(57)【要約】本発明は、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスゲノムへの外因性配列の組み込みに有用な新規挿入部位に関する。また本発明は、ＭＶＡのゲノムに外因性ＤＮＡを挿入するためのプラスミドベクターも提供する。さらに本発明は、前記新しい挿入部位に挿入されている外因性ＤＮＡ配列を含む組換えＭＶＡを、医薬品またはワクチンとして提供する。
2005525822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入された異種ＤＮＡ配列を含む組換え変異ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）。
【請求項２】
異種ＤＮＡ配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群より選択される隣り合う２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間にあるＩＧＲに挿入される、請求項１記載のＭＶＡ。
【請求項３】
異種ＤＮＡ配列が、好ましくはポックスウイルス転写制御要素の転写制御下にある、少なくとも１つのコード配列を含む、請求項１または２記載のＭＶＡ。
【請求項４】
異種ＤＮＡ配列が、１種以上のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、外来抗原または抗原エピトープをコードする、請求項１〜３のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項５】
異種ＤＮＡ配列が、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及び（又は）免疫不全ウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する、請求項１〜４のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項６】
デングウイルスに由来する異種ＤＮＡ配列が、ＮＳ１およびＰｒＭを含む群から選択される、請求項５記載のＭＶＡ。
【請求項７】
ＮＳ１遺伝子がＯＲＦ  ０６４Ｌ−０６５Ｌ間のＩＧＲに挿入される、請求項６記載のＭＶＡ。
【請求項８】
ＰｒＭ遺伝子が４つのデングウイルス血清型の１種以上に由来する、請求項６または７記載のＭＶＡ。
【請求項９】
ＰｒＭ遺伝子が、００７Ｒ−００８Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択されるＯＲＦ間のＩＧＲに挿入される、請求項６〜８のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項１０】
免疫不全ウイルスに由来する異種ＤＮＡ配列がＨＩＶ  ｅｎｖをコードする、請求項５記載のＭＶＡ。
【請求項１１】
ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子がＯＲＦ  ００７Ｒ−００８Ｌ間のＩＧＲに挿入される、請求項１０記載のＭＶＡ。
【請求項１２】
ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡである、請求項１〜１１のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項１３】
医薬品及び（又は）ワクチンとして使用される請求項１〜１２のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項１４】
ウイルス感染及び（又は）増殖性疾患を処置及び（又は）予防するための医薬品及び（又は）ワクチンの製造を目的とする、請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡの使用方法。
【請求項１５】
デングウイルス感染または免疫不全ウイルス感染、好ましくはＨＩＶ感染を処置または予防するための請求項１４記載の使用方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡを含むワクチン。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡと薬学的に許容し得る担体、希釈剤、アジュバント及び（又は）添加剤とを含む、薬学的調合物。
【請求項１８】
ヒトを含む動物の生体における免疫応答に影響を及ぼす方法、好ましくはヒトを含む動物の生体における免疫応答を誘発する方法であって、これを必要とする、ヒトを含む動物に、請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡ、請求項１６記載のワクチン及び（又は）請求項１７記載の組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項１９】
タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗原またはエピトープをインビトロで製造する方法であって、
宿主細胞を請求項１〜１３のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡに感染させる工程と、
感染した宿主細胞を適切な条件下で培養する工程と、
前記宿主細胞が産生したポリペプチド、タンパク質、ペプチド、抗原、エピトープ及び（又は）ウイルスを単離及び（又は）濃縮する工程と、
を含む、上記方法。
【請求項２０】
ある細胞に、その細胞のゲノムにとって相同及び（又は）異種であるＤＮＡ配列を、インビトロで導入する方法であって、前記細胞を請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡに感染させる、上記方法。
【請求項２１】
ある細胞に、その細胞のゲノムにとって相同及び（又は）異種であるＤＮＡ配列を、エクスビボで導入する方法であって、前記細胞を請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡに感染させた後、その感染細胞を、ヒトを含む動物の生体に投与する、上記方法。
【請求項２２】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡ、請求項１６に記載のワクチン及び（又は）請求項１７に記載の組成物を、ヒトを含む動物に投与することによって、ヒトを含む動物の生体に、その動物体のゲノムにとって相同及び（又は）異種であるＤＮＡ配列を導入する、上記方法。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡを含む、細胞。
【請求項２４】
ＭＶＡのゲノムに由来するＤＮＡ配列またはＭＶＡのゲノムにとって相同なＤＮＡ配列を含むプラスミドベクターであって、前記ＤＮＡ配列はウイルスゲノムの隣り合う２つのＯＲＦ間に位置するＩＧＲ配列の全断片または部分的断片を含み、前記ＩＧＲ配列には、ＭＶＡのゲノムにとって異種であるＤＮＡ配列を挿入するための、そして場合によりレポーター遺伝子及び（又は）選択遺伝子カセットを挿入するためのクローニング部位が挿入されている、プラスミドベクター。
【請求項２５】
ＭＶＡのゲノムに由来するＤＮＡ配列またはＭＶＡのゲノムにとって相同なＤＮＡ配列を含むプラスミドベクターであって、前記ＤＮＡ配列は隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列を含み、前記ＩＧＲ配列には、ＭＶＡのゲノムにとって異種であるＤＮＡ配列を挿入するための、そして場合によりレポーター遺伝子及び（又は）選択遺伝子カセットを挿入するためのクローニング部位が挿入されている、プラスミドベクター。
【請求項２６】
前記ＤＮＡ配列がＩＧＲ配列の全断片または部分的断片を含み、前記ＩＧＲ配列が異種ＤＮＡ配列を挿入するための、そして場合によりレポーター遺伝子及び（又は）選択遺伝子カセットを挿入するためのクローニング部位を含む、請求項２５記載のプラスミドベクター。
【請求項２７】
ＩＧＲ配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択されるＯＲＦ間のＩＧＲに由来する、請求項２４〜２６のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
【請求項２８】
ＩＧＲ由来配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の５２７〜６０８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の２９９〜８８３番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の３３９〜８５２番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の３７６〜６４７番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の５９７〜８５５番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の４００〜６０７番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項２４〜２７のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
【請求項２９】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択される、請求項２４〜２８のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
【請求項３０】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の１〜５２６番目および６０９〜１１９０番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の１０１〜２９８番目および８８４〜１１９８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の１〜３３８番目および８５３〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の１〜３７５番目および６４８〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の１〜５９６番目および８５６〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の１〜３９９番目および６０８〜１０８１番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項２４〜２９のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
【請求項３１】
ＤＮＡ配列が、ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡのゲノムに由来するか、または同ゲノムにとって相同である、請求項２４〜３０のいずれか１つに記載のプラスミドベクター。
【請求項３２】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡを製造する方法であって、
請求項２４〜３１のいずれか1つに記載のプラスミドベクターを細胞にトランスフェクトする工程と、
トランスフェクトされた細胞をＭＶＡに感染させる工程と、
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡを同定し、単離し、場合により精製する工程と、
を含む、上記方法。
【請求項３３】
ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡに細胞を感染させる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ＭＶＡのゲノムに由来するかまたはＭＶＡのゲノムにとって相同なＤＮＡ配列であって、ウイルスゲノムの隣り合う２つのＯＲＦ間に位置するＩＧＲ配列の全断片または部分的断片を含む、上記ＤＮＡ配列。
【請求項３５】
ＭＶＡのゲノムに由来するかまたはＭＶＡのゲノムにとって相同なＤＮＡ配列であって、隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列を含む、上記ＤＮＡ配列。
【請求項３６】
ＩＧＲ配列の全断片または部分的断片を含む、請求項３５記載のＤＮＡ配列。
【請求項３７】
ＭＶＡゲノムにとって異種である外因性ＤＮＡ配列がＩＧＲに挿入される、請求項３４〜３６のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項３８】
ＩＧＲ配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択されるＯＲＦ間のＩＧＲに由来する、請求項３４〜３７のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項３９】
ＩＧＲ由来配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の５２７〜６０８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の２９９〜８８３番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の３３９〜８５２番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の３７６〜６４７番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の５９７〜８５５番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の４００〜６０７番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項３４〜３８のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項４０】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択される、請求項３４〜３９のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項４１】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の１〜５２６番目および６０９〜１１９０番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の１０１〜２９８番目および８８４〜１１９８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の１〜３３８番目および８５３〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の１〜３７５番目および６４８〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の１〜５９６番目および８５６〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の１〜３９９番目および６０８〜１０８１番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項３４〜４０のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項４２】
ＤＮＡ配列が、ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡのゲノムに由来するか、または同ゲノムにとって相同である、請求項３４〜４１のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＶＡゲノムへの外因性ＤＮＡ配列の組み込みに役立つ新規挿入部位に関する。
【背景技術】
【０００２】
変異ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）はオルトポックスウイルス科の一員であり、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞で約５７０代にわたって連続継代することによって作出された（概要については非特許文献1を参照されたい）。これらの継代の結果、得られたＭＶＡウイルスが持つゲノム情報はＣＶＡと比較して３１キロ塩基分少なく、宿主細胞が著しく制限される（非特許文献２）。ＭＶＡは、極度に弱毒化されている（すなわち毒力または感染性が低下している）が、依然として優れた免疫原性を持つことを特徴とする。様々な動物モデルで試験したところ、ＭＶＡは免疫抑制された個体においても非病原性であることが判明した。さらに重要なことに、ＭＶＡ株の優れた性質は、広範な臨床試験によって実証されている（非特許文献３）。高リスク患者を含む１２０，０００人を超える被験者で行われたこれらの試験では、副作用が見られなかった（非特許文献４）。
【０００３】
また、ＭＶＡでは、哺乳動物細胞におけるウイルス複製サイクルの後期が遮断されることもわかっている（非特許文献５）。したがってＭＶＡは、そのＤＮＡを完全に複製し、初期、中期および後期遺伝子産物を合成するが、感染細胞から放出されうる成熟した感染性ウイルス粒子を組み立てる能力を持たない。そういう理由から、すなわち複製が制限されていることから、ＭＶＡは遺伝子発現ベクターとして役立つと提唱された。
【０００４】
