(57)【要約】粒子の増強された分解能を提供する高分解能粒子識別プロセスおよび分離システムは、選択された粒子特性に基づく。特に、本システムは分解能の増強されたフローサイトメーターを含む。ある実施形態では、本発明は、細胞検出システム（１３）によって粒子分解能を増強する角度で、分解能増強ノズル（２５）へ０の液体ソース流（２４）を導入する少なくとも１つの液体ソース導管（２４）を含むことができる。本発明はまた、ノズル（２）の内の液体流（３）の層流形成の破壊、乱流、歪み、あるいは遅延を減少させる方法、あるいは射出ポイント（１８）でノズル内に導入された粒子あるいは細胞（１６）を有するコア流を備えるラミナー流を確立する方法で、ノズル（２）内に液体ソース（４）から液体を導入する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリー方法であって、
ａ．哺乳類種の雄の精細胞を得るステップと、
ｂ．射出ポイントで液体流に前記精細胞を射出するステップと、
ｃ．前記液体流中の複数の液滴を形成するステップと、
ｄ．前記複数の液滴部分に前記精細胞の各々の１つを同伴させるステップと、
ｅ．前記複数の液滴の前記部分における精細胞を分析するステップと、
ｆ．前記精細胞間を識別し、少なくとも１つの精細胞特性に基づいた２つの集団を生成するステップと、
ｇ．前記液体流における前記精細胞の前記射出ポイントを調整し、前記精細胞の少なくとも２つの集団の分解能を向上させるステップとを包含する方法。
【請求項２】
前記哺乳類種の前記雄が、ウシ種の哺乳類、ウマ種の哺乳類、羊種の哺乳類、犬種の哺乳類、ネコ種の哺乳類、ブタ種の哺乳類、海洋種の哺乳類、シカ種の哺乳類からなる群から選択される請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項３】
前記液体流がシース液体を有する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項４】
前記シース液体が、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液を含むシース液体からなる群から選択されるシース液体を含む請求項３に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項５】
哺乳類種の雄の精細胞を得る前記ステップは、第１の哺乳類種の精細胞を得るステップと、第２の哺乳類種の精細胞を得るステップとを有し、前記精細胞の前記少なくとも２つの集団の分解能を向上させるために、前記液体流中の前記精細胞の前記射出ポイントを調整する前記ステップは、前記少なくとも２つの集団の分解能を増加させるために、前記液体流内の第１の位置で前記第１の哺乳類種の前記精細胞の第１の射出ポイントを確立するステップと、前記少なくとも２つの集団の分解能を増加させるために、前記液体流内の第２の位置で前記第２の哺乳類種の前記精細胞の第２の射出ポイントを確立するステップとを包含する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項６】
前記精細胞の少なくとも２つの集団の分解能を向上させるために、前記液体流中の前記精細胞の前記射出ポイントを調整する前記ステップは、粒子インジェクターが前記液体流へ前記精細胞を導入する位置を調整するステップを包含する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項７】
粒子インジェクターが前記液体流へ前記精細胞を導入する位置を調整するステップは、前記粒子インジェクターとノズル本体との間にスライド調整可能な結合を提供するステップを包含する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項８】
粒子インジェクターが前記液体流へ前記精細胞を導入する位置を調整するステップは、前記粒子インジェクターと前記ノズル本体との間のらせん状のねじ山の対になったペアを操作するステップを包含する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項９】
前記精細胞の前記少なくとも２つの集団の分解能を向上させるために、前記液体流中の前記精細胞の前記射出ポイントを調整する前記ステップは、前記液体流中への前記精細胞の前記射出ポイントと前記液体流が流れる前記ノズル開口部との間の距離を変化させるために、前記粒子インジェクターを第２の粒子インジェクターと交換するステップを包含する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項１０】
前記精細胞の前記少なくとも２つの集団の分解能を向上させるために、前記液体流中の前記精細胞の前記射出ポイントを調整する前記ステップは、前記液体流の中への前記精細胞の前記射出ポイントと前記液体流が流れるノズル開口部との間の距離を調整するステップを包含する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項１１】
前記液体流は液体流特性を有し、前記精細胞の前記少なくとも２つの集団の分解能を向上させるために、前記液体流中の前記精細胞の前記射出ポイントを調整する前記ステップは、前記液体流特性に基づいて前記精細胞の前記射出ポイントを調整するステップを包含する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項１２】
前記液体流は液体流特性を変化させ、前記精細胞の前記少なくとも２つの集団の分解能を向上させるために、前記液体流中の前記精細胞の前記射出ポイントを調整する前記ステップは、前記変化した液体流特性に基づいて前記精細胞の前記射出ポイントを調整するステップを包含する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項１３】
精細胞の第１の集団および精細胞の第２の集団へ、前記精細胞を分離するステップをさらに包含する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの精細胞特性に基づいて２つの集団を生成するために前記精細胞間を識別する前記ステップは、性別特性に基づいて前記精細胞間を識別するステップを備え、精細胞の前記第１の集団はＸ染色体を有し、精細胞の前記第２の集団はＹ染色体を有する請求項１に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項１５】
フローサイトメーターであって、
ａ．液体流と、
ｂ．前記液体流が流れるノズル本体と、
ｃ．前記液体流が前記ノズルを出るノズル開口部と、
ｄ．粒子ソースと、
ｅ．前記液体流中の位置で少なくとも１つの粒子を同伴させる前記粒子ソースに流体結合した粒子インジェクターと、
ｆ．前記ノズル開口部と、前記粒子インジェクターが前記少なくとも１つの粒子を同伴させる前記液体流中の前記位置との間の距離を変化させる選択的可変調整素子と、
を備えるフローサイトメーター。
【請求項１６】
前記粒子は細胞を含む請求項１５に記載のフローサイトメーター。
【請求項１７】
前記粒子は精細胞を含む請求項１５に記載のフローサイトメーター。
【請求項１８】
前記精細胞は、ウシ種の哺乳類、ウマ種の哺乳類、羊種の哺乳類、犬種の哺乳類、ネコ種の哺乳類、ブタ種の哺乳類、海洋種の哺乳類、シカ種の哺乳類からなる群から選択される哺乳類種の雄から得られる請求項１５に記載のフローサイトメーター。
【請求項１９】
前記ノズル開口部と、前記粒子インジェクターが前記少なくとも１つの粒子を同伴させる前記液体流中の前記位置との間の距離を変化させる前記選択的可変調整素子は、前記粒子インジェクターと前記ノズルとの間のスライド調整可能な係合を備える請求項１５に記載のフローサイトメーター。
【請求項２０】
前記ノズル開口部と、前記粒子インジェクターが前記少なくとも１つの粒子を同伴させる前記液体流中の前記位置との間の距離を変化させる前記選択的可変調整素子は、前記粒子インジェクターと前記ノズルとの間で係合するらせん状のねじ山の対になったペアを備える請求項１５に記載のフローサイトメーター。
