(57)【要約】本発明は、生細胞におけるｍＲＮＡ並びにその他のＲＮＡの、信頼度の高い、効率的な検出法と、所望の特性に応じて細胞を特定し、要すれば細胞を分離するための用法に向けられる。この方法は、従来の処理過程を格段に簡単化し、その実行に必要な時間を短縮し、かつ、新規の研究法、例えば、ある特定のタンパクまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成する細胞の選択、複数タンパクを発現する細胞系統の生成、一つ以上のタンパクをノックアウトされた細胞系統の生成等の新規研究法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、
ａ）前記少なくとも一つのＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞中に導入する工程；
ｂ）前記細胞を、前記少なくとも一つのＲＮＡにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、ＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；および、
ｃ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程
を含む方法。
【請求項２】
二つ以上のＲＮＡの少なくとも一つを発現する細胞を単離する方法であって、
ａ）第１ＲＮＡをコードする第１ＤＮＡを細胞中に導入する工程；
ｂ）少なくとも一つの第２ＲＮＡをコードする第２ＤＮＡを前記細胞に導入する工程；
ｃ）前記細胞を、前記第１ＲＮＡにハイブリダイズすると蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第１ＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；
ｄ）前記細胞を、前記少なくとも第２ＲＮＡにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第２分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第２ＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；および、
ｅ）前記分子ビーコンの少なくとも一つが、その対応ＲＮＡにハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
を含む方法。
【請求項３】
少なくとも一つのＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、
ａ）前記少なくとも一つのＲＮＡおよび少なくとも一つのタグ配列をコードするＤＮＡを細胞中に導入する工程；
ｂ）前記細胞を、前記タグ配列のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、タグ配列のＲＮＡ転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；および、
ｃ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程
を含む方法。
【請求項４】
二つ以上のＲＮＡの少なくとも一つを発現する細胞を単離する方法であって、
ａ）第１ＲＮＡおよび少なくとも一つの第１タグ配列をコードする第１ＤＮＡを細胞中に導入する工程；
ｂ）少なくとも一つの第２ＲＮＡおよび少なくとも一つの第２タグ配列をコードする第２ＤＮＡを前記細胞に導入する工程；
ｃ）前記細胞を、第１タグ配列にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第１分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第１タグ配列のＲＮＡ転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；
ｄ）前記細胞を、第２タグ配列にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第２分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、前記第２タグ配列のＲＮＡ転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；および、
ｅ）前記分子ビーコンの少なくとも一つが、前記タグ配列の対応ＲＮＡ転写物にハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
を含む方法。
【請求項５】
少なくとも一つのＲＮＡを過剰発現する細胞を単離する方法であって、
ａ）前記少なくとも一つのＲＮＡと少なくとも一つの第１タグ配列とをコードする少なくとも一つの第１ＤＮＡ、および、前記少なくとも一つのＲＮＡと少なくとも一つの第２タグ配列とをコードする少なくとも一つの第２ＤＮＡを細胞中に導入し、前記第１タグ配列は前記第２タグ配列とは異なるものとする工程；
ｂ）前記細胞を、前記少なくとも第１タグ配列のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第１分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第１タグ配列のＲＮＡ転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；
ｃ）前記細胞を、前記少なくとも第２タグ配列のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第２分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第２タグ配列のＲＮＡ転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；および
ｄ）前記分子ビーコンの少なくとも一つが、前記タグ配列の対応ＲＮＡ転写物にハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
を含む方法。
【請求項６】
少なくとも一つの第１タンパク質を過剰発現するが、少なくとも一つの第２タンパク質については機能的ゼロ発現またはその発現が低下している細胞を単離する方法であって、
ａ）前記少なくとも一つの第１タンパク質をコードする少なくとも一つのＲＮＡと、少なくとも一つの第１タグ配列とをコードする少なくとも一つの第１ＤＮＡ、および、前記少なくとも一つのＲＮＡと、少なくとも一つの第２タグ配列とをコードする少なくとも一つの第２ＤＮＡを細胞中に導入し、前記第１および第２タグ配列とは異なるものとする工程；
ｂ）前記少なくとも第２タンパク質のｍＲＮＡ転写物に結合する少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡをコードする少なくとも一つの第３ＤＮＡを細胞中に導入する工程；
ｃ）前記細胞を、前記少なくとも第１タグ配列のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第１分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第１タグ配列のＲＮＡ転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；
ｄ）前記細胞を、前記少なくとも第２タグ配列のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第２分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第２タグ配列のＲＮＡ転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；
ｅ）前記細胞を、前記少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第３分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、アンチセンスＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；および、
ｆ）前記分子ビーコンが、それぞれのＲＮＡにハイブリダイズした際に発する蛍光を発する細胞を単離する工程、
を含む方法。
【請求項７】
少なくとも一つの第１ＲＮＡを発現する細胞を単離する方法であって、
ａ）前記少なくとも第１ＲＮＡを発現する能力を有する細胞を供給する工程；
ｂ）前記細胞を、前記少なくとも第１ＲＮＡにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第１分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第１ＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；
ｃ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程、
を含む方法。
【請求項８】
前記細胞はさらに少なくとも一つの第２ＲＮＡを発現する能力を有しており、
ａ）前記細胞を、前記少なくとも第２ＲＮＡにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第２分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第２ＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程；および、
ｂ）前記分子ビーコンが、前記第２ＲＮＡにハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質は、細胞表面局在タンパク質および細胞内タンパク質からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２タグ配列は、第１タグ配列と同じか、または、異なることを特徴とする、請求項２または４に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２分子ビーコンは、第１分子ビーコンのものと同じか、または、異なる蛍光物質を有する、請求項２、４、５および８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１、第２および第３の分子ビーコンが、同じか、別々の蛍光物質、または、それらの組み合わせを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１ＲＮＡの前記工程が、前記第２ＲＮＡの対応工程と同時に、継時的に、またはその両方のいずれかで実行される、請求項２、４および８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１タグ配列および第２タグ配列の前記工程が、同時に、継時的に、またはその両方のいずれかで実行される、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１タグ配列、第２タグ配列およびアンチセンスＲＮＡの前記工程が、同時に、継時的に、またはその両方のいずれかで実行される、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１ＤＮＡおよび前記第２ＤＮＡが、同じ構築体、または、異なる構築体上に存在する、請求項２，４および５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１ＤＮＡ、第２ＤＮＡおよび第３ＤＮＡが、同じ構築体、異なる構築体、またはそれらの組み合わせの上に存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記二つ以上のＲＮＡが同じか、または異なる、請求項２または４に記載の方法。
【請求項１９】
蛍光を発する前記細胞を単離する工程が、蛍光活性化細胞ソーター技術または蛍光顕微鏡法によって実行される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＮＡはアンチセンスＲＮＡである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離された細胞は、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の発現が機能的にゼロであるか、または発現が低下しており、前記アンチセンスＲＮＡは、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の、事実上全てのｍＲＮＡ，またはその転写物の実質的部分に結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡは、条件付プロモーターに作動可能に結合される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロモーターは誘導可能であり、前記細胞を分子ビーコンに曝露する前にインデューサーが適用される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程ａ）の後に、ただし、前記細胞を前記分子ビーコンに曝露する前に細胞を選択する工程をさらに含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも一つのＤＮＡは少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをさらにコードし、前記方法は、前記マーカーによって耐性を付与されて、少なくとも一つの薬剤に対して耐性を持つようになった細胞を選択する工程をさらに含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から６のいずれか１項によるＲＮＡを発現するトランスジェニック動物を作製する方法であって、請求項１から６のいずれか１項による工程を実行すること、胚幹細胞を利用すること、前記幹細胞の生存率を決定すること、および、前記生存胚幹細胞を用いて、前記トランスジェニック動物を生産することを含む方法。
【請求項２７】
前記ＲＮＡはアンチセンスＲＮＡであり、前記トランスジェニック動物は、アンチセンスＲＮＡが、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質のｍＲＮＡ転写物の、事実上全て、またはその実質的部分に結合することによって、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の発現が機能的にゼロであるか、または発現が低下する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
生物学的サンプルにおける少なくとも一つの第１ＲＮＡ発現のレベルを定量するための方法であって、
ａ）前記生物学的サンプルを、前記第１ＲＮＡとハイブリダイズすると蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第１ＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的な配列とを含むものとする工程；
ｂ）前記生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程；および、
ｃ）前記蛍光レベルを、前記少なくとも第１ＲＮＡの前記レベルと相関させる工程、
を含む方法。
【請求項２９】
前記生物学的サンプルは、細胞サンプルおよび組織サンプルからなる群から選ばれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的サンプルは固定されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記蛍光は、蛍光顕微鏡法または蛍光活性化細胞ソーター技術によって定量される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも一つの第２ＲＮＡの発現のレベルが、前記生物学的サンプルにおいて、前記第２ＲＮＡにハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンによって定量され、前記第２分子ビーコンは、第２ＲＮＡに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２ＲＮＡの前記工程が、前記少なくとも第１ＲＮＡの対応工程と同時に、継時的に、またはその両方のいずれかで実行される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２分子ビーコンが、第１分子ビーコンのものと同じか、または、異なる蛍光物質を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞サンプルは細胞である、請求項２８または３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも第１ＲＮＡまたは第２ＲＮＡまたはその両方の発現レベルに基づいて、前記細胞を単離する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞は、蛍光活性化細胞ソーター技術または蛍光顕微鏡法を用いて単離される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞を育成する工程をさらに含む、請求項１から８および３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
一つの細胞系統、または、複数の細胞系統が生成される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＲＮＡは、タンパク質をコードするＲＮＡ、構造的ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ペプチドをコードするＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよびｓｎＲＮＡの一つ以上である、請求項１から８および２８から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
タンパク質分解活性を生成する単一ハイブリダイゼーションプローブであって、
標的配列に対して相補的な１本鎖標的相補配列；
標的相補配列を両側挟持する、一対のオリゴヌクレオチドアームであって、５‘末端に共有的に結合する５’アーム配列と、３‘末端に共有的に結合する３’アーム配列とから成り、ステム２本鎖を形成する前記一対のオリゴヌクレオチドアーム；
タンパク質分解酵素と前記タンパク質分解酵素の阻害剤とを含む相互作用ペアであって、各ペアの一方のメンバーは５‘アーム配列にコンジュゲートされ、他方のメンバーは３’アーム配列にコンジュゲートされ、前記阻害剤は、前記タンパク質分解酵素と相互作用を持つと、前記タンパク質分解酵素のタンパク質分解活性を少なくとも部分的に不活性化することが可能である相互作用ペア、
を含むハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項４２】
請求項４１に記載のプローブであって、前記標的配列不在のアッセイ条件下では、そのタンパク質分解活性レベルは、前記タンパク質分解酵素と前記阻害剤との相互作用の程度を表す関数となるという特徴的なタンパク質分解活性を有し、前記標的配列が過剰に存在する条件下では、標的相補配列の標的配列へのハイブリダイゼーションが、前記特徴的タンパク質分解活性のレベルを上昇させる、プローブ。
【請求項４３】
前記アッセイ条件は、標的配列を検出するための検出温度を有する、請求項４２に記載のプローブ。
【請求項４４】
前記タンパク質分解酵素阻害剤はペプチドである、請求項４１に記載のプローブ。
【請求項４５】
前記タンパク質分解酵素、および前記タンパク質分解酵素の前記阻害剤は、
アミノペプチダーゼとアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼとアンチパイン、アミノペプチダーゼとベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼとキモスタチン、アミノペプチダーゼとジプロチンＡまたはＢ、カルボキシペプチダーゼＡとＥＤＴＡ、エラスターゼ様セリンプロテアーゼとエラスチナール、および、テルモリシンまたはアミノペプチダーゼＭと１，１０−フェナントロリンからなる群から選ばれる、請求項４１に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、１９９３年１１月２３日出願の仮出願第６０／１６６，９８７号に対する優先権を主張する。なお、この出願の全体を引用することにより本明細書に含める。
【０００２】
発明の背景
分子ビーコンは、ある特定の核酸配列の存在を認識し伝える核酸プローブである。このプローブは、標的配列に相補的なヌクレオチドからなる中央直線部と、短い相互に相補的な配列を含む末端部を備えるヘアピン型配列である。一方の末端は蛍光分子に共有的に結合し、他方の末端は消光基に共有的に結合する。末端同士がハイブリダイズした元々の状態にある場合には、蛍光分子と消光分子の近接性は、蛍光が全く発せられない程度のものとなっている。このビーコンは、標的核酸にハイブリダイズした場合に、自然に蛍光発光性の立体構造変化を受ける。例えば、米国特許第５，９２５，５１７号を参照されたい。
【０００３】
