(57)【要約】本明細書は、プラスミド設計を最適化し、且つトランスフェクトされた標的細胞における目的のｃＤＮＡの転写を促進する、有効なプロモーター−エンハンサーを選択するための系統的方法を含む、亢進された遺伝子転写系を提供する。本発明は、発現遺伝子を十分且つ選択的に同定し、前記遺伝子のプロモーター−エンハンサーを含むプラスミドを作製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞にトランスフェクトするために用いられるプラスミドに含めるためのプロモーターを選択する方法であって、
標的細胞内の非常に豊富な転写産物を同定するステップと、
前記転写産物に関係しているプロモーターを同定するステップと、
発現される治療用遺伝子を有している遺伝子発現プラスミド構築物に前記プロモーターを挿入するステップと、
前記遺伝子発現プラスミド構築物を前記標的細胞にトランスフェクトするステップと、
前記標的細胞中の前記治療用遺伝子の遺伝子発現を確認するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記転写産物が特異的なｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記転写産物がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記転写産物の同定に遺伝子発現連続分析法を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍＲＮＡの同定にＳＡＧＥデータベースを用いる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記転写産物の同定にｃＤＮＡハイブリダイゼーションを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プロモーターと関係しているエンハンサーを同定するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子治療で使用する、プラスミドに含めるためのプロモーターを選択する方法であって、
病変組織における複数の転写産物について遺伝子発現レベルを決定するステップと、
前記病変組織及び該病変組織に関連している標的細胞において非常に豊富な転写産物を選択するステップと、
前記転写産物に関連しているプロモーターを同定するステップと、
発現される治療用遺伝子を有する遺伝子発現プラスミド構築物に前記プロモーターを挿入するステップと、
前記遺伝子発現プラスミド構築物を前記標的細胞にトランスフェクトするステップと、
前記標的細胞での前記治療用遺伝子の遺伝子発現を確認するステップと
を含む方法。
【請求項９】
前記病変組織にトランスフェクトするステップと、該病変組織における前記治療用遺伝子の遺伝子発現を確認するステップとを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記病変組織における前記転写産物について前記遺伝子発現レベルを同定するのにマイクロアレイ解析を用いる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記転写産物を選択するのにＳＡＧＥデータベースを用いる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記プロモーターに関連しているエンハンサーを同定するステップと、前記遺伝子発現プラスミド構築物に前記エンハンサーを挿入するステップとを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記病変組織が乳癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
標的組織にトランスフェクトするためのプラスミドを設計する方法であって、
複製開始点、多重クローニング部位、治療用遺伝子、ポリアデニル化シグナル配列、及び抗生物質耐性遺伝子を有する遺伝子発現プラスミドを選択するステップと、
標的組織に関連している細胞系において非常に豊富な転写産物を同定するステップと、
前記転写産物に関連しているプロモーターを同定するステップと、
前記治療用遺伝子に近い様々な位置で前記遺伝子発現プラスミドに前記プロモーターを挿入し、複数のプラスミド構築物を形成するステップと、
各プラスミド構築物を前記標的細胞系にトランスフェクトするステップと、
各プラスミド構築物でトランスフェクトされている前記標的細胞系における前記治療用遺伝子の遺伝子発現を測定するステップと、
前記トランスフェクトされた標的細胞系で効率的な遺伝子発現を提供する前記プラスミド構築物を選択するステップと、
前記選択したプラスミド構築物由来の前記治療用遺伝子の前記標的組織における遺伝子発現を確認するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記プロモーターに関連しているエンハンサーを同定するステップと、
前記遺伝子発現プラスミドに前記エンハンサーを挿入するステップと
を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療用遺伝子がｐ５３遺伝子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的組織が乳房組織である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子発現プラスミドが構成プロモーターを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記構成プロモーターがウイルスプロモーターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスプロモーターがサイトメガロウィルスプロモーターである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記転写産物を同定するのにＳＡＧＥデータベースを用いる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
複製遺伝子の起点、ポリアデニル化部位、抗生物質耐性遺伝子、多重クローニング部位、治療用遺伝子、及び請求項１に記載の方法により選択されたプロモーターを含む発現プラスミド。
【請求項２４】
前記抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子である、請求項２３に記載の発現プラスミド。
【請求項２５】
前記治療用遺伝子がｐ５３遺伝子である、請求項２３に記載の発現プラスミド。
【請求項２６】
前記プロモーターがグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素プロモーターである、請求項２３に記載の発現プラスミド。
【請求項２７】
エンハンサーを更に含む、請求項２３に記載の発現プラスミド。
【請求項２８】
前記エンハンサーが低酸素エンハンサーである、請求項２７に記載の発現プラスミド。
【請求項２９】
１種を超えるエンハンサーを更に含む、請求項２３に記載の発現プラスミド。
【請求項３０】
前記発現プラスミドが前記エンハンサーの１種を超えるコピーを含有する、請求項２７に記載の発現プラスミド。
【請求項３１】
ウイルス構成プロモーターを更に含む、請求項２３に記載の発現プラスミド。
【請求項３２】
ＣＭＶプロモーター−エンハンサーを更に含む、請求項２３に記載の発現プラスミド。
【請求項３３】
前記発現プラスミドが請求項１に記載の方法により選択された１種を超えるプロモーターを含有する、請求項２３に記載の発現プラスミド。
【請求項３４】
複製遺伝子の起点；ポリアデニル化部位；抗生物質耐性遺伝子；多重クローニング部位；治療用遺伝子；ＧＡＤＰＨプロモーター；及び低酸素エンハンサーを含む、乳癌の遺伝子治療用発現プラスミド。
【請求項３５】
ケラチン−８プロモーター−エンハンサーを更に含む、請求項３４に記載のプラスミド。
【請求項３６】
前記低酸素エンハンサーの複数のコピーを有する請求項３４に記載のプラスミド。
【請求項３７】
前記ＧＡＰＤＨプロモーター及び前記低酸素エンハンサーが前記治療用遺伝子の５’に位置している、請求項３４に記載のプラスミド。
【請求項３８】
前記ＧＡＰＤＨプロモーター及び前記低酸素エンハンサーが、前記治療用遺伝子に隣接している、請求項３７に記載のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府の資金提供を受けた研究又は開発に関する陳述）
本発明に至った研究の一部は、連邦政府により助成金Ｐ５０ＣＡ５８１８３を受けて国立衛生研究所のＢｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ＳＰＯＲＥにより支援されたものである。従って、米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、一般に、遺伝子治療の分野に関する。更に詳しくは、本発明は、組織特異的プロモーターを選択する方法を含む、亢進された転写系に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子治療について、種々の疾患を治療する手段として積極的研究が進められている。その基本的な考え方は、機能遺伝子を投与して、標的細胞に新たなタンパク質生産能力を付与することである。一遺伝子性又は単一遺伝子性(monogenetic or single-gene)のメンデル先天性疾患（例えば、嚢胞性繊維症）の治療において、この新たな機能遺伝子は、存在しているはずであったが、欠落又は欠損している遺伝子を置換する。別の状況では、その細胞中では機能するはずのない外来遺伝子を特定の疾患の細胞に導入し、その細胞を死滅させるために用いることができる。この技術は、心臓病及び癌をはじめとする後天性疾患に特に用いることができる。一遺伝子性の先天性疾患のほとんどはどちらかというと稀であることから、遺伝子治療は、後天性疾患においてその最も重要な公衆衛生上の効果を有していると考えられる。
【０００４】
すべての症例において、目的の達成は、追加した遺伝子がどの程度十分に治療用タンパク質を産生するよう機能しているかによって評価される。主要な問題は、適正な目的位置に遺伝子を送達すること、及び十分量の所望の治療用タンパク質を産生させる上で、有効な期間、遺伝子を作用させることにある。３つの重要な問題は、検討しなければならない重大な局面を迎えている。第１は、特異的な標的細胞への効果的な送達系の必要性である。第２は、ベクター力価、即ち標的細胞核で達成されるプラスミドＤＮＡのレベルである。第３は、治療用タンパク質を産生する効果的な遺伝子発現系である。
【０００５】
標的細胞への効果的なターゲティングは、標的細胞へトランスフェクトするベクターの力価に密接に関係している。最終的には、トランスフェクトされた細胞におけるベクター力価が十分であるように思われる場合であっても、プラスミドが標的細胞中で適当なレベルにて目的のｃＤＮＡを発現することができる場合のみ、有効な遺伝子治療を達成することができる。近年、標的化送達において著しい進歩が得られており、複数の研究者が、トランスフェクトされた細胞核内で高レベルのプラスミドＤＮＡが得られたことを報告している。しかし、ベクター力価が高いにもかかわらず、これらの細胞における遺伝子発現は低いままか、又は検出されなかった［Ｈａｎｄｕｍｒｏｎｇｋｕｌら］。
