(57)【要約】アニオン性多糖の試料中の分子量分布を決定するための方法が提供される。一般的には、該方法は下記工程を含む：０．０５ないし１０ＭＤａの範囲の平均分子量を有するアニオン性多糖の試料を用意すること；アニオン交換クロマトグラフィーカラムに試料を適用して、多糖をカラムに固定化すること；溶出される多糖の量のクロマトグラムを時間の関数として記録しながら、固定化された多糖を溶出させること；次いで、そのクロマトグラムを分析することにより多糖試料中の分子量分布を決定すること。０．０５ないし１０ＭＤａの範囲の平均分子量を有するアニオン性多糖の試料中の分子量分布の決定のためのアニオン交換クロマトグラフィーの使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）０．０５ないし１０ＭＤａの範囲の平均分子量を有するアニオン性多糖の試料を用意し；
（ｉｉ）試料をアニオン交換クロマトグラフィーカラムに適用して、多糖をカラムに固定化し；
（ｉｉｉ）固定化された多糖を溶出させ、溶出した多糖の量のクロマトグラムを時間の関数として記録し；次いで
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られたクロマトグラムを分析することにより試料中の多糖の分子量分布を決定する
ことを特徴とする、試料中のアニオン性多糖の分子量分布を決定する方法。
【請求項２】
アニオン性多糖の標準試料のセットに関して、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）で用いられるクロマトグラフィー条件下でクロマトグラフィーの保持時間を確認することをさらに特徴とする方法であって、各標準試料がアニオン性多糖の既知平均分子量を有するものであり、工程（ｉｖ）における分子量分布の決定が、標準試料に関する保持時間において工程（ｉｉｉ）で得られたクロマトグラムのピークを分割することを特徴とするものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料中のアニオン性多糖の平均分子量が０．１ないし１０ＭＤａの範囲である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
試料中のアニオン性多糖の平均分子量が０．５ないし５ＭＤａの範囲である請求項３記載の方法。
【請求項５】
クロマトグラフィー系の移動相のｐＨ値が４ないし１１の範囲である請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
クロマトグラフィー系の移動相のｐＨ値が６ないし９の範囲である請求項５記載の方法。
【請求項７】
アニオン性多糖以外のコンタミナントが試料中の負に帯電した種の５％未満を占める純度を有する請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
アニオン性多糖以外のコンタミナントが試料中の負に帯電した種の１％未満を占める純度を有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
アニオン性多糖以外のコンタミナントが試料中の負に帯電した種の０．１％未満を占める純度を有する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
アニオン性多糖がコンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸またはヘパラン硫酸である請求項１ないし９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
アニオン性多糖がヒアルロン酸である請求項１ないし９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
アニオン交換クロマトグラフィーカラムが、トリメチルアミノメチル、トリメチルアミノヒドロキシプロピル、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル、第４級化ポリエチレンイミン、トリエチルアミノエチル、トリメチルアミノエチル、および３−トリメチルアミノ−２−ヒドロキシプロピルからなる群より選択される官能基を含むものである請求項１ないし１１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、アニオン性多糖の試料中の分子量分布を決定することに関する。より詳細には、本発明は、かかる決定のためのクロマトグラフィー法に関する。
【０００２】
技術背景
