(57)【要約】  低分子分析物を検出するためのバイオセンサ装置が提供される。装置は、第１のクラスの分子たとえばタンパク質を使用し、これは、分析物と第２のクラスの分子たとえば核酸との両方に結合する。タンパク質の分析物および核酸への結合は、相互に排他的で有り得、試料中に分析物が存在することは、結果として、核酸からタンパク質の検出可能な変位になる。あるいは、タンパク質の核酸への結合は、試料中の分析物の存在に依存しうる。特定の実施の形態において、タンパク質または核酸のいずれかが固相サポート上に固定化される。ヒ素検出システムが実証される。大腸菌ａｒｓオペロンからのＡｒｓＲ結合配列がゴールドプレート表面上に固定化される。ＡｒｓＲタンパク質は、ヒ素がない場合にＤＮＡに結合し、ヒ酸ナトリウムまたは酸化フェニルアルシンが存在する場合に解放される。タンパク質が解放される結果として、表面プラズモン共鳴が変化し、変化の大きさまたは運動がヒ素の濃度を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物（アナライト）の存在を検出するためのシステムであって、（ｉ）前記分析物に特異的に結合する単離されたタンパク質と、（ｉｉ）前記タンパク質によって特異的に結合される特異的な結合配列を含む単離された核酸と、（ｉｉｉ）前記分析物の存在中に前記タンパク質の前記核酸への結合の変化を示す検出システムと、を具備するシステム。
【請求項２】
前記核酸および前記分析物へのタンパク質の結合は、相互に排他的であり、前記核酸に結合した前記タンパク質は、前記分析物に結合時に、前記核酸から解放されるようにする請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記核酸に結合した前記タンパク質は、前記分析物に結合時に、アロステリズムの変化を受ける請求項２記載のシステム。
【請求項４】
前記核酸はＤＮＡである請求項１記載のシステム。
【請求項５】
前記分析物は、Ａｇ、Ａｓ、Ｂａ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｈｇ、ＰｂおよびＳｅからなる群から選択される金属化合物である請求項１記載のシステム。
【請求項６】
前記金属化合物はＡｓである請求項５記載のシステム。
【請求項７】
前記タンパク質は、金属応答オペロンによってエンコードされる細菌ＤＮＡ結合規制タンパク質であり、前記核酸は、前記タンパク質によって特異的に結合される金属応答オペロンプロモーターから特異的な結合配列を含むＤＮＡである請求項１記載のシステム。
【請求項８】
前記金属化合物は、Ａｇ、Ａｓ、Ｃｄ、Ｃｒ、ＨｇおよびＰｂからなる群から選択される請求項７記載のシステム。
【請求項９】
前記金属化合物はＡｓであり、前記タンパク質はＡｒｓＲであり、前記プロモーターはａｒｓオペロンプロモーターである請求項７記載のシステム。
【請求項１０】
試料中の分析物の存在を検出するためのバイオセンサ装置であって、（ｉ）前記分析物に特異的に結合するタンパク質と、（ｉｉ）前記タンパク質によって特異的に結合される特異的な結合配列を含む単離された核酸と、（ｉｉｉ）前記分析物の存在中に前記タンパク質の前記核酸への結合の変化を示す検出システムと、を具備し、前記タンパク質または前記核酸のいずれかが固相サポートに結合されるバイオセンサ装置。
【請求項１１】
前記核酸および前記分析物へのタンパク質の結合は、相互に排他的であり、前記核酸に結合した前記タンパク質は、前記分析物に結合時に、前記核酸から解放されるようにする請求項１０記載の装置。
【請求項１２】
前記検出システムは、表面プラズモン共鳴システムである請求項１０記載の装置。
【請求項１３】
前記タンパク質は、金属応答オペロンによってエンコードされる細菌ＤＮＡ結合規制タンパク質であり、前記核酸は、金属化合物によって特異的に結合される金属応答オペロンプロモーターから特異的な結合配列を含むＤＮＡである請求項１０記載の装置。
【請求項１４】
前記分析物は、Ａｇ、Ａｓ、Ｃｄ、Ｃｒ、ＨｇおよびＰｂからなる群から選択される金属化合物である請求項１３記載の装置。
【請求項１５】
前記金属化合物はＡｓであり、前記タンパク質はＡｒｓＲであり、前記プロモーターはａｒｓオペロンプロモーターである請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
前記ａｒｓオペロンは、大腸菌ａｒｓオペロンである請求項１５記載の装置。
【請求項１７】
前記固体サポートは、前記固体サポート上に液体が流れるのを可能にするフローセルに接触する請求項１０記載の装置。
【請求項１８】
前記固体サポートは、液体とのインターフェースを形成する金属フィルムを具備し、前記検出システムは表面プラズモン共鳴システムである請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
前記固体サポートは、１平方センチメートル未満の面積のシリコンチップである請求項１８記載の装置。
【請求項２０】
前記装置は、試料を加えるときに温度安定性を確実にするために、高温を受け入れる材料から製造される請求項１８記載の装置。
【請求項２１】
前記表面でプラズモン共鳴の経時変化を処理することができるマイクロプロセッサをさらに具備する請求項１８記載の装置。
【請求項２２】
試料中の分析物の存在を検出するための方法であって、
ａ．前記分析物に特異的に結合するタンパク質に前記試料を接触するステップであって、このタンパク質は、前記タンパク質用の特異的な結合配列を含む単離された核酸へ結合され、前記タンパク質の前記分析物への結合は、前記核酸への結合とは相互に排他的であるステップと、
ｂ．前記核酸から前記タンパク質の解放を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２３】
前記タンパク質は、前記分析物に結合時に、アロステリズムの変化を受ける請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸はＤＮＡである請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記分析物は、Ａｇ、Ａｓ、Ｂａ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｈｇ、ＰｂおよびＳｅからなる群から選択される金属化合物である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記金属化合物はＡｓである請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質は、金属応答オペロンによってエンコードされる細菌ＤＮＡ結合規制タンパク質であり、前記核酸は、前記タンパク質によって特異的に結合される金属応答オペロンプロモーターから特異的な結合配列を含むＤＮＡである請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
前記分析物は、Ａｇ、Ａｓ、Ｃｄ、Ｃｒ、ＨｇおよびＰｂからなる群から選択される金属化合物である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質は、ＤＮＡおよび前記金属を結合するのに十分な金属応答オペロンによってエンコードされる細菌ＤＮＡ結合規制タンパク質の配列を含む請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸は、前記タンパク質によって特異的に結合される金属応答オペロンプロモーターからの特異的な結合配列とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なるように改変される配列を含むＤＮＡであり、そのＤＮＡは、前記改変されていない配列とは異なる結合定数で前記タンパク質によって特異的に結合される請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸は、前記タンパク質によって特異的に結合される金属応答オペロンプロモーターからの特異的な結合配列とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なるように改変される配列を含むＤＮＡであり、そのＤＮＡは、前記改変されていない配列とは異なる結合定数で前記タンパク質によって特異的に結合される請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも９０％は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１−９７のアミノ酸配列に等しいアミノ酸配列を有するＡｒｓＲタンパク質であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される核酸配列に結合するＡｒｓＲタンパク質。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１−９７のアミノ酸配列を有する請求項３２記載のＡｒｓＲタンパク質。
【請求項３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される配列から、３を超えない塩基または塩基対が異なる配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される配列を有する請求項３４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
二本鎖である請求項３４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８；および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドハイブリッド対から構成される請求項３６記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとで、２００１年８月２０日に出願された予備出願第６０／３１３，７１４号の優先権の利益を主張し、その全体を参照してここに組み込むものとする。
本発明は、バイオセンサの分野に関し、より詳細には、競合分子結合アッセイを使用して、分子および小化合物の存在を、特に、金属イオンおよび金属イオン錯体を検出するためのバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサという用語は一般に、試料内に所望の化合物（分析物：アナライト）を測定し、試料中の化合物の濃度を定量しうる信号を選択的に生成する装置の種類を意味する。多くのバイオセンサの１つの望ましい特徴は、分離または単離を必要とせずに特異的に分析物を識別することができる能力である。たとえば、バイオセンサは、血液または水試料中の特定の化合物の存在を、関係する分析物を見出すための長い又は複雑な精製ステップの必要を無くして直接検出することができる。
【０００３】
バイオセンサ技術は、分析物の濃度定量に使用される電気信号またはインパルスを発生するような電気化学的変換器に生物学的認識システムを連結することによってさらに特徴づけることができる。従来のバイオセンサに使用される電気化学的変換器の典型的な分類は、電位差測定機構、電流滴定機構または光学系変換器機構を含む。
【０００４】
電位差測定系センサ装置において、電極の表面における電荷密度の蓄積が測定され、バイオセンサが露出される分析物の濃度を表す。電位差測定系バイオセンサの１つの例は、鉄等のイオン、または、二酸化炭素または酸素等の気体を検出するために使用されてもよいイオン選択性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）センサである。
電流滴定センサにおいて、生物学的システムと電極との間で交換される電子は電流を生成し、これは、試料内の分析物の濃度を決定するためにモニタされるようにしてもよい。電流滴定センサは一般に、血液グルコースおよびエタノールセンサに使用され、生物学的に意義のある化合物をモニタする他の装置も同様である。
【０００５】
前述のバイオセンサ装置が試料溶液内の比較的大量の分析物に適切である一方、量的に微量な分析手順における無機物質を検出するのに必要な感度を欠いており、多くの干渉種が不正確な帯電関連エラーを起こすため、特異性を欠く。無機物質の微量分析は、非常に低い濃度で試料内に存在し研究者に有意であるヒ素等の理想的な要素または化合物を識別するのに有用である。そのような分析的な方法は、多くの分野で適用することができ、公衆衛生および環境毒性等の領域に特に関連がある。
【０００６】
より近年には、光学式バイオセンサが開発されており、これは、分析物濃度の変化を検出された光波の特徴の変化を関連付けることによって、分析物濃度の変化をモニタするように設計された光波検出方法を使用する。バイオセンサに使用されるように説明されてきた光学式センサ装置の特定のクラスは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサを含む。表面プラズモン共鳴は、光の全反射（ＴＩＲ）が発生する金属フィルム−液体インターフェースで観察される光学的現象である。表面プラズモン共鳴センサ上の全反射の過程中に、エバネッセント波と称される入力光の構成要素が、インターフェースに近接する分子を励起する。光学式センサの場合、エバネッセント波エネルギはセンサの金属フィルム相によって吸収され、結果として反射角度および光強度が変化する。
【０００７】