【０００６】
遺伝子発現の主要な調節（すなわち、異なる組織のＲＮＡ及びタンパク質濃度における差）は転写のレベルにおいてなされることが十分に証明されている。転写は、ＤＮＡの配列で構成されている遺伝子を酵素のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ）により解読するプロセスである。酵素ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩがＤＮＡを解読すると、異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）と呼ばれる別の分子がこの鋳型から直接的に作成される。ｈｎＲＮＡは核内のプロセスを受け、そこでその一部（イントロンと呼ばれる）がスプライシングされる。その結果、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が得られる。次いで、ｍＲＮＡは細胞核の外側の細胞質に移送され、そこで更に解読される。このｍＲＮＡの鋳型の解読によってタンパク質が作られる。
【０００７】
最終的にタンパク質を産生する特定の種類の遺伝子における転写の亢進は、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩによる転写の開始速度が高まることにより媒介されることが証明されている。ＲＮＡポリメラーゼ、転写因子及び補助タンパク質によるエンハンサー及びプロモーター認識は、制御ＤＮＡの第１次配列及び第２次配列(primary and secondary sequence)の特性が関与していると考えられる複合プロセスである。この転写の開始及び介在は、プロモーターとして知られている遺伝子の領域で起こり、更に、エンハンサーとして知られているＤＮＡ配列によって調節されることがある。
【０００８】
プロモーターは、核酸断片又は遺伝子の発現を調節するその核酸断片又は遺伝子内にあるヌクレオチド配列エレメントである。プロモーター配列は、効率的な転写に必要なＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子に認識される。種々の起源由来のプロモーターを真核細胞及び組織で効率的に用い、センス遺伝子構築物及びアンチセンス遺伝子構築物を発現させることができる。
【０００９】
エンハンサーは、プロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列エレメントである。エンハンサーは、遺伝子の転写を制御するタンパク質によって媒介されるシグナルに応答する。エンハンサーは、それが影響を及ぼすプロモーターに隣接して、或いは当該プロモーターの上流又は下流（その遺伝子配列の５’及び／又は３’末端）の遠位（ｂｐｓで１００番目〜１０００番目）に位置することがある制御ヌクレオチド配列である。また、エンハンサーは、イントロン内に位置することがある。エンハンサーは、ポジティブ又はネガティブなの制御効果を奏する。後者の場合、通常それらはサイレンサーと呼ばれている。エンハンサーは、多くの異なる位置で、いずれかの方向に機能し得る。またエンハンサーは、異種プロモーターに融合された場合に機能することができる。一般に、真核生物の遺伝子は、各々特有の制御機能を有する（例えば、特定の時間的パターン又は空間的パターンで転写を刺激する、或いはステロイドホルモンなどの特定の刺激に応答して転写を刺激する）複数のエンハンサーを持っている。エンハンサーは、典型的には、複数の転写因子に対するクラスタ化結合部位を構成する。
【００１０】
治療上の要求を満たす適当な転写レベルを提供するプロモーターを選択する一般的な手法は、遍在性のある構成的活性を有する強力なウイルスプロモーターを用いることであった。サイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶ）又はシミアンウィルス４０プロモーター−エンハンサー（ＳＶ４０）などのこれらのプロモーターは、臨床試験において用いられる好ましい発現調節エレメントであったが、これらのプロモーターは、組織非特異的性質と高度に制御されていない遺伝子発現が原因で悪影響を及ぼすことが分かった。更に、ＣＭＶ又はＳＶ４０の非特異的性質を許容したとしても、これらのプロモーターは、治療上の要求を満たすのに適当な転写レベルを誘導する点で効果が不十分であることが分かった。
【００１１】
ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０プロモーターにおける組織非特異性のない適当なプロモーターを見出す手法の１つは、マウス細胞でのステロイド制御遺伝子発現を提供するマウス乳腺腫瘍ウィルスプロモーター−エンハンサー（ＭＭＴＶ）などの制御プロモーターを研究することであった。残念ながら、これらのプロモーターについて、治療上要求される発現レベルを充足するのに必要な組織特異性又は頑強性は証明されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、当技術分野では、遺伝子治療における転写効率を亢進し得るプロモーター及びエンハンサーを選択する系統的方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、プラスミド設計を最適化し、且つトランスフェクトされた標的細胞における目的のｃＤＮＡの転写を促進する、亢進された遺伝子転写系及び効率的なプロモーター−エンハンサーを選択するための系統的方法を提供する。本発明は、十分且つ選択的に発現された遺伝子を同定し、これらの遺伝子の周知又は新規のプロモーター−エンハンサーを含むプラスミドを作製する。
【００１４】
本発明の一態様は、（ａ）標的細胞内の非常に豊富な転写産物を同定するステップと、（ｂ）前記転写産物に関係しているプロモーターを同定するステップと、（ｃ）発現される治療用遺伝子を有している遺伝子発現プラスミド構築物に前記プロモーターを挿入するステップと、（ｄ）遺伝子発現プラスミド構築物で標的細胞をトランスフェクトするステップと、（ｅ）標的細胞中の治療用遺伝子の遺伝子発現を確認するステップとを含む、標的細胞にトランスフェクトするために用いられるプラスミドに含めるためのプロモーターを選択する方法である。
【００１５】
本発明の別の態様は、（ａ）病変組織における複数の転写産物について遺伝子発現レベルを測定するステップと、（ｂ）病変組織及び当該病変組織に関連する標的細胞において非常に豊富な転写産物を選択するステップと、（ｃ）前記転写産物に関連するプロモーターを同定するステップと、（ｄ）発現される治療用遺伝子を有する遺伝子発現プラスミド構築物に前記プロモーター又はエンハンサーを挿入するステップと、（ｅ）前記遺伝子発現プラスミド構築物で標的細胞をトランスフェクトするステップと、（ｆ）標的細胞の治療用遺伝子の遺伝子発現を確認するステップとを含む、遺伝子治療で使用するプラスミドに含めるためのプロモーターを選択する方法である。
【００１６】
更に、本発明の別の態様は、（ａ）複製開始点、多重クローニング部位、治療用遺伝子、ポリアデニル化シグナル配列、及び抗生物質耐性遺伝子を有する遺伝子発現プラスミドを選択するステップと、（ｂ）標的組織に関連する細胞系における非常に豊富な転写産物を同定するステップと、（ｃ）前記転写産物に関連するプロモーター又はエンハンサーを同定するステップと、（ｄ）治療用遺伝子に近い様々な位置で遺伝子発現プラスミドにプロモーターを挿入し、複数のプラスミド構築物を形成するステップと、（ｅ）各プラスミド構築物で標的細胞系をトランスフェクトするステップと、（ｆ）各プラスミド構築物でトランスフェクトされている標的細胞系における治療用遺伝子の遺伝子発現を測定するステップと、（ｇ）トランスフェクトした標的細胞系で効率的な遺伝子発現を提供するプラスミド構築物を選択するステップと、（ｈ）選択したプラスミド構築物の標的組織における遺伝子発現を確認するステップとを含む、標的組織にトランスフェクトさせるためのプラスミドを設計する方法である。
【００１７】
更に、本発明の別の態様は、複製遺伝子の起点、ポリアデニル化部位、抗生物質耐性遺伝子、多重クローニング部位、治療用遺伝子、及び標的細胞の非常に豊富な転写産物に関連しているプロモーターを含む発現プラスミドである。
【００１８】
上記は、下記の本発明の詳細な説明をより一層理解できるようにするために、本発明の幾つかの態様をかなり大まかに概説したものである。本発明の特許請求の範囲の内容を形成する本発明のさらなる特徴及び利点は、下記に記載する。
【００１９】
記載されている概念及び特定の実施形態は、本発明と同一の目的を実施するためにその構造を改変又は再変更する基礎として容易に利用することができることは当業者には理解されよう。かかる同等の構築物は、添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の趣旨及び範囲から逸脱されるものではないことを当業者は理解されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
後天性疾患及び先天性疾患の遺伝子治療の実施にあたっては、この分野の多くの領域で改善が求められているが、何よりも特に、特定の標的細胞内で治療用遺伝子発現の調節を効率的且つ安定して行うことが求められている。高い形質導入効率及び力価は、治療用遺伝子を発現させる必要がある特定の細胞群へその目的の治療用遺伝子を導入するために基本的に必要とされる。多くの場合、遺伝子が効率良く適正な細胞に向けられ、トランスフェクトされた場合でさえ、導入遺伝子の発現の安定性を達成することは困難であり、且つ／又は導入遺伝子の発現は、治療効果を得るために適当なタンパク質産生物レベルに到達しない。
【００２１】
癌は、ゲノムレベルで起こる変化によって、それに対応する正常細胞対応物よりはるかに複雑な分子生物学的特性を有している。腫瘍の遺伝子は、正常細胞のそれら同様の遺伝子とは異なって制御されていると考えられており（Ｂａｒｇｏｕ，Ｒ．Ｃ．ら、１９９７、Ｂａｌｄｉｎｉ  Ｎ．、１９９７）、構成的プロモーターの調節下で単一発現カセットを使用することは一般に有用ではない。遺伝子治療では、治療タンパク質を導入することによって特定の癌細胞を死滅させなければならず、この基準を満たすためには、通常、遍在的で構成的な活性を有する強力なウイルスプロモーターが、臨床試験で用いられる好ましい発現調節エレメントであった。これらプロモーターは、その非組織特異的性質とその高度に制御されていない遺伝子発現が原因で、悪影響を及ぼすことが分かった。
【００２２】
治療用の導入遺伝子を適切に発現することが不可能であることの一因には、標的細胞によりプロモーターが認識されないか、又は活性化されないことが原因である可能性がある。ある患者で効果がないのは、特定の癌又は異常細胞におけるトランス転写活性因子（ＴＡＦ）のレベルの差が原因である可能性がある。ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ、転写活性因子及び補助タンパク質によるエンハンサー及びプロモーター認識は、調節ＤＮＡの第１次配列及び第２次配列の特性が関与していると考えられる複雑なプロセスである。細胞の転写調節領域内における転写活性因子結合部位の数、多様性、方向及び配置は、遺伝子発現を定義付けるパラメーターである。
