(57)【要約】本発明は、ランダムなフラグメント化によってＤＮＡ分子または複数のＤＮＡ分子を調製するための方法に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、ランダムなフラグメント化によるＤＮＡ配列決定のためのテンプレートの調製に関する。特定の実施形態において、ランダムなフラグメント化は、化学的なフラグメント化、機械的なフラグメント化もしくは酵素学的なフラグメント化を包含する。さらに特定の実施形態において、万能配列は、例えば、アダプター配列の連結により、もしくはターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いたホモポリマーテーリングにより、ＤＮＡフラグメントの３’末端に結合される。他の実施形態において、ライブラリーは、本発明の方法を用いて調製される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ分子を調製する方法であって、該方法は、以下；
ＤＮＡ分子を得る工程；
該ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化し、ＤＮＡフラグメントを生成する工程；
複数の前記ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に公知である配列を有するプライマーを結合し、プライマー連結フラグメントを生成する工程；および
複数の該プライマー連結フラグメントを増幅する工程、
を包含する、
方法。
【請求項２】
前記複数のプライマー連結フラグメントを同時に配列決定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、機械的フラグメント化による、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡの前記機械的フラグメント化が、水力学的剪断、超音波処理もしくは噴霧化による、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、化学的フラグメント化による、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化学的フラグメント化が、酸性触媒の加水分解、アルカリ性触媒の加水分解、金属イオンによる触媒、ヒドロキシラジカル、照射もしくは加熱による、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化学的フラグメント化が、加熱による、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記加熱が、約４０℃〜１２０℃の温度で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記加熱が、約８０℃〜１００℃の温度で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記加熱が、約９０℃〜１００℃の温度で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記加熱が、約９２℃〜９８℃の温度で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記加熱が、約９３℃〜９７℃の温度で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記加熱が、約９４℃〜９６℃の温度で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記加熱は、約９５℃の温度で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ分子の前記加熱が、０から約１００ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記加熱が、約０から約１０ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
前記加熱が、約０．１から約１ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記加熱が、約０．１から約０．５ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
前記加熱が、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液中で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
前記加熱は、水の溶液中で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、酵素的フラグメント化による、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵素的フラグメント化が、ＤＮＡｓｅＩを用いた消化を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡｓｅＩ消化が、Ｍｇ２＋イオン存在下で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｍｇ２＋の濃度が、約１ｍＭから約１０ｍＭで行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡｓｅＩ消化は、Ｍｎ２＋イオン存在下で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｍｎ２＋の濃度は、約１ｍＭから約１０ｍＭで行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プライマーが、少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に実質的に公知である配列を有するプライマーの前記結合が、該ＤＮＡフラグメントのホモポリマー伸長の作製を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ホモポリマー伸長が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより作製される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ホモポリマー伸長が、ポリＧ路を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に実質的に公知である配列の前記結合は、ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端へのアダプター分子の連結を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記アダプターが、少なくとも一つ平滑末端を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アダプターが、一本鎖領域を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法は、さらに、前記ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの平滑末端の作製を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記平滑末端が、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウまたはその組み合わせにより作製される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＤＮＡ分子のライブラリーを調製する方法であって、該方法は、以下；
複数のＤＮＡ分子を得る工程；
少なくとも一つの前記ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化し、ＤＮＡフラグメントを生成する工程；
複数の前記ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に公知である配列を有するプライマーを結合し、プライマー連結フラグメントを生成する工程；および
複数の前記プライマー連結フラグメントを増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記複数のプライマー連結フラグメントを同時に配列決定することをさらに包含する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、機械的フラグメント化による、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＮＡの前記機械的フラグメント化が、水力学的剪断、超音波処理もしくは噴霧化による、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、化学的フラグメント化による、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記化学的フラグメント化が、酸性触媒の加水分解、アルカリ性触媒の加水分解、金属イオンまたは複合体による触媒、ヒドロキシラジカル、照射あるいは加熱による、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記化学的フラグメント化が、加熱による、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記加熱が、約４０℃〜１２０℃の温度で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記加熱が、約８０℃〜１００℃の温度で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記加熱が、約９０℃〜１００℃の温度で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記加熱が、約９２℃〜９８℃の温度で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記加熱が、約９３℃〜９７℃の温度で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記加熱が、約９４℃〜９６℃の温度で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記加熱が、約９５℃の温度で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＤＮＡ分子の前記加熱が、０から約１００ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記加熱が、約０〜約１０ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記加熱が、約０．１〜約１ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記加熱が、約０．１〜約０．５ｍＭの濃度の塩を有する溶液中で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
前記加熱は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液中で行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記加熱が、水の溶液中である、請求項５に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ分子の前記ランダムフラグメント化が、酵素的フラグメント化による、請求項３６に記載の方法。
【請求項５７】
前記酵素的フラグメント化が、ＤＮＡｓｅＩを用いた消化を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤＮＡｓｅＩ消化が、Ｍｇ２＋イオン存在下で行われる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＤＮＡｓｅＩ消化が、Ｍｎ２＋イオン存在下で行われる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記プライマーが、少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に結合される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に実質的に公知である配列を有するプライマーの前記結合が、該ＤＮＡフラグメントのホモポリマー伸長の作製を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記ホモポリマー伸長が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより作製される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ホモポリマー伸長が、ポリＧ路を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に実質的に公知である配列を有するプライマーの前記結合、ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端にアダプター分子の連結を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６５】
前記アダプターが、少なくとも一つ平滑末端を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記アダプターが、一本鎖領域を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記方法が、前記ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの平滑末端の作製をさらに包含する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記平滑末端は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウまたはその組み合わせにより作製される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項３６の方法により作製されたライブラリー。
【請求項７０】
ＤＮＡテンプレートのライブラリーを作製する方法であって、該方法は、以下；
複数のＤＮＡ分子を得る工程；
前記複数のＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化し、ＤＮＡフラグメントを生成する工程；
複数の前記ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に公知である配列を有する第１プライマーを結合し、プライマー連結フラグメントを生成する工程；および
複数の前記プライマー連結フラグメントを増幅する、
を包含する、方法であって、
ここで、該増幅する工程は、以下：
前記ＤＮＡフラグメント中の公知である配列に相補的な第２プライマー；および
前記第１プライマーに相補的な第３プライマー
を使用する、
方法。
【請求項７１】
前記ＤＮＡフラグメントにおいて前記既知配列に相補的な第４プライマーを用いて、該複数のＤＮＡフラグメントを同時に配列決定する工程をさらに包含する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記第４プライマーは、前記第２プライマーである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
請求項７０に記載の方法により作製された、ライブラリー
【請求項７４】
複数のＤＮＡフラグメントを同時に配列決定する方法であって、該方法は、以下；
複数のＤＮＡ分子を得る工程；
該ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して、重複配列を有する複数のＤＮＡフラグメントを作製する工程；
該複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に既知配列を有する第１プライマーを結合して、プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
複数の前記プライマー結合フラグメントを増幅する工程であって、ここで、該増幅は、以下：
該ＤＮＡフラグメントにおいて既知配列に相補的な第２プライマー；および
該第１プライマーに相補的な第３プライマー、
を利用する工程；および
該ＤＮＡフラグメントにおいて該既知配列に相補的な第４プライマーを用いて、該複数のＤＮＡフラグメントを配列決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７５】
前記第４プライマーは、前記第２プライマーである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
核酸配列の一連の連続重複を配列決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
重複配列を有する複数のＤＮＡ分子を得る工程；
前記複数のＤＮＡ分子において既知配列に相補的なプライマーを用いて、該複数のＤＮＡ分子の第１領域を同時に配列決定する工程；および
該第１領域配列決定する工程から決定された配列に相補的なプライマーを用いて、該複数のＤＮＡ分子の第２領域を同時に配列決定する工程、
を包含し、ここで該核酸配列の一連の重複における領域の前記次の連続配列決定は、先の重複配列決定産物で得た配列から配列決定を開始することにより生成される工程、
を包含する、方法。
【請求項７７】
請求項７６に記載の方法であって、前記得る工程は、少なくとも一つの親ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して、重複配列を有する複数のＤＮＡフラグメントを作製する工程；
該複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に実質的に既知配列を有する第１プライマーを結合して、プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
該複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程であって、該増幅は、以下：
該ＤＮＡフラグメントにおいて既知配列に相補的な第２プライマー；および
該第１プライマーに相補的な第３プライマー
を利用する工程、としてさらに規定される、方法。
【請求項７８】
複数のＤＮＡ分子を配列決定する方法であって、該方法は、以下：
親ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化することによって前記複数のＤＮＡ分子を得る工程；
該複数の分子における既知配列に相補的なプライマーを用いて、該複数のＤＮＡ分子を同時に配列決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７９】
前記方法は、前記複数のＤＮＡ分子の増幅をさらに包含する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記増幅は、以下：
前記複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に実質的に既知配列を有する第１プライマーを結合して、プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
該複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程であって、該増幅は、以下：
該ＤＮＡフラグメントにおける既知配列に相補的な第２プライマー；および
該第１プライマーに相補的な第３プライマー、
を利用する、工程、としてさらに規定される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記分子において二次構造を生成する配列を有するＤＮＡ分子を調製する方法であって、該方法は、以下：
該配列を有するＤＮＡ分子を得る工程；
該ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して、複数のＤＮＡフラグメントを生成する工程であって、該複数のＤＮＡフラグメントは、該二次構造を生成する一部もしくは全ての配列を有するＤＮＡフラグメントを含む、工程；
該複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に実質的に既知配列を有するプライマーを結合して、プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
該複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項８２】
前記複数のプライマー結合フラグメントを同時に配列決定する工程をさらに包含する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記複数のＤＮＡフラグメントは、前記二次構造を作製する配列を有さないＤＮＡフラグメントをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記二次構造は、ヘアピン、ＧＧＧＧもしくは三重らせんである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記得られたＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８６】
ＤＮＡ分子の３’末端を条件付けする方法であって、該３’末端をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに暴露する工程を包含する、方法。
【請求項８７】
前記ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を含むようにさらに規定される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記暴露工程は、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を提供する工程をさらに包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
ＤＮＡ分子の末端に３’エキソヌクレアーゼ活性を提供する方法であって、該分子の末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを導入する工程を包含する、方法。
【請求項９０】
前記導入工程は、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を提供する工程をさらに包含する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
プローブを調製する方法であって、該方法は、以下：
少なくとも一つのＤＮＡ分子を得る工程；
該ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して、ＤＮＡフラグメントを生成する工程；
該複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に実質的に既知配列を有する標識化プライマーを結合して、標識化プライマー結合フラグメントを生成する工程；および
該複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程、
を包含する、方法。
【請求項９２】
前記標識化プライマーの結合工程は、前記ＤＮＡフラグメントのホモポリマー伸長の生成を包含し、該伸長は該標識を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ホモポリマー伸長は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより生成される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記標識化プライマーの結合工程は、前記ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端へのアダプター分子の連結を包含し、該アダプター分子は該標識を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記標識は、放射性核種、アフィニティータグ、ハプテン、酵素、発色団、もしくは発蛍光団を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
請求項９１の方法から生成される、標識化プローブ。
【請求項９７】
請求項９１の方法から生成されるプローブを含む、キット。
【請求項９８】
少なくとも一つの一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端を修復する方法であって、該３’末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを提供する工程を包含する、方法。
【請求項９９】
前記提供工程は、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を提供する工程をさらに包含する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
少なくとも一つの一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端を修復するためのキットであって、該キットは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む、キット。
【請求項１０１】
請求項１００に記載のキットであって、該キットは、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を含む、キット。
【請求項１０２】
損傷されたＤＮＡ分子を検出する方法であって、該損傷されたＤＮＡ分子にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、および標識化グアニンリボヌクレオチド、標識化グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその双方を提供する工程を包含する、方法。
【請求項１０３】
前記損傷されたＤＮＡは、ニック、二重鎖切断、もしくは双方を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記提供工程は、前記損傷されたＤＮＡ分子に修復を提供するようにさらに規定される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記標識は、放射性核種、アフィニティータグ、ハプテン、酵素、発色団、もしくは発蛍光団を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記損傷されたＤＮＡは、細胞の外側にある、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記損傷されたＤＮＡは、照射、紫外光、酸素、ラジカル、金属イオン、ヌクレアーゼ、もしくは機械的な力の結果である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記損傷されたＤＮＡは、細胞内にある、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０９】
前記細胞は、アポトーシス細胞である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記損傷されたＤＮＡは、照射、熱、紫外光、酸素、ラジカル、一酸化窒素、カテコールアミン、もしくはヌクレアーゼの結果である、請求項１０８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００１年１１月１３日に出願された米国仮特許出願番号６０／３３８，２２４（本明細書中においてその全体が参考として援用される）に対して優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はゲノム、分子生物学、および配列決定の分野に関する。特に、本発明は、ＤＮＡ分子の調製、配列決定のためのＤＮＡテンプレートの調製およびランダムにフラグメント化したＤＮＡ分子の配列決定の方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ配列決定は、生存システムの遺伝的基礎を理解するために、最も重要な分析手段である。そのプロセスは生物のＤＮＡ分子を構成する４つの主要なヌクレオチド塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）の各々の位置を決定することを包含する。短いＤＮＡの配列は通常、ネスト化されたＤＮＡフラグメントのセット（特有部位で始まり、特定の塩基で構成される複数の位置で終わる）を作製することにより決定される。４つの天然の核酸塩基（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）の各々で終止するそのフラグメントは、その後、特有部位に対する４つの塩基の各々の位置を決定するために、分子サイズに従って分離される。特定の塩基で終止する鎖によるフラグメント長のパターンは「配列決定ラダー」と呼ばれている。ＤＮＡ分子における１実験の結果としての塩基位置の解釈は、「読み取り（ｒｅａｄ）」と呼ばれる。終末ＤＮＡ分子のネスト化セットを作製し分離する異なった方法が存在する（Ａｄａｍｓら、１９９４；Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，１９９８；Ｃａｎｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９９）。
