(57)【要約】生物学的試料からＤＮＡを単離するための改良法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料からＤＮＡを単離する方法であって、以下の一連の工程：
（ａ）  生物学的試料の残留物からＤＮＡを含んでなる生物学的材料を分離し、
（ｂ）  工程（ａ）のＤＮＡを含んでなる分離した前記生物学的材料と、高張高塩試薬とを接触させ、ＤＮＡを含む前記生物学的材料の懸濁液を形成させ、
（ｃ）  工程（ｂ）の前記懸濁液と、リーシス試薬とを接触させ、前記生物学的材料から放出されたＤＮＡおよび非ＤＮＡ生物学的成分を含んでなる溶解産物を形成し、
（ｄ）  工程（ｃ）の前記溶解産物中の非ＤＮＡ生物学的成分からＤＮＡを物理的に分離して、単離したＤＮＡを得ること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
ＤＮＡを含んでなる生物学的材料を含んでなる生物学的試料からＤＮＡを単離する方法であって、以下の一連の工程：
（ａ）  ＤＮＡを含んでなる生物学的材料と高張高塩試薬とを接触させ、ＤＮＡを含んでなる生物学的材料の懸濁液を形成し、
（ｂ）  工程（ｂ）の懸濁液と、リーシス試薬とを接触させ、生物学的材料から放出されたＤＮＡおよび非ＤＮＡ生物学的成分を含んでなる溶解産物を形成し、かつ、
（ｃ）  工程（ｃ）の溶解産物中の非ＤＮＡ生物学的成分からＤＮＡを物理的に分離して、単離したＤＮＡを得ること
を含んでなる、方法。
【請求項３】
前記生物学的試料が、植物組織、動物組織、培養した植物細胞、培養した動物細胞、血液細胞、および体液からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料がウイルスである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料が骨髄試料である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料が全血（whole blood）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記非ＤＮＡ生物学的成分が、タンパク質、脂質、ＲＮＡ、および炭水化物からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記高張高塩試薬がＰｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）タンパク質沈澱溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記高張高塩試薬が溶解産物からタンパク質を沈澱させるのに有効な量の塩を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記塩が、可溶性ナトリウム、アンモニウム、またはカリウム塩からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記塩の濃度が約１Ｍを上回る、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩の濃度が約２Ｍを上回る、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記リーシス試薬が界面活性剤を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記リーシス試薬がアニオン性界面活性剤を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸のナトリウム、カリウム、およびリチウム塩からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アニオン性界面活性剤の濃度が約０．１％（重量／容量）を上回る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記リーシス試薬がＲＮアーゼ溶液をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記リーシス試薬がＰｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）細胞リーシス溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡを溶解産物から物理的に分離する工程が、追加試薬を用いることなく溶解産物から非ＤＮＡ生物学的成分を物理的に沈澱させ、非ＤＮＡ沈澱、およびＤＮＡを含む溶液を得ることをさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
溶解産物からＤＮＡを物理的に分離する工程が、溶解産物を遠心分離することをさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡを含む溶液とアルコールとを接触させ、単離したＤＮＡを含んでなる沈澱を得ることをさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
単離したＤＮＡと洗浄溶液とを接触させることをさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
単離したＤＮＡを水和試薬で処理する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
細胞を含んでなる生物学的試料からＤＮＡを単離する方法であって、以下の一連の工程：
（ａ）  生物学的試料の残りからＤＮＡを含んでなる細胞を分離し、
（ｂ）  工程（ａ）のＤＮＡを含んでなる分離した細胞と、高張高塩試薬とを接触させ、前記生物学的細胞の懸濁液を形成させ、
（ｃ）  工程（ｂ）の懸濁液とリーシス試薬とを接触させ、生物学的材料のＤＮＡおよび非ＤＮＡ生物学的成分を含んでなる溶解産物を形成させ、
（ｄ）  工程（ｃ）の溶解産物の非ＤＮＡ生物学的成分からＤＮＡを物理的に分離し、単離したＤＮＡを得ること
を含んでなる、方法。
【請求項２５】