【請求項２１】
前記ノズル開口部と、前記粒子インジェクターが前記少なくとも１つの粒子を同伴させる前記液体流中の前記位置との間の距離を変化させる前記選択的可変調整素子は、前記液体流中の第２の位置で前記少なくとも１つの粒子を同伴させる第２の粒子インジェクターを有する前記粒子インジェクターと交換するステップを備える請求項１５に記載のフローサイトメーター。
【請求項２２】
フローサイトメーターであって、
ａ．液体流と、
ｂ．前記液体流が流れるノズル本体と、
ｃ．前記液体流が前記ノズルを出るノズル開口部と、
ｄ．粒子ソースと、
ｅ．前記液体流中の選択的可変位置で少なくとも１つの粒子を同伴させる前記粒子ソースに流体結合した粒子インジェクターと、
を備えるフローサイトメーター。
【請求項２３】
フローサイトメーターであって、
ａ．液体流と、
ｂ．前記液体流が流れるノズル本体と、
ｃ．前記液体流が前記ノズルを出るノズル開口部と、
ｄ．粒子ソースと、
ｅ．前記液体流中の位置で前記粒子ソースから少なくとも１つの粒子を同伴させる前記粒子ソースに流体結合した調整可能な粒子インジェクターと、を備え、前記粒子インジェクターの調整により、前記ノズル開口部と前記粒子インジェクターが前記少なくとも１つの粒子を同伴させる前記液体流中の前記位置との間の距離を変化させる、フローサイトメーター。
【請求項２４】
フローサイトメーターであって、
ａ．液体流と、
ｂ．前記液体流が流れるノズル本体と、
ｃ．前記液体流が前記ノズルを出るノズル開口部と、
ｄ．粒子ソースと、
ｅ．前記ノズル本体に前記粒子ソースを流体結合する導管と、
ｆ．前記液体流中の位置で少なくとも１つの粒子を同伴させる前記導管に結合された粒子インジェクターと、
ｇ．前記ノズル開口部と前記粒子インジェクターが前記少なくとも１つの粒子を同伴させる前記液体流中の前記位置との間の距離を変化させる選択的可変調整素子と、
を備えるフローサイトメーター。
【請求項２５】
フローサイトメーターであって、
ａ．ノズル開口部を有するノズルと、
ｂ．前記ノズル内に調節により位置決めされた粒子インジェクターと、を備え、これにより、前記粒子インジェクターの位置的調整は、前記粒子インジェクターの射出ポイントと前記ノズル開口部との間の距離を変化させる、フローサイトメーター。
【請求項２６】
フローサイトメトリー方法であって、
ａ．ノズル内に液体流を生成するステップと、
ｂ．ノズル開口部から前記液体流を放出するステップと、
ｃ．前記ノズル開口部から離れた前記液体流中の粒子射出ポイントを確立するステップと、
ｄ．前記射出ポイントで前記液体流中に細胞を同伴させるステップと、
ｅ．前記ノズル内で粒子インジェクターの位置を調整するステップと、
ｆ．少なくとも１つの細胞特性に基づいて前記細胞を分析するステップと、
ｇ．前記ノズル内で粒子インジェクターの位置を調整するステップとを包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｉ．  技術分野
粒子特性に基づいた粒子の高分解能識別および分離。特に、Ｘ染色体を運ぶ、およびＹ染色体を運ぶ集団への精細胞の高分解能識別および分離、あるいは均一性の向上。
【背景技術】
【０００２】
ＩＩ．  背景
性別の効率的な予選択は、精細胞を濃縮されたＸ染色体関連、およびＹ染色体関連集団に分離する安全で信頼性のある方法の開発により、哺乳類の多様な種において達成されている。本明細書に開示されるように、および参照によって本明細書に引用された多様な国際特許出願、例えば、国際公開第９８／３４０９４号パンフレット、国際公開第９９／３３９５６号パンフレット、国際公開第９９／４２８１０号パンフレット、国際公開第００／０６１９３号パンフレット、国際公開第０１／４０７６５号パンフレット、国際公開第０１／８５９１３号パンフレット、国際公開第０２／４３４８６号パンフレット、国際公開第０２／４３５７４号パンフレットによって開示されるように、Ｙ染色体関連からのＸ染色体関連精細胞分離を行うことができる。
【０００３】
ここで、図１および２を参照すると、従来技術のフローサイトメーターでは、粒子あるいは細胞（１６）（これには、細胞小器官、ミトコドリアｍｉｔｏｃｈｏｄｒｉａ、個々の染色体などの細胞部分と同様に、生物学的成分が結合するビーズまたは微小球、またはナノスフェアー  などの人工粒子と同様に、精細胞または精子、精子頭部、一般に白血球、リンパ球、単球、好中球、好塩基球、マクロファージ、赤血球、血小板などの血球で生じるもの、母体血内の循環系における胎性細胞などの微量な細胞型、ウイルス、癌細胞、およびその他同種のものを保有する細胞、などがある）を確立または供給するために作用し、分析のために少なくとも１つの蛍光色素で染色することができる粒子または細胞ソース（１）を提供する。粒子または細胞（１６）は、粒子または細胞（１６）が液体流（３）またはシース液体（３）中に導入されるような様式でノズル（２）内に導入される。  粒子または細胞ソース（１）が液体（３）中に粒子または細胞（１６）を供給するように、液体流（３）はいくつかの液体ソース（４）によって通常供給される。これらはノズル（２）を介して同時に取り込まれる。
【０００４】
このように、液体流（３）は粒子または細胞（１６）のための液体環境を形成する。ある圧力でフローサイトメーターに様々な液体が提供されると、ノズル開口部（５）でノズル（２）より放出される。発振器コントロール（７）を介して非常に正確にコントロールされるあるタイプの発振器（６）の提供により、ノズル（２）内に圧力波が発生し、液体流（３）に伝達され、ノズル開口部（５）でノズル（２）を出る。発振器（６）がシース液体（３）に作用すると、最終的にノズル開口部（５）の下方で液体流（８）が形成され、規則的に液滴（９）を形成する。粒子または細胞（１６）はノズル開口部の下方に形成された液体流（８）に包囲されるので、液滴（９）はその中に個々に単離された粒子または細胞（１６）が同伴される。
【０００５】
液滴（９）が個々の粒子あるいは細胞（１６）を同伴することができるので、フローサイトメーターを使用してこのような粒子または細胞（１６）を、粒子または細胞特性に基づいて分離することができる。これは、粒子または細胞検出システム（１０）を介して達成される。粒子または細胞検出システムは、液体流（８）内に含む粒子または細胞（１６）に応答する少なくともあるタイプの検出器またはセンサー（１１）を備える。粒子または細胞検出システム（１０）は、ＤＮＡまたは脂質、またはミトコンドリア、あるいは細胞内の細胞小器官などの粒子または細胞、あるいはそれらの成分と結合し、レーザ（１２）などの照射源により励起され、粒子または細胞（１６）が応答性を示す照射ビームを生じる蛍光色素などの特性の相対的な有無に応じて作用する。
【０００６】
各タイプの粒子、細胞、またはそれらの成分が少なくとも１つのタイプの蛍光色素で染色されると、使用される特定のタイプの蛍光色素が利用できる結合部位の数に基づいて、異なる量の蛍光色素（複数）がそれぞれ個々の粒子または細胞（１６）に結合する。精子に関して、しかし１例として、ヘキスト３３３４２染色における結合部位の有効性は、各精子内に含まれてるＤＮＡ量に依存する。Ｘ染色体関連精子はＹ染色体関連精子よりも多くのＤＮＡを含んでいるので、哺乳類種のＸ−染色体関連精子は、哺乳類の同じ種に対応するＹ−染色体関連精子よりも多くの蛍光色素と結合することができる。したがって、励起後、結合した蛍光色素により放射された蛍光の測定によって、Ｘ関連精子とＹ関連精子とを区別することが可能である。
【０００７】
粒子または細胞特性に基づく分離および単離を達成するために、放射光はセンサー（１１）に受光され、液滴（９）内に含まれる粒子または細胞（１６）特性に基づいて、各液滴（９）により差動的に帯電する液滴荷電装置に接続されたあるタイプの分離識別システム（１３）に取り込まれる。このように、分離識別システム（１３）は、静電偏向プレート（１４）が適切な粒子または細胞（１６）を含むかどうかに基づいて液滴（９）を偏向するように作用する。
