(57)【要約】本発明は、内皮機能障害を併発する疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退に向けた薬剤製造へのプロテアソーム阻害剤の使用に関する。本発明は低用量療法としてのプロテアソーム阻害剤の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮機能障害に伴う疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退に向けた薬剤製造のための少なくとも１種類のプロテアソーム阻害剤の使用。
【請求項２】
内皮機能障害に伴う疾患が非インスリン関連疾患であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
内皮機能障害がアテローム性動脈硬化症、特に冠動脈硬化症および冠動脈疾患に併発することを特徴とする請求項1または2に記載の使用。
【請求項４】
内皮機能障害が心不全に併発することを特徴とする請求項1または2に記載の使用。
【請求項５】
末梢動脈閉塞性疾患などの虚血性疾患、例えば重篤な下肢虚血、心筋梗塞および臓器、例えば腎臓、脾臓、脳、肺の虚血性疾患を含む群から選択される疾患に内皮機能障害が伴発することを特徴とする請求項1または2に記載の使用。
【請求項６】
プロテアソーム阻害剤が、
ａ）C-末端にエポキシケトン構造を持つペプチド誘導体、β-ラクトン誘導体、アクラシノマイシンA、ラクタシスチン、クラストラクタシステインを含む天然産のプロテアソーム阻害剤；
ｂ）修飾ペプチドアルデヒド、例えばN-カルボベンゾキシ-L-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ロイシナル（MG132またはzLLLとも呼ぶ）、またはMG232のボロン酸誘導体、N-カルボベンゾキシ-Leu-Nva-H（MG115とも呼ぶ）、N-アセチル-L-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ノルロイシナル（LLnLとも呼ぶ）、N-カルボベンゾキシ-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H（PS1とも呼ぶ）
を含む合成プロテアソーム阻害剤；
ｃ）α,β-エポキシケトン構造、ビニル-スルフォン、例えばカルボベンゾキシL-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ロイシン-ビニル-スルフォンまたは4-ヒドロキシ-5-ヨード-3-ニトロフェニルアセチル-L-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ロイシン-ビニル-スルフォン（NLVS)を含むペプチド；
ｄ）グリオキザル-またはボロン酸残基、例えばピラジル-CONH(CHPhe)CONH(CHイソブチル)B(OH)2およびジペプチジルボロン酸誘導体；
ｅ）ピナコール-エステル、例えばベンジルオキシカルボニル(CbZ)-Leu-ロイボロ-Leu-ピナコール-エステル
を含む群から選択されることを特徴とする前記請求項1または2に記載の使用。
【請求項７】
プロテアソーム阻害剤が、ペプチジル-ホウ酸誘導体としてのPS-314、即ちN-ピラジネカルボニル-L-フェニルアラニン-L-ロイシン-ホウ酸（C19H25BN4O4)；β-ラクトン誘導体およびラクタシスチン誘導体としてのPS-519、即ち1R-[1S,4R, 5S]-1-(1-ヒドロキシ-2メチルプロピル)-4-プロピル-6-オキサ-2アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン-3,7-ジオン（C12H19NO4)；PS-273（モルフォリン-CONH-(CH-ナフチル)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2)およびそのエナンチオマー；PS-293；PS-296（8-キノリル-スルフォニル-CONH-(CH-ナフチル)-CONH(-CH-イソブチル)-B(OH)2)；PS-303 (NH2(CH-ナフチル)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2； (モルフォリン-CONH-(CH-ナフチル)-CONH-(CH-フェニルアラニン)-B(OH)2)としてのPS-321；PS-334 (CH3-NH-(CH-ナフチル -CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2)； PS-325(2-キノル-CONH-(CH-ホモ-フェニルアラニン)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2；PS-352 (フェニルアラニン-CH2-CH2-CONH-(CH-イソブチル)l-B(OH)2；PS-383(ピリジル-CONH-(CHpF-フェニルアラニン)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2)；PS-341；およびPS-1 Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-CHO；PS-2 [ベンジルオキシカルボニル)-Leu-Leu-フェニルアラニナルまたはZ-LLF-CHOまたはZ-Leu-Leu-Phe-CHOPS-1；β-ラクトン-およびラクタシスチン誘導体としてのPS-519、即ち1R-[1S,4R, 5S]-1-(1-ヒドロキシ-2メチルプロピル)-4-プロピル-6-オクサ-2アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン-3,7-ジオン(C12H19NO4)；エポキソマイシン(C28H86N4O7) およびエポネマイシン(C20H36N2O5)
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか1項に記載の使用。
【請求項８】
プロテアソーム阻害剤が、ペプチドアルデヒド、ペプチドボロネート、ペプチドビニルスルフォン、ペプチドエポキシケトン、ラクタシスチン、ペプチドα-ケトンアルデヒド、α-ケトアミド、インダノンペプチド、ポリアルキレンアルデヒド、カテキン-3-ガレートなどのポリフェノールを含む群から選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
プロテアソーム阻害剤が、Z-Leu-Leu-Leu-al (MG132)、Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-al (PS-1)、CEP1612、ピラジルカルボニル-Phe-Leu-ボロネート(PS-341)、ダンシル-Phe-Leu-ボロネート (DFLB)、モルフォリノナフチルアラニン-Leu-ボロネート(MG273)、NIP-Leu3-ビニルスルフォン(NLVS)、Tyr-Leu3-VS、NIP-Leu-Leu-Asn-VS、Ada-Tyr-Ahx3-Leu3-VS、Ada-Lys(ビオ)-Ahx3-Leu3-VS、Ac(Me)-Ile-Ile-Thr-Leu-EX(エポキソマイシン)、ジヒドロエポネマイシン、ラクタシスチン、クラスト-ラクタシスチン-ベータ-ラクトン(オムラライド)、PS-519、Ac-Leu-Leu-Nle-al(ALLN)、3,4-ジクロロ-イソクマリン(DCI)、4-(2-アミノエチル)-ベンゾールスルフォニルフルオライド(ペファブロック SC)、TMC-95-A、グリオトキシン、(-)エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、リトナビア、ロバスタチン、アクラシノマイシンA (アクラルビシン)、シクロスポリンを含む群から選択される（この場合、Z はベンジルオキシカルボニルを示し、alはアルデヒドを示し、VSはビニルスルフォンを示し、NIPは3-ニトロ-4-ヒドロキシ-5-ヨードフェニルアセテートを示し、ビオはビオチンを示す）ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
プロテアソーム阻害剤がプロテアソーム複合体の少なくとも１個の成分の遺伝子発現を阻害することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
プロテアソーム遺伝子発現を阻害するプロテアソーム阻害剤が、アンチセンスRNA、二本鎖RNAおよび少なくとも１個のプロテアソーム複合体成分をコード化するDNA配列とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを含む群から選択されることを特徴とする請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
プロテアソーム遺伝子発現を阻害するプロテアソーム阻害剤がノックアウトコンストラクトを含む群から選択されることを特徴とする請求項10または11に記載の使用。
【請求項１３】
疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退に向けた薬剤の製造への少なくとも１種類のプロテアソーム阻害剤の使用であって、対象患者に提供するプロテアソーム阻害剤の用量がナノモルの範囲であることを特徴とする少なくとも１種類のプロテアソーム阻害剤の使用。
【請求項１４】
疾患が内皮機能障害を併発することを特徴とする請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
内皮機能障害を伴う疾患が非インスリン関連疾患であることを特徴とする請求項13または14に記載の使用。
【請求項１６】
内皮機能障害がアテローム性動脈硬化症、特に冠動脈硬化症および冠動脈疾患を併発することを特徴とする請求項13〜15のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
内皮機能障害が心不全を併発することを特徴とする請求項13〜15のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
内皮機能障害が末梢動脈閉塞性疾患などの虚血性疾患、例えば重篤な下肢虚血、心筋梗塞および臓器、例えば腎臓、脾臓、脳、肺の虚血性疾患を含む群から選択される疾患を併発することを特徴とする請求項13〜15のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
プロテアソーム阻害剤が
ａ）C-末端にエポキシケトン構造を持つペプチド誘導体、β-ラクトン誘導体、アクラシノマイシンA、ラクタシスチン、クラストラクタシステインを含む天然産のプロテアソーム阻害剤；
ｂ）修飾ペプチドアルデヒド、例えばN-カルボベンゾキシL-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ロイシナル（MG132またはzLLLとも呼ぶ）または、MG232のボロン酸誘導体、N-カルボベンゾキシ-Leu-Nva-H（MG115とも呼ぶ）、N-アセチル-L-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ノルロイシナル（LLnLとも呼ぶ）、N-カルボベンゾキシIle-Glu(OBut)-Ala-Leu-H（PS1とも呼ぶ）
を含む合成プロテアソーム阻害剤；
ｃ）α,β-エポキシケトン構造、ビニル-スルフォン、例えばカルボベンゾキシL-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ロイシン-ビニル-スルフォンまたは4-ヒドロキシ-5-ヨード-3-ニトロフェニルアセチル-L-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ロイシン-ビニル-スルフォン（NLVS)を含むペプチド；
ｄ）グリオキザル-またはボロン酸残基、例えばピラジル-CONH(CHPhe)CONH(CHイソブチル)B(OH)2およびジペプチジルボロン酸誘導体；
ｅ）ピナコール-エステル、例えばベンジルオキシカルボニル(CbZ)-Leu-ロイボロ-Leu-ピナコール-エステル
を含む群から選択されることを特徴とする請求項13〜18のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
プロテアソーム阻害剤が、ペプチジル-ホウ酸誘導体としてのPS-314、即ちN-ピラジネカルボニル-L-フェニルアラニン-L-ロイシン-ホウ酸（C19H25BN4O4)；β-ラクトン誘導体およびラクタシスチン誘導体としてのPS-519、即ち1R-[1S,4R,5S]-1-(1-ヒドロキシ-2メチルプロピル)-4-プロピル-6-オキサ-2アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン-3,7-ジオン（C12H19NO4)；PS-273（モルフォリン-CONH-(CH-ナフチル)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2)およびそのエナンチオマー；PS-293；PS-296（8-キノリル-スルフォニル-CONH-(CH-ナフチル)-CONH(-CH-イソブチル)-B(OH)2)；PS-303 (NH2(CH-ナフチル)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2； (モルフォリン-CONH-(CH-ナフチル)-CONH-(CH-フェニルアラニン)-B(OH)2)としてのPS-321；PS-334 (CH3-NH-(CH-ナフチル -CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2)； PS-325(2-キノル-CONH-(CH-ホモ-フェニルアラニン)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2；PS-352 (フェニルアラニン-CH2-CH2-CONH-(CH-イソブチル)l-B(OH)2；PS-383(ピリジル-CONH-(CHpF-フェニルアラニン)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2)；PS-341；および PS-1 Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-CHO； PS-2 [ベンジルオキシカルボニル)-Leu-Leu-フェニルアラニナルまたはZ-LLF-CHOまたはZ-Leu-Leu-Phe-CHOPS-1；β-ラクトン誘導体およびラクタシスチン誘導体としてのPS-519、即ち1R-[1S, 4R, 5S]-1-(1-ヒドロキシ -2メチルプロピル)-4-プロピル-6-オキサ-2アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン-3,7-ジオン(C12H19NO4)；エポキソマイシン (C28H86N4O7)およびエポネマイシン(C20H36N2O5)を含む群から選択されることを特徴とする請求項13〜19のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
プロテアソーム阻害剤がペプチドアルデヒド、ペプチドボロネート、ペプチドビニルスルフォン、ペプチドエポキシケトン、ラクタシスチン、ペプチドα-ケトンアルデヒド、α-ケトアミド、インダノンペプチド、ポリアルキレンアルデヒド、カテキン-3-ガレートなどのポリフェノールを含む群から選択することを特徴とされる請求項13〜20のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
プロテアソーム阻害剤が、Z-Leu-Leu-Leu-al (MG132)、Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-al (PS-1)、CEP1612、ピラジル-カルボニル-Phe-Leu-ボロネート(PS-341)、 ダンシル-Phe-Leu-ボロネート (DFLB)、モルフォリノナフチルアラニン-Leu-ボロネート(MG273)、NIP-Leu3-ビニルスルフォン(NLVS)、Tyr-Leu3-VS、NIP-Leu-Leu-Asn-VS、Ada-Tyr-Ahx3-Leu3-VS、Ada-Lys(ビオ)-Ahx3-Leu3-VS、Ac(Me)-Ile-Ile-Thr-Leu-EX(エポキソマイシン)、ジヒドロエポネマイシン、ラクタシスチン、 クラスト-ラクタシスチン-ベータ-ラクトン(オムラライド)、PS-519、Ac-Leu-Leu-Nle-al (ALLN), 3,4-ジクロロ-イソクマリン(DCI)、4-(2-アミノエチル)-ベンゾールスルフォニルフルオリド(ペファブロックSC)、TMC-95-A、グリオトキシン、(-)エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、リトナビア、ロバスタチン、アクラシノマイシンA(アクラルビシン)、シクロスポリンを含む群から選択する（この場合、Z はベンジルオキシカルボニルで、alはアルデヒドで、VS はビニルスルフォンで、NIPは3-ニトロ-4-ヒドロキシ-5-ヨードフェニルアセテートであり、ビオはビオチンである）ことを特徴とする請求項13〜21のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
プロテアソーム阻害剤がMG132であることを特徴とする請求項13〜22のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
プロテアソーム阻害剤がプロテアソーム複合体の少なくとも１種類の成分の遺伝子発現を阻害することを特徴とする請求項13〜23のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
プロテアソーム遺伝子発現を阻害するプロテアソーム阻害剤がアンチセンスRNA、二本鎖RNAおよび少なくとも１個のプロテアソーム複合体成分をコード化するDNA配列とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを含む群から選択されることを特徴とする請求項13〜24のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
