(57)【要約】本発明は薬剤のデリバリーシステムに関する。このデリバリーシステムは、その内部区画内に送達されるべき薬剤を含むとともにその外部表面に結合する細胞接着分子ＮＣＡＭを有するリポソームを包含する。好ましい実施態様は、前記薬剤がＤＮＡまたは、好ましくは遺伝子の発現構成に操作可能に結合したｃＤＮＡである場合である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その内部区画中に薬剤を含むとともにその外部表面に結合された細胞接着分子ＮＣＡＭを有するリポソームもしくはその断片を包含するシステムからなる薬剤のデリバリーシステム。
【請求項２】
前記ＮＣＡＭの断片がＩＧループ領域I、IIおよびIIIを含む請求項１に記載のデリバリーシステム。
【請求項３】
前記細胞接着分子が経膜領域分子もしくは疎水性アンカー分子を介して前記リポソームの前記外部表面に結合されてなる、請求項１または２に記載のデリバリーシステム。
【請求項４】
前記薬剤がＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗新生物剤、ホルモン、ビタミン、酵素、抗ウイルス剤、抗生物質、抗炎症剤、抗プロトゾア剤、放射性化合物、抗体、プロドラッグおよびそれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記請求項各項のいずれかに記載のデリバリーシステム。
【請求項５】
前記薬剤がＤＮＡ、好ましくは遺伝子の発現構成に操作可能に結合されたｃＤＮＡである請求項４に記載のデリバリーシステム。
【請求項６】
前記ｃＤＮＡが機能性蛋白をエンコードする請求項５に記載のデリバリーシステム。
【請求項７】
前記機能性蛋白がヒトジストロフィン蛋白である請求項６に記載のデリバリーシステム。
【請求項８】
前記デリバリーシステム中にＤＮＡコンパクト化剤を含む請求項５ないし６のいずれかのデリバリーシステム。
【請求項９】
前記ＤＮＡコンパクト化剤が可逆的に架橋できるカチオンである請求項８に記載のデリバリーシステム。
【請求項１０】
前記可逆的な架橋がイオウ架橋である請求項９に記載のデリバリーシステム。
【請求項１１】
前記デリバリーシステムがエンドソームバリアーを破るための化学的封入物および／または生物学的封入物を含む請求項５〜１０のいずれかに記載のデリバリーシステム。
【請求項１２】
前記デリバリーシステムが核局在性シグナルを、好ましくはＰＮＡに結合されたペプチドまたはＰＮＡに結合されたリガンドの形で含む請求項５〜１１のいずれかに記載のデリバリーシステム。
【請求項１３】
前記デリバリーシステムが抗アポプトーシス活性を含む請求項５〜１２のいずれかに記載のデリバリーシステム。
【請求項１４】
前記抗アポプトーシス活性がＢｃｌ−２、Ｂａｘを指向する低分子干渉性ＲＮＡ、カスパーゼ阻害剤配列を含むペプチド、好ましくはＢｃｌＸＬからなる群から選ばれる、請求項１３に記載のデリバリーシステム。
【請求項１５】
前記デリバリーシステムがＤＮＡインテグラーゼ活性もしくは該ＤＮＡインテグラーゼ活性をエンコードする分子を含む請求項４ないし１４のいずれかに記載のデリバリーシステム。
【請求項１６】
前記インテグラーゼがファイＣ３１バクテリオファージのインテグラーゼである請求項１５に記載のデリバリーシステム。
【請求項１７】
請求項１ないし１６のいずれかに記載のデリバリーシステムを包含する薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願においては２００２年7月１０日出願のヨーロッパ特許出願02 014 991.0を優先権として主張するが、その全内容を引用により本願に組み入れるものとする。
本発明は薬剤のデリバリーシステムに関するものである。該デリバリーシステムにはリポソームが含まれ、それにはまたその内部区画に送達されるべき薬剤が含まれるとともに、外部表面に結合された細胞接着分子NCAMまたはその断片が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは細胞の中へ各種の材料、たとえば、治療薬、DNAなどを送達するために広く利用されている。カプセル化された材料を特定タイプの細胞に的中させることを目的として、リポソームをさまざまに修飾する方法が開発されてきた。その１つの方法として、標的細胞上で細胞表面分子ICAM-1(細胞間接着分子―１)を結合する接着性ペプチドをリポソームの表面に結合させることが行われた(Jaafari MR, Foldvari M, J. Pharm. Sci. 91(2):396-404, 2002)。もう１つの方法として、モノクローナル抗体を利用してカチオン性のリポソームをインビトロで特定の腫瘍細胞に的中させることが行われた（Kao GY, 他 Cancer Gene Ther. 3(4): 250-6、1996)。
