(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病に関するトリプル・トランスジェニック動物モデル、並びに多重トランスジェニック動物の作製方法に関する。本発明は、アルツハイマー病理（AD）又はAD型病理を治療及び/又は改善するのに潜在的に有用な生理活性物質をスクリーニングする方法、AD又はAD型病理を治療するのに有用な組成物、及びAD患者を治療する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプル・トランスジェニック動物であって、当該動物のゲノムが、以下の： 
アルツハイマー病(AD)病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒト・プレセニリン-1ポリペプチドをコードする第1トランスジーンであって、第1プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒト・タウ・タンパクをコードする第2トランスジーンであって、第2プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、及び
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒトβ-アミロイド前駆体タンパク(βAPP)をコードする第3のトランスジーンであって、第3プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、
を含み、ここで、当該トランスジーンの発現が、上記トリプル・トランスジェニック動物においてタウ病理をもたらす前記動物。
【請求項２】
前記第1トランスジーンがPS1M146Vをコードする、請求項1に記載の動物。
【請求項３】
前記第2トランスジーンがTauP301Lをコードする、請求項1に記載の動物。
【請求項４】
前記第3トランスジーンがAPPSWEをコードする、請求項1に記載の動物。
【請求項５】
前記第1プロモーターが、内因性プレセニリン・プロモーターである、請求項1に記載の動物。
【請求項６】
前記第2プロモーターが、Thy1.2プロモーターである、請求項1に記載の動物。
【請求項７】
前記第3プロモーターが、Thy1.2プロモーターである、請求項1に記載の動物。
【請求項８】
前記動物が繁殖力を有し、そして前記3つのトランスジーンをその子孫に伝える、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記第2トランスジーン及び第3トランスジーンが、胚製造期に前記動物の祖先に導入される、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記動物が、該ヒトβAPPトランスジーンに関してヘミ接合性である、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記動物が、該ヒトβAPPトランスジーンに関してホモ接合性である、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記動物が、該ヒト・タウ・トランスジーンに関してヘミ接合性である、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記動物が、該ヒト・タウ・トランスジーンに関してホモ接合性である、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
該動物がマウスである、請求項1に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
トリプル・トランスジェニック動物であって、当該動物のゲノムが、以下の：
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒト・プレセニリン-1ポリペプチドをコードする第1トランスジーンであって、第1プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒト・タウ・タンパクをコードする第2トランスジーンであって、第2プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、及び
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒトβ-アミロイド前駆体タンパクをコードする第3トランスジーンであって、第3プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、
を含み、ここで、当該トランスジーンの発現が、上記トリプル・トランスジェニック動物においてAβ病理をもたらす前記動物。
【請求項１６】
前記第1トランスジーンがPS1M146Vをコードする、請求項15に記載の動物。
【請求項１７】
前記第2トランスジーンがTauP301Lをコードする、請求項15に記載の動物。
【請求項１８】
前記第3トランスジーンがAPPSWEをコードする、請求項15に記載の動物。
【請求項１９】
前記第1プロモーターが、内因性プレセニリン・プロモーターである、請求項15に記載の動物。
【請求項２０】
前記第2プロモーターが、Thy1.2プロモーターである、請求項15に記載の動物。
【請求項２１】
前記第3プロモーターが、Thy1.2プロモーターである、請求項15に記載の動物。
【請求項２２】
前記動物が繁殖力を有し、そして前記3つのトランスジーンをその子孫に伝える、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２３】
前記第2トランスジーン及び第3トランスジーンが、胚製造期に前記動物の祖先に導入される、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２４】
前記動物が、該ヒトβAPPトランスジーンに関してヘミ接合性である、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２５】
前記動物が、該ヒトβAPPトランスジーンに関してホモ接合性である、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２６】
前記動物が、該ヒト・タウ・トランスジーンに関してヘミ接合性である、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２７】
前記動物が、該ヒト・タウ・トランスジーンに関してホモ接合性である、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２８】
前記動物がマウスである、請求項15に記載のトランスジェニック動物。
【請求項２９】
多重トランスジェニック動物の製造方法であって、以下のステップ：
第1トランスジーンに関してホモ接合性のトランスジェニック動物を準備し；
該トランスジェニック動物の胚内に第2トランスジーンをマイクロインジェクションし；そして、
該胚を出産時まで発育させることにより、該多重トランスジェニック動物を作製する、
を含む前記製造方法。
【請求項３０】
前記胚内に少なくとも第3トランスジーンをマイクロインジェクションするステップをさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
トリプル・トランスジェニック動物の製造方法であって、以下のステップ：
第1トランスジーンに関してホモ接合性のトランスジェニック動物を準備し；
該トランスジェニック動物中に第2トランスジーン及び第3トランスジーンを同時マイクロインジェクションし；そして、
該胚を出産時まで発育させることにより、該トリプル・トランスジェニック動物を作製する、
を含む前記製造方法。
【請求項３２】
多重トランスジェニック動物であって、以下のステップ：
第1トランスジーンに関してホモ接合性のトランスジェニック動物を準備し；
該トランスジェニック動物の胚内に第2トランスジーンをマイクロインジェクションし；そして、
該胚を出産時まで発育させることにより、該多重トランスジェニック動物を作製する、
によって作製される前記多重トランスジェニック動物。
【請求項３３】
トリプル・トランスジェニック動物であって、以下のステップ：
第1トランスジーンに関してホモ接合性のトランスジェニック動物を準備し；
該トランスジェニック動物中に第2トランスジーン及び第3トランスジーンを同時マイクロインジェクションし；そして、
該胚を出産時まで発育させることにより、該トリプル・トランスジェニック動物を作製する、
によって作製される前記トリプル・トランスジェニック動物。
【請求項３４】
トリプル・トランスジェニック動物であって、該動物のゲノムが、以下の：
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒト・プレセニリン-1ポリペプチドをコードする第1トランスジーンであって、第1プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒト・タウ・タンパクをコードする第2トランスジーンであって、第2のプロモータに作用可能な状態で連結されているもの、及び
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒトβ-アミロイド前駆体タンパク(βAPP)をコードする第3トランスジーンであって、第3プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、
を含み、ここで、当該トランスジーンの発現が、上記トリプル・トランスジェニック動物においてタウ病理及びAβ病理をもたらす前記動物。
【請求項３５】
トリプル・トランスジェニック動物であって、該動物のゲノムが、以下の：
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒト・プレセニリン-1ポリペプチドをコードする第1トランスジーンであって、第1プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒト・タウ・タンパクをコードする第2トランスジーンであって、第2プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、及び
AD病理又はAD型病理と関連する突然変異を有するヒトβ-アミロイド前駆体タンパク(βAPP)をコードする第3トランスジーンであって、第3プロモータに作用可能な状態で連結されているもの、
を含み、当該トランスジーンの発現が、上記トリプル・トランスジェニック動物においてAD病理又はAD型病理をもたらす前記動物。
【請求項３６】
in vivoのタウ病理の軽減を促進する生理活性物質のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
請求項1に記載のトランスジェニック動物に候補物質を投与し、そして、
該タウ病理に対する前記物質の効果を判断する、
を含む前記方法。
【請求項３７】
in vivoのAβ病理の軽減を促進する生理活性物質のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
請求項15に記載のトランスジェニック動物に候補物質を投与し、そして、
該Aβ病理に対する前記物質の効果を判断する、
を含む前記方法。
【請求項３８】
in vivoのタウ病理及びAβ病理双方の軽減を促進する生理活性物質のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
請求項34に記載のトランスジェニック動物に候補物質を投与し、そして、
該タウ病理及びAβ病理双方に対する前記物質の効果を判断する、
を含む前記方法。
【請求項３９】
in vivoのAD病理又はAD型病理の軽減を促進する生理活性物質のスクリーニング方法であって、以下のステップ：
