この遺伝子は、扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質、および脊髄を含む調べられた中枢神経系の全領域において高レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子産物の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、総合失調症およびうつ病のような中枢神経系疾患の処置で有用であり得る。
【０９６３】
パネル５Ｄ概要：Ａｇ４０７４  この遺伝子の最も高発現は、脂肪で検出される（ＣＴ＝３０）。パネル１．４でみられる発現と一致して、この遺伝子は、このパネルでの遍在発現を示す。この遺伝子の有用性のさらなる考察のため、パネル１．４を参照されたい。
【０９６４】
ＡＩ．ＣＧ９７０２５−０１：ＨＭＧ−ＣｏＡ合成様遺伝子
遺伝子ＣＧ９７０２５−０１の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４０８７を用いて評価し、表ＡＩＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＩＢ、ＡＩＣ、ＡＩＤ、ＡＩＥ、ＡＩＦ、ＡＩＧおよびＡＩＨに示す。
【０９６５】
【表４７０】
2005515758.tif 000472
【０９６６】
【表４７１】
2005515758.tif 000473
【０９６７】
【表４７２】
2005515758.tif 000474
【０９６８】
表ＡＩＣの続き
【表４７３】
2005515758.tif 000475
【０９６９】
【表４７４】
2005515758.tif 000476
【０９７０】
表ＡＩＤの続き
【表４７５】
2005515758.tif 000477
【０９７１】
【表４７６】
2005515758.tif 000478
【０９７２】
表ＡＩＥの続き
【表４７７】
2005515758.tif 000479
【０９７３】
【表４７８】
2005515758.tif 000480
【０９７４】
【表４７９】
2005515758.tif 000481
【０９７５】
【表４８０】
2005515758.tif 000482
【０９７６】
ＣＮＳ_神経変性_ｖ１．０概要：Ａｇ４０８７  このパネルは、アルツハイマー病でのこの遺伝子の差のない発現を示す。しかしながら、このプロフィールは、脳における高レベルから中レベルでのこの遺伝子の発現を確かにする。中枢神経系でのこの遺伝子の有用性の考察のため、パネル１．４を参照されたい。
【０９７７】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４０８７  この遺伝子の最も高発現は、胎児の肝臓で見られる（ＣＴ＝２２．８）。加えて、この遺伝子は、胎児の肺（ＣＴ＝２６）において成人の対応物での発現（ＣＴ＝２９）と比較してより高いレベルで発現する。反対に、この遺伝子は、胎児の組織での発現（ＣＴ＝３２）と比較して、胎児の骨格筋（ＣＴ＝２８）でより高く発現する。従って、この遺伝子の発現を用いて、これら組織に胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得る。
【０９７８】
この遺伝子は、脳腫瘍細胞株、大腸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、および黒色腫細胞株での高発現と共に、このパネルで広く発現する。この発現プロフィールは、細胞生存および細胞増殖でのこの遺伝子産物の働きを示す。この遺伝子産物の調節は、癌の処置で有用であり得る。
【０９７９】
代謝機能を有する組織の間で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、および成人および胎児の骨格筋、心臓、および肝臓において高レベルから中レベルで発現する。これら組成機間でのこの広範な発現は、この遺伝子産物が正常神経内分泌機能および正常代謝機能で働き得ること、およびこの遺伝子の非制御発現が神経内分泌疾患または肥満および糖尿病のような代謝性疾患の一因となり得ることを示す。
【０９８０】
この遺伝子は、サイトゾルＨＭＧＣｏＡ合成酵素をコードする。遺伝子発現差であるCuraGenの GeneCalling［登録商標］方法を用いて、この遺伝子の発現は、２つの異なる肥満のげっ歯類モデルでアップレギュレートされることが分かる。ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素は、コレステロール生合成経路の酵素であり、かつＬＸＲα活性化因子（リガンド）の産物の基質を提供する。ＬＸＲαは、脂質代謝と関連する組織で過剰に発現する核受容体である。高コレステロール状態下で、ＬＸＲαは活性化される。それは順に、脂肪酸合成に関与する遺伝子の主用な制御因子である、ステロール制御エレメント結合タンパク質１ｃの転写をアップレギュレートする。ＬＸＲαリガンドの増加産物は、脂肪酸合成およびトリグリセロール形成および脂肪塊の増加を導き得る。それゆえ、この遺伝子の治療的調節は、肥満の処置で有用であり得る。
【０９８１】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃体、小脳および大脳皮質を含む、ＣＮＳで高レベルで発現する。それゆえ、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、総合失調、多発性硬化症、脳卒中およびてんかんのような神経性疾患の処置で有用であり得る。
【０９８２】
パネル３Ｄ概要：Ａｇ４０８７  最も高発現は、このパネルの全試料での高レベルから中レベルの発現と共に、肺癌細胞株で見られる（ＣＴ＝２６）。この発現は、１．４での発現と一致する。
【０９８３】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４０８７  最も高発現は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βで処理された小気道上皮で見られる（ＣＴ＝２６）。この遺伝子はまた、健康および疾患での免疫応答での有意な細胞タイプの広範で中レベルで発現する。これらの細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮細胞および線維芽細胞、および大腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織のメンバーを含む。発現の遍在パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞タイプおよび組織のホメオスタシス過程で関与しうることを示す。このパターンは、一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４での発現プロフィールと一致し、かつ細胞生存および細胞増殖での遺伝子産物での働きも示す。それゆえ、機能的療法での遺伝子産物の調製は、これら細胞タイプと関連する機能の変化を導き得るし、かつ喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、関節リウマチ、および骨関節炎のような自己免疫疾患および炎症性疾患を病む患者の症状の改善を導き得る。
【０９８４】
パネル５島概要：Ａｇ４０８７  最も高発現は、肝臓細胞株で見られる（ＣＴ＝２７．８）。加えて、サイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素は、脂肪、骨格筋およびランゲルハンス島を含む広範な組織を有する。最近、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素のアップレギュレーションが膵島β細胞の高グルコースに対するインスリン分泌応答と関連することが示された（Flamez et al., 2002, 糖尿病 51(7):201824, PMID: 12086928）。従って、この遺伝子の薬理活性は、２型糖尿病でのインスリン分泌を増強するための処置であり得る。
