(57)【要約】本発明は、特にヒト血球前駆体細胞とその他の血液細胞誘導体においてヒトの遺伝子治療用の形質導入遺伝子を発現させる上で安全で、効率が高く、非常に強力なHIV誘導レチノベクタを提供する。このレンチウイルス・ベクターは細胞タイプ及び組織に固有な発現を促進する作用を有するプロモータを含んでいる。さらに、アクチベータ、エンハンサ、そしてレプレッサによる制御に敏感に反応するプロモータが提供される。これらのベクターは生物学的安全性のために自己不活性化構造を有している。これらのベクターはウッドチャック肝炎ウイルス後転写性規制要素などの追加的転写増強要素を含むこともでき、その場合でも特異性やプロモータによる制御に影響は及ばない。これらのベクターは従って遺伝的、及び後天性リンパ血液不全などの遺伝子治療、特に血液に関係した癌などの癌治療、そして、ヒトHSCのレンチベクタ媒介修飾を介しての造血の研究などのための有効な手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクターにおいて、
(a) レンチウイルス性gag、pol及びrev遺伝子と、
(b) ヒトの細胞内の形質導入遺伝子の検出可能な転写を促進する活性を有するプロモータの制御下に置かれる形質導入遺伝子を含む発現カセットと、そして
(c) 上記発現カセットの上流に配置される中央ポリプリン・トラクト（cPPT）と
を含有している遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクター。
【請求項２】
cPPTが配列識別番号１のヌクレオチド配列を含んでいることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３】
ベクターが細胞の約20％から約80％に形質導入することができる請求項１記載のベクター。
【請求項４】
ベクターが細胞の約40％から約80％に形質導入することができる請求項１記載のベクター。
【請求項５】
ベクターが細胞の約60％から約80％に形質導入することができる請求項１記載のベクター。
【請求項６】
さらに、cPPTに近接して配置された複数の独特なクローニング・サイトを含んでいることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項７】
複数の独特なクローニング・サイトがcPPTの上流に配置されていることを特徴とする請求項２記載のベクター。
【請求項８】
複数の独特なクローニング・サイトがcPPTの下流に配置されていることを特徴とする請求項２記載のベクター。
【請求項９】
複数の独特なクローニング・サイトがcPPTの上流と下流の両方に配置されていることを特徴とする請求項２記載のベクター。
【請求項１０】
gag、pol及びrev遺伝子がHIV gag、pol及びrev遺伝子であることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項１１】
gag、pol及びrev遺伝子がHIV-1 gag、pol及びrev遺伝子であることを特徴とする請求項10記載のベクター。
【請求項１２】
さらに、自己不活性化ベクター（SIN）と定義されることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項１３】
LTR領域が3' LTRのU3領域の欠失によって転写的にほぼ不活性化されていることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項１４】
欠失がU3-R領域境界に対して位置-418から位置-18のヌクレオチドの欠失であることを特徴とする請求項13記載のベクター。
【請求項１５】
さらに遺伝子組み換えを通じて野生種レンチウイルスの再構成ができないと定義されていることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項１６】
ベクターがgag、pol及びrev遺伝子以外の機能性レンチウイルス遺伝子を発現しないことを特徴とする請求項15記載のベクター。
【請求項１７】
プロモータが、gp91-フォックス・プロモータ、gp47-フォックス・プロモータ、CD11bプロモータ、EF1-αプロモータ、PGKプロモータ、β-グロビン・プロモータ、MHCクラスIIプロモータ、クロッティング・ファクターIXプロモータ、インシュリン・プロモータ、PDXIプロモータ、CD4プロモータ、そしてCD2 プロモータであることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項１８】
プロモータがgp91-フォックス・プロモータであることを特徴とする請求項17記載のベクター。
【請求項１９】
プロモータがgp47-フォックス・プロモータであることを特徴とする請求項17記載のベクター。
【請求項２０】
プロモータがCD11bプロモータであることを特徴とする請求項17記載のベクター。
【請求項２１】
プロモータがEF1-αプロモータであることを特徴とする請求項17記載のベクター。
【請求項２２】
さらに、少なくとも１つのエンハンサ配列を含んでいることを特徴とする請求項17記載のベクター。
【請求項２３】
少なくとも１つのエンハンサ配列が配列識別番号２、配列識別番号３、配列識別番号４、配列識別番号５、配列識別番号６、及び配列識別番号７の群から選択されることを特徴とする請求項22記載のベクター。
【請求項２４】
少なくとも１つのエンハンサ配列がｃPPTに隣接して配置されていることを特徴とする請求項22記載のベクター。
【請求項２５】
少なくとも１つのエンハンサ配列がｃPPTの上流に配置されていることを特徴とする請求項24記載のベクター。
【請求項２６】
少なくとも１つのエンハンサ配列がｃPPTの下流に配置されていることを特徴とする請求項24記載のベクター。
【請求項２７】
エンハンサ配列がｃPPTの上流と下流の両方に配置されていることを特徴とする請求項24記載のベクター。
【請求項２８】
エンハンサ配列が配列識別番号２、配列識別番号３、配列識別番号４、配列識別番号５、配列識別番号６、及び配列識別番号７で構成される群から選択されることを特徴とする請求項27記載のベクター。
【請求項２９】
プロモータが約10から約200の範囲の信号対ノイズ比で形質導入遺伝子の発現を促進することができることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３０】
プロモータが約40から約200の範囲の信号対ノイズ比で形質導入遺伝子の発現を促進することができることを特徴とする請求項29記載のベクター。
【請求項３１】
プロモータが約150から約200の範囲の信号対ノイズ比で形質導入遺伝子の発現を促進することができることを特徴とする請求項30記載のベクター。
【請求項３２】
プロモータが転写アクチベータに反応して形質導入遺伝子の発現を促進することができることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３３】
転写アクチベータがINF-ガンマであることを特徴とする請求項32記載のベクター。
【請求項３４】
プロモータが特定の細胞タイプで形質導入遺伝子の発現を促進することができることを特徴とする請求項32記載のベクター。
【請求項３５】
プロモータが特定の細胞タイプで形質導入遺伝子の発現を促進することができることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項３６】
特定の細胞タイプが成熟した血液細胞、好中球、単球、顆粒球、ニューロン、肺細胞、筋肉細胞、肝細胞、膵臓細胞、内皮細胞、心臓細胞、皮膚細胞、骨髄間質細胞、及び眼球細胞の群から選択されることを特徴とする請求項35記載のベクター。
【請求項３７】
細胞タイプが成熟した血液細胞であることを特徴とする請求項35記載のベクター。
【請求項３８】
細胞タイプが好中球であることを特徴とする請求項35記載のベクター。
【請求項３９】
細胞タイプが単球又は顆粒球であることを特徴とする請求項35記載のベクター。
【請求項４０】
細胞タイプがニューロンであることを特徴とする請求項35記載のベクター。
【請求項４１】
形質導入遺伝子がgp91-フォックス、gp47-フォックス、エリスロポエチン（赤血球生成促進因子）、インターロイキン、コロニー刺激性因子、インテグリンαIIbβ、多剤耐性遺伝子、アンチウイルス遺伝子、血液凝固因子VIIIをコードする遺伝子、血液凝固因子IXをコードする遺伝子、T細胞抗原レセプタ、B細胞抗原レセプタ、単鎖抗体（ScFv）、TNF、γインターフェロン、CTL A4 、B7、メラナ、MAGE、マーカー遺伝子、発光酵素あるいはGFPであることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項４２】
形質導入遺伝子がgp91-フォックスであることを特徴とする請求項41記載のベクター。
【請求項４３】
形質導入遺伝子がgp47-フォックスであることを特徴とする請求項41記載のベクター。
【請求項４４】
形質導入遺伝子がマーカー遺伝子をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項41記載のベクター。
【請求項４５】
形質導入遺伝子がGFPをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項41記載のベクター。
【請求項４６】
さらに、形質導入遺伝子の発現を促進するように配置された転写後規制配列を含んでいることを特徴とする請求項１記載のベクター。
【請求項４７】
転写後規制配列が発現カセット内に配置されたイントロンであることを特徴とする請求項46記載のベクター。
【請求項４８】
イントロンがベクター・ゲノム・トランスクリプトとは反対の向きに配置されていることを特徴とする請求項47記載のベクター。
【請求項４９】
転写後規制配列が転写後規制要素であることを特徴とする請求項46記載のベクター。
【請求項５０】
転写後規制要素がウッドチャック肝炎ウイルス転写後規制要素（WPRE）であることを特徴とする請求項49記載のベクター。
【請求項５１】
転写後規制要素がB型肝炎ウイルス転写後規制要素(HPRE)であることを特徴とする請求項50記載のベクター。
【請求項５２】
請求項１記載のベクターで形質導入されたホスト細胞。
【請求項５３】
細胞がウイルス生産細胞であることを特徴とする請求項52記載の形質導入ホスト細胞。
【請求項５４】
生産細胞が293T細胞であることを特徴とする請求項53記載の形質導入ホスト細胞。
【請求項５５】
細胞がヒトの血球前駆細胞であることを特徴する請求項54記載のホスト細胞。
【請求項５６】
ヒトの血球前駆細胞がCD34+細胞であることを特徴とする請求項55記載の形質導入ホスト細胞。
【請求項５７】
自己不活性化遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクターにおいて、
(a)  レンチウイルスgag、pol、及びrev遺伝子と、
(b)  プロモータが転写アクチベータと接触すると活性化されて、ヒト細胞内で形質導入遺伝子の検出可能な転写を促進するプロモータの制御下に配置された形質導入遺伝子を含む発現カセットと、
(c)  上記発現カセットの上流に配置された中央ポリプリン・トラクト(cPPT)と、そして
(d)  上記形質導入遺伝子の発現を促進するように配置された転写後規制要素
とを含有している自己不活性化遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクター。
【請求項５８】
自己不活性化遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクターにおいて、
(a)  レンチウイルス性gag、pol、及びrev遺伝子と、
(b)  特定のヒト細胞タイプの細胞内で形質導入遺伝子の検出可能な転写を促進する活性を有するプロモータの制御下に配置された形質導入遺伝子を含む発現カセットと、
(c)  上記発現カセットの上流に位置する中央ポリプリン・トラクト(cPPT)と、そして
(d)  上記形質導入遺伝子の発現を促進するように配置された転写後規制要素
とを含有していることを特徴とする自己不活性化遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクター。
【請求項５９】
自己不活性化遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクターにおいて、
(a)  レンチウイルス性gag、pol、及びrev遺伝子と、
(b)  下記(i)及び(ii)であるプロモータの制御下に配置された形質導入遺伝子を含む発現カセットと、
(i)  プロモータが特定のヒト細胞タイプの細胞内で形質導入遺伝子の検出可能な転写を促進する活性を有し、
(ii)  プロモータが、そのプロモータと転写アクチベータが接触すると、特定のヒト細胞タイプの細胞内で形質導入遺伝子の検出可能な転写を促進する活性を有している
(c)  上記発現カセットの上流に配置された中央ポリプリン・トラクト(cPPT)と、そして
(d)  上記形質導入遺伝子の発現を促進するように配置された転写後規制要素と
を含有していることを特徴とする自己不活性化遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクター。
【請求項６０】
自己不活性化遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクターにおいて、
(a)  レンチウイルス性gag、pol、及びrev遺伝子と、
(b)  下記(i)及び(ii)であるプロモータの制御下に配置された形質導入遺伝子を含む発現カセットと、
(i)  プロモータが特定のヒト細胞タイプの細胞内で形質導入遺伝子の検出可能な転写を促進する活性を有し、
(ii)  プロモータが、そのプロモータと転写アクチベータが接触すると、特定のヒト細胞タイプの細胞内で形質導入遺伝子の検出可能な転写を促進する活性を有している
(c)  上記発現カセットの上流に配置された中央ポリプリン・トラクト(cPPT)と、
(d)  上記形質導入遺伝子の発現を促進するように配置された転写後規制要素と、そして
(e)  少なくとも１つのエンハンサ要素と
を含有していることを特徴とする自己不活性化遺伝子組み換え体レンチウイルス性ベクター。
【請求項６１】
造血幹細胞を含むヒト細胞の群を請求項１のベクターと、前記群内のヒト造血血球前駆体細胞の前記ベクターによる形質導入を起こさせる条件下で接触させるステップを含む、ヒト造血幹細胞を形質導入するための方法。
【請求項６２】
ヒト造血幹細胞群がCD34+細胞を含んでいることを特徴とする請求項61記載の方法。
【請求項６３】
細胞群が幹細胞の多分化能をほとんど失わずに細胞増殖を刺激するように処理されることを特徴とする請求項61記載の方法。
【請求項６４】
幹細胞がin vivoで形質導入されることを特徴とする請求項61記載の方法。
【請求項６５】
幹細胞がin vitroで形質導入されることを特徴とする請求項61記載の方法。
【請求項６６】
形質導入された幹細胞がヒト個体に注入されることを特徴とする請求項65記載の方法。
【請求項６７】
請求項61記載のヒト細胞を形質導入するステップと、望ましい細胞タイプの成熟化をもたらすステップとを含む、一定の組み合わせの細胞タイプ内で形質導入遺伝子を発現させる方法。
【請求項６８】
さらに、プロモータを転写アクチベータに接触させることによって形質導入遺伝子の発現を刺激するステップを含む請求項67記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、参照によって本明細書にその本文全体が組み込まれる、2001年10月2日に出願された米国仮出願番号第60/326,593の利点を特許請求するものである。
【０００２】
本発明は、望ましい形質導入遺伝子の標的細胞への遺伝子送達及び高レベル発現における改良されたレンチウイルス性ベクター及びそれらの利用に関するものであり、具体的には、レンチウイルス性ベクター修飾ヒト造血幹細胞（hHSC）に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ヒト造血幹細胞（hHSC）の形質導入を介した遺伝子治療は、数多くの遺伝性及び後天性リンパ・血液疾患の治療にとってきわめて有望な方法である。しかし、既存の遺伝子送達システムでhHSCを長期に再増殖させる安定的な遺伝子操作を、治療上の実態に則した効率で達成することは不可能であった。例えば、Moloneyマウス白血病ウイルス(MLV)に由来する腫瘍レトロウイルス・ベクターは、それらが自身の積み荷を標的細胞の染色体に組み込むのできわめて魅力的であるが、増殖誘導因子で先に処理されていないhHSCを形質導入することはできない（Kohn et al., 1991; Mazurier et al., 1998）。実際、MLV前組込み複合体の核の運搬には、有糸分裂で発生する核膜の破壊が必要である（Roe et al., 1993; Lewis and Emerman, 1994）。残念ながらhHSCは、骨髄（BM）、臍帯血（UCB）から入手できても、あるいは末梢循環で回収されても、継続的な刺激と増殖の後には殆ど分裂せず、多能性を失う（Bhatia et al., 1997; Dao et al., 1997; Dorrell et al., 2000）。しかし、最近の報告で、多能性細胞、及び、SCID再増殖細胞(SRC)とも称される、非肥満糖尿病／重症複合型免疫不全（NOD/SCID）における長期移植が可能な細胞のかなりの大きさの移植片を、特定の刺激条件を用いて維持、形質転換及び拡大すらすることが可能なことが示された（Dorrell et al., 2000; Dao et al., 1998; Piacibello et al., 1999; Ueda et al., 2000）。
【０００４】
レンチウイルスは、核孔を通じたその活発な搬入を可能にさせる前組込み複合体の核親和性特性によって非分裂細胞に影響を及ぼすことができるレトロウイルスの下位群である。同様に、１型ヒト免疫不全ウイルス・タイプ（HIV-1）に由来するレンチウイルス性ベクターは、in vitroとin vivoの両方で非有糸分裂細胞への形質導入遺伝子の効果的な送達、組み込み及び長期発現を調節する（Naldini et al., 1996a; Naldini et al., 1996b; Blomer et al., 1997）。特に、HIV系ベクターは、ヒトCD34＋血球細胞をサイトカイン刺激の不在下で効果的に形質転換することが可能である（Akkina et al., 1996; Sutton et al., 1998; Uchida et al., 1998; Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999）。これらの細胞はNOD/SCIDマウスで長期移植が可能である（Miyoshi et al., 1999）。これらの一次移植受容マウスは、形質転換された細胞を有する二次マウスを再増殖することが可能で、きわめて原始的な血球前駆体、最も可能性が高いのは真正幹細胞のレンチウイルス媒介遺伝子修飾を確認するものである。その他の現在利用可能な遺伝子送達システムのいずれも、造血の研究のため、及びHSCの遺伝子修飾を介した遺伝性及び後天性リンパ・血液疾患の遺伝子治療のための従来未探求である基礎原理を提供していない。
【０００５】
しかし、この重要な点が示したことは、生物学的研究における安全性の必要条件を満たさなかった（Akkina et al., 1996; Sutton et al., 1998; Uchida et al., 1998）、あるいはきわめて低い形質導入遺伝子発現レベルしか誘発しなかった（Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999; An et al., 2000）といういずれかの理由で、治療上の応用には不適当なレンチウイルス性ベクターが初期に産生されたことであった。従って、血球細胞、特に血球前駆細胞を効果的に形質導入することが可能であり、そして、望まれる形質導入遺伝子を高レベルで発現することが可能である形質導入ベクターとして用いられる、改良されたレンチウイルスを開発する大きな必要性が存在する。
【０００６】
最良の幹細胞遺伝子治療法は、治療用遺伝子の特定の成熟血液細胞系統への制限発現において、HSCの効果的な形質導入をもたらし、幹細胞の柔軟性を考慮すべきである。第３世代のレンチウイルス性ベクターは、非循環的ヒトHSCへの遺伝子送達のための最も最適化された手段である。さらに、自己不活性化ベクター（SIN）は、上流LTRからの干渉なしに組織特異的プロモータの利用を提供する。
【発明の開示】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、生物学的研究における安全性の必要条件を満たし、かつ、望ましいように刺激され、組織または幹細胞系統に特異的な方法で形質導入遺伝子の高レベルな発現を誘発することができる改良されたレンチウイルス性ベクターの開発に関するものである。さらに、本発明は、プロモータまたはエンハンサを転写制御因子に接触させて生じる転写活性または抑制を介して形質導入される細胞内で形質導入遺伝子の発現の制御を提供する。
【０００８】
従って、本発明では、ヒト血球前駆細胞（HPC）の形質導入のために、及び特定の分化血液系統における、または特定の転写因子の制御下にある形質導入遺伝子の発現のために、特に好適と考えられる遺伝子導入媒体について述べられる。これらのベクターは、造血幹細胞の遺伝子操作のためのレンチウイルス性ベクターの一層の利用を促進し、研究と治療上の応用の両方に特に有用であるべきである。検討される細胞タイプのいくつかの例には、未成熟血液細胞、成熟血液細胞、好中球、単球／マクロファージ及び顆粒球などがある。
【０００９】
しかしながら、熟練した当業者であれば、本発明は血球細胞の形質導入に限定されるものではなく、本発明のレンチウイルス性ベクターをその他の細胞タイプでの形質導入遺伝子の細胞特異的発現にも用いることができることを理解するであろう。検討されるその他の細胞タイプのいくつかの例には、ニューロン、肺細胞、筋肉細胞、肝細胞、膵臓細胞、内皮細胞、心臓細胞、皮膚細胞、骨髄間質細胞及び眼球細胞などがある。さらに、膵管細胞、神経前駆体及び中胚葉幹細胞のような幹細胞及び前駆細胞も検討される。
【００１０】
従って、本発明は一般的及び全体的意味において、ヒト血球前駆細胞または幹細胞（hHSC）のトランスフェクト及び形質導入を可能にするように設計される改良されたベクターに関するものであり、そうした細胞内で望まれる形質導入遺伝子の高レベルな発現を提供する。さらに、本発明は、発現がHSCの特異的子孫系統において、または転写アクチベータに応答して、発現を達成するように制御されているという点で、これらの望まれる形質導入遺伝子の制限発現を提供する。本発明によるベクターは、これらのベクターがヒトへの適用に安全性を付与する特定の『自己不活性化』設計特性を含んでいると言う点で、自己不活性なレンチウイルス性ベクターであってもよい。この自己不活性化またはSIN設計特性は、上記ベクターのLTR修飾を含むことができ、その結果、複製コンピテント・レンチウイルス・ゲノムの再構成が回避される。そのようなSIN設計の特に好ましい実施の形態には、3' LTR U3領域でのヌクレオチドの欠失などがある。
【００１１】
本発明によるレンチ・ベクターは、初めて、遺伝子組み換えhHSCの分化された子孫における望まれる形質導入遺伝子の制御され、細胞タイプに特異的で、そして、高レベルな発現を達成する効果的な手段を提供している。ヒトHSCは、非刺激状態では従来のベクター系による形質導入に比較的抵抗性があるため形質導入されることが困難であった。本発明によるレンチウイルス性ベクターは、核孔を通じた活性な搬入を可能にさせる前組込み複合体の核親和性特性によって非分裂細胞に影響を及ぼす能力を有する。さらに、本発明による好ましいレンチウイルス性ベクターは、in vitroとin vivoの両方で、サイトカイン刺激の不在下でさえも、形質導入遺伝子の非有糸分裂細胞への効果的な送達、組み込み、及び、適切な期間または長期間の発現を調節することが可能である。本発明のより好ましいレンチ・ベクターによって形質導入される幹細胞は、例えば、NOD/SCIDマウスでの長期移植が可能である。しかし、最も顕著には、本発明によるより好ましいレンチ・ベクターは、生物学的研究における安全性の必要条件を満たすと共に、ヒト前駆細胞及び成熟分化細胞タイプの特定の系統での形質導入遺伝子の制御された、しかも高レベルの発現を可能にするきわめて望ましい特徴を有している。
【００１２】
従って、本発明によるウイルス・ベクターは、利用可能な産生細胞株を用いて妥当な量のベクター産生を可能にする、少なくともレンチウイルスgag、pol及びrev遺伝子、またはウイルス産生に必要な遺伝子を含んでいる組み換え体ベクターとして一般に述べることができる。重要なヒトの生物学的研究における安全性の必要条件を満たすため、本発明によるより好ましいベクターには、vpr、vif、vpu、nef、tatのようなその他の活性を有するレンチウイルス性ベクターは含まない。これらの遺伝子は、除去されるか、そうでなければ不活性化されることができる。ベクター内に存在する活性なレンチウイルス性遺伝子は、前述のgag、pol及びrev遺伝子のみであることが望ましい。
【００１３】
本発明によるレンチ・ベクター産生に用いられるレンチウイルス性遺伝子及びバックボーン（すなわち、長い末端反復またはLTR）の最も好ましい組み合わせは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）由来、より具体的にはHIV-1由来のものである。従って、gag、pol及びrev遺伝子は、好ましくは、HIV遺伝子、より好ましくは、HIV-1遺伝子である。しかし、gag、pol及びrev遺伝子、及びその他のレンチウイルスからのLTR領域は、HIV-2、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルスなどの遺伝子及びLTRを含め、本発明による特定の応用に用いることができる。そうしたコンストラクトは、例えば、ヒト由来でない特定の細胞を修飾したい場合に有用であろう。しかし、HIV系ベクター・バックボーン（すなわち、HIV LTR及びHIV gag、pol及びrev遺伝子）は、HIV系コンストラクトがヒト血球前駆細胞の形質導入で最も効果的であるという点で、本発明の大部分の態様に関して一般に好ましい。
【００１４】
本発明によるウイルス・ベクターは、ヒト細胞内で形質導入遺伝子の検出可能な転写を促進する活性を有するプロモータの制御下に配置された形質導入遺伝子で構成される発現カセットも含んでいる。好ましい実施の形態で、上記プロモータは、ヒト血球前駆細胞内の形質導入遺伝子の転写促進において活性を有する。より好ましい実施の形態は、特定の細胞タイプまたは前駆細胞の子孫系統において転写を促進する活性を有するプロモータを含んでいる。さらにより好ましい実施の形態は、転写制御因子またはアクチベータ及びリプレッサによる活性化または抑制のいずれかを通じて制御されるプロモータを含んでいる。
