(57)【要約】本発明は、多発性骨髄腫の治療法に関する。より詳しくは、本発明は、K121様抗体の投与により、骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に、毒素または細胞溶解物質が結合していないK121様抗体を有効量投与する段階を含む、患者におけるκ型多発性骨髄腫の治療法。
【請求項２】
K121様抗体の投与前に、患者の体液中に存在する遊離κ軽鎖のレベルを減少させるために患者を処置する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
遊離κ軽鎖のレベルが血漿交換法により減少される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
(i) 患者から造血前駆細胞集団を取り除く段階、
(ii) 細胞集団をK121様抗体で処置する段階、および
(iii) 段階(ii)で処置した細胞集団を患者に移植する段階を含み、
該K121様抗体は毒素または細胞溶解物質を結合していない、患者における自家造血性細胞移植のための方法。
【請求項５】
患者へのK121様抗体の静脈内注射がさらに含まれる、請求項4記載の方法。
【請求項６】
自家移植法が、細胞減少療法中または細胞減少療法の後に、患者に実施される、請求項4または請求項5記載の方法。
【請求項７】
細胞混合集団を、毒素または細胞溶解物質が結合していないK121様抗体に接触させる段階を含む、細胞混合集団中のκ型骨髄腫細胞を殺傷するための方法。
【請求項８】
細胞を、毒素または細胞溶解物質が結合していないK121様抗体に曝露する段階を含む、KMA保持細胞にアポトーシスを誘導するための方法。
【請求項９】
KMA保持細胞がκ型骨髄腫細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
K121様抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
K121様抗体には、図9aに示すように、K121抗体のCDRのループ(CDR1、CDR2およびCDR3)が含まれる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
K121様抗体には、図9aに示すように、K121抗体のVHおよびVL遺伝子が含まれる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
K121様抗体がキメラ抗体かまたはヒト化抗体である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、多発性骨髄腫の治療法に関する。より詳しくは、本発明は、K121様抗体の投与により、骨髄腫細胞にアポトーシスを誘導するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多発性骨髄腫(MM)は、最終分化したB細胞(形質細胞)の骨髄中の蓄積を特徴とする、B細胞の悪性腫瘍である。最近の研究により、骨髄腫形質細胞で起こる幾つかの遺伝的および分子的欠陥が同定された(Drach, J.ら (2000) Cancer Res Clin Oncol. 126:441; Ludwig, H.ら (1999) Annals Oncol. 10 (6):S31)。これらのデータにより、多数の分子イベントが、細胞の重大な遺伝的不安定性、化学療法に対する抵抗性および骨髄血管新生の増加を引き起こしていることが示唆される。MMに対する現在の治療法は、高用量化学療法および/または自家末梢血幹細胞移植法である。現在のところ、5年生存率がより高い(52 %対12 %)ため、後者の治療法が好まれている。最近、サリドマイドのような抗血管新生薬により、治療抵抗性患者の約30 %で目的とする応答が引き起こされた。MMは、これらの徹底的な治療にもかかわらず、不可逆性の致死症であり、治療方法にもよるが平均生存期間は4〜6年である(Kyle, RA.ら (2001) The Oncologist. 6(2):119)。
【０００３】
現在、米国内にMM罹患患者が4万人存在し、毎年、新たに患者と診断される患者は約1万4千人と推定される(Chauhan, D.およびAnderson KC. (2001) Apoptosis. 6 (1〜2): 47)。全世界でMMの罹患率は、国にもよるが年間10万人当たり1.5〜4.5人の間である(Hurez, D. (1993) Revue du Praticien. 43(3):271)。
【０００４】
MMの悪性B細胞は、免疫グロブリンの成分である、軽鎖を過剰量産生するので、これらの軽鎖は、この疾患の罹患患者の血清および尿中に存在する。MM患者の約70 %がκ型の軽鎖を産生し、残りの30 %がλ型である(Kyle, RA. (1999) Path Biol. 47(2):148)。
【０００５】
K121は、ヒト遊離κ軽鎖およびκ型骨髄腫細胞の表面に発現した抗原を特異的に認識する、マウスモノクローナル抗体(mAb)である。この抗原は、κ骨髄腫抗原またはKMAと呼ばれている(Boux, HA.ら (1983) J Exp Med. 158:1769)。KMAは、細胞膜上のアクチンと非共有的に会合した状態で発現した遊離κ軽鎖で構成されていることが明らかとなった(Goodnowら (1985) J. Immunol. 135:1276)。K121は、任意の正常もしくは悪性リンパ細胞との、または原型ヒト免疫グロブリン分子との交差反応性を示さない(Boux, HAら (1984) Eur. J. Immunol. 14:216)。
【０００６】
MMを患っている患者の血清および尿中の遊離κ軽鎖を測定するための定量的イムノアッセイ法が、K121を利用して開発された(Axiak, SM. (1987) J Immunol Methods. 99:141)。最近の文献により、これらの患者の治療に対する進展および応答性を監視するために、遊離軽鎖の定量を使用できることが示唆されている(Drayson, M. (2001) Blood 97 (9):2900)。
【０００７】
κ型骨髄腫細胞に対する細胞毒素を輸送するために、K121を使用できることも示唆されている(Goodnowら、(1985) J. Immunol. 135:1276)。実際に、細胞溶解性ペプチドであるメリチンが連結したK121 scFV断片(scFv-mel)を含有する免疫毒素複合体が、MMの治療に対する潜在的な治療物質として開発されている(Dunn, RD.ら、(1996) Immunotechnology 2:229)。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明者らは、K121単独(即ち、毒素または細胞溶解物質に結合されていない)で、KMA保持細胞にアポトーシスを誘導して殺傷できることを発見した。さらに、本発明者らは、K121単独で、インビボにて腫瘍細胞の増殖を阻止できることを証明した。これらの発見により、K121様抗体は、多発性骨髄腫の治療における初期治療物質として有用である可能性が示唆される。
【０００９】
従って、第一の局面において、本発明により、患者に、毒素または細胞溶解物質が結合していないK121様抗体を有効量投与する段階を含む、患者におけるκ型多発性骨髄腫の治療法が提供される。
【００１０】
本発明によりまた、κ型多発性骨髄腫を治療する医薬品を調製するための、毒素または細胞溶解物質が結合していないK121様抗体の使用が提供される。
【００１１】
第一の局面の好ましい態様において、本方法には、K121様抗体の投与前に、患者の体液中に存在する遊離κ軽鎖の量を減少させるために患者を処置する段階がさらに含まれる。患者の血清中に存在する遊離κ軽鎖の量が減少することが好ましい。遊離κ軽鎖の量の減少を、例えば、血漿交換法により達成してもよい。遊離κ軽鎖の量を減少させるための処置は、K121様抗体の投与直前に、患者で行うことが好ましい。
【００１２】
第二の局面において、本発明により、
(i) 患者から造血前駆細胞集団を取り除く段階、
(ii) 細胞集団をK121様抗体で処置する段階、および
(iii) 段階(ii)で処置した細胞集団を患者に移植する段階を含み、
