(57)【要約】本発明は、免疫反応性ペプチドを同定するための方法に関する。該方法によれば、腫瘍および相当する健康な組織の試料をまず提供し、腫瘍特異的発現プロファイルを続いて決定し、抗原性ペプチドを、腫瘍組織から単離して、解析する。次いで得られた各データをマッチさせ、ペプチドを、上記データに基づいて同定する。
2005535299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む免疫反応性ペプチドを同定するための方法：
ａ）腫瘍とそれに対応する健常組織の試料を準備すること、
ｂ）該準備された試料について腫瘍特異的発現プロファイルを決定すること、
ｃ）腫瘍組織の試料中で抗原性ペプチドを単離および解析すること、
ｄ）工程ｂ）およびｃ）で得られたデータをマッチングさせること、および
ｅ）マッチングさせたデータに基づいてペプチドを同定すること。
【請求項２】
前記抗原性ペプチドがＭＨＣリガンドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）が、マイクロアレイ解析および／または逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応によって実施されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）の解析が、質量分析によって実施されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）において、候補の抗原性ペプチドが、適切なデータベースを用いた発現プロファイルに基づいて予測されること、およびペプチドについて質量分析計によって測定されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）の後に、末梢白血球、好ましくはＴリンパ球の反応性が、単離された抗原性ペプチドに対して試験される更なる工程が実施されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
反応性試験が、白血球によって合成されたサイトカインｍＲＮＡおよび／またはγ−インターフェロンｍＲＮＡの測定によって実施されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）の後、特異的Ｔリンパ球の存在が検出される更なる工程が実施されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
特異的Ｔリンパ球の検出が、抗原提示分子および抗原性ペプチドの再構成複合体で白血球を標識する方法によって実施されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドが、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法にしたがって同定され、該同定されたペプチドが、化学的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにて合成される、免疫反応性ペプチドを調製するための方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって同定された、および／または請求項１０に記載の方法によって調製された、免疫反応性ペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の１つまたはそれ以上のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
腫瘍疾患の治療のための、請求項１１に記載のペプチドの使用。
【請求項１４】
腫瘍疾患の治療のための医薬を調製するための、請求項１１に記載のペプチドの使用。
【請求項１５】
腫瘍疾患の治療経過を評価するための、請求項１１に記載のペプチドの使用。
【請求項１６】
抗体を調製するための、請求項１１に記載のペプチドの使用。
【請求項１７】
請求項１１に記載のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１１に記載のペプチドを生産する、請求項１７に記載の核酸分子によって遺伝的に改変された細胞。
【請求項２０】
ａ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を実施すること、
ｂ）該同定された免疫反応性ペプチドを調製すること、および
ｃ）該調製した免疫反応性ペプチドを製剤化すること、
の工程を含むワクチンを調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫反応性ペプチドを同定するための方法、免疫反応性ペプチドを調製するための方法、およびそれによって同定／調製された免疫反応性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
そのようなペプチドは、例えば、腫瘍関連疾患の免疫療法で使用される。腫瘍細胞が免疫系によって排除される場合、免疫系の成分による腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の同定がきわめて重要な役割を果たす。この機構は、腫瘍細胞と正常細胞との間に質的または量的な差違が存在するという事実に基づいている。抗腫瘍応答を誘導するためには、腫瘍細胞は、腫瘍の排除に十分である免疫応答を誘導する抗原を発現しなければならない。
【０００３】
