(57)【要約】本発明は、捕捉された結合タンパク質、リポーター基を含む変異結合タンパク質、分析物透過性マトリックス中のリポーター基を含む変異結合タンパク質を有する組成物、ならびにin vitroおよびin vivoの両方における分析物バイオセンサーとしてのこれらの使用を対象とする。結合タンパク質は、フルオレセイン染料に共有結合されており、そのため、所与の試料中の分析物（たとえばグルコース）の濃度は蛍光信号の大きさに比例する。
2005539205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つの変異結合タンパク質、および前記変異結合タンパク質に結合され、前記変異結合タンパク質が様々なグルコース濃度に曝されたときに検出可能で可逆的な信号を生成する少なくとも１つのリポーター基と
ｂ）前記変異結合タンパク質を捕捉または封入することができる分析物透過性マトリックスと
を含むことを特徴とするグルコースバイオセンサー。
【請求項２】
前記検出可能で可逆的な信号は、前記様々な分析物濃度と相関していることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記変異結合タンパク質はグルコース／ガラクトース結合タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのアミノ酸置換を有することを特徴とする請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記アミノ酸置換は、位置１のシステイン、位置１のセリン、位置１１のシステイン、位置１４のシステイン、位置１９のシステイン、位置４３のシステイン、位置７４のシステイン、位置１０７のシステイン、位置１１０のシステイン、位置１１２のシステイン、位置１１３のシステイン、位置１３７のシステイン、位置１４９のシステイン、位置２１３のシステイン、位置２１６のシステイン、位置２３８のシステイン、位置２８７のシステイン、位置２９２のシステイン、位置１５２のシステイン、位置１８２のシステイン、位置２３６のシステインおよび位置２９６のシステインからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
位置１１２のシステインと位置２３８のセリン、位置１４９のシステインと位置２３８のセリン、位置１５２のシステインと位置１８２のシステイン、位置１５２のシステインと位置２１３のセリン、位置２１３のシステインと位置２３８のシステイン、位置１４９のシステインと位置２１３のアルギニン、位置１４９のシステインと位置２１３のシステイン、位置１４９のシステインと位置２１３のトレオニン、位置１４９のシステインと位置２１３のロイシン、位置１４９のシステインと位置２１３のチロシン、位置１４９のシステインと位置２２３のアスパラギン、位置１４９のシステインと位置２３８のシステイン、位置１４９のシステインと位置２５６のセリン、位置１４９のシステインと位置２５６のアルギニン、位置１５２のシステインと位置２１３のアルギニン、位置１５２のシステインと位置２２３のアスパラギン、位置２１３のシステインと位置２５５のシステインからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項４に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項７に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
位置１４９のシステイン、位置２１３のセリンおよび位置２３８のセリン；位置１４９のシステイン、位置２１３のアルギニンおよび位置２３８のセリン；位置１４９のシステイン、位置２１３のシステインおよび位置２３８のシステイン；位置１４９のシステイン、位置２１３のセリンおよび位置２２３のアスパラギン；および、位置１４９のシステイン、位置２２３のアスパラギンおよび位置２５６のアルギニンからなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項４に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
前記結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項９に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
位置１のセリン、位置１４９のシステイン、位置２１３のアルギニンおよび位置２３８のセリン；位置１のセリン、位置１４９のシステイン、位置２１３のセリンおよび位置２３８のセリン；および、位置１４９のシステイン、位置１８２のシステイン、位置２１３のシステインおよび位置２３８のセリンからなる群から選択される少なくとも４つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項４に記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
前記リポーター基は発光標識であることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
前記発光標識は約６００ナノメートルよりも長い励起波長を有することを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
前記発光標識は約６００ナノメートルよりも長い発光波長を有することを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
前記発光標識は、前記少なくとも１つのグルコース／ガラクトース結合タンパク質と共有結合していることを特徴とする請求項１３に記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
前記発光標識は、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、５−ＴＭＲＩＡ（テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミド）、Quantum Red（商標）、Texas Red（商標）、Ｃｙ３、Ｎ−（（２−ヨードアセトキシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンゾオキサジアゾール(IANBD)、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン(acrylodan)、ピレン、Lucifer Yellow、Ｃｙ５、Dapoxyl（登録商標）（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イルヨードアセトアミド(BODIPY（登録商標）507/545 IA)、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ−ヨードアセチルエチレンジアミン(BODIPY（登録商標）530/550 IA)、５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−ｌ−スルホン酸(1,5-IAEDANS)、およびカルボキシ−Ｘ−ローダミン、５／６−ヨードアセトアミド(XRIA 5,6)からなる群から選択される構成要素との反応によって、前記少なくとも１つのグルコース／ガラクトース結合タンパク質と共有結合的にカップリングしていることを特徴とする請求項１６に記載のバイオセンサー。
【請求項１８】
前記分析物はグルコースまたはガラクトースであることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサー。
【請求項１９】
前記分析物透過性マトリックスは、共有結合性架橋ヒドロゲル、透析膜、ゾル−ゲルおよびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項２０】
前記マトリックスは、約１０００から約２５，０００ダルトンの分子量カットオフを有する透析膜を含むことを特徴とする請求項１９に記載のバイオセンサー。
【請求項２１】
前記マトリックスは、ポリペプチド類、多糖類、多糖誘導体類、ポリビニルアルコール類、ポリアクリル酸類、ポリアクリルアミド類、ポリエチレングリコール類、スチレンと無水マレイン酸の共重合体、オレフィンと無水マレイン酸の共重合体、およびビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体からなる群から選択される共有結合性架橋ヒドロゲルを含むことを特徴とする請求項１９に記載のバイオセンサー。
【請求項２２】
前記架橋ヒドロゲルは、ポリ（ビニルアルコール）、Ｎ−メチル−４（４’−ホルミルスチリル）ピリジニウムアセタール塩を含むポリビニルアルコールであることを特徴とする請求項２１に記載のバイオセンサー。
【請求項２３】
前記マトリックスは、少なくとも１つの水溶性有機ポリオール成分と縮合した、少なくとも部分的に硬化した加水分解的に縮合性のシロキサンから選択されるゾル−ゲルを含むことを特徴とする請求項１９に記載のバイオセンサー。
【請求項２４】
前記マトリックスは、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールから選択される少なくとも１つの水溶性有機ポリオール成分を含むことを特徴とする請求項２３に記載のバイオセンサー。
【請求項２５】
少なくとも１つの水溶性ポリマー成分をさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載のバイオセンサー。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの水溶性ポリマー成分は、ポリビニルアルコール、スチレンと無水マレイン酸の共重合体、オレフィンと無水マレイン酸の共重合体、ビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体、ポリ（ビニルスルホン酸）塩、およびポリビニルピロリドンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載のバイオセンサー。
【請求項２７】
官能基化されたシリコーン添加剤をさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載のバイオセンサー。
【請求項２８】
前記官能基化されたシリコーン添加剤は、アルキル、アリール、アミン、アミド、チオール、シアノ、カルボキシル、エステル、オレフィン性、エポキシ、シリル、ニトロおよびハロゲンからなる群から選択される少なくとも１つの有機官能基を含むことを特徴とする請求項２７に記載のバイオセンサー。
【請求項２９】
ａ）少なくとも１つの変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質およびこれに結合した少なくとも１つのリポーター基を提供する工程と、
ｂ）前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質を分析物透過性マトリックス中に捕捉または封入する工程と、
ｃ）前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質を様々なグルコース濃度に曝す工程と、
ｄ）前記リポーター基からの信号を検出する工程と
を含むことを特徴とするグルコース検出法。
【請求項３０】
前記リポーター基を励起して前記信号を発することができるエネルギー源に、前記リポーター基を曝す工程をさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出は、前記様々なグルコース濃度に対応する可逆信号の検出を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出は、連続検出、プログラム検出、散発的検出またはこれらの組合せであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
