(57)【要約】本発明は、疾患（特にパーキンソン病）の処置、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせる薬剤および／またはこれがバースティングモードから離れるのを防ぐ薬剤の効果を同定するアッセイ方法および／または改善するアッセイ方法、ならびにこれらの１つ以上の同定された薬剤の所定量を調製する薬剤および過程、個体が神経変性障害を有するか否かを決定する診断方法を、提供する。この処置の方法は、上述の薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得るおよび／またはこれがバースティングモードでなくなるのを防ぎ得る場合、薬剤を必要とする被験体に投与する工程を包含する。好ましい局面において、前述の薬剤は以下を調節する：Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬の製造における薬剤の使用であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る、使用。
【請求項２】
医薬の製造における薬剤の使用であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得る、使用。
【請求項３】
医薬の製造における薬剤の使用であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得る、使用。
【請求項４】
医薬の製造における薬剤の使用であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／または該ドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、使用。
【請求項５】
医薬の製造における薬剤の使用であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、使用。
【請求項６】
医薬の製造における薬剤の使用であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、使用。
【請求項７】
医薬の製造における薬剤の使用であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、使用。
【請求項８】
医薬の製造における薬剤の使用であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、使用。
【請求項９】
医薬の製造における薬剤の使用であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、使用。
【請求項１０】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／または該ドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る、処置方法。
【請求項１１】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得る、処置方法。
【請求項１２】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得る、処置方法。
【請求項１３】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／または該ドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、処置方法。
【請求項１４】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、処置方法。
【請求項１５】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、処置方法。
【請求項１６】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／または該ドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、処置方法。
【請求項１７】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、処置方法。
【請求項１８】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、処置方法。
【請求項１９】
薬剤の効果を同定および／または改善するアッセイ方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／または該ドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、該改善は、効率を改善するための薬品開発プログラムにおけるアッセイの使用による、アッセイ方法。
【請求項２０】
薬剤の効果を同定および／または改善するアッセイ方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得る、アッセイ方法。
【請求項２１】
薬剤の効果を同定および／または改善するアッセイ方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得る、アッセイ方法。
【請求項２２】
薬剤の効果を同定および／または改善するアッセイ方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【請求項２３】
薬剤の効果を同定および／または改善するアッセイ方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【請求項２４】
薬剤の効果を同定および／または改善するアッセイ方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【請求項２５】
薬剤の効果を同定および／または改善するアッセイ方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／または該ドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【請求項２６】
薬剤の効果を同定および／または改善するアッセイ方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【請求項２７】
薬剤の効果を同定および／または改善するアッセイ方法であって、該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【請求項２８】
例えば、効率を改善するための薬品開発プログラムにおけるアッセイの使用により、薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を利用し、ここで、該薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／または該ドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る、アッセイ方法。
【請求項２９】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイはＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を利用し、ここで、該薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得る、アッセイ方法。
【請求項３０】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイはＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を利用し、ここで、該薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに、影響を与え得る、アッセイ方法。
【請求項３１】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイはＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を利用するアッセイ方法であって、ここで、該薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／または該ドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【請求項３２】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイはＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を利用し、ここで、該薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え得、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【請求項３３】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイはＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を利用し、ここで、該薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え得、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【請求項３４】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイはＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を利用し、ここで、該薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【請求項３５】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイはＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を利用し、ここで、該薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【請求項３６】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイはＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を利用し、ここで、該薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え得、ここで、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【請求項３７】
以下：
（ａ）請求項１０〜３６のいずれか１項に記載のアッセイを行う、工程；
（ｂ）Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節し得る、１つ以上の薬剤を同定する工程；ならびに
（ｃ）該１つ以上の同定された所定量の該薬剤を調製する工程、
を、包含する、プロセス。
【請求項３８】
ドパミンレベル、好ましくは内因性ドパミンレベルの上昇により緩和され得る症状を処置する方法であって、該方法は、薬剤を必要とする被験体へ投与する工程を包含し、ここで該薬剤は、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役をインビトロアッセイにおいて調節し得、ここで該インビトロアッセイ方法は、請求項１０〜３６のいずれか１項において定義される、方法。
【請求項３９】
ドパミンレベル、好ましくは内因性ドパミンレベルの上昇により緩和され得る症状の処置のための、薬学的組成物の調製における薬剤の使用であって、ここで、該薬剤が、請求項１０〜３６のいずれか１項において定義されるインビトロアッセイ方法においてＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役を調節し得る、使用。
【請求項４０】
請求項１０〜３６のいずれか１項に記載のアッセイ方法により同定される、薬剤。
【請求項４１】
医薬における使用のための、請求項４０に記載の薬剤。
【請求項４２】
パーキンソン病の治療における使用のための、請求項４０に記載の薬剤。
【請求項４３】
医薬における使用のための、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役。
【請求項４４】
医薬における使用のためのＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役の、調節因子。
【請求項４５】
医薬における使用のためのＴ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役の、遮断薬。
【請求項４６】
ドパミンレベル、好ましくは内因性ドパミンレベルの上昇により緩和され得る症状、好ましくはパーキンソン病、の処置のための薬品の、調製における使用のための、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役の使用。
【請求項４７】
ドパミンレベル、好ましくは内因性ドパミンレベルの上昇により緩和され得る症状、好ましくはパーキンソン病、の処置のための薬品の調製における使用のための、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役の、調節因子の使用。
【請求項４８】
ドパミンレベル、好ましくは内因性ドパミンレベルの上昇により緩和され得る症状、好ましくはパーキンソン病、の処置のための薬品の調製における使用のための、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネルとの共役の、遮断薬の使用。
【請求項４９】
個体がＴ型カルシウムチャネルおよび／もしくはＳＫカリウムチャネルならびに／またはこれらの共役の構造および／または機能に影響する欠陥を有するか否かを決定する工程を包含する、該個体が神経変性障害を有するか否かの決定のための、診断方法。
【請求項５０】
前記個体が、Ｔ型カルシウムチャネルおよび／もしくはＳＫカリウムチャネルならびに／またはこれらの共役の構造および／または機能に影響する、遺伝的欠陥を有するか否かを決定するために、核酸プローブまたはプライマーを利用する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＳＫカリウムチャネルがＳＫ３カリウムチャネルである、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の発明。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか１項に関する発明および本明細書に実質的に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、とりわけ、ドパミン作動性ニューロンの活性の調節に関連する。
【背景技術】
【０００２】
黒質におけるドパミン作動性ニューロンは、ペースメーカーモード（規則正しい低い発射レベルの活動電位）からバースティング（ｂｕｒｓｔｉｎｇ）モード（活動電位の発射の高頻度のバースト）に転換し得る。バースティングモードにおいてこれらのニューロンの発射が起こる場合、ドパミン放出が上昇する。
【０００３】
ドパミン作動性ニューロンに関する徹底的な研究にも関わらず、どのようにドパミン作動性ニューロンがその発射パターンをペースメーカーモードからバースティングモードに転換するのかという機構については未知である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明に従って、本発明者らは、これまでどのようにドパミン作動性ニューロンがその発射パターンをペースメーカーモードからバースティングモードに転換するのかについて同定した。
【０００５】
特に、本発明者らは、小さいコンダクタンス（カルシウム活性化カリウム（ＳＫ）チャネル）とＴ型のカルシウムチャネルとの優先的な結合が、ドパミン作動性中脳ニューロンにおけるバースティングを防止することを見出した。
【０００６】
これらの所見は、多数の臨床的／医学的分野（例えば、精神分裂病およびパーキンソン病の治療において）において重要な意味を有する。
【０００７】
（発明の局面）
本発明の局面は、添付の特許請求の範囲および以下の説明において示される。
【０００８】
実施例によって、本発明の重要な局面は、以下に関連する：
医薬の製造における薬剤の使用であって、ここで該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせることができ、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止することができる。
【０００９】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置の方法であって、ここで該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせることができ、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止することができる。
【００１０】
薬剤の効果（例えば、効能を改善するための薬品開発プログラムにおけるアッセイを使用することによる）を同定し、そして／または改善するためのアッセイ法であって、ここで該薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせることができ、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止することができる。
【００１１】
本発明はまた、ドパミン作動性ニューロンがバースティングモードにあるかまたはバースティングモードに入る傾向にあるか、もしくはバースティングモードのままである傾向にあるか否かを検出する（直接的にまたは間接的に）ための手段を包含する診断組成物またはキットを含む。
【００１２】
間接的な手段の例は、Ｃａ２＋流入および／またはＫ＋排出のレベルを決定する手段である。
【００１３】
診断組成物またはキットはまた、本発明に従う薬剤を含み得る。
【００１４】
本発明はまた、本発明の薬剤および別の薬学的に活性な薬剤を含むキットを含み、該他の薬剤は、本発明に従う薬剤として必要に応じて作用することができる。
【００１５】
さらなる実施例によって、本発明の好ましい局面は、以下に関連する：
医薬の製造における薬剤の使用であって、ここで該薬剤は、該ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出の有益な増加を引き起こすドパミン作動性ニューロンの発射モードに作用する（特に交換を引き起こす）ことができ、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役をブロックする。
【００１６】
処置の必要な被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置の方法であって、ここで該薬剤が、該ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出の有益な増加を引き起こすドパミン作動性ニューロンの発射モードに作用する（特に交換を引き起こす）ことができ、該薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役をブロックする。
【００１７】
薬剤の効果を同定しそして／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで該アッセイが：Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役を利用し、ここで該薬剤は、該ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出における有益な増加を引き起こすドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を及ぼし（特に、変化を引き起こし）得、ここで該薬剤は：Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役をブロックする。
【００１８】
以下の工程を含むプロセス：
（ａ）本発明に従うアッセイを実行する工程；
（ｂ）Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役を調節することができる１つ以上の薬剤を同定する工程；および
（ｃ）一定量の１つ以上の同定された薬剤を調製する工程。
【００１９】
以下の工程を含むプロセス：
（ａ）本発明に従うアッセイを実行する工程；
（ｂ）Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役を調節することができる１つ以上の薬剤を同定する工程；および
（ｃ）１つ以上の同定された薬剤を改変する工程；
（ｄ）本発明に従うアッセイを実行する工程；
（ｅ）１つ以上の（ｄ）の薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役を調節することができることを調べる工程；
（ｆ）必要に応じて、工程（ｃ）〜（ｅ）を１回以上繰り返す工程；および
（ｇ）一定量の１つ以上の同定された改変薬剤を調製する工程。
【００２０】
薬剤を処置の必要な被験体に投与する工程を包含するドパミンのレベル、好ましくは内因性ドパミンレベルの増加につれて軽減され得る状態を処置する方法であって；ここで、該薬剤は、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはインビトロアッセイ方法におけるＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役を調節することができ；ここでインビトロアッセイ方法は、本発明のアッセイ方法である。
【００２１】
ドパミンのレベル、好ましくは内因性ドパミンレベルの増加につれて軽減され得る状態を処置するための薬学的組成物の調製における薬剤の使用であって、ここで該薬剤は、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはインビトロアッセイ方法におけるＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役を調節することができ；ここで、インビトロアッセイ方法は、本発明のアッセイ方法である。
【００２２】
本発明のアッセイ方法によって同定される薬剤。
【００２３】
医療で使用するためのＴ型チャネルチャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルチャネルとの共役。
【００２４】
医療で使用するためのＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルチャネルとの共役の調節因子。
【００２５】
医療で使用するためのＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルチャネルとの共役のブロッカー。
【００２６】
ドパミンレベル、好ましくは内因性のドパミンレベルの増加につれて軽減され得る状態の処置のための医薬の調製における使用のための、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルチャネルとの共役の使用であって、好ましくはその状態とはパーキンソン病である。
【００２７】
ドパミンレベル、好ましくは内因性のドパミンレベルの増加につれて軽減され得る状態の処置のための医薬の調製における使用のための、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルチャネルとの共役の調節因子の使用であって、好ましくはその状態とはパーキンソン病である。
【００２８】
ドパミンレベル、好ましくは内因性のドパミンレベルの増加につれて軽減され得る状態の処置のための医薬の調製における使用のための、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルチャネルとの共役のブロッカーの使用であって、好ましくはその状態とはパーキンソン病である。
【００２９】
本発明の他の局面は、添付の特許請求項の範囲ならびに以下の説明および図面で示される。これらの局面は、分けられたセクションの表題の下に示される。しかし、各セクション下での教示は、必ずしもその特定のセクション表題に限定されないことが理解されるべきである。
【００３０】
以下の注釈において、「本発明のヌクレオチド配列」および「本発明のアミノ酸」に関する言及は、それぞれ本明細書中で示されるか、または議論された任意の１つ以上のヌクレオチド配列および本明細書中で示されるか、または議論された任意の１つ以上のアミノ酸配列をいう。また、本明細書で使用される場合、「アミノ酸」とは、ペプチドまたはタンパク質の配列をいい、そしてそれらの部分を称し得る。さらに、用語「本発明のアミノ酸配列」は、句「本発明のポリペプチド」と同義である。また、用語「本発明のヌクレオチド配列」は、句「本発明のポリヌクレオチド配列」と同義である。
【００３１】
（好ましい局面）
本発明の好ましい局面は、添付の特許請求項の範囲および以下の説明において示される。
【００３２】
好ましくは、薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに間接的に入らせる。
【００３３】
より好ましい実施形態において、薬剤はＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／もしくはＴ型チャネルとＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルとの共役に影響を及ぼすことによって、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに間接的に入らせる。
【００３４】
好ましくは、薬剤はドパミンレベルにおける増加によって軽減され得る状態の処置のためである。
【００３５】
好ましくは、ドパミン作動性ニューロンは、中脳ドパミン作動性ニューロンである。
【００３６】
好ましくは、ドパミン作動性ニューロンは、ドパミン作動性黒質ニューロンである。
【００３７】
好ましくは、障害は、ニューロン障害である。
【００３８】
好ましくは、障害は、神経変性障害である。
【００３９】
好ましくは、障害は、中脳に影響を及ぼす。
【００４０】
好ましくは、障害は、黒質に影響を及ぼす。
【００４１】
好ましくは、薬剤は、パーキンソン病の処置用である。
【００４２】
処置されるべき障害は、遺伝性起源であり得る。従って、それらは、有害な効果を生じる１つ以上の変異（例えば、遺伝子または他の領域における変異）に起因して起こり得る。変異は、遺伝子産物の過剰な発現または活性、不十分な発現または活性、もしくはそれ以外の異常な発現または活性を生じ得る。処置されるべき障害は、また／あるいは、環境因子に起因して生じ得る。
【００４３】
高度に好ましい局面において、薬剤は、バースティングモードに入るドパミン作動性ニューロンに影響を及ぼし、そして／もしくはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを妨げ、ここでこの薬剤は、以下：Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ３チャネルならびに／あるいはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役、を調節する。
【００４４】
（ドパミン作動性ニューロン）
ニューロンは、高度に分極した細胞であり、その最も明らかな特徴は、軸索および樹状突起の広範囲なシステムである。ニューロンは、形態学的、機能的および／または生化学的特徴において異なる細胞母集団である。本明細書中で使用される場合、用語「ドパミン作動性ニューロン」は、黒質対細胞層として公知の腹側中脳（ＶＭ）の領域中に細胞体を有し、そして線条に対して投射するニューロンに関する。これらのニューロンは、それらが神経伝達物質としてドパミンを分泌し、従って高レベルでドパミンの生合成における律速工程を触媒する酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現するという事実によって生化学的に区別される。
【００４５】
パーキンソン病のような神経変性疾患を有する患者において進行的に機能を消失するのはこれらの細胞であることに起因して、ドパミン作動性ニューロンは、非常に臨床的に重要である。
【００４６】
ドパミン作動性（ＤＡ）中脳ニューロンは、随意運動、作業記憶、および報酬のような種々の脳機能において欠くことのできない役割を果たす（Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｒａｋｉｃ，１９９９；Ｋｉｔａｉら，１９９９；ＳｐａｎａｇｅｌおよびＷｅｉｓｓ，１９９９）。さらに、それらは、精神分裂病、薬物常用、およびパーキンソン病のような神経精神医学的および神経学的障害に密に関与する（ＤｕｎｎｅｔｔおよびＢｊｏｒｋｌｕｎｄ，１９９９；Ｖｅｒｈｏｅｆｆ，１９９９；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，２０００）。これらの脳の機能および疾患は、解剖学的に異なるＤＡニューロンの部分集団と関連するので、中脳ＤＡニューロンの機能的特徴が、解剖学的な小群に従って区別されるか否かという疑問が生じる。平行中央線条体ネットワーク（Ｍａｕｒｉｎら，１９９９）、中央辺縁系ネットワーク（Ｇｒｏｅｎｅｗｅｇｅｎら，１９９９）、および中央皮質性ネットワーク（Ｔｚｓｃｈｅｎｔｋｅ,２００１）内で、ＤＡニューロンは、それぞれの標的細胞に対するドパミン放出およびその機能的効果を制御する電気的活性のパターンを産生するために内因性ペースメーカーに関連してシナプス入力を調整することによって機能を発揮する。従って、ＤＡシステム内の電位多様性は、軸索投射における違いおよびシナプス結合性における違いの両方から起こり得、そして体樹状突起（ｓｏｍａｔｏ−ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）統合およびペースメーカーの発散特性から起こり得る。
【００４７】
ドパミン作動性中脳ニューロンは、３つの部分的に重複する核中に分布する：赤核後（ｒｅｔｒｏｒｕｂｒａｌ）野（ＲＲＡ、Ａ８）、黒質（ＳＮ、Ａ９）、および腹側被蓋野（ＶＴＡ、Ａ１０）であり、これらは異なる中央終脳投射に対応する（ＧａｒｄｎｅｒおよびＡｓｈｂｙ，２０００；ＪｏｅｌおよびＷｅｉｎｅｒ，２０００）。黒質ニューロンは主に、背側線条（中央線条投射）を標的にし、そして運動機能に関与されるが、一方でＶＴＡのニューロンは腹側線条（例えば、側坐核（中央辺縁系投射））および前前頭皮質（中央皮質性投射）に対して優勢に投射し、従って、辺縁系の機能と関連する（ＧａｒｄｎｅｒおよびＡｓｈｂｙ，２０００；ＪｏｅｌおよびＷｅｉｎｅｒ，２０００）。最近の追跡研究は、中央終脳結合の局所解剖学的構成のより微細な概念を示した。ＳＮにおいて、２つの神経化学的に異なる層が線条における異なる神経化学的区画（すなわち、辺縁系領域および感覚運動領域）に投射し、そしてそこから入力を受ける（Ｍａｕｒｉｎら，１９９９；Ｈａｂｅｒら，２０００）。カルシウム結合タンパク質、カルビンジン（Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）Ｄ２８−Ｋを発現しない（カルビンジン陰性、ＣＢ−）腹側層ＤＡニューロンは、斑区画に投射し、そして次第にマトリクス中の線条体投射ニューロンからの神経支配を受ける。逆に、カルビンジン陽性（ＣＢ＋）背側層ＤＡニューロンは、マトリクスに投射するが、辺縁系斑区画から入力を受ける（Ｇｅｒｆｅｎ，１９９２；Ｂａｒｒｏｔら，２０００）。いくつかの研究が、パーキンソン病およびその動物モデルの両方における変性に対するＤＡニューロンの損傷性における著しい差異は、ＣＢの差示的発現と密接に関連することを示した。従って、ＣＢ＋ＤＡニューロンは、より脆弱さが少ない（Ｌｉａｎｇら，１９９６；Ｄａｍｉｅｒら，１９９９ａ；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＨｅｒｎａｎｄｅｚおよびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ，２０００；Ｔａｎら，２０００）。
【００４８】
十分に記載された解剖学的および神経化学的構成とは対照的に、ＤＡニューロンの異なる部分集団内の電気生理学についてはあまり知られていない。現在までのところ、インビトロ電気生理学的研究は、ＤＡ中脳ニューロンを主に単一集団としてみなしてきた（ＰｕｃａｋおよびＧｒａｃｅ,１９９４；Ｋｉｔａｉら,１９９９）。これらの「典型的」なＤＡニューロンは、イオンチャネルの高度に保存されたレパートリーの発現を示唆する多数の特徴（すなわち、低頻度ペースメーカー活性、著しい後過分極が後に続く幅広い活動電位、過分極活性化チャネル（Ｉｈチャネル）およびＤ２自己受容体媒介性過分極によって媒介される強い垂下成分（ｓａｇ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ））を有する（Ｓａｎｇｈｅｒａら、１９８４；ＧｒａｃｅおよびＯｎｎ、１９８９；Ｌａｃｅｙら、１９８９；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９９７）。しかし、インビボ研究は、ＤＡ中脳ニューロンの小群間の放電速度、バースト発射、および自己受容体制御における著しい違いを強調する（Ｃｈｉｏｄｏら，１９８４；Ｇｒｅｅｎｈｏｆｆら，１９８８；ＳｈｅｐａｒｄおよびＧｅｒｍａｎ，１９８８；Ｐａｌａｄｉｎｉら，１９９９）。
【００４９】
（ニューロン活性）
一般的に、ニューロンは、活動電位と呼ばれる電気インパルスの特定の型のコンダクタンスに関して特定化された単一軸索を有する。活動電位は、ニューロン原形質膜を横切る電気電位における一連の突発性変化である。電位は、休止であるか、発射であるか、ペースメーカーであるか、またはバースティングであり得るニューロン細胞の原形質膜の生理学的モードによって変化する。
【００５０】
用語「休止モード」とは、刺激されておらず、そしてＴ型カルシウムチャネルまたはＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルのような任意の電位型イオンチャネルが開放されるニューロン原形質膜をいう。
【００５１】
刺激の際に、膜電位における変化に応答して、電位型イオンチャネルは、ニューロン原形質膜に沿って活動電位を伝播する第２の部分に関してのみ開放される。本明細書中で使用される場合、用語「発射モード」とは、活動電位を産生し得る刺激されたニューロン原形質膜をいう。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「ペースメーカーモード」とは、規則正しいか、あるいは維持された低レベルの発射活動電位をいう。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「バースティングモード」とは、活動電位の高頻度の発射をいう。
【００５４】
（Ｔ型チャネル）
Ｔ型チャネルは、低電圧活性化または急速な不活性化を伴う、一過性の電流を有することに起因して、こういわれる。異なるカルシウム流動を規定する主要因子は、いずれのα１サブタイプがチャネル複合体に含まれるかである。α１Ｇ、α１Ｈおよびα１Ｉサブユニットのサブファミリーは、Ｔ型チャネルの低電圧活性化特性を示す。Ｔ型チャネルは、心筋および血管平滑筋；ならびに神経系に位置される。Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓらは、ニューロン性低電圧活性化Ｔ型カルシウムチャネルの分子特徴を議論する（Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８９６〜９００，１９９８）。Ｔ型チャネルは、例えば、ニッケルイオン、Ｍｉｂｅｆｒａｇｉｌ（Ｒｏｃｈｅから入手可能）、およびＫｕｒｔｏｘｉｎ（南アフリカサソリ、Ｐａｒａｂｕｔｈｕｓ  ｔｒａｎｓｖａａｌｉｃｕｓ由来のペプチド）によってブロックされ得る。
【００５５】
Ｔ型カルシウムチャネルに関するさらなる背景教示は、Ｖｉｃｔｏｒ  Ａ．ＭｕＫｕｓｉｃｋらによって、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍ上で示される。Ｔ型カルシウムチャネルに関係する以下の情報は、この情報源から引き出された。
【００５６】
電圧活性化カルシウムチャネルは、その電圧依存性、非活性化、および単一チャネルコンダクタンスに基づいて区別され得る。低電圧活性化カルシウムチャネルは、その電流が急速な不活性化に起因して一過性であり、かつ小さいコンダクタンスに起因して小さいことの両方であるので、「Ｔ」型と称される。Ｔ型チャネルは、ペースメーカー活性、低閾値カルシウムスパイク、ニューロン振動および共鳴、ならびに反跳バースト発射に関与すると考えられる。カルシウムチャネルに関係する配列に関してＥＳＴデータベースを検索することで、Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓら（１９９８）は、新規のチャネル（彼らがα−１ＧまたはＣａ（Ｖ）Ｔ．１と表した）をコードする部分的ヒトｃＤＮＡを同定した。著者らは、この部分的ｃＤＮＡを使用して、さらなるヒト、ラット、およびマウスのα−１Ｇ  ｃＤＮＡを単離した。ヒトおよびラットの組織のノーザンブロット分析は、α−１Ｇ遺伝子が、８．５ｋｂ  ｍＲＮＡとして脳において優勢に発現されたことを示した。さらなる９．７ｋｂ転写物もまた検出された。Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞中で発現した場合、ラットα−１Ｇチャネルは、低電圧活性化Ｔ型カルシウムチャネルの特性を示した。
【００５７】
ＦＩＳＨおよび放射能ハイブリッド分析によって、Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓら（１９９８）は、１７ｑ２２にＣＡＣＮＡ１Ｇ遺伝子をマップした。異種間での戻し交雑分析を使用して、彼らはマウスＣａｃｎａ１ｇ遺伝子を第１１番染色体の遠位部分（１７ｑ２２と相同的なシンテニーを示す領域において）にマップした。
【００５８】
ネイティブカルシウムチャネルは、Ｔ型、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ型およびＱ型のように、その電気生理学的および薬理学的特性によって分類される（概説に関しては、ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ，Ｅ．Ｗ．ら  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｍｂｒ（１９９１）３９：２９５〜３２６、およびＤｕｎｌａｐ，Ｋ．ら  Ｔｒｅｎｄ  Ｎｕｅｒｏｓｃｉ（１９９５）１８：８９〜９８を参照のこと）。Ｔ型（すなわち、低電圧活性化）チャネルは、負の電位で一過的に活性化し、そして休止電位の変化に対して高度に感受性である幅広い分子種を記載する。Ｌ型、Ｎ型、Ｐ型およびＱ型チャネルは、より正の電位で活性化し（高電圧活性化）、そして多様な反応速度論的特性および電圧依存特性を示す。高電圧活性化チャネルの生物物理学的特性においていくつかの重複があり、その結果として薬理学的プロフィールは、それらをさらに区別するために有用である。Ｌ型チャネルは、ジヒドロピリジンアゴニストおよびアンタゴニストに対して感受性であり、Ｎ型チャネルは、Ｃｏｎｕｓ  ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓペプチド毒素（ω−コノトキシン（ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）ＧＶＩＡによってブロックされ、そしてＰ型チャネルは、ジョウゴグモ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）の毒物由来のペプチドアガトキシン（ａａｇａｔｏｘｍ）ＩＶＡによってブロックされる。高電圧活性カルシウムチャネルの第４の型（Ｑ型）が記載されるが、Ｑ型およびＰ型チャネルが異なる分子実体であるか否かは、議論を呼んでいる（Ｓａｔｈｅｒ，Ｗ．Ａら  Ｎｅｕｒｏｎ（１９９５）１１：２９１〜３０３；Ｓｔｅａ，Ａ．ら  Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：１０５７６〜１０５８０；Ｂｏｕｒｉｎｅｔ,Ｅ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２：４０７４１５）。カルシウムコンダクタンスのいくつかの型は、上述のカテゴリーのいずれにもきちんと分かれず、そしてさらなるカルシウムチャネル亜類型が分類されるべきままであることを示唆して、１つのカテゴリー内においてでさえ、特性の可変性がある。生化学的分析は、ニューロンの高電圧活性化カルシウムチャネルは、３つの異なるサブユニット（α１、α２、δおよびβ）からなるヘテロオリゴマー複合体であることを示す（Ｄｅ  Ｗａａｒｄ，Ｍ．ら  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ（１９９７）第４巻，Ｎａｒａｈａｓｈｉ，Ｔ．編  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹによって概説される）。α１サブユニットは、主要な孔形成サブユニットであり、そして電圧センサーおよびカルシウムチャネルアンタゴニストのための結合部位を含む。主に細胞外のα２は、膜貫通δサブユニットとジスルフィド結合され、そして両方とも同じ遺伝子に由来し、そしてインビボでタンパク質分解的に切断される。βサブユニットは、α１サブユニットの細胞質領域に対する高親和性結合を有する非グリコシル化親水性タンパク質である。第４のサブユニットであるγは、骨格筋Ｔ管で発現するＬ型カルシウムチャネルに独特である。γサブユニットをコードするｃＤＮＡの単離および特徴付けは、米国特許第５，３８６，０２５号において記載される。
【００５９】
