(57)【要約】本発明は、酵素の基質に結合した２つの化合物の間のきわめて近接した移動から生じるシグナルを測定することによる、サンプル中のエンドグリコシダーゼ酵素活性、特別にはヘパラナーゼタイプのエンドグリコシダーゼ酵素活性の測定方法、及びエンドグリコシダーゼ、特別にはヘパラナーゼタイプの活性を有するエンドグリコシダーゼの活性を変更することのできる化合物の検出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のエンドグリコシダーゼ酵素活性の測定方法であって、以下のステップ：
ｉ．エンドグリコシダーゼによって切断可能な基質を前記サンプルと接触させること、及び、
ｉｉ．未反応の基質の量の変化を測定すること、ここで、この基質の量の減少は、上記サンプル中のエンドグリコシダーゼ活性を表す、
を含み、上記基質が直接的又は間接的に第１のドナー化合物及び第２のアクセプター化合物で標識され、そして未反応の基質の量がアクセプター化合物により発せられたシグナルを測定することによって決定され、このシグナルが、上記ドナー及び上記アクセプター間がきわめて近接していることによる効果を介する移動により生じることに特徴を有する、前記測定方法。
【請求項２】
上記第１のドナー化合物及び上記第２のアクセプター化合物が蛍光化合物であって、上記きわめて近接した移動がエネルギー移動であって、そして発せられた上記シグナルが蛍光シグナルであることに特徴を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エンドグリコシダーゼ酵素活性を変更することのできる化合物の検出方法であって、以下のステップ：
ｉ．試験化合物の存在下または非存在下で、エンドグリコシダーゼによって切断可能な基質をエンドグリコシダーゼと接触させること、
ｉｉ．未反応の基質の量の変化を測定すること、及び、
ｉｉｉ．上記試験化合物の非存在下で測定した基質量の変化を、試験化合物の存在下で測定した基質量の変化と比較すること、
を含み、上記基質が、直接的または非直接的に、第１ドナー化合物及び第２アクセプター化合物で標識され、そして未反応の基質量が上記アクセプター化合物により発せられたシグナルを測定することによって決定され、このシグナルが上記ドナー及び上記アクセプター間がきわめて近接していることによる効果を介する移動によって生じることに特徴を有する、前記方法。
【請求項４】
上記第１のドナー化合物及び上記第２のアクセプター化合物が蛍光化合物であり、上記きわめて近接した移動がエネルギー移動であり、そして発せられた上記シグナルが蛍光シグナルであることに特徴を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記エンドグリコシダーゼが、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ、非精製ヘパラナーゼおよびヘパリチナーゼから選ばれる、ヘパラナーゼタイプの酵素であることに特徴を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記基質が、へパラン硫酸プロテオグリカン及びそれらの誘導体、細胞外マトリックスに結合したヘパラン硫酸塩およびそれらの誘導体、ヘパリン、並びにヘパラン硫酸塩又はそれらの誘導体であり、以下の式：
【化１】
2005534312.tif 000005
｛式中、
Ｒ1及びＲ3は、以下の：Ｈ、ＳＯ3Ｈ、ＳＯ3Ｈ‐から成る群から選ばれ、
Ｒ2は、ＳＯ3Ｈ、ＳＯ3Ｈ‐、C(O)CH3から成る群から選ばれ、
X1及びX2がH又はCOOHを表す。｝
により表される単位を１〜３０単位含むであろうということに特徴を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記基質が、ドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物に共有結合で結合されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記基質が第１のリガンド−受容体対の要素及び第２のリガンド−受容体対の要素に共有結合で結合されており、そして上記ドナー蛍光化合物が上記第１のリガンド−受容体対の他の要素に共有結合で結合され、そして、上記ドナー蛍光化合物が上記第２のリガンド‐受容体対の他の要素に結合されていることに特徴を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上記基質が上記ドナー蛍光化合物に共有結合で結合され、そしてリガンド−受容体対の要素に共有結合で結合されており、そして上記アクセプター蛍光化合物が前記リガンド−受容体対の他の要素に共有結合で結合されていることに特徴を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
上記基質が上記アクセプター蛍光化合物に共有結合で結合され、そしてリガンド−受容体対の要素に共有結合で結合されており、そして、上記ドナー蛍光化合物が前記リガンド−受容体対の他の要素に共有結合で結合されていることに特徴を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
上記第１の及び上記第２のリガンド−受容体対が異なり、そして以下の対：ハプテン／抗体、DNP／抗−DNP抗体、GST／抗−GST抗体、ビオチン／アビジン、６HIS／抗−６HIS抗体、Cmyc／抗−Cmyc抗体；FLAG(登録商標)／抗−FLAG(登録商標)抗体；HA／抗−HA抗体から選ばれることに特徴を有する、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記ドナー化合物が希土類クリプテート又はキレートであり、そして上記アクセプター蛍光化合物がローダミン、シアニン、スクアレン、ボディピー色素、フルオレセイン、アロフィコシアニン及びそれらの誘導体から選ばれることに特徴を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が、抗ヘパラナーゼ抗体、天然物、合成物、コンビナトリアルケミストリーによって得られた化合物ライブラリーからの生成物、ペプチド及びタンパク質から選ばれることに特徴を有する、請求項３または４に記載のヘパラナーゼタイプの酵素活性を変更可能な化合物の検出方法。
【請求項１４】