K121様抗体は毒素または細胞溶解物質が結合していない、患者における自家造血性細胞移植のための方法が提供される。
【００１３】
第二の局面の好ましい態様において、本発明にはまた、患者へのK121様抗体の静脈内注射が含まれる。
【００１４】
第二の局面の好ましい態様において、自家移植法は、細胞減少療法中または細胞減少療法の後に、患者に実施される。
【００１５】
第三の局面において、本発明により、細胞混合群を、毒素または細胞溶解物質が結合していないK121様抗体に接触させる段階を含む、細胞混合群中のκ型骨髄腫細胞を殺傷するための方法が提供される。
【００１６】
第四の局面において、本発明により、細胞を、毒素または細胞溶解物質が結合していないK121様抗体に曝露する段階を含む、KMA保持細胞にアポトーシスを誘導するための方法が提供される。
【００１７】
第四の局面の好ましい態様において、KMA保持細胞はκ型骨髄腫細胞である。
【００１８】
本発明の一つの態様において、K121様抗体には、図9aに示すように、K121抗体のCDRのループ(CDR1、CDR2およびCDR3)が含まれる。もう一つの態様において、K121様抗体には、図9aに示すようなK121抗体のVHおよびVL遺伝子が含まれる。
【００１９】
本発明のさらに好ましい態様において、K121様抗体は、キメラ抗体かまたはヒト化抗体である。
【００２０】
本発明の詳細な説明
本明細書で使用される場合、「K121様抗体」という語句は、κ型骨髄腫細胞に対する結合に関して、図9aに示されているVHおよびVL領域を有する抗体と競合する抗体を指す。好ましくは、「K121様抗体」という語句は、図9aに示されているVHおよびVL領域を有する抗体と同じ抗原決定基に結合する抗体を指す。
【００２１】
K121様抗体には、図9aに示すようなK121抗体のCDRのループ(CDR1、CDR2およびCDR3)が含まれていることが好ましい。K121様抗体には、図9aに示すようなK121抗体のVHおよびVL遺伝子が含まれていてもよい。
【００２２】
K121様抗体を、HMy2細胞上のKMAに結合する際のK121(またはキメラ型もしくはヒト化型K121)との競合能により識別してもよい。この手法に関して、K121を、確立された手法(Hofmann Kら、(1982) Biochemistry 21: 978〜84)を用い、ビオチンで標識してもよい。次いで、K121様抗体を、HMy2細胞上のKMAに対するビオチン化K121の結合との競合能により評価する。HMy2細胞に対するビオチン化K121の結合を、K121分子上のビオチンに結合するフルオレセイン標識ストレプトアビジンを添加して評価してもよい。次いで、細胞の蛍光染色を、フローサイトメトリー法により定量化し、それからK121様抗体の競合効果を、競合相手の非存在下で得られた蛍光レベルとの比率で表す。
【００２３】
本発明において、「抗体」という語句には、明細書に明記されていない限り、標的抗原に対する結合活性を保持している、完全な抗体の二価断片が含まれる。そのような断片には、例えば、F(ab')2断片が含まれる。
【００２４】
本発明の好ましい態様において、K121様抗体は、組換え型またはモノクローナル抗体である。さらに好ましい態様において、抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体である。
【００２５】
本発明の方法において使用される場合、K121様抗体は、毒素または細胞溶解物質を結合していない。「毒素」により、本発明者らは、リシン、サリン、ジフテリア毒素および緑膿菌(Pseudomonas)外毒素のような当技術分野において周知の任意の毒素を意味する。「細胞溶解物質」により、本発明者らは、細胞溶解を引き起こすメリチンのような物質を意味する。
【００２６】
本明細書の全体にわたって、「含む(comprise)」という用語、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」という変化形は、記述された要素、そのものもしくは段階、または要素、そのものもしくは段階の群を含むが、他の如何なる要素、そのものもしくは段階、または要素、そのものもしくは段階の群を排除することを意味するわけではない。
【００２７】
モノクローナル抗体
抗原決定基KMAに対するモノクローナル抗体は、当業者により容易に作製され得る。ハリブリドーマによりモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法は周知である。不死化した抗体産生細胞株は、細胞融合によりおよび同様にして、腫瘍原性DNAを有するBリンパ球の直接形質転換法、またはEpstein-Barrウイルスによるトランスフェクション法のような他の方法により作製できる。抗原決定基KMAに対して産生されたモノクローナル抗体の集団を、種々の特性に関して；即ち、イソ型および抗原決定基との親和性に関してスクリーニングできる。
【００２８】
マウス由来のモノクローナル抗体を、インビボにおける直接免疫療法および対外免疫療法の双方で使用できる。しかし、マウス由来のモノクローナル抗体を、治療物質としてヒトで使用した場合、患者によりヒト抗マウス抗体が産生されてしまうことが認められている。従って、マウス由来のモノクローナル抗体は、治療に対して、とりわけ長期使用に対しては好ましくない。しかし、確立された遺伝子工学法を用い、動物由来のおよびヒト由来の部位を有する、キメラ抗体またはヒト化抗体を作製することは可能である。動物は、マウスまたはラットのような他の齧歯類とすることができる。
【００２９】
キメラ抗体の可変領域がマウス由来であっても定常領域がヒト由来であれば、そのキメラ抗体は一般的に、「純型の」マウス由来のモノクローナル抗体よりも免疫原性がより低いと思われる。これらのキメラ抗体は、治療的使用に、より適している可能性があると思われ、「純型の」マウス由来の抗体は不適当であることが判明した。
【００３０】
キメラ抗体
当業者は、キメラ抗体を作製する方法を利用できる。例えば、軽鎖および重鎖を、例えば、別々のプラスミド中の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖を用い、別々に発現することができる。次いで、これらを精製し、インビトロで完全な抗体へと組み立てることができる;そのような組み立てを達成する方法が説明されている。例えば、Scharff, M., Harvey Lectures 69:125 (1974)を参照されたい。Oiら, Bio Techniques 4(4):214〜221 (1986);およびSunら, Hybridoma 5 (1986) Suppl 1:517〜20もまた参照されたい。そのようなDNAコンストラクトには、ヒト定常領域をコードするDNAに連結したK121様抗体の軽鎖または重鎖の可変領域に対する機能的に再編成された遺伝子をコードするDNAが含まれていてもよい。DNAコンストラクトをトランスフェクトした骨髄腫またはハイブリドーマのようなリンパ球様細胞により、抗体鎖を発現することおよび組み立てることができる。
【００３１】
単離された還元型の軽鎖および重鎖からIgG抗体を形成するためのインビトロ反応パラメータについてもまた、説明されている。例えば、Beychok, S., Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York, p.69, 1979を参照されたい。完全なH2L2 IgG抗体への重鎖および軽鎖の細胞内会合および連結を達成するため、同一細胞で軽鎖および重鎖を同時発現することもまた、可能である。そのような同時発現は、同一宿主細胞において同じまたは別々のプラスミドを用いて達成することができる。
【００３２】
ヒト化抗体
本発明のもう一つの好ましい態様において、K121様抗体はヒト化される、即ち、分子モデル化法により作製される抗体であって、抗体のヒト含量が最大となるが、マウス抗体の可変領域による結合親和性がほとんどまたは全く損なわれなることがない。
【００３３】
下記に記載される方法は、K121様抗体のヒト化に適用できる。2段階法を使用することができ、これには(a) ヒト化のため、ヒト骨格として使用するヒト抗体配列を選択する段階、および(b) 選択したヒト骨格に組み入れることを目的として、動物モノクローナル抗体のどの可変領域の残基を選択するかを決定する段階が含まれる。