近年、これらのα１サブユニットのそれぞれがクローン化および発現され、従ってこれらはより広範囲な薬理学的研究を認容する。これらのチャネルは、α１Ａ、−α１Ｉおよびα１Ｓと表され、そして上記で示されるサブユニットと相関する。α１Ａチャネルは、Ｐ／Ｑ型であり；α１Ｂは、Ｎ型を示し；α１Ｃ、α１Ｄ、α１Ｆおよびａｃｓは、Ｌ型を示し；α１Ｅは、カルシウムコンダクタンスの新規の型を示し、そしてα１Ｇ、α１Ｉは、Ｔ型ファミリーのメンバーを示す（Ｓｔｅａ，Ａ．ら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ（１９９４），Ｎｏｒｔｈ，Ｒ．Ａ．編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ,ら  Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９１：８９６〜９００；Ｃｒｉｂｂｓ，Ｌ．Ｌ．ら  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９８）８３：１０３〜１０９；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）１９：１９１２〜１９２１において総説される）。
【００６０】
（ＳＫチャネル）
ＳＫチャネルは、電圧非依存的な様式で活性化され、そして比較的小さい単位のコンダクタンスおよびカルシウムに対する高感度を有する。Ｋｏｈｌｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３  １７０９〜１７１４，１９９６）は、彼らがＳＫ１、ＳＫ２、およびＳＫ３と表したＳＫチャネルのファミリーをコードする、ラットおよびヒト脳のｃＤＮＡを単離した。３つのタンパク質全ては、細胞内Ｎ末端およびＣ末端ならびに６つの高度に保存された膜貫通セグメントを含む。インサイチュハイブリダイゼーションは、これらのサブユニットをコードするｍＲＮＡが、異なっているが重複したパターンで、ラット脳において幅広く発現することを示した。Ｃｈａｎｄｙら（Ｍｏｌｅｃ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．３：３２〜３７，１９９８）は、ヒトＳＫ３、またはＳＫＣａ３（ホモログ）をコードするｃＤＮＡを同定した。予想されるタンパク質は、７３１アミノ酸長である。著者らは、ＳＫ３遺伝子が、このタンパク質のＮ末端領域における２配列のＣＡＧトリヌクレオチド（ポリグルタミン）の反復を含むことを決定した。第２のＣＡＧ反復は、コントロール個体において高度に多型であり、対立遺伝子は、サイズにして１２〜２８個の反復の範囲にわたった。
【００６１】
ＳＫ３カリウムチャネルに関するさらなるバックグラウンド教示は、Ｖｉｃｔｏｒ  Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋらによってｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｎ．ｈｔｍ上で示される。ＳＫ３カリウムチャネルに関する以下の情報が、この情報源から引き出された。
【００６２】
脊椎動物ニューロンにおける活動電位には、数秒間持続し得、そしてニューロンの発射パターンについての顕著な結果を有し得る後過分極（ＡＨＰ）が後に続く。ＡＨＰの各成分は、反応速度論的に異なり、そして異なるカルシウム活性化カリウムチャネルによって媒介される。ＳＫチャネルは、電圧に非依存的な様式で活性化され、そして比較的小さい単位のコンダクタンスおよびカルシウムに対する高い感受性を有する。Ｋｏｈｌｅｒら（１９９６）は、ＳＫチャネルファミリー（彼らがＳＫ１（ＫＣＮＮ１）、ＳＫ２およびＳＫ３と称した）をコードするラットおよびヒト脳のｃＤＮＡを単離した。３つのタンパク質全ては、細胞内Ｎ末端およびＣ末端ならびに６つの高度に保存された膜貫通セグメントを含む。インサイチュハイブリダイゼーションは、これらのサブユニットをコードするｍＲＮＡが、異なっているが重複したパターンで、ラット脳において幅広く発現されることを示した。
【００６３】
Ｃｈａｎｄｙら（１９９８）は、ヒトＳＫ３、またはＳＫＣａ３（ホモログ）をコードするｃＤＮＡを同定した。予測されるタンパク質は、７３１アミノ酸長である。著者らは、ＳＫ３遺伝子が、このタンパク質のＮ末端領域における２配列のＣＡＧトリヌクレオチド（ポリグルタミン）の反復を含むことを決定した。第２のＣＡＧ反復は、コントロール個体において高度に多型であり、対立遺伝子は、サイズにして１２〜２８個の反復の範囲にわたった。いくつかのヒト遺伝性神経変性疾患（例えば、ハンティングトン病）は、遺伝子内の拡大したトリヌクレオチド反復によって引き起こされる。精神分裂病および双極性障害Ｉを有する患者における拡大したＣＡＧ配列に関する以前の報告を引用することで、Ｃｈａｎｄｙら（１９９８）は、ＳＫ３のより長い対立遺伝子とこれらの神経精神医学的障害との間の関連に関して試験した。彼らは、精神分裂病患者におけるより長い対立遺伝子の統計学的に有意な過剰発現、および双極性障害患者における類似の、非有意な傾向を見出し、より長い対立遺伝子と、これらの疾患との間の可能な関連についての証拠を提供した。著者らは、ポリグルタミン反復の長さにおける弱い変化は、チャネル機能、およびそれゆえニューロン挙動における僅かな変化を生じ得ることを示唆した。
【００６４】
Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄｔら（１９９８）は、前に記載されたタンデムに整列されたＣＡＧ反復の両方が、エキソン１に位置されることを示した。前に位置付けられた配列タグ化部位（ＳＴＳ）（Ｇ１６００５）との相同性は、この遺伝子が２２ｑ上にあり得ることを示した；しかし、体細胞ハイブリッドＤＮＡのＰＣＲ増幅および２  Ｐ１人工染色体クローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄｔら（１９９８）は、その遺伝子を物理的に１ｑ２１．３に位置付けた。
【００６５】
ＫＣＮＮ３遺伝子の高度に多型の第２の（さらに３つの主な）ＣＡＧ反復と、１１７人のコントロールと比較して９８人の患者における精神分裂病との間の関連が以前に見出されているので、Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄｔら（１９９８）は、精神分裂病を有するさらなる１９人の患者を遺伝子型決定し、そして発症年齢、家族歴、および患者の性に対する起こり得る効果を調査するために、患者およびコントロールの全群に関する統計分析を、観察された関連に関して実行した。これらの要因のいずれも、その結果に影響しないことが見出された。８６人の双極性障害Ｉ患者およびコントロールにおいて見出される両ＣＡＧ反復の対立遺伝子頻度における有意な差異はなかった。
【００６６】
Ｎａｖｏｎら（１９９８）は、ＦＩＳＨを使用して、ＫＣＮＮ３遺伝子を１ｑ２１に位置付け、ＫＣＮＮ３遺伝子を有するこの領域に前もってマップしたＳＴＳの整列もまた示した。彼らは、コントロールと比較して、イスラエルのユダヤ人精神分裂病患者におけるこの遺伝子内のより大きいＣＡＧ反復との関連を観察した。
【００６７】
Ｆｒｅｂｏｕｒｇら（１９９８）は、拡大した対立遺伝子と、先行に関する臨床証拠を有する２０家族または５８人の散発性精神分裂病患者における精神分裂病との関連についての証拠を見出さなかった。
【００６８】
Ａｕｓｔｉｎら（１９９９）は、放射能ハイブリッド分析によってこの遺伝子（彼らがヒトＫＣａ３（ｈＫＣａ３）と称した）を１ｑ２１にマップした。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＭＨ）Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅからの家族において、彼らは、不調和同胞（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｓｉｂ）に対する伝播と、影響を及ぼされる子孫に対する親からの伝播を比較した。全体的に、ＫＣＮＮ３  ＣＡＧの長さが精神分裂病とコントロールとの間で異なっているという説得力のある証拠はなかった。影響を及ぼされる子孫に対する長いＣＡＧ反復対立遺伝子の過剰な親の伝播の証拠もまた無かった。
【００６９】
Ｂｏｎｄら（２０００）は、遺伝子スイッチ（ＳＫ３発現の実験的調節を許容するが、正常なＳＫ３プロモーター機能を維持する）の挿入のための相同組み換えによって、ＳＫ３遺伝子を標的化した。ＳＫ３の欠損は、明白な表現型上の影響を示さなかった。しかし、ＳＫ３の過剰発現は、低酸素症に対する異常な呼吸応答を誘導し、そしておそらく子宮収縮への影響によって分娩を危険にさらす。両状態は、遺伝子のサイレンシングによって修正される。Ｂｏｎｄら（２０００）は、彼らの結果が、睡眠時無呼吸症候群または乳児突然死症候群のような障害および分娩の間の子宮収縮を調節する為の潜在的な治療標的としてＳＫ３チャネルに関わると結論を下した。
【００７０】
（調節する／調節している）
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」／「調節している」は、好ましくは以下のいずれか１つ以上を意味する：Ｔ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／もしくはそれらの共役に対して有害な影響を及ぼすか、それらを減少するか、除去するか、阻害するか、拮抗するか、ブロックするかまたはダウンレギュレートする。
【００７１】
（ブロックする／ブロックキング）
好ましい局面において、薬剤は、Ｔ型チャネル活性および／またはＳＫ３チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役をブロックする。本明細書中において使用される場合、用語「ブロックする／ブロックキング」は、部分的または完全なブロッキングを包含する。１つの好ましい局面において、この用語は、好ましくは少なくとも実質的なブロックを意味する。
【００７２】
薬剤は、イオンチャネル（特にカルシウムイオンチャネルまたはカリウムイオンチャネル）を介したイオン輸送のレベルまたは速度を減少し得る。従って、薬剤としては、開放性イオンチャネルを閉鎖させ得、それゆえチャネルが閉ざされた状態である場合、それ以上所定の型のイオンにチャネルを通り抜けさせない薬剤であるが、これに限定されない。
【００７３】
Ｔ型カルシウムチャネルまたはＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルのいずれか（もしくは両方ともを）ブロックすることによって、細胞をペースメーカーモードからバースティングモードにスイッチさせることにおける成功は、これまで本発明者らによって達成された。本発明以前にカルシウムチャネルの活性化は、バースティングを導くと考えられていたので、これは完全に予想外であった。しかし、本発明者らは、正反対の利用がドパミン作動性ニューロンに関しては本質的である（すなわち、カルシウムチャネルの活性化がバースティングを阻害する）ことを示した。これは、以下で議論されるように、重要な医療的／臨床的応用を導く。
【００７４】
（ドパミン）
神経伝達物質は、１つの脳細胞から他へメッセージを送るために使用される、脳における化学物質である。神経伝達物質は、神経細胞の膜中の特定の受容体タンパク質へ結合（鍵と鍵穴のような）し、これは、細胞内での化学応答の引き金となる。ドパミンは、中枢神経系（ＣＮＳ）神経伝達物質の例であり、これは、ノルエピネフリン、セロトニン、およびヒスタミンとともに生物起源の神経伝達物質の種に属するカテコールアミンである。このカテコールアミン（特に、ドパミンおよびセロトニン）は、運動；気分；注意；そしておそらくは、特定の内分泌、心臓血管、およびストレス応答の制御に関与する。神経伝達物質産生におけるアンバランスは、種々の精紳障害および身体的な障害（例えば、パーキンソン病（ＰＤ））に関係する。したがって、そのようなアンバランスを診断しそしてモニターすること、および脳化学に影響を及ぼす薬剤および物質の効果をモニターすることが望まれる。
【００７５】
ドパミンは、神経系によって媒介される種々の異なる機能（視覚、運動、および挙動を含む（一般的にＣｏｏｐｅｒら，１９７８，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，第３版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１６１〜１９５頁を参照のこと）に関与する神経伝達物質である。ドパミンの多様な生理学的作用は、次々にＧタンパク質対合受容体の５つの基本型（それぞれ、酵素アデニリルシクラーゼを刺激し、そして阻害するＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５（ＫｅｂａｂｉａｎおよびＣａｌｎｅ，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ  ２７：９３〜９６））との相互作用によって媒介される。これらの受容体の数または活性における変化は、パーキンソン病（運動性障害）および精神分裂病（挙動障害（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）のような疾患状態における有力な因子であり得る。
【００７６】
（ドパミン放出）
１つの局面において、本発明は、ドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を及ぼし得る（特に変化を引き起こす）か、またはそうでなければ、ドパミン放出における変化によって軽減される障害を処置するための医薬の製造において生じる変化を妨げ得る薬剤の使用を提供する。
【００７７】
ドパミン放出における変化は、薬剤の非存在下で生じることに関連して、ドパミン放出における増加または減少であり得る。
【００７８】
好ましくは、ドパミン放出における絶対的な増加または減少がある（例えば、少なくとも５％、１０％、２５％または５０％の増加または減少）。望ましくは、これは維持期間（例えば、少なくとも１時間、また少なくとも２４時間）にわたって達成され得る。
【００７９】
（スイッチング）
本発明の１局面にしたがって、増加したドパミン放出によって軽減される障害を処置するための医薬の製造において、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入れ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンをバースティングモードでなくなることを妨げ得る薬剤の使用が提供される。
【００８０】
望ましくは、薬剤は非バースティングモード（例えば、ペースメーカーモード）からバースティングモードへのスイッチを引き起こす。
【００８１】
本発明はさらに、増加したドパミン放出によって軽減される障害を処置するための医薬の製造において、ドパミン作動性ニューロンのカルシウムチャネルを介したカルシウムの排出を減少し得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのカリウムチャネルを介したカリウムの排出の減少し得る薬剤の使用を提供する。
【００８２】
好ましくは、薬剤は、Ｔ型カルシウムチャネルを介したカルシウム排出の減少および／またはＳＫ３カリウムチャネルを介したカリウム排出の減少によって作用する。
【００８３】
カルシウムチャネルおよびカリウムチャネルは、好ましくはドパミン作動性ニューロンのチャネルであり、より好ましくは黒質ドパミン作動性ニューロンのチャネルである。
【００８４】
種々の障害は、前記ニューロンからの増加したドパミン放出によって軽減（直接または間接のいずれかで）され得る。
【００８５】
それらは、パーキンソン病のような神経変性障害を含む。
【００８６】
Ｔ型カルシウムチャネルを介したカルシウム排出の減少するように作用する薬剤とＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルを介したカリウム排出を減少するように作用する別の薬剤との組み合わせが使用され得る。薬剤は、単一の組成物を介して投与され得るか、または別々に（例えば、連続して）投与され得る。それらは、キット中に提供され得、そして別個のコンテナー中に存在し得る。
【００８７】
いくつかの場合において、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出の増加を引き起こす１つ以上の薬剤の投与の後、ドパミンレベルは、望ましくないほど高いか、またはそうなる傾向にあることが見出され得る。次いで、ドパミン放出の減少を引き起こす薬剤が提供され得る。キットは、ドパミン放出の増加を引き起こし得る薬剤およびドパミン放出の減少を引き起こし得る薬剤の両方を別個のコンテナー中に含むように提供され得る。このことは、ドパミンレベルの調節において有用である。
【００８８】
（障害）
障害の例としては、発作、慢性および急性疼痛、高血圧および不整脈のような心臓の状態ならびに神経変性障害が挙げられる。
【００８９】
（神経変性障害）
本発明の好ましい局面において、薬剤は神経変性障害を処置するために使用される。神経変性障害の例としては、パーキンソン病、精神分裂病、ハンティングトン病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、レッシュ−ナイハン症候群、片頭痛、てんかん、精神病、うつ病、無呼吸およびアルツハイマー病が挙げられる。
【００９０】
好ましくは、障害はパーキンソン病または精神分裂病である。
【００９１】
より好ましくは、障害は、パーキンソン病である。
【００９２】
（パーキンソン病）
パーキンソン病は、脳におけるドパミン作動性黒質線条体経路の進行性変性によって特徴付けられる。パーキンソン病は、筋肉が硬直および弛緩し、運動がぎこちなく、および困難になり、そして筋肉の群の制御不可能な律動的単収縮が特徴的な振せんまたは震えを生じる自発的な運動障害である。この状態は、脳におけるシナプス前ドパミン作動性ニューロンの変性によって引き起こされ得ると考えられる。その結果、ニューロン活性の間の化学伝達物質ドパミンの適切な放出の不足は、パーキンソン症候群の徴候を導く。パーキンソン症候群のために最も幅広く使用された処置のうちの１つは、Ｌ−ＤＯＰＡ（消失したドパミンを置換することによって間接的に作用するドパミンの前駆体）の投与である。治療の変形形態は、シナプス後部ドパミンにアゴニスト（例えば、ブロモクリプチンのような麦角アルカロイド類）を投与することである。
【００９３】
１９６０年代に行われた生化学研究は、神経伝達物質、特にドパミンの欠乏によるこの疾患の病因において果たされる基本的な役割の発見を導く。病理学の神経化学的ベースの理解におけるこの重要な進展は、障害に対する薬理学的アプローチにおける強烈な変化を引き起こし、そして治療においてドパミンの即時的生物学的前駆体（（−）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニン）（レボドパとして、より一般的に公知である）治療の導入を導く。レボドパの使用は、パーキンソン症候群における劇的な改善を導き、そしてこの疾患の処置において幅広く使用される。
【００９４】
（精神分裂病）
精神分裂病は、約３００万人のアメリカ人を含む全世界人口の１％に対して影響を及ぼす重篤な疾患である。職業、病院収容、医療などの消失に起因して、米国単独に関してこの疾患の年次損害は、一年で６００億ドルを超え、そして苦しんでいるヒトにおけるその代価は、この疾患を有する人々に対して１０〜１３パーセントの自殺率として示された（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｎｌｉｎｅ（１９９８）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｙｃｈ．ｏｒｇ）。精神分裂病の症状は、３つの別個のカテゴリーに分類され得る。これらは、（１）幻覚および現実のゆがみと関係する陽性症状；（２）注意障害および思考障害によって特徴付けられる分裂症状；および（３）無関心および言語流暢性の消失のような陰性症状である（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｐ．Ｏ．およびＧｒａｃｅ，Ａ．Ａ．（１９９８），「Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｓ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉｃ  ｓｙｍｐｔｏｍ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ」，Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｂｕｌｌ．，２４（２）：２６７〜２８３）。研究の長い歴史は、陽性症状および分裂症状の軽減におけるＤ２レセプター拮抗の効力を証明した（Ｇｒａｙ，Ｊ．Ａ．（１９９８），「Iｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ」，Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｂｕｌｌ．，２４（２）：２４９〜２６６）。陰性症状の残留は、たとえ精神遮断薬処置の後でも、しばしば持続する（Ａｒｎｄｔ，Ｓ．ら（１９９５），「Ａ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｙｍｐｔｏｍ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ」，Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５２：３５２〜３５９）。陰性症状の安定性は、いくらかは、精神遮断薬投薬自体にあるとされる（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｗ．Ｔ．（１９９７），「Ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ」，Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｂｕｌｌ．，２３（１）：１１〜１８）。辺縁系の皮質系の機能障害は、症状の３つの型全てに影響を与え得る。腹側線条に対する縮小された海馬からの刺激性グルタマテルジック（ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ）入力および他の辺縁系構造は、精神病の陽性症状および思考分裂に影響を与え得、そして陰性症状は、前頭葉構造の異常機能（例えば、辺縁系構造からの接続を受け取る機能、および／または解剖学的変則）から生じるようである（Ｃｓｅｒｎａｎｓｋｙ，Ｊ．Ｇ．およびＢａｒｄｇｅｔｔ，Ｍ．Ｅ．（１９９８），「Ｌｉｍｂｉｃ−Ｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ」Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｂｕｌｌ．２４（２）：２３１〜２４８）。
【００９５】
過剰なドパミン産生は、精神分裂病に影響を与える。精神分裂病のドパミン仮説は、疾患とドパミン作動性ニューロンにおいて増加した活性を関連させる。精神分裂病の症状は、初期の辺縁系皮質損傷および腹側線条に対するグルタマテルジック入力における欠乏によって引き起こされた異常なドパミン作動状態によって引き起こされ得る（Ｃｓｅｒｎａｎｓｋｙ，Ｊ．Ｇ．およびＢａｒｄｇｅｔｔ，Ｍ．Ｅ．（１９９８），前出）。放射線トレーサー研究は、線条体ドパミン受容体の増加を有する精神分裂病患者における基準より高いＤ２ドパミン受容体レベルは、時に正常値を超えて何倍も増加することを示した（Ｓｅｅｍａｎ，Ｐ．ら（１９９３），「Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｄ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ」，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：４４１〜４４５；Ｔｕｎｅ，Ｌ．Ｅ．ら（１９９３），「Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｄ２  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｉｎ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ：Ａ  Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  １１Ｃ−Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｓｐｉｐｅｒｏｎｅ」，Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ    ４９：２１９〜２３７）。薬理学的に引き起こされるドパミン放出は、正常値より３００％高いと見積もられる（Ｂｒｅｉｅｒ，Ａ．ら（１９９７），「Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｍｅｔｈｏｄ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４（６）：２５６９〜２５７４）。黒質からドパミン突出は、ドパミンＤ１およびＤ２受容体を介した線条体ニューロン活を調節する（Ｅｇａｎら（１９９７），「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔａｒｄｉｖｅ  Ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ」Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｂｕｌｌ．２３（４）：５８３〜６０９）。
【００９６】
精神分裂病におけるドパミン障害に関する最も強烈な証拠の１つは、Ｄ２受容体のアンタゴニストの精神分裂病症状を軽減させる能力から生じる。Ｄ２レセプターに作用する効果的な抗精神病薬（ハロペリドール（ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ）のような「代表的」な抗精神病薬およびクロザピンのような「異型」抗精神病薬を含む）は、ドパミン系の崩壊を生じる。長期のハロペリドール処置は、黒質におけるドパミン細胞の活性を減少する。クロザピンは、辺縁系に突出する腹側被蓋野における中央辺縁系／中央皮質細胞中のドパミン細胞の活性を減少する（Ｏ‘Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｐ．およびＧｒａｃｅ，Ａ．Ａ．（１９９８），「Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｓ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉｃ  Ｓｙｍｐｔｏｍ  Ｃｌｕｓｔｅｒｓ」，Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｂｕｌｌ．２４（２）：２６７〜２８４）。
【００９７】
過去の研究は、精神病の発症、この障害の進行および合併症におけるドパミンおよびＤ２レセプターに関する顕著な役割を証明した。より近年の研究は、ドパミン系自体および精神分裂病における他の神経伝達物質との関連において多数の異常を発見した。これらの研究の総説は、Ｄ２ドパミン受容体以外の過剰な刺激から証明する精神分裂病に関与する他のより微妙な症状の一般的な理解を伝達する。
【００９８】
５つの異なるドパミン受容体が、２つのファミリーに分類されている：Ｄ１様ドパミン受容体は、Ｄ１およびＤ５受容体からなる；そしてＤ２様ドパミン受容体は、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４受容体からなり、後者は、多数の抗精神病薬と高い親和性を有する（Ｄａｍａｓｋ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９６），「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｌｏｚａｐｉｎｅ  ａｎｄ  ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ  ｏｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ａｎｄ  ｃｏｒｔｅｘ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４１：２４１〜２４９）。Ｄ４受容体は、精神分裂病において上昇されることが見出された（Ｓｅｅｍａｎ，Ｐ．ら（１９９３）,「Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｄ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ」，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：４４１〜４４５）。幻覚および妄想の減少において高度に効果的な「代表的」な抗精神病薬は、Ｄ２受容体の選択的アンタゴニストである。「異型」抗精神病薬（情緒平板（ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）のような陰性症状、およびモチベーションの不足が応答する）は、Ｄ１およびＤ２受容体の両方に対する親和性を示す（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ，Ｎｅａｌ  Ｒ．およびＧｅｙｅｒ，Ｍａｒｋ  Ａ．，「Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｅｎｓｏｒｉｍｏｔｏｒ  Ｇａｔｉｎｇ  ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ」，Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ２４（２）：２８５〜３０１；Ｂｅｎｅｓ，Ｆ．Ｍ．，「Ｍｏｄｅｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｒｏｂｅ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｉｎｇｕｌａｔｅ  Ｃｏｒｔｅｘ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉｃ  Ｂｒａｉｎ」，Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｂｕｌｌ．２４（２）：２１９〜２３０）。Ｄ１受容体は、幅広く分配されるが、Ｄ５受容体は、げっ歯動物の海馬、視床および視床下部における発現に限定される。Ｄ２、Ｄ３およびＤ４は、ドパミン作動性アンタゴニストに対する高い親和性を有する。Ｄ２受容体は、運動構造および辺縁系構造を含む脳のほとんどのドパミン感受性領域において発現されるようである。Ｄ３およびＤ４受容体は、皮質下辺縁系組成物において豊富である。
【００９９】
精神分裂病は、主としてドパミンアンタゴニストで処置される。
【０１００】
（標的）
本発明の１つの局面において、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルは、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役を調節することができる薬剤を同定するための検査における標的として使用され得る。例として、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性は、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役を調節する（例えば、Ｃａ２＋流入および／またはＫ＋排出の減少）ことができる薬剤を同定するための検査における標的として使用され得る。
【０１０１】
便宜上、本明細書中で使用される用語「標的」は、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはそれらの共役に対する言及を包含する。
【０１０２】
これに関して、標的は、公知のアミノ酸配列、または公知のヌクレオチド配列、あるいは組換え方法および／または合成方法によって調製されるこれらをコードするその改変体、ホモログ、誘導体、またはフラグメントを含み得る。
【０１０３】
標的は、単離形態および／または精製形態であり得る。標的は、細胞中または細胞内あるいは組織中に存在し得る。
【０１０４】
（薬剤）
本発明の薬剤は、ドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を及ぼす（特に変化を引き起こす）か、または他のところで生じる変化を防止することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態に関して、薬剤は、増加したドパミン放出によって軽減される障害を処置するための医薬の製造において、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入れることができるか、および／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、薬剤は、ドパミン放出の変化によって軽減される障害を処置するための医薬の製造において、ドパミン作動性ニューロンのカルシウムチャネルを介したカルシウム排出および／またはドパミン作動性ニューロンのカリウムチャネルを介したカリウム排出に影響を及ぼす（特に変化を引き起こす）ことができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、薬剤は、増加したドパミン放出によって軽減される障害を処置するための医薬の製造において、ドパミン作動性ニューロンのカルシウムチャネルを介したカルシウム排出および／またはドパミン作動性ニューロンのカリウムチャネルを介したカリウム排出を減少することができる。
【０１０８】
好ましくは、カルシウムチャネルは、Ｔ型カルシウムチャネルであり、そして／またはカリウムチャネルは、ＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルである。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、用語「薬剤」は、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましいＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役を調節することができる任意の実体を含む。例として、本発明の薬剤としては、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましいＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役のブロッカーが挙げられるが、これらに限定されない。薬剤はまた、アンタゴニストであり得る。
【０１１０】
望ましくは、Ｔ型カルシウムチャネルを介したカルシウム排出を増加するために作用する薬剤とＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルを介したカリウム排出を増加するために作用する別の薬剤の組み合わせが使用され得るが、これは必須ではない。薬剤は、単一組成物を介して投与され得るか、または別々に（例えば、連続して）投与され得る。それらは、キットで提供され得、そして別個のコンテナーであり得る。
【０１１１】
本明細書中で使用される場合、用語「薬剤」としては、任意の適切な供給源（天然であるか否かのいずれか）から得られ得るか、または産生され得る化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
薬剤は、ポリペプチド（スクリーニングによって同定されるもののような）であり得る。そうであるならば、当業者は、また有用であり得る広い範囲の付加的薬剤が提供され得ることを理解する。これらは、前記ポリペプチド（フラグメントを含む）；そのようなポリペプチドまたは改変体をコードする核酸、そのような核酸を含むベクターまたは細胞；およびポリペプチドまたは改変体の発現または活性を増加することができる薬剤に関連する１つ以上のアミノ酸変化を有するポリペプチドの改変体を含む。
【０１１３】
薬剤は、ペプチド、および他の化合物（例えば、有機低分子および特に新たに導かれた化合物）を含み得る化合物のライブラリーから設計され得るか、または得られ得る。例として、薬剤は天然物質、生物学的高分子、または細菌、真菌、もしくは動物（特に哺乳動物）の細胞もしくは組織のような生体材料から作られる抽出物、有機分子もしくは無機分子、合成薬剤、半合成薬剤、構造模倣体または機能模倣体、ペプチド、ペプチド模倣体、誘導体化薬剤、全タンパク質から切断されるペプチド、あるいは（例えば、ペプチド合成機もしくは組み換え技術またはそれらの組み合わせ、組み換え薬剤、抗体、天然または非天然薬剤、融合タンパク質またはそれらの等価物およびそれらの変異体、誘導体または組み合わせのいずれかを使用して）合成的に合成されるペプチドであり得る。薬剤は、Ｔ型チャネル活性および／もしくはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはこれらの共役の模倣体、あるいはＴ型チャネル活性および／もしくはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性を含むアミノ酸配列あるいはＴ型チャネル活性および／もしくはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性またはそれらの改変体、ホモログもしくはこれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列、あるいはこれらの機能的等価物（例えば、模倣体）あるいは上で概説されるような薬剤の組み合わせでさえあり得る。
【０１１４】
本発明の薬剤はまた、１種以上の有益な機能特性を示し得る。
【０１１５】
好ましくは、薬剤は、選択的にアゴナイズ（ａｇｏｎｉｓｅ）され得、そして／または選択的にアップレギュレートされ得るか、もしくは選択的に適切な標的を阻害し得る。
【０１１６】
いくつかの適用について、好ましくは薬剤は、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、好ましくは約７５ｎＭ未満、好ましくは約５０ｎＭ未満、好ましくは約２５ｎＭ未満、好ましくは約２０ｎＭ未満、好ましくは約１５ｎＭ未満、好ましくは約１０ｎＭ未満、好ましくは約５ｎＭ未満のＥＣ５０値を有する。
【０１１７】
いくつかの適用について、好ましくは薬剤は、所望される標的に対して少なくとも約２５倍、５０倍、７５倍、１００倍の選択性、好ましくは、所望される標的に対して少なくとも約１５０倍の選択性、好ましくは所望される標的に対して少なくとも約２００倍の選択性、好ましくは所望される標的に対して少なくとも約２５０倍の選択性、好ましくは所望される標的に対して少なくとも約３００倍の選択性、好ましくは所望される標的に対して少なくとも約３５０倍の選択性を有する。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、用語「薬剤」は、単一の実体であり得るか、または薬剤の組み合わせであり得る。
【０１１９】
薬剤は、アミノ酸配列であり得るか、またはそれらの化学的誘導体であり得る。物質は、有機化合物または他の化学物質でさえあり得る。薬剤は、ヌクレオチド配列でさえあり得る（センス配列またはアンチセンス配列であり得る）。薬剤は、抗体でさえあり得る。
【０１２０】
薬剤が有機化合物である場合、いくつかの用途に関しては、有機化合物は代表的に１つ以上のヒドロカルビル（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ）基を含む。ここで、用語「ヒドロカルビル基」は、少なくともＣおよびＨを含む基を意味し、そして必要に応じて、１つ以上の他の適切な置換基を含み得る。そのような置換基の例としては、ハロ基、アルコキシ基、ニトロ基、アルキル基、環式基などが挙げられ得る。置換基が環式基である可能性に加えて、置換基の組み合わせが環式基を形成し得る。ヒドロカルビル基が１つより多いＣを含む場合、それらの炭素が必ずしも互いに結合される必要はない。例えば、これらの炭素の少なくとも２つは、適切な元素または基を介して連結され得る。したがって、ヒドロカルビル基は、ヘテロ原子を含み得る。適切なヘテロ原子は、当業者に理解され、そして例えば、硫黄、窒素および酸素を含む。
【０１２１】
薬剤は、ハロ基を含み得る。ここで「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
【０１２２】
薬剤は、１つ以上のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキレン基およびアルケニレン基（非分枝鎖または分枝鎖であり得る）を含み得る。
【０１２３】
薬剤は、所望の効果を提供するために直接的または間接的に作用し得る。例えば、細胞、ベクターまたは核酸は、所望のポリペプチドのレベルを増加するために患者に提供され得る（患者体内に存在しないポリペプチドを提供する工程を含む）。ポリペプチドは、それ自体が所望の効果を提供し得るか、または所望の効果を提供するために１つ以上の他の部分に対して作用し得る。
【０１２４】
いくつかの場合において、薬剤は、遺伝子を不活性化すること、あるいはＲＮＡまたはポリペプチドレベルで発現を防止するかまたは減小することによって作用し得る。例えば、「ノックアウト」技術は、特定の遺伝子を非機能的にするために使用され得る。アンチセンス技術は、ＲＮＡ産生または翻訳をブロックするために使用され得る。
【０１２５】
他の場合において、薬剤は、個体に既に存在する遺伝子を活性化することによって（例えば、適切なプロモーター、エンハンサーまたは他の調節領域を提供することによって）、ＲＮＡまたはポリペプチドレベルでの発現を増加することによって、またはさらなる遺伝子またはそれらの遺伝子産物を導入することによって作用し得る。それゆえ、幅広い範囲の薬剤が使用され得ることが理解される。それらのいくつかは、遺伝子治療に関与する技術によって導入され得る。
【０１２６】
遺伝子治療技術は、任意の適切な手段によって患者内へ核酸を導入する工程を包含する。核酸は、細胞またはベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたは非レトロウイルスベクター）中に含まれ得るが、これは必須ではない。これは、宿主内の核酸と組み合わせるために使用され得るか（例えば、相同組み換えまたは非相同組み換えを介して）、または宿主の核酸（例えば、エピソーム）から分離したままであり得る。遺伝子治療技術は、例えば、米国特許第５３９９３４６号、ＷＯ９３／０９２２２、米国特許第５３７１０１５号などにおいて開示される。もちろん、非遺伝子治療技術は使用され得、そしてしばしば好まれ得る。