【０９８５】
パネル５Ｄ概要：Ａｇ４０８７  最も高発現は、肝臓細胞株で見られる（ＣＴ＝２７．５）。加えて、このサイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素は、脂肪、骨格筋、およびランゲルハンス島を含む広範な組織発現を有する。
【０９８６】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ４０８７  最も高発現は、腎臓癌で見られる（ＣＴ＝２７）。加えて、この遺伝子は、対応正常隣接組織より肺癌および大腸癌でより高く発現する。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌のマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子産物の発現または機能の治療的調節は、肺癌、大腸癌および腎臓癌の処置で有用であり得る。
【０９８７】
ＡＪ．ＣＧ９７９５５−０３：カルボキシペプチダーゼＡ１
物理的クローンの全長ＣＧ９７９５５−０３の発現をプライマー−プローブのセットＡｇ４１３５を用いて評価し、表ＡＪＡに記載した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を表ＡＪＢ、ＡＪＣおよびＡＪＤに示す。
【０９８８】
【表４８１】
2005515758.tif 000483
【０９８９】
【表４８２】
2005515758.tif 000484
【０９９０】
表ＡＪＢの続き
【表４８３】
2005515758.tif 000485
【０９９１】
【表４８４】
2005515758.tif 000486
【０９９２】
表ＡＪＣの続き
【表４８５】
2005515758.tif 000487
【０９９３】
【表４８６】
2005515758.tif 000488
【０９９４】
一般的_スクリーニング_パネル_ｖ１．４概要：Ａｇ４１３５  この推定カルボキシペプチダーゼの発現は、膵臓および膀胱で最も高い（ＣＴ＝２０）。低レベルだが有意なレベルの発現は、脂肪、精巣、脾臓、成人および胎児の骨格筋、大腸癌組織、胎児の腎臓、胎児の肝臓、胎児の肺、胎盤、および扁平上皮癌細胞株で見られる。それゆえ、この遺伝子の治療的調節は、膵炎を含むこれらの組織に作用する疾患の処置で有用であり得る。
【０９９５】
加えて、この遺伝子は、胎児の肝臓（ＣＴ＝２６）において、成人の対応物（ＣＴ＝４０）より高発現する。従って、この遺伝子の発現を用いて、この組織の胎児の供給源と成人の供給源とを区別し得る。加えて、胎児でのこの遺伝子の相対過剰発現は、タンパク質産物が胎児での肝臓成長または発達を増強し得るし、従って成人での再生能力でも働きうることを示す。それゆえ、この遺伝子によりコード化されたカルボキシペプチダーゼの治療的調節は、肝臓関連疾患の処置で有用であり得る。
【０９９６】
パネル４．１Ｄ概要：Ａｇ４１３５  この遺伝子は、両方の実施において胸腺で有意なレベルでのみ発現する（ＣＴ＝３３）。この遺伝子によりコード化されるタンパク質はそれゆえ、Ｔ細胞成熟において重要な働きを示す。この遺伝子によりコード化されるカルボキシペプチダーゼに対してデザインされた低分子療法、または抗体療法を利用して、免疫機能（Ｔ細胞成熟）を調節し得るし、かつ器官移植、ＡＩＤＳ処置または化学療法後の免疫再構成に重要で有り得る。
【０９９７】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル_ｖ_２．４概要：Ａｇ４１３５  この遺伝子の発現は、前立腺癌由来試料に制限される（ＣＴ＝３２．６）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルのこの試料と他の試料とを区別し得るし、かつ膵臓癌の存在を検出するマーカーとして用いられ得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的調節は、前立腺癌の処置で効果的であり得る。
【０９９８】
実施例Ｄ：NOVX核酸配列中の単一ヌクレオチド多型の同定
変異体配列も本願に含まれる。変異体配列には単一ヌクレオチド多型（SNP）を含み得る。SNPは、場合によって、SNPを含むヌクレオチド配列がcDNAとして起こることを示すため「cSNP」と称される。SNPはいく通りかの方法で生じ得る。例えば、SNPは多型部位でのあるヌクレオチドの別のものとの置換によるものであり得る。かかる置換はトランジションまたはトランスバーションのいずれかであり得る。SNPはまた参照対立遺伝子と比べて、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも生じ得る。この場合、この多型部位とはある対立遺伝子が別の対立遺伝子の特定のヌクレオチドに関してギャップを有する部位である。遺伝子内に生じるSNPは、SNPの位置にある遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更をもたらす場合がある。遺伝暗号の重複性の結果としてSNPを含むコドンが同じアミノ酸をコードする場合、遺伝子内のSNPがサイレントである場合もある。遺伝子の領域外で、または遺伝子のイントロン内で生じるSNPはタンパク質のどのアミノ酸配列にも変化をもたらさないが、発現パターンの調節の変更をもたらす場合がある。例として、時間的発現、生理的応答調節、細胞種発現調節、発現強度、および転写されたメッセージの安定性の変更が挙げられる。
【０９９９】
エクソン結合プロセスによって得られたSeqCallingアセンブリーを以下の基準を用いて選択し、伸長させた。最初の配列または伸長させた配列の全てまたは部分に対し98%の同一性を持つ領域を有するゲノムクローンを、ヒトゲノムデータベースをクエリーするのに適切な配列を用いてBLASTN検索によって同定した。この同一性がこれらのクローンがこれらSeqCallingアセンブリーのゲノム座位を含むことを示すことから、得られたゲノムクローンをさらなる解析のために選択した。これらの配列は推定コード領域ならびに既知DNAおよびタンパク質配列との類似性に関して解析した。これらの解析に用いたプログラムとしては、Grail、Genscan、BLAST、HMMER、FASTA、Hybridおよびその他の適切なプログラムが挙げられる。
【１０００】
さらなるゲノム領域を、選択したSeqCallingアセンブリーがそれらの領域についてマッピングするということでいくつか同定しておいてもよい。かかるSeqCalling配列は相同性またはエクソン予測により規定される領域と重複していてもよい。また、断片の位置が類似性または当初の予測配列に含まれていたエクソン予測により同定されるゲノム領域の近傍にあったという理由でこれらを含めてもよい。このように同定された配列を手作業でアセンブルし、次いでCuraGen社のヒトSeqCallingデータベースから得られる1以上のさらなる配列を用いて伸長しておいてもよい。含めるのに好適なSeqCalling断片を、CuraTools（商標）プログラムSeqExtendにより、または解析したゲノムクローンの適当な領域へマッピングするSeqCalling断片の同定により同定した。
【１００１】
