(57)【要約】本発明は、以下の段階を含む、核酸分子を含む試料中に存在する検体核酸を同定するための方法に関する：(a) 多孔性基体を準備する段階であって、上記基体は複数のマイクロチャンネルを含み、上記マイクロチャンネルは、その上に上記試料中に存在する検体に結合することができる標的分子が固定されており、上記チャンネルはさらに、検体増幅成分、レポーターシステム；および上記試料；が提供され；(b) 上記試料中に存在する検体核酸分子を増幅する段階；および(c) 段階(b)で得られた増幅された検体核酸、上記基体のチャンネル上に固定された上記標的分子、および上記レポーターシステムとの間で結合を生じさせる段階であって、上記レポーターシステムにより、上記標的分子と上記検体核酸との間で結合が生じたかどうかを検出することができる段階。本発明はさらに、上記方法の使用、さらには上記方法を実行するためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、試料中の検体核酸を同定するための方法：
(a) 多孔性基体を準備する段階であって、前記基体は複数のマイクロチャンネルを含み、前記マイクロチャンネルは、前記試料中に存在する検体に結合することができる標的分子を上に固定されており、前記チャンネルはさらに、
−検体増幅成分
−レポーターシステム、および
−前記試料
を提供される；
(b) 前記試料中に存在する検体核酸分子を増幅する段階；
(c) 段階(b)で得られた増幅された検体核酸、前記基体のチャンネル上に固定された前記標的分子、および前記レポーターシステムとの間で結合を生じさせる段階であって、前記レポーターシステムにより、前記標的分子と前記検体核酸との間で結合が生じたかどうかを検出することができる段階。
【請求項２】
前記レポーターシステムが、前記標的分子内に一体化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポーターシステムが、着色反応を誘導することができ、および／または生体発光、化学発光、もしくは光発光が可能である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記レポーターシステムが、蛍光消光システムである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記蛍光消光システムが分子ビーコンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階(c)における前記標的分子と前記検体核酸との間で結合が生じたかどうかの前記検出がリアルタイムで行われる、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記増幅反応が等温条件下である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
段階(b)における前記核酸分子の前記増幅が、PCR、SDA、TYRAS、NASBA、RCA、3SR、およびTMAを含む群より選択される増幅技術による、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記多孔性基体がフロースルー型基体である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記多孔性基体が金属酸化物の基体である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記金属酸化物の基体が酸化アルミニウムの基体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基体がハウジング内に組み込まれている、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ハウジングは閉鎖手段を含み、前記閉鎖手段が基体の上面の上に設置されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試料中の核酸の同定および定量のための、請求項１から１３のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１５】
遺伝子型の同定を行うための、請求項１から１３のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１６】
核酸変異の検出を行うための、請求項１から１３のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項１７】
多孔性基体を含む、試料中の検体核酸配列を同定するための装置であって、前記多孔性基体がマイクロチャンネルを含み、前記マイクロチャンネルは、標的分子を上に固定されており、増幅成分を提供される装置。
【請求項１８】
標的分子が上に固定されている前記マイクロチャンネルが、さらにレポーターシステムを提供される、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記レポーターシステムが前記固定された標的分子内に一体化されている、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれかに記載の装置を含む、核酸分子を含む試料中の検体核酸を同定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一体化した増幅、同定、および分析段階を含む、試料中の検体（類）の検出および定量に有用な方法に関する。さらに具体的には、本発明は、有効な多段階の核酸配列の増幅および診断分析を行うための事項に関する。
【０００２】
本発明の方法は、例えば、疾患の診断（感染症およびその他）、遺伝的分析、農業および環境への応用、薬剤の発見、薬理ゲノム学、ならびに食物および／または水のモニタリングおよび分析を含む種々の用途に有用である。
【背景技術】
【０００３】
特定の核酸の検出は、診断医学および分子生物学的研究についての重要なツールである。細菌およびウイルスのような感染性微生物を同定すること、正常な遺伝子の発現を精査し、そして腫瘍遺伝子のような変異遺伝子を同定すること、組織移植の前に適合性について組織型を決定すること、法医学については組織または血液試料を適合させること、ならびに、種々の種に由来する遺伝子間の相同性を探ることにおいて、遺伝子プローブアッセイは、現在、役割を担っている。
【０００４】
理想的には、遺伝子プローブアッセイは、高感度で特異的であるべきであり、容易に自動化できるべきである。感度、すなわち、検出限界は、なおも核酸検出システムにおける大きな障害のままであり、少量および／または低濃度の試料しか利用できない場合には特にそうである。検体の増幅を含む、この問題に対応するための種々の技術が開発されている。検体の増幅には、試料中の被検出検体配列の増幅（すなわち、複製）が含まれ、これによって検体分子の数の著しい増大が生じる。感度についての要件（すなわち、低い検出限界）は、研究者らに分析の前に特異的な核酸配列を指数的に増幅することを可能にするポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および他の増幅技術の開発によって大きく緩和された。
【０００５】
その標準的な形式では、核酸分析のための増幅技術には、試薬の費用や、工程を自動化する能力を含む商業的な利用に対する多数の限界がある。
【０００６】
マイクロアレイ技術においては、多様なかつ重要な情報が生みだされ、そして可能性のある多くの用途が提供されている。研究、診断、および関連する用途におけるこれらのマイクロアレイの使用はかなり広がってきており、また広がり続けると予想される。膨大な数の特許および他の公開されている文献によって明らかであるように、バイオテクノロジー産業での広がりつつある必要性を満たすために、種々の多様なアレイ技術が開発されている。
【０００７】
マイクロアレイ分析に使用される試料の微量な形式の観点から、検体分子の増幅が間違いなく望まれる。増幅反応の小型化の可能性は、米国特許出願公開第2002/0037510 A1号（特許文献１）において明らかにされている。ここでは、ガラススライド上に並べられたマイクロスポットの中で行われた増幅反応が開示されている。