上述のＳＰＲ原理に基づいて、溶液の屈折率の変化は、反射光強度の変化として光学式センサによって定性され定量化されることができる。ビアコアバイオセンサ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン）が以前に説明されており、ＳＰＲセンサ技術を組み込み、溶液中の球形タンパク質を定量化する。この装置によって課せられる欠点は、高コストは別にして、無機物質の定性および定量を直接実施する能力を欠いていることである。そのような装置は、可搬性も欠いている。さらに、このシステムは、１０億の範囲当たり低部の、微量の分析物を直接定量化するのにも適切ではない。さらに、このシステムは、検出することができ且つ同一測定装置を使用して複数の異なる型の分析物を検出するには適切でない分子の型に対して制限される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このようにして、無機物質の分析において、迅速に信頼のおけるやり方で計量手順を正確に実施することができる検出システムが必要である。このシステムを使用して、バイオセンサ装置は、望ましくは、複雑な混合物内の微量の原子またはイオン物質を識別することができる高度に特異的な検出方法を使用すべきであり、液体試料および気体試料の両方で使用可能でなければならない。原子吸着法および比色分析法に基づいたものを含む多くの既存のバイオセンサでは欠けている別の望ましい特徴は、限られた修正で単一のバイオセンサプラットフォームを使用して、タンパク質、核酸、有機分子、無機分子等の様々な異なる分析物を検出する能力である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の実施の形態は、自然発生的なタンパク質および核酸の構成物質および修正された構成物質を使用して、環境的な試料または生物学的な試料中の微量の微分子分析物、特に金属イオンおよび金属イオン錯体を検出し定量化するための物質（たとえば、タンパク質およびＤＮＡオリゴヌクレオチド）、装置、システムおよび方法を含む。この技術は、感度が高く、１０億の範囲当たり低部の特異的に分析物を検出することができるという特性を有し、様々な異なる状態および条件で多数の型の物質を識別するのに使用されてもよい。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、競合結合表面が形成されるときにエバネッセント波使用装置を使用して、ヒ素等の毒性無機分子を検出し定量化するのに使用されるバイオセンサを具備する。センサ表面は、第１のクラスの分子が塗布され、その配列または構造は、第２のクラスの分子へ可逆的に結合するという特性を呈する。センサ表面で第１のクラスの分子に結合される第２のクラスの分子の量は、屈折率に特徴的変化を起こし、これは、センサ表面の自由振動電子の共鳴角度の変化の差および／または速度を決定することによって、測定される。これらの共鳴角度の変化は、結果として、センサ表面から方向づけられた屈折光線の量、強度または方向の変化になる。分析物の検出および計量は、したがって、屈折光線の特徴の変化に基づき、これは、センサ装置のエバネッセント波の生産および反射光強度のその後の変化によって生成される電子検出信号の関数として測定される。
【００１１】
１つの実施の形態において、センサ表面が分析物に露出されるときに分析物の検出が発生し、それは、センサ表面に存在する特異的なタンパク質またはペプチドへの競合結合の特性を呈する。分析物がタンパク質に結合するために、チップ表面上のタンパク質濃度または結合の状態が変わり、反射光強度の変化が観察され測定される。
【００１２】
このようにして、本発明は、１つの実施の形態において、試料中の金属化合物の存在を検出するためのシステムを提供する。このシステムは、（ｉ）金属構成要素に特異的に結合する単離されたタンパク質と、（ｉｉ）タンパク質によって特異的に結合される特異的な結合配列を含む単離された核酸であって、タンパク質の金属化合物への結合が、核酸への結合からこれを解放するタンパク質の構造変化を引き起こす単離された核酸と、（ｉｉｉ）核酸からタンパク質の解放を示す検出システムと、を具備する。タンパク質は、金属化合物への結合時にアロステリズムの変化を受ける。システムの特定の実施の形態において、タンパク質は金属応答オペロンによってエンコードされる細菌ＤＮＡ結合規制タンパク質であり、核酸は、金属化合物によって特異的に結合される金属応答オペロンプロモーターから特異的な結合配列を含むＤＮＡである。
【００１３】
様々な実施の形態において、金属化合物は、Ａｇ、Ａｓ、Ｂａ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｈｇ、ＰｂまたはＳｅであってもよく、特に、Ａｇ、Ａｓ、Ｃｄ、Ｃｒ、ＨｇまたはＰｂである。関係のある他の金属化合物は、Ｂｅ、Ｃｕ、Ｎｉ、ＴｉおよびＺｎを含み；Ａｌ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｋ、ＮａおよびＶも、スーパーファンド浄化部位で関係するものである。加えて、本発明は、Ａｇ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ａｌ、Ａｕ、Ｔｉ、Ｐｔ等の、見込みのある有用な金属の検出を可能にする。Ｕ、Ｐｕ、Ｔｃ、Ｎｐ、ＣｓおよびＩ等の放射性核種もまた、本発明のバイオセンサで検出されることができる。Ａｓを検出するためのシステムおよび方法が実証される。
【００１４】
本発明は、金属化合物検出システムに基づいたバイオセンサ装置も提供する。そのような装置において、タンパク質または核酸のいずれかが、固相サポートに結合される。特定の実施の形態において、固体サポートはフローセルに含まれ、固体サポート上に液体が流れるのを可能にする。下記に実証される特定の実施の形態において、固体サポートは、液体とのインターフェースを形成する金属フィルムを具備し、検出システムは、表面プラズモン共鳴システムである。好ましくは、そのような装置は、固体サポートおよび試料の安定した温度を維持し、たとえば、高温を受け入れる材料を使用して、表面プラズモン共鳴の検出における温度の影響を最小限にする。表面でプラズモン共鳴の経時変化を処理することができるマイクロプロセッサもまた装置に含まれてよく、結合相互作用の分析を容易にする。
【００１５】
本発明はさらに、試料中の金属化合物の存在を検出する方法を提供する。この方法は、金属化合物に特異的に結合するタンパク質に試料を接触することを含み、このタンパク質は、タンパク質の特異的な結合配列を含む単離された核酸へ結合され、タンパク質の金属化合物への結合は、核酸への結合からこれを解放するタンパク質の構造変化を引き起こす。この接触が発生した後、方法は、核酸からタンパク質の解放を検出することを提供する。
特定の実施の形態において、タンパク質は、ＤＮＡおよび金属を結合するのに十分な金属応答オペロンによって書き換えされる細菌ＤＮＡ結合規制タンパク質の配列を含む。別の実施の形態において、核酸は、タンパク質によって特異的に結合される金属応答オペロンプロモーターからの特異的な結合配列とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なるように変更（又は修飾）される配列を含むＤＮＡであり、そのＤＮＡは、変更されていない配列とは異なる結合定数でタンパク質によって特異的に結合される。さらなる実施の形態において、変更されたタンパク質と変更された核酸との両方が使用される。そのような変更は、システムのダイナミックレンジの拡張を可能にするか、または、システムの必要に応じて、感度か特異性かまたは両方を上げるように導くことができる。
【００１６】
本発明にはまた、少なくとも９０％は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸１−１１７の、特に１−９７の、アミノ酸配列に等しいアミノ酸配列を有するＡｒｓＲタンパク質が提供され、このＡｒｓＲタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される核酸配列に結合する。そのようなタンパク質は、ヘキサヒスチジン配列等の精製ハンドルまたはタグをさらに含んでもよい。本発明は同様に、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、特に、ＡｒｓＲ結合配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される配列から、３を超えない塩基または塩基対が異なる配列を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のこれらおよび他の態様、利点および新規特徴は、下記の詳細な説明を読み、添付の図面を参照すれば明らかになる。
図面において、同一の要素は同一の参照符号を有する。
【００１８】
本発明は、下記に実証されるようにヒ素との小化合物、たとえば金属および金属イオン錯体を迅速且つ効果的に検出するバイオセンサを有利に提供する。バイオセンサは、特異的な微量の物質（単／複）の存在を測定するために、その名の通り、生物成分（様々な有機天然炭水化物、タンパク質様物質、核酸または脂質）を、分析的検出プロセスまたは器具で、集める。イオンおよび非常に低分子は、その化学的性質によって、従来の分光法または他の古典的化学方法を使用して識別し定量化することは困難である。金属／金属イオン錯体イオン（ヒ素、鉛、クロム、カドミウム）および低分子、たとえば、石油炭化水素（たとえばベンゼン）、ガソリン酸化物（エーテルたとえばＭＴＢＥ）、有機ハロゲン化合物（たとえばＴＣＥ）、芳香族ニトロ化合物（たとえばＴＮＴ）は、大きな且つ高まっている環境的健康的関心事である。本発明は、分子の特異的な結合特徴を上手く利用するが、１つの結合パートナーの構造に対するアロステリズムの変化によって影響される可能性があり、そのような低分子の正確な検出および計量を可能にする。
【００１９】
ヒ素イオンを検出するための下記実施例において、微量のヒ素の毒性状態の正確で特定的な定量化を提供するシステムおよび方法が考案されている。システムは、特定的であり（今まで交叉反応は検出されていない）、感度が良く（１ｐｐｂ未満の推定検出限界で内輪にみて１０ｐｐｂ未満）、速く（約２分）、使用が容易である（特別な知識が必要ではない）。さらに、スプリータ（商標）（Ｓｐｒｅｅｔａ）チップ等の非常に小さなセンサを適合させることによって、本発明は、本発明の小型の手持ち式のバイオセンサを可能にする。
【００２０】
本願で使用されるように、「システム」という用語は、（ｉ）第１のクラスの分子、たとえば、分析物および核酸を特異的に結合する単離されたタンパク質、（ｉｉ）第２のクラスの分子、たとえば、タンパク質によって特異的に結合される特異的な結合配列を含む単離された核酸、および、（ｉｉｉ）第２のクラスの分子（核酸）から第１のクラスの分子（タンパク質）の解放を示す検出システム、の組み合わせを意味する。第１の実施の形態において、第１のクラスの分子（たとえばタンパク質）を分析物および第２のクラスの分子（たとえば核酸）に結合することは、相互に排他的であり、たとえば、分析物の存在する場合には、結合されたタンパク質の解放が発生する。たとえば、下記に実証されるように、タンパク質を金属化合物に結合することは、タンパク質の構造変化を引き起こし、これが核酸への結合からタンパク質を解放し、したがって金属化合物および核酸への結合は相互に排他的である。代替的な実施の形態において、第１のクラスの分子を分析物へ結合することは、第２のクラスの分子へ結合するために必要であり、たとえば、溶液中の分析物に結合されたタンパク質が核酸に結合するようにする。このようにして、本発明のシステムは、分析物がない場合に比較して分析物が存在する場合には第１のクラスの分子を第２のクラスの分子へ結合することにおける変化の検出を提供する。
【００２１】
特定の実施の形態において、システムは固相サポートを使用し、これに対して核酸またはタンパク質が結合される。しかし、多くの液相および同質の検出システムが、たとえばイミュノアッセイ分野から公知であり、これらは本発明に容易に適用されることができる。
ここで「タンパク質」および「核酸」（またはＤＮＡ）に対する意味は、本発明をこれらの好適な実施の形態に限定するように解釈されるべきではなく、これは、理解を容易にするために使用される（タンパク質−ＤＮＡ結合は、たとえば、第１のクラスの分子−第２のクラスの分子の結合よりもより容易に想定される）。
【００２２】
「タンパク質」という用語は、ここでは、アミノ酸のポリマーを意味するように使用され、完全長さの野生型タンパク質、ＤＮＡおよびその分析物結合ドメインフラグメント、さらに後述の変形例を含む。この用語はここでは、「ポリペプチド」と等価であるとして使用される。本発明は、タンパク質を、低分子分析物と、たとえば核酸等の結合パートナーと、の両方に特異的に結合することができる分子として具体的に実証しているが、そのように限定されるべきではない。相互に排他的に結合する（下記にさらに詳述される）かまたは協同的に結合する（やはり下記に詳述される）かのいずれかが可能であるいずれの分子を、本発明を実行する際に使用することができる。
【００２３】
「核酸」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマーの形態、または、たとえば一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかの、ホスホロチオエートおよびチオエステル等のいずれのそのホスホエステル類似物、を意味する。二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡのヘリックスが可能である。核酸分子という用語、特にＤＮＡまたはＲＮＡの分子は、分子の一次および二次構造物のみを意味し、これをいずれの特定の三次形態に限定しない。ここで使用されるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、特異的なタンパク質結合部位を有し、一般に少なくとも１０の、好ましくは少なくとも１５の、より好ましくは少なくとも２０のヌクレオチド、好ましくは１００個までのヌクレオチドの核酸を意味する。
【００２４】
一般に、オリゴヌクレオチドは合成で調製され、好ましくは核酸合成器で調製されるが、細胞のまたはクローンのＤＮＡおよびＲＮＡから得ることもできる。合成であるならば、オリゴヌクレオチドは、非自然発生ホスホエステル類似物結合たとえばチオエステル結合等で調製することができる。合成オリゴヌクレオチドの特異的な非限定的な例として、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキル、または、シクロアルキル糖間連鎖（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ  ｌｉｎｋａｇｅ）または短鎖異種原子または複素環糖間連鎖を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。もっとも好適なものは、ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2、ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2およびＯ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2バックボーンを備えたものである（ただし、ホスホジエステルは、Ｏ−ＰＯ2−Ｏ−ＣＨ2である）。米国特許第５，６７７，４３７号には、複素環式芳香族化合物オリゴヌクレオシド連鎖が記載されている。窒素リンカーまたは窒素を含む基を使用して、オリゴヌクレオチド模倣体を調製することもできる（米国特許第５，７９２，８４４号および第５，７８３，６８２号）。米国特許第５，６３７，６８４号には、ホスホラミデートおよびホスホロチオアミデートオリゴマー化合物が記載されている。また、モルホリノバックボーン構造物を有するオリゴヌクレオチドも想定される（米国特許第５，０３４，５０６号）。ペプチド核酸（ＰＮＡ）バックボーン等の他の実施の形態において、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンは、ポリアミドバックボーンに取って代わられてもよく、塩基は、ポリアミドバックボーンのアザ窒素原子（ａｚａ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ａｔｏｍ）に直接または間接的に結合される（Ｎｉｅｌｓｅｎら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９９１、２５４：１４９７）。
