(57)【要約】保存共通配列内に非同類(non-conservative）置換を含有する特定のCC-ケモカインの突然変異体は CC-ケモカインのアンタゴニストとして作用する。これは炎症性疾患、自己免疫疾患、癌及び細菌感染又はウィルス感染の治療に有効に使用することができる。特に好ましいのは、配列番号: 1, 2, 3 又は4 のアミノ酸配列を有する RANTES/CCL5である。
2005525089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記共通配列：
C-C-(X)18-19-(Xa)2-Xb-X-C
を含有するCC-ケモカインの突然変異体であって、
上記式中、
Cはシステインを表し；
Xは任意のアミノ酸を表し；
Xaはセリン又はトレオニンを表し；
Xbはグリシン又はセリンを表し；
そして前記突然変異体が：
a)  位置Xbにおいて非同類置換を含有し；そして
b)  対応するCC-ケモカインのアンタゴニストとして作用する、
CC-ケモカインの突然変異体。
【請求項２】
該CC-ケモカインが、CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13及びCCL15の中から選択されたヒトCC-ケモカインである、請求項1に記載の突然変異体。
【請求項３】
該位置Xbにおけるアミノ酸が、プロリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン又はアスパラギンと置換されている、請求項1又は2に記載の突然変異体。
【請求項４】
配列番号:1,2,3又は4のアミノ酸配列を含む、請求項3に記載の突然変異体。
【請求項５】
1つ以上のアミノ酸が付加、削除又は置換されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアンタゴニストの活性突然変異体。
【請求項６】
配列番号:5,6又は7のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の活性突然変異体。
【請求項７】
CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13及びCCL15の中から選択されたCC-ケモカイン中に含まれる配列に対応するペプチドであって、請求項1に記載の共通配列内に示された位置Xbに対応する位置における残基の非同類置換を含有することを特徴とする、CC-ケモカイン中に含まれる配列に対応するペプチド。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか1項に記載のアミノ酸配列と、対応するCC-ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列とを含むことを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、以下のタンパク質配列：膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質、シグナル・ペプチド含有タンパク質、輸出シグナル含有タンパク質のうちの1つ以上に属するアミノ酸配列を含む、請求項8に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載のCC-ケモカイン突然変異体の活性前駆体、塩、誘導体、接合体又は複合体。
【請求項１１】
前記アンタゴニストが、放射性標識、ビオチン、蛍光標識、細胞傷害物質、又は薬剤送達物質の中から選択された分子との活性接合体又は複合体の形を成している、請求項10に記載の突然変異体。
【請求項１２】
請求項1〜9のいずれか1項に記載のCC-ケモカイン突然変異体をコードするDNA配列を含む、DNA分子。
【請求項１３】
請求項12に記載のDNA分子を含む、発現ベクター。
【請求項１４】
請求項12に記載のDNA分子又は請求項13に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の突然変異体を調製するための組換え方法であって、適切な培地内で請求項14に記載の細胞を培養し、そして発現されたタンパク質を捕集することを特徴とする、組換え方法。
【請求項１６】
前記突然変異体が乾燥重量を基準として少なくとも1%であることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載のCC-ケモカイン突然変異体の精製された調整物。
【請求項１７】
請求項1〜11のいずれか1項に記載のCC-ケモカイン突然変異体の使用であって、薬剤として使用されることを特徴とする、CC-ケモカイン突然変異体の使用。
【請求項１８】
請求項1〜11のいずれか1項に記載のCC-ケモカイン突然変異体の使用であって、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、又は細菌及びウィルス感染を治療するための医薬組成物を製造するのに使用されることを特徴とする、CC-ケモカイン突然変異体の使用。
【請求項１９】
自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、又は細菌及びウィルス感染を治療するための医薬組成物であって、医薬として許容される賦形剤と共に、活性成分として請求項1〜11のいずれか1項に記載のCC-ケモカイン突然変異体を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２０】
自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、又は細菌及びウィルス感染を治療するための医薬組成物を製造する方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載のCC-ケモカイン突然変異体のアンタゴニストを、医薬として許容されるキャリヤと合体することを含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項２１】
自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、又は細菌及びウィルス感染を治療するための、疾患の治療又は予防方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載のCC-ケモカインのアンタゴニストの有効量を投与することを含む、疾患の治療又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はCC-ケモカイン・アンタゴニストとして作用する新規のCC-ケモカイン突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、分泌される小さな寸法 (70〜130個のアミノ酸)の炎症促進性タンパク質である。これらのタンパク質は大抵、細胞の指向性移動及び活性化、特に、これらの細胞の漸増(recruitment）を必要とする組織局部に血液から白血球を溢出させることに関与する(Baggiolini M他, 1997; Rossi D及びZlotnik A, 2000; Fernandez EJ及びLolis E, 2002)。通常ケモカインは、負傷、炎症、又は他の組織変化の部位で、傍分泌又は自己分泌の形式で生成され、細胞型に対して特異的な移動及び活性化を引き起こす。
【０００３】
配列内の保存されたシステインの数と位置に応じて、ケモカインはC, CC, CXC及びCX3Cケモカインに分類されている。これらの群のそれぞれの中で、ケモカインは配列全体の相同性、又は特異的セグメントの相同性に応じて、さらにグループ分けすることができる。
【０００４】
ヘプタヘリカルGタンパク質にカップリングされた一連の膜受容体が、結合相手である。これらの結合相手は、ケモカインが標的細胞上で生体活性を発揮するのを可能にする。これらの標的細胞は、これらの状態及び/又はタイプに応じて、受容体の特異的な組み合わせを示す。ケモカイン・リガンド及び受容体の名称は、元はこれらの発見者によって極めて多元的に命名されていたが、統一された命名法が提案され、これらの分子のそれぞれを、累進的な数を含めた体系的な名称と組み合わせるようになっている。すなわち、CCケモカインに対しては、CCL1, CCL2などと命名し、CCケモカイン受容体に対しては、CCR1, CCR2などと命名する。
【０００５】
ケモカインの生理学的効果は、同時相互作用の複合的且つ統合的なシステムから生じる。受容体はしばしばオーバラップするリガンド特異性を有するので、単一の受容体が種々異なるケモカインと結合することができ、同様に単一のケモカインが種々異なる受容体と結合することもできる。具体的には、ケモカインのN末端ドメインは受容体結合に関与し、N末端プロセシングは、ケモカインを活性化するか、又はケモカインを完全に不活性にすることができる。
【０００６】