【特許文献１】米国特許出願公開第2002/0037510 A1号
【発明の開示】
【０００８】
しかし、当該分野で十分に理解されているように、研究用および診断用混合物中の検体としての化学的、生化学的、および生物学的物質を同定しそして定量する、迅速で特異性の高い方法を確保する、改良されたマイクロアレイ分析法への必要性が引き続いてあり、そして拡大している。
【０００９】
本発明の１つの目的は、自動化されたマイクロアレイ分析システムにおいて、改良された検出限界および時間管理の実行を提供することである。本発明の１つの目的は、試料検体の増幅−ハイブリダイゼーション−検出を一体化した、高処理能のマイクロアレイ分析法を提供することである。そのようなものとして、大幅に小型化された感度の高い分析の実行に加えて、本発明は試料中での検体分子の並行した増幅／同定を提供し、これにより同定され増幅された試料検体の効率的な直接検出をより一体化する。例えば、プレ分析増幅段階および／または検出のための過剰な標識の洗い流しのような、時間のかかる段階が全て省略される。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、以下の段階を含む、試料中の検体核酸を同定するための方法を提供する：
(a) 多孔性基体を準備する段階であって、前記基体は複数のマイクロチャンネルを含み、前記マイクロチャンネルは、前記試料中に存在する検体に結合することができる標的分子を上に固定されており、前記チャンネルはさらに、
−検体増幅成分
−レポーターシステム、および
−前記試料
を提供される；
(b) 前記試料中に存在する検体核酸分子を増幅する段階；および
(c) 段階(b)で得られた増幅された検体核酸分子、前記基体のチャンネルの上に固定された前記標的分子、および前記レポーターシステムとの間に結合を生じさせる段階であって、ここで前記レポーターシステムにより、前記標的分子と前記検体核酸との間で結合が生じたかどうかを検出することができる段階。
【００１１】
本発明の主な利点は、チャンネルの表面または多孔性の基体の内部に局在する孔に固定された標的分子に対する、生じた反応成分またはアンプリコンの結合と、前記チャンネルまたは孔の中での実際の反応の一体化に基づく。
【００１２】
本発明はさらに、標識段階を一体化することを可能にし、そしてそのような高処理能自動システムが可能になる。
【００１３】
本発明のさらなる特徴および利点が以下の詳細な説明に示され、そして一部は、記載から明らかになるか、または本発明の実施により知ることができるであろう。本発明の目的および他の利点は、記載される説明および添付の特許請求の範囲に具体的に示される過程によって実現されそして達成されるであろう。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、具体的には、試料中の検体核酸の、一体化した増幅−ハイブリダイゼーション−検出アッセイに関する。
【００１５】
本発明の方法およびこの方法において使用される溶液について記載する前に、本発明が、記載される特定の方法、成分、または溶液に限定されないことが理解されるべきである。というのは、そのような方法、成分、および溶液は当然に変更可能だからである。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲においては、単数形「a」、「an」および「the」は、状況が別個に明確に記載されていない限りは、複数についての言及を含む。
【００１７】
本発明の技術的範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書中で使用される専門用語が限定するものとは意図されないこともまた理解されるべきである。
【００１８】
したがって、定義は、本発明の範囲を限定するようには理解されるべきではない。むしろ、それらは明細書の言語、適切である場合には、特許請求の範囲の言語の解釈のために使用されるべきである。これらの用語はまた、本発明の明細書の文脈の中においてより完全に理解されるであろう。本発明の明細書中にはそれ以上定義されていないか、あるいはその文脈に基づいては解釈できない用語が明細書または特許請求の範囲に含まれている場合は、その分野の当業者によって理解される意味と同じ意味を有するとみなされるべきである。
【００１９】
本明細書中に記載されている方法および材料と同様または同等のあらゆる方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書中に記載されている。
【００２０】
本発明の基体としての使用に適している多数の材料が当該分野で記載されている。本発明の基体としての使用に特に適している材料としては、当該分野で公知の任意の型の多孔性基体が挙げられる。本発明の基体としての使用に特に適しているさらなる材料としては、当該分野で既知の任意の型の固体の多孔性基体が挙げられる。用語「多孔性基体」は、本明細書中で使用される場合には、孔を有しているかまたは孔の多い基体を意味する。ここでは、用語「孔」とは、それにより物質を吸収できるか、またはその中を物質を通過させることができるかのいずれかである、微小な開口部またはマイクロチャンネルを意味する。具体的には、孔がその中を物質を通過させる場合は、基体は透過性であり得る。
【００２１】
基体はビーズ、粒子、シート、フィルム、または膜の形態であることができ、透過性であってもよい。例えば、基体は繊維（例えば、ガラスウールもしくは他のガラス、またはプラスチック繊維）、ガラスまたはプラスチック製のキャピラリーチューブ、または金属酸化物の膜から構成されていてもよい。多孔性基体は平板状であっても、また単純な形状もしくは複雑な形状であってもよい。分子を付着させる表面は、多孔性基体の外表面であっても内表面であってもよい。具体的には、表面が多孔性である場合は、分子は内表面に結合され得る。固体の表面が多孔性である場合は、様々な大きさの孔を、システムの性質に応じて使用することができる。
【００２２】
多孔性基体の材料は、例えば、金属、セラミック用金属酸化物、または有機高分子であることができる。金属としては、例えば、ステンレス鋼（焼結金属）の多孔性基体を使用することができる。耐熱性を必要としない用途には、有機高分子の多孔性基体を、十分に堅い場合には、使用することができる。とりわけ、耐熱性および耐薬品性の観点から、金属酸化物が使用される場合がある。また、金属酸化物は、高いチャンネル密度および高い空孔率の両方を有する基体を提供し、これにより試料を適用する表面の単位ごとに異なる標的分子を含む、高密度のアレイが可能になる。さらに、金属酸化物は可視光線についての透過性が高い。金属酸化物は比較的安価な基体であり、特有の微細加工技術を使用することを全く必要とせず、電気化学的に製造された金属酸化物の膜のような基体は、基体の表面全体をおおう液体分布の制御を改善することができる。貫通した（through-going）方向性のある（oriented）チャンネルを有している金属酸化物の膜は、金属シートの電気化学エッチングにより製造することができる。
【００２３】
したがって、本発明の１つの実施形態においては、上記多孔性基体が金属酸化物の基体である、本明細書中に記載される方法が提供される。
【００２４】
金属酸化物の種類は特には限定されない。金属酸化物としては、中でも、ジルコニウム、ケイ素、ムライト、コージライト、チタン、ゼオライトまたはゼオライト類似物、タンタル、およびアルミニウムの酸化物、さらには、２つまたはそれ以上の金属酸化物の合金、ドープした金属酸化物、ならびに金属酸化物を含む合金が考えられる。
【００２５】
１つの実施形態においては、上記多孔性基体が酸化アルミニウムの基体である、本明細書中に記載される方法が提供される。
【００２６】
本発明の方法において使用される金属酸化物の基体または膜は、陽極酸化皮膜である場合がある。当該分野で周知であるように、金属アルミニウムの基体は、電解質中で陽極酸化されて、陽極酸化皮膜となることができる。陽極酸化の過程により一方の面から伸びる大きな孔のシステムが生じ、他方の面からその内部に広がる小さい孔のシステムと相互接続する。孔の大きさは、小さい孔の最小直径によって決定され、一方、流速は、主に小さい孔の長さによって決定され、それを非常に短くすることができる。したがって、このような膜は、十分に制御された直径と、有用な化学的表面特性を有している、方向性のある貫通した部分的に分岐したチャンネルを有することができる。本発明の方法において使用される金属酸化物の基体または膜の有用な厚みは、例えば、50μmから150μm（60、70、80、90、100、110、120、130、および140μmの厚みを含む）の範囲であればよい。基体の厚みの特に適している例は、60μmである。