【００１５】
本発明に関して好ましくは用いることができるプロモータの例には、gp91-phox、gp47-phox、CD11b、EF1-α、PGK、ベータ・グロビン・プロモータ、MHCクラスII、クロッティング・ファクターIX、インシュリン・プロモータ、PDXIプロモータ、CD11、CD4及びCD2 プロモータなどがある。これらのうちgp91-phoxプロモータが特に好ましい。gp91-phoxプロモータは、gp91-phoxプロモータが主に単球及び顆粒球での形質導入遺伝子の発現を促進する点で、そして、その活性は上記プロモータをアクチベータ、特にインターフェロン・ガンマ（INF-ガンマ）と接触させることによって調節することができる点で、特定の望まれる細胞タイプに制限される制御可能な発現を提供するプロモータの１つの例である。しかし、いずれにしても、本発明の実施は、そのプロモータが、標的にされるか、または転写調節に応答性である前駆体、血球またはその他の細胞で活性を有する限り、前述のプロモータに限定されるものではない。
【００１６】
特定のプロモータが有用であるかどうかを判定するため、選択されたプロモータがin vitroで選択された前駆細胞内のコンストラクトでテストされ、そして、そのプロモータが検出可能な信号対ノイズ比で形質導入遺伝子の発現を促進することができるならば、それは本発明に従って一般に有用である。望ましい信号対ノイズ比は約10から約200の範囲のものであり、より望ましい信号対ノイズ比は約40から約200の範囲のものであり、そして、さらにより望ましい信号対ノイズ比は約150から約200の範囲のものである。そのようなプロモータをテストする1つの手段は、下により詳しく述べられるように、緑色蛍光蛋白質（GFP）のような形質導入遺伝子を生成する信号の利用によるものである。
【００１７】
さらに、本発明は、ベクター内の中央ポリプリン・トラクト（cPPT）の封入を通じて形質導入の効率を高める。形質導入の効率は20％、30％、40％、50％、60％、70％、または80％以内の形質導入である。好ましい実施の形態で、上記cPPTは配列のプロモータの上流に配置される。cPPTの１つの例は、配列識別番号１によって記述されるヌクレオチド配列である。
【００１８】
本発明の別の好ましい態様には、複数の独特なクローニング・サイトが含まれる。独特なクローニング・サイトとは、ベクター配列内で独特な制限酵素認識配列のサイトである。クラスター形成されたいくつかのそうしたサイトは、複数の独特なクローニング・サイトを提供する。これらのサイトは、ポリヌクレオチドのベクター内への、またはベクター外への操作に好都合ないずれの位置にでも配置することができるが、好ましくはcPPTとプロモータの間、またはcPPTの上流に挿入される。例えば、これらの複数の独特なクローニング・サイトは、本発明の実施において、さらに有用で有益なベクター配列要素への導入を容易にする。
【００１９】
上述のプロモータは、転写に必要な追加的要素を含むことができ、従って、転写カセットの一部となる。転写カセットは、形質導入遺伝子の強固な、または組織制限的な発現を確実にするために、エンハンサ及び／又は遺伝子座調節領域と結合される１つ以上のプロモータ要素で構成されるものとして定義される。１つ以上のエンハンサが、形質導入遺伝子の発現を調節する上で最も活性のあるベクターのどこにでも配置されることが可能である。標的分化細胞系統で高レベルの形質導入遺伝子発現を達成するために、エンハンサが標的分化系統に特異的であってもよい。系統特異的エンハンサにはHSサイトなどがある。HSサイトは、ベータ・グロブリン、CD2及びgp91が知られているが、別のHSまたはHSタイプ・サイトも確認されている。例えば、赤芽球に対するGATA-1エンハンサである。ヒト・ゲノム配列の利用により、本発明の一部として検討されるそうした要素の特定が大いに促進される。
【００２０】
エンハンサ及びインシュレータ要素の特に好ましい１つの群は、遺伝子座調節領域（LCR）内に位置するものであり、DNA分解酵素高感受性サイトとして特定することができる。これらHSサイトの協調したエンハンサ活性は、クロマチン・ドメイン開始活性を引き起こし、その結果クロマチンでの転写因子の接近可能性を促進し、エンハンサ結合因子とプロモータ結合因子の間の蛋白質間相互作用を刺激し、そして、領域境界を決めるために必要であると考えられている。シスに存在するプロモータ−遺伝子カセットに対するHSサイトは、高レベルで、組み込みサイトに依存しない発現を引き起こす。これらの要素は、形質導入遺伝子カセットの上流または下流のいずれかに、単独でまたは複数で配置されることが可能である。本発明による最も好ましい実施の形態で、上記HS要素はcPPTに近接し、その上流と下流の両方に配置され、全体としてプロモータの上流にある。従って、これらのHSサイトは、上に述べられた複数の独特なクローニング・サイトの位置で導入される。近接とは、対象要素、例えばcPPT要素が、基準要素すなわちプロモータ要素の境界からベクター配列を読み取る場合に、最初に見いだされる機能的に重要な要素である。
【００２１】
特定の応用のため、例えば、形質導入のための標的細胞内で穏やかな活性しか持たないプロモータの場合、その形質導入遺伝子の発現を促進するよう配置された転写後調節配列の利用が望まれる。転写後調節配列の1つのタイプは、遺伝子発現を刺激するため作用することができる発現カセット内に配置されたイントロンである。しかし、そのように配置されたイントロンは、レンチウイルスのRNA転写を正常な細胞スプライシングまたはプロセシング・メカニズムにさらしてしまう場合がある。従って、特定の実施の形態で、イントロンを含んでいる形質導入遺伝子をベクターのゲノム転写の方向とは反対方向に配置することが望ましい。
【００２２】
形質導入遺伝子の発現を高めるより好ましい方法は、単純ヘルペス・ウイルスの転写後プロセシング要素、Ｂ型肝炎ウイルス（HPRE）の転写後調節要素、または、HPREには見られない付加的なシス活性要素を含んでいるウッドチャック肝炎ウイルス（WPRE）の転写後調節要素のようなスプライシング事象に依存しない転写後調節要素の利用を通じたものである。上記調節要素は、形質導入遺伝子のRNA転写内に、しかし、形質導入遺伝子翻訳ユニットの終止コドンの外に含まれるようベクター内に配置される。そうした調節要素は穏やかな作用のプロモータの状況下で特に好ましいが、きわめて高効率なプロモータの場合には禁忌とすることが可能である。
【００２３】
本発明によるレンチ・ベクターにおいて、野生型LTRに対するプロモータ活性を減少させたLTR領域を使用することが特に望ましく、それは、そうしたコンストラクトが『自己不活性化』（SIN）の生物学的安全特性を提供するからである。自己不活性化ベクターとは、形質導入された細胞内の全長ベクターRNAの産生が大きく低減、または完全に破壊されたものである。この特性は、複製コンピテント遺伝子組み換え体（RCR）が出現する危険を最小限に抑える。さらに、それによって、ベクター組み込みサイトに近接して配置される細胞コード配列が異常発現する危険が低減される。また、SINの設計により、形質導入遺伝子の発現を促進するLTRとプロモータの間の干渉の可能性が減少する。従って、SINの設計は、内部プロモータの最大の可能性を引き出すために特に適している。
【００２４】
自己不活性化は、ベクターDNA、すなわちベクターRNAを産生するために用いられるDNAの3' LTRのU3領域における欠失の導入を通じて達成されることが好ましい。従って、逆転写の間に、この欠失はプロウイルスDNAの5' LTRへ転送される。LTRの転写活性を大きく低減、または完全に破壊し、それによって、形質導入された細胞内の全長ベクターRNAの産生を大きく低減、または破壊するため、十分にU3配列を除去することが望ましい。しかし、U3、R及びU5に展開する機能である、ウイルスRNAのポリアデニル化に関与するLTRのそれらの要素を保持することが一般に望ましい。従って、ポリアデニル化決定基を使わずにおきながら、LTRからの転写的に重要なモチーフを可能な限り多く除去することが望ましい。HIV系レンチ・ベクターの場合、そうしたベクターは、ベクター力価の大幅な減少なしにLTR TATAボックスの除去（例えば、-418から-18の欠失）などの重要なU3欠失を許容することがわかっている。これらの欠失は、LTRの転写能力が約90％以下に減少するという点で、LTR領域を実質的に転写的に不活性化する。好ましい実施の形態で、LTR転写は約95％から99％の範囲に減らされる。従って、LTRは約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％から約99％の範囲で転写的に不活性化することができる。
【００２５】
本発明によるレンチ・ベクターは、その適用に応じて、いずれの望まれる形質導入遺伝子を送達するために用いられてもよい。血球前駆細胞への送達の場合、例えば、グロビン遺伝子；エリスロポエチン（EPO）、インターロイキン（インターロイキン１（IL-1）、インターロイキン２（IL-2）、インターロイキン３（IL-3）、インターロイキン６（IL-6）、インターロイキン１２（IL-12）など）及びコロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子または幹細胞コロニー刺激因子など）などの血球成長因子；血小板特異的インテグリンαIIbβ；多剤耐性遺伝子、慢性肉芽腫症（CGD）の患者において不完全であるgp91-phox又はgp47遺伝子；ヒト免疫不全ウイルスのような病原体への感染に対して細胞に抵抗性を付与する抗ウイルス遺伝子；白血病患者において変異している血液凝固因子VIIIまたはIXをコードする遺伝子；Ｔ細胞抗原レセプタのようなＴ細胞媒介免疫応答に関与するリガンド；細胞抗原レセプタ及び、Ｔ細胞及びＢ細胞抗原レセプタのみの組み合わせまたはScFv、腫瘍壊死因子（TNF）、IL-2、IL-12、ガンマ・インターフェロン、CTLA4、B7などの単鎖抗体と組み合わせたＴ細胞及びＢ細胞抗原レセプタ、Melana、MAGE遺伝子（MAGE-1、MAGE-3など）、P198、P1A、gp100などの腫瘍細胞で発現する遺伝子などの細胞に望ましい機能を付与する形質導入遺伝子が通常選択される。
【００２６】
１つの好ましい実施の形態で、治療に導入される形質導入遺伝子はgp91-phox遺伝子である（Dinauer, et al. 1987）。別の好ましい実施の形態で、その形質導入遺伝子は、CGDに対する治療に導入されるgp91-phox遺伝子プロモータと操作可能に結合されるgp91-phox遺伝子である。最も好ましい実施の形態で、そのgp91-phox遺伝子プロモータは、gp91-phox遺伝子の単球及び顆粒球発現を提供し、さらに、アクチベータINFガンマの活性を通じてgp91-phox遺伝子発現の調節を提供する。別の好ましい実施の形態で、転写後調節要素WPREは、ベクター内に配置され、gp91-phox遺伝子の発現を強化する。同様な好ましい実施の形態で、治療に導入される形質導入遺伝子はgp47-phox遺伝子である。
【００２７】
本発明の形質導入遺伝子の主な応用は、数多くの起こり得る理由に基づいて、望まれる形質導入遺伝子を血球細胞に送達することである。これには、当然のことながらそれだけに限られるものではないが、AIDSなどの感染症、遺伝子疾患、ガンなどの化学療法または免疫抑制療法の結果として引き起こされることがある骨髄抑制療法及び好中球減少症の治療などが含まれる。
【００２８】
検討される血球細胞の典型的な遺伝子疾患には、鎌状赤血球貧血、サラセミア（ベータ・サラセミアを含む）、異常ヘモグロビン症、グランツマン血小板無力症、リソソーム蓄積症（ファブリー病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病及びウィスコット・アルドリッチ症候群）、重症複合型免疫不全症候群（SCID）、白血球接着不全（LAD）、及び、例えば、血液凝固因子VIII及び／又はIXのような分泌蛋白質の全身的産生の不足に起因する疾患などである。そのような場合、グロビン遺伝子（ベータ・グロビンを含む）；アルファ・ガラクトシダーゼＡ；グルコセレブロシダーゼ；スフィンゴミエリン・ホスホジエステラーゼ−１；サイトカイン・レセプタ；CD18インテグリン・サブユニット；エリスロポエチン（EPO）、インターロイキン（特にインターロイキン１（IL-1）、インターロイキン２（IL-2）、インターロイキン３（IL-3）、インターロイキン６（IL-6）、インターロイキン１２（IL-12）など）及びコロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子または幹細胞コロニー刺激因子など）などの血球成長因子；血小板特異的インテグリンαIIbβ；多剤耐性遺伝子、gp91-phox又はgp47-phox遺伝子；ヒト免疫不全ウイルスのような病原体への感染に対して細胞に抵抗性を付与する抗ウイルス遺伝子；白血病患者において変異している血液凝固因子VIIIまたはIXをコードする遺伝子；Ｔ細胞抗原レセプタのようなＴ細胞媒介免疫応答に関与するリガンド；Ｂ細胞抗原レセプタ（免疫グロブリン）；Ｔ細胞とＢ細胞抗原レセプタの双方のみの組み合わせ及び／又は単鎖抗体（ScFv）、IL-2、IL-12、TNF、ガンマ・インターフェロン、CTLA4、B7などと組み合わせたＴ細胞とＢ細胞抗原レセプタの組み合わせ；Melana、MAGE遺伝子（MAGE-1、MAGE-3など）、P198、P1A、gp100などの腫瘍細胞で発現する遺伝子；などの形質導入遺伝子を導入することが望まれるであろう。
【００２９】
典型的なガンは、例えば、骨髄、リンパ及び赤血球系統、またはそれらの前駆細胞から生じる血球に由来するガンである。典型的な骨髄性疾患には、それだけに限られるものではないが、急性前骨髄性白血病（APML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）などがある。本発明によるレンチ・ベクターを用いて治療することができるリンパ性悪性腫瘍には、それだけに限られるものではないが、Ｂ系統ALL及びＴ系統ALLなどの急性リンパ芽球性白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病（PLL）、毛様細胞白血病（HLL）及びWaldenstromのマクログロブリン血症（WM）などがある。本発明によるレンチウイルス性ベクターを用いる治療のための候補として検討される悪性リンパ腫の別な形状には、それだけに限られるものではないが、非ホジキン・リンパ腫及びその異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（CTCL）、大顆粒リンパ球性白血病（LGF）及びホジキン病などがある。
【００３０】
その他の実施の形態において、本発明は、前述のレンチ・ベクターのひとつで形質導入されたホスト細胞に関するものである。本発明によるレンチ・ベクターは殆どあらゆる細胞を形質導入するために用いることができると考えられる。典型的な細胞には、それだけに限られるものではないが、CD4＋細胞、末梢血リンパ球細胞、末梢血単核細胞、血球幹細胞、臍帯血細胞、線維芽細胞、脳細胞、肺細胞、肝細胞、筋肉細胞、膵臓細胞、内皮細胞、心臓細胞、皮膚細胞、骨髄間質細胞、眼球細胞、膵管細胞、神経前駆体、中胚葉幹細胞などがある。形質導入される細胞はさらに、霊長類、マウス、ブタまたはヒト由来、あるいは別の動物種由来でもよい。
【００３１】
ウイルス粒子の産生のため、レンチウイルス性gag及びpol遺伝子の発現と両立可能なあらゆる細胞、または、そうした発現を支援するために遺伝子操作されることが可能なあらゆる細胞を用いることができる。例えば、293T細胞及びHT1080細胞のような産生株細胞を用いることができる。
【００３２】
当然のことながら、上に述べられたように、本発明によるレンチ・ベクターは、骨髄、末梢血または臍帯血のいずれかから得られたヒト血球前駆細胞または血球幹細胞の形質導入において、そして、CD4＋細胞、末梢血ＢまたはＴリンパ球細胞、末梢血単核細胞、樹状細胞及び単球細胞の形質導入において特に有用である。特に好ましい標的細胞は、回収された末梢血から単離されたものなどCD34+細胞である。
【００３３】
さらに別の実施の形態で、本発明は、ヒト血球幹細胞を含んでいるヒト細胞群と前述のレンチ・ベクターの１つとを、ベクターによって前述の群内のヒト血球前駆細胞の形質導入を実施する条件下で接触させるステップを含む、ヒト血球幹細胞を形質導入するための方法に関するものである。その幹細胞は、最終的な適用に応じて、in vivoまたはin vitroで形質転換されることが可能である。ヒト幹細胞の遺伝子治療のようなヒト遺伝子治療の場合であっても、幹細胞をin vivoで形質転換し、または代わりに、形質転換された幹細胞をヒト個体へ導入した後にその幹細胞をin vitroで形質転換することができる。この実施の１つの態様で、ヒト幹細胞は、当業者に周知の方法を用いてヒト、例えばヒトの患者から取り出されて、上に述べられたように形質導入されることが可能である。その後、形質導入された幹細胞は、同一または別のヒトに再導入される。
【００３４】
ヒト個体が、そのヒト個体へのベクター導入によって直接治療される場合、その治療はベクターの静脈内投与によって通常行われる。細胞、例えばCD34+細胞、樹状細胞、末梢血細胞または腫瘍細胞がex vivoで形質導入される場合、そのベクター粒子は、通常ほぼ１から50の間の感染多重度（MOI）であり、また、細胞105個あたりウイルス・ベクターが１ｘ105から50ｘ105の形質導入単位にも相当する分量を用いてその細胞と共に培養される。これには当然のことながら、１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、15、20、25、30、35、40、45及び50 MOIに相当する量のベクターが含まれている。通例、ベクターの量は、Hela形質導入単位（TU）に置き換えて発現させることが可能である。ベクター投与のその他の経路には、動脈内、内視鏡的、病変内、経皮的、皮下的、筋肉内、髄膜下、眼窩内、皮内、腹膜内、経気管、表皮下、胸骨内注入によって、吸入または鼻腔内噴霧、気管内経路などを通じたものである。本発明によるベクターを用いる腫瘍／ガン治療に関する実施の形態で、発現ベクターは、腫瘍内または腫瘍脈管構造内への直接注入によって送達することが可能である。
【００３５】
ex vivo遺伝子治療の１つの好ましい例は、慢性肉芽腫症（CGD）を患う患者であり、そのCD34+細胞は骨髄または末梢血から単離され、ex vivoでgp91-phox遺伝子を発現させるレンチ・ベクターを用いて、再移植の前にgp91-phoxプロモータの制御下で形質導入されることが可能である。類似の方法を、例えばベータ・サラセミアなどのサラセミアを患う患者の治療で用いることができ、細胞は、ベータ・グロブリンの制御下でベータ・グロブリンを発現させるレンチ・ベクター、またはその他適切なプロモータを用いて形質導入されることが可能である。同様に、白血球接着不全（LAD）の治療のための適切な遺伝子とプロモータの組み合わせを発現させる本発明によるレンチ・ベクターが検討される。
【００３６】
重症複合型免疫不全（SCID）を患う患者の場合、例えば、適切な組織または細胞特異性及び操作可能な制御を提供する適切なプロモータと操作可能に結合されるインターロイキン・レセプタの共通のガンマ鎖をコードする遺伝子など、その患者において不完全である遺伝子を発現させる本発明によるレンチ・ベクターを用いて、本発明者等は同様の方法を検討する。HIV感染の遺伝子治療について、本発明者等は細胞内免疫化を検討し、細胞は、抗ウイルス遺伝子の導入を通じてHIVウイルスに対する抵抗性を付与される。HIVに対する細胞内免疫化の実施の形態で、本発明によるレンチ・ベクターの標的には、血球前駆体、末梢血CD 4+Ｔ細胞及び単球などがある。当業者に認識されるように、類似の細胞内免疫化法がその他のウイルス感染に対して用いられることも可能である。ガンの免疫療法のために、樹状細胞のような腫瘍細胞または抗原提示細胞は、本発明によるレンチ・ベクターで遺伝子組み換えされる。ガン治療のために、本発明によるレンチ・ベクターのコンストラクトで用いることができるいくつかの形質導入遺伝子は、増殖を抑制及び／又は阻止及び／又は回避し、及び／又はTNFのようなガン／腫瘍細胞及び／又は遺伝子のアポトーシスを媒介することが可能な形質導入遺伝子である。
【００３７】
本明細書で述べられるレンチ・ベクターは、血液内または特定の器官への直接注入によってin vivoで用いることもできる。例えば、１つの実施の形態で、グリア細胞由来神経成長因子（GDNF）を発現させるレンチ・ベクターの脳内注入が、パーキンソン病の治療のために用いられる。別の例で、血友病Ａの治療のために凝固因子VIIIを発現させるレンチ・ベクターの門脈内注入が構想される。さらに別の例で、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のためのジストロフィン遺伝子を発現させる本発明によるレンチ・ベクターの静脈内または筋内注入が構想される。別の好ましい例で、gp91-phoxを発現させるレンチ・ベクターが慢性肉芽腫症（CGD）の治療で注入される。特に好ましい実施の形態で、gp91-phoxをgp91-phoxプロモータの制御下で発現させるレンチ・ベクターが、CGDの治療で注入されることが可能である。従って、当業者であれば、遺伝子治療の観点から本発明によるレンチ・ベクターのコンストラクトの広範囲にわたる利用を認識するであろう。
【００３８】
この本明細書及び特許請求の範囲で用いられるように、『構成される(comprising)』という語と併せて用いられる場合、『１つの(a)』または『ある(an)』という語は１つまたは１つより多いものを意味する。本明細書で用いられるように『別の(another)』という語は少なくとも第２番目のもの、またはそれより多いものを意味する。
【００３９】
本発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施の形態を示しながらも、本発明の精神及び意図の範囲内での種々の変更及び変形が当業者にはこの詳細な記述から明らかであるので、例示のためだけに提供されることが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
レンチウイルス性ベクターは遺伝子治療、そして特にヒト血球幹細胞（hHSC）の形質導入に対して大きな可能性を提供するものであるが、今までに開発されたベクターは生物学的研究における安全性の基準を満たすことができず、形質導入遺伝子の発現において未だ非効率的である。例えば、CMVプロモータを含んでいるHIV由来のベクターは、中枢神経系で高レベルの形質導入遺伝子の発現を誘発することが可能であり（Naldini et al., 1996a; Naldini et al., 1996b; Blomer et al., 1997）、多能性血球前駆体がこの遺伝子送達手段によって効果的に形質導入可能であることを初めて実証したが、それらのベクターは、治療用遺伝子を多くのリンパ・血球細胞へ運ぶためには、これらの標的内でその転写活性がきわめて低いため、概ね実用にならない（Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999; An et al., 2000）。現在のレンチウイルス性ベクターは、組み換えによる野生型ウイルスの再構成の可能性を除去するHIVビルレンス遺伝子を複合的に弱毒化している（Zufferey et al., 1997; Dull et al., 1998）。HIVの転写要素を除去することにより、自己不活性化設計はベクターをさらに生物学的に安全にした（Zufferey et al., 1998）。しかし、これは、明らかにポリアデニル化の効率を減少させることによって、形質導入遺伝子の発現に悪影響を与え得る（DeZazzo et al., 1991; Valsamakis et al., 1991; Brown et al., 1991; Cherrington and Ganem, 1992; Valsamakis et al., 1992; Gilmartin et al., 1992）。
【００４１】
本発明では、本技術分野におけるそのような、及びその他の欠陥を克服し、生物学的研究における安全性と増強された遺伝子発現の両方の点で最適化された、改良されたHIV由来のベクターの開発について述べられる。従って、本発明の実施において、ヒトの細胞は、複製コンピテント組み換え体（RCR）の形成を回避する要素で構成され、血球前駆体とin vitro分化血液系統の両方で、そして、一次Ｔ細胞で高レベルの形質導入遺伝子の発現を誘発する内部プロモータ要素でさらに構成される、HIV由来のレンチ・ベクターで形質導入することができる。例えば、ヒトCD 34+細胞及びその他のヒト血球系統は、本発明によるベクターを用いて形質導入することが可能である。
【００４２】
述べられたベクターのプロモータ要素には、当業者に認識されるように、殆どすべてのプロモータ要素を用いることができるが、gp91-phoxプロモータ、ベータ・サラセミア・プロモータ、gp47-phox及びCD4プロモータ、EF1αプロモータまたはCD11ｂプロモータなどが含まれる。
【００４３】
gp91-phoxプロモータは、特定の細胞タイプ、すなわち分化した顆粒球及び単球で発現を起こす活性を有した。さらに、gp91-phoxプロモータは、プロモータをINFガンマのようなアクチベータと接触させることによって活性化することができる。また、これらのプロモータからのin vitroでの発現安定性を確認するため、NOD/SCIDマウスでこれらのベクターを用いる移植及び再増殖も検討される。
【００４４】
本発明によるレンチ・ベクターでRCRを回避する要素は自己不活性化（SIN）設計である。これは、ベクター・プラスミドの3' LTRでU3の大部分を欠失することによって達成されて、自己不活性化（SIN）構造をもたらす（Zufferey et al., 1998）。この欠失は、LTRと内部プロモータ要素の間の起こり得る干渉も回避する。しかし、SINは、特にPGKプロモータのようなあまり強力でないプロモータにおいて、形質導入遺伝子の発現減少を誘発することができる。本発明では、欠失3' LTRのすぐ上流で、ベクター内のウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（WPRE）または肝炎ウイルスＢ調節要素（HPRE）のようなその他の調節要素を挿入することによって強力なプロモータを持たないレンチ・ベクター・コンストラクトでの形質導入遺伝子レベルを救出する方法がさらに述べられる。WPRE要素の挿入は、プロモータ要素の発現特異性に影響を及ぼさない。
【００４５】