ビオチン及びDNP基を含むことができるか又は含むことができない複数のHSを含み、上記DNP／HSの最終モル比が０．３〜２の間、好ましくは０．７に等しく、そして上記ビオチン／HSの最終モル比が０．５〜２の間、好ましくは１に等しいことに特徴を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって使用可能な組成物。
【請求項１５】
DNP／HSPGの最終モル比が６及び１５の間、好ましくは１０．８であり、且つビオチン／HSPGの最終モル比が６及び１５の間、好ましくは１５であることに特徴を有する、ビオチン及びDNP基を含む複数のHSPGを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法によって使用可能な組成物。
【請求項１６】
以下の要素：
ヘパラナーゼタイプの活性を有する酵素によって切断可能な基質、
前記基質に共有結合で結合された、又は間接的に結合することのできる、ドナー蛍光化合物、
前記基質に共有結合で結合された、又は間接的に結合することのできる、アクセプター化合物、
を含み、ここで、上記蛍光化合物が共有結合で前記基質に結合されていない場合、前記要素が同じボトル又は異なるボトル中にある、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１７】
以下の要素：
ビオチン及びDNPに共有結合で結合されたヘパラン硫酸、
抗−DNP抗体に結合された希土類クリプテート、及び
ストレプトアビジンに結合されたXL665、
を含むことに特徴を有する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
以下の要素：
ビオチン及びDNPに共有結合で結合されたヘパラン硫酸プロテオグリカン、
抗−DNP抗体に結合された希土類クリプテート、及び
ストレプトアビジンに結合されたXL665、
を含むことに特徴を有する、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のエンドグリコシダーゼ、特別にはヘパラナーゼタイプのエンドグリコシダーゼの活性測定方法、及びエンドグリコシダーゼ、特別にはヘパラナーゼタイプの活性を有するエンドグリコシダーゼの活性を変更することのできる化合物の検出方法に関する。
【０００２】
エンドグリコシダーゼは、グリコシド鎖内の切断反応を触媒することのできる酵素である。
【０００３】
ヘパラナーゼは、例えば、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン（HSGAG）のようなグリコサミノグリカン単位を含むポリマーを切断することのできる酵素である。
【０００４】
血液系の腫瘍の癌性細胞による組織への浸潤の主なプロセスは、それらが血管内皮を通過すること及び一組のプロテアーゼ及びグリコシダーゼによる、その下の基底層及び細胞外マトリックスのその後の分解を含む。
【０００５】
基底層及びその下の結合組織は、フィブロネクチン、ラミニン、IV型コラーゲン及びビトロネクチンから成り、そのそれぞれが細胞外マトリックス内に包埋されたプロテオグリカンのヘパラン硫酸（HS）側鎖と相互作用する。
【０００６】
したがって、侵潤性の細胞により産生されたエンドグリコシダーゼ、例えばヘパラナーゼタイプの活性を有する酵素によるHSの切断は、細胞外マトリックス及び基底層の分解に寄与し、そしてしたがって、細胞の遊走を容易にする。
【０００７】
ヘパラナーゼ活性がマウス及びヒトのメラノーマ細胞株の転移能に関連することが示された。特別には、ヒト及びマウスの線維肉腫及びメラノーマ細胞株の転移能は、これらの細胞株によって産生されたヘパラナーゼ活性に関係している。さらに、ヘパラナーゼ活性は、いくつかの組織及び細胞タイプ、特にラット肝臓、ヒト胎盤、ヒト血小板、培養線維芽細胞、ヒト好中球、活性化ラットTリンパ細胞、マウスBリンパ細胞及びヒト単球、並びにヒト臍帯静脈内皮細胞において報告されている。
【０００８】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）は、細胞膜内に包埋されたHS鎖で置換されたタンパク質成分から作られている。これらの鎖は、一般的に（圧倒的に、ベータD−グルクロン酸に連結したN-アセチル化グルコサミンのジサッカライド単位である）硫酸化されていない又は比較的硫酸化されていない領域によって分離された（圧倒的に、アルファL-イズロン酸残基に連結したN-硫酸化グルコサミン単位である）硫酸化ジサッカライド単位から成る。HSは、ジサッカライド単位の数が変更可能であること及び鎖ごとに異なるそれらの配列によって、大きな多様性を示すことができる。
【０００９】
このように、HSの切断が転移性の細胞の基底膜を横切る遊走に必須であるらしいため、ヘパラナーゼ活性阻害剤は、抗転移薬又は抗炎症性薬としての使用の可能性のある新しい化合物のクラスを構成する。
【００１０】
いくつかのグループが、特に医薬品として使用されるかもしれない新規化合物を単離する目的で、ヘパラナーゼ活性のアッセイ方法を開発した。
【００１１】
ヘパラナーゼ活性をアッセイするのに開発された方法のほとんどは、ヘパラナーゼの基質を放射能標識すること及びこの酵素を含むサンプルとともにインキュベーションした後に生成した断片を分析することに基づく。
【００１２】
ＰＣＴ国際特許出願公開WO00/77241号は、その導入部分において、HSGAGを放射性元素又は基（35S、3H）の存在下で細胞を培養すると、これらの放射性元素がHSGAGに取り込まれることができることを報告している。放射標識されたHSGAGはその後、基質として使用される。HSGAGを3H又は125Iで標識することも可能である。ヘパラナーゼ活性は、放射活性の減少又は標識分子の分子量の減少を測定することによって決定される。後者の場合、基質は、電気泳動又はクロマトグラフィーによって分析される。
【００１３】
これらの技術は、放射性元素の使用に関連する通常の欠点を、特に放射線防護に関して有し；それらは定性的なものであり、測定された酵素活性を定量することを非常に困難にし、そしてハイスループットスクリーニングには適さない。
【００１４】
