(57)【要約】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と、ＨＣＶ抗原に応答して産生した抗体との同時検出のための方法に関する。さらに、本発明は、感染の初期急性期において、さらには抗体の産生前においても、抗原を検出することを可能にし、それにより、感染した血液および血液製剤の初期検出を可能にして、血液供給の安全性を向上させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中の少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と少なくとも１つのＨＣＶ抗体とを同時に検出する方法であって、
ａ）該試験サンプルを、１）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相上にコートされた、少なくとも１つのＨＣＶウイルス抗原またはその一部と、および２）抗原／抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、該固相上にコートされた、ＨＣＶに対する少なくとも１つの抗体またはその一部と、接触させる段階、
ｂ）該抗体／抗原複合体を検出する段階（該複合体の存在は、該試験サンプル中のＨＣＶ抗原の存在を示す）、および
ｃ）該抗原／抗体複合体を検出する段階（該複合体の存在は、該試験サンプル中のＨＣＶ抗体の存在を示す）
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
該固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５およびそれらの一部よりなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該固相上にコートされた少なくとも１つの抗体が、１３−９５９−２７０、１４−１２６９−２８１、１４−１２８７−２５２、１４−１５３−２３４、１４−１５３−４６２、１４−１７０５−２２５、１４−１７０８−２６９、１４−１７０８−４０３、１４−１７８−１２５、１４−１８８−１０４、１４−２８３−１１２、１４−６３５−２２５、１４−７２６−２１７、１４−８８６−２１６、１４−９４７−１０４、１４−９４５−２１８、１０７−３５−５４、１１０−８１−１７、１３−９７５−１５７、１４−１３５０−２１０、Ｃ１１−３、Ｃ１１−７、Ｃ１１−１０、Ｃ１１−１４およびＣ１１−１５よりなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該固相上にコートされた少なくとも１つの抗体が、該固相上にコートされた少なくとも１つの抗原に対して反応性ではない、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記の少なくとも１つの抗体が、ＨＣＶ抗コアモノクローナル抗体であり、前記の少なくとも１つの抗原が組換えＨＣＶコアタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該組換えコアタンパク質が、該抗コアモノクローナル抗体が結合するエピトープを含有しない、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該固相が微粒子である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原および少なくとも１つのＨＣＶ抗体の存在を同時に検出するための方法であって、
ａ）該試験サンプルを、１）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶウイルス抗原またはその一部と、および２）抗原／抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、該固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体またはその一部と接触させる段階、
ｂ）生じた抗体／抗原複合体に、コンジュゲート（該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうる化学発光性化合物に結合した第２抗体を含む）を、該コンジュゲートが（ａ）（１）における結合抗体に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加え、同時に、生じた抗原／抗体複合体に、第２コンジュゲート（該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうる化学発光性化合物に結合した第３抗体を含む）を、該コンジュゲートが（ａ）（２）における結合抗原に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加える段階、および、
ｃ）生成したシグナルを検出する段階
を含んでなり、
該シグナルの存在が、ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ抗原よりなる群から選ばれる該試験サンプル中の少なくとも１つの抗原の存在を示す、前記方法。
【請求項９】
該固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５およびそれらの一部よりなる群から選ばれる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該固相上にコートされた少なくとも１つの抗体が、１３−９５９−２７０、１４−１２６９−２８１、１４−１２８７−２５、１４−１５３−２３４、１４−１５３−４６２、１４−１７０５−２２５、１４−１７０８−２６９、１４−１７０８−４０３、１４−１７８−１２５、１４−１８８−１０４、１４−２８３−１１２、１４−６３５−２２５、１４−７２６−２１７、１４−８８６−２１６、１４−９４７−１０４、１４−９４５−２１８、１３−９７５−１５７および１４−１３５０−２１０、１０７−３５−５４、１１０−８１−１７、Ｃ１１−３、Ｃ１１−７、Ｃ１１−１０、Ｃ１１−１４およびＣ１１−１５よりなる群から選ばれるモノクローナル抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該固相上にコートされた少なくとも１つのモノクローナル抗体が、該固相上にコートされた少なくとも１つの抗原に対して反応性ではない、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ａ）固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗原を含有する容器と、
ｂ）固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体を含有する容器とを含んでなるキット。
【請求項１３】
１）固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗原と、２）該固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体とを含有する容器を含んでなるキット。
【請求項１４】
結合したシグナル生成化合物を含む少なくとも１つのコンジュゲートを更に含む、請求項１２または請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
該シグナル生成化合物がアクリジニウムである、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原を検出する方法であって、
ａ）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体と該試験サンプルとを接触させる段階、および
ｂ）抗体／抗原複合体の存在を検出する段階
を含んでなり、該複合体の存在が該試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原の存在を示す、前記方法。
【請求項１７】
試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原を検出する方法であって、
ａ）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体と該試験サンプルとを接触させる段階、
ｂ）生じた抗体／抗原複合体にコンジュゲート（該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうる化学発光性化合物に結合した第２抗体を含む）を、該コンジュゲートが少なくとも１つの結合抗体に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加える段階、および、
ｃ）該化学発光性化合物により生成されたシグナルを検出する段階
を含んでなり、該化学発光性化合物により生成されたシグナルが該試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原の存在を示す、前記方法。
【請求項１８】
配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６およびそれらの同類アミノ酸置換体よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなる組換えタンパク質。
【請求項１９】
例えば配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号１５よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含んでなる組換えタンパク質。
【請求項２０】
配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号１５よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含んでなるベクターまたは構築物。
【請求項２１】
請求項２０記載のベクターまたは構築物を含んでなる宿主細胞。
【請求項２２】
試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原と少なくとも１つのＨＣＶ抗体とを同時に検出するイムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と、ＨＣＶ抗原に応答して産生した抗体との同時検出のための方法に関する。さらに、本発明は、感染の初期急性期において、さらには抗体の産生前においても、抗原を検出することを可能にし、それにより、感染した血液および血液製剤の初期検出を可能にして、血液供給の安全性を向上させる。
【背景技術】
【０００２】
世界中で１億７千万人がＨＣＶに感染しており、それらの感染例の５０％以上で、その感染は慢性であることが、最近の疫学的研究から示されている。米国では、約４００万人が感染しており、毎年３０，０００の新たな感染が生じていると推定されている（ＮＩＨ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌ  １：２Ｓ（１９９７））。また、ＨＣＶは、米国において毎年８，０００〜１０，０００人の死亡の原因となっており、肝臓移植に関する主要な指標となっている。
【０００３】
ＨＣＶゲノムは、約９４００〜９５００ヌクレオチド長である正の極性の一本鎖ＲＮＡ分子である。コード領域の構造は、他のフラビウイルス属［Ｍａｊｏｒら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２５：１５２７（１９９７）］および最近発見されたＧＢウイルス［Ｍｕｅｒｈｏｆｆ  ＡＳら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：５６２１（１９９５）］のものに類似している。ＨＣＶゲノムは、個々の分離体に応じて３０１０〜３０３３アミノ酸であるポリタンパク質前駆体をコードする大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する［Ｃｈｏｏら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２４５１（１９９１）；Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：１３８５（１９９３）］。ＨＣＶ構造遺伝子（コアおよびエンベロープ）は、そのゲノムの５’末端付近にコードされており、それに続いてプロテアーゼおよびヘリカーゼ、ヘリカーゼ補因子およびレプリカーゼがコードされている。非コード領域（ＮＣＲ）は、複製に重要だと考えられており、該ゲノムの両端に見出される。
【０００４】
ＨＣＶの感染は、主として、非経口的曝露、すなわち、注射針の共用、刺青、または汚染された血液もしくは血液製剤の輸血により生じる。曝露後、該ウイルスは感受性肝細胞に侵入し、ウイルスの複製が生じる。約１０日間の暗黒期があり、その間は、ウイルスの存在の証拠は全く認められず（すなわち、ウイルスＲＮＡを検出することができない）、血清トランスアミナーゼ値は正常限界内であり、ＨＣＶに対する免疫応答の証拠は全く認められない［Ｂｕｓｃｈら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０：１４３（２０００）］。典型的には、曝露の約１０日後に、血清１ｍｌ当たり１００，０００〜１２０，０００，０００  ＨＣＶ  ＲＮＡコピーのウイルス負荷をしばしば有するＨＣＶ  ＲＮＡが検出されうる。数週間後、典型的には、肝臓の炎症を示すＡＬＴ値の上昇が認められる。抗体は、平均して、曝露の約７０日後に検出される。
【０００５】
ＨＣＶ感染の広がりを抑制するために用いる予防手段の１つは、ＨＣＶに対する抗体の検出により又は血清／血漿中のウイルス特異的分子（例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡまたはＨＣＶコアタンパク質）の検出により、ＨＣＶに対する曝露に関して血液をスクリーニングすることである。ＨＣＶに曝露されたことがこれらの試験により確認された個体に由来する血液または血液製剤は血液供給から除外され、被投与者への血液製剤の配給には利用されない（例えば、米国特許第６，１７２，１８９号を参照されたい）。これらの試験は、ＨＣＶ感染に起因する肝疾患を診断するために臨床場面において利用することも可能である。
【０００６】
天然の無傷ＨＣＶビリオンを利用することができないため、血清学的抗体試験は、該ウイルスポリタンパク質の選択された断片に相当する組換え抗原または合成ペプチドに基づいている。第１世代の抗ＨＣＶスクリーニング試験は、非構造的ＮＳ−４タンパク質（Ｃ１００−３）中の配列に由来する組換えタンパク質（ＨＣＶ遺伝子型１ａ）に対する抗体の検出に基づくものであった［Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３５９（１９８９）；Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３６２（１９８９）］。第１世代のアッセイでは、慢性ＨＣＶ感染を有する個体の約１０％および急性ＨＣＶ感染を示す個体の１０〜３０％までにおいては、抗体を検出することができなかった。第２世代の抗ＨＣＶアッセイは、コア、ＮＳ３およびＮＳ４タンパク質からのアミノ酸配列を含む、３つの異なるＨＣＶゲノム領域からの組換えタンパク質（ＨＣＶ遺伝子型１ａ）を含んでいて［Ｍｉｍｍｓら，Ｌａｎｃｅｔ  ３３６：１５９０（１９９０）；Ｂｒｅｓｔｅｒｓら，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ６２：２１３（１９９２）］、ＨＣＶに感染した献血者の同定において第１世代の試験に対する顕著な改善をもたらした［Ａａｃｈら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２５：１３２５（１９９１）；Ｋｌｅｉｎｍａｎら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３２：８０５（１９９２）］。第２世代のアッセイは、慢性ＨＣＶの症例の約１００％において［Ｈｉｎｏ  Ｋ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７：７７（１９９４）］、また、感染後１２週間までの急性症例の約１００％において［Ａｌｔｅｒら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２７：１８９９（１９９２）；Ｂｒｅｓｔｅｒｓら，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ６２：２１３（１９９２）］、抗体を検出する。第３世代の試験は、ＮＳ５領域からのアミノ酸配列とコア、ＮＳ３およびＮＳ４からの抗原とを表現する組換えタンパク質を含む。いくつかの研究は、第３世代の試験を第２世代の試験と比較した場合、感度における若干の改善を示しているが［Ｌｅｅら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３５：８４５（１９９５）；Ｃｏｕｒｏｕｃｅら  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３４：７９０−７９５（１９９４）］、この改善は、主として、ＮＳ５が含まれていることよりもむしろＮＳ３タンパク質における変化に起因する［Ｃｏｕｒｏｕｃｅら，Ｌａｎｃｅｔ  ３４３：８５３（１９９４）］。
【０００７】
一般に、第２および第３世代のＨＣＶ抗体試験は、ＨＣＶに対する曝露を、曝露の約７０日後に検出する。ＨＣＶは、持続性の、そして多くの場合には生涯にわたる感染を確立するため、ＨＣＶに対する抗体の検出は、ＨＣＶに対する曝露を判定するための非常に効率的な方法の１つである。しかし、抗体試験だけでは、曝露後の最初の７０日間はＨＣＶ感染個体を検出できないことが多い。
【０００８】
