(57)【要約】本出願は、標的に結合するリガンドに関し、好ましくはそのリガンドは少なくとも１のスルフェート化またはスルフォネート化アミノ酸を有するペプチドを包含する。そのリガンドは生体分子のヘパリン結合部位に特異的に結合するのが好ましい。そのリガンドの製造と使用のための組成物、システム、および方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生体分子に結合するリガンドであって、前記リガンドが少なくとも１のスルフ(オン)エート化アミノ酸ならびに中性および陽性荷電アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸を有するペプチドを含有し、ここで標的生体分子に対する前記リガンドのKDは生理溶液中で約600μM未満であり、前記標的生体分子には前記リガンドに結合する少なくとも１のヘパリン結合部位があることを特徴とするリガンド。
【請求項２】
Kdが約60μM未満であることを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項３】
少なくとも２のスルフ(オン)エート化アミノ酸を更に含むことを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項４】
ペプチドが少なくとも１の疎水性アミノ酸を有する請求項１記載のリガンド。
【請求項５】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:1を含む配列を含み、導入SEQ ID NO:1のチロシンがスルフォネート化またはスルフェート化されていることを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項６】
導入SEQ ID NO:1の少なくとも１のアミノ酸が保存的に置換されていることを特徴とする請求項５記載のリガンド。
【請求項７】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:２、導入SEQ ID NO:３、導入SEQ ID NO:４、導入SEQ ID NO:５、導入SEQ ID NO:６、導入SEQ ID NO:７、導入SEQ ID NO:８、導入SEQ ID NO:９、導入SEQ ID NO:10、導入SEQ ID NO:13、導入SEQ ID NO:14、導入SEQ ID NO:15、導入SEQ ID NO:16、および導入SEQ ID NO:17から成る群から選択された少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のチロシンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項８】
導入配列が少なくとも１の保存置換を有することを特徴とする請求項７記載のリガンド。
【請求項９】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:２、導入SEQ ID NO:３、導入SEQ ID NO:４、導入SEQ ID NO:５、導入SEQ ID NO:６、導入SEQ ID NO:７、導入SEQ ID NO:８、導入SEQ ID NO:９、導入SEQ ID NO:10、導入SEQ ID NO:13、導入SEQ ID NO:14、導入SEQ ID NO:15、導入SEQ ID NO:16、および導入SEQ ID NO:17から成る群の一つのメンバーと少なくとも80％の相同性を有する少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のチロシンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項１０】
リガンドの標的がVEGFであることを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項１１】
ペプチドがセリン、チロシン、スレオニンおよびリジンのスルフ(オン)エート化誘導体から成る群の一つのメンバーを含むことを特徴とする請求項１０記載のリガンド。
【請求項１２】
リガンドの標的がATIIIであることを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項１３】
ペプチドがセリン、チロシン、スレオニンおよびリジンのスルフ(オン)エート化誘導体から成る群の一つのメンバーを更に含むことを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項１４】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:11、導入SEQ ID NO:12、導入SEQ ID NO:18、導入SEQ ID NO:19、導入SEQ ID NO:20、導入SEQ ID NO:21、導入SEQ ID NO:22、導入SEQ ID NO:23、および導入SEQ ID NO: 24から成る群から選択された少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のセリンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項１５】
導入配列が少なくとも１の保存置換を有することを特徴とする請求項１４記載のリガンド。
【請求項１６】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:11、導入SEQ ID NO:12、導入SEQ ID NO:18、導入SEQ ID NO:19、導入SEQ ID NO:20、導入SEQ ID NO:21、導入SEQ ID NO:22、導入SEQ ID NO:23、および導入SEQ ID NO: 24から成る群の一つのメンバーと少なくとも80％の相同性を有する少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のセリンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項１７】
リガンドに、リガンドを患者に運搬するための運搬担体が付随していることを特徴とする請求項１記載のリガンド。
【請求項１８】
運搬担体がリポソームである請求項１７記載のリガンド。
【請求項１９】
ヘパリン結合性生物学的標的とリガンドを結合する方法であって、リガンドを標的に晒し、前記リガンドが少なくとも１のスルフ(オン)エート化アミノ酸ならびに中性および陽性荷電アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸を有し、ここで標的に対する前記リガンドのKDは生理溶液中で約600μM未満であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
晒すことがリガンドの患者への注入によって行われることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
注入が、皮下注入、筋肉内注入、および腹膜内注入から成る群から選択されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
リガンドに運搬担体を付随させることを更に含む請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
ヘパリン結合性標的に特異的に結合するリガンドを作成する方法であって、
ヘパリン結合部位を含む標的を用意し、
複数のメンバーのセットであって、各メンバーが1個のペプチドを含むセットを用意し、ここでそのペプチドは少なくとも１のスルフ(オン)エート化アミノ酸ならびに中性および陽性荷電アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸を有し、
前記セットをスクリーニングして、標的に特異的に結合する前記セットの少なくとも１のメンバーを同定し、かつ
標的に特異的に結合する前記セットの少なくとも１のメンバーに対する化学的同一性を決定することによりリガンドを同定する、
ことを含む方法。
【請求項２４】
セットをコンビナトリアルケミストリーによって作成することを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
メンバーがペプチドであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも２のスルフ(オン)エート化アミノ酸を有するペプチドを含むようにリガンドを選択することを更に含む請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
リガンドが少なくとも１の疎水性アミノ酸を含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
標的が成長因子であることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
成長因子が、繊維芽細胞成長因子ファミリー、ヘパリン結合性上皮細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子ファミリー、形質転換成長因子ベータスーパーファミリー、インシュリン様成長因子、骨形態発生タンパク質、肝細胞成長因子、レイオトロフィン、神経成長因子、神経突起成長促進因子−１、VEGF、ATIII、bFGF、およびPDGFから成るセットから選択されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
約600μM未満のKDを持つようにリガンドをスクリーニングすることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
リガンドがSEQ ID NO:１の配列を含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
配列が少なくとも１の保存置換を有することを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:２、導入SEQ ID NO:３、導入SEQ ID NO:４、導入SEQ ID NO:５、導入SEQ ID NO:６、導入SEQ ID NO:７、導入SEQ ID NO:８、導入SEQ ID NO:９、導入SEQ ID NO:10、導入SEQ ID NO:13、導入SEQ ID NO:14、導入SEQ ID NO:15、導入SEQ ID NO:16、および導入SEQ ID NO:17から成る群から選択された少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のチロシンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
導入配列が少なくとも１の保存置換を有することを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:２、導入SEQ ID NO:３、導入SEQ ID NO:４、導入SEQ ID NO:５、導入SEQ ID NO:６、導入SEQ ID NO:７、導入SEQ ID NO:８、導入SEQ ID NO:９、導入SEQ ID NO:10、導入SEQ ID NO:13、導入SEQ ID NO:14、導入SEQ ID NO:15、導入SEQ ID NO:16、および導入SEQ ID NO:17から成る群の一つのメンバーと少なくとも80％の相同性を有する少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のチロシンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３６】
リガンドの標的がVEGFであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３７】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:11、導入SEQ ID NO:12、導入SEQ ID NO:18、導入SEQ ID NO:19、導入SEQ ID NO:20、導入SEQ ID NO:21、導入SEQ ID NO:22、導入SEQ ID NO:23、および導入SEQ ID NO: 24から成る群から選択された少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のセリンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３８】
