(57)【要約】本発明は、癌細胞集団内で（ｉ）分化関連タンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させ、（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させることにより、その集団において増殖を抑制し、細胞死を誘発する方法および組成物に関する。このことは、少なくとも一部には、膵臓癌細胞において突然変異した活性化Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を減少させると共に、発現可能なｍｄａ−７遺伝子を導入すると、無胸腺ヌードマウスにおいて相乗的な細胞の増殖抑制作用および抗生存作用がもたらされ、細胞の腫瘍形成能が消失したという発見に基づく。本発明の方法は、膵臓癌および他の悪性腫瘍の治療に適用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞集団内で（ｉ）分化関連タンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させ、（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させることにより、該集団において増殖を抑制し、細胞死を誘発する方法。
【請求項２】
前記集団の１または２以上の細胞に、ＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で導入することによってＭＤＡ−７の量を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸がウイルスベクター中に含まれている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記癌細胞集団に、たとえばアンチセンス分子、リボザイム、三重らせんの前駆体、またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤であってよい有効量の抗ＲＡＳ剤を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アンチセンス分子をコードする有効量のウイルスベクターを投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドである有効量のアンチセンス分子を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスベクターが、ＭＤＡ−７をコードする核酸を発現可能な形でさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌細胞集団に、上皮細胞成長因子レセプター、ＲＡＦ、ＭＡＰＫキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、およびＰＩ３キナーゼからなる群から選択される分子を阻害する有効量の剤を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
癌細胞中で（ｉ）分化関連タンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させ、（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させることにより、前記癌細胞の増殖を抑制し、および／またはその細胞死を誘発する方法。
【請求項１２】
前記癌細胞中に、ＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で導入することによってＭＤＡ−７の量を増加させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸がウイルスベクター中に含まれている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌細胞に、たとえばアンチセンス分子、リボザイム、三重らせんの前駆体、またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤であってよい有効量の抗ＲＡＳ剤を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
アンチセンス分子をコードする有効量のウイルスベクターを投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドである有効量のアンチセンス分子を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターが、ＭＤＡ−７をコードする核酸を発現可能な形でさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌細胞に、上皮細胞成長因子レセプター、ＲＡＦ、ＭＡＰＫキナーゼ、およびＰＩ３キナーゼからなる群から選択される分子を阻害する有効量の剤を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異体を有する膵臓癌細胞集団において、該集団内で（ｉ）分化関連タンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させ、（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させることにより、増殖を抑制し、細胞死を誘発する方法。
【請求項２２】
前記集団の１または２以上の細胞に、ＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で導入することによってＭＤＡ−７の量を増加させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＭＤＡ−７タンパク質をコードする前記核酸がウイルスベクター中に含まれている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記膵臓癌細胞集団に、たとえばアンチセンス分子、リボザイム、三重らせんの前駆体、またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤であってよい有効量の抗ＲＡＳ剤を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
アンチセンス分子をコードする有効量のウイルスベクターを投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドである有効量のアンチセンス分子を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルスベクターが、ＭＤＡ−７をコードする核酸を発現可能な形でさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記膵臓癌細胞集団に、上皮細胞成長因子レセプター、ＲＡＦ、ＭＡＰＫキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、およびＰＩ３キナーゼからなる群から選択される分子を阻害する有効量の剤を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の突然変異体を有する膵臓癌細胞でについて、前記膵臓癌細胞中（ｉ）分化関連タンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させ、（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させることにより、該癌細胞の増殖を抑制し、および／またはその細胞死を誘発する方法。
【請求項３２】
前記膵臓癌細胞中に、ＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸を発現可能な形で導入することによってＭＤＡ−７の量を増加させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸がウイルスベクター中に含まれている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌細胞に、たとえばアンチセンス分子、リボザイム、三重らせんの前駆体、またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤であってよい有効量の抗ＲＡＳ剤を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
アンチセンス分子をコードする有効量のウイルスベクターを投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドである有効量のアンチセンス分子を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ウイルスベクターが、ＭＤＡ−７をコードする核酸を発現可能な形でさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記膵臓癌細胞に、上皮細胞成長因子レセプター、ＲＡＦ、ＭＡＰＫキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、およびＰＩ３キナーゼからなる群から選択された分子を阻害する有効量の剤を投与することによってＲＡＳ活性を低下させる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
膵臓癌に罹患した被験者を治療する方法であって、該被験者に、膵臓癌細胞中で（ｉ）分化関連タンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させのに有効な剤、および（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させるのに有効な量の剤を併用投与することを含む方法。
【請求項４２】
膵臓癌に罹患した被験者を治療する方法であって、該被験者に、膵臓癌細胞中で（ｉ）分化関連タンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させるのに有効な量、および（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させるのに有効な量の、（ａ）ｍｄａ−７遺伝子を発現可能な形で含むウイルスベクターと、（ｂ）アンチセンスｒａｓオリゴヌクレオチドとを併用投与することを含む方法。
【請求項４３】
ｍｄａ−７／抗ＲＡＳ併用療法によって治療するのに適する癌細胞を同定する方法であって、（ｉ）試験癌細胞に、該癌細胞中でＭＤＡ−７タンパク質の量を増加させる第１の剤と組み合わせて、ＲＡＳ活性を低下させる第２の剤を投与すること、および（ｉｉ）該癌細胞が、少なくとも１つのアポトーシスの特徴を示しているかどうかを判定することを含み、アポトーシスの特徴の存在と、ｍｄａ−７／抗ＲＡＳ併用療法による治療に対する該癌細胞の適合性とが正の相関関係にある、上記方法。
【請求項４４】
ｍｄａ−７／抗ＲＡＳ併用療法によって治療するのに適する癌細胞を同定する方法であって、（ｉ）試験癌細胞培養物に、ＭＤＡ−７タンパク質の量を増加させる第１の剤と組み合わせて、ＲＡＳ活性を低下させる第２の剤を投与すること、（ｉｉ）該培養物中で癌細胞の増殖を測定すること、ならびに（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で測定した細胞の増殖と、単独で用いた同じ濃度の第１の剤または第２の剤の存在下で該癌細胞の対照培養物の増殖とを比較することを含み、第１の剤と第２の剤の併用によって、単独で用いた前記第１の剤と前記第２の剤による作用の和よりも大きく細胞増殖が減少する場合に、該癌細胞がｍｄａ−７／抗ＲＡＳ併用療法による治療に適するものとする、上記方法。
【請求項４５】
ＭＤＡ−７タンパク質をコードする核酸と、アンチセンスｒａｓ核酸をコードする核酸とを含み、それぞれがプロモーター要素に作動的に連結されているウイルスベクター。
【請求項４６】
癌細胞の増殖を抑制する方法であって、該癌細胞を有効濃度の細胞外ＭＤＡ−７タンパク質に曝すことを含む方法。
【請求項４７】
前記癌細胞と接触する体液に単離したＭＤＡ−７タンパク質を導入することによって前記細胞外ＭＤＡ−７タンパク質を供給する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ｍｄａ−７遺伝子が発現可能な形で導入されている細胞から分泌させることによって前記細胞外ＭＤＡ−７タンパク質を供給する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ｍｄａ−７遺伝子が導入されている細胞が非悪性細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記非悪性細胞が肝細胞である、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載する主題は、米国国立衛生研究所許可番号ＣＡ３５６７５、ＣＡ３７６７０、ＣＡ７４４６８、およびＤＫ５２８２５、ならびに国防省許可番号ＢＣ９８−０１４８によって一部援助を受けているので、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
１．序
本発明は、癌細胞集団内で（ｉ）分化関連タンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させ、（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させることにより、その集団において増殖を抑制し、細胞死を誘発する方法および組成物に関する。このことは、少なくとも一部には、膵臓癌細胞において突然変異した活性化Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を減少させると共に、発現可能なｍｄａ−７遺伝子を導入すると、無胸腺ヌードマウスにおいて相乗的な細胞の増殖抑制作用および抗生存作用がもたらされ、細胞の腫瘍形成能が消失したという発見に基づく。本発明は、膵臓癌または他の悪性腫瘍に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
２．１．膵臓癌
膵臓癌は、世界的に発現率第８位の種類の固形腫瘍であるが、現在有効な治療がないために、癌の死亡原因としては第４位である（ＧｕｎｚｂｕｒｇおよびＳａｌｍｏｎｓ、２００１年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻（１）：３０〜３７頁）。米国では２００１年中に２９，２００例が診断されると推定され、その患者のうちの２８，９００名が死亡することが予想される（Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ，２００１、米国ジョージア州アトランタ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００１年）。臓器限定的な疾患を罹っている患者の長期生存率は、わずか２０パーセントに過ぎず、大多数の症例では、疾患が診断されたときにはすでに膵臓以外に広がっており、生存率はたったの４パーセントである（ＨｉｌｇｅｒｓおよびＫｅｒｎ、１９９９年、Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ＆  Ｃａｎｃｅｒ第２６巻：１〜１２頁；Ｒｅｇｉｎｅら、１９９８年、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．第３巻：Ｅ１８６〜Ｅ１９２頁；Ｂｌａｓｚｋｏｗｓｋｙ、１９９８年、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．第３巻：Ｅ２１４〜Ｅ２２５頁；Ｌｏｒｅｎｚら、２０００年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第３６巻：９５７〜９６５頁；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、２０００年、Ｄｒｕｇｓ第５９巻：１０７１〜１０８９頁）。
【０００４】
膵臓癌に関して予後が悪いのは、いくつかの要因のためであると考えられている。それら要因には、（１）膵臓の解剖学的な位置のため、また特定の初期症状の欠如によって初期の診断が難しくなること、（２）腫瘍が、周囲の命に関わる臓器に急速に広がること、（３）小さな腫瘍でさえ転移しがちであること、さらに（４）一般にこの癌の標準的な治療手段に対する応答が弱いことが含まれる（Ａｏｋｉら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５５巻：３８１０〜３８１６頁、ここで引用されるＹａｍａｇｕｃｈｉら、１９８９年、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．第１９巻：１４〜２２頁；ＷａｒｓｈａｗおよびＣａｓｔｉｌｌｏ、１９９２年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．第３２６巻：４５５〜４６５頁；Ｃｏｈｎ、１９８９年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌ．第７巻：１〜１１頁；Ｏｚａｋｉら、１９９２年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌ．第１２巻：５〜９頁；Ａｒｂｕｃｋ、１９９０年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌ．第７巻：２０９〜２２２頁）。
【０００５】
膵臓癌の死亡率のために、先端の治療手段が認められている。最近の研究は、（フルオロウラシルを使用する）膵十二指腸切除と術後アジュバント化学療法および外部ビーム照射療法とを併用する複合治療が、局所の腫瘍を最大限に制御し、生存期間を延長することを示している（Ｅｖａｎｓら、２００１年、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔ）第１５巻（６）：７２７〜７３７頁）。腫瘍が切除不能になったときには、ゲムシタビンとドクタクセルによる併用化学療法は、腫瘍塊の縮小および／または血清腫瘍マーカーの低減においてそれほど成功を収めていない（ＳｈｅｒｍａｎおよびＦｉｎｅ、２００１年、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ第６０巻（４）：３１６〜３２１頁）。
【０００６】
２．２．膵臓癌の分子生物学
この侵襲性の腫瘍をより有効に治療するために、科学者らは、分子レベルで膵臓癌を理解する試みを行っている。いくつかの分子および経路が、病因となる役割を担い、または治療の機会を生み出すものとして示唆されており、それらには、Ｅ−カドヘリン／カテニン系のモジュレーターとしての線維芽細胞成長因子（Ｈａｒｉｒｙら、２００１年、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第８４巻（１２）：１６５６〜１６６３頁）、２６Ｓプロテアソーム（Ｓｈａｈら、２００１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第８２巻（１）：１１０〜１２２頁）、他の第２のメッセンジャーと共に作用して、腫瘍成長ホルモン放出ホルモンレセプターからのシグナルを媒介するサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）（Ｒｅｋａｓｉら、２００１年、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ第２２巻（６）：８７９〜８８６頁）、潜在的に機能し得るが、膵臓癌細胞中の未知のタンパク質によってブロックされることが報告されているＣＤ９５（ＦＡＳ−Ａｐｏ−１）アポトーシス経路（Ｇｌａｚｙｒｉｎら、２００１年、Ｐａｎｃｒｅａｓ第２２巻（４）：３５７〜３６５頁）、ＭＥＫ／ＥＲＫが媒介する増殖の負の調節因子としてのＰ３８ＭＡＰキナーゼ（ＤｉｎｇおよびＡｄｒｉａｎ、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第２８２巻（２）：４４７〜４５３頁）、および形質転換成長因子β１（「ＴＧＦ−β１」；Ｇｉｅｈｌら、２０００年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１９巻（３９）：４５３１〜４５４１頁；、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、２００１年、Ｐａｎｃｒｅａｓ第２２巻（４）：３４１〜３４７頁；Ｅｌｌｅｎｒｉｅｄｅｒら、２００１年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第９３巻（２）：２０４〜２１１頁）が含まれる。
【０００７】
膵臓腫瘍中では、ＴＧＦ−βおよびそのレセプターの過剰発現の発生率が高いだけでなく、Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子の突然変異を活性化することが報告されており、「ＲＡＳカスケードとＴＧＦ−β経路の相互作用が、膵臓の発癌において重要な役割を果たしているかもしれない」ことが示唆されている（Ｅｌｌｅｎｒｉｅｄｅｒら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６１巻：４２２２〜４２２８頁）。この仮説を検証する実験では、Ｋ−ｒａｓ突然変異が活性化しているそれぞれの膵臓癌細胞をＴＧＦ−βで処理した結果、上皮−間葉分化転換が起こり、より侵入性の表現型がもたらされたが、これは、ＭＥＫ１阻害剤（前掲）による前処理によって低減し、または不能にすることができた。
【０００８】
遺伝子の多数のサブセットで、腫瘍が発生し、進行する間の遺伝子の変化、すなわち活性化または不活性化が観察されている（ＨｉｌｇｅｒｓおよびＫｅｒｎ、１９９９年、Ｇｅｎｅｓ、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ＆  Ｃａｎｃｅｒ第２６巻：１〜１２頁；Ｐｅｒｕｇｉｎｉら、１９９８年、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．第８巻：３７７〜３９３頁；Ｆｒｉｅｓｓら、１９９９年、Ｄｉｇ．Ｓｕｒｇ．第１６巻：２８１〜２９０頁）。膵臓癌でよく起こる遺伝子の変更には、Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子の活性化（８５〜９５パーセント）、ならびに腫瘍抑制遺伝子のｐ１６／ＲＢ１（＞９０パーセント）、ｐ５３（７５パーセント）、およびＤＰＣ４（５５パーセント）の不活性化が含まれる（前掲）。これらの知見は、膵臓癌の複雑さを強調するものであり、また、この新生物の侵襲性、および化学療法や放射線療法など、従来の治療に対する固有の抵抗性について一部説明を提供している。（Ｒｅｇｉｎｅら、１９９８年、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．第３巻：Ｅ１８６〜Ｅ１９２頁；Ｂｌａｓｚｋｏｗｓｋｙ、１９９８年、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．第３巻：Ｅ２１４〜Ｅ２２５頁；Ｌｏｒｅｎｚら、２０００年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第３６巻：９５７〜９６５頁；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、２０００年、Ｄｒｕｇｓ第５９巻：１０７１〜１０８９頁）。
【０００９】
２．３．ＲＡＳタンパク質
膵臓癌で起こる遺伝子の変化の中では、主にコドン１２におけるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異が最も頻繁に起こる（ＨｉｌｇｅｒｓおよびＫｅｒｎ、１９９９年、Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ＆  Ｃａｎｃｅｒ第２６巻：１〜１２頁；Ａｌｍｏｇｕｅｒａら、１９８８年、Ｃｅｌｌ第５３巻：５４９〜５５４頁；ＬｏｎｇｎｅｃｋｅｒおよびＴｅｒｈｕｎｅ、１９９８年、Ｐａｎｃｒｅａｓ第１７巻：３２３〜３２４頁）。ＲＡＳタンパク質は、細胞の外側からの情報が内側に伝達されるのを援助するように働き、遺伝子の転写および発現のレベル、増殖状態、分化状態など、細胞の基本的性質の変化をもたらす真核生物細胞タンパク質ファミリーの構成要員である（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９８年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１７巻：１３９５〜１３４１頁；Ｋｏｌｃｈ、２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３５１巻：２８９〜３０５頁）。ＲＡＳタンパク質は、それ自体、細胞の癌細胞へのトランスフォーメーション、すなわち「発癌」と呼ばれる過程において重要な役割を果たし得る。ｒａｓファミリーは、機能しうる３種のいわゆる「癌遺伝子」、すなわちＨ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、およびＮ−ｒａｓを含み、これらは、分子量が２１，０００ダルトンの非常に類似したタンパク質をコードしている（ＲｅｕｔｈｅｒおよびＤｅｒ、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１２巻：１５７〜１６５頁；一般の慣行に反するが、本明細書（下記参照）内で統一するために、このファミリーのタンパク質および遺伝子は、本明細書ではそれぞれ大文字または小文字のイタリック体で示されていることに留意されたい）。
