(57)【要約】本発明は、臭気物質に対して敏感になるように刷り込む方法に関し、その結果、嗅覚器におけるPVCRの調節が起こり、次いで海水または淡水に移した後に同じ臭気物質に曝される。本発明はまた、魚の嗅覚器におけるPVCRの発現および／または感受性を調節することにより、魚を帰巣または誘引する方法、ならびに魚を追い払う方法を含む。
2005505278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１つの多価カチオン感受性レセプター（PVCR）の発現および／または感受性を調節するのに十分な量の少なくとも１つのPVCR調節因子を淡水に添加する工程、該PVCR調節因子は臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させるものである；
ｂ．魚が消費する飼料を淡水に添加する工程、該飼料は該臭気物質および魚の血清中の該PVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含み、それにより、魚は臭気物質で刷り込まれる；
ｃ．刷り込まれた魚が移される海水に該臭気物質の供給源を提供する工程；
を含み、それにより、刷り込まれた魚は該該臭気物質に反応することができる、魚に対する少なくとも１つの臭気物質に対して魚を刷り込ませる方法であって、魚が海水に移される前に淡水で維持される、方法。
【請求項２】
少なくとも１つのPVCRの増大した発現が、魚が海水に移されるまで維持される請求項１記載の方法。
【請求項３】
臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させることが、魚の嗅覚ラメラへの臭気物質の結合後に嗅神経刺激を生じさせることをさらに含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
PVCR調節因子が二価カチオン、三価カチオン、アミノグリコシド、有機ポリカチオン、アミノ酸、I型カルシミメティック、II型カルシミメティック、1,25ジヒドロキシビタミンＤ、サイトカインおよびマクロファージ走化性ペプチド-1からなる群より選ばれる請求項３記載の方法。
【請求項５】
二価カチオンがカルシウム、マグネシウムまたは両方である請求項４記載の方法。
【請求項６】
有機ポリカチオンがプトレシン、スペルミン、スペルミジン、またはその組み合わせである請求項４記載の方法。
【請求項７】
明期に魚を曝すことをさらに含む請求項４記載の方法。
【請求項８】
ａ．少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量の少なくとも１つのPVCR調節因子を淡水に添加する工程；
ｂ．魚が消費する飼料を淡水に添加する工程、該飼料は魚の血清中の該PVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含む；
ｃ．該臭気物質を淡水に添加する工程、該PVCR調節因子は、臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させるものであり、それにより、魚は臭気物質で刷り込まれる；
ｄ．刷り込まれた魚が移される海水に該臭気物質の供給源を提供する工程；
を含み、それにより刷り込まれた魚は該該臭気物質に反応することができる、魚に対する少なくとも１つの臭気物質に対して魚を刷り込む方法であって、魚が海水に移される前に淡水で維持される、方法。
【請求項９】
臭気物質が魚誘引物質である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
誘引物質がアミノ酸、ヌクレオチド、有機化合物、またはその組み合わせである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
臭気物質が魚忌避物質である請求項８記載の方法。
【請求項１２】
忌避物質が哺乳動物の指リンス液に由来する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ａ．スモルト化の間に淡水中の該臭気物質に対して遡上魚を刷り込む工程；
ｂ．遡上魚を海水に移す工程；および
ｃ．魚が消費する飼料を海水に添加する工程、該飼料は該臭気物質および栄養の供給源を含む、
を含み、遡上魚を成長させる方法であって、遡上魚が該魚に対する少なくとも１つの臭気物質に対して敏感になり、遡上魚が海水に移される前に淡水で維持される、方法。
【請求項１４】
ａ．少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量の少なくとも１つのPVCR調節因子を添加する工程；および
ｂ．淡水に魚が消費する飼料を淡水に添加する工程、該飼料は該臭気物質および遡上魚の血清中の該PVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含み、それにより、魚は臭気物質で刷り込まれる、
をさらに含む、該臭気物質に対して遡上魚を刷り込む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ａ．スモルト化の間に淡水中の誘引物質に対して遡上魚を刷り込む工程；
ｂ．遡上魚を海水に移す工程；および
ｃ．魚の嗅覚感受性器においてPVCRを調節するのに十分な量の該誘引物質に魚を曝す工程、
を含む、該魚に対する少なくとも１つの誘引物質で刷り込まれた遡上魚を誘引または帰巣する方法であって、遡上魚が海水に移される前に淡水で維持される、方法。
【請求項１６】
該誘引物質に魚を曝す工程が、物体に誘引物質を接着させる工程および接着した誘引物質を有する物体を海水中に配置する工程をさらに含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
物体がネットまたは魚ルアーである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ａ．スモルト化の間に淡水中の忌避物質に対して遡上魚を刷り込む工程；
ｂ．海水に遡上魚を移す工程；および
ｃ．魚の嗅覚感受性器においてPVCRを調節するのに十分な量の忌避物質に魚を曝す工程、
を含む、魚に対する少なくとも１つの忌避物質で刷り込まれた遡上魚を追い払う方法であって、遡上魚が海水に移される前に淡水中で維持される、方法。
【請求項１９】
忌避物質に魚を曝す工程が、物体に忌避物質を接着させる工程および接着した忌避物質を有する物体を海水中に設置する工程をさらに含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ａ．少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量のマグネシウムおよびカルシウムを淡水に添加する工程、該PVCR調節因子は、臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させるものである；
ｂ．魚が消費する飼料を淡水に添加する工程、該飼料は、該臭気物質および成魚前遡上魚の血清中のカルシウムおよび／またはマグネシウムの有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含み、それにより遡上魚は臭気物質で刷り込まれる；および
ｃ．刷り込まれた遡上魚が移される海水に該臭気物質の供給源を提供する工程；
を含み、それにより刷り込まれた遡上魚が該該臭気物質に反応することができる、該魚に対する少なくとも１つの臭気物質に対して遡上魚を刷り込む方法であって、遡上魚が海水に移される前に淡水で維持される、方法。
【請求項２１】
臭気物質がアミノ酸である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ａ．少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量のマグネシウムおよびカルシウムを淡水に添加する工程；
ｂ．淡水に該臭気物質を添加する工程、該マグネシウムおよびカルシウムは臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させる；
ｃ．淡水に魚が消費する飼料を添加する工程、該飼料は、成魚前の遡上魚の血清中のカルシウムおよび／またはマグネシウムの有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含み、それにより遡上魚は臭気物質で刷り込まれる；および
ｄ．刷り込まれた遡上魚が移される海水に該臭気物質の供給源を提供する工程；
を含み、それにより刷り込まれた遡上魚は該該臭気物質に反応することができる、該魚に対する少なくとも１つの臭気物質に対して遡上魚を刷り込む方法であって、遡上魚が海水に移される前に淡水で維持される、方法。
【請求項２３】
ａ．少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量の少なくとも１つのPVCR調節因子を有する淡水に海水魚を移す工程、該PVCR調節因子が臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させるものである；
ｂ．魚が消費する飼料を淡水に添加する工程、該飼料が該臭気物質および海水魚の血清中の該PVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含む；および
ｃ．魚が海水に移された後に該臭気物質の供給源を提供する工程；
を含み、それにより魚が該臭気物質で刷り込まれる、該魚に対する少なくとも１つの臭気物質に対して海水魚を刷り込む方法。
【請求項２４】
ａ．少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量の少なくとも１つのPVCR調節因子を淡水に添加する工程、該PVCR調節因子は臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させるものである；
ｂ．魚が消費する飼料を淡水に添加する工程、該飼料は、該臭気物質および魚の血清中の該PVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含む；
ｃ．魚が該PVCR調節因子を有する淡水から移された後に該臭気物質の供給源を提供する工程；
を含み、それにより魚が該臭気物質で刷り込まれる、魚に対する少なくとも１つの臭気物質に対して魚を刷り込む方法であって、さかなが淡水で維持される、方法。
【請求項２５】
ａ．少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量の少なくとも１つのPVCR調節因子を水の第１ボディに添加する工程、該PVCR調節因子は臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させるものである；
ｂ．水の第１ボディに魚が消費する飼料を添加する工程、該飼料は、該臭気物質および魚の血清中の該PVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含み、それにより魚は臭気物質で刷り込まれる；
ｃ．刷り込まれた魚が移される水の第２ボディに該臭気物質の供給源を提供する工程
を含み、それにより刷り込まれた魚は該臭気物質に対して反応することができる、魚に対する少なくとも１つの臭気物質に対して魚を刷り込む方法であって、魚は水の第１ボディに維持される、方法。
【請求項２６】
ａ．少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量の少なくとも１つのPVCR調節因子を水の第１ボディに添加する工程；
ｂ．魚が消費する飼料を水に添加する工程、該飼料は、魚の血清中の該PVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含む；
ｃ．水に該臭気物質を添加する工程、該PVCR調節因子は、臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させるものであり、それにより魚は臭気物質で刷り込まれる；
ｄ．刷り込まれた魚が移される水の第２ボディに該臭気物質の供給源を提供する工程；
を含み、それにより刷り込まれた魚が該臭気物質に対して反応することができる、魚に対する少なくとも１つの臭気物質に対して魚を刷り込む方法であって、魚が水の第１ボディに維持される、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、2001年10月11日に出願された米国仮出願第60/328,464の利益を請求する。上記の出願の全体の教示が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の背景
魚を誘引または拒絶できることには大きな利点が存在するが、かかる方法はまだ十分には開発または理解されていない。従って、魚を誘引または拒絶するための改善された方法が必要とされている。
【０００３】
発明の要旨
本発明は、魚が臭気物質（例えば、誘引物質または忌避物質）で刷り込み(imprint)され得、その結果魚が後にその臭気物質に曝されると、それらは臭気物質に反応し、例えば、居老い物質を識別するか、または魚の基礎的な生物学的機構を操作することにより臭気物質に感受されるという発見に関する。特に、本発明は、多価カチオン感受性レセプター（PVCR）と呼ばれるタンパク質が、魚をイオンおよびアミノ酸に「感受」させる役割を有し、魚を臭気物質で刷り込ませるために、所定の条件で、臭気物質レセプターと共に作用するという発見を含む。PVCRは、臭気物質レセプターと相互作用し、魚の嗅覚の感受能力を変化させる。
【０００４】
本発明は、淡水魚、海水魚および遡上魚を含む水生種のいくつかのタイプに適用される。ある態様では、遡上魚は、幼生段階（例えば、卵黄嚢幼生、または第１摂食幼生）またはスモルト段階を含む種々の相の間に刷り込まれうる。天然には、多くの遡上魚は、成体期のほとんどを海水中で過ごすが、繁殖のために淡水に遡上する。結果として、遡上魚は、淡水中で卵から孵る。これらの魚は成長すると、下流へ泳ぎ、海水に徐々に適応する。これらの魚を養殖するために、魚孵化場は、これらの魚がスモルト化を受けると、淡水から海水に移す。スモルト化は、魚が淡水から海水に適応可能になる段階である。従って、魚が臭気物質に刷り込まれている間、それは、淡水で維持され、次いで海水に移される。
【０００５】
本発明は、少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量の少なくとも１つのPVCR調節因子を水（例えば淡水）の第１ボディに添加すること；および魚が消費する飼料を水に添加することにより、少なくとも１つの魚臭気物質（例えば、魚誘引物質または魚忌避物質）に対して魚を刷り込ませる方法に関する。飼料は、少なくとも１つの臭気物質および魚の血清中のPVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含む。PVCR調節因子は、臭気物質に対する嗅覚感受性を変化させる。少なくとも１つのPVCRの調節発現は、魚が水の第２ボディに移されるまで維持されうる。ある態様では、魚（例えば、海水魚または遡上魚）は海水に移され得、別の態様では、魚（例えば、淡水魚）は、PVCR調節因子の添加なしで海水に移されうる。さらに別の態様では、魚は、臭気物質の添加なしでPVCR調節因子を有する淡水に移され得る。本発明はまた、魚が水の第２ボディに移された後、前記臭気物質の供給源を提供することを含む。魚が水の第２ボディに移された場合、魚の嗅覚感受性器は、臭気物質を識別するか、または臭気物質に敏感（sensitized）になりうる。臭気物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させることは、魚における嗅覚ラメラへの臭気物質の結合後に嗅神経インパルスを生じることをさらに含む。この方法はまた、飼料にPVCR調節因子を添加することを含む。魚誘引物質の例は、アミノ酸、ヌクレオチド、有機化合物およびその組み合わせである。哺乳動物の指リンス液を行うことに由来する化合物は、例えば、魚忌避物質として使用されうる。
【０００６】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量の少なくとも１つのPVCR調節因子を水の第１ボディ（例えば、淡水）に添加すること；水に少なくとも１つの臭気物質を添加すること；および魚が消費する飼料を水に添加することによる、魚に対する少なくとも１つの臭気物質を魚に刷り込ませる方法に関し、ここで、飼料は、魚の血清中のPVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与するのに十分な量のNaClを含む。PVCR調節因子は、臭気物質に対する魚の臭覚感受性を変化させる。本発明はまた、魚が水の第２ボディに移された後、前記臭気物質の供給源を提供することを含む。魚が水の第２ボディに移された場合、魚の嗅覚感受性器は、臭気物質を識別するか、または臭気物質に敏感になりうる。
【０００７】
本発明はまた、上記に記載されるように、スモルト化の間に遡上魚を淡水中の魚誘引物質で刷り込むこと；海水に遡上魚を移すこと；および海水に魚が消費する飼料を添加することにより、遡上魚が少なくとも１つの魚臭気物質に敏感になるように遡上魚を成長させる方法を含み、ここで飼料は、栄養の供給源および刷り込みのために使用される誘引物質を含む。海水に移される場合、これらの刷り込まれた魚の嗅覚感受性器が誘引物質を識別するか、または誘引物質に敏感になる。
【０００８】
本発明はまた、淡水中の遡上魚により消費される飼料を具体化する。飼料は、１つ以上の栄養供給源；約10,000mg/kg〜約100,000mg/kgのNaClの量；および少なくとも１つの魚誘引物質を含む。飼料は、約１〜約10gm/kgの量のトリプトファン等のPVCR調節因子を添加することをさらに含みうる。同様に、本発明は、海水中の遡上魚により消費される飼料を含む。この海水飼料は、栄養の供給源；および魚が刷り込まれた魚誘引物質を含む。
【０００９】
本発明はまた、魚の組織に試験対象の臭気物質を曝すこと、ここで少なくとも１つの臭気物質レセプターおよび少なくとも１つのPVCRが組織に存在する；および嗅神経応答の規模または特徴を評価することによる、魚臭気物質を同定する方法、および魚の嗅覚系に存在する少なくとも１つのPVCRによるその調節に関する。嗅神経刺激の存在は、化合物が、魚嗅覚上皮と接触した水中の臭気物質またはPVCR調節因子であることを示す。嗅神経刺激の非存在は、化合物が、魚嗅上皮と接触した水中の臭気物質またはPVCR調節因子ではないことを示す。臭気物質およびPVCR調節物質の種々の組み合わせに対する嗅上皮の曝露の際の嗅神経刺激の規模または特徴における変化は、この組織に存在する臭気物質レセプターおよび／またはPVCRタンパク質からの嗅神経シグナルの調節を示す。かかるアッセイは、淡水に存在するPVCR調節因子およびこれらの方法を用いるアッセイの前に淡水に添加される飼料への魚の曝露によりさらに改変されうる。行動誘引物質アッセイまたは行動回避アッセイ等の当該分野で公知のアッセイが、臭気物質が、それぞれ、誘引物質であるか忌避物質であるかを決定するために行われうる。