【００２３】
本発明には、遺伝子治療用プロモーター−エンハンサーを選択するための新規の系統的手法が含まれる。この系統的手法は、特定の細胞及び組織において十分に転写されたタンパク質に関連性のあるプロモーター及びエンハンサーを同定する。
【００２４】
このプロモーター選択プロセスの第１ステップは、種々の細胞及び組織における遺伝子発現の定量的測定（例えば、遺伝子発現連続分析法（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、マイクロアレイデータ、又は発現プロファイリングを検出するのに用いられる他のデータベース）を利用して、特定の標的細胞に非常に豊富に存在するｍＲＮＡ又はタンパク質を同定する。これらのｍＲＮＡ又はタンパク質に関連性のあるプロモーター及びエンハンサーは、細胞及び組織の細胞性転写機構によって認識され、その結果、ｍＲＮＡが効率的に転写され、且つ／又はタンパク質に高度に翻訳される。
【００２５】
従って、特定の癌細胞をはじめとする、特定の組織及び細胞における遺伝子発現を最適化するプロモーター−エンハンサーキメラを選択する。プロモーター−エンハンサーは、標的細胞又は組織におけるｍＲＮＡ又は異種タンパク質の遺伝子発現を定量測定するデータに基づいて選択する。特定の細胞、組織又は腫瘍から得られる遺伝子発現連続分析法（ＳＡＧＥ）又はマイクロアレイデータにより、高度且つ特異的に発現されたタンパク質を同定する。かかるタンパク質に関連性のある候補プロモーターを選択する。腫瘍の治療においては、候補プロモーターは、これに限定されるものではないが、腫瘍転写作用が遺伝子発現を制限しないものを選択する。
【実施例１】
【００２６】
選択的に豊富に発現されたｍＲＮＡ又はタンパク質を検出する方法
Ａ．ＳＡＧＥ（遺伝子発現連続分析法）
ＳＡＧＥは、逆転写、オリゴヌクレオチドを得るための制限酵素エンドヌクレアーゼによる消化、連結、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる多重ステップの方法に基づくものである。簡単に説明すると、ＳＡＧＥは、逆転写によってポリアデニル化ｍＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へ変化させる。ｃＤＮＡを制限酵素により切断し、９〜１１塩基対のオリゴヌクレオチド「タグ（ｔａｇ）」を得る。次いで、これらのタグを互いに連結してコンカテマーを形成し、これをＰＣＲにより増幅し、次いでサブクローニングして配列決定する。存在しているタグ数は、特異的ｍＲＮＡの普及率を示している（すなわち、タグ数が多いほど、メッセージと遺伝子産物の普及率は大きくなる）。新規遺伝子については、研究者は、タグの配列を用いてゲノムのデータベースを調べ、遺伝子の同一性を決定する。
【００２７】
ＳＡＧＥ：遺伝子発現の測定
遺伝子発現連続分析法、すなわちＳＡＧＥは、遺伝子発現の定量測定を得るために考案された技術である。ＳＡＧＥ技術は、それ自体に、分子生物学的なＤＮＡ塩基配列決定とバイオインフォマティクス技術を利用する幾つかのステップを含んでいる。これらのステップを用いて９〜１１塩基からなる「タグ」を得、次いで、タグに遺伝子表示を割り当てる。実験上の理由により、これらのタグは、ｃＤＮＡ配列の３’−最上（ｍｏｓｔ）ＮｌａＩＩＩ制限部位の３’末端に直接隣接している。
【００２８】
オンラインデータ分析
国立がん研究所（ＮＣＩ）、国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＳＡＧＥライブラリーの情報、及びこれらのライブラリーから得られたデータへのアクセスは、ｘＰｒｏｆｉｌｅｒ及びＶｉｒｔｕａｌ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎによる幾つかのオンラインツールを用いて調査し分析することができる。
【００２９】
遺伝子マッピングに対するタグ
ＳＡＧＥ開発を支援するために、遺伝子マップに対する包括的なヒトＳＡＧＥタグが作製されている。この方法は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＵｎｉＧｅｎｅプロジェクトが大いに関わっている。ＵｎｉＧｅｎｅは、類似のＧｅｎＢａｎｋ  ＤＮＡ配列をクラスタへグループ化するプロジェクトであり、各クラスタは、特有の数値又は識別子により認定されている。これらの特有の識別子は、特定の種を識別する２個の文字が接頭に付けられている（「Ｈｓ」はヒトを表し、「Ｍｍ」はハツカネズミを表し、「Ｒｎ」はドブネズミを表す）。ＵｎｉＧｅｎｅは、理想的には、類似するＧｅｎＢａｎｋ配列の潜在的に大きなプールに対して１つの識別子及び記載を提供し、従って、１種又は複数のＵｎｉＧｅｎｅクラスタに１つのタグを「マッピング」し、また逆に、特定のＵｎｉＧｅｎｅクラスタからマッピングされているタグを同定するためのメカニズムを提供するので、ＵｎｉＧｅｎｅはＳＡＧＥに有用である。Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、すなわちＣＧＡＰは、癌細胞の分子フィンガープリントを示すために開始された、ＮＣＩ主導の委託プロジェクトである。ＳＡＧＥライブラリー及び配列の作製をはじめとする、様々な化学的、分子生物学的、シーケンシング及びバイオインフォマティクス技術は、この試みにおいて利用されている（Ｌａｓｈ，Ａ．Ｅ．ら、２０００；及びＬａｌ，Ａ．ら、１９９９）。
【００３０】
遺伝子発現連続分析法
遺伝子発現連続分析法、すなわちＳＡＧＥは、ハイスループットシーケンシング技術を利用して、細胞の遺伝子発現の定量的プロファイルを得ることを目的とした技術である。本質的には、ＳＡＧＥ技術は遺伝子の発現レベルを測定するのではなく、遺伝子の転写産物を示す「タグ」を定量する。ＳＡＧＥのためのタグは、定めた長さのヌクレオチド配列、直接的には、特定の制限酵素に対する３’−隣接制限部位から３’−最上制限部位である。当初の記載では（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，ＶＥら、１９９５）、タグの長さは９塩基であり、制限酵素はＮｌａＩＩＩであった。今日のＳＡＧＥプロトコルは１０〜１４塩基タグを作製する（Ｚｈａｎｇ  Ｌら、１９９７）。また、ＮｌａＩＩＩは今なお最も広く用いられている制限酵素であるが、酵素の置換は可能である。ＳＡＧＥ技術のデータ産物は対応する数値を有するタグのリストであり、従って、細胞の遺伝子発現のデジタル表現である。
【００３１】
ＳＡＧＥマップ分析ツール
ＳＡＧＥライブラリーデータをプールし比較するための分析ツールである、ＳＡＧＥｍａｐ  ｘＰｒｏｆｉｌｅｒは、異なる種類の分析用に考案されている。類似するライブラリーは、それらの特性（例えば、正常結腸又は結腸癌）に基づいて２群のうちの１群に入れることができる。次いで、比較は、ＮＣＢＩのＳｔｅｐｈｅｎ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによってＳＡＧＥデータに対して特別に開発された統計的試験を用いて２群の間で行われる。所望ならば、２つの任意のフィルター関数を使用することができる。第１のフィルターは、一般に使用されている統計分散度、変動係数（１００＊ｓ／Ｍ；ｓ＝ｓｔｄ偏差、Ｍ＝平均）に基づいており、１つの群内の値の間で機能する（０％、デフォルト、不活性化）。第２のフィルターはタグマッチに基づくものである。タグのリストを入力することができ、それらのタグに関する結果のみが戻ってくる。
【００３２】
ｖｉｒｔｕａｌ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｔｏｏｌ、すなわちｖＮｏｒｔｈｅｒｎは、入力の際に配列をアクセプトするように考案されている。次いで、候補タグがこの配列から抽出され、ＳＡＧＥｍａｐウェブサイト上に現在提示されている様々なＳＡＧＥライブラリーのデータにアクセスするためにリンクが提供される。
【００３３】
ＵｎｉＧｅｎｅマッピングのためのＳＡＧＥタグ
遺伝子マッピングのためのＳＡＧＥタグの構築は、多重ステップの自動化された方法である。この方法のステップは、
（ａ）ＧｅｎＢａｎｋサブミッションレコードから個々のヒト配列を分離するステップと、
（ｂ）ポリアデニル化シグナル（ＡＴＴＡＡＡ又はＡＡＴＡＡＡ）、ポリアデニル化尾部、及び配列標識の特定の組み合わせを介して配列オリエンテェーションを割り当てることにより、各配列にＳＡＧＥタグを割り当て、次いで、ＮＣＢＩのＵｎｉＧｅｎｅプロジェクトの情報を用いて、１０塩基タグの３’−隣接ＮＩａＩＩＩ部位から３’−最上ＮＩａＩＩＩ部位（ＣＡＴＧ）を抽出するステップと、
（ｃ）ＳＡＧＥタグを用いて個々のヒト配列にＵｎｉＧｅｎｅ識別子を割り当てるステップと、
を含む。
【００３４】
この方法の結果は、結合で付加されたフォワード配列及びリバース配列の度数重量（ｗ）を保持している、ＵｎｉＧｅｎｅ識別子マッピングのためのＳＡＧＥタグである。
【００３５】
得られたマッピング
２つの、タグによる遺伝子マッピング（ｔａｇ  ｔｏ  ｇｅｎｅ  ｍａｐｐｉｎｇ）が、この方法全体から得られる。１つは「完全な」地図であり、もう１つは「信頼性の高い」マッピングである。これらは共に、ダウンロード可能なファイル（非常に大容量）としてＳＡＧＥｍａｐのＦＴＰサイト上に提供されており、またサーチ可能なインターフェースを介してこのサイト上のＳＡＧＥライブラリーデータと統合される。少数のタグをサーチしたい場合、そのサーチ可能なインターフェースをタグページから遺伝子ページ上で及び遺伝子ページからタグページ上で用いることができる。また、この信頼性の高いマッピングは、様々なＳＡＧＥライブラリーのＳＡＧＥタグ作表データのディスプレイでも用いられる。
【００３６】
Ｂ．マイクロアレイ分析
ｃＤＮＡ比較ハイブリダイゼーションの目的は、２種以上の異なる細胞の遺伝子転写を比較することである。２種類の異なる組織（すなわち、心筋及び前立腺上皮）由来の細胞は、生物体内で異なる機能を果たすように分化される。細胞はそれらの表現型により異なる組織から認識され得るが、それは、１つの細胞が、平滑筋として、またニューロンとして、更にまた前立腺として機能する遺伝子発現の制御である。最終的に、細胞の役割は、細胞が産生するタンパク質により決定され、それは更にはその発現遺伝子に依存する。比較ハイブリダイゼーション実験を行うと、特定の組織で優先的に発現される遺伝子を明らかにすることができる。これらの遺伝子の一部は細胞の組織の種類を特徴づける挙動を示すが、他の制御遺伝子は、細胞がその種類にとっての機能を果たすことのみ実現させる。
【００３７】
Ｃ．発現変化を測定することの有用性
先天性疾患は、過剰であるかごくわずかであるかの不適当に転写されている遺伝子、或いは完全に欠損している遺伝子によって発生することが多い。かかる異常は特に癌では一般的であり、それは、制御遺伝子が欠失しているか、不活性化されているか、又は構成的に活性になる場合に生じ得る。単一の不完全遺伝子が常に原因である一部の先天性疾患（例えば、嚢胞性繊維症）とは異なり、臨床的に同じように見える癌は遺伝学的には異種であり得る。例えば、前立腺癌（前立腺の腺癌）は、一人の患者でも幾つかの異なる非依存的制御遺伝子により発生し得る。一群の前立腺癌患者では、全員が、異なる一連の欠損遺伝子又は損傷遺伝子を有している可能性があり、疾患の予後及び治療に対する影響が相違する。