【００２５】
他の合成オリゴヌクレオチドは、２位の位置に下記の１つを含む置換糖成分を含んでもよい。すなわち、ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ3、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2またはＯ（ＣＨ2）nＣＨ3であり、ただし、ｎは１から約１０であり；Ｃ１からＣ１０の低アルキル基、置換低アルキル基、アルカリル基またはアリールアルキル基；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣＦ3；Ｏ−；Ｓ−またはＮ−アルキル基；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル基；ＳＯＣＨ3；ＳＯ2ＣＨ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2；Ｎ3；ＮＨ2；複素環式アルキル；複素環式アルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアリキルアミノ；置換シリル；フルオレセイン成分；ＲＮＡクリーブグループ；リポーターグループ；インターカレーション；オリゴヌクレオチドの薬物動態的特性を改良するためのグループ；またはオリゴヌクレオチドの薬理的特性を改良するためのグループ；および、類似特性を有する他の置換基である。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルまたは他の炭素環式化合物等の疑似糖を有してもよい。アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジン以外のヌクレオシドを有するヌクレオチドユニット、たとえばイノシンが、オリゴヌクレオチド分子に使用されてもよい。
【００２６】
本発明は、第２のクラスの分子として核酸を実証するが、他の分子も第１のクラスの分子たとえばタンパク質に、特異的に結合することができ、排他的であるかまたは分析物と協同的であるかを、当業者は容易に認識することができる。そのような分子として、（１）ペプチドおよびタンパク質、（２）炭水化物、（３）他の低分子化合物、（４）グリカンが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、この点でいずれの特定のクラスの分子に限定される必要はない。
【００２７】
さらに、第２のクラスの分子用の新しい配列を識別することが望ましい場合には、核酸、ペプチド、炭水化物、低分子等、組み合わせライブラリを含むそのような分子の様々なライブラリを使用することが有利である。あるいは、またはアッセイ効率を高めるための方法として、そのような分子のマイクロアレイを、特異的な結合相互作用のために検査されることができる。
【００２８】
「分析物」という用語は、当該の低分子を意味し、すなわち、本発明のバイオセンサによって検出されることが望ましい。分析物は、有機であっても無機であってもよく、または有機金属であってもよい。本願で使用される「無機物質」という用語は、有機金属を含む。分析物は、電荷を運ぶことができ、したがってこの用語は、カチオン（たとえば、金属イオンまたは金属イオン錯体）、アニオン（たとえば、集約農業活動の領域に見ることができるリン酸塩および硝酸エステル）、塩、中性種等を含む。本発明のバイオセンサは、金属化合物を検出するのに特に有用である。
【００２９】
「金属化合物」という用語は、金属イオン、金属イオン錯体（有機金属）、または、金属イオンの他の分子形態を意味する。好ましくは、金属は、周期表の２１位またはそれより高い要素であり、半金属（ヒ素等）および一定の「非金属」要素（たとえばセレン）を含む。より好ましくは、金属は毒性重金属である。したがって、本発明のシステムおよび装置は、Ａｓ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｐｂ、Ｈｇを検出するために使用することができる。資源保全再生法８は、Ａｇ、Ａｓ、Ｂａ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｓｅを含む。優先汚染金属（Ｐｒｉｏｒｉｔｙ  ｐｏｌｌｕｔａｎｔ  ｍｅｔａｌ）（１３）は、Ｓｂ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｐｂ、Ｈｇ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ａｇ、ＴｉおよびＺｎである。包括的環境対処補償責任法（ＣＥＲＣＬＡ）別名スーパーファンド契約研究所プログラム（ＣＬＰ）リストは２３金属を含み、すなわち、Ａｌ、Ｓｂ、Ａｓ、Ｂａ、Ｂｅ、Ｃｄ、Ｃａ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｐｂ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｈｇ、Ｎｉ、Ｋ、Ｓｅ、Ａｇ、Ｎａ、Ｔｌ、Ｖ、Ｚｎである。本発明はさらに、Ａｕ、Ａｇ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｆｅ、ＰｔおよびＴｉ等の金属を検出するためのシステム、装置および方法を企図する。本発明のバイオセンサで検出することができる関係のある放射性核種は、Ｕ、Ｐｕ、Ｔｃ、Ｎｐ、ＣｓおよびＩを含む。金属化合物は、本発明のシステム、装置および方法によって検出することができる低分子のクラスである。
【００３０】
関係する有機分析物として、殺虫剤、除草剤、ハロゲン化炭化水素、芳香族化合物等が挙げられるが、これらに限定されない。
「試料」という用語は、低分子、たとえば金属イオンまたは金属イオン錯体等の存在を検査されるべき物質を意味する。試料は、一例を挙げると、地下水、貯水池、湖および川、鉱山尾鉱、毒性廃棄現場からの泥、探鉱鉱石試料を含むが、これらに限定されない。特定の実施の形態において、試料は、液体または固体の液体抽出物であり、第１および第２のクラスの結合分子たとえばタンパク質および核酸の結合および解放の相互作用を容易にする。
【００３１】
「オペロン」という用語は、本願では、業界における通常の意味にしたがって使用され、すなわち、一のプロモーター（誘発因子）の発現制御におけるコード配列のグループを意味する。オペロンは、普通は、細菌のゲノムに見られる。本発明の実施において、オペロンは典型的に、低分子ターゲットたとえば金属イオンまたは金属イオン錯体の存在に対して感受性のあるプロモーター−リプレッサー（抑制因子）の結合タンパク質（該当分析物に結合されるときに核酸に結合されるアクチベータタンパク質も企図されるが）をエンコードする。リプレッサーシステムにおいて、このプロモーター結合タンパク質は、後述されるように、オペロンからの発現のフィードバック制御を提供する。１つの実施の形態において、金属結合タンパク質およびプロモーターからのＤＮＡは、同一オペロンから孤立している。オペロンは、様々な金属イオン用によく知られており、ａｒｓ、ｃｚｃ、ｃａｄ、ｃｈｒ、ｍｅｒおよびｐｂｒを含むがそれらに限定されない。非金属結合特異性を備えたオペロンも公知であり、たとえば、ｔｅｔリプレッサーシステムおよびｌａｃオペロン、さらに、多剤耐性オペロン、たとえば、枯草菌のｂｍｒ、黄色ブドウ球菌のｎｏｒおよびｑａｃ、大腸菌のｅｍｒ、緑膿菌のｍｅｘ、および、定足数測定システムたとえば緑膿菌のｌａｓおよびｒｈｌである。これらのシステムの多くは、可逆性であり、すなわち、誘導因子分子がない場合ではなくその存在する場合に、オペロンに結合するように作ることができる。特定的な例は、ｔｅｔアクティベータ変異体である。
下記表は、本発明に適切なオペロンシステムを開示する。
【００３２】
【表１】
2005515468.tif 000002
【００３３】
オペロンがまだ知られていない場合には、または当該の特異的な低分子に応答するために存在しそうにないときには、直接展開および遺伝子シャフリングのよく知られた技術（たとえば、米国特許第６，４２０，１７５号、第６，３５２，８４２号、第６，３３５，１６０号、第６，３１９，７１３号および第６，２３８，８８４号；国際特許公開第ＷＯ０２／１０７５０号；Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ１９９９、９６：１８９８〜１９０３、Ｂａｉｌｅｙ、ネイチャーバイオテック（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１９９９；１７：６１６〜６１８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１９９８、９５：１２７４４〜１２７４６；Ｃａｎｅら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９９９、３８：１６４３〜１６５１；Ｌａｕら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）１９９４、３７０：３８９〜３９１）が、特定の配列を有するＤＮＡへおよび当該の分子へ結合するタンパク質の開発を提供し、該当の分子への結合は、核酸への結合とは相互に排他的であるようにし、たとえば、構造変化を誘導し、これは結果としてタンパク質をＤＮＡから解放するか、または、核酸への結合を引き起こす。さらに、システムは、特異的なＤＮＡ認識ペプチドモチーフを備えて設計された特異的な金属結合タンパク質を使用して形成されることができる。
【００３４】
「バイオセンサ装置」は、本発明のシステムを使用するいずれの製造された機械である。一般に、そのような装置は、液体試料を入れることができるように入口ポートを有する。１つの実施の形態において、装置は、まず、溶解性の結合分子を含む溶液を提供し、これは、第２の分子に結合することができ、これは装置内で自由であってもよく、または、下記に実証されるように、固体サポートに結合されてもよいことによって、調製される。あるいは、装置には、既に可逆的に互いに結合されて試料を受け取るように準備された第１および第２の結合分子を設けることができる。装置が、分析物の存在する場合にタンパク質が核酸に結合するのを検出する場合には、装置は、核酸に導入する前または導入中に、タンパク質と試料との混合を提供する。好ましくは、装置は、受動的に（高特異的な熱構成要素の使用による）または能動的に（加熱要素または冷却要素の使用による）、温度制御を提供する。バイオセンサ装置は、第１および第２の分子の結合および解放を検出するための検出器も含む。そのような検出器は、たとえば、表面プラズモン共鳴または蛍光の光学式検出器を含む。あるいは、電気的な、たとえば「ＤＮＡワイヤ」型の検出システムを有利に使用することができる。
【００３５】
相互に排他的な結合の実施の形態の特定的な代替の実施の形態において、第１のクラスの分子（タンパク質）は、第２のクラスの分子（核酸）に接触する前に分析物に接触する。次に、第１のクラスの分子がタンパク質であり第２のクラスの分子が核酸である（がそれには結合されていない）実施の形態を特定的に参照すると、タンパク質の結合における差を測定するために、装置は、固定化された核酸に既に結合したタンパク質を備える。結合のレベルは決定される。このレベルは、最大結合の制御として作用する。次いで、タンパク質は核酸から洗浄され（高い塩下で、または、他の非常に厳しい状態下で）、核酸を自由にし、タンパク質との複合体を形成する。いずれの残りの洗浄バッファはシステムから除去され、そのため結合は正常に進行することができる。核酸に接触する前に、タンパク質および分析物試料が一緒に混合される。試料内に分析物がある場合には、タンパク質の核酸への結合を遅らせる。結合のこの阻止または遅延は、分析物がタンパク質を核酸から変位する場合に可能であるよりも、大きな程度である。試料内に分析物がない場合には、タンパク質は高いレベルで核酸に結合する。この実施の形態は、検出ステップを簡略化し、より強固な測定を提供する。当然ながら、協同的な結合が分析物の存在を検出するための基礎である場合には、第１のクラスの分子は、分析物および第２のクラスの分子に同時に接触していなければならない。
【００３６】
本発明のシステムおよびバイオセンサを使用する分析検査の実施は、温度の制御だけではなく、ｐＨ、酸化還元電位、塩濃度および他のいずれの変数の制御にも関係することができる。関係したシステム、試料の性質および分析物の型に依存して、１つ以上のこれらの要因が、アッセイを混乱させる可能性がある。さらに、本発明は、１つ以上のこれらの要因を、好ましくは２つ以上を組み合わせて、最適化し、所望のアッセイ感度および特異性を達成することを企図する。
【００３７】
ここで使用されるように、「単離された」という用語は、参照された物質が通常見出される自然の環境において見出される構成要素からその物質は遊離していることを意味する。特に、単離された生物学的物質は、細胞構成要素がない。核酸分子の場合には、単離された核酸は、ＰＣＲ生成物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、制限断片またはオリゴヌクレオチドを含むがそれらに限定されない。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工染色体等に挿入されることが可能である。したがって、特定の実施の形態において、組み換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質には、他のタンパク質または核酸またはその両方が連結されてもよく、それらに細胞内で連結し、または、膜連結タンパク質である場合には細胞膜に連結する。単離された物質は、精製されてもよいが、必要はない。しかし、本発明のもっとも感度がよく特定的な操作では、単離された材料は精製されるべきである。
【００３８】
ここで使用される「精製される」という用語は、関係ない物質すなわち汚染物質を減少するかまたは排除する条件下で単離された材料を意味する。たとえば、精製されたタンパク質は、細胞または組み換え発現内で連結する他のタンパク質または核酸が実質的にないことが好ましく、精製された核酸分子は、細胞内で見出すことができるタンパク質または他の関係のない核酸分子が実質的にないことが好ましい。ここで使用されるように、「実質的にない」という用語は、物質の分析的検査に関連して、作用的に使用される。好ましくは、実質的に汚染物質がない精製された物質は、少なくとも５０％の純度である。より好ましくは９０％の純度であり、さらにより好ましくは９９％の純度である。純度は、クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、イミュノアッセイ、組成物分析、バイオロジカルアッセイ、および、業界で他の公知の方法によって評価することができる。
