(57)【要約】  ブテニル−スピノシン生合成遺伝子、生合成遺伝子で形質転換したスピノシンを生産する微生物、ブテニル−スピノシン殺虫性マクロライドの生産を上げるための生合成遺伝子の使用、およびスピノシンを生産する微生物による生産される産物を変化させるために遺伝子またはそれらのフラグメントを使用する方法。
2005512506.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブテニル−スピノシン生合成酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子であって、該酵素が配列番号３−７および８−２９からなる群から選択される１つの配列に少なくとも９８％同一のアミノ酸配列からなり、ただし配列が選択された配列に１００％未満で同一である場合、その差はコードされる酵素の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない上記の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】
ＤＮＡ配列がｂｕｓＡ、ｂｕｓＢ、ｂｕｓＣ、ｂｕｓＤ、ｂｕｓＥ、ＯＲＦ  ＲＩ、ＯＲＦ  ＲＩＩ、ＯＲＦ  ＲＩＩＩ、ｂｕｓＦ、ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＫ、ｂｕｓＬ、ｂｕｓＭ、ｂｕｓＮ、ｂｕｓＯ、ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲ、ｂｕｓＳ、ＯＲＦ  ＬＩ、ＯＲＦ  ＬＩＩ、ＯＲＦ  ＬＩＩＩ、ＯＲＦ  ＬＩＶ、ＯＲＦ  ＬＶＩ、ＯＲＦ  ＬＶＩＩ、ＯＲＦ  ＬＶＩＩＩおよびＯＲＦ  ＬＩＸからなる遺伝子群から選択され、該遺伝子がそれぞれ配列番号１の塩基１−１３０３２、１３０５９−１９５０５、１９５５３−２９０５３、２９０９２−４３８９０、４３９４５−６０６３６、６２０９０−６３９３７、６５２２９−６６６０２および６８７６２−６９６７６、ならびに配列番号２の１１４−９３８、１３８９−２５５８、２６０１−３３５０、３３６２−４５４６、４６８４−６３００、６３１７−７５０７、７５５５−８４０３、８６４０−９５６９、９６７１−１０６６６、１０６７８−１２１３５、１２８６７−１４１７７、１４６２７−１５９６７、１６００８−１７１４１、１７１６８−１７９１４、１８５２３−１９９３２、１９９８２−２０４８８、２０５３９−２１０３３、２１１７９−２１９２２、２２６７４−２３４５３、２３６９０−２４８８６、２６１８０−２６９２３および２７６４６−２８４７３により記載される、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項３】
ＫＳｉ、ＡＴｉ、ＡＣＰｉ、ＫＳｂ、ＡＴｂ、ＫＲｂ、ＤＨｂ、ＡＣＰｂ、ＫＳ１、ＡＴ１、ＫＲ１およびＡＣＰ１から選択されるブテニル−スピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、該ドメインがそれぞれ配列番号３のアミノ酸７−４２３、５２８−８５３、８９５−９７７、９９８−１４１３、１４９５−１８３６、１８４６−２０２８、２３０６−２５１８、２６２１−２７１０、２７３５−３１６０、３２４１−３６０４、３９０７−４０８６および４１８１−４２６２により記載される単離されたＤＮＡ分子。
【請求項４】
ＤＮＡ配列が配列番号１の塩基１６−１２６９、１５８２−２５５９、２６８３−２９３１、２９９２−４２３９、４４８３−５５０８、５５３８−６０８４、６９１６−７５５４、７８６１−８１３０、８２０３−９４８０、９７２１−１０８１２、１１７１９−１２２５８および１２５４１−１２７８６からなる群から選択される、請求項３に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項５】
ＫＳ２、ＡＴ２、ＤＨ２、ＥＲ２、ＫＲ２およびＡＣＰ２から選択されるスピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、該ドメインがそれぞれ配列番号４のアミノ酸１−４２１、５３４−９６４、９９０−１０７５、１３３６−１６８１、１６８５−１８６４および１９５３−２０３１により記載される単離されたＤＮＡ分子。
【請求項６】
ＤＮＡ配列が配列番号１の塩基１３０５９−１４３２１、１４６５８−１５９００、１６０２６−１６２８３、１７０６４−１８１００、１８１１１−１８６５０および１８９１５−１９１５１からなる群から選択される、請求項５に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項７】
ＫＳ３、ＡＴ３、ＫＲ３、ＡＣＰ３、ＫＳ４、ＡＴ４、ＫＲ４およびＡＣＰ４から選択されるスピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、該ドメインがそれぞれ配列番号５のアミノ酸１−４２１、５２８−８１４、１１５７−１３３５、１４２２−１５０３、１５２６−１９４９、２０６３−２３９３、２６９７−２８７５および２９６９−３０４９により記載される単離されたＤＮＡ分子。  
【請求項８】
ＤＮＡ配列が配列番号１の塩基１９５５３−２０８１５、２１１４３−２２０００、２３０２１−２３５５７、２３８１６−２４０６１、２４１２８−２５３９９、２５７３９−２６７３１、２７６４１−２８１８３および２８４５７−２８６９９からなる群から選択される、請求項７に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項９】
ＫＳ５、ＡＴ５、ＤＨ５、ＫＲ５、ＡＣＰ５、ＫＳ６、ＡＴ６、ＫＲ６、ＡＣＰ６、ＫＳ７、ＡＴ７、ＫＲ７およびＡＣＰ７から選択されるスピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、該ドメインがそれぞれ配列番号６のアミノ酸１−４２２、５３７−８６４、８９１−１０７６、１３８２−１５６３、１６４３−１７２４、１７４６−２１７０、２２８１−２６１１、２９１４−３０９３、３１８６−３２６７、３２８９−３７１１、３８２３−４１５１、４３４２−４６３６におよび４７２３−４８０４により記載される単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１０】
ＤＮＡ配列が配列番号１の塩基２９０９２−３０３５７、３０７００−３１６８３、３１７６２−３２３１９、３３２３５−３３７８０、３４０１８−３４２６３、３４３２７−３５６０１、３５９３２−３６９２４、３７８３１−３８３７０、３８６４７−３８８９２、３８９５６−４０２２４、４０５６０−４１５４４、４２１１５−４２９９９および４３２５８−４３５０３からなる群から選択される、請求項９に記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１１】
ＫＳ８、ＡＴ８、ＤＨ８、ＫＲ８、ＡＣＰ８、ＫＳ９、ＡＴ９、ＤＨ９、ＫＲ９、ＡＣＰ９、ＫＳ１０、ＡＴ１０、ＤＨ１０、ＫＲ１０、ＡＣＰ１０およびＴＥ１０から選択されるスピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、該ドメインがそれぞれ配列番号７のアミノ酸１−４２４、５３０−８４８、８８５−１０７２、１３７１−１５５４、１６５０−１７２８、１７５１−２１７５、２２８９−２６１６、２６４２−２７７５、３１３１−３３１５、３３９６−３４７４、３５０８−３９２１、４０３６−４３６６、４３８９−４５６９、４８７６−５０５４、５１４８−５２２９および５２７８−５５３１により記載される単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１２】
ＤＮＡ配列が配列番号１の塩基４３９４５−４５２１６、４５５３２−４６４８８、４６５９７−４７１６０、４８０５５−４８６０６、４８８９２−４９０８３、４９１９５−５０４６９、５０８０９−５１７９２、５１８６８−５２２６９、５３３３５−５３８８９、５４１３０−５４３６６、５４４６６−５５７０７、５６０５０−５７０４２、５７１０９−５７６５１、５８５７０−５９１０６、５９３８６−５９６３１および５９７７６−６０５３７からなる群から選択される、請求項１１記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１３】
スピノシンＰＫＳモジュールをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、該モジュールが配列番号３のアミノ酸６−９７７、配列番号３の９９８−２７１０、配列番号３の２７３５−４２６２、配列番号４の１−２０３１、配列番号５の１−１５０３、配列番号５の１５２６−３０４９、配列番号６の１−１７２４、配列番号６の１７４６−３２６７、配列番号６の３２８９−４８０４、配列番号７の１−１７２８、配列番号７の１７５１−３４７４および配列番号７の３５０８−５５３１からなる群から選択される、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１４】
ＤＮＡ配列が配列番号１の塩基１６−２９３１、２９９２−８１３０、８２０３−１２７８６、１３０５９−１９１５１、１９５５３−２４０６１、２４１２８−２８６９９、２９０９２−３４２６３、３４３２７−３８８９２、３８９５６−４３５０３、４３９４５−４９０８３、４９１９５−５４３６６および５４４６６−６０５３７からなる群から選択される、請求項１３記載の単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１７】
１）組換えＤＮＡベクターまたはそれらの部分で、生合成経路によりブテニルスピノシンまたはブテニル−スピノシン前駆体を生産する微生物を形質転換し、該ベクターまたはそれらの部分は該経路で律速である活性の発現をコードする上記のような本発明のＤＮＡ配列を含んでなり、そして
２）該ベクターで形質転換した該微生物を、細胞の成長および分裂、該ＤＮＡ配列の発現およびスピノシンの生産に適する条件下で培養する、
工程を含んでなるスピノシン−生産微生物のスピノシン−生産能を上げる方法。
【請求項１８】
ゲノムに作動性のブテニル−スピノシン生合成遺伝子を有する微生物を培養することを含んでなるブテニル−スピノシンの調製法であって、ただし微生物のゲノムが少なくとも１つのブテニル−スピノシン合成遺伝子ｂｕｓＡ、ｂｕｓＢ、ｂｕｓＣ、ｂｕｓＤ、ｂｕｓＥ、ｂｕｓＦ、ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＫ、ｂｕｓＬ、ｂｕｓＭ、ｂｕｓＮ、ｂｕｓＯ、ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲおよびｂｕｓＳの重複コピーが存在するように修飾されている上記調製法。
【請求項１９】
ゲノムにブテニル−スピノシン生合成遺伝子を有する微生物を培養することを含んでなるブテニル−スピノシンの調製法であって、ただし該遺伝子の少なくとも１つが不活性化され、該遺伝子の残りは破壊された遺伝子が作動できる場合に生産されるブテニル−スピノシン以外のブテニル−スピノシンを生産するように作動できる上記調製法。
【請求項２０】
ゲノムに作動性のブテニルスピノシン生合成遺伝子を含むように形質転換されたヘテロロガスな微生物を培養することを含んでなる、ブテニルスピノシンの調製法。
【請求項２１】
ゲノムに作動性のブテニルスピノシン生合成遺伝子を有する微生物を培養することを含んでなるブテニルスピノシンの調製法であって、該遺伝子がａ）配列番号１に存在するより多い、または少なくとも１以上である、少なくとも１つの作動性のＰＫＳモジュールを含み；またはｂ）ＫＲ、ＤＨまたはＥＲドメインの削除、不活性化または付加により、あるいはＡＴドメインの置換により配列番号１に記載された対応するモジュールとは異なるＰＫＳモジュールを含む、上記調製法。
【請求項２２】
ブテニル−スピノシン生産微生物のゲノムライブラリーを作成し、そしてハイブリダイゼーションプローブとして少なくとも２０塩基長である配列番号１または配列番号２の標識フラグメントを使用することを含んでなるブテニル−スピノシン生合成遺伝子の単離法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の要約
本発明は新規ブテニル−スピノシン生合成遺伝子（ｂｕｔｅｎｙｌ−ｓｐｉｎｏｓｙｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ）、生合成遺伝子を包含するベクター、生合成遺伝子で形質転換したサッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）株、スピノシン−様殺虫マクロライドの生産を上げるためのこれらの遺伝子の使用法、およびサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｐ）のスピノシン−生産株による作られた代謝産物を変化させるための遺伝子またはそれらのフラグメントの使用法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
自然に生産されるスピノシン化合物は、１２−員の大環系ラクトン、中性糖（ラムノース）およびアミノ糖（ホロサミン（ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅ））に縮合した５，６，５−三環式環系からなる（非特許文献１）。アミノ糖が存在しない場合、化合物はシュードアグリコン（ｐｓｅｕｄｏａｇｌｙｃｏｎｅ）と呼ばれ、そして中性糖が存在しなければ化合物は逆シュードアグリコン（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｓｅｕｄｏａｇｌｙｃｏｎｅ）と呼ばれて来た。
【０００３】
Ａ８３５４３スピノシンはサッカロポリスポラ  スピノサ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ）ＮＲＲＬ１８３９５株およびそれらの誘導体により生産される。Ａ８３５４３スピノシンファミリーの知られている員およびそれらを生産する株は、特許文献１；２；３；４および５に開示された。化合物は文字命名により確認される：スピノシンＡ、Ｂ等（非特許文献１）。Ａ８３５４３スピノシンＡの構造は後の表１に与える。Ａ８３５４３スピノシン化合物は蛛形類、線虫類および昆虫、特に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）種の防除に有用であり、そしてそれらは好ましい環境的および毒物学的プロフィールを有する。
【０００４】
Ａ８３５４３スピノシンの生合成を支配する酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配列は特許文献６に開示されている。クローン化された遺伝子およびオープンリーディングフレイムは、ｓｐｎＡ、ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤ、ｓｐｎＥ、ｓｐｎＦ、ｓｐｎＧ、ｓｐｎＨ、ｓｐｎＩ、ｓｐｎＪ、ｓｐｎＫ、ｓｐｎＬ、ｓｐｎＭ、ｓｐｎＮ、ｓｐｎＯ、ｓｐｎＰ、ｓｐｎＱ、ｓｐｎＲ、ｓｐｎＳ、Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ ｇｔｔ、Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ ｇｄｈ、Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ ｅｐｉおよびＳ．ｓｐｉｎｏｓａ ｋｒｅと命名されている。