プロテアソーム遺伝子発現を阻害するプロテアソーム阻害剤がノックアウトコンストラクトを含む群から選択されることを特徴とする請求項13〜25のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内皮機能障害に伴う疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退に向けた薬剤製造のためのプロテアソーム阻害剤の使用に関する。
【０００２】
本発明は、低用量治療に向けた前記プロテアソーム阻害剤を使った疾患の予防、初期療法、急性療法および/または後退に向けた薬剤の製造に対するプロテアソーム阻害剤の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
一酸化窒素（NO)は、重要な抗アテローム産生分子であり、NO主体治療は再狭窄に対抗する強力な方法である。
【０００４】
内皮一酸化窒素シンターゼ（eNOS）は血管壁恒常性の主要調節因子である。その産物一酸化窒素は剪断応力誘発による内皮依存性血管拡張を媒介し、顕著な抗アテローム産生作用を発揮する。冠動脈疾患、高血圧、糖尿病および心不全などの数種の病態の病理生理において、NO生成および／または生体内利用能の低下が示唆されている（非特許文献１〜５）。
【０００５】
eNOS調節は転写時、転写後および翻訳後の各レベルで起こる。細胞内カルシウムおよびリン酸化反応の増加は、eNOS活性の急速な一過性の上昇を誘発し、環境条件の変化への速やかな応答を可能にする（非特許文献６および７）が、持続的改変は、主として、eNOSタンパク質の発現レベルの変化を原因とする（非特許文献８）。以下の物質を含めて、多数の刺激がeNOS発現を増加させることは周知である。即ち、成長因子、例えばVEGF（非特許文献９）、EGFおよびbFGF（非特許文献１０）、並びに、TGF-β（非特許文献１１）；ホルモン、例えばインスリン（非特許文献１２）およびエストロジェン（非特許文献１３；HMG-補酵素Aレダクターゼ阻害剤（非特許文献１４）；剪断応力などの機械的力（非特許文献１５）である。
【０００６】
ユビキチン-プロテアソーム系は真核細胞における細胞内タンパク質分解の主要経路である（非特許文献１６）。26Sプロテアソームはタンパク質分解コア複合体、20Sプロテアソームおよび２個の19S調節複合体から成る（非特許文献１７および１８）。分解前に各基質がマルチユビキチン鎖との共役によって標識される。多数の律速酵素と転写因子の急速分解はプロテアソームが触媒となる。
【０００７】
プロテアソーム阻害によるeNOSの活性化および血管弛緩の増強は潜在的に重要な心臓血管の保護作用を示す。従って、ユビキチン-プロテアソーム経路は内皮機能を改善する新規の薬剤の標的になる可能性がある。
【０００８】
Musial AとEissa T（非特許文献１９）はプロテアソームを誘導NOSの一次分解経路として同定した。
【０００９】
WO 98／35691（特許文献１）はプロテアソーム阻害剤、ユビキチン経路阻害剤、ユビキチンプロテアソーム経路経由NF-κBの活性化を阻害する薬剤またはそれらの混合物の投与による虚血および虚血後の再灌流障害の治療を志向している。この出願の具体的実施態様によれば、プロテアソーム阻害剤は、ペプチジルアルデヒド、ペプチジルボロン酸またはペプチジルボロン酸エステル、ラクタシスチン類似体、N-(2-ピラジン)カルボニル-L-フェニルアラニン-L-ロイシンボロン酸および7-n-プロピル-クラスト-ラクタシスチン-β-ラクトンの群から選択される。
【００１０】
WO 02／05810（特許文献２）は、PKCβを調節することによって、内皮NOS（eNOS）発現、例えばインスリン刺激eNOS発現、を調節する方法を記述している。記述されている方法は、インスリン関連疾患、例えば高血圧、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、虚血またはインスリン抵抗性、の治療に有用である。
【００１１】
Lussら（非特許文献２０）は、数種の細胞型について、カルボベンゾキシル-ロイシニル-ロイシニル-ロイシナル（MG132）のようなプロテアソーム阻害剤が72kDaの熱ショックタンパク質（Hsp72）を誘導し、細胞保護作用を発揮すると述べている。これらの著者等は培養新生仔ラット心筋細胞中のMG132の作用を検討し、mRNAおよびタンパク質レベルでＭＧ132が時間および濃度に依存してHsp72とHsp32を誘導することを認めた。Hsp60mRNAは誘導されたが、Hsp60タンパク質レベルは不変であった。MG132（1 μM）は、46℃での心筋細胞の自然拍動時間を5＋／‐2分（対照高体温）から28＋／−5分まで延長した（P＜0.05、n=４）。従って、MG132によるプロテアソーム機能の阻害は心筋細胞を高体温や酸化的損傷から保護し、新規心臓保護手段になる可能性がある。
【００１２】
最後に、Stangleら（非特許文献２１）は心筋細胞においてMG132（0.1〜10 μM）およびMG262による熱ショックタンパク質（HSP)発現に対するプロテアソーム阻害作用を開示している。これらの実験では、1μM未満の濃度は心筋細胞に適用すると、保護作用を示さなかった。
【００１３】
総合的に考えると、上記開示物は人体において達成困難と思われる上昇濃度レベルでプロテアソーム阻害剤を使って治療できる数種の適応症を記載している。更に、プロテアソーム阻害剤に基づいたその他の治療法は欠けている。
【特許文献１】WO 98／35691
【特許文献２】WO 02／05810
【非特許文献１】Kojda G, Harrison D. Cardiovasc Res.1999; 43:562-571 “NOと反応性酸素種との間の相互作用：アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病および心不全における病理生理学的重要性”
【非特許文献２】Oemar BS, et al. Circulation.1998;97:2494-2498 “ヒトアテローム性動脈硬化症における内皮一酸化窒素シンターゼ発現および産生の減少”
【非特許文献３】Zeiher AM, et al. J Clin Invest.1993;92:652-662 “ヒトにおける内皮介在冠血流調節.年齢、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および高血圧の作用”
【非特許文献４】Busse R, Fleming I. J VaseRes.1996;33:181-194 “アテローム性動脈硬化症における内皮機能障害”
【非特許文献５】Treasure CB, et al. Circulation.1990;81:772-779 “拡張型心筋症において微小冠血管系の内皮依存性拡張が損傷される”
【非特許文献６】DimmelerS, et al. Nature.1999;399:601-605, 2000;477:258-262 “Akt-依存性リン酸化反応による内皮細胞中の一酸化窒素の活性化”
【非特許文献７】Dimmeler S, Dembach E, Zeiher M. FEBSLetters. 2000;477:258-262 “VEGF誘発による内皮細胞移動には、Ser-1177での内皮一酸化窒素シンターゼのリン酸化反応が必要である”
【非特許文献８】Wu KK. Ann N Y Acad Sci.2002;962:122-130 “内皮一酸化窒素シンターゼ活性および遺伝子発現の調節”
【非特許文献９】Hood JD, Meininger CJ, Ziche M, etal. Am J Physiol. 1998;274:H1054-H1058“ヒト内皮細胞において、VEGFはeNOSメッセージ、タンパク質およびNO産生を上方調節する”
【非特許文献１０】ZhengJ, Bird IM, Melsaether AN, et al.Endocrinology.1999;140:1399-1407 “ウシ胎仔胎盤動脈内皮細胞において、マイトジェン-活性化プロテインキナーゼカスケードの活性は必要だが、内皮一酸化窒素シンターゼの塩基性線維芽細胞成長因子-および上皮成長因子刺激による発現には不十分”
【非特許文献１１】Inoue N, Venema RC, Sayegh HS, etal. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1995;15:1255-1261“トランスフォーミング成長因子-ベータ1によるウシ内皮一酸化窒素シンターゼの分子調節”
【非特許文献１２】Kuboki K, Jiang ZY, Takahara N, etal. Circulation. 2000; 101:676-681 “内皮細胞およびin vivoにおける内皮構成一酸化窒素シンターゼ遺伝子発現の調節”“インスリンの特異性脈管作用”