この性質により、研究者達は、主にインビトロ反応において、ある場合には生細胞においても特定の核酸を検出することが可能になった。生細胞のリポソームに輸送された分子ビーコンを用いて、メッセンジャーＲＮＡの生体内視覚化が実現された（Ｍａｔｓｕｏ，１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３７９：１７８−１８４）。これまでのところ細胞を扱う研究は、極めて弱い蛍光分子ＥＤＡＮＳによって発生されるビーコンを用いていた。なぜなら、この分子が、消光分子ＥＤＡＣによって消光されるものとして知られている唯一のものだったからである。その結果は、識別はつくもののかろうじてできるという体のもので、この方向の研究をインビボ検出へ応用することは有望ではなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の大要
一つの局面では、本発明は、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する方法であって、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクと少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとをコードする少なくとも一つのＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程；
ｃ）選択された細胞を、第１分子ビーコンに曝露し、第１分子ビーコンは、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）蛍光を発する細胞を単離する工程；
ｅ）単離された細胞を育成することによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクを発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法に向けられる。
【０００５】
前述の方法は、蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて実行することが可能である。さらに別の局面では、細胞系統は、第２のあらかじめ選択されたタンパクを発現するように仕向けることも可能である。すなわち、第２のあらかじめ選択されたタンパクと第２の薬剤耐性マーカーとをコードする第２のＤＮＡ構築体によって前記細胞系統をトランスフェクトすること；第２マーカーを発現する細胞を選択すること；その細胞を、第２のあらかじめ選択されたタンパクのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物および第２ｍＲＮＡ転写物それぞれにおいて蛍光を示す細胞を単離する工程をさらに実行する。前記工程を繰り返すことによって、二つを越えるタンパクを発現する細胞系統を供給することも可能である。第２タンパクを導入する方法は同時にまたは継時的に実行してもよい。第１および第２薬剤耐性マーカーが同じである場合は、同時選択は、薬剤濃度を増すことによって実現が可能である。
【０００６】
本発明の別の局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクを発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、少なくとも一つの第１エピトープタグをコードする少なくとも一つのＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程；
ｃ）選択された細胞を、第１分子ビーコンに曝露し、第１分子ビーコンは、第１エピトープタグのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）蛍光を発する細胞を単離する工程；および
ｅ）単離された細胞を育成することによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクを発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法が提供される。
【０００７】
前述の方法は、蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて実行することが可能である。エピトープタグをコードする構築体のＤＮＡ部分は、前記少なくとも一つのタンパクをコードするＤＮＡ部分と、読み枠が一致していても、一致していなくてもよい。さらに別の実施態様では、細胞系統は、第２のあらかじめ選択されたタンパクを発現するように仕向けることも可能である。すなわち、その工程は、第２のあらかじめ選択されたタンパク、第２の薬剤耐性マーカー、および、第２のエピトープタグをコードする第２のＤＮＡ構築体によって前記細胞系統をトランスフェクトすること；第２マーカーを転写する細胞を選択すること；その細胞を、第２エピトープタグのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、第１および第２エピトープタグそれぞれの蛍光を示す細胞を単離することをさらに含む。二種のタンパク質の場合、第２エピトープタグをコードするＤＮＡ配列の部分は、第２タンパクをコードするＤＮＡ配列部分と読み枠が一致していても、一致していなくともよい。第２のあらかじめ選択されたタンパクは、第１のものと同時にまたは継時的にトランスフェクトされてもよい。本法を同時に実行し、かつ、両方の構築体に同じ薬剤耐性マーカーを使用する場合、薬剤の高い方の濃度を用いて、両構築体を発現する細胞を選択することが可能である。さらに、前述の工程を反復することによって細胞系統中に二つを越えるタンパクを供給することが可能である。
【０００８】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子および少なくとも一つの薬剤耐性遺伝子をコードするＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程；
ｃ）細胞を、アンチセンスＲＮＡ分子にハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに曝露する工程；
ｄ）蛍光を発する細胞を単離する工程；および、
ｅ）単離された細胞を育成することによってあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ配列を発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法が提供される。
【０００９】
蛍光を発する細胞の単離は、蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて実行することが可能である。この細胞系統は、少なくとも一つの第２のあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡを発現するように仕向けることも可能である。すなわち、その工程は、第２のあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子と第２の薬剤耐性マーカーとをコードする第２のＤＮＡ構築体によって細胞系統を同時にまたは継時的にトランスフェクトすること；第２マーカーを発現する細胞を選択すること；その細胞を、第２アンチセンスＲＮＡ分子にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物および第２ｍＲＮＡ転写物それぞれにおいて蛍光を示す細胞を単離することをさらに含む。方法を同時に実行し、かつ、両構築体に同じ薬剤耐性マーカーを使用する場合、選択は高い方の薬剤濃度を用いることによって実現が可能である。前述の工程を別の構築体と共に反復することによって二つを越えるアンチセンスＲＮＡ分子を供給することが可能である。
【００１０】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、第１エピトープタグヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程；
ｃ）選択された細胞を、第１エピトープタグのｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露する工程；
ｄ）蛍光を発する細胞を単離する工程；
ｅ）単離された細胞を育成することによってあらかじめ選択された少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法が提供される。
【００１１】
この細胞系統は、少なくとも一つの第２のあらかじめ選択された、エピトープタグ付きアンチセンスＲＮＡを発現するように仕向けることも可能である。すなわち、その工程は、第２のあらかじめ選択された、エピトープタグ付きアンチセンスＲＮＡ分子と第２の薬剤耐性マーカーとをコードする第２のＤＮＡ構築体によって前記細胞系統をトランスフェクトすること；第２マーカーを発現する細胞を選択すること；その細胞を、第２エピトープタグ付きｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物および第２ｍＲＮＡ転写物の両方に対して蛍光を示す細胞を単離することをさらに含む。これらの工程は、第１のものと同時にまたは継時的に実行してもよい。同じ薬剤耐性マーカーを持つ両構築体に基づく同時トランスフェクションによる選択は、薬剤の高い方の濃度を用いて実行することが可能である。追加工程を実行して二つを越えるエピトープタグ付きアンチセンス分子を導入することが可能である。
【００１２】
前述の方法は、アンチセンスＲＮＡ分子、または、ｒＲＮＡの他にｈｎＲＮＡおよびｓｎＲＮＡを含めた構造的ＲＮＡ−ただしそれらに限定されない−を含む全てのタイプのＲＮＡ分子を発現する細胞を調製するのに使用することが可能である。さらに、注意しなければならないことは、トランスフェクトされた構築体の分子ビーコンによる検出のためにエピトープタグが供給されている方法の全てにおいて、エピトープタグ配列が分子ビーコンによって検出可能である限り、エピトープタグが、コードされたタンパクと読み枠が一致していているか、一致していないかは重要ではないことである。
【００１３】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのタンパク質またはＲＮＡを発現する細胞を単離するための方法であって、
ａ）少なくとも一つのタンパクを発現することが予想される細胞を供給する工程；
ｂ）その少なくとも一つのタンパクをコードするｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程；
ｃ）蛍光を発する細胞を単離する工程、
を含む方法が提供される。
【００１４】
蛍光を発する細胞を単離するには蛍光活性化細胞ソーターを用いることが可能である。非限定的例として挙げるのであるが、このタンパクは、細胞表面の局在タンパクであっても、または、細胞内タンパクであってもよい。他にも任意のＲＮＡの検出が可能である。この方法はまた、第２タンパクまたはＲＮＡを発現する細胞を特定するのに使用することが可能である。すなわち、標的ＲＮＡとハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに細胞を曝露させ、第１と第２分子ビーコンのそれぞれの蛍光を有する細胞を単離する。二つを越えるタンパクの同時発現も実現可能である。
【００１５】
本発明はまた、生物学的サンプルにおける少なくとも一つのＲＮＡ転写発現物のレベルを定量するための方法であって、
ａ）その生物学的サンプルを、前記ＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露する工程；
ｂ）生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程；および、
ｃ）蛍光レベルを、前記少なくとも一つのＲＮＡ転写物のレベルと相関させる工程、
を含む方法に向けられる。
【００１６】
この生物学的サンプルは、細胞サンプルまたは組織サンプルであってもよい。このサンプルは固定されていてもよい。このＲＮＡ転写物は、タンパクをコードするＲＮＡ、構造的ＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであってもよいが、ただしそれらに限定されない。蛍光は、蛍光顕微鏡検査または蛍光活性化細胞ソーター技術によって定量することが可能である。その生物学的サンプルにおける、少なくとも一つの第２ＲＮＡ転写発現のレベルを、その第２のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンを用いて定量化することも可能である。
【００１７】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのタンパク質を過剰発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも二つのＤＮＡ配列であって、一方の配列は、前記タンパク、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、第２配列は、前記タンパク、少なくとも一つの第２エピトープタグ、および、少なくとも一つの第２薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、そのような少なくとも二つのＤＮＡ配列によって細胞をトランスフェクトする工程；
ｂ）第１および第２薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
ｃ）選択された細胞を第１および第２分子ビーコンに曝露し、それらの分子ビーコンは、それぞれ、第１および第２エピトープタグのＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）第１および第２分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程；および、
ｅ）単離した細胞を育成することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を過剰発現する細胞系統を生成する工程、
を含む方法が提供される。
【００１８】
本発明の前述の局面では、少なくとも二つのＤＮＡ配列は同じ構築体の上に局在してもよい。第１および第２エピトープタグは、それぞれ独立に、前記タンパクと読み枠が一致していても、一致していなくともよい。ＦＡＣＳを用い、もっとも強い蛍光を発現する細胞を単離することによって、両構築体を発現する細胞を単離することが可能である。本明細書に前述した方法と同様、トランスフェクションは同時に、または、継時的に実行してもよい。同じ薬剤耐性マーカーが両構築体中に存在しており、かつ、同時トランスフェクションを行う場合、選択は薬剤レベルを増すことによって実現が可能である。
【００１９】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ分子を過剰発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも二つのＤＮＡ配列であって、一方の配列は、前記タンパク、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、第２配列は、前記タンパク、少なくとも一つの第２エピトープタグ、および、少なくとも一つの第２薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、そのような二つのＤＮＡ配列によって細胞をトランスフェクトする工程；
ｂ）第１および第２薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
ｃ）選択された細胞を第１および第２分子ビーコンに曝露し、それらの分子ビーコンは、それぞれ、第１および第２エピトープタグのＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）第１および第２分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程；および、
ｅ）単離した細胞を育成することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子を過剰発現する細胞系統を生成する工程、
を含む方法が提供される。
【００２０】
前記少なくとも二つのＤＮＡ配列は同じ構築体の上に局在してもよい。第１および第２エピトープタグは、それぞれ独立に、前記アンチセンス分子と読み枠が一致していても、一致していなくともよい。所望の産物を実現するための条件および別法は前述した通りである。さらに、どのような形のＲＮＡを供給してもよい。
【００２１】
本発明の別局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質またはＲＮＡの発現に対して機能的にゼロである細胞を生成する方法であって、細胞において、前記あらかじめ選択されたタンパクまたはＲＮＡに対し、複数のアンチセンスＲＮＡを供給し、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクまたはＲＮＡに対する複数のアンチセンスＲＮＡが、ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡからなる事実上全てのＲＮＡ転写物に結合し、除去されることからなる工程を含む方法が提供される。あるあらかじめ選択されたタンパクに対して細胞をゼロとする場合、そのあらかじめ選択されるタンパクは、特異的な唯一のタンパクであってもよいし、あるいは、ある遺伝子産物の、別様にスプライスされた複数の形態からなるサブセットであってもよい。
【００２２】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質について機能的ゼロ発現突然変異種であるトランスジェニック動物を生成する方法であって、前述の工程を胚幹細胞を用いて実行すること、前記あらかじめ選択されたタンパクを機能的にゼロ発現する幹細胞の生存率を定量すること、および、生存胚幹細胞を用いてトランスジェニック動物を生成することを含む方法が提供される。
【００２３】
さらに、少なくとも一つのタンパク質については機能的にゼロ発現し、少なくとも一つの別のタンパク質については過剰発現する細胞系統を生成する方法であって、本明細書で前述した方法を、同じ細胞に実行することを含む方法が提供される。さらに、前述の方法を実行し、その際工程（ａ）を極少量のインデューサーの存在下に実行することによって、誘発可能なプロモーターの制御下に致死的アンチセンスＲＮＡを発現する細胞系統を生成する方法が提供される。
【００２４】
生細胞において遺伝子組み換え事象を特定するための方法であって、
ａ）組み換え配列から転写されたＲＮＡ配列と非組み換え配列から転写されたＲＮＡ配列とからなる群から選ばれるＲＮＡ配列とハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに細胞を曝露する工程；
ｂ）前記細胞を検出または選択抽出する工程、
を含む方法である。
【００２５】
前記細胞の検出および／または選択抽出は、ＦＡＣＳまたは顕微鏡によって実行が可能である。
【００２６】
別局面では、本発明は、本明細書ではプローブプロテアーゼと呼ぶ、タンパク分解活性を生成させる単一ハイブリダイゼーションプローブに向けられる。このプローブプロテアーゼは分子ビーコンと同様に働くが、分子ビーコンが標的核酸配列と相互作用を持つと発する蛍光変化ではなく、このプロテアーゼは、標的の存在下でタンパク分解性を帯びる。プローブプロテアーゼは、分子ビーコンタイプのオリゴヌクレオチドの一端にプロテアーゼを、他端に、相補的なプロテアーゼ阻害剤を設ける。このオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズしていない場合は、オリゴヌクレオチドの両端が近接しているために、プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤とは相互作用を持つことが可能となり、プロテアーゼのタンパク分解活性を抑制する。しかしながら、オリゴヌクレオチドの標的配列が標的にハイブリダイズすると、プロテアーゼとその阻害剤は分離されて、プロテアーゼを活性化する。このプロテアーゼの活性化は簡単に測定が可能であり、さらに、ある特定の核酸標的配列の存在下で活性を有するプロテアーゼは、検出目的ばかりでなく、治療目的のためにも使用が可能である。すなわち、治療目的の場合、例えば、ある特定の遺伝子、例えば、細胞の形質変換、発ガン性、異常増殖等に関連する遺伝子が転写された場合、プローブプロテアーゼが送り込まれた細胞はタンパク分解され、生きられなくなる。
【００２７】
前述のプローブは、タンパク分解酵素を可逆的に不活性化することが可能なペプチドまたは別の分子であるタンパク分解酵素阻害剤を有していてもよい。酵素および阻害剤の、非限定的例としては、アミノペプチダーゼとアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼとアンチパイン、アミノペプチダーゼとベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼとキモスタチン、アミノペプチダーゼとジプロチンＡまたはＢ、カルボキシペプチダーゼＡとＥＤＴＡ、エラスターゼ様セリンプロテアーゼとエラスチノール、および、テルモリシンまたはアミノペプチダーゼＭと１，１０−フェナントリンが挙げられる。
【００２８】
