(57)【要約】  抗体のエピトープ結合特性に基づいて抗体を分類するための方法を記載する。異なる抗体のエピトープ認識性を決定するための方法およびシステムを提供する。抗体のエピトープ認識性に基づいて抗体をクラスタリングするため、異なるエピトープ結合特性を有する抗体を同定するための、データ分析法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原上のエピトープと結合する抗体を決定するための抗体競合アッセイ法であって、
抗原と結合する一組の抗体を用意すること、
前記組のそれぞれの抗体を標識して、標識済み参照抗体の組を作製することであって、その結果、それぞれの標識済み参照抗体が、前記標識済み参照抗体の組中の他の全ての標識済み参照抗体と区別可能であること、
該抗原と結合する前記抗体の組からプローブ抗体を選択すること、
前記プローブ抗体と前記標識済み参照抗体の組を前記抗原の存在下で接触させること、
前記抗原、前記抗原と結合した1つの標識済み参照抗体、および前記抗原と結合した前記標識済みプローブ抗体を含む複合体中の、前記プローブ抗体を検出すること、
それぞれの前記複合体中において前記抗原と結合した、それぞれの前記標識済み参照抗体を同定すること、
前記プローブ抗体が前記標識済み参照抗体の組中の任意の参照抗体と競合するかどうかを決定することであって、競合によって前記プローブ抗体が、抗原と結合する前記抗体の組中の他の抗体と同じエピトープに結合することが示されること
を含む抗体競合アッセイ法。
【請求項２】
前記プローブ抗体を標識して標識済みプローブ抗体を形成することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記標識済みプローブ抗体が、酵素標識、比色定量用標識、蛍光標識、または放射標識から選択される標識を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブ抗体を検出するために標識済み検出用抗体を用意することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記標識済み検出用抗体が、酵素標識、比色定量用標識、蛍光標識、または放射標識から選択される標識を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
抗原と結合する抗体の組のそれぞれの抗体を独自に着色したビーズで標識して、標識済み参照抗体の組を形成することであって、その結果、それぞれの標識済み参照抗体が、前記標識済み参照抗体の組中の他の全ての標識済み参照抗体と区別可能である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記それぞれ独自に着色したビーズが異なる発光スペクトルを有する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブ抗体が標識済みプローブ抗体である、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブ抗体を検出するために標識済み検出用抗体を用意することをさらに含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
結合特性に基づいて抗体を特定するための方法であって、
抗原と結合する一組の抗体を使用する少なくとも1つの抗体競合アッセイの結果を表す入力データを用意すること、
前記入力データを正規化して正規化強度行列を作製すること、
少なくとも1つの非類似性行列を計算することであって、前記正規化強度行列から閾値行列を作製することを含み、前記閾値行列から非類似性行列を計算すること、および
前記非類似性行列のセルの非類似性値に基づいて抗体をクラスタリングして、抗原と結合する前記抗体の組のエピトープの結合パターンを決定すること、
を含む方法をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
競合パターン認識(CPR)法を、結合特性に基づいて抗体を特定するために使用する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記入力データを高スループット競合抗体アッセイによって作製する、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記高スループット競合抗体アッセイが多重競合抗体値域分け(MCAB)アッセイである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記入力データが、抗原と結合する一組の抗体を使用する少なくとも1つの抗体競合アッセイの結果を表すシグナル強度値を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1つの抗体競合アッセイの結果を表すシグナル強度値を含む前記入力データが、行列形で保存される入力データを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
行列形で保存される前記入力データが二次元行列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
行列形で保存される前記データが多次元行列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
行列形で保存される前記入力データが複数の行列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
行列形で保存される前記入力データが、マルチウエル形式を使用して行われる抗体競合アッセイの結果を表すシグナル強度値を含み、前記行列のそれぞれのセルが前記マルチウエル形式の1つのウエルで行われるアッセイの結果を表す、請求項15に記載の方法。
【請求項２０】
前記入力データを正規化して正規化強度行列を作製することが、抗原を加えなかった第一の抗体競合アッセイからのシグナル強度値を含む第一の行列を、抗原を加えた第二の抗体競合アッセイからのシグナル強度値を含む第二の行列から引くことによって、バックグラウンド正規化強度行列を作製することを含む、請求項15に記載の方法。
【請求項２１】
阻害緩衝値用の最少の閾値を設定し、前記閾値未満の任意の阻害緩衝値を、前記正規化強度行列の前記作製前に前記閾値に調整することを含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記バックグラウンド正規化強度行列の列中のそれぞれの値を、前記列に関する阻害緩衝強度値で割ることをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記正規化ステップが、前記強度正規化行列のそれぞれの前記列をその対応する対角値で割って最終的な強度正規化行列を作製することを含む、プローブ抗体の基準シグナルに対する正規化をさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
それぞれの前記対角値を、それぞれの列をその対応する対角値で割る前記除法の前に、ユーザー定義の閾値と比較し、前記ユーザー定義の閾値未満の任意の前記対角値を前記閾値に調整する、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記正規化ステップが、前記バックグラウンド正規化強度行列の行中のそれぞれの値を前記行に関する阻害緩衝強度値で割ることによって、強度正規化行列を作製することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
前記正規化ステップが、前記強度正規化行列のそれぞれの前記行をその対応する対角値で割って最終的な強度正規化行列を作製することを含む、プローブ抗体の基準シグナルに対する正規化をさらに含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
それぞれの前記対角値を、それぞれの行をその対応する対角値で割る前記除法の前に、ユーザー定義の閾値と比較し、前記ユーザー定義の閾値未満の任意の前記対角値を前記閾値に調整する、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記閾値行列の前記作製が、前記正規化強度行列のそれぞれのセルの正規化値を値one(1)またはzero(0)に設定することを含み、閾値以下の正規化値を値zero(0)に設定し、前記閾値より大きい正規化値を値one(1)に設定する、請求項20に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも1つの非類似性行列を、1および0の前記閾値行列を用意し、行のそれぞれの対が異なる位置の数を決定することによって計算する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
複数の非類似性行列を複数の閾値を使用して計算する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の非類似性行列の平均値を計算する、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の非類似性行列の前記平均値を、前記クラスタリングステップのための入力値として用意することを含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記非類似性行列のセルの前記非類似性値に基づく前記抗体のクラスタリングが、階層的クラスタリングを含む、請求項10に記載の方法。
【請求項３４】
前記階層的クラスタリングが、抗原と結合する前記抗体の組中において抗体の枝分かれ部分集合の階層を作製することを含み、
最低の非類似性値を有する前記組中の抗体の対を決定すること、
次に低い非類似性値を有する抗体の対を決定すること、
一対の抗体が残るまで、次に低い非類似性値を有する前記抗体の対の前記決定を相互作用的に繰り返し、その結果、前記抗体の組中における競合パターンの類似性を示す、枝分かれ部分集合の階層を作製すること、および
競合パターンに基づいてクラスターを決定すること、
を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記クラスタリングステップからのデータを収集する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
データを自動化手段によって収集する、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記クラスタリングステップがディスプレーを作製する、請求項34に記載の方法。
【請求項３８】
前記ディスプレーがデータ入力装置またはコンピュータと適合性がある形式である、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記ディスプレーが非類似性行列を含む、請求項37に記載の方法。
【請求項４０】
前記非類似性行列のそれぞれのセルの非類似性値の視覚的評価指標によって、クラスターを決定する、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記非類似性行列が、前記セルによって表される抗体対が属するクラスターの視覚的指標を有するセルを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記視覚的指標が色である、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記視覚的指標が陰影である、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記視覚的指標がパターンである、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
前記ディスプレーが、前記抗体の組に関して計算した非類似性値によって定義される系統樹である、請求項37に記載の方法。
【請求項４６】
前記系統樹が、前記抗体の組中の抗体を表す分岐を含み、分岐の配置が前記抗体の組中の抗体間の関係を表し、さらに前記配置が前記抗体の組中の抗体のクラスターを表す、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記系統樹がさらに分岐を含み、任意の前記分岐の長さが、抗体の結合パターンまたは前記分岐によって表される抗体のクラスターの間の類似性の程度を表す、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
複数の抗体競合アッセイの結果を表す入力データを用意することを含み、それぞれのアッセイが抗原と結合する一組の抗体を使用する個々の実験を表し、さらにそれぞれの前記実験が少なくとも1つの他の実験においても試験される少なくとも1つの抗体を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項４９】
それぞれの前記個々の実験に関する個々の正規化強度行列を作製することを含み、それぞれの個々の正規化強度行列において表されるそれぞれの抗体対の平均強度値を計算することによって、1つの正規化強度行列を作製することをさらに含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５０】
前記複数の抗体競合アッセイにおいて試験されるそれぞれの抗体対を表す、1つの非類似性行列を作製することをさらに含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
結合特性に基づいて抗体を特定するための方法であって、
標識済み参照抗体の組を用意することであって、その結果、前記組中のそれぞれの標識済み参照抗体が、前記標識済み参照抗体の組中の他の全ての標識済み参照抗体と区別可能であり、かつそれぞれの抗体が抗原と結合すること、
抗原と結合する前記抗体の組からプローブ抗体を選択すること、
前記プローブ抗体と前記標識済み参照抗体の組を前記抗原の存在下で接触させること、
前記抗原、前記抗原と結合した1つの標識済み参照抗体、および前記抗原と結合した前記標識済みプローブ抗体を含む複合体中の、前記プローブ抗体を検出すること、
それぞれの前記複合体中において前記抗原と結合した、それぞれの前記標識済み参照抗体を同定すること、
前記プローブ抗体が前記標識済み参照抗体の組中の任意の参照抗体と競合するかどうかを決定することであって、競合によって前記プローブ抗体が、抗原と結合する前記抗体の組中の他の抗体と同じエピトープに結合することが示されること、
抗原と結合する一組の抗体を使用する少なくとも1つの抗体競合アッセイの、結果を表す入力データを用意することであって、さらに前記入力データが、抗原と結合する一組の抗体を使用する少なくとも1つの抗体競合アッセイの結果を表すシグナル強度値を含むこと、
前記入力データを行列形で保存すること、
抗原を加えなかった第一の抗体競合アッセイからのシグナル強度値を含む第一の行列を、抗原を加えた第二の抗体競合アッセイからのシグナル強度値を含む第二の行列から引いて、バックグラウンド正規化強度行列を形成すること、
前記バックグラウンド正規化強度行列のそれぞれの対角セルの値を計算すること、
前記列のそれぞれの対角セル中の値より有意に大きな値を有する、前記バックグラウンド正規化強度行列のそれぞれの列中のセルを決定すること、および
類似の結合パターンを有する列を値域としてグループ分けすること
を含む結合特性に基づいて抗体を特定するための方法。
【請求項５２】
前記列のそれぞれの対応する対角セル中の前記値より有意に大きな値を有する、前記バックグラウンド正規化強度行列中の前記セルが、それぞれの対角セル中の前記値の少なくとも2倍の値を有する、請求項51に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体が認識するエピトープに基づいて抗体をグループ分けすること、および異なる結合特性を有する抗体を同定することに関する。詳細には本発明は、エピトープと結合する抗体を決定するための抗体競合アッセイ法、および抗原特異的抗体を、異なる結合特異性を示す群すなわち「値域(bin)」に分けるためのデータ分析法に関する。具体的には本発明は、多重競合抗体値域分け(MCAB)高スループット抗体競合アッセイ、および高スループットアッセイによって作製したデータを分析するための競合パターン認識(CPR)データ分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体(mAb)は、感染病、心臓病、炎症および癌などの広くさまざまな疾患の治療において、重要な治療上の有用性を示す(Storch(1998)Pediatrics102:648〜651;Coller他、(1995)Thromb.Haemostasis 74:302〜308;Present他、(1999)New Eng.J.Med.6:1398〜1405;Goldenberg (1999)Clin.Ther.21:309〜318)。外来物質または抗原による感染または免疫処置に応答して、細胞は抗体を産生する。モノクローナル抗体の考えられる治療上の有用性は、部分的には抗体の特異的で親和性の高い標的との結合によるものである。抗体は、抗原上の特定部位すなわちエピトープを認識することによって、標的抗原と特異的に結合する。近年開発されたXenoMouse(商標)技術(Abgenix,Inc.,Fremont,CA)、およびハイブリドーマ細胞またはB細胞に関する確立された手順(Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495〜497)、およびリンパ球の単離(Babcook他、(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:7843〜7848)を使用することによって、ほぼすべてのヒト抗原に対する、多数の抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を作製することが可能である(Green(1999)Jnl.Immunol Methods231:11〜23、Jakobovits他、(1993)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.,90:2551〜2555,Mendez他、(1997)Nat.Genet.15:146〜156;Green and Jakobivits,J.Exp.Med.(1998),188:483〜495)。