【非特許文献１３】Kleinert H, et al. Hypertension.1998;31:582-588“エストロジェンはヒト内皮NOシンターゼ遺伝子の転写を増加させる”“関係する転写因子の分析”
【非特許文献１４】Laufs U, et al. Circulation.1998;97:1129-1135 “HMG CoAレダクターゼ阻害剤による内皮一酸化窒素シンターゼの上方調節”
【非特許文献１５】Ziegler T, et al. Hypertension1998;32:351-355“機械的力に曝露された内皮細胞における一酸化窒素シンターゼ発現”
【非特許文献１６】Rock KL, et al. Cell.1994;78:761-771 “MHCクラスI分子上に存在する大半の細胞タンパク質のプロテアソーム阻害分解とペプチドの生成の阻害剤”
【非特許文献１７】Coux O, Tanaka K, Goldberg AL.Annu Rev Biochem. 1996;65:801-847  “20S、26Sプロテアソームの構造と機能”
【非特許文献１８】Hershko A, CiechanoverA,Varshavsky A. Nat Med. 2000; 10: 1073-1082“ユビキチン系”
【非特許文献１９】Musial A,  Eissa T. J Biol Chem. 2002;276:24268-242273  “誘導一酸化窒素シンターゼはプロテアソーム分解経路によって調節される”
【非特許文献２０】Luss H,Schmitz W, Neumann J.Cardiovasc Res. 2002; 54:140-51“プロテアソーム阻害剤は心臓保護作用を持つ”
【非特許文献２１】Stangl K,Gunther C, Frank T,Lorenz M, Meiners S, Ropke T, Stelter L, Moobed M, BaumannG, Kloetzel PM,Stangl V. Biochem Biophys Res Commun 2002 Mar 1;291(3):542-9 “ユビキチン-プロテアソーム経路の阻害は心筋細胞に示差的熱ショックタンパク質応答を誘発し、早期の心臓保護を行う”
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そのために、本発明の目的は、プロテアソーム阻害剤を使った、従来の技術上周知の治療法を改善するための新規方法を提供することである。プロテアソーム阻害によって内皮機能を改善するために新規方法を提供するのが、本発明の別の目的である。これらの新規方法はできる限り低量の投薬に基づいた長期的に有効な治療法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
内皮機能障害を伴う疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退のための薬剤製造ための少なくとも１種類のプロテアソーム阻害剤の使用によって本発明の目的は解決する。
【００１６】
本発明の目的は、さらに、内皮機能障害を伴う疾患を含む群から選択する疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退のための薬剤製造のための少なくとも1種類のプロテアソーム阻害剤の使用によって解決し、この場合、対象患者に提供するプロテアソーム阻害剤の用量が低量、即ちナノモルの範囲である。
【００１７】
本発明の目的は、少なくとも１種類の治療有効量をプロテアソーム阻害剤の対象患者への適用を含めて、内皮機能障害を併発する疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退の方法によっても解決する。
【００１８】
本発明の目的は、プロテアソーム阻害剤を対象患者への投与を含めて、内皮機能障害を伴う疾患を含む疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退の方法によっても解決し、この場合、提供するプロテアソーム阻害剤の用量が低量、即ちナノモルの範囲である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のある実施態様では内皮機能障害を伴う疾患は非インスリン関連疾患である。
【００２０】
本発明の別の実施態様では内皮機能障害はアテローム性動脈硬化症、特に冠動脈硬化症および冠動脈疾患を伴う。
【００２１】
本発明の別の実施態様では内皮機能障害は心不全を伴う。
【００２２】
本発明の全く別の実施態様では、内皮機能障害は、心臓、脳、四肢末梢、腎臓、肝臓、脾臓および肺を含む群から選択する臓器および／または身体の一部の虚血および／または再灌流障害から起こる疾患を伴いおよび／またはその中で内皮機能障害は、心筋梗塞や重篤な四肢虚血のような梗塞を含む群から選択された疾患を伴いおよび／または内皮機能障害は末梢動脈閉塞性疾患のような虚血性疾患、例えば、重篤な下肢虚血、心筋梗塞および例えば腎臓、脾臓、脳および肺などの臓器の虚血性疾患を含む群から選択する疾患を伴う。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様では、プロテアソーム阻害剤は、
ａ）C-末端エポキシケトン構造を持つペプチド誘導体、β-ラクトン誘導体、アクラシノマイシンA、ラクタスタチン、クラストラクタシステインを含む天然産のプロテアソーム阻害剤；
ｂ）修飾ペプチドアルデヒド、例えばN-カルボベンゾキシ-L-ロイシニル- L-ロイシニル-L-ロイシナル（MG132またはzLLLとも呼ぶ）、またはＭＧ232のボロン酸誘導体、N-カルボベンゾキシ-Leu-Nva-H（MG115とも呼ぶ）、N-アセチル-L-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ノルロイシナル（LLnLとも呼ぶ）、N-カルボベンゾキシ-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H（PS1とも呼ぶ）
を含む合成プロテアソーム阻害剤；
ｃ）α,β-エポキシケトン構造、ビニル-スルフォン、例えばカルボベンゾキシ-L-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ロイシン-ビニル-スルフォンまたは4-ヒドロキシ-5-ヨード-3-ニトロフェニルアセチル-L-ロイシニル-L-ロイシニル-L-ロイシン-ビニル-スルフォン（NLVS）を含むペプチド；
ｄ）グリオキザル-またはボロン酸残基、例えばピラジル-CONH(CHPhe)CONH(CHイソブチル)B(OH)2およびジペプチジルボロン酸誘導体；
ｅ）ピナコール-エステル、例えばベンジルオキシカルボニル(CbZ)-Leu-ロイボロ-Leu-ピナコール-エステル
を含む群から選択する。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様では、プロテアソーム阻害剤は、ペプチジル-ホウ酸誘導体としてのPS-314、即ちN-ピラジネカルボニル-L-フェニルアラニン-L-ロイシン-ホウ酸（C19H25BN4O4)；β-ラクトン-およびラクタシスチン誘導体としてのPS-519、即ち1R-[1S,4R, 5S]-1-(1-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-4-プロピル-6-オキサ-2-アザビシクロ[3.2.0]ヘプタン-3,7-ジオン（C12H19NO4)；PS-273（モルフォリノ-CONH-(CH-ナフチル)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2)およびそのエナンチオマー；PS-293；PS-296（8-キノリル-スルフォニル-CONH-(CH-ナフチル)-CONH(-CH-イソブチル)-B(OH)2)；PS-303 (NH2(CH-ナフチル)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2； (モルフォリノ-CONH-(CH-ナフチル)-CONH-(CH-フェニルアラニン)-B(OH)2)としてのPS-321；PS-334 (CH3-NH-(CH-ナフチル -CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2)； PS-325(2-キノル-CONH-(CH-ホモ-フェニルアラニン)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2；PS-352 (フェニルアラニン-CH2-CH2-CONH-(CH-イソブチル)-l-B(OH)2；PS-383(ピリジル-CONH-(CHpF-フェニルアラニン)-CONH-(CH-イソブチル)-B(OH)2)；PS-341；および PS-1 Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-CHO； PS-2 [ベンジルオキシカルボニル)-Leu-Leu-フェニルアラニナルまたはZ-LLF-CHOまたはZ-Leu-Leu-Phe-CHO PS-1；b-ラクトン誘導体およびラクタシスチン誘導体としてのPS-519、即ち1R-[1S, 4R,5S]-1-(1-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-4-プロピル-6-オキサ-2-アザビシクロ [3.2.0]ヘプタン-3,7-ジオン (C12H19NO4)；エポキソマイシン(C28H86N4O7)およびエポネマイシン(C20H36N2O5)を含む群から選択する。