【０００４】
多数の細胞から単離できる任意の特定のＤＮＡ分子の量は通常微量であるので、大部分の適用（配列決定を含む）のために十分なＤＮＡ分子を調製するための唯一の実践的な方法は、インビボまたはインビトロにおいて特異的なＤＮＡ分子を増幅することに関係している。基本的に、分析のためＤＮＡ操作に重要な、６つの一般的方法がある：１）ＤＮＡ特有フラグメントのインビボクローニング；２）ＤＮＡ特有フラグメントのインビトロ増幅；３）ＤＮＡフラグメントライブラリー（混合物）のインビボクローニング；４）ＤＮＡフラグメントのランダムライブラリーのインビトロ調製；５）整列されたＤＮＡライブラリーのインビボクローニング；および６）整列されたＤＮＡライブラリーのインビトロ調製。ＤＮＡの増幅混合物の有益な効果は、分子ライブラリー（現存する方法で分析されるように十分に小さい）を作製することによるＤＮＡの大きな断片（例えば、染色体）の分析を促進することである。例えば、ＤＮＡ配列決定法に供され得る最も大きな分子は、２０００塩基長より小さい。それは、生物の一つの染色体よりも数桁短い。短い分子は分析され得るが、短い分子の分析からの情報をＤＮＡの大きな断片の記載へと組み立てるためにかなりの努力が必要とされる。
【０００５】
（１．特有ＤＮＡのインビボクローニング）
特有配列の供給源のＤＮＡ分子は、それらを他の分子から分離することによって（例えば、電気泳動による）、それらを自律性複製遺伝子エレメントへ連結することによって（例えば、細菌プラスミド）、宿主細胞へ組み換え遺伝子エレメントをトランスフェクションすることによって、および一つのトランスフェクトされた宿主細胞のクローンを増殖して、供給源ＤＮＡと同じ特有配列を有する挿入物を有する遺伝子エレメントの多くのコピーを産生することにより増幅され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。
【０００６】
（２．特有ＤＮＡのインビトロ増幅）
インビトロにおいてＤＮＡを増幅するために設計された多数の方法がある。通常、これらの方法は複雑混合物（例えば、ゲノムＤＮＡまたは人工染色体）からの特有ＤＮＡ分子の調製に使用される。あるいは、分子の制限されたセットは、複雑混合物において配列の部分セットで表されたライブラリーとして調製され得る。これらの増幅方法としてはＰＣＲＴＭ、ローリングサークル増幅および鎖置換が挙げられる（Ｗａｌｋｅｒら，１９９６ａ；Ｗａｌｋｅｒら，１９９６ｂ；米国特許第５，６４８，２１３号；米国特許第６，１２４，１２０号）。
【０００７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）は、二つの既知の配列間のＤＮＡの特定の領域を増幅するために使用され得る（米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｆｒｏｈｍａｎら，１９９５）。ＰＣＲＴＭは供給源（テンプレート）ＤＮＡの変性、増幅領域に隣接する既知の配列への二つのオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション、二つのプライマー部位間に配置されるＤＮＡ領域に相補的な鎖を合成するためにＤＮＡポリメラーゼを使用したプライマー伸長からなるサイクルの反復を包含する。増幅１サイクルの生産物は続くサイクルのための供給源ＤＮＡとして使用されるため、増幅は指数的である。ＰＣＲＴＭは多数の特異的分子を速やかに安価に合成し得る。
【０００８】
ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲＴＭ方法の主要な欠点は、１）二つの隣接基配列についての情報は、プライマーの配列を明確にするために知られていなければならない；２）プライマーの合成は高価である；３）達成される増幅のレベルは、プライマー配列、供給源ＤＮＡ配列および増幅されたＤＮＡ分子量に強く依存している；および４）「ｌｏｎｇ−ｄｉｓｔａｎｃｅ」ＰＣＲＴＭ（Ｃｈｅｎｇ、１９９４）は２０ｋｂもの増幅された分子を提供するが、増幅されたＤＮＡ長は通常５ｋｂ未満に制限されている。
【０００９】
「Ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭ」技術は、一つの既知の配列に隣接した未知のＤＮＡを増幅し得る。これらの技術は４つのカテゴリーに分類される得る：ａ）  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲＴＭ（制限エンドヌクレアーゼで消化することによって通常作製された末端への、万能アダプター配列の付加による促進）、ｂ）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲＴＭ（任意の部位で開始されたプライマー伸長反応による促進）、ｃ）ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲＴＭ（ＤＮＡフラグメントの３’末端に同一ヌクレオチド「末尾」を付加することによる促進）；およびｄ）ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲＴＭ（テンプレート分子の環状化による促進）。これらの技術は、「染色体ウォーキング」と時々呼ばれる過程で、大きい領域に沿った連続した領域を増幅するために使用され得る（Ｈｕｉら、１９９８）。
【００１０】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲＴＭは、多数の形能で実行される。Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら（１９９０）は、制限フラグメント末端付近に位置する既知の配列に直接隣接した、未知のＤＮＡ領域を増幅する基礎的な過程の概要を述べた。Ｒｅｉｌｅｙら  （１９９０）は、特定のプライミング部位を有しない分子の増幅を抑制するため、アダプターと正確に相補的ではないプライマーを使用した。Ｊｏｎｅｓ（１９９３）およびＳｉｅｂｅｒｔ（１９９５；米国特許第５，５６５，３４０号）は、鎖内に「平なべの柄（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）」構造（二つの万能アダプターを有する分子のＰＣＲＴＭ分子を抑制）に形成された長い万能プライマーを使用した。Ａｒｎｏｌｄ（１９９４）は、ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ（片側鎖）ＰＣＲＴＭの特異性を増大させるため、不対中心領域を有する「ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ」プライマーを使用した。ＭａｃｒａｅおよびＢｒｅｎｎｅｒ（１９９４）は、特定の配列およびベクター配列からのネスト化プライマーを用いて、Ｆｕｇｕゲノムクローンライブラリーから短挿入物を増幅した。Ｌｉｎら（１９９５）は、突出した５’末端を有する制限フラグメント末端にアダプターを連結し、また、一つの万能アンカープライマー、およびヒトフラグメント配列を特異的に増幅するための、ネスト化特異的部位プライマーを用いるｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＰＣＲＴＭを使用した。Ｌｉｏら（１９９７）は、ゼブラフィッシュプロモーターを増幅させるため、二つの特異的部位のプライマーおよび二つの万能アダプター（そのうち一つは、非特異的なバックグラウンドを減少させるため、ブロック３’末端を有する）を使用した。Ｄｅｖｏｎら（１９９５）は、ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲＴＭの間、二つの万能配列を用いる非特異的な分子の増幅を減少させるため、特殊な二次構造を有する「ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ−ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ」アダプターを使用した。ＰａｄｅｇｉｍａｓおよびＲｅｉｃｈｅｒｔ（１９９８）は、トウモロコシ配列の特異的な増幅を増大させるため、ホスホロチオエートで遮断したオリゴヌクレオチド、および反応物から非連結および部分的に連結された分子を除去するための、ＰＣＲＴＭ実施前にｅｘｏＩＩＩ消化を使用した。ＺｈａｎｇおよびＧｕｒｒ（２０００）は、真菌ゲノムを６ｋｂまで増幅させるため、ネスト化プライマーを用いて、制限フラグメントのｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ  ＰＣＲＴＭを使用した。大きなアンプリコンは、その後、プライマー伸長を用いて直接的に配列決定がなされた。
【００１１】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲＴＭ産物の特異性を増大させるために、多くの方法は、片方または両方の末端に隣接する特定の配列を選択することにより、増幅プロセスに「指標」を付けるために使用されている（例えば、Ｓｍｉｔｈ，１９９２；Ｕｎｒａｕ，１９９４；Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ，１９９７；米国特許第５，５０８，１６９号）。
【００１２】
Ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭは、特有プライマーおよび非特有プライマーの組み合わせを用いた直接増幅により、達成され得る。ＬｉｕおよびＷｈｉｔｔｉｅｒ（１９９５）は、効率的なＰＣＲ戦略法、ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ（ＴＡＩＬ）−ＰＣＲ（特異的産物および非特異的産物の相対的な増幅効果が熱的にコントロールされ得るように、任意の短変性プライマーとともに、ネスト化配列特異的プライマーを利用した）を開発した。Ｈａｒｒｉｓｏｎら，（１９９７）は、マウス細胞内の導入遺伝子の配列を決定するために、未知配列と相補な変性オリゴヌクレオチドプライマー、および既知の配列と相補な三つのネスト化プライマーを使用し、ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭを実施した。米国特許第５，９９４，０５８号は、特有ＰＣＲＴＭプライマー及び二番目の部分変性ＰＣＲＴＭプライマー（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭを達成するため）の使用を明確に記述している。Ｗｅｂｅｒら，（１９９８）は、既知の配列および頻繁な制限部位に相補的な１−４プライマーからのネスト化プライマーを用い、ゲノムＤＮＡの直接ＰＣＲＴＭを使用した。この方法は、制限消化および制限フラグメント末端へのアダプターの連結を必要とはしていない。
【００１３】
ターミナルトランスフェラーゼは、ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭで使用され得る。ＣｏｒｍａｃｋおよびＳｏｍｓｓｉｃｈ（１９９７）は、ＲＡＧＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｄｓ）と呼ばれる方法ａ）一つ以上の制限酵素を用いたゲノムの制限；ｂ）被制限ＤＮＡの変性；ｃ）ターミナルトランスフェラーゼを用いた３’テールポリチミジンの供給；およびｄ）既知の配列およびアダプターと相補的なネスト化プライマーを用いたＰＣＲＴＭを２回行うこと）を用い、ゲノムＤＮＡフラグメントの末端を増幅し得た。Ｒｕｄｉら，（１９９９）は、ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭａ）テンプレートＤＮＡの変性；ｂ）既知の配列と相補的なプライマーを用いた直線増幅；ｃ）ターミナルトランスフェラーゼによる触媒反応を用い、直線増幅の１本鎖産物の３’末端ポリＣ（テール）付加；およびｄ）既知の配列内における二番目のプライマー、および未知の領域内におけるポリＣテールと相補的なポリＧプライマーを用いた産物のＰＣＲＴＭ増幅により、制限消化の影響を受けない）の一つの方法を用い、細菌における染色体ウォーキングを達成するため、ターミナルトランスフェラーゼを使用した。Ｒｕｄｉ（１９９９）によって増幅された産物は、とても広範囲なサイズ分布を有し、恐らくそれは直線的に増幅されたＤＮＡ分子の長さの広範囲な分布によって引き起こされる。
【００１４】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの１本鎖増幅を達成するために使用され得る。米国特許第６，０２７，９１３号は、ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭが、一つだけ既知の配列を有するＤＮＡ領域を増幅し、配列決定するためにＲＮＡポリメラーゼを用いた転写とどのように組み合わされ得るか示している。
【００１５】
Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲＴＭ（Ｏｃｈｍａｎら、１９８８）は、一つのＤＮＡの知識に基づいてＤＮＡを増幅するための別の方法である。Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲＴＭのためのテンプレートは完全な制限消化により作製された一つのＤＮＡ環状分子であり、それは小さな既知の配列領域および隣接した未知の配列領域を含有する。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲＴＭの間、既知の配列から伸長されたプライマー伸長産物を生じさせるように配向される。この「ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ」ＰＣＲＴＭは、末端において既知の配列を有する、直線ＤＮＡ産物を生じる。
【００１６】
全「ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭ」法の不利益は、ａ）産物の長さは、ＰＣＲＴＭ（通常２ｋｂだが、特別な試薬を用いた場合は５０ｋｂまで）の制限により制限される；ｂ）産物が一つのＤＮＡ分子の１ｋｂよりも長い場合、これらは直接配列決定するにはあまりにも長い；ｃ）ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲＴＭにおいて、万能プライムの部位と特定のプライムの部位との間では、ランダムな距離のため、アンプリコン長は予測し得ず、その結果、ある産物においてあまりにも短くて重要な距離をウォーキングし得なかったり、また、小さいサイズのため優先的に増幅されたり、あまりにも長いため増幅および分析することができないとなる；およびｄ）プライマー伸長産物の終末にポリヌクレオチドを尾部に付加するため、ターミナルトランスフェラーゼを用いる方法において、プライマー伸長率にて配列依存性の相違のため、アンプリコンの長さに大きな不均一性がある。
【００１７】
鎖置換増幅（Ｗａｌｋｅｒら、１９９６ａ；Ｗａｌｋｅｒら、１９９６ｂ；米国特許第５，６４８，２１３号；米国特許第６，１２４，１２０号）は、等温鎖置換反応を用いて、一つまたは多数のＤＮＡフラグメントの末端を増幅する方法である。その方法は、２重鎖ＤＮＡ分子の終末付近にあるニックで開始される。それらは通常、制限酵素によって引き起こされ、テンプレート鎖と相補鎖を置換し得るＤＮＡポリメラーゼによる重合反応が続く。合成される場合、各々の産物鎖のニックによって何度もテンプレートが再利用されることによって、相補鎖の直線増幅が達成される。その産物は、特有部位５’末端および５’末端から多種の距離の３’末端を有する鎖である。鎖置換反応の伸長は、コントロールされておらず、それゆえ産物鎖の長さは均一ではない。鎖置換増幅に使用されたポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性を含有しない。
【００１８】
ローリングサークル増幅（米国特許第５，６４８，２４５号）は、環状テンプレートを用いた鎖置換反応の効果を増大させる方法である。ポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないが、テンプレートの周囲で多様なの連続的なサイクルを引き起こすため、環状テンプレートにおいて多種の情報コピーを作成する。産物の長さは、とても大きく、代表的には、あまりにも大きいため、直接的に配列決定できない。付加増幅は、第２番目の鎖置換プライマーが、テンプレートとして、第１番目の鎖置換産物で使用された反応に付加されるかどうかで達成される。
【００１９】
（３．ランダムライブラリーＤＮＡのインビボクローニング）
ライブラリーは、大きなＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の集合体の全部分を現す、小さなＤＮＡ分子の集合体である（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，１９９８；ＣａｎｔｏｒおよびＳｍｉｔｈ，１９９９）。ライブラリーは分析および調製目的で使用され得る。ゲノムクローンライブラリーは、ゲノムＤＮＡフラグメントを含有した細菌クローンの集合体である。ｃＤＮＡクローンライブラリーは、ｍＲＮＡ分子から得られたクローンの集合体である。
【００２０】
非特異的ＤＮＡクローニングは、分析のため、分離およびＤＮＡ増幅に共通に使用される。全ゲノム、染色体、ウイルスまたは細菌プラスミドからのＤＮＡは、適切な方法によりフラグメント化（例えば、流体力学的切断または制限酵素を用いた消化）され、細菌プラスミドまたは他のクローニングベクターの特殊領域へ連結され、コンピテント細胞へトランスフェクトされ、細胞増殖の間プラスミドまたは染色体の一部として増幅され、そして細胞培養より収集される。この方法特異性に重要なのは、異なるＤＮＡ挿入部を持つ細胞の混合物が希釈され、表面上または液量のいずれかにおけるいくらかのアリコートが、ＤＮＡ特有フラグメントを含有する一つのトランスフェクトされた細胞を含有するように分割量化され得るという事実である。この一つの細胞（インビボクローニング）増殖は、分析され得るよう、この特有ＤＮＡフラグメントを増幅する。この「ショットガン」クローニング方法は、とても頻繁に使用される。それは、１）高価ではない；２）純粋配列（通常、供給源ＤＮＡの正確なコピーである）を産生する；３）無制限量の特定配列ＤＮＡを作製するため、クローンスクリーニング技術とともに使用され得る；４）多数の相違配列の同時増幅を可能にさせる；５）１，０００，０００ｂｐ長と同じくらい大きなＤＮＡを増幅するために使用され得る；そして６）クローン化されたＤＮＡは、配列決定および他の目的に直接的に使用され得る、という理由からである。
【００２１】
クローニングは高価ではない。なぜなら、ＤＮＡの多数の片が宿主細胞の中に同時にトランスフェクトされ得るからである。多数の異なる実体（例えば、電子シグナルまたは分子）を混合する過程で、この一般的用語は「多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）」であり、また、シグナルまたは分子（同時に進行され、個々のシグナルまたは分子についての情報を修復するためその後分離され得る）数を増大させるための共通の戦略である。従来のクローニングの場合、修復プロセスは細菌培養での希釈（その結果、アリコートは、一つのプラスミドを持つ一つの細菌を含有する）、多数のオリジナルプラスミドコピーを作製するため細菌を繁殖させ、また、更なる分析でクローン化ＤＮＡを単離するということを包含する。
【００２２】
同様のトランスフェクション実験において異なる分子を多重化する原理は、クローニング方法の経済面においても決定的なものである。しかしながら、トランスフェクション後、各々のクローンは分離して増殖され、そのＤＮＡは分析のために別々に単離されなければならない。これらの工程（特にＤＮＡ単離工程）は、高価で時間を浪費する。いくつかの試みがクローニング後の多重化工程でなされた。それにより、数百ものクローンがＤＮＡ単離および分析の工程の間組み合わされ、個々のＤＮＡ分子特性が後に回復され得る。多重化クローニングの１バージョンにおいて、ＤＮＡフラグメントは、多くのプールへ分離される（例えば、１００プール）。各々のプールは、異なるベクターへ連結され、特有配列を有する核酸タグを持ち、細菌へトランスフェクトされる。各々のトランスフェクションプールからの１つのクローンは、挿入配列（各々の特異的挿入配列は、特有ベクター配列でタグ化され、それゆえ核酸タグへのハイブリダイゼーションにより同定され得る）の混合物を有する細菌混合物を作製するため、他のトランスフェクションプールの各々から一つのクローンと組み合わされる。クローン化されたＤＮＡ分子のこの混合物は、その後分離され、ポリメラーゼによる処理または電気泳動によるサイズ分離といった分析のため、酵素的、化学的または物理的プロセスに供される。個々の分子についての情報は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲＴＭ増幅またはＤＮＡ配列決定による核酸タグ配列の検出により回復され得る。Ｃｈｕｒｃｈは、ＤＮＡ単離、配列決定反応および変性させたＤＮＡ鎖の電気泳動分離の工程の間、異なる標識を用いてタグ化されたクローンのプールによる、ＤＮＡ分子の配列決定のため、多重化クローニングを使用した方法および組成を示している（米国特許第４，９４２，１２４号および同第５，１４９，６２５号）。そのタグは、ベクターＤＮＡ配列の一部としてＤＮＡに付加される。使用されたタグは、放射線活性、蛍光基または揮発性質量標識で標識したオリゴヌクレオチドを用いて検出され得る（ＣａｎｔｏｒおよびＳｍｉｔｈ、１９９９、米国特許第４，９４２，１２４号、同第５，１４９，６２５号、および同第５，１１２，７３６号、ＲｉｃｈｔｅｒｉｃｈおよびＣｈｕｒｃｈ、（１９９３））。後の特許は、万能ベクターを用いたクローニングの前に、タグ配列のＤＮＡフラグメントと連結される方法に関した（米国特許第５，７１４，３１８号）。他の特許は、トランスフェクション前に付加されたタグ配列が、変性させたＤＮＡの電気泳動分離後、ＰＣＲＴＭを用いて増幅させるという方法を明確に述べている（ＰＣＴ  ＷＯ  ９８／１５６４４）。
【００２３】
（４．ランダムライブラリーとしてのインビトロＤＮＡ調製）
ＤＮＡライブラリーはインビトロにおいて形成され、特定の配列についての情報を回復するための種々の選択工程に供され得る。インビトロライブラリーは、まれにゲノムで使用される。なぜならこのようなライブラリーを作成するために存在する方法は、クローン化されたライブラリー以上の利点を提供しないからである。特に、インビトロライブラリーを増幅するために使用される方法は、サイズおよび配列と増幅効率との相関関係により、公平な方法にて全ＤＮＡを増幅し得ることはできない。ＰＣＴ  ＷＯ  ００／１８９６０は、ＤＮＡ増幅の異なる方法が、遺伝子多型性検出目的のため、ゲノム内で配列の特定のサブセットを表すＤＮＡ分子ライブラリー作成するために、どのように使用され得るか記載されている。「ランダムープライム  ＰＣＲＴＭ（米国特許第５，０４３，２７２号、米国特許第５，４８７，９８５号）」、「ランダムープライム鎖置換（米国特許第６，１２４，１２０号）」および「ＡＦＬＰ（米国特許第６，０４５，９９４号）」は、ＤＮＡ分子の複合混合物のサブセットを表すライブラリーを作製する３つの方法の例である。
【００２４】
１分子ＰＣＲＴＭは、個々にランダムにフラグメント化したＤＮＡ分子を増幅するために使用され得る（Ｌｕｋｙａｎｏｖら、１９９６）。一つの方法において、供給源ＤＮＡは、まず始めに通常１０，０００ｂｐサイズより少ない分子にフラグメント化され、アダプターオリゴヌクレオチドに連結され、しばしば１分子だけを含有するように別々の分画に広範囲に希釈され分割される。１分子を含有する分画のＰＣＲＴＭ増幅は、最初のフラグメントの１つと同一の多数の分子を作製する。分子がランダムにフラグメント化される場合、増幅された分画は、供給源ＤＮＡ内におけるランダム部位からのＤＮＡを表す。
【００２５】
ＷＯ００１５７７９Ａ２は、ローリングサークル増幅を用い、特定配列がどのようにランダムゲノム挿入物を用いて環状分子ライブラリーから増幅され得るかを記載している。
【００２６】
（５．順序づけられた（ｏｒｄｅｒｅｄ）ＤＮＡライブラリーの直接インビボクローニング）
直接クローニングは、ＤＮＡの大きな区分の相違部分からＤＮＡをクローニングするための手順であり、通常、供給源ＤＮＡにおける相違部分からＤＮＡを配列決定する目的のためである。「ネスト化欠失（ｎｅｓｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）」を用いてＤＮＡをクローン化する方法は、クローン（供給源ＤＮＡの長い区分に沿って異なる領域で開始されるＤＮＡを有する）の「順序づけられたライブラリー」を作製するために使用されている。１つバージョンにおいて、供給源ＤＮＡの１つの末端は、配列部分を欠失するため、一つ以上のエキソヌクレアーゼ活性で消化される（ＭｃＣｏｍｂｉｅら、１９９１、米国特許第４，８４３，００３号）。エキソヌクレアーゼ消化の程度をコントロールすることにより、欠失の平均量は制御され得る。ＤＮＡ分子は、その後、サイズに基づいて分離されクローン化される。異なる分子量で分子をクローニングすることにより、多数の同一ＤＮＡプラスミド（供給源ＤＮＡ内の制御された位置で終わる挿入物を有する）のコピーが産生される。トランスポゾン挿入（Ｂｅｒｇら、１９９４）はまた、プライミングまたはプラスミドにおいてランダムな部位での分割を促進することにより、供給源ＤＮＡの異なる領域のクローン化として使用された。サイズ分離および再クローニング工程は、これらの方法を骨折りにし、遅くさせた。それらは、一般的に１０ｋｂよりも少ないカバー領域に限定され、クローン化ＤＮＡ分子ではなく、ゲノムＤＮＡでは直接使用され得ない。ゲノムＤＮＡの順序づけられたライブラリーを直接作製するというインビボ方法はない。
【００２７】
（６．順序づけられたＤＮＡライブラリーの直接インビトロ調製）
順序づけられたライブラリーは、インビトロにおいて頻繁に作製されていない。Ｈａｇｉｗａｒａ（１９９６）は、ＰＣＲＴＭ産物（約１４ｋｂのコスミドを配列決定するために使用された）の順序づけられたライブラリーを作製するため、ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭを使用した。コスミドは、最初に多種の制限酵素で消化され、その後、その産物にｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅアダプターを連結、コスミドにおいて特有配列およびアダプターに相補的なプライマーを用いた産物のＰＣＲＴＭ増幅、制限部位で順序を確率するための増幅ＤＮＡのサイズ分離、そして順序づけられたＰＣＲＴＭ産物の配列決定が行われた。制限部位の非均一な間隔のため、１６ｋｂ領域のうち２ｋｂは配列決定されなかった。この方法は、クローン化ＤＮＡの配列決定のため、ＰＣＲＴＭ産物を産生し処理するため、相当の試みを要した。順序づけられたＤＮＡゲノムライブラリーを直接作製するためのインビトロ方法はない。
【００２８】
（７．ＤＮＡ調製）
当該分野で知られており使用されている方法では、配列決定のための分子が調製される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４）を参考のこと）。
【００２９】
さらに、日本特許番号ＪＰ８１７３１６４Ａ２は、クローニング非存在下でのｓｏｒｔｉｎｇ−ｏｕｔ  ＰＣＲＴＭ増幅によるＤＮＡ調製、２本鎖ＤＮＡのフラグメント化、切断末端への既知配列オリゴマーの連結、およびオリゴマーに相補的な分類化（ｓｏｒｔｉｎｇ−ｏｕｔ）配列を有するプライマーを用いた得られたＤＮＡフラグメントの増幅法を記載している。分類化配列は、ＤＮＡフラグメントのコピー数を増幅させるため、５’末端および３’末端で蛍光標識および１〜４塩基からなる。
【００３０】
米国特許第６，１０７，０２３号は、二つのフラグメント混合物（すなわち、ネガティブな供給源から得られたフラグメント混合物がなく、ポジティブな供給源から得られた二重鎖ＤＮＡフラグメントの混合物で表されたフラグメント）のうち一つに特有である二重鎖ＤＮＡフラグメントの単離法を記載する。この方法を実施する際、二本鎖リンカーは、各々のフラグメント混合物に付着され、また、各々の混合物でのフラグメント数は、（ｉ）一つのフラグメント鎖を産生するためのフラグメントの変性；（ｉｉ）鎖／プライマー複合体を形成するために、プライマー（これらの配列は、各々の鎖の一つの末端のリンカー領域に相補的である）を用いた１本鎖のハイブリダイゼーション；そして（ｉｉｉ）鎖／プライマー複合体をポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドの存在下で二重鎖フラグメントへ変換、の連続的な繰り返し工程により増幅される。所望のフラグメント増幅が達成された後、二つのフラグメント混合物は変性され、二つの混合物と結合させたリンカー領域がハイブリッド形成をしない条件で、ハイブリダイズされる。ＤＮＡ種（ポジティブな供給源の混合物に特有であり、すなわち、ネガティブな供給源の混合物からのＤＮＡフラグメント鎖でハイブリッド形成されなかった）は、そのとき選択的に単離される。
【００３１】
米国特許第６，１１４，１４９号は、異なる配列のＤＮＡフラグメント（ＲＮＡ転写から形成されるか、ゲノム一本鎖または二本鎖ＤＮＡフラグメントから得られ得る）の混合物を増幅する方法に関係する。フラグメントは、アンチセンス鎖の３’末端においてホモポリマーテールを形成するため、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼおよび選択されたデオキシヌクレオチドで処理され、センス鎖は共通の３’末端配列が与えられる。フラグメントは、フラグメントを増幅するために、フラグメント変性の反復サイクル、アニーリングおよび重合を用い、ホモポリマープライマー（アンチセンス鎖のホモポリマーテールと相同）および規定された配列のプライマー（センス鎖に共通の３’末端配列と相同）と混合される。一つの実施形態において、規定された配列およびホモポリマープライマーは同一であり、すなわち一つのプライマーだけが使用される。そのプライマーは、増幅されたフラグメントの末端で方向性の制限部位を提供するため、選択された制限部位配列を含有してもよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
