(57)【要約】本発明は、一種の薬のターゲットとして肝臓癌の組織からの新たなタンパク質分子ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 に関し、そのタンパク質分子ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の相補のＲＮＡプスラミドに関し、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 分子のペプチド拮抗剤に関する。前記のペプチド拮抗剤には請求の範囲の中に示されたようなアミノ酸の配列が含まれている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓癌組織から由来するおよび肝臓癌などの腫瘍の転移を促進するタンパク質分子ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 であって、前記タンパク質分子は白血球分化抗原であるＣＤ147 分子の遺伝子の配列と高度な同族であり、かつＣＤ147 家族系列に属し、前記タンパク質分子は肝臓癌の特異性なモノクローナル抗体ＨＡｂ18のアフィニティクロマトグラフィによって肝臓癌の膜抗原の粗製試料から得られた天然な純抗原であり、或いはモノクローナル抗体を使ってヒトの肝臓癌組織ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてなるタンパク分子であり、そのアミノ酸の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.:１のように示されていることを特徴とするタンパク質分子ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 。
【請求項２】
肝臓癌の転移にかかわるタンパク分子ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 分子の相補の核酸のベクターＰＣＩ-neo/as ＨＡｂ18Ｇであって、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 ｃＤＮＡの全長の配列を真核発現ベクターＰＣＩ-neoに反対に接続したもので、相補のＲＮＡプラスミドが出来上り、これによりＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 ｍＲＮＡの翻訳を阻止することを特徴とする核酸のベクターＰＣＩ-neo/as ＨＡｂ18Ｇ。
【請求項３】
次のようなアミノ酸の配列を持つことを特徴とするＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 のペプチド拮抗剤。
(1) Met Thr His Asp Pro Val Ile Ser Leu Pro Thr Thr (SEQ ID NO.:2)；
(2) Leu His Arg His Ser His GIy His Ser Tyr Lys Ser (SEQ ID NO.:3)；
(3) Gly His Trp His Asn His Arg His Gin Ala Pro Leu (SEQ ID NO.:4)；
(4) Lys Tyr Pro His Gin His Leu His Met His Asp Ser (SEQ ID NO.:5)：
(5) Ile Gly Trp His Tyr Tyr Leu Arg Thr Gin His Ser (SEQ ID NO.:6)；
(6) Tyr Pro Phe His His Lys His Trp His Arg Pro Asn (SEQ ID NO.:7)；
(7) Ala Asn Ile Val Pr0 Ile His Ala Asn His Phe Gin (SEQ ID NO.:8)：
(8) Met His Lys His Pro His Gly Ser Gin Gly Pro Thr (SEQ ID NO.:9)；
或いは
(9) Tyr Lys Leu Pro Gly His His His His Tyr Arg Pro (SEQ ID NO.:10)
【請求項４】
前記ペプチド拮抗剤が固相合成によって合成されるものであることを特徴とする請求項３に記載のＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 のペプチド拮抗剤。
【請求項５】
前記ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 ペプチド拮抗剤の配列の中のアミノ酸はＬ- 型アミノ酸であることを特徴とする請求項３に記載のＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 のペプチド拮抗剤。
【請求項６】
前記ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 ペプチド拮抗剤の配列の中のアミノ酸はＤ- 型アミノ酸であることを特徴とする請求項３に記載のＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 のペプチド拮抗剤。
【請求項７】
腫瘍の再発と転移、リューマチ関節炎、骨関節炎、ＨＩＶウイルスの感染とＡＩＤＳ、動脈硬化症と拡張性心筋症の予防と治療のための方法であって、該方法は患者の治療に対する有効な投与量における請求項２に記載の相補の核酸のベクターＰＣＩ-neo/as ＨＡｂ18Ｇ或いは請求項３に記載のペプチド拮抗剤或いは両者の組合せを含むことを特徴とする予防と治療のための方法。
【請求項８】