【００１０】
本発明は、遡上魚の食物消費を増大させる方法、１つ以上の遡上魚の成長速度を増大させる方法、海水に移動した後の遡上魚の生存を増大する方法、および遡上魚のための飼料変換率（FCR）を改善する方法を含む。これらの方法は、嗅覚ラメラ、脳および胃腸管を含む種々の器官においてPVCRタンパク質の役割の知識を用いて達成される。魚嗅覚系において、PVCRタンパク質が、周囲の水のイオン組成を「匂い」、および水塩分と共に特定の誘引物質を完全にすることを可能にする機能を制御することがわかった。魚の胃腸管では、PVCRタンパク質が、イオンおよび腸内容物の栄養組成物の両方に関する二重センサーとして作用することがわかった。これらのPVCRの二重機能は、魚G.I.管を裏打ちする細胞が成長ための栄養素を任意に利用するために食物から由来する水のイオン組成およびアミノ酸消費における情報を完全にすることが可能である。これらの方法は、少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を調節するのに十分な量で淡水において少なくとも１つのPVCR調節因子に遡上魚を曝すこと；魚が消費する飼料を淡水添加すること、ここで飼料は、遡上魚の血清中のPVCR調節因子の有意に増大したレベルに寄与にするのに十分な量のNaClおよび少なくとも１つの魚誘引物質を含む；海水に遡上魚を移すこと；および海水に魚が消費する飼料を添加することにより行われ得る。PVCR調節因子は、誘引物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させる。海水飼料は、栄養素の供給源および魚の嗅覚組織のPVCRを調節するのに十分な量の刷り込みの間に使用される誘引物質を含む。
【００１１】
本発明はまた、刷り込まれた遡上魚を誘引または帰巣する方法に関する。遡上魚は、遡上魚を海水に移すこと；および魚の嗅覚感受性器においてPVCRを調節するのに十分な量で刷り込み処理の間に使用される誘引物質に魚を曝すことにより、本明細書中に記載されるように、スモルト化の間に淡水中で少なくとも１つの誘引物質で刷り込まれ、魚の嗅覚感受性器は、誘引物質を識別しうるか、または誘引物質に感受され得る。海水中では、魚は、物体（例えば、網または魚ルアー）に誘引物質を接着させ、そこに接着した誘引物質を有する物体を海水に配置することにより、誘引物質に曝されうる。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本明細書中に記載される、刷り込まれた遡上魚を拒絶する方法に関し、その結果、魚は少なくとも１つの魚忌避物質に敏感になる。本方法は、スモルト化の間に淡水中の少なくとも１つの忌避物質に遡上魚を刷り込ませること、それにより、魚の嗅覚感受性器は、忌避物質を識別しうるか、または忌避物質に敏感になり；海水に遡上魚を移すこと；および魚の嗅覚感受性器においてPVCRを調節するのに十分な量で刷り込み処理の間に使用される同じ忌避物質に魚を曝すことを含む。忌避物質は、海水に配置される物体に接着されうる。
【００１３】
本発明は、例えば、孵化場が魚の食物消費を増大し、それらの成長がより速くなること；繁殖の改善のために魚の帰巣を可能にすること；ネットまたはルアーに魚をより容易に誘引することを可能にすること；および危険な領域から魚を忌避することを含む多数の利点を提供する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、発達の所定の段階の間に魚が臭気物質（例えば、誘引物質または忌避物質）で刷り込まれ得、後で同じ臭気物質に曝された場合、それらは臭気物質を容易に識別しうるか、または臭気物質に感受されるという基礎的な発見に関する。特に、本発明は、多価カチオン感受性レセプター（PVCR）が魚をイオンおよびアミノ酸の両方に「敏感」にさせることが可能であることにおいて役割を有する新規に発見された理解を含む。PVCRタンパク質は、体液および胃腸管の内容物中の、水塩分（例えば、イオン濃度）およびそれらを取り囲む水中のアミノ酸の濃度の両方に対して魚を「敏感」にする。PVCRは、臭気物質に対して魚を刷り込ませるための臭気物質レセプターとともに働き、PVCRの調節因子は、魚の嗅覚感受性能力を変化させる。
【００１５】
本発明の方法は、淡水魚、海水魚、遡上魚、甲殻動物、軟体動物および棘皮動物を含む全ての型の水生種に関する。
【００１６】
海水魚は、その成体期の少なくともほとんどを海水中で生活する魚である。海水魚としては、例えば、タラ、ハドック、ヘイク、オヒョウ、サバ、ポラック、ハタ、メカジキ、マグロ、ウインターフラウンダー、およびサマーフラウンダーが挙げられる。海水魚は、PVCRモジュレーターを有する淡水に順応される。淡水魚は、その成体期の少なくともほとんどを淡水中で生活する魚である。用語「海水魚」および「淡水魚」は当業者に理解される。
【００１７】
遡上魚とは、産卵するために海水から淡水へと泳ぐ魚である。遡上魚としては、例えば、サケ（例えば、タイセイヨウサケ（Salmo salar）、ギンザケ（Oncorhynchus kisutch）、シロザケ（Oncorhynchus keta）、マスノスケ（Oncorhynchus tshawytscha）、カラフトマス（Oncorhynchus gorbuscha）、ベニザケ（Oncorhynchus nerka））、チャー（例えば、アルプスイワナ（Salveninus  alpinus））およびマス（例えば、ニジマス（Oncorhynchus mykiss））が挙げられる。遡上魚としては、海水へ泳ぐことができないが（例えば、陸封されたもの）、海水へ適応する生理学的メカニズムを有する魚も含まれる。本明細書で使用される用語「成魚前の遡上魚」とは、未だ海水に適応していない遡上魚をいう。これらの魚は、一般に稚魚である。成魚前の遡上魚としては、限定されるものではないが、小魚（fingerlings ）、幼魚（parr）またはスモルト（smolts）である魚が挙げられる。本明細書で使用する「スモルト」とは、魚が海水へ適応可能となる、または海水への続く移行の際に生存可能となる生理学的変化を受けた魚をいう。用語「スモルト」とはまた、海水への移行の際に無傷で生存する、まさに発達段階にあるのではなく、むしろ、統計的サンプリングおよび評価に基づき、海水への移行の準備が整った生理学的段階にあると決定される魚集団の１つである魚をいう。
【００１８】
サケ等の遡上魚は、成体期の間に海洋の広い地域に何年も旅行し、住んでいたにも関わらず、彼らが孵化した淡水流の特定の位置に戻ることができる。この離れ業を達成するために、遡上魚は、彼らの生活環の種々の局面の間に、特定の位置を認識し、そこに戻ることを可能にする刷り込みを受ける。１つのかかる局面は、それらが河床で孵化する生命の幼生段階の間であり、別の局面は、それらが海水中での生活に適応する川でのスモルト化の間である。スモルト化の間に特定の臭気物質にサケを曝すことにより、対応する成体のサケにその臭気物質を含む場所に戻るように刷り込ませることが示されているが、本発明の発見まで、これらの魚が天然または人工の臭気物質のいずれかを用いて如何にしてこの課題を達成するかは不明であった。河口または川の特定の領域への魚による放卵移動は遡上魚の種類には限定されない。フラウンダー等のフラットフィッシュは、放卵のために深海水から沿岸の川の付近の特定の河口まで移動し、次いで海洋に戻る。
【００１９】
魚を誘引または忌避するために改善された能力は、枯渇した天然集団の補充および海洋網生簀（netpens）または海洋農場による商業生産のための魚の繁殖および生産において孵化場生産者を大いに補助する。現在の方法は、孵化場での多数の幼若魚の生産、それに続く、川または河口の数カ月での野生へのそれらの放出による野生魚集団の補充を含む。これらの魚に対する誘引物質の使用は、釣り針または網を使用する漁師による効率的な収穫において補助しうる。類似した様式で、海洋農場のための幼若のサケの大量の商業生産がアラスカおよび太平洋北西等の領域で起こる。しかし、かかる方法は、多数の魚が野生への移動を生き残れなく、従って特定の場所に応じて、淡水の場所への１〜20％の帰還を支えるために非常に多数の魚が生産され、放出される。野生魚集団における補充の試みは、発電所およびダムタービンの水取り込みに多数の幼若魚が迷い込むことにより妨害される。忌避物質による孵化場からの放出後のかかる幼若魚の首尾良い嫌悪は、これらの補充の試みの効率を効果的に増大し、および／または発電所またはタービンの運転に関して魚により引き起こされる問題を回避する。さらに、多数のサケおよびマスは、淡水孵化場で生産され、ここでそれらは、狭い空間内で成長するために海洋網生簀に直接移される。本発明の前に、この直接移動法により生じるサケスモルトは、新しい海水環境に適応する多数の問題に遭遇する。海水への移動後の摂食の遅れおよび海水生活のための腸機能の再構築は、現在、海水へ移動後のこれらの魚の成長を減少させる。
【００２０】
本発明は、魚を成長させる方法に関する。魚の孵化場は、遡上魚の養殖の際、困難性を経験する。というのは、成魚前の魚が海水に適応する〔例えば、スモルト化（smoltification）を経る〕時間のウインドウ（window）は短く、正確に指摘するのが困難でありうるためである。その結果、魚は海水へ移行される場合、しばしばストレス（例えば、浸透圧衝撃）および摂餌の減少を経験する。移行された数匹の魚は、その結果死亡する。本発明は、PVCR調節因子を有する淡水において誘引物質を魚に刷り込み(imprinting)、海水への移行後に同じ誘引物質を有する飼料を魚に与えることにより、魚が海水により良く適応し、かつ食物消費を増加することを可能にする方法および組成物を提供する。
【００２１】
PVCR調節因子は、臭気物質に対する魚の嗅覚感受性(olfactory sensing）を変化させる。ある場合において、淡水における（例えば、少なくとも１つの）PVCR調節因子の存在は、一定の臭気物質を感受する魚の能力を可逆的に低減または除去する。他の場合において、それは高められうるかまたは増加されうる。PVCR調節因子を有する淡水中の魚（例えば、遡上魚）を臭気物質に曝露することにより、魚は臭気物質に対して減少したかまたは鈍くなった応答を有する。PVCRは、魚が本明細書にさらに規定される種々の型の調節因子を「感受する」ことを可能にする。「感受する(sense)」または「感受性(sensing)」という用語は、PVCR調節因子に応答してその発現および／または感受性を変化させるPVCRの能力のことを言う。PVCRを調節することに加えて、臭気物質の感受は、１つ以上の嗅覚レセプターの変化させることを伴いうる。PVCRは、例えば、臭気物質の感受の間に１つ以上の嗅覚レセプターと作用して神経刺激を生じる。この神経刺激の生成は、魚における嗅覚ラメラへの臭気物質の結合の際に生じる。
【００２２】
魚の嗅覚系は、脳の嗅上皮、嗅神経および嗅球からなる。本発明の方法を使用して、抗PVCR抗血清およびRT-PCRは、魚の嗅覚系の各成分が少なくとも１つのPVCRタンパク質を含むことを示す。本発明は、魚がPVCRによるCa2+、Mg2+およびNa+のイオン濃度の感受を介して周囲の水の塩分濃度の「匂いをかぐ」ことを可能にする少なくとも１つのPVCR機能を証明する方法に関する。本発明はさらに、Ca2+、Mg2+、Gd3+およびネオマイシンなどのPVCR調節因子に魚の嗅上皮を曝露することにより野生のサケが遭遇する塩分濃度範囲に生じるものに対応する濃度範囲において濃度依存嗅神経刺激を生成する方法に関する。これらのデータは、嗅上皮細胞における機能的PVCRタンパク質の存在および魚による塩分濃度感受におけるそれらの鍵となる役割を実証する。
【００２３】
これらの同一の方法が、臭気物質（例えば、アミノ酸誘引物質または忌避剤）およびPVCRアゴニスト（Ca2+またはGd3+）への嗅上皮の同時曝露が、得られる嗅神経刺激の大きさおよび／または特徴を変化させることを証明するために使用された。この変更は、臭気物質レセプター（特定の臭気物質分子を感受する）およびPVCR（存在する場合、塩分濃度およびアミノ酸の両方を感受する）により作製されるシグナル間の相互作用により作製される。PVCRは、臭気物質レセプターおよびその能力を調節または変化させ、神経刺激を生じる。
【００２４】
臭気物質レセプター（特定の臭気物質分子を感受する）と共にPVCRタンパク質（塩分濃度および選択されたアミノ酸を感受する）の両方の存在は、サケが産卵するために生息地に戻るときに、特定の川または小川の臭気ならびにその塩分濃度プロフィールの両方をどのように感受しうるかについての説明を提供する。
【００２５】
イオン組成において広く変化する水性環境中で、淡水および海水魚は臭気物質を感受する。嗅上皮細胞におけるPVCRは、嗅覚細胞がイオン環境の広い範囲にわたり臭気物質に対して意味のある応答を提供することを可能にするのに大きな役割を果たす。さらに、特定の嗅覚細胞におけるPVCRは、淡水および海水魚が「匂いをかぐ」かまたは水の塩分濃度を感受することを可能にする。本明細書に記載のように、PVCRは種々の調節因子、特にアミノ酸および二価カチオンを感受しうる。
【００２６】
周囲の淡水ならびに魚の血清におけるPVCR調節因子の存在は、魚を海水に移行した後にのみ通常生じるものに類似する様式で少なくとも１つのPVCRの発現および／または感受性を変化させる。したがって、海水への移行後に食物または水に存在する臭気物質を刷り込む代わりに、遡上魚は、海水で生じているものと同一の様式で臭気物質を刷り込むが、驚くことに魚は淡水に残る。魚が海水に移行される場合、魚の嗅覚感受性器は、海水環境にすでに十分適応し、かつ刷り込みされており、魚は容易に海水における臭気物質を識別し、思い出しうる。
【００２７】
臭気物質は、嗅覚レセプターに結合する化合物であり、魚に臭気物質を感受させる。嗅神経刺激の発生は、嗅覚ラメラへの臭気物質の結合を生じる。魚臭気物質は、魚誘引物質または魚忌避剤のいずれかである。魚誘引物質は、魚が誘引される化合物である。誘引物質の感受性は、PVCR調節因子に応答した魚の嗅覚器(olfactory apparatus)におけるPVCRの感受性および／または発現により、少なくとも部分的に調節される。誘引物質の例としては、アミノ酸（例えば、L-トリプトファン、L-チロシン、L-フェニルアラニン、L-アラニン、L-セリン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-グリシン、L-リジン、L-メチオニン、L-アスパラギン、L-プロリン、L-グルタミン、L-スレオニン、L-バリンおよびL-システイン）、ヌクレオチド（例えば、イノシン一リン酸）、有機化合物（例えば、グリシン-ベタインおよびトリメチルアミン酸化物）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。同様に、魚忌避剤は、魚が忌避される化合物であり、忌避剤に対する魚の感受性が、PVCR調節因子の存在下で魚の嗅覚器においてPVCRの発現および／または感受性を介して変化される。忌避剤の例は、皮膚の表皮細胞により生成された哺乳動物オイルおよび脂肪酸の混合物であり、ヒトの手が水溶液でリンスされた後に残っている「指リンス液(finger rinse)」である。指リンス液を行なうための方法は、当該分野において公知であり、実施例の段落により詳細に記載されている。
【００２８】
魚が淡水中でPVCR調節因子および臭気物質に曝露される期間中に、それらは臭気物質で「刷り込まれる」ようになる。魚を臭気物質で刷り込みするプロセスとは、魚において持続する影響または印象を生成し、その結果、魚は臭気物質に「反応」し得、例えば、それらは臭気物質に敏感になるかまたは臭気物質を識別しうることを言う。臭気物質に敏感になるとは、臭気物質をより容易に認識するかまたは思い出す魚の能力のことを言う。臭気物質の識別とは、１つ以上の臭気物質の間を区別するか、または別のものにまさって１つの臭気物質に対する好みを有する魚の能力のことを言う。１つの態様において、本発明は、本明細書にさらに記載されるように、誘引物質を用いて魚を刷り込み、PVCRを調節し、次いで同一の誘引物質を有する特有の飼料組成物を提供する方法に関する。
【００２９】
特に、魚を成長させる方法は、少なくとも１つのPVCR調節因子（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）を淡水に添加すること、および特別に作製されたかもしくは改変された飼料を魚による消費のために淡水に添加することにより、魚を誘引物質に対して刷り込むことを含む。飼料は、血清中のPVCR調節因子のレベルを有意に増加させるのに十分な量の塩化ナトリウム（NaCl）（例えば、約１重量％〜約10重量％、または約10,000mg/kg〜約100,000mg/kgの間）、および誘引物質（例えば、微量〜約100mg/kgの間）を含む。飼料中のNaClのこの量は、より多くの淡水を遡上魚に飲ませるようにするか、または飲むのを誘導する。淡水はPVCR調節因子を含んでおり、魚は多量の水を摂取するので、PVCR調節因子の血清レベルが魚で有意に増加し、PVCR発現を調節（例えば、増加および／または減少）および／またはPVCR感受性を変化させる。PVCR調節因子は、本発明に記載のように誘引物質に対する魚の嗅覚感受性を変化させる。
【００３０】
別の態様では、飼料に臭気物質を添加することによるのではなく、例えば魚がスモルト化を経ているかまたは一定の幼生段階にある間にPVCR調節因子を有する淡水（PVCR調節因子環境）に臭気物質を添加することにより、魚（例えば、遡上魚）が刷り込みされる。魚は、本明細書に記載されるものと同じ工程に供される。すなわち、臭気物質が飼料よりもむしろ淡水の水に添加されることを除いて、魚は、PVCR調節因子環境にあり、NaClおよび任意にPVCR調節因子（例えば、トリプトファン）を有する食餌を与えられる。臭気物質は、約1ナノモル〜約500ミリモルの量で淡水に添加される。このプロセスは、嗅覚器においてPVCRの発現および／または感受性を調節することにより、魚を臭気物質を用いて刷り込み、その結果、魚の嗅覚感受性器が臭気物質を識別しうるかまたは臭気物質に対して敏感になる。
【００３１】
本発明は、さらに別の態様では、水の第１ボディー(body)におけるPVCR調節因子および臭気物質の導入を含む。魚が刷り込みされた後、それらは水の第２ボディーに移行される。本発明の工程に供される魚の型に依存して、魚は淡水または海水に由来しうる。例えば、成魚前の遡上魚は、本発明の工程を実行する前に淡水に維持される。本明細書に記載のように、スモルト化の間、魚はPVCR調節因子および臭気物質に供され、それにより魚を刷り込む。遡上魚を次いで海水に移行し、そこで魚は臭気物質をより容易に識別しうる。淡水魚の場合、例えば、魚は淡水において維持され得、PVCR調節因子および臭気物質は淡水に導入されうる。一度刷り込み期が生じると、次いで魚はPVCR調節因子が添加されていない淡水に戻されうる。さらに別の例では、海水魚はPVCR調節因子および臭気物質が添加された淡水に海水から直接移行されうる。代替的には、海水魚はまた、PVCR調節因子が添加された淡水においても成長しうるので、本発明は、本明細書に記載のようにこのPVCR環境に臭気物質を導入することにより実行されうる。淡水において海水魚を成長させる方法は、特許第6,463,882号明細書に詳細に記載されている。海水魚が刷り込まれた後、それらは次いで海水に移行されうるか、または所望の場合、PVCR調節因子が添加された淡水（例えば、臭気物質のない水）に戻されうる。