【００１０】
機能上、ＲＡＳタンパク質は、細胞中で交互に２つの形態をとる。細胞膜に接着せず、化合物ＧＤＰ（グアニン二リン酸）に結合しているとき、ＲＡＳタンパク質は、生物学的活性のない状態にある。ＲＡＳが活性状態になるには、いくつかの事象が起こらなければならない。第１に、タンパク質は、ファルネシル化と呼ばれる過程によって化学修飾を受けなければならない。この修飾は、ＲＡＳタンパク質に脂肪酸側鎖を付け、脂質に富んだ細胞膜の内側に結合する能力を高めるものである。ＲＡＳは、一度細胞膜に固定されれば、次いでいくつかの他のタンパク質と相互に作用して、活性化を完了することができる。そうした他のタンパク質には、細胞膜の外側に提示される情報分子を結合する膜貫通型タンパク質レセプター、およびＲＡＳと受容体タンパク質の相互作用を媒介する様々なアクセサリー分子が含まれる。後者の分子、いわゆる交換タンパク質およびアダプタータンパク質は、ＲＡＳタンパク質からのＧＤＰの放出、および活性化の最終段階であるＧＴＰ（グアニン三リン酸）の結合も援助する。
【００１１】
野生型のＲＡＳタンパク質の活性化は、可逆的な過程である。ＲＡＳ自体は、ＧＴＰａｓｅでもあり、換言すれば、ＲＡＳは、ＧＴＰを加水分解してＧＤＰとするものである。この変換の率は、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）として知られている他の細胞タンパク質によって大幅に高められるものであり、ＲＡＳを媒介とするシグナルが細胞中にどれだけの間残存するかを決定する重要な要素である。ＲＡＳは、活性化されると、シグナルのカスケードを始動させ、シグナルは細胞膜から細胞の核へと運搬される。ＲＡＳ経路の簡略版である図を図１に示す。これらのシグナルは、細胞タンパク質のリン酸化を触媒する酵素である一連のキナーゼによって媒介される。結局、この経路によって、細胞内で特定遺伝子の転写の率を上げるように働く転写因子と呼ばれる核タンパク質が活性化される。Ｋ−ＲＡＳは、活性化されると、古典的ＭＡＰＫ経路、ホスファチジルイノシトール（「ＰＩ３」）キナーゼ経路、ＪＮＫ経路などの下流の多数のシグナル伝達経路を介して細胞質ゾルにシグナルを送って、増殖および細胞生存の増強を含むおびただしい細胞の変化を誘発し得る。（Ｄｅｎｔら、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５７巻：１４０４〜１４０７頁；Ｇｉｒｅら、２０００年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１９巻：２２６９〜２２７６頁；Ａｌｍｅｉｄａら、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１４９巻：７４１〜７５４頁）。
【００１２】
転写がＲＡＳ活性化によってアップレギュレーションされる遺伝子の多くは、細胞周期の制御に関与し、したがってＲＡＳが持続的に活性化されると細胞の増殖に異常をきたす可能性があり、そうした活性化は、このタンパク質のＧＴＰａｓｅ活性を減じる、ｒａｓ遺伝子の突然変異によって引き起こされ得る。実際、この機構は、ヒトの広範な種類の癌の発生と関連付けられてきた。膵臓癌および他の癌に共通する出来事は、Ｋ−ｒａｓの点突然変異を伴い、この突然変異には、コドン１２（膵臓癌細胞に共通する突然変異）、ならびに（他の癌でより共通性のある）コドン１３および６１が関与する（ＨｉｌｇｅｒｓおよびＫｅｒｎ、１９９９年、Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ＆  Ｃａｎｃｅｒ第２６巻：１〜１２頁；Ａｌｍｏｇｕｅｒａら、１９８８年、Ｃｅｌｌ第５３巻：５４９〜５５４頁；ＬｏｎｇｎｅｃｋｅｒおよびＴｅｒｈｕｎｅ、１９９８年、Ｐａｎｃｒｅａｓ第１７巻：３２３〜３２４頁）。たとえば、Ｎｏｄａら（２００１年、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．第８巻（４）：８８９〜９２頁）は、非小細胞肺癌腫瘍におけるコドン１２、１３、および６１の突然変異を報告している。Ｄｅｍｕｎｔｅｒら（２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６１巻：４９１６〜４９２２頁）は、研究した原発性悪性黒色腫腫瘍の１５パーセントで見られたが、いずれの転移性黒色腫では見られなかった、Ｎ−ｒａｓ遺伝子のエクソン１のコドン１８における新規な突然変異を報告している。ｒａｓの点突然変異に関連した他の癌には、胆嚢癌（Ｋｉｍら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．第１６９巻（１）：５９〜６８頁）および結腸癌（Ｃｌａｒｋｅら、２００１年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ．第１６巻（２）：１０８〜１１１頁）が含まれる。
【００１３】
ras突然変異と癌の関連を見込んで、幾人かの研究者は、突然変異したｒａｓ遺伝子を選択的に抑制することによる、細胞中での逆発癌（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ）を試みている。たとえば、アンチセンスＲＮＡ（Ａｏｋｉら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５５巻：３８１０〜３８１６頁；Ａｏｋｉら、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．第２０巻：２５１〜２５８頁）を使用し、またはＫ−ｒａｓ突然変異に特異的なホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（Ｋｉｔａら、１９９９年、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第８０巻：５５３〜５５８頁）を用いてＫ−ｒａｓの発現を妨害すると、Ｋ−ｒａｓ突然変異を含む膵臓癌細胞の増殖は抑制されるが、突然変異していない野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子を含む膵臓癌細胞の増殖は抑制されないことが観察されている。Ｈ−ｒａｓドミナントネガティブ変異体Ｎ１１６Ｙは、腫瘍形成およびヌードマウス肝臓への転移を含む膵臓癌細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで抑制することが判明した（Ｓｈｉｃｈｉｏｎｏｈｅら、１９９６年、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．第１４２巻：６３〜７１頁；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻：５１８〜５２６頁）。これらの研究は、有望ではあるが、Ｋ−ｒａｓを抑制する単一の手法では、膵臓癌細胞の完全な根絶には不十分であることを実証するものであった（Ａｏｋｉら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５５巻：３８１０〜３８１６頁；Ａｏｋｉら、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．第２０巻：２５１〜２５８頁；Ｋｉｔａら、１９９９年、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第８０巻：５５３〜５５８頁；Ｓｈｉｃｈｉｏｎｏｈｅら、１９９６年、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．第１４２巻：６３〜７１頁）。
【００１４】
２．４．ＭＤＡ−７
本発明の決定的な要素である（黒色腫分化関連遺伝子（ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）として名付けられた）ｍｄａ−７遺伝子は、膵臓癌細胞の悪性の特性を変更するのに有効でないことが前々からわかっていた。ｍｄａ−７は、活発に増殖している黒色腫細胞から調製した、ならびに組換えヒト線維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）およびプロテインキナーゼＣ活性化因子のメゼレイン（ｍｅｚｅｒｅｉｎ）で処理することにより終末的に分化誘導された黒色腫細胞から調製したｃＤＮＡライブラリーを使用する、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション技術によって同定された（ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．第１巻：２８５〜２９９頁；Ｊｉａｎｇら、１９９５年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１１巻：２４７７〜２４８６頁）。ＭＤＡ−７は、２０６個のアミノ酸を有する、２３．８ｋＤａの大きさのタンパク質であると特徴付けられており、配列は、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１６２６１；Ｊｉａｎｇら、１９９５年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１１巻：２４７７〜２４８６頁）に記載されるとおりである。
【００１５】
ｍｄａ−７遺伝子を広いスペクトルのヒトの癌に導入したとき、癌細胞の増殖が抑制された（１９９８年１月２０日発行のＦｉｓｈｅｒによる米国特許第５，７１０，１３７号；Ｊｉａｎｇら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９３巻：９１６０〜９１６５頁；Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁）。ＭＤＡ−７は、網膜芽細胞腫（「ｒｂ」）とｐ５３腫瘍の両方の抑制遺伝子を発現させないか、またはそれら遺伝子に欠陥のある癌細胞において増殖が抑制されることが認められており、ｍｄａ−７によって媒介される増殖抑制が、これらの要素に依存しないことを示している（Ｊｉａｎｇら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９３巻：９１６０〜９１６５頁）。様々な癌細胞に対する抗増殖性作用とは対照的に、この遺伝子を正常なヒト線維芽細胞または上皮細胞に導入したときには、顕著な増殖抑制作用は現れなかった（Ｊｉａｎｇら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９３巻：９１６０〜９１６５頁；Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁；Ｓａｅｋｉら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻：２０５１〜２０５７頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻：２７１〜２８２頁）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
様々な腫瘍に対して抑制作用をもつにもかかわらず、ｍｄａ−７は、膵臓癌細胞に対して有効でないことが判明した。本発明は、ｍｄａ−７遺伝子の導入も、ＲＡＳの抑制も、膵臓癌細胞の増殖を有効に制御することが認められていないが、これらを組み合わせることにより、相乗効果が生まれ、その結果細胞増殖が劇的に抑制され、細胞生存率が低下するという発見に基づく。膵臓癌と同程度に侵襲性で急速に死をもたらす癌に対するｍｄａ−７／抗ＲＡＳの効力は、どちらかの剤を単独で使用しても有効性がないことを考えると予想外である。さらに、ＭＤＡ−７が有効となるのにＲＡＳの抑制が必要であるという事実は、ＭＤＡ−７は、ＲＡＳ活性が増大した状況において抗増殖作用を発揮することが認められていること、ｍｄａ−７遺伝子の導入が、Ｈ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換したラット胚線維芽細胞に対して強力な抗増殖作用をもつこと、を考えると、驚くべきことである（Ｊｉａｎｇら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９３巻：９１６０〜９１６５頁）。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
３．発明の概要
本発明は、癌細胞集団内で（ｉ）分化関連タンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させ、（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させることにより、その集団において増殖を抑制し、細胞死を誘発する方法および組成物に関する。ＲＡＳ活性は、ＲＡＳ自体、またはたとえば上皮細胞成長因子レセプター（「ＥＧＦＲ」）、ＲＡＦ、ＭＡＰＫキナーゼ、ＭＡＰＫ、およびＰＩ３キナーゼなどの、ＲＡＳ経路におけるＲＡＳの上流または下流の分子に向けられる剤によって低下させることができる。好ましい実施形態では、この方法は、癌細胞中で（ｉ）ＭＤＡ−７タンパク質の量を増加させるステップと、（ｉｉ）活性化ｒａｓ遺伝子の発現を低減するステップとを含む。こうした方法および組成物は、癌、特に膵臓癌に罹患している被験者の治療に適用することができる。
【００１８】
本発明は、少なくとも一部には、ＭＤＡ−７をコードする核酸を導入し、かつＫ−ＲＡＳの発現を抑制することにより、Ｋ−ｒａｓ中に活性化状態の突然変異をもつ膵臓癌細胞のアポトーシスを誘発することができたという発見に基づく。特に、膵臓癌細胞中に、Ｋ−ｒａｓを標的としたアンチセンス核酸と共に、ｍｄａ−７遺伝子を保有する複製能欠陥アデノウイルスを導入すると、アポトーシスが誘発されるだけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで悪性細胞コロニーの形成が、さらにヌードマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍形成が抑制されることがわかっていた。
【００１９】
したがって、本発明は、活性化されたｒａｓ遺伝子を有する癌細胞、特に膵臓癌細胞の増殖を抑制し、および／またはその生存率を低下させる方法、ならびにそのような方法を利用する治療計画を提供する。特定の癌細胞が本発明の方法に対して応答しそうであるかどうかを判定する方法も提供する。
【００２０】
本発明はさらに、ＭＤＡ−７の発現を増大させ、および／またはＲＡＳ活性を低下させるべく使用することのできる組成物を提供する。詳細な非限定的一実施形態では、本発明は、ｍｄａ−７をコードする配列と、アンチセンスｒａｓをコードする配列とを発現可能な形で含むアデノウイルスベクターを提供する。
【００２１】
本発明の追加の態様では、ＭＤＡ−７を発現する細胞の培養上清が、アンチセンスｒａｓ分子と同時投与されたときに、膵臓癌細胞に対して抗増殖作用をもつことが見出された。したがって、本発明は、癌細胞を細胞外のＭＤＡ−７に曝すことを含む、癌細胞の増殖の抑制方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
５．発明の詳細な説明
限定するのではなく、明瞭に説明するため、この項を以下の下位項目、すなわち、
（ｉ）ＭＤＡ−７タンパク質を増加させる組成物、
（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させる組成物、
（ｉｉｉ）適切な標的細胞を同定するためのアッセイ、
（ｉｖ）抗癌小分子を同定するためのアッセイ、および
（ｖ）使用方法
に分ける。
【００２３】
５．１．ＭＤＡ−７タンパク質を増加させる組成物
本発明の方法を実施するのに必要な第１の構成要素は、癌細胞中および／または癌細胞集団内のＭＤＡ−７タンパク質の量を増加させる手段である。本明細書では、小文字と大文字を使用して遺伝子とタンパク質とを区別する慣行に従うので、ｍｄａ−７は核酸分子を指し、ＭＤＡ−７はタンパク質を指す（ｒａｓ遺伝子およびそれにコードされているタンパク質にも同じ呼称を用いる）。本明細書で使用される用語「遺伝子」とは、最終的に機能性タンパク質を誘導する任意の核酸を指し、たとえば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。本明細書で使用される用語「ＭＤＡ−７」とは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号がＵ１６２６１である、配列番号２として示されるアミノ酸配列を本質的に有するタンパク質を指す。ＭＤＡ−７をコードする核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１６２６１で配列番号１として示されるコード配列を有していてもよいし、あるいは、翻訳されたときに本質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質を産生する別の配列を有していてもよい。配列番号１で示される核酸配列のうち、タンパク質コード領域を構成する部分は、ヌクレオチド２７５からヌクレオチド８９５にわたっていることを留意すべきである。本発明の範囲には、天然分子において重要でない部分が変化した、上記核酸およびタンパク質の機能性等価物が含まれる。たとえばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、たとえば、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７パーセントのドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）中６５℃でハイブリダイズさせ、６８℃の０．１×ＳＳＣ／０．１パーセントＳＤＳ中で洗浄する条件（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２．１０．３）下で、配列番号１で示す核酸配列とハイブリダイズする単離された核酸、ならびにこのようなハイブリッド形成配列によってコードされるタンパク質が含まれる。配列番号１で示す配列を本質的に有するが、特定の発現ベクターに挿入するのに適当な制限部位を含むように改変された核酸も含まれる。
【００２４】
用語「増加する」の使用は、レベルが検出不可能なレベルまたは0（ゼロ）のレベルから「増加」するように、検出可能なレベルのＭＤＡ−７タンパク質が処理前の細胞中に構成的に存在することを前提としていない。。ＭＤＡ−７タンパク質の増加は、ＭＤＡ−７をコードするｍＲＮＡの存在を検出し、かつ／またはその量を定量することによって間接的に評価してもよいし、あるいはＭＤＡ−７タンパク質の存在を検出し、および／またはその量を定量することによって直接的に評価してもよい。ＭＤＡ−７をコードするｍＲＮＡは、たとえば、Ｊｉａｎｇら、１９９５年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１１巻：２４７７〜２４８６頁に記載されているように、ノザンブロットまたは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）（たとえば、ＡＴＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＴＡ（配列番号３）やＣＴＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＧＴ（配列番号４）などの、ｍｄａ−７に特異的なプライマーを使用する）によって検出することができる。ＭＤＡ−７タンパク質は、これもＪｉａｎｇら、１９９５年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１１巻：２４７７〜２４８６頁に記載されているように、たとえば、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ（配列番号５、ＭＤＡ−７タンパク質のアミノ酸残基１５３〜１６４）などの、ＭＤＡ−７に特異的なペプチドに対する抗体を使用するウエスタンブロットによって検出することができる。好ましい実施形態では、ＭＤＡ−７タンパク質の量は、少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍増加する。
【００２５】
ＭＤＡ−７タンパク質の量は、癌細胞中の、ｍｄａ−７をコードしているｍＲＮＡの量を増加させることによって増加させることができる。たとえば、癌細胞中に、ＭＤＡ−７をコードする核酸を含む発現ベクターを発現可能な形で導入することにより、ＭＤＡ−７をコードするｍＲＮＡの量を増大させることができる。「発現可能な形」とは、転写および／または翻訳に必要な要素を含むけ形態である。たとえば、ＭＤＡ−７をコードする核酸は、適切なプロモーター要素に作動的に連結することができ、転写開始部位、転写終結部位、核局在配列をコードする核酸、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定化配列などを含んでよい。
【００２６】
たとえば、ｍｄａ−７核酸を転写によってＲＮＡにする場合、この核酸を、適切なプロモーター要素、たとえば、限定されないが、サイトメガロウイルス即時型プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復プロモーター、ヒト伸長因子１αプロモーター、ヒトユビキチンｃプロモーターなどに作動的に連結することができる。本発明のある実施形態では、誘導性プロモーターを使用することが望ましいであろう。誘導性プロモーターの非限定的な例には、マウス乳癌ウイルスプロモーター（デキサメタゾンによって誘導される）、市販のテトラサイクリン応答性もしくはエクジソン誘導性プロモーターなどが含まれる。本発明の特定の非限定的実施形態では、プロモーターは、癌細胞中で選択的に活性であることができ、そのようなプロモーターの一例は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７１９９、（１９９９年１０月７日に英語で公表された）国際公開ＷＯ９９／４９８９８に記載されているＰＥＧ−３プロモーターであり、他の非限定的な例には、前立腺特異的抗原遺伝子プロモーター（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、２０００年、Ｐｒｏｓｔａｔｅ第４５巻：１４９〜１５７頁）、カリクレイン２遺伝子プロモーター（Ｘｉｅら、２００１年、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第１２巻：５４９〜５６１頁）、ヒトαフェトプロテイン遺伝子プロモーター（Ｉｄｏら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５５巻：３１０５〜３１０９頁）、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子プロモーター（Ｔａｋａｋｕｗａら、１９９７年、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第８８巻：１６６〜１７５頁）、ヒト癌胎児性抗原遺伝子プロモーター（Ｌａｎら、１９９６年、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．第１１１巻：１２４１〜１２５１頁）、ガストリン放出ペプチド遺伝子プロモーター（Ｉｎａｓｅ  ら、２０００年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第８５巻：７１６〜７１９頁）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子プロモーター（ＰａｎおよびＫｏｅｎｍａｎ、１９９９年、Ｍｅｄ．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ第５３巻：１３０〜１３５頁）、ヘキソキナーゼＩＩ遺伝子プロモーター（Ｋａｔａｂｉら、１９９９年、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第１０巻：１５５〜１６４頁）、Ｌ−プラスチン遺伝子プロモーター（Ｐｅｎｇら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６１巻：４４０５〜４４１３頁）、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーター（Ｔａｎａｋａら、２００１年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第２１巻：２９１〜２９４頁）、ミドカイン遺伝子プロモーター（Ａｄａｃｈｉら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６０巻：４３０５〜４３１０頁）、ヒトムチン遺伝子ＭＵＣ１プロモーター（Ｓｔａｃｋｈｏｕｓｅら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第６巻：２０９〜２１９頁）、および膵臓癌細胞中で特に活性のあるヒトムチン遺伝子ＭＵＣ４プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２４１５３５）（Ｐｅｒｒａｉｓら、２００１年、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．によって２００１年６月１９日発行、原稿番号Ｍ１０４２０４２００としての「ＪＢＣ  Ｐａｐｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ」）が含まれる。