【００３９】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値用の許容可能な誤差の範囲内を意味し、これは、部分的には、値がどのように測定されるかまたは決定されるかに依存し、すなわち、測定システムの限定による。たとえば、「約」は、業界での慣習にあたり、１または１を超える標準偏差内を意味することが可能である。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味することが可能である。あるいは、特に生物学的なシステムまたはプロセスに関しては、この用語は、値の１桁内、好ましくは５倍内、より好ましくは２倍を意味することが可能である。
【００４０】
特定の実施の形態の説明
下記の説明は図面を参照しているが、ここに述べられた手順、試薬およびアッセイ条件は、他のアッセイシステムにも同様に適用することができることが理解されるべきである。
【００４１】
図１は、実験混合物１０７からターゲット分析物１０５を検出し定量するのに使用されるバイオセンサ装置１００のブロック図である。バイオセンサ１００は、競合結合表面（ＣＢＳ）層１１５を有するセンサモジュール１１０を具備し、それは、層１１５の組成に基づいて特異的な分析物１０５に応答する。センサモジュール１１０は、ＣＢＳ層１１５の構成要素との選択的な結合によって分析物１０５の存在を識別して、センサ信号１１７を生成し、これは検出モジュール１２０によって受け取られる。検出モジュール１２０は、次いでセンサ信号１１７を検出信号１２５に変換し、これはデコーディングモジュール１３０によって受け取られ、ＣＢＳ層１１５のまわりに存在する分析物を識別し定量化する目的のために使用される。
【００４２】
この後、より詳細に説明されるように、バイオセンサ１００は、特異的で感度の高いやり方でＣＢＳ層１１５が露出される分子を含む分析物１０５の存在を検出することが望ましい。検出されるべき分子の量および型は、ＣＢＳ層１１５の組成を決定するための基礎をさらに提供する。１つの態様において、バイオセンサ装置１００は、競合結合アッセイの使用によって分析物１０５を検出するのに高められた感度を提供することが望ましく、ＣＢＳ層１１５の組成は結果として、ＣＢＳ層１１５の１つ以上の構成要素を分析物１０５に結合することになる。結果として得られたターゲット分析物１０５のＣＢＳ層１１５の構成要素との結合は、結果として分解可能なセンサ信号１１７を生成し、これは、実験混合物１０７における分析物１０５の濃度を表す値または識別子に変換される。
【００４３】
バイオセンサ１００装置の１つの特徴は、迅速且つ再現可能なやり方で、実験混合物１０７に含まれる分析物１０５の組成に関する定性的且つ定量的な情報を迅速に得ることができることである。さらに、バイオセンサ１００の感度は、センサモジュール検出信号１１７を検出器モジュールに連結することによって高められ、検出器モジュールは信号１１７を増幅しその後検出信号１２５を生成し、これは、非常に低い濃度のターゲット分析物１０５を識別することができる。バイオセンサ１００装置のさらなる利点は、実験混合物１０７の他の構成要素に対して微量に存在する分析物１０５の濃度でターゲット分析物１０５を定量化するのに、固体、液体および気体の形態の実験混合物１０７を使用してもよいことである。
【００４４】
図２は、ＣＢＳ層１１５の拡大図を例示し、分析に対する競合結合アプローチを使用して分析物１０５を検出するための機械的状態を示す。ＣＢＳ層１１５は、ＣＢＳ層表面２１０に固定される複数の基質結合分子２０５を含む（状態２０１）。基質結合分子は、ＣＢＳ層１１５の表面の化学的性質および基質結合分子２０５の反応性に依存して、共有結合または非共有結合によって、ＣＢＳ層表面２１０に固定されてもよい。
【００４５】
例示された実施の形態において、基質結合分子２０５は、特異的なヌクレオチド配列を有する核酸ストランドまたはＤＮＡ分子を有し、それに対して複数の解放分子２１５が可逆性結合活性を呈する。解放分子２１５は、望ましくは、基質結合分子２０５が位置し（状態２０３）、第１の結合アフィニティが観察される（状態２０７）基質結合分子２０５の領域２２０に沿って結合することができる環境に導入される。１つの態様において、解放分子２１５は、タンパク質またはペプチド配列を含み、これは、基質結合分子２０５内にある特異的なヌクレオチド配列に対して結合活性を呈する。
【００４６】
二本鎖ＤＮＡ分子として例示されているが、他の型の核酸種がバイオセンサ装置１００とともに適切に使用されてもよいことが、当業者には認識される。たとえば、一本鎖ＤＮＡが、バイオセンサ装置１００に組み込まれてもよく、さらに、ＲＮＡ、または、核酸組成物の他の組み合わせも同様である。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、ヘアピン型ヘリックス、または、規定された二次および三次構造物の複合体構造を形成することができる。同様に、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドは、複合体構造を取り入れることができる。さらに、解放分子２１５は、タンパク質またはペプチドフラグメント、さらに、基質結合分子２０５に結合アフィニティを呈する他の分子を含んでもよい。
【００４７】
上記に記したように、本発明の装置は、たとえば安定した結合複合体で、核酸に予め結合されたタンパク質をサポートすることができる。加えて、装置には、固定化された核酸（またはタンパク質）が供給されることができ、分析物分析用の試料に接触する直前に溶解性の結合パートナーに反応する。
目的の分析物分子１０５は、その後、基質結合分子２０５が解放分子２１５に結合する環境（状態２０９）に導入される。競合解放分子２１５は、分析物分子１０５に第２の結合アフィニティを呈し、基質結合分子２０５との連結解除および分析物分子１０５への結合を可能にする。解放分子２１５が分析物分子１０５に結合することが、解放可能な複合体２２５を形成し、これは、位置を変えられて、ＣＢＳ層１１５を囲繞する環境内に自由に動いてもよい（状態２１１）。この位置を変えられることが、さらに、基質結合分子２０５を連結解除状態にし、下記により詳細に説明されるやり方で検出される。
【００４８】
解放分子２１５を基質結合分子２０５および分析物１０５に連結することは、解離因子および平衡結合速度の同一性によって決定され、それらは、これらの分子２１５、２０５、１０５の互いに対する濃度に依存する。解離因子および平衡結合速度は、ＣＢＳ層１１５に結合され分析の条件および感度を最適化するのに使用されてもよい解放分子２１５の割合をさらに説明する。
【００４９】
分析物１０５の識別および濃度の測定は、望ましくは、基質結合分子２０５の解放分子２１５への連結状態を評定することによって決定される。間接分析のこのやり方は、より大きな信号分子（たとえばタンパク質）を使用することによって、ターゲット分析物１０５を検出することができる感度を改良し、分析を迅速に達成するためにエバネッセント波使用方法の使用を可能にする。１つの態様において、ＣＢＳ層１１５の表面２１０に発生する相互作用は、ターゲット分析物１０５に対する結合アフィニティを組み込む生物学的システムをモデルにする。適切な生物学的システムは、原核生物のヒ素代謝経路を含み、それから、上述の分析への競合結合アプローチに組み込むことができる核酸およびタンパク質配列の両方が得られてもよい。さらに、分析の感度および条件は、必要に応じて、核酸およびタンパク質構成要素の配列を改変して、分析物１０５と解放分子２１５と基質結合分子２０５との間の解離因子および平衡結合速度を改変することによって、変えることができる。たとえば、実証されるように、ダイアドリピートを含むＤＮＡ結合配列は、タンパク質の結合アフィニティを変えるために半分にされることが可能である。バイオセンサ装置１００の機能域は、望ましくは、必要に応じて、上述の改変の様々な組み合わせによって調整されてもよい。加えて、結合配列の混合物に異なるタンパク質の結合アフィニティを提供することによって、アッセイの機能域を増加することができる。そのような機能域の調整は、微量分析を改良するために装置の感度を上げるのに有用であるだけではなく、装置の感度を下げることによる試料の希釈が望ましくない場合に装置を使用できるようにするのにも有用である。
【００５０】
１つの態様において、バイオセンサ装置１００の機能域は、望ましくは、１０億当たりおよそ０．１部から１０億当たり５０００部であり、より好ましくは１０億当たりおよそ１部から１０億当たり３０００部であり、さらにより好ましくは１０億当たりおよそ１部から１０億当たり１５００部である。さらに、バイオセンサ装置は、およそ０．１μｇ／ｍｌから５０００μｇ／ｍｌの範囲の、より好ましくはおよそ１μｇ／ｍｌから３０００μｇ／ｍｌの範囲の、さらにより好ましくはおよそ１μｇ／ｍｌから１５００μｇ／ｍｌの範囲の、ターゲット分析物１０５の濃度を検出することができる。
【００５１】
バイオセンサ装置を使用する分析の条件は、望ましくは、およそ４℃から４５℃の間の温度で、より好ましくはおよそ１０℃から４０℃の間の温度で、さらにより好ましくはおよそ１８℃から３８℃の間の温度で、バイオセンサ表面をターゲット分析物に露出することを含む。バイオセンサ装置１００が望ましくはターゲット分析物１０５に露出されるべき分析の時間は、およそ１０秒から１８０秒の間であり、より好ましくは３０秒から１２０秒の間であり、さらにより好ましくは４５秒から７５秒の間の時間である。
【００５２】
１つの実施の形態において、バイオセンサ装置は、必ずしも自然発生生体分子であることを必要としない基質結合分子２０５および解放分子２１５を使用して製造することができる。これらの分子２０５、２１５の一方または両方は、その相互作用がターゲット分析物１０５によって仲介される合成生化学分子であってもよい。別の実施の形態において、所望のターゲット分析物１０５と相互作用する基質結合分子２０５および／または解放分子２１５は、ファージまたはリボソームディスプレイ実験によって識別されることができる。さらに別の実施の形態において、先に識別された基質結合分子２０５および／または解放分子２１５は、さらに他の選択実験に使用されることができ、互いに相互作用するかまたはターゲット分析物１０５と相互作用する他の適切な分子を識別する。これらの新しく識別された分子は、次いで、ターゲット分析物１０５の存在を競合検出するためのバイオアッセイに組み込まれることができる。
【００５３】
図３は、例示的な原核生物のヒ素代謝経路の構成要素をさらに例示し、これは、無機重金属を含む分析物分子１０５を定量するためにバイオセンサ装置１００とともに使用されてもよい。このシステムで使用される生物学的分子は、重金属（具体的にはヒ素）の酸化イオンへの耐性を与えるため使用される大腸菌でのａｒｓオペロン向きにした構成要素を含む。このやり方で検出可能な他の重金属イオンとして、特に、アンチモン、カドミウム、クロム、鉛、水銀、および、テルルが挙げられ、その分子と、核酸またはタンパク質等の生物学的分子の構成要素との相互作用は、バイオセンサ装置１００での検出および定量の目的のために使用することができる。
【００５４】
１つの態様において、大腸菌等の有機体に見られる生物学的経路に存在する生物学的分子および構成要素の使用は、望ましくは、ターゲット分析物分子をアッセイすることができる検出の感度が高く特異的な手段を提供する（添付のフレキシブルディスクのシーケンスリストを参照）。たとえば、下記により詳細に示されるように、ａｒｓオペロンの構成要素は、ヒ素等の特定の無機イオンに高度に特異的であり、リン酸塩、硫酸塩、硝酸エステル等の他の無機イオンには比較的感度が低い。このようにして、これらの生物学的分子および経路をＣＢＳ層１１５に組み込むことによって、バイオセンサ装置１００は選択的に分析物分子１０５を検出して定量することができ、一方、分析物試料に存在した場合には当該ターゲット分析物１０５の誤った定量または検出に導く可能性のある他の構造的にまたは化学的に類似した分子には比較的感度が低いままである。
【００５５】
ａｒｓオペロンに使用において、タンパク質（ＡｒｓＲ）は、大腸菌および他の原核生物さらにいくつかの真核生物におけるヒ素耐性の１つの構成要素で遺伝子エンコーディングによって生成される。ＡｒｓＲタンパク質は、高度に選択的なヒ素結合特性を有し、一方、他の非金属イオンには比較的感度が低い。さらに、ＡｒｓＲタンパク質は、ａｒｓオペロンの転写誘発域を含むヌクレオチド配列にＤＮＡ結合アフィニティの特性を呈する。このようにして、ＡｒｓＲタンパク質および対の転写誘発域ヌクレオチド配列は、バイオセンサ装置１００を使用してヒ素分子を検出するのに必要な競合結合構成要素を形成するために、使用されることができる。
【００５６】
図３に示されるように、ＡｒｓＲタンパク質３５０は、平衡解離定数（ＫdDNA）３６０の関数として測定されることができるヌクレオチド誘発配列３５５により特徴的な結合アフィニティを発現する。ＡｒｓＲタンパク質３５０とヌクレオチドプロモーター配列３５５との間の結合が発生するときには、ヌクレオチドプロモーター配列３５５へ非共有結合されたＡｒｓＲタンパク質３５０を含むタンパク質／ＤＮＡ複合体３６５が形成される。これらの分子をバイオセンサ装置１００に組み込むことを達成することができ、そこで、ヌクレオチドプロモーター配列３５５は基質結合分子２０５として作用し、ＡｒｓＲタンパク質３５０は解放分子２１５として作用する。
【００５７】
ヒ素金属分子３７０（図２のターゲット分析物１０５を表す。）は、ＡｒｓＲタンパク質３５０について結合アフィニティを有し、特徴的な解離定数（Ｋdmetal）３８０を備えた金属／タンパク質複合体３８５を形成する。このようにして、基質結合分子２０５（ヌクレオチド誘発配列３５５を含む）が存在する領域内にヒ素分子３７０が導入されるため、ＡｒｓＲタンパク質３５０に対して競合結合が発生する。ヒ素分子３７０はＡｒｓＲタンパク質３５０に結合するため、タンパク質／ＤＮＡ複合体３６５にとどまるヌクレオチド誘発配列３５５の量は減少する。タンパク質／ＤＮＡ複合体３６５のこの減少は、エバネッセント波使用装置に連結されるときに反射光特性の変化として観察可能である。これらの相互作用のさらなる詳細、および、分析物の定量にどのように使用されるかは、その後の図面に提供される。
【００５８】