腫瘍の再発と転移、リューマチ関節炎、骨関節炎、ＨＩＶウイルスの感染とＡＩＤＳ、動脈硬化症と拡張性心筋症の予防と治療のために使う薬剤組成物であって、治療に対する有効な投与量における請求項２に記載の相補の核酸のベクターＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 或いは請求項３に記載のペプチド拮抗剤或いは両者の組合せ、薬学的に許容できるベクターを含むことを特徴とする薬剤組成物。
【請求項９】
ナノメータのリポゾームで包んだ請求項３〜６のいずれか一項に記載のＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 ペプチド拮抗剤を含むことを特徴とする請求項８に記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、バイオテクノロージィ、及び生体医学の分野に関するものである。詳細には、この発明は、肝臓癌細胞からの新たな蛋白質分子であるＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 、そのＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 における相補的なＲＮＡプラスミドベクター、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 のペプチド拮抗剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界中で、年間約１００００万人の癌患者が増え続けている。中国では、毎年18１８万人の癌患者が発生し、死亡人数は１４０万人で、１分間で平均１．３人が癌で死亡している。また癌の発生率が急激に増え続ける傾向にある。
【０００３】
ＷＨＯによると、世界では、癌による死亡人数は毎年約６００万人で、この数は世界中の死亡人数の１２％を占めている。１９９５年の中国における主な病気の死亡率と死亡原因は、悪性腫瘍が第２位で、病気による死亡人数の２１．８５％を占めていた。癌の発生率の高い順位は、胃癌（総死亡率の２１．７６％）、肝臓癌（１７．８３％）、肺癌（１５．１９％）、食道癌（１５．０２％）であった。また、これまで腫瘍の高再発および転移率が高いという問題が長期に亘り悩みの原因とされ、臨床治療において、解決しなければならない課題でもあった。
【０００４】
現在のところ、癌細胞の浸潤、転移を抑制することは、国内外における癌治療の関心の高い問題の１つである。腫瘍の転移の特性は非常に複雑で、多くの要因が含まれている。たとえば、（１）プロティナーゼ、（２）血管の生成因子、（３）附着因子整合因子、セレクション（Ｅ-cadheri）等、（４）運動因子、（５）情報伝達ルートおよびそれに関連のある分子等である。
【０００５】
腫瘍の組織への浸潤と転移には、細胞が間質細胞にプロティナーゼを分泌させるのを誘導する。プロティナーゼは、主に４種類が含まれている。すなわち、セーリンプロティナーゼ（ＰＡＳ等）、システインプロティナーゼ（cathepsin Ｂ等）、アスパラギン酸プロティナーゼ（pepsin等）及びマトリックスメタロプロテティナーゼ（ＭＭＰｓ）である。これらのプロティナーゼの中では、メタロプロティナーゼＭＭＰｓは一番重要なものである。多くの研究では、悪性腫瘍の組織の中にＭＭＰｓの量とその活性が周りの正常組織よりも著しく高いことが見い出されている。また腫瘍の悪性の程度に相関関係があることが明らかにされている［非特許文献１：デイビース・ビー・マイルス・デイダブリュー  外（Ｄavies Ｂ．Ｍiles  ＤＷ  et al.）著，「英国癌学会誌（Ｂritish cancer ）」，１９９３年，６７：ｐ１１２６−１１３１参照］。
【０００６】
現在、２０種類のＭＭＰｓが発見されている。その殆どは、細胞外の全てのマトリックス（extracelluar matrix ）を退化させることができる。ＭＭＰｓの主な働きは次のようなものである。
【０００７】
（１）間質を退化させ、膠原における癌細胞を抑制する機械的な障壁の働きを失なわさせる。
（２）基底膜の完全性を壊し、癌細胞が血管の壁を通り抜け、血液中に入るのに有利な働きをしている。
（３）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の改造によって、腫瘍の新生血管の生成および転移病巣の形成を促進させる。
【０００８】
腫瘍の浸潤、転移には、ＭＭＰｓの働きが大変重要であり、癌細胞組織内のＭＭＰｓがどこから来ているのかが非常に興味深い問題であり、主な研究課題でもある。近年、多くの研究実験では、ＣＤ147 分子が腫瘍細胞膜に関係があり、それが癌の間質細胞に刺激を与え、その細胞にＭＭＰｓを分泌させていることが示されている。グオ等（Ｇuo et al. ）の研究によると、ＣＤ147 分子は、ＭＭＰｓの生成を刺激することだけでなく、ＭＭＰｓと一緒に癌細胞の表面に合成物を形成すること、この合成物が癌細胞の周囲にＭＭＰｓを濃縮することになり、癌細胞の周囲基質の退化に有利に働き、癌細胞の拡散と転移を容易にさせた［非特許文献２：グオ・エイチ  外（Ｇuo  Ｈ，et al.）著，「癌研究（Ｃancer Ｒesearch ）」，２０００年，６０(4) ：ｐ８８８−８９１参照］。
【０００９】
現在、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を退化するには、プロティナーゼの抑制剤が良く使われている。例えば、天然プロティナーゼ抑制剤である組織型のメタロプロティナーゼ抑制剤（ＴＩＭＰｓ）がある。その抑制剤が、ＭＭＰｓと結合して、ＭＭＰｓの活性を抑制している。しかし組織の中のＴＩＭＰｓの量は僅かであり、取り出し難い。また、組換えＴＩＭＰｓは、タンパク質分子が大きくて、退化、吸収し難いという問題がある。メタロプロティナーゼ抑制剤、バティマスタット（Ｂatimastat ）〔ＢＢ−94〕等の合成のプソイドペポチドは、早期の腫瘍のＭＭＰｓの活性しか抑制をすることができない。だが、末期腫瘍が大量のＭＭＰｓを生成するので、その活性を抑制することができなくて、 III期の臨床実験の停止まで導いた。