次いで、本明細書に開示された最終配列を導くため、前記手順により規定される領域を手作業で統合し、例えば、元の断片中でミスコールされた塩基から、または予測されるエクソン結合部、EST位置と配列類似性領域との間の矛盾から生じ得た明らかな不一致を訂正した。必要であれば、SeqCallingアセンブリーおよびゲノムクローンを同定および解析するプロセスを繰り返して全長配列を導いた（Alderbornら, Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing. Genome Research. 10（8）1249-1265,2000）。
【１００２】
変異体は個々に報告されるが、変異体の全てまたは選択サブセットのいずれの組み合わせも本発明の考慮されるNOVXの実施形態として含まれる。
【１００３】
【表４８７】
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【１００４】
【表４８８】
2005515758.tif 000490
【１００５】
【表４８９】
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【１００６】
【表４９０】
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【１００７】
【表４９１】
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【１００８】
【表４９２】
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【１００９】
【表４９３】
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【１０１０】
【表４９４】
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【１０１１】
【表４９５】
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【１０１２】
【表４９６】
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【１０１３】
【表４９７】
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【１０１４】
【表４９８】
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【１０１５】
【表４９９】
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【１０１６】
【表５００】
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【１０１７】
【表５０１】
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【１０１８】
【表５０２】
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【１０１９】
【表５０３】
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【１０２０】
【表５０４】
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【１０２１】
実施例Ｅ：ＮＯＶＸ関連ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法
本発明は一部分は病態、疾病、あるいは異常な状態または状況における調節に差のある生物学的高分子の同定に基づき、かつ/またはcDNAライブラリーまたは1つ1つのマトリックス反応を用いる酵母ツーハイブリッドスクリーニングで同定される、タンパク質およびポリペプチドならびにそれらをコードする核酸の新規の関連性に基づいている。目下注目される病状または疾病の中には内分泌学的疾患、癌、種々の腫瘍および腫瘍形成、炎症性疾患、中枢神経系疾患、および類似の異常状態または状況に関するものをはじめとする代謝病が含まれる。生物学的高分子が関与する重要な代謝疾患としては肥満症および糖尿病、特に肥満症およびII型糖尿病が挙げられる。肥満症は患者をII型糖尿病にかかりやすくすると考えられている。本発明の極めて重要な実施形態では、これらの病状および状態に関係している生物学的高分子はタンパク質およびポリペプチドであり、このような場合、本発明は同様にそれらをコードする核酸にも関与する。関係のある生物学的高分子を同定するために用いることができる方法としては、疾患に関連するタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸の発現の差を検出するいずれかの手順、ならびにそれぞれのタンパク質およびポリペプチド自体を検出する手順が挙げられる。本発明者らの用いた有意な方法としては、各々それぞれ全文を引用することにより本明細書の一部とされる、米国特許第5,871,697号および1999年10月13日出願の米国特許出願第09/417,386号に開示される、GeneCalling（登録商標）技術およびSeqCalling（商標）技術が挙げられる。GeneCalling（登録商標）はShimketsら, Nature Biotechnology, 17：198-803（1999）にも記載されている。
【１０２２】
本発明は哺乳類において疾病または病状、または異常状態または状況と新規の関連を有すると特定されたポリペプチドおよびそれによってコードされるヌクレオチドを提供する。本発明には核酸配列およびそれらにコードされるポリペプチドが含まれる。この配列を総じて「肥満症および/または糖尿病核酸」または「肥満症および/または糖尿病ポリヌクレオチド」と呼び、対応するコードされるポリペプチドは「肥満症および/または糖尿病ポリペプチド」または「肥満症および/または糖尿病タンパク質」と呼ぶ。例えば、本発明の肥満症および/または糖尿病核酸は肥満症および/または糖尿病核酸を含む核酸であり、本発明の肥満症および/または糖尿病ポリペプチドは肥満症および/または糖尿病ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。特に断りのない限り、「肥満症および/または糖尿病」とは本明細書に開示の新規の関連を有するいずれの配列も指すものとする。
【１０２３】
本発明は種々の疾病、病状、異常状態および状況の処置における治療薬の標的として関与する、天然ポリペプチド、このポリペプチドまたはタンパク質の前駆体型またはプロタンパク質または成熟型をはじめとする一連のタンパク質およびポリペプチドを同定する。標的は、標的と相互作用し、そうすることによって所望のまたは好ましい効果を発揮する候補治療薬を同定するための種々のスクリーニング方法論のいずれかで用いてもよい。本発明の重要な実施形態では、候補治療薬は物質または化合物の大きな収集物をスクリーニングして同定する。かかる収集物は、物質または化合物の少なくとも1つのサブセットにおいて、個々のメンバーが特定の基準または基本的な化学構造に基づく簡単な構造上の変化によって互いに関与している、物質または化合物のコンビナトリアル・ライブラリーを含んでなっていてもよい。この変化には、例を限定するものではないが、結合した原子の基礎構造の長さまたは同一性における変化;環状構造、架橋構造、脂環式環、および芳香環の数、構成および配置における変化;ならびに特定の位置で、結合した原子の基礎構造または環状構造、架橋構造、脂環式構造、あるいは芳香族構造と結合しているペンダントまたは置換原子もしくは基における変化が挙げられる。
【１０２４】