請求項35に記載のトランスジェニック動物に候補物質を投与し、そして、
該AD病理又はAD型病理に対する前記物質の効果を判断する、
を含む前記方法。
【請求項４０】
患者のAD病理又はAD型病理を治療する組成物であって、該組成物が、請求項39に記載の方法によってスクリーニングされ、かつ、AD病理又はAD型病理を軽減するのに効果的であることがわかった前記組成物。
【請求項４１】
ADと診断された患者の治療方法であって、治療として有効量の請求項40に記載の組成物を該患者に投与することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病のトリプル・トランスジェニックマウス・モデルに関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年12月20日付けで出願された米国仮出願第60/343,383号明細書、標題「Triple Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease」の優先権を主張する。この明細書の内容全体を参考のため本発明書に引用する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アルツハイマー病(AD)の神経病理は、2つの顕著な障害を特徴とする。これらの障害とはすなわち、主としてアミロイド-β(Aβ)ペプチドから成る広汎性且つ神経性の斑、及び、高リン酸化されたタウ・タンパクの線維状凝集体から成る、神経原線維のもつれである{(Selkoe, D.J.(2001) 「アルツハイマー病:遺伝子、タンパク質及び治療(Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy)」 Physiol. Rev. 81, 741-66}。ニューロン・シナプス密度、及びシナプス数の損失が、この疾患の他の不変の特徴であり、この特徴は、明白なニューロン変性に先行すると考えられる{DeKosky, S.T. & Scheff, S.W.(1990) 「アルツハイマー病の前頭皮質生検におけるシナプス損失:認知障害の重症性との相関(Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer's disease: correlation with cognitive severity)」 Ann. Neurol. 27, 457-64; Scheff, S.W., Scott, S.A. & DeKosky, S.T.(1991) 「若年及び老年のFischer 344ラットの中隔核におけるシナプス密度の定量(Quantitation of synaptic density in the septal nuclei of young and aged fischer 344 rats)」 Neurobiol. Aging 12, 3-12}。
【０００４】
特に、AD患者における記憶及び認知の低下は、斑又はもつれよりもシナプス病理と大きく相関し{Terry, R. D.他(1991) 「アルツハイマー病における認知変化の身体的根拠:シナプス損失が認知障害との主要な相関関係を成す(Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment)」 Ann. Neurol, 30, 572-80; Dickson, D. W.他(1995) 「シナプスマーカー及び病理マーカーと、高齢者の認知との相関関係(Correlations of synaptic and pathological markers with cognition of the elderly)」 Neurobiol. Aging 16, 285-98; Sze, C. I.他(1997) 「海馬におけるシナプス前小胞タンパク質シナプトフィジンの損失が、アルツハイマー病における認知低下と相関する(Loss of the presynaptic vesicle protein synaptophysin in hippocampus correlates with cognitive decline in Alzheimer disease)」J. Neuropathol. Exp. Nerol 56, 933-44; Masliah, E.他(2001) 「シナプス・タンパク質の発現の変化が、アルツハイマー病の進行中、早期発生する(Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease)」 Neurology 56, 127-9}、そして、記憶損失の初期段階に関与する最も有意なファクターであると考えられる{Selkoe, D. J.(2002) 「アルツハイマー病はシナプスの不足である(Alzheimer's disease is a synaptic failure)」 Science 298, 789-91}。
【０００５】
遺伝子を標的にされたトランスジェニックマウスは、シナプス機能障害の根底を成すメカニズムのいくつかに対処するのに、極めて有益であることが判っている{Larson, J.他(1999)「若年及び老年のPDAPPマウスから得られた海馬切片におけるシナプス伝達及び長期増強の変化(Alterations in synaptic transmission and long-term potentiation in hippocampal slices from yound and aged PDAPP mice)」Brain Res. 840, 23-35; Hsia, A.Y.他(1999)「アルツハイマー病マウス・モデルにおける、斑とは無関係な神経回路崩壊(Plaque-independent disruption of neural circuits in Alzheimer's disease mouse models)」Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3228-33; Chapman, P. F.他(1999)「アミロイド前駆体タンパク質トランスジェニック老年マウスにおけるシナプス可塑性障害及び学習障害(Impaired synaptic plasticity and learning in aged amyloid precursor protein transgenic mice) Nat. Neurosci. 2, 271-6; Fitzjohn, S.M.他(2001)「アミロイド前駆体タンパク質のヒトAPP695SWE突然変異形を過剰発現させるトランスジェニックマウスにおける、加齢性シナプス伝達障害及び正常な長期増強(Age-related impairment of synaptic transmission but normal long-term potentiation in transgenic mice that overexpress the human APP695SWE mutant form of amyloid precursor protein)」J. Neurosci. 21., 4691-8}が、これらのモデルのうち、顕著な両病理学的障害を反復するものはない{Wong, P.C.他(2002)「神経変性疾患の遺伝子工学的マウス・モデル(Genetically engineered mouse models of neurodegenerative diseases)」Nat. Neurosci. 5, 633-9}。従って必要なのは、複数のアルツハイマー病関連遺伝子を導入されたトランスジェニック動物モデルであって、顕著な両病理学的障害を含む、この疾患に関連する複数の主要な特徴を作製するモデルである。
【０００６】
トランスジェニックマウスのようなトランスジェニック動物を作製する際には、正常な非トランスジェニックマウスに由来する受精卵内にヒトトランスジーンがマイクロインジェクションされるのが典型的である。このようなトランスジェニックマウスは、「ダブル」トランスジェニックマウスを作製するために使用されている。「ダブル」トランスジェニックマウスの作製は、それぞれ異なるトランスジーンを含有する種々異なる系統のトランスジェニックマウスを交配して、両トランスジーンを含有する系列(すなわちダブル・トランスジェニックマウス系列)を作製することにより、行われる(例えば米国特許第5,898,094号明細書参照)。同様に、第3トランスジーンを含有するトランスジェニックマウスと、ダブル・トランスジェニックマウスとを交配して、トリプル・トランスジェニックマウスを作製することもできる。
【０００７】
トリプル・トランスジェニックマウスを作り出すこのプロセスには、幾つかの欠点がある。第1に、前述のようなマイクロインジェクション/育種/スクリーニング/選択という一連の工程によって、多重トランスジェニックマウスを作製するために著しく時間がかかる。第2に、このプロセスは、高価な育種費用、収容費用、スクリーニング費用及び人件費を必要とするので、極めてコストが高い。第3に、このプロセスは、遺伝的バックグラウンドが変動するマウスを作製する。このことは、治療研究及び行動研究にとって主要な問題と成り得る。
【０００８】
従って、上記に挙げた欠点のうちの1つ又は2つ以上を回避する多重トランスジェニックマウスを作製する方法も必要となる。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の1つの側面は、アルツハイマー病に対応するトリプル・トランスジェニック動物モデルに関する。
本発明の他の側面は、多重トランスジェニック動物の作製方法に関する。
【００１０】
本発明の他の側面は、アルツハイマー病病理(AD)又はAD型病理を治療及び/又は改善するのに潜在的に有用な生理活性物質をスクリーニングする方法に関する。
本発明の他の側面は、アルツハイマー病病理(AD)又はAD型病理を治療するのに有用な組成物に関する。
本発明の他の側面は、AD患者の治療方法に関する。
【００１１】
発明の詳細な説明
特に定義しない限り、本明細書中に使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術における当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法、装置及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法、装置及び材料について以下に説明する。
【００１２】
本明細書において言及された全ての刊行物を、参考のため本明細書に引用する。この引用の目的は、本発明との関連において利用することができる、これらの刊行物に記載の例えば細胞系列、構造及び方法を説明して開示することにある。上記に論議された刊行物及び本明細書全体を通して論議された刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示内容に関してのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、先行発明に照らして、このような開示の日付けを早める資格が発明者に与えられないことを承認したものとして解釈されるべきではない。
【００１３】
定義
「トランスジーン」という用語は、動物、具体的には哺乳動物、より具体的には生きている動物の哺乳動物細胞のゲノム内に人工的に挿入されているか、又はまさに挿入されようとしている遺伝物質を意味する。
【００１４】
「トランスジェニック動物」は、ヒト以外の動物、通常は哺乳動物であって、非内因性(すなわち異種)核酸配列を有し、この核酸配列が、その細胞の一部に染色体外要素として存在するか、又は、その生殖細胞系列DNA(すなわちその細胞の殆ど又は全てのゲノム配列)内に安定的に組み入れられた動物を意味する。異種核酸は、例えば宿主動物の胚又は胚幹細胞を遺伝子操作することにより、このようなトランスジェニック動物の生殖細胞ライン中に導入される。