【０００３】
これまでに知られているリポソーム系薬剤デリバリーシステムの主な欠点は薬剤を効果的に細胞中へ送達できないことである。したがって、それとは別のリポソーム系薬剤デリバリーシステムが必要となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明の１つの目的は、細胞間での薬剤送達のためのシステムを提供することであって、該システムにはリポソームが包含され、それらの内部区画の中に薬剤が含まれるとともに、それらの外部表面に結合した形で細胞接着分子NCAM（神経細胞接着性分子）またはその断片が包含されるものとする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の好ましい態様の１つは前記したNCAMの断片がIG(免疫グロブリン)のループ領域I、IIおよびIIIを包含する場合である。
本発明の好ましい態様の１つは、前記した細胞接着分子が前記リポソームの外部表面に経膜領域分子またはGPIアンカーのような疎水性アンカー分子を介して結合されている場合であり、それらは細胞接着蛋白を、もしくは細胞接着分子のイソプレニル化によって細胞接着蛋白をリピド2重層に、つなぎ止められるようにする。
【０００６】
リポソームの産生方法は当業者にはよく知られており、たとえば「リポソームの実際的アプローチ」(Liposomes a practical approach, RRC New Editor. IRL press at oxford university press. 1990)に記載されている。
【０００７】
ここで使用される「細胞接着分子」の用語には少なくとも自然原料から分離された細胞接着分子、組換え技術で得られた細胞接着分子およびインビトロのペプチド合成によって得られた細胞接着分子ならびにそれらの断片が包含される。
ここで使用される「薬剤」なる用語には生体システムにおいて効果を発揮するあらゆる種類の化学的化合物が包含される。
本発明において用いるのに好適とされる薬剤は、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗新生物剤、ホルモン類、ビタミン類、酵素、抗ウイルス剤、抗生物質、抗炎症剤、抗原生動物剤、抗リウマチ剤、放射性化合物、抗体、プロドラッグならびにそれらの組み合わせからなる群から選ばれる分子である。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様においては、前記薬剤はDNA、特には遺伝子の発現構成に操作可能に組み込まれることによって前記発現が可能になるｃDNAであり、より好ましくは機能性蛋白をエンコードするｃDNAである。代表的には、発現構成にはホスト細胞における発現を達成するのに必要とされる調節配列が包含されており、それは場合によってはエピソーム状態で存在するために要求されるプラスミドの複製に必要な配列を含むか、もしくは染色体への組み込み用にデザインされたものである。ここで用いる「調節配列」の用語には発現構成にもとづいて発現されるべき本来の調節配列と非相同調節配列の両者が含まれる。そのような発現構成を組み立てることは当業者にはよく知られており、たとえば、サムブルク他、「分子クローニング:実験室マニュアル」(Molecular Cloning、A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)に記載されている。
【０００９】
前記した発現構成が染色体への組み込みを意図するものであれば、ホストゲノムへの組み込みは、たとえばスリーピングビューティのような一過性に発現されたトランスポゼースによって認識できる発現構成にシスエレメントを含めて達成されることが好ましい。該トランスポゼースは前駆体ｍRNAをデリバリーシステムの中へ含めることによって一時的に発現させることができる。前記した、染色体への組み込みのための発現構成は、ランダムな組み込みに引き続く転写段階でのサイレンシングを防止するシスエレメントを包含することが好ましい。