【００３４】
第一段階には、その配列情報が利用できる、最も利用可能なヒト骨格配列の選択が含まれる。この選択過程は、下記の選択基準に基づいている。
【００３５】
(1) 同一性の割合
ヒト化される動物モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列を、全ての公知のヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域の配列と最適整列させ、且つ望ましく比較する。
【００３６】
いったん配列をこのように比較すれば、残基の同一性が示され、そして同一性の割合が決定される。他の要因は全て同じなので、動物抗体との同一性の割合が最高となるヒト抗体を選択するのが望ましい。
【００３７】
(2) 配列のあいまい性
配列が直接的タンパク質配列解析により得られている場合には、その公知のヒト抗体鎖の配列を、配列の不確定要素である未確認残基および/またはあいまい性の存在で評価してもよい。そのような不確定要素のうち最も一般的なものは、配列解析処理中のアンモニアの喪失により、アミノ酸アミドを酸性アミノ酸とする間違った同定、例えば、タンパク質中に実際に存在している残基がグルタミン残基であったのに、グルタミン酸残基とする間違った同定である。他の要因は全て同じなので、そのようなあいまい性が可能な限り少ないヒト抗体鎖を選択するのが望ましい。
【００３８】
(3) ピン領域間隔(Pin-region Spacing)
抗体鎖の可変領域には、ドメイン内ジスルフィド架橋が含まれている。これらの架橋を構成するシステイン残基間の距離(残基数)は、ピン領域間隔(Pin-region spacing)と呼ばれている(Chothiaら, J. Mol. Biol. 196:901 (1987))。他の要因は全て同じなので、選択したヒト抗体のピン領域間隔(Pin-region spacing)が、動物抗体のそれと類似であるかまたは同一であることが最も望ましい。コンピュータモデル化を容易にするため、ヒト配列のピン領域間隔(Pin-region spacing)が、公知の抗体の三次元構造のそれと類似していることもまた、望ましい。
【００３９】
上記の基準を基に、全体として望ましい特性の組み合わせが最良となるヒト抗体(または抗体(antibodies))を、動物抗体のヒト化のための骨格として選択する。選択した重鎖および軽鎖は、同じまたは異なるヒト抗体に由来していてもよい。
【００４０】
本発明の方法の第二段階には、ヒト骨格中に移入することを目的として、動物抗体の可変領域の配列のどこを選択するかの決定が含まれる。この選択過程は、下記の選択基準に基づいている。
【００４１】
(1) 残基選択
動物抗体配列中の2種類の潜在的な可変領域残基を評価する。その一つは、「最小残基」と呼ばれている。これらの最小残基には、CDRのループ構造に加えて、コンピュータモデル化により示されるような、CDRのループ構造を支持および/または配向させるために必要とされる任意の残基がさらに含まれる。
【００４２】
もう一方の種類の潜在的な可変領域残基は、「最大残基」と呼ばれている。それらには最小残基に加えて、コンピュータモデル化により決定されるような、CDRのループ構造の残基のおよそ10Åの範囲に入り且つ水溶媒との接触可能表面を有する任意の残基がさらに含まれる(Leeら, J. Biol. Chem. 55:379 (1971))。
【００４３】
(2) コンピュータモデル化
潜在的な可変領域残基を同定するため、(a) ヒト化される動物抗体の可変領域配列、(b) 選択したヒト抗体の骨格配列、ならびに(c) さまざまな最小および最大の動物抗体残基が移入された、ヒト抗体の骨格配列を含む全ての可能性ある組換え型抗体に関し、コンピュータモデル化を行う。
【００４４】
コンピュータモデル化は、(a) 動物抗体の可変領域のアミノ酸配列にほぼ一番等しい可変領域のアミノ酸配列を有する、および(b) 公知の三次元構造を有する抗体から得られた、タンパク質モデル化および構造情報に適したソフトウェアを用いて行う。使用できるソフトウェアの一例としては、SYBYL Biopolymer Module software(Tripos Associates社)がある。構造情報を得る抗体は、ヒト抗体としてもよいが、必ずしもヒト抗体であることを要しない。
【００４５】
上記の解析で得られた結果に基づき、コンピュータモデル化による構造が動物抗体のものにほぼ一番近い、動物の可変領域を含む組換え型の抗体鎖を、ヒト化を目的として選択する。
【００４６】
完全なヒト抗体は、ヒト抗体の断片(VH, VL, FV, Fd, Fab,またはF(ab')2)を産生するヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(Stratagene社, La Jolla, Calif.)を用いて、およびキメラ抗体を産生するための方法に類似の方法を利用して、完全なヒト抗体を構築するためにこれらの断片を用いて、作製することができる。
【００４７】
投与方法
K121様抗体を、多発性骨髄腫の治療が必要な患者に直接投与してもよい。
【００４８】
腫瘍細胞の増殖を、治療が必要な患者に有効量のK121様抗体を投与することにより阻害するかまたは減少させてもよい。通常、抗体を、一回の投与につき体重1 kgあたり約0.001〜2000 mg、より好ましくは一回の投与につき体重1 kgあたり約0.01〜500 mgの量で投与してもよい。治療医師の処方に従って、反復投与を行ってもよい。しかし、その他の用量もまた適している。一般的に、抗体の投与は、投与速度を変えて、有害な影響を生ずる恐れのある抗体の存在量が制御されるように、注射により行われる。通常、一回分の注射を、数時間持続させてもよい。しかし、同様にして本明細書で考慮されるものは、治療目的で、血清中の抗体が一定レベルに維持されることを可能とする用量の一定注射である。K121様抗体の注射を下記のように行ってもよい。静脈内投与のため、静脈注射(I.V.)管を、例えば、0.9 % NaClおよび5 %ヒト血清アルブミンで前処理し、配置してもよい。静脈注射には、総量250 mlの0.9 % NaClおよび5 %ヒト血清アルブミンが含まれ、認められる任意の速度依存的な副作用にもよるが、約2時間にわたって注射してもよい。バイタルサインを、例えば、注射中は15分毎に、さらに注射後は安定するまで1時間毎に取る。十分な心肺検診を注射前に、さらに注射の終わりに行ってもよい。アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、エピネフリン、およびコルチコステロイドを含む医薬品を、アレルギー反応が起きた場合の治療のため、すぐに使える状態にしておいてもよい。抗体の投与は、医師により望ましいと思われれば、繰り返し行ってもよい。
【００４９】
当業者により十分理解されているように、一部の骨髄腫患者は、循環血液中の遊離κ軽鎖のレベルが顕著である。K121様抗体は、遊離κ軽鎖と反応するので、患者の体液中にそれらが存在すると治療効果が減少してしまう可能性がある。従って、本発明の好ましい態様において、治療法には、K121様抗体の投与前に、患者の体液(例えば、血液)中を循環している遊離κ軽鎖のレベルを減少させるために患者を処置する段階がさらに含まれる。この追加処置段階には、例えば、血漿交換法が含まれてもよい。当業者に周知であるように、血漿交換法は、血液成分分離装置として知られる装置により、血液細胞から血漿を除去する工程である。その分離装置は、液体成分から細胞を分離するため、血液を高速回転させるか、または血漿成分しか通過できないような非常に小さな孔を有する膜に血液を通過させるかのいずれかで機能する。細胞は患者に戻されるが、遊離κ軽鎖を含んでいる血漿は捨てられ、他の液体で置換される。血液が凝固するのを防ぐための医薬品(例えば、抗凝固剤)を、処置の間、静脈投与してもよい。
【００５０】