最近、ＭＶＡを使って、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子部位（特許文献1）またはＭＶＡゲノム中の天然欠失部位（特許文献２）に挿入された抗原配列を発現する、組換えワクチンが作製された。
【０００５】
ｔｋ挿入座は組換えポックスウイルスの作製、特に組換えワクシニアウイルスの作製に、広く使用されているが（非特許文献６）、この技術はＭＶＡには応用できなかった。ＭＶＡは、組換えポックスウイルスの作製に使用することができる他のポックスウイルスと比較して、ゲノムの改変に対する感受性がはるかに高いことを、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒらは明らかにした。特に、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒらは、ポックスウイルスゲノムへの異種ＤＮＡの組み込みに最もよく使われる部位の１つ、すなわちチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子座を、組換えＭＶＡの作製に使用することはできないことを明らかにした。結果として得られるｔｋ（−）組換えＭＶＡはいずれも著しく不安定であることが判明し、精製すると、挿入されたＤＮＡはＭＶＡのゲノムＤＮＡの一部と共に直ちに欠失した（非特許文献７）。
【０００６】
不安定であることと、それゆえにゲノム組換えの確率が高いことは、ポックスウイルス学では既知の問題である。実際、ＭＶＡは、組織培養細胞でインビトロ増殖させた場合にＣＶＡのウイルスゲノムが不安定であるという事実を利用して、長期継代中に樹立された。ＭＶＡゲノムからは数千ヌクレオチド（３１ｋｂ）が欠失していた。したがってＭＶＡゲノムは、元のＣＶＡゲノムと比較して、６個の主要な欠失と数多くの小さな欠失を特徴とする。
【０００７】
最近、ＭＶＡゲノムのゲノム構成が記載された（非特許文献８）。ＭＶＡの１７８ｋｂゲノムは高密度に詰め込まれていて、長さが少なくとも６３アミノ酸であるタンパク質をコードする１９３個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでいる。感染性の高い痘瘡ウイルス、およびワクシニアウイルスの原型、すなわちコペンハーゲン株と比較すると、ＭＶＡのＯＲＦは大部分が断片化または短縮されている（非特許文献９）。しかし、ごくわずかな例外を除いて、全てのＯＲＦは、断片化されたＯＲＦおよび短縮されたＯＲＦを含めて、転写され、タンパク質に翻訳される。以下の説明では、Ａｎｔｏｉｎｅらの命名法を使用し、必要に応じて、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素消化物に基づく命名法も示す。
【０００８】
従来、安定な組換えＭＶＡは、ＭＶＡゲノムの天然欠失部位に外因性ＤＮＡを挿入することでしか得られていない（特許文献２）。残念なことに、ＭＶＡゲノム中の天然欠失部位の数は限られている。また、他の挿入部位、例えばｔｋ遺伝子座などは、組換えＭＶＡの作製にはほとんど役に立たないことも明らかにされている（非特許文献1０）。
【特許文献１】米国特許第５，１８５，１４６号明細書
【特許文献２】ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６
【非特許文献１】Ｍａｙｒ，Ａ．等、［１９７５］Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４
【非特許文献２】Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８［１９９１］
【非特許文献３】Ｍａｙｒ等、Ｚｂｌ．Ｂａｋｔ．Ｈｙｇ．Ｉ，Ａｂｔ．Ｏｒｇ．Ｂ  １６７，３７５−３９０［１９８７］
【非特許文献４】Ｓｔｉｃｋｌ等、Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２［１９７４］
【非特許文献５】Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．およびＭｏｓｓ，Ｂ．［１９９２］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１０８４７−１０８５１
【非特許文献６】Ｍａｃｋｅｔｔら［１９８２］Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ７９，７４１５−７４１９
【非特許文献７】Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら［１９９６］Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４１：６６３−６６９
【非特許文献８】Ａｎｔｏｉｎｅら［１９９８］Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４４，３６５−３９６
【非特許文献９】Ａｎｔｏｉｎｅら［１９９８］Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４４，３６５−３９６
【非特許文献１０】Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら［１９９６］Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １４１：６６３−６６９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の目的
ＭＶＡゲノムの新たな挿入部位を同定すること、およびその新たに同定されたＭＶＡゲノムの挿入部位への外因性ＤＮＡ配列の挿入を指示する挿入ベクターを提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
また、ＭＶＡゲノムの新規挿入部位に安定に組み込まれた外因性ＤＮＡ配列を含む組換えＭＶＡを提供することも、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明者らは、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスのゲノムに外因性ＤＮＡ配列を挿入するための新しい部位を同定した。これらの新規挿入部位はウイルスゲノムの遺伝子間領域（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ：ＩＧＲ）に位置し、そのＩＧＲは、ＭＶＡゲノムの隣り合う２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間に位置しているか、またはＭＶＡゲノムの隣り合う２つのオープンリーディングフレームに隣接している。
【００１２】
したがって本発明は、ウイルスゲノムのＩＧＲ中に挿入された異種ＤＮＡ配列を含む組換えＭＶＡに関する。本発明によれば、１種以上の外因性ＤＮＡ配列を、１種以上のＩＧＲ中に挿入することができる。
【００１３】
実際、外因性ＤＮＡ配列は、ＭＶＡゲノムのＩＧＲ中に挿入された状態で安定であることがわかった。上述のようにＭＶＡのゲノムは極めて不安定であるとみなすべきなので、これは驚くべきことである。ウイルスの増殖にとって必須でない遺伝子またはＤＮＡ配列は欠失するか、断片化されると思われる。ＭＶＡゲノム中の天然欠失部位に異種ＤＮＡ配列を挿入すると安定な組換えＭＶＡが得られることがわかっており（ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６）、これもまた驚くべきことであるが、これとは対照的に、他の組換えポックスウイルスの作製に広く用いられているｔｋ座などの宿主域遺伝子は、ＭＶＡ中の挿入部位としては適切でないことがわかった。Ｖｅｒｏ−ＭＶＡがゲノム欠失を１つ余分に持っているという事実（ＰＣＴ／ＥＰ０１／０２７０３）も、増殖にとって必要でない遺伝子をたやすく欠失させるという意味でゲノムが動的であることを示唆している。したがって、ウイルス増殖にとって必須でない異種ＤＮＡ配列をＯＲＦ間の区域に挿入しても、ウイルスはそれを同様に欠失させると予想されるだろう。
【００１４】
ＯＲＦのヌクレオチド配列が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を形成するアミノ酸配列をコードしているのに対して、２つのＯＲＦの間にあるＩＧＲはコード能力を持っていないが、ＩＧＲには、ウイルス遺伝子発現の転写制御に不可欠なまたはウイルス遺伝子発現の転写制御に関与する調節要素、結合部位、プロモーター及び（又は）エンハンサー配列が含まれている可能性がある。したがってＩＧＲはウイルス生活環の調節制御に関与している可能性がある。しかし、本発明者らは、ＭＶＡの典型的な特徴および遺伝子発現に影響を及ぼしたりそれらを変化させたりすることなく外因性ＤＮＡ配列をＭＶＡゲノム中に安定に挿入することができるという予想外の利点を、これらの新規挿入部位が持っていることも、明らかにした。これらの新規挿入部位は、ＭＶＡのＯＲＦまたはコード配列を変化させないので、とりわけ有用である。
【００１５】
その上、驚くべきことに、ＩＧＲに挿入された外来遺伝子の発現レベルは、ＭＶＡゲノムの欠失部位に挿入された外来遺伝子の発現レベルより高いこともわかった（実施例１も参照されたい）。
【００１６】
ＯＲＦのヌクレオチド配列は、通例、開始コドンで始まって、停止コドンで終わる。隣り合う２つのＯＲＦの向きに依存して、それらＯＲＦ間の領域であるＩＧＲは、隣り合う２つのＯＲＦの２つの停止コドンに隣接するか、隣り合う２つのＯＲＦの２つの開始コドンに隣接するか、第１ＯＲＦの停止コドンと第２ＯＲＦの開始コドンとに隣接するか、または第１ＯＲＦの開始コドンと第２ＯＲＦの停止コドンとに隣接することになる。
【００１７】
したがって、ＩＧＲへの外因性ＤＮＡ配列の挿入部位は、第１ＯＲＦの下流、すなわち３’側でありうる。隣り合うＯＲＦ（第２ＯＲＦともいう）が第１ＯＲＦと同じ向きを持つ場合、第１ＯＲＦの停止コドンの下流にあるこの挿入部位は、第２ＯＲＦの開始コドンの上流、すなわち５’側にあることになる。
【００１８】
第２ＯＲＦが第１ＯＲＦとは反対の向きを持つ場合、すなわち隣り合う２つのＯＲＦの向きが互いの方向を指している場合、挿入部位は、両方のＯＲＦの停止コドンの下流にあることになる。
【００１９】
第３の選択肢として、隣り合う２つのＯＲＦは反対向きに読まれるが、それら２つの隣り合うＯＲＦの向きが互いの方向とは反対の方向を指している場合（これは、２つのＯＲＦの開始コドンが、互いに隣り合っていることを特徴とする配置と、同じことを表している）、外因性ＤＮＡは、両方の開始コドンから見て上流に挿入されることになる。
【００２０】
ＭＶＡゲノム中のＯＲＦには２つのコード方向がある。したがってポリメラーゼ活性は、左から右向きに、すなわち順方向に生じると共に、右から左向き（逆方向）にも生じる。ＯＲＦを、それらの向きと、ゲノムのさまざまなＨｉｎｄＩＩＩ制限消化断片上でのそれらの位置とによって同定することは、ポックスウイルス学ではよく行われることであり、ワクシニアウイルスの標準的分類法になっている。この命名法では、さまざまなＨｉｎｄＩＩＩ断片を、降順のサイズに対応する降順の大文字によって名付ける。ＯＲＦは、各ＨｉｎｄＩＩＩ断片上で左から右に向かって番号が付与され、ＯＲＦの向きは大文字のＬ（右から左（Ｌｅｆｔ）に向かう転写を意味する）またはＲ（左から右（Ｒｉｇｈｔ）に向かう転写を意味する）によって示される。また、最近になってＭＶＡゲノム構造が公表されたが、そこでは、単にゲノムの左端から右端に向かってＯＲＦに番号を付与し、ＯＲＦの向きを大文字のＬまたはＲで示すという、異なる命名法が用いられている（Ａｎｔｏｉｎｅら［１９９８］Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４４，３６５−３９６）。一例として、旧命名法でのＩ４Ｌ  ＯＲＦは、Ａｎｔｏｉｎｅらによれば０６４Ｌ  ＯＲＦに相当する。別段の表示がない場合、本発明ではＡｎｔｏｉｎｅらの命名法を用いることにする。
【００２１】
本発明によれば、
００１Ｌ−００２Ｌ、００２Ｌ−００３Ｌ、００５Ｒ−００６Ｒ、００６Ｌ−００７Ｒ、００７Ｒ−００８Ｌ、００８Ｌ−００９Ｌ、０１７Ｌ−０１８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０１９Ｌ−０２０Ｌ、０２０Ｌ−０２１Ｌ、０２３Ｌ−０２４Ｌ、０２４Ｌ−０２５Ｌ、０２５Ｌ−０２６Ｌ、０２８Ｒ−０２９Ｌ、０３０Ｌ−０３１Ｌ、０３１Ｌ−０３２Ｌ、０３２Ｌ−０３３Ｌ、０３５Ｌ−０３６Ｌ、０３６Ｌ−０３７Ｌ、０３７Ｌ−０３８Ｌ、０３９Ｌ−０４０Ｌ、０４３Ｌ−０４４Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０４６Ｌ−０４７Ｒ、０４９Ｌ−０５０Ｌ、０５０Ｌ−０５１Ｌ、０５１Ｌ−０５２Ｒ、０５２Ｒ−０５３Ｒ、０５３Ｒ−０５４Ｒ、０５４Ｒ−０５５Ｒ、０５５Ｒ−０５６Ｌ、０６１Ｌ−０６２Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、０６５Ｌ−０６６Ｌ、０６６Ｌ−０６７Ｌ、０７７Ｌ−０７８Ｒ、０７８Ｒ−０７９Ｒ、０８０Ｒ−０８１Ｒ、０８１Ｒ−０８２Ｌ、０８２Ｌ−０８３Ｒ、０８５Ｒ−０８６Ｒ、０８６Ｒ−０８７Ｒ、０８８Ｒ−０８９Ｌ、０８９Ｌ−０９０Ｒ、０９２Ｒ−０９３Ｌ、０９４Ｌ−０９５Ｒ、０９６Ｒ−０９７Ｒ、０９７Ｒ−０９８Ｒ、１０１Ｒ−１０２Ｒ、１０３Ｒ−１０４Ｒ、１０５Ｌ−１０６Ｒ、１０７Ｒ−１０８Ｌ、１０８Ｌ−１０９Ｌ、１０９Ｌ−１１０Ｌ、１１０Ｌ−１１１Ｌ、１１３Ｌ−１１４Ｌ、１１４Ｌ−１１５Ｌ、１１５Ｌ−１１６Ｒ、１１７Ｌ−１１８Ｌ、１１８Ｌ−１１９Ｒ、１２２Ｒ−１２３Ｌ、１２３Ｌ−１２４Ｌ、１２４Ｌ−１２５Ｌ、１２５Ｌ−１２６Ｌ、１３３Ｒ−１３４Ｒ、１３４Ｒ−１３５Ｒ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１３７Ｌ−１３８Ｌ、１４１Ｌ−１４２Ｒ、１４３Ｌ−１４４Ｒ、１４４Ｒ−１４５Ｒ、１４５Ｒ−１４６Ｒ、１４６Ｒ−１４７Ｒ、１４７Ｒ−１４８Ｒ、１４８Ｒ−１４９Ｌ、１５２Ｒ−１５３Ｌ、１５３Ｌ−１５４Ｒ、１５４Ｒ−１５５Ｒ、１５６Ｒ−１５７Ｌ、１５７Ｌ−１５８Ｒ、１５９Ｒ−１６０Ｌ、１６０Ｌ−１６１Ｒ、１６２Ｒ−１６３Ｒ、１６３Ｒ−１６４Ｒ、１６４Ｒ−１６５Ｒ、１６５Ｒ−１６６Ｒ、１６６Ｒ−１６７Ｒ、１６７Ｒ−１６８Ｒ、１７０Ｒ−１７１Ｒ、１７３Ｒ−１７４Ｒ、１７５Ｒ−１７６Ｒ、１７６Ｒ−１７７Ｒ、１７８Ｒ−１７９Ｒ、１７９Ｒ−１８０Ｒ、１８０Ｒ−１８１Ｒ、１８３Ｒ−１８４Ｒ、１８４Ｒ−１８５Ｌ、１８５Ｌ−１８６Ｒ、１８６Ｒ−１８７Ｒ、１８７Ｒ−１８８Ｒ、１８８Ｒ−１８９Ｒ、１８９Ｒ−１９０Ｒ、１９２Ｒ−１９３Ｒ
を含む群から選択される、隣り合う２つのＯＲＦの間にある１種以上のＩＧＲに、異種ＤＮＡ配列を挿入することができる。
【００２２】
旧命名法でいうと、ＯＲＦ  ００６ＬはＣ１０Ｌに相当し、０１９ＬはＣ６Ｌに相当し、０２０ＬはＮ１Ｌに、０２１ＬはＮ２Ｌに、０２３ＬはＫ２Ｌに、０２８ＲはＫ７Ｒに、０２９ＬはＦ１Ｌに、０３７ＬはＦ８Ｌに、０４５ＬはＦ１５Ｌに、０５０ＬはＥ３Ｌに、０５２ＲはＥ５Ｒに、０５４ＲはＥ７Ｒに、０５５ＲはＥ８Ｒに、０５６ＬはＥ９Ｌに、０６２ＬはＩ１Ｌに、０６４ＬはＩ４Ｌに、０６５ＬはＩ５Ｌに、０８１ＲはＬ２Ｒに、０８２ＬはＬ３Ｌに、０８６ＲはＪ２Ｒに、０８８ＲはＪ４Ｒに、０８９ＬはＪ５Ｌに、０９２ＲはＨ２Ｒに、０９５ＲはＨ５Ｒに、１０７ＲはＤ１０Ｒに、１０８ＬはＤ１１Ｌに、１２２ＲはＡ１１Ｒに、１２３ＬはＡ１２Ｌに、１２５ＬはＡ１４Ｌに、１２６ＬはＡ１５Ｌに、１３５ＲはＡ２４Ｒに、１３６ＬはＡ２５Ｌに、１３７ＬはＡ２６Ｌに、１４１ＬはＡ３０Ｌに、１４８ＲはＡ３７Ｒに、１４９ＬはＡ３８Ｌに、１５２ＲはＡ４０Ｒに、１５３ＬはＡ４１Ｌに、１５４ＲはＡ４２Ｒに、１５７ＬはＡ４４Ｌに、１５９ＲはＡ４６Ｒに、１６０ＬはＡ４７Ｌに、１６５ＲはＡ５６Ｒに、１６６ＲはＡ５７Ｒに、１６７ＲはＢ１Ｒに、１７０ＲはＢ３Ｒに、１７６ＲはＢ８Ｒに、１８０ＲはＢ１２Ｒに、１８４ＲはＢ１６Ｒに、１８５ＬはＢ１７Ｌに、そして１８７ＲはＢ１９Ｒに相当する。
【００２３】
好ましくは、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択される隣り合う２つのＯＲＦに隣接するＩＧＲに異種配列を挿入する。
【００２４】
異種ＤＮＡ配列または外因性ＤＮＡ配列は、自然界において、本発明で使用されるポックスウイルスに、通常は、付随して見いだされない配列である。本発明のもう１つの態様では、この外因性ＤＮＡ配列が少なくとも１つのコード配列を含む。このコード配列は、転写制御要素、好ましくはポックスウイルス転写制御要素に、作動的に連結される。また、ポックスウイルス転写制御要素と、例えば内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）などとの組合せも使用することができる。
【００２５】
もう１つの態様として、外因性ＤＮＡ配列は、１種以上の転写制御要素に連結された２つ以上のコード配列を含むこともできる。コード配列は、好ましくは、１種以上のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、外来抗原または抗原エピトープ、特に治療上興味深い遺伝子のものをコードする。
【００２６】
本発明では、治療上興味深い遺伝子として、疾患を引き起こす病原性または感染性微生物の遺伝子に由来する遺伝子、または疾患を引き起こす病原性または感染性微生物の遺伝子と相同な遺伝子を挙げることができる。したがって本発明では、特異的免疫応答に影響を及ぼし（好ましくは特異的免疫応答を誘発し）、その結果として、当該微生物による感染に対して、ある生物を予防接種または予防的に保護するために、上述のような治療上興味深い遺伝子を、その生物の免疫系に提示する。本発明のさらなる好ましい態様では、治療上興味深い遺伝子が、感染性ウイルスの遺伝子、例えばデングウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルス、またはＨＩＶなどの免疫不全ウイルス（ただしこれらに限らない）の遺伝子から選択される。