【００２７】
適切な基体の孔の直径は、150〜250nmの範囲であり、160、170、180、190、200、210、220、230、および240nmを含む。孔の直径の特に適している例は、200nmである。これらの直径は、本発明の限定と解釈すべきではない。
【００２８】
このような膜は透明であり、特に湿式状態では、種々の光学技術を使用して有利にアッセイができることは有利である。AnoporeTM多孔性基体を開示している国際公開第WO 99/02266号はこの点において代表的であり、本発明において引用により具体的に援用される。
【００２９】
本明細書に記載される方法において使用される特に有用な多孔性基体は、三次元基体であり、これにより液体、例えば試料溶液の、その構造の内部を通る加圧型の移動が可能である。このように、本発明の方法において使用される特に有用な多孔性基体は、透過性またはフロースルー性（flow-through）を有する。二次元基体とは対照的に、本明細書中に記載される方法において使用される三次元基体またはマイクロアレイは、ハイブリダイゼーション時間の顕著な短縮と、シグナルおよびシグナル対ノイズ比の増大をもたらす。さらに、基体の孔を通じて試料溶液を動的に汲み上げ、そして汲み出すために、正圧または陰圧をアレイに加えることができる。基体の孔の壁への生じた生成物の素早い結合によって基体の孔の中で生じる反応から生じた上記生成物の迅速な除去、および生じた上記生成物のリアルタイムの検出を行う能力が、上記の動的なポンプ輸送により可能となる。
【００３０】
さらなる態様においては、上記多孔性基体がフロースルー型基体である、本明細書中に記載される方法が提供される。
【００３１】
本発明において使用される多孔性基体の性質および幾何学的形状は種々の要因、中でも、アレイの型（例えば、一次元、二次元、または三次元）および結合の態様（例えば、共有結合または非共有結合）を含む要因に依存する。一般的には、本発明の基体は、標的分子の永久的な固定が可能であり、そして使用される反応条件下では融解しないかまたはそうでなければ実質的に分解することのない、任意の多孔性材料から構成され得る。
【００３２】
本明細書中で使用される表現「多孔性基体上に固定された」とは、上記基体の内表面への結合または付着を含む、多孔性基体の表面への１つまたはそれ以上の標的分子の結合または付着をいう。
【００３３】
分子または化合物は、共有的に（例えば、システイン残基の単一の反応性チオール基を利用して）、または非共有的に、しかし特異的に（例えば、固定化された抗体、ビオチン／ストレプトアビジンシステムなどを介して）、当該分野で既知の任意の方法によってのいずれかで固定することができる。共有的な固定が意図される場合は、基体は多官能性であるか、または固定される標的と共有結合を形成できる反応基（例えば、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、水酸基、メルカプト基など）で多官能化または活性化することができなければならない。
【００３４】
多孔性基体に標的分子を結合させるために利用できる種々の方法のさらなる例としては、ストレプトアビジンと非共有的に複合体を形成するビオチンリガンド、SHと反応してチオエーテル結合を形成するヨードアセトアミドまたはマレイミドのようなアルキル化剤を介して共有結合するSH-リガンド、活性化カルボン酸塩基（例えば、EDAC結合したものなど）を介して共有結合するアミンリガンド、サリチルヒドロキサム酸（SHA）と複合体を形成するフェニルボロン酸（PBA）リガンド、および遊離のアクリル酸モノマーと重合してポリアクリルアミドを形成するかまたはSHもしくはシラン表面と反応することができる、アクリル結合が挙げられるが、これらに限定されない。さらに具体的には、タンパク質の固定は、臭化シアノゲン、スクシンイミド、アルデヒド、塩化トシル、アビジン-ビオチン、N-γ-マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（GMBS）のようなヘテロ二官能性架橋剤を含む光架橋剤、エポキシド、およびマレイミドを含む群より選択される結合剤を通じて行うことができる。抗体は、支持体の内部に存在する反応性側基に対して、抗体上の遊離のアミノ基を化学的に架橋させることによって、多孔性基体に結合させることができる。例えば、抗体は、遊離のアミノ、カルボキシル、またはイオウ族を含む基体に対して、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、またはGIVMSのようなヘテロ二官能性剤を架橋リンカーとして使用して化学的に架橋することができる。
【００３５】
いわゆるリンカー分子は、活性化された基体から離して標的分子を使用することにおいて有用である場合がある。リンカーは、特定の用途に応じて、長いまたは短い、柔軟性のある、半剛性または剛性、帯電しているまたは帯電していない、疎水性または親水性であることができる。基体の表面上に存在することができ上記表面への標的分子の結合に使用される特に有用なリンカーは二官能性であり、すなわち、これらは活性化された基体と連結を形成することができる１つの官能基または官能性部分と、別のリンカー分子または標的分子との連結を形成することができる任意の他の官能基または官能性部分を有する。
【００３６】
特定の状況では、リンカーを、１つの官能基を別の官能基に「転換させる」ために使用することができる。例えば、アミノ活性化基体を、例えば、3-ヒドロキシ-プロピオン酸との反応によってヒドロキシル活性化基体へと転換させることができる。この方法では、特定の反応性官能基では容易に活性化することができない基体材料を、適切に活性化された基体へと簡単に転換させることができる。このような反応基の「転換」に適切な化学反応および試薬は周知であり、当業者に明らかである。
【００３７】
リンカーはまた、必要な場合には、活性化された基体上の反応基の数を増大させる、または「増幅する」ために使用することができる。この実施形態については、リンカーは３つまたはそれ以上の官能基を有する。官能基の１つによる活性化された基体への結合の後、残っている２つまたはそれ以上の基が、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのような標的分子の結合に利用される。この様式で活性化された基体上の官能基の数を増幅することは、基体を十分な数の反応基で活性化することが容易にはできない場合に、特に便利である。
【００３８】
適切なリンカーまたは架橋リンカー分子としては、限定はされないが、例としてポリプロリンまたはポリアラニンのようなポリペプチド、1-アミノ-ヘキサン酸のような飽和または不飽和二官能性炭化水素、ポリエチレングリコールなどの高分子、水酸基とのホスホジエステル結合の形成に有用な1,4-ジメトキシトリチル-ポリエチレングリコールホスホルアミダイトを挙げることができ、これらは例えば、Zhang等、1991、Nucl. 20 Acids Res. 19: 3929-3933およびDurand等、1990、Nucl. Acid Res. 18: 6353-6359に記載されている。他の有用なリンカーは商業的に入手することができる。
【００３９】