【０００３】
特定の標的抗原に対して作製される多数の抗体は、どの程度強く抗体が抗原および特定のエピトープに結合するか、抗体が標的抗原上に結合するかという点で実質的に変わる可能性がある。抗原に対して作製される異なる抗体は異なるエピトープを認識し、それぞれのエピトープに対してさまざまな結合親和性を有する。多数の作製した候補の抗体から治療上有用な抗体を同定するために、それらの結合親和性およびエピトープ認識性に関して、多数の抗体をスクリーニングすることが必要である。この理由のため、特定の標的抗原に対して作製した抗体をスクリーニングして、治療効果を有する可能性が最も高い抗体を同定する、迅速な方法を有することが有利であると思われる。さらに、その標的エピトープ結合部位に従って作製した抗体を分類するための、機構を提供することが有利であると思われる。
【非特許文献１】Storch(1998)Pediatrics102:648〜651
【非特許文献２】Coller他、(1995)Thromb.Haemostasis 74:302〜308
【非特許文献３】Present他、(1999)New Eng.J.Med.6:1398〜1405
【非特許文献４】Goldenberg(1999)Clin.Ther.21:309〜318
【非特許文献５】Babcook他、(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:7843〜7848
【非特許文献６】Green(1999)Jnl.Immunol Methods231:11〜23
【非特許文献７】Jakobovits他、(1993)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.,90:2551〜2555
【非特許文献８】Mendez他、(1997)Nat.Genet.15:146〜156
【非特許文献９】Green and Jakobivits,J.Exp.Med.(1998),188:483〜495
【非特許文献１０】Eisen他、(1998)Proc.Mad.Acad.Sci.USA95:14863〜14868
【非特許文献１１】Luminex User Manual、75〜76項
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、抗体のエピトープ結合特性に基づいて抗体を分類するための、方法を提供するものである。一態様は、異なる抗体のエピトープ認識性を決定するための、方法およびシステムを提供する。他の態様は、抗体のエピトープ認識性に基づいて抗体をクラスタリングし、異なるエピトープ結合特性を有する抗体を同定するためのデータ分析法を提供する。本明細書で開示および特許請求する抗体分類すなわち「値域分け」は、抗原特異的抗体の集団のエピトープ結合特性を決定し、異なるエピトープ結合特性を示す「値域」に抗体をクラスタリングし、所望の結合特性を有する抗体を同定するための、アッセイ法およびデータ分析法を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
結合特性に基づいて抗体を分類するための方法は、以下のことを含む:
a)抗原と結合する一組の抗体を用意し、組中のそれぞれの抗体を標識して、標識済み参照抗体の組を形成することであって、その結果それぞれの標識済み参照抗体が、標識済み参照抗体の組中の他の全ての標識済み参照抗体と区別可能であること、抗原と結合する抗体の組からプローブ抗体を選択すること、プローブ抗体と標識済み参照抗体の組を抗原の存在下で接触させること、抗原と結合した標識済み参照抗体、抗原、および抗原と結合したプローブ抗体を含む複合体中の、プローブ抗体を検出すること;および
b)ステップa)と同様の抗原と結合する一組の抗体を使用する少なくとも1つの抗体競合アッセイの結果を示す入力データを用意し、入力データを正規化して正規化強度行列を作製し、少なくとも1つの非類似性行列を計算し、正規化強度行列から閾値行列を作製することを含み、閾値行列から非類似性行列を計算し、非類似性行列のセルの非類似性値に基づいて抗体をクラスタリングして、抗原と結合する抗体の組のエピトープの結合パターンを決定すること。入力データは、高スループットアッセイ、好ましくは多重競合抗体値域分け(MCAB)アッセイによって作製することができる。競合パターン認識法を、データ分析用に使用することが好ましい。
【０００６】
抗体競合アッセイ法に関しては、プローブ抗体を標識することができ、プローブ抗体は、抗原と結合した標識済み参照抗体、抗原、および抗原と結合した標識済みプローブ抗体を含む複合体中において検出することができ、これによって標識済みプローブ抗体が、標識済み参照抗体の組中の任意の参照抗体と競合するかどうかを決定することができる。なぜなら競合によってプローブ抗体が、抗原と結合する抗体の組中において、他の抗体と同じエピトープに結合することが示されるからである。プローブ抗体は、例えば酵素標識、または比色定量用標識、または蛍光標識、または放射標識で標識することができる。
【０００７】
抗体競合アッセイ法の好ましい実施形態では、検出用抗体を使用して結合したプローブ抗体を検出し、この場合検出用抗体は、プローブ抗体のみに結合し、参照抗体とは結合しない。検出用抗体は、抗原と結合した標識済み参照抗体、抗原、および抗原と結合した標識済みプローブ抗体を含む複合体中の、結合したプローブ抗体を検出する。標識済み検出用抗体を使用して結合したプローブ抗体を検出し、この場合検出用抗体は、例えば酵素標識、または比色定量用標識、または蛍光標識、または放射標識で標識することができる。あるいは検出用抗体は、抗体結合タンパク質などの検出手段を使用して検出する。
【０００８】
特に、抗原上のエピトープと結合する抗体を決定するための抗体競合アッセイ法は、抗原と結合する一組の抗体を用意し、組中のそれぞれの抗体を独自に着色したビーズで標識して、標識済み参照抗体の組を形成することであって、その結果それぞれの標識済み参照抗体が、標識済み参照抗体の組中の他の全ての標識済み参照抗体と区別可能であること、抗原と結合する抗体の組からプローブ抗体を選択すること、プローブ抗体と標識済み参照抗体の組を抗原の存在下で接触させること、抗原と結合した標識済み参照抗体、抗原、および抗原と結合したプローブ抗体を含む複合体中の、結合したプローブ抗体を検出すること、およびプローブ抗体が標識済み参照抗体の組中の任意の参照抗体と競合するかどうかを決定することであって、競合によってプローブ抗体が、抗原と結合する抗体の組中において、他の抗体と同じエピトープに結合することが示されることを含む。それぞれの独自に着色したビーズは、異なる発光スペクトルを有することができる。プローブ抗体は、例えば酵素標識、または比色定量用標識、または蛍光標識、または放射標識で標識することができる。あるいは、検出用抗体を使用して結合したプローブ抗体を検出し、この場合検出用抗体を標識することができる。標識される検出用抗体は、例えば酵素標識、または比色定量用標識、または蛍光標識、または放射標識で標識することができる。
【０００９】
本発明の他の態様は、結合特性に基づいて抗体を特定するための方法を提供し、この方法は、抗原と結合する一組の抗体を使用する少なくとも1つの抗体競合アッセイの結果を示す入力データを用意し、入力データを正規化して正規化強度行列を作製し、少なくとも1つの非類似性行列を計算し、正規化強度行列から閾値行列を作製することを含み、閾値行列から非類似性行列を計算し、非類似性行列のセルの非類似性値に基づいて抗体をクラスタリングして、抗原と結合する抗体の組のエピトープの結合パターンを決定することによるものである。
【００１０】
入力データは、抗原と結合する一組の抗体を使用する抗体競合アッセイの、結果を表すシグナル強度値であってよい。抗体競合アッセイの結果を表す入力データは、行列形で保存することができる。行列形で保存される入力データは、二次元行列または多次元行列であってよく、複数の行列で保存することができる。行列形で保存される入力データは、抗体競合アッセイの結果を表すシグナル強度値であってよい。抗体競合アッセイは、多重競合抗体値域分け(MCAB)アッセイであってよい。行列形で保存される入力データは、少なくとも1つの行列であって、行列のそれぞれのセルが個々の抗体競合アッセイのシグナル強度値を含む行列であってよい。
【００１１】
入力データを正規化して正規化強度行列を作製することは、抗原を加えなかった(陰性対照)第一の抗体競合アッセイからのシグナル強度値を有する第一の行列を、抗原を加えた第二の抗体競合アッセイからのシグナル強度値を有する第二の行列から引くことによって、バックグラウンド正規化強度行列を作製することを含むことができる。阻害緩衝値用の最少の閾値を設定し、その閾値未満の任意の阻害緩衝値は、前記正規化強度行列の作製前に閾値に調整する。
【００１２】
望むならば正規化ステップは、バックグラウンド正規化強度行列の列中のそれぞれの値を、列に関する阻害緩衝強度値で割ることによって、強度正規化行列を作製することを含む。正規化ステップは、プローブ抗体の基準シグナルに対する正規化をさらに含むことができ、これは強度正規化行列のそれぞれの列をその対応する対角値で割って、最終的な強度正規化行列を作製することによる。それぞれの列をその対応する対角値で割る前に、それぞれの対角値をユーザー定義の閾値と比較し、そのユーザー定義の閾値未満の任意の前記対角値を、閾値に調整する。
【００１３】
望むならば正規化ステップは、バックグラウンド正規化強度行列の行中のそれぞれの値を、行に関する阻害緩衝強度値で割ることによって、強度正規化行列を作製することを含む。正規化ステップは、プローブ抗体の基準シグナルに対する正規化をさらに含むことができ、これは強度正規化行列のそれぞれの行をその対応する対角値で割って、最終的な強度正規化行列を作製することによる。それぞれの行をその対応する対角値で割る前に、それぞれの対角値をユーザー定義の閾値と比較し、そのユーザー定義の閾値未満の任意の前記対角値を、閾値に調整する。
【００１４】
閾値行列の作製は、正規化強度行列のそれぞれのセルの正規化値を、値one(1)またはzero(0)に設定することを含み、閾値以下の正規化値は値zero(0)に設定し、閾値より大きい正規化値は値one(1)に設定する。
【００１５】
少なくとも1つの非類似性行列を、行のそれぞれの対が異なる位置の数を決定することによって、1および0の閾値行列から計算する。複数の非類似性行列を、複数の閾値を使用して計算することができる。複数の非類似性行列の平均値を計算することができ、クラスタリングステップのための入力値として使用することができる。
【００１６】
前記非類似性行列のセルの前記非類似性値に基づく抗体のクラスタリングは、階層的クラスタリングを含むことができる。階層的クラスタリングは、抗原と結合する抗体の組中において抗体の枝分かれ部分集合の階層を作製することを含み、これは最低の非類似性値を有する組中の抗体の対を決定し、次いで次に低い非類似性値を有する抗体の対を決定し、一対の抗体が残るまで、次に低い非類似性値を有するそれぞれの抗体の対のこの決定を相互作用的に繰り返し、その結果、抗体の組中における競合パターンの類似性を示す、枝分かれ部分集合の階層を作製することによるものである。競合パターンに基づいて、クラスターを決定する。
【００１７】
あるいは、データ分析法は、抗原を用いて行った実験に関するデータ行列を、抗原を用いずに行った実験に関するデータ行列から引くことを含む。次いでそれぞれの対角セルの値を、対応する列中の抗体の結合親和性を決定するための、バックグランド値として使用する。対応する対角値より有意に大きい値を有する減法行列中のセルを、際立たせるかあるいは他の方法で示す。
【００１８】
クラスタリングステップからのデータは、自動化手段を含めた手段によって収集することができる。詳細には、クラスタリングステップからのデータは、データ入力装置またはコンピュータと適合性がある形式で収集することができる。クラスタリングステップによってディスプレーを作製することができ、これはデータ入力装置またはコンピュータと適合性がある形式であってよい。クラスタリングステップによって作製されるディスプレーは、非類似性行列であってよい。非類似性行列のそれぞれのセルの非類似性値の視覚的指標によって、クラスターを決定することができる。非類似性行列は、前記セルによって表される抗体対が属するクラスターの、視覚的指標を有するセルを含むことができ、その視覚的指標は色、または陰影、またはパターンであってよい。あるいはディスプレーは、一組の抗体に関して計算した非類似性値によって定義される系統樹であってよい。このような系統樹は、抗体の組中の抗体を表す分岐を有し、分岐の配置は抗体の組中の抗体間の関係を表し、その配置は抗体の組中の抗体のクラスターをさらに表す。このような系統樹では、任意の分岐の長さが、抗体の結合パターンまたは前記分岐によって表される抗体のクラスターの間の、類似性の程度を表す。
【００１９】
複数の抗体競合アッセイの結果を表す入力データを分析することができ、それぞれのアッセイは、抗原と結合する一組の抗体を使用する個々の実験を表し、さらにそれぞれの実験は、少なくとも1つの他の実験においても試験される少なくとも1つの抗体を含む。複数の実験を分析するとき、個々の正規化強度行列を、それぞれの個々の実験に関して作製することができ、1つの正規化強度行列を、それぞれの個々の正規化強度行列において表されるそれぞれの抗体対の、平均強度値を計算することによって作製することができる。複数の抗体競合アッセイにおいて試験されるそれぞれの抗体対を表す、1つの非類似性行列は、1つの正規化強度行列から作製することができる。
【００２０】
それぞれのハイブリドーマ-細胞融合実験から多数の抗原特異的抗体を生成する、融合の有効性が高まるにつれて、多数の抗体を処理し優先順位をつけるスクリーニング法が、さらに重要になる。一組のモノクローナル抗体が標的抗原に対して作製されたとき、その組の異なる抗体は異なるエピトープを認識し、さまざまな結合親和性も有するであろう。したがって、多数の抗体を有効にスクリーニングするためには、それぞれの抗体がどのエピトープに結合するかを決定すること、およびそれぞれの抗体の結合親和性を決定することが重要である。
【００２１】
本明細書に記載する、エピトープの値域分けは、抗体が認識するエピトープに基づいて、抗体をグループ分けする方法である。より詳細には、エピトープの値域分けは、異なる抗体のエピトープ認識性を差別化するための方法およびシステムを含み、抗体のエピトープ認識性に基づいて抗体をクラスタリングし、異なる結合特異性を有する抗体を同定するための、コンピュータによる方法と組み合わせる。したがって、本発明の実施形態は、抗体のエピトープ結合性を決定するためのアッセイ、およびこのようなアッセイから生じるデータを分析するための方法を含む。
【００２２】
一般に本発明は、ある試験要素(抗体など)が他の試験要素(他の抗体など)と競合して、試験対象(抗原など)と結合するかどうかを決定するための、アッセイを提供する。収集要素を使用して、試験対象および/または試験要素を明確な方式で収集し、検出用要素を利用して、他の試験要素と試験対象の間の結合を明確に検出する。アッセイされる試験要素と試験対象上の同一または類似の位置と、試験要素が結合するとき、結合は検出されず、一方、アッセイされる試験要素と試験対象上の異なる位置と試験部分が結合するとき、結合が検出される。それぞれの場合、結合またはその欠如は明らかであり、したがって、試験要素と試験対象の間の相対的相互作用は、容易に確認し分類することができる。
【００２３】
本発明の一実施形態は、一抗原に対して作製された一組の抗体を分類する、競合性に基づく方法である。この方法は、組からのそれぞれの抗体をその組からの他のすべての抗体に対する競合結合性に関して試験する、一連のアッセイを行うことを利用するものである。したがって、それぞれの抗体は2つの異なる方式で使用され:少なくとも1つのアッセイでは、それぞれの抗体が、組中の他のすべての抗体に対して試験される「プローブ抗体」として「検出」方式で使用され、;他のアッセイでは、アッセイされる参照抗体の組中において「参照抗体」として「収集」方式で、抗体が使用される。参照抗体の組中では、それぞれの参照抗体は、参照抗体の混合物中のそれぞれの参照抗体の検出および同定を可能にする方法で、独自に標識される。この方法は、参照抗体、抗原、およびプローブ抗体を含む「サンドウィッチ」または複合体を形成すること、これらの複合体の形成または形成の欠如を検出することを利用するものである。組中のそれぞれの参照抗体は独自に標識されるので、アッセイされる参照抗体の組中に存在するそれぞれの参照抗体の複合体が、形成されたかどうかを明確に決定することができる。
【００２４】
抗体アッセイの概要
本発明の方法は、ある抗原に対する抗体の組から抗体を選択することによって始まり、選択される抗体は、その組の他のすべての抗体に対する競合結合性に関して試験される「プローブ抗体」として働く。すべての抗体を含む混合物は、アッセイ用の一組の「参照抗体」として働き、混合物中のそれぞれの参照抗体は独自に標識される。アッセイでは、プローブ抗体と参照抗体の組を、標的抗原の存在下で接触させる。したがって、プローブ抗体と、標的抗原上の同じエピトープに関して競合しない組中の任意の他の抗体の間で、複合体が形成される。プローブ抗体と、標的抗原上の同じエピトープに関して競合する組中の任意の他の抗体の間では、複合体は形成されない。複合体の形成は、プローブ抗体を結合させる標識済み検出用抗体を使用して検出する。混合物中のそれぞれの参照抗体は独自に標識されるので、その参照抗体がプローブ抗体との複合体を形成するかしないかを、それぞれの参照抗体に関して決定することができる。したがって、混合物中のどの抗体がプローブ抗体と競合し、プローブ抗体と同じエピトープに結合するかを決定することができる。
【００２５】