既存のＨＣＶ抗原試験は、血清または血漿中のＨＣＶコア抗原の存在の検出に基づくものである。コア（またはヌクレオキャプシド）タンパク質は、ポリタンパク質の最初の１９１アミノ酸を含む。血清中のＨＣＶコア抗原の検出を可能にする２つの異なるタイプの血清学的アッセイが開発されている。一方のアッセイ形態は、セロコンバージョンの前に被検体におけるＨＣＶコア抗原を検出するものであり、献血者のスクリーニングにおいて利用される。もう一方のアッセイ形態は、Ｃ型肝炎患者においてのみ、彼らのＨＣＶ抗体状態とは無関係にコア抗原を検出するものであり、ＨＣＶに対する曝露を診断するために又は抗ウイルス療法をモニターするために臨床検査室において利用される。
【０００９】
セロコンバージョン前の期間に得たサンプルに関する最近のデータが示しているとおり、該ＨＣＶ抗原試験は、抗体試験より有意に早期に、ＨＣＶに対する曝露を検出し［Ａｏｙａｇｉら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７：１８０２（１９９９）；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ７８：８０（２０００）；Ｄａｗｓｏｎら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，ＳＤ１６１，４０（２０００）；Ｍｕｅｒｈｏｆｆら，７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ，２０００年１２月３〜７日］、セロコンバージョン前の期間においてＨＣＶに対する曝露を検出するための、核酸試験に代わる方法に相当する。ＨＣＶ抗原検出の利点としては、試験が迅速であり、簡便であり、サンプル抽出または他の前処理が必ずしも必要ではなく、ＨＣＶ  ＲＮＡ試験の場合と比べて処理上の過誤（例えば、汚染）が生じる可能性が低いことが挙げられる。
【００１０】
臨床検査室においては、該ＨＣＶ抗原試験は、異なるＨＣＶ遺伝子型に感染した患者におけるＨＣＶに対する曝露の検出において［Ｄｉｃｋｓｏｎら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１５１２（１９９９）］及び抗ウイルス療法のモニターにおいて［Ｔａｎａｋａら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２：３８８（２０００）；Ｔａｎａｋａら，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２３：７４２（１９９５）］、ＨＣＶ  ＤＮＡ試験と比較しうる感度を有する。したがって、ＨＣＶコア抗原試験は、献血者をスクリーニングするための又は抗ウイルス療法をモニターするための、ＨＣＶ  ＲＮＡに代わる実用的な方法となる。
【００１１】
本発明のユニークさは、それがＨＣＶ抗体とＨＣＶ抗原とを同時に検出しうることにある（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ９９／０４１２９も参照されたい）。この組合せ試験、すなわち「コンボ（ｃｏｍｂｏ）」アッセイは、セロコンバージョン前の「ウィンドウ期間」においてＨＣＶに対する曝露を同定するための抗原検出と、セロコンバージョン後にＨＣＶに対する曝露を同定するための抗体検出とを利用する。
【００１２】
本明細書中に言及するすべての米国特許および刊行物の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、試験サンプル中の少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と少なくとも１つのＨＣＶ抗体とを同時に検出する方法であって、ａ）該試験サンプルを、１）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相（例えば、微粒子）上にコートされた、少なくとも１つのＨＣＶウイルス抗原またはその一部と、および２）抗原／抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、該固相上にコートされた、ＨＣＶに対する少なくとも１つの抗体またはその一部と接触させる段階、ｂ）該抗体／抗原複合体を検出する段階（該複合体の存在は、該試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原の存在を示す）、およびｃ）該抗原／抗体複合体を検出する段階（該複合体の存在は、該試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗体の存在を示す）を含んでなる方法を含む。該固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗原は、例えば、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５およびそれらの一部（または断片）でありうる。該固相上にコートされた少なくとも１つの抗体は、例えば、１３−９５９−２７０、１４−１２６９−２８１、１４−１２８７−２５２、１４−１５３−２３４、１４−１５３−４６２、１４−１７０５−２２５、１４−１７０８−２６９、１４−１７０８−４０３、１４−１７８−１２５、１４−１８８−１０４、１４−２８３−１１２、１４−６３５−２２５、１４−７２６−２１７、１４−８８６−２１６、１４−９４７−１０４、１４−９４５−２１８、１０７−３５−５４、１１０−８１−１７、１３−９７５−１５７、１４−１３５０−２１０、Ｃ１１−３、Ｃ１１−７、Ｃ１１−１０、Ｃ１１−１４およびＣ１１−１５よりなる群から選ばれるモノクローナル抗体でありうる。さらに、該固相上にコートされた少なくとも１つのモノクローナル抗体は、好ましくは、該固相上にコートされた少なくとも１つの抗原に対して反応性ではない。特に、前記の少なくとも１つのモノクローナル抗体はＨＣＶ抗コアモノクローナル抗体であることが可能であり、前記の少なくとも１つの抗原は組換えＨＣＶコアタンパク質であることが可能である。該組換えコアタンパク質は、該抗コアモノクローナル抗体が結合するエピトープを含有しない。
【００１４】
また、本発明は、試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原および少なくとも１つのＨＣＶ抗体の存在を同時に検出するための方法であって、ａ）該試験サンプルを、１）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相（該固相は例えば微粒子である）上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶウイルス抗原またはその一部と、および２）抗原／抗体複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、該固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体またはその一部と接触させる段階、ｂ）生じた抗体／抗原複合体に第１コンジュゲート［該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうる標識（例えば、化学発光性化合物）に結合した第２抗体（例えば、マウス抗ヒトＩｇＧ）を含む］を、該コンジュゲートが（ａ）（１）における結合抗体に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加え、同時に、生じた抗原／抗体複合体に、第２コンジュゲート［該第２コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうる標識（例えば、化学発光性化合物）に結合した第３抗体（例えば、Ｃ１１−１０のような抗ＨＣＶコア抗原に対するモノクローナル抗体）を含む］を、該第２コンジュゲートが（ａ）（２）における結合抗原に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加える段階、およびｂ）生成したシグナルの存在を検出する段階を含んでなり、該シグナルの存在が、該試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原または少なくとも１つのＨＣＶ抗原の存在を示すことを特徴とする方法を含む。この場合もまた、該固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗原は、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５およびそれらの一部よりなる群から選ばれうる。該固相上にコートされた少なくとも１つの抗体は、例えば、１３−９５９−２７０、１４−１２６９−２８１、１４−１２８７−２５２、１４−１５３−２３４、１４−１５３−４６２、１４−１７０５−２２５、１４−１７０８−２６９、１４−１７０８−４０３、１４−１７８−１２５、１４−１８８−１０４、１４−２８３−１１２、１４−６３５−２２５、１４−７２６−２１７、１４−８８６−２１６、１４−９４７−１０４、１４−９４５−２１８、１３−９７５−１５７、１４−１３５０−２１０、１０７−３５−５４、１１０−８１−１７、Ｃ１１−３、Ｃ１１−７、Ｃ１１−１０、Ｃ１１−１４およびＣ１１−１５よりなる群から選ばれうる。さらに、該固相上にコートされた少なくとも１つのモノクローナル抗体は、好ましくは、該固相上にコートされた少なくとも１つの抗原に対して反応性ではない。
【００１５】
また、本発明は、ａ）固相（該固相は、例えば微粒子である）上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗原を含有する容器と、およびｂ）固相（該固相は、好ましくは微粒子である）上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体とを含有する容器を含んでなるキットを含む。
【００１６】
本発明はまた、１）固相（該固相は、好ましくは微粒子である）上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗原と、および２）該固相上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体とを含有する容器を含んでなるキットを含む。該キットは更に、ＨＣＶ抗原またはＨＣＶ抗体に結合したシグナル生成化合物を含む少なくとも１つのコンジュゲートを含みうる。該シグナル生成化合物は、例えば、アクリジニウムまたはアクリジニウム含有化合物でありうる。
【００１７】
また、本発明は、試験サンプル中のＨＣＶ抗原を検出する方法であって、ａ）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相（該固相は微粒子である）上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体（例えば、モノクローナル抗体）と該試験サンプルとを接触させる段階、およびｂ）抗体／抗原複合体の存在を検出する段階を含んでなり、該複合体の存在が該試験サンプル中の抗原の存在を示すことを特徴とする方法を含む。
【００１８】
本発明はまた、試験サンプル中のＨＣＶ抗原を検出する方法であって、ａ）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間にわたり及び条件下、固相（該固相は、好ましくは微粒子である）上にコートされた少なくとも１つのＨＣＶ抗体（例えば、モノクローナル抗体）と該試験サンプルとを接触させる段階、ｂ）生じた抗体／抗原複合体にコンジュゲート［該コンジュゲートは、検出可能なシグナルを生成しうる標識（例えば、化学発光性化合物）に結合した第２抗体（例えば、マウス抗ヒトＩｇＧ）を含む］を、該コンジュゲートが少なくとも１つの結合抗体に結合するのに十分な時間にわたり及び条件下で加える段階、およびｃ）該標識（例えば、化学発光性化合物）により生成されたシグナルを検出する段階を含んでなり、該標識により生成されたシグナルが該試験サンプル中の抗原の存在を示すことを特徴とする方法を含む。
【００１９】
また、本発明は、例えば配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）６、配列番号８、配列番号１２および配列番号１６よりなる群から選ばれるアミノ酸配列ならびにこれらの配列の同類アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含んでなる組換えタンパク質を含む（同類アミノ酸置換は、配列の機能を変化させない、該配列中の１以上のアミノ酸の置換と定義される）。本発明はまた、例えば配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号１５よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含んでなる組換えタンパク質を含む（該配列にコードされるタンパク質に機能的に影響を及ぼさない、該配列中の置換、欠失および付加も、本発明の範囲内であるとみなされる）。
【００２０】
また、本発明は、例えば配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号１５よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含んでなるベクターまたは構築物を含む。本発明はまた、該ベクターまたは構築物を含んでなる宿主細胞を含む。
【００２１】
さらに、本発明は、試験サンプル中の少なくとも１つのＨＣＶ抗原または少なくとも１つのＨＣＶ抗体を同時に検出しうるイムノアッセイを含む。
【００２２】
発明の詳細な記載
本発明は、生物学的サンプル中のＨＣＶの抗原およびＨＣＶに対する抗体を同時に検出するために使用しうる種々の方法に関する。したがって、個体が、被検生物学的サンプル中に、ＨＣＶに対する特異的抗体を産生している、および／または、ＨＣＶ特異的抗原を有する場合、本発明の方法は陽性結果を与える。そのような結果は、例えば、感染（すなわち、急性または慢性）の存在および状態に関して患者を診断するために並びに輸血のための献血または血液製剤サンプルの適合性を判定するために用いることができる。
【００２３】
また、本発明は、個体がＨＣＶに感染しているが抗体を未だ産生していない可能性がある「ウィンドウ期間」（すなわち、感染後５０〜６０日間）に関連した問題を克服するものである。そのような個体は、この期間にＨＣＶを他者に伝染しうる。したがって、この「ウィンドウ期間」にＨＣＶを検出することにより、本発明は、抗体の産生を待つのとは対照的に、ＨＣＶの迅速な診断を可能にし、血液供給における汚染を予防する。
【００２４】
本発明の１つの実施形態においては、ＨＣＶウイルス抗原（例えば、コア、Ｎ３、Ｎ４およびＮ５）またはその一部を固相上にコートする（または液相中に配置する）。ついで該試験または生物学的サンプル（例えば、血清、血漿、尿など）を該固相と接触させる。該サンプル中に抗体が存在すれば、そのような抗体が該固相上の抗原に結合し、ついで直接的または間接的方法により検出される。該直接的方法は、該複合体自体の存在、したがって該抗体の存在を単に検出することを含む。該間接的方法においては、コンジュゲートを該結合抗体に加える。該コンジュゲートは、シグナル生成化合物または標識に結合した、第１抗体に結合する第２抗体を含む。第２抗体が結合第１抗体に結合すると、シグナル生成化合物は、測定可能なシグナルを生成する。したがって、そのようなシグナルは試験サンプル中の第１抗体の存在を示す。
【００２５】
診断イムノアッセイにおいて使用する固相の具体例としては、多孔性および非多孔性物質、ラテックス粒子、磁性粒子、微粒子（米国特許第５，７０５，３３０号を参照されたい）、ビーズ、膜、マイクロタイタープレートおよびプラスチックチューブが挙げられる。所望により、固相物質、および該コンジュゲート中に存在する抗原または抗体を標識する方法の選択を、所望のアッセイ形態の性能特性に応じて決定する。
【００２６】
前記のとおり、該コンジュゲート（または指示試薬）は、シグナル生成化合物または標識に結合した抗体（または、該アッセイに応じて、抗抗体であるかもしれない）を含む。このシグナル生成化合物または「標識」はそれ自体が検出可能であるか、または１以上の追加的化合物と反応して検出可能な産物を生成しうる。シグナル生成化合物の具体例には、色素原、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１４Ｃ）、化学発光性化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視性または蛍光性）、核酸、錯化剤または触媒、例えば酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼおよびリボヌクレアーゼ）が含まれる。酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）を使用する場合には、色素原、蛍光原または発光原基質の添加により、検出可能なシグナルが生成する。他の検出系、例えば、時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）およびラマン分光も有用である。
【００２７】
前記イムノアッセイにより試験されうる生物学的流体の具体例には、血漿、尿、全血、乾燥全血、血清、脳脊髄液、唾液、涙、鼻洗浄液、または組織および細胞の水性抽出物が含まれる。
【００２８】
該抗体が検出されるのと同時に、ＨＣＶ抗原も検出される。したがって、本発明では、２つの異なる試験を実施する必要がない。これは、ＨＣＶに対する特異的抗体（例えば、コアに対するヒトまたは動物モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体など）でコートされた固相（または液相）に該試験サンプルをさらすことにより達成される。抗原は、該サンプル中に存在すれば、該固相に結合し、ついで前記の直接的または間接的方法により検出されうる。より詳しくは、該間接的方法は、標識またはシグナル生成化合物に結合した第２抗体（これは結合抗原に結合する）を含むコンジュゲートの添加を含む。第２抗体が結合抗原に結合すると、試験サンプル中のＨＣＶ抗原の存在を示す検出可能なシグナルが生成する。
【００２９】