【０００５】
ラムノース生合成を除くスピノシン生合成遺伝子、特に遺伝子ｓｐｎＡ、ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤ、ｓｐｎＥ、ｓｐｎＦ、ｓｐｎＧ、ｓｐｎＨ、ｓｐｎＩ、ｓｐｎＪ、ｓｐｎＫ、ｓｐｎＬ、ｓｐｎＭ、ｓｐｎＮ、ｓｐｎＯ、ｓｐｎＰ、ｓｐｎＱ、ｓｐｎＲおよびｓｐｎＳは、Ｓ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）染色体の約７４ｋｂ領域上に連続して位置している。ｓｐｎＡ、ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤおよびｓｐｎＥ遺伝子はポリケチド生合成の原因である遺伝子に類似することが示され、そしてｓｐｎＡ、ｓｐｎＤまたはｓｐｎＥの破壊はすべてのスピノシン生産を排除した。Ａ８３５４３スピノシン生合成はまたラクトン核の橋架け、マクロライド生産体には稀な活性にも関与し；ｓｐｎＦ、ｓｐｎＪ、ｓｐｎＬおよびｓｐｎＭ遺伝子はこの生合成段階に関与すると考えられた。ｓｐｎＧ、ｓｐｎＨ、ｓｐｎＩ、およびｓｐｎＫ遺伝子はラムノースの付加および修飾に関与し、そしてｓｐｎＮ、ｓｐｎＯ、ｓｐｎＰ、ｓｐｎＱ、ｓｐｎＲおよびｓｐｎＳ遺伝子はホロサミン糖の生合成および付加に関与すると報告された。ラムノース生合成に必要な遺伝子は、Ａ８３５４３スピノシン生合成遺伝子の残りに連続して配置されていなかった。Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ ｇｔｔおよびＳ．ｓｐｉｎｏｓａ ｋｒｅは１つの異なるフラグメント上にクローン化され、そしてＳ．ｓｐｉｎｏｓａ ｇｄｈおよびＳ．ｓｐｉｎｏｓａ ｅｐｉは他の異なるフラグメント上にクローン化された。
【０００６】
最近、新規生物、サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）またはそれらの誘導体により生産される第２クラスのスピノシンであるブテニル−スピノシンが特許文献７および８に対応する特許文献９に開示された。この化学的ファミリーの４０以上もの員が前記出願で定められた。サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）により生産されるブテニル−スピノシン化合物は、Ａ８３５４３スピノシン系の化合物とは異なる。この２種類のスピノシン間の主な差異は、Ｃ−２１で大環式環に結合した炭素尾（ｃａｒｂｏｎ  ｔａｉｌ）の置換である。天然のブテニルスピノシンはＣ−２１で３〜４炭素鎖、好ましくはブテニルに置換され、一方、天然のＡ８３５４３スピノシンはＣ−２１で１〜２炭素鎖、好ましくはエチルに置換されている。
【０００７】
ブテニル−スピノシン化合物は、２００１年３月２１日に出願された「２１−ブテニルおよび関連スピノシンの合成誘導体（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ２１−Ｂｕｔｅｎｙｌ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｐｉｎｏｓｙｎｓ）」で特許文献１０に開示されているように合成的に修飾されたスピノソイド化合物の生産における反応物として有用である。より好ましくはブテニル−スピノシン化合物およびそれらの合成誘導体は、蛛形類、線虫類および昆虫、特に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の防除に有用である。
【０００８】
Ｃ−２１のブテニル基に加えて、ブテニル−スピノシンはＡ８３５４３スピノシン系とは異なる数々の他の差異を現す。ブテニル−スピノシン化合物のサブセットおよびＡ８３５４３スピノシンに比べて多様性を示す因子を表１にまとめた。ブテニルスピノシンは表１に名前を挙げ、そして今後、構造的頭字語「ｆｏｒ−ｒｈａｍＩ」、「ｆｏｒ−ｒｈａｍＩＩ」、「ｆｏｒ−ｒｈａｍＩＩＩ」およびそれらの誘導体で称する。これらの場合で、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩは正しく置換されたマクロライド構造（Ｉ：Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈ；ＩＩ：Ｒ５＝ＣＨ３、Ｒ４＝ＨまたはＯＨ；ＩＩＩ：Ｒ５＝Ｈ、Ｒ４＝ＯＨ）、「ｆｏｒ」はＣ−１７の糖（ｆｏｒ＝ホロサミン）を表し、そして「ｒｈａｍ」はＣ−９の糖（ｒｈａｍ＝トリ−Ｏ−メチルラムノース）を表す。ＮＲＲＬ３０１４１株により生産される、１４−員のマクロライド環を有する一般式（２）を持つ第２型のマクロライド構造は今後、ＩＶと呼び、そして完全にグリコシル化された化合物を「ｆｏｒ−ｒｈａｍ−ＩＶ」と呼ぶ。式（１）および（２）のブテニル−スピノシン化合物は、蛛形類、線虫類および昆虫、特に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）の防除に有用であり、そしてそれらは環境に優しく、しかも魅力的な毒物学的プロフィールを有する。
【０００９】
これらの差異にはＣ−２１位での徹底的な修飾、Ｃ−８位でのヒドロキシル化およびＣ−１７のホロサミンの中性糖を含む別の糖への置換を含む。さらにそれぞれＣ−１７およびＣ−９に結合したホロサミンおよびラムノースを含む１４員のマクロ−環式環に縮合した５，６，５−三環式環系を有する化合物は、前記出願で以前に開示された。
【００１０】
【表１】
2005512506.tif 000003
【００１１】
【表２】
2005512506.tif 000004
【００１２】
【表３】
2005512506.tif 000005
【００１３】
表１の化合物１−２１はサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）により生産され、そして特許文献７に対応する特許文献９に開示されている。化合物３２および２３は２００１年３月２１日に出願された特許文献８「殺虫性マクロライド（Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  Ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）」に開示されている。
【００１４】
ブテニル−スピノシンとＡ８３５４３スピノシンとの間の構造の差異にもかかわらず、生合成遺伝子の幾つかは類似すると推定することができる。しかし上記のように、サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）は広い範囲の独自なブテニル−スピノシン因子および化合物を生産し、これはＡ８３５４３スピノシンで観察された。したがってこの微生物は新規な生合成酵素も保有するはずであり、これはＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）のＡ８３５４３スピノシン生合成酵素とは異なる。具体的にはＡ８３５４３スピノシンに対して、サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）ブテニル−スピノシン生合成酵素は２炭素までポリケチド鎖を延長することができなければならない（Ｃ−２１でエチルではなくブテニルを生じる）。それらはまたＣ−１７で別のアミノおよび中性糖を、そしてＣ−８およびＣ−２４でヒドロキシレートを合成し、そして結合できなければならない。さらにラムノースメチル化はＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）に対してサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）中で異ならなければならない。Ａ８３５４３スピノシンに関してラムノースの改変されたメチル化を現すＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）のブロック突然変異体（特許文献２および３に開示されている）は、典型的にはＡ８３５４３スピノシンのモノ−デスメチル化ラムノース誘導体を生産した。Ａ８３５４３スピノシンのジ−デスメチルラムノース誘導体は、メチラーゼインヒビター様シネフンジンの存在下でのみ検出された。改変したラムノースのメチル化を含むサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）の突然変異体は、メチラーゼインヒビターの不存在下でブテニル−スピノシンのジ−およびトリ−デスメチルラムノース誘導体を大量に生産した。
【００１５】
ブテニル−スピノシン化合物を生産する試みは、大変少量のブテニル−スピノシンを生産するために大変大規模な発酵容量が必要であるという事実が生じる。ブテニル−スピノシン生合成酵素の１または複数の遺伝子を含むＤＮＡのクローン化したフラグメントは、収量を上げるために遺伝子の複写（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を可能とする。この種類の収量の増加は、マクロシン（ｍａｃｒｏｃｉｎ）をタイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）に転換する律速のメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を複写することによりストレプトミセス  フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）の発酵により（非特許文献２）、およびｇｔｔおよびｇｄｈ遺伝子を複写することによりＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）で達成された（非特許文献３）。
【００１６】
クローン化したブテニル−スピノシン生合成遺伝子も、異なる殺虫活性のスペクトルを有するブテニル−スピノシンの新たな誘導体を生産する方法を提供する。特別な中間体（またはそれらの自然な誘導体）は、ブテニル−スピノシン生合成のための酵素をコードする特定の遺伝子が組換えＤＮＡ法を使用して破壊されたサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）の突然変異株により合成することができる。そのような方法を効果的に使用して、新規６−デオキシエリスロマイシン誘導体を生産するサッカロポリスポラ  エリスレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）株を作成した（非特許文献４）。またブテニル−スピノシン生合成遺伝子は類似の化合物を生産するＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）のような他の生物中で発現することもできる。自然なブテニル−スピノシンプロモーターまたはヘテロロガスなプロモーターから発現した時、これらの遺伝子はスピノシンおよびブテニル−スピノシンの両方の幾つかの独特な構造的特徴を持つ新規ハイブリッド分子を生産する。
【００１７】
新規中間体は、ブテニル−スピノシン生合成に関する酵素をコードする特定の遺伝子の部分がインビトロで特別に突然変異した同じ遺伝子の部分に、または他の生物に由来する遺伝子の対応する部分に置き換えられたサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）またはＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）の突然変異株によっても合成することができる。ハイブリッド遺伝子は新規な酵素的変換の活性を欠くか、または行う改変した機能を持つタンパク質を生産する。新規化学物質は突然変異株の発酵で蓄積する。そのような方法を使用して、新規アンヒドロエリスロマイシン誘導体を生産するサッカロポリスポラ  エリトレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）株を作成した（非特許文献５）。
【００１８】
ブテニル−スピノシンの生合成は２−および３−炭素カルボン酸前駆体の段階的縮合および修飾を介して進行し、環化そして架橋して四環式アグリコンを生成する直鎖状ポリケチド（図１Ａ）を生じる（図１Ｂ）。シュードアグリコン（トリ−Ｏ−メチル化ラムノースを含む）が次いで形成され、ジ−Ｎ−メチル化ホロサミンまたは別の糖が付加されて生合成が完了する（図１Ｂ）。抗生物質エリスロマイシン、抗寄生虫剤アベルメクチンおよび免疫抑制剤ラパマイシンのような他のマクロライドは同様な様式で合成される。これらの化合物を生産する細菌では、抗生物質生合成はＩ型ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）の幾つかの大変大きな多機能性タンパク質により触媒される（非特許文献６；７；８）。ポリペプチドと一緒に、各々が成長しているポリケチド鎖に特異的なアシル−ＣａＡ前駆体を付加し、そして特異的な様式でβ−ケト基を修飾するイニシエーターモジュール（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｍｏｄｕｌｅ）および幾つかのエクステンダーモジュール（ｅｘｔｅｎｄｅｒ  ｍｏｄｕｌｅ）からなる複合体を形成する（図１Ａ）。したがってポリケチドの構造はＰＫＳ中のモジュールの組成および順序により決定される。モジュールは幾つかのドメインを含んでなり、その各々が特別な機能を行う。イニシエーターモジュールは前駆体からアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）ドメインへアシル基を付加するためのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインからなる。またイニシエーターモジュールはＫＳＱドメインも含み、これはβ−ケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインに高度に類似するが、必須の活性部位シテインがグルタミンに置き換えられたので（非特許文献９）、ＫＳＱはもはや縮合活性をもたない。ＫＳＱドメインはデカルボキシラーゼ活性を保持し、そしてイニシエーターモジュールの前駆体特異性を決定する。エクステンダーモジュールはＡＴおよびＡＣＰドメインを、脱カルボキシル的縮合により既存のポリケチド鎖を新たなアシル−ＡＣＰに付加する完全なβ−ケトシンターゼ（ＫＳ）ドメインと一緒に含む。さらなるドメインも各エクステンダーモジュール中に存在して特異的なβ−ケト修飾を行うことができる：β−ケト基をヒドロキシル基に還元するβ−ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン、ヒドロキシル基を除去し、そして二重結合を残すデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメイン、および二重結合を還元し、そして飽和炭素を残すエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン。最後のエクステンダーモジュールは、大環式ラクトンの形でＰＫＳ酵素からポリケチドを遊離するチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインで終結する。ポリケチド合成酵素は一般に、３−７の大きなオープンリーディングフレイムによりコードされる（非特許文献６；７；８）。機能的ポリケチドシンターゼの集成にはこれらタンパク質間の特異的なタンパク質−タンパク質相互作用が必要である。
【００１９】
