(57)【要約】本発明は、物質ライブラリー基板を保持するためのモジュール構造装置および所定の分子標的分子を定性的および定量的に検出するためのそのような装置の使用方法に関する。より具体的に言えば、本発明は、互いに固定し得る２つの保持要素（１０１および１０２）が、（ｉ）下面に物質ライブラリー（２０１）がついた検出表面を有し、少なくとも検出表面領域において透光性であるカバー要素（２００）と、（ｉｉ）密閉溝を有する中間シール要素（３００）と、（ｉｉｉ）カバー要素の検出表面領域が透光性であるボトム要素（４００）とからなる積層複合体を形成し、それによって透光性の室領域が得られることを特徴とする、物質ライブラリー基板保持装置（１）に関する。
2005504974.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質ライブラリー基板保持装置（１）であって、
互いに固定可能な２つの保持要素（１０１および１０２）が、
（ｉ）  下面に物質ライブラリー（２０１）がついた検出表面を有し、少なくとも該検出表面領域では透光性である蓋要素（２００）と、
（ｉｉ）  密閉凹部を有するシール中間要素（３００）と、
（ｉｉｉ）  少なくとも蓋要素の検出表面領域では透光性であるベース要素（４００）と、
からなる積層複合体を形成し、これらの要素（２００，３００，４００）が共に室空間を有する透光性の室（５００）を形成することを特徴とする装置。
【請求項２】
ベース要素（４００）が一体化加熱−温度センサー装置を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の装置（１）。
【請求項３】
ベース要素（４００）が、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔ  ３３、シリカガラス、単結晶ＣａＦ２および／または単結晶シリコンからなることを特徴とする、請求項１または２に記載の装置（１）。
【請求項４】
蓋要素（２００）が、ガラス、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔ  ３３、石英ガラス、単結晶ＣａＦ２、単結晶シリコン、フェニルメチルメタクリレートおよび／またはポリカーボネートからなることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項５】
中間要素（３００）が弾性であり、カニューレで側面から繰返し穴を開けられること、およびカニューレを抜去すると前記室空間が密閉状態に維持されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項６】
中間要素（３００）が、ポリジメチルシロキサン（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４または１８２の名前で入手可能）、天然ゴム、ブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ニトリル−ブタジエンゴム、ブチルゴム、イソプレン−スチレンゴム、ポリノルボルネンゴム、エチレン−プロピレンゴム、フルオロゴム（Ｂｉｔｏｎ、Ｔｅｃｎｏｌｆｌｏｎ、Ｆｌｕｏｒｅｌ、Ｄａｉｅｌの名前で入手可能）、ペルフルオロゴム（Ｋｌａｒｅｚの名前で入手可能）、メチル−フェニル−シリコンゴム、メチル−ビニル−シリコンゴム、メチル−フルオロ−シリコンゴム、フルオロ−シリコンゴム、ポリスルフィドゴム、ウレタンゴム、４，４′−メチレンジ（フェニルイソチオシアネート）またはトルエンジイソシアネートをベースとするポリエステルまたはポリエーテルプレポリマー（Ａｄｉｐｒｅｎ、Ｅｌａｓｔｏｔｈａｎｅ、Ｇｅｎｔｈａｎｅ、Ｕｒｅｐａｎ、Ｖｉｂｒａｔｈａｎの名前で入手可能）からなることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項７】
中間要素の凹部（３０１）が室空間の幾何学的形状を区画形成することを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項８】
室空間（３０１）を気泡なしに充填し得ることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項９】
中間要素（３００）によって区画形成された室空間（３０１）がＤ、三日月または鎌の形で形成されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項１０】
蓋要素（２００）、中間要素（３００）およびベース要素（４００）により形成された室（５００）を冷却し得ることを特徴とする、請求項１から９のいずれか１項に記載の装
置（１）。
【請求項１１】
２つの保持要素（１０１および１０２）が、互いに係合し、かつ合わせて押し付けるとプレスばめ（１１５）によってつなぎ合わされるシェルの半分であることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項１２】
互いに係合された保持要素（１０１および１０２）が室（５００）を冷却するための通路（１０５）を有することを特徴とする、請求項１から１１のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項１３】
互いに係合された保持要素（１０１および１０２）が、試料室（５００）に装填するスライド（１１００）またはラグ（１１０３）を受容するための凹部（１０３）を有することを特徴とする、請求項１から１２のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項１４】
室（５００）を加熱するための媒体接続部（４０３）、室（５００）を冷却するための媒体接続部（１０５）および注入装置を受容するための凹部（１０３）が装置の１つの側面（１２０）に配置されていることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項１５】
コネクタ（１０００）に取り付け得ることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項１６】
コネクタ（１０００）を介して完全自動操作し得ることを特徴とする、請求項１から１５のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項１７】
手動充填スタンド（２０００）に取り付け得ることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項１８】
物質ライブラリー（２０１）がタンパク質ライブラリーであることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項１９】
タンパク質ライブラリーが、抗体ライブラリー、受容体タンパク質ライブラリーまたは膜タンパク質ライブラリーであることを特徴とする、請求項１８に記載の装置（１）。
【請求項２０】
物質ライブラリー（２０１）がペプチドライブラリーであることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項２１】
ペプチドライブラリーが、受容体リガンドライブラリー、生理活性ペプチドライブラリーまたはペプチドホルモンライブラリーであることを特徴とする、請求項２０に記載の装置（１）。
【請求項２２】
物質ライブラリー（２０１）が核酸ライブラリーであることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか１項に記載の装置（１）。
【請求項２３】
核酸ライブラリーがＤＮＡ分子ライブラリーであることを特徴とする、請求項２２に記載の装置（１）。
【請求項２４】
物質ライブラリーがＲＮＡ分子ライブラリーであることを特徴とする、請求項２２に記載の装置（１）。
【請求項２５】
マイクロアレイでの試験を実施するための請求項１から１７のいずれか１項に記載の装置（１）の使用方法。
【請求項２６】
ハイブリダイゼーション試験を実施するための請求項１から１７のいずれか１項に記載の装置（１）の使用方法。
【請求項２７】
ＰＣＲ、ＬＣＲまたはＬＤＲを実施するための請求項１から１７のいずれか１項に記載の装置（１）の使用方法。
【請求項２８】
マイクロアレイでの試験とＰＣＲとを同時に実施するための請求項１から１７のいずれか１項に記載の装置の使用方法。
【請求項２９】
請求項１から２２のいずれか１項に記載の装置（１）を充填するための装置（２０００）であって、