固相上にコートされた抗体および「第２抗体」は、前記のとおり、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。例えば、モノクローナル抗体を使用することを選択すれば、それらは、アボット（Ａｂｂｏｔｔ）モノクローナル抗体１３−９５９−２７０、１４−１２６９−２８１、１４−１２８７−２５２、１４−１５３−２３４、１４−１５３−４６２、１４−１７０５−２２５、１４−１７０８−２６９、１４−１７０８−４０３、１４−１７８−１２５、１４−１８８−１０４、１４−２８３−１１２、１４−６３５−２２５、１４−７２６−２１７、１４−８８６−２１６、１４−９４７−１０４および１４−９４５−２１８よりなる群から選ばれうる。本発明の目的のために、以下の抗コアモノクローナル抗体を使用することも可能である：１０７−３５−５４、１１０−８１−１７、１３−９７５−１５７、１４−１３５０−２１０（米国特許第５，７５３，４３０号を参照されたい）およびＴｏｎｅｎ  ＨＣＶコアモノクローナル抗体Ｃ１１−３、７、１０、１４および１５（ＰＣＴ出願ＷＯ  ０９９／０６８３６）（これらのすべてはｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９から入手可能である）（モノクローナル抗体を製造しうる方法の考察には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９４を参照されたい；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｒｒｅｌｌ編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８２）に概説されている；Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８３；米国特許第５，７５３，４３０号も参照されたい）。
【００３０】
ＨＣＶコアタンパク質は、該アッセイのＨＣＶ抗原部分の可能な標的の１つでありうることに注目すべきである。より詳しくは、該コアタンパク質の検出は、該コアタンパク質中のエピトープに対するモノクローナル抗体を使用することにより達成される。これらの抗コアモノクローナル抗体を該固相上に配置し、試験サンプルからのコア抗原タンパク質の捕捉を促進させる。試験サンプル中のＨＣＶ抗体の検出のためには、組換えＨＣＶコアタンパク質も該固相上に配置する。しかし、抗原試験のための標的として及び抗体検出のための捕捉試薬として単一のタンパク質を使用することに伴う重要な問題があること、すなわち、該固相上にコートされた抗コアモノクローナル抗体とコア抗原との間の有意な「交差反応性」に注目すべきである。これは、試験サンプルの非存在下であっても、偽陽性シグナルを生成する。なぜなら、該モノクローナル抗体が、該組換えタンパク質上に存在するエピトープに結合するからである。
【００３１】
そのような交差反応性を避けるために、該アッセイの抗体検出部分に使用するコアタンパク質を修飾して、ＨＣＶコアへの抗コアモノクローナル抗体の結合能を除去する。そのような修飾は、エピトープ領域（すなわち、モノクローナル抗体の結合に必要な短いアミノ酸配列）を除去または修飾する組換えＤＮＡ技術を用いて達成することができる。したがって、修飾組換えコアタンパク質を使用すれば、結果的に、感染個体の血清中に存在する抗体が結合する幾つかのヒトエピトープは維持されるが、抗原の捕捉に使用する抗コアモノクローナル抗体は該修飾タンパク質に結合しないであろう。あるいは、ほとんどの感染個体の血清中に存在する抗体に結合することが知られている配列を含むが、ＨＣＶコア抗原を検出するために使用する抗コアモノクローナル抗体により認識されるエピトープを含有する配列を含まないポリペプチドで、該ＨＣＶコア組換えタンパク質を置換することが可能であろう。
【００３２】
より詳しくは、前記のとおり、交差反応性を避けるために、該アッセイにおける抗体の検出にコア抗原を使用することができる。特に、本発明においては、非構造タンパク質（ＮＳ）３、４および／または５（すなわち、ＮＳ３、ＮＳ４および／またはＮＳ５）および／または該コアタンパク質で該固相をコートすることができる。あるいは、本発明においては、（抗体の検出のために）前記ＨＣＶタンパク質またはそのセグメントもしくは一部のいずれかの単体または組合せ体で該固相をコートすることができる。該固相をコートするのに使用する抗原は、単一物または分離した物質として組換えタンパク質として発現された連続した組換えタンパク質として、あるいは単一物または分離した物質として設計された合成ペプチドとして作製されうる。
【００３３】
また、該コンボアッセイにおいてＨＣＶ  Ｅ２に対する抗体を検出することも可能であることに注目すべきである。したがって、抗コア抗体を検出するアッセイの代わりに、本明細書に記載の本アッセイを用いることが可能である。あるいは、そのような抗コア抗体アッセイを、本明細書に記載のコンボアッセイの抗原アッセイ形態で補うことが可能である（ＨＧＢＶ  Ｅ２抗体または抗原の検出に関しては、例えば、米国特許第６，１５６，４９５号を参照されたい）。
【００３４】
前記のとおり、本発明における抗原の検出に関しては、該固相上にコートされたモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、（抗体の検出のために）該固相上で使用するコア抗原を認識するものであってはならない。したがって、例えば、本発明においては、完全抗体またはそのフラグメントを使用することができる（本発明の目的においては、抗体の「フラグメント」または「一部」は、結合特性に関して完全抗体と機能的に同様に反応する該抗体のサブユニットと定義される）。
【００３５】
また、該イムノアッセイにおいて使用する（ＨＣＶ抗原を検出するための）最初の捕捉抗体は、該固相に共有結合または非共有結合（例えば、イオン結合、疎水結合など）されうることに注目すべきである。共有結合のための連結剤は当技術分野で公知であり、固相の一部であることが可能であり、あるいはコートする前にそれに誘導体化されうる。
【００３６】
ＨＣＶ抗体を検出するために該固相を使用する第２の方法は、該コア抗原を完全に除去することを含む。例えば、該固相をＮＳ３、ＮＳ４および／またはＮＳ５、ならびに該コアタンパク質またはその領域の代替物（例えば、Ｅ２）でコートする。一方、抗原の検出のために固相上にコートされる抗体は、ＨＣＶのコアタンパク質に対するものである。
【００３７】
抗原および抗体を同時に検出するために本発明の目的に使用しうる他のアッセイ形態には、例えば、二重（Ｄｕａｌ）アッセイストリップブロット、高速試験（ｒａｐｉｄ  ｔｅｓｔ）、ウエスタンブロット、およびＡｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）アッセイ（Ｆｒａｎｋ  Ｑｕｉｎｎ，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ編，ｐ．３６３−３６７，２００１）における常磁性粒子の使用が含まれる。そのような形態は当業者に公知である。
【００３８】
また、所望により、本発明のアッセイは、ＨＣＶ抗原またはＨＣＶ抗体の両方ではなくそれらの一方のみを検出するためにも使用しうることに注目すべきである。確かに、感染が初期に存在することを確認したい場合には、「ウィンドウ期間」中のように、試験サンプル中の抗原の存在のみを確認することを望むかもしれない。一方、感染の段階（例えば、急性なのか慢性なのか）を確認したい場合には、抗体の存在およびその力価を調べることを望むかもしれない。
【００３９】
また、前記のアッセイの要素はキットの形態での使用に特に適していることに注目すべきである。該キットは、バイアル、ボトルまたはストリップのような１つの容器を含むことが可能であり、この場合、各容器は、予め準備された固相を含有し、他の容器はそれぞれのコンジュゲートを含有する。これらのキットはまた、該アッセイを実施するために必要な他の試薬（例えば、洗浄液、加工および指示試薬）のバイアルまたは容器を含有しうる。
【００４０】
本発明は、以下の非限定的な実施例を用いることにより例示されうる。
【実施例】
【００４１】
実施例Ｉ
モノクローナル抗体により認識されるＨＣＶコアエピトープのマッピング
各モノクローナル抗体が結合するＨＣＶコアタンパク質内の領域を決定するために、一連の重複するビオチン化ペプチドを合成した（表Ｉ）。これらのペプチドは、後記のとおり、ＥＩＡを行うために使用した。後記のものに類似したＥＩＡ法を用いて、すべてのモノクローナル抗体が組換えＨＣＶコア融合タンパク質を検出し得たことに注目すべきである（データ非表示）。
【００４２】
【表１】
2005518186.tif 000002
【００４３】
ポリスチレンビーズのコーティング：
０．２５インチのポリスチレンビーズを、ペプチドＥＩＡの固相として使用した。コーティングに先だって、ビーズを、攪拌することなく、１５％  イソプロパノール（水中）で室温で３０分間洗浄した。イソプロパノールを除去し、該ビーズを脱イオン水で１回すすいだ。ついで、洗浄したビーズを、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で５μｇ／ｍｌに希釈した該ペプチドを含有するバイアルに加えた（０．２３３ｍｌ／ビーズ）。ビーズを、回転させて混合しながら５６℃で２時間インキュベートした。ついでビーズをＰＢＳで３回洗浄し、ついで、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中、回転させて混合しながら４０℃で１時間インキュベートした。ビーズを再びＰＢＳ中で３回洗浄し、ついで５％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中、回転させて混合しながら４０℃で１時間インキュベートした。ビーズをＰＢＳで４回洗浄し、ついで、５％  スクロースを含有するＰＢＳ中、混合せずに室温で２０分間インキュベートした。スクロースバッファーを除去し、ビーズを風乾させた。コートされたビーズを、乾燥した状態で４℃で保存した。
【００４４】
ビーズのコーティングの確認：
該ビオチン化ペプチドが実際に該ビーズ上にコートされたかどうかを確認するために、アッセイを行った。該アッセイにおいては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（２００〜４００ｎｇ／ｍｌ）を含有するバッファー中でビーズをインキュベートした。ついで該ビーズを脱イオン水で洗浄し、基質を加えた。生成物は、４９２ｎｍの吸光度によって検出された。このアッセイにより、表Ｉのすべてのペプチドが該ポリスチレンビーズ上にコートされたことが示された（データ非表示）。
【００４５】
ＨＣＶペプチドＥＩＡ：
組換えＨＣＶコアタンパク質に対して産生させたモノクローナル抗体（実施例Ｉを参照されたい）を、以下のとおりに、ペプチドコート化ビーズのそれぞれに結合するそれらの能力について試験した。モノクローナル抗体をサンプル希釈バッファー（２０％  ヤギ血清、１０％  仔ウシ血清、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびアジ化ナトリウムを含有するＴｒｉｓバッファー）で５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、その０．２ｍｌを、該ペプチドコート化ビーズを含有する反応ウェルに加え、混合しながら室温で２時間インキュベートした。ついでビーズを脱イオン水で洗浄し、ついで、０．２ｍｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（０．３μｇ／ｍｌ）を加えた。ビーズを、混合しながら室温で６０分間インキュベートした。ビーズを脱イオン水で洗浄し、０．３ｍｌのＯＰＤ（０．０２％  Ｈ２Ｏ２を含有するクエン酸バッファー中の０．３％  Ｏ−フェニレンジアミン−２ＨＣｌ）基質を加えたプラスチックチューブへ移し、混合せずに暗室中、室温で３０分間インキュベートした。１ｍｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応をクエンチし、４９２ｎｍでのＯＤを測定した。該吸光度は、該ビーズに結合した抗体の量に正比例する。
【００４６】
モノクローナル抗体のペプチドマッピング：
前記のアッセイを用いて、該モノクローナル抗体のそれぞれを、該ＨＣＶコア由来ペプチドコート化ビーズのそれぞれに結合するそれらの能力についてアッセイした。モノクローナル抗体が特定のペプチドコート化ビーズに結合することが判明した場合には、該モノクローナル抗体の１０倍系列希釈を行い、ついでそれらを、同じペプチドへの結合についてアッセイした。これにより、各モノクローナル抗体の結合特異性の決定が可能となった。表ＩＩに示す結果は、結合（バックグラウンドの少なくとも３倍の吸光度）を示したモノクローナル抗体の最低希釈度を示す。
【００４７】
【表２】
2005518186.tif 000003
【００４８】
実施例ＩＩ
モノクローナル抗体のエピトープマッピング
Ａ．ＨＣＶ遺伝子断片ライブラリーの調製
ランダムなエピトープコード化断片を得るために、ＨＣＶのＨ系統（Ｏｇａｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３３９２−３３９６（１９９１））のヌクレオチド１４−５２９５をｐＧＥＭ−９Ｚｆ（−）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中に含有するプラスミドを、以下の方法によりＤＮアーゼＩを使用して部分消化した。
【００４９】
プラスミドＤＮＡの５μｇ  アリコートを、０．１単位から０．７単位までのいずれかの量のＤＮアーゼＩの存在下、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２中、１５℃で１０分間インキュベートした。各消化からのアリコートをアガロースゲル電気泳動により分析した。０．６および０．７単位のＤＮアーゼＩを含有する２つの消化混合物が、５０〜２００ｂｐの範囲の最大量の断片を与えることが判明した。これらの２つの混合物をプールし、等容量のフェノール−クロロホルム（１：１，ｖ／ｖ）で１回抽出し、ついで１／１０容量の３Ｍ  酢酸ナトリウムおよび２．５容量の１００％  エタノールを加えて沈殿させ、続いて１４，０００×ｇで１０分間遠心分離した。ついでＰＣＲ  Ｐｏｌｉｓｈｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を該製造業者の説明に従い使用して、該ＤＮＡ分子の末端を平滑化した。該ＤＮＡを、前記のとおりに再び抽出し沈殿させ、続いてＴ４ＤＮＡリガーゼキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を該製造業者の指示通りに使用して、１０μｌの反応容量中、二本鎖アダプターに連結した。この二本鎖アダプターの配列は以下のとおりであった。
【００５０】
【化１】
2005518186.tif 000004
【００５１】
ついで該アダプターのセンス鎖オリゴヌクレオチド（配列番号１）を、その配列に無関係にすべてのＤＮＡが増幅されるよう、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。この方法は、Ａｋｏｗｉｔｚら，Ｇｅｎｅ  ８１：２９５−３０６（１９８９）およびＲｅｙｅｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ５：４７３−４８１（１９９１）に記載の方法の変法である。１００μｌの反応容量中、該センス鎖オリゴヌクレオチドプライマー（最終濃度１μＭ）の存在下、ＰＥ−９６００サーモサイクラー中でＧｅｎｅＡｍｐ  Ｇｏｌｄ  ＰＣＲキット（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を該製造業者の指示通りに使用してＰＣＲを行った。９４℃で８分間プレインキュベーションをし、ついで以下のとおりにＰＣＲを２５サイクル行った：９４℃で２０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で１．０分間の伸長。これについで、７２℃で１０分間の最終伸長工程を行った。該ＰＣＲ産物を前記のとおりに抽出し沈殿させた。全ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル上で泳動させ、約７０〜２５０ｂｐのＤＮＡ断片を含有するゲル片を取り出した。ＱＩＡＥＸ  ＩＩキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を該製造業者の説明に従い使用して、該ＤＮＡを該ゲル片から抽出した。制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を該製造業者の指示通りに使用して、該ＤＮＡを消化した。ついで、消化したＤＮＡを前記のとおりに抽出し沈殿させた。
【００５２】
Ｔ７  Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）をＥｃｏＲＩで消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で脱リン酸化した（これは該製造業者の指示通りに行った）。サイズにより選択された消化ＤＮＡ断片（３０ｎｇ）（前掲）を、１６℃で一晩、５μｌの反応容量中、０．５μｇの消化されたＴ７  Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂに連結させた。該全連結体を、Ｔ７  Ｓｅｌｅｃｔパッケージングエクストラクト（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してファージ頭部にパッケージングし、該製造業者の指示どおりに用いて力価測定した。得られた未増幅ライブラリーは、合計３．９×１０６のメンバー（ＰＦＵ）を含有していた。パッケージングされたファージを、Ｔ７  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）による指示通りに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＴ５４０３（２０ｍｌ培養液）内で液体溶菌増幅により増幅した。増幅されたライブラリーは１．３×１０１１  ＰＦＵ／ｍｌの力価を有していた。