導入配列が少なくとも１の保存置換を有することを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項３９】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:11、導入SEQ ID NO:12、導入SEQ ID NO:18、導入SEQ ID NO:19、導入SEQ ID NO:20、導入SEQ ID NO:21、導入SEQ ID NO:22、導入SEQ ID NO:23、および導入SEQ ID NO: 24から成る群の一つのメンバーと少なくとも80％の相同性を有する少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のセリンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項４０】
SEQ ID NO:12がスルフ(オン)エート化されていないセリンを含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
リガンドの標的がATIIIであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項４２】
標的が、天然または合成のヘパリン結合性生物分子および天然または合成のヘパリン結合性配列から成る群から選択されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項４３】
セットを、スルフ(オン)エート化セリン、スルフ(オン)エート化スレオニン、スルフ(オン)エート化チロシン、スルフ(オン)エート化リジン、およびこれらの保存置換から成る群の少なくとも１のメンバーを有するペプチドを含むように選択することを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項４４】
リガンドに、リガンドを患者に運搬するための運搬担体が付随していることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項４５】
標的に対するリガンドであって、前記リガンドは少なくとも１のスルフ(オン)エート化アミノ酸ならびに中性および陽性荷電アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸を有するペプチドを含み、前記リガンドは合成により得られ、標的上のヘパリン結合性部位に特異的に結合することを特徴とするリガンド。
【請求項４６】
標的がVEGFであることを特徴とする請求項４５記載のリガンド。
【請求項４７】
標的がATIIIであることを特徴とする請求項４５記載のリガンド。
【請求項４８】
標的に結合するリガンドであって、前記リガンドは少なくとも１のスルフ(オン)エート化アミノ酸を有するペプチドを含み、前記標的はヘパリン結合性上皮細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子ファミリー、形質転換成長因子ベータスーパーファミリー、インシュリン様成長因子、骨形態発生タンパク質、肝細胞成長因子、レイオトロフィン、神経成長因子、神経突起成長促進因子−１、VEGF、ATIII、およびPDGFから成る群から選択されることを特徴とするリガンド。
【請求項４９】
標的がVEGFであることを特徴とする請求項４８記載のリガンド。
【請求項５０】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:２、導入SEQ ID NO:３、導入SEQ ID NO:４、導入SEQ ID NO:５、導入SEQ ID NO:６、導入SEQ ID NO:７、導入SEQ ID NO:８、導入SEQ ID NO:９、導入SEQ ID NO:10、導入SEQ ID NO:13、導入SEQ ID NO:14、導入SEQ ID NO:15、導入SEQ ID NO:16、および導入SEQ ID NO:17から成る群から選択された少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のチロシンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項４９記載のリガンド。
【請求項５１】
導入配列が少なくとも１の保存置換を有することを特徴とする請求項５０記載のリガンド。
【請求項５２】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:２、導入SEQ ID NO:３、導入SEQ ID NO:４、導入SEQ ID NO:５、導入SEQ ID NO:６、導入SEQ ID NO:７、導入SEQ ID NO:８、導入SEQ ID NO:９、導入SEQ ID NO:10、導入SEQ ID NO:13、導入SEQ ID NO:14、導入SEQ ID NO:15、導入SEQ ID NO:16、および導入SEQ ID NO:17から成る群の一つのメンバーと少なくとも80％の相同性を有する少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のチロシンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項４９記載のリガンド。
【請求項５３】
標的がATIIIであることを特徴とする請求項４８記載のリガンド。
【請求項５４】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:11、導入SEQ ID NO:12、導入SEQ ID NO:18、導入SEQ ID NO:19、導入SEQ ID NO:20、導入SEQ ID NO:21、導入SEQ ID NO:22、導入SEQ ID NO:23、および導入SEQ ID NO: 24から成る群から選択された少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のセリンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項５３記載のリガンド。
【請求項５５】
導入配列が少なくとも１の保存置換を有することを特徴とする請求項５４記載のリガンド。
【請求項５６】
ペプチドが、導入SEQ ID NO:11、導入SEQ ID NO:12、導入SEQ ID NO:18、導入SEQ ID NO:19、導入SEQ ID NO:20、導入SEQ ID NO:21、導入SEQ ID NO:22、導入SEQ ID NO:23、および導入SEQ ID NO: 24から成る群の一つのメンバーと少なくとも80％の相同性を有する少なくとも１の配列を含み、前記導入配列のセリンがスルフ(オン)エート化されていることを特徴とする請求項５３記載のリガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願番号60/306,726、出願日2001年7月20日に基づく優先権を主張する。前記出願は、引用により本願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、生物学的化合物に作用する薬剤、特にスルフォネート化またはスルフェート化基を有するペプチドを含有する薬剤の製造および使用方法に関する。このような薬剤、特にタンパク質のヘパリン結合部位に結合する薬剤に関するコンビナトリアルケミストリーの方法と用途が記載されている。
【背景技術】
【０００３】
ヘパリンは、天然由来の生物分子であり、多くの医療用途に使用される。一つの用途は、生物分子アンチトロンビンIII(ATIII)へのヘパリンの結合性を利用するものである。ヘパリンは患者の血液中に導入され、血液中でATIIIに結合し、望ましからざる血液凝固の防止に役立つ。ヘパリンがATIIIに結合するのは、ATIII上の特異なヘパリン結合部位との相互作用による。ヘパリンの陰荷電スルフェートおよびスルフォネート基がこの結合に重要な役割を演じている。
【０００４】
ヘパリン結合部位を有する生物分子は多いが、ヘパリンのそれらへの結合は弱いか、または特異性が殆どない。患者に与えられたヘパリンは、標的への特異性がなければ他の生物分子に取り込まれてしまうので、標的への到達が妨げられる。仮に到達したとしても、結合が弱ければ効果は殆どない。実際にヘパリンには、他の分子との相互反応の特異性、速度、強度に関して制限が多い。
【０００５】
コンビナトリアルケミストリーは、多数の化学物質の製造およびそれらのスクリーニングに関する技術である。そのスクリーニングテストを利用して化学物質を試験し、どの化学物質が与えられた標的に関連して有用な化学特性を有するかを決定する。コンビナトリアルケミストリーは多くの薬物の製造に使用されて成功を収めている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、リガンド、特にヘパリンのある機能を模倣し、またある環境に置かれるとヘパリン機能が向上するリガンドを製造するシステムと方法の提供である。このリガンドには、スルフォネート化またはスルフェート化した化学基があり、スルフォネート化またはスルフェート化したアミノ酸が好ましい。へパリン性化合物を製造するシステムは、スルフォネート化またはスルフェート化したアミノ酸を組み込むコンビナトリアルケミストリープロセスを利用する実施例を包含する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明リガンドを使用する利点は、与えられた用途に合わせてそのリガンドを調整することができることである。例えば、ヘパリンを模倣していながら、分解がヘパリンより速いまたは遅いリガンドを作ることができる。あるいは、標的とする小集団にのみ結合する様にリガンドを調整して、ヘパリン結合タンパク質のある小集団のみを標的にすることも望ましい。ヘパリン性化合物を模倣するリガンドを製造する本システムおよび方法によって、特異的なヘパリン結合タンパク質を標的とするリガンドを迅速に生産できることは有利である。
【０００８】
本発明の一実施例は、標的生物分子に結合するリガンドであって、このリガンドには少なくとも１のスルフ(オン)エート化（sulf(on)ated）アミノ酸を持ったペプチドがあり、同時にこのリガンドは標的生物分子に特異的に結合する。特異的に結合するには、KDが生理的溶液中で約600μM未満であるのが好ましい。また、ペプチドには少なくとも１の陽性電荷または中性電荷のアミノ酸があるのが好ましい。標的生物分子には少なくとも１のヘパリン結合部位があるのが好ましい。本発明の他の実施例はヘパリン結合性生物学的分子をリガンドと反応させる方法であって、この方法はリガンドを標的に曝露することを含み、そのリガンドには少なくとも１のスルフ(オン)エート化アミノ酸があり、またリガンドの標的生物分子に対するKDは生理的溶液中で約600μM未満である。
【０００９】
本発明の他の実施例は、ヘパリン結合標的と相互反応するリガンドを作成する方法であって、この方法には、ヘパリン結合部位を含む標的を用意すること、複数のメンバーのセットであって、各メンバーが1個のペプチドを含有し、そのペプチドは少なくとも１のスルフ(オン)エート化アミノ酸を有するセットを用意すること、前記セットを標的とスクリーニングして、標的に特異的に結合する少なくとも１のメンバーを同定すること、かつ標的に結合する少なくとも１のメンバーに対する化学的同一性を決定することによりリガンドを同定すること、が包含される。また、ペプチドには少なくとも１の陽性電荷または中性電荷のアミノ酸があるのが好ましい。
【００１０】
本発明の他の実施例には、標的に対するリガンドであって、スルフ(オン)エート化ペプチドを有するものが挙げられ、このペプチドには導入SEQ ID NO:１〜10および13〜17から成る群から選択される配列、およびこれら配列の保存置換を有する配列が含有され、これら配列にはチロシンのスルフ(オン)エート化が導入されることを特徴とする。また他の実施例は、標的に対するリガンドであって、スルフ(オン)エート化ペプチドを有するリガンドであり、このペプチドには導入SEQ ID NO:11、12および17〜24から成る群から選択される配列、およびこれら配列の保存置換を有する配列が含有され、これら配列にはセリンのスルフ(オン)エート化が導入されることを特徴とする。またこれらペプチドには少なくとも１の陽性電荷または中性電荷のアミノ酸があるのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ヘパリンの有用性は、ヘパリンが他の分子と結合する方法の多様性およびヘパリンが結合する分子の多様性に一部由来する。ヘパリンの陰性電荷をもったスルフェートおよびスルフォネート基は、他の分子上の陽電荷をもった基との結合を形成するのに役立つ。これらの結合は通常は静電的な相互作用を含む。他の重要な相互作用には、例えば親水性、疎水性、および配座効果によって推進されるものが挙げられる。荷電分子間の電荷対電荷の相互作用を静電的相互作用と言い、これには結合力または反撥力が含まれる。結合薬剤をリガンドと言う。リガンドが結合する分子を標的と言う。多くの生物学的プロセスはリガンドと標的の結合事象によって進行する。この結合事象には各種の効果があり、例えば他の分子と標的との結合を阻害すること、標的を活性化し標的に新たな機能を実行させること、あるいは標的を失活させて不活性なものにすること、が挙げられる。
【００１２】