（ｉ）  装置（１）が本体（２１００）と本体に固定できるカバー（２２００）とからなり、本体（２１００）が、充填ユニット、排気ユニットおよび請求項１から２２のいずれか１項に記載の装置（１）を受容するための凹部を有すること、および
（ｉｉ）  前記凹部が、中間要素（３００）にその側面から穴を開けることにより請求項１から２２のいずれか１項に記載の装置（１）の試料室（５００）を充填および排気し得るように配置されていること、
を特徴とする装置（２０００）。
【請求項３０】
充填ユニットはカニューレ（２４０２）がついた注射器（２４０１）であり、排気ユニットはカニューレ（２４０３）であることを特徴とする、請求項２９に記載の装置（２０００）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質ライブラリー基板を保持するためのモジュール構造装置、および特定の分子標的分子を定性的および定量的に検出するためのそのような装置の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物医学試験は、多くの場合、既知量で既知位置に存在する分子（分子プローブ）と、単一または複数の検出対象未知分子（分子標的分子）との相互作用の検出に基いている。最新試験では、プローブを物質ライブラリーの形態で基板、いわゆるマイクロアレイまたはチップ上に堆積させて、試料を数種のプローブと並行して同時に分析することが可能である（例えば、非特許文献１参照）。マイクロアレイを作製する場合、プローブは、通常、適当なマトリクス、例えば、特許文献１（例えば、特許文献２、３参照）に記載のものまたは合成されたもの（例えば、特許文献４参照）の上に特定の方式で固定する。
【０００３】
プローブと標的分子との相互作用の検出は以下のように生じる：
単一または複数のプローブをマイクロアレイ形態の特定のマトリクス上に特定の方式で固定する。次いで、溶液中で標的とプローブとを接触させ、規定条件下インキュベートする。インキュベーションの結果として、プローブと標的との特異的相互作用が生じる。結果として生じる結合は、標的分子と標的分子に特異的ではないプローブとの結合より明らかに安定している。特異的に結合しなかった標的分子を除去するために、系を適当な溶液で洗浄するか、加熱する。
【０００４】
標的とそのプローブとの特異的相互作用の検出は、通常、標的分子とマイクロアレイとの相互作用の前、間または後に標的分子に導入されたマーカーの性質に依存する、多様な方法によって生じ得る。通常、そのようなマーカーは蛍光基であり、それゆえ、特異的標的−プローブ相互作用は、他の一般的な検出法（特に質量に依存する方法）に比べて高い局所解像度で極めて容易に光学的に蛍光を読み取り得る（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
この試験原理を用いて、マイクロアレイ上に固定された物質ライブラリーと標的分子の化学的性質とに応じて、核酸間の相互作用、タンパク質間の相互作用、および核酸とタンパク質との相互作用を解析することができる（概説については、例えば、非特許文献３参照）。
【０００６】
マイクロアレイまたはチップ上に固定し得る物質ライブラリーとしては、抗体ライブラリー、受容体ライブラリー、ペプチドライブラリーおよび核酸ライブラリーが可能である。核酸ライブラリーはずば抜けて重要な役割を果たす。
【０００７】
ここで必要なのは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子を固定した、マイクロアレイである。蛍光基で標識した標的分子（ＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子）とマイクロアレイの核酸プローブとを結合させるためには、標的分子とプローブ分子がどちらも一本鎖核酸の形で存在している必要がある。
【０００８】
そのような分子間でのみ、有効かつ特異的なハイブリダイゼーションが生じ得る。一本鎖核酸標的分子と核酸プローブ分子は、通常、熱変性や、ほぼ完全な（互いに対応する）相補配列を有するプローブのみが標的配列と対をつくって存続することを確実にする最適に選択されるべきパラメータ（温度、イオン強度、ヘリックス不安定化分子の濃度）によって得られる（例えば、非特許文献４参照）。
【０００９】
生物試験法におけるマイクロアレイの代表的な応用例は、生物医学診断における試料中の微生物の検出である。ここでは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子が遍在的に分布すると共に、それぞれの種に特徴的な配列セグメントを有することを利用する。これらの種に特徴的な配列を一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの形でマイクロアレイ上に堆積させる。先ず、分析対象標的ＤＮＡ分子を分析対象試料から単離し、蛍光マーカーを付ける。次いで、標識した標的ＤＮＡ分子をマイクロアレイ上に堆積させたプローブと一緒に溶液中でインキュベートし、適切な洗浄ステップで非特異的相互作用を除去し、蛍光分析により特異的相互作用を検出する。このようにして、１回の試験で試料中の数種の微生物を同時に検出することができる。この試験法では、理論上、検出可能な微生物の数は、マイクロアレイ上に堆積された特異的プローブの数にのみ依存する。
【００１０】
これらの試験を実際に実施するために、マイクロアレイまたはチップを、洗浄ステップおよびハイブリダイゼーションステップに必要な流体の交換用入口および出口を有する密閉室内に固定する。そのようなシステムが、例えば、特許文献５および６に記載されている。
【００１１】
特許文献５に記載されている室は、室を冷却または加熱し得る集成装置を有していない。しかし、これは、ハイブリダイゼーションを特異的に制御するには望ましいであろう。さらに、チップが入った反応室の組み立ては複雑であり、反応室のシールにはいくつもの接着ステップを要し、それによって汚染の危険が生じる。
【００１２】
特許文献６には、これもマイクロアレイが入った室が記載されている。これらの室は、加熱し得るが冷却できない。ここでもまた、室は数ステップを経て組み立てられ、室をシールするためにいくつかの接着ステップが必要である。このように、上記文献に記載されている室は極く限られたパラメータの操作（加熱、冷却など）しか可能ではなく、この組立体は汚染されやすく、検出反応の自動化に望ましい周辺接続は存在しないか、多大な努力と費用をもってしか達成されない。
【００１３】
生物医学診断における多くの試験では、実際の試験法を開始する前に、先ず、標的分子が十分な量で存在する必要があり、このために、多くの場合、試料から増幅させなければならないという問題が生じる。ＤＮＡ分子の増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われる。ＲＮＡを増幅させるためには、ＲＮＡ分子を逆転写によって対応する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換しなければならない。次いで、このｃＤＮＡもＰＣＲで増幅させ得る。ＰＣＲは標準実験室法である（例えば、非特許文献５参照）。
【００１４】
ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は比較的高速であり、小型化法を用いることにより低バッチ容量で高い試料処理量が得られる。しかし、核酸のキャラクタリゼーションは増幅によるだけでは不可能である。それどころか、増幅後のＰＣＲ産物のキャラクタリゼーションには、核酸配列決定などの解析法または電気泳動分離および単離法を用いる必要がある。
【００１５】
特許文献７、８、９および１０から、ＰＣＲを実施するためのいくつかの小型化可能または小型化された方法および装置（サーモサイクラー）が公知である。これらの文献には、マイクロアレイの組込みまたはＤＮＡチップの組込みは論じられていない。
【００１６】
特許文献７、１１、１２では、流体試料をポンプで３種の温度ゾーン上に連続的に送り込む原理に従って機能する小型化可能または小型化されたサーモサイクラーが記載されている。連続的に作動するこれらのサーモサイクラーにもＤＮＡチップは組込まれていない。
【００１７】
上述解決法すべての欠点は、オンライン検出では、核酸が増幅されたか、またどの位増幅が可能であったかという情報しか得られないことである。増幅産物のそれ以上のキャラクタリゼーションは不可能である。
【００１８】