このように、本発明は、困難なＤＮＡ分子の更なる効率的な配列決定、高度の配列の品質およびより長い読み取り（ｒｅａｄｓ）のための、ＤＮＡテンプレート調製の新しい方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
（発明の要旨）
本発明は、多様な目的（配列決定を含む）のためのＤＮＡ分子の調製に関する。特定の実施形態において、分子の調製は、フラグメントを産生するための親ＤＮＡ分子のランダムなフラグメント化、少なくとも一つのプライマーのこのフラグメントへの付着、および少なくともこのフラグメントの一部の増幅を包含する。
【００３４】
本発明の目的には、ＤＮＡ分子を調製する方法があり、この方法は、以下の工程を包含する：ＤＮＡ分子を得る工程；このＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化してＤＮＡフラグメントを作製する工程；実質的に既知の配列を有するプライマーを複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも１つの末端に結合させて、プライマー結合フラグメントを作製する工程；およびこれら複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程。特定の実施形態において、この方法はさらに、複数のプライマー結合フラグメントを同時に配列決定する工程を包含する。さらに特定の実施形態において、ＤＮＡ分子のランダムなフラグメント化は、機械的なフラグメント化（例えば、流体力学的剪断、超音波処理もしくは噴霧化による）、または、化学的なフラグメント化（例えば、酸性触媒の加水分解、アルカリ性触媒の加水分解、金属イオンによる触媒、ヒドロキシラジカル、照射もしくは加熱による）である。特定の実施形態において、加熱は、約４０℃と１２０℃の間、約８０℃と１００℃の間、約９０℃と１００℃の間、約９２℃と９８℃の間、約９３℃と９７℃の間、もしくは約９４℃と９６℃の間の温度である。好ましい実施形態において、加熱は、約９５℃までの温度である。
【００３５】
特定の実施形態において、ＤＮＡ分子の加熱は、０から約１００ｍＭまでの濃度の塩、約０から約１０ｍＭまでの濃度の塩、約０．１から約１ｍＭまでの濃度の塩、もしくは約０．１から約０．５ｍＭまでの濃度の塩を有する溶液中である。特定の実施形態において、加熱は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液もしくは水溶液中である。
【００３６】
別の実施形態において、ＤＮＡ分子のランダムなフラグメント化は、ＤＮＡｓｅＩを用いた消化を包含する、酵素的なフラグメント化によるものである。特定の実施形態において、ＤＮＡｓｅＩ消化は、Ｍｇ２＋イオン（例えば、約１ｍＭから約１０ｍＭまでの濃度中）の存在下である。別の特定の実施形態において、このＤＮＡｓｅＩ消化は、Ｍｎ２＋イオン（例えば、約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度中）存在下である。
【００３７】
本発明の特定の実施形態において、プライマーは、少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも１つの３’末端に結合される。別の特定の実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡフラグメントの少なくとも１つの３’末端に、実質的に既知配列を有するプライマーを結合させることは、このＤＮＡフラグメント（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより作製される）のホモポリマー伸長の作製を包含する。特定の実施形態において、このホモポリマー伸長は、ポリＧ路を包含する。
【００３８】
別の特定の実施形態において、少なくとも一つのＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの３’末端に実質的に既知の配列を結合させることは、ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端へのアダプター分子の結合を含む。特定の実施形態において、このアダプターは、少なくとも一つの平滑末端を含む。別の特定の実施形態には、このアダプターは、１本鎖領域を含む。さらに特定の実施形態において、この方法は、上記ＤＮＡフラグメント（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウもしくはそれらの組合せによって作製されるようなフラグメント）の少なくとも一つの平滑末端を作製する工程をさらに包含する。
【００３９】
本発明の別の目的には、ＤＮＡ分子のライブラリーを調製する方法があり、この方法は、以下の工程を包含する：複数のＤＮＡ分子を得る工程：このＤＮＡ分子の少なくとも一つをランダムにフラグメント化してＤＮＡフラグメントを作製する工程；複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に既知の配列を有するプライマーを結合させて、プライマー結合フラグメントを作製する工程；およびこれら複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程。特定の実施形態において、この方法は、複数のプライマー結合フラグメントを付随的に配列決定する工程をさらに包含する。
【００４０】
本発明のさらなる目的には、本明細書中に記載される方法によって作製されたライブラリーがある。
【００４１】
本発明のさらなる目的には、ＤＮＡテンプレートのライブラリーを作製する方法があり、この方法は以下の工程を包含する：複数のＤＮＡ分子を得る工程；複数のＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化してＤＮＡフラグメントを作製する工程；複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に重要な既知配列を有する第１プライマーを結合させて、プライマー結合フラグメントを作製する工程；および複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程。ここで、この増幅工程は、ＤＮＡフラグメントにおいて既知配列と相補的な第２のプライマー；および第１プライマーと相補的な第３プライマーを利用する。特定の実施形態において、この方法は、ＤＮＡフラグメントにおいて上記既知配列と相補的な第４プライマーを用いて、上記複数のＤＮＡフラグメントを付随的に配列決定する工程をさらに包含する。特定の実施形態において、第４プライマーは、上記第２プライマーである。
【００４２】
本発明の別の目的には、複数のＤＮＡフラグメントを付随的に配列決定する方法があり、この方法は以下の工程を包含する：複数のＤＮＡ分子を得る工程；ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して重複配列を有する複数のＤＮＡフラグメントを作製する工程；複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に実質的に既知の配列を有する第１プライマーを結合させて、プライマー結合フラグメントを作製する工程；および複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程（ここで、この増幅工程は、ＤＮＡフラグメントにおいて、既知の配列と相補的な第２プライマー；および第１プライマーと相補的な第３プライマーを利用する）；ならびに、ＤＮＡフラグメントにおいて上記既知配列と相補的な第４プライマーを用いて、上記複数のＤＮＡフラグメントを配列決定する工程。特定の実施形態において、第４プライマーは第２プライマーである。
【００４３】
本発明の別の目的には、核酸配列の連続した重複種を配列決定する方法があり、この方法は、以下の工程を包含する：重複配列を有する複数のＤＮＡ分子を得る工程；上記複数のＤＮＡ分子において既知配列と相補的なプライマーを用いて、上記複数のＤＮＡ分子での第１領域を付随的に配列決定する工程；および第１領域の配列から決定された配列と相補的なプライマーを用いて、上記複数のＤＮＡ分子において第２領域を付随的に配列決定する工程。ここで、核酸配列の重複種において、次に連続的した領域の配列決定は、前述の重複配列決定産物で得られた配列から、配列決定を開始することにより行われる。特定の実施形態において、取得工程は、重複配列を有する複数のＤＮＡフラグメントを作製するため、少なくとも一つの親ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化する工程；複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に既知の配列を有する第１プライマーを結合させて、プライマー結合フラグメントを作製する工程；および、複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程（ここで、この増幅工程は、ＤＮＡフラグメントにおいて既知配列に相補的な第２プライマー；および、第１プライマーと相補的な第３プライマーを使用する）として、さらに規定される。
【００４４】
本発明のさらなる目的には、複数のＤＮＡ分子を配列決定する方法があり、この方法は、以下の工程を包含する：親ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化することにより、上記複数のＤＮＡ分子を得る工程；上記複数の分子において、既知配列と相補的なプライマーを用いて、上記複数ＤＮＡ分子を付随的に配列決定する工程。特定の実施形態において、この方法は、複数のＤＮＡ分子の増幅をさらに包含する。さらに特定の実施形態において、この増幅は、複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に既知の配列を有する第１プライマーを結合させて、プライマー結合フラグメントを作製する工程；および複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程、としてさらに規定される。ここで、この増幅は、ＤＮＡフラグメントにおいて既知配列と相補的な第２プライマーを利用し；そして第１プライマーと相補的な第３プライマーを利用する。
【００４５】
本発明のさらなる目的には、上記分子において二次構造を作製する配列を有する、ＤＮＡ分子を調製する方法があり、この方法は、以下の工程を包含する：上記配列を有するＤＮＡ分子得る工程；ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化して、複数のＤＮＡフラグメントを作製する工程（ここで、複数のＤＮＡフラグメントは、二次構造により生じる配列の一部あるいは全てを有するＤＮＡフラグメントを含有する）；複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に既知の配列を有するプライマーを結合させて、プライマー結合フラグメントを作製する工程；および複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程。特定の実施形態において、この方法は、複数のプライマー結合フラグメントを付随的に配列決定する工程をさらに包含する。特定の実施形態において、複数のＤＮＡフラグメントは、二次構造を生じる配列を有さないＤＮＡフラグメントをさらに含有する。別の特定の実施形態において、二次構造は、ヘアピン、Ｇの四重項（ＧＧＧＧ）、もしくは３重へリックスである。さらなる特定の実施形態において、得られたＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡ、もしくはプラスミドＤＮＡを含有する。
【００４６】
本発明の別の目的には、ＤＮＡ分子の３’末端を条件付けする方法があり、この方法は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに上記３’末端を暴露する工程を包含する。特定の実施形態において、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を包含するものとして、さらに規定される。別の特定の実施形態において、この暴露工程は、グアニンリボヌクレオチドもしくはグアニンデオキシリボヌクレオチドを提供する工程をさらに包含する。
【００４７】
本発明のさらなる目的には、ＤＮＡ分子の末端に３’エキソヌクレアーゼ活性を提供する方法があり、この方法は、上記分子の末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを導入する工程を包含する。特定の実施形態において、この導入工程は、グアニンリボヌクレオチドもしくはグアニンデオキシリボヌクレオチドを提供する工程をさらに包含する。
【００４８】
本発明のさらなる目的には、プローブを調製する方法があり、この方法は、以下の工程を包含する：少なくとも一つのＤＮＡ分子を得る工程；ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化してＤＮＡフラグメントを作製する工程；複数のＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端に、実質的に既知の配列を有する標識化プライマーを結合させて、標識化プライマー結合フラグメントを作製する工程；および複数のプライマー結合フラグメントを増幅する工程。特定の実施形態において、標識化プライマーの結合工程は、上記ＤＮＡフラグメントのホモポリマー伸長の作製を包含する（ここで、上記伸長は、この標識を包含する）。特定の実施形態において、ホモポリマー伸長は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより作製される。さらに特定の実施形態において、標識化プライマーの結合工程は、ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端へのアダプター分子の連結を包含する（ここで、アダプター分子は、この標識を包含する）。別の特定の実施形態において、この標識は、放射性核種、アフィニティータグ、ハプテン、酵素、発色団または発蛍光団である。別の実施形態には、本方法から作製された標識化プローブがある。さらなる実施形態において、本方法から作製されたプローブを備えるキットがある。
【００４９】
本発明の別の目的には、上記３’末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを提供する工程を包含する、一本鎖ＤＮＡ分子の少なくとも一つの３’末端を修復する方法がある。特定の実施形態において、この提供する工程は、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチドもしくはそれら両方を提供する工程をさらに包含する。
【００５０】
本発明のさらなる目的には、一本鎖ＤＮＡ分子の少なくとも一つの３’末端を修復するためのキットがある。このキットは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを備える。
【００５１】
本発明のさらなる目的には、損傷ＤＮＡ分子ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび標識化グアニンリボヌクレオチド、標識化グアニンデオキシリボヌクレオチドもしくはそれら両方を提供する工程を包含する、損傷ＤＮＡ分子を検出する方法がある。特定の実施形態において、損傷ＤＮＡ分子は、ニック（ｎｉｃｋ）もしくは二本鎖切断を含む。別の特定の実施形態において、この提供する工程は、上記損傷ＤＮＡ分子に修復を提供する工程として、さらに規定される。さらなる特定の実施形態において、その標識は、放射性核種、アフィニティータグ、ハプテン、酵素、発色団もしくは発蛍光団を包含する。さらに、特定の実施形態において、損傷ＤＮＡは細胞の外側にある。特定の実施形態において、損傷ＤＮＡは、放射線、紫外線、酸素、ラジカル、金属イオン、ヌクレアーゼもしくは力学的動力の結果である。特定の実施形態において、損傷ＤＮＡは細胞の内側にある。別の特定の実施形態において、細胞はアポトーシス細胞である。さらなる特定の実施形態において、損傷ＤＮＡは、放射線、熱、紫外線、酸素、ラジカル、一酸化窒素、カテコールアミンもしくはヌクレアーゼの結果である。
【００５２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のみによって与えられることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神および範囲内での変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるからである。
（発明の詳細な説明）
長期にわたる特許法の規約を保持する際に、単語「ａ」および「ａｎ」は、特許請求の範囲を含む言葉と合わせて、本明細書で使用される場合、「一つ以上」を意味する。
【００５３】
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術範囲内である、従来の分子生物学技術、微生物学技術、組換えＤＮＡ技術などを用いる。このような技術は、文献で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第二版（１９８９），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７），ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７），ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，およびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ編、１９８７），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ｅ．ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、１９９１）；ＡＮＮＵＡＬ  ＲＥＶＩＥＷ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ；ならびに、ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹのような学術論文を参照のこと。全ての特許、特許出願およびこの中で言及される刊行物（上記および下記の両方）は、本明細書中で参考として援用される。
【００５４】
米国６，１９７，５５７は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００５５】
（Ｉ．本発明）
本発明は、ＤＮＡ分子もしくはＤＮＡ分子のライブラリー、またはその両方を調製するための方法に関する。ＤＮＡ分子の調製は、分子のランダムなフラグメント化、およびその分子の少なくとも一つのフラグメントの増幅を包含する。調製された分子は、当該技術分野において公知のいかなる目的に対しても使用され得るが、特定の実施形態において、それは分子の少なくとも一部分の配列決定のため使用される。本発明はまた、ＤＮＡ分子ライブラリー（特に、少なくとも一つの親ＤＮＡのランダムなフラグメント化により生成された分子フラグメント）に関する。特定の実施形態では、ライブラリー構成要素は、付随的に配列決定される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「ランダムなフラグメント化」という用語は、中断部を含むかつ／または中断部の周囲のヌクレオチドの配列同一性もしくは位置にかかわりないような、定められない様式でのＤＮＡ分子のフラグメント化をいう。
【００５７】
特定の実施形態では、ランダムなフラグメント化により生成されたフラグメントは、配列決定前に増幅される。当業者は、ランダムに生成されたＤＮＡフラグメントの増幅産物は、一ヌクレオチドのみで長さが異なる実施形態においては、異なる位置で終結する異なる長さの分子の混合物を生じる、ということを認識する。ゲル上でのこのような混合物は、スミア（ｓｍｅａｒ）として示され、このことは、明瞭に、配列決定のテンプレートとして利用され得ないことを示唆している。しかしながら、本発明は、配列決定テンプレートとして異なる位置で終結する、この異なる長さのフラグメント混合物の利用に関する。さらに、特定の実施形態では、フラグメントの混合物は、付随的に配列決定される。
【００５８】
他の特定の実施形態では、一連の重複する配列が、ランダムなフラグメント化により生成され、これらフラグメントは特定領域で付随的に配列決定され、次いで、前述の領域で決定された配列を利用することにより、ウォーキング（ｗａｌｋｉｎｇ）が、重複する配列に沿って生じる。
【００５９】
（Ａ．ランダムにフラグメント化したＤＮＡの調製）
ライブラリーは、少なくとも二つの工程で調製される：第１工程、１〜５ｋｂ断片へＤＮＡのランダムなフラグメント化、および第２工程、ＤＮＡフラグメント末端（好ましくは３’末端）への万能アダプター配列の付着（図１）。これらのライブラリーは、テール化ランダムフラグメント化（Ｔａｉｌｅｄ、Ｒａｎｄｏｍｌｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ）（ＴＲＦ）ＤＮＡライブラリーといわれる。
【００６０】
ＤＮＡのランダムなフラグメント化は、当該技術分野において周知の方法により、達成され得る（図２）。いくつかの例は図２に示される。
【００６１】
（１．機械的フラグメント化）
機械的なフラグメント化は、当該技術分野において公知の任意の方法により生じ得、その方法としては、狭いキャピラリーもしくは穴にそれを通すことによるＤＮＡの流体力学的な剪断（Ｏｅｆｎｅｒら，１９９６；Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｏｎら，１９９８）、ＤＮＡの音波処理（例えば、超音波による）（Ｂａｎｋｉｅｒ，１９９３）、および／またはＤＮＡの噴霧化（Ｂｏｄｅｎｔｅｉｃｈら，１９９４）が挙げられる。機械的なフラグメント化は、通常、ＤＮＡ分子内に二本鎖切断を生じる。
【００６２】
（２．熱フラグメント化を包含する、化学的フラグメント化）
ＤＮＡの化学的フラグメント化は、当該技術分野において公知の任意の方法により達成し得、その方法としては、ＤＮＡの酸もしくはアルカリ触媒性加水分解（ＲｉｃｈａｒｄｓおよびＢｏｙｅｒ，１９６５）、金属イオンおよび複合体による加水分解（ＫｏｍｉｙａｍａおよびＳｕｍａｏｋａ，１９９８；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，２００１；Ｂｒａｎｕｍら，２００１）、ヒドロキシルラジカル（Ｔｕｌｌｉｕｓ，１９９１；ＰｒｉｃｅおよびＴｕｌｌｉｕｓ，１９９２）もしくはＤＮＡの放射線処理（Ｒｏｏｔｓら，１９８９；Ｈａｙｅｓら，１９９０）が挙げられる。化学的な処理は、二本鎖もしくは一本鎖、もしくはその双方の切断を生じ得た。
【００６３】
本発明において、新規な方法が、ＤＮＡ分子に切断を導入するために提供される（ＤＮＡの熱フラグメント化）。熱フラグメント化は、分子が室温以上の温度（いくつかの実施形態では少なくとも約４０℃）下にある場合、ＤＮＡ分子において、二本鎖切断もしくは一本鎖切断もしくはその双方を生成するとして明らかにされる。選択的な実施形態では、温度は、環境温度である。さらに特定の実施形態では、温度は、約４０℃〜１２０℃、約８０℃〜１００℃、約９０℃〜１００℃、約９２℃〜９８℃、約９３℃〜９７℃、または約９４℃〜９６℃である。いくつかの実施形態では、温度は、約９５℃である。いくつかの実施形態では、温度は、１００℃よりも高い。当業者は、ｐＨおよび／または塩濃度のような、温度以外のパラメーターが切断に影響を及ぼし得ることを認識する。特定の実施形態では、熱フラグメント化の条件は、９５℃（約８０℃〜１００℃の温度範囲）で低塩緩衝液（Ｌ−ＴＥ緩衝液）中で中性ｐＨ（ｐＨ６．０〜９．０）を包含する。本発明の方法は、例えば、ターミナルトランスフェラーゼを用いてホモポリマーＧ伸長部を有する３’末端で効率的にテール化され得るＤＮＡ分子を生成する。他の実施形態では、アダプターが、フラグメント末端に連結され得る。
【００６４】
ＤＮＡは、加熱により中性ｐＨで効率的にフラグメント化され得る（Ｅｉｇｎｅｒら，１９６１）。プリン−グリコシル結合が不安定のため、高温でのＤＮＡのインキュベーションは、ＤＮＡからプリンを放出する、もしくは脱プリンする結果となる。脱プリン化したＤＮＡは、順に、アプリン性部分で加熱誘導性加水分解を受けやすくなる。両過程は、生理的に有意であるが、とても緩慢な速度で生じる（ＧｒｅｅｒおよびＺａｍｅｎｈｏｖ，１９６２；ＬｉｎｄａｈｌおよびＮｙｂｅｒｇ，１９７２；ＬｉｎｄａｈｌおよびＡｎｄｅｒｓｓｏｎ，１９７２）。おそらく標準緩衝液中でのその低い速度のために、加熱誘導性ＤＮＡ加水分解は、ＤＮＡをフラグメント化するために、標準分子生物学的手法では一度も使用されなかった。
【００６５】
従って、本発明では、確証され最適化された方法が、ＤＮＡ分子に切断を導入するために提供される（９５℃（約８０℃〜１００℃の温度範囲）で低塩緩衝液（Ｌ−ＴＥ緩衝液）中で中性ｐＨ（ｐＨ６．０〜９．０）でのＤＮＡの熱フラグメント化）。その方法は、ＤＮＡ分子（例えば、約５０〜約２，０００塩基長）を生成し、そのフラグメント長は、加熱時間、塩もしくは緩衝液濃度、またはその両方（図２１，実施例１１）により、再現可能に制御され得る。切断は、プリン部位、およびいくつかの場合ではピリミジン塩基で最も生じる（図２２、実施例１２）。熱フラグメント化は、少なくとも、ターミナルトランスフェラーゼを用いてホモポリマーＧ伸長部を有する３’末端で効率的にテール化され得る、またはアダプターと連結され得るＤＮＡ分子を生成する。
【００６６】
熱フラグメント化ＤＮＡは、ランダムなＤＮＡライブラリーもしくはＤＮＡプローブの調製に使用され得る。
【００６７】
（３．酵素的フラグメント化）
ＤＮＡの酵素的フラグメント化は、当該分野において、標準方法（例えば、Ｃｖｉ  ＪＩエンドヌクレアーゼによる部分的制限消化（Ｇｉｎｇｒｉｃｈら，１９９６）、ＤＮＡｓｅＩ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９８１；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８７）による部分的制限消化）により利用され得る。ＤＮＡｓｅＩによるフラグメント化は、Ｍｇ２＋イオン（約１〜１０ｍＭ；主に一本鎖切断）の存在下、もしくはＭｎ２＋イオン（約１〜１０ｍＭ；主に二本鎖切断）存在下で生じ得る。
【００６８】
これらの方法に共通して、流体力学的剪断過程は、適切かつ狭いサイズ分布を有するＤＮＡ分子を産生する（図２）。市販のデバイスのＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ（ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、１．５ｋｂから５ｋｂまでの範囲の平均分子サイズで、２倍のサイズ分布内にＤＮＡをランダムに破砕し得る。その方法は、ＤＮＡにさらなる改変を導入せずに、そのフラグメントは、酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）による３’末端のテーリングに直接使用され、平滑末端アダプターの連結反応に直接使用され得る。
【００６９】
（Ｂ．ＤＮＡフラグメント末端への配列結合）
プライマーは、ＤＮＡフラグメントの末端（好ましくは３’末端）へ結合され、これは当該分野において公知の任意の方法により達成され得る。当業者は、生成されるプライマーは、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼもしくはアダプター配列の連結反応による、ホモポリマーテールでありえることうを認識する（図３）。
【００７０】
プライマーは、特定の実施形態では、実質的な既知配列を含む。その増幅を含むＤＮＡ分子の調製を可能にするのに「実質的な既知（である）」とは十分な配列情報を有することにことをいうと当業者は認識する。ある実施形態において、いくつかのプライマー配列はランダムであるが、これは代表的には約１００％である。このように、特定の実施形態には、実質的に既知であるとは、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約９７％〜約１００％、約９８％〜約１００％、約９９％〜約１００％をいう。
【００７１】
ＤＮＡフラグメント化に従って、その生成されたフラグメント分子は、そのフラグメント化のためのさらなる工程を促進するための改変として本明細書中に定義づけられるような条件調整を必要とすることを当業者は認識する。例えば、３’末端でフラグメント化を必要としてもよく、５’末端でフラグメント化を必要としてもよく、また、その両方であってもよい。特定の実施形態には、３’末端は、熱フラグメント化または力学的フラグメント化の後に条件調整を必要とする。さらなる具体的な実施形態において、その条件調整は、３’ＯＨ基を欠失する３’末端の改変を含む。さらなる具体的な実施形態では、上記の３’末端は、エキソヌクレアーゼ（例えば、３’エキソヌクレアーゼ）によるエキソヌレクアーゼ活性を介して条件調整され、そのフラグメント分子の遠位ヌクレオチドが光学的に除去する。好ましい実施形態では、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは、このような反応に利用される。代替的な実施形態では、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ以外の酵素（クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）を含む、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼもしくはＤＮＡポリメラーゼＩ）が利用される。
