(57)【要約】  本発明はイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、前記ポリペプチドのモジュレーターを同定するための前記ポリペプチド及び核酸の使用、前記モジュレーターの同定方法、並びに殺真菌剤としての前記モジュレーターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺真菌剤の同定方法であって、
（ａ）ＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性をもつポリペプチドを化合物又は化合物の混合物と接触させ、
（ｂ）化合物又は化合物の混合物の存在下におけるＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性を化合物又は化合物の混合物の不在下におけるＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性と比較し、
（ｃ）ＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性を特異的に阻害する化合物を決定する、
ことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
段階（ｃ）で決定された化合物を１種以上の真菌と接触させることによりその殺真菌作用を確かめることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
殺真菌化合物を検出するためのＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性をもつポリペプチドの使用。
【請求項４】
殺真菌剤としてのＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性をもつポリペプチドの阻害剤の使用。
【請求項５】
植物病原性真菌を防除するためのＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性をもつポリペプチドの阻害剤の使用。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の方法により同定可能な殺真菌剤。
【請求項７】
ＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
Ｕ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードすることを特徴とする請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
１本鎖又は２本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの形態であることを特徴とする請求項７又は８に記載の核酸。
【請求項１０】
ゲノムＤＮＡのフラグメント又はｃＤＮＡの形態であることを特徴とする請求項７から９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１】
ａ）配列番号１又は配列番号３に示す配列、
ｂ）配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列、
ｃ）モチーフ［ＬＩＶＭ］−［ＲＫ］−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−ｘ−Ｇ−Ｓ−［ＬＩＶＭ］−Ｃ−ｘ−Ｔ又はコンセンサス配列−ＬＲＶＧＭＧＳＧＳＩＣＩＴ−を含むポリペプチドをコードする配列、
ｄ）少なくとも１５塩基対長であるａ）〜ｃ）に記載の配列の部分配列、
ｅ）４２〜６５℃のハイブリダイゼーション温度でａ）〜ｃ）に記載の配列とハイブリダイズする配列、
ｆ）ａ）〜ｆ）に記載の配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の一致度をもつ配列、
ｇ）ａ）〜ｆ）に記載の配列に相補的な配列、及び
ｈ）遺伝コードの縮重によりａ）〜ｆ）に記載の配列と同一アミノ酸配列をコードする配列、
から選択される配列を含む請求項７から１０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項７から１１のいずれか一項に記載の核酸と異種プロモーターを含むＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
請求項７から１１のいずれか一項に記載の核酸又は請求項１２に記載のＤＮＡ構築物を含むベクター。
【請求項１４】
原核又は真核細胞で核酸の発現を確実にする調節配列に機能的に連結されていることを特徴とする請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項７から１１のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２に記載のＤＮＡ構築物又は請求項１３もしくは１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
原核細胞の形態であることを特徴とする請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
真核細胞の形態であることを特徴とする請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項７から１１のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号２又は配列番号４に示す配列に対して少なくとも６０％の一致度をもつアミノ酸配列を含むＩＭＰデヒドロゲナーゼの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２１】
請求項７から１１のいずれか一項に記載の核酸の作製方法であって、
（ａ）それ自体公知の方法で完全に化学合成するか、あるいは
（ｂ）オリゴヌクレオチドを化学合成し、オリゴヌクレオチドを標識し、ゲノムライブラリー又は真菌細胞に由来するゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡとオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、陽性クローンを選択し、陽性クローンからハイブリダイズするＤＮＡを単離するか、あるいは
（ｃ）オリゴヌクレオチドを化学合成し、ターゲットＤＮＡをＰＣＲにより増幅する段階、
を含む前記方法。
【請求項２２】
請求項１８又は１９に記載のポリペプチドの作製方法であって、
（ａ）請求項７から１１のいずれか一項に記載の核酸の発現を確実にする条件下で請求項１５から１７のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するか、又は
（ｂ）請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸をｉｎ−ｖｉｔｒｏ系で発現させること、及び
（ｃ）細胞、培地又はｉｎ−ｖｉｔｒｏ系からポリペプチドを回収すること、
を含む前記方法。
【請求項２３】
請求項１８又は１９に記載のポリペプチド又は請求項１５から１７のいずれか一項に記載の宿主細胞を使用することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１８又は１９に記載のポリペプチドの発現を修飾する化合物の検出方法であって、
（ａ）請求項１５から１７のいずれか一項に記載の宿主細胞を化合物又は化合物の混合物と接触させる段階と、
（ｂ）ポリペプチド濃度を測定する段階と、
（ｃ）ポリペプチドの発現に特異的に影響を与える化合物を決定する段階、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、前記ポリペプチドのモジュレーターを同定するための前記ポリペプチド及び核酸の使用、前記モジュレーターの同定方法、並びに殺真菌剤としての前記モジュレーターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
望ましくない真菌増殖は毎年農業に多大な損害をもたらすが、殺真菌剤の使用により防除することができる。殺真菌剤はその活性、価格に加え、特に環境に安全であることが益々要求されている。従って、強力で環境に安全な新規殺真菌剤の開発に利用可能な新規物質又は物質類が求められている。一般に、このような新規主要構造は温室試験で探索するのが通例である。しかし、このような試験には多大な労力と費用が必要である。従って、温室で試験できる物質の数は限られている。このような試験の代法は、高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）法として知られる方法の使用である。この方法は多数の個々の物質が細胞、個々の遺伝子産物又は遺伝子に及ぼす効果を自動法で試験する。所定物質が効果をもつことが判明した場合には、慣用スクリーニング法で試験し、必要に応じて更に開発することができる。
【０００３】
殺真菌剤の有利なターゲットは主要生合成経路で探索されることが多い。更に、理想的な殺真菌剤は真菌の植物病原性の発現に決定的に重要な遺伝子産物を阻害する物質である。
【０００４】
従って、本発明の目的は潜在的殺真菌活性化合物に適した新規ターゲットを同定し、入手可能にすることと、殺真菌剤として使用可能なこのターゲットのモジュレーターの同定を可能にする方法を提供することである。
【０００５】
イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２０５）（以下、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ又はＩＭＰＤＨと略称）はｄｅ  ｎｏｖｏ  ＧＴＰ合成の律速不可逆的段階を触媒する。イノシン５’−一リン酸（ＩＭＰ）をＩＭＰＤＨによりニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）と反応させると、ＮＡＤＨ／Ｈ＋とＸＭＰが得られる（図１）。イノシン５’−一リン酸はｄｅ  ｎｏｖｏプリン生合成の終産物であり、アデニンとグアニンヌクレオチドの上記合成の主要中間体である。従って、ＩＭＰＤＨは細胞に極めて重要なＧＴＰを提供するための主要酵素である。ＧＴＰはＲＮＡとＤＮＡに取込まれ、ＧＴＰアーゼ（例えばＧ蛋白質結合受容体のように細胞シグナル伝達経路において）、グアニル酸シクラーゼ（二次メッセンジャー物質ｃＧＭＰの生産）の基質及び多数の酵素反応の補助基質として作用すると共に、ｍＲＮＡ（５’−キャップ構造）の転写後調節に役割を果たす。従って、ＩＭＰＤＨはかねてから抗ウイルス、免疫抑制、制癌及び抗微生物活性化合物の探索におけるターゲットであった。
【０００６】
更に、ＩＭＰＤＨは植物では窒素の同化、輸送及び貯蔵に関連する全く異なる別の役割を果たすことが立証されている。例えば、ＩＭＰＤＨはウレイドとアラントインの形成に関与することが立証されている。
【０００７】