特許文献１３は、３つの小型化室間を行ったり来たりしてポンプ圧送し得るシステムを開示している。このシステムの１つの室でＰＣＲが行われ、次の室でプロセシング／精製が行われ、第３の室で例えばＤＮＡチップ上で反応産物が検出される。小型化ＰＣＲ管は文献に十分に記載されている種類の標準的な管である（例えば、非特許文献６参照）。この装置の欠点は、流体試料をＰＣＲ室から検出室に輸送するために、複雑で、故障しやすく、制御に手間がかかる、圧力駆動流体工学システムを構成しなければならないことである。
【００１９】
特許文献６には、一体化加熱システムを有する試料室内のＤＮＡチップ上でＰＣＲと核酸のハイブリダイゼーションとを単一の室反応として実施し得るユニットが記載されている。しかし、このユニットは、冷却ができず、試料の混合に複雑な四重極システムが必要であり、かつこのユニットの組み立てにはパーツの接着を要するという欠点を有する。さらに、このユニットは、使い捨て製品であり、製造コストが高いために不経済である。
【００２０】
非特許文献７には、ＤＮＡ精製ステップ、ＰＣＲ、酵素処理およびハイブリダイゼーションをＤＮＡチップ上で実施することが可能であり、異なる反応が異なる反応室で生じる、指の厚さくらいのカートリッジが記載されている。このプロセスの種々のステップを実施するために、複雑な圧縮空気駆動ユニットを用いて、試料溶液が反応室から反応室にポンプで送り込まれる。このシステムの欠点は、圧力駆動流体工学の構成に多大な努力が費やされ、故障しがちであり、かつ一体化加熱・冷却集成装置がないことである。さらに、自動化し得るのはＰＣＲと酵素処理だけである。
【特許文献１】
ＷＯ００／１２５７５号明細書
【特許文献２】
米国特許第５，４１２，０８７号明細書
【特許文献３】
ＷＯ９８／３６８２７号明細書
【特許文献４】
米国特許第５，１４３，８５４号明細書
【特許文献５】
米国特許第６，２８７，８５０号明細書
【特許文献６】
ＰＣＴ／ＥＰ００／０６１０３明細書
【特許文献７】
米国特許第５，７１６，８４２号明細書
【特許文献８】
独国特許第１９５  １９  １９０１５Ａ１号明細書
【特許文献９】
ＷＯ９４／０５４１４号明細書
【特許文献１０】
米国特許第５，４９８，３９２号明細書
【特許文献１１】
ＷＯ９１／１６９６６号明細書
【特許文献１２】
ＷＯ９２／１３９６７号明細書
【特許文献１３】
米国特許第５，８５６，１７４号明細書
【特許文献１４】
ＰＣＴ／ＥＰ００／０６１０３号明細書
【非特許文献１】
ディー  ジェイ  ロックハート（Ｄ．Ｊ．Ｒｏｃｋｈａｒｔ），イー  エイ  ウィンツェラー（Ｅ．Ａ．Ｗｉｎｚｅｌｅｒ），“Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ”；Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，第４０５巻：ｐ．８２７−８３６
【非特許文献２】
エイ  マーシャル（Ａ．Ｍａｒｓｈａｌｌ），ジェイ  ホッジソン（Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ），“ＤＮＡ  ｃｈｉｐｓ：Ａｎ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８年，第１６巻，ｐ．２７−３１；ジー  ラムゼイ（Ｇ．Ｒａｍｓａｙ），“ＤＮＡ  Ｃｈｉｐｓ：Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｒｔ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８年，第１６巻，４０−４４
【非特許文献３】
エフ  ロッツパイチ（Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ），エイチ  ゾルバス（Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ），“Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ”，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（ハイデルベルグ  ベルリン），１９９８年
【非特許文献４】
エイ  エイ  リーチ（Ａ．Ａ．Ｌｅｉｔｃｈ），ティー  シュワルツァッヒャー（Ｔ．Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒ），ディー  ジャクソン（Ｄ．Ｊａｃｋｓｏｎ），アイ  ジェイ  リーチ（Ｉ．Ｊ．Ｌｅｉｔｃｈ），“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎｇ”，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（ハイデルベルグ  ベルリン  オックスフォード），１９９４年
【非特許文献５】
ジェイ  サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ），イー  エフ  フリッチュ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ），ティー  マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ニューヨーク），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９年
【非特許文献６】
エス  ポーザー（Ｓ．Ｐｏｓｅｒ），ティー  シュルツ（Ｔ．Ｓｃｈｕｌｚ），ユー  ディルナー（Ｕ．Ｄｉｌｌｎｅｒ），ブイ  バイアー（Ｖ．Ｂａｉｅｒ），ジェイ  エム  ケーラー（Ｊ．Ｍ．Ｋｏｅｈｌｅｒ），ディー  シムカット（Ｄ．Ｓｃｈｉｍｋａｔ），ジー  メイヤー（Ｇ．Ｍａｙｅｒ），エイ  ジーベルト（Ａ．Ｓｉｅｂｅｒｔ），“Ｃｈｉｐ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆａｓｔ  ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｉｎｇ，Ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  Ａ      ｃｔｕａｔｏｒｓ  Ａ”，１９９７年，ｐ．６２６７２−６７５
【非特許文献７】
アール  シー  アンダーソン（Ｒ．Ｃ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ），エックス  スー（Ｘ．Ｓｕ），ジー  ジェイ  ボグダン（Ｇ．Ｊ．Ｂｏｇｄａｎ），ジェイ  フェントン（Ｊ．Ｆｅｎｔｏｎ），“Ａ  ｍｉｎｏａｔｕｒｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓａｙｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００年，第２８巻，第１２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
上述の技術の現状を考えると、完全に自動化されたマイクロアレイでの検出試験を実施し得る装置が大いに必要とされていることが明らかになる。特に、例えば、冷却などの温度調節および流量調整などのパラメータ制御が完全に自動化されたマイクロアレイでの試験を実施するための装置が求められている。さらに、マイクロアレイでの試験に必要な標的分子などの成分を例えばＰＣＲによりｉｎ  ｓｉｔｕ合成し、増幅産物を試験系で手で処理することなくそのまま使用し得るマイクロアレイでの試験を実施するための装置が必要である。一般的には、簡単な構造、扱い易さ、汚染源の回避、試験の再現性、および低製造コストを特徴とするマイクロアレイでの試験を実施するための装置が必要である。
【００２２】
したがって、本発明の目的は、完全自動化かつパラメータ制御下にマイクロアレイでの試験を実施し得る装置を提供することである。本発明のさらなる目的は、簡単な構造、扱い易さ、したがって、費用効率の高い製造を特徴とする装置を提供することである。さらに、本発明の目的は、汚染源を回避することにより、ＰＣＲとマイクロアレイでの試験を単一室系で同時に実施し得る装置を提供することである。本発明のさらなる目的は、マイクロアレイが入った試料室を充填するための手動充填スタンドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の上記および他の目的は、特許請求の範囲に記載されている主題を提供することにより解決される。好ましい実施形態は従属請求項に明示されている。この点について、