【０００８】
その結果、フローサイトメーターは、１つ以上の回収容器（１５）にこれらを偏向させることにより、液滴（９）中に同伴された個々の粒子または細胞（１６）を分離するために作用する。例えば、Ｘ−染色体関連精子およびＹ−染色体関連精子により含まれるＤＮＡの相対量に基づいて、分離識別システム（１３）が精細胞を識別する場合、Ｘ−染色体関連精子を同伴する液滴はプラスに帯電し、これにより１つの方角に偏向され、一方、Ｙ−染色体関連精子を同伴する液滴はマイナスに帯電し別な方向に偏向される。また不溶な流出物（これは、粒子または細胞（１６）を同伴しないか、不要な分類不可能な細胞を同伴する液滴である）は、帯電されず、偏向されていない流れに収集される。多数の偏向軌道は、ある従来のフローサイトメーターにより同時に確認し、収集することができる。
【０００９】
細胞または粒子の分離のための従来のフローサイトメーターは過去数年にわたって改善されているが、従来のフローサイトメーターの分解能に関して、重要な問題が依然残されている。
【００１０】
図１に示すような従来のフローサイトメーター技術に関する重要な問題は、対応する液体ソース導管（複数）（２３）を伝わる液体ソース（４）は、ノズル（２）内の液体（３）フローに対して実質的に垂直に液体（３）をノズル（２）内に導入することである。これらの２つの方向の流れは、ノズル（２）内での層流の形成を中断させ、変形させ、遅延させる可能性がある。ある粒子あるいは細胞（１６）は、液体流分子と比較すると大きく、また位置決め、配向、および粒子間分布が個々粒子あるいは細胞（１６）の正確な分析に必須であり、個々の液滴（９）の中への個々粒子または細胞（１６）の正確な同伴が必要とされる特別な場合では、乱流となる可能性のある液体運動によって強く影響を受け、またこのため、層流を維持することが重要な態様となり、これは従来のフローサイトメーター技術の設計では見過ごされている。個々の液滴（９）の形成を可能とするための圧力波を供給する主要な機能に寄与する発振器（６）は、層流特性に影響を及ぼすノズル（２）内で圧力の定常波も提供すると予想され、特に不適当なノズルデザインは圧力拍動あるいはサブ周期変動などの高調波発散を引き起こす可能性があることも注目すべきである。
【００１１】
図１に示すような従来のフローサイトメーター技術に関する第２の重要な問題は、細胞ソース（１）とノズル（２）との間の細胞ソース導管（１７）が直線ではないことである。細胞ソース導管（１７）の本質的な屈曲は、細胞ソース導管中の屈曲に応じて液圧の変化を引き起こし、不同の流速度を示す横断面を有する液体流を生み出す可能性がある。  この問題は、細胞ソース導管（１７）内の屈曲部で凝集する細胞または細片により悪化する可能性がある。
【００１２】
図１に示すような従来のフローサイトメーター技術に関する第３の重要な問題は、細胞ソース導管（１７）が長すぎることである。細胞ソース（１）から液体流への粒子または細胞の射出ポイント（１８）までの従来のフローサイトメーター細胞ソース導管（１７）の長さは４インチ以上である。従来長さの細胞ソース導管（１７）は、細胞ソース導管内またはフロースルーで乱流を増加させるように細胞の沈降または凝集を引き起こす可能性があり、したがって細胞集団の見かけの分解能を低下させる可能性がある。
【００１３】
図１に示すような従来のフローサイトメーター技術に関する第４の重要な問題は、細胞ソース導管（１７）および特に細胞ソース導管の粒子インジェクター（１９）部分が別々に交換可能ではないことである。このため、細胞ソース導管（１７）あるいは粒子インジェクター（１９）部分の故障、または性能低下により、ノズル（２）に分離不可能な状態で接合されているフローサイトメーターの他の部品と共にノズル（２）および細胞ソース導管（１７）全体を交換する必要が生じる。
【００１４】
従来のフローサイトメーター技術に関する第５の重要な問題は、インジェクター部分（１９）を細胞ソース液体導管（１７）と接合するため、細胞ソース導管（１７）の粒子インジェクター（１９）部分の入口末端にマウントされたコネクター（２０）が存在することである。ゼロデッドボリュームコネクターまたはカプラーでも、細胞ソース導管内面に粒子または細片が接着し、粘着し、付着できる十分な変形あるいは非同心が導入される。あるいはコネクター（２０）の位置で固定化され、細胞ソース液体流に運ばれる試料集団間で相互汚染の可能性を生じ、または制限を引き起こし、あるいは細胞ソース液体経路の構造を変化させる。
【００１５】
従来のフローサイトメーター技術に関する第６の重要な問題は、細胞ソース導管（１７）の内面、あるいは細胞ソース導管（１７）のインジェクター（１９）部分の内面が、細胞または粒子の混合集団の見かけの分解能を減少させるのに十分に粗面または不均質であることである。この問題の１つの態様は、時に細胞ソース導管内面からはく離し、また流路内で停滞する場合のある粗くまたは不均質な表面を生じる表面特性を有する可能性がある。ある場合には、細胞ソース導管（１７）に制限あるいは閉塞が生じる場合がある。この問題の別の態様では、粒子は細胞ソース導管の粗いまたは不均質な特性と相互作用する可能性があり、液体流の速度に非対称性が生じ、細胞集団の見かけの分解能が減少する全くの力または乱流特性が発生する可能性がある。
【００１６】
従来のフローサイトメーター技術に関する第７の重要な問題は、ノズル（２）の断面積が大きすぎることである。ノズル（２）の断面積が大きいほど、気泡、または細片、あるいは粒子（１６）が付着し、ノズルアセンブリ内の流体力学と干渉できる面積がより大きくなり、ノズル（２）内で安定化される定常圧力波およびサブハーモニック圧力波の複雑性が増加する。
【００１７】
従来のフローサイトメーター技術に関する第８の重要な問題は、ノズル（２）本体が、第１のノズル本体エレメント（２１）および第２のノズル本体エレメント（２２）を備えることである。これにより、従来のフローサイトメーターの分解能が減少する方向に変えることのできる液体流の層流を分裂させるか減少させるのに十分な歪みまたは粗さを有するノズルの内面が生じる。あるいは、第１のノズル本体エレメント（２１）および第２のノズル本体エレメント（２２）の２つの製作材料が異なる弾性を有する場合、発振器（６）から各々異なるサブハーモニック特性を有する圧力波を発生する可能性がある。これは開口部（５）に存在するノズル（２）の直前の粒子流路の臨界領域における層流を歪ませる傾向がある。
【００１８】
従来のフローサイトメーター技術における第９の重要な問題は、生きた哺乳類精子などの粒子あるいは細胞はＤＮＡ含有量の既知の相違に起因して異なる量の蛍光色素と結合し、さらにこの測定を不明瞭にする大きな変動係数を有するが、このためこの中のＤＮＡの正確な測定が困難であることである。例えば、ジョンソンら、家畜繁殖学、第５２巻、８号、１３２６ページ（１９９９年）で示すように、実際のＤＮＡ量（他の全ての染色体の数およびサイズ）と共に、特定の哺乳類種におけるＸおよびＹ染色体サイズとの間の相違により、生きた精細胞の総ＤＮＡ含有量におけるＹ染色体サイズの影響と比較した生きた精細胞の総ＤＮＡ含有量におけるＸ染色体サイズの影響が測定された。また特に、ヒトでは２．８％、ウサギでは３．０％、雄ブタ（ブタ）では３．６％、雄ウマ（ウマ）では３．７％、雄ウシ（ウシ）では３．８％、イヌでは３．９％、ラム（ヒツジ）では４．２％、およびチンチラでは７．５％の（Ｘ−Ｙ）／Ｘ。しかしながら、ウェルシュらは、従来方式による精子の分析における変動係数（ＣＶ）が０．９％、さらに１．９７％と高い場合でも良好と考えられていることを示している：ウェルシュら、家畜繁殖学、第５２巻、８号、１３４８ページ（１９９９年）。したがって、２．８％の非常に低い（Ｘ−Ｙ）／Ｘ値を有するヒトのような種では特に、ＣＶを１％未満に減少させることが重要であり、可能な限りゼロに近いことが好ましい。本願発明の明細書で使用されるように分解能の定義は、各々の単独の精子から既知の値まで測定された近接度に基づき、２つの集団内に精子を分離する機器の能力を意味し、分析されるべき集団における高いＣＶを示す主要なネガティブな決定因子が含まれる。