【００２７】
適切な発現ベクターには、ウイルスベクター、および非ウイルスベースのＤＮＡもしくはＲＮＡ送達系が含まれる。適切なウイルスベースの遺伝子導入ベクターの例には、レトロウイルス由来のもの、たとえば、ＬＸ、ＬＮＳＸ、ＬＮＣＸ、ＬＸＳＮなどのモロニーマウス白血病ウイルス系ベクター（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、１９８９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第７巻：９８０〜９８９頁）；レンチウイルス、たとえばヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、ネコ白血病ウイルス（「ＦＩＶ」）、もしくはウマ感染性貧血ウイルス（「ＥＩＡＶ」）系のベクター（Ｃａｓｅら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９６巻：２２９８８〜２９９３頁；Ｃｕｒｒａｎら、２０００年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒ．第１巻：３１〜３８頁；Ｏｌｓｅｎ、１９９８年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第５巻：１４８１〜１４８７頁；米国特許第６，２５５，０７１号および同第６，０２５，１９２号）；アデノウイルス（Ｚｈａｎｇ、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第６巻（２）：１１３〜１３８頁；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、１９９９年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．第１巻（５）：５６５〜５７２頁；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９０年、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第１巻：２４１〜２５６頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５２巻：４３１〜４３４頁；Ｗａｎｇら、１９９１年、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第３０９巻：６１〜６６頁；Ｊａｆｆｅら、１９９２年、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．第１巻：３７２〜３７８頁；Ｑｕａｎｔｉｎら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８９巻：２５８１〜２５８４頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２年、Ｃｅｌｌ第６８巻：１４３〜１５５頁；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第９１巻：２２５〜２３４頁；Ｒａｇｏｔら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ第３６１巻：６４７〜６５０頁；Ｈａｙａｓｋｉら、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：２３８７２〜２３８７５頁；Ｂｅｔｔら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９１巻：８８０２〜８８０６頁）、たとえばＡｄ５／ＣＭＶ系Ｅ１欠失ベクター（Ｌｉら、１９９３年、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第４巻：４０３〜４０９頁）；アデノ随伴ウイルス、たとえばｐＳｕｂ２０１系ＡＡＶ２由来ベクター（Ｗａｌｓｈら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８９巻：７２５７〜７２６１頁）；単純ヘルペスウイルス、たとえばＨＳＶ−１系ウイルス（ＧｅｌｌｅｒおよびＦｒｅｅｓｅ、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８７巻：１１４９〜１１５３頁）；バキュロウイルス、たとえばＡｃＭＮＰＶ系ベクター（ＢｏｙｃｅおよびＢｕｃｈｅｒ、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９３巻：２３４８〜２３５２頁）；ＳＶ４０、たとえばＳＶｌｕｃ（ＳｔｒａｙｅｒおよびＭｉｌａｎｏ、１９９６年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第３巻：５８１〜５８７頁）；エプスタイン・バーウイルス、たとえばＥＢＶ系レプリコンベクター（Ｈａｍｂｏｒら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８５巻：４０１０〜４０１４頁）；アルファウイルス、たとえばセムリキ森林熱ウイルスもしくはシンドビスウイルス系ベクター（Ｐｏｌｏら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９６巻：４５９８〜４６０３頁）；ワクシニアウイルス、たとえば改変ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）系ベクター（ＳｕｔｔｅｒおよびＭｏｓｓ、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８９巻：１０８４７〜１０８５１頁）、またはヒト腫瘍細胞に効率よく形質導入することができ、治療効能を得るのに必要な核酸配列を収容することのできる他の任意の種類のウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明に従って使用してよい非ウイルスベースの送達系の非限定的な例には、いわゆる裸の核酸（Ｗｏｌｆｆら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２４７巻：１４６５〜１４６８頁）、リポソームにカプセル封入した核酸（Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１９８７巻：１５７〜１７６頁）、核酸／脂質複合体（ＬｅｇｅｎｄｒｅおよびＳｚｏｋａ、１９９２年、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第９巻：１２３５〜１２４２頁）、および核酸／タンパク質複合体（ＷｕおよびＷｕ、１９９１年、Ｂｉｏｔｈｅｒ．第３巻：８７〜９５頁）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
ＭＤＡ−７は、酵母もしくは細菌発現系によって産生されてもよい。たとえば、細菌による発現は、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）、ｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州パロアルト、下記参照）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）などのプラスミドを使用して実施することができる。
【００３０】
使用する発現系に応じて、トランスフェクション、形質導入、電気穿孔法、バイオ弾道弾法（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）、マイクロインジェクションなどを含む標準のどんな技術によって核酸を導入してもよい。
【００３１】
本発明の好ましい非限定的実施形態では、発現ベクターは、血清型５のＥ１欠失ヒトアデノウイルスベクターである。このベクターを調製するには、ＭＤＡ−７コード領域に作動的に連結された転写プロモーター要素、およびポリＡ付加シグナル配列を含む発現カセットを、アデノウイルスベクターのシャトルプラスミド、たとえばｐＸＣＪＬ．１（Ｂｅｒｋｎｅｒ、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第６巻：６１６〜６２４頁）の多クローニング領域に導入することができる。このプラスミドに関しては、ヒト血清型５アデノウイルスのゲノムの５’末端に相同的なＤＮＡ配列に発現カセットを挿入し、アデノウイルスのＥ１遺伝子領域を破壊することができる。Ｅ１トランス相補的（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）２９３細胞系（Ｇｒａｈａｍら、１９７７年、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第３６巻：５９〜７４頁）または当業界で知られている別の適切な細胞系に、このシャトルプラスミドを、ｐＪＭ１７（Ｂｅｒｋｎｅｒ、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第６巻：６１６〜６２４頁；ＭｃＧｒｏｒｙら、１９８８年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１６３巻：６１４〜６１７頁）、ｐＢＨＧ１０（Ｂｅｔｔら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９１巻：８８０２〜８８０６頁）などのアデノウイルスベクターヘルパープラスミド、またはアデノウイルス５ゲノムから単離したＣｌａＩ消化断片（Ｂｅｒｋｎｅｒ、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第６巻：６１６〜６２４頁）のいずれかと組み合わせてトランスフェクションすると、アデノウイルスシャトルプラスミド中に含まれる相同的なアデノウイルス配列とヘルパープラスミドもしくはアデノウイルスゲノム断片のいずれかとの間で組換えを起こすことが可能になる。この組換え事象によって、機能性Ｅ１遺伝子の代わりに、外来遺伝子を発現させるためのカセットが挿入された組換えアデノウイルスゲノムが生じる。（たとえば、２９３細胞中で発現される）ヒトアデノウイルス５型Ｅ１遺伝子のタンパク質産物によってトランス相補されると、そうした組換えアデノウイルスベクターゲノムは複製され、完全に感染性のアデノウイルス粒子中にパッケージングされうる。次いで、１回または２回以上のプラーク精製によって、混入しているウイルス粒子からこの組換えベクターを単離することができ（Ｂｅｒｋｎｅｒ、１９８８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第６巻：６１６〜６２４頁）、密度勾配超遠心によってこのベクターをさらに精製濃縮してもよい。
【００３２】
本発明の特定の非限定的実施形態では、発現可能な形のｍｄａ−７核酸を、改変されたＡｄ発現ベクターｐＡｄ．ＣＭＶ（Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第４５巻：６８４〜６８９頁）に挿入してもよい。
【００３３】
このベクターは、アデノウイルスゲノムの左端からの最初の３５５塩基対、サイトメガロウイルス即時型プロモーター、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位をコードするＤＮＡ、ｍｄａ−７遺伝子のクローン化部位、βグロブリン遺伝子由来のポリＡ付加シグナル配列をコードするＤＮＡ、およびＥ１Ｂコード領域内から伸びている約３キロ塩基対のアデノウイルス配列を順番に含んでいる。次いで、この構築物は、プラスミドＪＭ１７（前掲）と共に２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、１９７７年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第３６巻：５９〜７２頁）に導入して、上で説明したように、相同的組換えによって、ＭＤＡ−７をコードする核酸を含む複製能欠陥アデノウイルスを作製することができる。図２Ａは、ｐＡｄ．ＣＭＶベクター中に挿入されて、ｐＣＭＶ／ｍｄａ−７を形成するｍｄａ−７遺伝子を示し、図２Ｂは、ＪＭ１７プラスミドとｐＣＭＶ／ｍｄａ−７との間の組換え事象（曲線）を示し、図２Ｃは、得られるＡｄ．ｍｄａ−７複製能欠陥アデノウイルスを示す。
【００３４】
培養中の細胞にｍｄａ−７を導入する、本発明の別の特定の非限定的実施形態では、適切な発現ベクターは、オープンリーディングフレームをコードする、配列番号１で示す配列のヌクレオチド１７６からヌクレオチド９６０にわたるｍｄａ−７核酸を、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のＣＭＶプロモーターの下流に挿入することによって調製できる。別の適切なベクターは、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）として入手可能なラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）ベクターとしうる。
【００３５】
代替実施形態では、癌細胞に内在するｍｄａ−７遺伝子の発現を増大させることにより、ＭＤＡ−７をコードするｍＲＮＡの量を増加させることができる。たとえば、細胞を１種または複数の分化促進剤に曝すことにより、そのような発現の増大を誘発することができる。１つの特定の非限定例として、癌細胞を有効濃度のＩＦＮ−βおよびメゼレインに曝すことができる（たとえば、細胞を培養中に２０００単位／ｍｌのＩＦＮ−βおよび１０ｎｇ／ｍｌのメゼレインに曝す、ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．第１巻（３）：２８５〜２９９頁を参照のこと）。あるいは、癌細胞を、第５．４節で述べるような有効量の同定された小分子に曝してもよい。
【００３６】
別の実施形態では、癌細胞中および／または癌細胞集団内のＭＤＡ−７の量を、その細胞および／または集団にＭＤＡ−７タンパク質を導入することによって増加させることができる。たとえば、細胞に導入するために、ＭＤＡ−７タンパク質を微小粒子に組み入れると、飲作用または食作用によって取り込ませることができるはずである。ＭＤＡ−７タンパク質は、細胞の細胞外環境に存在するように集団に導入してもよい。ＭＤＡ−７が、分泌されたタンパク質であり、それ自体細胞外の状況で生物学的活性をもち得るという証拠があるが、細胞外に投与されたＭＤＡ−７の生物学的活性についての裏付けは下記第８節で示す。ＭＤＡ−７タンパク質を細胞または細胞集団に導入する実施形態では、ＭＤＡ−７を、微小粒子、リポソーム、または当業界で知られている他のタンパク質安定化製剤中に含ませることができる。
【００３７】
５．２．ＲＡＳ活性を低下させる組成物
本発明の方法を実施するのに必要な第２の構成要素は、癌細胞中および／または癌細胞集団内のＲＡＳ活性を低下させる手段である。この活性の低下は、遺伝的手段（たとえば、アンチセンス法、トリプレックス法、またはリボザイム法を適用して、ｒａｓ遺伝子もしくはその伝令の転写もしくは翻訳を低減し、またはＲＡＳ経路内の別の１種または複数の分子の転写もしくは翻訳を低減するもの）、あるいは薬理学的手段（たとえば、ＲＡＳ経路の小分子阻害剤、またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤を使用して、ＲＡＳと細胞膜の結合を不能にするもの）によって実施することができる。
【００３８】
本明細書で使用する用語「ＲＡＳ」は、ＲＡＳタンパク質ファミリーのメンバーを指し、これには、それぞれ、本明細書に参照により組み込まれるＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ００２７７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ５４９６８、およびＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＸＭ００１３１７で示される配列を有する、タンパク質のヒトＨ−ＲＡＳ、Ｋ−ＲＡＳ、およびＮ−ＲＡＳと、対応する遺伝子のＨ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、およびＮ−ｒａｓ、ならびに突然変異型が含まれる。野生型Ｋ−ｒａｓの核酸配列およびコードされたそのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６および７として示す。ＲＡＳの突然変異型には、アミノ酸残基１２、１３、１８、および／または６１の点突然変異を有するものが含まれる。したがって、本発明に含まれるＲＡＳタンパク質は、前述のアミノ酸配列、ならびに１２、１３、１８、および／もしくは６１位の任意のアミノ酸が置換されている配列を含む。本発明の範囲には、前記アミノ酸配列をコードする核酸も含まれる。配列番号８〜１１は、これら各位置で単一のアミノ酸が置換されているＫ−ＲＡＳアミノ配列であり、Ｘａａは、任意のアミノ酸を表すことができる。特定の非限定的実施形態では、Ｋ−ｒａｓの１２位のアミノ酸が、アスパラギン酸（Ｘａａ＝Ａｓｐ）、グリシン（Ｘａａ＝Ｇｌｙ）、バリン（Ｘａａ＝Ｖａｌ）、またはアルギニン（Ｘａａ＝Ａｒｇ）で置換されていてもよい。
【００３９】
また用語「ｒａｓ」は、（ＲＮＡおよびＤＮＡ分子を含む）核酸；厳密なハイブリダイゼーション条件下、たとえば、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７パーセントのドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）中６５℃でハイブリダイズさせ、６８℃の０．１×ＳＳＣ／０．１パーセントのＳＤＳで洗浄する条件下（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．２．１０．３）で、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ００２７７、配列番号６、またはＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＸＭ００１３１７で示される核酸配列にハイブリダイズする核酸分子；およびこれらがコードするタンパク質に関して適用される。本発明は、コード鎖核酸分子と同様にその相補鎖（アンチセンス鎖）、ならびにそのオリゴヌクレオチド部分を提供する。オリゴヌクレオチドは、長さが５〜５０塩基もしくは塩基対であることが好ましいであろう。
【００４０】
（オリゴヌクレオチドを含む）前述のｒａｓ核酸分子は、より大きな核酸分子、たとえば適切なベクター分子中に含まれてもよく、その中でその核酸分子は、上で定義したような「発現可能な形」にすることができる。さらに、本発明に含まれる核酸分子は、天然に存在しない核酸を含むように、または安定化された（ヌクレアーゼ抵抗性の）結合を有するように変更されてもよい。
【００４１】
使用可能な修飾塩基部分の例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−カルボキシヒドロキシメチルウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、βガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５′−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、擬ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
修飾された結合の好ましい非限定的な一例は、たとえば２００１年６月５日発行のＣｏｏｋおよびＭａｎｏｈａｒａｂによる米国特許第６，２４２，５８９号に記載されているようなヌクレオシド間のホスホロチオエート結合である。ヌクレアーゼによる消化に抵抗性のある他のヌクレオシド結合には、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルの糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環の糖間結合が含まれる（２００１年５月８日発行のＷｕによる米国特許第６，２２９，００６号を参照のこと）。たとえば、１９９６年７月２３日発行のＮｉｅｌｓｅｎらによる米国特許第５，５３９，０８２号、１９９８年２月３日発行のＢｕｃｈａｒｄｔらによる米国特許第５，７１４，３３１号、１９９８年２月１１日発行のＢｕｃｈａｒｄｔらによる米国特許第５，７１９，２６２号、およびＮｉｅｌｓｅｎら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５４巻：１４９７〜１５００頁に記載されているようなペプチド核酸を使用することもできる。
【００４３】
本明細書で使用する用語「ＲＡＳ活性の低下」とは、ＲＡＳ経路内の活性化状態にある１または２以上のの分子種の量または割合が減少することを指す。本発明に従って、ＲＡＳ活性をもたらし得るＲＡＳの上流および下流の（すべてでない）ある特定の分子を示す、ＲＡＳ経路の簡略図を図１に提示する。ＲＡＳ経路のある特定のメンバーについては、リン酸化によって活性化状態がもたらされる。「低下」は、細胞または細胞集団中の、本発明に従って処理されていない活性化分子の量または比率に関係がする。１つの特定の非限定例として、ＲＡＳタンパク質は、ＧＴＰに結合しているときに活性状態にある。本発明が、活性状態にあるＲＡＳ分子の比率の低下を生じる場合、ＲＡＳ活性は低下している。
【００４４】
本明細書で定義した「ＲＡＳ活性の低下」が生じるように、もたらされたり、および／または、抑制されたりすることができる、ＥＧＦレセプター、ＲＡＦ１（「ＲＡＦ」）、ＰＩ３キナーゼ、ＭＡＰＫキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ（「ＭＡＰＫ」）、ＭＥＫＫ１、およびＭＡＰＫタンパク質ＥＲＫ１およびＥＲＫ２が含まれるが、これらに限定されない。１つの特定の非限定例として、ＭＡＰＫキナーゼ（この分子の活性型はリン酸化されている）のリン酸化を低減することによってＲＡＳ活性の低下をもたらすことができ、ＭＡＰＫキナーゼを抑制することによって、本明細書で定義したようにＲＡＳ活性を低下させることができる。「ＲＡＳ活性の低下」は、現時点では同定または確認されていないＲＡＳエフェクター分子の活性化を低下させることによって招いてもよい。本明細書は、ＣｒｅｓｐｏおよびＬｅｏｎ、２０００年、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．第５７巻：１６１３〜１６３６頁で表されているＲＡＳエフェクター分子の定義を取り込むが、この参照文献の記述では、ＲＡＳエフェクター分子とは、「（１）ＧＴＰ結合型のＲＡＳに優先的に結合し、（２）その際エフェクタードメイン内の領域に結合し、この結合がエフェクター分子の活性化を誘発し、その後生化学的および／または生物学的作用がもたらされ、さらに（３）この推定上のエフェクター分子の機能不全によって、ＲＡＳを媒介とする作用の少なくとも一部が消滅するものである。
【００４５】