それぞれの抗体は、少なくとも1つのアッセイにおいてプローブ抗体として使用される。抗体の組全体に対して組中のそれぞれの個々の抗体を試験する、この方法を繰り返すことによって、抗原に対する抗体の組全体の、競合結合親和性を生じさせることができる。このような親和性の測定から、組中のどの抗体が組中の他の抗体と同様の結合特性を有するかを決定することができ、これによってそのエピトープの結合概略に基づいて、それぞれの抗体のグループ分けすなわち「値域分け」することが可能になる。一連の競合結合親和性測定は、アッセイ結果を示すための適切な方法である。本発明の1つの好ましい実施形態は、抗体の高スループットスクリーニング用の、多重競合抗体値域分け(MCAB)アッセイである。
【００２６】
この実施形態は抗体の競合性を試験し、抗原に対して作製した抗体の組全体に対して1つの抗体を試験することを利用するものであるので、この方法を実施するための1つの試みは、組中の1つの抗体と他の抗体の任意の1つの間で形成される複合体を、個別に同定し定量的に測定するために使用される機構に関するものである。2つの抗体が抗原上の同じエピトープに関して競合しているかどうかの評価を用意するのは、この定量測定である。
【００２７】
以下に記載するように、本発明の実施形態は、すべての抗体の混合物を作製する前に、組中のそれぞれの参照抗体を独自に標識することに関する。以下で論じるこの独自の標識は、任意の特定の機構に限られない。そうではなくて、組中のそれぞれの参照抗体と組中のそれぞれ他の参照抗体を区別することができる、混合物中のそれぞれの参照抗体を同定するための手段を用意する任意の方法が、適切であろうと企図される。例えば、それぞれの参照抗体を比色定量的に標識して、その結果組中のそれぞれの抗体の個々の色を決定することができる。あるいは、組中のそれぞれの参照抗体を、異なる放射性同位体を使用して放射標識することができる。ビーズまたは他の表面などの標識済みの物体と抗体を結合、連結、または付着させることによって、参照抗体を標識することができる。
【００２８】
ひとたび組中のそれぞれの参照抗体が独自に標識されると、すべての参照抗体を含む混合物が形成される。抗原を混合物に加え、プローブ抗体を混合物に加える。結合したプローブ抗体を含む複合体を検出するために、検出用標識が必要である。検出用標識は標識済み検出用抗体であってよく、あるいはプローブ抗体と結合する他の標識であってよい。例えば、一組のヒトモノクローナル抗体を試験するとき、マウス抗ヒトモノクローナル抗体を検出用抗体として使用するのが適切である。参照抗体を標識するために使用される混合物中の他のすべての標識とは異なる、検出用標識を選択する。例えば、標識済み検出用抗体は、独自の色で標識し、または放射標識し、あるいはフィコエリトリン(PE)などの特定の蛍光マーカーによって標識することができる。
【００２９】
実験の設計は、検出用抗体がプローブ抗体のみに結合し、参照抗体とは結合しないような、条件の選択を含まなければならない。参照抗体がビーズまたは他の物質と抗体を介して結合する実施形態では、参照抗体をビーズと結合させる抗体(「収集抗体」)は、検出用抗体と同じ抗体であろう。本発明のこの実施形態に従い、検出用抗体を具体的に選択または改変して、その結果検出用抗体がプローブ抗体のみに結合し、参照抗体とは結合しないようにする。検出用と収集用に同じ抗体を使用することによって、それぞれの抗体が、そのそれぞれの標的と結合するのを互いに阻害するであろう。したがって、収集抗体が参照抗体と結合するとき、収集抗体は、検出用抗体が参照抗体上の同じエピトープと結合するのを阻害し、偽陽性の結果が生じるであろう。検出用抗体として使用するのに適した抗体には、Calbiochemから入手可能なマウス抗ヒトIgG2、IgG3およびIgG4抗体(カタログ番号411427、Southern Biotechnology Associates,Inc.から入手可能なマウス抗ヒトIgKappa(カタログ番号9220-01および9220-08、およびPharMingenからのマウス抗hIgGがある(カタログ番号555784および555785)。
【００３０】
ひとたび標識済み検出用抗体を混合物に加えた後、次いで混合物全体を分析して、標識済み検出用抗体、結合したプローブ抗体、抗原、および独自に標識した参照抗体の間の複合体を検出することができる。検出法は、混合物中のそれぞれ独自に標識した参照抗体に関する、複合体(またはその欠如)の検出を可能にしなければならない。
【００３１】
組中のプローブ抗体とそれぞれの参照抗体の間で形成された複合体が、それぞれの参照抗体を示すかどうか、その参照抗体が同じ(または近くの)エピトープとの結合に関してプローブ抗体と競合するかどうかを検出する。参照抗体の混合物はプローブ抗体として使用される抗体を含むので、これが陰性対照を用意すると予想される。複合体形成を検出することによって、試験される組中の抗体の競合親和性を測定することができる。次いで、この競合親和性の測定結果を使用して、標的抗原上の同じエピトープに抗体がどれだけ強くあるいは弱く結合するかに基づいて、組中のそれぞれの抗体を分類する。これによって、それらの結合特性に基づいて組中の抗体をグループ分けするための、迅速な方法が与えられる。
【００３２】
一実施形態では、以下に記載するような本発明の実施形態に従った1つの実験で、多数の抗体をそれらのエピトープ認識性に関して、同時にスクリーニングすることができる。一般に用語「実験」は、本明細書では非排他的に使用して、個々の抗体アッセイおよび適切な対照の集合を示す。用語「アッセイ」は、本明細書では非排他的に使用して、個々のアッセイ、例えば1つのプローブ抗体を使用してマイクロタイタープレートの1つのウエルにおいて行われる反応を指し、またはこの用語を使用してアッセイの集合を指し、あるいは本明細書に記載する抗体の結合および競合を測定する方法を指すことができる。
【００３３】
一実施形態では、組中のそれぞれの参照抗体が独自に標識された「収集」抗体と結合した、一組の参照抗体に関するサンドウィッチアッセイを使用して、多数の抗体をそれらのエピトープ認識性に関して、同時にスクリーニングする。収集抗体は例えば、組中の抗体に関して強い親和性を有する、比色定量的に標識された抗体であってよい。一例として収集抗体は、標識されたマウス、ヤギ、またはウシ抗ヒトIgGまたは抗ヒトIgKappa抗体であってよい。本明細書に記載する実施形態はマウスモノクローナル抗ヒトIgG抗体を使用するが、研究する抗体と結合するであろう他の類似の収集抗体は、本発明の範囲内にある。したがって当業者は、元の組の試験する抗体に基づいて、適切な収集抗体を選択することができる。
【００３４】
したがって、本発明の一実施形態は、例えば標的抗原上のどのエピトープが、その標的抗原に対して作製した50の異なる抗体によって結合するかを、分類する方法を提供する。ひとたび50個の抗体が標的抗原とのある程度の親和性を有することを決定した後、以下に記載する方法を使用して、50個の群中のどの抗体が同じエピトープに結合するかを決定する。これらの方法は、50個の抗体のそれぞれ1つをプローブ抗体として使用して、50個の抗体すべての混合物(参照抗体)に対して交差競合させることによって行われ、混合物中の50個の独自に標識された参照抗体は、収集抗体によってそれぞれ標識される。同じエピトープを認識する抗体は互いに競合するであろうが、競合しない抗体は同じエピトープに結合しないと考えられる。以下に記載するように1つの反応において、多数の抗体を独自に標識することにより、これらの方法によって、予め選択した抗体を一回に10、25、50、100、200、300またはそれより多くの抗体に対して競合させることができる。この理由のため、一回の実験において試験用の50個の抗体を選択することは任意であり、本発明を制限するものとしてみなすべきではない。
【００３５】
多重競合抗体値域分け(MCAB)アッセイを使用することが好ましい。MCABアッセイは、LUMINEX System(Luminex Corp.,Austin TX)を使用して実施することがより好ましく、これは図1に示す方法を使用して、100個までの抗体を同時に値域分けすることができる。MCABアッセイは、2つの抗体と1つの抗原分子の競合結合性に基づくものである。特定する抗体の組全体はMCABアッセイでは2回、MCABサンドウィッチアッセイでは「収集」および「検出」方式で使用される。
【００３６】
一実施形態では、それぞれの収集抗体を独自に標識する。ひとたび収集抗体を独自に標識した後、それを試験する抗体の組の1つに曝し、独自に標識された参照抗体を形成する。これを組中の残りの抗体に繰り返し、その結果それぞれの抗体が異なる色の収集抗体と共に標識される。例えば、50個の抗体を試験するとき、標識された参照抗体の混合物を、50個の独自に標識された参照抗体すべてを1つの反応用ウエルに混合させることによって作製する。この理由のため、それぞれの標識が、他の標識と混合したときにそれを区別または検出することができる、異なる性質を有することが有用である。1つの好ましい実施形態では、それぞれの収集抗体を異なる型の蛍光色素で標識するので、それらは互いに比色定量によって区別することができる。
【００３７】
ひとたび試験抗体の混合物を作製した後、それを例えば多数のウエルのマイクロタイタープレートに置く。この例では、同じ抗体混合物を50のマイクロタイターウエルそれぞれに置き、次いで競合アッセイの第一のステップとして、それぞれのウエル中の混合物を標的抗原と共にインキュベートする。標的抗原と共にインキュベートした後、元の50個の抗体の組から選択した1つのプローブ抗体を、それぞれのウエルに加える。この例では、ただ1つのプローブ抗体を、それぞれの参照抗体の混合物に加える。ウエル中の任意の標識済み参照抗体が、プローブ抗体と同じエピトープにおいて標的抗原と結合する場合、それらはエピトープ結合部位に関して互いに競合するであろう。
【００３８】
本発明の実施形態が、1つのプローブ抗体をそれぞれのウエルに加えることのみに限られないことは、当業者により理解される。それぞれ互いに区別可能に標識された多数のプローブ抗体を混合物に加える、他の方法が企図される。
【００３９】
プローブ抗体がウエル中の50個の標識済み参照抗体のいずれかと結合したかどうかを決定するために、標識済み検出用抗体を50個の反応混合物それぞれに加える。一実施形態では、標識済み検出用抗体は、収集抗体として使用する区別可能な標識型の同じ抗体である。したがって、例えば検出用抗体は、マウス抗ヒトIgG抗体または抗ヒトIgKappa抗体であってよい。検出用抗体は、ウエル中に置かれたプローブ抗体に結合し、標識するであろう。
【００４０】
検出用抗体上の標識によって、参照抗体、抗原、およびプローブ抗体によって形成される複合体と結合した、プローブ抗体の量を検出し測定することができる。この複合体は、プローブ抗体と参照抗体の間の競合の基準として働く。検出用抗体は、二次抗体の検出を容易にする任意の適切な標識で標識することができる。例えば、検出用抗体はビオチンで標識することができ、ストレプトアビジン-フィコエリトリン(PE)を加えるとき、これはプローブ抗体の蛍光検出を容易にする。検出用抗体は、複合体の一部としてその存在を独自に決定する、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、放射性同位体、酵素、または他の標識などの、任意の標識で標識することができる。望むならば標識は、ビーズまたは他の表面と結合した抗体-抗原複合体の分離を容易にすることもできる。
【００４１】
それぞれ独自に標識された参照抗体と結合した標識済み検出用抗体の量は、結合したプローブ抗体の量を示し、標識済み検出用抗体は、標識された参照抗体と結合した抗原と結合したプローブ抗体と結合する。50個の標識された参照抗体のそれぞれ1つと結合した標識済み検出用抗体の量を測定することによって、得ることができる結合したプローブ抗体の量が示され、結合したプローブ抗体の量は、2つの抗体(プローブおよび参照)のエピトープ認識性の類似性または非類似性の指標である。測定可能な量の標識済み検出用抗体が、標識済み参照抗体-抗原複合体上で検出される場合、それはプローブ抗体および参照抗体が、抗原上の同じエピトープに結合しないことを示すと理解される。逆に、測定可能な検出用抗体が標識済み参照抗体-抗原複合体上で、ほとんどあるいは全く検出されない場合、したがってその反応に関するプローブ抗体が、抗原上の非常に類似しているかまたは同一のエピトープに結合することを示すと理解される。少量の検出用抗体が参照抗体-抗原複合体上で検出される場合、参照抗体とプローブ抗体は、類似しているが同一ではないエピトープ認識性を有する可能性があり、例えば参照抗体とそのエピトープの結合によって、プローブ抗体とそのエピトープの結合が害されるが、それが完全に阻害されることはないことを示すと理解される。
【００４２】
本発明の他の態様は、参照抗体および抗原と結合したプローブ抗体の量を検出するための方法を提供する。異なる参照抗体を含む抗体複合体を混合させた場合、したがって、収集抗体上の独自の標識によって与えられる独自の性質を使用して、そのビーズと結合した参照抗体を同定することができる。その異なる性質は、独自の発光スペクトルであることが好ましい。
【００４３】
任意の参照抗体と結合したプローブ抗体の量は、複合体と結合した検出用標識の量を測定することによって、決定することができる。検出用標識は、複合体と結合したプローブ抗体と結合した標識済み検出用抗体であってよく、あるいは検出用標識は、プローブ抗体に付着した標識であってよい。したがって、参照抗体およびプローブ抗体のエピトープ認識性は、エピトープに関する2つの抗体間の競合の比較測定を使用することによって測定することができる。
【００４４】
手順を最適化するための条件は、経験的方法および当業者の知識によって決定することができる。インキュベーション時間、温度、緩衝液、試薬、および他の要因は、充分強力または明確なシグナルが得られるまでは、変わる可能性がある。例えば、さまざまな抗体の最適濃度は、異なる濃度で抗体および抗原を試験し、最強のシグナルまたは他の望ましい結果を生み出す濃度を探すことにより、当業者によって経験的に決定することができる。一実施形態では、一次抗体および二次抗体の最適濃度、すなわち抗体が値域分けされる濃度は、抗原を認識しない陰性対照抗体の存在下における、同じ抗原の異なるエピトープに対して産生された2つの抗体の二重の抗体価測定によって決定される。
【００４５】
着色ビーズを使用するアッセイ
好ましい実施形態では、色コード付けした小球またはビーズを使用して、好ましくはLuminex Corporation(Luminex Corp,Austin TX)から入手可能なシステムを使用して、最も好ましくはLuminex100systemを使用して、1つのチューブまたはウエル中の多数の反応混合物を同定するする1つのアッセイにおいて、多数の抗体をそれらのエピトープ認識性に関して同時にスクリーニングする。Luminexの技術を使用して、MCABアッセイを行うことが好ましい。他の好ましい実施形態では、試験する100個までの異なる抗体を、100の異なる色を有するLuminexビーズと結合させる。このシステムによって、さまざまな量の蛍光色素が埋め込まれた、100の異なる組のポリスチレンビーズが与えられる。これによってそれぞれの組のビーズに、異なる蛍光発光スペクトル、したがって異なる色コードが与えられる。
【００４６】
Luminex100systemを使用して抗体の結合性を特定するために、それぞれのビーズと共有結合する収集抗体で、ビーズをコーティングする;マウス抗ヒトIgGまたは抗ヒトIgKappaモノクローナル抗体を使用することが好ましい。次いでそれぞれの組のビーズを、特定する参照抗体を含むウエル中(例えば、ハイブリドーマ細胞の上清を含む)でインキュベートし、その結果ビーズ、収集抗体、および参照抗体の間で複合体(以後、「参照抗体-ビーズ」複合体)が形成され、この複合体は異なる蛍光発光スペクトル、したがって色コードを有し、これによってその参照抗体に関する独自の標識が与えられる。
【００４７】
この好ましい実施形態では、それぞれの参照抗体を含むそれぞれの反応混合物からの、それぞれの参照抗体-ビーズ複合体を他の参照抗体-ビーズ複合体と混合させて、試験する参照抗体すべてを含む混合物を形成させ、この場合それぞれの参照抗体は、ビーズと結合することによって独自に標識されている。実験に必要とされるだけ96ウエルプレートのできる限り多くのウエルに、混合物を等分する。一般にウエルの数は、試験するプローブ抗体およびさまざまな対照の数によって決定される。参照抗体-ビーズ複合体の混合物の等分試料を含む、それぞれのこれらのウエルを、抗原と共に最初に、次いでプローブ抗体(特定する抗体の1つ)と共に、次いで検出用抗体(元の収集抗体の標識型)と共にインキュベートし、検出用抗体は結合したプローブ抗体を検出するために使用する。好ましい実施形態では、検出用抗体は、ビオチン化マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体である。この方法は図1に例示する。
【００４８】
図1に示す例示的な実施形態では、それぞれの参照抗体が異なる発光スペクトルを有するビーズと結合し、この場合参照抗体はマウス抗ヒトモノクローナル収集抗体を介して結合し、独自に標識された参照抗体を形成する。独自に標識された参照抗体の組全体を、マルチウエルマイクロタイタープレートのウエル中に置く。参照抗体の組を抗原と共にインキュベートし、次いでプローブ抗体をウエルに加える。プローブ抗体は、異なるエピトープを認識する参照抗体と結合した、抗原のみに結合するであろう。プローブ抗体と抗原が結合することによって、収集抗体を介してビーズと結合した参照抗体、抗原、および結合したプローブ抗体からなる、複合体が形成されるであろう。標識済み検出用抗体を加えて、結合したプローブ抗体を検出する。ここで、検出用抗体をビオチンで標識し、結合したプローブ抗体を、ストレプトアビジン-PEとビオチン化検出用抗体の相互作用によって検出する。図1に示すように、抗体番号50をプローブ抗体として使用し、参照抗体は抗体番号50および抗体番号1である。プローブ抗体番号50は、参照抗体番号1と結合した抗原と結合するであろう。なぜなら、異なるエピトープと結合する抗体、および標識された複合体を検出することができるからである。プローブ抗体番号50は、参照抗体番号50によって結合した抗原とは結合しないであろう。なぜなら、両方の抗体が同じエピトープに関して競合し、その結果標識された複合体が形成されないからである。