【００１０】
本発明者等は、長年に亘り肝臓癌および免疫薬物の研究に携わっている。新鮮なヒトの肝臓癌組織を用い、マウスを免疫したことがある。マウスの脾臓の細胞と骨髄の腫瘍細胞を融合させ、ハイブリドーマを得て、特異な肝臓癌抗体、ＨＡｂ18を生成させた。このＨＡｂ18を配合子とし、アフィニティークロマトグラフィによって、ヒトの肝臓癌組織からの粗い膜抗原が純化され、ＨＡｂ18の天然な純粋抗原が得られた。そして、そのＨＡｂ18を用い、ヒトの肝臓癌組織ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングし、相応なコーティング配列も得られた。遺伝子バンクを調べることによって、そのアミノ酸の配列が白血球から分化された抗原ＣＤ147 分子と殆ど同族体であることを見出した。このため、ＨＡｂ18は、ＣＤ147 分子家族に属すると見做されている。抗体のＨＡｂ18を用いたことから、それはＨＡｂ18／ＣＤ147 と名付けられた。類似的な分子が他の組織に見られ、その働きがそれぞれ異なっている。例えば、リューマチ関節炎および反応性関節炎の患者の外周グラヌロシトの表面［非特許文献３：ウォッチャラク，エッダフィビーグ，ステファノーバル・ジェイ（Ｗatcharak，Ｅddafiebige，Ｓtepanoval Ｊ）著，「免疫学（Ｉmmunology ）」，１９９２年（３）：ｐ８４７参照］、肺癌［非特許文献４：グオ・エイチ，ズッカー・エス  外（Ｇuo  Ｈ，Ｚucker Ｓ et al. ）著，「生物化学（Ｊ  Ｂiol Ｃhem ）」，１９９７年，２７２(1) ：ｐ２４参照］、脳［非特許文献５：シュロッシャウアー・ビイ，ヘルゾーグ・ケイ・エイチ（Ｓchlosshauer Ｂ，Ｈerzog Ｋ．Ｈ．）著，「細胞生物学（Ｊ  Ｃell Ｂiology）」，１９９０年，１１０(4) ：ｐ１２６１参照］等の組織に見られた。
【００１１】
マトリゲル- ボイデン・チャンバー及びゼラチン・ザイモグラフィ（Ｍatrigel-boyden chamber and gelatin zymography ）の実験分析によって、ＨＡｂ18／ＣＤ147 分子の肝臓癌における働きは、ＣＤ147 分子の他の腫瘍での働きと同様で、肝臓癌細胞の浸潤と転移を大いに促進し、肝臓癌の転移に相関関係があると検証されていた。そのメカニズムは、それが肝臓癌細胞の周りの間質細胞を誘導し、それにＭＭＰｓを分泌させた点にある。ＭＭＰｓは肝臓癌細胞に周りのマトリックスの成分を退化させ、肝臓癌細胞の転移を促進した。以上の研究結果に基づいて、ＨＡｂ18／ＣＤ147 は、正常の組織には殆ど見られないこと及び肝臓癌等の腫瘍組織に多く見られたことから、ＨＡｂ18／ＣＤ147 分子の働きを遮断することで、肝臓癌等の腫瘍の転移を抑制することができると言える。
【００１２】
中国では、リューマチ関節炎（ＲＡ）における成人の発生率は約０．３％で、患者数が３００万人にも達している。その特徴は患者年齢が若く、障害になる率も高い。幼い型のリューマチが結合組織病で、子供等にもよく見られる。その特徴は、全身の関節の増殖性及び侵蝕性滑膜炎に及んでいて、一生にその再発が繰り返される。その増殖性と壊滅的な病理変化から、リューマチは、極限的な悪性腫瘍だと見做されている。その自発的に軽減されることは滅多に見られない。その末期には関節の軟骨と骨の損傷をすることにより、関節は硬直し、変形して、正常に働かなくなってくる。その病理変化は心臓、肺、動脈、神経及び目等の結合組織が侵されてしまうことになる。
【００１３】
リューマチ（ＲＡ）には有効な治療法がない。９０年代以来、国内外の学者等は、結核病と悪性腫瘍の治療法を採り入れ、リューマチの治療に取り組んでいる。これは良い１効果をもたらした。一部分の患者の病状は軽減され、生活の質も向上した。しかし、この組合せによる治療方法は、完壁な治療ではない。軟骨と骨への侵蝕が抑制されていないことは、依然として解決されていないままである。リューマチ（RA）の病理学的特徴は、滑膜の下地で増殖し過ぎ、膜の下層に大量の炎症が発生し、モノクローナル核細胞が侵蝕されていることである。滑膜細胞などのフイブロブラストと滑膜組織のマクロファージが、関節損傷に最も重要な役割を果たしている。これらの細胞は大量のＭＭＰｓを産出すると見られる。ＭＭＰｓは協力作用の方式で滑膜、関節の軟骨及び軟骨の中の全ての主要な細胞外のマトリックス（ＥＣＭ）を消化してしまう。リューマチ滑膜内のＣＤ147 は上がると、部分的にＭＭＰ-1、ＭＭＰ-2、ＭＭＰ-3等のポリメラーゼが生じる。また、ＭＭＰｓとＴＩＭＰｓとの不均衡をもたらし、最後にリューマチ（ＲＡ）関節の破滅に至る。
【００１４】
ＭＭＰｓは直接的に軟骨、骨組織を退化させ、間接的に血管の促進をさせ、リューマチ（ＲＡ）関節の壊滅に強く関与している。だから、ＭＭＰｓを抑制することはリューマチ（ＲＡ）治療方法の一つと言える。人間の寿命が伸びるにつれて、関節炎の発生率も高くなってきた。軟骨細胞、滑膜細胞およびフイブロブラストが、ＭＭＰｓを生成し骨関節炎の発生に重要な働きをしている。しかし、今日まで、プロティナーゼ阻害剤を使って、ＥＣＭ退化への抵抗に関する臨床実験の結果は、上述した腫瘍の転移を抑制する治療の効果と同じように、望ましいものではなかった。そこで、有効なＣＤ147 のペプチド拮抗剤を選び、高レベルで細胞のＭＭＰｓ分泌を遮断することが、リューマチ関節炎と骨関節炎における治療方法の一つであり、今後の治療方法の方向でもある。
【００１５】
ＡＩＤＳは、人類社会に未曾有の最も破滅的な病気である。ＡＩＤＳは発生してから、６０００万人余りの人々がＨＩＶウイルスに感染した。世界では第４の殺し屋になったが、しかし、未だに特効薬がない。
【００１６】