工程ｃ）をin vivoで実施することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのアミノ酸置換を有することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記アミノ酸置換は、位置１のシステイン、位置１のセリン、位置１１のシステイン、位置１４のシステイン、位置１９のシステイン、位置４３のシステイン、位置７４のシステイン、位置１０７のシステイン、位置１１０のシステイン、位置１１２のシステイン、位置１１３のシステイン、位置１３７のシステイン、位置１４９のシステイン、位置２１３のシステイン、位置２１６のシステイン、位置２３８のシステイン、位置２８７のシステイン、位置２９２のシステイン、位置１５２のシステイン、位置１８２のシステイン、位置２３６のシステインおよび位置２９６のシステインからなる群から選択されることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記結合タンパク質は、位置１１２のシステインおよび位置２３８のセリン；位置１４９のシステインおよび位置２３８のセリン；位置１５２のシステインおよび位置１８２のシステイン；位置１５２のシステインおよび位置２１３のセリン；位置２１３のシステインおよび位置２３８のシステイン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のアルギニン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のシステイン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のトレオニン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のロイシン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のチロシン；位置１４９のシステインおよび位置２２３のアスパラギン；位置１４９のシステインおよび位置２３８のシステイン；位置１４９のシステインおよび位置２５６のセリン；位置１４９のシステインおよび位置２５６のアルギニン；位置１５２のシステインおよび位置２１３のアルギニン；位置１５２のシステインおよび位置２２３のアスパラギン；位置２１３のシステインおよび位置２５５のシステイン；位置１４９のシステイン、位置２１３のセリンおよび位置２３８のセリン；位置１４９のシステイン、位置２１３のアルギニンおよび位置２３８のセリン；位置１４９のシステイン、位置２１３のシステインおよび位置２３８のシステイン；位置１４９のシステイン、位置２１３のセリンおよび位置２２３のアスパラギン；位置１４９のシステイン、位置２２３のアスパラギンおよび位置２５６のアルギニン；位置１のセリン、位置１４９のシステイン、位置２１３のアルギニンおよび位置２３８のセリン；ならびに、位置１４９のシステイン、位置１８２のシステイン、位置２１３のシステインおよび位置２３８のセリンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換の組合せを有することを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのリポーター基は発光標識であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記発光標識は約６００ナノメートルよりも長い励起波長を有することを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記発光標識は約６００ナノメートルよりも長い発光波長を有することを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記発光標識は、前記少なくとも１つの変異結合タンパク質と、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、５−ＴＭＲＩＡ（テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミド）、Quantum Red（商標）、Texas Red（商標）、Ｃｙ３、Ｎ−（（２−ヨードアセトキシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンゾオキサジアゾール(IANBD)、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン(acrylodan)、ピレン、Lucifer Yellow、Ｃｙ５、Dapoxyl（登録商標）（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イル）ヨードアセトアミド(BODIPY（登録商標）507/545 IA)、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ−ヨードアセチルエチレンジアミン(BODIPY（登録商標）530/550 IA)、５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−ｌ−スルホン酸(1,5-IAEDANS)、およびカルボキシ−Ｘ−ローダミン、５／６−ヨードアセトアミド(XRIA 5,6)からなる群から選択される構成要素との反応によって、前記少なくとも１つのグルコース／ガラクトース結合タンパク質と共有結合していることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
ａ）位置１のシステイン、位置１のセリン、位置１１のシステイン、位置１４のシステイン、位置１９のシステイン、位置４３のシステイン、位置７４のシステイン、位置１０７のシステイン、位置１１０のシステイン、位置１１２のシステイン、位置１１３のシステイン、位置１３７のシステイン、位置１４９のシステイン、位置２１３のシステイン、位置２１６のシステイン、位置２３８のシステイン、位置２８７のシステイン、位置２９２のシステイン、位置１５２のシステイン、位置１８２のシステイン、位置２３６のシステインおよび位置２９６のシステインからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質と、
ｂ）分析物透過性マトリックスと、
ｃ）少なくとも１つのリポーター基と
の混合物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４４】
前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記結合タンパク質は、位置１１２のシステインおよび位置２３８のセリン；位置１４９のシステインおよび位置２３８のセリン；位置１５２のシステインおよび位置１８２のシステイン；位置１５２のシステインおよび位置２１３のセリン；位置２１３のシステインおよび位置２３８のシステイン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のアルギニン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のシステイン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のトレオニン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のロイシン；位置１４９のシステインおよび位置２１３のチロシン；位置１４９のシステインおよび位置２２３のアスパラギン；位置１４９のシステインおよび位置２３８のシステイン；位置１４９のシステインおよび位置２５６のセリン；位置１４９のシステインおよび位置２５６のアルギニン；位置１５２のシステインおよび位置２１３のアルギニン；位置１５２のシステインおよび位置２２３のアスパラギン；位置２１３のシステインおよび位置２５５のシステイン；位置１４９のシステイン、位置２１３のセリンおよび位置２３８のセリン；位置１４９のシステイン、位置２１３のアルギニンおよび位置２３８のセリン；位置１４９のシステイン、位置２１３のシステインおよび位置２３８のシステイン；位置１４９のシステイン、位置２１３のセリンおよび位置２２３のアスパラギン；位置１４９のシステイン、位置２２３のアスパラギンおよび位置２５６のアルギニン；位置１のセリン、位置１４９のシステイン、位置２１３のアルギニンおよび位置２３８のセリン；位置１のセリン、位置１４９のシステイン、位置２１３のセリンおよび位置２３８のセリン；ならびに、位置１４９のシステイン、位置１８２のシステイン、位置２１３のシステインおよび位置２３８のセリンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換の組合せを含むことを特徴とする請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質は少なくとも１つのヒスチジンタグをさらに含むことを特徴とする請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
少なくとも１つのリポーター基は発光標識であることを特徴とする請求項４５に記載の組成物。
【請求項４８】
前記発光標識は約６００ナノメートルよりも長い励起波長を有することを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記発光標識は約６００ナノメートルよりも長い発光波長を有することを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
【請求項５０】
前記発光標識は、前記少なくとも１つの変異結合タンパク質と、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、５−ＴＭＲＩＡ（テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミド）、Quantum Red（商標）、Texas Red（商標）、Ｃｙ３、Ｎ−（（２−ヨードアセトキシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンゾオキサジアゾール(IANBD)、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン(acrylodan)、ピレン、Lucifer Yellow、Ｃｙ５、Dapoxyl（登録商標）（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イル）ヨードアセトアミド(BODIPY（登録商標）507/545 IA)、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ−ヨードアセチルエチレンジアミン(BODIPY（登録商標）530/550 IA)、５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−ｌ−スルホン酸(1,5-IAEDANS)、およびカルボキシ−Ｘ−ローダミン、５／６−ヨードアセトアミド(XRIA 5,6)からなる群から選択される構成要素との反応によって、前記少なくとも１つのグルコース／ガラクトース結合タンパク質と共有結合していることを特徴とする請求項４７に記載の組成物。
【請求項５１】
前記分析物透過性マトリックスは、共有結合性架橋ヒドロゲル、透析膜、ゾル−ゲルおよびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の組成物。
【請求項５２】