ケモカインを治療剤として使用することに潜在的な欠点があるとしても(凝集し易さ、無差別な結合)、これらの分子は、具体的には、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌及び細菌感染又はウィルス感染に関連する多様の兆候に対して、細胞、具体的には白血球の過剰な漸増及び活性化を防止しようとする目的で、特異的なケモカイン及びこれらの受容体を阻害し/これらに拮抗することにより、このようなプロセスに付随する病理状態に治療的に介入するのを可能にする(Carter PH, 2002; Schneider GP他, 2001, Baggiolini M, 2001; Godessart N及びKunkel SL, 2001; Proudfoot A他, 2000)。
【０００７】
現在まで特徴付けされた全てのケモカインの中で、CC-ケモカイン、例えばCCL5(RANTESとしても知られている;Appay V及びRowland-Jones SL, 2001)が、治療上有用な分子を同定するために集中的に研究されている。最大9つのN末端アミノ酸が不足しているCC-ケモカインの変異形が、自然発生形のインヒビター又はアンタゴニストとしてのこれらの活性に関して試験されている。これらの分子は単球上で不活性であり、受容体アンタゴニストとして有用である(Gong J及びClark-Lewis I, 1995; Gong JHなど、1996;国際公開第99/16877号パンフレット)。或いは、成熟CC-ケモカインを1つのメチオニンでN末端伸長することによって、分子が殆ど完全に不活性化される。この分子はまた、真のケモカインのためのアンタゴニストのように振舞う(国際公開96/17935号パンフレット)。
【０００８】
さらに、CC-ケモカインの構造機能分析を実施するために、種々異なる位置に置換又は化学修飾を含有する変異形、並びに、CC-ケモカイン由来のペプチドが、受容体又はその他の分子、例えばグリコサミングリカン(GAG)との相互作用に関して試験されている。これらの変異形のいくつかは、有意に変化させられた結合特性を有するものとして開示されており、或る場合には、これらはCC-ケモカイン・アンタゴニストとして活性であり、HIV感染及び炎症性疾患又はアレルギー性疾患の治療に潜在的な治療用途を有する (国際公開第99/33989号パンフレット；米国特許第6057123号明細書;PCT/EP01/11428;Nardese V他、2001;Martin L他、2001; Beck C他、2001; Hemmerich S他,1999)。
【０００９】
しかし、これらのアプローチのうち、CC-ケモカイン又はこれらのサブセット中に保存された各１つの位置における非同類(non-conservative）置換に由来する全ての突然変異体の特性を網羅的に研究したものはない。
【発明の開示】
【００１０】
驚くべきことに、CC-ケモカインのサブセットに共通する共通配列内に１つの非同類置換を含有する、CC-ケモカイン(RANTESとしても知られるCCL5)の特定の突然変異体が、このCC-ケモカインのアンタゴニストとして作用することが判った。
【００１１】
これらの証拠を活用して、同じ共通配列を共有するこのCC-ケモカイン・サブセットの類似の特性を有する突然変異体を生成することができる。本発明に従って調製された分子は、炎症性疾患及び自己免疫疾患、癌、及び細菌又はウィルス感染の治療に使用することができる。
【００１２】
本発明のその他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
結晶学的な研究に基づいて、我々は今般、位置32でRANTES(CCL5)を突然変異させることにより、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌、又は細菌及びウィルス感染の治療に有用なRANTESアンタゴニストを得るのが可能であることを見出した。RANTES G32Nの構造の解析、及び、その領域においてCCL5とより類似するその他の既知のCC-ケモカインの構造及び配列との比較(図9参照)は、この残基がCC-ケモカイン・サブセットの生体活性において一般的な役割を演じることを示唆している。
【００１４】
従って、我々は、CC-ケモカインを特徴付けるCys-Cys部位と、次の保存Cys残基(図9)との間に含まれるセグメント内の共通配列を規定した。この共通配列はCC-ケモカイン・サブセットに共通しており、また、適切に置換される場合には、CC-ケモカインをCC-ケモカイン・アンタゴニストに変化させる保存残基(conserved residue）を含有する。従来技術は、この位置における非同類置換の重要性及び可能な用途に関して、及び、このような共通配列に基づいて規定された特定のCC-ケモカイン群における非同類置換の重要性及び可能な用途に関して、何も示唆することがなかった(国際公開99/33989号パンフレット;米国特許第6057123号明細書;PCT/EP01/11428; Nardese V他、2001; Mayer MR及びStone MJ, 2001; Martin L他, 2001; Beck C他、2001; Hemmerich S他、1999)。
【００１５】
従って、本発明の主な対象は、下記共通配列：
C-C-(X)18-19-(Xa)2-Xb-X-C
［式中、
Cはシステインを表し；
Xは任意のアミノ酸を表し；
Xaはセリン又はトレオニンを表し；
Xbはグリシン又はセリンを表す］
を含有するCC-ケモカインの突然変異体であって、
前記突然変異体が：
a)  位置Xbにおいて非同類置換を含有し；そして
b)  対応するCC-ケモカインのアンタゴニストとして作用する、
CC-ケモカインの突然変異体を提供することである。
【００１６】
このような共通配列を共有するヒトCC-ケモカインは、CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13及びCCL15である。
【００１７】
位置Xbにおけるアミノ酸は、グリシン及びセリンの特性(小型、中性及びフレキシブルであること)とは異なる特性を有する他の任意のアミノ酸によって非同類置換することができる。好ましくは、この置換は、より大きく、極性の、且つ/又は剛性のアミノ酸、例えばプロリン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン又はアスパラギンに関わる。このような突然変異体の例は、本特許出願においてはRANTES/CCL5のために提供される(配列番号:1,2,3及び4)。
【００１８】
位置Xbにおける突然変異に加えて、本発明の突然変異体は野生型分子に対するその他の修飾、例えば削除、置換又は付加を含み、上記CC-ケモカイン・アンタゴニストの活性突然変異体を生成することができる。これらの付加的な修飾は、本特許出願に例示された突然変異体のアンタゴニスト特性を維持するか、又は増強さえするように意図されるべきである。分子のこのカテゴリーは、前記配列の天然類似体の又は人工類似体を含み、これらの類似体においては、1つ又は2つ以上のアミノ酸が付加、削除又は置換されている。但しこの場合、類似体は、本発明において特徴付けされた、又は、当業者に知られたその他の任意の当該手段によって特徴付けされた同じ生体活性を、匹敵するレベル又はより高いレベルで示すことを条件とする。
【００１９】
特異的CC-ケモカイン突然変異体は、受容体結合に影響を与えることが知られているN末端領域において、付加、削除又は置換されている1つ又は2つ以上のアミノ酸を有することができる。このような付加的な突然変異は、CC-ケモカイン・アンタゴニストを生成することで既に知られている。例えば本発明のRANTES突然変異体は、国際公開第96/17935号パンフレットに記載されているように、付加的なN末端アミノ酸を含有することもでき、或いは、国際公開第99/16877号パンフレットに記載されているように、最初の2つのN末端アミノ酸を欠くこともできる。従って、RANTES G32Nに基づき、かつ、Met-RANTES G32N(配列番号:5)及びRANTES(3-68) G32N(配列番号:6)のアミノ酸配列を有する分子を得ることができる。これらの分子も本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
或いは、RANTES G32Nは、国際公開第99/33989号パンフレットに記載されているように、他の部位に単独の突然変異を含有することもでき、或いは、PCT/EP01/11428に記載されているように、GAG結合ドメインに他の突然変異を含有することもできる。後者の場合、分子はRANTES G32N ALL40's(配列番号:7)のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