前記生物学的試料が植物組織、動物組織、培養した植物細胞、培養した動物細胞、血液細胞、および体液からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物学的試料が骨髄試料である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的試料が全血である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記非ＤＮＡ生物学的成分が、タンパク質、脂質、ＲＮＡ、および炭水化物からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記高張高塩試薬がＰｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）タンパク質沈澱溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記高張高塩試薬が溶解産物からタンパク質を沈澱させるのに有効な量の塩を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記塩が可溶性ナトリウム、アンモニウム、またはカリウム塩からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記塩の濃度が約１Ｍを上回る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記塩の濃度が約２Ｍを上回る、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記リーシス試薬が界面活性剤を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記リーシス試薬がアニオン性界面活性剤を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸のナトリウム、カリウム、およびリチウム塩からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アニオン性界面活性剤の濃度が約０．１％（重量／容積）を上回る、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記リーシス試薬が更にＲＮアーゼ溶液を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
前記リーシス試薬がＰｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）細胞リーシス溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
溶解産物からＤＮＡを物理的に分離する工程が、追加試薬を用いることなく溶解産物から非ＤＮＡ生物学的成分を物理的に沈澱させ、非ＤＮＡ沈澱、およびＤＮＡを含む溶液を得ることをさらに含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項４１】
溶解産物からＤＮＡを物理的に分離する工程が、溶解産物を遠心分離することをさらに含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＤＮＡを含む溶液とアルコールとを接触させ、単離したＤＮＡを含んでなる沈澱を得ることをさらに含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
単離したＤＮＡと洗浄溶液とを接触させることをさらに含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
単離したＤＮＡを水和試薬で処理する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
赤血球および白血球を含んでなる全血試料からＤＮＡを単離する方法であって、以下の一連の工程：
（ａ）  生物学的試料と赤血球リーシス試薬とを接触させ、赤血球をリーシスし、
（ｂ）  白血球をリーシスした赤血球から分離し、
（ｃ）  前記白血球と高張高塩試薬とを接触させ、前記白血球を前記高張高塩試薬の溶液に懸濁し、次いで
（ｄ）  工程（ｃ）の白血球とリーシス試薬とを接触させ、ＤＮＡおよび非ＤＮＡ細胞材料を含む溶解産物を形成させ、
（ｅ）  ＤＮＡを溶解産物の非ＤＮＡ細胞材料から物理的に分離し、単離したＤＮＡを得ること
を含んでなる、方法。
【請求項４６】
前記生物学的試料が血球および体液からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物学的試料が骨髄試料である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記生物学的試料が全血である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記非ＤＮＡ生物学的成分がタンパク質、脂質、ＲＮＡ、および炭水化物からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記高張高塩試薬がＰｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）タンパク質沈殿溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記高張高塩試薬が、溶解産物からタンパク質を沈澱させるのに有効な量の塩を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記塩が可溶性のナトリウム、アンモニウム、またはカリウム塩からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記塩の濃度が約１Ｍを上回る、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記塩の濃度が約２Ｍを上回る、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記リーシス試薬が界面活性剤を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
前記リーシス試薬がアニオン性界面活性剤を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
前記アニオン性界面活性剤がドデシル硫酸のナトリウム、カリウム、およびリチウム塩からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記アニオン性界面活性剤の濃度が約０．１％（重量／容積）を上回る、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記リーシス試薬がＲＮアーゼ溶液をさらに含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
前記リーシス試薬がＰｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）細胞リーシス溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis）である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
溶解産物からＤＮＡを物理的に分離する工程が、追加試薬を用いることなく溶解産物から非ＤＮＡ生物学的成分を物理的に沈澱させ、非ＤＮＡ沈澱、およびＤＮＡを含む溶液を得ることをさらに含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
溶解産物からＤＮＡを物理的に分離する工程が、溶解産物を遠心分離することをさらに含んでなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＤＮＡを含む溶液とアルコールとを接触させ、単離したＤＮＡを含んでなる沈澱を得ることをさらに含んでなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
