(57)【要約】本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質の天然に存在する小分子アンタゴニストおよび化学合成した小分子アンタゴニストに関する。特に、本発明は、ゴッシポール誘導体ならびに特にBcl-2ファミリータンパク質（例えばBcl-2および／またはBcl-XL）を過剰発現する癌細胞におけるBcl-2およびBcl-XLタンパク質の抗アポトーシス効果のアンタゴニストとしてのゴッシポール誘導体の使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、細胞におけるアポトーシスの調整方法
a．i．Bcl-2ファミリータンパク質を過剰発現する細胞、
ii．ゴッシポール化合物
とを得る工程、
b．該細胞を、該細胞のアポトーシスが調整されるような条件下で有効量の該ゴッシポール化合物で治療する工程。
【請求項２】
ゴッシポール化合物が、Bcl-2ファミリータンパク質と結合し、細胞のアポトーシスが調整される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ゴッシポール化合物が(±)-ゴッシポールである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ゴッシポール化合物が(-)-ゴッシポールである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ゴッシポール化合物が(+)-ゴッシポールである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ゴッシポール化合物が(±)-ゴッシポロンである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ゴッシポール化合物が(-)-ゴッシポロンである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ゴッシポール化合物が(+)-ゴッシポロンである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ゴッシポール化合物が(±)-ゴッシポール酢酸である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ゴッシポール化合物が(-)-ゴッシポール酢酸である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ゴッシポール化合物が(+)-ゴッシポール酢酸である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
ゴッシポール化合物が(±)-エチルゴッシポールである、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
ゴッシポール化合物が(-)-エチルゴッシポールである、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
ゴッシポール化合物が(+)-エチルゴッシポールである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
ゴッシポール化合物が(±)-ヘミゴッシポロンである、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
ゴッシポール化合物が(-)-ヘミゴッシポロンである、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
ゴッシポール化合物が(+)-ヘミゴッシポロンである、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
ゴッシポール化合物が(±)-ゴッシポールのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
ゴッシポール化合物が(-)-ゴッシポールのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
ゴッシポール化合物が(+)-ゴッシポールのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
ゴッシポール化合物が(±)-ゴッシポロンのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
ゴッシポール化合物が(-)-ゴッシポロンのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
ゴッシポール化合物が(+)-ゴッシポロンのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
ゴッシポール化合物が(±)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
ゴッシポール化合物が(-)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
ゴッシポール化合物が(+)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
ゴッシポール化合物が(±)-エチルゴッシポールのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
ゴッシポール化合物が(-)-エチルゴッシポールのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
ゴッシポール化合物が(+)-エチルゴッシポールのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
ゴッシポール化合物が(±)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
ゴッシポール化合物が(-)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
ゴッシポール化合物が(+)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基である、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
Bcl-2ファミリータンパク質が、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1/BFL-1、およびBOO-DIVAからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３４】
細胞が罹患している、請求項1記載の方法。
【請求項３５】
疾患が、高増殖性疾患、癌、AIDS、変性病態、血管疾患、および感染症からなる群から選択される疾患を含む、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
癌が乳癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
癌が前立腺癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
癌がリンパ腫を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
癌が皮膚癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
癌が膵臓癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
癌が結腸癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４２】
癌が黒色腫を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４３】
癌が卵巣癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４４】
癌が脳腫瘍を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４５】
癌が肝臓癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４６】
癌が膀胱癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４７】
癌が非小細胞肺癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４８】
癌が頚癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４９】
癌が骨髄腫を含む、請求項35記載の方法。
【請求項５０】
癌が副腎癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項５１】
癌が白血病を含む、請求項35記載の方法。
【請求項５２】
癌が神経芽細胞腫を含む、請求項35記載の方法。
【請求項５３】
癌が膠芽細胞腫を含む、請求項35記載の方法。
【請求項５４】
癌が頭頚部癌を含む、請求項35記載の方法。
【請求項５５】
癌が転移性である、請求項35記載の方法。
【請求項５６】
感染症が病原体によって発症する、請求項35記載の方法。
【請求項５７】
病原体が細菌である、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
病原体が真菌である、請求項56記載の方法。
【請求項５９】
病原体がウイルスである、請求項56記載の方法。
【請求項６０】
以下の工程を含む、組織の細胞分裂を調整する方法
a．i．Bcl-2タンパク質を過剰発現する組織、
ii．ゴッシポール化合物、
iii．抗癌薬とを得る工程、および
b．該組織を、該細胞分裂が調整されるような条件下で有効量の該ゴッシポール化合物および該抗癌薬で治療する工程。
【請求項６１】
ゴッシポール化合物がBcl-2ファミリータンパク質と結合し、細胞における細胞分裂が調整される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
Bcl-2ファミリータンパク質を過剰発現する被験体にゴッシポール化合物を投与する工程を含む、被験体の治療方法。
【請求項６３】
ゴッシポール化合物が、Bcl-2ファミリータンパク質と結合する、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
Bcl-2ファミリータンパク質を過剰発現する被験体にゴッシポール化合物および抗癌薬を投与する工程を含む、被験体の治療方法。
【請求項６５】
Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる病態を有する患者に有効量のゴッシポール化合物を投与する工程を含む、被験体の癌治療方法。
【請求項６６】
Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる病態が、高増殖性疾患、癌、AIDS、変性病態、血管疾患、および感染症からなる群から選択される病態を含む、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
癌が、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、脳腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頚癌、骨髄腫、副腎癌、白血病、神経芽細胞腫、および膠芽細胞腫からなる群から選択される、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
癌が転移性である、請求項66記載の方法。
【請求項６９】
感染症が病原体によって発症する、請求項66記載の方法。
【請求項７０】
病原体が細菌である、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
病原体が真菌である、請求項69記載の方法。
【請求項７２】
病原体がウイルスである、請求項69記載の方法。
【請求項７３】
Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する被験体に、有効量のゴッシポール化合物および抗癌薬を投与する工程を含む、被験体の癌治療方法。
【請求項７４】
癌治療への耐性によって特徴付けられる癌を有する患者に、有効量のゴッシポール化合物を投与する工程を含む、被験体の癌治療方法。
【請求項７５】
癌治療が化学療法である、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
癌治療が放射線治療である、請求項74記載の方法。
【請求項７７】
癌治療がホルモン治療である、請求項74記載の方法。
【請求項７８】
Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する患者に、該Bcl-2タンパク質の過剰発現を減少させるのに十分な用量のゴッシポール化合物を投与する工程を含む、被験体の癌治療方法。
【請求項７９】
Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する被験体に、該Bcl-2タンパク質の過剰発現を減少させるのに十分な用量のゴッシポール化合物および抗癌薬を投与する工程を含む、被験体の癌治療方法。
【請求項８０】
以下を含む、薬学的組成物
a．ゴッシポール化合物、および
b．Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる被験体に該ゴッシポール化合物を投与するための説明書。
【請求項８１】
以下を含む、薬学的組成物
a．ゴッシポール化合物、および
b．癌治療への耐性によって特徴付けられる被験体に該ゴッシポール化合物を投与するための説明書。
【請求項８２】
以下を含む、ゴッシポール化合物および試験化合物のスクリーニング方法
a．i．ゴッシポール化合物、
ii．試験化合物、および
iii．第1の細胞群とを得る工程、
b．該第1の細胞群を該ゴッシポール化合物および該試験化合物に接触させる工程と、ならびに
c．該第1の細胞群の該ゴッシポール化合物および該試験化合物への接触効果を観察する工程。
【請求項８３】
d）細胞中で認められた効果をゴッシポール化合物のみまたは試験化合物のみと接触させた第2の細胞群と比較する工程をさらに含む、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
観察が、第1の細胞群の増殖に対する第1の細胞群とゴッシポール化合物および試験化合物との接触効果を観察する工程を含む、請求項82記載の方法。
【請求項８５】
観察が、第1の細胞群におけるアポトーシスに対する第1の細胞群とゴッシポール化合物および試験化合物との接触効果を観察する工程を含む、請求項82記載の方法。
【請求項８６】
観察が、第1の細胞群のBcl-2ファミリータンパク質の発現に対する第1の細胞群とゴッシポール化合物および試験化合物との接触効果を観察する工程を含む、請求項82記載の方法。
【請求項８７】
観察が、第1の細胞群のカスパーゼレベルに対する第1の細胞群とゴッシポール化合物および試験化合物との接触効果を観察する工程を含む、請求項82記載の方法。
【請求項８８】
e）試験化合物を販売する工程をさらに含む、請求項82記載の方法。
【請求項８９】
化合物を販売する工程が、ゴッシポール化合物を販売する工程を含む、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
試験化合物がキットで販売される、請求項88記載の方法。
【請求項９１】
キットが、試験化合物の被験体への投与のための説明書を含む、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
試験化合物を第三者が販売する、請求項88記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年3月30日提出の米国特許仮出願第60/293,983号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質の天然に存在する小分子アンタゴニストおよび化学合成した小分子アンタゴニストに関する。特に、本発明は、ゴッシポール誘導体ならびに特にBcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XLタンパク質）を過剰発現する癌細胞におけるBcl-2およびBcl-XLタンパク質の抗アポトーシス効果のアンタゴニストとしてのゴッシポール誘導体の使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
多細胞生物は、生物を良好に保つために損傷した細胞または不必要な細胞の破壊を指示するアポトーシスと呼ばれる過程を使用する。アポトーシスプロセスの制御は、生物の正常な発生（例えば、胎児の手の指および足の指の発生には、脳内で適切に神経シナプス形成が行われるように、アポトーシスによる過剰な相互連結組織の除去を制御する必要がある）のために非常に重要である。同様に、アポトーシスの制御は、月経開始時の子宮の内膜（子宮内膜）の剥がれ落ちを担う。
【０００４】
アポトーシスは、発生中の組織の削り出しおよび正常な細胞の維持において重要な役割を果たすだけでなく、生物全体の健康を脅かす細胞に対する最初の防御でもある。例えば、細胞媒介免疫応答では、効果細胞（例えば、細胞傷害性Tリンパ球「CTL」）は、アポトーシスを受けるように感染細胞の誘導によってウイルス感染細胞を破壊する。生物はその後効果細胞がもはや必要なくなった場合にこれらを破壊するアポトーシス過程に依存する。自己免疫を、相互およびこれら自体でアポトーシスを誘導するCTLによって防止する。この過程での防御は、紅斑性狼瘡および慢性関節リウマチなどの種々の自己免疫疾患に関連する。
【０００５】
多細胞生物はまた、核酸（例えば、DNA）が損傷した細胞に癌化する前にこれらを破壊するように指示するアポトーシス過程を使用する。しかし、いくつかの発癌性ウイルスは、形質転換した細胞でアポトーシスを防止する。例えば、2つのヒト乳頭腫ウイルス（HPV）は、p53アポトーシスプロモーターを不活化するタンパク質（E6）の産生による形質転換細胞のアポトーシス除去の抑制による頚癌の発症に関連していた。エプスタイン-バーウイルス（EBV）（単核細胞症およびBリンパ球のバーキットリンパ腫固形腫瘍の原因物質）は、Bcl-2と類似のタンパク質および形質転換細胞がBcl-2産生を増加させる別の物質を産生する。これらの両方の機構は、エプスタイン-バーウイルス形質転換細胞にアポトーシス耐性を与え、癌細胞が増殖し、生物全体に拡大する。
【０００６】
非ウイルス手段によって生じるいくつかの癌もまた、アポトーシスによる破壊を回避する機構が発達している。例えば、黒色腫細胞は、Apaf-1をコードする遺伝子発現の阻害によってアポトーシスを回避する。他の癌細胞（特に、胚癌細胞および結腸癌細胞）は、FasLに結合する高レベルの可溶性おとり分子を分泌してFasへの結合を阻害する。したがって、CTLは、これらの癌細胞の破壊が禁じられる。他の癌細胞は高レベルのFasLを発現し、さらにCTLによる破壊を回避する。さらに他のウイルスは、直接癌を発症することなく細胞におけるアポトーシス機構を操作する。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に感染した個体の免疫系の破壊は、その姉妹細胞にアポトーシスを受けるように指示する感染CD4＋T細胞（約1/100,000）によって進行すると考えられる。
【０００７】
アポトーシス機構に欠陥のある制御はまた、種々の変性病態および血管疾患に関与する。
【０００８】
アポトーシス過程およびアポトーシス機構の制御の調節は、多細胞生物の生存に不可欠であることが明らかである。典型的には、アポトーシスを受けるように指示された細胞で起こる生化学的変化は、規則正しい順序で起こる。しかし、上記のように、欠陥のあるアポトーシス過程および機構の制御により、深刻な悪影響および疾患が生物で引き起こされ得る。
【０００９】
異常な細胞（例えば、癌細胞）におけるアポトーシス機構の制御および修復のための種々の試みが存在する。一般に、これらの試みは、多数の理由（例えば、毒性、無効力、および高価であることなど）によるアポトーシス機構の欠陥のある制御によって特徴付けられる元の疾患の治療として限られた成功しか収められていない。アポトーシス過程の制御によって特徴付けられる疾患および病態を罹患した被験体におけるアポトーシス制御のための組成物および方法が必要である。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質の天然に存在する小分子アンタゴニストおよび化学合成した小分子アンタゴニストに関する。特に、本発明は、ゴッシポール誘導体ならびに特にBcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XLタンパク質）を過剰発現する癌細胞におけるBcl-2およびBcl-XLタンパク質の抗アポトーシス効果のアンタゴニストとしてのゴッシポール誘導体の使用方法を提供する。
【００１１】
Bcl-2は、タンパク質ファミリーの基礎をなすメンバーであり、癌遺伝子産物として最初に単離された。タンパク質のBcl-2ファミリーには、現在、Bcl-2およびBcl-XLなどの抗アポトーシス分子ならびにBax、Bak、Bid、およびBadなどのプロアポトーシス分子が含まれる。Bcl-2およびBcl-XLは、Bcl-2ファミリー媒介アポトーシスの重要な調節因子と考えられる。
【００１２】
好ましい態様では、ゴッシポール化合物の投与は、新生物病態および細胞（例えば、腫瘍細胞）の異常な高増殖に関与する他の障害の有効な治療を提供することである。
【００１３】
