(57)【要約】本発明は、哺乳動物の糖質コルチコイド受容体の発現を調節する組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ヒト糖質コルチコイド受容体をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンス化合物が図１または図２に記載の核酸配列に相補的である、哺乳動物の糖質コルチコイド受容体をコードする核酸分子を標的とするアンチセンス化合物。
【請求項２】
アンチセンス化合物が特異的にハイブリダイズし、哺乳動物の糖質コルチコイド受容体の発現を阻害する、哺乳動物の糖質コルチコイド受容体をコードする核酸分子を標的とする８〜３０個の長さの核酸塩基からなるアンチセンス化合物。
【請求項３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載のアンチセンス化合物。
【請求項４】
配列番号１〜配列番号４７６９からなる群より選択される核酸配列、および、配列番号１〜配列番号４７６９に記載の少なくとも８個の連続したヌクレオチドのフラグメントを含む、請求項３に記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項４に記載のアンチセンス化合物。
【請求項６】
修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項５に記載のアンチセンス化合物。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された糖成分を含む、請求項３に記載のアンチセンス化合物。
【請求項８】
修飾された糖成分は、２′−Ｏ−メトキシエチル糖成分である、請求項７に記載のアンチセンス化合物。
【請求項９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された核酸塩基を含む、請求項３に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１０】
修飾された核酸塩基は、５−メチルシトシンである、請求項９に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１２】
請求項２に記載のアンチセンス化合物、および、製薬上許容できるキャリアーまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項１３】
コロイド分散系をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
哺乳動物の糖質コルチコイド受容体の発現が阻害されるように、細胞または組織と、請求項２に記載のアンチセンス化合物とを接触させることを含む、細胞または組織における哺乳動物の糖質コルチコイド受容体の発現を阻害する方法。
【請求項１６】
患者に、哺乳動物の糖質コルチコイド受容体の発現が阻害されるように、治療的または予防的な有効量の請求項２に記載のアンチセンス化合物を投与することを含む、哺乳動物
の糖質コルチコイド受容体に関連する病気または症状を有する患者を治療する方法。
【請求項１７】
病気または症状は、糖尿病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
病気または症状は、肥満症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
病気または症状は、心臓血管疾患である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
病気または症状は、高脂血症である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
病気は、クッシング症候群である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、合衆国法典第３５編第１１９条に基づき、２００２年５月２０日付けで出願された米国仮出願第６０／３８１,８５７号の優先権を主張する（当該米国仮出願は、本願
に記載されたものとして参照によりその全体を本明細書に加入する）。
【０００２】
本発明は、哺乳動物の糖質コルチコイド受容体の発現を調節するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ヒト糖質コルチコイド受容体をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。このようなオリゴヌクレオチドは、糖質コルチコイド受容体の発現を調節することができる。
【背景技術】
【０００３】
非インスリン依存性糖尿病（II型糖尿病）は、血糖値の異常な上昇を特徴とする衰弱性疾患であり、３つの要因：肝臓でのグルコース生産が増加すること、インスリン介在経路によるグルコースのクリアランスが不十分であること、および、循環するグルコースの組織での吸収が減少すること、により引き起こされる。（Diabetes Review 5 (3), 77〜269, 1997年)）。血糖値を制御する基本的なアプローチは、肝臓でのグルコース生産を減少させる物質の投与である（Am．J．Physiol．257, E35〜E42 (1989年)．Ｊ．Clin．Endocrinol．Metab．77, 1180〜1183（1994年）、および、J．Clin．Invest., 92, 2283〜2290（1993年））。
【０００４】
糖質コルチコイドが、グルコース生産に大きい影響を与えることがわかっている。糖尿病マウスにおいて、過量の糖質コルチコイドは慢性糖尿病を悪化させるが、糖質コルチコイドの欠乏は血糖を減少させ、グルコース制御を改善する。(Diabetes Review, 1 (3), 301〜308, (993年)．Diabetologia, 9, 376〜379 (1973年)．Horm．Metab．Res., 9, 152
〜156 (1977年)）。これらの効果を引き起こす基礎メカニズムは、糖質コルチコイドにより誘導された、糖新生に必要な肝酵素のアップレギュレーションと考えられる。（Recent
Prog．Harm．Res., 26, 411〜457 (1970年)．Physiol．Rev., 64, 170〜259（1984年)。
【０００５】
糖質コルチコイドは、副腎皮質で合成される脂溶性ホルモンである。これらは、容易に細胞膜を通過し、標的組織の細胞質に入り、細胞質中で熱ショックタンパク質と複合体を形成することにより糖質コルチコイド受容体に結合することができる。ホルモンとその受容体とが結合する際、この受容体は、コンフォメーション変化を経て、熱ショックタンパク質を解離させ、リガンドが結合した糖質コルチコイド受容体を細胞核に移動させ、そこで特定の遺伝子の転写を開始または抑制することができる。リガンドが結合した受容体複合体がホモ二量体化され、次いでホモ二量体受容体リガンド複合体が調節された遺伝子のプロモーター領域中の配列特異的な部位で染色体ＤＮＡに結合する場合に、転写の活性化が起こる。（Cell, 56, 335〜344 (1989年)．Annu．Rev．Genet., 19, 209〜215（1989年））。糖質コルチコイドがアップレギュレートする遺伝子のなかでも、糖新生およびグリコーゲン分解において重要な役割を有するのは、特に、ＰＥＰＣＫおよびグルコース−６−ホスファターゼである。（Advanced Enzymology., Meister編，ニューヨーク，ジョン・ワイリー＆サンズ社，203〜281（1994年）、および、Diabetes 45，1563〜1571（1996
年））。
【０００６】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）は、オキサロ酢酸からホスホエノールピルビン酸への変換を触媒し、グルコース−６−ホスファターゼは、グルコース−６−リン酸からグルコースへの変換を触媒し、いずれも、肝臓におけるオキサロ酢酸からのグルコース合成に必要である。近年、肥満性糖尿病ｄｂ／ｄｂ トランスジェニックマウスにおいて、効力のある糖質コルチコイド受容体アンタゴニストであるミフェプリストン（Aventis社）が、肝臓におけるＰＥＰＣＫとグルコース−６−ホスファターゼのｍＲＮＡ量を減少させ、血漿グルコース量の５０％減少を引き起こすことが示された。（J．Biol．Chem．272 (50)，31475〜31481 (1997年)）。ステロイドベースの糖質コルチコイド受容体アンタゴニストは、インビボでのグルコース降下作用に関する有効性を実証するのに有用であったが、このような薬剤の有用性は、その他のステロイド受容体、特にプロゲステロン受容体（ＰＲ）や鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）との強い交差反応性により生じる副作用のために限定される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
糖質コルチコイドアンタゴニストとして機能する物質は、II型糖尿病の制御に対する新規のアプローチを表わし、従って、糖質コルチコイド受容体拮抗剤は、その臨床上の可能性に関して現在活発に研究されている主題である。参照として、米国特許第５,９２９,０５８号が挙げられ、この特許において、鉱質コルチコイド受容体アゴニスト活性と、糖質コルチコイド受容体アンタゴニスト活性とを示す非選択的ステロイド剤の組み合わせを投与することを含む、II型糖尿病の治療方法が開示されている。
【０００８】
従って、糖質コルチコイド受容体に拮抗する非ステロイド性の糖質コルチコイド選択的薬剤を提供することは、当業界において重要な貢献となり得る。これら化合物は、II型糖尿病とそれらの症状、例えば高血糖症、不十分なグルコースクリアランス、肥満症、インスリン過剰血症、高トリグリセリド血症、および、循環する糖質コルチコイドの高いレベルを治療するのに特に有用と考えられる。
【０００９】
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物の発現を減少させるのに有効な手段として新しく生じた技術であり、従って、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）発現を調節するための多くの治療、診断および研究における適用において比類なく有用であることを示すことができる。全身投与されたアンチセンスは、肝臓で優勢的に蓄積されその効果を発揮するが、脂肪ではより低い程度であることが示された（R.S．Geary，R.Z．YuおよびA.A．Levin，
「Pharmacokinetics of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides」，Curr．Opin．Investig．Drugs，第2巻，第4号，562〜573頁）。この相対的な組織特異性は、糖質コルチコイド受容体のその他の役割を残しながら、代謝性疾患の治療、例えば免疫機能の治療において有用と考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、糖質コルチコイド受容体をコードする核酸を標的とし、哺乳動物の糖質コルチコイド受容体の発現を調節するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを目的とする。本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物およびその他の組成物も提供される。細胞または組織における糖質コルチコイド受容体の発現を調節する方法がさらに提供され、この方法は、前記細胞または組織と、１またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物とを接触させることを含む。１またはそれ以上の本発明のアンチセンス化合物または組成物の治療的または予防的な有効量を投与して、糖質コルチコイド受容体活性を調節することにより治療可能な病気または症状を有する、または罹りやすいと思われる動物、特にヒトを治療する方法が、さらに提供される。
【００１１】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、糖質コルチコイド受容体をコードする核酸分子の機能を調節し、最終的には生産される糖質コルチコイド受容体の量を調節するのに用いられる、オリゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを用いる。これは、１またはそれ以上の糖質コルチコイド受容体をコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供
することにより達成される。本発明で用いられる用語「標的核酸」および「ＧＲをコードする核酸」は、ＧＲをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、さらに、このようなＲＮＡから得られたｃＤＮＡを包含する。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションにより、核酸の正常な機能が干渉される。このような、標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能の調節は、一般的に、「アンチセンス」といわれる。干渉され得るＤＮＡの機能としては、複製や転写が挙げられる。干渉され得るＲＮＡの機能としては、全ての生体機能、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの移動、ＲＮＡからタンパク質への翻訳、１またはそれ以上のｍＲＮＡ種が生じるようなＲＮＡスプライシング、および、ＲＮＡが関与する、またはＲＮＡで促進される可能性のある触媒活性が挙げられる。このような標的核酸の機能への干渉は、総合的にＧＲ発現の調節に効果を有する。本発明において、「調節」は、遺伝子発現の増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明において、好ましい遺伝子発現の調節の形態は阻害であり、好ましい標的はｍＲＮＡである。
【００１２】
アンチセンスを、特異的な核酸に標的化することが好ましい。本発明においてアンチセンス化合物を特定の核酸に「標的化すること」は、多段階プロセスである。このプロセスは通常、機能を調節しようとする核酸配列の同定から始められる。このような核酸配列は、例えば、その発現が特定の疾患もしくは病状に関連する細胞性遺伝子（または、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、または、伝染性因子からの核酸分子であり得る。本発明において、標的は、ＧＲをコードする核酸分子である。標的化プロセスはまた、望ましい効果（例えばタンパク質発現の検出または調節）が生じるような、起こり得るアンチセンス相互作用に関与するこの遺伝子内の部位または部位群の決定も含む。本発明において、好ましい遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを包含する領域である。当業界で既知であるように、翻訳開始コドンは、典型的には５′−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては５′−ＡＴＧ）であることから、翻訳開始コドンはまた、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」とも言う。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列が５′−ＧＵＧ、５′−ＵＵＧまたは５′−ＣＵＧの翻訳開始コドンを有し、ならびに５′−ＡＵＡ、５′−ＡＣＧおよび５′−ＣＵＧは、インビボで機能することが示されている。従って、いずれの場合においても開始アミノ酸は、典型的にはメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）であるが、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は多くのコドン配列を包含し得る。また当業界で既知であるが、真核遺伝子および原核遺伝子は、２またはそれ以上の代替開始コドンを有していてもよく、それらのいずれか１つは、特定の細胞型または組織における翻訳開始のために優先的に、または、特定の一連の条件下で優先的に利用され得る。本発明において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、ＧＲをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始させるのにインビボで用いられるコドンを意味し、このようなコドンの配列はどのようなものでもよい。
【００１３】
また、当業界で既知であるが、遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は、３つの配列、すなわち５′−ＵＡＡ、５′−ＵＡＧ、および、５′−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５′−ＴＡＡ、５′−ＴＡＧ、および、５′−ＴＧＡ）のいずれか１つを有し得る。用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、このようなｍＲＮＡ、または、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち５′または３′）の約２５〜約５０個の連続したヌクレオチドを包含する遺伝子の部分を意味する。同様に、用語「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」は、このようなｍＲＮＡ、または、翻訳終止コドンからのいずれかの方向（すなわち５′または３′）の約２５〜約５０個の連続したヌクレオチドを包含する遺伝子の部分を意味する。
【００１４】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」は、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を意味することが当業界で既知であり、効果的に標的化することができる領域でもある。その他の標的領域としては、５′非翻訳領域（５′ＵＴＲ）（この領域は、翻訳開始コドンから５′方向のｍＲＮＡの部分、従って５′キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド、または、遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むことを意味することが当業界で既知である）、および、３′非翻訳領域（３′ＵＴＲ）（この領域は、翻訳終止コドンから３′方向のｍＲＮＡの部分、従って翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３′末端との間のヌクレオチド、または、遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むことを意味することが当業界で既知である）が挙げられる。ｍＲＮＡの５′キャップは、５′−５′三リン酸結合を介してｍＲＮＡの５′の最末端残基と連結したＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５′キャップ領域は、５′キャップ構造それ自体、および、キャップに隣接する最初の５０個のヌクレオチドを含むと考えられる。５′キャップ領域はまた、好ましい標的領域となり得る。
【００１５】
いくつかの真核性ｍＲＮＡ転写物は直接翻訳されるが、多くは、「イントロン」として知られる１またはそれ以上の領域を含み、イントロンは転写物が翻訳される前に転写物から切り出される。残りの（従って翻訳される）領域は「エキソン」として知られており、共にスプライスされ、連続したｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、すなわちイントロン−エキソンジャンクションはまた、好ましい標的領域でもあり、異常なスプライシングが病気に関与するような状況、または、特定のｍＲＮＡスプライス産物の過剰生産が病気に関与するような状況で特に有用である。再配列または欠失による異常に融合したジャンクションもまた、好ましい標的である。また、イントロンもまた有効であり、それゆえに、例えばＤＮＡまたはプレｍＲＮＡに標的化されたアンチセンス化合物の好ましい標的領域となり得ることががわかった。
【００１６】
１またはそれ以上の標的部位が同定されれば、標的に十分に相補的な、すなわち、十分良好に、かつ十分な特異性で標的にハイブリダイズし、望ましい効果を提供し得るオリゴヌクレオチドを選択することができる。
【００１７】
本発明において、「ハイブリダイゼーション」は、水素結合を意味し、この水素結合は、相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の、ワトソン−クリック型水素結合、フーグスティーン型水素結合、または、リバースフーグスティーン型水素結合が可能である。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対をなす相補核酸塩基である。本発明で用いられる「相補的な」は、２つのヌクレオチド間で正確に対を形成する能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドの所定の位置のヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができる場合、オリゴヌクレオチド、および、ＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置において互いに相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチド、および、ＤＮＡまたはＲＮＡは、それぞれの分子において対応する位置の十分数が互いに水素結合することができるヌクレオチドで占有されている場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で安定で特異的な結合が生じるような、相補性または正確な対形成の十分な程度を示すのに用いられる用語である。当業界では明白であるが、アンチセンス化合物の配列は、その標的核酸の配列に特異的にハイブリダイズ可能であるように１００％相補的である必要はない。化合物と標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子との結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能に干渉し、それにより有用性が失われる場合や、相補性が十分であるため、特異的結合が望まれる条件下で（すなわちインビボ分析または治療的処置の場合は生理学的条件下で、および、インビトロ分析の場合は分析が行われる条件下で）、アンチセンス化合物と非標的配列との非特異的結合が防がれる場合、アンチセンス化合物は、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００１８】
アンチセンス化合物は、一般的に研究試薬や診断として用いられる。例えば、優れた特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、特定の遺伝子の機能を明確にするために当業者によく用いられる。アンチセンス化合物はまた、例えば様々な種類の生物学的経路の機能を区別するためにも用いられる。それゆえにアンチセンス調節は、研究用途で利用されてきた。
【００１９】
アンチセンスの特異性と感度はまた、治療用途でも当業者に利用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおいて病状を治療する際の治療的成分として用いられてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、安全かつ効果的にヒトに投与されており、多数の臨床試験が現在進行中である。従って、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物（特にヒト）を治療するための治療計画において有用であるように設定することができる有用な治療法であり得ることが立証されている。本発明において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらのミメティックの、オリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および、ヌクレオシド間（主鎖）の共有結合で構成されたオリゴヌクレオチド、同様に、同様に機能する天然に存在しない部分を含むオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば高められた細胞摂取、高められた核酸標的に対する親和性、および、ヌクレアーゼ存在下における増加した安定性などの望ましい特性を有するため、場合によっては天然型よりも好ましい。
【００２０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンス化合物の好ましい形態であるが、本発明は、その他のオリゴマーアンチセンス化合物も包含しており、例えば、これらに限定されないが、以下で説明するようなオリゴヌクレオチドミメティックが挙げられる。本発明に係るアンチセンス化合物は、好ましくは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または、５０個の核酸塩基を含む。本発明に係るアンチセンス化合物は、好ましくは、約８〜約３０個の核酸塩基（すなわち約８〜約３０個の連結したヌクレオシド）を含む。特に好ましいアンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、約１２〜約２５個の核酸塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明に係るアンチセンス化合物は、好ましくは、配列番号１〜配列番号４７６９、および、配列番号１〜配列番号４７６９の少なくとも８個の連続したヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される核酸配列を含む。当業界で既知であるように、ヌクレオシドは、塩基と糖の組み合わせである。通常、ヌクレオシドの塩基部分は、複素環式の塩基である。このような複素環式の塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関して、リン酸基は、糖の２′、３′または５′ヒドロキシル成分のいずれかと結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、隣接するヌクレオシドと相互に共有結合し、直鎖状ポリマー化合物を形成する。順に、この直鎖状ポリマー構造のそれぞれの末端がさらに結合し、環状構造を形成することができるが、一般的に開環した直鎖状構造が好ましい。オリゴヌクレオチド構造中で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するとみなされる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常のＩ結合（Ｉ linkage）または主鎖は、３′と５′とのホスホジエステル結合である。
【００２１】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例としては、修飾された主鎖、または、非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書で定義されるように、修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドとしては、主鎖中にリン原子を保持するオリゴヌクレオチド、および、主鎖中にリン原子を有さないオリゴヌ