【００１９】
本願発明は、粒子特性に基づいて濃縮された集団内におけるフロー分離可能な粒子あるいは細胞（１６）、細胞、および特に精細胞を分離する際の、あるいは濃縮されたＸ染色体関連およびＹ染色体関連集団における精細胞に関する従来のフローサイトメーター機器の分解能の減少に関する多様な問題に対処している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ＩＩＩ．  発明の開示
したがって本発明の広い目的は、１つ以上の粒子特性によって識別された単離した集団の増加した均質性を与える分解能の向上したフローサイトメーターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明のこの目的に関する第１の態様では、ノズル（２）の内の液体流（３）の層流形成の破壊、乱流、歪み、あるいは遅延を減少させる方法で、あるいは射出ポイント（１８）でノズル内に導入された粒子あるいは細胞（１６）を有するコア流を備えるラミナー流を確立する方法で、ノズル（２）内に液体ソース（４）から液体を導入することである。
【００２２】
本発明のこの目的に関する第２の態様では、細胞ソース導管（１７）内の細胞ソース液体流の断面において、実質的に一定の面積速度を維持し、あるいは細胞ソース内での湾曲、変形、または屈曲に起因する細胞ソース液体流の速度変化を実質的に排除し、細胞ソース導管（１７）内の障害、閉塞、あるいは粒子凝集または収集領域を減少させる、細胞ソース（１）と射出ポイントとの間の細胞ソース液体流を提供することである。
【００２３】
本発明のこの目的に関する第３の態様では、特定タイプの粒子あるいは粒子識別特性のタイプにおいて、細胞ソース（１）からインジェクターポイント（１８）までの粒子流（１６）について一貫性を維持する細胞ソース液体流容量を備える調整可能な細胞ソース液体流構造を提供することである。
【００２４】
本発明のこの目的に関する第４の態様では、特定タイプの粒子において、あるいは特定タイプの粒子識別特性において、より大きな一貫性を有するノズル開口部（５）の下方で形成された液体流（８）の内に粒子（１６）を含むコア流を備える調整可能な同軸性液体流を提供することである。
【００２５】
本発明のこの目的に関する第５の態様では、交換可能な細胞ソース導管（２８）の粒子インジェクター部分（３１）を提供することである。
【００２６】
本発明のこの目的に関する第６の態様では、細胞ソース導管（１７）のインジェクター（１９）部分の入口末端にマウントされたコネクター（２０）を取り除くことである。
【００２７】
本発明のこの目的に関する第７の態様では、細胞ソース導管（１７）の内壁の粗さまたは不均質性を除去または実質的に減少させることである。
【００２８】
本発明のこの目的に関する第８の態様では、ノズル内部の環状断面積の非同心性を実質的に除去または減少させる、あるいはノズルの内面の変形を実質的に除去または減少させる連続的な一体式ワンピースノズルを供給することである。
【００２９】
本発明の別の重要な目的は、フローソートプロセス全体にわたり、ママリアン精細胞のより大きな生存度を維持することができる精細胞を分離する装置または方法を提供することである。
【００３０】
当然、本発明のさらに詳細な目的は、手続きの記載および図面により明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
Ｖ．  本発明の実施形態
本発明は、多様な細胞、または粒子特性を別々にあるいはその組み合わせに基づいて、細胞、精細胞、または粒子の混合集団を互いに分離するための分解能を高めることができる高分解能フローサイトメーターを含む。
【００３２】
このため、精細胞を分離すること、あるいはウシまたはウマの無損傷の生きた精細胞を分離することに関する本発明を説明するために、本発明の特定の実施例が提供されるので、本明細書で説明される分解能増強技術は、これに限定されないが種々の方法で収集し、処置し、または貯蔵された細胞、精子または精核などの様々な種類のフロー分離形粒子の分離に関する適用を含めることができると理解すべきである。
【００３３】
精子のＸ染色体関連、およびＹ染色体関連集団は、限定的ではないが、ヒト、ならびにウシ科、ウマ科、シカ科、オビズｏｖｉｄｓ、イヌ科、ネコ科、ヤギ、ブタ、またはラクダなどの他の哺乳類、ならびにクジラ類（クジラまたはイルカの様々な種）などの海洋哺乳類の精子を含み、特に絶滅危惧哺乳類種および特定の個体種を含む、哺乳類種の雄から得られたフロー分離またはソートされた精子の濃縮集団を含むことも理解すべきである。特定の個体種とは、動物学的検体（類）、稀少または貴重な検体（類）、もしくは畜産、牛群管理システム、人工授精プロトコル、極低温貯蔵に使用するための精液を提供する哺乳類種、または例えば、参照によって本明細書に引用されるウィルソン、Ｄ．Ｅ．およびリーダー、Ｄ．Ｍ．著「Ｍａｍｍａｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ（世界の哺乳類種）」スミソニアン協会出版社（１９９３年）にリストされた哺乳類種、の検体としてもよい。
【００３４】
この動物リストは、精子を得ることができる、または極めて本明細書に記載の分解能の増強されたフローサイトメーターに関する発明によりフローソートすることができる多様な哺乳類を代表したものであり、本発明の高分解能または増強された分解能の態様は、哺乳類のあらゆる種、または個々の哺乳類由来の任意のタイプの粒子または精子の分析またはフロー分離に限定されるべきものではない。
【００３５】
本明細書に記載された分解能の増強されたフローサイトメトリーに関する発明を使用して得られた細胞、精子、または粒子は、これらに限定されないが、人工授精プロトコル、あるいは特許協力条約による出願、ＰＣＴ／ＵＳ０１／１８８７９号明細書、またはＰＣＴ／ＵＳ９９／１７１６５号明細書に記載されるような営利事業手法の一部として含まれる様々な用途または製品に取り入れることができ、あるいは特許協力条約による出願、ＰＣＴ／ＵＳ９８／２７９０９号明細書に記載されているように低用量受精プロトコルと共に使用することができ、あるいは特許協力条約による出願、ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５２３７号明細書に記載されるように、ヒトを含む動物からの卵母細胞の体外受精と共に使用することができる。上記の出願または明細書の各々は、本願明細書に参照によって引用されている。
【００３６】
純度という用語の使用は、特定の識別特性または特性の所望の組み合わせを運ぶ単離された精子集団のパーセントと解釈すべきである。例えば、Ｙ染色体に対立するＸ染色体を運ぶことに基づいて精子の集団が分離される場合、９０％の純度を有するＸ染色体を運ぶ集団は、個々の精子の９０％がＸ染色体を運び、一方このような精子の集団の１０％はＹ染色体を運ぶ精子の集団を含む。このため、本発明により生成された精子のＸ染色体を運ぶ集団またはＹ染色体を運ぶ集団に関する純度は、従来のフロー分離装置により達成される純度よりも高い純度を有し、あるいは約７０％から約９９％の間の純度を有することができ、あるいは、約９０％から約１００％の間、約９１％から約１００％の間、約９２％から約１００％の間、約９３％から約１００％の間、約９４％から約１００％の間、約９５％から約１００％の間、約９６％から約１００％の間、約９７％から約１００％の間、約９８％から約１００％の間、約９９％から約１００％の間からなる群から選択することができる。
【００３７】