他の好ましい態様では、本発明は、Bcl-2および／またはBcl-XLの阻害有効量においてゴッシポール化合物（またはその類似物）を被験体に投与し、それにより腫瘍抑制を増大し、そして／またはアポトーシスを誘導する被験体の癌の治療または予防方法を提供する。好ましくは、ゴッシポール化合物またはその類似物を、腫瘍細胞アポトーシス促進薬（例えば、ゲラニルゲラニオール［3,7,11,15-テトラメチル-2,6,10,14-ヘキサデカトラエン-1-オール］）と組み合わせて投与する。本発明は、腫瘍アポトーシスの増加により基本レベルのBcl-2および／またはBcl-XL発現に関連する正常なアポトーシス制御が再確立されることを意図する。
【００１４】
本発明の方法は、Bcl-2ファミリータンパク質（Bcl-2および／またはBcl-XLが含まれるが、これらに限定されない）の過剰発現を特徴とする癌の治療に特に十分に適切である。
【００１５】
他の好ましい態様では、本発明の方法は、多数の病態（乳癌、前立腺癌、肺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、脳腫瘍、頭頚部癌、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頚癌、白血病、神経芽細胞腫、および膠芽細胞腫、ならびにT細胞およびB細胞媒介自己免疫疾患などが含まれるが、これらに限定されない）の治療を提供する。
【００１６】
さらに他の好ましい態様では、本発明の方法は、有効量のゴッシポロン（gossypolone）のBcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる病態を有する患者への投与を提供する。
【００１７】
1つの好ましい態様では、本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質を過剰発現する細胞と、ゴッシポール化合物とを得る工程と、細胞を、細胞が調整されるアポトーシスを受けるような条件下で有効量のゴッシポール化合物で治療する工程とを含む、細胞におけるアポトーシスの調整方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法は、任意の特定のゴッシポール化合物の投与に限定されることを意図しない。実際、本発明は、多数のゴッシポールの鏡像異性体、代謝産物、誘導体、および薬学的に許容される塩、ならびにこれらの化合物のシッフ塩基の投与を意図する。例えば、本発明で使用されるゴッシポール化合物には、(±)-ゴッシポール、(-)-ゴッシポール、(+)-ゴッシポール、(±)-ゴッシポロン、(-)-ゴッシポロン、(+)-ゴッシポロン、(±)-ゴッシポール酢酸、(-)-ゴッシポール酢酸、(+)-ゴッシポール酢酸、(±)-エチルゴッシポール、(-)-エチルゴッシポール、(+)-エチルゴッシポール、(±)-ヘミゴッシポロン、(-)-ヘミゴッシポロン、(+)-ヘミゴッシポロン、(±)-ゴッシポールのシッフ塩基、(-)-ゴッシポールのシッフ塩基、(+)-ゴッシポールのシッフ塩基、(±)-ゴッシポロンのシッフ塩基、(-)-ゴッシポロンのシッフ塩基、(+)-ゴッシポロンのシッフ塩基、(±)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基、(-)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基、(+)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基、(±)-エチルゴッシポールのシッフ塩基、(-)-エチルゴッシポールのシッフ塩基、(+)-エチルゴッシポールのシッフ塩基、(±)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基、(-)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基、および(+)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基などが含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
好ましい態様では、本発明は、(-)-ゴッシポール鏡像異性体をBcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる病態を有する患者に投与する工程を提供する。いくつかの態様では、意図するBcl-2ファミリータンパク質には、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Al/BFL-1、およびBOO-DIVA、Bcl-w、Bcl-6、Bcl-8、およびBcl-yなどが含まれるが、これらに限定されない。さらにいつくかの他の態様では、Bcl-2ファミリータンパク質は、プロアポトーシス活性を有する。さらに他の態様では、Bcl-2ファミリータンパク質は、抗アポトーシス活性を有する。
【００２０】
いくつかの態様では、罹患した細胞および組織を、本発明の方法および組成物を使用して治療する。これに関して、種々の疾患は、本発明の方法および組成物を使用した治療または予防に影響を受けやすい。これらの疾患の非限定的な例には、乳癌、前立腺癌、肺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、脳腫瘍、頭頚部癌、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頚癌、白血病、神経芽細胞腫、および膠芽細胞腫、T細胞およびB細胞媒介自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症、高増殖性疾患、AIDS、変性病態、ならびに血管疾患などが含まれる。いくつかの態様では、治療される癌細胞は転移性である。
【００２１】
いくつかの態様では、本発明の組成物および方法での治療に適切な感染症には、ウイルス、細菌、真菌、およびマイコプラズマなどが含まれるが、これらに限定されない。しかし、本発明は、いかなる特定の感染症または病原菌の治療に限定されることを意図しない。
【００２２】
1つの好ましい態様では、本発明は、Bcl-2タンパク質を過剰発現する組織と、ゴッシポール化合物と、抗癌薬とを得る工程と、組織を、細胞分裂が調整されるような条件下で有効量のゴッシポール化合物と抗癌薬で治療する工程とを含む、組織の細胞分裂を調整する方法を提供する。これらの態様では、本発明は、ゴッシポール化合物がBcl-2ファミリータンパク質と結合し、それにより細胞分裂が調整されることを意図する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質を過剰発現する被験体にゴッシポール化合物を投与する工程を含む被験体（例えば、患者）の治療方法を提供する。これらの態様の好ましい例では、ゴッシポール化合物は、Bcl-2ファミリータンパク質と結合する。
【００２４】
本発明のいくつかの態様は、Bcl-2ファミリータンパク質を過剰発現する被験体にゴッシポール化合物および抗癌薬を投与する工程を含む被験体の治療方法の提供に関する。
【００２５】
本発明の方法での使用に多数の適切な抗癌薬が意図される。実際、本発明は、多数の抗癌薬（アポトーシスを誘導する薬剤、ポリヌクレオチド（例えば、リボザイム）、ポリペプチド（例えば、酵素）、薬物、生体模倣物、アルカロイド、アルキル化剤、抗腫瘍抗生物質、抗代謝産物、ホルモン、白金化合物、抗癌薬に結合させたモノクローナル抗体、毒素、および／または放射性核種、生体反応修飾物質（例えば、インターフェロン（例えば、IFN-αなど）およびインターロイキン（例えば、IL-2など）など）、養子免疫療法薬、造血成長因子、腫瘍細胞分化を誘導する薬剤（例えば、全トランス-レチノイン酸など）、遺伝子治療薬、アンチセンス治療薬およびヌクレオチド、腫瘍ワクチン、ならびに血管新生のインヒビターなどが含まれるが、これらに限定されない）の投与を意図する。開示のゴッシポール化合物との同時投与に適切な化学療法化合物および抗癌治療の他の多数の例は、当業者に公知である。
【００２６】
好ましい態様では、抗癌薬は、アポトーシスを誘導または刺激する薬剤を含む。アポトーシスを誘導する薬剤には、照射（例えば、UV）、キナーゼインヒビター（例えば、上皮成長因子受容体（EGFR）キナーゼインヒビター、血管成長因子受容体（VGFR）キナーゼインヒビター、線維芽細胞成長因子受容体（FGFR）キナーゼインヒビター、血小板由来成長因子受容体（PGFR）キナーゼインヒビター、およびBcl-Ablキナーゼインヒビター（STI-571、Gleevec、およびGlivecなど））、アンチセンス分子、抗体（例えば、HerceptinおよびRituxan）、抗エストロゲン（例えば、ラロキシフェンおよびタモキシフェン）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、アミノグルテタミド、ケトコナゾール、および副腎皮質ステロイド）、シクロオキシゲナーゼ2（COX-2）インヒビター（例えば、Celecoxib、メロキシカム、NS-398、および非ステロイド性抗炎症薬（NSAID））、および癌化学療法薬（例えば、イリノテカン（Camptosar）、CPT-11、フルダラビン（Fludara）、ダカルバジン（DTIC）、デキサメタゾン、ミトキサントロン、ミロターグ(Mylotarg)、VP-16、シスプラチン、5-FU、ドキソルビシン(Doxrubicin)、タキソテール(Taxotere)、またはタキソール）、細胞シグナル伝達分子、セラミドおよびサイトカイン、ならびにスタウロスプリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
さらに他の態様では、本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる病態を有する患者に有効量のゴッシポール化合物を投与する工程を含む被験体の癌治療方法を提供する。
【００２８】
さらなる態様は、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する患者に有効量のゴッシポール化合物および抗癌薬を投与する工程を含む被験体の癌治療方法に関する。
【００２９】
さらに他の方法は、癌治療への耐性（例えば、化学療法耐性、照射耐性、およびホルモン耐性など）によって特徴付けられる癌を有する患者に、有効量のゴッシポール化合物を投与する工程を含む、被験体の癌治療方法に関する。
【００３０】
いくつかの態様では、本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する患者に、Bcl-2タンパク質の活性の阻害および／または過剰発現の減少に十分な用量のゴッシポール化合物を投与する工程を含む、被験体の癌治療方法を提供する。
【００３１】
本発明のいくつかの態様では、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する患者に、Bcl-2タンパク質の過剰発現の減少に十分な用量のゴッシポール化合物および抗癌薬を投与する工程を含む被験体の癌治療方法を記載する。