【００７２】
（１．ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼテーリング）
最も簡単で速いプロトコルとしては、酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によるグアニン分子の付加が挙げられる（図２３Ａ）。この場合では、短い（１０〜２０塩基）ポリＧテールは、ＤＮＡフラグメント３’末端で合成される。ＴｄＴを介したテーリングのため、フラグメントは二本鎖もしくは一本鎖であり得る。ポリＧテールはまた、ＤＮＡにランダムに導入されたニック（ｎｉｃｋ）においてその３’末端に、例えば、ＤＮＡａｓｅＩもしくは別の方法（例えば、米国特許第６，１９７，５５７Ｂ１号参照）で、付加され得る。
【００７３】
ターミナルトランスフェラーゼは、ｄＧＴＰを付加してポリＧテールを合成するために３’ヒドロキシルを必要とする（ＧｒｏｓｓｅおよびＲｏｕｇｅｏｎ，１９９３）。本発明には、ターミナルトランスフェラーゼが首尾よく使用され、流体力学的剪断および熱フラグメント化によって生じたＤＮＡを繋ぐのに使用される。加熱による鎖切断は、アプリン（ａｐｕｒｉｎｉｃ）糖残基の３’部位で生じ、β除去反応を含む（ＢｒｏｗｎｎおよびＴｏｄｄ，１９９５）。結果として、３’−ＯＨ残基を有するヌクレオチド末端で３’末端は、非常に小さな範囲でのみ生成される（ＫｏｔａｋａおよびＢａｌｄｗｉｎ，１９６４；ＬｉｎｄａｈｌおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９７２）。図２３および図２４に表された結果は、ターミナルトランスフェラーゼは、熱フラグメント化により産生された３’ＤＮＡ末端を効果的につなぎ得る（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる新しい３’エキソヌクレアーゼ活性を示している）。このような「プルーフリーディング」活性は、多くのＤＮＡポリメラーゼで公知の特徴であるが、ターミナルトランスフェラーゼ以前は一度も立証されていなかった。
【００７４】
ターミナルトランスフェラーゼ修復活性は、ＤＮＡポリメラーゼの３’エキソ活性でとても異なる：それは補助因子を必要とし、ｄＧＴＰヌクレオチドの存在下でのみ顕在化される（図４および図２６）。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの存在（図２６）下で、３’ブロック化末端のテーリング欠失は、ＴｄＴによる触媒される修復工程で、デオキシグアニントリフォスフェートにとって重要な役割を示す。実際、ｄＧＴＰは、ターミナルトランスフェラーゼにより加水分解されたテーリングメカニズムにおいて、二重の役割を示す。第１番目に、それは、末端修復工程を導き、末端残基を除去する補助因子として役割を果たす。第２番目に、それは、テーリング反応の基質として役割を果たす。ターミナルトランスフェラーゼ３’エキソヌクレアーゼ活性により除去された残基の数は、約１〜３塩基を構成する（図２７）。ｄＧＴＰの濃度は重要であり、約４０μＭを超えるべきであった（図２５）。
【００７５】
グアニントリホスフェート（リボＧＴＰ）は、ＴｄＴ酵素による修復／テーリング処理を刺激し得る（図２７）。リボトリホスフェートは、ターミナルトランスフェラーゼのためには良好な基質であるが、数塩基だけがくみこまれ得る（Ｂｏｕｌｅら，２００１）。この発明には、リボＧＴＰおよびデオキシＧＴＰヌクレオチドの平衡混合物は、長さが制御されるＴｄＴを介したＧ修復／テーリング反応（流体剪断もしくは熱フラグメント化により産生されたＤＮＡフラグメントに８〜１２個のグアニン塩基を付加する）のための溶液を供給する（図２８）。
【００７６】
（２．アダプターの連結反応）
ランダムに生成されたＤＮＡフラグメント末端に連結され得る、二つのタイプのアダプターがある（図３）。
【００７７】
「平滑末端」アダプターは、フラグメント化方法（通常、力学的もしくは酵素的）により産生された二本鎖ＤＮＡフラグメント末端へ付加され得る（図３Ａ：左側）。いくつかのフラグメント化方法は、付加工程（Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはクレノウフラグメントによりＤＮＡ末端の修復、および３’突出または５’突出の除去を包含する）が必要であった。
【００７８】
「平滑末端」アダプターの構造は、図３Ｂ左側で示され、それは米国特許第６，１９７，５５７Ｂ１号および米国特許出願０９／８６０，７３８（両方とも、本明細書中で参考として援用される）のアダプターに類似する。このアダプターの最も重要な特徴は、アダプターが自己連結反応（ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）行うことを妨げる、両方の３’末端でのブロック基である。このリン酸塩基は、そのアダプターの一方の末端のみに存在して、１つのＤＮＡ末端の方向にのみその連結反応を生じる。
【００７９】
４〜６個のランダムな塩基（図３Ｂで「Ｎ」と表示された）およびリン酸化された逆方向（ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ）の５’末端を含む、短い３’突出部を伴う「一本鎖ＤＮＡ」アダプターは、一本鎖ＤＮＡ分子３’末端へ付加され得る（図３Ａ）。いくつかのフラグメント化方法は、付加工程（Ｔ４  ＴＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメントもしくはエキソヌクレアーゼＩによる一本鎖分子３’末端の修復を含む）を必要とした。
【００８０】
「一本鎖ＤＮＡ」アダプターの構造は、図３Ｂ右側に示され、それは米国特許出願０９／８６０，７３８（本明細書中で参考として援用とする）のアダプターデザインと類似する。
【００８１】
アダプターは、アダプターの自己連結反応を妨げる、両方の３’末端でブロック基を持つ。リン酸基は、そのアダプターの逆方向の５’末端に存在する。アダプターの４〜６個の塩基３’突出部は、ランダムな塩基組成を持つ。特定の実施形態において、それは、一本鎖ＤＮＡ分子へのアニーリングおよびアダプターの連結反応を促進する。
【００８２】
（Ｃ．ランダムフラグメント化およびテール化されたＤＮＡライブラリーを用いた、特異的ＤＮＡ領域の増幅および直接的配列決定）
ランダムＤＮＡフラグメント化により調製されたＴＲＦライブラリーは、高度に重複したＤＮＡライブラリーである。一つの配列特異的プライマーおよび一つの汎用プライマー（図４で「Ｕ」と示された）を用いた標準ＰＣＲＴＭによる多くのオーバーラップＤＮＡ分子の増幅は、非常に大規模な集団の分子（具体的には、Ｐ１プライマーに相補的な同じプライミング部位を共有する様々な配列のＤＮＡフラグメントのネスト化セット）を生じた（図４）上述した技術による導入されたＤＮＡ切断の頻度は高い（潜在的に、どの塩基位置でも）でも高いため、ＰＣＲＴＭによって増幅された様々な長さのＤＮＡフラグメントの数は非常に大きい。
【００８３】
増幅された分子が、配列決定プライマーとして同一のプライマーＰ１（もしくはネスト化プライマーＰ２）を用いるＤＮＡの配列決定のために直接的に使用され得るということは、明らかではない。二つの要因は、得られる配列決定ラダーの質および長さに、潜在的に影響を及ぼし得た。第１番目に、最も短いＤＮＡフラグメントの優先的な増幅に対するバイアスは、ＤＮＡ配列決定長を減少し得た。第２番目に、短いＤＮＡフラグメントの（ランダムに作製された末端における）汎用アダプター配列と長いフラグメントのＤＮＡ配列との間でのオーバーラップは、オーバーラップ領域での塩基同定にて不明瞭な結果を生じた。
【００８４】
米国特許出願番号６０／２８８，２０５（本明細書中で参考として援用する）で表されたデータの確認において、ニックトランスレーションにより生成された分子のライブラリーと関係して、発明者らは、（一つもしくはそれ以上の配列特異的なプライマーおよび一つの汎用プライマーを用いる）ＴＲＦライブラリーを用いたＰＣＲＴＭにより生成されたネスト化分子の複合混合物は、配列決定分析のためにも直接使用され得る、ということを発見した。
【００８５】
アダプター配列（異なるフラグメントのため、異なる距離に位置される）は、配列決定データの全ての質に影響を及ぼさない（図５）。ＴＲＦライブラリーの平均サイズは１５００塩基であり、また３’末端（例えば、Ｇテール）での普遍配列のサイズは１０塩基であると仮定すると、アダプター配列（図５の丸）でＤＮＡ（図５の星）内にランダムに選択された塩基位置にオーバーラップするフラグメントは１０だけある。例えば、５０１番目の塩基位置番号（配列決定プライマーの３’末端からの距離）で、約１０００分子が、正確なＤＮＡ配列決定情報を与え、わずか１０テンプレートのみが汎用アダプター配列により生成されたシグナルを産生する（図５）。このオーバーラップのため、要求された雑音信号比は、わずか約１０／１０００＝１％である。その数は、制限酵素で頻繁に切断し、部分的な消化により産生されたライブラリーの場合で評価された雑音信号比よりもさらに低い（米国特許出願６０／２８８，２０５参照）。特に、ＴＲＦライブラリーから生成されたＤＮＡのケースにおいて、配列決定ラダーへのアダプター配列の寄与は、ごくわずかであることを意味する。
【００８６】
（Ｄ．ＴＲＦライブラリーから生成されたＤＮＡアンプリコン内におけるプライマー「ウォーキング」による配列決定）
ＴＲＦライブラリー内でＤＮＡフラグメントの平均サイズは、ＰＣＲＴＭにより生成されたネスト化分子の集団内で、最大限のＤＮＡ分子長の範囲に設定する（図６）。第１配列決定プライマーＳ１は（ＰＣＲＴＭ増幅工程の間、配列特異的プライマーも）、Ｗ１（６００〜８００塩基）領域の配列決定を与える。
【００８７】
この戦略は、反復を持つＤＮＡ配列決定の際、通常生じる問題を解決することを助け得る。特有のＤＮＡ領域（図６で領域Ｓ１）において、ＰＣＲＴＭプライマーを選択することにより、反復領域を含むＤＮＡの大きな断片を増幅し得る。例えば、もし反復的なＤＮＡエレメントがＷ２範囲内にあるならば、２つの特有のＷ１およびＷ３は、連続的なゲノム配列への配列決定読み取りであるＷ１、Ｗ２およびＷ３の明確アセンブリを可能にする。
【００８８】
（Ｅ．困難なＤＮＡテンプレートを配列決定する一般的アプローチとしてのネスト化ＤＮＡフラグメント）
ＤＮＡ配列決定のためのネスト化ＤＮＡ分子の混合物の使用が、均一なサイズの標準ＤＮＡテンプレートの使用よりも一般的に良くあり得るという重要な理由がある：プラスミド、ＰＣＲＴＭ産物など。もしも、ＤＮＡフラグメント内（図７Ａで示された分子内構造を形成し得る）に二つの領域ＡおよびＢがあると仮定する。配列決定反応の間、表示された領域は、ＤＮＡポリメラーゼが複製するための問題をもたらし得た。結果として、そのフラグメントは領域Ｌまで配列決定されるのみである。
【００８９】
ネスト化フラグメントの混合物の場合において、ＤＮＡはより長い距離を簡単に配列決定され得る（図７Ｂ）。このケースにおいて、ＤＮＡ分子の大部分は、ヘアピン構造を形成しない。そのため、ポリメラーゼは、ＤＮＡを簡単に複製し、領域Ｍまで配列決定ラダーを産出し得る。当業者は、二次構造の多様な実施例（ヘアピン、ＧＧＧＧ、三重らせんなどを包含する）があるということを認識し、そして、本発明の方法は、このような構造を有するＤＮＡ分子の調製およびその後の操作（例えば、配列決定）に有益であるということを認識する。
【００９０】
一般的な配列決定実施のため、この方法を遂行するいくつかの方法がある。まず第１番目に、ネスト化分子は、上記に記述した手順により生成され得る。例えば、組換えプラスミドＤＮＡもしくはＰＣＲＴＭ産物は、ランダムにフラグメント化され、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてＧをテール化させ、そしてＭ１３プライマー（プラスミドＤＮＡのケースにおいて）もしくはＰＣＲＴＭ産物および万能ポリＣプライマーの生成に使用されたプライマーの一つを用いた、ＰＣＲＴＭにより再増幅される。この方法は、非常に少量の独自の（均一サイズ）ＤＮＡテンプレートを、潜在的に処理し得る。第２番目に、ＤＮＡ配列決定のための、改良したＤＮＡテンプレートの調製は、独自のＤＮＡのランダムなフラグメント化のみに制限され得る。
【００９１】
（Ｆ．本発明の適用）
特定の実施形態で、本発明の方法は、適用（その非制限例が以下に示される）に利用される。
【００９２】
一つの実施形態には、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ここで、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは３’エキソヌクレアーゼ活性（明細書に記載された新しい活性）を含む）に３’末端を暴露することを包含する、ＤＮＡ分子３’末端を調製する方法がある。好ましい実施形態において、暴露工程はさらに、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチドもしくはその両方の提供を包含する。
【００９３】
別の実施形態には、分子末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを導入する工程を包含する、ＤＮＡ分子末端に３’エキソヌクレアーゼ活性を提供する方法がある。特定の実施形態において、導入工程はさらに、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチドもしくはその両方の提供を包含する。
【００９４】
さらなる実施形態には、少なくとも一つのＤＮＡ分子を収得する工程；ＤＮＡフラグメントを産出させるため、ＤＮＡ分子をランダムにフラグメント化する工程；標識化プライマーを結合させたフラグメントを産出させるため、複数のＤＮＡフラグメント末端の少なくとも一つに実質的に既知の配列を有する標識化プライマーを付加する工程；および複数のプライマー結合させたフラグメントを増幅する工程を包含する、プローブ調製法がある。特定の実施形態では、標識化プライマーの付加工程は、上記ＤＮＡフラグメントのホモポリマー伸長物の生成を包含し、ここでこの伸長物は標識を含む。特定の実施形態では、ホモポリマー伸長物は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより生成される。代替の実施形態では、標識化プライマーの付加工程は、ＤＮＡフラグメントの少なくとも一つの末端への、アダプター分子の連結反応を包含し、ここでアダプター分子は標識を含み、その例としては、放射性核種、アフィニティー標識、ハプテン、酵素、発色団もしくは発蛍光団が挙げられる。本発明は、この方法もしくはプローブを含むキットから生成された標識化プローブも包含する。
【００９５】
本発明のさらなる実施形態には、３’末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを提供する工程を包含する、少なくとも一つの一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端を修復する方法がある。特定の実施形態では、提供する工程は、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチドもしくはその両方を提供する工程をさらに包含する。当業者は、本明細書で使用される場合用語「修復」は、ＤＮＡ分子３’末端からの少なくとも一つのヌクレオチドの除去、および重合として定義される、ということを認識する。特定の実施形態では、重合工程は、除去工程の次である。特定の実施形態では、遠位３’ヌクレオチドは損傷される（その非限定的な例は、３’ＯＨ基を欠くと定義される）。他の実施形態では、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは、少なくとも一つのヌクレオチドを除去するための活性を包含するか、もしくは重合するための活性を包含するかのいずれかである。特定の実施形態では、他の酵素は、除去もしくは重合プロセスまたはその両方を容易にする。特定の実施形態では、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる修復において、約１〜３個の塩基が、重合反応においてテーリング前に切除される。
【００９６】
他の実施形態には、少なくとも一つの一本鎖ＤＮＡ分子３’末端を修復するキットがあり、ここで上記キットは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む。さらなる特定の実施形態では、そのキットは、グアニンリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチドもしくはその両方を含み、他の特定の実施形態では、グアニンリボヌクレオチドおよび／もしくはグアニンデオキシリボヌクレオチドは標識化される。
【００９７】
本発明のさらなる目的では、損傷されたＤＮＡ分子にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、および標識化グアニンリボヌクレオチド、標識化グアニンデオキシリボヌクレオチド、もしくはその両方を提供する工程を包含する、損傷されたＤＮＡ分子を検出する方法がある。非限定的な例では、損傷されたＤＮＡ分子は、切れ目（ｎｉｃｋ）もしくは二本鎖切断、またはその両方を包含する。他の特定の実施形態では、提供する工程は、損傷されたＤＮＡ分子の修復を提供するとしてさらに定義される。さらなる特定の実施形態では、標識は、放射性核種、アフィニティー標識、ハプテン、酵素、発色団もしくは発蛍光団を包含する。インビボでＤＮＡ切断の原因となる因子としては、（電離）放射線、熱、ＵＶ光、酸素、ラジカル、酸化窒素（ＮＯ）、カテコールアミン、および／またはアポトーシス（ヌクレアーゼ）が挙げられる。インビトロでＤＮＡ切断の原因となる因子としては、（電離）放射線、ＵＶ光、酸素、ラジカル、金属イオン、ヌクレアーゼ、力学的／流体力学的な因子、および／または化学試薬が挙げられる。
【００９８】
（ＩＩ．ＤＮＡ配列決定）
本発明は、ＤＮＡ配列決定のため、ＤＮＡ分子（特に増幅後）を調製する方法に関するものである。当業者は、以下の方法は、本明細書で記載された方法を用いて、テンプレート生成後の配列決定に適切であることを認識する。
【００９９】
（Ａ．マキサム−ギルバート法）
マキサム−ギルバート法は、化学試薬を用いて特定の塩基でのＤＮＡ分解を包含する。特定の塩基で終結するＤＮＡ鎖は、変性され、その特定の塩基の位置を決定するため電気泳動される。マキサム−ギルバート法は、危険な化学物質を包含し、時間および労力集中的である。それは、もはやほとんどの適用で使用されていない。
【０１００】
（Ｂ．サンガー法）
サンガー配列決定法は、配列決定のための、最近最も評判のよいフォーマットである。それは、Ｍ１３のような特定のウイルスを用いて、もしくは二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を変性することにより産出された、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を使用する。オリゴヌクレオチド配列決定プライマーは、ｓｓＤＮＡの特有部位にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼは、全ての四つのデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）および合成の終結の起因となる、少量の一つもしくはそれ以上のジデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰおよび／またはｄｄＴＴＰ）を用いて、元の鎖に相補的な新しい鎖を合成することに使用される。ＤＮＡは変性され、プライマーの５’末端から終結部位の距離を表している「ラダー（ｌａｄｄｅｒ）」バンドへ電気泳動される。もし、一つのみのｄｄＮＴＰ（例えば、ｄｄＧＴＰ）がグアニンで終結する分子のみに使用されただけならば、ラダー（ｌａｄｄｅｒ）で検出され得る。四つの異なる標識を有するｄｄＮＴＰを用いることにより、全ての四つのｄｄＮＴＰは、同一の重合反応に組み込まれ得、そして各々の四つの塩基で終結する分子は、塩基配列を読み取るため、電気泳動後に別個に検出され得る。
【０１０１】
種々のポリメラーゼが使用され得るが、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ）の使用は、元のサンガー法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９８；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，１９９１）を越える重大な改良であった。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、固有の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、ｄｄＮＴＰの組み込みに対する減少した選択性を持つ。しかしながら、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、オリゴヌクレオチドプライマーのいくらかの分解を導く。ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭは、化学的に修飾されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が減少された）である（Ｔａｂｏｒら，１９８７）。ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭバージョン２．０は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を完全に欠く、Ｔ７ポリメラーゼの遺伝子的に処理された形態である。ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭは、非常に高度なプロセシビティーを持ち、高い重合率を持つ。それは、ｄＩＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰ（配列決定ゲルにおいて、圧縮領域を分解するために使用される）のような、ヌクレオチドアナログを効率的に組み込み得る。高いＧ＋Ｃ含有量を含むＤＮＡ領域では、フーグスティーン型結合形成が生じ得、これは、ＤＮＡの圧縮を導く。これらの圧縮は、配列決定ゲル上で、オリゴヌクレオチド鎖の異常泳動パターンを得る結果となる。これらの塩基アナログは従来のヌクレオチドと弱く対となるため、電気泳動の間、鎖内二次構造は緩和される。これに対して、クレノウは効率的にこれらのアナログを組み込まない。
【０１０２】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびその突然変異体の使用は、サンガー法（米国特許第５，０７５，２１６号）の改良への、さらに新しい付加である。Ｔａｑポリメラーゼは、耐熱性酵素（７０−７５℃で効率的に作用する）である。上昇した温度におけるＤＮＡ合成の触媒能は、３７℃（クレノウおよびＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ反応で使用される標準温度）で広範囲な二次構造を持つ配列決定テンプレートで、Ｔａｑポリメラーゼを有効にさせる。Ｔａｑポリメラーゼは、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭと同様に、高度のプロセシビティーを持ち、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ２．０と同様に、３’→５’ヌクレアーゼ活性を欠く。Ｔａｑおよび関連酵素（例えば、ＴｔｈおよびＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ）の熱安定性は、これらの熱安定性酵素がサイクル配列決定（配列決定反応の間、ＤＮＡを増幅し、従って配列決定がより少量のＤＮＡで実施されることを可能にする）に使用され得るという点で、Ｔ７ポリメラーゼ（およびその全ての突然変異体）を超える利益を提供する。標準サンガー法においてＴａｑ使用の最適化は、内因性５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を除去し、そして一本鎖テンプレートＤＮＡ（ＥＰ  ０  ６５５  ５０６Ｂ１）における二次構造に起因する、間違った終結を減らすためにｄｄＮＴＰを取り込む能力を増大するために、Ｔａｑを修飾することに焦点を集めている。蛍光標識化ヌクレオチドの導入は、自動配列決定（生産性を増大する）の導入をさらに可能にしている。
【０１０３】
既知配列のベクターもしくはＰＣＲＴＭプライマーＤＮＡによって隣接された配列決定ＤＮＡは、これらの既知配列に相補的なプライマーを用い、一つの末端から開始されるサンガー停止反応を受け得る。これらの配列決定プライマーは安価である。なぜなら、同一プライマーは、同一ベクターでクローン化されたかもしくは共通末端配列を有するプライマーを用いてＰＣＲＴＭ増幅されたＤＮＡに対して使用され得るからである。ジデオキシリボヌクレオチド終結化ＤＮＡ分子を分離するために通常使用される電気泳動技術は、５００−１０００塩基より短い配列決定ラダー（ｌａｄｄｅｒｓ）を分解することに制限される。それゆえ、最初の５００−１０００核酸塩基だけが、この、もしくは他のＤＮＡ配列決定方法により「読み取り」され得る。最初の５００−１０００塩基を越えるＤＮＡ配列決定は、特別な技術を必要とする。
【０１０４】
（Ｃ．他の塩基特異的終結法）
他の停止反応が提唱されている。提唱のうち一つの群は、エキソヌクレアーゼ活性に耐性を持つ、チオール化もしくはホウ素化塩基のアナログを置換することを包含する。サンガー反応にとても似た取込み反応後、３’→５’エキソヌクレアーゼは、最終塩基アナログ位に合成された鎖を除去するために使用される。これらの方法は、サンガー法を超える相当な利益はない。
【０１０５】
大量のＤＮＡを配列決定するために必要とされる電気泳動分離の数を削減するための方法が提唱されている。これらは、分離して検出され得るよう、異なる分子に独特のタグを付加することにより、同一電気泳動装置上での多数の異なる分子のマルチプレックス配列決定を包含する。一般に、異なる蛍光色素は、一つの電気泳動レーンもしくはキャピラリーにおいて、四つの異なる型のＤＮＡ分子を多様にするために使用される（米国特許第４，９４２，１２４号）。さほど一般的ではないが、そのＤＮＡは、クローニングもしくはＰＣＲＴＭ増幅の間、多数の異なる核酸配列で標識され、ハイブリダイゼーション（米国特許第４，９４２，１２４号）もしくはマススペクトロメトリー（米国特許第４，９４２，１２４号）により検出される。
【０１０６】
原則的には、短いフラグメントの配列は、未知配列に異なるオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすること、およびその配列を再構築するために情報を解読することにより、読み取られ得る。この「ハイブリダイゼーションによる配列決定」は、長さにおいて＜５０ｂｐのＤＮＡフラグメントに限定される。配列決定をするために、このような短いＤＮＡ片を増幅することは難しい。しかしながら、多数のランダムな５０ｂｐ片を増幅することが可能であっても、短く、時には重複する配列を、大きなＤＮＡ片の完全配列へと集合させることは不可能であった。ハイブリダイゼーションによる配列決定の使用は、現在再配列決定（すなわち、すでに配列決定されている領域の配列を試験すること）に限定される。
【０１０７】
（Ｄ．長い配列を決定するためのＤＮＡ調製）
１塩基分離を用いて、１０００塩基よりも長いＤＮＡ分子を分離することは、現在とても難しいので、より長いＤＮＡ分子内においてＤＮＡ領域を配列決定するために特別な方法が考案された。「プライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ）」法は、長いＤＮＡ内における配列特異的部位で、サンガー反応を開始する。しかしながら、最も強調することは、（末端の１つが長いＤＮＡ分子内の特定の位置から始まるように）ＤＮＡを増幅する方法に関する。
【０１０８】
（１．プライマーウォーキング）
一度、配列の一部が決定されたら（例えば、末端５００塩基）、その配列の既知の部分に相補的なカスタム配列決定プライマーが作製され得て、ＤＮＡの未知の領域へさらに伸長するサンガージデオキシリボヌクレオチド停止反応をプライムするために使用され得る。この手段は、「プライマーウォーキング」と呼ばれる。新しいオリゴヌクレオチドを４００−１０００ｂｐごとに合成するための必要条件は、この方法を高価にさせる。その方法は緩慢である。なぜなら各々の工程は、並列にではなくむしろ連続して行われるからである。さらに、各々の新しいプライマーは、最適な条件が決定されるまで、有意な失敗率を有する。プライマーウォーキングは、ショットガン配列決定の後に読み取りされなかった配列において、ギャップを埋めるため主に使用されるか、もしくは長さ＜５，０００ｂｐの小さいＤＮＡフラグメント配列決定を完了するために使用される。しかしながら、ＷＯ  ００／６０１２１は、既知配列から未知配列までゲノムウォーキングするためにＰＣＲＴＭのための１つの合成プライマーを用いて、この問題に取り組んでいる。５’ブロック化プライマーは、変性テンプレートにアニールし、伸長され、引き続き既知配列の３’ブロック化オリゴヌクレオチドの伸長産物を連結し、これにより、既知標的ＤＮＡ配列の１つの領域のみを有する一本鎖分子を作製する。連結した３’ブロック化オリゴヌクレオチドを有する伸長産物から増幅産物を配列決定することにより、この工程は、連続的に隣接した未知配列を解明するために繰り返し適用され得る。
【０１０９】
（２．ＰＣＲＴＭ増幅）
ＰＣＲＴＭは、大きなＤＮＡ分子内の特定領域を増幅するために使用し得る。ＰＣＲＴＭプライマーは、特定領域に隣接するＤＮＡに相補的でなければならないので、この方法は、ＤＮＡの領域を「再配列決定」するためにＤＮＡを調製するためにだけ通常使用される。
【０１１０】
（３．ネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）欠失およびトランスポゾン挿入）