重要なことは、本明細書には、本発明の多数の実施形態を含み、そのうちいくつかは精子のＸ染色体およびＹ染色体を運ぶ単離された集団を含むので、また本明細書では分解能の増強された精子分離装置の特定の態様、またはどのように精子の混合集団の分解能を増強するかに関する方法をさらに開示するので、本発明の基本的な考え方は、同様または異なる粒子識別特性、または事象識別特性を有するその他のタイプの粒子、または事象に適用可能であると解釈すべきである。本発明は、光生成された信号の微小な相違の分解能力が増強された場合を含み様々な環境に適用可能である。
【００３８】
さらに、本開示は、Ｘ染色体を運ぶ精子をＹ染色体運ぶ精子からフロー分離するための装置および方法に関する実施形態の説明を提供するので、本発明のこれらの実施形態の説明は、本発明の範囲を精子のフロー分離のみ、あるいは高分解能または増強された分解能のフローサイトメーター精子分離装置のみに限定することが目的ではなく、むしろこれらの実施例は、多様な粒子または用途に適用されるように実際的な方法で本発明の基本的な考え方を例示することを意図するものである。
【００３９】
まず主に図３を参照すると、本発明は、細胞センシングシステム（１３）によって粒子分解能を増強するノズル（２５）内に流れる液体流（２６）に相対する角度で、分解能増強ノズル（２５）内の液体ソース流（２４）を導入する少なくとも１つの液体ソース導管（２３）を備えることができる。導入角度は、識別すべき粒子集団のタイプに依存して変化させることができる。本発明のいくつかの実施形態において、分解能増強ノズル（２５）中央の縦軸に対して約ゼロ度から約４５度までの間の角度で、液体ソース導管（２３）に液体ソース流（２４）を導入することができる。本発明のある実施形態において、複数の液体ソース導管（２３）は、分解能増強ノズル（２５）へ複数の液体ソース流（２４）を導入することができる。
【００４０】
再び主に図３を参照すると、本発明は、細胞ソース導管（２８）内に対称な速度の細胞ソース液体流（２７）をさらに備えることができる。対称な速度の細胞ソース液体流は、細胞ソース導管（２８）の内表面の近傍、またはその内表面における速度の減少と関連した予測される対称性を含むことができるが、細胞ソース液体流（２７）の垂直断面全体にわたって速度の非対称性を防止するか減少させることが可能な細胞ソース液体流（２７）の垂直断面の全体にわたって実質的に対称性を示す速度を有する細胞ソース液体流（２７）を提供する。細胞ソース液体流（２７）の速度においてこの対称性を確立するために、本発明のある実施形態では、実質的に直線的な細胞ソース導管（２８）を利用することができる。直線的な細胞ソース導管（２８）は、細胞ソース液体流（２７）に対して、速度を減少させるための細胞ソース液体流（２７）部分、あるいは速度を増加させるためのこの液体流部分を必要とする細胞ソース液体流（２７）による干渉を受ける実質的にあらゆる湾曲、屈曲、または回転を持たない直線的な流路、あるいは従来技術よりもより直線的な流路を与える。このため、図１に示すように従来技術と比較すると、対称な速度の細胞ソース液体流（２７）により、従来タイプの細胞ソース液体流（２９）による以下に述べる問題点を解決する手段が提供される。
【００４１】
ここで図１に示す従来技術を参照すると、流れ速度が対称でない場合、細胞ソース液体流（２９）に導入された細胞はそれぞれ異なる速度で移動することができ、従来の細胞ソース液体流（２７）内での細胞ソース（１）による粒子の最初の分布が得られ、射出ポイント（１８）において示される粒子集団の明瞭な分解能を達成することができる実質的に異なる分布を生じる。
【００４２】
従来技術に関する特別な問題は、細胞ソース導管（１７）は、例えば小さな半径湾曲または屈曲に反応するための従来の細胞ソース液体流（２９）を必要とする９０°屈曲を有することができることである。この屈曲部では、細胞ソース液体流（２９）またはその一部の全断面領域にわたって、細胞ソース液体流（２９）速度が急激に低下する。細胞ソース流（２９）速度のこの減少では、より大きな外面半径に近接した流れの速度よりも、実質的にこの屈曲のより小さな内径において減少する。これにより環境によっては、細胞ソース液体流（２９）における非対称性を悪化させ、射出ポイント（１８）に送達される粒子の分布にさらに干渉する可能性のある細胞ソース導管（１７）の湾曲または屈曲部で蓄積または凝集した粒子を生じる可能性がある。この粒子により、部分的にあるいは全般にわたって細胞ソース液体流（２９）の流れが遮断され、フロー分離イベントが完全に損なわれる場合がある。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態では、独立してあるいは本発明の別の態様と組み合わせ、細胞ソース液体流（２７）と細胞ソース導管（２８）の内部との間の制限された抵抗インターフェース表面を含むことができる。樹脂または金属などの材料における制限された抵抗インターフェース表面は、細胞ソース導管（２８）研磨された、または平滑化された内表面を有する。観察された分解能が最大または所望の値に達するまで、内表面を研磨または平滑化することができる。あるいはインターフェース表面の制限された抵抗性または歪みは、細胞ソース導管（２８）を製造するために使用される材料の置換によって達成することができる。例えば、ガラス管またはテフロン（登録商標）管を金属または他の種類のプラスチックの代わりに用いることができる。制限された抵抗細胞ソース導管（２８）は、細胞ソース導管（２８）内表面の化学処理によってさらに達成することができる。本発明のこれらの実施形態では、例えばプラスチックあるいはガラスではシラン処理を行うことができ、一方、金属では酸洗浄によりさらにパッシファイ（ｐａｓｓｉｆｉｅｄ）することができる。
【００４４】
再び主に図３を参照すると、本発明の実施形態では、調整された同軸状の液体流特性を有する細胞ソース液体流（２７）を含むことができる。粒子の分解能は、温度、流速度、流圧力、液体流が流れる導管の構造、流内における粒子の射出ポイント、流内に注入される粒子の種類、またはその類似条件などの操作パラメーターにより生み出された液体流特性に依存するので、粒子集団の分解能を達成し、維持し、または増強するために流特性をコントロールすることが重要である。このため、  細胞ソース導管（２８）の直径または長さ、およびノズル（２５）内における細胞ソース液体流（２７）の射出ポイント（３０）の位置の各々または組み合わせは、粒子集団の分解能に影響を及ぼす可能性がある。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態において、粒子インジェクター（３１）は、ノズル開口部（５）と、液体流（２６）内の粒子インジェクター（３１）が細胞ソース（１）から送り出された粒子（１６）を同伴する位置との間の距離を調整または変更することができる選択的可変調整素子（３５）を有する。粒子インジェクター（３１）の選択的可変調整により、操作条件の変化は、シース液体、精細胞種、温度、液体流圧力、液体流温度、あるいはそれ以外の変更を含むかどうかにかかわらず、最初の操作条件セットから第２の操作条件セットまでの操作条件の変更の補償として、液体流特性の変更が可能となる。重要なことは、粒子インジェクター（３１）とノズル開口部（５）との距離を調整することにより、細胞特性に基づいた分解能の増加を達成することができる。精細胞に関して、図５〜７に示すように、Ｘ染色体またはＹ染色体を運ぶことに基づく分離された精細胞の分解能の増加は、本発明を利用して達成することができる。
【００４６】
射出ポイント（３０）の調整を可能とする粒子インジェクター（３１）の選択可能な変数の調整は、種々の方法で達成することができる。第１の方法は、図３ｂに示すように、粒子インジェクター（３１）とノズル本体（２５）との間で噛み合わさる１組の対となったらせん状のねじ山（３６）により、粒子インジェクター（３１）の回転調整を行うことが可能であり、射出ポイント（３０）の位置を変化させることができる。第２の方法は、図３ｃに示すように、スライド可能な係合（３７）が提供されることにより、粒子インジェクター（３１）とノズル本体（２５）との間で調整可能な係合が得られる。第３の方法は、図３、４ｄおよび８に示すように、ノズル本体（２５）に合わせたキー止め金具（３８）により確定された交互長を有することができる。