ａｒｓオペロンのさらなる説明および平衡解離定数の決定は、「ヒ素の環境化学（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｒｓｅｎｉｃ）」、Ｓｉｍｏｎ  Ｓｉｌｖｅｒら著、第９章、マルセルデッカーパブリッシャーズ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）（２００１）、および、「表面プラズモンン共鳴による高分子相互作用のための速度および平衡結合定数の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｔｅ  ａｎｄ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）」、Ｄａｎｉｅｌ  Ｊ．Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら著、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、２４０巻、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）（１９７５）に見ることができる。しかし、いずれの所与のシステムでは、文献からの熱力学的結合分析が、特に検討中の所与のシステムでは、不正確であるかまたは不完全である可能性があることを理解しなければならない。このようにして、文献からの平衡解離定数は、所与のシステムに存在するかまたは所与の試料に見られるｐＨ、酸化還元および塩の条件を考慮に入れることも入れないこともある。この理由のため、使用するように企図されたアッセイシステムまたは装置における経験的検査および適合が、これらの変数に対して満足のいく条件かまたは最適な条件に到着するために必要である。
【００５９】
さらに、エバネッセント波検出方法の詳細は、「バイオセンサ技術を使用するバイオ特異的な相互作用（Ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｍａｇｎｕｓ  Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３６１巻、（１９９３）に見ることができる。
【００６０】
図４は、バイオセンサ装置１００の初期設定についての方法３００を例示する。プロセス３００は、スタート状態３０５で開始し、状態３１０へ進み、そこで、バイオセンサ１００の組み込みに適切である基質結合分子１１５に対応する競合結合要素（ＣＢＥ）が、３１０で識別される。この状態３１０において、所望の分析物１０５用の結合アフィニティを有する核酸および／またはペプチド配列が識別される。核酸およびペプチド配列の望ましい特徴は、高い程度の特異性でさらに比較的低い濃度で分析物１０５に結合される能力を含む。そのような結合は、事実上、可逆であっても不可逆であってもよく、様々な異なる条件で発生してもよい（すなわち、温度、濃度、物理的状態）。核酸およびペプチド配列の結合アフィニティの特異性は、バイオセンサ１００が当該の所望の分析物１０５のみを登録し、一方、分析が行われる実験混合物１０７から誤った信号または高いバックグラウンドを最小限にすることを保証するのに重要である。
【００６１】
先に説明したように、バイオセンサ対応分子の１つの例示的なカテゴリーは、適切なバイオセンサ１００を準備するためのモデルとして使用されてもよい細菌内のヒ素の代謝に関しての遺伝子エンコーディングを含む原核生物耐性遺伝子のカセットまたはオペロンを含む。このシステムにおいて、タンパク質のヒ素コードの代謝に関連した遺伝子は、誘発要素の核酸配列およびヒ素分子の両方に多機能アフィニティを有する。これらのタンパク質は、ヒ素分析物１０５の検出に使用される必要な基質結合分子２０５および競合解放分子２１０を提供するために、誘発要素をコード化する核酸配列の部分とともに使用されてもよい。
【００６２】
バイオセンサ装置１００の上述の説明に記載されたものに類似したやり方で構成要素が使用されてもよい多数の生物学的経路および分子が存在することが、当業者によって認識される。したがって、ここに記載されたやりかたでバイオセンサ装置１００とともに他の生物学的経路および分子を使用することが、本発明の他の実施の形態を表すと思われる。
【００６３】
状態３１０におけるＣＢＥの識別に続いて、プロセス３００は、ＣＢＥが単離される状態３２０へ進む。この状態３２０において、基質結合分子２０５に対応する核酸配列は、適切なプラスミドベクトルに組み込まれてもよく、宿主細胞の伝播によって広がるか、または、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、十分量の基質結合分子を生成し、バイオセンサ１００の競合結合層１１５の表面２１０を被覆する。さらに、競合解放分子２１５に対応するタンパク質またはペプチド配列が、直接合成されてもよく、または適切な翻訳方法によって得られてもよい。
【００６４】
単離されたＣＢＥは、その後、状態３２０でセンサ１００に組み込まれ、競合結合表面層１１５を準備する。先に示されたように、ＣＢＥの解離因子に基づいて、望ましくはバイオセンサの感度を高める各ＣＢＥ用の望ましいシーディング密度が決定されてもよい。さらに、単離されたＣＢＥは、分析物１０５対してその活性を変えるように改変されてもよく、バイオセンサ表面の構成要素の間に望ましい平衡解離特性を生成する。ＣＢＥ組み込み３３０後に、プロセス３００は、終了状態３３５へ進み、バイオセンサ表面層１１５の初期設定を完了する。
【００６５】
図５は、実験混合物１０７における分析物１０５の存在の定性的且つ定量的ための方法４００を例示する。方法４００は、スタート状態４０５で開始し、ＣＢＳ層１１５が分析物１０５に露出されるようにセンサ１００が実験混合物１０７の近傍に位置決めされる状態４１０へ進む。この後の例示でより詳細に説明されるように、分析物１０５は解放分子２１５に選択的に結合し、結果として、基質結合分子２０５から連結解除する。連結解除の速度および程度は、実験混合物１０７に存在する分析物１０５の量に比例し、結果として前述のセンサ信号１１７が生成される。
【００６６】
センサ信号１１７は、新しい状態４２０で検出され、そこで、センサ信号１１７が電子的に変換されるかまたは増幅されて検出信号１２５を生成し、それがその後、状態４３０で分析物の定量に使用される。定量状態４３０は、センサ信号強度を分析物１０５の対応する濃度に関連づけるキャリブレートされた信号強度基準を使用して検出信号１２５に基づいて、実験混合物１０７内の分析物１０５の量を決定する。分析物１０５の定量時に、方法４００は結果を電子的にアクセス可能な形態に格納し、これは、ユーザに出力されてもよく、プロセスは終了、すなわち状態４３５へ進む。
【００６７】
図６および７は、分析物１０５の濃度を検出し測定するのに使用される分析機器５００におけるセンサ図をさらに例示する。図６ＡからＣおよび７ＡからＣにおいて、解放分子２１５が分析物１０５に選択的なアフィニティを有する結合の２つのモードが示される。図６Ａに示されるように、ＣＢＳ層１１５は、上部表面２１０に固定された基質結合分子２０５を含み、基質結合分子２０５のアフィニティ部位を占める解放分子２１５をさらに含む。溶液または混合物５１５が分析機器５００の露出領域５０５に導入されるときには、光５２０をＣＢＳ層１１５の下部表面５３０へ向けて方向づけることによって、特徴的な反射率を測定することができる。先に述べたように、反射光５４０が次いで測定され、溶液または混合物５１５の反射率のベースライン測定を得る。
【００６８】
その後、当該の分析物１０５を含む溶液または混合物５５０が、露出領域５０５内に導入され（図６Ｂ）、結果として分析物１０５の解放分子２１５に対する競合結合になる（図６Ｃ）。前述の結合は、解放分子２１５の少なくとも一部を溶液または混合物５５０内に遊離し、基質結合分子２０５の少なくとも一部を自由なまたは占有されていないアフィニティ部位に残す。光５２０をＣＢＳ層１１５の下部表面５３０に対して再方向づけることが、基質結合分子２０５の結合状態の変化から生じる反射光５４０の強度の変化として登録される。したがって、基質結合分子２０５のアフィニティ部位占有の２つの状態の間の強度の変化を比較しキャリブレートすることができ、溶液または混合物５５０中の分析物１０５の濃度を決定する。
【００６９】
前述の分析機器５００を使用して、固体、液体および気体の状態を含む異なる要素状態のものを含む多数の異なる溶液または混合物内の分析物１０５の濃度を測定してもよい。さらに、分析機器５００は、異なるターゲット分析物１０５用に変動するアフィニティを備えた複数の異なる基質結合分子２０５を組み込んでもよい。このようにして、分析機器５００を使用して、２つ以上のターゲット分析物１０５を測定し、その柔軟性および機能性を高めてもよい。
【００７０】
分析機器５００のさらなる特徴は、複数の分析を順次実施することができるように再使用可能であるかまたは再充電可能であるように作ることができることである。たとえば、機器５００で第１の分析を行った後に、ＣＢＳ層１１５を洗浄して、解放分子２１５のみを含む溶液（いずれの分析物１０５がない）が、基質結合分子２０５の先に占有しなかった結合部位へ結合することを可能にする。これは、ＣＢＳ層１１５を初期状態に戻し、そこでは、機器５００が、定量および分析の目的でターゲット分析物分子１０５を再度受け取る準備をしている。さらに、尿素、塩酸グアニジンおよびドデシル硫酸ナトリウムを含むがそれに限定されない変性剤を使用して、バイオセンサ装置１００のターゲット分析物１０５の結合能力を部分的にまたは全体的に元に戻してもよい。
【００７１】
図７ＡからＣは、分析機器５００の別の実施の形態を例示し、基質結合分子２０５は、解放分子２１５とターゲット分析物１０５との両方における競合結合アフィニティを有する。この機器５００において、ＣＢＳ層１１５は、前と同様に、解放分子２１５を基質結合分子２０５上のアフィニティレセプタに結合することによって、準備される（図６Ａ）。分析物１０５が露出領域５０５に導入されるため（図６Ｂ）、分析物１０５は基質結合分子２０５に直接結合して解放分子２１５を付随的に解放する（図６Ｃ）。基質結合分子２０５の結合におけるこれらの変化は、前と同様に、ＣＢＳ層１１５の下部表面５３０の反射された光５２０の強度の変化を測定することによって、検出することができる。
【００７２】
前述の機器５００は、望ましくは、特異的なヌクレオチド配列およびヒ素等のターゲット分析物分子の両方に選択的な結合アフィニティを備えたペプチドまたはタンパク質分子を使用してもよい。この実施の形態において、ヒ素分子は、ＣＢＳ層１１５に添付されたペプチドまたはタンパク質分子に直接結合し、結果としてヌクレオチド分子が解放される。ＣＢＳ層１１５に添付された分子の結合の状態は、次いで、反射光５４０の強度の変化の関数として測定される。
【００７３】
図８ＡからＣは、バイオセンサ装置５００の別の実施の形態を例示し、ＣＢＳ層１１５の方向に光５２０を発するように発光源７１０が位置決めされる。発光源７１０は、白熱、レーザおよびＬＥＤ発光源を含む多数の異なる光生成要素のいずれを具備してもよい。さらに、光は、偏光されるかまたはフィルタされるかしてもよく、望ましくはＣＢＳ層１１５の照度および反射の質を改良する波長特異的な光を生成する。図８Ａに示されるように且つ先に述べられたように、センサ装置５００がターゲット分析物１０５に露出されないときには、発せられた光５２０は、第１のサンプリング強度（ＩA）７１５で反射する。反射光５４０は次いで検出器７２０に対して投影され、反射光５４０を測定し第１のサンプリング強度７１５を定量することができる。検出器７２０は、露出される光の強度の変化における小さな差を検出し定量することができるフォト検出器または他の感光性要素を具備する。強度コンパレータ７２５は、反射光強度を示す信号を検出器７２０から受け取り、この情報を処理して、下記により詳細に説明されるやり方で、ターゲット分析物１０５の濃度を決定する。
【００７４】
分析物１０５がセンサ表面２１０に露出されるときには（図８Ｂ）、反射光５４０の強度の変化が観察されてもよく、結果として第２のサンプリング強度（ＩB）７３５が生成される（図８Ｃ）。第２のサンプリング強度７３５は、検出器７２０によって記録され、センサ５００内の適切な分子に結合された分析物１０５の相対量を示す。分析物１０５の計量は、強度コンパレータ７３５が第１のサンプリング強度７１５（分析物が存在しない）と第２のサンプリング強度７３５（分析物が存在する）とを比較するときに進行し、分析物１０５の濃度を表す値を生成する。１つの態様において、標準カーブまたはキャリブレーション表を強度コンパレータ７２５が使用して、分析物１０５の濃度を決定してもよい。標準カーブは、分析物１０５の公知の濃度を予想された光強度に連結し、分析物１０５の濃度を識別する迅速な手段を提供する。
【００７５】
バイオセンサ装置５００の１つの特徴は、リアルタイム獲得モードで操作するように構成されてもよいことであり、複数の強度測定が一定の期間にわたって記録され、連続的なやり方で分析物１０５の濃度をモニタする。このようにして、気体または液体の試料がバイオセンサ表面２１０上を通過してもよく、分析物１０５の濃度の変化は、様々な時間で反射光強度をサンプリングすることによって連続したやり方で検出され定量されてもよい。バイオセンサ装置５００のこの特徴は、その柔軟性を改良し、センサ５００を取り替えたり交換したりせずに、分析物１０５の複数の濃度または定量測定が行われるべき適用に、バイオセンサ装置５００が使用されるのを可能にする。
【００７６】
図９ＡからＣは、その後検出器７２０によって取り込むことができる角度でセンサ表面２１０からの反射光５４０を再方向づけることができる二次反射表面５５５を組み込むバイオセンサ機器５００の別の実施の形態を例示する。１つの態様において、二次反射表面５５５を加えることは、バイオセンサ装置５００の構成要素を位置決めする際の柔軟性が増加し、反射光５４０の取り込みおよび計量が改良される。反射表面５５５は、さらに集光表面として作用してもよく、これは、センサ表面２１０から比較的分散した量の反射光５４０を受け取り、その後、光を新しい方向に狭く伝達し、再方向づけられた光５６５が検出器７２０の小さな受け取り領域に集光されてもよいようにする。このようにして、反射表面５５５を組み込むことは、減少したサイズのバイオセンサ装置５００を作ることを容易にし、比較的小さな検出表面を有する検出器を使用するのを可能にする。
【００７７】
先に示されたように、バイオセンサ装置５００は、競合連結および解放特性に基づいて数多くの分析物分子を検出するために使用されてもよい。１つの態様において、ヌクレオチドストランドおよびタンパク質等の生物学的分子を使用して、選択的且つ競合的に分析物１０５を結合してもよい。これらの分子は、上述のように、望ましくはバイオセンサ表面２１０に固定され、分析物１０５の計量に使用される検出信号を生成する。
【００７８】
図１０ＡからＢは、グラフ８０１、８０２を例示し、これらは、ＡｒｓＲタンパク質、Ａｒｓオペロンおよびヒ素リガンドに適用されるような競合結合機構の適合性および感受性を例証する。図１０Ａにおいて、抑制グラフ８０１は、ヒ素分子８１０の様々な濃度の存在に基づいてＡｒｓＲ／ＤＮＡ複合体形成におけるパーセンテージ抑制８０５の関数として測定されたＡｒｓＲ／ＤＮＡ複合体３６５の相対連結を示す。抑制カーブ８１５は、リガンドヒ素８１０の濃度を上げることが、結果としてＡｒｓＲ／ＤＮＡ複合体形成の抑制を高めることをさらに例証する。抑制グラフ８０１は、競合結合システム置１００を検出する感度の範囲および絶対的限界を識別するのに有用である。