前記マトリックスは、約１０００から約２５，０００ダルトンの分子量カットオフを有する透析膜を含むことを特徴とする請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記マトリックスは、ポリペプチド類、多糖類、多糖誘導体類、ポリビニルアルコール類、ポリアクリル酸類、ポリアクリルアミド類、ポリエチレングリコール類、スチレンと無水マレイン酸の共重合体、オレフィンと無水マレイン酸の共重合体、およびビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体からなる群から選択される共有結合性架橋ヒドロゲルを含むことを特徴とする請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記共有結合性架橋ヒドロゲルは、ポリ（ビニルアルコール）およびＮ−メチル−４（４’−ホルミルスチリル）ピリジニウムアセタール塩を含むポリビニルアルコールを含むことを特徴とする請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記マトリックスは、少なくとも１つの水溶性有機ポリオール成分と縮合した、少なくとも部分的に硬化した加水分解的に縮合性のシロキサンから選択されたゾル−ゲルを含むことを特徴とする請求項５１に記載の組成物。
【請求項５６】
前記水溶性有機ポリオール成分は、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールから選択されることを特徴とする請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも１つの水溶性ポリマー成分をさらに含むことを特徴とする請求項５５に記載の組成物。
【請求項５８】
前記水溶性ポリマー成分は、ポリビニルアルコール、スチレンと無水マレイン酸の共重合体、オレフィンと無水マレイン酸の共重合体、ビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体、ポリ（ビニルスルホン酸）塩、およびポリビニルピロリドンから選択されることを特徴とする請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
官能基化されたシリコーン添加剤をさらに含むことを特徴とする請求項５５に記載の組成物。
【請求項６０】
前記官能基化されたシリコーン添加剤は、アルキル、アリール、アミン、アミド、チオール、シアノ、カルボキシル、エステル、オレフィン、エポキシ、シリル、ニトロおよびハロゲンからなる群から選択される少なくとも１つの有機官能基を含むことを特徴とする請求項５９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオテクノロジー分野に属する。詳細には本発明は、捕捉された変異結合タンパク質、リポーター基を含む変異結合タンパク質、分析物透過性マトリックス中のリポーター基を含む変異結合タンパク質からなる組成物、およびin vitroおよびin vivo分析物バイオセンサーとしてのこれらの使用とを対象とする。
【背景技術】
【０００２】
グルコース濃度を監視して糖尿病患者の適切な代謝制御を容易にすることは望ましい目標であり、これによって多くの人の寿命は向上するであろう。現在、大部分の糖尿病患者は、血中グルコースレベルを監視するのに「指穿刺(finger stick)」法を使用しているが、頻繁な穿刺（日に数回）によって生じる痛みのため、患者が指示どおりにおこなっているかどうかは疑わしい。そのため、血中グルコースまたはグルコースを含む他の体液を頻繁および／または連続的に監視する非侵襲性またはできるだけ侵襲性の低いin vivo法、およびより効率的なin vitro法を開発する努力が続けられてきた。これらのうち最も有望ないくつかの方法はバイオセンサーの使用を伴う。バイオセンサーは、トランスデューサ（検出）要素に結合した生物学的認識要素を使用して、特定の定量的または半定量的分析情報を提供することができるデバイスである。
【０００３】
バイオセンサーの生物学的認識要素は選択性を決定し、そのため測定される化合物だけが信号を引き起こす。この選択は、リガンド（たとえばグルコース）の化学構造が変化しない場合のリガンドの生化学的認識に基づいてもよく、または生化学的認識要素が分析物の生化学反応を触媒する生体触媒作用に基づいてもよい。
【０００４】
トランスデューサ要素は、生物学的認識要素の認識結果を半定量的または定量的な信号に変換する。可能なトランスデューサ技術は、光学、電気化学、音響／機械または比色定量技術である。これまでに利用された光学特性は、吸光度、蛍光／りん光、生物発光／化学発光、反射率、光散乱および屈折率を含む。蛍光化合物などの慣用のリポーター基を使用してもよく、あるいはまた、標識の必要なしで光学的に直接に検出できる状況もある。
【０００５】
信号変換のための生物学的要素として使用される、グルコースを検出するために特に設計されるバイオセンサーは、典型的には、グルコースオキシダーゼ活性の電気化学検出または比色検出を使用する。この方法の使用は、特に酸素レベルの影響、血液中の阻害物質の存在および電極にまつわる問題に起因する難点を伴う。さらに、検出によって分析物が消費され、低いグルコース濃度を測定するときにはこのことが問題になる可能性がある。
【０００６】
バイオセンサーの開発が急速に進んでいる領域は、蛍光標識されたペリプラズム結合タンパク質（ＰＢＰ）の使用である。非特許文献１に報告されているように、標識されたマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、有用なマルトースセンサーであることが示された。この研究では、もともとシステイン残基を持たないＭＢＰを変異させて、位置３３７に単一のシステイン残基を有するタンパク質（Ｓ３３７Ｃ）を得た。この変異位置は、マルトース結合間隙(cleft)内にあり、マルトースが結合すると大きな環境変化を受けた。多数のフルオロフォアが調査され、そのうちのいくつかはリガンド結合をブロックし、またはタンパク質の立体配座の変化を妨害した。調査したフルオロフォアのうち、ＩＡＮＢＤでは、マルトース結合後、蛍光強度が大幅に増大した（１６０％）。この結果は、マルトース結合時のヒンジの閉鎖に関して理論的に予測されたように、親水性すなわち溶媒露出環境からより疎水性の高い環境へ変化するフルオロフォアの位置と一致する。しかし、この変異タンパク質および関連リポーター基は、哺乳動物の体液中の診断上重要な糖と結合しない。このタンパク質とＴｉＯ2表面との会合が開示されているが、この表面結合タンパク質には、時間とともに活性が低下し、定常的な水和が必要であるという欠点がある（非特許文献２）。
【０００７】
Hellinga他の特許文献１は、システイン残基を含むように変異させたガラクトース／グルコース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）に蛍光トランスデューサを導入することによって、グルコース結合時に生じる大規模な立体配座の変化を利用するグルコースバイオセンサーの設計を報告している。Hellinga他の特許文献１は、変異ＧＧＢＰの立体配座の変化の伝達を利用して、アロステリックカップリング機構を介してグルコース結合事象を蛍光の変化に変換する、統合された信号変換機能を構築することができることを開示している。この蛍光変換機能は、ＧＧＢＰの糖結合ポケットの固有の結合特性を最低限度しか妨害しないと報告されている。
【０００８】
血液、間質液、眼溶液、または汗などのような生物学的溶液中のグルコース濃度を正確に決定するためには、対象の生物学的溶液の生理的および／または病理学的作働範囲と調和するようにバイオセンサーの感知分子の結合定数を調整することが望ましい。適切な結合定数を持たなければ、特定の生理的および／または病理学的濃度に関して、信号が範囲外となる可能性がある。さらに、Lakowiczの特許文献２に開示されているように、バイオセンサーは、それぞれが異なる結合定数を有する２種類以上のタンパク質を使用して、広い範囲のグルコース濃度にわたって正確な測定値を与えるように構成することができる。
【０００９】
変異ＧＧＢＰの有用性にもかかわらず、リポーター基の有無のいずれにおいても、これらのタンパク質のわずかのものが、設計および試験されたにすぎない。特定の部位の変異および／またはある種のリポーター基の結合は、予測不可能な方法で結合定数を変化させる働きをする。さらに、リポーター基を含むバイオセンサーは望ましい結合定数を有する可能性があるが、分析物の結合後に容易に検出可能な信号を生成しない。具体的な分析物の検出のために特定のタンパク質に結合させた特定のリポータープローブの感度を決定する最優先の因子の１つが、選択されるプローブとタンパク質のアミノ酸残基との間の具体的な相互作用の性質であることは従来技術から明らかである。タンパク質内のこれらの相互作用をコンピュータ計算法を使用して予測することは現在のところ不可能であり、および合理的な設計方法論を使用してリポータープローブの選択を最適化することも不可能である。さらに、タンパク質中のリポーター基の位置に基づいて結合定数に対する効果を予測すること（またはその逆）も不可能である。
【００１０】
無試薬で、自己充足的の、および／または埋込み可能な、および／または再使用可能なバイオセンサータンパク質を開発するためには、トランスデューサ要素が、トランスデューサ要素に対しておよび該トランスデューサ要素からの信号をインターロゲートする検出デバイスと連絡していなければならない。典型的な方法は、光ファイバまたは平面導波路の内部または表面に、固定化法を使用してタンパク質を配置することを含む。このような固定化法は、半透膜、有機ポリマーマトリックスまたは無機ポリマーマトリックスの中にタンパク質を捕捉することを含むが、それらに限定されるものではない。使用する固定化法は、作動中のバイオセンサーの性能を最終的に決定する。従来技術は、生体分子の固定化に関連した数多くの問題を詳述している。たとえば、多くのタンパク質は、立体配座の不可逆的な変化、変性および生化学的活性の損失を受ける。固定化されるタンパク質は、任意の特定の表面に可能な多数の配向で存在することができる。たとえば、あるタンパク質は活性部位が露出するように配向し、他のタンパク質は活性部位が露出しないように配向し、したがって分析物との選択的な結合反応を経験することができない。また、固定化されるタンパク質は、時間に依存した変性、固定化中の変性、および固定化後に捕捉されたタンパク質の浸出にさらされる。これによって、たとえば、検知装置の較正を維持できないこと、および信号のドリフトを含む問題点が生じる。一般的に、結合タンパク質は、その有効な使用を可能にするための配向制御を必要とし、したがって、文献に教示された物理的吸収およびランダムまたはバルク表面共有結合または固定化法は概して成功していない。
【００１１】
低温ゾル−ゲル処理法によって形成される単純な無機シリコンマトリックス中にタンパク質および他の生物学的システムを封入するいくつかの報告がある（たとえば非特許文献３および非特許文献４）。いくつかのゾル−ゲルマトリックスは光学的に透明であり、そのため、これらのマトリックスは、光学変換、たとえば吸収または蛍光分光学的方法に依存する化学および生化学センサーの開発に有用である。しかし、機能的であるためには、捕捉または固定化された結合タンパク質が、少なくとも、分析物によって誘発される何らかの立体配座の変化を受けることができなければならない。文献に教示された大部分のゾル−ゲルマトリックスでは、結合タンパク質の立体配座の変化が実質的に限定される。ゾル−ゲルに捕捉されたタンパク質は、劇的に変化した結合定数、あるいは比較的に短い時間でまたは様々な環境条件下で変化する結合定数を示す可能性があることが報告されている。さらに、ゾル−ゲルマトリックスの中に捕捉されたタンパク質の機能は時間に依存すると報告されており、この時間に依存する特性は、in vitroおよびin vivo用途のためのバイオセンサーへのゾル−ゲルの一般的な適用可能性を制限する特性である。
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，２７７，６２７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１９７，５３４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５１７，３１３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９１０，６６１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８９４，３５１号明細書
【特許文献６】米国特許第５，３４２，７８９号明細書
【非特許文献１】Cass, Anal Chem. 1994, 66, 3840-3847