クレオチドが挙げられる。本明細書の目的において、当業界でたびたび言及されるように、ヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオシドとも考えられる。
【００２２】
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホネート、例えば３′アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば３′−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルならびに正常な３′−５′結合を有するボラノホスフェート、これらの２′−５′結合類似体、ならびに、極が逆転したもの（隣接するヌクレオシド単位の対が、３′−５′ではなく５′−３′で、または、２′−５′ではなく５′−２′で結合している）が挙げられる。また、様々な塩、混合塩、および、遊離酸型も含まれる。
【００２３】
上記リン含有結合の製造を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第３,６８７,８０８号；第４,４６９,８６３号；第４,４７６,３０１号；第５,０２３,２４３号；第５,１７７,１９６号；第５,１８８,８９７号；第５,２６４,４２３号；第５,２７６,０１９号；第５,２７８,３０２号；第５,２８６,７１７号；第５,３２１,１３１号；第５,３９９,６７６号；第５,４０５,９３９号；第５,４５３,４９６号；第５,４５５,２３３号；第５,４６６,６７７号；第５,４７６,９２５号；第５,５１９,１２６号；第５,５３６,８２１号；第５,５４１,３０６号；第５,５５０,１１１号；第５,５６３,２５３号；第５,５７１,７９９号；第５,５８７,３６１号；および、第５,６２５,０５０号が挙げられ、これらはいずれも、参照により本発明に加入させる。
【００２４】
好ましいリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または、１もしくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間結合で形成された主鎖を有する。これら主鎖としては、モルホリノ結合を有する主鎖（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成された）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチル、および、チオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル、および、チオホルムアセチル主鎖；アルケンを含む主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ、および、メチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート、および、スルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素が混在した主鎖が挙げられる。
【００２５】
上記オリゴヌクレオシドの製造を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第５,０３４,５０６号；第５,１６６,３１５号；第５,１８５,４４４号；第５,２１４,１３４号；第５,２１６,１４１号；第５,２３５,０３３号；第５,２６
４,５６２号；第５,２６４,５６４号；第５,４０５,９３８号；第５,４３４,２５７号；
第５,４６６,６７７号；第５,４７０,９６７号；第５,４８９,６７７号；第５,５４１,３０７号；第５,５６１,２２５号；第５,５９６,０８６号；第５,６０２,２４０号；第５,６１０,２８９号；第５,６０２,２４０号；第５,６０８,０４６号；第５,６１０,２８９号；第５,６１８,７０４号；第５,６２３,０７０号；第５,６６３,３１２号；第５,６３３,３６０号；第５,６７７,４３７号；および、第５,６７７,４３９号が挙げられ、これらはいずれも、参照により本発明に加入させる。
【００２６】
その他の好ましいオリゴヌクレオチドミメティックは、糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわちヌクレオチド単位の主鎖が、新規の基で置換されたものである。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されており、このようなオリゴマー化合物の１つであるオリゴヌクレオチドミメティックは、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されており、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミドを含む主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の製造を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第５,５３９,０８２号；第５,７１４,３３１号；および、第５,７１９,２６２号が挙げられ、これらはいずれも、参照により本発明に加入させる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Nielsen等，Science，1991年，254，1497〜1500で見出すことができる。
【００２７】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド、および、ヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシドであり、特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ(ＣＨ３)−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ(ＣＨ３)−ＣＨ２、−ＣＨ２Ｎ(ＣＨ３)−Ｎ(ＣＨ３)−ＣＨ２−、および、−Ｏ−Ｎ(ＣＨ３)−ＣＨ２−ＣＨ２−［ここで、天然のホスホジエステル主鎖は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−と示される］、これは、上記で参照した米国特許第５,４８９,６７７号に記載されており、ならびに、上記で参照した米国特許第５,６０２,２４０号のアミド主鎖を有するものである。また、上記で参照した米国特許第５,０３４,５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【００２８】
修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、１またはそれ以上の置換された糖成分を含んでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２′位に、以下のいずれか１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくは、Ｎ−アルキニル；または、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、上記アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、または、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルでもよい）。特に好ましくは、Ｏ[(ＣＨ２)ｎＯ]m、ＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎ、ＯＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、Ｏ(ＣＨ２)ｎＣＨ３、Ｏ(ＣＨ２)ｎＯＮＨ２、および、Ｏ(ＣＨ２)nＯＮ[(ＣＨ２)ｎＣＨ３]２であり、ここで、ｎおよびｍは、１〜約１０である。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２′位に以下のいずれか１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル（alkaryl）、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡを切断する基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、または、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および、類似の特性を有するその他の置換基。好ましい修飾としては、２′−メトキシエトキシ（２′−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、また、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）、または、２′−ＭＯＥとしても知られる）（Martin等，Helv．Chim．Acta，1995年，78，486〜504）すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらに好ましい修飾としては、２′−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ(ＣＨ２)２ＯＮ(ＣＨ３)２基（また、下記の実施例に記載されているように２′−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、および、２′−ジメチルアミノエトキシエトキシ（また、２′−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、または、２′−ＤＭＡＥＯＥとして当業界で既知である）、すなわち、２′−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ2−Ｎ(ＣＨ２)２（下記の実施例にも記載されている）が挙げられる。
【００２９】
その他の好ましい修飾としては、２′−メトキシ（２′−ＯＣＨ３）、２′−アミノプロポキシ（２′−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および、２′−フルオロ（２′−Ｆ）が挙げられる。類似の修飾はまた、オリゴヌクレオチド上のその他の位置、特に、３′末端ヌクレオチド上または２′−５′結合オリゴヌクレオチド中の糖の３′位、および、５
′末端ヌクレオチドの５′位でなされてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル成分のような糖ミメティックを有していてもよい。このような修飾された糖構造の製造を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第４,９８１,９５７号；第５,１１８,８００号；第５,３１９,０８０号；第５,３５９,０４４号；第５,３９３,８７８号；第５,４４６,１３７号；第５,４６
６,７８６号；第５,５１４,７８５号；第５,５１９,１３４号；第５,５６７,８１１号；
第５,５７６,４２７号；第５,５９１,７２２号；第５,５９７,９０９号；第５,６１０,３００号；第５,６２７,０５３号；第５,６３９,８７３号；第５,６４６,２６５号；第５,６５８,８７３号；第５,６７０,６３３号；および、第５,７００,９２０号が挙げられ、これらはいずれも、その全体を参照により本発明に加入させる。
【００３０】
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当業界においては、場合により単に「塩基」とも言う）の修飾または置換を含んでもよい。本発明で用いられる「非修飾」または「天然」の核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）、および、グアニン（Ｇ）、ならびに、ピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、および、ウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾された核酸塩基としては、その他の合成および天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、およびその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに、３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３,６８７,８０８号で開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering（858〜859頁，Kroschwitz，J.I．編，ジョン・ワイリー＆サンズ，1990年）で開示されたもの、Englisch等のAngewandte Chemie（International Edition，1991年，30，613）で開示されたもの、および、Sanghvi，Y.S．の「Antisense Research and Applications」の第15章（289〜302頁，Crooke，S.T．およびLebleu，B．編，CRCプレス（CRC Press），1993年）により開示されたものが挙げられる。これら核酸塩基のうちいくつかが、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。このようなものとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに、Ｎ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および、５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシンの置換は、０.６〜１.２℃で核酸の二本鎖の安定性を高めることが示されており（Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T．およびLebleu，B．編，Antisense Research and Applications，CRCプレス，ボカ・ラートン，1993年，276〜278頁）、現在のところ塩基の置換として好ましく、さらに２′−Ｏ−メトキシエチルの糖の修飾と組み合わせると特に好ましい。
【００３１】
上記の修飾された核酸塩基およびその他の修飾された核酸塩基のいくつかの製造を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、上述の米国特許第３,６８７,８０８号、同様に、米国特許第４,８４５,２０５号；第５,１３０,３０２号；第５,１３４,０６６号；第５,１７５,２７３号；第５,３６７,０６６号；第５,４３２,２７２号；第５,４５７,１８７号；第５,４５９,２５５号；第５,４８４,９０８号；第５,５０２,１７７号；第５,５２５,７１１号；第５,５５２,５４０号；第５,５８７,４６９号；第５,５９４,１２’，５,５９６,０９１号；第５,６１４,６１７号；第５,７５０,６９２号；および、第５,６８１,９４１号が挙げられ、これらはいずれも、参照により本発明に加入させる。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾としては、１またはそれ以上の成分または複合体をオリゴヌクレオチドに化学的に連結させることも含まれ、これらは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または、細胞摂取を高める。このような成分としては、これらに限定されないが、脂質成分、例えばコレステロール成分（Letsinger等，Proc．Natl
．Acad．Sci．USA，1989年，86，6553〜6556）、コール酸（Manoharan等，Bioorg．Med．Chem．Let.，1994年，4，1053〜1060）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan等，Ann．N.Y．Acad．Sci.，1992年，660，306〜309；Manoharan等，Bioorg．Med．Chem．Let.，1993年，3，2765〜2770）、チオコレステロール（Oberhauser等，Nucl．Acids Res.，1992年，20，533〜538）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Saison-Behmoaras等，EMBO J.，1991年，10，1111〜1118；Kabanov等，FEBS Lett.，1990年，259，327〜330；Svinarchuk等，Biochimie，1993年，75，49〜54）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１,２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995年，36，365’〜3654；Shea等，Nucl．Acids Res.，1990年，18，3777〜3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Mancharan等，Nucleosides & Nucleotides，1995年，14，969〜973）、または、アダマンタン酢酸（Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995年，36，365’〜3654）、パルミチル成分（Mishra等，Biochim．Biophys．Acta，1995年，1264，229〜237）、または、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分（Crooke等，J．Pharmacol．Exp．Ther.，1996年，277，923〜937）が挙げられる。
【００３３】
このようなオリゴヌクレオチド複合体の製造を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第４,８２８,９７９号；第４,９４８,８８２号；第５,
２１８,１０５号；第５,５２５,４６５号；第５,５４１,３１３号；第５,５４５,７３０
号；第５,５５２,５３８号；第５,５７８,７１７号；第５,５８０,７３１号；第５,５８
０,７３１号；第５,５９１,５８４号；第５,１０９,１２４号；第５,１１８,８０２号；
第５,１３８,０４５号；第５,４１４,０７７号；第５,４８６,６０３号；第５,５１２,４３９号；第５,５７８,７１８号；第５,６０８,０４６号；第４,５８７,０４４号；第４,６０５,７３５号；第４,６６７,０２５号；第４,７６２,７７９号；第４,７８９,７３７号；第４.８２４,９４１号；第４,８３５,２６３号；第４,８７６,３３５号；第４,９０４,５８２号；第４,９５８,０１３号；第５,０８２,８３０号；第５,１１２,９６３号；第５,２１４,１３６号；第５,０８２,８３０号；第５,１１２,９６３号；第５,２１４,１３６号；第５,２４５,０２２号；第５,２５４,４６９号；第５,２５８,５０６号；第５,２６２,５３６号；第５,２７２,２５０号；第５,２９２,８７３号；第５,３１７,０９８号；第５,３７１,２４１号；第５,３９１,７２３号；第５,４１６,２０３号；第５,４５１,４６３号；第５,５１０,４７５号；第５,５１２,６６７号；第５,５１４,７８５号；第５,５６５,５５２号；第５,５６７,８１０号；第５,５７４,１４２号；第５,５８５,４８１号；第５,５８７,３７１号；第５,５９５,７２６号；第５,５９７,６９６号；第５,５９９,９２３号；第５,５９９,９２８、および、５,６８８,９４１が挙げられ、これらはいずれも、参照により本発明に加入させる。
【００３４】
所定の化合物の全ての位置が一様に修飾されていなくてもよく、実際には上述の修飾の２以上が、１つの化合物中に含まれていればよく、また、オリゴヌクレオチド中の１つのヌクレオシドに含まれているだけでもよい。本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明において、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位（すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド）で構成された２またはそれ以上の化学的に別個の領域を含むアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらオリゴヌクレオチドは、典型的には、増加したヌクレアーゼ分解に対する耐性、増加した細胞摂取、および／または、増加した標的核酸に対する結合親和性がオリゴヌクレオチドに付与されるようにオリゴヌクレオチドが修飾された少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として役立ち得る。一例として、ＲＮアーゼＨは、細胞性エンドヌクレアーゼであり、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する。それゆえに、ＲＮアーゼＨを活性化すると、ＲＮＡ標的の切断が起こり、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率を大いに高めることができる。その結果として、場合によっては、キメラオリゴヌクレオチドを用いる場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドより短いオリゴヌクレオチドを用いても、匹敵する結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動や、必要に応じて、当業界で既知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって慣例的に検出することができる。
【００３５】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述したような２またはそれ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／または、オリゴヌクレオチドミメティックの複合構造として形成することもできる。当業界において、このような化合物はまた、ハイブリッドまたはギャップマー（gapmer）とも言われている。このようなハイブリッド構造の製造を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第５,０１３,８３０号；第５,１４９,７９７号；第５,２２０,００７号；第５,２５６,７７５号；第５,３６６,８７８号；第５,４０３,７１１号；第５,４９１,１３３号；第５,５６５,３５０号；第５,６２３,０６５号；第５,６５２,３５５号；第５,６５２,３５６号；および、第５,７００,９２２号が挙げられ、これらはいずれも、その全体を参照により本発明に加入させる。
【００３６】
本発明に従って用いられるアンチセンス化合物は、周知の固相合成技術で、便利かつ慣例的に製造することができる。このような合成のための装置は、数々のメーカーにより市販されており、例えば、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスターシティー，カリフォルニア州）である。当業界で既知のこのような合成のためのあらゆるその他の手段が、追加で、または、代替として用いることができる。類似の技術を用いて、ホスホロチオエートやアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを製造することが周知である。
【００３７】
本発明のアンチセンス化合物はインビトロで合成されるものであって、生物学的な起源のアンチセンス組成物や、アンチセンス分子のインビボ合成を指示するように設計された遺伝子ベクターコンストラクトは含まない。本発明の化合物はまた、その他の分子、分子構造または化合物の混合物と、混合、カプセル化、複合体化、または、結合してもよく、例えば摂取、分布および／または吸収を補助するための、リポソーム、受容体を標的化した分子、経口製剤、直腸製剤、局所製剤またはその他の製剤が挙げられる。このような摂取、分布および／または吸収を補助する製剤の製造を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第５,１０８,９２１号；第５,３５４,８４４号；第５,４１６,０１６号；第５,４５９,１２７号；第５,５２１,２９１号；第５,５４３,１５８号；第５,５４７,９３２号；第５,５８３,０２０号；第５,５９１,７２１号；第４,４２６,３３０号；第４,５３４,８９９号；第５,０１３,５５６号；第５,１０８,９２１号；第５,２１３,８０４号；第５,２２７,１７０号；第５,２６４,２２１号；第５,３５６,６３３号；第５,３９５,６１９号；第５,４１６,０１６号；第５,４１７,９７８号；第５,４６２,８５４号；第５,４６９,８５４号；第５,５１２,２９５号；第５,５２７,５２８号；第５,５３４,２５９号；第５,５４３,１５２号；第５,５５６,９４８号；第５,５８０,５７５号；および、第５,５９５,７５６号が挙げられ、これらはいずれも、参照により本発明に加入させる。
【００３８】
本発明のアンチセンス化合物は、あらゆる製薬上許容できる塩、エステル、または、このようなエステルの塩、または、ヒトなどの動物へ投与すると生物学的に活性な代謝産物もしくは残基を（直接的または間接的に）提供することが可能なあらゆるその他の化合物を包含する。従って、本発明の開示はまた、例えば、本発明の化合物のプロドラッグおよび製薬上許容できる塩、このようなプロドラッグの製薬上許容できる塩、および、その他の生物学的に同等なものにも及ぶ。
【００３９】
用語「プロドラッグ」は、不活性型に製造された治療剤を示し、この不活性型の治療剤は、内因性の酵素またはその他の化学物質および／または環境の作用により体内またはそれらの細胞内で活性型（すなわち薬物）に変換される。特に、本発明ののオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、ＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として、Gosselin等のＷＯ ９３／２４５１０（１９９３年１２月９日に公開）、
または、Imbach等のＷＯ ９４／２６７６４で開示された方法に従って製造される。
【００４０】
用語「製薬上許容できる塩」は、本発明の化合物の生理学的に、および、製薬上許容できる塩、すなわち、親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、望ましくない毒物学的な作用を与えない塩を意味する。
【００４１】
