(57)【要約】Ｇβγのホスデューシン部位に結合することができる作用物質を投与することによる心臓、心筋または心筋細胞Ｉの収縮能を増大する方法が提供される。当該ホスデューシン結合部位は、好ましくはＮ末端欠失ホスデューシンの結合部位である。さらに、心筋の収縮能を増大することができる化合物を同定する方法、およびＧβγ媒介性プロセスを抑制することができる化合物を同定する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇβγのホスデューシン結合部位に結合することが可能な作用物質を投与することによる、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大する方法。
【請求項２】
前記作用物質がポリペプチドである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが活性ホスデューシン、活性Ｎ末端欠失ホスデューシン、または活性ホスデューシンもしくは活性Ｎ末端欠失ホスデューシンの機能保存性変異体である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドがＮ末端欠失ホスデューシンまたはその機能保存性変異体である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが天然ホスデューシンの少なくとも３０〜６０個のＮ末端アミノ酸を欠く請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが天然ホスデューシンの２１７〜２３１個のアミノ酸を含む請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドがアミノ酸配列ＦＬＮＥＹＧＬＬを含む請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記作用物質がＧβγに対する抗体である請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記作用物質がアプタマーとして機能する核酸である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記作用物質が非ポリペプチド薬である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記作用物質がＮ末端欠失ホスデューシンのＧβγ上の結合部位に結合する請求項１記載の方法。
【請求項１２】
Ｇβγのホスデューシン結合部位に結合することが可能なポリペプチドまたは核酸をコードするベクターを投与することによる、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大する方法。
【請求項１３】
前記ベクターが請求項３に記載するポリペプチドをコードする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
アンチセンスメカニズムによりＧβγコンポーネントの発現を抑制する核酸を投与することによる、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大する方法。
【請求項１５】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能保存性変異体、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、天然ホスデューシンの少なくとも５０個のＮ末端アミノ酸を欠くポリペプチド、および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
の群から選択される、活性Ｎ末端欠失ホスデューシン。
【請求項１６】
（ａ）配列番号１の配列を有する核酸または遺伝暗号の縮重に基づく任意の変異体、
（ｂ）その相補鎖が高緊縮条件下で配列番号１の核酸配列を有する核酸とハイブリダイズする核酸、および
（ｃ）配列番号１の配列と少なくとも８０％同一の配列を有する核酸
の群から選択される、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンをコードする核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載するヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１８】
アデノウイルスベクターである請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
体細胞遺伝子療法に有用なガットレス（gutless）ベクターである請求項１８記載のベクター。
【請求項２０】
Ｇβγのホスデューシン結合部位に結合することが可能な抗体またはアプタマー。
【請求項２１】
ホスデューシン結合部位でＧβγと結合することが可能な化合物を同定する方法であって、
（ａ）所定濃度のＧβγおよび所定濃度のホスデューシン、Ｎ末端欠失ホスデューシンまたはその機能保存性変異体を含む混合物を、前記ホスデューシン、Ｎ末端欠失ホスデューシンまたはその機能保存変異体のＧβγとの結合を可能にする条件下でインキュベートする工程、
（ｂ）Ｇβγと結合できる可能性がある所定濃度の試験化合物の存在下において、前記工程（ａ）に記載する条件下で前記工程（ａ）に記載する混合物をインキュベートする工程、および
（ｃ）前記工程（ａ）における混合物より高い濃度で、前記工程（ｂ）における混合物中にホスデューシン、前記Ｎ末端欠失ホスデューシンまたは前記Ｇβγと結合しない前記変異体を提供する試験化合物を選択する工程
を含む方法。
【請求項２２】
前記工程（ｂ）が、前記試験化合物を前記工程（ａ）に記載する混合物に添加することにより実行される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
筋細胞の収縮能を増大する化合物を同定する方法であって、
（ａ）好ましくはβアドレナリン作動性受容体アゴニストによる、刺激後の単離筋細胞の収縮能を測定する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）と同様に単離筋細胞の収縮能を測定する工程であって、その際、前記筋細胞がその収縮能を増大する可能性がある試験化合物に曝露される工程、および
（ｃ）前記工程（ａ）におけるよりも前記工程（ｂ）においてより高い収縮能を生じる試験化合物を選択する工程
を含む方法。
【請求項２４】
前記筋細胞が心筋細胞である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
心筋の収縮能を増大する化合物を同定する方法であって、請求項２３記載の方法が請求項２１記載の方法の工程（ｃ）において選択される化合物を用いて実行される方法。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれか記載の方法により得られたか、または得ることが可能な化合物。
【請求項２７】
心臓の筋細胞の収縮能を増大する方法であって、ホスデューシン、その機能保存性変異体またはそれをコードする核酸を投与することを含む方法。
【請求項２８】
Ｇβγ媒介性プロセスを抑制する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）所定濃度でＧβγおよびＧβγ媒介性プロセスの下流コンポーネントを含む混合物をインキュベートする工程であって、その際、前記コンポーネントが前記混合物中でＧβγ媒介性プロセスにより制御される工程、
（ｉｉ）Ｇβγ、Ｇβγ媒介性プロセスの前記下流コンポーネントおよびＧβγ媒介性プロセスを抑制する可能性がある試験化合物を含む混合物を、前記工程（ｉ）と同様の条件下でインキュベートする工程、および
（ｉｉｉ）前記Ｇβγ媒介性プロセスにおいてＧβγを抑制する試験化合物を選択する工程
を含む方法。
【請求項２９】
前記コンポーネントがホスホリパーゼＣβであり、前記混合物がさらにホスファチジルイノシトールを含有し、そして前記抑制がホスホリパーゼＣβの酵素活性により定まる請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
細胞におけるＧβγ媒介性プロセスを抑制する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）Ｇタンパク質結合受容体のアゴニストとともに細胞をインキュベートし、Ｇβγ媒介性プロセスのコンポーネントの量または活性によるシグナルを測定する工程、
（ｉｉ）前記アゴニストおよびＧβγ媒介性プロセスを抑制する可能性がある試験化合物とともに細胞を前記工程（ｉ）と同様の条件下でインキュベートし、前記Ｇβγ媒介性プロセスの前記コンポーネントの量または活性による上記シグナルを測定する工程、および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉ）におけるよりも前記工程（ｉｉ）においてより低い前記コンポーネントの量または活性を生じる試験化合物を選択する工程
を含む方法。
【請求項３１】
前記コンポーネントが、その活性がその酵素活性により定まるホスホリパーゼＣβである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記コンポーネントがブラジキニンＢ１受容体である請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が筋細胞、好ましくは心筋である、請求項３０記載の細胞におけるＧβγ媒介性プロセスを抑制する化合物を同定する方法。
【請求項３４】
筋細胞の収縮能を増大する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）ホスデューシンのＧβγタンパク質複合体への結合部位の三次元構造を定める一組の原子座標を得る工程、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた原子座標を用いて合理的薬剤設計を実施することにより試験化合物を選択する工程であって、該選択はコンピューターモデリングを伴って実施される工程、
（ｉｉｉ）前記試験化合物を筋細胞と接触させる工程、および
（ｉｖ）前記筋細胞が所定の収縮能を示す所定条件下で収縮能を測定する工程
を含み、
その非存在下と比較して試験化合物の存在下でより高い収縮能が認められる場合に収縮能を増大する化合物として試験化合物が同定される方法。
【請求項３５】
Ｇβγ媒介性プロセスの阻害剤として用いるための化合物を同定する方法であって、
（ｉ）ホスデューシンのＧβγタンパク質複合体への結合部位の三次元構造を定める一組の原子座標を得る工程、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた原子座標を用いて合理的薬剤設計を実施することにより試験化合物を選択する工程であって、該選択はコンピューターモデリングを伴って実施される工程、
（ｉｉｉ）Ｇβγ媒介性プロセスの測定を可能にする混合物中で、前記試験化合物をＧβγと接触させる工程、および
（ｉｖ）Ｇβγ媒介性プロセスを測定する工程
を含み、
その非存在下と比較して試験化合物の存在下でＧβγ媒介性プロセスの活性の減少が認められる場合にＧβγ媒介性プロセスを抑制する化合物として試験化合物が同定される方法。
【請求項３６】
Ｇβγと結合できる可能性がある化合物を同定するためのスクリーニングキットであって、標識されていてもよい活性Ｎ末端欠失ホスデューシンおよびＧβγを含むスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の技術分野］
本発明は、うっ血性心不全の治療に関する。特に本発明は、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大する方法に関する。さらに本発明は、筋肉、特に心筋または心筋細胞の収縮能を増大することが可能な化合物を同定する方法に関する。最後に本発明は、抗体を含む新規のタンパク質、ならびに本発明の方法に有用なポリヌクレオチドおよびベクターに関する。
【０００２】
［発明の背景］
うっ血性心不全は、米国で約５００万人の人々が罹患している慢性疾患である。うっ血性心不全を罹患した患者の５年死亡率は現在５０％のレベルであるが、特定の形態または付加的な合併症が死亡率の劇的な増大をもたらしている。うっ血性心不全は、心臓が収縮能に対する異常に高い要求に長時間対処しなければならない場合に発症する。そのような異常に高い要求は、高血圧や心筋虚血のような心臓血管性疾患、あるいは心筋症または先天性心疾患により引き起こされ得る。
【０００３】
うっ血性心不全の慣用的薬剤療法は、心拍出量の増大ならびに肺うっ血および末梢浮腫の軽減を対象とする。心拍出量は慣用的には、心筋収縮の力および速度を増強することにより心筋収縮能を刺激する筋変力作用陽性物質の投与により増大される。うっ血性心不全の治療のための最も古くそして依然として最も重要な薬剤は、強心配糖体をベースにしている。強心配糖体は、心筋に、より具体的には、膜に結合したＮａ＋およびＫ＋依存性アデノシントリホスファターゼに直接作用する、密接に関連した天然生成物の一群を代表するものである。生理学的条件下では、この酵素はＡＴＰを加水分解し、濃度勾配に抗して細胞外Ｋ＋と細胞内Ｎａ＋との交換を行わせる。強心配糖体は、この膜結合酵素の外表面にある特異的受容体部位に結合する。また、配糖体による能動輸送系は、細胞内Ｎａ＋の増大および細胞内Ｋ＋の低減をもたらす。Ｎａ＋の蓄積は、Ｎａ＋／Ｃａ２＋キャリヤー系により調節されるＣａ２＋の流入増大と結びついている。その結果、より多くのＣａ２＋が筋原線維との相互作用に利用可能となる。
【０００４】
強心配糖体は、所望の陽性の筋変力作用および心拍数低減を含む複雑な作用の組合せを示す。１．５〜２．５という非常に狭い治療範囲のために、強心配糖体を用いた療法は難しい。患者の中には、少なくとも部分的には治療効果をもたらすのに必要な用量で、毒性症状が観察される者もいる。強心配糖体の毒性は、心臓外および心臓に対する作用の両方を含む。心臓毒性は不整脈を引き起こし、重度の場合には、これがさらに心室細動を引き起こして、その後の収縮期停止および死亡という結果をもたらす。
【０００５】
強心配糖体はうっ血性心不全の経過および症状を改善することができるが、しかし死亡率の改善は慣用的な筋変力作用陽性物質を用いて実証されているわけではない。
【０００６】
したがって、うっ血性心不全の治療のための代替療法の開発ならびに陽性の筋変力作用を有する作用物質の同定が、強く望まれる。陽性の筋変力作用を有する物質の同定は、今のところ、心臓の収縮能が基づくとされる既知の生化学的メカニズムにより限定されている。その結果、代替療法の開発の可能性も非常に限定されている。