これらの目的は、本発明により以下のように解決される：互いに固定可能な２つの保持要素（１０１、１０２）によって積層複合体４００、３００、２００を合わせて押し付けることで、物質ライブラリー２０１がついた検出表面を有し、マイクロアレイでの試験だけでなくＰＣＲなどの反応も実施し得る、透光性の室５００を有する装置１を形成する。
【００２４】
ベース要素４００、中間要素３００および蓋要素である積層複合体の構成要素のこの種の構成と性質が、新たに作成された、以後試料室または反応室とも称される室５００の有利な効果の原因である。装置全体１は以後カートリッジ１とも称される。
【００２５】
本発明に従ってカートリッジ１および反応室５００を構成することによって、物質ライブラリー基板をたやすく交換し得るカートリッジ１および反応室５００を製造することができる。この構成原理の別の利点は、新たに作成された反応室５００が接着の必要なく密閉シールされ、それによって、現状水準の反応室５００の通常の組立体に比べて作業ステップがいくつか少なくて済むことである。したがって、本発明の装置はそれ自体がより改良されたものであるが、それに加えて、接着ステップに起因する試料空間汚染の可能性も防止される。新たに作成された反応室５００の上記および他の有利な特性は、反応室を構成するベース要素、中間要素および蓋要素の性質に基く。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明によれば、蓋要素２００という名称は、検出表面上に物質ライブラリー２０１を有し、少なくともその検出表面領域内では透光性かつ非蛍光性である基板要素２０２を指す。検出表面とは、基板要素２０２上の物質ライブラリー２０１が固定されている領域を意味する。本発明のそのような好ましい実施形態において、物質ライブラリー２０１は蓋要素２００上に直接堆積される。
【００２７】
他の好ましい実施形態においては、物質ライブラリー２０１を透光性かつ非蛍光性のチップ上に堆積させ、次いで、このチップを、少なくともチップにより区画形成された検出領域では透光性かつ非蛍光性である基板要素２０２に固定して結合させるが、チップの寸法は基板要素２０２の寸法より小さい。この場合、物質ライブラリー２０１を有するチップと基板要素２０２は一緒になって蓋要素２００を構成する。
【００２８】
基板要素２０２は、透光性かつ非蛍光性の材料からなる。これらの材料は、ガラス、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔ  ３３〔ショット社（Ｓｃｈｏｔｔ）〕、石英ガラス、単結晶ＣａＦ２（ショット社）、単結晶シリコン、フェニルメチルメタクリレートおよび／またはポリカーボネートであるのが好ましい。
【００２９】
物質ライブラリーを直接基板要素２０２上に堆積させるのではなく、チップ上に堆積させる場合、このチップも、透光性かつ非蛍光性の材料からなる。好ましい材料は、ガラス、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔ  ３３（ショット社から入手可能）、石英ガラス、単結晶ＣａＦ２（ショット社から入手可能）、単結晶シリコン、フェニルメチルメタクリレートおよび／またはポリカーボネートである。
【００３０】
物質ライブラリーはベース要素４００上に配置してもよい。この場合、蓋要素２００が、その位置、サイズおよび形状がベース要素４００上の物質ライブラリー２０１の位置、サイズおよび形状によって区画形成された領域を有する基板要素２０２からなることは当業者には明らかである。光学的検出法を用いて標的−プローブ相互作用の解析を行う場合、蓋要素２００は、この場合、少なくともこの領域では透光性かつ非蛍光性である。
【００３１】
物質ライブラリー２０１は、タンパク質物質ライブラリー、ペプチド物質ライブラリー、および核酸物質ライブラリーであり得る。タンパク質物質ライブラリーは、特に、抗体
ライブラリー、受容体分子ライブラリー、および膜タンパク質ライブラリーであり得る。ペプチドライブラリーは、特に、受容体リガンドライブラリーであり得、受容体リガンドライブラリーは、生理活性ペプチドライブラリーおよびペプチドホルモンライブラリーであり得る。核酸物質ライブラリーは、特に、ＤＮＡ分子ライブラリーおよびＲＮＡ分子ライブラリーであり得る。ＤＮＡ分子ライブラリーの場合、特に、微生物のリボソームＤＮＡ配列が蓋要素２００上に堆積され得る。さらに、ＤＮＡ分子ライブラリーは、ＳＮＰ解析用の核酸物質ライブラリーであり得る。さらに、ＤＮＡ分子ライブラリーは、いわゆる「発現プロファイリング」を可能にするタンパク質物質ライブラリーまたは核酸物質ライブラリーであり得る。ＤＮＡ分子ライブラリーはコンビナトリアル物質ライブラリーのこともある。
【００３２】
この場合、物質ライブラリー２０１は、得られた室の試料空間と接触するように基板要素２０２上に堆積させる。したがって、本発明によれば、新たに作成された反応室の蓋要素２００は、その下面側に物質ライブラリーがついた検出表面を有し、少なくともその検出表面領域においては透光性であることを特徴とする。
【００３３】
本発明の有利な実施形態は、得られた反応室５００がシールされ、液体が漏れたり、試料が蒸発したりすることなく、時間の経過にわたって水性試料が最大１００℃までの温度に加熱され得るものである。
【００３４】
これらの有利な効果は、中間要素３００のシール材としての特性により達成される。さらに、中間要素は、弾性で、カニューレで繰返し穴開け可能であり、カニューレは抜去可能であり、カニューレ抜去後に中間要素からの液体の漏れは生じない。中間要素は、ポリジメチルシロキサン（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４または１８２の名前で入手可能）、天然ゴム、ブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ニトリル−ブタジエンゴム、ブチルゴム、イソプレン−スチレンゴム、ポリノルボルネンゴム、エチレン−プロピレンゴム、フルオロゴム（Ｂｉｔｏｎ、Ｔｅｃｎｏｌｆｌｏｎ、Ｆｌｕｏｒｅｌ、Ｄａｉｅｌの名前で入手可能）、ペルフルオロゴム（Ｋｌａｒｅｚの名前で入手可能）、メチル−フェニル−シリコンゴム、メチル−ビニル−シリコンゴム、メチル−フルオロ−シリコンゴム、フルオロ−シリコンゴム、ポリスルフィドゴム、ウレタンゴム、４，４′−メチレンジ（フェニルイソチオシアネート）またはトルエンジイソシアネートをベースとするポリエステルまたはポリエーテルプレポリマー（Ａｄｉｐｒｅｎ、Ｅｌａｓｔｏｔｈａｎｅ、Ｇｅｎｔｈａｎｅ、Ｕｒｅｐａｎ、Ｖｉｂｒａｔｈａｎの名前で入手可能）からなるのが好ましい。
【００３５】
本発明の範囲内で、中間要素３００は隔壁またはシール隔壁とも称される。
中間要素３００は閉じた凹部（以後、密閉凹部）３０１を有することを特徴とする。反応室５００の（３０１より与えられる）反応空間の容積を区画形成するこの凹部３０１によって、反応空間の形状も容積も異なり得る。反応空間３０１は以後、試料空間または室空間とも称される。
【００３６】
シール隔壁３００によって、容積が５〜１００μＬ、好ましくは１０〜５０μＬまたは１５〜４０μＬ、１５〜３５μＬもしくは１５〜２５μＬの反応空間３０１が形成されるのが好ましい。
【００３７】
物質ライブラリー２０１は、シール隔壁３００内の凹部３０１の形状に応じて種々の幾何学的配置で蓋要素２００上に堆積させることができ、物質ライブラリー２０１の配置形状は、シール隔壁３００の凹部３０１の形状にのみ依存する。
【００３８】
このシール隔壁３００の有利な設計によって、反応空間３０１を気泡なしに充填することができる。シール隔壁３００によって区画形成される反応空間の形状はＤ形であるのが
好ましく、別の有利な形状は、三日月、鎌またはミカンの１房の形状である。
【００３９】
本発明の有利な実施形態は、反応空間の幾何学的形状がシール隔壁３００によって区画形成され、その結果、反応空間は、装置全体１を改造することなく変えることができ、かつ個別の問題に応じてカスタマイズし得るものである。
【００４０】
本発明のさらなる有利な実施形態は、反応室５００がシール隔壁３００で密閉されることにより、一方では、チップの貯蔵寿命が増大し、他方では、分析時の汚染の危険が減少するものである。本発明のさらなる有利な実施形態は、シール隔壁３００の設計に応じて、蓋要素２００上に異なる外形寸法を有する物質ライブラリー２０１を堆積させて使用し得るものである。
【００４１】