【非特許文献２】Cass, Analytical Chemistry 1998, 70 (23), 5111-5113
【非特許文献３】Brennan, J. D., Journal of Fluorescence 1999, 9 (4), 295-312
【非特許文献４】Flora, K., Brennan, J. D., Analytical Chemistry 1998, 70 (21), 4505-4513
【非特許文献５】N. K. Vyas, M. N. Vyas, F. A. Quiocho, Science 1988, 242, 1290-1295
【非特許文献６】S. L. Mowbray, R. D. Smith, L. B. Cole, Receptor 1990, 1, 41-54
【非特許文献７】Turcatti et al., J Bio. Chem. 1996 271, 33, 19991-19998
【非特許文献８】Greg T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1996, San Diego, pp. 4-16
【非特許文献９】H. J. Gruber et al., Bioconjugate Chem. (2000), 11, 161-166
【非特許文献１０】Beach, R. D. et al., IEEE Transactions on Instrumentation and Measurement (1999) 48, 6, p. 1239-1245
【非特許文献１１】Quinn, C. P., Pathak, C. P., Heller, A., Hubbell, I. A., Biomaterials 1995, 16 (5), 389-396
【非特許文献１２】Quinn, C. A. P., Connor, R. E., Heller, A., Biomaterials 1997, 18 (24), 1665-1670
【非特許文献１３】"Biosensors Fundamentals and Applications", edited by A. D. F. Turner, I. Karube, G. S. Wilson; published from Oxford University Press, in 1988
【非特許文献１４】Gill and Ballesteros, Journal of the American Chemical Society, 1998, 120 (34), 8587-8598
【非特許文献１５】Cass, A. et al., Anal. Chem. 1994, 66, 3840-3847
【非特許文献１６】Pisarchick and Thompson (1990)
【非特許文献１７】Kunkel (1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、当技術分野では、バイオセンサーとして使用するための、分析物が結合すると検出可能で可逆的な信号を生成するさらなる有用な変異タンパク質および変異ＧＧＢＰタンパク質を設計することが求められており、さらに、信号送信要素および受信要素とインターフェースをとるための分析物透過性マトリックス中に、これらタンパク質を組み込むことが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、in vivoまたはin vitroバイオセンサーとして使用する、捕捉または封入された変異結合タンパク質、およびこれに結合したリポーター基を有する変異結合タンパク質を提供する。さらに、本発明は、（ａ）変異結合タンパク質と、この変異結合タンパク質に結合され、変異結合タンパク質がグルコースに曝されたときに検出可能な信号を生成する少なくとも１つのリポーター基と、（ｂ）変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質およびリポーター基をその中に封入することができる分析物透過性マトリックスとを含むグルコースバイオセンサーを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、（ａ）少なくとも１つの変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質およびこれに結合した少なくとも１つのリポーター基と、（ｂ）分析物透過性マトリックスを提供するヒドロゲル、透析膜、ゾル−ゲルまたはこれらの組合せとを含む混合物を含み、変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質およびリポーター基はマトリックス中に封入されている組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、（ａ）位置３３７にシステインを含む変異マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、および変異ＭＢＰがマルトースに結合したときに検出可能な信号を生成するように結合される少なくとも１つのリポーター基と、（ｂ）マルトース透過性マトリックスとを含み、変異ＭＢＰおよびリポーター基はマトリックス中に封入されているデバイスを提供する。
【００１７】
本発明はさらに、（ａ）変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質、および変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質が様々なグルコース濃度に曝されたときに検出可能で可逆的な信号を生成するように結合される少なくとも１つのリポーター基と、（ｂ）分析物透過性マトリックスとを含み、変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質およびリポーター基はマトリックス中に封入されている、in vivoでの使用に適したデバイスおよびその組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
用語バイオセンサーは、一般的に、分離された酵素、免疫系、組織、細胞小器官または細胞全体によって媒介される特定の生化学反応を使用して、化合物を、通常は電気、熱または光信号によって検出するデバイスを指す。本明細書で使用するときに、用語「バイオセンサー」は、分析物に結合することができるタンパク質であって、本明細書に記載の検出手段によって分析物または分析物濃度の変化を検出する目的に使用することができるタンパク質を指す。具体的には、本発明のバイオセンサーは、少なくとも１つの変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質およびこれに結合した少なくとも１つのリポーター基と、分析物を透過させることができるマトリックスとを含み、変異グルコース／ガラクトース結合タンパク質およびリポーター基はマトリックスの中に封入することができる。
【００１９】
用語「結合タンパク質」は、記載される方法を用いて、分析物が存在しない場合の信号、時間とともに濃度が変化する分析物が存在する場合の信号から区別できる検出可能および／または可逆的な信号を変換または提供することができるような方法で、あるいは濃度に依存した方法で、特定の分析物と相互作用するタンパク質を指す。この変換事象は、１回だけの適用または再使用可能な適用を含む連続手段、プログラム手段および散発的(episodic)手段を含む。分析物の存在または濃度との相関が確立されている場合、可逆信号変換は、瞬時であっても時間依存であってもよい。変換が達成されるような方法で変異させた結合タンパク質が好ましい。
【００２０】
本明細書で使用する用語「ガラクトース／グルコース結合タンパク質」すなわち「ＧＧＢＰ」、あるいは「マルトース結合タンパク質」すなわち「ＭＢＰ」は、天然の細菌のペリプラズム区画に見出されるタイプのタンパク質を指す。自然の状態において、これらのタンパク質は、走化性および小分子（たとえば糖、アミノ酸および小ペプチド）の細胞質中への輸送に関与する。たとえば、ＧＧＢＰは、３本の鎖によって接続されてヒンジを形成した２つの球状α／βドメインからなる単鎖タンパク質である。結合部位は、２つのドメイン間の間隙に位置する。グルコースが結合部位に入ると、ＧＧＢＰは、ヒンジを中心とした立体配座の変化を受け、これによって２つのドメインが一緒になり、結合部位にグルコースが捕捉される。E.coli（非特許文献５）およびS.Typhimurium（非特許文献６）の閉鎖形のＧＧＢＰのＸ線結晶構造が決定された。これらのＸ線結晶構造はそれぞれ、Protein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb/）から２ＧＢＰおよび３ＧＢＰとして入手可能である。野生型E.coliのＧＧＢＰのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/に登録番号Ｄ９０８８５（ゲノムクローン）および登録番号２３０５２０（アミノ酸配列）として出ている。好ましいＧＧＢＰはE.coliのＧＧＢＰである。
【００２１】
本明細書で使用する際に、用語「変異結合タンパク質」（たとえば「変異ＧＧＢＰ」）は、天然のタンパク質に存在するアミノ酸が置換したアミノ酸、天然のタンパク質に存在するアミノ酸から欠落したアミノ酸、または天然のタンパク質に存在するアミノ酸に付加されたアミノ酸を含む、細菌由来の結合タンパク質を指す。このような置換、欠失または挿入には５アミノ酸未満、より好ましくは１つまたは２つのアミノ酸残基が関与することが好ましい。結合タンパク質の例示的な変異には、システイン基の付加または置換、非天然アミノ酸（非特許文献７）、および実質的に非反応性のアミノ酸を、電気化学または光反応性リポーター基の共有給合を提供する反応性のアミノ酸で置換することなどが含まれる。「反応性」アミノ酸は、チオール反応性染料を用いたシステインの標識化のように、標識化剤で修飾することができるアミノ酸を意味する。非反応性アミノ酸には、タンパク質に組み込まれた後に容易に修飾されない側鎖を持つアラニン、ロイシン、フェニルアラニンなどのアミノ酸が含まれる（アミノ酸側鎖の反応性の分類については非特許文献８を参照されたい）。
【００２２】
ＧＧＢＰタンパク質の例示的な変異には、位置１１のリシンを置換したシステイン（Ｋ１１Ｃ）；位置１４のアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ１４Ｃ）；位置１９のバリンを置換したシステイン（Ｖ１９Ｃ）；位置４３のアスパラギンを置換したシステイン（Ｎ４３Ｃ）；位置７４のグリシンを置換したシステイン（Ｇ７４Ｃ）；位置１０７のチロシンを置換したシステイン（Ｙ１０７Ｃ）；位置１１０のトレオニンを置換したシステイン（Ｔ１１０Ｃ）；位置１１２のセリンを置換したシステイン（Ｓ１１２Ｃ）；位置１１２のセリンを置換したシステインおよび位置２３８のロイシンを置換したセリンを含む２重変異（Ｓ１１２Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）；位置１１３のリシンを置換したシステイン（Ｋ１１３Ｃ）；位置１３７のリシンを置換したシステイン（Ｋ１３７Ｃ）；位置１４９のグルタミン酸を置換したシステイン（Ｅ１４９Ｃ）；位置１４９のグルタミン酸を置換したシステインおよび位置２３８のロイシンを置換したセリンを含む２重変異（Ｅ１４９／Ｌ２３８Ｓ）；位置１５２のヒスチジンを置換したシステインおよび位置１８２のメチオニンを置換したシステインを含む２重変異（Ｈ１５２Ｃ／Ｍ１８２Ｃ）；位置２１３のアラニンを置換したセリンおよび位置１５２のヒスチジンを置換したシステインを含む２重変異（Ｈ１５２Ｃ／Ａ２１３Ｓ）；位置１８２のメチオニンを置換したシステイン（Ｍ１８２Ｃ）；位置２１３のアラニンを置換したシステイン（Ａ２１３Ｃ）；位置２１３のアラニンを置換したシステインおよび位置２３８のロイシンを置換したシステインを含む２重変異（Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ）；位置２１６のメチオニンを置換したシステイン（Ｍ２１６Ｃ）；位置２３６のアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ２３６Ｃ）；位置２３８のロイシンを置換したシステイン（Ｌ２３８Ｃ）；位置２８７のアスパラギン酸を置換したシステイン（Ｄ２８７Ｃ）；位置２９２のアルギニンを置換したシステイン（Ｒ２９２Ｃ）；位置２９６のバリンを置換したシステイン（Ｖ２９６Ｃ）；位置１４９のグルタミン酸を置換したシステイン、位置２１３のセリンを置換したアラニンおよび位置２３８のロイシンを置換したセリンを含む３重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｓ／Ｌ２３８Ｓ）；位置１４９のグルタミン酸を置換したシステイン、位置２１３のアラニンを置換したアルギニンおよび位置２３８のロイシンを置換したセリンを含む３重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）；位置１のセリン、位置１４９のシステイン、位置２１３のアルギニンおよび位置２３８のセリンを含む４重変異（Ａ１Ｓ／Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）；位置１のセリン、位置１４９のシステイン、位置２１３のセリンおよび位置２３８のセリンを含む４重変異（Ａ１Ｓ／Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｓ／Ｌ２３８Ｓ）；および位置１４９のシステイン、位置１８２のシステイン、位置２１３のシステインおよび位置２３８のセリンを含む４重変異（Ｅ１４９Ｃ／Ｍ１８２Ｃ／Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）が含まれる。