【００１５】
「作用可能な状態で連結」とは、適切な転写アクチベータ・タンパクが調節配列に結合されたときに遺伝子発現を可能にするように、DNA配列と調節配列とが結合されることを意味する。例えば、ヒト・アミロイド-β前駆体タンパク(βAPP)をコードする核酸配列をマウスThy1.2プロモーターに作用可能な状態で連結して、これにより、マウス細胞中のβAPPの作製を容易にすることができる。
【００１６】
「Aβ病理」とは、脳内に観察される広汎性且つ神経性の斑を意味する。これらの斑は主として、アミロイド-β(Aβ)ペプチドから成る。Aβ病理はまた、ニューロン及び/又はグリア細胞封入体、或いは、抗Aβ抗体で陽性染色する不溶性沈着物を含む。
【００１７】
「タウ病理」とは、脳内に観察される神経原線維のもつれを意味し、螺旋状フィラメント対(PHF)、真直ぐなタウ・フィラメント、及びその他の任意のタイプのタウ・フィラメントのうちの1つ又は2つ以上を含む。タウ病理はまた、ニューロン及び/又はグリア細胞封入体、或いは、抗タウ抗体で陽性染色する不溶性沈着物を含む。
【００１８】
「AD病理」とは、AD患者における病理変化、例えばAβ病理、タウ病理、ニューロン・シナプス密度及びシナプス数の損失、認知能力の低下、記憶の損失及びADに関連したその他の病理を意味する。
【００１９】
「AD関連ポリペプチド」は、AD病理及びAD関連病理、例えばAβ病理及びタウ病理と関連することが判っているポリペプチド、野生型又は突然変異体を意味する。AD関連ポリペプチドの一例としては、プレセニリン、βAPP及びタウが挙げられる。
【００２０】
「異種ポリペプチド」とは、トランスジェニック動物内のトランスジーンによって発現されるポリペプチド、野生型又は突然変異体を意味する。異種ポリペプチドの例は、ヒト以外の動物内で発現される、ヒトのプレセニリン、タウ、βAPP及びその他のAD関連ポリペプチドを含むことができる。
【００２１】
導入
本発明の1側面は、アルツハイマー病のトリプル・トランスジェニック動物モデルに関する。一例において、ヒト遺伝子を既に含有する、遺伝子的操作されたマウスのゲノム中に2つのヒト遺伝子を挿入し、これによりトリプル・トランスジェニックマウスを作製した。
【００２２】
本発明の他の側面は、総体的に多重トランスジェニック動物を作製するための方法に関する。典型的には、正常な非トランスジェニックマウスから分離された受精卵中に外来遺伝子をマイクロインジェクションすることにより、トランスジェニックマウスが作製される。本発明の場合、既にトランスジェニック型であるマウスで始めることにより、付加的なヒトトランスジーンを発現させるマウスを製造することが可能であることが判った。すなわち、既存のトランスジェニックマウスから単胚細胞(受精卵)が採取され、細胞中に付加的なトランスジェニックDNAフラグメントがマイクロインジェクションされている。本明細書中に示された結果は、トランスジェニックマウスに由来する既存の受精卵がマイクロインジェクション・プロセスに耐えること、そして、2つ以上のタイプのトランスジェニックDNAフラグメントを同時にマイクロインジェクションすることにより、多重トランスジェニックマウスの作製に成功することが可能であることを実証した。
【００２３】
このプロセスの利点は、同じ遺伝的バックグラウンドにおける多重トランスジェニックマウスの作製を可能にすることである。加えて、多重トランスジェニックマウスを容易且つ簡単に育種することが可能である。以前は、多重トランスジェニックマウスの作製は、広範囲な育種戦略を必要とし、このことにより、遺伝的バックグラウンドが混じり合ったマウスが作製されることになり、行動研究、薬理研究及び治療研究を目的とした調査において交絡変数が生じた。
【００２４】
多重トランスジェニック動物を作製するためのプロセスは、アルツハイマー病に対応する多重トランスジェニックマウス・モデルに関連して本明細書中に記載されているが、記載されたプロセスを用いることにより、AD病理及びAD型病理に関連したもの以外のトランスジーンを使用して、マウス以外の多重トランスジェニック動物、例えばラット、ハムスター、ウサギなどを作製できることは当業者には明らかである。本発明の、多重トランスジェニック動物を作製する方法は、下記ADの特定のトリプル・トランスジェニックマウス・モデルに限定されるものではなく、むしろ、多重トランスジーンを発現させるのが望ましい、ヒト以外の任意の動物モデルに適用することができる。
【００２５】
本発明において作製された新規のトリプル・トランスジェニックマウス・モデルは、アルツハイマー病の顕著な病理学的特徴に関与する3つの主要な遺伝子を含有する。NIHのMark Mattson博士から得られたトランスジェニックマウスから出発して、このトランスジェニックマウス・モデルは、マウス系列の交雑を必要としない新規の戦略を用いて、アルツハイマー病の病理に関与するヒト遺伝子をコードする2つの付加的なトランスジーンを導入することによって改善された。これらのマウスは、治療研究、及び動物モデルに痴呆を引き起こす行動学的、生理学的、分子/細胞生物学的及び薬理学的なプロセスを理解することを目的とした基礎研究にとって極めて高い価値を有する。
【００２６】
この新規のトリプル・トランスジェニックモデル(3xTg-AD)は、ADに関連する脳部位にAβ及びタウの両病理を発生させるための最初のトランスジェニックモデルである。3xTg-ADマウスは、アミロイド・カスケード仮説と合致して、もつれ製造の前に細胞外Aβ沈着物を発生させた。これらのマウスは、長期増強(LTP)を含むシナプス可塑性の欠損を示す。長期増強の欠損は細胞外Aβ沈着及びタウ病理の前に発生するが、しかし細胞内Aβ免疫反応性に関連する。このような発見は、シナプス機能障害が、細胞外斑製造及びタウ病理の発生に先行する、アルツハイマー病の病理生物学における近位欠陥であることを示唆する。これらの3xTg-ADマウスを使用することにより、今や、シナプス機能障害及びタウ媒介性神経変性を緩和する上での抗Aβ治療の効果を評価することができる。
【００２７】
トランスジェニック動物
トランスジェニック動物は、永続的又は一時的な遺伝子変化、好ましくは永続的な遺伝子変化を引き起こすための、動物の細胞内に組み込まれた外生的DNAを含む。安定的な組み入れのためのベクターは、プラスミド、レトロウィルス及びその他の動物ウィルス及びYACなどを含む。一般に、トランスジェニック動物は哺乳動物であり、最も典型的にはマウスである。
【００２８】
外生的核酸配列は、染色体外要素として存在するか、又は、動物の細胞の全部又は一部、特に生殖細胞に安定的に組み入れることができる。特に指示しない限り、トランスジェニック動物は生殖細胞系列に対する安定的な変化を含む。この動物の最初の構成中、キメラ動物(キメラ)を発生させる。キメラにおいては、細胞のサブセットだけが、変化したゲノムを有する。次いで、キメラを育種して、トランスジーンに関してヘテロ接合性の子孫を生じさせた。次いで雄及び雌のヘテロ接合体を育種して、ホモ接合性トランスジェニック動物を生じさせた。
【００２９】
典型的には、異なる種に由来するトランスジーン、又は、変更された核酸配列を有するトランスジーンを使用して、トランスジェニック動物を発生させる。例えば、ヒト遺伝子、例えばβAPP又はタウをコードする核酸を、マウス又はその他の動物のゲノム内に、トランスジーンとして導入することができる。導入される遺伝子は野生型遺伝子、自然発生型多形、又は遺伝子操作された配列、例えばコード領域又は非コード領域において削除、置換又は挿入を有する配列であってよい。例えば、導入されるヒトβAPP遺伝子は野生型であってよく、又は、突然変異、例えば既に特徴付けされた「スウェーディッシュ突然変異」を含むことができる。導入される遺伝子がコード配列である場合、この遺伝子は通常、プロモーターに作用可能な状態で連結される。このプロモーターは、構成的配列又は誘導性配列、及び宿主動物における発現に必要なその他の調節配列であってよい。
【００３０】
核酸組成物
本発明において使用するための構造は、例えばプレセニリン、タウ又はβAPPをコードする配列、その他のAD関連ポリペプチド・コード配列、又はその他の異種ポリペプチド・コード配列として、所期発現レベルの所期トランスジーンを有するトランスジェニック動物の作製に使用するのに適した任意の構造を含む。所期配列を分離してクローニングするための方法、並びに、宿主動物内の選択された配列を発現させるのに適した構造が、当業者に良く知られている。異種ポリペプチド・コード配列に加えて、構造はその他の配列、例えば検出可能なマーカーを含有することができる。
【００３１】
異種ポリペプチド・コーディング構造は、野生型配列、又は、ヌクレオチド挿入、削除、スプライス変異形及び塩基置換を含む突然変異形を含有することができる。ヒトにおけるAD病理及び/又はAD型病理に関連するヌクレオチド挿入、削除、スプライス変異形又は塩基置換を含むAD関連ポリペプチド・コーディング構造は、有用な構造の一例である。
【００３２】
異種ポリペプチド・コーディング構造は、特異的ポリペプチド、イントロン、及び、発現の調節に関与する、隣接する5'及び3'非コーディング・ヌクレオチド配列をコードするオープン・リーディング・フレームを含んでよい。構造の異種ポリペプチド・コーディング部分は、cDNA又はゲノムDNA又はそのフラグメントであってよい。遺伝子は、染色体外で維持するのに適したベクター、又は宿主内に組み入れるのに適したベクター内に導入することができる。
【００３３】
本発明において使用される核酸組成物は、必要に応じて、異種ポリペプチド・コード配列の全部又は一部をコードすることができる。コンベンショナルな方法に従ったオリゴヌクレオチドの化学合成、制限酵素消化、PCR増幅、及び当業者に知られたその他の技術によって、DNA配列からフラグメントを得ることができる。
【００３４】
プレセニリン-1突然変異ノックイン・マウス
染色体14上のプレセニリン-1(PS1)遺伝子における突然変異が、早期に発症する遺伝型ADの多くの事例と因果関係を有している。PS1突然変異「ノックイン」マウス(PS1M146V)が既に記載されている。このマウスの場合、マウスPS1遺伝子内の相同エクソンが、AD関連PA1突然変異と置換されている{Guo, Q他(1999) プレセニリン-1突然変異ノックイン・マウスにおける興奮毒性壊死に対する海馬ニューロンの脆弱性の増大(Increased vulnerability of hippocampal neurons to excitotoxic necrosis in presenilin-1 mutant knock-in-mice)」Nat. Med. 5,101-6}。ホモ接合状態では、このようなマウスは、突然変異体PS1しか作製せず、野生型PS1を作製しない。さらに、突然変異体PS1は、第2の突然変異であるI145V置換を導入することにより、これらのマウスにおいて「ヒト化」されている。
【００３５】
APP遺伝子、及び本発明における使用に適したその誘導体
APP遺伝子は、米国特許第6,455,757号明細書に記載されている。その内容全体を参考のため本明細書中に引用する。
【００３６】
本発明のトランスジェニック動物は、所期APP遺伝子、好ましくはヒトAPP遺伝子をコードする異種配列を含む。好ましくは、宿主動物は、高レベルのヒトβAPP又はそのタンパク分解フラグメント、例えばヒトAβ42を作製する。好ましくは、βAPP遺伝子は、ゲノムβAPP配列又はスプライスされたβAPP遺伝子をコードする配列(例えばcDNA)、より好ましくは、フルレングス・ヒトβAPP cDNA配列をコードする。或いは、βAPP 遺伝子は突然変異体、具体的には、AD病理及び/又はAD型病理に関連するβAPP突然変異体であってよい。特定の当該突然変異体は、スウェーディッシュ二重突然変異を収容するヒトβAPP cDNAを含む。
【００３７】