本発明の上記局面およびその他の局面は、下記の詳細な説明から理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本明細書の発明は、分子プローブが、生細胞においてＲＮＡ配列の特定を可能とする能力と、一つ以上の波長において蛍光のあるレベル（単数または複数）を示す細胞を特定および／または分離する蛍光細胞ソーターまたは関連技術の使用に基づく。ＥＤＡＣが、通常使用される各種最強蛍光分子の発光を抑止可能であることは今では既知である。生細胞においてｍＲＮＡのみならずその他のＲＮＡをも安定的にかつ効率的に検出することが可能になったということは、所望の特性に基づいて、例えば、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を用いて、細胞を特定するために、要すればそのような細胞を分離するためにそれらのＲＮＡを用いることが可能になったということである。本出願は、従来の既知の処理過程を格段に簡単化し、かつ、その実行に必要な時間を格段に短縮する方法を多数提供すると共に、新規方法をも提供する。ビーコンや生細胞を用いる従来の試験は、コントロールに対して際立った差を示さなかった。この問題は、先ずより強力な蛍光分子を用いることによって、さらに、ステムループ分子の内ステム部分を形成するヌクレオチドの数を、従来使用されていた５または６ヌクレオチド長よりも長くなるようにビーコンを修飾することによって取り除かれる。このように修飾することによって、ステムループ分子が、標的配列不在の場合に非蛍光状態をより確実に維持できるようになるので、背景は低下されることになる。
【００３０】
前述の方法論により、様々な役割を持つＲＮＡ、すなわち、タンパクをコードすることもなければ、アンチセンスＲＮＡとしても作動しないが、細胞によって発現されるＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡとして作動するＲＮＡ、既に挙げた二つのクラスのＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡである他のＲＮＡを発現するトランスフェクト細胞系統を安定的に生成することが可能になる。上述の他のＲＮＡとしては、構造的ＲＮＡ、例えば、リボソームＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ等が挙げられる。
【００３１】
１．タンパク発現細胞系統の生成。  細胞系統生成に関わる工程の内もっとも退屈なもののいくつかが、本明細書に記述される通りに分子ビーコンを運用することによって除去される。所望の遺伝子に加えて、薬剤耐性をもコードするＤＮＡ構築体によってトランスフェクトされた細胞の薬剤性選択の後、対象遺伝子のメッセージを認識するように設計された分子ビーコンをその細胞中に導入する。前記遺伝子を転写した細胞は発光する。その後ＦＡＣＳ分析をすることによって蛍光細胞が単離され、次にこれらを育成すると、選択した遺伝子を発現する細胞系統が生成される。
【００３２】
対象メッセージを認識するように設計されたビーコンが、内因的に存在する標的配列を検出することが可能な場合、トランスフェクトされた細胞によって生産される標的配列の割合と比べた場合の内因性配列の比率によって、ソーターがこの二つの細胞タイプを区別することができるようになる。別態様では、対象遺伝子にエピトープタグを付け、このタグをコードするヌクレオチド配列を認識するようにビーコンを設計することによって、内因性蛍光の発光は取り除かれる。これらのヌクレオチドは、生産されるタンパクにタグを付することが必要であるかどうかに応じて、遺伝子のメッセージと読み枠が合致していてもよいし、または、読み枠が合致していなくともよい。
【００３３】
さらに、任意の細胞における対象遺伝子の発現レベルは変動してもよい。このような場合、発現レベルを評価するためにＦＡＣＳが適用される。ＦＡＣＳは、同じ遺伝子を発現する個々の細胞を差別的に選択するのに使用される。
【００３４】
２．アンチセンス発現細胞系統の生成。  タンパクをコードするＲＮＡではなく、遺伝子または遺伝子の一部のアンチセンスであるＲＮＡを発現する細胞系統の生成について記載する研究がいくつかある。これらの方法は、細胞における特異的タンパクの量を下げることを目的とする。タンパク発現細胞系統の生成に関して前述した工程が、この場合にも同じく適用が可能であり、内容的には、ビーコンがアンチセンスＲＮＡであるＲＮＡを検出するように設計されることを除き、ほとんど同一である。
【００３５】
安定的にトランスフェクトされたアンチセンス発現細胞系統を作成しようという試みの全てが、標的タンパクの発現が十分な影響を受けている細胞系統をもたらすわけではない。この困難があるために、この種の細胞系統の生産を続行することの価値が低下する。一方、本明細書に記述される処理過程は簡単なので、活性の高いアンチセンス発現細胞系統生成能力に関して、異なる多数の遺伝子配列について効力を定量することが容易である。
【００３６】
３．細胞表面局在抗原に基づく細胞の区別。  免疫学者やその他の研究者達は長い間細胞を仕分けするのにＦＡＣＳを用いてきた。本発明によれば、細胞表面局在タンパクの存在を検出するには、対象タンパクをコードするｍＲＮＡを標的として持つビーコンを製造する。このビーコンをトランスフェクションによって細胞中に導入し、次に、細胞ソーターを用いてプラスの得点を挙げた細胞を単離する。
【００３７】
さらに、ＦＡＣＳは最近では、最大３種の細胞表面局在タンパクの発現に基づいて細胞を仕分けるように使用される。ＦＡＣＳのこの特性は、複数のビーコンの組み合わせであって、それぞれが対象タンパク質の内の一つのｍＲＮＡを標的とし、かつ、それぞれが別様に標識される複数のビーコンの組み合わせを用い、本明細書で記述する通りに分子ビーコンを使用すれば実現される。三つよりも多い発現ＲＮＡに基づいて細胞を仕分けるには、仕分けを複数回実行する。
【００３８】
４．特異的ＲＮＡの発現について細胞を定量し、細胞におけるＲＮＡ発現レベルを定量すること。  細胞中に導入された分子ビーコンの標的ＲＮＡが存在する場合、その細胞は蛍光を発する。この情報は、蛍光顕微鏡またはＦＡＣＳを用いることによって定量的に評価されるが、これはどちらの方法でも定量が可能である。例えば、ある特定のＲＮＡについて発現パターンを確定するのに、組織スライスについて体内逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行ってきたが、これを実施せず、代わりにビーコンを使用しても同じ実験ができる。さらに、それぞれが異なる蛍光を発する複数のビーコンであって、それぞれが特異的ＲＮＡを標的とする複数のビーコンの組み合わせを用いることによって、いくつかの対象ＲＮＡの存在または量が一工程でアッセイされる。
【００３９】
５．細胞および組織中のＲＮＡ検出と組み合わせた抗原の局在。  固定細胞または組織スライスを使用し、免疫細胞化学を利用することによって、認識されたタンパク抗原の局在を記述し、特異的ＲＮＡを標的とする分子ビーコンを用いることによって、同じサンプル中で対象ＲＮＡを同時に局在化する。ＲＮＡに対して向けられた分子ビーコンは固定細胞においても機能することが示されている。
【００４０】
６．複数タンパク質を発現する細胞系統の生成。  本発明の方法を用いて、任意の数のタンパクを発現する形質転換細胞系統が、多数の選択的薬剤からなる混合物の存在下にそれらの細胞を維持する必要もなく、非常に速やかに、安定的に生成される。遺伝子トランスフェクションおよび薬剤選択の後、それぞれが各タンパクメッセージに対して特異的な複数の分子ビーコンの組み合わせを、細胞内に導入する。各ビーコンのループ配列を、メッセージがそれと関連する可能性のある、複数の遺伝子の内のただ一つのもののｍＲＮＡ、または、複数のエピトープタグの内（前記参照）ただ一つのもののヌクレオチド配列にハイブリダイズするように設計することによって、各ビーコンは、複数の遺伝子の内ただ一つによってコードされるｍＲＮＡを認識するように設計される。次に、細胞をＦＡＣＳによって仕分ける。一つ、二つまたは三つ全部の蛍光信号を選ぶことによって、単一の運用で様々の細胞系統が生成される。
【００４１】
三つを越える対象ＲＮＡを発現する細胞系統を生産する必要のある場合がある。例えば、ある特定の複合体の形成に関わっていると考えられるタンパク質およびＲＮＡ配列の全てが過剰発現される細胞系統を持つことができたならば、それは極めて豊かな情報をもたらすであろう。このことを実現するためには、既に複数のＲＮＡの組み合わせを発現している細胞を宿主細胞として用い、さらに別のＲＮＡをコードする追加の構築体をこれらの細胞にトラスフェクトさせることによって、前述の工程を繰り返す。
【００４２】
発現されるべき複数のＲＮＡが皆、細胞に同じ薬剤に対する耐性を付与する構築体においてクローンされる場合、ＦＡＣＳを用いて、所望のＲＮＡ全てを発現する細胞を単離する。これらの配列は安定にゲノムに組み込まれるので、細胞は、どの配列の発現も欠如させることはない。しかしながら、配列の内の１個以上が失われることがあり得る。このような場合には、細胞が育成される培養液中の選択薬剤の濃度を増すと、このような可能性はより少なくなる。別態様として、それぞれが別々の薬剤に対する耐性を付与する複数の構築体を用い、細胞を適当な薬剤の混合物中に維持する。また、安定に細胞にトランスフェクトされる構築体サブセットを、一つの薬剤に対する耐性遺伝子をコードするように選出し、かつ、別の薬剤に対する耐性遺伝子をコードする別のサブセットを選出する。
【００４３】
さらに、ある細胞系統においていくつかの細胞が対象ＲＮＡを失った場合は、一つの救済策として、細胞を単離するために行われた前述の第１実験を繰り返して新しい細胞を得る。別法として、前述の細胞混合物を、所望のＲＮＡの全てを発現する細胞を再度単離する目的でＦＡＣＳによって分析する。これは極めて有用な処置である。なぜなら、これによって、元の選ばれた細胞系統と同じ遺伝的構成を持つ細胞系統を生成する細胞が再び得られるからである。
【００４４】
前述の方法は、ほとんど無限の分析法に対して適用可能な、複数のタンパクおよびＲＮＡ配列の任意の組み合わせを発現する細胞の無制限な供給を実現する。それでもなお、過剰発現されるタンパクがその細胞にとって有毒である可能性があるが、後に論ずるように、この可能性については速やかに対処することが可能である。
【００４５】
細胞集団がもはや所望のＲＮＡ全てを発現することのない細胞をいくつか含んでいる細胞系統クローンから、所望のＲＮＡ全てを発現する細胞を簡単に再度単離することができるということは、細胞系統を、薬剤の不在下に、または、極小濃度の薬剤の存在下に維持することを可能とするということに注意されたい。
【００４６】
７．一つ以上のタンパク質を目覚しく過剰発現する細胞系統の生成。  各遺伝子を高度に過剰発現させるためには、例えば、同じ遺伝子の二つ以上の配列を、先ず、薬剤耐性を付与するＤＮＡ構築体にクローンする。各遺伝子の複数の配列はそれぞれ、異なるエピトープタグをコードする配列を含むように設計される。このＤＮＡ構築体を細胞にトランスフェクトさせ、次に薬剤選択した後、複数のビーコンで、それぞれがただ一つのエピトープタグを標的とし、かつ、別様に蛍光標識された複数のビーコンを細胞に導入し、細胞ソーターを用いて、それらの信号に対して陽性である細胞を単離する。これらの細胞は、そのゲノムの中に、別々のエピトープ配列タグ付き遺伝子の少なくとも１コピーを組み込んでいるのであるから、対象配列の発現は、事実上同じ対象配列の、漸増する複数コピーから生じる。この方法をＦＡＣＳの使用と組み合わせて、各蛍光分子信号についてもっとも高得点を挙げた細胞を選択する。
【００４７】
８．複数のアンチセンスＲＮＡを発現する細胞系統の生成。  複数のアンチセンスメッセージを発する、安定にトランスフェクトされる細胞系統は下記のように形成される。このアンチセンスメッセージは、ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡを標的とする。トランスフェクトされた複数のアンチセンス配列の内の任意の一つについて様々なレベルで発現する細胞を選択する。安定なトランスフェクションを繰り返すことによって、無制限な数のＲＮＡのアンチセンスメッセージを発現する、安定にトランスフェクトされる細胞系統を生じる可能性のある細胞が簡単に選出される。
【００４８】
もちろん、アンチセンスＲＮＡ以外のＲＮＡを発現する細胞も、本明細書に記載される方法によって調製が可能である。そのようなＲＮＡとしてはｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、その他の構造的ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡまたはｓｎＲＮＡが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００４９】
９．一つ以上のタンパク質について機能的にノックアウトされた細胞系統の生成。  本発明の方法は、培養細胞において機能的ノックアウトを調製する手段を提供する。これによって、酵母またはマウスにおいてヒトのタンパクのノックアウト特徴を調べることによって、そのヒトのタンパクの役割を解読するという必要がなくなる。ほとんど同じアンチセンスＲＮＡから一意のＲＮＡ配列までを、複数の座位から発現する細胞を生成することにより、対象任意のタンパクを機能的にノックアウトさせた細胞系統が生成される。例えば、複数の構築体であって、それぞれが、ある特定の遺伝子のアンチセンスＲＮＡをコードする構築体を、細胞中に安定にトランスフェクトする。この場合、各アンチセンスＲＮＡ配列は、それぞれが、一意のエピトープタグのヌクレオチド配列によってタグされている点でのみ異なる。様々にタグされたアンチセンスＲＮＡの全てを発現する細胞を選択する。前述したように、ＦＡＣＳを用いて蛍光を定量すると、この有利な特典により、前記アンチセンスＲＮＡの内の任意の一つ以上をもっとも高度に発現する細胞を選択することが可能である。
【００５０】
重要なことであるが、この方法では、同じ遺伝子を標的とする異なるアンチセンス配列が用いられる。例えば、前記複数のアンチセンスＲＮＡの内のいくつかについて、その発現に関して分子ビーコンとＦＡＣＳを用いて選出しておいたものを、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの特定領域を標的とするように設計し、一方、別のアンチセンスＲＮＡは、同じメッセンジャーの別部分を標的とするように設計する。対象タンパクの機能的ノックアウトである細胞系統を生成するためには、その対象タンパクを検出可能なレベルでは発現しない、または、別態様として受容可能なほどの低レベルでしか発現しない細胞系統の形成に必要な、対象同じ遺伝子に対する類似のまたは異なるアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子配列のできるだけ多数を安定に細胞にトランスフェクトする。
【００５１】
さらに、複数の細胞系統であって、そこにおいて、アンチセンスによって機能的にノックアウトされる任意の数の配列を標的としながら、前述の処理過程を反復することによって複数のタンパクが機能的にノックアウトされる複数の細胞系統を生成する。例えば、複数のタンパクからなる複合体を調べるために、その複合体を構成する複数のタンパクの内の全て、または、任意の組み合わせをノックアウトする。
【００５２】
１０．一つ以上の遺伝子の唯一の選択された形態、または、選択的スプライシング形態の機能的ノックアウトである細胞系統の生成。  ある単一遺伝子の、様々にスプライスされた変種は、異なる機能を持つタンパクに翻訳されることが多い。本発明の方法を用いて、一つ以上のタンパクの、複数の選択的スプライシング形態の内選択されたもののみの機能的ノックアウトである細胞系統が生成される。例えば、遺伝子のＲＮＡメッセンジャーの、複数の選択的スプライシング変種の内、細胞から取り除きたいと思うもののみを標的とするアンチセンスを設計することによって、対象選択的スプライシングメッセージを除き、対象遺伝子の選択的スプライシングＲＮＡの全てが機能的にノックアウトされる。
【００５３】
１１．一つ以上のタンパクを発現し、もう一方で、他の、一つ以上のタンパクの発現を機能的にノックアウトされた細胞系統の生成。  前述の方法論を用いて、様々の役割を持つ複数のＲＮＡ、すなわち、あるＲＮＡはタンパクをコードもしないし、アンチセンスＲＮＡとして活動することもしないが、細胞によって発現され、一方、他のあるものはメッセンジャーＲＮＡとして活動し、また、別のあるものは、前述した二つのものに対してアンチセンスＲＮＡとなる、そのような複数のＲＮＡを発現する、安定にトラスフェクトされた細胞系統を生成することが可能である。このような複数のＲＮＡとしては、リボソームＲＮＡのような構造的ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびその他の非ｍＲＮＡが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００５４】
例えば、互いに相互作用を持つと考えられる、１群のタンパクがある場合、対象タンパクの一つ以上を、アンチセンスＲＮＡの細胞発現によって機能的にノックアウトさせた、安定にトランスフェクトされた細胞系統を生成することによって、それらの相互作用を調べることが可能である。次に、細胞中の、残りの対象タンパクの機能を調べることが、しかもより興味深く調べることが可能となる。すなわち、今度は、残りの、一つ以上の対象タンパクを過剰発現するようにさらに操作して細胞を変えることが可能である。このような一連の思考を無限に進めることが可能であり、これによって、細胞においてさらに別のタンパクを発現させたり、または、その発現を取り除いたりすることが可能となる。
【００５５】
前述の方法は、組織培養で維持が可能な哺乳類細胞およびその他の細胞に関する科学を、従来不可能であった多数の遺伝的操作を可能とするように変質させる。初めて、ヒト細胞において機能的ノックアウトを生成すること、さらにヒト細胞にタンパクを過剰発現させることも可能になった。この場合も、ある種のタンパクを過剰発現すること、または、ある種のタンパクを機能的にノックアウトすることは、細胞にとって致命的な可能性がある。これは、下記で向き合う問題である。
【００５６】
１２．トランスジェニックマウスの生成。  目的によっては、培養細胞の研究では十分ではないことがある。しかしながら、前述の方法論は、胚幹細胞の操作にも応用される。前述の処理過程を順守することによって、複数のタンパクを発現する、あるいは、複数のタンパクを、または、複数のタンパクからなる選択的スプライシング形態のサブセットを機能的にノックアウトさせた胚幹細胞を入手することが可能である。次に、この胚幹細胞を、ノックアウト動物の形成基盤として利用する。ノックアウト動物を形成するという試みを実行する前に、この処理過程を用いてその実験が致死的表現形をもたらすかどうかが判断される。例えば、必須タンパクが、胚幹細胞において機能的にノックアウトされた場合、その細胞は、ＦＡＣＳによる単離後生存することができない。
【００５７】
１３．誘導可能な、安定にトランスフェクトされた細胞系統を生成すること。  細胞において、ある種のタンパクまたはＲＮＡの過剰発現または発現不足が致命的となる場合がある。それでいて、有害なタンパクまたはＲＮＡを過剰発現する細胞、または、それなしでは生存できないタンパクまたはＲＮＡを機能的にノックアウトさせた細胞を調べることが、決定的に重要である場合がある。この目的のために、安定にトランスフェクトされた細胞であって、その細胞では、細胞に対して有害な作用を持つ選択されたＲＮＡは誘導可能なプロモーターの制御下にある、そのような細胞を生成する。このような細胞系統を単離するには、トランスフェクトされ、薬剤選択された細胞に、先ず、極小の誘導を施し、誘導性遺伝子の転写に影響を及ぼし、次に、適当なＲＮＡを認識するように設計された分子ビーコンをその細胞にトランスフェクトさせた後に、ＦＡＣＳ分析を行う。得られた細胞は、有毒なＲＮＡが誘導されず、必要な時にのみ転写されるようにして維持される。
【００５８】
誘導システムは、有毒ＲＮＡの発現以外の用途にも好都合である。例えば、細胞中に安定的にトランスフェクトされた遺伝子配列の発現を、同期化された細胞系統の細胞サイクルのある時点で誘導する。別態様として、１組の、一つ以上の、安定にトランスフェクトされた遺伝子配列の発現産物が、別の組の発現産物に作用を及ぼすことが想定される場合、第１の組の遺伝子配列を、一つの誘導性プロモーターの制御下にクローンし、かつ、第２の組のものを、第２の誘導性プロモーターの制御下にクローンしたならば興味深いものがある。誘導を変えることによって、どちらかの組の遺伝子配列によってコードされる発現産物が、もう一方の組の発現産物の不在下に、または、存在下に調べられる。
【００５９】
１４．生細胞における遺伝子組み換え事象の検出、および、それに続く、組み換えされない、または、様々に組み換えされた細胞の単離。  安定な細胞系統の生産につながる、組み換え事象検出のための分子ビーコンの使用と平行して、様々の生細胞の混合物から、別様の、特異的組み換え事象を経験した細胞を検出・単離するためにビーコンが使用される。同じ原理を、例えば、ＶＤＪ組み換え、転位、および、ウィルスゲノム取り込みのアッセイに使用することが可能である。
【００６０】
細胞の組み換え事象では、例えば、ゲノムＤＮＡの一つの配列が別物と交換される。組み換え事象の起こった領域をコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写された場合、このような事象の存在は、組み換えされないＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ、または、組み換え配列から転写されるＲＮＡを認識するように設計された分子ビーコンによって検出される。このアッセイは、蛍光顕微鏡によっても実行される。組み換えられた細胞と、組み換えを受けていない細胞とを互いに分離したい場合には、これらの細胞をＦＡＣＳに適用して、仕分ける。さらに、ＦＡＣＳを用いて、細胞における多数の組み換え事象の有無に基づいて細胞を仕分ける。