別の利点は、HS要素を上記ベクターに操作可能に組み込むことによって得ることができる。例えば、エンハンサ要素の一連のHSのpHPX-GFPへの組み込みは、HSのサイレンス活性が原因で、より高い遺伝子発現と、発現におけるより少ない異型性をもたらすことができる。例えば、引用によって本明細書に組み込まれる、May et al., (2000) "Therapeutic haemaglobin synthesis in beta-thalassaemic mice expressing lentivirus-encoded human beta-globin", Nature 406:82-86を参照されたい。May et al., (2000)は、ベータ・グロビンcDNAのより高い、しかし、より異型性が少ない発現を促進するためのベータ・グロビン・プロモータの上流でレンチ・ベクターに含まれるHS要素について開示している。
【００４６】
本発明によるレンチ・ベクターは、MLV系ベクターが効率的ではない条件を用いて、CD34＋細胞などいくつかのヒト血液系統細胞を効率的に形質導入することが可能である。さらに、遺伝子導入の効果は形質導入される細胞の60％から70％で飽和状態になるが、ヒトCD34＋細胞は、比較的低いMOIで効果的に形質導入が可能なことも示されている。例えば、最適な形質導入を達成するためにMOI 10が用いられたが、それは先の研究で述べられた値よりも大幅に低く、以前は60−300と1000−3000の間の範囲であった（Miyoshi et al., 1999; Case et al., 1999）。これは、本発明による方法にはCD34＋細胞を少量（200μlに10？個の細胞）のベクター粒子に約６時間から24時間暴露するステップを含んでいるので、ひとつにはベクター標的命中率が上がるためであろう。
【００４７】
従って、本発明は、ヒト血球前駆細胞内及びその他すべての血液細胞誘導体内、そして、自己不活性化構造物内であっても、形質導入遺伝子を発現させるために安全で高度に効率的、きわめて強力なHIV由来ベクターを提供する。さらに、これらのベクターは、分化細胞内で細胞タイプ特異的発現及び制御可能な発現を提供する。従って、これらのベクターは、遺伝性及び後天性リンパ・血液疾患に対する遺伝子治療、特に血液ガンなどのガンに対する遺伝子治療、HIV感染の治療及び予防のため、そして、ヒトHSCのレンチ・ベクター媒介修飾を介した血球の研究のための有用な手段を提供する。
【００４８】
１．レンチウイルス性ベクターと遺伝子治療
レンチウイルスは、通常のレトロウイルス遺伝子gag、pol及びrevに加えて、調節または構造機能を持つその他の遺伝子を含んでいる複雑なレトロウイルスである。そのより高度な複雑性により、上記ウイルスは、潜伏感染の過程でそうであるように、そのライフサイクルを調節することができる。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス：HIV-1、HIV-2、及びサル免疫不全ウイルス：SIVなどがある。レンチウイルス性ベクターは、例えば、env、vif、vpr、vpu及びnef遺伝子を除去してそのベクターを生物学的に安全にするなど、HIVビルレント・ウイルスを複合的に弱毒化することによって生成されている。
【００４９】
レンチウイルス性ベクターは、遺伝子治療に大きな利点を提供する。それらは長期発現が必要とされる標的細胞の染色体へ安定的に組み込まれる。さらに、それらはウイルスの遺伝子を運搬しないので、細胞傷害性Ｔ細胞によって破壊される可能性がある形質導入細胞の生成という問題を回避する。さらに、それらは、想定される殆どの臨床応用に十分な、比較的大きなクローニング能力を有している。さらに、レンチウイルスは、その他のレトロウイルスとは対照的に、非分裂細胞を形質導入することができる。これは、血球系、脳、肝臓、肺及び筋肉のような組織に対する遺伝子治療との関連できわめて重要である。例えば、HIV-1に由来するベクターは、形質導入遺伝子のニューロン、幹細胞及び筋細胞のような細胞への効果的なin vivo及びex vivoの送達、組み込み及び安定な発現を可能にする（Blomer et al., 1997; Kafri et al., 1997: Naldini et al., 1996; Naldini et al., 1998）。
【００５０】
レンチウイルス・ゲノム及びプロウイルスDNAは、レトロウイルスに見られる３つの遺伝子、gag、pol及びenv遺伝子を有しており、それら遺伝子には長い末端反復（LTR）配列が隣接する。gag遺伝子は、内部構造（細胞間質、キャプシド及びヌクレオキャプシド）蛋白質をコードし、；pol遺伝子はRNA指示DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼ及びインテグラーゼをコードし：そして、env遺伝子はウイルス・エンベロープ糖蛋白をコードする。5' 及び3' LTRは、ビリオンRNAの転写及びポリアデニル化を促進する役目を果たす。上記LTRは、ウイルスの複製に必要なその他すべてのシス活性配列を含んでいる。レンチウイルスは、さらにvif、vpr、tat、rev、vpu、nef及びvpxなどの遺伝子も有している。
【００５１】
5' LTRに近接して、ゲノムの逆転写のため（tRNAプライマー結合サイト）及びウイルスRNAの粒子への効率的なキャプシド形成のため（Psiサイト）に必要な配列がある。キャプシド形成（またはレトロウイルスRNAの感染性ビリオンへのパッケージング）に必要な配列がウイルスのゲノムに欠けていると、そのシスの欠陥によってゲノムRNAのキャプシド形成が回避される。しかし、その結果生じる突然変異体は、すべてのビリオン蛋白質の合成を命令する能力を保持する。
【００５２】
レンチウイルス性ベクターは本技術分野で周知であり、そのすべてが引用によって本明細書に組み込まれる、Naldini et al., (1996 and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., (1998); Ramezani et al., (2000)を参照されたい。また、そのすべてが引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,994,136号明細書、米国特許第6,013,516号明細書、米国特許第6,165,782号明細書、米国特許第6,207,455号明細書、米国特許第6,218,181号明細書、米国特許第6,218,186号明細書、及び米国特許第6,277,633号明細書を参照されたい。一般に、これらのベクターはプラスミド系またはウイルス系であり、外来の核酸を組み込むため、選択のため、及びその核酸をホスト細胞内へ運ぶためにきわめて重要な配列を運ぶよう構成される。
【００５３】
ウイルス系遺伝子送達システムの形成には２つの構成要素が関与しており：１つは、感染性粒子を生成するために必要な構造蛋白質及び酵素を含んでいるパッケージング要素であり、もう１つは、ベクターそれ自体、つまり運搬される遺伝物質である。生物学的研究における安全性の保護手段をこれら両方の構成要素の設計に導入することが可能である。従って、第１世代のHIV系ベクターのパッケージング・ユニットは、エンベロープ蛋白質以外のすべてのHIV-1蛋白質で構成された（Naldini et al., 1998）。その後、毒性の原因となる４つの付加的なウイルス遺伝子、vpr、vif、vpu及びnefの欠失は、ベクター系の有用性を変えないことが示された（Zufferey et al., 1997）。また、HIVの主要なトランスアクチベータであるTatは十分効率的なベクターの産生には不要であることも示された（Dull et al., 1998）。従って、HIV系レンチウイルス性ベクターの第３世代パッケージング・ユニットは、親ウイルスのわずか３つの遺伝子、gag、pol及びrevで構成され、組み換えによる野生型ウイルスの再構成の可能性を排除する。
【００５４】
このシステムは、ベクターからHIV転写ユニットを除去することによってさらに改良された（Zufferey et al., 1998）。そのシステムでは、DNAの3' LTRのU3領域での欠失の導入を用いて、ベクターRNA生成自己不活性化（SIN）ベクターを産生したことが示された。逆転写の間に、この欠失はプロウイルスDNAの5' LTRへ運搬された。TATAボックスの除去など十分な配列が排除され、LTRの転写活性を消滅させて、形質導入細胞内の全長ベクターRNAの産生が阻止された。しかしながら、これは、ベクター力価又はin vitro若しくはin vivoでのベクターの性質に影響しない。
【００５５】
本発明は、上記の、そして本明細書のその他の部分で述べられるように、既存のレンチ・ベクターにいくつかの改善を提供する。本発明における血球及びリンパ・造血疾患を治療するための遺伝子のような異種遺伝子を提供するレンチ・ベクターをパッケージング細胞へ導入することにより、当該の外来遺伝子を運ぶ感染性ウイルス粒子を解放する産生株細胞が産生される。
【００５６】
env遺伝子は、レトロウイルスなどいずれのウイルスからも由来することができる。envは、好ましくは、ヒト及びその他の種の細胞の形質導入を可能にする両種性エンベロープ蛋白質である。レトロウイルス由来のenv遺伝子の例には、それだけに限られるものではないが、Moloneyマウス白血病ウイルス（MoMuLVまたはMMLV）、Harveyマウス肉腫ウイルス（HaMuSVまたはHSV）、マウス乳腺癌ウイルス（MuMTVまたはMMTV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLVまたはGALV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、及びラウス肉腫ウイルス（RSV）などがある。水泡性口内炎ウイルス（VSV）蛋白質Ｇ（VSV G）のようなその他のenv遺伝子、肝炎ウイルス及びインフルエンザのenv遺伝子も用いることができる。
【００５７】
VSG G蛋白質は、VSV Gが組み換えウイルスに広範なホスト域を付与することから、望ましいenv遺伝子であるが、VSV Gはホスト細胞に対して有害な場合がある。従って、VSV Gに対する遺伝子などの遺伝子が用いられる場合、誘発可能なプロモータ系を用いることが好ましく、それによって、VSV Gの発現が必要とされないときは、VSV Gの発現を調節してホストの毒性を最小限にすることができる。例えば、Gossen & Bujard; (1992)のテトラサイクリン調節可能遺伝子発現系を用いて、運搬された細胞からテトラサイクリンを回収する場合、VSV Gの誘発可能な発現を提供することが可能である。従って、tet/VP16トランスアクチベータは第１のベクター上に存在し、VSV Gコード配列は、別なベクターのtetオペレータ配列によって制御されるプロモータから、下流でクローニングされる。
【００５８】
ウイルスのenv核酸配列を提供するベクターは、プロモータまたはエンハンサのような調節配列に操作可能に結合される。その調節配列は、例えば、EF1α、PGK、Moloneyマウス白血病ウイルス・プロモータ-エンハンサ要素、ヒト・サイトメガロウイルス・エンハンサ、ワクシニアP7.5プロモータなどいずれの真核プロモータまたはエンハンサでもよい（下の表１及び２も参照されたい）。Moloneyマウス白血病ウイルス・プロモータ-エンハンサ要素のようないくつかの場合、プロモータ−エンハンサ要素はLTR配列の内部に、または近接して配置される。好ましくは、上記調節配列は、ベクターが構成されているレンチウイルスに対して内在性でない。従って、そのベクターがSIVから産生されるならば、そのSIV LTRに見られるSIV調節配列は、SIVに由来しない調節要素によって置き換えられるであろう。
【００５９】
特定の細胞タイプのレセプタを標的にするための抗体または特定のリガンドを有するエンベロープ蛋白質の連鎖によってその組み換え体ウイルスをさらに標的とすることができる。当該配列（調節領域を含む）をそのウイルス・ベクターに挿入することによって、特定の標的細胞上のレセプタのためのリガンドをコードする別の遺伝子と共に、例えば、そのベクターは標的特異性となる。レトロウイルス・ベクターは、例えば、糖脂質または蛋白質を挿入することによって標的特異性にされることが可能である。向標は多くの場合、単鎖抗体のような抗体または組み換え抗体型分子の抗原結合部分を用いて達成され、レトロウイルス・ベクターを標的にする。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、レトロウイルス・ベクターの特定の標的への送達を達成するための特定の方法を理解し、容易に確認することが可能である。
【００６０】
本明細書に述べられる遺伝性または後天性造血疾患のために治療用遺伝子のような遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列のような異種または外来の核酸は、調節核酸配列に操作可能に結合される。好ましくは、上記異種配列はプロモータと結合され、キメラ遺伝子となる。
【００６１】
マーカー遺伝子は、ベクターの存在をアッセイし、それによって、感染と組み込みを確認するために用いることができる。マーカー遺伝子の存在により、挿入断片を発現させるそれらホスト細胞のみの選択と成長が確保される。典型的な選択遺伝子は、例えば、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキサート、及び細胞表面マーカーなどの抗体、及びその他毒性物質に抵抗性を付与する蛋白質をコードする。
【００６２】
本発明による組み換え体ウイルスは、核酸配列を哺乳動物細胞に運搬することができる。『核酸配列』という語は、本明細書で詳細に検討されるように、あらゆる核酸分子、好ましくはDNAを意味する。核酸分子はDNA、cDNA、合成DNA、RNAまたはそれらの組み合わせなど種々の供給源に由来することができる。そうした核酸配列は、自然発生的なイントロンを含んでいる、または含んでいないゲノムDNAで構成されることができる。さらに、そうしたゲノムDNAは、プロモータ領域、ポリＡ配列、またはその他結合される配列に関連して得ることができる。ゲノムDNAは、本技術分野で十分周知の手段によって適切な細胞から抽出、精製することができる。あるいは、メッセンジャーRNA（mRNA）を細胞から単離し、逆転写またはその他の手段によってcDNAを産生するために用いることが可能である。
【００６３】
上記ベクターは、トランスフェクトまたは感染によってパッケージング細胞株へ導入される。パッケージング細胞株は、ベクターのゲノムを含んでいるウイルス粒子を産生する。トランスフェクトまたは感染の方法は当業者に周知である。パッケージング・ベクターとトランスファー・ベクターの同時形質導入の後、組み換え体ウイルスは培地から回収され、当業者によって用いられる標準的な方法によって力価が評価される。従って、パッケージング・コンストラクトは、通常はネオマイシン、DHFR、グルタミン合成酵素またはADAのような優性選択マーカーと共に、リン酸カルシウム・トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔法によってヒト細胞株へ導入され、その後適切な薬剤の存在下での選択及びクローンの単離が行われる。選択マーカー遺伝子は、コンストラクト内のパッケージング遺伝子へ物理的に結合することが可能である。
【００６４】
パッケージング機能が適切なパッケージング細胞によって発現されるよう構成された、安定な細胞株が周知である。例えば、パッケージング細胞について述べられている米国特許第5,686,279号明細書及びOry et al., (1996)を参照されたい。それらに組み込まれたレンチウイルス性ベクターを有するパッケージング細胞は産生株細胞を形成する。従って、産生株細胞は、当該の治療用遺伝子を運ぶパッケージされた感染性ウイルス粒子を生成または放出することが可能な細胞または細胞株である。さらに、これらの細胞は、ガラスあるいはプラスチックのような表面に付着すると、最適に成長、生存及び機能を維持することを意味する、付着依存が可能である。また、産生株細胞は、新生物的に形質転換されてもよい。ベクターが複製コンピテントである場合のレンチウイルス性ベクター・パッケージング細胞株として用いられる付着依存細胞株のいくつかの例は、HeLaまたは293細胞及びPERC.6細胞である。
【００６５】
いくつかの適用において、特にウイルスが遺伝子治療への適用に用いられる場合、ベクターは複製欠損性（または複製欠陥性）であり、治療を受ける個体内でのウイルスの制御不能な増殖を回避することが望ましい。そのような例において、重要なウイルス機能をコードするための産生株細胞ゲノムの修飾によって、または、ウイルス・ゲノムから除去された効果または配列を補完する蛋白質を発現させるための産生株細胞とヘルパー・ウイルスとの同時感染によってのいずれかで遺伝子操作された哺乳動物細胞株が選択される。例えば、HIV-1由来ベクターについて、HIV-1パッケージング細胞株であるPSI1422を、Corbeau, et al. (1996)で述べられているように用いることができる。同様に、産生されるべきウイルス・ベクターがレトロウイルスである場合、高い力価のレトロウイルス粒子を産生することができるヒト293由来レトロウイルス・パッケージング細胞株（293GPG）を、Ory, et al. (1996)で述べられているように用いることができる。最小限のベクター系の産生において、産生株細胞は遺伝子操作され（ウイルス・ゲノムの改変、あるいはヘルパー・ウイルスまたはコスミドの利用のいずれかによって）、産生株細胞株のビリオンへの複製及びパッケージングを可能にする親ウイルスの機能を補完する。
【００６６】
Naldini et al. (1996)によるレンチウイルス・トランスファー・ベクターが、in vitroで成長停止したヒト細胞を感染させ、成体マウスの脳への直接注入後にニューロンを形質導入するために用いられている。そのベクターは、in vivoでマーカー遺伝子をニューロンへ運搬する上で効果的であり、検出可能な病理なしに長期の発現が達成された。そのベクターを１回注入して10か月後に分析された動物に、基準レベルの形質導入遺伝子発現の減少、及び組織病理または免疫応答の兆候は何ら見られなかった（Blomer et al. 1997）。
【００６７】
２．SIN設計
SIN設計によって、レンチウイルス性ベクターの生物学的研究における安全性が向上する。大部分のHIV LTRはU3領域から成る。U3領域は、感染細胞内で、及び細胞活性に応答してHIVゲノムの基礎的及び誘発された発現を調節するエンハンサ及びプロモータ要素を含んでいる。これらプロモータ要素のいくつかはウイルス複製に不可欠である。エンハンサ要素のいくつかは、ウイルス分離体の中で高度に保存され、ウイルス性病原の重要な毒性因子として関与している。エンハンサ要素は、ウイルスの種々の細胞標的の複製速度に影響を与える作用を及ぼすことができる（Marthas et al., 1993）。
【００６８】
ウイルス転写は5' LTRのU3領域の3' 末端から開始されるが、それらの配列はウイルスmRNAの一部ではなく、3' LTRからのそのコピーは、組み込まれたプロウイルス内の両方のLTRの産生のためのテンプレートとしての機能を果たす。U3領域の3' コピーがレトロウイルス・ベクター・コンストラクト内で改変されると、ベクターRNAは、産生株細胞内の無処置の5' LTRから依然として産生されるが、標的細胞内では再生成されない。そのようなベクターの形質導入は、子孫ウイルス内での両方のLTRの不活性化を招く。従って、そのレトロウイルスは自己不活性（SIN）であり、それらのベクターはSINトランスファー・ベクターとして知られる。
【００６９】
SIN設計は、いずれも引用によって本明細書に組み込まれる、Zufferey et al., 1998及び米国特許第5,994,136号明細書に詳細に述べられている。しかし、本明細書に述べられるように、3' LTRでの欠失の程度には限界がある。第１に、U3領域の5' 末端は、ベクター運搬において、組み込みに必要であるという別の重要な機能を果たす。従って、末端ジヌクレオチド及びatt配列は、欠失が可能なU3配列の5' 境界を表すことができる。さらに、いくつかの大まかに定義された領域は、Ｒ領域の下流ポリアデニル化サイトの活性に影響を及ぼすことができる。3' LTRからのU3配列の過度の欠失はベクター転写のポリアデニル化を減少させ、産生株細胞内のベクター及び標的細胞内の形質導入遺伝子発現の力価の両方に不都合な結果をもたらす。他方、限定的な欠失は、形質導入された細胞内のLTRの転写活性を抑制しない。
【００７０】
本明細書に述べられるレンチウイルス性ベクターは、ヌクレオチド-418から-18の範囲の3' LTRのU3領域の欠失を有している。これは、最も広範囲な欠失で、TATAボックスにまで達しており、従って、形質導入された細胞内のLTRのいずれの転写活性も排除する。産生株細胞内のベクター及び標的細胞内の形質導入遺伝子発現の力価は、これらのベクター内で影響を受けなかった。従って、この設計によってベクターの安全性がきわめて大きく向上する。
【００７１】
U3領域のそのような広範囲の欠失を有するSIN型ベクターは、形質導入の効率を損なわずにマウス白血病ウイルス（MLV）または脾臓壊死ウイルス（SNV）系レトロウイルス・ベクターに対して産生されることはない。
【００７２】
-418から-18の範囲のヌクレオチド配列の欠失は、LTRの転写活性を無効にし、その結果、形質導入遺伝子内の全長ベクターDNAの産生が無効にされる。しかし、HIV由来レンチ・ベクターでは、in vitroまたはin vivo特性のいずれもSIN設計によって損なわれなかった。
【００７３】
３．転写後調節要素（PRE）
形質導入遺伝子の発現増強が、いくつかの実施の形態、特に作用が穏やかなプロモータを有する本発明によるレンチ・ベクター・コンストラクトに関する実施の形態で必要になる場合がある。
【００７４】
PREの１つのタイプは、遺伝子発現を刺激することができる発現カセット内に位置するイントロンである。しかし、イントロンは、レンチウイルスのライフサイクル事象の間に挿入されることがある。従って、イントロンがPREとして用いられる場合、それらは、ベクターのゲノム転写と逆方向に配置されなければならない。
【００７５】
スプライシング事象に依存しない転写後調節因子は、ウイルスのライフサイクルの間に除去されないという利点を提供する。いくつかの例は、単純ヘルペス・ウイルスの転写後調節要素、Ｂ型肝炎ウイルス（HPRE）及びウッドチャック肝炎ウイルス（WPRE）の転写後調節要素である。これらのうち、WPREはHPREには見られない付加的なシス活性要素を含んでいるのできわめて好ましい（Donello et al., 1998）。この調節要素は、形質導入遺伝子のRNA転写に含まれるが、形質導入遺伝子翻訳ユニットの終止コドンの外部に位置するようベクター内部に配置される。本発明及びZufferey et al., 1999で示されるように、WPRE要素は、レンチウイルス性ベクターとの関連で望ましい形質導入遺伝子の遺伝子発現を刺激、増強するための有用な手段である。
【００７６】
WPREは、引用によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,136,597号明細書で特徴づけられ、述べられている。そこに述べられているように、WPREは、核から細胞質へのRNAの効果的な輸送を調節するRNA搬出要素である。WPREは、上記要素及び形質導入遺伝子が単一の転写物内に含まれるように、シス活性核酸配列の挿入によって形質導入遺伝子の発現を増強する。センス方向でのWPREの存在は、形質導入遺伝子の発現を最大７倍から10倍まで増大させることが示された。イントロンとしての完全イントロンを含む遺伝子の代わりに、cDNAの形状のレトロウイルス・ベクター転移配列が、レトロウイルス粒子の形成につながる一連の事象の間に通常挿入される。イントロンは、スプライシング機構で一次転写物の相互作用を調節する。スプライシング機構によるRNAのプロセシングは、スプライシング及び輸送機構の間の連結によってRNAの細胞質搬出を容易にするため、cDNAは多くの場合非効率的に発現される。従って、ベクター内のWPREの封入は形質導入遺伝子の増強された発現をもたらす。
【００７７】
４．プロモータとエンハンサ
『プロモータ』とは、転写の開始と速度を制御する核酸配列の領域である、制御配列である。それは、核酸配列として特定の転写を開始するため、RNAポリメラーゼ及びその他転写因子のような、調節蛋白質及び分子がそこで結合できる遺伝子要素を含むことができる。『操作可能に配置された』、『操作可能に結合された』、『制御下』及び『転写制御下』という語句は、プロモータが核酸配列に対して正しい機能的位置及び／又は方向にあり、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するという意味である。
【００７８】
プロモータは、RNA合成の開始サイトを配置する機能を果たす配列を通常含んでいる。これの最もよく知られた例はTATAボックスであるが、例えば、哺乳動物末端デオキシヌクレオチド・トランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモータ、及びSV40後期遺伝子のためのプロモータのようなTATAボックスを欠いたいくつかのプロモータでは、開始サイトに重なる個々の要素自体が開始位置の決定を助ける。別のプロモータ要素は転写開始の頻度を調節する。多くのプロモータが開始サイトの下流にも機能要素を含んでいることが示されているものの、通例、これらは開始サイトの30-110 bp上流の領域に配置されている。コード配列をプロモータの『制御下』に持ってくるため、それは、選択されたプロモータの転写リーディング・フレーム『下流』の（すなわち、3' の）転写開始サイトの5' 末端に位置する。『上流』のプロモータは、DNA転写を刺激し、コードされたRNAの発現を促進する。
【００７９】
プロモータ要素間のスペーシングは多くの場合弾力的であり、その結果、プロモータ機能は、要素が互いに挿入または移動されても保存される。tkプロモータでは、プロモータ要素間のスペーシングは、活性が低下し始める前に50 bp離れるように増大する。プロモータに応じて、個々の要素は協調的または独立的のいずれかで機能し、転写を活性化すると考えられる。プロモータは、核酸配列の転写活性に関与するシス活性制御配列である『エンハンサ』と協調して、あるいは協調せずに用いることができる。
【００８０】