単離したＤＮＡと洗浄溶液とを接触させることをさらに含んでなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
単離したＤＮＡを水和試薬で処理する、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
医科学が進歩し続けるに伴い、単離ＤＮＡの使用およびより多量の単離ＤＮＡへの希求が、多数の様々なその単離方法を生んできた。単離したＤＮＡは、遺伝子発見、疾病診断法、薬剤発見、法医化学、および他の研究などの多くの用途、およびハイブリダイゼーション、増幅などの技術を用いる組換えＤＮＡ研究、クローニング、シークエンシングなどの臨床上の用途に用いられている。典型的には、ＤＮＡは、（１）細胞をリーシスして（lyse）タンパク質、脂質、ＲＮＡおよびＤＮＡを含むその内容物を放出させ、（２）リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）を所望により添加してＲＮＡを除去し、（３）タンパク質のような非ＤＮＡ混入物を除去して純粋なＤＮＡを得る、という三つの連続した工程により細胞から単離される。
【０００２】
核酸を血液、培養細胞、組織または体液のような生物学的試料から単離する方法は、典型的には生物学的試料を直接界面活性剤含有リーシス溶液またはカオトロピック含有リーシス溶液に時にはまた粒状固相（例えば、ＷＯ９６／１８７３１号明細書（Deggerdahl et al.）、米国特許第５，２３４，８０９号明細書（Boom et al.））の存在下にて加えることによって開始される。あるいは、細胞を最初に遠心分離によって濃縮した後、懸濁溶液に懸濁することができる。固く結びついた細胞を均一に懸濁すると、界面活性剤および／または細胞膜および構造を崩壊させるカオトロピック試薬と一層均一に接触することによって核酸の単離が向上する。典型的な懸濁溶液は、哺乳類血液の赤血球のリーシスの前処理工程により用いられるような低張性溶液（米国特許第５，７７７，０９８号明細書（Gray）、米国特許第５，９７３，１３７号明細書（Heath et al.））、またはリン酸緩衝食塩水（例えば、ＷＯ９６／１８７３１号明細書（Deggerdahl et al.））、グルコース（ＷＯ９７／１０３３１号明細書（Gonzales））またはソルビトール（米国特許第５，９７３，１３７号明細書（Heath et al.））などの等張溶液である。
【０００３】
数種類のリーシス試薬が、細胞のリーシスのために処方されている。溶解産物は、細胞またはウイルスを含んでなる生物学的試料とリーシス試薬とを混合することによって、組織試料をリーシス試薬の存在下乳棒を用いて粉砕してリーシス試薬の細胞中への浸透を促進することによって、または組織試料を機械的または他の手段によって（例えば、音波処理を用いて）解離させることによって生成される。リーシス試薬は、典型的には細胞膜を崩壊させ且つタンパク質および脂質を可溶化する目的で界面活性剤を含む。リーシス試薬処方物に用いられるほとんどの一般的界面活性剤は、Sambrook et al. （「分子クローニング：実験室便覧（Molecular Cloning : A Laboratory Manual）」，第２版， 7.3-7.24, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)）およびAusubel et al. （「分子生物学の最新のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」， 4.0-4-4.5.3 and 13.12.1-13.12.3, John Wiley & Sons, New York (1989)）に記載されているアニオン性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびＮ−ラウロイルサルコシンである。非イオン性およびカチオン性界面活性剤も、この目的のためにそれぞれFavaloro et al. （Methods Enzymol, 65, 718-749(1980)）および米国特許第５，０１０，１８３（MacFarlane）によって記載されている。
【０００４】
リーシスの後、ＤＮＡは、一般にＲＮＡ、脂質およびタンパク質のような非ＤＮＡ細胞材料を含む複雑な溶解産物から分離することによって精製される。溶解産物を、一般に有機溶媒、典型的にはフェノールおよび／またはクロロホルムと混合する。フェノールはタンパク質を変性させるだけでなく、遠心分離の後にタンパク質を有機層と水層との間の界面に集め、クロロホルムは有機相と水相の分離を促進する。しかしながら、このような試薬は、典型的には酸化により保存中に不安定となる。さらに、これらの試薬は有害な化学物質である。このような試薬の毒性は、それらのＬＤ５０値によって表される。ＬＤ５０値が低くなればなるほど、この化合物は有害である。一般に、リーシスおよび／または精製溶液はクロロホルムを含んでおり、これは毒性が高く、既知の発癌性物質であり、ＬＤ５０は９０８ｍｇ／ｋｇ（ラット、経口投与）である。フェノールも同様に毒性が高く、ＬＤ５０は３１７ｍｇ／ｋｇ（マウス、経口投与）である。フェノールやクロロホルムの代わりに用いるベンジルアルコールのような余り有害でない化合物を用いるＤＮＡ単離の方法は、米国特許第５，３９３，６７２号明細書（Ness et al.）に開示されている。しかしながら、ベンジルアルコールの毒性は低いにも拘わらず、これもラットの経口投与ではＬＤ５０が１２３０ｍｇ／ｋｇであり尚有害であると分類されている。さらに、毒性が低い有機溶媒であっても、特殊な取扱いと廃棄が必要である。
【０００５】
従来のＤＮＡ単離法のさらにもう一つの重要な問題点は、手間と時間がかかることである。生物学的試料からのＤＮＡの単離は手間がかかりかつ継続的に手間がかかり、つまり時間がかかりかつ専門技術者の時間の大半を占める反復作業を必要とし、他の作業が除外されることが多かった。現在、ＤＮＡの単離の手作業による方法は、最大２４時間の時間集約的作業が必要である。インキュベーション時間を除き、専門技術者は単離工程において通常約２０の仕事を行うことを要求されることがある。ＤＮＡ単離は反復的とはいえ繊細な工程であり、精確さと細部への注意を必要とし、相対意味の成功および／またはその収率は、単離に関わる専門技術者の技術に依存することが多い。精確な工程の反復的操作は、試料から単離したＤＮＡの品質および／または量に悪影響を及ぼしたり試料を汚染することがある誤りを招きやすい。さらに、ＤＮＡの単離に必要な一般に多数の工程は、汚染や試料の交差汚染の危険性を増加させる。特有のまたは限定された試料の場合において、反復することができない、または取り替えが利かない試料を扱うときに、このような誤差が起こるかもしれない。
【０００６】