PCT国際特許出願公開第WO00/77241号は、試験サンプル中に存在する酵素によって切断されたHSGAG断片の検出に基づいて、ヘパラナーゼ活性をアッセイする方法を開示する。HSGAG基質は最初に結合モチーフによって固相支持体に結合させられ、第二に、（成長因子などの）HSGAGに結合することのできる細胞調節物質に結合することができる。試験サンプルと接触させられた後、切断された断片は第二固相支持体との特異的結合によって固定化される。こうして分離された断片は、例えば、結合基又は成長因子に特異的な標識抗体を用いて分光技術によって、又は蛍光技術によって検出されることができる。測定された信号は、サンプル中のヘパラナーゼ活性を表すものであり、生理学的又は病理学的状態において産生された成長因子／HSGAG複合体の生理活性を直接的に反映している。この技術の欠点は、非特異的な吸着の問題に導きうる固相支持体の使用にあり、それは、アッセイ及びハイスループットスクリーニングプロセスにおいて冗長でありうる分離ステップにおいても、困難性及び費用を増加させる。
【００１５】
PCT国際特許出願公開第WO00/03306号は、グリコシダーゼ活性のアッセイ、そして特別には抗癌剤又は抗炎症剤のスクリーニング方法を記載する。該方法は、HSタイプの基質の存在下における、試験作用物質のヘパラナーゼ活性に及ぼす効果を研究することに基づく。ヘパラナーゼ活性は、比色アッセイ、特別には、基質の切断中に形成した還元糖を検出するための比色アッセイをともなうカラムクロマトグラフィー又は電気泳動によって、切断された基質断片を分離することによって決定される。
【００１６】
その適用において、基質はセファロース（登録商標）ビーズに結合され、そして、可溶性の切断断片を分離するため及びそれらを比色法（カルバゾール又はジメチルメチレンブルー）によって同定するために、遠心分離ステップが必要とされる。
【００１７】
米国特許第６，２０７，４０２号は、この酵素の基質の分解産物の分離及び検出ステップを含む、ヘパラナーゼ酵素活性の測定方法を記載する。
【００１８】
エネルギー移動によって発せられた蛍光の検出に基づく加水分解酵素アッセイが記載されたが（カスパーゼ３、ヘルペス単純ウイルスプロテアーゼ、HIVプロテアーゼ）、すべての場合において、基質はタンパク質又はペプチド基質であった。そのような基質は、ヘパラナーゼ又はヘパリチナーゼのようなエンドグリコシダーゼの基質の場合とは異なり、容易に官能基化されることができる。これは特に、HSが一組の複雑な生化学的プロセスによって生成され、そしてしたがって化学合成によって生成するのは困難であること、そしてまたヘパラン硫酸が非常に多様であることによる。
【００１９】
コンビナトリアルケミストリーは、数百数千の産物からなる化合物のライブラリーを作り出した。これらの分子の有益性を合理的な時間内で及び合理的な費用で試験するためには、容易に自動化されうる単純で、迅速で、信頼できるモデルを使用することが必要である。ヘパラナーゼ活性をアッセイするために先に開発された技術は、そのような用途、特に分子ライブラリーのハイスループットスクリーニングとの関係においては、比較的適さないものである。
【００２０】
したがって、解決されるべき技術的問題は、これらの基準を満たす技術、特別には高感度で、小規模化可能であり、集中的な使用に適したヘパラナーゼ活性のアッセイを開発することにある。本発明はそのようなアッセイを提供する。
【発明の開示】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の対象は、酵素基質に結合した２つの化合物の間のきわめて近接した移動により生じるシグナルを測定すること、そしてしたがって、上記酵素活性に由来する断片の分離ステップを必要としないことに基づいてエンドグリコシダーゼ活性をアッセイすることである。
【００２２】
きわめて近接した移動は、エネルギー移動（FRET現象、HTRF（登録商標）技術、CIS bio international）、フォトン移動、一重項酸素移動（Alphascreen（登録商標）技術、PerkinElmer、例えば、Beaduet et al., Genome Res. 2001 Apr. 11(4), 600-8を参照のこと。）又は電子移動（SPA Technology, Amersham Biosciences, 例えば、Udenfriend et al., Anal. Biochem., 1987, Mar., 161(2), 494-500を参照のこと。）であることができる。
【００２３】
特別には、本発明は、基質に結合したドナー蛍光化合物とアクセプター蛍光化合物の間のエネルギー移動により生じる蛍光の均一時間分解測定に基づくエンドグリコシダーゼ活性のアッセイに関する。好ましくは、このエンドグリコシダーゼはヘパラナーゼタイプの活性を有する。
【００２４】
FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）現象は、蛍光の均一な時間分解測定を可能とする。特にG. Mathisらにより開発された希土類クリプテート又はキレートを用いるこの技術の使用(特に、”Homogeneous time resolved fluorescence energy transfer using rare earth cryptates as tool for probing molecular interactions in biology”, Spectrochimica Acta Part A 57 (2001) 2197-2211を参照のこと)は、インビトロの診断及び医薬産業におけるハイスループットスクリーニングの分野においていくつかの適用と可能としている多くの利点を有する。
【００２５】
HTRF（登録商標）（均一時間分解蛍光）とも呼ばれるこの技術は、第１ドナー蛍光化合物及び第２アクセプター蛍光化合物を使用する。本発明による方法においては、これらの化合物は、エンドグリコシダーゼ活性、特別にはヘパラナーゼタイプの活性を有する酵素の基質に直接的又は間接的に結合する。
【００２６】
基質を含む媒体の光励起後、ドナー化合物とアクセプター化合物の間にエネルギー移動が起こり、アクセプター化合物による光の発光を生じさせ、これは蛍光光度計を用いて測定することができる。エンドグリコシダーゼ活性、特別にはヘパラナーゼタイプの活性を有する酵素の存在下では、基質は切断され、そしてドナーとアクセプター化合物が離れているために、エネルギー移動はもはや起こらず、アクセプター化合物により発せられるシグナルが減少するだろう。
【００２７】
エンドグリコシダーゼ活性、特別にはヘパラナーゼタイプの活性を阻害又は活性化する化合物の存在下では、測定されるシグナルは、阻害剤又は活性化剤のない場合に測定されるシグナルに比べて変更されている。
【００２８】