製薬上許容できる塩基付加塩は、金属またはアミン、例えばアルカリおよびアルカリ土類金属、または、有機アミンと共に形成される。カチオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適切なアミンの例は、Ｎ,Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、および、プロカインである（例えば、Berge等，「Pharmaceutical Salts」，J．of Pharma Sci.，1977年，66，119を参照）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、従来の方法で、遊離酸形態と十分量の望ましい塩基とを接触させ、塩を生成させることにより製造される。遊離酸形態は、従来の方法で、塩の形態と酸とを接触させ、遊離酸を分離することにより再生させることが可能である。遊離酸形態と、それらのそれぞれの塩の形態とは、所定の物理学的特性（例えば極性溶媒中での溶解性）においていくぶん異なるが、本発明の目的に関して、塩は、それぞれの遊離酸と同等である。本発明で用いられる「医薬付加塩」としては、本発明の組成物の成分のうち１つの酸の形態の製薬上許容できる塩が挙げられる。このような塩としては、アミンの有機酸または無機酸の塩が挙げられる。好ましい酸の塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩、および、リン酸塩である。その他の適切な製薬上許容できる塩は、当業者周知であり、例えば、様々な無機酸および有機酸の塩基の塩が挙げられ、このような酸としては、例えば、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホン酸もしくはリン酸、または、Ｎ−置換スルファミド酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸、ニコチン酸またはイソニコチン酸；および、アミノ酸、例えば天然のタンパク質合成に関与する２０種のα−アミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸、およびさらに、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１,２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１,５−ジスルホン酸、２−もしくは３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（サイクラミン酸塩の形成を伴う）、または、その他の酸の有機化合物、例えばアスコルビン酸、が挙げられる。化合物の製薬上許容できる塩はまた、製薬上許容できるカチオンを用いて製造することができる。適切な製薬上許容できるカチオンは、当業者周知であり、例えば、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウムカチオンが挙げられる。炭酸塩または炭酸水素塩も可能である。
【００４２】
オリゴヌクレオチドに関して、製薬上許容できる塩の好ましい例としては、これらに限定されないが、（ａ）カチオンと共に形成された塩、カチオンとしては、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミンおよびスペルミジンなど；（ｂ）無機酸と共に形成された酸付加塩、無機酸としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など；（ｃ）有機酸と共に形成された塩、有機酸としては、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸など；および、（ｄ）塩素、臭素、および、ヨウ素のような元素のアニオンで形成された塩が挙げられる。
【００４３】
本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防のため、ならびに研究試薬およびキットとして利用することができる。治療に関しては、ＧＲ発現を調節することによって治療可能な病気または疾患を有する可能性がある動物（好ましくはヒト）は、本発明に係るアンチセンス化合物を投与することによって治療される。本発明の化合物は、医薬組成物において利用することができ、有効量のアンチセンス化合物を適切な製薬上許容できる希釈剤またはキャリアーに加えることによってなされる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、予防面で有用な可能性があり、例えば、例えば感染、炎症または腫瘍形成を防いだり遅延させたりすることができる。
【００４４】
本発明のアンチセンス化合物は、研究および診断に有用であり、なぜなら、これら化合物は、ＧＲをコードする核酸にハイブリダイズし、サンドイッチやその他の分析を容易に組み立てて、この現象を利用することができるためである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとＧＲをコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当業界で既知の手段により検出することができる。このような手段としては、酵素とオリゴヌクレオチドとの結合、オリゴヌクレオチドの放射標識、または、あらゆるその他の適切な検出手段が挙げられる。このようなサンプル中のＧＲレベルを検出するための検出手段を利用したキットもまた、製造することができる。
【００４５】
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療のいずれが望ましいのか、さらに、治療しようとするエリアはどこかにより様々な方法で投与することができる。投与は、局所投与（例えば眼内や粘膜、膣内および直腸内への送達）、例えば粉末またはエアロゾルの吸入または通気による肺への投与（ネブライザー等による）；気管内投与、鼻腔内投与、表皮投与および経皮投与、経口投与または非経口投与が可能である。非経口投与としては、静脈、動脈、皮下、腹膜内または筋肉内注射または注入；または、頭蓋内、例えば、髄腔内、または、心室内投与が挙げられる。少なくとも１つの２′−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００４６】
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体、および、粉末が挙げられる。従来の医薬キャリアー、水性基材、粉末基材または油性基材、増粘剤などが、必要であるか、または、望ましい場合がある。コーティングされたコンドーム、グローブなども有用である可能性がある。
【００４７】
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末、または、顆粒、懸濁液、または、水溶液もしくは非水性媒体溶液、カプセル、サシェ、または、錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味矯臭薬剤、希釈剤、乳化剤、分散剤、または、結合剤が、望ましい場合がある。
【００４８】
非経口、髄腔内または心室内投与のための組成物および製剤としては、滅菌水溶液が挙げられ、滅菌水溶液は、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤、例えば、これらに限定されないが、浸透増強剤、キャリアー化合物、およびその他の製薬上許容できるキャリアーまたは賦形剤を含んでもよい。
【００４９】
本発明の医薬組成物としては、これらに限定されないが、溶液、エマルジョン、および、リポソームを含む製剤が挙げられる。これら組成物は、様々な成分（例えば、これらに限定されないが、予め形成された液体、自己乳化性の固体、および、自己乳化性の半固体）から製造することができる。
【００５０】
本発明の医薬製剤は、１回投与量で便利に提供することができ、製薬産業において周知の従来技術に従って製造することができる。このような技術としては、活性成分と医薬キャリアーまたは賦形剤とを結合させる工程が挙げられる。一般的に、このような製剤は、活性成分と、液体キャリアーもしくは微細化した固体キャリアーまたはその両方とを均一かつ密に結合させ、必要に応じて、製品に成型することによって製造される。
【００５１】
本発明の組成物は、様々な可能な投薬形態のいずれか、例えば、これらに限定されないが、錠剤カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤および浣腸に製剤化できる。本発明の組成物はまた、水性、非水性または混合媒体での懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質をさらに含んでもよく、このような物質としては、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／または、デキストランが挙げられる。懸濁液はまた、安定剤を含んでもよい。
【００５２】
本発明の一実施形態において、医薬組成物は、発泡体として製剤化し、使用することができる。医薬発泡体としては、これらに限定されないが、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー、および、リポソームのような製剤が挙げられる。性質が基本的に類似している範囲で、これらの製剤の最終製品や濃度の成分は様々である。このような組成物および製剤の製造は、一般的に、製薬や製剤分野の当業者に知られており、本発明の組成物の製剤に適用することができる。
【００５３】
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして製造および製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、一方の液体が、液体粒子（通常、直径０.１μｍを超える）の形状でもう一方の液体に分散してなる不均質な系である。（Idsonの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社（Marcel Dekker，Inc），ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，199頁；Rosoffの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，245頁；Blockの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker (編), 1988年, マルセル・デッカー社, ニューヨーク, ニューヨーク州, 第2巻，335頁；Higuchi等の「Remington's Pharmaceutical Sciences」，マック・パブリッシング社，イーストン，ペンシルベニア州，1985年，301頁）。エマルジョンは、場合によっては、互いに密に混合および分散させた２つの不混和性の液相を含む二相系である。一般的に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれかであり得る。水性相を微細な液体粒子に微細化し、微細な液体粒子として大部分の油性相に分散させて得られた組成物を、油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンという。あるいは、油性相を微細な液体粒子に微細化し、微細な液体粒子としてに大部分の水性相に分散させて得られた組成物を、水中油（ｏ／ｗ）エマルジョンという。エマルジョンは、分散された相に添加されたさらなる成分、および、活性薬物を含んでもよく、水性相、油性相または別個の相としてそれ自身のいずれかに溶液として存在させることができる。また、医薬賦形剤、例えば乳化剤、安定剤、色素および抗酸化剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在してもよい。医薬エマルジョンはまた、３以上の相からなるマルチプルエマルジョンであってもよく、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）、および、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合が挙げられる。このような複雑な製剤はしばしば、単なる２相エマルジョンにはない特定の利点を提供する。ｗ／ｏ／ｗエマルジョンは、ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴粒子により小さい水滴粒子が被覆されたマルチプルエマルジョンにより構成される。同様に、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンは、油性の連続相中で安定化された、水の小滴で被覆された油滴粒子の系により提供される。
【００５４】
エマルジョンは、熱力学的な安定性が低いか、または熱力学的な安定性がないことを特徴とする。場合によっては、エマルジョンの分散相または不連続相は、外部相または連続相によく分散し、乳化剤や製剤の粘度によりこの形態が維持される。エマルジョンの相のいずれかは、例えばエマルジョン状軟膏の基材やクリームの場合、半固体または固体であってもよい。エマルジョンを安定化するその他の手段は、エマルジョンの相のいずれかに取り込ませることが可能な乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、概して、４つのカテゴリー：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基材、および、微細化した固体、に分類することができる（Idsonの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，199頁）。
【００５５】
合成界面活性剤はまた、表面活性剤として知られており、エマルジョン製剤において広い適応可能性が見出されており、以下の文献で総論されている（Riegerの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker(編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，285頁；Idsonの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker（編），マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，1988年，第1巻，199頁）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分とを含む。界面活性剤の親水性の疎水性に対する比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）といい、製剤の製造において界面活性剤を分類および選択するのに有用な手段である。界面活性剤は、親水性基の特徴：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および、両性に基づき様々なクラスに分類することができる（Riegerの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，285頁）。
【００５６】
エマルジョン製剤に用いられる天然に存在する乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、および、アラビアゴムが挙げられる。吸収基材は、親水性特性を有するため、水を吸収して、ｗ／ｏエマルジョンを形成し、なおそれらの半固体の稠度を保持させることができ、例えば無水ラノリンや親水性ワセリンである。微細化された固体はまた、特に界面活性剤と組み合わせて、および、粘性の調合物中で、優れた乳化剤として用いられてきた。これらは、極性無機固体、例えば重金属の水酸化物、非膨潤性粘土、例えばベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モントモリロナイト、コロイドケイ酸アルミニウム、および、コロイドケイ酸マグネシウムアルミニウム、ピグメント、および、非極性固体、例えば炭素、または、トリステアリン酸グリセリンを含む。
【００５７】
また、多種多様な非乳化物質も、エマルジョン製剤に含まれ、エマルジョン特性に寄与する。このような物質としては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、潤滑剤、親水性  コロイド、保存剤、および、抗酸化剤が挙げられる（Blockの
「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker(編），1988年，マ
ルセル・デッカー社，ニューヨーク，ューヨーク州，第1巻，335頁；Idsonの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker(編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク, ニーヨーク州，第1巻，199頁）。
【００５８】
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然に存在するゴム、および、合成ポリマー、例えば多糖類（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアールガム、カラヤゴム、および、トラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、および、カルボキシプロピルセルロース）、および、合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、および、カルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらを水に分散したり、膨潤させたりして、コロイド溶液を形成することができ、コロイド溶液は、分散相の液体粒子の周囲に強い界面膜を形成し、外部相の粘度を高めることによってエマルジョンを安定化することができる。
【００５９】
エマルジョンは、場合によっては、微生物の成長を容易に補助する可能性のある様々な成分（例えば炭水化物、タンパク質、ステロール、および、ホスファチド）を含むために、エマルジョン製剤は、場合によっては保存剤を含んでもよい。エマルジョン製剤に含まれる、一般的に用いられる保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、および、ホウ酸が挙げられる。また、抗酸化剤も、一般的にエマルジョン製剤に加えられ、製剤の変質を防ぐことができる。用いられる抗酸化剤としは、活性酸素スカベンジャー、例えばトコフェロール、アルキル没食子酸塩、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または、還元剤、例えばアスコルビン酸、および、メタ重亜硫酸ナトリウム、および、抗酸化剤の相乗剤、例えばクエン酸、酒石酸、および、レシチンが可能である。
【００６０】
外皮、経口および非経口経路によるエマルジョン製剤の適用およびそれらの製造方法は、以下の文献で総論されている（Idsonの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Liebennan，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，199頁）。経口送達のためのエマルジョン製剤は、製剤化の簡便さ、吸収後の有効性、および、生物学的利用率の観点により、極めて広範囲で用いられている。（Rosoffの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Liebennan，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，245頁；Idsonの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Liebennan，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，199頁）。一般的にｏ／ｗエマルジョンとして経口投与されている物質のなかでも、鉱油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および、高脂肪栄養調合物が挙げられる。
【００６１】
本発明の一実施形態において、オリゴヌクレオチドおよび核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および両親媒性物質の系として定義することができ、一様な光学的に等方性の、熱力学的に安定な液状溶液である（Rosoffの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Liebennan，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，245頁）。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を水性界面活性剤溶液に分散し、続いて十分量の第四の成分（一般的に中鎖アルコール）を加え、透明な系を形成することによって製造される系である。それゆえに、マイクロエマルジョンはまた、表面活性分子の界面膜により安定化された２種の不混和性液体の、熱力学的に安定な、等方的に透明な分散液とも説明されている（LeungおよびShah，「Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems」，Rosoff，M．編，1989，VCH Publishers，ニューヨーク，1852’5頁）。一般的に、マイクロエマルジョンは、油、水、界面活性剤、コサーファクタント、および、電解質などの３〜５種の成分を組み合わせることにより製造される。マイクロエマルジョンが、油中水（ｗ／ｏ）型か、水中油（ｏ／ｗ）型かは、用いられた油と界面活性剤の特性、および、界面活性剤分子の極性の頭部の構造と幾何学的な充填や炭化水素のテールに依存する（Schottの「Remington’s Pharmaceutical Sciences」，マック・パブリッシング社，イーストン，ペンシルベニア州，1985年，271頁）。
【００６２】
相平衡状態図を利用した現象学的なアプローチが、広範囲にわたり研究されており、当業者は、どのようにマイクロエマルジョンを配合するかに関する包括的な知識を得ている（Rosoffの「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，245頁；Block
の「Pharmaceutical Dosage Forms」，Lieberman，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，第1巻，335頁）。従来のエマルジョンに比べて、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定安定な液体粒子の製剤中に、水不溶性薬物を可溶化するという利点を提供する。
【００６３】
マイクロエマルジョンの製造に用いられる界面活性剤としては、これらに限定されないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸デカグリセロール（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられる（単独で、または、コサーファクタントと組み合わせて）。コサーファクタントは、通常、エタノール、１−プロパノール、および、１−ブタノールのような短鎖アルコールであり、界面活性剤膜に浸透することによって界面の流動性を高めるのに役立ち、その結果として界面活性剤分子間に空間ができるために不規則な膜を形成する。しかしながら、マイクロエマルジョンは、コサーファクタントを使用しなくても製造することができ、および、アルコール非含有の自己乳化性マイクロエマルジョン系が当業界で既知である。水性相としては、典型的には、これらに限定されないが、水、薬物、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、および、エチレングリコール誘導体の水溶液が挙げられる。油相としては、これらに限定されないが、Captex３００、Captex３５５、Capmul ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、および、トリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、ならびに、シリコーンオイルのような物質が挙げられる。
【００６４】
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化や高められた薬物吸収の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗとｗ／ｏとの両方）は、ペプチドなどの薬物の経口での生物学的利用率を高めることが提唱されている（Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994年，11，1385〜1390；Ritschel，Meth．Find．Exp．Clin．Pharmacol.，1993年，13，205）。マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化の改善、酵素による加水分解からの薬物の保護、界面活性剤により誘導された膜流動性および透過性の改変により可能な薬物の吸収の増強、製造の簡便さ、固体の投薬形態を超える経口投与の簡便さ、臨床の有効性の改善、および、毒性の減少に対して利点を与える（Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994年，11，1385；Ho等，J．Pharm．Sci.，1996年，85，138〜143）。場合によっては、マイクロエマルジョンは、それらの成分が周囲温度で合わさると、自発的に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、または、オリゴヌクレオチドを配合する場合に特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、化粧品と医薬両方への適用において、活性成分の経皮送達に有効である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、消化管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の全身性の吸収を容易に高めると考えられ、同様に、消化管、膣、口腔、およびその他の投与領域内でのオリゴヌクレオチドおよび核酸の局所的な細胞摂取を改善すると考えられる。
【００６５】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、さらなる成分および添加剤、例えばモノステアリン酸ソルビタン（Grill３）、ラブラゾル（Labrasol）、および、浸透増強剤を含んで
もよく、製剤の特性を改善し、本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を高めることができる。本発明のマイクロエマルジョンで用いられる浸透増強剤を、５つの大まかなカテゴリー、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および、非キレート非界面活性剤のいずれかに属するものとして分類することができる（Lee等，Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems，1991年，92頁）。これらのクラスはそれぞれ上述
されている。
【００６６】
リポソーム
マイクロエマルジョンのほかにも、研究されており、薬物の製剤に用いられている多くの系統的な界面活性剤構造がある。このような界面活性剤構造としては、単分子層、ミセル、二分子層、および、小胞が挙げられる。小胞、例えばリポソームは、薬物送達の観点から、それらの特異性、および、それらが提供する作用の持続時間のために、高い関心をひいてきた。本発明において用いられる用語「リポソーム」は、球状の二分子層または二分子層に配置された両親媒性脂質で構成される小胞を意味する。
【００６７】