【００６１】
１５．発現ＲＮＡに基づく細胞の仕分け。  本明細書に前述した分子ビーコンの使用法によって、内部局在のタンパクの発現に基づいてばかりでなく、抗体を形成させることができないようなタンパクに基づいて細胞を仕分けることが可能となる。例えば、様々な細胞からなる混合集団から出発して、対象内部性タンパクを発現する細胞が、そのタンパクをもたらすｍＲＮＡを認識する分子ビーコンを設計することによって単離される。この分子ビーコンを、前記細胞混合物にトランスフェクトさせ、ＦＡＣＳを用いて細胞を適当に仕分けする。仕分けを複数回実施してもよい。
【００６２】
さらに、研究者は、例えば、サイトカインで刺激されて、一つ以上の特異的タンパクを発現するように誘導される細胞を、同様のやり方によって誘導されない細胞から分離することに興味を覚える場合がある。このために、先ず、細胞混合物をサイトカインで誘導し、次に、複数のビーコンであって、それぞれが、対象タンパクの内の一つをもたらすｍＲＮＡを認識するように設計されたビーコンによってトランスフェクトする。次に、ＦＡＣＳを用いて、対象ｍＲＮＡに対してプラスの得点を挙げた細胞を単離する。別の実施態様では、例えば、ウィルスに感染された細胞が、ある特定の遺伝子の発現の有無に関してアッセイされる。
【００６３】
本明細書に上述された方法論を用いて、様々の役割を持つ複数のＲＮＡ、すなわち、あるＲＮＡはタンパクをコードもしないし、アンチセンスＲＮＡとして活動することもしないが、細胞によって発現され、一方、他のあるものはメッセンジャーＲＮＡとして活動し、また、別のあるものは、前述した二つのものに対してアンチセンスＲＮＡとなる、そのような複数のＲＮＡの存在に関して陽性な細胞を検出することが可能である。このような複数のＲＮＡとしては、リボソームＲＮＡのような構造的ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびその他の非ｍＲＮＡが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００６４】
１６．その後の細胞選択と組み合わせた、核酸のインビボ検出。  必要とされる化学的詳細が十分に明らかにされているので、様々のやり方で分子ビーコンを修飾して新しい可能性を生み出すことが可能である。例えば、その発現が、細胞の悪性形質変換をもたらす、ある特異的ｍＲＮＡを発現する細胞は選択的に破壊され、一方、このｍＲＮＡを発現しない細胞は、後述のように大なり小なり放置される。分子ビーコンは、細胞混合物のいくつかにおいて転写される、対象遺伝子に含まれる核酸の特異的配列を認識し、その特異的配列にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドからなるように選択される。このオリゴヌクレオチドは、その一端にはプロテアーゼを、他端には、１分子以上の、プロテアーゼ阻害剤、例えば、ペプチド阻害剤を共有的に結合させる。使用されるこのオリゴヌクレオチドは、分子ビーコンの場合と同様、互いにハイブリダイズすることが可能な両端を持つビーコンを合成させるようなものであることが重要であることに注意されたい。上述の分子がそのステムループ構造を維持している限り、分子の一端のペプチド阻害剤は、他端のプロテアーゼと十分に近接するので、抑制を実行する。議論をやり易くするために、上述の分子をプローブプロテアーゼと呼ぶことにする。
【００６５】
プローブプロテアーゼを、プローブプロテアーゼによって認識されるＲＮＡを発現する細胞にトランスフェクトさせると、このプローブプロテアーゼは、標的にハイブリダイズする。これによってプロテアーゼは活性化される。なぜなら、ハイブリダイズ状態では、プロテアーゼはもはやペプチド阻害剤の近傍にはいないからである。このようなプローブプロテアーゼの標的が存在し、かつ、認識される細胞は破壊され、従って、間引かれる。
【００６６】
さらに、プローブプロテアーゼは、他の各種用途においても有用である。例えば、細胞の内のあるものはある特定のウィルスによって感染される、そのような細胞を含む細胞集団がある場合、特定のウィルス性ｍＲＮＡを標的とするプローブプロテアーゼを細胞中に導入する。そのようなｍＲＮＡを有する細胞は、自らの含むプローブプロテアーゼのタンパク分解活性を活性化し、これによって、この細胞は破壊される。
【００６７】
本明細書に上述された方法論を用いて、様々の役割を持つ複数のＲＮＡ、すなわち、あるＲＮＡはタンパクをコードもしないし、アンチセンスＲＮＡとして活動することもしないが、細胞によって発現され、一方、他のあるものはメッセンジャーＲＮＡとして活動し、また、別のあるものは、前述した二つのものに対してアンチセンスＲＮＡとなる、そのような複数のＲＮＡを発現する、安定にトランスフェクトされた細胞系統を生成することが可能である。
【００６８】
前述の記載に基づいて、下記の方法の実施が可能である。
【００６９】
少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する方法であって、
ａ）前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクと少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとをコードする少なくとも一つのＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つのＤＮＡ構築体と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している工程；
ｃ）選択された細胞を、第１分子ビーコンに曝露し、第１分子ビーコンは、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程；
ｅ）前記単離された細胞を育成することによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクを発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法。
【００７０】
この方法では、蛍光を発する前記細胞の単離は、蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて実行してもよい。細胞系統はさらに、第２のあらかじめ選択されたタンパクを、同時にまたは継時的に、発現するように調製されてもよい。すなわち、追加の工程は、第２のあらかじめ選択されたタンパクと第２の薬剤耐性マーカーとをコードする第２のＤＮＡ構築体によって前記細胞系統をトランスフェクトする工程；前記第２マーカーを発現する細胞を選択する工程；その細胞を、第２のあらかじめ選択されたタンパクのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露する工程；および、前記少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物および第２ｍＲＮＡ転写物それぞれにおいて蛍光を示す細胞を単離する工程を含む。現在、最近の技術では、仕分け過程において、最大３種までの異なるタンパクを検出することが可能であり、今のところ、上記過程を同時に反復することによって、最大３種までの異なるタンパクの発現を実現することが可能である。要すれば、次に、三つの異なるタンパクを発現する細胞系統を、この過程の実行によるさらに沢山のタンパクの導入のための開始点として使用してもよい。
【００７１】
トランスフェクションのために用いられるＤＮＡ構築体は、単一遺伝子と薬剤耐性マーカーとをコードしてもよいし、対応するマーカーを備えたさらに別の遺伝子をコードしていてもよい。前述したように、新たな遺伝子の導入を同時にするか継時的にするかに拘わらず、一時に検出可能な発現メッセージの数は、蛍光技術によって制限される可能性があるが、本法は、さらに多くの遺伝子を加えるよう反復実行することが可能である。最大三つまでの蛍光分子が検出可能である場合、一時に三つの遺伝子を導入することが可能である。
【００７２】
トランスフェクトされる遺伝子と関連するエピトープタグを、分子ビーコンの標的として用いる、関連法が開示される。この方法により、そのｍＲＮＡを背景の中から特定することが困難な場合、例えば、分子ビーコンがごく近接する関連ＲＮＡ分子を検出する場合、そのようなｍＲＮＡによるタンパクを発現する細胞の選択が可能になる。従って、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクを発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、少なくとも一つの第１エピトープタグをコードする少なくとも一つのＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つのＤＮＡ構築体と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している工程；
ｃ）前記細胞を、第１分子ビーコンに曝露し、第１分子ビーコンは、第１エピトープタグのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程；および
ｅ）前記単離された細胞を育成することによって前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクを発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法が提供される。
【００７３】
この方法は、使用される分子ビーコンが、所望の導入タンパクのＲＮＡ転写物ではなく、エピトープタグを認識するように設計されることを除いては、前述のものと事実上同じである。この処理過程が、前述のものに優る利点は、一つ以上のタンパクを発現する、多数の、異なる細胞系統を調製するのに、異なるエピトープタグの数に対応した、ごく少数の分子ビーコンしか要求されない点である。現在、蛍光仕分け技術は、三つの蛍光分子に制限されるので、この方法では僅か三つの異なるビーコンしか必要ではない。もしも技術が今後、さらに多数の蛍光分子の同時検出を可能とするようになった場合には、この必要数も増大させてよい。しかしながら、一時に最大三つまでの導入タンパクの添加が可能である場合であっても、三つの遺伝子を上手くトランスフェクトさせた細胞を、さらに新たな遺伝子添加のための開始点として用いることも可能である。
【００７４】
本発明に使用が可能であり、それに対してビーコンを調製することが可能なエピトープタグの例としては、ＨＡ（インフルエンザヘムアグルチニンタンパク）、ｍｙｃ、ｈｉｓ、プロテインＣ、ＶＳＶ−Ｇ，ＦＬＡＧまたはＦＬＵが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。上記のものおよびその他のエピトープタグも当業者には既知である。本明細書で使用する場合、エピトープタグとは、分子ビーコンで認識される、一意の核酸配列である。この核酸配列が、構築体のコードされたタンパクと読み枠が一致するか否かは、決定的には重要ではない。すなわち、分子ビーコンはいずれの場合でも認識が可能である。従って、エピトープタグ核酸配列を有する転写ＲＮＡは、分子ビーコンによる転写物の検出のためだからといって翻訳される必要はない。
【００７５】
もちろん、前述の方法を用いて、一つを越えるタンパクを細胞に導入してもよい。すなわち、追加の実行工程は、第２のあらかじめ選択されたタンパク、第２薬剤耐性マーカー、および、第２エピトープタグをコードする第２のＤＮＡ構築体で細胞系統を同時に、または、継時的にトランスフェクトすること；前記細胞を、前記第２エピトープタグのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、前記第１および第２エピトープタグそれぞれの蛍光を示す前記細胞を単離すること、を含む。第２エピトープタグは、前記第２タンパクをコードするＤＮＡ配列の部分と読み枠が一致していても、一致していなくともよい。
【００７６】
上手くトランスフェクトされた細胞の選択は、標準法によって実行される。すなわち、それに対抗するように薬剤耐性マーカーが供給される、そのような薬剤の存在下に細胞を育成することである。選択が二つの異なるマーカーについて行われる場合は、細胞は、同時にでも、継時的にでも選択が可能である。二つの異なるトラスフェクトされた構築体に対して同じ薬剤耐性マーカーを使用している場合には、両構築体によってトランスフェクトされた細胞を選出するには、用量作用を考慮して、高い方の薬剤濃度が必要とされる。
【００７７】
一つ以上のタンパクを発現する細胞系統を調製するための前述の方法は、一つ以上のアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞系統を生成する方法に簡単に応用が可能である。その方法は、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードするＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトすること；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つのＤＮＡ構築体と、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写していること；
ｃ）前記アンチセンスＲＮＡ分子にハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに、前記細胞を曝露すること；
ｄ）蛍光を発する前記細胞を単離すること；および
ｅ）前記単離された細胞を育成することによって前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクを発現する細胞系統を生成すること、
を含む。
【００７８】
これらの方法の全ての詳細は前述した通りである。ビーコンが特定のｍＲＮＡを検出できない場合には、エピトープタグ法を用いてもよい。すなわち、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、第１エピトープタグヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトすること；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択すること、この時前記細胞は少なくとも一つのＤＮＡ構築体と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写しており；
ｃ）前記選択された細胞を、前記第１エピトープタグのｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露すること；
ｄ）蛍光を発する前記細胞を単離すること；および、
ｅ）単離された前記細胞を育成することによってあらかじめ選択された少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞系統を生成することである。
【００７９】
既述のように、エピトープタグ検出法の利点は、各アンチセンスＲＮＡに対して別々のビーコンを調製する必要がないことである。ビーコンはごく少数のエピトープタグに対して必要であるだけで、これらのタグは、多数のアンチセンス分子を、または、１分子の過剰発現を細胞系統に導入する順次工程において使用が可能である。もちろん、前記方法は、任意の細胞系統に二つ以上のアンチセンスＲＮＡ分子を導入するために、同時にまたは継時的に繰り返してもよい。
【００８０】
さらに、ある特定の一つのタンパクまたは複数のタンパクを発現するように仕向けられた細胞を、複数のタンパクおよびアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞を作成するための開始点として用いてもよい。もちろんこの複数のアンチセンス分子を発現する細胞は、本明細書の方法を用いて発現タンパクを加えるための開始点として用いることも可能である。対応するビーコンと、またもし要すればエピトープタグと一緒に、タンパクとアンチセンス分子の同時トランスフェクションを実行してもよい。前述の過程の各種組み合わせも本明細書の中に包摂される。
【００８１】
同様に、少なくとも一つのタンパク質を発現する細胞を単離するための方法であって、
ａ）前記少なくとも一つのタンパクを発現することが予想される細胞を供給する工程；
ｂ）前記少なくとも一つのタンパクをコードするｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程；
ｃ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程、
を含む方法が提供される。
【００８２】
この方法は、細胞表面局在タンパクまたは細胞内タンパクであるタンパクに対して有用である。この方法は、タンパク自体に対するプローブの使用を必要としないが、プローブはより難しく、あるいは、それ以上の実験が不可能となるほどに細胞を冒すことがある。複数の分子ビーコンを用いて、最大、単離のために使用される技術で同時検出可能な数まで、一つ以上のタンパクの特定が可能である。
【００８３】
もちろん、前述の過程を用いて、生物学的サンプルにおける少なくとも一つのＲＮＡ転写発現のレベルを定量することが可能であって、その過程は、
ａ）その生物学的サンプルを、前記ＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露する工程；
ｂ）生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程；および、
ｃ）蛍光レベルを、少なくとも一つのＲＮＡ転写物の前記レベルと相関させる工程、
を含む。
【００８４】
生物学的サンプルは細胞サンプルまたは組織サンプルであってもよい。これらは、例えば、フォルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、または、分子ビーコンによるＲＮＡの検出を妨げないものである限り、任意の数の既知の細胞固定剤によって固定されてよい。
【００８５】
検出されたＲＮＡ転写物は、タンパク、構造ＲＮＡ、および、アンチセンスＲＮＡをコードするＲＮＡであってよい。蛍光は、蛍光顕微鏡検査、または、蛍光活性化細胞ソーター技術によって定量化されてもよい。さらに別のＲＮＡ分子を、第２ＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンを用いて同時に定量してもよい。
【００８６】
前記方法の別の用法として、少なくとも一つのタンパクを過剰発現する細胞系統を生成する方法が提供される。これは、同じタンパクをコードする二つ以上の配列によって細胞をトランスフェクトし、かつ、転写物の別々のコピーと関連するエピトープタグによって発現を特定することによって実現される。この工程は、
ａ）少なくとも二つのＤＮＡ配列であって、前記配列はそれぞれ、前記タンパク、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、同じタンパク、少なくとも一つの第２エピトープタグ、および、少なくとも一つの第２薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、そのような少なくとも二つのＤＮＡ配列によって細胞をトランスフェクトすること；
ｂ）第１および第２薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞を選択すること；
ｃ）選択された細胞を第１および第２分子ビーコンに曝露すること、ここに、それらの分子ビーコンは、それぞれ、前記第１および第２エピトープタグのＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとし；
ｄ）前記第１および第２分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離すること；および、
ｅ）単離した細胞を育成することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を過剰発現する細胞系統を生成すること、
を含む。
【００８７】
既述のように、遺伝子の各コピーに対して同じ薬剤耐性マーカーを用いた場合、両配列によってトランスフェクトされた細胞を選出するには、高い方の薬剤レベルが必要とされる可能性がある。前記の方法の場合と同様に、その少なくとも二つのＤＮＡ配列は、同じ構築体に局在していてもよい。第１および第２エピトープタグは、それぞれ独立に、前記タンパクと読み枠が一致していても、一致していなくともよい。
【００８８】
前述の過程は、少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ分子を過剰発現する細胞の生成に簡単に運用することが可能である。その方法は、
ａ）少なくとも二つのＤＮＡ配列であって、その配列は、前記アンチセンスＲＮＡ分子、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、前記アンチセンスＲＮＡ、少なくとも一つの第２エピトープタグ、および、少なくとも一つの第２薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、そのような少なくとも二つのＤＮＡ配列によって細胞をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記第１および第２薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