活性なマクロライド抗生物質は、メチル化のようなさらなる修飾、そして還元状態の変化、および普通ではない糖の付加により大環式ラクトンから誘導される。これらの修飾、および糖の合成および付加に必要な遺伝子のほとんどがＰＫＳ遺伝子の周りに集まっている。デオキシ糖生合成酵素をコードする遺伝子は、エリスロマイシンおよびタイロシンのようなマクロライド抗生物質の生産体中（非特許文献５；１０）、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびエリシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）のＯ−抗原のような細胞外多糖の生産体中の遺伝子に類似する（非特許文献１１；１２）。すべてのこれらの合成には二リン酸ヌクレオチドの付加によるグルコースの活性化、続いて脱水、還元および／またはエピ化が関与する。生成したデオキシ−糖は脱酸素化、アミノ基転移およびメチル化のような１以上のさらなる修飾を受けることができた。糖は特異的なグリコシルトランスフェラーゼの作用によりマクロライド中に包含される。糖の合成および付加に関与する遺伝子は強固に集まるか−たとえ１つのオペロンとして転写されても−、またはそれらは分散さていてもよい（非特許文献７；１３；１４）。
【００２０】
本明細書では以下の用語を以下に定義するように使用する：
ａ．ａ．−アミノ酸。
【００２１】
ＡｍＲ−アプラマイシン耐性−付与遺伝子。
【００２２】
ＡＣＰ−アシルキャリアータンパク質ドメイン。
【００２３】
ＡＴ−アシルトランスフェラーゼドメイン。
【００２４】
ブロック（ｂｌｏｃｋｅｄ）突然変異体−前駆体または分岐（ｓｈｕｎｔ）産物が生産されるように、生合成経路の特異的酵素の機能を遮断する突然変異を有する突然変異株。
【００２５】
ｂｐ−塩基対。
【００２６】
ｂｕｓ−ブテニル−スピノシン生合成遺伝子
ブテニル−スピノシン−特許文献９および８に開示されたＡ８３５４３スピノシン（表１）とは構造的に異なる発酵産物、またはブテニル−スピノシン遺伝子のすべてまたはほとんどを利用する微生物により生産される類似の大環式ラクトン発酵産物。
【００２７】
ブテニル−スピノシン遺伝子−ブテニル−スピノシン生合成に必要な産物をコードするＤＮＡ配列、より具体的にはこれから記載する遺伝子ｂｕｓＡ、ｂｕｓＢ、ｂｕｓＣ、ｂｕｓＤ、ｂｕｓＥ、ｂｕｓＦ、ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＫ、ｂｕｓＬ、ｂｕｓＭ、ｂｕｓＮ、ｂｕｓＯ、ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲおよびｂｕｓＳまたはそれらの機能的均等物。
【００２８】
クローニング−ＤＮＡのセグメントを組換えＤＮＡクローニングベクターに包含し、そして組換えＤＮＡを含む細胞で宿主細胞を形質転換するプロセス。
【００２９】
コドン偏向（ｂｉａｓ）−アミノ酸を特定するために特定のコドンを使用する傾向。サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）の場合には、この傾向は第３塩基としてシトシンまたはグアニンを有するコドンを使用することである。
【００３０】
相補−クローン化した遺伝子により突然変異株をその正常な表現型へ回復すること。
【００３１】
接合−遺伝材料が１つの細菌細胞から別の細胞へ移るプロセス。
【００３２】
ｃｏｓ−バクテリオファージラムダの付着末端配列。
【００３３】
コスミド−プラスミドと同じ様式で宿主細胞中で複製できるだけでなく、ファージの頭にパッケージングされることもできる組換えＤＮＡクローニングベクター。
【００３４】
ＤＨ−デヒドラターゼドメイン。
【００３５】
ＥＲ−エノイルレダクターゼドメイン。
【００３６】
遺伝子−ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【００３７】
ゲノムライブラリー−特定の生物中の実質的にすべてのＤＮＡ配列を表すＤＮＡのセグメントがクローン化された１組の組換えＤＮＡクローニングベクター。
【００３８】
相同性−配列間の類似性の程度。
【００３９】
ハイブリダイゼーション−２つの一本鎖ＤＮＡ分子をアニーリングして二本鎖ＤＮＡ分子を形成するプロセス、この二本鎖ＤＮＡ分子は完全に塩基対を形成してもしなくてもよい。
【００４０】
インビトロパッケージング−感染によりＤＮＡを宿主細胞に導入することができるウイルス様粒子を生産するための、コートタンパク質中のＤＮＡのインビトロカプセル化。
【００４１】
ｋｂ−キロ塩基対。
【００４２】
ＫＲ−β−ケトレダクターゼドメイン。
【００４３】
ＫＳ−ケトシンターゼドメイン。
【００４４】
突然変異誘発−ＤＮＡ配列中の変化の作成。それらは不規則であるか、または標的化することができ、インビボまたはインビトロで作成することができる。突然変異はサイレントであるか、またはタンパク質の特性を改変させ、そして突然変異の表現型を生じる翻訳産物のアミノ酸配列に変化をもたらすことができる。
【００４５】
ＯＲＦ−オープンリーディングフレイム。
【００４６】
ｏｒｉ−複製（ｏｒｉＲ）または転移（ｏｒｉＴ）のプラスミド起点
％同一性−２つの配列を比較した時、ＢＬＡＳＴプログラムにより与えられる同一性の％値。
【００４７】
％類似性−２つの配列を比較した時、ＢＬＡＳＴプログラムにより与えられる類似性の％値。
【００４８】
ＰＣＲ−ポリメラーゼ連鎖反応−ＤＮＡの領域を特異的に増幅する方法。
【００４９】
ＰＫＳ−ポリケチドシンターゼ。
【００５０】
プロモーター−転写の開始を支配するＤＮＡ配列。
【００５１】
組換えＤＮＡクローニングベクター−任意の自律複製または組込み作用物質（ａｇｅｎｔ）、限定するわけではないが１以上のさらなるＤＮＡ分子を加えることができる、または加えたＤＮＡ分子を含んでなるプラスミドを含む。
【００５２】
組換えＤＮＡ法−組換えＤＮＡベクターにクローン化されるＤＮＡセグメントの作成、特性決定および修飾に使用する技術。
【００５３】
制限フラグメント−１以上の制限酵素の作用により作成される任意の直線状ＤＮＡ分子  スピノシン−Ａ８３５４３としても知られる発酵産物、典型的にはＣ−２１に１−２炭素鎖を含む１２−員の大環式ラクトン、中性糖（ラムノース）およびアミノ糖（ホロサミン）に縮合した５，６，５−三環式環系、あるいはＡ８３５４３スピノシン遺伝子の全部またはほとんどを利用して微生物により生産された類似の大環式ラクトン発酵産物。
【００５４】
スピノシン遺伝子−Ａ８３５４３スピノシン生合成に必要な産物をコードするＤＮＡ配列、より具体的には今後記載するような遺伝子ｓｐｎＡ、ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤ、ｓｐｎＥ、ｓｐｎＦ、ｓｐｎＧ、ｓｐｎＨ、ｓｐｎＩ、ｓｐｎＪ、ｓｐｎＫ、ｓｐｎＬ、ｓｐｎＭ、ｓｐｎＮ、ｓｐｎＯ、ｓｐｎＰ、ｓｐｎＱ、ｓｐｎＲ、ｓｐｎＳ、Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ ｇｔｔ、Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ ｇｄｈ、Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａ ｅｐｉおよびＳ．ｓｐｉｎｏｓａ ｋｒｅまたはそれらの機能的均等物。
【００５５】
ｓｐｎ−Ａ８３５４３スピノシン生合成遺伝子。
【００５６】
サブクローン−等しいサイズまたはより大きい別のＤＮＡに由来する挿入ＤＮＡを含むクローニングベクター。
【００５７】
ＴＥ−チオエステラーゼドメイン。
【００５８】
接合完了体−接合交配に由来する組換え株。
【特許文献１】米国特許第５，３６２，６３４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２０２，２４２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８４０，８６１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５３９，０８９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，７６７，２５３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，１４３，５２６号明細書
【特許文献７】国際公開０１／１９８４０第号パンフレット
【特許文献８】米国特許出願第６０／２７７，６０１号明細書
【特許文献９】米国特許出願第０９／６６１，０６５号明細書
【特許文献１０】米国特許仮出願第６０／２７７，５４６号明細書
【非特許文献１】Ｋｉｒｓｔ，Ｈ．Ａ．，Ｋ．Ｈ．Ｍｉｃｈｅｌ，Ｊ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，  Ｌ．Ｃ．Ｃｒｅｅｍｅｒ，Ｅ．Ｈ．Ｃｈｉｎｏ，Ｒ．Ｃ．Ｙａｏ，Ｗ．Ｍ．Ｎａｋａｔｓｕｋａｓａ，Ｌ．Ｄ．Ｂｏｅｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｏｃｃｏｌｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｗ．Ｐａｓｃｈａｌ，Ｊ．Ｂ．Ｄｅｅｔｅｒ，Ｎ．Ｄ．Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｄ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ．（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３２：４８３９−４８４２．
【非特許文献２】Ｂａｌｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７
【非特許文献３】Ｂａｌｔｚ，Ｒ．Ｈ．，Ｍ．Ｃ．Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ，Ｋ．Ｐ．Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｋ．Ｍａｄｄｕｒｉ，Ｄ．Ｊ．Ｍｅｒｌｏ，Ｐ．Ｊ．Ｔｒｅａｄｗａｙ，Ｊ．Ｒ．Ｔｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗａｌｄｒｏｎ（２０００）米国特許第６，１４３，５２６号明細書
【非特許文献４】Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｊ．Ｂ．ＭｃＡｌｐｉｎｅ（１９９２）米国特許第５，１４１，９２６号明細書
【非特許文献５】Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｓ．，Ｊ．Ｂ．ＭｃＡｌｐｉｎｅ，Ｐ．Ｓ．Ｓｈｅｌｄｏｎ，Ｍ．Ｊａｃｋｓｏｎ  ＆  Ｌ．Ｋａｔｚ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：７１１９−７１２３
【非特許文献６】Ｄｏｎａｄｉｏ，Ｓ．，Ｍ．Ｊ．Ｓｔａｖｅｒ，Ｊ．Ｂ．ＭｃＡｌｐｉｎｅ，Ｓ．Ｊ．Ｓｗａｎｓｏｎ  ＆  Ｌ．Ｋａｔｚ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：６７５−６７９
【非特許文献７】Ｉｋｅｄａ，Ｈ．，Ｔ．Ｎｏｍｏｎｉｙａ，Ｍ．Ｕｓａｍｉ，Ｔ．Ｏｈｔａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｏｍｕｒａ  （１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：９５０９−９５１４．
【非特許文献８】Ｓｃｈｗｅｃｋｅ，Ｔ．，Ｊ．Ｆ．Ａｐａｒｉｃｉｏ，Ｌ  Ｍｏｌｎａｒ，Ａ．Ｋｏｎｉｇ，Ｌ．Ｅ．Ｋｈａｗ，Ｓ．Ｆ．Ｈａｙｄｏｃｋ，．Ｍ．Ｏｌｉｙｎｙｋ，Ｐ．Ｃａｆｆｒｅｙ，Ｊ．Ｃｏｒｔｅｓ，Ｊ．Ｂ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｇ．Ａ．Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｓｔａｕｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｆ．Ｌｅａｄｌａｙ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８３９−７８４３
【非特許文献９】Ｂｉｓａｎｇ，Ｃ．，Ｐ．Ｆ．Ｌｏｎｇ，Ｊ．Ｃｏｒｔｅｓ，Ｊ．Ｗｅｓｔｃｏｔｔ，Ｊ．Ｃｒｏｓｂｙ，Ａ−Ｌ．Ｍａｔｈａｒｕ，Ｒ．Ｊ．Ｃｏｘ，Ｔ．Ｊ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｓｔａｕｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｆ．Ｌｅａｄｌａｙ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：５０２−５０２−５０５
【非特許文献１０】Ｍｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ  Ｅ．Ｃｕｎｄｅｌｉｆｆｅ（１９９４）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：３４９−３５５
【非特許文献１１】Ｊｉａｎｇ，Ｘ．Ｍ．，Ｂ．Ｎｅａｌ，Ｆ．Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｓ．  Ｊ．Ｌｅｅ，Ｌ．Ｋ．Ｒｏｍａｎａ  ＆  Ｐ．Ｒ．Ｒｅｅｖｅｓ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：６９５−７１３
【非特許文献１２】Ｔｒｅｆｚｅｒ，Ａ．，Ｊ．Ａ．Ｓａｌａｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ（１９９９）Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１６：２８３−２９９
【非特許文献１３】Ｓｈｅｎ，Ｂ．，Ｗ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ｄ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｔａｎｄａｇｅ（２０００）国際公開第００／４０５９６号パンフレット
【非特許文献１４】Ａｇｕｉｒｒｅｚａｂａｌａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．
【発明の開示】
【００５９】
発明の簡単な説明
ブテニル−スピノシン生合成遺伝子および関連するＯＲＦはクローン化され、そして各々のＤＮＡ配列が決定された。クローン化された遺伝子およびＯＲＦは今後、ｂｕｓＡ、ｂｕｓＢ、ｂｕｓＣ、ｂｕｓＤ、ｂｕｓＥ、ｂｕｓＦ、ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＫ、ｂｕｓＬ、ｂｕｓＭ、ｂｕｓＮ、ｂｕｓＯ、ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲ、ｂｕｓＳ、ＯＲＦ  ＬＩ、ＯＲＦ  ＬＩＩ、ＯＲＦ  ＬＩＩＩ、ＯＲＦ  ＬＩＶ、ＯＲＦ  ＬＶＩ、ＯＲＦ  ＬＶＩＩ、ＯＲＦ  ＬＶＩＩＩ、ＯＲＦ  ＬＩＸ、ＯＲＦ  ＲＩ、ＯＲＦ  ＲＩＩおよびＯＲＦＲＩＩＩと命名する。スピノシン生合成においてクローン化された遺伝子の提案された機能を図１で確認し、そしてこれから検討する。
【００６０】