多くの薬物はリガンドである。ある薬剤は標的を活性化する作動剤である。他の薬物は拮抗剤であり、標的と結合して他の生物分子が標的と反応するのを防止する。他の薬物は親和結合剤であり、標的に結合して標的を担体に固定する。ヘパリンの薬物としての使用は、アンチトロンビンIIIに結合することであり、それによりアンチトロンビンIIIはトロンビンを失活させる。トロンビンは血液凝固を支援するので、ヘパリン投与によりトロンビンが失活すると患者が血液凝固に襲われる危険が少なくなる。これらのリガンドと標的の結合事象は全て静電的相互作用により仲介される。
【００１３】
静電的相互作用は、通常生物学的結合において重要であり、生物活性剤、例えばマーカー、作動剤、拮抗剤および親和結合剤の製造に有用なことが多い。スルフェートおよびスルフォネートはある結合事象を仲介する。これらは陰性に荷電しているので生物学的分子上の陽性電荷と静電的に相互作用する。これらの親水性または疎水性および立体配座も結合事象に参画する。
【００１４】
天然において、スルフェートおよびスルフォネートを有する最も通常に存する生物分子は糖質様構造であり、例えばヘパリン、ヘパリン硫酸およびコンドロイチン硫酸である。天然においてタンパク質上にスルフェートが採用される程度は非常に低く、例えばアミノ酸のスルフェート化は、重要ではあるが、稀な翻訳後修飾である。細胞ではアミノ酸が鎖状に連結してタンパク質ができる。したがって、アミノ酸はモノマーであり、鎖はポリマーである。ペプチドには少なくとも２のアミノ酸があり、このアミノ酸は隣接していても離れていてもよい。アミノ酸ペプチドは、少なくとも部分的にその配列を記述すればよい。翻訳後修飾はアミノ酸ポリマーに対する変化であって、この変化は細胞でアミノ酸が重合してポリマーとなった後に起こる。反応してポリペプチドの一部を形成したアミノ酸を本明細書ではアミノ酸と呼ぶ。例えば、ペプチド結合を介して他のアミノ酸に連結したアミノ酸は、たとえその連結によってある構造的態様が変化してもアミノ酸と呼ぶ。
【００１５】
スルフェート化および／またはスルフォネート化アミノ酸を組み込んだペプチドを高度に荷電化した分子として、適切な対応構造を有する多数の生物学的物質に対し強力な結合性を発揮させることは可能である。したがって、スルフェート化および／またはスルフォネート化基を有するペプチドは、例えば各種の標的に結合するのに有用である。好ましい標的はヘパリンに結合するものである。これら標的にはヘパリン結合領域がある。生物ファミリー学で使用する結合の語は特異的結合を意味する。一般に、特異的結合には複数の非共有結合的な相互作用、例えば静電的相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合等が挙げられる。抗原−抗体結合、酵素−基質結合、特異的結合性タンパク質−受容体相互作用は、特異的結合の相互作用によって特徴づけられる。スルフェートまたはスルフォネートがカルボン酸に比して有利なのは、通常カルボン酸ではヘパリン結合部位に対する特異性が少ない点にある。
【００１６】
他の研究者によるヘパリンを模倣するアプローチはポリサッカライドの利用を指向してきた。ポリサッカライドは糖である。これら他の研究者はポリサッカライドを使用してポリサッカライドを模倣してきた。特に成功している模倣物はペンタサッカライドと云われる薬剤クラスに見出される。これら研究者の中には、スルフォネート化ポリサッカライドを使用している研究者もいる。デキストランを使用している研究者もいるが、これはポリサッカライドである(de Raucourtら、(1989))。ヘパリン模倣物としてポリサッカライドを使用する例と概観は、例えば、Herbertら(1998)、Herbertら(1996)、Logeart-AvamoglouおよびJozefonvicz(1998)、Ferct(2001)、van BoeckelおよびPetitou(1993)、Folkmanら(1989)、Zugmaierら(1992)、Parishら(1999)に記載されている。
【００１７】
他の研究者は各種のヘパリン模倣物を報告している。一つの例はスルフォン酸基を有するエンジニアリングポリマーである(例えば、Liekensら、1999)。ポリマーのこの基は繊維芽細胞成長因子−２(FGF−2)に対して指向した。エンジニアリングポリマーには、アミノ酸を取り込んだリガンドを利用する利点、例えばコンビナトリアル合成へのペプチドの適合性が欠けている。一般に、ペプチドはエンジニアリングポリマーに比較して崩壊および消失の特性が優れる。生物分子を指向するスルフェート化ペプチドは、例えばMuramatsuら(1997)に記載されている。Muramatsuと共同研究者が記載しているスルフェート化デカペプチドは、トロンビンの陰イオン結合性外在部位を指向しているが、この部位はトロンビンのヘパリン結合領域から離れている。Muramatsuらは、コンビナトリアルケミストリーのアプローチによりペプチドを使用してトロンビンに対するリガンドを開発することは記載していない。Bentolilaら(1999)はポリ(N-アクリルアミノ酸)ポリマー、例えばスルフェート化ヒドロキシプロリンを持つある種のポリマーを記載した。しかし、Bentolilaはヘパリン模倣物として活性なポリマーは全て陰性荷電密度がアミノ酸残基当たり少なくとも１であったと記載している。これに対し、本明細書では、荷電密度がアミノ酸残基当たり１未満の、有効なヘパリン模倣物であるリガンドを説明した実施例を報告する。Miaoら(1997)はFGF−2を指向する非スルフェート化ポリ陰イオン性化合物を報告した。ポリサッカライドでのコンビナトリアル合成が、例えばWO9926956に記載されている。
【００１８】
これに対し本出願に記載の方法と組成物はポリサッカライドを使用してヘパリンを模倣していない。ある実施例では、スルフェート化および／またはスルフォネート化アミノ酸のコンビナトリアルライブラリーを利用して生物分子と相互作用するペプチドを生産する。天然では、生物学的認識にはスルフェート化アミノ酸が利用されるが、ほとんどの場合に単一または孤立したスルフェート部位が利用される。実施例の証明によれば、適切な標的と特異的で高度に親和的な相互作用をするリガンドは、スルフェート化またはスルフォネート化した部位の多いライブラリーをデザインすることにより得られる。ライブラリーには、疎水性アミノ酸との組み合わせでスルフェート化および／またはスルフォネート化アミノ酸を持つメンバーがあるのが好ましい。また、ライブラリーには、疎水性および／または酸性および／またはアルコール性官能基を持ったアミノ酸があるのが好ましい。アミノ酸の利用には多くの利点、例えば、強力高処理法を利用して高純度ペプチドを作成することができる、がある。
【００１９】
コンビナトリアルライブラリーのアプローチにより合成したスルフェート化およびスルフォネート化ペプチドは、適切な標的に結合するペプチドを製造するのに好ましい。ペプチドのコンビナトリアルライブラリーはペプチドのセットである。ライブラリーの各ペプチドは唯１個であってもよいし、あるいは相互を複写するものであってもよい。標的に対してライブラリーをテストすれば、ライブラリーのどのメンバーが標的と最も良好に相互作用するかを決定することができる。したがって、標的分子と、例えば結合によって相互作用するリガンドを同定すれば、作成される。この際にリガンドは一般に既知の方法を使用して大量生産してもよい。リガンドは標的に結合する分子である。一般に標的には、リガンドとの相互作用において最も活性である結合部位または結合領域と呼ばれる部分がある。製造方法にコンビナトリアルライブラリーが含まれるのが好ましい。理由は、ライブラリーサイズ、化合物サイズ、組成を操作することによって化学的および生物学的特性が種々異なる分子を得ることができるからである。
【００２０】
ヘパリン結合領域に結合するリガンドを製造するシステムおよび方法の実施例が本明細書に記載されている。これらのシステムおよび方法を使用するある種の実施例が実施例の項に記載されている。しかし、本発明のシステムおよび方法はその実施例に限定されない。更に、特定のリガンドと標的が考察され、本明細書中で、例えば図1および図２に提示されている。記載されている本発明システムおよび方法を製造し使用する方法の中には、適切なリガンド、標的、例えば生物分子およびヘパリン結合部位のモチーフ、およびコンビナトリアル手順が含まれる。
標的分子と相互作用するリガンド
好ましいリガンドは、アミノ酸に位置するスルフェート化および／またはスルフォネート化基を包含する。本明細書で使用するスルフ(オン)エート化の語は、スルフェート化、スルフォネート化、またはこの両者をされた化学基を言う。スルフ(オン)エート化アミノ酸またはペプチドとは、スルフェート化、スルフォネート化、またはスルフェート化とスルフォネート化の両方をされたアミノ酸またはペプチドである。スルフェート化およびスルフォネート化基はそれらの結合活性から見るとほとんどの環境で相互に交換可能である。スルフ(オン)エート化ペプチドは好ましくはTyr、Ser、Thr、またはLysである(図１A)。他のスルフ(オン)エート化ペプチドも使用可能である、例えば図１A〜１Cを参照。アミノ酸の標準的な１文字および３文字省略形を使用する（例えば、チロシンはTyrまたはY）。これらの省略形はAlbertsら Molecular Biology of the Cell、２版に収載されており、全ての目的に対して、引用により本明細書に取り込む。XあるいはXXXは、文脈に応じてある種のアミノ酸を示す。
【００２１】
Stryer、Biochemistry ３版に記述されているように、疎水性アミノ酸は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、TyrおよびTrp、および水溶液中での溶解度がこれらと類似の合成アミノ酸である。アミノ酸の保存置換とは、疎水性アミノ酸は他の疎水性アミノ酸に置換され、同様に親水性アミノ酸は親水性アミノ酸に、塩基性アミノ酸は塩基性アミノ酸に、酸性アミノ酸は酸性アミノ酸に置換される場合の置換である。更にスルフェートをスルフォネートに置換すること、およびこの逆は、保存置換である。
【００２２】
重合の前後いずれかにペプチドへスルフェート化可能な任意のアミノ酸が使用可能である。これらは、天然由来の２０個のアミノ酸並びに合成アミノ酸およびこれらの修飾体を含む。ペプチドライブラリーは、天然アミノ酸、例えばスルフェート官能基を有するアミノ酸から作成するのが好ましい。後述の実施例では、スルフェート化チロシン(Tyr(SO3))、スルフェート化セリン（Ser(SO3)）、およびスルフェート化リジン（Lys(SO3)）を使用して行ったライブラリー合成が記述されている。或るスルフェート化およびスルフォネート化ペプチドは、市販品で入手可能であり、既知の市販元、例えばBACHEMから入手してもよい。更にスルフェート化アミノ酸の製造は、文献、例えばCamposら(2002)に記載されている。
【００２３】
リガンドはペプチドが好ましい。しかし、ペプチドまたはリガンドはより大きな構造物に付随してもよい。付随すると、リガンドの運搬あるいは用途の修正に有用となる。このような付随には、共有結合および非共有結合が含まれる。そのような構造物は、例えばリガンド担持構造物と言ってもよい。より大きな構造物は、任意の生体適合性構造物、例えば合成ポリマー、タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、天然または合成の生物分子、医療具、移植可能な医療具である。更なる例として、そのような構造物には、リポソーム、カプセル、ゲル、ヒドロゲル、疎水性ポリマー、親水性ポリマー、ポリエチレンオキサイド、医療具表面、カテーテル、股関節移植物、ステント、血管グラフト、組織用エンジニアリングマトリックス、ペースメーカー、除細動装置、移植可能な医療具のためのリード線が挙げられる。また、リガンドにはリガンドの結合機能を果たす複数アミノ酸も含まれてよい。例えば、リガンド上の二つのアミノ酸が短い非アミノ酸スペーサー、例えば合成ポリマーによって離れていてもよい。ポリマーの例は、Polymer Handbook４版、J.Brandrup、 E.H. Immergut、 B.A.Grulke, Akihiro Abe、およびD.Bloch(編)に記載されており、引用により本明細書に取り込む。望ましい追加特性をリガンドに付与するためにリガンドをより大きな構造物の一部として使用する。リガンドの語は広義に使用され、結合事象に直接参画する化学的部分ばかりでなく結合部分を有する分子も含んでよい。
【００２４】
リガンドは、サイズが小さく、非毒性で、患者に注入後に免疫応答を誘発しないのが好ましい。一般にリガンドのサイズは任意であるが、小分子リガンド用の好ましいサイズは、約5000Da未満である。更に好ましいサイズは約2500Da未満である。本明細書に記載の方法を使用すれば、各種サイズのペプチド性リガンドを迅速に作成することができる。実施例にはテトラペプチドおよびデカペプチドが記載されているが、ペプチドの適切な長さは個々の用途に調整し得る。一般に小さなリガンドは、患者の細胞中への導入が容易であるので、有利である。細胞膜および脳関門に交絡可能とする構造の脂肪親和性、芳香族性または複素環型の構造を有するリガンドは、通常好ましい。