【００１０】
きわめて好ましいとされる実施態様は前記ＤＮＡ構成がホスト細胞のゲノムへの選択的な組み込みができるようにデザインされている場合である。この目的のためには、ファイバクテリオファージＣ３１のインテグラーゼを用いるのが好ましい（Ortiz-Urda S.ほかNat Med 2002,8(10):1166-70）。ファイバクテリオファージＣ３１のインテグラーゼを使用すると、ＤＮＡ構成にＡｔｔＢ配列が含まれることになり、それがＣ３１インテグラーゼによって認識される。このインテグラーゼは、たとえば、本発明のデリバリーシステムによってホスト細胞中に送達されるアデノウイルス発現ベクターからホスト細胞中で発現させることができる。本発明のデリバリーシステムにＣ３１インテグラーゼをコードする、インビトロで産生されたｍＲＮＡを含めることもまた可能である。Ｃ３１インテグラーゼが組換アデノウイルスを介して、もしくはｍＲＮＡを介してホスト細胞中で一過性に発現することは、そのようなＤＮＡ再配列酵素の長期間発現そのものが遺伝子毒になり得るので避けるべきであるという考え方に関係がある。
【００１１】
もう１つの好ましい実施態様は前記したＤＮＡ構成にさらにマトリックス接着サイトのような遺伝子座制御要素（ＬＣＲ）が含まれている場合である。
本発明のきわめて好ましいとされる実施態様は前記ＤＮＡがヒトジストロフィン蛋白をエンコードする場合である。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様の１つは、薬剤としてＤＮＡを含む前記デリバリーシステムに、たとえば、カチオン性ペプチドのようなＤＮＡコンパクト化剤がさらに含まれている場合である。前記ＤＮＡコンパクト化剤はリポソーム粒子のサイズを減少させるものである。好ましいＤＮＡコンパクト化剤は、粒子が形成された後で架橋できる可逆的架橋が可能なカチオンである。特に好ましい架橋はイオウ架橋である。
【００１３】
本発明のもう１つの好ましい実施態様は、薬剤としてＤＮＡを包含する前記デリバリーシステムが、さらにたとえば2級および3級アミンのような化学封入物および／または、たとえばアデノ繊維のような生物学的封入物を包含していて細胞内エンドソームバリアーが破れる場合である。
【００１４】
薬剤としてＤＮＡを含む前記デリバリーシステムには核局在性信号が含まれていることが好ましく、特に好ましいのは前記核局在性信号がＰＮＡに結合されたペプチドおよび／またはＰＮＡに結合されたリガンドである場合である。前記した、ＰＮＡに結合されたペプチドまたはＰＮＡに結合されたリガンドは核―細胞質シャトルによって拾い上げられてＤＮＡの核送達を可能にする。
【００１５】
本発明のもう１つの好ましい実施態様は前記した、薬剤としてＤＮＡを含むデリバリーシステムがさらに抗アポプトーシス活性を含む場合である。抗アポプトーシス活性として好ましいのは、Bcl-２、Ｂａｘを指向する低分子干渉ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）およびカスパーゼ阻害配列を包含するペプチドからなる群から選ばれたものである。本発明のデリバリーシステムで使用するのに好ましい抗アポプトーシス活性はBcl-ＸＬである。本発明のデリバリーシステムには前記の抗アポプトーシス活性が1種類だけ含まれていてもよければ、それらの混合物が含まれていてもよい。前記した活性は、せっかく移入できた細胞がアポプトーシスのために失われないようにするために本発明のデリバリーシステムに包含させるものである。抗アポプトーシス活性は本発明のデリバリーシステム中にアデノウイルス発現ベクターの形で存在してもよければインビトロで産生されたｍＲＮＡの形で存在してもよい。
【００１６】
本発明のＤＮＡ用デリバリーシステムは以上の実施態様に開示された構造要素のいかなる組み合わせを包含していてもよいことを理解しなければならない。
本発明のもう１つの目的は、本発明のデリバリーシステムを包含してなる薬剤組成物にある。
【００１７】