【０１２７】
本発明の薬剤は、実質的に純粋形態または実質的に単離された形態で提供され得る。それは、薬学的に受容可能な組成物の形態（例えば、適切な薬学的に受容可能なキャリア、希釈薬、または賦形剤を混合された）で提供され得る。
【０１２８】
ドパミン放出の増加を提供するために使用され得る薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせることができる、そして／またはドパミン作動性ニューロンをバースティングモードでなくなることを防止することができる薬剤を含む。
【０１２９】
それらは、カルシウムおよび／またはカリウムチャネルブロッカー、好ましくはＴ型カルシウムチャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルのブロッカー、最も好ましくは黒質におけるそのようなチャネルのブロッカーを含む。
【０１３０】
種々のＴ型カルシウムチャネルブロッカーおよび／またはＳＫ（好ましいＳＫ３）チャネルブロッカーが、後に記載されるようなスクリーニングによって同定され得る。
【０１３１】
種々のＴ型カルシウムチャネルブロッカーは、公知である（例えば、ミベフラジルおよび／またニッケルイオン）。
【０１３２】
推定されるカルシウムチャネルブロッカーの他の型が利用できる。その例は、代表的にはジヒドロピリジンである。ジヒドロピリジンの例としては、ニフェジピン、ニトレンジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニルジピン（ｎｉｌｕｄｉｐｉｎｅ）、リオジピン（ｒｉｏｄｉｐｉｎｅ）（ｒｙｏｓｉｄｉｎｅ）、フェロジピン、ダロジピン（ｄａｒｏｄｉｐｉｎｅ）、イスラジピン、（＋）Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、（−）２０２−７９１、（＋）Ｈ  １６０／Ｓ１、ＰＮ２００−１１０およびニソルジピンが挙げられる。カルシウムチャネルブロッカーの他の例としては、クルトキシン（Ｋｕｒｔｏｘｉｎ）、ジルチアゼム（ジルゼム（ｄｉｌｚｅｍ））およびＴＡ  ３０９０のようなベンゾチアゼピン（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｅｐｉｎｅ）ならびにベラパミル（イソプチン）、デスメトキシベラパミル、メトキシ  ベラパミル（Ｄ−６００、ガロパミル（ｇａｌｌｏｐａｍｉｌ）または（−）Ｄ−８８８）、プレニラミンのようなフェニルアルキルアミン、フェンジリン（ｆｅｎｄｉｌｉｎｅ）、テロジリン（ｔｅｒｏｄｉｌｉｎｅ）、カロベリン（ｃａｒｏｖｅｒｉｎｅ）、ペルヘキシリンが挙げられる。
【０１３３】
カルシウムチャネルブロッカーに関するバックグラウンド教示は、Ｖｉｃｔｏｒ  Ａ．ＭｃＫｕｓｉｃｋらによって、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｏｍｉｍ／ｓｅａｒｃｈｏｍｉｍ．ｈｔｍ．で示される。カルシウムチャネルブロッカーに関する以下の情報が、この情報源から抽出される。
【０１３４】
米国特許第５，６４６，１４９号は、処方式Ａ−−Ｙ−−Ｂのカルシウムアンタゴニストを記載し、ここでＢはＹに直接結合するピペラジンまたはピペリジンを含む。これらの分子の必須成分は、Ａで示され、Ａは抗酸化物質でなければならない；ピペラジン（ｐｙｐｅａｚｉｎｅ）またはピペリジン自体は、重要であると言われる。例示される化合物は、ベンズヒドリル（ｂｅｎｚｈｙｄｒｉｌ）置換基（公知のカルシウムチャネルブロッカーをベースにした）を含む（以下を参照のこと）。米国特許第５，７０３，０７１号は、虚血症の処置において有用であると言われる化合物を開示する。この分子の必須部分は、トロポロン（ｔｒｏｐｏｌｏｎｅ）残基である；とりわけ許容される置換基は、ピペラジン（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）誘導体であり、これは、そのベンズヒドリル誘導体を含む。米国特許第５，４２８，０３８号は、神経保護効果および抗アレルギー性効果を発揮するといわれる化合物を開示する。これらの化合物は、ピペラジン誘導体および他の６員のヘテロ環を含み得るクマリン誘導体である。ヘテロ環に関して許容される置換基は、ジフェニルヒドロキシメチルである。従って、カルシウムチャネルブロッキング活性に関与し得る種々の指標に関する当該分野のアプローチは、ベンズヒドリルで置換されるピペリジン部分またはピペラジン部分を付随的に含む化合物を使用するが、さらなる置換基に官能性を維持させる。
【０１３５】
ベンズヒドリル部分とピペリジンまたはピペラジンの両方を含む特定の化合物は、カルシウムチャネルアンタゴニストおよび抗精神病薬であることが公知である。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８３）８０：５１２２〜５１２５は、リドフライン（ｌｉｄｏｆｌａｉｎｅ）、フラスピリレン（ｆｌｕｓｐｉｒｉｌｅｎｅ）、ピモジド（ｐｉｍｏｚｉｄｅ）、クロピモジド（ｃｌｏｐｉｍｏｚｉｄｅ）、およびペンフルジドール（ｐｅｎｆｌｕｒｉｄｏｌ）のような抗分裂病性抗精神病薬を記載する。また、フルスピリレンは、Ｌ型カルシウムチャネル（Ｋｉｎｇ，Ｖ．Ｋ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８９）２６４：５６３３〜５６４１）ならびにブロッキングＮ型カルシウムキューレント（ｃｕｅｒｅｎｔ）（Ｇｒａｎｔｍ  Ｃ．Ｊ．ら，Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９４４）１１１：４８３〜４８８）に関する部位に結合する。さらに、Ｋｅｎｅｂｏ  Ｋ  Ｋによって明らかにされたように、ロメリジン（ｌｏｍｅｒｉｚｉｎｅ）は、公知のカルシウムチャネルブロッカーである。ロメリジンに関する公開公報の総説は、Ｄｏｏｌｅｙ，Ｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ＣＰＮＳ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ（１９９９）において見出される。
【０１３６】
（薬学的に受容可能な塩）
薬剤は、酸添加塩（ａｃｉｄ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓａｌｔ）または塩基塩のような薬学的に受容可能な塩、あるいはそれらの溶媒和物（それらの水和物を含む）の形態であり得、そして／またはこれらとして投与され得る。適切な塩に関する総説に関しては、Ｂｅｒｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１〜１９を参照のこと。
【０１３７】
代表的に、薬学的に受容可能な塩は、適切なように、所望の酸または塩基の使用によって容易に調製され得る。塩は、溶液から沈殿し、そしてろ過によって集められるか、または溶媒の蒸発によって回収され得る。
【０１３８】
適切な酸添加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成され、そして例は、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、コハク酸塩、サッカレート、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモエート塩である。
【０１３９】
適切な塩基塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成され、そして例は、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛およびジエタノールアミン塩である。
【０１４０】
（多型形態／不斉炭素）
本発明の薬剤は、多型形態で存在し得る。
【０１４１】
本発明の薬剤は、１つ以上の不斉炭素原子を含み得、そしてそれゆえ、２つ以上の立体異性形態で存在する。薬剤がアルケニル基またはアルケニレン基を含む場合、シス（Ｅ）およびトランス（Ｚ）立体異性もまた生じ得る。本発明は、薬剤の個々の立体異性体および適切な場合、それらの互変異性形態（それらの混合物とともに）を含む。
【０１４２】
ジアステレオマーまたはシス異性体およびトランス異性体の分離は、慣用的な技術（例えば、薬剤の立体異性体混合物もしくは適切の塩またはそれらの誘導体の分画結晶化、クロマトグラフィーまたはＨ．Ｐ．Ｌ．Ｃ．によって達成され得る。薬剤の化合物の個々のエナンチオマーはまた、対応する光学的に純粋な中間体からか、あるいは適切なキラル支持体を使用する対応ラセミ化合物の融解によって（例えば、Ｈ．Ｐ．Ｌ．Ｃ．によって）または適切な場合、この対応ラセミ化合物と適切な光学的に活性な酸または塩基との反応によって形成されるジアステレオ異性体塩の分画結晶化によって調製され得る。
【０１４３】
（同位体バリエーション）
本発明はまた、薬剤の全ての適切な同位体バリエーションまたはそれらの薬学的に受容可能な塩を含む。本発明の薬剤の同位体バリエーションまたはそれらの薬学的に受容可能な塩は、少なくとも１つの原子が同じ原子数を有するが、天然において通常見出される原子質量とは異なる原子質量を有する原子によって置換されるものとして規定される。薬剤およびそれらの薬学的に受容可能塩に取り込まれ得る同位体の例としては、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆおよび３６Ｃｌのような水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体が挙げられる。薬剤およびそれらの薬学的に受容可能な塩の特定の同位体バリエーション（例えば、３Ｈまたは１４Ｃのような放射性同位元素が取り込まれるもの）は、薬物研究および／または基質組織分布研究において有用である。トリチウム化（すなわち３Ｈ）および炭素１４（すなわち１４Ｃ）同位体は、特に調製および検出性の容易さのために好ましい。さらに重水素（すなわち、２Ｈ）のような同位体での置換は、より大きな代謝安定性（例えば、増加したインビボ半減期または減少された投薬要求）から生じる特定の治療上の利点を提供し得、そしてそれゆえ、いくつかの状況において好まれ得る。本発明の薬剤の同位体バリエーションおよびこの発明の薬学的に受容可能な塩は、概して適切な試薬の適切な同位体バリエーションを使用する従来の手順によって調製される。
【０１４４】
（プロドラッグ）
本発明の薬剤は、プロドラッグにから誘導され得ることが当業者によって理解される。プロドラッグの例としては、特定の保護基を有する実体が挙げられ、そしてこの実体は、それだけでは薬学的活性を保持しないが、特定の例において、投与され得（例えば、経口または非経口）、そしてその後、薬学的に活性な本発明の薬剤を形成するために体内において代謝され得る。
【０１４５】
（プロモエティー（ｐｒｏ−ｍｏｉｅｔｙ））
「プロモエティー」として公知の特定の部分（例えば、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５による「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（この開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように）は、薬剤の適切な機能性に配置され得ることがさらに理解される。このようなプロドラッグもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４６】
（アンタゴニスト）
本発明の１つの実施形態において、好ましくは薬剤は、Ｔ型のチャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルならびに／あるいはこれらの共役のアンタゴニスト、部分的アンタゴニストおよび競合アンタゴニストからなる群から選択される。
【０１４７】
所定の部分アンタゴニストは、その部分の１つ以上の活性（例えば、全活性）を阻害し得る。例えば、その部分に対してまたはその部分と相互作用する（例えば、結合する）あるものに対して、競合的または非競合的な様式で結合し得る。
【０１４８】
（結合剤）
薬剤は、結合剤と結合し得るか、または結合剤であり得る。
【０１４９】
ここで、結合剤は、本発明にチャネルブロッカーとして有用であり得る。例えば、それらは、それらの一部またはチャネルと作動可能に結合する別の部分への結合によってチャネルをブロックし得る。
【０１５０】
結合剤の例は、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルに特異的である抗体またはそのフラグメントである。
【０１５１】
本発明において使用され得る結合剤のさらなる型は、レクチンである。レクチンは、非免疫（例えば、植物）起源の炭水化物結合タンパク質である（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１８２（１９９０）によるレクチンの議論を参照のこと）。異なるレクチンが、特定の炭水化物部分（例えば、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、など）の存在に基づいて特定の糖タンパク質を選択するために使用され得る。いくつかの場合において、複数の異なるレクチンが使用され得る（例えば、糖タンパク質が、３つの異なる糖を含むことが公知である場合、３つの異なるレクチンは、糖タンパク質を精製するために使用され得る）。それらは、例えば、連続したアフィニティカラムにおいて、連続的に使用され得る。
【０１５２】
結合剤の別の型は、本発明のポリペプチドまたはこのポリペプチドと相互作用する（例えば、結合する）部分に結合するリガンドまたはその一部である。リガンドまたはその一部は、固定化または非固定化（可溶性）形態で提供され得る。
【０１５３】
結合剤の多くの異なる型が、本発明で使用され得ることが理解される。
【０１５４】
（抗体）
本発明の１つの実施形態において、本発明の薬剤は、抗体であり得る。さらに、または代替的に、本発明の標的は、抗体であり得る。
【０１５５】
抗体は、本発明の物質での免疫またはファージディスプレイライブラリーの使用のような標準的な技術によって産生され得る。
【０１５６】
本発明の目的のために、用語「抗体」としては、相反するものに対して特定化されない限り、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなフラグメントとしては、標的物質に対する結合活性を保持する全抗体のフラグメント（Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質ならびに抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質が挙げられる。そのうえ、それらの抗体およびフラグメントは、ヒト化抗体であり得る。中和抗体（すなわち、物質ポリペプチドの生物活性を阻害するもの）は、特に診断および治療のために好まれる。
【０１５７】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、など）は、本発明の同定された薬剤および／または物質から得られるエピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫される。宿主の種に依存して、種々のアジュバントは、免疫応答を増加させるために使用され得る。そのようなアジュバントとしては、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、およびリゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、多価陰イオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールカサガイヘモシアニン、およびジニトロフェノールのような界面活性物質が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｉ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍは、全身性防御を刺激する目的で精製された物質ポリペプチドが免疫学的に危険にさらされている個体に対して投与される場合、使用され得る潜在的に有効なヒトアジュバントである。
【０１５８】
免疫された動物由来の血清は、公知の手順に従って集められ、そして処理される。本発明の同定された薬剤および／または物質から得られるエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が、他の抗原に対する抗体を含む場合、このポリクローナル抗体は、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナル抗血清を産生し、そしてプロセッシングするための技術は、当該分野で公知である。そのような抗体を作る目的で、本発明はまた、本発明のポリペプチドまたは動物もしくはヒトにおける免疫原として使用するための別のポリペプチドに対してハプテン化されるこれらのフラグメントを提供する。
【０１５９】
本発明の同定された薬剤および／または物質から得られるエピトープに対して指向されるモノクローナル抗体はまた、当業者によって容易に産生され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作るための一般的な方法論は、周知である。不死化抗体産生細胞株は、細胞融合によって、および腫瘍形成ＤＮＡでのＢリンパ球の直接的な形質転換、またはエプスタイン−バーウイルスでのトランスフェクションのような他の技術によっても創られ得る。眼窩エピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性（すなわち、アイソタイプ親和性およびエピトープ親和性）についてスクリーニングされ得る。
【０１６０】
本発明の物質および／または同定された薬剤に対するモノクローナル抗体は、培養中の継続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製され得る。これらとしては、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７）によって本来記載されるハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８０：２０２６〜２０３０）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ，７７〜９６頁）が挙げられるが、これに限定されない。さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（適切な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシング）が使用され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６８５１〜６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４〜６０８；Ｔａｋｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２〜４５４）。あるいは、単鎖抗体産生のために記載される技術（米国特許第４，９４６，７７９号）は、単鎖抗体に特異的な物質を産生するために適用され得る。
【０１６１】
本発明の同定された薬剤および／または物質から得られるエピトープに対して指向される抗体（モノクローナルおよびポリクローナルの両方）は、診断において特に有用であり、そして中和抗体は、受動免疫治療において有用である。特にモノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を生じるために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、保護が所望される物質および／または薬剤の「内部像」を有する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を生じるための技術は、当該分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、治療において有用であり得る。
【０１６２】
抗体はまた、リンパ球母集団中でのインビボ産生の誘導あるいはＯｒｌａｎｄｉら（１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：３８３３〜３８３７）、ならびにＷｉｎｔｅｒ  ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９９１；Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９）に開示されるような組み換え免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルのスクリーニングによって産生され得る。
【０１６３】
その物質について特異的な結合部位を含む抗体フラグメントがまた、生成され得る。例えば、そのようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の減少によって産生され得るＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするように構築され得る（Ｈｕｓｅ  ＷＤら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２７５〜１２８１）。
【０１６４】
（化学合成方法）
代表的に、本発明の薬剤は、化学合成技術によって調製される。
【０１６５】
本発明の薬剤またはそれらの改変体、ホモログ、誘導体、フラグメントまたは模倣体は、薬剤全体または一部を合成するための化学方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチドは、固相技術によって合成され得、樹脂から分割され得、そして分取用高性能液体クロマトグラフィーによって精製され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認され得る（例えば、ｔｈｅ  Ｅｄｍａｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，前出）。
【０１６６】
薬剤またはそれらの改変体、ホモログ、誘導体、フラグメントまたは模倣体の直接合成は、種々の固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ  ＪＹら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２〜２０４）を使用して実行され得、そして自動合成は、例えば、メーカーによって提供される使用説明書に従って、ＡＢＩ  ４３  １  Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成され得る。さらに、薬剤またはそれらの任意の部分を含むアミノ酸配列は、直接合成の間に変更され得、そして／または改変薬剤（例えば、改変Ｔ型チャネルおよび／または改変ＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル）を産生するように、他のサブユニットからの配列、またはそれらの任意の部分と化学方法を使用して組み合わせられ得る。
【０１６７】
本発明の変更実施形態において、薬剤またはそれらの改変体、ホモログ、誘導体、フラグメントまたは模倣体のコード配列は、当該分野で周知の化学方法を使用して、全体または一部合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨら（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２１５〜２３，Ｈｏｒｎ  Ｔら（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２２５〜２３２を参照のこと）。
【０１６８】
（模倣体）
本明細書中で使用される場合、用語「模倣体」は、ペプチド、ポリペプチド、抗体または他の有機化学薬品（参照される実体と同じ定性的活性または効果を有する）が挙げられるが、これらに限定されない任意の化学薬品と関係する。
【０１６９】
（誘導体）
本明細書中で使用される場合、用語「誘導体」または「誘導される」は、薬剤の化学的改変を含む。そのような化学的改変の実例は、ハロ基、アルキル基、アシル基またはアミノ基による水素の置換である。
【０１７０】
（化学的改変）
本発明の１つの実施形態において、薬剤は、化学的に改変された薬剤であり得る。
【０１７１】
本発明の薬剤の化学的改変は、薬剤と標的との間の水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水的相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用または双極子相互作用を増強し得るか、または減少し得る。
【０１７２】
１つの局面において、同定された薬剤は、他の化合物の開発のためのモデル（例えば、テンプレート）として作用し得る。
【０１７３】
（薬学的組成物）
本発明はまた、本発明の薬剤の治療上の有効量および薬学的に受容可能なキャリア、希釈薬または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含む薬学的組成物を提供する。
【０１７４】
薬学的組成物は、ヒト医療および獣医医療におけるヒトへの使用または動物への使用のためであり得、そして代表的に薬学的に受容可能な希釈薬、キャリア、または賦形剤のいずれか１つ以上を含む。治療上の使用のための受容可能なキャリアまたは希釈薬は、薬学分野において周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏに記載される（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）。薬学的キャリア、賦形剤または希釈薬の選択は、投与の意図された経路および標準的な薬学診療に関して選択され得る。薬学的組成物は、キャリア、賦形剤または希釈薬として、またはそれらに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑油、懸濁薬剤、コーティング薬剤、溶解薬剤を含み得る。
【０１７５】
保存薬、安定剤、色素および香り付け薬でさえ、薬学的組成物中に提供され得る。保存薬の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化物質および懸濁薬もまた、使用され得る。
【０１７６】
異なる送達システムに依存して、異なる組成物／処方物の要求があり得る。例としては、本発明の薬学的組成物は、ミニポンプを使用するかまたは粘膜経路によって（例えば、鼻孔スプレーまたは吸入のためのエアロゾルあるいは摂取可能な溶液として）、あるいは組成物が、例えば静脈経路、筋内経路または皮下経路による送達のために注射可能な形態に処方される場合、非経口的に送達されるように処方され得る。あるいは、処方物は、両経路によって送達されるように設計され得る。
【０１７７】
薬剤が胃腸管粘膜を通って粘膜的に送達され得る場合、胃腸管を通過する間、薬剤は、安定なままであり得るべきである；例えば、タンパク質分解性の分解に対しては耐性であり、酸性ｐＨでは安定でありそして胆汁の界面活性効果に対して耐性であるべきである。
【０１７８】
適切な場合、薬学的組成物は、吸入によって、坐剤または膣坐薬の形態で、局所（ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形態で）、皮膚パッチの使用、経口（デンプンまたは乳糖のような賦形剤を含む錠剤形態、あるいは単独または賦形剤との混合物のいずれかであるカプセルまたは小卵形態、もしくはフレーバー剤または着色剤を含むエリキシル、溶液または懸濁液形態で）によって投与され得るか、またはそれらは、非経口（例えば、静脈、筋内または皮下）的に注射され得る。非経口投与のために、組成物は、他の物質（例えば、血液と等張の溶液を作るために十分な塩または単糖類）を含み得る無菌の水性溶液の形態で最も良く使用され得る。頬または舌下からの投与のために、組成物は、通常の方法で処方され得る錠剤またはロゼンジの形態で投与され得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態に関して、本発明の薬剤はまた、シクロデキストリンとの組み合わせで使用され得る。シクロデキストリンは、薬剤分子を有する包接複合体および非包接複合体を形成することが公知である。薬剤−シクロデキストリン複合体の処方は、薬剤分子の可溶性、溶解速度、バイオアベイラビリティおよび／または安定特性を改変し得る。薬剤−シクロデキストリン複合体は、概してほとんどの投薬形態および投与経路について有用である。薬剤との直接的な複合化に対する代替として、シクロデキストリンは、補助添加物（例えば、キャリア、希釈薬または溶解剤）として使用され得る。α−、β−およびγ−シクロデキストリンは、最も一般的に使用され、そして適切な例は、ＷＯ−Ａ−９１／１１１７２、ＷＯ−Ａ−９４／０２５１８およびＷＯ−Ａ−９８／５５１４８に記載される。
【０１８０】
本発明の薬学的組成物は、制御される放出形態で提供され得る。これは、前もって決定された方法で生理的条件下で分解する物質に関連して薬学的に活性な薬剤を提供することで達成され得る。分解は酵素依存性またはｐＨ依存性であり得る。
【０１８１】
薬学的組成物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断して通過するように与えら得る。例えば、脂肪酸、イノシトールまたはコレステロールのようなＢＢＢに浸透し得るキャリアが、選択され得る。キャリアは、脳内皮細胞における特異的な輸送システムを介して脳へ入る物質（例えば、インスリン様成長因子ＩまたはＩＩ）であり得る。キャリアは、活性薬剤と結合され得るか、または活性薬剤を含み得る／活性薬剤との混合であり得る。リポソームは、ＢＢＢを横切るために使用され得る。ＷＯ−Ａ−９１／０４０１４は、活性薬剤がカプセル化され得る／包埋され得る、および通常ＢＢＢを横断して輸送される分子（例えば、インスリンあるいはインスリン様成長因子ＩまたはＩＩ）が、リポソーム外部表面上に存在するリポソーム送達システムを記載する。リポソーム送達システムはまた、ＵＳ−Ａ−４７０４３５５において考察される。
【０１８２】
異なる薬剤送達システムは、投与の望ましい経路に依存して、本発明の薬学的組成物を投与するために使用され得る。薬剤送達システムは、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３（１９９１））ならびにＩｌｌｕｍおよびＤａｖｉｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：２５４〜２５９（１９９１））によって記載される。
【０１８３】
好ましい実施形態において、本発明のアセント（ａｓｅｎｔ）は、全身に送達される（例えば、経口、頬、舌下で、より好ましくは経口で）。
【０１８４】
それゆえに、好ましくは薬剤は、経口からの送達のために適切な形態である。
【０１８５】
（投与）
用語「投与される」は、ウイルス性または非ウイルス性方法による送達を含む。ウイルス性送達機構としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターが挙げられるが、これに限定されない。非ウイルス性送達機構としては、脂質媒介性トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン表面両親媒性化合物（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｆａｃｉａｌ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｅｓ）（ＣＦＡ）およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１８６】
本発明の薬剤は単独で投与され得るが、概して薬学的組成物として投与される（例えば、薬物が、投与の意図された経路および標準的な薬学診療に関して選択される適切な薬学的賦形剤、希釈薬またはキャリアとの混合である場合）。
【０１８７】
例えば、薬剤は錠剤、カプセル、小卵、エリキシル、溶液または懸濁液の形態で投与（例えば、経口的または局所的）され得、これは、即時放出、遅延放出、改変放出、持続放出、パルス放出または制御放出の適用のためにフレーバー剤または着色剤を含み得る。
【０１８８】
錠剤は、賦形剤（例えば、微結晶性セルロース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシン）、崩壊剤（例えば、デンプン（好ましくはコーンデンプン、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン）、デンプングリコレートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）、クロスカルメルロース（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウムおよび特定の複合シリクート）、および顆粒結合体（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ショ糖、ゼラチンおよびアカシア）を含み得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルべへネート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈｅｎａｔｅ）および滑石のような滑沢剤が挙げられ得る。
【０１８９】
類似型の固形組成物はまた、ゼラチンカプセル中の充填剤として使用され得る。これに関して好ましい賦形剤としては、乳糖（ｌａｃｔｏｓｅ）、デンプン、セルロース、乳糖（ｍｉｌｋ  ｓｕｇａｒ）または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液および／またはエリキシルについて、薬剤は、種々の甘味剤またはフレーバー剤、着色物質または色素と組み合わせられ得、乳化剤および／または懸濁剤と組み合わせられ得、そして水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンのような希釈剤、ならびにそれらの組み合わせと組み合わせられ得る。
【０１９０】
投与（送達）のための経路としては：
経口（例えば、錠剤、カプセルとして、または摂取可能な溶液として）、局所、粘膜（例えば、鼻孔スプレーまたは吸入のためのエアロゾル）、鼻、非経口（例えば、注射形態によって）、胃腸、脊椎内、腹腔内、筋内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、脳内、皮下、眼（レンズ内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ）または眼球内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ））、経皮、直腸、頬、ペンシス（ｐｅｎｓｉｓ）経由、膣、硬膜外、舌下のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
必ずしも全薬剤が同じ経路によって投与される必要はないことが理解されるべきである。同様に、その組成物が１つより多い活性成分を含む場合、それらの成分は、異なる経路によって投与され得る。
【０１９２】
本発明の薬剤が非経口で投与される場合、そのような投与の例としては：静脈内、動脈内、腹腔内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋内または皮下への薬剤投与のうちの１つ以上；および／または注入技術の使用が挙げられる。
【０１９３】
非経口投与に関して、薬剤は、他の物質（例えば、血液と等張の溶液を作るために十分な塩またはグルコース）を含み得る無菌の水溶液の形態で最も使用される。水溶液は、必要ならば、適切に緩衝化（好ましくはｐＨ３〜９に）されるべきである。無菌条件下での適切な非経口の処方物の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術によって容易に達成される。
【０１９４】
示されるように、本発明の薬剤は、鼻腔からまたは吸入によって投与され、そして乾燥粉末吸入器または適切な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン（例えば、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４ＡＴＭ）または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡＴＭ）、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用する加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー投与の形態で、都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計器で測定された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器は、活性化合物の溶液または懸濁液を含み得（例えば、エタノールと溶媒のような高圧ガスの混合物を使用することで）、これは、さらに潤滑油（例えば、ソルビタントリオレエート（ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）を含み得る。吸入器または注入器で使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから作られる）は、薬物と乳糖またはデンプンのような適切な粉末ベースの粉末混合物を含むように処方され得る。
【０１９５】
あるいは、本発明の薬物は、坐剤または膣坐薬の形態で投与され得るか、またはゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形態で局所的に塗布され得る。本発明の薬剤はまた、皮膚的または経皮的に（例えば、皮膚パッチの使用によって）に投与され得る。それらはまた、肺経路または直腸経路によって投与され得る。それらはまた、眼経路によって投与され得る。眼への使用のために、化合物は、等張で、ｐＨが合わせられた無菌生理食塩水において微粉にされた懸濁剤として、または好ましくは、等張で、ｐＨが合わせられた無菌生理食塩水における溶液として、必要に応じて塩化ベンジルアルコニウムのような保存剤との組み合わせで処方され得る。あるいは、それらは、ワセリンのような軟膏で処方され得る。
【０１９６】
皮膚への局所的な塗布のために、本発明の薬剤は、例えば、以下のうちの１つ以上との混合において懸濁されるか、または溶解される活性化合物を含む適切な軟膏として処方される：鉱油、流動ワセリン、ホワイトワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水。
【０１９７】
あるいは、それは、例えば、以下のうちの１つ以上との混合において懸濁されるか、または溶解される適切なローションまたはクリームとして処方され得る：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリール（ｃｅｔｅａｒｙｌ）アルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水。
【０１９８】
本発明の組成物は、直接注射によって投与され得る。
【０１９９】
いくつかの適用に関して、好ましくは、薬剤は、経口投与される。
【０２００】
いくつかの適用に関して、好ましくは、薬剤は、局所投与される。
【０２０１】
（用量レベル）
代表的に、医師は、個々の被験体について最も適切な実際の投与量を決定する。任意の特定の患者に対する特定の用量レベルおよび投薬頻度は変更され得、そして種々の因子（使用される特定の化合物の活性、代謝安定性およびその化合物の作用時間、年齢、体重、全身の健康状態、性、食事、投与モードおよび時間、排泄速度、薬剤の組み合わせ、特定の状態の重症度、および治療を受ける個人を含む）に依存する。本発明の薬剤および／または薬学的組成物は、１日あたり１〜１０回（例えば、１日あたり１回または２回）のレジメンに従って投与され得る。
【０２０２】
ヒト患者への経口および非経口投与について、薬剤の１日の投薬レベルは、単回用量または分割用量であり得る。
【０２０３】
必要に応じて、薬剤は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重）の用量で投与され得る。当然、本明細書中で記述される投薬は、平均的なケースの例示である。もちろん、より高いまたはより低い投薬量範囲が正当な個体の事例もあり得る。
【０２０４】
（処方物）
本発明の薬剤は、例えば、当該分野において公知の技術の使用による１つ以上の適切なキャリア、希釈剤または賦形剤との混合によって薬学的組成物中へ処方され得る。
【０２０５】
（個体）
本明細書中で使用される場合、用語「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーをいう。この用語は、家畜、愛玩動物、霊長類およびヒトを包含するが、これに限定されない。
【０２０６】
（処置）
処置に関する本明細書中の全参照は、治癒療法、待機療法および予防療法を含むことが理解される。
【０２０７】
（薬学的組み合わせ）
一般的に、薬剤は、１つ以上の他の薬学的に活性な薬剤との組み合わせで使用され得る。他の薬剤は、時々補助薬剤であるものとして称される。
（バイオアベイラビリティ）
好ましくは、本発明の化合物（および組み合わせ）は、経口的に生物利用可能である。経口バイオアベイラビリティとは、体循環に到達する経口投与された薬物の割合をいう。薬物の経口バイオアベイラビリティを決定する因子は、溶解、膜透過性および代謝安定性である。代表的に、最初にインビトロ技術、次いでインビボ技術のカスケードのスクリーニングは、経口バイオアベイラビリティを決定するために使用される。
【０２０８】
溶解（胃腸管（ＧＩＴ）の水性内容物による薬の可溶化）は、ＧＩＴを模倣するように適切なｐＨで実施されるインビトロ溶解度実験から予想され得る。好ましくは、本発明の化合物は、５０ｍｃｇ／ｍｌの最小の溶解度を有する。溶解度は、当該分野において公知の標準的な手順（例えば、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２３，３〜２５，１９９７において記載される）によって決定され得る。