【００３２】
一度魚が刷り込まれると、それらはPVCR調節因子および臭気物質を有する淡水環境から水の第２ボディー（例えば、海水、淡水またはPVCR調節因子を有する淡水）に移行されうる。本発明は、魚が移行された後に臭気物質の供給源を提供することを含む。供給源は、魚を臭気物質に曝露させることが可能である事実上全てのものまたは組成物でありうる。この臭気物質は、魚が刷り込まれるものと同じ臭気物質である。例としては、本明細書にさらに記載され、例えば、物体(objects)、組成物、懸濁液、スプレーなどが挙げられる。本明細書に記載のように、移行された後に魚が臭気物質に曝露される場合、魚は臭気物質に反応しうる。
【００３３】
遡上魚の場合、一度魚が臭気物質を用いて刷り込まれ、スモルト化プロセスを経ると、魚は海水へ移行される準備が整っている。魚が海水へ移行される場合、魚は栄養の供給源だけでなく、魚は淡水中で本明細書に記載のプロセスに曝露された時に魚に刷り込まれたのと同じ誘引物質または誘引物質の組み合わせも含む飼料を提供される。魚は、海水への移行後、本発明の方法に曝露されていない魚よりも多くの飼料を消費し、それをより初期に行なう。したがって、魚はより良好に海水に順応し、より速く成長する。１つの態様では、刷り込まれなかった誘引物質を有する飼料と比較して、魚は刷り込まれた誘引物質を有する飼料を好む。
【００３４】
スモルト化とは、魚が淡水から海水への順化または適応化を受ける段階である。スモルト化はまた、未だ淡水中にいるが、海水への生理学的前適応にある成魚前の遡上魚に生じるプロセスをいう。スモルト化プロセスは、種ごとで異なる。異なった種の遡上魚は、魚の一生の内に、異なる大きさ、体重および時間でスモルト化を受けうる。本発明は、広範な多数のまたは全ての成魚前の遡上魚に、このプロセスを受けさせ、海水への移行の準備をさせる。魚は、この期間の間に本明細書に記載のように臭気物質を用いて刷り込まれうる。
【００３５】
スモルト化の間の刷り込みに加えて、刷り込みプロセスは、魚の他の発達段階の間にも生じうる。臭気物質はまた、幼魚において刷り込まれうる。「卵黄嚢」幼生段階とも呼ばれる初期幼生段階は、魚の主な食物供給源が卵黄嚢に由来する期間である。この段階の間、幼生はPVCR調節因子および臭気物質に曝露され得、その結果臭気物質が刷り込まれうる。本明細書にさらに記載のように、十分な期間PVCR調節因子および臭気物質が淡水に添加され、刷り込みを生じさせる。刷り込みが生じうる間の別の発達段階は、「第１食餌(first feeding)」幼生段階である。この段階において、魚は、徐々に卵黄嚢を栄養の供給源として使用するのをやめ、飼料を摂取し始める。第１食餌幼生は、刷り込みのためにPVCR調節因子および臭気物質に曝露されうる。本明細書に記載のように、臭気物質は、淡水または飼料に添加されうる。刷り込みプロセスは、これらの段階、すなわち卵黄嚢幼生段階、第１食餌幼生段階、およびスモルト化段階の１つまたは組み合わせで同じ臭気物質を用いて生じうる。１つより多くのこれらの段階の間に、刷り込みプロセスを行なうことにより、魚は海水への移行後に一定の臭気物質に曝露される場合にそれに対するより強い応答を作り出す。
【００３６】
本発明はまた、他の型の魚、すなわち、希釈された海水濃度を有する海岸の河口に移動し、そこで放卵するフラウンダー(flounder)に適用されうる。生じるフラウンダーの幼生および若年段階は海に戻る前にこれらの河口で発達する。現在進行中のプログラムの補充を介するフラットフィッシュの刷り込みは、本明細書にさらに記載されるように、本発明の方法が生じうる環境を提供する。
【００３７】
遡上魚は、PVCR調節因子を添加する前に淡水中に維持される。用語「淡水」とは、例えば、小川、川、池、公共の上水道から来る、または、例えば、以下のイオン組成（約2mM 未満のマグネシウム、カルシウムおよびNaCl）を有する他の非海洋源から来る水を意味する。用語「淡水」はまた、本明細書で記載されるように、少なくとも１つのPVCR調節因子が添加された淡水をいう。
【００３８】
PVCR調節因子は、PVCRの発現を調節するのに、またはPVCRの感受性を変化させるのに十分な量で淡水に添加される。PVCRは、実施例の段落に記載のように、分子生物学的手法を用いて、数種の遡上魚の様々な組織から単離された。DNAが、タイセイヨウサケ、チャー、シロザケ、ギンザケ、マスノスケ（King or Chinook Salmon）、カラフトマス、ベニザケおよびマスを含む様々な種の遡上魚由来の試料から単離された。
【００３９】
遡上魚の様々な組織（例えば、鰓、皮膚、嗅覚ラメラ、嗅上皮、腸、腎臓、膀胱、胃腸管、脳または筋肉）に位置するPVCRは、例えば、周囲の水中で、魚の血清中で、或いは、腎臓、膀胱、または腸等の体内の細管の管腔内容物（luminal contents）中で、種々のイオン（例えば、二価カチオン）を含むPVCR調節因子における変化を感受する。魚の嗅覚器に位置するPVCRは、本明細書に記載のように、PVCR調節因子および／または臭気物質を感受するのに重要な役割を果たす。これらの調節因子を感受するその能力はPVCRの発現を増加させ、および／または減少させ、それにより、魚が海水へよりよく適応可能となる。PVCRの増加したおよび／または減少した発現は、例えば、１以上の組織でまたは全組織で生じうる。PVCRの調節が魚の嗅覚器において生じる場合、魚はPVCR調節因子または臭気物質を感受し、レセプターと結合して脳に神経刺激を送りうる。PVCR調節因子の存在は、臭気物質に対するPVCRの発現、感受性および／または反応性を可逆的に減少し、それにより嗅神経刺激を減少するか、最小限にするか、または排除する。
【００４０】
PVCRタンパク質の分子クローニングは、これらのイオンレセプターが、臭気物質およびフェロモンレセプターを含むレセプターに連結したGTP結合タンパク質の大スーパーファミリーに属することを証明する。哺乳動物の神経系におけるPVCR(CaR)発現の局在化は、嗅葉におけるCaR mRNAの大量の発現を証明する。
【００４１】
哺乳動物および魚の臭気物質レセプターの分子クローニングは、PVCR（哺乳動物におけるカルシウムレセプターすなわちCaR）が、臭気物質およびフェロモンレセプターの両方（広範囲の臭気物質分子に結合する）ならびにグルタメートに結合する代謝性(metabotropic)グルタミン酸レセプター(mGluR)に構造上関連することを証明した。臭気物質およびPVCRは両方とも、Gタンパク質と相互作用し、アデニル酸シクラーゼおよび／またはホスホリパーゼA2を含むシグナル伝達分子を活性化し、細胞内のCa2+濃度を増加するGタンパク質連結レセプターである。
【００４２】
「PVCR調節因子」は、PVCRの発現を調節する（例えば、増加させるおよび／または減少させる）か、或いはPVCRの感受性または反応性を変化させる化合物を意味すると本明細書において定義されている。かかる化合物としては、限定されるものではないが、PVCRアゴニスト（例えば、無機ポリカチオン、有機ポリカチオンおよびアミノ酸）、２型カルシミメティクス（calcimimetics）、およびPVCR発現を間接的に変化させる化合物（例えば、約3,000 〜10,000国際単位/kg 飼料の濃度の1,25ジヒドロキシビタミンＤ）、インターロイキンベータ等のサイトカイン、並びにマクロファージ走化性ペプチド−１（MCP-1））が挙げられる。PVCRの発現および／または感受性を増加させるおよび／または減少させる２型カルシミメティクスの例は、例えば、NPS ファーマシューティカル  インコーポレイテッド（ソルトレイク、ユタ州、特許番号第5,962,314 号；第5,763,569 号；第5,858,684 号；第5,981,599 号；第6,001,884 号）製のNPS-R-467 およびNPS-R-568 である。それらは、飼料または水中、約0.1μM〜約100μMの間の濃度で投与されうる。ネメース（Nemeth）, E. F. ら、PNAS 95: 4040-4045 (1998)参照。無機ポリカチオンの例としては、約2.0〜約10.0mMの間の濃度のカルシウムおよび約0.5 〜約10.0mMの間の濃度のマグネシウムを含む二価カチオン；および限定されるものではないが、約１〜約500 μM の間の濃度のガドリニウム（Gd3+）を含む三価カチオンである。有機ポリカチオンとしては、限定されるものではないが、約1 〜約8gm/kg飼料の間の濃度のネオマイシンまたはゲンタマイシン等のアミノ糖類、並びにポリアミン類（例えば、飼料中、約10μM 〜10mMの間の濃度の、ポリアルギニン、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、スペルミン、カダベリン、プトレシン、ポリアルギ二ン／ヒスチジン、ポリリジン／アルギニンの共重合体）を含む有機ポリカチオンが挙げられる。ブラウン（Brown), E. M. ら、Endocrinology 128:3047-3054 (1991)；クイン（Quinn), S. J. ら、Am. J. Physiol. 273:C1315-1323 (1997) を参照。さらに、PVCRアゴニストとしては、約１〜約10gm/kg 飼料の間の濃度の、L-トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、およびＬ−システイン等のアミノ酸が挙げられる。コニグレーブ（Conigrave), A. D. ら、 PNAS 97:4814-4819 (2000)参照。１つの態様では、アミノ酸はまた、低レベル（例えば、約1mM〜約10mMの間）の細胞外カルシウムの存在下に少なくとも１つのPVCRにより感受されうるアミノ酸と定義される。細胞外カルシウムの存在下、腸、幽門盲腸（pyloric caeca）、または腎臓等の器官または組織におけるPVCRはよりよくアミノ酸を感受しうる。実施例の段落を参照。モル濃度とは、淡水中のPVCR調節因子の遊離のまたはイオン化物の濃度をいい、結合したPVCR調節因子（例えば、ガラス、タンパク質、またはプラスチック表面を含む負に帯電した粒子に結合したPVCR調節因子）の量は含まない。これらの調節因子の任意の組み合わせが、かかる組み合わせによりPVCRの発現および／または感受性を調節する限り、（本明細書に��載のように、NaClと共に）水にまたは飼料に添加されうる。
【００４３】
PVCR調節因子は、多くの方法で魚に投与することができる。本発明は、PVCRの発現を調節するのに、および／またはPVCRの感受性を変化させるのに十分なあらゆる方法でのPVCRの投与を包含する。１つの態様では、PVCR調節因子は、本明細書に記載のように、様々な濃度で淡水に単純に添加される。少なくとも１つのPVCR調節因子を有する淡水環境は本明細書において「PVCR調節因子環境」という。水に添加されるPVCR調節因子（例えば、カルシウムおよびマグネシウム）は、魚の皮膚および鰓上のPVCRの発現を調節および／またはPVCRの感受性を変化させ、特に、魚が約１％〜約10％の間のNaCl（例えば、約10,000mg/kg 飼料〜約100,000 mg/kg 飼料の間の濃度）を有する飼料を給与された場合、該魚により摂取されうる。飼料にNaClを添加するのに加え、PVCR調節因子（例えば、トリプトファン等のアミノ酸）も飼料に添加することができる。飼料に添加されるPVCR調節因子の量およびタイプも本明細書に記載されている。他の態様には、魚を調節因子、例えば、有機ポリカチオン類中に「浸漬」することにより、魚をPVCR調節因子に供することが含まれる。有機ポリカチオン類は、PVCRの発現を調節するのに十分な量で魚の皮膚および鰓に接着可能となるような方法で処方されうる。
【００４４】
１つの好ましい態様では、本発明は、２つのPVCRアゴニストの組み合わせを淡水に添加することにより実施される。特に、カルシウムとマグネシウムを淡水に添加し、各々の濃度を、カルシウム約2.0mM〜約10.0mMおよびマグネシウム約0.5mM〜約10.0mMとする。水にカルシウムとマグネシウムを添加することに加え、これらのイオン濃度の範囲は、魚に対し淡海水（例えば、希釈した海水）環境を提供することにより達成されうる。
【００４５】
カルシウムおよびマグネシウムは種々の供給源から得られ得、水に添加される場合、カルシウムおよび／またはマグネシウムのレベルは、PVCRの発現を調節し、および／または前記範囲内にある。カルシウムとマグネシウムの供給源は種々の化合物の混合物でありえ、または各々は実質的に均一若しくは純粋な化合物に由来しうる。カルシウムの供給源としては、例えば、Ca(CO3)2、CaCl2、CaSO4、およびCa(OH)2が挙げられ、マグネシウムの供給源としては、例えば、MgCl2、MgSO4、MgBr2 、およびMgCO3が挙げられる。
【００４６】
１つの態様では、本発明は、NaCl食の間の、少なくとも１つのPVCR調節因子を有する淡水への非連続的（例えば、中断した）並びに連続的（例えば、中断のない）曝露を含む。PVCRへの非連続的曝露は、PVCR発現および／またはPVCRの変化した感受性が調節（例えば、種々の組織における増加および／または減少）されたままである限り、生じうる。
【００４７】
本発明の方法は、淡水から海水への移行のための魚の準備を整える。成魚前の遡上魚は、魚に臭気物質を刷り込みするのに十分に長く、PVCR調節因子を有する淡水環境中に維持される。魚は、臭気物質を刷り込み、PVCRを調節するのに十分な期間、PVCR調節因子環境において臭気物質に曝露され、その結果嗅覚器において神経刺激の発生が生じる。時間の長さは、魚の生理学的および身体的成熟度に依存する。魚の中には、より容易に環境に適応し、それらのPVCRの発現を調節し、および／またはPVCRの感受性を変化させるものがあるであろう一方、そうするのにもっと時間を要するものもあろう。PVCRの発現を調節し、および／またはPVCRの感受性を変化させるのに必要な時間の長さに影響を与えうる因子としては、限定されるものではないが、あるとすれば、PVCR調節因子の淡水への添加前における魚の大きさ、PVCR発現または感受性のレベル、PVCR調節因子およびイオンを排出する魚の能力、魚の体積に対する表面の比などが挙げられる。それゆえ、魚が維持される時間の長さは、約７日から数カ月の範囲（例えば、７、14、21、30、45、90および120日）、好ましくは約2週間から約6週間の範囲でありうる。
【００４８】
本発明は、さらに飼料を淡水に添加することを含む。魚が給与される飼料の頻度および量は当該分野で教示される。一般に、魚は１日に１〜３回、合計で約0.25〜5.0％体重／日が給餌される。飼料は、成魚前の遡上魚の血清中でのPVCR調節因子のレベルの有意な増加に寄与するのに十分なNaClを有する。より具体的には、NaClは少なくとも２つの効果を有する。最初のものは、十分な量のNaClが飼料中に存在する場合に生ずる。飼料中のNaClの存在は、成魚前の遡上魚に周囲の環境から多くの水を飲ませるようにする。第２のものは、NaClは直接的な負のPVCR調節因子であり、PVCR感受性を減少するように働く。感受性を減少するNaClの効果にもかかわらず、魚がNaCl食を給与され、周囲の淡水環境がその中に少なくとも１つのPVCR調節因子を有する場合、驚くべきことに、一定の組織においてPVCR発現が増加する。PVCR調節因子を有する淡水の摂取の増加は、PVCR調節因子の血清レベルの全体的な増加を引き起こす。
【００４９】
本発明はまた、魚の飼料に関する。１つの態様では、飼料は、遡上魚の血清中でのPVCR調節因子のレベルを有意に増加させるのに寄与するのに十分な薬剤を有する。かかる薬剤は本明細書に記載の本発明の方法において使用されうる。魚の血清中のPVCR調節因子のレベルを有意に増加させる薬剤の一例はNaClである。したがって、別の態様では、飼料は、NaClを約１重量％〜10重量％の間で、または約10,000mgNaCl/kg飼料〜約100,000mgNaCl/kg飼料の間（例えば、12,000mg/kg）で含む。飼料は、本明細書に記載のような誘引物質もまた含む。これらの飼料は、本明細書で「NaCl／誘引物質食」と呼ばれうる。臭気物質は、魚の嗅覚感受性を変化させるのに十分な量で飼料中に存在する（例えば、微量〜約100mg/kg）。NaClおよび臭気物質に加えて、PVCR調節因子、特にアミノ酸などのPVCRアゴニストが任意に添加されうる。１つの態様では、飼料は約１重量％〜約10重量％の間のNaCl、L-アラニン等の臭気物質、および約１〜約10gm/kgの間の量のトリプトファン等のアミノ酸を有する。上記するように、飼料を構成する、本発明の特有の成分に加え、飼料は、さらに、例えば、栄養および／または嗜好性のために伝統的に飼料に含められる成分を含みうる。例えば、飼料は、カレイ若しくはイカ肉、または魚油等の魚成分を含みうる。かかる飼料はまた、幼生魚、幼若魚および成魚を含む魚の特定のライフステージに対して設計されうる。
【００５０】
飼料は、適切な濃度のNaClが存在する限り、多くの方法で調製されうる。飼料は、例えば、飼料を再処方することにより、または飼料によるNaClを有する溶液の吸収を可能にし、任意に臭気物質および／またはPVCR調節因子を添加することにより、調製されうる。嗜好性のためトップドレシング(top dressing)を添加することができる。
【００５１】
本発明の別の態様は、約2.0〜約10.0mMの間のカルシウム、および約0.5mM〜約10.0mMの間のマグネシウムを有する淡水環境に遡上魚が維持される際に、該魚に１重量％〜10重量％の間のNaClおよび臭気物質を有する飼料を給与することを含む。
【００５２】
別の態様では、魚はまた、PVCR調節因子を有する淡水中にいる間、光周期（photoperiod）に曝露される。光周期とは、魚を光（例えば、太陽光、白色光または蛍光灯）に曝露することをいう。好ましくは、光周期は、実質的に連続的であり、または成長が増大するのに、スモルト化が誘導されるのに、および／または死亡率が減少するのに十分に長く行われる。魚は、淡水中で本発明の工程を受けながら（例えば、PVCR調節因子環境中でNaCl／誘引物質食を給与されながら）、並びにこの環境に曝露され、次いで海水に移行された後、連続的な光周期に曝露されうる。光周期は、24時間間隔内で少なくとも約12時間、または約14、16、18、20、22、または好ましくは約24時間等のより長い期間行われうる。魚が光周期に曝露される日数は約１日〜数カ月（例えば、１、３、７、14、21、30、45、90および120日）の範囲でありうる。好ましくは、魚がPVCR調節因子環境に維持され、NaCl／誘引物質食を給与されている間の光周期は、好ましくは約４日〜約50日の間である。海水へ移行後、光周期曝露は、好ましくは約７日〜約45日の間である。魚を光周期に曝露する方法は当該分野で公知であり、例えば、ウィロービー（Willoughby）, S., Manual of Salmonid Farming, Blackwell Scientific, Oxford, UK, 106, および152-154 (1999)に記載されている。
【００５３】