本発明による方法を開発するにあって、いくつかの技術的障害が考慮されなければならなかった。
【００２９】
第１及び第２蛍光化合物の間の距離は、FRET現象を用いるアッセイの決定的側面を構成する。特に、エネルギー移動は、ドナー及び１０6倍にエネルギー励起されるアクセプター間の距離に反比例する。この側面は、本発明によるアッセイにおいて使用される基質の標識化において考慮されなくてはならず；第１及び第２蛍光化合物を隔てている距離は、エネルギー移動が起こること及び上記二つの蛍光化合物を効果的に遠ざけるための基質の切断の両方を可能としなければならない。
【００３０】
したがって、ドナー及びアクセプター蛍光化合物それぞれの量は、最適化されなければならず；基質が過剰に多数の蛍光化合物を含む場合、エンドグリコシダーゼ活性、特別にはヘパラナーゼタイプの活性を有する酵素による切断の間、観察されるシグナルは顕著な変化はしないであろう。逆に、少なすぎる蛍光化合物が使用される場合、エネルギー移動は起こらず、シグナルの欠如を生じるであろう。発明者らは、したがって、基質を官能基化するのに使用されるドナー及びアクセプター蛍光化合物の比率を最適化した。これらの比率は、各蛍光物質について、最初のモル比（Rmi）及び最後のモル比（Rmf）に相当する。Rmiは、標識化反応の間の基質に対する蛍光物質の比率に相当する。蛍光物質がリガンド／受容体対を介して間接的に基質に結合する場合、Rmi は、基質の量に対するリガンドの比率に相当する。Rmf は、標識化反応の後であるが、同様に計算され；したがって、それは蛍光物質の分子数又は基質に結合したリガンドの分子数に相当する。
【００３１】
本発明の方法において使用されることのできる基質の製造の間においては、他のパラメーターが考慮されなければならなかった。
【００３２】
特にヘパラン硫酸のアミン又はカルボキシル基がドナー蛍光化合物の、アクセプター蛍光化合物の、又はリガンド／受容体対の要素の結合において使用される場合には、反応媒体のpHは標識化反応の間に重要な役割を果たす。実際、pHは、基質の官能基化において使用されるアミン又はカルボキシル官能基の反応性を決定する。したがって、発明者らは、本発明による方法において使用可能な基質を生成するための最適pHが、HSの遊離アミンが使用された場合には、７．５〜９の範囲内、好ましくは８．３に等しく、遊離のカルボキシル官能基が使用された場合には、５〜７の範囲内、好ましくは６に等しいことを決定した。
【００３３】
エンドグリコシダーゼ活性、より特別にはヘパラナーゼタイプの酵素活性のアッセイをFRET現象に基づいて開発するために、発明者らは、特にタンパク質基質又は他の酵素活性のアッセイにおいては明らかでない、これらの酵素をアッセイする場合に特異的に遭遇する以下のいくつかの困難性を克服しなければならなかった：
【００３４】
1／従来技術のFRET技術に基づく酵素活性のアッセイにおいては、酵素切断部位は明白に特徴付けされているにもかかわらず、HSに関しては不確実性が残る。したがって、切断部位の両側において基質を官能基化することは非常に困難である。
【００３５】
２／HSは、グリコシド単位配列及び鎖の長さの両方に関して非常に大きな不均一性を示し：したがって、HSの構造が分子ごとに異なることにより、化学的に局在化された官能基化は困難である。
【００３６】
３／タンパク質−HSの相互作用は、タンパク質−タンパク質の相互作用よりもずっと不安定であり：ドナー及びアクセプター化合物の直接的又は間接的結合は、より一層容易にエンドグリコシダーゼ／HS相互作用を妨害することができる。
【００３７】
第一に、本発明はサンプル中のエンドグリコシダーゼ酵素活性の測定方法であって、以下のステップ：
ｉ．エンドグリコシダーゼによって切断可能な基質を前記サンプルと接触させること、そして
ｉｉ．サンプル中のエンドグリコシダーゼ活性を表す、この基質の未反応の基質の量の変化、この基質の減少量を測定すること、
を含む上記方法に関する。
【００３８】
この方法においては、基質は、直接的又は間接的に第１のドナー化合物及び第２のアクセプター化合物によって標識され、未反応の基質の量が、アクセプター化合物の発するシグナルによって決定され、このシグナルは、ドナー及びアクセプター間がきわめて近接していることによる効果を介した移動によって生じる。
【００３９】
この方法は、例えば、ヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼのような、ヘパラン硫酸塩を切断することのできるエンドグリコシダーゼの測定に使用されることができる。
【００４０】
この方法の特別な実施においては、第１のドナー化合物及び第２のアクセプター化合物が蛍光化合物であり、きわめて近接した移動は、エネルギー移動であり、発せられるシグナルは蛍光シグナルである。
【００４１】
「直接的な標識」という用語は、基質上に存在する、又は先に基質に導入された、又は基質上に生成された官能基への蛍光標識の結合を意味する。スペーサーアームは、蛍光標識と基質の間に導入されることができる。
【００４２】
「間接的な標識」という用語は、リガンド／受容体対を介した、蛍光標識の基質への結合を意味する。この場合、蛍光標識及び基質はそれぞれリガンド／受容体対の要素で標識される。
【００４３】
ドナー蛍光化合物は、所定の波長で励起された後、エネルギー移動を行うことによって蛍光シグナルを発し、アクセプター蛍光化合物を励起させる蛍光化合物である。多くのドナー蛍光化合物が本発明において使用されることができる。例として、ヨーロッパ特許第EP180492号、同第EP321353号及び同第EP601113号に記載の希土類クリプテート（ユーロピウム、テルビウム）及び希土類キレートが挙げられる。
【００４４】
アクセプター蛍光化合物は、ドナー化合物からのエネルギー移動によって励起された後に所定の波長で蛍光シグナルを発する蛍光化合物である。
【００４５】
本発明による方法を実施するために使用可能な多くのアクセプター化合物が存在し、その中には、アロフィコシアニン、XL665（CIS BIO International）のような架橋アロフィコシアニン、Cy5のようなシアニン、ローダミン、スクアレン、ボディピー（bodipy）色素及びフルオレセインなどがある。
【００４６】
当業者は、選ばれたドナー蛍光化合物と相関関係にあるものとして、適切なアクセプター蛍光化合物を選択することができる。
【００４７】
上記のエンドグリコシダーゼ活性測定法は、それを試験することが望まれる化合物によってあらわされるこの酵素活性の変更の効果の研究を可能とすることができる。