上に記載されているように、ヌクレアーゼ切断によりもたらされたネスト化欠失、もしくはトランスポゾン挿入を有する長いＤＮＡのクローニングまたはＰＣＲＴＭ増幅は、順序付けされたＤＮＡライブラリーを作製し得る。エキソヌクレアーゼが、ＤＮＡの片方の末端を連続的に消化するために使用される時、分子の片方の末端の位置に対していくらかコントロールをする。しかしながら、エキソヌクレアーゼ活性は、分子量で狭い分布を与えるようにはコントロールされ得ない。そのため、代表的には、エキソヌクレアーゼで処理されたＤＮＡは、クローニング前にＤＮＡサンプル末端の位置をよりいっそう選ぶため、電気泳動により分離される。トランスポゾン挿入は、ほとんどランダムであるので、どのクローンが特定の挿入部位に挿入を持つかを選ぶ前に、挿入エレメントを含むクローンはスクリーニングされなければならない。クローンスクリーニングの労働集約的工程は、約１０ｋｂ長未満のＤＮＡを除いて、これらの方法を実行不可能にさせる。
【０１１１】
（４．順序付けられたＤＮＡクローンを調製するための連結フラグメントＤＮＡプローブ）
ＣｏｌｌｉｎｓおよびＷｅｉｓｓｍａｎは、大きい染色体領域を順序付けられたクローンライブラリーへ分割するために、「連結フラグメントＤＮＡプローブおよびプローブクラスター」を使用することを提案している（米国特許第４，７１０，４６５号）。この特許は、部分的制限消化後ゲノムＤＮＡフラグメントをサイズ的に分画すること、各々のサイズ画分においてフラグメントを環状化して、ゲノムにおいて異なる物理的な距離で隔てられている配列間で連結部を形成すること、そして各々のサイズ画分の連結部をクローン化することを提案する。既知配列由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、各々のサイズ画分から得られた全てのクローンをスクリーニングすることにより、既知配列から異なる距離に配置された配列有する順序付けられたクローンライブラリーが作製され得た。この方法は、染色体に沿って１０６塩基の距離をウォーキングするように計画されたが、各々のサイズ画分から数十万個ものクローンを保持し、スクリーニングする必要性があったため、実用には至らなかった。さらに、交差ハイブリダイゼーションは、偽陽性クローンの大きな画分を産生することが予想された。
【０１１２】
（５．ショットガンクローニング）
配列決定のため５〜２０ｋｂより長いＤＮＡを調製するための唯一の実践的な方法は、配列決定するのに十分に小さいランダムなフラグメントとして、供給源ＤＮＡをサブクローニングすることである。大きな供給源ＤＮＡ分子は、超音波処理もしくは流体力学的剪断によりフラグメント化され、最適のフラグメントサイズを選ぶために分画され、そして細菌プラスミドもしくはウイルスゲノムにサブクローンされる（Ａｄａｍｓら，１９９４；Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，１９９８；ＣａｎｔｏｒおよびＳｍｉｔｈ，１９９９）。個々のサブクローンは、供給源ＤＮＡ内の配列を決定するため、サンガー反応もしくは別の配列決定反応に供され得る。多数の重複するサブクローンが配列決定された場合、大きい供給源ＤＮＡの全体配列が決定され得る。別の技術を超えるショットガンクローニングの利点は：１）配列とは無関係に高効率でクローン化され得るように、フラグメントはサイズが小さくサイズが均一である；２）フラグメントは両方の鎖がサンガー反応を用いて配列決定され得るのに十分に短くし得る；３）多数のクローンの形質転換および増殖は速く安価である；４）クローンはとても安定している。
【０１１３】
（Ｅ．ゲノム配列決定）
ゲノム（および約５ｋｂより大きな任意のＤＮＡ）を配列決定するための最近の技術は、ＤＮＡ全体からの小さいランダムなフラグメントのショットガンクローニングに依存する。細菌ゲノムおよび他のとても小さなゲノムは、直接的にショットガンクローン化および配列決定され得る。これは、「純粋ショットガン配列決定（ｐｕｒｅ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」と呼ばれている。大きなゲノムは、通常、大きな片としてまずクローン化され、各々のクローンがショットガン配列決定される。これは、「指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ショットガン配列決定」と呼ばれる。
【０１１４】
（１．純粋ショットガン配列決定（ｐｕｒｅ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））
数百万もしくは数十億の塩基対長までのゲノムは、ランダムにフラグメント化され得て、小さなフラグメントとしてサブクローンされ得る（Ａｄａｍｓら，１９９４；Ｐｒｉｍｏｒｏｓｅ，１９９８；ＣａｎｔｏｒおよびＳｍｉｔｈ，１９９９）。しかしながら、フラグメント化の過程において、天然ゲノム中のフラグメント配列の相対位置についての全情報は失われる。この情報は、異なるフラグメントの配列（コンピュータープログラムは、サブクローンから大きな連続配列（コンティグ）へとこの配列を集め得る）の間に十分に多数の重複を生成するように、５倍〜１０倍重複（すなわち、異なる反応で配列決定される塩基の数は、ゲノム中の塩基の５倍〜１０倍となる）で配列決定することにより回復され得る。しかしながら、ある領域は別な領域よりもクローン化することが困難であること、および不完全な統計的サンプリングに起因して、高度に重複した配列決定の後でさえ配列決定されていない領域がゲノム内に依然として存在する。これらの未知領域は「ギャップ」と呼ばれる。ショットガン配列をコンティグへと組み合わせた後、ギャップを充填することにより、配列決定は「仕上げられる」。仕上げは、サブクローンのさらなる配列決定によってか、コンティグの端で始まるプライマーウォーキングによってか、または隣接したコンティグの端からプライマーを用いて作製されたＰＣＲＴＭ産物を配列決定することにより行われなければならない。
【０１１５】
純粋ショットガン戦略にはいくつかの欠点がある：１）配列決定されるべき領域のサイズが増大するにつれて、ショットガンの読み取りから連続する配列を組み合わせる努力は、Ｎ  ＩｎＮ（Ｎは読み取りの数である）よりも速く増大する；２）反復ＤＮＡおよび配列決定エラーは、配列の組み合わせにおいて不明瞭さを引き起こし得る；３）ゲノム全体からのサブクローンは同時に配列決定され、配列の有意な重複が中程度のサイズのコンティグを得るために必要であるので、配列の精度およびコンティグサイズがゲノムについて相当の情報を得るために十分である以前に、配列決定の約５０％が完成されていなければならない。一つの領域に対して配列決定努力を集中することは、不可能である。
【０１１６】
（２．指向性ショットガン配列決定）
指向性ショットガンの戦略は、人ゲノムプロジェクト（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）により採用され、一度に一つの大きなクローンへと分析を限定することにより、配列組み合わせの困難を削減する。この「クローン・バイ・クローン（ｃｌｏｎｅ−ｂｙ−ｃｌｏｎｅ）」アプローチは、以下の４つの工程を必要とする。１）ａ）１００，０００〜３００，０００ｂｐサイズセグメントへのゲノムのランダムなフラグメント化、ｂ）大きなセグメントのクローニング、およびｃ）クローンの単離、選択およびマッピングから構成される、大インサートクローニング；２）ランダムなフラグメント化および多数の短いサブクローンとしての各クローンのサブクローニング；３）ランダムなサブクローンの配列決定、および重複する配列を連続する配列へと集合させること；ならびに４）連続する領域間のギャップを充填することおよび誤りを解決することによって、配列を「仕上げること（ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ）」。ゲノムにける大きなクローンの配列の位置は、マッピング工程により決定され、サブクローンの配列の位置は、そのサブクローンの重複配列決定および個々の大きなクローン配列のコンピューターによる集合によって、決定される。資源および時間の実質的初期投資が、配列決定が開始する前に初めの２つの工程で必要とされる。これは、異なる種もしくは個体に由来するＤＮＡの配列決定を阻害する。ランダムなサブクローンを配列決定することは、とても非効率的である。なぜなら、サブクローンが約７倍の重複度に配列決定されるまで、有意なギャップが存在するからである。仕上げは、「利口な（ｓｍａｒｔ）」作業者と、さらなる約３倍の配列重複度と同等の努力とを必要とする。
【０１１７】
指向性ショットガン配列決定法は、純粋なショットガン配列決定よりも大きなゲノムを仕上げる可能性がある。ヒトゲノムについて、例えば、指向性ショットガン配列決定に関するコンピューターの労力は、純粋ショットガン配列決定のために必要とされる労力の２０分の１未満である。
【０１１８】
ゲノム配列決定の配列決定工程および仕上げ工程を単純化するためのさらに大きな必要性がある。原則的には、これは、順序付けられたＤＮＡライブラリーを作製して一様な（ランダムではなく）適用範囲を与えることにより、行われる。このことは、約３倍重複度のみで正確な配列決定を可能にし、事業の仕上げ段階を除去する。順序付けられたライブラリーを産生するための最近の方法は、実用的ではない。なぜなら、それらは、短い領域（約５，０００ｂｐ）のみを網羅し得、かつ労働集約的であるからである。
【０１１９】
（Ｆ．ＤＮＡ再配列決定）
既知ＤＮＡ配列の存在もしくは既知配列の変化は、新規な配列決定よりも速くかつ安価である、種々の技術を用いて検出され得る。これらの「再配列決定」技術は、どの対立遺伝子が存在しているかを決定することが、予後判定的および診断的な価値を有する場合に、健康適用のために重要である。
【０１２０】
（１．特定ＤＮＡ配列のマイクロアレイ検出）
個々のヒトまたは動物に由来するＤＮＡは、通常ＰＣＲＴＭにより増幅され、検出可能な標識を用いて標識され、そして表面に結合した既知配列をＤＮＡスポットにハイブリダイズさせることによって、増幅される（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，１９９８；ＣａｎｔｏｒおよびＳｍｉｔｈ，１９９９）。その個体のＤＮＡが、ＤＮＡアレイ上の一つ以上のスポットと相補的な配列を含む場合、タグ化分子が物理的に検出される。その個体の増幅されたＤＮＡが、スポット中のプローブＤＮＡと相補的ではない場合、タグ化分子は検出されない。異なるデザインのマイクロアレイは、試験されたＤＮＡ量およびポジティブな結果のために必要な正確な配列相補性の量に対し、異なる感度を有する。マイクロアレイ配列決定技術の利点は、個体ＤＮＡの多数の領域が、多重ＰＣＲＴＭを用いて同時に増幅され得、増幅された遺伝的エレメントの混合物が、何千もの異なるプローブスポットを有するマイクロアレイに同時にハイブリダイズされ得、その結果、多数の異なる部位での変化が、同時に検出され得ることである。
【０１２１】
ＤＮＡを増幅させるためにＰＣＲＴＭを用いることに対する一つの欠点は、多重ＰＣＲＴＭが使用されない限り、一つの遺伝的エレメントだけが各反応において増幅され得、この場合、１０〜５０個程度の多さの座しか、同時に増幅され得ない。ＳＮＰ（一ヌクレオチド多型）スクリーニングのような特定の適用について、１，０００〜１００，０００個のエレメントを同時に増幅させ、そして増幅させた配列を同時に検出することは、有利である。ＰＣＲＴＭに対する第２番目の不利点は、制限された数のＤＮＡ塩基しか、各々のエレメント（通常＜２０００ｂｐ）から増幅され得る。多くの適用には、遺伝子全体を再配列決定することが必要であり、遺伝子全体は、２００，０００ｂｐ長まで達し得る。
【０１２２】
（２．再配列決定の別な方法）
マススペクトロメトリー、二次構造コンフォメーション多型性、連結物増幅、プライマー伸長、および標的依存性切断のような別の方法は、配列多型性を検出するために使用され得る。これらの方法は全て、ＰＣＲＴＭにより、一つ以上の特定の遺伝的エレメントの初回増幅を必要とするか、もしくはＰＣＲＴＭの同一欠陥を持つ増幅に別の形態を組み込むかのいずれかである。なぜなら、それは同時に非常に制限されたゲノム領域のみ増幅し得るからである。
【０１２３】
（ＩＩＩ．核酸の増幅）
増幅のためテンプレートとして有用な核酸は、標準的な方法により（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）、細胞、組織もしくは別のサンプルから単離され得る。特定の実施形態において、分析は、核酸テンプレートの実質的な精製なく、全細胞もしくはホモジネートした組織、もしくはの生物学的な液体サンプルに対して実施される。核酸はゲノムＤＮＡ、フラグメント化ＤＮＡもしくは全細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡが使用される場合、まず、そのＲＮＡを相補的なＤＮＡに変換することが所望され得る。
【０１２４】
「プライマー」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の核酸（テンプレートに依存的な工程で、初期の核酸の合成をプライミングできる）を包含することを意味する。代表的には、プライマーは、長さにおいて１０から２０および／もしくは３０塩基対のオリゴヌクレオチドであるが長い配列は使用され得る。一本鎖化形態が好ましいが、プライマーは、二本鎖および／もしくは一本鎖化形態が供給され得る。
【０１２５】
選択的に核酸とハイブリダイズさせるために設計されたプライマー対は、選択的なハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、テンプレート核酸と接触させる。所望の適用に依存して、高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件は、プライマーの完全な相補性配列へのハイブリダイゼーションを可能にするのみであるように選ばれ得る。別の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、プライマー配列を用いた、一つ以上のミスマッチを含む、核酸の増幅を与えるために、減少したストリンジェンシーの下で生じ得る。一度ハイブリダイズさせると、テンプレート−プライマーの複合体は、テンプレート依存性の核酸合成を助長する一つ以上の酵素と接触され得る。増幅の多数のラウンドは、「サイクル」ともいわれ、これは十分量の増幅産物が産生されるまで行われる。
【０１２６】
増幅産物は検出され得るか、もしくは量化され得る。特定の適用において、検出は視覚的な方法により実施され得る。あるいは、検出は、化学発光、取り込まれた放射性標識の放射性シンチグラフィーもしくは蛍光標識を適した、またはさらに電気的なおよび／もしくは熱インパルスシグナル（Ａｆｆｙｍａｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたシステムを通した産物の間接的な同定を包含し得る。
【０１２７】
多くのテンプレート依存性プロセスは、与えられたテンプレートサンプル中に存在する、オリゴヌクレオチド配列を増幅するために有効である。周知の増幅方法の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭといわれる）（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号ならびにＩｎｎｉｓら、１９９０に詳細が記載されており、それらの各々が本明細書中においてその全体が参考として援用される）である。簡単に、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅されるテンプレートＤＮＡ（各々の鎖に対して一つ）の２つの領域に相補的であり、過剰デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）および耐熱性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ）存在下で、テンプレートＤＮＡ（精製される必要はない）に付加される。一連の熱サイクル（代表的には３０〜３５回）において、標的ＤＮＡは反復的に変性され（約９０℃）、プライマーにアニールされ（代表的には５０〜６０℃）およびプライマーから娘鎖が伸長される（７２℃）。娘鎖が作製されるので、それらはその後のサイクルでテンプレートとして働く。このように、２つのプライマーの間のテンプレート領域は、線形的にというよりはむしろ、指数的に増幅される。
【０１２８】
逆転写ＰＣＲＴＭ増幅手順は、増幅されたｍＲＮＡ量を定量するために実施され得る。ＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写する方法は、周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に記載されている。逆転写のための代替方法は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は、ＷＯ  ９０／０７６４１に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応方法は当該分野で周知である。ＲＴ−ＰＣＲＴＭの代表的な方法は、米国特許第５，８８２，８６４号に記載されている。
【０１２９】
（Ａ．ＬＣＲ）
増幅のための別な方法は、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）であり、ヨーロッパ特許出願第３２０，３０８号に開示されている（本明細書中において参考として援用される）。ＬＣＲにおいて、二つの相補的なプローブ対が調製され、標的配列存在下で、各々の対は、それらが隣り合うように、標的の反対側の相補鎖に結合する。リガーゼ存在下で、二つのプローブの対は１単位を形成し結合する。ＰＣＲＴＭにおいて、熱サイクルによって、結合され、連結された単位は、標的から解離し、過剰プローブ対のライゲーションのため「標的配列」として働く。米国特許第４，８８３，７５０号は、明細書中において参考として援用され、標的配列へプローブ対を結合するためのＬＣＲと類似の方法を記載している。
【０１３０】
（Ｂ．Ｑβレプリカーゼ）
Ｑβレプリカーゼは、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号に記載されており、本発明の別の増幅方法としても使用され得る。この方法において、標的配列に相補性領域をもつ、ＲＮＡの複製配列は、ＲＮＡポリメラーゼ存在下でサンプルに添加される。ポリメラーゼは、検出され得る複製配列をコピーする。
【０１３１】
（Ｃ．等温増幅）
等温増幅法は、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼが標的分子（制限部位の一方の鎖にヌクレオチドチオフォスフェートを含む）の増幅を達成するために使用され、また、本発明において核酸の増幅に有用であり得る。このような増幅方法は、Ｗａｌｋｅｒら，１９９２に記述されており、本明細書中において参考として援用される。
【０１３２】
（Ｄ．鎖置換増幅）
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、鎖置換および合成（すなわちニックトランスレーション）の多数のラウンドを包含する、核酸の等温増幅を実行する別の方法である。類似の方法は、修復連鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれ、増幅のために標的化した領域全体に、いくつかのプローブをアニーリングし、その後、４塩基のうち２塩基のみが存在する修復反応を包含する。他の２塩基は、簡単な検出のため、ビオチン化誘導体として付加され得る。同様のアプローチがＳＤＡで使用される。
【０１３３】
（Ｅ．環状プローブ（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｒｏｂｅ）反応）
標的特異的配列はまた、環状プローブ反応（ＣＲＰ）を用いて検出され得る。ＣＲＰにおいて、非特異的ＤＮＡの３’配列および５’配列を有するプローブならびに特異的ＲＮＡの中間配列は、サンプルに存在するＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションにおいて、その反応は、ＲＮａｓｅＨを用いて処理され、プローブ産物は消化後に放出される特有の産物として同定される。オリジナルテンプレートは別の環状プローブでアニールされ、反応は繰り返される。
【０１３４】
（Ｆ．転写に基づいた増幅）
別の核酸増幅手順は、転写に基づいた増幅システム（ＴＡＳ）を包含し、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲを包含する（Ｋｗｏｈら，１９８９；ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ８８／１０３１５ら，１９８９、本明細書中において各々援用される）。
【０１３５】
ＮＡＳＢＡにおいて、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床サンプルの加熱変性、溶解緩衝液で処理、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためにミニスピン（ｍｉｎｉｓｐｉｎ）カラム、もしくはＲＮＡの塩酸グアニジニウム抽出により、増幅のために調製され得る。これらの増幅技術は、標的特異的配列を有するプライマーのアニーリングを包含する。重合後、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅＨを用いて消化され、二本鎖ＤＮＡ分子は再び加熱で変性される。いずれにしても、一本鎖ＤＮＡは、第２の標的特異的プライマーの付加、その後の重合により、完全に二本鎖にされる。二本鎖ＤＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７もしくはＳＰ６のような）により増大して転写される。等温循環反応において、ＲＮＡは二本鎖ＤＮＡへ逆転写され、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７もしくはＳＰ６のような）を用いて一旦再び転写される。結果産物は、短縮化されているかもしくは完全であるかのいずれであっても、標的特異的配列を表す。
【０１３６】
（Ｇ．ローリング環状増幅）
ローリング環状増幅（米国特許第５，６４８，２４５号）は、環状テンプレートを用いることにより、鎖置換反応の有効性を増大させるための方法である。ポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性をもたず、テンプレート周囲に多数の連続的な環を作製するので、環状テンプレート上に多数の情報コピーを作製する。産物の長さは、非常に大きく、典型的には、あまりにも大きいため直接的に配列決定することができない。さらなる増幅は、第２鎖置換プライマーがテンプレートとして第１鎖置換産物を用いた反応に添加されれば、達成される。
【０１３７】
（Ｈ．別の増幅方法）
別の増幅方法は、イギリス特許出願第ＧＢ２，２０２，３２８号、およびＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号（各々本明細書中において参考として援用される）に記述されており、本発明に従って使用され得る。前者の出願において、「改変された」プライマーはＰＣＲＴＭと同様、テンプレートおよび酵素に依存した合成で使用される。プライマーは捕獲部分（例えば、ビオチン）および／もしくは検出部分（例えば、酵素）で標識することにより、改変され得る。後者の出願において、過剰な標識化プローブは、サンプルに添加される。標的配列存在下で、プローブは結合し、触媒で切断される。切断後、標的配列は過剰なプローブにより結合されたままであるように放出される。標識化プローブの切断は、標的配列の存在を示す。
【０１３８】
Ｍｉｌｌｅｒら、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ  ８９／０６７００（本明細書中において参考として援用される）は、標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、その後の多数のＲＮＡコピー配列の転写、に基づいた核酸配列増幅構成を開示する。この構成は循環的でなく、すなわち、新しいテンプレートは得られたＲＮＡ転写産物から産生されない。
【０１３９】
別の適切な増幅方法は、「ＲＡＣＥ」および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）  ＰＣＲＴＭ」（Ｆｒｏｈｍａｎ，１９９０；Ｏｈａｒａら，１９８９，  各々、本明細書中において参考として援用される）を包含する。得られる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で、二つ（以上）オリゴヌクレオチドの連結に基づき、それによりジオリゴヌクレオチドを増幅する方法は、本発明の増幅工程において使用され得る（Ｗｕら，１９８９，  本明細書中において参考として援用される）。
【実施例】
【０１４０】
以下の実施例は、発明の好ましい実施形態を示すために包含される。以下の実施例に開示される技術は、発明の実施において、十分に機能することを本発明者により発見された技術を表し、従って、実施のために好ましい様式を構成するために考慮され得ることが当業者により理解される。しかしながら、本開示を考慮して、当業者は、多数の変更が、開示される特定の実施形態において行われ得、また、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、同類もしくは同様の結果を得ることを認識する。
【０１４１】
（実施例１：流体力学的剪断によるＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡからのＴＲＦライブラリーの調製）
この実施例は、特に流体力学的剪断（ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒデバイス，ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ）およびデオキシグアノシントリフォスフェート（ｄＧＴＰ）を用いたターミナルトランスフェラーゼを介したテーリングにより、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡから平均サイズ３ＫｂのＴＲＦライブラリーの調製を記述する。
【０１４２】
調製されたライブラリーは、一つの配列特異的プライマーおよび万能ホモポリマープライマーＣ１０（１０のシトシンを包含する）を用いて、多数のネスト化ＤＮＡ混合物の再現可能な増幅を与える。同一のプライマーを用いたこれらの混合物の配列決定は、選択されたカーネルプライマー（ｋｅｒｎｅｌ  ｐｒｉｍｅｒ）に隣接した６００から８００塩基の読み取りを生成する。
【０１４３】
ＤＮＡは、標準的な精製により、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＭＧ１６５５株のような（Ｙａｌｅ大学から手に入れた））から単離され、ＴＥ−Ｌ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で１００ｎｇ／μｌまで希釈される。サンプルは、４５℃で１５分間インキュベートされる。インキュベーション過程の間、ＤＮＡサンプルは３分ごとに３０秒間、最大速度でボルテックスされる。サンプルは、室温で１５分間、１６，０００×ｇで遠心分離される。上清をゆっくり吸引し、きれいなチューブに移して、最後の３０μＬを捨てる。
【０１４４】
１５０μｌＤＮＡ調製物のアリコートを、製造者のプロトコルに従ってスピードコート９で２０パスの間、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ装置（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）で機械的なフラグメント化に供する。剪断ＤＮＡは、製造者によって予測された通り、約３ｋｂの平均サイズを有し、ゲル電気泳動により確認される。ＤＮＡキャリーオーバーのコンタミネーションを妨ぐため、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒの剪断アセンブリを、フラグメント化前後に、０．２Ｍ  ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＯＨで各々３回ずつ洗浄され、ＴＥ−Ｌバッファーで５回洗浄する。全ての溶液を、使用前に０．２μｍで濾過する。
【０１４５】
ホモポリマーＧテールは、約１０〜１５のヌクレオチドを含み、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより、酵素学的にＤＮＡフラグメントの３’末端に付加される。８０ｎｇ／μｌのＤＮＡテンプレートを、１×ＮＥＢ制限緩衝液＃４（０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、および２μＭ  ｄＧＴＰを含み、最終容量は５０μｌ）中で３７℃で１５分間、１０単位のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）ターミナルトランスフェラーゼと共にインキュベートする。その反応を、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）５μｌを付加することにより終了する。サンプルに、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）の１／１０容量を補充し、２μｇグリコゲン存在下で２．５容量のエタノールで沈殿させ、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、次いでそのペレットは室温で７０％エタノールで２回洗浄し、ＴＥ−Ｌ緩衝液に溶解する。
【０１４６】
（実施例２：流体力学的剪断により調製されたＴＲＦライブラリー由来の特異的プライマーを用いたＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ領域の増幅および配列決定）
ランダムなフラグメント化により生成されたＤＮＡ分子を用いたＤＮＡ増幅および配列決定