ＩＭＰＤＨの活性をもつポリペプチドは特定真菌でも既に同定されている。１例として、ヒトに病原性で５２１アミノ酸の配列からなる真菌Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＩＭＰＤＨが挙げられる。対応配列は例えば「ｔｒｅｍｂｌ」データベース（Ｕ８５０４９，ＡＦ２４９２９３）として知られるものにより得ることができる。発酵で利用されることが多い糸状菌である５２２アミノ酸長のＡｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ（ｔｒｅｍｂｌ，Ａ９４８６０及びＥＰ  ０  ９２７  ７６１  Ａ２）、５２４ＡＡのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｚ９７２１１）及び５２４アミノ酸のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｚ４６７２９）や、ヒトに病原性の単細胞真菌である５２９アミノ酸のＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ（ＡＦ１９６９７５）に由来する配列も入手可能である。興味深いことに、ＩＭＰＤＨの活性をもつポリペプチドをコートする数種の遺伝子が酵母で既に同定されている。
【０００８】
公知特異的ＩＭＰＤＨ阻害剤であるミコフェノール酸は例えば臓器移植後の免疫応答を抑制するための公知医薬である。ＩＭＰＤＨと阻害剤ミコフェノール酸の構造は既に解明されており（Ｓｉｎｔａｃｋら（１９９６）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｉｎｏｓｉｎｅ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ  Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ”．Ｃｅｌｌ  ８６，９２１）、ミコフェノール酸によるＩＭＰＤＨの阻害の生化学的メカニズムについても報告されている（Ｆｌｅｍｉｎｇら（１９９６）“Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＭＰＤＨ  ｂｙ  Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ：Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，６９９０）。
【０００９】
ミコフェノール酸は哺乳動物ＩＭＰＤＨには極めて有効であるが、抗微生物活性化合物としては非常に効果が低い（Ｄｉｇｉｔｓら（１９９９）“Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｏｓｉｎｅ  ５’−Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｂｙ  Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ”．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８  １５３８８）。ミコフェノール酸はＸＭＰがＩＭＰからＮＡＤ＋結合部位のニコチンアミド結合ポケットに形成される時点で出現する中間体と結合する。しかし、異なる種に由来するポリペプチドの相違により、ヒトＩＭＰＤＨに対する感受性は微生物ＩＭＰＤＨに対する感受性の２０〜４５０倍である（この点については、Ｚｈａｎｇら（１９９９）“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＩＭＰ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ．”  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６，５３７も参照）。
【００１０】
医療分野で公知の他のＩＭＰＤＨ阻害剤としては例えば抗ウイルス性をもつグアノシン類似体であるリボビリン、５’水酸基のリン酸化後にＮＡＤ様チアゾフリンアデニンジヌクレオチドを形成し、制癌剤として使用されるＣヌクレオシドであるチアゾフリン、又は移植医療で免疫抑制に使用されるミゾリビンが挙げられる（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎとＣｏｌｂｙ（１９９９）“ＩＭＰ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ”．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６，５１９）。他方、ミゾリビンはヒトに病原性の真菌Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対してほぼ無効であり、カンジダ症に対して活性な物質としては全く使用できないと想われる（Ｉｓｈｉｋａｗａ（１９９９）“Ｍｉｚｏｒｉｂｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  Ｍｏｆｅｔｉｌ”．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６，５７５）。
【００１１】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓから単離されているＩＭＰＤＨはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び他の生物に由来するＩＭＰＤＨと顕著な配列類似性を示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）は典型的エキソン−イントロン境界をもつ小さいイントロン（２８９塩基対（ｂｐ））により遮断される（Ｋｏｈｌｅｒら（１９９７）Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｎｅｄ  ＩＭＰ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，２３３１）。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞の増殖は１μｇ／ｍｌミコフェノール酸により阻害することができるが、組換えＩＭＰＤＨをもつプラスミドを導入した細胞は４０μｇ／ｍｌまで耐性である。
【００１２】
Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉの場合には、ミコフェノール酸がこの生物に由来するＩＭＰＤＨの阻害剤として作用できることが示されており（Ｏ’Ｇａｒａら（１９９７）“ＩＭＰ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ”．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４１，４０）、この生物の感受性ターゲットとしてのＩＭＰＤＨの利用が提案されている。Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ  ＩＭＰＤＨ（アミノ酸配列）は細菌ＩＭＰＤＨ（３１〜３８％）、原生動物ＩＭＰＤＨ（４８〜５９％）、哺乳動物ＩＭＰＤＨ（６０〜６２％）及び真菌ＩＭＰＤＨ（６２％）と相同性を示す。２５μＭミコフェノール酸の濃度では、組換えＩＭＰＤＨの活性を５０％阻害した。
【００１３】
初期研究によると、上述のようにミコフェノール酸はヒトに病原性の所定真菌（例えばＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を阻害するが、この化合物はＣａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅには無効であることが示されている（Ｎｏｔｏら（１９６９）“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ”．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），２２，１６５）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
これらの結果から明らかなように、哺乳動物ＩＭＰＤＨは公知阻害剤ミコフェノール酸で有効に阻害することができるが、微生物の場合には阻害剤の効果が低い。ヒトに病原性の真菌の試験によると、効果は一定しないようである。例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の所定の真菌はＩＭＰＤＨ阻害剤による阻害に非感受性であると記載されているが、ヒトに病原性の他の真菌では殺真菌効果でなく静真菌効果ではあるものの効果を観察することができる。従って、ＩＭＰＤＨが殺真菌剤のターゲット蛋白質として又は殺真菌活性化合物の探索用として適切であるかどうかは疑わしい。特に、ヒトに病原性の少数の真菌で少なくとも静真菌効果のみが認められているが、植物病原性真菌に由来するＩＭＰＤＨの核酸又はアミノ酸配列はまだ得られておらず、ＩＭＰＤＨ阻害剤を殺真菌剤として使用できるように植物病原性真菌がＩＭＰＤＨ阻害剤と高感度で反応するか否かについては何ら報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従って、本発明の目的は植物病原性真菌のＩＭＰＤＨと、前記酵素の阻害剤を同定し、このような阻害剤を植物病原性真菌で殺真菌剤として使用できるか否かを試験するのに好適な方法を提供することである。
【００１６】
（配列表の説明）
配列番号１：Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードするゲノムＤＮＡ。ゲノムＤＮＡはイントロンを含む。
【００１７】
配列番号２：配列番号１に示すＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列。
【００１８】
配列番号３：Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡ。
【００１９】
配列番号４：配列番号３のＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列。
【００２０】
配列番号５：配列番号１及び３並びに相同配列のＤＮＡを取得及び／又は増幅するのに適した人工配列（プライマー）。
【００２１】
配列番号６：配列番号１及び３並びに相同配列のＤＮＡを取得及び／又は増幅するのに適した人工配列（プライマー）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
定義
本明細書で使用する「一致度」なる用語はアラインメントで一致する配列位置数を意味する。殆どの場合にはアラインメント長の百分率として示される。
【００２３】
これに対して、本明細書で使用する「類似度」なる用語は類似度の測定基準の存在を想定しており、例えばバリンとスレオニン又はロイシンのように所望推定類似性の尺度である想定している。
【００２４】
他方、本明細書で使用する「相同度」なる用語は進化的関係を示す。共通の前駆体配列から２種の相同蛋白質が生じている。相同配列は一般に非相同配列よりも類似度が高い（又はアラインメントでより多くの一致位置を占める）という事実を除き、この用語は必ずしも一致度又は類似度と同義ではない。
【００２５】
本明細書で使用する「ＩＭＰＤＨ」なる用語はＩＭＰデヒドロゲナーゼを意味し、イノシン５’−リン酸デヒドロゲナーゼ、イノシン酸デヒドロゲナーゼ、イノシン５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ、ＩＭＰオキシドレダクターゼ又はイノシン一リン酸オキシドレダクターゼとも言い、イノシン５’−一リン酸＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ＝キサントシン５’−一リン酸＋ＮＡＤＨ／Ｈ＋の反応を触媒する。