【００５３】
Ｂ．ＨＣＶ遺伝子断片ライブラリーのバイオパンニング
バイオパンニングに使用する各モノクローナル抗体（２０μｇ）を、３００μｌのブロッキングバッファー（２％  ＢＳＡ、３％  脱脂粉乳、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０２％  アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水）中、回転振とう機上で４℃で４時間インキュベートした。該モノクローナル抗体のインキュベート中に、約１０１１個のファージを含有する増幅されたＨＣＶ遺伝子断片ライブラリー（前掲）のアリコートを以下のとおりに沈殿させた。１／１０容量の５Ｍ  ＮａＣｌを該ファージに加え、よく混合し、ついで１／６容量のポリエチレングリコール（ＭＷ  ８０００）を加え、再びよく混合し、氷上で１〜２時間インキュベートした。該ファージを室温で６０００×ｇで１０分間遠心分離をし、全上清を除去し、該ファージペレットを１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するバッファー１２０μｌに激しく再懸濁した。該ファージを、プレインキュベートされたモノクローナル抗体に加え、回転振とう機上で４℃で一晩インキュベートした。
【００５４】
翌朝、該抗体―ファージ複合体を、以下のとおりに、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）に結合した常磁性粒子上に捕捉した。ヤギ抗マウス（Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ  Ｆｃ  ＢｉｏＭａｇ粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）の０．２ｍｌ  アリコートを、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％  ＢＳＡ、０．０２％  アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）０．４ｍｌで、穏やかにボルテックスすることにより３回洗浄し、ついで磁気スタンド上で０．５〜１分間捕捉した。該上清を、該粒子をかき乱さないように注意深く除去した。ついで粒子を、前記の一晩のインキュベート物からのＩｇＧ−ファージ中に再懸濁し、回転振とう機上、室温で３時間インキュベートした。粒子を、前記のとおりに、１回の洗浄につき、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ  ６．０ｍｌを用いて、６回洗浄した。結合したファージは、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％  ＢＳＡ，１．０％  ＳＤＳを含有するＰＢＳ  ０．２ｍｌを用いて、回転振とう機上、室温で９０分間溶出した。該チューブを磁気スタンド上に１〜２分間配置し、ついで、該溶出ファージを含有する上清を清潔なチューブに移した。溶出ファージを含有するサンプルを、Ｔ７  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌの指示通りに力価測定した。
【００５５】
該溶出ファージを以下のとおりに増幅した。１０ｍｌのＬＢブロス（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）＋１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＴ５４０３を接種し、それを、振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、３５ｍｌのＬＢブロス＋１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン、１×Ｍ９塩、０．４％  グルコース、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４に該一晩培養物の０．２ｍｌを接種し、それを、Ａ６００吸光度が０．５〜０．６になるまで、振とうしながら３７℃でインキュベートした。第１ラウンドのバイオパンニング（前掲）からの溶出ファージ（１８５μｌ）を加え、該培養物のＡ６００吸光度が約０．５（これは溶菌を示す）に低下するまで、３７℃でのインキュベートを１．５〜２時間継続した。該培養物を８０００×ｇで１０分間遠心分離し、該上清を清潔なチューブに取り、４℃で保存した。該培養液上清を、Ｔ７  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌに指示されているとおりに力価測定した。
【００５６】
バイオパンニングおよび増幅の、後続の１〜２ラウンドは、前記の方法に以下の修飾をして行った。該モノクローナル抗体を４℃で４時間プレブロッキングした後、出発ライブラリーからの１０１１  ＰＥＧ−沈殿ファージの代わり、バイオパンニングの前ラウンドからの増幅ファージ１５０μｌを加えた。さらに、バイオパンニング後に、３５ｍｌの培養物の代わりに２０ｍｌの培養物を使用して該溶出ファージを増幅し、１８５μｌの溶出ファージの代わりに１００μｌの溶出ファージを該培養物に加えた。
【００５７】
Ｃ．ＨＣＶコア含有クローンの選択および配列決定
ＨＣＶヌクレオキャプシドタンパク質のアミノ酸１−１７３をコードするＨＣＶゲノムの領域を含有するＤＮＡ断片を、ハイブリダイゼーションプローブとして利用した。この領域を選択したのは、該バイオパンニング実験で分析したモノクローナル抗体のすべてが該ＨＣＶコアタンパク質内のエピトープを認識するからである。バイオパンニングおよび増幅の２〜３ラウンドから得られたファージを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＴ５４０３上にプレーティングし、プラークが形成されるまで３７℃でインキュベートした。ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）上にトランスファーし、変性させ、中和し、ＵＶ架橋した（これらは該製造業者の指示通りに行った）。該メンブレンを、当技術分野において記載され公知である方法により、ＨＣＶヌクレオキャプシド遺伝子３２Ｐ標識プローブとプレハイブリズさせ、ハイブリダイズさせ、洗浄し、露光した。個々のハイブリダイズしたプラークを単離し、該インサートを、Ｔ７ＳｅｌｅｃｔＵＰおよびＴ７ＳｅｌｅｃｔＤＯＷＮプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をＴ７  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌの指示通りに使用するＰＣＲにより増幅した。各モノクローナル抗体について、独立した３０〜５０個のハイブリダイズしたプラークを増幅し、ついでＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて精製した。精製されたＰＣＲ産物を、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）およびＴ７ＳｅｌｅｃｔＵＰプライマーを用いて、ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで、直接的に配列決定した。特定のモノクローナル抗体を用いたバイオパンニングにより得られた配列のすべてを、ＨＣＶヌクレオキャプシド遺伝子配列と共に整列させ、すべてのクローンにおける重複の最小領域を同定した。この重複領域は、該モノクローナル抗体により認識されるエピトープを決定した。この方法を用いて同定したいくつかのモノクローナル抗体により認識されるエピトープを、表ＩＩＩに示す。
【００５８】
【表３】
2005518186.tif 000005
【００５９】
実施例ＩＩＩ
ＨＣＶコア抗体／抗原組合せアッセイに使用する組換え抗原の構築
Ａ．背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアに対するヒトの免疫応答は、ほとんどの場合、専ら該天然タンパク質のＮ末端半分に対するものである。複数のエピトープ（一定数のアミノ酸（通常＜１０）を含む領域）が、該天然タンパク質の最初の１１５アミノ酸中に同定されている（Ｓａｌｌｂｅｒｇら）。したがって、感染個体の血清中に存在するヒト抗コア抗体の検出のためのアッセイに利用される組換え抗原は、該天然タンパク質のこの部分を含有していれば十分である。逆に、ＨＣＶコアタンパク質の検出のためのインビトロアッセイは、感染個体の血清中に同様に存在する天然コアタンパク質を捕捉し検出するためにマウスモノクローナル抗体を利用する。コア抗原とヒト抗コア抗体との両方を単一のアッセイで同時に検出するための組合せアッセイは、それらの２つのアッセイ形態を兼ね備えたものである。この場合、該血清中に存在するヒト抗コア抗体によって認識されるが、該血清中に同様に存在する天然コア抗原の捕捉および検出に使用するマウスモノクローナル抗体による認識を免れる組換えコア抗原が必要である。該コア抗原内の小領域（１〜３０またはそれ以上のアミノ酸）を除去して、該マウスモノクローナル抗体により認識されるエピトープを破壊または除去し、一方同時に、ヒト抗コア抗体検出を可能にする多数の他のエピトープを無傷のまま残すことにより、そのような組換え体を構築することが可能である。
【００６０】
Ｂ．抗原の構築
構築したこれらの抗原の最初のものは、該組換え体からアミノ酸３２−５０が除去されたＨＣＶアミノ酸８−１００を含有していた。この場合、それぞれアミノ酸３２−３６および４５−５０にあるエピトープに結合する抗体Ｃ１１−１０およびＣ１１−１４（実施例ＩＩ）は、生じた組換え抗原には結合しないであろう。ＨＣＶのＨ系統（Ｏｇａｔａ、前掲（１９９１））からのヌクレオチド３４２−７９１の細菌コドン最適化形態を含有するプラスミドを、ＰＣＲの鋳型として用いた。この配列用に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを、ＨＣＶコア抗原の別々の２つの断片（１＝配列番号１および配列番号２；２＝配列番号３および配列番号４）（一方は該欠失の上流、もう一方は該欠失の下流）を増幅するために使用した。さらに、各断片上の欠失に隣接するオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２および３）は、互いに重複する領域を含有していた。ＰＥ−９６００サーモサイクラー内で、０．５μＭの各オリゴヌクレオチドプライマーおよび３〜５ｐｇのプラスミド鋳型の存在下、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ，Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を該製造業者の指示に従い使用して、ＰＣＲを行った（５０μｌ容量）。９４℃で１分間のプレインキュベーションについで３５サイクルのＰＣＲ（９４℃で２０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長）を行い、ついで７２℃で１０分間の最終伸長を行った。それらの２つの断片の独立した増幅の後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、それぞれを精製し、２５μｌの水中に溶出した。ついで、それらの２つの精製断片（２０μｌの容量の反応液中のそれぞれ１μｌ）を該オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２および配列番号３）内の重複領域において互いに連結するために、ＰＣＲの第２ラウンドを前記のとおりに１０サイクル行った。最後に、該第２ＰＣＲの産物を、０．５μＭの隣接オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１および配列番号４）および前記の条件（１００μｌ容量）を用いる３５サイクルの第３ＰＣＲにおいて増幅した。
【００６１】
Ｃ．組換え発現
該第３ＰＣＲの産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、ついで制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで、隣接オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１および配列番号４）中に取り込まれた該消化部位を消化した。該組換え体をコードする断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで同様に消化された細菌発現ベクターｐＪＯ２００に連結し、ついでＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に形質転換した。適当な大きさにされたインサートを含有するクローンの選択の後に、該組換え体のヌクレオチド配列が確認され（配列番号５）、その推定アミノ酸配列（配列番号６）が示されている（組換えタンパク質の発現の記載については、米国特許第５，３２２，７６９号および米国特許第６，１７２，１８９号を参照されたい）。
【００６２】
Ｄ．他の組換え体
いくつかの他のＨＣＶコア組換え体を前記と同じ方法で構築し、クローニングし、発現した。これらの最初のもの（ヌクレオチド配列配列番号７および対応アミノ酸配列配列番号８を参照されたい）は、アミノ酸３３−３５および４６−４９が欠失したＨＣＶアミノ酸８−１００を含有する。第１  ＰＣＲにおいて２つの断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列番号１および配列番号９、ならびに配列番号１０および配列番号４であった。ついで第３  ＰＣＲにおいて、配列番号１および配列番号４を用いて最終増幅を行った。これらの組換え体の第２のもの（ヌクレオチド配列配列番号１１および対応アミノ酸配列配列番号１２を参照されたい）は、アミノ酸３６のロイシン残基がバリンで置換されアミノ酸４７のアルギニン残基がロイシンで置換されたＨＣＶアミノ酸８−１００をコードする。第１  ＰＣＲにおいて２つの断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列番号１および配列番号１３、ならびに配列番号１４および配列番号４であった。ついで配列番号１および配列番号４を用いて第３  ＰＣＲで最終増幅を行った。最終的に、ＨＣＶアミノ酸８−１００をコードする組換え体（ヌクレオチド配列配列番号１５および対応アミノ酸配列配列番号１６を参照されたい）が、単一のＰＣＲ反応において、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号１および配列番号４を用いて構築された。
【００６３】
実施例ＩＶ
ＨＣＶコア抗体／抗原組合せアッセイにおいて使用する追加的組換え抗原の構築
Ａ．背景
ＨＣＶ抗原／抗体組合せアッセイにおいて使用するために構築した追加的組換え抗原は、該ウイルスのコア領域へ連結されたＨＣＶの３３ｃ領域（アミノ酸１１９２−１４５７）を含有する抗原を含んでいた。そのような構築のために用いた鋳型は、アミノ酸１１９２−１４５７の細菌コドン最適化配列およびそれに続くＨＣＶのＨ系統（Ｏｇａｔａ，１９９１）由来のアミノ酸１−１５０を、それらの２つの配列を分離する２つの非ＨＣＶコード化アミノ酸と共に含有するプラスミドであった。この組換え体（ＨＣ−４３）は、ＨＣＶの検出のための多数の商業的アッセイにおいて常套的に使用される。ＨＣ４３組換え体は、バクテリオファージλのｐＬプロモーターから非融合タンパク質として発現される（ＨＣ４３の考察には、米国特許第５，７０５，３３０号、米国特許第５，６１６，４６０号および米国特許第５，７７３，２１２号を、λｐＬベクター系の考察には、米国特許第６，１５３，３７７号および米国特許第５，８５９，１９３号を参照されたい）。該追加的組換え体は、２つの方法のうちの１つにより構築した。まず、別々の関連した組換え体をコードする既存クローンをＤＮＡライゲーションにより連結して、第３の特有の組換え体を形成させるか、あるいは実施例ＩＩＩ、Ｂ部に記載の連結ＰＣＲにより新規の特有のクローンを構築した。
【００６４】
Ｂ．初期抗原の構築
構築した、より新しい抗原の最初のもの（ｐ９ＭＢ−１８）は、アミノ酸３２−５０が欠失したアミノ酸１−１００（コアタンパク質のセグメントを表す）に連結されたＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７（ＮＳ３のセグメントを表す）を含有していた。この組換え体は、エンドヌクレアーゼＸｍａＩおよびＢａｍＨＩでプラスミドｐＨＣ４３を制限消化することにより構築した。ＸｍａＩはｐＨＣ４３を該コアコード化領域のアミノ酸２４の近傍で切断し、一方、ＢａｍＨＩは翻訳終止コドンの下流で切断する。ｐＨＣ４３のこの領域を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用するＤＮＡライゲーションにより、実施例ＩＩＩに記載の３２−５０が欠失したＨＣＶコアアミノ酸８−１００をコードするｐＪＯ２００ベクター（配列番号５および配列番号６）から得たＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片で置換した。ついで、その新たなプラスミドを、ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を形質転換するために使用した。適当な大きさにされたインサートを含有するクローンの選択後、該組換え体のヌクレオチド配列が確認され（配列番号１７）、その推定アミノ酸配列が配列番号１８に示されている。
【００６５】
Ｃ：連結ＰＣＲにより構築された他の組換え体