【０００７】
Ｇβγは、多数の膜結合受容体のシグナルトランスデューサとして作用するＧタンパク質中の二量体タンパク質複合体である。Ｇタンパク質は、ＧＴＰ／ＧＤＰ結合αサブユニットと緊密に結合したＧβγ複合体とからなる膜結合へテロ三量体タンパク質複合体である。Ｇタンパク質に媒介されるシグナル伝達は、種々の調節制御を受けやすい。この制御は大部分は受容体レベルで行われるが、いくつかのタンパク質は直接的相互作用によりＧタンパク質の活性を変更するといわれている。
【０００８】
ホスデューシン（phosducin）は、Ｇタンパク質のシグナル伝達を調節するＧβγ結合タンパク質の一例である（Bauer et al., 1992; Lee et al., 1992）。ホスデューシンは、網膜および松果体中に存在する（Reig, 1990）。さらにホスデューシンは脳からも精製され（Bauer et al., 1992）、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は他の組織中で検出されている（Bauer et al., 1992; Danner and Lohse, 1996）。Ｇβγと結合するホスデューシンは、Gaudet et al., 1996およびＷＯ９８／０４０４０２により知られている。
【０００９】
［発明の概要］
本発明の一課題は、うっ血性心不全の治療に有用である、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大する新規の方法を提供することである。さらに本発明の一課題は、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大することが可能な化合物を同定する方法を提供することである。
【００１０】
本発明は、Ｇβγのホスデューシン結合部位に結合することが可能な作用物質を投与することによる、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大する方法を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、Ｇβγのホスデューシン結合部位に結合することが可能なポリペプチドまたは核酸をコードするベクターを投与することによる、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大する方法を提供する。上記核酸は、例えばアプタマーである。
【００１２】
さらに、本発明は、アンチセンスメカニズムによりＧβγコンポーネントの発現を抑制する核酸を投与することによる、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大する方法を提供する。
【００１３】
さらに、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能保存性変異体、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、天然ホスデューシンの少なくとも５０個のＮ末端アミノ酸を欠くポリペプチド、および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド
の群から選択される、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンが提供される。
【００１４】
また、
（ａ）配列番号１の配列を有する核酸または遺伝暗号の縮重に基づく任意の変異体、
（ｂ）その相補鎖が高緊縮（high stringency）条件下で配列番号１の核酸配列を有する核酸とハイブリダイズする核酸、および
（ｃ）配列番号１の配列と少なくとも８０％同一の配列を有する核酸
の群から選択される、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンをコードする核酸が提供される。
【００１５】
本発明はさらに、上記の方法で用いられる化合物を同定するスクリーニング方法を提供する（以下参照）。
【００１６】
本発明は、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能に及ぼす、ホスデューシンとＧβγとの細胞内結合の作用に基づいている。さらに本発明は、細胞外刺激、例えばアドレナリンのようなβアドレナリン作動性受容体アゴニストに対する心臓、心筋または心筋細胞の感受性に及ぼす、細胞内で提供されるホスデューシンの作用の認識に基づいている。心臓、心筋または心筋細胞の収縮能および感受性の増大と、ホスデューシンとＧβγの結合との間の因果関係の認識が、慢性うっ血性心不全の療法への新規のアプローチを提供する。本発明は、心不全のマウス疾患モデルにおける全長ホスデューシンの過剰発現が心不全の発症にいかなる陽性作用も示さなかったという知見に鑑みれば、特に驚くべきことである（参照例１参照）。
【００１７】
Ｎ末端欠失ホスデューシン（「ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン」）の過剰発現が生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での遺伝子移入後の正常および欠陥心筋細胞の両方において明らかな陽性の筋変力作用をもたらす、ということを実施例は示す。さらに、心不全を有するウサギにおいて、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）遺伝子移入後の心臓機能は明らかに改善された。これらの結果は、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンがＧβγ媒介性経路の抑制によりその陽性作用を発揮する、ということを示唆する。緊張性交感神経副腎性の神経活性化および機械的負荷がない状態での心筋活動に及ぼすｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン過剰発現の直接的な機能的意義を確定するために、生体外での遺伝子移入後の正常または欠陥心臓から単離された左心室心筋細胞の収縮能が測定された（実施例３）。ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン存在下での単離心筋細胞のイソプロテレノール依存性収縮能の明らかな増大が観察された。また、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの過剰発現は、正常および欠陥心筋細胞の両方の基礎収縮および最大収縮能を強化した。さらに、濃度−収縮能曲線の明らかな左方へのシフトが起きた（図５）。ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの過剰発現が収縮能を増大し、生体内での遺伝子移入後の心不全のさらなる悪化を防止する、ということも見出された（図６）。
【００１８】
［発明の詳細な説明］
定義
本明細書中で頻繁に用いられる特定の用語の理解を容易にするために、以下の定義を提示する。
【００１９】
「ホスデューシン」といったときは、特に、配列番号２で記述されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能保存変異体、例えば任意の全長野生型ホスデューシン分子を指す。上記のホスデューシンは、好ましくは哺乳類型、最も好ましくはヒト型である。
【００２０】
本明細書中で用いる場合、「活性Ｎ末端欠失ホスデューシン」または「ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン」といったときは、Ｃ末端ペプチド配列の少なくとも一部を含有するが、Ｎ末端ドメインの少なくとも一部を欠く、全長野生型ホスデューシンの断片またはその機能保存変異体を指し、リン酸化により生理学的条件下で不活性化されていてもよい。好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個、さらに好ましくは少なくとも５０個のＮ末端アミノ酸が欠失している。活性Ｎ末端欠失ホスデューシンの一つの具体例は、配列番号２で記述されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。全長野生型ホスデューシンのＮ末端部分の欠失に加えて、末端欠失ホスデューシン中のリン酸化可能アミノ酸を生理学的条件下でリン酸化されないアミノ酸に交換することも可能である。活性Ｎ末端欠失ホスデューシンは、Ｇβγに結合可能であり、それによりＧβγ媒介性プロセスが抑制される。本明細書中に開示されるように、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンは、複数の手段により、例えばホスデューシンのタンパク質分解的消化、化学合成、さらに好ましくは組換えＤＮＡ技法により産生され得る。Ｎ末端欠失ホスデューシンを発現する核酸を構築するための一般的技法は、当該技術分野における慣用的な分子生物学、微生物学ならびに組換えＤＮＡ技法である。このような技法は、文献中で十分に説明されている。例えばSambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（本明細書中では「Sambrook et al., 1989」という）；DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N.Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]；Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]；Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]；Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照せよ。
【００２１】
「Ｇβγ」といったときは、細胞膜中に存在し、７膜貫通ドメイン受容体に結合する大型ＧＴＰ結合タンパク質（「Ｇタンパク質」）のβおよびγサブユニットのタンパク質複合体を指す。Ｇβγ複合体の例は、βγＢ、βγＴ、β１γ３、β２γ３、β２γ、β１γ２である。このようなＧβγ複合体の産生は、例えばMueller et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 11781-11786に記載されている。
【００２２】
「変異体」といったときは、それぞれ、基準となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、しかし本質的な性質を保有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの典型的変異体は、そのヌクレオチド配列が当該別の（すなわち基準）ポリヌクレオチドとは異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更することもあり得るし、そうでない場合もある。ヌクレオチド変化は、下記に述べるように基準配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および末端欠失を生じ得る。ポリペプチドの典型的変異体は、アミノ酸配列が当該別の（すなわち基準）ポリペプチドとは異なる。一般に差異は、基準ポリペプチドおよび変異体の配列が全体的に非常に類似し、多くの領域で同一であるような範囲に限られる。変異体および基準ポリペプチドは、１つまたは複数の置換、付加、欠失またはそれらの任意の組合せによりアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入アミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされる場合もあるし、そうでない場合もある。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、天然のもの、例えば対立遺伝子変異体であり得るし、あるいは天然では存在が知られて変異体でもあり得る。そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発技法や直接合成によって作製され得る。
【００２３】
「ホスデューシン活性」または「ホスデューシンの生物学的活性」といったときは、Ｇβγに及ぼす上記のホスデューシンの生理学的機能、例えば類似の活性または改善された活性または望ましくない副作用の低減を伴う活性を指す。好ましくは「ホスデューシン活性」とは、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大する本発明のホスデューシン変異体の能力を指す。
【００２４】
「Ｇβγ活性」または「Ｇβγの生物学的活性」といったときは、Ｇβγ媒介性シグナル伝達経路に及ぼす上記のＧβγの生理学的機能、例えば類似の活性または改善された活性または望ましくない副作用の低減を伴う活性を指す。上記のＧβγの抗原性および免疫原性活性も含まれる。
【００２５】
「抗体」とは、本明細書中で用いる場合、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ断片、例えばＦａｂまたは別の免疫グロブリン発現ライブラリの産物を包含する。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。これは非修飾化ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは修飾化ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」としては、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはさらに典型的には二本鎖であり得る、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに「ポリヌクレオチド」といったときは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をも指す。ポリヌクレオチドという用語は、１つまたは複数の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに安定性またはその他の理由のために修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡも包含する。「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、分子の一次および二次構造のみを指し、任意の特定の三次形態にそれを限定しない。したがって、この用語は、線状または環状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、プラスミドおよび染色体中に特に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の考察に際しては、本明細書では、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同の配列を有する鎖）の配列だけを５’から３’方向に通常の取決めに従って本明細書中で記載することがある。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００２７】