【００２５】
好ましい実施態様では、プロテアソーム阻害剤はペプチドアルデヒド、ペプチドボロネート、ペプチドビニルスルフォン、ペプチドエポキシケトン、ラクタシスチン、ペプチドα-ケトンアルデヒド、α-ケトアミド、インダノンペプチド、ポリアルキレンアルデヒド、カテキン-3-ガレートなどのポリフェノールを含む群から選択する。
【００２６】
全く別の好ましい実施態様では、プロテアソーム阻害剤はZ-Leu-Leu-Leu-al(MG132)、Z-Ile-Glu(OtBu)-Ala-Leu-al(PS-1)、CEP1612、ピラジル-カルボニル-Phe-Leu-ボロネート(PS-341)、 ダンシル-Phe-Leu-ボロネート (DFLB)、モルフォリノ-ナフチルアラニン-Leu-ボロネート(MG273)、NIP-Leu3-ビニルスルフォン(NLVS)、Tyr-Leu3-VS、NIP-Leu-Leu-Asn-VS、Ada-Tyr-Ahx3-Leu3-VS、Ada-Lys(ビオ)-Ahx3-Leu3-VS、Ac(Me)-Ile-Ile-Thr-Leu-EX(エポキソマイシン)、ジヒドロエポネマイシン、ラクタシスチン、 クラスト-ラクタシスチン-b-ラクトン(オムラライド)、PS-519、Ac-Leu-Leu-Nle-al(ALLN)、3,4-ジクロロ-イソクマリン(DCI)、4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルフォニルフルオライド(Pefablock SC)、TMC-95-A、グリオトキシン、(-)エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)、リトナビア、ロバスタチン、アクラシノマイシンA(アクラルビシン)、シクロスポリンを含む群から選択し、この場合、Z はベンジルオキシカルボニルであって、alはアルデヒドを、VS はビニルスルフォンを、NIPは3-ニトロ-4-ヒドロキシ-5-ヨードフェニルアセテートを、ビオはビオチンを示す。
【００２７】
優先的に、プロテアソーム阻害剤はMG132である。
【００２８】
別の好ましい実施態様では、プロテアソーム阻害剤はプロテアソーム複合体の少なくとも１個の成分の遺伝子発現を阻害する。
【００２９】
好ましい実施態様では、プロテアソーム遺伝子発現を阻害するプロテアソーム阻害剤はアンチセンスRNA、二本鎖RNAおよび少なくとも１個のプロテアソーム複合体成分をコード化するDNA配列とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを含む群から選択する。
【００３０】
別の好ましい実施態様では、プロテアソーム遺伝子発現を阻害するプロテアソーム阻害剤はノックアウトコンストラクトを含む群から選択する。
【００３１】
本明細書での使用には、本発明に従って治療に使用するプロテアソーム阻害剤は多様な利用可能なプロテアソーム阻害剤から選択できる。そのような阻害剤は一般にプロテアソーム複合体の形成および／または作用を阻害する全ての物質を含む。プロテアソーム阻害剤の選択については、KisselevAF とGoldberg AL (Chemistry &Biology. 2001; 8: 739-758)を参照すること。該プロテアソーム阻害剤を参考のために本明細書に組み入れる。市販のプロテアソーム阻害剤については、A.G.Scientific, Inc. (http://www.proteasomes.com)のカタログリストも参照すること。このプロテアソーム阻害剤を参考のため本明細書に組み入れる。
【００３２】
本発明の文脈中の「予防」、「初期療法」、「急性療法」および「後退」という用語は当業者に一般に周知の意味に従って使用する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「内皮機能障害」という用語は、当業者に一般に周知の意味に従って使用する。特に、この用語は内皮の機能、構造および／または生理的異常を指すことを意味する。
【００３４】
本発明の一態様によれば、プロテアソーム阻害剤を極低量で対象患者に提供する。驚くべきことに、単回低用量MG132処理（100nmol／L）は、CPAE細胞（牛肺動脈内皮細胞株、ATCC、#CCL-209）において長期作用を誘発し、eNOSタンパク質および酵素活性を10日間まで増加させた。プロテアソーム阻害剤を対象患者に合わせて、現在投与を計画している量よりもはるかに少ない量で投与できる。この低用量は、最終的に1〜100 nmol/L、即ちナノモルの範囲の治療有効量になる量を含む。当然、個々の適用量は、使用するプロテアソーム阻害剤、患者の体重、治療すべき特定の疾患、重症度などの特定の投薬に伴ういくつかの要因に基づいて異なってくる。これらの要因はすべて当業者に周知であり、そのため、特定の治療状況および要件に適合させるために、変更、区別することができる。
【００３５】
最終的には、少なくとも１種類のプロテアソーム阻害剤の治療有効量の対象患者への適用を含めて、内皮機能障害を伴う疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退のための方法を提供する。
【００３６】
ユビキチン-プロテアソーム系の阻害がラット頚動脈において新内膜形成および再狭窄を予防、軽減することを本発明者達は最近立証しており、それによって、本発明者達はその後にプロテアソームとeNOSとの間に可能性のある関連を検討した。NOには抗アテローム産生性を有することが認められており、NO主体による処置は再狭窄予防に向かう潜在的に強力な方法であると思われる（Janero DR and Ewing JF. Free Radical Biol Med. 2000; 29:1199-1221“一酸化窒素と血管形成後再狭窄：病理学的相関と治療の可能性”）ので、1つの目的は、ユビキチン-プロテアソーム経路とeNOSとの間に関連があるか否かを検討することであった。プロテアソームがeNOSを調節するか否かは、現在まで明らかでなかった。
【００３７】
内皮一酸化窒素シンターゼ（eNOS）は血管壁恒常性の主要調節因子である。本明細書では本発明者達は26Sプロテアソームが内皮細胞内でのeNOS発現を調節したことを示した。極めて低い、非毒性の単回阻害剤量によってプロテアソームを遮断すると、eNOS発現を増加させた。この上方調節は前投与ラットの大動脈内でeNOS活性を高め、NO-依存性血管弛緩の増強を招いた。プロテアソーム誘導によるeNOSの上方調節は10日間まで持続する長期作用を示していた。
【００３８】
ユビキチン-プロテアソーム系がeNOS酵素の重要な調節因子であるとする本発明者達の所見は潜在的な治療上の意味を伴う当該分解系の別の態様を解明する。プロテアソーム系の阻害剤は、その抗増殖、抗炎症およびアポトーシス促進の各作用によって癌や炎症の治療の優れた可能性を有することが認められているが、現在、証拠を積み重ねることによってこれらの阻害剤の能力を統合的臓器保護にまで拡大できることが指摘される。従って、プロテアソーム機能を遮断する阻害剤は、多種の細胞型、例えばHepG2、イヌの腎臓およびヒトの腸上皮細胞内での熱ショック応答を誘発することが認められている。さらに、プロテアソーム阻害が心筋細胞に差別的熱ショック応答を誘発し、多種のストレス後に細胞の生存強化と機能回復の改善を伴うことを本発明者達は最近立証した。
【００３９】
ユビキチン-プロテアソーム系の阻害がどの程度、eNOS発現および活性の増加において内皮細胞に対して重要な役割を果たし、その結果、内皮機能を改善しているかについて本発明者達はこの試験において述べている。NOは内皮依存性血管拡張を媒介し、強力なアテローム防御性を発揮する。eNOS活性またはNO生体内利用能の低下はアテローム性動脈硬化症の極めて早期の症状発現の1種であり、eNOSを活性化することによってこれらの作用を防止または拮抗できる方法が有益な治療ツールを示すと思われる。
【００４０】
本試験はプロテアソーム阻害がeNOS mRNAを上方調節することを、いかなる理論にも拘束されずに、指摘している。プロテアソーム阻害によるeNOSの上方調節は16〜24時間後に起こり、エストロジェンなどの強力な生理的刺激やスタチンなどの強力な薬剤について述べたとおりの規模の結果を伴う。eNOS活性の30%の変化でさえ血流31に相応の増加を誘導することができることに関して、プロテアソーム阻害後に認められる200〜300%のeNOS活性の上昇は有意である。従って、本発明者達はMG132前投与ラットの血管輪に内皮依存性血管弛緩の有意な増加を認めた。
【００４１】