【００２５】
リガンドに中性または荷電性アミノ酸を加える利点は、それによってリガンドの溶解度および全体の荷電が影響を受けることである。溶解度はリガンドの加工および製造に重要な効果がある。理由は、市販の溶媒を無制限に選択することはなく、使用にあたり他の溶媒よりも安全または安価な溶媒があるからである。ペプチドおよび／またはリガンドの全体電荷も、細胞のリガンド取り込み、すなわち標的が細胞内にある場合には重要となるプロセス、の能力に影響する。大部分の細胞の糖質繊維状外皮は高度に陰性荷電しているので、中性または陽性荷電が存在すると取り込みが促進される場合がある。更に、高い陽性または陰性荷電を持ったリガンドは、例えば患者への注入後に望ましくない非特異的結合を示す可能性がある。
【００２６】
スルフェート化(スルフォネート化ではなく)ペプチドの利点は、生体内ではスルフェート化ペプチドは徐々に脱スルフェート化し、その際徐々にその強力な結合親和性を失うので、これが運搬システムならびに体外放出には有用であるということである。更に、スルフェート化ペプチドは、化学的な手段で脱スルフェート化すれば標準的な配列決定法による評価が容易となるので、これはスルフェート化ペプチドの更なる利点である。他方、スルフォネート化リガンドの利点は、スルフォネート化基の方がスルフェート化基よりも安定であり、これはある環境では有用な特徴であるということである。
【００２７】
合成のペプチドあるいは非ペプチドを組み込んだリガンドも考えられている。合成とは、天然には見いだされないとの意味である。その例には、ペプトイド（Simonら、1992）、オリゴカルバメート（Choら、1993）、オリゴウレア（Burgessら、1995）、ビニロガススルフォニルペプチド（Gennariら、1995）、ペプチドスルフォナミド（de Bontら、1996）、アザタイド（HanおよびJandaら、1996）、ケタイド（KhoslaおよびZawada、1996）、およびスルフェート化ペプチド（Muramatsuら、1997）が挙げられる。更に、リガンドは、剛体、柔軟、線状、分枝状、樹枝状、環状いずれでもよく、あるいは治療にもっと好ましい特殊な物理的、化学的あるいは構造的特性を示してもよい。天然アミノ酸は好ましいが、D−アミノ酸および他の合成アミノ酸、特にスルフォネートや他の官能基を有するものを使用することができる。実施例に記載のペプチドはアミド(CONH2)末端を有する。他の末端は置換してよく、例えば環化に向けて終わってもよい。
【００２８】
ヘパリン結合タンパク質の小集団を標的にしたい場合には、リガンドを調整してその標的小集団にのみ結合させることもできる。標的化を達成するには、本明細書に記載のごとく、リガンドと競合する分子またはそのリガンドに結合しないと思われる分子の存在下で、標的に指向するリガンドをスクリーニングすればよい。例えば、アンチトロンビンIII(ATIII)に対向するペプチド性リガンドはヘパリンの存在下でスクリーニングすればよく、そのリガンドの方がヘパリンよりも強固にATIIIに結合する(実施例参照)。あるいは、この標的に対するリガンドの集団を作成してそのリガンドをスクリーニングするにあたり、それらを使用する系でのそれらの運命を決定しても可能である。例えば、ATIIIに対向するペプチド性リガンドにマークを付けて動物またはヒトの患者に注入することができる。マーカーを利用すればどのリガンドが他の基質とは反対にATIIIに最も効果的に結合するかを決定することができる。
【００２９】
ペプチドは当業者に知られたプロトコールに従って合成される。一般に固相合成は固体表面、通常はビーズを第一番アミノ酸と反応させることを含む。後続のアミノ酸が第一番アミノ酸と反応してペプチドが構築される。この反応プロセスでは、アミノ酸上のある官能基が保護基による保護を要求されることが屡々ある。保護基は必要に応じて加えられ、除去される。ペプチドライブラリーの合成は文献、例えばThompsonおよびEllman(1996)に記載されている。コンビナトリアル生物触媒反応を含む合成は、例えばKhoslaおよびZawada(1996)およびKhmelnitsky(1996)に記載されている。
リガンドと相互作用する標的分子
標的分子として適切なのは、生物分子、特にヘパリン結合領域を有するか、またはヘパリンまたはヘパランスルフェートに結合する生物分子である。任意のヘパリン結合領域に対するリガンドは本明細書に記載の製造方法により製造し得る。また、標的分子に対する特異性および／または結合強度が所望の程度にあるリガンドを製造することができる。これらの特性を達成する一つの方法は、ペプチドライブラリーを所望の特性についてスクリーニングすることである。標的分子には、ウイルス粒子、バクテリア、真菌、および細胞の上または中に存するペプチド、タンパク質、糖タンパク質、ポリサッカライド、抗体、酵素および受容体が挙げられるが、これらに限定されない。標的分子に対するリガンドを製造する方法の実施要領は後述の実施例に記載するが、そこでの標的は血管内皮細胞成長因子(VEGF)およびATIIIである。
【００３０】
ATIIIは適切な標的の例である。ATIIIの語は、ヒトアンチトロンビンIIIの全ての改変体、変異体、誘導体、および異形体を言う。ATIIIは、セルピンファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤であり、内因性血液凝固で重要な役割を果たす。ヘパリンがATIIIに結合すると、ATIIIはその形状が変化し活性となる。活性化ATIIIはXa因子またはトロンビンを阻害することができる。血液中でこれら因子の一つが阻害されると、血液は凝固活性が少なくなる。アンチトロンビンIIIへの結合によってXa因子を阻害するのに必要なヘパリン構造は、五糖単位だけである。しかし、トロンビンを阻害するためには、五糖単位よりも遥かに長いヘパリン部分がアンチトロンビンIIIに結合する必要がある。
【００３１】
抗トロンビン薬物は多くの臨床用途に有用である。ATIIIは血液中に普通に存在するので、これを活性化する薬物があれば有用である。報告されているヘパリン模倣物が基礎としているのは、明らかに、サッカライド、例えば合成スルフェート化五糖、あるいはポリマー、例えば硫酸デキストランまたはスルフォネート化ポリスチレンだけである。しかし、本出願では、標的、例えばATIIIのヘパリン結合領域に結合するスルフェート化タンパク質を製造するシステムと方法が記載されている。更に、本出願では、スルフェート化アミノ酸を利用してATIIIのヘパリン結合領域に結合する、ペプチドを基礎とする特異的リガンドが記載されている。
【００３２】
VEGF、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、および血小板由来成長因子(PDGF)も適切な標的の例である。新脈管形成、すなわち既存の血管からの新しい血管の形成は、傷の治癒ならびに各種疾患、例えば増殖性網膜症、関節リウマチおよび癌の病因に関連する。このプロセスは多数の成長因子、例えばVEGF、bFGF、およびPDGFによって制御される。これら各成長因子には生物学的活性があり、その活性はスルフェート化ポリサッカライド、ヘパリンへの結合によって増強または阻害され得る。これらタンパク質に結合し活性を調節することによりヘパリンを模倣する分子は有用である。そのようなヘパリン模倣物は小さく、明確で、特異性があり、非毒性であるのが好ましい。
【００３３】
成長因子は適切な標的であり、例えば、繊維芽細胞成長因子ファミリー、ヘパリン結合性表皮細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子ファミリー、形質転換成長因子ベータスーパーファミリー、インシュリン様成長因子、骨形成タンパク質(BMP)、肝細胞成長因子(HGF)、レイオトロフィン、神経細胞成長因子、神経突起成長促進因子−１(NEGF1)が挙げられる。他の適切な標的は細胞外マトリックス分子、例えばフィブリ(ノーゲ）ン、ラミニン、フィブロネクチンである。血液系、例えば内因性および外因性の連続的な相互作用の成分は適切な標的である。ヘパリンに結合する細胞表面受容体は適切な標的であり、例えばインテグリン、細胞接着分子、細胞−細胞接着分子である。他の適切な標的はプロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤、例えばヘパリン、ヘパリナーゼおよびヘパリナーゼである。
【００３４】
ヘパリン模倣物を使用すればヘパリン結合成長因子の新脈管形成活性を調節することができる。ヘパリンそのものをこの目的に使用してきたが、組成が不均質なために製造物毎に活性が変動すること、抗凝固活性による毒性があること、親和性が低いこと(KDが約5.5μM)がポリサッカライドの使用にとって欠点である。これらの欠点は、ヘパリンを模倣する他の天然および合成の分子の研究に導いている。しかし、そうした模倣物の多くは毒性が高く、治療指数が低く、非特異的であり、あるいは結果が一貫しない。例えば、糖、例えばペントサンポリスルフェート(PPS)、ヘパリン以外のスルフェート化ポリサッカライド、およびシクロデキストリンはヘパリン代替物として使用できるが、ヘパリンと同様な問題が示される。スルフェート化化合物スラミンと類似体も成長因子誘導の新脈管形成を阻害する。しかし、多くの環境においてこれらの化合物は特異性がなく、重篤な毒性を示し、治療指数が低い。
【００３５】
VEGFのヘパリン結合領域に高い親和性をもって結合するスルフェート化ペプチドの製造方法と組み合わせのデザイン、合成、実施が実施例に記載してある。血管内皮細胞(EC)の増殖と移動を刺激する受容体を活性化すると、VEGFが新脈管形成を始動する。他の脈管形成成長因子、例えばbFGFと異なり、VEGFの活性は内皮細胞に高度に特異的である。VEGFはヘパリン結合成長因子として特徴付けられる。ヘパリンスルフェートプロテオグリカン(HSPG)として細胞表面に存在するヘパリンは、成長因子誘導の脈管形成活性が生起するために必要と思われる。細胞表面HSPGがVEGFの受容体への結合を安定化する結果、新脈管形成活性が刺激されることを示唆する多くの証拠がある。これに符号して外在ヘパリンは、そのサイズと濃度に応じて、VEGFの細胞表面受容体への結合を増進あるいは阻害する。すなわち、スルフェート化またはスルフォネート化リガンド、特にヘパリンを模倣するペプチド性リガンドを使用すれば、VEGF活性を調節することができる。更に、そのようなリガンドは結合および放出の用途に有用である。  適切な標的分子はヘパリン結合部位を含有することが多い。そのような部位の多くは、例えばFrommら、1997に記載されているように既知である。図２には既知部位のいくつかが示してある。ヘパリン結合部位とは生物学的な用語であり、この語にはヘパリンならびに天然のヘパリン変形体、例えばヘパランに結合する分子が含まれる。
リガンドと結合部位の間の解離定数
リガンドは、生理学的な設定条件において結合部位に対し他のリガンドと屡々競合する。リガンドは結合部位に結合するが、定期的に離脱状態になる。部位に対する結合親和性が高い場合には、リガンドが結合部位に付着している状態の時間は長い。解離定数Kdは特定結合部位に対するリガンドの結合親和性の定量的な尺度である。T+L  TLという反応において、Lをリガンドの濃度、Tをリガンドが結合する標的の濃度、TLをリガンドと標的が形成する錯体とすると、Kdは反応物の濃度の積を産生物の濃度で割って算出する。すなわちKd＝[T][L]／[TL]である。一般に解離定数Kdは、[TL]／([TL]+[T])＝0.5となった場合の濃度で報告されており、これはKDとして表示され、本明細書でも半飽和解離定数と言う。すなわち、KDは、T上に存在する結合部位の丁度半分を飽和するのに必要なリガンド濃度を表示している。KD値が高いと標的とリガンドの間の結合親和性は弱く、KD値が低いと結合親和性は強いことを表す。
【００３６】
解離定数を算出する通例の方法では、複数の濃度に対して作成したスキャッチャードプロット上の線の勾配を利用する。例えば複数リガンドまたは標的上の複数結合部位に適用するためのこのプロセスおよび、このプロセスの変形は当業者に既知である。
【００３７】
本出願では、解離定数は、生理学的溶液を反映するために浸透圧が約300〜330mOsモル、pHが7.0と7.4の間の溶液中で測定している。リガンドの標的に対するKDは約600μM未満が好ましい。更に好ましくは、KDは約60μM未満であり、より更に好ましくは、約6μM未満であり、なお更に好ましくは、約0.6μM未満であり、より一層好ましくは、約0.06μM未満である。
コンビナトリアルケミストリー