有害な毒性試薬を用いず、かつ従来の方法より工程数が少ない、生物学的試料からＤＮＡを単離する方法が求められている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＤＮＡを単離する改良法を提供することによって、従来技術の問題点を解決する。第一に、本発明は、標準的ＤＮＡ精製法において見られる方法の工程数を減らし、かつ通常のＤＮＡ単離法において見られるものに少なくとも匹敵するＤＮＡ収率および純度を得ながらも、毒性化学物質を用いないものである。第二に、本発明は、実際に必要とする工程および試薬の総数を減らしながら、ＤＮＡを単離するための従来技術において普通に見られる工程の順序を反転させても類似のＤＮＡの収率および純度が得られる、という予期せぬ知見を教示する。本発明は、最初に高張高塩試薬をＤＮＡを含む生物学的材料、例えば、白血球に加えた後、細胞リーシス試薬、および所望によりＲＮアーゼを連続的に加えることによってこれらの二つの目的を達成する。所望により、ＤＮＡを含む生物学的試料は、生物学的試料の残りから分離することができる。例えば、ゲノムＤＮＡを含む白血球は、それらを赤血球および他の血液成分から選択的に分離することによって血液試料の残りから分離することができる。高張高塩試薬を加えた後にリーシス試薬を加えることによって、単一工程にて白血球のような細胞の再懸濁が促進され、複数の再懸濁工程をさらに用いることなく次の細胞リーシスのための細胞の利用可能性が向上し、かつほとんどの通常のＤＮＡ単離法において見られるものとは反対に細胞リーシスの後にもう一つのタンパク質沈澱試薬をさらに添加する必要がない。本発明にあっては、単一リーシス後の工程である遠心分離のような分離の単一物理的手段により、非ＤＮＡ細胞材料からＤＮＡを好適に分離することが可能であり、ここで非ＤＮＡ細胞材料は、しばしばＤＮＡを懸濁液に残したまま遠心分離または沈澱させることができるものである。しかしながら、従来技術にて開示されているＤＮＡ単離の方法には、最初にリーシス試薬を加えた後にタンパク質沈澱試薬を加えること、およびＲＮＡ、タンパク質、脂質などの非ＤＮＡ細胞材料からＤＮＡを分離するために遠心分離のような追加の別個の物理的分離工程を用いることが教示されている。従来技術における他の方法によれば、複数工程を含むリーシス後の再懸濁工程が必要である。さらに、従来技術において通常見られる方法によれば、タンパク質沈澱試薬を加える前に細胞材料の凝集塊または集合体をバラバラにするために追加のリーシス後工程が必要なことがある。このような方法は、溶解産物の加熱、物理的再懸濁、およびプロテイナーゼＫのような酵素の添加を含む。本発明において開示される一連の工程では、凝集を防止するためのリーシス後の方法を必要としない。これは、上記の開示された一連の工程によれば、このような凝集が生じることを防止できるからである。従来技術における幾つかの場合には、リーシス試薬を添加する前に追加工程をこの方法に組込んでいる。例えば、低張溶液を最初に加えて溶液中の脂質および他の混入物を除いた後、同じ低張溶液を少なくとも１つの他の細胞再懸濁工程において用いる。米国特許第５，７７７，０９８号明細書（Gray et al.）を参照されたい。これは、細胞リーシスの後にさらにもう一つの試薬、すなわちタンパク質沈澱試薬を添加する追加工程を必要とする。対照的に、本発明による���法は、脂質を除去しかつ細胞再懸濁するための低張溶液の使用を必要としない。本発明による方法では、細胞を高張高塩試薬に直接懸濁した後、リーシス試薬を加えることができる。この便利でかつ迅速な方法により、一層少ない試薬数、一層少ない工程数にて、従って一層少ない総時間および努力にて、従来技術におけるより一般的な上記方法で見られるのに匹敵する収率および純度が得られる。
【０００８】
記載した順序で上記試薬を直接添加すると、ＤＮＡ精製を含む総ての関連工程の時間が著しく節約されるが、特に複数の試料を処理するときに有利である。例えば、本発明による方法を用いる８個の血液試料の処理にあっては、従来の方法を用いた場合に１２０分以上を要したのとは対照的に４５分以下で行うことができる。これは、一層少ない数の試薬および／または工程を用いることによって行われる。さらに、高張高塩試薬を細胞の濃縮試料（例えば、白血球を遠心分離したペレット）に直接添加すると、渦流攪拌、複数のピペット採取（pipetting）、音波処理などのような追加の物理的再懸濁工程を用いることなく細胞が直ちに懸濁される。さらに、上記試薬を記載した順序にて添加すると、通常のＤＮＡ単離法を用いて得たのに匹敵する、下流工程におけるＤＮＡ収率が得られる。同等な収率は、長期間保存されており凝固を示しまたはあらゆる意味において欠陥を生じている試料においても得られる。さらに、高張高塩試薬を細胞ペレットに添加すると、当業者が用いる方法において普通に見られるよりＲＮＡの混入レベルが減少する。このＲＮＡの混入レベルの限少によって、独立したＲＮＡを除去する工程を設ける必要がなくなる。
【０００９】
本発明の一態様によれば、細胞を含んでなる生物学的試料からＤＮＡを分離する方法が提供される。この細胞は、培養細胞、一次細胞、生理学的試料、例えば血液のような生理学的流体または組織試料中の細胞であることができる。これらの細胞は、微生物、ウイルス、植物、酵母、真菌など任意の供給源に由来するもの、または動物供給源、例えば、霊長類、ヒトのような脊椎動物に由来するもの、またはイヌ、ウシ、ネコ、ヤギといった供給源などに由来する細胞であることができる。高張高塩試薬を直接細胞に添加した後、リーシス試薬を加えて細胞リーシスを促進する。リーシス試薬は、ＲＮアーゼを含むことができる。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明は、ＤＮＡを生物学的試料から単離するための方法およびキットであって、水性試薬を用いるものを提供する。ＤＮＡを含むこのような生物学的試料としては、（ｉ）ＤＮＡを含む水性混合物中のまたは乾燥試料（例えば、乾燥した血液スポット）としての生物学的材料、（ii）原核生物または真核生物細胞の複雑な生物学的混合物、（iii）血液、唾液、脳脊髄液などの生理学的流体、（iv）心臓、肝臓、および脳のような固形動物組織、（ｖ）糞便および尿のような動物の排泄物、（vi）植物組織、（vii）酵母、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、原生動物、リケッチア、および（viii）他の小さな微生物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、生物学的材料としては、タンパク質および脂質も挙げられる。本明細書にて用いられる「単離した」ＤＮＡとは、ＤＮＡが実質的に純粋でありかつ従来技術または本発明にて用いられる方法によって酵素的または化学的手段によって実質的損なわれないことを意味し、これは標準的手法を用いる当該技術分野の技術の一つによって容易に決定することができる。本明細書にて用いられる「実質的に純粋」とは、ＲＮＡ、脂質およびタンパク質のような以後の分析または使用を妨げる可能性がある汚染物質を有意な量含まないことを意味する。本明細書にて用いられるＤＮＡとは、総ＤＮＡを意味し、従ってゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアおよびプラスミドＤＮＡなどを包含する。
【００１１】