多糖の分子量はその最も基本的な特徴の１つであり、種々の適用例における多糖の機能および有用性に重大な影響を及ぼすものである。しかしながら、それは測定が非常に難しいことがわかっているパラメーターである。多分散性、コンホーメーションの柔軟性および高濃度での自己会合のごとき多くの多糖の特性により困難性が生じている。多糖の分子量を決定する際に遭遇する困難性は、多糖試料中の分子量分布を決定することが目的の場合には、さらに大きい。生化学における多糖の役割ならびにそれらの可能な生物工学的、医学的および他の商業的用途を明らかにしようとする場合に、多糖の分子量および分子量分布に関する知識が非常に重要なので、これらの困難性は問題となるものである。多糖の分子量の決定に関するトピックの一般的レビューはSE Harding et al., Advances in Carbohydrate Analysis 1:63-144 (1991)にある。
【０００３】
食品産業において、多糖ゲル化剤または増粘剤中に大量に存在しすぎる低分子種はそのような剤の品質を低下させるものであり、他の食品添加物中の低分子形態の可能な毒性に関する報告もある。多糖は油脂産業においても種々の目的で、例えば、流動性の制御に使用されており、これらの目的を達成することにおけるそれらの有効性はそれらの分子量により大まかに決定されている。医薬品産業では、薬剤デリバリーシステムにおける多糖の使用が増えており、そこで使用される多糖の品質もまたそれらの分子量特性に依存している。このことは、多糖を介する活性物質の輸送に関する特性、例えば除放性剤形に関連している。また、多糖（デキストラン、シゾフィラン、ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、およびキトサンのごとき）は治療薬自体として患者に適用あるいは注射されている。特定の生理学的特性のほかに、多糖の化学構造に依存して、かかる剤が粘度、浸透圧およびゲル化のごとき物理的要求を満たすことも頻繁にあり、そのような特性は分子量および分子量分布に大いに依存する。
【０００４】
医学的に重要なアニオン性多糖の典型例はヒアルロン酸である。ヒアルロン酸（ＨＡ）は目のガラス体から初めて単離され（K Meyer and JW Palmer, J Biol Chem 107:629-634 (1934)）、（−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＵＡ−）ｎ型のグルコサミノグルカン［式中、ＧｌｃＮａｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンであり、ＧｌｃＵＡはＤ−グルコサミンである］であることが示されている。このポリマーはらせんコンホーメーションを有し、目のガラス体、軟骨、および関節の滑液のような組織中に見出されている（TC Laurent and RE Fraser, FASEB J 6:2397-2404 (1992)）。ヒアルロン酸ポリマーの分子量は１００００Ｄａから約１ｘ１０７Ｄａの範囲である（T Sugiyama et al J Appl Ther Res 2:141-145 (1998)）。ＨＡの市販医薬製品は関節の疾病、例えば、リューマチ性関節炎の治療に用いられており、目の外科手術にも用いられている。これらの製品のＨＡの平均分子量は約０．５〜５ＭＤの範囲である。低分子ＨＡ（０．５ＭＤａまたはそれ未満の分子量を有するＨＡ）が強力な種々の組織において炎症メディエイタであり、この炎症応答がケモカイン遺伝子の発現により引き起こされることを明らかにするいくつかの報告が公表されている（CM McKee et al, J Clin Invest 98:2403-2413 (1996)）。さらなる例は、低分子ＨＡが培養臍帯線維芽細胞からのＩＬ−８の産生を誘導しうることを示す結果である（N Kanayama et al, Pediatr Res 45:510-5147 (1999)）。一般的には、ＩＬ−８は強力な好中球化学走性因子であり、種々の組織で炎症反応を誘導するものと見なされている。それゆえ、これらの製品の製造および分析における重要なステップは、ヒアルロン酸の平均分子量および分子量分布の決定である。
【０００５】
０．１ＭＤａおよびそれ以上の分子量範囲の種を含有する多糖試料の分子量を決定するためにいくつかの方法が用いられている。これらはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Sugiyama et al, supra）、アガロースゲル電気泳動（N Kanayama et al, supra）、キャピラリー電気泳動（S Hayase et al, J Chromatogr A768: 295-305 (1997)）、粘度測定法（T Yanaki and T Yamaguchi, Biopolymers 30: 415-425 (1990)）、およびレーザー光散乱（ＬＡＬＬＳ）ディテクター（C Kvam et al Anal Biochem 211: 44-49 (1993)）を包含する。質量スペクトル法は、これらが高分子量であるため使用できない。さらにそのうえ、上記方法のうちかなりのものが分子量の平均値よりも高い値を示す。
【０００６】