好ましい実施形態では、アンチセンス技術を使用してＲＡＳタンパク質の合成を抑制することにより、ＲＡＳ活性を低下させることができる。「アンチセンスｒａｓ」分子を使用して、スプライシング、触媒活性、ＲＮＡのタンパク質翻訳部位への移動、および／またはＲＮＡからのタンパク質の翻訳を含む様々な段階で、ｒａｓＲＮＡの機能を妨害することができる（たとえば、アンチセンス技術および材料の総説を提供する２００１年７月３日発行のＢｅｎｎｅｔｔらによる米国特許第６，２５５，１１１号を参照のこと）。本発明によれば、内在遺伝子の全体または部分に相補的な合成核酸配列を細胞に導入することによって、ｒａｓに特異的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳をブロックすることができる。そのような合成ヌクレオチド配列は、その配列相補性に基づき内在性のｍＲＮＡ配列と相互に作用し、１本鎖ＲＮＡに比べタンパク質種に翻訳される能力が劣り、かつ、酵素のＲＮａｓｅＨによってより分解しやすい２本鎖ＲＮＡ種を形成する。この手法またはその変形は、いくつかのヒト癌細胞系のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖の抑制（Ａｏｋｉら、１９９７年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ第２０巻：２５１〜２５８頁；Ｋｉｔａら、１９９９年、Ｉｎｔｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ第８０巻：５５３〜５５８頁）および動物モデルにおけるヒトの腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖の抑制（Ｎａｋａｎｏら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒ．第３巻：４９１〜４９９頁）において成功を収めていると示されている。
【００４６】
アンチセンス分子は、ras  ｍＲＮＡの、たとえば、オープンリーディングフレームの翻訳開始コドンまたは終止コドンを含む領域を標的とするように設計することができる。好ましい実施形態では、アンチセンス分子は、約６塩基長と５０塩基長の間であり、アンチセンス・オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって、ＲＡＳタンパク質を形成するための翻訳が抑制または阻止される程度にｒａｓ  ｍＲＮＡの部分に相補的なオリゴヌクレオチドである。特定の非限定的実施形態では、上で規定したようなストリンジェントな条件下で、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを野生型もしくは突然変異したｒａｓ核酸にハイブリダイズさせる。ｒａｓ  ｍＲＮＡの５’末端、たとえばＡＵＧ開始コドンを含むそのコドンまでの５’側非翻訳配列、に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドが好ましいが、３’側非翻訳配列、またはあまり好ましくないがｒａｓ  ｍＲＮＡのコード領域、に相補的なオリゴヌクレオチドを使用してもよい。ｒａｓが点突然変異を含んでいる場合、野生型でない突然変異したｒａｓ遺伝子の発現を選択的に抑制することができるので、突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００４７】
アンチセンスｒａｓ核酸をコードするウイルスベクターの特定の非限定例は、当業界で知られている（たとえば、ＡＳ−Ｋ−ｒａｓ−ＬＮＳＸ（Ａｏｋｉら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５５巻：３８１０〜３８１６頁）、ＡχＣＡ−ＡＳ−Ｋ−ｒａｓ（Ｎａｋａｎｏら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．第３巻（４）：４９１〜４９９頁））。本発明の詳細な非限定的実施形態では、アンチセンスｒａｓをコードする複製能欠損アデノウイルスベクターを使用することができる。そのようなベクターは、Ａｄ．ｍｄａ−７の調製に使用したものと類似の方法を使用して調製することができる。図３Ａ〜Ｃは、そうしたベクターの一具体例の調製を示すが、その調製では、Ｋ−ｒａｓのヌクレオチド１７２〜８０２に相当する６３１ヌクレオチド配列を、アンチセンス配向でｐＡｄ．ＣＭＶに挿入して、ｐＣＭＶ／Ｋ−ｒａｓＡＳを生成する（図３Ａ）。２９３細胞中でのｐＪＭ１７との相同的組換え（図３Ｂ）を利用すると、複製能欠陥Ａｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳウイルス（図３Ｃ）を作製することができる。アンチセンスｒａｓ配列をコードするアデノウイルスベクターをＡｄ．ｍｄａ−７と共に用いた際の有効性は、下記の第９節に示すデータによって実証される。別の特定の実施形態では、以下の第６節で述べるように、３４６ヌクレオチドのＫ−ｒａｓ遺伝子断片（ヌクレオチド１７２〜５１７）を含むｐｃＤＮＡ３．１（ネオマイシン耐性）発現ベクターを使用してもよい。
【００４８】
アンチセンスｒａｓオリゴヌクレオチドの特定の非限定例は、当業界で知られており、たとえば、Ｋ−ｒａｓのコドン１２の突然変異を標的とする以下のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（下線部が突然変異体に特異的な配列）、すなわち、
ＧＴＴへの突然変異についての５’−ＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡ−３’（配列番号１２）、
ＣＧＴへの突然変異についての５’−ＣＴＡＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＴＣＣＡ−３’（配列番号１３）、および
ＧＡＴへの突然変異についての５’−ＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡ−３’（配列番号１４）
（Ｋｉｔａら、１９９９年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第８０巻：５５３〜５５８頁）である。
【００４９】
好ましい特定の実施形態では、下記の第６節で述べるように、（開始コドンに隣接する）Ｋ−ｒａｓヌクレオチドの１９６〜２１３に相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号１５）を使用してもよいし、あるいは配列番号１５を含むか、またはストリンジェントな条件下で配列番号１５の相補配列とハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【００５０】
アンチセンスｒａｓ核酸を生成するための発現可能な配列を含むベクターは、感染、トランスフェクション、電気穿孔法などの当業界で知られている方法によって、癌細胞／癌細胞集団に導入することができる。
【００５１】
アンチセンスｒａｓオリゴヌクレオチドは、当業界で知られている方法によって癌細胞／癌細胞集団に導入することができるが、そのような方法では、たとえば、リポソーム（たとえばＤＣ−コレステロール・リポソーム、カチオン性リポソーム、センダイウイルス外皮タンパク質を含むリポソーム）、イミダゾリウム脂質（たとえば、２００１年６月１２日発行のＷａｎｇらによる米国特許第６，２４５，５２０号を参照のこと）、カチオン脂質（たとえば２００１年５月２２日発行のＷａｎｇらによる米国特許第６，２３５，３１０号を参照のこと）、リポフェクション、アシアロ糖タンパク質−ポリ（Ｌ）リシン複合体、およびマイクロバブル（たとえば２００１年６月１２日発行のＰｏｒｔｅｒらによる米国特許第６，２４５，７４７号を参照のこと）を利用してよい。たとえば、リポフェクタミンを使用して、オリゴヌクレオチドの取り込みを促進する、下記の第６節で述べる実験を参照されたい。
【００５２】
本発明の特定の非限定的実施形態では、単一のベクターを使用して、ＭＤＡ−７をコードする核酸とアンチセンスｒａｓ配列の両方を導入することができる。たとえば、限定するものではないが、同一プロモーター、同一の２つのプロモーター、または異なる２つのプロモーターに作動的に連結された発現可能な形のｍｄａ−７核酸およびｒａｓアンチセンスをコードする核酸配列を、上述のように血清型５のＥ１欠陥ヒトアデノウイルスベクター、たとえばｐＡｄ．ＣＭＶに組み込むことができる。図４は、そのようなベクターの調製を示す図である。簡潔に述べると、ＨＥＫ−２９３細胞のＥ３領域に、Ａｄ．ｍｄａ−７のウイルスゲノム、およびアンチセンス配向でクローン化した、Ｋ−ｒａｓ配列を含むように改変されたプラスミドｐＰＦ４４６（ＶｏｌｋｅｒおよびＹｏｕｎｇ、１９８３年、Ｖｉｒｏｌ．第１２５巻：１７５〜１９３頁）に由来する重なり合うＤＮＡ断片を用いてトランスフェクションすることができる。２種の断片間の組換え（曲線で示す）によって、ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓの両方の配列を含むゲノムが作製される。
【００５３】
他の非限定的な実施形態では、リボザイムを使用して、ＲＡＳ活性を低下させることができる。リボザイムは、ＲＮＡの特定の切断を触媒する酵素ＲＮＡ分子である。本発明によるリボザイム分子は、ｒａｓ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることのできる、ｒａｓ  ｍＲＮＡに相補的な領域を含み、ヘアピン構造またはハンマーヘッド構造をとることができる（Ｒｏｓｓｉ、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第４巻：４６９〜４７１頁；１９９２年３月３日発行のＣｅｃｈらによる米国特許第５，０９３，２４６号；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ第３３４巻：５８５〜５９１頁；Ｚａｕｇら、１９８４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２２４巻：５７４〜５７８頁；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２３１巻：４７０〜４７５頁；Ｚａｕｇら、１９８６年、第３２４巻：４２９〜４３３頁；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ、１９８６年、Ｃｅｌｌ第４７巻：２０７〜２１６頁）。
【００５４】
別の実施形態では、転写を妨げる三重らせん構造をもたらす、ｒａｓ遺伝子調節領域に相補的な標的指向性のデオキシリボ核酸配列によって、ｒａｓ遺伝子の転写をブロックすることができる（Ｈｅｌｅｎｅ、１９９１年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ．Ｄｅｓ．第６巻（６）：５６９〜５８４頁；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２年、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第６６０巻：２７〜３６頁；Ｍａｈｅｒ、１９９２年、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ第１４巻（１２）：８０７〜８１５頁）。
【００５５】
別の実施形態では、癌細胞に、ドミナントネガティブなｒａｓ変異体（たとえば、Ｈ−ｒａｓ変異体Ｎ１１６Ｙ；Ｓｈｉｃｈｉｎｏｈｅ、１９９６年、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．第６６巻：１２５〜１３０頁）を導入することによって、ＲＡＳ活性を低下させることができる。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、下記の第５．４節で述べる方法を使用して同定される可能性のある有効量の小分子を投与することによって、ＲＡＳ活性を低下させることができる。
【００５７】
本発明の追加の実施形態では、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤によってＲＡＳ活性を低下させてもよい。ＧＴＰ結合によって活性化されるようになるには、細胞質ゾル型のＲＡＳが、細胞膜の内側の表面に局在していなければならない。この過程は、ＲＡＳタンパク質上で行われる少なくとも３タイプの翻訳後修飾によって調節される。そのうちの１つは、脂肪酸のファルネシル部分が、タンパク質のＣ末端付近に位置するＣＡＡＸモチーフ中のシステイン残基に酵素的に結合するファルネシル化の過程である。酵素のファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）によって触媒されるこの反応を阻害すると、劇的にＲＡＳの活性化を低減し、ＲＡＳを媒介とするトランスフォーメーションをブロックすることができる（Ｋｏｈｌら、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２６０巻：１９３４〜１９３７頁；Ｋｏｈｌら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９１巻：９１４１〜９１４５頁）。ＦＴ阻害剤は、数クラスに分けられる。第１のクラスは、ファルネシル部分と競合するものである。そのような化合物には、特に、リモネン、ペリリルアルコール、およびペリラ酸（ｐｅｒｉｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）が含まれる（Ｈａｒｄｃａｓｔｌｅら、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．第５７巻：８０１〜８０９頁の総説）。第２のクラスには、ＲＡＳタンパク質中に存在するＣＡＡＸモチーフを模倣する剤が含まれる。このような剤は、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）と呼ばれ、これには、他の化合物の中でも特に、ＦＴ１−２７６（Ｌａｎｔｒｙら、２０００年、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ第２巻：１１３〜１１６頁）、ＦＴＩ−２７７（Ａｄｊｅｉら、２０００年、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ第６巻：２３１８〜２３２５頁）、およびＬ−７３９，７４９（Ｌｅｂｏｗｉｔｚら、１９９５年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ第１５巻：６６１３〜６６２２頁）が含まれる。第３のクラスは、前述の両群の特徴を兼ね備えており、二基質型阻害剤と呼ばれる化合物からなる。このクラスの化合物には、ＢＭＳ−１８６５１１（ＳｃｈｌｉｔｚｅｒおよびＳａｔｔｌｅｒ、２０００年、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０００、第３５巻：７２１〜７２６頁）が含まれる。ＲＡＳ活性は、有効量の前述の化合物、または当技術分野で知られている他のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤のいずれを投与しても低下させることができる。こうした化合物は、他の経路の中でも経口投与、静脈内投与、または腫瘍内注射によって投与することができる。
【００５８】
５．３．適切な標的細胞を同定するアッセイ
「標的細胞」とは、本明細書では、本発明の方法を適用したとき、増殖能力の抑制および／またはプログラム細胞死（「アポトーシス」）の特徴を示すことが期待される癌細胞であると定義する。
【００５９】
本発明の好ましい特定の非限定的実施形態では、本発明は、膵臓癌細胞の増殖および生存を抑制することに関する。下記の第６節で提示する実験データは、ＭＤＡ−７とｒａｓアンチセンス分子の相乗効果が、ｒａｓ遺伝子が突然変異によって活性化されている膵臓癌細胞中では認められるが、野生型のｒａｓを有する細胞中では認められないことを示している。したがって、本発明の方法を適用する前の膵臓癌細胞中でＲＡＳ活性が増大するかどうかを確かめることが、必要ではないが望ましい。
【００６０】
本発明の方法は、その起源が膵臓以外である癌細胞を対象としてもよいので、この節では、適切な標的細胞を同定するための指針を提示する。適切な非膵臓癌標的細胞は、ＲＡＳ活性の増加を示し、たとえばｒａｓ遺伝子中に突然変異があることを確認することができる。たとえば、限定するものではないが、ＲＡＳ活性を増大させるｒａｓ遺伝子の突然変異と関連付けられている癌には、悪性黒色腫（Ｄｅｍｕｎｔｅｒら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６１巻：４９１６〜４９２２頁）、胃癌（Ｈａｏら、１９９８年、Ｊ．Ｔｏｎｇｊｉ  Ｍｅｄ．Ｕｎｉｖ．第１８巻（３）：１４１〜１４４頁）、胆嚢癌（Ｋｉｍら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．第１６９巻（１）：５９〜６８頁）、大腸癌（Ｃｌａｒｋｅら、２００１年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ．第１６巻（２）：１０８〜１１１頁）、肺癌、特に非小細胞肺癌（Ｎｏｄａら、２００１年、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．第８巻（４）：８８９〜９２頁）、急性リンパ芽球性白血病（Ｎａｋａｏら、２０００年、Ｌｅｕｋｅｍｉａ第１４巻（２）：３１２〜３１５頁）、肝細胞癌（Ｗｅｉｈｒａｕｃｈら、２００１年、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第８４巻（７）：９８２〜９８９頁）、肝臓の血管肉腫（Ｍａｒｉｏｎら、１９９１年、Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．第４巻（６）：４５０〜４５４頁）、多発性黒色腫（Ｔａｎａｋａら、１９９２年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．第５６巻（２）：１１９〜１２７頁）、膀胱癌（Ｓａｉｔｏら、１９９７年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．第４巻（２）：１７８〜１８５頁）、末梢神経鞘腫瘍（Ｗａｔａｎａｂｅら、２０００年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第５巻（６）：６０５〜６０８頁）、小児脳腫瘍（Ｍａｌｔｚｍａｎら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．第６巻（４）：２３９〜２４３頁）、卵巣腫瘍（Ｖａｒｒａｓら、１９９９年、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ第５６巻（２）：８９〜９６頁）、子宮頚癌（Ｇｒｅｎｄｙｓら、１９９７年、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．第６５巻（２）：３４３〜３４７頁）、甲状腺癌（Ｂａｓｏｌｏら、２０００年、Ｔｈｙｒｏｉｄ第１０巻（１）：１９〜２３頁）、軟骨肉腫（Ｓａｋａｍｏｔｏら、２００１年、Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．第１４巻（４）：３４３〜３４９頁）、および心臓の原発性肉腫（Ｇａｒｃｉａら、２０００年、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第８２巻（６）：１１８３〜１１８５頁）が含まれる。Ｍｉｙａｋｉｓら（１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第２５１巻（２）：６０９〜６１２頁）は、乳癌の被験者ではｒａｓの点突然変異の発生率が低かったが、調査した乳癌の検体の６７パーセントでｒａｓの過剰発現が認められたことを報告している。
【００６１】
癌細胞、たとえばヒトの被験者から採取した癌細胞中にｒａｓの突然変異が存在するかは、たとえば、ＰＣＲ−制限断片長多形性（「ＰＣＲ−ＲＦＬＰ」）分析、ＰＣＲ−１本鎖コンホーメーション多形性（「ＰＣＲ−ＳＳＣＰ」）分析、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ法（ＰＣＲ産物の融解温度の分析、Ｎａｋａｏら、２０００年、Ｌｅｕｋｅｍｉａ第１４巻（２）：３１２〜３１５頁を参照のこと）、蛍光オリゴヌクレオチド・ライゲーション法（Ｅｇｇｅｒｄｉｎｇ、２０００年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１４巻（３）：２２３〜２３３頁）、ＰＣＲ／ドットブロットハイブリダイゼーション法（Ｇｒｅｎｄｙｓら、１９９７年、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．第６５巻（２）：３４３〜３４７頁）、ＰＣＲ／制限酵素処理／ドットブロットハイブリダイゼーション法（Ｓａｉｔｏら、１９９７年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．第４巻（２）：１７８〜１８５頁）、ＰＣＲプライマー導入制限と突然変異体アレルの富化（「ＰＣＲ−ＰＩＲＥＭＡ」アッセイ、Ｂａｓｏｌｏら、２０００年、Ｔｈｙｒｏｉｄ第１０巻（１）：１９〜２３頁）、および／またはＤＮＡ配列決定など、実験室向けの標準の技術を使用して決定することができる。
【００６２】
ｒａｓの過剰発現は、ノザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲを含む標準の技術を使用して測定することができる（Ｍｉｙａｋｉｓら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第２５１巻（２）：６０９〜６１２頁）。
【００６３】
癌細胞用の代表的な細胞系が入手可能である場合、たとえば、下記の第６節に記載の膵臓癌細胞系について述べるような技術を使用して、前記細胞系の培養物中のＭＤＡ−７を増加させ、ＲＡＳ活性を低下させることがさらに望ましいといえる。癌細胞が標的細胞として適切であることは、細胞増殖の減少、軟寒天中でのコロニー形成の減少、細胞死（たとえばアポトーシス細胞死）の増加、および／または（たとえばヌードマウスにおける）腫瘍形成能の低下によって示されるはずである。たとえば、アポトーシス細胞死は、当技術分野で知られている方法、たとえばＧｒａｖｉｅｌｉら、１９９２年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１１９巻：４９３〜５０１頁に記載されているようなＴＵＮＥＬ法によって測定することができる。本発明の特定の非限定的実施形態では、アポトーシスの増加が、ＢＡＸタンパク質レベルの上昇および／またはＢＣＬ−２タンパク質の減少によって示されてよく、たとえば、ＢＡＸが少なくとも約３倍増加し、かつ／またはＢＣＬ−２が１．２分の１以下に減少し、および／またはＢＡＸ／ＢＣＬ−２比が少なくとも約２倍に増大することが好ましいであろう（Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁；Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｓａｅｋｉら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻：２０５１〜２０５７頁）。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明は、ｍｄａ−７／抗ＲＡＳ併用療法によって治療するのに適する癌細胞を同定する方法であって、（ｉ）試験癌細胞に、癌細胞中のＭＤＡ−７タンパク質の量を増加させる第１の剤と組み合わせて、ＲＡＳ活性を低下させる第２の剤を投与するステップと、（ｉｉ）前記癌細胞が、少なくとも１つのアポトーシス特徴を示しているかどうかを決定するステップとを含み、アポトーシス特徴の存在と、ｍｄａ−７／抗ＲＡＳ併用療法による治療への前記癌細胞の適合性とが正の相関関係にある方法を提供する。
【００６５】
他の特定の実施形態では、本発明は、ｍｄａ−７／抗ＲＡＳ併用療法によって治療するのに適する癌細胞を同定する方法であって、（ｉ）試験癌細胞培養物に、ＭＤＡ−７タンパク質の量を増加させる第１の剤と組み合わせて、ＲＡＳ活性を低下させる第２の剤を投与するステップ、（ｉｉ）前記培養物中での癌細胞の増殖を測定するステップ、ならびに（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で測定した細胞の増殖と、単独で用いた同じ濃度の第１の剤または第２の剤の存在下で前記癌細胞の対照培養物の増殖とを比較するステップを含み、第１の剤と第２の剤の併用によって、単独で用いた前記第１の剤と前記第２の剤による作用の和よりも大きく細胞増殖が減少する場合に、前記癌細胞がｍｄａ−７／抗ＲＡＳ併用療法による治療に適するものとする、上記方法を提供する。
【００６６】
５．４．抗癌小分子を同定するアッセイ
本発明はさらに、癌治療に有効であり、ＲＡＳ活性の低下を示す可能性のある小分子を同定する方法を提供する。
【００６７】