本発明のデリバリーシステムおよび薬剤組成物は、たとえば、遺伝病、ガンのような種種のヒトの病気の処置や遺伝子治療のための好適な道具となり得る。機能性ジストロフィン蛋白をエンコードするＤＮＡを薬剤として含む本発明のデリバリーシステムはデユシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のための有力な道具である。本発明のデリバリーシステムに包含される細胞接着分子によっては、人体または動物体の特定の細胞および／または組織をある薬剤の標的とすることもできる。本発明のデリバリーシステムはまた、インビトロの状態で細胞に薬剤を導入するのにも使用できる。
【００１８】
本発明のデリバリーシステムまたは薬剤組成物は大量一時の、またはある期間内にわたる連続静脈点滴、筋肉内、皮下、関節内、滑膜内、髄膜内、経口、あるいは吸入などの経路で投与することができる。このような薬剤組成物には本質的に無毒で治療効果のない、薬学的に許容できるキャリアーが含まれていてもよい。そのようなキャリアーの例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清蛋白、リン酸塩やグリシンなどの緩衝剤、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物油脂肪酸混合物の部分グリセリド、水、硫酸プロタミンなどの塩類または電解質、塩化ナトリウム、金属塩類、コロイダルシリカ、トリケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースポリマー類およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【実施例】
【００１９】
次に、本発明を実施例によりさらに説明する。
実施例１
その膜内に組み込まれた、細胞接着分子を有するリポソームの調製
使い捨てガラス管の中で0.5 μモルのジオレオイルフォスファチジルコリンを窒素雰囲気下で乾燥する。デシケーターを排気して30分間真空に保持する。必要量の緩衝剤／dH2Oを加えてから、ガラス管の側壁からリピドをこすり落とす。使用したリピドに対して1 μg／μlの蛋白を加える。30秒間、渦巻き状に振りり混ぜる。水浴超音波装置内で７度、１５秒間の超音波処理を2回行う。
【００２０】
この操作によって、多層液胞体が得られるが、このものは超音波処理時間を長くすると小さい単層液胞体(SUV)になる。大きい単層液胞体を得るには押し出し機を使用する。
【００２１】
実施例２
リピド標識蛋白の発現およびそのリピド標識蛋白を組み込んだリポソームの調製
ＨＢ１０１株の大腸菌をプラスミドで形質転換させ、ＬＢ培地中、３７℃でアンピシリンを用いて培養した。プラスミドは標識された蛋白を純化すべくヘキサヒスチジニル末端をエンコードする。シグナルペプチドおよび大腸菌の主要リポ蛋白のＮ−末端アミノ酸残基（ｌｐｐ）をエンコードするＤＮＡ配列はその蛋白をエンコードするＤＮＡに結合されていた。生成する蛋白のＮ−末端システイン残基は細菌膜中のリピドと酵素的に結合されている。ＩＰＴＧによる誘導後、細胞を３０℃でさらに１２時間培養し、遠心分離によって収得した。１リットルの培地から得た細胞を５０ｍｌの溶解緩衝液に懸濁させ、超音波処理によって溶解させた。細胞の外被膜を超遠心分離（１５００００Ｇ，１時間、４℃）によって集め、ペレットを１％（ｗ/ｖ）のトリトンＸ−１００を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.４）に懸濁させた。試料をＮｉ2+カラムに適用してヘキサヒスチジニル末端部分を有するリピド標識蛋白を精製した。
【００２２】
１０ミリグラムのフォスファチジルコリンを試験管内で１ｍｌのクロロホルムに溶解した。窒素気流下で充分に乾燥させてから、１ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７.４）に懸濁させ１０分間の超音波処理を行った。３００００Ｇで２０分間の遠心分離を行って最終的に得られたリポソームのペレットを１ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁させた。ついで、精製されたリピド標識蛋白の溶液を、収得されたリポソームに４℃で攪拌しながら添加した。
【００２３】
本発明の、さしあたり好ましいとされる実施態様を記載したが、本発明はそれらに限定されるものではなく、下記の特許請求の範囲の要旨内で、さまざまに異なった態様で実施してもよいことははっきりと理解すべきである。
【国際調査報告】
2005535666.tif 000002
2005535666.tif 000003
2005535666.tif 000004