本明細書に開示される方法を用いれば、より一般的な他の方法を用いて得たものに同等な高収率および実質的純度のＤＮＡを得ることができる。好ましくは、単離したＤＮＡは実質的に純粋であり、ＲＮＡ、脂質およびタンパク質のような以後の分析または使用を妨げる可能性がある汚染物質を有意な量含まないことによって決定することができる。例えば、単離したＤＮＡは、増幅、ハイブリダイゼーション、シークエンシング、サザンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、マイクロアレイ分析（microarray analysis）などのような当該技術分野にて普通に見られる様々な下流の分析（downdtream）または診断法に用いることができる。
【００１２】
本発明による方法およびキットに用いられる試薬は、多くの従来の核酸単離試薬を比較し有害成分をほとんど含まない。低級アルコール（すなわち、（Ｃｌ−Ｃ４）アルカノール）を細胞リーシス後のＤＮＡ濃縮および／または残留混入物の除去に用いることができるが、本発明による試薬は有機溶媒を実質的に含まない。本明細書にて用いられる「実質的に含まない」とは、約１％未満であり、典型的には０．５％（容量／容量）未満であることを意味する。一般に、本発明による水性試薬は、室温（２０−３０℃）にて少なくとも約３年間安定である普通の塩および界面活性剤の水性処方物からなる。
【００１３】
本明細書において「高張高塩試薬」と呼ばれる第一の試薬は、水に溶解した、ナトリウム、アンモニウム、またはカリウム塩のような塩を高濃度にて含む高張性試薬である。高張溶液は、細胞または組織のような生物学的存在物中に見出されるより高い浸透圧を有する溶液である。これは、典型的には塩のような溶解した溶質分子を高濃度にて有するものである。等張溶液は、細胞または組織のような生物学的存在物中に見出されるのと同じ浸透圧を有する溶液である。対照的に、低張溶液は、細胞または組織のような生物学的存在物中に見出されるより低い浸透圧を有する溶液である。これは、典型的には、低濃度の溶解した溶質分子を有するか、または溶質分子を全く持たない。本発明における高張高塩試薬に用いるのに適当な塩は、水に可溶性でありかつタンパク質を溶液から沈澱させることができるものである。このような塩としては、塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムのようなナトリウム塩、塩化カリウムおよび酢酸カリウムのようなカリウム塩、並びに塩化アンモニウムおよび酢酸アンモニウムのようなアンモニウム塩などが挙げられるが、これらに限定されない。この塩は、タンパク質を試料から沈澱させ、タンパク質が以後のＤＮＡの下流分析を妨げないようにするのに有効な十分な高濃度にて高張高塩試薬に含まれている。好ましくは、このような塩の濃度は、約１．０Ｍを上回る。さらに好ましくは、このような塩の濃度は、約２．０Ｍを上回る。好ましい高張高塩試薬は、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Protein Precipitation Solution （Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, カタログ番号Ｄ−５００３）である。高張高塩試薬は、また、細胞を溶液に再懸濁することによって細胞を以後のリーシスに一層効率的に利用可能にすることに用いることができる。例えば、高張高塩試薬を細胞ペレットに添加することによって、集合体または凝集塊を形成することなく、ほとんど同時に細胞を再懸濁する。さらに、高張高塩試薬を用いることによって、脂質および他の混入物を溶液から除去するための低張洗浄溶液のような予備洗浄溶液の必要性がなくなる。
【００１４】
酵母細胞の懸濁には、代替細胞懸濁試薬を用いることができる。この好ましい細胞懸濁試薬は、ｐＨが約７−８．５であり、さらに好ましくは、約７．５−８．０である。この細胞懸濁試薬は、細胞壁は溶解酵素によって消化されて行くが、細胞を完全なままに保持する。この試薬は、Ｔｒｉｓを、試薬の総容量に対して、好ましくは約０．０５−０．１５Ｍ、さらに好ましくは約０．０８−０．１２Ｍの濃度にて含む。細胞懸濁試薬は、また、ＥＤＴＡを、試薬の総容量に対して、好ましくは約０．０５−０．１５Ｍ、さらに好ましくは約０．０８−０．１２Ｍの濃度にて含む。Ｔｒｉｓ対ＥＤＴＡの好ましいモル比は、約１：１である。この試薬は、ソルビトールを、試薬の総容量に対して好ましくは約０．８−１．０Ｍの濃度にて、さらに好ましくは約０．８５−０．９５Ｍの濃度にて含む。細胞懸濁試薬は、脱イオン水、好ましくは上記の純度のレベルまで脱イオンしかつ細孔径が約０．２μＭのフィルターを用いる濾過によってさらに精製したものを含む。
【００１５】
本発明の一態様によれば、この方法は、細胞（またはウイルス）を含んでなる生物学的材料と、アニオン性界面活性剤を含む溶解産物を形成するためのリーシス試薬とを組み合わせることによって達成される、細胞またはウイルスのような生物学的材料のリーシスを包含する。上記の高張高塩試薬を生物学的材料に加えた後に、リーシス試薬を加える。本明細書にて用いられる「リーシス」とは、細胞膜を破壊することによる細胞の破壊を表す。「リーシス試薬」としては、一般に緩衝液に溶解したアニオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。この試薬は、約１０未満、好ましくは約９未満のｐＨまで緩衝される。好ましくは、リーシス試薬のｐＨはトリス−［ヒドロキシメチル］アミノメタン−エチレンジアミン酢酸（Ｔｒｉｓ）緩衝液のような緩衝液を用いて約９未満に保持されるが、緩衝液がその水性媒体中約９未満のｐＨを提供することができる限りＴｒｉｓ緩衝液は必要条件ではない。しかしながら、当業者に知られている任意の適当な緩衝液を用いることができる。適当なアニオン性界面活性剤は、試薬の総容量に対して少なくとも約０．１％（重量／容量）の濃度で水に可溶性であり、かつ細胞を溶解しおよび／またはこの濃度でタンパク質および脂質を可溶化することができるものである。このようなアニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸の塩（例えば、ナトリウム、カリウムおよびリチウム塩）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アニオン性界面活性剤はドデシル硫酸塩である。好ましくは、このようなドデシル硫酸塩の濃度は、０．１％（重量／容量）を上回る。この試薬は、細胞およびウイルスを溶解して溶解産物を形成する。好ましいリーシス試薬は、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）Ｃｅｌｌリーシス溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, カタログ番号Ｄ−５００２）である。
【００１６】
本発明による他の態様は、リーシス試薬および高張高塩試薬の他に１種類以上の任意の補助試薬を含むものである。これらの補助試薬は、核酸精製について当業者に知られている試薬を含む。しかしながら、当業者であれば同じ目的を達成するために他の試薬および／または手法を用いることができるので、本発明の方法はこれらの特定の補助試薬の使用に限定されない。また、リーシス試薬および高張高塩試薬は各々、所望により、他の試薬および／または手法と共に用いることができる。