βAPPの幾つかのイソ形及び同族体が知られている。クローニングされたβAPPの付加的な同族体が、当業者に知られた種々の方法によって同定される。例えば、低緊縮条件下でのハイブリッド製造により、配列類似性を有する核酸が検出される。標識付け核酸フラグメントを使用して、相同βAPP配列を例えば他の種に由来するものと同定することができる。
【００３８】
宿主動物は、βAPPコード配列に関してホモ接合性、ヘミ接合性又はヘテロ接合性であってよく、好ましくはホモ接合性である。βAPP遺伝子はプロモーターと作用可能な状態で連結して、宿主動物における所期発現レベルを可能にし、且つ/又は、組織特異的な発現を可能にする。βAPPの発現は構成的又は誘導性であってよい。
【００３９】
本発明における使用に適したβAPP遺伝子は分離されており、また配列決定されている。ヒトβ-アミロイド前駆体タンパクに対応する配列は、GenBank受託番号XM047793に見出される。また、米国特許第6,455,757号明細書の表2も参照されたい。この表には、ヒトAPP配列のリストが、列挙されたAPP配列に関連するGenBank受託番号と共に記載されている。
【００４０】
タウ遺伝子、及び本発明における使用に適したその誘導体
タウ遺伝子は、PHFの主要成分である微小管結合タンパク質タウをコードする。PHFは、ADに見られる特徴的なもつれ及び他の神経変性障害を製造する。脳内に見出されるヒト・タウ・タンパクは、11個のエクソンによってコードされる。野生型ヒト・タウ遺伝子の配列は、Andreadis, A他(1992)Biochemistry, 31:10626-10633によって記載されている。ヒト・タウ遺伝子の配列は、GenBank 受託番号11426018に見出される。
【００４１】
本発明のトランスジェニック動物は、所期タウ遺伝子、好ましくはヒト・タウ遺伝子をコードする異種配列を含む。好ましくは、宿主動物は、高レベルのヒト・タウ又はそのタンパク分解フラグメントを作製する。好ましくは、タウ遺伝子は、ゲノム・タウ配列又はスプライスされたタウ遺伝子をコードする配列(例えばcDNA)、より好ましくは、フルレングス・ヒト・タウcDNA配列をコードする。或いは、タウ遺伝子は突然変異体、具体的には、AD病理及び/又はAD型病理に関連するタウ突然変異体であってよい。特定の当該突然変異体は、P301L突然変異を収容するヒト・タウcDNAを含む。本発明における使用に適したタウ遺伝子のその他の突然変異体が、米国特許第6,475,723号明細書に記載されている。その内容全体を参考のため本明細書中に引用する。
【００４２】
タウの幾つかのイソ形及び同族体が知られている。クローニングされたタウの付加的な同族体が、当業者に知られた種々の方法によって同定される。例えば、低緊縮条件下でのハイブリッド製造により、配列類似性を有する核酸が検出される。標識付け核酸フラグメントを使用して、相同βAPP配列を例えば他の種に由来するものと同定することができる。
【００４３】
宿主動物は、タウ・コード配列に関してホモ接合性、ヘミ接合性又はヘテロ接合性であってよく、好ましくはホモ接合性である。タウ遺伝子はプロモーターと作用可能な状態で連結して、宿主動物における所期発現レベルを可能にし、且つ/又は、組織特異的な発現を可能にする。タウの発現は構成的又は誘導性であってよい。
【００４４】
トランスジェニック動物の製造方法
当業者に知られた任意の好適な方法、例えば胚、胚幹細胞などの操作によって、トランスジェニック動物を作製することができる。トランスジェニック動物は、相同組換えによって製造することができる。この組換えにおいて、内因性遺伝子座が変化させられる。或いは、ゲノム内に核酸構造がランダムに一体化される。安定的な組み入れのためのベクターは、プラスミド、レトロウィルス及びその他の動物ウィルス、YACなどを含む。
【００４５】
本発明のトランスジェニック動物の特定の調製方法が、本明細書中に記載されている。しかし、当業者には、数多くのトランスジェニック動物の調製方法が現在知られており、そして他の調製方法も開発されると考えられる。例えば、米国特許第6,252,131号、同第6,455,757号、同第6,028,245号及び同第5,766,879号明細書を参照されたい。これらの内容を参考のため本明細書中に引用する。本発明の実施における使用には、複数のAD関連ポリペプチドを発現させるトランスジェニック動物を作製するいかなる方法も適している。記載されたマイクロインジェクション技術は、他の遺伝子の除去を伴わずに、ゲノム中にトランスジーンを組み込むのに特に有用である。
【００４６】
薬剤スクリーニング・アッセイ
本明細書に記載されたトランスジェニック動物を使用して、AD病理及び/又はAD関連病理の処理に有用な化合物を同定することができる。例えば、本発明のトランスジェニック動物は、種々の候補化合物で処理することができ、そして、広汎性且つ神経性の斑、神経原線維のもつれ、及び/又は、ニューロン・シナプス密度及びシナプス数の損失に対する効果が生じるのであれば、この効果を評価することができる。認知及び記憶に対する候補化合物の効果を、当業者に知られた技術を用いて、本発明のトランスジェニック動物において評価することもできる。スクリーニングされた化合物は、ヒトにおける使用に適しているのが好ましい。
【００４７】
トランスジェニック動物と共に使用するのに一般に適した薬剤スクリーニング・アッセイが知られている。例えば、米国特許第6,028,245号明細書及び同第6,455,757号明細書を参照されたい。本発明のトランスジェニック動物と共に使用するのに適した免疫ブロット分析、発現研究、ELISAによるAβタンパク分解フラグメントの測定、脳切片の免疫細胞化学的且つ組織学的な分析が本明細書中に記載されている。しかし、他の多くのアッセイが利用できることが当業者には明らかである。被検動物は単独で、又は対照動物と組み合わせて使用することができる。対照動物は、例えば、ADとは関連しない野生型βAPP、タウ及び/又はプレセニリントランスジーンを有していてよく、或いは、プレセニリン、タウ又はβAPPをコードする配列を含有しない対照構造に関してトランスジェニック型であってよい。本発明のトランスジェニック動物を使用するスクリーンは、動物モデルにおいて容易に評価できるAD病理又はAD関連病理に関連する任意の現象を採用することができる。
【００４８】
治療薬
AD病理及び/又はAD関連病理の影響を排除又は緩和するものとして、化合物が薬剤スクリーニング・アッセイにおいて同定されると、これらの化合物を治療薬として使用することができる。但し、これらの化合物が、これらが投与される動物、好ましくはヒトと生体適合性を有することを条件とする。
【００４９】
本発明の治療薬は、適切な製薬上許容可能なキャリヤ又は希釈剤と組み合わせることにより、製薬組成物に配合することができ、そして、固形、半固形又は液状又は気体状の形態、例えば錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、溶液、座剤、注射剤、吸入剤、ゲル、ミクロ球体及びエアロゾルの形態の調製物に配合することができる。化合物は当業者に知られた種々の方法、例えば経口、口腔、直腸、非経口、腹膜内、皮内、経皮、気管内などの投与経路により投与することができる。
【００５０】
特定の投与経路に応じて、当業者に良く知られた製薬上許容可能な種々のキャリヤを使用することができる。これらのキャリヤは、例えば糖、澱粉、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝生理食塩水、乳化剤、等張液、及び発熱物質非含有の水を含む。保存剤及びその他の添加剤が存在してもよい。例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガスを添加することができる{概要に関しては、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版、Mack(1980)を参照されたい}。
【００５１】
配合物中の治療活性化合物の濃度は、約0.1〜100重量%であってよい。
当業者には明らかなように、投与レベルは、特定の治療薬、症状の重症性、及び副作用に対する患者の感受性との関連において変動してよい。所与の治療薬の好ましい投与量は、当業者によって種々の手段で容易に決定することができる。好ましい手段は、所与の治療薬の生理学的効力を測定することである。
【実施例】
【００５２】
本発明をいかにして実施して利用するかを当業者に全面的に開示し、説明するために、以下に実施例を示す。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。使用された数値(例えば量、温度、濃度など)に関しては正確を期したが、しかし、いくらかの試験誤差及び偏差は許容されるべきである。特に断りのない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧に近い圧力である。
【００５３】
実施例1:材料及び方法
ELISA及び免疫ブロット。事実上、既述の通り{Suzuki, N他(1994) 「家族性アミロイド・ベータ・タンパク前駆体(ベータAPP717)突然変異体によって分泌された長いアミロイド・ベータ・タンパクのパーセンテージの増大(An increased percentage of long amyloid beta protein secreted by familial amyloid beta protein precursor (beta APP717) mutants)」Science 264,1336-40}に、AβのELISAを実施した。免疫ブロットの場合、トランスジェニックマウス及び対照マウスから抽出された脳を、完全な状態でのMiniプロテアーゼ・インヒビター錠(Roche, No. 1836153)が補足された0.7mg/mlペプスタチンAを含有するH2O中の2%SDSの溶液中に、ダウンス均質化した。均質化された混合物を短時間にわたって超音波処理してDNAを剪断し、4℃で1時間にわたって、100,000gで遠心分離した。その上澄みを免疫ブロット分析のために使用した。タンパク質を還元条件下でSDS/PAGE(Invitrogenから入手した10%Bis-Tris)によって分離し、これをニトロ・セルロース膜に移した。この膜を20℃で1時間にわたって、無脂乳の5%溶液中でインキュベートした。一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした後、ブロットを20分間にわたってトゥイーン-TBS中で洗浄し、二次抗体で20℃でインキュベートした。ブロットを20分間にわたってT-TBS中で洗浄し、そしてSuper Signal(Pierce)と共に5分間にわたってインキュベートした。
【００５４】
免疫組織化学。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された脳を、5μmの切片にし、シランが塗被されたスライド上に載置し、記載のように処理した。下記抗体を使用した：抗Aβ6E10及び4G8(Signet Laboratories, Dedham, MA)、抗Aβ1560(Chemicon)、抗APP 22C11(Chemicon)、抗タウ HT7, AT8, AT180(Innogenetics)、タウC17(Santa Cruz)、タウ5(Calbiochem)、抗GFAP(Dako)及び抗アクチン(Sigma)。GFAPは1:3000、6E10は1:1000、1560, AT8, AT180及びタウ5は1:500、及びHT7は1:200の希釈率で、一次抗体を適用した。
【００５５】
電気生理学
マウスをハロタンで麻酔し、断頭し、そして脳を氷温人工脳脊髄液中に素早く取り出した(aCSF; 125mM NaCl, 2.5mM KCl, 1.25mM KH2PO4, 25mM NaHCO3, 1.2mM MgSO4, 2mM CaCl2及び10mM デキストロース、95%O2 - 5%CO2で発泡, pH7.4)。横方向の海馬切片(400μm)を、バイブロ・スライスを用いてaCSF中で調製し、そして記録に先立って1時間以上、aCSFを含有する保持チャンバ内で室温で平衡させておいた。