【００４８】
「酵素活性の変更」という表現は、そのメカニズムにかかわらず、この酵素活性の阻害又は活性化を意味する。
【００４９】
したがって、本発明は、エンドグリコシダーゼタイプの酵素活性を変更することのできる化合物の検出方法であって、以下のステップ：
ｉ．試験化合物の存在下又は非存在下において、エンドグリコシダーゼによって切断可能な基質をエンドグリコシダーゼと接触させること、
ｉｉ．未反応の基質量の変化を測定すること、そして、
ｉｉｉ．試験品の非存在下で測定した基質量の変化を、試験品の存在下で測定したものと比較すること、
を含む、上記方法にも関する。
【００５０】
この方法において、基質は第１のドナー化合物及び第２のアクセプター化合物で直接的又は間接的に標識され、そして未反応の基質の量がアクセプター化合物によって発せられるシグナルを測定することによって決定され、このシグナルはドナー及びアクセプターの間がきわめて近接していることによる効果を介する移動により生じる。
【００５１】
後者の方法においては、使用されるエンドグリコシダーゼは、特に、組み換えヘパラナーゼ、精製ヘパラナーゼ、非精製ヘパラナーゼ及びヘパリチナーゼから選ばれるヘパラナーゼである。
【００５２】
この方法の特別な実施においては、第１のドナー化合物及び第２のアクセプター化合物は蛍光化合物であり、きわめて近接した移動はエネルギー移動であり、そして発せられるシグナルは蛍光シグナルである。
【００５３】
先の方法において使用される基質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）及びそれらの誘導体、細胞外マトリックスに結合したヘパラン硫酸（HS）及びそれらの誘導体、ヘパリン並びにヘパラン硫酸（HS）又はそれらの誘導体から選ばれることができ、そして、以下の式：
【化１】
2005534312.tif 000002
｛式中、
R1及びR3は、以下の基：H、SO3H、SO3Hから選ばれ、
R2は、以下の基：SO3H、SO3H‐、C(O)CH3から選ばれ、
X1及びX2はH、COOH、COO-をあらわす。｝
により表される単位を少なくとも１つ含む。
【００５４】
上記基質誘導体は、酵素−基質の認識を妨げない些細な修飾をおこなったHS又はHSPGである。より正確には、これらの基質誘導体は、ヘパラナーゼタイプの活性を有する酵素によって切断されることができる。
【００５５】
本発明による方法は、多様な様式によって実施されることができる。以下の型は、好ましい様式であり、図１にあらわされる。
【００５６】
ａ型：基質は、ドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物に共有結合で結合されることができる。
【００５７】
ｂ型：基質は、第１リガンド−受容体対の要素及び第２リガンド−受容体対の要素に共有結合で結合され、ドナー蛍光化合物は共有結合で第１のリガンド−受容体対の他の要素に結合され、そして、ドナー蛍光化合物は第２のリガンド−受容体対の他の要素に結合される。
【００５８】
ｃ型：基質はドナー蛍光化合物に共有結合で結合され、リガンド−受容体対の要素に共有結合で結合され、そしてアクセプター蛍光化合物は、前記リガンド−受容体対の他の要素に共有結合で結合される。
【００５９】
ｄ型：基質は、アクセプター蛍光化合物に共有結合で結合され、そしてリガンド−受容体対の要素に共有結合で結合され、そしてドナー蛍光化合物は前記リガンド−受容体対の他の要素に共有結合で結合される。
【００６０】
「リガンド−受容体対」は、以下の対：ハプテン／抗体；DNPがジニトロフェノールを表す、DNP／抗DNP抗体；GSTがグルタチオンSトランスフェラーゼを表す、GST／抗GST抗体；ビオチン／アビジン；６HISが６個のヒスチジンからなるペプチドである、６HIS／抗６HIS抗体；CmysがヒトCmysタンパク質の410〜419のアミノ酸から成るペプチドである、Cmyc／抗Cmyc 抗体；FLAG（登録商標）が４つのアミノ酸のペプチドである、FLAG（登録商標）／抗FLAG（登録商標）抗体；HAが９個のアミノ酸からなるインフルエンザヘマグルチニンエピトープである、HA／抗HA抗体のような２つの結合パートナーを意味する。他の対も使用可能である。
【００６１】
これらの「タグ／反（anti）タグ」系は、当業者に周知であり、商業的に入手可能である。
【００６２】
ドナー蛍光化合物、アクセプター蛍光化合物及び第１及び第２のリガンド−受容体対の要素は、マレイミド、カルボン酸、ハロアセタミド、アルキルハライド、アジド、ヒドラジド、アルデヒド、ケトン、アミノ、スルフヒドリル、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、アジリジン、スルホニルハライド、酸ハライド、ヒドロキシサクシニミドエステル、ヒドロキシスルホサクシニミドエステル、イミドエステル、ヒドラジド、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、アジド、３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオナミド、又はグリオキサル基、及びより特別には、以下の式：
【化２】
2005534312.tif 000003
｛式中、
ｎは、０〜８の範囲内にあり、そして
ｐは、０又は１に等しく、そして、
Ａｒは、場合により、ハロゲン原子で置換された、１〜３個のヘテロ原子を含む５又は６個の環の構成要素を有するヘテロ環である。｝
により表される基のような反応基を用いて共有結合で基質に結合されることができる。
【００６３】
これらの反応性基は、これらの分子上にあるNH2、COOH、及び／又はCHO官能基を用いて、ドナー又はアクセプター蛍光化合物又はリガンド−受容体対の要素そして基質上へ導入される。
【００６４】
使用される基質がHSである場合、蛍光化合物又はリガンド−受容体対の要素を、HSのアミン又はカルボキシル官能基を介して結合させることが可能である。コンジュゲートを作成するためのこれらの基の使用は、”Bioconjugate Techniques", G.T. Hermanson, Academic Press, 1996中に記載されている。
【００６５】