【００４９】
この実施形態では、インキュベーションステップが終了した後、所与のウエルのビーズをキュベット中において一列に整え、1つのビーズを1度に2本のレーザーに通す。第1のレーザーによって、ビーズ中に埋め込まれた蛍光色素が励起され、どの参照抗体がそれぞれのビーズと結合したかが同定される。第2のレーザーによって、ビーズ複合体と結合した蛍光分子が励起され、これによって結合した検出用抗体の量、したがって参照抗体-ビーズ複合体上の抗原と結合したプローブ抗体の量が定量化される。ビーズ上で検出用抗体に関する強いシグナルが測定されるとき、それは、そのビーズと結合した参照抗体およびプローブ抗体が抗原上の異なる部位に結合し、したがって抗原上の異なるエピトープを認識することを示す。ビーズ上で結合した検出用抗体に関する弱いシグナルが測定されるとき、それは、対応する参照抗体とプローブ抗体が、同じエピトープに関して競合することを示す。これは図1に示す。この実施形態の重要な利点は、高スループット方式でそれを行うことができ、したがって多数の競合アッセイを1つのウエル中で同時に行い、時間および資源を節約することができることである。
【００５０】
本明細書に記載するアッセイは、特定する一次抗体および二次抗体のエピトープ認識性の少なくとも1つの追加的パラメータ、例えば温度、イオン濃度、溶媒(洗浄剤含む)または当該の任意の他の要因の影響の測定を含むことができる。当業者は本開示を使用して、少なくとも1つの追加的要因の試験を可能にする、実験設計を進展させることができる。必要な場合は、多数回のアッセイを行うことができ、その中で温度、イオン濃度、溶媒またはその他などの要因は、実験設計に従って変わる。追加的要因を試験するとき、データ分析の方法をそれに応じて調整して、その追加的要因を分析に含めることができる。
【００５１】
データ分析
本発明の他の態様は、少なくとも1つのアッセイから、好ましくは少なくとも1つの高スループットアッセイから生じたデータを分析して、類似および非類似のエピトープ認識性を有する抗体を同定するための方法を提供する。抗体の集合のエピトープ認識性を比較することに基づく、比較手法によって、同じエピトープに関して競合する可能性がある、類似のエピトープ認識性を有する抗体の同定、および異なるエピトープと結合する可能性がある、非類似のエピトープ認識性を有する抗体の同定が可能である。このようにして、抗体がどのエピトープを認識するかに基づいて、抗体を分類すなわち「値域分け」することができる。好ましい実施形態は、高スループットアッセイによって生じたデータを分析するための、競合パターン認識(CPR)法を提供する。CPRを使用して、多重競合抗体値域分け(MCAB)高スループット競合アッセイによって生じた、データを分析することがより好ましい。本明細書で開示し特許請求するデータ分析法を適用することによって、MCABアッセイなどのアッセイにより特定され抗原特異的抗体の集団中に示される、異なる結合特異性を同定することにより冗長性を排除することができる。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態は、抗原標的に関して異なる結合特異性を表す「値域」すなわちカテゴリーに、抗体をクラスタリングする方法を提供する。他の好ましい実施形態では、CPR法を、それぞれの抗体がそれぞれ他の抗体と抗原分子上での結合部位に関して競合する、MCAB高スループット競合アッセイの結果を表すデータに適用する。XenoMouse動物から生じた抗体の異なるデータ組を使用して行う実施形態は、本発明の方法を適用することによって、一貫した再現性のある結果が生じる証拠を用意する。
【００５３】
実験から生じたデータの分析は典型的には、試験した抗体の競合パターンを識別し分類することによって、アッセイを行った異なるウエル中のデータおよびクラスターデータを正規化するための、マルチステップの操作に関するものである。抗体をクラスタリングするための行列に基づくコンピュータによる方法を、抗体の競合パターンの類似性に基づいて次いで行い、この方法を適用して抗体、好ましくはハイブリドーマ細胞から作製した抗体の組を分類する。
【００５４】
その競合パターンの類似性に基づいてクラスタリングされる抗体は、同じエピトープまたは類似のエピトープに結合すると考えられる。これらのクラスターは、行列形式、または系統樹として「樹状」形式、またはコンピュータ可読形式、あるいは任意のデータ入力装置適合形式で場合によっては示すことができる。クラスターに関する情報は、行列、系統樹から、あるいはコンピュータまたは他のコンピュータ装置によって収集することができる。データの収集は、視覚的、手動的、自動的、またはこれらの任意の組合せであってよい。
【００５５】
本明細書で使用するように、用語「値域」は、本発明の方法に従って類似の競合性を有するとして同定された抗体のクラスターを指すための、名詞として使用することができる。用語「値域分けする」は、本発明の方法を実施することを指すための、動詞として使用することもできる。本明細書で使用するように、用語「エピトープ値域分けアッセイ」は、本明細書に記載する競合性に基づくアッセイを指し、アッセイによって生じるデータの任意の分析を含む。
【００５６】
データ分析のステップは以下の開示中に詳細に記載し、実施例2で表されるデータおよび結果を参照することによって、実際的な指針が与えられる。実施例2のデータ、特に実施例2の入力データに関するさまざまなデータ分析ステップを行うことによって作製した、行列または系統樹の参照事項は、単なる例として働き、決して本発明の範囲を制限するものではない。
【００５７】
多大な数および大きさのデータ組を作製するとき、系統的方法が、シグナル強度の行列を分析し、どの抗体が類似のシグナル強度パターンを有するかを決定するために必要とされる。例えば、m行およびm列を含む2つの行列を1回の実験で作製し、この場合mは調べる抗体の数である。1つの行列は、抗原が存在する競合アッセイの組に関する、シグナル強度を有する。第二の行列は、抗原が存在しない陰性対照実験に関する、対応するシグナル強度を有する。行列中のそれぞれの行は、マルチウエルマイクロタイタープレート中の独自のウエルを表し、これによって独自のプローブ抗体が同定される。それぞれの列は独自のビーズのスペクトルコードを表し、これによって独自の参照抗体が同定される。行列中のそれぞれのセルで検出されるシグナルの強度は、参照抗体およびプローブ抗体に関する個々の競合アッセイの結果を表す。行列中の最後の行は、阻害緩衝剤がプローブ抗体の代わりに加えられるウエルに対応する。同様に、行列中の最後の列は、阻害緩衝剤が参照抗体の代わりに加えられる、ビーズのスペクトルコードに対応する。(参照抗体-プローブ抗体対の)ただ1つの抗体が存在するとき、阻害緩衝剤は陰性対照として働き、存在するシグナルの量を決定する。
【００５８】
2つの行に関する類似のシグナルの強度値パターンによって、2つのプローブ抗体が類似の結合性を示し、したがって同じエピトープに関して競合する可能性があることが示される。同様に、2つの列に関する類似のシグナルの強度値パターンによって、2つの参照抗体が類似の結合性を示し、したがって同じエピトープに関して競合する可能性があることが示される。非類似性のシグナルパターンを有する抗体は、異なるエピトープに結合する可能性がある。類似のシグナルパターンを有する行を1つにグループ分けすること、または類似のシグナルパターンを有する列を1つにグループ分けすることにより、抗体が認識するエピトープに従って、抗体をグループ分け、すなわち「値域分け」することができる。前に記載したようなアッセイを、エピトープ値域分けアッセイと呼ぶ。
【００５９】
競合パターン認識(CPR)法を適用するためのプログラム
本発明の一態様は、2つの主要ステップ:(1)シグナル強度の正規化;および(2)その正規化シグナル強度に基づく非類似性行列の作製および抗体のクラスタリングを有する、CPR法を適用するためのプログラムを提供する。用語「主要ステップ」は、使用する実験物質の性質および所望のデータ分析の性質に応じて、必要に応じて行うことができる多数のステップを含むことは理解される。追加的ステップを、本発明の一部として実施することができることも理解される。
【００６０】
シグナル強度のバックグラウンド正規化
意味のあるパターンを検出する能力を向上させる一連の前処理ステップを、入力データに施す。好ましくは、入力データは二次元行列で保存されるシグナル強度を含み、クラスタリング分析前に、一連の正規化ステップを行って、ノイズの源またはシグナルの偏りを除去する。
【００６１】
分析する入力データは、エピトープ認識性の完全なアッセイからの結果を含む。これらの結果は、標識された二次抗体を使用して行われるアッセイから測定される、シグナル強度を含むことが好ましい。より好ましくは、MCABアッセイを使用した結果を本明細書に記載するように分析する。2つの入力ファイルを作製する:抗原が加えられたアッセイからの1つの入力ファイル;および抗原が不在であったアッセイからの第2の入力ファイル。抗原が存在しない実験は、陰性対照として働き、標識された抗体による抗原に対してではない結合の量を定量化することができる。好ましくは、試験する一次抗体と二次抗体のそれぞれの組合せは、抗原の存在下および不在下でアッセイされて、その結果それぞれの組合せが、入力データの両方の組に表される。さらに好ましくは、アッセイは、本開示中の他の箇所に開示するマルチウエル形式を使用して、多数の抗体のエピトープ認識性をアッセイするための手順を使用して行う。
【００６２】
入力データは通常、二次元行列で保存されるシグナル強度を含む。第一に、抗原(陰性対照)実験値が存在しない実験に対応する行列ABを、抗原が存在する実験に対応する行列AEから引いて、AN=AE-ABによって用意されるバックグラウンド正規化行列を得る。この減法ステップによって、抗体と抗原の結合によるものではない、バックグラウンドシグナルが除去される。前述の行列は(m+1)×(m+1)次元であり、この場合mはクラスタリングされる抗体の数である。最後の行および最後の列は、阻害緩衝剤をそれぞれプローブ抗体または参照抗体の代わりに加えた、実験に関する強度値を含む。
【００６３】
例示的実施形態、図8Aおよび8Bでは、実施例2で開示する実施形態において作製した強度行列を示し、これらはデータ分析の後のステップ用の入力データ行列として使用される。図8Aは抗原を用いて行った実験に関する強度行列であり、図8Bは抗原を用いずに行った同じ実験に関する強度行列である。行列中のそれぞれの行は、1つのウエル中の異なるビーズに関するシグナル強度に対応し、それぞれのウエルは独自の検出用抗体を表す。それぞれの列は、独自の一次抗体とそれぞれの二次抗体との競合に対応する、シグナル強度を表す。行列中のそれぞれのセルは、一次抗体と二次抗体の異なる対に関する個々の競合アッセイを表す。エピトープ認識性のアッセイでは、阻害緩衝剤を抗体の1つの代わりに添加することが、陰性対照として働く。図8Aおよび8Bによって示される実施形態では、行列中の最後の行は、阻害緩衝剤が二次抗体の代わりに加えられるウエルに対応し、行列中の最後の列は、阻害緩衝剤が一次抗体の代わりに加えられるビーズに対応する。行列中のセルの他の配置を使用して、本発明の態様を実施することができ、当業者と同様に、他の形式を有するデータ行列を設計し、これらのデータ行列をその後の操作に適合させて、選択した個々の形式を反映することができる。
【００６４】
抗原が存在しない実験から得られた値に対応する行列を、抗原が存在する実験から得られた値に対応する行列から引くことによって、異なる行列を作製することができる。このステップを行って、シグナル全体から、標識済みプローブ抗体と抗原の結合に起因しないシグナルの量を引く。この減法ステップによって、図9に示すような残差行列が生成する。この減法の後に、他の対角値と比べてその対角値に関して異常に高い強度を有する、任意の抗体を印付けする。対角またはそれ以外の列の高い値によって、この特定のビーズに関するデータは信頼できない可能性があることが示唆される。これらの列に対応する抗体をこのステップで印付けし、個々の値域としてみなす。
【００６５】
非特異的結合によるバックグラウンドシグナルの除去:行列の行または列中のシグナル強度の正規化。
いくつかの場合、バックグラウンド正規化シグナル強度行列中の異なる行または列の間で、全体的なシグナル強度の著しい不一致がある。行の変化はウエル毎の強度の変化によるものである可能性があり、一方で列の変化は、異なるプローブ抗体の親和性および濃度の変化によるものである可能性がある。本発明の一態様によれば、行または列の阻害緩衝値と行または列の平均シグナル強度値の間に、直線的相関関係が存在することが多い。強度の変化が観察される場合、行および/または列の正規化の追加的ステップを、以下に記載するように行う。
【００６６】
行の正規化。任意の重大なウエル特異的なシグナルの偏りが存在するとき、行の正規化を行い、これを行って、他の場合データ分析に導入されると思われる任意の「シグナル人工産物」を除去する。当業者は、阻害緩衝陰性対照の強度値の分布に基づいて、ステップが望ましいかどうか決定することができる。例えば図2Aでは、それぞれの行の阻害緩衝強度値を、対応する行の(阻害緩衝値を除いた)平均強度値に対してプロットする。図2Aのプロットは、阻害緩衝値と行の平均強度値の間の、明らかな直線的相関関係を示す。この図は、ウエル特異的なシグナルの偏りが分析するサンプルに存在すること、および阻害緩衝剤の強度値は行中の全体のシグナル強度と相関関係があることを示す。異なる行で見られる異なる強度の偏りは部分的には、抗原用の二次抗体の親和性の変化、およびこれらの二次抗体の濃度変化によるものである可能性がある。図2Bによって、同じ実施形態に関して、列の阻害緩衝強度値と平均した列の強度値の間に、弱い相関関係が存在することが示されることに留意されたい。
【００６７】
行の強度の変化に関しては、行列中のそれぞれの行の強度を、行中のそれぞれの値をその行の阻害緩衝強度値で割ることによって調整する。阻害緩衝剤のデータが存在しない場合、それぞれの行の値を、その行の平均強度値で割る。CPR法を適用する実施形態では、強度正規化行列は以下の式によって用意され、
【００６８】
【数１】
2005512044.tif 000002
【００６９】
上式でIは阻害緩衝または平均強度を含むベクトルであり、正規化が行に関して行われる場合、k=iである。
【００７０】
列の正規化。この最終前処理ステップでは、行を正規化した行列(残差行列を作製したステップでは印付けしなかった)中のそれぞれの列を、その対応する対角値で割る。対角に沿ったセルは、一次抗体と二次抗体が同じである競合アッセイを表す。理想的には、対角に沿った値は小さいはずである。なぜなら、同じ抗体の2つのコピーは、同じエピトープに関して競合するに違いないからである。それぞれの列をその対応する対角値で割る除法を行って、競合、すなわち抗体それ自体の競合を反映することが知られている強度と比べた、それぞれの強度を測定する。
【００７１】
列の強度の変化に関しては、行列中のそれぞれの列の強度を、列中のそれぞれの値をその行の阻害緩衝強度値で割ることによって調整する。阻害緩衝剤のデータが存在しない場合、それぞれの列の値を、その列の平均強度値で割る。CPR法を適用する実施形態では、強度正規化行列は以下の式によって用意され、
【００７２】
【数２】
2005512044.tif 000003
【００７３】
上式でIは阻害緩衝または平均強度を含むベクトルであり、正規化が列に関して行われる場合、k=jである。
【００７４】
行または列の正規化前の、閾値の設定
この正規化ステップにおける低いシグナル値の人為的増大を妨げるために、行または列の除法前に、最少のユーザー定義の閾値未満の阻害緩衝値すべてを印付けし、次いで最も信頼性の低いシグナル強度値を表すユーザー定義の閾値に調整する。この閾値は、シグナル強度のヒストグラムに基づいて設定する。この正規化ステップは、ウエル毎の強度の変化を調整する。
【００７５】
例えば図17は、実施例2のデータに関して調整した残差行列を示し、最も信頼性の低いシグナル強度は200強度単位に設定する。行列中のそれぞれの行は、それを行中の最後の強度値で割ることによって調整する。前述のように、それぞれの行中の最後の強度値は、阻害緩衝剤が一次抗体の代わりに加えられるビーズの強度値に対応する。このステップは、行全体のウエル毎の強度値の変化を調整する。図18は、実施例2のデータに関して行を正規化した行列を示す。
【００７６】
さらに、例えば図2Aは、一実施形態からのデータを表し、その中では、それぞれの行の阻害緩衝強度値を、対応する行の平均強度値に対してプロットした。このプロットは、阻害緩衝値と行の平均強度値の間の直線的相関関係を示し、ウエル特異的な強度の偏りが存在することを示唆する。これらの偏りは部分的には、抗原用のプローブ抗体の親和性の変化、およびプローブ抗体の濃度変化によるものである可能性がある。図2Bは、一実施形態からのデータを表し、その中では、それぞれの列の阻害緩衝強度値を、対応する列の平均強度値に対してプロットした。
【００７７】
他の例示的実施形態、図2Cでは、抗原を使用する実施形態から生じた行列の強度に対してプロットした、バックグラウンド-正規化した残差行列の強度の分散プロットを示す。このプロットは、1000より大きいシグナル値に関しては強い直線的相関関係(勾配=1)、およびそれより低いシグナル値に関してはさらに分散型の相関関係を示す。図2C中の点は、抗原が存在する実験のシグナルで割ることにより減法型シグナルとして計算した、分数比の値に従って陰影をつける。小さな分数比の値(ゼロに近い)は、高いバックグラウンド寄与率に対応し、図2Cにおいて明るい陰影を有する。大きな分数比の値(1に近い)は、低いバックグラウンド寄与率に対応し、暗い陰影を有する。図2Cでは、小さな分数比の値が分散プロットの左下領域に主に存在し、バックグラウンドの寄与率が、1000より大きい減法型シグナル値に関して低くなることが示唆される。
【００７８】