特に、ＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔリンパ球（以下ＣＴＬ）が、腫瘍の拒絶に関与している。細胞傷害性Ｔ細胞によるそのような免疫応答を誘導するためには、外来タンパク質／ペプチドがＴ細胞に提示されなければならない。抗原は、細胞表面上でＭＨＣ分子によって提示された場合にのみ、Ｔ細胞によってペプチド断片として認識される。これらのＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子は、通常、細胞内でペプチドに結合してペプチドを細胞表面に輸送する、ペプチドレセプターである。ペプチドとＭＨＣ分子のこの複合体はＴ細胞によって認識される。ヒトＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。
【０００４】
過去に、Ｔ細胞に基づく抗原特異的免疫療法が癌の治療によい結果をもたらすことが証明されている。
【０００５】
腫瘍に対する特異的ＣＴＬ応答の誘導は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＭＨＣクラスＩリガンドの同定に依存している。そのようなＴＡＡは、例えば、変異した遺伝子の産物として、完全に悪性細胞中にだけ存在しうる。他の重要な腫瘍関連抗原のクラスは精巣癌抗原のような組織特異的構造物であり、腫瘍関連抗原の第三のクラスは腫瘍にて過剰発現されるタンパク質である。
【０００６】
腫瘍ワクチンの開始点を提示するＴＡＡを同定およびその特性を決定するための方法は、一方で、患者由来のＣＴＬまたは抗体の使用に基づいている。この免疫学的アプローチは、認識されたペプチドの遺伝子発現アプローチまたは質量分析（ＭＳ）補助シークエンシングのいずれかと組み合わされる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら，１９９１，「ヒトの黒色腫上の細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原をコードしている遺伝子(A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on
a human melanoma)」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３−１６４７、およびＣｏｘら，１９９４，「５つの黒色腫特異的ヒト細胞傷害性Ｔ細胞株によって認識されるペプチドの同定(Identification of a peptide recognized by five melanoma-specific human cytotoxic T cell lines.)」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：７１６−７１９を参照のこと）。腫瘍および相当する正常組織の比較転写プロファイリングに基づく、ＴＡＡの同定のための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡマクロアレイ技術の使用がある。
【０００７】
Ｃｅｌｉｓら，１９９４、「初代培養物および合成ペプチドエピトープを用いた、正常なヒトにおける抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導(Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes.)」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１０５−２１０９では、選択された腫瘍関連抗原由来ＭＨＣクラスＩリガンドの予想を利用し、これらのリガンドを、次の段階でＴ細胞エピトープとして確認する方法が適用された。
【０００８】
患者由来のＴ細胞に基づくアプローチの欠点は、大規模な培養技術とそれらが既存のＴ細胞の頻度を制限することである。
【０００９】
当該分野で公知の別のＴ細胞に依存しないアプローチは、エピトープ予測および複合体ペプチド混合液中での予想ペプチドに対するスクリーニングを組み合わせたものであり、ペプチドを高感度キャピラリー液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって同定できる（Ｓｃｈｉｒｌｅら，２０００，「新規Ｔ細胞非依存アプローチによる、腫瘍関連ＭＨＣクラスＩリガンドの同定(Identification of tumor-associated MHC class I-ligands by a novel T cell independent approach)」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２２１６−２２２５を参照のこと）。
【００１０】
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、腫瘍及び対応する自己の正常組織との比較発現プロファイリングを用いた新規なアプローチを提供する。Ｙｏｕｎｇら，２００１、「腎臓上皮新生物の発現プロファイリング：腫瘍分類および診断用分子マーカーの探索のための方法(Expression profiling of renal epithelial neoplasms:a method for tumor classification and discovery of diagnostic molecular markers.)」Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：１６３９−１６５１は、この技術を用いることによって、個々の腫瘍試料から多数の腫瘍関連抗原を同定することができることを開示している。過剰発現されたかまたは選択的に発現されたタンパク質に由来するＭＨＣ−Ｉリガンドは、腫瘍の特異的ＣＴＬ認識についての可能性のある標的を提供する。Ｍａｔｈｉａｓｓｅｎら，２００１，「ｍＲＮＡ発現プロファイリングによって同定された腫瘍関連抗原は、保護的抗腫瘍免疫を誘導する(Tumor-associated antigens identified by mRNA expression profiling induce protective anti-tumor immuity.)」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．３１：１２３９−１２４６は、マウスモデルで、発現解析をエピトープ予測と組み合わせることによって、良好なワクチンを調製することができることを示した。