ｃ）前記選択された細胞を第１および第２分子ビーコンに曝露し、各分子ビーコンは、それぞれ、前記第１および第２エピトープタグのＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）前記第１および第２分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程；および、
ｅ）前記単離した細胞を育成することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を過剰発現する細胞系統を生成する工程、
を含む。
【００８９】
詳細は前述したものと同様である。
【００９０】
細胞にアンチセンスＲＮＡ分子を導入することは、細胞から一つ以上のタンパクを機能的に除去するのに有用である。前述の方法に従って、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の発現に対して機能的にゼロである細胞を生成する方法であって、前記細胞において、前記あらかじめ選択されたタンパクに対し、複数のアンチセンスＲＮＡを供給する工程を含み、各アンチセンスＲＮＡは前述の方法に従って供給され、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクに対する前記複数のアンチセンスＲＮＡは、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクの事実上全てのｍＲＮＡ転写物に結合することを特徴とする方法が提供される。このあらかじめ選択されたタンパクは、一つの遺伝子産物の、選択的スプライシング形であってもよい。同様の線に沿って、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクに関して機能的にゼロ発現性突然変異であるトランスジェニック動物を生成するための方法であって、胚幹細胞を用いて前述の工程を実行すること、前記あらかじめ選択されたタンパクを機能的にゼロ発現する前記胚幹細胞の生存率を定量すること、および、前記生存胚幹細胞を用いて前記トランスジェニック動物を生産することを含む方法が提供される。
【００９１】
同様に、少なくとも一つのタンパク質については機能的にゼロ発現し、少なくとも一つの別のタンパク質については過剰発現する細胞系統を生成する方法であって、本明細書で前述した方法を、同じ細胞に実行することを含む方法が提供される。同様に、トランスフェクション工程を、極少量のインデューサーの存在下に実行することによって、誘発可能なプロモーターの制御下に致死的アンチセンスＲＮＡを発現する細胞系統を生成する方法が提供される。
【００９２】
生細胞において遺伝子組み換え事象を特定するための方法であって、
ａ）組み換え配列から転写されたＲＮＡ配列と非組み換え配列から転写されたＲＮＡ配列とからなる群から選ばれるＲＮＡ配列とハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに細胞を曝露する工程；
ｂ）前記ＲＮＡ配列を発現する前記細胞を検出する工程、
を含む方法が提供される。
【００９３】
本発明はまた、新しい形態の分子ビーコンに向けられる。このビーコンは、標的核酸に結合する従来技術による分子ビーコンによって示される蛍光性とは異なり、同じ結合によってタンパク分解活性を示す。このタンパク分解活性は検出目的に使用可能であるばかりでなく、そのタンパクをコードするｍＲＮＡが細胞中に存在する限り、細胞中の特定のタンパク配列を変性させるのに使用が可能である。例えば、ウィルスタンパクを特異的に分断するプロテアーゼが、潜伏感染の場合のようにウィルスの転写が活性化されると、活性化される可能性がある。
【００９４】
阻害剤との相互作用によって酵素の可逆的抑制を実現するために、タンパク分解酵素阻害剤はペプチドであることが好ましいが、ただし、金属および金属キレート剤を含むその他の分子も同様に有用である。タンパク分解酵素およびタンパク分解酵素阻害剤の有効なペアの例としては、アミノペプチダーゼとアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼとアンチパイン、アミノペプチダーゼとベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼとキモスタチン、アミノペプチダーゼとジプロチンＡまたはＢ、カルボキシペプチダーゼＡとＥＤＴＡ、エラスターゼ様セリンプロテアーゼとエラスチナール、および、テルモリシンまたはアミノペプチダーゼＭと１，１０−フェナントロリンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００９５】
本発明は、本発明の例示のために提供される、下記の、非限定的実施例を参照することによってさらによく理解されよう。下記の実施例は、本発明のより好ましい実施態様をより十分に具体的に示すために提示されるものである。これらの実施例を、どのようなやり方でも本発明の広範な範囲を限定するものと思量してはならない。
【実施例】
【００９６】
実施例１
全体プロトコール。開始材料：分子ビーコンは、プラスミド由来のＲＮＡを全く発現しない細胞に導入されるかも知れないし、プラスミドでコードされたＲＮＡメッセージを検出するのに使用されるかも知れない。ビーコンを、これら２種類の細胞に導入する方法は同一である。下記のプロトコールの要求する条件は、分析される細胞は互いに分離可能であり、その分離はＦＡＣＳ分析によって実現可能であるということだけである。
【００９７】
１）本発明の説明にさらに詳細に記述されているように、組織細胞を、細胞内における、特定ＲＮＡの発現または発現欠如に基づいて仕分けるために、ビーコンをＦＡＣＳと組み合わせて用いることが可能である。このためには、細胞を先ず、ホモジェニゼーションおよびその後の化学的処理のような、標準的で確立された方法によって分離しなければならない。次に、適当なビーコンを、下記のプロトコールに従って、この細胞に導入することが可能になる。
【００９８】
２）第二に、細胞集団にトランスフェクトさせたプラスミドによってコードされる特定のＲＮＡを発現する細胞を選出するためにビーコンを使用することが可能になる。このためには、先ず、所望のＲＮＡをコードする単一の、または、複数のプラスミドを培養細胞にトランスフェクトさせなければならない。次に、本発明の説明においてさらに詳細に記述されているように、これらのＲＮＡを認識するビーコンが作成される。プラスミドの細胞へのトランスフェクションは、所有の試薬を用いて、または、生化学会社（Ｑｉａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇｅｎｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ等）から入手したキットをメーカーの指示に従って用いて、多種多様な方法で実現が可能である。プラスミドは、それぞれが一つの抗生物質に対する耐性を付与するように選ばなければならない。これらのプラスミドを細胞に導入し、細胞の回復のために短時間（通常２４時間）置いた後、細胞を適当な抗生物質に曝露し、プラスミドによって抗生物質耐性を与えられた細胞のみが生き延びられるようにする。これは、細胞の種類および使用される抗生物質の両方に左右されるが、一般的に３から４日を要する。
【００９９】
結果として、ある一塊の細胞が残存するが、これらは全て抗生物質に対して耐性を示すものの、そのほんの小部分しか対象ＲＮＡを発現しない。所望のＲＮＡを発現する細胞を選出するために、下記のプロトコールを守ってもよい。
【０１００】
実施例２
ビーコンによる細胞の選択
１）ビーコンを細胞にトランスフェクトさせる。ビーコンは、所望のＲＮＡに内在する配列にハイブリダイズすることによって、または、元のＲＮＡに添加されたタグにハイブリダイズすることによって、その所望のＲＮＡを認識するように設計されていなければならない。ビーコンの設計は、本発明の説明において詳細に論じられている。
【０１０１】
トランスフェクションは、プラスミドの細胞に対するトランスフェクションと同様、多種多様な方法によって実行が可能である。採用する方法は、使用する細胞タイプに基づいて選択しなければならない。なぜなら、細胞によって、よりよく反応するトランスフェクション法が異なるからである。トランスフェクションは、使用するトランスフェクション試薬のメーカーの指示に従って実行するべきである。
【０１０２】
細胞に対するビーコンのトランスフェクションは、使用するトランスフェクション試薬に応じて、懸濁細胞で行っても、固相表面で成長する細胞で行ってもよい。
【０１０３】
２）ビーコンの細胞に対するトランスフェクションの後、細胞に対してＦＡＣＳ分析を施す。ＦＡＣＳは、使用した複数のビーコンの内の任意の一つ以上に対して陽性の細胞を選出するのに用いることが可能である。ＦＡＣＳはまた、ビーコン信号の特異性に基づいて細胞を仕分けるのに使用することも可能であり、これによって、研究者は、様々な程度でＲＮＡを発現する細胞を選択することが可能となる。
【０１０４】
実施例３
一つ以上のＲＮＡを発現する細胞系統の生成
ＦＡＣＳ選択の後、プラスの得点を挙げた細胞を、本発明の説明においてさらに詳細に記述されるように、適当な培養液中に維持することが可能である。この細胞は、対象ＲＮＡを発現する細胞系統を形成する。
【０１０５】
ビーコンの濃度：使用されるビーコンの濃度は、いくつかの要因に左右される。例えば、細胞内における、検出されるＲＮＡの量、および、このＲＮＡとビーコンとの接触機会を考慮しなければならない。例えば、検出されるＲＮＡがごく少量しか存在しない場合、または、そのＲＮＡが、ＲＮＡの３次元折り畳みによって簡単には接触機会の無いＲＮＡ部分の中に存在する場合は、検出されるＲＮＡが多量にある場合、および、ビーコンによって認識される部位が完全に接触可能な場合と比べて、より多量のビーコンを用いなければならない。使用されるビーコンの正確な量は、各用途毎に経験的に決められなければならない。
【０１０６】
このことは、様々な量のビーコンを、様々なグループの細胞に導入し、背景の蛍光が低度で、かつ、信号が高度である条件（細胞の内の全てがではなく、細胞の内のあるものだけが、そのビーコンに対してプラスを得点する条件）を選択することによって実現が可能である。
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月26日(2004.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年6月9日(2005.6.9)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、１９９９年１１月２３日出願の仮出願第６０／１６６，９８７号に対する優先権を主張する。なお、この出願の全体を引用することにより本明細書に含める。
【０００２】
発明の背景
分子ビーコンは、ある特定の核酸配列の存在を認識し伝える核酸プローブである。このプローブは、標的配列に相補的なヌクレオチドの中央直線部と、短い相互に相補的な配列を含む末端部を備えるヘアピン型配列である。一方の末端はフルオロフォアに共有的に結合し、他方の末端は消光基に共有的に結合する。ハイブリダイズした末端を有する天然の状態である場合には、フルオロフォアと消光分子の近接性は、蛍光が全く発せられない程度のものとなっている。このビーコンは、標的核酸にハイブリダイズした場合に、自然に蛍光発光性の立体構造変化を受ける。例えば、米国特許第５，９２５，５１７号を参照されたい。
【０００３】
この性質により、研究者達は、主にインビトロ反応において、ある場合には生細胞においても特定の核酸を検出することが可能になった。リポソーム中の生細胞に輸送された分子ビーコンを用いて、メッセンジャーＲＮＡの生体内視覚化が実現された（Ｍａｔｓｕｏ，１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３７９：１７８−１８４）。これまでのところ細胞を扱う研究は、極めて弱いフルオロフォアＥＤＡＮＳによって発生されるビーコンを用いていた。なぜなら、この分子が、消光分子ＥＤＡＣによって消光されるものとして知られている唯一のものだったからである。その結果は、識別はつくもののかろうじてできるという体のもので、この方向の研究をインビボ検出へ応用することは有望ではなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の大要
一つの局面では、本発明は、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する方法であって、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとをコードする少なくとも一つのＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程；
ｃ）選択された細胞を、第１分子ビーコンに曝露し、第１分子ビーコンは、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）蛍光を発する細胞を単離する工程；
ｅ）単離された細胞を培養することによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法に向けられる。
【０００５】
前述の方法は、蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて実行することが可能である。さらに別の局面では、細胞系統は、第２のあらかじめ選択されたタンパク質を発現するように仕向けることも可能である。すなわち、第２のあらかじめ選択されたタンパク質と第２の薬剤耐性マーカーとをコードする第２のＤＮＡ構築体によって前記細胞系統をトランスフェクトすること；第２マーカーを発現する細胞を選択すること；その細胞を、第２のあらかじめ選択されたタンパク質のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物および第２ｍＲＮＡ転写物それぞれにおいて蛍光を示す細胞を単離する工程をさらに実行する。前記工程を繰り返すことによって、二つを越えるタンパク質を発現する細胞系統を供給することも可能である。第２タンパク質を導入する方法は同時にまたは継時的に実行してもよい。第１および第２薬剤耐性マーカーが同じである場合は、同時選択は、薬剤濃度を増すことによって実現が可能である。
【０００６】
本発明の別の局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、少なくとも一つの第１エピトープタグをコードする少なくとも一つのＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程；
ｃ）選択された細胞を、第１分子ビーコンに曝露し、第１分子ビーコンは、第１エピトープタグのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）蛍光を発する細胞を単離する工程；および
ｅ）単離された細胞を培養することによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法が提供される。
【０００７】
前述の方法は、蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて実行することが可能である。エピトープタグをコードする構築体のＤＮＡ部分は、前記少なくとも一つのタンパク質をコードするＤＮＡ構築体部分を含むフレーム内であってもその外であってもよい。さらに別の実施態様では、細胞系統は、少なくとも第２のあらかじめ選択されたタンパク質を発現するように仕向けることも可能である。すなわち、その工程は、第２のあらかじめ選択されたタンパク質、第２の薬剤耐性マーカー、および、第２のエピトープタグをコードする第２のＤＮＡ構築体によって前記細胞系統をトランスフェクトすること；第２マーカーを転写する細胞を選択すること；その細胞を、第２エピトープタグのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、第１および第２エピトープタグそれぞれの蛍光を示す細胞を単離することをさらに含む。二種のタンパク質の場合、第２エピトープタグをコードするＤＮＡ配列の部分は、第２タンパク質をコードするＤＮＡ配列部分のフレーム内であってもその外であってもよい。第２のあらかじめ選択されたタンパク質は、第１のものと同時にまたは継時的にトランスフェクトされてもよい。本法を同時に実行し、かつ、両方の構築体に同じ薬剤耐性マーカーを使用する場合、薬剤の高い方の濃度を用いて、両構築体を発現する細胞を選択することが可能である。さらに、前述の工程を反復することによって細胞系統中に二つを越えるタンパク質を供給することが可能である。
【０００８】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子および少なくとも一つの薬剤耐性遺伝子をコードするＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程；
ｃ）細胞を、アンチセンスＲＮＡ分子にハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに曝露する工程；
ｄ）蛍光を発する細胞を単離する工程；および、
ｅ）単離された細胞を培養することによってあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ配列を発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法が提供される。
【０００９】
蛍光を発する細胞の単離は、蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて実行することが可能である。この細胞系統は、少なくとも一つの第２のあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡを発現するように仕向けることも可能である。すなわち、その工程は、第２のあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子と第２の薬剤耐性マーカーとをコードする第２のＤＮＡ構築体によって細胞系統を同時にまたは継時的にトランスフェクトすること；第２マーカーを発現する細胞を選択すること；その細胞を、第２アンチセンスＲＮＡ分子にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物および第２ｍＲＮＡ転写物それぞれの蛍光を示す細胞を単離することをさらに含む。方法を同時に実行し、かつ、両構築体に同じ薬剤耐性マーカーを使用する場合、選択は高い方の薬剤濃度を用いることによって実現が可能である。前述の工程を別の構築体と共に反復することによって二つを越えるアンチセンスＲＮＡ分子を供給することが可能である。
【００１０】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、第１エピトープタグヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程；
ｃ）選択された細胞を、第１エピトープタグのｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露する工程；
ｄ）蛍光を発する細胞を単離する工程；
ｅ）単離された細胞を培養することによってあらかじめ選択された少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法が提供される。
【００１１】
この細胞系統は、少なくとも一つの第２のあらかじめ選択された、エピトープタグ付きアンチセンスＲＮＡを発現するように仕向けることも可能である。すなわち、その工程は、第２のあらかじめ選択された、エピトープタグ付きアンチセンスＲＮＡ分子と第２の薬剤耐性マーカーとをコードする第２のＤＮＡ構築体によって前記細胞系統をトランスフェクトすること；第２マーカーを発現する細胞を選択すること；その細胞を、第２エピトープタグのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物および第２ｍＲＮＡ転写物の両方の蛍光を示す細胞を単離することをさらに含む。これらの工程は、第１のものと同時にまたは継時的に実行してもよい。同じ薬剤耐性マーカーを持つ両構築体に基づく同時トランスフェクションによる選択は、薬剤の高い方の濃度を用いて実行することが可能である。追加工程を実行して二つを越えるエピトープタグ付きアンチセンス分子を導入することが可能である。
【００１２】
前述の方法は、アンチセンスＲＮＡ分子、または、ｒＲＮＡの他にｈｎＲＮＡおよびｓｎＲＮＡを含めた構造的ＲＮＡ−ただしそれらに限定されない−を含む全てのタイプのＲＮＡ分子を発現する細胞を調製するのに使用することが可能である。さらに、注意しなければならないことは、トランスフェクトされた構築体の分子ビーコンによる検出のためにエピトープタグが供給されている方法の全てにおいて、エピトープタグ配列が分子ビーコンによって検出可能である限り、エピトープタグが、コードされたタンパク質のフレーム内であるかその外であるかは、重要ではないことである。
【００１３】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのタンパク質またはＲＮＡを発現する細胞を単離するための方法であって、
ａ）少なくとも一つのタンパク質を発現することが予想される細胞を供給する工程；
ｂ）その少なくとも一つのタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程；
ｃ）蛍光を発する細胞を単離する工程、
を含む方法が提供される。
【００１４】