ＨＩＶ-1は、サイクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）と複合を生成する。そのサイクロフィリンＡが細胞膜の受容体ＣＤ147 分子と結合し、ウイルスの細胞への浸入を促進することは、もう明らかになっている。ウイルスの細胞への浸入を遮断することは、ＡＩＤＳの予防と治療において最も重要な一歩である。
【００１７】
ＨＩＶウイルスは、ＡＩＤＳの病原体である。ＨＩＶに感染した宿主の細胞における一つの重要な通路は、ＣＤ147 分子の媒介によるものである。だから、有効なＣＤ147 分子のペプチド拮抗剤を用い、ＨＩＶとＣＤ147 分子の結合を遮断することによって、ＡＩＤＳの予防と治療のための新しい手段が提供できる。
【００１８】
最近の研究では、ＣＤ147 が動脈硬化症と拡張性心筋症の発生にも関与していることが発見された。このため、ＣＤ147 分子の拮抗剤がこれらの病気の予防と治療には潜在的な応用価値を持っていると言える。
【００１９】
【非特許文献１】
デイビース・ビー・マイルス・デイダブリュー  外（Ｄavies Ｂ．Ｍiles  ＤＷ  et al.）著，「英国癌学会誌（Ｂritish cancer ）」，１９９３年，６７：ｐ１１２６−１１３１
【非特許文献２】
グオ・エイチ  外（Ｇuo  Ｈ，et al.）著，「癌研究（Ｃancer Ｒesearch ）」，２０００年，６０(4) ：ｐ８８８−８９１
【非特許文献３】
ウォッチャラク，エッダフィビーグ，ステファノバル・ジェイ（Ｗatcharak，Ｅddafiebige，Ｓtepanoval Ｊ）著，「免疫学（Ｉmmunology ）」，１９９２年（３）: ｐ８４７
【非特許文献４】
グオ・エイチ，ズッカー・エス  外（Ｇuo  Ｈ，Ｚucker Ｓ et al. ）著，「生物化学（Ｊ  Ｂiol Ｃhem ）」，１９９７年，２７２(1) ：ｐ２４
【非特許文献５】
シュロッシャウアー・ビイ，ヘルゾーグ・ケイ・エイチ（Ｓchlosshauer Ｂ，Ｈerzog Ｋ．Ｈ．）著，「細胞生物学（Ｊ  Ｃell Ｂiology）」，１９９０年，１１０(4) ：ｐ１２６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
この発明の第１の特徴は、肝臓癌組織からの新たなタンパク質分子であるＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 を提供することである。そのアミノ酸の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.:１のように示されている。
【００２１】
この発明の第２の特徴は、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 分子の相補的な核酸のベクターＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇを提供することにある。
【００２２】
この発明の第３の特徴は、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 のペプチド拮抗剤を提供することにある。そのアミノ酸の配列は次のようなものである。
【００２３】
(1) Met Thr His Asp Pro Val Ile Ser Leu Pro Thr Thr (SEQ ID NO.:2)；
(2) Leu His Arg His Ser His GIy His Ser Tyr Lys Ser (SEQ ID NO.:3)；
(3) Gly His Trp His Asn His Arg His Gin Ala Pro Leu (SEQ ID NO.:4)；
(4) Lys Tyr Pro His Gin His Leu His Met His Asp Ser (SEQ ID NO.:5)：
(5) Ile Gly Trp His Tyr Tyr Leu Arg Thr Gin His Ser (SEQ ID NO.:6)；
(6) Tyr Pro Phe His His Lys His Trp His Arg Pro Asn (SEQ ID NO.:7)；
(7) Ala Asn Ile Val Pr0 Ile His Ala Asn His Phe Gin (SEQ ID NO.:8)：
(8) Met His Lys His Pro His Gly Ser Gin Gly Pro Thr (SEQ ID NO.:9)；
或いは
(9) Tyr Lys Leu Pro Gly His His His His Tyr Arg Pro (SEQ ID NO.:10)
【００２４】
この発明の第４の特徴は、次のような病気の予防と治療における方法を提供することにある。それらは腫瘍の再発と転移、リューマチ関節炎、骨関節炎、ＨＩＶウイルスの感染とＡＩＤＳ、動脈硬化症と拡張性心筋症である。上述した方法には、第２の特徴の患者に対する有効な投与量の相補の核酸のベクターＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇと第３の特徴のペプチド桔抗剤、或は両者の組み合わせを含む。
【００２５】
この発明の第５の特徴は、腫瘍の再発と転移、リューマチ関節炎、骨関節炎、ＨＩＶウイルスの感染とＡＩＤＳ、動脈硬化症と拡張性心筋症の予防と治療のために、薬剤組成物を提供することにある。上述した薬剤組成物には、第２の特徴における患者に対する有効な投与量の相補の核酸のベクターＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇと第３の特徴におけるペプチド桔抗剤、或は両者の組み合わせを含む。そして薬学的に受容できるベクターも含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