本発明によれば、核酸分子は、アンチセンスメカニズムにより所望のＧβγコンポーネントの発現を抑制するために用いられ得る。このような核酸は、好ましくはＲＮＡベースの核酸であり、体液または細胞中での安定性を増大するために修飾され得る。アンチセンスＲＮＡの調製のための適切なアプローチは当該技術分野で知られており、例えばＥＢ−Ｂ１  ０  ２２３  ３９９に記載されている。
【００２８】
アプタマーは、例えば化学的に修飾されたＲＮＡ分子の大型ライブラリから標的タンパク質に対する結合親和性により単離され得るタンパク質結合性核酸分子である。本発明に関しては、アプタマーはＧβγ複合体上のホスデューシン結合部位への結合のために選択される。例えばBiotechniques (2001), 30, 1094-1096およびアプタマー取得における方法に関してそこに引用された参考文献を参照せよ。
【００２９】
核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、一本鎖形態の核酸分子が他の核酸分子とアニーリングし得る場合、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡと「ハイブリダイズ可能」である（Sambrook et al.、上記、参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「緊縮性」を確定する。相同核酸に関する予備スクリーニングのためには、５５℃のＴｍに対応する低緊縮ハイブリダイゼーション条件（例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルクおよび無ホルムアミド；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ）が用いられ得る。中等度の緊縮ハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍに対応し、例えば４０％ホルムアミド（および５×または６×ＳＳＣ）である。高緊縮ハイブリダイゼーション条件は、最高Ｔｍに対応し、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要するが、しかしハイブリダイゼーションの緊縮性によって、塩基間の不適合（mismatch）がありうる。核酸をハイブリダイズするための適切な緊縮性は核酸の長さおよび相補性の程度によるが、これは当該技術分野でよく知られた変数である。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴｍの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長より長いハイブリッドに関しては、Ｔｍを算定するための方程式が得られている（Sambrook et al.、上記、9.50-0.51参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに関しては、不適合の位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrook et al.、上記、11.7-11.8参照）。好ましくはハイブリダイズ可能な核酸の最小長は、少なくとも約１２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約２７ヌクレオチド、最も好ましくは３６ヌクレオチドである。
【００３０】
特定の実施形態では、「標準ハイブリダイゼーション条件」という用語は、５５℃のＴｍを指し、上記の条件を利用する。好ましい実施形態では、Ｔｍは６０℃であり、さらに好ましい実施形態では、Ｔｍは６５℃である。
【００３１】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾化ペプチド結合により互いに連結された２つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質、即ちペプチド同配体を指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖と、一般にタンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子にコード化された２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。「ポリペプチド」は、天然プロセス、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技術分野で既知である化学的修飾技法により修飾されたアミノ酸配列を包含する。このような修飾は、基礎的な教科書や、より詳細なモノグラフや、多数の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ポリペプチド中のどこでも、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端で起こり得る。同一種類の修飾が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位に、同一または種々の程度で存在し得る。さらに所定のポリペプチドは、多数の種類の修飾を含有し得る。ポリペプチドは、ユビキチン結合の結果として分枝され得るし、それらは分枝を伴うかまたは伴わない環状であり得る。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスに起因し得るし、あるいは合成法により作製され得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビン、ヘム部分、ビオチン、フルオレシンまたは別の蛍光染料の共有付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有付加、脂質または脂質誘導体の共有付加、ホスホチジルイノシトールの共有付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有的架橋の形成、シスチン生成、ピログルタミン酸生成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性付加（例えばアルギニル化）およびユビキチン結合が挙げられる。例えばPROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al.、「Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors」、 Meth Enzymol (1990) 182: 626-646およびRattan et al.、「Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging」、 Ann NY Acad Sci (1992) 663: 48-62を参照せよ。
【００３２】
「同一性」とは、当該技術分野で既知のように、配列を比較した場合の、２またはそれ以上のポリペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野では、「同一性」とは、このような配列間の適合性を定めるものであるが、場合によっては、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、既知の方法により容易に算定され、その例としては、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;およびSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991;およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載された方法が挙げられるが、これらに限定されない。同一性を定めるための好ましい方法は、試験される配列間の最大適合を生じるように設計される。同一性および類似性を定めるための方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに集大成されている。２つの配列間の同一性および類似性を定めるための好ましいコンピュータープログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよびその他の供給元（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）から公的に利用可能である。よく知られたスミスウォーターマンアルゴリズムも、同一性を定めるために用いられ得る。
【００３３】
好ましいポリヌクレオチドの実施形態としてはさらに、配列番号１のポリヌクレオチド基準配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９７または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドが挙げられるが、この場合、上記の基準配列は、配列番号１の配列と同一であり得るが、あるいは基準配列と比較した場合にある特定の整数までのヌクレオチド変化を含み、上記の変化は、ヌクレオチドの欠失、置換（例えば転位および転換）、あるいは挿入のうちの少なくとも１つからなる群から選択され、そして上記の変化は、基準ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置、あるいは、それら末端位置間の任意の位置にあってよく、基準配列のヌクレオチドの中にそれぞれ離れて点在していても、１ないし２以上のグループとしてかたまって存在していてもよい。
【００３４】
好ましいポリペプチドの実施形態としてはさらに、配列番号２のポリペプチド基準配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９７または１００％の同一性を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドが挙げられるが、この場合、上記の基準配列は、配列番号２の配列と同一であり得るが、あるいは基準配列と比較した場合にある特定の整数までのアミノ酸変化を含み、上記の変化は、アミノ酸の欠失、置換（例えば保存的および非保存的置換）、あるいは挿入のうちの少なくとも１つからなる群から選択され、そして上記の変化は、基準ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端位置、あるいは、それら末端位置間の任意の位置にあってよく、基準配列のアミノ酸の中にそれぞれ離れて点在していても、１ないし２以上のグループとしてかたまって存在していてもよい。
【００３５】
本発明のポリペプチド
本発明は、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチド（ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン）に関する。本発明の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドとしては、配列番号２のポリペプチド；ならびに配列番号２のアミノ酸配列を含むＮ末端欠失ホスデューシンポリペプチド；およびその全長に亘って、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＮ末端欠失ホスデューシンポリペプチドが挙げられる。さらに、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するものが非常に好ましい。Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドは、少なくともＧβγ結合性相互作用を示す。好ましくは本発明の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドは、生理学的条件下でリン酸化により不活性化されない。
【００３６】
活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であることもできるし、あるいは、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であることもできる。上記のポリペプチドは、分泌またはリーダー配列、プロ配列、精製に役立つ配列（例えば複数のヒスチジン残基）を付加的に含有したり、あるいは組換え産生中の安定性のための付加的配列を含有し得る。
【００３７】
活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドの断片も、本発明に含まれる。断片は、上記の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドのアミノ酸配列の一部と全く同一であるが、しかし全部と全く同一ではないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドに関してと同様に、断片は、それだけで単独に存在していてもよいし、それらが一部または一領域を構成する、最も好ましくは単一の連続領域としてより大きいポリペプチド内に含まれていてもよい。活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドの断片は、生物学的活性を保持せねばならない。生物学的に活性な断片は、Ｇβγと結合し、Ｇβγ媒介性受容体活性を抑制するかまたは減少させるものである。
【００３８】