リガンドの製造に適用可能なコンビナトリアルライブラリーの生産を実行する通常の技法は少なくとも五つある。Lam(1997)参照、Al-Obeidiら(1998)も参照、米国特許5,424,186、5,449,754、5,503,805、5,650,489、5,962,736、6,042,789、6,051,439、6,083,682、6,117,397、6,168,913、6,168,914、および6,355,490参照。通常の技法は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス可能な平行または固相溶液ライブラリー、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、１ビーズ1化合物法、およびアフィニティークロマトグラフィーによる選別を利用する合成ライブラリー法である。一般に、コンビナトリアルライブラリー製造技術には、一般的には無作為または半無作為なアルゴリズムを使用してペプチド配列をアレンジして、アミノ酸からペプチド集団(ライブラリーとも言う)を作成すること、一般的にはどのペプチドが標的に結合するかを決定して、特異的な生物学的特性について集団を迅速にスクリーニングすること、および生物学的特性を有するペプチドを同定することが含まれる。一般に、ペプチドの同定は、デコンボリューション法、直接の化学分析、またはアミノ酸配列の分析によって行われる。
【００３８】
リガンドのコンビナトリアルな製造方法の通常のタイプには各種の形態がある。空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリーには、例えばマルチピン技術、SPOT膜、チップ上での光指向ペプチド合成、およびダイバーソーマー(diversomer)技術が挙げられる。デコンボリューションを必要とする合成ライブラリーには、反復アプローチ、位置走査、回帰デコンボリューション、および直交分配アプローチが挙げられる。
【００３９】
ペプチドのコンビナトリアルライブラリーは、最初に導入された当時、例えば1984年頃には数百の化合物に限定されていた。しかし、現在は、特に生物学的アプローチ（例えばDevlinら、1990）、液相ペプチドライブラリーへの反復アプローチ（例えばHoughtonら、1991）、１ビーズ１化合物アプローチ（例えばLamら、1991）、あるいはスプリットプール反復アプローチを利用する場合には、何百万ものペプチドの製造とスクリーニングが実施可能である。
【００４０】
生物学的ライブラリーでは、細胞、ファージ、プラスミドおよび／またはポリソームを使用してペプチドを作成することが含まれる。ファージでのアプローチはPalmleyおよびSmith,1988により例示されている。プラスミドでのアプローチはSchatz,1993により例示されている。ポリソームでのアプローチはKawasaki,1991により例示されている。生物学的アプローチは、大きなリガンドまたはリガンド担持の生物学的化合物を所望する場合に有用である。
【００４１】
空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリーは、固相担体上にペプチドを合成し、ペプチドを空間的にアドレス可能とし、各ペプチドの配列が解り、あるいは配列を予備決定することにより製造される。各ペプチドの配列は一般に予備的に決定し、次にその位置を決定するだけでペプチドの配列が確定する。マルチピンアプローチはGeysenら、(1984）により例示されている。SPOT膜アプローチはFrank(1992)により例示されている。チップ上の光指向ペプチド合成アプローチはFodorら(1991)により例示されている。ダイバーソーマーアプローチはDeWittら(1993)により例示されている。
【００４２】
デコンボリューションを必要とする合成ライブラリーには反復技法が含まれる。反復技法はBlondelleら(1995)により例示されている。この技法には、複数ペプチドの合成、スクリーニングおよび分析の段階が含まれる。例えば、アミノ酸20個および長さ10個アミノ酸のリガンドを使用する操作では、リガンドの第一位置および第二位置を既知のごとく有し、二つのペプチドのあらゆる可能な組み合わせが存在する複数ペプチド混合物を作成する。残余の位置は無作為のアミノ酸である。すなわち最初の二つの位置を二つの既知ペプチドのあらゆる組み合わせが占めると、総計400個の混合物となる。複数混合物を生物学的活性についてスクリーニングし、最も活性な混合物を選別する。最初の二つの位置が固定され、第三位置が系統的に変動する新しい混合物集団を作成する。最初の三つの各位置を既知のごとく有する20個の新しい混合物を作成する。次にこの混合物を生物学的特性についてスクリーニングし、プロセスを反復する。
【００４３】
関連デコンボリューション法は、DooleyおよびHoughten(1993)により例示されている位置走査法である。一例として、ヘキサペプチドリガンドおよび20個アミノ酸について、120個の混合物を作成するが、各混合物は六つの位置の一つにおいて既知アミノ酸を有する。混合物をスクリーニングし、活性混合物を使用してリガンドを組み立てることができる。
【００４４】
他の関連反復技法はスプリット合成技法であり、Erbら、(1994)により例示されている。図３はこのアプローチのアルゴリズムを示すが、ペプチドを固相合成により合成しており、この場合に付着したアミノ酸でビーズを調製し、追加するアミノ酸を配列順に結合してペプチドを構築する。図３を参照すると、混合物には、各々が既知アミノ酸A、B、またはCを持つ複数のビーズがある。ビーズを組み合わせて一つの混合物にし、次に(三つの既知アミノ酸があるので)三つの同じ混合物に分割する。各混合物には既知アミノ酸A、B、またはCが付着しており、A、B、およびCで作成されるアミノ酸二量体のあらゆる可能な組み合わせを作る。次に混合物を組み合わせ、(二量体の九つの異なる組み合わせがあるので)九つの同一混合物に分割する。各混合物をA、B、Cと反応させ、組み合わせ、27個の同一混合物に分割する。所望の長さが達成されるのに必要なだけこのプロセスを繰り返す。図３を参照すると、各ビーズには最終的には個別の独自のペプチドが担持される。全ての組み合わせが作成された後にスクリーニング段階を１回実施するのが好ましい。
【００４５】
リガンドを作成する別の関連反復技法は直交分配技法であり、Deprezら(1995)およびPirrungおよびChen(1995)により例示されている。この技法はスプリット合成と位置走査アプローチを結合している。
【００４６】
リガンドを作成する別の関連反復技法は１ビーズ１化合物技法であり、LamおよびLebl(1996)およびLamら(1997)が記載している。この技法でスプリット合成法を利用するとアプローチは特に効果的となる。図４を参照して、「O」と表示されるビーズは１個のアミノ酸で被覆される。ビーズを数グループに分配し、次に各ビーズを使用予定の全てのアミノ酸と反応させる。グループをまとめ、分割し、追加のアミノ酸と反応させる。20個アミノ酸の場合には、最初にビーズを20グループに分け、各ビーズに独自のアミノ酸を振り当てる。次に樹脂を混合し、脱保護し、20グループに分配する。各グループに追加のアミノ酸を振り当てる。結合サイクル毎に20個アミノ酸のペンタペプチドライブラリーには205(3.2百万)個の順列ができる。そのようなライブラリーは大学設備のささやかな装置中に2~3日で迅速に作成することができる、Lam、1997参照。一般に市販の装置を使用すればこのようなライブラリーをより遥かに迅速に生産することができる。
【００４７】
アフィニティークロマトグラフィー選別を利用する合成ライブラリー法もリガンドの製造に有用である。一般にこの方法には、通常ビーズを使用するスプリット合成法によって固相でのライブラリーを作成することが含まれる。ペプチドをビーズから溶液中に離し、ペプチドは等モル量で存在する。次に標的分子を固定化したアフィニティークロマトグラフィーカラムに溶液を通過させる。適切な洗浄段階を経た後、ペプチドをカラムから溶出し、配列を調べてどのペプチドが標的に結合するかを決定する。この技法には多数の変法があり、例えば、結合したペプチドを、濃度上昇のある連続洗浄法を利用して溶出してもよく、この結果結合アフィニティーの異なるペプチドが別々の溶出分画中に捕捉される。この技法の例示的な報告はSongyangら(1993および1995)にある。
【００４８】
生物学的活性リガンドの構造を決定する段階が必要なコンビナトリアル法があり、例えば１ビーズ１分子法である。エドマン分解による自動的な配列決定が好ましい。理由はこのプロセスの検出感度は現在１ピコモルを超えるからである。しかし、別のアプローチでは、質量分析法、例えばマトリックス支援レーザー脱着イオン化質量分析法(MALDI)、イオン化質量分析法、あるいはMS-MS技法、および標識、特に化学標識の利用が含まれる。
【００４９】
多数のスクリーニング戦略が利用可能である。一つのアプローチは固相分析の利用である。リガンドを固相担体、例えばチップ、ピン、ビーズ、プラスチックシート、ガラス、フィラメント状ファージに付着させる。標的を担体に加え、リガンドを生物学的活性について試験する。そのような活性には、例えば結合、あるいは機能測定、例えばタンパク質分解あるいはリン酸化が含まれていてもよい。結合は直接(例えば、標的上の色素を目視化することにより)あるいは間接(例えば、酵素等のレポーター群により)測定されるので都合がよい。
【００５０】
他のスクリーニング法には溶液相測定がある。リガンドを含む溶液を標的に晒す。リガンドと標的の間の相互作用を検出し、リガンドを単離する。このような技法の例には、既知の放射能標識標的またはリガンドを使用する競合受容体結合測定法、プレートコートした抗原を使用する競合ELISA測定法、蛍光基質を使用するタンパク質分解測定法のような酵素測定法、抗菌測定法、および細胞ベースの信号伝達測定法が挙げられる。
【００５１】
スプリットプールおよび反復デコンボリューションコンビナトリアル合成アプローチは、スルフェート化アミノ酸を有するリガンドの製造には好ましい。しかし、他の技法、例えば位置走査、アレー合成、非線形、二重、および直交の戦略も適用してよい。ライブラリーは固相担体上でスクリーニングされるのが好ましいが、他の技法、例えば溶液中またはマルチピン法を利用して簡単にスクリーニングし得る。
【００５２】
コンビナトリアルケミストリーは、リガンド製造方法の好ましい形態である。しかし、他の技法も適切である。スルフェート化およびスルフォネート化アミノペプチドを基礎とするペプチドメチックスも直接におよび／または合理的なデザインによって発見することができる。
【００５３】
使用と用途
ヘパリン結合領域を有する標的に対しては、スルフェート化またはスルフォネート化リガンドを製造することができる。このリガンドは多くの用途、例えば標的結合段階を必要とする例に有用である。これらの用途は、例えばin vitroおよびin vivoの両方での作用を包含する。これらリガンドの用途には、例えば作動剤、拮抗剤、親和結合剤、マーカー、および運搬用担体としての使用が挙げられる。作動剤の例は、標的に結合するリガンドであって、他のリガンドが標的から引き出す効果を模倣するものが挙げられる。作動剤の他の例は、ヘパリン模倣物として機能するペプチドであって、ヘパリンと同様な方法でATIIIに結合しこのタンパク質に立体配置的な変化を誘起し、その結果ATIIIのトロンビン阻害活性を誘導するものが挙げられる。このリガンドは、バイオテクノロギーおよび医療において、例えばマーカー、作動剤、拮抗剤、特異的な親和結合剤として有用である。
【００５４】
拮抗剤の例は、標的に結合するリガンドであって、標的の生物学的活性を停止または減少するものが挙げられる。他の例は、ペプチドであって、そのヘパリン結合領域単独またはその領域とタンパク質上の他の部位との連携を介して成長因子に結合し、その成長因子が他の分子に結合するのを阻止するものが挙げられる。VEGFの場合には、それの親和性が低いまたは高い細胞表面受容体への結合を阻止されてもよい。細胞表面受容体、特に親和性の低い細胞表面受容体への成長因子の結合には、ヘパリン親和結合部位が関与するので、この部位を阻止すればVEGFの生物学的活性を阻止することができる。
【００５５】
親和結合剤の例は、生物分子に結合し、次にこれを固定化するリガンドである。ペプチドと例えば成長因子の間の親和性は、これを精製用担体上に固定化すると、成長因子を複雑な生物学的または醗酵混合物から精製するのに使用される。成長因子は、これを薬物運搬マトリックスまたは移植可能な装置上に固定すると、装置近辺で生物学的活性を保持し、あるいは装置から放出される。
【００５６】
マーカーの例は、薬剤と錯結合し、その結果リガンドと標的の間の相互作用がマークされるリガンドである。例としては、蛍光分子、色素、アビジン、ビオチン、抗体、着色用酵素、西洋ワサビ過酸化酵素および放射活性標識に錯結合したリガンドが挙げられる。他の例には、DNA、タンパク質、緑色蛍光タンパク質、ラジオ波発振器、コントラスト剤、ナノ粒子がある。
【００５７】