K121様抗体はまた、液体または組織試料である生物学的試料から悪性形質細胞を取り除くことにも適用できる。液体試料から骨髄腫細胞を取り除くことは、本発明の一部であって、悪性形質細胞を含んでいると疑われる生物学的液体を、悪性細胞に選択的に結合し、アポトーシスを引き起こすことができるK121様抗体と接触させることにより実践してもよい。この方法を、患者から生物学的試料を抽出し、K121様抗体により誘導されるアポトーシスによって悪性細胞を除去し、次いでその除去試料を患者に補充することにより、好ましくない細胞をエクスビボで取り除くために使用してもよい。
【００５１】
K121様抗体の使用を含む多発性骨髄腫の治療法は、単独でまたは周知の化学療法もしくは放射線療法の補助として行うことが可能であると理解されるであろう。例えば、K121様抗体による治療は、メルファランまたはシクロフォスファミドのような薬剤による治療と同時に、またはその後に行ってもよい。
【００５２】
本発明がより明確に理解されるように、好ましい形態を以下の非限定的な実施例に関連して説明する。
【００５３】
実施例1: 細胞障害性の評価
モノクローナル抗体K121の細胞障害活性を、細胞溶解の間、細胞により上清中に放出された乳酸脱水素酵素(LDH)を測定する、CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit(Promega社)を用いて評価した。HMy2(KMA陽性)およびK562(KMA陰性)細胞を保存培養液から回収し、5 % FBSを添加した2×RPMI 1mlあたり細胞1×106個として再懸濁した。細胞を3×104個分に分割して、96ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加した。K121モノクローナル抗体を、濃度2.5 μM、5.0 μM、7.5 μM、10 μM、12.5 μMとして、二連で適当なウェルに30 μlの容量で添加した。5 % CO2の雰囲気中で37 ℃にて20時間、インキュベーションした後、各ウェルから上清を回収し、3000 gで1分間、遠心した。不純物を除去した上清(50 μl)を、別の96ウェルマイクロタイターアッセイプレートに移し、さらに等量の基質と混合した。プレートを暗所中、室温にて30分間、インキュベートし、次いで停止溶液50 μlを加えて反応を停止させた。吸光度値を、Organon Teknikaマイクロイライザプレートリーダー(Turnhout社、Belgium)にて、492 nmで測定した。培地中のFBSおよびフェノールレッドにより、LDHレベルの明らかな上昇がもたらされる可能性があるため、培地(2.5 % FBSを添加した1×RPMI)単独のものを、バックグラウンド対照として含めた。時間的経過の研究に関しては、HMy2細胞を12.5 μMのK121モノクローナル抗体とインキュベートし、次いで培養上清を、抗体を添加してから4時間、8時間、12時間、16時間および20時間後に回収した。
【００５４】
実施例2: アポトーシスアッセイ法
K121のHMy2細胞への細胞障害活性の機構を2通りの方法、アネキシンV結合法およびTUNELアッセイ法で評価した。両アッセイの間、細胞死が起こったことを確認するため、LDHアッセイ法を並行して行った。
【００５５】
アネキシンV結合法
アネキシンVは、細胞膜中のホスファチジルセリンに特異的に結合するタンパク質である。いったん膜が壊れ始めると、結合が生じ、そのリン脂質が細胞外の媒体中に「舞い上がる」。その結果として、この方法によっては、最も早い段階のアポトーシスが測定される。アネキシンV結合法について簡単に説明する。HMy2細胞を保存培養液から回収し、5 % FBSを添加した1×RPMI中に密度1×106細胞/mlとして再懸濁した。細胞溶液を500 μlに分割して、6ウェル組織培養プレートに添加した。等量のK121モノクローナル抗体を、10.7 μMの濃度で細胞に添加し、次いでアッセイトレイを5 % CO2の雰囲気中、37 ℃でインキュベートした。陰性対照として、等量のPBSを添加した。16時間および20時間で、細胞をウェルから遠心により回収した。細胞外LDHに対して上清の一部を測定し、細胞沈殿物は結合用緩衝液(10 mM HEPES, 140 mM NaClおよび2.5 mM CaCl2・2H2O)中で洗浄した。洗浄した細胞を、結合用緩衝液100 μl中に再懸濁し、次いでアネキシンV-FITC(Bender MedSystems社, Vienna, Austria) 2 μlと室温で15分間、インキュベートした。結合用緩衝液をさらに400 μl添加し、次いで細胞を、氷上にて15分間、1 mg/mlプロピジウムイオダイド(Sigma-Aldrich社, St Louis, MI)1 μlで対比染色した。その後、細胞をFACScan(BD社)を用いてフローサイトメトリーにより解析した。
【００５６】
TUNELアッセイ法
アポトーシスの末期段階では、染色体DNAは特徴的パターンの断片化を受ける。TUNELアッセイ法は、断片化したDNAの3'末端を標識するターミナルトランスフェラーゼ酵素に依存する。従って、このアッセイ法により、アポトーシスの末期段階が測定される。簡単に言えば、HMy2細胞をK121/またはPBSの存在下で含有するウェルを二連に設け、前項で説明したようにインキュベートした。TdTを介したdUDPニックエンドラベリング(TUNEL)アッセイ法は、アポトーシス検出システムフルオロセイン(Apoptosis Detection System Fluorescein)(Promega社, Madison, WI)を用いて行った。製造元により説明されているように、細胞を調製し、さらにアッセイ法を行った。簡単に言えば、細胞をPBS中で洗浄し、それから10 %ホルムアルデヒド、続いて70 %アルコールで固定した。細胞内DNAを、その3'末端でフルオレセイン-12-dUTPにより酵素標識し、次いでFACScanにて解析した。
【００５７】
実施例3: SCIDマウス腫瘍モデル
K121のインビボでの潜在的な抗腫瘍効果を評価するため、第0日に、6週齢のSCIDマウスにHMy2細胞を腹腔内(i.p.)注射した。腫瘍細胞の注射に続いて、マウスにK121抗体かまたはPBSのどちらかを腹腔内注射により投与した。HMy2細胞はヒトIgGを分泌するので、ヒトIgG特異的イムノアッセイ法を利用して、移植を受けたマウスの血清中のヒトIgGを定量することにより、腫瘍増殖の進行を監視した。
【００５８】
実施例4: ヒトIgGの定量
酵素結合免疫測定法(ELISA)を、SCIDマウス血清中のヒトIgGレベルを定量するために使用した。プロテインAのPBS-Az溶液(100 μg/mlを1ウェルあたり50 μl)を96ウェルELISAプレート中、37℃で1時間、インキュベートした。ウェルをPBS-Az溶液で3回洗浄し、次いで非特異的結合部分を3 % BSAのPBS-Az溶液により37℃で1時間、ブロッキングした。ウェルをPBS-Az溶液で2回洗浄し、次いで1 % BSAのPBS-Az溶液で2.5倍希釈したマウス血清を1ウェルあたり50 μl加え、37℃で1時間、インキュベートした。PBS-Az溶液で3回洗浄した後、結合した抗体を、アルカリフォスファターゼ(AP)標識ヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体(1 % BSA-PBS-Az溶液で1000倍希釈)を1ウェルあたり50 μl加え、37℃で1時間、検出した。PBS-Az溶液で2回、MilliQ精製水で1回およびELISA基質緩衝液で1回洗浄した後、結合した抗原-抗体複合体を、ELISA基質緩衝液(0.1 M glycine, 1 mM MgCl2, 1mM ZnCl2, pH 10.4)に溶解したp-ニトロフェニルホスフェート(pNPP)基質溶液(1 mg/mlを1ウェルあたり50 μl)を添加して可視化した。室温で10分間発色させ、次いで3 M NaOH溶液(1ウェルあたり50 μl)を添加して反応を停止させた。吸光度を、Organon Teknikaマイクロイライザプレートリーダー(Turnhout社、Belgium)を用い、405 nmで測定した。
【００５９】
ヒトIgGを定量化するため、標準曲線をアッセイに含めた。マウス血清を、連続希釈した精製ヒトIgG1κ(6 μg/ml〜6 ng/ml; Serotec Ltd, Oxford, England)に置き換えて行った。
【００６０】
実施例5: K121とのインキュベーションにより抗原保持細胞の死が引き起こされる