かくして、高分子の市販多糖製品の試料中の分子量分布に関する情報は、実際のところ、光散乱法およびサイズ排除クロマトグラフィーによってのみ得られている。さらに、これら２つの方法のいずれの使用にも問題がある。光散乱を用いる方法は、分析すべき試料中の埃または高分子凝集体に対して非常に感受性がある。なぜならかかるコンタミネーションは重大な誤差を招くからである。サイズ排除クロマトグラフィーは、多糖の分子量分布の決定に最も一般的で広く用いられている方法であるが、この方法で分析可能な最大分子量がやや低いことが多いという欠点を有する。このことは、個々のポリマー分子のかなりの部分が特定の最大分子量以上の分子量を有している市販多糖試料中の分子量分布の分析が実行不可能であることを意味する。例えば、約４〜５ＭＤａの平均分子量を有する重要な市販ヒアルロン酸製品があるが、ヒアルロン酸のサイズ排除クロマトグラフィーは約３ＭＤａまでの分子量に対してのみ行われうる。
【０００７】
Y Zang et al, Anal Biochem 250:245-251 (1997)には、パルス電流検出手段とカップリングされた高品質アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣＤ−ＰＡＤ）を用いるオリゴ糖の分離方法が記載されている。この報告において、約２４ｋＤａまたはそれ未満の分子量に対応する重合度８０までのオリゴ／ポリ−シアル酸が分離された。他の研究者は、同じ方法を用いてより小型のオリゴ糖を分離している（例えば、KN Price et al,Carbohydrate Research 303: 303-311 (1997)参照）。これらの実験に使用されたクロマトグラフィーのタイプは特別なタイプのクロマトグラフィー装置およびカラムを必要とし、分析すべきオリゴ糖上の負に帯電したＯＨ−基を作り出すのに十分高いｐＨ値においてのみ実行できるものである。上で引用した報告において、Y Zhangらは約１３のｐＨにおいて操作を行っている。
【０００８】
上で述べたことから、現行方法を補完し、現実的で有効な別法を提供する、多糖の分子量分布を分析するための新しい改良された方法に対する必要性があることは明白である。
【０００９】
発明の概要
かくして、多糖の分子量分布の決定のためのかかる別法を提供することが、本発明の１の目的である。
【００１０】
上記のサイズ排除クロマトグラフィーの分子量閾値のごとき、高分子の多糖試料の簡単で単純な分析を可能にすることが、本発明のもう１つの目的である。
【００１１】
本発明のさらにもう１つの目的は、現行の標準的方法に容易に適用できる、クロマトグラフィーおよびクロマトグラムの分析のための方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、慣用的なアニオン交換クロマトグラフィーの新たな使用を確立することである。
【００１３】
以下の詳細名説明から当業者に明らかであろうこれらの目的および他の目的は、特許請求の範囲に記載の本発明に合致するものである。かくして、本発明は、１の態様において、下記工程を特徴とするアニオン性多糖の試料中の分子量分布の決定方法を提供する：
（ｉ）０．０５ないし１０ＭＤａの範囲の平均分子量を有するアニオン性多糖の試料を用意し；
（ｉｉ）試料をアニオン交換クロマトグラフィーカラムに適用して、多糖をカラムに固定化し；
（ｉｉｉ）溶出した多糖の量のクロマトグラムを時間の関数として記録しながら、固定化された多糖を溶出させ；次いで
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られたクロマトグラムを分析することにより多糖試料中の分子量分布を決定する。
【００１４】
もう１つの態様において、本発明は、０．０５ないし１０ＭＤａの範囲の平均分子量を有するアニオン性多糖の試料中の分子量分布を決定するためのアニオン交換クロマトグラフィーの使用を提供する。
【００１５】
かくして、本発明は、アニオン性多糖の試料の分子量分布を決定するために慣用的なアニオン交換クロマトグラフィーを有利に使用できるという驚くべき知見に基づくものである。他の利点のなかでも、本発明は、オリゴ糖の分子量分布を決定するためにすでに用いられているサイズ排除クロマトグラフィーおよびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法と比較して、クロマトグラフィーにより分析できる分子量範囲を上方に拡張する可能性を提供する。本発明は、いずれかの特定のアニオン交換クロマトグラフィーシステムにクリティカルに依存するものではなく、例えば、市販のＨＰＬＣ装置を用いて実行することができる。さらにそのうえ、本発明は、埃または混合物分子凝集体を含まない試料にクリティカルに依存しないので、光散乱法の実際的かつ単純な別法を提供する。
【００１６】
発明の詳細な記述