細胞傷害性を回避するために、本発明者達はeNOS発現を増強できる最低阻害剤量を測定した。驚くべきことに、使用した内皮細胞培養液中では、eNOSは阻害剤の極低用量ですでに上方調節されていた。これらの低濃度で起こるポリユビキチン化タンパク質の蓄積は、当該eNOS上方調節が、実際にプロテアソーム阻害に寄与したことを表している。プロテアソームなどの一般的な基礎的調節系を標的とする場合には、そのような低阻害剤用量が特異的心臓血管保護作用を発揮する推定上のメカニズムは依然として不明である。そのような低用量のプロテアソーム阻害剤はサブユニット特異的方法で部分的阻害によってのみおよび／または20Sプロテアソームサブタイプを示差的に遮断することによってのみ作用すると推測できる。
【００４２】
興味深いことに、プロテオゾーム阻害作用が３日目まで認められるに過ぎないにもかかわらず、単回低用量MG132は10日間までeNOS発現を上方調節する。さらに、内皮細胞は表現型移行を起こし、順により高いNO産生能を獲得すると推測できる。本発明者達はeNOSのものと類似の長期上方調節が証明されている他の物質を知らない。
【００４３】
最も重要な点としては本発明者達はプロテアソーム阻害剤が内皮損傷剤の作用を逆転および／または緩和できることを認めている。
【００４４】
要約すると、本発明者達はeNOSの重要な調節因子としてユビキチン-プロテアソーム経路を同定した。プロテアソーム阻害剤はラットの大動脈輪においてeNOS発現および活性を数日間有意に高めることによって、内皮細胞中の一酸化窒素の利用能を増強し、内皮依存性血管拡張能を増大する。そのためにプロテアソーム系を標的にすることは、血管拡張の改善の点で並びに抗アテローム産生性の増幅または回復によって、内皮機能の改善のための新規の治療概念を提供する。
【００４５】
ここで、本発明を添付した図と関連して以下の実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はそれに制約されるものではない。
【実施例】
【００４６】
材料および方法
【００４７】
１．材料および統計分析
プロテアソーム阻害剤MG132、MG262および非プロテアソーム系カテプシン阻害剤ALLM（N-アセチル-ロイシル-ロイシル-メチオニナール）をCalBiochem（SanDiego、  California）から入手した。転写阻害剤α-アマニチンをRoche Diagnostics（Mannheim、独）から；L-アルギニンをAmersham（Freiburg、独）から；DowexAG50WX-8、フェニルエフリン、アセチルコリン、パパベリンをSigmaChemical（Deisenhofen、独）からそれぞれ購入した。抗eNOSモノクロナール抗体をBDtransductionLaboratories（Heidelberg、独）から、抗ユビキチン抗体をDAKO（Hamburg、独）から購入した。二次抗マウス抗体をSanta CruzBiotechnology（Santa Cruz、California）から、抗ウサギ抗体をDianova（Hamburg、独）から入手した。
【００４８】
全数値は対照と比較した平均値±標準誤差として表す。バンド強度は濃度測定法で分析した。血管弛緩はフェニルエフリンによる前収縮に対する%として表す。統計分析は適宜にANOVA、Mann-WhitneyまたはStudentの検定を使って実施した。全統計的検定でP<0.05水準を有意と見なした。
【００４９】
２．方法
方法１：細胞培養および処理
ウシ肺動脈内皮細胞系（CPAE細胞）をAmericanType Culture Collection（ATCC、#CCL-209）から購入し、5% FCS、1.5 g／L 炭酸水素ナトリウム、0.11 g／L ピルビン酸ナトリウム、100 U／ml ペニシリンおよび100 μg／ml ストレプトマイシンを補充したMEM中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を単離し、前述のとおりに培養した（Stangleら、BiochemBiophys Commun.2001; 280:1093-1100 “ホモシステインはTNF-α誘導による内皮接着分子発現と核因子κB依存性経路を経た単球接着を阻害する”）。HUVECの純度をvonWillebrand因子染色法で評価した。実験に際して、細胞を直径6mmのシャーレに接種し、プロテアソーム阻害剤MG132、MG262で、非プロテアソーム系カテプシン阻害剤ALLMで、または溶媒（DMSO）で所定の時間および濃度について処理した。ある実験では、転写阻害剤α-アマニチン（2.5 μg/mL）をプロテアソーム阻害剤の添加の１時間前に前培養した。トリパンブルー排除法で細胞生存力を評価した。HUVECについては、本発明者達は全実験について第二〜第三継代細胞のみを使用した。ファロイジン-DAPI二重染色に際して、細胞を4% パラホルムアルデヒドで固定し、1% Tritonで浸透化し、1% FCSでブロックした。本発明者達はZeissカメラで細胞写真を撮影し、それをAxiovert3.0ソフトウェアで分析した。
【００５０】
HUVEC中のeNOS発現に関しては、70nMのMG132の存在下で、細胞をDMSO（対照）、TNF-α（1、2.5、5 ng／ml）およびTNF-α（同一濃度）で48時間処理し、その後にeNOS mRNAレベルを測定した（方法３参照）。
【００５１】
方法２：ウエスタンブロット分析
処理後に細胞をPBSで２回洗浄し、mmol／L単位のTris／HCl 50（pH7.4）、KCl 154、グルコース5、EDTA 0.5、PMSF 1、DTT2および1% Triton X-100を含有する抽出緩衝液中で溶解した。総タンパク質（1レーン当たり50 μg）をSDS-PAGEに供し、膜を抗eNOSモノクロナール抗体（1：2500）または抗ユビキチン抗体（1：1000）で探査した。eNOSについては、アルカリフォスファターゼと複合化した二次抗マウス抗体（1：2500）で、ユビキチンについては、西洋ワサビパーオキシダーゼ（1：10000）と複合化した抗ウサギ抗体で、それぞれ膜を培養した。eNOSに対してはBCIPおよびNitroBlueTetrazolium（Sigma）を使って、またユビキチンに対しては、ECL検出系（Amersham）を用いてバンドを可視化した。
【００５２】
方法３：リアルタイム-PCR（RT-PCR)
処理後にTriazol試薬（GibcoLife Technologies, Karlsruhe、独）中で細胞を溶解し、全RNA 800ngをランダムヘキサマーで逆転写した。TIBMolbiol（Berlin、独）およびEurogentec（Seraing、ベルギー）のTaqManプローブでプライマー配列を合成した。表１は本試験で使用したプライマーおよびプローブの配列を纏まとめている。mRNA発現を、ハウスキーピング遺伝子であるHPRT（ハイポキサンチンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子に統一したが、その転写レベルは、我々の実験条件下では影響を受けなかった。5700Sequence Detection System（Perkin ElmerApplied Biosystems)において、0.3または0.9／μmol／Lプライマー、0.2／μmol／LTaqManプローブおよび1μlの逆転写反応を含む25 μLの TaqMan Universal PCR Master Mix（PerkinElmerApplied Biosystems, Foster City, California)の中でPCR増幅を実施した。温度サイクリング条件は95℃で10分間の初期変性段階の後、95℃で15秒間および60℃で1分間を40回行った。増幅産物のサイズと純度を20% PAAゲル上で確認した。CT（thresholdcycle）を蛍光シグナルが検出閾値を越えるのに必要なサイクル数と定義する。ハウスキーピング遺伝子と比較する標的遺伝子の発現を２種類の遺伝子の閾値間の差として算出した。
【００５３】
ウシeNOS mRNAの定量的増幅にSYBRGreen法を適用した。プライマー配列を表１に示す。転写阻害剤α-アマニチンによる我々の分析において、α-アマニチンはRNAポリメラーゼIIを遮断するが、RNAポリメラーゼIはこの毒素に感受性を示さない（Lindell Tj et al、Science. 1970; 170:447-449 “アルファ-アマンチンによる核RNAポリメラーゼIIの特異阻害”）。本発明者達はeNOS mRNA発現をハウスキーピング遺伝子としてRP29（リポゾームタンパク質29）遺伝子に標準化した。熱サイクル条件はTaqMan PCRと同一であった。
【００５４】
表１：RT-PCRで使用するオリゴヌクレオチドの配列     
2005537292.tif 000002
【００５５】
方法４：eNOS活性の測定