上記配列および断片の変異体も、本発明の一部を形成する。好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換により基準配列から変化したもの、すなわち一つの残基を同様の特性を有する別のもので置き換えたものである。典型的なこのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；ならびに塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間；あるいは芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間である。特に好ましいのは、数個、５〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたり、そうした変換の組合せを含む変異体である。
【００３９】
本発明の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドは、任意の適切な方法で調製され得る。このようなポリペプチドとしては、単離された天然ポリペプチド、組換えにより作られたポリペプチド、合成により作られたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより作られたポリペプチドが挙げられる。
【００４０】
本発明の核酸
本発明の別の局面は、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドとしては、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドおよびその断片をコードする単離ポリヌクレオチド、およびそれと密接に関連するポリヌクレオチドが挙げられる。特に本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号２の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドをコードする、配列番号１に含有されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびに配列番号１の特定の配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはさらに、その全長に亘って、配列番号２の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにその全長に亘って配列番号１の配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。この点では、配列番号１と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも９５％の同一性を有するものが特に好ましい。さらに、少なくとも９７％の同一性を有するものは非常に好ましく、少なくとも９８〜９９％の同一性を有するものは最も非常に好ましく、少なくとも９９％が最も好ましい。増幅のため、あるいはプローブまたはマーカーとして用いるために使用可能である条件下で、その相補鎖が配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列も、本発明のポリヌクレオチド下に包含される。本発明は、このようなポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチドも提供する。
【００４１】
活性Ｎ末端欠失ホスデューシンをコードする本発明のポリヌクレオチドは、発現化配列タグ（ＥＳＴ）分析を用いてｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡライブラリーから、標準クローニングおよびスクリーニングを用いて得られる（Adams, M.D., et al. Science (1991) 252: 1651-1656; Adams, M.D., et al. Nature, (1992) 355: 632-634; Adams, M.D., et al., Nature (1995) 377 Supp: 3-174）。本発明のポリヌクレオチドは、天然供給源、例えばゲノムＤＮＡライブラリからも得られるし、あるいはよく知られた商業的に利用可能な技法を用いて合成され得る。
【００４２】
配列番号２の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１中に含有される配列と同一であり得るし、あるいはそれは、遺伝暗号の冗長（縮重）の結果として、配列番号２のポリペプチドをコードする配列でもあり得る。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドが活性Ｎ末端欠失ホスデューシンの組換え産生のために用いられる場合、そのポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドまたはその断片に関するコード配列を含み得るが、他のコード配列、例えばリーダーまたは分泌配列、プレまたはプロまたはプレプロペプチド配列、あるいはその他の融合ペプチド部分をコードするものを伴うリーディングフレーム内に、成熟ポリペプチドまたは断片に関するコード配列を包含し得る。例えば融合ポリペプチドの精製を促すマーカー配列がコードされ得る。本発明のこの局面のある種の好ましい実施形態では、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen, Inc.）中に提供され、そしてGentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 821-824に記載されたようなヘキサヒスチジンペプチドであり、あるいはＨＡタグである。ポリヌクレオチドは、非コード５’および３’配列、例えば転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列も含有し得る。
【００４４】
さらなる好ましい実施形態は、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加あるいはそれらの組合せを含む配列番号２のアミノ酸配列を含む活性Ｎ末端欠失ホスデューシン変異体をコードするポリヌクレオチドである。
【００４５】
本発明はさらに、本明細書中の上記の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点では、本発明は特に、緊縮条件下で本明細書中の上記のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いる場合、「緊縮条件」という用語は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは９７〜９９％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイズが起きることを意味する。
【００４６】
配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列と同一であるかまたは十分に同一である本発明のポリヌクレオチドまたはその断片は、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、そして活性Ｎ末端欠失ホスデューシン遺伝子と高配列類似性を有するその他の遺伝子（ヒト以外の種から相同体およびオルトログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして用いられ得る。このようなハイブリダイゼーション技法は、当業者に既知である。典型的にはこれらのヌクレオチド配列は、対象物の配列と８０％同一、好ましくは９０％同一、さらに好ましくは９５％同一である。プローブは一般に、少なくとも１５ヌクレオチドを含む。好ましくはこのようなプローブは少なくとも３０ヌクレオチドを有し、そして少なくとも５０ヌクレオチドを有し得る。特に好ましいプローブは、３０〜５０ヌクレオチドの範囲である。
【００４７】
一実施形態では、ヒト以外の種からの相同体およびオルトログを含めた活性Ｎ末端欠失ホスデューシンをコードするポリヌクレオチドを得ることは、配列番号１の配列またはその断片を有する標識化プローブを用いて緊縮ハイブリダイゼーション条件下で適切なライブラリーをスクリーニングする工程、および上記のポリヌクレオチド配列を含有する全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含む。したがって、別の局面では、本発明の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリヌクレオチドはさらに、緊縮条件下で配列番号１を有するヌクレオチド配列またはその断片とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を包含する。活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドに関しては、上記のハイブリダイゼーション条件により得られるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。このようなハイブリダイゼーション技法は、当業者によく知られている。緊縮ハイブリダイゼーション条件は上記と同様であるか、あるいは、５０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベートし、その後、約６５℃の０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件である。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、研究試薬として、ならびに動物およびヒト疾患に対する治療および診断の発見のための物質として用いられ得る。
【００４９】
ベクター、宿主細胞、発現
本発明は、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞、ならびに組換え技法による本発明のポリペプチドの産生にも関する。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いて、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。
【００５０】
組換え産生のために、宿主細胞は遺伝子操作されて、本発明のポリヌクレオチドに関する発現系またはその部分を組入れ得る。宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入は、多数の標準実験室マニュアル、例えばDavis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR  BIOLOGY (1986)およびSambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1989)に記載された方法により、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、切屑負荷、弾道的導入または感染により実行され得る。
【００５１】
適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば連鎖球菌属、ブドウ球菌属、大腸菌、ストレプトミセス属および枯草菌細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス属細胞；昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびヨトウ類(Spodoptera)Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびBowes黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。
【００５２】
非常に種々の発現系が用いられ得る。このような系としては、特に、染色体、エピソームおよびウイルス由来系、細菌プラスミド由来の、バクテリオファージ由来の、トランスポゾン由来の、酵母エピソーム由来の、挿入エレメント由来の、酵母染色体素子由来の、ウイルス（例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）由来のベクター、ならびにそれらの組合せから得られるベクター（例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメント、例えばコスミドおよびファージミド）から得られるものが挙げられる。発現系は、発現を調節し、生じさせる制御領域を含有し得る。一般に、宿主中でポリペプチドを産生するためのポリヌクレオチドを保持し、増殖し、または発現するのに適した任意の系またはベクターが用いられ得る。
【００５３】
適切なヌクレオチド配列は、任意の種々のよく知られたルーチン的な技法のいずれかにより、例えばSambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUALに記述されたものにより、発現系に挿入され得る。
【００５４】
小胞体の管腔への、細胞周辺腔への、または細胞外環境への翻訳されたタンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルが所望のポリペプチド中に組入れられ得る。これらのシグナルはポリペプチドに対して内因性であり得るし、あるいはそれらは異種シグナルであり得る。
【００５５】
活性Ｎ末端欠失ホスデューシンがスクリーニングアッセイに用いるために発現される場合は一般に、ポリペプチドが細胞の表面で産生されるのが好ましい。この場合、細胞は、スクリーニングアッセイに用いる前に採取され得る。活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドが培地中に分泌される場合、ポリペプチドを回収し、精製するために培地が回収され得る。細胞内で産生される場合、細胞はポリペプチドを回収するために溶解されねばならない。
【００５６】
活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドは、よく知られた方法により、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー，ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーにより、組換え細胞培養から回収され、精製され得る。最も好ましくは、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）が精製のために用いられる。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性される場合、タンパク質の再フォールディングのためのよく知られた技法が用いられて、活性配座を再生し得る。