【００３８】
特定の環境下の特定の組織における遺伝子発現を定量的に測定することは、疾患研究の２つの目的に役立ち得る。それは、正常細胞から疾患細胞への変化に関与する転写の違いを正確に示すことができることと、癌などの不均一な疾患における異常転写の異なるパターンを識別することができることである。癌は遺伝学的な不均一な疾患の一般的な例であるが、それらは決して１種類のみではない。糖尿病、心臓病及び多発性硬化症の患者は、遺伝的危険因子が不均一であることが知られている疾患を有している。
【００３９】
また、対象となる発現変化には、ホルモン、インターロイキン及びインターフェロンなどのシグナル分子の導入、並びに細胞モデル系又は培養物中の患者のバイオプシー組織への薬剤の作用が関与している。これらの分子はすべて、細胞の挙動における変化（場合によってはその死が含まれる）を刺激する。それらの変化の一部は単にタンパク質レベルでもたらされ得るが、他の変化は、細胞内の遺伝子発現の定量測定によって検出可能な新しい転写を必要とする。
【００４０】
癌増殖中、細胞ではＤＮＡ複製、有糸分裂が起こり、最後には死に至る。これらの活性には、ゲノム複製のためのＤＮＡポリメラーゼ又は有糸分裂のための微小管スピンドルタンパク質などの全く異なる遺伝子産物が必要である。細胞の遺伝子は、これらの活性に関する「プログラム」をコードしており、これらのプログラムを実行するには遺伝子転写が必要である。細胞周期の異なる時期に遺伝子発現を定量的に測定することにより、細胞増殖の調節に関与する経路の同定が容易になり得る。
【００４１】
従って、健康状態及び疾患状態の特定の組織における遺伝子発現の定量的測定を用いて、それらの組織で行われ得る細胞の転写機構、及び特定の疾患状態で起こるこれらの機構における変化を推定することができる。本発明によれば、これにより、これらの組織の遺伝子治療で使用するプロモーター−エンハンサーキメラを選択することができる。
【実施例２】
【００４２】
選択的に豊富に発現されたタンパク質の決定
ＳＡＧＥデータベース及び関連のツールはオンラインで利用可能であり、すべての周知の発現遺伝子又は未知の発現遺伝子に関するｍＲＮＡの量を見つけ出す優れた手段を提供する（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｖ．Ｅ．ら、１９９５）。特定の細胞系又は組織に対する有効なプロモーター−エンハンサーを同定するには、他の組織（例えば、脳、結腸、内皮及び前立腺）のライブラリーに対して、指定した組織（乳房）ライブラリー及び細胞ライブラリーで高度に発現された遺伝子をＳＡＧＥデータベースで探索した。ＳＡＧＥマップｘＰｒｏｆｉｌｅｒは、正常細胞に対する癌細胞中の遺伝子の転写を検出するのに用いられる。ＳＡＧＥマップｘＰｒｏｆｉｌｅｒは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥ／ｓａｇｅｘｐｓｅｔｕｐ．ｃｇｉにある。表１には、この分析によって同定された非常に豊富に且つ選択的に発現された幾つかの転写情報を挙げている。
【００４３】
異なる組織及び細胞の種類にわたる配列データを得るためにＳＡＧＥ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析を用いた［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥ／ｓａｇｅｖｎ．ｃｇｉを参照されたい］。タグマッピングのためのＳＡＧＥ遺伝子により、全データベース中の特定の遺伝子の発現レベルを求める方法が得られた［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＡＧＥ／ＳＡＧＥｃｉｄ．ｃｇｉを参照されたい］。
【００４４】
分析されたＮＣＩ  ＳＡＧＥデータベース、ＮＩＨ  ＳＡＧＥデータベースには、乳癌細胞系（例えば、ＭＣＦ７、ＨＭＥＣ−Ｂ４１、ＭＤＡ−４５３、ＳＫ−ＢＲ−３及びＤＣＩＳ２精製細胞）、顕微解剖されたヒト癌（例えば、ＤＣＩＳ悪性乳房組織）、並びに正常組織（例えば、乳房上皮細胞及びルミナール（ｌｕｍｉｎａｒ）上皮細胞）が含まれていた。組織ＳＡＧＥライブラリーと細胞ＳＡＧＥライブラリーの両方をスクリーニングし、研究対象の異種移植片モデルで用いられている腫瘍細胞系と真のヒト乳癌で用いられている腫瘍細胞系の両方で高度に発現されているｍＲＮＡレベルを決定した。従って、この分析により、プロモーターが動物研究と乳癌の臨床試験における治療用途の双方で有用となり得る遺伝子が同定された。
【００４５】
表１に、様々な細胞系及び組織におけるデオキシチミジル酸キナーゼ、Ｎ−Ｒａｓ関連タンパク質、ケラチン−８、リボソームＬ３０、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、及びインターフェロンα（ＩＦＮａ）誘導性タンパク質遺伝子発現に関するＳＡＧＥデータを示す。
【表１】
2005522225.tif 000002
【００４６】
Ｎ−Ｒａｓ関連タンパク質遺伝子及びＩＦＮａ誘導性タンパク質遺伝子は、乳房組織（正常な胸組織及び乳癌組織の両方）並びにある種の乳癌細胞系において非効率的に転写されていた。従って、これらのタンパク質に関するプロモーターは乳癌の遺伝子治療での使用にあたって検討からはずした。一方、デオキシチミジル酸キナーゼ、ケラチン−８、リボソームＬ３０、及びグリセルアルデヒド３−リン酸塩脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に関するプロモーターは、正常な乳房細胞だけでなく乳癌細胞において導入遺伝子の効率的な発現をする候補プロモーターと考えられた。ＧＡＰＤＨ遺伝子転写は、乳癌細胞（特にＭＣＦ７細胞）では非常に過剰であり、正常乳房上皮では発現が不十分であった（表１を参照されたい）。
【００４７】
ＳＡＧＥデータにより、ヒトグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子プロモーターが正常な乳房組織ではなく幾つかの乳癌細胞のＴＡＦによって広く認識されているプロモーター−エンハンサーであることが示唆された。ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーター配列は同定されており（Ａｋｉ，Ｔ．ら、１９９７）、且つ市販されている（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）。腫瘍で共通のことである、低酸素症の時にはＧＡＰＤＨタンパク質はアップレギュレートされる（Ｅｓｃｏｕｂｅｔ，Ｂら、１９９９及びＧｒａｖｅｎ，ＫＫら、１９９４）。従って、ＨＩＦ−１  ＤＮＡ結合部位（Ｇｒａｖｅｎ  ＫＫら、１９９９）は、低酸素症応答時に非常に大きな機能を果たし得る。
【００４８】
また、ＳＡＧＥデータは、ケラチン−８プロモーターが正常な乳房ではなく乳癌内の導入遺伝子の効率的な発現に有用であることを示唆している。別の２種のケラチン由来のプロモーターである１４及び１９は、マウスの他の組織に対する導入遺伝子発現を目的として広く用いられてきている（Ｄｅｌ  Ｒｉｏ，Ｍら、１９９９、Ｓｉｎｈａ，Ｓ、２０００、Ｓｉｎｈａ，Ｓ、２００１、Ｂｒｅｍｂｅｃｋ，ＦＨ、２００１、及びＷａｉｋｅｌ，ＲＬら、２００１）。従って本発明によれば、ｘＰｒｏｆｉｌｅｒによって同定されたケラチン−８プロモーターは、周知のウイルスのプロモーターを含む、又は含まない、組織特異的及び／又は疾患特異的プラスミドに対する優れた候補である。
【実施例３】
【００４９】
プラスミドの構築
治療上のリポーター遺伝子発現は非ウイルス系プラスミドＤＮＡの送達後、ある種の細胞系内で試験した。ＨＣＣ  １４２７、ｐ５３  ｎｕｌｌ乳癌細胞系のｐ５３の転写におけるｐＶＡＸＩ及び４１１９のベクター成分の有効性を試験するために、３個のｐ５３含有プラスミドを構築した。更に、９個の異なるプラスミドをリポーター遺伝子を用いて構築し、それらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける転写能力の試験に用いた。
【００５０】
細胞内の濃度を測定するのが簡単で、またその遺伝子が真核生物のものではないことから、リポーター遺伝子としてはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼタンパク質が広く用いられている。従って、哺乳動物細胞でのその発現は挿入ベクター由来のものだけである。これは、アセチル化によりストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）由来の抗生物質クロラムフェニコールを不活性化する酵素である。
【００５１】
これらの実験では、成功と失敗の両方をもたらすにもかかわらず、幾つかの癌の臨床試験で用いられてきていることから、ｐ５３遺伝子を用いた。これは、細胞周期停止に関与する種々の遺伝子を活性化し、且つ遺伝子発現／機能を抑制し得る転写活性因子である。遺伝子活性化及び／又は抑制の結果は増殖停止及び／又はアポトーシスである。しかし、ｐ５３に突然変異が生じた場合、癌細胞に増殖停止及びアポトーシスシグナルを回避させ得る機能的欠陥が生じる。
【００５２】
ヒトの癌におけるｐ５３突然変異の大部分は、優性−陰性であると考えられる。このことは、野生型ｐ５３機能を喪失した突然変異対立遺伝子産物もまた転写調節、増殖停止及びアポトーシスに関する野生型対立遺伝子産物の機能に悪影響を及ぼすことを意味する。また、これらの差異は、特定のシグナル伝達経路を広めるために相乗作用でＴＡＦを必要とするアポトーシス誘発剤の効果も無効にする。この機能を欠損する細胞に野生型ｐ５３遺伝子を挿入すると、野生型ｐ５３の機能は回復可能である。しかし、ｐ５３はその転写活性に関して四量体として機能する。そのため、十分量の機能タンパク質を保証するためにハイレベルで発現することが重要である。細胞が同一細胞で突然変異体ｐ５３と野生型のペプチドヘテロダイマラーゼ（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒａｓｅ）を発現する場合、突然変異体ペプチドは、トランスフェクト遺伝子により発現された野生型ペプチドの機能を排除し得る。野生型機能の修復が阻止される、優性−陰性突然変異体のこの問題は、今後の遺伝子治療において重大な影響を有している。従って、癌細胞において最大のｐ５３発現を得ることが重要である。
【００５３】
個々の腫瘍の中の遺伝子発現のレベルに大きな差異が認められており、それらの特定のプロモーター−エンハンサー構築物を認識した癌細胞内の転写活性因子（ＴＡＦ）間の差異は、遺伝子発現におけるレベルの差異に関与していたことを示唆している。患者内の、又は患者間の腫瘍が不均一であることから、この不均一により臨床試験で観察された遺伝子発現の差を説明することができる。下に説明している実験で示した遺伝子発現の変動は、蛍光標識したプラスミドＤＮＡを用いたトランスフェクション試験で核中のＤＮＡのレベルに差異が示されなかったことから（データは示さず）、高発現細胞及び低発現細胞の核へのプラスミドＤＮＡの送達における違いにより説明されるものではない。
【００５４】