蛍光を発する細胞を単離するには蛍光活性化細胞ソーター技術を用いることが可能である。非限定的例として挙げるのであるが、このタンパク質は、細胞表面の局在タンパク質であっても、または、細胞内タンパク質であってもよい。他にも任意のＲＮＡの検出が可能である。この方法はまた、第２タンパク質またはＲＮＡを発現する細胞を特定するのに使用することが可能である。すなわち、標的ＲＮＡとハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに細胞を曝露させ、第１と第２分子ビーコンのそれぞれの蛍光を有する細胞を単離する。二つを越えるタンパク質の同時発現も実現可能である。
【００１５】
本発明はまた、生物学的サンプルにおける少なくとも一つのＲＮＡ転写発現物のレベルを定量するための方法であって、
ａ）その生物学的サンプルを、前記ＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露する工程；
ｂ）生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程；および、
ｃ）蛍光レベルを、前記少なくとも一つのＲＮＡ転写物のレベルと相関させる工程、
を含む方法に向けられる。
【００１６】
この生物学的サンプルは、細胞サンプルまたは組織サンプルであってもよい。このサンプルは固定されていてもよい。このＲＮＡ転写物は、タンパク質をコードするＲＮＡ、構造的ＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡであってもよいが、ただしそれらに限定されない。蛍光は、蛍光顕微鏡検査または蛍光活性化細胞ソーター技術によって定量することが可能である。その生物学的サンプルにおける、少なくとも一つの第２ＲＮＡ転写発現のレベルを、その第２のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンを用いて定量化することも可能である。
【００１７】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのタンパク質を過剰発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも二つのＤＮＡ配列であって、一方の配列は、前記タンパク質、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、第２配列は、前記タンパク質、少なくとも一つの第２エピトープタグ、および、少なくとも一つの第２薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、そのような少なくとも二つのＤＮＡ配列によって細胞をトランスフェクトする工程；
ｂ）第１および第２薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
ｃ）選択された細胞を第１および第２分子ビーコンに曝露し、それらの分子ビーコンは、それぞれ、第１および第２エピトープタグのＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）第１および第２分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程；および、
ｅ）単離した細胞を培養することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を過剰発現する細胞系統を生成する工程、
を含む方法が提供される。
【００１８】
本発明の前述の局面では、少なくとも二つのＤＮＡ配列は同じ構築体の上に局在してもよい。第１および第２エピトープタグは、それぞれ独立に、前記タンパク質のフレーム内であってもその外であってもよい。ＦＡＣＳを用い、もっとも強い蛍光を発現する細胞を単離することによって、両構築体を発現する細胞を単離することが可能である。本明細書に前述した方法と同様、トランスフェクションは同時に、または、継時的に実行してもよい。同じ薬剤耐性マーカーが両構築体中に存在しており、かつ、同時トランスフェクションを行う場合、選択は薬剤レベルを増すことによって実現が可能である。
【００１９】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ分子を過剰発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）少なくとも二つのＤＮＡ配列であって、一方の配列は、前記タンパク質、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、第２配列は、前記タンパク質、少なくとも一つの第２エピトープタグ、および、少なくとも一つの第２薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、そのような二つのＤＮＡ配列によって細胞をトランスフェクトする工程；
ｂ）第１および第２薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
ｃ）選択された細胞を第１および第２分子ビーコンに曝露し、それらの分子ビーコンは、それぞれ、第１および第２エピトープタグのＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程；
ｄ）第１および第２分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程；および、
ｅ）単離した細胞を培養することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子を過剰発現する細胞系統を生成する工程、
を含む方法が提供される。
【００２０】
前記少なくとも二つのＤＮＡ配列は同じ構築体の上に局在してもよい。第１および第２エピトープタグは、それぞれ独立に、前記アンチセンスＲＮＡ分子のフレーム内であってもその外であってもよい。所望の産物を実現するための条件および別法は前述した通りである。さらに、どのような形のＲＮＡを供給してもよい。
【００２１】
本発明の別局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質またはＲＮＡの発現に対して機能的にゼロである細胞を生成する方法であって、細胞において、前記あらかじめ選択されたタンパク質またはＲＮＡに対し、複数のアンチセンスＲＮＡを供給し、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質またはＲＮＡに対する複数のアンチセンスＲＮＡが、ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡからなる事実上全てのＲＮＡ転写物に結合し、除去されることからなる工程を含む方法が提供される。あるあらかじめ選択されたタンパク質に対して細胞をゼロとする場合、そのあらかじめ選択されるタンパク質は、特異的な唯一のタンパク質であってもよいし、あるいは、ある遺伝子産物の、別様にスプライスされた複数の形態からなるサブセットであってもよい。
【００２２】
本発明のさらに別の局面では、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質について機能的ゼロ発現突然変異種であるトランスジェニック動物を生成する方法であって、前述の工程を胚幹細胞を用いて実行すること、前記あらかじめ選択されたタンパク質を機能的にゼロ発現する幹細胞の生存率を定量すること、および、生存胚幹細胞を用いてトランスジェニック動物を生成することを含む方法が提供される。
【００２３】
さらに、少なくとも一つのタンパク質については機能的にゼロ発現し、少なくとも一つの別のタンパク質については過剰発現する細胞系統を生成する方法であって、本明細書で前述した方法を、同じ細胞に実行することを含む方法が提供される。さらに、前述の方法を実行し、その際工程（ａ）を極少量のインデューサーの存在下に実行することによって、誘発可能なプロモーターの制御下に致死的アンチセンスＲＮＡを発現する細胞系統を生成する方法が提供される。
【００２４】
生細胞において遺伝子組み換え事象を同定するための方法であって、
ａ）組み換え配列から転写されたＲＮＡ配列と非組み換え配列から転写されたＲＮＡ配列とからなる群から選ばれるＲＮＡ配列とハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに細胞を曝露する工程；
ｂ）前記細胞を検出または選択抽出する工程、
を含む方法である。
【００２５】
前記細胞の検出および／または選択抽出は、ＦＡＣＳまたは顕微鏡によって実行が可能である。
【００２６】
別局面では、本発明は、本明細書ではプローブプロテアーゼと呼ぶ、タンパク分解活性を生成させる単一ハイブリダイゼーションプローブに向けられる。このプローブプロテアーゼは分子ビーコンと同様に働くが、分子ビーコンが標的核酸配列と相互作用を持つと発する蛍光変化ではなく、このプロテアーゼは、標的の存在下でタンパク分解性を帯びる。プローブプロテアーゼ組成物は、分子ビーコンタイプのオリゴヌクレオチドの一端にプロテアーゼを、他端に、相補的なプロテアーゼ阻害剤を設ける。このオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズしていない場合は、オリゴヌクレオチドの両端が近接しているために、プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤とは相互作用を持つことが可能となり、プロテアーゼのタンパク分解活性を抑制する。しかしながら、オリゴヌクレオチドの標的配列が標的にハイブリダイズすると、プロテアーゼとその阻害剤は分離されて、プロテアーゼを活性化する。このプロテアーゼの活性化は簡単に測定が可能であり、さらに、ある特定の核酸標的配列の存在下で活性を有するプロテアーゼは、検出目的ばかりでなく、治療目的のためにも使用が可能である。すなわち、治療目的の場合、例えば、ある特定の遺伝子、例えば、細胞の形質転換、発ガン性、異常増殖等に関連する遺伝子が転写された場合、プローブプロテアーゼが送り込まれた細胞はタンパク分解され、生きられなくなる。
【００２７】
前述のプローブは、タンパク分解酵素を可逆的に不活性化することが可能なペプチドまたは別の分子であるタンパク分解酵素阻害剤を有していてもよい。酵素および阻害剤の、非限定的例としては、アミノペプチダーゼとアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼとアンチパイン、アミノペプチダーゼとベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼとキモスタチン、アミノペプチダーゼとジプロチンＡまたはＢ、カルボキシペプチダーゼＡとＥＤＴＡ、エラスターゼ様セリンプロテアーゼとエラスチナール、および、テルモリシンまたはアミノペプチダーゼＭと１，１０−フェナントリンが挙げられる。
【００２８】
本発明の上記局面およびその他の局面は、下記の詳細な説明から理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本明細書の発明は、分子プローブが、生細胞においてＲＮＡ配列の同定を可能とする能力と、一つ以上の波長において蛍光のある特定のレベル（単数または複数）を示す細胞を同定および／または分離する蛍光細胞ソーターまたは関連技術の使用に基づく。ＥＤＡＣが、通常使用される各種最強蛍光分子の発光を抑止可能であることは今では既知である。生細胞においてｍＲＮＡのみならずその他のＲＮＡをも安定的にかつ効率的に検出することが可能になったということは、所望の特性に基づいて、例えば、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を用いて、細胞を同定するために、要すればそのような細胞を分離するためにそれらのＲＮＡを用いることが可能になったということである。本出願は、従来の既知の処理過程を格段に簡単化し、かつ、その実行に必要な時間を格段に短縮する方法を多数提供すると共に、新規方法をも提供する。ビーコンや生細胞を用いる従来の試験は、コントロールに対して際立った差を示さなかった。この問題は、先ずより強力な蛍光分子を用いることによって、さらに、ステムループ分子の内ステム部分を形成するヌクレオチドの数を、従来使用されていた５または６ヌクレオチド長よりも長くなるようにビーコンを修飾することによって取り除かれる。このように修飾することによって、ステムループ分子が、標的配列不在の場合に非蛍光状態をより確実に維持できるようになるので、背景は低下されることになる。
【００３０】
前述の方法論により、様々な役割を持つＲＮＡ、すなわち、タンパク質をコードすることもなければ、アンチセンスＲＮＡとしても作動しないが、細胞によって発現されるＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡとして作動するＲＮＡ、および既に挙げた二つのクラスのＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡであるＲＮＡを発現する、トランスフェクト細胞系統を安定的に生成することが可能になる。上述の他のＲＮＡとしては、構造的ＲＮＡ、例えば、リボソームＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ等が挙げられる。
【００３１】
１．タンパク質発現細胞系統の生成。  細胞系統生成に関わる工程の内もっとも退屈なもののいくつかが、本明細書に記述される通りに分子ビーコンを運用することによって除去される。所望の遺伝子に加えて、薬剤耐性をもコードするＤＮＡ構築体によってトランスフェクトされた細胞の薬剤性選択の後、対象遺伝子のメッセージを認識するように設計された分子ビーコンをその細胞中に導入する。前記遺伝子を転写した細胞は発光する。その後ＦＡＣＳ分析をすることによって蛍光細胞が単離され、次にこれらを増殖させると、選択した遺伝子を発現する細胞系統が生成される。
【００３２】
対象メッセージを認識するように設計されたビーコンが、内因的に存在する標的配列を検出することが可能な場合、トランスフェクトされた細胞によって生産される標的配列の割合と比べた場合の内因性配列の比率によって、ソーターがこの二つの細胞タイプを区別することができるようになる。別態様では、対象遺伝子にエピトープタグを付け、このタグをコードするヌクレオチド配列を認識するようにビーコンを設計することによって、内因性蛍光の問題は取り除かれる。これらのヌクレオチドは、生産されるタンパク質にタグを付することが必要であるかどうかに応じて、遺伝子のメッセージと読み枠が合致していてもよいし、または、読み枠が合致していなくともよい。
【００３３】
さらに、任意の所定の細胞における対象遺伝子の発現レベルは変動してもよい。このような場合、発現レベルを評価するためにＦＡＣＳが適用される。ＦＡＣＳは、同じ遺伝子を発現する個々の細胞を差次的に選択するのに使用される。
【００３４】
２．アンチセンス発現細胞系統の生成。  タンパク質をコードするＲＮＡではなく、遺伝子または遺伝子の一部のアンチセンスであるＲＮＡを発現する細胞系統の生成について記載する研究がいくつかある。これらの方法は、所定の細胞における特異的タンパク質の量を下げることを目的とする。タンパク質発現細胞系統の生成に関して前述した工程が、この場合にも同じく適用が可能であり、内容的には、ビーコンがアンチセンスＲＮＡであるＲＮＡを検出するように設計されることを除き、ほとんど同一である。
【００３５】
安定的にトランスフェクトされたアンチセンス発現細胞系統を作成しようという試みの全てが、標的タンパク質の発現が十分な影響を受けている細胞系統をもたらすわけではない。この困難があるために、この種の細胞系統の生産を続行することの価値が低下する。一方、本明細書に記述される処理過程は簡単なので、活性の高いアンチセンス発現細胞系統生成能力に関して、異なる多数の遺伝子配列について効力をアッセイすることが容易である。
【００３６】
３．細胞表面局在抗原に基づく細胞の区別。  免疫学者やその他の研究者達は長い間細胞を仕分けするのにＦＡＣＳを用いてきた。本発明によれば、細胞表面局在タンパク質の存在を検出するには、対象タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的として持つビーコンを製造する。このビーコンをトランスフェクションによって細胞中に導入し、次に、細胞ソーターを用いてプラスの得点を挙げた細胞を単離する。
【００３７】
さらに、ＦＡＣＳは最近では、最大３種の細胞表面局在タンパク質の発現に基づいて細胞を仕分けるように使用される。ＦＡＣＳのこの特性は、複数のビーコンの組み合わせであって、それぞれが対象タンパク質の内の一つのｍＲＮＡを標的とし、かつ、それぞれが別様に標識される複数のビーコンの組み合わせを用い、本明細書で記述する通りに分子ビーコンを使用すれば実現される。三つよりも多い発現ＲＮＡに基づいて細胞を仕分けるには、仕分けを複数回実行する。
【００３８】
４．特異的ＲＮＡの発現について細胞をアッセイし、細胞におけるＲＮＡ発現レベルを定量すること。  細胞中に導入された分子ビーコンの標的ＲＮＡが存在する場合、その細胞は蛍光を発する。この情報は、蛍光顕微鏡またはＦＡＣＳを用いることによって定量的に評価されるが、これはどちらの方法でも定量が可能である。例えば、ある特定のＲＮＡについて発現パターンを確定するのに、組織スライスについてインサイチュ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行ってきたが、これを実施せず、代わりにビーコンを使用しても同じ実験ができる。さらに、それぞれが異なる蛍光を発する複数のビーコンであって、それぞれが特異的ＲＮＡを標的とする複数のビーコンの組み合わせを用いることによって、いくつかの対象ＲＮＡの存在または量が一工程でアッセイされる。
【００３９】
５．細胞および組織中のＲＮＡ検出と組み合わせた抗原の局在。  固定細胞または組織スライスを使用し、免疫細胞化学を利用することによって、認識されたタンパク質抗原の局在を記述し、特異的ＲＮＡを標的とする分子ビーコンを用いることによって、同じサンプル中で対象ＲＮＡを同時に局在化する。ＲＮＡに対して標的された分子ビーコンは固定細胞においても機能することが示されている。
【００４０】
６．複数タンパク質を発現する細胞系統の生成。  本発明の方法を用いて、任意の数のタンパク質を発現する形質転換細胞系統が、多数の選択的薬剤からなる混合物の存在下にそれらの細胞を維持する必要もなく、非常に速やかに、安定的に生成される。遺伝子トランスフェクションおよび薬剤選択の後、それぞれが各タンパク質メッセージに対する複数の分子ビーコンの組み合わせを、細胞内に導入する。各ビーコンのループ配列を、メッセージがそれと関連する可能性のある、複数の遺伝子の内のただ一つのもののｍＲＮＡ、または、複数のエピトープタグの内（前記参照）ただ一つのもののヌクレオチド配列にハイブリダイズするように設計することによって、各ビーコンは、複数の遺伝子の内ただ一つによってコードされるｍＲＮＡを認識するように設計される。次に、細胞をＦＡＣＳによって仕分ける。一つ、二つまたは三つ全部の蛍光信号を選ぶことによって、単一の運用で様々の細胞系統が生成される。
【００４１】
三つを越える対象ＲＮＡを発現する細胞系統を生産する必要のある場合がある。例えば、ある特定の複合体の形成に関わっていると考えられるタンパク質およびＲＮＡ配列の全てが過剰発現される細胞系統を持つことができたならば、それは極めて豊かな情報をもたらすであろう。このことを実現するためには、既に複数のＲＮＡの組み合わせを発現している細胞を宿主細胞として用い、さらに別のＲＮＡをコードする追加の構築体をこれらの細胞にトラスフェクトさせることによって、前述の工程を繰り返す。
【００４２】
発現されるべき複数のＲＮＡが皆、細胞に同じ薬剤に対する耐性を付与する構築体においてクローン化される場合、ＦＡＣＳを用いて、所望のＲＮＡ全てを発現する細胞を単離する。これらの配列は安定にゲノムに組み込まれるので、細胞は、どの配列の発現も欠如させることはない。しかしながら、配列の内の１個以上が失われることがあり得る。このような場合には、細胞が増殖する培養液中の選択薬剤の濃度を増すと、このような可能性はより少なくなる。別態様として、それぞれが別々の薬剤に対する耐性を付与する複数の構築体を用い、細胞を適当な薬剤の混合物中に維持する。また、安定に細胞にトランスフェクトされる構築体サブセットを、一つの薬剤に対する耐性遺伝子をコードするように選出し、かつ、別の薬剤に対する耐性遺伝子をコードする別のサブセットを選出する。
【００４３】
さらに、ある細胞系統においていくつかの細胞が対象ＲＮＡを失った場合は、一つの救済策として、細胞系統を単離するために行われた前述の第１実験を繰り返して新しい細胞を得る。別法として、前述の細胞混合物を、所望のＲＮＡの全てを発現する細胞を再度単離する目的でＦＡＣＳによって分析する。これは極めて有用な処置である。なぜなら、これによって、元の選ばれた細胞系統と同じ遺伝的構成を持つ細胞系統を生成する細胞が再び得られるからである。
【００４４】
前述の方法は、ほとんど無限の分析法に対して適用可能な、複数のタンパク質およびＲＮＡ配列の任意の組み合わせを発現する細胞の無制限な供給を実現する。それでもなお、過剰発現されるタンパク質がその細胞にとって有毒である可能性があるが、後に論ずるように、この可能性については速やかに対処することが可能である。
【００４５】
細胞集団がもはや所望のＲＮＡ全てを発現することのない細胞をいくつか含んでいる細胞系統クローンから、所望のＲＮＡ全てを発現する細胞を簡単に再度単離することができるということは、細胞系統を、薬剤の不在下に、または、極小濃度の薬剤の存在下に維持することを可能とするということに注意されたい。
【００４６】