【００５７】
スクリーニングアッセイ
心筋細胞中のＧβγのホスデューシン結合部位との結合は、心臓、心筋または心筋細胞の収縮能および感受性の増大を担う。したがって、心筋細胞中のＧβγの機能を抑制し得る化合物および薬剤を見出すのが望ましい。概して、本発明により同定されたＧβγシグナル伝達経路のアンタゴニストは、うっ血性心不全の治療のために療法目的で用いられる。
【００５８】
ホスデューシンの結合部位との結合により心筋細胞中のＧβγの機能を抑制し得る化合物および薬剤に関するスクリーニングは、Ｇβγのタンパク質構造に基づいた合理的薬剤設計により実行され得る。Ｇβγとホスデューシンの複合体の２．４Å分解能での結晶構造が発表されており（Gaudet et al., Cell, 87, 577-588, (1996)）、ホスデューシン／Ｇβγ構造の座標は、タンパク質データベース（登録１Ａ０Ｒ、１Ｂ９Ｘ、１Ｂ９Ｙおよび２ＴＲＣ）から入手可能である。さらにＧβγのさらなる結晶構造またはＧβγとホスデューシンまたは活性Ｎ末端欠失ホスデューシンとの相互作用は、当該技術分野で既知の一般的方法により利用可能である。Ｇβγの３−Ｄ構造に基づいて、標準ドッキングプログラム、例えばＧＲＡＭ、ＤＯＣＫまたはＡＵＴＯＤＯＣＫを用いたコンピューターモデリングの使用により、候補薬剤または作用物質が検査され得る（Goodsell et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics, 8, 195-201; Kuntz et al. (1982) J. Mol. Biol. 161, 269-288）。この手法は、Ｇβγへの候補作用物質のコンピューター適合を含む。コンピューター方法は、Ｇβγのホスデューシン結合部位に対する作用物質の吸引、反発および立体障害を概算するためにも用いられ得る。一般に、これらの特性はより緊密な結合定数と一致するため、適合が緊密であるほど（例えば立体障害が低いほど、および／または吸引力が大きいほど）、候補薬剤はより強力である。さらに候補薬剤の特異性が高いほど、薬剤は、関連タンパク質をより妨害せず、したがって、他のタンパク質との望ましくない相互作用のための候補副作用をより最小限にすると思われる。
【００５９】
化合物および薬剤は、Ｇβγの任意のホスデューシン結合部位に結合し得る。好ましくはこのような化合物は、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの結合部位に、最も好ましくは配列番号２のポリペプチドの結合部位に結合する。これらの結合部位は、Gaudet et al.（上記）の研究から得られる。
【００６０】
最初に、候補薬剤は、Ｎ末端欠失ホスデューシンに基づいて産生されるペプチドライブラリーまたは化学ライブラリをスクリーニングすることにより得られる。このように選択された作用物質は、次に、１つまたは複数の有望な候補薬剤が同定されるまで、コンピューターモデリングプログラムにより体系的に修飾され得る。この戦略に関する実例は、Lam et al., Science 263: 380-384 (1994); Wlodawer et al., Ann. Rev. Biochem. 62: 543-585 (1993); Appelt, Perspectives in Drug Discovery and Design 1: 23-48 (1993)から既知である。このようなコンピューターモデリングは、作製され得る無数の本質的に無作為な化学修飾とは対照的に、多数の合理的化学修飾の選択を可能にする。したがって、三次元構造分析およびコンピューターモデリングを用いることにより、多数のこれらの化合物がコンピューターで迅速にスクリーニングされ、２〜３の考え得る候補が手間のかかる合成を伴わずに確定され得る。
【００６１】
一旦候補薬剤が同定されれば、それは、ほとんどの大化学会社から市販されているような化学物質の市販のライブラリーから選択され得る。１つまたは比較的小群の特定化合物のｄｅ  ｎｏｖｏ合成は、薬剤設計の技術分野において合理的であり、活性作用物質にいたる途中の過度の負担とはみなされ得ない。
【００６２】
候補薬剤は次に、例えば本発明の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンの存在下でＧβγと結合するその能力に関して、競合的結合アッセイ（例えばハイスループット結合アッセイ）で試験され得る。あるいは候補薬剤は、（１）本発明のスクリーニングアッセイにおける筋細胞の収縮能を増大するその能力；あるいは（２）Ｇβγ媒介性プロセスを抑制するその能力に関して試験され得る。適切な候補薬剤が同定されると、二次構造分析が、Ｇβγおよび候補薬剤間に形成される結合複合体に関して任意に実施され得る。
【００６３】
本発明のスクリーニングアッセイの特定の実施形態において、該スクリーニングは、
（ａ）予定濃度のＧβγおよび予定濃度のホスデューシン、Ｎ末端欠失ホスデューシンまたはその機能保存性変異体を含む混合物を、ホスデューシン、Ｎ末端欠失ホスデューシンまたは機能保存変異体のＧβγとの結合を可能にする条件下でインキュベートする工程、
（ｂ）Ｇβγと潜在的に結合することが可能な所定濃度の試験化合物の存在下で（ａ）記載の条件下で（ａ）記載の混合物をインキュベートする工程、および
（ｃ）工程（ａ）の混合物より高い濃度の、工程（ｂ）の混合物中のホスデューシン、Ｎ末端欠失ホスデューシン、またはＧβγと結合しない変異体を提供する試験化合物を選択する工程を含む。
【００６４】
概して、このようなスクリーニング手法は、Ｇβγを含有する適切な混合物を提供することを含む。このような混合物としては、細胞下混合物、あるいは精製ホスデューシン変異体およびＧタンパク質媒介性シグナル伝達経路のコンポーネントを基礎にして調製される混合物が挙げられる。
【００６５】
特定の実施形態によれば、Ｇβγのホスデューシン結合部位に結合することが可能な化合物は、Shuker et al., Science 274: 1531-1534 (1996)に従ってＮＭＲベースの方法により特異的に設計され得る。このような一実施形態では、特定の化合物または低分子量化合物のライブラリーがスクリーニングされて、Ｇβγに対する結合相手を同定する。任意の化合物または任意の化学ライブラリーが用いられ得る。アッセイは、活性ホスデューシンを含有する混合物を１５Ｎ−標識化Ｇβγと接触させることで開始する。ホスデューシンとＧβγとの結合は、二次元的１５Ｎ−へテロ核単一量子相関（１５Ｎ−ＨＳＱＣ）スペクトルにおける１５Ｎ−または１Ｈ−アミド化学シフト変化をモニタリングすることにより確定され得る。次に１つまたは複数の試験化合物を含有するさらに別の混合物が１５Ｎ−標識化Ｇβγと接触させられて、試験化合物とＧβγとの結合が上記と同様に確定され得る。このようなＮＭＲスペクトルは迅速に得られるため、多数の化合物をスクリーニングすることが実行可能である。化合物は、ホスデューシンによりＧβγと結合する場合、考え得るリガンドとして同定される。さらなる工程において、試験化合物は、試験化合物を含有しない混合物と比較して、混合物中の高濃度の遊離非結合ホスデューシン、Ｎ末端欠失ホスデューシンまたは変異体を提供し得るか否かに関して、試験される。試験化合物の構造は次に、モデル構造として用いられ、化合物の類似体が得られる（例えば市販の膨大な化学ライブラリーから、あるいはｄｅ  ｎｏｖｏ合成により）。類似体は次に、Ｇβγと結合し、試験化合物を含有しない混合物と比較した場合に、混合物中により高濃度の遊離非結合ホスデューシン、Ｎ末端欠失ホスデューシンまたは変異体を提供するそれらの能力に関して再びスクリーニングされる。最初の試験化合物の類似体は、それが考え得るリガンドより高い結合親和性でＧβγと結合する場合、改良型試験化合物として選択される。この種類の好ましい実施形態では、類似体は、上記のような１５Ｎ−標識化Ｇβγへの類似体の付加時に、１５Ｎ−ＨＳＱＣ−分光分析によりスクリーニングされる。
【００６６】
さらに化合物は、Ｇβγ上の２つの隣接ホスデューシン結合部位への結合に関してスクリーニングされ得る。この場合、Ｇβγの第一部位と結合するがしかし第二隣接部位とは結合しない化合物が最初に同定される。第二部位との結合は、第一部位に関して試験化合物（または考え得るリガンド）の存在下で実行された元のスクリーンまたは第二スクリーンにおける異なる組のアミド化学シフトにおける変化をモニタリングすることにより、確定され得る。化学シフト変化の分析から、第二部位に関する候補リガンドのおよその位置が同定される。次に、構造的に関連する化合物（例えば上記のような類似体）をスクリーニングすることにより、その部位との結合のための第二リガンドの最適化が実行される。第一部位および第二部位に関するリガンドが同定されると、三元複合体中のそれらの位置および配向が、ＮＭＲ分光分析またはＸ線結晶学により実験的に確定され得る。この構造情報に基づいて、第一部位に関するリガンドおよび第二部位に関するリガンドが連結される連結化合物が合成される。この種類の好ましい実施形態では、２つのリガンドは共有結合される。この連結化合物は、それが２つの個々のリガンドのいずれかより高いＧβγに対する結合親和性を、そして活性ホスデューシンより高い結合親和性を有するか否かを確定するために、試験される。連結化合物は、それが２つのリガンドまたは活性ホスデューシンより高いＧβγに対する結合親和性を有する場合、選択される。この種類の好ましい実施形態では、試験化合物は、上記のような１５Ｎ−標識化Ｇβγへの試験化合物の付加時に、１５Ｎ−ＨＳＱＣ−分光分析によりスクリーニングされる。
【００６７】
従来技術から既知の任意のＧβγタンパク質が、このようなＮＭＲ薬剤スクリーニング手法に用いられ得る。さらに、例えば連結化合物より高いことさえあるＧβγとの親和性を有する多重連結化合物を生成するためにＧβγ上の３つの隣接部位に結合する３つのリガンドを連結することにより、同様の方法でより大型の連結化合物が構築され得る。
【００６８】
別のアッセイでは、Ｇβγは固体支持体上に置かれるかまたは固体支持体上に被覆される。固体支持体上にペプチドまたはタンパク質を置くための方法は当該技術分野で既知であり、例えばタンパク質にビオチンを連結し、そして固体支持体にアビジンを連結するような手段が挙げられる。標識され得る活性ホスデューシンは、Ｇβγへの活性ホスデューシンの結合を可能にする条件下で付加され、そして平衡させられる。その後、試験化合物は、競合的結合に関して試験するためにＧβγ／ホスデューシン複合体と平衡させられる。
【００６９】
活性ホスデューシンまたは試験化合物は、標識され得る。例えば一実施形態では、放射性標識化化合物を用いて、化合物の結合を測定する。別の実施形態では、化合物は蛍光マーカーを有する。さらに別の実施形態では、Ｇβγで被覆されたBiocoreチップ（Pharmacia）が用いられ、表面導電率の変化が測定され得る。さらなる実施形態では、放射性標識化活性ホスデューシンが、化合物の結合を測定するために用いられる。別の実施形態では、活性ホスデューシンは蛍光マーカーを有する。
【００７０】
Ｇβγ上の試験化合物の効果はまた、Ｇβγを含有する生細胞でアッセイされ得る。具体的には、本発明は、筋細胞の収縮能を増大する化合物を同定する方法であって、
（ａ）好ましくはβアドレナリン作動性受容体アゴニストによる刺激後の単離筋細胞の収縮能を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）の単離筋細胞の収縮能を測定する工程であって、それにより上記筋細胞がさらに、筋細胞の収縮能を潜在的に増大する試験化合物に曝露される、測定する工程、および
（ｃ）工程（ａ）におけるよりも工程（ｂ）においてより高い収縮能を生じる試験化合物を選択する工程を含む方法を提供する。
【００７１】
特に、本発明のホスデューシンをコードするポリヌクレオチドは、心筋細胞をトランスフェクトして、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドを発現するために用いられ得る。細胞は次に、結合、刺激または機能的応答の抑制を観察するために、試験化合物と接触される。
【００７２】
βアドレナリン作動性受容体アゴニスト（例えばアドレナリン、ノルアドレナリン）を提供することによりＧβγシグナル伝達が活性化される条件下で、有望な薬剤が試験される。上記の工程（ａ）より工程（ｂ）でより高い収縮能を生じる試験化合物が選択される。任意の筋肉細胞、好ましくは心筋細胞が用いられ得る。
【００７３】
他のスクリーニング技法は、Ｇβγ媒介性プロセスを抑制する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）予備限定濃度でのＧβγおよびＧβγ媒介性プロセスの下流コンポーネントを含む混合物をインキュベートする工程であって、それにより上記コンポーネントが混合物中のＧβγ媒介性プロセスにより制御される、インキュベートする工程、
（ｉｉ）Ｇβγ、Ｇβγ媒介性プロセスの上記下流コンポーネント、およびＧβγ媒介性プロセスを潜在的に抑制する試験化合物を含む混合物を（ｉ）と同様の条件下でインキュベートする工程、および
（ｉｉｉ）Ｇβγ媒介性プロセスにおいてＧβγを抑制する試験化合物を選択する工程を含む。
【００７４】
さらに、細胞におけるＧβγ媒介性プロセスを抑制する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）Ｇタンパク質結合受容体のアゴニストとともに細胞をインキュベートし、かつＧβγ媒介性プロセスのコンポーネントの量および活性によるシグナルを測定する工程、
（ｉｉ）上記アゴニスト、およびＧβγ媒介性プロセスを潜在的に抑制する試験化合物とともに細胞を（ｉ）と同様の条件下でインキュベートし、かつ上記Ｇβγ媒介性プロセスの上記コンポーネントの量および活性による上記シグナルを測定する工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉ）におけるよりも工程（ｉｉ）においてより低い上記コンポーネントの量および活性を生じる試験化合物を選択する工程を含む。
【００７５】
試験化合物の非存在下および存在下で産生されるレポーターの量（および／または活性）が確定され、比較される。好ましいレポーターは、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）であって、これは市販のキットを用いて定量され得る。産生されるレポーターの量（および／または活性）を低減する試験化合物は、Ｎ末端相互作用の候補アンタゴニストである。