図2Cに示すプロットによって、この実施形態に関しては、1000より大きいバックグラウンド正規化行列の強度値は、抗原結合によるシグナルと比べて、低いバックグラウンドシグナル寄与率を有することが示唆される。これらの行列のセルはおそらく、同じエピトープに関して競合しない抗体対に対応する。逆に、1000未満の強度値はおそらく、同じエピトープに結合する抗体対に対応する。本発明の一態様に従うと、対角に沿った強度値は小さいと予想される。なぜなら、同一の参照抗体およびプローブ抗体は、同じエピトープに関して競合するからである。図2Cに示す実施形態では、バックグラウンド正規化シグナル強度行列の対角値のすべてではないが1つが、1000未満の強度値を有する。
【００７９】
プローブ抗体の基準シグナルに対する、シグナル強度の正規化
第一のステップでは、それぞれの列または行をその対応する対角値で割って、以下の式によって用意される最終的な正規化行列を作製することにより、データを調整する。
【００８０】
【数３】
2005512044.tif 000004
【００８１】
もう一度、この正規化ステップにおける低いシグナル値の人為的増大を妨げるために、対角値の除法を行う前に、最少のユーザー定義の閾値未満の対角値すべてを、閾値に調整する。このステップは、他の列または行の値と比べて有意に高い対角値を有する列または行以外の、すべての列または行に行う。このステップは、参照抗体とプローブ抗体が同じである個々の競合アッセイに対応する強度に対する、それぞれの強度値を正規化する。この強度値は低く、理想的には列または行の基準シグナル強度値を反映しなければならない。なぜなら、2つの同じ抗体は同じエピトープに関して競合し、したがって同じ抗原に同時に結合することができないはずだからである。異常に大きな対角値を有する列は外れ値として識別され、分析から除外される。高い対角強度値は、例えば抗原がホモ二量体であるとき、抗原が同じエピトープの2つのコピーを有することを示す可能性がある。
【００８２】
パターン認識分析:非類似性行列
本発明の他の態様によれば、データ分析の第二のステップは、正規化強度行列から2ステップで非類似性行列を作製することを含む。最初に、ユーザー定義のバックグラウンドの閾値未満である正規化強度値を0に設定し(したがって競合を表す)、残りの値は1に設定し、抗体が2つの異なるエピトープと結合することが示される。したがって、対角値の強度値を掛けたこの閾値と等しい強度未満である強度値は、充分低いとみなされ、抗体対による同じエピトープの競合を表す。所与の閾値の非類似性行列または距離行列を、それぞれの対の行が異なる位置の数を決定することによって、0および1の行列から計算する。i行およびj列の項目は、その競合パターンがi行およびj行で表される列二次抗体と異なる一次抗体の合計数の分数比に対応する。
【００８３】
例えば、図14は、任意の2つの抗体のパターンが異なる(合計22のうちの)位置の数を示す。この実施形態では、非類似性を列ではなく行に関して計算する。なぜなら、行の強度はウエル特異的な強度の偏りが既に調整されており、したがって、不均一な二次抗体の親和性および濃度の望ましくない影響が、要因として除かれているからである。さらに、一次抗体の濃度および親和性は、行間で一致する。しかしながら、列に関しては、平均強度とバックグラウンド強度の間に明らかな一致した傾向が存在せず、これによって、さまざまな一次抗体の濃度および親和性の望ましくない影響を要因として除くための、明確な方法が存在しないことが示唆される。したがって、列間のシグナルを比較することは、あまり有効ではないと思われる。
【００８４】
CPRを使用する非類似性行列
CPR法を適用する実施形態では、以下に記載するような0および1の閾値行列ATを作製する。閾値以下の正規化値を0に設定して、抗体の対応する対が同じエピトープに関して競合することを示す。閾値行列は以下の式によって用意される。
【００８５】
【数４】
2005512044.tif 000005
【００８６】
残りの正規化強度値は1に設定し、これらの値は異なるエピトープと結合する抗体の対を表す。
【００８７】
非類似性行列のi行j列の値を、0および1の行列の2つの行iおよびjが異なる位置の分数比に設定することによって、閾値行列から非類似性行列を計算する。特定の閾値Tに関する非類似性行列は、以下の式によって用意され、
【００８８】
【数５】
2005512044.tif 000006
【００８９】
上式でN1は、i行およびj行を合計したときの、存在する1の数である。
【００９０】
例えば、以下の表1に示す行列に関しては、第一および第二行に対応する非類似性値は0.4である。なぜなら、2つの行が異なる位置の数は、5個のうちの2個だからである。理想的な実験に関しては、元のシグナル強度行列の行の比較に基づいて作製された非類似性行列は、列の比較に基づいて作製された非類似性行列と同じでなければならない。
【００９１】
【表１】
2005512044.tif 000007
【００９２】
多数の閾値において、非類似性行列を計算することの効果
望むならば、非類似性行列を作製する方法を、強度の下限および上限閾値(この場合閾値は前に記載したものである)を表す、2つのユーザー定義の閾値の間でのみ増大するバックグラウンド閾値に繰り返す。バックグラウンド閾値の範囲で作製した非類似性行列を平均し、クラスタリングアルゴリズムのための入力値として使用する。いくつかの閾値を平均する方法を行って、閾値のいずれか1つの特定の選択に対する、最終的な非類似性行列の反応性を最少にする。閾値を変えることの見た目の非類似性に対する影響は図4に示し、これによって、抗体(2.1と2.25)の対に関する非類似性の分数比が、1.5と2.5の間の範囲の閾値の、閾値の関数として示される。閾値が1.8〜1.9で変わると、2つの抗体に関するシグナルパターン間の非類似性の量は、実質的に15%〜0%近くで変わる。この数字によって、一対の抗体に関するシグナルパターン間の非類似性の量が、カットオフ値の1つの特定の選択に対してどのように反応することができるのかが示される。なぜならそれは、異なる閾値に関して実質的に変わる可能性があるからである。異なる閾値の範囲で平均的な非類似性値を取ることによって、この反応性は緩和される。
【００９３】
CPRを使用する多数の閾値における非類似性行列の計算。好ましい実施形態では、CPRを使用する非類似性行列を計算する方法を、ユーザー定義範囲の値内の、いくつかの増大した閾値に繰り返す。これらの非類似性行列の平均を計算し、クラスタリングステップのための入力値として使用し、平均は以下のものとして計算する。
【００９４】
【数６】
2005512044.tif 000008
【００９５】
上式でNTは、平均される異なる閾値の数である。
【００９６】
いくつかの閾値を平均するこの方法を行って、閾値の特定のカットオフ値に対する、非類似性行列の反応性を最少にする。
【００９７】
多数の実験からの非類似性行列
2つ以上の実験の入力データ組が存在する場合、正規化強度行列を、それぞれ個々の実験に関して前に記載したように最初に作製する。閾値(典型的には4に設定)より大きい正規化値を、次いでこの閾値に設定する。平均正規化強度値をそのセルに関して計算するとき、大きな強度値の閾値への設定を行って、いずれか1つの強度値が過剰な重みを有することを防ぐ。平均強度行列は、入力データ組の少なくとも1つである抗体からなる群の、それぞれの抗体対に関するデータ地点すべての個々の平均を得ることによって計算する。強度値が存在しない抗体対を印付けする。非類似性行列の作製は前に記載した通りである。ただし、i行j列の項目は、両方の行が強度値を有する位置の数全体の、2つの行iおよびjが異なる位置の分数比に対応する。2つの行がこのような位置を有さない場合、非類似性値を任意に高く設定し、印付けする。
【００９８】
その正規化シグナル強度に基づく抗体のクラスタリング
本発明の他の態様は、その正規化シグナル強度に基づいて抗体をクラスタリングするための方法を提供し、これらの方法はさまざまなコンピュータ手法を使用して、複合データの基底パターンを識別する。任意のこのような方法は、多次元空間中の地点をクラスタリングするために開発された、コンピュータ手法を使用することが好ましい。これらの方法を実験データに直接適用して、抗体組のエピトープ結合パターンを決定することができ、これはn個のサンプル参照抗体中にn個のプローブ抗体が存在するn2競合アッセイに関するシグナルレベルを、n次元空間中のn個の地点を定義するものとしてみなすことによる。これらの方法をエピトープ値域分けに直接適用することができ、これはそれぞれの二次抗体およびn個の異なる一次抗体すべての、競合アッセイに関するシグナルレベルを、n次元空間中のある地点を定義するものとしてみなすことによる。
【００９９】
クラスタリング分析の結果は、視覚表示装置を使用して表すことができる。追加的あるいは代替的には、クラスタリング分析の結果は、任意の視覚表示装置とは無関係に収集および保存することができる。視覚表示装置は、エピトープ値域分けアッセイの結果を少なくとも1人の人間に伝えるために有用である。視覚表示装置は、収集および保存用の定量データを提供するための手段として使用することもできる。1つの好ましい実施形態では、クラスターを行列形式で表し、クラスターに関する情報を行列から収集する。行列のセルは異なる強度の陰影またはパターンを有し、それぞれのセルの数値を示すことができ;あるいは、行列のセルを色でコード付けして、それぞれのセルの数値を示すことができる。他の好ましい実施形態では、クラスターを系統樹すなわち「樹」として表すことができ、クラスターに関する情報は、分岐の長さおよび分岐の高度(距離)に基づいて系統樹から収集する。他の好ましい実施形態では、クラスターを自動化手段によって識別し、クラスターに関する情報は、コンピュータまたは任意のデータ入力装置を使用する自動データ分析法によって収集する。
【０１００】
多量の生物学的データ組を分析するのに有用であることが証明されている1つの手法は、階層的クラスタリングである(Eisen他、(1998)Proc.Mad.Acad.Sci.USA95:14863〜14868)。この方法を適用することによって、抗体の非類似性値に基づいて、枝分かれ部分集合の厳密な階層に、抗体を押し込むことができる。例示的実施形態では、最低の非類似性値を有する抗体の対を、最初に1つにグループ分けする。次に低い非類似性(または平均非類似性)値を有する、抗体の対またはクラスターを、次いで1つにグループ分けする。1つのクラスターが残るまで、このプロセスを相互作用的に繰り返す。この方法では、抗体の競合パターンが他の抗体と比較してどのくらい類似しているかに従って、抗体をグループ分けする。一実施形態では、抗体を系統樹(「系統発生樹」と呼ばれることもある)にグループ分けし、その分岐の長さは、2つの抗体の結合パターンの間の非類似性の程度を表す。2つの抗体間の分岐の長さが長いことによって、それらが異なるエピトープと結合する可能性があることが示される。分岐の長さが短いことによって、2つの抗体が同じエピトープに関して競合する可能性があることが示される。
【０１０１】
好ましい実施形態では、行列の行に対応する抗体を、平均非類似性行列中の値に基づく階層的クラスタリングによってクラスタリングし、これは平均非類似性行列の入力用非類似性行列を有するマンハッタン計量を取り込んだ凝集型ネスティングサブルーチンを使用する。特に好ましい実施形態では、平均非類似性行列中の値に基づく階層的クラスタリングによって、抗体をクラスタリングし、これは平均非類似性行列の入力用非類似性行列を有するマンハッタン計量を使用する、SPLUS2000凝集型ネスティングサブルーチンを使用する(SPLUS2000 Statistical Analysis Software、Insightful Corporation、Seattle、WA)。
【０１０２】
本発明の他の態様に従うと、2つの系統樹の間の非類似性の程度によって、CPR法を適用するプログラムによって行われる分析の、自己一貫性の指標が与えられる。類似性および一貫性に関する非制限的理論によって、行をクラスタリングすることによって作製された系統樹、および同じバックグラウンド正規化シグナル強度行列の列をクラスタリングすることによって作製された系統樹は、まったく同一であるかあるいはほぼ同一であるはずであることが予想される。なぜなら:抗体番号1と抗体番号2が同じエピトープに関して競合する場合、したがってその強度は、抗体番号1が参照抗体であり抗体番号2がプローブ抗体であるとき、および抗体番号2が参照抗体であり抗体番号1がプローブ抗体であるとき、低いはずである。同様に、2つの抗体が異なるエピトープに結合するとき、その強度は均一に高いはずである。この理由によって、シグナル強度行列の2つの行間の類似性の程度は、類似の行列の2つの列間と同じであるはずである。行のクラスタリングと列のクラスタリングの間の高度の自己一貫性によって、所与の実験に関して、本発明の方法を適用するためのプログラムによって実施される、本明細書に記載する実験プロトコルが、確固たる結果を生み出すことが示唆される。
【０１０３】
本発明の他の態様に従うと、2つのエピトープの間の重複の程度も、系統樹中のクラスターを結ぶ最長の分岐の長さに基づいて推測することができる。例えば、標的抗原が2つの異なる、完全に非重複状態のエピトープを有する場合、そのエピトープの1つと結合する抗体は、他のエピトープと結合する抗体と正反対のシグナル強度パターンを有するであろうと予想される。この理由に従うと、結合部位が非重複状態である場合、1つのエピトープと結合する抗体の組のシグナルパターンは、他のエピトープを認識する抗体の組のシグナルパターンとは、完全に反相関関係であるはずである。したがって、2つの異なるクラスターのone(1)に近い非類似性値によって、対応するエピトープは互いに干渉せず、あるいは抗原上のその結合部位が重複しないことが示唆される。
【０１０４】
以下の実施例2に記載する実施形態によって、どのようにしてクラスタリングの結果を、系統樹(図5)として、あるいは行列形で(図16および17)示すことができるかが実証される。データ地点(ANTIGEN14標的に対する抗体の値)を、系統樹にグループ分けし、その分岐の長さは、2つの抗体間の非類似性の程度を表し、その系統樹は、SPLUS2000統計分析ソフトウェアのAgglomerative Nestingモジュールを使用して作製した。比較を容易にするために、図16および17では、行列の行および列中の抗体の順序は、図5の系統樹で左から右に示す、抗体の順序と同じである。個々のセルは、それらの数値に従いセルに陰影をつけることによって、目に見えるようにコード化する。図16では、低閾値未満の値を有するセルは、暗い陰影を有する。低閾値および高閾値未満の値を有するセルは、陰影を付けない。高閾値を超える値を有するセルは、明るい陰影を有する。陰影を付けていない、または暗い陰影を有するセルを有するブロックによって、そのブロックに対応するすべての抗体が同じエピトープを認識することが示される。明るい陰影を有するセルは、異なるエピトープを認識する抗体に対応する。図17では、セルは正規化強度値であり、それらの値に従ってさらに目に見えるようにコードする。明るい陰影を有するセルは低閾値未満の強度を有し、陰影を付けていないセルは低閾値および高閾値未満の値を有し、一方暗い陰影を有するセルは高閾値を超える値を有する。明るい陰影を有するセルによって、その対応する行および列の抗体は、同じエピトープに関して競合する(強度が低いとき)が示される。暗い陰影のセルは高い強度に対応し、対応する行および列の抗体が異なるエピトープと結合することが示される。
【０１０５】
この例示的実施形態(実施例2)からの結果によって、本発明の方法が、2つの抗体が同じエピトープに関して競合するかどうかを明らかにすることに関するデータの、高度の自己一貫性を用意することが示される。対角に関する図16および17の陰影の対称性は、この自己一貫性を明らかに示す。その理由は、A行B列の抗体は、B行A列と同じ対だからである。それ故、抗体の対が同じエピトープに関して競合する場合、抗体Aが一次抗体であり抗体Bが二次抗体であるとき、および抗体Bが一次抗体であり抗体Aが二次抗体であるとき、したがって強度は低いはずである。それ故、i行j列のセルの強度、およびj行i列のセルの強度も低いはずである。同様に、これらの2つの抗体が異なるエピトープを認識する場合、したがって両方の対応する強度は高いはずである。図17の約200対のセルの中で、1対のみが不一致を示し、対の1つのメンバーは1.5未満の強度を有しており、一方他のメンバーは2.5を超える強度を有していた。このアルゴリズムによって作製される結果として生じる正規化行列の、自己一貫性のレベルは、生じたデータおよびアルゴリズムの分析データの、信頼性の指標を用意する。ANTIGEN14標的に対する抗体の、データ組に関する高度の自己一貫性(99%を超える)は、本明細書で開示および特許請求するデータ分析法は、信頼性のある結果を生み出すことを示唆する。
【０１０６】
多数の実験からの抗体のクラスタリング
本発明の他の態様は、データ組を組み合わせて、抗体をスクリーニングするために使用する実験系の制約を克服するための方法を提供する。それぞれの実験が互いの実験と共通の少なくともx個の抗体を有する、多数の実験を行い、クラスタリング法のための入力値としての多数の生成データ組を用意することによって、非常に多数の抗体を確実にクラスタリングすることができるはずである。m個の実験間で共通なm個の抗体の組を有することによって、それらをそれぞれ他の抗体に対して試験しない場合でも、どのクラスターに抗体が属する可能性があるかを推測することが可能になる。これは、多数のデータ組に関するデータ分析のこの方法を使用することによって、数個のアッセイに関してさらに高スループットを得ることができる可能性があることを示唆する。
【０１０７】
例えばLuminex技術は、100個の独自の蛍光色素を与え、したがって1回の実験で最大100個もの抗体を研究することができる。個々のデータ組および組み合わせたデータ組に関する、クラスタリングステップによって生じた結果の一貫性によって、エピトープおよび/または抗体をそれぞれ他の抗体に対して試験しない場合でも、どのエピトープがどの抗体によって認識されるかを推測することができることが示される。好ましい実施形態では、CPR法を使用して100を超える抗体の結合パターンを特定することができ、これは重複する抗体組を使用して多数の実験を行うことによる。それぞれの実験が他の実験と共通の一組の抗体を有するように、実験を設計することによって、組み合わせた平均行列はいかなる誤ったデータも有さないであろう。