【００４７】
ここで主に図３および４を参照すると、本発明は、シングルピースノズル（２５）（図４ｄ）をさらに備えることができる。図１および４ａに示すノズル（２）とは異なり、本願発明により、図１および４ｂに示すように、第１のノズルエレメント（２１）および第２のノズルエレメント（２２）などの２つ以上の個別のノズルエレメントの接合中に生じる可能性のある非同心性を排除するこができる。
【００４８】
再び主に図３および４を参照すると、本発明は、従来技術に含まれるコネクター（２０）と置き換えるために圧縮スリーブカプラー（３２）をさらに備えることができる。圧縮スリーブカプラー（３２）の実施形態は、粒子インジェクター（３１）管と結合するのに十分な弾力的弾性特性を有する細胞ソース導管（２８）のターミナルエンドを備えることができる。本発明のこの実施形態は、Ｓｉｌａｓｔｉｃ（登録商標）またはＳｉｌａｓｔｉｃ（登録商標）類似の製品を有する他の材料を含む細胞ソース導管を備えることができ、あるいは粒子インジェクター（３１）管の外表面と適合するように、テフロン（登録商標）などの十分な弾性特性、またはＴｙｇｏｎ（登録商標）などの弾力的弾性特性を有する細胞ソース導管（２８）を備えることができる。
【００４９】
ここで主に図４ａから４ｄを参照すると、本発明（図４ｃおよび４ｄ）のノズルアセンブリと対比して、従来のノズルアセンブリ（図４ａおよび４ｂ）を示す。図１および図３および図４ｂおよび図４ｄの比較により分かるように、従来技術では細胞ソース（１）と射出ポイント（１８）との間でより長い流路（図４ｂの粒子インジェクター管を参照）、および液体ソースと射出ポイント（１８）との間でより長い液体流経路（３）の使用が必要である。図５ｂ、６ｂ、および７ｂに示すように、異なる細胞集団の分解能を向上させる操作条件の一因となる本発明によるより短い流路と比較すると、従来技術により利用されるより長い流路は、図５ａ、６ａ、７ａで示すように、異なる細胞集団の分解能を減少させる操作条件の一因となる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞液流（２７）の長さの減少は、分解能の増加が最大となるまで、細胞ソース（１）と射出ポイント（３０）との間の細胞ソース導管（２８）の全長を短縮することにより達成することができる。細胞ソース（１）と射出ポイント（３０）との間の距離は、従来技術よりも実質的に短くすることができ、図４ｃおよび４ｄに示すように長さは４インチ未満である。
【００５１】
フローサイトメーターに関する本発明において、および分離される粒子集団の種類に関して、粒子、細胞、または精細胞の集団間の分解能が向上するように、本発明の多様な実施形態を個別に、および組み合わせて使用することができる。特に、図５ｂ、６ｂ、および７ｂに示すようにウシの精細胞の分離に使用される本発明の実施形態において、細胞ソース（１）から射出ポイント（３０）までより短い流路を利用するが、ノズル開口部（５）から同じ距離にある射出ポイント（３０）が維持される１つのノズル部品（２５）により、Ｘ染色体を運ぶ精細胞（３９）とＹ染色体を運ぶ精細胞（４０）との間の分解能が著しく向上する。しかしながら、ウシ精細胞の集団を分離するために使用されたこの位置で精細胞を分析する場合、この事例は調整可能な射出ポイント（３０）発明の使用を制限することを意図するものではない。分析すべき他の種の哺乳類由来の精細胞における本発明の実施形態では、分解能を向上させるか、または精細胞の集団を最初に分離するために、多少射出ポイントをノズル開口部に接近させる必要がある。
【００５２】
主に図４を再び参照すると、本発明ではノズル（２５）内に面積の減少した液体流（２６）を備えることができる。本発明のいくつかの実施形態において（図４ａおよび４ｂに示す）、ノズル（２）内の従来の液体流の断面積は、実施例の図４ｃおよび４ｄ）に示すように実質的に減少している。図４ａおよび４ｂに示すように基準とする従来技術（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＳＸ  ＭｏＦｌｏ（登録商標）ノズル）と比較した場合、本発明のいくつかの実施形態における液体流（２６）断面積の減少は、従来の液体流断面積（３３）の４分の１と６分の１との間にある。さらに、図４ｃおよび４ｄの両方に示すように、本発明のいくつかの実施形態では従来ノズル（２）の長さを実質的に短くでき、より短い液体流流路を提供できる。特に、ウシ精子のフロー分離に関して、フロー流断面積は、図４ｃに示す従来技術のおよそ５分の１に減少した。
【００５３】
ここで主に図５、６、および７を参照すると、Ｘ染色体を運ぶ、およびＹ染色体を運ぶウシ核を識別する増強された分解能のフローサイトメーター発明の実施例を示す。
【００５４】
増強された分解能のフローサイトメーター発明は、下記条件を使用してセットアップされた：
液体流圧力：  ５０．０ｐｓｉ
ノズル開口部：  ７０μｍ
レーザパワー：  １５０ｍＷ
光電子増倍管ボルト：  ２２０／２３０Ｖ
標準：  新鮮な雄ウシ核
試料：  昼夜平分時ロット＃１９９０１
しかしながら、３０〜４０ｐｓｉのより低い液体流圧力を使用することができ、実質的に同じ結果、および精細胞の受精能が増加が認められる。
【００５５】
図５、６および７から分かるように、比較データは、毎秒約２５，０００イベント、毎秒約５０，０００から６０，０００イベント、または毎秒約１００，０００から１１０，０００イベントの３つの異なるイベント割合で、従来のフローサイトメーター技術（図５ａ、６ａおよび７ａ）および本高分解能フローサイトメーター発明（図５ｂ、６ｂおよび７ｂ）を使用して得た。蛍光色素で染色された精子が検出可能な蛍光を発すると、イベントがカウントされる。一般により大きなイベント割合は、検出された蛍光の大きさの相違に基づいて精細胞を識別することがより困難となる可能性がある。全てのイベント割合に関して、本明細書で述べたような高分解能フローサイトメーター発明を使用すると、非常に広い範囲でＸ染色体を運ぶ、およびＹ染色体を運ぶウシ核の混合集団が識別された。
【００５６】
ここで主に本発明の実施形態の成分を示す図８〜１１を参照する。図８は、ノズル本体（２５）を伴うキー止め金具を有する可換の長さを減少させた粒子インジェクター（３１）の実施形態を示す。斜角がつけられたチップ（４１）。本発明の実施形態において、粒子インジェクターは、約１から約２ミリメートルの直径を有し、約０．２から約０．３ミリメートルの内径を有することができる。斜角がつけられたチップは、約０．５から約０．７ミリメートルの幅を有する斜面の端子端部で、粒子インジェクターの縦軸に垂直な平面と約８４度で交差することができる。  回転配向の一貫性を作り出すために、キー止め金具（３８）は平坦部（４２）を構成できる。
【００５７】
図９および１０は、平坦部により施錠されたノズルボディー内側（４３）の実施形態を示し、粒子インジェクター（３１）をすべりながら受容され配置さる。図１０に示すように、ノズルボディー外側（４４）にノズルボディー内側（４３）が挿入される。ノズルボディー外側は、液体ソース（４５）からの少なくとも１つの流路をさらに含み（図１０に示された本発明の実施形態のうちの２つ）、またフレアレス管継手あるいはリークプルーフ継手を形成し、ノズルボディー外側（４４）に液体ソース導管を接続することができる。
【００５８】
図１１は、シース液体経路の特別な構造を示すノズルボディー外側（４４）を通る断面Ｂ−Ｂを表す追加図１１ａ、およびノズルボディー外側の透視図を表す追加図１１ｂを示す。
【００５９】
図４ｃ、４ｄ、９、および１１から分かるように、シングルピースノズル（２５）はノズルボディー外側（４４）と連結され、止め輪（４５）で適切に保持することができる。本ノズルアセンブリ発明は、図１、２、４ａおよび４ｂに示す従来のノズル技術と置き換えて使用可能で、図６ｂ、７ｂ、および８ｂに示すような増加した分解能を提供することができる。