連結ＰＣＲにより作製される組換え抗原を、実施例ＩＩＩ、Ｂ部に詳細に記載されているとおりに構築した。これらの組換え体の最初のものであるｐ９ＭＢ−１９（配列番号１９（ヌクレオチド配列）および配列番号２０（アミノ酸配列））は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、およびそれに続く、アミノ酸３２−５０が欠失したアミノ酸８−１００を含有する。第１  ＰＣＲにおいて最初の２つの断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列番号２１および配列番号２２、ならびに配列番号２３および配列番号４であった。第３  ＰＣＲにおける最終増幅では、配列番号２１および配列番号４のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
【００６６】
組換え体ｐ９ＭＢ−２０（配列番号２４および配列番号２５）は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、４個のグリシン残基および１個のセリン残基、およびそれに続く、アミノ酸３２−５０が欠失したＨＣＶアミノ酸８−１００を含有する。第１  ＰＣＲにおいて最初の２つの断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列番号２１および配列番号２２、ならびに配列番号２６および配列番号４であった。第３  ＰＣＲにおける最終増幅では、配列番号２１および配列番号４のオリゴヌクレオチドプライマーを利用した。
【００６７】
組換え体ｐ９ＭＢ−２２（配列番号２７および配列番号２８）は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、４個のグリシン残基および１個のセリン残基、およびそれに続くＨＣＶアミノ酸１−１５０を含有する。第１  ＰＣＲにおいて最初の２つの断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列番号２１および配列番号２２、ならびに配列番号２９および配列番号３０であった。第３  ＰＣＲにおける最終増幅では、配列番号２１および配列番号３０のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
【００６８】
組換え体ｐ９ＭＢ−３１（配列番号３１および配列番号３２）は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、ならびにそれに続く、アミノ酸３１、３２、３３、４７および４８が欠失したアミノ酸１−１００を含有する。第１  ＰＣＲにおいて最初の２つの断片を増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ配列番号２１および配列番号３３、ならびに配列番号３４および配列番号４であった。第３  ＰＣＲにおける最終増幅では、配列番号２１および配列番号４のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
【００６９】
Ｄ．ＤＮＡライゲーションにより構築された他の組換え体
組換え体９ＭＢ−２４（配列番号３５および配列番号３６）は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、ならびにそれに続く、該組換え体からアミノ酸３３−３５および４６−４９が欠失したＨＣＶアミノ酸１−１００を含有する。この組換え体は、プラスミドｐＨＣ４３をエンドヌクレアーゼＸｍａＩおよびＢａｍＨＩで制限消化し、該断片を、配列番号７から得られたＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片でＤＮＡライゲーションにより置換することにより構築した。
【００７０】
組換え体９ＭＢ−２５（配列番号３７および配列番号３８）は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、４個のグリシン残基および１個のセリン残基、ならびにそれに続く、該組換え体からアミノ酸３３−３５および４６−４９が欠失したＨＣＶアミノ酸１−１００を含有する。この組換え体は、プラスミドｐ９ＭＢ−２２をエンドヌクレアーゼＸｍａＩおよびＢａｍＨＩで制限消化し、該断片を、配列番号７から得られたＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片でＤＮＡライゲーションにより置換することにより構築した。
【００７１】
組換え体９ＭＢ−２５（配列番号３９および配列番号４０）は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、４個のグリシン残基および１個のセリン残基、およびそれに続く、該組換え体からアミノ酸３２−５０が欠失したＨＣＶアミノ酸１−１００を含有する。この組換え体は、プラスミドｐ９ＭＢ−２２をエンドエンドヌクレアーゼＸｍａＩおよびＢａｍＨＩで制限消化し、該断片を、ｐ９ＭＢ−１８（配列番号２７）から得られたＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片でＤＮＡライゲーションにより置換することにより構築した。
【００７２】
実施例Ｖ
微粒子の調製
いくつかのモノクローナル抗体でコートされた微粒子を、ＨＣＶコアタンパク質内の種々の領域を認識するＨＣＶモノクローナル抗体で微粒子のいくつかの分離した集団をコートすることにより調製した。同様に、ＨＣＶのＮＳ３およびＮＳ４領域からクローニングされた組換え抗原で微粒子をコートした。微粒子のコーティングに使用したペプチドは、ＨＣＶのコア領域由来であった。
【００７３】
抗体アッセイのための微粒子：
以下の組換えタンパク質およびペプチドを、抗体アッセイ用の微粒子をコートするために使用した。
【００７４】
Ａ．組換えタンパク質の調製：
ｉ．ＨＣＶ  ＨＣ４３抗原ＨＣＶ
ＨＣ４３組換え抗原を、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ．より入手した。それは、ＨＣＶ−１（前記のとおり、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）より入手可能なアミノ酸配列）のアミノ酸配列１−１５０（コアタンパク質に相当する）および１１９２−１４５７（ＮＳ３中のアミノ酸残基に相当する）を含有していた。
【００７５】
ｉｉ．ＨＣＶ  Ｃ−１００抗原
ＨＣＶ  Ｃ―１００組換え抗原を、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．より入手した。それは、ＨＣＶ−１（前記のとおり、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）より入手可能）のアミノ酸配列１５６９−１９６１（ＮＳ４のアミノ酸残基に相当する）を含有していた。
【００７６】
ｉｉｉ．ＨＣＶ  ＮＳ５抗原
ＨＣＶ  ＮＳ５組換え抗原を、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．より入手した。それは、ＨＣＶ（前記のとおり、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）より入手可能）のアミノ酸配列２０５４−２９９５を含有していた。
【００７７】
ｉｖ．ＨＣＶ  ＮＳ３  ＮＳ４  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）構築物ＣＫＳ−３３ｃ−ＢＣＤ抗原
ＨＣＶ  ＨＣ３１組換え抗原を、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．より入手した。それは、ＨＣＶのアミノ酸配列１１９２−１４５７、およびＮＳ４領域のアミノ酸配列１６７６−１９３１を含有していた。さらに、それは、ＣＫＳ（前記のとおり、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）より入手可能）の２３９アミノ酸よりなる。
【００７８】
Ａ１．Ｒ−抗原コート化微粒子の調製
ｉ．ＨＣＶ  ＨＣ４３／Ｃ１００微粒子の調製
ＨＣ４３およびｃ−１００の両方でコートされた微粒子を、以下の方法で調製した。簡潔に説明すると、微粒子（１０％  重量／容量、０．７〜０．９ミクロン、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．より入手可能）の５００μｌ  アリコートを９６２μｌのコーティングバッファー（Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸バッファー（ｐＨ５．０））と室温で約１分間混合した。ついで、１５４μｌのＨＣＶ  Ｃ１００−３抗原溶液（０．６５ｍｇ／ｍｌ）および３０８μｌのＨＣ４３抗原溶液（６５０μｇ／ｍｌ）を該微粒子溶液に加え、室温で１６時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）ミクロ遠心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で１２，０００×ｇで１０分間ペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー（リン酸塩、ＮａＣｌ、ジチオトレイトール−ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、ドデシル硫酸ナトリウム−ＳＤＳ、ｐＨ６．５）で洗浄し、５６℃で２０時間、熱ストレスに付した。ついで該微粒子を、２．０％の最終濃度で、２．５ｍｌの微粒子希釈剤（リン酸バッファー（ｐＨ６．５）、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、ＮａＣｌおよびＳＤＳ、スクロース、アジ化物）に再懸濁させた。
【００７９】
ｉｉ．ＨＣＶ  ＮＳ５微粒子の調製
５３０μｌのＨＣＶ  ＮＳ５コーティングバッファー（炭酸塩（ｐＨ１０）、ＳＤＳ）および２００μｌの１０％  重量／容量、０．７〜０．９ミクロンの微粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄより入手可能）を２７０μｌのＨＣＶ  ＮＳ５抗原溶液（６５０μｇ／ｍｌの濃度）に加えた。該微粒子を、室温で１６時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ  ミクロ遠心機で１２，０００×ｇで１０分間のペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー（リン酸塩、ＮａＣｌ、ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ｐＨ６．５）で洗浄し、５６℃で２０時間、熱ストレスに付した。ついで、その洗浄した微粒子を、０．４％の最終濃度で、２．５ｍｌの微粒子希釈剤（リン酸バッファー（ｐＨ６．５）、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ，ＮａＣｌおよびＳＤＳ、スクロース、アジ化物）に再懸濁させた。
【００８０】
ｉｉｉ．ＨＣＶ  ＮＳ３  ＮＳ４大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）構築物ＣＫＳ−３３ｃ−ＢＣＤ微粒子の調製
微粒子の１００μｌ  アリコート（１０％  重量／容量、０．７〜０．９ミクロン、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄより入手可能）を４５２μｌのコーティングバッファー（Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸バッファー（ｐＨ５．０））と室温で約１０分間混合した。ついで、２００μｇのＣＫＳ−３３Ｃ−ＢＣＤ  Ａｇを加え、室温で１６時間混合した。
【００８１】
該微粒子をエッペンドルフ  ミクロ遠心機で１２，０００ｘｇで１０分間ペレット化した。調製された微粒子を洗浄バッファー（ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳを含有するＰＢＳ、ｐＨ６．５）で洗浄した。該上清を除去し、該微粒子を１ｍｌの微粒子希釈剤（リン酸バッファー（ｐＨ６．５）、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、ＮａＣｌ、スクロースおよびＳＤＳ、スクロース）に再懸濁させた。
【００８２】
ｉｖ．ＨＣＶ  ＨＣ４３／Ｃ１００およびＨＣＶ  ＮＳ５微粒子の混合
実施例（ＩＶ）（Ａ１）（ｉ）に記載のとおりに調製した２２０μｌのＨＣＶ  ＨＣ４３／Ｃ１００微粒子と、実施例（ＩＶ）（Ａ１）（ｉｉ）に記載のとおりに調製した３３０μｌのＨＣＶ  ＮＳ５微粒子とを混合した。この混合物を室温で１５分間インキュベートし、微粒子希釈剤（リン酸バッファー（ｐＨ６．５）、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、ＮａＣｌ、スクロースおよびＳＤＳ、スクロース）で５０ｍｌに希釈した。。
【００８３】
ｖ．ビオチン化コアペプチドの調製
自動化ペプチドシンセサイザーを使用する合成中に、ＨＣＶコアペプチド  ａａ１１−２８がＮ末端において＞９０％の純度でビオチン化された。
【００８４】
ｖｉ．ストレプトアビジンコート化微粒子の調製
カルボキシル化微粒子（１０％  重量／容量、０．２２７ミクロン、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ）の４ｍｌ  アリコートを２４８６μｌのカップリングバッファー（ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ６．７）と室温で１０分間混合した。ついで１１４．４μｌのＥＤＡＣ溶液（カップリングバッファー中１０ｍｇ／ｍｌ）を該微粒子溶液に加え、室温で１５分間混合した。続いて、１ｍｌのストレプトアビジン溶液（ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌ）を該活性化微粒子に加え、室温で１６時間回転させた。ついで、調製された微粒子を、エッペンドルフ・ミクロ遠心機で１２，０００×ｇで３分間ペレット化した。該上清を除去し、該微粒子を４ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。該遠心分離過程をもう１回繰り返し、微粒子を４ｍｌのＰＢＳ中に保存して、約１％の最終濃度を得た。
【００８５】
ｖｉｉ．コアペプチドコート化微粒子の調製
実施例（ＩＶ）（Ａ１）（ｖｉ）から得た１ｍｌのコート化微粒子に、実施例（Ｖ）（Ａ１）（ｖ）から得た３７５μｌのＨＣＶコアペプチドとＰＢＳバッファー中の１ｍｇ／ｍｌの１１−２８ａａとを加えた。ついで該混合物を室温で２時間インキュベートした。調製された微粒子を洗浄バッファー（ＤＴＴ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳを含有するＰＢＳ、ｐＨ６．５）で洗浄し、該微粒子を１ｍｌの微粒子希釈剤（仔ウシ血清、ウマＩｇＧ、ＴＷＥＥＮ  ２０、ＢＳＡ、カゼイン、ＥＤＴＡ、スクロースおよびプロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）、ｐＨ６．５）に、１％の固体最終濃度になるよう再懸濁した。
【００８６】
抗原アッセイのための微粒子：
Ｂ．モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体の製造方法は米国特許番号５，７５３，４３０に記載されている。簡潔に説明すると、ｐＨＣＶ３４（ＨＣＶ−コア、ａ．ａ．１−１５０）と称される、ＨＣＶ配列によりコードされる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来組換え抗原を、コアに対する抗体用の免疫原として使用した。ｐＨＣＶ３４のクローニングについての詳細な情報は、参照により本明細書に組み入れる米国特許出願第０７／５７２，８２２号に開示されている。当業者により行われるとおり、該タンパク質は、精製後、適当なアジュバントととの免疫化用に調製した。
【００８７】
製造業者の指示通りに調製されたバッファー  エマルション中のそれぞれ１５μｇのトレハロース  ジミコーラート（ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）およびエム・フレイ（Ｍ．Ｐｈｌｅｉ）ならびに１５μｇの精製ｐＨＣＶ３４を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内注射した。それに続く免疫化を第１４日、第２８日および第４２日に行った。第２１日および第４９日にマウスから採血し、米国特許第５，７５３，４３０号に詳細に記載されているとおりに、ポリスチレンビーズ上にコートされたｐＨＣＶ３４を使用する酵素結合イムノソルベントアッセイにより該免疫応答を調べた。
【００８８】
免疫化マウスの血清中に合理的な力価で存在する特異的抗ＨＣＶ抗体の証明に際して、４０μｇのｐＨＣＶ３４抗原でマウスを追加免疫した。該マウスを犠死させ、それらの脾臓を取り出し、該白血球をＳＰ２／０細胞と混合し融合させた。該細胞混合物を、２０％  ウシ胎児血清で補足されたＢｉｓｃｏｅ変法Ｄｕｂａｃｈ培地（ＩＭＤＭ）中で培養し、該雑種形成細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン培地を使用して選択した。ハイブリドーマ細胞系を樹立させ、コアに対する抗体に特異的なすべてのモノクローナル抗体を該マウスの腹水から調製し、プロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上のクロマトグラフィーにより精製した。該モノクローナル抗体のエピトープを、実施例Ｉに記載のＥＬＩＳＡ試験により分析した。
【００８９】
Ｂ１．抗原アッセイ用のモノクローナル抗体コート化微粒子の調製
ｉ．ＨＣＶ  Ｃ１１−１４微粒子の調製