【０１０８】
他の態様によって、所与の抗体組のデータ分析の結果は、その後の実験の妥当な設計を手助けするのに有用であることが与えられる。例えば、第一の実験のデータ組が充分明確なクラスターの出現を示す場合、したがって第二の実験の抗体組は、第一の抗体組および非試験抗体からの代表的な抗体を含むはずである。この手法によって、それぞれの抗体組が2つのエピトープを定義するための充分な材料を有し、いくつかの組の間で充分に重複する組を比較することができることが確実になる。第二の実験の非試験抗体の組と第一の実験からの知られている抗体のサンプル組の競合パターンを比較することによって、非試験抗体が第一の抗体組と同じエピトープを認識するかどうかを、決定することができるはずである。この重複実験の設計によって、抗体の第一の組と第二の組の競合パターンの信頼性のある比較が可能であり、第二の実験の抗体が既存のエピトープを認識するかどうかを決定し、あるいは抗体が1つまたは複数の完全に新規なエピトープを認識するかどうかを決定することができる。さらに、最適な方法で実験を相互作用的に設計することができ、その結果多数組の抗体を、既存および新たなクラスターに対して試験することができる。
【０１０９】
多数の実験からのデータの分析
ANTIGEN39標的に対する抗体を使用する、以下の実施例3に記載する実施形態からの結果によって、本明細書で開示し特許請求する方法が、多数の実験からのデータを分析するのに適していることが実証される。この実施形態では、ANTIGEN39抗体を、細胞表面のANTIGEN39抗原との結合に関して試験した。ここで、ANTIGEN39抗原は細胞表面タンパク質である。最初に正規化強度行列を、それぞれ個々の実験に関して作製し、選択した閾値を超える正規化値は、その選択した閾値に設定して、任意の1つの正規化強度値が、その抗体対の平均値に対して過度の影響を有することを防ぐ。1つの正規化行列を個々の正規化行列から作製し、これはデータが入手可能であったそれぞれの抗体対に関するすべての実験の、正規化強度値の平均を取ることによるものであった。次いで、1つの非類似性行列を前に記載したように作製した。ただし、2つの行iおよびjが異なる位置の分数比は、両方の行が強度値を有する位置の数のみとしてみなす。
【０１１０】
ANTIGEN39抗体を使用する5つの実験に関して、5つの入力データ組のクラスタリングの結果によって、類似性の程度がさまざまである多数のクラスターが存在したことが示され、そのうちの数個は重複する可能性がある、いくつかの異なるエピトープの存在が示唆された。これは図6A、図18、図19、および図30に示す。例えば、抗体1.17、1.55、1.16、1.11および1.12を含むクラスターと、1.21、2.12、2.38、2.35および2.1を含むクラスターは、非常密接に関連している。なぜなら、それぞれの抗体対は、2.35および1.11を除いて、25%を超えない差異を示すからである。2つのクラスターのこの高度の類似性によって、2つの異なるエピトープが高度の類似性を有する可能性があることが示唆された。
【０１１１】
ANTIGEN39抗体を使用する別々の実験からの5つのデータ組も、独立にクラスタリングして、本明細書で開示し特許請求する方法が、一貫したクラスタリングの結果を生み出すことを実証した。クラスタリングの結果は、図6B〜6F中および図20〜30中に要約し、図30には、個々のデータ組それぞれ、および5つの実験の抗体すべてと組み合わせたデータ組のクラスターを要約する。図6Bは、実験1に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.12、1.63、1.17、1.55および2.12は、この実験および他の実験において常に一緒に分類され、抗体1.46、1.31、2.17および1.29も同様であった。図6Cは、実験2に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.57および1.61は、この実験および他の実験において常に一緒に分類された。
【０１１２】
図6Dは、実験3に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.55、1.12、1.17、2.12、1.11および1.21は、この実験および他の実験において常に一緒に分類された。図6Eは、実験4に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.17、1.16、1.55、1.11および1.12は、この実験および他の実験において常に一緒に分類され、抗体1.31、1.46、1.65および1.29、ならびに抗体1.57および1.61も同様であった。図6Fは、実験5に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.21、1.12、2.12、2.38、2.35および2.1は、この実験および他の実験において常に一緒に分類された。
【０１１３】
一般に、クラスタリングアルゴリズムによって、個々の実験間、および組合せデータ組と個々のデータ組の間で、一貫した結果が生み出された。多数の個々のデータ組に関して、一緒に分類されるかあるいは近隣クラスターである抗体は、組合せのデータ組に関しても、一緒に分類されるかあるいは近隣クラスターである。例えば、明るい陰影を有するセルによって、組合せのデータ組、および抗体が存在したデータ組すべてにおいて(実験1、3、4、および5)、常に一緒に分類された抗体が示される。これらの結果は、このアルゴリズムによって、多数の個々の実験で一貫したクラスタリングの結果が生み出され、多数のデータ組を併わせることによって一貫性が保たれることを示す。
【０１１４】
最後に、2つの抗体が同じエピトープに関して競合するかどうかを明らかにすることに関するデータの、高度の自己一貫性が存在する。抗体が同じエピトープに関して競合するかどうかをデータが一貫して明らかにする、抗体対の割合をそれぞれのデータ組に関して以下の表2に記載し、これによって、5つの個々のデータ組のうちの4つ、および組合せのデータ組に関して、一致率が90%近かったことが明らかになる。
【０１１５】
【表２】
2005512044.tif 000009
【０１１６】
エピトープ値域分けの結果と、フローサイトメトリー(FAGS)の結果の一致
ANTIGEN39標的に対する抗体を使用する、以下の実施例3に記載する実施形態からの結果によって、本発明の方法に従ったエピトープ値域分けによって生じた結果が、フローサイトメトリー(蛍光活性化細胞選別装置、FACS)を使用して生じた結果と一致することがさらに実証される。ANTIGEN39を発現する細胞をFACSによって選別し、ANTIGEN39陰性細胞を陰性対照として使用し、これもFACSによって選別した。異なる値域からの抗体によって認識される細胞表面の結合部位は、異なるエピトープを表す。図3は、抗ANTIGEN39抗体を使用する抗体実験からの結果と、FRCSを使用した結果の比較を示す。図3に示すように、所与の値域の抗体は、FACSにおいてすべて陽性(値域1、4、5)またはすべて陰性(値域2および3)であり、これによって、抗体エピトープ値域分けアッセイにより、抗体がそれらのエピトープ結合性に基づいて、実際に値域分けされることが示される。したがって、本明細書に記載するエピトープ値域分けによって、抗体のエピトープ認識性を決定するため、抗体が認識するエピトープに基づいて抗体を選別および分類するための、有効、迅速で、信頼できる方法が与えられる。
【０１１７】
他のデータ分析法、およびエピトープ値域分けと配列結果との一致
他のデータ分析法は、抗原を用いて行った実験に関するデータ行列を、抗原を用いずに行った実験に関するデータ行列から引いて、正規化バックグランド強度行列を作製することを含む。次いでそれぞれの対角セルの値を、対応する列中の抗体の結合親和性を決定するための、バックグランド値として使用する。その列の対角セルの値より有意に大きい値を有する、それぞれの列のセル、正規化バックグランド強度行列(減法行列)を、際立たせるかあるいは他の方法で示す。一般に、対応する対角の約2倍の値が「有意に大きい」とみなされるが、当業者は、特定の実施形態では、使用する試薬および条件、および入力データの「ノイズ」を考慮すると、バックグランドを増大させるのは「有意に大きい」閾値であることを決定することができる。類似の結合パターンを有する列は、1つの値域としてグループ分けされ、その値域中のわずかな差異はサブ値域として識別される。このデータ分析は、所与の入力データ組に自動式に行うことができる。例えば、入力データはコンピュータのデータベースの適用において保存することができ、対角のセルは自動的に印付けされ、対角の数と比較したそれぞれの列のセルを際立たせ、類似の結合パターンを有する列をグループ分けする。
【０１１８】
ANTIGEN54に対する52個の抗体を使用する好ましい実施形態では、前に記載したデータ分析法を使用した値域分けの結果は、配列分析、MCAB競合抗体アッセイを使用して値域分けした抗体のCDR領域と相関関係があった。この52個の抗体は、20の細胞系からの2または3種のクローンからなっていた。予想されたように、同じ系からのクローンの配列は同一であり、したがって、それぞれの系からのただ1つの代表的なクローンを、配列決定した。エピトープ値域分けの結果と、この方法により値域分けした抗体の配列分析の間の対応性によって、この手法が類似の結合パターンを有する抗体を同定するのに適していることが示される。さらに、エピトープ値域分けの結果と、この方法により値域分けした抗体の配列分析の間の対応性によって、このエピトープ値域分け法により、どの抗体の配列が抗体結合のエピトープ特異性を決定する際に重要であるかについての、情報および指針が与えられることが意味される。
【実施例】
【０１１９】
(実施例1)
エピトープ認識性のアッセイ
抗体の作製および事前特定
値域分けに使用するための、抗原特異的ヒトIgGモノクローナル抗体を含むハイブリドーマ細胞の上清を、培養ハイブリドーマ細胞から回収し、これを融合プレートから24ウエルプレートに移した。値域分け分析用に24ウエルプレートから、上清を回収した。当該の抗原に特異的な抗体を、それらの抗原に対してELISAスクリーニングを使用して、ハイブリドーマ細胞のスクリーニングによって選択した。その抗原との結合に関して陽性である抗体を、96ウエルプレートの親和性ランク付け法とBIAcore親和性測定の組合せによって、それらの結合親和性によりランク付けした。当該の抗原との親和性が高い抗体を、エピトープ値域分け用に選択した。これらの抗体は、参照およびプローブ試験抗体としてこのアッセイにおいて使用する。
【０１２０】
Luminexビーズを使用するアッセイ
最初に、参照抗体を収集するための収集抗体として使用する、マウス抗ヒトIgG(mxhIgG)モノクローナル抗体の濃度を測定し、mxhIgG抗体をPBS中で透析して、結合プロセスを害する可能性があるアジドまたは他の防腐剤を除去した。次いで、Luminex User Manual、75〜76項の製造者の教示書に従って、mxhIgG抗体をLuminexビーズ(Luminex100System、Luminex Corp.、Austin TX)と結合させた。簡潔には、500μlのPBS中に50μg/mlのmxhIgG収集抗体を、300μl中に1.25×107ビーズ/mlでビーズと組み合わせた。結合後、血算盤を使用してビーズを計数し、濃度を1×107ビーズ/mlに調整した。
【０１２１】
抗原特異的な抗体を回収し、前に記載したようにスクリーニングし、それらの濃度を決定した。100個までの抗体をエピトープ値域分け用に選択した。100個までの独自に標識したビーズと抗体を結合させて、標識済み参照抗体を形成するために、以下の式に従って抗体を希釈した。
それぞれのチューブ中のサンプルの合計体積:Vt=(n+1)×100μl+150μl、
上式でn=対照を含めたサンプルの合計数。
希釈に必要な個々のサンプルの体積:Vs=C×Vt/Cs、Cs=IgG
それぞれのサンプルの濃度。C=0.2-0.5μg/ml。
【０１２２】
前の式に従ってサンプルを調製し、参照抗体を含む150μlのそれぞれの希釈サンプルを、96ウエルプレートのウエルに等分した。他の等分試料は、アッセイの後の段階でプローブ抗体として使用するために保った。mxhIgG結合ビーズのストックを攪拌し、ウエル当たりそれぞれ2500個のビーズ、すなわち0.5×105ビーズ/mlの濃度に希釈した。参照抗体は、暗所において室温で一晩、攪拌機上でmxhIgG結合ビーズと共にインキュベートした。
【０１２３】
96ウエルの濾過プレートを、200μlの洗浄緩衝液を加え吸引することによって予め湿らせた。一晩インキュベートした後に、ビーズ(およびここではビーズと結合したmxhIgGと結合した参照抗体)を集め、ウエル当たり2000個のビーズの濃度で、96ウエルのマイクロタイター濾過プレートのそれぞれのウエルに、100μlを等分した。ビーズの等分試料の合計数は、試験したサンプルの数の2倍であり、これによって抗原ありおよび抗原なしの並行実験が可能であった。緩衝剤は即座に吸引して任意の非結合参照抗体を除去し、ビーズは三回洗浄した。
【０１２４】
一組のサンプルに抗原を加え(50μl);ビーズを抗原と共に、1μg/mlの濃度で1時間インキュベートした。緩衝剤の対照を他の組のサンプルに加えて、抗原を含まない陰性対照を用意する。
【０１２５】
プローブ抗体として使用したすべての抗体を、次いですべてのサンプル(抗原あり、および抗原なし)に加えた。この実験では、参照抗体として使用したそれぞれの抗体を、プローブ抗体としても使用して、すべての組合せを試験した。プローブ抗体は参照抗体と同じ希釈溶液から取り出され、その抗体を同じ濃度で使用することを確実にするはずである。プローブ抗体(50μl/ウエル)をすべてのサンプルに加え、混合物は暗所において室温で2時間、攪拌機上でインキュベートした。サンプルは三回洗浄して、非結合プローブ抗体を除去した。
【０１２６】
検出用抗体:ビオチン化mxhIgG(50μl/ウエル)を1:500の希釈で加え、混合物は暗所において1時間、攪拌機上でインキュベートした。ビーズは三回洗浄して、非結合ビオチン化mxhIgGを除去した。1:500に希釈したストレプトアビジン-PEを、50μl/ウエルで加えた。混合物は暗所において室温で15分間、攪拌機上でインキュベートし、次いで三回洗浄して、非結合要素を除去した。
【０１２７】
製造者の指示書に従って、Luminex100およびXYP baseを、Luminexソフトウェアを使用してウォーミングアップ状態にした。新しいセッションを開始し、アッセイで使用する数のサンプル、および視定数のビーズを取り入れた。
【０１２８】
それぞれのウエル中のビーズを、80μlの希釈緩衝液に再懸濁させた。96ウエルプレートをLuminex based中に置き、それぞれのウエルの蛍光発光スペクトルを読み取り記録した。
【０１２９】
アッセイの最適化
アッセイを最適化するために、Luminex User's Manual Version 1.0を、ビーズの濃度、抗体、およびインキュベーション時間に関する指針用に、最初に使用した。長いインキュベーション時間によって確実な結合飽和が与えられ、これはアッセイで使用するナノグラムの抗体濃度にさらに適していたことを、経験的に決定した。
【０１３０】
(実施例2)
1つのデータ組の分析:ANTIGEN14抗体
データ入力
実施例1に記載したように抗体をアッセイし、結果を回収した。入力ファイルは、ANTIGEN14標的に関する1つの実験に対応するデータ組の、図8A(抗原が存在)および図8B(抗原が不在)に示す入力行列からなっていた。
【０１３１】
ANTIGEN14標的データの正規化
最初に、抗原が不在である実験(陰性対象、図8B)に対応する行列を、抗原が存在する実験(図8A)に対応する行列から引いて、標識済み抗体の非特異的結合による、バックグラウンドシグナルの量を除外した。2つの行列間の差異は図9に示す。抗体2.42に対応する列は、対角上またはそれ以外で異常に大きな値を有し、前に記載したデータ分析において別々に印付けし処理する。
【０１３２】
行の正規化
図10に示すように、200というユーザー定義の閾値未満の値をこの閾値に設定することによって、残差行列を調整した。この調整を行って、後の正規化ステップにおける低いシグナル値の著しい人為的増大を妨げた(前に記載したように)。次いで行列中のそれぞれの行の強度を、それぞれの行の値を阻害緩衝値に対応する行の値で割ることによって、正規化した(図11)。これによって、前に論じ図2Aに示すように、ウエル毎の強度の変化を調整する。
【０１３３】
列の正規化
抗体2.42に対応する列以外のすべての列を、前に論じ図12に示すように、列正規化した。
【０１３４】
非類似性行列
非類似性(または距離)行列を、マルチステップ手順で作製した。最初に、ユーザー定義の閾値未満の強度値(対角強度値の2倍に設定したもの)を0に設定し、残りの値は1に設定した(図13)。これは、対角値の強度値の2倍未満の強度値は充分に低いとみなされ、抗体対による同じエピトープに関する競合を表すことを意味する。非類似性行列は、i行およびj列の項目を、2つの行iおよびjが異なる位置の分数比に設定することによって、0および1の行列から作製する。図14は、任意の2つの抗体のパターンが、ANTIGEN14標的に対して作製した抗体の組に関して異なっていた、(合計22のうちの)位置の数を示す。
【０１３５】
非類似性行列を、(対角の値の)1.5〜2.5倍の範囲、0.1の増大分で、いくつかの閾値のそれぞれから作製した、0および1の行列から作製した。これらの非類似性行列の平均を計算し(図15)、クラスタリングアルゴリズムのための入力値として使用した。いくつかの非類似性行列の平均を計算することの有意性は、図4に示す。図4は、1.5〜2.5の範囲の閾値の、閾値の関数として、抗体(2.1と2.25)の対に関する非類似性の分数比を示す。閾値が1.8〜1.9で変わると、2つの抗体に関するシグナルパターン間の非類似性の量は、実質的に0%〜約15%で変わった。この数字によって、一対の抗体に関するシグナルパターン間の非類似性の量が、カットオフ値の1つの特定の選択に対してどのように反応することができるのかが示される。なぜならそれは、異なる閾値に関して実質的に変わる可能性があるからである。