プロモータは、コード断片及び／又はエクソンの上流に位置する5' 非コード配列を単離することによって得られるように、核酸配列と自然に結合するものである。そのようなプロモータは『内因性』と称することができる。同様に、エンハンサは核酸配列と自然に結合し、その配列の下流または上流のいずれかに位置するものである。あるいは、組み換え体の制御下、または、その自然な環境では核酸配列と通常結合しないプロモータである異種プロモータの制御下で、そのコードする核酸断片を配置することによっていくつかの利点が得られるであろう。そうしたプロモータまたはエンハンサには、その他の遺伝子のプロモータまたはエンハンサ、その他いずれかのウイルス、または原核または真核細胞から単離されるプロモータまたはエンハンサ、及び、『自然発生的』、すなわち、種々の転写調節領域の種々の要素、及び／又は発現を変える突然変異体を含んでいるプロモータまたはエンハンサなどである。例えば、組み換えDNA構造に最も広く用いられるプロモータには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース及びトリプトファン（trp）プロモータ系などがある。プロモータ及びエンハンサの核酸配列を合成的に産生することに加えて、配列は、本明細書で開示される組成物と共に、PCRTMなどの組み換え体クローニング及び／又は核酸増幅技術を用いて産生することができる（それぞれが引用によって本明細書に組み込まれる、米国特許第4,683,202号明細書及び米国特許第5,928,906号明細書参照）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などのような非核細胞小器官内で配列の直接転写及び／又は発現を命令する制御配列を用いることも可能であると考えられる。プロモータ、エンハンサ及びその他の座または転写制御／調節要素で構成される制御配列も、『転写カセット』と称される。
【００８１】
当然のことながら、発現のために選択された細胞小器官、細胞タイプ、組織、器官または有機体内のDNA断片の発現を効果的に命令するプロモータ及び／又はエンハンサを用いることが重要である。分子生物学の分野の当業者は蛋白質発言のためのプロモータ、エンハンサ及び細胞タイプの組み合わせを通常周知している（例えば、引用によって本明細書に組み込まれるSambrook et al., 1989参照）。用いられるプロモータは、遺伝子治療のために、または組み換え蛋白質及び／又はペプチドの大規模産生のような適用のために有利であるような、導入されるDNA断片の高レベル発現を命令するための適切な条件下で、構造的、組織特異的、誘発可能及び／又は有用である。上記プロモータは異種または内因性である。
【００８２】
T3、T7またはSP6細胞質発現系の利用は、もう１つの可能な実施の形態である。真核細胞は、適切な細菌性ポリメラーゼが送達複合体の一部として、または別の遺伝子発現コンストラクトとしてのいずれかで提供されると、特定の細菌性プロモータからの細胞質転写を支援することができる。
【００８３】
表１に、RNAの発現を調節するための、本発明の状況で用いることができる要素／プロモータの非限定的な例を挙げる。表２には、特定の刺激に応答して活性化される核酸配列の領域である誘発可能要素の非限定的な例を挙げる。
【００８４】
【表１−１】
2005504539.tif 000002
【００８５】
【表１−２】
2005504539.tif 000003
【００８６】
【表２】
2005504539.tif 000004
【００８７】
組織固有プロモータあるいは要素の素性とそれらの活性の特徴を把握するためのアッセイは当業者には周知である。そうした領域の非限定的実例には、ヒトLIMK2遺伝子（Nomoto et al., 1999）、ソマトスタチン・レセプタ2遺伝子(Kraus et al., 1998)、マウス副睾丸レチノイン酸結合遺伝子（Lareyre et al., 1999）、ヒトCD4(Zhao-Emonet et al., 1998)、マウス・アルファ２（XI）コラーゲン（Tsumaki, et al., 1998）、DIAドーパミン・レセプタ遺伝子（Lee, et al., 1997）、インシュリン状成長因子II(Wu et al., 1997)、及びヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Almendro et al., 1996）などがある。
【００８８】
本発明によるレンチウイルス・ベクターは主に調節真核プロモータの制御下で治療用遺伝子を用いて細胞を形質変換させるために設計される。gp91-phoxプロモータが好ましいが、上の表１及び表２に示すその他のプロモータ及び調節信号要素を用いてもよい。さらに、本発明のレンチウイルス・ベクターとの関連で用いられる対象となる治療用遺伝子をコードする構造的遺伝子の発現を起こさせるために、（真核プロモータ・データベースEPDSに示されているような）どんなプロモータ／エンハンサの組み合わせでも用いることができる。あるいは、癌遺伝子治療用あるいは腫瘍を標的とする組織固有プロモータを癌、特に血液癌の治療のために本発明のレンチウイルス・ベクターと組み合わせて用いてもよい。
【００８９】
一般的に、真核細胞内で遺伝子をコードする蛋白質の転写を制御するプロモータ及びエンハンサは複数の遺伝子要素で構成されている。この細胞機構は各要素によって運ばれる規制情報を集めて統合し、種々の遺伝子が、複合化された転写規制の異なった、多くの場合複雑なパターンを発展させることができる。こうしたプロモータ及びエンハンサの活性化あるいは抑制は、これらの要素を、図1Bでgp91-phoxプロモータについて示され、さらに引用によって本明細書に組み込まれたLuo and Shalnik (1996) J. Biol. Chem, 271:18203-210 、及びLuo and Skalnik (1996) J. Biol. Chem. 271: 23445-23451に開示されているような適切な転写アクチベータあるいは抑制因子と接触させることで起こすことができる。gp91-phoxプロモータに関しては、発現カセットの転写と発現の調節におけるインターフェロン−ガンマの活性は、そうしたプロモータ及びエンハンサ要素及びそれらと相互作用する因子を本発明の実施においてどのように用いることができるかの一例である。
【００９０】
エンハンサは最初、同じDNA分子の遠位位置に配置されているプロモータからの転写を増強される遺伝子要素として検出された。距離が離れていても影響を及ぼすことができる能力は原核転写規制に関する古典的な研究にはほとんど先例がなかったものである。その後の作業で、エンハンサ活性を有するDNAの領域はほとんどプロモータと同様の構成を有していることが示された。つまり、それらは多くの個別の要素で構成されており、そのそれぞれが１つ以上の転写性蛋白質と結合する。例えば、図1Bに示されているgp91-phoxプロモータの規制モデル参照。本発明で想定されている具体的なエンハンサは、Lien LL, Lee Y, Orkin SH, (1997), "Regulation of the myeloid-cell-expressed human gp91-phox gene as studied by transfer of yearst artificial chromosome clones into embryonic stem cells: suppression of a variegated cellular pattern of expression requires a full complement of distant cis elements", Mol Cell Biol. 17(4): 2279-90（この引例全体を本明細書に組み込み）に示されているDNAase HyperSensitive要素及びそれらの同族体である。これらのエンハンサ要素の影響で、（エンハンサ活性HSのせいで）高い方へ、あるいは（HSのサイレンサ活性のせいで）低い方向へ遺伝子発現を変化させることができる。
【００９１】
gp91-phoxのHS要素の類似物は他のエンハンサ・システムでも活性を示す。例えば、May C, Rivella S, Callegal J, Heller G, Gaensler KM, Luzzatto L, Sadelain M, (2000) Therapeutic haemoglobin synthesis in beta-thalassaemic mice expression lentivirus-encoded human beta-globin参照。参照によって本明細書に組み込まれるNature 406 (6791): 82-6では、同様のベータ−グロビンHS要素がベータ・グロビンcDNAの発現を起こさせるために、ベータ・グロビン・プロモータから上流に位置するレンチベクタ内に組み入れられる。
【００９２】
プロモータ及びエンハンサは細胞内で転写を活性化させる同様の一般的機能を有している。それらはしばしば重複及び連続しており、また多くの場合、非常に類似したモジュール状組織を有しているように見える。これらを考え合わせると、これらの考察はエンハンサ及びプロモータが実体的には類似のもので、これらの配列に結合する転写性アクチベータ蛋白質が基本的には同じ方法で細胞の転写機構と相互作用する可能性を示唆している。エンハンサとプロモータとの間の基本的な違いは操作的なものである。エンハンサ領域は全体としては、離れた位置から転写を刺激することができなければならず、このことはプロモータ領域やその構成要素の場合必ずしも当てはまらなくてもよい。一方、プロモータは特定の部位あるいは特定の方向にRNA合成の開始を指示する１つ以上の要素を持っていなければならず、エンハンサの方はこうした特殊性を欠いている。こうした操作的な違いとは別に、エンハンサとプロモータは非常に似た実体である。転写及び発現を制御する要素の構成は、従って、強化された利用性及び操作を制御する手段を提供するように構成された種々の要素で構成されている。
【００９３】
有効性を示すことができる信号はポリアデニル化信号(hGH, BGH,SV40)である。多重遺伝子、あるいは多シストロン性メッセージをつくるために内部リボソーム結合サイト（IRES）要素を用いることができる。IRES要素は5' メチル化キャップ依存翻訳のリボソーム走査モデルをバイパスして、内部サイトで翻訳を開始することができる（Pelletier and Sonenberg, 1988）。ピコルナ・ウイルス系の２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）からのIRES要素についてはすでに述べられており（Pelletier and Sonenberg, 1988）、哺乳動物のメッセージからのIRESについても同様である（Macejak and Sarnow, 1991）。IRES要素は異種オープン・リーディング・フレームに結合させることができる。複数のオープン・リーディング・フレームを一緒に転写し、それぞれがIRESで分離されて、多シストロン性メッセージをつくることができる。IRES要素のおかげで、それぞれのオープン・リーディング・フレームはリボソームにアクセスして効率的な翻訳を行うことができる。１つのプロモータ／メッセージを用いて複数の遺伝子を効率的に発現させて１つのメッセージを転写することができる。
【００９４】
いずれにせよ、プロモータが遺伝子の上流に機能的に配置された場合、その遺伝子の発現をもたらすDNA要素であることは理解されるであろう。本発明によるレンチウイルス・ベクターを用いて形質変換されるほとんどの形質導入遺伝子はプロモータ要素の下流に機能的に配置されている。
【００９５】
コーディング配列を効率的に翻訳する特殊な開始信号を用いることもできる。これらの信号はATG開始コドンあるいは隣接する配列を含んでいる。ATG開始コドンを含む外来性翻訳制御信号も提供する必要がある。当業者であれば、これについては容易に判断して、必要な信号を提供することができるであろう。挿入物全体を確実に翻訳させるためには、望ましいコーディング配列のリーディング・フレームと共に『イン−フレーム』でなければならないことはよく知られている。外来性翻訳制御信号及び開始コドンは天然のものでも、合成されたものであってもよい。発現の効率は適切な転写エンハンサ要素を含むことで強化される。
【００９６】
５．配列リストの簡単な説明
配列識別番号１は、Follenzi A., Allies, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. (2000) "Gene Transfer by Lentiviral Vecotrs is Limited by Nuclear Translocation and Rescued by HIV-1 pol Sequences", Nat. Genet. 25:217-22に報告されているようなHIVから得られたHIV中央プリプリン・トラクト要素のヌクレオチド配列を提供する。配列識別番号２−６はDNAase HyperSensitive サイトで構成され、本発明の一定の実施の形態でエンハンサとして用いられるヌクレオチド配列を提供する。Lien LL, Lee Y, and Orkin SH, "Regulation of the myeloid-cell-expressed human gp91-phox gene as studied by transfer of yeast artificial chromosome clones into embryonic stem cells: suppression of a variegated cellular pattern of expression required a full complement of distant cis elements", Mol. Cell. Biol. 17(4): 2279-90 (1997)参照。
【００９７】
配列識別番号７−16は配列識別番号２−６のHS要素を発生させるために用いられるＰＣＲのヌクレオチド配列を提供する。PCRプライマの配列とHS要素配列はHuman Genome Project (contig NT 011844; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)によって公開されたヒト・ゲノム配列に基づいている。ヒト・ゲノムDNA配列内でのPCR増幅HS要素（+1gp91-phox転写開始）の位置は：HS-12 (-11503, -13244)、HS-14(-13244, -14715)、HS-26 (-25345、-26529)、HS-27 (-26529, -27656)、HS-28 (-27657, -28893)である。用いられるフラグメントはコーディングを容易にするためにその末端で制限サイト（HS-12及びHS-14；pHPX-GFPでこのサイトにクローニングを行った後5' SnaBIを再生するためのgta；HS-26、HS-27、HS-28 SalI；gcgtcgac及びXhol；ctcgagcggc）を組み込むことから、計算値よりやや大型である。
【００９８】
本発明の特定の実施の形態に組み込まれるその他の配列には、gp91-phoxに対するGenbank Accession番号NM000397（Dinauer, et al., 1987）：配列識別番号18、及び配列識別番号19の配列のポリペプチドを含めて、gp91-phox及びその類似物をコードするものなどがある。特定の実施の形態ではGenbank Accession番号M66390：配列識別番号17のヌクレオチド配列、及びGenbank Accession番号M82856：配列識別番号20のヌクレオチド配列によってコードされるCD11bプロモータによってコードされるgp91-phoxプロモータなども組み込まれる。
【００９９】
６．核酸
本発明の１つの実施の形態は、治療用遺伝子、特に上に述べたような遺伝性、あるいは後天性の造血性及びリンパ造血性不全のための治療に役立つ遺伝子をコードする核酸を転移させることを目的としている。１つの実施の形態で、核酸はそうした遺伝子の全長、ほぼ全長、あるいはそれと機能的に同等な長さをコードする。
【０１００】
従って、本発明のいくつかの実施の形態では、造血性及びリンパ造血性不全の治療は治療用核酸発現構成物を含む本発明のレンチウイルス・ベクターを造血源の細胞に投与するステップを含んでいる。この造血細胞は上記の構成物を摂取して、核酸によってコードされる治療用ポリペプチドを発現し、それによってそれらの細胞の通常の表現形を回復すると考えられる。
【０１０１】
核酸は当業者に周知のいずれの技術によってでもつくることができる。合成核酸、特に合成オリゴヌクレオチドの非限定的例としては、ホスホトリエステル、ホスフィン、あるいはホスホルアミダイト化学及び参照によって本明細書に組み込まれるEP266,032号明細書に述べられているような固相技術を用いて、あるいはそれぞれ参照によって本明細書に組み込まれるFroehler et al., 1986及び米国特許第5,705,629号明細書に述べられているようなジオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間物を経由してin vitro化学合成によってつくられる核酸などがある。酵素を用いて産生される核酸の非限定的例としては、PCRTMなどの増幅反応で酵素によってつくられるもの（例えば、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第4,683,202号明細書及び米国特許第4,682,195号明細書参照）、あるいは参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第5,645,897号明細書に述べられているようなオリゴヌクレオチドの合成によってつくられるものなどがある。生物学的につくられる核酸の非限定的例としては、生きた細胞内での遺伝子組み換え体核酸生成などがある（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるSambrook et al., 1989参照）。
【０１０２】
核酸はポリアクリルアミド・ゲル、塩化セシウム遠心分離勾配上で、あるいは当業者に周知のその他の方法（例えば、参照によって本明細書に組み入れられるSambrook et al., 1989参照）によって精製することができる。
【０１０３】
『核酸』という用語は一般的にはDNA内で見出される天然のプリンあるいはピリミジン基など（例えばアデニンA、グアニンG、チミンT、そしてシトシンC）あるいはRNA(例えばA、G、ウラシルU、及びC)などの少なくとも１つのヌクレオベースで形成されるDNA、RNA、あるいはその誘導体、あるいは類似物の１つの分子あるいはストランドを意味している。『核酸』という用語は『オリゴヌクレオチド』及び『ポリヌクレオチド』などの用語を内包している。『オリゴヌクレチド』という用語は長さが約３から約100ヌクオベースの少なくとも１つの分子を意味している。『ポリヌクレオチド』という用語は、長さが約100ヌクレオベース以上の少なくとも１つの分子を意味している。これらの定義は一般的に少なくとも１つの単一ストランド分子を意味しているが、特殊な実施の形態では、上記１つの単一ストランド分子に対して部分的、ほぼ、あるいは完全に相補的である少なくとも１つの追加的ストランドを含んでいる場合もある。従って、核酸は、１つ以上の相補的ストランドあるいはその分子の１つのストランドで構成される特定の配列の『相補物』で構成される少なくとも１つの二重ストランド分子あるいは少なくとも１つの三重ストランド分子を含んでいる場合もある。
【０１０４】
一定の実施の形態で、『遺伝子』とは転写される核酸を意味する。ここで用いられる場合、『遺伝子セグメント』とは１つの遺伝子の核酸セグメントである。一定の実施態様で、遺伝子は転写、あるいはメッセージ産生あるいは構成に関与する規制的配列を含んでいる。特殊な実施の形態においては、遺伝子は蛋白質、ポリペプチド、あるいはペプチドをコードする転写配列を含んでいる。他の特殊な態様においては、遺伝子は１つの核酸を含んでおり、及び／又はポリペプチドあるいは造血性において欠陥があったりあるいは突然変異されていて、リンパ造血不全である遺伝子のペプチド・コーディング配列をコードする。本明細書の用いられている用語法に即して言うと、『単離された遺伝子』とは、転写された核酸、規制配列、コーディング配列など、その他の自然発生の遺伝子、規制配列、ポリペプチド、あるいはペプチド・コーディング配列などそうした配列からほぼ基本的に分離されたものを意味している。この点で、『遺伝子』という用語は単純に転写されたヌクレオチド配列、あるいはその相補物を含んでいる核酸を意味する場合もある。特定の態様では、転写されたヌクレオチド配列は少なくとも１つの機能性蛋白質、ポリペプチド及び／又はペプチド・コーディング単位を含んでいる。当業者であればすぐ分かるであろうが、『遺伝子』という機能的な用語は両方のゲノム配列、RNA又はｃDNA、あるいは、１つの遺伝子の転写されていないプロモータ又はエンハンサなどを含む１つの遺伝子の非転写部分の核酸セグメントを含むより小型の遺伝子操作された核酸セグメントを含んで用いられる。このより小型の遺伝子操作された核酸セグメントは蛋白質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合蛋白質、突然変異体などを発現することができ、あるいは核酸操作技術を用いてそれらを発現するのに適している。従って、『切断された遺伝子』とは連続する核酸残基のつながりの一部を欠失した核酸配列を意味している。
【０１０５】
特定の核酸配列に基づいて種々の核酸セグメントを設計することができ、そしていろいろな長さの核酸セグメントを設計することができる。例えば、１つの配列に数値を割り当てて、第１の残基を１、第２の残基を２などとすると、すべての核酸セグメントを定義するセグメントは：
ｎ − ｎ+ｙ
とすることができる。ここでｎはその配列の最初の１から最後までの番号であり、ｙはその核酸セグメントマイナス１の長さであり、ｙがその配列の最後の番号を越えることはない。従って、例えば10-merの場合、その核酸セグメントは塩基１−10、２−11、３−12・・・に対応する。さらに15-merの場合、その核酸セグメントは塩基１−15、２−16、３−17・・・に対応する。20-merの場合、その核酸セグメントは塩基１−20、２−21、３−22・・・などに対応する。
【０１０６】
本発明による核酸は、その配列自体には関係なく、プロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化信号、制限酵素サイト、多重クローニング・サイト、コーディング・セグメントなどとその他の核酸配列と結合させて１つ、あるいは複数の核酸構成物をつくることができる。その全長はそれら核酸構成物間でかなり違う場合がある。従って、ほとんどどんな長さの核酸セグメントでも用いることができるが、全長は意図した遺伝子組み換え体核酸手順での調製あるいは使用の簡便さを考えて制限するのが好ましい。
【０１０７】
『ベクター』という用語は、その内部にそれが複製される細胞に導入するために核酸配列を挿入できる基質核酸分子を指して用いられる。本発明によるベクターは上に、あるいは本明細書の別の場所で述べたようなレンチウイルスに基づくものである。本発明によるベクターで担持される核酸分子は治療用遺伝子をコードし、遺伝子治療を行うために用いられる。当業者であれば、標準的な遺伝子組み換え技術（例えば、Maniatis et al., 1988及びAusubel et al., 1994参照。これらはいずれも引用により本明細書に組み込み）を通じてそうした治療用ベクターを構成することができるであろう。
【０１０８】
『発現ベクター』という用語は転写が可能なRNAをコードする核酸を含んだあらゆるタイプの遺伝子構成物を指している。いくつかの場合、RNA分子はその後、蛋白質、ポリペプチド、あるいはペプチドに翻訳される。他のケースで、これらの配列は、例えばアンチセンス分子あるいはリボザイムの生成において翻訳されない。発現ベクターは種々の『制御配列』を含むことができ、これは特定のホスト細胞内で遺伝子操作的に結合されたコーディング配列の転写、場合によっては翻訳に必要な核酸配列を示している。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは他の機能も果たすことができ、以下に述べるような核酸配列を含んでいる場合もある。
【０１０９】
Ａ.  多重クローニング・サイト
本発明によるベクターは多重クローニング・サイト（MCS）を含むことができ、これは複数の制限酵素サイトを含む核酸領域であり、そのどれでも標準的な遺伝子組み換え技術と組み合わせて用いてベクターを消化することができる（例えば、Carbonelli et al., 1999, Levenson etal., 1998, 及びCocea, 1997参照。これらは参照により本明細書に組み込まれる）。『制限酵素消化』とは核酸分子内の特定の位置でだけ機能を発揮する酵素による核酸分子の触媒的切断を意味している。これらの制限酵素の多くは市販されている。そうした酵素の利用は当業者には広く理解されている。しばしば、１つのベクターは外来性配列がそのベクターにライゲートできるようにするためにMCS内で切断を行い制限酵素を用いて線形化されたりフラグメント化される。『ライゲーション』とは相互に連続している場合もあればそうでない場合もある２つの核酸フラグメント間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを示している。制限酵素及びライゲーション反応を用いた技術は遺伝子組み換え技術の分野の当業者には周知である。
【０１１０】
Ｂ．  スプライシング・サイト
ほとんどの転写された真核RNA分子はRNAスプライシングを受けて、一次転写物からイントロンが除去される。ゲノム真核配列を含むベクターは蛋白質発現のための転写物の適切な処理を確実に行うためにドナー及び／又はアクセプタ・スプライシング・サイトを必要とする場合がある（例えば、Chandler et al., 1997参照。引用により、本明細書に組み込み）。
【０１１１】
Ｃ．  終止信号
本発明によるベクターあるいは構成物は通常、少なくとも１つの終止信号を含んでいる。『終止信号』あるいは『ターミネータ』はRNAポリメラーゼによるRNA転写物の所定の終止に関与するDNA配列で構成されている。従って、一定の実施の形態で、RNA転写物の生成を終わらせる終止信号が想定されている。ターミネータはin vivoで望ましいメッセージ・レベルを達成できることが必要である。
【０１１２】
真核システムでは、ターミネータ領域はポリアデニル化サイトを露出させるために新しい転写物のサイト固有切断を可能にする特殊なDNA配列を含んでいる場合もある。これは外来性ポリメラーゼに対して約200Ａ残基（ポリA）のストレッチをその転写物の３´末端に付加するように信号を発信する。このポリAテールで修飾されたRNA分子はより安定しているようであり、より効率的に翻訳される。従って、真核生物を関与させる他の実施の形態で、ターミネータがRNAの切断に関する信号を含んでいることが好ましく、そのターミネータ信号がそのメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。このターミネータ及び／又はポリアデニル化サイト要素はメッセージ・レベルを強化し、同時に、そのカセットから他の配列へのリード・スルーを最小限化するように機能することができる。
【０１１３】
本発明での使用が考えられるターミネータは、本明細書に述べられているかあるいは当業者に周知のすべてのターミネータを含んでおり、その中には、例えば、ウシ成長ホルモン・ターミネータなどの遺伝子の停止配列、あるいは例えばSV40ターミネータなどのウイルス性終止配列などがある。いくつかの実施の形態では、終止信号は、例えば配列トランケーションなどにより転写可能なあるいは翻訳可能な配列が含まれていない場合もある。