これらのポリペプチドは、化学合成、部位特異的突然変異誘発技術、又はこれに適したその他の既知の技術によって調製することができる。これらの技術は、実質的に対応する突然変異型又は短縮型のペプチド又はポリペプチドの有限集合を提供する。これらのペプチド又はポリペプチドは、従来技術又は本特許出願の実施例に示された教示内容を用いて、当業者によって規定通りに獲得し、試験することができる。コーディングDNAの従来型の突然変異誘発技術から、又は、コーディングDNA配列レベルでのコンビナトリアル技術(例えばDNAシャフリング、ファージ表示/選択)から、又は、ケモカイン相互作用のためのデコイをデザインするためのコンピュータ支援デザイン研究(Rajarathnam K, 2002)から、類似化合物を生じさせることもできる。
【００２２】
本発明によれば、これらの活性突然変異体におけるその他の付加的な好ましい変化は、「同類」(conservative)又は「安全」(safe)置換、すなわち、CC-ケモカイン・アンタゴニストとしての分子の構造及び生体機能を維持するために、アミノ酸が十分に類似の化学特性を有する置換として一般に知られている。アミノ酸の挿入及び削除は、具体的には挿入又は削除が数個のアミノ酸、例えば10個未満、好ましくは3つ未満のアミノ酸にしか関与せず、また、タンパク質又はペプチドの機能的コンホメーションにとって重要なアミノ酸を除去するか変位させるのではない場合に、上記配列において、配列の機能を変化させることなしに行うこともできるのは明らかである。
【００２３】
文献に記載された多くのモデルにおいて、天然タンパク質の配列及び/又は構造に関する統計的且つ物理化学的研究に基づいて、同類アミノ酸置換を選択することができる(Rogov SI及びNekrasov AN, 2001)。タンパク質デザイン試験が示したところによれば、特異的なアミノ酸サブセットを使用すると、折畳み可能な活性タンパク質を生成することができ、アミノ酸「同義」(synonymous)置換の分類を助けることができる。これらの「同義」置換は、タンパク質構造内でより容易に適応させることができ、また、機能的及び構造的なホモログ及びパラログを検出するのに使用することができる(Murphy LRなど、2000)。同義アミノ酸基及びより好ましい同義基を表Iにおいて定義する。
【００２４】
CC-ケモカインに属する配列に対応するペプチドが、従来技術に開示されている(Nardese V他、2001)。既に同定されたCC-ケモカイン・サブセットのいずれかに含まれ、そして、共通配列において既に示された位置Xbに対応する位置に残基の非同類置換を含有する類似のペプチドも、本発明の一部を形成する。これらのペプチドは、既に示されたCC-ケモカインに所属する配列に対応するべきであり、5つ以上のアミノ酸、好ましくは10個以上のアミノ酸から形成されるべきである。
【００２５】
さらに、このようなペプチドに基づく別のアンタゴニストを、ペプチド擬似体(ペプチド・ミメティクス)の形で生成することができる。このペプチド擬似体において、ペプチド及びポリペプチドの性質は、アミノ酸側鎖、アミノ酸対掌性、及び/又はペプチド主鎖のレベルで化学修飾されている。これらの変更は、調製、有効性及び/又は薬物動態学的特徴が改善されたアンタゴニストを提供するように意図されている。
【００２６】
例えば、患者への注射後にペプチドがペプチダーゼによって開裂されやすいことが問題である場合、特に感受性の高いペプチド結合を非開裂性ペプチド擬似体と交換することにより、ペプチドをより安定化し、ひいては治療薬としてより有用にすることができる。同様に、L-アミノ酸残基の置換は、ペプチドのタンパク質分解に対する感受性をより小さくし、最終的には、ペプチドをペプチド以外の有機化合物と一層類似させる標準的な方法である。アミノ末端ブロック基、例えばt-ブチルオキシカルボニル、アセチル、テイル、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキサアジピル、メトキシスベリル、及び2,4-ジニトロフェニルも有用である。有効性を増大させ、活性を延長し、精製を容易にし、且つ/又は半減期を増大させるのを可能にするその他の多くの修飾が、文献に記載されている(国際公開第02/10195号パンフレット;Villain M他, 2001)。
【００２７】
ペプチド擬似体中に含まれるアミノ酸誘導体の好ましい別の「同義」基を、表IIにおいて定義する。アミノ酸誘導体の一例はまた、アミノ-イソ酪酸(Aib)、ヒドロキシ-プロリン(Hyp)、1,2,3,4-テトラヒドロ-イソキノリン-3-COOH、インドリン-2-カルボン酸、4-ジフルオロ-プロリン、L-チアゾリジン-4-カルボン酸、L-ホモプロリン、3,4-デヒドロ-プロリン、3,4-ジヒドロキシ-フェニルアラニン、シクロヘキシル-グリシン及びフェニル-グリシンを含む。
【００２８】
「アミノ酸誘導体」は、遺伝的にコードされる20種の自然発生型アミノ酸以外のアミノ酸又はアミノ酸様化学物質であるものとする。具体的には、アミノ酸誘導体は、置換型又は無置換型のアルキル直鎖状部分、分枝鎖状部分又は環状部分を含有することができ、そして1つ又は2つ以上のヘテロ原子を含むことができる。アミノ酸誘導体は、de novoで形成することができ、或いは、商業的な供給元(Calbiochem-Novabiochem AG, Switzerland; Bachem, USA)から得ることができる。
【００２９】
in vitro及びin vivo翻訳システムを用いて、非天然型アミノ酸誘導体をタンパク質中に組み入れ、これによりタンパク質の構造及び機能を試験及び/又は改善するための種々の方法が文献中に開示されている(Dougherty DA, 2000)。ペプチド擬似体並びに非ペプチド擬似体の合成技術及び作成技術も当業者に良く知られている(Sawyer TK, 1997; Hruby VJ及びBalse PM, 2000; Golebiowski A他、2001)。
【００３０】
「CC-ケモカイン・アンタゴニスト」という用語は、対応する成熟したCC-ケモカイン及び/又は完全長の自然発生型(野生型)CC-ケモカインに対するアンタゴニストとして作用する任意の分子を意味する。
【００３１】
「活性」という用語は、このような別の化合物が本発明のCC-ケモカイン突然変異体のアンタゴニスト特性を維持するべきであり、また、同様に医薬上許容可能且つ有用であるべきであることを意味する。
【００３２】
本発明はまた、上記CC-ケモカインのアンタゴニストと、対応CC-ケモカイン以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列とを含むポリペプチドを開示する。この異種配列は、アンタゴニスト活性を著しく損なうことなしに、付加的な特性を提供するべきである。このような付加的な特性の例は、より容易な精製手順、体液中でより長く継続する半減期、付加的な結合部分、内部タンパク質分解消化による成熟、又は細胞外の局在化である。この後者の特徴は、上記定義に含まれる融合タンパク質又はキメラ・タンパク質から成る特異群を定義するのに特に重要である。それというのも、細胞外の局在化という特徴は、本特許出願においてCC-ケモカイン・アンタゴニストと定義された分子が、これらのポリペプチドの分離及び精製が容易になる空間だけではなく、CC-ケモカインが受容体及びその他の分子と自然に相互作用する空間にも局在化されるのを可能にするからである。これらの部分、リガンド、及びリンカーの構成、並びに、融合タンパク質の構成、精製、検出及び使用のための方法及び戦略が、文献において幅広く論議されている(Nilsson J他、1997;「Applications of chimeric genes and hybrid proteins」Methods Enzymol. 第326-328巻、Academic Press, 2000; 国際公開第01/77137号パンフレット)。
【００３３】
本発明のアンタゴニストを生成するのに使用することができる付加的なタンパク質配列は、膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、輸出シグナル含有タンパク質の中から選択することができる。本発明のCC-ケモカイン突然変異体に融合されるべきこれらの配列の1つ以上を選択することは、特定の用途及び/又は調製方法に対して役立つ。
【００３４】
本特許出願に開示されたポリペプチド及びペプチドは、所望の使用方法及び/又は製造方法に応じて好ましいその他の別の形態で、例えば活性画分、前駆体、塩、誘導体、接合体又は複合体として提供することができる。
【００３５】
「前駆体」は、細胞又は生物への投与前又は投与後の代謝又は酵素処理により、本発明の化合物に変換することができる化合物である。
【００３６】
本明細書中の「塩」という用語は、カルボキシル基の塩、及び、本発明のペプチド、ポリペプチド又はこれらの類似体の酸付加塩塩、の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当業者に知られた手段によって形成することができ、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第2鉄又は亜鉛塩などのような無機塩、及び、例えばアミン(例えばトリエタノールアミン)、アルギニン又はリシン、ピペリジン及びプロカインなどと形成されるような、有機塩基との塩を含む。酸付加塩は、例えば鉱酸(例えば塩酸又は硫酸)との塩、及び、有機酸、例えば酢酸又はシュウ酸との塩を含む。このような塩はいずれも、本発明のペプチド及びポリペプチド、又はこれらの類似体と実質的に同様の活性を有するべきである。