一般的に、標的分子は基体に共有結合させられると考えられる。これにより、基体からの上記分子の損失を最少にする。金属酸化物への有機化合物の共有結合は当該分野で周知であり、例えば、Chu. C. W. 等（J. Adhesion Sci. Technol. 7、417-433頁、1993）およびFadda, M. B. 等（Biotechnology and Applied Biochemistry、16、221-227頁、1992）によって記載された方法を使用する。さらに、シラン化剤および生体分子の結合による金属酸化物支持体の活性化の後にも、なお上記のシラン化剤の多数のアミノ基が、無負荷のアミノ基として存在することができる。これにより、負荷された支持体が使用される媒体中に存在する種々の物質との上記アミノ基の望ましくない相互作用が生じ、これにより高いバックグラウンドシグナルが生じる場合がある。無負荷のアミノ基は、続いて酸性溶液で負荷した支持体を処理することにより、支持体の負荷部分に影響を与えることなく支持体から除去することができる。同様に、活性化され負荷された支持体は、この方法が(3-アミノプロピル）-トリエトキシシランでアミノ化された酸化アルミニウムのナノ粒子の誘導に使用されないという条件で、塩基性または中性溶液で処理することができる。ここでは、塩基性溶液にはさらに大過剰のN-アセチルホモシステインラクトンが含まれる。これに関しては、国際公開第WO 01/12846号が代表例であり、この公開特許出願は本発明において具体的に援用される。
【００４０】
用語「標的」および「標的分子」は本発明を通じて同じ意味で使用され、基体の上に固定された分子をいい、また、固定されたプローブまたは捕捉プローブとも呼ばれる。広範囲の多様な種々の分子を本発明のアレイの基体上に固定することができる。同様に、本発明の方法は、本発明のアレイの基体上に固定することができる広範囲の多様な種々の分子または標的に対して適用することができる。標的または標的分子は、本明細書中で使用される場合は、特定の検体の検出および同定のためのマイクロアレイ分析を行う目的のために基体に結合させることができる任意の分子をいう。標的はさらに、特定の増幅された検体によって認識することができ、および／または特定の増幅された検体と相互作用することができる分子をいう。
【００４１】
この方法およびアレイは、基体上に固定された標的としての、デオキシリボ核酸（DNA、cDNA）、リボ核酸（RNA、mRNA、cRNA、aRNA）、ペプチド核酸（PNA）、ならびに／またはポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含むそれらの断片を含む核酸配列に関して、本明細書中で具体的に説明される。
【００４２】
固定された分子は、特定の検体分子に結合するかまたは特定の検体分子とハイブリダイズするように調整されることができる。例えば、mRNA分子より逆転写したcDNAライブラリーから特定の遺伝子の発現を決定するためにアレイを使用する場合は、固定した分子を、その遺伝子、遺伝子断片、またはそのような遺伝子もしくは遺伝子断片の発現産物に相補的な配列を有するように、あるいは別の方法でそれらを認識できるように構築することができる。この場合、核酸を、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、ウイルス、環境、または他の供給源を含むがこれらに限定されない任意の生物学的供給源から得ることができる。
【００４３】
固定された標的分子、例えば、ポリヌクレオチドの組成は重要ではない。唯一の要件は、固定された標的分子が、もしあれば、相補配列の検体分子、例えば核酸に、ハイブリダイズできることである。例えば、固定されたポリヌクレオチドは、全てが天然の、または全てが合成のヌクレオチド塩基から構成されていてもよく、または両方の組み合わせによって構成されていてもよい。本発明での使用に適切な修飾塩基の限定的ではない例は、例えば、Practical Handbook of Biochemistry and Molecular biology, G. Fasman編、CRC Press, 1989、385-392頁に記載されている。ほとんどの例においては、ポリヌクレオチドは全体が天然の塩基（A、C、G、T、またはU）から構成されているが、特定の状況においては合成の塩基の使用が好まれる場合がある。
【００４４】
さらに、固定されたポリヌクレオチドの骨格は、一般的には、全体が「天然の」ホスホジエステル結合から構成され、これらは１つまたはそれ以上のホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、または他の修飾された結合のような、１つまたはそれ以上の修飾された結合を含むことができる。特異的な例としては、１つまたはそれ以上の固定されたポリヌクレオチドがペプチド核酸（PNA）であり、これはアミド間結合を含む。本発明と組み合わせて使用することができる修飾された塩基および骨格、さらにはそれらの合成のための方法のさらなる例は、例えば、Uhlman & Peyman, 1990、Chemical Review 90 (4): 544-584; Goodchild, 1990、Bioconjugate Chem. 1 (3): 165-186; Egholm等、1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895-1897、さらには上記の全ての中で引用されている参考文献において見ることができる。骨格、糖、または複素環塩基の変更を含む天然の構造の修飾は、細胞内安定性および結合親和性を高めることが示されている。中でも、骨格の化学的性質の有用な変化の中にはホスホロチオエート；架橋していない酸素が両方とも硫黄で置換されているホスホロ−ジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートである。対掌性のリン酸誘導体（A-chiral phosphate derivatives）としては、3'-O-5'-S-ホスホロチオエート、3'-S-5'-O-ホスホロチオエート、3'-CH2-5'-O-ホスホネート、および3'-NH-5'-O-ホスホロアミダートが挙げられる。ペプチド核酸は、リボースホスホジエステル骨格全体をペプチド結合で置き換える。ロックされた（locked）核酸は、デオキシリボースの2'-カルボキシル基と5'-カルボキシル基または4'-カルボキシル基との間でのさらなる結合によって、糖部分にさらに立体構造的な安定性を与える。糖の修飾もまた、安定性および親和性を高めるために使用される。デオキシリボースのa-アノマーを使用することができる場合もある。a-アノマーでは塩基は天然のp-アノマーに関しての反転である。リボース糖の2'-OHは、親和性を含まないで分解に対する抵抗性を提供する2'-O-メチルまたは2'-O-アリル糖を形成するように変更することができる。本発明の方法での使用が見出されている複素環塩基の修飾は、適切な塩基対合が可能な修飾である。有用な置換として、デオキシチミジンについてデオキシウリジン；デオキシシチジンについて5-メチル-2'-デオキシシチジンおよび5-ブロモ-2'-デオキシシチジンが挙げられる。5-プロピニル-2'-デオキシウリジンおよび5-プロピニル-2'-デオキシシチジンは、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンをそれぞれで置換した場合に、親和性と生物学的活性を増大することが示されている。
【００４５】
塩基対合の関係を形成することができる自然界には存在しない塩基の例として、アザ-およびデアザ-ピリミジン類似体、アザ-およびデアザ-プリン類似体、ならびにプリンおよびピリミジン環の１つまたはそれ以上の炭素および窒素原子がヘテロ原子、例えば、酸素、イオウ、セレニウム、リンなどによって置換されている他の複素環塩基類似体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４６】
固定された分子の長さは、それらがヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、または同様の高分子である場合は、通常は5から1000ヌクレオチド、状況に応じて5から500ヌクレオチド、さらに状況に応じて5から250ヌクレオチドであり、なおさらに状況に応じて5から75ヌクレオチドである。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸プローブは二本鎖であるかまたは一本鎖であってもよく、あるいはcDNAから増幅したPCR断片でもよい。
【００４７】
固定されたポリヌクレオチドは、国際公開第WO 98/31836号の具体的には27〜29頁において議論されているように、例えば核酸を配列決定するための、「ユニバーサルセット」を構成することができる。あるいは、ポリヌクレオチドのセットを、既知の配列中で同定されるべき特定の変異に対応させることができる。