本明細書に記載され、かつ、スクリーニング手順で標的として役立つポリペプチドまたはタンパク質としては、天然のポリペプチドまたは前駆体型またはプロタンパク質の産物が挙げられる。天然のポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、例えば、対応する遺伝子にコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。天然のポリペプチドとしてはまた、本明細書に記載されるオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質も挙げられる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型は宿主細胞をはじめとする細胞内で生じ得る1以上の天然のプロセシングステップの結果として生じる。このプロセシングステップは遺伝子産物が生じる時に、例えばオープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされるアミノ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質加水分解切断により起こる。したがって、1からNまでの残基を有し、残基1がN末端メチオニンである前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型には残基2からNが残存する。あるいは、残基1〜Nを有し、残基1から残基Mまでのアミノ末端シグナル配列が切断される前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は残基M+1から残基Nまでの残存する残基を含む。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質加水分解によらない翻訳後修飾からも生じ得る。かかる非タンパク質加水分解プロセスとしては、例えば、グリコシル化、ミリスチル化またはリン酸化が挙げられる。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質はこれらのプロセスのただ1つの働き、またはそれらのうちのいずれかの組み合わせから生じ得る。
【１０２５】
本明細書において「同一な」残基とは、2つの配列のアラインメントで対応するヌクレオチド塩基またはアミノ酸残基が同一残基であるような2つの配列間の比較における残基にあたる。あるいは、アラインメントでの2つの配列間の比較が、比較上対応する位置にある残基が同じアミノ酸か以下に定義する保存アミノ酸のいずれかであると示す場合に、残基は「類似の」または「ポジティブ」と記載される。
【１０２６】
本明細書において「化学組成物」とは、天然の供給源より合成されたか抽出されたかどちらかの少なくとも1種の化合物を含む組成物に関する。化学化合物は規定された合成手順の産物であり得る。かかる合成化合物は本明細書では分子式、結合した原子の相互の会合に関する分子構造、電気泳動図または分光学的特性その他などの物理的特性に関して規定の特性を有するものと理解される。有利なことに、天然の供給源より抽出された化合物は、分子式、結合した分子の相互の会合に関する分子構造、電気泳動図または分光学的特性その他などの物理的特性をはじめとするその規定の特性の説明を提供するため、化学的および物理的方法で分析されている。
【１０２７】
本明細書において「候補治療薬」とは、標的生体高分子と結合すると示される少なくとも1種の物質を含む化学化合物である。本発明の重要な実施形態では、標的生体高分子はタンパク質またはポリペプチド、核酸、多糖またはプロテオグリカン、あるいは複合脂質などの脂質である。標的と結合する化合物の同定方法は結合親和性をほとんどまたは全く持たない化合物を効果的に除去し、それによって同定された化学化合物が有益な治療用途を持つ可能性が高まる。「候補治療薬」が1種以上の化学化合物の混合物である場合には、次いでスクリーニング手順を実施して、結合性化合物であって候補治療薬として同定されるであろう混合物中の特定の物質を同定してもよい。
【１０２８】
本明細書において「医薬」は、疾病または病状に関して所望のまたは有益な治療効果を発揮する候補を同定するための、その病状または病理モデルを用いる候補治療薬のスクリーニングにより提供される。首尾よくかかる効果をもたらすかかる候補を本明細書では医薬と呼ぶ。限定するものではないが、かかるスクリーニングに用いてよいモデル系の例としては、特定の細胞株、培養細胞、組織調製物、全組織、器官調製物、完全な器官、および非ヒト哺乳類が挙げられる。医薬を同定するためには少なくとも1つの系、好ましくは1以上の系を用いるスクリーニングを用いればよい。このように同定された医薬はいずれもヒト被験者を用いるさらなる研究で取り組めばよい。
【１０２９】
Ａ．ＮＯＶ４１：ヒトサイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素様タンパク質
以下のセクションは、ＮＯＶ４１タンパク質およびそれらのいずれかの変異体をコード化するサイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素を、診断マーカー、抗体療法の標的、および肥満および／または糖尿病の小分子標的として同定するために用いられる研究デザインおよび技術を記載する。
【１０３０】
多数のマウス系統が、体重および組成において異なることが同定された。ＡＫＲおよびＮＺＢ系統が肥満であり、ＳＷＲ、Ｃ５７ＬおよびＣ５７ＢＬ／６系統が平均的体重である一方で、ＳＭ／ＪおよびＣａｓｔ／Ｅｉ系統はやせている。これらの系統由来の主要な代謝組織での遺伝子発現の差を理解することは、肥満の病態生理学的な基準を解明する。ラットのこれらの特異的系統は、体重についての量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）および関連形質が公開遺伝子研究で報告されたため、異なる遺伝子発現解析のため選択された。組織は、脳、骨格筋、内臓脂肪、および肝臓を含む。
【１０３１】
サイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素は、コレステロールの生合成の初期ステップを仲介する。この酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの基質であるＨＭＧ−ＣｏＡ由来のアセトアシル−ＣｏＡでアセチルＣｏＡを縮合する。一般に、Carlsson et al., 2001 Am J Physiol Endocrinol Metab. 281(4):E77281; Lopez et al., 2001 Mol Cell Biochem. 217(12):5766; Olivier et al., 2000 Biochim Biophys Acta. 1529(13):89102; Mascaro et al., 2000 Biochem J. 350 Pt 3:78590; Sato et al.,  2000 J Biol Chem. 275(17):12497502; Mascaro et al., 2000 Arch Biochem Biophys. 374(2):28692; Scharnagl et al.,  1995 J Lipid Res. 36(3):6227;およびRoyo et al., 1993 Biochem J. 289 ( Pt 2):55760を参照されたい。
【１０３２】
ＮＯＶ４１発現
マウスサイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素の遺伝子フラグメントは、CuraGenのGeneCalling［登録商標］差次的遺伝子発現法を用いてＳＭＪマウスと比べてＮＺＢマウスの肝臓で７倍アップレギュレートされることがまずわかった。約３１２．１ヌクレオチド長に移動する発現に差のあるマウス遺伝子フラグメント（表１Ａおよび１Ｂ−縦線）は、マウスサイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素ｃＤＮＡの構成要素であるとして決定的に同定された（グラフ中、横線はヌクレオチド長がとられ、縦軸はシグナル応答がとられている）。競合ＰＣＲ法は、遺伝子評価の形成のために用いられた。ラットサイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素の遺伝子フラグメントに対応するクロマトグラフィーピークは、遺伝子特異的プライマー（以下を参照）がＰＣＲ増幅の際にリンカーアダプター中のプライマーと競合する場合に除去される。３１２．１ヌクレオチド長でのピークが、ＮＺＢおよびＳＭＪマウスの両方の試料では除去されている。３１２ヌクレオチド長遺伝子フラグメントおよび競合ＰＣＲ法のために用いられる遺伝子特異的プライマーの直接配列は、イタリック体で示されている。フラグメントの５’末端および３’末端の遺伝子特異的プライマーは太字である。この結果は、競合ＰＣＲにより確認された。
【１０３３】
生化学
サイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの基質であるＨＭＧ−ＣｏＡを形成するためにアセトアセチル−ＣｏＡでアセチルＣｏＡを縮合する。この縮合反応は、コレステロール生化学経路のファルネソイック酸（farnesoic acid）への分割点上で生じる。反応は以下である：
アセチル−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ＋アセトアセチル−ＣｏＡ＝（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ＋ＣｏＡ
【１０３４】
小分子薬および抗体療法の診断および／または標的の原理
ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素は、明らかなＬＸＲα活性化により特徴付けられる肥満の遺伝子モデルにおいて７倍アップレギュレートされ（ＡｐｏＥの脂肪誘導、リンゴ酸酵素、ＡＴＰクエン酸脱離酵素、ＦＡＳ、ＳＣＤ）、従って、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素はＬＸＲαリガンドの基質を提供する。
この酵素の阻害物質は、肥満の予防または処置のための処置であり得る。
全体として、データは、ヒトサイトゾルＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素は肥満および／または糖尿病の処置において有益であろうことを示す。
【１０３５】
Ｂ．ＮＯＶ３：ヒトステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ様タンパク質
以下のセクションは、ＮＯＶ３タンパク質、およびそれらのいずれかの変異体をコード化するステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼを、診断マーカー、抗体療法の標的および肥満および／または糖尿病の小分子薬として適当であるとして同定するために用いられる研究デザインおよび技術を記載する。
【１０３６】
ステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）をＯ２および還元シトクロムｂ５由来の電子を利用して、９位の炭素（「デルタ−９デサチュラーゼ」）のパルミトイル−ＣｏＡおよびステアリン酸−ＣｏＡを含む脂肪酸−ＣｏＡ基質のスペクトルへの二重結合の挿入を触媒する。ステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ発現は、脂肪分化および脂質生成で本質的である転写因子のＳＲＥＢＰおよびＣ／ＥＢＰαの両方により制御される。ＳＣＤは、トリグリセリド（ＴＧ）として貯蔵される不飽和脂肪酸の合成において鍵となる酵素であり、そしてＴＧ合成の誘導はＳＣＤの発現に高く依存する。最近、ＳＣＤを欠くマウスはやせておりかつ異化亢進である一方で、ＳＣＤにミューテーションを有するｏｂ／ｏｂマウスはほとんど肥満でなく、通常のｏｂ／ｏｂマウスは、ＳＣＤ１がレプチンの代謝行動での重要な構成要素であることを示す、ことがわかった。げっ歯類において２つのＳＣＤ遺伝子ＳＣＤ１およびＳＣＤ２が存在する一方で、ヒトにおいてはたった１つのＳＣＤのみが存在する。
【１０３７】
ＳＣＤ２は肥満の２遺伝子モデルにおいてアップレギュレートされる。肥満ＮＺＢ／ＢＩＮＪマウスの脂肪組織において、ＳＣＤ２は痩せ型ＳＭ／Ｊマウスと比較してアップレギュレートされた。自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）由来の内臓脂肪において、ＳＣＤ２はまた、同一系統由来の皮下脂肪と比較して、アップレギュレートされる。さらに、食事誘導肥満モデル由来の本データは、高脂肪食の肥満マウス（ＳＣＤ１、ＳＣＤ４、ＳＣＤ７および高血糖性ＳＤ７）の全４標準誘導体にとって、ＳＣＤ１は、褐色脂肪細胞においてダウンレギュレートされることを示した。白色脂肪細胞において、ＳＣＤ１は、代謝性肥満ＳＣＤ１マウスにおいてアップレギュレートされた一方で、幾つかの肥満マウス（ＳＤ７）の白色脂肪細胞においてダウンレギュレートされた。ＳＣＤのダウンレギュレートが高脂肪食に応答する代謝性メカニズムであり、褐色脂肪細胞でのそれ自体を明らかにし、従ってこの知見は保護的であり得る。それゆえ、ＳＣＤを直接的に阻害するためのＳＣＤの拮抗物質は、肥満の効果的な治療であり得る。
【１０３８】
自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）は、ヒト代謝症候群Ｘの特徴を表す系統である。フェノタイプ特徴は、肥満、高血糖、高血圧、異脂肪血症および異常線維素溶解を含む。組織は、大人のオスのラットおよび対照系統（Wistar  Kyoto）から取り除かれて、ＳＨＲの病的状態およびトリグリタゾンのような様々な抗項血糖物質で処置された動物に基礎を置く遺伝子発現の差を同定した。組織は、半皮下脂肪、内臓脂肪および肝臓を含む。
【１０３９】
多数のマウス系統は、体重および構成要素が異なるとして同定された。ＡＫＲおよびＮＺＢ系統は肥満であり、ＳＷＲ、Ｃ５７ＬおよびＣ５７ＢＬ／６系統は平均的体重であるが、ＳＭ／ＪおよびＣａｓｔ／Ｅｉ系統はやせている。これら系統由来の主要な代謝組織での遺伝子発現の差を理解することは、肥満の病態生理的基盤を明らかにする。ラットのこれらの特異的系統は、体重についての定量形質遺伝子座（ＱＴＬ）および関連形質が公開遺伝子研究において報告されたので、差次的遺伝子発現解析のために選択された。組織は脳全体、骨格筋、内臓脂肪、および肝臓を含む。
【１０４０】
ヒト間葉幹細胞由来の骨髄は、筋肉、脂肪、軟骨および骨への分化を可能とする。培養条件は、脂肪、軟骨および骨への経路に沿ってインビトロで分化を可能とすることを確立した。これらの明らかな分化過程を伴う遺伝子発現変化を理解することは、かなりの生物学的価値がある。脂肪細胞の分化の制御は、肥満、糖尿病および高血圧の処置で重要である。３ドナー由来のヒト間葉幹細胞を得て、そして公開されている方法によりインビトロで分化させた。未分化および途中まで分化および完全に分化した細胞試料由来のＲＮＡは差次的遺伝子発現の解析のために単離された。一般にMiyazaki et al., 2001 J Lipid Res. 42(7):101824; Kim et al. 2000 J Lipid Res. 41(8):13106; Kim et al. 1998 Cell. 93(5):693704; Miyazaki et al. 2000 J Biol Chem. 275(39):301328; Kim et al. 1999 Biochem Biophys Res Commun. 266(1):14; Miyazaki et al. 2001 J Biol Chem. 276(42):3945561; Bene et al. 2001 Biochem Biophys Res Commun 284(5):11948;およびCohen et al. 2002 Science 297(5579):2403を参照されたい。