【００３７】
本明細書に使用される「誘導体」という用語は、アミノ酸部分の側鎖上、又は、既知の方法に基づくN末端基/又はC末端基上に存在する官能基から調製することができる誘導体を意味する。このような誘導体は例えば、カルボキシル基のエステル又は脂肪族アミド、及び遊離アミノ基のN-アシル誘導体、又は遊離ヒドロキシル基のO-アシル誘導体を含み、アシル基、例えばアルカノイル基又はアロイル基と共に形成される。或いは、誘導体は糖、又はアミノ酸部分の側鎖上に存在する官能基に結合されたリン酸基を含有してもよい。このような分子は、主要な配列を通常は変えることのないin vivo又はin vitroプロセス、例えばペプチドの化学的な誘導体化(アセチル化又はカルボキシル化)、リン酸化反応(ホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホスレオニン残基の導入)又はグロコシル化(グリコシル化に影響を与える酵素、例えば哺乳類のグリコシル化酵素又は脱グリコシル化酵素に対してペプチドを暴露することによる)から生じることができる。
【００３８】
他のタンパク質との相互作用の検出(放射能標識又は蛍光標識、ビオチン)、治療効果(細胞傷害物質、同位体)、又は薬剤送達効果(例えばポリエチレングリコール及びその他の天然型又は合成型ポリマー(Pillai O及びPanchagnula R, 2001))を改善するために、当業者に知られた分子及び方法を用いて、本発明のアンタゴニストの有用な接合体又は複合体を生成することができる。薬剤送達効果の事例では、アンタゴニストは、天然型配列中に存在する適切な残基、又は、内側位置又は末端位置で天然型配列を突然変異させることにより導入された適切な残基の特定部位を修飾するのに続いて生成することができる。同様の修飾はケモカインに関して既に開示されている(国際公開02/04499号パンフレット;同第02/04015号パンフレット;Vita C他、2002)。
【００３９】
ポリマー付着されやすい側鎖(すなわち、官能基を担持するアミノ酸、例えばリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジンなどの側鎖)を有するものであれば、任意の残基を付着に使用することができる。或いは、これらの部位における残基を、ポリマー付着され易い側鎖を有する異なるアミノ酸と交換することもできる。また、遺伝子コードされたアミノ酸の側鎖を、ポリマー付着のために化学修飾することもでき、或いは、適切な側鎖官能基を有する非天然型アミノ酸を採用することもできる。ポリマー付着は、アンタゴニストの特異位置において自然発生するアミノ酸の側鎖、又は、アンタゴニストの特異位置に自然発生するアミノ酸に取って代わる天然型又は非天然型のアミノ酸の側鎖にだけ生じるのではなく、標的位置におけるアミノ酸の側鎖に付着された炭水化物又はその他の部分にも生じ得る。
【００４０】
これらの目的に適したポリマーは、生体適合性を有しており、つまり、これらは生体系に対して非毒性であり、そしてこのようなポリマーが数多く知られている。このようなポリマーは性質上疎水性又は親水性であり、生物分解性、非生物分解性、又はこれらの組み合わせであってよい。これらのポリマーは天然ポリマー(例えばコラーゲン、ゼラチン、セルロース、ヒアルロン酸)、並びに、合成ポリマー(例えばポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物)を含む。疎水性非分解性ポリマーの例は、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、及びポリメチルメタクリレートを含む。親水性非分解性ポリマーの例は、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリビニルアルコール、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、及びこれらのコポリマーを含む。好ましいポリマーは、エチレンオキシドを連続反復単位として、例えばポリエチレングリコール(PEG)を含む。
【００４１】
好ましい付着法は、ペプチド合成と化学的連結反応との組み合わせを採用する。有利には、水溶性ポリマーの付着が、生物分解性リンカーを介して、特にタンパク質のアミノ末端領域で行われることになる。このような修飾は、前駆体(例えば「プロドラッグ」)形としてタンパク質を提供するように作用する。前駆体形は、リンカーが分解すると、ポリマー修飾を伴わずにタンパク質を放出する。
【００４２】
本発明のアンタゴニストは、組換えDNA関連技術及び化学合成技術を含めて、当業者に良く知られた任意の手順によって調製することができる。
【００４３】
本発明の別の対象は、本発明のCC-ケモカイン突然変異体をコードするDNA配列（実質的に同じヌクレオチド配列を包含する）を含むDNA分子である。
【００４４】
「実質的に同じヌクレオチド配列」とは、遺伝子コードの縮重によって、所与のアミノ酸配列をやはりコードする他の全ての核酸配列を含む。
【００４５】
本発明はまた、上記DNAを含む発現ベクター、このようなベクターで形質転換される宿主細胞、及び本発明のこのようなCC-ケモカイン突然変異体の調製方法を含み、この調製方法は、適切な培地内に前記形質転換された細胞を培養し、そして発現されたタンパク質を捕集することを含む。ベクターがアンタゴニストを、細胞外タンパク質、輸出シグナル含有タンパク質又はシグナルペプチド含有タンパク質との融合タンパク質として発現させると、CC-ケモカイン・アンタゴニストは、細胞外空間に分泌することができ、より容易に捕集し、更なる処理を考慮して培養細胞から精製することができる。
【００４６】
本明細書中に述べたように、本発明の組換えタンパク質のうちのいずれかの発現は、適切な発現ベクターを使用して、真核細胞(例えば酵母、昆虫又は哺乳動物細胞)中又は原核細胞中で行うことができる。当業者に知られた任意の方法を採用することができる。
【００４７】
具体的には、哺乳動物細胞、例えば具体的には、ヒト、サル、マウス及びチャイニーズ・ハムスターの卵巣(CHO)細胞が好ましい。なぜならば、これらの細胞は、タンパク質分子に対する翻訳後修飾を可能にするからである。翻訳後修飾は、正しい折畳み又は正しい部位におけるグリコシル化を含む。酵母細胞も、グリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を実施することができる。数多くの組換えDNA戦略が存在し、これらの戦略は、強力なプロモーター配列及び高複製数のプラスミドを活用する。これらのプラスミドは、酵母中の所期のタンパク質の生成に活用することができる。酵母は、クローニングされた哺乳動物遺伝子生成物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を担持するペプチド(すなわちプレ・ペプチド)を分泌する。或いは、文献に開示された細菌細胞中でケモカインを発現させるための特定のプロトコルのいずれかを使用することもできる(Edgerton MD他、2000)。
【００４８】
特定のプラスミド又はウィルス・ベクターを選択する上で重要なファクターは：ベクターを含有するレシピエント細胞を、ベクターを含有しないレシピエント細胞から認識し、選択することが容易であること；特定の宿主内に望まれるベクターの複写数；及び様々な種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」可能であることが望ましいか否か、という点を含む。
【００４９】
ベクターは、転写開始/終止調節配列の制御下で、原核又は真核宿主細胞において、本発明のアンタゴニストを含む分離タンパク質又は融合タンパク質の発現を可能にするべきである。転写開始/終止調節配列は、前記細胞内で構成的に活性であるか又は誘導性であるように選択されている。ベクターの導入後、宿主細胞は選択培地内で成長させられ、この選択培地は、ベクター含有細胞の成長を選択する。クローニングされた遺伝子の配列が発現する結果、所期タンパク質が生成される。このような細胞内で著しく富化された細胞系を次いで分離して、安定的な細胞系を提供することができる。
【００５０】