特定の非限定的実施形態では、ＲＡＳ活性を低下させる化合物は、以下の方法によって同定できる。発現可能な形のｍｄａ−７遺伝子（たとえばＡｄ．ｍｄａ−７）を、ＲＡＳ活性が増大している癌細胞系（たとえば、Ｋ−ｒａｓの突然変異が活性化している膵臓癌細胞系）に導入して、「試験細胞」集団を形成することができる。試験細胞中のＭＤＡ−７のＲＮＡもしくはタンパク質のレベル（または検出可能なＭＤＡ−７が存在しないこと）を決定（判定）し、次いで、試験細胞の並行培養物の培地に１種または複数の化合物を加えることにより、その試験細胞を様々な化学的もしくは生化学的化合物、たとえば小分子のコンビナトリアルライブラリー（本明細書では構造が明確に定められている小分子とも呼ぶ）に曝すことができる。試験細胞内および／または培地中で、ＭＤＡ−７をコードするＲＮＡもしくはタンパク質が出現し、またはＭＤＡ−７をコードするＲＮＡもしくはＭＤＡ−７タンパク質が増加していれば、試験される化学物質が細胞中でＲＡＳ活性を低下させた可能性が示唆されるはずである。特定の理論に拘束されるものでないが、この結論は、Ｋ−ｒａｓの活性化によってＭＤＡ−７タンパク質へと翻訳されるｍｄａ−７ＲＮＡの能力が妨害されるらしいことを観察ことにより、裏付けられるはずである（下記の第６節参照のこと）。次いで、このアッセイ手順によって陽性であると同定された化学物質は、ＲＡＳ活性を低下させる、および／あるいは、癌細胞の増殖および／または生存を抑制することができるかさらに試験してもよい。さらに、こうした化学物質の特徴付けを行って、活性化されたＫ−ｒａｓに対するそれらの作用が発揮される機構をより明確に定めることもできる。
【００６８】
あるいは、（たとえばｒａｓ突然変異の結果として）ＲＡＳ活性の増大を示す膵臓癌細胞系または不死化細胞系を、ＲＡＳ活性を低下させることが知られている化合物（たとえばアンチセンスｒａｓ分子）で処理して、試験細胞集団を作製してもよい。試験細胞中の（検出可能なものがあれば）ＭＤＡ−７をコードするＲＮＡまたはＭＤＡ−７タンパク質のレベルを測定することができる。次いで、試験細胞の並行培養物の培地に１種または複数の化合物を加えることにより、その試験細胞を様々な化学的もしくは生化学的化合物、たとえば小分子のコンビナトリアルライブラリーに曝すことができる。試験細胞内および／または培地中で、ＭＤＡ−７をコードするＲＮＡもしくはＭＤＡ−７タンパク質が出現するか、あるいは、ＭＤＡ−７をコードするＲＮＡもしくはＭＤＡ−７タンパク質が増加していれば、試験される化学物質が試験細胞中でＭＤＡ−７の活性を高めることができた、と示唆されるはずである。あるいは/さらに、増殖抑制やアポトーシスなどの生物学的指標を、スクリーニング手順の中で利用してもよい。次いで、このアッセイ手順によって陽性であると同定された化学物質は、さらに特徴付けを行って、その潜在的抗癌性を判定し、かつ／またはこのような細胞プロセスに対するその作用が発揮される機構をより明確に定めることもできる。
【００６９】
５．５．使用方法
本発明は、癌細胞集団で（ｉ）分化に関連するタンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させ、（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させることにより、その集団において増殖を抑制し、細胞死を誘発する方法に関する。「集団」とは、本明細書では、少なくとも２個の細胞を含むものと定義する。集団の非限定例には、固形腫瘍、浸潤腫瘍、（たとえば、転移性疾患に罹っている被験者に存在するはずの）被験者体内に散在した癌細胞、および培養細胞が含まれる。本発明の全範囲を実施するために、細胞内および／または細胞外でＭＤＡ−７の量を増加させることができ、ＭＤＡ−７タンパク質の増加および／またはＲＡＳ活性の低下を集団の全細胞において実現する必要はない。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明は、癌細胞中で（ｉ）分化に関連するタンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させ、（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させることにより、その癌細胞の増殖を抑制し、および／または細胞死を誘発する方法に関する。
【００７１】
前述の方法の癌細胞は、膵臓癌細胞でも、または前の節で述べたような他の適切な標的細胞でもよい。
【００７２】
低下したＲＡＳ活性の存在中、細胞増殖の低減と細胞死の誘発の際に、有効なある量のＭＤＡ−７タンパク質が存在するように、癌細胞に、ｍｄａ−７をコードする核酸を発現可能な形で導入することによって、または癌細胞および／または癌細胞集団に、上記の第５．１節で述べたようにＭＤＡ−７タンパク質を投与することによって、ＭＤＡ−７の量を増加させることができる。
【００７３】
たとえば、限定するものではないが、ｍｄａ−７をウイルスベクターによって癌細胞に導入する場合、細胞を曝すウイルスの量は、約１〜１０００ｐｆｕ／細胞の間、好ましくは約１００〜２５０ｐｆｕ／細胞の間でよい。下記の第６節で述べる実施例では、複製能欠陥アデノウイルスベクター中に含まれた１００ｐｆｕ／細胞のｍｄａ−７を使用した。
【００７４】
ＭＤＡ−７タンパク質を細胞に投与する場合、本発明の特定の非限定的実施形態では、細胞を曝すＭＤＡ−７の濃度は、約１〜１００ｎｇ／ｍｌの間でよい。
【００７５】
ＲＡＳ活性の量は、癌細胞または癌細胞集団に、たとえば、アンチセンス分子、リボザイム、三重らせんの前駆体、構造が明確な小分子（上の第５．４節を参照のこと）、またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤でよい、有効量の抗ＲＡＳ剤、あるいはＲＡＳ経路の他の何らかの点で作用する剤、たとえば、限定されないが、ＥＧＦレセプター拮抗薬、またはＲＡＦ、ＭＡＰＫキナーゼ、もしくはＰＩ３キナーゼの阻害薬を投与することによって低減することができる。本発明の好ましい実施形態では、アンチセンス分子、特にアンチセンス・オリゴヌクレオチド、最も好ましくはホスホロチオエート結合を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを使用する。特定の実施形態では、治療しようとする癌細胞中で特定のｒａｓ突然変異が同定されている場合、突然変異に特異的オリゴヌクレオチドを使用することもできる。
【００７６】
本発明の好ましい非限定的実施形態では、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’−ＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＴ−３’（配列番号１５）を使用してもよいし、あるいは前記ヌクレオチドを含むか、またはストリンジェントな条件下で前記ヌクレオチドの相補配列とハイブリッド形成可能なオリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【００７７】
特定の非限定的実施形態では、癌細胞を曝すオリゴヌクレオチドの濃度は、約０．１〜１０マイクロモルの間、好ましくは約０．２５〜０．７５マイクロモルの間でよい。下記の第６節で述べる実験では、０．１〜５．０マイクロモルの濃度範囲を用いた。
【００７８】
ＭＤＡ−７を増加させ、ＲＡＳ活性を低下させる、併用される剤の「有効量」とは、癌細胞の増殖の減少および癌細胞の死の増加をもたらす、各剤の量である。剤の量は、他方が存在しなければ有効でなく、またおそらく有効でない。限定するものではないが、細胞増殖が、どちらかの剤に曝されていない対照癌細胞に対して少なくとも２５パーセントまで減少し、かつ細胞死がその少なくとも約２５パーセントまで減少することが好ましい。
【００７９】
本発明および前述の諸方法は、癌に罹患した被験者の治療に適用することができる。被験者は、ヒトでも、ヒトでない哺乳動物の被験者でもよく、癌は、膵臓癌細胞からなっていてもよいし、または前の節で定義したような他の適切な標的細胞からなっていてもよい。特定の非限定的実施形態では、本発明は、膵臓癌に罹患した被験者を治療する方法であって、前記被験者に、膵臓癌細胞中で（ｉ）分化に関連するタンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させるのに有効な量の剤、および（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させるのに有効な量の剤を併用投与することを含む方法を提供する。特定の非限定的実施形態では、膵臓癌に罹患した被験者を、その被験者に、膵臓癌細胞中で（ｉ）分化に関連するタンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させるのに有効な量、および（ｉｉ）ＲＡＳ活性を低下させるのに有効な量の、（ａ）ｍｄａ−７遺伝子を発現可能な形で含むウイルスベクターと、（ｂ）アンチセンスｒａｓオリゴヌクレオチドとを併用投与することによって治療する。
【００８０】
被験者には、ＭＤＡ−７を増加させる剤とＲＡＳ活性を低下させる剤の組合せを、腫瘍内注入、静脈内、動脈内、鞘内、筋肉内、皮内、皮下などを含む適切な経路によって治療有効量投与することができる。治療有効量のこれら剤は、腫瘍塊の縮小、癌細胞数の減少、血清腫瘍マーカーの減少、腫瘍転移の減少、腫瘍の成長速度の低下、臨床症状の改善、および／または患者生存期間の延長のうち、１または複数の成果をもたらす。適宜癌にまず外科的処置を施して、腫瘍塊のかさを減らしてもよい。
【００８１】
ｍｄａ−７および／またはアンチセンスｒａｓをコードする各核酸配列のどちらかを送達するのにウイルスベクターを使用する場合、好ましい実施形態では、被験者に投与するベクターの量は、約１０９ｐｆｕと１０１３ｐｆｕの間である。ｍｄａ−７またはアンチセンスｒａｓをコードするどちらかの核酸を送達するのに複製能欠陥ウイルスベクターを使用する場合、たとえば腫瘍内注射、または外科的切除後の腫瘍床への注入によって、このようなベクターを癌細胞に直接的に、またはその周囲に送達することが好ましい。
【００８２】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与する場合、有効投与量は、各製剤の間で様々でよい。最適な投与量は、培養細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、および／またはモデル動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで決定されたＥＣ５０に基づいて決定することができる。たとえば、限定するものではないが、投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１マイクログラム〜１０ｍｇの範囲でよい。
【００８３】
本発明は、被験者内の転移癌の治療にも適用することができる。転移癌とは、本明細書では、原発性の腫瘍と直接に接触しない部位での１個または複数の癌細胞の発生であると定義する（たとえば、原発腫瘍部位からのリンパドレナージを受けているリンパ節中の非リンパ腫由来の癌細胞；肺、脳、骨、または肝臓で同定された癌細胞で、原発性癌が、それぞれ肺、脳、骨、または肝臓で生じたものでないもの）。「転移癌」の定義は、原発腫瘍が同定できない事例も含み、この場合では、癌細胞または癌細胞群が、それが検出された組織で生じたものでないことが組織学的に判定される。
【００８４】
そのような実施形態のサブセットでは、本発明は、ｍｄａ−７遺伝子を保有したウイルスベクターを、遠隔転移状態の癌細胞に感染させるのに十分な数を提供するのは困難であるかもしれないという問題に対処する、被験者の転移癌の治療方法を提供する。この問題は、被験者中の細胞集団を、ｍｄａ−７を有するウイルスベクターで感染させ、それによって被験者中の遠く離れた癌細胞に、感染した集団が放出または分泌するＭＤＡ−７を供給することにより対処できる。癌細胞の増殖を抑制する際にそのような放出／分泌されたＭＤＡ−７が有効であることは、下記の第８節で示すデータによって裏付けられる。遠隔癌細胞は、オリゴヌクレオチド（たとえばホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチド）の形のアンチセンスｒａｓによってさらに治療してもよい。治療効能を確定する手段として調べることのできる指標の非限定的な例には、転移腫瘍の数および大きさの減少、その成長速度の低下、および／または被験者の生存期間の延長が含まれる。当業者ならば、治療効能を評価するために、罹患率および／または死亡率を測る他の多くの客観的尺度を調べてもよいことがわかるであろう。
【００８５】
特定の実施形態では、転移性疾患の治療は、被験者に、（ｉ）血液中または他の細胞外液中で、分化に関連するタンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させるのに有効な量の剤、および（ｉｉ）原発腫瘍部位と転移部位の両方に存在する標的細胞中のＲＡＳ活性を低下させるのに有効な量の剤を併用投与することによって実施できる。特定の非限定的実施形態では、転移癌に罹患した被験者を、その被験者に、（ｉ）血液中または他の細胞外液中で、分化に関連するタンパク質ＭＤＡ−７の量を増加させるのに有効な量、および（ｉｉ）原発腫瘍と転移部位の両方の位置にある細胞中のＲＡＳ活性を低下させるのに有効な量の、（ａ）ｍｄａ−７遺伝子を発現可能な形で含むウイルスベクターと、（ｂ）アンチセンスｒａｓオリゴヌクレオチドとを併用投与することによって治療する。この実施形態の好ましい形態は、（ｉ）癌細胞周辺の体液中の前記オリゴヌクレオチド濃度を０．１〜５０マイクロモルの間に到達させることのできる用量の、配列番号１５で表されるものや、ストリンジェントな条件下で前記ヌクレオチド配列の相補配列とハイブリッド形成可能な他のヌクレオチド配列などの抗ｒａｓホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）その投与後に、ＭＤＡ−７タンパク質が、ウイルスで形質導入された細胞中で合成され、その細胞から血液または他の細胞外液に放出されて、標的細胞周辺の体液中で１〜１００ｎｇ／ｍｌのＭＤＡ−７濃度を実現することができる、ｍｄａ−７をコードするウイルスベクターとの併用投与を含むことができる。本発明の詳細な非限定的実施形態では、ｍｄａ−７遺伝子を有するウイルスベクターは、同定された細胞集団、たとえば肝細胞に導入してもよいし、または原発腫瘍細胞に導入してもよい。
【００８６】
放出／分泌されるＭＤＡ−７が抗増殖活性を有するという発見に基づく関連実施形態では、本発明は、ＲＡＳ活性を低下させる必要なしにＭＤＡ−７に応答する癌細胞を治療する方法であって、前記癌細胞を、前記細胞の増殖を抑制するのに有効なレベルの細胞外ＭＤＡ−７タンパク質に曝すことを含む方法を提供する。そのような細胞外タンパク質は、タンパク質の投与によって供給してもよいし、またはｍｄａ−７遺伝子を被験者の細胞（たとえば正常な肝細胞、線維芽細胞、筋細胞、癌細胞、異なる細胞型の組合せなど、その被験者のどんな型の非悪性もしくは悪性細胞でもよい）中に、細胞がＭＤＡ−７を放出／分泌し、次いでそれが遠隔部位でも癌細胞の増殖／生存を抑制できるように導入することによって供給してもよい。ＭＤＡ−７の抗増殖作用を受けやすい癌細胞には、黒色腫細胞、多形性膠芽腫細胞、骨肉腫細胞、乳癌細胞、子宮頚癌細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、上咽頭癌細胞、卵巣癌細胞、および前立腺癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。（細胞外ＭＤＡ−７を供給する）Ａｄ．ｍｄａ−７感染肝細胞の培地が、ヒト前立腺癌細胞に対して増殖抑制作用をもたらすことが観察されている（下記の第８節を参照のこと）。
【００８７】
前述の治療は、化学療法、遺伝子治療、免疫療法、および放射線療法を含む、他の外科的および非外科的な治療様式と共に施してよい。
【実施例】
【００８８】
６．実施例：ヒト膵臓癌細胞においてプログラム細胞死を選択的に誘発するコンビナトリアルな手法
６．１．材料および方法
細胞系、培養条件、および増殖アッセイ  空気９５パーセント二酸化炭素５パーセントの加湿インキュベーターにおいて、（アメリカンタイプカルチャーコレクションから得た）ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、およびＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌細胞系を、ウシ胎児血清（「ＦＢＳ」）を１０パーセント含有するＲＰＭＩ１６４０中３７℃で増殖させた。細胞増殖および生細胞数を、血球計数器およびＭＴＴ染色によって（Ｌｅｂｅｄｅｖａら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６０巻：６０５２〜６０６０頁）に記載のとおりにモニターした。
【００８９】
動物試験  腫瘍形成能アッセイは、Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁およびＳｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁に記載のとおりに実施した。簡潔に述べると、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、未処理とするか、または１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ．ｖｅｃもしくはＡｄ．ｍｄａ−７に感染させ、次いでトランスフェクションしないか、またはセンスもしくはＡＳ配向にクローン化された３４６ｎｔのｋ−ｒａｓ遺伝子断片（ｎｔ１７２〜ｎｔ５１７）を含む発現ベクターをトランスフェクションし、１×１０６個の細胞をＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、４８時間後に無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁に記載のとおりに、動物の腫瘍形成をモニターし、腫瘍体積を決定した。
【００９０】
ウイルスの構築、精製、および感染性アッセイ  複製能欠陥Ａｄ．ｍｄａ−７を２ステップで作製した。最初のステップでは、ｍｄａ−７遺伝子を、改変されたアデノウイルス発現ベクターＡｄ．ＣＭＶ（Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第４５巻：６８４〜６８９頁）にクローン化した。このベクターは、Ａｄゲノムの左端からの最初の３５５ｂｐ、サイトメガロウイルス即時型プロモーター、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位をコードするＤＮＡ、ｍｄａ−７発現カセットを挿入するためのクローン化部位、βグロブリン遺伝子由来の、ポリＡシグナル配列をコードするＤＮＡ、およびＥ１Ｂコード領域内から伸びている約３キロ塩基対のアデノウイルス配列を順番に含んでいる。この配置によって、サイトメガロウイルス即時型遺伝子プロモーターによるクローン化配列の高レベル発現、および適切なＲＮＡプロセシングが可能になる。次のステップでは、ｍｄａ−７を含むベクターとプラスミドＪＭ１７の相同的組換えによって、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、１９７７年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．第３６巻：５９〜７２頁）中で組換えウイルスをｉｎ  ｖｉｖｏで作製した。２種のプラスミドをトランスフェクションした後、感染性のウイルスを回収し、ゲノムを分析して、組換え構造であることを確認し、次いでウイルスをプラーク精製し、滴定した（ＶｏｌｋｅｒｔおよびＹｏｕｎｇ、１９８３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１２５巻：１７５〜１９３頁）。
【００９１】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド  １８塩基のホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（「ＰＳ  ＯＤＮ」）を合成し、ＨＰＬＣによって精製した（Ｌｅｂｅｄｅｖａら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６０巻：６０５２〜６０６０頁）。アンチセンスｒａｓホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ」）ＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＴ（配列番号１５）を合成したが、これは、（開始コドンに隣接する）野生型Ｋ−ｒａｓのヌクレオチド１９６〜２１３と相補的である。これまでの研究（Ｓａｋａｋｕｒａら、１９９５年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ第６巻：５５３〜５６１頁）に基づき、同じ領域（ｎｔ１９６〜２１３）に対する不適合型（「ＭＭ」）Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ  ＣＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＡＧＴ（配列番号１６）および無秩序型（scrambled;「ＳＣ」）Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ  ＡＣＴＡＧＣＴＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＴ（配列番号１７）も合成した。
【００９２】
ＲＮＡの単離およびノザンブロット分析  グアニジニウム／フェノール法によって総ＲＮＡを単離し、ＪｉａｎｇおよびＦｉｓｈｅｒ、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．第１巻：２８５〜２９９頁、およびＪｉａｎｇら、１９９５年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１１巻：２４７７〜２４８６頁に記載のとおりにノザンブロットを実施した。
【００９３】
ＤＮＡ抽出、断片化アッセイ、ＦＡＣＳ分析、およびアネキシンＶ、ＰＩ、ＤＡＰＩ染色  単一もしくは併用治療プロトコルに従ってから３日後に、ＤＮＡを抽出し、Ｓｕら、１９９５年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第１５巻：１８４１〜１８４８頁に記載のとおりに断片化アッセイを実施した。以前に記載されている方法（Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｌｅｂｅｄｅｖａら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６０巻：６０５２〜６０６０頁；Ｓｕら、１９９５年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第１５巻：１８４１〜１８４８頁；Ｍａｒｔｉｎら、１９９５年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８２巻：１５４５〜１５５６頁）を使用して、ＦＡＣＳ分析、ならびにアネキシンＶおよびＰＩ染色を実施した。
【００９４】
ウエスタンブロッティング  Ｋｉｔａら、１９９９年、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第８０巻：５５３〜５５８頁；Ｌｅｂｅｄｅｖａら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６０巻：６０５２〜６０６０頁；およびＳｕら、１９９５年、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．第７巻：１２７９〜１２８４頁に記載のとおりに、ＲＩＰＡ緩衝液中の細胞抽出物を調製し、ウエスタンブロッティングによって等濃度のタンパク質のＭＤＡ−７、ＢＣＬ−２、ＢＡＸ、およびＥＦ−１αタンパク質レベルを評価した。
【００９５】
６．２．結果および考察
Ａｄ．ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮの組合せは、突然変異Ｋ−ｒａｓを発現するヒト膵臓癌細胞の増殖を相乗的に抑制した。Ｍｄａ−７は、広スペクトルの癌特異的な成長抑制遺伝子であり、正常細胞中では明らかな有害作用を示さない（Ｊｉａｎｇら、１９９５年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１１巻：２４７７〜２４８６頁；Ｊｉａｎｇら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９３巻：９１６０〜９１６５頁；Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁；Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｓａｅｋｉら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻：２０５１〜２０５７頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻：２７１〜２８２頁）。黒色腫、多形性膠芽腫、骨肉腫、乳癌、子宮頚癌、大腸癌、上咽頭癌、肺癌、および前立腺癌を含む、多様な群のヒトの癌にＡｄ．ｍｄａ−７を感染させると、成長が抑制され、しばしばアポトーシスに関連する細胞の変化である低二倍体性がもたらされる（Ｊｉａｎｇら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９３巻：９１６０〜９１６５頁；Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁；Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｓａｅｋｉら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻：２０５１〜２０５７頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻：２７１〜２８２頁）。数種の乳癌細胞系を用いたある詳細な研究では、Ａｄ−ｍｄａ−７が増殖抑制を引き起こす能力は、ＤＮＡヌクレオソーム・ラダー形成法、ＴＵＮＥＬ反応、およびアネキシンＶ染色（Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁；Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻：２７１〜２８２頁）によってモニターしたところ、ｐ５３の状態とは無関係であり、アポトーシスの誘導と相関があることがわかった。それとは対照的に、正常な初期継代乳房上皮細胞、または正常な乳房上皮細胞系のＨＢＬ−１００では、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた後、増殖は最小限の影響しか受けず、アポトーシスの誘導は見られなかった。