【００７６】
これらの技法において、化合物は混合物または細胞と接触され、それにより二次メッセンジャー応答、例えばＩＰ３、ｃＡＭＰまたはＣａ２＋が次に測定されて、候補化合物がＧβγを活性化するかまたは抑制するかを確定する。
【００７７】
本発明は、上記のスクリーニング法から得られるアンタゴニストも提供する。
【００７８】
Ｇβγのホスデューシン結合部位に結合し得る可能性のある化合物（アンタゴニスト）の例としては、ペプチド模倣物、合成有機分子、天然産物、抗体または核酸（例えばアプタマー、イントラマー）が挙げられる。小分子アンタゴニストの例としては、小ペプチド、ペプチド様分子または非ペプチド分子が挙げられる。
【００７９】
本明細書中に記載された薬剤スクリーニングアッセイのすべてに関して、薬剤の構造に対するさらなる精密化が一般に必要であり、特定の薬剤スクリーニングアッセイ、例えばＮＭＲによる構造分析により提供される任意のおよび／またはすべての工程の連続的繰り返しにより成され得る。
【００８０】
本発明は、Ｇβγと結合することが可能な化合物を同定するスクリーニングアッセイにおける試薬としての活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドの使用にも関する。特に本発明のＮ末端欠失ホスデューシンポリペプチドは、Ｇβγと結合し、それを抑制する化合物（アンタゴニストと呼ばれる）に関するスクリーニングのための一プロセスに用いられ得る。したがって、本発明のＮ末端欠失ホスデューシンポリペプチドを用いて、例えばＧβγを含有する細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物混合物中の小分子およびリガンドの結合を評価し得る。これらの小分子およびリガンドは天然分子であり得るし、あるいは構造的または機能的模倣物であり得る（Coligan, et al., Current Protocols in Immunology (2): Chapter 5 (1991)参照）。
【００８１】
本発明は、Ｇβγ−結合薬（アンタゴニスト）のｄｅ  ｎｏｖｏ同定のために、または上記のような既存のアンタゴニストのさらなる精密化のために用いられ得る合理的薬剤設計方法も提供する。
【００８２】
具体的には、本発明は、筋細胞の収縮能を増大する化合物を同定する方法であって、
（ｉ）Ｇβγタンパク質複合体とのホスデューシンの結合部位の三次元構造を限定する一組の原子座標を得る工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた原子座標を用いて合理的薬剤設計を実施することにより試験化合物を選択する工程であって、該選択はコンピューターモデリングと一緒に実施される、選択する工程、
（ｉｉｉ）潜在的な作用物質を筋細胞と接触させる工程、および
（ｉｖ）筋細胞が予定収縮能を有する予定条件下で収縮能を測定する工程を含み、
その非存在下と比較して試験化合物の存在下でより高い収縮能が認められる場合に収縮能を増大する化合物として試験化合物が同定される方法を提供する。
【００８３】
さらに、本発明は、Ｇβγ媒介性プロセスの阻害剤として用いるための化合物を同定する方法であって、
（ｉ）Ｇβγタンパク質複合体とのホスデューシンの結合部位の三次元構造を限定する一組の原子座標を得ること、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた原子座標を用いて合理的薬剤設計を実施することにより試験化合物を選択することであって、該選択はコンピューターモデリングと一緒に実施される、選択すること、
（ｉｉｉ）Ｇβγ媒介性プロセスを可能にする混合物中で、試験化合物をＧβγと接触させること、および
（ｉｖ）Ｇβγ媒介性プロセスを測定することを含み、
その非存在下と比較して試験化合物の存在下でＧβγ媒介性プロセスの活性の低減が認められる場合にＧβγ媒介性プロセスを抑制する化合物として試験化合物が同定される方法を提供する。
【００８４】
本発明は、Ｇβγと結合することが可能な化合物を同定するためのアッセイキットであって、活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリヌクレオチドを含むアッセイキットにも関する。具体的には、Ｇβγと結合することが可能な化合物を同定するためのスクリーニングキットは、
（ｂ）好ましくは標識される、好ましくは配列番号２の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチド、および／または
（ｃ）Ｇβγ分子
を含む。
【００８５】
Ｇβγに対する抗体
Ｇβγは、Ｇβγに対して免疫特異的である抗体を産生するための免疫原としても用いられ得る。「免疫特異的」という用語は、抗体が、従来技術における他の関連ポリペプチドに対するよりもＧβγに対する実質的に大きい親和性を有することを意味する。
【００８６】
Ｇβγに対して産生される抗体は、ルーチンプロトコールを用いて、動物、好ましくは非ヒトに、ポリペプチドまたはエピトープ保有断片、類似体または細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製のためには、連続細胞株培養により産生される抗体を提供する任意の技法が用いられ得る。例としては、ハイブリドーマ技法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4: 72）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985）が挙げられる。一本鎖抗体の産生のための技法（米国特許第４，９４６，７７８号）も、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生するために適合され得る。さらにトランスジェニックマウスまたはその他の生物体（例えばその他の哺乳類を用いて）ヒト化抗体を発現し得る。
【００８７】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するために、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために用いられ得る。
【００８８】
Ｇβγに対する抗体はさらに、うっ血性心不全を治療または予防するために用いられ得る。
【００８９】
治療方法
本発明は、Ｇβγのホスデューシン結合部位に結合することが可能な作用物質を投与することにより心臓、心筋または心筋細胞の収縮能を増大することによるうっ血性心不全を治療する方法を提供する。
【００９０】
Ｇβγの活性が高すぎるか、または心臓の収縮能が不十分である場合、いくつかのアプローチが利用可能である。一アプローチは、Ｇβγへの結合によりＧタンパク質の活性化を抑制するのに有効な量で薬学的に許容可能な担体と一緒に本明細書中に上述されたような阻害剤化合物（アンタゴニスト）を被験体に投与することを含む。アンチセンス技法のための核酸またはアプタマーは、直接投与され得るし、あるいはそれらは遺伝子療法を用いて生体内で産生され得る。
【００９１】
遺伝子療法はさらに、被験体における関連細胞による活性Ｎ末端欠失ホスデューシンの内因性産生を実行するために用いられ得る。例えば本発明のポリヌクレオチドは、複製欠陥ウイルスベクター中での活性Ｎ末端欠失ホスデューシンの発現のために操作され（engineered）得る。ウイルス発現構築物は単離され、そして例えば本発明のポリペプチドまたは核酸遺伝子産物をコードするＤＮＡを含有するアデノウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞中に導入され得る。ヘルパーウイルスを用いて、パッケージング細胞は、当該遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生し得る。これらの産生株細胞は、生体内で細胞を操作するために、ならびに生体内でのポリペプチドの発現のために、被験体に投与され得る。遺伝子療法の概要に関しては、Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (and references cited therein) in Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996)を参照されたい。別のアプローチは、治療的量の活性Ｎ末端欠失ホスデューシンポリペプチドを適切な薬学的担体と組合せて投与することである。
【００９２】
処方物および投与
ペプチド、例えば活性Ｎ末端欠失ホスデューシン、アンタゴニストペプチド、小分子または核酸薬剤は、適切な薬学的担体と組合せて処方され得る。このような処方物は、治療的有効量のポリペプチドまたは化合物、ならびに薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。このような担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、リポソームおよびそれらの適切な組合せが挙げられるが、これらに限定されない。処方物は投与方式に合わせるべきであり、十分に当該技術分野の技術者の範囲内である。本発明はさらに、本発明の上記の組成物の１つまたは複数の成分を充填された１つまたは複数の容器を含む薬学的パックおよびキットに関する。
【００９３】
本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独で、または他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に用いられ得る。
【００９４】
薬学的組成物の全身投与の好ましい形態としては、典型的には静脈内注射による注射が挙げられる。その他の注射経路、例えば皮下、筋肉内または腹腔内が用いられ得る。あるいは全身投与のための手段としては、浸透剤、例えば胆汁酸塩またはフシジン酸またはその他の洗剤を用いた経粘膜および経皮投与が挙げられる。さらに、腸溶性または封入処方物中に適正に処方される場合、経口投与も可能であり得る。これらの化合物の投与は、軟膏剤、ペースト、ゲル等の形態で、局所的であり得るか、および／または局在化され得る。
【００９５】
必要とされる投薬量範囲は、ペプチドの選択、投与経路、処方物の性質、被験体の状態の性質、ならびに開業医の判断に拠る。しかしながら適切な投薬量は、０．１〜１００ｍｇ／被験体１ｋｇの範囲である。必要とされる投薬量における広範な変動は、利用される化合物の多様性および種々の投与経路の異なる効率を考慮して予測される。例えば経口投与は、静脈内注射による投与より高い投薬量を要すると予測される。これらの投薬量レベルの変動は、当該技術分野において十分に理解されるように、最適化のための標準経験的ルーチンを用いて調整され得る。
【００９６】
治療に用いられるポリペプチドはまた、上記のように「遺伝子療法」としばしば呼ばれる治療様式において、被験体中で内因的に生成され得る。したがって、例えば被験体からの細胞は、生体外で、そして例えばウイルスベースベクターの使用により、ポリペプチドをコードするために、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡで操作され得る。細胞は次に、被験体中に導入される。
【００９７】
あるいはＮ末端欠失ホスデューシンをコードするポリヌクレオチドを含有する複製欠陥ウイルスベクターが、患者に投与され得る。このようなウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、最も好ましくはgutlessアデノウイルスベクターであり得る（gutlessベクターに関する概要に関しては、Kochanek (1999), Human Gene Therapy 10, 2451-2459を参照されたい）。
【００９８】
［実施例］
本発明をここで、以下の実施例に基づいてさらに説明する。データはすべて、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。統計学的分析のために、反復測定のための分散の分析（ＡＮＯＶＡ）と、その後のシェッフェアッセイ、あるいは適切な場合には、両側分布を伴うスチューデントアッセイを用いた。全分析に関して、Ｐ＜０．０５の値は統計学的に有意であるとみなされた。
【００９９】
種々のＧタンパク質βγサブユニットの発現および精製は、Mueller et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 11781-11786により記載されたように実施した。
【０１００】
以下の実施例において、「ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン」とは、配列番号２の特定のホスデューシン変異体を指す。
【０１０１】
参考例１
全長ホスデューシンを過剰発現するトランスジェニックマウスのクローニング：
Engelhardt et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7059-64により記載されたように、全長ホスデューシンの配列をプラスミド中にクローン化した。標準手法に従って、過排卵ＦＶＢ／Ｎマウスからの受精卵に精製線状ＤＮＡ（１μｇ／μｌ）を注射した。注射卵細胞を、偽妊娠ＣＤ−１マウスの卵管に移した。マウスは全て、特定の無病原体施設中に保持した。これらのマウスの出産および調査は、責任能力を有する政府機関により認可された。特定のプライマーを用いてＰＣＲにより、導入遺伝子の組込みに関してＦ０世代をスクリーニングした。
【０１０２】
ネズミ疾患モデルにおける心不全の発症に及ぼす野生型全長ホスデューシンの過剰発現の作用に関して、トランスジェニックマウスを試験した。心臓欠陥マウスと、上記のように調製した全長ホスデューシンを過剰発現するマウスと交雑させた心臓欠陥マウスとの間に、心不全の程度（心臓切片の筋細胞肥大および線維症として組織学的に確定）における観察可能な差異は存在しない、ということが判明した（図８およびその凡例）。
【０１０３】
実施例１