真核宿主(例えば酵母、昆虫又は哺乳動物細胞)の場合、宿主の性質に応じて、種々異なる転写調節配列及び翻訳調節配列を採用することができる。これらの調節配列は、ウィルス源、例えばアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、又はシミアン・ウィルスなどに由来してよく、このウィルスにおいて、調節シグナルは、高発現レベルを有する特定の遺伝子と連携する。その例はヘルペス・ウィルスのTKプロモーター、SV40初期プロモーター、酵母gal4遺伝子プロモーターなどである。抑制及び活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択することができ、これにより、遺伝子の発現を調節することができる。導入されたDNAによって安定的に形質転換された細胞は、1つ又は2つ以上のマーカーをやはり導入することにより、選択することができる。このマーカーは、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする。マーカーは栄養要求性宿主に対する光栄養、殺生剤、例えば抗生物質に対する耐性、又は重金属、例えば銅などを提供することもできる。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきDNA遺伝子配列に直接的にリンクするか、又は、同時トランスフェクションによって同じ細胞中に導入することができる。
【００５１】
本発明のこれらの対象は、CC-ケモカインのアンタゴニストに関して本特許出願により開示されたものと、一般的な分子生物技術の知識とを組み合わせることにより、達成することができる。ベクター、及び原核宿主細胞又は真核宿主細胞を使用して、いかにして組換えタンパク質をクローニングし、生成するかに関しては、数多くの文献及び概要、例えばOxford University Press発行、連続出版物「A Practical Approach」の中の幾つかの標題(「DNA Cloning 2: Expression Systems」, 1995; 「DNA Cloning 4: Mammalian Systems」, 1996;「Protein Expression」, 1999;「Protein Purification Techniques」, 2001)に教示されている。
【００５２】
本発明のCC-ケモカイン突然変異体は、当業者に良く知られた他の任意の手順によって、具体的には十分に確立された化学合成手順によって調製することができ、分子の長さが短いならば、効率的に適用することができる。付加的な化学基をも含有する全体的に合成型のCC-ケモカインが、文献に開示されている(Brown A他、1996; Vita C他、2002)。
【００５３】
化学合成技術の例は固相合成及び液相合成である。固相合成としては、例えば、合成されるべきペプチドのカルボキシ末端に対応するアミノ酸が、有機溶剤中に不溶性の支持体に結合される。そして、アミノ基を有するアミノ酸と、適切な保護基で保護された側鎖官能基とが1つずつ、カルボキシ末端からアミノ末端まで順序良く縮合される1反応と、樹脂に結合されたアミノ酸又はペプチドのアミノ基の保護基が放出される1反応とが交互に反復することにより、ペプチド鎖が伸長される。固相合成法は、使用される保護基のタイプに応じて、tBoc法とFmoc法とに大きく分類される。典型的に使用される保護基は、アミノ基に対しては、tBoc(t-ブトキシカルボニル)、Cl-Z(2-クロロベンジルオキシカルボニル)、Br-Z(2-ブロモベンジルオキシカルボニル)、Bzl(ベンジル)、Fmoc(9-フルオレニルメトキシカルボニル)、Mbh(4,4'-ジメトキシジベンズヒドリル)、Mtr(4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル)、Trt(トリチル)、Tos(トシル)、Z(ベンジルオキシカルボニル)及びCl2-Bzl(2,6-ジクロロベンジル)を含み；グアニジノ基に対しては、NO2(ニトロ)及びPmc(2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル)を含み；そして、ヒドロキシル基に対してはtBu(t-ブチル)を含む。所期のペプチドの合成後、このペプチドは、脱保護反応させられ、固体支持体から切り出される。このようなペプチド切断反応は、Boc法の場合にはフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸で行い、そしてFmoc法の場合にはTFAで行うことができる。最後に、無傷の完全長のペプチドが精製され、化学的又は酵素的に折り畳まれる(システイン間のジスルフィド結合の形成を含む)ことにより、本発明の対応するCC-ケモカイン突然変異体が形成される。
【００５４】
天然型、合成型又は組換え型タンパク質の精製は、この目的において知られている方法のうちのいずれか1つ、すなわち、抽出、析出、クロマトグラフィ又は電気泳動などに関与する任意の常用手順によって実施される。本発明のタンパク質を精製するために優先して用いることができる更なる精製手順は、モノクローナル抗体、ヘパリン、又は他の任意の好適なリガンドを使用したアフィニティ・クロマトグラフィである。リガンドは、高い効率で標的タンパク質と結合することができ、また、カラム内に含有されたゲル・マトリックス上に固定化することができる。タンパク質を含有する不純な調製物がカラムを通される。タンパク質は、このリガンドによってカラムに結合される一方、不純物は通過することになる。洗浄後、タンパク質は、pH又はイオン強度の変化によってゲルから溶出される。或いは、HPLC(高性能液体クロマトグラフィ)を用いることもできる。
【００５５】
本発明はまた、上述のCC-ケモカイン突然変異体の精製された調製物を含む。本明細書中で使用される「精製された調製物」とは、乾燥重量を基準として1%以上、好ましくは5%以上の本発明のCC-ケモカイン突然変異体を含有する調製物を意味する。
【００５６】
本発明の別の対象は、薬剤として、具体的には医薬組成物中(及び、医薬として許容されるキャリヤ、賦形剤、安定剤、アジュバント又は希釈剤との組み合わせで配合された医薬組成物中)の活性成分として、上記CC-ケモカイン突然変異体を使用することである。さらに別の対象は、前記分子のアンタゴニスト特性が有益な効果を与えることができる疾患、例えばケモカインに関する文献によれば、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、並びに細菌及びウィルス感染を治療又は予防するための医薬組成物を製造するために、本発明のCC-ケモカイン突然変異体を使用することである。具体的な疾患の一例としては、関節炎、リウマチ様関節炎(RA)、乾癬性関節炎、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、全身性硬化症、強皮症、多発性筋炎、糸球体腎炎、黒色腫、悪性腫瘍、白血病、リンパ芽球腫、肝線維症、皮膚線維症、肺線維症、アレルギー疾患又は過敏性疾患、皮膚炎、遅延型過敏症又はDTHとも呼ばれるIV型過敏症、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、敗血性ショック、HIV感染症、移植、移植片対宿主疾患(GVHD)、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。
【００５７】
従って、本発明の別の対象は、本発明のケモカイン突然変異体の有効量を、医薬として許容される賦形剤と一緒に、且つ/又は、本発明のCC-ケモカイン突然変異体と協同で又は調和されて作用する別の治療用組成物と一緒に投与することにより、上述の疾患のいずれかを治療又は防止する方法である。例えばCC-ケモカイン・アンタゴニストの同様の相乗作用特性が、シクロスポリンとの組み合わせにおいて実証されている(国際公開第00/16796号パンフレット)。
【００５８】
「有効量」とは、疾患の経過及び重症性に影響を与えるのに十分であり、このような病状を軽減又は寛解させる活性成分の量を意味する。有効量は、投与経路及び患者の状態に依存する。
【００５９】
本発明の更なる対象は、上述の疾患のいずれかを治療又は予防するための、医薬として許容される1種又は2種以上の賦形剤の存在において本発明のケモカイン突然変異体を含有する医薬組成物である。医薬組成物は、投与様式の必要性に見合った許容可能な任意の方法で配合することができる。例えば、薬剤送達のための生体材料及びその他のポリマーの使用と共に、特定の投与様式の有効性を確認するための種々異なる技術及びモデルが、文献に開示されている(Luo B及びPrestwich GD, 2001; Cleland JL他、2001)。
【００６０】
「医薬として許容される」は、活性成分の生体活性の効果を妨害せず、投与される宿主に対して毒性を有さない任意のキャリヤを包含することを意味する。キャリヤはまた、澱粉、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及び石油、動物、植物又は合成起源の油(落花生油、大豆油、鉱物油、ごま油)を含む種々の油から選択することもできる。例えば、非経口投与の場合、上記活性成分は、ビヒクル、例えば生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル溶液中に注射用単位投与形態で配合することができる。
【００６１】