本発明のさらなる有利な実施形態は、シール隔壁３００が任意の所望形状の凹部３０１を有するものである。シール隔壁３００は、その側面から繰返し穴を開けて試料室を充填し得るように弾性シール材料からなるのが好ましく、シール隔壁は、試料室の充填に用いたカニューレを抜去した後の液漏れが無いようにシールされる。この場合、シール隔壁３０は、ポリジメチルシロキサン（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４または１８２の名前で入手可能）、天然ゴム、ブタジエンゴム、クロロプレンゴム、ニトリル−ブタジエンゴム、ブチルゴム、イソプレン−スチレンゴム、ポリノルボルネンゴム、エチレン−プロピレンゴム、フルオロゴム（Ｂｉｔｏｎ、Ｔｅｃｎｏｌｆｌｏｎ、Ｆｌｕｏｒｅｌ、Ｄａｉｅｌの名前で入手可能）、ペルフルオロゴム（Ｋｌａｒｅｚの名前で入手可能）、メチル−フェニル−シリコンゴム、メチル−ビニル−シリコンゴム、メチル−フルオロ−シリコンゴム、フルオロ−シリコンゴム、ポリスルフィドゴム、ウレタンゴム、４，４′−メチレンジ（フェニルイソチオシアネート）またはトルエンジイソシアネートをベースとするポリエステルまたはポリエーテルプレポリマー（Ａｄｉｐｒｅｎ、Ｅｌａｓｔｏｔｈａｎｅ、Ｇｅｎｔｈａｎｅ、Ｕｒｅｐａｎ、Ｖｉｂｒａｔｈａｎの名前で入手可能）などの材料からなるのが好ましい。
【００４２】
試料室のベース要素４００は、一体化ヒーター／センサー基板を有するように設計するのが好ましい。ヒーター／センサー基板は、一般に、温度調節式加熱システムである。そのようなヒーター／センサー基板は、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ００／０６１０３号明細書に記載されている。
【００４３】
この場合、ベース要素４００は、少なくともシール隔壁３００の凹部によって区画形成された試料空間領域または蓋要素の検出表面によって区画形成された領域では透光性かつ非蛍光性である。ベース要素は、Ｂｏｒｏｆｌｏａｔ  ３３（ショット社から入手可能）、石英ガラス、単結晶ＣａＦ２（ショット社から入手可能）、および／または単結晶シリコンなどの材料からなるのが好ましい。ベース要素４００に一体化されたヒーター／センサー基板により、温度を、０〜１００℃、好ましくは０〜９５℃および／または５０〜９５℃の範囲内で±１℃に調整することができる。
【００４４】
本発明の１つの実施形態において、物質ライブラリー２０１はベース要素４００上に配置される。この場合、ベース要素も、そのサイズ、形状および位置が物質ライブラリー２０１の検出表面によって区画形成された領域内では透光性かつ非蛍光性でなければならない。物質ライブラリーをチップ上に配置し、このチップをベース要素４００に固定する場合、このチップは光学的に透明かつ半透明でなければならない。
【００４５】
本発明の１つの特定実施形態において、物質ライブラリー２０１は直接ベース要素４００上に配置される。この場合、ベース要素４００は、標的分子と物質ライブラリーのプローブ分子との相互作用の検出が光学的検出法では検出できないが、電子測定可能な変数、
例えば、インピーダンス、伝導率、電位、容量などによって検出できる電極構造を有し得る〔例えば、米国特許第６，０１３，１６６号明細書、同第６２８，５９０号明細書、同第６，２４５，５０８号明細書、同第５，９６５，４５２号明細書、チューら（Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ），“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”（２０００年），第２１巻参照〕。この場合、ベース要素４００も蓋要素２００も、物質ライブラリー２０１によって区画形成された領域で透光性かつ非蛍光性である必要はないが、そうであってもよい。
【００４６】
ベース要素４００、中間要素３００および蓋要素２００からなる積層反応室５００は、コアユニット５００とも称される。コアユニットを固定し、位置合わせするために、ベース要素４００と、中間要素３００と、蓋要素２００とを、互いに係合させ得る保持要素１０１および１０２内に設けられた凹部１１７内で積み重ねて配置する。
【００４７】
２つの保持要素を合わせて押し付けることにより、ベース要素と、中間要素と、蓋要素とからなるコアユニットが密閉圧縮される。そのために、好ましい実施形態では、互いに固定可能である保持要素１０１および１０２の凹部は、シール隔壁３００を側面に押し付ける返し（Ｗｉｄｅｒｌａｇｅｒ／Ｗｉｄｅｒｈａｋｅｎ）１１８を有する。このプロセスを妨げないように、シール隔壁３００は、伸縮継手３０２を有するように構成される。伸縮継手３０２があるにもかかわらずシール隔壁３００が保持要素１０１および１０２内に確実に安定配置されるように、シール隔壁３００はその４角に位置合わせ耳を有する。
【００４８】
別の実施形態において、蓋要素２００、中間要素３００およびベース要素４００は互いに膠着させ得る。
このようにして形成された密閉シール反応空間３０１に空き容積（デッドボリューム）なく注入するために、規定間隔で固定された少なくとも２つのカニューレを正確な位置で側面からシール隔壁３００内に挿入する。次いで、反応空間３０１のＤ形凹部の平坦面の角または三日月形凹部の角に針を刺す。このようにして、反応空間３０１、したがって反応室５００は入口と出口を有する。次いで、注射器で試料を反応室５００に注入する。同じように、反応室を空にしたり、試料液を例えば洗浄緩衝液と交換したりし得る。
【００４９】
反応空間３０１の形状は、高い再現性をもって気泡なしに試料液を充填し得るように流体的に設計される。充填後、針を抜去すると、弾性シール隔壁３００の挿入穴が閉じ、試料が圧密状態になって反応室５００内に密閉シールされる。全試料液が反応空間３０１内にあって、供給路または排出路にはないことが、カートリッジ１が空き容積なしに機能する理由である。
【００５０】
反応室５００を密閉シールすることにより、機械的応力を受けやすい物質ライブラリー２０１が損傷から保護される。本発明の別の利点は、高い汚染を受けやすい物質を検出する場合、分析開始まで、保護液や保護ガスなどの保護物質で反応空間３０１を充填し得ることである。そのような保護ガスは、アルゴンガス、窒素ガスおよび不活性ガスであるのが好ましい。表面結合物質ライブラリーが、例えばリボヌクレアーゼ感受性ＲＮＡ分子からなる場合、試料室５００は、分析開始まで、リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＤＥＰＣ水）で保護し得る。試料物質を充填している間に、保護物質を単純移動させて除去する。
【００５１】
さらに、製造プロセス中に、反応空間３０１に標準物質を供給し得る。ＰＣＲ用には、例えば、ヌクレオチドと、プライマーと、ポリメラーゼと、ＰＣＲ緩衝液との混合物が適当であろう。
【００５２】
本発明の有利な実施形態はコアユニット５００を冷却することができる。そのために、保持要素１０１および１０２は、種々の冷媒で操作し得る冷却通路を有し得る。冷媒は、
フルオロ炭化水素、Ｒ１３４、アンモニア、プロパンなどの揮発性炭化水素、冷却空気、液体または気体ＣＯ２などの冷却ガスであるのが好ましい。この有利な実施形態により、特にＰＣＲを正確に実行することができる。
【００５３】
例えば、ＣＯ２またはＲ１３４を用いることにより、カートリッジ内の試料を室温より明らかに低い温度にサーモスタット制御することができるが、これは、ハイブリダイゼーション反応に特に好ましい操作モードの１つである。本発明の有利な実施形態において、冷媒は、保持要素１０１および１０２に適切に一体化された冷媒入口１１２および１１７と冷媒出口１１６を介してコアユニット５００上に吹き込まれる。例えば、ＣＯ２または別の冷媒Ｒ１３４を用いて、コアユニットを室温より低い温度に冷却し得る。ヒーター／センサー基板４００により、室温より低い温度を±１℃の精度で調節し得る。その場合、カートリッジの利用可能操作範囲は、−３０〜１００℃、好ましくは０〜９５℃および／または５０〜９５℃である。
【００５４】
本発明の１つの有利な実施形態においては、互いに係合する２つのシェルの半分を構成するように互いに固定可能な２つの保持要素１０１および１０２が可能である。コアユニット５００を挟んで互いに固定された保持要素または互いに固定されたシェルの半分は、カートリッジ１とも称される装置を構成する。
【００５５】
本発明によれば、カートリッジは、上側保持要素１０１、蓋要素２００、中間要素３００、ベース要素４００、下側保持要素１０２である種々の構成要素を単純に積み重ねて配置し、一方の側面から組み立て得る。
【００５６】