本発明の１つの観点では、ブテニル−スピノシン生合成酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子を提供し、ここで該酵素は配列番号３−７および８−２９からなる群から選択されるアミノ酸配列により定められるか、あるいは該酵素はコードされる酵素の機能的特性に実質的に影響を及ぼさなかった１以上のアミノ酸置換がなされた該アミノ酸配列の１つにより定められる。好適な態様では、ＤＮＡ配列はｂｕｓＡ、ｂｕｓＢ、ｂｕｓＣ、ｂｕｓＤ、ｂｕｓＥ、ＯＲＦ  ＲＩ、ＯＲＦ  ＲＩＩ、ＯＲＦ  ＲＩＩＩ、ｂｕｓＦ、ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＫ、ｂｕｓＬ、ｂｕｓＭ、ｂｕｓＮ、ｂｕｓＯ、ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲ、ｂｕｓＳ、ＯＲＦ  ＬＩ、ＯＲＦ  ＬＩＩ、ＯＲＦ  ＬＩＩＩ、ＯＲＦ  ＬＩＶ、ＯＲＦ  ＬＶＩ、ＯＲＦ  ＬＶＩＩ、ＯＲＦ  ＬＶＩＩＩおよびＯＲＦ  ＬＩＸからなる遺伝子群から選択され、該遺伝子がそれぞれ配列番号１の塩基１−１３０３２、１３０５９−１９５０５、１９５５３−２９０５３、２９０９２−４３８９０、４３９４５−６０６３６、６２０９０−６３９３７、６５２２９−６６６０２および６８７６２−６９６７６、ならび配に列番号２の１１４−９３８、１３８９−２５５８、２６０１−３３５０、３３６２−４５４６、４６８４−６３００、６３１７−７５０７、７５５５−８４０３、８６４０−９５６９、９６７１−１０６６６、１０６７８−１２１３５、１２８６７−１４１７７、１４６２７−１５９６７、１６００８−１７１４１、１７１６８−１７９１４、１８５２３−１９９３２、１９９８２−２０４８８、２０５３９−２１０３３、２１１７９−２１９２２、２２６７４−２３４５３、２３６９０−２４８８６、２６１８０−２６９２３および２７６４６−２８４７３により記載される。
【００６１】
本発明の別の観点では、ＫＳｉ、ＡＴｉ、ＡＣＰｉ、ＫＳｂ、ＡＴｂ、ＫＲｂ、ＤＨｂ、ＡＣＰｂ、ＫＳ１、ＡＴ１、ＫＲ１およびＡＣＰ１から選択されるブテニル−スピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子を提供し、該ドメインはそれぞれ配列番号３のアミノ酸７−４２３、５２８−８５３、８９５−９７７、９９８−１４１３、１４９５−１８３６、１８４６−２０２８、２３０６−２５１８、２６２１−２７１０、２７３５−３１６０、３２４１−３６０４、３９０７−４０８６および４１８１−４２６２により記載される。好適な態様では、ＤＮＡ配列は配列番号１の１６−１２６９、１５８２−２５５９、２６８３−２９３１、２９９２−４２３９、４４８３−５５０８、５５３８−６０８４、６９１６−７５５４、７８６１−８１３０、８２０３−９４８０、９７２１−１０８１２、１１７１９−１２２５８および１２５４１−１２７８６からなる群から選択される。
【００６２】
本発明の別の観点では、ＫＳ２、ＡＴ２、ＤＨ２、ＥＲ２、ＫＲ２およびＡＣＰ２から選択されるスピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子を提供し、該ドメインはそれぞれ配列番号４のアミノ酸１−４２１、５３４−９６４、９９０−１０７５、１３３６−１６８１、１６８５−１８６４および１９５３−２０３１により記載される。好適な態様ではＤＮＡ配列は配列番号１の塩基１３０５９−１４３２１、１４６５８−１５９００、１６０２６−１６２８３、１７０６４−１８１００、１８１１１−１８６５０および１８９１５−１９１５１からなる群から選択される。
【００６３】
本発明の別の観点では、ＫＳ３、ＡＴ３、ＫＲ３、ＡＣＰ３、ＫＳ４、ＡＴ４、ＫＲ４およびＡＣＰ４から選択されるスピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子を提供し、該ドメインはそれぞれ配列番号５のアミノ酸１−４２１、５２８−８１４、１１５７−１３３５、１４２２−１５０３、１５２６−１９４９、２０６３−２３９３、２６９７−２８７７および２９６９−３０４９により記載される。好適な態様ではＤＮＡ配列は配列番号１の塩基１９５５３−２０８１５、２１１４３−２２０００、２３０２１−２３５５７、２３８１６−２４０６１、２４１２８−２５３９９、２５７３９−２６７３１、２７６４１−２８１８３および２８４５７−２８６９９からなる群から選択される。
【００６４】
本発明の別の観点では、ＫＳ５、ＡＴ５、ＤＨ５、ＫＲ５、ＡＣＰ５、ＫＳ６、ＡＴ６、ＫＲ６、ＡＣＰ６、ＫＳ７、ＡＴ７、ＫＲ７およびＡＣＰ７から選択されるスピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子提供し、該ドメインはそれぞれ配列番号６のアミノ酸１−４２２、５３７−８６４、８９１−１０７６、１３８２−１５６３、１６４３−１７２４、１７４６−２１７０、２２８１−２６１１、２９１４−３０９３、３１８６−３２６７、３２８９−３７１１、３８２３−４１５１、４３４２−４６３６および４７２３−４８０４により記載される。好適な態様ではＤＮＡ配列は配列番号１の塩基２９０９２−３０３５７、３０７００−３１６８３、３１７６２−３２３１９、３３２３５−３３７８０、３４０１８−３４２６３、３４３２７−３５６０１、３５９３２−３６９２４、３７８３１−３８３７０、３８６４７−３８８９２、３８９５６−４０２２４、４０５６０−４１５４４、４２１１５−４２９９９および４３２５８−４３５０３からなる群から選択される。
【００６５】
本発明の別の観点では、ＫＳ８、ＡＴ８、ＤＨ８、ＫＲ８、ＡＣＰ８、ＫＳ９、ＡＴ９、ＤＨ９、ＫＲ９、ＡＣＰ９、ＫＳ１０、ＡＴ１０、ＤＨ１０、ＫＲ１０、ＡＣＰ１０およびＴＥ１０から選択されるスピノシンＰＫＳドメインをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子を提供し、該ドメインがそれぞれ配列番号７のアミノ酸１−４２４、５３０−８４８、８８５−１０７２、１３７１−１５５４、１６５０−１７２８、１７５１−２１７５、２２８９−２６１６、２６４２−２７７５、３１３１−３３１５、３３９６−３４７４、３５０８−３９２１、４０３６−４３６６、４３８９−４５６９、４８７６−５０５４、５１４８−５２２９および５２７８−５５３１により記載される。好適な態様ではＤＮＡ配列は配列番号１の塩基４３９４５−４５２１６、４５５３２−４６４８８、４６５９７−４７１６０、４８０５５−４８６０６、４８８９２−４９０８３、４９１９５−５０４６９、５０８０９−５１７９２、５１８６８−５２２６９、５３３３５−５３８８９、５４１３０−５４３６６、５４４６６−５５７０７、５６０５０−５７０４２、５７１０９−５７６５１、５８５７０−５９１０６、５９３８６−５９６３１および５９７７６−６０５３７からなる群から選択される。
【００６６】
本発明の別の観点では、配列番号３のアミノ酸６−９７７、配列番号３の９９８−２７１０、配列番号３の２７３５−４２６２、配列番号４の１−２０３１、配列番号５の１−１５０３、配列番号５の１５２６−３０４９、配列番号６の１−１７２４、配列番号６の１７４６−３２６７、配列番号６の３２８９−４８０４、配列番号７の１−１７２８、配列番号７の１７５１−３４７４および配列番号７の３５０８−５５３１からなる群から選択されるスピノシンＰＫＳモジュールをコードするＤＮＡ配列を含んでなる単離されたＤＮＡ分子を提供する。好適な態様ではＤＮＡ配列は配列番号１の塩基１６−２９３１、２９９２−８１３０、８２０３−１２７８６、１３０５９−１９１５１、１９５５３−２４０６１、２４１２８−２８６９９、２９０９２−３４２６３、３４３２７−３８８９２、３８９５６−４３５０３、４３９４５−４９０８３、４９１９５−５４３６６および５４４６６−６０５３７からなる群から選択される。
【００６７】
本発明の別の観点では、上記の本発明のＤＮＡ配列を含んでなる組換えＤＮＡベクターを提供する。
【００６８】
本発明の別の観点では、上記の本発明の組換えベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
【００６９】
本発明の別の観点では、
１）組換えＤＮＡベクターまたはそれらの部分で、生合成経路によりブテニルスピノシンまたはブテニル−スピノシン前駆体を生産する微生物を形質転換し、該ベクターまたはそれらの部分は該経路の律速である活性の発現をコードする上記のような本発明のＤＮＡ配列を含んでなり、そして
２）該ベクターで形質転換した該微生物を、細胞の成長および分裂、該ＤＮＡ配列の発現およびスピノシンの生産に適する条件下で培養する、
工程を含んでなるスピノシン−生産微生物のスピノシン−生産能を上げる方法を提供する。
【００７０】
本発明の別の観点では、作動性のブテニル−スピノシン生合成遺伝子を有するスピノシン生産微生物を提供し、ここで少なくとも１つのブテニル−スピノシン生合成遺伝子ｂｕｓＡ、ｂｕｓＢ、ｂｕｓＣ、ｂｕｓＤ、ｂｕｓＥ、ｂｕｓＦ、ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＫ、ｂｕｓＬ、ｂｕｓＭ、ｂｕｓＮ、ｂｕｓＯ、ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲおよびｂｕｓＳが複写されている（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ）。
【００７１】
本発明の別の観点では  ゲノムにブテニル−スピノシン生合成遺伝子を有するブテニル−スピノシン生産微生物を提供し、該遺伝子の少なくとも１つが不活性化され、該遺伝子の残りは破壊された遺伝子が作動できるならば生産されるブテニル−スピノシン以外のブテニル−スピノシンを生産するように作動できる。好ましくは微生物はサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）またはＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）の突然変異体である。より好ましくは微生物はサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）の突然変異体である。
【００７２】
また本発明は通常はブテニル−スピノシンを生産しない生物中のブテニル−スピノシン生合成遺伝子の発現も提供する。遺伝子は自然なｂｕｓ遺伝子プロモーターの下、または受容体株と適合性があるヘテロロガスなプロモーターに由来するプロモーターの下で発現され得る。好ましくは生物はスピノシン−様化合物を生産することができる。より好ましくは微生物はＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）またはそれらの誘導体である。
【００７３】
本発明はゲノムに作動できるブテニル−スピノシン生合成遺伝子を有するブテニル−スピノシン生産微生物も提供し、ここで該遺伝子ａ）は配列番号１に存在するより多い、または少なくとも１つ少ない、少なくとも１つの作動性ＰＫＳモジュールを含むか；あるいはｂ）ＫＲ、ＤＨまたはＥＲドメインの削除、不活性化または付加により、あるいはＡＴドメインの置換により配列番号１に記載された対応するモジュールとは異なるＰＫＳモジュールを含む。好ましくは微生物はサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）の突然変異体である。
【００７４】
本発明は本発明の新規微生物の培養により生産されるブテニル−スピノシンも提供する。
【００７５】
本発明の別の観点では、ブテニル−スピノシン生産微生物のゲノムライブラリーを作成し、そしてハイブリダイゼーションプローブとして少なくとも２０塩基長である配列番号１または配列番号２の標識フラグメントを使用することを含んでなる、ブテニル−スピノシン生合成遺伝子の単離法を提供する。
【００７６】
当業者はタンパク質の機能性を実質的に変化させることなく特許請求するアミノ酸配列に置換を作成することができると理解するだろう。本発明はそのような変異体アミノ酸配列および変異体をコードするＤＮＡ配列を包含する。好適なアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列と実質的に同じ機能性を有し、そして少なくとも９８％同一である配列である。
【００７７】
発明の詳細な説明
ブテニル−スピノシン遺伝子の特性決定および利用の先行条件として、この昆虫防除剤の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を単離し、そして特性決定することが必要である。以下の実施例１に記載するこの取り組には、ゲノムコスミドライブラリーの構築、そして続いてＤＮＡ−ハイブリダイゼーションを介したスクリーニングが含まれる。
【実施例１】
【００７８】
ａ．サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）に由来する全細胞ＤＮＡの単離
サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）は、５００−ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中の１００ｍＬの栄養培地（９．０ｇ／Ｌデキストロース、３０ｇ／Ｌ  トリプチカーゼソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ）、３．０ｇ／Ｌ  酵母エキス、２．０ｇ／Ｌ  硫酸マグネシウム７Ｈ２Ｏ）に接種し、そして１５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で７２時間インキューベーションした。この培養物を１０分間、３，０００ｒｐｍ／４℃で遠心して細胞をペレットにした。上清の流体を取り出し、そして細胞ペレットを２０ｍＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）で洗浄した。細胞を再度３，０００ｒｐｍで遠心し、そしてペレットは全細胞ＤＮＡを単離するために解凍するまで−２０℃に凍結した。
【００７９】
全細胞ＤＮＡはゲノムＤＮＡ精製キット（キアジェン社（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、バレンシア、カリフォルニア州）を使用してサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）から単離した。１００ｍＬのカルチャーからの凍結した細菌細胞ペレットは、１１μｌのキアジェンＲｎａｓｅ  Ａ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を含む１１ｍｌのバッファーＢ１（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にボルテックス混合することにより再懸濁した。この懸濁液に３００μｌのリゾザイム（１００ｍｇ／ｍｌ；シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、セントルイス、ミズーリ州）保存溶液および５００μｌのプロティナーゼＫ（５０ｍｇ／ｍｌ；シグマケミカル社）保存溶液を加えた。懸濁液をボルテックス処理することにより混合し、そして３７℃で３０分間インキューベーションした。４ｍｌのバッファーＢ２（３ＭグアニジンＨＣｌ；２０％Ｔｗｅｅｎ２０）を細菌溶解物に加え、そして溶液は管をゆるやかに逆さにすることにより混合した。細菌溶解物は５０℃で３０分間インキューベーションした。全細胞ＤＮＡはキアジェンＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ５００／Ｇチップを製造元の使用説明に従い使用して細菌溶解物から単離した。生じた精製ＤＮＡを５ｍＬのＴＥバッファーに溶解し、そして４℃で保存した。