【００９６】
多様な癌サブタイプに対するｍｄａ−７の作用を評価すると、膵臓癌細胞が固有にｍｄａ−７の異所性の発現に耐性であることが容易に明らかとなった。突然変異型または野生型のＫ−ｒａｓを発現する膵臓癌細胞を、１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ．ｍｄａ−７またはＡｄ．ｖｅｃ（ｍｄａ−７遺伝子挿入体を欠くＡｄ構築物）に感染させても、増殖に有意な影響を及ぼさず、アポトーシスの選択的な誘導は、明らかでなかった（図５を参照のこと）。種々の膵臓癌細胞を０．１〜５マイクロモルのアンチセンスＫ−ｒａｓホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ）で処理すると、用量依存的な増殖抑制作用が明らかとなり、５マイクロモルのＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮで３日または４日間処理したとき、細胞型に応じて最大約１０〜約３０パーセントが阻害された（図５）。野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子を有するＢｘＰＣ−３の増殖は、Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮによる抑制を最も受けなかった。ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮの選択性は、無秩序型（「ＳＣ」）または不適合型（「ＭＭ」）ＰＳ  ＯＤＮのいずれかでの処理がもたらした増殖抑制が、ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮでの処理よりも有意に低かったことによって示された（図５を参照のこと）。これらの研究は、突然変異または野生型Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞系にＡｄ．ｍｄａ−７またはＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮを単独で適用すると、程度の様々な増殖抑制が誘発できるという証拠を提供するものである。しかし、いずれの場合でも、増殖抑制は一過性であり、細胞は、５マイクロモルのＰＳ  ＯＤＮに最初に曝したときですら単一の処理から生き残り、増殖し続けた。
【００９７】
突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞にＡｄ．ｍｄａ−７を感染させ、次いでＳＣもしくはＭＭ  ＰＳ  ＯＤＮでなく、０．１〜５．０マイクロモルのＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮで処理したとき、甚大な相乗的増殖抑制作用、および細胞生存期間の短縮が明らかになった（図５および図６Ｍ〜Ｏ）。それとは対照的に、野生型Ｋ−ｒａｓＢｘＰＣ−３細胞では、相乗的な増殖抑制および細胞生存率の低下が検出されなかった（図５および図６Ｐ）。さらに、増殖および生存率に対する作用は、正常な初期継代ヒト前立腺上皮細胞ではどんな処理によってもはっきりと現れず、あるいは膵臓癌細胞に、ルシフェラーゼまたはβガラクトシダーゼを発現させるアデノウイルスを感染させ、次いでＡＳ  Ｋ−ｒａｓＯＤＮで処理したときにもはっきりと現れなかった。これらの結果は、ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮの併用による抗生存作用が、突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞ではもたらされるが、野生型Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞または正常な上皮細胞ではもたらされないことの証拠を提供するものである。
【００９８】
これまでの研究は、Ｋ−ｒａｓコドン１２の特定の点突然変異を標的とするＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮが、突然変異膵臓癌細胞系では増殖を低減し得るが、野生型Ｋ−ｒａｓＢｘＰＣ−３細胞では低減し得ないことを報告している（Ｋｉｔａら、１９９９年、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第８０巻：、適切な突然変異によって不適合になったＡＳ  ＰＳ  ＯＤＮを使用するとより大きかった。分析した特定の膵臓癌のＫ−ｒａｓコドン１２における突然変異に正確には対応していないＡＳ  ＰＳ  ＯＤＮを使用したときにも、それよりも弱いが増殖に対する作用がはっきりと現れた。この観察は、標的細胞において、ＡＳ  ＰＳ  ＯＤＮが特異的作用と明らかに非特異的な作用の両方を誘発し得ることを示すこれまでの数多くの研究を裏付けるものである（ＳｔｅｉｎおよびＣｈｅｎｇ、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２６１巻：１００４〜１０１２頁；Ｓｔｅｉｎ、１９９６年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１４巻：１４７〜１４９頁；Ｐａｗｌａｋら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．第２６巻：３３３−３５０３０−３２）。
【００９９】
本研究では、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のＡＵＧ開始コドンと相互作用するようにＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮを設計した。突然変異および野生型Ｋ−ｒａｓを発現する各膵臓癌細胞を、ＭＭもしくはＳＣ  ＰＳ  ＯＤＮでなくＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮで処理すると、突然変異および野生型の両方のＫ−ｒａｓ細胞で、Ｋ−ｒａｓ  ｐ２１タンパク質のレベルが２４時間以内に８０パーセント以上低下した（図７）。この作用は、Ａｄ．ｖｅｃまたはＡｄ．ｍｄａ−７による感染の有無にかかわらず認められ、Ｋ−ｒａｓレベルの整合性のある更なる変更は生じなかった（図７）。さらに、ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮの増殖抑制作用は、野生型Ｋ−ｒａｓＢｘＰＣ−３細胞系よりも、３種の突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞で大きかった（図５）。Ｋｉｔａら（１９９９年、Ｉｎｔｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ第８０巻：５５３〜５５８頁）の研究で観察されたように、（この実施例のような）ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮによって誘発された、点もしくは開始コドン特異的増殖抑制は、ＳＣもしくはＭＭ  ＰＳ  ＯＤＮを用いて観察されたものを上回っていた。さらに、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させ、その後ＳＣもしくはＭＭ  ＰＳ  ＯＤＮで処理した膵臓癌細胞では、相乗的な増殖抑制作用または細胞生存期間の短縮がはっきりと現れなかった。これらの結果は、特に、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させ、ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮで処理した後の突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞における甚大な相乗的増殖抑制作用を確認するものである。
【０１００】
形質膜に結合した低分子量のＧＴＰ結合タンパク質は、形質膜の内側の葉状層（ｌｅａｆｌｅｔ）から細胞質ゾルへシグナルが伝達される過程で細胞に利用されることが多い。低分子量のＧＴＰ結合タンパク質ファミリーの原型が、ｒａｓ遺伝子ファミリーである（Ｋｏｌｃｈ、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３５１巻：２８９〜３０５頁）。管様癌細胞を囲む非定型で過形成性の管中にＫ−ｒａｓ突然変異が現れるという観察（Ｌｅｍｏｉｎｅら、１９９２年、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．第１０２巻：２３０〜２３６頁）を根拠に、最近では、Ｋ−ｒａｓ突然変異が、膵臓での発癌における非常に初期の事象を表していると考えられている。生じたＫ−ｒａｓ突然変異は、ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解を低減することにより、分子のコンホーメーションを変化させ、それに伴ってＲＡＳ活性を維持させる（Ｋｏｌｃｈ、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３５１巻：２８９〜３０５頁；ＲｅｕｔｈｅｒおよびＤｅｒ、２０００年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１２巻：１５７〜１６５頁）。Ｋ−ＲＡＳは、活性化されると、古典的ＭＡＰＫ経路、Ｐ１３キナーゼ経路、ＪＮＫ経路などの多数の下流シグナル伝達経路を介して細胞質ゾルにシグナルを送って、増殖の増強を含む、おびただしい細胞の変化を引き起こす（Ｄｅｎｔら、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５７巻：１４０４〜１４０７頁；Ｇｉｒｅら、２０００年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ第１９巻：２２６９〜２２７６頁；Ａｌｍｅｉｄａら、２０００年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１４９巻：７４１〜７５４頁）。このような状況では、Ｋ−ＲＡＳの発現をブロックすることによって、突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞中での下流経路の活性を変更し、その癌細胞をＭＤＡ−７が引き起こす増殖抑制、および細胞の生存能力に対する作用に敏感にすることができる。
【０１０１】
突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞にＡｄ．ｍｄａ−７を感染させた後、ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ発現ベクターをトランスフェクションすると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖が抑制され、ヌードマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍形成が抑制された。Ｋ−ｒａｓの発現を抑制する追加の手法として、アンチセンス配向で使用したときにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで膵臓癌細胞の増殖を抑制することが前々からわかっている（Ａｏｋｉら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５５巻：３８１０〜３８１６頁；Ａｏｋｉら、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ．第２０巻：２５１〜２５８頁）、（ヌクレオチド１７２〜ヌクレオチド５１７にわたる）３４６ヌクレオチドのＫ−ｒａｓ遺伝子断片を、ＰＣＲによってＢｘＰＣ−３細胞から単離し、ｐｃＤＮＡ３．１（ネオマイシン耐性）発現ベクターにクローン化した。次いで、単独またはＡｄ．ｍｄａ−７との組合せで使用したときに膵臓癌細胞に対する作用があるかについて、この発現ベクターを試験した。図８（上列の培養プレート）からわかるように、ＭＩＡ  ＰａＣＡ−２細胞にＡｄ．ｖｅｃを単独またはＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮとの併用で感染させると、コロニー形成は有意に変更されなかった。同様に、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞にＡｄ．ｍｄａ−７を感染させても、単層培養でのクローン化効率は改変されなかった。それとは対照的に、Ａｄ．ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮの併用によって、コロニー形成が劇的に抑制された（血球計数器およびＭＴＴ染色によって細胞数を数えると、これまでの研究が確実になった）。Ａｄ．ｍｄａ−７と併用したＡＳ  Ｋ−ｒａｓプラスミドの膵臓癌細胞の増殖に対する作用を試験するために、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞にＡｄ．ｖｅｃまたはＡｄ．ｍｄａ−７を感染させ、対照またはＡＳ  Ｋ−ｒａｓプラスミドをトランスフェクションし、Ｇ４１８耐性コロニー形成を測定した。図８（下の列の培養プレート）からわかるように、Ａｄ．ｍｄａ−７に感染させ、ＡｓＫ−ｒａｓプラスミドでトランスフェクションしたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞においてのみ、劇的な増殖の抑制が観察された。定量的に類似の増殖抑制結果が、ＡｓＰＣ−１もしくはＰＡＮＣ−１突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞を用いて同じプロトコルを利用したときに得られたが、野生型Ｋ−ｒａｓＢｘＰＣ−３細胞では得られなかった。これらの結果は、プラスミドによる移入によってＡＳ  ＰＳ  ＯＤＮとアンチセンスＫ−ｒａｓ発現のどちらを発現させても、ｍｄａ−７との相乗作用が示され、突然変異したＫ−ｒａｓ膵臓癌細胞の増殖が抑制できることを示している。
【０１０２】
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞は、無胸腺ヌードマウス中に短い潜伏時間で腫瘍を形成する。ＡＳ  Ｋ−ｒａｓプラスミドでトランスフェクションし、またはＡｄ．ｍｄａ−７を感染させると、８０パーセントの動物で腫瘍が急速に成長した（３つの独立した実験、ｎ＝２６）。同様に、遺伝子を挿入していないプラスミドであるＡｄ．ｖｅｃを感染させるか、またはセンス配向でクローン化した３４６ヌクレオチドのＫ−ｒａｓ遺伝子断片を含むプラスミド構築物でトランスフェクションしても、腫瘍形成は有意に抑制されなかった（７６パーセントの腫瘍、ｎ＝１７、３つの独立した実験）。
【０１０３】
それとは対照的に、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に、無胸腺ヌードマウスに注射する前にＡｄ．ｍｄａ−７を感染させ、次いでＡＳ  Ｋ−ｒａｓプラスミドでトランスフェクションしたときに限り、腫瘍形成の完全な抑制が顕著に現れた（１３匹の動物で腫瘍が形成されなかった；３つの独立した実験）。これらの知見は、突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞で、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させるのと併せて、少サブセットの細胞中で抑制するため、ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ発現プラスミドでのトランスフェクションによってＫ−ｒａｓ遺伝子のターゲッティングを行ったことが、ヌードマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍形成を消失させたという証拠を提供するものである。トランスフェクションは、標的細胞に遺伝子を導入する手段として本質的に効率が悪いので、併用処理を受ける細胞に、ｍｄａ−７を含む隣接する腫瘍細胞を敏感にして生存能力を失わせる因子を放出させ、それによって腫瘍形成を妨げることが可能である。
【０１０４】
Ａｄ．ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮを併用すると、突然変異したＫ−ｒａｓを発現させるヒト膵臓癌細胞で選択的にアポトーシスが誘発された  ＭＤＡ−７がコロニー形成、およびヒト癌細胞の増殖を選択的に低減する機構には、アポトーシスの誘発が関与している（Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁；Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｓａｅｋｉら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻：２０５１〜２０５７頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻：２７１〜２８２頁）。Ｋ−ｒａｓが突然変異した膵臓癌細胞への併用処理が、アポトーシスの誘発によって細胞の生存能力を低減するかを判定するために、プログラム細胞死をモニターするのに通常使用されるいくつかのアッセイを実施した。多くの細胞では、アポトーシスの誘発には、ＤＮＡ分解が伴い、このことは、ヌクレオソームＤＮＡラダーの生成によってモニターすることができる（Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｒｅｅｄ、２０００年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．第１５７巻：１４１５〜１４３０頁；ＧｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２８１巻：１３０９〜１３１２頁）。図９からわかるように、野生型Ｋ−ｒａｓを発現させるＢｘＰＣ−３でなく突然変異したＫ−ｒａｓを発現する膵臓癌細胞をＡｄ．ｍｄａ−７プラスＡｓＫ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮで処理した結果、ＤＮＡの断片化が生じた。この作用の特異性は、単独でＡｄ．ｍｄａ−７を感染させた、または５．０μＭのＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮで処理した膵臓癌細胞において、あるいはＡｄ．ｍｄａ−７と５．０μＭのＭＭ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮの組合せで処理した細胞において、ヌクレオソームＤＮＡラダーがなかったことによりさらに実証された。３種の突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞において併用処理によってアポトーシスが誘発されたことの確認は、ＤＡＰＩによって、およびヨウ化プロピジウム染色によって検証し、低二倍体細胞の数の増加およびアネキシンＶ染色をＦＡＣＳ分析によって検証した。これらの結果から、Ａｄ．ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮを併用すると、突然変異したＫ−ｒａｓを発現する膵臓癌細胞の生存率がアポトーシスの誘発によって低減されたことが確認される。
【０１０５】
Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させ、ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮで処理した後、突然変異したＫ−ｒａｓを発現するヒト膵臓癌細胞中にＭＤＡ−７タンパク質が存在した  膵臓癌細胞がｍｄａ−７に耐性である理由、ならびにＡｄ．ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮの併用によって、特定の膵臓癌細胞がｍｄａ−７による増殖抑制およびアポトーシスの誘発に敏感になる機構は不明である。１つの仮説は、突然変異Ｋ−ｒａｓタンパク質、またはこのタンパク質によって変更された生化学的経路が、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた後のＭＤＡ−７タンパク質の合成、プロセシング、および／または分泌を妨げるというものである。この可能性を、異なる膵臓癌細胞系において、様々な治療プロトコルが細胞内ＭＤＡ−７タンパク質レベルに影響を及ぼすかを判定することによって検証した（図１０Ａ〜Ｄ）。Ａｄ．ｍｄａ−７を単独またはＭＭもしくはＳＣ  ＰＳ  ＯＤＮとの併用で感染させてから２４時間目に、４種の異なる膵臓癌からの細胞可溶化液中にＭＤＡ−７タンパク質は検出されなかった。Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた後４種の膵臓癌細胞系のすべてでｍｄａ−７ｍＲＮＡが生成されたにもかかわらず、このことが起こった（図１１）。それとは対照的に、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させ、ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮで処理した後の３種のＫ−ｒａｓ突然変異膵臓癌細胞系では、ＭＤＡ−７タンパク質が容易に検出された（図１０Ａ〜Ｃ）。野生型Ｋ−ｒａｓを発現するＢｘＰＣ−３の場合では、ＭＤＡ−７タンパク質は検出されなかった（図１０Ｄ）。これらの結果は、突然変異したＫ−ｒａｓが、突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞中でのＭＤＡ−７タンパク質のプロセシングにマイナスの影響を及ぼすかもしれないことを示唆している。同様のプロトコルを利用して、ＢｘＰＣ−３細胞中にＭＤＡ−７タンパク質が存在しなかったことは、膵臓癌細胞中でＭＤＡ−７タンパク質の発現および／または保持を変更する他の経路が作動している可能性を示唆している。アポトーシスは、ｍｄａ−７とアンチセンスｒａｓを併用して処理したＫ−ｒａｓ突然変異膵臓癌細胞中でしか起こらないので、これらの研究は、膵臓癌細胞において、ＭＤＡ−７タンパク質の存在／保持と増殖抑制およびプログラム細胞死との間に潜在的な相関があることを裏付けるものである。
【０１０６】
Ａｄ．ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮの併用は、アポトーシス関連タンパク質のレベルを変更する  これまでの研究は、多様な癌細胞にＡｄ．ｍｄａ−７を感染させると、アポトーシスがもたらされ、大方の場合、この過程がＢＡＸタンパク質のアップレギュレーション、ならびにＢＡＸタンパク質対ＢＣＬ−２タンパク質比の変化を伴うことを示している（Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁；Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｓａｅｋｉら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻：２０５１〜２０５７頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻：２７１−２８２１８−２１）。しかし、ＢＡＸタンパク質を産生しないＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞などの特定の癌細胞のアポトーシスを誘発するＡｄ．ｍｄａ−７（Ｒａｍｐｉｎｏら、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２７５巻：９６７〜９６９頁）は、ｍｄａ−７が、ある特定の癌細胞中でＢＡＸに依存的でない経路によってもプログラム細胞死を媒介できることを示唆している。これらの見解、およびＭＤＡ−７タンパク質が併用処理を施した突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞中に特異的に存在することに基づき、実験を実施して、処理した細胞中のＢＡＸおよびＢＣＬ−２タンパク質のレベルを測定した。併用処理を施してから３日目に分析したとき、Ｋ−ｒａｓ突然変異細胞の大半はアポトーシスを起こし、ＰＡＣＮ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、およびＡｓＰＣ−１細胞中のＢＡＸタンパク質レベルが、それぞれ約７．５倍、約３倍、および約１０倍に上昇したが、ＢｘＰＣ−３細胞では上昇しなかった（図１２）。さらに、ＢＣＬ−２タンパク質のレベルは、ＰＡＮＣ−１（約８倍）およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２（約１３．５倍）細胞で有意に減少し、ＡｓＰＣ−１細胞（約１．２倍）でかろうじて減少し、ＢｘＰＣ−３細胞では変化しないままであった（図１２）。これらの結果は、併用処理を施した膵臓癌細胞のアポトーシスが誘発される際に、ＢＡＸタンパク質が関与し、ＢＡＸタンパク質対ＢＣＬ−２タンパク質比が変化することと整合性がある。