【００１１】
しかしながら、欠点として、ごく限られた標的遺伝子についてのエピトープ予測が多数の候補ペプチドを同定することになり、その大多数は実際にはＭＨＣ分子によっては提示されておらず、したがって、ＣＴＬ応答を誘導しないことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、免疫反応性ペプチドの選択的かつ簡単な同定のための新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明にしたがって、この目的は、以下の、
（ａ）腫瘍とそれに対応する健常組織の試料を準備すること、
（ｂ）上記準備された試料について腫瘍特異的発現プロファイルを決定すること、
（ｃ）腫瘍組織の試料中で抗原性ペプチドを単離および解析すること、
（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）で得られたデータをマッチングすること、および
（ｅ）マッチングさせたデータに基づいてペプチドを同定すること、
を含む、免疫反応性ペプチドを同定するための方法によって達成される。
【００１４】
本発明者らは、発現解析を、単離され解析された抗原性腫瘍ペプチドと組み合わせることによって、個々のワクチンについての特異的な候補を同定することができることを明らかにした。
【００１５】
抗原性ペプチドを単離し、それらを腫瘍組織の遺伝子発現プロファイルとマッチングさせることによって、膨大な数の可能性のある免疫反応性ペプチドが得られることを避けることができる。それどころか逆に、実際にＭＨＣ分子によって提示される、免疫反応性ペプチドとして好適である、特異的ペプチドが同定される。
【００１６】
本発明の方法を用いれば、特異的免疫応答を誘導するためのワクチンとして使用することのできる、患者特異的ペプチドをそれぞれ同定することができる、つまり、ペプチドを正確に患者にマッチさせることができるのである。
【００１７】
例えば、工業研究所は、患者の試料を受領した後に、体系的および効果的にこの方法を実施でき、適切な免疫反応性ペプチドを同定した後に、上記ペプチド配列の管理を医療機関へ任せ、次いで医療機関が、上記ペプチドを合成し投与することができる。あるいは、研究所が、それぞれの患者に適切なペプチドの同定ならびに生産を実施することもできる。
【００１８】
したがって、この新規な方法は、単なるサービスの範囲内に留まらず、同定された免疫反応性ペプチドの供給との組み合わせにも適用することができる。
【００１９】
好ましい実施形態では、工程（ｃ）で単離されたペプチドはＭＨＣリガンドである。
【００２０】
ＭＨＣ分子に結合するペプチドのみが、細胞性免疫応答を誘導することができる。例えば、腫瘍の過剰発現された遺伝子に由来するがＭＨＣ分子には結合しないペプチドは、ＣＴＬ免疫応答を誘導しない。したがって、例えばエピトープ予測でのみ同定されたペプチドが、必ずしも全て免疫応答性というわけではない。
【００２１】
さらに好ましい実施形態では、工程（ｂ）はマイクロアレイ解析および／または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施される。
【００２２】
マイクロアレイ解析を用いて、腫瘍組織の発現プロファイルが、特定のＤＮＡチップまたは遺伝子チップを用いることによって、対応する正常組織と比較され、選択的に発現された遺伝子あるいは過剰発現された遺伝子が同定される。この方法は、当該分野でよく知られており、例えば、Ｓｃｈｅｎａら，１９９５、「相補ＤＮＡマイクロアレイでの遺伝子発現パターンの定量的モニタリング(Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray)」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４６７−４７０にて開示されている。
【００２３】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＲＴ−ＰＣＲ）を利用して、遺伝子発現を定量することができる。
【００２４】
この目的のために、ｃＤＮＡを、例えば腫瘍細胞から単離したＲＮＡから合成し、このｃＤＮＡを続いてＰＣＲの鋳型として使用する。この方法においては、増幅されたＤＮＡに基づいて、どの遺伝子がどのような強度で転写されたかを比較することができる。
【００２５】
好ましい実施形態では、工程（ｃ）は質量分析によって実施される。
【００２６】
この技術を用いて、各ペプチドを、高い性能で、正確かつ効果的に同定することができる。例えば、Ｓｃｈｉｒｌｅら，２０００、「新規Ｔ細胞非依存アプローチによる、腫瘍関連ＭＨＣクラスＩリガンドの同定(Identification of tumor-associated MHC class I ligands by a novel T cell independent approach)」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２２１６−２２２５には、腫瘍組織に由来するペプチドを同定するための、質量分析の使用が記載されている。