【００２７】
デングウイルス由来の遺伝子は、好ましくは、ＮＳ１遺伝子およびＰｒＭ遺伝子である。この場合、これらの遺伝子は、４つのデングウイルス血清型の１つ、２つ、３つまたは全部に由来しうる。ＮＳ１遺伝子は、好ましくは、デングウイルス血清型２に由来し、好ましくは、ＯＲＦ  ０６４Ｌ−０６５Ｌ（Ｉ４Ｌ−Ｉ５Ｌ）間のＩＧＲに挿入される。ＰｒＭ遺伝子（好ましくは４つのデングウイルス血清型の全てに由来するもの）は、好ましくは、００７Ｒ−００８Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌから選択されるＯＲＦ間のＩＧＲに挿入される。より好ましくは、デングウイルス血清型１由来のＰｒＭ遺伝子（ＰｒＭ１）を１４８Ｒ−１４９Ｌ間のＩＧＲに、ＰｒＭ２をＩＧＲ  ００７Ｒ−００８Ｌに、ＰｒＭ３をＯＲＦ  ０４４Ｌ−０４５Ｌ間のＩＧＲに、そしてＰｒＭ４をＩＧＲ  １３６Ｌ−１３７Ｌに挿入する。
【００２８】
本発明のもう１つの好ましい態様では、異種ＤＮＡ配列がＨＩＶに由来し、ＨＩＶ  ｅｎｖをコードする。この場合、ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子は、好ましくは、ＯＲＦ  ００７Ｒ−００８Ｌ間のＩＧＲに挿入される。
【００２９】
さらにまた、本発明では、治療上興味深い遺伝子が、増殖性障害、癌または代謝疾患に対して治療効果を持つ疾患関連遺伝子も含む。例えば、癌の場合、治療上興味深い遺伝子として、特異的抗癌免疫反応を誘発する能力を持つ癌抗原を挙げることができる。
【００３０】
本発明のもう１つの態様では、コード配列が少なくとも１つのマーカーまたは選択遺伝子を含む。
【００３１】
選択遺伝子は細胞に特定の耐性を形質導入し、その結果、一定の選択方法が可能になる。当業者には、ポックスウイルス系に使用することができるさまざまな選択遺伝子がよく知られている。それらには、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ）や、ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）などがある。
【００３２】
マーカー遺伝子は、形質導入細胞の同定に使用することができる呈色反応を、形質導入細胞内で誘導する。当業者には、ポックスウイルス系に使用することができるさまざまなマーカー遺伝子がよく知られている。それらには、例えばβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、β−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕ）、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または青色蛍光タンパク質などをコードする遺伝子がある。
【００３３】
本発明のさらにもう１つの態様では、外因性ＤＮＡ配列が、外因性ＤＮＡ配列中のポックスウイルス転写制御要素及び（又は）コード配列を、隣り合うＯＲＦの停止コドン及び（又は）開始コドンから引き離すスペーシング配列（ｓｐａｃｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。隣り合うＯＲＦの停止／開始コドンと挿入された外因性ＤＮＡ中のコード領域との間にあるこのスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）には、挿入された外因性ＤＮＡを安定化し、ひいては、得られる組換えウイルスを安定化するという利点がある。スペーサー配列のサイズは、その配列が自らコード機能または調節機能を持たない限り、可変である。
【００３４】
もう１つの態様では、外因性ＤＮＡ配列中のポックスウイルス転写制御要素及び（又は）コード配列を、隣り合うＯＲＦの停止コドンから引き離すスペーサー配列が、少なくとも１ヌクレオチド長である。
【００３５】
本発明のもう１つの態様では、外因性ＤＮＡ配列中のポックスウイルス転写制御要素及び（又は）コード配列を、隣り合うＯＲＦの開始コドンから引き離すスペーサー配列が、少なくとも３０ヌクレオチドである。特に、典型的なワクシニアウイルスプロモーター要素が開始コドンの上流に同定される場合は、外因性ＤＮＡの挿入によって、そのプロモーター要素が隣り合うＯＲＦの開始コドンから引き離されてはならない。典型的なワクシニアプロモーター要素は、例えば後期プロモーターの「ＴＡＡＡＴ」という配列（ＤａｖｉｓｏｎおよびＭｏｓｓ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９８９；２１０：７７１−７８４）および初期プロモーターのＡ／Ｔリッチドメインを探すことによって、同定することができる。約３０ヌクレオチドのスペーシング配列は、ＯＲＦの開始コドンの上流に位置するポックスウイルスプロモーターが影響を受けないことを保証するために好ましい距離である。また、もう１つの好ましい態様では、挿入された外因性ＤＮＡと隣り合うＯＲＦの開始コドンとの間の距離を、約５０ヌクレオチド、より好ましくは約１００ヌクレオチドとする。
【００３６】
本発明のもう１つの好ましい態様では、スペーシング配列が、隣り合うＯＲＦの転写を制御する能力を持つ追加のポックスウイルス転写制御要素を含む。
【００３７】
組換えＭＶＡを作製するために本発明で使用することができる典型的なＭＶＡ株は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に受託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７として寄託されているＭＶＡ−５７５である。
【００３８】
もう１つの好ましいＭＶＡ株はＭＶＡ−Ｖｅｒｏまたはその誘導体である。ＭＶＡ−Ｖｅｒｏ株はヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ９９１０１４３１および０１０２１４１１として寄託されている。ＭＶＡ−Ｖｅｒｏの安全性は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／０２７０３に記載の生物学的、化学的および物理的特徴に反映されている。他のＭＶＡ株と比較すると、Ｖｅｒｏ−ＭＶＡは、ゲノム欠失を１つ余分に含んでいる。
【００３９】
さらにもう１つの、より好ましいＭＶＡ株は、ＭＶＡ−ＢＮである。ＭＶＡ−ＢＮはヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ０００８３００８として寄託されている。ＭＶＡ−ＢＮウイルスは、極度に弱毒化されたウイルスであり、やはり変異ワクシニアウイルスアンカラウイルスに由来している（ＰＣＴ／ＥＰ０１／１３６２８も参照されたい）。
【００４０】
本発明ウイルスの「誘導体」という用語は、親ウイルスと同じ特徴を示すがそのゲノムの１種以上の部分に相違を示す子孫ウイルスを表す。「ＭＶＡの誘導体」という用語は、ＭＶＡと比較して同じ機能的特徴を持つウイルスを示す。例えば、ＭＶＡ−ＢＮの誘導体はＭＶＡ−ＢＮと同じ特徴を持つ。ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体のこれらの特徴の１つは、その弱毒性と、ヒトＨａＣａｔ細胞中では複製が起こらないことである。
【００４１】
本発明の組換えＭＶＡは医薬品またはワクチンとして有用である。もう１つの態様では、標的細胞に外因性コード配列を導入するために、本発明の組換えＭＶＡを使用する。この場合、前記配列は標的細胞のゲノムにとって相同または異種である。
【００４２】
タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗原または抗原エピトープを生産するために、標的細胞への外因性コード配列の導入をインビトロで行うことができる。この方法では、宿主細胞を本発明の組換えＭＶＡに感染させ、感染した宿主細胞を適切な条件下で培養し、前記宿主細胞が産生したポリペプチド、ペプチド、タンパク質、抗原、エピトープ及び（又は）ウイルスを単離及び（又は）濃縮する。
【００４３】
さらにまた、細胞に１種以上の相同配列または１種以上の異種配列を導入する方法を、インビトロ治療およびインビボ治療に応用することもできる。インビトロ治療の場合は、免疫応答に影響を及ぼすために、好ましくは免疫応答を誘発するために、前もって（エクスビボで）本発明の組換えＭＶＡに感染させておいた単離細胞を、動物の生体に投与する。インビボ治療の場合は、免疫応答に影響を及ぼすために、好ましくは免疫応答を誘発するために、本発明の組換えポックスウイルスを動物の生体に直接投与する。この場合は、接種部位周辺の細胞だけでなく、血流などを介してウイルスが輸送される細胞も、インビボで本発明の組換えＭＶＡに直接感染する。感染後、これらの細胞は、外因性コード配列がコードしている治療遺伝子のタンパク質、ペプチドまたは抗原エピトープを合成し、次いでそれらまたはそれらの一部を細胞表面に提示する。免疫系の専門化した細胞は、そのような異種タンパク質、ペプチドまたはエピトープの提示を認識し、特異的免疫応答を開始する。
【００４４】
ＭＶＡは増殖が著しく制限されていて、その結果、高度に弱毒化されているので、ヒトを含む多種多様な哺乳動物（免疫低下した動物またはヒトを含む）の処置に有用である。本発明は、ヒトを含む動物の生体内で免疫応答を誘発するための薬学的調合物およびワクチンも提供する。
【００４５】
本薬学的調合物は、一般に、１種以上の医薬的な、許容できるかつ／または承認された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤及び（又は）安定剤を含みうる。そのような補助物質としては、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを挙げることができる。適切な担体は通例、大きくてゆっくり代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質集合体などである。
【００４６】
ワクチンを製造するには、本発明の組換えポックスウイルスを生理学的に許容できる形態に変換する。これは、天然痘の予防接種に用いられるポックスウイルスワクチンの製造に関する経験（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら［１９７４］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２に記載されているもの）に基づいて行うことができる。例えば、精製ウイルスは、５×１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、約１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に製剤化して、−８０℃で保存される。ワクチン注射剤を製造するには、例えば２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌ中のウイルス粒子１０２〜１０８個を、アンプル（好ましくはガラスアンプル）内で凍結乾燥する。もう１つの選択肢として、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスの段階的凍結乾燥によって製造することもできる。この製剤は、さらに、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドンなどの添加剤、または、インビボ投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤もしくは組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの他の助剤も含むことができる。次に、ガラスアンプルを封印して、４℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。ただし、必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で保存することが好ましい。
【００４７】
予防接種または治療を行うには、上記の凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、乱切法、または当業者に知られる他の任意の投与経路によって、投与することができる。当業者であれば、投与様式、投与量および投与回数を、既知の方法で最適化することができる。ただし、最も一般的には、１回目の予防接種注射の約１ヶ月〜６週間後に２回目の注射を行うことによって、患者を予防接種する。
【００４８】
さらに本発明は、本発明の組換えＭＶＡを作製するために使用することができるプラスミドベクターに関すると共に、一定のＤＮＡ配列に関する。
【００４９】
通例、隣り合う２つのＯＲＦ間に位置するＩＧＲ、または隣り合う２つのＯＲＦに隣接するＩＧＲは、興味ある外因性ＤＮＡ配列を挿入することができるヌクレオチド配列を含む。したがって本発明のプラスミドベクターは、ＭＶＡのゲノムに由来するＤＮＡ配列、またはＭＶＡのゲノムにとって相同なＤＮＡ配列であって、ウイルスゲノムの隣り合う２つのＯＲＦ間に位置するＩＧＲ配列、またはウイルスゲノムの隣り合う２つのＯＲＦに隣接するＩＧＲ配列の全断片または部分的断片が含まれているＤＮＡ配列を含む。本プラスミドベクターでは、前記ＩＧＲ由来配列に、興味ある外因性ＤＮＡ配列を挿入するためのクローニング部位、好ましくは前記異種ＤＮＡ配列に作動的に連結されたポックスウイルス転写制御要素を挿入するためのクローニング部位が、少なくとも１つは挿入されていることが好ましい。場合により、本プラスミドベクターは、レポーター遺伝子及び（又は）選択遺伝子カセットを含む。本プラスミドベクターは、好ましくは、上述したＩＧＲ配列の全断片または部分的断片に隣り合う２つの隣り合うＯＲＦの配列も含む。
【００５０】
ヌクレオチド配列を含まないＩＧＲもいくつか同定されている。これらの場合は、プラスミドベクターが、ＩＧＲ隣接配列のＤＮＡ配列、すなわち隣り合う２つのＯＲＦのＤＮＡ配列を含む。好ましくは、異種ＤＮＡ配列を挿入するためのクローニング部位を、ＩＧＲ中に挿入する。ＩＧＲ隣接配列のＤＮＡは、ＭＶＡゲノム中の対応するＩＧＲへの外因性ＤＮＡ配列の挿入を指示するために使用される。そのようなプラスミドベクターはさらに、異種ＤＮＡ配列を挿入するため、または場合によりレポーター遺伝子及び（又は）選択遺伝子カセットを挿入するためのクローニング部位を含むＩＧＲ配列の全断片または部分的断片も含みうる。
【００５１】
ＩＧＲ−ＤＮＡ配列および隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列は、好ましくは、
００１Ｌ−００２Ｌ、００２Ｌ−００３Ｌ、００５Ｒ−００６Ｒ、００６Ｌ−００７Ｒ、００７Ｒ−００８Ｌ、００８Ｌ−００９Ｌ、０１７Ｌ−０１８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０１９Ｌ−０２０Ｌ、０２０Ｌ−０２１Ｌ、０２３Ｌ−０２４Ｌ、０２４Ｌ−０２５Ｌ、０２５Ｌ−０２６Ｌ、０２８Ｒ−０２９Ｌ、０３０Ｌ−０３１Ｌ、０３１Ｌ−０３２Ｌ、０３２Ｌ−０３３Ｌ、０３５Ｌ−０３６Ｌ、０３６Ｌ−０３７Ｌ、０３７Ｌ−０３８Ｌ、０３９Ｌ−０４０Ｌ、０４３Ｌ−０４４Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０４６Ｌ−０４７Ｒ、０４９Ｌ−０５０Ｌ、０５０Ｌ−０５１Ｌ、０５１Ｌ−０５２Ｒ、０５２Ｒ−０５３Ｒ、０５３Ｒ−０５４Ｒ、０５４Ｒ−０５５Ｒ、０５５Ｒ−０５６Ｌ、０６１Ｌ−０６２Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、０６５Ｌ−０６６Ｌ、０６６Ｌ−０６７Ｌ、０７７Ｌ−０７８Ｒ、０７８Ｒ−０７９Ｒ、０８０Ｒ−０８１Ｒ、０８１Ｒ−０８２Ｌ、０８２Ｌ−０８３Ｒ、０８５Ｒ−０８６Ｒ、０８６Ｒ−０８７Ｒ、０８８Ｒ−０８９Ｌ、０８９Ｌ−０９０Ｒ、０９２Ｒ−０９３Ｌ、０９４Ｌ−０９５Ｒ、０９６Ｒ−０９７Ｒ、０９７Ｒ−０９８Ｒ、１０１Ｒ−１０２Ｒ、１０３Ｒ−１０４Ｒ、１０５Ｌ−１０６Ｒ、１０７Ｒ−１０８Ｌ、１０８Ｌ−１０９Ｌ、１０９Ｌ−１１０Ｌ、１１０Ｌ−１１１Ｌ、１１３Ｌ−１１４Ｌ、１１４Ｌ−１１５Ｌ、１１５Ｌ−１１６Ｒ、１１７Ｌ−１１８Ｌ、１１８Ｌ−１１９Ｒ、１２２Ｒ−１２３Ｌ、１２３Ｌ−１２４Ｌ、１２４Ｌ−１２５Ｌ、１２５Ｌ−１２６Ｌ、１３３Ｒ−１３４Ｒ、１３４Ｒ−１３５Ｒ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１３７Ｌ−１３８Ｌ、１４１Ｌ−１４２Ｒ、１４３Ｌ−１４４Ｒ、１４４Ｒ−１４５Ｒ、１４５Ｒ−１４６Ｒ、１４６Ｒ−１４７Ｒ、１４７Ｒ−１４８Ｒ、１４８Ｒ−１４９Ｌ、１５２Ｒ−１５３Ｌ、１５３Ｌ−１５４Ｒ、１５４Ｒ−１５５Ｒ、１５６Ｒ−１５７Ｌ、１５７Ｌ−１５８Ｒ、１５９Ｒ−１６０Ｌ、１６０Ｌ−１６１Ｒ、１６２Ｒ−１６３Ｒ、１６３Ｒ−１６４Ｒ、１６４Ｒ−１６５Ｒ、１６５Ｒ−１６６Ｒ、１６６Ｒ−１６７Ｒ、１６７Ｒ−１６８Ｒ、１７０Ｒ−１７１Ｒ、１７３Ｒ−１７４Ｒ、１７５Ｒ−１７６Ｒ、１７６Ｒ−１７７Ｒ、１７８Ｒ−１７９Ｒ、１７９Ｒ−１８０Ｒ、１８０Ｒ−１８１Ｒ、１８３Ｒ−１８４Ｒ、１８４Ｒ−１８５Ｌ、１８５Ｌ−１８６Ｒ、１８６Ｒ−１８７Ｒ、１８７Ｒ−１８８Ｒ、１８８Ｒ−１８９Ｒ、１８９Ｒ−１９０Ｒ、１９２Ｒ−１９３Ｒ
を含む群より選択されるＩＧＲおよびＯＲＦから、それぞれ選択される。
【００５２】
これらの配列は、より好ましくは、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｌ−１４９Ｌを含む群より選択されるＩＧＲおよびＯＲＦから、それぞれ選択される。ＩＧＲ由来の配列は、好ましくは、以下のヌクレオチド配列を含む群から選択される：