【００５６】
界面チャンバ内に切片を置き、aCSFと共に34℃で連続的に灌流させ、そして、加熱され加湿された連続ガス流(95% O2, 5% CO2)でカバーした。フィールド興奮性シナプス後電位(fEPSP)を、aCSFが充填されたガラス微小電極(1〜5Ω、〜5μm直径)を使用して、CA1の放線状層において記録した。0.1msパルス幅の同心双極刺激電極で、シェーファー側副枝/交連経路を刺激することにより、シナプス応答を誘発した。20μAの増分で0〜300μAの刺激強度を用いて、入力/出力曲線を作製した。50msの刺激間インターバルを用いて、PPFを評価した。高周波刺激(HFS)前の15分間にわたって、最大fEPSPの〜30%で、ベースラインfEPSPを誘発した。20秒のインターバルで連続4回の100Hz刺激から成るHFSを用いて、LTPをベースライン強度で誘導した。HFS後60分間にわたって30秒毎に記録を取った。アキソグラフ・ソフトウェアを使用して、最大fEPSP勾配をオフラインで測定し、15分間のベースライン記録からの平均勾配のパーセンテージとして表した。幾つかの試験において、ベースラインEPSP勾配が、非Tgマウスにおける平均ベースラインEPSP(通常、振幅〜0.7mVのEPSP)と適合するように、刺激強度を上昇させた。データを平均±S.E.M.として表し、スチューデント試験を用いて有意性に関して評価した。
【００５７】
実施例2:F1ヘミ接合性トリプル・トランスジェニックマウス
F1トランスジェニックマウスの作製。国立衛生研究所(NIH)のMark Mattson博士によって、プレセニリン-1ノックイン(PS1M146VKI)マウスが提供された。PS1M146V KIマウスの誘導及び特徴付けに関しては、Guo他(1999)Nat. Med. 5:101-106に記載されており、Leissring他(2000)J.Cell Biol. 149:793-797も参照されたい。
【００５８】
先ずホモ接合性突然変異プレセニリン-1ノックイン・マウス(M146V突然変異を収容する)から単胚細胞を採取することにより、トリプル・トランスジェニックマウスを作製した。前核マイクロインジェクション技術を用いて、これらの単胚細胞内に2つのトランスジーンを同時にマイクロインジェクションした。
【００５９】
2つのトランスジーンは、ヒト・スウェーディッシュAPP突然変異、又はヒト・タウ遺伝子内のP301LをコードするcDNA分子を含有した。これらのcDNA分子の双方を、マウスThy1.2遺伝子カセット内に個別に挿入し、この配列の調節制御下で発現させておいた。次いで、マイクロインジェクションされた胚を養母マウスに移し、3週間後に子マウスが生まれた。
【００６０】
これらの子マウスをスクリーニングして、サザン・ブロット分析によって、どれがトランスジーンを含有するかを同定した。系列のうちの5つが、両トランスジーンを含有していることが見出された。これらをホモ接合性突然変異プレセニリン-1ノックイン・マウスと戻し交雑した。マウスをホモ接合性プレセニリン-1ノックイン・マウスと戻し交雑することにより、突然変異プレセニリン-1トランスジーンは、ホモ接合性バックグラウンドで維持され、突然変異型のタウ・トランスジーン及びAPPトランスジーンはヘミ接合性バックグラウンドで維持されている。続いて、3つの全てのトランスジーン(プレセニリン-1、APP、及びタウ)がホモ接合性となるように、マウスを下記のように育種した。
【００６１】
多重トランスジェニックマウスを作製するための新規の戦略を図1に示す。突然変異ヒト遺伝子プレセニリン-1ノックイン(PS1M146V)に関してトランスジェニック型である2匹のマウスを交配させ、その結果生じた受精卵(胚細胞)を採取した。単胚細胞にThy1.2-APPSWE695及びThy1.2-TAUP301Lを同時マイクロインジェクションし、次いでこれを養母内に移植した。その結果生じた子孫は、多重トランスジェニック(この場合、PS1M146VKI/APPSWE695/TAUP301Lトリプル・トランスジェニック又は「3xTg-AD」)マウス系列の創始者であった。
【００６２】
云うまでもなく、このプロセスは、以前の育種戦略よりも、著しくシンプルで、高速であり、またコストの上で効果的なトランスジェニックマウス作製方法である。それというのも、マウス・コロニーの育種及び遺伝子型特定の手間が著しく低減されるからである。
【００６３】
タウ(P301L)遺伝子を含有するプラスミドは、Michael Hutton博士によって、また、APPswe遺伝子を含有するプラスミドは、Rachel Neve博士によって提供された。ヒトβ-アミロイド前駆体タンパクの配列は、GenBank受託番号XM047793に見出される。ヒト・タウ遺伝子の配列は、GenBank受託番号11426018に見出される。
Thy1.2遺伝子は、Pico Caroni博士によって提供された。Thy1.2遺伝子の配列は、GenBank受託番号M12379に見出される。
【００６４】
創始者系列。図2に示すチャートは、図1に示して上述した同時ミクロインジェクション戦略から得られた6つの創始者系列に該当する遺伝子型を含む。図2に示すように、創始者系列の全てがPS1M146V KIに関してホモ接合性であり、6つの系列のうちの5つ(A2, B1, F5, F7及びG6で示す)が、APPSWE695及びTAUP301Lに関してヘミ接合性である。創始者系列のうちの1つ(A1で示す)が、TAUP301Lに関してのみヘミ接合性である。
【００６５】
発現研究。3つの創始者系列及び1つの非トランスジェニック対照に由来するタンパク質(80μg)を含有する免疫ブロットを、マウス及びヒト双方のタウ・タンパクを検出する抗体であるTauC17、及びヒトのタウ・タンパク質に対して特異的な抗体であるHT7でプローブした。TauC17抗体はSanta Cruz製(品番SC-1995)であった。HT7はInnogenetics製(品番BR-01)であった。
【００６６】
その結果を図3に示す。図示のように、創始者マウス系列のうちの2つA1及びB1は、ヒト・タウ・タンパクを発現させた(2重のバンドはタウ・タンパクのイソ形に起因する)。G6系列も、このヒト特異的タンパク質で検出されるヒト・タウ・タンパクを低レベルで発現させたが、しかしマウス・タウ・タンパクを高レベルで発現させた(データは示さない)。
【００６７】
同様に、図4に示すように、3つの創始者系列及び1つの非トランスジェニック対照に由来するタンパク質を含有する免疫ブロットを、マウス及びヒト双方のAPPタンパクを検出する抗体である22C11、及びヒトのAPPタンパクに対して特異的な抗体である6E10でプローブした。22C11抗体はChemicon International製(品番MAB348)であった。6E10抗体はSignet製(品番9320-02)であった。この図から明らかなように、図3においてヒト・タウ・タンパクを発現させることが示された創始者マウス系列B1は、ヒトAPPタンパクをも発現させた。フルレングスAPPタンパクがβ-セクレターゼで処理されると、タンパク質分解フラグメントC99が作製される。このC99は、高アミロイド発生性アミロイド-β(Aβ)ペプチドのための即時型前駆体である。図5において、B1型トリプル・トランスジェニック3xTg-ADマウスの脳、及び、プレセニリン-1ノックイン対照マウスの脳から分離されたタンパク質を6E10でプローブした。C99フラグメントは、B1トリプル・トランスジェニックマウスに由来する組織内にのみ見出された。このことは、B1マウスがヒトトランスジーンに由来するAPPタンパクを発現し、且つプロセッシングすることを示唆する。
【００６８】
このことは図6において更に実証される。図6には、B1マウス(T13B1)がまた、APPをAβにプロセッシングしたことが示されている。図6Aにおいて、T13B1マウス及び非トランスジェニック対照マウスに由来するタンパクを含有するウェスタン・ブロットを、1:500希釈率の一次抗体6E10でプローブした。B1マウスは、APPのAβフラグメントを発現させたが、しかし対照マウスはこれを発現させなかった。
【００６９】
ELISA試験を用いて、B1マウス、及び高レベルのAβを発現させることで知られているトランスジェニック対照マウスTg2576において、Aβの2つのイソ形、すなわちAβ40及びAβ42を測定した。Aβ42イソ形は、2つのイソ形のうちで、アミロイド発生性がより高く、Aβ40に対するAβ42の比(42/40比)は、アルツハイマー病患者において増大する。
【００７０】
図6Bに示すように、B1マウスは、両Aβイソ形を発現させるが、しかし、Tg2576よりも42/40比が高い。このことは、B1トリプル・トランスジェニックマウスが、アルツハイマー病と合致する特徴をより厳密に示し、従って、この疾患の改善されたマウス・モデルを提供することを示す。
【００７１】
上述のように、ヒトAPPSWE及びヒトTauP301Lをコードする2つの独立したトランスジーンを、両方ともマウスThy1.2調節要素の制御下で、ホモ接合性突然変異PS1M146Vノックイン(KI)マウスから採取された単胚細胞内に同時マイクロインジェクションすることにより、F1ヘミ接合性トリプル・トランスジェニックマウスを作製した（図1）。サザン・プロッティングによる遺伝子型分析は、タウ・トランスジーン及びAPPトランスジーンが同じ遺伝子座に共に組み入れられることを示した。この発見はさらに、後続の作製において伝達頻度の分析により確認された(データは示さず)。
【００７２】
APPトランスジーン及びタウ・トランスジーンの独立組み合わせは生じそうもなく、そしてM146V突然変異が内因性マウスPS1遺伝子座15に「ノックイン」されたので、マウスが3つのトランスジーンを含有しても、これらの3xTg-ADマウスは事実上、「単一」トランスジェニック系列と同じく容易に繁殖する。このことは、マウス・コロニーの確立及び維持を容易にし、そして子孫の遺伝子型分析の必要性を低減する。さらに、この戦略は他の重要な実際的な利益をもたらす。それというのも、3xTg-ADマウスが同じ遺伝的バックグラウンドを有しており、これにより、独立したトランスジェニック系列の交雑時には回避することのできない交絡生体変数を排除するからである。
【００７３】
実施例3:ホモ接合性トリプル・トランスジェニックマウス
3つの全てのトランスジーン(PS1M146V, TauP301L, APPSWE)に関してホモ接合性のマウスを作製するために、ヘミ接合性F1を互いに交雑させた。図7は、潜在的なホモ接合性候補マウスを同定するサザン・ブロットを示す。ホモ接合性マウスは、サザン・ブロッティングにより視覚化され得るように、ヘミ接合性マウスと比較して遺伝子量を2倍にした。このようなデータは、潜在的ホモ接合性動物を、正常な非トランスジェニックマウスと交雑させることにより確認することができる。サザン・ブロットにより予測されるように、マウスがホモ接合性の場合、子孫の全てがトランスジーンの特徴に関して陽性となる。このような交雑の結果を図7に示す。同定された陽性トランスジェニックマウス数及び作製されたマウス数が示された表の備考欄によって示されるように、子孫の100%がホモ接合性であることが判った候補マウスの全てが、トランスジェニックマウスであった。
【００７４】
図8Aにおいて、ヘミ接合性及びホモ接合性双方のB1トリプル・トランスジェニックマウス、並びに、対照プレセニリン-1ノックイン単一トランスジェニックマウスから採取したタンパク質を、ヒトAPPに対する6E10抗体、ヒト・タウ・タンパクに対するHT7抗体、又はβ-アクチンに対する抗体(各マウス系列に由来するタンパク質の等しい量が、免疫ブロットを作製するのに使用されるゲル上にローディングされたことを保証するために使用される対照)でプローブした。予想通り、両B1マウスは、タウ及びAPPの両タンパク質を発現させるとともに、ホモ接合性B1マウスは、ヘミ接合性B1マウスの2倍の量のタウ・タンパク及びAPPタンパクを発現させた。プレセニリン-1ノックイン・マウスは、タウ・タンパクを示さず、またAPPタンパクを少量しか示さない。このAPPタンパクは、マウスAPPタンパクの交差反応性から生じるものである。