【００２７】
また他の実施形態では、工程（ｃ）で、候補の抗原性ペプチドが、適切なデータベースを用いて発現プロファイルに基づいて予想され、質量分析によって上記予想された抗原が測定される。
【００２８】
候補の抗原の予測のためにデータベースを使用し、得られたデータを用いることは、例えば、Ｓｃｈｉｒｌｅら，２００１、「コンピュータアルゴリズムを、実験アプローチと組み合わせることにより、定義された抗原に由来するＴ細胞エピトープの迅速かつ的確な同定が可能になる(Combining computer algorithms with experimental approaches permits rapid and accurate identification of T cell epitopes from defined antigens)」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５７：１−１６にて開示されている。データベースの例は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｐｒｏｃ．ｄｅに見ることができる。
【００２９】
また方法の更なる好ましい実施形態では、工程（ｃ）の後に、末梢白血球、好ましくはＴ白血球の単離された抗原性ペプチドに対する反応性が試験される更なる工程が続く。
【００３０】
好ましい実施形態では、単離された抗原性ペプチドに対する末梢白血球の応答性が、白血球によって合成されたγ−インターフェロンｍＲＮＡおよび／またはサイトカインｍＲＮＡの測定によって試験される。
【００３１】
γ−インターフェロンｍＲＮＡまたはサイトカインｍＲＮＡを検出することによって、白血球の、好ましくはＴリンパ球の、抗原性ペプチドに対する特異的な反応性を正確に証明することができる。いずれの物質も、対応する抗原性ペプチドによるそれらの活性化の後に、活性化されたＴリンパ球によって分泌される。
【００３２】
この追加の工程によって、すでに同定されたペプチドの候補を、より正確に同定することができる。
【００３３】
この方法のまた別の好ましい実施形態では、工程（ｃ）の後に、Ｔリンパ球の存在を検出する更なる工程が実施される。
【００３４】
この方法を用いて、単離され同定されたペプチドに対して指向するＴリンパ球がどの程度患者の中に以前から存在しているかを特異的に検出することができる。この工程を実施することによって、それらに対するＴリンパ球が患者の中に以前から存在しているペプチドのみをワクチンとして利用することができる。次いでペプチドを、これらの特異的Ｔリンパ球を活性化するために使用することができる。
【００３５】
さらに好ましい方法では、特異的な既存のＴリンパ球の検出は、抗原提示分子と抗原性ペプチドの再構築複合体を用いて白血球を標識することによって実施される。
【００３６】
この方法では、テトラマー技術と呼ばれるものが使用される。そのような再構築複合体（テトラマー（ｔｅｔｒａｍｅｒｓ））を作成する方法、およびこれらを利用する方法は、例えば、Ａｌｔｍａｎら，１９９６，「抗原特異的Ｔリンパ球の表現型解析(Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes)」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６にて開示されている。
【００３７】
本発明はさらに、本発明の方法によって同定され、調製された免疫反応性ペプチドに関する。
【００３８】
同定の後、これらのペプチドを、それぞれの患者について選択的および特異的に調製することができる。
【００３９】
本発明はさらに、本発明の方法によって同定および／または調製された１つまたはそれ以上のペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【００４０】
上記組成物は、例えば、非経口で、例えば皮下、皮内または筋肉内投与することができ、また経口で投与することもできる。その際、ペプチドは、薬理学的に許容可能な担体、好ましくは水性担体中に溶解または懸濁させられ、組成物にはさらに、添加物、例えば、緩衝液、結合剤などを含むことができる。ペプチドはまた、免疫刺激物質、例えばサイトカイン類とともに投与することもできる。この種の組成物において使用することができる添加物の多数の記載は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３．Ｅｄ．，２０００，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓに見ることができる。
【００４１】
本発明にしたがって、ペプチドを、腫瘍疾患の治療のため、および腫瘍疾患の治療するための医薬を調製するために、使用することができる。
【００４２】
治療される腫瘍疾患としては、腎臓癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、精巣癌および／または皮膚癌を挙げることができる。腫瘍疾患のリストは、単に例示であり、使用の範囲を制限するものではない。
【００４３】
ペプチドはさらに、腫瘍疾患の治療経過を評価するために使用することができる。
【００４４】
ペプチドはまた、他の免疫処置または療法にて治療をモニターするために使用することができる。この方法においては、本発明のペプチドは、治療方法だけではなく、診断方法でも使用することができる。
【００４５】
更なる実施形態では、ペプチドは、抗原を作成するために使用される。
【００４６】
ポリクローナル抗体は、一般的な方法で、ペプチドの注入による動物の免疫と、それに続く免疫グロブリンの精製によって得ることができる。
【００４７】