HMy2およびK562細胞のK121とのインキュベーションにより、そのモノクローナル抗体が、時間と濃度の双方に依存したかたちで、標的細胞特異的な死を引き起こすことが明らかとなった(図1)。K121の細胞障害活性は、まず標的培養細胞への添加から約12時間後に検出され、細胞死のレベルはその後、8時間にわたって増加した。K121の細胞障害作用は、終濃度3.6 μMで最大となり、有意な細胞障害性は2.5 μMで検出された。K121の細胞障害活性は、副効果器細胞(accessory effector cells)または血清成分(即ち、補体)を添加しなくとも観測された。
【００６１】
K121の存在下また非存在下でインキュベートしたHMy2細胞を、倒立型光学顕微鏡の下で、倍率200倍にて観察した。scFv-mel免疫毒素複合体(Dunn, RD.ら、(1996) Immunotechnology 2: 229)と共にインキュベートしたHMy2細胞の観察を同時に行った。K121モノクローナル抗体と共にインキュベートした細胞により、細胞縮小および膜「泡状化」の兆候が示された。対照的に、scFv-melにより、細胞凝集および膜溶解が引き起こされた。
【００６２】
K121で処置したHMy2細胞のフローサイトメトリー解析により、未処置細胞に比べて、90度方向の光散乱(側方光散乱)特性の増加(図2)が示されたが、これは抗体処置細胞における内部粒状性およびクロマチン凝縮の増加を反映している。抗体処置細胞の前方光散乱特性が同時に減少したが、これは細胞縮小を示している。K121処置細胞により示された、粒状性、クロマチン凝縮および細胞縮小の増加という組み合わせから、これらの細胞がアポトーシス誘導の結果として死んでいたことが示唆された。
【００６３】
実施例6: K121の標的細胞との相互作用によりアポトーシスが誘導される
二つの独立したアッセイ系を、K121が抗原保持細胞を殺傷する機構について調べるために利用した。初期段階のアポトーシスを、アネキシンVのK121処置細胞への結合により評価した。アネキシンV-FITCによる免疫蛍光染色により、抗体未処置細胞に比べて、K121で処置を開始してから16時間および20時間後に陽性染色されたHMy2細胞の数が増加していることが明らかとなった(図3a)。アネキシンV染色細胞の増加比率は、プロピジウムイオダイドを用いた染色(図3a)およびLDH漏出(図3b)により測定された死細胞比率の増加と相関していた。
【００６４】
アポトーシス末期段階の過程であるDNA断片化解析は、TUNEL法を用いて評価した。K121と共にインキュベートしたHMy2細胞で観測された蛍光の移動は、未処置細胞と比較した場合、16時間および20時間インキュベーション後に顕著であった(図4a)が、これはアポトーシスと関連したDNA断片化パターンの典型的な例である。繰り返しになるが、アポトーシスの測定結果は、LDH漏出(図4b)により測定された死細胞の増加数と相関していた。総合すると、これらのデータから、K121処置細胞はアポトーシスを起こしていることが示唆される。
【００６５】
実施例7: K121はマウスでHMy2腫瘍細胞の増殖を抑制する
第0日に、HMy2細胞107個を移植したSCIDマウスへ、第1日、2日および3日に、3回連続してK121(各1.25 mg) (n=6)もしくはscFv-mel(各0.5 mg) (n=7)の用量を、または処置対照としてPBS(各1.25 mg) (n=6)を投与した。血液試料を、腫瘍細胞の投与前および腫瘍細胞の注射後は週1回の間隔で採取し、動物血清中のヒトIgGの出現により、HMy2細胞の増殖を監視した。PBS処置対照マウスにおいて、ヒトIgGの検出開始時間は、腫瘍細胞の注入後、第3週〜第8週にまで及び、6匹中6匹の動物血清中にヒトIgGが検出された(図5a)。同様にして、細胞溶解ペプチドであるメリチンが連結したK121 scFv断片(scFv-mel)を含む免疫毒素複合体で処置したマウスも、細胞注入から3週間後にヒトIgGレベルの上昇が示された(図5b)。対照的に、K121処置動物の血清中では、同じ期間にわたってヒトIgGが検出されなかった(図5c)。総じて、PBSおよびscFv-mel処置動物は腹部膨満を示し、昏睡状態となりそして、9週間後、6匹中5匹のマウスが死亡した。K121で処置したマウスがこれらの兆候を示すことはなく、且つ全てが第9週まで生存していたが、この時点でこの群からマウス1匹と、他に対照群から生き残った動物とを屠殺しさらに解剖した。K121処置動物は、巨視的には器官の異常はなかった。しかし、未処置動物では、腹腔中の大きな腫瘤、脾腫および肺の萎縮があった。両動物由来の組織試料を、現在、HMy2浸潤に関する免疫細胞化学的手法により調査中である。これらの研究により、K121単独で、免疫不全(SCID)モデルマウスにおいてヒトリンパ芽球状腫瘍細胞の増殖を抑制できることがはっきりと証明された。
【００６６】
第二の例として、第0日に、HMy2細胞107個を注入したSCIDマウスに、下記の通り、第1日、2日および3日に、投与レベルを変えながらK121を与えた。
群1; PBS対照 (n=6)
群2; 用量あたりK121 1.0 mg。総抗体投与量、3.0 mg (n=6)
群3; 用量あたりK121 0.5 mg。総抗体投与量、1.5 mg (n=6)
群4; 用量あたりK121 0.1 mg。総抗体投与量、0.3 mg (n=6)
群5; 用量あたりK121 0.05 mg。総抗体投与量、0.15 mg (n=6)
【００６７】
腫瘍の進行は、マウス血清中のヒトIgGを定量することにより監視した。
【００６８】
全ての未処置マウスは、第28日までヒトIgGレベルの上昇が進行し(図6)、さらに第42日までにこの群の大部分(5匹中4匹)が死亡した(図7)。検死により、脾腫、ならびに肝臓および腎臓の肉眼で見える腫瘍が明らかとなった。K121で処置した腫瘍保持マウスは、血清中のヒトIgGレベルおよび第56日の実験終了時の検死により示されている(図6および図8)ように、腫瘍進行の開始が遅延されるかまたは腫瘍増殖が全く無かった。4つの処置群全体では、マウス24匹中の7匹が、第42日の時点でそれらの血清中のヒトIgGは検出できないレベルにあった(図8)。これらのマウスのうち6匹は、第56日における検死にて腫瘍増殖の巨視的な兆候が示されなかった。全ての未処置マウスは、第49日までに死ぬかまたは倫理的な理由のため安楽死させたが、抗体処置群のマウス24匹中の13匹は、第56日まで生き残った(図7)。
【００６９】
要約すれば、腫瘍保持マウスは、K121処置に対して用量依存的に応答した。第42日の時点で腫瘍増殖が全く無いことが、マウスの30 %で明らかとなり、この効果は、K121の総投与量1.5 mgを与えたマウスで最も著しかった(図8)。腫瘍増殖は、未処置マウスでは急速且つ活動的であって、第49日までの死亡率は100 %であった(図7)。この時点において、処置群全体での死亡率は10 %未満であった。
【００７０】
実施例8: PCRを用いたオリゴヌクレオチドアセンブリによるK121様抗体の合成
PCRを用いた合成オリゴヌクレオチドの伸長により、モノクローナル抗体を作製するために使用した戦略の例は、以前に文献(Satoら. (1994) Molecular Immunology 31 (5): 371)で説明されている。公開されたDNA配列(図9aに示すように)からK121様モノクローナル抗体を作製するために、VH遺伝子を6個の重複するオリゴヌクレオチドVH1〜VH6(図9b)に分割できる。同様に、K121 VL遺伝子を6個の重複するオリゴヌクレオチドVL1〜VL6(図9c)に分割できる。VHオリゴヌクレオチドのうちの3個は、センスDNA配列(図9d, VH1,VH3およびVH5)を有し、且つ3個はアンチセンスDNA配列(図9d, VH2,VH4およびVH6)を有する。同様にして、VLオリゴヌクレオチドのうちの3個は、センスDNA配列(図9e, VL1,VL3およびVL5)を有し、且つ3個はアンチセンスDNA配列(図9e, VL2,VL4およびVL6)を有する。
【００７１】