【１０４１】
臨床的個体群において肥満の主な原因は、過剰カロリー摂取である。この食事誘導肥満（ＤＩＯ）と呼ばれるものは、４０％より多い脂肪率の高脂肪食を与えあられたことにより動物モデルにおいて、模倣される。ＤＩＯ研究を確立して、食事誘導肥満の発展および進行に帰する遺伝子発現変化を同定した。加えて、研究デザインは高脂肪食の作用に抵抗するある個体の能力を導き、そしてそれにより肥満を予防する因子を同定するために探す。研究のための試料群は、固形試料を与えられた対照の体重＋１Ｓ．Ｄ、＋４Ｓ．Ｄおよび＋７Ｓ．Ｄを有した（表Ｅ１参照）。加えて、＋７Ｓ．Ｄマウスの生化学特性は、肥満および高血糖を示すマウスにもかかわらず正常糖血症特性を保持するマウスへのこれらのマウスの層別化を明らかにする。調べられた組織は、視床下部、脳幹、肝臓、腹膜後白色脂肪細胞（ＷＡＴ）、精巣上体ＷＡＴ、褐色脂肪細胞（ＢＡＴ）、腓腹筋（速筋骨格筋）およびヒラメ筋（遅筋骨格筋）を含む。これらの組織の差次的遺伝子発現特性は、肥満の治療標的として用いられ得る遺伝子および経路を明らかにする。
【１０４２】
【表５０５】
2005515758.tif 000507
【１０４３】
ＮＯＶ３発現
ラットステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ２遺伝子は、CuraGenのGeneCalling［登録商標］差次的遺伝子発現法を用いて自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）の皮下脂肪と比べて内臓脂肪において１．９倍でアップレギュレートされることがまずわかった。約３７３．６ヌクレオチド長に移動する発現に差のあるラット遺伝子フラグメントは、ラットステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ２ｃＤＮＡの構成要素として同定された。競合ＰＣＲ法は、遺伝子評価の形成のために用いた。ラットステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼの遺伝子フラグメントに対応する電気泳動図のピークは、遺伝子特異的プライマーがＰＣＲ増幅の際にリンカー−アダプター中のプライマーと競合する場合に除去される。３７３．６ヌクレオチド長でのピークは、内臓および皮下脂肪の両方由来の試料において除去されている。ＳＨＲ内臓脂肪対皮下脂肪の遺伝子発現の差は＋１．９倍である。
【１０４４】
マウスステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ２の遺伝子フラグメントはまた、CuragenのGeneCalling［登録商標］差次的遺伝子発現法を用いるＳＭ／Ｊ痩せ型マウスと比べてＮＺＢ／ＢＩＮＪ肥満マウスの脂肪組織において１．９倍によりアップレギュレートされるとわかった。約９４ヌクレオチド長に移動する発現に差のあるマウス遺伝子フラグメントは、マウスステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼの構成要素として決定的に同定された。競合ＰＣＲ法は、遺伝子評価の形成のために用いられた。マウスのステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ２の遺伝子フラグメントに対応する電気泳動図のピークは、遺伝子特異的プライマーがＰＣＲ増幅間でリンカー−アダプターにおいてプライマーと競合する場合に除去される。９４ヌクレオチド長のピークは、ＮＺＢ／ＢＩＮＪ肥満およびＳＭ／Ｊ痩せ型マウスの両方由来の試料において除去される。Ｂ／ＢＩＮＪ（肥満）対ＳＭ／Ｊ（痩せ型）脂肪細胞の遺伝子発現の差は＋１．９倍である。
【１０４５】
ヒトステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼの遺伝子フラグメントはまた、CuragenのGeneCalling［登録商標］差次的遺伝子発現法を用いて、途中まで分化した脂肪細胞と比べて分化した脂肪細胞において２〜４倍によりアップレギュレートされることがわかった。約４４３ヌクレオチド長に移動する発現に差のあるヒト遺伝子フラグメントは、ヒトステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼｃＤＮＡの構成要素として決定的に同定された。競合ＰＣＲ法は、遺伝子評価の形成のために用いられた。ヒトステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼの遺伝子フラグメントに対応する電気泳動図のピークは、遺伝子特異的プライマーがＰＣＲ増幅間でリンカー−アダプターにおいてプライマーと競合する場合、除去される。４４３ヌクレオチド長のピークは、ドナー２由来の完全に分化した脂肪細胞由来の試料において除去されている。分化した脂肪細胞対途中まで分化した脂肪細胞の遺伝子発現の差は３．９倍である。
【１０４６】
マウスステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ１の遺伝子フラグメントはまた、CuragenのGeneCalling［登録商標］差次的遺伝子発現法を用いて、正常体重（固形飼料）マウスと比べて肥満高インスリン性ｎｇｓｄ７マウスの褐色脂肪細胞組織において２倍によりダウンレギュレートされることがわかった。約９４ヌクレオチド長に移動する発現に差のあるマウス遺伝子フラグメントは、マウスステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ１ｃＤＮＡの構成要素として決定的に同定された。競合ＰＣＲ法は、遺伝子評価の形成のため用いられた。マウスステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ１の遺伝子フラグメントに対応する電気泳動図ピークは、遺伝子特異的プライマーがＰＣＲ増幅の間、リンカー−アダプターにおいてプライマーと競合する場合、除去される。９４ヌクレオチド長のピークは、肥満高インスリン性ｎｇｓｄ７マウス由来の試料において除去される。ｓｄ７−褐色脂肪細胞対固形飼料褐色脂肪細胞の遺伝子発現の差は２倍である。
【１０４７】
GeneCalling結果の概要；ステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼのアップレギュレートは、げっ歯類肥満の２遺伝子モデルである、食事誘導肥満モデルおよび分化脂肪細胞における肥満と関連する。
【１０４８】
生化学
ステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ（デルタ−９デサチュラーゼとしても知られている）は、Ｏ２および還元チトクロムｂ５由来の電子を利用して、パルミトイル−ＣｏＡおよびステアリン酸−ＣｏＡを含む脂肪アシルＣｏＡ基質のスペクトルへの二重結合の挿入を触媒する。イオンは反応の補酵素として働く：
ステアリン酸−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｏ２→オレオイル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＰ＋２Ｈ２Ｏ
【１０４９】
肥満および／または糖尿病の病因および原因に関連する経路