モノクローナル抗体は、例えばＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６），１２１，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに記載されているような、標準的な手順にしたがって作成することができる。
【００４８】
更なる態様では、本発明は、本発明の方法を用いて単離されたペプチドをコードする核酸分子にも関する。
【００４９】
上記核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、同様に腫瘍の免疫療法に使用することができる。
【００５０】
本発明にしたがって、核酸分子をベクター中に提供することができる。
【００５１】
本発明はさらに、核酸分子の方法によって遺伝的に改変された細胞に関し、そのような細胞は、本発明にしたがって同定されたペプチドを生産する。
【００５２】
本発明はさらに、免疫反応性ペプチドを調製するための方法に関する。これにより、開示された方法に従ってペプチドが同定され、同定されたペプチドは、化学的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで合成される。
【００５３】
ペプチドは、例えば、当該分野で公知のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法によって、アミノ酸の化学結合によって調製することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ＲＢ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４を参照のこと）。
【００５４】
ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、例えば無細胞系で、および細胞を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで調製することができる。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態は、以下の工程、
ａ）開示された方法を実施すること、
ｂ）同定された免疫反応性ペプチドを調製すること、および
ｃ）上記調製された免疫反応性ペプチドを製剤化すること、
を含む、ワクチンの調製方法である。
【００５６】
上記の特徴、さらには以下で説明される特徴は、特定の各場合の組み合わせのみではなく、本発明の範囲から逸脱することなく、他の組み合わせで、またはそれらを単独で使用できることが理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
本発明の実施形態は、以下の図および実施例で表示され、説明される。
【実施例】
【００５８】
患者試料
腎細胞癌が組織学的に確認された患者の試料を、テュービンゲン大学の泌尿器科から得た。いずれの患者も、手術前治療を受けていなかった。患者１（以下ＲＣＣ０１と表記）は、以下のＨＬＡ型、ＨＬＡ−Ａ＊０２  Ａ＊６８  Ｂ＊１８  Ｂ＊４４を、患者２（以下ＲＣＣ１３と表記）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２  Ａ＊２４  Ｂ＊０７  Ｂ＊４０を有していた。
【００５９】
ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドの単離
ショック冷凍（ｓｈｏｃｋ−ｆｒｏｚｅｎ）した腫瘍試料は、Ｓｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．らの記載「新規Ｔ細胞−非依存アプローチによる、腫瘍関連ＭＨＣクラスＩリガンドの同定(Identification of tumor-associated MHC-class I ligands by a novel T cell-independent approach)」2000,European Journal of Immunology,30:2216-2225に従い処理した。ペプチドは、クラスＩＨＬＡに特異的なモノクローナル抗体Ｗ６／３２、又は、ＨＬＡ−Ａ２に特異的なモノクローナル抗体ＢＢ７．２を用いて標準的な手順により単離された。これらの抗体の生産方法と使用方法は、Barnstable, C.J.らの「グループＡ赤血球、ＨＬＡおよび他のヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の生産−遺伝的解析のための新規ツール(Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes,HLA and other human cell surface antigens-New tools for genetic analysis.)」1978,Cell,14:9-20、及び、Parham, P.及びBrodsky F.M.の「ＢＢ７．２の部分精製および特性。ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８の変異体に対する特異性を持つ細胞傷害性モノクローナル抗体(Partial purification and some properties of BB7.2.A cytotoxic monoclonal antibody with specificity for HLA-A2 and a variant of HLA-A28)」1981,Hum.Immunol.,3:277-299による。
【００６０】
質量分析