この実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉＴＲＦライブラリー由来の特定領域の増幅および配列決定を記述する。ＰＣＲＴＭ増幅の間、特異的プライマーを、１０塩基ホモポリマーシトシンプライマー（Ｃ１０プライマー）に沿って使用する。得られたアンプリコンは、次いで、ＰＣＲＴＭで使用された同一の特異的プライマーを用いて、サイクル塩基配列のためテンプレートとして利用される。
【０１４７】
増幅プライマーは、オリゴバージョン６．５３プライマー分析ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）を用いて設計される。プライマーは、２１〜２３塩基長で、高度な内部安定性、低い３’末端安定性、５７〜６２℃の融解温度（５０ｍＭ塩、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２において）を有する。プライマーは、全ての標準判断基準（例えば、低いプライマーダイマーおよびヘアピン形成）を満たすように設計され、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの５マー頻度データベースに対して濾過される。
【０１４８】
非限定的な例示の目的のため、ＰＣＲＴＭ増幅でのオリゴヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡの６つの特定領域のアンプリコンを標的にするために設計される：プライマーＳ１，Ｓ３，Ｓ７，Ｓ３１，Ｓ３６およびＳ４１（表１）。
【０１４９】
【表１】
2005535283.tif 000002
2005535283.tif 000003
ＰＣＲＴＭ増幅は、２００ｎＭの特異的プライマー、２００ｎＭの万能Ｃ−１０プライマー、および４０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉＴＲＦライブラリーＤＮＡ（実施例１に記述されている）を最終容量２５μｌにして、標準チタンＴａｑポリメラーゼ条件（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）下で実施する。９４℃２分間での最初の変性後、サンプルを、３２サイクル（９４℃１０秒、６８℃２分１５秒、最後の伸長は７２℃２分）に供する。コントロール反応を、同じ条件下で、２００ｎＭのＣ−１０プライマーのみを用いて実施する。１２μｌの各々のＰＣＲＴＭ反応のアリコートを、１％アガロースゲルの電気泳動により分析する（図８および図９）。示されるように、特定の別個のバンドを、フラグメント化非テール化ＤＮＡ（図９）から増幅されるが、ＴＲＦライブラリーＤＮＡがテンプレートとして使用される場合、均一なスメアが得られる。このスメアは、フラグメント化のランダムな過程を示す。
【０１５０】
ＰＣＲＴＭ増幅産物を、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  Ｉｍａｇｅｒソフトウエア（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）の容量定量分析器を用い、標準ＤＮＡマーカーと比較することにより、染色されたゲルから定量する。ＰＣＲＴＭ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）（３０μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出される）により、プライマーおよびヌクレオチドを含まないように精製され、そしてＰＣＲＴＭで使用された同一のプライムを用いたサイクル配列決定のテンプレートとして使用される。
【０１５１】
サイクル配列決定は、４０〜２５０ｎｇの総ＤＮＡのを含む、２〜１１μｌの配列決定テンプレートと、５μＭの各々の配列決定プライマーの１μｌおよびＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーター試薬混合物（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の８μｌとの、９６ウェルプレートで最終容量２０μｌでの混合により実施される。増幅は、３０サイクル実施される：９４℃２０秒、５８℃１５秒、６０℃７５秒。サンプルを、７０％エタノールを用いて沈殿させ、製造者のプロトコルを用いて、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００キャピラリー電気泳動配列決定システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で分析する。
【０１５２】
表ＩＩは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの６つの領域から得られた配列決定結果の要旨を示す。
【０１５３】
【表２】
2005535283.tif 000004
分析された配列の平均的な読み取りの長さは、６００塩基以上である。１００以下の塩基が同定可能である場合、配列は失敗とみなされる。有効な配列決定の読み取りを、Ｐｈｒｅｄアルゴリズム（Ｃｏｄｏｎ  Ｃｏｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）を用いて、＞２０の前もって設定された閾値スコアに制限し、それは１％の確立と誤差に対応する。公表されたＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＧ１６５５配列と比較した、配列の正確度は、９８％以上である。
【０１５４】
従って、この実施例は、特定のゲノム領域が増幅され得、流体力学的剪断により細菌ＤＮＡから生成されたＴＲＦライブラリーから高レベルの正確度で、長い読み取り長さで配列決定される。
【０１５５】
（実施例３：ＴＲＦライブラリーから作製されたＤＮＡアンプリコン内のプライマーウォーキングによる増幅および配列決定）
この実施例は、プライマーウォーキングのアプローチによるＥ．ｃｏｌｉＴＲＦライブラリー（流体力学的剪断により調製された）からの特定領域の増幅および配列決定を記述する。Ｔｏｕｃｈ  Ｄｏｗｎ  ＰＣＲＴＭ（ＴＤ  ＰＣＲＴＭ）増幅の間、特異的プライマーは、万能１０ｍｅｒポリＣ（Ｃ１０）プライマーに沿って使用される。ＴＤ  ＰＣＲＴＭの条件は、増幅産物の産生を増大するように選ばれる。次いで生じたアンプリコンは、増幅プライマーに対して遠位のプライマー（３’方向）を用いて、サイクル配列決定のためのテンプレートとして利用される。遠位のプライマー、すなわちウォーキングプライマーは、代表的に、重複している配列決定の読み取りを作製するために間隔をあけられる。次いで読み取りは、組み合わされて、一つの長い連続した形態配列が形成される。
【０１５６】
プライマーＳ１を、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡアンプリコンＳ１（図１および表１）の一つの特定領域の増幅（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を標的化するように設計する。ＴＤ  ＰＣＲＴＭ増幅を、標準的なチタンＴａｑポリメラーゼ条件（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）下において、３００ｎＭの特異的プライマー、３００ｎＭの万能Ｃ１０プライマーおよび４０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉＴＲＦライブラリーＤＮＡ（実施例１に記述された）を用いて最終容量２５μｌで実施する。９５℃２分での最初の変性後、サンプルを、各々のサイクルで０．５℃ずつ温度を減少させながら、２０サイクル（９５℃１５秒、７３℃２分１５秒）に供する。次の増幅ラウンドは、各々のサイクルで伸長時間を１秒ずつ増やしながら、２５サイクル（９５℃１５秒、６０℃２分）である。
【０１５７】
ＰＣＲＴＭ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲＴＭ精製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）（３０μｌの１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で溶出する）により、プライマーおよびヌクレオチドを含まないように精製し、より遠位のウォーキングプライマーを用いて、サイクル配列決定のテンプレートとして使用する。
【０１５８】
アンプリコンＳ１内の配列決定のためのプライマーおよびウォーキングのためのプライマーを、ＰＣＲＴＭ増幅のために使用された開始プライマーから、または別のプライマー（プライマーＴ４およびＴ５；表Ｉ）から６００〜７００塩基離れるように設計する。サイクル配列決定は、前述した通り（実施例２）実施する。
【０１５９】
分析されたゲノム領域（アンプリコンＳ１）は、図１０に示される。第１領域の配列決定は、配列決定プライマーとしてＳ１を用いることにより獲得される。結果は、実施例２に表される（表２参照）。
【０１６０】
アンプリコンＳ１（図１０参照）の第２領域および第３領域の配列決定は、それぞれＴ４およびＴ５配列決定（「ウォーキング」）プライマーを用いることにより達成される。このアプローチを用いることで、２．２ｋｂが配列決定され、このうちの１．７Ｋｂは、高質配列情報（Ｐｈｒｅｄスコア＞２０）を表す。
【０１６１】
表ＩＩは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの三つの特定領域について得られた配列決定結果の要旨を示す。分析された配列の平均読み取り長は、Ｐｈｒｅｄアルゴリズムを用い、＞２０閾値スコアで５００塩基である。公開されたＥ．ｃｏｌｉＫ１２ＭＧ１６５５配列と比較した配列の正確度は９８％以上である。
【０１６２】
従って、この実施例は、ＴＲＦライブラリーから作製されたアンプリコン内の２ｋｂの距離上に、「ウォーキング」の能力があることを論証する。
【０１６３】
（実施例４：流体力学的剪断によるヒトゲノムＤＮＡからＴＲＦライブラリーの調製）
この実施例は、流体力学的剪断によるヒトゲノムＤＮＡからの、約３ｋｂの平均サイズのＴＲＦライブラリーの調製を記述する。
【０１６４】
ＤＮＡを、新鮮なヒトリンパ球から標準的な精製により単離し、ＴＥ−Ｌ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；０．１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）で１００ｎｇ／μｌに希釈する。このサンプルを、４５℃１５分でインキュベートする。インキュベーションの過程の間、ＤＮＡサンプルを、３分毎に３０秒間、最大速度でボルテックスする。次いで、このサンプルを、室温で１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。粒子物質の存在を避けるために、上清をゆっくりと吸引し、清潔なチューブに移し、最後の５０μｌを捨てる。
【０１６５】
１８０μｌＤＮＡ調製物のアリコートを、製造者のプロトコルに従って、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ装置（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）（スピードコード９で２０パス）で機械的なフラグメント化に供する。剪断ＤＮＡは、製造者によって予測された通り、約３ｋｂの平均サイズを有し、ゲル電気泳動により確認される。ＤＮＡキャリーオーバーのコンタミネーションを妨げるため、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒの剪断アセンブリを、フラグメント化前後に、０．２Ｍ  ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＯＨで各々３回ずつ洗浄し、ＴＥ−Ｌ緩衝液で５回洗浄する。全ての洗浄液は、使用前に０．２μｍで濾過される。
【０１６６】
ホモポリマーＧテールは、約１０〜１５のヌクレオチドを含み、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより、酵素学的にＤＮＡフラグメントの３’末端に付加される。２０ｎｇ／μｌのテンプレートＤＮＡは、１×ＮＥＢ制限緩衝液＃４（０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、および２μＭ  ｄＧＴＰを含み、最終容量は１００μｌ）中で３７℃で２０分間、４０単位のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）ターミナルトランスフェラーゼと共にインキュベートする。その反応を、４μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を添加することにより終了する。このサンプルに、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を補充し、２μｇグリコゲン存在下で２．５容量のエタノールで沈殿させ、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、次いでそのペレットを室温で７０％エタノールで２回洗浄し、そしてＴＥ−Ｌ緩衝液に溶解する。ライブラリーＤＮＡを、−２０℃で貯蔵する。
【０１６７】
（実施例５：流体力学的剪断により調製されたＴＲＦライブラリー由来のヒトｔｐ５３遺伝子領域の位置増幅および配列決定）
この実施例は、流体力学的剪断により調製されたＴＲＦライブラリー由来の特定のヒトｔｐ５３遺伝子領域の増幅および配列決定を記載する。ＰＣＲＴＭ増幅の一次工程において、特定の近位プライマーを、一般的な１０マーのポリＣ（Ｃ１０）プライマーとともに使用する。この増幅されたＤＮＡを希釈し、Ｃ１０プライマーと併用して特定の遠位プライマーを用いて、ネスト化ＰＣＲＴＭ増幅もしくは二次ＰＣＲＴＭ増幅のためのテンプレートとして使用する。次いで、ネスト化増幅産物を、ネスト化ＰＣＲＴＭで使用された同じプライマーもしくはさらに遠位の配列決定プライマーを用いて、サイクル配列決定のためのテンプレートとして利用する。
【０１６８】
増幅プライマーを、オリゴ（バージョン６．５３）プライマー分析ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）を用いて設計する。プライマーは２１〜２３塩基長であり、高い内部安定性を有し、低い３’末端安定性を有し、かつ５７〜６２℃（５０ｍＭ塩および２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）の温度で融解する。プライマーを、全ての標準的な基準（例えば、低いプライマーダイマーおよびヘアピン形成）を満たすように設計し、ヒトゲノムデータベースの６マー度数表に対して濾過する。
【０１６９】
一次ＰＣＲＴＭ増幅のためのオリゴヌクレオチドを、ヒトｔｐ５３遺伝子の三つの特定領域のアンプリコンを標的化するように設計する：エキソン５、エキソン６およびエキソン７を包含する標的領域に特異的なプライマーＨＳ３＋、エキソン７、エキソン８およびエキソン９のプライマーＨＳ４＋、エキソン１１のプライマーＨＢ７−（図１１および表Ｉ）。一次ＰＣＲＴＭを、標準的なチタンＴａｑポリメラーゼ条件下（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で、２４０ｎＭの特定プライマー、１００ｎＭの万能Ｃ１０プライマー、および２００ｎｇのヒトＴＲＦライブラリーＤＮＡ（実施例４に記載される）を最終容量２５μｌで行う。９４℃にて２分間の初期変性後、サンプルを、３７サイクル（９４℃で１０秒、６８℃で２分１５秒、最終伸長は７２℃で３分）に供する。コントロール反応を、テンプレートとしてテール化ヒトＤＮＡではなく、２００ｎｇのフラグメント化ヒトＤＮＡを用いるか、もしくはＣ１０プライマーのみを用いて、同じ条件下で行う。１５μｌの各々のＰＣＲＴＭ反応のアリコートを、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析する（図１２）。図に示す通り、分離バンドの特異的なパターンを、フラグメント化した、非テール化ＤＮＡから増幅する。しかし、ＴＲＦライブラリーＤＮＡがテンプレートとして使用される場合、不変スメアが得られる。このスメアは、フラグメント化のランダムなプロセスを反映し、平均的なライブラリーサイズ（すなわち、３Ｋｂ）から数百塩基対以下のサイズ領域に広がる。
【０１７０】
一次増幅のために使用された同じプライマーもしくはネスト化プライマーのいずれかを用いて、直接的にヒトＴＲＦライブラリーから一次アンプリコンを配列決定する試みは、失敗に終わった。それは、細菌ＴＲＦライブラリーアンプリコン（実施例２）からの配列決定結果とは異なっていた。同一プライマーを利用した場合において、配列決定クロマトグラムは混合され、これは、一つより多い配列の存在を示している。ネスト化プライマーの場合、プライマー濃度が二倍にされるかまたはテンプレートが配列決定反応あたり数百ｎｇまで増加されたとしても、そのシグナルは低すぎる。
【０１７１】
図１３は、ＨＳ４＋およびＣ１０プライマーを用いた一次ＰＣＲＴＭ増幅で使用されたライブラリーＤＮＡ量の滴定を表す。図に示す通り、使用された最も少ないＤＮＡ量（すなわち、５０ｎｇ）において、非テール化の、剪断化ＤＮＡを用いたコントロールサンプルにおいて、分離バンドの増幅は存在しない。なお、スメアは、Ｇテール化ライブラリーサンプルにおいて増幅された。高量のテンプレートは、コントロールにおいて多数の分離バンドの出現の原因となる。従って、引き続く一次増幅において、テンプレート量を、ＰＣＲＴＭ反応につき５０ｎｇで維持した。少量のＤＮＡを用いるさらなる利点は、Ｇテール化ライブラリーから増幅されたスメアにおいて、分離バンドを欠如していることである。特に、バンドが短い産物であった場合、このようなバンドの存在は、シグナル強度（図１２、レーン６とレーン９との比較）の突然および早期の減少に起因して、二次アンプリコンからの配列決定の質を落とし得る。
【０１７２】
二次ＰＣＲＴＭを、テンプレート、万能Ｃ１０プライマー、および一次増幅部位から下流に位置された特定のプライマーとして、希釈された一次アンプリコンを用いて実施する。使用されたプライマーは：ＨＳ２＋およびＨＳ４＋、プライミング部位ＨＳ３＋のネスト化；ＨＳ１４１７７＋、プライミング部位ＨＳ４＋のネスト化；ＨＢ８−、プライミング部位ＨＢ７−のネスト化（図１１および表Ｉ）である。ＰＣＲＴＭ増幅を、２００ｎＭのネスト化プライマー、１００ｎＭ  Ｃ１０プライマーおよびテンプレートとして１，０００〜１０，０００倍に希釈された一次アンプリコンの１μｌを用いて、２５μｌの二重反応で行う。ＰＣＲＴＭ条件は、９４℃にて２分間の初期変性、９４℃にて１０秒の初回サイクル、６８℃２分１０秒、３６を超えるサイクルでは１サイクルにつき２秒の伸長時間の増加を包含する。１０μｌの各々のＰＣＲＴＭ反応のアリコートを、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析する（図１４）。図に示す通り、増幅されたフラグメントの分離パターンを、二次増幅において得る。
【０１７３】
二次ＰＣＲＴＭ増幅産物を、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  Ｉｍａｇｅｒソフトウエア（Ｂｉｏ  Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の容量定量ツールを用い、標準ＤＮＡマーカーバンドに対する、染色ゲルから定量化する。ネスト化ＰＣＲＴＭ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、プライマーおよびヌクレオチドなしで精製し、５０μｌの３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に溶解し、ネスト化ＰＣＲＴＭで使用した同じプライマー、もしくはウォーキング配列決定のためのさらなるネスト化プライマーを用いたサイクル配列決定のテンプレートとして使用する。
【０１７４】
サイクル配列決定を、２〜１１μｌの配列決定テンプレート（総ＤＮＡの４０〜２５０ｎｇを含む）を、２０μｌの最終容量で９６ウェルプレート中、各配列決定プライマーおよび８μｌのＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーター試薬混合物（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の５μＭ溶液の１μｌと混合することによって行う。増幅を、以下の３０サイクル実施する：９４℃にて２０秒、５８℃にて１５秒、および６０℃にて７５秒。サンプルを、７０％エタノールを用いて沈殿化させ、製造業者のプロトコルを用いて、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００キャピラリー電気泳動配列決定システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で分析する。
【０１７５】
表ＩＩは、３つの標的化ｔｐ５３ゲノム領域で得られた配列決定結果の要旨を示す。分析された配列の平均的な読み取り長は、６００塩基を超える。もし１００以下の塩基が同定可能である場合、配列決定は失敗したとみなされる。有効な配列決定の読み取りは、フレッド（Ｐｈｒｅｄ）アルゴリズム（Ｃｏｄｏｎ  Ｃｏｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）を用い、＞２０の事前に設定した閾値スコアにした。これは、１％の確率誤差に相当する。公表されたヒトｔｐ５３配列（ＡＦ１３６２７０およびＸＭ０４３２１１）と比較して、配列の正確度は９８％もしくはそれ以上である。
【０１７６】
従って、この実施例は、高等真核生物由来のＴＲＦライブラリーから高レベルの精度で、特定のゲノム位が増幅され得、配列決定され得ることを実証する。
【０１７７】
（実施例６：流体力学的剪断によるトウモロコシゲノムＤＮＡからのＴＲＦライブラリーの調製）
この実施例は、流体力学的剪断によるトウモロコシゲノムＤＮＡからの平均サイズ約３ＫｂのＴＲＦライブラリーの調製を記述する。
【０１７８】
野生型６Ｎ６１５トウモロコシ株からのＤＮＡを、指定の修飾を用いたＲｏｃｈｅ（Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号１６６７  ３１９）を使用して、種子から単離する。２ｇの植物組織材料を、液体窒素で凍らせ、最大速度で２分間ボルテックスすることにより、５つの粉砕ビーズを用いて加工処理する。ビーズを取り除き、粉砕した植物材料を、製造業者のプロトコルに従って、１０分間６５℃で溶解する。タンパク質および他の不純物を、氷上で沈殿させ、上清を、布フィルターを通して濾過することにより浄化し、全核酸を、−２０℃で２０分間沈殿させる。そのペレットを、７０％エタノールで３回洗浄し、６５℃にて３００μｌ緩衝液＃４に溶解し、上清を、３７℃で２５分間、１８μｌのＲＮａｓｅカクテル（Ａｍｂｉｏｎ；Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）（５００Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ，２０，０００Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ｔ１）で処理する。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（容量で２５：２４：１）を用いて二相に抽出した後、水相に、室温で１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０および２．５容量の無水エタノールを補充する。ＤＮＡペレットを、７０％室温エタノールで４回洗浄し、ＤＮＡを、３００μｌのＴＥ−Ｌ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解する。代表的な収量は、組織１グラムあたり３０〜６０μｇＤＮＡである。
【０１７９】
ゲノムＤＮＡを、ＴＥ−Ｌ緩衝液で１００ｎｇ／μｌに希釈する。サンプルを４５℃にて５分間インキュベートし、最大速度で２分間ボルテックスし、室温で１０分間１６，０００×ｇで遠心分離する。粒子体の存在を避けるために、上清をゆっくりと吸引し、きれいなチューブに移し、最後の５０μｌは捨てる。１８０μｌのＤＮＡ調製のアリコートを、製造業者のプロトコルに従って、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒデバイス（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）（スピードコード９で２０段階）を用いて機械的なフラグメント化に供する。剪断ＤＮＡは、製造者によって予測された通り、３ｋｂの平均サイズを有し、ゲル電気泳動により確認される。ＤＮＡの混入を防止するため、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒの剪断アセンブリを、フラグメント化前後に、０．２Ｍ  ＨＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＯＨで各々３回ずつ洗浄し、ＴＥ−Ｌ緩衝液で５回洗浄する。全ての洗浄液を、使用前に０．２μｍで濾過する。
【０１８０】
ホモポリマーＧテールは、約１０〜１５のヌクレオチドを含み、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより、酵素学的にＤＮＡフラグメントの３’末端に付加される。２０ｎｇ／μｌのＤＮＡテンプレートを、１×ＮＥＢ制限緩衝液＃４（０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、５〜２０μＭ  ｄＧＴＰを含む）中、最終容量１００μｌで３７℃にて２０分間、４０単位のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）ターミナルトランスフェラーゼとともにインキュベートする。反応を、４μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えることにより終了する。このサンプルに、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を補充し、２μｇグリコゲン存在下で２．５容量のエタノールで沈殿させ、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、次いで、そのペレットを室温で７０％エタノールで２回洗浄し、ＴＥ−Ｌ緩衝液に溶解する。１μｇのライブラリーのアリコートを、１％アガロースゲルでの電気泳動によって分析する。ライブラリーＤＮＡを、−２０℃で保管する。
【０１８１】
（実施例７：流体力学的剪断により調製されたＴＲＦライブラリーからの、トウモロコシにおける４つのゲノム領域の位置的増幅および配列決定）
この実施例は、ＴＲＦライブラリー（図１５）由来の４つの特定のトウモロコシゲノム領域の増幅および配列決定を記載する。ＰＣＲＴＭ増幅の一次工程において、近位プライマーを、一般的な１０−マーのポリ−Ｃ（Ｃ１０）プライマーとともに使用する。この増幅されたＤＮＡを希釈し、遠位プライマーおよびＣ１０プライマーを用いて、ネスト化ＰＣＲＴＭ増幅もしくは二次ＰＣＲＴＭ増幅のためのテンプレートとして使用する。次いで、ネスト化増幅の産物を、ネスト化ＰＣＲＴＭで使用された同じプライマーもしくはさらに遠位のウォーキング配列決定プライマーを用いて、サイクル配列決定のためのテンプレートとして利用する。
【０１８２】
増幅プライマーを、オリゴバージョン６．５３プライマー分析ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）を用いて設計する。プライマーは、２１〜２３塩基長であり、高度な内部安定性を有し、低い３’末端安定性を有し、５７〜６２℃の温度（５０ｍＭ塩および２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で融解する。プライマーを、全ての標準判断基準（例えば、低いプライマーダイマーおよびヘアピン形成）を満たすように設計し、トウモロコシゲノムデータベースの６マー頻度表に対して濾過する。
【０１８３】
一次ＰＣＲＴＭを、２００ｎＭの特定プライマー、１００ｎＭの万能Ｃ１０プライマー、および８０ｎｇのトウモロコシＴＲＦライブラリーＤＮＡ（実施例６に記述されている）を用いて、最終容量２５μｌで標準チタンＴａｑポリメラーゼ条件（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）下で実施する。９４℃にて２分間での最初の変性後、サンプルを、３７サイクル（９４℃にて１０秒、６８℃にて２分１５秒、最後の伸長は７２℃にて３分）に供する。いくつかの場合（ゲノム領域３および４：以下参照）では、一次ＰＣＲＴＭ増幅を、９４℃にて２分間の初期変性、９４℃にて１０秒間の初回サイクル、６８℃にて２分１０秒、３６を超えるサイクルでは１サイクルにつき２秒の伸長時間の増加により行う。コントロール反応を、テンプレートとしてテール化ヒトＤＮＡではなく、８０ｎｇフラグメント化ヒトＤＮＡを用いて、同じ条件下で実施する。１２μｌの各々のＰＣＲＴＭ反応のアリコートを、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析される。
【０１８４】
二次（ネスト化）ＰＣＲＴＭを、テンプレートとして希釈した一次アンプリコン、万能Ｃ１０プライマーおよび初回増幅部位から下流にある特定のプライマーを用いて実施する。ＰＣＲＴＭ増幅は、９４℃にて２分間の初期変性、９４℃にて１０秒の初回サイクル、６８℃にて２分１０秒、３６を超えるサイクルでは１サイクルにつき２秒の伸長時間の増加により、２００ｎＭのネスト化プライマー、１５０ｎＭ  Ｃ−１０プライマーおよびテンプレートとして１，０００倍に希釈された一次アンプリコンの１μｌを用いた、２５μｌの重複反応である。１０μｌの各々のＰＣＲＴＭ反応のアリコートを、１％アガロースゲルでの電気泳動により分析する。
【０１８５】