【０１０７】
７．実施例：３４６または６３１ヌクレオチドを有するアンチセンスＲＡＳ核酸をｍｄａ−７と併用すると、膵臓癌細胞のコロニー形成が抑制される
７．１．材料および方法
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ．ｍｄａ−７を感染させ、次いで３４６ヌクレオチド（Ｋ−ｒａｓ  ｃＤＮＡのヌクレオチド１７２〜５１７）または６３１ヌクレオチド（Ｋ−ｒａｓ  ｃＤＮＡのヌクレオチド１７２〜８０２）の野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子断片１０マイクログラムをｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにアンチセンス配向にクローン化したものを、１０マイクロモルのリポフェクタミンの存在下でトランスフェクションした。対照として、ある細胞に１００ｐｆｕ／細胞のＡＤ．ｍｄａ−７を感染させ、次いで１０マイクログラムの空のｐｃＤＮＡ３．１ベクターでトランスフェクションし、別の細胞にはアデノウイルスを感染させず、空のｐｃＤＮＡ３．１ベクターでのトランスフェクションだけを行った。トランスフェクションを行ってから１２時間目に、細胞を様々な細胞密度で播き、Ｇ４１８含有培地で選択し、２〜３週間後にコロニー形成を評価した。ＰＡＮＣ−１およびＡｓＰＣ−１細胞を使用して類似の実験を実施した。
【０１０８】
７．２．結果
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を使用する前述の実験の結果は、図１３に棒グラフの形式で示す。コロニー形成は、ｍｄａ−７単独、またはＡｄ．ｍｄａ−７の感染なしの３４６もしくは６３１ヌクレオチドのｒａｓアンチセンス配列のどちらかのトランスフェクションによって、あるとしても若干しか抑制されなかった。しかし、３４６または６３１ヌクレオチドのどちらかのアンチセンスｒａｓをコードするプラスミドでのトランスフェクションと組合わせてＡｄ．ｍｄａ．７を感染させると、コロニー形成がかなり抑制され、種々の大きさのｒａｓアンチセンス・ヌクレオチドがＲＡＳ活性を有効に抑制できることを示した。ＰＡＮＣ−１およびＡｓＰＣ−１細胞でも定量的に類似の結果が認められた。
【０１０９】
８．実施例：初代ラット肝細胞にＡＤ．ｍｄａ−７を感染させた後の生物学的に機能性のＭＤＡ−７の分泌
８．１．概要
アデノウイルスベクターを全身に感染させると、決まって肝臓が高いレベルで感染する（Ｈｕａｒｄら、１９９５年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第２巻（２）：１０７〜１１５頁；Ｍｏｒｒａｌら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９６巻：１２８１６〜１２８２１頁）。特定の例では、この相互作用は毒性をもたらし得る（ＳｏｍｉａおよびＶｅｒｍａ、２０００年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．第１巻（２）：９１〜９９頁）。これまでの研究は、ｍｄａ−７が、皮膚および肺の線維芽細胞、乳房および前立腺上皮細胞、内皮細胞、およびメラニン形成細胞を含む、あるスペクトルの正常なヒト細胞型に対して無毒であることの証拠を提供している（Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁；Ｓａｅｋｉら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻：２０５１〜２０５７頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻：２７１〜２８２頁）。それとは対照的に、ｍｄａ−７は、黒色腫、多形性膠芽腫、骨肉腫、乳癌、子宮頚癌、大腸癌、肺癌、上咽頭癌細胞、卵巣癌、および前立腺癌を含む、多様なスペクトルのヒト腫瘍細胞において、増殖の抑制およびプログラム細胞死（アポトーシス）を選択的に引き起こす（Ｍａｄｉｒｅｄｄｉら、２０００年、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６５巻：２３９〜２６１頁；Ｓａｅｋｉら、２０００年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第７巻：２０５１〜２０５７頁；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第７巻：２７１〜２８２頁）。しかし、膵臓癌細胞は、感染を、ＲＡＳ活性を低下させる手法と組み合わせない限り、Ａｄ．ｍｄａ−７に対して屈折性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ）である。この節で述べる実験は、（１）初代肝細胞へのＡｄ．ｍｄａ−７の感染が毒性を引き起こすかどうかを判定し、また（２）初代肝細胞へのＡＤ．ｍｄａ−７の感染によって、細胞内、および感染させた肝細胞を増殖させるのに使用した培地中で生物学的活性のあるＭＤＡ−７タンパク質が産生されるかどうかを判定するために実施した。
【０１１０】
８．２．材料および方法
初代ラット肝細胞の調製、ならびに調整培地および細胞可溶化液の調製  Ｐａｒｋら、２０００年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．第１１巻：２９１５〜２９３２頁に記載されているような２段階のコラゲナーゼ灌流法を利用して、初代ラット肝細胞を単離した。付着してから４時間目に、細胞に３０回の多数の感染で空のアデノウイルスベクター（Ａｄ．ｖｅｃ）またはＡｄ．ｍｄａ−７のいずれかを感染させた（Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁）。この過程の間、細胞を穏やかに振盪して、ウイルスの吸着および感染を促進した。感染させてから８４時間目に、細胞から培地を取り除き、以下に述べるように更なる実験に使用した。感染させた肝細胞をかき取って、細胞培養の間使用した同体積の無菌ダルベッコ改良イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）に入れ、−２０℃の単一凍結融解サイクルにかけ、解凍した後Ｐ１０００ピペットチップで摩砕することによって溶解し、次いで細胞の破砕物を遠心分離によって除去し、細胞抽出物を含有する培地をデカントした。この培地を、これも以下で述べるように更なる実験に使用した。
【０１１１】
Ａｄ．ｍｄａ−７およびＡｄ．ｖｅｃを感染させた肝細胞の調整培地および溶解した細胞のヒト膵臓癌細胞に対する生物学的活性についてのアッセイ  ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を１×１０６／１０ｃｍのプレートに播いた。翌日、細胞を次の各群に配分し、次のように処理した。各群は、（１）未処理対照群；（２）Ａｄ．ｍｄａ−７感染群（１００ｐｆｕ／細胞を使用）；（３）１ミリリットルあたり１０マイクログラムのリポフェクタミンの存在下、配列番号１５を有する０．５マイクロモルの濃度のＡＳ  Ｋ−ｒａｓホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした群；または（２）群および（３）群と同じ条件を使用して、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させ、ＡＳ  Ｋ−ｒａｓホスホロチオエートオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした群である。翌日、種々の群からの細胞をトリプシン／ベルセンを使用して再懸濁させ、１×１０５／３５ｍｍのプレートに２連に播き直した。細胞の接着が起こった後（約６時間）、増殖培地を取り除き、上述のように調製した、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の可溶化液または培養上清のいずれか（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清で１：１に希釈したもの）と置き替えるか、あるいは対照については、新鮮な増殖培地と置き替えた。８日間にわたり細胞数を毎日測定した。
【０１１２】
８．３．結果
結果は、ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の可溶化液（図１４Ａ）または上清（図１４Ｂ）のいずれかで処理した対照細胞については図１４Ａ〜Ｂに、ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の可溶化液（図１５Ａ）または上清（図１５Ｂ）で処理したＡｄ．ｍｄａ−７感染ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞については図１５Ａ〜Ｂに；さらにｍｄａ−７を感染させた肝細胞の可溶化液（図１６Ａ）または上清（図１６Ｂ）のいずれかで処理したＡＳ  Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドでトランスフェクションされたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞については図１６Ａ〜Ｂに示す。図１５Ａ〜Ｂおよび１６Ａ〜Ｂは、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させ、かつＡＳ  Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドでトランスフェクションしたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の細胞数も示す。
【０１１３】
初代ラット肝細胞へのＡｄ．ｍｄａ−７（３０ｐｆｕ／細胞）の感染は、初代肝細胞に毒性作用を引き起こさなかった。感染を受けた肝細胞は、ＭＤＡ−７がプロセシングを受けたタンパク質を明らかに分泌した。そして、Ａｄ．ｍｄａ−７感染（図１５Ｂ）またはＡＳ  Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした（図１６Ｂ）ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞のいずれかに投与したときに、このタンパク質は細胞増殖を抑制した。さらに、感染後８４時間目にアッセイを行うと、Ａｄ．ｖｅｃでなく、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた肝細胞可溶化液を、感作した膵臓癌細胞に加えたときにも、（増殖の抑制によって証明される）生物学的活性が認められた（図１５Ａおよび図１６Ａ）。これらの結果は、Ａｄ．ｍｄａ−７による感染がＭＤＡ−７タンパク質の産生をもたらすこと、およびこのタンパク質が、周囲の培地を介して投与されたときに、適切に感作した膵臓癌細胞に影響を及ぼし得ることを示している。
【０１１４】
ＡＳ  Ｋ−ｒａｓオリゴヌクレオチドで処理したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（図１６ＡおよびＢ）に対する生物学的作用が最も大きいようであった。Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（図１５ＡおよびＢ）でもかなりの増殖抑制が認められ、細胞内経路と膜を媒介とするシグナル伝達経路とが相乗的に作用する可能性が示唆された。それとは対照的に、未処理ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、感染を受けた肝細胞の可溶化液または培養上清のいずれかに曝したときには、有意の作用がはっきり現れなかった（図１４ＡおよびＢ）。
【０１１５】
追加の実験では、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の培養上清が、細胞内ＭＤＡ−７タンパク質の増加に応答することが知られている癌細胞、特にＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞に対する増殖抑制作用を有することも観察された。
【０１１６】
９．実施例：ｍｄａ−７またはＡＳ  Ｋ−ｒａｓを保有したウイルスベクターによる同時感染は、膵臓癌細胞の増殖を抑制する
９．１．材料および方法
４種の異なる膵臓癌細胞系ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、ＰＡＮＣ−１、およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２については、以下の手順に従った。細胞を１×１０６／１０ｃｍのプレートに播き、その翌日、培養物を処理しないか（対照）、あるいは１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ．ｍｄａ−７もしくはＡｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳを感染させ、または５０ｐｆｕ／細胞＋５０ｐｆｕ／細胞のＡｄ．ｍｄａ−７＋Ａｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳを感染させた（すなわち、両方のウイルスを感染させた）。種々のウイルスと共に２時間インキュベートした後、１０パーセントのウシ胎児血清を補充した完全増殖培地ＲＰＭＩ−１６４０を細胞に加え、それを５パーセントＣＯ２／９５パーセント空気の加湿インキュベーターにおいて、３７℃でさらに６〜８時間インキュベートした。次いで、細胞を再懸濁させ、１×１０５／３５ｍｍのプレートに３連に播き、同じ条件下、３７℃で細胞をインキュベートした。２日、４日、６日、および８日後、血球係数器を用いて細胞数を測定した。反復実験のサンプルの変動は、１０パーセント以下であった。
【０１１７】
９．２．結果
結果を図１７Ａ〜Ｄに示す。（図１７Ａ〜Ｄで白抜きの丸をつなぐ断続線として表される）Ａｄ．ｍｄａ−７単独による感染は、試験したどの細胞系に対してもほとんど作用をもたなかった。（図中で白抜きの三角をつなぐ破線として表される）上述のようにＫ−ｒａｓの６３１ｂｐ断片をアンチセンス配向で含むＡｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳによる感染は、４種の膵臓癌細胞系の増殖を様々な程度に抑制した。すなわち、Ａｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳによる感染は、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（図１７Ｄ）およびＰＡＮＣ−１（図１７Ｃ）の増殖を等しく抑制し、ＡｓＰＣ−１（図１７Ａ）に対して同様の抑制作用をもち、ＢｘＰＣ−３（図１７Ｂ）に対してはほとんど作用をもたなかった。それとは対照的に、（図中で＋を重ね書きした四角をつなぐ断続線として表される）Ａｄ．ｍｄａ−７とＡｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳによる同時感染は、Ｋ−ｒａｓの突然変異が活性化している細胞系（ＡｓＰＣ−１、ＰＡＮＣ−１、およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２；図１７Ａ、Ｃ、およびＤ）に対して相乗的抑制作用をもたらしたが、野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子を有するＢｘＰＣ−３（図１７Ｂ）に対しては有意な作用がなかった。これらの研究は、Ａｄ．ｍｄａ−７＋Ａｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳの併用が、突然変異Ｋ−ｒａｓ遺伝子を発現させる膵臓癌細胞の増殖を大いに抑制するが、野生型Ｋ−ｒａｓを有する膵臓癌細胞ではこの作用が引き起こされないことを実証するものである。
【０１１８】
１０．実施例：ｍｄａ−７またはＡＳ  Ｋ−ｒａｓを単独で発現させるアデノウイルスベクターと、ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓを同時に発現させる２部構成アデノウイルスベクターによる感染の膵臓癌細胞の増殖に対する作用との比較
１０．１．材料および方法
細胞培養および生存率アッセイ。空気９５％、ＣＯ２５％の加湿インキュベーターにおいて、ＡｓＰＣ−１、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２、ＰＡＮＣ−１、およびＢｘＰＣ−３ヒト膵臓癌細胞系を、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中、３７℃でインキュベートした。（Ｌｅｂｅｄｅｖａら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６０巻：６０５２〜６０６０頁）に記載のとおりに、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）染色法によって細胞の増殖および生存率をモニターした。
【０１１９】
アデノウイルス感染プロトコル  Ａｄ．ｍｄａ−７（図２）、Ａｄ．ＡＳ．Ｋ−ｒａｓ（図３）、およびＡｄ．ｂｐｖ（図４）を含む種々の複製能不適合アデノウイルスを構築した。空のアデノウイルスベクター（Ａｄ．ｖｅｃ）を対照として使用した。ＭＴＴアッセイについては、９６穴プレートの各穴に１５００個の細胞を播いた。その翌日、１００ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でアデノウイルスを感染させた。細胞をウイルスと共に、３０μｌの血清非含有培地中で２時間インキュベートして、ウイルスを完全に吸着させた。２時間後、細胞を完全増殖培地中で培養した。他の実験では、１×１０６個の細胞を１０ｃｍのプレートに播き、翌日、１．５ｍｌの血清非含有培地中で２時間かけてアデノウイルスに感染させ、次いで培地を完全増殖培地と置き替えた。感染後１日、３日、５日、および７日目に細胞の生存率をＭＴＴアッセイによって評価した。
【０１２０】
全ＲＮＡの抽出およびノザンブロット分析  細胞に１００ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でアデノウイルスベクターを感染させた。３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したｍｄａ−７ｃＤＮＡプローブを使用するノザンブロット分析によって、ｍｄａ−７の発現を分析した。感染後２日目に、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットによって製造者のプロトコルに従いながら全ＲＮＡを抽出した。５μｇの全ＲＮＡを７０℃で１０分間かけて変性させ、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルでの電気泳動にかけ、ナイロンの膜に転写した。製造者のプロトコルに従いながらＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州パロアルト）を使用して、膜を３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識したｍｄａ−７ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、膜を洗浄し、露光してオートラジオグラフィーを行った。
【０１２１】
全細胞可溶化液の調製およびウエスタンブロット分析  細胞を処理しない（対照）か、または１００ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄ．ｖｅｃもしくはＡｄ．ｂｐｖのどちらかに感染させた。感染後３日目に、細胞を１０ｃｍ皿から９００μｌのＲＩＰＡ緩衝液［１％のノニデットＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、および０．１％のＳＤＳが含まれたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国インディアナ州インディアナポリス）を加えたもの］中に収穫した。ＤＮＡを２１ゲージの針に通してせん断し、４℃で１０分間、１２，０００ｒｐｍの遠心分離にかけた。上清を全細胞可溶化液として使用した。各サンプルからの３０マイクログラムの全細胞可溶化液を、１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で泳動した。エレクトロブロッティング装置を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。ＢｌｏｔｔｏＡ［１０ミリモル／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ミリモル／ＬのＮａＣｌ、５％のスキムミルク、および０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０］を用い、室温で１時間かけて膜をブロックし、ＭＤＡ−７に対する抗体（１：１０００、ウサギポリクリーナル）およびＫ−ＲＡＳに対する抗体（１：２００、マウスモノクローナル）と共に４℃で終夜インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ［１０ミリモル／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ミリモル／ＬのＮａＣｌ、および０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０］で膜を５分間ずつ３回洗浄し、ＢｌｏｔｔｏＡ中で、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００）と共に室温で１時間インキュベートした。膜をＴＢＳ−Ｔ中で１０分間ずつ３回洗浄した。ＥＣＬウエスタンブロッティング検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ、英国Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ）によって、製造者のプロトコルに従いながら化学発光を検出した。
【０１２２】
１０．２．結果
ｍｄａ−７およびＡＳ．Ｋ−ｒａｓを単一のアデノウイルスベクターから発現させる目的で、Ａｄ．ｂｐｖを構築した。Ａｄ．ｂｐｖによる感染がｍｄａ−７のｍＲＮＡおよびタンパク質の産生をもたらすことを確認するために、種々の膵臓癌細胞系に、Ａｄ．ｖｅｃまたはＡｄ．ｂｐｖのいずれかを１００ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染後１２時間、２４時間、および４８時間目に、細胞を収集し、全ＲＮＡを抽出した。Ａｄ．ｂｐｖ感染後のｍｄａ−７ｍＲＮＡの発現を、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識したｍｄａ−７ｃＤＮＡプローブを使用するノザンブロット分析によって分析した。図１８に示すように、Ａｄ．ｖｅｃを感染させた細胞ではｍｄａ−７ｍＲＮＡを検出できなかった。しかし、Ａｄ．ｂｐｖを感染させた細胞では、高レベルのｍｄａ−７ｍＲＮＡを検出することができた。この知見は、Ａｄ．ｂｐｖによる感染によってｍｄａ−７ｍＲＮＡが産生されることを示すものであった。
【０１２３】