患者ＲＣＣ０１の腫瘍組織由来のペプチドは、逆相ＨＰＬＣ（ＳＭＡＲＴ−ｓｙｓｔｅｍ，  μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ  ２．１／１９，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により分離され、フラクションはｎａｎｏＥＳＩ  ＭＳを用いて分析された。これに際し、手順はＳｃｈｉｒｌｅ，Ｍ．等の報告に記載されている方法で実施した（Identification of tumor-associated MHC-class I ligand by a novel T
cell-independent approach, 2000,European Journal of Immunology, 30:2216-2225）。
【００６１】
ペプチドを患者ＲＣＣ１３の腫瘍組織から、少し変更を加えて、上記のように、オンラインキャピラリーＬＣ−ＭＳによって同定した。約１００μｌの試料容量をロードし、脱塩し、３００μｍ×５ｍｍのＣ１８  μ−プレカラム上で予め濃縮した（ＬＣパッキング）。気密性１００μｌのシリンジ（１７１０  ＲＮＲ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を備えたシリンジポンプ（ＰＨＤ  ２０００、ハーバード  アパラタス社（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．）により、２μｌ／分で溶媒および試料を供給した。ペプチドの分離のために、予め濃縮したカラムを、７５μｍ×２５０ｍｍのＣ−１８（ＬＣパッキング）カラムに一列で切り替えた。その後ＴＥＥピース（ＺＴｌＣ、Ｖａｌｃｏ）および３００μｍ×１５０ｍｍのＣ−１８カラムのプレカラムを用いて、１２μｌ／分の流速をおよそ３００ｎｌ／分まで減少させ、７０分間の２５％〜６０％のＢによる二液グラジエント溶出を実施した。。
【００６２】
ブランクランを常時実施して、確実に本系に残余ペプチドを含めないようにした。オンライン断片化を上述のように実施して、断片スペクトルを手動で解析した。
【００６３】
データベース検索（ＮＣＢＩｎｒ、ＥＳＴ）を、ＭＡＳＣＯＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を用いて行った。
【００６４】
ＲＮＡの調製
正常組織および悪性腎臓組織の一部を解剖し、ショック凍結し、液体窒素下で、乳鉢および乳棒によって細かく粉砕し、ＴＲＩＺＯＬ（ライフ  テクノロジーズ）中のロータリーホモジナイザー（ハイドルフ  インストゥルメンツ）でホモジナイズした。トータルＲＮＡを取扱説明書にしたがって調製し、その後、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン）で浄化した。ヒト組織由来のトータルＲＮＡは商業的に入手した（Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｐａｎｅｌ  ＩＩ、クロンテック）。
【００６５】
高密度オリゴヌクレオチドマイクロ−アレイ解析
スーパースクリプトＲＴ  ＩＩ逆転写酵素（ライフ  テクノロジーズ）を用いて、二本鎖ＤＮＡを、４０μｇのトータルＲＮＡから合成した。プライマー（ユーロジェンテック）を、アフィメトリックスのマニュアルによって作成した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を、ＢｉｏＡｒｒａｙ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ（登録商標）ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（エンゾ  ダイアゴノスティックス社（ＥＮＺＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．））を用いて実施し、続いて、断片化およびハイブリダイゼーションを、取扱説明書（アフィメトリックス）にしたがって、アフィメトリックス  ＨｕＧｅｎｅＦＬ遺伝子チップに対して、ストレプトアビジン−フィコエリスリンおよびビオチン化抗ストレプトアビジン抗体を用いて実施した。アフィメトリックスＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用し、データを、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ  ４．０  Ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。
【００６６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
マイクロアレイ解析のために作成したｃＤＮＡを、定量ＰＣＲ解析に使用した。
【００６７】
各遺伝子を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システム（アプライド  バイオシステムズ）上で、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ化学反応を用いて、二重で走らせた（４０サイクル、９５℃×１５秒間、６０℃×１分間）。試料を別々に２〜３回解析した。プライマー（ＭＷＧ−バイオテック）をイントロンに隣接するように選択し、ＰＣＲ効率をすべてのプライマー対について試験し、これがほぼ１に近いことを発見した。
【００６８】
ＰＣＲ産物を精製のために３％アガロースゲル上で解析し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（インビトロジェン）を用いてｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター内にクローニングした後に配列を確認した。データ解析には、比較定量のためにデルタＣＴ法を含めた。