【００７９】
１つの態様において、競合結合システム１００の構成要素は、たとえば配列の変更によって、操作されるかまたは修正されてもよく、より大きな機能域および正確度を備えたシステム構成要素を得る。競合結合システム１００の改変された構成要素および濃度の結果をグラフ化することによって、システム１００の感度を決定してもよい。さらに、抑制グラフ８０１は、エバネッセント波の使用装置で使用される基質結合分子および解放分子の適切な量を決定し且つ分析物の検出および計量の目的のために望ましい反射信号を達成するために、使用されてもよい。
【００８０】
図１０Ｂは、別の競合結合グラフ８０２を例示し、ＡｒｓＲ／ＤＮＡ複合体３６５は、リガンドヒ素８１０の様々な濃度で結合され、ＡｒｓＲフラクション８２０の関数として測定される。先に述べたように、この競合結合グラフ８０２から得られた情報は、システムの構成要素および効率を分析するのに有用である。さらに、この情報は、バイオセンサ装置１００に使用されるべき適切なＣＢＳ層組成物を開発するために、使用されてもよい。
【００８１】
図１１は、前述のバイオセンサ装置１００を使用する準備および分析のためのプロセス９００を例示する。プロセスは、スタート状態９０５で開始し、状態９１０へ進み、そこで、基質結合分子２０５がセンサ表面２１０に付着される。先に示したように、２つ以上の型の分子がセンサ表面２１０に結合されてもよく、たとえば、複数のターゲット分析物型１０５の検出を提供する。複数の型の基質結合分子２０５を結合するための決定は、決定状態９１５で取り扱われ、これは、状態９２０へ進み、そこで、解放分子２１５が導入される。この状態で、解放分子は基質結合分子に付着し、ターゲット分析物１０５を分析するためにセンサ１００を準備する。
【００８２】
状態９２５において、ターゲット分析物１０５が導入されセンサ表面２１０に露出され、識別可能な信号を生成し、これは、状態９３０で記録される。分析状態９３０中に、信号差分析が行われてもよく、ターゲット分析物１０５の存在によって生成された信号を、ターゲット分析物１０５がない場合に解放分子２１５のみが基質結合分子２０５に結合されるときに生成された信号に対して比較する。
【００８３】
１つの態様において、標準カーブは、測定された信号に基づいてターゲット分析物１０５の濃度を決定するのを支援するために、作られ使用されてもよい。これらの標準カーブは、さらに、公知の濃度のターゲット分析物１０５を有する溶液か、または、検査溶液の分析物濃度を決定するのを支援するターゲット分析物１０５の結合に対する抑制剤を使用して、準備されてもよい。
状態９３０におけるターゲット分析物の検出および計量に続いて、プロセス９００は状態９３５へ進み、そこで、バイオセンサ装置１００の検出表面２１０を再生成する決定が行われてもよい。再生成が所望される場合には、再生成プロトコルが状態９４０で使用され、ターゲット分析物１０５を状態９２５に再導入するためにセンサ１００を準備する。再生成が所望されない場合には、プロセス９００はエンド状態９４５へ到達し、準備分析プロセス９００を完了する。
【００８４】
バイオセンサ装置１００は、無機分子検出システムに使用されるように記載されているが、この装置１００は、分子（分析物）の多数の他の型および変形を検出し計量するのに使用されるのに容易に適合することができる。これらの分析物は、有機および無機の分子およびイオンを含んでもよい。さらに、ターゲット分析物１０５のサイズおよび分子重量は制限されず、したがって、装置１００は、大きな分子と小さな分子との両方を同様に検出するように構成されることができる。
【００８５】
部分的に、バイオセンサ装置１００の感度、および、装置１００で使用される基質結合分子２０５および解放分子２１５の特異性および感受性に基づいて、バイオセンサは、ピコモルまたはさらにアトモルの範囲で、感度または検出能力の閾値を有してもよい。さらに、検出されることが可能である分子のサイズは、１０００未満の、より好ましくは５００未満の、さらにもっとも好ましくは１５０未満の、分子重量を有してもよい。
【００８６】
本発明のバイオセンサ用の低分子ターゲット
上述の金属化合物に加えて、バイオセンサ１００の様々な構成によって検出されることが可能である分子のいくつかの特定の例として、メチルターシャリーブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、一般的に使用されるガソリン酸化添加剤；ロケット燃料生産に、ゴム用の可塑剤として、電池の製造に、さらにポリマーおよびコポリマーの合成に使用されるＮ−ニトロソジメチルアミン（ＮＤＭＡ）；および、有機化学製造における溶剤安定剤として、および、繊維加工における湿潤分散剤として使用される、１，４−ジオクサンが挙げられる。
【００８７】
低分子結合タンパク質
上記に記したように、低分子ターゲットおよび特異的なＤＮＡ配列へ、両方に同時にではなく、結合するタンパク質には、様々な可能性を利用することができる。一般に、タンパク質は、ＤＮＡおよび低分子ターゲットの両方へ結合する特異性に基づいて選択される。さらに、ルーチン分子の生物学的技術によって、タンパク質のＤＮＡまたは低分子結合特性を変えて、システムの機能域を増加させ、特異性を高め、感度を上げることが可能である。下記に述べられる修正の効果は、動的および濃度依存の両方またはその組み合わせの、ルーチン結合アッセイによって決定することができる。
【００８８】
自然発生的な金属応答オペロンは、そのようなタンパク質およびそれらが特異的に結合するＤＮＡ分子で良好な源を提供することは明らかである（たとえば、様々なワールドワイドウェブサイト、米国特許第５，５７１，７２２号参照のこと）。たとえば、本発明の第１の代替実施の形態は、ＭｅｒＲ（水銀耐性オペロンに対する抑制（リプレレッサー）タンパク質）をＭｅｒオペロンと組み合わせて含んでもよい。Ｈｇ（ＩＩ）イオンがリプレッサータンパク質ＭｅｒＲに付着するため、ＭｅｒＲは、誘発（プロモーター）結合部位に対して、したがってオリゴヌクレオチド上のその結合部位に対して、区別をしてふるまう。
【００８９】
同様に、本発明の第２の代替の実施の形態は、ＣａｄＲおよびカドミウムオペロンに関与してもよい。ｃａｄオペロンは、ｃａｄＣ遺伝子を含み、その生成物は、転写を否定的に規制する。Ｃｄ（ＩＩ）イオンを加えることは、プロモーターからリプレッサータンパク質ＣａｄＲを除去することによって、抑制を緩和する。ＣａｄＲは、亜鉛および鉛も結合することが示されている。
【００９０】
本発明の第３の代替の実施の形態は、ｓｍｔＢに関与してもよい。ｓｍｔＢは、シアノバクテリアメタロチオネイン遺伝子ｓｍｔＡの金属依存（特異的にＺｎ（ＩＩ）イオン）リプレッサーである。そのようであるから、Ｚｎ（ＩＩ）イオンの存在は、タンパク質ＤＮＡ複合体を仲介する。
【００９１】
さらなる実施の形態において、自然発生的なタンパク質は、結合特性を変えるように改変（修飾）される。たとえば、特定の実施の形態において、アミノ酸９８−１１７が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示されるＡｒｓＲタンパク質から削除され、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸残基１−９７に対応するタンパク質を産する。あるいは、Ｃ末端システイン（アミノ酸１１６）の除去は、タンパク質を安定させることもある。本発明のこの態様を実施するのに使用される低分子ＤＮＡ結合タンパク質のいずれに、類似の改変は可能である。そのようなタンパク質フラグメントは、別のタンパク質、たとえば、精製ハンドル（ヘキサヒスチジン、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ等）で、溶解されてもよい。特定の態様において、タンパク質は、ＤＮＡおよび金属を結合するのに十分な金属応答オペロンによってエンコードされる細菌ＤＮＡ結合規制タンパク質の配列を含む。たとえば、ＡｒｓＲタンパク質は、少なくとも９０％は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸１−９７のアミノ酸配列に等しいアミノ酸配列を有してもよく、このＡｒｓＲタンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される核酸配列に結合する。
あるいは、アミノ酸置換を低分子結合タンパク質に導入することによって、ＤＮＡ結合特性または低分子結合特性またはその両方を必要に応じて変えることができる。
加えて、公知のタンパク質、特に公知の金属結合タンパク質は、上述の直接展開および遺伝子シャフリングの技術によって、修正することができ、異なる金属イオンまたは金属イオン錯体に特異性を備えたタンパク質を生成し、異なる低分子結合特異性を備えたタンパク質を生成する。
【００９２】
タンパク質またはこれをエンコードする遺伝子の源に関係なく、高レベルのタンパク質を表すためにルーチン分子の生物学的技術を使用する。このようにして、本発明にしたがって、従来の分子生物学、微生物学、および、業界内の組み換えＤＮＡ技術が使用されてもよい。そのような技術は、文献に完全に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室マニュアル、第２版（１９８９）コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（ここでは「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡクローニング：実践的アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、第１巻、第２巻、（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）；核酸ハイブリッド形成（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）［Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）］；転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）［Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）］；動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）［Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｄ．（１９８６）］；固定化細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）［ＩＲＬプレス、（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、分子クローニングへの実践的ガイド（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８４）；Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．）、分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ワイリー＆サン社（１９９４）。
【００９３】
核酸
ＤＮＡに結合し低分子によって結合されるときに解放するタンパク質について特異的な結合配列を含む様々な核酸が知られている（上述のリプレッサーシステムは、このふるまいのよく知られた例である）。好ましくは、ＤＮＡは、固相サポートに付着されるべき場合には、リンカーを含む。１つの例示的リンカーはビオチンである。ビオチン標識された核酸は、アビジンまたはストレプトアビジンが塗布された表面に付着する。たとえばスプリータ（商標）装置表面に使用するための特定の実施の形態において、結合分子はニュートラビジンである。ＤＮＡをマイクロアレイサポートに結合するための他のリンカーが公知である。核酸をサポートへ直接付着することも想定される。さらに、二本鎖ＤＮＡを形成するオリゴは、再度、固体サポートに結合するリンカーを高めるために、非対称長さであってもよい。核酸の固定化は公知である（たとえば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、バイオコンジュゲート技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、アカデミックプレス：ボストン、１９９６を参照のこと）。
【００９４】
さらに、タンパク質と同様に、核酸配列の改変は、タンパク質結合相互作用の変更を提供する。核酸は、特異的な結合配列からの少なくとも１つの核酸によってプロモーターまたは他の規制タンパク質結合配列とは異なる配列を含むように改変されてもよく、この核酸は、改変されていない配列とは異なる結合定数でタンパク質によって特異的に結合される。たとえば、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択される配列とは、３つまでの塩基または塩基対が、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを想定する。一般に、改変されるヌクレオチドの数は多くても１０％を超えないか、または、３０ｍｅｒオリゴヌクレオチドにおける３つ以下の塩基の変化である。さらに、実施例に例証されるように、ダイアドリピートを半分にすることも可能であり、結果として、より低いアフィニティ結合（関与する特定のシステムには望ましいものであってもよい）を備えたより短いＤＮＡになる。ＤＮＡが固定化されるさらに別の実施の形態において、異なる配列を備えた異なる分子の組み合わせが固定化され、結合特徴の不均一なアソートメントを提供する。この不均一なアソートメントは、信号出力に悪影響を与えないが、アッセイの機能域を有意に高めることができる。タンパク質の修正と同様に、特定の修正が所望の効果を有するか否かを決定するために、結合アッセイを行うことがルーチンである。
【００９５】
検出システム
第１のクラスの分子（たとえばタンパク質）が第２のクラスの分子（たとえば核酸）に結合することまたは結合の欠如を検出するための多数の検出システムが利用可能である。さらに、結合定量は、測定相互作用の絶対値によって達成することができ、または、場合によっては、結合または解放の動力学を測定することによってより正確に達成することができる。動力学に基づいた分析物検出のために、検出システムは、データ獲得および分析のために、マイクロプロセッサ装置たとえばＰＣボードに接続されることが好ましい。このようにして、本発明の装置は、好ましくは分析物濃度の決定された値を提供するもので、むしろその値の独立演算のためのそのままのデータではない。