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の５２７〜６０８番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の２９９〜８８３番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の３３９〜８５２番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の３７６〜６４７番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の５９７〜８５５番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の４００〜６０７番目。
【００５３】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列は、好ましくは、以下のヌクレオチド配列を含む群から選択される：
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の１〜５２５番目および６０９〜１１９０番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の１０１〜２９８番目および８８４〜１１９８番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の１〜３３８番目および８５３〜１２００番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の１〜３７５番目および６４８〜１２００番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の１〜５９６番目および８５６〜１２００番目、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の１〜３９９番目および６０８〜１０８１番目。
【００５４】
これらのＤＮＡ配列は、好ましくは、ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡのゲノムに由来するか、そのゲノムと相同である。
【００５５】
本発明のプラスミドベクターを作製するには、上記の配列を単離し、それらがＭＶＡゲノムに挿入しようとする外因性ＤＮＡに隣接するように、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの標準的クローニングベクター中にクローニングする。場合により、そのようなプラスミドベクターは選択遺伝子またはレポーター遺伝子カセットを含み、それらのカセットは、当該カセットに含まれる反復配列によって最終的な組換えウイルスから欠失させることができる。
【００５６】
プラスミドベクターによってＭＶＡゲノム中に外因性ＤＮＡ配列を導入する方法、および組換えＭＶＡを取得する方法は、当業者にはよく知られていると共に、以下の参考文献から演繹することもできる：
・Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９。この文献には、例えばＤＮＡのクローニング、ＲＮＡ単離、ウェスタンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ増幅技術などの標準的な分子生物学技術に関する技術およびノウハウが記載されている。
・Ｂｒｉａｎ  ＷＪ  ＭａｈｙおよびＨｉｌｌａｒ  Ｏ  Ｋａｎｇｒｏ編「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６。この文献には、ウイルスの取り扱いと操作に関する技術が記載されている。
・ＡＪ  ＤａｖｉｓｏｎおよびＲＭ  Ｅｌｌｉｏｔｔ編「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９９３の第９章「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ（ワクシニアウイルスベクターの発現）」。
・「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、出版社：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎ  Ｉｎｃ．，１９９８の第１６章、ＩＶ節「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ（ワクシニアウイルスベクターを使った哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現）」。この文献には、ＭＶＡの取り扱い、操作および遺伝子工学に関する技術とノウハウが記載されている。
【００５７】
本発明のＭＶＡ（好ましくはＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ）は、本発明のプラスミドベクターを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞をＭＶＡに感染させた後、本発明のＭＶＡを同定し、単離し、場合により精製することによって、製造することができる。
【００５８】
本発明のＤＮＡ配列は、本発明のＭＶＡまたはその誘導体ならびに本発明のＭＶＡに感染した細胞または個体を同定または単離するために使用することができる。本ＤＮＡ配列は、例えば、ＰＣＲプライマーやハイブリダイゼーションプローブを作製するために使用することができ、また、アレイ技術でも使用することができる。
【００５９】
図面の簡単な説明
図１：図１は、Ｉ４Ｌ  ＯＲＦ後の挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ３９（図１ａ）、ｐＢＮＸ７０（図１ｂ）およびｐＢＮ８４（図１ｃ）の制限酵素地図である。これらのプラスミドは、隣接配列Ｆｌａｎｋ１（Ｆ１  Ｉ４Ｌ−Ｉ５Ｌ）とＦｌａｎｋ２（Ｆ２  Ｉ４Ｌ−Ｉ５Ｌ）の間に、ポックスウイルスプロモーター（Ｐ）の転写制御を受ける外因性ＤＮＡ（それぞれＥｃｏｇｐｔおよびｈＢＦＰ）も含んでいる。Ｆ１ｒｐｔは、得られた組換えウイルスからレポーターカセットを欠失させることができるようにするためのＦｌａｎｋ１の反復配列を意味する。ｐＢＮ８４（図１ｃ）はデングウイルスＮＳ１タンパク質（ＮＳ１  ＤＥＮ）もコードしている。その他の略号：ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子、ｂｐｓ＝塩基対。
【００６０】
図２：図２は、ＯＲＦ  １３７Ｌ後の挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ５１（図２ａ）、ｐＢＮＸ６７（図２ｂ）およびｐＢＮ２７（図２ｃ）の制限酵素地図である（Ｆｌａｎｋ１：Ｆ１１３６−１３７はＭＶＡゲノムの１２９３４０〜１２９９３０位に相当する。Ｆｌａｎｋ２：Ｆ２１３６−１３７はＭＶＡゲノムの１２９９３１〜１３０５４０に相当する）。さらに、ベクターｐＢＮＸ６７（図２ｂ）は、隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーター（Ｐ）の転写制御を受ける外因性ＤＮＡ（ＮＰＴ  ＩＩ遺伝子＝ネオマイシン耐性）を含む。Ｆ２ｒｐｔは、得られた組換えウイルスからレポーターカセットを欠失させることができるようにするためのＦｌａｎｋ２の反復配列を意味する。ｐＢＮ２７（図２ｃ）は、ポックスウイルスプロモーターの制御下にあるデングウイルスＰｒＭ４もコードしている。その他の略号：ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子、ｂｐｓ＝塩基対、ＩＲＥＳ＝内部リボソーム結合部位、ＥＧＦＰ＝強化緑色蛍光タンパク質の遺伝子。
【００６１】
図３：図３は、ＯＲＦ  ００７Ｒと００８Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ７９（図３ａ）、ｐＢＮＸ８６（図３ｂ）、ｐＢＮＸ８８（図３ｃ）、ｐＢＮ３４（図３ｄ）およびｐＢＮ５６（図３ｅ）の制限酵素地図である（Ｆｌａｎｋ１：Ｆ１  ＩＧＲ  ０７−０８はＭＶＡゲノムの１２２００番目から始まる。Ｆｌａｎｋ２：Ｆ２  ＩＧＲ  ０７−０８はＭＶＡゲノムの１３４００番目で終わる）。Ｆ２ｒｐｔは、得られた組換えウイルスからレポーターカセットを欠失させることができるようにするためのＦｌａｎｋ２の反復配列を意味する。さらにベクターｐＢＮＸ８８（図３ｃ）およびｐＢＮＸ８６（図３ｂ）は、隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーター（Ｐ）の転写制御を受ける外因性ＤＮＡ（それぞれＢＦＰ＋ｇｐｔおよびＮＰＴ  ＩＩ＋ＥＧＦＰ）も含む。Ｆ２ｒｐｔは、得られた組換えウイルスからレポーターカセットを欠失させることができるようにするためのＦｌａｎｋ２の反復配列を意味する。ｐＢＮ５６（図３ｅ）はさらにＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質をコードし、ｐＢＮ３４（図３ｄ）はポックスウイルスプロモーターの制御下にあるデングウイルスＰｒＭ２コード配列を含む。その他の略号：ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子、ｂｐｓ＝塩基対。
【００６２】
図４：図４は、ＯＲＦ  ０４４Ｌと０４５Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００／６４０ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ８０（図４ａ）、ｐＢＮＸ８７（図４ｂ）およびｐＢＮ４７（図４ｃ）の制限酵素地図である（Ｆｌａｎｋ１：Ｆ１  ＩＧＲ４４−４５はＭＶＡゲノムの３６７３０番目から始まる。Ｆｌａｎｋ２：Ｆ２  ＩＧＲ４４−４５はＭＶＡゲノムの３７９７０番目で終わる）。さらにベクターｐＢＮＸ８７（図４ｂ）は、隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーター（Ｐ）の転写制御を受ける外因性ＤＮＡ（ＮＰＴ  ＩＩ遺伝子＋ＥＧＦＰ）を含む。Ｆ２ｒｐｔは、得られた組換えウイルスからレポーターカセットを欠失させることができるようにするためのＦｌａｎｋ２の反復配列を意味する。ｐＢＮ４７（図４ｃ）は、ポックスウイルスプロモーターの制御下にあるデングウイルスＰｒＭ３もコードしている。その他の略号：ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子、ｂｐｓ＝塩基対。
【００６３】
図５：図５は、ＯＲＦ  １４８Ｒと１４９Ｌの間にある挿入部位に隣接する約５９６／６０４ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ９０（図５ａ）、ｐＢＮＸ９２（図５ｂ）およびｐＢＮ５４（図５ｃ）の制限酵素地図である（Ｆｌａｎｋ１：Ｆ１  ＩＧＲ１４８−１４９はＭＶＡゲノムの１３６９００番目から始まる。Ｆｌａｎｋ２：Ｆ２  ＩＧＲ１４８−１４９はＭＶＡゲノムの１３８１００番目で終わる）。さらにベクターｐＢＮＸ９２（図５ｂ）は、隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーター（Ｐ）の転写制御を受ける外因性ＤＮＡ（ｇｐｔ＋ＢＦＰ）を含む。ｐＢＮ５４（図５ｃ）はさらにデングウイルスＰｒＭ１をコードしている。Ｆ２ｒｐｔは、得られた組換えウイルスからレポーターカセットを欠失させることができるようにするためのＦｌａｎｋ２の反復配列を意味する。その他の略号：ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子、ｂｐｓ＝塩基対。
【００６４】
図６：図６は、ＭＶＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９４８４８）の遺伝子間挿入部位を表す概略図である。
【００６５】
図７：図７は、デングウイルスＮＳ１がＩＧＲ  Ｉ４Ｌ−Ｉ５Ｌに挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  Ｉ４Ｌ−Ｉ５ＬのＰＣＲ解析である。レーン「ＢＮ」は、ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターを使ったＰＣＲ産物を表す。ＮＳ１組換えＭＶＡを使用すると、より大きいサイズの断片を検出することができる（１、２、３、４：ＤＮＡ濃度が異なる）。Ｍ＝分子量マーカー、Ｈ２Ｏ＝水陰性対照。
【００６６】
図８：図８は、図８ａ：デングウイルスＰｒＭ４がＩＧＲ  １３６−１３７に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  １３６−１３７のＰＣＲ解析である。レーン「ＢＮ」は、ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターを使ったＰＣＲ産物を表す。ＰｒＭ４組換えＭＶＡを使用すると、より大きいサイズの断片を検出することができる（ｍＢＮ２３、１／１０、１／１００：ＤＮＡ濃度が異なる）。Ｍ＝分子量マーカー、Ｈ２Ｏ＝水陰性対照、ｐＢＮ２７＝プラスミド陽性対照。図８ｂ：ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターおよびＩＧＲ  １３６−１３７にＰｒＭ４が挿入されている組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２３）の多段階増殖曲線（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｔｅｐ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｕｒｖｅ）。
【００６７】
図９：図９は、図９ａ：デングウイルスＰｒＭ２がＩＧＲ  ０７−０８に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  ０７−０８のＰＣＲ解析である。レーン３は、ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターを使ったＰＣＲ産物を表す。ＰｒＭ２組換えＭＶＡを使用すると、より大きいサイズの断片を検出することができる（レーン２）。Ｍ＝分子量マーカー、レーン１＝水陰性対照。図９ｂ：ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターおよびＩＧＲ  ０７−０８にＰｒＭ２が挿入されている組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２５）の多段階増殖曲線。
【００６８】
図１０：図１０は、ＨＩＶ  ｅｎｖがＩＧＲ  ０７−０８に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  ０７−０８のＰＣＲ解析である。レーンＢＮは、ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターを使ったＰＣＲ産物を表す。ＰｒＭ２組換えＭＶＡを使用すると、より大きいサイズの断片を検出することができる（レーン１、２、３）。Ｍ＝分子量マーカー、−＝水陰性対照、＋＝プラスミド陽性対照。
【００６９】
図１１：図１１は、図１１ａ：デングウイルスＰｒＭ３がＩＧＲ  ４４−４５に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  ４４−４５のＰＣＲ解析である。レーンＢＮは、ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターを使ったＰＣＲ産物を表す。ＰｒＭ３組換えＭＶＡを使用すると、より大きいサイズの断片を検出することができる（レーン１〜４：ＤＮＡ濃度が異なる）。Ｍ＝分子量マーカー、−＝水陰性対照。図１１ｂ：ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターおよびＩＧＲ  ４４−４５にＰｒＭ３が挿入されている組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２８）の多段階増殖曲線。
【００７０】
図１２：図１２は、図１２ａ：デングウイルスＰｒＭ１がＩＧＲ  １４８−１４９に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  １４８−１４９のＰＣＲ解析である。レーンＢＮは、ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターを使ったＰＣＲ産物を表す。ＰｒＭ１組換えＭＶＡを使用すると、より大きいサイズの断片を検出することができる（レーン１）。Ｍ＝分子量マーカー、−＝水陰性対照、＋＝プラスミド陽性対照。図１２ｂ：ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターおよびＩＧＲ  ４４−４５にＰｒＭ１が挿入されている組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｍＢＮ３３）の多段階増殖曲線。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
以下に本発明を実施例によって詳細に説明する。本発明がこれらの実施例によって何ら限定されないことは当業者に十分理解されている。本発明の範囲は、本願請求項の範囲全体によってのみ限定される。
【実施例１】
【００７２】
（挿入ベクターｐＢＮＸ３９、ｐＢＮＸ７０およびｐＢＮ８４）