【０２０９】
膜透過性とは、ＧＩＴの細胞を通る化合物の通過をいう。脂肪親和性は、この膜透過性を予想する上で重要な特性であり、そして有機溶媒および緩衝液を使用するインビトロＬｏｇ  Ｄ７．４測定によって定義される。好ましくは、本発明の化合物は、−２〜＋４のＬｏｇ  Ｄ７．４、より好ましくは、−１〜＋２のＬｏｇ  Ｄ７．４を有する。ｌｏｇ  Ｄは、当該分野において公知の標準的な手順（例えば、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９０，４２：１４４に記載される）によって決定され得る。
【０２１０】
ＣａＣＯ２のような細胞単層アッセイは、ｐ−糖タンパク質のような排出輸送体の存在下で好都合な膜透過性の予測に対して、いわゆるカコ−２（ｃａｃｏ−２）流入を実質的に加える。好ましくは、本発明の化合物は、２×１０−６ｃｍｓ−１より大きい、より好ましくは、５×１０−６ｃｍｓ−１より大きいカコ−２排出を有する。カコ排出値は当該分野において公知の標準的な手順（例えば、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，１９９０，７９，５９５〜６００に記載される）によって決定され得る。
【０２１１】
代謝安定性は、吸収プロセスの間の化合物を代謝するＧＩＴまたは肝臓の能力（初回通過効果）を扱う。ミクロソーム、肝細胞などのようなアッセイ系は、代謝の負担を予測する。好ましくは、実施例の化合物は、０．５未満の肝抽出に比例したアッセイ系における代謝安定性を示す。アッセイ系およびデータ操作の例は、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖｅｌ．，２０１，４，３６〜４４，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．，２０００，２８，１５１８〜１５２３に記載される。
【０２１２】
上のプロセスの相互作用に起因して、薬物がヒトにおいて経口的に生物利用可能であるというさらなる支持が、動物におけるインビボ実験によって得られ得る。確かなバイオアベイラビリティは、これらの研究において、化合物を、別々でまたは混合して、経口経路によって投与することにより決定される。確かな決定（吸収％）のために、静脈経路もまた、使用される。動物における経口バイオアベイラビリティのスクリーニングの例は、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．，２００１，２９，８２〜８７；Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，１９９７，４０，８２７〜８２９，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．，１９９９，２７，２２１〜２２６において見出され得る。
【０２１３】
（診断キット）
本発明はまた、（ｉ）生体流体および組織におけるＴ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役の検出および測定；および／または（ｉｉ）組織におけるＴ型チャンネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役の局在化；ならびに／あるいは（ｉｉｉ）パーキンソン病のような神経変性状態に対する素因の検出の為の診断組成物または診断方法あるいはキットを含む。この点において、組成物またはキットは、１つ以上の標的（例えば、試験サンプルにおけるＴ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役）の存在、または１つ以上のこの標的の非存在さえ示し得る実体を含む。好ましくは、試験サンプルは、黒質から得られる。
【０２１４】
例として、本診断組成物は、本明細書中で記述されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つまたはそれらの改変体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体、あるいはそのヌクレオチド配列のいずれか１つの全体または部分にハイブリダイズし得る配列を含み得る。
【０２１５】
１つの実施形態において、本発明は１つの方法を提供し、ここで該方法は、前記個体がＴ型カルシウムチャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルならびに／あるいはそれらの共役の構造および／または機能に影響を及ぼす遺伝的欠損を有するか否かを決定するために、核酸プローブまたはプライマーを使用する。
【０２１６】
例として、本方法は、前記個体がＴ型カルシウムチャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルの構造、あるいはそれと作用的に結合する部分の構造に影響を及ぼす欠損を有するか否かを決定するために、エピトープまたは他の構造部分に結合し得る結合剤を使用し得る。
【０２１７】
本発明はまた、核酸プローブまたはプライマーあるいは結合剤を含む診断キットを提供する。
【０２１８】
本発明はまた、検出可能なシグナル（例えば、蛍光標識、放射能標識）を含むキットおよび／またはキットが使用中である場合、検出可能な変化を提供するため（例えば、酵素触媒性変化を提供するため）の手段を提供する。本キットは、本発明に従って、障害の診断における使用についての指示書を含み得る。
【０２１９】
（プローブ）
本発明の診断組成物および／またはキットは、標的コード領域（例えば、Ｔ型チャネルコード領域および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルコード領域）をコードするポリヌクレオチド配列（ゲノム配列を含む）または対立遺伝子のような密接に関連のある分子を検出し得る核酸ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブのようなプローブを含み得る。プローブの特異性（すなわち、それが高度に保存的な、保存的なまたは非保存的な領域またはドメインに由来するか否か）、およびハイブリダイゼーションまたは増幅のストリンジェンシー（高い、中間または低い）は、プローブが天然に存在する標的コード配列のみ、または関連配列を同定するか否かを決定する。関連核酸配列の検出のためのプローブは、標的ファミリーメンバーの保存的または高度に保存的なヌクレオチド領域から選択され、そしてそのようなプローブは、変性プローブのプールにおいて使用され得る。同一の核酸配列の検出のために、または最大限の特異性が所望される場合、核酸プローブは、標的ポリヌクレオチドの非保存的ヌクレオチド領域または特有の領域から選択される。本明細書中で使用される場合、用語「非保存的ヌクレオチド領域」とは、本明細書中で開示される標的コード配列に特有のヌクレオチド領域をいい、そして関連するファミリーメンバーにおいては生じない。
【０２２０】
ＵＳ−Ａ−４６８３１９５、ＵＳ−Ａ−４８００１９５およびＵＳ−Ａ−４９６５１８８において記載されるようなＰＣＲは、標的配列に基づくオリゴヌクレオチドに関するさらなる用途を提供する。そのようなオリゴマーは、一般的に化学的に合成されるが、それらは酵素的合成され得るか、または組み換え供給源から産生され得る。概して、オリゴマーは、特定遺伝子または条件の同定のために最適化された条件下で使用される２つのヌクレオチド配列（１つはセンス配向（５’→３’）を有し、そして１つはアンチセンス（３’←５’）を有する）を含む。同じ２つのオリゴマー（ネスト化オリゴマーセット、またはオリゴマーの変性プールでさえ）は、密接に関連するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の検出および／または定量化のためのより低いストリンジェントな条件下で使用され得る。
【０２２１】
標的に関する核酸配列はまた、以前に記載されたような（内因性ゲノム配列をマップすることに関して）ハイブリダイゼーションプローブを生成するために使用され得る。配列は、特定の染色体または染色体の特異的な領域に、周知の技術を使用してマップされ得る。これらは、染色体スプレッド（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｓｐｒｅａｄ）（Ｖｅｒｍａら（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ）、フローソートした（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体調製物、またはＹＡＣ、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）のような人工染色体構築物、細菌性ＰＩ構築物もしくは単染色体ｃＤＮＡライブラリーに対するインサイチュハイブリダイゼーションを含む。
【０２２２】
染色体調製物のインサイチュハイブリダイゼーションおよび確立された染色体マーカーを使用する連鎖分析のような物理的マッピング技術は、遺伝子地図の拡大において非常に貴重である。遺伝子地図の例は、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５；２７０：４１０ｆおよび１９９４；２６５：１９８１ｆ）において見出され得る。しばしば別の哺乳動物種の染色体上での遺伝子の配置は、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合であっても、関連マーカーを示し得る。新たな配列は、染色体アーム、またはそれらの一部に物理的マッピングによって指定され得る。これは、ポジショナルクローニングまたは他の遺伝子発見技術を使用して障害遺伝子を検索する研究者に対して価値ある情報を提供する。いったん障害または症候群が、遺伝子連鎖によって特定のゲノム領域に大ざっぱに場所を限定された場合、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のために関連遺伝子または調節遺伝子を示し得る。本発明のヌクレオチド配列はまた、正常な保因者または罹患した個体の間の転座、逆位などに起因する染色体位置における差異を検出するために使用され得る。
【０２２３】
（組み換え方法）
代表的に、本発明の薬剤は、組み換えＤＮＡ技術によって調製される。
【０２２４】
１つの実施形態において、好ましくは、標的は、Ｔ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役である。
【０２２５】
いくつかの局面に関して、例えばアッセイ方法、好ましくはＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルは、組み換えＤＮＡ技術によって調製される。
【０２２６】
（アミノ酸配列）
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸配列」とは、ペプチド、ポリペプチド配列、タンパク質配列またはそれらの部分をいう。
【０２２７】
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および／または用語「タンパク質」と同義である。いくつかの実施例において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。いくつかの実施例において、用語「アミノ酸配列」は、用語「タンパク質」と同義である。
【０２２８】
アミノ酸配列は、適切な供給源から単離されて調製され得るか、または合成的に作られ得るか、あるいは組み換えＤＮＡ技術の使用によって調製され得る。
【０２２９】
１つの局面において、本発明は、Ｔ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役を調節するためにアミノ酸配列に影響を及ぼし得る１つ以上の薬剤および／またはそれらの誘導体を同定するためのアッセイにおいて標的として作用し得るアミノ酸配列を提供する。
【０２３０】
好ましくは、標的は、Ｔ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役である。
【０２３１】
好ましくは、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャンネルは、単離され、そして／または精製される。
【０２３２】
Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルは、実質的に単離された形態であり得る。Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルは、チャネルの意図される目的に干渉しないキャリアまたは希釈薬と混合され得、そして実質的に単離されたものとみなされることが理解される。Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルはまた、実質的に精製された形態であり得、この場合、精製された形態は、概して、調製物中にＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルを含み、９０％を超える（例えば、９５％、９８％または９９％）調製物がチャネルである。
【０２３３】
（アミノ酸配列の改変体／ホモログ／誘導体）
Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルに関する公知のアミノ酸配列を使用することが可能である。しかし、本発明はまた、任意の供給源から得られた相同性配列および例えば、合成ペプチド、ならびにそれらの改変体または誘導体の使用を含む。
【０２３４】
したがって、本発明は、本明細書中で示されるアミノ酸配列の改変体、ホモログまたは誘導体、およびそれらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の改変体、ホモログまたは誘導体を含む。
【０２３５】
本発明の状況において、相同配列は、少なくとも例えば、公知のアミノ酸配列にわたってアミノ酸レベルで少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５または９８％同一であるアミノ酸配列を含むとみなされる。特に、相同性は、代表的には、非必須の近接配列ではなくチャネル活性について必須であることが公知である配列の領域に関して熟慮されるべきである。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ残基）に関して熟慮され得るが、本発明の情況において、配列同一性に関する相同性を表すことが好ましい。
【０２３６】
相同性比較は、視覚によって、またより通常には、容易に入手できる配列比較プログラムの補助をもって実行され得る。これらの市販で入手可能なコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間の％相同性を計数し得る。
【０２３７】
％相同性は、連続配列にわたって計数され得る（すなわち、１つの配列が他の配列とともに整列され、そして１つの配列における各アミノ酸が他の配列における対応するアミノ酸と一度に１残基、直接比較される）。これは、「非ギャップ化」整列と呼ばれる。代表的に、そのような非ギャップ化整列は、比較的短い数の残基にわたってのみ実行される。
【０２３８】
これは、非常に簡素および首尾一貫した方法であるが、例えば、他の点で同一な配列対において、１挿入または欠失が引き続くアミノ酸残基を整列させず、したがって、全体の整列が実行される場合に、潜在的に％相同性の大きな減少を生じることを考慮しない。結果として、ほとんどの配列比較方法は、全相同性スコアに過度にペナルティーを与えることなく可能な挿入および欠失を考慮する最適な整列を産生するように設計される。これは、局所的相同性を最大限にすることを試すために、配列整列内に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０２３９】
しかし、これらのより複雑な方法は、各ギャップ（整列内で生じ、そのため、同じ数の同一アミノ酸については、可能な限り少ないギャップ（２つの比較される配列の間でより高度な関連性を反映する）を有する配列整列が、多くのギャップを有するものより高いスコアを達成する）に対して「ギャップペナルティー」を与える。ギャップの存在に対する相対的に高いコストおよびギャップにおける各々の次の残基に対してより小さいペナルティーを課す「アファインギャップコスト」が、代表的に使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろん、より小さいギャップを有する最適化された整列を生じる。ほとんどの整列プログラムは、ギャップペナルティーが改変されることを可能にする。しかし、配列比較のためのそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（以下を参照のこと）を使用する場合、アミノ酸配列に関するデフォルトギャップペナルティーは、１個のギャップについて−１２であり、そして各伸張について−４である。
【０２４０】
それゆえ、最大％相同性の計算は、第一に最適化整列の生成を必要とし、これは、ギャップペナルティーを考慮する。そのような整列を実行するための適切なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら  １９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）。配列比較を実行し得る以外のソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら  １９９９  同書−第１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら  １９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３〜４１０）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスートが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方は、オフラインおよびオンライン検索について利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら  １９９９  同書，７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。しかし、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新規のツールもまた、タンパク質配列およびヌクレオチド配列を比較するために利用できる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７〜５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７〜８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
【０２４１】
最終的な％ホモログは、同一性に関して測定され得るが、整列プロセス自体は、代表的にあるかなしの対合比較に基づかない。代わりに、化学的類似性または進化学的距離（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）に基づいて、対合した（ｐａｉｒｗｉｓｅ）比較についてスコアを与えるスケールされた（ｓｃａｌｅｄ）類似性スコアマトリクスが、一般的に使用される。そのようなマトリクスの例としては、一般的にＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（ＢＬＡＳＴスートのプログラムに関するデフォルトマトリクス）が使用される。供給される場合、ＧＣＧ  Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般的に公開デフォルト値またはカスタムシンボル（ｃｕｓｔｏｍ  ｓｙｍｂｏｌ）比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細に関しては、ユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージについては公開デフォルト値、または他のソフトウェアの場合において、デフォルトマトリクス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）を使用することが好ましい。
【０２４２】
いったんソフトウェアが最適な整列を生じたならば、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、代表的に、配列比較の一部としてこれを行い、そして数値結果を生成する。
【０２４３】
本発明のアミノ酸配列に関する用語「改変体」または「誘導体」としては、Ｔ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性を有し、好ましくは、少なくとも公知のアミノ酸配列と同じＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性を有する得られるアミノ酸配列を提供する配列からの、またはそれに対する１つ（以上）のアミノ酸の任意の置換、バリエーション、改変、交換、欠失または付加が挙げられる。
【０２４４】
例として、公知の配列は、本発明における使用のために改変され得る。代表的に、配列の結合特異性を維持する改変が行われる。アミノ酸置換は、例えば、１個、２個または３個〜１０個または２０個の置換（改変配列が必要とされるチャネル活性を維持する場合）から行われ得る。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を含み得る。
【０２４５】
本発明のチャネルはまた、サイレントな変化を生じ、そして機能的に等価なチャネルを生じるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。意図的なアミノ酸置換は、チャネルの活性が維持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性性質における類似性を基礎として行われ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の疎水性度を有する非荷電極性ヘッド基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
【０２４６】
保存的置換は、例えば、以下の表に従って行われ得る。第２列における同じブロック中の、および好ましくは第３列における同じ行中のアミノ酸は、互いに置換され得る。
【０２４７】
【数１】
2005518346.tif 000002
好ましくは、単離されたチャネルおよび／または精製されたチャネルならびに／あるいは非ネイティブチャネルは、組み換え技術の使用によって調製される。
【０２４８】
（ヌクレオチド配列）
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、用語「ポリヌクレオチド」と同義である。
【０２４９】
ヌクレオチド配列は、ゲノムまたは合成あるいは組み換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ヌクレオチド配列は、センス鎖またはアンチセンス鎖あるいはそれらの組み合わせを示していようといなかろうと、二本鎖または一本鎖であり得る。
【０２５０】
いくつかの適用に関して、好ましくは、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡである。
【０２５１】
いくつかの適用に関して、好ましくは、ヌクレオチド配列は、組み換えＤＮＡ技術（例えば、組み換えＤＮＡ）の使用によって調製される。
【０２５２】
いくつかの適用に関して、好ましくは、ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡである。
【０２５３】
いくつかの適用に関して、好ましくは、ヌクレオチド配列は、天然に生じる形態と同じであり得る。
【０２５４】
１つの局面において、本発明は、Ｔ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの共役を調節し得る１つ以上の薬剤および／またはそれらの誘導体の同定に関するアッセイ（例えば、酵母ツーハイブリッドアッセイ）において標的と作用し得る物質をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【０２５５】
本発明の１つの局面において、ヌクレオチド配列は、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルをコードする。
【０２５６】
多数の異なるヌクレオチド配列が、遺伝暗号の縮重の結果、本発明と同じチャネルをコードし得ることが当業者によって理解される。さらに、当業者は、慣用的な技術を使用して、本発明のチャネルが発現されるべき任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度（ｕｓａｇｅ）を反映するために、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるチャネルに影響を及ぼさないヌクレオチド置換を実行し得ることが理解されるべきである。公知のヌクレオチド配列に関する用語「改変体」、「ホモログ」または「誘導体」としては、Ｔ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性を有し、好ましくは、公知の配列と少なくとも同じチャネル活性を有するチャネルをコードする、得られるヌクレオチド配列を提供する、配列からの、または配列に対する１つ（以上）の核酸の任意の置換、バリエーション、改変、交換、欠失または付加が挙げられる。
【０２５７】
上で示されるように、配列相同性に関連して、公知の配列に対して、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。ヌクレオチド相同性比較は、上で記載されるように実行され得る。好ましい配列比較プログラムは、上で記載されるＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリングマトリクスは、それぞれ同一なヌクレオチドについては１０、そしてそれぞれ不一致なものについては−９という一致値（ｍａｔｃｈ  ｖａｌｕｅ）を有する。それぞれのヌクレオチドについて、デフォルトギャップ創造ペナルティーは−５０であり、そしてデフォルトギャップ伸長ペナルティーは−３である。
【０２５８】
本発明はまた、本明細書中で示される配列、またはそれらの任意の改変体、フラグメントまたは誘導体に対して、あるいは上記のいずれかの相補体に対して選択的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、好ましくは、長さが少なくとも１５個のヌクレオチドであり、より好ましくは、長さが少なくとも２０個、３０個、４０個または５０個のヌクレオチドである。
【０２５９】
（ハイブリダイゼーション）
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と連結するプロセス」およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において実行されるような増幅プロセスを包含するものとする。
【０２６０】
本明細書中で示されるヌクレオチド配列に対して、またはその相補体に対して、選択的にハイブリダイズし得る本発明のヌクレオチド配列は、概して、本明細書中で示される対応する相補ヌクレオチド配列と、少なくとも２０個、好ましくは、少なくとも２５個または３０個、例えば、少なくとも４０個、６０個または１００個以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８５または９５％そしてより好ましくは、少なくとも９５％または９８％相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、本発明の配列表のうちの配列番号２で示されるヌクレオチド配列と相同な（好ましくは、少なくとも８０または９０％およびより好ましくは、少なくとも９５％、本発明の配列表のうちの配列番号２で示されるヌクレオチド配列と相同である）領域を含む。
【０２６１】
用語「選択的にハイブリダイズ可能な」は、プローブとして使用される場合、本発明の標的ヌクレオチド配列がプローブとバックグラウンドより有意に高いレベルでハイブリダイズすることが見出される条件下でヌクレオチド配列が使用されることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーにおいて存在する他のヌクレオチド配列に起因して生じ得る。この場合、バックグラウンドは、プローブと、ライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生成される、標的ＤＮＡを用いて観察される特異的相互作用より１０倍小さい、好ましくは１００倍小さい強度であるシグナルのレベルを意味する。相互作用の強度は、例えば、プローブを（例えば、３２Ｐで）放射標識することによって測定され得る。
【０２６２】
ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）（例えば、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）において教示される）に基づいており、そして以下で説明されるような規定された「ストリンジェンシー」を与える。
【０２６３】
最大ストリンジェンシーは、代表的に約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い）で生じる；高ストリンジェンシーは、Ｔｍより約５℃〜１０℃下で生じる；中間ストリンジェンシーは、Ｔｍより約１０℃〜２０℃下で生じる；そして低ストリンジェンシーは、Ｔｍより約２０℃〜２５℃下で生じる。当業者によって理解されるように、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定するか、または検出するために使用され得る一方で、中間（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得る。
【０２６４】
好ましい局面において、本発明は、ストリンジェント条件下（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸  Ｎａ３  （ｐＨ７．０））で本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する。本発明のヌクレオチド配列が二重鎖である場合、二重鎖の両鎖（個体または組み合わせのいずれか）は、本発明によって含まれる。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合、そのヌクレオチド配列の相補配列もまた、本発明の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【０２６５】
本発明の配列と１００％相同ではないが、本発明の範囲内に含まれるヌクレオチド配列は、多数の方法で得られ得る。本明細書中で記載される配列の他の改変体は、例えば、一定範囲の供給源から作られたＤＮＡライブラリーをプローブすることによって得られ得る。さらに、他のウイルスホモログ／細菌ホモログ、または細胞性ホモログ（特に、哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）において見出される細胞ホモログ）が得られ得、そしてそのようなホモログおよびそれらのフラグメントは、概して、本明細書中の配列表中で示される配列に対して選択的にハイブリダイズし得る。そのような配列は、他の動物種から作られるｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーをプローブし、そして中間ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーの条件下で、本発明の配列表のうちの配列番号２で示されるヌクレオチド配列の全体または部分を含むプローブでこのようなライブラリーをプローブすることによって得られ得る。類似の斟酌が、本発明のアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子改変体の獲得のために適用される。
【０２６６】
改変体および株／種ホモログはまた、本発明の配列内の保存的アミノ酸配列をコードする改変体およびホモログ内の配列を標的にするように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを使用することで得られ得る。保存的配列は、例えば、いくつかの改変体／ホモログ由来のアミノ酸配列を整列することによって予測され得る。配列整列は、当該分野で公知のコンピューターソフトウェアを使用することで実行され得る。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵＰプログラムが、幅広く使用される。縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含み、そして公知の配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される条件より低いストリンジェンシー条件で使用される。
【０２６７】
あるいは、そのようなヌクレオチド配列は、特徴付けられた配列（例えば、本発明の配列表のうちの配列番号２で示されるヌクレオチド配列）の部位特異的変異誘発によって得られ得る。これは、例えば、ヌクレオチド配列が発現されるべき特定の宿主細胞についてコドン優先度を最適にするために配列に対してサイレントコドン変化が必要とされる場合、有用であり得る。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するか、あるいはヌクレオチド配列によってコードされるＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルの活性を変化させるために所望され得る。
【０２６８】
本発明のヌクレオチド配列は、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー）、プローブ（例えば、放射性標識または非放射性標識を使用する従来の手段による顕示性標識で標識される）を産生するために使用され得るか、またはヌクレオチド配列は、ベクターにクローン化され得る。そのようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、長さが少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、例えば少なくとも２５個、３０個または４０個ヌクレオチドであり、そしてまた、本明細書中で使用されるような本発明の用語ヌクレオチド配列に含まれる。
【０２６９】
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブのようなヌクレオチド配列は、組み換え的、合成的に、または当業者が利用できる任意の手段によって産生され得る。それらはまた、標準的な技術によってクローン化され得る。
【０２７０】
一般的に、プライマーは、合成手段によって産生され、この合成手段は、所望される核酸配列の段階的な製造（１回に１ヌクレオチドずつ）を含む。自動化技術を使用してこれに達成する技術は、当該分野において容易に利用される。
【０２７１】
より長いヌクレオチド配列は、概して、組み換え手段を使用して（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して）産生される。これは、クローン化することが所望される標的配列の領域に隣接する１対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、これらのプライマーを、動物細胞またはヒト細胞から得られるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、所望される領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行し、増幅フラグメントを（例えば、アガロースゲルによって反応混合物を精製することによって）単離し、そして増幅ＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、適切な制限酵素認識部位を含むように設計され得、そのため、増幅ＤＮＡは適切クローニングベクターにクローン化され得る。
【０２７２】
遺伝暗号の固有の縮重に起因して、実質的に同じアミノ酸配列または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列は、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルをクローン化し、そして発現するために使用され得る。当業者によって理解されるように、特定の発現システムに関して、それは、Ｔ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル（自然では生じないコドンを保持するヌクレオチド配列をコードする）を産生するために有利であり得る。特定の原核生物宿主または真核生物宿主によって好まれるコドン（Ｍｕｒｒａｙ  Ｅら（１９８９）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：４７７〜５０８）は、例えば、チャネル発現の速度を上昇させるために、または所望される特性（例えば、天然に生じる配列から産生される転写物より長い半減期）を有する組み換えＲＮＡ転写物を産生するために選択され得る。
【０２７３】
（ベクター）
本発明の１つの実施形態において、本発明の薬剤あるいはＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルは、個体に対して直接投与され得る。
【０２７４】
本発明の別の実施形態において、本発明の薬剤あるいはＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネルをコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、個体に対して投与される。
【０２７５】
好ましくは、組み換えチャネルは、遺伝的ベクターを使用して標的部位に対して調製されるか、そして／または送達される。
【０２７６】
当該分野において周知であるように、ベクターは、ある環境から他の環境への実体の移入を認容するか、または促進する手段である。本発明に従って、そして例に従えば、本発明のヌクレオチド配列を含み、および／または本発明のヌクレオチド配列によってコードされる本発明のタンパク質を発現するベクターを複製する目的で、組み換えＤＮＡ技術において使用されるいくつかのベクターは、実体（例えば、ＤＮＡセグメント（例えば、異種ＤＮＡセグメント、例えば、異種ｃＤＮＡセグメント））が宿主および／または標的細胞に移入されることを認容する。組み換えＤＮＡ技術で使用されるベクターの例としては、プラスミド、染色体、人工染色体またはウイルスが挙げられるが、これに限定されない。
【０２７７】
用語「ベクター」は、発現ベクターおよび／または形質転換ベクターを含む。
【０２７８】
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロ／エクスビボで発現し得る構築物を意味する。
【０２７９】
用語「形質転換ベクター」は、１つの種から別の種へ移入され得る構築物を意味する。
【０２８０】
（「裸のＤＮＡ」）
神経変性障害（例えば、パーキンソン病）の処置において使用するための本発明の薬剤または本発明のチャネルをコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、「裸の核酸構築物」として直接投与され得、さらに好ましくは、宿主細胞ゲノムと相同な隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。
【０２８１】
本明細書中で使用される場合、用語「裸のＤＮＡ」とは、本発明の薬剤または本発明のチャネルをコードするヌクレオチド配列を、その産生を制御するための短いプロモーター領域とともに含むプラスミドをいう。プラスミドが任意の送達ビヒクル中で運ばれないことに起因して、それは、「裸の」ＤＮＡと呼ばれる。そのようなＤＮＡプラスミドが宿主細胞（例えば、真核生物細胞）に入る場合、それがコードするタンパク質（例えば、本発明の薬剤あるいはＴ型チャネルおよび／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル）は、細胞内で転写され、そして翻訳される。
【０２８２】
（非ウイルス性送達）
あるいは、本発明のヌクレオチド配列または本発明の薬剤を含むベクターは、当該分野において公知の種々の非ウイルス性技術（例えば、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーションおよびバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換）を使用して適切な宿主細胞内に導入され得る。
【０２８３】
本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション」とは、遺伝子を標的哺乳動物細胞に送達するために非ウイルス性ベクターを使用するプロセスをいう。
【０２８４】
代表的に、トランスフェクション方法としては、エレクトロポレーション、ＤＮＡバイオリスティック、脂質媒介性トランスフェクション、緻密化ＤＮＡ媒介性トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性薬剤媒介性、カチオン表面両親媒性化合物（ＣＦＡ）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６  １４；５５６）、多価カチオン（例えば、スペルミン、カチオン脂質またはポリリジン）、１,２，−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）−コレステロール複合体（ＷｏｌｆｆおよびＴｒｕｂｅｔｓｋｏｙ  １９９８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４２１）およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２８５】