Taqポリメラーゼを用いた一次PCRにより、三組のオリゴヌクレオチドがアセンブルされ、三つの二本鎖DNA断片が生成される(図9f)。次いで、一次増幅した三つの産物をゲル抽出し、さらに単離したDNA断片を、Taqポリメラーゼを用いて完全長の遺伝子配列をアセンブルするための鋳型として使用する。VH遺伝子の最後のアセンブリにおいて、その遺伝子の5'領域に相補的なPCRプライマー(VHF)とその遺伝子の3'領域に相補的なアンチセンスプライマー(VHR)とを、完全なK121 VH遺伝子配列を作製するために使用する。同様にして、VL遺伝子の5'領域(VLF)および3'領域(VLR)に対するPCRプライマーを、完全なK121 VL遺伝子を増幅するために使用する。最終遺伝子産物は、完全なV遺伝子の存在および忠実性を確認するために塩基配列決定する。
【００７２】
次いで、合成したK121 VHおよびVL遺伝子を、対応するマウスIg定常領域の遺伝子、即ち、重鎖に対してはCγ1および軽鎖に対してはCκ、を含む哺乳動物発現ベクター中で連結する。次いで、哺乳動物細胞株に、作製したベクターをトランスフェクトし、さらに機能するK121の発現をイムノアッセイ法により、キメラ抗体に関して説明したように監視する。
【００７３】
実施例9: キメラ抗体cK121の構築
K121 VHおよびVL遺伝子の単離
モノクローナル抗体K121の重鎖(K121 VH)および軽鎖(K121 VL)の可変領域の遺伝子は、PCRにより単離した。VHおよびVL遺伝子を増幅するための鋳型は、scFv-mel遺伝子コンストラクトとした。増幅のために使用したPCRプライマー(図10)は、哺乳動物発現ベクターpCMV-γ1およびpCMV-KR(Mahlerら、(1997) Immunotechnology 3:31)中に直接的なクローニング用の互換性制限部位を導入するために設計した。
【００７４】
PCR増幅産物は、1 %アガロースゲルでの電気泳動により分離し、次いで予想される大きさのDNAのバンドを、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen社, Germany)を用いて抽出した。その後、単離した遺伝子断片をpGEM-Tベクターに連結し、次いでコンピテント細菌性細胞JM109(Promega社, USA)に形質転換した。一晩、インキュベーションした後、ベクター特異的プライマー(M13)を用いたPCRスクリーニングにより、インサートを含むコロニーを同定した。VHおよびVLの陽性クローンを選択し、次いでプラスミドDNAを、Wizardミニプレップキット(Promega社, USA)を用いて調製した。VHおよびVLに相当する2クローンは、シドニー大学プリンスアルフレッド高分子解析センター(Sydney University Prince Alfred Macromolecular Analysis Centre) (SUPAMAC)により、ABI全自動DNAシークエンサーで塩基配列決定した。K121 VHおよびVLのDNA配列は、図9aに示すものと同一であって、PCRプライマーに組込まれた制限酵素部位およびヌクレオチドが付加されていた(図10)。
【００７５】
K121 VHおよびVLの発現ベクターへの連結
K121 VHおよびVL遺伝子を、制限酵素Bam HIおよびApa LIを用い、pGEM-Tクローンから制限切断した。制限切断したVHおよびVLインサートを、ゲル抽出により精製した。重鎖および軽鎖のリーダー配列は、Apa LIおよびHind IIIによるpCMV-γ1の制限切断、続いてリーダー配列インサートのゲル抽出により単離した。Hind IIIおよびApa LIで消化したリーダー配列を、K121 VHおよびVL遺伝子と同時に、Hind IIIおよびBam HIで制限切断したpCMV-γ1およびpCMV-KRにそれぞれ連結した。コンピテント細胞JM109に形質転換した後、インサートを含むコロニーを、VHおよびVL遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRによりスクリーニングした。プラスミドDNAを陽性クローンから調製し、さらにBam HIおよびHind IIIによる制限酵素消化により、インサートを確認した。この段階で、K121 VHおよびVL DNA配列が正しいことを確認するために、pCMV-γ1-cVHおよびpCMV-KR-cVLプラスミドをベクター特異的なプライマーを用いて塩基配列決定する。
【００７６】
発現プラスミドのCHO細胞へのトランスフェクション
CHO-K1(チャイニーズハムスター卵巣)細胞は、10 % FBS(Sigma Aldrich社, USA)を添加したDMEM/F12培地中で増殖させ、且つ5 % CO2雰囲気中、37℃でインキュベートした。プラスミド調製物、pCMV-γ1-cVHおよびpCMV-KR-cVLの総量5 μgを、10 % FBSおよび2 mM L-グルタミン(Trace Biosciences社, NSW)を添加したRPMI培地(Sigma Aldrich社, USA)200 μl中で、4×106個のCHO細胞と共にインキュベートした。細胞/DNA混合物をキュベット中に設置し、次いでエレクトロポレーションをGene Pulser(BioRad社, USA)中で、以下の設定にて行った; 抵抗100オーム, 0.3ボルト, 電気容量Ext 960 μFDおよび時定数33〜38 msec。その後、細胞を10 % FBSを添加したDMEM/F12培地10 mlに移し、さらに5 % CO2雰囲気中、37℃で48時間、増殖させた。トランスフェクションした細胞の選択は、DMEM/F12に溶解した抗生物質G418(GENETICIN, Sigma Aldrich社, USA) 400 μg/mlを含むネオマイシン選択培地を用いて行った。3日後、培養上清を交換し、さらに細胞を150 cm2組織培養フラスコに拡げて播いた。7日後、選択培地において、cK121の発現を2つの別個のELISA法により評価した。
【００７７】
実施例10: 発現したキメラ抗体cK121の評価
ELISA法の手順は、特定の試薬をいくらか変えて、実施例4に詳述されているように行った。簡単に言えば、ヒトFc領域を含むキメラ抗体の発現を測定するため、96ウェルプレートのウェルをヤギ抗ヒトIgG、IgAおよびIgM抗体(10 μg/mlを1ウェルあたり50 μl)でコーティングすることにより、ELISA法にて行った。次いで、トランスフェクトしたCHO細胞由来の条件培地をウェル中でインキュベートし、続けてアルカリフォスファターゼ(AP)標識ヤギ抗ヒト(Fc特異的)抗体とインキュベートし、さらに基質pNPP(Sigma Aldrich社, USA)を用いて発色させた。第一のELISA法に対する標準曲線は、ヒトIgG1κの連続希釈(6 μg/ml〜6 ng/ml)を用いて作成した。並行して、トランスフェクトしたCHO細胞由来の不純物を除去した上清を連続希釈し、次いでその試料を解析した(図11a)。cK121を発現しているCHO細胞に関して、標準曲線に類似した希釈曲線が得られた。CHO細胞の条件培地中のcK121推定濃度は、6 ng/μlであった。
【００７８】
第二のELISA法は、発現抗体の、K121により特異的に認識される抗原への結合を実証するために行った。第二のアッセイプレートのウェルを、ヒト遊離κ軽鎖(100 μg/ml溶液を1ウェルあたり50 μl)でコーティングした。第二のELISA法において、不純物を除去したCHO細胞上清の、ヒト遊離κ軽鎖との結合が、試料の希釈範囲にわたって示された(図11b)。比較として、トランスフェクトしていないCHO細胞の条件培地に関しては、結合は観測されなかった。
【００７９】
実施例11: cK121の精製
cK121の精製は、CHO細胞の条件培地(1.4リットル)中のタンパク質を硫酸アンモニウム沈殿して行った。再び可溶化したタンパク質をPBS-Az中で徹底的に透析した後、その試料を、プロテインAアガロース(Sigma Aldrich社, USA)によるアフィニティー精製に供した。溶出した試料をPBS pH7.4中で透析し、アミコン撹拌セル(Amicon stirred cell)(Millipore社, USA)で濃縮し、さらにろ過滅菌した(Minisart RC15, 0.2 μm, Sartorius, AG社)。cK121の濃度を、吸光度280 nmでの吸光係数14を用いて推定した。
【００８０】