ｂ．ゲノムコスミドライブラリーの構築
サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）から単離した全細胞ＤＮＡは、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．の第３．１．３章（分子生物学の現在の手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョンウィリー  アンド  サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）ニューヨーク、  ニューヨーク州）に基づきＳａｕ３ＡＩで部分消化した。小規模（８０μｌの反応容量中の４０μｇの全細胞ＤＮＡ）反応を行って、２５〜５０Ｋｂサイズの範囲の部分消化したＤＮＡフラグメントの最大濃度をもたらす全細胞ＤＮＡに対して正しい酵素の比率を決定した。反応物は６５℃で１５分間加熱してＳａｕ３ＡＩ酵素を不活性化し、そして反応のアリコートを０．３％アガロースゲルでの電気泳動で分析して所望するサイズの範囲中の部分消化ＤＮＡフラグメントの相対的量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を決定した。いったん全細胞ＤＮＡに対して最適な酵素の比が観察されたら、コスミドライブラリーの構築に挿入ＤＮＡとして使用するために反応容量を増して十分な量の部分消化した全細胞ＤＮＡを得た。典型的な規模の反応は、９単位のＳａｕ３ＡＩ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、ゲチスバーグ、メリーランド州）と３７℃で１５分間、８００μｌの全容量の１×Ｒｅａｃｔ４バッファー（１０×で製造元より供給される）中でインキューベーションした４００μｇのサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）全細胞ＤＮＡであった。反応物を６５℃で２０分間加熱して酵素を不活性化した。部分消化したゲノムＤＮＡを等容量の平衡化フェノール−クロロホルム（５０：５０；容量／容量）溶液と混合し、そしてゆるやかに逆さにすることにより混合した。１４，０００×ｇで１５分間遠心した後、水性相を取り出し、そして等容量のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１；容量／容量）溶液と混合した。ゆるやかに逆さにすることにより２つの相を混合した後、溶液を１４，０００×ｇで１５分間遠心した。水性相を新しい試験管に取り出し、そして０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えた。２容量の氷冷１００％エタノールを加え、そして溶液は逆さにすることにより混合した。ＤＮＡを沈殿させるために、サンプルを−７０℃に一晩置いた。沈殿したＤＮＡを１４，０００×ｇで２０分間遠心することによりペレットとした。ＤＮＡペレットを５０μｌの二重蒸留水に再懸濁し、そして−２０℃で保存した。
【００８０】
コスミドライブラリーの構築に使用するベクターは、選択のためにアプラマイシン耐性遺伝子を含むｐＯＪ４３６（図３）であった。コスミドベクターＤＮＡの自身への再連結を最少とするために、ＢａｍＨＩで消化したｐＯＪ４３６ＤＮＡは、消化したＤＮＡを２０単位のエビのアルカリホスファターゼ（ロッシュ／ベーリンガーマンハイム（Ｒｏｃｈｅ／Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）と、３７℃で２時間、全容量１．２ｍｌの１×ＳＡＰバッファー（製造元により１０×で供給される）中でインキューベーションすることにより脱リン酸化した。Ｓａｕ３ＡＩ消化ゲノムＤＮＡは、脱リン酸化したｐＯＪ４３６のＢａｍＨＩ部位に連結し、そして５：１の比率の部分消化した挿入物を使用してベクターＤＮＡに連結した。この反応のために、挿入物およびベクターＤＮＡを２０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイオラボズ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．）、ビバリー、マサチューセッツ州）と、１６℃で１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（１０×として製造元から供給される）中で一晩インキューベーションした。連結混合物をＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ、カリフォルニア州）を使用してパッケージングし、そして組換えファージは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α−ＭＲＣ＋細胞株（ギブコＢＲＬ）を使用して製造元の使用説明に記載されているように滴定した。アリコート（２０〜４０μｌ）の組換えファージおよび宿主細胞培養物を、アプラマイシン（１００ｍｇ／ｌ、シグマケミカル社）を含むＬＢ寒天上（１０ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−トリプトン、１０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、５ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−酵母エキス、１５ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−寒天；ディフコラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にまき、そして３７℃で一晩インキューベーションした。冷凍庫で保存するためのコスミドライブラリーのマスタープレートを構築するために、１つのコロニーを滅菌した楊枝で取り上げ、そして２５０μｌのテリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）（ＴＢ培地：１２ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−トリプトン、２４ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−酵母エキス、０．４容量／容量％グリセロール、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４）を含み、１００ｍｇ／ｌアプラマイシンを補充した滅菌９６−ウェルマイクロウェルプレートの個々のウェルに接種し、そして振盪せずに一晩、３７℃でインキューベーションした。マスタープレートからコピープレートを作成するために、９６−ウェルマイクロプレートのレプリケーター（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック社（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して、１００ｍｇ／ｌのアプラマイシンを含有する２５０μｌのＴＢ培地を含む滅菌９６−ウェルマイクロウェルプレートに接種した。コピープレートは振盪せずに一晩、３７℃でインキューベーションした。
【００８１】
マスターおよびコピープレートの両方について、７（容量／容量）％のジメチルスルフォキシド溶液をプレートに加え、そして培養物をマルチチャンネルピペットを使用して混合した。プレートは保存のために−７０℃に置いた。
【００８２】
選択した組換えコスミドの平均挿入サイズは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ核酸精製キット（クローンテック  ラボラトリーズ社（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、パロアルト、カリフォルニア州）を使用してコスミドＤＮＡを単離し、そして回収したＤＮＡを２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニューイングランド  バイオラボス）を用いて３７℃で１時間消化することにより評価した。制限処理ＤＮＡは１．０％アガロースゲル中での電気泳動により分析した。ＤＮＡフラグメントは０．５％エチジウムブロミド（シグマケミカル社）染色後にＵＶ光を用いて視覚化し、そしてフラグメントの相対的サイズを１ｋｂ  ＤＮＡラダー（ギブコＢＲＬ）との比較により推定した。構築されたコスミドライブラリーの挿入サイズは２０Ｋｂ−４０Ｋｂの範囲であった。
ｃ．コスミドライブラリーのスクリーニングおよびブテニル−スピノシン生合成遺伝子を含むコスミドの同定
代表的な各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コスミドクローンは、９６−ウェルマイクロプレートレプリケーター（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック社）を使用して、ＨｙｂｏｎｄＮ＋（アマーシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）核酸結合膜上に二重に接種した。膜は１００ｍｇ／Ｌのアプラマイシンを補充したＬＢ寒天プレート上で支持し、そして３７℃で一晩インキューベーションした。膜を製造元のプロトコールに従い処理した。接種した膜はコロニー側を上にして０．５Ｎ  ＮａＯＨで１分間飽和させた３ＭＭ−フィルターペーパー（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）、クリフトン、ニュージャージー州）に置いた。フィルターは１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６で１分間飽和させた３ＭＭ−フィルターペーパーに移してＤＮＡを変性させた。膜は１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６／１．５Ｍ  ＮａＣｌで１分間飽和させた３ＭＭ−フィルターペーパーに移すことにより中和した。最後の洗浄は１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６／１．５Ｍ  ＮａＣｌの溶液中で行い、ここで残りのコロニー屑を膜から除去した。ＤＮＡはＵＶＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ１８００（ストラタジーン）を使用して１２００マイクロジュールで膜に架橋結合させた。      
【００８３】
このように調製した組換え細菌のライブラリーは、Ｓ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）に由来するｓｐｎ遺伝子に基づく３つの放射能標識したＤＮＡプローブに対して相同性をスクリーニングした（Ｂａｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；表２）。オリゴヌクレオチド対を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通してｓｐｎ生合成遺伝子クラスターに特異的なヌクレオチド領域を増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーは３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成器（アプライドバイオシステムズ／パーキンエルマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して合成し、そして表２に掲げる。ＰＣＲ反応はＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼキット（パーキンエルマー／ロッシュ、ブランチバーグ、ニュージャージー州）を使用して製造元のプルトコールに従い行った。ＤＮＡフラグメントは４８−サンプルＤＮＡ熱循環器（パーキンエルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ））中で以下の循環条件下で増幅した：１）９４℃、１分；５５℃、２分；７２℃、３分；２５循環  ２）７２℃、１０分；１循環。増幅した産物は０．１％アガロースゲル電気泳動を使用して分析し、そして適切なサイズに対応するバンドをキアジェンＩＩゲル抽出キット（キアジェン社）を利用して製造元の指示に従いゲル−抽出した。
【００８４】
【表４】
2005512506.tif 000006
【００８５】
膜は放射能標識プローブを加える前に６５℃で３時間、６×ＳＳＣ（５２．５９ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２４．６６ｇ／Ｌ  クエン酸ナトリウム、１０Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを７．０に調整）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハーツ溶液（５０ｍｇ／Ｌ  Ｆｉｃｏｌｌ［４００型、ファルマシア］、５．０ｍｇ／Ｌ  ポリビニルピロリドン、５．０ｍｇ／Ｌ  ウシ胎児血清アルブミン）、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子からなる３００ｍｌのプレ−ハイブリダイゼーション溶液中でインキューベーションした。
【００８６】
ＤＮＡフラグメントの濃度は、すべてのプローブについて２５ｎｇに調整し、沸騰水浴中で１０分間変性させ、そして４μｌのＨｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ反応混合物（ベーリンガーマンハイム）を製造元のプロトコールに従い使用して、５０μＣｉ［α３２］ｄＣＴＰ、３０００Ｃｉ／ｍＭＯｌでランダム−プライム標識した。放射能標識したＤＮＡプローブから非包含ヌクレオチドの分離は、ＮｕｃＴｒａｐ  Ｐｕｓｈカラム（ストラジーン）を使用して行い、そして沸騰水浴中で１０分間変性させた後、プレ−ハイブリダイゼーション膜に添加した。すべてのＤＮＡハイブリダイゼーションのために約２．０×１０７ｃｐｍを膜に加えた。すべてのプローブに関するハイブリダイゼーション条件は、６５℃の振盪水浴中で１６時間であった。
【００８７】
放射能標識したプローブｓｐｎＦ、ｓｐｎＳおよびｓｐｎＥ（ＴＥ）を含むハイブリダイゼーション溶液をデカントし、そして各組の膜を中程度のストリンジェンシー条件下で洗浄した：１）１５分、室温で３００ｍｌの３×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中；２）３０分、６５℃にて３００ｍｌの新たな３×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で振盪；３）３０分、室温で３００ｍｌの１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ。サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）コスミド９Ｄ３配列に由来する放射能標識プローブでスクリーニングした膜を、ストリンジェントな条件下で洗浄した：１）３０分、６５℃で３００ｍｌの新たな１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で振盪；２）３０分、６５℃にて３００ｍｌの新たな０．３３×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で振盪；３）３０分、６５℃にて３００ｍｌの新たな０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で振盪。フィルターは手で持つＧｅｉｇｅｒ−Ｍｕｅｌｌｅｒカウンターを使用してモニタリングして、バックグラウンドの同位体検出が最少であるかどうかを測定した。膜を３ＭＭフィルターペーパー上にのせ、そしてプラスチックラップで覆い、そしてｘ−線フィルムに暴露した。膜はフィルムに−７０℃で２４〜７２時間暴露した後、現像した。