この発明の第１の特徴においては、肝臓癌細胞からの新しいタンパク質分子ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 を提供する。
【００２７】
１．ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の天然純抗原の精製について
（１）モノクローナル抗体ＨＡｂ18はセファロース（Ｓepharose-4Ｂ）カラムに結合し、親和性の円柱を作った。
（２）培養された大量のＨＨＣＣ（ヒトの肝臓癌細胞）を解離させ、遠心機にかけ、透析したあと、最初の粗いメンブラン抗原サンプル（膜のタンパク質分子）を得た。それを調製したセファロース（Ｓepharose-4Ｂ）カラムに載せ、結合、溶離、収集の手順を経て、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の純抗原を得た。
【００２８】
ＳＤＳ -ＰＡＧＥおよびウエスターン・ブロッティング（Ｗestern blotting ）の測定によって、肝臓癌抗原ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 がシングルバンドであり、その分子量が６０ｋｄだと判った。
【００２９】
２．ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 のクローニングについて
モノクローナル抗体ＨＡｂ18を用いて、ヒトの肝臓癌組織のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングし、相応なコード配列が得られ、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 タンパク分子として表している。ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 は２６９個のアミノ酸からなっている。そのＮ端はシグナル・ペプチドの配列となって、疎水性残基（hydrophobic residues）が多く含まれている。そのあとには、膜外の機能部位となっている。２０６から２２９までは、２４個のアミノ酸が膜貫通ドメインを構成する。Ｃ- ターミナルからは、細胞内結構部位が３９個のアミノ酸から構成されている。その分子ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 には大量の翻訳後修飾が存在する。その種類や器官によってグリコシル化（glycosylation ）の様式が異なっている。そこで、肝臓癌組織に見出されたＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 分子は、その最初段階の構造がＣＤ147 分子と同族体だと判ったが、そのグリコシル化が他の組織における類似的な分子とは異る可能性があるので、その働きも相違するかもしれない。
【００３０】
３．ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の機能に関する研究について
ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 分子の主な働きはフイブロブラストに刺戟を与え、それにＭＭＰｓを生じさせることである。発明者は純化されたＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 抗原でヒトのフイブロブラストを刺激した結果、以上の結論が証明された。その具体的な方法は次のように行った。
【００３１】
まず、純化されたＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 をヒトのフイブロブラストと一緒に培養し、培養された上澄の水のサンプルをＳＤＳ- ＰＡＧＥ電気泳動に付にした。その電気泳動とは、常用のプロテイン電気泳動と違ってその分離の膠質には１．０ｍｇ／ｍｌのゼラチン（gelatin ）が含まれ、濃度は５％である。サンプルは煮込まず、その溶液にＤＴＴを含ないこと、電気泳動したあと、そのゲル（gel ）は室温で２回洗浄し、洗浄は毎回４５分間である。それから、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌで２回洗浄し、洗浄は毎回２０分間である。最後に、そのゲル（gel ）は、３７度の培養液に入れ、２４時間以上温置する。０．５％（ｗ／ｖ）クーマシー・ブルー（Ｃoomassie  Ｂlue ）で染色したあと、脱色し、ゲルのブルーの背景には出てきたＭＭＰｓが透明のバンドとなった、これは最も良い効果になったと考えられる。
【００３２】
ザイモグラフ法では、フイブロブラストは純化されたＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の刺激を受けたあと、産出したＭＭＰｓ量と種類が明らかな差があることが示されている。すなわち、ブルーのゲル（gel ）には分子量の異る３つの白いバンドが現われた。それはそれぞれ、９２ＫＤのＭＭＰ-9ザイモゲン、８６ＫＤの化性物、７２ＫＤのＭＭＰ-2ザイモゲンおよび６８ＫＤのＭＭＰ-2の活性物；４３ＫＤのＩ型のＭＴＩ- ＭＭＰである。
【００３３】
機能実験からＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 は、主にフイブロブラストを刺激し、それに何種類かのＭＭＰｓを産出させた。そのＭＭＰｓは肝臓癌細胞の転移と浸潤活動を活発したことがわかった。そこで、発明者等はその表われた量を減少させる方法や手段を探さずには居れず、肝臓癌患者に遺伝子の治療法を施した。相補の核酸が述べられる手段の一つである。
【００３４】