【００７５】
遺伝子量の2倍化は、選択されたマウスにおいてサザン・ブロッティング(図8B)によっても明らかである。このマウス・コロニーの育種及び維持を更に容易にする他に、ヒトのタウ・トランスジーン及びAPPトランスジーンの作製物の発現レベルは、ホモ接合性マウスにおいて2倍になる(図8C)。タウ及びAPP双方の定常状態レベルは、ヘミ接合性マウスの脳内の内因性レベルの約3〜4倍、及びホモ接合性マウスの脳内の内因性レベルの約6〜8倍に接近する(図8D)。ヘミ接合性及びホモ接合性の双方の3xTg-ADマウスが維持されると、発現レベルが同じ遺伝的バックグラウンドのマウスにおいて2倍になるという状況において、これらの遺伝子相互作用が齢の関数として及ぼす影響を研究することが可能になる。
【００７６】
実施例4：トリプル・トランスジェニックマウスにおける病理変化
B1トリプル・トランスジェニックマウス及びPS1-KI対照(単一トランスジェニック)マウスの脳から切片を調製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。B1マウス(図9)に由来する脳切片は、アルツハイマー病患者の脳内に見られるのと同様の、矢印によって示されたもつれ様病理を示す。この病理変化は、PS1-KI対照マウスから摂取された脳切片には見られない。
【００７７】
トリプル・トランスジェニックマウスに由来する脳切片は、アルツハイマー病患者の脳内の共通の特徴であるAβ沈着をも示す。図10において、ヒトAPPに対する6E10抗体で染色された、B1トランスジェニックマウスに由来する脳切片がAβ沈着を示している。
【００７８】
実施例5：3xTg-ADマウスにおけるヒトトランスジーンの定常状態レベルの分析
マウスThy1.2発現カセットは、トランスジーン発現の大部分をCNSで行わせることが実証された{Caroni,P.(1997)「成年マウスのニューロンにおける成長関連タンパク質の過剰発現(Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult trangenic mice)」J. Neurosci. Methods 71,3-9}。B1 3xTg-AD系列(最高発現系列と特徴付け済)に由来する複数の周辺組織におけるヒトのAPP及びタウを免疫ブロット分析することにより、発現の大部分がCNAに限定される(発現が専らCNAに限定されるのではない場合)ことが確認された(図11A)。CNSのどの領域がヒトのAPP及びタウ・タンパクを発現させるのかを見極めるために、複数の脳部位(海馬、皮質、小脳など)を顕微解剖し、タンパク抽出物を調製し、そしてトランスジェニックヒト・タンパク質をウェスタン・ブロッティングによって測定した(図11B)。図示のように、海馬及び大脳皮質を含むAD関連部位は、トランスジーン由来のヒトAPPタンパク及びヒト・タウ・タンパク双方を最高定常状態レベルで含有する部位の中にあった。その他の部位、例えば小脳は、トランスジェニックタンパクを含有しているようには見えなかった。その理由は、これらのタンパクが小脳に発現されなかったか、或いは、急速に退化したからである。
【００７９】
APPタンパクがAβフラグメントを遊離するようにプロセッシングされたか否かを見極めるために、ヘミ接合性マウス及びホモ接合性マウスに由来するホモジェネートを、免疫沈降/ウェスタン・ブロッティングによって分析した。図11Cは、Aβ由来抗体によるプローブの後に、ヘミ接合性脳に対してホモ接合性脳において2倍の多さで4-kDaの種が存在することを示している。また、齢及び性別が一致したNonTgマウス、ヘミ接合性3xTg-ADマウス及びホモ接合性3xTg-ADマウスの脳において、ELISAによって、Aβ40レベル及びAβ42レベルを比較した。3xTg-AD脳において、齢の関数としてAβ製造量が漸増し、Aβ42に対して特に劇的な効果が生じる(図11D)。
【００８０】
実施例6:3xTg-ADマウスにおいて、Aβ沈着がタウ病理に先行する。
ニューロン内Aβ免疫反応性は、3xTg-ADマウスにおける最も早期の神経病理徴候の1つであり、先ず新皮質部位において、続いてCA1錐体ニューロンにおいて検出可能である。細胞内Aβ免疫反応性は、3xTg-ADマウスの新皮質において、月齢3〜4ヶ月で明らかになり、月齢6ヶ月までに、ヘミ接合性及びホモ接合性マウスの海馬のCA1サブフィールドにおいて明らかになる(図12A,D)。これに続いて、数ヶ月後に、細胞外Aβ沈着物が出現する(図12B,C)。ニューロン内染色と同様に、細胞外Aβ沈着物の最大の塊が、前頭皮質に先ず見出され、大部分が層4〜5に発生するが、しかし、より高齢のマウスにおいてはその他の皮層及び海馬に関与する。12ヶ月までには、細胞外Aβ沈着物が、その他の皮質部位において容易に明らかになる。このことは、ヒトAD脳に見出されたパターンを厳密に模倣した3xTg-ADマウスにおいて、Aβ沈着物に対する加齢性の部位依存性が存在することを示唆している。Aβ沈着の漸増は、ELISAデータによって確認される(図11D)。
【００８１】
このアプローチは3xTg-ADマウスを作製するために用いられるので、タウ・トランスジーン及びAPPトランスジーンの双方は、同じ脳部位において同等レベルまで発現される。その結果、これらのマウスは、アミロイド・カスケード仮説を直接的に試験するために使用することができる。この仮説は、Aβが、ADの全ての事例の根底を成す誘発トリガーであると予測している{Hardy,J & Selkoe, D.J.(2002)「アルツハイマー病のアミロイド仮説：進行、及び治療への過程の問題(The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics) Science 297,353-56)}。月齢6〜15ヶ月の範囲の3xTg-ADマウスにおけるAβ病理及びタウ病理の発生を比較した(図12d-f及び12g-i参照)。細胞内Aβ免疫反応性が海馬(及び皮質における細胞外Aβ沈着物)において月齢6ヶ月までに存在するのに対し、この月齢では有意なタウ免疫反応性は存在しない(図12g)。ヒト・タウ免疫反応性は、CA1ニューロンにおいて月齢12ヶ月で先ず明らかになり、体性樹状区画の広範囲な免疫標識を示し、15ヶ月までに染色を漸増させる(図12H,I)。
【００８２】
実施例7:タウ病理は海馬で始まり、新皮質まで進行する。
ヒト特異的タウ抗体HT7に対して免疫陽性のニューロン部分集合は、リン酸タウに対して特異的な、幾つかの立体配座抗体とも免疫反応性を有する。これらは、立体配座特異的抗体MC1(図13A,B)、セリン202及びトレオニン205でリン酸化されたタウを検出するAT8(図13C)、及び、トレオニン231におけるリン酸化タウを検出するAT180(図13D,E)を含む。図示のように、タウは、3xTg-ADマウスの脳内の複数の残基において異常に高リン酸化されている。Aβ染色とは対照的に、タウ免疫染色は、海馬のCA1部位において先ず明らかになり、次いで、皮質ニューロンに徐々に関与した(図13F)。組織学的染色、例えばGallyas及びチオフラビンSも、タウ反応性ニューロンを同定することができる(図13G, H)。最後に、細胞外Aβ沈着物に隣接して、反応性星状細胞も容易に明らかであることが判った(図13J)。
【００８３】
3xTg-ADマウスは、進行性且つ加齢性のAβ病理及びタウ病理を発生させる。本明細書中に示された分析は、Aβ病理がタウ病理に先行することを示す。既に報告されているように、Aβ病理は、タウ病理の発生に影響を与える{Lewis, J.他(2000)「突然変異形のタウ及びAPPを発現させるトランスジェニックマウスにおける、高められた神経原線維変性(Enhanced neurofibrillary degeneration in transgenic mice expressing mutant tau and APP)」Science 293, 1487-91; Gotz, J.他(2001)「Aβ42原線維によって誘発されたP301lタウトランスジェニックマウスにおける神経原線維のもつれの製造(Formation of neurofibrillary tangles in P301l tau transgenic mice induced by Aβ42 fibrils)」Science 293,1491-5}。Aβ病理及びタウ病理は3xTg-ADマウスの異なる脳部位(例えばAβは皮質、またタウは海馬)において開始されるが、これは、Aβがタウ病理に影響を与えるという概念と矛盾するものではない。Aβがタウ病理に影響するという仮説はさらに、二重標識付け免疫組織化学によって明らかにされたように(図13I)、タウ及びAβの免疫反応性が同じニューロンに共に局在化され得るという発見によっても支持される。その結果、細胞内Aβ免疫反応性(最初に検出される病理徴候)は、タウ病理の発生に影響を与えると考えられる。
【００８４】
実施例8:3xTg-ADマウスにおける加齢性シナプス機能障害
ニューロン及びシナプスの機能障害は、AD神経病理の主要な表現型徴候である。シナプス機能障害は例えば、ADを特徴付ける記憶及び認知の変化と最大の相関関係にある。CA1海馬部位にシナプス機能の加齢性障害があるか否かを見極めるために、月齢1ヶ月及び6ヶ月のホモ接合性3xTg-ADマウスを比較した。年齢及び性別が一致したNonTg及びPS1M146VKIマウスを、対照として使用した。PS1M146VKIマウスを評価して対照として使用したのは、この系列の電気生理学特性が未知であり、しかも3xTg-ADマウスはこの系列に直接的に由来するものであったからである。このように、シナプス機能に対するPS1突然変異の効果を見極めることは、極めて重大であった。加えて、6ヶ月の時点を選択したのは、細胞外Aβ沈着物が新皮質においてのみ明らかであり、そして、細胞内Aβ免疫反応性が明らかであるにもかかわらず、細胞外Aβ沈着物は海馬のCa1部位では明らかではないからである。このことは、シナプス機能障害がこれらのマウスにおける斑及びタウ病理に先行するか否かを我々が見極めるのを可能にした。
【００８５】
基礎シナプス伝達を調査するために、増大する刺激強度においてシェーファー側副枝を刺激することによりCA1に誘発されるフィールド興奮性シナプス後電位(fEPSP)を測定することによって、入力/出力(I/O)曲線を作製した。月齢1ヶ月のPS1M146VKIマウスと3xTg-ADマウスとの間のI/O曲線は、NonTgマウスとは有意には異ならなかった(図14A)。対照的に、6ヶ月のPS1M146VKIマウス及び3xTg-ADマウスは、NonTgマウスと比較して、試験された全ての刺激強度において小さなfEPSP勾配及び振幅を示し、また、最大fEPSPを著しく低減した(図14B)。しかし、PS1M146VKIマウスは、3xTg-ADマウスとは有意には異ならなかった(P<0.1)。これらの結果は、基礎シナプス伝達が、月齢6ヶ月のPS1M146VKIマウス及び3xTg-ADマウスの双方において損なわれていることを示す。
【００８６】