７．一つ以上のタンパク質を目覚しく過剰発現する細胞系統の生成。  各遺伝子を高度に過剰発現させるためには、例えば、同じ遺伝子の二つ以上の配列を、先ず、薬剤耐性を付与するＤＮＡ構築体にクローン化する。各遺伝子の複数の配列はそれぞれ、異なるエピトープタグをコードする配列を含むように設計される。このＤＮＡ構築体を細胞にトランスフェクトさせ、次に薬剤選択した後、複数の分子ビーコンで、それぞれがただ一つのエピトープタグを標的とし、かつ、別様に蛍光標識された複数の分子ビーコンを細胞に導入し、細胞ソーターを用いて、それらの信号に対して陽性である細胞を単離する。これらの細胞は、そのゲノムの中に、各々別々のエピトープ配列タグ付き遺伝子の少なくとも１コピーを組み込んでいるのであるから、対象配列の発現は、事実上同じ対象配列の、漸増する複数コピーから生じる。この方法をＦＡＣＳの使用と組み合わせて使用し、各蛍光分子信号についてもっとも高得点を挙げた細胞を選択する。
【００４７】
８．複数のアンチセンスＲＮＡを発現する細胞系統の生成。  複数のアンチセンスメッセージを発する、安定にトランスフェクトされる細胞系統は下記のように形成される。このアンチセンスメッセージは、ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡを標的とする。トランスフェクトされた複数のアンチセンス配列の内の任意の一つについて様々なレベルで発現する細胞を選択する。安定なトランスフェクションを繰り返すことによって、無制限な数のＲＮＡのアンチセンスメッセージを発現する、安定にトランスフェクトされる細胞系統を生じる可能性のある細胞が簡単に選出される。
【００４８】
もちろん、アンチセンスＲＮＡ以外のＲＮＡを発現する細胞も、本明細書に記載される方法によって調製が可能である。そのようなＲＮＡとしてはｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、その他の構造的ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡまたはｓｎＲＮＡが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００４９】
９．一つ以上のタンパク質について機能的にノックアウトされた細胞系統の生成。  本発明の方法は、培養細胞において機能的ノックアウトを調製する手段を提供する。これによって、酵母またはマウスにおいてヒトのタンパク質のノックアウト特徴を調べることによって、そのヒトのタンパク質の役割を解読するという必要がなくなる。ほとんど同じアンチセンスＲＮＡから一意のＲＮＡ配列までを、複数の座位から発現する細胞を生成することにより、対象任意のタンパク質を機能的にノックアウトさせた細胞系統が生成される。例えば、複数の構築体であって、それぞれが、ある特定の遺伝子のアンチセンスＲＮＡをコードする構築体を、細胞中に安定にトランスフェクトする。この場合、各アンチセンスＲＮＡ配列は、それぞれが、一意のエピトープタグのヌクレオチド配列によってタグ化されている点でのみ異なる。様々にタグ化されたアンチセンスＲＮＡの全てを発現する細胞を選択する。前述したように、ＦＡＣＳを用いて蛍光を定量すると、この有利な特典により、前記アンチセンス配列の内の任意の一つ以上をもっとも高度に発現する細胞を選択することが可能である。
【００５０】
重要なことであるが、この方法では、同じ遺伝子を標的とする異なるアンチセンス配列が用いられる。例えば、前記複数のアンチセンスＲＮＡの内のいくつかについて、その発現に関して分子ビーコンとＦＡＣＳを用いて選出しておいたものを、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの特定領域を標的とするように設計し、一方、別のアンチセンスＲＮＡを、同じメッセンジャーの別部分を標的とするように設計する。対象タンパク質の機能的ノックアウトである細胞系統を生成するためには、その対象タンパク質を検出可能なレベルでは発現しない、または、別態様として受容可能なほどの低レベルでしか発現しない細胞系統の形成に必要な、同じ対象遺伝子に対する類似のまたは異なるアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子配列のできるだけ多数を安定に細胞にトランスフェクトする。
【００５１】
さらに、複数の細胞系統であって、そこにおいて、アンチセンスによって機能的にノックアウトされる任意の数の配列を標的としながら、前述の処理過程を反復することによって複数のタンパク質が機能的にノックアウトされる複数の細胞系統を生成する。例えば、複数のタンパク質からなる複合体の機能を調べるために、その複合体を構成する複数のタンパク質の内の全て、または、任意の組み合わせをノックアウトする。
【００５２】
１０．一つ以上の遺伝子の唯一の選択された形態、または、選択的スプライシング形態の機能的ノックアウトである細胞系統の生成。  ある単一遺伝子の、様々にスプライスされた変種は、異なる機能を持つタンパク質に翻訳されることが多い。本発明の方法を用いて、一つ以上のタンパク質の、複数の選択的スプライシング形態の内選択されたもののみの機能的ノックアウトである細胞系統が生成される。例えば、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの、複数の選択的スプライシング変種の内、細胞から取り除きたいと思うもののみを標的とするアンチセンスを設計することによって、対象選択的スプライシングメッセージを除き、対象遺伝子の選択的スプライシングＲＮＡの全てが機能的にノックアウトされる。
【００５３】
１１．一つ以上のタンパク質を発現し、もう一方で、他の、一つ以上のタンパク質の発現を機能的にノックアウトされた細胞系統の生成。  前述の方法論を用いて、様々の役割を持つ複数のＲＮＡ、すなわち、あるＲＮＡはタンパク質をコードもしないし、アンチセンスＲＮＡとして活動することもしないが、細胞によって発現され、一方、他のあるものはメッセンジャーＲＮＡとして活動し、また、別のあるものは、前述した二つのものに対してアンチセンスＲＮＡとなる、そのような複数のＲＮＡを発現する、安定にトラスフェクトされた細胞系統を生成することが可能である。このような複数のＲＮＡとしては、リボソームＲＮＡのような構造的ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびその他の非ｍＲＮＡが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００５４】
例えば、互いに相互作用を持つと考えられる、１群のタンパク質がある場合、対象タンパク質の一つ以上を、アンチセンスＲＮＡの細胞発現によって機能的にノックアウトさせた、安定にトランスフェクトされた細胞系統を生成することによって、それらの相互作用を調べることが可能である。次に、細胞中の、残りの対象タンパク質の機能を調べることが、しかもより興味深く調べることが可能となる。すなわち、今度は、残りの、一つ以上の対象タンパク質を過剰発現するようにさらに操作して細胞を変えることが可能である。このような一連の思考を無限に進めることが可能であり、これによって、細胞においてさらに別のタンパク質を発現させたり、または、その発現を取り除いたりすることが可能となる。
【００５５】
前述の方法は、組織培養で維持が可能な哺乳類細胞およびその他の細胞に関する科学を、従来不可能であった多数の遺伝的操作を可能とするように変質させる。初めて、ヒト細胞において機能的ノックアウトを生成すること、さらにヒト細胞にタンパク質を過剰発現させることも可能になった。この場合も、ある種のタンパク質を過剰発現すること、または、ある種のタンパク質を機能的にノックアウトすることは、細胞にとって致命的な可能性がある。これは、下記で向き合う問題である。
【００５６】
１２．トランスジェニックマウスの生成。  目的によっては、培養細胞の研究では十分ではないことがある。しかしながら、前述の方法論は、胚幹細胞の操作にも応用される。前述の処理過程を順守することによって、複数のタンパク質を発現する、あるいは、複数のタンパク質を、または、複数のタンパク質の選択的スプライシング形態のサブセットを機能的にノックアウトさせた胚幹細胞を入手することが可能である。次に、この胚幹細胞を、ノックアウト動物の形成基盤として利用する。ノックアウト動物を形成するという試みを実行する前に、この処理過程を用いてその実験が致死的表現形をもたらすかどうかが判断される。例えば、必須タンパク質が、胚幹細胞において機能的にノックアウトされた場合、その細胞は、ＦＡＣＳによる単離後生存することができない。
【００５７】
１３．誘導可能な、安定にトランスフェクトされた細胞系統を生成すること。  細胞において、ある種のタンパク質またはＲＮＡの過剰発現または発現不足が致命的となる場合がある。それでいて、有害なタンパク質またはＲＮＡを過剰発現する細胞、または、それなしでは生存できないタンパク質またはＲＮＡを機能的にノックアウトさせた細胞を調べることが、決定的に重要である場合がある。この目的のために、安定にトランスフェクトされた細胞であって、その細胞では、細胞に対して有害な作用を持つ選択されたＲＮＡは誘導可能なプロモーターの制御下にある、そのような細胞を生成する。このような細胞系統を単離するには、トランスフェクトされ、薬剤選択された細胞に、先ず、極小の誘導を施し、誘導性遺伝子の転写に影響を及ぼし、次に、適当なＲＮＡを認識するように設計された分子ビーコンをその細胞にトランスフェクトさせた後に、ＦＡＣＳ分析を行う。得られた細胞は、有毒なＲＮＡが誘導されず、必要な時にのみ転写されるようにして維持される。
【００５８】
誘導システムは、有毒ＲＮＡの発現以外の用途にも好都合である。例えば、細胞中に安定的にトランスフェクトされた遺伝子配列の発現を、同期化された細胞系統の細胞サイクルのある時点で誘導する。別態様として、１組の、一つ以上の、安定にトランスフェクトされた遺伝子配列の発現産物が、別の組の発現産物に作用を及ぼすことが想定される場合、第１の組の遺伝子配列を、一つの誘導性プロモーターの制御下にクローン化し、かつ、第２の組のものを、第２の誘導性プロモーターの制御下にクローン化したならば興味深いものがある。誘導を変えることによって、どちらかの組の遺伝子配列によってコードされる発現産物が、もう一方の組の発現産物の不在下に、または、存在下に調べられる。
【００５９】
１４．生細胞における遺伝子組み換え事象の検出、および、それに続く、組み換えされない、または、様々に組み換えされた細胞の単離。  安定な細胞系統に導く、組み換え事象検出のための分子ビーコンの使用と平行して、様々の生細胞の混合物から、別様の、特異的組み換え事象を経験した細胞を検出・単離するためにビーコンが使用される。同じ原理を、例えば、ＶＤＪ組み換え、転位、および、ウィルスゲノム取り込みのアッセイに使用することが可能である。
【００６０】
細胞の組み換え事象では、例えば、ゲノムＤＮＡの一つの配列が別物と交換される。組み換え事象の起こった領域をコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写された場合、このような事象の存在は、組み換えされないＤＮＡ配列から転写されるＲＮＡ、または、組み換え配列から転写されるＲＮＡを認識するように設計された分子ビーコンによって検出される。このアッセイは、蛍光顕微鏡によっても実行される。組み換えられた細胞と、組み換えを受けていない細胞とを互いに分離したい場合には、これらの細胞をＦＡＣＳに適用して、仕分ける。さらに、ＦＡＣＳを用いて、細胞における多数の組み換え事象の有無に基づいて細胞を仕分ける。
【００６１】
１５．発現ＲＮＡに基づく細胞の仕分け。  本明細書に前述した分子ビーコンの使用法によって、内部局在のタンパク質の発現に基づいてばかりでなく、抗体を形成させることができないようなタンパク質に対して細胞を仕分けることが可能となる。例えば、様々な細胞からなる混合集団から出発して、対象内部局在性タンパク質を発現する細胞が、そのタンパク質をもたらすｍＲＮＡを認識する分子ビーコンを設計することによって単離される。この分子ビーコンを、前記細胞混合物にトランスフェクトさせ、ＦＡＣＳを用いて細胞を適当に仕分けする。仕分けを複数回実施してもよい。
【００６２】
さらに、研究者は、例えば、サイトカインで刺激されて、一つ以上の特異的タンパク質のｍＲＮＡを発現するように誘導される細胞を、同様のやり方によって誘導されない細胞から分離することに興味を覚える場合がある。このために、先ず、細胞混合物をサイトカインで誘導し、次に、複数のビーコンであって、それぞれが、対象タンパク質の内の一つをもたらすｍＲＮＡを認識するように設計されたビーコンによってトランスフェクトする。次に、ＦＡＣＳを用いて、対象ｍＲＮＡに対してプラスの得点を挙げた細胞を単離する。別の実施態様では、例えば、ウィルスに感染された細胞がまた、ある特定の遺伝子の発現の有無に関してアッセイされる。
【００６３】
本明細書に上述された方法論を用いて、様々の役割を持つ複数のＲＮＡ、すなわち、あるＲＮＡはタンパク質をコードもしないし、アンチセンスＲＮＡとして活動することもしないが、細胞によって発現され、一方、他のあるものはメッセンジャーＲＮＡとして活動し、また、別のあるものは、前述した二つのものに対してアンチセンスＲＮＡとなるような複数のＲＮＡの存在に関して陽性な細胞を検出することが可能である。このような複数のＲＮＡとしては、リボソームＲＮＡのような構造的ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびその他の非ｍＲＮＡが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００６４】
１６．その後の細胞選択と組み合わせた、核酸のインビボ検出。必要とされる化学的詳細が十分に明らかにされているので、様々のやり方で分子ビーコンを修飾して新しい可能性を生み出すことが可能である。例えば、その発現が、細胞の悪性形質転換をもたらす、ある特異的ｍＲＮＡを発現する細胞は選択的に破壊され、一方、このｍＲＮＡを発現しない細胞は、後述のように大なり小なり放置される。分子ビーコンは、細胞混合物の一部において転写される、対象遺伝子に含まれる核酸の特異的配列を認識し、その特異的配列にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドからなるように選択される。このオリゴヌクレオチドは、その一端にはプロテアーゼを、他端には、１分子以上の、プロテアーゼ阻害剤、例えば、ペプチド阻害剤を共有結合させる。使用されるこのオリゴヌクレオチドについては、分子ビーコンの場合と同様、互いにハイブリダイズすることが可能な両端を持つようなビーコンを合成することが重要であることに注意されたい。上述の分子がそのステムループ構造を維持している限り、分子の一端のペプチド阻害剤は、他端のプロテアーゼと十分に近接するので、抑制を実行する。議論をやり易くするために、上述の分子をプローブプロテアーゼと呼ぶことにする。
【００６５】
プローブプロテアーゼを、プローブプロテアーゼによって認識されるＲＮＡを発現する細胞にトランスフェクトさせると、このプローブプロテアーゼは、標的にハイブリダイズする。これによってプロテアーゼは活性化される。なぜなら、ハイブリダイズ状態では、プロテアーゼはもはやペプチド阻害剤の近傍にはいないからである。このようなプローブプロテアーゼの標的が存在し、かつ、認識される細胞は破壊され、従って、間引かれる。
【００６６】
さらに、プローブプロテアーゼは、他の各種用途においても有用である。例えば、細胞の内のあるものがある特定のウィルスによって感染されるような細胞を含む細胞集団がある場合、特定のウィルスｍＲＮＡを標的とするプローブプロテアーゼを細胞中に導入する。そのようなｍＲＮＡを有する細胞は、自らの含むプローブプロテアーゼのタンパク質分解活性を活性化し、これによって、この細胞は破壊される。
【００６７】
本明細書に上述された方法論を用いて、様々の役割を持つ複数のＲＮＡ、すなわち、あるＲＮＡはタンパク質をコードもしないし、アンチセンスＲＮＡとして活動することもしないが、細胞によって発現され、一方、他のあるものはメッセンジャーＲＮＡとして活動し、また、別のあるものは、前述した二つのものに対してアンチセンスＲＮＡとなるような複数のＲＮＡを発現する、安定にトランスフェクトされた細胞系統を生成することが可能である。
【００６８】
前述の記載に基づいて、下記の方法の実施が可能である。
【００６９】
少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する方法であって、
ａ）前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとをコードする少なくとも一つのＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択する工程であって、前記細胞は少なくとも一つのＤＮＡ構築体と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している、工程；
ｃ）選択された細胞を、第１分子ビーコンに曝露し、第１分子ビーコンは、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する、工程；
ｄ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程；
ｅ）前記単離された細胞を増殖させることによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法。
【００７０】
この方法では、蛍光を発する前記細胞の単離は、蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて実行してもよい。細胞系統はさらに、第２のあらかじめ選択されたタンパク質を、同時にまたは継時的に発現するように調製されてもよい。すなわち、追加の工程は、第２のあらかじめ選択されたタンパク質と第２の薬剤耐性マーカーとをコードする第２のＤＮＡ構築体によって前記細胞系統をトランスフェクトする工程；前記第２マーカーを発現する細胞を選択する工程；その細胞を、第２のあらかじめ選択されたタンパク質のＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露する工程；および、前記少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物および第２ｍＲＮＡ転写物それぞれにおいて蛍光を示す細胞を単離する工程を含む。現在、最近の技術では、仕分け過程において、最大３種までの異なるフルオロフォアを検出することが可能であり、今のところ、上記過程を同時に反復することによって、最大３種までの異なるタンパク質の発現を得ることが可能である。必要であれば、次に、三つの異なるタンパク質を発現する細胞系統を、この過程の実行後に、さらに沢山のタンパク質の導入のための開始点として使用してもよい。
【００７１】
トランスフェクションのために用いられるＤＮＡ構築体は、単一遺伝子と薬剤耐性マーカーとをコードしてもよいし、対応するマーカーを備えたさらに別の遺伝子をコードしていてもよい。各遺伝子のトランスフェクションの成功は、対応する薬剤による選択によって達成され得る。前述したように、新たな遺伝子の導入を同時にするか継時的にするかに拘わらず、一時に検出可能な発現メッセージの数は、蛍光技術によって制限される可能性があるが、本法は、さらに多くの遺伝子を加えるよう反復実行することが可能である。最大三つまでのフルオロフォアが検出可能である場合、一時に三つの遺伝子を導入することが可能である。
【００７２】
トランスフェクトされる遺伝子と結合するエピトープタグを、分子ビーコンの標的として用いる、関連法が開示される。この方法により、分子ビーコンがごく近縁のＲＮＡ種を検出する場合のような、そのｍＲＮＡをバックグラウンドの中から同定することが困難である可能性のあるタンパク質を発現する細胞の選択が可能になる。従って、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成するための方法であって、
ａ）前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、少なくとも一つの第１エピトープタグをコードする少なくとも一つのＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有する細胞を選択する工程であって、前記細胞は少なくとも一つのＤＮＡ構築体と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している、工程；
ｃ）前記細胞を、第１分子ビーコンに曝露し、第１分子ビーコンは、第１エピトープタグのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する、工程；
ｄ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程；および
ｅ）前記単離された細胞を増殖させることによって前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程；
を含む方法が提供される。
【００７３】
この方法は、使用される分子ビーコンが、所望の導入タンパク質のＲＮＡ転写物ではなく、エピトープタグを認識するように設計されることを除いては、前述のものと事実上同じである。この処理過程が、前述のものに優る利点は、一つ以上のタンパク質を発現する、多数の、異なる細胞系統を調製するのに、異なるエピトープタグの数に対応した、ごく少数の分子ビーコンしか要求されない点である。現在、蛍光ソーター技術は、三つの蛍光分子に制限されるので、この方法では僅か三つの異なるビーコンしか必要ではない。もしも技術が今後、さらに多数のフルオロフォアの同時検出を可能とするようになった場合には、この必要数も増大させてよい。しかしながら、一時に最大三つまでの導入タンパク質の添加が可能である場合であっても、三つの遺伝子を上手くトランスフェクトさせた細胞を、さらに新たな遺伝子添加のための開始点として用いることも可能である。