【００２６】
本明細書で使用する「完全ＩＭＰＤＨ」なる用語はＡＴＧ開始コドンから出発して転写単位の完全コーディング領域によりコードされるＩＭＰＤＨを意味し、起源生物に存在するＩＭＰＤＨをコードする遺伝子の情報を含む全エキソン領域と正確な転写終結に必要なシグナルを含む。
【００２７】
本明細書で使用する「ＩＭＰＤＨの生物活性」なる用語はポリペプチドが上記反応即ちＩＭＰからＸＭＰへの変換と同時にＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換を触媒する能力を意味する。
【００２８】
本明細書で使用する「活性フラグメント」なる用語はＩＭＰＤＨをコードするが完全ではない核酸を意味し、ＩＭＰＤＨの生物活性をもつポリペプチドをコードし、上記のようなＩＭＰＤＨの特徴的反応を触媒することが可能なものを言う。このようなフラグメントはＩＭＰＤＨをコードする上記完全核酸よりも短い。この関連では、配列の３’及び／又は５’の両末端で核酸を除去してもよいし、ＩＭＰＤＨの生物活性に決定的な悪影響を与えない限り、配列の一部を欠失即ち除去してもよい。活性が低下又は必要に応じて増加しても、得られるＩＭＰＤＨフラグメントを特性決定又は使用できるならば本明細書で使用する用語の意味を満たすとみなされる。本明細書で使用する「活性フラグメント」なる用語はＩＭＰＤＨのアミノ酸配列を意味する場合もあり、この場合もポリペプチドについて上述したと同様に、同酵素の生物活性に決定的な悪影響を与えないという条件で上記完全配列に比較して所定部分を含まないものを言う。フラグメントは種々の長さとすることができ、例えば少なくとも１２０、少なくとも３００、少なくとも４００又は少なくとも５００アミノ酸とすることができる。
【００２９】
本明細書で使用する「遺伝子」なる用語はポリペプチド鎖の合成に関与する細胞のゲノムに由来するセグメントを意味する。
【００３０】
本明細書で使用する「ｃＤＮＡ」なる用語は逆転写によりｍＲＮＡから得られる相補的ＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡのエキソンに対応する配列のみを含む。ｃＤＮＡシーケンシング後に、必要に応じてこのｃＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列を推定することができる。ｃＤＮＡを細胞に導入後に、このｃＤＮＡによりコードされる各蛋白質を大量に合成することができる。
【００３１】
本明細書で使用する「ハイブリダイズする」なる用語は１本鎖核酸分子が相補鎖と塩基対合するプロセスを意味する。例えば、本明細書に記載するか又は推定可能な配列情報から出発し、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ以外の植物病原性真菌から本発明のＩＭＰＤＨの１種と同一又は類似の性質をもつＩＭＰＤＨをコードするＤＮＡフラグメントをこうして単離することができる。
【００３２】
ハイブリダイゼーション条件はほぼ下式により計算される。
融点
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６｛ｌｏｇ［ｃ（Ｎａ＋）］｝＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（５００／ｎ）
（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．，Ｚｏｒｂａｓ  Ｈ．（編）．（１９９８）．Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ．Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）。
【００３３】
上記式中、ｃは濃度であり、ｎはハイブリダイズする配列セグメントの長さを塩基対で表す。＞１００ｂｐの配列では、項５００／ｎは減少する。最高ストリンジェンシーはＴｍより５〜１５℃低い温度とイオン強度１５ｍＭ  Ｎａ＋（０．１×ＳＳＣに対応）での洗浄を含む。ハイブリダイゼーションにＲＮＡサンプルを使用する場合には、融点は１０〜１５℃高くなる。
【００３４】
好適ハイブリダイゼーション条件を以下に記載する。
【００３５】
ハイブリダイゼーション溶液：ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ，ＺＺ）、ハイブリダイゼーション温度：４２℃〜７０℃、好ましくは４２〜６５℃（ＤＮＡ−ＤＮＡ）又は５０℃（ＤＮＡ−ＲＮＡ）。この場合に特に適したストリンジェントなハイブリダイゼーション温度は５０〜６５℃であり、温度６５℃が特に適切なストリンジェント温度である。
洗浄段階１：室温で２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで５分間×２回、
洗浄段階２：５０℃で１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで１５分間×２回、好ましくは６５℃で０．５×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで１５分間×２回、特に好ましくは６８℃で０．２×ＳＳＣで１５分間×２回。
【００３６】
核酸の一致度はＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮプログラムＶｅｒｓｉｏｎ  ２．０．４により測定することが好ましい（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９）。
【００３７】
本明細書で使用する「殺真菌剤」又は「殺真菌」なる用語は植物、植物部分もしくは植物生産物を攻撃して損傷させるか又はその収穫高もしくは価値を低下させる真菌を防除することが可能な化合物を意味する。上記植物部分としては例えば葉、種子及び果実（例えば液果、果実、穀粒）が挙げられる。上記植物生産物としては植物由来の原料又は物質（例えば木材又は繊維）が挙げられる。
【００３８】
本明細書で使用する「異種プロモーター」なる用語は起源生物における着目遺伝子の発現を制御するプロモーター以外の性質をもつプロモーターを意味する。
【００３９】
本明細書で使用する「競合性」なる用語は化合物がＩＭＰＤＨとの結合について他の恐らく未同定の化合物と競合して同酵素から後者化合物に置換するか又は後者化合物により置換される性質を意味する。
【００４０】
本明細書で使用する「アゴニスト」なる用語はＩＭＰＤＨ活性を加速又は増加する分子を意味する。
【００４１】
本明細書で使用する「アンタゴニスト」なる用語はＩＭＰＤＨ活性を減速又は抑制する分子を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する「モジュレーター」なる用語はアゴニスト又はアンタゴニストの総称である。モジュレーターは本発明のポリペプチドと結合するか又はその活性に影響を与える小さい有機化学分子、ペプチド又は抗体とすることができる。更に、モジュレーターは本発明のポリペプチドと結合する分子と結合してその生物活性に影響を与える小さい有機化学分子、ペプチド又は抗体とすることができる。モジュレーターは天然基質及びリガンド、又はその構造的もしくは機能的模擬体とすることができる。しかし、本明細書で使用する「モジュレーター」なる用語は天然基質又はリガンドを構成しない分子の形態である。
【００４３】
本明細書で使用する「阻害剤」又は「特異的阻害剤」なる用語は上記酵素活性の少なくとも１種だけでなく、必要に応じて２種以上を直接又は間接的に阻害する物質を意味する。このような阻害剤は特異的であることが好ましく、即ち別の無関係の効果を生じるために必要な阻害剤の濃度よりも低濃度でＩＭＰＤＨ活性を阻害する。濃度は非特異的効果を生じるために必要な化合物の濃度の２分の１が好ましく、より好ましくは５分の１、最も好ましくは少なくとも１０分の１又は２０分の１である。
【００４４】
本発明によると、植物病原性真菌Ｕ．ｍａｙｄｉｓに由来するＩＭＰＤＨをコードする核酸配列が同定単離され、前記配列によりコードされるポリペプチドが得られた。更に、ＨＴＳ及びＵＨＴＳ法等でＩＭＰＤＨ活性を測定し、同酵素の阻害剤を同定及び評価するのに適した方法が開発された。更に、植物病原性真菌に由来するＩＭＰＤＨ阻害剤を植物保護剤として使用できることも本発明により立証された。
【００４５】
担子菌である黒穂菌Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓはトウモロコシ植物体を攻撃する。疾病はトウモロコシが栽培される全区域で発生するが、雨の少ない年のみに問題となる。典型的な症状は全気中植物部分に形成されるこぶし大の瘤様膨腫（発疱）である。瘤は最初は白灰色の粗目膜で覆われている。膜が破れると、黒穂胞子の黒い塊が放出され、最初はべたべたしているが、後に粉状になる。Ｕｓｔｉｌａｇｏ属の他の種としては例えばＵ．ｎｕｄａ（オオムギ及びコムギの裸黒穂病の病原菌）、Ｕ．ｎｉｇｒａ（オオムギの偽裸黒穂病の病原菌）、Ｕ．ｈｏｒｄｅｉ（オオムギの堅黒穂病の病原菌）及びＵ．ａｖｅｎａｅ（オートムギの裸黒穂病の病原菌）が挙げられる。
【００４６】
Ｕ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨ（以下、「Ｉｍｐ１」と言う）は１９９９ｂｐ長である。コーディングｃＤＮＡは１６５９ｂｐ長である。従って、Ｉｍｐ１は３４０ｂｐ長のイントロンを含む。ｃＤＮＡのＯＲＦから推定されるポリペプチドは５５３アミノ酸長である。これはモノマーでは約６０ｋＤの分子量計算値に対応する。
【００４７】
本明細書ではＩｍｐ１をコードする核酸配列を配列番号１（ゲノム配列）又は配列番号３（ｃＤＮＡ）として開示する。前記配列の各々によりコードされるポリペプチドを本明細書では配列番号２及び配列番号４として寄託する。
【００４８】
このように、本発明は植物病原性真菌（この場合はＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）のＩＭＰＤＨを初めて完全に解明する。上述したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ及びＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉに由来するＩＭＰＤＨ以外に他の真菌に由来するＩＭＰＤＨをコードする配列はまだ知られていない。特に植物病原性担子菌に由来するＩＭＰＤＨをコードする配列は従来知られていなかった。
【００４９】
配列番号１及び３に示すＩＭＰＤＨをコードするＵ．ｍａｙｄｉｓ配列を他の真菌に由来するＩＭＰＤＨをコードする公知配列、ヒト配列及びシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）配列と相同性比較すると、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列はＵ．ｍａｙｄｉｓ配列と最高の相同度を示すことが分かる（表Ｉ）。上述したミコフェノール酸はヒトＩＭＰＤＨの公知阻害剤であり且つＣ．ａｌｂｉｃａｎｓで静真菌作用をもつが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅには無効であるので、この点は特に興味深い（Ｎｏｔｏら（１９６９）“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ”．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ），２２，１６５）。表Ｉは各種生物に由来するＩＭＰＤＨをコードするＤＮＡとＵ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨをコードするＤＮＡの相同性比較を示す。