追加の例が後の第２表に示されている。アミノ酸残基番号は、後に詳細に示す３０９個の残基を有するE.coliの公表された配列を指し、または代替源（たとえば、Citrobacter freundiiまたはSalmonella typhimuriumのグルコース／ガラクトース結合タンパク質。配列登録番号はそれぞれＰ２３９２５およびＰ２３９０５）からの実質的に相同の任意の配列中の対応するアミノ酸残基を指す。
【００２３】
本発明の捕捉または封入される変異結合タンパク質は、たとえば分析物（たとえばグルコース）が関与する生体反応の速度を追跡できるin vitroまたはin vivo分析物アッセイ、ならびに臨床アッセイ、および食品または飲料の工業試験で使用することができる。マトリックス中の結合タンパク質の濃度は、タンパク質と分析物との結合定数（Ｋd）よりも小さいことが好ましい。
【００２４】
変異は、いくつかある目的のうちの１つまたは複数の目的を果たすことができる。たとえば、タンパク質の長期安定度を変化させ、特定の封入マトリックスまたはポリマーにタンパク質を結合させ、検出可能なリポーター基に結合部位を提供し、または特定の分析物に関してその結合定数を調整する目的で、あるいはこれらの任意の組合せのために、天然タンパク質を変異させることができる。
【００２５】
本発明では、分析物と変異タンパク質が結合パートナーとして機能する。本明細書で使用する用語「会合」または「結合」は、検出手段によってタンパク質との結合を検出することができる十分に強い相対結合定数（Ｋd）を有してパートナーと結合することを指す。Ｋdは、半分のタンパク質が結合したときの遊離の分析物の濃度またはその逆として計算することができる。対象となる分析物がグルコースのときには、結合相手のＫd値が約０．０００１ｍＭから約３０ｍＭであることが好ましい。
【００２６】
本発明では、グルコースが結合しているときに検出可能な信号を生成するリポーター基を変異ＧＧＢＰに結合させることによって、変異ＧＧＢＰを使用してグルコースの結合を検出できることが示された。本明細書で使用する際に、「検出可能な信号を生成する」とは、リガンド−タンパク質結合の検出を可能にする方法で、リポーター基の特性変化を認識する能力を指す。たとえば、１つの実施形態では、変異ＧＧＢＢが、グルコース結合時に起こるタンパク質の立体配座の変化によってその検出可能な特性が変化する、検出可能なリポーター基を含む。好ましい実施形態では、リポーター基は、グルコースに対して親和性を有する変異ＧＧＢＰを生成し、グルコースが結合すると検出可能な発光特性のシフトを示す発光標識である。この検出可能な特性の変化は、変異ＧＧＢＰに結合した標識の環境の変化に起因してもよい。
【００２７】
この発光標識は蛍光標識であってもよく、またはリン光標識であってもよい。特定波長の光に対する暴露によって励起されて蛍光を発する蛍光標識の使用が好ましい。
【００２８】
１つの実施形態では、リポーター基がフルオロフォアである。本明細書で使用するとき、用語「フルオロフォア」は、エネルギーを吸収して発光する分子を指す。本発明のリポーター基として有用なフルオロフォアの非制限的例は、フルオレセイン、クマリン類、ローダミン類、5-TMRIA（テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミド）、Quantum Red（商標）、Texas Red（商標）、Ｃｙ３、Ｎ−（（２−ヨードアセトキシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンゾオキサジアゾール(IANBD)、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン(acrylodan)、ピレン、Lucifer Yellow、Ｃｙ５、Dapoxyl（登録商標）（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イル）ヨードアセトアミド(Bodipy507/545 IA)、（Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ−ヨードアセチルエチレンジアミン(BODIPY（登録商標）530/550 IA)、５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−1−スルホン酸(1,5-IAEDANS)、およびカルボキシ−Ｘ−ローダミン、５／６−ヨードアセトアミド(XRIA 5,6)を含む。IANBDを使用することが好ましい。フルオロフォアリポーター基の多くの検出可能な固有特性を監視して、グルコースの結合を検出することができる。グルコースの結合時に変化する可能性がある特性は、蛍光寿命、蛍光強度、蛍光異方性または偏光、および蛍光放射のスペクトルシフトが含まれる。これらのフルオロフォア特性の変化はたとえばタンパク質の立体配座の変化に起因する変化などのフルオロフォアの環境の変化から引き起こされる。この点で、IANBDのような環境に敏感な染料は特に有用である。フルオロフォア特性の他の変化はたとえば、分析物自体との相互作用、またはたとえばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を使用して２つのフルオロフォア間の距離の変化を監視するときの第２のリポーター基との相互作用に起因する。
【００２９】
蛍光標識の使用が好ましいが、他のリポーター基を使用することも企図される。たとえば、リポーターの環境の変化によってその酸化還元状態が変化する電気化学リポーター基を使用することもできる。このような変化はたとえば電極の使用によって検出することができる。
【００３０】
さらに、分光学的方法によって検出可能な他の標識、たとえばＮＭＲ（核磁気共鳴）によって検出可能な標識を使用してもよいことも予想される。
【００３１】
リポーター基は、当技術分野で知られている任意の慣用の手段によって、変異タンパク質すなわちＧＧＢＰに結合させることができる。たとえば、タンパク質上のアミンまたはカルボキシル残基を介してリポーター基を結合させることができる。しかし、特に好ましいのは、システイン残基上のチオール基を介した共有結合的カップリングである。たとえば、本発明の変異ＧＧＢＰでは、位置１１、位置１４、位置１９、位置４３、位置７４、位置１０７、位置１１０、位置１１２、位置１１３、位置１３７、位置１４９、位置１５２、位置２１３、位置２１６、位置２３８、位置２８７および位置２９２にシステインが位置することが好ましい。
【００３２】
当技術分野で知られている任意のチオール反応性基を使用して、フルオロフォアなどのリポーター基を、設計されたタンパク質または変異タンパク質のシステインに結合させることができる。ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミドまたはマレイミドは、この目的に使用することができるよく知られたチオール反応性部分である。
【００３３】
分子センサーをin vivoで使用するとき、たとえば埋込み可能なバイオセンサーデバイスに分子センサーを組み込んで使用するときには、長い励起および発光波長（たとえば約６００ｎｍ以上の励起または発光波長）で機能するフルオロフォアが好ましい（６００ｎｍよりも短い波長に対して皮膚は不透明である）。現在、このスペクトル領域で使用可能な環境に敏感なプローブはほとんどなく、チオール反応性官能基を有するものはおそらく１つもない。しかし、Ｃｙ−５のチオール反応性誘導体は、たとえば非特許文献９の教示に従って調製することができる。たとえば変異ＧＧＢＰに含まれる様々なシステイン基に結合した、これらのフルオロフォアを含有する複合体をスクリーニングして、グルコース結合時に最も大きな蛍光変化を起こすものを確認することができる。
【００３４】
本発明で有用な変異ＧＧＢＰは、タンパク質のＮ末端またはＣ末端あるいはその両方にヒスチジンタグを有するように設計または変異させることができる。ヒスチジン融合タンパク質は、タンパク質の精製を支援するために分子生物学の分野で広く使用されている。例示的なタグ系は、約６個のヒスチジンを含むタグを有するタンパク質を生み出し、好ましくはこのようなタグ付けは変異ＧＧＢＰの結合活性を損なわない。
【００３５】
本明細書で使用するとき、用語「マトリックス」は、リガンド−タンパク質相互作用に起因する検出可能な信号を測定する目的で少なくとも１つの結合タンパク質を固定化し、捕捉し、または封入することができる本質的に３次元の環境を指す。マトリックスの成分と結合タンパク質との間の関係には、共有結合性、イオン性およびファンデルワールス相互作用ならびにこれらの組合せが含まれるが、それらに限定されるものではない。マトリックスと結合タンパク質の間の空間関係には、マトリックス体積の任意の部分またはマトリックス体積全体の内部および／または表面での不均一分布および均一分布が含まれる。マトリックスは、有機、無機、ガラス、金属、プラスチックまたはこれらの組合せから構成されてもよい。マトリックスは、たとえば患者の組織に挿入して散発的、連続的またはプログラムされた読取りを可能にするファイバまたは侵襲が最小限である他の小型プローブの遠位端に組み込むことができる結合タンパク質のトランスデューサ要素構成を提供する。トランスデューサ（変換）要素から患者への情報は、たとえば、遠隔測定、視覚または音声手段によって、あるいはたとえば特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６および非特許文献１０に教示されている当技術分野で知られている他の手段によって提供することができる。情報には、適切であるように、分析物の濃度または濃度変化を得るのに適した電気、機械および化学線、放射線情報が含まれる。
【００３６】