魚はまた、海水へ移行後、光周期に曝露されうる。光周期への曝露の利点としては、海水への移行後における魚の死亡率の劇的な減少が挙げられる。従って、１つの態様では、魚を連続的な光周期に維持することは、海水へのそれらの適応の際のそれらの生存率を増加させる。
【００５４】
用語「海水」とは、海由来の水、または海由来の水の化学組成およびミネラル組成を擬態するように処方された水を意味する。調製された海水の主要な元素組成は、好ましくは、天然の海水（例えば、以下のイオン組成を有する：30mMを超えるマグネシウム、約6mMを超えるカルシウム、および約300mMを超えるNaCl）の主要な元素組成の範囲内に実質的に入る。人工海水の調製方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第5,351,651号明細書に記載されている。
【００５５】
成魚前の遡上魚に対し本発明の方法を実施する場合、魚は、本発明に供されていない成魚前の遡上魚と比べて、成長（例えば、SGR）、消化管の運動性および／または飼料消費の有意な増加を示す。本発明は、海水移行の前、海水移行の際、および海水移行の後における、成長、消化管の運動性および／または飼料消費の増大を可能にする。海水への移行の際、本発明の工程に供されていない魚は一般に、浸透圧ストレス、飼料消費の減少若しくは飼料の無消費、および死さえも経験する。浸透圧ストレスは、周囲の環境と魚の体内区画との間の浸透圧の差から生ずる。これは、魚の恒常的平衡を乱し、成長の減少、生殖不良および疾患への耐性の減少を生ずる。浸透圧ストレスの結果として、魚はまたよりゆっくりと成長し、市場サイズに達するのにより長くかかる。さらに、本発明は、種々の大きさの魚の成長の増加を可能にする。成長の増加は、小型の魚（例えば、約15gm）、中型の魚（例えば、40gm）並びに大型の魚（例えば、90〜120gm ）において見られることが予期される。したがって、本発明は約15gm〜約120gmの範囲の体重を有する成魚前の遡上魚の成長の増加方法に関する。PVCRの発現および／または感受性を、例えば、魚の嗅覚器で調節することができ、鰓組織の塩類細胞(chloride cell)中で、胃腸管（例えば、胃、幽門盲腸、近位若しくは遠位腸）、腎臓の管、皮膚または膀胱中の上皮細胞中などの組織の他の型で調節することができる。
【００５６】
また、ある群における摂餌しないかまたは乏しい摂餌浸透圧ストレスを受けた魚の排除は、全群における全体的な飼料変換率を改善する。処理した魚の群の全メンバーによる海水移行後の最適な摂餌および成長は、より良い飼料の利用を可能とし、魚が市場サイズに達する場合の全体的な生産収量を改善する。
【００５７】
本発明は、飼料の有効利用を増加するための方法およびスモルト化プロセスの間に飼料または淡水のいずれかにおいて含められた単一または混合物のL-アミノ酸を含むPVCRアゴニストに魚を曝露することによる魚の胃腸管の機能の最適化または魚の胃腸管の成長を増加することによる遡上魚の成長を増加する方法を含む。これらの方法は、淡水に添加され、魚に摂取される食物への少なくとも１つのPVCRモジュレーターの添加により達成され得、それにより幼生魚または若い魚の種々の胃腸管セグメントの管腔を調節因子による変更に対して裏打ちする(line)細胞中に存在するPVCRを曝露する。魚における胃腸管PVCRの調節は、PVCRが媒介する特定のアミノ酸の感受および胃腸管を裏打ちし、この上皮を横切ってイオンおよび栄養の両方を運ぶ細胞のシグナル伝達を介する摂取された食物のそれらの利用を最適化する。
【００５８】
魚の胃腸管を裏打ちする細胞は、胃、幽門盲腸および腸ならびにこれらの細胞の基底外側膜に直ぐ続いて位置した微環境の両方の管腔部分に曝露されるたくさんのPVCRタンパク質を含む。本発明は、PVCRタンパク質が、イオンとアミノ酸の両方の濃度ならびに適切に応答するPVCRを含むシグナル細胞を感受する能力を所有するという知見に関する。アミノ酸の局部の濃度を感受することにより、PVCR含有細胞は、腸プロテアーゼによりこれらの上皮細胞に吸収されるアミノ酸に消化される栄養（タンパク質）の存在を常に見分けうる。したがって、腸の上皮細胞におけるPVCRタンパク質は、嗅上皮細胞について上記したものと類似した機能をはたしているが、PVCRにより生じるシグナルは神経シグナルにより伝わらない。その代わりに、胃腸管におけるPVCRの活性化は、輸送プロセスの活性化を引き起こし、胃腸管の運動性を変化させ、ならびに腸の上皮細胞の増殖および成長を引き起こす。PVCRタンパク質のこれらの２個の機能は、魚の有効な成長および発達に必要な胃腸管の感受を提供する。本発明の方法は、魚が淡水に残っている間に海水における最適な機能のための胃腸管の再構築および発達を可能にする。
【００５９】
従って、本発明は、臭気物質を用いて刷り込まれた、海水へ移行される遡上魚に対するFCRを改善する方法を含む。飼料変換率、すなわちFCRは、ある群の魚で増加した体重でこれらの群の魚に給与した食物の量を割ることにより得られる。魚による体重増加への食物の変換が効率的であればあるほど、FCRは小さくなる（少量の飼料／魚の大きな体重増加）。非常に小さいFCR数（１未満）は、体重増大への食物の高効率の変換を包含し、それは、産業が努力していることである。対照的に、大きなFCRは、体重増大への食物の不十分な変換を意味し、それは一般に望まれていない。大きな若しくは乏しいFCRは、望ましくない。というのは、飼料は通常高価であり、所定の体重まで魚を成長させるのにより多く使用しうるためである。本発明の方法に供された魚のFCR値は一般に、ほとんどの産業が公表している値よりも小さく、望ましいことが予期される。というのは、本発明は、食物を食べるが成長しないので、全体的なFCRが増加する傾向にある、浸透圧ダメージを受けた魚の存在を排除するためである。結果として、魚を本発明の方法に供することにより、１つの態様において、FCRは減少し、それによりほとんど全ての魚の最適な摂餌および成長が可能となる。本発明に供された魚のFCRは、大多数の魚の成長および摂餌を維持するのに十分であるか、または、好ましくは、大多数の魚の成長および飼料消費を増加するのに十分である。魚が本発明の方法に供された場合、それらは、例えば、約0.7〜約7.0の値を含むであろうFCRの範囲を示す。特に、食物消費または食物摂取が改善される。というのは、魚が嗅覚ラメラまたは嗅球の細胞においてPVCRおよび臭気物質レセプターにより食物の「匂いをかぎ」または該食物を「感受する」からである。
【００６０】
同様に、本発明は、成魚前の遡上魚の世代間の時間の減少または低減を可能にする。これらの魚は、より早く繁殖を開始する。というのは、本発明は、本明細書に記載されるように、それらの成長を増加するためである。性的に成熟した魚を得るために２〜３年が必要であるので、特性の選択的な繁殖に取り組もうとする試みには、所定の特性が選択され得、魚がその特性の繁殖を示す前にこの２〜３年の間隔を要する。成長、および本発明により生産される成熟体に達する時間の改善は、魚が性的な成熟に達するのに必要な時間間隔を、約６ヵ月〜約12ヵ月低減する。繁殖の間隔の低減は、多くの魚の生産を可能とし、海水へのより良い適応が可能である特性以外の特性を有する魚の選抜（例えば、改善された味、増加した肉の厚さ、増加したα３オメガ脂肪酸含量を有する魚、またはPVCR発現をより容易に調節することができる魚の選抜）を改善可能である。
【００６１】
本発明以前、淡水から海水へ移行される遡上魚は一般に、「臨界サイズ（critical size ）」と呼ばれる特定の大きさで移行される。臨界サイズは種ごとで変化するが、一般に、魚が海水へ移行されうる最小の大きさをいう。サケ、マスおよびチャーの臨界サイズは、それぞれ、約50〜約100gmの間、約70〜約120gmの間、および100gmを超える。ギンザケ、マスノスケおよびベニザケの臨界サイズは、それぞれ、約10〜約15gmの間、約20〜約40gmの間、および約１〜約2gmの間である。シロザケおよびカラフトマスはそれぞれ、約3gm未満の臨界サイズを有する。
【００６２】
本発明以前、平均臨界サイズに達した成魚前の遡上魚の集団が海水へ移行された。生理学的に移動の準備が整った魚がいる一方、準備が整っていない魚もいる。これは、海水への移行の際の死亡率の増加の理由の１つである。本発明の方法は、PVCR発現および／または嗅覚器および他の組織の感度を調節することにより、および／またはスモルト化を誘導することにより、全ての若しくはほとんど全ての、海水へ移行される魚を生理学的に調製する。一態様において、約15グラムを超える重量の本質的にすべての魚が、死亡率を示すことなく、移行され得る。それゆえ、本発明の方法は、海水への移行への成魚前の遡上魚を調製する方法、並びに成魚前の遡上魚においてスモルト化を誘導する方法を含む。
【００６３】
本発明の方法は、遡上魚におけるPVCRの発現および／または感度を調節し、臭気物質を刷り込んで(imprint)いるので、海水飼料が、魚に刷り込んだ同じ臭気物質を有し、これにより良好に給餌されるため、魚は、海水へ移行された場合により良く生存する。浸透圧ストレスの低減は、死亡率の低減を生ずる。これは、本方法で処理された魚が、淡水とは非常に異なるイオン組成を有する海水へ移行された場合に、浸透圧ショックを経験しないために生ずる。それゆえ、本発明は、成魚前の遡上魚が海水へ移行された後の死亡率の低減方法を具体化する。
【００６４】
本発明は、海水への移行後の死亡率の低減に有効であるだけでなく、本発明は、移行前の淡水における生存率の増加にも使用される。本発明の発見前、孵化場が海水へ成魚前の遡上魚を移行させる「スモルトウインドウ」が存在し、魚がスモルト化を経た後に淡水中で維持され続けるならば、魚が死亡した。本発明のPVCR調節因子環境およびNaCl、誘引物質食は、魚が無期限に成長し続けるのを可能にする。魚は、飼料を消費し、成長し続ける。従って、本発明の方法は、魚が海水へ移行され得る期間またはウインドウを有意に増加させるか、或いはそれを全く排除する。さらに、これらの魚が海水へ移行された後、それらは、本発明の工程を経ていない魚と比べて、より多く飼料を消費し、より良く成長する。
【００６５】
本発明はまた、特定の種の魚について産業で認められる臨界サイズと比べて、より小さな体重を有する成魚前の遡上魚を海水へ移行させる方法を含む。本明細書に記載されるように、本発明の方法は、通常通りに海水へ移行された魚、またはスモルト化を経た若しくは経ようとしている魚よりも小さな魚においてPVCR発現を調節する。これらの方法は、スモルトになる前の稚魚の段階にある幼魚を海水へ移行する工程を含む。幼魚は、稚魚または卵黄嚢稚魚の成熟後に生ずる成魚前の遡上魚の生活段階である。幼魚または小魚は、それらの脇腹に沿って特徴的なオビッドストライプ（ovid stripes）または幼魚マークを表示し、通常、スモルト化前に淡水中で成長および発達を受ける。用語「幼魚」は当技術分野で公知の語である。卵黄嚢稚魚（yolk sac fry）に給餌し続けると、それらはより大きな幼魚に成長する。幼魚は、それらが成長した条件に依存して幅広い体重の範囲を有しうる。幼魚の体重は、種ごとで変わる。幼魚の体重は約0.5gm〜約70ｇｍの範囲で有意に変化する。本明細書に記載するように、１つの実験での本発明の実施により、臨界サイズ体重（約70〜約100gmの間）の約13％〜約18.5％の間、すなわち、約13gm程度の体重を有するタイセイヨウサケ幼魚の移行に至った。従って、本発明は、海水への移行のために、海水への移行時に約15グラム〜約120 グラムの間の体重の遡上魚を調製する方法を包含する。
【００６６】
本発明は、さらに、過去において魚が移行させられた水温（６#〜14℃）に比べて、暖かい温度（例えば、14℃および19℃）を有する海水へ成魚前の遡上魚を移行する方法を提供する。魚は、本発明の方法を用いて海水へ移行された場合、低減された若しくはほとんどない浸透圧ストレスを経験するので、魚は、死亡率の増加を示すことなく、より高い水温への移行に耐えうる。
【００６７】
本発明の方法はまた、スモルトおよび成長したサケの中での疾患の発生を減少させる。本発明の方法により処理されたスモルトは海水への移行の際に少ないストレスを経験するので、それらの免疫機能はより強く、それらは、寄生性、ウイルス性、細菌性および真菌性の疾患に対し感受性が低い。本明細書に記載の方法により処理されていない魚は、かかる疾患に対し感受性がより高く、健常な魚を感染しうる疾患の保有魚として機能しうる。
【００６８】
PVCRおよび臭気物質の評価方法
本発明は、臭気物質を刷り込みした後、魚が淡水から海水へ移動する準備があるかどうかを決定するためにPVCRのレベルを検出する方法を含む。PVCRレベルの測定方法は、いくつかの適当なアッセイを含む。適当なアッセイは、ＦＡＣＳ分析、放射免疫アッセイ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、酵素結合免疫ソルベントアッセイ（ELISA ）および化学発光アッセイなどの免疫学的方法を含む。現在公知のまたは最近開発された任意の方法は、PVCR発現を測定するために使用され得る。
【００６９】
PVCRまたはその一部と反応する抗体が使用され得る。好ましい態様において、抗体は、PVCRまたはその一部と特異的に結合する。この抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびそれらの機能性断片を包含すると意図される。ポリクローナルおよびモノクローナルという用語は、抗体調製物の均等性の程度をいい、特定の製造方法に限定することを意図しない。
【００７０】
いくつかの好ましい態様において、免疫学的技術は、PVCRレベルを、抗PVCR抗体（すなわち、１つ以上の抗体）を使って、検出する。用語「抗PVCR」抗体は、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体、およびそれらの混合物を含む。
【００７１】
抗PVCR抗体は、単離されたおよび／または組み換えPVCRまたはそれらの一部（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適当な免疫原に対して発生され得る。一つの態様において、抗体は、単離されたおよび／または組み換えPVCRまたはそれらの一部（たとえば、ペプチド）に対してあるいは組み換えPVCRを発現する宿主細胞に対して発生される。さらにトランスフェクト細胞などの組み換えPVCRを発現する細胞は、免疫原としてまたはレセプターを結合する抗体のスクリーニングに使用され得る。
【００７２】
任意の適当な技術は、免疫抗原を調製し、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作製することができる。当該分野は、種々のこれらの方法を含む（たとえば、Kohlerら、Nature 256:495-497(1975)とEur. J. Immunol. 6:511-519(1976); Milsteinsら, Nature 266: 550-552(1997); Koprowski ら、米国特許第4,172,124 号; Harlow, E.およびD. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol.2（補遺27, 1994年夏), Ausubel, F.M.ら, 編, (John Wiley&Sons: New York, NY), 11 章, (1991)) 。一般に、適当な不死またはミエローマ細胞株（SP2/0 など）を抗体産生細胞と融合することでハイブリドーマを産生することができる。所望の抗原で免疫された動物は、抗体産生細胞、好ましくは膵臓またはリンパ節由来の細胞を提供する。選択的な培養条件は、抗体産生ハイブリドーマ細胞を単離し、一方、限界希釈技術はそれらを製造する。研究者らは、ELISA などの適当なアッセイを用いて所望の特異性を有する抗体産生細胞を選択することができる。
【００７３】
他の適当な方法は、必須の特異性を有する抗体を作製または単離することができる。他の方法の例は、ライブラリーから組み換え抗体を選択することまたはマウスなどのトランスジェニック動物の免疫化に依存することを含む。
【００７４】
前記方法によれば、アッセイは、生物学的試料におけるPVCRのレベルを決定できる。PVCRの量を決定する際に、アッセイは、抗体とPVCRとの複合体の形成に適当な条件下で、試験される試料をPVCRに対して特異性を有する抗体と組み合わせ、複合体の形成を検出または測定（直接的にまたは間接的に）することを含む。試料は、直接的または間接的に得ることができ、特定の試料および選択されたアッセイフォーマットに適当な方法により調製され得る。
【００７５】
特に、組織試料（たとえば、鼻腔薄膜、嗅覚器または鰓）は、魚をMS-222 で麻酔したあと、その魚から採取することができる。組織試料は、魚の浸透性に対応した適当なリンガー溶液中２％パラホルムアルデヒドへの浸漬で固定化し、リンガー溶液で洗浄し、ついで包埋化合物（たとえば、O.C.T.（登録商標）（Miles, Inc., Elkahart, Indiana,USA）中で、液体窒素で冷却したメチルブタンを用いて凍結させる。クリオスタットで8-10μの組織切片を切った後、個々の切片を種々の染色プロトコルに供する。たとえば、切片は、１）ヤギ血清または同じ種の魚から得られる血清でブロックされ、２）ウサギ抗CaR または抗PVCR抗血清とともにインキュベートされ、そして３）ペルオキシダーゼ結合アフィニィティー精製ヤギ抗ウサギ抗血清で洗浄およびインキュベートされる。結合したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗血清の位置は、ついで、淡紅色のアミノエチルカルバゾール反応生成物の発生で顕在化される。個々の切片は、標準的な光学顕微鏡技術により、検鏡板に固定し、観察し、写真撮影される。魚PVCRタンパク質を検出するのに使用される抗CaR 抗血清は、RaKCaRタンパク質の細胞外ドメインに局在化された214-236 のアミノ酸数に対応する23マーペプチドを用いてウサギで発生させる。２３マーペプチドの配列は、ADDDYGRPGIEKFREEAEERDIC （配列番号：９）であり、また、配列DDYGRPGIEKFREEAEERDICI（配列番号：10）またはARSRNSADGRSGDDLPC （配列番号：11）を有する小ペプチドは、PVCRに対する抗体を含有する抗血清を作製するのに使用され得る。かかる抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたはキメラであり得る。
【００７６】
放射性標識、蛍光標識または化学発光標識などの適当な標識を直接的に検出することができる。これらの標識は、酵素標識やビオチンのような他の抗原性または特異的結合パートナーなどの標識を用いて間接的に検出することもできる。かかる標識の例としては、フルオレセイン、ローダミンなどの蛍光標識、ルシフェラーゼなどの化学発光標識、32Ｐ、125Ｉ、131Ｉなどの放射性同位体標識、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識、およびアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン、アビジン、スピン標識などが含まれる。複合体中における抗体の検出は、次いで検出される（たとえば、標識により）二次抗体を用いて免疫学的にも行われ得る。通常の方法または他の適当な方法は、直接的または間接的に抗体を標識し得る。