【００８８】
推定上の陽性コスミドクローンは、さらに制限エンドヌクレアーゼ消化分析およびコスミドベクターからエンド−シークエンシングを介して特性決定した。コスミドＤＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ核酸精製キット（クローンテックラボラトリーズ社、パロアルト、カリフォルニア州）を使用して単離し、そして２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（ニューイングランドバイオラボズ）で３７℃にて１時間消化した。制限処理したＤＮＡを１．０％アガロースゲルで電気泳動した。ＤＮＡフラグメントは０．５％エチジウムブロミド染色後にＵＶ光で視覚化し、そしてフラグメントの相対的サイズを１ＫｂのＤＮＡラダーと比較することにより推定した。さらにコスミド／ベクター連結部から、Ｂｕｒｇｅｔｔ  ａｎｄ  Ｒｏｓｔｅｃｋ（１９９４）の方法に従い蛍光サイクルシークエンシングによりサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）ヌクレオチド配列を得た。シークエンシング反応は３７７ＡＢＩＰｒｉｍ（商標）シークエンサー（アプライドバイオシステムズ社）を用いた９６℃、３０秒；５０℃  １５秒；６０℃、４分；を２５循環の熱循環条件下で、３μｌ（２μｇの精製コスミドＤＮＡ）鋳型、１μｌのユニバーサルプライマー（４ｐｍｏｌｅ）または逆プライマー（４ｐｍｏｌｅ）、８μｌＢｉｇ  Ｄｙｅ（商標）反応混合物、１μｌＤＭＳＯ、７ｍｌＨ２Ｏからなった。      
【００８９】
８つのコスミドクローンがＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）プローブｓｐｎＳ、ｓｐｎＦおよびｓｐｎＥ（ＴＥ）に陽性にハイブリダイズすると同定された。コスミド８Ｈ３はｓｐｎＳおよびｓｐｎＦプローブの両方にハイブリダイズした２つのクローンのうちの１つであった。コスミド９Ｄ３はｓｐｎＦプローブにのみハイブリダイズした３つのクローンの１つであった。コスミド１０Ｃ１はｓｐｎＥ（ＴＥ）プローブのみにハイブリダイズした３つのクローンのうちの１つであった。コスミド９Ｆ４は、コスミド９Ｄ３（配列番号１の塩基２９７４７７−３０１６３）からコスミド／ベクター末端のヌクレオチドシークエンシングを介して解明された、サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）に直接由来する放射能標識ＰＣＲ−フラグメントへのハイブリダイゼーションによりゲノムライブラリーから同定された。コスミド９Ｄ３  ＤＮＡ配列に基づき２つのプライマーを合成した（配列番号３０および配列番号４０）。４１６ｂｐのＤＮＡフラグメントをサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）ゲノムＤＮＡから、上に詳細に記載し、そしてハイブリダイゼーションに使用したこれらのプライマーを使用して増幅した。
【００９０】
コスミド８Ｈ３、９Ｄ３、９Ｆ４および１０Ｃ１の完全な配列は、ファージＭ１３（シークライト（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ）、ヒューストン、テキサス州）中にクローン化したランダムＤＮＡフラグメントの蛍光サイクルシークエンシング法により決定した。コスミド８Ｈ３および９Ｄ３中の挿入物は重複し、コスミド９Ｄ３および９Ｆ４中の挿入物は重複し、そして９Ｆ４および１０Ｃ１中の挿入物は重複した。図２を参照にされたい。一緒にすると４種のコスミド挿入物は約１１１ｋｂの独自な配列（配列番号１および２）に広がった。配列番号１はｂｕｓＡの開始コドンおよびすべてのＤＮＡのその３’までを含む（図２を参照）。配列番号２はｂｕｓＡの開始コドンの前の塩基から始まり、そしてすべてのＤＮＡをその塩基の５’側まで含む。以下の表３では４種の各挿入物に含まれる配列番号１および配列番号２の部分を確認する。
【００９１】
【表５】
2005512506.tif 000007
【００９２】
図２は１１０ｋｂの配列に対する４種の挿入物の関係のグラフ表示を与える。
【００９３】
ＰＫＳ遺伝子
配列番号１は既知のマクロライド生産体であるポリケチドシンセターゼをコードするＤＮＡに目立った相同性を持つ約６０ｋｂの中央領域を含む（Ｄｏｎａｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；ＭｃＤａｎｉｅｌ  ＆  Ｋａｔｚ，２００１；Ｄｅｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ブテニル−スピノシンＰＫＳ  ＤＮＡ領域は、ＡＣＰドメインの末端にフレイム内終結コドンを含む５個のＯＲＦからなり、他のマクロライド生産細菌中のＰＫＳ  ＯＲＦに類似する。５個のブテニル−スピノシンＰＫＳ遺伝子は頭から尾に配列され（図２を参照にされたい）、エリスロマイシンＰＫＳ遺伝子ＡＩとＡＩＩとの間に見いだされる挿入要素のような介入非−ＰＫＳ機能は無い（Ｄｏｎａｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。このＰＫＳ遺伝子はｂｕｓＡ、ｂｕｓＢ、ｂｕｓＣ、ｂｕｓＤおよびｂｕｓＥと命名する。５個のスピノシンＰＫＳ遺伝子の各々に関するヌクレオチド配列および対応するポリペプチドは、以下の表４で確認する：
【００９４】
【表６】
2005512506.tif 000008
【００９５】
ｂｕｓＡはイニシエーターモジュール（配列番号１、塩基１−２９３１）、エクステンダーモジュールｂ（配列番号１、塩基２９９２−８１３０）およびエクステンダーモジュール１（配列番号１、塩基８２０５−１３０３２）をコードする。イニシエーターモジュールおよびエクステンダーモジュールｂおよび１内の各機能的ドメインに関するヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、以下の表５で確認する：
【００９６】
【表７】
2005512506.tif 000009
【００９７】
ｂｕｓＢはエクステンダーモジュール２（配列番号１、塩基１３０５９−１９５０５）をコードする。エクステンダーモジュール２内の各機能的ドメインに関するヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、以下の表６で確認する：
【００９８】
【表８】
2005512506.tif 000010
【００９９】
ｂｕｓＣはエクステンダーモジュール３（配列番号１、塩基１９５５３−２４０６１）およびエクステンダーモジュール４（配列番号１、塩基２４１２８−２９０５３）をコードする。エクステンダーモジュール３および４内の各機能的ドメインに関するヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、以下の表７で確認する：
【０１００】
【表９】
2005512506.tif 000011
【０１０１】
ｂｕｓＤはエクステンダーモジュール５（配列番号１、塩基２９０９２−３４２６３）、エクステンダーモジュール６（配列番号１、塩基３４３２７−３８８９２）およびエクステンダーモジュール７（配列番号１、塩基３８９５６−４３５０３）をコードする。エクステンダーモジュール５、６および７内の各機能的ドメインに関するヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、以下の表８で確認する：
【０１０２】
【表１０】
2005512506.tif 000012
【０１０３】
ｓｐｎＥはエクステンダーモジュール８（配列番号１、塩基４３９４５−４９０８３）、エクステンダーモジュール９（配列番号１、塩基４９１９５−５４３６６）およびエクステンダーモジュール１０（配列番号１、塩基５４４６６−６０７０７）をコードする。エクステンダーモジュール８、９および１０内の各機能的ドメインに関するヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、以下の表９で確認する：
【０１０４】
【表１１】
2005512506.tif 000013
【０１０５】
前述の表７〜１１で確認した５５ドメインの境界および機能は、他のポリケチドシンターゼ、特にエリスロマイシンポリケチドシンターゼ中のドメインの保存されたアミノ酸配列に対する類似性に基づき予想する（Ｄｏｎａｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。Ａ８３５４３スピノシンＰＫＳと同様に、ｂｕｓＰＫＳはＫＳＱドメインをイニシエーターモジュールのアミノ末端に有する。このＫＳＱドメインはβ−ケトシンターゼ活性に必要なシステインの代わりにアミノ酸１７２にグルタミン残基を含むので、β−ケトシンターゼとして機能することはできない（Ｓｉｇｇａｒｄ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ，１９９３）。ＫＳＱドメインはマロニル−ＡＣＰをデカルボキシレートするように機能し、そして連鎖開始因子であることが報告された（Ｂｉｓａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。他のブテニル−スピノシンＰＫＳドメインは機能的である。それらのいずれもエリスロマイシンおよびラパマイシンＰＫＳ遺伝子中に見いだされる不活性ドメインの配列特徴をもたない（Ｄｏｎａｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ａｐａｒｉｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０１０６】
ｂｕｓＢ−ＥはサイズがｓｐｎＢ−Ｅに匹敵するが、ｂｕｓＡはｓｐｎＡよりも５，２４４ｂｐ長い。ｂｕｓＡの最初の４２４５ｂｐおよび最後の３，４８６ｂｐはｓｐｎＡに対する高度な類似性を有する。しかし塩基４２４６−９５４８はｓｐｎＡ遺伝子中の対部分をもたない。この５ｋｂ領域は５個の機能的ドメイン：ＫＳｂ、ＡＴｂ、ＤＨｂ、ＫＲｂおよびＡＣＰｂを持つさらなるモジュールをコードする。これらの機能は先行する開始ドメインと一緒にブテニル側鎖の生合成の原因であり、Ａ８３５４３スピノシンに対してブテニル−スピノシンの特徴である。クローン化ｂｕｓＰＫＳ遺伝子、ｂｕｓＢ、ｂｕｓＣ、ｂｕｓＤおよびｂｕｓＥは、同族のＡ８３５４３スピノシンＰＫＳ遺伝子ｓｐｎＢ、ｓｐｎＣ、ｓｐｎＤおよびｓｐｎＥに類似することが示された（表１０）（Ｂａｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１０７】
【表１２】
2005512506.tif 000014
【０１０８】
スピノシンの生合成で同様の反応を行うタンパク質は８７−９３％のアミノ酸同一性を共有し、そして遺伝子は９３−９４％のＤＮＡ配列同一性の範囲である。ｓｐｎＰＫＳ酵素ＳｐｎＢ−Ｅおよび類似のｂｕｓＰＫＳ酵素Ｂ−Ｅは、酵素により行われる反応は同一であるが、基質ポリケチドが異なるので、異なる基質特異性を維持しなければならないことに注目すべきである。さらにＰＫＳ酵素の機能的ＰＫＳへの凝集には、特異的なタンパク質−タンパク質相互作用が必要である。このサブユニット分子間認識に関与する残基は未知であり、そしてＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）とサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）との間で保存されないかもしれない。
【０１０９】
さらなる修飾の原因であるＰＫＳに隣接する遺伝子
ＰＫＳ遺伝子（コスミド８Ｈ３にクローン化された）の上流のＤＮＡでは、２２個のオープンリーディングフレイム（ＯＲＦ）があり、各々が少なくともＡＴＧまたはＧＴＧで始まり、そしてＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡで終わる１００コドンからなり、そしてＤＮＡが高い割合のグアニンおよびシトシン残基を含む生物中で予想されるタンパク質−コード領域のコドンの偏りを有する（Ｂｉｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。これら２２個のＯＲＦは図２にグラフで表す。これから検討する証拠に基づき、ＯＲＦの１４個がブテニル−スピノシン生合成遺伝子と命名された、すなわち：ｂｕｓＦ、ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＫ、ｂｕｓＬ、ｂｕｓＭ、ｂｕｓＮ、ｂｕｓＯ、ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲおよびｂｕｓＳ（図２の標識ＦからＳ）。以下の表１１では、ＤＮＡ配列および対応するポリペプチドのアミノ酸配列がこれら各遺伝子について、ならびにｓｐｎＳの直ぐ下流で見いだされるＯＲＦ（コスミド８Ｈ３中のＯＲＦ  ＬＩ、ＯＲＦ  ＬＩＩ、ＯＲＦ  ＬＩＩＩ、ＯＲＦ  ＬＩＶ、ＯＲＦ  ＬＶＩ、ＯＲＦ  ＬＶＩＩ、ＯＲＦ  ＬＶＩＩＩおよびＯＲＦ  ＬＩＸ）について確認されている。また表１１で確認されるのは、ＰＫＳ遺伝子（コスミド２Ｃ１０）の下流のＯＲＦ  ＲＩ、ＯＲＦ  ＲＩＩおよびＯＲＦ  ＲＩＩに関するヌクレオチド配列およびそれらに対応するアミノ酸配列である。
【０１１０】
【表１３】
2005512506.tif 000015
【０１１１】
表１１で確認されるポリペプチドに機能を割り振るために、４つの証拠筋（ｌｉｎｅ）を利用した：既知の機能の配列に対する類似性、Ａ８３５４３スピノシン生合成遺伝子に対する類似性、標的遺伝子破壊実験の結果および生物転換（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）実験の結果。
【０１１２】
予想されるポリペプチドのアミノ酸配列は、ナショナル  センター  フォ  バイオテクノロジー  インフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ、ワシントン、ＤＣ）のデータベースに寄託されている配列と、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して比較して、それらがどれくらいよく既知のタンパク質に関連しているかを決定した。ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴ調査も周期的に繰り返して、さらなる相同性から新たな洞察を得た。表１２は２００１年２月１８日付けの基本的ＢＬＡＳＴ調査から重要な対合を与える。
【０１１３】
【表１４】
2005512506.tif 000016
【０１１４】
【表１５】
2005512506.tif 000017
【０１１５】