カートリッジは、（冷媒１０５および加熱システム接点４０３用の）すべての媒体接続部が１つの側面１２０上に位置するように設計するのが有利である。
カートリッジは、媒体接続部１２０が位置する側面に凹部１０３を有し、この凹部１０３を介してこの側面から少なくとも２つのカニューレでシール隔壁３００に穴を開けて反応室５００を充填するように設計するのが有利である。
【００５７】
本発明の１つの有利な実施形態において、凹部１０３は、位置決めラグ１１０３を滑りばめして凹部に挿入できるように設計する。試料を反応室５００内に注入するために、本発明の１つの有利な実施形態では、規定間隔を空けて固定された少なくとも２つのカニューレを側面からシール隔壁３００内に挿入し、カートリッジ１の凹部１０３に挿入させ得る位置決めラグ１１０３とカートリッジ内の２つの位置決め穴（針ガイド１１３）により正確に配置し得る。試料は試料室５００の反応空間３０１内に注入されるが、同じように、これら２つのカニューレを介して試料室５００を空にしたり、液体試料を例えば洗浄緩衝液と交換したりすることもできる。
【００５８】
本発明の１つの有利な実施形態において、カートリッジ１は、凹部１０３および媒体接続部１２０の側にスナップクロージャ１０６を有するように設計する。これのおかげで、カートリッジ１を規定構造タイプ（例えば、１０００）の任意のコネクタに結合または接続させて、すべての媒体接続部を直ぐ利用可能にすることができる。本発明のこの有利な実施形態に対応するコネクタ１０００は、挿入カニューレ１２０１を位置決めラグ１１０３と一緒に運ぶスライド１１００を有する。スライド１１００は、充填または洗浄目的で試料室５００を開くためにサーボモーターによりカートリッジ１内に押し込まれる。試料室５００はスライド１１００を引き抜くと再密閉される。
【００５９】
カートリッジ１を充填するためのポンプやバルブなどのコンピュータ制御外部装置は、コネクタ１０００を介して接続し得る。カートリッジ１に関するコンピュータ制御温度調節器もコネクタ１０００を介して加熱要素の接点４０３に接続される。さらに、コンピュ
ータ制御冷媒供給装置もコネクタ１０００を介してこの目的で設けられたカートリッジ１の媒体接続部１０５に接続し得る。
【００６０】
コネクタ１０００は、出来る限り広く種々の装置に取り付けられるように薄くかつ小型に構成するのが好ましく、ねじ込み接続および固定に適した取付穴１００２と位置合わせピンホール１００１とを有する。
【００６１】
さらに、冷却通路１３００は、冷媒の加熱を防ぐよう断熱材から形成されている。必要な場合には、冷媒が、冷媒接続部１２０５を介して断熱冷却通路１３００に接続されている冷媒管１２０４を通って冷却通路１０５内に圧入される。
【００６２】
コネクタ１０００は、カートリッジ１に電力を供給するための電気ケーブル１２０６と電気接続部１２０７とを有する。
本発明の１つの有利な実施形態では、コネクタ１０００を介してカートリッジ１を完全自動操作することができる。
【００６３】
スライド１１００は、位置決めラグ１１０３をそのために設けられているカートリッジ１の凹部１０３内に挿入し得るように、滑りリニアベアリング（Ｇｌｅｉｔｌｉｎｅａｒｌａｇｅｒ）１００３で柔軟に支持されている。カニューレは、種々の溶液を試料室５００にポンプ注入し得る充填管１２０２に接続されている。スライドを電気機械的に駆動可能にするために、スライドは、駆動装置を取り付けるためのネジ山付きスライドロッド１２１０を有する。スライドロッド１２１０は、電気機械的駆動部のぎくしゃくした動きを相殺するように補正する機械的制振装置１２１２を備えている。したがって、経済的価格の駆動装置を用い得る。
【００６４】
さらに、数種の試料を異なるカートリッジで同時に分析できるようにするために、いくつかの上記コネクタ１０００を並列配置し得る。
本発明の１つの有利な実施形態において、カートリッジは、位置合わせピンホール１０８を有し、それを使ってＤＮＡ読取装置内に配置できるようにし、それによって画像フィールドまたは焦点の調整が不要になるように設計される。
【００６５】
本発明の有利な実施形態において、互いに固定可能な保持要素１０１および１０２は、プレスばめ１１５によって互いに対して単純に押し付けて結合させる２つのインターロッキング式シェルの半分である。
【００６６】
本発明の他の有利な実施形態において、カートリッジの２つの保持要素１０１および１０２はねじ留めされる。
本発明の別の有利な実施形態において、互いに固定可能な２つの保持要素１０１および１０２は、プラスチックから射出成形して便利に製造し得るように設計されており、したがって安価である。保持要素の製造に用いられる材料は、ポリカーボネートプラスチック（例えば、Ｍａｋｒｏｌｏｎの名前で入手可能）、骨材としてグラスファイバーを含み得るポリスチレン、着色もしくは非着色プレキシグラス、またはＳＰＳ  ＧＥ３０〔シュラテック社（ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｎｙ  Ｓｃｈｕｌａｔｅｃ）から入手可能〕であるのが好ましい。
【００６７】
本発明の１つの有利な実施形態において、カートリッジ１は、１回使用した後で廃棄し得るように設計される。それゆえ、使用後のいかなる形態での洗浄も不要になる。
本発明によれば、カートリッジ１の２つの保持要素１０２および１０２は、反応室の透光性を保証するためにコアユニット５００の上下に目視窓を有するように構成される。
【００６８】
本発明の１つの有利な実施形態において、カートリッジは、保持要素１０１の読出し光学素子の方に向いた面に光の散乱を抑制する反射防止構造１０９が存在するように構成される。この構造は、平行な狭い溝（リッフリング）形状を有するのが好ましい。反射構造として使用可能な他の形状は、こぶ、粗面構造、およびピラミッド配列である。カートリッジのこの有利な特性により、試料室で調べられる相互作用の解析に、多くの光学的方法（暗視野、入射光、斜光および透過光−蛍光測定、共焦点蛍光測定、ルミネセンス測定、リン光測定、吸光測定）を利用し得る。
【００６９】
本発明の別の有利な実施形態において、各カートリッジ１は、データマトリクス６００を介して個々に識別される。このために、カートリッジの組み立て時に、ヒーター／センサー基板４００に関するパラメータに加えて、導入された物質ライブラリー２０１をどのように解析し、首尾良く診断を下すためにカートリッジ１の試料をどのように取り扱うべきかに関する情報を含むデータセットがデータベースに記憶される。このデータセットには、データマトリクス６００としてカートリッジ上に付けられる番号が与えられる。データマトリクス６００の形式で記録された番号は、組み立て時に生成されたデータセットにアクセスする。そこで見出されたプロトコルに基いて、試料は完全自動処理される。ユーザーは、試料を注入し、解析結果を書き留めるだけでよい。
【００７０】
本発明の別の有利な実施形態において、試料室５００は、以後、インジェクター２０００とも称される手動充填スタンド２０００を用いて手で充填し得る。この装置は、試料などを注入するためだけのコネクタ機能を果たし、一体化急速閉鎖コネクタ２１０６を有する。
【００７１】
特に、この装置は、カートリッジ１の試料室５００の充填・排気空間と、カートリッジ１の受容空間とを有する。好ましくは、これらの空間は、付属カニューレ２４０２を有する試料液で充填された使い捨て注射器２４０１と単一の排気カニューレ２４０３とを受容するための空間であってよく、したがって、カートリッジ１の取り付け時には、これらのカニューレも同時に試料室５００の反応空間３０１内に入る。次いで、試料をカートリッジ１の試料室５００内に注入し得るが、試料室５００の排気は排気カニューレ２４０３を介して行われる。試料室５００の充填後、カートリッジ１をインジェクタ２０００から取り外し、さらなる処理のためにコネクタ１０００に取り付ける。注射器２４０１とカニューレ２４０２および２４０３は使い捨ての品なので、望ましくない物質による試料空間の汚染が回避される。
【００７２】
手動充填スタンド２０００は、本発明の装置１、充填ユニットおよび排気ユニットを固定するのに適した凹部を有する、２つの部分、すなわち、蓋２２００と本体２１００とからなる。充填ユニットはカニューレ２４０２がついた注射器２４０１であり、排気ユニットはカニューレ２４０３であるのが好ましい。蓋２２００および本体２１００は、任意の装置により互いに固定し得る。この固定は磁石によって生じるのが好ましい。
【００７３】