本発明の方法は、その開始時点において、アニオン性多糖の試料を用いるものであり、該試料は工程（ｉ）で用意される。この試料は品質確認のためにその分子量分布を調べられる市販製品の試料であってもよいが、基礎研究において研究および特徴付けされる試料であってもよい。本発明は、特定の用途または使用分野に限定されない。ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸およびヘパラン硫酸からなる群からアニオン性多糖を選択することができる。特に好ましいアニオン性多糖はヒアルロン酸である。好ましくは、多糖試料は少なくとも０．０５ＭＤａ、より好ましくは少なくとも０．１ＭＤａの平均分子量を有する。本発明の方法を、試料中の個々のポリマー鎖が１０ＭＤａまで、あるいは約５ＭＤａまでであるような非常に高分子のものを含む試料の分析に適用してもよい。分析すべき試料が高純度であることがさらに好ましい。特別には、ある種の蛋白または硫酸化多糖のごとき負に帯電した種のコンタミネーションは最小限であるのが好ましい。かかるコンタミナントが使用アニオン交換材料に強く結合し、かくして分析を妨害することが、この理由である。したがって、試料中の負に帯電した種のコンタミネーションが５％未満、好ましくは１％未満、より好ましくは０．１未満となるような純度を試料が有することが好ましい。
【００１７】
本発明の方法の工程（ｉｉ）において、多糖がカラムに固定化される条件下で多糖試料をアニオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する。本発明は、特定のアニオン交換材料に限定されるものではないが、有利には、例えば、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、ジメチルアミノエチル、ポリエチレンイミン、トリメチルアミノメチル、トリメチルアミノヒドロキシプロピル、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル、第４級化ポリエチレンイミン、トリエチルアミノエチル、トリメチルアミノエチルおよび３−トリメチルアミノ−２−ヒドロキシプロピルからなる群より選択される官能基を有するカラムのごとき市販の強または弱アニオン交換クロマトグラフィーカラムを用いる。これらのうち、第４級アミンを含む官能基、例えば、トリメチルアミノメチル、トリメチルアミノヒドロキシプロピル、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）−アミノエチル、第４級化ポリエチレンイミン、トリエチルアミノエチル、トリメチルアミノエチルおよび３−トリメチルアミノ−２−ヒドロキシプロピルを有する強アニオン交換体が好ましい。多糖がカラムに固定化される条件は、過度の実験を要さずとも当業者により容易に確認されうる。しかしながら、本発明の方法は移動相の高いｐＨ値に依存するものではないが、有利には、中性または弱塩基性のｐＨを有する移動相を用いて実行してもよい。かくして、移動相のｐＨ値はｐＨ４ないしｐＨ１１の範囲、例えばｐＨ６ないしｐＨ９の範囲でありうる。ｐＨ約１２のごとき高すぎるｐＨ値の使用は、そのような高いｐＨにおける多糖のアルカリ加水分解の危険性を生じうる。
【００１８】
本発明の方法の工程（ｉｉｉ）における固定化多糖の溶出は、一般的には、既知のクロマトグラフィー法に従って、溶出塩の溶液の濃度グラジエントを用いて行われる。使用する溶出塩は、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウム、酢酸ナトリウム、過塩素酸リチウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウムおよび硫酸カリウムのごときイオン交換クロマトグラフィー用の標準的な溶出塩、あるいは当業者に知られた他の溶出塩から選択することができる。使用する検出方法により、例えば吸光特性により特定の塩が他の塩よりも好ましいことがある。かくして、紫外光の吸収に基づく検出には、硫酸塩が低い吸光度を有するので好ましい。より一般的には、硫酸塩は比較的イオン強度が高いので有利に用いることもできる。イオン強度が高いということは、溶出に低い塩濃度ですむことを意味する。本発明の方法に使用するのに特に好ましい溶出塩は硫酸ナトリウムである。
【００１９】
溶出中に、時間の関数として溶出多糖の量を示すクロマトグラムを記録する。より短いポリマー鎖、例えば、低い分子量および小さい正味の荷電量を有する鎖は、より長いポリマー鎖よりも低い溶出塩濃度で溶出され、かくして、溶出中の早い時期に検出されるであろう。したがって、試料中の個々の多糖鎖の相対溶出時間は多糖鎖の相対サイズに対応するであろう。溶出された多糖の検出を、いずれの既知検出手段を用いて行ってもよく、適当には、検出手段はクロマトグラフィーカラムの出口に接続される。かかる検出器は当業者によく知られており、経済的理由、アクセス容易性または他の特別な理由により、特定の検出器が好ましいことがある。
【００２０】