組換えアデノウイルスの構築および精製：ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンに関する組換え（Ｅ１／Ｅ３欠損）フラッグ−タグ化アデノウイルス（Ａｄ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰ）を生成し、二シストロン系において２つの個々のＣＭＶプロモーターの制御下で、導入遺伝子およびグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させた（He et al. (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2509-14）。対照として、さらなる導入遺伝子を含有しないＡｄ−ＧＦＰを用いた。大型ウイルスストックを、従来記載されているように調製した（Laugwitz et al. (1999) Circulation 99, 925-933）。非Ｅ１発現細胞におけるプラーク滴定およびＧＦＰ発現滴定を用いて、アデノウイルス力価を確定した。
【０１０４】
実施例２
成体心室心筋細胞の調製および培養ならびにアデノウイルス感染：単一カルシウム耐性心室筋細胞をホワイトニュージーランドウサギから単離した。健常および欠陥ウサギ心臓からの心筋細胞を、同一プロトコールにより単離した（Laugwitz et al. (2001) Cir Res. 88, 688-95）。要するに、心臓を灌流し、コラゲナーゼで消化した。次に、１．５×１０５細胞／ｃｍ２（５％ＣＯ２および３７℃）の密度で、ラミニン予備被覆皿（５〜１０μｇ／ｃｍ２）上の改質Ｍ１９９中で、単離心筋細胞を再懸濁し、培養した。プレーティング（plating:平板培養）の５時間後に、細胞をアデノウイルスに感染させた（多重感染（ｍｏｉ）１ｐｆｕ／細胞）。感染心筋細胞の５０〜６０％が、この力価で導入遺伝子を発現した。アデノウイルス感染後４８時間目に、心筋細胞を採取した。細胞を均質化し、次に、ホスデューシンに対して産生されたポリクローナルウサギ抗体を用いるウエスタンブロッティングのために細胞質ゾル抽出物を用いた。Dianova(Germany)によるヤギ抗ウサギ二次抗体を、二次抗体として用いた。
【０１０５】
実施例３
単離心筋細胞中のＧβγに結合するｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの機能的結果
アデノウイルス送達後の単一細胞収縮：上記（Laugwitz et al. (2001) Cir Res. 88, 688-95）のような短縮および弛緩の振幅および速度のオンラインデジタル化評価に連結された電気−光学的モニタリングシステムにより、感染心筋細胞の収縮能を測定した。収縮振幅が安定に達した後、漸増濃度のイソプロテレノールを適用した。
【０１０６】
生体外での遺伝子移入後の欠陥および正常心臓からの単一単離心筋細胞における短縮分率および短縮の速度の測定により、心筋細胞収縮能に及ぼすｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの作用を実証する。Ａｄ−ＧＦＰ感染対照細胞と比較した場合、イソプロテレノールに応答する基礎および最大収縮能は、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン発現心筋細胞において顕著に増大された（図５Ａ）。ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの過剰発現も、イソプロテレノールに応答する欠陥心筋細胞の最大収縮振幅を増強した（図５Ｂ）。短縮速度に関して、非常によく似た結果を得た。ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン発現正常および欠陥細胞の濃度−応答曲線は、有意に左にシフトされた。ウイルス感染細胞の全バッチにおいて、ＧＦＰ−陰性心筋細胞（導入遺伝子を発現しない）も収縮能に関して試験した。これらの細胞は、非感染細胞と比較して、いかなる差異も示さず、したがって、調製物の質の比較可能性を実証した。
【０１０７】
心筋細胞における細胞内ｃＡＭＰ生成：Ｇタンパク質媒介性シグナル伝達に及ぼすｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン発現の作用を、生体外での遺伝子移入後の単離心筋細胞中のｃＡＭＰ蓄積の測定に基づいて示す。アデノウイルス感染の４８時間後に、心筋細胞を調べた。細胞を採取し、漸増濃度のイソプロテレノールで２０分間刺激した。ｃＡＭＰ分解を阻止するためのＩＢＭＸ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）の存在下での１００μｌの２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）の添加と、その後の１００℃での７分間の加熱により、反応を停止した。メーカーの使用説明書を用いて、この懸濁液を遠心分離し、上清をｃＡＭＰ特異的抗体（Stratagene、カタログ番号２０００２０）とともにＥＬＩＳＡアッセイに用いた。
【０１０８】
その結果、βアドレナリン作動性受容体アゴニストイソプロテレノールは、全群において細胞内ｃＡＭＰ含量を増大した（図３）。ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン発現心筋細胞では、イソプロテレノールに応答したｃＡＭＰ生成低減傾向が認められたが、しかしながらこれは、統計学的有意に達しなかった（図３）。全長ホスデューシンは、異なる細胞型および組織において、対照と比較して、最大βＡＲ依存性アデニリルシクラーゼ刺激性を有意に低減することさえ示されている（Bauer et al. (1992) Nature. 358, 73-76; Schulz et al. J. Biol. Chem. (1996) 271, 22546-22551）。Ｎ末端欠失および全長ホスデューシン間のわずかな差異は、ほとんどおそらくは、Ｎ末端欠失変異体のより高いＧβγ結合能力によるものであり、これは、βＡＲ依存性ｃＡＭＰ蓄積に及ぼす異なる正味作用を説明し得る。
【０１０９】
アデノウイルス送達後のＧβγ媒介性作用の抑制：２つのＧβγ依存性シグナル伝達経路に及ぼす導入遺伝子の作用を、ブラジキニンおよびアセチルコリンの両方に応答した細胞内ＩＰ３生成におけるＧβγ抑制の機能的結果に関して、図４に示す。ＩＰ３アッセイのために、アデノウイルス感染心筋細胞をそれぞれのアゴニストで１分間刺激し、過塩素酸（４％）の添加により反応を停止し、細胞を掻き取った。それらを２０００×ｇで遠心分離し、次にＫＯＨ（１０ｍｏｌ／Ｌ）１０μｌを添加した。溶液を再懸濁し、再び遠心分離して、Bradford (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254の方法により、各試料のタンパク質含量を確定した。メーカーの使用説明書に従って、ＩＰ３生成を測定するために３Ｈ−イノシトール−（１，４，５）−三リン酸および結合タンパク質（Amersham、カタログ番号ＴＲＫ１０００）を用いるアッセイキットのために、上清を用いた。
【０１１０】
実験の結果、過剰発現ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンは、生体外での遺伝子移入後の正常および欠陥心筋細胞の両方において、明らかな陽性の筋変力作用を生じる、ということが示される。
【０１１１】
緊張性交感神経副腎性神経活性化および機械的負荷の非存在下での心筋動作に及ぼすｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン過剰発現の直接的機能的意義を、生体外での遺伝子移入後の正常または欠陥心臓から単離した左心室心筋細胞の収縮能に基づいて実証する。ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの過剰発現は、正常または欠陥心筋細胞の両方の基礎収縮および最大収縮能を増強する。さらに濃度−収縮能曲線の明らかな左方シフトが起きた（図５）。
【０１１２】
実施例４
生体内でＧβγと結合するｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの機能的結果：
心不全モデル：メドトロニック（Mectronic）製ペースメーカーをニュージーランドホワイトウサギ（体重３．６±０．３ｋｇ；Harlan, Munich, Germanyから）に埋め込んだ。２日後に、３２０拍／分で高頻度ペーシングを開始した。このプロトコール下で、頻脈誘発性心不全（ＨＦ）が１週間にわたって再現可能的に発症する。次にペーシングを３６０拍／分で継続したが、これは、予測可能的に心不全のさらなる悪化をもたらした。欠陥心臓における平均収縮能は、２２００±３２０ｍｍＨｇ／秒（これに対して健常対照では４０００±３９０ｍｍＨｇ／秒；ｐ＜０．０５）であり、ＬＶＥＤＰは３．６±０．４ｍｍＨｇから１３．５±１．２に増大した（ｐ＜０．０５）。
【０１１３】
ウサギ心筋へのアデノウイルス遺伝子移入：高頻度ペーシングの１週間後、全ウサギに、以前に記載されたのと同様に（Weig et al. (2000) Circulation 101, 1578-1585）、心筋へのカテーテルベースのアデノウイルス遺伝子移入（５×１０９ｐｆｕ）を施した。インターベンションのために、ウサギをフェンタニルおよびプロポフォールで麻酔した。
【０１１４】
全導入遺伝子はＧＦＰとともに二シストロン的に発現されるため、生体内での遺伝子移入後の心臓におけるＧＦＰの同時発現を試験することにより、全導入遺伝子の過剰発現を調べた。全心臓における遺伝子移入の効力を評価するために、新鮮組織分析のための心筋の横断凍結切片を、実験終了後に得た。薄片を標準的方法により、ヘマトキシリン／エオシンおよびバイゲルト染色で染色した。蛍光顕微鏡を用いて凍結切片で、ＧＦＰの発現を調べた。Ａｄ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰに感染させたウサギ心臓の肉眼的薄片中に例示的に示されたように、左心室全体でＧＦＰ同時発現を確定し得た（図１）。ウエスタンブロッティングは、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの発現が特異的抗体を用いて検出可能であり、導入遺伝子は全長ホスデューシンより６ｋＤ小さいことを実証した（図２）。
【０１１５】
遺伝子移入の領域の形態学的変化を評価するために、４％パラホルムアルデヒドを用いて逆方向に心臓を灌流し、ブアン溶液で後固定し、５μｍ薄片に切断した。
【０１１６】
心エコー検査および心室内チップカテーテル法による心筋収縮能測定：高頻度ペーシングの開始前、アデノウイルス遺伝子移入前、ならびにプロトコール終了時（ペーシング開始後２週間目および遺伝子移入後１週間目）に、左心室収縮能を検査した。上記と同様にウサギを麻酔した。ＥＣＧを継続的にモニタリングした。
【０１１７】
心エコー検査のために、７．５ＭＨｚプローブを三脚に固定した。標準切片を記録したが、これは十分に再現可能であった。チップカテーテル測定のために、鑑別装置に接続したMillar３Ｆチップカテーテルを左心室に入れた。基礎収縮能および左心室圧の範囲を限定後、２００μＬのＮａＣｌ（０．９％）を負の対照として注射した。イソプロテレノールを漸増用量で注入した。十分な平衡期間後、チップカテーテル測定を実行した。
【０１１８】
アデノウイルス送達後のペーシング誘発性心不全におけるＬＶ機能不全の改善：１週間の高頻度ペーシング後にＡｄ−ＧＦＰおよびＡｄ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰをウサギ心臓に直接送達し、３６０ｂｐｍでのさらに１週間のペーシング後に、血行力学的パラメーターを測定した。この目的のために、連続心エコー検査を実験を通して実行した。広範チップカテーテル処置により、全実験を終了させた。図６Ａおよび図６Ｂは、全群の血行力学的測定からの結果を示す。
【０１１９】
ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン発現群では、ＬＶ圧の一次微分係数（ｄｐ／ｄｔ  ｍａｘ）およびイソプロテレノールに応答した収縮期ＬＶ圧の増大の両方が、Ａｄ−ＧＦＰ感染対照群の場合より有意に高かった。
【０１２０】
ＬＶ短縮分率（ＦＳ）を連続心エコー検査により追跡調査し、遺伝子移入前および実験終了時のＦＳの割合を確定した。ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン発現群では、ＦＳは高頻度ペーシングの第二週中は変化しなかったが、一方、Ａｄ−ＧＦＰ感染群では、ＦＳの明らかな低減が起きた（図７）。
【０１２１】
本実施例の結果、導入遺伝子の生体内での遺伝子移入後の心不全ウサギにおいて心機能は明らかに改善される、ということが示された。これらの結果は、βアドレナリン作動性受容体の再感作と関連しないそれらのＧβγ媒介性経路の抑制により、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンがその陽性作用を発揮する、ということを示す。さらに、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの過剰発現が収縮能を増大し、生体内での遺伝子移入後の心不全のさらなる悪化を防止した、ということも示される（図６）。
【０１２２】
要するに、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンにより誘導される収縮能の増強は明らかに、細胞内ｃＡＭＰ蓄積の増大とは無関係であり、したがって、ほとんどおそらくは受容体の再感作と無関係である、と結論づけられ得る。
【０１２３】
心不全における心臓収縮能に及ぼすｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの有益な作用は、Ｇβγを引き離す、したがって、Ｇβγ依存性経路、例えばホスホリパーゼＣ−βおよびホスファチジルイノシトール（ＩＰ３）（Clapham et al. Nature. (1993) 365, 403-6）または分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼを抑制するそれらの能力によっている。ＭＡＰおよびＰＩ３−キナーゼ活性は、近年、活性化Ｇβγ−βＡＲＫにより抑制されることが示された（Luttrell et al. Science (1999) 283, 655-61; Naga-Prasad et al. J. Biol. Chem. (2000) 275, 4693-4698）。
【０１２４】
実施例５
細胞中のＧβγ媒介性プロセスの抑制：ホスデューシントランスフェクト化心筋を用いたホスホリパーゼＣ活性アッセイ