【００１７】
第一の補助試薬は、生物学的材料が哺乳類の全血を含んでなるときに用いられる赤血球リーシス試薬（「ＲＢＣリーシス試薬」）である。赤血球リーシス試薬は、赤血球を溶解し、さらに哺乳類の全血に含まれる白血球からのＤＮＡの単離を促進することに使用される。この試薬は、本明細書では「ＲＢＣリーシス試薬」と呼ばれ、脱イオン水中に塩化アンモニウム、重炭酸ナトリウム、およびＥＤＴＡのような化合物を、白血球と比較して赤血球を優先的に溶解するのに十分な濃度にて含んでなるものである。このような濃度は、当業者には知られている。特に、ＲＢＣリーシス試薬は、赤血球の細胞膜を優先的に破壊するが、白血球の細胞膜または核膜には著しい溶解効果を持たない。ＲＢＣリーシス試薬を哺乳類の全血に加えると、赤血球を溶解するが、溶液中の白血球は実質的に損なわれないままである。次に、白血球（および存在する可能性がある任意の細胞関連ウイルス）を赤血球溶解産物から遠心分離または任意の他の適当な方法によって分離し、赤血球溶解産物を廃棄した後、高張高塩試薬を白血球に直接加える。次いで、リーシス試薬を加えて膜を破壊し、ＤＮＡを放出させる。好ましいリーシス試薬はＰｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＲＢＣリーシス溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, カタログ番号Ｄ−５００１）である。本発明では、ＲＢＣリーシス試薬は、赤血球の溶解だけに用いられる。これは、細胞リーシス前に白血球または任意の他の生物学的材料の再懸濁には用いられない。
【００１８】
他の補助試薬としては、アルコール、例えばＤＮＡを沈澱させるための１００％イソプロパノール、沈澱したＤＮＡを洗浄するための７０％エタノール、ＲＮＡを除去するためのＲＮアーゼＡのようなＲＮアーゼ、タンパク質を消化するためのプロテイナーゼＫのようなプロテイナーゼ、ＤＮＡ沈澱および回収を促進するためのグリコーゲン、およびＤＮＡ水和試薬が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡ水和試薬は、単離して精製したＤＮＡを溶解して保存するのに用いる。ＤＮＡ水和試薬中で保存するときには、単離したＤＮＡは−２０または−８０℃の温度で無期限に保存することができる。好ましくは、ＤＮＡ水和試薬は、緩衝液、例えば１０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含み、ｐＨが約７−８である緩衝液を含んでなる。好ましいＤＮＡ水和試薬は、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ水和溶液（Gentra Systems, Inc.,Minneapolis, MN, カタログ番号Ｄ−５００４）である。
【００１９】
本発明の他の態様は、本明細書に記載の試薬と組み合わせて用いて、本発明による方法によってＤＮＡを単離することができる特定のプロトコールを含むキットである。このキットは、リーシス試薬および高張高塩試薬を含む。用途によっては、このキットは本明細書に記載の１種類以上の補助試薬を含むこともできる。プロトコールは、試薬同士の比が一定であれば、用いる生物学的材料の量によってそのスケールを増減させることができる。
【００２０】
哺乳類血液からＤＮＡを単離するためのキットは、ＲＢＣリーシス試薬、リーシス試薬、高張高塩試薬、所望によりＤＮＡ水和試薬、および、使用説明書（哺乳類全血、好ましくは容量が０．１１−５０ｍＬ、さらに好ましくは容量が５−１０ｍＬの試料からＤＮＡを単離するためのものである）を含むことができる。このキットを用いて、ＤＮＡを少なくとも１０ｍＬの全血当たり約１００−５００μｇの収率で、典型的には１０ｍＬの全血当たりＤＮＡ約２００−４００μｇの範囲で好ましく単離される。しかしながら、収率は白血球数によって変化し、この白血球数は個人毎にまたは生物学的試料間でかなり変動する。
【００２１】
植物および動物固形組織、培養植物および動物細胞、体液（例えば、脳脊髄液、血漿、唾液、精液、血清、滑液、尿など）またはグラム陰性菌からＤＮＡを単離するためのキットは、リーシス試薬、高張高塩試薬、ＤＮＡ水和試薬、および使用説明書（例えば、５０ｍｇ−２ｇの植物および動物の固形組織試料、および１−４００ｘ１０６個の培養植物および動物の細胞、１−５０ｍＬの体液、１−５０ｍＬのグラム陰性菌培養物からＤＮＡを単離するためのものである）を含む。このキットを用いて、ＤＮＡは、１ｍｇ植物または動物の固形組織当たり少なくとも約１μｇ、１０６個の細胞当たり１０６個の培養植物および動物の細胞当たり少なくとも約１−１０μｇ、および１ｍＬの一晩培養したグラム陰性菌当たり少なくとも約１０−１００μｇの収率にて好ましく単離される。
【００２２】
従来技術において開示された幾つかのＤＮＡ単離法では、生物学的試料を最初にＲＢＣのリーシスを引き起こす試薬にて処理する。次に、生物学的試料およびＲＢＣリーシス試薬を含む混合物を遠心分離し、赤血球破片を除いた後、次に、得られた白血球のペレットを緩衝液または低張溶液にて洗浄し、再度遠心分離し、緩衝液または低張溶液に再懸濁した後、細胞のリーシスを引き起こすリーシス試薬にて処理する。この工程に続いて、ＲＮアーゼの溶液を所望により細胞溶解産物に加えて、混入しているＲＮＡを溶解する。次に、タンパク質沈澱を促進する１種類以上の試薬を加え、生成する溶液を典型的には遠心分離して、タンパク質および他の混入物を集める。次に、ＤＮＡを含む画分をイソプロパノールのようなアルコールに加えてＤＮＡを沈澱させ、次いで遠心分離の後に回収して、エタノールにて洗浄する。
【００２３】
従来技術に開示されたＤＮＡ単離の方法では、タンパク質沈澱工程を加える前にリーシス試薬を用いる。しかしながら、本発明は、新規な方法であって、高張高塩試薬を最初に加えた後にリーシス試薬を加える方法を開示する。高張高塩試薬は意外なことには白血球の溶液における再懸濁を引き起こし、普通に見られる凝集や凝集塊の問題は起こらない。従って、高張高塩試薬を用いて、その通常の機能であるタンパク質混入物の沈澱と共に材料を再懸濁することに用いられる。従って、この手法において高張高塩試薬は、３つの目的、１）生物学的材料を再懸濁し、凝集および凝集塊を除去することによって効率的な細胞リーシスを促進し、２）ＲＮＡの混入を減少させ、３）通常の機能である、界面活性剤の存在下で混入物（例えば、タンパク質）を除去することを行う。
【００２４】
リーシス試薬は、細胞または生物学的材料を高張高塩試薬に懸濁した後に添加する。さらに、本発明の幾つかの態様では、ＲＮアーゼを加えてあるリーシス試薬を用いることもできる。従来のＤＮＡ単離の方法に対するこれらの改良により、工程数が減少し、従ってＤＮＡ単離に要する時間が減少する。同時に、ＤＮＡの収率は、一層多くの工程数とかなりの増加時間と努力を伴った標準的方法によって得たものに匹敵する。意外なことには、本発明の新規な改良法では、有意なＲＮＡ混入は見られない。
【００２５】