【００３２】
本発明のいくつかの態様では、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する患者に、Bcl-2ファミリータンパク質の活性の阻害および／またはBcl-2タンパク質の過剰発現の減少に十分な用量のゴッシポール化合物を投与する工程を含む、被験体の癌治療方法を記載する。
【００３３】
さらに他の態様では、本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する患者に、Bcl-2タンパク質の活性の阻害および／またはBcl-2タンパク質の過剰発現の減少に十分な用量のゴッシポール化合物および抗癌薬を投与する工程を含む、被験体の癌治療方法を提供する。
【００３４】
いくつかの他の態様では、本発明は、ゴッシポール化合物と、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる被験体に、ゴッシポール化合物を投与するための説明書を含む薬学的組成物を提供する。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、ゴッシポール化合物と、癌治療への耐性によって特徴付けられる被験体にゴッシポール化合物を投与するための説明書を含む、薬学的組成物を提供する。好ましい態様では、これらのキットと共に含まれる説明書は、食品医薬品局(U.S. Food and Drug Administration)の規則、規定、および治療化合物の供給についての提案を満たす。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、ゴッシポール化合物と、試験化合物と、第1の細胞群とを得る工程と、および第1の細胞群をゴッシポール化合物および試験化合物に接触させる工程と、および第1の細胞群のゴッシポール化合物および試験化合物への接触効果を観察する工程とを含む、ゴッシポール化合物および試験化合物のスクリーニング方法を提供する。これらのいくつかの態様では、本発明は、さらに、第1の細胞中で観察された効果をゴッシポール化合物のみまたは試験化合物のみと接触させた第2の細胞群と比較するさらなる工程を提供する。観察される効果には、細胞増殖の変化、アポトーシス状態の変化、およびBcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XL）の発現の変化などが含まれるが、これらに限定されない。さらに他の態様では、本発明は、さらに、上記方法によってスクリーニング／同定した試験化合物を販売するさらなる方法を意図する。これらの態様では、試験化合物を、1つまたは複数の形態（例えば、試験化合物の患者への投与についての説明を含むキット）での第三者による販売を提供することができる。
【００３７】
本発明の他の利点、利益、および好ましい態様は、当業者に自明である。
【００３８】
添付の図面は、明細書の一部を構成し、本発明の一定の局面および態様をさらに示すために含まれる。しかし、本発明は、これらの図面で特に引用された態様に制限されることを意図しない。
【００３９】
定義
本発明の理解を容易にするために、多数の用語および句を以下で定義する。
【００４０】
本明細書中で使用される、用語「ゴッシポール化合物」は、ゴッシポール分子の鏡像異性体、誘導体、代謝産物、シッフ塩基、および薬学的に許容される塩をいう。したがって、ゴッシポール化合物には、(±)-ゴッシポール、(-)-ゴッシポール、(+)-ゴッシポール、(±)-ゴッシポロン、(-)-ゴッシポロン、(+)-ゴッシポロン、(±)-ゴッシポール酢酸、(-)-ゴッシポール酢酸、(+)-ゴッシポール酢酸、(±)-エチルゴッシポール、(-)-エチルゴッシポール、(+)-エチルゴッシポール、(±)-ヘミゴッシポロン、(-)-ヘミゴッシポロン、(+)-ヘミゴッシポロン、(±)-ゴッシポールのシッフ塩基、(-)-ゴッシポールのシッフ塩基、(+)-ゴッシポールのシッフ塩基、(±)-ゴッシポロンのシッフ塩基、(-)-ゴッシポロンのシッフ塩基、(+)-ゴッシポロンのシッフ塩基、(±)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基、(-)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基、(+)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基、(±)-エチルゴッシポールのシッフ塩基、(-)-エチルゴッシポールのシッフ塩基、(+)-エチルゴッシポールのシッフ塩基、(±)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基、(-)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基、および(+)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書中で使用される、用語「Bcl-2ファミリータンパク質」は、Bcl-2ファミリーの抗アポトーシスメンバー（Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1/BFL-1、およびBOO-DIVA、Bcl-w、Bcl-6、Bcl-8、およびBcl-yが含まれるが、これらに限定されない）およびBcl-2ファミリーのプロアポトーシスメンバー（Bak、Bax、Bad、tBid、Harakiri、Bim、Bmf、およびゴッシポール化合物によって制御されるタンパク質を含むBH3他のメンバー（Bcl-2ホモロジー3）が含まれるが、これらに限定されない）をいう。
【００４２】
本明細書中で使用される、用語「Bcl-2の過剰発現」または「Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現」は、Bcl-2ファミリータンパク質をコードする高レベル（例えば、異常）のmRNA、および／またはBcl-2ファミリータンパク質をコードする基底レベルのmRNAを発現するか基底レベルのBcl-2ファミリータンパク質を有する類似の正常な対応する非病理学的細胞および組織と比較して細胞または組織中の高レベルのBcl-2ファミリータンパク質をいう。細胞または組織中のBcl-2ファミリータンパク質をコードするmRNAレベルまたはBcl-2ファミリータンパク質レベルには、免疫組織化学的方法および核酸増幅方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書中で使用される、用語「抗癌薬」または「従来の抗癌薬」は、癌治療で使用される任意の化学療法化合物、放射線治療、または外科的介入をいう。
【００４４】
本明細書中で使用される、用語「インビトロ」は、人工的環境および人工的環境下でおこる過程または反応をいう。インビトロ環境は、試験管および細胞培養からなることができるが、これらに限定されない。用語「インビボ」は、天然の環境（例えば、動物または細胞）および天然の環境下で起こる過程または反応をいう。
【００４５】
本明細書中で使用される、用語「宿主細胞」は、インビトロまたはインビボのいずれかで存在する任意の真核細胞または原核細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、および昆虫細胞）をいう。
【００４６】
本明細書中で使用される、用語「細胞培養」は、任意のインビトロ細胞培養をいう。この用語には、連続継代細胞系（例えば、不死表現型）、初代細胞、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）ならびに卵母細胞および胚を含むインビトロで維持された任意の他の細胞集団が含まれる。
【００４７】
本明細書中で使用される、用語「被験体」は、本発明の方法によって治療されるべき生物をいう。このような生物には、ヒトが含まれるが、これに限定されない。本発明の文脈では、用語「被験体」は、一般に、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1（Bfl-1）、およびBoo）の過剰発現によって特徴付けられる疾患のための治療（例えば、ゴッシポール化合物および選択的に1つまたは複数の抗癌薬の投与）を受ける予定の、または受けた個体をいう。
【００４８】
本明細書中で使用される、用語「診断された」は、疾患の徴候および症状（例えば、従来の癌治療薬への耐性）または遺伝学的分析、病理学的分析、および組織学的分析などによる疾患の認識をいう。
【００４９】
本明細書中で使用される、用語「結合の競合」は、第2の分子（例えば、Bax、Bak、Bid、およびBadなどのプロアポトーシスBcl-2ファミリータンパク質）と同一の基質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XL）に結合する活性を有する第1の分子（例えば、ゴッシポール化合物）に関して使用する。第1の分子による結合の有効性（例えば、速度または熱力学）は、第2の分子に結合する基質の有効性と同一であるか、より高いか、より低くてもよい。例えば、基質への結合についての平衡結合定数（KD）は、2つの分子で異なり得る。
【００５０】
本明細書中で使用される、用語「アンチセンス」は、特定のRNA配列（例えば、mRNA）に相補的なRNA配列に関して使用する。細菌による遺伝子調節に関与するアンチセンスRNA（「asRNA」）は、本定義の範囲内に含まれる。アンチセンスRNAを、任意の方法（コード鎖を合成可能なウイルスプロモーターに対して逆方向での関心対象の遺伝子のスプライシングによる合成が含まれる）によって産生することができる。例えば、一旦胚に移入されると、この転写された鎖は、胚によって産生された天然のmRNAと組み合わされて二重鎖を形成する。これらの二重鎖は、mRNAのさらなる転写またはその翻訳を遮断する。この様式では、変異表現型を作製することができる。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に相補的な核酸鎖に関して使用する。記号(-)（すなわち、「ネガティブ」）は、しばしばアンチセンス鎖に関して使用し、記号(+)は、しばしばセンス（すなわち、「ポジティブ」）鎖に関して使用する。アンチセンス分子に接近可能な核酸配列領域を、利用可能なコンピュータ分析法を使用して決定することができる。
【００５１】
本明細書中で使用される、用語「サンプル」を、広義で使用する。Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる病状が疑われるサンプルは、細胞、組織、もしくは、体液、細胞から単離された染色体（例えば、有糸分裂中期のもの）、ゲノムDNA（サザンブロット分析用などの溶液または固体支持体に結合したもの）、RNA（のノーザンブロット分析用などの溶液または固体支持体に結合したもの）、およびcDNA（溶液または固体支持体に結合したもの）などを含み得る。タンパク質を含むことが疑われるサンプルは、細胞、組織の一部、および1つまたは複数のタンパク質などを含む抽出物を含み得る。