哺乳動物細胞による裸の核酸構築物の取り込みは、いくつかの公知のトランスフェクション技術（例えば、トランスフェクション薬剤の使用を含むもの）によって増強される。これらの薬剤の例としては、カチオン性薬剤（例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクタント（例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍＴＭおよびｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍＴＭ）が挙げられる。代表的に、核酸構築物は、組成物を産生するためにトランスフェクション薬剤とともに混合される。
【０２８６】
（ウイルスベクター）
あるいは、本発明の薬剤または本発明のヌクレオチド配列を含むベクターは、当該分野において公知の種々のウイルス性技術（例えば、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびアデノウイルスのような組み換えウイルスベクターの感染）を使用して適切な宿主細胞内に導入され得る。
【０２８７】
好ましくは、ベクターは、組み換えウイルスベクターである。適切な組み換えウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ポックスウイルスベクターまたはパルボウイルスベクターが挙げられるが、これに限定されない（Ｋｅｓｔｌｅｒら  １９９９  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０（１０）：１６１９〜３２を参照のこと）。ウイルスベクターの場合、チャネルをコードするヌクレオチド配列の送達は、標的細胞のウイルス感染によって媒介される。
【０２８８】
（標的化ベクター）
用語「標的化ベクター」とは、細胞に感染／トランスフェクト／形質導入するか、または宿主細胞および／または標的細胞において発現される能力が、宿主生物内の特定の細胞型（通常は共通または類似の表現型を有する細胞）型に限定されるベクターをいう。
【０２８９】
（複製ベクター）
本発明の薬剤または本発明のチャネルをコードするヌクレオチド配列は、組み換え複製可能ベクターに取り込まれ得る。ベクターは、適合性宿主細胞においてヌクレオチド配列を複製するために使用され得る。従って、本発明の１つの実施形態において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を複製可能なベクターに導入し、このベクターを適合性宿主細胞に導入し、そしてこのベクターの複製を引き起こす条件下でこの宿主細胞を増殖させることによって本発明のチャネルを作製する方法を提供する。このベクターは、宿主細胞から回収され得る。
【０２９０】
（発現ベクター）
好ましくは、本発明の薬剤またはベクターに挿入される本発明のヌクレオチド配列は、本発明のチャネルのコード配列のようなコード配列の宿主細胞による発現のために提供され得るコントロール配列と実施可能に結合される（すなわち、ベクターが発現ベクターである）。本発明の薬剤または宿主組み換え細胞によって産生されるチャネルは、分泌され得るか、あるいは配列および／または使用されるベクターに依存して細胞内に含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明の薬剤またはチャネルコード配列を含む発現ベクターは、特定の原核生物細胞膜または真核生物細胞膜を通る本発明の薬剤またはチャネルコード配列の分泌を指示するシグナル配列とともに設計され得る。
【０２９１】
（インビトロ発現）
本発明のベクターは、本発明の薬剤または本発明のチャネルの発現を提供するために、以下に記載されるような適切な宿主細胞および／または標的細胞内へ形質転換され得るか、またはトランスフェクトされ得る。このプロセスは、ベクターによる本発明の薬剤またはチャネルをコードするコード配列の発現を提供する条件下で、発現ベクターが形質転換された宿主細胞および／または標的細胞の培養および発現した本発明の薬剤またはチャネルの必要に応じた回収を包含し得る。ベクターは、例えば、複製開始点、必要に応じて前記ポリヌクレオチドの発現のためにプロモーターおよび必要に応じてプロモーターのレギュレーターを提供されるプラスミドベクターまたはウイルスベクターであり得る。ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、細菌性プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、または哺乳動物ベクターについてはネオマイシン耐性遺伝子）を含み得る。本発明の薬剤または本発明のチャネルの発現は、構成的であり得る（例えば、それらが連続して産生される）か、または誘導的（発現を開始するための刺激を必要とする）である。誘導的な発現に関しては、必要とされる場合、本発明の薬剤またはチャネルの産生は、例えば、培地に誘発因子物質（例えば、デキサメタゾンまたはＩＰＴＧ）の添加によって開始され得る。
【０２９２】
（融合タンパク質）
本発明のチャネルまたは薬剤は、本発明の薬剤またはチャネルの抽出および精製ならびに／または個体への送達を助成し、そして／またはチャネル活性を調節し得る薬剤についてのスクリーニングの開発を促進するための融合タンパク質として発現され得る。融合タンパク質のパートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質配列の分離を認容するために、融合タンパク質パートナーと関連のタンパク質配列の間にタンパク質分解性切断部位を含むこともまた都合が良い。好ましくは、融合タンパク質は、標的の活性を妨げない。
【０２９３】
融合タンパク質は、本発明の物質と融合する抗原または抗原決定因子を含み得る。この実施形態において、融合タンパク質は、免疫機構の全身性刺激を提供する意味でアジュバントとして作用し得る物質を含む天然には生じない融合タンパク質であり得る。抗原または抗原決定因子は、この物質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合され得る。
【０２９４】
本発明の別の実施形態において、アミノ酸配列は、融合タンパク質をコードするための異種配列に対して連結され得る。例えば、この物質の活性に影響を及ぼし得る薬剤についてのペプチドライブラリーのスクリーニングのために、市販の抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードすることは有用であり得る。
【０２９５】
（宿主細胞）
幅広い種々の宿主細胞が、薬剤（例えば、本発明の薬剤または本発明のチャネル）をコードするヌクレオチド配列の発現のために使用され得る。これらの細胞は、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方であり得る。適切な宿主細胞としては、Ｅ．Ｃｏｌｉのような細菌、酵母、糸状真菌、昆虫細胞、哺乳動物（代表的には、不死化（例えば、マウス、ＣＨＯ，ヒトおよびサル）細胞株ならびにそれらの誘導体）が挙げられる。
【０２９６】
本発明の範囲内にある適切な発現宿主の例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種（例えば、ＥＰ−Ａ−０１８４４３８およびＥＰ−Ａ−０２８４６０３に記載されるもの）およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種のような真菌；Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、ＥＰ−Ａ−０１３４０４８およびＥＰ−Ａ−０２５３４５５に記載されるもの）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種のような細菌；ならびに、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種（例えば、ＥＰ−Ａ−００９６４３０およびＥＰ−Ａ−０３０１６７０に記載されるもの）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種のような酵母である。例に従って、代表的な発現宿主は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ｔｕｂｉｇｅｎｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｖｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択され得る。
【０２９７】
適切の宿主細胞の使用（例えば、酵母、真菌および植物宿主細胞）は、本発明の組み換え発現産物に対して最良の生物活性を与えるために必要とされ得る場合、翻訳後の改変（例えば、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ）、糖化、先端切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、脂質化（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）およびチロシンリン酸化、セリンリン酸化またはトレオニンリン酸化）を提供し得る。
【０２９８】
好ましい宿主細胞は、適切な成熟ポリペプチドを産生するために発現産物をプロセスし得る。プロセッシングの例としては、糖化、ユビキチン化、ジスルフィド結合形成および一般的な翻訳後の改変が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９９】
（スクリーニング）
本発明は、スクリーニング方法の範囲を包含する。
【０３００】
スクリーニングは、インビトロで実行され得る。これは、例えば、ニューロンまたはそれらの部分を使用することによって実行される。例えば、カルシウムまたはカリウムイオンチャネルあるいはそのようなチャネルを含む膜が使用され得る。カルシウムおよびカリウムチャネルは、好ましくは、ドパミン作動性ニューロンのチャネルであり、より好ましくは、黒質ドパミン作動性ニューロンのチャネルである。望ましくは、そのカルシウムおよびカリウムチャネルは、Ｔ型カルシウムチャネルおよびＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルである。
【０３０１】
あるいは、動物モデルまたはコンピューターモデルが使用され得る。本明細書中で記載されるカルシウムチャネルまたはカリウムチャネルを既に保持する非ヒト動物（例えば、霊長類）が使用され得る。あるいは、カルシウムイオンチャネルまたはカリウムイオンチャネルを発現し得るトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）が作製され得る。トランスジェニック動物を産生する技術は周知であり、そして例えば、ＵＳ−Ａ−４８７０００９およびＵＳ−Ａ−４８７３１９１において記載される。例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸は、受精した卵母細胞の前核中に微量注入され得る。次いで、この卵母細胞は、偽妊娠雌性里親動物において発生することが認容され得る。卵母細胞の発生から生じた動物は、それがポリペプチドを発現するか否かを決定するために試験され得る（例えば、抗体を用いて）。あるいは、それが導入遺伝子を有するか否かを決定するために、プローブで試験され得る。トランスジェニック動物は、創始動物として使用され得、そしてこれは、さらなるトランスジェニック動物を産生するために飼育され得る。２頭のトランスジェニック動物が交配され得る。例えば、いくつかのケースにおいて、トランスジェニック動物は、所定の遺伝子については一倍体であり、そして交配を介して２倍体の子孫の提供を試すことが所望され得る。トランスジェニック動物は、例えば、ＷＯ−Ａ−９７／０７６６８およびＷＯ−Ａ−９７／０７６９９に示される手順を使用することによって、クローン化され得る（また、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０〜８１３（１９９７）を参照のこと）。従って、休止細胞が提供され得、そして核が除去された卵母細胞と組み合わせられ得る。これは、電気的放電を使用して達成され得る。合成細胞は、培養にて発生することが認容され得、そして偽妊娠雌性に転移され得る。
【０３０２】
ニューロンの発射モードにおいて変化し得た場合、動物モデルのイオンチャネルを通るカルシウム排出および／またはカリウム排出がアッセイされ得る。
【０３０３】
コンピューターモデルもまた使用され得る。それらは、上述されるようなチャネルのモデル、特に前記チャネルの開閉に対する薬剤の効果および／または発射モードにおける変化を予測するモデルを含む。コンピューターモデルはまた、結合剤のための結合部位を同定するために使用され得る。コンピューター生成モデルは、コンピューター生成イメージを含む。モデルは２次元または３次元であり得るが、これは必須ではない。それは、大多数の対等物（例えば、それは、Ｘ線結晶学的イメージのような結晶学的イメージであり得る）を含み得る。それは、回転可能であるように、またはそうでなければ、異なる面から撮影され得るために移動可能であるように整列され得る。
【０３０４】
標的のチャネル活性を調節し得る試験薬剤は、当該分野で周知のアッセイ方法においてスクリーニングされ得る。スクリーニングは、例えばインビトロで（細胞培養中で）、および／またはインビボで実行され得る。生物学的スクリーニングアッセイは、チャネル活性をベースにした応答モデル（結合アッセイ（薬物がどれほどチャネル活性を調節するかを測定する））、ならびに細菌細胞株、酵母細胞株、および動物細胞株をベースにされ得るが、これに限定されない。アッセイは、高容量高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）（多数の化合物が、活性を調節する所望のチャネルを有する化合物を同定するために試験され得る（例えば、ＷＯ  ８４／０３５６４を参照のこと）ために自動化され得る。チャネル活性を調節し得る（例えば、チャネルの開口時間率（ｏｐｅｎｉｎｇ  ｔｉｍｅ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）を調節することによって）薬剤がいったん同定された場合、チャネル活性改変能力を改善するために、化合物を選択するか、および／または改変するか、ならびに／あるいは現存化合物を改変するように、さらなるステップが実行され得る。
【０３０５】
特定のスクリーニングは、ドパミン作動性ニューロンの作用モードに基づかれ得る。
【０３０６】
例としては、本発明の１つの方法は、薬物を提供する工程およびそれがドパミン作動性ニューロンの発射モードにおける変化を引き起こし得るか否か、または他で生じた変化を防止し得るか否かを決定する工程を包含する。たとえば、薬物は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得るか、またはそれがバースティングモードでなくなることを防止し得る。
【０３０７】
さらなる例に従って、さらなる方法としては、薬剤を提供する工程およびそれがカルシウムチャネルを通るカルシウム排出を縮小し得るか否か、またはカリウムチャネルを通るカリウム排出を縮小し得るか否かを決定する工程を包含する。これは、チャネルブロッカーを同定するために使用され得る。
【０３０８】
好ましくは、チャネルは、ドパミン作動性ニューロンのチャネルであり、より好ましくは黒質ドパミン作動性ニューロンのチャネルである。望ましくは、チャネルは、Ｔ型カルシウムチャネルまたはＳＫ（好ましくはＳＫ３）カリウムチャネルである。
【０３０９】
上で示されるように、スクリーニングは、個々のニューロンまたはそれらの部分を使用することによって実行され得る。例えば、吸引法は、マイクロピペッターを膜の一部に対して接着させるために使用され得る。次いで、膜中のイオンチャネルを通る電流が記録され得る。望ましくは、膜のパッチがマイクロピペッターとともに除去され得、そしてスクリーニングのために使用され得る（例えば、カルシウム排出またはカリウム排出を測定するために）。この技術の有利な点は、膜側のイオン組成物が容易に調節し得ることである。それゆえ、単一のイオンチャネルのみ、または少数のイオンチャネルのみを含む膜パッチは、この方法で得られ、そして使用され得る。
【０３１０】
さらなる例に従って、スクリーニングは、結合研究に基づけられ得る。ここで、カルシウムまたはカリウムチャネル、あるいはそれらと機能的に関連する部分（例えば、チャネルの開閉を引き起こし得る部分）に対する結合剤は、チャネルアクティベーターまたはブロッカーとして有用であり得る。それゆえ、結合研究は、上述されるようなさらなるスクリーニングに供され得る薬剤を同定する工程において有用である。そのような研究は、結合剤の提供工程およびそれがイオンチャネルに対して、またはそのチャネルと機能的に関連する部分に対して結合するか否かを決定する工程を包含する。望ましくは、結合剤は、同定を助成するために標識され得る。
【０３１１】
本発明の種々のスクリーニング方法に加えて、そのようなスクリーニング方法（そのような様式によらず）によって同定された、または同定可能な薬剤は、本発明の範囲内である。これ自体は、治療薬として有用であり得るか、または治療薬の供給に通じる薬品開発プログラムにおいて使用され得る。
【０３１２】
薬品開発プログラム自体およびそのような薬剤を含む薬学的組成物がそうであるように、そのような治療薬の医療での使用は本発明の範囲内である。薬品開発プログラムは、例えば、本発明のスクリーニング方法によって同定されたまたは同定され得る薬剤を取り込む工程、必要に応じてそれを改変する工程（例えば、その構造を改変する工程、そして／または前記部分を含む新規の組成物を提供する工程）およびさらなる研究（例えば、毒性研究および／または活性、構造または機能に関する研究）を実行する工程を包含する。試行は、非ヒト動物に対して実行され得、そして最終的にヒトに対して実行され得る。そのような試行は、概して、異なる用量レベルの効果を決定する工程を含む。薬品開発プログラムは、スクリーニングによって同定された部分を分析するために（例えば、構造および／または機能を予測するために可能なアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために、類似の構造または機能を有し得る他の部分を検索するためになど）コンピューターを利用し得る。そのような分析を実行するために調節されたコンピューターは、そのような分析をベースにして開発された薬剤およびそれらの使用がそうであるように、本発明の範囲内である。
【０３１３】
示されるように、任意の１つ以上の適切な標的（例えば、アミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列）は、任意の種々の薬剤スクリーニング技術において、Ｔ型チャネル活性および／またはＳＫ（好ましくはＳＫ３）チャネル活性ならびに／あるいはそれらの
両方を調節し得る薬剤を同定するために使用され得る。そのような試験において利用される標的は、溶液中で遊離状態であるか、固形支持体に対して添付されるか、細胞表面上で帯びられるか、または細胞内に位置付けられ得る。標的活性の消失または試験される標的と薬剤と間の結合複合体の形成が、測定され得る。
【０３１４】
薬剤スクリーニングのための技術は、Ｇｅｙｓｅｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ８４／０３５６４（１９８４年９月１３日に公開）に記載される方法に基づけられ得る。要約すると、多数の異なる小ペプチド試験化合物が固形物質（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の面）上で合成される。ペプチド試験化合物は、適切な標的またはそれらのフラグメントと反応され、そして洗浄される。次いで、結合した実体が検出される（例えば、当該分野で周知の適切な適合方法によって）。精製された標的はまた、薬剤スクリーニング技術における使用のために、プレート上に直接コートされ得る。あるいは、非中和抗体が、ペプチドを捕捉し、そしてそれを固形支持体に固定化するために使用され得る。
【０３１５】
本発明はまた、アンタゴニスト剤スクリーニングアッセイ（標的と特異的に結合し得る中和抗体が標的と結合するための試験化合物と競合する）の使用を企図する。
【０３１６】
スクリーニングのための別の技術は、物質に対して適切な結合親和性を有する薬剤の高処理能力スクリーニング（ＨＴＳ）を提供し、そしてＷＯ  ８４／０３５６４において詳細が記載される方法に基づけられる。
【０３１７】
本発明のアッセイ方法は、試験化合物の小スケールスクリーニングおよび大スケールスクリーニングの両方について、ならびに定量アッセイにおいて適切であることが予測される。
【０３１８】
従って、本発明は、個体の黒質におけるチャネル活性を選択的に調節する薬剤を同定する方法を提供し、この方法は、個々の黒質由来の（またはそこから得られ得る）適切な標的と接触する工程、次いでチャネル活性および／またはドパミン放出範囲を測定する工程を包含する。
【０３１９】
本発明はまた、チャネル活性を調節する薬剤と同定する方法に関し、この方法は、適切な標的と薬剤を接触させる工程、次いで、チャネル発現の活性および／またはレベルを測定する工程を包含する。
【０３２０】
本発明はまた、チャネル活性を選択的に調節する薬剤を同定する方法に関し、この方法は、適切な標的と薬剤を接触させ、次いで、チャネル発現の活性および／またはレベルを測定する工程を包含する。
【０３２１】
（アッセイ方法）
診断組成物および／または方法ならびに／あるいはキットは、以下に挙げられる技術において使用され得るが、これらに限定されない；拮抗および非拮抗アッセイ、放射免疫測定法、生体発光および化学発光アッセイ、蛍光比色アッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡを含む酵素結合アッセイ、マイクロタイタープレート、尿または血液の迅速なモニタリングのための抗体コート細片またはディップスティック、免疫組織化学および免疫細胞化学。例に従って、免疫組織化学キットはまた、黒質におけるチャネル活性の位置付けのために使用され得る。この免疫組織化学キットは、研究および臨床目的の両方のために使用され得る光学顕微鏡および電子顕微鏡の両方を使用して、組織切片および培養細胞中のチャネルの位置を可能にする。そのような情報は、神経変性障害（例えば、パーキンソン病）の検出および／または予防ならびに／あるいは処置において診断目的およびおそらくは治療目的のために有用である。各キットについて、アッセイの範囲、感度、精度、信頼性、特異性および再現性が確立される。アッセイ内およびアッセイ間のバリエーションは、置換または活性の標準曲線上の２０％ポイント、５０％ポイントおよび８０％ポイントで確立される。
【０３２２】
（診断試験）
障害診断のための基礎を提供するために、標的由来の正常値および標準値が確立されるべきである。これは、正常な被験体（動物またはヒトのいずれか）から得られる体内流体または細胞抽出物と、例えば、当該分野において周知である複合体形成のために適切な条件下で標的に対する抗体を組み合わせることによって達成され得る。標準的な複合体形成の量は、それを陽性コントロールの連続希釈物（既知の抗体量が既知の精製タンパク質濃度と組み合わせられる）と比較することによって定量され得る。次いで、正常サンプルから得られた標準値は、潜在的に神経変性障害によって影響を及ぼされた被験体由来のサンプルから得られた値と比較され得る。標準値と被験体値の間の偏差は、疾患状態の存在を確立する。
【０３２３】
標的自体、またはそれらの任意の部分は、診断化合物および／または予防化合物ならびに／あるいは治療化合物のための基礎を提供し得る。診断目的のために、標的のポリヌクレオチド配列は、神経変性障害が含まれ得る状況、障害または疾患おける遺伝子発現を検出し、そして定量するために使用され得る。
【０３２４】
ポリヌクレオチド配列をコードする標的は、標的の発現から生じる神経変性障害の診断のために使用され得る。例えば、標的をコードするポリヌクレオチド配列は、標的発現における異常を検出するために、生検または剖検由来の組織あるいは生物学的流体のハイブリダイゼーションアッセイまたはＰＣＲアッセイにおいて使用され得る。そのような定性または定量方法の形態としては、サザン分析またはノーザン分析、ドットブロットあるいは他の膜ベースの技術；ＰＣＲ技術；ディップスティック、ピンまたはチップ技術；およびＥＬＩＳＡまたは他の多サンプル形式の技術が挙げられる。これらの技術の全ては、当該分野において周知であり、そして事実多くの市販のキットに基づいている。
【０３２５】
そのようなアッセイは、特定の治療処置レジメの効能をスクリーニングするために調整され得、そして動物実験、臨床試行、または個々の患者に対する処置のモニタリングにおいて使用され得る。障害の診断のための基礎を提供するために、標的の発現についての正常プロフィールまたは標準プロフィールが確立されるべきである。これは、正常な被験体（動物またはヒトのいずれか）から得られる体内流体または細胞抽出物と、ハイブリダイゼーションまたは増幅のために適切な条件下で標的またはそれらの部分を組み合わせることによって達成される。標準的なハイブリダイゼーションは、正常被験体について得られた値を、陽性コントロールの連続希釈物と比較する（既知の精製標的量が使用されるのと同じ実験において行われる）ことによって定量され得る。正常サンプルから得られた標準値は、潜在的に標的コード配列の発現と関係する障害または疾患によって影響を及ぼされる被験体由来のサンプルから得られた値と比較され得る。標準値と被験体値の間の偏差は、疾患状態の存在を確立する。疾患が確立される場合、既存の治療薬が投与され、そして処置プロフィールまたは処置値が生成され得る。最終的に、アッセイは、その値が正常型または標準型方向に進行するか、または戻るか否かをスクリーニングするための規則的な基礎に関して繰り返され得る。首尾よい処置プロフィールは、数日間または数ヶ月の期間にわたる処置の効能を示すために使用され得る。
【０３２６】
従って、一局面において、本発明は、抗標的抗体（例えば、神経変性障害状態における標的レベルを検出および定量するために、診断的に使用され得る）を産生するための、標的ポリペプチド、またはこれらの改変体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体の使用に関する。
【０３２７】
本発明は、精製された標的（ポジティブコントロールとして使用され得る）および抗標的抗体を含む、細胞および組織における標的の検出のための、診断アッセイおよびキットを、さらに提供する。このような抗体は、溶液ベース、膜ベース、または組織ベースの技術において、標的タンパク質の発現または欠失の発現またはこれらの改変体、ホモログ、フラグメントもしくは誘導体に関連した任意の疾患状態または症状を検出するために使用され得る。
【０３２８】
これらの実体（ｅｎｔｉｔｅｓ）を含む診断の組成物および／またはキットは、適切な組織抽出物における適切なチャネル活性の、迅速で、確かで、感度が高く、かつ特異的な測定および位置決定に、使用され得る。
【０３２９】
従って、本明細書中で議論される医学的使用に加え、本発明は、診断において使用され得る。例えば、上で議論されるような結合剤は、健常な個体において存在しないが、本明細書中で記載する障害を有する個体において存在する、エピトープまたは他の構造物を、患者が有するか否かを決定するために、使用され得る。あるいはまた、結合剤は、この障害を有する個体において存在しないが、健常な個体において存在する、エピトープまたは他の構造物を同定するために、使用され得る。エピトープまたは他の構造物は、例えば、ＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）の一部もしくはＴ型チャネルの一部であり得るか、またはチャネルと作動的に関係する部分の一部であり得る（例えば、チャネルを開いたりまたは閉じたりさせる部分の一部であり得る）。
【０３３０】
核酸分子が、上で議論される障害の１つ以上を生じ得る遺伝的欠陥（例えば、欠陥遺伝子）を患者が有するか否かを決定するために試行されるハイブリダイゼーション研究において、使用され得る。好ましくは、遺伝的欠陥は、ＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）、Ｔ型チャネル、またはこれらと作動的に関係する部分（例えば、チャネルを開いたりまたは閉じたりさせる部分）の構造および機能に影響する。核酸は、プローブまたはプライマーとして提供され得る（例えば、診断キットにおいて）。核酸は、標識され得る。プローブまたはプライマーは、ＰＣＲベースの増幅に使用され得る。プローブまたはプライマーはまた、逆ＰＣＲにも使用され得る。ハイブリダイゼーション研究は、ストリンジェント条件下で行われ得る。好ましくは、この条件は、点変異を同定するために１ヌクレオチド変更を区別するのに充分にストリンジェントである。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］のｐｐ  １．１０１−１．１１０およびｐｐ  １１．４５−１１．６１において、詳細に議論される。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液の使用、および５×ＳＳＣを使用する５５℃で一晩のハイブリダイゼーションの試行を含む。しかし、多くの他の可能性が、存在する。例えば、これらうちの幾つかは、ＷＯ−Ａ−９８／４５４３５の表１に列挙される。ストリンジェンシーが次第に増加する洗浄が、ハイブリダイゼーションに続き得る。このように、最初の洗浄は低ストリンジェンシー条件下であり得るが、ハイブリダイゼーションが行われた条件のストリンジェンシーまでの、より高いストリンジェンシー洗浄が続き得る。
【０３３１】
（レポーター）
広範な種々のレポーターが、都合よく検出し得るシグナル（例えば、分光学により）を提供する好ましいレポーターを用いる本発明のアッセイ方法（ならびにスクリーニング）において、使用され得る。一例として、レポーター遺伝子は、吸光特性を変える反応を触媒する酵素をコードし得る。
【０３３２】
レポーター分子の例としては、β−ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、エキソグルカナーゼおよびグルコアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、放射性標識ヌクレオチドまたは蛍光タグ標識ヌクレオチドが、新生転写に組み込まれ得る（次いで、オリゴヌクレオチドプローブに結合された場合に同定され得る）。
【０３３３】
好ましい一実施形態において、レポーター分子の産生は、レポーター遺伝子産物（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の酵素活性により、測定される。
【０３３４】
標的の発現を検出および測定するための種々のプロトコール（例えば、このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを使用する）は、当該分野で公知である。例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。標的上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する、二部位モノクローナルベース免疫アッセイが好ましいが、競合結合アッセイは、使用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイは、特にＨａｍｐｔｏｎ  Ｒら（１９９０，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ  ＭＮ）およびＭａｄｄｏｘ  ＤＥら（１９８３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １５  ８：１２１  １）において記載される。
【０３３５】
広範な種々の標識および結合体化技術が、当業者に公知であり、そして、種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。標的ポリヌクレオチド配列の検出のための標識化ハイブリダイゼーションプローブまたは標識化ＰＣＲプローブを生成するための手段として、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識ヌクレオチドを使用したＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいはまた、標的コード配列またはその任意の一部は、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター内にクローン化され得る。このようなベクターは、当該分野に公知であり、市販で入手可能であり、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６など）および標識ヌクレオチドの添加により、インビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用され得る。
【０３３６】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）などの多くの企業が、これらの手順についての市販のキットおよびプロトコールを、提供する。適切なレポーター分子または標識として、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素剤が挙げられ、同様に、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許として、ＵＳ−Ａ−３８１７８３７；ＵＳ−Ａ−３８５０７５２；ＵＳ−Ａ−３９３９３５０；ＵＳ−Ａ−３９９６３４５；ＵＳ−Ａ−４２７７４３７；ＵＳ−Ａ−４２７５１４９およびＵＳ−Ａ−４３６６２４１が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンも、ＵＳ−Ａ−４８１６５６７において示されるように産生され得る。
【０３３７】
特定の分子の発現を定量するためのさらなる方法は、ヌクレオチドの放射性標識（Ｍｅｌｂｙ  ＰＣら（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５９：２３５−４４）またはビオチン化（Ｄｕｐｌａａ  Ｃら（１９９３）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２９−３６）、コントロール核酸の共増幅（ｃｏａｍｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、および実験結果が内挿される標準曲線を含む。多くのサンプルの定量は、目的のオリゴマーが種々の希釈において提示され、そして分光光度反応または熱量反応が迅速な定量を与える、ＥＬＩＳＡ形式におけるアッセイの実行により、迅速化され得る。
【０３３８】
マーカー遺伝子発現の存在／不在は、目的の遺伝子もまた存在することを示唆するが、その存在および発現は、確認されるべきである。例えば、ヌクレオチド配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合、これを有する組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって、同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下で、標的コード配列と縦列に置かれ得る。誘導または選択への反応におけるマーカー遺伝子の発現は、通常、同様に標的の発現を示す。
【０３３９】
あるいは、標的へのコード配列を含み、標的コード領域を発現する宿主細胞が、当業者に公知の種々の手順によって、同定され得る。これらの手順として、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイ技術または免疫アッセイ技術（膜ベース、溶液ベース、またはチップベースの技術を含む）が、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のために挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３４０】
（動物モデル）
神経変性障害（パーキンソン病など）を処置するための療法または治療薬剤を調査するためおよび／または設計するために、インビボモデルが、使用され得る。このモデルは、ドパミン放出を示す種々のパラメータにおいて、種々の道具／鉛化合物の効果を調査するために、使用され得る。
【０３４１】
本発明は、本発明のチャネルまたはその改変体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントをコードするヌクレオチド配列を発現し得るトランスジェニック非ヒト動物、および／あるいは本発明のチャネルまたはその改変体、ホモログ、誘導体もしくはフラグメントをコードする１つ以上のヌクレオチド配列が不活性化されたトランスジェニック非ヒト動物を、さらに提供する。このようなヌクレオチド配列の発現は、通常、プロモーター（および必要に応じてエンハンサー）にヌクレオチド配列を作動可能に連結し、そしてこの構築物を接合体に微量注射（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｎｇ）することにより、達成される。Ｈｏｇａｎら，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。このようなヌクレオチド配列の不活性化は、クローン化ヌクレオチド配列が陽性選択マーカーの挿入によって不活性化されたトランスジーンの形成によって、達成され得る。Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，１２８８−１２９２（１９８９）を参照のこと。トランスジーンは、次いで、胚幹細胞内に導入され、ここで、内在性改変遺伝子との相同組換えを受ける。マウスおよび他のげっ歯類は、好ましい動物である。このような動物は、チャネル活性を調節し得る薬剤の同定のためのスクリーニングおよび／またはスクリーニング系を提供する。
【０３４２】
（実質的に純粋／実質的に単離された）
用語「実質的に純粋な形態」は、与えられた構成要素が高レベルで存在することを示すために使用される。構成要素は、望ましくは、組成物中に存在する主な構成要素である。これは、好ましくは、３０％以上、５０％以上、７５％以上、９０％以上、またはさらに９５％以上のレベルで存在する（上述のレベルは、考慮中の総組成に関して、乾燥重量／乾燥重量を基に決定される）。非常に高いレベルにおいて（例えば、９０％以上、９５％以上、または９９％以上のレベルで）、構成要素は、「単離形態」にあるとみなし得る。本発明の生物学的活性物質（ポリペプチド、核酸分子、結合剤、スクリーニング経由で同定された／同定され得る部分などが挙げられる）は、そうでなければこれら物質が結合し得る１つ以上の夾雑物を実質的に含まない形態において、提供され得る。従って、例えば、それらは、１つ以上の可能性のある夾雑ポリペプチド分子または夾雑核酸分子を実質的に含み得ない。これらは、他の細胞構成要素（例えば、細胞膜、細胞質など）を実質的に含まない形態において、提供され得る。組成物が、与えられる夾雑物を実質的に含まない場合、この夾雑物は、低レベル（例えば、上で示した乾燥重量／乾燥重量の基準で、１０％未満、５％未満、または１％未満のレベル）である。
【０３４３】
（緩和された）
この用語は、被験体（患者など）が、与えられた処置から、有益な効果を受けることを示す。この用語は、疾患または障害の完全な治癒または予防に限られず、疾患の有害な症状または疾患の進行率を減少させることに関した任意の有益な効果を含む。
【０３４４】
（要旨）
本発明者らは、小コンダクタンス、カルシウム活性化カリウム（ＳＫ）チャネルの、Ｔ型カルシウムチャネルへの優先的な結合は、ドパミン性中脳ニューロンのバースティングを防ぐことを見出している。
【０３４５】
従って、本発明者らの研究を鑑みると、Ｔ型チャネルへのＣａの流入が、ＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）を特異的に活性化させ、これが、次いでＫ流出を刺激し、これが、次いでニューロンをペースメーカーモードに保つことが、ここで分かる。
【０３４６】
従って、これらの工程／作用モードの任意の１つの遮断により、Ｋ流出の刺激（これが、次いでニューロンをバースティングモードに入らせ得、そしてそうすることにおいて、ドパミン放出の増加を引き起こし得る）を減少させるかまたは防ぎ得る。
【０３４７】
ドパミン放出の増加は、多くの臨床的／医学的分野（例えば、精神分裂病およびパーキンソン疾患の療法）において、利用され得る。
【０３４８】
従って、本発明の局面は、以下に関する：
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得る、使用。
【０３４９】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る、使用。
【０３５０】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、使用。
【０３５１】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、使用。
【０３５２】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、使用。
【０３５３】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、使用。
【０３５４】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、使用。
【０３５５】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、使用。
【０３５６】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得る、処置方法。
【０３５７】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードにおける変化を起こし得る、処置方法。
【０３５８】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る、処置方法。
【０３５９】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、処置方法。
【０３６０】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、処置方法。