【００９６】
表面プラズモン共鳴は、公知技術の方法である。好ましくは、分析物の濃度は、基質結合分子を解放分子に連結する状態を探知することによって決定される。好ましくは、測定可能な変化を受ける基質結合分子の特性は、光学特徴である。エバネッセント波使用方法は好適な実施の形態であるが、本願に開示されるような特異的な生物学的認識機構とともに、他のセンサ方法を使用することができることを当業者は認識する。バイオセンサの検出機構を構成することができる技術を当業者は認識する。これらは、いずれの電気化学的変換器を含み、電位差測定機構、電流滴定機構または光学系変換機構を含み、分析物キャプチャ（たとえば赤外線）の分析について異なる波長を使用する光ファイバシステムを含む。これらの方法の多くは、業界では公知であり開示されている（たとえば、米国特許第６，０６３，５７３号、第６，０８７，１００号、第６，０７１，６９９号、第５，９５２，１７２号および第５，５９１，５７８号を参照のこと）。国際特許公開第８９／０５９７７号には、バイオセンサに組み込まれる一般に使用される電気化学的および光学的変換器が開示されている。好ましくは、機器は、アッセイを実施するために、関連器具およびコンピュータ制御およびデータ処理手段に連結される。適切な器具、コンピュータ制御およびデータ処理手段は公知である。
【００９７】
上述のバイオセンサ製造および使用方法は、比色分析または蛍光系検出方法を使用するものを含む多数の他のバイオセンサ装置とともに操作するように適合されてもよいと思われる。バイオセンサシステムの競合結合態様を使用する蛍光系検出方法の例として、生化学分子の定性および定量を、（フォスター）共鳴エネルギトランスファ（ＦＲＥＴ）または蛍光消光を使用して検出することができる。これらの溶液系方法は、ターゲット分析物の検出にＳＰＲを必要とせず、ターゲット分析物の定性および定量への競合結合アプローチとともに使用されてもよく、バイオ分子を検出する高感度手段を提供する。
【００９８】
簡単に述べると、検出のＦＲＥＴ系方法は、競合結合分子の一方を蛍光ドナーでラベルづけ、他方の競合結合分子を蛍光アクセプタでラベルづけ、ドナーの放出波長とアクセプタの励起波長とが一致するようにする。蛍光分光光度計または類似の検出手段を使用して、これらの分子の間の相互作用の定量化が可能である。これらの蛍光系検出システムに使用される分子は、さらに、自然のまたは誘発された蛍光性を有し、これは、ターゲット分析物１０５の相互作用時に波長または強度が変化し、したがって分析物の存在を定量化するのに使用される。このバイオセンサ構成を使用して、様々な蛍光分子の間の相互作用（単／複）の測定は、当該のターゲット分析物の存在に帰すことができ、したがって、識別および定量の目的のために使用されてもよい。
【００９９】
国際特許公開第０２／１０７５０号には、蛍光的にラベルづけられた分析物がバイオポリマーに結合される蛍光偏光が開示されている。参考文献は、バイオポリマーがタンパク質を含むとして規定している。分析物が試料に加えられるときには、これは、ラベルづけられた分析物をタンパク質から変位する。解放されたフルオロホンは、結合されたフルオロホンよりも有意に低い偏光を有し、結果として信号が検出可能に変化する。蛍光波長移行は、バイオポリマーの部位から水性環境へ解放されるときに、多くの蛍光団が励起および／または放出波長および蛍光の量子収量における変化を呈するという所見に基づいている。
【０１００】
参考文献には、蛍光の変化が分析物のバイオポリマーへの結合に依存しており、蛍光団が消光するように設計されている蛍光消光がさらに開示されており、同様に、比色消光の使用に関与する検出方法が開示されている。不安定な色素分子がバイオポリマーに結合されている。バイオポリマーに結合されているときに、色素は反応しない。しかし、分析物結合時には、色素は変位されて、反応する。
【０１０１】
蛍光スペクトルは、非常に低い濃度の分析物に適した技術である。蛍光は、大幅な信号増幅を提供するが、それは、単一の蛍光団が多くのフォトンを吸収し放出することができ、非常に低い濃度でさえ強い信号へ導くからである。加えて、蛍光タイムスケールは、濃度変動のリアルタイムモニタリングを可能にするのに十分に速い。蛍光特性は、蛍光団に関連する変化にのみ応答し、したがって、高度に選択的で有り得る。蛍光ラベルづけ有機キレート剤およびペプチドを含む多くの蛍光化学センサは、金属イオン検出のために開発されている。国際特許公開第０２／００００６号には、劈開前に蛍光強度が消光剤によって減少されるように、近位に配列された蛍光団および消光剤を具備するバイオセンサの好適な実施の形態が開示されている。しかし、劈開時に、蛍光団および消光剤は分離され、蛍光強度の増加に導く。
【０１０２】
蛍光を検出するための方法は、よく開発されている。国際特許公開第９９／２７３５１号には、バイオリポーターおよび光学適用特異集積回路を具備するモノシリックバイオエレクトニカル装置が記載されている。この装置によって、溶液中の物質の存在を遠隔サンプリングすることができる。さらに、現場で使用される蛍光光度計が市販されている。蛍光検出は、光ファイバ技術と互換性がある。数種類の蛍光関連パラメータが、蛍光強度、放出または励起波長、蛍光寿命および異方性を含む測定の目的のために査定されることができる。光ファイバ検出方法は、Ｅｗｉｎｇ，Ｋ．Ｊ．、Ｎａｕ，Ｇ．、Ｊａｇａｎａｔｈａｎ，Ｊ．、Ｂｉｌｏｄｅａｕ，Ｔ．、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉ．、Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｉ．Ｄ．、「水中の重金属を決定するための光ファイバ流れ注入センサ（Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃ  Ｆｌｏｗ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅａｖｙ  Ｍｅｔａｌｓ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ）」、海軍研究試験所（Ｎａｖａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、光科学部（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、コード６５０３．２、ワシントンＤ．Ｃ．２０３７５に開示されている。
【０１０３】
米国特許第５，４５９，０４０号には、サンドイッチアッセイが開示されており、これは、２つの錯化剤キレートで集合体または錯体を形成する分析物の能力を基にする。錯化剤の一方は、固体サポート上に固定化され、金属イオンに結合することができ、他方の錯化剤は、リポーターグループに連結されるかまたは結合され、錯化されたキレートに結合することができ、サンドイッチキレート錯体を形成する。リポーターグループは、当該の分析物が試料中に存在するときには結果として検出可能な信号または変化になるいずれの成分、分子、原子または種を意味する。リポーターグループとして、指標と組み合わされた酵素、色原体、蛍光団、ラジオアイソトープおよびビオチン、または、サンドイッチキレートを認識する抗体に付着する群が挙げられる。具体的には、リポーターグループは、蛍光信号、燐光信号、生物発光信号、化学発光信号または電気化学信号の形成に触媒作用を及ぼすことができてもよい。したがって、サンドイッチキレート錯体の存在は、リポーターグループが存在するかしないかによって検出される。
【０１０４】
参考文献には、キレート剤用の試料に存在する金属イオンに匹敵する有機金属化合物の使用に基づいた競合方法も開示されている。この方法において、キレート剤は、キレート錯体を形成する金属イオンと結合することができる固体サポート上に固定化される。リポーターグループ上に固定化された有機金属化合物は、金属イオンに結合することができてキレート錯体を形成し、試料に加えられる。金属イオンの存在は、リポーターグループが存在するかしないかによって検出される。
【０１０５】
力増幅生物学的センサ（ＦＡＢＳ）の使用は、Ｂａｓｅｌｔ，Ｄ．Ｒ．、Ｌｅｅ，Ｇ．Ｕ．、Ｃｏｌｔｏｎ，Ｒ．Ｊ．、「力顕微鏡技術に基づいたバイオセンサ（Ａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、海軍研究試験所、コード６１７７、ワシントンＤ．Ｃ．２０３７５−５３４２に開示されており、そのようなリポーターグループを検出するのに使用することができる。ＦＡＢＳは、イミュノビーズサンドイッチアッセイに基づいており、これは、取り込まれたイミュノビーズを検出するために、カンチレバーを使用する。存在する磁気ビーズの数は、試料中の分析物の濃度に比例する。
【０１０６】
電気化学検出システムは、電位差測定（たとえば、ｐＨ、選択的イオンレベル測定）および導電性変化（すなわち、抵抗の変化）をさらに含む。そのような方法は、タンパク質を含むバイオセンサバイオポリマーの使用を含み、それは、分析物の結合時に、電気化学的に検出可能な信号、電流測定的に検出可能な信号、電位差測定的に検出可能な信号、ｐＨの変化として検出可能な信号、特異的なイオンレベルに基づいた信号、導電性の変化に基づいた信号、圧電性信号、共鳴周波数の変化、表面弾性波として検出可能な信号、水晶振動子マイクロバランスによって検出可能な信号等を生成する。
【０１０７】
基質結合分子を解放分子に連結する状態に関連する様々な事象を検出するのに加えて、これらの変換器は、事象を電子信号または光学信号等の測定可能な量に変換するか転換するかによって、これらの事象に関連した情報を生成することもできる。これらの信号は、次いで、ディスプレイ、レコード、デジタル化されたデータ等に表された情報を処理する装置へ、業界で公知の接続を経由してチャネルで送られる。特定の装置は、検出されている物理的なまたは化学的な現象の型に依存する。電気化学変換器は、電位計、電圧計、インピーダンス分析器およびキャパシタンスブリッジに連結されることが多い。光電子増倍管、フォトダイオード、フォトトランジスタ、分光光度計、モノクロムメータおよびフォトンカウンタが、装置内で一般に使用され、光学的変換器によって生成された情報を処理する。
【０１０８】
前述のバイオセンサ変換技術および装置を本発明に使用してもよいが、小型化、および、質量分析、ガスクロマトグラフィおよびＮＭＲ等の他の分析技術における将来の改良によって、そのような他の技術およびシステムを本発明に使用することができてもよい。さらに、着色ラテックスビーズ、コロイド状の金（当然ながら、金はアッセイシステムに干渉しない）、酵素、蛍光団等を含むイミュノアッセイシステムに使用される技術のいずれを、本発明を実施するのに使用することができる。
【実施例】
【０１０９】
下記の実施例は、タンパク質／ＤＮＡの相互作用およびヒ素用のＡｒｓＲの結合アフィニティを例示する。
実施例１：  大腸菌ＡｒｓＲの発現および精製
大腸菌からのＡｒｓＲの高レベル発現についての合成遺伝子が、コドン最適化を使用して準備された（Ｗａｄａら、核酸Ｒｅｓ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１９９２、２０（補遺）：２１１１−２１１８；Ｚｈａｎｇら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１９９１、１０５：６１−７２）。より高い濃度のｔＲＮＡに整合ししたがって翻訳の効率を高めるｍＲＮＡトリプレットをエンコードするトリプレット配列を使用するコドン最適化が、収率を上げるために使用された。遺伝子およびこれがエンコードするタンパク質の配列は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１および２に示される。制限部位の追加は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列の最初の３つおよび最後の６つの塩基に存在する。
【０１１０】
初期細胞増殖のために、新鮮形質転換が最初にカンプレート（Ｋａｎ  Ｐｌａｔｅ）で一晩中行われた。次に、コロニーピックからの培養を、一晩中、ＬＢの５０ｍｌで、選択のため２５μ／ｍｌのカナマイシンで、３７℃で増殖させた。使用されたプラスミドは、Ｈｉｓ６カルボキシ末端タグで溶解されたＡｒｓＲタンパク質（ゲンバンクアクセション（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）＃ｘ１６０４５バージョン−ｘ１６０４５．１  ＧＩ：４２７１６）についての最適化配列を含むｐＥＴ３０Ａ＋であった。これは、この配列のＡＴＧをベクトルの第１のＡＴＧを備えたフレームに置き、タンパク質のカルボキシ末端で配列…ＫＡＶＣＩＬＥＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）を産し、ただし、配列ＫＡＶＣＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）はＡｒｓＲタンパク質からであり、ＬＥはＸｈｏ１部位からであり、Ｈｉｓ６タグはカルボキシ末端でベクトルのＨＨＨＨＨＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）である。遺伝子配列は、プラスミドポリリンカー内に挿入され、Ｔ７転写制御システムを使用した。形質転換された細胞は、ＢＬ２１ＤＥ３（ＲｅｃＡ-、Ｆ-、ｏｍｐＴ、ＨＳＤＳ、ＲＢ-、ＭＢ-、ｇａｌ、ＤＣＭ、ＨＭＳ１７４、ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から入手可能、＃７０２３５−３）であった。１リットルのＬＢ＋１％グルコース、２５ｕｇ／ｍｌカナマイシンが接種され、３７℃で一晩中、シェーカーフラスコ（２５０ｒｐｍ）で増殖された。
【０１１１】
発酵剤増殖（５リットルサイズ）のために、５リットルのＬＢ＋１％グリセロール、２５ｕｇ／ｍｌカナマイシンが、飽和細胞増殖に接種され（先行する培養から）、５００ｒｐｍで攪拌され、３７℃で１０，０００ｃｃ／分で空気供給された。光学密度は、６００ｎｍでモニタされた。光学密度が１．０（初期／中期ログ）であったときには、試料は、予め誘発試料を採取した後に、０．５ｍＭＩＰＴＧで誘発され、次いで３時間の間、後誘発増殖された。細胞は、シャープルズ連続遠心分離で収穫され、ＰＢＳで再懸濁された。次いでペレットが洗浄され、遠心分離され、重さを量られた。結果として得られたペレットの重量は３５ｇであった。
【０１１２】