【０１１４】
Ｄ．  ポリアデニル化信号
真核性遺伝子発現においては、通常転写物の適切なポリアデニル化が行われるようにするためのポリアデニル化信号が用いられる。このポリアデニル化信号の性質は本発明をうまく実施する上で決定的に重要であるとは考えられないが、そうした配列を用いてもよい。そうした実例としては、種々の標的細胞で機能するのに適しており、そうした機能を果たすことが知られているSV40ポリアデニル化信号あるいは仔ウシ成長ホルモン・ポリアデニル化信号などがある。ポリアデニル化は転写物の安定性を強化したり、あるいは細胞質移送をより容易にすることができる。
【０１１５】
Ｅ．  複製の発生源
ホスト細胞内で本発明によるベクターが増殖できるようにするために、１つ以上の複製発生源サイト（しばしばoriと表記される）を含むことができ、これは、その場所で複製が開始される特殊な核酸配列である。あるいは、ホスト細胞がイースト菌の場合は、自動複製配列（ARS）を用いることもできる。
【０１１６】
Ｆ．  選択可能そしてスクリーニング可能なマーカー
本発明の一定の実施の形態では、本発明のレンチベクタによって形質導入された細胞を、発現ベクター内にマーカーを含むことによってin vitroあるいはin vivoで識別することができる。そうしたマーカーは形質導入された細胞に識別可能な変化をもたらして、その発現ベクターを含む細胞を簡単に識別できるようにしてくれる。一般的に、選別可能なマーカーは選別を可能にするような性質を付与するものである。ポジティブな選別可能マーカーはそのマーカーの存在そのものが選別を可能にしてくれるものであり、ネガティブな選別可能マーカーは、その存在がその選別を阻むものである。ポジティブな選別可能マーカーの1例は薬品抵抗マーカーである。
【０１１７】
通常、薬品選別マーカーを含ませるのは形質転換細胞のクローニング及び識別に役立ち、例えば、ネオマイシン、プロマイシン、ヒグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、そしてヒスチジノルに抵抗性を付与する遺伝子構成物は有益な選別可能マーカーである。条件の適用によって形質転換細胞の判別を可能にしてくれる表現形を付与するマーカーに加えて、その根拠が比色分析であるGFPなどのスクリーニング可能なマーカーを含むその他のマーカーの利用も考えられる。あるいは、ヘルペス・シンプレックス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（tk）あるいはクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（CAT）などのスクリーニング可能な酵素を用いることもできる。当業者であれば、免疫学的マーカーを、多くの場合FACS分析と組み合わせてどのように用いるかについては簡単に分かるであろう。それが遺伝子生成物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限り、どのマーカーを用いるかはそれほど重要な問題ではない。さらに、選別可能及びスクリーニング可能なマーカーの例は当業者には周知である。
【０１１８】
７．ホスト細胞
本明細書では、『細胞』、『細胞株』及び『細胞培養体』とは相互に取替え可能な意味で用いることができる。これらの用語のすべては、その後代細胞も含んでおり、これは後の世代の細胞の一部、あるいはすべてを意味している。意図的な、あるいは意図していない突然変異が起きるので、すべての後代細胞がまったく同じ訳ではない。異種核酸配列の発現との関連では、『ホスト細胞』とは原核あるいは真核性細胞を意味しており、それはベクターを複製できたり、あるいは本発明のベクターによってコードされる異種核酸を発現できるいずれの形質転換可能な生物も含んでいる。ホスト細胞はベクターの受容体として用いることができ、従来も用いられてきた。ホスト細胞は『トランスフェクト』あるいは『形質転換』されることができ、これは外来性核酸がホスト細胞内に移送あるいは導入されるプロセスを意味している。形質転換された細胞は一次細胞とその後代細胞を含んでいる。本明細書では、『遺伝子操作された』及び『遺伝子組み換え体』細胞あるいはホスト細胞という用語は、例えば、治療用遺伝子構成物を担持する本発明のレンチベクタなどの外来性核酸配列が導入された細胞を示す意図で用いられている。従って、遺伝子組み換え体細胞とは遺伝子組み換えで導入された核酸を含んでいない天然の細胞とは識別可能である。
【０１１９】
いくつかの実施の形態では、RNAあるいは蛋白質配列が同じホスト細胞内で他のRNA又は蛋白質配列と同時に発現される可能性も想定されている。共発現は、ホスト細胞を２つ以上の異なった遺伝子組み換え体ベクターで共トランスフェクトすることで行わせることができる。あるいは、１つの遺伝子組み換え体ベクターを構成してRNAに対する複数の異なったコーディング領域を含むようにし、それらを上記１つのベクターでトランスフェクトされたホスト細胞内で発現させることもできる。
【０１２０】
ホスト細胞は望ましい結果がそのベクターの複製なのか、あるいはそのベクターによってコードされる核酸配列の一部なのか全体なのかによって、原核生物あるいは真核生物のいずれからでも誘導することができる。ホスト細胞としてはいろいろな細胞株及び培養体を用いることができ、それらは、生きた培養体及び遺伝子材料の保存機関として機能するAmerican Type Culture Collection (ATCC)（www.atcc.org）を通じて入手することができる。この発明で用いられるホスト細胞のいくつかの例としては、ウイルス・パッケージング細胞、ウイルス・プロデューサ細胞、293T細胞、ヒト血球前駆体細胞、ヒト血球幹細胞、CD34+細胞、CD4+細胞などがある。
【０１２１】
Ａ.組織と細胞
組織は核酸伝達組成物及び／又は追加的な作用因子で形質転換される、あるいはそれと接触させられる１つ又は複数の細胞を含んでいる。この組織は１つの生物の一部であっても、あるいはそれから切り離されていてもよい。いくつかの実施の形態で、組織及びそれを構成している細胞は、血液（たとえば（ヒト血球前駆体細胞、ヒト血球幹細胞、CD34+細胞、CD4+細胞などの）血球細胞、リンパ球及びその他の血液系細胞）、骨髄、脳、幹細胞、血管、肝臓、肺、骨、乳房、軟骨、頚部、結腸、角膜、胚、子宮内膜、内皮、上皮、食道、顔面、繊維芽、甲状腺濾胞腺、膠細胞、杯細胞、腎臓、リンパ節、筋肉、ニューロン、卵巣、すい臓、抹消血液、前立腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣などである。
【０１２２】
Ｂ.生物
いくつかの実施の形態では、ホスト細胞あるいは組織は少なくとも１つの生物の体内にあってもよい。いくつかの実施の形態で、その生物とはヒト、霊長類、あるいはネズミである。他の実施の形態で、その生物とはこの分野の当業者なら理解できるように真核生物であっても、あるいは（ユーバクテリア、原始細菌などの）原核生物であってもよい（例えば、ウェブページhttp://phylogeny.arizona.edu/tree/phylogeny.html 参照）。本発明によるいくつかのレンチベクタは原核あるいは真核細胞内で増幅されたり、あるいは発現されたりすることができるようにする制御配列を有している場合もある。当業者であれば上に述べたようなホスト細胞のすべてを培養してそれらを維持したり、あるいは増殖できるようにするための条件については容易に理解するであろう。本発明のレンチベクタを大規模に生産したり、それらのレンチベクタによってコードされる核酸、及びそれらと同系のポリペプチド、蛋白質、あるいはペプチドの生産を可能にするような技術及び条件も分かるであろう。これらの一部は治療用遺伝子、あるいは遺伝子治療に用いられる蛋白質である。
【０１２３】
Ｃ．注射用組成物及び医薬品製剤
本発明のレンチウイルス・ベクター組成物を用いた遺伝子治療を達成するためには、通常はそれが必要としている細胞を治療用遺伝子を含むレンチウイルス・ベクターと接触させる。この細胞はさらにそうした遺伝子治療を必要とする例えばヒトなどの生物の体内に入れられる。投与のルートは疾病の位置や性質によって当然変わり、静脈、動脈、皮膚内、経皮、筋肉内、鼻腔内、皮下、気管内、腹膜内、腫瘍内注射、潅流、そして洗浄などの方法を用いることができる。これらの細胞は生物から取り出されて、in vitroでレンチベクタに露出させて、その後で体内に戻される場合もよくある。
【０１２４】
本発明によるレンチウイルス性核酸構成物の注入は、発現構成物が注入に必要な針の特定のゲージを通じて送り込まれる限り、注射器あるいはその他溶液の注入に用いられるどんな方法を用いても差し支えない。新しい針なしの注入システムについても開示されており（米国特許第5,846,233号明細書）、これは溶液を保持するためのアンプル・チェンバーを形成するノズルとその溶液をノズルから伝達サイトに押し出すためのエネルギー装置を有している。所定の量の溶液をどんな深さにでも、そして複数回注入できるようにする遺伝子治療での使用を目的とした注射システムについても開示されている（米国特許第5,846,225号明細書）。
【０１２５】
遊離塩基あるいは薬学的に許容される塩としての核酸溶液は水中で、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適当に混合することで調製することができる。グリセロル、液体ポリエチレン・グリコル、そしてそれらの混合物はオイル中で分散液をつくることも可能である。保存及び使用のための通常の条件下で、これらの製剤は微生物の成長を防ぐために保存剤を含んでいる。注射剤として使用するのに適した薬品形態としては滅菌水溶液あるいは分散剤、そして滅菌された注射可能な溶液あるいは分散剤をその場で製剤化するための滅菌粉末などである（米国特許第5,466,468号明細書参照。参照によってその全体を本明細書に組み込み）。すべての場合に、その形状は滅菌された状態でなければならず、注射のために容易に外部に出て行けるような流体でなければならない。それは製造及び保存条件下で安定していなければならず、バクテリアや黴などの微生物による汚染作用から護られていなければならない。基剤は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロル、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び／又は野菜オイルなどを含む溶液あるいは分散剤であってもよい。レシチンなどのコーティング剤を用いたり、分散液の場合であれば必要な粒子サイズを維持したり、あるいは界面活性剤を用いることで適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の阻止は例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサルなどの種々の抗菌剤と抗黴剤を使用することで実施することができる。多くの場合、例えば砂糖や塩化ナトリウムなどの等張剤を含んでいることが好ましい。注射用組成物の時間をかけた吸収はその組成物内で、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を用いることで実現することができる。
【０１２６】
水溶液にいれて非経口投与を行うためには、例えば、その溶液は必要があれば適切に緩衝化されていなければならず、その液体希釈剤は十分な食塩あるいはグルコースを用いて等張化されていなければならない。これらの特殊な水溶液は静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、そして腹膜内投与を行うために特に適している。これとの関連で、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示を参考にすれば当業者には容易に分かるであろう。例えば、1回分の用量を1mlの等張性NaCl溶液に溶解して、1000mlの皮下注入液に加えるか、あるいは注入が予定されている箇所に注入する（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, ページ1035−1038及び1570−1580参照）。治療の対象となる個体の状態に応じて、用量に一定の変化が生じることは当然であろう。投与に責任を有する人は、どんな場合でも、個々の個体に合わせて必要な容量を判断することになる。さらに、ヒトに投与する場合、製剤はFDA Office of Biologics standards が定めるような無菌性、発熱性、そしてその他の一般的安全性及び純度基準を満たしていなければならない。
【０１２７】
無菌注射液は必要な量の活性化合物を上に挙げたようなその他の成分のうちの必要なものと共に適切な溶剤に組み込み、その後でろ過滅菌をすることで調製することができる。一般的には、分散剤は種々の滅菌活性成分を基礎分散媒及びその他の上に列挙したような必要な成分を含む無菌ビークルに組み込むことによってつくられる。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び冷凍乾燥で、これらの方法は活性成分の粉末と事前に滅菌ろ過されたその溶液からの追加的な望ましい成分の粉末をつくりだしてくれる。
【０１２８】
ここで開示されている組成物は中性あるいは塩形状で製剤化することができる。薬学的に許容される塩とは、酸添加塩、そして、例えば、塩酸あるいはリン酸などの無機酸や、酢酸、タルタル酸、そしてマンデル酸などの有機酸を用いてつくられる塩である。遊離カルボキシル基でつくられる塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、あるいは水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。製剤化したら、溶液は用量製剤の場合と同様の方法で、そして治療的に有効な量で投与される。この製剤は注射液や薬品放出カプセルなどの種々の用量形態で簡単に投与することができる。
【０１２９】
本明細書で用いられる場合、『基剤』とは溶剤、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び抗黴剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、基質溶液、懸濁液、コロイドなどのいずれか、あるいはそれらのすべてを含んでいる。薬学的に活性な物質のためにこうした媒体及び薬剤を使用することはこの技術分野では周知のことである。従来用いられている媒体あるいは薬剤が活性成分と共存できない場合を別にすれば、治療用組成物でのその使用も考えられる。それらの組成物には補助的な活性成分も組み入れることができる。
【０１３０】
『医薬品的に受け入れ可能な』とか『薬学的に許容される』という表現は、ヒトに投与した場合に、アレルギー性あるいはそれに類似した望ましくない反応を引き起こさない分子集合あるいは組成物を意味している。活性成分として蛋白質を含んでいる水性組成物の調製もこの技術分野ではよく知られている。通常、そうした組成物は液体溶液かあるいは懸濁液のいずれかの形態の注射剤としてつくられるが、注射前の液体に溶液あるいは懸濁液とするのに適した固体形状での調製も可能である。
【０１３１】
『接触させられる』あるいは『露出される』という表現は、細胞に関して用いられる場合は、それによって治療用レンチウイルス・ベクターが標的細胞に伝達されるプロセスを示すために用いられる。
【０１３２】
個別の硬い、そしてアクセス可能な腫瘍に対する遺伝子治療の場合、腫瘍内注射あるいは腫瘍脈管構造への注射が特に考えられる。局所的、領域的、あるいは全身投与も適切であろう。４cm以上の腫瘍に対しては、投与される量は４−10ml（好ましくは10ml）程度であり、４cmより小さな腫瘍に対しては、約１−３ml（好ましくは３ml）の体積が用いられる。1回の容量として提供される複数回の注射は約0.1−約0.5mlである。ウイルス粒子は腫瘍に対して、１cm程度の間隔をおいて複数回注射することで好適に接触させることができる。血液学的悪性腫瘍に対しては全身投与が好ましい。
【０１３３】
適切な場合は連続投与も用いることができる。注射器あるいはカテーテルによる投与が好ましい。こうした連続投与は治療開始から約１−２時間、約２−６時間、約６−12時間、約12−24時間、約１−２日間、約１−２週間、あるいはもっと長い期間行われる場合もある。通常、連続的潅流による治療用組成物の用量は１回あるいは複数回の注射で投与される量と同じであり、その措置が行われる期間中に調節することができる。
【０１３４】
治療処方も同様に多様であり、疾病のタイプ、疾病組織の位置、そして患者の健康及び年齢などの要素にも多くの場合依存している。本発明のレンチウイルス・ベクターに用いられる治療用製剤の周知の薬効及び毒性に基づいてそうした決定を行うには、医師が最も適しているであろう。
【０１３５】
治療には種々の『単位用量』が用いられる場合もある。単位用量は本発明によるレンチウイルス・ベクターを含む治療用組成物を所定の量だけ含んでいる量と定義される。投与されるべき量及び特定の投与経路や製剤状態については、臨床の現場にいる人々には周知であろう。単位用量は必ずしも１回で投与されなければならない訳ではなく、一定の期間に複数回注入することによって投与されてもよい。本発明による単位用量はHelaあるいは293などの細胞株上でベクターを滴定して判定した場合の形質導入単位(T.U)として記述することができる。この単位用量は、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013 T.Uあるいはそれ以上の範囲である。
【０１３６】
（実施例）
以下の実施例は本発明の好ましい実施の形態を示すために含められるものである。いかに示される実施例に開示されている技術は本発明の実施においてよく機能することが本発明者によって見出された技術を示しているものであって、従って、その実施のための好ましい形態を示すものであるとみなし得ることを当業者は理解すべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、ここに開示されている具体的な実施の形態に多くの変更を施すことができること、そして本発明の精神と範囲を逸脱せずに同様の、あるいは類似の結果を達成できることは理解すべきである。
【０１３７】
Ａ.  実施例１−３に用いられている素材と方法
１．ベクターの調製
小胞口内炎ウイルス(VSV)Gエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化されたHIV誘導ベクターの生成を３つのプラスミドを293T上皮細胞を用いてNaldini et al 1996aに述べられている方法に従って行った。用いられたHIV誘導内包構成物はpCMVΔR8.91で、これはHIV-1 Gag及びPol前駆体と調節蛋白質Tat及びRev（Zufferey et al., 1997）をコードするものである。VSV GはｐMD.Gから発現された。
【０１３８】
これらのHIVベクター・プラスミドは最初のpHR'バックボーン（Naldini et al., 1996a）からの誘導体で、以下の修飾が行われた。自己不活性化ベクターは上に述べたSIN-18ベクターからつくられたもので、3' LTRのU3領域で、nt-418からnt-18までの欠失を含んでおり、転写性活性配列のすべてがなくなっていた（Zufferey et al., 1998）。簡単に言うと、pHR'SINプラスミドは以下のように発生された。ポリプリン・トラクトと3' LTRを含むKpnl-XbalフラグメントをpHR'プラスミドから切り取って、pUC18の対応するサイトにサブクローンさせた。このプラスミドをEcoRVで完全に、一部はPvullで消化させて自己ライゲートさせた。U3の400ヌクレオチドが欠失したプラスミドが回収された。Xholリンカーをその欠失プラスミドのEcoRIサイトに挿入して、Xhol-Xbalフラグメントを対応する酵素で消化させたｐHR'CMVlacZプラスミド内にクローン・バックした。他のすべてのSIN-18プラスミドはlacZに対するレポータ遺伝子（ルシフェラーゼ、GFP及びNeoをコードする）を置換して得た。用いられたｐHR'ベクター・プラスミドは、ポリプリン・トラクトの上流のNefコーディング配列から118のヌクレオチドを取り去るXhol-Kpnl欠失、及び3' LTRの上流のヒト配列の1,456ヌクレオチドが欠失している点が、最初に報告されたプラスミド（Naldini et al., 1996）とは違っていた。このヒト配列はHXB2プロウイルス・ゲノムの最初のクローニングで残っていたものである。これら２つの欠失はベクターの力価及び分割293T細胞の形質導入遺伝子発現には影響を及ぼさなかった。
【０１３９】
EF1アルファの挿入は、EF1-GFP挿入物を含むClaI-BamHIカセットをpHR'-GFP-W-SINのClaI-BamHI site(Zufferey et al., 1999)内に挿入してpHR-EF1-GFP-W-SINベクターをつくりだすことによって行われた。このベクターからの誘導体はいくつかの機能的な違いを有していた。その機能的な違いとはEF-1アルファ−短プロモータ、3' LTRのloxPサイト、そしてｃPPTである。3' LTRのloxPサイトを形質導入遺伝子内で5' LTRに複製すると、追加的に発現されるCreリコンビナーゼの存在下で、一体化したプロウイルスを取り除くことができる。しかしながら、loxPサイトとCre媒介刺激がgp91-phoxプロモータ活性に必要ではなく、血球肝細胞に基づく臨床実験で行われる可能性のあるそれらベクターの適用においても必要であったり、用いられたりすることはないであろう。pHR-EF1-GFP-(+/-)W-SINに存在しているEF-1アルファとpHPT-GFP及びpWPT-GFPに存在しているEF-1アルファ・プロモータとの間の違いは、その短い方がイントロンを含んでおらず、そのベクターを小型にしていることである。
【０１４０】
図５A から図５Dまでに示されているマップはプラスミド構成物pHPT-GFP、pWPT-GFP、pHPP91-GFP及びpWPP91-GFPを示している。
【０１４１】
293T細胞内で燐酸カルシウムによってプラスミドを一過的にトランスフェクトさせた後、上澄み液を取り出して、無血清Cellgro(登録商標)SCGM媒体（Cellgenix, Germany）内に再懸濁させて0.45ミクロンSpinXフィルターで濾過したサクロース勾配を用いて超遠心分離によって濃縮させた。ウイルス・ストックは−70℃で保存し、その力価は前にも述べたように（Zufferey et al., 1997）HeLa細胞内に形質導入を行いGFP発現をフロー・サイトメトリ分析で判定した。それらの力価は１mlあたり、５ x 10７から10８HeLa形質導入単位（TU）の範囲であった。
【０１４２】
２．CD34＋細胞の精製と形質導入
臍帯血(CB)サンプルを機関のガイドラインに従って入手し、CD34＋細胞をこれまでに述べられている手順（Arrighi et al., 1999）に従って精製した。要約的に述べると、Ficoll-Paque(Pharmacia, Uppsala, Sweden)勾配遠心分離で処理した後に回収したCB単核細胞を抗CD34-M450 Dynabeads (Dynal, Norway)を用いて、氷上でメーカーの指示通りに培養した。未結合の細胞を除去するために何回か洗浄を行った後、CD34＋細胞をキット内に含まれた"Detach-a-bead"を用いて37℃の温度下で15分間培養することによってビーズから回収した。細胞をすぐ洗浄して、フロー・サイトメトリで分析した。精製されたCD34+細胞の割合は89±7.0であった。形質導入を行うために、105個の細胞を、抗生物質（Gibco BRL、Life Technologies LTD、Paisley, Scotland, U. K.）、10-4Mジチオトレイオル(Fluka Biochemika, Buchs, Switzerland)及びTPO (10ng/ml)とSCF（50ng/ml）、Flt3L(50ng/ml)で補強したCellgro(登録商標)SCGM培養液100μlを入れた96ウェル・プレートに播種した。一晩培養した後、ウェル１つあたり（通常）106、（用量応答分析の場合は）105から５ x 106のHeLa形質導入ユニット（TU）のベクターを加えて、TPOを含んでいるCellgro(登録商標)SCGM培養液で体積を200μlに調節した。24時間後、細胞を洗浄して、抗生物質、10-4Mジチオトレイオル及びTPO (10ng/ml)とSCF（50ng/ml）、Flt3L(50ng/ml)で補強したCellgro(登録商標)SCGM培養液400μlに希釈して３日間培養した。細胞はGFP及びCD34発現に関して直接分析するか、あるいは３つの成長因子でさらに培養した。
【０１４３】
３．サイトカイン
すべてのサイトカインは遺伝子組み換えによるヒトの素材であり、Reprotech社（London, U. K.）から入手したものである。
【０１４４】
４．抗体及び免疫反応体
すべての抗体はBecton Dickinson Pharmingen (USA)から入手したものである。抗CD34 mlgG被覆M450 DynabeadsはDynal A/S(Oslo, Norway)から入手したものである。
【０１４５】
５．In vitroでの分化及びINF-ガンマ刺激
分化は単球性分化に関してGM-CSF及びSCFの存在下でin vitroで行われ、G-CSFあるいはG-CSFの存在下で３週間、そして顆粒球分化に関してはSFCの存在下で行われた。分化された細胞をINF-γ(1000U/ml)で６日間刺激をあたえ、PE-接合モノクローナル抗体でラベルして、FACSを用いてPEポジティブ群でのGFP発現を分析した。数字は４分区間での細胞の割合を示している。
【０１４６】
６．フロー・サイトメトリー分析
細胞は、多少修正を加えたFACScalibur (Becton-Dickson)上で、開示されている方法（Arrighi et al., 1999）に従って分析した。GFPに対してはFL-1を、PE-ラベルMAbsに対してはFL-2、そしてPercP-ラベルMabsに対してはFL-3をそれぞれ用いた。細胞懸濁液は分析を行う前に0.5％パラホルムアルデヒドに調整した。データをScripps Institute (La Jolla, CA)のJ. Trotterが作成したWINMDIソフトウエア及びCellQuestソフトウエア（Becton-Dickinson）を用いて分析した。
Ｂ．実施例１−４
【実施例１】
【０１４７】
[gp91-phoxプロモータの制御下で発現カセットを含むHIVに基づくレンチベクタを用いてヒト血球前駆体の形質導入を行うと単球及び顆粒球での限定的発現がもたらされた。]