第２のＰＣＲＴＭ増幅の産物を、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  Ｉｍａｇｅｒソフトウエア（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）の容量定量化ツールを用いて、標準ＤＮＡマーカーバンドに対して定量化する。ネスト化ＰＣＲＴＭ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプライマーおよびヌクレオチドを含まないようにし、５０μｌの３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に溶出し、ネスト化ＰＣＲＴＭについて使用された同一のプライマー（ｐｒｉｍｅ）またはウォーキング配列決定のためのさらなるネスト化プライマーを用いたサイクル配列決定のテンプレートとして使用する。サイクル配列決定は、４０−２５０ｎｇの総ＤＮＡを含む、２〜１１μｌの配列決定テンプレートを、１μｌの５μＭの各々の配列決定プライマーおよび８μｌのＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーター試薬ミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と、９６ウェルプレートで最終容量２０μｌに混合することによって実施される。増幅は以下で３０サイクルである：９４℃２０秒、５８℃１５秒、６０℃７５秒。サンプルを、７０％エタノールを用いて沈殿化し、製造業者のプロトコルを用いて、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００キャピラリー電気泳動配列決定システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で分析される。１００以下の塩基が同定され得る場合は、配列決定は失敗であるとみなされる。有効な配列決定の読み取りを、Ｐｈｒｅｄアルゴリズム（Ｃｏｄｏｎ  Ｃｏｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）を用い、前もって設定された２０を超える閾値スコアを制約した。それは１％のエラー率に相当する。
【０１８６】
以下のゲノム領域を分析する（図１５参照）：
（領域１．ａｓｇ６０．ｓ１ｂ）その配列は、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（これらのウェブサイト上で見い出され得る）で公表された第５染色体にマップされた４５６ｂｐ  ＳＴＳである。未知の下流隣接領域を、増幅し、第１増幅のためにプライマーａｓｇ６０．ｓ１  １３３＋を用い、そしてネスト化増幅および配列決定（表Ｉ）の両方のためにプライマーａｓｇ６０．ｓ１  ４０５＋を用いて配列決定する。３つの個々の配列決定連続ランからの平均な読み取り（ｒｅａｄｓ）長は、２０を超えるＰｈｒｅｄスコアで５６２塩基（５４７−５８１の範囲）である。６９６ｂｐのコンセンサス配列を、３つの配列決定クロマトグラムファイルから組み立てる。
【０１８７】
（領域２．Ｍａｙｓｉｎｅエンハンサー）トウモロコシ転写調節遺伝子に対応する１，３７６ｂｐの遺伝子領域（登録番号ＡＦ１３６５３０）は、トウモロコシの絹Ｍａｙｓｉｎｅエンハンサーと相同であり、第３染色体上のｓｈ２−ａｌ領域に単一コピー遺伝子としてマップされる（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｍａｉｚｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ）。未知の上流隣接領域は、トウモロコシＴＲＦライブラリーからの第１ＰＣＲＴＭにおいて、プライマーＺｅａ  Ｘ２１１−およびＺｅａ  Ｘ２５４−を用いて増幅され、ネスト化ＰＣＲＴＭ（表Ｉ，図１６）においてプライマーＺｅａ  Ｘ２１１−、Ｚｅａ  Ｘ１４９−およびＺｅａ  Ｘ４９−を用いて再増幅される。各々のネスト化ＰＣＲＴＭプライマーは、３つの個々のサイクル配列決定反応で配列決定プライマーとしても使用される。６つの質の配列決定ランからの平均読み取り長は、２０を超えるＰｈｒｅｄスコアで５８３塩基（４２１−７０３の範囲）である。７８２ｂｐのコンセンサス配列は、配列決定クロマトグラムファイルから組み立てられる。
【０１８８】
（領域３．ＭｕｂＧ１上流領域）公開されたＭｕｂＧ１（ポリユビキチン遺伝子１）プロモーターからの特有５００ｂｐ配列を、プライマーを設計するために使用する。プロモーターの上流の未知の隣接領域を、トウモロコシＴＲＦライブラリーからの第一のＰＣＲＴＭにおいて、プライマーＭｕｂＧ１  ２１８−、ＭｕｂＧ１  ３１７−、ＭｕｂＧ１  ３５６−を用いて増幅し、ネスト化ＰＣＲＴＭ（表Ｉ、図１７）においてプライマーＭｕｂＧ１  ２４−、ＭｕｂＧ１  ２１８−、ＭｕｂＧ１  ３１７−を用いて増幅する。プライマーＭｕｂＧ１  ２１８−およびＭｕｂＧ１  ２４−を、３つの個々のサイクル配列決定反応において、３つの増幅されたテンプレートとともに使用する。全ての９つのランからの平均読み取り長は、２０を超えるＰｈｒｅｄスコアで５７８塩基（４４４−６５２の範囲）である。８６７ｂｐのコンセンサス配列を、配列決定クロマトグラムファイルの生データから組み立てる。
【０１８９】
（領域４．ＭｕｂＧ１下流領域）ポリユビキチン遺伝子の３’末端に位置するゲノムＭｕｂＧ１コンティグからの特有５００ｂｐ配列を、プライマーを設計するために使用する。未知の隣接下流領域を、トウモロコシＴＲＦライブラリーからの第一ＰＣＲＴＭにおいて、プライマーＭｕｂＧ１  ３９３＋、ＭｕｂＧ１  ３９５＋を用いて増幅し、ネスト化ＰＣＲＴＭ（表Ｉ、図１７）においてはプライマーＭｕｂＧ１  ４２８＋およびＭｕｂＧ１  ４３０＋を用いて再増幅する。プライマーＭｕｂＧ１  ４２８＋およびＭｕｂＧ１  ４３０＋を、ネスト化ＰＣＲＴＭから得られた２つの配列決定テンプレートを用いる配列決定および３つの個々のサイクル配列決定反応に使用する。第１のプライマーは、良好な質の配列決定ラダーを生成できない。プライマーＭｕｂＧ１  ４３０＋を用いた３つの質の配列決定ランからの平均読み取り長は、２０を超えるＰｈｒｅｄスコアで６２４塩基（６１６−６３９の範囲）である。６２６ｂｐのコンセンサス配列を、配列決定クロマトグラムファイルから組み立てる。
【０１９０】
従って、この実施例において、４つの得られたゲノム領域のうち４つを、首尾よく配列決定した。２０を超えるＰｈｒｅｄスコアの平均読み取り長は、５８１塩基である。生成した全ての高い質の配列は２，９７１塩基であり、そのうち１，３５０塩基をデノボで配列決定し、参照配列のいずれとも一致しない。参照配列に重複する新規配列の１，６２１塩基のうち、ミスマッチの数は、全部で６つである。８つの配列決定プライマーのうち１つは、受容可能な質の配列決定ラダーを生成しなかった。
【０１９１】
（実施例８：熱フラグメント化方法によるＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡからのＴＲＦライブラリーの調製）
この実施例は、特に中性条件下で高い温度でのＤＮＡ加水分解による、およびデオキシグアノシン三リン酸を用いたターミナルトランスフェラーゼ媒介性テーリングによる、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡから１ｋｂの平均サイズのＴＲＦライブラリーの調製を記述する。
【０１９２】
調製されたライブラリーは、一つの配列に特異的なプライマーならびに万能ホモポリマープライマーＣ１０（１０個のシトシンを含む）を用いて、多数のネスト化ＤＮＡ混合物の再現性のある増幅を与える。同一プライマーを用いてこれらの混合物を配列決定することは、６００―８００塩基の読み取り（選択されたカーネルプライマーに隣接する）を生じる。
【０１９３】
ＤＮＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５から、標準的な精製により単離され、ＴＥ−Ｌ緩衝液で２００ｎｇ／μｌまで希釈される（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）。ＤＮＡを熱的にフラグメント化するために、サンプルを、ヒーティングリッドを用いるＭｉｎｉ  Ｃｙｃｌｅｒ機械（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中で、９５℃で５分間インキュベートする。比較のため、機械的に破砕されたＤＮＡサンプルを、実施例１，４および６に記述されているように調製するが、ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ装置（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）でのフラグメント化が、スピードコード３で２０工程により達成されることを除く。次いで、フラグメント化ＤＮＡの平均サイズを、アルカリ条件下で１％アガロースゲル電気泳動により分析する。図１８は、熱フラグメント化および流体力学的剪断後のＤＮＡサイズ分布を示す。
【０１９４】
ホモポリマーＧテールは、１０〜１５のヌクレオチドからなり、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより、酵素学的に３’末端ＤＮＡフラグメントに付加される。１０ｎｇ／μｌのＤＮＡテンプレートを、１×ＮＥＢ制限緩衝液＃４（０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、２０μＭ  ｄＧＴＰを含む最終容量１００μｌ中で２０単位のＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）ターミナルトランスフェラーゼと共に３７℃で１５分間、インキュベートする。その反応を、１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を付加することにより終了する。サンプルに、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を補充し、このサンプルを２μｇグリコゲン存在下で２．５容量のエタノールで沈殿し、室温で７０％エタノールで２回洗浄し、ＴＥ−Ｌ緩衝液に溶解する。
【０１９５】
（実施例９：熱フラグメント化方法により調製されたＴＲＦライブラリー由来の特定のプライマー  対  流体力学的剪断（ｈｙｄｒｏ−ｓｈｅａｒｉｎｇ）法により調製されたライブラリー由来の特定プライマーを用いたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ領域の増幅および配列決定）
増幅プライマーを、オリゴバージョン６．５３プライマー分析ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）を用いて設計する。プライマーは、２１〜２３塩基長であり、高度な内部安定性、低い３’末端安定性、および５７〜６２℃の融解温度（５０ｍＭ塩および２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を有する。プライマーを、全ての標準的な基準（例えば、少ないプライマーダイマー形成およびヘアピン形成）に合致するように設計し、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの６マー頻度データベース（６―ｍｅｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｄａｔａｂａｓｅ）に対してフィルターする。
【０１９６】
ＰＣＲＴＭ増幅のためのオリゴヌクレオチドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの２つの特定領域のアンプリコンを標的化するように設計する：プライマーＳ３、Ｓ６（表Ｉ）。
【０１９７】
ＴＤ  ＰＣＲＴＭ増幅を、３００ｎＭの特定プライマー、３００ｎＭの万能Ｃ１０プライマー、および４０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ  ＴＲＦライブラリーＤＮＡ（実施例８に記述される）を最終容量２５μｌで、標準チタンＴａｑポリメラーゼ条件（ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）下で実施する。９５℃２分間での最初の変性後、サンプルを、２０サイクル（９５℃１５秒、７３℃２分１５秒、各々のサイクルで０．５℃漸減させる）に供される。増幅の次のラウンドは、２５サイクル（９５℃１５秒、６０℃２分、各々のサイクルで１秒の伸長時間の漸増）である。各々のＰＣＲＴＭ反応の１２μｌのアリコートを、１％アガロースゲル（図１９）の電気泳動により分析する。示すように、流体力学的剪断により調製されたＴＲＦライブラリーがテンプレートとして使用される場合、一様なスメアが獲得され、一方でいくつかのぼんやりとした離散バンドを有するスメアは、熱フラグメント化により調製されたＴＲＦライブラリーから増幅される。
【０１９８】
ＰＣＲＴＭ増幅産物を、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  Ｉｍａｇｅｒソフトウエア（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）の容量定量ツールを使用して、標準ＤＮＡマーカーと比較することにより、染色されたゲルから定量化する。ＰＣＲＴＭ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＴＭ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によってプライマーおよびヌクレオチドを含まないように精製し、３０μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中に溶出し、そしてＰＣＲＴＭで使用した同一のプライマーを用いたサイクル配列決定のテンプレートとして使用する。
【０１９９】
サイクル配列決定は、４０−２５０ｎｇの総ＤＮＡを含む、２〜１１μｌの配列決定テンプレートを、１ｍｌの５μＭの各々の配列決定プライマーおよび８μｌのＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーター試薬ミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と、９６ウェルプレートで最終容量２０μｌに混合することによって実施される。増幅は以下で３０サイクルである：９４℃２０秒、５８℃１５秒、６０℃７５秒。サンプルを、７０％エタノールを用いて沈殿化し、製造業者のプロトコルを用いて、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００キャピラリー電気泳動配列決定システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で分析する。
【０２００】
表ＩＩＩは、熱フラグメント化および流体力学的剪断法により調製されたＴＲＦライブラリー由来のＥ．ｃｏｌｉゲノムの２つの領域から得られた配列決定結果の比較を示す。両方のライブラリーについて、分析された配列の平均読み取り長は、６００塩基を超える。公開されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＭＧ１６５５配列と比較する場合、配列の正確さは、９８％以上である。
【０２０１】
【表３】
2005535283.tif 000005
この実施例は、細菌ＤＮＡから熱フラグメント化により調製されたＴＲＦライブラリー由来の特定のゲノム領域を増幅し、高いレベルの正確さおよび長い読み取り長で配列決定し得ることを示す。
【０２０２】
（実施例１０：熱フラグメント化方法により作製された多数のＴＲＦ  ＤＮＡライブラリーの高スループット調製法、増幅および配列決定）
この実施例は、異なるＤＮＡ供給源由来の多数のＴＲＦライブラリーの平行調製法を記述する。提案されたプロトコルは、熱フラグメント化手順によるＴＲＦライブラリーの調製およびターミナルトランスフェラーゼ媒介性Ｇ−テーリング反応が、９６または３８４マルチウェルフォーマットまで容易に増やされ得るという妥当な仮定に基づいている。
【０２０３】
図２０は、マルチウェル形式でＴＲＦライブラリーの調製に関与する全工程を概略的に図で示す。図は、３６ウェルプレートのみを示すが、９６，３８４，１５３６もしくはそれより大きな形式も得られ得る。
【０２０４】
プロトコルに包含された重要な工程は、例えば：１）低塩ＴＥ緩衝液中でのＤＮＡの調製；２）特定の時間（例えば、５分）で高温（例えば、９５℃）でのＤＮＡのインキュベーション；ターミナルトランスフェラーゼによるＤＮＡフラグメントの３’末端へのホモポリマーＧテールの酵素的付加；３）エタノール沈殿もしくはスピンカラムによるＤＮＡ精製；４）配列特異的プライマーＳ（ＳＮ）および万能ホモポリマープライマーＣ１０を用いたＰＣＲＴＭ（ネスト化ＰＣＲＴＭ）増幅；５）プライマーおよびヌクレオチドの除去；６）配列特異的プライマーＳもしくはＳＮを用いたサイクル配列決定；７）エタノール沈殿もしくはスピンカラムによるＤＮＡ精製；ならびに／または８）９６キャピラリーＤＮＡ配列決定デバイスによるＤＮＡサンプルの分析、を包含する。
【０２０５】
（実施例１１：異なるバッファーおよび塩の条件下におけるＤＮＡの熱フラグメント化）
この実施例は、低塩の条件でのＤＮＡ熱フラグメント化の効率を説明し、高温でのインキュベーションの間、ＤＮＡ分解に対する一価および二価カチオンの阻害効果を示す。
【０２０６】
ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５からの標準的な精製により単離し、エタノールで沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、１００μｇ／ｍｌ濃度のＴＥ緩衝液に溶解した。１μｇＤＮＡアリコートを、２μｇグリコゲン（Ｒｏｃｈｅ）存在下でエタノール沈殿し、１６，０００×ｇで３０分遠心分離し、室温にて７０％エタノールで２回洗浄し、次いで１０μｌの以下の溶液に溶解する：超純粋な蒸留水（「ＧＩＢＣＯ」）；ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣＬ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）；２０倍希釈ＴＥ緩衝液（５００μＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣＬ，５０μＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充したＴＥ緩衝液；１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０単独；１００ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０単独；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ，ｐＨ７．５単独；１Ｍ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ，ｐＨ７．５；５０ｍＭ  酢酸カリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸、１０ｍＭ  マグネシウム酢酸、１ｍＭ  ジチオトレイトール、ｐＨ７．９を含む１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；または２５０μＭ  ＣｏＣｌ２を補充した１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４；４０ｍＭ  トリシンＫＯＨ、１６ｍＭ  ＫＣｌ  ３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ３ｎｇ／μｌ  ＢＳＡ、ｐＨ８．０を含む１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。ＤＮＡサンプルを、ヒーティングリッドを用いるＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ―１５０  ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ中で熱フラグメント化に供した。サンプルを、９５℃で示した時間の間インキュベートし、次いで、アルカリアガロースゲルにより分析した。電気泳動を、緩衝液として４０ｍＭ  ＮａＯＨおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて１％アガロース（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９）で実施する。ゲルを、緩衝液循環を用いて室温で１６時間１Ｖ／ｃｍ（２４０―２８０ｍＡ）でランした。電気泳動後、そのゲルを中性化し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、Ｂｉｏ―Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ  Ｓ  Ｉｍａｇｅｒを用いて分析した。
【０２０７】
図２１Ａは、二つの低塩緩衝液および水におけるＤＮＡの熱フラグメント化の速度論を示す。データは、高分子量ＤＮＡ（図２１Ａ、レーン２）は９５℃の数分以内での暴露で１〜２ｋｂフラグメントに変換され得ることを示す。長時間（３０分まで）の加熱処理（図２１Ａ、レーン８、１４および２１）は、１００塩基以下のＤＮＡの平均サイズの減少を導く。水（図２１Ａ、レーン３〜８）および希釈されたＴＥ緩衝液（図２１Ａ、レーン９〜１４）における熱フラグメント化の割合は、ＴＥ緩衝液（図２１Ａ、レーン１６〜２１）内より高い。
【０２０８】
ＤＮＡの熱フラグメント化において異なる塩および緩衝液の阻害効果は、一定時間のインキュベーション（３０分）の間で図１１Ｂに示される。９５℃で、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（図２１Ｂ、レーン７）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（図２１Ｂ、レーン８）、ＰＣＲ緩衝液（図２１Ｂ、レーン１０）およびＮＥ緩衝液４（図２１Ｂ、レーン１２）でＤＮＡのインキュベーションは、独自のサイズのＤＮＡ（図２１Ｂ、レーン３）の緩やかな変化を生じる。対照的に、ＴＥ（図２１Ｂ、レーン２）、Ｈ２Ｏ（図２１Ｂ、レーン４）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（図２１Ｂ、レーン５）および１ｍＭ  ＥＤＴＡ（図２１Ｂ、レーン６）のような低塩緩衝液において９５℃でのＤＮＡのインキュベーションは、１，０００塩基より小さいＤＮＡフラグメントを産生する。ＴＥ緩衝液（図２１Ｂ、レーン９）への１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の添加は、ＤＮＡ熱分解の強い阻害（図２１Ｂ、レーン２に比較して）も引き起こす。ＮＥ緩衝液４へＣｏ＋＋イオンの添加は、熱フラグメント化（図２１Ｂ、レーン１１）の速度に影響を及ぼさない。
【０２０９】
このように、この実施例は、ＤＮＡは９５℃で熱処理により、中性ｐＨでとても効果的にフラグメント化され得るということを実証する。フラグメント化ＤＮＡのサイズは、時間および緩衝液／塩濃度により制御され得る。Ｍｇ２＋イオンの存在は、ＤＮＡ分解も妨げる。
【０２１０】
（実施例１２：中性ｐＨでの熱誘導性ＤＮＡフラグメント化のメカニズム）
この実施例は、熱フラグメント化が、プリン塩基で優先的に生じるということを示し、それは、プリン塩基の放出を伴うグリコシル結合の熱誘導性加水分解により開始され、アプリン部位でＤＮＡ分子の熱誘導性破壊に続くという、二つの工程メカニズムを提示している。
【０２１１】
２９残基長で、５’末端にフルオレセイン基、３’末端でアミノ修飾基および中間に一つだけプリン塩基を有する二つのピリミジンリッチなオリゴヌクレオチドは、合成された：１９位においてｄＧおよびｄＡ塩基各々を有する（表ＩＶ）、オリゴヌクレオチドＯＬ１（配列番号２９）およびＯＬ２（配列番号３０）。
【０２１２】
【表４】
2005535283.tif 000006
これらのオリゴヌクレオチドの１０ｐｍｏｌを、１０μｌの水（ＧＩＢＣＯ）に希釈し、加熱蓋を用いてＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒで熱フラグメントに供する。サンプルを、時間経過にわたって９５℃でインキュベートし、１５％変性ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｎｏｖｅｘ）（図２２）で分析した。ゲルを、Ｒｅｄ  Ｒｏｌｌｅｒハイブリダイゼーションオーブン（Ｈｏｅｆｅｒ）で一定の温度（５５℃）で４５分間１８０Ｖで実施した。電気泳動後、ゲルをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ  Ｓ  Ｉｍａｇｅｒを用いて蛍光フィルターおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウエアで分析した。
【０２１３】
図２２Ａは、Ｇ塩基を用いてオリゴヌクレオチドＯＬ１の熱フラグメント化の速度論を示す。９５℃で２０分のインキュベーション後、二つの別々のバンドは、ゲルで見られ得て、それらは４０分のインキュベーションで同等の強度に達する。上部のバンドは、完全な（ｕｎｂｒｏｋｅｎ）蛍光標識化オリゴヌクレオチドであり、下部のバンドはｄＧ部位で切断の結果生じたフルオレセイン標識化１９マーに相当する。９５℃で１時間の熱処理後、５０％より多いオリゴが１９塩基の産物へ変換され、小さなフラグメントが現れ、それは、かなり低い割合ではあるが、ｄＧ部位だけではなくｄＣおよびｄＴ塩基部位に鎖切断が生じることを表している。９５℃で１１０分の暴露後、ほとんど全ての元の分子は、加水分解され、１９塩基および短い産物に変換される。
【０２１４】
プリン塩基Ａを用いたオリゴヌクレオチドＯＬ２の熱フラグメント化の速度論は、図２２Ｂに示される。それは、いくらか低い速度ではあるが、オリゴヌクレオチドＯＬ１に関して類似の方法で生じる。この場合において、熱加水分解の初回産物は、９５℃で３０分のインキュベーション後にのみ出現し、そのバンドは５０分後に同等の強度になる。
【０２１５】
以前の研究は、加熱：ＤＮＡ鎖切断、アプリン化（ａｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）、グアニン酸化およびシトシンの脱アミノ化、によりＤＮＡへ導入された損傷のいくつかのタイプを記述した。本明細書で与えられたデータは、中性ｐＨの熱誘導性鎖切断は、プリン塩基で優先的に起こり、それらはＤＮＡで熱誘導性アプリン化を最も引き起こしそうであることを明確に示す。
【０２１６】
（実施例１３：熱フラグメント化後のＤＮＡのＴｄＴテーリング）
この実施例は、ターミナルトランスフェラーゼによる酵素学的なテーリングで、ＤＮＡ末端、特に熱フラグメント化後に作製された３’末端の有効性を実証する。
【０２１７】
ＤＮＡを、新鮮なヒトリンパ球から標準的な精製法により単離し、エタノールで沈殿し、１００ｎｇ／μｌ濃度でＴＥ緩衝液に溶解した。
【０２１８】
５μｇＤＮＡのアリコートを、加熱蓋を用いてＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒで熱フラグメント化に供した。サンプルを、９５℃で５分間インキュベートし、その後、１０ｍＭ  酢酸マグネシウムを含むＮＥ緩衝液４で、１０分間同じ温度でさらなる加熱処理を行った。この工程は、Ｍｇ２＋イオン存在下で第２の加熱は、新規無塩基部位の顕著な創作（および破壊）はなく、第１の加熱工程（低塩で）後に残されたアプリン部位で鎖の切断を刺激するという期待を紹介された（ＬｉｎｄａｈｌおよびＡｎｄｅｒｓｓｏｎ、１９７２）。これは、モデルオリゴヌクレオチドシステムの実験により確認された。この反応産物を、１％アガロースアルカリゲルを通して電気泳動し、ＳＹＢＲ  ＧＯＬＤで染色し、約１ｋｂサイズに表されるバンドをゲルから切り取った。分子を、ＤＮＡ抽出キット（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用いることによりゲルから抽出し、エタノールで沈殿化した。次に、ホモポリマーｄＧテール、ｄＡテールおよびｄＧおよびｄＡを混合されたテールを、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるＤＮＡフラグメントの３’末端に酵素学的に付加した。１００ｎｇ／μｌのＤＮＡテンプレートを、０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２および１００μＭ  ｄＧＴＰもしくは１００μＭ  ｄＡＴＰもしくは１００μＭ  ｄＧＴＰおよび１００μＭ  ｄＡＴＰの混合物を含有する１×ＮＥ緩衝液４に１０単位ターミナルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を用いて最終容量を２０μｌにし、２０分間３７℃でインキュベートした。反応は２μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を付加することにより止めた。サンプルを、エタノールで沈殿化し、６％変性ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｎｏｖｅｘ）で分析した。ゲルを、Ｒｅｄ  Ｒｏｌｌｅｒハイブリダイゼーションオーブン（Ｈｏｅｆｅｒ）で一定温度５５℃で１８０Ｖで４５分間電気泳動した。電気泳動後、ゲルをＳＹＢＲ  ＧＯＬＤで染色し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ  Ｓ  Ｉｍａｇｅｒを用いて分析した。
【０２１９】