幾つかの異なるキメラプロモーターは、図１に示すＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから購入したｐＶＡＸ１プラスミド、及び図２に示すカリフォルニア州サンフランシスコ所在のＣａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＲｏｂｅｒｔ  Ｄｅｂｓ博士の好意により提供されたｐ４１１９プラスミドを用いて構築した。ヒトＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーは、カリフォルニア州サンディエゴのＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入したｐＤＲＩＶＥ−ｈＧＡＰＤＨプラスミドから得た。
【００５５】
ｐＶＡＸ１は、それらのキメラプロモーターを形成するために用いられるバックボーンベクターである。ｐＶＡＸ１は、カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ｐＶＡＸ１は、非常に簡素化され、合理化されたベクターとなるように遺伝子操作されている。ｐＶＡＸ１は、ベクターサイズは制限するが、長い複製起点（ｐＭＢ１）と同様の活性を有するように構築された、最小限の大腸菌複製起点を含有している。また、このｐＶＡＸ１ベクターは、「半最適の」サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター−エンハンサー、Ｔ７プロモーター／プライミング部位、多重クローニング部位（６９６塩基〜８１１塩基）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（ＢＧＨ  ｐＡ）、及びカナマイシン抗生物質耐性遺伝子を含有している。このベクター内のＣＭＶプロモーター−エンハンサーは、カナマイシン耐性遺伝子の発現を起動する。前記遺伝子はそのタンパク質を発現している細胞の検出に用いられている。
【００５６】
図２に示すように、ｐ４１１９ベクターは、完全な「最適の」ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、イントロン、ＣＡＴリポーター遺伝子、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、遺伝子の最適翻訳のための翻訳配列、シミアンウィルス４０ポリアデニル化シグナル配列（ＳＶ４０  ｐｏｌｙ  Ａ）、細菌の複製起点部位（ｏｒｉ）、及びアンピシリン耐性遺伝子配列（ＡＭＰｒ）を含有している。
【００５７】
ｐ５３発現プラスミドは、以下のように構築した：ｐ５３−１は４１１９ベクターに類似しているが、ＣＡＴ遺伝子の代わりにｐ５３遺伝子を含有している；ｐ５３−２プラスミドはｐＶＡＸ１ベースであるが、３’ＵＴＲ及びｐ４１１９ベクターの翻訳配列を含有している；ｐ５３−３プラスミドは、ｐＭＢ１  ｏｒｉ、ｐＶＡＸ１のカナマイシン遺伝子、ＣＭＶプロモーター−エンハンサー、イントロン、３’ＵＴＲ、ｐ４１１９ベクター由来の翻訳配列及びＳＶ４０  Ｐｏｌｙ  Ａ遺伝子を含有している。
【００５８】
ＨＣＣ  １４２８細胞は、ｐ５３発現プラスミド（すなわち、ｐ５３−１、ｐ５３−２及びｐ５３−３）の非ウイルス系送達後に試験した。ｐ５３の存在はウエスタンブロット定量分析により評価した。これらの結果により、ｐ５３−３のみが、乳癌細胞において優位なレベルのｐ５３遺伝子発現を起こすことが明らかとなった。しかし、トランスフェクトしたＨ１２９９肺癌細胞における同様の実験によれば、多くのｐ５３が肺癌細胞で産生されていることが明らかとなった。ｐ５３発現プラスミドのＣＭＶプロモーター−エンハンサーによるこれらの細胞の非効率的且つ非特異的な転写は、下に記載されているようなＣＡＴリポーター遺伝子を含有するプラスミドの試験につながった。
【００５９】
ＳＡＧＥスクリーニング分析で同定されたＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーは、カリフォルニア州サンディエゴのＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入し、プラスミド構築物に用いた。ＧＡＰＤＨ遺伝子は解糖の重要な制御酵素をコードしており、一般には構成的ハウスキーピング遺伝子と考えられてきた。しかし、ＳＡＧＥデータベースによると、正常細胞に対する乳癌におけるＧＡＰＤＨ転写のレベルが異なることが明らかである（表１）。ＳＡＧＥスクリーニング分析によって示唆された低酸素エンハンサーの包含は、腫瘍内の遺伝子発現を増加させる低酸素症応答エレメントの使用と一致している（Ｃａｏ，Ｙ．Ｊ．ら、２００１；Ｒｕａｎ，Ｈ．ら、２００１；Ｉｄｏ，Ａ．ら、２００１；Ｄａｃｈｓ，Ｇ．Ｕ．ら、２０００；Ｍｏｄｌｉｃｈ，Ｕ．ら、２０００；Ｓｈｉｂａｔａ，Ｔ．ら、２０００）。
【００６０】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドは、以下のようにして構築した。
【００６１】
ｐＣＡＴ−ｐ４１１９。このプラスミドは、ＣＡＴ遺伝子（Ｚｈｕ，Ｎら、１９９３）を含有している４１１９ベクターに相当する。
【００６２】
ｐＣＡＴ−１。このプラスミドは延長因子１アルファ（ＥＦ−１α）プロモーター−エンハンサー、ＣＡＴ遺伝子、及びｐＥＦＩＲＥＳバックボーンを有している。ｐＥＦＩＲＥＳプラスミドは、テキサス州ヒューストンのＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＭｉｎｇ  Ｚｈａｎｇから取得した。ＥＦ−１αは、真核細胞で最も過剰なトランス転写活性化タンパク質の一種で、ほとんどすべての哺乳動物細胞で発現されている。
【００６３】
ｐＣＡＴ−２（図４に示す）。ｐＣＡＴ−２ベクターはｐＶＡＸ１ベースである。しかし、図３及び図４に示すように、このｐ４１１９ベクターは、ｐＣＡＴ−２にＣＡＴ遺伝子、３’ＵＴＲ及び翻訳配列を付加するために用いた。これらの配列をｐ４１１９ベクターから削除し、ｐＶＡＸ１ベクターの多重クローニング部位へアニールした。従って、ｐＣＡＴ−２ベクターは、ｐＶＡＸ１ベクター由来の半最適のＣＭＶプロモーター−エンハンサーと最小限量の細菌配列を含有している。
【００６４】
ｐＣＡＴ−３（図５に示す）。ｐＣＡＴ−３にｐＭＢ１  ｏｒｉ及びカナマイシン遺伝子を付加するためにｐＶＡＸ１ベクターを用いた。ｐ４１１９ベクターからＣＭＶプロモーター−エンハンサー、イントロン、ｏｒｉ及びＡＭＰｒ遺伝子を除去し、残りの配列をｐＶＡＸ１のｐＭＢ１ｏｒｉとカナマイシン遺伝子の間に挿入した。ＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーと呼ばれるＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーは、ｐＣＡＴ−３ベクターのＣＡＴ遺伝子の上流に挿入した。ＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーは、ｐＣＡＴ−３の唯一のプロモーター−エンハンサーであった。
【００６５】
ｐＣＡＴ−４（図７に示す）。ｐＣＡＴ−４にｐＭＢ１  ｏｒｉ及びカナマイシン遺伝子を付加するためにｐＶＡＸ１ベクターを用いた。図６に示したとおり、ｐ４１１９ベクターからｏｒｉ遺伝子及びＡＭＰｒ遺伝子を除去し、残りの配列をｐＶＡＸ１のｐＭＢ１ｏｒｉとカナマイシン遺伝子の間に挿入した。ｐＣＡＴ−４ベクターは、ｐ４１１９ベクター由来の最適のＣＭＶプロモーター−エンハンサーと、ｐＶＡＸ１由来の最小限量の細菌配列を含有している。また、ｐＣＡＴ−４ベクターは、イントロンとｐＣＡＴ−２ベクター及びｐ５３−２ベクターより多くのｐ４１１９ベクター由来の細菌配列を含有している。必要以上の細菌配列は真核細胞に対する毒性を有し、半最適なものと考えられる。
【００６６】
ｐＣＡＴ−５（図８に示す）。ｐＣＡＴ−５は、ＣＭＶエンハンサープロモーターの上流にＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーを挿入することを除いては、ｐＣＡＴ−４と同様に作製した。
【００６７】
また、ＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー及び他のＧＡＰＤＨ制御エレメントの最適位置を決定し、過剰の細菌配列を除去するためにさらなるプラスミド遺伝子操作を行った。
【００６８】
ｐＣＡＴ−６（図９に示す）。ｐＣＡＴ−６は、ＣＭＶエンハンサープロモーター及びＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーの順序を逆にすることによりｐＣＡＴ−５を改変して作製した（図８と図９を比較されたい）。
【００６９】
ｐＣＡＴ−７（図１０に示す）。ｐＣＡＴ−７は、ＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーの後にではなく、ＣＭＶエンハンサープロモーターとＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーの間にｐ４１１９イントロンを配置するという点を除いて、ｐＣＡＴ−６と同じである（図９と図１０を比較されたい）。
【００７０】
ｐＣＡＴ−８（図１２に示す）。ｐＣＡＴ−８は、イントロンを除去してｐＣＡＴ−７を改変することにより作製した（図１０と図１２を比較されたい）。
【００７１】
ｐＣＡＴ−９（図１３に示す）。ｐＣＡＴ−９は、ＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー配列を逆方向に配置したという点を除いて、ｐＣＡＴ−８と全く同様にして構築する。
【００７２】
プラスミド調製
ｐＥＦＩＲＥＳプラスミドはＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＭｉｎｇ  Ｚｈａｎｇから取得し、ｐ４１１９プラスミドはＲｏｂｅｒｔ  Ｄｅｂｓから取得した。ｐＶＡＸ１プラスミドは、カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ヒトＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーは、カリフォルニア州サンディエゴのＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入したｐＤＲＩＶＥ−ｈＧＡＰＤＨプラスミドから得た。プラスミド設計及び構築は上に記載している。アンピシリン選択下で増殖させたｐＥＦＩＲＥＳ−ベースのプラスミドｐＣＡＴ−１を除いて、すべてのプラスミドはカナマイシン選択下、ＤＨ５α大腸菌中で増殖させた。すべてのプラスミドは、ドイツ国ＱｉａｇｅｎのＱｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。すべてのプラスミドペレットは、１０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）に再懸濁し、−２０℃にて保存した。
【実施例４】
【００７３】
ＭＣＦ７細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションによる新規プラスミドの比較