この発明の第２の特徴においては、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 分子の相補の核酸ベクターＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇを提供する。
【００３５】
１．ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 における相補のＲＮＡプラスミドの構築について
ＸbaＩとＸhoＩ酵素を使ってもとのプラスミドベクターＰＢlue script ks(+/-)ＨＡｂ18Ｇを切断した。そのプラスミドベクターが発明者の実験室で構築された。酵素分解したあと、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 ｃＤＮＡの全長が得られた。それをＸbaＩとＸhoＩ酵素の真核のベクターＰＣＩ-neo〔アメリカ合衆国、ウィスコンシン州、マディソン所在のプロメガ社（Ｐromega company，Ｍadison，ＷＩ，ＵＳＡ）〕に接続した。分解酵素の配列が反対なので、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 ｃＤＮＡは逆に酵素ベクターに接続されてしまった。そこで、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 ｍＲＮＡと補い合う相補のＲＮＡが転写された。その結果、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 ｍＲＮＡの翻訳を阻止し、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の表れが封じ込まれた。
【００３６】
２．ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 における相補のＲＮＡプラスミドの機能について
ａ．導入されていた肝臓癌細胞のＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 と導入されていないものとの比較
肝臓癌細胞がＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇで導入されていたあと、その細胞の免疫化の染色の強度が著しく低下したことや細胞膜の表面蛍光強度も弱めになったことがＦＡＣＳの分析と免役学的な方法によって証明された。これらの変化は、主に相補のＲＮＡがＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の表れを封じ込めたことによるものである。封じ込め効率は９５％にも達していた。
【００３７】
ｂ．ＭＭＰｓの抑制実験について
相補のＲＮＡを封じ込んだヒトの肝臓癌細胞（ＨＨＣＣ）を用い、ヒトのフイブロブラストと一緒に培養して、培養物の上澄を集め、ＳＤＳ- ＰＡＧＥ膠着酵素電気泳動（ＳＤＳ- ＰＡＧＥ  Ｇelatin Zymography ）により分析した。その結果、相補のＲＮＡが封じ込んだＨＨＣＣは、フイブロブラストにＭＭＰｓの産出をさせる能力が大いに低下した。これは主にＭＭＰｓの量の減少によるものである。
【００３８】
ｃ．細胞の基底膜への侵蝕実験について
細胞培養の個室が２４の孔がある板に置かれ、個室の底には８μｍ孔の濾過膜で密閉されている。マトリゲル（Ｍatrigel ）〔主要な成分はIV型膠原〕を濾過膜につけて、膠質膜となして、細胞を個室に入れて一晩中培養した。その後、膜の上の細胞を取り、膜を固定し、染色し、基底膜を通り抜けた細胞の数を計算する。その結果、相補のＲＮＡを封じ込んだヒトの肝臓癌細胞（ＨＨＣＣ）は、ヒトのフイブロブラストにＭＭＰｓの産出をさせる能力が大いに低下した。ＭＭＰｓの産出量が減少した場合、ＨＨＣＣが膠原を退化する能力は低下し、基底膜を透過する能力も低下し、通り抜けた細胞の数が減少したということを表している。
【００３９】
上に述べた結果によると、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の相補のＲＮＡは、そのＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の表れを阻止し、肝臓癌細胞の浸潤の力を抑制することができる。また主要な細胞の生物学的な行動も変えられる。この相補のＲＮＡプラスミドのベクターＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 D147の優れたところは、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の表れを有効に封じ込めることで、肝臓癌細胞の浸潤、転移を効果的に抑制することができることである。
【００４０】
この発明の第３の特徴においては、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 のペプチド拮抗剤を提供する。このペプチド桔抗剤は次のような方法で得られた。
【００４１】
１．ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の天然抗原の精製
（１）．モノクローナル抗体ＨＡｂ18はセファロース（Ｓepharose-4Ｂ）に結合し、親和性のカラムを調整した。
（２）、培養された大量のＨＨＣＣ（ヒトの肝臓癌細胞）を解離させ、遠心機にかけ、透析したあと、最初の粗製メンブラン抗原サンプル（膜のタンパク分子）を得た。それを工程（１）で調製したセファロース（Ｓepharose-4Ｂ）カラムに載せ、結合、洗浄、選択、収集の手順を経て、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の純抗原を得た。