【０３６１】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、処置方法。
【０３６２】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、処置方法。
【０３６３】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、処置方法。
【０３６４】
処置を必要とする被験体に薬剤を投与する工程を包含する処置方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、処置方法。
【０３６５】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法（例えば、効力を改善するための薬物開発プログラムにおいてこのアッセイを使用することによる）であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得る、アッセイ方法。
【０３６６】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る、アッセイ方法。
【０３６７】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る、アッセイ方法。
【０３６８】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、アッセイ方法。
【０３６９】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、アッセイ方法。
【０３７０】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、アッセイ方法。
【０３７１】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、アッセイ方法。
【０３７２】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、アッセイ方法。
【０３７３】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、アッセイ方法。
【０３７４】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ（例えば、効力を改善するための薬物開発プログラムにおいてこのアッセイを使用することによる）であって、ここで、このアッセイが、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を利用し、ここで、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのバースティングモードでなくなることを防止し得る、アッセイ方法。
【０３７５】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで、このアッセイが、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を利用し、ここで、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る、アッセイ方法。
【０３７６】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで、このアッセイが、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を利用し、ここで、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る、アッセイ方法。
【０３７７】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を利用し、ここで、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、アッセイ方法。
【０３７８】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を利用し、ここで、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、アッセイ方法。
【０３７９】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を利用し、ここで、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を調節する、アッセイ方法。
【０３８０】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、アッセイ方法。
【０３８１】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、アッセイ方法。
【０３８２】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え得（特に発射モードにおける変化を起こし）、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）ならびに／またはＴ型チャネルとＳＫチャネル（好ましくはＳＫ３チャネル）との共役をブロックする、アッセイ方法。
【０３８３】
上で示したように、この薬剤は、適切な薬剤の混合物であり得る。
【０３８４】
本発明の非常に好ましい局面は、以下に関する：
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、使用。
【０３８５】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、使用。
【０３８６】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、使用。
【０３８７】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤は、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、使用。
【０３８８】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、使用。
【０３８９】
医薬の製造における薬剤の使用であって、この薬剤は、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、使用。
【０３９０】
ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する、処置方法。
【０３９１】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する、処置方法。
【０３９２】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する、処置方法。
【０３９３】
ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する処置方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、処置方法。
【０３９４】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する処置方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、処置方法。
【０３９５】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する処置方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、処置方法。
【０３９６】
ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する処置方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、処置方法。
【０３９７】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する処置方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、処置方法。
【０３９８】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤を、処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する処置方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、処置方法。
【０３９９】
ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る薬剤の効果を、同定および／または改善する（例えば、効率を改善するための薬品開発プログラムにおけるアッセイの使用による）、アッセイ方法。
【０４００】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤の効果を、同定および／または改善する、アッセイ方法。
【０４０１】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤の効果を、同定および／または改善する、アッセイ方法。
【０４０２】
ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る薬剤の効果を、同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【０４０３】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤の効果を、同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【０４０４】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤の効果を、同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【０４０５】
ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る薬剤の効果を、同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【０４０６】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤の効果を、同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【０４０７】
ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る薬剤の効果を、同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【０４０８】
薬剤の効果を同定および／または（例えば、効率を改善するための薬品開発プログラムにおけるアッセイの使用により）改善する、アッセイ方法であって、このアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得る、アッセイ方法。
【０４０９】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え得（特に発射モードにおける変化を起こし）る、アッセイ方法。
【０４１０】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得る、アッセイ方法。
【０４１１】
薬剤の効果を同定および／または改善する、アッセイ方法であって、このアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【０４１２】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を利用し、ここで、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【０４１３】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を利用し、ここで、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を調節する、アッセイ方法。
【０４１４】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードに入らせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードでなくなることを防止し得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【０４１５】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な変化を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え（特に発射モードにおける変化を起こし）得、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【０４１６】
薬剤の効果を同定および／または改善するためのアッセイ方法であって、ここでこのアッセイは、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役を利用し、この薬剤が、ドパミン作動性ニューロンからのドパミン放出において有益な増加を生じさせるドパミン作動性ニューロンの発射モードに影響を与え得（特に発射モードにおける変化を起こし）、ここで、この薬剤が、Ｔ型チャネルおよび／もしくはＳＫ３チャネルならびに／またはＴ型チャネルとＳＫ３チャネルとの共役をブロックする、アッセイ方法。
【０４１７】
上で示したように、この薬剤は、適切な薬剤の混合物であり得る。
【０４１８】
非常に好ましい局面において、この薬剤は、パーキンソン疾患の処置のための薬剤である。
【０４１９】
（実施例）
本発明は、ここで参照が以下の図に対してなされる例としてのみ、さらに記載される。
【０４２０】
（実験セクションＡ）
（方法）
(切片調製)
若い（１０日〜１４日齢）のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスを、Ａｎｉｍａｌ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）Ａｃｔ，１９８６（ＵＫ）に従って、頚椎脱臼により屠殺した。脳を、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２５ｍＭグルコースを含有する、氷冷した人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）に浸した。冠状脳切片（２５０μｍ）を切り、そして９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で泡立てたＡＣＳＦ中に、室温（２１〜２４℃）で保存した。
【０４２１】
（電気生理学的読み出し）
黒質のニューロンを、赤外線差動干渉コントラストビデオ顕微鏡（ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｖｉｄｅｏ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により可視化した。読み出しを、ＥＰＣ−９パッチクランプ増幅器およびＰＵＬＳＥ＋ＰＵＬＳＥＦＩＴソフトウェアを使用して、室温（以下を除き）で行った。ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を誘発させ、そして記録するため、電圧クランプ条件下で、短い、非クランプ（ハイブリッド）脱分極を使用して、電圧活性化カルシウム流入を起こした。本発明者らは、ＤＡニューロンのＩ−ＡＨＰが、主にアパミン感受性ＳＫ電流によって、標準的な全細胞読み出し、および−８０ｍＶの維持電位／読み出し電位から＋６０ｍＶまでの、１００ｍｓハイブリッドパルス（ここで図３においてだけ使用される）を使用して媒介されることを、以前に示している（１）。
【０４２２】
本研究において、本発明者らは、単一の活動電位を刺激し、そして穿孔した形状（以下を参照）、２０ｍｓハイブリッドパルスおよび−６０ｍＶの読み出し電位／維持電位の使用によるＩ−ＡＨＰの減少を制限することを目的とした。
【０４２３】
（電流クランプ読み出しおよびハイブリッドクランプ読み出し（上記以外）について）
穿孔した全細胞形状を、使用した（１１）。パッチピペットは、１４０ｍＭ  ＫＭeＳＯ４、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  ＥＤＧＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ  ７．４）を含む溶液で満たされたチップであった。アンホテリシンＢ（１００ｍｇ／ｍｌ  ＤＭＳＯストック）を、同溶液で０．４ｍｇ／ｍｌまで希釈し、パッチピペットに埋め戻しした。ギガシール（ｇｉｇａｓｅａｌ）形成に続き、穿孔を、結合形状において、活動電位またはＩ−ＡＨＰが安定レベルに達するまでモニターした。記録された細胞を、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  グルコース、０．０５ｍＭ  ピクロトキシン、０．０５ｍＭ  キヌレン酸（ｐＨ７．４）を含有する適用溶液で、局所的に灌流した。電流クランプ記録を、室温または３６℃〜３７℃で行った。スパイキング(ｓｐｉｋｉｎｇ)パターンにおいて有意な相違が存在しない場合、データを、図５で示す分析のためにプールした。
【０４２４】
（低圧活性化カルシウムチャネル）
低圧活性化カルシウムチャネルを、標準的な全細胞形状および（１４０ｍＭ  ＴＥＡＣＩ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．３）含有溶液で満たした）パッチピペットにおいて、記録した。記録したニューロンを、１４５ｍＭ  ＴＥＡＣＩ、２．５ｍＭ  ＣｓＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭグルコース（ｐＨ７．４）を含有する適用溶液で局所的に還流した。従って、コントロール溶液は、５０μＭ  ピクロトキシン、５μＭ  キヌレン酸、０．５μＭ  テトロドトキシン、４ｍＭ  ４−ＡＰ、１０μＭ  ニフェジピン、１０ｎＭ  ω−コノトキシンを含有した。薬物を、それぞれの適用溶液中に希釈し、そして（＜５０μｍ）５０〜１００μｌ／分で、可視制御下にて局所的に適用した。
【０４２５】
（分析）
分析およびプロッティングのために、ソフトウェアＩｇｏｒＰｒｏを使用した。示した電圧クランプトレースを、１００Ｈｚで濾過し、定常状態レベルにて３〜１０回の追跡を平均化した。スパイキングパターンの分析のために、バースト検出器を、ＩｇｏｒＰｒｏにおいてプログラムした。バースト検出器は、追跡の全てのスパイク間隔（ＩＳＩ）をその平均スパイキング率と比較し、そして２〜７の継続的なスパイクの間で短いＩＳＩ（０．５＊＜平均率）と長いＩＳＩ（＞１．２５＊平均率）との一致を検出し、これを「バースト」としてマークした。バースト内での間隔を、ポワソンサプライズメカニズム（ｐｏｉｓｓｏｎ  ｓｕｒｐｒｉｓｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）（ＩＳＩを、記録の全てのＩＳＩのポワソン分布と比較する（１２））により、さらに試験した。バーストの間のスパイクをまとめ、そして追跡におけるスパイクの総数に標準化した。全ての値は、平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）である。有意な値は、ｐ＜０．０５（＊）である。
【０４２６】
（実験の考察）
（序論）
ドパミン作動性中脳（ＤＡ）ニューロンは、運動、認識、報酬のために重要であり、精神分裂症およびパーキンソン病のような障害に関与する。本発明者らは、ＳＫ３（小コンダクタンスのカルシウム活性化カリウムチャネルファミリーのメンバー）が、黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ）(ＳＮ)のＤＡニューロンにおけるペースメーカースパイクの周波数および精度を調節するが、腹側被蓋野では調節しないことを、最近示した（１）。本研究の目的は、マウスのＳＮ  ＤＡニューロンにおけるＳＫチャネル活性化のカルシウム供給源を、決定することであった。ＳＫチャネルは、電圧感受性カルシウムチャネル（ＶＳＣＣ）を介して活性化されると仮定され、そして海馬のニューロンにおいて、ＶＳＣＣは、特に、ＳＫチャネルを活性化するＬ型ＶＳＣＣであり得る（２）。全ての主要なＶＳＣＣ型（Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型およびＴ型）が、ＤＡニューロンにおいて存在することが示されており、従って、これは、ＳＫチャネル活性化のための潜在的なカルシウム供給源である（３、４）。あるいは（または増幅機構として）、内部貯蔵からのカルシウム放出が、ＳＫチャネルを活性化し得る（５）。本発明者らは、ＳＫチャネル活性化のカルシウム供給源を決定するために、穿孔パッチクランプ技術およびハイブリッドクランププロトコールを使用して、異なるＶＳＣＣ遮断薬を適用している間に、ＳＫ媒介過剰脱分極後電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、記録した。
【０４２７】
本発明者らの結果は、ＳＫチャネルが、Ｔ型カルシウムチャネルにより、優先的に活性化されることを証明している。
【０４２８】
インビボで、ＤＡ  ＳＮニューロンは、活動電位発射の２つの異なる自然発的モード（単回スパイキング発射および長い中断により隔てられた近接して間隔を空けた活動電位のバースト発射）を示した（６）。しかし、ＤＡニューロンは、脳切片のみで規則的なペースメーカースパイキングを表す。これは、ＮＭＤＡレセプター活性化がバースト発射を生じる能力（７）と一緒に、バースト発射がシナプス機構であると一般に推定される理由である（８）。しかし、バースト発射は、内在性のメカニズムであり得る（ＤＡ細胞の幾つかのラット脳切片記録において、ＳＫ選択的遮断薬アパミンがバースト発射を生じる場合）こともまた、示唆されている（９）。後者の仮説に一致して、本発明者らの本結果は、Ｔ型チャネル（ＳＫチャネル活性化の主要なカルシウム供給源（上を参照））のブロッキングが、インビトロのバースティングを誘導し得ることを示唆する。このことは、視床皮質ニューロン（Ｔ型チャネルがバースティングを促進する（１０））と対照的に、Ｔ型チャネルの役割が、そのＳＫチャネルとの機能的結合により、ＤＡニューロンに逆転されることを示す。
【０４２９】
（要旨）
本発明者らの結果は、マウスＳＮ  ＤＡニューロンにおいて、ＳＫチャネルが優先的にＴ型チャネルを経由して活性化されることを示唆する。
【０４３０】
１．ハイブリッドパルスが起こしたＡＨＰ電流の穿孔パッチクランプ記録の間、他のＶＳＣＣ遮断薬（Ｌ型、Ｐ／Ｑ型）は、効果を有さないかまたは少数成分のみをブロックする（２６％、Ｎ型）が、Ｔ型チャネル遮断薬の適用は、カルシウム感受性Ｉ−ＡＨＰを８５％〜９４％減少させた。
【０４３１】
２．Ｉ−ＡＨＰおよびＬＶＡ電流の定量的薬理学は、ＳＫ電流およびＴ型電流が、ミベフラジルおよびニッケルに対し、非常に類似の感受性を保有していることを示す。
【０４３２】
３．ＳＫ電流およびＴ型電流は、時間的なＡＨＰ挙動を規定する、類似の用途依存性不活性化を示す。
【０４３３】
４．ＳＫチャネルおよびＴ型チャネルは、穿孔電流クランプ記録で示したように、ＤＡニューロンにおいて、高精度のペースメーカーのスパイキングを維持するために等しく重要である。
【０４３４】
Ｔ型チャネルの阻害は、ＤＡニューロンの部分集団において、バースティングを起こす。これは、バースティング機構が、他の脊椎動物脳ニューロンにおいて記載されたものと、異なっていることを示す。本発明者らの結果は、Ｔ型カルシウムチャネルおよび小コンダクタンスのカルシウム活性化カリウム（ＳＫ）チャネルが、マウスＤＡニューロンにおいて、ペースメーカーのスパイキングを安定化させて、バースト発射を防ぐ、機能的シグナル伝達複合体を構成することを示唆する。
【０４３５】
（実験セクションＢ）
（序論）
ドパミン作動性（ＤＡ）中脳ニューロンは、種々の脳機能（例えば、随意運動、歩行記憶、および報酬）に不可欠な役割を果たす（Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｒａｋｉｃ（１９９９）；Ｋｉｔａｉら（１９９９）；ＳｐａｎａｇｅｌおよびＷｅｉｓｓ（１９９９））。その上、これらは、神経精神医学的障害および神経学的障害（例えば、精神分裂病、薬物依存症、およびパーキンソン病）に、密接に関与する（ＤｕｎｎｅｔｔおよびＢｊｏｒｋｌｕｎｄ（１９９９）；Ｖｅｒｈｏｅｆｆ（１９９９）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ（２０００））。これらの脳機能および脳疾患が、解剖学的に明らかなＤＡニューロン部分集団に関連する場合、生理学的条件および病理学的条件の下の、明らかな中脳ＤＡニューロンの機能を理解することが、重要である。インビボにおいて、ＤＡニューロンは、シナプス入力をその突出した内在性ペースメーカー活性化に組み込んで、樹状突起のドパミン放出およびシナプスのドパミン放出を制御する電気的活性化のパターンを作製することによって、その機能を発揮する。インビトロの脳切片調製物において保存されるＤＡニューロンの内在性ペースメーカーは、特異的な一組の共発現イオンチャネルによって統合されるようである。先行研究は、ペースメーカー活性化に影響を及ぼす多数のイオンコンダクタンスに焦点を当てているが、それぞれのイオンチャネルの分子の本質は、知られていなかった。また、殆どのインビボ電気生理学研究（ＧｒａｃｅおよびＯｎｎ（１９８９）；Ｌａｃｅｙら（１９８９）；Ｙｕｎｇら（１９９１）；Ｒｉｃｈａｒｄｓら（１９９７））は、ＤＡ中脳ニューロンを、解剖学的多様性に拘らず、同質の特性を有する単一集団とみなしている。対照的に、ＤＡ中脳ニューロンは、異質であるが局所解剖学的に秩序だった様式で、パーキンソン病およびその動物モデル（他種が生存して間、数種のＤＡ部分集団は、非常に損傷性である）における神経変性プロセスに応答する（Ｇｅｒｍａｎら（１９９６）；Ｄａｍｉｅｒら（１９９６ｂ）；Ｂｅｔａｒｂｅｔら（２０００））。よく知られる若年発症形態のＰＤにおける変異体遺伝子の確認により、有意な進歩がなされたが（Ｈａｔｔｏｒｉら、２０００）、十分に文書に記されたミトコンドリア機能不全が、どのようにして選択的ＤＡ神経変性を開始するか（Ｋｏｓｅｌら（１９９９））、そして明らかなＤＡの部分集団の生存率に何故劇的な相違が存在するか（Ｄａｍｉｅｒら（１９９９ａ））は、未だに分かっていない。従って、研究プログラムは、２つの主要な標的を有している。第一に、ＤＡペースメーカー調節におけるイオンチャネルの分子の同一性および機能的役割を、ＤＡ中脳ニューロンの解剖学的多様性の背景に基づいて規定することである。第二に、ＤＡ中脳ニューロンの差示的損傷性に関する神経変性の病理学的機構を分子レベルにおいて規定することである。
【０４３６】
（ＤＡ中脳ニューロンにおけるペースメーカー調節の分子生理学）
閾値以下の範囲において活性であるイオンチャネルは、ＤＡ中脳ニューロンにおけるペースメーカーの周波数および精度をチューニングするための良い候補である（Ｇｒａｃｅ（１９９１）；Ａｍｉｎｉら（１９９９）；Ｋｉｔａｉら（１９９９））。ＤＡニューロンにおける（少なくともＤＡ  ＳＮニューロンにおける）活動電位は、まず顕著なカルシウム依存性後過分極（ａｆｔｅｒ  ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を開始し、この後に自発的低速ペースメーカー脱分極が続き、この低速ペースメーカー脱分極が膜電位を閾値まで戻す。これらの２相の最初（スパイク間間隔を構成する）が、カルシウムおよびアパミンに感受性であるので、本発明者らは、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（ＳＫ１チャネル〜ＳＫ４チャネル）ファミリーの機能ならびにｍＲＮＡおよびタンパク質発現を研究した（Ｂｏｎｄら（１９９９））。本発明者らは、ＤＡニューロンにおけるネイティブなＳＫチャネルの生物物理的薬理学的特性および定量的薬理学的特性を規定し、これらは、複合的かつ半定量的単一細胞ＲＴ−ＰＣＲの結果およびＳＫ抗体を使用する免疫細胞化学研究と一致した。全てのデータの組は、ホモメリックＳＫ３チャネルが、ＤＡ  ＳＮニューロンにおいてネイティブアパミン感受性Ｋチャネルを構成することに一致する。追加の証拠は、本発明者らの組み合わせられた電気生理学的かつ半定量的なレーザー共焦点ＳＫ３免疫組織化学実験に由来し、これは、ネイティブなＳＫ電流振幅と相対的ＳＫ３免疫シグナル強度との間の相互関係を、個々のＤＡニューロンレベルで示した。さらに、本発明者らは、ＳＫ３チャネルが、ＤＡ  ＳＮニューロンにおいて、周波数（周波数依存的様式において）およびスパイク間間隔の精度を制御することを証明した。興味深いことに、ＶＴＡにおける、ＤＡニューロンの異なった非常に不規則な発射集団は、有意に低い密度のＳＫ３チャネルを保有し、そしてこの小さなチャネルプールは、ペースメーカーの周波数の制御または安定化に関与しない（Ｗｏｌｆａｒｔら（２００１））。ＳＫ３依存性後過分極の後、ほぼ直線状の脱分極が続き、発射閾値に戻る。本発明者らは、この相の間に、Ａ型カリウムチャネルの不活性化および過分極活性化サイクリックヌクレオチドゲートチャネル（Ｉｈチャネル）の活性の両方が、ＤＡ  ＳＮニューロンにおける周波数制御に寄与する証拠を見出した（Ｌｉｓｓら（２００１）；Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００１））。ＤＡ  ＳＮニューロン（高密度のＩｈチャネルを発現する）において、３０μＭ  ＺＤ７２８８による選択的Ｉｈ阻害は、ペースメーカー周波数を約５０％低下させる。Ｉｈチャネルの分子組成を理解するために、本発明者らは、その候補遺伝子（ＨＣＮ１〜４）の、ＤＡニューロンにおける１細胞ｍＲＮＡ発現プロフィールを調べた（Ｆｒａｎｚら（２０００））。１細胞ＲＴ複合ＰＣＲプロトコールを用い、本発明者らは、ＤＡにおいて、そして、視床皮質ニューロンにおいてもまた、低速ゲート閉鎖性Ｉｈ発現型が、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３、およびＨＣＮ４の共発現と相関性があったことを示した。対照的に、ＨＣＮ１は、高速ゲート閉鎖性Ｉｈ電流を有する海馬ニューロンおよび皮質ニューロンにお��て発現され、ＤＡ  ＳＮニューロンにおいては常に不在であった。ＤＡニューロンにおける体細胞樹状突起Ｉｈチャネルの機能的化学量論を決定するため、さらなる定量的１細胞ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫細胞化学実験が、必要とされる。
【０４３７】
（定量的リアルタイム１細胞ＲＴ−ＰＣＲ：ペースメーカー周波数とイオンチャネル転写数との間の線形相互関係）
Ａ型Ｋチャネル候補遺伝子についての１細胞ＲＴ−ＰＣＲ発現プロフィールは、さほど複雑ではなかった。可変の振幅を有する急速不活性化Ａ型Ｋ電流を示したが、均一な生物物理学的ゲート閉鎖特性（凝集した外側外面型パッチ（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔ  ｐａｔｃｈ）において実証された）を示す、ＤＡ  ＳＮニューロンにおいて、試験した全ての候補遺伝子のうち、Ｋｖ４．３の長いスプライシングバリエーションだけが、発現された。ネイティブなＡ電流の、ＤＡ  ＳＮニューロンにおける薬理学的特性および生物物理学的特性は、Ｋｖ４チャネルの発現と一致した。ＴＨ陽性ＤＡ  ＳＮニューロンにおけるＫｖ４．３タンパク質の存在は、免疫組織化学により確認された。本発明者らは、生理学的範囲内（０．５Ｈｚ〜５Ｈｚ）の発射周波数のバリエーションが、Ｋｖ４．３チャネル密度のバリエーションと高度に相互関係していること、およびＫｖ４．３チャネルのヘテロポダトキシン（ＨｐＴｘ３）による選択的阻害が、発射周波数を上昇させることを観察した。本発明者らは、リアルタイム蛍光ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎプライマー／ハイブリダイゼーションプローブアッセイ）に基づき新規の定量的単一細胞ＲＴ−ＰＣＲアッセイを開発し、そして、活性化Ｋｖ４．３チャネルの数が、個々のＤＡ  ＳＮニューロンのペースメーカー周波数と密接に関係しているだけでなく、Ｋｖ４．３Ｌ（長いスプライシングバリエーション）ｍＲＮＡ分子の数にも高度に相互関係していることを証明した。従って、Ｋｖ４．３Ｌ転写におけるバリエーションは、同定されたＤＡ  ＳＮニューロンにおける、自発的なペースメーカー周波数の全スペクトルを説明するのに充分である。Ｋｖ４．３Ｌ  ｍＲＮＡの存在量、Ａ型チャネル密度およびペースメーカー周波数の間のこの線形結合は、ＤＡ  ＳＮニューロンが単一のイオンチャネル遺伝子の転写制御によってその可変的発射率を制御する、驚くべき単純な分子メカニズムを、示唆する（Ｌｉｓｓら（２００１））。
【０４３８】
（ＤＡ中脳ニューロンの機能的局所解剖学）
ＳＮおよびＶＴＡの両方におけるドパミン作動性中脳ニューロンの機能的多様性も、研究した。電気生理学的分析と形態学的および神経科学的な特徴付けのための細胞標識とを結び付けて、本発明者らは、ペースメーカー活性および閾値下統合作用の様式において有意な相違を有する、４つのＤＡ中脳部分集団を同定した。これらのＤＡニューロン部分集団の分布は、高度に局所解剖学的に組織され、かつ、カルシウム結合タンパク質カルビンジンＤ２８−Ｋの相違のある発現と相互関係する。本発明者らは、Ｉｈチャネル密度における大きな相違が、これらのＤＡ部分集団の１つの重要な決定因子であることを証明した。それは、時間的閾値下統合作用における有意な相違を生じさせ、そして、ＤＡニューロンが阻害後興奮性を増加させるかまたは減少させるかを決定する。その上、ＤＡ部分集団の１つ（古典的カルビンジン陰性ＳＮニューロン）においてのみ、Ｉｈチャネルは、ペースメーカー制御に直接含まれる。本発明者らは、これらの解剖学的、かつ神経化学的に異なったＤＡ部分集団中の他の閾値下チャネル（特に、Ａ型およびＳＫチャネル）の特性における機能的に関連した相違もまた、同定した（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００１）：Ｗｏｌｆａｒｔら（２００１））。従って、ＤＡ系の多様性は、分岐性軸索突出およびシナプス結合における相違に制限されないが、その体細胞樹状突起ドメインにおけるＤＡニューロン間の相違を本質的に含む。
【０４３９】
（ＤＡ中脳ニューロンの神経変性に対する差次的損傷性におけるＡＴＰ感受性カリウム（Ｋ−ＡＴＰ）チャネルの役割）
本発明者らは、黒質（ＳＮ）中のＤＡニューロンが低ナノモル濃度密度の複合体Ｉインヒビターロテノンに対し異なる応答をすることを同定した。ＤＡ  ＳＮニューロンの、高度に感受性な１つの集団は、過分極し、そしてロテノンの存在下でその自発的活性を完全に失ったが、別の集団には影響はなかった。本発明者らは、この異なった応答が、Ｋ−ＡＴＰチャネルの選択的活性化により媒介されたことを証明した。１細胞ＲＴ複合ＰＣＲを使用し、本発明者らは、Ｋ−ＡＴＰサブユニットの差次的ｍＲＮＡ発現とＳＵＲ１／Ｋｉｒ６．２（ロテノン感受性ＤＡ部分集団において見出された（Ｌｉｓｓら（１９９９ｂ）））発現とが、相互関係していることを示した。その上、ドパミン作動性神経変性の遺伝的マウスモデル（ｗｅａｖｅｒ  ｍｏｕｓｅ）において、本発明者らは、機能獲得（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）細胞表現型（変異体（非選択的ｗｅａｖｅｒＧＩＲＫ２チャネルおよびＫ−ＡＴＰチャネル）の共活性化により構成された）を同定した。後者は、特にｗｅａｖｅｒＧＩＲＫ２誘導の膜脱分極を補償した。野生型マウスとは対照的に、本発明者らは、ｗｅａｖｅｒマウス中の生存カルビンジン陽性ＤＡニューロン（Ｌｉｓｓら（１９９９ａ））において、高度に代謝的に感受性のＳＵＲ１／Ｋｉｒ６．２  Ｋ−ＡＴＰアイソフォームのみを検出した。本発明者らの結果は、Ｋ−ＡＴＰチャネルの差次的発現および緊張性機能的活性化が、生存ＤＡニューロンの細胞表現型において活性のある役割を果たすことをこのＰＤのマウスモデルについて示し、そして差次的なＫ−ＡＴＰチャネル発現が、ＤＡニューロンの差次的な損傷性に寄与する分子メカニズムであることをを示唆することを、証明する。最近、本発明者らは、コントロールおよびＫｉｒ６．２ノックアウトマウスにおけるロテノンへの機能的応答および同様にＭＰＰ＋への機能的応答を研究した。本発明者らの単一細胞ＲＴ−ＰＣＲの結果と一致して、本発明者らは、Ｋｉｒ６．２ノックアウトマウスのＤＡニューロンにおける機能的Ｋ−ＡＴＰチャネルの不在を証明した。その上、Ｋｉｒ６．２ノックアウトマウスのＤＡニューロンにおけるロテノンおよびＭＰＰ＋への過分極応答は、完全に失われた（Ｋ−ＡＴＰチャネルが、ＤＡニューロンの部分集団におけるミトコンドリア機能不全の選択的および感受性のトランスデューサを構成することを証明する（Ｌｉｓｓら（２０００）））。ロテノン（ＥＣ５０＝約１５ｎＭ）およびＭＰＰ＋（ＥＣ５０＝約２μＭ）の両方へのその感受性は、それぞれ、インビボの選択的ＤＡ神経変性を誘導する濃度の範囲内に存在する。この文脈において、ＭＰＴＰのみでなく、ナノモル濃度密度のロテノンを用いた慢性的なチャレンジもまた、ＤＡニューロンの選択的変性を誘導するのに充分であったことに留意することが、重要である（Ｂｅｔａｒｂｅｔら（２０００））。現在、慢性的ＰＤのＭＰＴＰマウスモデルを使用して、本発明者らは、機能的Ｋ−ＡＴＰチャネルの損失、およびそれによるＫｉｒ６．２ノックアウトマウスにおける神経毒素誘導性のミトコンドリア機能不全への応答における膜過分極が、インビボのＤＡ神経変性の程度およびパターンに影響するか否かの疑問を、調査中であ���。
【０４４０】
（視床下部Ｋ−ＡＴＰチャネルは、グルコースホメオスタシスに不可欠である）
本発明者らの結果は、ＤＡニューロンにおけるＫ−ＡＴＰチャネルの病態生理学的役割の証拠を提供するが、ニューロンにおけるその生理学的機能は、不明なままである。本発明者らは、穿孔性パッチクランプ記録において、ＤＡニューロンの部分集団の発射率が、外部グルコース濃度の生理学的変動により、制御されることを観察した。本発明者らは、異なった脳領域（重要な神経グルコースセンサーを形成すると考えられている）におけるＫ−ＡＴＰチャネルの潜在的役割を、研究した。本発明者らは、腹側医学的視床下部ニューロンが、Ｋｉｒ６．２ＫＯマウスには存在しなかったＳＵＲ１／Ｋｉｒ６．２媒介性Ｋ−ＡＴＰチャネルを発現する、代謝感受性ＤＡ部分集団を好むことを、証明した。その上、これらのニューロンは、外部グルコース濃度の変化に応答するその興奮性を変えるための能力もまた、失っていた。インビボの実験は、視床下部におけるこのＫ−ＡＴＰチャネル依存性グルコース感知が、グルカゴン放出、グルコースホメオスタシスおよび食欲制御のために不可欠であることを示した。さらに、この制御は、食物摂取およびエネルギー均衡を制御するレプチン経路またはＮＰＹ経路とは、関係がなかった（Ｍｉｋｉら（２００１））。ＤＡニューロンにおけるグルコース感知の特定の寄与は、さらに評価される必要があるが、トランスジェニックマウス由来の強力な遺伝的証拠（ＤＡシグナルが、食物摂取のために不可欠な刺激であること）が、存在する（ＺｈｏｕおよびＰａｌｍｉｔｅｒ（１９９５）；Ｓｚｃｚｙｐｋａら（２０００））。
【０４４１】
（酢酸グアニジンメチルトランスフェラーゼ（ＧＡＭＴ）欠損症の病態生理学：蓄積代謝産物グアニジノ酢酸は、ＧＡＢＡＡレセプターを活性化する）
基底の神経節細胞の機能に影響するヒトの疾患は、必ずしも高齢の障害でなくてもいい。ＧＡＭＴ欠損症は、生後、発生の遅延および舞踏病様行動障害と共に表れるクレアチン生合成のヒト疾患として、最近同定された。ＭＲＩ画像法研究は、淡蒼球における選択的損傷を強調している。ニューロンにおける高エネルギーリン酸の欠損および累積代謝産物グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）の神経毒作用の両方は、この疾患の病態生理学についての候補メカニズムである。ＧＡＭＴ欠損症におけるＧＡＡ累積の潜在的役割を調査するため、本発明者らは、培養ニューロンにおけるＧＡＡ適用によって誘導された電気生理学的応答を、分析した。ＧＡＡは、１６４μＭのＥＣ５０で、ＧＡＢＡＡレセプター媒介性塩素電流を引き起こした。加えて、臨床的に関連したＧＡＡの密度は、マウス脳切片において淡蒼球ニューロンを過分極させ、そしてそのスパイク周波数を減少させた。ＧＡＢＡＡレセプターアンタゴニスト（ピクロトキシンおよびビククリン）は、これらのＧＡＡ誘導効果をブロックする。対照的に、ミリモル濃度のクレアチンは、ニューロン活性に対し、効果を有さなかった。脳における（特に淡蒼球における）ＧＡＡのＧＡＢＡ模擬作用は、ＧＡＭＴ欠損症を有する患者における錐体外路系機能不全を説明する、候補メカニズムであり得る（Ｎｅｕら（２０００））。
【０４４２】
（要旨）
本局面の目的は、機能的電気生理学的技術と、１細胞分子生物学的技術かつ免疫組織化学的技術とを組み合わせて、１つのドパミン作動性（ＤＡ）ニューロンに対する遺伝子型表現型相互関係を理解することであった。２つの中心となる論題は、以下である：ａ）差次的に発現するイオンチャネル遺伝子（ＤＡニューロン部分集団の機能的相違を決定する）の特徴付け；およびｂ）差次的に発現するイオンチャネル遺伝子（パーキンソン病における変性ＤＡニューロンの選択的損傷性に関与する）の同定。
【０４４３】
本発明者らは、イオンチャネル候補遺伝子のｍＲＮＡ発現プロフィールを、マウス中脳切片の１つの機能的に特徴付けられたＤＡニューロンにおけるマーカー遺伝子との組み合わせて分析するための１細胞分子技術を開発し、そして適用した。本発明者らのプロトコールは、以下を本発明者らに可能にする：ａ）幾つかの候補遺伝子のｍＲＮＡ発現プロフィールを、ＲＴ複合ＰＣＲ技術を平行して使用して、質的に評価すること、ｂ）１細胞ｃＤＮＡプールの連続の希釈により、多量に検出されたｍＲＮＡ種を比較すること、ｃ）定量的リアルタイム蛍光ＲＴ−ＰＣＲにより、選択された標的ｍＲＮＡの絶対転写数を定量すること。加えて、本発明者らは、標準的全細胞記録および標準的穿孔パッチ記録における、機能的特徴付けと、神経ビオチン（ｎｅｕｒｏｂｉｏｔｉｎ）細胞標識、多標識免疫組織化学、および共焦点再構成を、組み合わせ、個々のＤＡニューロンの機能的表現型を、その形態学、中脳における局所解剖学的位置、ならびにチャネルおよびマーカータンパク質の発現を関連付けるている。これらの研究は、変異体およびノックアウトマウスモデルに対する調査と共に、以下の進歩を生じさせた：