【００７７】
前記方法を行う際に、種々の組織におけるPVCRのレベルは、対照と比較して変化する。対照と比較して、種々の組織中のPVCR発現の調節されたレベルまたは存在は、その魚または統計的に有意な数の魚が試験された魚の群が淡水に移動する準備があることを示す。対照は、本発明の工程に供されない魚由来のPVCR（もしあれば）のレベルをいう。
【００７８】
PVCRは、また、組織試料由来のmRNAのノザンブロット分析によりアッセイされ得る。種々のサメ組織由来のノザンブロット分析は、最高度のPVCR発現が鰓組織中にあり、次いで腎臓および直腸腺が続くことを示している。約7kb 、4.2kb および2.6kb の少なくとも３つの別々のmRNA種があるようである。
【００７９】
PVCRは、また、ハイブリダイゼーションにより、たとえば、本明細書で提供されるPVCR配列の一つまたは該配列の一つから得られるオリゴヌクレオチドを魚由来のDNA 含有組織試料にハイブリダイズすることにより、アッセイされ得る。かかるハイブリダイゼーション配列は、ハイブリダイゼーション産物の検出を可能にするために付着する検出可能な標識、たとえば、放射能、蛍光などを有し得る。ハイブリダイゼーションの方法は周知であり、かかる方法は、Jacobsらによる米国特許第5,837,490 号で提供され、そのすべての教示は本明細書に全て参照として取り込まれる。オリゴヌクレオチドプローブの設計は、これらのパラメーターに従うことが好ましいであろう：（ａ）あるとすれば、最も少数の不明瞭な塩基（「Ｎ」のもの）を有する配列の領域に設計され、（ｂ）およそ80℃のTm（ＡまたはＴ毎に２℃、ＧまたはＣ毎に４℃と仮定する）を有するように設計されるだろう。
【００８０】
ハイブリダイゼーションに対してストリンジェンシーな条件とは、一番目の核酸配列の２番目の核酸配列へのハイブリダイゼーションを可能にする温度条件および緩衝液組成の条件をいい、該条件は互いにハイブリダイズするそれらの配列間での同一性の程度を決定する。したがって、「高ストリンジェンシーな条件」は、互いに極めて類似している核酸配列のみがハイブリダイズするそれらの条件である。該配列は、中程度のストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする場合、互いに対する類似性は少なくなりうる。さらに少ない類似性は、低ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする２つの配列にとって必要とされる。ハイブリダイゼーションが起こらないストリンジェンシーレベルからハイブリダイゼーションが初めて見られるレベルにハイブリダイゼーション条件を変えることにより、所定の配列がそれに最も類似するそれらの配列にハイブリダイズする条件を測定することができる。特定のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する正確な条件には、イオン強度、温度、およびホルムアミドなどの脱安定化剤の濃度だけでなく、核酸配列の長さ、それらの塩基組成、２つの配列間のミスマッチな塩基対の割合、他の非同一な配列内での配列のサブセット（たとえば、リピートの小ストレッチ）の出現の頻度などのファクターも含む。洗浄は、条件が互いにハイブリダイズする配列間の類似性の最小レベルを決定するために設定された工程である。一般に、相同のハイブリダイゼーションのみが生じる最低温度から、２つの配列間での１％のミスマッチは、任意の選ばれたＳＳＣ濃度あたり溶融温度（Ｔｍ）が１℃低減する。一般に、ＳＳＣの濃度を２倍にすると、Tmが約１７℃増加する。これらのガイドラインを使用すると、洗浄温度は調べたミスマッチのレベルにより、経験に基づいて決定され得る。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. ら, 編, John Wiley & Sons, Inc., 1995,  最新情報を補足した) の2.10.1頁〜2.10.16 頁および6.3.1 頁〜6.3.6 頁において説明されている。
【００８１】
高ストリンジェンシーな条件は、（１）１×ＳＳＣ（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍ  クエン酸ナトリウム・２Ｈ2 Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ７．０にする）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、  （２）１×ＳＳＣ、50％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、１ｍＭ  Ｎａ2 ・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4 （ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ4 ＝１リットルあたり１３４ｇＮａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４ｍｌ  ８５％Ｈ3 ＰＯ4 ）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、（４）50％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト溶液（１００×＝１０ｇのフィコール４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇのウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、水で５００ｍｌにする）、10％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、50％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、のいずれかで、（１）０．３〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、または（２）１ｍＭ  Ｎａ2 ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ4 （ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、６５℃のいずれかの高ストリンジェンシー洗浄を用いて、ハイブリダイゼーションを行うことができる。上記条件は、５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて用いられることが意図される。該ハイブリッドは、長さが１８塩基対よりも少ないと考えられる場合、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたTmのものより５〜10℃低いだろう。ここでTm（℃）＝（２×Ａ塩基およびＴ塩基の数）＋（４×Ｇ塩基およびＣ塩基の数）である。長さが約18〜約49塩基対であると考えられるハイブリッドについて、Tm（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ10Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）であり、ここで、「Ｍ」は一価のカチオン（たとえば、Na+ ）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである。
【００８２】
中程度ストリンジェンシーな条件は、（１）４×ＳＳＣ、（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム・２Ｈ2 Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ７．０にする）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、（２）４×ＳＳＣ、50％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、１ｍＭ  Ｎａ2 ・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4 （ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ4 ＝１リットルあたり１３４ｇＮａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４ｍｌ  ８５％Ｈ3 ＰＯ4 ）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、（４）50％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト溶液（１００×＝１０ｇのフィコール４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇのウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、水で５００ｍｌにする）、10％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、（５）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、50％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、のいずれかで、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の中程度ストリンジェンシー洗浄を用いて、ハイブリダイゼーションを行うことができる。上記条件は、５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて用いられることが意図される。該ハイブリッドが、長さが１８塩基対よりも少ないと考えられる場合、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたTmのものより５〜10℃低いだろう。ここでTm（℃）＝（２×Ａ塩基およびＴ塩基の数）＋（４×Ｇ塩基およびＣ塩基の数）である。長さが約18〜約49塩基対であると考えられるハイブリッドについて、Tm（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ10Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）であり、ここで、「Ｍ」は一価のカチオン（たとえば、Na+）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである。
【００８３】
低ストリンジェンシーな条件は、（１）４×ＳＳＣ、（１０×ＳＳＣ＝３Ｍ
ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム塩・２Ｈ2Ｏ（８８ｇ／リットル）、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ７．０にする）、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、５０℃、（２）６×ＳＳＣ、50％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４０℃、（３）１％ウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、１ｍＭ  Ｎａ2 ・ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4 （ｐＨ７．２）（１Ｍ  ＮａＨＰＯ4 ＝１リットルあたり１３４ｇＮａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４ｍｌ  ８５％Ｈ3 ＰＯ4 ）、７％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、５０℃、（４）50％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１×デンハルト溶液（１００×＝１０ｇのフィコール４００、１０ｇのポリビニルピロリドン、１０ｇのウシ血清アルブミン（Ｖ画分）、水で５００ｍｌにする）、10％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４０℃、（５）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、５０℃、または（６）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、50％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、４０℃、のいずれかで、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、または  （２）０．５％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、１ｍＭ  Ｎａ2 ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ4 （ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳのいずれかの低ストリンジェンシー洗浄を用いて、ハイブリダイゼーションを行うことができる。上記条件は、５０塩基対以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて用いられることが意図される。該ハイブリッドが、長さが１８塩基対よりも少ないと考えられる場合、ハイブリダイゼーション温度および洗浄温度は、ハイブリッドの計算されたTmのものより５〜10℃低いだろう。ここでTm（℃）＝（２×Ａ塩基およびＴ塩基の数）＋（４×Ｇ塩基およびＣ塩基の数）である。長さが約18〜約49塩基対であると考えられるハイブリッドについて、Tm（℃）＝（８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ10Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ）であり、ここで、「Ｍ」は一価のカチオン（たとえば、Na+ ）のモル濃度であり、「Ｌ」は塩基対でのハイブリッドの長さである。
【００８４】
本発明は、本明細書に開示されるプライマーまたは本明細書に記載の配列から得られるプライマーを使用するPCR 方法を用いたPVCRの検出を包含する。たとえば、PVCRは、以下のプライマー：5'-TGT CKT GGA CGG AGC CCT TYG GRA TCG C-3' （配列番号：12）および5'-GGC KGG RAT GAA RGA KAT CCA RAC RAT GAA G-3' （配列番号：13）（ここでＫはＴまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、およびＲはＡまたはＧである）を用いるPCR により検出することができる。PCR は、配列特異的なプライマーおよび耐熱性ポリメラーゼを利用した核酸複製の繰り返される循環による、標的配列の選択的な増幅である。PCR は、公知の配列の２つの末端の間の全配列の回収を可能にする。PCR 法は、本明細書に記載され、当該分野で公知である。
【００８５】
特に、水生動物PVCRのレベルは、水生種由来のポリA+RNA の単離後、リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、種々の組織において決定され得る。PCR 法およびRT-PCR法は、当該分野で充分に特徴付けされている（一般には、PCR 技術：DNA 増幅に関する原理と応用（H.A. Erlich 編, Freeman Press, NY, NY, 1992 ）；PCR プロトコル：方法と応用へのガイド（Innis,ら編、Academic Press, San Diego, CA, 1990 ）; Mattila ら、Nucleic Acids ReS., 19:4967 (1991) ；Eckertら、PCR 法および応用, 1:17 (1991) ；PCR （McPherson ら編、IRL Press, Oxford ）；Ausebel, F.M. ら, 分子生物学における最新のプロトコル、Greene Publishing Assoc. およびWiley-Interscience 1987 、& Supp. 49,2000 ；および米国特許第4,683,202 号を参照）。簡単には、mRNAは所望の組織から抽出され、逆転写される。次いで、PCR 反応を、PVCR特異的プライマーを用いて行い、予想されるPVCR産物の存在を、たとえば、アガロースゲル電気泳動により決定する。PVCR特異的プライマーの例は、配列番号：12および／または配列番号：13である。PVCR特異的プライマーで行われるRT-PCR反応産物は、本明細書でRT-PCR産物と呼ばれる。RT-PCR産物は、PVCR配列の一部または全てを有する核酸分子を含みうる。RT-PCR産物は、必要に応じて放射性標識され得、PVCR産物の存在または量は、オートラジオグラフィを用いて決定され得る。かかるアッセイに使用され得る市販の蛍光プローブの２つの例は、モレキュラー・ビーコン（ストラタジーン）およびTaqman（登録商標）（Applied Biosystems) である。RT-PCR産物を標識しかつ定量するかわりの方法は、当業者にとって周知である（Ausebel, F.M. ら、分子生物学における最新のプロトコル、Greene Publishing Assoc.およびWiley-Interscience 1987, & Supp.49, 2000を参照。ポリＡ＋ＲＮＡは、標準的な方法により、少なくとも１つのPVCRを含む任意の組織から単離され得る。かかる組織には、たとえば、鰓、鼻腔薄膜、膀胱、腎臓、腸、胃、肝臓および脳が含まれる。
【００８６】
その上、本発明は、PVCRまたはその一部に対して特異的な抗体、あるいはPVCRの核酸にハイブリダイズし得る核酸配列のいずれかを有する、嗅覚器におけるPVCRの検出用キットまたは嗅覚器におけるPVCRの定量用キットを含む。
【００８７】
PVCRの発現または感度の変化は、また、適当なトランスジーン(transgene) の導入により達成され得る。適当なトランスジーンはPVCR遺伝子自体あるいはPVCRモジュレータおよび／または臭気物質に応答してPVCR遺伝子発現に直接的または間接的に影響を与える修飾遺伝子のいずれかを含むだろう。魚卵母細胞、幼生および成体におけるトランスジーンの成功した導入方法、選択方法および発現方法は、Chen, TTら、トランスジェニックフィッシュ、Trends in Biotechnology 8:209-215 (1990)に記載されている。
【００８８】