すでに開発され報告されているプロトコル（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．ら、１９９７）によって調製した押出しＤＯＴＡＰリポソームでトランスフェクションするために、ｐＣＡＴ−１からｐＣＡＴ−９と称する９種類のプラスミドを用いた。これらのリポソームはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて種々の細胞をトランスフェクトする（Ｙｏｔｎｄａ，Ｐ．ら、２００２；Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、未公表データ）。
【００７４】
Ａ．方法
ＭＣＦ７細胞系はＣ．Ｋｅｎｔ  Ｏｓｂｏｒｎｅ（テキサス州ヒューストンのＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得た。細胞は、１０％ウシ胎仔血清及び１０〜１２μＭのインシュリン（メリーランド州ゲイサーズバーグのＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で培養した。細胞系は、７０％の集密度まで６ウェル組織培養クラスタ中で培養した。
【００７５】
ＤＮＡリポソーム複合体はすでに記載されているようにして（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．ら、１９９７）調製した。しかし、合成コレステロール（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州アラバスター）から購入したコレステロールの代わりに用い、ＤＯＴＡＰ：コレステロールを５０：４５で用いた。用いたリポソームは二層状の重積小胞である。
【００７６】
細胞は、１ウェル当たり５μｇを用い、押出しＤＯＴＡＰ  ＤＮＡ：リポソーム複合体でトランスフェクトした。トランスフェクションは３時間無血清培地で実施した。６つの独立したｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションを報告されている各データポイントについて行った。
【００７７】
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、Ｒｏｃｈｅ（インディアナ州インディアナポリス）のＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキットを用いて実施した。各細胞系についての３つの対照ウェルは、ＣＡＴ産生の任意のバックグラウンド輝度を検出するためにリポソーム単独でトランスフェクトした。すべてのＣＡＴタンパク質定量は、対照細胞で検出された任意のＣＡＴ免疫反応性に対して調整した。タンパク質定量は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡキット（イリノイ州ロックフォード所在のＰｉｅｒｃｅ）を用いて行った。データは、平均Ｓ．Ｄ．として報告されている。両サイドスチューデントｔ検定を用いて、報告されているｐ−値を検出した。
【００７８】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションにおける比較
伸長因子−１α（ＥＦ−１α）のみを含有しているｐＥＦＩＲＥＳプラスミドを用いて、ＣＡＴ遺伝子を発現するプロモーター−エンハンサーのｐＣＡＴ−１を構築した。これまでの研究では、ｐＥＦＩＲＥＳ−ｍａｓｐｉｎ  ｃＤＮＡ構築物は押出しＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソーム中に封入されており、静脈注射又は直接的腫瘍注射の後、同質遺伝子的乳癌転移モデルにおける有効性が証明されている（Ｓｈｉ，Ｈ．Ｙ．ら、２００２）。乳腺腫瘍は、ＭＭＴＶポリオーマウイルスミドルＴトランスジェニックマウスから単離されたＰｙＶ  ＭＴ親腫瘍細胞系を用いて証明された。しかし、図１４に示すように、ｐＣＡＴ−１は、ＭＣＦ７細胞のトランスフェクション後、検出可能なレベルのＣＡＴ産生物を生じなかった。
【００７９】
ｐＶＡＸ１プラスミド（カリフォルニア州カールズバッド所在のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、約６００塩基対（ｂｐ）の短いＣＭＶプロモーター−エンハンサーを含有している。たとえ、ｐＶＡＸ１のＣＭＶプロモーター−エンハンサーが最適状態には及ばなくても、このプラスミドは有用である。その理由は、ｐＶＡＸ１バックボーンが細菌配列について最小限とされており、プラスミド増殖中に抗生物質選択に用いるカナマイシン耐性遺伝子を含有しているためである。ヒトの臨床試験に用いられるプラスミドＤＮＡについては、カナマイシン選択を使用し、アンピシリン選択は禁じる。
【００８０】
ＣＡＴ−２プラスミドはｐＶＡＸ１へサブクローン化されたＣＡＴ遺伝子を含有している。図１４に示すように、ＣＡＴ−２プラスミドはＭＣＦ７細胞のトランスフェクションの後、低レベルのＣＡＴを産生した。ｐＶＡＸ１  ＣＭＶプロモーター−エンハンサーをｐＣＡＴ−２から取り除き、ｐＣＡＴ−３を産生するためにＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーで置き換えた。図１４に示したように、ＣＡＴ−３でトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞のＣＡＴ産生は低レベルのＣＡＴを産生した。
【００８１】
ｐ４１１９ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子送達及び遺伝子発現のために設計されたＣＡＴプラスミドである（Ｚｈｕ，Ｎ．ら、１９９３；Ｌｉｕ，Ｙ．ら、１９９５）。このプラスミドは、ＣＡＴ遺伝子の開始コドンに約８００ｂｐを超える長さのＣＭＶプロモーター−エンハンサーと４００ｂｐのイントロン５’が入れられている。しかし、ｐ４１１９プラスミドバックボーンは、約５９０ｂｐ以上の細菌配列を含有し、ｐＶＡＸ１のバックボーンよりも長く、且つ、好ましいカナマイシンではなく、選択用のアンピシリン耐性遺伝子を含有している。ｐＣＡＴ−４構築物は、ｐＣＡＴ−２中のｐＶＡＸ１  ＣＭＶプロモーター−エンハンサーを、ｐ４１１９  ＣＭＶプロモーター−エンハンサー及びイントロンと置き換えることにより調製した。図１４に示すように、ｐＣＡＴ−４をトランフェクトしたＭＣＦ７細胞は、ｐＣＡＴ−２をトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞と比べるとＣＡＴ産生を３．７倍高めた（ｐ＜０．０１）。
【００８２】
プラスミドｐＣＡＴ−５、ｐＣＡＴ−６及びｐＣＡＴ−７は、異なる位置にＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーを挿入することにより、ｐＣＡＴ−４から改変したものである。ｐＣＡＴ−５は、ｐ４１１９  ＣＭＶプロモーター−エンハンサーにＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー５’が入れられている。ｐＣＡＴ−６は、ｐ４１１９  ＣＭＶプロモーター−エンハンサーにＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー５’とｐ４１１９イントロンにＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー３’が入れられている。ｐＣＡＴ−７は、ＣＡＴ遺伝子にＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー５’が入れられている。ＭＣＦ７細胞のトランスフェクション後、ｐＣＡＴ−７だけがｐＣＡＴ−４と比較して１．９倍増のＣＡＴ産生物を産生し（ｐ＜０．０２５）、ｐＣＡＴ−２と比較して７倍増のＣＡＴ産生物を産生した（ｐ＜０．０２５）。図１４に示したこれらの結果は、プロモーター−エンハンサーとＣＡＴ遺伝子の間にはイントロンが含まれていない方が良好であることを示唆している。
【００８３】
ｐＣＡＴ−７を改良するため、ｐ４１１９イントロンを除去して、ＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーにｐ４１１９  ＣＭＶプロモーター−エンハンサーを近接させた。この構築物はｐＣＡＴ−８と命名し、ＭＣＦ７細胞のトランスフェクション後、全タンパク質ｍｇ当たりＣＡＴ１６５６．２ｎｇ（ｎｇ  ＣＡＴ／ｍｇタンパク質）の最高レベルでＣＡＴ産生物を産生した（図１４を参照）。従って、ｐＣＡＴ−８はｐＣＡＴ−４と比較して６．２倍増のＣＡＴ産生物を産生し（ｐ＜０．０５）、ｐＣＡＴ−２と比較して２２．５倍増のＣＡＴ産生物を産生した（ｐ＜０．０５）。
【００８４】
ｐＣＡＴ−９を作製するためにｐＣＡＴ−８内のＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー配列を逆にすることによって、ＭＣＦ７細胞のトランスフェクション後のＣＡＴ産生は、ほとんど検出不可能なレベルのＣＡＴ産生物（すなわち、ＣＡＴ３．３ｎｇ／ｍｇタンパク質）まで低下した。これらのデータは、亢進された遺伝子発現の最高レベルとＭＣＦ７細胞のタンパク質産生は、プラスミド内のＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー配列によってもたらされていることを示唆している。
【００８５】
ｐＣＡＴ−８内のＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー領域に欠損を含有している他のプラスミド（低酸素エンハンサー配列を含むもの、又はそのエンハンサー配列を含まないもの）を試験した。低酸素エンハンサー配列を含まないプラスミド構築物はすべて、低酸素エンハンサーを含んでいる利点を示すｐＣＡＴ−８と比較して（データ示さず）、低いレベルのＣＡＴ発現をもたらした。
【実施例５】
【００８６】
様々な肺癌及び乳癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるトランスフェクション
ＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサー配列によりもたらされているＣＡＴ産生が増加したすべての細胞型特異性を検出するため、ＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーを含有するプラスミド、及びＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーを含まないプラスミドで種々の異なる乳癌及び肺癌細胞をトランスフェクトした。
【００８７】
Ａ．細胞系
用いたＭＣＦ７細胞系は、Ｃ．Ｋｅｎｔ  Ｏｓｂｏｒｎｅ（テキサス州ヒューストン所在のＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により提供されたものである。Ｈ３５８、Ｈ４６０及びＨ１２９９細胞系は、Ｊａｃｋ  Ａ．Ｒｏｔｈ（テキサス州ヒューストン所在、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）から提供された。Ｔ−４７Ｄ、ＳＫ−ＢＲ−３、Ａ５４９及びＨＣＣ１４２８細胞系は、ヴァージニア州マナッサス所在Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＨＣＣ１４２８は最近ＡＴＣＣへ寄託されており、Ａｄｉ  Ｆ．Ｇａｚｄａｒ（テキサス州ダラス所在、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって提出されたものである。ＨＣＣ１４２８は、低レベルのＨＥＲ２／ｎｅｕ（１４）を含んでいるｐ５３ｎｕｌｌヒト導管性乳癌細胞系である。