【００７４】
本発明に使用が可能であり、それに対してビーコンを調製することが可能なエピトープタグの例としては、ＨＡ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質）、ｍｙｃ、ｈｉｓ、プロテインＣ、ＶＳＶ−Ｇ，ＦＬＡＧまたはＦＬＵが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。上記のものおよびその他のエピトープタグは当業者には既知である。本明細書で使用する場合、エピトープタグとは、分子ビーコンで認識される、独自の核酸配列である。この核酸配列が、構築体のコードされたタンパク質と読み枠が一致するか否かは、決定的には重要ではない。決定的には重要ではない。すなわち、分子ビーコンはいずれの場合でも認識が可能である。従って、エピトープタグ核酸配列を有する転写ＲＮＡは、分子ビーコンによる転写物の検出のためだからといって翻訳される必要はない。
【００７５】
もちろん、前述の方法を用いて、一つ以上のタンパク質を細胞に導入してもよい。すなわち、追加の実行工程は、同時に、または、継時的におこなわれる：第２のあらかじめ選択されたタンパク質、第２薬剤耐性マーカー、および、第２エピトープタグをコードする第２のＤＮＡ構築体で細胞系統をトランスフェクトする工程；前記第２マーカーを発現する細胞を選択する工程；前記細胞を、前記第２エピトープタグのＲＮＡ転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第２分子ビーコンに曝露すること；および、前記第１および第２エピトープタグそれぞれの蛍光を示す前記細胞を単離すること、を含む。第２エピトープタグは、前記第２タンパク質をコードするＤＮＡ配列の部分と読み枠が一致していても、一致していなくともよい。
【００７６】
上手くトランスフェクトされた細胞の選択は、標準法によって実行される。すなわち、薬剤の存在下で、それに対抗するように薬剤耐性マーカーが供給された細胞を増殖させることである。選択が二つの異なるマーカーについて行われる場合は、細胞は、同時にでも、継時的にでも選択が可能である。二つの異なるトラスフェクトされた構築体に対して同じ薬剤耐性マーカーを使用している場合には、両構築体によってトランスフェクトされた細胞を選出するには、用量効果を考慮して、高い方の薬剤濃度が必要とされる。
【００７７】
一つ以上のタンパク質を発現する細胞系統を調製するための前述の方法は、一つ以上のアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞系統を生成する方法に簡単に応用が可能である。その方法は、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードするＤＮＡ構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有する細胞を選択する工程であって、前記細胞は少なくとも一つのＤＮＡ構築体と、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している、工程；
ｃ）前記アンチセンスＲＮＡ分子にハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程；
ｄ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程；および
ｅ）前記単離された細胞を増殖させることによって前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたＲＮＡ配列を発現する細胞系統を生成する工程、
を含む。
【００７８】
これらの方法の全ての詳細は前述した通りである。ビーコンが特定のｍＲＮＡを検出できない場合には、エピトープタグ法、すなわち、
ａ）少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および第１エピトープタグヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ構築物を用いて細胞株をトランスフェクトする工程；
ｂ）前記マーカーが耐性を与えるような薬物に対する細胞耐性について選択する工程であって、前記細胞は、少なくとも一つのＤＮＡ構築物と少なくとも一つの薬物耐性マーカーとを転写している、工程；
ｃ）前記選択された細胞を、前記第１エピトープタグのｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露する工程；
ｄ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程；および
ｅ）前記単離された細胞を増殖させることによってあらかじめ選択された少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞株を生成する工程
を包含する方法が使用され得る。
【００７９】
既述のように、エピトープタグ検出法の利点は、各アンチセンスＲＮＡに対して様々なビーコンを調製する必要がないことである。ビーコンはごく少数のエピトープタグに対して必要であるだけで、これらのタグは、多数のアンチセンス分子、または、１分子の過剰発現を細胞株に導入する連続工程において使用が可能である。もちろん、前記方法は、所定の細胞株における二つ以上のアンチセンスＲＮＡ分子を導入するために、同時にまたは連続的に繰り返してもよい。
【００８０】
さらに、ある特定の一つのタンパクまたは複数のタンパクを発現するようにされた細胞を、複数のタンパクおよびアンチセンスＲＮＡ分子を発現する細胞を作成するための開始点として用いてもよい。もちろんこの複数のアンチセンス分子を発現する細胞は、本明細書の方法を用いて発現タンパクを加えるための開始点として用いることも可能である。対応するビーコンと、またもし要すればエピトープタグと一緒に、タンパクとアンチセンス分子の同時トランスフェクションを実行してもよい。前述の過程の各種組み合わせも本明細書の中に包摂される。
【００８１】
同様に、少なくとも一つのタンパク質を発現する細胞を単離するための方法であって、
ａ）前記少なくとも一つのタンパクを発現することが予想される細胞を提供する工程；
ｂ）前記少なくとも一つのタンパクをコードするｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程；
ｃ）蛍光を発する前記細胞を単離する工程、
を含む方法が提供される。
【００８２】
この方法は、細胞表面局在タンパクまたは細胞内タンパクであるタンパクに対して特に有用である。この方法は、タンパク自体に対するプローブの使用を必要としないが、このプローブの使用はより困難であるか、あるいは、それ以上の実験が不可能となるほどに細胞に影響を及ぼし得る。複数の分子ビーコンを用いて、単離のために使用される技術で同時に検出可能な数まで、一つより多くのタンパクが同定され得る。
【００８３】
もちろん、前述の手順は、生物学的サンプルにおける少なくとも一つのＲＮＡ転写発現のレベルを定量するために使用され得、その手順は、
ａ）その生物学的サンプルを、前記ＲＮＡ転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する第１分子ビーコンに曝露する工程；
ｂ）生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程；および、
ｃ）蛍光レベルを、少なくとも一つのｍＲＮＡ転写物の前記レベルと相関させる工程、
を含む。
【００８４】
生物学的サンプルは細胞サンプルまたは組織サンプルであり得る。これらは、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、または、分子ビーコンを用いるＲＮＡの検出を妨げない任意の数の公知の細胞固定剤によって固定され得る。
【００８５】
検出されたＲＮＡ転写物は、タンパク、構造ＲＮＡ、および、アンチセンスＲＮＡをコードするＲＮＡであり得る。蛍光は、蛍光顕微鏡検査、または、蛍光活性化細胞ソーター技術によって定量化され得る。さらなるＲＮＡ種が、第２ＲＮＡ転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する第２分子ビーコンを用いて同時に定量され得る。
【００８６】
前記方法の別の用途として、少なくとも一つのタンパクを過剰発現する細胞株を生成する方法が提供される。これは、同じタンパクをコードする二つ以上の配列によって細胞をトランスフェクトし、転写物の様々なコピーと関連するエピトープタグによって発現を
選択し、そして同定することによって達成される。この工程は、
ａ）少なくとも二つのＤＮＡ配列によって細胞をトランスフェクトする工程であって、前記配列はそれぞれ、タンパク、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分；ならびに同じタンパク、少なくとも一つの第２エピトープタグ、および、少なくとも一つの第２薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、工程；
ｂ）第１および第２薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
ｃ）選択された細胞を、第１および第２分子ビーコンに曝露する工程であって、各分子ビーコンは、それぞれ、前記第１および第２エピトープタグのＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズする際に蛍光を発する、工程；
ｄ）前記第１および第２分子ビーコンのそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程；および、
ｅ）単離した細胞を増殖させることによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を過剰発現する細胞株を生成する工程、
を含む。
【００８７】
既述のように、遺伝子の各コピーに対して同じ薬剤耐性マーカーを用いた場合、両配列によってトランスフェクトされた細胞を選択するには、より高いレベルの薬剤が必要とされ得る。前記の方法のように、その少なくとも二つのＤＮＡ配列は、同じ構築物に存在し得る。第１および第２エピトープタグは、それぞれ独立に、前記タンパクと読み枠が一致していても、一致していなくともよい。
【００８８】
前述の手順は、少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ分子で過剰発現する細胞の生成に容易に運用することが可能である。その方法は、
ａ）少なくとも二つのＤＮＡ配列によってトランスフェクトする工程であって、その配列は、前記アンチセンスＲＮＡ分子、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分；ならびに前記アンチセンスＲＮＡ分子、少なくとも一つの第２エピトープタグ、および、少なくとも一つの第２薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、工程；
ｂ）前記第１および第２薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのＤＮＡ配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
ｃ）前記選択された細胞を第１および第２分子ビーコンに曝露する工程であって、各分子ビーコンは、それぞれ、前記第１および第２エピトープタグのＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズす際に蛍光を発する、工程；
ｄ）前記第１および第２分子ビーコンのそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程；および、
ｅ）前記単離した細胞を増殖させることによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスＲＮＡ分子を過剰発現する細胞株を生成する工程、
を含む。
【００８９】
詳細は前述したものと同様である。
【００９０】
細胞にアンチセンスＲＮＡ分子を導入することは、細胞から一つ以上のタンパクを機能的に除去するのに有用である。前述の方法に従って、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の発現に対して機能的にヌルである細胞を生成する方法が提供され、この方法は、前記細胞において、前記あらかじめ選択されたタンパクに対し、複数のアンチセンスＲＮＡを提供する工程を含み、各アンチセンスＲＮＡは前述の方法に従って提供され、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクに対する前記複数のアンチセンスＲＮＡは、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクの実質的に全てのｍＲＮＡ転写物に結合する。このあらかじめ選択されたタンパクは、の遺伝子産物の、代替的スプライシング形であってもよい。同様の概略に従って、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパクに関して機能的にヌル発現変異体であるトランスジェニック動物を生成するための方法が提供され、この方法は、胚幹細胞を用いて前述の工程を実行すること、前記あらかじめ選択されたタンパクを機能的にヌル発現する前記幹細胞の生存率を決定すること、および、前記生存胚幹細胞を用いて前記トランスジェニック動物を産生することを含むる。
【００９１】
同様に、少なくとも一つのタンパク質については機能的にヌル発現し、少なくとも一つの別のタンパク質については過剰発現する細胞株を生成する方法が提供されこの方法は、本明細書で前述した方法を、同じ細胞に実行することを含む方法が提供される。同様の様式で、本明細書の方法を実行することによって、誘発可能なプロモーターの制御下で致死的アンチセンスＲＮＡを発現する細胞株を生成する方法が提供され、ここで、前記トランスフェクト工程は、最少量のインデューサーの存在下で行われる。
【００９２】
生細胞において遺伝子組み換え事象を同定するための方法であって、
ａ）組み換え配列から転写されたＲＮＡ配列と非組み換え配列から転写されたＲＮＡ配列とからなる群から選ばれるＲＮＡ配列とハイブリダイズする際に蛍光を発する分子ビーコンに、細胞を曝露する工程；
ｂ）前記ＲＮＡ配列を発現する前記細胞を検出する工程、
を含む方法が提供される。
【００９３】
本発明はまた、標的核酸への結合において従来技術によって示される蛍光特性とは異なる新しい形態の分子ビーコンに関する。このようなタンパク分解活性は、検出目的に使用され得るだけでなく、そのタンパクをコードするｍＲＮＡが細胞中に存在するはずの細胞において、特定のタンパク配列を変性させるために使用され得る。例えば、ウィルスタンパクを特異的に切断するプロテアーゼが、潜伏感染の場合のようにウィルスの転写が活性化されると、活性化され得る。
【００９４】
好ましくは、阻害剤との相互作用によって酵素の可逆的阻害を提供するために、タンパク分解酵素阻害剤はペプチドであるが、ただし、金属および金属キレート剤を含むその他の分子も同様に有用である。タンパク分解酵素およびタンパク分解酵素阻害剤の有用なペアの例としては、アミノペプチダーゼとアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼとアンチパイン、アミノペプチダーゼとベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼとキモスタチン、アミノペプチダーゼとジプロチンＡまたはＢ、カルボキシペプチダーゼＡとＥＤＴＡ、エラスターゼ様セリンプロテアーゼとエラスチナール、および、テルモリシンまたはアミノペプチダーゼＭと１，１０−フェナントロリンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００９５】
本発明は、本発明の例示のために提供される、下記の、非限定的実施例を参照することによってさらによく理解され得る。下記の実施例は、本発明のより好ましい実施態様をより十分に具体的に示すために提示されるものである。これらの実施例は、決して本発明の広範な範囲を限定するものと思量されない。
【実施例】
【００９６】
実施例１
全体的なプロトコール。開始材料：分子ビーコンは、プラスミド由来のＲＮＡを全く発現しない細胞に導入され得るか、または、プラスミドでコードされたＲＮＡメッセージを検出するのに使用され得る。ビーコンを、これら２種類の細胞に導入する方法は同一である。下記のプロトコールは、分析される細胞が互いに分離可能であり、その分離がＦＡＣＳ分析に従うことのみを必要とする。
【００９７】
１）本明細書により詳細に記述されているように、組織細胞を、細胞内における特定のＲＮＡの発現または発現欠如に基づいて分類するために、ビーコンがＦＡＣＳと組み合わせて用いられ得る。このためには、細胞を先ず、ホモジェニゼーションおよびさらなる化学的処理のような、標準的で十分に確立された方法によって互いに分離しなければならない。次に、適当なビーコンを、下記のプロトコールに従って、この細胞に導入し得る。
【００９８】
２）第二に、細胞集団にトランスフェクトさせたプラスミドによってコードされる特定のＲＮＡを発現する細胞について選択するために、ビーコンを使用し得る。このためには、先ず、所望のＲＮＡをコードする単一の、または、複数のプラスミドを細胞培養物にトランスフェクトさせなければならない。次に、本明細書においてさらに詳細に記述されているように、これらのＲＮＡを認識するためにビーコンが作成される。プラスミドの細胞へのトランスフェクションは、所有の試薬を用いるか、または、生化学系の会社（Ｑｉａｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇｅｎｅｐｏｒｔｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ等）から入手したキットをメーカーの指示に従って用いるかのいずれかで、多種多様な方法によって達成され得る。プラスミドは、それぞれが一つの抗生物質に対する耐性を付与するように選ぶべきである。これらのプラスミドを細胞に導入し、短時間（２４時間）で細胞を回収した後、細胞を適当な抗生物質に供し、プラスミドによって抗生物質耐性を得た細胞のみが生き延びられるようにする。これは、細胞の型および使用される抗生物質の両方に依存して、一般的に３日から４日を要する。
【００９９】
結果として、ある一塊の細胞が残存するが、これらは全て抗生物質に対して耐性を示すものの、そのほんの小部分しか対象ＲＮＡを発現しない。所望のＲＮＡを発現する細胞を選出するために、下記のプロトコールを守ってもよい。
【０１００】
実施例２
ビーコンによる細胞の選択
１）ビーコンを細胞にトランスフェクトさせる。ビーコンは、ＲＮＡに内在する配列にハイブリダイズするか、または、天然のＲＮＡ配列に添加されたタグにハイブリダイズするかのいずれかによって、所望のＲＮＡを認識するように設計されていなければならない。ビーコンの設計は、本明細書において詳細に論じられている。
【０１０１】
トランスフェクションは、プラスミドの細胞に対するトランスフェクションと同様、多種多様な方法によって実行が可能である。採用する方法は、使用する細胞型に基づいて選択すべきである。なぜなら、細胞によって、よりよく反応するトランスフェクション法が異なるからである。トランスフェクションは、使用するトランスフェクション試薬のメーカーの指示に従って実行するべきである。
【０１０２】
細胞に対するビーコンのトランスフェクションは、使用するトランスフェクション試薬に応じて、懸濁細胞で行っても、固相表面で成長する細胞で行ってもよい。
【０１０３】
２）ビーコンの細胞に対するトランスフェクションの後、細胞をＦＡＣＳ分析に供する。ＦＡＣＳは、使用した複数のビーコンの内の任意の一つ以上に対して陽性の細胞を分類するために使用され得る。ＦＡＣＳはまた、ビーコン信号の強度に基づいて細胞を分類するために使用され得、これによって、研究者は、様々な程度でＲＮＡを発現する細胞を選択することが可能となる。
【０１０４】
実施例３
一つ以上のＲＮＡを発現する細胞株の生成
ＦＡＣＳ選択の後、ポジティブと記録した細胞を、本明細書においてさらに詳細に記述されるように、適当な培養液中に維持することが可能である。この細胞は、目的のＲＮＡを発現する細胞株となる。
【０１０５】
ビーコンの濃度：使用されるビーコンの濃度は、いくつかの要因に左右される。例えば、細胞内における、検出されるＲＮＡの量、および、このＲＮＡとビーコンとの接触機会を考慮しなければならない。例えば、検出されるＲＮＡがごく少量しか存在しない場合、または、そのＲＮＡが、ＲＮＡの３次元折り畳みによって簡単には接触機会の無いＲＮＡ部分の中に存在する場合は、検出されるＲＮＡが多量にある場合、および、ビーコンによって認識される部位が完全に接触可能な場合と比べて、より多量のビーコンを用いなければならない。使用されるビーコンの正確な量は、各用途毎に経験的に決められなければならない。
【０１０６】
このことは、様々な量のビーコンを、様々な細胞群に導入し、バックグラウンドの蛍光が低度で、かつ、信号が高度である条件（細胞の内の全てではなくいくつかが、そのビーコンに対してポジティブを記録する条件）を選択することによって達成され得る。
【国際調査報告】
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