ＭＶＡの０６５Ｌ  ＯＲＦに隣り合う遺伝子間領域に外因性配列を挿入するために（挿入部位はゲノム位置５６７６０にある）、その挿入部位に隣り合う約１２００ｂｐの隣接配列を含むベクターを構築した。これらの隣接配列は２つの隣接部分に分離され、一方の隣接部分には０６５Ｌ  ＯＲＦ（別名：Ｉ４Ｌ  ＯＲＦ）の約６１０ｂｐが含まれ、他方の部分には０６５Ｌ  ＯＲＦに続く遺伝子間領域とその直後のＯＲＦの一部との約５８０ｂｐが含まれる。これらの隣接配列の間には、それぞれＥｃｏｇｐｔ遺伝子（ｇｐｔは大腸菌から単離されるホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を意味する）、およびＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）が、ポックスウイルスプロモーターの転写制御下に置かれている。また、Ｉ４Ｌ  ＯＲＦに続く遺伝子間領域に追加の遺伝子または配列を挿入するためのクローニング部位も、少なくとも１つは存在する。典型的な本発明のベクターコンストラクトを図１ａおよび図１ｂに示す（ｐＢＮＸ３９、ｐＢＮＸ７０）。ベクターｐＢＮ８４（図１ｃ）では、デングウイルスＮＳ１のコード領域が、ｐＢＮＸ７０（図１ｂ）のクローニング部位に挿入されている。
（相同組換えによる組換えＭＶＡの作製）
外来遺伝子は相同組換えによってＭＶＡゲノム中に挿入することができる。この目的のために、興味ある外来遺伝子を、上述のプラスミドベクターにクローニングする。このベクターをＭＶＡ感染細胞にトランスフェクトする。組換えは、感染し、かつトランスフェクトした細胞の細胞質で起こる。同じく挿入ベクターに含まれている選択及び（又は）レポーターカセットを利用して、組換えウイルスを含む細胞を同定し、単離する。
【００７３】
相同組換えを行うには、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）か、またはＶＰ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）＋４ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−グルタミン（無血清製造法の場合）を使って、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞またはＣＥＦ（初代ニワトリ胚線維芽細胞）を６穴プレートに播種する。
【００７４】
細胞はまだ増殖期にあることが必要なので、トランスフェクションの日に６０〜８０％コンフルエントに到達すべきである。感染に用いる感染多重度（ｍｏｉ）を判定するには細胞数を知っておく必要があるので、播種前に細胞を数える。
【００７５】
感染を行うには、５００μｌの希釈液が０．１〜１．０のｍｏｉを与える適当なウイルス量を含むように、ＭＶＡストックをＤＭＥＭ／ＦＣＳまたはＶＰ−ＳＦＭ／Ｌ−グルタミンに希釈する。細胞は、播種後に１回分裂したと仮定する。細胞から培地を取り除き、細胞を５００μｌの希釈ウイルスに、室温で振とうしながら１時間感染させる。接種物を除去し、細胞をＤＭＥＭ／ＶＰ−ＳＦＭで洗浄する。感染細胞を、それぞれ１．６ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＣＳおよびＶＰ−ＳＦＭ／Ｌ−グルタミン中に入れておき、その間に、トランスフェクション反応（キアゲン・エフェクテン・キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｋｉｔ））の準備をする。
【００７６】
トランスフェクションには、「エフェクテン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）」トランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する。線状化した挿入ベクター１〜２μｇ（多重トランスフェクションの場合は総量）と緩衝液ＥＣとのトランスフェクション混合物を、最終体積が１００μｌになるように調製する。３．２μｌのエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）を加え、ボルテックスし、室温で５分間インキュベートする。次に、原液のチューブをボルテックスした後、１０μｌのエフェクテンを加え、その溶液をボルテックスを使って十分に混合し、室温で１０分間インキュベートする。それぞれ６００μｌのＤＭＥＭ／ＦＣＳおよびＶＰ−ＳＦＭ／Ｌ−グルタミンを加え、混合した後、そのトランスフェクション混合物全体を、既に培地で覆われている細胞に加える。培養皿を穏やかに振とうしてトランスフェクション反応液を混合する。３７℃、５％ＣＯ２で、一晩インキュベートする。翌日、培地を除去し、新鮮なＤＭＥＭ／ＦＣＳまたはＶＰ−ＳＦＭ／Ｌ−グルタミンと置き換える。インキュベーションを３日目まで続ける。
【００７７】
採取するために、細胞を培地中にこすり取り、得られた細胞懸濁液を適当なチューブに移して、短期保存の場合は−２０℃で凍結し、長期保存の場合は−８０℃で凍結する。
（ＭＶＡのＩ４Ｌ挿入部位へのＥｃｏｇｐｔの挿入）
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡに感染させ、さらに、レポーター遺伝子としてＥｃｏｇｐｔ遺伝子（Ｅｃｏｇｐｔ（略してｇｐｔ）はホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を意味する）を含んでいる挿入ベクターｐＢＮＸ３９（図１ａ）でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの添加によるホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択下で、プラーク精製を３回行うことによって精製した。ミコフェノール酸（ＭＰＡ）はイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害し、大半の細胞株でプリン合成の遮断およびウイルス複製の阻害をもたらす。この遮断は、構成的プロモーターからＥｃｏｇｐｔを発現させると共に、基質キサンチンおよびヒポキサンチンを与えることによって、克服することができる。
【００７８】
得られた組換えウイルスを、予想される挿入部位を選択的に増幅するプライマー対を使った標準的なＰＣＲアッセイによって同定した。Ｉ４Ｌ挿入部位を増幅するために、プライマー対、ＢＮ４９９（ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＣＣ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＢＮ５００（ＣＧＡ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＴＡＴ  Ｇ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用した。空ベクターウイルスＭＶＡのＤＮＡを増幅した場合、予想されるＰＣＲ断片は３２８ヌクレオチド（ｎｔ）長であるが、Ｉ４Ｌ挿入部位に外因性ＤＮＡが組み込まれている組換えＭＶＡを増幅した場合には、断片は相応に大きくなる。
（ＭＶＡのＩＧＲ  ０６４Ｌ−０６５Ｌ（Ｉ４Ｌ−Ｉ５Ｌ）挿入部位へのＮＳ１の挿入）
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡに感染させ、さらに、選択用のＥｃｏｇｐｔ遺伝子とレポーター遺伝子としてのＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）を含んでいる挿入ベクターｐＢＮ８４（図１ｃ）でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの添加によるホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択下で、プラーク精製を７回行うことによって精製した。ミコフェノール酸（ＭＰＡ）はイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害し、大半の細胞株でプリン合成の遮断およびウイルス複製の阻害をもたらす。この遮断は、構成的プロモーターからＥｃｏｇｐｔを発現させると共に、基質キサンチンおよびヒポキサンチンを与えることによって、克服することができる。
【００７９】
得られた組換えウイルスを、予想される挿入部位を選択的に増幅するプライマー対を使った標準的なＰＣＲアッセイによって同定した。Ｉ４Ｌ挿入部位の増幅には、プライマー対ＢＮ４９９（ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＴＴＡ  ＣＣ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＢＮ５００（ＣＧＡ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＴＡＴ  Ｇ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用した。空ベクターウイルスＭＶＡのＤＮＡを増幅した場合、予想されるＰＣＲ断片は３２８ヌクレオチド（ｎｔ）長であるが、Ｉ４Ｌ挿入部位にデングウイルスＮＳ１コード領域が組み込まれているＮＳ１の組換えＭＶＡを増幅した場合には、断片は１６８３ｂｐになると予想される。図７に記載のＰＣＲ結果は、１７回のウイルス増幅後に、ＮＳ１がＩ４Ｌ挿入部位に安定に挿入されていることを明瞭に示している。
（ＮＳ１を含むｒｅｃＭＶＡ（ＭＶＡ−ＢＮ２２）のインビトロでの試験）
ＢＨＫ細胞の約８０％コンフルエントな単層が形成されているＴ２５フラスコに、１％ＦＣＳを含むＭＥＭαで１×１０７に希釈したウイルスストック１００μｌを接種し、室温で３０分間振とうした。３％ＦＣＳを含むＭＥＭα  ５ｍｌを各フラスコに加え、ＣＯ２培養器中、３０℃で培養した。そのフラスコを４８時間後に採取した。上清をフラスコから取り出し、４℃にて２６０ｇで１０分間遠心分離した。上清を小分けして−８０℃で保存した。ペレットを５ｍｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した後、１％ＴＸ１００を含む低張ホモジナイズ緩衝液（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃ  ｄｏｕｎｃｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）１ｍｌに再懸濁した。細胞溶解物を採取し、１６，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を微量遠心管に入れて−８０℃で保存した。
【００８０】
ＧＦＰを含むＭＶＡを接種したフラスコ、欠失部位にＮＳ１遺伝子を含むＭＶＡ（ＭＶＡ−ＢＮ０７）を接種したフラスコ、および疑似感染フラスコも、上記と同じ方法で処理した。
【００８１】
細胞／ウイルス溶解物および上清を、非還元／還元試料緩衝液中、非加熱／加熱条件下で処理した。タンパク質を１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。そのブロットを、希釈率１：５００のプール回復期患者血清（ＰＰＣＳ）で一晩プローブした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロットを抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）と共に室温で２時間インキュベートした。ブロットを前述のように洗浄した後、４−クロロ−１−ナフトールを使って発色させた。
【００８２】
ウェスタンブロットの結果から、ＭＶＡ−ＢＮ２２中のＮＳ１は大量に発現されることが明らかになった。ＮＳ１は、非加熱条件では二量体として、加熱条件では単量体として、正しいコンフォメーションで発現した。
【００８３】
ＭＶＡ−ＢＮ２２とＭＶＡ−ＢＮ０７でのＮＳ１発現を比較した。ＢＨＫ細胞に同じｐｆｕを接種し、４８時間後に採取した。その結果、ＮＳ１の発現量はＢＮ２２の方がＢＮ０７よりもはるかに高いことが明らかになった。ウェスタンブロットの結果も、上清中に分泌されるＮＳ１量はＢＮ０７よりもＢＮ２２の方が多いことを示した。
【００８４】
ＢＮ２２に感染した細胞中で発現するＮＳ１は抗原性であり、プール回復期患者血清によって認識されることも明らかになった。
【００８５】
結論として、ＢＮ２２に感染したＢＨＫ細胞では、ＮＳ１が大量に、かつ正しいコンフォメーションで発現する。二量体と単量体はどちらも抗原性であり、プール回復期患者血清によって認識される。
【実施例２】
【００８６】
（挿入ベクターｐＢＮＸ６７およびｐＢＮ２７）
以下のプライマーを使って、興味ある配列の標準的なＰＣＲ増幅を行うことにより、ＯＲＦ  １３６Ｌと１３７Ｌの間の新しい挿入部位（ゲノム位置１２９９４０）に隣り合うＭＶＡ配列を単離した：Ｆｌａｎｋ１の単離にはｏＢＮ５４３（ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＴＴＡＧＡＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）およびｏＢＮ５４４（ＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＣＧＣＴＣＧＴＡＡＡＡＡＣＴＧＣＧＧＡＧＧＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；Ｆｌａｎｋ２の単離にはｏＢＮ５７８（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＣＡＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびｏＢＮ５７９（ＣＧＧＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＴＴＧＴＡＴＡＡＴＡＴＣＴＧＧＴＡＡＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。
【００８７】
Ｆｌａｎｋ１を含むＰＣＲ断片を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｂａＩで処理し、ＳａｃＩＩ／ＸｂａＩ消化して脱リン酸化した基本ベクター（例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にライゲートした。
【００８８】
得られたプラスミドをＸｈｏＩ／ＡｐａＩ消化し、脱リン酸化し、Ｆｌａｎｋ２を含むＸｈｏＩ／ＡｐａＩ消化ＰＣＲ断片にライゲートした。
【００８９】
必要に応じて、プライマーｏＢＮ５４５（ＣＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＣＧＴＴＣＡＧＣＣＴＴＣＡＴＧＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）およびｏＢＮ５４６（ＣＧＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＡＴＧＧＴＴＴＡＧＧＡＴＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を使ったＰＣＲによって単離してＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ消化したＦｌａｎｋ２の反復配列を、得られたベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入した。そのベクター（ｐＢＮＸ５１）を図２ａに示す。
【００９０】
合成プロモーター、ＮＰＴＩＩ遺伝子（ネオマイシン耐性）、ポリＡ領域、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰ遺伝子含むレポーターカセット（Ｐｓ−ＮＰＴＩＩ−ポリＡ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）をＥｃ１１３６ＩＩ／ＸｈｏＩ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でＨｉｎｄＩＩＩ部位を平滑末端化した挿入ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。この実施例のベクターコンストラクトの典型例について、制限酵素地図を図２ｂに示す（ｐＢＮＸ６７）。
【００９１】
ｐＢＮ２７（図２ｃ）を構築するために、血清型４のデングウイルスＰｒＭを、ｐＢＮＸ６７の唯一のＰａｃＩ部位に挿入した。
（相同組換えによる組換えＭＶＡの作製）
ベクターｐＢＮＸ６７（図２ｂ）は、上述のプロトコールを使った組換えＭＶＡの作製に使用することができる。例えば、ｐＢＮ２７（図２ｃ）を使って相同組換えを行うと、隣り合う２つのＯＲＦの間にある遺伝子間領域にデングウイルスＰｒＭ４を持つ組換えＭＶＡが得られる。
（ＭＶＡのＩＧＲ１３６−１３７挿入部位へのＰｒＭ４の挿入）
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡに感染させ、さらに、選択用のＮＰＴ遺伝子とレポーター遺伝子としてのＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）を含んでいる挿入ベクターｐＢＮ２７（図２ｃ）でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、Ｇ４１８選択下でプラーク精製を４回行うことによって精製した。
【００９２】