アミン官能基は、第１の又は第２の蛍光物質、或いはそうでなければリガンド−受容体対の要素を結合させるのに使用可能である。これを行うには、蛍光化合物又はリガンド−受容体対の要素がHS又はHSPGのアミンとの結合を可能とする反応性基と結合される。非制限的な例により、第１又は第２の蛍光物質、及びリガンド／受容体対の要素のうちの一つもイソチオシアネート、イソシアネート、N-ヒドロキシサクシニミドエステル、アシルアジド、スルホニルクロライド、アルデヒド、グリオキサル、エポキシド、エポキシラン、炭酸塩、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド又はアンハイドライド基に結合することができる。
【００６６】
HSのカルボキシル官能基が使用される場合、蛍光化合物又はリガンド受容体対の要素は、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール又はカルボジイミドなどの、これらのカルボキシル官能基と反応する基に結合されることができる。
【００６７】
使用される基質がHSPGである場合、炭化水素成分（HS）の糖の（OH基の酸化後の）CHO官能基又はタンパク質成分（プロテオグリカン）のアミン官能基を介して、蛍光化合物又はリガンド−受容体対の要素を結合させることが可能である。
【００６８】
本発明の方法においては、ドナー化合物は希土類クリプテート又はキレートであり、ドナー蛍光化合物はローダミン、シアニン、スクアレン、ボディピー色素、フルオレセイン、アロフィコシアニン及びそれらの誘導体から選ばれる。アクセプター蛍光化合物誘導体は、その分光学的性質がエネルギー移動に適合した蛍光分子である。
【００６９】
本発明の方法において優先的に使用される希土類クリプテートは、以下の式：
【化３】
2005534312.tif 000004
により表される、ユーロピウムクリプテートである。
【００７０】
ヘパリナーゼタイプの酵素活性を変更することのできる化合物の検出方法は、特に抗ヘパリナーゼ抗体、天然物、合成物、コンビナトリアルケミストリーにより得られた化合物ライブラリーからの生成物、ペプチド及びタンパク質である、化合物のライブラリーをスクリーニングすることを可能とする。
【００７１】
ビオチン及びDNP基を含むHSからなる方法によって使用可能な他の基質は、DNP／HS最終モル比が０．３及び２の間、好ましくは０．７に等しく、そしてビオチン／HS最終モル比が０．５及び２の間、好ましくは１に等しいことに特徴を有する。
【００７２】
ビオチン及びDNP基を含むHSPGからなる方法によって使用可能な他の基質は、DNP／HSPG最終モル比が６及び１５の間、好ましくは1０．８に等しく、そしてビオチン／HSPG最終モル比が６及び１５の間、好ましくは８に等しいことに特徴を有する。
【００７３】
最後に、本発明は、本発明の方法の実施に必要とされる試薬、そして特別には以下の要素：
−ヘパラナーゼタイプの活性を有する酵素によって切断可能な基質
−前記基質に共有結合で結合された又は間接的に結合することのできる、ドナー蛍光化合物、
−前記基質に共有結合で結合された又は間接的に結合することのできる、アクセプター化合物を含むキットにも関し、ここで、蛍光化合物が上記基質に共有結合で結合されていない場合、上記要素は同じボトル中、又は異なるボトル中にあることができる。
【００７４】
本発明によるキットは、好ましくは以下の：
−ビオチン及びDNPで標識されたヘパラン硫酸
−抗DNP抗体に結合された希土類クリプテート
−ストレプトアビジンに結合されたXL665、
を含む。
【００７５】
本発明による他のキットは、以下の：
−ビオチン及びDNPで標識されたヘパラン硫酸プロテオグリカン
−抗DNP抗体に結合された希土類クリプテート
−ストレプトアビジンに結合されたXL665、
を含む。
【００７６】
本発明による方法は、従来技術の方法に比べた以下の多くの利点、特に以下の利点を有する：
−それらは、実施が非常に単純であり、それはなぜなら、ヘパラナーゼタイプの酵素活性に特徴を有する蛍光シグナルを得ることが可能であるために、多様な試薬を接触させることで十分だからである。化学的な処理又は分離ステップは必要ない。
【００７７】
−使用される容積は非常に小さく（１ウエルあたり２０μl）、それは、アッセイを小規模化し、そして試薬の節約を可能とする。例えば、PCT国際特許出願公開第WO00/03036号において５〜５０μgの基質が使用されるにもかかわらず、３０ngよりも少ない基質が実施例４では使用される。アッセイにおいて使用される酵素の量についても同じことが言える。さらなる小規模化が期待され、そして好適な読み取り機を用いて実施することが簡単である。
【００７８】
−試薬のためのインキュベーション時間は短く：実施例４にしめすとおり、シグナルを得るためには、酵素反応のあとの１時間のインキュベーションで充分である。したがって、本発明による方法は、ヘパラナーゼ活性を変更することのできる分子ライブラリーを迅速にスクリーニングすることが可能である。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例は、本発明による方法の好ましい実施を非制限的に例示する。
【００８０】
実験セクション
以下の略語が使用される：
DNP：ジニトロフェノール
EDC：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
HS：へパラン硫酸
NHS：N−ヒドロキシサクシニミド
【００８１】
Ａ／へパラン硫酸タイプの基質の使用
この場合、基質はHSのCOOH及びNH2官能基を用いて官能基化される。
【００８２】
実施例１：ＤＮＰ−ＨＳ−ビオチン基質の調製
使用される試薬：
２０mg/mlのHS溶液：１０mg HS＋０．５ml 10mM PO4(Na/K)緩衝液、pH 7.0、0.15M NaCl
２０mMのEDC溶液：２．４mg EDC(PIERCE) ＋０．６２５ml 0.1M  MES緩衝液、pH6.0 
４７mM ５−（ビオチナミド）ペンチルアミン溶液：４．２mg ５−（ビオチナミド）ペンチルアミン（PIERCE）+０．２７１ml 0.1M MES緩衝液、pH6.0
1mg/mlのDNP-NHS溶液：３mg DNP-NHS(CIS-Bio)+１．０ml DMSO(Sigma D8418)
【００８３】
ビオチン標識