工程（ｉｉｉ）で得られたクロマトグラムの工程（ｉｖ）における分析は、多糖試料の分子量分布に関する所望の情報を提供する目的を有する。この情報は、例えば、第１の値未満の分子量を有する試料中のポリマー鎖のパーセンテージ、第１の分子量と第２分子量の間の分子量を有する別のパーセンテージ、第２の分子量と第３の分子量の間の分子量を有するさらに別のパーセンテージ、ならびに第３の分子量よりも高い分子量を有する最後のパーセンテージとして表されてもよい。例えば、問題とする多糖の特定の分子量フラクションの生物学的特性に基づいて該第１、第２および第３の値を選択してもよい。もちろん、かかる試料の細分化を、必要なフラクションの量を用いて、所望の分割の程度に至るまで行ってもよい。
【００２１】
かくして、特定の溶出時間は特定の分子量に対応する。本発明の方法の工程（ｉｉｉ）で得られたクロマトグラムの分析を行って試料の分子量分布を確認するためには、好ましくは、試験試料の分析に用いられる条件下で、各多糖が既知平均分子量を有する１セットの標準多糖試料を分析する。このことは、特定の分子量に対する特定の溶出時間の決定を可能にするであろう。次いで、本発明の方法の工程（ｉｖ）は、好ましくは、工程（ｉｉｉ）で得られたクロマトグラムの１のピークまたは複数のピークを、分子量標準物質に対応する時間において分割することを含む。このアプローチは下記実施例において実行されている。有利には、多糖試料中の分子量分布に関する所望情報を確立するために、得られたクロマトグラムの処理をコンピューターソフトウェアを用いて行う。クロマトグラムのコンピューター処理のためのソフトウェアは市販されており、さらに、ピーク積分およびピーク分割のためのアルゴリズムが当業者に知られている。
【００２２】
その第２の態様において、本発明は、アニオン交換クロマトグラフィーの新規使用に関する。かくして、有利なことに、かかるクロマトグラフィーが０．０５ＭＤａよりも大きい分子量のアニオン性多糖の試料中の分子量分布の分析に使用可能であることが、意外にも見出された。この目的にアニオン交換クロマトグラフィーを用いるためには、標準的な装置またはカラムを特別に修飾する必要はない。サイズ排除クロマトグラフィーよりもむしろアニオン交換クロマトグラフィーを用いることは、分子量が大きすぎて以前にはクロマトグラフィーによる分析が不可能であった多糖の分析を可能にする。
【００２３】
特記しないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の分野の当業者により通常に理解されているのと同じ意味を有する。適当な方法および材料を以下に説明するが、本明細書で説明されるのと同様の方法および材料を本発明の実施および試験に用いることもできる。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、参照により本明細書に一体化される。コンフリクトの場合、定義を包含する本明細書が支配的であろう。さらに、材料、方法、および実施例は説明のためだけのものであり、限定的なものと解されない。
【００２４】
本発明をその実施例を説明することによりさらに説明する。実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【実施例】
【００２５】
実施例１：ヒアルロン酸の分子量分布の決定，０．１−１ＭＤａ
Pharmacia AB, Uppsala, Swedenから得た４種のヒアルロン酸研究室標準試料を、負の対照（水ブランク；図１Ａ）をつけて分析した。
【００２６】
ヒアルロン酸標準試料の濃度および平均分子量を、カルバゾール法（T Bitter and HM Muir, Anal Biochem 4:330-334 (1962)）およびＬＡＬＬＳにより、各々決定した。試料の平均分子量は０．１、０．２５、０．５および１ＭＤａであった。ヒアルロン酸標準試料は高純度（＞９７％）であり、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，２０ｍＭ 硫酸ナトリウム，ｐＨ８．０中１ｍｇ／ｍｌに希釈された。
【００２７】
強アニオン交換クロマトグラフィーカラムＰＬ−ＳＡＸ−４０００（４０００Å，８μｍ，１５０ｘ４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．）およびＰＬ−ＳＡＸプレカラム（両方とも、Polymer Laboratories, Ltd (Church Stretton, UK)から購入した）を装備したＨＰＬＣシステムを用いてヒアルロン酸試料をクロマトグラフィーにかけた。ポリマーカラムの官能基は第４級アミン基である。
【００２８】
オーブンで４５℃に加熱されたカラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム，２０ｍＭ 硫酸ナトリウム，ｐＨ７．０（移動相Ａ）で平衡化させた。１０ｍＭリン酸ナトリウム，２２５ｍＭ硫酸ナトリウム，ｐＨ７．０（移動相Ｂ）を溶出に用いた。１５μｌの各ヒアルロン酸標準試料を流速０．５ｍｌ／分で２回注入した。０から１００％までの移動相Ｂ（０−５０分で）直線グラジエントを用い、次いで、１００％のＢで１０分間イソクラチック溶出、最後に移動相Ａにて１０分平衡化させることにより溶出を行った。平衡化時間の間、溶出開始から６０ないし６９分の時間において流速を１ｍｌ／分に増加させた。２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出を行った。