本発明の１つの態様では、バイオセンサーを使用してin vivoで分析物を検出する。この態様では、バイオセンサーをマトリックスの中に封入し、次いで。これを埋込み可能なデバイスとして使用してもよい。「マトリックス」は、分析物を透過させるものである限り、円板、円筒、パッチ、ナノ粒子、マイクロスフェア、多孔質ポリマー、連続気泡発泡体の１つまたは複数を含む、望ましい任意の形態または形状をとることができる。マトリックスはさらにバイオセンサーの浸出を防ぐ。マトリックスは、光源からの光、あるいはリポーター基への、またはリポーター基からの他の任意のインターロゲート光(interrogating light)がバイオセンサーを通過することを許す。in vivo用途で使用するとき、バイオセンサーは、実質的に生理的範囲の分析物に曝され、分析物濃度の変化を決定または検出することが望ましい。この決定または検出は、連続検出手段、プログラムされた検出手段および散発的検出手段を含む。したがって、想定される本発明のin vivoバイオセンサーは、分析物透過性の捕捉または封入マトリックスの中に少なくとも１つの変異結合タンパク質を含み、該変異結合タンパク質は、様々な分析物濃度に曝されたときに検出可能で可逆的な信号を生成し、該検出可能で可逆的な信号は分析物の濃度と相関することができるようなものである。いくつかの実施形態では、埋込み可能なバイオセンサーを、哺乳動物の表皮−真皮接合部の皮膚または皮下に埋め込んで、間質液、組織または他の体液と相互作用させてもよい。埋め込んだバイオセンサーから患者への情報は、たとえば遠隔測定、視覚または音声手段、あるいは先に述べた当技術分野で知られている他の手段によって提供することができる。
【００３７】
好ましくは、マトリックスは、生体適合材料から調製されるか、または身体との有害な反応を最小化することができる材料を含む。埋込みバイオセンサーに関する有害反応には、炎症、タンパク質の詰まり(protein fouling)、組織の壊死、免疫応答および有毒物質の浸出が含まれる。そのような材料または処置は、たとえば非特許文献１１および非特許文献１２の教示されるように、当技術分野でよく知られており、かつ実施される。
【００３８】
バイオセンサーは、実質的にヒドロゲルに由来するマトリックスの中に封入することができる。ヒドロゲルのポリマー部分は、タンパク質またはリポーター基への水素結合または共有結合的カップリングに適した官能基（たとえばヒドロキシル基、アミノ基、エーテル結合、カルボン酸、およびエステルなど）を含むことができる。
【００３９】
本発明では数多くのヒドロゲルを使用することができる。ヒドロゲルは、たとえば、アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、セルロースなどの多糖、または、たとえばカルボキシメチル誘導体などの多糖誘導体、あるいは、たとえばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、スチレンと無水マレイン酸の共重合体、ビニルエーテルと無水マレイン酸の共重合体、およびそれらの誘導体などの水膨潤性有機ポリマーであってもよい。共有結合によって架橋されたネとワーク構造を与える誘導体が好ましい。ポリペプチドに基づき、ポリペプチドを含むヒドロゲルの合成ならびに生医学的応用および薬学的応用は、何人かの研究者によって記述されている（たとえば非特許文献１３を参照されたい。）水溶性でＵＶ架橋性のポリマーに由来する例示的なヒドロゲルマトリックスは、PolyScience (Warrington, PA)から入手可能なポリ（ビニルアルコール）、Ｎ−メチル−４（４’−ホルミルスチリル）ピリジニウムメトスルファートアセタール（ＣＡＳ登録番号［１０７８４５−５９−０］）を含む。
【００４０】
封入プロセスの１つの実施形態では、タンパク質のタイプに依存する約４から約１０までの範囲のｐＨを有する水性緩衝液中の変異結合タンパク質溶液に対して、１種または複数種のヒドロゲル水溶液を加える。引き続くマトリックスの硬化、たとえば架橋が、物理的な形態を与える。この技術および慣用の製造プロセス（たとえばブロックキャスティング、逆性乳化重合(reverse emulsion polymerization)、スクリーン印刷、密着印刷、流動床コーティング、浸漬コーティングまたはスピンコーティング）を使用して、in vitroおよびin vivoでの使用に適した様々な形態（たとえば顆粒、ナノ粒子、マイクロ粒子、モノリス、厚膜および薄膜）のマトリックスを得ることができる。
【００４１】
１つの実施形態では、マトリックスを、修飾されたゾル−ゲルから構成してもよい。修飾されたゾル−ゲルは、透過性金属酸化物ガラス構造から構成される少なくとも部分硬化（またはゲル化）された製剤を含む。該ガラス構造は、ゾル−ゲル前駆物質に加えて、ゾル−ゲル前駆物質とともに加水分解的に縮合する１種または複数種の有機成分を含有して、得られるゾル−ゲルマトリックスにたとえば埋込みに適した特性を与えるようにすることが好ましい。適当な特性には、低い経時的な体積収縮、亀裂および他の物理的な欠陥に対する抵抗性、タンパク質機能の維持、タンパク質および／またはリポーター基との適合性、ならびにそれを埋め込む動物または対象との適合性が含まれる。適当な有機材料には、たとえば非特許文献１４に教示されるような、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのようなポリオールが含まれる。一般的に、先に記載した属性は、タンパク質／ゾル−ゲル／リポーター基の所与の組合せに対して予測することはできず、したがって、所与の結合タンパク質−リポーター対に関するゾル−ゲル前駆物質、有機成分およびタンパク質溶液材料の最適化が予想されるであろうことを当業者が認識できることが理解される。そのような最適化が、他のマトリックスまたはその水性溶液に比較して予想外の信号増強、結合定数のシフト、マトリックスの物理的性能属性の向上およびそれらの組合せを提供することを、本発明の出願人は発見した。タンパク質−リポーター対の性能属性および封入マトリックスの機能性能属性の最適化は、たとえば、組合せ的方法または当技術分野で知られている統計に基づく他の設計方法によって達成することができる。
【００４２】
本発明に有用なゾル−ゲルマトリックスは、慣用の周知のゾル−ゲル法によって調製された材料を含み、および無機材料、有機材料または混合有機／無機材料を含む。ゾル−ゲルの生成に使用する材料は、アルミネート、アルミノシリケートおよびチタネートを含むことができるが、それらに限定されるわけではない。これらの材料を、有機的に修飾されたシリケート(ormosils)および官能基化されたシロキサンを用いて増強して、親水性および疎水性、イオン性電荷、タンパク質の共有結合などを付与および操作する手段を提供することができる。本明細書で使用するとき、用語「加水分解的に縮合性のシロキサン」は、全部で４つの置換基を有し、それら置換基の少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つまたは４つが、酸素を介してケイ素に共有結合しているアルコキシ置換基であるゾル−ゲル前駆物質およびこれらの混合物を指す。アルコキシ置換基を３個、２個および１個含む前駆物質の場合には、少なくとも１つの残りの置換基が好ましくは炭素を介してケイ素に共有結合しており、およびそれら残りの置換基が、アルキル、アリール、アミン、アミド、チオール、シアノ、カルボキシル、エステル、オレフィン性、エポキシ、シリル、ニトロおよびハロゲンから選択される有機官能基を含有する。
【００４３】
封入プロセスの１つの実施形態では、加水分解的に縮合性の１つまたは複数のシロキサンは、水中で自発的あるいは酸または塩基触媒の存在下で加水分解して、加水分解的に縮合性のシロキサンに対して約１０：１から１：１０、好ましくは約５：１から１：５、最も好ましくは約１：１のモル量で存在する有機ポリオール成分を有する誘導体を形成する。最終的なゲル化の前に、この混合物に対して、タンパク質のタイプに依存する約４から約１０までの範囲のｐＨを有する水性緩衝液中の変異結合タンパク質溶液を加える。少なくとも部分的な縮合反応によって最終的なマトリックスを生じさせる。
【００４４】
他の実施形態では、水中で自発的にあるいは酸または塩基触媒の存在下で加水分解して有機ポリオールを有する誘導体を形成する加水分解縮合性のシロキサンを、水溶性ポリマー成分と混合する。適当な水溶性ポリマーには、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリ（マレイン酸ｃｏ−オレフィン）ナトリウム塩（ＰＭＳＡ）、ポリ（ビニルスルホン酸）ナトリウム塩（ＰＶＳＡ）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が含まれる。ポリ（マレイン酸ｃｏ−オレフィン）は、スチレン、ビニルエーテルおよびＣ1〜Ｃ8オレフィン類と無水マレイン酸の共重合体、およびそれらの塩（たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム塩など）を含む。好ましくは、水溶性ポリマー成分は、ゾル−ゲル組成物の０から約３０重量％である。
【００４５】
他の実施形態では、水中で自発的にあるいは酸または塩基触媒の存在下で加水分解して有機ポリオールを有する誘導体を形成する加水分解的に縮合性のシロキサンを、加水分解的に縮合性のシロキサンの０から約０．６モル％の量の１種または複数種の官能基化されたシリコーン添加剤(FSA)と混合する。例示的なＦＳＡには、アルキル誘導体：たとえばメチルトリメトイシラン(MTMOS)、アミン誘導体：たとえば３−アミノプロピルトリエトキシシラン(ATEOS)、およびビスシラン誘導体：たとえば（ビス（３−メチルジメトキシシリル）プロピル）ポリプロピレンオキシド(BIS)が含まれる。
【００４６】
他の実施形態では、水溶性ポリマー成分と官能基化されたシリコーン添加剤の両方を、水中で自発的にあるいは酸または塩基触媒の存在下で加水分解して有機ポリオールを有する誘導体を形成する加水分解的に縮合性のシロキサンと混合して、結合タンパク質の捕捉または封入に適したマトリックスを得る。前述のゾル−ゲル技術および慣用の製造プロセス（たとえばブロックキャスティング、逆性乳化重合、スクリーン印刷、密着印刷、流動床コーティング、浸漬コーティングまたはスピンコーティング）を使用して、in vitroおよびin vivoでの使用に適した様々な形態（たとえば顆粒、ナノ粒子、マイクロ粒子、モノリス、厚膜および薄膜）のエーロゲル−マトリックスまたはキセロゲル−マトリックスを得ることができる。
【００４７】
他の実施形態では、透析膜からマトリックスを形成してもよい。タンパク質を物理的に封入し捕捉するように、透析膜を構築することができる。膜への共有結合は、記載したような実施形態の範囲に含まれると考えられる。分子量カットオフに基づいて膜を選択して、対象となる分析物は膜を容易に通過できるが、高分子量の材料は膜マトリックスに入ることを制限され、または変異結合タンパク質の場合には膜マトリックスから出ていくことを制限されるようにするべきである。必要な分子量カットオフは上記の要件を満たすようなものであり、これは当業者の技術の範疇である。典型的には、約１０００から約２５，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜が適している。この技術を使用して、in vitroおよびin vivoで使用するのに適した様々な形態および形状のマトリックスを調製することができる。
【００４８】
結合タンパク質およびリポーター基を含むマトリックスを、１つまたは複数のヒドロゲル、ゾル−ゲルおよび透析膜の組合せとすることも企図される。たとえば、ヒドロゲルまたはゾル−ゲルの中に捕捉されまたは封入されたタンパク質を、さらに適当な形状およびサイズの透析膜の中に配置し、対象の中に埋め込み、あるいはマトリックスの分析物に対する質量輸送特性または透過性を操作することができる。
【００４９】
本発明のマトリックス捕捉または封入された結合タンパク質バイオセンサーは、マイクロモル濃度（１０-6モル濃度）からモル濃度の分析物濃度を、試薬を消費することなく測定し検出することができる。いくつかの実施形態では、分析物に対するそれらの感度が、バイオセンサーを、低体積の間質液試料中に存在することが知られている低分析物濃度を測定するのに使用することを可能にする。いくつかの実施形態では、埋込み可能なバイオセンサーを、間質液、組織または他の体液と相互作用させるために、哺乳動物の表皮−真皮接合部の皮膚または皮下に埋め込むことができる。本発明の結合タンパク質バイオセンサーは、使用者または症状の治療にとって適当であろうように、分析物を連続的に、散発的に、または「オンデマンド」で監視する手段を提供する。
【００５０】