生物学的分子は標的として役立ち、マークされることができる。マーカーは標的がどのように発現され機能するかを示す。ヒトのゲノム解析プロジェクトが完了以後マーカーの必要はいっそう緊急である。理由は、発見された多くの分子の発現および機能が未知だからである。したがって、生物分子に結合する任意のリガンドは全てマーカーとして有用である。マーカーはin vivoまたはin vitroで支給されてよい。in vitro での使用には、履歴用および蛍光顕微鏡の目視化ツールとしての着色が挙げられる。in vivoでの使用には、標的にタグを付けてその濃度、分布、移動を確認することが挙げられる。例えば、肝臓中の成長因子の濃度およびその消失時間は、その成長因子に対するリガンドを有するマーカーを肝臓に注入して、モニターすることができる。マーカーを検出すれば成長因子の運命を決定することができる。in vivo用に現在使用されている多くのマーカーは、リガンドとの使用に採用してよく、例えばマーカーにリガンドを加え、あるいはマーカーのリガンドを本明細書に記載のように製造したリガンドで置き換えてよい。
【００５８】
形態は、分解、特にスルフェートの分解によって半減期が制御されるリガンドを包含する。例えば、リガンドには結合部位と相互作用する多数のスルフェート基があってよい。リガンドの分解が促進されると標的に対するリガンドの親和性が徐々に低下する。あるいは、リガンドは、スルフェート基の数が制限され、またスルフェート基が分解する場合は活性が本質的なバックグラウンドの水準にまで落下してもよい。結合した因子の放出を制御するために、半減期が制限されるのは有用である。例えば、リガンドをもって医療具に結合している成長因子はリガンドが分解すれば放出される。立体障害、局部pＨ、折りたたみ等の要因によってスルフェート基の分解は影響を受けるかもしれない。スルフェート分解を制御するようにこれらの要因でリガンドをデザインしてもよい。分解可能なリガンドの別の利用は患者におけるリガンドの半減期の制御である。例えば、半減期の短いリガンドであって血液凝固を阻止するものは患者に投与できるであろう。間もなくそのリガンドは分解してしまうので、患者を正常の血液凝固状態に回復させるための薬剤を投与する必要がなくなる。
【００５９】
ATIIIに結合してこれを活性化するリガンドは、例えば血液凝固の阻止に使用可能である。ATIII結合リガンドは、所望の阻止レベルを達成するのに必要な濃度で患者に導入してもよい。VEGFに結合しこれの活性を阻害するリガンドを使用して、例えば新脈管形成を阻止してもよい。すなわち、このリガンドは腫瘍治療、関節リュウマチ、糖尿病性血管障害、眼疾患、例えば網膜過形成、および低酸素性慢性炎症疾患、あるいは非制御的脈管形成性で特徴づけられる他の疾患の治療に有用と思われる。
【００６０】
運搬担体の例は、ある他の薬剤を所望の位置または所望の標的に運搬するのに使用されるリガンドである。例えば、毒物と錯結合したリガンドを使用すれば、毒物をリガンドの標的、例えば苦痛受容体、T細胞、あるいは癌細胞に運搬することができるであろう。あるいは、リガンドをリポソームに付着させることにより、リポソームがリガンドの標的、例えば特定の細胞種類に付着することができる。
【００６１】
リガンドを標的との相互作用に使用する既存の技法は、本明細書に記載のリガンドとの使用に適用してもよい。例えば、米国特許5,851,527に記載の酵素運搬用抗体を本明細書に記載のようにして製造したリガンドで置き換えることができる。あるいは、米国特許5,662,904に記載の成長因子中和用抗体ベースアプローチを本明細書に記載のリガンドとの使用に適用することができる。
【００６２】
運搬
本出願に適用する適切な手段によってリガンドを運搬してよい。リガンド運搬の例は、静脈内、筋肉内、あるいは皮下にて薬理学的に受容可能な溶液および生理学的緩衝液(例えば食塩液またはグルコース血清)のような無菌担体を包含する注入経由を包含する。また、リガンドは経口または直腸経由で投与してもよい。その場合にはリガンドを薬理学的に受容可能な固体または液体の賦形剤と組み合わせる。またリガンドは、外用にて、例えば点鼻にて、例えばこの投与モードに適した担体と共にエアロゾールの形態で投与することができる。更に、カテーテルまたは他の外科的なチュービングを介して運搬することもできる。別の経路には、錠剤、カプセル等、液状製剤用ネブライザー、および凍結乾燥またはエアロゾール化したリガンド用の吸入器が挙げられる。
【００６３】
リガンド運搬の多くの態様が本明細書に記載されている。リガンドの運搬は、リガンドだけが運搬されるほかに、リガンドが付着または付随している構造物または化合物と共にリガンドが運搬されることも伴う。
【００６４】
分子、特に小さな分子またはペプチドをin vivoおよびin vitroで運搬する現在既知の方法を本リガンドに使用してもよい。そのような方法には、微小球、リポソーム、他の微粒子担体、あるいはある組織中、例えば血液中に置かれた放出が制御された製剤が挙げられる。放出が制御された担体には、成形品、例えば座剤またはマイクロカプセルの形状をした半透過性ポリマーマトリックスが挙げられる。各種の適切な運搬方法は、例えば以下に記載されている。Senelら(2001)、Cleland(1997)、Okada HおよびToguchi(1995)、Lehr(1994)、Jabbal-Gillら(2001)、Fix(1996)、Duncan(1992)、LangerおよびMoses(1994)、Sanders(1990)、Eppstein(1988)、Hyon(2000)、Vermaら(2000)、HarounおよびBrem(2000)、Meers(2001)、Brandl(2001)、Banerjee(2001)、Ravi(2000)、HatefiおよびAmsden(2002)、Vandamme(2002)、Lavasanifarら(2002)、VermaおよびKrishna(2002)、SoodおよびPanchagnula(2001)、ZimmerおよびAshburn(2001)、Bussemerら(2001)、Regarら(2001)、Loら(2001)、Qiuら(2001)、Grabowら(2001)、Torchilin(2001)、Pillaiら(2001)、Vyasら(2001)、Krafft(2001)、Groothuis(2000)、Soppimathら(2001)、Muller(2000)、SinhaおよびKaur(2000)、Kumar(2000)、Hussain(2000)、EttensonおよびEdelman(2000)、Chomyら(2000)、Gonda(2000)、HarounおよびBrem(2000)、米国特許5,626,877、5,891,108、5,972,027、6,041,252、6,071,305、6,074,673、6,083,996、6,086,582、6,086,912、6,110,498、6,126,919、6,132,765、6,136,295、6,142,939、6,235,312、6,235,313、6,245,349、6,251,079、6,283,947、6,283,949、6,287,792、6,296,621、6,309,370、6,309,375、6,309,380、6,309,410、6,317,629、6,346,272、6,350,780、6,379,382、6,387,124、6,387,397、および6,296,832。更なる運搬方法は、以下に記載されている。同時係属中の米国特許出願、2001年10月22日出願の10/021,508、2001年12月28日出願の10/035,625、2001年3月19日の09/811,901、2000年12月15日出願の09/738,961、2001年1月28日出願の09/772,174、2001年3月2日出願の09/798,338、および2000年2月6日出願の09/586,937  名称「医薬的活性化合物の制御運搬のための共役付加反応」。
【００６５】
本明細書に記載のシステムと方法は本発明の例示であって、本発明の範囲と精神を限定する事を意図しない。当業者が本開示を読めば、本発明の形態における変形例を認識するであろう。本明細書に引用または参照した刊行物、例えば図書、雑誌、特許出願および特許は全て引用により本願に組み込まれる。
【実施例】
【００６６】
実施例１  VEGF標的に対するリガンドの製造
スプリットプール合成アプローチに従ってライブラリーに組み立てたスルフェート化ペプチドを使用してVEGFに結合するリガンドを製造した。合成は半無作為に行い、ライブラリーの配列の一部を理論的に選択し、高度の親和性をもってVEGFに結合するペプチドを作成した。
【００６７】
ライブラリー合成
手操作による標準的なフルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)固相ペプチド合成により、アミノポリエチレングリコールアクリルアミド(PEGA)樹脂(3.6ｇ、0.22mmol)を合計４倍のFmoc-Gly-OH(0.26ｇ、0.86mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT、0.12g、0.86mmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロフォスフェート(HBTU、0.33g、0.86mmol)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA、0.3mL、1.7mmol)に加えてFmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-PEGA樹脂を作成した。次にFmoc-Gly-Gly-Gly-Gly-PEGA樹脂(0.22mmol)を9個の均等部分に分割し、48穴溶融ガラスプレートの９穴に入れた。樹脂をDMFで１時間膨潤し、DMF(3×4mL)で洗浄した。次いで20％ピペリジン/DMF（2×4mL×10分/穴）を使用してFmoc基を除去し、樹脂をDMF(3×4mL)で濯いだ。HOBT(0.12ｇ、0.86mmol)およびHBTU(0.33mｇ、0.86mmol)を含有する小瓶にDMF18mLを加え、固体が溶解するまで小瓶を撹拌した。溶液を9個の均等部分に分割し、Fmoc-Try(SO3)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ile-OH、またはFmoc-Phe-OHを0.096mmol含有する9個の小瓶に加えた。固体が溶解するまで小瓶を撹拌し、次にDIEA(34μL、0.19mmol/小瓶)を加えた。各小瓶を樹脂の一部に加え、プレートを密封し、機械的に１時間撹拌した。次に樹脂をDMF(5×4mL)で濯ぎ、集め、十分に混合し、9個の均等部分に分割した。この操作を更に３回繰り返し、樹脂をプールし、DMF(5×4mL)、 DCM(5×4mL)、および メタノール(5×4mL)で濯いだ。保護基を除去するために、4?に冷却したTFA：TIS：H2O(95：2.5：2.5)33mLを樹脂に加え、混合物を4?で2時間保持し、溶液を除去し、まず冷TFA(20mL)で次にメタノール(400mL)で樹脂を洗浄した。約6600個の異なるペプチドのコピーを含有する脱保護ライブラリーをメタノール中に膨潤状態で、−20?で使用時まで保存した。
【００６８】
DMF中のHBTU、HOBT,、およびDIEAをカップリング剤として使用して、ライブラリーのFmoc固相手操作標準合成を行った。ポリ(エチレングリコール)ベースのNOVA-biochem製アミノPEGAビーズは、蛍光バックグラウンドが低くこの樹脂の水中膨潤特性が好ましいので、これを採用した。スクリーニングプロセスでは蛍光性ビーズを同定するので、バックグラウンドシグナルが低いことは重要である。フルオレスセインまたはDapiフィルターを介して見ると標準的なTENTAGEL樹脂には不均質なバックグラウンド蛍光があった。樹脂のアンカーとライブラリーのカルボキシル末端との間にテトラグリシンの区域を挿入したので、スクリーニングプロセス中におけるVEGFへのアクセス性が増大し、ライブラリーの特徴付けが助けられた。ライブラリー中のテトラグリシンを有するペプチドは大部分が特異的活性を欠いているので、テトラグリシンはVEGFに非特異的に結合すると信じられている。チロシンの脱スルフェート化を防止するために、TFAを4?で使用してペプチドの保護基を除去した。この要領で6600の構成員からなるライブラリーの多くのコピーを合成した。
【００６９】
ヘパリンの官能基およびVEGFのヘパリン結合部位に関する試験に基づいて配列の各部分を理論的に選択した。理論的選択段階は随意であり、ライブラリーのサイズが小さくなるように適宜採用した。この場合、標的分子VEGFには、ヘパリン結合領域と推定される領域に塩基性アミノ酸アルギニンおよびリジンが存在することが判った。ヘパリン結合領域の最小区域を占める最小ペプチド長さはアミノ酸4個分であるから、ライブラリーのペプチド長さを４に設定した。ヘパリンはスルフェート基、カルボキシル基およびヒドロキシル基を含有することが判っている。以上の理由から、スルフェート化チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリンをライブラリーのペプチド用アミノ酸として含有させた。更に、疎水性相互作用はヘパリン結合を支援すると信じたので、疎水性アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、イソロイシンおよびフェニルアラニンも採用した。すなわち9個のアミノ酸からペプチドライブラリーを組み立て、94または約6600個の化合物を製造した。これとは別に、例えば全て中性の20個のアミノ酸を使用して204または約160,000個の化合物のライブラリーを製造した。