【００５０】
【表１】
2005512575.tif 000002
【００５１】
担子菌Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓにおけるノックアウト分析の結果、驚くべきことにこの植物病原性真菌において前記酵素は生物の生存に重要であることが本発明により判明した。従って、ＩＭＰＤＨは植物病原性真菌又は真菌一般に重要な役割を果たすと結論することができる。これまでに真菌で同様の結果は立証されておらず、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでも同様であるが、これは酵母には数種のＩＭＰＤＨをコードする遺伝子が存在するので、ＩＭＰＤＨの役割が認識されなかったためであると考えられる。このように、ＩＭＰＤＨが植物病原性真菌に対する新規な特異的殺真菌剤の探索の最適ターゲットとして初めて認識された。従って、このターゲットを用いることにより、ＩＭＰＤＨを阻害して穀物保護剤又は殺真菌剤として使用可能な完全に新規な主要構造を同定することができる。
【００５２】
更に、理論的に重要な種々のターゲットには必ずしも当てはまらないが、同酵素の活性に作用する物質を適切な試験方法で同定するためにＩＭＰＤＨを使用できることも本発明により判明した。従って、そのアミノ酸配列と同アミノ酸配列をコードする核酸配列により特徴付けられる植物病原性真菌に由来するＩＭＰＤＨに加え、同酵素のモジュレーターを同定するために適切な試験方法としてＨＴＳ法で使用するのにも適切な方法が提供される。
【００５３】
更に、ＩＭＰＤＨは実際に活性化合物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害され、これらの活性化合物で処理することにより真菌を損傷又は死滅できることも本発明により判明した。従って、植物病原性真菌に由来するＩＭＰＤＨ阻害剤は穀物保護において殺真菌剤として使用することができる。例えば、本発明によると、上記試験システムで同定された物質でＩＭＰＤＨを阻害すると、合成培地と植物の両者で処理後の真菌が破壊されることが判明した。
【００５４】
上述のように、ＩＭＰＤＨは熱心に研究され、ＩＭＰＤＨ阻害剤は既に公知であり、人体医療で利用されているにも拘わらず、ＩＭＰＤＨを真菌において殺真菌活性物質のターゲット蛋白質とすることができることは従来知られていなかった。こうして、ＩＭＰＤＨが特に植物病原性真菌に重要な酵素であり、従って更に改善された殺真菌活性化合物を探索するためのターゲット蛋白質として使用するのに特に適切な酵素であることが本発明で初めて立証された。
【００５５】
ＩＭＰＤＨは数個の相同領域に分割することができる。これらの領域の１つは恐らくＩＭＰ結合に役割を果たすと思われる触媒中心、特にシステインに集中する。この中心はＩＭＰデヒドロゲナーゼに特徴的な配列モチーフである。このようなモチーフはＰＲＯＳＩＴＥデータベースで適切な検索により同定された（Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｋ．，Ｂｕｃｈｅｒ  Ｐ．，Ｆａｌｑｕｅｔ  Ｌ．，Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ．（１９９９）“Ｔｈｅ  ＰＲＯＳＩＴＥ  ｄａｔａｂａｓｅ，ｉｔｓ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  １９９９”．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，２１５）。これは以下のように示すことができる。
［ＬＩＶＭ］−［ＲＫ］−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−ｘ−Ｇ−Ｓ−［ＬＩＶＭ］−Ｃ−ｘ−Ｔ。
【００５６】
ＰＲＯＳＩＴＥはＩＭＰデヒドロゲナーゼの機能的ドメインを同定することができ、遺伝子産物の機能を予想するのに適している。
【００５７】
Ｐｒｏｓｉｔｅモチーフは１文字コードを使用して示される。記号「ｘ」は任意アミノ酸が許容される位置を表す。種々の特定アミノ酸が許容される可変位置を大括弧「［．．．］」で示し、この位置に可能なアミノ酸を列挙する。他方、特定位置に許容されないアミノ酸は中括弧「｛．．．｝」に示す。ハイフン「−」はモチーフの個々の要素又は位置を表す。特定位置が反復する場合、例えば「ｘ」が数回連続する場合には、ｘの後に括弧内に反復数を記載することにより示すことができ、例えば「ｘ（３）」は「ｘ−ｘ−ｘ」を表す。
【００５８】
こうして、Ｐｒｏｓｉｔｅモチーフは最終的にコンセンサス配列の成分と当該アミノ酸間の距離を表し、従って、特定類の酵素の特徴を表す。このモチーフと照合し、本発明の核酸に基づいて、本発明のポリペプチドと同一類に属する植物病原性真菌に由来する別のポリペプチドを同定又は指定することができる。
【００５９】
Ｕ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨの場合と同様に、このモチーフはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ又はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにも存在し（図５参照）、Ｕ．ｍａｙｄｉｓ配列はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列と１又は２位置が異なる。従って、本発明の別のポリペプチドを同定又は指定するために使用可能な本発明のＩＭＰデヒドロゲナーゼの特異的コンセンサス配列は−ＬＲＶＧＭＧＳＧＳＩＣＩＴ−が特に好ましい。
【００６０】
上記Ｐｒｏｓｉｔｅモチーフ又は特異的コンセンサス配列は本発明のポリペプチドの特徴を表し、これらのコンセンサス配列に照らしてポリペプチドの構造を確定し、従って明確に同定することができる。
【００６１】
従って、本発明は上記Ｐｒｏｓｉｔｅモチーフ［ＬＩＶＭ］−［ＲＫ］−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−ｘ−Ｇ−Ｓ−［ＬＩＶＭ］−Ｃ−ｘ−Ｔを含むＩＭＰＤＨの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチド、好ましくは上記コンセンサス配列−ＬＲＶＧＭＧＳＧＳＩＣＩＴ−を含むポリペプチドにも関する。
【００６２】
上記結果とＩＭＰＤＨをコードする種特異的核酸に存在する相同性により、上記目的を達成するために他の植物病原性真菌に由来するＩＭＰＤＨを同定及び使用することも可能であり、即ち穀物保護において殺真菌剤として使用可能なＩＭＰＤＨ阻害剤を同定するために使用することができる。他方、殺真菌活性ＩＭＰＤＨ阻害剤を同定するために、非植物病原性の別の真菌又はそのＩＭＰＤＨもしくはＩＭＰＤＨをコードする配列を使用することも可能である。本明細書に示す配列番号１もしくは配列番号３に示す配列又は配列番号５及び６に示すプライマーを使用し、必要に応じて上記コンセンサス配列又はＰｒｏｓｉｔｅモチーフを使用すると、当業者は他の植物病原性真菌に由来するＩＭＰデヒドロゲナーゼをコードする別の核酸を例えばＰＣＲにより取得し、同定することが可能である。このような核酸と殺真菌活性化合物の同定方法におけるその使用も本発明に含むものとみなす。
【００６３】
従って、本発明はＩＭＰＤＨの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来する完全なポリペプチドをコードする核酸に関する。これらの核酸は６０、３００、６００又は１２００塩基対、好ましくはコーディング配列の全長にわたって少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の一致度をもつことが好ましい。各場合の上記核酸は上記Ｐｒｏｓｉｔｅモチーフ又は上記コンセンサス配列を含むことが好ましい。
【００６４】
本発明は特に植物病原性担子菌、好ましくはＵｓｔｉｌａｇｏ属に由来するＩＭＰＤＨをコードする核酸に関する。
【００６５】
本発明は更に好ましくはＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨをコードする核酸に関する。
【００６６】
本発明は特に好ましくは配列番号２もしくは配列番号４に示すポリペプチドをコードするＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓに由来する核酸又はそのフラグメントに関する。本発明は特に配列番号１及び配列番号３に示す核酸に関する。
【００６７】
本発明の核酸は特に１本鎖又は２本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の形態である。好適態様はイントロンを含み得るゲノムＤＮＡのフラグメントとｃＤＮＡである。
【００６８】
本発明の核酸は本発明の核酸のｃＤＮＡに対応するＤＮＡフラグメントの形態であることが好ましい。
【００６９】
本発明の核酸はＩＭＰＤＨの生物活性をもつポリペプチドをコードする植物病原性真菌に由来する配列として、
ａ）配列番号１又は配列番号３に示す配列、
ｂ）配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列、
ｃ）モチーフ［ＬＩＶＭ］−［ＲＫ］−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−ｘ−Ｇ−Ｓ−［ＬＩＶＭ］−Ｃ−ｘ−Ｔ又はコンセンサス配列−ＬＲＶＧＭＧＳＧＳＩＣＩＴ−を含むポリペプチドをコードする配列、
ｄ）少なくとも１５塩基対長であるａ）〜ｃ）に記載の配列の部分配列、
ｅ）４２〜６５℃のハイブリダイゼーション温度でａ）〜ｃ）に記載の配列とハイブリダイズする配列、
ｆ）ａ）〜ｃ）に記載の配列と少なくとも６０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、より好ましくは９５％の一致度をもつ配列、
ｇ）ａ）〜ｆ）に記載の配列に相補的な配列、及び
ｈ）遺伝コードの縮重によりａ）〜ｃ）に記載の配列と同一アミノ酸配列をコードする配列、から選択される配列を含むことが特に好ましい。
【００７０】
本発明の核酸は常法により作製することができる。例えば、化学合成のみにより核酸分子を作製することができる。他方、本発明の核酸の短いセクション（例えば配列番号５及び６に示すオリゴヌクレオチド）を化学的に合成し、このようなオリゴヌクレオチドを放射性標識又は蛍光色素で標識してもよい。標識オリゴヌクレオチドを使用して例えば植物病原性真菌に由来するｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするクローンを選択し、着目ＤＮＡフラグメントを単離する。単離したＤＮＡの特性決定後に簡単に本発明の核酸が得られる。
【００７１】
あるいは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ法により本発明の核酸を作製することもできる。