医薬として許容されるキャリヤ以外に、本発明の組成物は、少量の添加剤、例えば安定剤、賦形剤、緩衝液及び保存剤を含むこともできる。これらの添加剤は、活性化合物を処理して、医薬上使用可能な調整物にするのを容易にすることができる。さらに、これらの組成物は別の活性成分を含有することができる。この別の活性成分は、本発明のCC-ケモカイン突然変異体と協同して、又はこれと調和されて作用することができる。例えばCC-ケモカイン・アンタゴニストの同様の相乗作用特性が、シクロスポリンとの組み合わせにおいて実証されている(国際公開第00/16796号パンフレット)。
【００６２】
このような活性成分は、静脈内、筋肉内又は皮下経路で投与することができる。それぞれの成分の所期の血中濃度を確立することができる他の投与経路も、本発明に含まれる。例えば、種々の非経口経路、例えば皮下、静脈内、皮下、腹膜内、鼻腔内、経皮、経口又は舌下の経路によって投与を行うことができる。本発明の医薬組成物は、ポリペプチドを所定の速度で長時間投与するために、デポ注射剤、浸透ポンプなどを含む徐放性投与形態又は制御放出投与形態で、好ましくは正確な用量を単回投与するのに適した単位投与形態で投与することもできる。
【００６３】
非経口投与は、ボーラス注射により、又は所定の時間にわたって徐々に灌流することにより行うことができる。非経口投与のための調整物は、滅菌水溶液又は滅菌非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンを含み、これらは、当業者に知られている助剤又は賦形剤を含有することができ、そして規定通りの方法に従って調製することができる。さらに、活性化合物の懸濁液を適切な油性注射懸濁液として投与することができる。好適な親油性溶剤又はビヒクルは脂肪油、例えばごま油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリドを含む。懸濁液の粘性を高める物質を含有することができる水性注射懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び/又はデキストランを含む。任意には、懸濁液は安定剤を含有してよい。医薬組成物は、注射による投与に適した溶液を含み、賦形剤と共に、約0.01〜99.99%、好ましくは約20〜75%の活性化合物を含有する。
【００６４】
活性成分の最適投与量は、投与経路、患者の状態及び特徴(性別、年齢、体重、健康状態、身体の大きさ)、症状の範囲、同時に行われている治療、治療頻度及び所期の効果に応じて適切に選択することができる。確立された投与量の調節及び操作は当業者であれば、良好に行うことができる。
【００６５】
普通、活性成分の1日投与量は、体重1kg当たり約0.01〜100ミリグラムであってよく、分割投与又は徐放性形態の場合には、1日に付き、体重1kg当たり、通常1〜40ミリグラムが所期の結果を得るのに効果的である。2回目の投与又は後続の投与は、その個体に投与された最初又は以前の投与量と同じか、これよりも少ないか、又はこれよりも多い投与量で行うことができる。
【００６６】
本発明を特定の実施態様に関連して説明してきたが、この説明の内容は、特許請求の範囲の意味及び目的を逸脱することなしに、当業者によって考えられ得るあらゆる変更又は置換えを含む。
【００６７】
下記実施例によって本発明を以下に説明する。これらの実施例は、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。実施例では、下記に特定した図面を引用する。
【実施例】
【００６８】
実施例1：位置32におけるRANTES突然変異体の構成及び発現
ヒトRANTESを、位置32における突然変異形としてE.coli中で発現させた。この位置32はCC-ケモカイン・サブセットにおいて、Gly又はSerを含み、これらのCC-ケモカインは直前の2つの位置においてSer又はThrを有するものである(図1及び図9を比較されたい)。
【００６９】
異種のMetで始まるリーダー配列(MKKKWPR)を含有する成熟RANTES変異形として、RANTES突然変異体を発現させた。タンパク質分解酵素を使用して、この前駆体(secRANTES G32Nタンパク質; 配列番号:9;図1)からリーダー配列を後で排除し、これにより成熟タンパク質(RANTES G32N; 配列番号:1)を得る。位置32がこの成熟タンパク質に関連するので、突然変異位置は32で示される。
【００７０】
同じリーダー配列に融合されたヒトRANTES配列とハイブリッド形成する2つのオリゴヌクレオチド対を使用して、2ステップのPCRに基づいて突然変異を生成することによるヒトRANTESのPCR突然変異生成によって、突然変異体をコードするDNA(secRANTES G32N DNA; 配列番号:8;図1)を生成し、発現ベクターpET24d(Novagen)中でクローニングした。
【００７１】
順方向プライマーとして、リーダー配列と成熟ヒトRANTESの5'配列とを含むプライマー(プライマーP1;配列番号:10)を使用し、そして、逆方向プライマーとして、2つのヌクレオチドを変えることによりGlyコドンをAsnコドンと置換するための突然変異生成プライマー(プライマーP2;配列番号:11)を使用して、secRANTES G32N DNAの5'末端部分を生成した。また、順方向プライマーとして、2つのヌクレオチドを変えることによりGlyコドンをAsnコドンと置換するための突然変異生成プライマー(プライマーP3;配列番号:12)を使用し、そして、逆方向プライマーとして、ヒトRANTESの3'末端と、後でクローニング・ステップにおいて使用される配列とを含有するプライマー(プライマーP4;配列番号:13)を使用して、secRANTES G32N DNAの3'末端部分を生成した。
【００７２】
結果として生じた、RANTESの共通突然変異領域のレベルでハイブリッド形成する138bp及び139bpの生成物を精製し、1;1の比で混合した。この溶液を、元の末端プライマー(プライマーP1及びP4)を使用する第2のPCR反応に先立って、100倍に希釈した。244bpと予想されるPCR生成物を精製し、BspHl及びXhol制限エンドヌクレアーゼで消化し、pET24d中にNcol部位とXhol部位との間でクローニングし、TG1感応性E.coli細胞中に形質転換した。その結果生じたベクターのDNA配列分析により、予想突然変異部位(図1)が明らかになった。
【００７３】
同じアプローチを用いて、同じ位置RANTES G32P(配列番号:2)、RANTES G32D(配列番号:3)、RANTES G32K(配列番号:4)において、別の突然変異体を発現させるためのベクターを生成した。
【００７４】
RANTESをコードするpET24d系プラスミド及び位置32における突然変異体を、BL21(DE3)pLysS感応性E.coli細胞中に移入した。これらの細胞中で、1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を培地に添加することにより、タンパク質の発現を誘導した。誘発から3.5時間後に細胞を収穫し、溶菌緩衝液(50mMのTris/HCl pH 8, 10mMのMgCl2、5mMのベンズアミジン/HCl、1mMのDTT、0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、Dナーゼ20mg/L)中に再懸濁させた。フレンチ・プレッシャー・セル・ユニットを3回通過させることにより、細胞を破壊した。続いて懸濁液を4℃で30分間にわたって、10,000 x gで遠心分離した。RANTES又は突然変異タンパク質（mutein）を含有する封入体ペレットを、6Mのグアニジン/HCl及び1mMのDTTを含有する0.1MのTris/HCl, pH 8.0中で可溶化し、そして60℃で30分間にわたって撹拌した。この溶液を3回交換した1%酢酸に対して透析した。30分間にわたって10,000 x gで遠心分離することにより、不溶性材料を除去した。組換えタンパク質を含有する上澄みを凍結乾燥した。
【００７５】
6Mのグアニジン/HCl及び1mMのDTTを含有する0.1MのTris/HCl, pH 8.0中に、凍結乾燥粉末を溶解し、これにより約1mg/mlの濃度を得た。0.01mMの酸化型グルタチオンと0.1mMの還元型グルタチオンとを含有する、20mMのTris/HCl, pH 8.0のグアニジン溶液の容積の10倍の容積に滴下希釈することにより、タンパク質を再生(renature)した。溶液を4℃で一晩にわたって撹拌した。30分間にわたって10,000 x gで遠心分離することにより、不溶性材料を除去した。pHを酢酸で4.5に調節し、そしでH2Oで希釈することにより導電率を20mSに調節した。20mMの酢酸ナトリウム、pH4.5中で予め平衡させられたHiLoad S 26/10カラムに、この溶液を塗布し、同じ緩衝液中で線形の0-2MのNaCl勾配を付けてタンパク質を溶出した。組換えタンパク質を含有する画分をプールし、3回交換した酢酸に対して透析し、凍結乾燥させた。
【００７６】