他の実施形態では、分析物（たとえばグルコース）に対するバイオセンサーの感度が、それらバイオセンサーを使用して血中の分析物のレベルを検査できる感度、あるいは生体溶液または他の溶液中の分析物の濃度を決定することができるようなものである。本明細書で使用される際に、「生物学的溶液」は、血液、汗、および／または眼液または間質液ならびにこれらの組合せを含むが、それらに限定されるわけではない。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、本発明の好ましいいくつかの実施形態を説明する。ただし、これらは、すべての実施形態を説明することを意図したものではない。ここでは、フルオロフォアリポータープローブＮＢＤを有する標識された変異マルトース結合タンパク質S337C MBPを、非特許文献１５に記載の手順に従って使用した。標識された変異タンパク質の蛍光放射スペクトルを、SLM Aminco蛍光計(Ontario, Canada)を使用して測定して、様々なマトリックス中のフルオロフォア標識された捕捉タンパク質のリガンド−結合性能を溶液中の同じタンパク質の性能と比較した。励起に対するスリット設定は８および４、MC250発光モノクロメータに対する設定は５および５であった。初期蛍光放射強度をＩ0と定義する。タンパク質のそれぞれのリガンドが存在する場合の最大放射強度（Ｉf）の、リガンドが存在しない場合の放射強度（Ｉ0）に対する相対比をΔＦと定義する。
【００５２】
結合定数は、タンパク質溶液に対する、増大する濃度のグルコースの滴定によって求めた。溶液はグルコースを添加するたびに混合した。スリット設定は先に挙げたものと同じである。Ｋdは、非特許文献１６の関係を適合させた以下の関係から決定した。
【００５３】
【数１】
2005539205.tif 000003
【００５４】
式中、Ｆは蛍光強度、Ｆinfは無限大での蛍光、Ｆ0はグルコースが０の場合の蛍光、ｘは、以下の関係によって決定されるグルコースの遊離濃度（［Ｇｌｃ］free）である。
【００５５】
【数２】
2005539205.tif 000004
【００５６】
式中、［Ｇｌｃ］totおよび［Ｐｒｏ］totはそれぞれ、グルコースおよびタンパク質の全濃度である。
【００５７】
（実施例１）
この実施例は、ヒスチジンタグのない変異タンパク質の発現および精製のための方法を説明する。ＧＧＢＰは、E.coliのMg1B-1遺伝子によってコードされている。Mg1B-1遺伝子の部位特異的変異誘発によりアミノ酸であるシステインを様々な位置に導入することによって、このタンパク質を変化させた。次いで、E.coliの中でこれらのタンパク質を発現させ、精製した。
【００５８】
Mg1B-1のカセット変異誘発は以下のように実施した。野生型Mg1B-1遺伝子を、pTZ18Rベクタ(Dr.Anthony Cass, Imperial College, London, England)の中でクローン化した。非特許文献１７に記載の方法に本質的に従ったランダムなアミノ酸配列を生み出すカセット変異誘発を使用して、この親プラスミドから変異プラスミドを生成し、E.coli JM109(Promega Life Science, Madison, WI)の中でクローン化した。配列決定によって変異プラスミドを同定した。以下のようにJM109の中で変異タンパク質を誘発させ、精製した。変異プラスミドを含むE.coli JM109コロニーを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン(Amp)を含む３７℃のＬＢブロス(LB/Amp)中で振盪（２２０ｒｐｍ）しながら一晩増殖させた。この一晩増殖菌を、１Ｌの新鮮なLB/Ampで１００倍に希釈し、培養菌のＯＤ600が０．３〜０．５になるまで振盪しながら３７℃で培養した。最終濃度１ｍＭのIPTG (Life Technologies, Gaithersburg, MD)を添加し、培養および振盪を３７℃で４〜６時間にわたって継続することによって、変異の発現を誘導した。遠心法（１０，０００×ｇ、１０分、４℃）によって細胞を回収した。
【００５９】
浸透圧性衝撃によって変異タンパク質を回収し、カラムクロマトグラフィによって精製した。細胞ペレットをスクロース緩衝液（３０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁させ、室温で１０分間にわたって培養し、次いで遠心処理した（４０００×ｇ、１５分、４℃）。上澄みをデカントし、氷上に保持した。細胞ペレットを再懸濁させ、氷温の無菌脱イオン水１０ｍＬを繰り返し、懸濁液を氷上で培養し遠心処理した。残った上澄みを、別に集めた他の上澄みと一緒にし、再び遠心処理した（１２，０００×ｇ、１０分、４℃）。一緒にした衝撃液(shockate)を０．８μｍフィルタ、次いで０．４５μｍフィルタでろ過した。５％ｗ／ｖの硫酸ストレプトマイシン(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)を衝撃液に加え、３０分攪拌し、次いで遠心処理した（１２，０００×ｇ、１０分、４℃）。次いで、Amicon Centriprep 10 (10,000MWCO)フィルタ(Charlotte, NC)を使用して衝撃液を濃縮し、５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2に対して一晩透析した。透析した衝撃液を遠心処理した（１２，０００×ｇ、３０分、４℃）。得られた上澄みを、予め平衡させたDEAE Fast Flow Sepharoseカラム(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)に０．５ｍＬ／分の速度で加えた。このカラムを、５〜１０カラム容積の洗浄液で洗浄した。このカラムに０〜０．２Ｍ  ＮａＣｌの直線的勾配を適用し、フラクションを集めた。変異タンパク質を含むフラクションを、クーマシーブリリアントブルー染色（ＭＷ約３２ｋＤａ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定した。フラクションを一緒にし、リン酸で緩衝された食塩水（ＰＢＳ）または１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．４）に対して一晩透析し（４℃）、Amicon Centriprep 10フィルタを使用して濃縮し、４℃、またはグリセロールを用いて−２０℃で貯蔵した。この重炭酸アンモニウム透析タンパク質を凍結乾燥させた。
【００６０】
（実施例２）
この実施例は、ヒスチジンタグを含む変異ＧＧＢＰの発現および精製を説明する。部位特異的変異誘発またはカセット変異誘発のいずれかによってＧＧＢＰ変異を誘導した。部位特異的変異誘発(QuikChange, Stratagene, La Jolla, CA)を実行し、１つのアミノ酸（具体的には選択されたアミノ酸）を他のアミノ酸で置き換えることによってpQE70ベクタの個々のアミノ酸を変更した。カセット変異誘発法（非特許文献１７）を実行して、ＧＧＢＰ遺伝子の指定された領域のアミノ酸をランダム化した。次いで、これらの変異カセットをpQE70発現ベクタの中でサブクローン化した。pGGBP-Hisプラスミドは、pQE70発現ベクタ(Qiagen, Valencia, CA)中でクローン化されたＧＧＢＰ遺伝子を含む。この構成体は、ＧＧＢＰ遺伝子のＣ末端に６個のヒスチジン残基を配置する。E.coli SG13009株を使用して、変異ＧＧＢＰ−Ｈｉｓを標準手順(Qiagen)に従って過剰発現させた。２５０ｍＬの培養菌の過剰発現の後、遠心法（６０００ｒｐｍ）によって細胞を集め、２５ｍＬのBugBusterバッファー(Novagen, Madison, WI)の中で再懸濁させた。リゾチーム（２５ｍｇ）をこの溶解産物に加え、この混合物を、室温で３０分にわたって穏やかに混合した。遠心法（６０００ｒｐｍ）によって透明な溶解産物を生成し、これに、イミジゾール（１Ｍ）０．５ｍｌおよびＮｉ−ＮＴＡビーズ(Qiagen)３ｍｌを加えた。室温で３０分にわたって穏やかに混合した後、混合物を遠心処理し（６０００ｒｐｍ）、溶解産物を除去した。ビーズを溶液２５ｍｌ（１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で洗浄し、再び遠心処理した。溶液（１６０ｍＭイミダゾール、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、１５分混合することによって、ビーズから変異ＧＧＢＰ−Ｈｉｓを溶離した。直ちにCentriplus YM-100フィルタ(Amicon, Charlotte, NC)を使用してタンパク質溶液をろ過し、次いで、Centriplus YM-10フィルタを使用して１〜３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。このタンパク質を、貯蔵溶液（１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ８．０）２Ｌに対して一晩透析した。
【００６１】
（実施例３）
この実施例は、リポータープローブを用いた結合タンパク質の標識化を一般的に説明する。ＰＢＳに溶解したシステインを含む変異ＧＧＢＰ（４．０ｎｍｏｌ）のアリコートを、２ｍＭジチオトレイトール（５μＬ、１０ｎｍｏｌ）で３０分処理した。ＤＭＳＯ（１００μＬ、１１．９ｍＭ）中にＮ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−（ヨードアセチル）−Ｎ’−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）エチレンジアミン（IANBDアミド、０．５ｍｇ）を溶解した貯蔵液を調製し、その３．３６μＬ（４０ｎｍｏｌ）をタンパク質に加えた。暗所のDynal rotamix上、室温において４時間にわたって反応を進行させた。ＮＡＰ−５カラム(Amersham Pharmacia)によるゲルろ過によって、標識されたタンパク質を精製した。GeneWorks2.45(IntelliGenetics)で計算したＧＧＢＰの推定吸光係数（５０ｍＭ-1ｃｍ-1）、ε478（IANBDアミド）＝２５ｍＭ-1ｃｍ-1、ならびにIANBDアミドの標準溶液の２８０ｎｍおよび４７８ｎｍにおけるＯ．Ｄ．の測定値を使用して標識化比を求めた。タンパク質中の染料濃度は、Ｃdye＝Ａ478／ε478として計算した。２８０ｎｍのタンパク質の吸光度は、Ａprot(280)＝Ａtotal(280)−Ａdye(280)として計算した。ここでＡdye(280)＝Ａ478×（Ａ280／Ａ478）dye stdである。その際に、タンパク質の濃度は、Ｃprot(280)＝Ａprot(280)／ε280である。図１に、代表例である溶液中のA213C/L238C NBDアミドＧＧＢＰ  Ｈ6のグルコース濃度に対する蛍光応答の変化を示す。第１表は、少なくとも６００ナノメートルの励起または発光最大値のいずれかを有するリポーター基を含むリポーター基で標識された様々なＧＧＢＰ変異体の蛍光の変化をまとめたものである。第２表は、１つ、２つ、３つおよび４つのアミノ酸置換を有する変異体の蛍光変化および求められたＫd値をまとめたものである。このデータは、リポーター基で標識されたＧＧＢＰの変異がグルコースバイオセンサーとしての望ましい属性を提供できることをはっきりと示している。このデータは、試験した試料の変異−リポーター基関係を示している。
【００６２】
【表１】
2005539205.tif 000005
【００６３】
【表２】
2005539205.tif 000006
【００６４】
（実施例４）