【００７２】
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」なる用語は１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドから構成されるＤＮＡ分子を意味する。オリゴヌクレオチドを化学的に合成すると、ハイブリダイゼーション実験用プローブ又はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）用プライマーとして使用することができる。
【００７３】
本発明のポリペプチド、特に配列番号１又は配列番号３に示す核酸配列によりコードされるポリペプチドを作製するには、本発明の核酸の少なくとも１種を含む宿主細胞を適切な条件下で培養することも更に可能である。その後、細胞又は培地から常法により所望ポリペプチドを単離することができる。ｉｎ−ｖｉｔｒｏシステムでポリペプチドを作製することもできる。
【００７４】
本発明のＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨを作製するためには、例えば、遺伝子を大腸菌で組換え発現させ、大腸菌細胞から酵素調製物を調製することができる。
【００７５】
従って、ｉｍｐ１によりコードされるポリペプチドＩｍｐ１を発現させるために、配列表に配列番号５及び配列番号６として示す遺伝子特異的プライマーを使用して当業者に公知の方法により対応するＯＲＦをｍＲＮＡから増幅した。着目ｃＤＮＡをベクターｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｈｉｓタグ（Ｎ又はＣ末端）又はＳタグを導入可能）にクローニングした。得られたプラスミドｐ８３０はベクターからのチオレドキシンタグとのＮ末端融合部にｉｍｐ１の完全コーディング配列を含む。Ｉｍｐ１融合蛋白質の分子量計算値は７８ｋＤである（実施例１及び図２）。
【００７６】
プラスミドｐ８３０を使用して大腸菌細胞でＩｍｐ１を組換え発現させた（実施例１）。
【００７７】
核酸について上述したように、本発明は配列番号２又は配列番号４に示す配列番号のみに限定されない。本発明により最初に明らかになった本明細書に示す結果はＩＭＰＤＨの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来する他のポリペプチドにも適用される。即ち、上記のような他のそのような種に由来する相同ＩＭＰＤＨを本発明の方法で取得し、使用することも可能である。従って、ＩＭＰＤＨの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチドは本発明の要旨に含むものとみなす。
【００７８】
上記相同ポリペプチドは少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５、特に好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも１００連続アミノ酸長、最も好ましくは全長にわたってＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、特に少なくとも９８％の類似度をもつ形態であることが特に好ましい。
【００７９】
Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨ、特に配列番号２又は配列番号４のポリペプチドと相同であり、殺真菌活性物質を同定するために使用することができるこのようなポリペプチドは完全真菌ＩＭＰＤＨを構成する必要はなく、少なくとも完全ＩＭＰＤＨの生物活性をもつ限り、そのフラグメントでもよい。配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列をもつＩＭＰＤＨと同一型の生物活性をもつポリペプチドも本発明に含むものとみなす。本発明に含むものとみなすポリペプチドは特に、例えば以下の植物病原性真菌のＩＭＰＤＨ又はそのフラグメントに対応し且つその生物活性を維持するポリペプチドである。
【００８０】
ネコブカビ綱（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、卵菌綱（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ツボカビ綱（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌綱（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子嚢菌綱（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌綱（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）及び不完全菌綱（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）、例えばＰｙｔｈｉｕｍ種（例えばＰｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ）、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ種（例えばＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ種（例えばＰｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｕｍｕｌｉ又はＰｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ種（例えばＰｌａｓｍｏｐａｒａ  ｖｉｔｉｃｏｌａ）、Ｂｒｅｍｉａ種（例えばＢｒｅｍｉａ  ｌａｃｔｕｃａｅ）、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ種（例えばＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｉｓｉ又はＰ．ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、Ｅｒｙｓｉｐｈｅ種（例えばＥｒｙｓｉｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ種（例えばＳｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）、Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ種（例えばＰｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ）、Ｖｅｎｔｕｒｉａ種（例えばＶｅｎｔｕｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ）、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ種（例えばＰｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｅｒｅｓ又はＰ．ｇｒａｍｉｎｅａ（分生子形態：Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ、異名：Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種（例えばＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ（分生子形態：Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ、異名：Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））、Ｕｒｏｍｙｃｅｓ種（例えばＵｒｏｍｙｃｅｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）、Ｐｕｃｃｉｎｉａ種（例えばＰｕｃｃｉｎｉａ  ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ種（例えばＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、Ｔｉｌｌｅｔｉａ種（例えばＴｉｌｌｅｔｉａ  ｃａｒｉｅｓ）、Ｕｓｔｉｌａｇｏ種（例えばＵｓｔｉｌａｇｏ  ｎｕｄａ又はＵｓｔｉｌａｇｏ  ａｖｅｎａｅ）、Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ種（例えばＰｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ  ｓａｓａｋｉｉ）、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ種（例えばＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｏｒｙｚａｅ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種（例えばＦｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ種、Ｓｅｐｔｏｒｉａ種（例えばＳｅｐｔｏｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ種（例えばＬｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ）、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ種（例えばＣｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ種（例えばＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）又はＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ種（例えばＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ  ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）。
【００８１】
特に重要な他の真菌は例えばＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｕｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ、Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ種である。
【００８２】
従って、本発明のポリペプチドは植物病原性真菌に由来するアミノ酸配列として、
（ａ）配列番号２又は配列番号４に示す配列、
（ｂ）モチーフ［ＬＩＶＭ］−［ＲＫ］−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−ｘ−Ｇ−Ｓ−［ＬＩＶＭ］−Ｃ−ｘ−Ｔ又はコンセンサス配列−ＬＲＶＧＭＧＳＧＳＩＣＩＴ−を含む配列、
（ｃ）少なくとも１５アミノ酸長であるａ）及びｂ）に記載の配列の部分配列、
（ｄ）ａ）及びｂ）に記載の配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％一致度をもつ配列、並びに