【００４８】
本明細書中による方法およびアレイは、他の型の分子にも同様に適用できる。例えば、当業者は、例えば転写因子、薬剤、毒素、リポソームなどのタンパク質を含む標的に対して適用するために、本発明の方法およびアレイを容易に適応させることができる。
【００４９】
本発明においては、標的分子は、基体上の空間的に事前に決められた領域、すなわち、特定のスポットに固定される。用語「事前に決められた領域」または「スポット」は、本明細書中では同じ意味で使用され、そしてアレイ上の個々の、空間的に指定可能な位置をいう。
【００５０】
事前に決められた領域は、一般的には、分子の沈澱を標的化するために使用される、そのように使用された、または、そのように使用することが意図される基体の上面上の局所的な範囲である。その後、標的分子の固定を、上記の上面上（外部）で、または多孔性基体の内部の孔の表面上（内表面）、あるいはそれらの両方で行うことができる。
【００５１】
本発明のマイクロアレイは、任意の望ましい大きさであってよく、2スポットから106スポット、またはそれ以上であってよい。基体の大きさの上限および下限は、極端に小さいまたは大きい基体を用いた作業の実用性のみを考慮して、決定される。
【００５２】
ある一定の基体の大きさについては、上限はマイクロアレイ上にスポットを作成しそして検出する能力によってのみ決定される。
【００５３】
マイクロアレイ上のスポットの好ましい数は、一般的には、マイクロアレイが適用される特定の使用に応じて異なる。本明細書中で使用される場合には、スポットの密度は、基体の平坦な二次元（2D）の上面に対する図によって決定されるような、1平方ミリメートルあたりの空間的に事前に決められた領域の数に関すると理解される。
【００５４】
例えば、ハイブリダイゼーションによる配列決定には、一般的には大きなアレイが必要であるが、変異の検出にはごく小さなアレイしか必要がない場合がある。一般的には、本発明のマイクロアレイは、平坦な表面1平方ミリメートルあたり2から10,000個のスポットを含む。特に有用なスポットの密度は、2から1000スポット/mm2の範囲内である。よりさらに有用なスポットの密度は、2から100スポット/mm2の範囲内である。通常、本発明において有用なマイクロアレイは25スポット/mm2のスポット密度を有する。
【００５５】
さらに、マイクロアレイ上の全てのスポットが固有のものである必要はない。実際、多くの適用においては、スポットが過剰にあることが、内部対照として作用する目的のために望ましい。
【００５６】
本発明の方法およびアレイには、試料の調製の際のばらつきによるシグナルの誤りを補正するために、レポーター分子に結合することができる固定された内部標準の使用を一体化させることができる。これに関しては、国際公開第WO 03/054551号が代表例であり、この国際出願は本発明に具体的に組み込まれる。
【００５７】
アレイの各スポットには、種々の配列のポリヌクレオチドの混合物を含ませることができる。これらの混合物は、構造NxByNzの縮重ポリヌクレオチドを含むことができる。ここでは、Nは4つの塩基のいずれかを示し、所定の混合物中のポリヌクレオチドについて変化し、Bは4つの塩基のいずれかを示すが、所定の混合物中のポリヌクレオチドのそれぞれについて同じであり、x、y、zは整数である。あるいは、スポットは既知の核酸の種々の領域に対応するポリヌクレオチドの混合物を含むことができる。これらの領域は、重複していてもよく、隣接していてもよく、また隣接していなくてもよい。これらの型の混合物を含むアレイは、例えば、特定の病原体または他の生物体に由来するものを含む、特異的な核酸を同定することにおいて有用である。両方の型の混合物が、国際公開第WO 98/31837号において議論されている。
【００５８】
事前に決められた領域またはスポットは、例えば、円形、長方形、楕円形、くさび型などの任意の使いやすい形状であってよい。基体の平坦な二次元（2D）上面から決定される事前に決められた領域は、約1cm2より小さいか、または1mm2未満であってもよい。通常、そのような領域は50,000μm2未満、より一般的には10,000μm2未満の面積を有し、100μm2未満である場合も、また10μm2未満である場合もある。
【００５９】
基体上の事前に決められた領域は空間的に並べられており、点の列、または四角の列のような正確なパターン、あるいは異なるアレイを形成するための線になっている。
【００６０】
用語「マイクロアレイ」は、本明細書中で使用される場合は、特異的な位置に並べられた標的分子のマトリックスを有している多孔性基体をいう。
【００６１】
標的分子を上（外表面および／または内表面）に固定することができる基体表面はまた、活性表面とも呼ばれる。標的分子の固定は直接であっても、合成によるものであってもよい。異なる空間的アドレスでの事前に合成されたポリヌクレオチドの固定により、その配列をそれらの空間的なアドレスによって同定することができるポリヌクレオチドのアレイが得られる。ポリヌクレオチドのインサイチュ合成が必要である場合には、ポリヌクレオチドはその通常の様式で合成される。合成スキームによって、その配列をそれらの空間的なアドレスによって同定することができるポリヌクレオチドのアレイが得られる。
【００６２】
用語「標的分子」は、本明細書中で使用される場合は、検体分子に結合することができる分子をいう。標的分子は、基体に直接結合させることができ、また活性化基および／またはリンカーのような基体に結合する物質を介して結合させることができる。
【００６３】
本発明は、核酸配列のような検体分子を同定および定量するための、試料のマイクロアレイ分析に関する。特異的な標的／検体結合対またはハイブリッドの形成をベースとする典型的なアッセイとしては、特異的な結合対の形成の指標である検出可能なシグナルを提供するレポーターシステムが挙げられる。上記レポーターシステムは、蛍光物質、放射性物質、任意の他のシグナル伝達部分、または色のついた複合体もしくはいくつかの他のそのような検出可能な反応産物を形成するように別の種とさらに反応する物質を含むことができる標識であり得る。
【００６４】
したがって、１つの実施形態においては、上記レポーターシステムが、着色反応を誘導することができる、および／または生体発光、化学発光、もしくは光発光できるレポーターシステムである、本明細書中に記載される方法が提供される。
【００６５】
さらなる実施形態においては、上記レポーターシステムが蛍光消光システムである、本明細書中に記載される方法が提供される。
【００６６】
当該分野で周知であるように、蛍光消光システムは、これらの部分を保有している原型（intact）の「検出プローブ」において蛍光の消光を生じる立体構造にある蛍光基および消光基部分によって特徴付けられる。最適なシグナル対ノイズ比は、蛍光基および消光基部分がプローブの3'および5'末端にある場合に達成される。しかし、蛍光基および消光基部分が空間的に離れており、これらが接近した場合にエネルギーの移動が最も効率的であることが原因で、最適よりも低い蛍光の消光が生じる場合がある。したがって、別のプローブの設計は、２つの相補的なアーム配列内に埋め込まれたプローブ配列、いわゆる分子ビーコンを含んでいてもよい。検体配列または検体分子が存在しない場合には、アーム配列は互いにアニーリングして、それによりループとヘアピンのステム構造を形成する。ステム構造は蛍光基と消光基を両方とも保有している。検体核酸または検体分子と接触すると、相補的なプローブ配列と検体配列／領域はハイブリダイズする。ヘアピンステムはハイブリダイゼーションの際に形成される硬い二重螺旋と同時には存在できないので、生じる立体構造の変化によってアーム配列が離れて、蛍光基と消光基が分離される。蛍光基と消光基が離されると、蛍光供与基のエネルギーは受容基部分には移動せず、したがって蛍光シグナルが検出される。ハイブリダイズしていない分子ビーコンは蛍光を発さず、過剰な検出プローブをアッセイから除去する必要はない。
【００６７】