リポソームは、親油性物質で形成された膜と水性の内部とを有する単層または複層の小胞である。水性の部分は、送達しようとする組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合できるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的には融合できないが、インビボでマクロファージにより吸収される。
【００６８】
無傷の哺乳動物の皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮の勾配の影響下で、いずれも直径５０ｎｍ未満の一連の微細な孔を通過しなければならない。それゆえに、極めて変形しやすく、このような微細な孔を通過することができるリポソームを用いることが望ましい。
【００６９】
リポソームのさらなる利点としては；天然リン脂質から得られたリポソームは、生体適合性、生分解性であること；リポソームは、様々な水、および、脂溶性薬物を取り込むことができること；リポソームは、内部の区画中で、カプセル化された薬物を代謝や分解から保護することができること、が挙げられる（Rosoffの「Pharmaceutical Dosage Forms
」，Lieberman，RiegerおよびBanker（編），1988年，マルセル・デッカー社，ニューヨ
ーク，ニューヨーク州，第1巻，245頁）。リポソーム製剤の製造における重要な検討内容は、リポソームの脂質表面の電荷、小胞の大きさ、および、水性成分の量である。
【００７０】
リポソームは、活性成分の作用部位への移動および送達に有用である。リポソームの膜は、構造的に生体膜に類似しているため、リポソームを組織に適用すると、リポソームは、細胞膜に融合し始める。リポソームと細胞との融合が進行するにつれて、リポソームの内容物は、活性物質が作用し得る細胞に移行する。
【００７１】
リポソーム製剤は、様々な薬物の送達様式として、広範囲にわたる研究の焦点であった。局所投与に関して、リポソームはその他の製剤に対して数種の利点を有するという証拠が発展している。このような利点としては、投与された薬物が大量に全身吸収されることに関連する副作用の減少、望ましい標的での投与された薬物の蓄積の増加、および、親水性および疎水性いずれの多種多様な薬物を皮膚に投与できる能力、が挙げられる。
【００７２】
数々のレポートで、高分子量ＤＮＡを含む物質を皮膚に送達するリポソームの能力について詳述されている。鎮痛薬、抗体、ホルモン、および、高分子量ＤＮＡなどの化合物が、皮膚に投与された。ほとんどの適用により、上面表皮の標的化が起こった。
【００７３】
リポソームは、２種の大まかなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して、安定安定な複合体を形成する。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソームで内在化する。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞の細胞質に放出する（Wang等，Biochem．Biophys．Res．Commun.，1987年，147，980〜985）。
【００７４】
リポソームは、ｐＨ感受性であるか、または負に荷電しており、ＤＮＡとの複合体よりもＤＮＡを捕獲する。ＤＮＡと脂質はいずれも類似の電荷を有するため、反発作用を起こし、複合体形成は起こらない。それにもかかわらず、一部のＤＮＡは、これらリポソームの水性の内部に捕獲される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを倍地中で細胞の単分子層に送達するために、ｐＨ感受性リポソームが用いられてきた。標的細胞で外因性の遺伝子の発現が検出された（Zhou等, Journal of Controlled Release，1992年，19
，269〜274）。
【００７５】
リポソーム組成物１つの主要な型としては、天然で生じるホスファチジルコリンの他に、リン脂質がある。例えば、天然のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、または、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。一般的に、アニオン性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方で、アニオン性膜融合リポソームは、まずジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。その他の型のリポソーム組成物は、例えばダイズのＰＣや卵のＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。その他の型は、リン脂質、および／または、ホスファチジルコリン、および／または、コレステロールの混合物から形成される。
【００７６】
数々の研究により、リポソーム薬物製剤の皮膚への局所的な送達が評価されている。モルモットの皮膚へのインターフェロンを含むリポソームの適用は、皮膚ヘルペス潰瘍を減少させたが、その他の手段によるインターフェロン送達（例えば溶液またはエマルジョンとして）は有効的ではなかった（Weiner等，Journal of Drug Targeting，1992年，2，405〜410）。その上、さらなる研究により、水系を用いたインターフェロン投与に対して、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性が試験され、リポソーム製剤は、水系での投与より優れていると結論付けられた（du Plessis等，Antiviral Research，1992年，18，259〜265）。
【００７７】
また、非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系も試験され、皮膚への薬物送達の有用性が測定された。NovasomeTMＩ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）、および、NovasomeTMII（ジステアリン酸グリセリン／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を用いて、シクロスポリン−Ａをマウスの皮膚の真皮に送達した。その結果によれば、このような非イオン性リポソーム系は、シクロスポリン−Ａの皮膚の様々な層への堆積を容易にするのに有効であることが示された（Hu等，S.T.P．Pharma．Sci.，1994年，4，6，466）。
【００７８】
またリポソームとしては、「立体配置上安定化な」リポソームも挙げられ、これは、本発明で用いられる場合、１またはそれ以上の特化した脂質を含むリポソームを意味し、このような特化した脂質がリポソームに取り込まれると、このような特化した脂質を含まないリポソームに比べて循環寿命が高められる。立体配置上安定化なリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質の部分の一部（Ａ）が、１もしくはそれ以上のグリコリピド、例えばモノシアロガングリオシドＧM1を含み、または（Ｂ）が、１もしくはそれ以上
の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分で誘導体化されるものである。いかなる特定の理論に限定するつもりはないが、当業界では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、または、ＰＥＧで誘導体化された脂質を含む立体配置上安定化なリポソームに関しては、このような立体配置上安定化なリポソームの高められた循環半減期は、網内系（ＲＥＳ）細胞への摂取が減少することにより生じるものと考えられている（Alien等，FEBS Letters，1987年，223，42；Wu等，Cancer Research，1993年
，53，3765）。
【００７９】
１またはそれ以上のグリコリピドを含む様々なリポソームが、当業界で既知である。Papahadjopoulos等（Ann．N.Y．Acad．Sci.，1987年，507，64）により、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド、および、ホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力が報告された。これらの発見は、Gabizon等（Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，1988年，85，6949）により解説されている。米国特許第４,８３７,０２８号、および、ＷＯ ８８／０４９２４（いずれもAlien等）は、（１）スフィンゴミエリン、および、（２）ガングリオシドGjor、硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５,５４３,１５２号（Webb等）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。ＷＯ ９７／１３４９９（Lim等）では、１,２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、開示されている。
【００８０】
１またはそれ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む様々なリポソームおよびそれらの製造方法が、当業界で既知である。Sunamoto等（Bull．Chem．Soc．Jpn.，1980，53，2778）は、非イオン性界面活性剤、２Ｃ12１５Ｇ、（ＰＥＧ成分を含む）を含むリポソームを説明している。Illum等（FEBS Lett.，1984，167，79）は、高分子グリコールでポリスチレン粒子を親水性コーティングすると、血中半減期を顕著に高められることを記載している。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボキシ基を付着させることにより修飾された合成リン脂質が、Searsにより説明されている（米国特許第４,４２６,３３０号、および、第４,５３４,８９９号）。Klibanov等（FEBS Lett.，1990年，268，235）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームにより、血中循環半減期が顕著に増加したことを実証する実験を説明している。Blume等（Biochimica et Biophysica Acta，1990年，1029，91）は、このような観察を、その他のＰＥＧで誘導体化されたリン脂質、例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組み合わせで形成された）にも行った。外部表面に共有結合したＰＥＧ成分を有するリポソームは、欧州特許第０４４５１３１号（Ｂ１）、および、fisherのＷＯ ９０／０４３８４で説明されている。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを１〜２０モルパーセント含むリポソーム組成物およびそれらの使用方法が、Woodle等（米国特許第５,０１３,５５６号、および、第５,３５６,６３３号）、および、Martin等（米国特許第５,２１３,８０４号、および、欧州特許第０４９６８１３号（Ｂ１））で説明されている。多くのその他の脂質−ポリマー複合体を含むリポソームが、ＷＯ ９１／０５５４５、および、米国特許第５,２２５,２１２号（いずれもMartin等）、および、ＷＯ ９４／２００７３（Zalipsky等）で開示されている。ＰＥＧで修飾されたセラミド脂質を含むリポソームが、ＷＯ ９６／１０３９１（Choi等）で説明されている。米国特許第５,５４０,９３５号（Miyazaki等）、および、５,５５６,９４８（Tagawa等）は、ＰＥＧを含むリポソームを説明しており、それらの表面は機能的成分でさらに誘導体化されてもよい。
【００８１】
核酸を含むリポソームが、わずかながら当業界で既知である。Thierry等のＷＯ ９６／４００６２は、リポソーム中に高分子量核酸をカプセル化する方法を開示している。Tagawa等の米国特許第５,２６４,２２１号は、タンパク質が結合したリポソームを開示しており、このようなリポソームの内容物は、アンチセンスＲＮＡを含み得ることが主張されている。Rahman等の米国特許第５,６６５,７１０号では、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する方法が説明されている。Love等のＷＯ ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示している。
【００８２】
トランスファーソーム（transfersome）は、さらにその他の型のリポソームであり、これは、極めて変形しやすい脂質集合体であり、薬物送達の運搬手段として魅力的な候補である。トランスファーソームは、容易に液体粒子より小さい孔を通過して浸透できるほど極めて変形しやすい脂質の液体粒子と説明することができる。トランスファーソームは、それらが用いられる環境に適用可能であり、例えばトランスファーソームは、自己最適化し（皮膚の孔の形状に適応性する）、自己修復し、断片化することなく高い頻度でそれらの標的に到達し、場合によってはセルフローディングする。トランスファーソームを製造するために、表面のエッジアクチベーター（通常は界面活性剤）を、標準的なリポソーム組成物に付加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに用いられてきた。血清アルブミンのトランスファーソームが介在する送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射として有効であることがわかっている。
【００８３】
界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンなど）やリポソームのような製剤に広範囲な適用が見出されている。多くの様々な型の界面活性剤（天然と合成の両方を含む）の特性を分類し格付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）を使用することである。親水性基（または「頭部」として知られる）の性質が、製剤に用いられる様々な界面活性剤を分類するのに最も有用な手段を提供する（Riegerの「Pharmaceutical Dosage Forms」，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨーク州，1988年，285頁）
【００８４】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、その界面活性剤は、非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品や化粧品において広範囲の適用が見出されており、多様なｐＨ値にわたり使用に適している。一般的に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造によって２〜約１８の範囲であり、非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えばエチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、および、エトキシ化エステルが挙げられる。このクラスには、非イオン性アルカノールアミド、および、エーテル、例えば脂肪アルコールエトキシレート，プロポキシ化アルコール、および、エトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーも挙げられる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なメンバーである。
【００８５】
界面活性剤分子を水に溶解または分散させると界面活性剤分子が負電荷を有する場合、その界面活性剤は、アニオン性と分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボキシレート、例えば石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば硫酸アルキル、および、エトキシ化硫酸アルキル、スルホネート、例えばアルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート、および、スルホスクシネート、および、ホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、硫酸アルキル、および、石鹸である。
【００８６】
界面活性剤分子を水に溶解または分散させると界面活性剤分子が正電荷を有する場合、その界面活性剤は、カチオン性と分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩、および、エトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最もよく使用されるメンバーである。
【００８７】
界面活性剤分子が、正電荷または負電荷のいずれも有する能力がある場合、その界面活
性剤は、両性と分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、および、ホスファチドが挙げられる。
薬品、製剤、および、エマルジョンでの界面活性剤の使用が総説されている（Riegerの「Pharmaceutical Dosage Forms」，マルセル・デッカー社，ニューヨーク，ニューヨー
ク州，1988年，285頁）。
【００８８】
浸透増強剤
一実施形態において、本発明は、様々な浸透増強剤を用いて、核酸（特にオリゴヌクレオチド）の動物の皮膚への効率的な送達を達成できる。ほとんどの薬物は、溶液中にイオン化型または非イオン化型で存在する。しかしながら、通常は、脂溶性または親油性薬物しか容易に細胞膜を通過できない。通過させる膜を浸透増強剤で処理すると、非親油性薬物でも細胞膜を通過することができることが発見された。細胞膜を通過する非親油性薬物の拡散を補助することに加えて、浸透増強剤は親油性薬物の透過性も高める。
浸透増強剤は、５つの大まかなカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および、非キレート非界面活性剤の１つに属するものとして分類することができる（Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991年，92頁）。上述の浸透増強剤のクラスをそれぞれ以下でより詳細に説明する。
【００８９】
界面活性剤
本発明に関して、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解させると、溶液の表面張力、または、水溶液とその他の液体との界面張力を減少させ、それにより粘膜を通過するオリゴヌクレオチドの吸収を高めることができる化学物質である。胆汁酸塩や脂肪酸に加えて、このような浸透増強剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、および、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991年
，92頁）；および、過フルオロ化合物のエマルジョン、例えばＦＣ−４３（Takahashi等
，J．Pharm．Pharmacol.，1988年，40，252）が挙げられる。
【００９０】
脂肪酸
浸透増強剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ1-10アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、および、ｔ−ブチル）、および、それらのモノ−およびジ−グリセリド（すなわち、オレイン酸エステル、ラウリン酸エステル、カプリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、リノール酸エステルなど）が挙げられる（Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991年，92頁；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990年，7，1〜33；El Hariri等，J．Pharm．Pharmacol.，1992年，44，651〜654）。
【００９１】
胆汁酸塩
胆汁の生理学的な役割としては、脂質や脂溶性ビタミンの分散および吸収の簡便化がある（Bruntonの「Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics」の
第38章，第9版，Hardman等編，マグローヒル（McGraw-Hill），ニューヨーク，1996年，934〜935頁）。様々な天然の胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体は、浸透増強剤として作
用する。従って、用語「胆汁酸塩」は、胆汁の天然に存在する成分ののいずれか、同様に、それらの合成誘導体のいずれかを含む。本発明の胆汁酸塩としては、例えば、コール酸（または、その製薬上許容できるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコリン酸（glucholic acid）（グルコリン酸ナトリウム）、グリコリン酸（glycholic acid）（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４,２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、および、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991年，92頁；Swinyardの「Remington's Pharmaceutical Sciences」の第39章，第18版，Gennaro編，マック・パブリッシング社，イーストン，ペンシルベニア州，1990年，782〜783頁；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990年，7，1〜33；Yamamoto等，J．Pharm．Exp．Ther.，1992年，263，25；Yamashita等，J．Pharm．Sci.，1990年，79，579〜583）。
【００９２】
キレート剤
本発明において用いられるキレート剤は、金属イオンと複合体を形成することによって金属イオンを溶液から除去し、粘膜を通過するオリゴヌクレオチドの吸収を高めることができる化合物と定義することができる。ほとんどの特徴的なＤＮＡヌクレアーゼは、触媒反応に２価の金属イオンを必要とするため、キレート剤により阻害されるので、本発明においてキレート剤を浸透増強剤として用いると、キレート剤はさらにＤＮアーゼ阻害剤としての利点を有する（Jarrett，J．Chromatogr.，1993年，618，315〜339）。本発明のキレート剤としては、これらに限定されないが、エチレンジアミン四酢酸塩二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート、および、ホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体，ラウレス−９、および、β−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991年，92頁；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990年, ７，1〜33；Buur等，J．Control Rel.，1990年，14，43〜51）。
【００９３】
非キレート非界面活性剤
本発明で用いられる非キレート非界面活性剤の浸透増強化合物は、化合物キレート剤または界面活性剤としてはわずかな活性しか示さないが、胃腸の粘膜を通過してオリゴヌクレオチドの吸収を高めるものと定義することができる（Muranishi，Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems，1990年，7，1〜33）。このクラスの浸透増強剤と
しては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991年，92頁）；ならびに、非ステロイド性抗炎症薬、例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、および、フェニルブタゾン（Yamashita等，J．Pharm．Pharmacol.，1987年，39，621〜626）が挙げられる。
【００９４】
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの摂取を高める物質を、本発明の医薬組成物およびその他の組成物に加えてもよい。例えば、カチオン性脂質、例えばリポフェクチン（Junichi等，米国特許第５,７０５,１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、および、ポリカチオン性分子、例えばポリリシン（Lollo等，ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／３０７３１）も、オリゴヌクレオチドの細胞摂取を高めることが知られている。
【００９５】
投与された核酸の浸透性を高めるためにその他の物質を利用してもよく、例えばグリコール、例えばエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ピロール、例えば２−ピロール、アゾン（azone）、ならびに、テルペン、例えばリモネンおよびメントンが挙げられる。
【００９６】
キャリアー
本発明の特定の組成物はまた、製剤中にキャリアー化合物を取り込む。本発明で用いられる「キャリアー化合物」または「キャリアー」は、不活性（すなわち、それ自体は生物学的活性を有さない）であるが、例えば、生物学的に活性な核酸の分解や循環からの除去の促進により生物学的活性を有する核酸の生物学的利用率を減少させるインビボでのプロセスで、核酸として認識される核酸またはそれらの類似体を意味し得る。核酸とキャリアー化合物とを共に投与することにより（典型的には後者の物質が過量）、おそらくキャリアー化合物と核酸とが共通の受容体に関して競合することで、肝臓、腎臓またはその他の循環器以外の貯蔵器官で回収される核酸の量を実質的に減少させることができる。例えば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸（polycytidic acid）、または、４−アセトアミド−４イソチオシアノ−スチルベン−２,２′ジスルホン酸と共に投与すると、肝臓組織における部分的にホスホロチオエートであるオリゴヌクレオチドの回収を減少させることができる（Miyao等，Antisense Res．Dev.，1995年，5，115〜121；Takakura等，Antisense & Nucl．Acid Drug Dev.，1996年，6，177〜183）。
【００９７】
賦形剤