（ｅ）ａ）及びｂ）に記載の配列と同一生物活性をもつ配列、から選択される配列を含むことが好ましい。
【００８３】
本明細書で使用する「ポリペプチド」なる用語はペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと一般に呼ばれる短いアミノ酸鎖だけでなく、蛋白質と一般に呼ばれるより長いアミノ酸鎖も意味する。この用語は翻訳後プロセシング等の天然プロセス又は従来技術の化学的方法により修飾可能なアミノ酸鎖を含む。このような修飾はポリペプチドの種々の部位に繰返し存在していてもよく、例えばペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ及び／又はカルボキシ末端を修飾することができる。例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体、脂質もしくは脂質誘導体又はホスファチジルイノシトールとの共有結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解プロセシング、リン酸化、セレノイル化及びｔＲＮＡ媒介アミノ酸付加が挙げられる。
【００８４】
本発明のポリペプチドは「成熟」蛋白質として存在することもできるし、より大きい蛋白質（例えば融合蛋白質）の一部として存在することもできる。更に、分泌又はリーダー配列、プロ配列、精製を簡単にする配列（例えばポリヒスチジン残基）、又は付加安定化アミノ酸として存在することもできる。本発明の蛋白質は例えばその直接起源である生物に天然に存在する形態で存在することもできる。
【００８５】
天然に存在するＩＭＰＤＨの対応する領域に比較して、本発明のポリペプチドは少なくとも完全ＩＭＰＤＨの生物活性を示す限り、欠失又はアミノ酸置換をもつことができる。保存置換が好ましい。このような保存置換はあるアミノ酸を以下の群から選択される別のアミノ酸で置換する変異を含む。
１．小さい脂肪族非極性残基又は低極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；
２．極性、負電荷残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；
３．極性、正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；
４．大きい脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ；並びに
５．芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
【００８６】
好ましい保存置換は下表に示すことができる。
【００８７】
【表２】
2005512575.tif 000003
【００８８】
可能なＩＭＰＤＨ精製法は分取電気泳動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えばゲル濾過カラム、逆相カラム又は弱疎水性カラムの使用）、ゲル濾過、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーに基づく。
【００８９】
本発明により使用すべき核酸を使用して宿主細胞により合成された本発明のポリペプチドの迅速な単離方法はまず融合部分をアフィニティー精製により簡単に精製できる融合蛋白質を発現させる。例えば、融合部分は６×Ｈｉｓタグとすることができ、その場合には融合蛋白質をニッケル−ＮＴＡアフィニティーカラムで精製することができる。融合部分は例えば融合部分と精製すべき本発明のポリペプチドの間のリンカーで部分蛋白分解性開裂により除去することができる。リンカーはトリプシン開裂部位を規定するアルギニンやリジン残基等のターゲットアミノ酸を含むように設計することができる。このようなリンカーを作製するにはオリゴヌクレオチドを使用する標準クローニング法を利用することができる。
【００９０】
他の可能な精製法は分取電気泳動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えばゲル濾過カラム、逆相カラム又は弱疎水性カラムの使用）、ゲル濾過、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーに基づく。
【００９１】
本明細書で使用する「単離又は精製」なる用語は本発明のポリペプチドを細胞又は組織の他の蛋白質又は他の巨大分子から分離することを意味する。本発明のポリペプチドを含む組成物の蛋白質含量は宿主細胞調製物中の好ましくは少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも１００倍である。
【００９２】
本発明のポリペプチドはポリペプチドと結合する抗体を使用することにより融合部分を介さずにアフィニティー精製することもできる。
【００９３】
従って、本願は配列番号２もしくは配列番号４のポリペプチドＩｍｐ１又は前記ポリペプチドに相同であり、ＩＭＰＤＨの活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチドの製造方法にも関し、本方法は、
（ａ）当該核酸の発現を確実にする条件下でＩＭＰＤＨの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチドをコードする少なくとも１種の発現可能な核酸配列を含む宿主細胞を培養するか、又は
（ｂ）ＩＭＰＤＨの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチドをコードする発現可能な核酸配列をｉｎ−ｖｉｔｒｏ系で発現させること、及び
（ｃ）細胞、培地又はｉｎ−ｖｉｔｒｏ系からポリペプチドを回収すること、を含む。
【００９４】
特に、本発明は配列番号２もしくは配列番号４のポリペプチドＩｍｐ１又は前記ポリペプチドに相同であり、ＩＭＰＤＨの活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチドの製造方法に関し、本方法では、
（ａ）ＩＭＰＤＨの生物活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチドをコードする発現可能な核酸配列を適切な宿主細胞に形質転換し、
（ｂ）０．２％のグルコースを培地に加え、形質転換細胞を適切な温度で培養し、
（ｃ）細胞の十分な増殖に適した時間後に細胞を誘導し、
（ｄ）（ａ）に記載の核酸の十分な発現に適した時間後に細胞を回収し、必要に応じて、
（ｅ）回収した細胞からポリペプチドを単離精製する。
【００９５】
こうして得られた本発明のポリペプチドを含む細胞又はこうして得られた精製ポリペプチドはＩＭＰＤＨモジュレーター又は阻害剤の同定方法で使用するのに適している。
【００９６】
従って、本発明はＩＭＰＤＨの活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチドの阻害剤であって、殺真菌剤として使用することが可能なＩＭＰＤＨ阻害剤の同定方法における、ＩＭＰＤＨの少なくとも１種の生物活性を示し且つ下記配列：
（ａ）配列番号２又は配列番号４に示す配列、
（ｂ）モチーフ［ＬＩＶＭ］−［ＲＫ］−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−［ＬＩＶＭ］−Ｇ−ｘ−Ｇ−Ｓ−［ＬＩＶＭ］−Ｃ−ｘ−Ｔ又はコンセンサス配列−ＬＲＶＧＭＧＳＧＳＩＣＩＴ−を含む配列、
（ｃ）ａ）及びｂ）に記載の配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％の一致度をもつ配列、並びに、
（ｄ）ａ）及びｂ）に記載の配列と同一生物活性をもつ配列
から選択されるアミノ酸配列を含む植物病原性真菌に由来するポリペプチドの使用にも関する。
【００９７】
ＩＭＰＤＨの活性をもつ植物病原性真菌に由来するポリペプチドの阻害剤であって、殺真菌剤として使用することが可能なＩＭＰＤＨ阻害剤の同定方法において植物病原性担子菌、特にＵｓｔｉｌａｇｏ属、特にＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓに由来するポリペプチドを使用することが特に好ましく、配列番号２又は配列番号４に示すポリペプチドが特に好ましい。
【００９８】
従って、本発明のＩＭＰＤＨの１種により検出される殺真菌剤は他の植物病原性真菌種に由来するＩＭＰＤＨと相互作用することもできるが、これらの真菌に存在する種々のＩＭＰＤＨとの相互作用は必ずしも同等に顕著である必要はない。これは特に観察された活性物質の選択性による。
【００９９】
上述のように、本発明の核酸又はポリペプチドを適切な方法で使用すると、本発明のポリペプチドと結合するか及び／又は化合物を阻害する化合物を検出することができる。その後、これらの化合物を植物で殺真菌剤として使用することができる。
【０１００】
従って、本発明は本発明のポリペプチドと結合するか及び／又はその生物活性を調節、即ち活性化又は阻害する殺真菌活性化合物の同定に適した方法にも関する。
【０１０１】
本発明のポリペプチドのモジュレーター、即ちアクチベーターもしくは阻害剤、又はアゴニストもしくはアンタゴニストの同定に適した方法は一般にポリペプチドの活性又は生物学的機能の測定に基づく。この目的には無傷の細胞を利用する方法（ｉｎ−ｖｉｖｏ法）が主に適しているが、細胞から単離し、精製もしくは部分精製形態又は粗抽出物として存在し得るポリペプチドを使用する方法でもよい。これらの無細胞ｉｎ−ｖｉｔｒｏ法はｉｎ−ｖｉｖｏ法と同様に実験室規模で使用できるが、ＨＴＳ又はＵＨＴＳ法で使用するのも好ましい。
【０１０２】
化合物と天然抽出物のアッセイを目的とする多数のアッセイシステムは所定時間内にアッセイされる物質の数を最大にするように高スループット数に設計することが好ましい。無細胞法によるアッセイシステムは精製又は半精製蛋白質が必要である。これらのシステムはターゲット蛋白質に及ぼす物質の潜在的効果を検出することを主目的とする「初期」アッセイに適している。このような初期アッセイを行い、１種以上の化合物、抽出物等が検出されたら、このような化合物の効果を実験室で更に詳細に試験することができる。従って、ターゲット生物（この場合には１種以上の植物病原性真菌）に対する化合物の活性を引き続いてアッセイするために第１段階として再び本発明のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害又は活性化をアッセイする。その後、元の構造に基づくが、例えば活性、毒性又は選択性を最適化した殺真菌化合物を更に探索及び開発するための出発点として化合物を必要に応じて使用することができる。
【０１０３】
モジュレーターを検出するためには、例えば合成反応混合物（例えばｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写産物）又は細胞成分（例えば本発明のポリペプチドを含む膜、区画又は他の任意の調製物）をアゴニスト又はアンタゴニストであり得る候補分子の存在下と不在下で場合により標識したポリペプチドの基質又はリガンドと共にインキュベートすることができる。候補分子が本発明のポリペプチドの活性を増加又は阻害する能力は例えば場合により標識したリガンドの結合の増減又は場合により標識した基質の変換の増減に基づいて識別することができる。本発明のポリペプチドの活性を増加する分子はアゴニストである。本発明のポリペプチドの生物活性を阻害する分子は良好なアンタゴニストである。