用語「蛍光供与基」は、エネルギーを吸収することができ、別の蛍光発生分子または化合物の一部にエネルギーを移動させることができる、蛍光発生化合物のラジカルをいう。適切な供与基である蛍光発生分子として、クマリンおよび関連する色素、フルオレセイン、ロドール（rhodols）、およびローダミンのようなキサンチン色素、レゾルフィン、シアニン色素、ビマネ（bimane）、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、ルミノールおよびイソルミノール誘導体のようなアミノフタルヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン、ならびにユーロピウムおよびテルビウム錯体、ならびに関連化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
用語「消光基」は、供与基に結合すると蛍光供与基からの発光を減少させることができる、色素体分子または化合物の一部をいう。消光は、蛍光共鳴エネルギー転移、光誘導型電子移動、項間交差の常磁性増強、Dexter交換カップリング、および暗色錯体の形成のような励起カップリングを含むいくつかの機構のいずれかによって起こり得る。消光基は蛍光共鳴エネルギー転移を通じて作動し得る。多くの消光基は蛍光として、転移させられたエネルギーを再発光することができる。例としては、クマリンおよび関連する蛍光基、フルオレセイン、ロドール、およびローダミンのようなキサンチン、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアザインダセン、およびフタロシアニンが挙げられる。消光基の他の化学的なクラスは、一般的には、転移させられたエネルギーを再発光しない。例としては、インディゴ、ベンゾキノン、アントラキノン、アゾ化合物、ニトロ化合物、インドアニリン、ジ−およびトリフェニルメタンが挙げられる。
【００６９】
用語「色素」は、紫外線を含むがこれに限定されない光の特異的な周波数を吸収する分子または化合物の一部をいう。用語「色素」および「発色団」は同義である。用語「蛍光基」は蛍光を発する発色団をいう。
【００７０】
さらなる実施形態においては、上記蛍光消光システムが分子ビーコンである、本明細書中に記載される方法が提供される。
【００７１】
本発明において有用な分子ビーコンの相補的プローブ配列は、DNA、RNA、またはPNA（米国特許第6,361,942号を参照のこと）配列であり得る。
【００７２】
分子ビーコンがエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって分解されやすい場合は、例えば、米国特許第5,691,146号に開示されているように、１つまたはそれ以上の修飾されたヌクレオチド間結合を含めることによって、オリゴヌクレオチドの5'末端がヌクレアーゼ消化に侵されないようにすることができる。また、米国特許第5,691,146号において示唆されているように、PNAまたはペプチドをヌクレアーゼ耐性である結合として使用して、それによってヌクレオチドプローブの5'末端を修飾して、ヌクレアーゼ消化に侵されないようにすることもできる。
【００７３】
本明細書中に記載される方法において特に有用なレポーターシステムとしては、捕捉−プローブをベースとする検体配列検出システムを提供するための標的メンバーの標識が挙げられ、これにより試料中の目的の１つまたはそれ以上の検体配列または検体分子の存在、存在しないこと、および量の指標である検出可能なシグナルを生じることができる。このように、上記の「検出プローブ」は、基体上に固定された標的分子または捕捉プローブ自体である場合もある。このように、本発明は、本明細書中で使用される標的分子が分子ビーコンである場合があることを想定している。
【００７４】
したがって、上記レポーターシステムが上記標的分子内に一体化されている本明細書中で開示される方法が提供される。
【００７５】
検出の様式は、標識の性質に応じて異なる。蛍光標識については、当該分野で周知であるように、バックグラウンドのシグナルを共焦点カメラまたはCCDカメラを用いてアレイをスキャンすることによって簡単に定量することができる。
【００７６】
試料は、一般的には、検体を単離するおよび／または特徴付けるために操作される。多くの例では、複数の種の検体が非常に低い濃度で試料中に存在し；したがって、それによって生じる検出可能なシグナルは非常に弱い。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のような検体増幅技術を、核酸または核物質を含む試料に対して適用して、その濃度を増大させることができる。検体核酸を、また、逆転写のような当該分野で公知の技術を使用して他の核酸、例えば、mRNA、cDNA、cRNAなどへと処理し転換することもできる。検体核酸は、当該分野で公知の任意の方法を使用して目的の組織または細胞から単離することができる。全RNAまたはその転写活性のある画分mRNAを組織から単離し、標識し、そして検体核酸として直接使用することができ、また、逆転写、転写、Tyras、NASBA、および／またはPCRのような方法によって標識されたcDNA、cRNAなどへと転換することもできる。一般的には、このような方法には、オリゴヌクレオチドプライマーが使用され、プライマーは、バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーターによって連結させることができる。プライマーは多数の範囲のRNA種をコピーするように設計することができ、例えば、オリゴdTプライマーまたはランダムヘキサマー、また目的の遺伝子のサブセットをコピーするように特異的に設計することもできる。コピーする段階、すなわち、mRNAのcDNAへの転換の後、cDNAを、PCRまたはバクテリオファージRNAポリメラーゼ媒介性転写、NASBA、もしくはTyrasを使用する線形増幅によって増幅させることができる。検体核酸配列はまた、典型的な数の遺伝子特異的増幅プライマーのセットを使用して作成することもできる。
【００７７】
例えば、増幅のような試料操作がマイクロアレイ分析に一体化されている方法が、本発明において提供される。
【００７８】
本明細書中で使用される場合は、「増幅」とは、「アンプリコン」または「増幅産物」とも呼ばれる目的の特定の核酸検体のコピー数を増大させることをいう。
【００７９】
本明細書中で使用される場合は、「増幅成分」は、酵素、緩衝液、ならびに目的の検体核酸のアンプリコンまたは増幅産物を形成するための増幅反応を行うために必要な増幅プライマーおよびヌクレオチドを含む核酸のような反応試薬をいう。増幅プライマーは、「ブロックされていて」別の核酸に共有結合することができないか、またはブロックされておらず、DNAポリメラーゼもしくは逆転写酵素によって触媒されるような核酸鎖の伸張が可能である化学基を3'末端に保有しているかのいずれかである3'末端を有する核酸分子である。本発明で使用される増幅プライマーは、典型的には溶液中に存在し、固体のマイクロアレイ基体上には固定されない。したがって、本発明のマイクロアレイアッセイには、固定された標的分子とは組成および機能が明らかに異なる増幅プライマーが含まれる。このように、本発明のアッセイには、「チップ上での」増幅工程ではなくチップ内に一体化された増幅工程が含まれる。
【００８０】
標的分子内に一体化されていない場合（すなわち、標的分子自体が、例えば分子ビーコンのような検出プローブではない場合）は、分子ビーコンによって提供されるような検出プローブを含むレポーターシステムを、増幅成分の混合物に対して添加することができる。２つまたはそれ以上の異なって標識されたレポーターシステムまたは蛍光消光プローブまたは分子ビーコンを、例えば、複数の対立遺伝子変異体（野生型と変異体（類））について試料を分析するために、多重適用の目的のために上記混合物に対して添加することができ、これにより増幅の間に生じる蛍光色が遺伝子型を明らかにする。あるいは、異なって固定されたレポーターシステムもまた異なる標識を保有することができる。
【００８１】
有用な検体増幅ストラテジーとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）、および核酸配列増幅（NASBA）が挙げられる。