【００５２】
本明細書中で使用される、用語「精製された」または「精製するために」は、サンプルからの望ましくない成分の除去をいう。本明細書中で使用される、用語「実質的に精製された」は、天然の環境から取り出されるか、単離もしくは分離され、天然に会合した他の成分を少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、および最も好ましくは90％含まない分子（核酸配列またはアミノ酸配列のいずれか）をいう。したがって、例えば、「単離ポリヌクレオチド」は、実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
【００５３】
本明細書中で使用される、用語「ゲノム」は、生物または宿主細胞の遺伝物質（例えば、染色体）をいう。
【００５４】
用語、「関心対象のヌクレオチド配列」は、当業者による任意の理由（例えば、疾患の治療、改良された質の付与など）のために望ましいと考えられる操作を行う任意のヌクレオチド配列（例えば、RNAまたはDNA）をいう。このようなヌクレオチド配列には、コード配列、その一部、構造配列（例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬物耐性遺伝子、成長因子など）、およびmRNAまたはタンパク質産物をコードしない非コード調節配列（例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、終結配列、エンハンサー配列など）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書中で使用される、「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、そのフラグメントまたは一部、および一本鎖または二本鎖であってよく、かつセンスまたはアンチセンス鎖を示すゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAをいう。本明細書中で使用される、用語「コードする核酸分子」、「コードするDNA配列」、「コードするDNA」、「コードするRNA配列」、および「コードするRNA」は、デオキシリボ核酸鎖またはリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドの順序または配列をいう。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序は、mRNAから翻訳されたポリヌクレオチド（タンパク質）に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、DNAまたはRNA配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００５６】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆体（例えば、プロインスリン）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、DNAまたはRNA）配列をいう。ポリペプチドを、全長コード配列または全長またはフラグメントの所望の活性または機能的性質（例えば、酵素活性、リ癌ド結合、シグナル伝達など）が保持される限りコード配列の任意の一部によってコードすることができる。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域を含み、これらには、遺伝子が全長mRNAの長さに対応するようにいずれかの末端上の約1kbまたはそれ以上の距離の5'および3'末端両方上のコード領域に隣接して存在する配列が含まれる。コード領域の5'に存在し、かつmRNA上に存在する配列を、5'非翻訳配列という。コード領域の3'または下流に存在し、かつmRNA上に存在する配列を、3'非翻訳配列という。用語「遺伝子」は、遺伝子のcDNAまたはゲノム形態の両方を含む。ゲノム形態または遺伝子クローンは、「イントロン」、「介在領域」、または「介在配列」と呼ばれる非コード配列に割り込まれたコード領域を含む。イントロンは、核RNA（hnRNA）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンはエンハンサーなどの調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または最初の転写物から「スプライシング」により除去されるので、イントロンはメッセンジャーRNA（mRNA）転写物中には存在しない。mRNAは、初期ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定するために翻訳中で機能する。
【００５７】
本明細書中で使用される、用語「外因性遺伝子」は、宿主生物または細胞中に天然に存在しないか、宿主生物または細胞に人為的に移入された遺伝子をいう。
【００５８】
本明細書中で使用される、用語「ベクター」は、適切な調節エレメントに会合した場合に複製することができ、かつ細胞間に遺伝子配列を導入することができる任意の遺伝子エレメント（プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど）をいう。したがって、この用語には、クローニングおよび発現送達体ならびにウイルスベクターが含まれる。
【００５９】
本明細書中で使用される、用語「遺伝子発現」は、遺伝子の「転写」によって（すなわち、RNAポリメラーゼの酵素作用を介して）遺伝子にコードされた遺伝情報をRNA（すなわち、mRNA、rRNA、tRNA、またはsnRNA）およびタンパク質コード遺伝子についてはmRNAの「翻訳」を介してタンパク質に変換する過程をいう。遺伝子発現を、この過程の多数の段階で調節することができる。「情報制御」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち、RNAまたはタンパク質）の産生を増加させる制御をいい、「下方制御」または「抑制」は、産生を減少させる制御をいう。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）を、それぞれ「アクチベーター」および「リプレッサー」と呼ぶことがある。
【００６０】
本明細書中で使用される、用語「コードする核酸分子」、「コードするDNA配列」、「コードするDNA」、「コードするRNA配列」、および「コードするRNA」は、デオキシリボ核酸鎖またはリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドの順序または配列をいう。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序は、mRNAから翻訳されたポリヌクレオチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、DNAまたはRNA配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００６１】
核酸に関して使用する場合、用語「相同性」および「同一性の割合」は、相補性の程度をいう。部分的相同性（すなわち、部分的同一性）または完全な同一性（すなわち、完全な同一性）が存在し得る。部分的相補配列は、完全な相補配列の標的核酸配列へのハイブリッド形成を少なくとも部分的に阻害する配列であり、機能的用語「実質的に相同な」の使用をいう。標的配列への完全な相補配列のハイブリッド形成の阻害を、低ストリンジェンシーな条件下でのハイブリッド形成アッセイ（サザンまたはノーザンブロットおよび溶液ハイブリッド形成など）を使用して試験することができる。実質的に相同な配列またはプローブ（すなわち、関心対象の別のオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチド）は、低ストリンジェンシーな条件下で標的配列への完全に相同な配列の結合（すなわち、ハイブリッド形成）を競合および阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件は非特異的結合が許容されるほどとはいえず、低ストリンジェンシー条件は2つの配列の相互の配列が特異的（すなわち、選択的）相互作用である必要がある。非特異的結合が無いことを、部分的に相補性を欠く（例えば、約30％未満の同一性）第2の標的の使用によって試験することができ、非特異的結合の非存在下で、プローブは、第2の非相補標的とハイブリッド形成しない。
【００６２】
本明細書中で使用される、用語「ストリンジェンシー」は、核酸のハイブリッド形成が誘導される温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件に関して使用する。「高ストリンジェンシー」条件では、高頻度で相補塩基配列を有する核酸フラグメント間でのみ核酸の塩基対合が起こる。したがって、「弱い」または「低」ストリンジェンシー条件は、通常相補配列の頻度が低い遺伝的に離れた生物由来の核酸でしばしば必要である。低ストリンジェンシー条件を使用して本発明を行うことができるが、好ましい態様では、中程度から高いストリンジェンシー条件を使用する。
【００６３】
「高ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリッド形成に関して使用する場合、42℃（例えば、一晩）で、5×SSPE（43.8g/l  NaCl、6.9g/l NaH2PO4・H2O、および1.85g/l EDTA（NaOHでpHを7.4に調整する））、0.5％ SDS、5×Denhardt試薬（50×Denhardt試薬は、500mlあたり、5gのフィコール（タイプ400、Pharamacia）、5g  BSA（画分V、Sigma）を含む）、100μg/ml変性サケ精子DNA、および50％（V/V）ホルムアミドからなる溶液中での結合またはハイブリッド形成に等価な条件を含む。次いで、ハイブリッド形成DNAサンプルを、約500ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、2×SSPE、0.1％SDSを含む溶液にて室温で2回洗浄し、その後0.1×SSPE、1.0％SDSを含む溶液にて42℃で洗浄する。当業者は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成を促進する条件（例えば、ハイブリッド形成温度の上昇および／または洗浄ステップ、ハイブリッド形成溶液中でのホルムアミドの使用など）を理解している。
【００６４】