実施例12: K121のリンパ芽球様細胞HMy2およびK562への細胞障害性
K121のリンパ芽球様細胞HMy2およびK562への細胞障害性は、実施例1で説明したように、細胞質LDHの漏出アッセイ法を用いて測定した。精製したcK121は、抗原陽性のHMy2細胞に対して有意な細胞障害活性を示したが、抗原の非保持細胞株であるK562とは反応しなかった(図12)。これらの結果により、cK121は、標的細胞株に細胞死を誘導する能力を保持していたことが示唆される。その細胞死の機構がアポトーシスであることを確認するためには、実施例2で説明したアッセイ法を、精製したcK121を用いてHMy2細胞で行う。
【００８１】
実施例13: 安定的にcK121を分泌する細胞の選択
cK121の大量産生には、選択用抗生物質G418が存在しなくとも安定的に抗体を分泌できる細胞株の選択が必要となる。従って、両ELISA法で陽性結果(405 nmでの吸光度が0.2より大きい)を示したウェル由来のクローンを選択し、さらに限界希釈法によりクローニングした。その後、分泌型cK121を産生できた単一クローン由来のCHO細胞を、抗生物質が添加されていないDMEM-F12中で増殖させた。抗生物質がない状態でcK121を分泌し続けた細胞を、安定的にcK121を産生する細胞株として選択した。cK121 CHO細胞株由来の条件培地を、実施例9で説明したイムノアッセイ法により評価し、且つ産生された抗体量を、ヒトIgG1κによる標準曲線から決定した。図13に、今後に発現させる(future expression)ことを目的として選択した、5個の陽性クローンが示されている(クローン1〜5)。１個の陰性クローンを対照試料として含めた。
【００８２】
実施例13で得られたcK121クローンに関するさらなる機能研究を実施するため、大量発現実験を行ってもよい。cK121を精製してもよく、さらにインビボ動物実験を行ってもよい。
【００８３】
実施例14: VκヒトVL骨格領域を用いてK121軽鎖可変領域(VL)遺伝子をヒト化するための戦略
K121 VLをヒト化するために用いられたPCR手順の概要のアウトラインを図14aに示した。ヒトVL骨格領域(hVL)は、以前に説明されたPCRに基づく戦略(Asvadi, PhD Thesis, UTS, 1998)を用いて、以前にcDNAから同定且つ単離された。hVL遺伝子を含む単一クローン由来のプラスミドDNAを、塩基配列決定し、さらに図14b中のK121 VLのDNA配列と比較した。太字で示したDNA配列は、K121の相補鎖決定領域(CDR)をコードしている。K121のCDR1、CDR2およびCDR3に対するDNA配列をhVL骨格領域中に組込むために使用したオリゴヌクレオチドを、図14cに示した。制限酵素Age Iによる遺伝子の消化により、K121 CDR2を含む骨格領域を、hVLと区別することができる。その制限部位は、PCRプライマーVLCに示されている。
【００８４】
PCR増幅
図14aに示されているように、PCR増幅のための鋳型は、hVL遺伝子とした、そしてプライマー対、VLAとVLE、VLBとVLF、VLCとVLGおよびVLDとVLHを用いて一次PCRの反応を行った。4つの断片の増幅は、TITANIUM Taq PCRキット(Clontech社, CA)を用いて行った。各反応由来の産物を、エチジウムブロマイドを用いたアガロースゲル電気泳動により可視化し、次いでゲル抽出(Promega社, MA)により単離した。4つの増幅断片をアセンブルするため、二次PCRを行った。得られた増幅断片は、約380塩基対(bp)であった。製造元により推奨される手順(Promega社, MA)に従って、DNAバンドを抽出し、さらにpGEM-Tベクター中に連結した。連結反応混合物の一部をコンピテント細胞JM109に形質転換し、それから試料をLB-ampプレート上に播いた。37℃で一晩インキュベーションした後、手順書(Promega社, MA)に従って、単一コロニーを拾い、SOC培地中で一晩増殖させた。プラスミドDNAを、WizardプラスミニプレップDNA精製システムを用いて単離した。推奨される消化手順(Promega社, MA)に従って、10クローンを制限酵素Age IおよびBam HIによる消化に供した。消化産物を、エチジウムブロマイドを含む1 %アガロースゲルで可視化した。おおよそ的確な大きさのDNA断片を産生した単一クローンは、そのインサートに、改変したVL遺伝子が含まれていることを確認するため、塩基配列決定する。次いで、ヒト化K121 VL遺伝子を、実施例9で説明されているように、哺乳動物発現ベクターpCMV-KRに連結する。
【００８５】
実施例15: ヒトVH3骨格遺伝子を用いたK121重鎖可変領域(VH)遺伝子のヒト化
ヒト重鎖可変領域遺伝子hVHを、実施例14で説明されているPCR戦略を用いて単離且つクローニングした。そのhVH遺伝子を含むpGEM-Tプラスミドを、クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット(QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit)の方法における鋳型として使用した(図15a)。K121 VH由来の3つのCDRをhVH骨格に組込むために使用したプライマーを、図15bに描いた。突然変異誘発の各ラウンド後、DNA配列が正しいことを確認するため、塩基配列決定する。次いで、ヒト化K121 VH遺伝子を、実施例9で説明するように、哺乳動物発現ベクターpCMV-γ1に連結する。
【００８６】
考察
本明細書に詳述された実験により、マウスモノクローナル抗体K121は、任意の副効果器細胞(accessory effector cells)、または血清補体タンパク質の添加がなくとも、ヒトリンパ芽球様細胞株HMy2の細胞死を誘導することが証明される。本発明者らは以前、HMy2細胞が、K121により認識される抗原KMAを発現することを明らかにした。HMy2細胞を、濃度3.6 μMにてK121のみとインキュベートした場合、細胞内LDHの放出により示される(図1)ように、有意な細胞死が起こった。
【００８７】
K121の細胞障害活性の特異性は、KMA陰性細胞株K562を処置しても有意な細胞死が引き起こされなかった(図1)という事実から証明される。
【００８８】
K121の存在下または非存在下でインキュベートしたHMy2細胞の顕微鏡観察から、K121の存在下で細胞死が起こっていることが示された。K121の存在下では、細胞が縮小しているように見え、そして膜「泡状化」の証拠が存在していた。これらの作用は、プログラム細胞死またはアポトーシスと呼ばれる過程の細胞に典型的である(Kerr, JFR.ら, (1972) Br J Cancer 26:239)。対照的に、HMy2細胞の免疫毒素複合体scFv-melとのインキュベーションにより、細胞凝集および膜溶解が引き起こされた。明らかに、K121と共にインキュベートした細胞の外観は、免疫毒素複合体scFv-melと共にインキュベートしたものと異なっていた。これらの予備的観測から、K121による細胞死で起きている機構は、scFv-melの細胞障害作用とは異なることが示唆される。
【００８９】
K121誘導性の細胞死にあるHMy2細胞の光散乱特性の解析により、アポトーシスと合致した、細胞の内部構造および大きさの変化が明らかとなった(図2)。K121により標的細胞が殺傷される機構の解釈を、アポトーシス過程の早期および末期段階をそれぞれ測定する(図3および図4)、2つの別個のアポトーシス・アッセイ法により確認した。このように、K121は、任意の外来因子がなくとも、インビトロでKMA保持細胞にアポトーシスを誘導する。さらに、K121は、インビボで腫瘍細胞の増殖を抑制する。移植を受けたマウスの血清においてヒトIgGの存在から測定されるように、腫瘍誘導性のHMy2細胞の投与を受けたマウスへのK121の投与により、腫瘍増殖が抑制された(図5)。血清中のヒトIgGレベルおよび解剖による巨視的形態から示されるように、PBS処置群の全てのマウスで腫瘍増殖が観測された。
【００９０】