熱フラグメント化により産生されたＤＮＡフラグメントのテーリング結果は、図２３に表されている。レーン１および４は、熱フラグメント化後、オリジナル１ｋｂＤＮＡサイズ分画を示す。レーン２、３および５は、ターミナルトランスフェラーゼおよびｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ混合物各々を用いたインキュベーション後の同じＤＮＡを示す。約３０％の熱導入３’ＤＮＡ末端を、ｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ混合物（図２３、レーン５）を用いてテール化した。ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰヌクレオチドで見られ得るテーリングはない。
【０２２０】
（実施例１４：熱でフラグメント化させたオリゴヌクレオチドテンプレートでターミナルトランスフェラーゼにより触媒されたホモポリマーテーリング反応）
本実施例は、熱フラグメント化プロセスにより産生されたオリゴヌクレオチド末端のＴｄＴを介したテーリング効果を特徴づけ、ターミナルトランスフェラーゼ酵素の新しい３’末端修復機能を記述する。
【０２２１】
２９塩基長で、５’末端にフルオレセイン基を有する３つのピリミジンに富んだオリゴヌクレオチドを、使用した。オリゴヌクレオチドＯＬ１およびＯＬ２を、３’末端にＡｍｉｎｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ７ブロッキング基および中央の１つのプリン塩基（ｄＧもしくはｄＡ、各々）を用いて合成した（表ＩＶ；実施例１２も参照）。オリゴヌクレオチドＯＬ３（配列番号３１）は、オリゴヌクレオチドＯＬ１に類似しているが、３’−ＯＨ基を有する。１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＯＬ１、ＯＬ２またはＯＬ３を、１０μｌの水（ＧＩＢＣＯ）で希釈し、加熱蓋を用いてＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒで９５℃で５０分間、熱フラグメント化に供した。熱フラグメント化の産物および非加熱オリゴヌクレオチドＯＬ１、ＯＬ２またはＯＬ３を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によりテール化した。１０ｐｍｏｌのこれらのオリゴヌクレオチドを、０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２および１００μＭ  ｄＧＴＰ（図２４Ａおよび２４Ｂ）もしくはｄＡＴＰ（図２４Ｃ）を含む１×ＮＥ緩衝液４に１０単位のターミナルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を用いて最終容量を５０μｌにし、２０分間３７℃でインキュベートした。反応を５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を添加して止めた。サンプルを、エタノールで沈殿化し、変性化１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｎｏｖｅｘ）で分析した（図２４）。ゲルを、Ｒｅｄ  Ｒｏｌｌｅｒハイブリダイゼーションオーブン（Ｈｏｅｆｅｒ）で一定温度５５℃で１８０Ｖで４５分間電気泳動した。電気泳動後、ゲルをＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎフィルターおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウエアを伴うＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ  Ｓ  Ｉｍａｇｅｒを用いて分析した。
【０２２２】
意外にも、３’ＡｍＭｏｄ  Ｃ７基（ＤＮＡ合成においてプライマーとして関係することから、機能的にオリゴヌクレオチドをブロックする）の存在にも関わらず、、オリゴヌクレオチドＯＬ１およびＯＬ２の両方をｄＧＴＰで効率的にテール化し、ほとんど１００％の分子が、Ｇテールを受け、それらの移動性が変化する（図２４Ａおよび２４Ｂ）。熱フラグメント化の１９マーの産物を、完全ではないが、テール化もする。約５０％のこれらの産物は、Ｇテーリングのためには十分であり、それらの移動性を変更する（図２４Ａおよび２４Ｂ）。同時に、オリゴヌクレオチドＯＬ３の熱フラグメント化の１９マーの産物は、ｄＡＴＰ存在下ではテーリングを示さない。
【０２２３】
脱プリン化を経由するフラグメント化は、酵素学的に不十分な３’末端を持つＤＮＡフラグメントを産生する（ＫｏｔａｋａおよびＢａｌｄｗｉｎ、１９６４；ＬｉｎｄａｈｌおよびＡｎｄｅｒｓｓｏｎ、１９７２）。本実施例で表されたデータは、ターミナルトランスフェラーゼの新たな機能、特に３’ヒドロキシル基を欠損した末端の処理能力を実証する。ｄＧＴＰ存在下で、ＴｄＴはアプリン部位で切断後に生じる末端の有意な分画（５０％）およびＡｍｉｎｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ７を用いて末端化したほとんど全ての末端にテール化され得、これは、ターミナルトランスフェラーゼ酵素の新しい３’末端修復機能を示唆する。ｄＡＴＰ存在下でテーリングの欠乏は、ＴｄＴにより触媒された修復プロセスでデオキシグアニントリフォスフェートについての特定の役割を提示する。
【０２２４】
（実施例１５：ブロック化および正常オリゴヌクレオチドテンプレートのＴｄＴを介したテーリング：ｄＧＴＰ濃度の影響）
本実施例は、３’ブロック化および非ブロック化モデルオリゴヌクレオチドテンプレートの異なる濃度のｄＧＴＰ存在下で、ターミナルトランスフェラーゼにより触媒されたテーリング反応を比較する。ｄＧＴＰ濃度のタイトレーションは、オリゴヌクレオチドテンプレートのための作業濃度を規定するために必要であった。
【０２２５】
２つのピリミジンに富んだオリゴヌクレオチドＯＬ１およびＯＬ３（５’末端でフルオレセイン基を有する各々の２９残基長で）を使用した。オリゴヌクレオチドＯＬ１は、３’末端にブロッキング化Ａｍｉｎｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ７基およびオリゴヌクレオチドＯＬ３ヒドロキシ基を持つ（表ＩＶ）。１０ｐｍｏｌのこれらのオリゴヌクレオチドを、異なるｄＧＴＰ濃度の存在下でテーリング反応に供した。ブロック化および非ブロック化オリゴヌクレオチドを、０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含む１×ＮＥ緩衝液４、および１０μＭ〜１００μＭで変化するｄＧＴＰ濃度で最終容量５０μｌにし、３７℃（２０分）で１０単位のターミナルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を用いてインキュベートした。１／５の容量の反応混合物を、１５％変性ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｎｏｖｅｘ）で分析した（図２５）。ゲルを、Ｒｅｄ  Ｒｏｌｌｅｒハイブリダイゼーションオーブン（Ｈｏｅｆｅｒ）で一定温度５５℃で１８０Ｖで電気泳動した。電気泳動後、ゲルをＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎフィルターおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウエアを伴うＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ  Ｓ  Ｉｍａｇｅｒを用いて分析した。
【０２２６】
実験は、３’ＯＨ基を有するオリゴヌクレオチドの完全なテーリングは、１０μＭ  ｄＧＴＰで生じることを示す（図２５Ｂ）。類似の濃度のｄＧＴＰにおいて、３’ブロッキン化基を有するオリゴヌクレオチドは、テーリングを検出できないことを示す（図２５Ａ）。ブロック化３’末端において、テーリングは２０μＭ  ｄＧＴＰで可視になり、１００μＭ  ｄＧＴＰで最大（９０％以上）に達する（図２５Ａ）。
【０２２７】
これらのデータは、ｄＧＴＰはターミナルトランスフェラーゼの修復活性のために必要とされる、さらなる証拠を与え、高い濃度（５０μＭ以上）のこのヌクレオチドのみがブロック化３’末端のＴｄＴを介した修復を活性化することを示す。
【０２２８】
実施例５の結果は、通常「悪い（ｂａｄ）」３’末端を有する、種々の物理的法および化学的方法により生成されたＤＮＡフラグメントのＧテーリングのための条件を規定するために、重要である。特にそれは、なぜ、熱フラグメント化ＤＮＡが、ｄＧＴＰ／ｄＡＴＰを用いて効率的にテール化され得るが、実施例１３においてｄＡＴＰを用いてはそうなり得ないかの合理的な説明を（実施例１４および実施例１６と組み合わせて）提供する。
【０２２９】
（実施例１６：３’末端ブロック化テンプレートのターミナルトランスフェラーゼにより触媒されたテーリング反応におけるｄＧＴＰヌクレオチドの特別な役割）
本実施例は、３’アミノＣ７ブロッキングを用いてオリゴヌクレオチドの３’末端を処理する能力における、ヌクレオチドｄＧＴＰの独特な役割を実証する。
【０２３０】
本実施例において、以下の４つのオリゴヌクレオチドを使用した：５’末端にフルオレセイン基を有し、かつ３’末端にブロッキング基であるＡｍｉｎｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ７を有する、オリゴヌクレオチドＯＬ１およびＯＬ４（配列番号３２）；５’末端にフルオレセイン基を有し、かつ３’末端にＯＨ基を有する、オリゴヌクレオチドＯＬ５（配列番号３３）；５’末端にフルオレセイン基を有し、かつ３’末端にジデオキシＣ（ｄｄＣ）ブロッキング基を有する、オリゴヌクレオチドＯＬ７（表ＩＶ）。テーリング反応を、０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、５０μＭ  ｄＸＴＰ（ＸはＧ、Ａ、ＴもしくはＣ）を含む最終容量５０μｌの１×ＮＥＢ緩衝液４中にある、１０ｐｍｏｌオリゴヌクレオチドおよび１０単位ターミナルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）を、３７℃で２０分間使用して実施した。この反応を、５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を添加することによって、停止した。サンプルを、エタノール沈殿し、その後、変性１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ―尿素ゲルで分離した。電気泳動後、このゲルをＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎフィルターおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  ＯｎｅソフトウエアとともにＢｉｏ―Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ  Ｓ  Ｉｍａｇｅｒを使用して分析した。
【０２３１】
図２６Ａは、異なるヌクレオチド三リン酸を用いる、ＡｍＭｏｄ  Ｃ７でブロックしたオリゴヌクレオチドＯＬ１のＴｄＴ媒介修復／テーリングを示す。テーリングの効果は、ｄＧＴＰ（図２６、レーン１対レーン５）を用いた場合のみ認められ、他のヌクレオチドは効果がない（図２６、レーン１対レーン２、３、４）。
【０２３２】
図２６Ｂは、ｄＧＴＰ存在下での、別のＡｍｉｎｏ  Ｃ７でブロックしたオリゴヌクレオチドＯＬ４のＴｄＴ媒介修復／テーリングを示す（図２６Ｂ、レーン１およびレーン４）。興味深いことに、ターミナルトランスフェラーゼは、３’末端にジデオキシＣ（ｄｄＣ）ブロッキング基を有するオリゴヌクレオチドＯＬ７（配列番号３５）を修復およびテーリングし得ない（図２６Ｂ、レーン３およびレーン６）。ｄＧＴＰを用いた非ブロック化オリゴヌクレオチドＯＬ５のコントロールターミナルトランスフェラーゼテーリングが、図２６Ｂに示される（レーン２および５）。
【０２３３】
明らかに、ｄＧＴＰは、３’末端をブロックしたＤＮＡ基質に対して、ターミナルトランスフェラーゼにより触媒されたテーリング機構において二重の役割を果たす。第１番目に、それは、末端ブロックヌクレオチドを除去する末端修復プロセスを誘導する補助因子として役立つ。そして、第２番目にそれは、テーリング反応の基質として役立つ。ターミナルトランスフェラーゼのｄＧＴＰ誘導性修復活性は、以前には記載されていない新規な特性である。
【０２３４】
（実施例１７：ターミナルトランスフェラーゼの３’末端修復活性の機構）
本実施例は、ターミナルトランスフェラーゼは、３’末端から１つもしくは２つのヌクレオチドを除去すること、そしてその後、ホモポリマーＧテールを付加することにより、３’末端ブロックテンプレートを伸長することを、示す。ヌクレオチド濃度５０〜１００μＭ（ＴｄＴ修復活性に必要な濃度；実施例１５を参照）でのｄＧＴＰテーリングは、２５〜３５残基長のホモポリマーｄＧテールを作製するので、リボＧＴＰがこれらの実験で利用される。リボＮＴＰは、取り込まれたリボ塩基の数が１〜５ヌクレオチドに限定されるという唯一の差異を有するそのデオキシアナログ（Ｂｏｕｌｅら、２００１）と同じくらい効率的に、ターミナルトランスフェラーゼによって、ＤＮＡ末端に取り込まれ得る。以下に記述された実験は、リボＧＴＰが、ｄＧＴＰと同様に、同じ修復活性化を果たし得るという基礎にある仮定を確認する。
【０２３５】
３つの５’フルオレセイン標識オリゴヌクレオチド（３’末端にＡｍｉｎｏ  Ｃ７ブロッキング基を有する１１残基長のオリゴヌクレオチドＯＬ４；３’末端にブロッキング基ではなく類似配列を有する１１残基長のオリゴヌクレオチドＯＬ５；および１０残基長のオリゴヌクレオチドＯＬ６（配列番号３４）（表ＩＶ））を、ＴｄＴおよびリボＧＴＰを用いてテーリングさせた。一つの反応セットにおいて、５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＯＬ４、ＯＬ５およびＯＬ６を、０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２および１００μＭ  リボＧＴＰを含む１×ＮＥ緩衝液４中にある１０単位のターミナルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）とともにインキュベートした。別の反応セットにおいて、５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＯＬ５を、０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２および４つの異なる濃度のリボＧＴＰ（１μＭ、５μＭ、２０μＭ）を含む最終容量２０μｌの１×ＮＥ緩衝液４中にある１０単位のターミナルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）とともに、３７℃で２０分間インキュベートした。この反応を、２μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を添加することで停止した。サンプルをエタノール沈殿し、変性１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲルで分離した。電気泳動後、このゲルを、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎフィルターおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  ＯｎｅソフトウエアとともにＢｉｏ―Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ  Ｓ  Ｉｍａｇｅｒを使用して分析した。
【０２３６】
図２７は、ターミナルトランスフェラーゼが、Ａｍｉｎｏ  Ｃ７ブロックしたオリゴヌクレオチドＯＬ４を実際に修復し、その３’末端にリボＧＴＰヌクレオチドを付加することを、示す。レーン１および２は、それぞれ、リボＧテーリング前および後の、オリゴヌクレオチドＯＬ４を示す。Ｇテールを付加する前にＴｄＴにより除去されたヌクレオチドの数を決定するため、本発明者らは、ブロックしたオリゴヌクレオチドＯＬ４のリボＧテーリング産物の長さ（図２７、レーン２）と、コントロールオリゴヌクレオチドＯＬ５のリボＧテーリング産物の長さ（１１マー）（図２７、レーン４、８、９および１０）およびオリゴヌクレオチドＯＬ６のリボＧテーリング産物の長さ（１０マー）（図２７、レーン６）とを比較をした。レーン７は、レーン８、９および１０にローディングされたテール化オリゴサンプルの等モル混合物を表す。オリゴヌクレオチドＯＬ４のリボＧテール化産物は、１０マーオリゴヌクレオチドＯＬ６の対応産物よりも速くゲルを移動する（レーン２およびレーン６を比較）ので、約１〜３塩基が、このテールを付加する前にオリゴヌクレオチドＯＬ４の末端からターミナルトランスフェラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性により除去されるという結論が下される。
【０２３７】
（実施例１８：リボＧＴＰ／ｄＧＴＰ混合物を用いたターミナルトランスフェラーゼによる長さ制御テーリング）
本実施例は、ターミナルトランスフェラーゼは、オリゴヌクレオチドの３’末端に２〜１０個のグアニン塩基を付加するために使用され得ることを実証し、このことは、ＴＲＦライブラリーを調製するための制御されたＴｄＴ媒介修復／テーリング手順を示唆する。
【０２３８】
５’末端にフルオレセイン基を有する１１残基長のオリゴヌクレオチドＯＬ５（表ＩＶ）を、熱フラグメント化ＤＮＡ存在下および非存在下で、異なるリボＧＴＰ／ｄＧＴＰ比でターミナルトランスフェラーゼを用いてテーリングさせた。５ｐｍｏｌのこのオリゴヌクレオチドおよび１００ｎｇの熱フラグメント化ＤＮＡ、もしくはちょうど５ｐｍｏｌオリゴヌクレオチドを、０．２５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、１００μＭリボＧＴＰおよび様々な濃度（０μＭ、１０μＭ、２０μＭおよび５０μＭ）のｄＧＴＰを含む最終容量２０μｌの１×ＮＥＢ緩衝液４中にある、１０単位のターミナルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ）とともに３７℃で２０分間インキュベートした。この反応を、２μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を添加して停止した。サンプルをエタノール沈殿し、変性１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ―尿素ゲルで分離した。電気泳動後、このゲルを、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎフィルターおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  ＯｎｅソフトウエアとともにＢｉｏ―Ｒａｄ  Ｆｌｕｏｒ  Ｓ  Ｉｍａｇｅｒを使用して分析した。
【０２３９】
図２８は、リボＧＴＰ／ｄＧＴＰ混合物を用いたＴｄＴテーリングの結果を示す。レーン２は、未処理オリゴヌクレオチドＯＬ５の移動度を示す。オリゴヌクレオチドＯＬ５のＴｄＴおよび１００μＭ  リボＧＴＰとのインキュベーションは、３〜４個のＧ塩基のテールを生成する（図２８、レーン１）。１０μＭ濃度、２０μＭ濃度もしくは５０μＭ濃度のｄＧＴＰの付加は、平均６個、８個もしくは１０個の混合リボＧ／ｄＧ残基をそれぞれ含む、ホモポリマーテールを生じる（図２８、レーン３、５、７）。熱フラグメント化ゲノムＤＮＡの存在は、平均テール長をわずかに減少させた（図２８、レーン４、６、８）。ｄＧＴＰおよびリボＧＴＰの双方が、高ヌクレオチド濃度で、ターミナルトランスフェラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性を刺激する（実施例１４〜１７）という事実を考慮すると、同様のテールがゲノムＤＮＡの３’末端に付加されると推測することは、合理的である。
【０２４０】
このように、本実施例は、熱フラグメント化、機械的剪断、もしくは３’ヒドロキシル基を欠くＤＮＡ末端を生じる他の任意の手段により生成されたＤＮＡフラグメントの制御されたＧテーリングの手引きを提供する。
【０２４１】
（参考文献）
明細書中で言及された全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の水準を示す。あたかも各個の刊行物が詳細にかつ個別に参考として援用されると示されたのと同じ程度に、全ての特許ならびに刊行物が、本明細書中で参考として援用される。
【０２４２】
（特許）
【０２４３】
【表５】
2005535283.tif 000007
2005535283.tif 000008
2005535283.tif 000009
2005535283.tif 000010
2005535283.tif 000011
2005535283.tif 000012
。
【０２４４】
本発明およびその利点を詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変化、置換および変更がなされ得ることが、理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書中に記載されるプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法および工程に限定されることは意図されない。本発明の開示から当業者が容易に認識するように、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を実施するかまたは実質的に同じ結果を達成する、現在存在するかまたは後に開発される、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法もしくは工程が、本発明に従って利用され得る。従って、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法あるいは工程のを、その範囲内に包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
以下の図面は本明細書の一部を構成し、本発明の特定の局面をさらに証明するために包含される。本発明は、本明細書中に示される詳細な説明と組み合わせて、それらの図面の一つ以上を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】図１は、ランダムなフラグメント化および３’末端テーリングにより生成されるＴＲＦライブラリーの調製を説明する。
【図２】図２は、ランダムなＤＮＡフラグメント化の方法を例示する。
【図３】図３は、ＤＮＡフラグメントの３’末端に万能配列を付加する方法を説明する。
【図４】図４は、ランダムなフラグメント化により生成されたＤＮＡライブラリーの増幅および配列決定を例示する。
【図５】図５は、ネスト化ＤＮＡテンプレートの配列決定を説明する：アダプター配列寄与。
【図６】図６は、増幅されたＤＮＡフラグメント混合物内でのウォーキングによる配列決定を示す。
【図７】図７は、困難なテンプレートについての一般的なアプローチとしてのネスト化ＤＮＡフラグメントの配列決定を示す。
【図８】図８は、流体力学的剪断により調製されたＴＲＦライブラリーからの、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの３つの特定領域の初回増幅を例示する。
【図９】図９は、流体力学的剪断により調製されたＴＲＦライブラリーからの、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの３つの特定領域の初回増幅を例示する、さらなる実施例である。
【図１０】図１０は、ＴＲＦライブラリーからの、プライマーウォーキングにより配列決定されたＥ．ｃｏｌｉゲノムの特定領域の模式図である。
【図１１】図１１は、ＴＲＦライブラリーから増幅され配列決定された領域を含有する、ヒトｔｐ５３遺伝子の１０Ｋｂセグメントの模式図を例示する。
【図１２】図１２は、流体力学的剪断により調製されたＴＲＦライブラリーからの、ヒトｔｐ５３遺伝子の３つの特定領域の初回増幅を示す。
【図１３】図１３は、流体力学的剪断により調製されたＴＲＦライブラリーからの、ヒトｔｐ５３遺伝子のＨＳ４＋プライミング部位の初回増幅における、ライブラリーＤＮＡ投入量の滴定を説明する。
【図１４】図１４は、配列決定テンプレートとして使用される流体力学的に剪断されたＴＲＦライブラリーからの、ヒトｔｐ５３遺伝子の３つのゲノム領域の二次的（ネスト化）増幅を示す。
【図１５】図１５は、ＴＲＦライブラリーから配列決定された四つのトウモロコシゲノム領域の模式図を例示する。
【図１６】図１６は、流体力学的剪断により調製されたトウモロコシゲノムＴＲＦライブラリーからの、第３染色体上のメイシン（Ｍａｙｓｉｎｅ）エンハンサーから上流に位置された未公表のゲノム領域の二次的な（ネスト化）増幅を示す。
【図１７】図１７は、流体力学的剪断により調製されたトウモロコシＴＲＦライブラリーからの、ポリユビキチン１遺伝子（ＭｕｂＧ１）に隣接する未公表のゲノム領域の二次的な（ネスト化）増幅を示す。
【図１８】図１８は、熱処理および流体力学的剪断によるフラグメント化前および後のＤＮＡ分子サイズの比較を示す。
【図１９】図１９は、熱フラグメント化および流体力学的剪断の方法により調製されたＴＲＦライブラリーからの、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの二つの特定領域の初回増幅を示す。
【図２０】図２０は、マルチウェルマイクロプレートフォーマットにおける多様なＤＮＡサンプルの高処理能調製および配列決定分析を例示する。
【図２１】図２１は、異なる塩緩衝液の条件下での、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡの熱フラグメント化の動力学を示す。
【図２２】図２２は、一つのプリン塩基を伴うモデル５’蛍光標識化オリゴヌクレオチドに対する、熱フラグメント化の脱プリン化機構を例示する。
【図２３】図２３は、基質が熱フラグメント化され、サイズ分画されたヒトＤＮＡである場合の、ＴｄＴを介したテーリング反応の効率および特異性を説明する。
【図２４】図２４Ａは、基質が熱フラグメント化され、一つのグアニン塩基および３’末端にブロッキングＡｍＭｏｄ  Ｃ７基を有するインタクトな５’蛍光標識化オリゴヌクレオチドである場合のＴｄＴを介したｄＧＴＰテーリング反応の効率を説明する。図２４Ｂは、基質が熱フラグメント化され、一つのアデニン塩基および３’末端にブロッキングＡｍＭｏｄ  Ｃ７基を有するインタクトな５’蛍光標識化オリゴヌクレオチドである場合のＴｄＴを介したｄＧＴＰテーリング反応の効率を説明する。図２４Ｃは、基質が熱によりフラグメント化され、一つのグアニン塩基および固有の３’−ＯＨ基を有するインタクトな５’蛍光標識化オリゴヌクレオチドである場合のＴｄＴを介したｄＡＴＰテーリング反応の効率を説明する。
【図２５】図２５Ａは、基質が３’末端にブロッキングＡｍＭｏｄ  Ｃ７基を有する５’蛍光標識化オリゴヌクレオチドである場合のＴｄＴを介した修復／テーリング反応の効率において、ｄＧＴＰ濃度の効果を示す。図２５Ｂは、基質が３’末端に固有のＯＨ基を有する５’蛍光標識化オリゴヌクレオチドである場合ＴｄＴを介したテーリング反応の効率において、ｄＧＴＰ濃度の効果を示す。
【図２６】図２６Ａは、３’末端にブロッキングＡｍＭｏｄ  Ｃ７基を有する５’蛍光標識化オリゴヌクレオチド基質上のＴｄＴを介した修復／テーリング反応におけるｄＧＴＰヌクレオチドの特有な役割を説明する。図２６Ｂは、ＴｄＴ酵素が、ｄＧＴＰの存在下で、３’末端にジデオキシシトシンブロッキング基を有するオリゴテンプレートを修復し延長できないことを例示する。
【図２７】図２７は、基質の３’末端からの、修飾された塩基およびさらなる１または２塩基の除去後、ブロッキングＡｍＭｏｄ  Ｃ７基を伴うオリゴヌクレオチドのＴｄＴを介したリボＧＴＰテーリングが生じることを示す。
【図２８】図２８は、リボＧＴＰヌクレオチドおよびデオキシＧＴＰヌクレオチドの混合物の存在下での、５’蛍光標識化オリゴヌクレオチド基質の長さが制御された、ＴｄＴを介したテーリング反応を説明する。
【配列表】
2005535283.tif 000013
2005535283.tif 000014
2005535283.tif 000015
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【図１】
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【図２】
2005535283.tif 000022
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005535283.tif 000027
【図８】
2005535283.tif 000028
【図９】
2005535283.tif 000029
【図１０】
2005535283.tif 000030
【図１１】
2005535283.tif 000031
【図１２】
2005535283.tif 000032
【図１３】
2005535283.tif 000033
【図１４】
2005535283.tif 000034
【図１５】
2005535283.tif 000035
【図１６】
2005535283.tif 000036
【図１７】
2005535283.tif 000037
【図１８】
2005535283.tif 000038
【図１９】
2005535283.tif 000039
【図２０】
2005535283.tif 000040
【図２１】
2005535283.tif 000041
【図２２】
2005535283.tif 000042
【図２３】
2005535283.tif 000043
【図２４】
2005535283.tif 000044
【図２５】
2005535283.tif 000045
【図２６】
2005535283.tif 000046
【図２７】
2005535283.tif 000047
【図２８】
2005535283.tif 000048
【国際調査報告】
2005535283.tif 000049
2005535283.tif 000050