【００６９】
レーザー微量組織採取法
包埋した凍結組織標本を６μｍの厚さに切断し、７０％エタノール中に移して約１５分間おいた。スライドを、Ｍａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン（メルク）中で９０秒間インキュベートし、水中でリンスし、７０％エタノール中で１分間、９５％エタノール中で１分間、１％アルコール性エオシンＹ（シグマ）中で３０秒間、９５％エタノール中で２×２分間、１００％エタノール中で２×２分間、最後にキシレン中で２×２分間インキュベートした。１５分間風乾させた後、スライドを乾燥条件下で保存した。正常な悪性上皮管状細胞および癌細胞を、ＰｉｘＣｅｌｌ  ＩＩ  ＬＣＭシステム（アラクチュラス  エンジニアリング（Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ））を用いて、レーザー微量組織採取法（Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｔｉｏｎ（ＬＣＭ））によって単離した。トータルＲＮＡを、４００μｌのＴＲＩＺＯＬ中で抽出した。
【００７０】
ＰＢＭＣ、テトラマーの生産およびフローサイトメトリー
血清学的にＣＭＶ陽性と分類された、２人の健常なドナー（ＨＤ１およびＨＤ２）からの末梢血単核細胞（以下ＰＢＭＣ）を、勾配遠心分離（ＦｉｃｏＬｕｔｅ  Ｈ）および凍結によって単離した。
【００７１】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマー複合体を、Ａｌｔｍａｎら，１９９６，「抗原特異的Ｔリンパ球の表現型解析（Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.)」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６によって記載されているように、以下のように生産した。リフォールディングのために使用したＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドは、ケラチン１８由来のＡＬＬＮＩＫＶＫＬ、およびｐｐ６５  ＨＣＭＶＡ由来のＮＬＶＰＭＶＡＴＶであった。テトラマーは、ビオチン化モノマーをストレプトアビジン−ＰＥまたはストレプトアビジン−ＡＰＣと混合して作製し、２〜３×１０6個の細胞を、両方のテトラマーと共に、４℃にて３０分間インキュベートした：ＰＢＳ ０．０１％、ＮａＮ３ ２ｍＭ、ＥＤＴＡ ５０％及び子ウシ血清中、それぞれ１０μｇ／ｍｌのモノマー濃度。次いで、モノクローナル抗体抗−ＣＤ４−ＦＩＴＣ（コールター−イムノテック（Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ））および抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ（ベクトン  ディッキンソン）を２０分間かけて加えた。３回洗浄した後、試料を、ＦＡＣＳ緩衝液、１％ホルムアルデヒド中で固定した。四色解析を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒサイトメーター（ベクトン  ディッキンソン）上で実施した。
【００７２】
結果
２つの腎細胞癌の腫瘍および対応する正常組織において、およそ７０００個の遺伝子の発現を解析した。４００から５００個の間の遺伝子が、腫瘍において過剰発現されているか、または選択的に発現されていることを発見した。７０個の遺伝子が、両方の患者の腫瘍中で過剰発現されていた。患者１では、２６８個の過剰発現されている遺伝子と、１２９個の独占的に発現されている遺伝子が発見された。過剰発現されている遺伝子のほとんどが、癌関連、すなわち腫瘍遺伝子、腫瘍抑制遺伝子またはＣＣＮＤ１、ＣＡ９、セレブロシドスルホトランスフェラーゼおよび副甲状腺ホルモン様ホルモンのような、癌において過剰発現されることがすでに記載されている遺伝子いずれかである。がん関連脂肪分化関連タンパク質（ＡＤＦＰ）またはアジポフィリンは、過剰発現の程度が二番目に高かった。さらにこのタンパク質は、他の器官の正常組織に比べて、腫瘍組織中で、高度に過剰発現されていることが示され、このことは正常な腎臓組織との比較においてのみではなかった。
【００７３】
マイクロアレイ解析によって得られたデータを検証するために、選択された遺伝子の発現を、定量ＰＣＲによって解析した。図１に、ＲＴ−ＰＣＲによる選択された遺伝子の発現解析を示している。ＲＴ−ＰＣＲを、マイクロアレイ解析のために作製したものと同じｃＤＮＡを用いて実施した。コピー数は、１８Ｓ  ｒＲＮＡと比例し、各患者の正常組織（＝１）に対して標準化した。黒棒は、患者ＲＣＣ０１の腫瘍組織中の数に相当し、白棒は、正常組織の数を表し、しま模様のある灰色棒は、患者ＲＣＣ１３の腫瘍組織中の数を表す。
【００７４】
マイクロアレイによって証明されたアジポフィリン（ＡＤＦＰ）およびサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）の過剰発現を定量ＰＣＲによって確認できることが示された。さらに、ｅｔｓ−１（ＥＴＳ１）は正常および腫瘍組織の両方において同程度発現されることが明らかである。さらに、両方の技術によって検出された相対的な発現レベルは、おおよそ同程度であった。
【００７５】