原則的に、本発明の装置１は、標的分子とマイクロアレイ上に固定されたプローブとの特異的相互作用に基くすべての試験法に用い得る。これらの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、核酸−核酸相互作用であり得る。
【００７４】
本発明の装置１は、タンパク質またはペプチドと、チップ上に固定された抗体ライブラリーとの相互作用を調べる試験手順に用いるのが好ましい。別の好ましい用途において、本発明の装置は、標的核酸と核酸プローブとの相互作用に関するマイクロアレイでの研究に用いられる。特に好ましい用途において、本発明の装置は臨床試料中の微生物の検出に用いられる。
【００７５】
別の特に好ましい実施形態において、本発明の装置１は、ＤＮＡ配列の存在を検出するのに用いられる。特定のＤＮＡ配列を検出することにより、例えば、病原体の存在および治療薬に対するそれらの耐性を推定することができる。本発明の装置１を細胞または生物の遺伝子状態の決定、例えば、遺伝病（例えば、ムコビシドーシス、フェニールケトン尿症、不妊症など）の原因となる突然変異の検出または多形の検出に用いるのも特に好ましい。個体の同定につながる遺伝子の相違の検出（例えば、特に、親子鑑定のための法医学分野での応用）も好ましい応用分野である。
【００７６】
プローブと標的との相互作用の検出は、一般に、慣用法、例えば、Ｃｙ３、テキサスレッドなどの蛍光マーカーを用いた光学分析、放射性マーカー、または銀析出などの化学反応により生じる（例えば、ＷＯ第９８／０４７４０号明細書参照）。
【００７７】
本発明の装置を、例えば発現プロファイリングによる細胞の生理状態の検出に用いるのも特に好ましい。この場合、例えば線形ＰＣＲ増幅による線形増幅が好ましい。
本発明の装置を、実施のために循環温度方式を必要とする他の増幅法、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）またはリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）と組み合わせて用いること、特にアレイ上での分析と組み合わせて用いることも特に好ましい。
【００７８】
本発明の装置は、マイクロアレイでの試験法を、完全自動化、温度制御およびフロー制御下に実施し得る。本発明の装置はさらに、中間体を再処理せずにマイクロアレイでの試験法とＰＣＲとを同時に実施し得る。
【００７９】
本発明の装置は、ＰＣＲによる核酸の増幅と、プローブとして核酸を利用するマイクロアレイでの試験によるＰＣＲ産物の解析とに同時に用いるのが好ましい。
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および／またはリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）などの反応も本発明の装置１で実施し得る。
【００８０】
本発明の装置１の構成は、マイクロアレイでの試験法を実施するために用い得る使い捨てカートリッジの費用効果的製造を可能にする。
以下の実施例は、本発明を例示することを目的とし、本発明を決して限定するものではない。
（実施例１：  ＰＣＲ）
カートリッジ１を図２に従って組み立てた。同時に、このカートリッジに関するすべての技術データおよびプロトコルをデータベースに記憶させた。カートリッジに、カートリッジ１とデータベース中の対応データセットとを自動的にリンクさせる個別ナンバーをつけた。その番号はデータマトリクス６００として印刷し、カートリッジ１上に糊付けした。
【００８１】
１μＬのコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のゲノムＤＮＡ（５ｐｇ／μＬ）と、１μＬのプライマー（ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧ）（１０ｐｇ／μＬ）と、１μＬのプライマー（ＴＡＣ  ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＴＣＧ  ＴＣＣ  ＣＴＡ）（１０ｐｇ／μＬ）と、１μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）と、５μＬのＰＣＲ緩衝液と、１μＬの５０倍ｄＮＴＰ（塩基当り１０ｍＭ）と、０．５μＬのＴａｑ−ポリメラーゼ（５単位／μＬ）と、３９．５μＬの水とからなるＰＣＲ混合物をカニューレ２４０２で注射器２４０１に吸い込ませた。
【００８２】
注射器および排気カニューレ２４０１、２４０２および２４０３をインジェクタ２０００の本体２１００内に配置し、蓋２２００をのせ、カートリッジ１をカートリッジポケット２００１内に滑り込ませた。次いで、２０μＬのＰＣＲ混合物を試料室５００に注入し
、カートリッジ１をインジェクタ２０００から取り外した。
【００８３】
ＰＣＲ混合物の残りを慣用のサーモサイクラー中で増幅させるために反応管に入れ、増幅させた。
カートリッジ１をコネクタ１０００に取り付け、データマトリクス６００の形式でコード化された個々のカートリッジ番号を読出し、自動的に操作プログラムに送信させた。この番号により、ＰＣＲに必要な技術データおよびプロトコルがデータベースから読出された。温度調節に関する技術データは温度制御装置に伝送された。反応空間３０１を密閉状態にしておくためにスライド１１００はカートリッジ１内に滑り込ませなかった。以下の温度プロトコルを用いてカートリッジ内でＰＣＲを実施した：４５℃下に２４０秒の初期変性、それぞれ９５℃下に６０秒、５８℃下に６０秒、７２℃下に１５０秒で３０回の伸長サイクル、７２℃下に４２０秒の最終伸長。
【００８４】
冷却時間をスピードアップするために、冷媒管および断熱冷却通路を介して冷媒として圧縮空気をカートリッジ内にポンプ注入した。ＰＣＲの後、試料室５００を開口するためにスライド１１００をカートリッジ１内に滑り込ませ、ＰＣＲ試料をポンプ排出させた。カートリッジの機能性を立証するために、試料を電気泳動用ゲル上にのせた。慣用のサーモサイクラーでの結果と比較したこの実験の成功は図９に記録されている。
（実施例２：  ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ）
カートリッジ１を図２に従って組み立てた。同時にこのカートリッジに関するすべての技術データおよびプロトコルをデータベースに記憶させた。カートリッジ１に、カートリッジ１とデータベース中の対応データセットとを自動的にリンクさせる個別番号をつけた。その番号はデータマトリクス６００として印刷し、カートリッジ１上に糊付けした。
【００８５】
カートリッジ１内に組み込まれているアレイとも称される蓋要素２００は、その表面上にチェスボードパターンで配列された４種の異なるプローブからなる物質ライブラリーを有していた。アレイの各要素は、２５６×２５６μｍのサイズであった。各プローブは、重複配置、すなわち、それぞれ１６スポット上に配置された。その表面構造のせいで、個々のスポットはラスタスキャンを有する。このＤＮＡライブラリーは、（ＰＣＲフラグメントに相補的な）配列Ｐ１と３種の異なる欠失変異体とからなっていた：
Ｐ１：５′ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣ  ３′
Ｐ１  ｄｅｌ９ １１：５′ＣＣＴＣＴＧＣＡＡＴＡＣＴＡＴＴＡＣ  ３′
Ｐ１  ｄｅｌ１０ １２：５′ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＴＡＴＴＡＣ  ３′
Ｐ１  ｄｅｌ９ １０ １１ １２：５′ＣＣＴＣＴＧＣＡＡＣＴＡＴＴＡＣ  ３′。（ｄｅｌ＝欠失の意）
以下の成分からなるＰＣＲ混合物を注射器２４０１に吸い込ませた：
５μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ緩衝液〔クロンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、米国パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）所在〕、１μＬのｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ２０ｍＭ、１μＬのＴａｑポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２、クロンテク社、米国パロアルト所在）、１μＬのプライマー  Ｐ１（１０ｐｍｏｌ／μＬ）（５′ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣ  ３′）〔ＭＷＧ社、独国エバースベルク（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）所在〕、蛍光染料シアニン３と５′末端で結合させた１μＬのプライマー  Ｐ２（１０ｐｍｏｌ／μＬ）（５′ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡＣＧ  ３′）（ＭＷＧ社、独国エバースベルク所在）、配列５′ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧ  ３′を有する１μＬのテンプレート１０６ｍｅｒＰＣＲ産物（１ｎｇ／μＬ）、４０μＬの脱イオン水。