抽出生成のために、１：４湿潤ペレット重量対容量再懸濁液が溶菌バッファに生成され、これは、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．５、０．５ＭのＮａＣｌを含んだ。プロテアーゼ抑制剤（ロイペプチン、ＰＭＳＦ、アプロチン）が加えられた。抽出は、プローブジェネレータを使用して均質化によって達成され、各５秒で３パルスであった。懸濁液は次いで、細胞溶菌用に霧状にされ（２００ＰＳＩ、３通過）、４５分間、５０，０００×ｇで回転された。次いで、上清がデカントされた。
【０１１３】
精製のために、クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）が使用された。下記のバッファＡでＮｉＣｌで帯電された５ｍｌのハイトラップ（Ｈｉ−Ｔｒａｐ）ＩＭＡＣカラムが、釣り合った：５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．５ＭのＮａＣｌ。溶解性の抽出物は次いで、２ｍｌ／分でカラムに取り込まれ、バッファＡでベースラインへ洗浄され、１０ＣＶのＡ＋１０ｍＭのイミジゾルで洗浄された。カラムは次いで、１０ＣＶのＡ＋２０ｍＭのイミジゾルで洗浄された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に画分（５ｍｌ）が収集された。カラムは、Ａ＋２００ｍＭのイミジゾルで溶出され、画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に２０ｍＭのＤＴＴ内に収集された。
出発原料、フロースルー、洗浄および溶出のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が実施された。プーリング決定が行われ、プールされた試料のタンパク質濃度が決定された。
【０１１４】
次に透析が行われた。グリセロールが加えられ、プールを５％グリセロール容量濃度にした。プールは次いで、下記に挙げられる透析バッファでおよそ１ｍｇ／ｍｌに希釈された。ファクションプールは、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５ｍＭのＤＴＴおよび５％のグリセロールを含む１リットルに置かれた３５００分子重量カットオフチュービング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｕｔｏｆｆ  ｔｕｂｉｎｇ）で５時間、透析された。透析チュービングは次いで、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＤＴＴおよび５％のグリセロールの４リットルに一晩中置かれ、ＥＤＴＡを除去した。プールは次いで、遠心分離で浄化され、タンパク質濃度が決定され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは結果を得た。
【０１１５】
パイロット生成の最終生成物（合計３４ｇから５ｇの全体細胞ペレット）は、４８０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度を産した（タンパク質の安定化およびセンサ表面への非特異的な結合の減少のための０．０５％ポリソルベート溶液中）。この実験の合計容量は３．６ｍｌであり、これは、１．７５ｍｇの合計タンパク質産出を得た。これは、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＤＴＴおよび５％のグリセロールのバッファに溶解された。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％を超えた。このシステムにおいて、誘発は厳重に規制されて成功し、溶解性の画分で３０から４０％のタンパク質生成であった。透析用のＩＭＡＣからの初期産出は、１．０ｍｇ／ｍｌで５ｍｇであり、目に見える沈澱後透析であった。後透析産出は、０．４８ｍｇ／ｍｌで１．７５ｍｇであり、９５％純度（ゲル参照）であり、タンパク質は、複数の冷凍解凍サイクルへ安定した。
アミノ酸９８−１１７を除去することによって、または、少なくとも最後のシステインからタンパク質のカルボキシ端を除去することによって、タンパク質を凝集／沈澱を受けにくくしなければならない。
【０１１６】
実施例２：ＤＮＡの固定化およびＡｒｓＲのＤＮＡへの結合
表２は、ＡｒｓＲタンパク質結合に使用されるＤＮＡの配列を表示する。オペロンは、プラスミド上にまたはゲノム内に見出すことができる。したがって、ＰＬＡＳは、既存のプラスミドからの配列を示し、ＣＨＲＯＭは、一定の細菌上の染色体配列を示す。この指示に続く文字は、長いを表すＬかまたは短いを表すＳかのいずれである。続く「１Ｂ」または「１Ｔ」は、頂部または底部を示す。したがって、ＰＬＡＳＬ１Ｔは、プラスミドからの頂部の長いオリゴ配列を示す。
【０１１７】
【表２】
2005515468.tif 000003
【０１１８】
第１に、ＤＮＡを固定化するために、各ビオチン化オリゴは、ストレプトアビジンを予め塗布したセンサ表面に取り込まれた。各オリゴでの相補鎖が次いで表面上に注入され、ＤＮＡ鎖のハイブリッド形成を可能にした。ｄｓＤＮＡの合計１５２５共鳴ユニット（ＲＵ）は、センサ表面に固定化された。共鳴ユニット（ＲＵ）は、チップ表面に近い屈折率の変化を検出するために記録される信号として定義される。チップ表面の質量が増加すると、結果として屈折率が変化する。ブランクフローセルは各実験において制御表面として使用された。ランニングバッファは、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）であり、器具（ビアコアバイオセンサ）の温度は２５℃であった。
【０１１９】
タンパク質はランニングバッファで様々な濃度に希釈され、自動方法を使用して、ＤＮＡおよび制御表面上に注入された。センサグラムは、バイアエバリュエーション（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ）ソフトウェアを使用して、制御控除され評価された。ＰＬＡＳＬ１は、別個のセンサチップ上に固定化され、上述のように同一の結合データがＡｒｓＲにつて収集された。タンパク質結合および解放速度は、それぞれ、相対屈折率値の蓄積および減少から派生し、関連動力学定数用に分析され、タンパク質−ＤＮＡ結合アフィニティを計算するために使用された。
【０１２０】
ＡｒｓＲ（３．２７μＭ）は、様々な濃度の酸化フェニルアルシン（ＰＡＯ）の存在下でＰＬＡＳＬ１およびＣＨＲＯＭＬ１表面上に注入された。ＰＡＯの最高濃度（１００μＭ）で、ＡｒｓＲ結合は約５５％抑制された。
ＡｒｓＲ（３．２７μＭ）は、様々な濃度のヒ酸ナトリウムの存在下でＰＬＡＳＬ１およびＣＨＲＯＭＬ１表面上に注入された。各ＤＮＡ表面用の結合データが得られた。これらの実験からのデータは、タンパク質−ＤＮＡ結合アフィニティが使用される各配列で異なり、すべての配列は０．５ｕＭ±１０ｎＭのＫｄで結合されたことを示唆する。
【０１２１】
実施例３：プロトタイプ
図１２は、スプリータTM２０００（商標）（Ｓ２Ｋ）装置１００１を維持するための機器１０００の頂部斜視図である。図１３は、機器１０００の上面図である。図１４は、線１４−１４に沿って切られた図１３の側断面図である。機器１０００の１つの特徴は、クランプ１００２およびクランプブロック１００３であり、これらは、Ｓ２Ｋ装置１００１をしっかり把持し、これをその噛み合いコネクタ１００４へ適切な関係に保持する。攪拌するときにはおよびその場合には、クランプがＳ２Ｋ装置１００１とコネクタ１００４との間の相対運動を防止する。その代わり、運動は、相互接続ケーブル１００５に吸収される。クランプ１００２は、ケースに対して幾分の浮揚を有する。クランプ１００２を締めてＳ２Ｋ装置１００１を固定することは、ナールドサムねじ１００６、１．４ターンアクチュエータまたはスライドによって行うことができる。
【０１２２】
一定の量の流体の注入を可能にするフローセル１００７は、Ｓ２Ｋ装置１００１の前部表面に連結される。この装置に設計されるように、フローセル１００７は、いずれの金物を使用せずにＳ２Ｋ装置１００１に接着する。これは、装置の窪み内に嵌まるフィンガによってＳ２Ｋ装置１００１の側部のプラスチック突起物を把持する。フローセル１００７の取り外しは、単にフローセルの把持アーム１００８のスナップを外すだけである。ＰＣボード１０１４は、データ獲得、分析およびディスプレイを提供する。
【０１２３】
図１５は、装置１０００の底面図である。フローセル１００７に取り込まれた流体を攪拌するためのアジテータ１００９は、ポケベルおよび携帯電話（ここに例示される）に見られる偏心モータシステムであってもよい。あるいは、ピーク攪拌に適切な周波数で駆動される小型オーディオスピーカーが使用されてもよい。あるいは、磁石をフローセル１００７の表面上に前後に通過させることによって、無害のコーティングに封入されフローセル１００７に含まれる第１鉄ビーズを攪拌することができる。
【０１２４】
図１６は、装置１０００の正面図である。アジテータ１００９は、モータクランプ１０１０によって適切な位置に保持されているのを見ることができる。
図１７は、フローセル１００７の底部斜視図である。フローセル１００７は、Ｓ２Ｋ装置の前部表面に連結されるときには、一定の量の流体を注入することができる。これは、上記装置の窪み内に嵌まるフィンガによってＳ２Ｋ装置１００１の側部のプラスチック突起物を把持する。フローセル１００７の取り外しは、単にフローセルの把持アーム１００８のスナップを外すだけである。フローセル１００７に入る流体の温度均衡を確実にするために、セルは、アルミニウム等の熱導電性材料から作ることができ、耐食のために適切にコーティングされる。入口通路１０１１は、流体が、適切な速度で導入されるときに、周囲環境と釣り合った温度になることができるように、十分に長い。アルミニウムフローセル１００７の熱質量は、その温度にされている流体の熱質量よりもかなり大きい。
【０１２５】
開口１０１２の一方の端は、ペプチド先端または皮下注射器先端を挿入することができ、流体密封を形成するのに十分である。フローセルの遠位側の開口１０１３は、表面張力のみで流体を保持するのに十分なサイズである。これによって、新しい流体が入口開口部内に強制されるときに流体を自動的に排除するのを可能にし、それ以上の流体が挿入されないときに流体保持を提供する。
【０１２６】
好適な実施において器具のオペレータに与えられる情報は、簡略であり読むのが容易なものである。出力は、２つまたは３つの文字デジタルＬＣＤ読み取りに現れる汚染物質の１０億当たりの部で有り得る。装置ステータス情報はデジタルセグメントにエンコードされてもよく、または、ディスプレイを取り巻くオーバーレイに印刷されるテキストを示すＬＣＤ上の矢印によって示される。これらの特徴は、訓練されていないオペレータに、器具ユーザフレンドリーにする。
【０１２７】
本発明の先の記載は本発明の新規特徴を示し説明し指摘しているが、本発明の精神から逸脱することなく、例示された機器およびその使用の詳細な形態の様々な省略、置換および変更を行ってもよいことが当業者によって理解される。したがって、本発明は、単にエバネッセント波使用装置を使用する物質検出に限定されるとみなされるべきではない。その結果として、本発明の範囲は、前述の検討に限定されるべきではなく、非予備出願を出願するときに添付される特許請求の範囲によって規定されるべきである。
特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコルは、本願の至る所に引用されており、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照してここに組み込まれるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、競合連結バイオセンサ装置のブロック図である。
【図２】図２は、分析物分子を検出するために使用されるバイオセンサ表面に存在する例示的な競合結合層を例示する図である。
【図３】図３は、ヒ素バイオセンサにおける競合結合に連結する平衡解離因子を例示する図である。
【図４】図４、競合連結バイオセンサ装置を準備するための方法を例示する図である。
【図５】図５は、バイオセンサ装置を使用して、分析物の存在を質的および量的に査定するための方法を例示する図である。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、競合連結バイオセンサ装置の１つの実施の形態を例示する図である。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、競合連結バイオセンサ装置の別の実施の形態を例示する図である。
【図８】図８Ａ〜Ｃは、競合連結バイオセンサ装置のさらに別の実施の形態を例示する図である。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、競合連結バイオセンサ装置のさらなる実施の形態を例示する図である。
【図１０】図１０Ａ及びＢは、競合結合複合体に対するリガンド濃度の影響を測定するグラフである。
【図１１】図１１は、バイオセンサ装置を使用してターゲット分析物を検出するためのプロセスを例示する図である。
【図１２】図１２は、機器の斜視図である。
【図１３】図１３は、図１２に例示された機器の上面図である。
【図１４】図１４は、１４−１４に示された線に沿って切られた図１３の断面図である。
【図１５】図１５は、機器の底面図である。
【図１６】図１６は、機器の正面図である。
【図１７】図１７は、フローセルの底部斜視図である。
【図１８】図１８は、図１７に例示されたフローセルの上部斜視図である。
【配列表】
2005515468.tif 000004
2005515468.tif 000005
2005515468.tif 000006
2005515468.tif 000007
【図１】
2005515468.tif 000008
【図２】
2005515468.tif 000009
【図３】
2005515468.tif 000010
【図４】
2005515468.tif 000011
【図５】
2005515468.tif 000012
【図６】
2005515468.tif 000013
【図７】
2005515468.tif 000014
【図８】
2005515468.tif 000015
【図９】
2005515468.tif 000016
【図１０】
2005515468.tif 000017
【図１１】
2005515468.tif 000018
【図１２】
2005515468.tif 000019
【図１３】
2005515468.tif 000020
【図１４】
2005515468.tif 000021
【図１５】
2005515468.tif 000022
【図１６】
2005515468.tif 000023
【図１７】
2005515468.tif 000024
【図１８】
2005515468.tif 000025
【国際調査報告】
2005515468.tif 000026
2005515468.tif 000027