得られた組換えウイルスを、予想される挿入部位を選択的に増幅するプライマー対を使った標準的ＰＣＲアッセイによって同定した。ＩＧＲ１３６−１３７挿入部位の増幅には、プライマー対ＢＮ９００（ｃｇｔｔｃｇｃａｔｇｇｇｔｔａｃｃｔｃｃ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびＢＮ９０１（ｇａｃｇｃａｔｇａａｇｇｃｔｇａａｃ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を使用した。空ベクターウイルスＭＶＡのＤＮＡを増幅した場合、予想されるＰＣＲ断片は８８ヌクレオチド（ｎｔ）長であるが、ＩＧＲ１３６−１３７挿入部位にデングウイルスＰｒＭ４コード領域を組み込んだＰｒＭ４の組換えＭＶＡを増幅した場合には、断片は８８０ｂｐになると予想される。図８ａに記載のＰＣＲ結果は、２２回のウイルス増幅後に、ＰｒＭ４がＩＧＲ１３６−１３７挿入部位に安定に挿入されていることを明瞭に示している。この組換えＭＶＡは依然としてＭＶＡ−ＢＮと同じ増殖特性を示す。この組換えＭＶＡはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）中で複製し、哺乳動物細胞中では弱毒化される（図８ｂ）。
【実施例３】
【００９３】
（挿入ベクターｐＢＮＸ７９、ｐＢＮＸ８６、ｐＢＮＸ８８、ｐＢＮ３４およびｐＢＮ５６）
以下のプライマーを使って、興味ある配列の標準的なＰＣＲ増幅を行うことにより、ＯＲＦ  ００７Ｒと００８Ｌの間の新しい挿入部位（ゲノム位置１２８００）に隣り合うＭＶＡ配列を単離した：Ｆｌａｎｋ１の単離にはＩＧＲ  ０７／０８  Ｆ１ｕｐ（ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびＩＧＲ  ０７／０８  Ｆ１ｅｎｄ（ＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＴＧＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＴＡＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）；Ｆｌａｎｋ２の単離にはＩＧＲ  ０７／０８  Ｆ２ｕｐ（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＴＡＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＡＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびＩＧＲ  ０７／０８  Ｆ２ｅｎｄ（ＣＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＣＡＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）。
【００９４】
Ｆｒａｎｋ１を含むＰＣＲ断片を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＳａｃＩで処理し、ＳａｃＩＩ／ＳａｃＩ消化して脱リン酸化した基本ベクター（例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にライゲートした。
【００９５】
得られたプラスミドをＸｈｏＩ／ＡｐａＩ消化し、脱リン酸化し、Ｆｌａｎｋ２を含むＸｈｏＩ／ＡｐａＩ消化ＰＣＲ断片にライゲートした。
【００９６】
必要に応じて、プライマーＩＧＲ  ０７／０８  Ｆ２ｕｐ（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＴＡＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＡＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびＩＧＲ  ０７／０８  Ｆ２ｍｉｄ（ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴＡＣＴＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を使ったＰＣＲによって単離してＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ消化したＦｌａｎｋ２の反復配列を、得られたベクターのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入した。
【００９７】
例えばポックスウイルスプロモーター、マーカー遺伝子、ポリＡ領域を含み、場合によりＩＲＥＳ要素、もう１つの遺伝子（例えば治療活性を持つ物質または遺伝子産物を発現させるもの）を含むレポーター遺伝子または治療遺伝子含有カセットは、いずれも、制限消化後にＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）で平滑末端化して、プラスミドベクターの適当なクローニング部位に挿入することができる。この実施例のベクターコンストラクトの典型例について、制限酵素地図を図３ａに示す（ｐＢＮＸ７９）。ＮＰＴ／ＥＧＦＰ選択カセットを挿入してベクターｐＢＮＸ８６（図３ｂ）を、ｇｐｔ／ＢＦＰ選択カセットを挿入してベクターｐＢＮＸ８８（図３ｃ）をそれぞれ得た。治療遺伝子および作動可能に連結されたプロモーターを含む治療遺伝子用の発現単位の場合は、この発現単位をＰａｃＩ部位に挿入する。ｐＢＮ３４（図３ｄ）を構築するために、デングウイルスＰｒＭ２をｐＢＮＸ８８（図３ｃ）にクローニングし、ｐＢＮ５６（図３ｅ）を合成するために、ＨＩＶ  ｅｎｖコード領域をｐＢＮＸ８６（図３ｂ）にＰａｃＩクローニングした。
（相同組換えによる組換えＭＶＡの作製）
ベクターｐＢＮＸ８６（図３ｂ）およびｐＢＮＸ８８（図３ｃ）は、それぞれ上述のプロトコールを使った組換えＭＶＡの作製に使用することができる。ｐＢＮ３４（図３ｄ）を使って相同組換えを行うと、隣り合う２つのＯＲＦ間にある遺伝子間領域にデングウイルスＰｒＭ２を持つ組換えＭＶＡが得られる。ｐＢＮ５６（図３ｅ）とＭＶＡ−ＢＮゲノムとの組換えは、対応するＩＧＲ中にＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を持つ組換えＭＶＡをもたらす。
（ＭＶＡのＩＧＲ０７−０８挿入部位へのＰｒＭ２の挿入）
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡに感染させ、さらに、選択用のｇｐｔ遺伝子とレポーター遺伝子としてのＢＦＰを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ３４（図３ｄ）でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、実施例１で述べたようにミコフェノール酸による選択下で、プラーク精製を３回行うことによって精製した。
【００９８】
得られた組換えウイルスを、予想される挿入部位を選択的に増幅するプライマー対を使った標準的ＰＣＲアッセイによって同定した。ＩＧＲ０７−０８挿入部位の増幅には、プライマー対ＢＮ９０２（ｃｔｇｇａｔａａａｔａｃｇａｇｇａｃｇｔｇ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）およびＢＮ９０３（ｇａｃａａｔｔａｔｃｃｇａｃｇｃａｃｃｇ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を使用した。空ベクターウイルスＭＶＡのＤＮＡを増幅した場合、予想されるＰＣＲ断片は１９０ヌクレオチド（ｎｔ）長であるが、ＩＧＲ０７−０８挿入部位にデングウイルスＰｒＭ２コード領域が組み込まれているＰｒＭ２の組換えＭＶＡを増幅した場合には、断片は９５０ｂｐになると予想される。図９ａに記載のＰＣＲ結果は、２０回のウイルス増幅後に、ＰｒＭ２がＩＧＲ０７−０８挿入部位に安定に挿入されていることを明瞭に示している。この組換えＭＶＡは依然としてＭＶＡ−ＢＮと同じ増殖特性を示す。この組換えＭＶＡはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）中で複製し、哺乳動物細胞中では弱毒化される（図９ｂ）。
（ＭＶＡのＩＧＲ０７−０８挿入部位へのＨＩＶ  ｅｎｖの挿入）
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡに感染させ、さらに、選択用のＮＰＴ遺伝子とレポーター遺伝子としてのＥＧＦＰを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ５６（図３ｅ）でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、Ｇ４１８選択下でプラーク精製を６回行うことによって精製した。
【００９９】
得られた組換えウイルスを、予想される挿入部位を選択的に増幅するプライマー対を使った標準的ＰＣＲアッセイによって同定した。ＩＲ０７−０８挿入部位の増幅には、プライマー対ＢＮ９０２（ｃｔｇｇａｔａａａｔａｃｇａｇｇａｃｇｔｇ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）およびＢＮ９０３（ｇａｃａａｔｔａｔｃｃｇａｃｇｃａｃｃｇ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を使用した。空ベクターウイルスＭＶＡのＤＮＡを増幅した場合、予想されるＰＣＲ断片は１９０ヌクレオチド（ｎｔ）長であるが、ＩＧＲ０７−０８挿入部位にＨＩＶ  ｅｎｖコード領域が組み込まれているｅｎｖの組換えＭＶＡを増幅した場合には、断片は２．６ｋｂになると予想される。図１０のＰＣＲ結果は、２０回のウイルス増幅後に、ｅｎｖがＩＧＲ０７−０８挿入部位に安定に挿入されていることを明瞭に示している。
【実施例４】
【０１００】
（挿入ベクターｐＢＮＸ８０、ｐＢＮＸ８７およびｐＢＮ４７）
以下のプライマーを使って、興味ある配列の標準的なＰＣＲ増幅を行うことにより、ＯＲＦ  ０４４Ｌと０４５Ｌの間の新しい挿入部位（ゲノム位置３７３３０）に隣り合うＭＶＡ配列を単離した：Ｆｌａｎｋ１の単離にはＩＧＲ４４／４５Ｆ１ｕｐ（ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＴＴＡＧＣＴＡＧＡＧＴＧＡＴＡ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）およびＩＧＲ４４／４５Ｆ１ｅｎｄ（ＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｆｌａｎｋ２の単離にはＩＧＲ４４／４５Ｆ２ｕｐ（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）およびＩＧＲ４４／４５Ｆ２ｅｎｄ（ＣＡＧＧＧＣＣＣＣＴＡＡＡＴＧＣＧＣＴＴＣＴＣＡＡＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）。
【０１０１】
Ｆｒａｎｋ１を含むＰＣＲ断片を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＳａｃＩで処理し、ＳａｃＩＩ／ＳａｃＩ消化して脱リン酸化した基本ベクター（例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にライゲートした。
【０１０２】
得られたプラスミドをＸｈｏＩ／ＡｐａＩ消化し、脱リン酸化し、Ｆｌａｎｋ２を含むＸｈｏＩ／ＡｐａＩ消化ＰＣＲ断片にライゲートした。
【０１０３】
必要に応じて、プライマーＩＧＲ４４／４５Ｆ２ｕｐ（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＡＣＴＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）およびＩＧＲ４４／４５Ｆ２ｍｉｄ（ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＴＧＴＡＴＴＡＡＣＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を使ったＰＣＲによって単離してＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ消化したＦｌａｎｋ２の反復配列を、得られたベクターのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入した。
【０１０４】
例えばポックスウイルスプロモーター、マーカー遺伝子、ポリＡ領域を含み、場合によりＩＲＥＳ要素、もう１つの遺伝子（例えば治療活性を持つ物質または遺伝子産物を発現させるもの）を含むレポーター遺伝子または治療遺伝子含有カセットは、いずれも、制限消化後にＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）で平滑末端化して、プラスミドベクターの適当なクローニング部位に挿入することができる。レポーター遺伝子カセットの場合は、Ｆｌａｎｋ２とＦｌａｎｋ２反復配列の間にあるＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｖａＩまたはＸｈｏＩ制限酵素部位が、クローニング部位として好ましい。ｐＢＮＸ８７（図４ｂ）を構築するために、ＮＰＴ／ＥＧＦＰ選択カセットをｐＢＮＸ８０（図４ａ）に挿入した。
【０１０５】
治療遺伝子および作動可能に連結されたプロモーターを含む治療遺伝子用の発現単位の場合は、この発現単位をＰａｃＩ部位に挿入する。
【０１０６】
この実施例のベクターコンストラクトの典型例について、制限酵素地図を図４ａおよび図４ｂに示す（ｐＢＮＸ８０、ｐＢＮＸ８７）。
【０１０７】
このベクターは、隣り合う２つのＯＲＦ間にある遺伝子間領域に外因性配列を持つ組換えＭＶＡを、上述のプロトコールに従って作製するために使用することができる。ｐＢＮ４７（図４ｃ）を構築するために、デングウイルス血清型３のＰｒＭをｐＢＮＸ８７（図４ｂ）にクローニングした。
（ＭＶＡのＩＧＲ４４−４５挿入部位へのＰｒＭ３の挿入）
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡに感染させ、さらに、選択用のＮＰＴ遺伝子とレポーター遺伝子としてのＥＧＦＰを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ４７（図４ｃ）でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、Ｇ４１８選択下でプラーク精製を３回行うことによって精製した。
【０１０８】
得られた組換えウイルスを、予想される挿入部位を選択的に増幅するプライマー対を使った標準的ＰＣＲアッセイによって同定した。ＩＧＲ４４−４５挿入部位の増幅には、プライマー対ＢＮ９０４（ｃｇｔｔａｇａｃａａｃａｃａｃｃｇａｃｇａｔｇｇ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）およびＢＮ９０５（ｃｇｇａｔｇａａａａａｔｔｔｔｔｇｇａａｇ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を使用した。空ベクターウイルスＭＶＡのＤＮＡを増幅した場合、予想されるＰＣＲ断片は１８５ヌクレオチド（ｎｔ）長であるが、ＩＧＲ４４−４５挿入部位にデングウイルスＰｒＭ３コード領域が組み込まれているＰｒＭ３の組換えＭＶＡを増幅した場合には、断片は８５０ｂｐになると予想される。図１１ａのＰＣＲ結果は、１９回のウイルス増幅後に、ＰｒＭ３がＩＧＲ４４−４５挿入部位に安定に挿入されていることを明瞭に示している。この組換えＭＶＡは依然としてＭＶＡ−ＢＮと同じ増殖特性を示す。この組換えＭＶＡはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）中で複製し、哺乳動物細胞中では弱毒化される（図１１ｂ）。
【実施例５】
【０１０９】
（挿入ベクターｐＢＮＸ９０、ｐＢＮＸ９２およびｐＢＮ５４）
以下のプライマーを使って、興味ある配列の標準的なＰＣＲ増幅を行うことにより、ＯＲＦ  １４８Ｒと１４９Ｌの間の新しい挿入部位（ゲノム位置１３７４９６）に隣り合うＭＶＡ配列を単離した：Ｆｌａｎｋ１の単離にはＩＧＲ１４８／１４９Ｆ１ｕｐ（ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＧＧＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＴＡＴＣＧＡＣＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）およびＩＧＲ１４８／１４９Ｆ１ｅｎｄ（ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）；Ｆｌａｎｋ２の単離にはＩＧＲ１４８／１４９Ｆ２ｕｐ（ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＴＣＴＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＴＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）およびＩＧＲ１４８／１４９Ｆ２ｅｎｄ（ＴＡＧＧＧＣＣＣＧＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＧＡＴＡＧＡＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）。
【０１１０】
Ｆｒａｎｋ１を含むＰＣＲ断片を制限酵素ＳａｃＩＩおよびＸｂａＩで処理し、ＳａｃＩＩ／ＸｂａＩ消化して脱リン酸化した基本ベクター（例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にライゲートした。
【０１１１】
得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ消化し、脱リン酸化し、Ｆｌａｎｋ２を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ消化ＰＣＲ断片にライゲートした。