陽イオン交換クロマトグラフィーによってアミノ酸を分離した後にL-[3H]アルギニンからのL-[3H]シトルリンの形成によってeNOS活性を評価した。ウエスタンブロット分析に関して、内皮細胞をPBSで洗浄し、同一抽出緩衝液に溶解した。本発明者達は50 mmol／L Hepes pH7.4、0.1% Triton X-100、1 mmol／L EDTA、1.25 mmol／L CaCl2、1 mmol／LDTT、1 μmol／L FAD、15 μmol／L BH4、1 mmol／L NADPHおよび1 μCi L-[3H]アルギニンを含有する反応混合液に総タンパク質50 μgを添加した。培養は37℃で30分間実施した。氷冷Dowex（Na+型）0.5 mlを添加して反応を終了した。Dowexクロマトグラフィーによって、L-[3H]アルギニンからL-[3H]シトルリンを分離し、L-[3H]シトルリン形成を液体シンチレーション計測によって定量した。本発明者達は、細胞抽出物なしで培養したサンプルから得た数値を差し引いた。本発明者達は数例の反応に1 mmol／L ニトロ-L-アルギニンメチルエステル（L-NAME)を添加し、反応特異性を証明した。サンプル数例では、反応緩衝液からCaCl2を除外し、誘導性NOシンターゼ（iNOS）の寄与を排除した。
【００５６】
方法５：血管弛緩試験
雄Wistarラットの胸部大動脈を迅速に切除し、結合組織を除去し、組織チャンバー実験用に、長さ2〜3mmの輪切りにした。各大動脈輪を、50 U／mL ペニシリン、50 μg／mL ストレプトマイシン、0.1% BSAおよび1 μg／mLポリミキシンBを含有する37℃のMEM中、250nM MG132の存在下または不在下で、MG132 100nmol／L、250 nmol／Lまたは溶媒、もしくはTNF-α（250 pg／ml）と共に48時間培養した。次に、大動脈輪を、調整Krebs-Henseleit溶液（mmol／L単位の組成物：NaCl144、KCl  5.9、CaCli1.6、MgSO4−1.2、KH2PO4−1.2、NaHCO3−25およびD-グルコース  11.1）およびジクロフェナック1μmol／Lを含有する10 mlジャケットオーガンバス中でプラチナフックに載せた。張力を１時間かけて2 gまで徐々に調整した。浴槽中の溶液を、95% CO2と5% O2の混合気体中で37℃に保持した。平衡化およびフェニルエフリン（0.051 μmol/L）による最大下の前収縮後に内皮依存性血管拡張剤アセチルコリンの漸増濃度（1 nmol／L〜1 μmol／L）に対する弛緩を実施し、累積濃度-応答曲線を得た。フェニルエフリン曝露前にL-NAME（1 mmol／L）で処理した大動脈輪で選択試験を実施した。プロテアソーム阻害剤または溶媒との培養後にパパベリン（1 nmol／L〜1 μmol／L）に対する内皮非依存性の評価によって平滑筋統合性の維持を確認した。
【００５７】
結果
【００５８】
１．要約
ウシ肺動脈内皮細胞（CPAE細胞）をプロテアソーム阻害剤MG132で処理した。50〜250 nmol／Lで、MG132はeNOSのmRNA並びにタンパク質レベルを用量に依存して増加させた。別の特異的プロテアソーム阻害剤MG262で比較可能な結果を得たが、非プロテアソーム系カテプシン阻害剤ALLMは作用を示さなかった。同様に、eNOS活性が約2.8倍まで増加した（MG132  100 nmol／L、48時間）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC)で同様の結果が得られた。ラット大動脈輪のMG132との培養（48時間）はアセチルコリンに対する内皮依存性血管弛緩を有意に増強した。興味深いことに、単回低用量MG132処理（100 nmol／L）はCPAE細胞内で長期作用を誘発し、10日までeNOSタンパク質および酵素活性を増加させた。プロテアソーム阻害の効果は、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積を実証したウエスタンブロットによって認められた。RNAポリメラーゼII阻害剤であるα-アマニチンは全eNOS mRNAを減少させたが、プロテアソーム阻害剤誘発によるeNOS mRNA上昇には影響を与えなかった。このことはプロテアソーム阻害がeNOS mRNA安定性を強化することによって、eNOSを上方調節することを示唆している。
【００５９】
これらの結果は、プロテアソームの低用量阻害がeNOS発現および活性を増強する妥当な方法であり、治療法として見込みのあることを意味している。
【００６０】
２．プロテアソーム阻害によるeNOSタンパク質およびmRNAレベルの上方調節
eNOS発現に対するプロテアーゼ阻害の作用を検討するために、CPAE細胞をペプチドアルデヒドプロテアソーム阻害剤MG132と共に培養した。低濃度MG132（50〜250 nmol／L）がeNOSタンパク質レベルを徐々に高めることを用量-応答実験により明らかとなった。他方、500 nmol／L以上の高めの濃度のプロテアソーム阻害剤はeNOSタンパク質レベルを低下させた（図1A）。プロテアソーム阻害剤は細胞毒性作用を発揮することが周知であるので、本発明者達はCPAE細胞が適用量のMG132によって傷害を受けるか否かをさらに検討した。組織検査（ファロイジン-DAPI二重染色）によって、プロテアソーム阻害が用量依存性のCPAE細胞の表現型形態変化を誘発し、その細胞の伸長した紡錘形表現型を生ずることが認められた（図1B）。しかし、250 nmol／Lよりも高い用量ではトリパンブルー排除法で求めたような毒性があることを確証した（データ未掲載）。したがって、それ以後の実験はすべて≦250 nmol／Lの低無毒MG132濃度で実施した。eNOSタンパク質発現の上昇がMG132との16時間の培養で始まり、その後に48時間まで増加し、100 nmol／Lの濃度で2.4倍の発現が起こる（P<0.05）ことを時間および用量依存性実験により明らかとなった（図1C）。この上方調節はMG132の単回量とのその細胞の培養後に得られた。eNOSの上方調節がプロテアソームの阻害に特異的であることを実証するため、本発明者達は別のプロテアソーム阻害剤であるMG132ボロン酸誘導体のMG262で実験を再度行った。事実、同等力価の用量のMG262もMG132が惹起する程度と類似の程度にeNOSタンパク質の上方調節を誘発した（図１D）が、非プロテアソーム系カテプシン阻害剤であるALLMはeNOSを上方調節しなかった（データ未掲載）。さらに、ヒト細胞（HUVEC）でプロテアソーム阻害作用を評価し、該細胞に対してeNOSタンパク質発現の類似の上方調節が明らかになった（図1E）。
【００６１】
次の段階で、本発明者達は実験に使用した極低濃度MG132を使用してプロテアソーム阻害効果を実証した：eNOS発現を増加させる50〜250 nmol／Lの用量はポリユビキチン化タンパク質の蓄積も招いた。一方、eNOS発現に影響を与えなかった20 nmol／LのMG132はプロテアソーム阻害作用を示さなかった（図2）。本発明者達が同等量のMG262を使用した際に同様の結果が得られたが、非プロテアソーム系カテプシン阻害剤ALLMは再びプロテアソームを阻害しなかった（データ未掲載）。
【００６２】
その後、CPAE細胞中のeNOS mRNAレベルを測定した。MG132との培養後に16時間目からeNOS mRNAの用量依存性上方調節が認められ（データ未掲載）、24時間目に最大-対照レベルの6.5倍-に達した（100 nmol／L MG132、P＜0.05）（図3A、B）。HUVECで同様の結果が得られた（データ未掲載）。これらのeNOS mRNAレベルの増加が転写活性の増加に起因するのか、mRNAの安定性強化に起因するのかをさらに詳細に解明するため、CPAE細胞を転写阻害剤α-アマニチンで処理した。α-アマニチンの投与は全eNOSmRNAレベルを減少させ、MG132によって誘発されたmＲＮＡレベルの増加を排除しなかった（図3C)。その結果として、本発明者達はプロテアソーム阻害がeNOS mRNA安定性の強化を介してeNOS mRNAレベルの増加を誘発すると提言する。
【００６３】
70 nM MG132の存在下または不在下で対照としてのDMSO単独または漸増濃度TNF-α（1 ng／ml、2.5 ng／mlおよび5 ng／ml)によるヒト臍帯静脈内皮細胞の48時間処理の結果を示した図9においてプロテアソーム阻害剤がeNOS-発現に対して示す保護作用を見ることができる。DMSOによって認められるeNOSmRNA発現レベルを任意に取って1.0とし、その他の数値をそれと比較した。漸増濃度TNF-αがmRNA発現を減少させ、高濃度TNF-αではｍRNA発現をほぼ停止させ、それによって、eNOS mRNA発現に対するTNF-αの損傷作用示すことが、TNF-α単独実験からわかる。70 nM MG132の存在下では、このTNF-αの有害作用は逆転し、補償し、プロテアソーム阻害剤無添加のそれぞれの処理と比較すると、eNOS mRNA発現の実質的な増加発現をきたす。これは、明らかに、プロテアソーム阻害剤によるTNF-α誘発eNOS-抑制の防止を示す。従って、そのことがプロテアソーム阻害剤の強力な保護作用のための強力な指摘である。
【００６４】
３．プロテアソーム阻害によるeNOS酵素活性の増加と内皮機能の改善
本発明者達は次にプロテアソーム阻害後に認められるeNOSタンパク質含量増加が酵素活性増強に関して機能的結果であるか否かの疑問を提起した。したがって、本発明者達はタンパク質抽出物中のeNOS触媒活性をL-アルギニンのL-シトルリンへの転換によって測定した。MG132処理後のより高いeNOSタンパク質含量と平行して、eNOS活性は24時間目から用量に依存して増加し、48時間で2.8倍の増加を達成した（100 nmol／L MG132、P<0.05）（図4A、B）。