それぞれpWPT-GFP及びpHPT-GFPレンチウイルス・ベクター内で、食細胞NADPHオキシダーゼ・プロモータ（１）のgp91-phoxサブユニットの1540bpフラグメントとEF-1αプロモータを置換することで、pWPP91-GFP (WPREあり)とpHPP91-GFP(WPREなし)レンチウイルス・ベクターをつくった。pWPT-GFPとpHPT-GFPの両方とも、SIN(自己不活性化)レンチウイルス・ベクターであり、標的細胞の形質導入効率を向上させるために、中央ポリプリン・トラクト配列（cPPT）を含んでいる。前に述べた標準的な方法で遺伝子組み換え体レンチベクタをつくり、100倍に濃縮し、ヒト血球CD34+前駆体／幹細胞（HSC）の形質導入のために用いた。Salmon P, Kindler V, Ducrey O, Chapuis B, Zubler RH, Trono D., "High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors," Blood 96(10):3392-8(2000)参照。この資料は参照により本明細書に組み込み。
【０１４８】
UCB HSC形質導入の高い割合、最大80％は中央ポリプリン・トラクトがEF1-アルファ−GFP発現カセットより上流に挿入されたレンチベクタによって達成された。GFPポジティブ細胞のかなりの数が形質導入HSCのin vitro（サイトカイン・カクテル）あるいはin vivo (NOD/SCIDマウス移植)分化の後でも保持されていた。
【０１４９】
gp91-phoxGFPカセットを担持したレンチベクタでHSCを形質導入して、その後で、in vitro (サイトカイン・カクテルで)、あるいはin vivo（亜致死レベルまで放射線照射したNOD/SCIDマウス内に移植）したところ、成熟した単球及び顆粒球だけに限定されたGFP発現がもたらされた。成熟した好中球内でのgp91-phoxプロモータからのGFP発現は、WPREを挿入することで増強され、特異性は失われなかった。
【０１５０】
WPREを有する、あるいはWPREを有さないレンチベクタによってgp91-phoxプロモータをHP/SCに送り込むと、in vitroで成熟した好中球内でINF-γにその生理学的反応性が示された（図２）。
【実施例２】
【０１５１】
[HSエンハンサ要素はまだらな発現のレベルを高くしたり、低くしたりする。]
種々のリンパ−血液不全における遺伝子的措置における重要な問題は、分化した細胞の適当なサブセットにおける治療に役立つと推定される形質導入遺伝子の発現のレベルである。より高いレベルの、そしてまだらでない遺伝子発現を達成するために、４つのDNAase超高感度サイト(HS)内のgp-phox遺伝子から30kb上流のgp91-固有エンハンサ配列をレンチウイルス・ベクター内にクローンした。
【０１５２】
第一に、ウイルス・ゲノムのサイズを減らすために、gp91-プロモータの1540bpフラグメントを機能的に同等な0.5kbフラグメント（Skalnik, et al., 1991）で置換して、pHP500-GFPベクターを発生させた（図６A）。クローニングし易くするために、複数の独特の制限サイトを導入して、(エンハンサのクローニングにその中央位置と機能性を保持する) cPPTの両方のサイトでエンハンサの導入をできるようにして、pHPX-GFPベクターを発生させた（図６B）。
【０１５３】
４つの個別のHSサイトをカバーしているフラグメントを、ゲノムDNAをテンプレートとして用いてPCRで発生させた。PCRプライマの配列はHuman Genome Project (conting NT 011844; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)に公開されているヒト・ゲノム配列に基づいていた。配列識別番号２−16参照。gp91-phoxHSサイトの場所は公表されたデータに基づくものであった。Lien LL, Lee Y and Orkin SH (1997)参照。特定のサイトから分岐している約１−1.5kbの配列を増幅して、レンチベクタにクローンして、最終的にpHPHS-GFPを発生させた。配列識別番号２−16参照。WPRE配列をもっているものも発生された（pWPHS-GFP、図６C）。HSCを形質導入し分化させた後、この中のHS要素とその他の構成を含めると、その形質導入遺伝子のより高いレベルに全体的発現あるいは、まだら性がより低い発現が得られる。
【実施例３】
【０１５４】
[慢性肉芽腫病(CGD)治療の発展]
慢性肉芽腫病はNADPHのサブユニットをコードするgp91-phox遺伝子の欠陥との強い関連性を有している（Dinauer et al., 1987）。Ｘ結合慢性肉芽腫病はCDGを有する患者の約60％において欠陥を有している。例えば、Malech HL., "Progress in gene therapy for chronic granulomatous disease," J. Infect. Dis. 179 (Supple. 2): S 318-25, 1999参照。この治療に対する１つのアプローチはgp91-phoxの少なくとも１つの機能的コピーをその患者に導入するように適切な細胞を形質導入するステップを含むものとなろう。上に述べたように、このタイプの治療はその患者からの細胞の除去、ex vivoでの形質導入、そしてそれらの細胞の患者体内への再導入のステップを含むであろう。
【０１５５】
CD34細胞をCGD患者から分離して、gp91-phox遺伝子、例えば、配列識別番号18、あるいは配列識別番号19のアミノ酸配列の機能性ポリペプチドをコードするいずれかのヌクレオチド配列で構成されるヌクレオチドの配列によってコードされるgp91-phox遺伝子を含む本発明のベクターで形質導入する。そのベクター内に組み込まれたgp91-phoxプロモータによる制御を通じて、gp91-phoxポリペプチドの適切な発現を得ることができる。上に述べたようにWPRE要素及びHSエンハンサを含めることで、より増強された発現が得られるであろう。
【０１５６】
細胞をテスト対象、例えばSCID-NODマウス、あるいは患者に導入する。この方法の効率のさらなる評価は、マウスの適切なノック−アウト系統に形質導入された細胞を移植することによって行われる。
【実施例４】
【０１５７】
[白血球接着不全(LAD)の治療方法]
１つの治療方法は、骨髄単球性白血球インテグリンの少なくとも１つの機能性コピーを患者の体内に導入するための適切な細胞を形質導入するステップを含むであろう。上に述べたように、このタイプの治療はその患者からの細胞の取り出し、ex vivoでの形質導入、そしてそれらの細胞の患者体内への再導入のステップが含まれるであろう。
【０１５８】
CD34細胞をLAD患者から分離して、上記インテグリン遺伝子の機能性コピーを担持する本発明のベクターで形質導入する。そのベクターに組み込まれたCD11bプロモータによる制御でインテグリン・ポリペプチドの適切な発現が得られるであろう。CD11bプロモータは配列識別番号20のポリヌクレオチド配列によってコードされるプロモータから選択される。Hickstein et al., 1992参照。上に述べたように、WPRE要素及びHSエンハンサを含めることで、より増強された発現が得られるであろう。
【０１５９】
本明細書に開示され、権利が請求されているすべての組成物及び／又は方法は、本開示に照らせば、過重な実験を行わなくても作成、実施できるものである。本発明の組成物及び方法について好ましい実施の形態を述べたが、それら組成物及び／又は方法、及びここで述べられている方法のステップの順番について、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱せずに変更を加えることができることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関係している一定の薬剤をここに述べてある薬剤と交換しても同じ、あるいは同様の結果を得られることは明らかであろう。当業者には自明のそうした置換、変更のすべては添付請求項に定義されている本発明の精神、範囲、及び概念に含まれるものである。
【０１６０】
参考文献
以下の参考文献は、それらが典型的な処置あるいはここで述べられた他の補足的な詳細を提供する範囲で、ここに言及することにより具体的に盛り込まれるものである。
【０１６１】
米国特許第4,682,195号明細書
米国特許第4,683,202号明細書
米国特許第5,466,468号明細書
米国特許第5,645,897号明細書
米国特許第5,686,279号明細書
米国特許第5,705,629号明細書
米国特許第5,846,225号明細書
米国特許第5,846,233号明細書
米国特許第5,925,565号明細書
米国特許第5,928,906号明細書
米国特許第5,935,819号明細書
米国特許第5,994,136号明細書
米国特許第6,013,516号明細書
米国特許第6,136,597号明細書
米国特許第6,165,782号明細書
米国特許第6,207,455号明細書
米国特許第6,218,181号明細書
米国特許第6,218,186号明細書
EP266,032号明細書
【０１６２】
・Akkina, Walton, Chen, Li, Planelles, Chen, "High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G" J. Virol., 70:2581-2585, 1996.
・Almendro et al., "Cloning of the human platelet endothelial cell adhesion molecule-1 promoter and its tissue-specific expression. Structural and functional characterization," J. Immunol., 157(12):5411-5421, 1996.
・An, Wersto, Agricola, Metzger, Lu, Amado, Chen, Donahue, "Marking and gene expression by a lentivirus vector in transplanted human and nonhuman primate CD34(+) cells," J. Virol., 74:1286-1295, 2000.
・Angel, Bauman, Stein, Dellus, Rahmsdorf, and Herrlich, "12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate Induction of the Human Collagenase Gene is Mediated by an Inducible Enhancer Element Located in the 5' Flanking Region, "Mol. Cell. Biol., 7:2256, 1987a.
・Angel, Imagawa, Chiu, Stein, Imbra, Rahmsdorf, Jonat, Herrlich, and Karin, "Phorbol Ester-Inducible Genes Contain a Common cis Element Recognized by a TPA-Modulated Trans-acting Factor," Cell,49:729, 1987b.
・Arrighi, Hauser, Chapuis, Zubler, Kindler, "Long-term culture of human CD34(+) progenitors with FLT3-ligand, thrombopoietin, and stem cell factor induces extensive amplification of a CD34(-)CD14(-) and CD34(-)CD14(+) dendritic cell precursor," Blood, 93:2244-2252, 1999.
・Atchison and Perry, "Tandem Kappa Immunoglobulin Promoters are Equally Active in the Presence of the Kappa Enhancer: Implications for Model of Enhancer Function," Cell, 46:253, 1986.
・Atchison and Perry, "The Role of the Kappa Enhancer and its Binding Factor NF-kappa B in the Development Regulation of Kappa Gene Transcription," Cell, 48:121, 1987.
・Banerji et al., "Expression of a Beta-Globin Gene is Enhanced by Remote SV40 DNA Sequences," Cell, 27:299, 1981.
・Benerji, Olson, and Schaffner, "A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy-chain genes," Cell, 35:729, 1983.
・Berkhout, Silverman, and Jeang, "Tat Trans-activates the Human Immunodeficiency Virus Through a Nascent RNA Target," Cell, 59:273, 1989.
・Bhatia, Bonnet, Kapp, Wang, Murdoch, Dick, "Quantitative analysis reveals expansion of human hematopoietic repopulating cells after short-term ex vivo culture," J. Exp. Med, 186:619-624, 1997.
・Blanar, Baldwin, Flavell, and Sharp, "A gamma-interferon-induced factor that binds the interferon response sequence of the MHC class I gene, H-2Kb," EMBO J., 8:1139, 1989.
・Blomer, Naldini, Kafri, Trono, Verma, Gage, "Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector," J. Virol., 71:6641-6649, 1997.
・Bodine and Ley, "An enhancer element lies 3' to the human a gamma globin gene," EMBO J., 6:2997, 1987.
・Boshart, Weber, Jahn, Dorsch-Hasler, Fleckenstein, and Schaffner, "A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus," Cell, 41:521, 1985.
・Bosze, Thiesen, and Charnay, "A transcriptional enhancer with specificity for erythroid cells is located in the long terminal repeat of the friend murine leukemia virus," EMBO J., 5:1615, 1986.
・Braddock, Chambers, Wilson, Esnouf, Adams, Kingsman, and Kingsman, "HIV-I Tat activates presynthesized RNA in the nucleus," Cell, 58:269, 1989.
・Brown, Tiley, Cullen, "Efficient polyadenylation within the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat requires flanking U3-specific sequences," J. Virol., 65:3340-3343, 1991.
・Bulla and Siddiqui, "The hepatitis B virus enhancer modulates transcription of the hepatitis B virus surface-antigen gene from an internal location," J. Virol., 62:1437, 1986.
・Campbell and Villarreal, "Functional analysis of the individual enhancer core sequences of polyoma virus: cell-specific uncoupling of DNA replication from transcription," Mol. Cell. Biol., 8:1993, 1988.
・Campere and Tilghman, "Postnatal repression of the alpha-fetoprotein gene is enhancer independent," Genes and Dev., 3:537, 1989.
・Campo, Spandidos, Lang, Wilkie, "Transcriptional control signals in the genome of bovine papilloma virus type 1," Nature, 303:77, 1983.
・Carbonelli et al. "A plasmid vector for isolation of strong promoters in E. coli," FEMS Microbiol Lett. 177(1)75-82, 1999.
・Case, Price, Jordan, Yu, Wang, Bauer, Haas, Xu, Stripecke, Naldini, Kohn, Crooks, "Stable transduction of quiescent CD34(+)CD38(-) human hematopoietic cells by HIV-1 based lentiviral vectors," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2988-2993, 1999.
・Calander and Haseltine, "Glucocorticoid Regulation of Murine Leukemia Virus Transcription Elements is Specified by Determinants Within the Viral Enhancer Region," J. Virology, 61:269, 1987.
・Calander, Hsu, and Haseltine, "Regulatory Elements Within the Murine Leukemia Virus Enhancer Regions Mediate Glucocorticoid Responsiveness," J. Virology, 62:1314, 1988.
・Chandler, Maler, and Yamamoto, "DNA Sequences Bound Specifically by Glucocorticoid Receptor in vitro Render a Heterlogous Promoter Hormone Responsive in vivo," Cell, 33:489, 1983.
・Chandler et al., "RNA splicing specificity determined by the coordinated action of RNA recognition motifs in SR proteins," Proc Natl Acad Sci USA. 94(8):3596-3601, 1997.
・Chang, Erwin, and Lee, "Glucose-regulated Protein (GRP94 and GRP78) Genes Share Common Regulatory Domains and are Coordinately Regulated by Common Trans-acting Factors," Mol. Cell. Biol., 9:2153, 1989.
・Chatterjee, Lee, Rentoumis, and Jameson, "Negative Regulation of the Thyroid-Stimulating Hormone Alpha Gene by Thyroid Hormone : Receptor Interaction Adjacent to the TATA Box," Proc Natl. Acad Sci. U.S.A., 86:9114, 1989.
・Chen and Okayama, "High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA," Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752, 1987. Cherrington and Ganem, "Regulation of polyadenylation in human immuno-deficiency virus (HIV): contributions of promoter proximity and upstream sequences," Embo. J.,  11:1513-1524, 1992.
・Choi, Chen, Kriegler, and Roninson, "An altered pattern of cross-resistance in multi-drug-resistant human cells results from spontaneous mutations in the mdr-1 (p-glycoprotein) gene," Cell, 53:519, 1988.
・Cocea, "Duplication of a region in the multiple cloning site of a plasmid vector to enhance cloning-mediated addition of restriction sites to a DNA fragment," Biotechniques, 23:814-816, 1997.
・Cohen, Walter, and Levinson, "A Repetitive Sequence Element 3' of the Human c-Ha-ras1 Gene Has Enhancer Activity," J. Cell. Physiol., 5:75, 1987.
・Corbeau et al., PNAS (U.S.A.,) 93(24):14070-14075, 1996.
・Costa, Lai, Grayson, and Darnell, "The Cell-Specific Enhancer of the Mouse Transthyretin (Prealbumin) Gene Binds a Common Factor at One Site and a Liver-Specific Factor(s) at Two Other Sites," Mol. Cell. Biol., 8:81, 1988.
・Cripe, Haugen, Turk, Tabatabai, Schmid, Durst, Gissmann, Roman, and Turek, "Transcriptional Regulation of the Human Papilloma Virus-16 E6-E7 Promoter by a Keratinocyte-Dependent Enhancer, and by Viral E2 Trans-Activator and Repressor Gene Products : Implications for Cervical Carcinogenesis," EMBO J., 6:3745, 1987.
・Culotta and Hamer, "Fine Mapping of a Mouse Metallothionein Gene Metal-Response Element," Mol. Cell. Biol., 9: 1376, 1989.
・Dandolo, Blangy, and Kamen, "Regulation of Polyma Virus Transcription in Murine Embryonal Carcinoma Cells," J. Virology, 47:55, 1983.
・Dao, Hannum, Kohn, Nolta, "FLT3 ligand preserves the ability of human CD34+ progenitors to sustain long-term hematopoiesis in immune-deficient mice after ex vivo retroviral-mediated transduction," Blood, 89:446-456, 1997.
・Dao, Hashino, Kato, Nolta, "Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo, culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells," Blood, 92:4612-4621, 1998.
・Deschamps, Meijlink, and Verma, "Identification of a Transcriptional Enhancer Element Upstream From the Proto-Oncogene Fos," Science, 230:1174, 1985.
・De Villers, Schaffner, Tyndall, Lupton, and Kamen, "Polyoma Virus DNA Replication Requires an Enhancer," Nature, 312:242, 1984.
・DeZazzo, Kilpatrick, Imperiale, "Involvement of long terminal repeat U3 sequences overlapping the transcription control region in human immunodeficiency virus type 1 mRNA 3' end formation," Mol. Cell. Biol., 11:1624-1630, 1991.