【０１３６】
クラスタリング:
階層的クラスタリング
SPLUS2000統計分析ソフトウェアのAgglomerative Nesting Subroutineを使用することによって、前に記載した平均非類似性行列を入力値として使用して、抗体をグループ分け(すなわちクラスタリング)した。このアルゴリズムでは、抗体を枝分かれ部分集合の厳密な階層に押し込んだ。行列全体中で最低の対応する非類似性値を有する抗体の対を、最初に1つにグループ分けする。次いで、二番目に低い非類似性(または平均非類似性)値を有する、抗体の対、または抗体-クラスターを、次いで1つにグループ分けする。1つのクラスターが残るまで、このプロセスを相互作用的に繰り返した。
【０１３７】
系統樹中のクラスターの視覚化
ANTIGEN14標的に関して計算した系統樹を図5に示す。2つの抗体を結ぶ分岐の長さ(または高度)は、それが結ぶ抗体間の類似性の程度に反比例する。この系統樹によって、これらの抗体によって認識される、2種の非常に異なるエピトープが存在したことが示される。1種のエピトープは、抗体2.73、2.4、2.16、2.15、2.69、2.19、2.45、2.1および2.25によって認識された。異なるエピトープは、抗体2.13、2.78、2.24、2.7、2.76、2.61、2.12、2.55、2.31、2.56および2.39によって認識された。抗体2.42は、任意の他の抗体と非常に類似した型は有していないが、第二のクラスターといくらか顕著な類似性を有しており、第二のエピトープと部分的に重複する他の第三のエピトープを認識する可能性がある。
【０１３８】
行列中のクラスターの視覚化
これらの抗体のこのクラスタリングは、図16および図17においても見ることができる。図16では、非類似性行列の行および列を、系統樹の「葉」または分岐群の順序に従って再編成し、個々のセルは非類似性の程度に従って目に見えるようにコード化した。暗い陰影を有するセルは、非常に類似していた(非類似性10%未満の)抗体対に対応する。陰影を付けていないセルは、非常に類似していた(非類似性が10%と25%の間の)抗体に対応する。明るい陰影を有するセルは、非類似性が25%を超える抗体対に対応する。暗い陰影のブロックは、異なる抗体のクラスターに対応する。阻害緩衝剤以外に、前述の抗体のグループに対応する、2つ、あるいはおそらく3つのブロックが存在するようである。図16は、わずかに高い非類似性の許容度を考慮すると、抗体2.42を第二のクラスターのメンバーであるとみなすことができることも示す。
【０１３９】
図17では、正規化強度行列の行および列を、系統樹の葉の順序に従って再編成し、個々のセルは、それらの正規化強度値に従って目に見えるようにコード化した。暗い陰影を有するセルは、高い強度(バックグラウンドより少なくとも2.5倍大きい)を有していた抗体対に対応する。陰影を付けていないセルは、バックグラウンドの1.5倍と2.5倍の間の強度を有していた。明るい陰影を有するセルは、バックグラウンドの1.5倍未満であった強度に対応する。この行列の行の視覚的な印を比較すると、2つの非常に異なるパターンが、前に示した2つのエピトープに対応して生じた。さらに、視覚的コードは対角に関して非常に対称的であることに留意されたい。これによって、2つの抗体が同じエピトープに関して競合するかどうかを明らかにすることに関するデータの、高度の自己一貫性が存在したことが示される。その理由は、抗体Aと抗体Bが同じエピトープに関して競合する場合、抗体Aが一次抗体であり抗体Bが二次抗体であるときも、抗体Bが一次抗体であり抗体Aが二次抗体であるときも、強度は低いはずだからである。それ故、i行j列のセルの強度、およびj行i列のセルの強度も低いはずである。同様に、これらの2つの抗体が異なるエピトープを認識した場合、したがって両方の対応する強度は高かったはずである。約200対のセルの中で、1対のみに関して、対の1つのメンバーのが1.5未満の強度を有しており、一方他のメンバーは2.5を超える強度を有していた。このアルゴリズムによって作製される結果として生じる正規化行列の、自己一貫性のレベルは、生じたデータおよびアルゴリズムの分析データの、信頼性の指標を用意する。ANTIGEN14のデータ組に関する高度の自己一貫性(99%を超える)は、高い信頼度でこのデータ組に関するアルゴリズムの結果を、信頼することができることを示唆する。
【０１４０】
(実施例3)
多数のデータ組の分析:ANTIGEN39
2つ以上の実験の入力データ組が存在する場合、正規化強度行列を、それぞれ個々の実験に関して前に記載したように最初に作製する。閾値(典型的には4に設定)より大きい正規化値を、対応する閾値に設定する。これによって、いずれか1つの正規化強度値が、その抗体対の平均値に対して過剰な影響を有することを防ぐ。1つの正規化行列は、データが存在するそれぞれの抗体対に関する実験全体の、正規化強度値の平均を得ることによって、個々の正規化行列から作製する。対応する強度値が存在しない抗体対を印付けする。非類似性行列の作製は前に記載した通りである。ただし、2つの行iおよびjが異なる位置の分数比は、両方の行が強度値を有する位置の数として単にみなす。2つの行がこのような位置を有さない場合、非類似性値を任意に高く設定し、印付けする。
【０１４１】
5つの実験を、ANTIGEN39抗体を使用し、実施例1および2、および本明細書の記載全体に記載する方法を使用して行った。ANTIGEN39抗体の、5つの入力データ組のクラスタリングの結果は図6A、図18、図19、および図30に要約する。これらの結果は、類似性の程度がさまざまである多数のクラスターが存在したことを示す。これによって、そのうちの数個は重複する可能性がある、いくつかの異なるエピトープが存在したことが示唆される。これは例えば、抗体1.17、1.55、1.16、1.11および1.12を含むクラスターと、1.21、2.12、2.38、2.35および2.1を含むクラスターは、非常密接に関連している(それぞれの抗体対は、2.35および1.11を除いて、差異が25%を超えない)。2つのクラスターのこの高度の類似性によって、2つの異なるエピトープが高度の類似性を有する可能性があることが示唆される。
【０１４２】
アルゴリズムの能力を試験して一貫したクラスタリングの結果を生み出すために、5つのデータ組も、独立にクラスタリングした。異なる実験のクラスタリングの結果は、図6B〜6F中および図20〜30中に要約する。図30は、個々のデータ組それぞれ、および5つの実験の抗体すべてと組み合わせたデータ組のクラスターを要約する。図6Bは、実験1に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.12、1.63、1.17、1.55および2.12は、この実験および他の実験において常に一緒に分類され、抗体1.46、1.31、2.17および1.29も同様であった。図6Cは、実験2に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.57および1.61は、この実験および他の実験において常に一緒に分類された。
【０１４３】
図6Dは、実験3に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.55、1.12、1.17、2.12、1.11および1.21は、この実験および他の実験において常に一緒に分類された。図6Eは、実験4に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.17、1.16、1.55、1.11および1.12は、この実験および他の実験において常に一緒に分類され、抗体1.31、1.46、1.65および1.29、ならびに抗体1.57および1.61も同様であった。図6Fは、実験5に関するANTIGEN39抗体の系統樹を示す:抗体1.21、1.12、2.12、2.38、2.35および2.1は、この実験および他の実験において常に一緒に分類された。
【０１４４】
一般に、クラスタリングアルゴリズムによって、個々の実験間、および組合せデータ組と個々のデータ組の間で、一貫した結果が生み出された。多数の個々のデータ組に関して、一緒に分類されるかあるいは近隣クラスター中にある抗体は、組合せのデータ組に関しても、一緒に分類されるかあるいは近隣クラスター中にある。例えば、明るい陰影を有するセルによって、組合せのデータ組、および抗体が存在したデータ組すべてにおいて(実験1、3、4、および5)、常に一緒に分類された抗体が示される。同様に、暗い陰影を有するセルによって、組合せのデータ組、および実験1、4および5において、常に一緒に分類された抗体が示される。これらの結果は、このアルゴリズムによって、多数の個々の実験で一貫したクラスタリングの結果が生み出され、多数のデータ組を併わせることによって一貫性が保たれることを示す。
【０１４５】
最後に、2つの抗体が同じエピトープに関して競合するかどうかを明らかにすることに関するデータの、高度の自己一貫性が存在する。抗体が同じエピトープに関して競合するかどうかをデータが一貫して明らかにするための抗体対の割合を、それぞれのデータ組に関して前の表2に要約する。表2によって、5つの個々のデータ組のうちの4つ、および組合せのデータ組に関して、一致率が90%近かったことが明らかになる。
【０１４６】
(実施例4)
競合パターン認識データ分析法を使用する、小組のIL-8ヒトモノクローナル抗体の分析
IL-8、前炎症性物質に対して開発された、小組の充分に特定されたヒトモノクローナル抗体を使用して、CPR法を適用するプログラムを評価した。前にプレートベースのELISAによって、この組中の抗体が2つの異なるエピトープと結合し:HR26、a215、およびD111は1つのエピトープを認識し、一方K221とa33は第二のエピトープに関して競合したことが示された。エピトープ地図化の研究結果を使用する他の分析によって、HR26、a809、およびa928は同じまたは重複エピトープに結合し、一方a837は異なるエピトープに結合したことが示された。
【０１４７】
CPR法が抗体を正確にクラスタリングすることができたかどうかを決定するための、新しい実験において、本発明の方法を、前に挙げたモノクローナル抗体のいくつかを含めた、一組の7個のIL-8抗体に対して試験した。これらの結果は、図7Aに示す系統樹に要約する。左の系統樹は、バックグラウンド正規化シグナル強度行列の列をクラスタリングすることによって作製し、右の系統樹は行をクラスタリングすることによって作製した。両方の系統樹は、0.25という非類似性カットオフ値の2つのエピトープが存在し、:1つのエピトープはHR26、a215、a203、a393、およびa452によって認識され;第二のエピトープはK221およびa33によって認識されたことを示した。
【０１４８】
CPR法を使用して抗体をクラスタリングしたこれらの結果は、前に要約したプレートベースのELISAアッセイからのデータと一致した。CPR法を使用して得られた結果により、標的抗原は2つの異なるエピトープを有していたようであることが示され、プレートベースのELISAアッセイを使用して見られた結果が確認された。クラスタリング用のCPR法を使用して、HR26およびa215が一緒に分類され、K221およびa33も同様であり、プレートベースのELISAアッセイからの結果と再度一致したことが示された。
【０１４９】
2つの系統樹の間の非類似性の程度によって、この方法によって行われる分析の、自己一貫性の指標が与えられる。理想的に、2つの系統樹(左側の系統樹は列をクラスタリングすることによって作製され、右側の系統樹は行をクラスタリングすることによって作製された)は、以下の理由で同一であったはずである:抗体番号1と抗体番号2が同じエピトープに関して競合する場合、したがってその強度は、抗体番号1が参照抗体であり抗体番号2がプローブ抗体であるとき、および抗体番号2が参照抗体であり抗体番号1がプローブ抗体であるとき、低いはずである。同様に、2つの抗体が異なるエピトープに結合するとき、その強度は均一に高いはずである。この理由によって、シグナル強度行列の2つの行間の類似性の程度は、類似の行列の2つの列間と同じであるはずである。本発明の実施例では、図7Aの左側と右側の系統樹がほぼ同一である。いずれの場合も、同じ抗体が2つのクラスターに存在したようであった。行と列の両クラスタリング間のこの高度の自己一貫性から、実験プロトコルおよび方法が相まって、確固たる結果を生み出すことが示唆された。
【０１５０】
(実施例5)
競合パターン認識(CPR)データ分析法を使用する、IL-8抗体の多数のデータ組の分析
IL-8抗体を使用する多数のスクリーニング実験を行い、多数のデータ組を作製した。正規化強度行列を最初に、それぞれ個々の実験の行列に関して、前に記載したように作製した。ユーザー定義の閾値より大きい正規化値は、そのユーザー定義の閾値に設定した。高い強度値を閾値に割り当てて、後のステップにおいて平均正規化強度値をその個々の抗体対に関して計算したときに、任意の1つの強度値が過度の重みを有することを防ぐ。平均正規化強度行列の行および列は、本発明の方法を使用して同定した、「独自の」抗体の組に対応した。これらの「独自の」抗体は、すべての実験で使用したすべての抗体の中から同定した。平均強度をこの行列のそれぞれのセルに関して計算し、少なくとも1つの強度値が存在した。データのない抗体対と対応したセルは、誤ったデータ地点として識別した。非類似性行列を前に記載したように作製した。ただし分数比は、両方の行が強度値を有する位置の数すべてに対する、2つの行が異なる位置の数に基づいて決定した。2つの行が共通のデータを有さない場合、したがって対応するセルの非類似性値を印付けし、任意に高く設定し、したがって対応する抗体は人工産物として一緒にグループ分けされることはないと思われる。
【０１５１】
モノクローナル抗体の5つの重複組からの一組のモノクローナル抗体に関するクラスタリングの結果は、図7Bおよび表3(以下)に要約する。これらの系統樹によって、標的抗原上に2つの異なるエピトープが存在することを示す、結果が確認される。第一のエピトープはモノクローナル抗体a809、a928、HR26、x215およびD111によって定義され、第二のエピトープはモノクローナル抗体a837、K221、a33、a142、a358およびa203、a393、およびa452によって定義される。クラスターを結ぶ分岐の長さによって、第一のクラスターは他の2つと非常に異なっていたが、第二のクラスターと第三のクラスターは互いに類似していたことが示された。
【０１５２】
別々の実験で一貫した結果を生み出すCPR法の能力を試験するために、5つのデータ組も独立にクラスタリングした。異なる実験に関するクラスタリングの結果は、図7A、7B、7C、および表Bに示す系統樹に要約する。これらの系統樹によって、CPRクラスタリング法によって、個々の実験間、および組合せデータ組と個々のデータ組の間で、一貫した結果が生み出されたことが実証された。それぞれの系統樹は、2つの異なるエピトープを示す2つの主要な分岐を有していた。多数の個々のデータ組に関して、一緒に分類されるかあるいは近隣クラスター中にあった抗体は、組合せのデータ組に関しても、一緒に分類されるかあるいは近隣クラスター中に存在した。以下の表3に示すように、異なる実験中、あるいは個々の実験間、および組合せデータ組と個々のデータ組の間に、クラスタリングの結果のわずかに2つの小さな不一致が存在し、これらの不一致は太字によって表3に示す。実験3で作製したデータ組では、D111が、HR26およびa215ではなく、抗体a33およびK221と共に分類された。実験4で作製したデータ組では、抗体a203、a393、およびa452は第一のクラスター中に出現し、一方他の実験(および組合せデータ組)では、それらは第二のクラスター中に出現した。このわずかな差異は、抗体をプローブ抗体として使用する実験と、同じ抗体を参照抗体として使用する実験の間の、個々の抗体親和性の差異に起因する可能性がある。低い親和性を有する抗体は、参照抗体として使用するとき、溶液から抗原を収集する低い能力を有する可能性がある。しかしながら、クラスタリングの結果、および抗原のグループ分けの全体的な類似性によって、この方法によって一貫したクラスタリングの結果が生み出され、これらの結果は、多数の個々の実験中の他の実験からの結果と非常に一致し、多数のデータ組を併せたとき、これらの結果は依然として一致したことが示された。
【０１５３】
最後に、本発明の方法を使用して、個々および組合せデータ組に関して行および列をクラスタリングするとき、これらのデータそれぞれに関するクラスタリングの結果の、高度の一貫性が存在した。行のクラスタリングと列のクラスタリングの間の、クラスタリングの結果のわずかな不一致は、第三のデータ組中のD111に関するものであり、その中でD111は、行のクラスタリングを行うと抗体HR26およびa215と共に分類され、一方D111は、列のクラスタリングを行うと抗体a33およびK221と共に分類された。
【０１５４】
【表３】
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【０１５５】
多数のさまざまな変更形態を、本発明の精神から逸脱せずに作製することができることは、当業者により理解されるであろう。したがって、本発明の形態は単なる例示的なものであり、本発明の範囲を制限することを目的とするものではないことは明らかに理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】マイクロタイタープレートの1つのウエル中において標識ビーズ技術を使用する、エピトープ値域分けアッセイの一実施形態の概略を示す図である。それぞれの参照抗体が異なる発光スペクトルを有するビーズと結合し、独自に標識された参照抗体を形成する。独自に標識された参照抗体の組全体を、マルチウエルマイクロタイタープレートのウエル中に置き、抗原と共にインキュベートする。プローブ抗体を加え、プローブ抗体とそれぞれ独自に標識された参照抗体の相互作用を決定する。