「中程度のストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリッド形成に関して使用する場合、42℃で、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4・H2O、および1.85g/l EDTA（NaOHでpHを7.4に調整する））、0.5％SDS、5×Denhardt試薬（50×Denhardt試薬は、500mlあたり、5gのフィコール（タイプ400、Pharamacia）、5g BSA（画分V、Sigma）を含む）、100μg/ml変性サケ精子DNA、および50％（V/V）ホルムアミドからなる溶液中での結合またはハイブリッド形成に等価な条件、その後、約500ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、室温で1.0×SSPE、1.0％SDSを含む溶液での洗浄、42℃で2×SSPE、0.1％SDSを含む溶液での洗浄を含む。
【００６５】
「低ストリンジェンシー条件」は、42℃で、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l  NaH2PO4・H2O、および1.85g/l  EDTA（NaOHでpHを7.4に調整する））、0.1％SDS、5×Denhardt試薬（50×Denhardtは、500mlあたり、5gのフィコール（タイプ400、Pharamacia）、5g  BSA（画分V、Sigma）を含む）、100μg/ml変性サケ精子DNA、および50％（V/V）ホルムアミドからなる溶液中での結合またはハイブリッド形成に等価な条件、その後、約500ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、42℃で5×SSPE、0.1％SDSを含む溶液での洗浄を含む。さらに、当業者は、低ストリンジェンシー条件を含む多数の等価の条件を使用することができ、プローブの長さおよび性質（DNA、RNA、塩基組成）、標的（溶液中に存在するか固定されているDNA、RNA、塩基組成など）の性質、ならびに塩および他の化合物（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）の濃度などの要因を考慮し、ハイブリッド形成溶液を変化させて上記列挙の条件と異なるが等価の低ストリンジェンシー条件を得ることができることを十分に理解している。
【００６６】
一本鎖核酸配列に関して使用する場合、用語「実質的に相同な」は、上記の低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列にハイブリッド形成することができる（すなわち、相補的である）任意のプローブをいう。遺伝子は、一次RNA転写物の異なるスプライシングによって作製された複数のRNA種を産生することができる。同一遺伝子のスプライス変異型であるcDNAは、配列が同一か完全に相同な領域（両cDNA上に同一のエクソンまたは同一のエクソンの一部を示す）および完全に同一でない領域（例えば、cDNA1上にエクソン「A」が存在し、cDNA2には代わりにエクソン「B」を含む）を含む。2つのcDNAは同一配列の領域を含むので、これらは共に遺伝子全体または両cDNA上に見出される配列を含む遺伝子の一部に由来するプローブとハイブリッド形成し、したがって、2つのスプライス変異型は、実質的にこのようなプローブおよび互いに相同である。本発明は、完全に相同な配列間のみでハイブリッド形成が起こる条件に限定されない。いくつかの態様では、実質的に相同な配列とハイブリッド形成が起こる。
【００６７】
本明細書中で使用される、用語「関心対象のタンパク質」は、関心対象の核酸によってコードされるタンパク質をいう。
【００６８】
本明細書中で使用される、用語「天然の」（または野生型）は、タンパク質に関して使用する場合、部分的に相同な核酸によってコードされ、それによりタンパク質のアミノ酸配列が変化するタンパク質をいう。本明細書中で使用される、用語「変異型」は、タンパク質機能が変化しない保存的および非保存的アミノ酸置換された相同遺伝子によってコードされるタンパク質ならびにタンパク質機能が減少するか（例えば、ヌル変異）タンパク質機能が増加するアミノ酸置換された相同遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。
【００６９】
本明細書中で使用される、用語「逆ノーザンブロット」は、アガロースゲルでのDNAの電気泳動によりサイズに基づいてDNAを分画し、その後分画したDNAをゲルから固体支持体（ニトロセルロースまたはナイロンメンブレンなど）に移動させる、DNAの分析をいう。次いで、固定DNAを、標識オリゴリボヌクレオチドプローブで探索して、使用したリボプローブに相補的なDNA種を検出する。
【００７０】
本明細書中で使用される、用語「病原体」は、宿主に病態（例えば、感染症、癌など）を発症させる生物学的因子をいう。「病原体」には、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、および寄生虫が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
本明細書中で使用される、用語「生物」は、任意の種または型の微生物（細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、および寄生虫が含まれるが、これらに限定されない）をいうために使用する。本明細書中で使用される、用語「真菌」は、二形成真菌を含むカビおよび酵母などの真核生物に関して使用する。
【００７２】
本明細書中で使用される、用語「ウイルス」は、一定の例外も含まれるが、光学顕微鏡で観察することができず、独立代謝を欠き、生きた宿主細胞内のみで複製することができる感染性因子をいう。各粒子（すなわち、ビリオン）は、核酸およびタンパク質殻または外殻からなり、いくつかのビリオンは脂質含有膜も有する。用語「ウイルス」は、全てのウイルス型（動物、植物、ファージ、および他のウイルスが含まれる）を含む。
【００７３】
用語「細菌（複数）」および「細菌（単数）」は、全ての原核生物（原核生物界の全門内の生物が含まれる）をいう。この用語は、マイコプラズマ、クラミジア、アクチノマイセス、ストレプトマイセス、およびリケッチアを含む細菌であると考えられる全ての微生物を含むことが意図される。全ての細菌型（球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストなどが含まれる）がこの定義内に含まれる。グラム陰性またはグラム陽性の原核生物もまたこの用語の範囲内に含まれる。「グラム陰性」および「グラム陽性」は、当技術分野において周知のグラム染色過程内の染色パターンをいう。（例えば、Finegold  and  Martin、「診断微生物学」、第6版、CV  Mosby  St．Louis、13〜15頁、1982を参照のこと）。「グラム陽性細菌」は、グラム染色で使用した最初の色素が保持されて染色細胞が顕微鏡下で紺青色から紫色を呈する細菌である。「グラム陰性細菌」は、グラム染色で使用した最初の色素を保持しないが、対比染色によって染色される。したがって、グラム陰性細菌は、赤色を呈する。
【００７４】
本明細書中で使用される、用語「抗原結合タンパク質」は、特定の抗原に結合するタンパク質いう。「抗原結合タンパク質」には、免疫グロブリン（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体が含まれる）、Fabフラグメント、F（ab'）2フラグメント、およびFab発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されない。ポリクローナル抗体の産生に当技術分野において公知の種々の手順を使用する。抗体産生のために、種々の宿主動物を、所望のエピトープ（ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなど）に対応するペプチドでの注射によって免疫化することができる。好ましい態様では、ペプチドを、免疫原性キャリア（例えば、ジフテリア類毒素、ウシ血清アルブミン（BSA）、またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH））に結合させる。種々のアジュバントを使用して、宿主の種に依存して免疫応答を増大させ、このアジュバントには、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（ウシ型弱毒結核菌ワクチン）およびコリネバクテリウム・パルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
モノクローナル抗体調製のために、培養での連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することができる。（例えば、HarlowおよびLane、「抗体：実験マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照のこと）。これらには、KohlerおよびMilstein（KohlerおよびMilstein、Nature、256、495〜497、1975）によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozborら、Immunol．Today、4、72、1983を参照のこと）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら、「モノクローナル抗体と癌治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、Alan R．Liss,Inc．、77〜96頁、1985）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明によれば、単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第4,946,778号（参照として本明細書に組み入れられる））を、所望の特異的単鎖抗体を産生するように適合させることができる。本発明のさらなる態様は、Fab発現ライブラリー構築についての当技術分野において公知の技術（Huseら、Science、246、1275〜1281、1989）を使用して、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントを迅速かつ容易に同定可能である。
【００７７】
抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体フラグメントを、公知の技術によって作製することができる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるF(ab')2フラグメント、F(ab')2フラグメントのジスルフィド結合の還元によって作製することができるFab'フラグメント、および抗体分子のパパインおよび還元剤での処理によって作製することができるFabフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