PathCallingスクリーニングは、ほとんど特徴のない一般的な転写因子であるＳＣＤとＣＲＥＢ３との間の相互作用を同定した。ＣＲＥＢ３がＨＣＦＣ１（宿主細胞因子Ｃ１）として知られるサイトゾルタンパク質と相互作用することは文献において示された。この相互作用は、ＣＲＥＢ３の核の翻訳を妨げ、それゆえ転写活性と干渉する。ＨＣＦＣ１と同様に、ＳＣＤは、細胞質においてこの転写因子をトラップすることによりＣＲＥＢ３を阻害し得る。この相互作用の有意性は明らかにされるべきままである。
【１０５０】
小分子薬および抗体療法の診断および／または標的としてヒトステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ遺伝子の使用の原理
以下は、科学文献において知見としても取り込まれる発見研究、追加調査およびアッセイからの発見の概要である。全体として、データは、ヒトステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼの阻害物質／拮抗物質が肥満および／または糖尿病の処置において有益であることを示す。
【１０５１】
ステアリン酸ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ）は、トリグリセリド分子として貯蔵される不飽和脂肪酸の合成において鍵となる酵素であり、かつトリグリセリド合成の誘導は、ＳＣＤ発現に高く依存する。我々のGeneCallin研究において、ＳＣＤ２は「悪い」（すなわち、内臓および肥満）脂肪においてアップレギュレートされることがわかった。加えて、ＳＣＤ１は、中程度の肥満マウスの白色脂肪細胞においてアップレギュレートされる一方で、極度に肥満のマウスの白色脂肪細胞においてダウンレギュレートされる。さらに、ＳＣＤ遺伝子の発現は、エネルギー利用対貯蔵のより高いレベルについて既知の褐色脂肪細胞組織の全ステージの肥満においてダウンレギュレートされる。ＳＣＤのダウンレギュレートが、褐色脂肪細胞においてそれ自体を明らかにする高脂肪食に応答する代償性メカニズムであり、従って保護的であり得る。
【１０５２】
ＳＣＤ１のマウス欠損は、肝臓において非常に低レベルのトリグリセリド合成を有し、そしてＶＬＤＬおよびＬＤＬ脂質タンパク質機能において低レベルのトリグリセリドにおいて示される（Miyazaki et al., 2000; Miyazaki et al., 2001）。やせていてかつ異化亢進を有するＳＣＤ１欠損マウスの他の報告がある（Cohen et al., 2002）。加えて、ＳＣＤ遺伝子の転写物は、脂肪細胞分化および脂質合成において決定的であると見られてきた転写因子である、ＳＲＥＢＰならびにＣ／ＥＢＰαにより制御される（Bene et al., 2001）。さらに、抗糖尿病性チアゾリジンジノンは、集団初期脂肪細胞においてＳＣＤ１をダウンレギュレートする（Kim et al., 2000）。
共に用いるので、これらの発見は、ＳＣＤを直接的に阻害するＳＣＤの拮抗物質が肥満の効果的な治療であり得ることを示す。
【１０５３】
Ｃ．ＮＯＶ２；ヒトアリル炭化水素受容体様タンパク質
以下のセクションは、ＮＯＶ２タンパク質をコード化するヒトアリル炭化水素受容体、およびそれらのいずれかの変異体を、肥満および／または糖尿病の診断マーカー、抗体療法の標的および小分子薬の標的として適当であるものとして同定するために用いられる研究デザインおよび技術を記載する。
【１０５４】
アリル炭化水素受容体（ＡＨＲ）は、リガンド依存性の転写因子である。２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）は、ＣＹＰ１ｂ１およびグルタチオンＳトランスフェラーゼを含む複数遺伝子の発現を開始する既知の活性型リガンドである。アシル炭化水素受容体は、核輸送体のＡＲＮＴと共にヘテロ２量体を形成して、核膜をクロスする活性化複合体を形成して、ＤＮＡに結合する。ＡＨＲの活性化の結果として、ＰＰＡＲ−γは、抑制されるようになり、かつＧＬＵＴ４発現は脂肪組織においてダウンレギュレートされる様になり得る。これらの働きは、インスリン耐性および肥満の発達において生物学的に重要なものである。
【１０５５】
アリル炭化水素受容体は、発達および解毒における機能を有する転写因子のＰＡＰ（Ｐｅｒ−Ａｈｒ−Ｓｉｍ）スーパーファミリーのメンバーである。ただ最近は、このファミリーのいずれかのメンバーは肥満および糖尿病と関連してきた。
【１０５６】
妊娠性糖尿病は、４％の妊婦で悪化しかつＩＩ型糖尿病の発達の予後因子である。加えて、妊娠性糖尿病を発症する女性の子孫は、肥満になるおよび糖尿病を発症することに対して増加したリスクがある。従って、妊娠性糖尿病および非糖尿病の代謝組織由来の遺伝子発現の差は、糖尿病の病態生理と関連する根底にある差を明らかにする。多くの女性がＣ−セクションにより出産するため、この患者群は、正常由来の外科的材料、食事のみにより処置された妊娠性糖尿病およびインスリンで処置された妊娠性糖尿病における遺伝子発現の変化を調べる機会を提供する。これらの患者は一般に、臨床的状態を混乱させるものに罹患していないし、および遺伝子発現に影響し得る薬にさらされていない。このＩＲＢ改善研究において、臨床的情報および試料は非緊急Ｃ−セクションにより出産した女性由来の半皮膚脂肪細胞、骨格筋、内臓脂肪（網）および平滑筋（子宮）から得られた。材料および臍帯血はまた遺伝子型解析のため得られた。肥満度指数はこの患者群において広範囲に及んだ。妊娠性糖尿病の診断基準に合うこれらの患者は、食事の改変および／またはインスリン療法のいずれかで処理された。
【１０５７】
一般に、Ma 2001 Curr Drug Metab.:14964; Safe 2001 Toxicol Lett. 120(13):17; Ema 2001 Seikagaku. 73(2):818; Delescluse et al. 2000 Toxicology. 153(13):7382; Gu et al 2000 Annu Rev Pharmacol Toxicol. 40:51961; Schwarz et al. 2000 Toxicol Lett. 112113:6977; Okino et al. 2000 Vitam Horm. 59:24164; Crews et al. 1999 Curr Opin Genet Dev. 9(5):5807; Safe et al. 1998 Toxicol Lett. 102103:3437; Gonzalez et al. 1998 Drug Metab Dispos. 26(12):11948; Lahvis et al., 1998 Biochem Pharmacol. 56(7):7817; Holder et al. 2000 Hum Mol Genet. 9(1):1018; Seidel et al, 2000 Toxicol.Sci. 55:107115;およびAllen et al. 2001 Drug Metab.Dispos. 29:10741079を参照されたい。
【１０５８】
臨床的群において肥満の主要な原因は、過剰カロリー摂取である。この食事誘導肥満（ＤＩＯ）と呼ばれるものは、４０％より多い脂肪成分の高脂肪食を与えられることにより動物モデルにおいて模倣される。ＤＩＯ研究を確立して、食事誘導肥満の発達および進行に帰する遺伝子発現の変化を同定した。加えて、研究デザインは、高脂肪食の作用に耐える個体の能力を導き、それにより肥満を予防する因子を同定するために探す。研究の試料群は、飼料を与えられた対照（以下）の＋１Ｓ．Ｄ、＋４Ｓ．Ｄ．および＋７Ｓ．Ｄ．体重であった。加えて、７Ｓ．Ｄ．マウスの生化学特性は、肥満および高血糖を示すマウスにもかかわらず正常糖血症を保持するマウスへのこられの動物の層別化を明らかにする。調べられた組織は、視床下部、脳幹、肝臓、腹膜後白色脂肪組織（ＷＡＴ）、精巣上体ＷＡＴ、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、腓腹筋（速筋骨格筋）およびヒラメ筋（遅筋骨格筋）を含む。これらの組織の差次的遺伝子発現特性は、肥満の治療標的として用いられ得る遺伝子および経路を明らかにする。