ｂｕｓオープンリーディングフレイムはＡ８３５４３スピノシン生合成遺伝子の配列（寄託番号ＡＹ００７５６４）と直接比較した。ＤＮＡおよびタンパク質配列の両方でより高い類似性の程度は、遺伝子がスピノシンの生合成で類似の機能を行ったことを示した。表１３はｂｕｓとｓｐｎ遺伝子との間の類似性の比較を与える。  
【０１１６】
【表１６】
2005512506.tif 000018
【０１１７】
幾つかのｂｕｓおよびｓｐｎ遺伝子間の高度なＤＮＡおよびアミノ酸類似性にもかかわらず、幾つかのｂｕｓ遺伝子産物はＡ８３５４３スピノシンに比べて、ブテニル−スピノシンの生合成において顕著に異なる反応を触媒することに注目するべきである。これらの差異はサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）から単離された異なるブテニル−スピノシン化合物に現れる。開示されているすべての天然Ａ８３５４３スピノシンは、Ｃ−１７でホロサミンまたは特異的なホロサミン異性体に置換されている（Ｋｉｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。一方ブテニル−スピノシンは、Ｃ−１７でより広い範囲のホロサミン異性体、ならびに天然糖様アミセトース（ａｍｉｃｅｔｏｓｅ）、Ｏ−メチル−グルコースおよびＯ−メチルオレアンドロース（ｍｅｔｈｙｌｏｌｅａｎｄｒｏｓｅ）でも置換される。Ａ８３５４３スピノシンに対してこのＣ−１７グリコシル化の多様性には、生合成酵素が糖およびグリコシルトランスフェラーゼをこれらのグリコシル化を触媒できようにする必要がある。これらの糖はｂｕｓ遺伝子付近に、または染色体のいずれかに位置する特別なシンターゼ遺伝子により合成されるか、あるいはそれらは掲げたブテニル−スピノシン生合成遺伝子の別の基質特異性により合成されるのかもしれない。アミセトースはｂｕｓ遺伝子クラスターの外側の遺伝子により生産されることができるか、またはホロサミンの生合成の中間体かもしれない（図４）。メチルオレアンドロースはホロサミン生合成およびラムノースＯ−メチルトランスフェラーゼの副産物として生産されることができた（ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩおよびｂｕｓＫ）。ＮＤＰ−４−ケト−２，６−デオキシ−Ｄ−グルコースから合成することができたこの糖は、ホロサミンの生合成の中間体である。したがってこの前駆体の開示された遺伝子および他のサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）遺伝子によるケト還元およびＯ−メチル化は、メチルオレアンドロースを含むスピノシン誘導体の生合成を導くことができた（図４）。
【０１１８】
さらに表１３に掲げた９種の遺伝子が、ブテニル−スピノシンアグリコンまたはＰＳＡと直接相互作用する（ｂｕｓＦ、ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＫ、ｂｕｓＬ、ｂｕｓＭおよびｂｕｓＰ）。これらの遺伝子に関するアグリコンおよびＰＳＡ基質は、Ａ８３５４３スピノシンアグリコンおよびＰＳＡとは異なる。したがってこれらの遺伝子は表１３に掲げたそれらのｓｐｎ対に対して異なる基質特異性を有する。
【０１１９】
サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）により生産される数種のブテニル−スピノシン同族体は、Ｃ−８またはＣ−２４でヒドロキシル化されている（表２）。マクロライドはエリスロマイシン生合成においてＣ−６でのヒドロキシル化のようにＰ−４５０モノオキシゲナーゼにより合成後にヒドロキシル化されることができる（Ｗｅｂｅｒ＆ＭｃＡｌｐｉｎｅ，１９９２）。ＯＲＦ  ＬＶＩＩはＰ−４５０モノオキシゲナーゼに高度に類似し、そしてサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）染色体上のいたるところにコードされているＯＲＦ  ＬＶＩＩまたはモノオキシゲナーゼは、ブテニル−スピノシンのＣ−８またはＣ−２４でのヒドロキシル化の原因である。あるいはグリコレートまたはグリセロールのようなヒドロキシル化前駆体は、ロイコマイシン（ｌｅｕｃｏｍｙｃｉｎ）のようにポリケチド合成中に取り込まれ得る（Ｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。ニッダマイシン（ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）生産体（ｎｉｄＡＴ６）でのグリコレートの付加に特異的なＡＴドメインは、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）ＰＫＳ遺伝子のメチル−マロニル−ＣｏＡ特異的ＡＴドメインに類似していることが報告された（Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＰＫＳモジュール７はブテニル−スピノシンポリケチドの炭素８および９の付加の原因であるが、ｂｕｓＡＴ７ドメインはｎｉｄＡＴ６と同じメチル−マロニル−ＣｏＡ特異的配列を持たない。これらはグリコレート特異性の原因である他のＡＴドメインおよびｎｉｄＡＴ６に対してｂｕｓＡＴ７中にある独自な配列である。これらの修飾の原因であるブテニル−スピノシン生合成遺伝子は、そのようなヒドロキシル化スピノシンがＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）により生産されないので、Ａ８３５４３に比べて独自である。
【０１２０】
さらにラムノースメチル化の特異性は、Ｓ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）に比べてサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）で改変されている。米国特許第５，２０２，２４２号および同第５，８４０，８６１号明細書に開示されているようなＡ８３５４３スピノシンについてラムノースの改変されたメチル化を現すＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）の突然変異体は、典型的にはＡ８３５４３スピノシンのモノ−デスメチル化ラムノース誘導体を生産した。Ａ８３５４３スピノシンのジ−デスメチルラムノース誘導体は、メチルトランスフェラーゼインヒビター様シネフンジンの存在下でのみ検出された。ラムノースの改変されたメチル化を有するサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）の突然変異体は（Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、メチルトランスフェラーゼインヒビターの不存在下でブテニル−スピノシンのジ−およびトリ−デスメチルラムノース誘導体を高量で生産した。
【０１２１】
相補的な実験については、サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）ｂｕｓＤＮＡを含むコスミドは、ブテニル−スピノシン合成が改変したサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）突然変異体株に接合させた。（詳細は以下の実施例４に与える）次に接合完了体を、それらがブロック突然変異体の生産物を他のスピノシンに転換する能力について試験した。使用した突然変異体は、３’−Ｏ−デスメチルラムノース−ブテニル−スピノシン（３−ＯＤＭ）および関連する因子を生産する３０１４１．８であった。この３０１４１．８／８Ｈ３接合完了体は３−ＯＤＭの代わりにブテニル−スピノシンを生産したので、ラムノースの３’のメチル化の原因である遺伝子はコスミド８Ｈ３に存在するはずである。
【０１２２】
標的遺伝子破壊では、内部フラグメントをコスミドＤＮＡからＰＣＲ増幅により生成し、そしてプラスミドにクローン化した。次いで生成したプラスミドをサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）に接合させ、そしてアプラマイシン−耐性接合完了体を単離し、そして発酵した。破壊実験の基本は、内部遺伝子フラグメントを持つプラスミドを破壊する時、生合成遺伝子の２つの不完全なコピーが生じ、これにより酵素機能を排除する。発酵産物を分析してどのブテニル−スピノシンが蓄積するかを決定する。ｂｕｓＯ遺伝子の破壊はブテニル−スピノシンＰＳＡの蓄積を導き、ｂｕｓＯがホロサミンの合成または付加に必要であることを示す（実施例５を参照にされたい）。ホロサミン生合成遺伝子を使用して合成されないＣ−１７に糖を含む化合物もｂｕｓＯ突然変異体中に蓄積できる。
【０１２３】
ＢＬＡＳＴ調査、遺伝子破壊実験および生物変換実験から導かれる結論を、遺伝子基準で遺伝子についてこれからより詳細に検討する。
【０１２４】
ＰＫＳの上流の１４個の遺伝子は、それらのＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）のｓｐｎＦ−Ｓ遺伝子に対する高い類似性により（表１３）、およびＢＬＡＳＴ調査がこれらの遺伝子はブテニル−スピノシンの生合成に必要な機能をコードすることが知られている酵素に対して目立った類似性を有することを示すので、ブテニル−スピノシン生合成に関与すると決定した。
【０１２５】
ｂｕｓＦ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＬ、ｂｕｓＭ
遺伝子ｂｕｓＦ、ｂｕｓＪ、ｂｕｓＬおよびｂｕｓＭはｓｐｎＦ、ｓｐｎＪ、ｓｐｎＬおよびｓｐｎＭに対して高い類似性を示す。これらＡ８３５４３スピノシン遺伝子は、ＰＫＳ遺伝子の推定上の単環式ラクトン産物からアグリコンの生成に関与すると報告された。ｂｕｓＦ遺伝子産物はｓｐｎＦに対して９１％のアミノ酸同一性を有し、同様にｂｕｓＬ遺伝子はｓｐｎＬに対して９４％のアミノ酸同一性を有する。両ｓｐｎＦおよびｓｐｎＬ遺伝子産物はメチルトランスフェラーゼであると報告され、そしてすべての４種のタンパク質は炭素−炭素結合形成に関与することが知られているストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に由来する酵素に対して高い類似性を有する。ｂｕｓＪタンパク質はオキシドレダクターゼであると報告されているｓｐｎＪに対して８３％のアミノ酸同一性を有した。両ｂｕｓＪおよびｓｐｎＪはダウノルビシンの生合成においてＣ−Ｃ結合形成に関与することが知られているｄｎｒＷに高度に類似する。ｂｕｓＭ遺伝子産物はｓｐｎＭに対して９６％同一である。両ｂｕｓＭおよびｓｐｎＭの遺伝子産物は、カンジタ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）から分泌される新たなクラスのリパーゼに高度に類似している。メチルトランスフェラーゼとしてのｂｕｓＦおよびｂｕｓＬ、オキシダーゼとしてのｂｕｓＪ、そしてリパーゼとしてのｂｕｓＭの役割は、炭素−炭素架橋の形成におけるｓｐｎＦ、ｓｐｎＬ、ｓｐｎＪおよびｓｐｎＭ遺伝子の報告されている役割と一致する。
【０１２６】
ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩ、ｂｕｓＫ
ｂｕｓＧ、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩおよびｂｕｓＫは、Ｓ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）のｓｐｎＧ、ｓｐｎＨ、ｓｐｎＩおよびｓｐｎＫ遺伝子に高い類似性を有した。これらの遺伝子はＡ８３５４３スピノシンアグリコンへのラムノース付加、そして続いてメチル化に関与することが報告された。ｂｕｓＧ遺伝子はｓｐｎＧに対して９０％の類似性を有し、そしてポリケチドから誘導される抗生物質への糖付加に関与する幾つかの遺伝子に高度に類似していた（表１１）。ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩおよびｂｕｓＫ遺伝子産物は、スピノシン生合成においてラムノースのメチル化に関与することが報告されているそれぞれｓｐｎＨ（９７％）、ｓｐｎＩ（９２％）およびｓｐｎＫ（８８％）遺伝子に対して高いアミノ酸類似性を示した。すべての３つの遺伝子はストレプトミセス  フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）に由来する、実験的にマカロシン−Ｏ−メチルトランスフェラーゼであることが示された（Ｂａｔｅ  ＆  Ｃｕｎｄｉｆｆｅ，１９９９）ｔｙｌＥ（ｂｕｓＩおよびｂｕｓＫ）およびｔｙｌＦ（ｂｕｓＨ）遺伝子に対して高いアミノ酸類似性を有した。
【０１２７】
ｂｕｓＮ、ｂｕｓＯ、ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲ、ｂｕｓＳ
ｓｐｎＮ、ｓｐｎＯ、  ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲおよびｂｕｓＳは、Ｓ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）のｓｐｎＯ、  ｓｐｎＰ、ｓｐｎＱ、ｓｐｎＲおよびｓｐｎＳ遺伝子と高い類似性を有した（表１２）。これらの遺伝子はホロサミン糖の生合成または付加に関与すると報告された。ｂｕｓＰの他のグリコシルトランスフェラーゼに対する類似性は（表１１）、これがブテニル−スピノシンホロサミルトランスフェラーゼをコードすることを示す。ｂｕｓＯとｕｒｄＳ２，３デヒドラターゼとの間の高度な類似性は（表１１；Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、これがホロサミン合成の２’−脱酸素工程に関与することを示す。ｂｕｓＱ遺伝子産物とｕｒｄＱ３，４−デヒドラターゼとの間の類似性は（Ｓ．フラジエ（ｆｒａｄｉａｅ）；Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、これがホロサミン合成の３’−デヒドレーションに関与することを示す。ｂｕｓＲはデオキシ糖トランスアミナーゼとして機能することが提案されたタンパク質群に最高４０％の同一性を有し（Ｔｈｏｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ｂｕｓＲがホロサミン合成の４’−アミノ化工程に関与することを示す。最後にｂｕｓＳはアミノメチラーゼ群に高度に類似しており、ｂｕｓＳがホロサミンの４’アミノ基のメチル化に関与することを示す。したがってｂｕｓＮ、ｂｕｓＯ、ｂｕｓＰ、ｂｕｓＱ、ｂｕｓＲおよびｂｕｓＳはブテニル−スピノシンのホロサミン部分の生成に関与する。
【０１２８】
このようにサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）に由来する１９個の遺伝子は、ブテニル−スピノシン生合成に役割を割り当てることができる：大環式ラクトンを生成するための５ＰＫＳ遺伝子、これをアグリコンに修飾するための４遺伝子、ラムノースを加え、そしてメチル化する４遺伝子およびホロサミンを合成し、そして付加する６遺伝子。仮定の生合成経路を図１Ａおよび１Ｂにまとめる。
【０１２９】
用途
クローン化されたサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）のブテニル−スピノシンＤＮＡに関して多くの用途がある。クローン化された遺伝子はブテニル−スピノシンの収量を改善するために、そして新規ブテニル−スピノシンを生産するために使用することができる。改善された収量は特定のブテニル−スピノシン生産株のゲノムに、１以上のブテニル−スピノシン生合成遺伝子の複写コピーを組み込むことにより得られる。特定の突然変異体株において必要な酵素が欠損していることにより生合成経路が遮断された極端な場合では、所望するスピノシンの生産は必要な遺伝子のコピーを組み込むことにより回復することができる。