キャリアー化合物とは別に、「医薬キャリアー」または「賦形剤」は、製薬上許容できる溶媒、沈殿防止剤、または、１またはそれ以上の核酸を動物に送達するためのあらゆるその他の薬理学的に不活性な運搬手段である。賦形剤は、液体でも固体でもよく、核酸と所定の医薬組成物のその他の成分を合わせると望ましい容量や濃度などが提供されるように考慮された計画的な投与様式を用いて選択される。典型的な医薬キャリアーとしては、これらに限定されないが、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、または、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトース、およびその他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、または、リン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアレート、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、スターチ、ナトリウムスターチグリコレートなど）；および、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
【００９８】
非経口投与に適した、核酸と有害に反応しない製薬上許容できる有機または無機賦形剤はまた、本発明の組成物を配合するのに用いることができる。適切な製薬上許容できるキャリアーとしては、これらに限定されないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性のパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００９９】
核酸の局所投与のための製剤としては、滅菌および非滅菌水溶液、一般的な溶媒（例えばアルコール）の非水溶液、または、液状もしくは固形油ベースの核酸溶液が挙げられる。このような溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤を含んでもよい。非経口投与に適した、核酸と有害に反応しない製薬上許容できる有機または無機賦形剤を用いてもよい。
【０１００】
適切な製薬上許容できる賦形剤としては、これらに限定されないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性のパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１０１】
その他の成分
本発明の組成物は、慣例的に医薬組成物中に存在するその他の補助成分を、当業界で確立された使用レベルでさらに含み得る。従って、例えば、本組成物は、追加の適合性の医薬活性物質、例えば、止痒剤、収斂薬、局所麻酔剤もしくは抗炎症薬を含んでもよく、または、本発明の組成物の様々な投薬形態を物理的に製剤化するのに有用な追加の物質、例えば色素、矯味矯臭薬剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および、安定剤を含んでもよい。しかしながら、このような物質は、添加した際に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきではない。本製剤を滅菌してもよく、必要に応じて、補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤、矯味矯臭薬剤、および／または、芳香性物質など（これらは製剤の核酸と有害に相互作用しない）と混合してもよい。
【０１０２】
水性懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質を含んでもよく、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／または、デキストランが挙げられる。本懸濁液はまた、安定剤を含んでもよい。
【０１０３】
本発明の所定の実施形態は、（ａ）１またはそれ以上のアンチセンス化合物、および、（ｂ）非アンチセンスメカニズムで機能する１またはそれ以上のその他の化学治療剤を含む医薬組成物を提供する。このような化学治療剤の例としては、これらに限定されないが、抗ガン剤、例えばダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、および、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が挙げられる。一般的に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第15版，Berkow等編，1987年，ラーウェイ，ニュージャージー州，1206〜1228頁を参照。抗炎症薬としては、これらに限定されないが、非ステロイド抗炎症薬、および、コルチコステロイドが挙げられ、抗ウイルス剤としては、これらに限定されないが、リビビリン（ribivirin）、ビダラビン、アシクロビル、および、ガンシクロビルが挙げられ、本発明の組成物において併用することができる。一般的に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第15版，Berkow等編，1987年，ラーウェイ，ニュージャージー州，それぞれ2499〜2506頁および46〜49頁を参照。その他の非アンチセンス化学治療剤も本発明の範囲内である。２またはそれ以上の併用される化合物を、一緒に、または、連続して用いることもできる。
【０１０４】
その他の関連する実施形態において、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする１またはそれ以上のアンチセンス化合物（特にオリゴヌクレオチド）、および、第二の核酸標的を標的とする１またはそれ以上のさらなるアンチセンス化合物を含んでもよい。多数のアンチセンス化合物の例が、当業界で既知である。２またはそれ以上の併用される化合物を、一緒に、または、連続して用いることもできる。
【０１０５】
治療用組成物の製剤化、および、その後のそれらの投与は、当業者の技術範囲内であると考えられる。投与は、数日から数ヶ月にわたり継続される治療経過で、治療しようとする病状の重症度と反応性に応じて行われるか、または、治療が達成されるまで、または、病状の減退が達成されるまで行われる。最適な投与スケジュールは、患者の体内に蓄積された薬物量を測定することにより算出することができる。当業者であれば、最適な投与量、投与方法、および、反復率を容易に決定することができる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に応じて様々であってよく、一般的に、インビトロおよびインビボの動物モデルにおいて有効であることがわかっている、ＥＣ５０に基づき推定することができる。一般的に、投与量は、０.０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重であり、１日、１週、１月または１年あたり１回またはそれ以上で投与することができ、または、２〜２０年毎に１回でもよい。当業者であれば、測定された体液または組織中の薬物の滞留時間および濃度に基づき、投与のための反復率を容易に推測することができる。治療が成功した後、病状の再発を防ぐために患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、その場合、オリゴヌクレオチドは、０.０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重，１日に１回またはそれ以上〜２０年毎に１回の維持量で投与される。
【０１０６】
本発明の開示で引用された全ての出版物、特許および特許出願の全内容は、あたかも個々の出版物、特許または特許出願がそれぞれ、特定および個別に参照により本発明に加入させることが指示されているもののように、参照により加入される。
【０１０７】
上述の発明を、理解を明確にするための説明と実施例によってより詳細に説明するが、本発明の教示に関して、本発明の本質と範囲から逸脱しない限り変更や改変が可能であることは当業者には明らかである。以下の実施例は、例示の目的のためだけに提供されたものであって、上述で概説的に説明された本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【０１０８】
実施例１
オリゴヌクレオチド合成デオキシ、および、２′−アルコキシアミダイトのためのヌクレオシドホスホアミダイト
２′−デオキシ、および、２′−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホアミダイトは、商業的供給源より入手可能である（例えばケムジーンズ（ChemGenes），ニー
ダム，マサチューセッツ州、または、グレン・リサーチ社，スターリング，バージニア州）。その他の２′−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５,５０６,３５１号（参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。２′−アルコキシアミダイトを用いて合成されたオリゴヌクレオチドに関して、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準的なサイクルを利用した（ただしテトラゾールと塩基のパルス出力後の待機工程を３６０秒に増加させた）。
【０１０９】
５−メチル−２′−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを、市販のホスホアミダイト（グレン・リサーチ，スターリング，バージニア州、または、ケムジーンズ，ニーダム，マサチューセッツ州）を用いて公開された方法［Sanghvi等，Nucleic Acids Research，1993年，21，3197〜3203］に従って合成した。
【０１１０】
２′−フルオロアミダイト
２′−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
２′−フルオロオリゴヌクレオチドを、前述のように合成した［Kawasaki等，J．Med．Chem.，1993年，36，831〜841、および、米国特許第５,６７０,６３３号（参照により本発明に加入させる）］。簡単に言えば、保護されたヌクレオシドＮ６−ベンゾイル−２′−デオキシ−２′−フルオロアデノシンは、出発原料として市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを利用し、さらに、文献の方法を改変して、２′−β−トリチル基のＳN２−置換によって２′−α−フルオロ原子を導入することによって合成した。従って、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンが選択的に保護され、３′,５′−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として中程度の収率で得られた。ＴＨＰとＮ６−ベンゾイル基の脱保護が標準的な方法を用いて達成され、標準的な方法を用いて、５′−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）、および、５′−ＤＭＴ−３′−ホスホアミダイト中間体を得た。
【０１１１】
２′−フルオロデオキシグアノシン
テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）で保護された９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発原料として用い、中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンに変換することによって、２′−デオキシ−２′−フルオログアノシンを合成した。ＴＰＤＳ基を脱保護した後、ヒドロキシル基をＴＨＰで保護し、ジイソブチリルジ−ＴＨＰで保護されたアラビノフラノシルグアニンを得た。選択的にＯ−脱アシル化し、トリフレート化した後、フッ化物で粗生成物を処理し、ＴＨＰ基を脱保護した。標準的な方法を用いて、５′−ＤＭＴ−、および、５′−ＤＭＴ−３′−ホスホアミダイトを得た。
【０１１２】
２′−フルオロウリジン
２′−デオキシ−２′−フルオロウリジンの合成は、文献の方法を改変して、２,２′
アンヒドロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素−ピリジンで処理して達成された。標準的な方法を用いて、５′−ＤＭＴ、および、５′−ＤＭＴ−３′−ホスホアミダイトを得た。
【０１１３】
２′−フルオロデオキシシチジン
２′−デオキシ−２′−フルオロシチジンを、２′−デオキシ−２′−フルオロウリジンをアミノ化して合成し、続いて選択的に保護して、Ｎ４−ベンゾイル−２′−デオキシ−２′−フルオロシチジンを得た。標準的な方法を用いて、５′−ＤＭＴ、および、５′−ＤＭＴ−３′−ホスホアミダイトを得た。
【０１１４】
２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）で修飾されたアミダイト
２′−Ｏ−メトキシエチル−置換ヌクレオシドアミダイトを、以下のように、あるいは、Martin，P.，Helvetica Chimica Acta，1995年，78，486〜504に記載の方法のように製造した。
【０１１５】
２,２′−アンヒドロ［１−(β−Ｄ−アラビノフラノシル)−５−メチルウリジン］
５−メチルウリジン（リボシルチミン；ヤマサ（日本国銚子市）より市販されている）（７２.０ｇ，０.２７９Ｍ）、炭酸ジフェニル（９０.０ｇ，０.４２０Ｍ）、および、炭酸水素ナトリウム（２.０ｇ，０.０２４Ｍ）を、ＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。この混合物を還流下で撹拌しながら加熱し、発生した二酸化炭素ガスを制御下で放出させた。１時間後、わずかに黒ずんだ溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップを撹拌しながらジエチルエーテル（２.５Ｌ）に注いだ。ゴム状の生成物が得られた。エーテルをデカントし、残留物を最少量のメタノール（約４００ｍＬ）に溶解させた。この溶液を新しいエーテル（２.５Ｌ）に注ぎ、硬いゴムを得た。エーテルをデカントし、ゴムをを真空オーブ
ンで乾燥させ（１ｍｍＨｇで６０℃，２４時間）、薄い黄褐色の粉末に砕かれた固体を得た。さらなる反応にこの物質をそにまま用いて（または、酢酸エチル中のメタノールの濃度勾配（１０〜２５％）を用いたカラムクロマトグラフィーでさらに精製してもよい）、白色固体を得た。
【０１１６】
２′−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２,２′−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０.８１Ｍ）、ホウ酸トリス（２−メトキシエチル）（２３１ｇ，０.９８Ｍ）、および、２−メトキシエタノール（１.２Ｌ）を、２Ｌのステンレス鋼の圧力容器に加え、１６０℃に予備加熱したオイルバスに置いた。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した後、容器を開け、溶液を蒸発により乾燥させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で粉砕した。残留物を熱したアセトン（１Ｌ）に懸濁した。不溶性の塩をろ過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、ろ液を蒸発させた。残留物（２８０ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）に溶解させ、蒸発させた。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を０.５％Ｅｔ３ＮＨを含むＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中で充填した。残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）に溶解させ、シリカ（１５０ｇ）に吸着させた後、カラムにローディングした。生成物を充填した溶媒で溶出させ、表題の生成物を得た。不純な成分を再処理することによって追加の材料を得ることができた。
【０１１７】
２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２′−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０.５０６Ｍ）をピリジ
ン（２５０ｍＬ）で共に蒸発させ、乾燥した残留物をピリジン（１.３Ｌ）に溶解させた
。塩化ジメトキシトリチルの第一のアリコート（９４.３ｇ，０.２７８Ｍ）を加え、この混合物を室温で１時間撹拌した。塩化ジメトキシトリチルの第二のアリコート（９４.３ｇ，０.２７８Ｍ）を加え、この反応液をさらに１時間撹拌した。次に、メタノール（１
７０ｍＬ）を加え反応を停止させた。溶媒を蒸発させ、ＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）で粉砕した。残留物をＣＨＣｌ3（１.５Ｌ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３（２×５００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ（２×５００ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させた。残留物を、充填されたシリカゲルカラム（３.５ｋｇ）で、０〜５％Ｅ
ｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出して精製した。純粋な分画を蒸発させ、表題の生成物を得た。
【０１１８】
３′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０.１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（７５０ｍＬ；ＤＭＦ（５６２ｍＬ）とピリジン（１８８ｍＬ）で製造された３：１混合物）、および、無水酢酸（２４.３８ｍＬ，０.２５８Ｍ）を合わせ、室温で２４時間撹拌した。まず追加のＭｅＯＨでＴＬＣサンプルを急冷して、反応をＴＬＣでモニターした。ＴＬＣで判断して、反応が完了した後、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、この混合物を３５℃で蒸発させた。残留物をＣＨＣｌ３（８００ｍＬ）に溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム（２×２００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ（２×２００ｍＬ）で抽出した。水層をＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて残留物を得た。残留物を、シリカゲルカラム（３.５ｋｇ）で、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を用いて溶出させ精製した。純粋な生成物の分画を蒸発させ、表題の化合物を得た。
【０１１９】
３′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
第一の溶液を、３′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０.１４４Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ｍＬ）に溶解させることによって製造し、保存した。トリエチルアミン（１８９ｍＬ，１.４４
Ｍ）を、トリアゾール（９０ｇ，１.３Ｍ）のＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）溶液に加え、−５℃に
冷却し、オーバヘッド撹拌器を用いて０.５時間撹拌した。３０分間にわたりＰＯＣｌ３
を０〜１０℃で維持している撹拌した溶液に滴下して加え、得られた混合物をさらに２時間撹拌した。第一の溶液を後者の溶液に４５分間にわたり滴下して加えた。得られた反応混合物を低温室で一晩保存した。反応混合物から塩をろ過し、溶液を蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解させ、不溶性の固体をろ過によって除去した。ろ液をＮａＨＣＯ３（１×３００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃで粉砕し、表題の化合物を得た。
【０１２０】
２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
３′−Ｏ−アセチル−２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０.１４１Ｍ）のジオキサン（５００
ｍＬ）とＮＨ4ＯＨ（３０ｍＬ）中の溶液を室温で２時間撹拌した。このジオキサン溶液
を蒸発させ、残留物をＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）で共沸させた。残留物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解させ、２リットルのステンレス鋼の圧力容器に移した。ＮＨ３ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、容器を１００℃に２時間加熱した（ＴＬＣにより完全な変換が示された）。容器の内容物を蒸発により乾燥させ、残留物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥さ、溶媒を蒸発させ、表題の化合物を得た。
【０１２１】
Ｎ４−ベンゾイル−２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０.１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解させ、安息香酸無水物（３７.２ｇ，０.１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。３時間撹拌した後、ＴＬＣにより、反応が約９５％完了していることが示された。溶媒を蒸発させ、残留物をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で共沸させた。残留物をＣＨＣｌ３（７００ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ3（２×３００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させ、残留物を得た。残留物を、クロマトグラフィーで、シリカカラム（１.５ｋｇ）で、溶出溶媒として０〜５％Ｅｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を用いて処理した。純粋な生成物の分画を蒸発させ、表題の化合物を得た。
【０１２２】
Ｎ４−ベンゾイル−２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３′−アミダイト
Ｎ４−ベンゾイル−２′−Ｏ−メトキシエチル−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０.１０Ｍ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）に溶解させ、テトラゾ
ールジイソプロピルアミン（７.１ｇ）、および、亜リン酸２−シアノエトキシ−テトラ
（イソプロピル）（４０.５ｍＬ，０.１２３Ｍ）を窒素雰囲気下で撹拌しながら加えた。得られた混合物を室温で２０時間撹拌した（ＴＬＣにより、反応が９５％完了していることが示された）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１×３００ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出した。水性の洗浄液をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で逆抽出し、抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。得られた残留物を、クロマトグラフィーで、シリカカラム（１.５ｋｇ）で、溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）をを用いて処理した。純粋な分画を合わせ、表題の化合物を得た。
【０１２３】
２′−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、および、２′−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
２′−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２′−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［また、当業界で２′−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとして知られている］を以下の段落の説明に従って製造した。アデノシン、シチジン、および、グアノシンヌクレオシドアミダイトを、チミジン（５−メチルウリジン）と同様にして製造した（ただし環外のアミンを、アデノシンとシチジンの場合はベンゾイル成分で、グアノシンの場合はイソブチリルで保護した）。
【０１２４】
５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２′−アンヒドロ−５−メチルウリジン
Ｏ２−２′−アンヒドロ−５−メチルウリジン（Pro．Bio．Sint.，ヴァレーゼ，イタ
リア，１００.０ｇ，０.４６ミリモル）、ジメチルアミノピリジン（０.６６ｇ，０.０１３当量，０.００５４ミリモル）を、乾燥ピリジン（５００ｍｌ）に、周囲温度で、アルゴン雰囲気下で、機械で撹拌しながら溶解させた。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５.８ｇ，１１９.０ｍＬ，１.１当量，０.４５８ミリモル）を一部加えた。反応液を周囲温度で１６時間撹拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ０.２２，酢酸エチル）により、反応が完了したことが示された。この溶液を減圧下で濃縮し、粘性の油を得た。これを、ジクロロメタン（１Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム（２×１Ｌ）およびブライン（１Ｌ）で分離させた。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮し、粘性の油を得た。その油を、酢酸エチルとエチルエーテル（６００ｍＬ）との１：１混合物に溶解させ、その溶液を−１０℃に冷却した。得られた結晶性の生成物をろ過によって回収し、エチルエーテル（３×２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（４０℃，１ｍｍＨｇ，２４ｈ）、白色固体を得た。
【０１２５】