乾燥凍結タンパク質を、50mMのTris/HCl緩衝液、pH 8.0中に溶解した。トリプシン(1:10,000、酵素：基質、w/w)と一緒に37℃で3時間にわたってインキュベートすることにより、RANTES又はRANTES突然変異体からMKKKWPRリーダー配列を開裂した。6Mの尿素を含有する20mMの酢酸ナトリウム、pH4.5中で予め平衡させられたHiLoad S 26/10カラム上で陽イオン交換クロマトグラフィを行うことにより、開裂されたタンパク質を、開裂されていないタンパク質から分離した。そして、同じ緩衝液中で線形の0-2MのNaCl勾配を付けてタンパク質を溶出した。開裂された画分をプールし、2回交換した1%の酢酸に対して、そして最後に0.1%トリフルオロ酢酸に対して透析し、次いで、さらに使用する前に凍結乾燥した。
【００７７】
こうして発現された全てのタンパク質の同一性を質量分析によって検証し、そして、純度を高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)によって検証した。精製された組換えタンパク質を質量分析によって分析し、これにより正しい構造を確認した。酸化型タンパク質に対応する予想質量が7947.04Daであるのと比較して、RANTESの質量は7846.69Daであった。酸化型タンパク質に対応する予想質量が7903.54Daであるのと比較して、RANTES G32Nの質量は7904.08Daであった。
【００７８】
実施例2：平衡競合受容体結合アッセイ
このアッセイは、トレーサーとして[125I]-MIP-1αを使用したシンチレーション近接アッセイ(SPA)によって、CCR1及びCCR5を発現させるCHOトランスフェクタントから成る膜上で実施した。範囲10-6〜10-12Mを占めるように、標識付けされていないケモカインを結合緩衝液中に連続希釈することにより、競合相手を調製した。使用された結合緩衝液は、50mMのHEPES, pH7.2であり、1mMのCaCl2、5mMのMgCl2、0.15M NaCl及び0.5%ウシ血清アルブミンを含有した。小麦胚芽SPAビード(Amersham)をPBS中で可溶化して50mg/mlにし、そして、結合緩衝液中で10mg/mlに希釈した。アッセイにおける最終濃度は0.25mg/ウェルであった。CCR1及びCCR5を発現させる膜を-80℃で保存し、そして結合緩衝液中で希釈して、濃度を80μg/mlにした。等しい容積の膜とビード・ストックとをアッセイ実施前に混合し、これにより、バックグラウンドを低減した。最終膜濃度は2μg/mlであり、[125I]-MIP-1αの濃度は0.1nMであった。プレートを4時間にわたって撹拌しながら、室温でインキュベートした。放射能をベータ・カウンタでカウントした(1分/ウェル)。3つの試料からのデータを、Prism(登録商標)(GraphPad)を使用して分析した。
【００７９】
位置32における全てのRANTES突然変異体は、RANTES受容体であるCCR1及びCCR5に対して高い親和性結合を維持した。これらのRANTES突然変異体は、ナノモルの範囲でも、CCR1(図2a)及びCCR5(図2b)を巡って[125I]-MIP-1αと競合することができた。
【００８０】
実施例3：in vitro走化性
下記の分離手順を用いて、軟膜から単球を精製した。軟膜溶液(100ml)を100mlのPBSで希釈し、フィコール上で層形成し、そして室温で20分間にわたって600 x gで遠心分離した。界面を形成する細胞を捕集し、PBSで2回洗浄した。MACS細胞分離キット(Miltenyi Biotech)を使用して、T細胞、NK細胞、B細胞、樹状細胞及び好塩基球を消耗させることによる負の選択を行うことによって富化した。
【００８１】
フェノールレッドを含まないRPMI 1640培地中1.5 x 106/mlで、単球を再懸濁させた。FACS分析によって、前方散乱及び側方散乱により、純度を測定した。(フェノールレッドを含まない)RPMI培地中10-6〜10-12Mの範囲を占めるケモカイン希釈液(30μl)を、96ウェル型走化性チャンバ(Neuroprobe)の下側ウェルに入れた。フィルタ・ユニット(孔サイズ3μm)を下側ウェルの上方に設け、気泡がないことを確保した。細胞懸濁液(RPMI培地中1.5 x 106個の細胞で20μl)を上側ウェルに入れた。37℃で2時間にわたってO2下で、チャンバをインキュベートした。フィルタの上面を10mlのPBSで洗浄し、次いでフィルターを取り外した。製造元の指示書に従って、下側チャンバ内の移動細胞を第2の黒色96ウェル型プレートに移し、そして-80℃で凍結した。次いでプレートを室温にし、そして、製造元の指示書に従って、CyQUANT細胞増殖アッセイ・キット(Molecular Probes)を使用して、細胞の数を数えた。480nmの励起及び520nmの発光によって蛍光を測定し、そのデータを、Prism(登録商標)(GraphPad)ソフトウェアを使用して分析した。
【００８２】
単球走化性アッセイにおいて得られた結果は、突然変異体が高い親和性受容体結合を維持するという事実と相関する。RANTES G32Nは、RANTESと匹敵する活性を持って、単球走化性を誘発することができた(図3)。RANTES突然変異体のin vitro特性の類似性に関するその他の証拠は、ヘパリン結合アッセイにおいても得られた。
【００８３】
実施例4：腹膜細胞漸増アッセイ
8〜12週齢の雌Balb/Cマウスを0日目に感作させた。滅菌PBS中の100μgのオボアルブミン(Sigma, 等級V)と混合された10nMのCpG-ODN(Microsynth)を、全てのマウスに5回皮下注射した(それぞれの脚に4 x 50μl、及び首筋に1 x 100μl)。
【００８４】
1週間後、リポポリサッカライド非含有の0.2mlの滅菌食塩水(0.9%)中に希釈されたRANTES又はRANTES G32N突然変異体10μg(0.5mg/Kg)を腹膜内注射することにより、細胞漸増をBalb/Cマウス中に誘発した。RANTES G32N突然変異体のアゴニスト特性を試験する時に、同じ滅菌溶液0.2ml中に希釈されたタンパク質の指示量を、アゴニスト(RANTES)投与の30分前に投与した。
【００８５】
16時間後にエアロゾル化CO2によってマウスを致死させ、そして5mlのPBSで3回腹腔洗浄を行った。この洗浄物をプールし、5分間にわたって1500 x gで遠心分離し、ペレット化された細胞を最終容積1ミリリットル中に再懸濁した。試料毎の顕在化白血球の総数を血球計でカウントした。
【００８６】
RANTES G32N突然変異体は、RANTESが実質的な漸増を引き起こす投与量(10μg/マウス)では、腹膜内への細胞漸増（cellular recruitment）を誘発することはできなかった(図4)。他方において、突然変異体をRANTES投与の30分前に投与すると、RANTESによって誘発された細胞漸増は、RANTESアンタゴニストMet-RANTESと類似の統計的に有意な効果を伴ってRANTES G32Nにより投与量に関連して阻害される(図5）。
【００８７】
実施例5：オボアルブミン誘発型肺炎アッセイ
オボアルブミンで感作されたマウスは、オボアルブミンで鼻腔内攻撃されると、ヒト喘息の症状と似た症状を生じさせる。炎症反応は、肺内への白血球の多量の侵入と関連しており、この反応は気管支肺胞洗浄によって測定することができる。
【００８８】
8〜12週齢の雌Balb/Cマウス(1群当たりn=6)に、NaCl 200μl中の10μgのオボアルブミン(Sigma A-5503)及び2%AlOH3を腹膜内(i.p.)注射した。擬似群には食塩水だけを注射した。
【００８９】
15〜19日目に、吸入麻酔下で食塩水50μl中の15μgのオボアルブミンを鼻腔内投与する30分前に、10μgのRANTES G32N、又は陽性対照として1μgのMet-RANTES、又は陰性対照として200μlの食塩水(NaCl)を、マウスに腹膜内注射した。22日目に、ウレタンを腹膜内に過剰投与することによりマウスを致死させ、そして肺を4 x 0.4mlの氷温のPBS-EDTAで洗浄した。各動物から回収した細胞の総数を血球計算板で手動で計算した。
【００９０】
この処理のための陽性対照である1μg/マウスのMet-RANTESで観察された52%と比較して、RANTES G32N(10μg/マウス)は、細胞漸増を48%だけ阻害することができた(図6)。
【００９１】
実施例6：遅延型接触過敏症アッセイ
接触過敏症反応(CHS)は、T細胞媒介性のハプテン特異的皮膚炎である。大抵のハプテンは、主としてCD8+エフェクターT細胞から成るオリゴクローナルT細胞反応を引き起こし、これに対してCD4+T細胞はCHS反応においてダウンレギュレーションの役割を有する。
【００９２】
Garrigue JL他、1994によって記載された通りに、接触過敏症を測定するためのマウスの耳腫脹試験を実施した。手短かに云えば、アセトン/オリーブ油(4:1)中の2,4-ジニトロフルオロベンゼン(DNFB;Sigma Chemical Co.)溶液25μlを、毛を除去した腹部に塗布することにより、局所的にマウスを前感作させた。5日後、同じビヒクル中の0.2% DNFB20μlを、右耳に塗布し、そしてビヒクルだけを左耳に塗布し、これにより、耳腫脹を引き起こす細胞の走化性を誘発させた。
【００９３】