簡潔に説明すると、カルボキシル化微粒子（１０％  重量／容量、０．２２７ミクロン、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄより入手可能）の１ｍｌ  アリコートを９ｍｌのカップリングバッファー（ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ６．７）と室温で約１０分間混合した。ついで１５０μｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ、カップリングバッファー中、１０ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を該微粒子溶液に加え、室温で１５分間混合した。１８２２μｌのＣ１１−１４モノクローナル抗体溶液（２．１３ｍｇ／ｍｌ）を該活性化微粒子に加え、室温で１６時間、回転させて混合した。ついで該微粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で１２，０００×ｇで３分間ペレット化した。該上清を除去し、該微粒子を微粒子洗浄バッファー（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．２））で洗浄し、ついで微粒子コーティングバッファー（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）で洗浄し、微粒子最終交換バッファー（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ７．２））で最終洗浄した。該微粒子を５ｍｌの最終交換バッファーに再懸濁させ、４５℃で７２時間の熱ストレスに付した。熱ストレスに付した後、５ｍｌの微粒子希釈剤（仔ウシ血清、ウマＩｇＧ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＢＳＡ、カゼイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、スクロースおよびプロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）（ｐＨ６．５））を、約１．０％の最終濃度が得られるように加えた。
【００９０】
ｉｉ．ＨＣＶ  Ａ５（１４−６３５−２２５）Ｍａｂ微粒子の調製
微粒子上のコーティングに、Ｃ１１−１４  Ｍａｂの代わりにＡ５（１４−６３５−２２５）Ｍａｂを使用する以外は、実施例（Ｖ）（Ｂ１）（ｉ）に記載されているのと同様の方法を用いた。
【００９１】
ｉｉｉ．ＨＣＶ  Ｃ１１−３微粒子の調製
ｐＨを２．５にするために、６．６μｌの１Ｎ  ＨＣｌを３００μｌ（１．４５ｍｇ／ｍｌ）のＣ１１−３モノクローナル抗体に加えた。ついで該モノクローナル抗体を、このｐＨで５分間インキュベートした。ついで、５０ｍＭ  ＭＥＳバッファーを加えることにより、該ｐＨを６．５にした。ついでカルボキシル化微粒子（１０％  重量／容量、０．２２７ミクロン、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の１００μｌ  アリコートを３３３μｌのカップリングバッファー（ＭＥＳ，ｐＨ６．７）と室温で１０分間混合した。ついで１５μｌのＥＤＡＣ溶液（カップリングバッファー中、１０ｍｇ／ｍｌ）を該微粒子溶液に加え、室温で５分間混合した。５５２μｌのｐＨショック化Ｃ１１−３モノクローナル抗体溶液（０．７２５ｍｇ／ｍｌ）を該活性化微粒子に加え、室温で１６時間、回転させて混合した。ついで該粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で１２，０００×ｇで３分間ペレット化した。該上清を除去し、該微粒子を微粒子洗浄バッファー（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．２））で洗浄し、ついで微粒子コーティングバッファー（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）で洗浄し、微粒子最終交換バッファー（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ７．２））で最終洗浄した。該微粒子を０．５ｍｌの最終交換バッファーに再懸濁させ、４５℃で７２時間の熱ストレスに付した。熱ストレスに付した後、０．５ｍｌの微粒子希釈剤（仔ウシ血清、ウマＩｇＧ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＢＳＡ、カゼイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、スクロースおよびプロクリン（ＰｒｏＣｌｉｎ）、ｐＨ６．５）を、約１％の最終濃度が得られるように加えた。
【００９２】
ｉｖ．ＨＣＶ  Ｃ１１−１４およびＣ１１−３微粒子の混合
実施例（Ｖ）（Ｂ１）（ｉｉｉ）に記載のとおりに調製された３６μｌのＨＣＶ  Ｃ１１−３微粒子（１％  固形物）および実施例（Ｖ）（Ｂ１）（ｉ）に記載のとおりに調製された８４μｌのＨＣＶ  Ｃ１１−１４微粒子（１％  固形物）を、８８０μｌの微粒子希釈剤（仔ウシ血清、ウマＩｇＧ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＢＳＡ、カゼイン、ＥＤＴＡ、スクロースおよびプロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）、ｐＨ６．５）と混合した。
【００９３】
Ｃ．コンボアッセイ用の微粒子の調製：
該二重アッセイのために、２つの別々のＰＲＩＳＭ（登録商標）チャンネルを、その一方はＨＣＶ抗体アッセイに、もう一方はＨＣＶ抗原アッセイに使用した。コンボアッセイでは、該抗体アッセイおよび抗原アッセイの両方を、抗原アッセイおよび抗体アッセイの両方の試薬が１つのキット中で組合されている１つのチャネル上で行った。
【００９４】
ｉ．コア抗原（ペプチド）コート化微粒子およびＨＣＶ  ＨＣ３３抗原コート化微粒子とＣ１１−１４ｍＡｂコート化微粒子との混合
実施例（Ｖ）（Ａ１）（ｖｉｉ）に記載のとおりに調製された３５０μｌのコアペプチドコート化微粒子（１％  固体ストック）および実施例（Ｖ）（Ａ１）（ｉｉｉ）に記載のとおりに調製された７００μｌのＨＣＶ  ＮＳ３  ＮＳ４大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）構築物ＣＫＳ−３３Ｃ−ＢＣＤ  Ａｇコート化微粒子（１％  固体ストック）および実施例（Ｖ）（Ｂ１）（ｉ）に記載のとおりに調製された３１９μｌのＨＣＶ  Ｃ１１−１４微粒子（１．００９９％  固体ストック）を、５６３１μｌの微粒子希釈剤（仔ウシ血清、ウマＩｇＧ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＢＳＡ、カゼイン、ＥＤＴＡ、スクロースおよびプロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）、ｐＨ６．５）と混合した。
【００９５】
Ｄ．ｐ９ＭＢ１８コート化微粒子、ｃ２００コート化微粒子およびＣ１１−１４コート化微粒子を使用するコンボアッセイのための微粒子の調製：
ｉ．ＨＣＶ  Ｃ−２００抗原
ＨＣＶ  Ｃ−２００組換え抗原をＣｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．より得た。特に、該抗原はＨＣＶ（前記のとおり、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能）のアミノ酸配列１１９２−１９３２を含み、ＮＳ３およびＮＳ４領域に由来する。ｃ２００抗原は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）の１５４アミノ酸を有するキメラ融合タンパク質である。
【００９６】
ｉｉ．ｃ２００微粒子の調製
微粒子（１０％  重量／容量、０．７〜０．９ミクロン、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄより入手可能）の１００μｌ  アリコートを８３０．６μｌのコーティングバッファー（ＳＤＳを含有するＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５））と室温で約１０分間混合した。ついで６９．４μｌのｃ２００抗原溶液（０．７２ｍｇ／ｍｌ）を該微粒子溶液に加え、室温で１６時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で１２，０００×ｇで１０分間ペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー（リン酸塩、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ｐＨ６．５）で洗浄し、５６℃で１６〜２０時間の熱ストレスに付した。ついで該微粒子を２．０％の最終濃度で５００μｌの微粒子希釈剤（リン酸塩バッファー（ｐＨ６．５）、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、スクロース、ＳＤＳ，アジ化物）に再懸濁させた。
【００９７】
ｉｉｉ．ｐ９ＭＢ−１８微粒子の調製
微粒子（１０％  重量／容量、０．７〜０．９ミクロン、（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄより入手可能））の１００μｌ  アリコートを７８８μｌのコーティングバッファー（ＳＤＳを含有するＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５））と室温で約１０分間混合した。ついで１１２μｌのＨＣＶ  ｐ９ＭＢ−１８抗原溶液（０．８９ｍｇ／ｍｌ）を該微粒子溶液に加え、室温で１６時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で１２，０００×ｇで１０分間ペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー（リン酸塩、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ｐＨ６．５）で洗浄し、５６℃で１６〜２０時間の熱ストレスに付した。ついで該微粒子を２．０％の最終濃度で５００μｌの微粒子希釈剤（リン酸塩バッファー（ｐＨ６．５）、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、スクロース、ＳＤＳ，アジ化物）に再懸濁させた。
【００９８】
ｉｖ．Ｃ１１−１４  ｍＡｂコート化微粒子とＨＣＶ  ｐ９ＭＢ−１８コート化微粒子およびＨＣＶ  ｃ２００抗原コート化微粒子との混合
実施例（Ｖ）（Ｄ）（ｉｉｉ）のとおりに調製された５０μｌのｐ９ＭＢ−１８コート化微粒子（２％  固体ストック）、実施例（Ｖ）（Ｄ）（ｉｉ）に記載のとおりに調製された６２．５μｌのＨＣＶ  ｃ２００Ａｇコート化微粒子（２％  固体ストック）および実施例（Ｖ）（Ｂ１）（ｉ）に記載のとおりに調製された１２５μｌのＨＣＶ  Ｃ１１−１４微粒子（２％  固体ストック）を、４７６２．５μｌの微粒子希釈剤（ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、スクロース、およびプロクリン、ＰＢＳ、ｐＨ６．５）と混合した。
【００９９】
感度：
核酸試験データと比較して、セロコンバージョン感度は９５．８％であった。ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂ  Ｒｅａｌ  Ｃｏｍｂｏアッセイは、２４個中２３個の陽性採血液を、反応性のものとして検出した。データを、後記の表Ｖに要約する。全体的に見て、表ＩＶに示すセロコンバージョンパネルに関する感度は、図３に記載のアッセイ形態を用いた場合には、実施例（Ｖ）（Ｃ）（ｉ）に記載のとおりに調製された混合微粒子および実施例（Ｖ）（Ｃ）（ｉｖ）に記載のとおりに調製された微粒子の間で、比較しうるものである。一方、抗ＨＣＶコアに関しては、特異的サンプルＰ９ＭＢ１８コート化微粒子は、コンボアッセイ形態において組合せて用いた場合（表ＶＩ）には、コア特異的ペプチド（１１−２８ａａ、表ＶＩを参照されたい）に対する有意な改善を示した。
【０１００】
Ｄ．ｐ９ＭＢ３１コート化微粒子の調製
ｉ．微粒子（１０％  重量／容量、０．７〜０．９ミクロン、（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．より入手可能）の１００μｌアリコートを７８８μｌのコーティングバッファー（ＳＤＳを含有するＭＥＳバッファー、ｐＨ６．５）と室温で約１０分間混合した。ついで１１２μｌのＨＣＶ  ｐ９ＭＢ−３１抗原溶液（０．８９ｍｇ／ｍｌ）を該微粒子溶液に加え、室温で１６時間、回転させて混合した。該微粒子をエッペンドルフ・ミクロ遠心機で１２，０００×ｇで１０分間ペレット化した。該懸濁液を除去し、該微粒子を洗浄バッファー（リン酸塩、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、ｐＨ６．５）で洗浄し、５６℃で１６〜２０時間の熱ストレスに付した。ついで該微粒子を２．０％の最終濃度で５００μｌの微粒子希釈剤（リン酸塩バッファー（ｐＨ６．５）、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、スクロース、ＳＤＳ，アジ化物）に再懸濁させた。
【０１０１】
感度：
ＨＣＶパネルの感受性を、図１に記載のアッセイ形態を用いて、ｐ９ＭＢ−１８およびｐ９ＭＢ−３１  ｒ−抗原でコートされた微粒子の間で比較した。全体的に見て、これらのｒ−抗原の両方に対する感度は、表ＩＶに示すとおり、比較しうるものである。
【０１０２】
【表４】
2005518186.tif 000006
【０１０３】
【表５】
2005518186.tif 000007
【０１０４】
【表６】
2005518186.tif 000008
【０１０５】
実施例ＶＩ
アクリジニウム標識コンジュゲートの調製
Ａ．抗体アッセイのためのコンジュゲート：
抗体アッセイのために、アクリジニウムで直接標識されたマウス抗ヒトＩｇＧ、またはビオチン化抗ヒトＦ（ａｂ’）２とアクリジニウム抗ビオチンコンジュゲートとのプレ複合体のどちらかを使用した。
【０１０６】
ｉ．ビオチン化抗ヒトＦ（ａｂ’）２とアクリジニウム抗ビオチンコンジュゲートとのプレ複合体
該標識抗ビオチン抗体は、米国特許第５，７０５，３３０号に開示されているとおりに調製した。ビオチン化抗ヒトＦ（ａｂ’）２とアクリジニウム抗ビオチンコンジュゲートとのプレ複合体も、米国特許第５，７０５，３３０号に開示されているとおりに調製した。
【０１０７】
ｉｉ．アクリジニウム標識マウス抗ヒトＩｇＧ
リン酸ナトリウム、ＮａＣｌ、３−（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ−１−プロパン−スルホナート（ＣＨＡＰＳ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｏｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）、ｐＨ８．０を含有する結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）バッファー（ＣＢ）５３．６μｌ、および１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−トシル―Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジニウムカルボキシアミドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル  ７．２μｌ（ジメチルホルムアミド中、４ｍｇ／ｍｌ）を、１３１μｌのマウス抗ヒトＩｇＧ（４．５９ｍｇ／ｍｌ）および６０１μｌのＰＢＳに室温で加えた。該反応混合物をローテーターで室温で２０分間混合した。該反応混合物をＨＰＬＣ上にローディングすることにより、該反応をクエンチした。これを、ＣＨＡＰＳ、ＮａＣｌおよびリン酸ナトリウムを含有するバッファー（ｐＨ６．３）で平衡化された３００×７．８ｍｍ  Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ−２５０ゲルろ過カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に適用した。１１４Ｍ型ポンプを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ４２１Ａコントローラーを使用して、同じバッファーで１．０ｍｌ／分で該カラムを溶出した。１ｍｌの幾つかの画分を集め、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−７分光光度計で２８０ｎｍおよび３７０ｎｍでの吸光度を測定した。アクリジニウムの取り込みの度合を、米国特許第５，７０５，３３０号に記載のとおりに計算した。得られた、ＩｇＧに対するアクリジニウムの比率（モル／モル）は約２．５であった。該コンジュゲートは４℃で保存した。
【０１０８】
Ｂ．抗原アッセイのためのコンジュゲート：
ｉ．ｃ１１−１０コンジュゲートのアクリジン化
以下の変更以外は、実施例（Ｖ）（Ａ）（ｉｉ）に記載されているのと同様の方法を用いた。７００μｌのコンジュゲートバッファー、３００μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のＣ１１−１０  Ｍａｂおよび２．９μｌ（４ｍｇ／ｍｌ）のアクリジニウム誘導体を室温で１０分間混合した。得られた、ＩｇＧに対するアクリジニウムの比率（モル／モル）は約２．０であった。該コンジュゲートは４℃で保存した。
【０１０９】
Ｃ．コンボアッセイのためのコンジュゲート：
アクリジン化マウス抗ヒトＩｇＧおよびアクリジン化Ｃ１１−１０Ｍａｂコンジュゲートの混合：
１４μｌのアクリジン化マウス抗ヒトＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）を３９０μｌのアクリジン化Ｃ１１−１０Ｍａｂ（１．７９μｇ／ｍｌ）コンジュゲートと混合して、２ｎｇ／ｍｌマウス抗ヒトＩｇＧと共に１００ｎｇ／ｍｌ  Ｃ１１−１０を得、２時間インキュベートし、使用前にろ過した。マウス抗ヒトＩｇＧおよびアクリジン化Ｃ１１−１０  Ｍａｂコンジュゲートの調製は、それぞれ、実施例（Ｖ）（Ａ）（ｉｉ）および（ＶＩ）（Ｂ）に記載されている。