パルス対促進(PPF)、つまり短期可塑性の尺度も測定した。月齢1ヶ月のPS1M146VKIマウス及び3xTg-ADマウスには差異は観察されなかった(図14C)。月齢6ヶ月では、NonTgマウスと3xTg-ADマウスとの間の促進量に差はなかった(NonTg, 31 ±1.5%; 3xTg-AD, 30 ±2.7%, P<0.5)が、しかしPS1M146VKIは、NonTgマウスと比較して、PPFの著しい増大を示した(43 ±2.9%, P<0.01;図14D)。PPFの根底を成すメカニズムは、シナプス前性であると考えられ{Zucker, R.S. & Regehr, W.G.(2002)「短期シナプス可塑性(Short-term synaptic plasticity)」 Anuu. Rev. Physiol 64, 355-405)}、そして第1刺激後には、おそらく神経末端内の残留Ca2+に関与し、これにより、第2刺激中の神経伝達物質の放出量を増大させる{Thomson, A.M.(2002)「中心シナプスにおける促進、増加及び増強(Facilitation ,augmentation and potentiation at central synapses)Trends Neurosci. 23, 305-12}。図示の結果は、3xTg-ADマウスにおいて、シナプス前メカニズムは無傷であり、そしてPS1M146VKIマウスにおける促進の増大は、細胞内Ca2+を処理する際の変化に起因することを示唆している{Leissring M. A.他(2000)「突然変異プレセニリン-1ノックイン・マウスにおける容量性カルシウム流入の欠損及び管腔カルシウム含有量の上昇(Capacitative calcium entry deficits and elevated luminal calcium content in mutant presenilin-1 knockin mice)」 J. Cell Biol. 149, 793-8; LaFerla, F.M. (2002)「アルツハイマー病におけるカルシウムのホメオスタシス異常及び細胞内シグナル化(Calcium dyshomeostasis and intracellular signaling in Alzheimer's disease)Nat. Reviews Neurosci. 3, 862-872}。
【００８７】
学習及び記憶の根底を成すと考えられている可塑性の形態である長期増強(LTP){Bliss, T.V. & Collingridge, G.L.(1993)「記憶のシナプス・モデル：海馬における長期増強(A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus)」Nature 361, 31-9}を、CA1海馬部位において調査した。月齢1ヶ月の系列間には差異は観察されなかった(図14E)。月齢6ヶ月の3xTg-ADマウス内のLTPも調査し、最初の試験で、3xTg-ADマウスにおいてLTPが重度に損なわれることが判った。しかし、LTP誘導プロトコルが用いた刺激強度は、ベースライン刺激及び高周波刺激(HFS)中、最大fEPSP勾配の〜30%を誘発したので、より小さな絶対fEPSPがLTP欠損の原因となると考えるのが妥当である。
【００８８】
この可能性に対処するために、ベースラインfEPSP規模をNonTgマウスのベースラインfEPSP規模に適合させるように、刺激強度を調節した。これらの試験におけるLTP規模は、より弱い刺激が用いられたときには有意な差を示さなかった(データは示さず)。このことは、最大の影響は度外視できないものの、基礎伝達を低減することはおそらくLTPの欠損の原因とはならないことを示す。3xTg-ADマウスから得られた全てのデータを続いてプールし、低減されたLTPを実証した(図14F)。これとは対照的に、PS1M146VKIマウス内のLTP は事実上正常であり、HFSから50-60分後では、NonTg対照と比較してfEPSPが弱いにもかかわらず、NonTgマウスとの差はなかった。しかし、PS1A246E変異形を過剰発現させるトランスジェニックマウスにおいても報告されているように(Parent,A.前掲書)、PS1M146VKIマウスには、HFS後の最初の10分間にLTPが著しく高くなる傾向があった。3xTg-ADマウスと同様に、ベースラインfEPSPをNonTgレベルに上昇させても、有意に異なるLTP規模は生じず、従ってこれらのデータをプールした。
【００８９】
これらの結果は、細胞内Aβの出現とともに、しかし細胞外の斑及びタウ病理の製造に先立って、3xTg-ADマウスが基礎シナプス伝達及びLTPの欠損を呈することを示す。対照的に、PS1M146VKIマウスは、基礎シナプス伝達の欠損にもかかわらず、増大したLTPに対して正常であることを実証した。このことは、伝達の根底を成すメカニズムと、3xTg-ADマウスにおけるLTP欠損とが無関係であることを示唆している。これらの研究において比較された全ての群は、同じ遺伝的バックグラウンドを有する。このことは分析を大いに助ける。それというのも、LTPは、異なる近交マウス系統内では著しい影響を受けるおそれがあるからである{Nguyen, P.V.他(2000)「LTPにおける、系統に依存する差異及び近交マウスにおける、海馬に依存する記憶(Strain-dependent diffrences in LTP and Hippocampus-dependent memory in inbred mice)」Learn. Mem. 7, 170-9}。これら2つのモデル(すなわち3xTg-AD及びPS1M146VKI)のシナプス機能不全を続いて特徴付けすることは、関係する根底メカニズムと、ADに関わる種々異なる遺伝子突然変異の関与とを解明する助けになる。加えて、将来の研究が、シナプス機能に対するAβ病理及びタウ病理の関係を識別するのを助けることになる。
【００９０】
多重トランスジェニック動物、具体的にはADのトリプル・トランスジェニックモデルを発生させるための新規の戦略が、本明細書中に開示されている。交雑育種と比較して、このアプローチは、幾つかの主要な利点を有する。APPトランスジーン及びタウ・トランスジーンは同じ遺伝子配座に共に組み入れられ、後続の世代においていずれかのトランスジーンが自由組み合わせを生じる見込みはなくなる。その結果、PS1突然変異の「ノックイン」に結び付けられたこのような密な連関は、3xTg-ADマウスが、特にこれらのマウスがまたホモ接合性に育種されてからは、任意の単一トランスジェニック系列と同じように容易に繁殖することを示唆する。従って、多数のこれらの3xTg-ADを誘導することは簡単であり、コスト上効果的である。さらに、このトランスジェニック系列が容易に維持されることにより、これらの3xTg-ADマウスを他のトランスジェニックマウス又は遺伝子標的マウスと交配させるのが容易になる。最後に、これらのアプローチに伴う主要な利点は、バックグラウンド遺伝構造を変化又は混合することなしに、多重トランスジーンが動物内に導入されることである。従って、重大な交絡変数が回避される。この交絡変数は、行動学的試験、電気生理学的試験及びワクチンに基づく試験にとって極めて重大な問題となるおそれがある。
【００９１】
図示のように、3xTg-ADは、加齢性且つ進行性の神経病理学的表現型を発生させる。この表現型はホモ接合性マウスにおいてより頑健である。細胞内Aβ免疫反応性は、これらのトランスジェニックマウスの脳において最初に明らかになる神経病理徴候である。AD病原{LaFerla, F.M.他(1997)「アルツハイマー病における神経細胞の死は、アポE取り込み及び細胞内Aβ安定化と相関する(Neuronal cell death in Alzheimer's disease correlates with apoE uptake and intracellular Aβstabilization)」J. clin. Invest. 100, 310-20; Gouras, G.K.他(2000)「ヒトの脳内のニューロン内Aβ42の蓄積(Intraneuronal Aβ42 accumulation in human brain)」Am. J. Pathol. 156, 15-20}及び関連障害封入体筋炎{Sugarman, M.C.他(2002) 「骨格筋におけるβAPPのトランスジーン過剰発現によって誘発される封入体筋炎様表現型(Inclusion body myositis-like phenotype induced by transgenic overexpression ofβAPP in skeletal muscle)」Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6334-9;Mendell, J.R.他(1991)「封入体筋炎におけるアミロイド線維:この新発見がフィラメントの性質の洞察を可能にする(Amyloid filaments in inclusion body myositis:Novel findings provide insight into nature of filaments)」Arch. Neurol. 48, 1229-34}において、細胞内Aβ沈着が重要であることの証拠がある。ニューロン内Aβはまた、他のADトランスジェニックマウス・モデルの脳内でも証明されている{Wirths, O.他(2001)「ベータ・アミロイド前駆体タンパク質及びプレセニリン-1のダブル・トランスジェニックマウスにおいて、ニューロン内Aβ蓄積が、斑製造に先行する(Intraneuronal Aβaccumulation precedes plaque formation in beta-amyloid precursor protein and presenilin-1 double-transgenic mice)」Neurosci. Lett. 306, 116-20; Li, Q. X.他(1999)「高齢トランスジェニックマウスの海馬におけるアルツハイマー病前駆体タンパク質の洗剤可溶性アミロイド発生性Aβフラグメントの細胞内蓄積(Intracellular accumulation of detergent-soluble amyloidogenic Aβfragment of Alzheimer's disease precursor protein in the hippocampus of aged transgenic mice)」J. Neurochem. 72, 2479-87:Kuo, Y.M.他(2001)「APP23トランスジェニックマウス内に負荷されたAβペプチドの進化:アルツハイマー病におけるAβ沈着の意味(The evolution of Aβpeptide burden in the APP23 transgenic mice: implications for Aβdeposition in Alzheimer disease)」Mol. Med. 7, 609-18; LaFerla, F.M.他(1995)「アルツハイマー病のAβペプチドはトランスジェニックマウスにおいて、神経変性及びアポトーシス細胞死を誘発する(The Alzheimer's Aβpeptide induces neurodegeneration and apoptotic cell death in transgenic mice)」Nat. Genet. 9, 21-30}。しかし、ニューロン内Aβが細胞外Aβ沈着物源であると推測することは誘惑的ではあるものの、ニューロン内Aβの病理生理学的な関連性はまだ解明されていない。本明細書では、CA1錐体ニューロン内のニューロン内Aβの発生が、LTPの欠損を含むシナプス伝達の障害と相関することが判る。シナプス伝達及びLTPの欠損が顕在的な斑及びタウ病理に先行するという発見は、シナプス機能障害がADの早期徴候であることを示唆している。さらに、これらの研究は、細胞外Aβ沈着が、シナプス機能障害の根底を成す原因要素ではないことを示す。このことは、可溶性Aβオリゴマーがin vivoでLTPを阻害することを示す最近の発見{Walsh, D.M.他(2002)「アミロイド・ベータ・タンパクの自然分泌オリゴマーが海馬の長期増強をin vivoで強力に阻害する(Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo)」Nature 416, 535-9}とうまく一致する。
【００９２】