本発明は、嗅覚器レセプター感受性に対するPVCRモジュレーターの効果およびPVCRモジュレーターに対する嗅覚器レセプター感受性の効果(visa versa)を同定および／または定量するための方法を提供する。本発明はまた、化合物が臭気物質であるか否かを決定するための方法を含む。魚を臭気物質に曝露する（例えば、臭気物質が嗅覚器薄膜に結合する）と、臭気物質は魚の嗅覚器上皮に結合し、これは、神経インパルスの生成をもたらす。インパルスの電位は、当該技術分野において公知の方法または後に開発されるものを用いて測定され得る。電位を測定するために使用され得る方法の一例は、通常、EEGと呼ばれる脳波である。特に、魚の嗅覚器におけるPVCRの調整に関連するため、実施例３に、どのようにして魚の神経インパルスを測定するかを詳細に記載する。簡単には、魚を麻酔し、Ｖ-クランプ装置に載せ、そこで鰓を曝気海水で連続的に灌流し、吸入器嗅覚開口内の所定位置に保持されたチューブを介する蒸留水の流れにより、鼻腔薄膜を連続的に湿らせた。魚の嗅神経を、重層している骨質構造の除去により露出させた。被験臭気物質は嗅覚器上皮にボーラスとして、刺激物質を含む1ccの水が連続流の蒸留水を含むチューブ内に速やかに注入される三方弁により送達させることができる。電位は、例えば、高抵抗性タングステン電極を用いて得られ得、記録（Grass Amplifier Apparatus）、デジタル化、表示され得る。結果は、互換性ソフトウェアを用いてコンピューターにより解析し得る。電気インパルスの存在は、被験化合物が臭気物質であることを示し、電気インパルスの非存在は、臭気物質がないことを示す。
【００８９】
化合物が魚の臭気物質であるか否かを決定する科学的アッセイが存在する。かかる試験の例は、行動回避アッセイ（例えば、化合物が忌避物質であるかどうかを試験するため）および行動誘引アッセイ（例えば、化合物が誘引物質であるかどうかを試験するため）である。かかる行動アッセイの実施方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Royce-Malmgremら, J. Chemical ecology, 13(3) 533, 546(1987)に記載されている。簡単には、魚を被験化合物とともに迷路内に配置する。魚は、被験化合物の方に向かって泳ぐか、または被験化合物を避けて泳ぐかの選択肢を有する。多くの魚が対照に比べてより統計学的に有意な回数、化合物の方に向かって泳ぐならば、臭気物質は誘引物質であると決定される。同様に、より多くの魚が対照に比べて統計学的に有意な回数、臭気物質を避けて泳ぐならば、臭気物質は忌避物質であると決定される。化合物が魚誘引物質であるか魚忌避物質であるかを決定するための後に開発されるアッセイも使用し得る。
【００９０】
魚の帰巣および魚の忌避の方法
刷り込みの後、本発明はまた、海水への移行後での魚の臭気物質への曝露を具現化する。食餌に入れることによる臭気物質の導入の他に、臭気物質を海水に入れたり、魚の近辺の海水内に配置した物体に付着させることができる。したがって、本発明は、本明細書に記載のような誘引物質を魚に刷り込み、魚を海水に移行させた後、刷り込み工程で使用した誘引物質を物体上に配置することにより、魚を帰巣または誘引する方法に関する。「魚を帰巣または誘引する」とは、特定の臭気物質に誘引される魚をいう。かかる物体の例は、網漁用疑似餌または釣用疑似餌である。したがって、本発明は、網漁用疑似餌または釣用疑似餌に付着させた誘引物質、ならびに刷り込み工程で使用した誘引物質を有する物体を用いて魚を帰巣する方法を含む。漁師または養殖業者は、魚を捕獲または養殖する目的で魚を誘引することにより益を得る。特に、かかる誘引物質は、サケなどの多様な種の遡上魚の海洋放牧の効率の向上を含むサケの帰巣方法、スポーツフィッシング用の新規な種特定餌、および商用釣り針漁または網漁の収穫を増大する方法または貴重だが望ましくない種（副捕獲物(by-catch)）の捕獲を低減する方法などの広範な用途に使用し得る。
【００９１】
淡水での使用のために淡水魚に誘引物質を刷り込むことは、淡水中で魚を誘引物質に曝露することにより行ない得る。この作業の最も重要な要素は、淡水での使用に最適な適切な臭気物質の同定である。記載した実施例に示すように、ある種の臭気物質に対する嗅神経シグナルは、嗅覚器PVCRの同時刺激後に減衰または除去される。したがって、本発明の方法は、理想的な淡水臭気物質を同定するために使用され得る。
【００９２】
本発明は、海水において魚を忌避するための方法に関する。本明細書に記載の方法による刷り込み後、魚は、刷り込み工程で使用した忌避物質または忌避物質の組み合わせに対して増大した感受性を有する。その結果、魚は、刷り込み工程で使用した忌避物質に対して敏感になり、その魚に刷り込まなかった忌避物質に比べ、先の忌避物質をより避けて泳ぐようになる。魚は、刷り込み工程で使用した忌避物質の海水への投入（例えば、噴霧、流入、その他の海水への忌避物質の放出により）を含む、かなり多数のやり方で、または物体に忌避物質を配置することにより簡便に忌避物質に曝露する。この方法の一例は、本方法以外では魚に害を与える状態であるタービン付近またはタービンへの取水口上の物体への魚忌避物質の塗布である。忌避物質なしだと、魚は、取水口近辺を泳ぎ、怪我をする。本明細書に記載の魚を忌避する方法は、魚がこのような危険領域を回避することを可能にする。別の例は、通常遡上魚を収容する海洋網生簀(netpen)の仕切り網を忌避物質でコートすることである。仕切り網のコーティングは、忌避物質の含有または周囲環境により魚が網を避けるため、包囲された魚の脱出を阻止し得る。
【００９３】
本明細書に記載の方法を用いる魚の忌避の別の例は、水泳者、サーファー、ダイバーなどがサメなどの危険な魚を避けることである。忌避物質はPVCRアンタゴニストから構成され得、これは、嗅覚器内の少なくとも１つのPVCRによる海水の正常な感受性を弱めたり鈍化させ得ることにより、魚が淡水に入ったとき受ける刺激を模倣する。海水に限定されるサメなどの多くの海洋種は、淡水環境を避けるため、PVCRアンタゴニストでコートまたは包囲された物体およびヒトは、これらの魚によって淡水に包囲されていると知覚されるため回避され得る。
【００９４】
特に、これらの物体（例えば、網漁用疑似餌または釣用疑似餌）に付着させた誘引物質または忌避物質は、PVCRモジュレーターを、魚の嗅覚知覚器内のPVCRをモジュレートするのに充分な量で含有するものである。誘引物質または忌避物質は、物体に付着させたり、表面上にコートしたり、物体（例えば、ロープまたは網）内に含浸させることができ、またはさらに本明細書に記載するように、魚の嗅覚知覚器内のPVCRを改変することにより魚の帰巣または忌避を可能にするのに充分な量で臭気物質が存在する限り、任意の方法で物体に結合させることができる。臭気物質はまた、海水内に直接放出させ得る。臭気物質の量は、臭気物質を物体に結合する方法（例えば、臭気物質を網またはロープ内に含浸させる場合は、単に物体の外側に結合するのと比べて、より多くの臭気物質が必要であり得る）、魚と物体との距離（例えば、ずっと遠くの魚を誘引または忌避するためにはより多くの臭気物質が必要であろう）、魚に対する臭気物質の所望の効果（例えば、より強力な臭気物質応答には、より弱い応答の誘導を望む場合よりも多くの臭気物質が必要となろう）、魚の特徴（例えば、重量、体長、遡上魚の種類）、および海水中に存在するPVCRモジュレーターの量（例えば、ある種のPVCRモジュレーターは、さらに本明細書に記載するように、臭気物質の応答を減少し得る）などの種々の要因に依存する。一実験において、臭気物質であり得るある種のアミノ酸の単独または組み合わせでの存在は、生理学的濃度のカルシウムの存在下でPVCRがアミノ酸を「感じる」ことを可能にする、カルシウムに対する感受性を増加する。
【００９５】
本発明は、以下の実施例により、さらにかつより具体的に説明されるが、これはいかなる方法に限定することを意図するものではない。
【００９６】
実施例
以下の実施例は、終始プロセスIおよびプロセスIIに言及している。プロセスIは、本明細書では、「SUPERSMOLTTM Iプロセス」とも呼ばれる。「プロセスI」の魚またはスモルトは、プロセスIの工程を経た魚またはスモルトをいう。プロセスIのスモルトはまた、「SUPERSMOLTTM Ｉのスモルトと呼ばれる。同様に、プロセスIIは、本明細書では、「SUPERSMOLTTM IIプロセス」とも呼ばれる。「プロセスII」の魚またはスモルトは、プロセスIIの工程を経た魚またはスモルトをいう。プロセスIIのスモルトはまた、「SUPERSMOLTTM IIのスモルトと呼ばれる。
【００９７】
プロセスI：成魚前遡上魚（これは通常に作製されたS0、S1またはS2のスモルトならびにより小さい幼魚／スモルト魚の両方を含む）を2.0 〜10.0mMカルシウムおよび0.5 〜10.0mMマグネシウムイオンのいずれかを含む淡水中に曝露または維持する。この水は、淡水に炭酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを添加することにより調製される。魚には７％（重量／重量）NaClを含む食餌ペレットを給餌する。この食餌に関するさらなる詳細については実施例２を参照のこと。魚は、水混合物のこの食餌摂生と、標準的な孵化ケア技術を用いる全部で30〜45日間の給餌に曝されまたは維持される。水温は10〜16℃の間で変化する。魚は、プロセスIが継続される間一定の光周期に曝される。蛍光を光周期に用いる。
【００９８】
プロセスII：成魚前遡上魚（これは通常に作製されたS0、S1またはS2のスモルトならびにより小さい幼魚／スモルト魚の両方を含む）を2.0 〜10.0mMカルシウムおよび0.5 〜10.0mMマグネシウムイオンを含む淡水中に曝露または維持する。この水は、淡水に炭酸カルシウムおよび／または塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを添加することにより調製される。魚には７％（重量／重量）NaClおよび食餌1kg あたり2gmまたは4gmのいずれかのL-トリプトファンを含む食餌ペレットを給餌する。食餌に関するさらなる詳細については実施例２を参照のこと。魚は、水混合物のこの食餌摂生と、標準的な孵化ケア技術を用いる全部で30〜45日間の食餌に曝されまたは維持される。水温は10〜16℃の間で変化する。魚は、プロセスIIが継続される間一定の光周期に曝される。蛍光を光周期に用いる。
【００９９】
実施例１．  多価カチオン感受レセプター（PVCR）は、魚において塩分濃度センサーとして役に立つ。
多価カチオン感受レセプター（PVCR）は、魚において塩分濃度センサーとして役に立つ。これらのレセプターは、浸透度調節を担うことが知られている魚の体（たとえば、鰓、腸、腎臓）内の種々の細胞の先端の膜に局在されている。ツノザメ科のサメ由来の全長カチオンレセプター（CaR、「PVCR」とも呼ばれる）は、ヒトＨＥＫ細胞において発現されている。このレセプターは、ＨＥＫ細胞を浸す細胞外体液中のNaCl、Ca2+およびMg2+のイオン組成の変化に応答することが示された。このPVCRが応答するイオン濃度は、淡水から海水に移すことを含む範囲を包含していた。PVCR mRNAの発現はまた、淡水から海水への移行後の魚で増加し、PVCRアゴニストにより調整される。PVCRの部分的ゲノムクローンは、また、変性プライマーを用いる核酸増幅を使用することにより、ウィンターフラウンダーおよびナツガレイおよびダンゴウオを含む他の魚の種から単離されている。
【０１００】
この方法をまた、タイセイヨウサケ（図１）、アルプスイワナ（図２）およびニジマス（図３）についてPVCRの部分的なゲノムクローンを分離するために使用した。使用した変性オリゴヌクレオチドプライマーは、5'-TGT CKT GGA CGG AGC CCT TYG GRA TCG C-3'（配列番号：12）および5'-GGC KGG RAT GAA RGA KAT CCA RAC RAT GAA G-3'（配列番号：13）であった。ここでKはTまたはG、YはCまたはT、およびRはAまたはGである。変性オリゴを標準的な方法論により作製した（Preston, G.M.、1993、「Polymerase chain reaction with degenerate oligonucleotide primers to clone gene family members」：Methods in Mol. Biol., vol.58, A.Harwood 編、Humana Press、pp.303-312）。これらの３つの種由来のゲノムバンドを増幅し、アガロースゲル電気泳動により精製し、適切なプラスミドベクター（サケおよびアルプスイワナ種-pT7 Blue（Novagen, Madison, WI；マスに使用されるpGem-T（Promega Biotech. Madison, WI）にライゲートし、NovaBlueを有するサケおよびアルプスイワナ−pT7ベクター（Novagen, Madison, WI）およびマスpGEM-Tを適切な細菌宿主株に形質転換し、次いで使用したJM-109 E.coli細胞を液体培地で生育させた。プラスミドおよび挿入物を宿主細胞から精製し、シーケンスした。図４は、ツノザメ科のサメ（Squalus acanthias）の腎臓由来のPVCRと比較した、タイセイヨウサケ、アルプスイワナおよびニジマス由来のPVCRについての推定アミノ酸配列およびアライメントを示す。SK CaRアミノ酸および核酸配列を図４Ａ〜Ｈに示す。
【０１０１】
他の種の魚におけるさらなるPVCR配列を単離し、シーケンスする。これらの配列としては、ギンザケ（Oncorhynchus kisutch）、シロザケ（Oncorhynchus keta）、マスノスケ（Oncorhynchus tshawytscha）、カラフトマス（Oncorhynchus gorbuscha）、ベニザケ（Oncorhynchus nerka）において単離されたPVCRが挙げられるが、これらに限定されない。これらの種の配列は、2000年10月12日に出願された特許出願番号第09/687,477号に見出され得る。
【０１０２】
実施例２：飼料
APS処理IおよびIIの一部として、魚に消費させる飼料を調製するための一般的な方法が２つある。これらの２つの方法は、飼料の再配合または飼料に吸収させる濃縮溶液の添加、続く嗜好性のための追肥のいずれかを含む。この開示は、これらの２つの方法のそれぞれを用いて飼料を調製するための方法論を記載する。
【０１０３】
方法：
サケ実験のための飼料製造
飼料を再配合するための成分は、以下の通りである：ベース食餌は以下の成分および手順を用いて作製した：30％イカ（ブレンダーで液状化）、70％Corey Aquafeedsカレイ食餌（ブレンダーで粉末化）。成分を半湿性「生地」ボールにブレンドした。実験での必要性にしたがって、NaClまたはPVCR活性化合物を含む他の成分を重量基準でベース食餌にブレンドした。
【０１０４】
Moore Clark標準淡水サケ科食餌（サイズ1.2、1.5.2.0、2.5,および3.5mm）もまた使用しうる。追肥がベース食餌の4重量％を構成するようにペレットに追肥を塗布した。追肥は、50％クリル水解物（Specialty Marine Products Ltd.）および50％Menhaden魚油から構成される。追肥を嗜好性および添加した成分の封入のために添加する。
【０１０５】
他の成分としては、重量基準のベース食餌に重量基準で添加されるNaCl、MgCl2、CaCl2またはL-トリプトファンが挙げられうる。
【０１０６】
7％（重量／重量）NaClを含有する飼料の調製：
Process Ｉ用：Moore Clark標準淡水サケ科食餌の重量の7重量％の割合で配分された固体塩化ナトリウムすなわちNaClを、NaClの重量の約3〜4倍の大量の水道水に添加した。磁気撹拌棒の使用により混合しながら混合物を60〜70℃に加熱して塩を溶解した。次いで、NaCl溶液をハンドヘルドの噴霧器に注入し、1.5立方メートル電動セメントミキサーの内部で転動しているMoore Clark標準淡水サケ科食餌に塗布した。NaClリッチな溶液の吸収後、湿ったMoore Clark標準淡水サケ科食餌を、ウィンドウスクリーニング上に薄く散布し、次いでウィンドウスクリーニングに薄く広げ、ファンおよび1500ワットヒーターを備えた封入ラックシステムに配置し、乾燥プロセスを促進する。約6時間の乾燥の後、乾燥NaClリッチペレットをセメントミキサーに戻し、追肥を塗布する。飼料を使用時まで室温で保存する。
【０１０７】
Process IIのための7％（重量／重量）NaCl＋PVCRアゴニスト（トリプトファン）を含む飼料の調製：Moore Clark標準淡水サケ食餌重量の7％の重量比で分配した固体の塩化ナトリウムすなわちNaClを、NaClの重量の約3〜4倍の容積の水道水に添加した。混合物を、磁気撹拌棒の使用により混合しながら60〜70℃に加熱し、塩を溶解させた。USPグレードのL-トリプトファンを、製剤の必要性に応じてMoore Clark標準淡水サケ食餌の１kg当たり2gまたは4gのいずれかで前記水に添加した。トリプトファンが溶解し、溶液のpHが約4.0になるまで、希塩酸を、混合しながら前記水に添加した。次いで、NaCl＋トリプトファン溶液をハンドヘルドの噴霧器に注入して、次いで、セメントミキサーの内部で転動しているMoore Clark標準淡水サケ科食餌に塗布する。NaCl＋トリプトファン溶液の吸収後、湿ったMoore Clark標準淡水サケ食餌を、次いでウィンドウスクリーニングに薄く広げ、ファンおよび1500ワットヒーターを備えた封入ラックシステムに配置し、乾燥プロセスを促進した。約6時間の乾燥の後、乾燥NaCl/トリプトファン-リッチペレットを次いでセメントミキサーに戻し、追肥を塗布する。飼料を使用時まで室温で保存する。L-トリプトファンは、本明細書に記載のPVCR発現を調節する任意のアミノ酸で置換され得る。
【０１０８】
臭気物質を含有する刷り込みプロセス中に使用するための淡水用飼料を作製するために、上記のようなProcess IまたはIIのいずれかのための飼料を作製する工程が続き得、臭気物質を単に飼料に添加する。飼料に添加した臭気物質の量は僅かな量から約100mg/kg（飼料1kgあたりの臭気物質mg）の間である。飼料に使用した臭気物質は、本明細書に記載の方法により同定され得る。
【０１０９】
臭気物質を含む海水用飼料を、例えば、刷り込みプロセス中に使用される臭気物質を海水へ移行される魚に典型的に提供される飼料に添加することにより作製し得る。
【０１１０】
実施例３  魚の鼻腔ラメラ（nasal lamellae）および嗅球ならびにGI管におけるPVCRタンパク質の存在および機能
本明細書記載のデータは、魚が水塩分濃度および／またはイオン組成ならびに特定のアミノ酸における両者の変化を感じる、または「匂う（smell）」能力に関連する場合の、魚の嗅覚器官（鼻腔ラメラおよび嗅球）におけるPVCRタンパク質の役割を示す。これらのデータは、淡水から直接海水へ移行されるまたは淡水でProcess IもしくはIIに曝され次いで海水へ移行されるかのいずれかの遡上魚（サケ、マスおよびチャー）に特にあてはまる。
【０１１１】