【０１１２】
必要に応じて、プライマーＩＧＲ１４８／１４９Ｆ２ｕｐ（ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＴＴＣＴＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＴＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）およびＩＧＲ１４８／１４９Ｆ２ｍｉｄ（ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＡＡＴＡＣＣＡＣＧＡＧＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）を使ったＰＣＲによって単離してＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ消化したＦｌａｎｋ２の反復配列を、得られたベクターのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ部位に挿入した。
【０１１３】
例えばポックスウイルスプロモーター、マーカー遺伝子、ポリＡ領域を含み、場合によりＩＲＥＳ要素、もう１つの遺伝子（例えば治療活性を持つ物質または遺伝子産物を発現させるもの）を含むレポーター遺伝子または治療遺伝子含有カセットは、いずれも、制限消化後にＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）で平滑末端化して、プラスミドベクターの適当なクローニング部位に挿入することができる。ｐＢＮＸ９２（図５ｂ）を構築するために、ｇｐｔ／ＢＦＰ発現カセットをこのクローニング部位に挿入した。レポーター遺伝子カセットの場合は、Ｆｌａｎｋ２とＦｌａｎｋ２反復配列の間にあるＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位が、クローニング部位として好ましい。治療遺伝子および作動可能に連結されたプロモーターを含む治療遺伝子用の発現単位の場合は、この発現単位をＰａｃＩ部位に挿入する。ｐＢＮ５４（図５ｃ）を構築するために、デングウイルスＰｒＭ１をこのＰａｃＩ部位に挿入した。
【０１１４】
この実施例のベクターコンストラクトの典型例について、制限酵素地図を図５ａおよび図５ｂに示す（ｐＢＮＸ９０、ｐＢＮＸ９２）。
【０１１５】
このベクターは、隣り合う２つのＯＲＦ間にある遺伝子間領域に外因性配列を持つ組換えＭＶＡを、上述のプロトコールに従って作製するために使用することができる。デングウイルスＰｒＭ１を発現させる組換えＭＶＡを作製するために、ｐＢＮ５４（図５ｃ）を使って相同組換えを行った。
（ＭＶＡのＩＧＲ１４８−１４９挿入部位へのＰｒＭ１の挿入）
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡに感染させ、さらに、選択用のｇｐｔ遺伝子とレポーター遺伝子としてのＢＦＰを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ５４（図５ｃ）でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、ミコフェノール酸による選択下で、プラーク精製を３回行うことによって精製した。
【０１１６】
得られた組換えウイルスを、予想される挿入部位を選択的に増幅するプライマー対を使った標準的ＰＣＲアッセイによって同定した。ＩＧＲ１４８−１４９挿入部位の増幅には、プライマー対ＢＮ９６０（ｃｔｇｔａｔａｇｇｔａｔｇｔｃｃｔｃｔｇｃｃ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）およびＢＮ９６１（ｇｃｔａｇｔａｇａｃｇｔｇｇａａｇａ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）を使用した。空ベクターウイルスＭＶＡのＤＮＡを増幅した場合、予想されるＰＣＲ断片は４５０ヌクレオチド（ｎｔ）長であるが、ＩＧＲ１４８−１４９挿入部位にデングウイルスＰｒＭ１コード領域が組み込まれているＰｒＭ１の組換えＭＶＡを増幅した場合には、断片は１２００ｂｐになると予想される。図１２ａのＰＣＲ結果は、２３回のウイルス増幅後に、ＰｒＭ１がＩＧＲ１４８−１４９挿入部位に安定に挿入されていることを明瞭に示している。この組換えＭＶＡは依然としてＭＶＡ−ＢＮと同じ増殖特性を示す。この組換えＭＶＡはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）中で複製し、哺乳動物細胞中では弱毒化される（図１２ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１ａ】図１ａは、Ｉ４Ｌ  ＯＲＦ後の挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ３９の制限酵素地図である。
【図１ｂ】図１ｂは、Ｉ４Ｌ  ＯＲＦ後の挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ７０の制限酵素地図である。
【図１ｃ】図１ｃは、Ｉ４Ｌ  ＯＲＦ後の挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮ８４の制限酵素地図である。
【図２ａ】図２ａは、ＯＲＦ  １３７Ｌ後の挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ５１の制限酵素地図である。
【図２ｂ】図２ｂは、ＯＲＦ  １３７Ｌ後の挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ６７の制限酵素地図である。
【図２ｃ】図２ｃは、ＯＲＦ  １３７Ｌ後の挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮ２７の制限酵素地図である。
【図３ａ】図３ａは、ＯＲＦ  ００７Ｒと００８Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ７９の制限酵素地図である。
【図３ｂ】図３ｂは、ＯＲＦ  ００７Ｒと００８Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ８６の制限酵素地図である。
【図３ｃ】図３ｃは、ＯＲＦ  ００７Ｒと００８Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ８８の制限酵素地図である。
【図３ｄ】図３ｄは、ＯＲＦ  ００７Ｒと００８Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮ３４の制限酵素地図である。
【図３ｅ】図３ｅは、ＯＲＦ  ００７Ｒと００８Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮ５６の制限酵素地図である。
【図４ａ】図４aは、ＯＲＦ  ０４４Ｌと０４５Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００／６４０ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ８０の制限酵素地図である。
【図４ｂ】図４ｂは、ＯＲＦ  ０４４Ｌと０４５Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００／６４０ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ８７の制限酵素地図である。
【図４ｃ】図４ｃは、ＯＲＦ  ０４４Ｌと０４５Ｌの間にある挿入部位に隣接する約６００／６４０ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮ４７の制限酵素地図である。
【図５ａ】図５ａは、ＯＲＦ  １４８Ｒと１４９Ｌの間にある挿入部位に隣接する約５９６／６０４ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ９０の制限酵素地図である。
【図５ｂ】図５ｂは、ＯＲＦ  １４８Ｒと１４９Ｌの間にある挿入部位に隣接する約５９６／６０４ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮＸ９２の制限酵素地図である。
【図５ｃ】図５ｃは、ＯＲＦ  １４８Ｒと１４９Ｌの間にある挿入部位に隣接する約５９６／６０４ｂｐのＭＶＡ配列を含むベクターコンストラクトｐＢＮ５４の制限酵素地図である。
【図６】図６は、ＭＶＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９４８４８）の遺伝子間挿入部位を表す概略図である。
【図７】図７は、デングウイルスＮＳ１がＩＧＲ  Ｉ４Ｌ−Ｉ５Ｌに挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  Ｉ４Ｌ−Ｉ５ＬのＰＣＲ解析である。
【図８ａ】図８ａは、デングウイルスＰｒＭ４がＩＧＲ  １３６−１３７に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  １３６−１３７のＰＣＲ解析である。
【図８ｂ】図８ｂは、ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターおよびＩＧＲ  １３６−１３７にＰｒＭ４が挿入されている組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２３）の多段階増殖曲線（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｔｅｐ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｕｒｖｅ）である。
【図９ａ】図９ａは、デングウイルスＰｒＭ２がＩＧＲ  ０７−０８に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  ０７−０８のＰＣＲ解析である。
【図９ｂ】図９ｂは、ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターおよびＩＧＲ  ０７−０８にＰｒＭ２が挿入されている組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２５）の多段階増殖曲線である。
【図１０】図１０は、ＨＩＶ  ｅｎｖがＩＧＲ  ０７−０８に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  ０７−０８のＰＣＲ解析である。
【図１１ａ】図１１ａは、デングウイルスＰｒＭ３がＩＧＲ  ４４−４５に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  ４４−４５のＰＣＲ解析である。
【図１１ｂ】図１１ｂは、ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターおよびＩＧＲ  ４４−４５にＰｒＭ３が挿入されている組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｍＢＮ２８）の多段階増殖曲線である。
【図１２ａ】図１２ａは、デングウイルスＰｒＭ１がＩＧＲ  １４８−１４９に挿入されている組換えＭＶＡ中のＩＧＲ  １４８−１４９のＰＣＲ解析である。
【図１２ｂ】図１２ｂ：ＭＶＡ−ＢＮ空ベクターおよびＩＧＲ  ４４−４５にＰｒＭ１が挿入されている組換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ｍＢＮ３３）の多段階増殖曲線である。
【配列表】
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【図６】
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【図７】
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【図８ｂ】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月9日(2004.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスゲノムの遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入された異種ＤＮＡ配列を含む組換え変異ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）。
【請求項２】
異種ＤＮＡ配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群より選択される隣り合う２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間にあるＩＧＲに挿入される、請求項１記載のＭＶＡ。
【請求項３】
異種ＤＮＡ配列が、好ましくはポックスウイルス転写制御要素の転写制御下にある、少なくとも１つのコード配列を含む、請求項１または２記載のＭＶＡ。
【請求項４】
異種ＤＮＡ配列が、１種以上のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、外来抗原または抗原エピトープをコードする、請求項１〜３のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項５】
異種ＤＮＡ配列が、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及び（又は）免疫不全ウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する、請求項１〜４のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項６】
デングウイルスに由来する異種ＤＮＡ配列が、ＮＳ１およびＰｒＭを含む群から選択される、請求項５記載のＭＶＡ。
【請求項７】
ＮＳ１遺伝子がＯＲＦ  ０６４Ｌ−０６５Ｌ間のＩＧＲに挿入される、請求項６記載のＭＶＡ。
【請求項８】
ＰｒＭ遺伝子が４つのデングウイルス血清型の１種以上に由来する、請求項６または７記載のＭＶＡ。
【請求項９】
ＰｒＭ遺伝子が、００７Ｒ−００８Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択されるＯＲＦ間のＩＧＲに挿入される、請求項６〜８のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項１０】
免疫不全ウイルスに由来する異種ＤＮＡ配列がＨＩＶ  ｅｎｖをコードする、請求項５記載のＭＶＡ。
【請求項１１】
ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子がＯＲＦ  ００７Ｒ−００８Ｌ間のＩＧＲに挿入される、請求項１０記載のＭＶＡ。
【請求項１２】
ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡである、請求項１〜１１のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項１３】
医薬品及び（又は）ワクチンとして使用される請求項１〜１２のいずれか1つに記載のＭＶＡ。
【請求項１４】
ウイルス感染及び（又は）増殖性疾患を処置及び（又は）予防するための医薬品及び（又は）ワクチンの製造を目的とする、請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡの使用方法。
【請求項１５】
デングウイルス感染または免疫不全ウイルス感染、好ましくはＨＩＶ感染を処置または予防するための請求項１４記載の使用方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡを含むワクチン。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡと薬学的に許容し得る担体、希釈剤、アジュバント及び（又は）添加剤とを含む、薬学的調合物。
【請求項１８】
ヒトを含む動物の生体における免疫応答に影響を及ぼす方法、好ましくはヒトを含む動物の生体における免疫応答を誘発する方法であって、これを必要とする、ヒトを含む動物に、請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡ、請求項１６記載のワクチン及び（又は）請求項１７記載の組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項１９】
タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗原またはエピトープをインビトロで製造する方法であって、
宿主細胞を請求項１〜１３のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡに感染させる工程と、
感染した宿主細胞を適切な条件下で培養する工程と、
前記宿主細胞が産生したポリペプチド、タンパク質、ペプチド、抗原、エピトープ及び（又は）ウイルスを単離及び（又は）濃縮する工程と、
を含む、上記方法。
【請求項２０】
ある細胞に、その細胞のゲノムにとって相同及び（又は）異種であるＤＮＡ配列を、インビトロで導入する方法であって、前記細胞を請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡに感染させる、上記方法。
【請求項２１】
ある細胞に、その細胞のゲノムにとって相同及び（又は）異種であるＤＮＡ配列を、エクスビボで導入する方法であって、前記細胞を請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡに感染させた後、その感染細胞を、ヒトを含む動物の生体に投与する、上記方法。