【００８２】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は広く使用され、記載されている。これには、熱サイクルと組み合わせてプライマーの伸張を使用して、標的配列を増幅することが含まれる。米国特許第4,683,195号、および同第4,683,202号、およびPCR Essential Data, J. W. Wiley & Sons、C. R. Newton編、1995を参照のこと。引用によりこれらの全てを援用する。さらに、これらもまた本発明での使用が見出されている多数のPCRのバリエーションが存在し、「定量的競合的PCR」すなわち「QC-PCR」、「アービトラリリープライムド（arbitrarily primed）PCR」すなわち「AP-PCR」、「免疫PCR」、「Alu-PCR」、「PCR一本鎖高次構造多型」すなわち「PCR-SSCP」、対立遺伝子PCR；「逆転写PCR」すなわち「RT-PCR」、「ビオチン捕捉PCR」、「ベクトレッテ（vectorette） PCR」、「パンハンドル（panhandle） PCR」、および「PCR選択cDNAサブトラクション」などが挙げられる。
【００８３】
鎖置換増幅（SDA）は、Walker等、Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995、ならびに米国特許第5,455,166号および米国特許第5,130,238号に一般的に記載されている。引用によりこれらの全てを本明細書中に援用する。
【００８４】
引用により本明細書中に援用する国際公開第WO 99/43850号に開示されているTYRAS増幅法は、cDNA合成を含まない非選択的ポリ-A mRNA増幅法である。この方法には、オリゴ-Tストレッチを含むオリゴヌクレオチドの、mRNAのポリ-Aテールへのハイブリダイゼーション、これに続く反対側のオリゴヌクレオチドのRNaseH消化、および逆転写酵素での新しく形成されたmRNAの3'末端の伸張が含まれる。この方法では、オリゴ-Tストレッチを含むオリゴヌクレオチドの一部であるT7 RNAポリメラーゼ認識配列（すなわち、T7プロモーター）が二本鎖になる。T7 RNAポリメラーゼのプロモーターへの結合の際に、最初のmRNA分子は異極性の複数のRNAコピーへと転写される。
【００８５】
RNAはまた、引用により本明細書中に援用する米国特許第5,545,522号において開示されている方法にしたがって増幅することもできる。ここでは、cDNAが、RNAポリメラーゼのプロモーター領域相補物に連結された相補的プライマーを使用してRNA配列から合成され、その後、アンチセンスRNA（aRNA）が、プロモーター領域に結合することができるRNAポリメラーゼを導入することによってcDNAから転写される。
【００８６】
転写媒介性増幅（TMA）は、反応を駆動する２つの酵素：RNAポリメラーゼと逆転写酵素を使用するRNA転写増幅システムである。
【００８７】
核酸配列増幅法（NASBA）は、米国特許第5,409,818号、および「遺伝子診断によるプロフィッティング（Profiting from Gene-based Diagnostics）」、CTB International Publishing Inc., N. J., 1996に一般的に記載されている。引用によりこれらの両方を援用する。NASBAは３つの酵素：AMV-RT（トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素）、RNase H、およびT7 RNAポリメラーゼの同時の活性を利用する。NASBAは3SR増幅反応、すなわち自己維持配列複製反応（self-sustained-sequence-replication-reaction）の特殊な場合である。
【００８８】
3SR反応は、生体外での標的DNAまたはRNA配列の等温増幅のための非常に効率のよい方法である。この方法には３つの酵素活性：逆転写酵素、DNA依存性RNAポリメラーゼ、および大腸菌（Escherichia coli）リボヌクレアーゼHが必要である。
【００８９】
ローリングサークル増幅（RCA）は、感染した細胞中のそれらのDNAのコピーを迅速に大量生産するために、ウイルスによって使用されるものと同じ分子機構の一部を利用する。RCAにおいては、酵素が、文字通りDNAの長い繰り返された配列を転がりながら、DNAの円を囲むように読み取る。
【００９０】
したがって、核酸分子の増幅がPCR、rtPCR、SDA、TYRAS、NASBA、RCA、3SR、およびTMAからなる群より選択される増幅技術による、本明細書中に記載される方法が提供される。
【００９１】
特に有用なマイクロアレイの構成には、引用して本明細書中に援用する国際出願第PCT/EP02/02448号に開示されているようなインキュベーターシステムが含まれる。上記インキュベーターシステムには、本明細書中に記載される基体のハウジングに適切なチャンバー、混入およびそれによる制御されていない反応プロセスを防ぐための閉鎖手段が含まれる。特に有用な閉鎖手段は、限定はされないが、ガラスまたはPlexiglass（登録商標）などの透明プラスチックのような透明な材料からつくられたものである。このような透明な閉鎖手段は、上記基体の上面からシグナルを検出できるように、基体の上面の上に配置される。
【００９２】
閉じられてもなお、発生したシグナルの測定ができるように、基体を見ることができるままになっていなければならない。したがって、温度制御システムは、国際出願第PCT/EP02/02448号に開示されているように準備される。
【００９３】
したがって、本発明の１つの実施形態においては、基体がハウジング内に組み込まれている、本明細書中に記載される方法が提供される。
【００９４】
本発明のさらなる実施形態においては、上記ハウジングが閉鎖手段を含み、上記閉鎖手段が基体の上面の上に配置される、本明細書中に記載される方法が提供される。
【００９５】
本発明において意図されるように、増幅成分は単独で、またはレポーターシステムと組み合わせて、基体に試料を載せる前に基体に提供することができる。この場合、基体内のチャンネルには増幅成分とレポーターシステムを予め充填することができる。あるいは、試料、レポーターシステム、および増幅成分を、基体に載せる前に試料混合物と混合することができる。さらに代案として、上記チャンネルに予め増幅成分のみを充填し、ここにはレポーターシステムが、上記チャンネル内に固定されており、それにより標的分子を提示することができる。
【００９６】
上記温度制御システムは、増幅反応を開始させそして進行させるために適切な温度を生じることができる。温度を、増幅（例えば、PCR）の経過の間に変化させることができる。適切な温度のバリエーションとしては、30℃から95℃、および40℃、および95℃が挙げられる。定温を生じることもまた本発明の方法において有用である。上記の定温は、アレイ基体内、さらには上記基体が組み込まれている閉鎖されたハウジング内に作成することができる。したがって、試料混合物を基体に載せる際に、試料が膜チャンネルに達する前に増幅反応を試料内で開始させることができる。本発明に有用な定温は、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、または60℃であり得る。
【００９７】
本発明の１つの実施形態においては、上記増幅反応が等温条件下である本明細書中に記載される方法が提供される。
【００９８】
閉鎖されたハウジング内に組み込むことができる基体を通じて交互性の流れを生じさせ、これにより、検体または検体のアンプリコンと固定された標的分子および／またはレポーターシステムとの間での反応に好ましい条件下で、試料を基体の上側から基体の下側および逆方向へと少なくとも１回、基体のチャンネルを通して通過させる。
【００９９】
増幅後、試料検体物は、相補的な標的のハイブリダイゼーションを通じて同定することができる。
【０１００】