本明細書に記載のこれらのデータは、抗PVCR抗血清を用いる免疫細胞化学、鼻腔ラメラ由来のPVCRのRT-PCR増幅、培養細胞において発現された組換え水生動物PVCRタンパク質（これらのタンパク質が特定のイオンまたはアミノ酸を「感じる（sense）」）の機能研究、および淡水サケの嗅神経または嗅球からの神経細胞電気的活性の電気生理学的記録を含む供給源の組み合わせから得られた。
【０１１２】
本明細書に記載の免疫細胞化学とRT-PCRデータの組み合わせは、仔魚（larval）、幼魚（juvenile）および成魚（adult）生活段階の両方の魚の主な両ファミリー（板鰓亜網のサメ；硬骨類のサケ）におけるPVCRタンパク質の存在を示す。免疫細胞化学分析は、１つ以上のPVCRタンパク質が魚の鼻腔ラメラに位置する嗅覚レセプター細胞の部分（周囲の環境由来の水でぬれる）および魚脳の嗅球に存在する嗅糸球体を構成する神経細胞（これらの細胞は魚の身体の内部（interval）イオン環境に曝される）の両方に存在することを示す。従って、これらの位置から、魚は自身の内部イオン組成を参考にして周囲の水のイオン組成を比較することが可能である。PVCRタンパク質の発現および／または感受性における変化は、魚が出くわした水組成が以前に順応しているかまたは曝されている水組成と異なっているかどうかを連続ベースで魚が決定し得るという手段を提供する。このシステムは、魚の内部身体組成の制御および淡水から海水および逆もまた同じ（visa versa）へのサケの帰巣の両者に不可欠であるようである。従って、魚は、PVCRタンパク質を直接介して水塩分濃度における変化を「匂い」、その身体組成を調節するためおよび現存での生存に最もよい環境にとどまるための両方のために適切に応答する能力を有する。
【０１１３】
この生物学的システムの１つの特徴は、水のNaCl濃度における変化による二価カチオン（例えば、Ca2+およびMg2+）に対するPVCRタンパク質の感受性における変化である。従って、魚嗅覚器官におけるPVCRは、NaClの存在または非存在のいずれかにおいて、Ca2+に対して種々の見かけ感受性を有する。本明細書中のこれらのデータは、魚の嗅覚器に存在するPVCRタンパク質を介するこれらの機能に対する最初の直接証拠である。
【０１１４】
魚の嗅覚器におけるPVCRタンパク質機能の別の特徴は、特定の臭気物質（誘引物質または忌避物質）への嗅覚細胞の応答を調節することである。嗅覚細胞への特定の臭気物質の結合から生じる細胞シグナルの導入は、これらの細胞の形質膜を横切る継続的なイオン勾配における変化を介して起こる。嗅覚細胞への特定の臭気物質の結合は、標準化された電気生理学的電極および装置を使用して記録され得る電気的な神経伝導シグナルを生じる。この装置を使用して、淡水順応サケの嗅覚器は：
１．他の魚組織について以前に示された（ウィンターフラウンダー（winter flounder）膀胱について示された）のと類似の濃度依存様式でPVCRアゴニストに応答する。これらのデータは、PVCRタンパク質の存在の機能的な証拠；および
２．PVCRアゴニストの存在が臭気物質（誘引物質または忌避物質の両方を含む）から生じたシグナルを減少または除去することを提供する。従って、サケの嗅覚器におけるPVCRは種々の臭気物質に対する応答を調節する能力を有する。
【０１１５】
PVCRタンパク質の別の特徴は、周囲環境に存在する特定のアミノ酸を「感じる」能力である。全長組換えSKCaR cDNAを用いて、機能的SKCaRタンパク質をHEK細胞中で発現させ、単一のL-アミノ酸およびL-アミノ酸の混合物の両方に対して濃度依存様式の応答を示した。アミノ酸およびポリアミン類（プトレシン、スペルミンおよびスペルミジン）を含むPVCRアゴニストは海洋性生物（魚および甲殻類が挙げられる）に対する誘引物質であるので、これらのデータは、PVCRタンパク質が魚における嗅覚のモジュレーターとしてだけではなくアミノ酸およびポリアミン類自身のセンサーとして役立つ別の手段を提供する。魚の他の器官（魚のG.I.管および内分泌器官が挙げられる）におけるPVCRタンパク質はまた、魚における養分の消化および利用を伴う上皮細胞での幅広い細胞プロセス（アミノ酸輸送、増殖、イオン輸送、運動性および増殖）を提供する特定の濃度のアミノ酸を感じるために機能する。
【０１１６】
実験結果およびデータ解釈の説明：
PVCRタンパク質およびmRNAは淡水に順応した仔魚、幼魚および成魚タイセイヨウサケの嗅覚ラメラ、嗅神経および嗅球ならびにツノザメ（dogfish shark）の嗅覚ラメラに局在化している。
【０１１７】
図５は、幼魚タイセイヨウサケの嗅球および嗅神経ならびに嗅覚ラメラにおけるPVCRタンパク質局在化の代表的な免疫細胞化学写真である。PVCRタンパク質に対する染色の特異性を、PVCRタンパク質のそれぞれ異なる領域に対する２つの別個の抗血清の使用により実証する。従って、抗血清抗4641（細胞外ドメインPVCR領域を認識する）および抗血清抗SKCaR（細胞内ドメインPVCR領域を認識する）は、より小さな染色パターン（嗅球の連続切片上の種々の糸球体を含む）を示す。抗SKCaR抗血清を使用して、PVCRタンパク質の特異的染色を、嗅神経の別個の領域および外部イオン環境に曝された鼻腔ラメラ中の上皮細胞において観察する。
【０１１８】
鼻腔ラメラ細胞ならびに嗅球および嗅神経の両方におけるPVCRタンパク質の存在は、これらのそれぞれのPVCRタンパク質がサケの内部および外部イオン環境の両方を感じ得ることを示す。この目的のため、内部曝露PVCRを含む細胞は、神経系の中の電気接続を介して外部曝露PVCRに接続する。図６に図解して示されるように、これらのデータは、外部および内部曝露PVCRは一緒に機能して、サケの体液のイオン濃度を参照として使用して周囲のイオン環境のイオン濃度を感じる能力を提供することを示唆する。次いで、PVCRの外部セット対内部PVCRの発現および／または感受性における変化は、魚が異なる組成のイオン環境を通って移動する場合、魚の順応状態の長期の「記憶」を提供する。図７は抗SKCaR抗血清を使用した免疫細胞化学を示し、孵化直後（卵黄嚢段階）の仔魚タイセイヨウサケの発達中の鼻腔ラメラ細胞および嗅球の両方におけるPVCRタンパク質の存在を示している。本明細書に記載されるように、発育初期およびスモルト化中のサケの刷り込みは、出生時の流れへの野生サケの帰還の成功に重要な期間であることが示されている。サケ生活環のこれらの発育段階でのPVCRタンパク質の存在は、PVCRがこのプロセスに関係することを示す。
【０１１９】
板鰓亜網を含む他の魚種由来の抗SKCaR抗血清を用いて得られたデータは、細胞（マークＡ）その鼻腔ラメラ（図８）におけるPVCRタンパク質の染色が類似することを示す。特異的な縮重プライマーを用いるRT-PCR（図９）およびELISA方法（図１０）を含む他の方法論の使用により、魚の鼻腔ラメラにおけるPVCRタンパク質およびmRNAの存在を検出する。これらの２つの技術のいずれも記載のように定量値を提供するが、データの両セットは矛盾がなく、豊富なPVCRタンパク質がこの組織に存在することを示す。
【０１２０】
淡水順応タイセイヨウサケ由来の嗅神経からの細胞外電位（EEGの）の測定は、機能的PVCRタンパク質の存在を示す：
図１１は、Bodznick, D.J. Calcium ion: an odorant for natural water discriminations and the migratory behavior of sockeye salmon, Comp. Physiol. A 127:157-166(1975)、およびHubbard, PCら, Olfactory sensitivity to changes in environmental Ca2+ in the marine teleost Sparus Aurata, J. Exp. Biol. 203:3821-3829(2000)に記載されるのと類似の方法を使用した６匹の魚淡水順応幼魚タイセイヨウサケ（約300〜400gm）から得られた代表的な記録を示す。魚を麻酔した後、Vクランプ装置に置き、その鰓を曝気水で連続して灌注し、その鼻腔ラメラを、吸入用の嗅覚孔の位置に保持したチューブを介する蒸留水流れにより連続してぬらした。魚の嗅神経を上に重なっている骨性構造の除去によりむき出した。刺激物質を３方弁を介して嗅覚上皮にボーラスとして送達し、ここで、刺激を含む1ccの水を蒸留水の連続流れを含むチューブに速やかに注入した。細胞外記録を、高抵抗タングステン電極を使用して得、生じた増幅アナログシグナル（Grass Amplifier Apparatus）を、MacScopeソフトウェアを使用して数字で表示し、ディスプレーし、分析した。この実験アプローチを使用して、安定かつ再現性のある記録が魚の初期手術後6時間まで得られ得る。
【０１２１】
図１１に示すように、蒸留水でのサケ嗅覚上皮の灌注により、嗅神経における大きなシグナルの生成が最小となる。図１１のデータは、生記録（左欄）および右欄に示した各生記録に対して対応する統合シグナルの両方として示される。500マイクロモルのL-アラニン（魚に対する周知のアミノ酸誘引物質）に嗅覚上皮を曝露することにより、約２秒間続く嗅神経の神経インパルスを発する（firing）頻度および振幅の両方において大きな増加を生じる。同様に、1mM Ca2+または250mM NaClのいずれかの適用はまた、EEG活性における応答を生じる。機能的PVCRタンパク質の存在を試験するため、嗅覚上皮を50マイクロモルのガドリニウム（Gd3+-PVCRアゴニスト）に曝露し、応答を得た。図１２Ａは、種々のPVCRアゴニストまたはモジュレーターに対する複数の魚からの用量応答データを示し、個々の嗅神経応答の相対的な大きさを、嗅覚上皮の10mM Ca2+への曝露により生じる応答に関して標準化した。図１２Ａに示すように、淡水順応幼魚サケの嗅覚上皮は、Ca2+に非常に感受性であり、半最大興奮性応答（EC50）は約1〜10マイクロモルである。同様に、嗅覚上皮のPVCRアゴニストGd3+への曝露により、1〜10マイクロモルの濃度範囲でCa2+により引き起こされるのと類似の程度の応答を生じる。対照的に、Mg2+に対する嗅覚上皮応答は、10〜100マイクロモル用液を適用するまで起きない。これらの用量応答曲線（EC50 Gd3+≦Ca2+＜Mg2+）は、他の魚上皮（カレイ膀胱NaCl媒介水移行−SKCaR応用を参照）におけるPVCR調節応答で得られるのと類似である。
【０１２２】
対照的に、NaCl曝露に対する嗅覚上皮応答の分析は、250ミリモルNaClの濃度を適用するまで応答しないことを示す。NaClはGd3+Ca2+またはMg2+のような様式で直接PVCRを活性化しないが、むしろこれらのアゴニストに対するPVCRの感受性を減少するので、これらのデータはまた、嗅覚上皮PVCRの存在と一致する。有意な濃度のNaClへの上皮の曝露により起こる応答は、他のPVCR独立機構によりおそらく起こる。
【０１２３】
これらのデータは、嗅覚上皮に存在するPVCRタンパク質が、蒸留水中で適切な濃度のPVCRアゴニストに応じて、対応する嗅神経シグナルを感じ、かつ生じることを示唆する。
【０１２４】
図１２Ｂ〜１２Ｄに示すさらなるデータは、哺乳動物CaRタンパク質によって示されたのと類似の感受性プロファイルで、タイセイヨウサケの鼻腔ラメラにおける機能的PVCRタンパク質の存在についての指示を提供する。図１２Ｂは、種々のPVCRアゴニスト（Mg2+、Gd3+およびCa2+）および単一のアゴニスト（NaCl）に対する淡水順応タイセイヨウサケスモルト嗅覚応答の応答のより完全な特徴付けを示す。これらのデータは、上記データを拡張する。
【０１２５】
図１２Ｃは、PVCRアゴニスト（Ca2+）がタイセイヨウサケ嗅覚上皮の500mM NaClへの曝露により生じた嗅覚応答を減少する方法を示す。500mM NaCl溶液中の10mM Ca2+の存在が人工海水（ASW）曝露により生じるのと同一である応答を生じることに注意のこと。
【０１２６】
図１２Ｄは、500mM NaClでの鼻腔ラメラの灌注により生じるおおきな応答を減少するための種々のPVCRアゴニストの量的応答を示す。Ca2+がなくかつ二価がない海水が500mM NaClのみへの曝露後に示すのと類似の程度の応答を生じることを注意のこと。対照的に、１つのPVCRアゴニスト（1mM Mg2+、1mM Ca2+、1mM Sr2+または50ミリモルGd3+が挙げられる）の包含により、人工海水（ASW）での鼻腔ラメラの灌注により顕在化したのと同様に500mM NaClへの嗅覚応答を全て有意に減少する。これらの応答の全ては、蒸留水での鼻腔ラメラの灌注により顕在化したよりも大きい。
【０１２７】
これらのデータは、PVCRアゴニストがタイセイヨウサケの嗅覚応答を調節し得ることを示す。
【０１２８】
図１２Ｂ〜１２Ｄに記載のデータを得るために使用する刺激物質送達の方法を以下のようにして得た。
【０１２９】
刺激物質を吸入用の嗅覚孔に配置したガラス毛細管により嗅覚上皮へ送達した。この管を、6〜8ml/minの流速を維持しながらバックグランド灌流（木炭濾過淡水）から実験刺激物質へのスイッチを可能にする重力送りチュービングシステムに接続した。刺激物質送達管および電極の位置の確認を、1mL L-アラニンの「探索刺激物質」への応答を観察することにより行った。
【０１３０】
刺激物質はCaRアゴニスト（CaCl2、MgCl2、GdCl3、SrCl2およびNaCl）（Sigma-Aldrich）、対照淡水刺激物質（木炭濾過水道水）および対照海水刺激物質（ASW、Caを含まないASW、二価を含まないASW）からなっていた。刺激物質を単独でまたは500mM NaClと組み合わせて提供した。Ringerおよび人工海水処方をBiological Bulletin Compendiaから得た；（濃度は全てmMである）ASW（nAcl 423、KCl 9.0、CaCl2 22.94、MgSO4 25.50、NaHCO3 2.14、pH 8.0）；Caを含まないASW（NaCl 436.71、KCl 9.0、MgCl2 22.94、MgSO4 25.5、NaHCO3 2.14、pH 8.0）；二価を含まないASW（NaCl 461.85、KCl 10.73、NAHCO3 2.14、Na2SO4 7.04、pH 8.0）；FW Teleost Ringer（NaCl 111.0、KCl 5.37、Cacl2 1.0、MgSO4 0.6、HEPES 5.0、pH 7.3）。
【０１３１】
周知のサケ忌避物質を含有する蒸留水へのCa2+またはGd3+などのPVCRアゴニストの添加は、これらの刺激物質に対する嗅覚上皮の応答を可逆的に除去する：
【０１３２】
図１３は、嗅覚上皮を初めに周知の忌避物質、哺乳動物の指リンス液に曝露した単一の連続記録から得られた代表的なデータを示す。指リンス液を、オイルおよび脂肪酸の付着したヒトの指を蒸留水を用いて単にすすぐことにより得、EEG記録および行動回避アッセイの両方において強力な忌避物質刺激物質であることが以前に示されている（Royce-MalmgrenおよびW.H Watson J. Chem. Ecology 13:533-546(1987)）。しかしながら、PVCRアゴニスト5mM Ca2+または50ミリモルGd3+の包含は、哺乳動物の指リンス液に対する嗅覚上皮の応答を可逆的に除去する注意のこと。これらのデータは、PVCRアゴニストが哺乳動物の指リンス液などの臭気物質に対する嗅覚上皮の応答を調節することを示す。図１２Ａに示すPVCRアゴニストおよび哺乳動物の指リンス液の両方に対する応答の除去は、PVCRタンパク質と他の臭気物質レセプターとの間にいくつかの複雑な相互作用があることを示す。PVCRアゴニストの包含が哺乳動物の指リンス液の全ての刺激物質成分を溶液から除去し、その結果上皮を刺激できないということはきわめて起こりそうにもない。
【０１３３】
周知のサケ誘引物質L-アラニンを含有する蒸留水へのNaClを除くCa2+またはGd3+などのPVCRアゴニストの添加はこれらの刺激物質に対する嗅覚上皮の応答を可逆的に除去する：
【０１３４】
図１４は、嗅神経においてシグナルを生成するために500マイクロモルL-アラニン（サケ誘引物質）を使用したことを除き図１３に示したのと類似の刺激物質の時系列（単一の魚において各刺激の間２分）を示す。500マイクロモルL-アラニンへの5mM Ca2+（記録番号２）または50マイクロモルGd3+（記録番号７）のいずれかの添加により、この混合物の注射後嗅神経由来の対応する応答の完全喪失を生じることに注意のこと。従って、両方の場合において、これは、これらのPVCRアゴニストのいずれかによる嗅覚上皮の恒久的な変化のせいではない。なぜならば、PVCRアゴニストを用いないその後の同一の刺激物質（記録番号３および８）によりシグナルが復帰するからである。Gd3+添加の場合、その後のL-アラニンシグナルの程度は対照と比較して（記録番号６vs８を比較する）減少することは注目すべきであり、これは、嗅覚上皮がこの強力なPVCRアゴニストへの曝露からの回復の間隔を優先することを示す。しかしながら、L-アラニン刺激物質に対する応答の変化は、恒久的または非特異的ではない。なぜならば、250mM NaClと同じ用量のL-アラニンを組み合わせることにより、初めは類似の応答を生じ（記録番号４および９）、次いで、L-アラニン単独に対する応答が向上する（記録番号５および１０）からである。
【０１３５】
まとめると、図１３および図１４に示したデータは、忌避物質（指リンス液）または誘引物質（L-アラニン）のいずれかを含む溶液中のPVCRアゴニストの含有がこれらの臭気物質に対する嗅覚上皮の応答において劇的な減少を生じることを示している。忌避物質および誘引物質の両方について、複雑な相互作用のいくつかの形態は嗅覚上皮細胞内で起こる。なぜならば、PVCRアゴニストと臭気物質の混在は上皮をいずれの刺激物質に対しても一次的に不応答にするからである。かかる相互作用の特徴は現在知られていないが、かかる相互作用は、組換えPVCRタンパク質SKCaRを用いた実験からのデータにより示されるように、PVCR分子自身のレベルでは起こらない。本明細書にさらに記載されるように、Ca2+の存在下でのアミノ酸の含有は、周囲のCa2+濃度に対するSKCaRの応答を向上する。その性質にかかわらず、Ca2+を含むPVCRアゴニストのこれらのネガティブ調節効果は、淡水サケが低カルシウムから高カルシウム環境へ移動した後その環境中の対象を匂う方法に主な影響を生じるようである。このアッセイシステムの使用により、PVCRアゴニストとアンタゴニストの特定のクラスならびに忌避物質および誘引物質の両方を含む特定の臭気物質への各PVCRモジュレーターの特定の影響の同定および分析を可能にする。
【０１３６】
組換えPVCRタンパク質SKCaRは、ヒト胚性腎臓（HEK）細胞における発現後、アミノ酸の濃度を感じる能力を有する：
【０１３７】
全長組換えツノザメ科（Squalus acanthias）サメ腎臓カルシウムレセプター（SKCaR）を、本明細書に記載の方法を使用してヒト肺性腎臓細胞で発現させた。個々のアミノ酸および種々の混合物に応答するSKCaRの能力を、FURA-2比画像化蛍光を使用して定量した。
【０１３８】