１．  ＤＡニューロンの代謝感受性の決定における、Ｋ−ＡＴＰチャネルサブユニットの、異なった１細胞遺伝子発現の同定（Ｌｉｓｓら（１９９９ｂ））。
２．  ｗｅａｖｅｒマウス（パーキンソン病の遺伝モデル（Ｌｉｓｓら（１９９９ａ）））のＤＡニューロンにおけるＳＵＲ１媒介性Ｋ−ＡＴＰチャネルの、細胞表現型ならびに選択的発現および活性化の証明。
３．  ＤＡニューロンならびに他の皮質下ニューロンおよび皮質ニューロンにおけるニューロンＩｈチャネルの機能的特性のための、異なったＨＣＮ１遺伝子発現の役割の同定（Ｆｒａｎｚら（２０００）；Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００１））。
４．  グルコースホメオスタシスのための、視床下部ニューロン中の、Ｋ−ＡＴＰチャネルの不可欠な役割の発見（Ｍｉｋｉら（２００１））。
５．  ＤＡニューロンにおけるカルシウム活性化ＳＫチャネルの分子的同一性および機能的役割の定義（Ｗｏｌｆａｒｔら（２００１））。
６．  差次的Ｉｈチャネル発現が、ＤＡニューロン部分集団の異なった機能的表現型に対する重要な決定因子である、ＤＡ中脳ニューロンの機能的局所解剖学の証明（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２０００，２００１））。
７．  個々のニューロンのレベルでの定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲプロトコールの開発、およびそのＤＡ  ＳＮニューロンへの適用（Ｌｉｓｓら（２００１））。
８．  ＧＡメチルトランスフェラーゼ欠損症において、グアニジノ酢酸（ＧＡ）が、ＧＡＢＡＡレセプター活性化によって作用することの証明（Ｎｅｕら（２０００））。
【０４４４】
ＤＡニューロンの電気的活性の分子的基礎および細胞的基礎を理解することは、特に、パーキンソン病および精神分裂病におけるドパミン作用系を標的にした主要な薬物療法に対して、重要な関係を有する。異なった脳機能に関与する異なったＤＡ部分集団の同定は、新規の、高度に選択的な、薬理学的アプローチ（選択的ドパミン作動性サブシステムに影響する）を規定する、第一工程であり得た。パーキンソン病および精神分裂病の両方における標準的薬物レジメンの副作用の高い発生率は、より多くの選択的処置戦略の必要性を、最もよく説明する。ＤＡニューロンの選択的損傷性の分子生物学および細胞生物学を理解することは、新規の神経保護戦略に寄与し得た。高度に損傷性であり、かつ耐性であるＤＡニューロンの、異なった機能的表現型の定義は、差次的に発現し、パーキンソン病における異なった運命を制御する遺伝子に対するトランスクリプトームワイドな（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ−ｗｉｄｅ）の探索を、容易にする。
【０４４５】
（実験セクションＣ）
本局面の目的は、中脳における解剖学的かつ機能的に異なった部分集団に属する単一のドパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの、遺伝子型−表現型の相互関係を、さらに理解することであった。主要な目的は、以下である：ａ）異なって発現するイオンチャネルおよびチャネル機能調節遺伝子（ＤＡ部分集団の別個の機能的表現型を決定する）の同定および機能的特徴付け；およびｂ）パーキンソン病およびそのマウスモデルにおけるＤＡニューロンの異なった損傷性に対して応答性の、差次的に発現する遺伝子の、同定および機能的確認。
【０４４６】
とりわけ、本局面は、以下の論点に絞られる：
Ｉ．  ＤＡ中脳ニューロンの、定量的分子生理学。ペースメーカー産生、周波数制御、シナプス入力およびシナプス統合におけるＤＡ細胞機能行動の基礎を成す、重要なイオンチャネルとは何か？
ＩＩ．  ＤＡ中脳ニューロンの、分子解剖学。異なった脳領域を神経支配するＤＡニューロン集団の間の、分子的および機能的な相違は何か？ＤＡニューロンの異なった軸索の標的化を決定する分子プログラムは何か？
ＩＩＩ．  パーキンソン病のマウスモデルにおけるＤＡ中脳ニューロンの、機能的形成性および分子的形成性。パーキンソン病の特定のモデルにおける、疾患状態のＤＡニューロンにおける重要な、分子的および機能的な変化とは何か？
ＩＶ．  パーキンソン病におけるＤＡニューロンの機能的ゲノミクス。差次的に発現するどの遺伝子が、ＤＡニューロンにおいて神経変性に向かう損傷性の大きな相違を規定するのか？
【０４４７】
（調査した組織）
生育ＤＡニューロンに対する単一細胞分子生物学と免疫組織化学技術との組み合わせにおけるパッチクランプ電気生理学は、野生型マウスおよびトランスジェニックマウスの鋭い中脳切片または中脳切片培養において、実行される。コントロールマウス、処置後マウスおよびトランスジェニックマウス由来の灌流固定脳は、疾患モデルにおけるタンパク質発現およびＤＡニューロン生存の、免疫組織化学的分析に使用される。加えて、１細胞または特定細胞のプールの、レーザーベースの顕微鏡解剖（ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）は、マウスまたは死後のヒトの脳由来（後者は、コントロールおよびパーキンソン病患者由来である）の固定された脳切片上で実行される。
【０４４８】
（技術）
定性的かつ定量的な１細胞リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学的な光学顕微鏡技術および共焦点顕微鏡技術とを組み合わせたパッチクランプ電気生理学。インビボのＧＦＰ発現標識のための１細胞エレクトロポレーション、および脳（鋭い脳切片および切片培養）におけるリボザイムベースの遺伝子抑制を、使用する。加えて、アンチセンスＲＮＡ（(ａ)ＲＮＡ）増幅およびＤＮＡアレイベースの発現プロファイリングを、実行する。レーザーベースの顕微鏡解剖を使用し、単一のＤＡニューロンまたは特異的に前標識されたＤＡ集団を、ヒトまたはマウスの固定した脳切片から回収する。インビボ立体技術を、マウスにおいて、蛍光ビーズを用いた逆行性標識のために使用し、そして、ＧＦＰ発現ベクターに基づく代替の方法を、評価する。最後に、ＰＤの慢性的ＭＰＴＰ／プロペネシド（ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）ベースのマウスモデルを、使用し、Ｋ−ＡＴＰ（Ｋｉｒ６．２）ノックアウトマウスのコロニーを維持する。
【０４４９】
（測定）
細胞に結合する、標準的かつ穿孔性全細胞パッチクランプ記録を、規定されたＤＡニューロン（ある実験においては、蛍光ビーズ標識またはＧＦＰ標識され得る）の電気的行動（例えば、自発的行動、シナプスに起こされた行動、薬物負荷の間の行動、疾患モデルにおける行動）を研究するために使用する。細胞に結合する、標準的かつ穿孔性全細胞型パッチクランプ記録、および無細胞パッチクランプ記録を、イオンチャネルおよびＤＡニューロンのシグナル伝達カスケードの生物物理学的特性（透過性、選択性、ゲート開閉運動、電流密度、１チャネルプロフィール）および薬理学的特性を規定するために、実行する。関連候補遺伝子の定性的ｍＲＮＡ発現プロフィールは、１細胞ＲＴ複合ＰＣＲにより、決定される。定量的発現プロフィール分析および遺伝子型−表現型相互関係は、１細胞リアルタイム蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎプライマー／ハイブリダイゼーションプローブアッセイ）により、実行される。ニューロンの局在、形態学、および神経化学的表現型ならびにイオンチャネルおよび他の標的タンパク質の共発現および共局在は、光学および共焦点顕微鏡レベルの免疫組織化学技術により、分析される。パッチクランプ記録は、リボザイムベースの遺伝子抑制実験において、１細胞エレクトロポレーションの前および後に実行される。個々のニューロンのトランスクリプトームワイド１細胞ｍＲＮＡ発現プロフィール分析は、ａＲＮＡ増幅およびＤＮＡアレイハイブリダイゼーションにより、実行される。逆行標識ニューロンは、蛍光鏡検によって同定される。ＤＡ神経変性のパターンおよび範囲は、標準的免疫組織化学技術およびステレオロジー技術によって、決定される。
【０４５０】
（健康管理への予想される関連）
１細胞ベースのゲノムワイドな発現プロフィール分析（ＩＶを参照）は、神経保護療法開発のための新規の標的を構成するＰＤに含まれる遺伝子を、同定し得ることが期待される。この結果は、ＰＤ、精神分裂病および薬物乱用に含まれ、ならびにより選択的な療法的アプローチ（ＰＤおよび精神分裂病における現在の薬物療法を限定する、副作用を最小化し得る）に導き得る、異なったＤＡサブグループの、分子生理学のより良い理解に、寄与し得る。
【０４５１】
（序論）
ドパミン作動性（ＤＡ）中脳ニューロンは、種々の脳機能（例えば、随意運動、作業記憶、および報酬）において、不可欠な役割を果たす（Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｒａｋｉｃ（１９９９）；Ｋｉｔａｉら（１９９９）；ＳｐａｎａｇｅｌおよびＷｅｉｓｓ（１９９９））。加えて、これらは、神経精神医学障害および神経障害（精神分裂病、薬物依存症、およびパーキンソン病（ＤｕｎｎｅｔｔおよびＢｊｏｒｋｌｕｎｄ（１９９９）；Ｖｅｒｈｏｅｆｆ（１９９９）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ（２０００））など）に、密接に含まれる。これらの脳機能および脳疾患は、解剖学的に異なったＤＡニューロンサブグループを伴うので、中脳のＤＡニューロンの機能的特徴付けは、その解剖学的サブグループに従って区別されるか否かという疑問が、生じる。平行の中間線条（ｍｅｓｏｓｔｒｉａｔａｌ）ネットワーク（Ｍａｕｒｉｎら（１９９９））、中間辺縁系（ｍｅｓｏｌｉｍｂｉｃ）ネットワーク（Ｇｒｏｅｎｗｅｇｅｎら（１９９９））および中間皮質（ｍｅｓｏｃｏｒｔｉｃａｌ）ネットワーク（Ｔｚｃｈｅｎｔｋｅ（２００１））の範囲内で、ＤＡニューロンは、その機能を、その電気的活性のパターンを産生する内在性ペースメーカー（ドパミン放出およびその関連標的細胞における機能的効果を制御する）に関連して、シナプス入力を統合することにより、働かせる。従って、ＤＡ系において起こり得る多様性は、軸索突出およびシナプス結合性における相違と、また体細胞樹状突起インテグレータおよびペースメーカーの分岐特性との、両方から起こり得る。
【０４５２】
（ドパミン作動性中脳ニューロンの解剖学）
ドパミン作動性中脳ニューロンは、以下の３つの部分的に重複する核において分布される：レトロルブラル領域（ｒｅｔｒｏｒｕｂｒａｌ  ａｒｅａ）（ＲＲＡ、Ａ８）、黒質（ＳＮ、Ａ９）、および腹側被蓋領域（ＶＴＡ、Ａ１０）。これらの核は、異なった中間終脳突出（ｍｅｓｏｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）（ＧａｒｄｎｅｒおよびＡｓｈｂｙ（２０００）；ＪｏｅｌおよびＷｅｉｎｅｒ（２０００））に関連する。黒質ニューロンは、主に背側線条突出を標的し、そして運動機能に含まれる。一方、ＶＴＡのニューロンは、腹側線条（例えば、ｎｕｃｌｅｕｓ  ａｃｃｕｍｂｅｎ（中間辺縁突出））および前前頭皮質（中間皮質突出）に対して著しく発射し、従って、辺縁系の機能に関わる（ＧａｒｄｎｅｒおよびＡｓｈｂｙ（２０００）；ＪｏｅｌおよびＷｅｉｎｅｒ（２０００））。最近の追跡研究は、中間終脳結合の局所解剖学的組織の、より微細な概念を明らかにしている。ＳＮにおいて、２つの神経化学的に異なった層（ｔｉｅｒ）が、線条の異なった神経化学的区画（すなわち、辺縁系および感知運動領域（ｓｅｎｓｏｒｉ−ｍｏｔｏｒ  ｒｅｇｉｏｎ）（Ｍａｕｒｉｎら（１９９９）；Ｈａｒｂｅｒら（２０００）））へ発射し、そしてそこからの入力を受容する。腹側層ＤＡニューロン（カルシウム結合タンパク質カルビンジンＤ２８−Ｋ（カルビンジン陰性、ＣＢ−）を発現しない）は、パッチ区分へ発射し、そして今度はマトリックスにおける線条体の突出ニューロンから神経支配を受ける。逆に、カルビンジン陽性（ＣＢ＋）背側層ＤＡニューロンは、マトリックスへ発射し、一方、辺縁系パッチ区分から入力を受ける（Ｇｅｒｆｅｎ（１９９２）；Ｂａｒｒｏｔら（２０００））。幾つかの研究は、パーキンソン病およびその動物モデルの両方において、ＤＡニューロンの損傷性において相違を起こし変性させることが、ＣＢの異なった発現と密接に関係することを、明らかにしている。したがって、ＣＢ＋  ＤＡニューロンは、損傷性が、より低い（Ｌｉａｎｇら（１９９６）；Ｄａｍｉｅｒら（１９９９ａ）；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＨｅｒｎａｎｄｅｚおよびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ（２０００）；Ｔａｎら（２０００））。
【０４５３】
（ドパミン作動性ニューロンの生理学）
解剖学的および神経化学的な組織が、良く詳述されているのと対照的に、ＤＡニューロンの異なったサブグループの範囲内の電気生理学に関しては、あまり知られていない。現在まで、インビトロ電気生理学的研究は、ＤＡ中脳ニューロンを、主に単一の集団として考えている（ＰｕｃａｋおよびＧｒａｃｅ（１９９４）；Ｋｉｔａｉら（１９９９））。これらの「古典的」ＤＡニューロンは、高度に保存的なイオンチャネルのレパートリー（すなわち、低周波数ペースメーカー活性、広い活動電位で、その後に著しい後過剰分極、過剰分極活性化チャネル（Ｉｈチャネル）によって仲介される強い下成分（ｓａｇ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、およびＤ２自己レセプター仲介過剰分極が続く）の発現を示唆する、多くの特徴を有する（Ｓａｎｇｈｅｒａら（１９８４）；ＧｒａｃｅおよびＯｎｎ（１９８９）；Ｌａｃｅｙら（１９８９）；Ｒｉｃｈａｒｄｓら（１９９７））。しかし、インビボ研究は、発射率、バースト発射、およびＤＡ中脳ニューロンのサブグループ間の、自己レセプター制御における重要な相違を強調した（Ｃｈｉｏｄｏら（１９８４）；Ｇｒｅｅｎｈｏｆｆら（１９８８）；ＳｈｅｐａｒｄおよびＧｅｒｍａｎ（１９８８）；Ｐａｌａｄｉｎｉ（１９９９））。観察される多様性が、シナプス入力における相違から生じるのか、またはシナプス統合を制御するシナプス後イオンチャネルの異なった発現に関するのかは、知られていない。
【０４５４】
（ＤＡニューロンの異なった損傷性の機能的ゲノミクス）
以前のプログラムにおいて行われた研究は、本発明者らのＤＡニューロンの多様性の理解に、寄与している。本発明者らは、電気生理学的に異なったＤＡ発現型（局所解剖学的に、かつ神経化学的に組織され、それにより離散したＤＡサブグループの機能的な状況（ｌａｎｄｓｃａｐｅ）を形成する（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２０００，２００１）））を、同定した。加えて、等しく重要な平行のＤＡマップ（すなわち、詳細に記載される異なった損傷性の局所解剖学ならびにパーキンソン病（Ｄａｍｉｅｒら（１９９９ｂ））およびその動物モデル（Ｇｅｒｍａｎら（１９９６）；Ｂｅｔａｒｂｅｔら（２０００））におけるＤＡニューロンのサブグループ選択性変性）は、考慮される必要がある。解剖学的に組織された、異なった機能的ＤＡ表現型の分布と同様に、選択的な損傷性および変性のパターンは、規定された局所解剖学を有する。本発明者らが証明したように、（例えば、カルビンジン陽性背側層ＤＡニューロンとカルビンジン陰性腹側層ＤＡニューロンとを比較した場合）神経変性に対する損傷性に大きな相違を有するＤＡニューロンサブグループもまた、異なった機能的表現型を有する（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２０００，２００１））。
【０４５５】
本発明のこの局面は、ＤＡ中脳ニューロンのこれらの異なる解剖学的マップ、生理学的マップおよび病理生態学的なマップを、個々のニューロンのレベルで、互いに組み合わせる。これは、電気生理学的機能、解剖学的結合、および神経変性への損傷性に関連して、分子的基礎を規定すること、およびＤＡニューロンの観察される多様性の機能的関係を理解することを、目的とする。本発明者らの１細胞レベルの技術の組み合わせは、１細胞遺伝子型−表現型相互関係の概要を創造するという点で、非常に有利である。ポストゲノム生物学は、特定の機能に対応する分子モジュールを、共発現および共調節される遺伝子の塊（その産生物が物理的に相互作用しやすく、かつ、類似の細胞区分に局在しやすい）として、規定することを目的とする。本局面は、ＤＡニューロンにおける３つの重要なモジュールの、分子的および機能的規定に焦点を絞る。
１．  ペースメーカー産生、内在性周波数制御、およびシナプス統合
２．  選択的軸索標的化、分枝および標的細胞との結合性
３．  ＰＤおよびその動物モデルにおける神経変性への異なった損傷性
これは、２つの相補的戦略を組み合わせる：先行の実験的観察に基づく「１遺伝子１タンパク質」アプローチ、およびＤＡニューロンの分子的多様性を完全に捕捉する非バイアス、大規模発現プロフィール分析。
【０４５６】
（Ｉ．ＤＡ中脳ニューロンの定量的分子生理学）
（１  ペースメーカー周波数調節）
ニューロン機能は、体細胞樹状突起統合の細胞特異的パターンおよび電気的活性の産生と、密接に結びついている。この細胞興奮性は、今度は、共発現するイオンチャネルの特異的な一組と、合わせられる。現在、インビトロの電気生理学的研究は、ＤＡ中脳ニューロンを、主に単一の集団として考えている（Ｓａｎｇｈｅｒａら（１９８４）；ＧｒａｃｅおよびＯｎｎ（１９８９）；Ｌａｃｅｙら（１９８９）；Ｒｉｃｈａｒｄら（１９９７））。本発明者らは、この細胞ペースメーカーの重要な成分の分子的基礎を規定し、そしてＳＫ３、ＨＣＮ２−４、およびＫｖ４．３Ｌが仲介するイオンチャネルが、その周波数および精度の制御に含まれることを示している（Ｆｒａｎｚら（２０００）；Ｌｉｓｓら（２００１）；Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００１）；Ｗｏｌｆａｒｔら（２００１））。重要なことには、本発明者らはまた、密度における機能的に関連する相違（Ｉｈ、ＩＡ、ＳＫ）および／または解剖学的かつ神経化学的に異なるＤＡサブグループにおける閾値下チャネルのゲート開閉特性（ＩＡ）を、同定している（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２０００）（２００１））。複合の定量的１細胞ＲＴ−ＰＣＲを伴うパッチクランプ技術（Ｌｉｓｓら（１９９９ｂ）；Ｌｉｓｓら（２００１））および定量的共焦点免疫組織化学（Ｗｏｌｆａｒｔら（２００１））は、以下の問題に焦点を絞るために使用される：
（ＤＡニューロンにおける異なったＩｈチャネル密度の分子的基礎）
ＨＣＮ２、ＨＣＮ３、ＨＣＮ４転写物の定量的１細胞分析および免疫細胞化学的分析は、適切な抗体を用いて、実行される。これらの実験は、共発現されるＨＣＮ２−４サブユニットのいずれがＤＡニューロンにおける体細胞樹状突起Ｉｈチャネルに関連するか、そして転写レベルの１つ以上のＨＣＮサブユニットが、本発明者らが同定したＤＡサブグループにおけるＩｈチャネル密度の大きな相違と関連するか否か、を規定する。規定されたＨＣＮ遺伝子の機能的確認のために、１細胞エレクトロポレーション（Ｈａａｓら（２００１））およびリボザイムベースの遺伝子抑制技術（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（２０００）；Ｌｉｕら（２０００））を、使用する。Ｉｈ電流を、同じニューロンにおけるＨＣＮサブタイプ特異的遺伝子抑制の前および後に比較する。比較のために、組換えＨＣＮチャネルの異種発現は、有用である。トランスジェニックマウスまたはＨＣＮノックアウトマウス出現の分析は、統合され得る。
【０４５７】
（ＤＡニューロンにおける異なるＡ型カリウムチャネル（Ｋｖ４チャネル）ゲート開閉の分子的基礎）
本発明者らは、全細胞および外側パッチにおいて、「古典的」ＤＡ  ＳＮニューロン（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００１））と比較して５倍低速の不活性化運動を示すＡ型カリウムチャネルを発現する、ＶＴＡにおけるＤＡサブグループを同定した。組換え型Ａチャネルにおける最近の研究は、Ｋｖ４βサブユニット（ＫＣｈｉＰ）の、体細胞樹状突起Ｋｖ４チャネルのゲート開閉性変更体（ｇａｔｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）としての重要な役割を示唆する（Ａｎら（２０００））。比較のためのＫＣｈｉＰ遺伝子ファミリーの複合かつ定量的なｍＲＮＡ１細胞発現プロフィール分析は、異なったＤＡサブグループにおいて行われる。免疫細胞化学的分析は、適切な抗体を用いて行われる。規定されたＫｖ４遺伝子およびＫＣｈｉＰ遺伝子の機能的確認のために、１細胞エレクトロポレーション（Ｈａａｓら（２００１））ならびにリボザイムベースの遺伝子抑制技術（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（２０００）；Ｌｉｕら（２０００））が、使用される。Ａ型カリウム電流は、同じニューロンにおけるＫｖ４／ＫＣｈｉｐサブタイプ特異的遺伝子抑制の前および後に比較される。比較のため、異側性のＫｖ４チャネル＋ＫＣｈｉＰチャネルの異種発現が、使用される。
【０４５８】
（ＤＡニューロンにおける、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル（Ｋ−ＡＴＰチャネル）による代謝ペースメーカー周波数制御）
パッチクランプ電気生理学と１細胞ＲＴ−ＰＣＲとの組み合わせ、およびＫｉｒ６．２ノックアウトマウス（Ｓｅｉｎｏら（２０００））を使用し、本発明者らは、ニューロンＫ−ＡＴＰチャネルの分子的特性およびそのグルコース感知における不可欠な機能（Ｍｉｋｉら（２００１））を、証明した。Ｋｉｒ６．２ＫＯマウス（Ｌｉｓｓら（２０００））のＤＡニューロンにおけるＫ−ＡＴＰチャネルの不在は、本発明者らの先行の１細胞ＲＴ−ＰＣＲ研究（Ｌｉｓｓら（１９９９ｂ））を確認した。本発明者らは、ここで、細胞結合性および穿孔性パッチクランプ記録由来の、ＤＡニューロンサブグループのペースメーカー周波数は、細胞外グルコース濃度の生理学的変動によって制御される実験的証拠を、有する。これは、幾つかのＤＡニューロンは、摂食に不可欠であり、（ＺｈｏｕおよびＰａｌｍｉｔｅｒ（１９９５）；Ｓｚｃｚｙｐｋａら（２０００）；Ｗａｎｇら（２００１））皮質微小循環を直接制御し得る（Ｋｒｉｍｅｒら（１９９８））ため、とりわけ重要である。グルコース感受性を規定するための穿孔性パッチクランプ記録と、その後の、グルコース感受性ＤＡニューロンの局所解剖学を規定するための細胞標識および免疫細胞化学（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２０００）；Ｗｏｌｆａｒｔら（２００１））との組み合わせが、使用される。ｍＲＮＡ発現プロフィール分析は、異なって発現する遺伝子の組（ＤＡサブグループをグルコース感受性にするＫ−ＡＴＰサブユニットを含む）を規定するために使用される。推定し得るミトコンドリアＫ−ＡＴＰチャネルの機能的役割は、Ｋｉｒ６．１ノックアウトマウスにおいて研究される。
【０４５９】
（ペースメーカー産生）
カルシウム依存性シグナル伝達複合体がペースメーカー発射のために必要な自発律動様小波（ＳＯＰ）の主要なジェネレーターであるという、次第に増加していく証拠が存在する（Ａｍｉｎｉ  ら（１９９９）；ＷｉｌｓｏｎおよびＣａｌｌａｗａｙ（２０００））。ＤＡニューロンにおける先行研究は、ＳＯＰ産生における、ニフェジピン感受性およびニッケル感受性の両カルシウムチャネルに関連する（Ｙｕｎｇら（１９９１）；Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄら（１９９３））。自発的カルシウム活性化カリウムチャネル（ＳＫチャネル）の仲介外部電流（細胞内備蓄からの自発的カルシウム放出により起こされる）もまた、記載されている（Ｓｅｕｔｉｎら（２０００））。加えて、ＤＡニューロンにおけるＧｑ結合チャネルまたは備蓄操作チャネル（ｓｔｏｒｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ）の存在の証拠も、存在する（Ｇｕａｔｔｅｏら（１９９９））。しかし、電圧ゲート開閉カルシウムチャネルおよびカルシウム活性化カリウムチャネル（ＳＫチャネル、ＢＫチャネル）と、細胞内カルシウムプールおよびその関連カルシウム放出（ＩＰ３レセプター、リアノジンレセプター）および原形質膜における備蓄操作チャネル（ＴＲＰＣ１−７）（Ｈａｒｔｅｎｅｃｋら（２０００）；Ｓｔｒｕｂｉｎｇら（２００１））の協力相互作用は、規定されずに残っている。その上、ＤＡニューロンにおけるこのシグナル伝達複合体の、不可欠な役割を担う物質の分子的性質を、決定する必要がある。本発明者らは、電圧ゲート開閉カルシウムチャネルの、機能、発現および局在、そのＢＫチャネルおよびＳＫチャネルへの共役、ならびに細胞内カルシウム放出チャネルおよび備蓄操作チャネルの役割および分子的性質を、研究することを提案する。インタクトなカルシウム操作条件下の、ＤＡニューロンを分析するための穿孔性パッチクランプ研究と、電圧ゲート開閉カルシウムチャネルおよび備蓄操作チャネルの生物物理学的研究および薬理学的研究との組み合わせが、使用される。本発明者らが異なった機能的発現型と異なったカルビンジン発現（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２０００，２００１））との間の相互関係を確立しているため、ＤＡニューロンの多様性は、再び考慮に入れるべきである。分子レベルにおいて、複合的かつ定量的な１細胞ＲＴ−ＰＣＲ技術（Ｌｉｓｓら（２００１））および免疫細胞化学（Ｗｏｌｆａｒｔら（２００１））が、シグナル伝達複合体の構成要素の発現および局在を決定するために適用される。共焦点カルシウム画像技術の適用は、カルシウムシグナル伝達複合体（ＤＡニューロンにおける自発的活性のジェネレーターを形成する（ＷｉｌｓｏｎおよびＣａｌｌａｗａｙ（２０００）））の、空間的および時間的局面のよりよい理解に、どのように寄与し得るかを調べるために評価される。
【０４６０】
（ＤＡニューロンにおける電圧ゲート開閉カルシウムチャネルの機能的、薬理学的かつ分子的特徴付け）
穿孔性および標準的全細胞型で、また、有核の、外側排出パッチクランプ記録が、ＤＡニューロンにおける電圧ゲート開閉カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）の生物物理的特性および薬理学的特性を規定するために、実行される（ＫａｎｇおよびＫｉｔａｉ（１９９３ｂ）；ＣａｒｄｏｚｏおよびＢｅａｎ（１９９５））。これらの機能的プロフィールを、異なったＤＡサブグループの範囲内に加えるため、これらはまた、細胞充填および免疫細胞化学と結合される。定性的複合的かつ定量的１細胞ＲＴ−ＰＣＲ分析は、（まず）重要なシナプス後αサブユニット（α１Ａ−Ｉ）のｍＲＮＡ発現プロフィールを、それぞれのＤＡサブグループにおいて規定し得る（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ（１９９８）；Ｌａｃｉｎｏｖａら（２０００））。ｍＲＮＡ発現プロフィールの結果に導かれるタンパク質レベルにおいて、カルシウムチャネル記録は、細胞充填およびαサブユニット選択的抗体による免疫染色の半定量的分析と組み合わせられる。特異的ＶＧＣＣの選択的薬理的阻害は、穿孔性パッチ電流クランプ記録において実行され、異なったＤＡサブグループにおける、ペースメーカー活性へのその特異的寄与を理解する。α１Ｄは、ＤＡニューロンにおいてＳＯＰを産生するニフェジピン感受性ＶＧＣＣの良い候補であるので（Ｔａｋａｄａら（２００１））、本発明者らの分析は、α１Ｄノックアウトマウス（Ｐｌａｔｚｅｒら（２０００））におけるＤＡペースメーカーの研究のために、拡大され得る。
【０４６１】
（カルシウム供給源（チャネルおよび細胞内プール）とカルシウムセンサー（ＳＫおよびＢＫチャネル）との間の電気生理学的結合研究）
周期産生（ｒｈｙｔｈｍｏｇｅｎｅｓｉｓ）におけるその直接のジェネレーターの役割に加え、ＶＧＣＣは、カルシウム流入（カルシウム感受性カリウムチャネル（ＳＫおよびＢＫなど）の活性を制御する）をも提供する（ＭａｒｒｉｏｎおよびＴａｖａｌｉｎ（１９９８））。ＳＫ３チャネルについて、本発明者らは、最近、このメカニズムが、ＤＡペースメーカーの周波数および精度制御に重要である（Ｗｏｌｆａｒｔら（２００１））ことを、示している。大コンダクタンス、カルシウムチャネルおよび電圧活性化カリウムチャネル（ＢＫチャネル）の、ペースメーカー制御への機能的寄与を評価するため、高度に選択的なＢＫペプチド遮断薬（イベリオトキシン（ｉｂｅｒｉｏｔｏｘｉｎ））が、ＤＡニューロンの穿孔性パッチ電流クランプ記録において、適用される。仮に、ＤＡ集団の間に興味深い機能的相違が発見される場合、さらなるｍＲＮＡ発現研究が開始される。カルシウム供給源をＳＫチャネルに提供するＶＧＣＣを薬理学的に規定するため、穿孔的パッチクランプ記録において、ハイブリッド−クランプ方法が、使用される。予備的結果は、ニッケル感受性Ｔ型ＶＧＣＣチャネル（α１Ｇ−Ｉチャネル）およびとＳＫ３チャネルとの間の高度に選択的な共役を示唆するが、Ｌ型、Ｎ型またはＰ／Ｑ型ＶＧＣＣチャネルの主要な役割をなんら示唆しない（ＷｏｌｆａｒｔおよびＲｏｅｐｅｒ（２００１））。これらの結果は、ＤＡニューロンにおけるＶＧＣＣチャネルの、高度に機能的な分化およびおそらく空間的組織を示唆する。加えて、ＳＫ活性化は、ＩＰ３およびリアノジンレセプターカルシウムチャネルの両方により仲介される細胞内プールからのカルシウム放出により、さらに増加され得る（Ｍｏｒｉｋａｗａら（２０００））。穿孔的パッチ記録において薬理学的ツールを利用する、ＤＡペースメーカーの周波数および精度制御におけるカルシウムプールの役割は、調査される。
【０４６２】
（ＤＡニューロンにおける備蓄操作チャネルの機能的役割および分子的性質？）
ＤＡニューロンにおける先行の証拠（Ｇｕａｔｔｅｏら（１９９９））および他のペースメーカー系の類推（Ｖａｎ  Ｇｏｏｒら（１９９９））に基づき、ＴＲＰＣ１−７遺伝子ファミリーの備蓄操作チャネルまたはＧαｑ活性化チャネル（Ｈａｒｔｅｎｅｃｋら（２０００））は、細胞内カルシウム振動と膜興奮性との間の重要な連結を、構成し得る。本発明者らは、その生物物理学的特性および薬理学的特性、Ｇｑタンパク質に結合される７回膜貫通型レセプターの活性化および直接備蓄消費の両方によるその制御、ならびにＴＲＰＣ遺伝子ファミリーの発現プロフィールによるその分子的性質を、規定することを望む。非摂動カルシウム操作による穿孔性パッチ記録は、ＤＡニューロンにおけるペースメーカー活性への、ＴＲＰＣチャネルの可能性のある機能的寄与を調査するために、不可欠であり得る。
【０４６３】
（高速および低速のシナプスシグナル伝達とペースメーカー活性との相互作用：発射の非ペースメーカー形式の生成）
ＤＡ中脳ニューロンの機能は、内因性のペースメーカーメカニズムと外因性高速（イオン透過型（ｉｏｎｏｔｏｒｏｐｉｃ））および低速（代謝型（ｍｅｔａｂｏｔｏｒｏｐｉｃ）のシナプス入力との相互作用によって、制御される（Ｋｉｔａｉら（１９９９））。ＤＡ機能に対するシナプス統合の重要性は、ＤＡニューロンにおける相バースト発射のシナプス生成（単一スパイクペースメーカーから劇的に発散する活性）により、最もよく例示され得る（ＯｖｅｒｔｏｎおよびＣｌａｒｋ（１９９７）；Ｌｏｋｗａｎら（１９９９））。バースト活性は、非常に非直線的な様式でドーパミン放出と連関されており、そして脳における相ＤＡシグナル伝達についての細胞等量は、報酬、認識および運動学習において重要であると考えられる（Ｓｃｈｕｌｚ（１９９８））。ＤＡニューロンにおいて、イオンチャネル型ＧＡＢＡ作動性（ＧＡＢＡｅｒｇｉｃ）シナプス入力およびグルタミン酸作動性（ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ）シナプス入力が、ペースメーカー機構のより遅い入力（例えば、ムスカリン調節入力および内在性コンダクタンス）といかに正確に相互作用してバースト活性を産生しているかは、未解明である（Ｋｉｔａｉら（１９９９））：１つの容易なメカニズムは、調節的入力（ＳＫチャネルの薬理学的阻害など、よりバースト発射を起こりやすくする）による、ＳＫチャネルの下流制御であり得る（Ｓｅｕｔｉｎら（１９９３））。ＤＡニューロンにおける発射パターンにおける、この重要な移行のメカニズムを理解することは、ＤＡニューロンのシナプス入力を研究する主要な動機である。異なるＤＡ部分集団は、インビボで、そのバースト発射の周波数における大きな相違を示し（Ｇｒｅｅｎｈｏｆｆら（１９８８））、この相違は、異なるシナプス入力および細胞体−樹状突起（ｓｏｍａｔｏ−ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）コンダクタンスの異なるセットの双方に依存し得る（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００１））。
【０４６４】
（異なるＤＡ部分集団へのグルタミン酸作動性入力およびＧＡＢＡ作動性入力の電気生理学的特徴付け）
ＤＡニューロンへのＧＡＢＡ作動性入力（ＨａｕｓｓｅｒおよびＹｕｎｇ（１９９４）；Ｔｅｐｐｅｒら（１９９５）；Ｃｅｌａｄａら（１９９９）；Ｓｃｈｗａｒｚｅｒら（２００１））およびグルタミン酸作動性入力の先行研究（Ｆｕｔａｍｉら（１９９５）；Ｇｏｔｚら（１９９７）；Ｉｒｉｂｅら（１９９９）；Ｃｈａｔｈａら（２０００））の以前の研究に基づき、その生物物理学的特性および薬理学的特性は、異なるＤＡ部分集団（細胞標識および免疫細胞化学によって同定される）において研究される。インビボでのＤＡニューロン集団の異なるバースト活性（Ｇｒｅｅｎｈｏｆｆら（１９８８））から見て、ＤＡ部分集団が、高速シナプス入力の型において異なっているか否かを、評価することが重要であり得る。これに関連して、ＮＭＤＡＲ１、ＧｌｕＲ１−４およびＧｌｕＲ７（全てのＤＡ中脳ニューロンにおいて存在する）とは対照的に、ＧｌｕＲ５は、選択的にＳＮにおいて発現するが、ＶＴＡ  ＤＡニューロンには存在しない（Ｂｉｓｈｏｆｆら（１９９７））ことに、留意することが重要である。サブユニット選択的ＧｌｕＲ５アンタゴニスト（Ｂｏｒｔｏｌｏｔｔｏら（１９９９））を使用して、ＳＮにおけるグルタミン作動性入力とＶＴＡにおけるグルタミン作動性入力との間の機能的相違が、探求され得る。
【０４６５】
（ＤＮニューロンにおける発射のタイミングおよびパターンについてのシナプス入力と閾値下コンダクタンスとの機能的相互作用）
シナプス的に誘導された活動電位は、ペースメーカー発射の間のイオンチャネルと比べて、イオンチャネルの異なるセットを補充する（Ｈａｕｓｓｅｒら（２０００））という、証拠が存在する。とりわけ、ＤＡ  ＳＮニューロンにおいて、これらのＥＰＳＰ媒介型活動電位は、カルシウムコンダクタンスをあまり活性化させず、結果的にカルシウム活性化カリウムチャネルをあまり活性化させないようである（Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ（１９９９））。閾値下イオンチャネル（Ｉｈチャネル（Ｍａｇｅｅ（１９９８，１９９９）、Ａ型チャネル（Ｈｏｆｆｍａｎら（１９９７）；ＳｃｈｏｐｐａおよびＷｅｓｔｂｒｏｏｋ（１９９９）および他のカリウムチャネル、ナトリウムチャネルおよびカルシウムチャネルなど）は、他のニューロンにおいて、シナプス入力の一時的および空間的な統合を形作り、そしてしばしば非直線的な様式において、入力の増幅するか、またはフィルタにかけることが、示されている（ＢｅｎｎｅｔおよびＷｉｌｓｏｎ（１９９８）；Ｈａｕｓｓｅｒら（２００１）；ＳｔｕａｒｔおよびＨａｕｓｓｅｒ（２００１）；ＦｒｉｃｋｅｒおよびＭｉｌｅｓ（２００２））。本発明者らは、異なるＤＡ集団におけるこれらのチャネルのレパートリーにおける重要な相違を定義しており（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２００１））、これらのチャネルは、おそらく異なる形態のシナプス統合を保有するようである。重要なことに、ＤＡ  ＳＮ  ニューロンは、非常に効率的な樹状突起活動電位の逆伝播（重要な構成要素としてイオンチャネル種の細胞体−樹状突起空間的分布に関係する）を有する（Ｈａｕｓｓｅｒら（１９９５））。シナプス入力の刺激された注入とシナプス入力の擬似注入の統合は、バースト開始状態に焦点を当て、標準的記録および／または樹状突起細胞全体の記録と薬理学的に絶縁された興奮性入力または阻害性入力の刺激とを組み合わせて（Ｋｉｔａｉら（１９９９））、調査される。本発明者らは、現実的形態学（Ｖｅｔｔｅｒら（２００１））および生物物理学的に正確なチャネルメカニズム（ＨｉｎｅｓおよびＣａｒｎｅｖａｌｅ（２０００））を有するＤＡニューロンのコンピューターモデルの構築が、バースト発射の生成において、実験的データを解釈すること、およびシナプスメカニズムおよびシナプス後メカニズムのおそらく複雑な相互作用を理解することを助け得ると予測する。
【０４６６】
（ＤＡニューロンにおけるペースメーカーおよびバースト活性に対する低速代謝型シナプスメカニズムの機能的役割）
イオンチャネル型シナプス入力と細胞体樹状突起イオンチャネルとの相互作用に加えて、これらのイオンチャネルのサブセットの調節もまた、ペースメーカーおよびバースト活性において、重要な役割を果たすという、幾つかの証拠が存在する。インビトロのＤＡニューロンにおいて、ＳＫチャネルの選択的薬理学的阻害は、ＮＭＤＡ誘導バースト様発射を大いに促進することが、言及されている（Ｓｅｕｔｉｎら（１９９３））。代謝型レセプター（ｍＧｌｕＲ１およびＭ１など）は、細胞内カルシウム放出の制御を介して、ＳＫ活性を調整することもまた、示唆されている（ＦｉｏｒｉｌｌｏおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（１９９８、２０００））。本発明者らは、ムスカリン様Ｍ１レセプターおよびｍＧｌｕＲ１レセプターの薬理学的調節と穿孔性パッチクランプ記録における興奮性シナプス刺激との組み合わせにより、この連結がバーストの開始と関連するか否かを調査することを望む。ＩｈチャネルおよびＭチャネルもまた、７回膜貫通型レセプター（Ｍ１および５−ＨＴを含む）による調節についての魅力的な標的である。
【０４６７】
（ＤＡ中脳ニューロンの分子的解剖学）
本発明者らは、異なるＤＡニューロン表現型の局所解剖学的マップを作成した（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２０００，２００１））。ドーパミン作動性投射の十分に確立された解剖学的および神経化学的な局所解剖学（ＧａｒｄｎｅｒおよびＡｓｈｂｙ（２０００）ＪｏｅｌおよびＷｅｉｎｅｒ（２０００））に基づいて、本発明者らのマップは、異なる機能的ＤＡ表現型が、異なる軸索の線条体画分、側座核、および前前頭皮質への標的化と相関することを示唆する。しかし、この潜在的な関連性は、１細胞レベルで実験的に試験される必要がある。
【０４６８】
（インビトロ脳切片パッチクランプ記録と組み合わされた逆行追跡研究）
最近、機能的にかつ神経科学的に同定された異なるＤＡ部分集団の軸索標的領域を定義するために、定位的に導かれる逆行トレーサ（まず蛍光ビーズ）を、ドーパミン作動性軸索の異なる標的領域（マウスにおいて、前前頭皮質に始まり、側座核（中核／鞘）および背側線条）に注入する（Ｍａｔｔｉａｃｅら（１９８９））。術後１〜２日に、動物を屠殺し、冠状中脳切片を調製する。蛍光標識された個々のニューロンを蛍光鏡検によって同定する。これらのＤＡニューロンの電気生理学的特性を、パッチクランプ記録および免疫組織化学的処理より標識された細胞において研究する。これは、同定された軸索投射を有するＤＡニューロンの機能的マップを作成し得、どの程度の、ＤＡニューロンの異なる機能的特性（ＩおよびＩＩを参照のこと）が、その軸索投射と同時分離されるかという重大な疑問を目標とする。
【０４６９】
（機能的特性および１細胞ＤＡニューロンの軸索結合性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）を研究するためのインビボ１細胞発現標識）
１細胞追跡研究は、例えば、ジャクスタセルラー（ｊｕｘｔａｃｅｌｌｕｌａｒ）方法（Ｂｅｖａｎら（１９９８））の確立によって行われているが、本発明者らは、インビボの単一ＤＡニューロンへのＧＦＰ発現ベクター（すなわち、自己増幅分子標識に基づく）の導入における、大きな有利性を理解する。先行のトランスジェニック研究（Ｆｅｎｇら（２０００））に基づき、本発明者らは、単一のＧＦＰ発現標識化ＤＡニューロンの細胞体樹状突起画分および軸索投射の、完全であるが選択的な標識を予期し得、同定された単一ＤＡニューロンの詳細な解剖学的分析を大いに促進し得る。新しい重要な技術である、１細胞エレクトロポレーションベースの遺伝子転移技術（Ｈａａｓら（２００１））は、インビトロの脳切片および器官型（ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ）切片培養において、最初に確立され得る。一旦、単一ＤＡニューロンに最適なエレクトロポレーション技術が、インビトロで確立されると、この技術は、細胞外または細胞内の１細胞記録と組み合わせて、インビボにおいて適用され得る。１細胞インビボＧＦＰ発現標識は、定義されたＤＡ部分集団（例えば、カルビンジン陽性背側層ＤＡ  ＳＮニューロン）の軸索投射の型とシナプス結合性パターンの型についての、本発明者らの知見を大いに拡大し得る。仮に成功すれば、このアプローチは、脳幹神経節の他の領域における標識単一ニューロンにもまた、適用され得る。
【０４７０】
（ＤＡニューロンの異なる軸索標的化および軸索分枝を制御する候補遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイリング）