【００６０】
精細胞のような非対称粒子種において、本ノズルアセンブリ発明は、ノズル本体内で非対称粒子の大きな配向を提供することができ、特に、分析が放射された蛍光量あるいは細胞容量の定量を含む場合、より一貫性のある分析結果が得られる。
【００６１】
さらに、分析すべき粒子、細胞、あるいは精細胞の種類に依存するが、増加した分解能により、毎秒２０，０００から１００，０００イベントの間の非常に高いイベント割合を達成することができる。その結果、各々の秒毎により多数の精子が分離され、ソートされ、収集され、回収される。フローサイトメーターまたは細胞ソーターのコストが分離された粒子を生成するための総コストの大部分を占めるので、このアプローチにより単位時間当たりより多くの生成物が生産され、単位当たりの生産コストを減少させる。
【００６２】
ノズルアセンブリ発明をより低圧の液体流で操作し、収集された精細胞を分離し、あるいはソートされた場合、毎秒１０００ソートよりも大きいソート割合でも、運動性、生存度、および受精能（精細胞受精能特性）を向上させることができ、精細胞のある種において、実質的に精液中で新たに収集された精細胞と同じ精細胞受精能特性を有することができる。
【００６３】
ノズル本体アセンブリにより達成することができる増加した分解能のために、従来のノズル技術で達成されたソート割合よりも大きなソート割合でも、ソートされた粒子の純度が増加する場合がある。
【００６４】
この簡単なノズルアセンブリ発明は、粒子インジェクター（）の部分的または完全な閉塞が生じるイベントを起こす可能性がより少ない。そのため、代表的なフローサイトメーターまたは細胞ソーターを操作することが不可能となる時間がより少ない。
【００６５】
このノズルアセンブリ発明により、射出筒において閉塞した場合には、ノズルアセンブリ全体を取り外すか分解する必要なしに、この射出筒を速やかに取り出すことができる。この射出筒を容易に点検し、清掃し、そして再設置され、このような清掃イベントによる中断時間を非常に短くでき、したがってソート装置をより生産的に使用することができる。
【００６６】
本ノズルアセンブリ発明により、技術的な修理工の必要なしに、不熟練の（あるいは準熟練した）オペレータによる射出筒の清掃が可能である。これは、閉塞した射出筒の部分的に、または全体を修理するための労務費が節約されることを意味する。さらに、オペレータは、適切な修復人を捜すための時間を費やすことなしに、直ちにこのようなイベントを修正してもよいことを意味する。
【００６７】
本ノズルアセンブリ発明により、オペレータは分離分解能の損失を観察し、さらにそれを直ちに修正することが可能となる。従来のノズルアセンブリを使用しても部分的な閉塞で機器が故障することはないが、閉塞が形成されるにつれて、長時間、数日、あるいは数週間にもわたり機器の分解能が徐々に失われる状態が生じ、また不十分に分解するノズルが操作される全ての時間において、装置は一般に純度のより低い生成物を産し、あるいは特により低いソート割合で稼働する必要があると考えられ、製造すべき生成物量が減少する結果を招く（より低い生産性）。実際、熟練した技術者がノズルを変更するか清掃にした場合にのみ、より低い生産性にオペレータが気づく場合があり、一時的な改善が見られる。
【００６８】
射出筒の交換の容易さは、射出筒を使い捨てで使用するか、あるいはごく限定された期間で使用する部品とすることができる。ヒト胎性細胞、またはヒト精細胞、またはヒトの骨髄細胞などのソート材料などのフローサイトメーターのある使用において、試料間の相互汚染の排除を確実とするために複雑で長いＣＩＰ（適所で清潔）プロトコルが必要であるが、ＣＩＰ処置を試料と接触する全ての部品を交換する手順に置き換えると簡便で好都合であり、このため試料射出筒の交換が必要である。
【００６９】
より短い射出筒、および本願発明に伴うより小さなノズルは、検査中または組み立て中の屈曲などこの射出管のある種の形成異常を防止し、ノズル内でのこの管の運動（振動）自由度を少なくすることができる。これにより、ノズル内の所望の射出ポイントに近い射出筒チップが維持され、特定のノズル形状内におけるこの射出管の高調波共鳴数および振幅が減少する。
【００７０】
本願発明における射出筒の直線形状により、射出筒をノズル内へ多少深く挿入することができ、これによりユーザーは、試料を液体流に注入するポイントとノズルの開口部ポイントとの間の正確な距離を調節することができる。ノズル内（フィードバック制御ループ）の射出筒の位置決めに関してその決定に影響を及ぼす分解能データの観察を可能とすることによって、装置の操作の他の態様または試料が変更されるとダイナミックに変化する射出ポイント位置を確立することが可能である。
【００７１】
ほとんどのノズルアセンブリは高価な部品であり、少数製造されることが多く、また完全に同一のサブコンポーネントを製造することができない製造者によって製造されることが多い。したがって実際には、それぞれのノズルアセンブリを慎重に検査する必要があり、正確ではない場合、再構築または廃棄が必要と考えられる。本願発明はノズルアセンブリの多くの部品を簡単にし、ノズルアセンブリの多様なサブコンポーネントのための製造プロセスをより信頼できるものとし、機能性の乏しいノズルのより一般的な原因の１つである射出筒の容易な交換を可能とする。これらの対策全てにより、より低い製造原価、部品のより有効な使用が可能となり、その結果、週に７日（２４／７）の製造設定において、１日に２４時間使用する１つ以上の製造機器の維持費を減少させることができる。
【００７２】
本発明は、本発明の実施形態の任意方法を使用して単離または処置された精子を使用して産生された哺乳類胚または哺乳類をさらに含み、あるいは本発明の多様な実施形態により分離された精子を使用して産生された哺乳類胚またはあらかじめ決定された性別の哺乳類を含み、あるいはＸ染色体をを運ぶ精細胞を豊富に含む集団、またはＹ染色体を運ぶ精細胞を豊富に含む集団のいずれかを有する本発明によって調製された精細胞媒精試料（単数または複数）を使用して産生された哺乳類の胚または哺乳類を含み、あるいは精細胞媒精試料は哺乳類の特定種を用いる媒精に使用される代表的な数と比較して少数の精細胞を含む本発明の任意の実施形態に従って産生された哺乳類の胚または哺乳類を含む。
【００７３】
上述により容易に理解することができるように、本発明の基本概念を種々の方法で具体化してもよい。これには、種々の粒子、細胞、または精細胞に使用することができ、高分解能に粒子識別を達成する装置および選択された粒子特性に基づいて濃縮された集団内への分離と同様な両方のテクニックを含む高性能または増強されたフローサイトメーターシステムを提供するように構成されたある実施形態による高分解能精細胞処理システムが含まれる。
【００７４】
本出願では、記載されている多様な装置によって利用に伴う工程として達成されることが実証されている結果の一部として、多様な精細胞処理技術が開示されている。これらは意図され記載されたような装置を利用したことの当然の結果に過ぎない。さらに、いくつかの装置が開示されているが、これらはある方法を達成するだけではなく、いくつものやり方で変更できると理解されるべきである。重要なのは、上述の全てに関して、これらの態様の全てが本開示に含まれるものと解釈すべきということである。
【００７５】
この仮特許出願に含まれる記載は基本的な説明を行うためのものである。読者は、可能な実施形態がすべて明示的に記載されているとは限らず、代替例の多くが言外に示されていることを理解されるべきである。本発明の一般的な性質を完全に説明していない場合があり、それぞれの特色あるいは要素が、より幅広い機能、または非常に多様な変更、または同等の要素を実際にどのように表すことができるかを明示的に示していない場合もある。繰り返すが、これらは本開示に言外に含まれているのである。本発明が装置系の専門用語で記載されている場合、装置の各要素がある機能を自動的に実施する。記載された装置に関し、装置クレームが含まれるだけでなく、本発明および各要素が実施する機能を指定する方法クレームまたはプロセスクレームが含まれる場合もある。いかなる記載も専門用語も特許本出願に含まれるであろう請求の範囲を制限するものではない。