【請求項２２】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡ、請求項１６に記載のワクチン及び（又は）請求項１７に記載の組成物を、ヒトを含む動物に投与することによって、ヒトを含む動物の生体に、その動物体のゲノムにとって相同及び（又は）異種であるＤＮＡ配列を導入する、上記方法。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡを含む、細胞。
【請求項２４】
ＭＶＡゲノムの隣り合う２つのＯＲＦ間に位置するＩＧＲへの、ＭＶＡウイルスのゲノムにとって異種であるＤＮＡ配列（「異種配列」）の、相同組換えによる挿入を指示するＤＮＡ配列と、
前記異種配列と、
場合により、レポーター遺伝子及び（又は）選択遺伝子カセットと、
を含むプラスミドベクター。
【請求項２５】
前記ＤＮＡ配列がＩＧＲ配列の全断片または部分的断片を含む、請求項２４記載のプラスミドベクター。
【請求項２６】
前記ＤＮＡ配列が隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列を含む、請求項２４または２５記載のプラスミドベクター。
【請求項２７】
ＩＧＲ配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択されるＯＲＦ間のＩＧＲに由来する、請求項２４〜２６のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
【請求項２８】
ＩＧＲ由来配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の５２７〜６０８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の２９９〜８８３番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の３３９〜８５２番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の３７６〜６４７番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の５９７〜８５５番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の４００〜６０７番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項２４〜２７のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
【請求項２９】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択される、請求項２４〜２８のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
【請求項３０】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の１〜５２６番目および６０９〜１１９０番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の１０１〜２９８番目および８８４〜１１９８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の１〜３３８番目および８５３〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の１〜３７５番目および６４８〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の１〜５９６番目および８５６〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の１〜３９９番目および６０８〜１０８１番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項２４〜２９のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
【請求項３１】
ＤＮＡ配列が、ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡのゲノムのＩＧＲへの異種配列の挿入を指示する、請求項２４〜３０のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。  
【請求項３２】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡを製造する方法であって、
請求項２４〜３１のいずれか1つに記載のプラスミドベクターを細胞にトランスフェクトする工程と、
トランスフェクトされた細胞をＭＶＡに感染させる工程と、
請求項１〜１３のいずれか1つに記載のＭＶＡを同定し、単離し、場合により精製する工程と、
を含む、上記方法。
【請求項３３】
ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡに細胞を感染させる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ＭＶＡゲノムの隣り合う２つのＯＲＦ間に位置するＩＧＲへの、ＭＶＡウイルスのゲノムにとって異種であるＤＮＡ配列（「異種配列」）の、相同組換えによる挿入を指示するＤＮＡ配列と、
前記異種配列と、
を含むＤＮＡ。
【請求項３５】
ＭＶＡゲノムのＩＧＲへの異種配列の挿入を指示するＤＮＡ配列が、前記ＩＧＲ配列の全断片または部分的断片を含む、請求項３４記載のＤＮＡ配列。
【請求項３６】
ＭＶＡゲノムのＩＧＲへの異種配列の挿入を指示するＤＮＡ配列が、隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列を含む、請求項３４または３５記載のＤＮＡ配列。
【請求項３７】
ＩＧＲ配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択されるＯＲＦ間のＩＧＲに由来する、請求項３４〜３６のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項３８】
ＩＧＲ由来配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の５２７〜６０８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の２９９〜８８３番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の３３９〜８５２番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の３７６〜６４７番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の５９７〜８５５番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の４００〜６０７番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項３４〜３７のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項３９】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択される、請求項３４〜３８のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項４０】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の１〜５２６番目および６０９〜１１９０番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の１０１〜２９８番目および８８４〜１１９８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の１〜３３８番目および８５３〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の１〜３７５番目および６４８〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の１〜５９６番目および８５６〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の１〜３９９番目および６０８〜１０８１番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項３４〜３９のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項４１】
ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡのゲノムのＩＧＲへの異種配列の挿入を指示する、請求項３４〜４０のいずれか1つに記載のＤＮＡ配列。
【請求項４２】
請求項１〜１３のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡを作製及び（又は）製造することを目的とする、
ＭＶＡゲノムの隣り合う２つのＯＲＦ間に位置するＩＧＲへの、ＭＶＡウイルスのゲノムにとって異種であるＤＮＡ配列（「異種配列」）の、相同組換えによる挿入を指示するＤＮＡ配列と、
前記ＩＧＲ配列に挿入された、前記異種配列を挿入するためのクローニング部位と、
場合により、レポーター遺伝子及び（又は）選択遺伝子カセットと、
を含むプラスミドベクターの使用方法。
【請求項４３】
前記ＤＮＡ配列がＩＧＲ配列の全断片または部分的断片を含む、請求項４２記載の使用方法。
【請求項４４】
前記ＤＮＡ配列が、隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列を含む、請求項４２または４３記載の使用方法。
【請求項４５】
ＩＧＲ配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択されるＯＲＦ間のＩＧＲに由来する、請求項４２〜４４のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項４６】
ＩＧＲ由来配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の５２７〜６０８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の２９９〜８８３番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の３３９〜８５２番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の３７６〜６４７番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の５９７〜８５５番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の４００〜６０７番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項４２〜４５のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項４７】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択される、請求項４２〜４６のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項４８】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の１〜５２６番目および６０９〜１１９０番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の１０１〜２９８番目および８８４〜１１９８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の１〜３３８番目および８５３〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の１〜３７５番目および６４８〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の１〜５９６番目および８５６〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の１〜３９９番目および６０８〜１０８１番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項４２〜４７のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項４９】
ＤＮＡ配列が、ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡのゲノムのＩＧＲへの異種配列の挿入を指示する、請求項４２〜４８のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項５０】
請求項２４〜３１記載のいずれか1つに記載のプラスミドベクターを作製及び（又は）製造すること、及び（又は）請求項１〜１３のいずれか1つに記載の組換えＭＶＡを作製及び（又は）製造することを目的とする、ＭＶＡゲノムの隣り合う２つのＯＲＦ間に位置するＩＧＲへの、ＭＶＡウイルスのゲノムにとって異種であるＤＮＡ配列（「異種配列」）の、相同組換えによる挿入を指示するＤＮＡの使用方法。
【請求項５１】
ＭＶＡゲノムのＩＧＲへの異種配列の挿入を指示するＤＮＡ配列が、前記ＩＧＲ配列の全断片または部分的断片を含む、請求項５０に記載の使用方法。
【請求項５２】
ＭＶＡゲノムのＩＧＲへの異種配列の挿入を指示するＤＮＡ配列が、隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列を含む、請求項５０または５１記載の使用方法。
【請求項５３】
ＩＧＲ配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択されるＯＲＦ間のＩＧＲに由来する、請求項５０〜５２記載のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項５４】
ＩＧＲ由来配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の５２７〜６０８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の２９９〜８８３番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の３３９〜８５２番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の３７６〜６４７番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の５９７〜８５５番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の４００〜６０７番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項５０〜５３のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項５５】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、００７Ｒ−００８Ｌ、０１８Ｌ−０１９Ｌ、０４４Ｌ−０４５Ｌ、０６４Ｌ−０６５Ｌ、１３６Ｌ−１３７Ｌ、１４８Ｒ−１４９Ｌを含む群から選択される、請求項５０〜５４のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項５６】
隣り合う２つのＯＲＦのＩＧＲ隣接配列が、ヌクレオチド配列
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２の１〜５２６番目および６０９〜１１９０番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３の１０１〜２９８番目および８８４〜１１９８番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４の１〜３３８番目および８５３〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５の１〜３７５番目および６４８〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６の１〜５９６番目および８５６〜１２００番目と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７の１〜３９９番目および６０８〜１０８１番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項５０〜５５のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項５７】
ＤＮＡ配列が、ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡのゲノムのＩＧＲへの異種配列の挿入を指示する、請求項５０〜５６のいずれか1つに記載の使用方法。
【国際調査報告】
2005525822.tif 000046
2005525822.tif 000047
2005525822.tif 000048
2005525822.tif 000049