【図２Ａ】阻害緩衝強度値と平均強度の間の相関関係を示す図である。行中の、阻害緩衝強度と平均強度の間の相関関係を示す図である。それぞれの行の阻害緩衝強度値(y軸)を、阻害緩衝値を除いた行の平均強度値(x軸)に対してプロットした。直線とデータを適合させることによって、残りの行の阻害緩衝値と平均強度値の間の、強い直線的相関関係が示される。
【図２Ｂ】阻害緩衝強度値と平均強度の間の相関関係を示す図である。列中の、阻害緩衝強度と平均強度の間の相関関係を示す図である。それぞれの列の阻害緩衝強度値(y軸)を、阻害緩衝値を除いた列の平均強度値(x軸)に対してプロットした。直線とデータを適合させることによって、残りの列の阻害緩衝値と平均強度値の間の、比較的弱い直線的相関関係が示される。
【図２Ｃ】阻害緩衝強度値と平均強度の間の相関関係を示す図である。抗原に関する行列およびバックグラウンド正規化行列に関する、強度値の分散プロットを示す図である。このプロットは、高い減法型シグナル値に関しては強い直線的相関関係(勾配=1)を示し、抗原の存在下のシグナルと比べて、バックグラウンドシグナルが最少であることが示される。この図中の点は、抗原が存在した実験のシグナルで割ることにより減法型シグナルとして計算した、分数比の値に従って陰影をつける。小さな分数比の値(ゼロに近い)は、高いバックグラウンド寄与率に対応し、明るい陰影を有する。大きな分数比の値(1に近い)は、低いバックグラウンド寄与率に対応し、暗い陰影を有する。
【図３】エピトープ値域分けの結果とFRCSの結果の比較を示す図である。ANTIGEN39抗体を使用する抗体実験からの結果を示し、本明細書に記載するエピトープ値域分け法を使用した結果と、フローサイトメトリー(蛍光活性化細胞選別装置、FACS)を使用した結果を比較する。抗体を値域1〜15に割り当て、エピトープ値域分けアッセイを使用して左端の列に行1〜15によって示す。セルの陰影は、ANTIGEN39を発現する細胞(細胞系786-0)に関してFACS陽性である抗体を示し、陰影がないことによって、ANTIGEN39を発現しない細胞(細胞系M14)に関して陰性である抗体が示される。
【図４】非類似性とバックグラウンド値:閾値カットオフ値の選択の影響を示す図である。この図は、さまざまな閾値において計算した、抗体2.1と抗体2.25の間の非類似性の量を示す。非類似性の量は、2つの抗体、抗体2.1および抗体2.25に対応する項目に関する非類似性行列の値、異なる閾値を使用して計算した一連の非類似性行列に関する値を表す。ここで、x軸は閾値であり、y軸は閾値カットオフ値を使用して計算した非類似性値である。
【図５】ANTIGEN14抗体の系統樹を示す図である。2つの抗体を結ぶ分岐の長さは、その2つの抗体の間の類似性の程度に比例する。この図によって、これらの抗体によって認識される、2種の非常に異なるエピトープが存在することが示される。1種のエピトープは、抗体2.73、2.4、2.16、2.15、2.69、2.19、2.45、2.1および2.25によって認識される。異なるエピトープは、抗体2.13、2.78、2.24、2.7、2.76、2.61、2.12、2.55、2.31、2.56および2.39によって認識される。抗体2.42は、任意の他の抗体と非常に類似した型は有していないが、第二のクラスターといくらか顕著な類似性を有しており、第二のエピトープと部分的に重複する他の第三のエピトープを認識する可能性がある。
【図６Ａ】ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。5つの入力用実験データ組に関する、ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。抗体の独自のクラスターの数によって、いくつかの異なるエピトープが存在し、そのうちの数個は重複する可能性があることが示唆される。例えば、抗体1.17、1.55、1.16、1.11および1.12を含むクラスターと、1.21、2.12、2.38、2.35および2.1を含むクラスターは、非常に密接に関連しているようであり、それぞれの抗体対は、2.35および1.11を除いて、25%を超えて異なることはない。2つのクラスターのこの高度の類似性によって、2つの異なるエピトープそのものが高度の類似性を有することが示唆される。
【図６Ｂ】ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。実験1に関する、ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。抗体1.12、1.63、1.17、1.55および2.12は、この実験および他の実験において常に一緒に分類され、抗体1.46、1.31、2.17および1.29も同様である。
【図６Ｃ】ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。実験2に関する、ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。抗体1.57および1.61は、この実験および他の実験において常に一緒に分類される。
【図６Ｄ】ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。実験3に関する、ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。抗体1.55、1.12、1.17、2.12、1.11および1.21は、この実験および他の実験において常に一緒に分類される。
【図６Ｅ】ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。実験4に関する、ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。抗体1.17、1.16、1.55、1.11および1.12は、この実験および他の実験において常に一緒に分類され、抗体1.31、1.46、1.65および1.29、ならびに抗体1.57および1.61も同様である。
【図６Ｆ】ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。実験5に関する、ANTIGEN39抗体の系統樹を示す図である。抗体1.21、1.12、2.12、2.38、2.35および2.1は、この実験および他の実験において常に一緒に分類される。
【図７Ａ】IL-8モノクローナル抗体のクラスタリングに関する、系統樹を示す図である。7個のIL-8モノクローナル抗体のクラスタリングに関する、系統樹を示す図である。左の系統樹は、バックグラウンド正規化シグナル強度行列の列をクラスタリングすることによって作製し、右の系統樹は行をクラスタリングすることによって作製する。両方の系統樹は、0.25という非類似性カットオフ値を使用することによって、2つのエピトープが存在し、:1つのエピトープはモノクローナル抗体HR26、a215、a203、a393、およびa452によって認識され;第二のエピトープはモノクローナル抗体K221およびa33によって認識されることを示す。
【図７Ｂ】IL-8モノクローナル抗体のクラスタリングに関する、系統樹を示す図である。5つの異なる実験データ組を併せた組合せクラスタリング分析からの、IL-8モノクローナル抗体に関する系統樹を示す図である。左の系統樹は、バックグラウンド正規化シグナル強度行列の列をクラスタリングすることによって作製し、一方右の系統樹は行をクラスタリングすることによって作製した。両方の系統樹は、0.25という非類似性カットオフ値を使用することによって、2つのエピトープが存在し、:1つのエピトープはモノクローナル抗体a809、a928、HR26、x215およびD111によって認識され;第二のエピトープはモノクローナル抗体a837、K221、a33、a142、a358およびa203、a393、およびa452によって認識されることを示す。
【図７Ｃ】IL-8モノクローナル抗体のクラスタリングに関する、系統樹を示す図である。9個のIL-8モノクローナル抗体のクラスタリングに関する、系統樹を示す図である。左の系統樹は、バックグラウンド正規化シグナル強度行列の列をクラスタリングすることによって作製し、右の系統樹は行をクラスタリングすることによって作製する。両方の系統樹は、0.25という非類似性カットオフ値を使用することによって、2つのエピトープが存在し、:1つのエピトープはモノクローナル抗体HR26およびa215によって認識され;第二のエピトープはモノクローナル抗体K221、a33、a142、a203、a358、a393およびa452によって認識されることを示す。
【図８】ANTIGEN14に対する一組の抗体を使用して、実施例2で開示する実施形態において作製した強度行列を示す図である。図８Ａは抗原を用いて行った実験に関する強度行列を示す、表を示す図である。図８Ｂは抗原を用いずに行った同じ実験(対照)に関する強度行列を示す、表を示す図である。これらの行列は、データ分析の後のステップ用の入力データ行列として使用する。
【図９】ANTIGEN14標的に対する抗体に関する残差行列を示す図である。残差行列は、実施例2で開示するように、抗原が存在しない実験から得られた値に対応する行列(図8B参照)を、抗原が存在する実験から得られた値に対応する行列(図8A参照)から引くことによって作製される。
【図１０】最少の閾値に調整した残差行列を示す図である。実施例2の強度値に関して、最も信頼性の低いシグナル強度値を200強度単位に設定し、最少閾値未満の値を、閾値200に設定する。
【図１１】行を正規化した行列を示す図である。図10の調整した残差行列のそれぞれの行を、それを行中の最後の強度値で割ることによって調整し、この値は、阻害緩衝剤が一次抗体の代わりに加えられるビーズの強度値に対応する。これによってウエル毎の強度を調整する。
【図１２】対角を正規化した行列を示す図である。抗体2.42に対応する列以外のすべての列を、列正規化した。それぞれの列を、その対応する対角値で割ることを行って、競合、すなわちそれ自体の競合を反映することが知られている強度と比べた、それぞれの強度を測定する。
【図１３】抗体パターン認識行列を示す図である。実施例2で開示する実施形態からのデータに関して、ユーザー定義の閾値未満の強度値を0に設定した。ユーザー定義の閾値は、対角強度値の2倍に設定した。残りの値は1に設定した。
【図１４】非類似性行列を示す図である。実施例2で開示する実施形態からのデータに関して、非類似性行列を、i行およびj列の項目を、2つの行iおよびjが異なる位置の分数比に設定することによって、図13に示す0および1の行列から作製する。図14は、合計22のうちで、任意の2つの抗体のパターンが、ANTIGEN14標的に対して作製した抗体の組に関して異なっていた位置の数を示す。
【図１５】平均非類似性行列を示す図である。別々の非類似性行列を、対角値の1.5〜2.5倍の範囲のいくつかの閾値のそれぞれから作製した後に、これらの非類似性行列の平均を計算し(図15)、これらをクラスタリング法のための項目として使用した。
【図１６】置換型平均非類似性行列を示す図である。実施例2で開示する実施形態からのデータに関して、行列中のクラスターを目に見える状態にすることができる。図16では、非類似性行列の行および列を、図5に示す系統樹の「葉」または分岐群の順序に従って再編成し、個々のセルは、非類似性の程度に従って目に見えるようにコード化した。
【図１７】置換型正規化強度行列を示す図である。実施例2で開示する実施形態からのデータに関して、正規化強度行列の行および列を、図5に示す系統樹の葉の順序に従って再編成し、個々のセルは、それらの正規化強度値に従って目に見えるようにコード化した。
【図１８Ａ】5つのANTIGEN39入力用データ組に関する、置換型平均非類似性行列を示す図である。ANTIGEN39標的に対する抗体を使用して行った5つの実験(実施例3を参照)からのデータによって、5つの入力用データ組を生成した。非類似性行列をそれぞれの入力用データ組に関して作製し、平均非類似性行列を作製し、図6に示す対応する系統樹の配置に従って、行および列を編成(置換)した。
【図１８Ｂ】5つのANTIGEN39入力用データ組に関する、置換型平均非類似性行列を示す図である。ANTIGEN39標的に対する抗体を使用して行った5つの実験(実施例3を参照)からのデータによって、5つの入力用データ組を生成した。非類似性行列をそれぞれの入力用データ組に関して作製し、平均非類似性行列を作製し、図6に示す対応する系統樹の配置に従って、行および列を編成(置換)した。
【図１９Ａ】5つのANTIGEN39入力用データ組に関する、置換型正規化強度行列を示す図である。ANTIGEN39標的に対する抗体を使用して行った5つの実験(実施例3を参照)からのデータによって、5つの入力用データ組を生成した。正規化強度行列を5つの入力用データ組に関して作製し、図6に示す対応する系統樹の配置に従って、行および列を編成(置換)した。
【図１９Ｂ】5つのANTIGEN39入力用データ組に関する、置換型正規化強度行列を示す図である。ANTIGEN39標的に対する抗体を使用して行った5つの実験(実施例3を参照)からのデータによって、5つの入力用データ組を生成した。正規化強度行列を5つの入力用データ組に関して作製し、図6に示す対応する系統樹の配置に従って、行および列を編成(置換)した。
【図２０】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験1に関する、置換型平均非類似性行列を示す図である。実験1(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Bに示す系統樹を参照のこと。
【図２１】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験1に関する、置換型正規化強度行列を示す図である。実験1(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Bに示す系統樹を参照のこと。
【図２２】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験2に関する、置換型平均非類似性行列を示す図である。実験2(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Cに示す系統樹を参照のこと。
【図２３】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験2に関する、置換型正規化強度行列を示す図である。実験2(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Cに示す系統樹を参照のこと。
【図２４】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験3に関する、置換型平均非類似性行列を示す図である。実験3(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Dに示す系統樹を参照のこと。
【図２５】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験3に関する、置換型正規化強度行列を示す図である。実験3(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Dに示す系統樹を参照のこと。
【図２６】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験4に関する、置換型平均非類似性行列を示す図である。実験4(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Eに示す系統樹を参照のこと。
【図２７】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験4に関する、置換型正規化強度行列を示す図である。実験4(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Eに示す系統樹を参照のこと。
【図２８】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験5に関する、置換型平均非類似性行列を示す図である。実験5(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Fに示す系統樹を参照のこと。
【図２９】ANTIGEN39標的に対する一組の抗体を使用する実験5に関する、置換型正規化強度行列を示す図である。実験5(実施例3)で分析した抗体の組からのデータを分析した。図6Fに示す系統樹を参照のこと。
【図３０】ANTIGEN39標的に対する抗体の組を使用して、実験1〜5で同定したクラスターを示す図である。図30には、5つの個々のデータ組それぞれに関して、実施例3に開示する5つの実験すべてで作製した抗体すべての組み合わせたデータ組に関して同定した、クラスターを要約する。
【図１】
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【図２Ａ】
2005512044.tif 000012
【図２Ｂ】
2005512044.tif 000013
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005512044.tif 000017
【図６Ａ】
2005512044.tif 000018
【図６Ｂ】
2005512044.tif 000019
【図６Ｃ】
2005512044.tif 000020
【図６Ｄ】
2005512044.tif 000021
【図６Ｅ】
2005512044.tif 000022
【図６Ｆ】
2005512044.tif 000023
【図７Ａ】
2005512044.tif 000024
【図７Ｂ】
2005512044.tif 000025
【図７Ｃ】
2005512044.tif 000026
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2005512044.tif 000030
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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