抗原結合タンパク質をコードする遺伝子を、当技術分野において公知の方法によって単離することができる。抗体産生では、所望の抗体のスクリーニングを、当技術分野において公知の技術（例えば、放射免疫アッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュー免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素、または放射性同位体を使用）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなど）などによって行うことができる。
【００７９】
本明細書中で使用される、用語「ゴッシポール化合物の被験体への投与のための説明」は、細胞または組織におけるBcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる病態の治療用キット中に含まれる組成物の使用のための説明書を含む。この用語はまた、少なくとも1つの従来の癌治療（例えば、化学療法）への耐性によって特徴付けられる癌の治療用キット中に含まれる組成物の使用のための説明書をいう。いくつかの態様では、説明書は、米国連邦規則第201条（以下参照）に従って、キット中に含まれる組成物の推奨するまたは有用な投薬量の記述をさらに含む。本発明の方法および組成物に適用可能な標示付けおよび説明書の要件に関するさらなる情報は、米国食品医薬品局のインターネットウェブページで利用可能である。
【００８０】
用語「試験化合物」は、身体機能の疾患、疾病、病気、または障害の治療もしくは予防、またはサンプルの生理学的状態または細胞状態（例えば、細胞中のBcl-2ファミリータンパク質レベル）の変化に使用することができる任意の化学物質、医薬品、および薬物などをいう。試験化合物は、公知および潜在的な治療化合物を含む。試験化合物を、本発明のスクリーニング方法の使用によって治療薬と決定することができる。「公知の治療化合物」は、このような治療または予防で有効であることが示された（例えば、動物実験またはヒトへの投与を使用した事前の経験による）治療化合物をいう。好ましい態様では、「試験化合物」は、抗癌薬である。特に好ましい態様では、「試験化合物」は、細胞中でアポトーシスを誘導する抗癌薬である。
【００８１】
本明細書中で使用される、用語「第三者」は、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる病態の治療用ゴッシポール化合物との同時投与と意図する試験化合物を販売するための販売、保管、流通、または提供に従事している事業体をいう。
【００８２】
本明細書中で使用される、用語「調整する」は、細胞機能（細胞の成長、増殖、およびアポトーシスなど）の局面に影響を及ぼす（例えば、促進または遅延させる）化合物（例えば、ゴッシポール化合物）の活性をいう。
【００８３】
発明の概要
ゴッシポールは、粗綿実油（Gossypium sp.）由来の天然に存在する二ビフェノール化合物である。男性用避妊薬としてのゴッシポールの臨床試験では、これらの化合物の長期投与安全性が証明されている。ゴッシポールは、ヒトで許容されることが示されているが、再発性神経膠腫患者の大量に前治療した不十分な予後において、低いが無視できないほどの反応率を有する。
【００８４】
本発明は、ゴッシポール化合物は腫瘍成長を有意に阻害するが、いくつかの態様では、ゴッシポール化合物は1つまたは複数の従来の抗癌薬（例えば、デセタキセル）と組み合わせて使用した場合（同時投与）に腫瘍成長をさらに強力に阻害するインビボデータを提供する。したがって、好ましい態様では、ゴッシポール化合物ならびにその代謝産物、鏡像異性体、および誘導体を、Bcl-2および／またはBcl-XLの過剰発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）を罹患した患者に投与する。ゴッシポールは、高レベルのBcl-2および／またはBcl-XLを発現する細胞における癌におけるアポトーシスを誘導するが、ゴッシポールは、低レベルのBcl-XLおよび／またはBcl-2発現レベルの低い細胞にほとんど効果がない。
【００８５】
ゴッシポールは、経口投与することができる副作用のほとんどない精子形成の公知のインヒビターである。しかし、低カリウム血症はゴッシポールの長期投与に起因し得ることを示す研究者もいる。したがって、いくつかの態様では、本発明の方法および組成物は、さらに、ゴッシポール化合物治療を受ける患者へのカリウムサプリメントの同時投与を含む。
【００８６】
ゴッシポールは、1980年代からインビトロおよびインビボモデルで抗癌薬として研究されている。しかし、本発明以前、ゴッシポール抗癌薬の効果の機構は知られていなかった。ゴッシポールがBcl-2およびBcl-XLの強力なインヒビターであるという本発明の発見は、ゴッシポールの抗腫瘍活性が、少なくとも一部は、Bcl-2およびBcl-XLの抗アポトーシス活性の阻害およびその後の高レベルのBcl-2ファミリータンパク質を発現する癌細胞におけるアポトーシスの誘導に起因することを示す。したがって、本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現として特徴付けられる組成物および被験体のターゲティング方法を提供する。
【００８７】
現在の臨床試験では、ゴッシポールの患者における毒性は低い。いくつかの態様では、ゴッシポール化合物は転移性癌の有効な単一薬剤治療を提供することが意図される。本発明は、さらに、ゴッシポール化合物が、Bcl-2およびBcl-XLの抗アポトーシス効果を特異的に拮抗する新規の抗癌薬クラスを示すことを意図する。
【００８８】
Bcl-2は、抗アポトーシスメンバー（例えば、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1/BFL-1、およびBOO-DIVA、Bcl-w、Bcl-6、Bcl-8、およびBcl-yなど）およびプロアポトーシスメンバー（例えば、Bak、Bax、Bid、およびBadなど）が含まれるタンパク質ファミリーの基礎をなすメンバーである。bcl-2遺伝子は、第18染色体上に存在するヒト癌原遺伝子である。bcl-2遺伝子は、B細胞白血病における転座遺伝子座として発見された。この転座はまた、いくつかのB細胞リンパ腫で見出された。癌性B細胞では、bcl-2遺伝子座を含む第18染色体の一部は、抗体重鎖を含む第14染色体の一部と相互転座する。このt(14;18)転座により、bcl-2遺伝子が重鎖遺伝子エンハンサー付近に置かれる。bcl-2遺伝子産物（Bcl-2タンパク質）は、小胞体(ER)膜、核膜、およびミトコンドリアの外膜中に見出される不可欠な膜タンパク質である。Bcl-2およびBcl-XLは、アポトーシスの極めて重大なアンタゴニストとして機能することが意図される。
【００８９】
本発明の実施に機構の理解は必要なく、本発明はそのようにして制限されないにもかかわらず、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2およびBcl-XLは、プロアポトーシスBcl-2ファミリーメンバー（Bak、Bad、Bax、Mtd(Bok)、Bim、Hrk(DP5)、Blk、Bnip3、Bnip3L、およびDivaなど）とのヘテロ二量体の形成によってアポトーシスを抑制することが意図される。Bcl-2ファミリーのさらなる抗アポトーシスメンバー（または関連タンパク質）は、Mcl-1、Al/BFL-1、およびBOO-DIVA、Bcl-w、Bcl-6、Bcl-8、およびBcl-yが含まれると考えられるが、これらに限定されない。
【００９０】
いくつかの態様では、本発明は、阻害の標的としてのBH3ドメイン含有タンパク質を提供する。明細書はタンパク質のBcl-2ファミリーをいい、その開示はBH3ドメイン含有タンパク質に関連すると理解すべきである。したがって、いくつかの態様では、本発明は、BH3ドメイン含有タンパク質の異常な発現に関連する生物学的条件の制御のための組成物および方法を提供する。同様に、いくつかの態様では、本発明は、BH3ドメイン含有タンパク質の異常な発現を調整する（例えば、阻害または促進する）薬剤および化合物をスクリーニングするための方法および組成物を提供する。
【００９１】
Bcl-2およびBcl-XLは、相同性の高いタンパク質である。ヒト癌（例えば、骨髄性白血病および乳癌）の多数の形態はBcl-2および／またはBcl-XLを過剰発現する。Bcl-2およびBcl-XLの両方は、ヒト乳癌において過剰発現されることを見出した。特に、Bcl-2は、ヒト乳癌の60〜80％で過剰発現することが見出されている。Bcl-2発現は、エストロゲン受容体（ER）陽性乳癌と高度に相関する。Bcl-XLは、40〜70％のヒト乳癌、30〜60％の前立腺癌、80％のB細胞リンパ腫、90％の結腸直腸腺癌、および多数の他の癌形態で過剰発現する。Bcl-XLは、主に、ER陰性乳癌で見出される。Bcl-XLの発現は、典型的には、不十分な予後および生存度の低下と相関する。
【００９２】
いくつかの一連の証拠は、Bcl-2およびBcl-XLは癌の進行に寄与するだけでなく、従来の抗癌治療薬によって誘導されるアポトーシスへの癌耐性を付与することができることを示す。高レベルの細胞内Bcl-2は、アポトーシス破壊由来の細胞（例えば、癌細胞）を保護する。固形腫瘍の大部分は、少なくとも1つの抗アポトーシスBcl-2タンパク質によって保護される。ほとんどの現在利用可能な癌治療薬は、細胞内のDNAの完全性または複製をターゲティングし、腫瘍細胞におけるアポトーシスを間接的に誘発する。高レベルのBcl-2および／またはBcl-XLを発現する癌は、しばしば化学療法薬または放射線治療に耐性を示す。
【００９３】
しかし、Bcl-2およびBcl-XLの発現パターンは、Bcl-2ファミリータンパク質を過剰発現するいくつかの癌で異なる。いくつかの報告により、Bcl-2またはBcl-XLタンパク質のいずれかの発現は、癌細胞が化学療法または放射線治療へのBcl-2ファミリー媒介耐性を示すのに十分であることが示唆される。（J．C．Reed、Pharmacology、41、501〜553、1997；J．C．Reedら、J．Cell Biochem．、6、23〜32、1996を参照のこと）。さらなる研究により、いくつかの癌細胞は、過剰発現をBcl-2からBcl-XLに切り替えることができることが示唆される。（Z．Hanら、Cancer Res．、56、621〜628、1996を参照のこと）。したがって、本発明のいくつかの態様は、治療量の1つまたは複数のBcl-2アンタゴニスト（例えば、小分子）を、Bcl-2の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する患者に投与する工程を提供する。同様に、本発明の他の態様は、治療量の1つまたは複数のBcl-XLアンタゴニスト（例えば、小分子）を、Bcl-XLの過剰発現によって特徴付けられる癌を有する患者に投与する工程を提供する。なおさらなる態様では、本発明は、治療量の1つまたはそれ以上のBcl-2ファミリーアンタゴニスト（例えば、小分子）を、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる癌を有する患者に投与する工程を提供する。本発明は、さらに、Bcl-2ファミリータンパク質に対する1つまたは複数のアンタゴニスト（例えば、抗アポトーシスBcl-2ファミリータンパク質）および1つまたは複数のさらなる抗癌薬（例えば、タキソール、ドセタキセルなど）を含む組成物および方法の提供を意図する。好ましい態様では、本発明は、被験体に治療有効量のゴッシポール、ゴッシポロン、ならびにゴッシポールおよびゴッシポロンのシッフ塩基および鏡像異性体ならびにこれらの化合物の薬学的に許容される塩を含む抗癌法および組成物を含む。