ＳＤＳ- ＰＡＧＥおよびウエスターン・ブロッティング（Ｗestern blotting ）の測定によって、肝臓癌抗原ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 がシングルバンドで、その分子の量が６０ｋｄだと判った。
【００４２】
２．モノクローナル抗体ＨＡｂ18を用いて、ヒトの肝臓癌組織のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングし、相応する配列を得た。その配列はＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 タンパク質分子と高レベルでの同族体である。
【００４３】
３．ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の純抗原で１２ファージのベプチドライブラリーをスクリーニングして、９個のＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の結合ベプチドが得られた。それぞれの配列は次のようなものである。
【００４４】
(1) Met Thr His Asp Pro Val Ile Ser Leu Pro Thr Thr (SEQ ID NO.:2)；
(2) Leu His Arg His Ser His GIy His Ser Tyr Lys Ser (SEQ ID NO.:3)；
(3) Gly His Trp His Asn His Arg His Gin Ala Pro Leu (SEQ ID NO.:4)；
(4) Lys Tyr Pro His Gin His Leu His Met His Asp Ser (SEQ ID NO.:5)：
(5) Ile Gly Trp His Tyr Tyr Leu Arg Thr Gin His Ser (SEQ ID NO.:6)；
(6) Tyr Pro Phe His His Lys His Trp His Arg Pro Asn (SEQ ID NO.:7)；
(7) Ala Asn Ile Val Pr0 Ile His Ala Asn His Phe Gin (SEQ ID NO.:8)：
(8) Met His Lys His Pro His Gly Ser Gin Gly Pro Thr (SEQ ID NO.:9)；
(9) Tyr Lys Leu Pro Gly His His His His Tyr Arg Pro (SEQ ID NO.:10)
【００４５】
４．化学合成、純化を通し、以上９個のベプチド配列が得られた。ＦＰＬＣとＭＳの計測によって、それらの純度が９５％以上に達した。
【００４６】
これらの拮抗ペプチド配列のアミノ酸がＬ- 型アミノ酸だと考えられる。発明者は３次元の定量構成の相関関係に基づいて、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の拮抗ペプチドに対する改造が行なわれ、桔抗剤の配列のＬ- 型アミノ酸をＤ- 型アミノ酸に置き換えた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
得られた９種類のベプチド拮抗剤の活性への研究は次の通りである。
【００４８】
ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の拮抗性の活性についての研究
（１）生体外の機能実験について
細胞への浸潤力を抑制する実験を採用した。検出しようとする拮抗ペプチドは、一番下に敷かれたマトリゲル（Ｍatrigel ）膠の肝臓癌細胞およびヒトのフイブロブラストと一緒に培養したものに入れた。約２０時間の経過後、マトリゲル（Ｍatrigel ）膠を通り抜けた肝臓癌細胞は、対照群と比較し、減少したかどうかをチエックし、また肝臓癌細胞の転移の抑制率を計算した。その結果は以下の通りである。
【００４９】
2005504516.tif 000002
【００５０】
これらの拮抗ベプチドの中では、６個のペプチド（１、３、６、７、８、９号）が肝臓癌細胞の浸潤と転移に対する抑制があることが明らかである。最高の抑制率は９０.１％にも達した。それにゼラチン・ザイモグラフィ（Ｇelatin zymography ）の検証によって、その結果は浸潤力の抑制実験の結果と一致していた。粘着への抵抗実験の結果では、ＣＤ147 拮抗ペプチドは腫瘍細胞が細胞外の基質（ＥＣＭ）タンパクの（ＬＮ）、IV型膠原，および間質細胞の粘着に対して、ある程度、遮断の働きをしていることが示唆された。
【００５１】
生体外実験では、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 はその相応する肝臓癌細胞と周りのフイブロブラストと結合し、フイブロブラストが刺激され、ＭＭＰｓを産出した。それで、腫瘍組織中のＭＭＰｓ量と活性が著しく増加され、間質成分と血管の基底膜の膠原タンパクを退化させ、癌細胞が基底膜と結合組織を通り抜け、浸潤したり、拡散したりする。発明されたこれらの拮抗ペプチドは、細胞への浸潤力の抑制実験によって、肝臓癌細胞の転移への抑制率が−３９．０〜９０．１％だと示唆された。ゼラチン・ザイモグラフィ（Ｇelatin zymography ）の検証した結果は細胞への浸潤力の抑制実験の結果と一致している。
【００５２】
（２）生体内の機能実験について
ヒトの肝臓癌細胞ＨＨＣＣをヌードマウスの脇の両側に接種したあと、すぐ、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 拮抗ペプチド（２．５ｍｇ／ｋｇ）を尻尾の静脈から注入した。同時に対照群を作った。その結果、ＡＰ-1とＡＰ-6拮抗ペプチドは、肝臓癌細胞の生成を有効に抑制することが示されていた。対照群は、実験の１１日目に全てのマウスには腫瘍ができた。ＡＰ-6拮抗ペプチドグループの実験には、腫瘍ができたマウスがなかった。そして、治療グループの平均生存期が対照群より２倍以上伸びた。ヒトの転移活性が強い肝臓癌細胞が接種されたあと、ＣＤ147 拮抗ペプチドを用い治療が行なわれた。その結果には、拮抗ペプチドは肝臓癌の肝臓内への拡散および肺や腹腔への転移に対するある程度の治療効果が見られた。鳥の胚胎における血管の生成（ＣＡＭ）による実験の結果には、拮抗ペプチドが血管の生成を著しく遮断する効果が見られた。Ｃ５７ＢＬマウスのマトリゲル・プラグ（Ｍatrigel Ｐlug ）血管生成の誘導実験では、ＣＤ147 拮抗ペプチドは血管の生成に明らかな遮断作用があることが示された。