【０１０４】
本発明のポリペプチドの生物活性の検出はレポーターシステムとして知られるものにより改善することができる。この側面においてレポーターシステムは限定されないが、産物に変換される比色又は蛍光分析により検出可能な基質や、本発明のポリペプチドの活性又は発現の変化に応答するレポーター遺伝子や、他の公知の結合アッセイが挙げられる。
【０１０５】
本発明のポリペプチドのモジュレーターを検出することが可能な方法の別の例は本発明のポリペプチドと潜在的モジュレーターを本発明のポリペプチドと結合することが分かっている分子（例えば天然基質又はリガンド又は基質もしくはリガンド擬似体）と適切な条件下で共存させる置換アッセイである。リガンドと結合するか又は変換されるポリペプチドの数を正確に測定できるように、本発明のポリペプチド自体を例えば蛍光又は比色標識することができる。他方、場合により標識した基質、リガンド又は基質類似体により結合を監視することもできる。こうしてアゴニスト又はアンタゴニストの効力を測定することができる。
【０１０６】
細胞毒性等の効果は一般にこれらのｉｎ−ｖｉｔｒｏシステムでは無視される。アッセイシステムは物質の阻害又は抑制効果だけでなく、刺激効果も調査する。物質の効力は濃度依存的アッセイ系により調査することができる。効果を評価するために試験物質を含まない対照混合物を使用することができる。
【０１０７】
本発明のＩＭＰＤＨをコードする核酸を含む宿主細胞が本発明により入手可能になったことから、本発明のポリペプチドの活性を調節する物質を同定するための細胞アッセイシステムの開発が可能になった。
【０１０８】
従って、本発明のポリペプチドの活性を調節する物質の同定方法として考えられる更に別の例はシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）として知られる方法である。ＥＰ  ０１５  ４７３参照。このアッセイシステムはポリペプチド（例えばＵ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨ）と放射性標識リガンド又は基質の相互作用を利用する。この場合は、シンチレーター分子を付けたミクロスフェア又はビーズにポリペプチドを結合する。放射能が低下するにつれてミクロスフェアのシンチレーター物質は放射性ラベルの素粒子により励起され、検出可能なフォトンが発生する。リガンドから発生される粒子のみが本発明のポリペプチドに結合したリガンドにより発生されるシグナルとなるようにアッセイ条件を最適化する。
【０１０９】
同定するモジュレーターは小さい有機化合物が好ましい。
【０１１０】
従って、植物病原性真菌に由来するＩＭＰＤＨの活性を調節し、穀物保護において殺真菌剤として使用することができる化合物の同定方法は、
ａ）化合物と当該ポリペプチドの相互作用を可能にする条件下で本発明のポリペプチド又はこのポリペプチドを含む宿主細胞を化合物又は化合物の混合物と接触させ、
ｂ）化合物の不在下における本発明のポリペプチドの活性を化合物又は化合物の混合物の存在下における本発明のポリペプチドの活性と比較し、
ｃ）本発明のポリペプチドの活性を特異的に調節する化合物を決定する、ことからなる。
【０１１１】
この関連では、本発明のポリペプチドの活性を特異的に阻害する化合物を決定することが特に好ましい。本明細書で使用する「活性」なる用語は本発明のポリペプチドの生物活性を意味する。
【０１１２】
本発明のポリペプチドの活性又は活性の増減は基質ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換により測定することが好ましい。この場合、ＮＡＤ＋の減少又はＮＡＤＨの増加の分光測定により本発明のポリペプチドの活性の低下又は阻害を監視する。これは、ニコチンアミド環が光を吸収するので、還元ニコチンアミド補酵素ＮＡＤＨの吸光度が３４０ｎｍで最大になるためである。他方、酸化形ＮＡＤ＋は３００〜４００ｎｍで吸収しない。従って、ＮＡＤ＋を還元させる本発明の酵素反応は例えば３４０ｎｍの吸光度増加により監視することができる。こうして、この方法を使用して阻害剤が反応に及ぼす効果を測定することができる。
【０１１３】
基質ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換により活性又は活性の増減を測定する別法は共役ルシフェラーゼアッセイで形成されたＮＡＤＨを検出する方法である。この場合には、反応は下式：
ＦＭＮＨ２＋ＲＣＨＯ＋Ｏ２  −＞  ＦＭＮ＋ＲＣＯＯＨ＋Ｈ２Ｏ＋ｈｖ
（式中、Ｒ＝アルキルである）に要約するようにＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼに結び付けられる（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９７５）：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  Ｆｌａｖｉｎ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０，２７６３）。ＮＡＤＨはこの反応では一次電子供与体である。電子はその後、ＦＭＮを介してルシフェラーゼに移送され、発光する。本発明の反応中に形成されるＮＡＤＨは１〜２５μｍの範囲で容易に検出することができる。ルシフェラーゼの発光効率は著しくｐＨ依存性であり、ｐＨ７〜ｐＨ８．５の範囲が特に適切である。
【０１１４】
活性又は活性の増減は基質ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの変換により測定することも好ましく、形成されるＮＡＤＨの量の低下により発光する蛍光の増加の余り鋭くない増加により本発明のポリペプチドの活性の低下又は阻害を測定する（図１も参照）。ＮＡＤＨはＮＡＤ＋よりも多量の蛍光を発光する。
【０１１５】
この目的では、本発明のポリペプチドを好ましくは酵素０．１〜２０ｎｇ／μｌ、好ましくは０．１３〜１０ｎｇ／μｌの適切な濃度で５〜４００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭの濃度のＮＡＤ＋及び５〜４００μＭ、好ましくは５０〜３００μＭの濃度のＩＭＰと共に適切な温度でインキュベートする。ＩＭＰ濃度は各場合に基質ＮＡＤ＋の濃度の２倍が好ましい。両基質即ちＮＡＤ＋とＩＭＰについて基質阻害を観察できることに留意すべきであり、従って、この点で２種の基質の使用濃度を検討しなければならない。温度は８〜３７℃の範囲とすることができる。１０〜３０℃で測定することが好ましく、室温も特に適切である。反応は通常の緩衝液（「アッセイ緩衝液」）中で実施し、例えば２５〜１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を用い、例えば２０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ，１〜５ｍＭ  ＤＴＥ又はＤＴＴ，０．０１〜１％ＢＳＡ，０．０１〜０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０及び２〜１０％グリセロールを加え、ｐＨ８に調節すると好ましい（実施例２参照）。しかし、本発明のポリペプチドがその生物活性を維持し、触媒反応を実施できる限り、他の緩衝液組成も利用可能である。
【０１１６】
次に、励起波長３６０ｎｍ及び発光波長４６５ｎｍの蛍光により反応中のＮＡＤＨの形成を監視する。次に、化合物の存在下の蛍光増加を化合物の不在下の蛍光増加と比較することができる。比較の結果、化合物の存在下の蛍光増加が化合物の不在下よりも少ないか又は必要に応じて多いか、即ち前記化合物がアッセイ下のポリペプチドに対して活性化効果をもつか又は阻害効果をもつかが判明する。蛍光増加を測定する時間は変動できる。５〜１０時間後にプラトーに達するまでの数時間にわたってゆっくりした蛍光増加を観察することができる（図３も参照）。その後、蛍光は一般に減少する。しかし、この低変換率は文献から公知であり、ＩＭＰデヒドロゲナーゼの特徴であると思われる。従って、本発明のポリペプチドの安定化が最適となるように酵素を保存するか又は反応を実施する緩衝液を選択することが重要である。このような緩衝液は例えばＫＣｌ、ＢＳＡ、ＤＴＴ又はＤＴＥ及びグリセロールを適切な濃度で加えるべきである。ｐＨは８に調節すると好ましい。１０〜２００ｍＭ  ＫＣｌ、１０〜２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０２〜０．２％ＢＳＡ及び０．１〜５ｍＭ  ＤＴＥ又はＤＴＴ及び１２〜２５％グリセロールを使用すると好ましい。
【０１１７】
測定はＨＴＳ又はＵＨＴＳアッセイに慣用的に使用されているフォーマットで実施することもでき、例えばマイクロタイタープレートに例えば反応当たり又はウェル当たり総容量５〜５０μｌを導入し、各成分を上記終濃度で加える。酵素の活性を潜在的に阻害又は活性化する被験化合物（候補分子）を例えば上記ＩＭＰ含有アッセイ緩衝液に適切な濃度で導入する。次に、第２の基質ＮＡＤ＋を加えた上記アッセイ緩衝液に本発明のポリペプチドを加えて反応を開始する。次に、混合物を例えば２又は３時間まで適切な温度でインキュベートし、励起波長３６０ｎｍ及び発光波長４６０ｎｍで蛍光増加を測定する。
【０１１８】
候補分子と本発明のポリペプチドを加えずに対応する混合物でも測定する（陰性対照）。更に、候補分子の不在下で本発明のポリペプチドの存在下でも測定する（陽性対照）。こうして陰性対照と陽性対照は候補分子の存在下の混合物の参照値を提供する。
【０１１９】
ＩＭＰＤＨ阻害剤を同定するため又は本発明のポリペプチドの活性を測定するための方法に最適な条件を決定するためには、使用する本発明のポリペプチドのＫＭ値を測定すると有利であると思われる。この値は優先的に使用する基質の濃度に関する情報を提供する。Ｕ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨの場合には、ＫＭは２５μＭであることが分かった（図４参照）。
【０１２０】
例えば上記方法により、本発明のＩＭＰデヒドロゲナーゼ、特に配列番号２又は配列番号４に示すＵ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨを阻害する化合物を同定した（実施例１及び３参照）。
【０１２１】
表ＩＩは本発明の方法を使用してＩＭＰＤＨ阻害剤として同定された化合物の例を示す。
【０１２２】
同表に示すｐＩ５０値は酵素の５０％阻害をもたらす物質のモル濃度を示すＩＣ５０値として知られる値の負の常用対数である。
【０１２３】
例えばｐＩ５０値８は濃度１０ｎＭの酵素の最大阻害の２分の１に対応する。
【０１２４】
【表３】
2005512575.tif 000004
【０１２５】
本発明の方法により同定された本発明のＩＭＰＤＨの阻害剤が植物病原性真菌を損傷又は破壊させることができることも本発明により立証された。
【０１２６】
この目的では、試験すべき活性化合物の溶液を例えばマイクロタイタープレートのウェルにピペッティングした。溶媒を蒸発させた後、培地を各ウェルに加えた。培地は試験真菌の適切な濃度の胞子又は菌糸体で予め処理しておいた。得られた活性化合物濃度は例えば０．１、１、１０及び１００ｐｐｍであった。
【０１２７】
次に、未処理対照に十分な増殖が認められなくなるまで温度２２℃の振盪機でプレートをインキュベートした。
【０１２８】
プレートを波長６２０ｎｍで吸光度測定により評価した。未処理対照に比較して真菌増殖の５０％阻害を生じる活性化合物の用量（ＥＤ５０）を各種濃度の読み値から計算した。