軸索の選択的標的化および分枝の両方は、誘引（ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ）と相反（ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）に基づく、多くの相互作用ガイダンス分子（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）によって調整されるという、確証的な証拠が存在する（ＣｈｉｓｈｏｌｍおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ（１９９９）；ＢｒｏｓｅおよびＴｅｓｓｉｅｒ−Ｌａｖｉｇｎｅ（２０００））。ＤＡ軸索の、それぞれの線条画分および側座核画分ならびに皮質への異なる標的化パターンおよび分枝パターンを制御する分子ガイダンス合図については、殆ど知られていない（Ｙａｏら（１９９９））。ａ）に記載される逆行追跡研究は、異なる軸索標的を有するＤＡニューロンの機能的表現型に関する情報を提供し得る。この情報に基づくか、または逆行的に標識されたＤＡニューロンの直接的な細胞質ゾルの回収によって、単一ＤＡニューロンのｃＤＮＡプールは、定義された軸索標的と共に生成される。１細胞ＲＴ多重ＰＣＲプロトコールは、重要なガイダンス分子の発現プロフィールをプローブするために生成された。これらの研究は、中間線条体（ｍｅｓｏｓｔｒｉａｔａｌ）ＤＡニューロンと中間側座核（ｍｅｓｏａｃｃｕｍｂａｌ）ＤＡニューロンとの間の異なる標的化の機能的な役割としてのエフリン（ｅｐｈｒｉｎ）およびエフリンレセプターチロシンキナーゼファミリーに関する調査を含み、そして線条体マトリックス画分およびパッチ画分におけるエフリンの差次的な発現が報告されている（Ｊａｎｉｓら（１９９９）；Ｙｕｅら（１９９９））。最初の研究が成功する場合、このプロファイリングは、差次的な１細胞ｍＲＮＡ発現プロフィールを定義することを目的とする、他の主要なガイダンスタンパク質ファミリー（中間線条体ＤＡニューロン分子マーカー（パッチ対マトリックス）、中間辺縁系（ｍｅｓｏｌｉｍｂｉｃ）ＤＡニューロン分子マーカー（鞘対コア）および中間皮質（ｍｅｓｏｃｏｒｔｉｃａｌ）ＤＡニューロン分子マーカー）に、拡大される。
【０４７１】
（パーキンソン病のマウスモデルにおけるＤＡ中脳ニューロンの機能的および分子的な可塑性）
本発明は、脳における異なる機能的役割に関する、ＤＡ中脳ニューロンの生理学の正確な理解の提供に努める。この知見はまた、脳疾患状態の間に特定のＤＡ部分集団において起こる、関連した病理生理学的変化を同定するための詳細な枠組みを提供し得る。これらとしては、変更されたペースメーカー活性、変更されたシナプス入力およびシナプス統合、および、代謝経路または調節経路に対する変更された応答が、挙げられ得る。ドーパミン作動性神経変性の遺伝的モデルであるｗｅａｖｅｒマウスについて、本発明者らは、これらの変化がどのくらい劇的であり得るかを、証明している（Ｌｉｓｓら（１９９９ａ））。さらに、１細胞遺伝子型−表現型相互関係の定義は、病理生理学に寄与するこれらの遺伝子の同定を促進し得る。ｗｅａｖｅｒマウスについて、本発明者らは、ＳＵＲ１／Ｋｉｒ６．２媒介型Ｋ−ＡＴＰチャネルの重要な役割を同定している（Ｌｉｓｓら（１９９９ａ））。したがって、本発明者らは、脳疾患またはＤＡシグナル伝達を変更することが知られている慢性状態の病態生理学の、１細胞ベースの分析が、関連の細胞メカニズムおよび相関した遺伝子を同定するための有望なストラテジーであると考える。このアプローチは、パーキンソン病（Ｇｅｒｍａｎら（１９９６））、精神分裂症（Ｍｏｈｎら（１９９９）；Ｑｉａｏら（２００１））および薬物嗜癖（Ｓｏｒａら（１９９８）；Ｚｈｕａｎｇら（２００１））のマウスモデルにとって非常に有用である。ドーパミン作動性神経毒素ＭＰＴＰ（Ｂｅｚａｒｄら（１９９７））に基づく、ＰＤの慢性的神経毒物学的マウスモデルが調製され得る。ＰＤの慢性的ＭＰＴＰに基づくマウスモデルが、低急性毒性、選択的かつ進行性のＤＡ神経変性、安定的な運動表現型、および封入体の形成を組み合わせ得ること（Ｐｅｔｒｏｓｋｅら（２００１））を示す、最近改善されたプロトコールが使用され得る。モデルおよび基礎的分析的ツール（すなわち、ドーパミン神経化学、ＴＨ免疫組織化学、立体解析学的非バイアス細胞計数、ロータロッド試験の確立後、ＰＤモデルの異なる段階の、インビトロの脳切片におけるＤＡニューロンの機能的特性が、ＤＡニューロンの異なる型において起こる病理生理学的変化の経時的な順序を同定するために調査される。先行研究（Ｎｅｕｈｏｆｆら（２０００，２００１））に基づき、ＳＮおよびＶＴＡの４ＤＡ集団における表現型可塑性が比較される。非常に損傷性であるニューロン（腹側層カルビンジン陰性ＤＡ  ＳＮニューロン）は、より耐性なＤＡニューロン（背側層カルビンジン陽性ＤＡ  ＳＮニューロンおよびＤＡ  ＶＴＡニューロン）と比較される。機能的変化が、変性ＤＡニューロンにおいて、または生存ＤＡニューロンにおいて（代償性応答として）生じることが検出される場合、定量的１細胞ｍＲＮＡ発現プロファイリングおよび免疫細胞化学技術の利用に関連する遺伝子が、定義され得る。差し迫った変性または代償および生存と相関し得る、異なる病理生理学的ＤＡ表現型の同定は、本発明者らの比較遺伝的アプローチ（ＩＶを参照のこと）に利用される。
【０４７２】
本発明者らの先行研究（Ｌｉｓｓら（１９９９ｂ）；Ｌｉｓｓら（１９９９ａ）；Ｌｉｓｓら（２０００））に基づき、本発明者らは、Ｋ−ＡＴＰチャネルサブユニットの差次的発現が、ＤＡニューロンの異なる損傷性についての、分子候補メカニズムであることを提案する。これらの概念のインビボでの確認のために、Ｋｉｒ６．２ノックアウトマウスと野生型とを比較する、慢性ＭＰＴＰマウスモデル（上で記載）におけるＤＡ神経変性の程度およびパターンが研究される。本発明者らは、ＤＡニューロンおよび視床下部ニューロンにおける原形質膜Ｋ−ＡＴＰチャネルの完全欠損を、既に検証した（Ｌｉｓｓら（２０００）；Ｍｉｋｉら（２００１））。選択的ＤＡ神経変性におけるＫｉｒ６．２媒介型Ｋ−ＡＴＰチャネルの潜在的な役割が、インビボにおいて確認される場合、ＴＨプロモーター下でＫ−ＡＴＰチャネルサブユニットＫｉｒ６．２を発現するトランスジェニックマウスが作製され、そしてインビボレスキュー実験のために、Ｋｉｒ６．２ノックアウトマウスと交配される（Ｓｅｉｎｏら（２０００））。また、ＭＰＰ＋またはロテノンによって誘導されるミトコンドリア機能不全への応答における遺伝子発現は、ＤＮＡアレイベースの方法（ＩＶを参照のこと）を使用して、機能的Ｋ−ＡＴＰチャネルの存在または非存在において比較され、Ｋ−ＡＴＰチャネル依存性下流標的を規定し得る。推定し得るミトコンドリアＫ−ＡＴＰチャネルのノックアウトマウスモデル（Ｋｉｒ６．１）は、分析のために使用され得る。
【０４７３】
（パーキンソン病におけるＤＡニューロンの機能的ゲノミクス）
上で記載されるように、定性的かつ定量的なＰＣＲベースの１細胞発現プロファイリング技術を使用して、ＤＡ機能の分子メカニズムを同定する。同時にアッセイされ得る遺伝子の限られた数に起因して、その選択は、実験的観察により、直接的に指示されなければならない。しかし、ＤＮＡアレイ技術を使用する１細胞の非バイアスワイドスケール発現プロファイリングは、この限界を克服する。これは、異なる型のＤＡニューロンにおいて差次的に発現される候補遺伝子（生理学および病理生理学における差異の原因である）を同定するため、特に、幾つかのＤＡニューロンをＰＤにおける神経変性に対してより耐性にする、同時発現される遺伝子セットの同定において、非常に強力な手段である。限定要因は、主として、現在広く入手可能でありかつ十分に確立されているＤＮＡアレイ技術（ＥｐｓｔｅｉｎおよびＢｕｔｏｗ（２０００）；Ｈｕｇｈｅｓら（２０００））ではなく、１細胞ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのプールの直線的増幅の確かな方法である（Ｋａｃｈａｒｍｉｎａら（１９９９））。現在のアレイ技術について、数千個の遺伝子までのＤＮＡアレイ（オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡクローン）におけるハイブリダイゼーション分析のために、十分な開始物質を産生することが必要である。最近、数周期のアンチセンス（ａ）ＲＮＡ増幅（Ｅｂｅｒｗｉｎｅにより開発された（Ｋａｃｈａｒｍｉｎａら（１９９９）））に基づくより確かな１細胞増幅技術が、開始物質としての数百個の細胞と共に報告されている（Ｌｕｏら（１９９９））。本発明者らは、単一ＤＡニューロンのワイドスケール発現プロファイリングのための、確かなプロトコールを確立した。本発明者らは、現在、電気生理学的特徴付け、１細胞回収、および第一鎖ｃＤＮＡ合成について最適化されたプロトコールに寄与し、一方、本出願人は、ａＲＮＡ増幅プロトコールを提供し、ＤＮＡアレイ実験を行う。本発明者らの予備的な実験は、同じ部分集団のＤＡニューロンそれぞれに由来する、２０００個より多くの遺伝子のＤＮＡアレイ結果が、非常に類似の発現プロフィールを有した（ｒ＞０．９）ことを証明した。これらの知見に基づき、実験は、異なるＤＡ部分集団のｍＲＮＡ発現プロフィールのワイドスケールの系統的な比較を実行し、差次的に発現された遺伝子を同定する。まず、カルビンジン陽性ＤＡ集団およびカルビンジン陰性ＤＡ集団が、標的化され得る。なぜなら、これらは、回収前に、異なる電気生理学的フィンガープリントに基づいて同定することが可能であるからである。この実験の最初のセットは、おそらく非常に脆弱でありかつ耐性なＤＡニューロンにおいて差次的に発現される多くの遺伝子を同定するであろう。第二工程において、ＤＡニューロンの差次的な遺伝子発現が、ミトコンドリア機能不全への異なる電気生理学的応答により調査される（Ｌｉｓｓら（１９９９ｂ）；Ｌｉｓｓら（２０００））。差次的に発現される急性応答遺伝子は、おそらくＤＡニューロンの異なる損傷性に寄与するであろう。従って、最も有望な遺伝子が選択され、次いで、１細胞レベルでの差次的な発現の確証が調査される。同定された遺伝子の型（チャネル、レセプター、シグナル伝達タンパク質、転写因子、など）は、機能的分析のためのストラテジーを予測し得る。加えて、ＤＮＡアレイにより同定されたマウス損傷性遺伝子のヒトホモログの発現が調査される。コントロールの脳およびパーキンソン症候群の脳の固定された脳切片由来のＤＡニューロンのインサイチュハイブリダイゼーション、免疫細胞化学およびレーザー顕微解剖ベースのＲＴ−ＰＣＲ分析（Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら（１９９６）；ＳｃｈｕｔｚｅおよびＬａｈｒ（１９９８））が使用される。
【０４７４】
上の明細書中に記載される全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明に記載された方法および系の種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されているが、請求される本発明が、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことは、理解されるべきである。実際に、本発明を実行するための記載された様式の種々の改変（分子生物学または関連分野の当業者に明らかである）は、本発明に包含されることが、意図される。
【０４７５】
実施例によって、ドパミン放出の減少により軽減される障害を処置するための医薬の製造において、ドパミン作動性ニューロンをバースティングモードでなくさせ得、そして／またはドパミン作動性ニューロンがバースティングモードに入ることを防止し得る薬剤を、同定および／または開発するために、ここで、本発明の発見を利用することが可能であることが、予測される。
【０４７６】
同様に、ドパミン放出の減少により軽減される障害を処置するための医薬の製造において、ドパミン作動性ニューロンのカルシウムチャネルを通したカルシウム流出を増加し得、そして／またはドパミン作動性ニューロンのカリウムチャネルを通したカリウム流出を増加し得る薬剤を、同定および／または開発するために、ここで、本発明の発見を利用することが可能であることが、予測される。
【０４７７】
幾つかの場合において、ドパミン作動性ニューロンから減少ドパミン放出を生じさせる１つ以上の薬剤の投与後に、ドパミンレベルが望ましくなく低いか、または低くなりそうであることが見出され得る。次いで増加ドパミン放出を生じる薬剤が、提供され得る。別々の容器、ドパミン放出増加を生じ得る薬剤およびドパミン放出減少を生じ得る薬剤を含むキットが、提供され得る。これは、ドパミンレベルの調節において、有用であり得る。
【０４７８】
無論、ドパミン放出増加またはドパミン放出減少に基づく医学的使用に関する上述の議論が、ｍｕｔａｔｉｓ  ｍｕｔａｎｄｉｓを、処置の方法に適用することが、理解される。従って、本発明はまた、ヒトまたは非ヒト動物への、治療有効量の１つ以上の上で記載される薬剤の投与を含む、上で議論される障害の処置を含む。好ましくは、薬剤は、薬学的組成物として提供される。
【０４７９】
これらの局面について、上述の一般的教示は、等しく適用できる。
【０４８０】
【表１】
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【０４８１】
【表２】
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【０４８２】
【表３】
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【０４８３】
【表４】
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【０４８４】
【表５】
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【０４８５】
【表６】
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【０４８６】
【表７】
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【０４８７】
【表８】
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【０４８８】
【表９】
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【０４８９】
【表１０】
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【０４９０】
【表１１】
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【０４９１】
【表１２】
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【０４９２】
【表１３】
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【０４９３】
【表１４】
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【０４９４】
【表１５】
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【０４９５】
【表１６】
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【０４９６】
【表１７】
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【０４９７】
【表１８】
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【０４９８】
【表１９】
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【０４９９】
【表２０】
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【０５００】
【表２１】
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【０５０１】
【表２２】
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【０５０２】
【表２３】
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【０５０３】
【表２４】
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【図面の簡単な説明】
【０５０４】
【図１Ａ】図１−ａは、一連のグラフを示す。電位感受性カルシウムチャネル（Ｔ型、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型）のインヒビターに対する、ＡＨＰ電流に媒介されるＳＫの感度。ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、穿孔性パッチクランプ配列（記録電位−６０ｍＶ）を使用した２０ｍｓハイブリッドクランプの脱分極により、引き起こした。（ａ）低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（Ｔ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの大部分を可逆的に阻害した。（ｂ）コノトキシンＧＶＩＡ（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＧＶＩＡ）（１μＭ、Ｎ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの小さい方の部分を可逆的に減少させた。（ｃ）ニフェジピン（１０μＭ、Ｌ型）は、Ｉ−ＡＨＰに影響しなかった。（ｄ）ＦＴＸ−３．３（１μＭ、Ｐ／Ｑ型）は、Ｉ−ＡＨＰに何の影響も有さなかった（ｅのアガトキシンもまた参照のこと）。（ｅ）（ａ）〜（ｄ）においてのような実験の要旨は、ハイブリッドクランプによって起こされたコバルト感受性Ｉ−ＡＨＰが、低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（８５±９％、ｎ＝１３）およびミベフラジル（９４±１０％、ｎ＝６）に対して感受性のカルシウムチャネル（おそらくＴ型チャネル）によって優先的に活性化されたことを示す。Ｎ型チャネルの少量の寄与を、検出し（１μＭ  コノトキシンＧＶＩＡ、２６±３％、ｎ＝４）。Ｌ型およびＰ／Ｑ型は、ＳＫチャネルの活性化に対し、有意に寄与しなかった（１０μＭ  ニフェジピン：残留電流１０２±６％、ｎ＝６；１μＭ  ＦＴＸ−３．３：残留電流９７±５％  ｎ＝５；０．１μＭ  アガトキシンＴＫ：残留電流１０１±１％、ｎ＝３）。ＡＨＰ電流の振幅は、ミベフラジルが使用したコバルトブロックの平均値（１ｍＭ、残留電流２９％±４％、ｎ＝２９）であったことを除き、それぞれ個々の実験において、コバルト感受性構成要素に対して正規化した。（ａ）〜（ｄ）におけるスケールバーは、０．３ｓおよび２０ｐＡである。
【図１Ｂ】図１−ｂは、一連のグラフを示す。電位感受性カルシウムチャネル（Ｔ型、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型）のインヒビターに対する、ＡＨＰ電流に媒介されるＳＫの感度。ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、穿孔性パッチクランプ配列（記録電位−６０ｍＶ）を使用した２０ｍｓハイブリッドクランプの脱分極により、引き起こした。（ａ）低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（Ｔ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの大部分を可逆的に阻害した。（ｂ）コノトキシンＧＶＩＡ（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＧＶＩＡ）（１μＭ、Ｎ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの小さい方の部分を可逆的に減少させた。（ｃ）ニフェジピン（１０μＭ、Ｌ型）は、Ｉ−ＡＨＰに影響しなかった。（ｄ）ＦＴＸ−３．３（１μＭ、Ｐ／Ｑ型）は、Ｉ−ＡＨＰに何の影響も有さなかった（ｅのアガトキシンもまた参照のこと）。（ｅ）（ａ）〜（ｄ）においてのような実験の要旨は、ハイブリッドクランプによって起こされたコバルト感受性Ｉ−ＡＨＰが、低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（８５±９％、ｎ＝１３）およびミベフラジル（９４±１０％、ｎ＝６）に対して感受性のカルシウムチャネル（おそらくＴ型チャネル）によって優先的に活性化されたことを示す。Ｎ型チャネルの少量の寄与を、検出し（１μＭ  コノトキシンＧＶＩＡ、２６±３％、ｎ＝４）。Ｌ型およびＰ／Ｑ型は、ＳＫチャネルの活性化に対し、有意に寄与しなかった（１０μＭ  ニフェジピン：残留電流１０２±６％、ｎ＝６；１μＭ  ＦＴＸ−３．３：残留電流９７±５％  ｎ＝５；０．１μＭ  アガトキシンＴＫ：残留電流１０１±１％、ｎ＝３）。ＡＨＰ電流の振幅は、ミベフラジルが使用したコバルトブロックの平均値（１ｍＭ、残留電流２９％±４％、ｎ＝２９）であったことを除き、それぞれ個々の実験において、コバルト感受性構成要素に対して正規化した。（ａ）〜（ｄ）におけるスケールバーは、０．３ｓおよび２０ｐＡである。
【図１Ｃ】図１−ｃは、一連のグラフを示す。電位感受性カルシウムチャネル（Ｔ型、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型）のインヒビターに対する、ＡＨＰ電流に媒介されるＳＫの感度。ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、穿孔性パッチクランプ配列（記録電位−６０ｍＶ）を使用した２０ｍｓハイブリッドクランプの脱分極により、引き起こした。（ａ）低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（Ｔ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの大部分を可逆的に阻害した。（ｂ）コノトキシンＧＶＩＡ（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＧＶＩＡ）（１μＭ、Ｎ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの小さい方の部分を可逆的に減少させた。（ｃ）ニフェジピン（１０μＭ、Ｌ型）は、Ｉ−ＡＨＰに影響しなかった。（ｄ）ＦＴＸ−３．３（１μＭ、Ｐ／Ｑ型）は、Ｉ−ＡＨＰに何の影響も有さなかった（ｅのアガトキシンもまた参照のこと）。（ｅ）（ａ）〜（ｄ）においてのような実験の要旨は、ハイブリッドクランプによって起こされたコバルト感受性Ｉ−ＡＨＰが、低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（８５±９％、ｎ＝１３）およびミベフラジル（９４±１０％、ｎ＝６）に対して感受性のカルシウムチャネル（おそらくＴ型チャネル）によって優先的に活性化されたことを示す。Ｎ型チャネルの少量の寄与を、検出し（１μＭ  コノトキシンＧＶＩＡ、２６±３％、ｎ＝４）。Ｌ型およびＰ／Ｑ型は、ＳＫチャネルの活性化に対し、有意に寄与しなかった（１０μＭ  ニフェジピン：残留電流１０２±６％、ｎ＝６；１μＭ  ＦＴＸ−３．３：残留電流９７±５％  ｎ＝５；０．１μＭ  アガトキシンＴＫ：残留電流１０１±１％、ｎ＝３）。ＡＨＰ電流の振幅は、ミベフラジルが使用したコバルトブロックの平均値（１ｍＭ、残留電流２９％±４％、ｎ＝２９）であったことを除き、それぞれ個々の実験において、コバルト感受性構成要素に対して正規化した。（ａ）〜（ｄ）におけるスケールバーは、０．３ｓおよび２０ｐＡである。
【図１Ｄ】図１−ｄは、一連のグラフを示す。電位感受性カルシウムチャネル（Ｔ型、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型）のインヒビターに対する、ＡＨＰ電流に媒介されるＳＫの感度。ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、穿孔性パッチクランプ配列（記録電位−６０ｍＶ）を使用した２０ｍｓハイブリッドクランプの脱分極により、引き起こした。（ａ）低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（Ｔ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの大部分を可逆的に阻害した。（ｂ）コノトキシンＧＶＩＡ（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＧＶＩＡ）（１μＭ、Ｎ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの小さい方の部分を可逆的に減少させた。（ｃ）ニフェジピン（１０μＭ、Ｌ型）は、Ｉ−ＡＨＰに影響しなかった。（ｄ）ＦＴＸ−３．３（１μＭ、Ｐ／Ｑ型）は、Ｉ−ＡＨＰに何の影響も有さなかった（ｅのアガトキシンもまた参照のこと）。（ｅ）（ａ）〜（ｄ）においてのような実験の要旨は、ハイブリッドクランプによって起こされたコバルト感受性Ｉ−ＡＨＰが、低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（８５±９％、ｎ＝１３）およびミベフラジル（９４±１０％、ｎ＝６）に対して感受性のカルシウムチャネル（おそらくＴ型チャネル）によって優先的に活性化されたことを示す。Ｎ型チャネルの少量の寄与を、検出し（１μＭ  コノトキシンＧＶＩＡ、２６±３％、ｎ＝４）。Ｌ型およびＰ／Ｑ型は、ＳＫチャネルの活性化に対し、有意に寄与しなかった（１０μＭ  ニフェジピン：残留電流１０２±６％、ｎ＝６；１μＭ  ＦＴＸ−３．３：残留電流９７±５％  ｎ＝５；０．１μＭ  アガトキシンＴＫ：残留電流１０１±１％、ｎ＝３）。ＡＨＰ電流の振幅は、ミベフラジルが使用したコバルトブロックの平均値（１ｍＭ、残留電流２９％±４％、ｎ＝２９）であったことを除き、それぞれ個々の実験において、コバルト感受性構成要素に対して正規化した。（ａ）〜（ｄ）におけるスケールバーは、０．３ｓおよび２０ｐＡである。
【図１Ｅ】図１−ｅは、一連のグラフを示す。電位感受性カルシウムチャネル（Ｔ型、Ｌ型、Ｎ型、Ｐ／Ｑ型）のインヒビターに対する、ＡＨＰ電流に媒介されるＳＫの感度。ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、穿孔性パッチクランプ配列（記録電位−６０ｍＶ）を使用した２０ｍｓハイブリッドクランプの脱分極により、引き起こした。（ａ）低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（Ｔ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの大部分を可逆的に阻害した。（ｂ）コノトキシンＧＶＩＡ（Ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ  ＧＶＩＡ）（１μＭ、Ｎ型）は、これに対して、コバルト感受性Ｉ−ＡＨＰの小さい方の部分を可逆的に減少させた。（ｃ）ニフェジピン（１０μＭ、Ｌ型）は、Ｉ−ＡＨＰに影響しなかった。（ｄ）ＦＴＸ−３．３（１μＭ、Ｐ／Ｑ型）は、Ｉ−ＡＨＰに何の影響も有さなかった（ｅのアガトキシンもまた参照のこと）。（ｅ）（ａ）〜（ｄ）においてのような実験の要旨は、ハイブリッドクランプによって起こされたコバルト感受性Ｉ−ＡＨＰが、低マイクロモル濃度（１００μＭ）のニッケル（８５±９％、ｎ＝１３）およびミベフラジル（９４±１０％、ｎ＝６）に対して感受性のカルシウムチャネル（おそらくＴ型チャネル）によって優先的に活性化されたことを示す。Ｎ型チャネルの少量の寄与を、検出し（１μＭ  コノトキシンＧＶＩＡ、２６±３％、ｎ＝４）。Ｌ型およびＰ／Ｑ型は、ＳＫチャネルの活性化に対し、有意に寄与しなかった（１０μＭ  ニフェジピン：残留電流１０２±６％、ｎ＝６；１μＭ  ＦＴＸ−３．３：残留電流９７±５％  ｎ＝５；０．１μＭ  アガトキシンＴＫ：残留電流１０１±１％、ｎ＝３）。ＡＨＰ電流の振幅は、ミベフラジルが使用したコバルトブロックの平均値（１ｍＭ、残留電流２９％±４％、ｎ＝２９）であったことを除き、それぞれ個々の実験において、コバルト感受性構成要素に対して正規化した。（ａ）〜（ｄ）におけるスケールバーは、０．３ｓおよび２０ｐＡである。
【図２Ａ】図２−ａは、一連のグラフを示す。ＳＫ媒介ＡＨＰ電流およびＴ型チャネルは、ドパミン作動性ニューロンと非常によく似たニッケル感受性およびミベフラジル感受性を保有する。（ａ）ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、穿孔パッチクランプ配置（記録電位−６０ｍＶ）を使用した２０ｍｓハイブリッドクランプの脱分極により、起こした。ニッケルは、濃度依存的様式において、ほとんどのコバルト感受性（図１参照）Ｉ−ＡＨＰを減少させた。ニッケルＩ−ＡＨＰ阻害の平均用量応答は、３３．８μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数および１．３のＨｉｌｌ係数（ｎ＝３）によって表された。（ｂ）ミベフラジルは、主要成分のＩ−ＡＨＰを、不可逆的に阻害した。ミベフラジルＩ−ＡＨＰ阻害の平均用量応答は、５．９μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数１．８、ｎ＝１９）で表された。（ｃ）−１００ｍＶの維持電位から−５０ｍＶまでの脱分極によって起こした低圧活性化カルシウム電流（Ｉ−ＬＶＡ）を、標準的な全細胞読み出し（他の電流の遮断は、方法を参照のこと）を使用して記録した。ニッケルは、濃度依存的様式において、Ｉ−ＬＶＡを減少させた。ニッケルＩ−ＬＶＡ阻害の平均用量応答は、３３．９μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数０．９、（ｎ＝２６））によって表された。（ｂ）ミベフラジルは、Ｉ−ＬＶＡを、不可逆的に阻害した。ミベフラジルＩ−ＬＶＡ阻害の平均用量応答は、４．６μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数２．３、ｎ＝１８）で表された。（ａ）〜（ｂ）におけるスケールバーは、０．３秒および２０ｐＡであり、そして（ｃ）〜（ｄ）におけるスケールバーは、０．３秒および５００ｐＡである。
【図２Ｂ】図２−ｂは、一連のグラフを示す。ＳＫ媒介ＡＨＰ電流およびＴ型チャネルは、ドパミン作動性ニューロンと非常によく似たニッケル感受性およびミベフラジル感受性を保有する。（ａ）ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、穿孔パッチクランプ配置（記録電位−６０ｍＶ）を使用した２０ｍｓハイブリッドクランプの脱分極により、起こした。ニッケルは、濃度依存的様式において、ほとんどのコバルト感受性（図１参照）Ｉ−ＡＨＰを減少させた。ニッケルＩ−ＡＨＰ阻害の平均用量応答は、３３．８μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数および１．３のＨｉｌｌ係数（ｎ＝３）によって表された。（ｂ）ミベフラジルは、主要成分のＩ−ＡＨＰを、不可逆的に阻害した。ミベフラジルＩ−ＡＨＰ阻害の平均用量応答は、５．９μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数１．８、ｎ＝１９）で表された。（ｃ）−１００ｍＶの維持電位から−５０ｍＶまでの脱分極によって起こした低圧活性化カルシウム電流（Ｉ−ＬＶＡ）を、標準的な全細胞読み出し（他の電流の遮断は、方法を参照のこと）を使用して記録した。ニッケルは、濃度依存的様式において、Ｉ−ＬＶＡを減少させた。ニッケルＩ−ＬＶＡ阻害の平均用量応答は、３３．９μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数０．９、（ｎ＝２６））によって表された。（ｂ）ミベフラジルは、Ｉ−ＬＶＡを、不可逆的に阻害した。ミベフラジルＩ−ＬＶＡ阻害の平均用量応答は、４．６μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数２．３、ｎ＝１８）で表された。（ａ）〜（ｂ）におけるスケールバーは、０．３秒および２０ｐＡであり、そして（ｃ）〜（ｄ）におけるスケールバーは、０．３秒および５００ｐＡである。
【図２Ｃ】図２−ｃは、一連のグラフを示す。ＳＫ媒介ＡＨＰ電流およびＴ型チャネルは、ドパミン作動性ニューロンと非常によく似たニッケル感受性およびミベフラジル感受性を保有する。（ａ）ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、穿孔パッチクランプ配置（記録電位−６０ｍＶ）を使用した２０ｍｓハイブリッドクランプの脱分極により、起こした。ニッケルは、濃度依存的様式において、ほとんどのコバルト感受性（図１参照）Ｉ−ＡＨＰを減少させた。ニッケルＩ−ＡＨＰ阻害の平均用量応答は、３３．８μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数および１．３のＨｉｌｌ係数（ｎ＝３）によって表された。（ｂ）ミベフラジルは、主要成分のＩ−ＡＨＰを、不可逆的に阻害した。ミベフラジルＩ−ＡＨＰ阻害の平均用量応答は、５．９μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数１．８、ｎ＝１９）で表された。（ｃ）−１００ｍＶの維持電位から−５０ｍＶまでの脱分極によって起こした低圧活性化カルシウム電流（Ｉ−ＬＶＡ）を、標準的な全細胞読み出し（他の電流の遮断は、方法を参照のこと）を使用して記録した。ニッケルは、濃度依存的様式において、Ｉ−ＬＶＡを減少させた。ニッケルＩ−ＬＶＡ阻害の平均用量応答は、３３．９μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数０．９、（ｎ＝２６））によって表された。（ｂ）ミベフラジルは、Ｉ−ＬＶＡを、不可逆的に阻害した。ミベフラジルＩ−ＬＶＡ阻害の平均用量応答は、４．６μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数２．３、ｎ＝１８）で表された。（ａ）〜（ｂ）におけるスケールバーは、０．３秒および２０ｐＡであり、そして（ｃ）〜（ｄ）におけるスケールバーは、０．３秒および５００ｐＡである。
【図２Ｄ】図２−ｄは、一連のグラフを示す。ＳＫ媒介ＡＨＰ電流およびＴ型チャネルは、ドパミン作動性ニューロンと非常によく似たニッケル感受性およびミベフラジル感受性を保有する。（ａ）ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、穿孔パッチクランプ配置（記録電位−６０ｍＶ）を使用した２０ｍｓハイブリッドクランプの脱分極により、起こした。ニッケルは、濃度依存的様式において、ほとんどのコバルト感受性（図１参照）Ｉ−ＡＨＰを減少させた。ニッケルＩ−ＡＨＰ阻害の平均用量応答は、３３．８μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数および１．３のＨｉｌｌ係数（ｎ＝３）によって表された。（ｂ）ミベフラジルは、主要成分のＩ−ＡＨＰを、不可逆的に阻害した。ミベフラジルＩ−ＡＨＰ阻害の平均用量応答は、５．９μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数１．８、ｎ＝１９）で表された。（ｃ）−１００ｍＶの維持電位から−５０ｍＶまでの脱分極によって起こした低圧活性化カルシウム電流（Ｉ−ＬＶＡ）を、標準的な全細胞読み出し（他の電流の遮断は、方法を参照のこと）を使用して記録した。ニッケルは、濃度依存的様式において、Ｉ−ＬＶＡを減少させた。ニッケルＩ−ＬＶＡ阻害の平均用量応答は、３３．９μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数０．９、（ｎ＝２６））によって表された。（ｂ）ミベフラジルは、Ｉ−ＬＶＡを、不可逆的に阻害した。ミベフラジルＩ−ＬＶＡ阻害の平均用量応答は、４．６μＭのＩＣ５０によるＨｉｌｌ関数（Ｈｉｌｌ係数２．３、ｎ＝１８）で表された。（ａ）〜（ｂ）におけるスケールバーは、０．３秒および２０ｐＡであり、そして（ｃ）〜（ｄ）におけるスケールバーは、０．３秒および５００ｐＡである。
【図３】図３−ａは、一連のグラフを示す。図３−ｂは、一連のグラフを示す。図３−ｃは、一連のグラフを示す。ＳＫ型電流およびＴ型電流の用途依存性不活性化は、類似の動力学を示す。（ａ）ＡＨＰ電流（Ｉ−ＡＨＰ）を、標準的な全細胞形状（記録電位−８０ｍＶ）を使用した１Ｈｚの周波数でのハイブリッドクランプの脱分極（１００ｍｓ、＋６０ｍＶ）により起こした。継時的なＡＨＰ電流は、減少し、最初の振幅の３８％で定常状態レベルに達した。累積不活性化の時定数は、１．２６秒であった。スケールバーは、０．５秒および５０ｐＡである。（ｂ）（ａ）のように同圧パルスプロトコールにより起こされた、低圧活性化電流（Ｉ−ＬＶＡ）の、標準的な全細胞形状およびカルシウムチャネル記録溶液（方法参照）を使用した記録。１Ｈｚにおける継時的活性化は、Ｉ−ＬＶＡを減少に導き、４２％の定常状態レベルに達した。用途依存性不活性化の時定数は、０．７７秒であった。スケールバーは、０．５秒および２００ｐＡである。（ｃ）累積不活性化の時定数（τ）は、（ａ）〜（ｂ）におけるような実験により、決定された。ＬＶＡおよびＡＨＰの両電流は、１秒の範囲内の累積不活性化時定数を有している：Ｉ−ＬＶＡ、０．８０±０．０７秒（ｎ＝１０）およびＩ−ＡＨＰ、１．０４±０．０３秒（ｎ＝６１、ｐ＜０．０５）。（ｄ）活性電位の列の穿孔電流クランプ記録は、−８０ｍＶの過剰分極化膜電位から４秒間の１０ｐＡの注入により起こされる。最初の脱分極ＡＨＰは大きく、そして継時的活性電位を用いて、定常状態（ｓｔｓｔ）まで減少した。ニッケル（２５０μＭ）の適用は、ＡＨＰ振幅および累積不活性化の効果を減少させた。累積ＡＨＰ不活性化（τ＝１．１０秒）のコントロール率が、Ｉ−ＡＨＰおよびＩ−ＬＶＡについて決定された時定数（上を参照）と同様であったことに留意する。スケールバーは、０．５秒および１０ｍＶである。（ｅ）（ｄ）におけるような実験の要旨。これは、ＡＨＰがコントロール条件（２．０±０．１、ｎ＝８）下で２倍減少し、一方、ニッケルの適用により影響が無くなった（１．１±０．１、ｎ＝８、ｐ＜０．０００５）ことを示す。
【図４】図４−ａは、一連のグラフを示す。図４−ｂは、一連のグラフを示す。図４−ｃは、一連のグラフを示す。図４−ｄは、一連のグラフを示す。ニッケル感受性Ｔ型チャネルおよびアパミン感受性ＳＫチャネルは、ドパミン作動性ニューロンにおいて、高精度のペースメーカースパイキングを維持している。（（ａ）〜（ｃ））（ａ）コントロール、（ｂ）１００μＭニッケル、および（ｃ）３００ｎＭアパミンの適用の間の、穿孔電流クランプ記録。左のパネルは、それぞれの条件で記録した代表的な５分間の４秒の記録追跡を示す。スパイク間隔（ＩＳＩ）の頻度分布を、各記録について右側のパネルで表わす。ペースメーカーの精度の測定として、変動係数（ＣＶ）を、ＩＳＩヒストグラムのガウス適合から計算した。点線は、−５０ｍＶである。スケールバーは、０．５秒および１０ｍＶである。活動電位は、−２０ｍＶで切断される。（ａ）コントロール条件の間、ペースメーカーのスパイキングは１５％のＣＶと非常に規則的であった。（ｂ）１００μＭのニッケルの可逆的な適用は、ペースメーカーのスパイキングを不規則にした（ＣＶ＝３８％）。（ｃ）３００ｎＭのアパミンの適用は、ペースメーカーのスパイキングの不規則性を、同程度に増した（ＣＶ＝３５％）。（ｄ）（ａ）〜（ｃ）における実験の要旨は、ニッケル（１００μＭ）およびアパミン（３００ｎＭ）が、ペースメーカーの精度（それぞれｐ＜０．００５）を減少させ、同様に増大させる（ｐ＞０．８）ことを示す。平均ＣＶ：コントロール１４±２％（ｎ＝１１）、ニッケル２７±５％（ｎ＝１１）およびアパミン２６±４％（ｎ＝１１）。
【図５】図５−ａは、一連のグラフを示す。図５−ｂは、一連のグラフを示す。図５−ｃは、一連のグラフを示す。図５−ｄは、一連のグラフを示す。図５−ｅは、一連のグラフを示す。Ｔ型チャネルの阻害は、ドパミン作動性中脳ニューロンの部分集団においてバースティングを起こす。（（ａ）〜（ｃ））（ａ）コントロール、（ｂ）ニッケル、および（ｃ）洗浄条件の間の、穿孔電流クランプ記録。５分の記録の代表的な２０秒の記録追跡が、それぞれの条件について示される。ペースメーカーの精度の測定として、変動係数（ＣＶ）を、ＩＳＩヒストグラムのガウス適合から計算した（示さず：図４を参照）。点線は、−５０ｍＶである。スケールバーは、１秒および１０ｍＶである。（ａ）このニューロンは、下端にて、発射精度（ｆｉｒｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）のペースメーカーのスパイキングを示した（ＣＶ＝２０％、図４と比較のこと）。（ｂ）１００μＭのニッケルの適用は、発射パターンをペースメーカーからバーストに変えた（長いバースト間隔と交互の、２〜３の近接した間隔をあけた活動電位）。（ｃ）ニッケルの洗浄の際に、発射パターンは、（不規則な）ペースメーカースパイキングパターンに戻った。（ｄ）（ａ）〜（ｄ）および図４の穿孔パッチクランプ記録の間の発射パターンを、バースト検出プログラム（方法を参照のこと）によって評価した（このプログラムは、記録ごとの活動電位の総数により基準化したバーストに関与する活動電位を計数する（％バースティング（例えば、Ｃで示す記録については、８５％バースティング）））。点線は、７５％のバースティングを示す。コントロール条件下で、バースティング値（ｂｕｒｓｔｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）は０％であった（ｎ＝３０）。３００ｎＭアパミンの適用は、１つの細胞が短時間の「バースト様」パターンに起因して増加した値（４５％）を示したが、バースティング値を優位に変化させなかった（３±２％、ｎ＝１９）。１００μＭニッケルによるＴ型チャネルの阻害は、バースティング値を１２±６％（ｎ＝２７、ｐ＜０．０５）まで有意に増加させ、そして３つの細胞は、８４％を超えるバースティング値を示した。ニッケルおよびアパミンの組み合わせの適用（ｎｉ＋ａｐａ）は、ペースメーカーからバースティング挙動への変換において最も有効であり、平均バースティング値を３４±１０％（ｎ＝１６、ｐ＜０．０００５）にまで増加させ、５つのニューロンは、８６％より高いバースティング値に達した。（ｅ）発射パターンに対するＴ型チャネル阻害の差示的な効果は、コントロール条件下での、ペースメーカー精度に関連する（この図を図４と比較する）。コントロールＣＶ値は、それぞれの細胞の発射パターンに対するニッケルおよびアパミンの適用の効果に関与する：バースティングに変換されたニューロンは、ニッケル（またはニッケル＋アパミン）適用において不規則になった細胞（１４±１％、ｎ＝２２、ｐ＜０．０００５）と比較して、有意に高いＣＶ値を有する（２５±４％、ｎ＝６）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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