２０mg/mlのHS溶液０．２５ml（Seikagaku）を０．１２５mlの４７mＭ ５−（ビオチナミド）ペンチルアミン溶液と混合する。０．１２５mlの２０mM EDC溶液の存在下、混合物を１８時間、室温でインキュベートする。その後、１．５mlの0.15M NaCl 含有PO4(Na/K)緩衝液（１０mM）、pH 7.0を添加することによって反応を停止する。そして、Slide-A-Lyzer透析システム（Pierce）を用いて、該混合物を６００mlの０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7に対して透析する。６００mlの10mM PO4(Na/K)緩衝液、pH 7に対して３時間、６００mlの５０nMホウ酸緩衝液、pH8.3に対して１６時間、さらに２回の透析を行って、以後ビオチン−HSを呼ぶ、ビオチン標識HSを含む溶液２mlを得ることができる。
【００８４】
DNP標識
上記のビオチン−HS溶液２mlを１mlの３mg/ml DNP-NHS溶液と混合し、１mlの５０mM ホウ酸緩衝液、pH8.3、及び０．５mlのDMSOの存在下、室温で２時間、インキュベートした。反応混合物をその後、Sephadex G25 SFタイプ（Pharmacia）のカラム上のクロマトグラフィーによって、０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7で溶出した。こうして、以後「DNP-HS-ビオチン」と呼ぶ、ビオチン及びDNPで標識されたヘパラン硫酸の溶液を８．８３ml得る。
【００８５】
実施例２：最終モル比の決定
DNP-HS-ビオチンのアッセイ
HSのアッセイキット（Byscan, Biocolor Ltd）が、DNP-HS-ビオチン濃度の決定を可能とする。
【００８６】
DNPのアッセイ
DNP濃度は、DNP-HS-ビオチン溶液の360nmにおける吸収を分光光度計で測定することによって決定し、DNP濃度は、測定された値を標準曲線と比較することによって決定する。
【００８７】
ビオチンのアッセイ
ビオチン濃度は、FRET現象に基づくアッセイを使用して測定し、第一の曲線は、既知濃度のビオチン、クリプテート−ストレプトアビジンドナーコンジュゲート及びXL-ビオチンアクセプターコンジュゲートを合わせることによって確立し、得られるシグナルをRubystar蛍光光度計（BMG）によって測定する。置換曲線をプロットし、標準範囲として使用する。
【００８８】
アッセイされるビオチンをDNP-HS-ビオチンに変えて同じ実験を行う。得られるシグナルの値を、ビオチン濃度の決定を可能とする標準範囲とする。
【００８９】
得られたRmf値は、DNP／HS＝０．７及びビオチン／HS＝１である。
【００９０】
実施例３：均一時間分解蛍光（HTRF（登録商標））測定法を用いたDNP-HS-ビオチン化合物のアッセイ
本実施例は、均一媒体中での照射性の移動によって発せられた蛍光の時間分解測定に基づいたアッセイにおける、DNP-HS-ビオチン産物の使用の有効性を確認することを可能とする。
【００９１】
使用する試薬
１０μg/mlのストレプトアビジン−XLコンジュゲートの溶液：３．２μlの６２５μg/ml SA-XL(CIS bio international)+１９７μlの０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7.0；０．１％BSA ０．４M KF
１μg/mlのストレプトアビジン−XLコンジュゲートの溶液：１８μlの２０μg/ml SA-XL(CIS biointernational)+１６２μlの０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7.0；０．１％BSA ０．４M KF
１μg/mlの抗-DNP抗体−クリプテートコンジュゲート（以後、aDNP-Kと呼ぶ）溶液：４．５μlの１００μg/ml aDNP-K(CIS bio international)+４４５μlの０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7.0；０．１％BSA ０．４M KF
様々な濃度の（２２．２〜５４００ng/ml）DNP-HS-ビオチン溶液を、実施例１で得られた溶液から０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH 7中で調製する。
【００９２】
アッセイは、マルチウエルマイクロプレート上で実施する。各ウエルは、５μlのaDNP-K（１μg/ml）、５μlのSA-XL（1μg/ml又は１０μg/ml）及び１０μlの多様な濃度のDNP-HS−ビオチン溶液を含む。周囲温度で１時間インキュベート後、プレートをRubystar分光光度計（BMG）上で分析する（励起波長３３７nm、発光波長６２０及び６６５nm）。
【００９３】
得られた結果を、図２に表し、これは、シグナル変化をDNP-HS-ビオチン濃度の関数として示す。
【００９４】
図２は、驚くべきことに、DNP-HS-ビオチン基質によってシグナルが得られることを示しており、これは、ドナー化合物（aDNP-K）及びアクセプター化合物（SA-XL）間に明らかにエネルギー移動が起こることを意味している。他の化合物（ビオチン−HS基質をアッセイするためのSA-K及び抗-HS抗体−XL）を用いて実施された同じタイプの実験ではシグナルを得ることはできず、これは、エネルギー移動がまさにこの場合には起こることができなかったことを示す。この型を用いて得られたシグナルは、DNP-HS-ビオチン濃度と完全に相関し、これは、ヘパラナーゼタイプの酵素活性を測定するためのこれらの産物の使用を想定することを可能とするものである。
【００９５】
実施例４：ヘパラナーゼタイプの活性のアッセイ
使用する試薬：
２０mM PO4緩衝液、pH 7.2；0.15M NaCl；０．１％BSA中、０．２〜２００００μ単位／mlのヘパリチナーゼIII（Sigma）溶液
１μg/mlのSA-XL溶液： 1μlの６２５μg/ml SA-XL(CIS bio international)+６２４μlの０．１M PO4緩衝液、pH 7.2；０．４M KF NaCl；０．１％BSA 
０．８μg/mlのaDNP-K溶液：２μlの１００μg/ml aDNP-K(CIS bio international)+２４８μlの０．１M PO4緩衝液、pH 7.2；０．４M KF NaCl；０．１％BSA 
１．２μg/mlのDNP-HS-ビオチン溶液：３．８μlの４５μg/ml DNP-HS-ビオチン+１４０μlの２０mM PO4緩衝液、pH 7.2；０．１５M NaCl；０．１％BSA 
【００９６】
２０μlの１．２μg/ml DNP-HS-ビオチンと２０μlの多様な濃度のヘパリチナーゼ溶液（０．２〜２００００μ単位/ml）を混合することによって、酵素反応を行う。