アポトーシスは、胚発生ならびに、とりわけ、免疫系の発達および機能に関与する重要な生物学的事象である(Mastrangelo AJ.およびBetenbaugh M. (1998) TIBTECH. 16:88)。ネクローシスに起因する細胞死とは対照的に、アポトーシスは、いかなる病変もない状態で起こり、且つ免疫応答を引き起こすことはない(Kerr, JFR.ら, (1972) Br J Cancer 26:239)。これは、標的細胞にアポトーシスを引き起こす可能性のある潜在的な治療物質の使用に関する重要な考察である。
【００９１】
前記の全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００９２】
本明細書に含まれる文献、行為、材料、装置、論文等のすべての考察は、単に本発明を説明することを目的としている。これらの事柄のいずれかまたは全ては、それが本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在していたとしても、先行技術の基礎の一部を成すかまたは本発明に関連する分野における一般常識であったと自認するものと解釈されるべきではない。
【００９３】
特定の態様が明らかにされている本発明に対し、態様をより広く記載するが如く、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、ほかに様々な変更および/または改変が可能なことは当業者により理解されるであろう。従って、前述の実施例はあらゆる点で単なる例示にすぎず、限定的に解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】(a) 細胞質LDHの漏出により測定(吸光度492 nm)された、モノクローナル抗体K121のヒトリンパ芽球様細胞HMy2およびK562への細胞障害活性。細胞を、K121モノクローナル抗体(6.25 μM)の存在下および非存在下で20時間、インキュベートした。(b) K121誘導性細胞死の速度論。(c) HMy2細胞殺傷のK121による濃度依存。
【図２】HMy2細胞のK121誘導性アポトーシスのフローサイトメトリー解析。PBSまたはK121と共に16時間および20時間インキュベートしたHMy2細胞の光散乱特性。FSCとSSCは、それぞれ細胞の大きさと細胞の複雑性に相当する。
【図３】(a) アネキシンV-FITCを用いたHMy2細胞のK121誘導性アポトーシスのフローサイトメトリー解析。HMy2細胞を、K121の非存在下(対照)または存在下、37 ℃にて16時間または20時間、インキュベートした。その後、細胞をアネキシンV-FITCと共にインキュベートし、さらにプロピジウムイオダイドで対比染色した。(b) アネキシンVアッセイ法と並行して行われたK121モノクローナル抗体のHMy2細胞への細胞障害性。HMy2細胞を、K121モノクローナル抗体の非存在下(対照)または存在下(5.35 μM)、37 ℃にて16時間または20時間、インキュベートした。培養上清を、細胞質LDH漏出の解析のために回収した。
【図４】(a) TUNELアッセイ法を用いたHMy2細胞のK121誘導性アポトーシスのフローサイトメトリー解析。HMy2細胞を、K121の非存在下(対照)または存在下、37 ℃にて16時間または20時間、インキュベートした。その後、細胞を固定し、さらにフルオレセイン-12-dUDPにより細胞内DNAを、その3'末端で酵素標識した。(b) TUNELアッセイ法と並行して行われた、K121有りおよび無しと16時間および20時間インキュベーションした後のHMy2細胞の細胞障害性。HMy2細胞を、K121モノクローナル抗体の非存在下(対照)または存在下(5.35 μM)、37 ℃にて16時間または20時間、インキュベートした。培養上清を、細胞質LDH漏出の解析のために回収した。
【図５】(a) 未処置(PBS)、(b) scFv-melで処置、または(c) K121モノクローナル抗体で処置後、SCIDマウスでHmy2により分泌されたヒトIgGの血清レベルの時間的経過。第0日に、細胞(107個)を腹腔内に注射し、それから第1日〜第3日に、scFv-mel(0.5 mg/投与)またはK121モノクローナル抗体(1.25 mg/投与)による処置を施した。処置群内で、各記号は個々のマウスに対するIgG値を表す。
【図６】SCIDマウスにおける抗体処置の腫瘍増殖への効果。第0日に、SCIDマウスにHMy2細胞を注射し、それからK121モノクローナル抗体を、総投与量3.0 mg、1.5 mg、0.3 mg、0.15 mgおよび0 mg(PBS対照)として、3日間に渡り(第1日、第2日および第3日)投与した。腫瘍増殖を、マウス血清中のヒトIgGの定量により評価した。プロットした値は、未処置群の第6週の値(その値は単一マウス由来である)を除き、マウス6匹の平均値である。
【図７】抗体用量の腫瘍保持マウス生存率への効果。
【図８】腫瘍細胞の注射から42日後の未処置マウスおよび抗体処置マウスの血清中のヒトIgGレベル。値は、マウス個々に対し表示している。＊検出できないヒトIgG；†死亡。
【図９】(a) K121重鎖(VH)および軽鎖(VL)可変領域のアミノ酸配列および対応するDNA配列。CDR領域を太字で示す。(b) 重複するオリゴヌクレオチド(VH1〜VH6)は、K121のVH遺伝子から得た。(c) 重複するオリゴヌクレオチド(VL1〜VL6)は、K121のVL遺伝子から得た。(d) K121 VHのオリゴヌクレオチド伸長のためのPCRプライマー。(e) K121 VLのオリゴヌクレオチド伸長のためのPCRプライマー。(f) オリゴヌクレオチド伸長を利用したK121モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の作製法の概略図。
【図１０】K121 VHおよびVL遺伝子をPCR増幅するためのPCRプライマー。哺乳動物発現ベクター中へ直接的にクローニングするための制限酵素部位には、下線を引いてある。cK-VH-RおよびcK-VL-Rプライマーには、スプライスアクセプター部位が含まれる(太字で示す)。
【図１１】(a) トランスフェクトしたCHO細胞上清中のヒト抗体の検出および定量のためのELISA法。トランスフェクトしたCHO細胞由来の培養上清を連続希釈し、次いで固相化したヤギ抗ヒトIgG+IgA+IgM抗体に結合したヒト抗体を、アルカリフォスファターゼ(AP)標識ヤギ抗ヒトFc特異抗体で検出した。ヒトIgG1κの連続希釈を用いて、標準曲線を同時にとった。結合した抗体を発色により可視化し、次いで吸光度を405 nmにて測定した。(b) ヒトκ軽鎖に結合しているキメラK121の検出のためのELISA法。トランスフェクトしたおよびトランスフェクトしていないCHO細胞由来の培養上清を連続希釈し、次いで固相化したヒトκ軽鎖に結合した抗体を、アルカリフォスファターゼ(AP)標識ヤギ抗ヒトFc特異抗体を用いて検出した。発色後、結合した抗体を、吸光度405 nmにより検出した。
【図１２】細胞質LDH漏出により測定された、キメラK121(cK121)のリンパ芽球様細胞HMy2およびK562への細胞障害活性。標的細胞を、PBS(対照)、5.5 μMマウスK121(mK121)または0.8 μMキメラK121(cK121)の存在下、5 % CO2の雰囲気中で37 ℃にて20時間、インキュベートした。
【図１３】個々のクローンにより分泌されたcK121の濃度。cK121の濃度を、抗ヒトIgG、IgAおよびIgM抗体でコーティングしたウェルを用いたELISA法により決定した。データは、陽性クローン1〜5および陰性クローン6を示している。
【図１４】(a) 骨格としてヒトVL遺伝子を用いたK121 VLのヒト化の方法の概略図。(b) ヒト骨格VLおよびK121 VLのDNA配列。(c) PCRを用いたK121 VLのヒト化のためのオリゴヌクレオチド。
【図１５】(a) K121およびヒトVH3(hVH)の可変領域重鎖遺伝子のDNA配列。(b) K121のヒト化に使用するためのVH突然変異誘発用プライマー。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図９ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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