ＩＰ３アッセイのために、Ａｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰに感染させた心筋（実施例１）を、１μｍｏｌ／Ｌブラジキニンまたは１０μｍｏｌ／ｌアセチルコリンで１分間刺激した。さらに、アゴニストの非存在下で基礎レベルを確定した。次に、過塩素酸（４％）の添加により反応を停止し、細胞を掻き取った。それらを２０００×ｇで遠心分離し、次にＫＯＨ（１０ｍｏｌ／Ｌ）１０μｌを添加した。溶液を再懸濁し、再び遠心分離して、Bradford２２の方法により、各試料のタンパク質含量を確定した。メーカーの使用説明書に従って、ＩＰ３生成を測定するために３Ｈ−イノシトール−（１，４，５）−三リン酸および結合タンパク質（Amersham、カタログ番号ＴＲＫ１０００）を用いるアッセイキットのために、上清を用いた。結果を図４に示す。データは、５つの個々の実験の平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン。
【０１２５】
実施例６
細胞中のＧβγ媒介性プロセスの抑制：潜在的な阻害剤の存在下での心筋を用いたホスホリパーゼＣ活性アッセイ
実施例５に記載したのと同様にＩＰ３アッセイを実施したが、ただし、非トランスフェクト化心筋を用い、これをＧβγ媒介性プロセスの潜在的な阻害剤１ｍＭとともに１０分間インキュベートした後、１μｍｏｌ／Ｌブラジキニンまたは１０μｍｏｌ／ｌアセチルコリンで刺激した。
【０１２６】
実施例７
精製タンパク質を用いたｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンによるＧβγ刺激性ホスホリパーゼＣ−β２活性の抑制
Dietrich et al., (1994) Eur. J. Biochem. 219, 171-178により記載されたように、末端欠失ホスホリパーゼを用いて、ホスホリパーゼＣ活性を確定した。［３Ｈ」−ホスファチジル４，５−二リン酸を基質として用いた。Ｇβγの濃度は６００ｎＭ、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの濃度は１００μＭであった。活性は１分間に生成されるイノシトール１，４，５−三リン酸（ｐｍｏｌ）として表す。
【０１２７】
実施例８
精製タンパク質を用いた潜在的な阻害剤によるＧβγ刺激性ホスホリパーゼＣ−β２活性の抑制
実施例７の場合と同様に、ホスホリパーゼＣ活性を確定したが、ただし、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの代わりに１００μＭの潜在的な有機化学阻害剤を用いる。
【０１２８】
実施例９
潜在的な阻害剤の存在下および非存在下でのホスデューシンのＧβγ結合能力の確定
実施例１１に従って、Ｈｉｓタグ化ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンを生成した。精製６×Ｈｉｓ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン（２５０ｐｍｏｌ）を、０．０５％コール酸塩を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水（１４０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのＫＣｌ、６．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．３）２００μｌ中で、ウシ脳（または別の動物の脳）から精製した１３０ｐｍｏｌのＧβγおよび５００ｐｍｏｌの潜在的な阻害剤とともにインキュベートする。次にタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂３０μｌと結合させる。短時間遠心分離を介入させながら潜在的な阻害剤の存在下で同一緩衝液中でビーズを洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液中にビーズを取り出し、その後ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動し、かつγサブユニットに対する抗体（Signal transduction laboratories）を用いたウエスタンブロッティングにより結合Ｇβγを検出する。ペルオキシダーゼ結合抗体を用いて、ブロッティングシグナルを検出する。
【０１２９】
対照として、潜在的な阻害剤を省いた以外は同一のアッセイを実施する。これは、Ｇβγとホスデューシン変異体との最大結合を示す。
【０１３０】
実施例１０
ホスデューシンの結合部位でＧβγに結合することが可能な化合物に関するスクリーニング
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．６および０．００５％コール酸塩（インキュベーション緩衝液）１００μｌ中で、４℃で少なくとも４時間、３００ｎｇのβγ−複合体で微小滴定プレートのウエルを被覆した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充した同一氷冷緩衝液（洗浄緩衝液）で、ウエルを数回洗浄した。洗浄緩衝液中の３％ウシ血清アルブミンで遮断後、１０μｇのｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン（３μＭ）および１００μＭの潜在的なアンタゴニストをウエル中で４℃で２時間、１００μｌのインキュベーション緩衝液＋５ｍＭのＭｇＣｌ２中でインキュベートした。次に、上記と同様にウエルを洗浄し、遮断した。室温で１時間のアフィニティー精製ウサギ抗ホスデューシン抗体の付加により、結合ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンを確定した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧとともにインキュベート後、二塩酸ｏ−フェニレンジアミン（Sigma）を用いて発色反応を行ない、３Ｍの硫酸５０μｌを用いて停止させた。吸光度を４９０ｎｍで測定した。
【０１３１】
対照として、潜在的なアンタゴニストを省いた以外は、同一のアッセイを実施した。
【０１３２】
実施例１１
ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンのクローニングおよび発現
Bauer et al. (1992) Nature 358, 73-76に記載されたのと同様に、そして標準手法にしたがって、Ｈｉｓタグ化ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンを生成した。要するに、適切なプライマーを用いたＰＣＲにより、全長ホスデューシン遺伝子を含有するプラスミドから、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンをコードするＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、発現ベクターｐＱＥ３０（Qiagen）に結繋した。得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株中で形質転換させた。標準手法に従って、ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン発現を実施した．音波処理により、５０ｍＭのＮａ−リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中で細胞を溶解した。溶解物を１９，０００ｇで３０分間遠心分離し、Ｈｉｓタグ化タンパク質を上清から精製して、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen, Hilden, Germany）上でのクロマトグラフィーにより９５％均質性にした。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】心筋組織切片におけるＧＦＰ同時発現の視覚化を示す。Ａｄ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰの遺伝子移入後１週間目に、紫外線下でのウサギ心臓の凍結横断切片はグリーン蛍光を示す。
【図２】組換え大腸菌（レーン１）から、または特異的抗ホスデューシン抗体でプローブされたトランスフェクト化ＨＥＫ細胞の溶解物（レーン３）から精製された全長ホスデューシンと比較した場合の、Ａｄ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰの遺伝子移入後の細胞抽出物（レーン２）のウエスタンブロットを示す。レーン４は、負の対照としての偽トランスフェクト化ＨＥＫ細胞からの溶解物を示す。小型サイズのｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン（２７ｋＤ）は、全長ホスデューシン（３３ｋＤ）から容易に区別され得る。
【図３】Ａｄ−ＧＦＰまたはＡｄｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰに感染され、漸増濃度のイソプロテレノールで刺激された成体心室心筋細胞におけるｃＡＭＰ生成を示す。ｃＡＭＰ蓄積は、基線上方の倍増率として示される。データは、５つの個々の実験の平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５対ＧＦＰ。
【図４】Ａｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰに感染された心筋細胞におけるＩＰ３蓄積を示す。心筋細胞は、指示された場合、１μｍｏｌ／Ｌのブラジキニンまたは１０μｍｏｌ／ｌのアセチルコリンによる刺激後、アゴニストの非存在下（「基礎」）で調べられた。データは、５つの個々の実験の平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５対ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン。
【図５Ａ】健常心臓から単離された心筋細胞の収縮振幅。心筋細胞は、Ａｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰで生体外で感染された。短縮分率が、漸増濃度のイソプロテレノールに対して確定された。データは、平均±ＳＥＭを表す。８例の異なる心臓からの少なくとも２５の健常細胞が、全群で試験された。８例の異なる心臓からの少なくとも３０の欠陥細胞が全群で試験された。＊ｐ＜０．０５対ＧＦＰ；＊＊ｐ＜０．０１対ＧＦＰ。  ヒル（Hill）方程式を用いた非線状曲線の当てはめは、以下の概算を示した：それぞれＥＣ５０（μｍｏｌ／Ｌ）およびＥｍａｘ値；健常細胞：ＧＦＰ９±１および８．７±０．３；ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン：１０±０．１および１１．２±０．２（ｐ＜０．００１ともに導入遺伝子対ＧＦＰ）；ならびに欠陥細胞：ＧＦＰ２１．６±０．３および４．７±０．０４；ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン：１７±０．４μＭおよび７．８±０．１（ｐ＜０．００１ともに導入遺伝子対ＧＦＰ）。
【図５Ｂ】欠陥心臓から単離された心筋細胞の収縮振幅。心筋細胞は、Ａｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン−ＧＦＰで生体外で感染された。短縮分率が、漸増濃度のイソプロテレノールに対して確定された。データは、平均±ＳＥＭを表す。８例の異なる心臓からの少なくとも２５の健常細胞が、全群で試験された。８例の異なる心臓からの少なくとも３０の欠陥細胞が全群で試験された。＊ｐ＜０．０５対ＧＦＰ；＊＊ｐ＜０．０１対ＧＦＰ。  ヒル（Hill）方程式を用いた非線状曲線の当てはめは、以下の概算を示した：それぞれＥＣ５０（μｍｏｌ／Ｌ）およびＥｍａｘ値；健常細胞：ＧＦＰ９±１および８．７±０．３；ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン：１０±０．１および１１．２±０．２（ｐ＜０．００１ともに導入遺伝子対ＧＦＰ）；ならびに欠陥細胞：ＧＦＰ２１．６±０．３および４．７±０．０４；ｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシン：１７±０．４μＭおよび７．８±０．１（ｐ＜０．００１ともに導入遺伝子対ＧＦＰ）。
【図６Ａ】ＧＦＰまたはｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの遺伝子移入後１週間目のチップ特性化により確定された血行力学的機能を示す。データは平均±ＳＥＭを表す。測定はすべて、７匹の動物で三重反復試験で行なった。＊ｐ＜０．０５対ＧＦＰ。基線での、ならびにイソプロテレノールに対する左心室圧の最大一次微分係数（ＬＶ  ｄｐ／ｄｔ  ｍａｘ）。
【図６Ｂ】ＧＦＰまたはｎｔ−ｄｅｌ−ホスデューシンの遺伝子移入後１週間目のチップ特性化により確定された血行力学的機能を示す。データは平均±ＳＥＭを表す。測定はすべて、７匹の動物で三重反復試験で行なった。＊ｐ＜０．０５対ＧＦＰ。基線での、ならびにイソプロテレノールに対する最大左心室収縮期圧（ｍｍＨｇ）。
【図７】短縮分率の心エコー確定を示す。連続心エコーにより評価した場合の短縮分率における相対的低減。バーは、同一動物における遺伝子移入前の測定値で最終測定時のＦＳを割った比率を示す。測定はすべて、三重反復試験で７匹の動物において行なった。＊ｐ＜０．０５対ＧＦＰ。
【図８】トランスジェニックマウス心臓における組織学的変化。健常野生型マウスからの、およびトランスジェニック心臓欠陥モデル（「β−ＴＧ４」、Engelhardt et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7059-64参照）からのパラフィン包埋左心室心筋のヘマトキシリン／エオシン染色５μｍ切片。この心臓欠陥マウス系統と、特にそれらの心臓中で全長ホスデューシンを発現するマウスとの交雑（β１−ＴＧ４×Ｐｈｄ−ＴＧ）は、心不全表現型のいかなる組織学的改善も生じなかった（右の画像）。
【図９】全長ヒトホスデューシンのＤＮＡ配列を示す。１５６個のＮ末端塩基の欠失は、配列番号１を生じる。
【図１０】一文字暗号での全長ヒトホスデューシンのタンパク質配列を示す。５２個のＮ末端アミノ酸の欠失は、配列番号２を生じる。
【図１】
2005518187.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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