【００８８】
Ｂ．方法
細胞系は、７０％の集密度まで６ウェル組織培養クラスタ中で培養した。ＤＮＡリポソーム複合体は上に記載したようにして調製した。細胞は、１ウェル当たりＤＮＡ５μｇを用いて押出しＤＯＴＡＰ  ＤＮＡ：リポソーム複合体でトランスフェクトした。トランスフェクションは３時間無血清培地で実施した。６つの独立したｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションを報告されている各データポイントについて行った。
【００８９】
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、Ｒｏｃｈｅ（インディアナ州インディアナポリス）のＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキットを用いて実施した。各細胞系についての３つの対照ウェルは、ＣＡＴ産生の任意のバックグラウンド輝度を検出するためにリポソーム単独でトランスフェクトした。すべてのＣＡＴタンパク質定量は、対照細胞で検出された任意のＣＡＴ免疫反応性に対して調整した。タンパク質定量は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡキット（イリノイ州ロックフォード所在のＰｉｅｒｃｅ）を用いて行った。
【００９０】
Ｃ．比較細胞トランスフェクション
種々の異なる乳癌細胞及び肺癌細胞は、ＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサー非含有のｐＣＡＴ−４プラスミドと、本発明者らの最初の実験で最高レベルのＣＡＴ産生物を産生したＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーを含有するｐＣＡＴ−８プラスミドでトランスフェクトした（図１４を参照されたい）。トランスフェクトした乳癌細胞系は、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ７、ＳＫ−ＢＲ−３及びＨＣＣ１４２８であった（図１５Ａを参照されたい）。トランスフェクトした肺癌細胞系は、Ｈ３５８、Ｈ４６０、Ｈ１２９９及びＡ５４９であった（図１５Ｂを参照されたい）。
【００９１】
図１５Ｃには、ｐＣＡＴ−４に対してｐＣＡＴ−８でトランスフェクションした後の各細胞系で倍増したＣＡＴ産生物を示している。対照は１倍であって、増加は示さなかった。ｐＣＡＴ−８は、すべての乳癌細胞のＣＡＴ産生を３．１から６．２倍に高めた。一方、ｐＣＡＴ−８は、すべての肺癌細胞のＣＡＴ産生を１．３から２倍に高めた。これらのデータから、ＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーが、肺癌細胞よりも乳癌細胞において、トランスフェクション後のＣＡＴ産生を有意に高く改良したことが明らかである。
【実施例６】
【００９２】
低濃度酸素下で増殖させたＭＣＦ７細胞におけるＣＡＴ産生の比較
ＧＡＰＤＨ配列内の低酸素エンハンサーによって付与されたｐＣＡＴ−８によるＣＡＴ産生の上昇レベルを評価するために、ＭＣＦ７細胞をｐＣＡＴ−４及びｐＣＡＴ−８でトランスフェクトし、トランスフェクション後、標準（２１％）の酸素濃度又は低い（５．０％又は９．９％）酸素濃度で培養した。腫瘍中の酸素濃度は測定されており、腫瘍低酸素症は１．３％以下の濃度の酸素で存在する［Ｖａｕｐｅｌ，１９９６］。一方、標準の酸素で処理された組織は約５％の酸素を有する。
【００９３】
図１６Ａ及び図１６Ｂに示すように、有意に高い濃度のＣＡＴが産生されるｐＣＡＴ−８は、５．０％又は９．９％の酸素中で増殖した（ｐ＜０．０１）。更に、５．０％酸素中で増殖したＭＣＦ７細胞は、ｐＣＡＴ−８でトランスフェクションした後に９．９％酸素中で増殖した細胞よりもわずかに高い濃度のＣＡＴを産生した。ｐＣＡＴ−４でトランスフェクトし、トランスフェクション後に５．０％又は９．９％の酸素中で培養されたＭＣＦ７細胞では、有意なＣＡＴ産生の上昇は検出されなかった。
【００９４】
高められたＣＡＴ産生が、ｐＣＡＴ−８により得られた安定化遺伝子発現によるものではないことを示すために追加の実験を行なった。図１７Ａ及び図１７Ｂによれば、トランスフェクション後１４日経つと、ｐＣＡＴ−４又はｐＣＡＴ−８でトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞のＣＡＴ産生の濃度が同じように低下することが明らかである（ｐ＜０．０１）。従って、ｐＣＡＴ−８は、ＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーの転写アップレギュレーションと低濃度の酸素に対する低酸素エンハンサーの応答に基づいて、ＭＣＦ７細胞で高レベルの遺伝子発現をもたらした。
【実施例７】
【００９５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける乳癌での遺伝子発現
更にまた、ＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーを含まないプラスミド（すなわちｐＣＡＴ−４）及び ＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーを含むプラスミド（すなわちｐＣＡＴ−８）を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける乳癌のトランスフェクションを試験した。
【００９６】
Ａ．方法
マウス及びマウス腫瘍モデル。ヒトＭＣＦ７、同所性乳癌異種移植片は、エストラジオール錠を移植したメスのヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）で確立した。メスのヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）（５〜６週齢）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（インディアナ州インディアナポリス）から購入した。各マウスに１７β−エストラジオールの０．１２５ｍｇのペレットが皮下移植された。翌日、リン酸緩衝生理食塩水中で懸濁した５×１０６のＭＣＦ７細胞を注入することにより、これらのマウスにおいてＭＣＦ７同所性異種移植片を確立した。腫瘍は約７５〜１００ｍｍ３まで増殖させた。
【００９７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達。押出しＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ  ＤＮＡリポソーム複合体は、これまでに報告されているようにして調製した（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｎ．Ｓ．ら、１９９７）。上記の腫瘍を有するマウスに押出しＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡリポソーム複合体が静脈内注射又は直接的腫瘍注射により注入した。複合体はｐＣＡＴ−４プラスミドＤＮＡ又はｐＣＡＴ−８プラスミドＤＮＡのいずれかを含有していた。静脈注射の場合、５０μｇのＤＮＡを含有するＤＮＡリポソーム複合体１００μｌを少なくとも１分間にわたって３０ゲージ注射針を用いてマウスの尾部静脈へゆっくり注入した。直接的腫瘍注射の場合、５０μｇのＤＮＡを含有するＤＮＡリポソーム複合体１００μｌを３０ゲージ注射針を用いて腫瘍の中心に注入した。
【００９８】
組織におけるＣＡＴ産生についてのアッセイ。これまでに報告されているようにして、組織を回収し、抽出物を調製した（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、１９９７）。酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、Ｒｏｃｈｅ（インディアナ州インディアナポリス）のＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキットを用いて実施した。すべてのＣＡＴタンパク質定量値は、対照細胞で検出された任意のＣＡＴ免疫反応性に対して補正した。タンパク質定量は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡキット（イリノイ州ロックフォード所在のＰｉｅｒｃｅ）を用いて行った。実験群はすべて、１群当たり１０匹のマウスを含み、対照群１群当たり５匹のマウスを評価した。両側スチューデントｔ検定を用いて、報告されているｐ−値を検出した。対照マウスにはリポソームだけが注入された。この試験は、承認されている動物プロトコルを用いて、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのガイドラインに従って行った。
【００９９】
Ｂ．実験結果
図１８Ａに注射後の腫瘍におけるＣＡＴ産生を示す。ｐＣＡＴ−８  ＤＮＡリポソーム複合体を直接的腫瘍注射に用いた場合、ＣＡＴ産生は、ｐＣＡＴ−４  ＤＮＡを含有する複合体によって産生されたものと比較すると６７．３倍（図１８Ｃ、ｐ＜０．０２５）増加した。ＣＡＴ産生の平均は、この実験でタンパク質１ｍｇ当たりのＣＡＴが６〜１０７６ｐｇに増加した。
【０１００】
更に、静脈注射にｐＣＡＴ−８  ＤＮＡリポソーム複合体を用いた場合、ＣＡＴ産生は、ｐＣＡＴ−４  ＤＮＡを含有する複合体によって産生されたものと比較すると１６倍（図１８Ｃ、ｐ＜０．２５）増加した。静脈注射後のＣＡＴ産生の平均は、タンパク質１ｍｇ当たりＣＡＴ１２〜２１０ｐｇに増加した。
【０１０１】
これらのデータは、図１６〜図１７で示したデータと同様に、乳癌内の低酸素症は、組織培養トランスフェクション実験で産生されたものに比べてｐＣＡＴ−８によって増加したＣＡＴ産生を提供したことを示している（図１６Ｂを参照されたい）。詳しくは、ｐＣＡＴ−８は、ＭＣＦ７組織培養細胞においては６．２倍まで、またＭＣＦ７乳癌では６７．３倍までｐＣＡＴ−４の産生を上回ってＣＡＴ産生を増加させた。腫瘍は低酸素症であることが周知であるので、この腫瘍において増加した発現は、ｐＣＡＴ−８中のＧＡＰＤＨ配列内の低酸素エンハンサーに起因するものと思われる。従って、低酸素エンハンサーは、ＭＣＦ７乳癌において追加的な６１．１倍のＣＡＴ増加産生をもたらした。
【０１０２】
心臓及び肺をｐＣＡＴ−４又はｐＣＡＴ−８を含有するリポソーム複合体が静脈注射されたＭＣＦ７腫瘍を有する同一マウスから回収し、ＣＡＴ産生についてアッセイした（図１８Ｂを参照されたい）。心臓と肺はこれまでに報告されているようにしてＣＡＴ産生についてアッセイした。静脈注射した複合体中、ｐＣＡＴ−４に対するｐＣＡＴ−８を用いて、心臓及び肺組織におけるＣＡＴ産生の有意な増加（２．２倍及び２．４倍（図１８Ｃ））がそれぞれ認められた。従って、ＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーは、同一マウスの正常組織中では増加させることなく、ＭＣＦ７腫瘍組織において特異的にＣＡＴ産生を増加させた。