混合物を室温で５時間放置する。
１０μlの各反応混合物をマイクロプレートのウエル中に入れ、そこへ５μl／ウエルのaDNP-K（０．８μg/ml）及び５μl／ウエルのSA-XL（１μg/ml）を添加する。
室温での１時間のインキュベーション後、Rubystar蛍光光度計（BMG）上でプレートを読み取る。
【００９７】
得られた結果を図３に表し、これは、酵素濃度の増加に対するシグナル変化を示す。
【００９８】
シグナルの減少は、酵素活性の増加、すなわち、DNP-HS-ビオチン基質の切断と完全に相関する。したがって、使用する型は、ヘパリチナーゼのようなヘパラナーゼタイプの酵素のアッセイ方法には完全に適しているが、この酵素活性の調節剤を決定するためにも適している。
【００９９】
実施例５：ヘパラナーゼタイプの酵素活性の調節剤の決定
実施例４と同じ手順を実施するが、試験化合物の存在下又は非存在下において多様な反応混合物が同一の酵素活性とともにインキュベートされる。
【０１００】
試験化合物の存在下及び非存在下において得られた試験結果を比較することによって、試験化合物による阻害又は活性化のパーセンテージが決定される。
【０１０１】
B/ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）タイプの基質の使用
この場合においては、HSのOH官能基及びタンパク質成分（プロテオグリカン）のNH2基を用いて基質を官能基化する。
【０１０２】
実施例６：DNP-ヘパラン硫酸プロテオグリカン−ビオチン基質（以後、DNP-HSPG-ビオチンと呼ぶ）の合成
使用する試薬：
HSPG：Sigma、分子量２００kDa
ビオチンヒドラジド：Pierce、分子量２５８．３３Da
NalO4：Sigma
NaCNBH4：Sigma
HSPGは、１００mM炭酸塩溶液、pH９に対して透析する。
【０１０３】
DNP標識
HSPG及びDNP-NHSの溶液を周囲温度で１時間反応させる。使用する量は、初期モル比で、HSPGあたり１５DNPである。その後、反応混合物をSephadex G-25カラム（NAP-5、Pharmacia）上で１００mM PO4緩衝液、pH7で溶出する。DNP-HSPGの溶液が得られる。
【０１０４】
ビオチン標識
上で得られたDNP-HSPG溶液を１０mMNalO4溶液で３０分間、周囲温度で酸化した。SephadexG25カラム上で１００mMリン酸緩衝液で溶出することによって精製後、酸化DNP-HSPG溶液をビオチンヒドラジド溶液と混合する。使用量は、初期モル比でDNP-HSPGあたり１０ビオチンヒドラジドである。反応混合物を４℃で１６時間インキュベート後、１５mM NaCNBH4溶液で４℃で４０分間還元する。SephadexG215カラム上で１００mMリン酸緩衝液pH7.0で溶出することによって精製後、DNP-HSPG-ビオチンの溶液が得られる。
【０１０５】
実施例７：均一時間分解蛍光（HTRF（登録商標））測定法を使用するDNP-HSPG‐ビオチン化合物のアッセイ
本実施例は、均一な媒体中での照射性の移動によって発せられた蛍光の時間分解測定に基づくアッセイにおけるDNP-HSPG‐ビオチン産物の使用の有効性を想定することを可能とする。
【０１０６】
使用する試薬
０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH7.0、０．２％ BSA 0.8M KFで希釈した６２５μg/mlのSa-XLから調製した、１０μg/mlのストレプトアビジン−XLコンジュゲート（以後、Sa-XLと呼ぶ）溶液
０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH7.0、０．２％ BSA 0.8M KFで希釈したaDNP-K（CIS bio international）から調製した、０．４μg/mlの１００μg/mlの抗-DNP抗体−クリプテートコンジュゲート（以後、aDNP-Kと呼ぶ）溶液
０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH7.0、０．２％ BSA 0.8M KFで希釈した２００μg/mlのSa-K（CIS bio international）から調製した、０．８μg/mlのストレプトアビジン−クリプテートコンジュゲート（以後、Sa-Kと呼ぶ）溶液
０．１M PO4(Na/K)緩衝液、pH7.0、０．２％ BSA 0.8M KFで希釈した２５０μg/mlのaDNP-XL（CIS bio international）から調製した、４μg/mlの抗DNP抗体−XLコンジュゲート（以後、aDNP-XLと呼ぶ）溶液
多様な濃度のDNP-HSPG-ビオチン溶液（１０〜５０００ng/ml）は、実施例６において得られた溶液から、０．１MPO4(Na/K)緩衝液、pH７中で調製した。
【０１０７】
アッセイをマルチウエルプレート上で実施する。１００μlの多様な濃度のDNP-HSPG-ビオチン、５０μlのSa-XL及び５０μlのaDNP-K、又は１００μlの多様な濃度のDNP-HSPG-ビオチン、５０μlのSa-K及び５０μlのaDNP-XLを含む。室温で１時間インキュベート後、プレートをRubystar分光光度計（BMG）上で分析した（励起波長３３７nm、発光波長６２０及び６６５nm）。
【０１０８】
得られた結果を図４に表し、これは、シグナル変化をDNP-HSPG-ビオチン濃度の関数として示す。
【０１０９】
図４は、DNP-HSPG-ビオチン基質によってシグナルが得られることを示し、これは、ドナー化合物（aDNP-K又はSa-K）とアクセプター化合物（SA-XL又はaDNP-XL）の間に明白にエネルギー移動が起こることを意味する。これらの型を用いて得られたシグナルは、ＤＮＰ−ＨＳ−ビオチン濃度と完全に相関しており、これは、これらの化合物のヘパラナーゼタイプの酵素活性測定における使用の有効性を予想することを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
(原文記載なし）
【図１】
2005534312.tif 000006
【図２】
2005534312.tif 000007
【図３】
2005534312.tif 000008
【図４】
2005534312.tif 000009
【国際調査報告】
2005534312.tif 000010
2005534312.tif 000011