【００７０】
ライブラリーのスクリーニング
ビーズ(ライブラリーの約10コピー)を水中で1時間膨潤させた。混合物を遠心分離し、水を除去した。クメリン-VEGF/TBS溶液（約0.1mg/mL）をビーズに１時間加え、次にビーズを6個の部分に分割し、それらを6穴プレートに置いた。次にビーズを室温で16時間振蘯し、VEGF-クメリン溶液を除去した。コントロールとして、未置換PEGA樹脂(10mg)およびヘパリンアガロース(10mg)もクメリン-VEGFと共にインキュベートした。次にUV黒色ランプを取り付けた解剖用顕微鏡を通してビーズとコントロールを観察した。PEGAコントロールビーズが非蛍光性となるまでビーズとコントロールをTBSで洗浄した。0.25MNaCl(2×)、次に0.5MNaCl (3×)、次に1MNaCl (10×)、次に2MNaCl (2×)を含有するpH7.6の20mMトリスでライブラリービーズとヘパリン-アガロースビーズを洗浄した。解剖用顕微鏡とUV黒色ランプで目視しながら、ミクロピペットを使用してバックグラウンドビーズよりも明るいビーズ(総計288個)を1個ずつ回収し、各ビーズを96穴プレートの各穴に置いた。次にプレートを4?で保存した。
【００７１】
ビーズのランク付け
Dapiフィルターを装備した倒立顕微鏡上に各ビーズを画像化（ゲインを一定にし、およびホワイトバランスをゼロに設定したままで）して各ビーズの蛍光シグナルを定量した。各画像をMATROX INSPECTOR上のグレイスケールに変換した後に各ビーズの半径(r)およびピクセル総和（ΣPix）を測定した。INTERACTIVE DATA LANGUAGEおよびEXCELを使用して、ピクセル総和対半径についてχ2最小化を行い、最適値は2.35であることを決定した(付録１)。次に各ビーズをΣPix/r2.35に従ってランク付けした(付録2)。
【００７２】
ビーズ分析
分析を促進し、クメリン-VEGFを除去するために、Tyr(SO3)残基を脱スルフェート化した。ビーズを水(1×0.2mL)で洗浄し、水を除去した。各穴に30%TFA/水(0.1mL)を加え、プレートを60?までに設定したオーブン中で1時間加熱した。TFA溶液を除去し、各ビーズを水(4×0.1mL)で洗浄した。ビーズを水0.1mL中4?で使用まで保存した。更なる分析用に選別したビーズをミクロシーケンシングした。
【００７３】
VEGF165発現および精製
大腸菌発現宿主AD494(DE3)pLysSをプラスミドpRSET-VEGF165で形質転換した。組換え体VEGFタンパク質を発現し、前記した封入体から単離した。4M尿素と1mMEDTA含有pH7.6の20mMトリス緩衝液(2×1L)、次に2M尿素含有緩衝液(2×2L)、次に1M尿素(2×4L)、最後に緩衝液(2×4L)を透析外液として連続的に透析することによりVEGFの再折りたたみと二量化を達成した。SDS-PAGEおよび非還元条件下でのクマシー染色により二量化を確認した。次にタンパク質を、pH7.6の20mMトリス緩衝液中のNaCl濃度勾配0.25〜2Mを使用するヘパリン-アガロースクロマトグラフィーにより精製した。最終タンパク質を、pH7.6の20mMトリスおよび150mMNaCl(TBS) を透析外液として透析し、−80?で使用まで保存した。代表的な収量8mg/L VEGF165の細菌培地が得られた。
【００７４】
VEGF165の標識化
約1.2mgのVEGF165をヘパリン-アガロースカラム上に展開し、カラムを0.1MNaHCO3で数回洗浄した。6-((7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセチル)アミノ)ヘキサン酸サクシニミジルエステルをDMSO溶液から0.1MNaHCO3の中に希釈した。緩衝液1.3mL中のクメリン130μgをカラムに展開し、VEGF165と共に室温で1時間、次に4?で23時間インキュベートした。カラムをTBSで十分に洗浄して過剰のクメリンを除去し、次にpH7.6の20mMトリスおよび1MNaClでタンパク質を溶出した。VEGF165の標識化をSDS-PAGE上のUVによる明スポットによって確認したが、これはクマシー染色で目視したタンパク質に一致していた。最終タンパク質を濃縮し、MWCO5,000のVIVAスピンチューブを使用する遠心分離により脱塩し、4?で使用まで保存した。この方法での代表的な標識量は、UV測定によると4クメリン/ VEGF165であった。
【００７５】
VEGFの最も普通の異形体であるクマリン標識化VEGF165と共にビーズをインキュベートしてライブラリーのスクリーニングを実行した。VEGFの語には、ヒトVEGFの全ての形態、異形体、変形体、変異体、および導入形が含まれる。VEGF165は大腸菌から発現され、正確に二量体形に再折りたたまれた。7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸のサクシニミジルエステル(AMCA-NHS)は、光クエンチ作用に対し非常に安定であるので、ヘパリン-アガロースカラムに予め吸着したVEGF165に共役させた。ヘパリン結合領域とヘパリンとの相互作用を介してVEGF165はカラムに保持される。このようにAMCA-NHSをVEGFと反応させるので、ヘパリン結合領域の塩基性残基がサクシニミジルエステルと反応することは絶対ない。また、VEGFは=0.5MNaCl溶液を使用した場合にのみカラムから放出されるので、生産物の精製は容易である。タンパク質を溶出する前に低塩緩衝液で残存AMCA-NHSを除去した。標識化の程度はVEGF当たりクマリン4個と算定された。標識化の程度はタンパク質-クマリン錯体の吸光度測定から決定した。TBS中に標識化VEGF165約0.1mg/mLをライブラリーの約10個コピー、ペプチドを含有しないアミノ-PEGAビーズ、およびヘパリン-アガロースビーズと共に振蘯条件下16時間インキュベートした。後ろの二つをコントロールとした。
【００７６】
ビーズおよびヘパリンアガロースをTBSで洗浄し、ペプチドを含有しないアミノ-PEGAビーズが非蛍光性になるまで未結合のVEGF165を除去した。次にライブラリーおよびヘパリンアガロースビーズを0.25M(2×)の、次に0.5M(3×)の、次に1M(10×)の、次に2MのNaCl (2×)を含有するpH7.6の20mMトリスで連続的に洗浄した。ヘパリンアガロースコントロールビーズでは、1.0MNaCl含有緩衝液での洗浄後に蛍光標識化VEGF165は観察されなかった。解剖用顕微鏡およびUV黒色ランプを使用してライブラリーを目視しながら、バックグラウンドの非蛍光ビーズから蛍光ビーズをミクロピペットで摘み出し、96穴プレートの穴に1個づつ入れた。このようにして288個のビーズを更なる分析用に選別した。VEGF165は0.5〜1.0MNaClでヘパリンア-ガロースビーズから放出されるので、2MNaClで洗浄後に蛍光を発するビーズは強力にVEGFに結合していると推測した。
【００７７】
Dapiフィルターを装備した倒立顕微鏡上に各ビーズを画像化して各ビーズの蛍光を定量した。各画像をMATROX INSPECTOR上のグレイスケールに変換した後に各ビーズの半径(r)およびピクセル総和（ΣPix）を測定した。ビーズをΣPix/r2.35に従ってランク付けした。ピクセル総和対半径をプロットし、χ2最小化を行い、その最適値を得て指数を決定した。ビーズサイズの差および対応するピクセル強度の総和の人為的な差を補償するには、半径の2.35乗で割る必要があった。選別ビーズのヒストグラム(図５)から、ΣPix/r2.35の平均値は28であり、一方他のビーズよりも有意に明るくΣPix/r2.35が60を超えるビーズがいくつかあることが判る。最も明るいビーズ（ΣPix/r2.35が少なくとも60）、ΣPix/r2.35値が52と46の間の数種のビーズ、ΣPix/r2.35平均値の28のビーズ、および非蛍光ビーズをマイクロシーケンシングによる分析用に選別した。
【００７８】
マイクロシーケンシングの前に、ビーズを30％TFA中で60?１時間加熱して脱スルフェート化し分析を容易にした。このプロセス間にVEGF165は除去され、スルフェート基は結合に重要であるという証拠を補強した。クマリン標識化PEGAビーズはこのプロセスの後にも蛍光を保持していたので、クマリンが脱スルフェート化の過程で簡単に失活することはなかった。次にビーズをマイクロシーケンシングした。製造したリガンド、および親和性によるリガンドのランク付けを表１に示す。親和性はリガンドを製造したビーズの蛍光画像からピクセル総和と半径を決定して計量化した。塩で洗浄後に蛍光を保持しなかったビーズもネガチブコントロールとして配列決定した(表１で０として示す)。
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【００７９】
最も活性とランク付けされた二つのビーズは同じ、SY(SO3)DY(SO3)(SEQ ID NO:２参照)であり、ヘパリンにも存在する基、すなわちスルフェート基、カルボキシル基およびヒドロキシル基を含有していた。第三位にランク付けされたビーズには類似のモチーフ、Y(SO3)-D-Y(SO3)(SEQ ID NO:1参照)があり、アミン末端がセリンではなくアラニンであった。ΣPix/r2.35が52のビーズにはS-A-Y(SO3)-D-Y(SO3)(SEQ ID NO:３参照)があり、値が51および46のビーズは相互に非常に類似していた（セリンまたはグリシンの次にY(SO3)-A-Y(SO3)がある）。配列決定した平均蛍光を有する３種のビーズの中で、２種はスルフェート化チロシンを1個、他の1種は３個含有していた。ネガチブコントロールはDIDFであった。
【００８０】
2MNaClで洗浄後も蛍光性を有した配列決定ビーズは全てスルフェート化チロシンを少なくとも１個含有していた。しかし、ネガチブコントロールは、陰性荷電したアスパラギン酸を2個有するにもかかわらず、VEGF165に強力には結合しなかった。このことは、結合を促進するのはスルフェート基それ自体であって、それの荷電ではないことを示している。これは驚くべき結果である。この結果は、ビーズからVEGFを除去するにはペプチドの脱スルフェート化が必要であるという観察結果によって更に証明される。このデータは、VEGF165はヘパリン結合領域を介してペプチドに結合するという仮定に符号する。とはいえ、本発明はなんらの特別な操作理論に依存しない。
【００８１】
最も活性な配列決定した６種のビーズは全てスルフェート化チロシンを2個含有し、またこれらのビーズの中の5種ではこれら2個のスルフェート化チロシンが２番目と４番目の位置にあった。これは、テトラペプチドの２番目と４番目の位置のスルフェート化チロシンが強力結合のモチーフであることを示している。分析した蛍光性ビーズの全てにおいてその２番目の位置にスルフェート化チロシンがあったことから、この位置のスルフェート化チロシンがこれらペプチドのVEGF165への結合のモチーフであることが示唆される。更に、平均蛍光シグナルを有するビーズでは含有するスルフェート基は2個ではなく1個または３個のいずれかであることから、スルフェートの個数と位置が重要なモチーフであると思われる。
【００８２】
VEGFに結合するスルフェート化テトラペプチドを発明した。ライブラリースクリーニングでVEGFに強力に結合したペプチドは、スルフェート化チロシンを2個含有し、典型的にはこれらが配列の２と４の位置に局在した。分析したビーズの全てにおいて２番目のアミノ酸位置にスルフェート基があったことから、この基をどの位置に置くかがVEGFへの結合に有用であることが示唆される。これらペプチドによって成長因子活性を阻害もしくは促進することにより、VEGF活性を調節し得る。更に、VEGFの制御放出を封鎖または促進する目的でこれらペプチドをゲルまたはポリマーに取り込むことも可能である。
【００８３】
本実施例は、コンビナトリアルライブラリー合成アプローチを採用する形態により、VEGFに結合する小さなスルフェート化ペプチドを製造できることを実証している。同じライブラリーを使用する同じ方法は、他の適切な標的、例えばbFGFやPDGF等のヘパリン結合成長因子への結合剤のスクリーニングと組み合わせて使用可能である。
【００８４】
実施例２  ATIII結合性リガンドの製造
デコンボルーションストラテジーに従って作成したライブラリーに組み立てたスルフェート化ペプチドを使用してATIIIに結合するリガンドを製造した。本実施例は、コンビナトリアルライブラリー合成アプローチを採用する形態により、ATIIIに結合する小さなスルフェート化ペプチドを製造できることを実証する。便宜上、ライブラリー合成プロセスの過程で各種の位置を変動させることはなかった。