【実施例８】
【０１０３】
免疫力のある非腫瘍マウスにおける遺伝子発現の比較
正常なＢＡＬＢ／ｃメスマウスにおけるＣＡＴ産生は、ｐＣＡＴ−４  ＤＮＡに対するｐＣＡＴ−８を用いて、押出しＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ  ＤＮＡリポソーム複合体の静脈注射後に測定した。メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（５〜６週齢）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（インディアナ州インディアナポリス）から購入した。心臓、肺、肝臓、骨格筋及び乳腺を回収し、ＣＡＴ産生についてアッセイした（図１９Ａ）。ｐＣＡＴ−４に対してｐＣＡＴ−８を用いた骨格筋では、ＣＡＴ産生はわずかに低下した（図１７Ｂ、ｐ＜０．０１）。更に図１９Ｂによると、ｐＣＡＴ−４に対してｐＣＡＴ−８を用いた場合の心臓（１．１倍）、肺（２．０倍）、肝臓（１．５倍）及び乳腺（１．４倍）における有意なＣＡＴ産生の増加が明らかである。従って、ＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーは、乳腺をはじめとする正常組織では有意なＣＡＴ産生の増加はなく、更に、乳癌における特異的遺伝子発現は明らかであるが（図１８Ｃ）、正常な乳房組織では特異的遺伝子発現はなかった（図１９Ｂ）。
【実施例９】
【０１０４】
非ウイルス系プラスミドの構築
本発明はプロモーター−エンハンサーを選択する系統的手法を述べる。現在、遺伝子治療で用いられているプラスミドはすべて、良好な転写を得ることが期待されるウイルスプロモーターを有している。これらのウイルスプロモーターはその非特異性が原因で問題を生じ、ＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターに存在を必要としない効果的なプロモーターが求められている。
【０１０５】
本発明は、標的細胞における複数の有望なプロモーターを同定する系統的手法を提供する。上で記載されている結果は、ＳＡＧＥの使用により確認された、増強のあった転写がプロモーターを同定したことを証明している。上で記載されているデータは、乳癌細胞に対して設計されたプラスミド中のＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサーの挿入付近に集中しているが、ＳＡＧＥの結果により、プラスミドへ含めるのに良好な候補であった他の複数のプロモーターが同定された。同定された２つ以上のプロモーター−エンハンサーは、特定の細胞系における産生の増加を提供するために用いることができると仮定する。
【０１０６】
例えば、表１では、本発明を用いて同定された候補プロモーター−エンハンサーとして、デオキシチミジル酸キナーゼプロモーター−エンハンサー、ケラチン−８プロモーター−エンハンサー、及びリボソームＬ３０プロモーター−エンハンサー、並びにＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーが挙げられている。従って、図２０に示した仮説プラスミドは、ＧＡＰＤＨプロモーター  低酸素エンハンサー単独よりも治療効果に関するより多くの転写を提供するはずであり、その結果、ＣＭＶプロモーター−エンハンサー又は他のウイルスプロモーターを必要とすることなく治療効果に関する十分な転写が得られる。同様に、豊富な転写産物（例えばケラチン−８）に関連しているエンハンサーは、ケラチン−８プロモーターと共に用いても良く、或いはプロモーターなしで用いてもよい。また、１又は複数のコピーで用いることができる。
【０１０７】
更に、他の低酸素症応答エレメントが腫瘍内の遺伝子発現を高めるために用いられている（Ｃａｏ，Ｙ．Ｊ．ら、２００１；Ｒｕａｎ，Ｈ．ら、２００１；Ｉｄｏ，Ａ．ら、２００１；Ｄａｃｈｓ，Ｇ．Ｕ．ら、２０００；Ｍｏｄｌｉｃｈ，Ｕ．ら、２０００；Ｓｈｉｂａｔａ，Ｔ．ら、２０００）。従って、転写の増強における低酸素エンハンサーの効果は、プラスミドに２つ以上の低酸素エンハンサーのコピーを含めることにより更に増加されると仮定される。含まれる低酸素エンハンサーは、同一の低酸素エンハンサーであっても、異なる低酸素エンハンサーであってもよい。
【０１０８】
結論
トランスフェクション後の遺伝子発現の発生は複雑であり、核へのＤＮＡの送達以上に影響を与える。一般的に、核へのＤＮＡ送達とその後の遺伝子発現にはほとんど相関がないと思われる。プラスミドに存在するＣＭＶプロモーター−エンハンサーのわずかな差異により、類似する細胞の種類で異なるレベルの遺伝子発現が生じる。例えば、図１４は、ｐＶＡＸ１  ＣＭＶプロモーター−エンハンサー（ｐＣＡＴ−２）に対してｐ４１１９  ＣＭＶプロモーター−エンハンサー（ｐＣＡＴ−４）をｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトランスフェクションに用いた場合のＭＣＦ７細胞におけるＣＡＴ産生の４倍の差を明らかにしている。蛍光標識化プラスミドＤＮＡを用いたトランスフェクション研究から得られた予備的データでは、核内のＤＮＡのレベルに差はなかった。このことは、ＤＮＡの送達よりもプロモーター能力の差が、図１４で分析した８種類の細胞系に関する発現の異種性の原因となっていることを示唆している。
【０１０９】
何人かの研究者らは、乳癌を治療するために、肺癌の動物モデルで有効性を示した非ウイルス送達系を用いることを試みた。これらの研究者からは、肺癌を治療するために用いたのと同じＤＮＡ発現プラスミドを用いた乳癌動物モデルでの有効性は示されていない。それらの失敗は、非効率的な送達系、及び乳癌細胞における非効率的な遺伝子発現プラスミドのそれらの使用、又はプラスミド構築物単独によるそれらの使用に多分関係があるのであろう。従って、遺伝子治療の進歩において、特定の標的細胞の遺伝子発現に適合した適切なプラスミドの設計が重要である。
【０１１０】
〔参考文献〕
本明細書中に記載されているすべての特許及び刊行物は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示している。本出願に引用されているすべての特許及び刊行物は、引用に援用された場合に各特許及び刊行物が詳しく記載されているのと同じ程度に、また各特許及び刊行物が詳しくは記載されていない材料及び方法を開示している程度に、引用により本明細書に援用するものとする。
【０１１１】
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【０１１２】
本発明と好ましい態様を示し記載したが、本発明の趣旨及び開示から逸脱することなく、それらの変更は当業者により行うことができる。本明細書に記載されている実施例は単に具体例であり、これらに限定されるものではない。本発明と本明細書に記載されている装置の多様な修正及び変更は可能であり、それらは本発明の範囲内である。従って、保護の範囲は上に述べられている記載によって限定されるものではないが、特許請求の範囲の主題のすべての等価物を含む範囲である、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【０１１３】
本発明及びその長所をより完全に理解するために添付されている図面に関して以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】プラスミド構築物でバックボーンとして用いられたｐＶＡＸ１ベクターの概要説明である。
【図２】ｐ４１１９ベクターの概要説明である。その一部はほとんどのプラスミド構築物へ組み込まれた。
【図３】プラスミドｐＣＡＴ２に挿入されたベクターの一部を詳しく示した、図２に図示したｐ４１１９ベクターの概略図である。
【図４】プラスミドｐＣＡＴ２の概略図である。
【図５】プラスミドｐＣＡＴ３の概略図である。
【図６】プラスミドｐＣＡＴ４に挿入されたベクターの一部を詳しく示した、図２に図示したｐ４１１９ベクターの概略図である。
【図７】プラスミドｐＣＡＴ４の概略図である。
【図８】プラスミドｐＣＡＴ５の概略図である。
【図９】プラスミドｐＣＡＴ６の概略図である。
【図１０】プラスミドｐＣＡＴ７の概略図である。
【図１１】プラスミドｐＣＡＴ８に挿入されたベクターの一部を詳しく示した、図２に図示したｐ４１１９ベクターの概略図である。
【図１２】プラスミドｐＣＡＴ８の概略図である。
【図１３】プラスミドｐＣＡＴ９の概略図である。
【図１４】ｐＣＡＴ−１からｐＣＡＴ−９のプラスミド構築物でトランスフェクトしたＭＣＦ７細胞におけるＣＡＴ発現を示すグラフである。
【図１５Ａ】様々な乳腺細胞系におけるｐＣＡＴ−４発現とｐＣＡＴ−８発現とを比較したグラフである。
【図１５Ｂ】様々な肺細胞系におけるｐＣＡＴ−４発現とｐＣＡＴ−８発現とを比較したグラフである。
【図１５Ｃ】ｐＣＡＴ−４でトランスフェクトした同一細胞に対するｐＣＡＴ−８でトランスフェクトした細胞のＣＡＴ発現の増加倍率を示すグラフである。
【図１６Ａ】トランスフェクション後、２１％、５．０％又は９．９％の酸素を含有する培養チャンバーで増殖されたＭＣＦ７細胞におけるｐＣＡＴ−４発現とｐＣＡＴ−８発現とを比較した図である。
【図１６Ｂ】２１％の酸素中で増殖した場合に対して９．９％又は５．０％の酸素中で増殖した場合のｐＣＡＴ−４又はｐＣＡＴ−８によるトランスフェクト細胞の平均ＣＡＴ発現の増加倍率を示すグラフである。
【図１７Ａ】トランスフェクション後、２４時間、７日間又は１４日間で回収した場合のｐＣＡＴ−４及びｐＣＡＴ−８によるトランスフェクトＭＣＦ７細胞のＣＡＴ発現を比較したグラフである。
【図１７Ｂ】トランスフェクション後、２４時間、７日間又は１４日間で回収した場合のｐＣＡＴ−４に対するｐＣＡＴ−８によるトランスフェクトＭＣＦ７細胞の平均ＣＡＴ発現の増加倍率を示すグラフである。
【図１８Ａ】リポソーム被覆ｐＣＡＴ−４及びｐＣＡＴ−８の静脈注射又は直接腫瘍注射後の種々の胸腫瘍におけるｐＣＡＴ−４発現とｐＣＡＴ−８発現とを比較したグラフである。
【図１８Ｂ】リポソーム被覆ｐＣＡＴ−４及びｐＣＡＴ−８を静脈注射した動物の心臓及び肺におけるｐＣＡＴ−４発現とｐＣＡＴ−８発現とを比較したグラフである。
【図１８Ｃ】ｐＣＡＴ−４によりトランスフェクトした同一細胞上に対するｐＣＡＴ−８によりトランスフェクトした図１８Ａ及び図１８Ｂに図示した組織におけるＣＡＴ発現の増加倍率を示すグラフである。
【図１９Ａ】リポソーム被覆ｐＣＡＴ−４及びｐＣＡＴ−８の静脈注射後の免疫コンピテント正常マウスの種々の組織におけるｐＣＡＴ−４発現とｐＣＡＴ−８発現とを比較したグラフである。
【図１９Ｂ】ｐＣＡＴ−４に対してｐＣＡＴ−８を静脈注射した免疫コンピテント正常マウス由来の組織における平均ＣＡＴ発現の増加倍率を示すグラフである。
【図２０】ケラチン−８プロモーター−エンハンサー及びＧＡＰＤＨプロモーター−エンハンサーを有するウイルス配列を持たない仮説プラスミド構築物の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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2005522225.tif 000031