【００６５】
プロテアソームによるeNOS調節の機能的重要性をさらに詳細に解明するために、単離したラット大動脈輪標本の血管反応性に対するプロテアソーム阻害の影響を組織チャンバー実験で検討した（n=6〜8／群）。図5Aに示すように、内皮依存性血管拡張剤アセチルコリンへのフェニルエフリン前収縮大動脈輪の内皮依存性弛緩応答性はMG132前処理後に用量に依存して有意に増強した（100および250 nmol／L、48時間）。MG132前処理大動脈輪の最大弛緩（250 nmol／L）：溶媒処理大動脈輪の54.6±5.8%に対して89.4±5.7%（P<0.05）。NOシンターゼ阻害剤L-NAMEはアセチルコリン誘発による血管拡張を完全に取り除いた（データ未掲載）。パパベリンに応答した内皮非依存性血管弛緩はプロテアソーム阻害の影響を受けないままであった（図5B）。
【００６６】
４．eNOS発現および活性の長期上方調節
単回量のプロテアソーム阻害剤MG132 がeNOS発現および活性をどの位長く上方調節できるかを評価するため、実験を10日間まで延長した：本発明者達はなお７日後のeNOS mRNAの上昇、タンパク質増強並びにCPAE細胞におけるプロテアソーム阻害（100 nmol／L MG132)に続く10日間までの酵素活性を認めた（図6A、B)。興味深いことに、プロテアソーム阻害の効果を表すポリユビキチニン化タンパク質の蓄積は3日より長くない間検出可能であると言う事実にもかかわらず、長期eNOS上方調節が認められた（図6C）。
【００６７】
５．内皮機能に対するプロテアソーム阻害剤の保護作用
前述のeNOS酵素活性の増加、eNOS発現の上方調節などに勝るプロテアソーム阻害剤の、内皮機能に対する保護作用を直接立証するために、サイトカイン、例えばTNF-α、oxLDLまたはLPSなどの損傷剤が内皮に対して損傷作用を発揮するのを防止することの立証を目的とした実験を実施した。内皮機能を測定するために、フェニルエフリン前収縮させたラットの大動脈輪の血管反応性をアセチルコリンを使って検討した（図7および8）。損傷作用を刺激するために、大動脈輪を損傷剤（TNF-α、oxLDL、LPS）と共に48時間培養し、その後に内皮機能に対する得られた損傷作用を測定した。図7はTNF-α（250 pg／ml）で実施した一連の実験の要約を示す。対照（溶媒としてDMSO）に比較して、アセチルコリン依存性血管拡張はTNF-αで前培養した大動脈輪中で有意に減少した。図中、100%収縮は、大動脈輪がフェニルエフリン前収縮直後である状態に相当する。0%収縮は、DMSO対照に対して高めの濃度のアセチルコリンで誘発した場合の完全弛緩／血管拡張状態に相当する。プロテアソーム阻害剤の可能な保護作用を検討するに当たって、大動脈輪をTNF-α、プロテアソーム阻害剤MG132とともに培養した。図7は、TNF-αによって誘発した内皮の損傷を有意に軽減でき、しかもプロテアソーム阻害剤の適用によって血管反応性を有意に改善できることを示す。図8は一例として図7の単独実験を示す（初期軌跡）。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
従って、プロテアソーム阻害剤は内皮機能障害の防止／軽減／後退に関して、有意な保護作用を示し、したがって、内皮機能障害を伴う疾患の予防、初期療法、急性療法および／または後退用の薬剤製造の第一候補である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１はCPAE細胞におけるeNOSタンパク質発現および細胞形態に対するプロテアソーム阻害の作用を示す。controlは対照を表す。A、代表的ウエスタンブロット、250 nmol／Lまでの濃度のMG132とのCPAE細胞の培養後のeNOS発現の緩徐な上方調節およびプロテアソーム阻害剤の高めの用量におけるeNOSタンパク質レベルの減少を示す。B、CPAE細胞の用量依存性形態変化を示す、所定量のMG132との培養（24時間）後にファロイジンおよびDAPIにより二重染色したCPAE細胞の代表的顕微鏡スキャン。バーは100 μｍを示す。C、対照（溶媒）と比較した、MG132の時間および用量依存性作用の代表的ウエスタンブロットと濃度測定分析（平均値±標準誤差）。50 nmol／LのMG132とのCPAE細胞培養後24時間目からeNOSの有意な上方調節が認められた。各実験でn=3。対照に対して*P＜0.05。D、ウエスタンブロット、MG262もCPAE細胞中でeNOSを上方調節することを示す。E、HUVECにおいて、MG132との該細胞の培養後にウエスタンブロットは用量に依存したeNOSの増加を示している。
【図２】図２はCPAE細胞における極低濃度のMG132によるプロテアソーム阻害の効果を示す代表的ウエスタンブロット（抗ユビキチン抗体）を示す。50 nmol／Lで開始して、MG132はポリユビキチン化タンパク質の蓄積を招いた。縦軸は分子量（kD）マーカー。controlは対照を表す。
【図３】図３はリアルタイムRT-PCRを使ったeNOS mRNAレベルに対するプロテアソーム阻害作用を示す。CPAE細胞は溶媒（対照）またはMG132（20〜250 nmol／L）で24（A）および48（B）時間処理した。数値は３回の個別の実験からの平均値±標準誤差である。C、プロテアソーム阻害剤添加前の転写阻害剤α-アマニチン（2.5 μg／L）によるCPAE細胞の前処理（１時間）は全eNOS mRNAを減少させたが、MG132誘発によるeNOS mRNA増加を排除しなかった。数値は３回の個別の実験から得た平均値±標準誤差である。controlは対照を表す。対照に対して*P＜0.05。
【図４】図４はCPAE細胞中ではプロテアソームの阻害がeNOS活性を高めることを示す。対照条件（溶媒）下または漸増MG132濃度存在下で24時間目（A）および48時間目（B）に測定したL-[3H]シトルリンへのL-[3H]アルギニンの転換。数値は平均値±標準誤差である。controlは対照を表す。n=3、対照に対して*P＜0.05。
【図５】図５はラット大動脈輪における血管反応性に対するMG132前処理（100および250 nmol／L、48時間）の作用を示す。内皮依存性血管弛緩をアセチルコリン（A）で検討し、内皮非依存性血管拡張をパパベリン（B）で検討した。漸増濃度で両剤を添加し、累積濃度応答曲線を得た。グラフは最大フェニルエフリン誘発血管収縮に対する割合（%）としての弛緩を表す。MG132処理した大動脈輪に、内皮依存性血管弛緩の有意な増加が認められたが、内皮非依存性血管拡張は影響を受けないままであった。データは平均値±標準誤差（n=6〜8例の大動脈）で表す。溶媒処理大動脈輪に対して*P＜0.05。nsは有意でないことを表す。
【図６】図６はCPAE細胞におけるMG132単回量の長期作用を示す。プロテアソーム阻害後10日間までのeNOSタンパク質の上方調節（A）および同様にeNOS活性の有意な増加（B）を示す代表的ウエスタンブロット。数値は平均値±標準誤差、n=3、C、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積を３日間より長くは検出できなかったことを示す代表的ウエスタンブロット。陽性対照は24時間のMG132処理を示す。controlは対照を表す。対照に対して*P＜0.05。
【図７】図７はラット大動脈輪における血管反応性に対するプロテアソーム阻害剤（この場合MG132）の保護作用を示す。フェニルエフリンによってラット大動脈輪を前収縮させた。アセチルコリンで内皮依存性血管弛緩を検討した。DMSO（対照）で48時間、TNF-αで48時間、TNF-αは大動脈輪中の血管反応性への損傷作用を有する、またはMG132とともにTNF-αで48時間、大動脈輪を前培養した。図はラット大動脈輪について実施した３回の実験を示しており、これらの実験は対照（溶媒としてDMSO）またはTNF-α（250 pg／ml)またはTNF-α（250 pg／ml）+MG132（250 nM）で実施した。アセチルコリンを漸増濃度で添加し、累積濃度-応答曲線を得た。グラフはフェニルエフリンで誘発した初期状態を100%収縮として、最大フェニルエフリン誘発血管収縮に対する％として表す。
【図８】図７に表した一連の実験の内の単一の実験の初期の軌跡を示す。「PE」はフェニルエフリンの初回適用を示す；その後の矢印は対応する濃度のアセチルコリン（即ち、10-8 M；10-7 M、10-6 M、10-5 M）の適用を示す。軌跡3例を示すが、その内の１例は対照（DMSO単独）、その他は250 nM MG132添加および無添加の250 pg／ml TNF-αである。
【図９】図９はHUVECにおけるeNOS mRNAの発現に対するDMSO単独、70 nM MG（=MG132）添加および無添加のTNF-α（1 ng／ml、2.5 ng／mlおよび5 ng／ml）の48時間処理の作用を示す。
【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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