・Dinauer MC, Orkin SH, Brown R, Jesaitis AJ, Parkos CA, "The glycoprotein encoded by the X-linked chronic granulomatous disease locus is a component of the neutrophil cytochrome b complex," Nature, 327(6124):717-20(1987)
・Donello, Loeb, Hope, "Woodchuck hepatitis virus contains a tripartite posttranscriptional regulatory element," J. Virol., 72:5085-5092, 1998.
・Dorrell, Gan, Pereira, Hawley, Dick, "Expansion of human cord blood CD34(+)CD38(-) cells in ex vivo culture during retroviral transduction without a corresponding increase in SCID repopulating cell (SRC) frequency: dissociation of SRC phenotype and function,"  Blood, 95:102-110, 2000.
・Edbrooke, Burt, Cheshire, and Woo, "Identification of cis-acting sequences responsible for phorbol ester induction of human serum amyloid a gene expression via a nuclear-factor-kappa β-like transcription factor," Mol. Cell. Biol., 9:1908, 1989.
・Edlund, Walker, Barr, and Rutter, "Cell-specific expression of the rat insulin gene: evidence for role of two distinct 5' flanking elements," Science, 230:912, 1985.
・Fechheimer, Boylan, Parker, Sisken, Patel and Zimmer, "Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading," Proc Nat'l. Accad. Sci. USA 84:8463-8467, 1987.
・Feng and Holland, "HIV-I Tat Trans-Activation Requires the Loop Sequence Within Tar," Nature, 334:6178, 1988.
・Firak and Subramanian, "Minimal Transcription Enhancer of Simian Virus 40 is a 74-Base-Pair Sequence that Has Interacting Domains," Mol. Cell. Biol., 6:3667, 1986.
・Foecking and Hofstetter, "Powerful and Versatile Enhancer-Promoter Unit for Mammalian Expression Vectors," Gene, 45(1):101-105, 1986.
・Follenzi, A, Ailles, L.E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. (2000) "Gene Transfer by Lentiviral Vecotrs is Limited by Nuclear Translocation and Rescued by HIV-1 pol Sequences," Nat. Genet., 25:217-22.
・Fujita, Shibuya, Hotta, Yamanishi, and Taniguchi, "Interferon-Beta Gene Regulation: Tandemly Repeated Sequences of a Synthetic 6-bp Oligomer Function as a Virus-Inducible Enhancer," Cell, 49:357, 1987.
・Gilles, Morris, Oi, and Tonegawa, "A tissue-specific transcription enhancer element is located in the major intron of a rearranged immunoglobulin heavy-chain gene," Cell, 33:717, 1983.
・Gilmartin, Fleming, Oetjen, "Activation of HIV-1 pre-mRNA 3' processing in vitro requires both an upstream element and TAR," Embo. J., 11:4419-4428, 1992.
・Gloss, Bernard, Seedorf, and Klock, "The Upstream Regulatory Region of the Human Papilloma Virus-16 Contains an E2 Protein-Independent Enhancer Which is Specific for Cervical Carcinoma Cells and Regulated by Glucocorticoid Hormones," EMBO J., 6:3735, 1987.
・Godbout, Ingram, and Tilghman, "Fine-Structure Mapping of the Three Mouse Alpha-Fetoprotein Gene Enhancers," Mol. Cell. Biol., 8:1169, 1988.
・Goodbourn, Burstein, and Maniatis, "The Human Beta-Interferon Gene Enhancer is Under Negative Control," Cell, 45:601, 1986.
・Goodbourn and Maniatis, "Overlapping Positive and Negative Retulatory Domains of the Human β-Interferon Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:1447, 1988.
・Gopal, "Gene transfer method for transient gene expression, stable transformation, and cotransformation of suspension cell cultures," Mol. Cel. Biol. 5:1188-1190, 1985.
・Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci., 89:5547-5551, 1992.
・Graham and Van Der Eb, "A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA," Virology 52:456-467, 1973.
・Greene, Bohnlein, and Ballard, "HIV-1, and Normal T-Cell Growth: Transcriptional Strategies and Surprises," Immunology Today, 10:272, 1989.
・Grosschedl and Baltimore, "Cell-Type Specificity of Immunoglobulin Gene Expression is Regulated by at Least Three DNA Sequence Elements," Cell, 41:885, 1985.
・Haslinger and Karin, "Upstream Promoter Element of the Human Metallothionein-II Gene Can Act Like an Enhancer Element," Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:8572, 1985.
・Hauber and Cullen, "Mutational Analysis of the Trans-Activation-Responsive Region of the Human Immunodeficiency Virus Type I Long Terminal Repeat," J. Virology, 62:673, 1988.
・Hen, Borrelli, Fromental, Sassone-Corsi, and Chambon, "A Mutated Polyoma Virus Enhancer Which is Active in Undifferentiated Embryonal Carcinoma Cells is not Repressed by Adenovirus-2 E1A Products," Nature, 321:249, 1986.
・Hensel, Meichle, Pfizenmaier, and Kronke, "PMA-Responsive 5' Flanking Sequences of the Human TNF Gene," Lymphokine Res., 8:347, 1989.
・Herr and Clarke, "The SV40 Enhancer is Composed of Multiple Functional Elements That Can Compensate for One Another," Cell, 45:461, 1986.
・Hickstein, D.D., Baker, D.M., Gollahon, K.A. and Back, A.L., "Identification of the promoter of the myelomonocytic leukocyte integrin CD11b," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,89(6):2105-2109, 1992.
・Hirochika, Browker, and Chow, "Enhancers and Trans-Acting E2 Transcriptional Factors of Papilloma Viruses," J. Virol.,61:2599, 1987.
・Hirsch, Gaugler, Deagostini-Bauzin, Bally-Cuif, and Gordis, "Identification of Positive and Negative Regulatory Elements Governing Cell-Type-Specific Expression of the Neural-Cell-Adhesion-Molecule Gene," Mol. Cell. Biol., 10:1959, 1990.
・Holbrook, Gulino, and Ruscetti, "cis-Acting Transcriptional Regulatory Sequences in the Gibbon Ape Leukemia Virus (GALV) Long Terminal Repeat," Virology, 157:211, 1987.
・Horlick and Benfield, "The upstream muscle-specific enhancer of the rat muscle creatine kinase gene is composed of multiple elements," Mol. Cell. Biol., 9:2396, 1989.
・Huang, Ostrowski, Berard, and Hagar, "Glucocorticoid regulation of the ha-musv p21 gene conferred by sequences from mouse mammary tumor virus," Cell, 27:245, 1981.
・Hug, Costas, Staeheli, Aebi, and Weissmann, "Organization of the Murine Mx Gene and Characterization of its Interferon- and Virus-Inducible Promoter," Mol. Cell. Biol., 8:3065, 1988.
・Hwang, Lim, and Chae, "Characterization of the S-Phase-Specific Transcription Regulatory Elements in a DNA-Replication-Independent Testis-Specific H2B (TH2B) Histone Gene," Mol. Cell. Biol., 10:585, 1990.
・Imagawa, Chiu, and Karin, "Transcription Factor AP-2 Mediates Induction by Two Different Signal-Transduction Pathways: Protein Kinase C and cAMP," Cell, 51:251, 1987.
・Imbra and Karin, "Phorbol Ester Induces the Transcriptional Stimulatory Activity of the SV40 Enhancer," Nature, 323:555 1986.
・Imler, Lemaire, Wasvlyk, and Waslyk, "Negative Regulation Contributes to Tissue Specificity of the Immunoglobulin Heavy-Chain Enhancer," Mol. Cell. Biol., 7:2558, 1987.
・Imperiale and Nevins, "Adenovirus 5 E2 Transcription Unit: an E1A-Inducible Promoter with an Essential Element that Functions Independently of Position or Orientation," Mol. Cell. Biol., 4:875, 1984.
・Jakobovits, Smith, Jakobovits, and Capon, "A Discrete Element 3' of Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) and HIV-2 mRNA Initiation Sites Mediates Transcriptional Activation by an HIV Trans-Activator," Mol. Cell. Biol., 8:2555, 1988.
・Jameel and Siddiqui, "The Human Hepatitis B Virus Enhancer Requires Transacting Cellular Factor(s) for Activity," Mol. Cell. Biol., 6:710, 1986.
・Jaynes, Johnson, Buskin, Gartside, and Hauschka, "The Muscle Creatine Kinase Gene is Regulated by Multiple Upstream Elements, Including a Muscle-Specific Enhancer," Mol. Cell. Biol., 8:62, 1988.
・Johnson, Wold, and Hauschka, "Muscle creatine kinase sequence elements regulating skeletal and cardiac muscle expression in transgenic mice," Mol. Cell. Biol., 9:3393, 1989.
・Kadesch and Berg, "Effects of the Position of the Simian Virus 40 Enhancer on Expression of Multiple Transcription Units in a Single Plasmid," Mol. Cell. Biol., 6:2593, 1986.
・Karin, Haslinger, Heguy, Dietlin, and Cooke, "Metal-Responsie Elements Act as Positive Modulators of Human Metallothionein-IIA Enhancer Activity," Mol. Cell. Biol., 7:606, 1987.
・Katinka, Yaniv, Vasseur, and Blangy, "Expression of Polyoma Early Functions in Mouse Embryonal Carcinoma Cells Depends on Sequence Rearrangements in the Beginning of the Late Region," Cell, 20:393, 1980.
・Kawamoto, Makino, Niw, Sugiyama, Kimura, Anemura, Nakata, and Kakunaga, "Identification of the Human Beta-Actin Enhancer and its Binding Factor," Mol. Cell. Biol., 8:267, 1988.
・Kiledjian, Su, Kadesch, "Identification and characterization of two functional domains within the murine heavy-chain enhancer," Mol. Cell. Biol., 8:145, 1988.
・Klamut, Gangopadyhay, Worton, and Ray, "Molecular and Functional Analysis of the Muscle-Specific Promoter Region of the Duchenne Muscular Dystrophy Gene," Mol. Cell. Biol., 10:193, 1990.
・Klein et al., "High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells," Nature, 327:70-73, 1987.
・Koch, Benoist, and Mathis, "Anatomy of a new β-cell-specific enhancer," Mol. Cell. Biol., 9:303, 1989.
・Kraus et al., "Alternative promoter usage and tissue specific expression of the mouse somatostatin receptor 2 gene," FEBS Lett., 428(3):165-170, 1998.
・Kohn, Nolta, Weinthal, Bahner, Yu, Lilley, Crooks, "Toward gene therapy for Gaucher disease," Hum. Gene Ther., 2:101-105, 1991.
・Kriegler and Botchan, "A retrovirus LTR contains a new type of eukaryotic regulatory element," In: Eukaryotic Viral Vectors, Gluzman (ed.), Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982.
・Kriegler et al., "Promoter substitution and enhancer augmentation increases the penetrance of the sv40 a gene to levels comparable to that of the harvey murine sarcoma virus ras gene in morphologic transformation," In: Gene Expression, Alan Liss (Ed.), Hamer and Rosenberg, New York, 1983.
・Kriegler et al., "Viral Integration and Early Gene Expression Both Affect the Efficiency of SV40 Transformation of Murine Cells: Biochemical and Biological Characterization of an SV40 Retrovirus," In: Cancer Cells 2/Oncogenes and Viral Genes, Van de Woude et al. (eds), Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984.
・Kriegler, Perez, Defay, Albert and Liu, "A Novel Form of TNF/Cachectin Is a Cell-Surface Cytotoxix Transmembrane Protein: Ramifications for the Complex Physiology of TNF," Cell, 53:45, 1988.
・Kuhl, De La Fuenta, Chaturvedi, Parinool, Ryals, Meyer, and Weissman, "Reversible Silencing of Enhancers by Sequences Derived From the Human IFN-alpha Promoter," Cell, 50:1057, 1987.
・Kunz, Zimmerman, Heisig, and Heinrich, "Identification of the Promoter Sequences Involved in the Interleukin-6-Dependent Expression of the Rat Alpha-2-Macroglobulin Gene," Nucl. Acids Res., 17:1121, 1989.
・Lareyre et al., "A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice," J Biol Chem., 274(12):8282-8290, 1999.
・Larsen, Harney, and Moore, "Repression medaites cell-type-specific expression of the rat growth hormone gene," Proc Natl. Acad. Sci. USA., 83:8283, 1986.
・Laspia, Rice, and Mathews, "HIV-1 Tat protein increases transcriptional initiation and stalibizes elongation," Cell, 59:283, 1989.
・Latimer, Berger, and Baumann, "Highly conserved upstream regions of the alpha.sub.1-antitrypsin gene in two mouse species govern liver-specific expression by different mechanisms," Mol. Cell. Biol., 10:760, 1990.
・Lee, Mulligan, Berg, and Ringold, "Glucocorticoids Regulate Expression of Dihydrofolate Reductase cDNA in Mouse Mammary Tumor Virus Chimaeric Plasmids," Nature, 294:228, 1981.
・Lee et al., "Activation of beta3-adrencceptors by exogenous dopamine to lower glucose uptake into rat adipocytes," J Auton Nerv Syst. 74(2-3):86-90, 1997.
・Levenson et al., "Internal ribosomal entry site-containing retroviral vectors with green fluorescent protein and drug resistance markers," Human Gene Therapy, 9:1233-1236, 1998.
・Levinson, Khoury, Van De Woude, and Gruss, "Activation of SV40 Genome by 72-Base-Pair Tandem Repeats of Moloney Sarcoma Virus," Nature, 295:79, 1982.
・Lewis and Emerman, "Passage through mitosis is required for oncoretroviruses but not for the human immunodeficiency virus," J. Virol., 68:510-516, 1994.
・Lien LL, Lee Y, Orkin SH, (1997) "Regulation of the myeloid-cell-expressed human gp91-phox gene as studied by transfer of yeast artificial chromosome clones into embryonic stem cells: suppression of a variegated cellular pattern of expression requires a full complement of distant cis elements," Mol. Cell Biol. 17(4):2279-90
・Lin, Cross, Halden, Dragos, Toledano, and Leonard, "Delineation of an enhancerlike positive retulatory element in the interleukin-2 receptor alpha-chain gene," Mol. Cell. Biol., 10:850, 1990.
・Luo W, and Skalnik DG, "CCAAT Displacement Protein Competes with Multiple Transcriptional Activators for Binding to Four Sites in the Proximal gp91-phox Promoter, J. Biol. Chem. 271:18203-210, 1996.
・Luo W, and Skalnik DG, "Interferon Regulatory Factor-2 Directs Transcription from the gp91-phox promoter," J. Biol. Chem. 271:23445-23451, 1996.
・Luria, Gross, Horowitz, and Givol, "Promoter Enhancer Elements in the Rearranged Alpha-Chain Gene of the Human T-Cell Receptor," EMBO J., 6:3307, 1987.
・Lusky, Berg, Weiher, and Botchan, "Bovine Pappilloma Virus Contains an Activator of Gene Expression at the Distal End of the Early Transcription Unit," Mol. Cell. Biol. 3:1108, 1983.
・Lusky and Botchan, "Transient Replication of Bovine Papilloma Virus Type 1 Plasmids: cis and trans Requirements," Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:3609, 1986.
・Majors and Varmus, "A Small Region of the Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat Confers Glucocorticoid Hormone Regulation on a Linked Heterologous Gene," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:5866, 1983.
・Malech HL, "Progress in gene therapy for chronic granulomatous disease," J. Infect. Dis. 179(Suppl. 2):S 318-25, 1999.
・Marthas et al. J. Virol., 67:6047-6055, 1993.
・Mazurier, Moreau-Gaudry, Maguer-Satta, Salesse, Pigeonnier-Lagarde, Ged, Belloc, Lacombe, Mahon, Reiffers, de Verneuil, "Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein," Gene Ther., 5:556-562, 1998.
・McNeall, Sanchez, Gray, Chesterman, and Sleigh, "Hyperinducible Gene Expression From a Metallotionein Promoter Containing Additional Metal-Resonsive Elements," Gene, 76:81, 1989.
・Miksicek, Heber, Schmid, Danesch, Posseckert, Beato, and Schutz, "Glucocorticoid Responsiveness of the Transcriptional Enhancer of Moloney Murine Sarcoma Virus," Cell, 46:203, 1986.
・Miyoshi, Smith, Mosier, Verma, Torbett, "Transduction of human CD34+ cells that mediate long-term engraftment of NOD/SCID mice by HIV vectors," Science, 283:682-686, 1999.
・Mizushima and Nagata, "pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector," Nucleic Acides Res., 18:5322, 1990.
・Mordacq and Linzer, "Co-localization of Elements Required for Phorbol Ester Stimulation and Glucocorticoid Repression of Proliferin Gene Expression," Genes and Dev., 3:760, 1989.
・Moreau, Hen, Wasylyk, Everett, Gaub, and Chambon, "The SV40 base-repair repeat has a striking effect on gene expression both in sv40 and other chimeric recombinants," Nucl. Acids Res., 9:6047, 1981.
・Muesing et al., Cell, 48:691, 1987.
・Naldini, Blomer, Gallay, Ory, Mulligan, Gage, Verma, Trono, "In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector," Science, 272:263-267, 1996a.
・Naldini, Blomer, Gage, Trono, Verma, "Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11382-11388, 1996b.
・Ng, Gunning, Liu, Leavitt, and Kedes, "Regulation of the Human Beta-Actin Promoter by Upstream and Intron Domains," Nuc. Acids Res., 17:601, 1989.
・Nomoto et al., "Cloning and characterization of the alternative promoter regions of the human LIMK2 gene responsible for alternative transcripts with tissue-specific expression," Gene, 236(2): 259-271, 1999.
・Omitz, Hammer, Davison, Brinster, and Palmiter, "Promoter and enhancer elements from the rat elastase i gene function independently of each other and of heterologous enhancers," Mol. Cell. Biol. 7:3466, 1987.
・Ondek, Sheppard, and Herr, "Discrete Elements Within the SV40 Enhancer Region Display Different Cell-Specific Enhancer Activities," EMBO J., 6:1017, 1987.
・Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:11400-11406, 1996.
・Palmiter, Chen, and Brinster, "Differential regulation of metallo-thionein-thymidine kinase fusion genes in transgenic mice and their offspring," Cell, 29:701, 1982.
・Pech, Rao, Robbins, and Aaronson, "Functional identification of regulatory elements within the promoter region of platelet-derived growth factor 2," Mol. Cell. Biol., 9:396, 1989.
・Perez-Stable and Constantini, "Roles of fetal γ-globin promoter elements and the adult β-globin 3' enhancer in the stage-specific expression of globin genes," Mol. Cell. Biol., 10:1116, 1990.
・Piacibello, Sanavio, Severino, Dane, Gammaitoni, Fagioli, Perissinotto, Cavalloni, Kollet, Lapidot, Aglietta, "Engraftment in nonobese diabetic severe combined immunodeficient mice of human CD34(+) cord blood cells after ex vivo expansion: evidence for the amplification and self-renewal of repopulating stem cells," Blood, 93:3736-3749, 1999.
・Picard and Schaffner, "A Lymphocyte-Specific Enhancer in the Mouse Immunoglobulin Kappa Gene," Nature, 307:83, 1984.
・Pinkert, Omitz, Brinster, and Palmiter, "An albumin enhancer located 10 kb upstream functions along with its promoter to direct efficient, liver-specific expression in transgenic mice," Genes and Dev., 1:268, 1987.
・Ponta, Kennedy, Skroch, Hynes, and Groner, "Hormonal Response Region in the Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat Can Be Dissociated From the Proviral Promoter and Has Enhancer Properties," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:1020, 1985.
・Porton, Zaller, Lieberson, and Eckhardt, "Immunoglobulin heavy-chain enhancer is required to maintain transfected gamma 2a gene expression in a pre-b-cell line," Mol. Cell. Biol., 10:1076, 1990.
・Potter et al., "Enhancer-dependent expression of human k immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation," Proc Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984.
・Queen and Baltimore, "Immunoglobulin Gene Transcription is Activated by Downstream Sequence Elements," Cell, 35:741, 1983.
・Quinn, Farina, Gardner, Krutzsch, and Levens, "Multiple components are required for sequence recognition of the ap1 site in the gibbon ape leukemia virus enhancer," Mol. Cell. Biol., 9:4713, 1989.
・Ramezani A, Hawley TS, Hawley RG, "Lentiviral Vectors for Enhanced Gene Expresseion in Human Hematopoietic Cells," Mol. Ther. 2(5):458-69, 2000.
・Redondo, Hata, Brocklehurst, and Krangel, "A T-Cell-Specific Transcriptional Enhancer Within the Human T-Cell Receptor delta Locus," Science, 247:1225, 1990.
・Resendez Jr., Wooden, and Lee, "Identification of highly conserved regulatory domains and protein-binding sites in the promoters of the rat and human genes encoding the stress-inducible 78-kilodalton glucose-regulated protein," Mol. Cell. Biol., 8:4579, 1988.
・Reisman and Rotter, "Induced Expression From the Moloney Murine Leukemia Virus Long Terminal Repeat During Differentiation of Human Myeloid Cells is Mediated Through its Transcriptional Enhancer," Mol. Cell. Biol. 9:3571, 1989.
・Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., pages 1035-1038 and 1570-1580.
・Ripe, Lorenzen, Brenner, and Breindl, "Regulatory elements in the 5' flanking region and the first intron contribute to transcriptional control of the mouse alpha-1-type collagen gene," Mol. Cell. Biol., 9:2224, 1989.
・Rippe, Brenner and Leffert, "DNA-mediated gene transfer into adult rat hepatocytes in primary culture," Mol. Cell. Biol., 10:689-695, 1990.
・Rittling, Coutinho, Amarm, and Kolbe, "AP-1/jun-binding Sites Mediate Serum Inducibility of the Human Vimentin Promoter," Nuc. Acids. Res., 17:1619, 1989.
・Roe, Reynolds, Yu, Brown, "Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis," Embo. J., 12:2099-2108, 1993.
・Rosen, Sodroski, and Haseltine, "The location of cis-acting regulatory sequences in the human t-cell lymphotropic virus type III (HTLV-111/LAV) long terminal repeat," Cell, 41:813, 1988.
・Sakai, Helms, Carlstedt-Duke, Gustafsson, Rottman, and Yamamoto, "Hormone-Mediated Repression: A Negative Glucocorticoid-Response Element From the Bovine Prolactin Gene," Genes and Dev., 2:1144, 1988.
・Salmon P, Kindler V, Ducrey O, Chapuis B, Zubler RH, Trono D., "High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors," Blood 96(10):3392-8, 2000.
・Sambrook, Fritsch, Maniatis, In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 rev.ed., Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1(77):19-17.29, 1989.
・Satake, Furukawa, and Ito, "Biological activities of oligonucleotides spanning the f9 point mutation within the enhancer region of polyoma virus DNA," J. Virology, 62:970, 1988.
・Scharfmann, Axelrod, Verma, "Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4626-4630, 1991.
・Schaffner, Schirm, Mullen-Baden, Wever, and Schaffner, "Redundancy of Information in Enhancers as a Principle of Mammalian Transcription Control," J. Mol. Biol., 201:81, 1988.
・Schmid, Uittenbogaart, Keld, Giorgi, "A rapid method for measuring apoptosis and dual-color immunofluorescence by single laser flow cytometry," J. Immunol. Methods, 170:145-157, 1994.