本明細書ではまた、Aβ病理がこのモデルにおいてタウ病理に先行することが判る。APP及びタウ・トランスジーンは、同等レベルに発現されたので、この観察はアミロイド・カスケード仮説の強力な試験的サポートとなる。この仮説は、過剰作製、誤代謝又はクリヤランスの不足として発生するAβ蓄積が、全てのAD形態の根底を成す誘発トリガーであると仮定する。Aβ病理及びタウ病理の双方を3xTg-ADマウス・モデルにおいて発生させることは有意義である。それというのも、このことは、ADの神経病理をより厳密に模倣した動物モデルにおける潜在的な治療介入(例えばAβ免疫化)をより正確に評価することを可能にするはずだからである。加えて、このモデルは、Aβ病理又はタウ病理のいずれかを調節すると、他方の病理の発生に影響を与えるか否かを見極めるのに有用となる。
【００９３】
本発明を好ましい実施態様を参照しながら詳細に説明してきたが、云うまでもなく、本発明はこれらの実施態様そのものに限定されるものではない。むしろ、本発明を実施するための目下最良の形態を記載するこの開示内容に照らして、本発明の範囲及び思想を逸脱することなしに、多くの改変形及び変更形が存在することは当業者には明らかである。具体的には、本発明は、記載された特定の方法、プロトコル、細胞系列、動物の種又は属、構造、及び試薬に限定されるものではなく、当業者には明らかなように、種々に変更をこれに加えることができる。従って、本発明の範囲は、前述の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲と同等の意味及び範囲の中にある全ての変化、改変及び変更は、特許請求の範囲内にあるものとして考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】3xTg-ADマウス・モデルを作製するための新規戦略の構成を示す図である。突然変異ホモ接合性PS1M146Vノックイン・マウスから単胚細胞を採取した。前核マイクロインジェクション技術を用いて、マウスThy1.2調節要素の制御下で、ヒトAPPSWE及びTauP301L(4R/0N)をコードする独立した2つのトランスジーン構造を同時注入した。マウスThy1.2ゲノム配列全体を図示するとともに、エクソンはボックスとして、非コード配列は細線として示す。インジェクトされた胚を養母中に再移植し、そしてその結果生まれた子孫の遺伝子型を特定することにより、3xTg-ADマウスを同定した。
【図２】トリプル・トランスジェニックマウスを作製する新規戦略の成功を示すデータと共に示す図である。
【図３】トリプル・トランスジェニックマウス内のヒト・タウ・タンパクの発現を実証するウェスタン・ブロットのオートラジオグラムである。TAUC17は、ヒト及びマウス双方のタウ・タンパクを検出する抗体である。HT7は、ヒト・タウ・タンパクに対して特異的な抗体である。
【図４】トリプル・トランスジェニックマウスにおけるヒトAPPタンパクの発現を実証するウェスタン・ブロットのオートラジオグラムである。22C11は、ヒト及びマウス双方のAPPを検出する抗体である。6E10は、ヒトAPPタンパクに対して特異的な抗体である。
【図５】トリプル・トランスジェニックマウスの脳組織におけるC99の発現を実証するウェスタン・ブロットのオートラジオグラムである。
【図６】Aは、トリプル・トランスジェニックマウスにおけるAβタンパクの発現を実証するウェスタン・ブロットのオートラジオグラムである。Bは、トリプル・トランスジェニックマウスにおけるAβ発現をさらに実証するELIZA結果を示すチャートである。
【図７】Aは、選択されたホモ接合性候補マウスにおけるDNAレベルを示すサザン・ブロットである。Bは、ホモ接合性を成功裡に育種することを示すデータを含むチャートである。
【図８】Aは、ホモ接合性トリプル・トランスジェニックマウスが、ヘミ接合性マウスのレベルの2倍でヒトTAU及びヒトAPPを発現させることを示すウェスタン・ブロットである。βアクチンは対照として示されている。Bは、ヘミ接合性マウス及びホモ接合性マウスの尾部DNAから、タウ・トランスジーン及びAPPトランスジーンの遺伝子量を比較する代表的なサザン・ブロットである。Cは、月齢4ヶ月のヘミ接合性及びホモ接合性3xTg-ADマウスの脳におけるヒトのAPP及びタウ・タンパクの定常状態レベルを比較する免疫ブロットである。APP(抗体22C11で検出)及びタウ(抗体タウ5で検出)の双方に関して、レベルは、ホモ接合性マウスにおいて2倍である。Dは、βAPP及びタウ・タンパクの定常状態レベルが、ヘミ接合性マウスの内因性レベルよりもほぼ3〜4倍高く、ホモ接合性マウスの内因性レベルよりもほぼ6〜8倍高いことを示す棒グラフである。
【図９】ヘマトキシリン及びエオシンで染色された、トリプル・トランスジェニックマウス(B1)及び対照マウス(PS1-KI)から得た脳の切片を示す写真である。CA3は海馬の部位であるのに対し、DGは脳の他の部位である歯状回である。矢印は、トリプル・トランスジェニックマウスから採取された脳切片に見出された病理変化、すなわち、もつれ様病理を示す。
【図１０】トリプル・トランスジェニックマウスから採取した脳切片を、ヒトAPPタンパクに対して特異的な抗体6E10で染色した状態を示す写真である。黒い領域は、トリプル・トランスジェニックマウスの脳の病理変化、つまりAβ沈着を示す。
【図１１】3xTg-ADマウスにおけるヒトトランスジーンの定常レベルの分析を示す。(A)免疫ブロット分析によって複数の周辺組織を調査することにより、トランスジーン発現プロフィールを測定した。タウ及びAPPは、中枢神経系(CNS)に専ら発現されるように見える。(B)ウェスタン・ブロットによる種々の脳亜区におけるトランスジーン作製物の定量比較。ADに冒される顕著な2つの部位である海馬及び大脳皮質は、最高定常状態レベルのヒトトランスジーン作製物を含有する脳部位の中にある。(C) Aβレベルはホモ接合性マウスにおいて2倍になる。(D)種々の齢のマウス(n=3/群)からELISAによって測定されたAβ40レベル及びAβ42レベル。既述のように{Parent, A.他(1999)「FADにリンクされたプレセニリン1を発現させるトランスジェニックマウスにおけるシナプス伝達及び海馬長期増強(Synaptic transmission and hippocampal long-term potentiation in transgenic mice expressing FAD-linked presenilin 1)」Neurobiol. Dis. 6, 56-62)}、レベルを測定した。非トランスジェニック(NonTg)マウス、ヘミ接合性マウス及びホモ接合性マウスを、それぞれ青、黄、及び赤の棒で示す。ヘミ接合性マウスとNonTgマウスとの統計的な差異を**で示し、これに対して、*は、ホモ接合性マウスがヘミ接合性マウス及びNonTgマウスとは統計的に異なることを示す。
【図１２】3xTg-ADマウス内でAβ沈着がタウ病理に先行することを示す。(A)新皮質内部のニューロンにおいて、Aβ免疫反応性が細胞内に先ず検出される。(B,C)新皮質の層4〜5に細胞外Aβ沈着物を示す月齢9ヶ月のホモ接合性マウスに由来する新皮質を、それぞれ低倍率及び高倍率で示す図である。(D〜F) ホモ接合性3xTg-ADマウス(それぞれ月齢6,12,15ヶ月)が、最初にCA1部位の錐体ニューロンにおいてニューロン内Aβ染色を示し(D)、次いで細胞外Aβ染色を示す(E,F)。(G〜I)海馬内には、ヒト特異的抗タウ抗体HT7で検出されるヒト・タウ免疫反応性が最初に現れ、加齢と共にこの反応性はより重篤になる(それぞれ月齢6,12,15ヶ月)。パネルA〜Fは、モノクローナル抗体6E10を使用したAβ免疫反応性を示し、パネルG〜Iは、抗体HT7を用いたタウ免疫染色を示す。元の倍率は5X(D-I)、10X(B)、20X(A,C)である。
【図１３】タウ病理が海馬内で始まり、新皮質にまで進行することを示す。(A,B)立体配座の特異的抗体MC1を用いた染色に続いて、免疫陽性錐体ニューロンを示す海馬を低倍率及び高倍率で示す図である。(C)抗体AT8を用いた染色に続いて、免疫陽性ニューロンを示す海馬を高倍率で示す図である。抗体AT8は、セリン202残基及びトレオニン205残基でリン酸化タウ・タンパクを検出する。(D,E) 抗体AT180を用いた染色に続いて、免疫陽性ニューロンを示す海馬を低倍率及び高倍率で示す図である。抗体AT180は、トレオニン231残基でリン酸化タウ・タンパクを検出する。(F)ヒト特異的タウ抗体HT7を用いた新皮質の免疫染色。(G,H)Gallyas銀ステイン及びチオフラビンSで染色された月齢12ヶ月のホモ接合性マウスに由来する新皮質脳部位を、高倍率で示す図である。(I)同じ錐体ニューロンの多くに共に局在化されたAβ及びタウを示す新皮質を、高倍率で示す図である。Aβは抗体6E10で免疫染色し、続いてトゥルー・ブルー(青染色)で検出し、これに対して、タウは抗体HT7で免疫染色し、続いてDAB(褐色染色)で検出した。(J)細胞外Aβ沈着物の周りには、GFAP免疫反応性星状細胞も存在する。元の倍率は、5X(A,D)、10X(F)、20X(C,I,J)、40X(B,E)、100X(G,H)である。
【図１４Ａ−Ｂ】3xTg-ADマウスにおける加齢性シナプス機能障害を示す。(A)刺激強度の増大時における入力/出力(I/O)曲線及び代表的なfEPSPを、NonTg、PS1PS1M146VKI及び3xTg-ADマウスに関して示す。これらは月齢1ヶ月では差異を示さない。NonTg, 1.42 ±0.17 mV/ms, n = 12個の切片(マウス6匹から); PS1 KI, 0.60 ±0.06 mV/ms, n = 14/8, P<0.001; 3xTg-AD, 0.53 ±0.06 mV/ms, n = 14/6, P<0.001。(B) NonTgマウスと比較して、より小さなfEPSPが、月齢6ヶ月のPS1M146VKI及び3xTg-ADマウスにおいて誘発される。このことはシナプス伝達の障害を示す。
【図１４Ｃ−Ｄ】3xTg-ADマウスにおける加齢性シナプス機能障害を示す。(C)パルス対促進(PPF)をパルス間インターバル50msで測定した。PPFは月齢1ヶ月の全ての群に関して正常であった。(D)月齢6ヶ月の3xTg-ADマウスは、NonTgと比較して正常なPPFを示したが、しかしPS1M146Vマウスは、著しく増大したPPFを示した。
【図１４Ｅ−Ｆ】3xTg-ADマウスにおける加齢性シナプス機能障害を示す。(E)fEPSP勾配を記録し、テタヌス前ベースラインのパーセンテージとして表した。LTP導入前(実線)及び導入から60分後(点線)の代表的なfEPSPが示されている。LTPは月齢1ヶ月の全ての群においては正常であった。(F)LTPは3xTg-ADマウスにおいて著しく損なわれた。対照的に、短期LTPはPS1M146VKIマウスにおいて増大したが、しかしその他では正常であった。HFSから0〜10分後のfEPSPの増強量は、NonTgマウス(n = 12切片、動物6匹)において232 ±13%であり、PS1PS1M146VKIマウスにおいては著しく高く(282 ±19%、n = 12切片、動物8匹、P<0.05)、しかし3xTg-ADマウスにおいては著しく低減された(143 ±6%、n = 14切片、動物6匹、P<0.001)。HFSから50〜60分後の増強量は、NonTgマウスにおいて190 ±11%であり、PS1PS1M146VKIマウスにおいては有意な差はなかったが(212 ±13%、P<0.1)、3xTg-ADマウスにおいては著しく低減された(125 ±8%、P<0.01)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ−Ｄ】
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【図１４Ｅ−Ｆ】
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【国際調査報告】
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