【００７６】
本発明の主旨から逸脱せずに、種々の変更を施せることも理解されるべきである。このような変更も本記載の中に言外に含まれている。これらは依然として本発明の範囲内である。示されている明示的な実施形態、非常に多様な他の暗示的な実施形態、および多様な方法またはプロセス等を含む幅広い開示が本開示に含まれており、特許本出願のために本請求の範囲を起草する場合の基礎となり得る。このような文言の変更および幅広い請求は、出願人がこの仮特許ファイルに基づいて後で特許出願（要求される期限までに出願される）をしようとするときに行われると理解されるべきである。後で出願される本特許出願は、出願人の権利の範囲内と見なされるクレームのベースが広くなるような審査を求め、本発明の数多くの態様を単独および総合体系として包含する特許が得られるように構成される。
【００７７】
また、本発明および請求の範囲の多様な要素は、それぞれが種々の様式で達成されてもよい。変形例が任意の装置実施形態の変形例、方法またはプロセス実施形態の変形例、あるいは単なるこれらの任意の要素の変形例であるなら、本開示はそのような各変形例を含むものと理解されるべきである。特に、本開示は本発明の要素に関するものであるので、機能または結果のみが同じ場合でも各要素を指す言葉が等価な装置用語または方法用語により表現される場合があることを理解されるべきである。このような等価でより広い、あるいはより一般的でさえある用語が、各要素または各作用の説明に含まれと考えるべきである。本発明の権利が与えられる言外に広い範囲を明示することが望ましい場合、このような用語を置き換えることができる。しかし１つの例として、全ての作用がその作用を起こす手段、あるいはその作用を引き起こす要素として表現されることがあることを理解されるべきである。同様に、開示された各物理要素は、この物理要素によって促進される作用の開示を含むと理解されるべきである。しかし、この最後の態様に関して、１つの例として、「フローソーター」の開示は明示的な記載の有無に関わりなく「フローソートする」行為の開示を含むと理解されるべきであり、逆に、「フローソートする」行為の効果的な開示が存在する場合は、このような開示は「フローソートする手段」も含めて「フローソーター」の開示も含むと理解されるべきである。このような変更および代わりの用語は、本明細書に明示的に含まれていると理解すべきである。
【００７８】
本明細書中で特許に関して言及される法律、法令、規制、または規則の行為、あるいは本明細書中で特許に関して言及される特許、出版物、または他の参考文献は、いずれも参照によって本明細書に引用される。また、使用される各用語に関しては、本明細書におけるその使用が一般的な辞書の解釈と矛盾する場合を除き、各用語には一般的な辞書の定義が含まれていると理解されるべきであり、ランダムハウスウェブスター大辞典、第２版に含まれるような全ての定義、代用語、および類義語が参照によって本明細書に引用されたものとする。最後に、本仮特許出願に従って参照によって引用される参考文献のリストに表記されたすべての参考文献、または本出願と一緒に提出されたその他の記載情報は、参照により本明細書に添付され引用される。しかしながら、上述の各々に関して、参照によって引用されたこのような情報あるいは記載が、本発明の特許取得と矛盾すると考えられる場合には、そのような記載が本出願人によってなされたものと見なされるべきではないことは明らかである。
【００７９】
したがって、本出願人が請求するのは、少なくとも、ｉ）本明細書に開示および記載されている各精細胞処理装置、ｉｉ）開示および記載されている関連方法、ｉｉｉ）これらの装置および方法の各々の、同様変形例、同等変形例、および言外に含まれる変形例、ｉｖ）開示および記載されているとして示される各機能を達成するこれらの代替考案例、ｖ）開示および記載され、達成することが言外に含まれているとして示されている各機能を達成する、これらの代替考案例、ｖｉ）別個の独立した発明として示されている各特徴、構成要素、およびステップ、ｖｉｉ）開示された多様なシステムあるいは構成要素によって改善される応用例、ｖｉｉｉ）このようなシステムまたは構成要素によって産生されて得られる生成物、ｉｘ）実質的に上記の、添付されたいずれか実施例を参照しながら説明される方法および装置、ｘ）開示された各要素の多様な組み合わせおよび置換、およびｘｉ）示された独立クレームまたは概念の１つ１つに従属するものとして潜在的に従属的なクレームまたは概念、であると理解されるべきである。この点において、実際的な理由から、および数百項にもなりかねない請求項追加を避けるため、最終的に出願人が示す請求項には、最初の従属物だけしか含まれていない場合があると理解されるべきである。ある独立請求項または概念の下に示されるさまざまな従属物または他の要素を、いずれか他の独立請求項または概念の下に従属物または要素として追加できるようにするために、これに限定されないが、欧州特許条約第１２３条（２）および米国特許法３５ＵＳＣ１３２、または他の同様な法律を含むニューマター法に基づいて要求される範囲で裏付けが存在していることが理解されるべきである。また、使用される場合または使用されるとき、移行句「備える、有する」の使用は、従来クレーム解釈に従って、本明細書では「オープンエンド」クレームを主張するために使用される。したがって、前後関係で特に要求されなければ、用語「備える、有する」、あるいは「備える、有する」または「備える、有する」などの変形例は、記載された要素、またはステップ、または要素またはステップ群を含むが、それ以外の要素、またはステップ、または要素またはステップ群を除外するものではない。このような用語は、法的に許される最も広い範囲を出願人に与えるように、その最も広範な形で解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、従来のフローサイトメーター技術の概要を示す。
【図２】図２は、従来のフローサイトメーター技術の概要を示す。
【図３】図３は、分解能増強フローサイトメーター発明に関する特別の実施態様を示す。
【図４】図４は、従来のフローサイトメーターノズルアセンブリ（図４ａ）および従来のフローサイトメーター（図４ｂ）と、対応する分解能増強フローサイトメーターノズルアセンブリ発明（図４ｃ）および分解能増強フローサイトメーター発明の分解能増強インジェクター部分（図４ｄ）との比較を提供する。
【図５】図５は、それぞれ毎秒２５，０００イベントで、従来のフローサイトメーター技術（図５ａ）を使用したウシ精核試料の分解能と、分解能増強フローサイトメーター発明（図５ｂ）を使用した同じウシ精核試料の分解能との比較を提供する。
【図６】図６は、従来のフローサイトメーター技術（図６ａ）を使用し、毎秒５０，０００イベントで実施したウシ精核試料の分解能と、分解能増強フローサイトメーター発明（図６ｂ）を使用し、毎秒６０，０００イベントで実施した同じウシ精核試料の分解能との比較を提供する。
【図７】図７は、従来のフローサイトメーター技術（図７ａ）を使用し、毎秒１００，０００イベントで実施したウシ精核試料の分解能と、分解能増強フローサイトメーター発明（図７ｂ）を使用し、毎秒１１０，０００イベントで実施した同じウシ精核試料の分解能との比較を提供する。
【図８】図８は、本粒子インジェクター発明の特定の実施態様を示す。
【図９】図９は、ノズルボディー内側発明の特定の実施態様を示す。
【図１０】図１０は、ノズルボディー外側発明の特定の実施態様を示す。
【図１１】図１１は、図１０中に示される外部ノズル発明の特定の実施態様の断面Ｂ−Ｂを提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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