【００８６】
注射器および排気カニューレ２４０１、２４０２および２４０３をインジェクタ２００
０の本体２１００内に配置し、蓋２２００をのせ、カートリッジ１をカートリッジポケット２００１内に滑り込ませた。次いで、２０μＬのＰＣＲ混合物を試料室５００に注入し、カートリッジ１をインジェクタ２０００から取り外した。
【００８７】
カートリッジ１をコネクタ１０００と接触させ、データマトリクス６００形態でコード化された個々のカートリッジ番号を読出し、自動的に操作プログラムに送信した。この番号により、ＰＣＲに必要な技術データおよびプロトコルがデータベースから読出された。温度調節に関する技術データは温度制御装置に伝送された。カートリッジ１の反応空間３０１を密閉状態にしておくためにスライド１１００はカートリッジ１内に滑り込ませなかった。以下の温度プロトコルを用いてカートリッジ内でＰＣＲを実施した：
９５℃下に１２０秒の初期変性、それぞれ９５℃下に３５秒、４２℃下に４０秒、７２℃下に４０秒で３０回の伸長サイクル、７２℃下に２４０秒の最終伸長。
【００８８】
冷却時間をスピードアップするために、冷媒管および断熱冷却通路を介して冷媒として圧縮空気をカートリッジ１内にポンプ注入した。
ＰＣＲの後、ＰＣＲ産物をＤＮＡアレイ上の表面結合ＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせた。そのために、カートリッジを５分間９５℃に加熱し、次いで、３０℃下に１時間インキュベートした。非特異的に結合したＤＮＡを表面から除去し、かつ結合しなかったフルオロフォアをカートリッジから除去するために洗浄プロセスを実施した。そのために、スライド１１００をカートリッジ１の凹部１０３内に滑り込ませ、カートリッジ１を３０℃に維持しながら、５００μＬの洗浄緩衝液１（２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）（流速毎分約０．１ｍＬ）を連続的にポンプ注入して試料室５００内のＰＣＲ試料を交換した。次いで、カートリッジを同じ流速および温度の５００μＬの洗浄緩衝液２（２×ＳＳＣ）で洗浄した。この洗浄プロセスの後、試料室５００は洗浄緩衝液２で充填されたままであった。スライド１１００を移動させて、試料室５００から流体接続を外した。
【００８９】
ツァイス蛍光顕微鏡〔ツァイス社（Ｚｅｉｓｓ）、独国イエーナ（Ｊｅｎａ）所在〕を用いて洗浄緩衝液２（２×ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションシグナルを検出した。白色光源およびシアニン３に適した１セットのフィルターにより入射光で励起が起こった。シグナルをＣＣＤカメラ〔ＰＣＯ社／ＳｅｎｓｉＣａｍ、独国ケールハイム（Ｋｅｈｌｈｅｉｍ）所在〕で記録した。露光時間は５０００ｍｓであった（図１０）。
（符号の説明）
１          カートリッジ
１０１      上側保持要素
１０２      下側保持要素
１０３      ラグ／スライド受容用凹部
１０４      目視窓
１０５      冷却液用媒体接続部
１０６      スナップばめ
１０８      位置合わせピンホール
４０３      加熱要素の接点
１２０      媒体接続側面
１０９      反射防止構造
６００      データマトリクス
１１７      冷却通路出口
１１８      返し（Ｗｉｄｅｒｌａｇｅｒ／Ｗｉｄｅｒｈａｋｅｎ）
４００      一体化ヒーター／センサー基板を有するベース要素
４０１      一体化ヒーター／センサー基板
４０２      透光性凹部
４０３      ヒーター／センサー基板の接点
４０４      ヒーター／センサー基板の接点
３００      繰返し穴開け可能な弾性シール中間要素
３０１      反応空間を区画形成する３００で囲まれた凹部
３０２      伸縮継手
３０４      位置合わせ耳
２００      蓋要素
２０２      蓋基板要素
２０１      物質ライブラリーまたは物質ライブラリーを有するチップ
５００      コアユニットまたは室または反応室または試料室
１０５      冷却通路
１０９      スナップばめ
１１０      スナップばめ
１１１      ヒーター／センサー基板接点４０３用凹部
１１２      冷媒入口
１１６      冷媒出口
１１７      冷媒入口
１１５      プレスばめ
１０００    コネクタ
１１００    スライド
１１０３    位置決めラグ
１００１    位置合わせピンホール
１００２    取付穴
１２０６    電気ケーブル
１２０７    電気接続部
１２０２    充填管
１２１０    スライドロッド
１２１１    ねじ山
１２１２    制振装置
１２０４    冷媒管
１２０５    冷媒接続部
１３００    冷却通路
１２０１    挿入カニューレ
２０００    手動充填スタンド
２１０６    急速閉鎖コネクタ
２４０１    使い捨て注射器
２４０４    カニューレ
２４０３    排気カニューレ
２４０２    カニューレの先端
２４０３    カニューレの先端
２１００    手動充填スタンド本体
２２００    手動充填スタンド蓋
２１０１    凹部付きグリップ
２１０２    凹部付きグリップ
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】２つの保持装置１０１および１０２と、データマトリクス６００との媒体接続側面１２０と、反射防止構造１０９と、媒体接続側面のスナップばめ１０６とからなる組立カートリッジ１の図。さらに、位置合わせピンホール１０８が示されている。
【図２】カートリッジ１の個々の構成要素の分解図。図面上部には、保持装置１０２、図面中間には、ベース要素４００と、中間要素３００と、蓋要素２００とからなるコアユニット５００、図面下部には、第２保持装置１０１が示されている。
【図３】コネクタ１０００に取り付けられたカートリッジ１の図。
【図４】カートリッジ端子板（Ａｎｓｃｈｌｕｓｓｌｅｉｓｔｅ）を表示するコネクタ１０００の図。
【図５】スライドを利用したカニューレ１２０１による反応空間３０１の開口の略図。
【図６】シール隔壁３００に穴を開け、反応空間３０１に入口１２０２と出口１２０３を形成するカニューレ１２０１による反応空間３０１の開口の詳細図。カニューレは、スライド１１００上の位置決めラグ１１０３とカートリッジ１の針ガイド１１３により試料室方向に配置される。
【図７】注射器２４０１が取り付けられ、蓋２２００が付けられ、カートリッジ１が取り付けられた充填スタンド２０００の図。
【図８】カニューレ２４０２がついた注射器２４０１と、排気カニューレ２４０３とが取り付けられた充填スタンドの本体２１００の図。
【図９】電気泳動用ゲルの画像。レーンＡには、質量標準ＤＮＡ（１００塩基対毎に１フラグメント）、レーンＢおよびＤには、慣用のサーモサイクラーで産生されたＰＣＲ産物、レーンＣおよびＥには、本発明のカートリッジ内で産生されたＰＣＲ産物をのせた。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡを増幅させた。増幅産物は約５００塩基対の長さを有する。図９から、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅にカートリッジ１を用い得ること、およびカートリッジ１が慣用のサーモサイクラーと同等に有効であることが明らかとなる。
【図１０】実施例２で実施されたＰＣＲ反応の解析。強いハイブリダイゼーションシグナルは、標識ＰＣＲ鎖に完全に相補的なＰ１配列が占めるスポットでのみ検出された。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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