【０１１０】
実施例ＶＩＩ
モノクローナル抗体によるＨＣＶコアタンパク質の検出
抗原検出アッセイの開発には非常に多数の抗ＨＣＶコアモノクローナル抗体が利用可能であるため、モノクローナル抗体のどのような組合せが最大の感度を与えるかを決定することが必要であった。固相上（すなわち、捕捉のため）および液相中（すなわち、検出のため）で２以上のモノクローナル抗体を使用する場合に可能な組合せの数は厖大なものとなるため、最も効果を発揮するモノクローナル抗体のペアを同定するために、単純化された「スクリーニング」方法を用いた。最も高感度なペアを同定したら、必要に応じて、アッセイ感度を向上させるために他のモノクローナル抗体を加えることが可能であろう。
【０１１１】
したがって、最適なペアを同定するために、実施例ＩＶおよびＶに記載のとおりに、モノクローナル抗体を微粒子上にコートし、またはアクリジニウムに結合させた。スクリーニングアッセイにおいては、モノクローナル抗体コート化微粒子（直径０．４０μｍ）を０．０９〜０．１５％  固体の作用（ｗｏｒｋｉｎｇ）濃度で使用し、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）モノクローナル抗体を１００〜１２５ｎｇ／ｍｌの作用濃度で使用した。すべての実験に、同じ陽性および陰性対照血漿を使用した（各アッセイにつき０．１ｍｌ）。陽性対照血清は、ＨＣＶ抗体に関する試験では陰性であるが１９，０００，０００コピー／ｍｌのＨＣＶ  ＲＮＡ力価の血漿を有するＨＣＶ感染個体に由来するものであった。陰性対照血漿は、ＨＣＶ抗体およびＲＮＡに関して陰性である正常献血者に由来するものであった。実施例ＩＸに記載のとおりの装置および操作方法を用いて、アッセイを行った。
【０１１２】
表ＶＩＩは、モノクローナル抗体の種々のペアが陽性対照ヒト血漿中のＨＣＶコア抗原を検出する能力に関してそれらのペアを試験した際に得られた平均シグナル対陰性（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）（Ｓ／Ｎ）値を示す（ｎｄ：測定せず）。モノクローナル抗体の幾つかのペアは他のものより高い感度を示すこと、および該感度は該アッセイの適当な組合せ方に依っていることが、このデータから明らかである。例えば、モノクローナル抗体Ａ０５を捕捉試薬として使用し、Ｃ１１−１０を検出試薬として使用した場合には、得られたＳ／Ｎ値は１５０．０であったが、それとは逆の組合せ方を用いた場合には、得られたＳ／Ｎ値は僅か６．８であった。
【０１１３】
【表７】
2005518186.tif 000009
【０１１４】
実施例ＶＩＩＩ
ＨＣＶコア抗原アッセイサンプル希釈バッファー
実施例ＸＩに記載のとおり、ＰＲＩＳＭ（登録商標）でのＨＣＶコア抗原アッセイでは、試験するヒト血清または血漿サンプルの希釈にサンプル希釈バッファー（ＳＤＢ）を使用する。ついでモノクローナル抗体コート化微粒子を加えて反応混合物を得る。該抗原検出アッセイの感度および特異性は、ＳＤＢの成分およびそれらの濃度の点でＳＤＢの組成により影響される可能性がある。
【０１１５】
ＨＣＶは包膜ウイルスであると考えられているため、ＳＤＢ中に界面活性剤（表面活性物質）を含有させて脂質包膜を除去し、それによりコアタンパク質を溶液に露出させる必要があると仮定された。さらに、コア抗原の検出能を増強しうるヌクレオキャプシド複合体の溶解が、ＳＤＢへのカオトロピック塩の添加により促進されうると推測された。
【０１１６】
ＨＣＶコア抗原アッセイの感度に対するＳＤＢ組成の考えられうる影響を調べるために、モノクローナル抗体Ｃ１１−７またはＣ１１−１４コート化微粒子（表の凡例に記載のとおり）およびアクリジニウム標識モノクローナル抗体Ｃ１１−１０コンジュゲートから構成されるＨＣＶコア抗原アッセイにおいて、一連のバッファーを調製し試験した。成分数の点で最も単純である使用したＳＤＢ（基礎バッファーとも称される）は、０．１Ｍ  リン酸カリウム（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡよりなるものであった。このバッファーに、界面活性剤および塩を添加した。ＨＣＶ抗体に関する試験では陰性であるが１９，０００，０００コピー／ｍｌのＨＣＶ  ＲＮＡ力価の血漿を有する個体からの陽性対照ヒト血漿の試験で得られたシグナル対陰性（Ｓ／Ｎ）比に対するＳＤＢの影響を試験することにより、ＳＤＢの性能を測定した。陰性対照血漿は、ＨＣＶ抗体およびＲＮＡに関して陰性である正常献血者に由来するものであった。スクリーニングアッセイでは、コート化微粒子を０．０９〜０．１５％  固体の作用濃度で使用し、Ｃ１１−１０コンジュゲートを１００〜１２５ｎｇ／ｍｌの作用濃度で使用した。すべての実験に、同じ陽性および陰性対照血漿を使用した（各アッセイにつき０．１ｍｌ）。実施例ＶＩＩＩに記載のとおりの装置および操作方法を用いて、アッセイを行った。
【０１１７】
表ＶＩＩＩに示すとおり、得られたＳ／Ｎ値は、サンプル希釈バッファーに添加した界面活性剤およびその濃度に応じて著しく変化した。双性イオン界面活性剤ＳＢ−１２（ラウリルスルホベタイン）の添加が、最高のＳ／Ｎ値を与えた。さらに、表ＩＸに示すとおり、同じクラスであるが異なるアルキル鎖長の他の双性イオン界面活性剤と比較した場合に、ＳＢ−１２で再び最高のＳ／Ｎ値が認められた。０．５％または２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で基礎バッファーに添加したＳＢ−１２の量の滴定を、表Ｘに示す。ＳＢ−１２濃度が６％を超えると、該コア抗原アッセイで得られるＳ／Ｎ値は有意に減少した。
【０１１８】
更なる実験において、該コア抗原アッセイの感度に対する塩または異なる組合せの双性イオンまたは非イオン界面活性剤の添加の影響を調べた。表ＸＩおよびＸＩＩに示す結果は、ＮａＣｌの代わりにＫＣｌを使用しても、Ｓ／Ｎに対する僅かな影響が観察されるに過ぎず、尿素の添加に関しても同様であることを示唆している。ＳＢ−１６（パルミチルスルホベタイン）を含有するサンプル希釈バッファーはＳ／Ｎ値の増大を示すようである。前記の実験において他のものと比較して相応に高いＳ／Ｎ値を与えるＳＤＢの１つに、漸増濃度の尿素を含有させることにより、尿素の影響を調べた（表ＸＩＩＩ）。この特定のバッファーにおいては、２．０〜２．５Ｍの最終濃度の尿素の添加が、最も有意にＳ／Ｎ値を増加させたようである。
【０１１９】
また、非ヒト由来の種々のタンパク質または血清をサンプル希釈バッファーに添加することによるＳ／Ｎ値に対する影響も調べた（表ＸＩＶ）。他のタンパク質性成分の存在下または非存在下でウシ血清アルブミンを含有させても、ＨＣＶ陽性対照血清の試験で得られたＳ／Ｎ値を僅かに増大させたに過ぎなかった。これとは対照的に、タンパク質または血清の組合せの幾つかは、実際には、該タンパク質非含有バッファーで観察されたものと比較してＳ／Ｎ値を減少させた。
【０１２０】
【表８】
2005518186.tif 000010
【０１２１】
【表９】
2005518186.tif 000011
【０１２２】
【表１０】
2005518186.tif 000012
【０１２３】
【表１１】
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【０１２４】
【表１２】
2005518186.tif 000014
【０１２５】
【表１３】
2005518186.tif 000015
【０１２６】
【表１４】
2005518186.tif 000016
【０１２７】
実施例ＩＸ
ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｂ、ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｇ、およびＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｂ／Ａｇコンボアッセイ
ＰＲＩＳＭ（登録商標）抗体アッセイは、参照により本明細書に組み入れる米国特許第５，７０５，３３０号に記載されており、ＰＲＩＳＭ（登録商標）抗原および抗体アッセイは、同様に参照により本明細書に組み入れるＳｈａｈおよびＳｔｅｗａｒｔ，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版，Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ編，ｐ２９７−３０３（２００１）に記載されている。
【０１２８】
本発明においては、以下の方法を用いた。
【０１２９】
ＨＣＶ  Ａｂアッセイ：
アッセイ形態を図１に示す。
【０１３０】
一般には、ステーション１において、５０μｌの対照またはサンプル、５０μｌの試料希釈バッファー（ＳＤＢ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、新生仔ウシ血清、ＮａＣｌ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶菌液、アジ化物を含有するリン酸バッファー（ｐＨ７．０））、および５０μｌのＨＣＶ抗原コート化微粒子（前記の実施例（Ｖ）（Ａ１）（ｉｖ）に記載のとおりに調製した）を各インキュベーションウェルに分注し、アッセイの計時を開始した。これらを、外的攪拌または振とうを行うことなく他の成分への各成分の相互拡散により混合して、反応混合物を得た。ステーション４において、該反応混合物を、繊維状マトリックスを含有する検出ウェルに移し、３００μｌのトランスファー洗浄液（ＴＷ、ＮａＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０、グリセロールおよびプロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）３００と共にホウ酸バッファー（ｐＨ７．０）を含有する）で２回洗浄した。室温で１８分間インキュベートした後に、５０μｌのプレ複合体化ビオチン化Ｆ（ａｂ’）２／アクリジニウム標識抗ビオチン、（ヤギ抗ヒトＩｇＧのビオチン化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびアクリジニウム標識抗ビオチン抗体）をステーション５の検出ウェルのマトリックスに分注した。ステーション８において、該ウェルを３７℃で２３分間インキュベートし、該反応混合物を含有する繊維状マトリックスを、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）（ｐＨ５．７）をＮａＣｌおよびプロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）３００と共に含有する１００μｌのＦＷで３回洗浄した。ステーション９において、後記のアッセイのすべてと同様に、化学発光（ＣＬ）シグナルをアルカリ性過酸化水素溶液の添加により生成させ、光子増幅管により光子を測定した。放出される光の量はサンプル中の抗体の量に比例する。サンプルから集めた光子の数を、該バッチにおいて行った校正から決定されたカットオフ（Ｓ／ＣＯ）値と比較することにより、サンプル中の抗体の存在または非存在を判定する。結果は、後記の表ＸＶにＳ／ＣＯ（シグナル対カットオフ）として表されている。該カットオフ値は、陽性対照（ｎ＝４）の平均化学発光計数に０．５５を掛けて得られた積に陰性対照（ｎ＝４）の平均化学発光計数を足し算することにより算出される。
【０１３１】
感度：
セロコンバージョン感度は、選択された被検セロコンバージョンパネルの分析データの専門業者証明書に記載されているＨＣＶ  ＲＮＡデータと比較して、１００％であった。データを表ＸＶに要約する。
【０１３２】
特異性：
反復反応率（ｒｅｐｅａｔ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒａｔｅｓ）に基づけば、該ＨＣＶ  Ａｂアッセイの特異性は被検集団において＞９９％であった（表ＸＶＩＩ）。
【０１３３】
ＨＣＶ  Ａｇアッセイ：
アッセイ形態を図２に示す。
【０１３４】
Ｍａｂ  Ｃ１１−１４／Ｍａｂ  Ｃ１１−１０ペア：
一般には、ステーション１において、１００μｌの対照またはサンプル、５０μｌの試料希釈バッファー（ＳＤＢ、リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、尿素およびアジ化ナトリウム）、および５０μｌのＨＣＶ  Ｍａｂコート化微粒子（実施例（Ｖ）（Ｂ１）（ｉ）に記載のとおりに調製）を各インキュベーションウェルに分注し、アッセイの計時を開始した。これらを、外的攪拌または振とうを行うことなく他の成分への各成分の相互拡散により混合して、反応混合物を得た。ステーション４において、該反応混合物を、繊維状マトリックスを含有する検出ウェルに移し、室温で１８分間インキュベートした後、３００μｌのトランスファー洗浄液（ＴＷ）（ＭＥＳ、ＮａＣｌ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＰＥＧ、消泡剤、プロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）３００、ｐＨ５．６）で２回洗浄した。ステーション５において、５０μｌのアクリジン化Ｃ１１−１０  Ｍａｂコンジュゲート（実施例（ＶＩ）（Ｂ）に記載のとおり）を該検出ウェルのマトリックスに分注した。該ウェルの内容物を２３分間インキュベートし、該反応混液を含有する繊維状マトリックスを２００μｌの最終洗浄液（ＦＷ）（ＬｉＣｌおよびＬＤＳを含有するＴｒｉｓバッファー）で１回洗浄し、ついで１００μｌのＦＷで３回洗浄した。ステーション９において、該ＣＬシグナルを誘発させ、測定した。結果は、表ＸＶにＳ／ＣＯ（シグナル対カットオフ）として表されている。該カットオフ値は、陰性対照（ｎ＝５）の平均化学発光計数の２．２倍である。
【０１３５】
感度：
ＨＣＶに対する抗体を産生する個体から順次集められたサンプルを含有する商業的に入手可能なセロコンバージョンパネルの２群を、原型ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ抗原試験およびＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ抗体試験において試験した。セロコンバージョンサンプルの第１群では、最初の入手可能な採血の日には、ＨＣＶ  ＲＮＡに関して陰性であった。後の採血日においては、１以上の採血日においてＨＣＶ  ＲＮＡが検出され、ついですべての場合において、ＨＣＶに対する抗体が検出された。セロコンバージョンパネルの第２群では、最初の採血日に既にＨＣＶ  ＲＮＡに関して陽性であり、後の採血日において、ＨＣＶに対する抗体が検出された。それらの２つの群では、セロコンバージョン感度は、ＨＣＶ  ＲＮＡ試験により得られたデータと比較して９８．５％であった。ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｇは、６８個中６７個のＨＣＶ  ＲＮＡ陽性採血液を、反応性のものとして検出した。データを表ＸＶＩに要約する。これらのデータは、抗体応答が未だ上昇していない個体において、ＨＣＶ  Ａｇ試験がＨＣＶ感染を検出することを示している。
【０１３６】
特異性：
反復反応率（ｒｅｐｅａｔ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒａｔｅｓ）に基づけば、該ＨＣＶ  Ａｂアッセイの特異性は被検集団において＞９９％であった（表ＸＶＩＩＩ）。
【０１３７】
ＨＣＶ  Ａｇアッセイ：Ｍａｂ  Ａ５（１４−６３５−２２５）／Ｍａｂ  Ｃ１１−１０ペア：
Ｃ１１−１４／Ｃ１１−１０に関して記載したものに類似したアッセイ方法を用いた。唯一の相違は、該試験が、Ｍａｂ  Ｃ１１−１４コート化微粒子の代わりにＡｂｂｏｔｔ  Ａ５（１４−６３５−２２５）Ｍａｂコート化微粒子を使用したことであった。
【０１３８】
感度：
合計４個のセロコンバージョンパネルを評価し、感度を、Ｃ１１−１４／Ｃ１１−１０ペアを使用して得られたデータと比較した。これらのペアは共に、同数の陽性採血液を検出した。Ａ５（１４−６３５−２２５）／Ｃ１１−１０ペアに関する感度データを表ＸＶＩに要約する。
【０１３９】
特異性：
反復反応率（ｒｅｐｅａｔ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒａｔｅｓ）に基づけば、該ＨＣＶ  Ａｇアッセイの特異性は被検小集団（ｎ＝１００）において１００％であった（表ＸＩＸ）。
【０１４０】
ＨＣＶ  Ａｇアッセイ：Ｍａｂ  Ｃ１１−１４およびＣ１１−３／Ｍａｂ  Ｃ１１−１０ペア：
Ｃ１１−１４／Ｃ１１−１０に関して記載したものに類似したアッセイ方法を用いた。唯一の相違は、Ｍａｂ  Ｃ１１−１４コート化微粒子の代わりに、Ｃ１１−１４およびＣ１１−３混合微粒子（実施例（ＩＶ）（Ｂ１）（ｉｖ））を使用したことであった。
【０１４１】
感度：
ＨＣＶコア抗原に関して陽性である再石灰化（ｒｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ）ヒト血漿（「ＰＣ」と称する）とＨＣＶ抗原および抗体に関して陰性であるヒト血漿（「ＮＣ」と称する）とよりなるパネルに対してＳ／Ｎ比を比較することにより、このペアの性能を評価した（表ＸＸ）。該Ｓ／Ｎ値は、式：
Ｓ／Ｎ＝ＰＣの平均／ＮＣの平均
から求めた。
４つの試料の平均化学発光計数を用いて、各平均を求めた。
【０１４２】
ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂコンボアッセイ：
２つの異なる形態（すなわち、二重コンボアッセイおよびリアルコンボアッセイ）を、以下のとおりにＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂアッセイに関して評価した。
【０１４３】
二重コンボアッセイ：
ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂ二重コンボアッセイは、２つの異なるチャネルを用いてＰＲＩＳＭ（登録商標）上で同時に行う。ＰＲＩＳＭ（登録商標）内の合計６個のチャネルを同時に使用して、いくつかのアッセイ（ＨＩＶ、ＨＢコア、ＨＢｓＡｇ、ＨＴＬＶ、およびＨＣＶＡｂ）を行う。それらのチャンネルのうちの５つは現在使用されているが、１つのチャネルは、新たなマーカー（例えば、ＨＣＶ  Ａｇアッセイ）用に空けてあるか、またはそれらのチャネルのうちの１つに問題が生じた場合に備えて予備的に確保されているかもしれない。したがって、１つのチャネルをＨＣＶ  Ａｇアッセイに、そして５つの他のチャネルを５つの他のアッセイに使用すると、予備チャネルを、使用のために確保することはできない。
【０１４４】
ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  ＡｂおよびＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｇアッセイを別々に行った。両アッセイからの結果を１つの最終報告にまとめた。
【０１４５】
リアルコンボアッセイ：
ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  ＡｇアッセイとＨＣＶ  Ａｂアッセイとを組合せ、ＰＲＩＳＭ（登録商標）チャネルの１つにおいて単一のアッセイとして行った。
【０１４６】
ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂ二重コンボアッセイ：
感度：
ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂ二重コンボアッセイのセロコンバージョン感度は９８．５％であった。データを表ＸＶに要約する。
【０１４７】
特異性：
反復反応率（ｒｅｐｅａｔ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒａｔｅｓ）に基づけば、該ＨＣＶ  Ａｂ／Ａｇ二重コンボアッセイの特異性は被検集団において＞９９％であった（表ＸＸＩ）。
【０１４８】
ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂリアルコンボアッセイ：
アッセイ形態を図３に示す。以下の変更以外はＨＣＶ  ＡｂまたはＡｇアッセイに関して前記で示されているとおりに、２工程のＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶコンボアッセイを行った。ステーション１において、１００μｌの対照またはサンプル、５０μｌの試料希釈バッファー（Ｔｗｅｅｎ  ２０、新生仔ウシ血清、ＮａＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶菌液およびアジ化物を含有するリン酸バッファー（ｐＨ７．０））、ならびに５０μｌのＨＣＶ抗原およびＭａｂ混合微粒子（前記実施例（Ｖ）（Ｃ）（ｉ）に記載のとおりに調製）を各インキュベーションウェルに分注し、アッセイの計時を開始した。ステーション４において、該反応混合物を、繊維状マトリックスを含有する検出ウェルに移し、３００μｌのトランスファー洗浄液（ＴＷ）（ＭＥＳ、ＮａＣｌ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＰＥＧ、消泡剤、プロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）３００、ｐＨ５．６）で２回洗浄した。３７℃で１８分間インキュベートした後、５０μｌの混合コンジュゲートアクリジン化Ｃ１１−１０およびアクリジン化マウス抗ヒトＩｇＧ（実施例（ＶＩ）（Ｃ）に記載のとおりに調製）をステーション５の検出ウェルのマトリックスに分注した。該ウェルを２３分間インキュベートし、該反応混液を含有する繊維状マトリックスを１００μｌの最終洗浄液（ＬｉＣｌおよびＬＤＳを含有するＴｒｉｓバッファー）で３回洗浄した。ステーション９において、該ＣＬシグナルを誘発させ、測定した。結果は、後記表ＸＶにＳ／ＣＯ（シグナル対カットオフ）として表されている。該カットオフ値は、陰性対照（ｎ＝３）の平均化学発光計数の２．２倍である。
【０１４９】
感度：
セロコンバージョン感度は、ＰＣＲデータと比較して９５．８％であった。ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂリアルコンボアッセイは、２４個中２３個の陽性採血液を、反応性のものとして検出した。データを表ＸＶＩに要約する。
【０１５０】
特異性：
反復反応率（ｒｅｐｅａｔ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒａｔｅｓ）に基づけば、ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂリアルコンボアッセイの特異性は被検集団において１００％であった（表ＸＸ）。
【０１５１】
【表１５】
2005518186.tif 000017
2005518186.tif 000018
2005518186.tif 000019
2005518186.tif 000020
2005518186.tif 000021
2005518186.tif 000022
【０１５２】
【表１６】
2005518186.tif 000023
【０１５３】
【表１７】
2005518186.tif 000024
【０１５４】
【表１８】
2005518186.tif 000025
【０１５５】
【表１９】
2005518186.tif 000026
【０１５６】
【表２０】
2005518186.tif 000027
【０１５７】
【表２１】
2005518186.tif 000028
【０１５８】
【表２２】
2005518186.tif 000029
【０１５９】
実施例Ｘ
３つのペプチドへのモノクローナル抗体の結合
３つの新たなペプチドを合成した。そのうちの２つはＨＣＶ  Ａｂ／Ａｇコンボ形態に適合し、１つは対照としての使用に適している。各ペプチドは、固相での製造中の追跡を容易にするために、Ｎ末端ビオチンを伴って合成された。ペプチドａａ１０−５３（ＡＬＡＭ−１７）（ＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫＴＳ）（配列番号３７）は、介在性欠失を伴わないＨＣＶコアアミノ酸１０−５３を含有する。ペプチドａａ１０−５３＾３２−５０（ＡＬＡＭ−１８）（ＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＫＴＳ）（配列番号３８）は、ａａ３２−５０を含む１９アミノ酸の欠失を伴うＨＣＶコアアミノ酸１０−５３を含有する。ペプチドａａ１０−５３＾３１−３３＾４７−４８は、アミノ酸３１−３３および４７−４８が欠失しているＨＣＶコアアミノ酸１０−５３を含有する（ＡＬＡＭ１６）（ＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＴＲＫＴＳ）（配列番号３５）。ペプチドＡＬＡＭ１６およびＡＬＡＭ１８は共に、ＨＣＶ  Ａｂ／Ａｇコンボ形態に適合する。ＡＬＡＭ１６の場合、アミノ酸３１−３３の欠失は、モノクローナル抗体ｃ１１−１０（エピトープ３２−３６）が該抗原に結合するのを妨げ、アミノ酸４７および４８の欠失はｃ１１−１４モノクローナル抗体（エピトープ４５−５０）の結合を妨げる。ＡＬＡＭ１８は、ｃ１１−１０およびｃ１１−１４の結合領域の両方を含む欠失を含有する。モノクローナル抗体ｃ１１−１０およびｃ１１−１４によるＡＬＡＭ１６およびＡＬＡＭ１８への結合の欠如を示すデータを、以下の表に示す。
【０１６０】
【表２３】
2005518186.tif 000030
【０１６１】
さらに、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４および６に相当する２５４個の遺伝子型決定されたＨＣＶ血清陽性試料をペプチドａａ１０−５３＾３１−３３＾４７−４８（ＡＬＡＭ１６）により試験して、ＨＣＶ  Ａｂ／Ａｇアッセイ形態における抗原標的としてのこのペプチドの実施可能性を判定した。全２５４個（１００％）試料が、このペプチドに対して反応性であった。したがって、Ａｇの検出に必要なモノクローナル抗体による結合の除去をもたらすこのペプチド中に存在する欠失は、残りのコアエピトープに対する抗体の反応性に対して負の影響を及ぼさない。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｂアッセイ形態を例示する。該アッセイは、ＨＣＶゲノムのコア、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５領域からの組換えＨＣＶ抗原でコートされた微粒子よりなる２工程形態を用いる。これらの微粒子は、ドナー試料、希釈剤、およびヤギポリクローナル抗ヒトＦ（ａｂ’）２フラグメント／マウスモノクローナル抗ビオチン：アクリジニウムコンジュゲートの複合体と一緒になると、ＰＲＩＳＭ（登録商標）アクチベーター（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ）溶液により誘発されて、該試料中の抗ＨＣＶ抗体の定性的測定結果を表す或る量の光子を生成する。
【図２】図２は、ＨＣＶ  Ａｇアッセイ形態を例示する。このアッセイも、２工程形態を用いる。ＨＣＶ  Ｍａｂ（例えば、Ｃ１１−１４）でコートされた微粒子をドナー試料、希釈剤およびアクリジニウム標識Ｍａｂ（例えば、アクリジニウム標識Ｃ１１−１０）と一緒にすると、該試料中の抗ＨＣＶ抗原の定性的測定結果を表す或る量の光子が生じる。光子の測定量は、ＰＲＩＳＭ（登録商標）アクチベーター溶液により誘発された該試料中のＨＣＶ抗原の量を示す。
【図３】図３は、ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂコンボアッセイ形態を例示する。該アッセイは２工程形態を用いる。ＨＣＶ組換え抗原およびモノクローナル抗体混合微粒子（例えば、コア由来のＨＣＶペプチド、ならびにｃ１１−１４でコートされた微粒子と混合されたＨＣＶゲノムのＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５領域由来の組換え抗原）をドナー試料、希釈剤および混合アクリジニウム標識Ｍａｂ（例えば、アクリジニウム標識ｃ１１−１０およびアクリジン化マウス抗ヒトＩｇＧ）と一緒にすると、ＰＲＩＳＭ（登録商標）アクチベーター溶液により誘発されて、該試料中の抗ＨＣＶ抗原または抗ＨＣＶ抗体またはそれらの両方の定性的測定結果を表す或る量の光子が生じる。
【図４−１】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−２】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−３】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−４】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−５】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−６】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−７】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−８】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−９】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−１０】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図４−１１】図４は、本明細書中に言及するヌクレオチドおよびアミノ酸配列のすべて並びに対応配列認識番号を示す。
【図１】
2005518186.tif 000031
【図２】
2005518186.tif 000032
【図３】
2005518186.tif 000033
【図４−１】
2005518186.tif 000034
【図４−２】
2005518186.tif 000035
【図４−３】
2005518186.tif 000036
【図４−４】
2005518186.tif 000037
【図４−５】
2005518186.tif 000038
【図４−６】
2005518186.tif 000039
【図４−７】
2005518186.tif 000040
【図４−８】
2005518186.tif 000041
【図４−９】
2005518186.tif 000042
【図４−１０】
2005518186.tif 000043
【図４−１１】
2005518186.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月13日(2004.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【表１】
2005518186.tif 000045
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
【化１】
2005518186.tif 000046
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
Ｄ．ＤＮＡライゲーションにより構築された他の組換え体
組換え体ｐ９ＭＢ−２４（配列番号３５および配列番号３６）は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、ならびにそれに続く、該組換え体からアミノ酸３３−３５および４６−４９が欠失したＨＣＶアミノ酸１−１００を含有する。この組換え体は、プラスミドｐＨＣ４３をエンドヌクレアーゼＸｍａＩおよびＢａｍＨＩで制限消化し、該断片を、配列番号７から得られたＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片でＤＮＡライゲーションにより置換することにより構築した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
組換え体ｐ９ＭＢ−２５（配列番号３７および配列番号３８）は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、４個のグリシン残基および１個のセリン残基、ならびにそれに続く、該組換え体からアミノ酸３３−３５および４６−４９が欠失したＨＣＶアミノ酸１−１００を含有する。この組換え体は、プラスミドｐ９ＭＢ−２２をエンドヌクレアーゼＸｍａＩおよびＢａｍＨＩで制限消化し、該断片を、配列番号７から得られたＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片でＤＮＡライゲーションにより置換することにより構築した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
組換え体ｐ９ＭＢ−２６（配列番号３９および配列番号４０）は、ＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７、４個のグリシン残基および１個のセリン残基、およびそれに続く、該組換え体からアミノ酸３２−５０が欠失したＨＣＶアミノ酸１−１００を含有する。この組換え体は、プラスミドｐ９ＭＢ−２２をエンドエンドヌクレアーゼＸｍａＩおよびＢａｍＨＩで制限消化し、該断片を、ｐ９ＭＢ−１８（配列番号１７）から得られたＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片でＤＮＡライゲーションにより置換することにより構築した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
実施例Ｘ
３つのペプチドへのモノクローナル抗体の結合
３つの新たなペプチドを合成した。そのうちの２つはＨＣＶ  Ａｂ／Ａｇコンボ形態に適合し、１つは対照としての使用に適している。各ペプチドは、固相での製造中の追跡を容易にするために、Ｎ末端ビオチンを伴って合成された。ペプチドａａ１０−５３（ＡＬＡＭ−１７）（ＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＧＧＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＲＡＴＲＫＴＳ）（配列番号４２）は、介在性欠失を伴わないＨＣＶコアアミノ酸１０−５３を含有する。ペプチドａａ１０−５３＾３２−５０（ＡＬＡＭ−１８）（ＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＫＴＳ）（配列番号４３）は、ａａ３２−５０を含む１９アミノ酸の欠失を伴うＨＣＶコアアミノ酸１０−５３を含有する。ペプチドａａ１０−５３＾３１−３３＾４７−４８は、アミノ酸３１−３３および４７−４８が欠失しているＨＣＶコアアミノ酸１０−５３を含有する（ＡＬＡＭ１６）（ＫＴＫＲＮＴＮＲＲＰＱＤＶＫＦＰＧＧＧＱＩＶＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬＧＶＴＲＫＴＳ）（配列番号４１）。ペプチドＡＬＡＭ１６およびＡＬＡＭ１８は共に、ＨＣＶ  Ａｂ／Ａｇコンボ形態に適合する。ＡＬＡＭ１６の場合、アミノ酸３１−３３の欠失は、モノクローナル抗体ｃ１１−１０（エピトープ３２−３６）が該抗原に結合するのを妨げ、アミノ酸４７および４８の欠失はｃ１１−１４モノクローナル抗体（エピトープ４５−５０）の結合を妨げる。ＡＬＡＭ１８は、ｃ１１−１０およびｃ１１−１４の結合領域の両方を含む欠失を含有する。モノクローナル抗体ｃ１１−１０およびｃ１１−１４によるＡＬＡＭ１６およびＡＬＡＭ１８への結合の欠如を示すデータを、以下の表に示す。
【国際調査報告】
2005518186.tif 000047
2005518186.tif 000048
2005518186.tif 000049