１つの実施形態においては、標的分子と増幅された検体核酸との間で結合が生じたがどうかがリアルタイムに検出される、本明細書中に記載される方法が提供される。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合は、用語「検体」または「検体分子」、「検体核酸」および「検体配列」は同じ意味で使用される。上記の用語は、その存在または存在しないことが試料中で検出されることが望まれる核酸配列をいう。検体核酸は一本鎖であっても二本鎖でもあってもよい。さらに、検体核酸は、最も顕著には、DNA、RNA、PNAのいずれかの形態の核酸であり、それらの断片も含まれる。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合は、用語「試料」は、例えば、核酸のような目的の１つまたはそれ以上の検体分子の存在についてアッセイされる物質をいう。目的の核酸または核酸類は、他の核酸の混合物中に存在する場合がある。目的の核酸を含む試料は、多数の方法で得ることができる。細胞溶解物、精製されたゲノムDNA、ヒトまたは動物由来の体液、臨床試料、食品試料などを含む実質的に全ての試料を、本明細書の方法を使用して分析することができる。通常、試料は生物学的試料または生化学的試料である。用語「生物学的試料」は、本明細書中で使用される場合は、生物体から、または生物体の成分（例えば、細胞）から得られた試料をいう。試料はあらゆる生物学的組織または液体であることができる。多くの場合は、試料は「臨床試料」であり、これは患者由来の試料である。このような試料として、唾液、脳脊髄液、血液、胎児血清（例えば、SFC）を含む血清および血漿を含む血液画分、血球（例えば、白血球）、組織、または細針生検試料、尿、腹水、および胸膜液、あるいはそれらに由来する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的試料としてはまた、組織学的目的のために採取した凍結切片のような組織の切片が挙げられる。試料はまた、例えば、生理学的試料であってもよい。
【０１０３】
本発明は、既知および未知の多型および変異の高処理能の遺伝子型同定に適用することができる。核酸変異は、フレームシフト変異を含む欠失および挿入；および単一のヌクレオチド変異または多型を含む塩基対置換であり得る。
【０１０４】
したがって、１つの実施形態においては、試料中の核酸の同定および定量のための、本発明に従う本明細書中に記載される方法の使用が提供される。
【０１０５】
さらなる実施形態においては、遺伝子型同定を行うための、本発明に従う本明細書中に記載される方法の使用が提供される。
【０１０６】
ゲノムにはいくつかの型のDNA配列のバリエーションが存在する。これらのバリエーションには、挿入、欠失、および反復配列のコピー数の差が含まれる。遺伝子コードにおけるこれらの差異は、遺伝子多型と呼ばれる。ゲノムにおける最も一般的なDNA配列のバリエーションは、１塩基対置換である。これらは一般的には、変異体対立遺伝子が少なくとも１％の母集団頻度を有する場合に、一ヌクレオチド多型（SNP）と呼ばれる。SNPは、それらがゲノムにおいて現れる場所によって分類することができる。例えば、一ヌクレオチド多型は、それがタンパク質をコードする領域に存在する場合にはコードSNP（cSNP）として、またそれがコード領域内に存在するかどうかにはかかわらずゲノムのどこでも検出される場合にはゲノムSNP（gSNP）として分類することができる。コードSNPには、サイレントSNP（sSNP）が含まれ、そしてSNPは、調節領域または調節エレメント（例えば、調節SNP、すなわちrSNP）およびイントロン（例えば、イントロンSNP、すなわちiSNP）のようなコード配列に関係している領域中に存在する可能性がある。
【０１０７】
SNPは、DNA配列のバリエーションと、疾患、症状、および薬物応答との間の関係を研究することにおいて特に有用である。なぜなら、SNPは集団において安定であり、頻繁に生じ、そして反復配列のような他のゲノムのバリエーションよりも低い変異率を有するからである。さらに、SNPを検出するための方法は、他のあまり一般的ではないDNA配列のバリエーションを検出するための方法よりも、自動化しやすく、大規模な研究に使用しやすい。
【０１０８】
さらなる実施形態においては、核酸変異の検出を行うための、本発明に従う本明細書中に記載される方法の使用が提供される。
【０１０９】
本発明のさらなる目的は、多孔性基体を含む、試料中の検体核酸配列を同定するための装置を提供することであり、上記多孔性基体はマイクロチャンネルを含み、上記マイクロチャンネルにはその上に標的分子が固定されており、そして増幅成分が準備される。
【０１１０】
このように、本発明は、反応の実行に必要な成分の湿式または乾式の処方物中に予め調剤された試薬が満たされているマイクロチャンネルを有している多孔性基体を含む装置を提供する。
【０１１１】
１つの実施形態においては、その上に標的分子が固定されているマイクロチャンネルがさらにレポーターシステムを含むように準備される、本発明の装置が提供される。
【０１１２】
さらなる実施形態においては、上記レポーターシステムが上記固定された標的分子内に一体化されている本発明の装置が提供される。
【０１１３】
本発明のさらなる目的は、核酸分子を含む試料中の検体核酸を同定するためのキットを提供することであり、上記キットは本発明の装置を含む。
【実施例】
【０１１４】
本発明の以下の実施例は代表例であって、多少なりとも限定的にとられるべきではない。
【０１１５】
実施例１：NASBA増幅および分子ビーコンを通じた検出を含む一体化した分析を使用した標的の同定
分子ビーコンの設計
プローブを、一方のプライム末端を蛍光基で、そして他方のプライム末端を消光性分子で標識する。さらに、リンカーに、固体である基体の表面への結合を可能にする保護された反応性部分を結合させる。分子ビーコンの核酸配列を、等温増幅の温度、すなわち41℃で目的である標的に特異的にハイブリダイズするように設計する。種々の標的または対立遺伝子変異体を検出するために、種々の分子ビーコンを設計する。
【０１１６】
核酸配列に基づく増幅
全ての増幅試薬および標的検体を含む混合物をアレイに加える。温度を、41℃に設定して、膜内で増幅が生じることを可能にする。圧力によって駆動される試料の流入により、増幅が生じ、同時に基体の表面上に固定された分子ビーコンに対して生じたアンプリコンが結合することができる。
【０１１７】
検出
蛍光シグナルは、標的が分子ビーコンに結合した場合にのみ生じ、存在する標的の量に比例する。増幅反応の間に、蛍光顕微鏡を用いて蛍光をリアルタイムで測定する。存在する種々の標的についての配列情報を、特定のスポットに光を当てることによって得る。標的の定量は、目的の蛍光シグナルがバックグランドを上回って検出できるようになるインキュベーション時間（限界蛍光値）、いわゆる、限界時間を決定することによって正確に行う。（生物学的）試料中での最初のコピー数が少ないほど、限界蛍光値に到達するまでの限界時間は長くなる。比較定量を、例えば、ハウスキーピング遺伝子に対する限界時間の比較によって、または既知の量の目的の標的を含む検量線を使用して行う。
【０１１８】
実施例２：SDA増幅および分子ビーコンを通じた検出を含む一体化した分析を用いた標的の同定
プローブの設計および固定
オリゴヌクレオチドプローブを5'末端に反応性部分を含むように設計し、これによって固体の基体の表面に結合するようにする。これらのオリゴヌクレオチドは、標的DNAについての捕捉プローブとして働く。さらに、分子ビーコンを、目的の核酸についての検出プローブとして設計し、5'末端には蛍光基を、3'末端には消光基を含める。
【０１１９】
SDAを用いた増幅
増幅試薬、プライマー、および分子ビーコンを含む混合物をアレイに加える。増幅反応を等温条件下で行う。DNAポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼの作用の組み合わせにより、固定化したプローブ上に標的DNA配列を指数的にコピーする。この反応の産物は二本鎖のDNAハイブリッドであり、そのうちの一方の鎖は固体の基体に固定される。固定されていない鎖が除去されて、固体の基体に固定された一本鎖であるアンチセンスDNA（asDNA）が生じる。
【０１２０】
検出
分子ビーコンは、それが相補的であれば固定されたasDNA鎖にハイブリダイズし、蛍光シグナルを生じる。蛍光シグナルは、存在する核酸の量に比例する。これにより、標的配列の同定と、上記標的配列の正確な定量の両方が可能である。SNP検出においては、２つの異なって標識された分子ビーコンが混合物に添加され、両方が異なる対立遺伝子変異体（野生型または変異体）を認識することができる。結果として、増幅の間に生じた蛍光の発色により遺伝子型が明らかになる。
【国際調査報告】
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