【００８５】
ライブラリー合成
スルフェート化デカペプチドライブラリーの合成をFLEXCHEM96穴反応器ブロック(Robinson Scientific)で行った。Fmoc/tert-ブチルまたはFmoc/Bocによる保護ストラテジーを、蛍光バックグラウンドが非常に低くかつタンパク質のようなマクロ分子がよく透過するPEGベース樹脂、PEGA樹脂(NOVABIOCHEM)の上で利用した。特に指摘しない限り実施例１の方法を踏襲した。最後にFmocを除去した後に無水酢酸、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を使用してN末端をアセチル化した。トリフルオロ酢酸(TFA)および水を使用して保護基を除去し、次にL-セリンおよびL-チロシンのヒドロキシル基またはL-リジン残基のアミン基を三酸化硫黄-ピリジン錯体でスルフェート化した。
【００８６】
三つのスルフェート化デカペプチドライブラリーを合成したが、それぞれはスルフェート化残基、Ser(SO3)、Tyr(SO3)、またはLys(SO3)の中の一つの型のみを含有した。各ライブラリーは四つの構築ブロック、すなわち３個の疎水性アミノ酸、L-グリシン、L-フェニルアラニン、L-バリンおよそのびスルフェート化残基から構成された。ヘパリン結合領域では陽性荷電のアミノ酸の間に疎水性部分がスペーシングしているとFrommらが記載しているので、そのようなデカペプチドを製造した。更に、ヘパリン模倣デカペプチドにおいてはペプチジル樹脂の位置2、６および10のアミノ酸をスルフェート化残基に固定した。ペプチジル樹脂の位置1〜5には分割、結合および混合の過程でペプチドを充填し、その結果、各位置1、3、4および5には四つの構築ブロックのあらゆる可能な組み合わせが存在したので44 (256) 個の異なるペプチドが製造された。ペプチジル樹脂上のペプチドをプールし、反応器ブロックの64合成用穴に分割した。ペプチジル樹脂上の最後の五つの位置にはアミノ酸を充填し、位置７、８および９には構築ブロックのあらゆる可能な組み合わせ、すなわち総計43(64)個の組み合わせを充填した。したがって、各ライブラリーは64×256＝16,384個の異なるスルフェート化デカペプチドで作成され、各ライブラリーにおいてN末端に最も近い５個のアミノ酸の配列は既知のものと同じである。これらのライブラリーをスクリーニングし、最も良好なサブライブラリーを精選した。最も良好なサブライブラリーは、Ac-Ser(SO3)-Val-Phe-Val-Ser(SO3)-Xxx-Xxx-Xxx-Ser(SO3)-Xxx-PEGA(SEQ ID NO:11参照)であった。
【００８７】
この配列、すなわち最良結合サブライブラリーのN末端から5個のアミノ酸を有する配列を使用して第二のライブラリー、すなわち位置２および６~10は固定され位置1および3~5は変動するライブラリーを合成した。この第二ライブラリーを過剰ヘパリンの存在下でスクリーニングし、最適配列を決定した。最適配列は、配列Ac-Ser(SO3)-Val-Phe-Val-Ser(SO3)-Ser(SO3)-Val-Val-Ser(SO3)-Ser(SO3)-PEGA(SEQ ID NO:1２参照)であった。
【００８８】
スクリーニング
ライブラリーのスクリーニングは、アンチトロンビンIIIヘパリン結合領域を代表する蛍光標識化ペプチドを使用して行った。このペプチド、N-ダンシル-Gly-Lys-βAla-Phe-Ala-Lys-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Tyr-Arg-Lys-Ala-NH2の合成は、PIONEER PEPTIDE SYNTHESIZER(PERCEPTIVE BIOSYSTEMS、現在APPLIED BIOSYSTEMS) の上で標準的なFmoc化学を利用して行った。
【００８９】
三つのサブライブラリーの各々から2mgの樹脂（約120nmolペプチド）を採取し、pH7.4のPBS緩衝液100μlを含有する96フィルター穴プレートに移した。PEGA樹脂およびヘパリンアガロース樹脂を非特異的結合用コントロールとしておよび参照用として使用した。各穴に蛍光標識化ペプチドの等モル溶液を加え、樹脂を終夜連続的に振蘯しながらインキュベートした。ろ過してインキュベーション液を除去した後に、非修飾PEGAを入れた穴の蛍光シグナルがバックグラウンドのシグナルと同じになるまで樹脂を広範囲に洗浄した。ウエルプレートリダー付きのLS-50Bルミネッセンス分光器(PERKIN-ELMER)を使用し励起波長340nmおよび発光波長540nmで蛍光測定を行った。次に樹脂を5倍モル過剰のヘパリン（穴当たり600nmol）を含有するpH7.4のPBS緩衝液で終夜インキュベートし、再び樹脂を広範囲に洗浄した。ヘパリンとインキュベートした結果、コントロールとして使用したヘパリン-アガロース樹脂の蛍光シグナルはバックグラウンドのレベルに減少した。反対に、スルフェート化ペプチジルPEGA樹脂を入れた若干の穴では顕著な蛍光シグナルが観察されたので、このことからアンチトロンビンIIIのヘパリン結合領域が強力に結合していることが示された。
【００９０】
穴当たり樹脂1mgを使用し、かつアンチトロンビンIIIの蛍光標識化ヘパリン結合領域ペプチドとのインキュベートを10倍モル過剰のヘパリンの存在下で行った以外は上記と同様にして第二ライブラリースクリーニングを行った。かくして、ヘパリン性ペプチドリガンドは、ATIIIヘパリン結合領域に結合するにはヘパリンと競合しなければならなかった。
【００９１】
本実施例に記載のデカペプチドリガンドは10倍モル過剰のヘパリンの存在下でヘパリン結合領域に結合した。このことから、これらのペプチドにはアンチトロンビンIIIのヘパリン結合領域に対して高度に親和性のリガンドがあることが示している。最強の結合は、配列Ac-Ser(SO3)-Val-Phe-Val-Ser(SO3)-Ser(SO3)-Val-Val-Ser(SO3)-Ser(SO3)-PEGA(SEQ ID NO:12参照)を有するデカペプチドに見られた。他のATIII結合ペプチドを表２に挙げる。ヘパリン模倣特性を持ったこのスルフェート化デカペプチドまたはそのスルフォネート化類似体は新しいクラスの抗トロンビン剤である。
2005504025.tif 000003
【００９２】
実施例３：  VEGFに対するリガンド
本実施例は、本発明システムおよび方法においてスルフェート化ペプチドを使用する形態により、重要な内皮細胞マイトジェンである標的VEGFに高い親和性をもって結合するリガンドが生産されることを実証する。本実施例は特に言及しない限り実施例１を踏襲する。
【００９３】
コンビナトリアルライブラリー合成
7個のアミノ酸位置を有するペプチドのライブラリーを合成した。最初の三つのアミノ酸は実施例１で使用したと同じ９個のアミノ酸を使用して変動させた。7個の位置の中の他の4個のアミノ酸は、実施例１のライブラリーの結果から選択した配列Gly-Tyr(SO3)Asp-Tyr(SO3)に固定した。実施例１に対すると同じアミノ酸および条件を使用してこのライブラリーを合成した。ただし、Fmoc-Gly-Tyr(SO3)Asp-Tyr(SO3)-Gly-Gly-Gly-Gly-PEGAを出発樹脂として使用し、結合を全3回繰り返した。合成の結果、93個すなわち729個の異なるペプチドの多数のコピーが得られた。
【００９４】
スクリーニングプロセス
比色測定法を利用してライブラリーをスクリーニングした。この測定法では二つの異なる沈降性の発色色素を使用した。この方法でVEGF165に選択的にかつスルフェート官能基を介して結合するビーズを決定することができた。ライブラリーの一部（2〜3コピー）を水で膨潤し、TBSで3回濯いだ。トリス緩衝化塩溶液(TBS、保護用緩衝剤)中の0.1％アルブミンおよび0.2%ツイーンに樹脂を終夜接触せしめ、TBSで濯ぎ(２×)、次にストレプタビジンアルカリ性フォスファターゼ(1mg/mL溶液から1：1000に希釈)1mLを加え2時間振蘯した。樹脂をTBSで濯ぎ(５×）、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルフォスフェートp-トルイジン塩/ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(BCIP/NBT)試薬200μLを加え、ストレプタビジンアルカリ性フォスファターゼが存在するところに青/黒色を発色させた。ストレプタビジンアルカリ性フォスファターゼの非特異的吸着を青/黒染色化ビーズとして検出した。15分後に樹脂をTBS(５×)で濯ぎ、次に保護緩衝液400μL中に1または10当量のヘパリンナトリウム塩（ブタ腸内粘膜から単離）の存在下または非存在下に、約0.25nMビオチニル化VEGF165を100μL加えた。混合物を終夜振蘯し、溶液を除去し、樹脂をTBS(６×)で洗浄し、ストレプタビジンアルカリ性フォスファターゼ(1mg/mL溶液から1：1000に希釈)1mLを加えた。ストレプタビジンアルカリ性フォスファターゼはVEGFを有するビーズに優先的に付着した。理由は、VEGFはビオチンに付着し、ビオチンはストレプタビジンアルカリ性フォスファターゼ上のストレプタビジンに対するリガンドだからである。2時間後に溶液を除去しTBS(５×)で濯ぎ、FAST RED基質(PIERCE)を加えて赤色化しアルカリ性フォスファターゼの存在を目視可能にした。赤く染色したのが陽性ビーズであった。赤いビーズを選別し、8M塩酸グアニジンにpH1.4で20分間接触させ、次に残存色が除去されるまで水（３×）およびDMFで濯いだ。樹脂を30%TFAに60?で1時間接触させてペプチドの脱スルフェート化を完了した。選別したビーズを水で十分に濯ぎ、上記した様にストレプタビジンアルカリ性フォスファターゼに、次にFast Redに接触させて発色させた。脱スルフェート化後に無色のままに残ったビーズを選別し、ミクロシーケンシングを行った。
【００９５】
最強結合剤を選出するために、非常に低濃度のビオチニル化VEGF165 (約0.25nM)を最初に利用してライブラリーを分析した。それにもかかわらず結果から、約5~8％のライブラリーがVEGF165に結合したことが示された。したがって、同じく低濃度のビオチニル化VEGF165を使用して、1または10等量のヘパリンの存在下に競合測定法を実施した。１当量のヘパリンを使用した場合には、スルフェート官能基を介してVEGF165に結合した6個のビーズを発見し、これらの中の３個を配列決定した。10当量のヘパリンを使用した場合には、3個のビーズだけを選出し、これら全てを配列決定した。ミクロシーケンシングの結果を表３に示す。この結果は、ヘパリンの存在下、VEGF165はペプチドY(SO3)Y(SO3)GGY(SO3)DY(SO3)(SEQ ID NO:14参照)で置換したビーズに結合したことを実証している。
2005504025.tif 000004
実施例１の第一ライブラリー由来の最高ランクのビーズを元に、SY(SO3)DY(SO3)G(SEQ ID NO:17参照)のごとき配列を合成した。また本実施例のライブラリーからペプチドY(SO3)Y(SO3)GGY(SO3)DY(SO3)(SEQ ID NO:14参照)の両者を独立に合成し、解離定数(KD)を表面プラズマ共鳴(SPR)によって決定した。これらペプチドを、新脈管形成を阻害する既知のヘパリン模倣物スラミンと比較した。SPRによって三つの化合物の親和性を直接比較することができた。結果を表４に示す。この結果は、SY(SO3)DY(SO3)G(SEQ ID NO:17参照)およびY(SO3)Y(SO3)GGY(SO3)DY(SO3)(SEQ ID NO:14参照)はスラミンよりもかなり高い親和性をもってVEGFに結合し、後者は最強の結合剤であることを実証している。脱スルフェート化した類似のペプチドのVEGFへの結合は、SPRによって検出できなかった。
2005504025.tif 000005
【００９６】
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【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１Ａは硫酸塩化アミノ酸の例を示す。
【００９８】
図１Ｂはスルフォン酸塩化アミノ酸の例を示す。
【００９９】
図１Ｃは硫酸塩化及びスルフォン酸塩化アミノ酸の例を示す。
【図２】図２は本発明の一部の実施例のリガンドのために適したヘパリン結合部位のリストである。
【図３】図３はコンビナトリアル化学の実施手順である。
【図４】図４はコンビナトリアル化学の実施手順の別の例である。
【図５】図５は実施例１のライブラリーのスクリーニング処理の位置部として作成されたグラフである。
【図６】図６は配列番号で報告された配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005504025.tif 000093
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