・Searle, Stuart, and Palmiter, "Building a metal-responsive promoter with synthetic regulatory elements," Mol. Cell. Biol., 5:1480, 1985.
・Sharp and Marciniak, "HIV Tar: an RNA Enhancer?," Cell. 59:229, 1989. ・Shaul and Ben-Levy, "Multiple Nuclear Proteins in Liver Cells are Bound to Hepatitis B Virus Enhancer Element and its Upstream Sequences," EMBO J., 6:1913, 1987.
・Sherman, Basta, Moore, Brown, and Ting, "Class II Box Consensus Sequences in the HLA-DR. alpha. Gene: Transcriptional Function and Interaction with Nuclear Proteins," Mol. Cell. Biol., 9:50, 1989.
・Skalnik DG, Dorfman DM, Perkins AS, Jenkins NA, Copeland NG, Orkin SH, (1991) "Targeting of transgene expression to monocyte/macrophages by the gp91-phox promoter and consequent histiocytic malignancies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8505-09.
・Sleigh and Lockett, "SV40 Enhancer Activation During Retinoic-Acid-Induced Differentiation of F9 Embryonal Carcinoma Cells," J. EMBO, 4:3831, 1985.
・Spalholz, Yang, and Howley, "Transactivation of a Bovine Papilloma Virus Transcriptional Regulatory Element by the E2 Gene Product," Cell, 42:183, 1985.
・Spandau and Lee, "Trans-Activation of Viral Enhancers by the Hepatitis B Virus X Protein," J. Virology, 62:427, 1988.
・Spandidos and Wilkie, "Host-Specificities of Pappilloma Virus, Moloney Murine Sarcoma Virus and Simian Virus 40 Enhancer Sequences," EMBO J., 2:1193, 1983.
・Stephen and Hentschel, "The Bovine Papilloma Virus Genome and its Uses as a Eukaryotic Vector," Biochem. J., 248:1, 1987.
・Stuart, Searle, and Palmiter, "Identification of Multiple Metal Regulatory Elements in Mouse Metallothionein-I Promoter by Assaying Synthetic Sequences," Nature, 317:828, 1985.
・Sullivan and Peterlin, "Transcriptional Enhancers in the HLA-DQ Subregion," Mol. Cell. Biol., 7:3315, 1987.
・Sutton, Reitsma, Uchida, Brown, "Transduction of human progenitor hematopoietic stem cells by human immunodeficiency virus type 1-based vectors is cell cycle dependent," J. Virol., 73:3649-3660, 1999.
・Sutton, Wu, Rigg, Bohnlein, Brown, "Human immunodeficiency virus type 1 vectors efficiently transduce human hematopoietic stem cells," J. Virol., 72:5781-5788, 1998.
・Swartzendruber and Lehman, "Neoplastic Differentiation: Interaction of Simian Virus 40 and Polyoma Virus with Murine Teratocarcinoma Cells," J. Cell. Physiology, 85:179, 1975.
・Takebe, Seiki, Fujisawa, Hoy, Yokota, Arai, Yoshida, and Arai, "SR alpha. Promoter: An Efficient and Versatile Mammalian cDNA Expression System Composed of the Simian Virus 40 Early Promoter and the R-U5 Segment of Human T-Cell Leukemia Virus Type 1 Long Terminal Repeat," Mol. Cell. Biol., 8:466, 1988.
・Taylor and Kingston, "E1A Trans-Activation of Human HSP70 Gene Promoter Substitution Mutants is Independent of the Composition of Upstream and TATA Elements," Mol. Cell. Biol., 10:176, 1990.
・Taylor and Kingston, "Factor Substitution in a Human HSP70 Gene Promoter: TATA-Dependent and TATA-Independent Interactions," Mol. Cell. Biol., 10:165, 1990.
・Taylor, Solomon, Weiner, Paucha, Bradley, and Kingston, "Stimulation of the Human Heat-Shock Protein 70 Promoter in vitro by Simian Virus 40 Large T Antigen," J. Biol. Chem., 264:15160, 1989.
・Tavernier, Gheysen, Duerinck, Can Der Heyden, and Fiers, "Deletion Mapping of the Inducible Promoter of Human IFN-beta Gene," Nature, 301:634, 1983.
・Thiesen, Bosze, Henry, and Charnay, "A DNA Element Responsible for the Different Tissue Specificities of Friend and Moloney Retroviral Enhancers," J. Virology, 62:614, 1988.
・Tronche, Rollier, Bach, Weiss, and Yaniv, "The Rat Albumin Promoter: Cooperation with Upstream Elements is Required When Binding of APF/HNF 1 to the Proximal Element is Partially Impaired by Mutation or Bacterial Methylation," Mol. Cell. Biol., 9:4759, 1989.
・Tronche, Rollier, Herbomel, Bach, Cereghini, Weiss, and Yaniv, "Anatomy of the Rat Albumin Promoter," Mol. Biol. Med., 7:173, 1990.
・Trudel and Constantini, "A 3' Enhancer Contributes to the Stage-Specific Expression of the human Beta-Globin Gene," Genes and Dev., 6:954, 1987.
・Tsumaki et al., "Modular arrangement of cartilage- and neural tissue-specific cis-elements in the mouse alpha2(XI) collagen promoter," J. Biol. Chem. 273(36):22861-22864, 1998.
・Tur-Kaspa, Teicher, Levine, Skoultchi and Shafritz, "Use of electroporation to introduce biologically active foreign genes into primary rat hepatocytes," Mol. Cell. Biol., 6:716-718, 1986.
・Tyndall, La Mantia, Thacker, Favaloro, and Kamen, "A Region of the Polyoma Virus Genome Between the Replication Origin and Late Protein-Coding Sequences is Required in cis for Both Early Gene Expression and Viral DNA Replication," Nuc. Acids, Res., 9:6231, 1981.
・Uchida, Sutton, Friera, He, Reitsma, Chang, Veres, Scollay, Weissman, "HIV, but not murine leukemia virus, vectors mediate high efficiency gene transfer into freshly isolated G0/G1 human hematopoietic stem cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:11939-11944, 1998.
・Ueda, Tsuji, Yoshino, Ebihara, Yagasaki, Hisakawa, Mitsui, Manabe, Tanaka, Kobayashi, Ito, Yasukawa, Nakahata, "Expansion of human NOD/SCID-repopulating cells by stem cell factor, F1k2/Flt3 ligand, thrombopoietin, IL-6, and soluble IL-6 receptor," J. Clin. Invest., 105:1013-1021, 2000.
Unutmaz, Kewal, Ramani, Marmon, Littman, "Cytokine signals are sufficient for HIV-1 infection of resting human T lymphocytes," J. Exp. Med., 189:1735-1746, 1999.
・Valsamakis, Schek, Alwine, "Elements upstream of the AAUAAA within the human immunodeficiency virus polyadenylation signal are required for efficfient polyadenylation in vitro," Mol. Cell. Biol., 12:3699-3705, 1992.
・Valsamakis, Zeichner, Carswell, Alwine, "The human immunodeficiency virus type 1 polyadenylylation signal: a 3' long terminal repeat element upstream of the AAUAAA necessary for efficient polyadenylylation," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2108-2112, 1991.
・Vannice and Levinson, "Properties of the Human Hepatitis B Virus Enhancer: Position Effects and Cell-Type Nonspecificity," J Virology, 62:1305, 1988.
・Vasseur, Kress, Montreau, and Blangy, "Isolation and Characterization of Polyoma Virus Mutants Able to Develop in Multipotential Murine Embryonal Carcinoma Cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77:1068, 1980.
・Wang and Calame, "SV40 enhancer-binding factors are requied at the establishment but not the maintenance step of enhancer-dependent transcriptional activation," Cell, 47:241, 1986.
・Watanabe et al., "Gene transfection of mouse primordial germ cells in vitro and analysis of their survival and growth control, Experimental Cell Research, 230:76-83, 1997.
・Weber, De Villiers, and Schaffner, "An SV40 Enhancer Trap Incorporates Exogenous Enhancers or Generates Enhancers From its Own Sequences," Cell, 36:983, 1984.
・Weinberger, Jat, and Sharp, "Localization of a Repressive Sequence Contributing to B-cell Specificity in the Immunoglobulin Heavy-Chain Enhancer," Mol. Cell. Biol., 8:988, 1984.
・Winoto and Baltimore, "αβ-lineage-specific Expression of the α T-Cell Receptor Gene by Nearby Silencers," Cell, 59:649, 1989.
・Wu et al., "Promoter-dependent tissue-specific expressive nature of imprinting gene, insulin-like growth factor II, in human tissues," Biochem Biophys Res Commun. 233(1):221-226, 1997.
・Yang, Burkholder, Roberts, Martinell and McCabe, "In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment," Proc Nat'l Acad Sci. USA, 87:9568-9572, 1990.
・Yutzey, Kline, and Konieczny, "An Internal Regulatory Element Controls Troponin I Gene Expression," Mol. Cell. Biol., 9:1397, 1989.
・Zhao-Emonet et al., "The equine herpes virus 4 thymidine kinase is a better suicide gene than the human herpes virus 1 thymidine kinase," Gene Ther. 6(9):1638-1642, 1999.
・Zufferey, Nagy, Mandel, Naldini, Trono, "Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo," Nat. Biotechnol., 15:871-875, 1997.
・Zufferey, Dull Mandel, Bukovsky, Quiroz, Naldini, Trono, "Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery," J. Virol., 72:9873-9880, 1998.
・Zufferey, Donello, Trono, Hope, "Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors," J. Virol., 73:2886-2892, 1999.
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含められている。本発明は、本明細書に提示される特定の実施の形態の詳細な説明と組み合わせて１つ以上のこれらの図面を参照することによってよりよく理解することができる。
【図１Ａ】gp91-phoxプロモータを含んでいるレンチ・ベクターの図。gp91-phoxプロモータ（1540bp）（pHPP91-GFP）及びWPRE配列（pWPP91-GFP）を含んでいるレンチウイルス性ベクターの概略図。
【図１Ｂ】gp91-phoxプロモータの調節のためのモデル図。転写リプレッサCDPは、４つの要素で転写活性因子の結合と競合する。CDPのDNA結合活性は、末期の食細胞発生の間に反応が抑制され、それによって、転写アクチベータとgp91-phoxプロモータとの相互作用を可能にする（Luo W, Skalnik DG. JBC, 271: 18203,1996）。
【図２Ａ】pWPT-GFP及びpWPP91-GFPレンチ・ベクターで形質転換されたgp91-phoxプロモータUCB CD 34＋によって促進された単球に由来するUCB CD34＋でのインターフェロンγ誘発GFP発現を示す図。細胞はin vitroでGM-CSF（顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子）の存在下で単球（CD14＋細胞）へ３週間かけて分化した。分化細胞はINF-γ（1000 U/ml）で６日間刺激され、PE複合モノクローナル抗体で標識付けされた。PEポジティブ群のGFP発現は、FACSを用いて分析された。数字は四分区間内の細胞の百分率を示す。
【図２Ｂ】pWPT-GFP及びpWPP91-GFPレンチ・ベクター（MOI 10）で形質転換されたgp91-phoxプロモータUCB CD 34＋によって促進された顆粒球に由来するUCB CD34＋でのインターフェロンγ誘発GFP発現を示す図。細胞はin vitroでG-CSF（顆粒球コロニー刺激因子）の存在下で顆粒球（CD15＋細胞）へ３週間かけて分化した。分化細胞はINF-γ（1000 U/ml）で６日間刺激され、PE複合モノクローナル抗体で標識付けされた。PEポジティブ群のGFP発現は、FACSを用いて分析された。数字は四分区間内の細胞の百分率を示す。
【図３Ａ】UCB CD34＋で形質導入されたレンチ・ベクターを移植されたNOD/SCIDマウスの骨髄でのGFP発現を示す図。非形質導入UCB CD34＋が、亜致死放射線照射（375 cGy）されたNOD/SCIDマウス（生後８週から10週）へ静脈内注射された。８週間後、移植マウスの大腿骨から得られた骨髄細胞は、移植細胞に標識付けするためにPerCP複合抗ヒトCD45で標識付けされ、特定のヒト系統が、CD34（血球前駆細胞）、CD19（Ｂリンパ球）、CD33（好中球）、CD14（単球）、CD15（顆粒球）、CD42b（巨核球）及びグリコホリンＡ（赤芽球）；に対するPE複合抗体を用いてさらに識別された。GFP発現は、CD45＋ゲート及びPEポジティブ細胞で分析された。数字は四分区間内の細胞の百分率を示す。
【図３Ｂ】UCB CD34＋で形質導入されたレンチ・ベクターを移植されたNOD/SCIDマウスの骨髄でのGFP発現を示す図。pHPT-GFPレンチ・ベクター（MOI 10）で形質導入されたUCB CD34＋が、亜致死放射線照射（375 cGy）されたNOD/SCIDマウス（生後８週から10週）へ静脈内注射された。８週間後、移植マウスの大腿骨から得られた骨髄細胞は、移植された細胞に標識付けするためにPerCP複合抗ヒトCD45で標識付けされ、特定のヒト系統が、CD34（血球前駆細胞）、CD19（Ｂリンパ球）、CD33（好中球）、CD14（単球）、CD15（顆粒球）、CD42b（巨核球）及びグリコホリンＡ（赤芽球）；に対するPE複合抗体を用いてさらに識別された。GFP発現は、CD45＋ゲート及びPEポジティブ細胞で分析された。数字は四分区間内の細胞の百分率を示す。
【図３Ｃ】UCB CD34＋で形質導入されたレンチ・ベクターを移植されたNOD/SCIDマウスの骨髄でのGFP発現を示す図。pHPP91-GFPレンチ・ベクター（MOI 10）で形質導入されたUCB CD34＋が、亜致死放射線照射（375 cGy）されたNOD/SCIDマウス（生後８週から10週）へ静脈内注射された。８週間後、移マウスの大腿骨から得られた骨髄細胞は、移植された細胞に標識付けするためにPerCP複合抗ヒトCD45で標識付けされ、特定のヒト系統が、CD34（血球前駆細胞）、CD19（Ｂリンパ球）、CD33（好中球）、CD14（単球）、CD15（顆粒球）、CD42b（巨核球）及びグリコホリンＡ（赤芽球）；に対するPE複合抗体を用いてさらに識別された。GFP発現は、CD45＋ゲート（赤色）及びPEポジティブ細胞で分析された。数字は四分区間内の細胞の百分率を示す。
【図３Ｄ】UCB CD34＋で形質導入されたレンチ・ベクターを移植されたNOD/SCIDマウスの骨髄でのGFP発現を示す図。pWPT-GFPレンチ・ベクター（MOI 10）で形質導入されたUCB CD34＋が、亜致死放射線照射（375 cGy）されたNOD/SCIDマウス（生後８週から10週）へ静脈内注射された。８週間後、移植マウスの大腿骨から得られた骨髄細胞は、移植された細胞に標識付けするためにPerCP複合抗ヒトCD45で標識付けされ、特定のヒト系統が、CD34（血球前駆細胞）、CD19（Ｂリンパ球）、CD33（好中球）、CD14（単球）、CD15（顆粒球）、CD42b（巨核球）及びグリコホリンＡ（赤芽球）；に対するPE複合抗体を用いてさらに識別された。GFP発現は、CD45＋ゲート及びPEポジティブ細胞で分析された。数字は四分区間内の細胞の百分率を示す。
【図３Ｅ】UCB CD34＋で形質導入されたレンチ・ベクターを移植されたNOD/SCIDマウスの骨髄でのGFP発現を示す図。pWPP91-GFPレンチ・ベクター（MOI 10）で形質導入されたUCB CD34＋が、亜致死放射線照射（375 cGy）されたNOD/SCIDマウス（生後８週から10週）へ静脈内注射された。８週間後、移マウスの大腿骨から得られた骨髄細胞は、移植された細胞に標識付けするためにPerCP複合抗ヒトCD45で標識付けされ、特定のヒト系統が、CD34（血球前駆細胞）、CD19（Ｂリンパ球）、CD33（好中球）、CD14（単球）、CD15（顆粒球）、CD42b（巨核球）及びグリコホリンＡ（赤芽球）；に対するPE複合抗体を用いてさらに識別された。GFP発現は、CD45＋ゲート及びPEポジティブ細胞で分析された。数字は四分区間内の細胞の百分率を示す。
【図４】WPREが、骨髄性細胞内でin vivoでGFP発現促進gp91-phoxプロモータを救出する図。図３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄからのデータ；対照群細胞のバックグラウンド蛍光は除かれている。Neu−好中球、Mo−単球、Gr−顆粒球。
【図５】構成EF-1アルファ・プロモータ（図５Ａ、５Ｂ）の制御下、またはgp91-phox骨髄特異的プロモータ（図５Ｃ、５Ｄ）の制御下でGFPマーカーを運ぶレンチウイルス性ベクターを示す図。５Ｂ及び５ＤのベクターはWPRE配列を含んでいる。
【図６Ａ】gp91-phoxプロモータ断片（500bp）及びマルチクローニング・サイト（MCS）を運ぶレンチウイルス性ベクターの構造、及びpHPT-GFPから開始するgp91-phox特異的エンハンサの挿入を示す図。  先ず、ヒトgp91-phoxプロモータの500bp断片が、テンプレートとして1540bp断片を用いてPCRによって生成され（MCS-I配列が5' 前方プライマへ包含された）、EF-1α短プロモータの代わりにpHPT-GFPのXhoI-BamHIへ挿入されてpHP500-GFP媒介ベクターを生成した。
【図６Ｂ】次にMCSII、cPPT、MCS-I及びgp91-phox 500bp断片を含んでいるPCR断片が、テンプレートとしてpHP500-GFPベクターを用いて生成され（MCS-II配列が5' 前方プライマへ付加された）、pHOX-GFPベクターに位置されたClaI-BamHIへ挿入され、pHPX-GFPベクターを生成した。
【図６Ｃ】gp91-phox特異的エンハンサが、cPPT配列の上流または下流のいずれかで両方のMCSへ順次挿入され、pHPHS-GFPベクターを生成した。最後に、pWPHS-GFPベクターが、WPRE配列のpHPHS-GFPベクターへの挿入によって生成された。ヒトゲノムDNA配列でのPCR増幅HS要素（＋1 gp91-phox転写開始）の位置は：HS-12（-11503、-13244）、HS-14（-13244、-14715）、HS-26（-25345、-26529）、HS-27（-26529、-27656）、HS-28（-27657、-28893）である。  図示されたような断片は、クローニングを促進するため末端での制限サイトの組込みにより、計算されたものよりわずかに大きい（HS-12及びHS-14；ｐHPX-GFPのこのサイトへのクローニング後に5' SnaBIを修復するgta；HS-26、HS-27、HS-28 SalI；gcgtcgac及びXhoI；ctcgagcggc）。
【図７】cPPT要素のレンチウイルス性ベクターへの挿入を示す図。中央ポリプリン・トラクト（cPPT）が、pRRLsinb.hPGK.EGFPベクターから取り出された（Follenzi, A, Ailles, L.E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. (2000) Gene Transfer by Lentiviral Vectors is Limited by Nuclear Translocation and Rescued by HIV-1 pol Sequences. Nat. Genet. 25:217-22参照）。cPPT要素を含んでいるNotI-EcorRV断片は、pHPT-GFPを生成するpHOX-GFPのNotI-ClaIサイトへクローニングされた。NotI及びClaIサイトは両方のライゲーション断片を入れられたので、NotIはpHPT-GFPでは修復されない。ClaIサイトは修復されるが、damメチル化された。従って、プラスミド・ベクターは、このClaIサイトを用いるためにdamバクテリア内で培養されなければならない。
【図１Ａ】
2005504539.tif 000005
【図１Ｂ】
2005504539.tif 000006
【図２Ａ】
2005504539.tif 000007
【図２Ｂ】
2005504539.tif 000008
【図３Ａ】
2005504539.tif 000009
【図３Ｂ】
2005504539.tif 000010
【図３Ｃ】
2005504539.tif 000011
【図３Ｄ】
2005504539.tif 000012
【図３Ｅ】
2005504539.tif 000013
【図４】
2005504539.tif 000014
【図５】
2005504539.tif 000015
【図６Ａ】
2005504539.tif 000016
【図６Ｂ】
2005504539.tif 000017
【図６Ｃ】
2005504539.tif 000018
【図７】
2005504539.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2005504539.tif 000020
2005504539.tif 000021
2005504539.tif 000022
2005504539.tif 000023
2005504539.tif 000024
2005504539.tif 000025
2005504539.tif 000026
2005504539.tif 000027
2005504539.tif 000028
2005504539.tif 000029
2005504539.tif 000030
2005504539.tif 000031
2005504539.tif 000032
2005504539.tif 000033
2005504539.tif 000034
2005504539.tif 000035
2005504539.tif 000036
2005504539.tif 000037
2005504539.tif 000038
2005504539.tif 000039
2005504539.tif 000040
2005504539.tif 000041
2005504539.tif 000042
2005504539.tif 000043
2005504539.tif 000044
2005504539.tif 000045
2005504539.tif 000046
2005504539.tif 000047
2005504539.tif 000048
2005504539.tif 000049
2005504539.tif 000050
2005504539.tif 000051
2005504539.tif 000052
2005504539.tif 000053
2005504539.tif 000054
2005504539.tif 000055
2005504539.tif 000056
2005504539.tif 000057
2005504539.tif 000058
2005504539.tif 000059
2005504539.tif 000060
2005504539.tif 000061
2005504539.tif 000062
2005504539.tif 000063
2005504539.tif 000064
2005504539.tif 000065
2005504539.tif 000066
2005504539.tif 000067
2005504539.tif 000068
2005504539.tif 000069
2005504539.tif 000070
2005504539.tif 000071
2005504539.tif 000072
2005504539.tif 000073
2005504539.tif 000074
2005504539.tif 000075
2005504539.tif 000076
2005504539.tif 000077
2005504539.tif 000078
2005504539.tif 000079
2005504539.tif 000080
2005504539.tif 000081
2005504539.tif 000082
2005504539.tif 000083
2005504539.tif 000084
2005504539.tif 000085
2005504539.tif 000086
2005504539.tif 000087
2005504539.tif 000088
2005504539.tif 000089
2005504539.tif 000090
2005504539.tif 000091
2005504539.tif 000092
2005504539.tif 000093
2005504539.tif 000094
2005504539.tif 000095
2005504539.tif 000096
2005504539.tif 000097
2005504539.tif 000098
2005504539.tif 000099
2005504539.tif 000100
2005504539.tif 000101
2005504539.tif 000102
2005504539.tif 000103
2005504539.tif 000104
2005504539.tif 000105
2005504539.tif 000106
2005504539.tif 000107
2005504539.tif 000108
2005504539.tif 000109
2005504539.tif 000110
2005504539.tif 000111
2005504539.tif 000112
2005504539.tif 000113
2005504539.tif 000114
2005504539.tif 000115
2005504539.tif 000116
2005504539.tif 000117
2005504539.tif 000118
2005504539.tif 000119
2005504539.tif 000120
2005504539.tif 000121
2005504539.tif 000122
2005504539.tif 000123
2005504539.tif 000124
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504539.tif 000125
【国際調査報告】
2005504539.tif 000126
2005504539.tif 000127
2005504539.tif 000128