例えば、アジポフィリンは、定量ＰＣＲの方法によって測定された１８．１と比較して、マイクロアレイによって証明されるように、患者ＲＣＣ００１の腫瘍組織上では２９．１倍過剰発現されていた（図１を参照のこと）。患者ＲＣＣ１３については、マイクロアレイ解析によっては１１．４倍、そして定量ＰＣＲによっては６．７倍であることが明らかにされた（図１を参照のこと）。ガレクチン２（ＬＧＡＬＳ２）は患者ＲＣＣ０１にて過剰発現されており、ケラチン１８（ＫＲＴ１８）は患者ＲＣＣ１３で過剰発現されていた。マイクロアレイと定量ＰＣＲの間の一致における例外は、患者ＲＣＣ１３での、ＫＩＡＡ０３６７とｍｅｔ  原癌遺伝子（ＭＥＴ）の過剰発現であった。
【００７６】
ＭＨＣクラスＩリガンドの同定
合計８５個のリガンドが腫瘍組織から得られた。これらは、ＨＬＡ−サブタイプＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ＊６８、ＨＬＡ−Ｂ＊１８またはＨＬＡ−Ｂ＊４４に結合した。ＨＬＡ−Ａ＊０２に結合するペプチドは、対立遺伝子特異的ペプチドモチーブ（２位にロイシン、バリン、イソロイシン、アラニン、メチオニン、Ｃ−末端にロイシン、バリン、イソロイシンまたはアラニン）を反映した。ほとんどのリガンドが豊富に発現されているハウスキーピングタンパク質由来のものであるが、腫瘍関連性が報告されたタンパク質由来のリガンドも検出することができ、例えば、ｍｅｔ−原癌遺伝子由来のＹＶＤＰＶＩＴＳＩ、ケラチン１８由来のＡＬＬＮＩＫＶＫＬ、およびアジポフィリン由来のＳＶＡＳＴＩＴＧＶも検出できた。
【００７７】
ＨＬＡ−Ａ＊６８リガンドは、そのアンカーアミノ酸である２位のスレオニン、イソロイシン、バリン、アラニンまたはロイシンと、Ｃ−末端のアルギニンまたはリジンによって同定された。アジポフィリンに由来する２つの他のリガンドが、ＨＬＡ−Ａ＊６８提示ペプチド、ＭＴＳＡＬＰＩＩＱＫおよびＭＡＧＤＩＹＳＶＦＲの中から発見された。２位にグルタミン酸を持つリガンドはＨＬＡ−Ｂ＊４４とした。なぜなら、ＨＬＡ−Ｂ＊１８のペプチドモチーブが未知であるので、これらの２つのＨＬＡ−Ｂ分子のリガンド間の区別は不可能であるからである。
【００７８】
マイクロアレイデータと、単離したリガンドとの比較により、ＭＨＣリガンドの供給源として、１０個の過剰発現されている遺伝子が示された。それらは、アジポフィリン、ＫＩＡＡ０３６７、ＳＥＣ１４様１、Ｂ細胞転座遺伝子１、アルドラーゼＡ、サイクリンＤ１、アネキシンＡ４、カテニンα１、ガレクチン２およびＬＭＰ２である。これらのうち、ＫＩＡＡ０３６７、アルドラーゼＡおよびカテニンα１の３つは、ＳＥＲＥＸデータベース中にも含まれていた。
【００７９】
最も興味深いリガンドは、患者ＲＣＣ１３から同定された。これは、ＤＥＡＤ／Ｈ−ｂｏｘポリペプチド３（ＤＤＸ３）と比較して１ヌクレオチドのシフトがある “読み枠“によってコードされる（ＡＬＡＡＶＶＴＥＶ）。ＡＬＡＡＶＶＴＥＶは、ＤＤＸ３のコーディング鎖のヌクレオチド３１７〜３４３によってコードされ、一方、ヌクレオチド３１６〜３４２は、ＤＤＸ３タンパク質のＧＩＧＳＲＧＤＲＳをコードしている。
【００８０】
正常なＣＤ８＋  Ｔ細胞レパートリー中の特異的Ｔ細胞の検出
６個のＨＬＡ−Ａ２陽性の腎細胞癌患者由来のＰＢＭＣは、４つの関連ペプチド：アジポフィリン、ケラチン１８、ＫＩＡＡ０３６７およびｍｅｔ−原癌遺伝子からのＨＬＡ−Ａ＊０２拘束リガンドに対する反応について試験した。この際、非常に感度の良い定量ＰＣＴアッセイを行って、ペプチドでの７日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感作の後のＣＤ８＋  Ｔ細胞によるγ−インターフェロン−ｍＲＮＡの生産を検出した。散発的な応答が、ｍｅｔ−原癌遺伝子またはケラチン１８またはアジポフィリンペプチドでの刺激の後に見られた。
【００８１】
腫瘍患者および健常な個体のＰＢＭＣの、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマーでの染色は、アジポフィリン、ケラチン１８またはｍｅｔ−原癌遺伝子いずれかによる再構築したテトラマーを用いて実施された。
【００８２】
図２は、ケラチン１８特異的Ｔリンパ球の検出を示している。この目的のために、４人の健常なＨＬＡ−Ａ＊０２ドナー（ＨＤ１、２、４、６）からのＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ２／ケラチン１８−ＰＥテトラマー、ＨＬＡ−Ａ２／ＣＭＶ−ＡＰＣテトラマー、ＣＤ８−ＰｒｅＣＰおよびＣＤ４−ＦＩＴＣで同時に染色した。ドットプロットは、１×１０6個のＰＢＭＣについての３つの別々の実験の１つによる試料を示している。プロットには、ＣＤ８＋ＣＤ４−集団のうちのテトラマー＋細胞の割合が示されている。
【００８３】
思いがけなく、ケラチン１８に特異的なＣＤ８＋Ｔリンパ球の有意な集団（ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．０２％から０．２％の間の）が、２２人の健康な個体のうち４人で見られた。この集団は、ＣＭＶテトラマーでは染色されず、このことは、ケラチン１８テトラマーの結合が特異的であることを示している。
【００８４】
まとめると、ケラチン１８−ペプチドに特異的なＣＤ８＋  Ｔリンパ球が、ヒトＴ細胞レパートリー内に含まれると結論づけることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、選択された遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析を示している。
【図２】図２は、ケラチン１８特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の検出を示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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