５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２′−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２Ｌのステンレス鋼の撹拌を行わない圧力反応器に、ボランのテトラヒドロフラン溶液（１.０Ｍ，２.０当量，６２２ｍＬ）を加えた。ヒュームフード中で、手動で撹拌しながら、まずエチレングリコール（３５０ｍＬ，過量）を水素ガスの発生が静まるまで慎重に加えた。５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２′アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ，０.３１ｍｏｌ）、および、炭酸水素ナトリウム（０.０７４ｇ，０.００３当量）を手動で撹拌しながら加えた。反応器を密閉し、内部温度が１６０℃に達するまでオイルバス中で加熱し、１６時間維持した（圧力＜１００ｐｓｉｇ）。反応容器を周囲温度まで冷却し、開封した。ＴＬＣ（望ましい生成物のＲｆは０.６７であり、ａｒａ−Ｔ副産物である酢酸エチルのＲｆは０.８２）により、約７０％が生成物に変換されたことが示された。さらなる副産物形成を防ぐために、反応を停止させ、エチレングリコールを除去するためにさらに強い条件を用いて、温めたウォーターバス（４０〜１００℃）中で減圧下で濃縮した（１０〜１ｍｍ，Ｈｇ）。［あるいは、低沸点溶媒が蒸発すれば、残りの溶液を酢酸エチルと水とで分配することができる。生成物は有機相に存在する。］残留物をカラムクロマトグラフィーで精製した（シリカゲル２ｋｇ、酢酸エチル−ヘキサン勾配１：１〜４：１）。適切な分画を合わせ、揮散させ、乾燥させ、生成物（白色の細かく縮れた発泡体）、混入した出発原料、および、純粋な再使用可能な出発原料を得た。
【０１２６】
２′−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ］エチル）−５′−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２′−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ，３６.９８ミリモル）を、トリフェニルホスフィン（１
１.６３ｇ，４４.３６ミリモル）、および、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（７.２４ｇ，
４４.３６ミリモル）と混合した。これを次に、Ｐ２Ｏ５で、高真空下で、４０℃で２日
間乾燥させた。反応混合物をアルゴンでフラッシングし、乾燥ＴＨＦ（３６９.８ｍＬ，
アルドリッチの確実に密閉できるボトル）を、に加え、透明な溶液を得た。ジエチル−アゾジカルボキシレート（６.９８ｍＬ，４４.３６ミリモル）を反応混合物に滴下して加えた。添加速度は、添加により生じる深紅色への呈色が次の１滴を加える前にちょうど抜けるように維持した。添加が完了した後、反応液を４時間撹拌した。その後、ＴＬＣにより、反応が完了したことが示された（エチル酢酸塩：ヘキサン，６０：４０）。溶媒を真空中で蒸発させた。得られた残留物をフラッシュカラムに載せ、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出させ、２′−Ｏ−［（２−フタルイミドオキシ）エチル］−５′−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色の発泡体として得た。
【０１２７】
５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２′−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン
２′−Ｏ−［（２−フタルイミドオキシ）エチル］−５′−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３.１ｇ，４.５ミリモル）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４.５ｍＬ）に溶解させ、次いで、メチルヒドラジン（３００ｍＬ，４.６４ミリモル）を−１０℃〜０℃で滴下して加えた。１時間後、この混合物をろ過し、ろ液を氷冷したＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、合わせた有機相を水とブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。この溶液を濃縮し、２′−Ｏ（アミノオキシエチル）チミジンを得て、これを次に、ＭｅＯＨ
（６７.５ｍＬ）に溶解させた。これにホルムアルデヒド（２０％水溶液，ｗ／ｗ，１.１当量）を加え、得られた混合物を１時間撹拌した。溶媒を真空中で除去した；残留物をクロマトグラフィー処理し、５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２′−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白色の発泡体として得た。
【０１２８】
５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２′−Ｏ−［Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノオ
キシエチル］−５−メチルウリジン
５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２′−Ｏ−［（２−ホルムアドキシミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１.７７ｇ，３.１２ミリモル）を、１Ｍピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（ＰＰＴＳ）の乾燥ＭｅＯＨ（３０.６ｍＬ）溶液に
溶解させた。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０.３９ｇ，６.１３ミリモル）をこの溶液に、１０℃で、不活性雰囲気下で加えた。反応混合物を１０℃で１０分間撹拌した。その後、反応容器をアイスバスから取り出し、室温で２時間撹拌し、反応をＴＬＣでモニターした（ＣＨ２Ｃｌ２中の５％ＭｅＯＨ）。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％，１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル相を、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発により乾燥させた。残留物を、１Ｍ ＰＰＴＳのＭｅＯＨ（３０.６ｍＬ）溶液に溶解させた。ホルムアルデヒド（２０％ｗ／ｗ，３０ｍＬ，３.３７ミリモル）を加え、反応混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物をアイスバス中で１０℃に冷却し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０.３９ｇ，６.１３ミリモル）を加え、反応混合物を１０℃で１０分間撹拌した。１０分後、反応混合物をアイスバスから取り出し、室温で２時間撹拌した。反応混合物に５％ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）溶液を加え、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発により乾燥させた。得られた残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーで、ＣＨ２Ｃｌ２中の５％ＭｅＯＨで溶出させて精製し、５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２′−Ｏ−［Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを白色の発泡体として得た。
【０１２９】
２′−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３.９１ｍＬ，２４.０ミリモル）を乾燥ＴＨＦとトリエチルアミン（１.６７ｍＬ，１２ｍｍｏｌ，乾燥，ＫＯＨで保存）に溶解させ
た。次に、このトリエチルアミン−２ＨＦの混合物を、５′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２′−Ｏ−［Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１.４０ｇ，２.４ミリモル）に加え、室温で２４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターした（ＣＨ２Ｃｌ２中、５％ＭｅＯＨ）。溶媒を真空中で除去し、残留物をフラッシュカラムに載せ、ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨで溶出させ、２′−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジンを得た。
【０１３０】
５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
２′−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ，２.
１７ミリモル）を、Ｐ２Ｏ５で、高真空下で、４０℃で一晩乾燥させた。これを次に、無水ピリジン（２０ｍＬ）で共に蒸発させた。得られた残留物を、アルゴン雰囲気下でピリジン（１１ｍＬ）に溶解させた。４−ジメチルアミノピリジン（２６.５ｍｇ，２.６０ミリモル）、４,４′−塩化ジメトキシトリチル（８８０ｍｇ，２.６０ミリモル）をこの混合物に加え、全ての出発原料がなくなるまで反応混合物を室温で撹拌した。ピリジンを真空中で除去し、残留物をクロマトグラフィー処理し、ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨ（数滴のピリジンを含む）で溶出させ、５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−Ｏ−（ジメチルアミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジンを得た。
【０１３１】
５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−Ｏ−（２−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチ
ルウリジン−３′−［(２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］
５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１.０８ｇ，１.６７ミリモル）をトルエン（２０ｍＬ）で共に蒸発させた。残留物に、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０.２９ｇ，１.６７ミリモル）を加え、Ｐ2Ｏ5で、高真空下で、４０℃で一晩乾燥させた。次に、反応混合物を無水アセトニトリル
（８.４ｍＬ）に溶解させ、２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトライソプロピルホスホアミダイト（２.１２ｍＬ，６.０８ミリモル）を加えた。反応混合物を、不活性雰囲気下で、周囲温度で４時間撹拌した。反応の進行をでＴＬＣモニターした（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）。溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチル（７０ｍＬ）に溶解させ、５％ＮａＨＣＯ３水溶液（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。得られた残留物をクロマトグラフィー処理した（溶出液として酢酸エチル）、５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−Ｏ−（２−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３′−［（２−シアノエチル）−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］を発泡体として得た。
【０１３２】
２′−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２′−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［または、当業界で２′−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとして知られている］を以下の段落で説明するように製造した。アデノシン、シチジン、および、チミジンヌクレオシドアミダイトを同様にして製造した。
【０１３３】
Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２′−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５′−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリチル）グアノシン−３′−［（２−シアノ
エチル）−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］
２′−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミノプリンリボシドの選択的な２′−Ｏ−アルキル化により得ることができる。数グラムのジアミノプリンリボシドをシエーリングＡＧ（ベルリン）から購入し、少量の３′−Ｏ−アイソマーと共に２′−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを得た。２′−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドは、アデノシンデアミナーゼで処理することによって分解され、２′−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変換された。（McGee，D.P.C.，Cook，P.D.，Guinosso，C.J.，ＷＯ ９４／０２５０１（Ａ１）９４０２０３）。標準的な保護方法により、２′−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５′−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリチル）グアノシン、および、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２′−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５′−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリチル）グアノシンが生成し、これらが還元されて、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２′−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５′−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリチル）グアノシンが得られた。上述のように、光延反応によりヒドロキシル基をＮ−ヒドロキシフタルイミドで置換し、保護されたヌクレオシドを通常通りに亜リン酸化（phosphitylated）し、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２′−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５′−Ｏ−（４,４′−ジメトキシトリチル）グアノシン−３′−［（２−シアノエチル）−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］を得た。
【０１３４】
２′−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２′−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト
２′−ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（または、当業界で、２′−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル、すなわち、２′−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ(ＣＨ２)２、または、２′−ＤＭＡＥＯＥヌクレオシドアミダイトとして知られる）を以下のように製造した。その他のヌクレオシドアミダイトを同様に製造した。
【０１３５】
２′−Ｏ−［２（２−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン
２［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（アルドリッチ，６.６６ｇ，５０
ミリモル）を、ボランのテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ，１０ｍＬ，１０ミリモル）に、１００ｍＬのボンベで撹拌しながらゆっくり加えた。固体が溶解するにつれて水素ガスが発生した。Ｏ２−，２′−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１.２ｇ，５ミリモル）、および、炭酸水素ナトリウム（２.５ｍｇ）を加え、ボンベを密閉し、オイルバスに置き、１５５℃で２６時間加熱した。ボンベを室温に冷却し、開封した。粗溶液を濃縮し、残留物を水（２００ｍＬ）と、ヘキサン（２００ｍＬ）とで分配した。過量のフェノールをヘキサン層に抽出した。水層を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた、濃縮した。残留物を、１：２０のメタノール／塩化メチレン（２％トリエチルアミンを含む）を溶出液として用いてシリカゲルカラムで処理した。カラム分画を濃縮したら、無色の固体が形成され、これを回収し、表題の化合物を白色固体として得た。
【０１３６】
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［２（２−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエトキシ
）エチル］−５−メチルウリジン
０.５ｇ（１.３ミリモル）の２′−Ｏ−［２（２−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）
エチル］−５−メチルウリジンの無水ピリジン（８ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（０.３６ｍＬ）、および、塩化ジメトキシトリチル（ＤＭＴ−Ｃ１，０.８７ｇ，２当量）を加え、１時間撹拌した。反応混合物を水（２００ｍＬ）に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせたＣＨ２Ｃｌ２層を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、続いて飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、シリカゲルクロマトグラフィーでＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ３Ｎ（２０：１，ｖ／ｖ，１％トリエチルアミンを含む）を用いて処理し、表題の化合物を得た。
【０１３７】
５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［２（２−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエトキシ
）エチル）］−５−メチルウリジン−３′−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピ
ル）ホスホアミダイト
ジイソプロピルアミノテトラゾリド（０.６ｇ）、および、２−シアノエトキシＮ,Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト（１.１ｍＬ，２当量）を、５′−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−２′−Ｏ−［２（２−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウ
リジン（２.１７ｇ，３ミリモル）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解させた溶液に、アルゴン雰囲気下で加えた。反応混合物を一晩撹拌し、溶媒を蒸発させた。得られた残留物を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで、酢酸エチルを溶出液として用いて精製し、表題の化合物を得た。
【０１３８】
実施例２
オリゴヌクレオチド合成
非置換および置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを、ヨウ素での酸化による標準的なホスホアミダイト化学を用いて、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成した（アプライド・バイオシステムズ・モデル３８０Ｂ）。
ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成した（ただし、亜リン酸結合の段階的なチオ化（thiation）のために、標準的な酸化用容器を、０.２Ｍの３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン１,１−二酸化物のアセトニ
トリル溶液で置き換えた）。チオ化の待機工程を６８秒に増やし、続いてキャッピング工程を行った。ＣＰＧカラムから切り離し、濃水酸化アンモニウムで５５℃（１８時間）デブロッキングした後、０.５ＭのＮａＣｌ溶液から２.５倍量のエタノールで２回沈殿させることによってオリゴヌクレオチドを精製した。ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５,５０８,２７０号（参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
【０１３９】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第４,４６９,８６３号（参照に
より本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
３′−デオキシ−３′−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５,６１０,２８９号、または、第５,６２５,０５０号（参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
ホスホアミダイトオリゴヌクレオチドを、米国特許５,２５６,７７５第、または、米国特許第５,３６６,８７８号（参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを、ＷＯ ９４／１７０９３、および、ＷＯ ９４／０２４９９（参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
３′−デオキシ−３′−アミノホスホロアミデートオリゴヌクレオチドを、米国特許第５,４７６,９２５号（参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを、米国特許第５,０２３,２４３号（参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
ボラノリン酸オリゴヌクレオチドを、米国特許第５,１３０,３０２号、および、第５,１７７,１９８号（いずれも参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
【０１４０】
実施例３
オリゴヌクレオシド合成
メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（またはＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとも同定されている）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（またはＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとも同定されている）、および、メチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（またはアミド−３結合オリゴヌクレオシドとも同定されている）、および、メチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（またはアミド−４結合オリゴヌクレオシドとも同定されている）、同様に、例えば代替のＭＭＩおよびＰ＝０またはＰ＝Ｓ結合を有する混合型の主鎖化合物を、米国特許第５,３７８,８２５号；第５,３８６,０２３号；第５,４８９,６７７号；第５,６０２,２４０号；および、第５,６１０,２８９号（全て参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドを、米国特許第５,２６４,５６２号、および、第５,２６４,５６４号（参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
酸化エチレン結合オリゴヌクレオシドを、米国特許第５,２２３,６１８号（参照により本発明に加入させる）で説明されているように製造した。
【０１４１】
実施例４
ＰＮＡ合成
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、Peptide Nucleic Acids(PNA）：Synthesis，Properties and Potential Applications，Bioorganic & Medicinal Chemistry，1996年，4，523に記
載された様々な方法のいずれかに従って製造された。ペプチド核酸はまた、米国特許第５,５３９,０８２号；第５,７００,９２２号；および、第５,７１９,２６２号（参照により本発明に加入させる）に従って製造してもよい。
【０１４２】
実施例５
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または、混合型オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、数種の様々な型が可能である。これらとしては、第一の型（結合したヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、結合したヌクレオシドの５′と３′「ウィング」セグメントとの間に位置する）、および、第二の「オープンエンド」
型（「ギャップ」セグメントが、オリゴマー化合物の３′または５′末端のいずれかに位置する）が挙げられる。第一の型のオリゴヌクレオチドはまた、当業界で「ギャップマー」またはギャップの有る（gapped）オリゴヌクレオチドとして知られている。第二の型のオリゴヌクレオチドはまた、「ヘミマー（hemimer）」または「ウィングマー（wingmer）」として当業界で知られている。
【０１４３】
［２′−Ｏ−Ｍｅ］−［２′-デオキシ］-［２′-Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド
２′−Ｏ−アルキルホスホロチオエート、および、２′−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメラオリゴヌクレオチドを、上述の通りアプライド・バイオシステムズの自動ＤＮＡシンセサイザー・モデル３８０Ｂを用いて合成した。自動シンセサイザーを用いて、ＤＮＡ部分には２′−デオキシ−５′−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−ホスホアミダイト、および、５′と３′ウィングには５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−メチル−３′−Ｏ−ホスホアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成した。標準的な合成サイクルを改変した（テトラゾールと塩基を導入した後の待機工程を６００秒に増やし、ＲＮＡには４回、２′−Ｏ−メチルには２回繰り返した）。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、３：１のアンモニア／エタノール中で、リン酸基を室温で一晩脱保護し、凍結乾燥して乾燥させた。次に、メタノール・アンモニア中で室温で２４時間処理して全ての塩基を保護し、サンプルを再び凍結乾燥し、乾燥させた。ペレットを１Ｍ ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液に室温で２４時間再懸濁し、２′位を脱保護した。次に、反応を１Ｍ ＴＥＡＡで止め、サンプルをロトバック（rotovac）で１／２量に減らし、その後Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩した。次に、分光光度法で、収率および純度に関して、キャピラリー電気泳動とマススペクトロメトリーで回収されたオリゴを分析した。
【０１４４】
［２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−［２′−デオキシ］−［２′−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
［２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−［２′−デオキシ］−［−２′−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを上記の２′−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドの方法と同様に製造し、ホスホロチオエート オリゴヌクレオ
チドの置換を、上記の２′−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトと２′−Ｏ−メチルアミダイトとの方法と同様に製造した。
【０１４５】
［２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−［２′−デオキシホスホロチオエート］−［２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）］ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチド
［２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−［２′−デオキシホスホロチオエート］−［２′−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドの製造は、上記の２′−Ｏ−メチルキメラオリゴヌクレオチドの方法と同様に、ただし２′−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを２′−Ｏ−メチルアミダイトで置き換えて、ヨウ素で酸化して、キメラ構造のウィング部分内にホスホジエステルヌクレオチド間結合を形成し、ついで３Ｈ−１,２ベンゾジチオール−３−オン１,１二酸化物（Beaucage試薬）を用いて硫化して、中央のギャップにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を形成することによってなされた。
【０１４６】
その他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド、および、混合型キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドを、米国特許第５,６２３,０６５号（参照により本発明に加入させる）に従って合成した。
【０１４７】
実施例６
オリゴヌクレオチドの単離
制御多孔質ガラスのカラム（アプライド・バイオシステムズ）から切り離し、濃水酸化アンモニウム中で５５℃で１８時間デブロッキングした後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを０.５Ｍ ＮａＣｌから２.５倍量のエタノールで２回沈殿させて精製
した。合成されたオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動により変性ゲルで分析し、少なくとも８５％が全長の物質であると判断された。合成で得られたホスホロチオエートとホスホジエステル結合の相対量は、32Ｐ核磁気共鳴分光試験で定期的にチェックし、数々の研究のためにオリゴヌクレオチドを、ＨＰＬＣで、Chiang等，J．Biol．Chem．1991年，266，18162〜18171で説明されたように精製した。
【０１４８】
実施例７
オリゴヌクレオチド合成−９６ウェルプレートフォーマット
オリゴヌクレオチドの合成は、固相Ｐ（III）ホスホアミダイト化学法で、標準的な９
６ウェルフォーマットで９６個の配列を同時にアセンブルできる自動化シンセサイザーでなされた。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、ヨウ素水溶液での酸化により形成された。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中での３Ｈ−１,
２ベンゾジチオール−３−オン１,１二酸化物（Beaucage試薬）を用いた硫化により形成
された。標準の塩基が保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホアミダイトは、メーカー（例えばＰＥ−アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、ＣＡ、または、ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から購入した。標準以外のヌクレオシドを公知文献または特許された方法と同様に合成した。これらは、塩基として保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホアミダイトを利用している。
オリゴヌクレオチドを支持体から切り離し、濃ＮＨ４ＯＨを用いて高温（５５〜６０℃）で１２〜１６時間で脱保護し、放出された生成物を真空中で乾燥した。次に、乾燥した生成物を滅菌水に懸濁し、マスタープレートを得て、それから全ての分析および試験プレートサンプルをロボット利用のピペッターを利用して希釈した。
【０１４９】
実施例８
オリゴヌクレオチド分析−９６ウェルプレートフォーマット
各ウェルのオリゴヌクレオチド濃度を、サンプルの希釈とＵＶ吸収分光分析で評価した。個々の生成物の全長の完全性は、９６ウェルフォーマット（ベックマンＰ／ＡＣＥTM 
ＭＤＱ）で、または、個別に製造されたサンプルは市販のＣＥ装置（例えば、ベックマンＰ／ＡＣＥTM ５０００，ＡＢＩ２７０）上で、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）により評
価した。塩基と主鎖との組成を、エレクトロスプレーマススペクトロメトリーを用いた化合物の質量分析で確認した。全ての分析試験プレートを、シングルおよびマルチチャンネルロボット利用のピペッターを用いてマスタープレートから希釈した。プレートは、プレート上の少なくとも８５％の化合物が、少なくとも８５％全長である場合に許容できる、と判断された。
【０１５０】
実施例９
細胞培養、および、オリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在するような様々な細胞型のいずれかで試験することができる。この効果は、例えばＰＣＲまたはノーザンブロット分析を用いて通常どおり測定することができる。以下の６種の細胞型が説明の目的のために提供されるが、標的が選択された細胞型で発現されるようなその他の細胞型も通常どおり用いてもよい。この効果は、当業界で慣例的な方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護分析、または、ＲＴ−ＰＣＲで容易に測定することができる。
【０１５１】
Ｔ−２４細胞：
ヒト移行細胞膀胱ガン細胞系Ｔ−２４は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（マナサス，バージニア州）から購入した。１０％ウシ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）、ペニシリン１００ユニット／ｍＬ、および、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）を添加した完全McCoy's ５Ａ基礎培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）で、Ｔ−２４細胞を通常どおり培養した。細胞が９０％密度に達したら、通常どおり細胞をトリプシン処理し、希釈した。ＲＴ−ＰＣＲ分析用いるために、９６−ウェルプレート（ファルコン−プライマリア（Falcon-Primaria）＃３８７２）に、７０００細胞／ウェルの密度で細胞を播種した。
ノーザンブロットまたはその他の分析のために、細胞を１００ｍｍの組織培養プレートまたはその他の標準的な組織培養プレートに播種し、適量の培地とオリゴヌクレオチドで同様に処理した。
【０１５２】
Ａ５４９細胞：
ヒト肺ガン細胞系Ａ５４９を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（マナサス，バージニア州）から購入した。１０％ウシ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）、ペニシリン１００ユニット／ｍＬ、および、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）を添加したＤＭＥＭ基礎培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）で、Ａ５４９細胞を通常どおり培養した。細胞が９０％密度に達したら、通常どおり細胞をトリプシン処理し、希釈した。
【０１５３】
ＮＨＤＦ細胞；
ヒト新生児の皮膚の線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、クロンティクス社（Clonetics Corporation）（ウォーカーズビル，メリーランド州）から購入した。製造元の推奨に基づき添加された線維芽細胞成長培地（クロンティクス社，ウォーカーズビル，メリーランド州）で、ＮＨＤＦを通常どおり維持した。製造元の推奨に基づき細胞を１０世代まで維持した。
【０１５４】
ＨＥＫ細胞：
ヒト胎児のケラチノサイト（ＨＥＫ）は、クロンティクス社（ウォーカーズビル，メリーランド州）から購入した。製造元の推奨に基づき配合したケラチノサイト成長培地（クロンティクス社，ウォーカーズビル，メリーランド州）で、ＨＥＫを通常どおり維持した。製造元の推奨に基づき細胞を通常どおり１０世代まで維持した。
【０１５５】
ＭＣＦ-７細胞：
ヒト乳ガン細胞系ＭＣＦ−７は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マナサス，バージニア州）から購入した。１０％ウシ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）を添加したＤＭＥＭ低グルコース（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）で、ＭＣＦ−７細胞を通常どおり培養した。細胞が９０％密度に達したら、通常どおり細胞をトリプシン処理し、希釈した。ＲＴ−ＰＣＲ分析に用いるために、細胞を９６−ウェルプレート（ファルコン−プライマリア＃３８７２）に、７０００細胞／ウェルの密度で播種した。
ノーザンブロットまたはその他の分析のために、細胞を１００ｍｍまたはその他の標準的な組織培養プレートに播種し、適量の培地とオリゴヌクレオチドを用いて同様に処理した。
【０１５６】
ＬＡ４細胞：
マウス肺上皮細胞系ＬＡ４は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（マナ
サス，バージニア州）から購入した。１５％ウシ胎仔血清（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）を添加したＦ１２Ｋ培地（ギブコ／ライフテクノロジーズ，ゲーサーズバーグ，メリーランド州）で、ＬＡ４細胞を通常どおり培養した。細胞が９０％密度に達したら、通常どおり細胞をトリプシン処理し、希釈した。ＲＴ−ＰＣＲ分析で用いるために、細胞を９６−ウェルプレート（ファルコン−プライマリア＃３８７２）に３０００〜６０００細胞／ウェルの密度で播種した。
ノーザンブロットまたはその他の分析のために、細胞を１００ｍｍまたはその他の標準的な組織培養プレートに播種し、適量の培地とオリゴヌクレオチドを用いて同様に処理した。
【０１５７】
アンチセンス化合物での処理：
細胞が８０％密度に達したら、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。９６−ウェルプレートで培養した細胞について、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭTM−１血清使用量低減培地（ギブコＢＲＬ）で１回洗浄し、３.７５μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM（ギブコＢＲＬ）と望ましい濃度のオリゴヌクレオチドを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭTM
−１（１３０μＬ）で処理した。処理して４〜７時間後、培地を新しい培地で置換した。オリゴヌクレオチド処理の１６〜２４時間後に細胞を回収した。
細胞系によって様々なオリゴヌクレオチド濃度を用いた。特定の細胞系に最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を一連の濃度のポジティブコントロールオリゴヌクレオチドで処理した。８０％阻害が達成されない場合、Ｈ−ｒａｓまたはｃ−ｒａｆ
ｍＲＮＡが６０％阻害されるポジティブコントロールオリゴヌクレオチドの最低濃度が
、その細胞系の次の実験でのオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用された。６０％阻害が達成されない場合、その細胞系は、オリゴヌクレオチドのトランスフェクション実験に不適切と考えられる。
【０１５８】
実施例１０
ＧＲ発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
ＧＲ発現のアンチセンス調節は、当業界で既知の様々な方法で分析することができる。例えば、ＧＲｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）で定量することができる。現在、リアルタイム定量ＰＣＲが好ましい。ＲＮＡ分析は、トータル細胞性ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行うことができる。ＲＮＡの単離方法は、例えば、Ausubel，F.M．等，Current Protocols in Molecular Biology，第1巻，4.1.1〜4.2.9頁および4.5.1〜4.5.3頁，ジョン・ワイリー＆サンズ社，1993年で教示されている。ノーザンブロット分析は、当業界で慣用的であり、例えば、Ausubel，F.M．等，Current Protocols in Molecular Biology，第1巻，4.2.1〜4.2.9頁，ジョン・ワイリー＆サンズ社，1996年で教示されている。リアルタイム定量（ＰＣＲ）は、市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM ７７００配列検出システム（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州より入手可能）を、製造元の説明書に従って用いてうまく達成できる。定量ＰＣＲ分析の前に、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブセットを、それらがＧＡＰＤＨ増幅反応で「マルチプレックス(multiplex)」化される能力について評価する。マルチプレックス化において、標的遺伝子と、内部の標準的な遺伝子ＧＡＰＤＨはいずれも１つのサンプル中で同時に増幅される。この分析において、未処理細胞から単離されたｍＲＮＡは、連続的に希釈される。それぞれの希釈物を、ＧＡＰＤＨのみ、標的遺伝子のみ（「シングルプレックス」）、または、両方（マルチプレックス）に特異的なプライマー−プローブセットの存在下で増幅する。ＰＣＲ増幅の後、シングルプレックスサンプルとマルチプレックスサンプルの両方から、希釈の関数としてＧＡＰＤＨと標的ｍＲＮＡシグナルの標準曲線を作製する。マルチプレックスサンプルから得られたＧＡＰＤＨシグナルと標的シグナルの傾きと相関係数がいずれも、シングルプレックスサンプルから得られた対応する値１０％の範囲内であれば、その標的に特異的なプライマー−プローブセットは、マルチプレックス可能と考えられる。その他のＰＣＲ方法も当業界で既知である。
【０１５９】
ＧＲのタンパク質レベルは、当業界で周知の様々な方法、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット分析（免疫ブロット）、ＥＬＩＳＡ、または、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）で定量することができる。ＧＲに向けられた抗体は、様々な源、例えば抗体のＭＳＲＳカタログ（エアリー社（Aerie Corporation），バーミンガム，ミシガン州）から確認および入手が可能であり、または、従来の抗体生成方法で製造してもよい。ポリクローナル抗血清の製造方法は、例えば、Ausubel，F.M．等，Current Protocols in Molecular Biology，第2巻，11.12.1〜11.12.9頁，ジョン・ワイリー＆サンズ社，1997年で教示されている。モノクローナル抗体の製造は、例えば、Ausubel，F.M．等，Current Protocols in Molecular Biology，第2巻，11.4.1〜11.11.5頁，ジョン・ワイリー＆サンズ社，1997年で教示されている。
【０１６０】
免疫沈降法は、当業界で標準的な方法であり、例えば、Ausubel，F.M．等，Current Protocols in Molecular Biology，第2巻，10.16.1〜10.16.11頁，ジョン・ワイリー＆サンズ社，１９９８年で見出すことができる。ウェスタンブロット（免疫ブロット）分析は、当業界で標準的な方法であり、例えば、Ausubel，F.M．等，Current Protocols in Molecular Biology，第2巻，10.8.1〜10.8.21頁，ジョン・ワイリー＆サンズ社，1997年で見出すことができる。酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）は、当業界で標準的な方法であり、例えば、Ausubel，F.M．等，Current Protocols in Molecular Biology，第2巻，11.2.1〜11.2.22頁，ジョン・ワイリー＆サンズ社，1991年で見出すことができる。
【０１６１】
実施例１１
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、Miura等，Clin．Chem.，1996年，42，1758-1764に従って単
離される。その他のポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離方法は、例えば、Ausubel，F.M．等，Current Protocols in Molecular Biology，第1巻，4.5.1〜4.5.3頁，ジョン・ワイリー＆サンズ社，1993年で教示されている。簡単に言えば、９６−ウェルプレートでの細胞培養について、細胞から成長培地を除去し、各ウェルを冷ＰＢＳ（２００μＬ）で洗浄した。６０μＬのリシス緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７.６，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０.５Ｍ ＮａＣｌ，０.５％ＮＰ−４０，２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体）を、各ウェルに加え、プレートを穏かに撹拌し、室温で５分間インキュベートした。溶解産物（５５μＬ）を、オリゴｄ（Ｔ）でコーティングした９６−ウェルプレート（ＡＧＣＴ社，アーバイン，カリフォルニア州）に移した。プレートを室温で６０分間インキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７.６，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０.３Ｍ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートをペーパータオルにブロットして過量の洗浄緩衝液を除去し、５分間風乾した。７０℃に加熱した６０ｐＬの溶出緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７.６）を各ウェルに加え、プレートを９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートし、溶出物を新しい９６−ウェルプレートに移した。
１００ｍｍのプレートまたはその他の標準的なプレートで培養した細胞を、全ての溶液を適量で用いて同様に処理することができる。
【０１６２】
実施例１２
トータルＲＮＡの単離
キアゲン社（バレンシア，カリフォルニア州）から購入したＲＮＥＡＳＹ９６TMキットと緩衝液を、製造元が推奨する方法に従って用いて、トータルｍＲＮＡを単離した。簡単に言えば、９６−ウェルプレートで培養した細胞について、細胞から成長培地を除去し、各ウェルを冷ＰＢＳ（２００μＬ）で洗浄した。緩衝液ＲＬＴ（１００μＬ）を各ウェルに加え、プレートを徹底的に２０秒撹拌した。次に、７０％エタノール（１００μＬ）を
各ウェルに加え、ピペッティングで３回上下させて内容物を混合した。次に、廃物回収トレイを有するＱＩＡＶＡＣTMマニホールドおよび真空供給源に取り付けたＲＮＥＡＳＹ９６TMウェルプレートにサンプルを移した。１５秒間真空化された。緩衝液ＲＷ１（１ｍＬ）をＲＮＥＡＳＹ９６TMプレートの各ウェルに加え、再び１５秒間真空化した。次に、緩衝液ＲＰＥ（１ｍＬ）をＲＮＥＡＳＹ９６TMプレートの各ウェルに加え、１５秒間真空化した。次に、緩衝液ＲＰＥでの洗浄を繰り返し、さらに１０分間真空化した。次に、プレートをＱＩＡＶＡＣTMマニホールドから取り出し、ペーパータオルにブロットして乾燥させた。次に、１.２ｍＬ回収チューブを含む回収チューブラックを備えたＱＩＡＶＡＣTMマニホールドにプレートを再装着した。次に、ピペットで水（６０μＬ）を各ウェルに入れてＲＮＡを溶出させ、１分間インキュベートし、３０秒間真空化した。さらに水（６０μＬ）を用いて溶出工程を繰り返した。
繰り返しのピペッティングと溶出工程は、キアゲンのバイオ・ロボット（BiO-Robot）
９６０４（キアゲン社，バレンシア，カリフォルニア州）を用いて自動化してもよい。実質的に、培養プレート上の細胞が溶解した後、プレートをロボットデッキにに移し、そこでピペッティング、ＤＮアーゼ処理、および、溶出工程が行われる。
【０１６３】
実施例１３
ＧＲのｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析
ＧＲのｍＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM ７７００配列検出システム（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州）を製造元の説明書に従って用いて、リアルタイム定量ＰＣＲにより測定された。これは、密閉管の、ゲルベースではない蛍光検出システムであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物のリアルタイムでのハイスループットの定量が可能である。ＰＣＲ完了後に増幅産物が定量される標準的なＰＣＲとは対照的に、リアルタイム定量ＰＣＲ産物は、それらが蓄積されると定量される。これは、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマー間で特異的にアニールし、２種の蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応液に含ませることによって達成される。レポーター色素（例えば、ＪＯＥ、ＦＡＭ、または、ＶＩＣ；オペロン・テクノロジーズ社（Operon Technologies Inc.），アラメダ，カリフォルニア州、または、ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州のいずれかから購入）は、プローブの５′末端に付着しており、クエンチャー色素（例えば、ＴＡＭＲＡ；オペロン・テクノロジーズ社，アラメダ，カリフォルニア州、または、ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州のいずれかから購入）は、プローブの３′末端に付着している。プローブと色素がそのままである場合、レポーター色素の発色は、３′クエンチャー色素に接近することによって消される。増幅中、プローブと標的配列とがアニールして基質を形成し、この基質は、Ｔａｑポリメラーゼの５′−エキソヌクレアーゼ活性により切断され得る。ＰＣＲ増幅サイクルの伸長段階で、Ｔａｑポリメラーゼによりプローブが切断されることによって、残留したプローブから（すなわちクエンチャー成分から）レポーター色素が放出され、および、配列特異的な蛍光シグナルが生成する。各サイクルに伴い、さらなるレポーター色素分子がそれらのそれぞれのプローブから切断され、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM ７７００配列検出システムに設置されたレーザー光学装置で蛍光強度が規則的なインターバルでモニターされる。それぞれの分析において、未処理のコントロールサンプルからの一連のｍＲＮＡの希釈物を含む、一連のパラレル反応液から、標準曲線を作製、これを用いて、試験サンプルのをアンチセンスオリゴヌクレオチド処理した後の％阻害を定量することができる。
【０１６４】
ＰＣＲ試薬は、ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州から購入した。２５μＬのＰＣＲカクテル（１×ＴＡＱＭＡＮTM緩衝液Ａ、５.