【００５３】
（３）免疫学方法による滑膜におけるＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の表れについて
ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 モノクローナル抗体は、リューマチ（ＲＡ）関節炎と骨関節炎の滑膜に免疫をさせ染色した。その結果、リューマチ（ＲＡ）の滑膜細胞には、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 が相当に表れた。３重免疫蛍光法で流れ式の細胞標識によると次のようなことが明らかになった。(1) リューマチ患者の外周血液、滑液中にモノサイト／マクロファージと活性化のＴ細胞にＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 が大いに表れた。(2) リューマチ炎症関節中にＣＣＲ5 、ＣＸＣＲ3 配合体があり、高く表れた。ＣＣＲ5 とＣＸＣＲ3 のＴhl細胞群、モノサイト／マクロファージが選択的に関節病巣に集まり、リューマチ（ＲＡ）関節軟骨と骨損傷に関わる。生体外のゼラチン・ザイモグラフィ（Ｇelatin zymography ）および基底膜の侵入実験によると、モノサイト／マクロファージのＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の産出でフイブロブロストとの相互作用で、侵蝕を促すことになる。
【００５４】
ＭＭＰｓは直接に軟骨と骨組織を退化させ、間接的に血管の生成を促す。それによって、リューマチ関節を破壊していく。免疫学方法を利用して、リューマチの滑膜細胞には、ＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 が相当に表れたことが判った。３重免疫蛍光法で流れ式の細胞標識によって、リューマチ患者の外周血液、滑液中にモノサイト／マクロファージと活性化のＴ細胞にＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 が大いに表れた。リューマチ（ＲＡ）炎症関節中にＣＣＲ5 、ＣＸＣＲ3 配合体があり、高く表れだ。ＣＣＲ5 とＣＸＣＲ3 のＴhl細胞群、モノサイト／マクロファージが選択的に関節病巣に集まり、リューマチ関節軟骨と骨損傷に関わることが検証されていた。
【００５５】
生体外のゼラチン・ザイモグラフィ（Ｇelatin zymography ）および基底膜の侵入実験によると、モノサイト／マクロファージのＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 の産出でフイブロブラストと相互作用して、侵蝕を促すことになると示されていた。そこで、ＣＤ147 ペプチド拮抗剤はリューマチ関節炎と骨関節炎などの病気の治療において、潜在的な応用価値があると言える。
【００５６】
以上の研究に基づいて、この発明は同時に患者の治療にその相応な方法を提供してきた。それは有効な治療に対して、この発明の第２の特徴における相補の核酸ペクトーＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇ、この発明の第３の特徴におけるペプチド拮抗剤および両者の組合せで、腫瘍の再発と転移、リューマチ関節炎、骨関節炎、ＨＩＶウイルスの感染とＡＩＤＳ、動脈硬化症と拡張性心筋症といった予防と治療の方法が可能となる。
【００５７】
同時にこの発明では、腫瘍の再発と転移、リューマチ関節炎、骨関節炎、ＨＩＶウイルスの感染とＡＩＤＳ、動脈硬化症と拡張性心筋症の予防と治療のために薬物の組み合わせたものを提供してきた。上述した薬物の組み合わせたものには、第２の特徴における患者に対する有効な投与量の相補の核酸のベクターＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇと、第３の特徴におけるペプチド拮抗剤、或は両者の組み合わせを含む。そして薬学的に受容できるベクターも含まれる。これらの薬物の組み合せたものの製造には、この分野の公開した技術を利用することができる。
【００５８】
この発明の相補の核酸べクターＰＣＩ-as ＨＡｂ18Ｇ或いはペプチド拮抗剤の構築を利用することができる。そのほか、本発明者の研究によれば、ナノメータのリポソームで本発明の拮抗剤を包んで作られた製剤は、その衰弱期間が延ばされ、生体内の生物利用の頻度とその活性が増加された。
【００５９】
以上は、本発明の内容に対しする詳細な説明である。但し、本発明はこれらの具体的な実施方法に制限されるものではない。本発明の実質に違反しない限り、本発明に対する様々な修正および変更が許されている。
【００６０】
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【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明のＨＡｂ18Ｇ／ＣＤ147 分子とＣＤ147 分子のヌクレオチド配列の比較表である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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