【００２９】
０．１−１ＭＤａの分子量を有するヒアルロン酸の分子量標準試料は保持時間４９−５４分で溶出された（図１Ｂ−１Ｅ）。一連の実験の終わりに未知試料として分析された０．２５ＭＤａのヒアルロン酸標準試料は保持時間５１．４０分を有し（図４Ａ）、図３Ａ中の式から計算した場合０．２５ＭＤａのピーク分子量を示した。
【００３０】
個々の分子量標準試料に関する保持時間における手動のピーク分割は図４Ａに示すとおりであり、下記の分子量分布が得られた：
＜０．１ＭＤａ：            ２７％
０．１−０．５ＭＤａ：      ６４％
０．５−１ＭＤａ：          ２％
＞１ＭＤａ：                ６％
【００３１】
実施例２：ヒアルロン酸の分子量分布の決定，１−５ＭＤａ
標準曲線用のヒアルロン酸標準試料が１、３、４および５ＭＤａの分子量を有していたこと、ならびに移動相Ａが１０ｍＭリン酸ナトリウム，１７５ｍＭ硫酸ナトリウム，ｐＨ７．０を含んでいたこと以外は、実施例１と同じ装置および方法を用いた。また、負の対照である水ブランクも分析した（図２Ａ）。
【００３２】
ヒアルロン酸の１−５ＭＤａの分子量標準試料は保持時間４３−４５分で溶出された（図２Ｂ−２Ｅ）。一連の実験の終わりに未知試料として分析された４ＭＤａのＨＡ標準試料は保持時間４３．７１分を有し（図４Ｂ）、図３Ｂ中の式から計算した場合４．０ＭＤａのピーク分子量を示した。
【００３３】
個々の分子量標準試料に関する保持時間における手動のピーク分割は図４Ｂに示すとおりであり、下記の分子量分布が得られた：
＜１ＭＤａ：                ５１％
１−３ＭＤａ：              ３％
３−５ＭＤａ：              ２２％
＞５ＭＤａ：                ２４％
【００３４】
適当なソフトウェアプログラム、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーと組み合わせて分子量決定に使用されるタイプのものを僅かに改変することにより、特定の範囲の未知試料中の多糖の分子形態のパーセンテージの詳細を含め、分子量分布曲線を自動的に計算することが可能となる。上記結果は慣用的なＨＰＬＣソフトウェアを用いた手動積分により得られた。他の評価方法、例えば、個々のピークに関して測定された平均分子量を保持時間に対してプロットすることも有用でありうる。ここでは３次多項式曲線適合モデルが標準曲線用に用いられているが、それは最適な適合を与えなかった。しかしながら、約０．２５ＭＤａ（実施例１）ないし４ＭＤａ（実施例２）の実際の試料の決定には、該モデルは満足なものと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１Ａ−１Ｅは、（Ａ）水ブランク；（Ｂ）ヒアルロン酸，０．１ＭＤａ；（Ｃ）ヒアルロン酸，０．２５ＭＤａ；（Ｄ）ヒアルロン酸，０．５ＭＤａ；および（Ｅ）ヒアルロン酸，１ＭＤａのアニオン交換クロマトグラフィーを示すグラフである。溶出は２０−２２５ｍＭ硫酸ナトリウムのグラジエントによった。
【図２】図２Ａ−２Ｅは、（Ａ）水ブランク；（Ｂ）ヒアルロン酸，１ＭＤａ；（Ｃ）ヒアルロン酸，３ＭＤａ；（Ｄ）ヒアルロン酸，４ＭＤａ；および（Ｅ）ヒアルロン酸，５ＭＤａのアニオン交換クロマトグラフィーを示すグラフである。溶出は１７５−２２５ｍＭ硫酸ナトリウムのグラジエントによった。
【図３】図３Ａ−３Ｂは、ヒアルロン酸の分子量に対してプロットした保持時間の標準曲線である。図３Ａは、２０−２２５ｍＭ硫酸ナトリウムのグラジエントにより溶出された０．１−１ＭＤａのヒアルロン酸を示す。図３Ｂは、１７５−２２５ｍＭ硫酸ナトリウムのグラジエントにより溶出された１−５ＭＤａのヒアルロン酸を示す。３次多項式曲線適合モデル（third degree polynominal curve fit model）を示したように用いた。
【図４】図４Ａ−４Ｂは、未知試料として分析されたヒアルロン酸標準物質を示す。それぞれの分子量標準物質に対する保持時間において積分ピークを手動で分割することにより、クロマトグラムに示したような選択された範囲の分子量分布を得た。図４Ａは、２０−２２５ｍＭ硫酸ナトリウムのグラジエントにより溶出されたヒアルロン酸，０．２５ＭＤａを示す。図４Ｂは、１７５−２２５ｍＭ硫酸ナトリウムのグラジエントにより溶出されたヒアルロン酸，４ＭＤａを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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2005517955.tif 000016