【０１３０】
新規化合物は、ブテニル−スピノシンの生合成における工程を破壊するためにクローン化したＤＮＡのフラグメントを使用して生産することができる。そのような破壊は前駆体または「分岐」産物（前駆体の自然に処理された誘導体）の蓄積を導くことができる。破壊された遺伝子により生産される修飾スピノシンは、それら自体で昆虫防除剤となることができ、あるいはさらなる化学修飾の基質として役立ち、独特な特性および活性スペクトルを持つ新規な半−合成スピノシンを作成することができる。ｂｕｓＯ遺伝子の破壊はブテニル−スピノシンＰＳＡの蓄積をもたらす。ブテニル−スピノシンＰＳＡはＣ−１７に新規な基を含むスピノシン同族体の合成に出発材料として有用である。
【０１３１】
新規ブテニル−スピノシンは１以上のクローン化ｂｕｓ遺伝子またはそれらの部分をヘテロロガスな宿主へ転移することにより生産することもできる。これらの遺伝子は受容体宿主には存在しない酵素的機能を提供することができる。そのような遺伝子は別の糖を提供し、既存の糖またはアグリコン炭素を修飾し、アグリコンに別の糖を付加させ、あるいはアグリコン自体の基礎構造を改変させることができる。クローン化ｂｕｓ遺伝子のヘテロロガスな宿主への転移により生産される化合物は、それら自体で昆虫防除剤となることができ、あるいはさらなる化学修飾の基質として役立ち、独特な特性および活性スペクトルを持つ新規な半−合成スピノシンを作成することができる。コスミド８Ｈ３および９Ｄ３に由来するサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）ＤＮＡは、Ａ８３５４３スピノシンの生産体であるＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）に転移させることができ、そして接合完了体が新規スピノシンを生産する。
【０１３２】
新規ブテニル−スピノシンはクローン化された遺伝子の突然変異誘発、そして突然変異した遺伝子をブテニル−スピノシン生産生物中の非突然変異対と置換することにより生産することができる。突然変異誘発には例えば：１）１以上のＫＲ、ＤＨまたはＥＲドメインの機能が遮断され、そして株がスピノシンＡの核には存在しない二重結合、ヒドロキシル基またはケト基を含むラクトン核を有するスピノシンを生産するように、ＫＲ、ＤＨまたはＥＲドメインの削除または不活性化（Ｄｏｎａｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３を参照にされたい）；２）ラクトン核に異なるカルボン酸が包含されるようなＡＴドメインの置き換え（Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７を参照にされたい）；３）スピノシンＡの核には存在しない飽和結合、ヒドロキシル基または二重結合を含むラクトン核を有するスピノシンを生産するように、既存のＰＫＳモジュールにＫＲ、ＤＨまたはＥＲドメインの付加（ＭａｃＤａｎｉｅｌ  ＆  Ｋａｔｚ，２００１）；または４）環式ラクトン核がより多い、または少ない数の炭素原子を有するように、完全なＰＫＳモジュールの付加または削除が関与し得る。
【０１３３】
ブテニル−スピノシン遺伝子クラスター領域に由来するＤＮＡは、相同的配列を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。すなわちここでクローン化されたＤＮＡは、ここで記載する領域に重複するがサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）のゲノム中の隣接領域に由来するこれまでにクローン化されていないＤＮＡも含むサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）遺伝子ライブラリーに由来するさらなるプラスミドを配置するために使用することができる。またサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）ｂｕｓ遺伝子とＳ．スピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）ｓｐｎ遺伝子との比較により、エリスロマイシン、ラパマイシン、タイロシンおよびその他に関する生合成遺伝子のような非−スピノシン生産生合成遺伝子とは異なる保存された配列の同定を導く。これらのスピノシン−特異的遺伝子プローブならびにここでクローン化された領域に由来するすべてのＤＮＡは、他の生物中の非同一であるが類似配列を同定するために使用することができる。ハイブリダイゼーションプローブは通常、少なくとも約２０塩基長であり、そして標識して検出を可能とする。
【０１３４】
本発明により提供される修飾株は、２００１年３月２１日に出願された「殺虫性マクロライド（Ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ  Ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）」に関する米国特許第５，３６２，６３４号明細書または米国特許仮出願第６０／２７７，６０１号明細書に開示されているような通常のプロトコールを使用して培養してスピノシンを提供することができる。上記実施例は非限定的であり、本発明を限定すると解釈するべきではない。
【実施例２】
【０１３５】
ブテニル−スピノシン代謝産物に関する発酵ブロスを分析するためのＬＣ／ＭＳ法
以下の方法は、式（Ｉ）および他の成分の生産について発酵を監視するためにエレクトロスプレー（ＥＳＩ）マススペクトロメトリーを用いたＨＰＬＣ分離を利用する。そのような系を利用してエレクトロスプレー付加イオンから推定することにより、精製した因子の分子量も決定した。これらのデータは表１５にまとめる。
【０１３６】
発酵ブロスと等容量の変性エタノールを加える。混合物を１時間振盪し、次いで遠心し、そして濾過して（０．２２μｍの孔サイズ）、嵩のある細胞屑を除去した。１−ｍＬのアリコートをミクロ遠心し、次いで清澄化した抽出物をＬＣ−ＭＳシステムに従い分析する：
ＨＰＬＣシステム：カラムの固定相：２５０×４．６ｍｍカラム、塩基−不活性化シリカゲル、５μｍＣ８（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−Ｃ８−ＢＤＳ）。移動相：以下にまとめる１０ｍＭ  酢酸アンモニウム−メタノール−アセトニトリル直線勾配：
【０１３７】
【表１７】
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【０１３８】
ここで溶媒Ａは１０ｍＭ  酢酸アンモニウムであり、そして溶媒Ｂはメタノール−アセトニトリル（１：１）である；
流速：１ｍＬ／分；ＭＳ：ウエスト（ｗａｓｔｅ）比が約５：９５になるように、ＵＶ検出器後にスプリット（ｓｐｌｉｔ）；
検出：低および高コーン（ｃｏｎｅ）電圧モードで獲得した陽性ＥＳＩ
特徴的なＬＣ保持時間およびマススペクトロメトリーイオンは表１５にまとめる。
【０１３９】
【表１８】
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【実施例３】
【０１４０】
発酵を介したブテニル−スプレー代謝産物の調製
式（Ｉ）の代謝産物は、ＮＮＲ３０１４１、ＮＲＲＬ３０４２１株またはそれらの誘導体の１つから選択されたサッカロポリスポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）の所望する株を、以下に記載する発酵培地中で培養することにより生産する。１．８ｍＬの凍結栄養カルチャーを解凍し、１２５ｍＬのエルレンマイヤー羽根付きフラスコ中の２５ｍＬを栄養培地に接種し、そして３０℃にて１５０ｒｐｍで振盪しながら７２〜９６時間成長させた。
【０１４１】
【表１９】
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【０１４２】
振盪フラスコ培養
１２ミリリットルの成熟した第１段階の種を使用して、５００ｍＬの羽根付きエルレンマイヤー発酵フラスコ中の５０ｍＬの発酵培地に接種した。
【０１４３】
【表２０】
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【０１４４】
発酵は３０℃、２００ｒｐｍ（５０ｍｍストローク）で７〜１２日間維持した。成熟発酵ビール（ｂｅｅｒ）を適当な溶媒を用いて抽出し、そして代謝産物は実施例１に開示したようにクロマトグラフィー分離により回収することができる。
【実施例４】
【０１４５】
ＮＲＲＬ３０４２１株中のラロノースメチル化欠損のコスミド８Ｈ３による相補
ＮＲＲＬ３０４２１株はブテニル−スピノシン上のラムノースを完全にメチル化することができないサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ３０１４１の突然変異体である。ＮＲＲＬ３０４２１株は化合物４およびラムノースの３’位でＯ−メチル化を欠く（３’−ＯＤＭ）他のブテニル−スピノシンを蓄積する。このメチル化欠損は、ｂｕｓＨ、ｂｕｓＩまたはｂｕｓＫ遺伝子によりコードされるＯ−メチルトランスフェラーゼの１つの突然変異の結果であると推定される。これらすべての遺伝子はコスミド８Ｈ３に存在する（図２）。
【０１４６】
コスミド８Ｈ３（図３）は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ４７０５５からＮＲＲＬ３０４２１株に接合型転移（ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）により移された（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４））。コスミド８Ｈ３を用いて形質転換させた２つの独立した単離物を実施例２のように発酵させ、そして化合物１および化合物４の生産について実施例１で例示したように分析した。
【０１４７】
【表２１】
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【０１４８】
ＮＲＲＬ３０４２１は主に化合物４を生産するが、コスミド８Ｈ３を含むＮＲＲＬ３０４２１はほとんど化合物１を生産した［表１８］。コスミド８Ｈ３を含むＮＲＲＬ３０４２１中の化合物１および４の生産は、非突然変異体カルチャーＮＲＲＬ３０１４１に類似する（表１８）。したがってコスミド８Ｈ３での形質転換は、ＮＲＲＬ３０４２１株でのメチル化欠損を克服し、化合物１の強化された生産を回復することができる。
【実施例５】
【０１４９】
ｂｕｓＯの破壊により引き起こされるブテニル−スピノシン前駆体および分岐産物の蓄積
ｂｕｓＯ遺伝子はｂｕｓＯ遺伝子のクローン化内部フラグメントの組込みにより不活性化した。１対のオリゴヌクレオチド（第１は配列番号２の塩基１１８８２−１１８６１に対応し、そして第２は配列番号２の塩基１０９７０−１０９９３に対応する）を使用して、配列番号２の塩基１０９７０−１１８８２に対応する１，４５７ｂｐのｂｕｓＯ遺伝子に対する９１２ｂｐの領域内部を増幅した。このフラグメントを含むプラスミドを用いたサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）の形質転換により、ｂｕｓＯ遺伝子の部分的な重複が生じ、プラスミドと抗生物質耐性遺伝子を挟む遺伝子の２つの短縮化コピーが生じた。
【０１５０】
９１２ｂｐの内部ｂｕｓＯＰＣＲフラグメントは、ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＰＣＲ（エピセンター：Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を使用してプライマー配列番号３３および３４を用いて作成し、そして製造元（インビトロゲン）の使用説明に従いｐＣＲＩＩにクローン化した。生成したプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、そしてｂｕｓＯフラグメントをｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した（図３）。生成したプラスミドは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ４７０５５からサッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ３０１２１の誘導体に接合型転移により接合させた（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４））。６つの独立したアプラマイシン耐性エキソ接合体（ｅｘｏｃｏｎｊｕｇａｎｔ）を実施例２のように発酵させ、そして化合物１および他のスピノシン誘導体の生産について実施例１のように分析した。
【０１５１】
元の株ＮＲＲＬ３０１４１は高レベルの化合物１および低レベルのシュードアグリコン（ＰＳＡ：化合物１３）を生産した。少量の化合物９も生産した［表１９］。化合物１は６つのｂｕｓＯ突然変異体のいずれからも検出できず、ｂｕｓＯが完全なブテニル−スピノシン生合成に必要であることを示した。さらにＰＳＡのレベルは、ホロサミン供給の欠失から推定されるようにすべての６つのｂｕｓＯ突然変異体で上昇した。Ｃ１７にホロサミン以外の糖を有する化合物９のレベルもｂｕｓＯ突然変異体で上昇した。
【０１５２】
【表２２】
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【０１５３】
【表２３】
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【０１５４】
【表２４】
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【０１５５】
【表２５】
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【０１５６】
【表２６】
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【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ブテニル−スピノシン生合成経路を具体的に説明する図である。
【図２】サッカロポリスポラ種（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．）ＬＷ１０７１２９（ＮＲＲＬ３０１４１）ＤＮＡのクローン化された領域中のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶおよびＳｃａＩフラグメントおよびオープンリーゲィンクイフレイムの配列およびクローン化されたＤＮＡ中のブテニル−スピノシン遺伝子の位置を具体的に説明する地図である。
【図３】コスミドｐＯＪ４３６の制限部位および機能的地図である。
【図４】１７−（４”−Ｏ−メチルオレアンドロース）−ブテニル−スピノシン［表１：化合物（１１）］の生合成経路を具体的に説明する図である。
【配列表】
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【図１Ａ】
2005512506.tif 000191
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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