５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、それぞれ１００ｎＭのフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブ、２０ユニットのＲＮアーゼ阻害剤、１.２５ユニットのＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤT
M、ならびに、１２.５ユニットのＭｕＬＶ逆転写酵素）を、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液（２５μＬ）を含む９６ウェルプレートに加えることによってＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。４８℃で３０分間インキュベートすることによりＲＴ反応を行った。９５℃で１０分間インキュベートしてＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤＴＭを活性化した後、２段階ＰＣＲプロトコルを４０サイクル行った：９５℃で１５秒（変性）、続いて６０℃で１.５分間（アニール／伸長）。
【０１６５】
ヒトＧＲに対するプローブおよびプライマーを、図１に記載のヒトＧＲ配列にハイブリダイズするように公開された配列情報（GenBank寄託番号NM_000176，本発明に含む）を用いて設計した。ヒトＧＲのためのＰＣＲプライマーは、以下の通り：
フォワードプライマー：ＡＧＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＧＴＣＣＴＡＡＣＴ（配列番号４７７４）
リバースプライマー；ＴＡＧＴＣＴＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡ（配列番号４７７５）、および
ＰＣＲプローブは以下の通り：
ＦＡＭ−ＡＧＣＡＣＣＴＡＧＴＣＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＴＡＡＡ−ＴＡＭＰＡ（配列番号４７７６）、
ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州）は、蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州）は、クエンチャー色素である。ヒトシクロフィリンのためのＰＣＲプライマーは、以下の通り：
フォワードプライマー：ＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＴ（配列番号４７７７）
リバースプライマー：ＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＡＣＣＴＴ（配列番号４７７８）、および
ＰＣＲプローブは以下の通り：
ＪＯＥ−ＣＧＣＧＴＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＣＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号４７７９）、
ここで、ＪＯＥ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州）は、蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州）は、クエンチャー色素である。
【０１６６】
マウスＧＲに対するプローブおよびプライマーを、図２に記載のマウスＧＲ配列にハイブリダイズするように公開された配列情報（GenBank NM_008173、本発明に含む）を用い
て設計した。マウスＧＲのＰＣＲプライマーは、以下の通り：
フォワードプライマー：ＣＧＧＧＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＡＣ（配列番号４７８０）
リバースプライマー：ＧＣＡＣＣＣＣＡＴＡＡＴＧＧＣＡＴＡＣＣ（配列番号４７８１）、および
ＰＣＲプローブは以下の通り：
ＦＡＭ−ＴＧＣＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣ−ＴＡＭＰＡ（配列番号４７８２）、
ここで、ＦＡＭ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州）は、蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡ（ＰＥアプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州）は、クエンチャー色素である。マウスシクロフィリンのＰＣＲプライマーは、以下の通り：
フォワードプライマー：ＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＴ（配列番号４７８３）
リバースプライマー：ＴＴＧＴＧＴＴＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＴＴＴＧ（配列番号４７８４）、および
ＰＣＲプローブは以下の通り：
ＪＯＥ−ＡＡＧＣＡＴＡＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＴＣＣＡＴ−ＴＡＭＲＡ（配列番号４７８５）、
ここでＪＯＥ（ＰＥ−アプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州）は、蛍光レポーター色素であり、および、ＴＡＭＲＡ（ＰＥアプライド・バイオシステムズ，フォスターシティー，カリフォルニア州）は、クエンチャー色素である。
【０１６７】
実施例１４
２′−ＭＯＥウィングとデオキシギャップとを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトＧＲ発現のアンチセンス阻害
本発明において、一連のオリゴヌクレオチドが、ヒトＧＲのＲＮＡの様々な領域を標的化するように公開された配列（GenBank寄託番号NM_000176.1）を用いて設計された。そのオリゴヌクレオチドを表１に示す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列の最初の（５′の最も端の）ヌクレオチド番号を示す。各オリゴについて示されたパラメーターは、David H．Mathews，Michael Zuker、および、Douglas H．TurnerによるＲＮＡストラクチャー３.７（RNAstructure３.７）を用いて推測された。ＲＮＡストラクチャーは、ターナーラボ（Turner Lab）のホームページ（http://ma.chem.rochester.edu）で利用可能である。その他のアルゴリズムの最新の実施は、mfoldであり、ワールドワイドウェブのMichael Zukerのホームページ（http://bioinfo.math.rpi.edu/~zukerm/）で利用可能である。ＲＮＡフォールディングのアルゴリズムは、以下の研究に基づいている：D.H．Mathews等，Journal of Molecular Biology，288，911〜940,（1999年）。オリゴウォーク（OligoWalk）は、以下の研究に基づいている：D.H．Mathews．等，RNA，5，1458〜1469（1999年）。Dynalignアルゴリズムは、以下の研究に基づいている：D.H．MathewsおよびD.H．Turner，Journal of Molecular Biology 317（2），191〜203（2002年）。ミックス＆マッチ（mix & match）アルゴリズムは、以下の研究に基づいている：D.H．Mathews等，RNA，3，1〜16，(1997年）。フォールディングに関するＤＮＡパラメーターは、以下に基づく：J．SantaLucia，Jr.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 95，1460〜1465，(1998年）。オリゴウォークでのＤＮＡオリゴマーは、N．Sugimoto等．Biochemistry，34，11211〜11216（1995年）のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖パラメーターを用いる。
【０１６８】
オリゴは、メッセンジャーＲＮＡの推測された二次構造を阻止するオリゴの推測された自由エネルギーによって選別された。表１に記載の全ての化合物は、２０個のヌクレオチド長さのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、これらは、１０個の２′デオキシヌクレオチドからなる中央の「ギャップ」領域で構成されており、両側に（５′、および、３′方向）４個のヌクレオチドの「ウィング」を有する。ウィングは、２′−メトキシシエチル（２′−ＭＯＥ）ヌクレオチドで構成される。ヌクレオシド間（主鎖）結合は、オリゴヌクレオチド全てに関してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。２′−ＭＯＥウィングのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０１６９】
【表１】
2005525829.tif 000002
【０１７０】
【表２】
2005525829.tif 000003
【０１７１】
【表３】
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【０１７２】
【表４】
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【０１７３】
【表５】
2005525829.tif 000006
【０１７４】
【表６】
2005525829.tif 000007
【０１７５】
【表７】
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【０１７６】
【表８】
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【０１７７】
【表９】
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【０１７８】
【表１０】
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【０１７９】
【表１１】
2005525829.tif 000012
【０１８０】
【表１２】
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【０１８１】
【表１３】
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【０１８２】
【表１４】
2005525829.tif 000015
【０１８３】
【表１５】
2005525829.tif 000016
【０１８４】
【表１６】
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【０１８５】
【表１７】
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【０１８６】
【表１８】
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【０１８７】
【表１９】
2005525829.tif 000020
【０１８８】
【表２０】
2005525829.tif 000021
【０１８９】
【表２１】
2005525829.tif 000022
【０１９０】
【表２２】
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【０１９１】
【表２３】
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【０１９２】
【表２４】
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【０１９３】
【表２５】
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【０１９４】
【表２６】
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【０１９５】
【表２７】
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【０１９６】
【表２８】
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【０１９７】
【表２９】
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【０１９８】
【表３０】
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【０１９９】
【表３１】
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【０２００】
【表３２】
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【０２０１】
【表３３】
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【０２０２】
【表３４】
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【０２０３】
【表３５】
2005525829.tif 000036
【０２０４】
【表３６】
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【０２０５】
【表３７】
2005525829.tif 000038
【０２０６】
【表３８】
2005525829.tif 000039
【０２０７】
【表３９】
2005525829.tif 000040
【０２０８】
【表４０】
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【０２０９】
【表４１】
2005525829.tif 000042
【０２１０】
【表４２】
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【０２１１】
【表４３】
2005525829.tif 000044
【０２１２】
【表４４】
2005525829.tif 000045
【０２１３】
【表４５】
2005525829.tif 000046
【０２１４】
【表４６】
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【０２１５】
【表４７】
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【０２１６】
【表４８】
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【０２１７】
【表４９】
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【０２１８】
【表５０】
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【０２１９】
【表５１】
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【０２２０】
【表５２】
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【０２２１】
【表５３】
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【０２２２】
【表５４】
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【０２２３】
【表５５】
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【０２２４】
【表５６】
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【０２２５】
【表５７】
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【０２２６】
【表５８】
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【０２２７】
【表５９】
2005525829.tif 000060
【０２２８】
【表６０】
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【０２２９】
【表６１】
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【０２３０】
【表６２】
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【０２３１】
【表６３】
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【０２３２】
【表６４】
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【０２３３】
【表６５】
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【０２３４】
【表６６】
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【０２３５】
【表６７】
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【０２３６】
【表６８】
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【０２３７】
【表６９】
2005525829.tif 000070
【０２３８】
【表７０】
2005525829.tif 000071
【０２３９】
【表７１】
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【０２４０】
【表７２】
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【０２４１】
【表７３】
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【０２４２】
【表７４】
2005525829.tif 000075
【０２４３】
【表７５】
2005525829.tif 000076
【０２４４】
【表７６】
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【０２４５】
【表７７】
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【０２４６】
【表７８】
2005525829.tif 000079
【０２４７】
【表７９】
2005525829.tif 000080
【０２４８】
【表８０】
2005525829.tif 000081
【０２４９】
【表８１】
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【０２５０】
【表８２】
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【０２５１】
【表８３】
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【０２５２】
【表８４】
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【０２５３】
【表８５】
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【０２５４】
【表８６】
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【０２５５】
【表８７】
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【０２５６】
【表８８】
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【０２５７】
【表８９】
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【０２５８】
【表９０】
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【０２５９】
【表９１】
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【０２６０】
【表９２】
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【０２６１】
【表９３】
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【０２６２】
【表９４】
2005525829.tif 000095
【０２６３】
【表９５】
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【０２６４】
【表９６】
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【０２６５】
【表９７】
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【０２６６】
【表９８】
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【０２６７】
【表９９】
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【０２６８】
【表１００】
2005525829.tif 000101
【０２６９】
【表１０１】
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【０２７０】
【表１０２】
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【０２７１】
【表１０３】
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【０２７２】
【表１０４】
2005525829.tif 000105
【０２７３】
【表１０５】
2005525829.tif 000106
【０２７４】
【表１０６】
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【０２７５】
【表１０７】
2005525829.tif 000108
【０２７６】
【表１０８】
2005525829.tif 000109
【０２７７】
【表１０９】
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【０２７８】
【表１１０】
2005525829.tif 000111
【０２７９】
【表１１１】
2005525829.tif 000112
【０２８０】
【表１１２】
2005525829.tif 000113
【０２８１】
【表１１３】
2005525829.tif 000114
【０２８２】
【表１１４】
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【０２８３】
【表１１５】
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【０２８４】
【表１１６】
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【０２８５】
【表１１７】
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【０２８６】
【表１１８】
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【０２８７】
【表１１９】
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【０２８８】
【表１２０】
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【０２８９】
【表１２１】
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【０２９０】
【表１２２】
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【０２９１】
【表１２３】
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【０２９２】
【表１２４】
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【０２９３】
【表１２５】
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【０２９４】
【表１２６】
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【０２９５】
【表１２７】
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【０２９６】
【表１２８】
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【０２９７】
【表１２９】
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【０２９８】
【表１３０】
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【０２９９】
【表１３１】
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【０３００】
【表１３２】
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【０３０１】
【表１３３】
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【０３０２】
【表１３４】
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【０３０３】
【表１３５】
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【０３０４】
【表１３６】
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【０３０５】
【表１３７】
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【０３０６】
【表１３８】
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【０３０７】
【表１３９】
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【０３０８】
【表１４０】
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【０３０９】
【表１４１】
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【０３１０】
【表１４２】
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【０３１１】
【表１４３】
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【０３１２】
【表１４４】
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【０３１３】
【表１４５】
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【０３１４】
【表１４６】
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【０３１５】
【表１４７】
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【０３１６】
【表１４８】
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【０３１７】
【表１４９】
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【０３１８】
【表１５０】
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【０３１９】
【表１５１】
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【０３２０】
【表１５２】
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【０３２１】
【表１５３】
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【０３２２】
【表１５４】
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【０３２３】
【表１５５】
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【０３２４】
【表１５６】
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【０３２５】
【表１５７】
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【０３２６】
【表１５８】
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【０３２７】
【表１５９】
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【０３２８】
【表１６０】
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【０３２９】
【表１６１】
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【０３３０】
【表１６２】
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【０３３１】
【表１６３】
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【０３３２】
【表１６４】
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【０３３３】
【表１６５】
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【０３３４】
【表１６６】
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【０３３５】
【表１６７】
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【０３３６】
【表１６８】
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【０３３７】
【表１６９】
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【０３３８】
【表１７０】
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【０３３９】
【表１７１】
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【０３４０】
【表１７２】
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【０３４１】
【表１７３】
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【０３４２】
【表１７４】
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【０３４３】
【表１７５】
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【０３４４】
【表１７６】
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【０３４５】
【表１７７】
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【０３４６】
【表１７８】
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【０３４７】
【表１７９】
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【０３４８】
【表１８０】
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【０３４９】
【表１８１】
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【０３５０】
【表１８２】
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【０３５１】
【表１８３】
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【０３５２】
【表１８４】
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【０３５３】
実施例１５
ＧＲタンパク質レベルのウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析（免疫ブロット分析）を標準的な方法を用いて行った。オリゴヌクレオチド処理して１６〜２０時間後に細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、レムリー緩衝液（１００μｌ／ウェル）に懸濁し、５分間煮沸し、および、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲルを１５０Ｖで１.５時間泳動し、ウェスタンブロット用メンブレンに移した。ＧＲに向けられた適切な一次抗体を、一次抗体種に対して向けられた放射標識または蛍光標識した二次抗体と共に用いた。PHOSPHORIMAGERTM（モレキュラー・ダイナミックス，サニーベール，カリフォルニア州）を用いてバンドを可視化した。
【図面の簡単な説明】
【０３５４】
【図１】ヒト糖質コルチコイド受容体のｃＤＮＡ配列と、コードされたタンパク質配列を示す。
【図２】マウス糖質コルチコイド受容体のｃＤＮＡ配列と、コードされたタンパク質配列を示す。
【図１】
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【図１】
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【図１】
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【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005525829.tif 000194
2005525829.tif 000195