図１５は、蛍光計に置く前に10mM L-イソロイシン（L-Ile）の存在または非存在下で生理食塩水（125mM NaCl、4mM KCl、0.5mM CaCl2、0.5 MgCl2、20mM HEPES（NaOH）、0.1％D-グルコース、pH7.4）に浸したSKCaRを安定して発現するFURA-2負荷細胞の蛍光追跡の比較を示す。ベースライン細胞外Ca2+濃度は0.5mMであった。Ca2+のアリコートを添加して、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、20mM Ca2+の最終細胞外濃度を生成し、蛍光の変化を記録した。細胞蛍光の増加は10mM未満の細胞外Ca2+濃度について10mM Pheの存在下で大きくなることに注意のこと。
【０１３９】
図１６は、図１５に記載の複数の実験からプロットしたデータ（10mM Phe、10mM Ileまたは以下の濃度（マイクロモル／リットル）で全てのL-異性体を含むアミノ酸混合物（AA混合物）の影響）を示す：50 Phe、50 Trp、80 His、60 Tyr、30 Cys、300 Ala、200 Thr、50 Asn、600 Gln、125 Ser、30 Glu、250 Gly、180 Pro、250 Val、30 Met、10 Asp、200 Lys、100 Arg、75 Ile、150 Leu。10mM Pheおよび10mM Ileならびにアミノ酸の混合物の両方とも所定のCa2+濃度に対してSKCaRの応答を増加することに注意のこと。従って、これらのデータは、アミノ酸単独または組み合わせのいずれかの存在により、Ca2+に対する見かけ感受性を増加し、SKCaRが生理学的濃度のCa2+の存在下でアミノ酸を「感じる」ことを可能にすることを示す。SKCaRについて得られたこれらのデータはヒトCaRについて得られたデータに匹敵する。
【０１４０】
水生生物についてのこれらのデータの重要性は、ヒトCaRアミノ酸感受能力の役割と著しく対照的である。図１５は、アミノ酸を感じるSKCaRの最大能力が水生外部環境および種々の魚の体液の両方に存在するCa2+の範囲に限られるということを示す。以下の生理的プロセスが起こる：１）魚の近位（proximal）腸および幽門盲腸におけるアミノ酸の感受：腸上皮細胞の先端表面に存在するPVCRはProcess IIの一部でトリプトファンなどのアミノ酸に応答し得る。魚の飼料へのトリプトファンの含有は腸PVCRと相互作用し、海水移行を許容するように幼魚遡上魚の発育を改善する。２）成魚、幼魚および仔魚の両方において、胃の先端表面および腸上皮細胞に局在化するPVCRはタンパク質のアミノ酸へのタンパク質分解により生じるアミノ酸の存在を「感じ」得る。この機構を使用して、腸の上皮および神経内分泌細胞の両方に養分（タンパク質）の存在を知らせ、多数の応答（腸上皮の増殖および分化ならびに輸送タンパク質への結合、胃酸などのイオンの分泌または再吸収が挙げられる）を誘発し得る。先端PVCRはまた、腸ホルモン（例えば、コレシストキン（CCK）など）の分泌を調節する。３）PVCRタンパク質は魚の鼻腔ラメラの細胞に存在し、水塩分濃度（Ca2+、Mg2+およびNaClを介して）および誘引物質の例であるアミノ酸の両方を「匂う」。現時点で、PVCRのアミノ酸感受能力が嗅覚上皮により利用され、魚が種々のアミノ酸誘引物質を匂うことができるかどうかは明らかではない。
【０１４１】
これらのデータは、アミノ酸のPVCR感受は河口および魚移動経路にある種々の濃度の海水ならびに魚体（血清おおび体腔（腸、幽門盲腸および腎臓が挙げられる）が挙げられる）の種々の区画に存在する細胞外カルシウムの範囲で起こることを示す。ここで、経上皮（transepithelial）アミノ酸吸収が起こる。これらのデータは、魚におけるPVCRのアミノ酸感受性を示した最初の報告の構成要素となる。
【０１４２】
実施例４．淡水から海水への移行を刺激する条件下での淡水順応タイセイヨウサケの嗅神経記録
図１７は、単一の淡水順応タイセイヨウサケスモルトから得れた代表的な記録である。左上手のパネルは、蒸留水を使用してその鼻腔ラメラを灌注する間にこれらの魚の嗅神経から得られた電気インパルスの記録を示す。これらの魚は淡水順能であるので、記録した記録の内ごくまれに大きなふれ（２つの継続矢印で示す）を鼻腔ラメラの蒸留水での灌注（より大きな下方矢印）後に観察することに注意のこと。対照的に、同じ魚の鼻腔ラメラを今度は人工海水で灌注する場合（下パネル矢印）、特定の臭気物質（L-Alaなど）の検出を妨げる複数の大きなスケールの電気インパルスの開始がすぐにある（蒸留水での灌流中は右上に示す）。これらのデータは、淡水から直接海水へ移行され、本発明の方法に供さない場合に淡水順応タイセイヨウサケスモルトに起きていることを示す。本明細書に開示したように、これらのデータは、その周囲のイオン環境の劇的な変化により、淡水順応魚が海水中の飼料を匂いまたは検出できない一時的なインターバルがあることを示す。この現象は、おそらく海水移行後のインターバル中のかかる魚による摂食の有意な減少の原因である。対照的に、淡水でのProcess IまたはProcess IIへの曝露後、淡水から海水へ直接移行させた遡上魚は、海水移行後48時間で摂食し始めた。海水移行直後のインターバルの間に対照vs本発明の方法で処理した魚の間の飼料消費において観察された差は、これらの魚の嗅覚器官における少なくともPVCRの発現および／または感受性の調節である。
【０１４３】
2000年10月12日出願、タイトル「Growing Marine Fish in Fresh Water」、関連特許出願番号第09/687,373号；2000年10月12日出願、タイトル「Methods for Raising Pre-adult Anadromous Fish」、特許出願番号第09/687,476号；2000年10月12日出願、タイトル「Methods for Raising Pre-adult Anadromous Fish」、特許出願番号第09/687,372号；2000年10月12日出願、タイトル「Polyvalent Cation Sensing Receptor Proteins in Aquatic Species」、仮特許出願番号第60/240,392号；2000年10月12日出願、タイトル「Polyvalent Cation Sensing Receptor Proteins in Aquatic Species」、仮特許出願番号第60/240,003号；2001年10月11日出願、タイトル「Methods for Raising Pre-adult Anadromous Fish」、特許出願番号第09/975,553号；2001年10月11日出願、タイトル「Polyvalent Cation Sensing Receptor in Aquatic Species」、PCT出願番号第PCT/US01/31562号；2001年10月11日出願、タイトル「Growing Marine Fish in Fresh Water」、特許出願番号第PCT/US01/31625号は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１４４】
さらに、1998年9月28日出願、出願番号第09/162,021号、1997年3月27日出願、国際PCT出願番号第PCT/US97/05031号、および1996年3月27日出願、出願番号第08/622,738号（タイトルは全て、「Polycation Sensing Receptor in Aquatic Species and Methods of Use Thereof」）は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１４５】
Nearing, J.ら、「Polyvalent Cation Receptor Proteins (CaRs) are salinity Sensors in Fish」PNAS 99(14):9231-9236(2002)は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１４６】
本明細書中に引用される研究論文、参考文献、特許出願、特許公報および特許の関連部分は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１４７】
本発明は、その好ましい態様を参考として詳細に示され、記載されているが、形態および詳細における種々の変更が添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずにその中でなされ得ることが当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、タイセイヨウサケ（Salmo salar）の多価カチオン感受性レセプター（PVCR）の部分的ヌクレオチド（配列番号：１）およびアミノ酸（配列番号：２）配列を示す図である。
【図２】図２は、アルプスイワナ（Salvelinus alpinus）のPVCRの部分的ヌクレオチド（配列番号：３）およびアミノ酸（配列番号：４）配列を示す図である。
【図３】図３は、ニジマス（Onchorhynchus mykiss）のPVCRの部分的ヌクレオチド（配列番号：５）およびアミノ酸（配列番号：６）配列を示す図である。
【図４】図4A〜Eは、サメ腎臓カチオンレセプター（「SKCaR」）の全長核酸（配列番号：７）およびアミノ酸（配列番号：８）配列を示す図である。
【図５】図５は、抗PVCR抗体を用いてタイセイヨウサケ嗅球神経およびラメラのPVCR局在化を示す免疫細胞化学の一連の写真を示す図である。
【図６】図６は、PVCRモジュレーターに応答する嗅覚ラメラに対する外部および内部イオン濃度の効果を示す図である。
【図７】図７は、抗PVCR抗体を用いたタイセイヨウサケの孵化後の発達中の鼻ラメラおよび嗅球におけるPVCRタンパク質発現を示す免疫細胞化学の写真を示す図である。
【図８】図８は、抗PCV抗体を用いたホシザメの鼻ラメラにおけるPVCR局在を示す免疫組織化学の写真を示す図である。
【図９】図９は、適応した淡水の鼻ラメラにおけるPVCR mRNAの存在を示す西洋サケ由来のRT-PCR解析のサザンブロットの写真を示す図である。
【図１０】図１０は、種々の組織サンプル（鰓、肝臓、心臓、筋肉、胃、嗅上皮、腎臓、膀胱、脳、脳下垂体、嗅球、幽門盲腸、近位腸、および遠位腸）に関するELISAにより測定されるPVCRタンパク質の量（ng）を示すヒストグラムである。
【図１１】図１１は、500μM L-アラニン、１mmolカルシウム、50μMガドリニウム、および250mmolのNaClに曝された場合の淡水に適応したタイセイヨウサケの高抵抗性電極に由来する未処理および統合した記録を示す。
【図１２】図12Aは、10mMカルシウムで得られたシグナルに規準化されたカルシウム、マグネシウム、ガドリニウム、および塩化ナトリウムの淡水に適応したタイセイヨウサケ鼻ラメラの応答データを示すグラフである。  図12Bは、種々の濃度（10-6mol-1、10-5mol-1、10-4mol-1、10-3mol-1、10-2mol-1、10-1mol-1、100mol-1）でのカルシウム、マグネシウム、ガドリニウム、および塩化ナトリウムの淡水に適応したタイセイヨウサケ鼻ラメラの応答データを示すグラフである。  図12Cは、種々の濃度（10-6mol-1、10-5mol-1、10-4mol-1、10-3mol-1、10-2mol-1）および500mM塩化ナトリウムの存在下での人工海水（ASW）でカルシウムの淡水に適応したタイセイヨウサケ鼻ラメラの応答データを示すグラフである。  図12Dは、500mM塩化ナトリウム、カルシウム非含有ASW、二価フリーASW、ASW、滅菌水（対照）；および500mM塩化ナトリウムと組み合わせた以下のPVCRアゴニスト：１mMマグネシウム、１mMカルシウム、１mMストロンチウム、および50μMガドリニウムの淡水に適応したタイセイヨウサケ鼻ラメラの応答データを示すヒストグラムである。
【図１３】図１３は、忌避物質（指リンス液）の存在下ならびにPVCRアゴニスト（ガドリニウム）および忌避物質（指リンス液）の存在下での嗅神経刺激の高抵抗性電極からの未処理記録を示す。この図は、忌避物質に対する嗅神経刺激がPVCRアゴニストの存在下で可逆的に変化することを示す。
【図１４】図１４は、２分間隔の一連の繰り返し刺激（L-アラニンまたはNaCl）に応答する淡水に適応したタイセイヨウサケの高抵抗性電極からの未処理記録を示す。この図は、誘引物質に対する嗅神経刺激がPVCRアゴニストの存在下で可逆的に変化することを示す。
【図１５】図１５は、細胞外カルシウム（Ca2+）の種々の濃度（0.5、2.5、5.0、7.5、10.0および20.0mM）の10mM L-イソロイシンの存在下または非存在下でPVCRを発現するFURA-2細胞由来の比のグラフ図である。
【図１６】図１６は、Ca2+のみ、フェニルアラニン、イソロイシン、またはAA混合物（種々の濃度の種々のL-アイソマー）におけるPVCRに関する細胞外Ca2+（mM）と比べた分画Ca2+応答のグラフ図である。
【図１７】図１７は、滅菌水、ASW、および対照アミノ酸（500μM L-アラニン）における淡水タイセイヨウサケスモルト嗅上皮の嗅神経記録のグラフ図である。
【図１】
2005505278.tif 000003
【図２】
2005505278.tif 000004
【図３】
2005505278.tif 000005
【図４−１】
2005505278.tif 000006
【図４−２】
2005505278.tif 000007
【図４−３】
2005505278.tif 000008
【図４−４】
2005505278.tif 000009
【図４−５】
2005505278.tif 000010
【図５】
2005505278.tif 000011
【図６】
2005505278.tif 000012
【図７】
2005505278.tif 000013
【図８】
2005505278.tif 000014
【図９】
2005505278.tif 000015
【図１０】
2005505278.tif 000016
【図１１】
2005505278.tif 000017
【図１２−１】
2005505278.tif 000018
【図１２−２】
2005505278.tif 000019
【図１２−３】
2005505278.tif 000020
【図１３】
2005505278.tif 000021
【図１４】
2005505278.tif 000022
【図１５】
2005505278.tif 000023
【図１６】
2005505278.tif 000024
【図１７】
2005505278.tif 000025
【国際公開パンフレット】
2005505278.tif 000026
2005505278.tif 000027
2005505278.tif 000028
2005505278.tif 000029
2005505278.tif 000030
2005505278.tif 000031
2005505278.tif 000032
2005505278.tif 000033
2005505278.tif 000034
2005505278.tif 000035
2005505278.tif 000036
2005505278.tif 000037
2005505278.tif 000038
2005505278.tif 000039
2005505278.tif 000040
2005505278.tif 000041
2005505278.tif 000042
2005505278.tif 000043
2005505278.tif 000044
2005505278.tif 000045
2005505278.tif 000046
2005505278.tif 000047
2005505278.tif 000048
2005505278.tif 000049
2005505278.tif 000050
2005505278.tif 000051
2005505278.tif 000052
2005505278.tif 000053
2005505278.tif 000054
2005505278.tif 000055
2005505278.tif 000056
2005505278.tif 000057
2005505278.tif 000058
2005505278.tif 000059
2005505278.tif 000060
2005505278.tif 000061
2005505278.tif 000062
2005505278.tif 000063
2005505278.tif 000064
2005505278.tif 000065
2005505278.tif 000066
2005505278.tif 000067
2005505278.tif 000068
2005505278.tif 000069
2005505278.tif 000070
2005505278.tif 000071
2005505278.tif 000072
2005505278.tif 000073
2005505278.tif 000074
2005505278.tif 000075
2005505278.tif 000076
2005505278.tif 000077
2005505278.tif 000078
2005505278.tif 000079
2005505278.tif 000080
2005505278.tif 000081
2005505278.tif 000082
2005505278.tif 000083
2005505278.tif 000084
2005505278.tif 000085
2005505278.tif 000086
2005505278.tif 000087
2005505278.tif 000088
2005505278.tif 000089
2005505278.tif 000090
2005505278.tif 000091
2005505278.tif 000092
2005505278.tif 000093
2005505278.tif 000094
2005505278.tif 000095
2005505278.tif 000096
2005505278.tif 000097
2005505278.tif 000098
2005505278.tif 000099
2005505278.tif 000100
2005505278.tif 000101
2005505278.tif 000102
2005505278.tif 000103
2005505278.tif 000104
2005505278.tif 000105
2005505278.tif 000106
2005505278.tif 000107
2005505278.tif 000108
2005505278.tif 000109
2005505278.tif 000110
2005505278.tif 000111
2005505278.tif 000112
2005505278.tif 000113
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505278.tif 000114
2005505278.tif 000115
【国際調査報告】
2005505278.tif 000116
2005505278.tif 000117
2005505278.tif 000118