従って、一態様によれば、本発明による方法は、生物学的試料と高張高塩試薬とを組み合わせ、これを連続的にリーシス試薬と接触させてＤＮＡを含む溶解産物を形成した後、ＤＮＡをタンパク質およびＲＮＡのような非ＤＮＡ細胞混入物から分離することを含む。リーシス試薬は、所望により、特に高レベルのＲＮＡを含む生物学的材料上で用いるときには、ＲＮアーゼＡのようなＲＮアーゼを含むことができる。分離は、溶解産物からのタンパク質を沈澱させることを含むことができる。ＤＮＡ上清を集めて、低級アルコール（例えば、１００％イソプロパノール）の添加によりＤＮＡを沈澱させる。次に、沈澱したＤＮＡを遠心分離によって回収し、上清画分を傾瀉する。集めたＤＮＡペレットを、通常は７０％エタノールで洗浄して、乾燥する。次に、ＤＮＡを、典型的にはＤＮＡ水和試薬にて再水和する。
【００２６】
本発明を、下記の詳細な例を参照することによってさらに説明する。この例は、様々な特定および例示の態様および手法を更に例示する目的で提供される。下記の原料の総ては、Sigma Chemical Company (St. Louis, MO)またはGentra Systems, Inc. (Minneapolis,MN)のような商業的供給元から容易に入手することができる。下記の例では、現在用いられている標準的方法、本発明の改良法、および両方法の比較を詳細に説明する。
【実施例】
【００２７】
例１．  標準的方法と新規な迅速法の比較
実験設定
標準的な血液採取バッグに採取した血液試料は、Memorial Blood Centers of Minnesotaから入手し、使用まで４℃にて保管した。ＤＮＡを、血液試料から採血から９６時間以内に精製した。ＤＮＡは、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ精製キット（カタログ番号Ｄ−５０Ｋ， Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）を用い、標準的１０ｍＬ全血プロトコールおよび新規な迅速精製プロトコールの両方を用いて精製した。このキットは、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）試薬であるＲＢＣリーシス溶液、細胞リーシス溶液、タンパク質沈澱溶液、ＲＮアーゼＡ溶液、およびＤＮＡ水和溶液を含んでいた。追加試薬である１００％イソプロパノール（２−プロパノール）および７０％エタノールもこの処置に必要であった。この例に記載の生物学的材料は全血由来の白血球ペレットであるが、この方法は採取したまたはペレット化した培養細胞、ウイルス粒子、食塩水または界面活性剤溶液中の固形または液状体液からのペレットに応用可能である点に留意されたい。
【００２８】
ＤＮＡ精製の標準的方法
１０ｍＬ容量のヒト全血を５０ｍＬ遠沈管中の３０ｍＬのＲＢＣリーシス溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）に加えて、ゲノムＤＮＡを含まない赤血球を溶解した。それぞれの試料を反転させて内容物を混合し、室温にて１０分間インキュベーションし、インキュベーション期間の途中でさらに１回反転させた。ゲノムＤＮＡを含む白血球を採取するため、それぞれの試料を２０００ ｘ ｇにて１０分間遠心分離した。上清画分を除去し、その後には、目に見える白血球ペレットおよび約２００−４００μＬの残留液体が残った。それぞれの遠沈管を１０−２０秒間激しく渦流混合して、白血球を残留液体に再懸濁した。懸濁した白血球を溶解してＤＮＡを放出するため、１０ｍＬ容量の細胞リーシス溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）を加え、粘稠な溶解産物を得た。次に、それぞれの試料をピペット吸飲により少なくとも３回上下させ、細胞のリーシスを継続し、粘稠な細胞溶解産物を混合した。細胞凝集塊または集合体がまだ目に見えるときには、溶解産物が均質になるまで溶解産物を室温または３７℃にてインキュベーションする。次に、５０μＬ容量のＲＮアーゼＡ溶液を細胞溶解産物に加えた。それぞれの試料を遠沈管を２５回反転することによって混合した後、３７℃にて１５分間インキュベーションして混入ＲＮＡを消化した。タンパク質および他の混入物を沈澱させるため、３．３３ｍＬのタンパク質沈澱溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）を、室温まで放冷した試料に加えた。それぞれの試料を高速度設定にて２０秒間激しく渦流混合し、タンパク質沈澱溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）を細胞溶解産物と均一に混合した。それぞれの試料を２，０００ ｘ ｇで１０分間遠心分離して、沈澱タンパク質および他の混入物を回収し、これは堅い暗褐色ペレットを形成した。ＤＮＡを含む上清画分を１０ｍＬの１００％イソプロパノール（２−プロパノール）の入っている清浄な５０ｍＬ遠沈管に投入し、ペレット化した混入物を後に残した。ＤＮＡを沈澱するため、それぞれの試料を、目に見えるＤＮＡの白色繊維が形成されるまで緩やかに５０回反転混合した。それぞれの試料を２０００ ｘ ｇで３分間遠心分離して沈澱したＤＮＡを採取し、これは白色ペレットとして目に見えた。上清画分を傾瀉によって除き、遠沈管を清浄な吸湿紙上にて数秒間水を切った。ＤＮＡ試料を洗浄するため、１０ｍＬ容量の７０％エタノールをＤＮＡペレットに加え、遠沈管を数回反転した。それぞれのＤＮＡ試料を２，０００ ｘ ｇにて１分間遠心分離してペレットを遠沈管の基部に移し、エタノールを傾瀉によって除いた。それぞれの遠沈管を反転して清浄な吸湿紙上で水を切り、１０−１５分間風乾した。１ｍＬ容量のＤＮＡ水和溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）を試料に加え、ＤＮＡをローテーター（Clay Adams Nutator（登録商標）, Fisher Scientific，カタログ番号１４−０６２）上で一晩室温でインキュベーションすることによって再水和した。
【００２９】
ＤＮＡの迅速精製法