攻撃時に処理を開始し、処理剤を腹膜内注射によって毎日投与した。感作後 5〜12日目の同じマウスの右耳と比較した左耳の大きさの変化として、耳腫脹の差（デルタ）を計算した。5日目から9日目まで毎日、0.5mg/kgのRANTES G32N又は12.5mg/kgのIL-18結合タンパク質を腹膜内投与することによって、マウスに処理を施した。最初の処理剤はDNFB攻撃の1時間前に投与した。耳の厚さをダイヤル式厚さゲージ(Mitutoyo Corp.)で測定し、攻撃後の値から攻撃前の値を差し引くことにより、そしてさらに、ビヒクルで攻撃した対側の耳において検出された腫脹を差し引くことにより、耳腫脹を評価した。
【００９４】
5日目のDNFB攻撃は、ビヒクル対照と比較して(図7)、両処理群において著しい耳腫脹を誘発し、9日目には既にほとんど正常状態に戻った。接触過敏症/接触皮膚炎のこのように確立されたマウス・モデルにおいて、本発明のCC-ケモカイン突然変異体による3日間の処理は、ハプテンによる処理によって誘き出された腫脹/炎症の範囲に対して、著しく有益な効果をもたらした。
【００９５】
実施例7：RANTES G32N及びアンタゴニスト特性を有するその他のCC-ケモカイン突然変異体の結晶構造
【００９６】
RANTES G32Nの結晶構造を決定するために、水中10mg/mlで組換えタンパク質を溶解させ、50mMの緩衝酢酸溶液pH3.5を添加することにより、pHを3.5に調節した。懸滴蒸気拡散法により、結晶を成長させた。この方法において、5μlのタンパク質溶液を5μlのリザーバ溶液と混合し、1mlのリザーバ溶液に対して平衡させた。この溶液は15〜20%(v/v)のポリエチレングリコール(PEG)400、100mMの緩衝酢酸溶液pH4.5、及び10%(v/v)のグリセロールから成った。25%(v/v)のPEG400、100mMの緩衝酢酸溶液pH4.5、及び10%(v/v)のグリセロールから成る凍結防止剤中に、結晶を浸漬し、そして-190℃の窒素流中で直接的に凍結させた。Siemens XG-12回転アノード発生器に接続されたMAR345 X線検出器上に、-190℃で結晶データを収集し、このデータをDENZO及びSCALEPACKソフトウェアで処理した。
【００９７】
タンパク質はRANTES野生型と同じ空間群で、同様の単位格子寸法を有して結晶化した。fo-fc電子密度マップを検討することにより、Gly32における新しい電子密度の存在を明らかにし、Asnへの突然変異を確認した(図8)。
【００９８】
RANTES G32Nの構造の分析、及び、その他の既知のCC-ケモカインの配列及び構造との比較(図1及び9)は、置換された残基がCC-ケモカイン生体活性において一般的な役割を演じ得ることを示唆している。この特異位置32は、Thr30及びSer31、並びに周りの保存Cys残基と共に、CC-ケモカイン・サブセットに共通する共通配列を規定する。このCC-ケモカイン・サブセットについては、同様の非同類置換により、アンタゴニスト特性を有する突然変異体が生じ得ることが推測できる。
【００９９】
【表１】
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【０１００】
【表２】
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【０１０１】
【表３】
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【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図1は、secRANTES G32NのDNA及びタンパク質の配列(配列番号:8及び9)を示す図である。RANTES G32Nの成熟配列(配列番号:1;下線付き)は、E.coliで発現されたsecRANTES G32Nをトリプシンで消化し、リーダー配列MKKKWPRを排除した後に得られる。RANTES G32N中で、及びその他の対応する突然変異体RANTES G32P(配列番号:2)、RANTES G32D(配列番号:3)、RANTES G32K(配列番号:4)、Met-RANTES G32N(配列番号:5)、RANTES(3-68)G32N(配列番号:6)、RANTES G32N ALL40'S(配列番号:7)中で突然変異させられた特異位置(図9及び請求項1では位置Xbと呼ばれる)が四角で囲まれている。番号は、RANTESの成熟配列を基準として示されている。
【図２ａ】図2aは、平衡競合受容体結合アッセイにおいて、CCR1からのRANTES(黒四角)又はRANTES G32A(黒丸)による[125I]-MIP-1αの変位を示す図である。
【図２ｂ】図2bは、平衡競合受容体結合アッセイにおいて、CCR5からのRANTES(黒四角)又はRANTES G32A(黒丸)による[125I]-MIP-1αの変位を示す図である。
【図３ａ】図3aは、RANTESによって誘発された単球走化性を示す図である。
【図３ｂ】図3bは、RANTES G32Nによって誘発された単球走化性を示す図である。
【図４】図4は、10μgのRANTES(黒四角)及び10μgのRANTES G32N(黒丸)による腹膜内への細胞漸増の誘発を、食塩水(黒三角)の投与によって観察された基礎レベルと比較して示す図である。
【図５】図5は、RANTES G32Nによる、RANTESで誘発された腹膜漸増の阻害を示す図である。10μgのRANTES(黒四角)によって誘発された腹膜細胞漸増の阻害を、10μgのRANTES G32N(白四角)、1μgのRANTES G32N(白三角)、及び0.1μgのRANTES G32N(白丸)をRANTES投与の30分前に投与することにより、食塩水(黒三角)単独の投与により観察された基礎漸増と比較して見極めた。阻害のための陽性対照(黒丸)として、1μgのMet-RANTESによる処理を使用した。
【図６】図6は、オボアルブミンで感作されたマウスの気道内への細胞漸増を予防するRANTES G32Nの効果を示す図である。マウスは、オボアルブミンで感作されず、しかし単に食塩水で処理された陰性対照(NaCl)であるか、或いは、オボアルブミンで感作され、しかも食塩水で処理された陽性対照群(OVA)である。Met-RANTES処理を阻害のための対照として使用した。
【図７】図7は、接触過敏症の阻害を示す図である。処理群は、0.5mg/kgのRANTES G32N(黒丸)と、12.5mg/kgのIL-18結合タンパク質(基準対照; 黒三角)とを、PBS(陰性対照; 黒四角)との比較のために含んだ。第0, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 16日目に耳の腫脹を測定した。スチューデントT試験を用いて、ビヒクルとRANTES G32Nとの有意な差異を見極めた：D6 p=0.0117; D7 p=0.0146; D8 p=0.0083; D9 p=0.0107; D12 p=0.0334。
【図８】図8は、RANTES G32Nの構造であって、残基Thr30-Ser31-Gly32-Lys33の周りで2σで輪郭付けされた2fo-fc電子密度、及び具体的には、Gly 32からAsnへの突然変異を示す。
【図９】図9は、本発明において定義された共通配列を含有するCC-ケモカインのアミノ酸配列の配列アラインメントを示す図である：ヒトCC-ケモカインCCL1(I-309としても知られる、SWISSPROT受理番号P22362;セグメント33-57)、CCL2(MCP-1としても知られる、SWISSPROT受理番号P13500;セグメント34-59)、CCL3(MIP-1アルファとしても知られる、SWISSPROT受理番号P10147;セグメント33-57)、CCL4(MIP-1ベータとしても知られる、SWISSPROT受理番号P13326;セグメント34-58)、CCL5(RANTESとしても知られる、SWISSPROT受理番号P13501;セグメント33-57)、CCL7(MCP-3としても知られる、SWISSPROT受理番号P80098;セグメント34-59)、CCL11(Eotaxinとしても知られる、SWISSPROT受理番号P51671;セグメント32-57)、CCL13(MCP-4としても知られる、SWISSPROT受理番号Q99616;セグメント34-58)、CCL15(HCC-2としても知られる、SWISSPROT受理番号P16663;セグメント53-77)。対応する残基Xaを四角で囲み、非同類置換されるべき位置Xbに下線を引いた。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
2005525089.tif 000009
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005525089.tif 000015
【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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