【０１２９】
従って、本発明は本発明のポリペプチドのモジュレーター、特に配列番号２又は配列番号４に示すＵ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨを調節するのに適しており、本明細書に記載するＩＭＰＤＨモジュレーターの同定方法の１種により検出される化合物又は抽出物にも関する。
【０１３０】
更に、本発明は本発明のポリペプチドの発現を調節する化合物の検出方法も含む。このような「発現モジュレーター」も新規殺真菌活性化合物とすることができる。発現モジュレーターは本発明のポリペプチドをコードする核酸の調節領域と結合する小さい有機化学分子、ペプチド又は抗体とすることができる。更に、発現モジュレーターは本発明のポリペプチドをコードする核酸の調節領域と結合してその発現に影響を与える分子と結合する小さい有機化学分子、ペプチド又は抗体でもよい。発現モジュレーターはアンチセンス分子でもよい。
【０１３１】
本発明は本発明のポリペプチドのモジュレーターの使用又は殺真菌剤としてのその発現にも関する（実施例３参照）。
【０１３２】
本発明は上記発現モジュレーターの検出方法により検出されるイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの発現モジュレーターにも関する。
【０１３３】
本発明は更に本発明のポリペプチド又はそのフラグメントに特異的に結合する抗体にも関する。このような抗体は慣用方法で作製される。例えば、このような抗体は実質的に免疫適格な宿主に抗体産生に有効な量の本発明のポリペプチド又はそのフラグメントを注入した後、この抗体を得ることにより生産することができる。更に、モノクローナル抗体を産生する不死化細胞株もそれ自体公知の方法で得られる。抗体は必要に応じて検出試薬で標識してもよい。このような検出試薬の好適例は酵素、放射性標識元素、蛍光薬品又はビオチンである。完全抗体でなく、所望の特異結合性をもつフラグメントも使用できる。
【実施例１】
【０１３４】
Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓに由来するｉｍｐ１又はＩｍｐ１のクローニング、発現及び精製
ｉｍｐ１をクローニングして発現させるために、配列番号５及び６に示す遺伝子特異的プライマーを使用してＵ．ｍａｙｄｉｓ  ｍＲＮＡに由来するＯＲＦを増幅した。１６７５ｂｐ長アンプリコンである対応するｃＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクターｐＣＲＴＯＰ２．１に挿入（中間クローニング）した後、プライマーにより導入したＥｃｏＲＶ及びＮｏｔＩ開裂部位を介してＥｃｏＲＶとＮｏｔＩで切断したベクターｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。得られたプラスミドｐ８３０はベクターの一部であるチオレドキシンタグとのＮ末端融合部にｉｍｐ１の完全コーディング配列を含む。Ｉｍｐ１融合蛋白質の分子量計算値は７８ｋＤである。
【０１３５】
異種発現のために、形質転換混合物を選択培地５０ｍｌ中で予備培養物として直接利用できるようにプラスミドｐ８３０をＢＬ２１：：ＤＥ３に形質転換した。これらの細胞を一晩３７℃でインキュベートした後、選択培地（ＬＢ培地に１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加）で１００倍に希釈した。Ｔ７プロモーターの基礎活性を抑制するために、０．２％グルコースを培地に加えた。ＯＤ６００ｎｍ＝０．８〜１．０で細胞の温度を１６℃まで下げ、１０分後に１ｍＭ  ＩＰＴＧ（終濃度）で細胞を誘導した。１．５時間後に細胞を回収した。活性を低下することなく細胞ペレットを数カ月間−８０℃で保存することができた。溶解緩衝液（２００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭイミダゾール，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，１５％グリセロール）中で音波処理することにより細胞を破砕した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムについて製造業者のプロトコールに記載されているように精製した（図２も参照）。精製蛋白質の緩衝液を保存用緩衝液（２００ｍＭ  ＫＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，０．１％ＢＳＡ，１ｍＭ  ＤＴＥ，１７％グリセロール）に交換した。こうして、培地１リットルから可溶性蛋白質約４ｍｇを単離し、この蛋白質をＩＭＰＤＨモジュレーターの同定方法で使用した。
【実施例２】
【０１３６】
（Ａ）３８４ウェルＭＴＰにおけるＩＭＰデヒドロゲナーゼモジュレーターの同定
Ｇｒｅｉｎｅｒ社の３８４ウェルマイクロタイタープレートを使用してＵ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰＤＨ（Ｉｍｐ１）のモジュレーターを同定した。
【０１３７】
陰性対照を第１のカラムにピペッティングした。陰性対照は５％ＤＭＳＯを加えたアッセイ緩衝液（１００ｍＭ  ＫＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８，２ｍＭ  ＤＴＥ，０．１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０，５％グリセロール）５μｌ、２００μＭ  ＩＭＰを加えたアッセイ緩衝液２０μｌ及び１００μＭ  ＮＡＤ＋を加えたアッセイ緩衝液２５μｌから構成した。
【０１３８】
陽性対照を第２のカラムにピペッティングした。陽性対照は５％ＤＭＳＯを加えたアッセイ緩衝液５μｌ、２００μＭ  ＩＭＰと２ｎｇ／μｌ  ＩＭＰＤＨを加えたアッセイ緩衝液２０μｌ、及び１００μＭ  ＮＡＤ＋を加えたアッセイ緩衝液２５μｌから構成した。
【０１３９】
ＤＭＳＯ中２μＭの濃度の試験物質を残りのカラムに導入し、２００μＭ  ＩＭＰを加えたアッセイ緩衝液を使用して試験物質を容量５μｌまで希釈した。２００μＭ  ＩＭＰと２ｎｇ／μｌ  ＩＭＰＤＨを加えたアッセイ緩衝液２０μｌの添加後、１００ｍＭ  ＮＡＤ＋を加えたアッセイ緩衝液２５μｌを添加して反応を開始した。その後、室温で２時間インキュベートした。
【０１４０】
ＭＴＰに適したＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ分光蛍光光度計で絶対蛍光強度を測定することにより、反応中に産生されたＮＡＤＨを測定した。
【０１４１】
（Ｂ）１５３６ウェルＭＴＰにおけるＩＭＰデヒドロゲナーゼモジュレーターの同定
混合物の総容量を８μｌとした以外は上述のような方法を実施した。各成分は適切な方法で適応させた。
【実施例３】
【０１４２】
同定されたＩＭＰＤＨ阻害剤の殺真菌効果の実証
本発明の方法により同定された活性化合物のメタノール溶液を乳化剤で処理し、マイクロタイタープレートのウェルにピペッティングした。溶媒を蒸発させた後、ポテトデキストロース培地２００μｌを各ウェルに加えた。試験真菌（表ＩＩＩ参照）の適切な濃度の胞子又は菌糸体を予め培地に添加しておいた。
【０１４３】
得られた活性化合物濃度は例えば０．１、１、１０及び１００ｐｐｍであった。得られた乳化剤濃度は３００ｐｐｍであった。
【０１４４】
次に、未処理対照に十分な増殖が観察されなくなるまで温度２２℃の振盪機でプレートをインキュベートした。波長６２０ｎｍの吸光度測定により評価した。未処理対照に比較して真菌増殖の５０％阻害を生じる活性化合物の用量（ＥＤ５０）を各種濃度の読み値から計算した。表ＩＩの化合物３は表ＩＩＩに示す添加率でも適切な効果を示した。
【０１４５】
【表４】
2005512575.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】ＩＭＰＤＨにより触媒される反応はイノシン５’−一リン酸（ＩＭＰ）をキサントシン５’−一リン酸（ＸＭＰ）に変換し、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを産生する。ＩＭＰＤＨにより触媒されるこの反応はその生物活性又は酵素活性の指標である。
【図２】Ｕ．ｍａｙｄｉｓに由来するＩＭＰＤＨの精製はゲル分離により監視することができる。レーン１：１０ｋＤラダー；レーン２：未誘導培養液の蛋白質抽出物；レーン３：１．５時間インキュベーション後の誘導培養液の蛋白質抽出物；レーン４：大腸菌蛋白質抽出物の可溶性上清；レーン５：Ｎｉ−ＮＴＡカラムのスルーフロー；レーン６：Ｎｉ−ＮＴＡカラムの溶出液１；レーン７：Ｎｉ−ＮＴＡカラムの溶出液２；レーン８：１０ｋＤラダー。
【図３】ＩＭＰＤＨによるＮＡＤ＋の変換のキネティクス。アッセイ容量５０μｌ中２５μＭ  ＮＡＤ＋と５０μＭ  ＩＭＰを使用した。使用した蛋白質濃度を図に示す。産生されたＮＡＤＨの蛍光強度に基づいて変換を監視した。図は相対蛍光強度を示す。
【図４】ＮＡＤ＋のＫＭ測定を示し、Ｖｏ／ｍａｘ＝初速度／最大変換速度（μＭ／（ｍｇ−１ｍｉｎ−１））及びＳ＝基質濃度（μＭ）である。
【図５−１】Ｕ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰデヒドロゲナーゼと、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する公知配列及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）とシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するＩＭＰデヒドロゲナーゼのアミノ酸レベルの配列アラインメント。ＩＭＰデヒドロゲナーゼの特徴である酵素の触媒中心におけるコンセンサス配列を太字で示す。
【図５−２】Ｕ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰデヒドロゲナーゼと、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する公知配列及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）とシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するＩＭＰデヒドロゲナーゼのアミノ酸レベルの配列アラインメント。ＩＭＰデヒドロゲナーゼの特徴である酵素の触媒中心におけるコンセンサス配列を太字で示す。
【図５−３】Ｕ．ｍａｙｄｉｓ  ＩＭＰデヒドロゲナーゼと、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する公知配列及びヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）とシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するＩＭＰデヒドロゲナーゼのアミノ酸レベルの配列アラインメント。ＩＭＰデヒドロゲナーゼの特徴である酵素の触媒中心におけるコンセンサス配列を太字で示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【国際調査報告】
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