【１０５９】
ヒトアリル炭化水素受容体の遺伝子フラグメントは、CuraGenのGeneCalling［登録商標］差次的遺伝子発現法を用いて、正常妊娠メスと比べて、ヒトの妊娠性糖尿病の脂肪組織において１．９倍によりアップレギュレートされることがまずわかった。約１３１ヌクレオチド長に移動する発現に差のあるヒト遺伝子フラグメントは、ヒトアリル炭化水素受容体ｃＤＮＡの構成要素として決定的に同定された。競合ＰＣＲ法は、遺伝子評価の形成のために用いられた。ヒトアリル炭化水素受容体の遺伝子フラグメントに対応するクロマトグラフィーのピークは、遺伝子特異的プライマーがＰＣＲ増幅の間、リンカー−アダプターにおいてプライマーと競合する場合、除去される。１３１ヌクレオチド長のピークは、妊娠性糖尿病および正常患者両方由来の試料において除去される。
【１０６０】
加えて、ＡＨＲおよび２つのＡＨＲ結合タンパク質のマウスオルソログに対応する遺伝子フラグメント、ＡＲＮＴ（ＡＨＲ核の輸送体）およびＡＩＰ（ＡＨＲ相互作用タンパク質）は、食事誘導肥満のマウスモデルでの変化した発現を有することがわかった。動物モデルのこれらの遺伝子の変化した発現は、肥満および／または糖尿病の病態におけるアリル炭化水素受容体の役割をサポートする。
【１０６１】
肥満および／または糖尿病に関連する経路
ヒトアリル炭化水素受容体の発現での変化および肥満および／または糖尿病の病因および原因において関連する遺伝子産物機能は、文献において報告されたものと組み合わせたこれらの発見研究の特徴的知見に基づく。ヒトアリル炭化水素受容体の働きを阻害することの結果は、肥満および／または糖尿病の主要な問題であるインスリン耐性の減少である。
【１０６２】
妊娠性糖尿病において、アリル炭化水素受容体を含む多型複合体、ＨＳＰ９０のようなヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）、およびＡＨＲ相互作用タンパク質（ＡＩＰ）がアップレギュレートされる。アリル炭化水素受容体およびＡＩＰは、核に転座しそしてＡＲＮＴと相互作用する。この複合体は、インスリン耐性の結果として生じるＧＬＵＴ４およびＰＰＡＲγを阻害する因子の増加した遺伝子発現を引き起こす。
【１０６３】
小分子薬および抗体療法の診断および／または標的としての使用の原理
以下は、科学文献の知識も取り込む発見研究、追加調査およびアッセイ由来の知見の要約である。全体として、データは、ヒトアリル炭化水素受容体の阻害物質／拮抗物質が肥満および／または糖尿病の処置において有益であることを示す：
ａ）アリル炭化水素は、妊娠性糖尿病由来の半−皮膚脂肪細胞において１．９倍アップレギュレートされた。ＡＨＲの作用物質である、ＴＣＤＤは、ＰＰＡＲ−γを抑制する。逆に、ＴＺＤはＰＰＡＲ−γを活性化する。
ｂ）ＡＨＲの活性化は、脂肪細胞におけるＧＬＵＴ４の発現を減少する。
ｃ）臨床的上昇は、代償性応答を表し得る。
ｄ）解毒遺伝子（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、またはＣＹＰ１Ｂ）の調節不全はない。
ｅ）肥満、高血糖マウス肝臓および脂肪においてアップレギュレートされる。ＡＨＲの核輸送体（ＡＲＮＴ）およびＡＨＲ相互作用タンパク質（ＡＩＰ）はまた、アップレギュレートされる。
【１０６４】
実施例Ｆ．ＮＯＶ３５ｂ（ＣＧ５９４８２−０２）トリプシノーゲンでのアラインメント
表Ｆ１は、トリプシノーゲン（ＴＲＹ１_ヒト）でのＣＧ５９４８２−０２スプライスバリアントのClustWアラインメントを示す。シグナル配列は、１〜１５から伸長されて、プロペプチド配列は、配列番号：３４１の１６〜２３（矢印により示す）から伸長される。これらの２つの配列フラグメントは、成熟タンパク質から正常に切断される。触媒性３連構造を形成する残基は、配列の真下の「♯」により示される。
【１０６５】
【表５０６】
2005515758.tif 000508
【１０６６】
結晶データをまた示す。
図１は、２．２Å分解のトリプシン１のX線構造を示す（Gaboriaud, C. et. al, Jol. Mol. Biol., 1996, 259:9951010)(PDBは1TRNをコードする）。ＣＧ５９４８２−０２スプライスバリアントに存在しない配列は、小さな矢印で示される。図１の図は、活性部位（長い矢印により示す）中のジイソプロピル−ホスホフルオリダート（diisopropylphosphofluoridate）阻害物質で外側に向く活性部位を示す。
図２は、活性部位（矢印によりしめされる）の触媒作用の３連構造を形成する３残基を示す。
【１０６７】
図３は、触媒作用三連構造のメカニズム案を表す。セリンヒドロキシル基のｐＫａは普通は質の悪い求核試薬とする約１３である。アスパラギン酸塩、ヒスチジンおよびセリンが、側鎖をより反応性にする、このｐＫａを低くすることを助ける水素結合の電荷リレー系で準備される。アスパラギン酸塩上のカルボキシ側鎖はヒスチジン由来のタンパク質をひきつけ、そして逆に、それが反応し次にポリペプチド基質を切断することを可能とするセリン水酸化物由来タンパク質を抽出する。
【１０６８】
ＣＧ５９４８２−０２スプライスバリアントは、Ａｓｐ１０７およびＨｉｓ６３を失っており、結果として生じるタンパク質は触媒性３連構造を形成できず、そしてそれゆえ酵素的に不活性である。小タンパク質分解酵素の阻害物質が結合部位において示されるので、配列欠損への作用が基質結合上あることはこの構造から明らかではない。しかしながら、ある実施態様において、ポリペプチドはずっと大きくかつＣＧ５９７８２−０２の欠損部分と特異的に相互作用する（タンパク質が類似の構造へと折りたたまれると推定する）。
【１０６９】
その他の実施形態
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは単に説明目的のための例としてなされたものであり、以下に添付の特許請求の範囲について限定しようとするものではない。特に、特許請求の範囲で定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明に種々の置換、変更、および改変がなされ得ることを発明者らは考慮している。核酸出発物質、注目するクローン、またはライブラリーの種類の選択は、本明細書に記載の実施形態の知識を有する当業者であれば慣例の問題であると考えられる。その他の態様、利点、および改変は以下の特許請求の範囲内にあると考えられる。示した特許請求の範囲は本明細書で開示される発明を代表するものである。別の特許請求されていない発明も考慮される。出願人らは後の特許請求の範囲においてかかる発明を追求する権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【１０７０】
【図１】図１は、２．２Å分解のトリプシン１のX線構造を示す。
【図２】図２は、活性部位（矢印によりしめされる）の触媒作用の３連構造を形成する３残基を示す。
【図３】図３は、触媒作用３連構造のメカニズム案を表す。
【図１】
2005515758.tif 000509
【図２】
2005515758.tif 000510
【図３】
2005515758.tif 000511
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月11日(2004.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005515758000001.app