１０ｍＬ容量のヒト全血を５０ｍＬ遠沈管中の３０ｍＬのＲＢＣリーシス溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）に加えた。それぞれの試料を反転混合し、室温にて５分間インキュベーションし、インキュベーション期間の途中でさらに１回反転させた。ゲノムＤＮＡを含む白血球を採取するため、それぞれの試料を２，０００ ｘ ｇで２分間遠心分離した。上清画分を傾瀉によって除去し、その後には、目に見える白血球ペレットおよび約２００μＬの残留液体が残った。好ましくは、残留液体は２００μＬ未満とすべきである。白血球ペレットは、一般に溶液に再懸濁することが非常に困難である。激しい攪拌、機械攪拌またはＰＢＳ緩衝液などへの再懸濁によっても細胞を適当に再懸濁できず、細胞が凝集または集合し続けることが多い。従って、白血球を再懸濁するために、３．３３ｍＬの高張高塩試薬（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）タンパク質沈澱溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN, カタログ番号Ｄ−５００３））を用い、これを白血球ペレットの中心に勢いよく分配し、白血球ペレットを分散させた。意外なことには、これにより、（顕微鏡下で分析したときに分かるように）白血球に何ら有意な損傷を生じることなくかつ追加の物理的分散工程なしに直ちに懸濁液が形成された。この工程の直後に、１０ｍＬ容量のＲＮアーゼＡ溶液を含む細胞リーシス溶液（Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN）を試料に加えて、細胞を溶解した。ＲＮアーゼＡ溶液は必要ではないが、より直接的に標準的方法と比較を行う目的で用いた。細胞リーシス溶液とＲＮアーゼＡ溶液の組合せを調製するため、ＲＮアーゼＡ溶液５ｍＬを細胞リーシス溶液１０００ｍＬに加え、処置を開始する前に十分に混合した。この溶液は、室温で少なくとも６ヶ月間安定である。試薬を再懸濁した細胞と混合して、細胞リーシスを完了するため、それぞれの遠沈管を２０秒間激しく渦流混合した。次に、それぞれの試料を２０００ ｘ ｇで２分間遠心分離して、堅い暗褐色ペレットを形成した沈澱したタンパク質および他の混入物を採取した。
【００３０】
ＤＮＡを含む上清画分を１０ｍＬの１００％イソプロパノール（２−プロパノール）を含む清浄な５０ｍＬ遠沈管に移し、その後にはペレット化した混入物が残った。ＤＮＡを沈澱させるため、それぞれの試料を、目に見えるＤＮＡの白色繊維が形成されるまで緩やかに５０回反転混合した。それぞれの試料を２０００ ｘ ｇで２分間遠心分離して沈澱したＤＮＡを採取したところ、これは白色ペレットとして目に見えた。上清画分を傾瀉によって除き、遠沈管を清浄な吸湿紙上にて数秒間水を切った。ＤＮＡ試料を洗浄するため、１０ｍＬ容量の７０％エタノールをＤＮＡペレットに加え、遠沈管を数回反転した。それぞれのＤＮＡ試料を２，０００ ｘ ｇにて１分間遠心分離してペレットを遠沈管の基部に移し、エタノールを傾瀉によって除いた。それぞれの遠沈管を反転して清浄な吸湿紙上で水を切り、１分間風乾した。１ｍＬ容量のＤＮＡ水和溶液を試料に加え、ＤＮＡをローテーター（Clay Adams Nutator（登録商標）， Fisher Scientific，カタログ番号１４−０６２）上にて一晩室温でインキュベーションすることによって再水和した。
【００３１】
この方法に用いた試薬の容量は、一般に５．１−１０．０ｍＬの試料サイズに推奨される。しかしながら、約１．０−５．０ｍＬの試料容量に対しては、上記試薬の容量を半分にする。このような試料サイズに用いる試薬容量は、下記の通りである。
【００３２】
【表１】
2005517446.tif 000002
【００３３】
ＵＶ吸光度測定
ＤＮＡ収率は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−６４  ＵＶ分光光度計（Fullerton, CA）を用いて決定した。それぞれのＤＮＡ試料の１０μＬ容量を１９０μＬの超純水脱イオン水で希釈して、高速で５秒間渦流混合した。ＤＮＡ濃度を得るため、３２０ｎｍの吸光度（Ａ３２０（バックグラウンド））を２６０ｎｍの吸光度（Ａ２６０）の示す値から差し引き、生成する値に５０μｇ／ｍＬのＤＮＡ消光係数をかけた。次に、それぞれの濃度にグラム数での重量によって評価したそれぞれのＤＮＡ容量をかけることによって、ＤＮＡ収率を計算した。タンパク質混入物を評価するＡ２６０／Ａ２８０比は、これら２つの吸光度の示す値のそれぞれからバックグラウンド（Ａ３２０）を引いた後、わり算を行うことによって決定した。
【００３４】
ＤＮＡ制限酵素消化
ＤＮＡ品質を、Hind III（New England Biolabs, Beverly, MA and Sigma, St. Louis, MO）制限エンドヌクレアーゼによる消化を分析することによってさらに評価した。２５μＬの消化物容量では、Hind III ２単位を１μｇ ＤＮＡに加えて、３７℃にて３０分間消化を行った。消化につき、試料を検討するため、１０μＬの容量を０．１２５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む０．７％アガロースゲルによって分析をした。Kodak Digital Imaging System EDAS 120 LE (Rochester, NY)を用いてＵＶトランスイルミネーター(transilluminator)上でゲルの写真撮影を行った。
【００３５】
ＤＮＡサイズ分析
ＤＮＡサイズを評価するため、１００ｎｇの試料をそれぞれのレーンに載せ、０．６％アガロースゲル電気泳動によって分離した。ＤＮＡを、ゲルおよび流動緩衝液中で０．１２５ｍｇ／ｍＬ臭化エチジウムを用いて１５ボルトにて１６時間電気泳動した。Kodak Digital Imaging System EDAS 120 LE (Rochester, NY)を用いて、ＵＶトランスイルミネーター(transilluminator)上でゲルの写真撮影を行った。それぞれのＤＮＡ試料の移動距離を、５０ｋｂサイズの対照標準である １００ｎｇの未消化λＤＮＡと比較した。ＤＮＡ品質の基準である高分子量ＤＮＡは、そのＤＮＡの９５％を上回る量が少なくとも５０ｋｂのサイズであると評価された。
【００３６】
ＤＮＡ増幅
シトクロムＰ４５０遺伝子の一つ（ＣＹＰ２Ｄ６座）の１．５ｋｂターゲットに特異的なプライマーを用いて、精製ＤＮＡの増幅性能について評価した。それぞれの反応について、１００ｎｇの量のＤＮＡを、１Ｘ Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、０．０５Ｕ／μＬ Ｔａｑポリメラーゼ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Promega, Madison, WI）、並びに１μＭの前進および復帰プライマー（Research Genetics, Huntsville, AL）を含む２５μＬ中にて増幅した。ＣＹＰ２Ｄ６ターゲットの増幅条件は、３０サイクル；９４℃にて３０秒間、６３℃にて３０秒間、および７２℃にて３０秒間；７２℃にて６分間保持、４℃に保持であった。それぞれの反応からの１０μＬ容量を、２％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００３７】
結果
【表２】
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【００３８】
複製血液試料を用い、標準的方法および迅速法をそれぞれの方法について８個の複製を用いて比較した。細胞リーシス溶液と高濃度塩溶液の添加の順序を迅速法で逆にすることによって、時間と複雑さが減少した。これらの改良は、ＲＮアーゼを細胞リーシス溶液と組み合わせた直後にこれを細胞ペレットに添加することによっても増大した。しかしながら、ＤＮＡを収率、品質、サイズ、制限酵素消化能力、およびＰＣＲ増幅性能について分析したときには、２つの方法は同等であった。
【国際調査報告】
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