この実施例は、グリセロール修飾シリケート縮合物（ＧＭＳＣ）を使用した本発明のバイオセンサーの固定化を説明する。グリセロール修飾シリケート縮合物（ＧＭＳＣ）の添加。最初のテトラエトキシオルトシリケート（ＴＥＯＳ）またはテトラメトキシオルトシリケート（ＴＭＯＳ）の酸加水分解に引き続いて、グリセロールの添加を実施した。加水分解時間の範囲、ｐＨレベル、試薬を加える順序、およびＴＥＯＳ：グリセロール比を評価して、グリセリル化(glyceration)反応を開始させるための最適条件を決定した。好ましい条件は、加水分解とグリセロール添加の間の１０分から３０分の間隔、０．５から１までの間のｐＨ範囲、およびＴＥＯＳとグリセロールのモル比１：１を使用することであると分かった。以下に、ＴＥＯＳベースのグリセロール修飾シリケート縮合物（ＧＭＳＣ）を調製するための非特許文献１４の手順の修正手順を説明する。以下の試薬比を使用した：ＴＥＯＳまたはＴＭＯＳ：１、Ｈ2Ｏ：１、メタノール：４、グリセロール：１。メタノール中のＴＥＯＳまたはＴＭＯＳをフラスコに添加し、氷上で０℃まで冷却した。次にこの溶液に０．６Ｍ  ＨＣｌを滴加した。２０分間の攪拌の後、グリセロールを滴加した。この反応物を１〜２時間かけて２０〜２５℃までゆっくりと暖めた。その後、反応容器をさらに加熱し、窒素下で６０〜７０℃の範囲に３６時間から４２時間にわたって維持した。最適な時間は４０時間であった。３６時間よりも前に停止させた反応では、観測可能な相分離によって不完全なグリセリル化が示された。４２時間以上にわたって反応を維持すると、大幅に低下した物理特性（たとえば増大した脆性）を有するＧＭＳＣゾル−ゲルのモノリスが得られた。６０〜７０℃で４０時間にわたる反応に続いて、溶液が粘性かつ透明になるまでロータリーエバポレーションによって溶液の体積を低減させ、その時点で、溶液に対して、重量比４：１でメタノールを加えた。このＧＭＳＣ溶液は安定であることが証明され、冷凍庫の温度で保存したときに数カ月間にわたって不変の結果を提供した。ＧＭＳＣ溶液を使用するときには、ロータリーエバポレーションによってメタノールを除去し、ＧＭＳＣ試薬に重量比１：１の蒸留水を加えて、最終的な加水分解／ゲル化を触媒した。この手順を用い、型として機能する適当な容器を使用してモノリス、薄膜および粉末を製造した。ＧＭＳＣゾル−ゲルモノリスは脆性ではなく、温度４℃、相対湿度５０％で２週間にわたって硬化させると約８％収縮した（収縮率（％）は、マイクロキャリパで測定し、最初の型寸法と比較した直径および長さの変化の平均である）。電子顕微鏡法（ＳＥＭ）が、ＴＥＯＳ加水分解で作製されるモノリスと前述のＧＭＳＣ手順によって作製されるモノリスとの間で、表面破壊(surface fracturing)における著しい改善を例証した。この一連の実験は、本発明が教示する方法によって、改良された物理特性を有するゾル−ゲルをどのように作製できるかを示している。
【００６５】
（実施例５）
この実施例は、グリセロールがエチレングリコール（ＥＧ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で部分的に置換されたＧＭＳＣゾル−ゲルによる、物理特性のさらなる最適化を説明する。グリセロールに代替として、エチレングリコール（ＥＧ）を混合物中で評価した。該混合物において、グリセロールとＥＧの比は変化させたが、他の試薬に対するグリセロールおよびＥＧの全体のモル比は一定に維持した。前の実施例で説明した手順によってゾル−ゲルのモノリスを調製し、温度４℃、相対湿度５０％で２週間にわたって硬化させ、それらの収縮率（％）を第３表に示すように決定した。収縮率（％）は、元の寸法に対する長さおよび直径の減少の平均と定義される。収縮率の決定に使用されるモノリスは、タンパク質／フルオロフォアを有さなかった。Ｆ測定のため、H152 GGBP-H6 NBD（実施例３）を含む第１表に挙げた試料を下記のように調製した。
【００６６】
【表３】
2005539205.tif 000007
【００６７】
１％および５％ＥＧ／ＧＭＳＣゾル−ゲル（それぞれ第３表のエントリ５および６）は、普通のＴＥＯＳゾル−ゲルまたはＧＭＳＣ修飾ＴＥＯＳゾル−ゲル（それぞれ前記第３表のエントリ２および３）のいずれのものよりも著しく低い収縮率（％）を有することが分かった。グリセロールの部分的代替物としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も、ＧＭＳＣゾル−ゲル中の同様の比率で定性的に評価した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、良好な表面特性およびゴム様の可撓性を有するモノリスを生成した。これらをまとめると、ＧＭＳＣゾル−ゲル中のグリセロールをエチレングリコール（ＥＧ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で部分的に置換すると物理特性が向上する。たとえば収縮が最小化し、表面破壊が低減する。結合タンパク質を含むこれらのゾル−ゲルマトリックスは、溶液中のタンパク質に等しいか、またはそれよりも良好な性能を持つことが分かった。
【００６８】
（実施例６）
官能基化されたシリコーン添加剤（ＦＳＡ）およびポリマーを含むＧＭＳＣゾル−ゲル中への結合タンパク質の捕捉。
【００６９】
この実施例は、結合タンパク質を捕捉するためのＧＭＳＣゾル−ゲルを最適化し、リガンド結合時の結合タンパク質のスペクトル特性を維持および増強の両方を行うための、ポリマーおよび有機ポリオール添加剤の添加を記載する。結合タンパク質を（実施例３で説明したとおりに）フルオロフォアで標識した。前述の最終の加水分解／ゲル化工程中に、このタンパク質溶液を添加して、２〜４μＭのゾル−ゲル中の最終的なタンパク質濃度を生じさせた。ポリマー添加剤および官能基化されたシリコーン添加剤(FSA)は、Sigma Aldrich Chemicals (St.Louis, MO)から入手した。ポリマー添加剤は、０から約３０重量％の範囲で評価した。ＦＳＡは、ＧＭＳＣゾル−ゲルへの添加剤として、０から約０．６モル％比の量で評価した。その貯蔵液からメタノールを除去するためのＧＭＳＣ試薬のロータリーエバポレーションに続いて、重量比１：１の水で再構成した。この混合液の４００μＬアリコートに多Ｉａして、前もって混合しておいた水溶性ポリマー添加剤を含む緩衝液（ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳまたはトリス）８００μＬを、任意のＦＳＡ修飾ＧＭＳＣとともに加えた。次いで、溶液中の変異結合タンパク質を加え、よく混合した後に、この混合物１００μＬを９６ウェルマイクロプレート（Falconホワイトフラットボトムプレート、製品番号３５−３９４１、BD Labware, NJ）に分配した。ゾル−ゲルを含むマイクロプレートを、温度４℃、相対湿度５０％で１２〜１８時間にわたって硬化させた。ＴＥＯＳベースのＧＭＳＣと同じ手順でＧＭＳＣ−ＢＩＳを調製した。ただし、ＴＥＯＳの代わりに（ビス（３−メチルジメトキシシリル）プロピル）ポリプロピレンオキシドを使用した。ＧＭＳＣ−ＭＴＭＯＳおよびＧＭＳＣ−ＡＴＥＯＳを、ＴＥＯＳベースのＧＭＳＣ手順に比べて、１０％の量の酸を用いるか、または加水分解工程において酸を使用せずのいずれかにて加水分解を実施したことを除いて同様に調製した。蛍光放射は、マイクロウェルプレートアダプタを有するVarian Cary Eclipse走査型蛍光光度計(Varian Instruments (Victoria, Australia))を用いて測定した。励起は４７５ｎｍで、発光は５００から６００ｎｍまでを記録した。典型的には、発光最大ピーク蛍光を監視した。スリット幅は励起については５ｎｍ、発光については１０ｎｍであった。個々のＩ0の決定はそれぞれのウェルに対して実施し、リガンド溶液（Ｓ３３７Ｃ  ＭＢＰの場合は１ｍＭマルトース）１００μＬを加え、Ｉfの読取値を得て、ΔＦ値を計算した。修飾されたゾル−ゲルに捕捉されたタンパク質は、溶液中の等価の濃度の同じタンパク質に比べて、リガンドが存在しない場合に、より大きな初期蛍光（Ｉ0）を示した。図２に、Ｈ１５２に最適化されたゾル−ゲル中および溶液中のＧＧＢＰ  Ｈ１５２  Ｈｉｓ６  ＮＢＤに関して、グルコースの添加前後の蛍光放射を示す。それぞれの実験のＩ0スペクトルを最大値１．０に規格化した。この図は、分析物に曝した際に、結合タンパク質を含む最適化されたゾル−ゲルマトリックスについて得られるΔＦが、溶液中の結合タンパク質のΔＦに比べて、約２〜３倍に増強されていることを示している。したがって、それぞれのタンパク質に対してゾル−ゲル製剤を最適化した後には、ΔＦの増強が観察された。ゾル−ゲル捕捉タン��ク質−リポーター基試料では、溶液に比べて、発光極大がシフトする可能性があることに留意されたい。さらに、これらの修飾ゾル−ゲルマトリックスは、第３表のエントリ４に示すように、改良された物理特性を提供する。第４表に、評価した個々のタンパク質のそれぞれについて、改良された応答を与える製剤成分のおおよその範囲を示す。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
上で説明した製剤最適化実験では、いくつかの実験計画(DOE)を設計するのに、Design-Expert 6.0.5 (Stat-Ease,Inc., Minneapolis, MN)を使用した。それぞれのＤＯＥで最適化された製剤の他の可変要素は、緩衝液のタイプ（ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳおよびトリス）およびｐＨ（６．６から７．８まで）であった。意外にも、最適な製剤成分および濃度範囲は、タンパク質ごとにまったく異なった。しかし、すべてのケースで、溶液性能および非修飾ゾル−ゲルの性能に比べ、最適化された製剤の性能の大幅な改善が得られた。
【００７２】
（実施例７）
この実施例は、ＵＶ架橋ヒドロゲルマトリックスへのＧＧＢＰ  Ｈ１５２Ｃの捕捉、ならびに蛍光変化および結合アフィニティーに対するマトリックスの効果を説明する。この実験では、Polysciences Inc.のＳｂＱ−ＰＶＡにＰＢＳ緩衝液１００μｌを加え、ロータリーミキサで１時間にわたって混合した。次いで、この溶液８０μｌを標識したタンパク質２０μｌと混合した。最終的なタンパク質濃度は、０．１５ｍｇ／ｍｌであると分光学的に決定された。混合後、アリコートを９６ウェルプレートに分配し、湿度２０％に維持されたチャンバの中で１２時間にわたって乾燥させ、続いてＵＶ光で硬化させた。マトリックス中に封入されたタンパク質を含むウェルに１０ｍＭグルコース２μｌを加え、これを、マトリックスを含まず、等しいタンパク質配合量を有するタンパク質溶液と比較した。図３に、溶液中で得られるそれに同等の方法および感度で分析物に反応する変異タンパク質マトリックスの能力を示す。捕捉タンパク質のＫdは溶液中で得られるそれに匹敵していた。
【００７３】
（実施例８）
この実施例は、透析膜マトリックス中への本発明のバイオセンサーの固定化、および可逆的かつ連続的な読取値を提供するマトリックスの能力を説明する。光ファイバアタッチメントを有するVarian Eclipse蛍光計を使用して、ＧＧＢＰ  Ｌ２３８ＣＷＯ０３／Ａ２１３Ｃタンパク質（２μＭ、ＰＢＳ緩衝液）を、ファイバの遠位端に取り付けられた３５００ダルトンの分子カットオフを有する透析膜に捕捉した。ＰＢＳ緩衝液を含む溶液、ＰＢＳ緩衝液中に２ｍＭグルコースを含む溶液、およびＰＢＳ緩衝液中に２０ｍＭグルコースを含む溶液を調製した。ＰＢＳ溶液中のプローブを用いて、発光波長５２１ｎｍの読みを０．０２秒間隔で記録し、続いてグルコース溶液にファイバを挿入した。緩衝液のみを含む溶液にファイバを再配置すると最初の信号に戻った。図４に、緩衝液とグルコース溶液を交互に繰り返した複数の周期を示す。この図は、生理的範囲内における、透過性マトリックスの中に捕捉されたバイオセンサーの可逆性を示している。ゾル−ゲル捕捉試料でも同様の結果が観察され、連続的使用に対する適用可能性が示された。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】溶液中のＡ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ  ＮＢＤアミドＧＧＢＰ  Ｈ6のグルコースに対する蛍光応答の変化を示す図である。
【図２】分析物が存在する場合としない場合において、溶液中の結合タンパク質に比較した、捕捉された結合タンパク質の信号の増強を示す図である。
【図３】分析物が存在する場合としない場合の、溶液中の結合タンパク質に比較した、捕捉結合タンパク質を示す図である。
【図４】指示された濃度のグルコース溶液に曝した後に、本発明の１つの実施形態に由来する捕捉された結合タンパク質からの可逆信号を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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