Ａｄ．ｂｐｖによる感染の後に転写されたｍｄａ−７ｍＲＮＡがＭＤＡ−７タンパク質に効率よく翻訳され得ることを確認するために、Ｍｉａ  Ｐａｃａ−２細胞に、Ａｄ．ｖｅｃまたはＡｄ．ｂｐｖを１００ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させた。３日後に細胞を収穫し、全細胞可溶化液を作製した。抗ＭＤＡ−７抗体および抗Ｋ−ＲＡＳ抗体を使用するウエスタンブロット分析によって、ＭＤＡ−７およびＫ−ＲＡＳタンパク質の発現を検出した。図１９に示すように、対照（未処理）およびＡｄ．ｖｅｃ感染細胞ではＭＤＡ−７タンパク質が検出できなかった。しかし、Ａｄ．ｂｐｖ感染細胞ではＭＤＡ−７タンパク質を検出することができた。Ｋ−ＲＡＳタンパク質の発現は、対照およびＡｄ．ｖｅｃ感染細胞では検出できたが、Ａｄ．ｂｐｖ感染細胞によって感染させた細胞では検出できなかった（データ非表示）。これらの結果は、Ａｄ．ｂｐｖによる感染によって、効率よくＭＤＡ−７タンパク質が産生され、Ｋ−ＲＡＳタンパク質がダウンレギュレーションされるという仮説を確実にするものである。
【０１２４】
膵臓癌細胞系の増殖に対するＡｄ．ｂｐｖ感染の作用を次に試験した。突然変異Ｋ−ｒａｓを含む膵臓癌細胞系Ｐａｎｃ−１、Ｍｉａ  Ｐａｃａ−２、およびＡｓＰｃ−３と、野生型Ｋ−ｒａｓを含む細胞系ＢｘＰｃ−３に、Ａｄ．ｖｅｃ、Ａｄ．ｍｄａ−７、Ａｄ．ＡＳ．Ｋ−ｒａｓ、Ａｄ．ｍｄａ−７とＡｄ．ＡＳ．Ｋ−ｒａｓの組合せ、およびＡｄ．ｂｐｖを感染させた。感染は、１００ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで実施した。感染後１日、３日、５日、および７日目に、ＭＴＴアッセイによって細胞の増殖をモニターした。図２０Ａ〜Ｄに示すように、対照（未感染）、Ａｄ．ｖｅｃ感染、およびＡｄ．ｍｄａ−７感染細胞は、すべての細胞系において同程度の速度で増殖し続けた。Ａｄ．ＡＳ．Ｋ−ｒａｓのみによる感染は、突然変異Ｋ−ｒａｓを含む細胞系の細胞数を約２０％減少させた。Ａｄ．ｍｄａ−７とＡｄ．ＡＳ．Ｋ−ｒａｓの併用は、突然変異Ｋ−ｒａｓを含む細胞系の細胞増殖を完全に抑制した。Ａｄ．ｂｐｖのみによる感染は、突然変異Ｋ−ｒａｓを含む細胞系の増殖の抑制において、併用と同程度に強力であった。いずれの反復プロトコルでも、野生型Ｋ−ｒａｓを含むＢｘＰｃ−３細胞の増殖を抑制することはできなかった。これらの結果は、膵臓癌細胞の増殖を抑制する際に、Ａｄ．ｍｄａ−７とＡｄ．ＡＳ．Ｋ−ｒａｓの併用に代わってＡｄ．ｂｐｖを有効に利用できることを示している。２種のアデノウイルスベクターを併用する代わりに単一のアデノウイルスベクターを使用することは、感染に伴う潜在的な毒性がかなり低減されるので有利である。したがって、Ａｄ．ｂｐｖは、膵臓癌を治療する目的のために効果的なツールとなるはずである。
【０１２５】
本明細書では様々な刊行物およびＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列を引用したが、その内容の全体を参照により組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】ＲＡＳ経路の簡略図である。
【図２Ａ】ＭＤＡ−７をコードする核酸（すなわち、ｍｄａ−７遺伝子）を含む複製能欠陥アデノウイルスの調製を示す。（Ａ）は、ｐＣＭＶ／ｍｄａ−７プラスミドを示す。
【図２Ｂ】ＭＤＡ−７をコードする核酸（すなわち、ｍｄａ−７遺伝子）を含む複製能欠陥アデノウイルスの調製を示す。（Ｂ）は、２９３細胞中でのｐＣＭＶ／ｍｄａ−７とｐＪＭ１７との間の組換えを示す。
【図２Ｃ】ＭＤＡ−７をコードする核酸（すなわち、ｍｄａ−７遺伝子）を含む複製能欠陥アデノウイルスの調製を示す。（Ｃ）は、産物Ａｄ．ｍｄａ−７ウイルスを示す。
【図３Ａ】ＡＳ  Ｋ−ｒａｓをコードする核酸を含む複製能欠損アデノウイルスの調製を示す。（Ａ）は、ｐＣＭＶ／Ｋ−ｒａｓＡＳプラスミドを示す。
【図３Ｂ】ＡＳ  Ｋ−ｒａｓをコードする核酸を含む複製能欠損アデノウイルスの調製を示す。（Ｂ）は、２９３細胞中でのｐＣＭＶ／Ｋ−ｒａｓＡＳとｐＪＭ１７との間の組換えを示す。
【図３Ｃ】ＡＳ  Ｋ−ｒａｓをコードする核酸を含む複製能欠損アデノウイルスの調製を示す。（Ｃ）産物Ａｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳウイルスを示す。
【図４】２部構成Ａｄ．ｍｄａ−７／Ｋ−ｒａｓＡＳの調製を示す図である。この図は、一定の割合で描かれていないが、末端のヌクレオチドは、このベクターが由来するＡｄ血清型５の３５９５ヌクレオチド長に基づいて示す。文字「ＴＰ」を含む楕円は、天然ゲノムに共有結合された末端タンパク質を表す。サイトメガロウイルス即時型（ＣＭＶ）プロモーターを使用して、２部構成ベクターからｍｄａ−７とＫ−ｒａｓＡＳの両方を転写させた。
【図５】Ａｄ．ｍｄａ−７（ｍｄａ−７遺伝子を発現可能な形で有する複製能欠損アデノウイルス）とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ（ホスホロチオエートに結合したアンチセンスｒａｓオリゴヌクレオチド）の併用によって、突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞（Ｋ−ｒａｓ遺伝子中に突然変異を有する膵臓癌細胞）の増殖が相乗的に抑制されることを示す。細胞を、示した剤で３日間かけて処理し、血球計数器で生細胞数を測定した。ＡＳ  ＰＳ  ＯＤＮ：０．５または５．０μＭ、Ａｄ．ｍｄａ−７：１００プラーク形成単位（「ｐｆｕ」）／細胞、ＭＭ  ＰＳ  ＯＤＮ（不適合オリゴヌクレオチド）：５．０μＭ。結果は、４プレートの平均±平均値からの標準偏差（「Ｓ．Ｄ．」）である。追加の実験でも同様の性質の結果が得られた。
【図６】Ａｄ．ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮを併用すると、相乗的に、突然変異体Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞の増殖が抑制され、その生存が減少したことを示す。Ｋ−ｒａｓ遺伝子突然変異体を有する膵臓癌細胞系（ＡｓＰＣ−１［パネルＡ、Ｅ、Ｉ、Ｍ］、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２［パネルＢ、Ｆ、Ｊ、Ｎ］、およびＰＡＮＣ−１［パネルＣ、Ｇ、Ｋ、Ｏ］）と、野生型ｒａｓ遺伝子を有する膵臓癌細胞系ＢｘＰＣ−３（パネルＤ、Ｈ、Ｌ、Ｐ）を示すとおりに処理し、３日後に、それぞれの顕微鏡視野を撮影した。細胞は、未処理（対照、パネルＡ〜Ｄ）、０．５μＭのＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ処理（パネルＥ〜Ｈ）、Ａｄ．ｍｄａ−７による感染（１００ｐｆｕ／細胞、パネルＩ〜Ｌ）、またはＡｄ．ｍｄａ−７（１００ｐｆｕ／細胞）による感染の後０．５μＭのＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ処理（パネルＭ〜Ｐ）のいずれかである。
【図７】ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮが、膵臓癌細胞中でＫ−ＲＡＳタンパク質の合成を抑制したことを示す。この図は、様々な剤で３日間処理した細胞中のＫ−ＲＡＳおよびＥＦ−１αタンパク質レベルについてのウエスタンブロット分析を示す。ＭＭ、ＳＣ（無秩序型）、およびＡＳ  ＰＳ  ＯＤＮの濃度は０．５μＭであり、ウイルスの用量は１００ｐｆｕ／細胞であった。
【図８】Ａｄ．ｍｄａ−７とＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮもしくはＡＳ  Ｋ−ｒａｓプラスミドの併用が、突然変異Ｋ−ｒａｓＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞のコロニー形成を相乗的に抑制したことを示す。上列の各培養プレートは、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２のコロニー形成に対するＡｄ．ｍｄａ−７プラスＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮの作用を示す。細胞に１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ．ｖｅｃ（空ベクター対照）またはＡｄ．ｍｄａ−７を感染させ、０．５μＭのＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮプラス１０マイクロリットルのリポフェクタミンで処理し、４００細胞／プレートの密度で再接種し、固定し、３週間後にギムザ染色した。下の列の各培養プレートは、Ａｄ．ｍｄａ−７プラスＡＳ  Ｋ−ｒａｓプラスミドのトランスフェクションが、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２のＧ４１８耐性コロニーの形成に及ぼした作用を示す。細胞に１００ｐｆｕ／細胞のＡｄ．ｖｅｃまたはＡｄ．ｍｄａ−７を感染させ、１０マイクログラムのプラスミド（挿入体のない対照ｐｃＤＮＡ３．１、または３４６ヌクレオチドのＡＳ  Ｋ−ｒａｓ断片を含むｐｃＤＮＡ３．１ベクター）でトランスフェクションし、２．５×１０５細胞／プレートの密度で再接種し、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で選択し、次いでＧ４１８耐性コロニーを固定し、３週間後にギムザ染色した。
【図９】Ａｄ．ｍｄａ−７およびＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮによって誘発された、Ｋ−ｒａｓ突然変異体ヒト膵臓癌細胞のヌクレオソームＤＮＡ分解を示す。表示の細胞型を、表示のとおりに３日間処理した。ＡＳ：０．５μＭのＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ、Ａｄ．ｍｄａ−７：１００ｐｆｕ／細胞、Ａｄ．ｍｄａ−７による感染（１００ｐｆｕ／細胞）＋０．５μＭのＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ。ヌクレオソーム・ラダーの形成は、Ｋｏｌｃｈ、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３５１巻：２８９〜３０５頁に記載のとおりに測定した。
【図１０】Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させ、ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮで処理した突然変異Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞においてＭＤＡ−７タンパク質が検出されたことを示す。細胞系ＰＡＮＣ−１（パネルＡ）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（パネルＢ）、ＡｓＰＣ−１（パネルＣ）、およびＢｘＰＣ−３（パネルＤ）は、示すとおりに１日間処理した。それぞれのパネルの列は、次のように処理した細胞を含む。すなわち、１＝対照細胞、２＝ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ処理、３＝Ａｄ．ｖｅｃ処理、４＝Ａｄ．ｖｅｃ＋ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ処理、５＝Ａｄ．ｍｄａ−７処理、６＝Ａｄ．ｍｄａ−７＋ＭＭ  ＰＳ  ＯＤＮ処理、７＝Ａｄ．ｍｄａ−７＋ＳＣ  ＰＳ  ＯＤＮ処理、８＝Ａｄ．ｍｄａ−７＋ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮ処理、９＝Ａｄ．ｖｅｃで１日間処理したＰＣ−３前立腺癌細胞；１０＝Ａｄ．ｍｄａ−７で１日間処理したＰＣ−３細胞（ｍｄａ−７タンパク質発現の陽性対照として使用した）。処理した細胞の可溶化液(lysate)は、Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｌｅｂｅｄｅｖａら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６０巻：６０５２〜６０６０頁；およびＳｕら、１９９５年、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．第７巻：１２７９〜１２８４頁に記載のとおりに、ＭＤＡ−７およびＥＦ−１αタンパク質についてウエスタンブロッティングによって評価した。矢じりおよび角括弧が、ウエスタンブロッティングによって検出されたＭＤＡ−７タンパク質を示す。ＭＭ、ＳＣ、およびＡＳ  ＰＳ  ＯＤＮの濃度は０．５μＭであり、ウイルスの用量は１００ｐｆｕ／細胞であった。
【図１１】Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた突然変異および野生型Ｋ−ｒａｓ膵臓癌細胞中でのｍｄａ−７ｍＲＮＡの発現を示す。表示の細胞系は、３日間処理し、全ＲＮＡを単離し、ｍｄａ−７およびＧＡＰＤＨｍＲＮＡについてノザンブロッティングによって分析した。ＳＣ、ＭＭ、およびＡＳ  ＰＳ  ＯＤＮの濃度は０．５μＭであり、ウイルスの用量は１００ｐｆｕ／細胞であった。
【図１２】種々の処理プロトコルを経た後の膵臓癌細胞中でのＢＡＸ、ＢＣＬ−２、およびＥＦ−１α各タンパク質の発現を示す。異なる細胞系を示すとおりに３日間処理し、Ｓｕら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９５巻：１４４００〜１４４０５頁；Ｌｅｂｅｄｅｖａら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６０巻：６０５２〜６０６０頁；およびＳｕら、１９９５年、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．第７巻：１２７９〜１２８４頁に記載のとおりに、３０μｇの全タンパク質可溶化液を使用して、それぞれの抗体を用いるウエスタンブロッティングによってそれぞれのタンパク質のレベルを測定した。ＭＭ、ＳＣ、およびＡＳ  ＰＳ  ＯＤＮの濃度は０．５μＭであり、ウイルスの用量は１００ｐｆｕ／細胞であった。
【図１３】ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の％コロニー形成を示す。細胞は、バーの左から右へ表されるように、空ベクター（「Ｖｅｃ」）を感染させたもの；３４６Ｋ−ｒａｓ断片を含むベクターでアンチセンス配向にトランスフェクションしたもの（「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ（３４６）」）；６３１Ｋ−ｒａｓ断片をアンチセンス配向にトランスフェクションしたもの（「ＡＳ−Ｋｒａｓ（６３１）」）；空ベクターでトランスフェクションし、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させたもの（「Ｖｅｃ＋ｍｄａ−７」）；ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ（３４６）をコードするベクターでトランスフェクションし、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させたもの（「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ（３４６）＋ｍｄａ−７」）；またはＡＳ  Ｋ−ｒａｓ（６３１）をコードするベクターでトランスフェクションし、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させたもの（「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ（６３１）＋ｍｄａ−７」）であった。
【図１４Ａ】第８節で述べた実験の対照を示す。（Ａ）空アデノウイルスを感染させた肝細胞の可溶化液（白抜きの菱形、「Ｃｏｎ＋Ａｄ．ｖｅｃ可溶化液」）、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の可溶化液（白抜きの丸、「Ｃｏｎ＋Ａｄ．ｍｄａ−７可溶化液」）、または未処理（白抜きの四角、「Ｃｏｎ」）のいずれかで処理した非感染ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞の数を示す。
【図１４Ｂ】第８節で述べた実験の対照を示す。（Ｂ）空アデノウイルスを感染させた肝細胞の培養上清（白抜きの菱形、「Ｃｏｎ＋Ａｄ．ｖｅｃ上清」）、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の培養上清（白抜きの丸、「Ｃｏｎ＋Ａｄ．ｍｄａ−７上清」）、または未処理（白抜きの四角、「Ｃｏｎ」）のいずれかで処理した非感染ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞の数を示す。
【図１５Ａ】（Ａ）Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させたＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞の未処理のもの（白抜きの四角、「Ａｄ．ｍｄａ−７」）；空のアデノウイルスを感染させた肝細胞の可溶化液で処理したもの（白抜きの丸、「Ａｄ．ｍｄａ−７＋Ａｄ．ｖｅｃ可溶化液」）；Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の可溶化液で処理したもの（＋を重ね書きした四角、「Ａｄ．ｍｄａ−７＋Ａｄ．ｍｄａ−７可溶化液」）；またはＡＳ  Ｋ−ｒａｓホスオホロチオアートに結合したオリゴヌクレオチド（「ＰＳ  ＯＤＮ」）でトランスフェクションすることにより処理したもの（＋を重ね書きした菱形、「Ａｄ．ｍｄａ−７＋ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ」）の数を示す。
【図１５Ｂ】（Ｂ）Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させたＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞の未処理のもの（白抜きの四角、「Ａｄ．ｍｄａ−７」）；空のアデノウイルスを感染させた肝細胞の培養上清で処理したもの（白抜きの丸、「Ａｄ．ｍｄａ−７＋Ａｄ．ｖｅｃ上清」）、Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の培養上清で処理したもの（白抜きの三角、「Ａｄ．ｍｄａ−７＋Ａｄ．ｍｄａ−７上清」）；またはＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮでトランスフェクションすることにより処理したもの（白抜きの菱形「Ａｄ．ｍｄａ−７＋ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ」）の数を示す。
【図１６Ａ】（Ａ）ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮでトランスフェクションしたＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞の未処理のもの（白抜きの四角、「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ」）；空のアデノウイルスを感染させた肝細胞の可溶化液で処理したもの（白抜きの丸、「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ＋Ａｄ．ｖｅｃ可溶化液」）；Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の可溶化液で処理したもの（＋を重ね書きした四角、「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ＋Ａｄ．ｍｄａ−７可溶化液」）；またはＡｄ．ｍｄａ−７を感染させることにより処理したもの（＋を重ね書きした菱形、「Ａｄ．ｍｄａ−７＋ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ」）の数を示す。
【図１６Ｂ】（Ｂ）ＡＳ  Ｋ−ｒａｓＰＳ  ＯＤＮでトランスフェクションしたＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞の未処理のもの（白抜きの四角、「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ」）；空のアデノウイルスを感染させた肝細胞の培養上清で処理したもの（白抜きの丸、「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ−７＋Ａｄ．ｖｅｃ上清」）；Ａｄ．ｍｄａ−７を感染させた肝細胞の培養上清で処理したもの（白抜きの三角、「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ＋Ａｄ．ｍｄａ−７上清」）；またはＡｄ．ｍｄａ−７を感染させることにより処理したもの（白抜きの菱形、「ＡＳ  Ｋ−ｒａｓ＋Ａｄ．ｍｄａ−７」）の数を示す。
【図１７Ａ】（Ａ）ＡｓＰＣ−１膵臓癌細胞の増殖に対するＡｄ．ｍｄａ−７およびＡｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳの単独および併用での作用を示す。
【図１７Ｂ】（Ｂ）ＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞の増殖に対するＡｄ．ｍｄａ−７およびＡｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳの単独および併用での作用を示す。
【図１７Ｃ】（Ｃ）ＰＡＮＣ−１膵臓癌細胞の増殖に対するＡｄ．ｍｄａ−７およびＡｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳの単独および併用での作用を示す。
【図１７Ｄ】（Ｄ）ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞の増殖に対するＡｄ．ｍｄａ−７およびＡｄ．Ｋ−ｒａｓＡＳの単独および併用での作用を示す。
【図１８】膵臓癌細胞系にＡｄ．ｂｐｖを感染させた結果、ｍｄａ−７ｍＲＮＡが産生されたことを示す。
【図１９】Ｍｉａ  Ｐａｃａ−２細胞にＡｄ．ｂｐｖを感染させた結果、ＭＤＡ−７タンパク質が産生されたことを示す。
【図２０】膵臓癌細胞系にＡｄ．ｂｐｖを感染させた結果、（Ａ）ＡｓＰＣ−１、（Ｂ）ＢｘＰＣ−３、（Ｃ）ＰＡＮＣ−１、および（Ｄ）ＭＩＡ  ＰａＣａ−２の各膵臓癌細胞の増殖が抑制されたことを示す。データは、３回の独立した実験からの４連のサンプルの平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【配列表】
2005518340.tif 000002
2005518340.tif 000003
2005518340.tif 000004
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2005518340.tif 000009
2005518340.tif 000010
【図１】
2005518340.tif 000011
【図２Ａ】
2005518340.tif 000012
【図２Ｂ】
2005518340.tif 000013
【図２Ｃ】
2005518340.tif 000014
【図３Ａ】
2005518340.tif 000015
【図３Ｂ】
2005518340.tif 000016
【図３Ｃ】
2005518340.tif 000017
【図４】
2005518340.tif 000018
【図５】
2005518340.tif 000019
【図６】
2005518340.tif 000020
【図７】
2005518340.tif 000021
【図８】
2005518340.tif 000022
【図９】
2005518340.tif 000023
【図１０】
2005518340.tif 000024
【図１１】
2005518340.tif 000025
【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
2005518340.tif 000028
【図１４Ｂ】
2005518340.tif 000029
【図１５Ａ】
2005518340.tif 000030
【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
2005518340.tif 000032
【図１６Ｂ】
2005518340.tif 000033
【図１７Ａ】
2005518340.tif 000034
【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
2005518340.tif 000036
【図１７Ｄ】
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【図１８】
2005518340.tif 000038
【図１９】
2005518340.tif 000039
【図２０】
2005518340.tif 000040
【国際調査報告】
2005518340.tif 000041
2005518340.tif 000042
2005518340.tif 000043
2005518340.tif 000044