【００９４】
Bcl-2およびBcl-XLの三次元（3D）構造についての研究は、両分子がその抗アポトーシス作用に重要な疎水性結合ポケット（BH3結合ポケットと呼ばれる）を有することを示した。さらなる研究は、Bak、Bad、およびBaxは分子がBcl-2およびBcl-XL中のBH3ポケットに結合可能な結合ドメイン（BH3結合ドメインと命名する）を有することを示す。特に、Bcl-XL（S．W．Muchmoreら、Nature、381、335〜341、1996；およびM．Aritomiら、J．Biol．Chem．、272、27886〜27892、1997）のみおよびBak BH3（Bcl-2相同ドメイン3）ペプチドとの複合体（S．Michaelら、Science、275、983〜986、1997）の実験的3D高分解能構造が決定されている。Bcl-2およびBcl-XLは、そのアミノ酸配列の相同性が高い（同一性45％および類似性56％）。標的タンパク質（Bcl-2）とテンプレートタンパク質（Bcl-XL）との間の配列同一性が30％を超える場合、MODELLER（A．Saliら、Structure，Function，and Genetics、23、318〜326、1995）などの現在のコンピュータ相同性モデリング法により、標的タンパク質の正確な3D構造が得られる（S．Sali、Curr．Opin．Biotech．、6、437〜451、1995を参照のこと）ことが証明されている。したがって、本発明の好ましい態様では、コンピュータ相同性モデリングを使用して、Bcl-XL（テンプレートタンパク質）の実験的3D構造座標に基づいてBcl-2（標的タンパク質）の3D構造をモデリングする。
【００９５】
Bcl-XLと複合体形成したゴッシポールの高分解能3D NMR構造分析により、ゴッシポールはBH3結合ポケットを介してBcl-XLにも結合することが明らかとなる。実証的構造ベースの試験方法により、ゴッシポールおよびその鏡像異性体はBcl-XLの抗アポトーシス作用およびより狭い範囲でのBcl-2の抗アポトーシス作用の強力なインヒビターが明らかとなった。
【００９６】
したがって、Bcl-2/Bcl-XLの抗アポトーシス機能の阻害は、いくつかの癌の化学療法または放射線治療の耐性を克服するための新規かつ有望なストラテジーを示す。
【００９７】
発明の詳細な説明
本発明は、天然に存在するおよび化学合成したBcl-2ファミリータンパク質の小分子アンタゴニストに関する。特に、本発明は、ゴッシポール誘導体ならびにBcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XL）を過剰発現する特に癌細胞におけるBcl-2およびBcl-XLタンパク質の抗アポトーシス効果のアンタゴニストとしてのゴッシポール誘導体の使用方法を提供する。本発明の組成物および方法の例を、以下の節にさらに詳細に記載する。I．Bcl-2およびBcl-XLの結合活性；II．Bcl-2およびBcl-XLの小分子インヒビターの発見のための構造ベースのアプローチ；III．癌細胞株におけるBcl-2ファミリータンパク質の特徴づけ；IV．ゴッシポールは細胞成長および増殖を阻害する；V．ゴッシポール活性機構の提案；VI．MDA-231異種移植片マウスのみおよび従来の抗癌薬と組み合わせたゴッシポールの活性；VII．ゴッシポールと組み合わせるか同時投与した治療薬；ならびにVIII．薬学的処方物、投与経路、および投薬の検討。
【００９８】
I．Bcl-2およびBcl-XLの結合活性
本発明の実施に機構の理解は必要なく、本発明はそのように制限されていないが、Bcl-2およびBcl-XLタンパク質の抗アポトーシス作用は、少なくとも一部がBak、Bax、およびBadなどのプロアポトーシスBcl-2ファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成する能力に帰することが意図される。Bcl-2およびBcl-XLの実験的構造は、BH1（Bcl-2相同ドメイン1）ならびにBcl-2およびBcl-XLのBH2およびBH3ドメインは、BakまたはBad BH3ドメインが結合する疎水性結合ポケット（BH3結合ポケット）を形成することを示した。（例えば、S．W．Muchmoreら、Nature、381、335〜341、1996；M．Aritomiら、J．Biol．Chem．、272、27886〜27892、1997；S．Michaelら、Science、275、983〜986、1997；A．M．Petrosら、Protein Sci．、9、2528〜2534、2000；およびA．M．Petrosら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、98、3012〜3017、2001を参照のこと）。Bcl-2/Bcl-XL中の結合ポケットは、抗アポトーシス機能に不可欠である。（例えば、X．M．Yinら、Nature、369、321〜323、1994；S．C．Cosulichら、Curr．Biol．7、913〜920、1997；S．Michaelら、前出；およびA．M．Petrosら、前出を参照のこと）。したがって、本発明は、Bcl-2および／またはBcl-XL中のBH3結合部位に結合する小分子は、Bcl-2および／またはBcl-XLの抗アポトーシス機能が拮抗されて、Bcl-2および／またはBcl-XL過剰発現細胞でアポトーシス細胞にが誘導されるようにBcl-2ファミリータンパク質のプロアポトーシスメンバー（例えば、Bad、Bak、およびBaxなど）でBcl-2および／またはBcl-XLのヘテロ二量体形成を遮断することができることを意図する。好ましい態様では、本発明は、Bcl-2および／またはBcl-XLの結合ポケット（例えば、BH3）に結合する小分子アンタゴニストを提供する。いくつかのこれらの態様では、本発明は、さらに、Bcl-2および／またはBcl-XLの開示した小分子インヒビター（例えば、ゴッシポール化合物）と組み合わせて投与した1つまたは複数のさらなる抗癌薬（例えば、タキソールおよびドセタキセルなど）を提供する。特に好ましい態様では、ゴッシポール化合物を、アポトーシスを誘導する少なくとも1つの抗癌薬と組み合わせて投与する。
【００９９】
本発明は、Bcl-2およびBcl-XLの小分子インヒビターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、およびペプチドなどの他の一般的に利用可能なタンパク質アンタゴニストを超えるいくつかの利点（経口利用可能性の向上、安定性の向上、および低コストが含まれるが、これらに限定されない）を有することを意図する。
【０１００】
II．Bcl-2およびBcl-XLの小分子インヒビターの発見のための構造ベースのアプローチ
本発明は、膨大な3D化学データベースからBcl-2およびBcl-XLなどの抗アポトーシスBcl-2ファミリータンパク質の小分子アンタゴニストを同定するための強力な構造ベースの仮想スクリーニング法を使用した。このアプローチは、標的タンパク質中の結合部位（例えば、Bcl-2およびBcl-XL中のBH3）に結合する潜在的な有機小分子インヒビターを同定するためのコンピュータドッキング法を使用する。1つの態様では、Bcl-XLタンパク質を、ドッキング研究における融合原子接近を使用して処理した。極性水素のみをタンパク質に付加し、Kollman融合原子の部分的変化を割り当てた。すべての水分子を除去した。原子溶媒和パラメータおよび部分的体積をAutoDockユーティリティAddSolを使用してタンパク質原子に割り当てた。（AutoDockウェブページ；G．Morrisら、J．Computational Chemistry、19、1639〜1662、1998を参照のこと）。
【０１０１】
別の態様では、Bcl-2の3D構造を、MODELLER相同性モデリング法によってモデリングした。（A．Saliら、Structure，Function，and Genetics、23、318〜326、1995；およびA．Sali、Curr．Opin．Biotech．、6、437〜451、1995）。BLASTプログラムを使用して得られたBcl-2とBcl-XLとの間の配列アラインメントを図1に示し、これを本発明の相同性モデリングで使用した。Bak BH3ペプチドが良好な親和性でBcl-2およびBcl-XLの両方に結合するので（J．L．Wangら、Cancer Res．、60、1498〜1502、2000；およびJ．L．Wangら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、97、7124〜7129、2000を参照のこと）、Bak BH3ペプチドと複合体形成したBcl-2の3D構造をBak BH3ペプチドと複合体形成したBcl-XLの実験的NMR構造に基づいてモデリングした。（S．Michaelら、Science、275、983〜986、1997）。モデリングした3D複合体構造を、MSI CHARMM力場を使用したCHARMMプログラム（B．R．Brooksら、J．Comp．Chem．、4、187〜217、1983；およびP．V．R．Schleyerら、「CHARMM：エネルギー機能およびプログラムの概観を使用したそのパラメータ化(CHARMM: The Energy Function and Its Parameterization with an Overview of the Program)」、The Encyclopedia of Computational Chemistry、1、271〜277、John Wiley＆Sons編、Chichester、1998）を使用して明示的水中での分子力学（MD）シミュレーションによってさらに精密化した。Bak BH3ペプチドと複合体形成したBcl-2の精密化した構造を、図2に示す。図2は、Bak BH3ペプチドと複合体形成したBcl-2構造全体のリボン図を示す。潜在的なインヒビターを、生化学的および生物学的アッセイによって確認する。
【０１０２】
ランダムスクリーニングと比較して、構造ベースの3Dデータベース検索は非常に有効かつ低コストである。漢方薬から同定および単離した約7,000個の有機小化合物を含む三次元データベースを構築し、これをプログラムDOCK（S．MakinoおよびI．D．Kuntz、J．Comput．Chem．、18、1812〜1825、1997）を使用した現在の構造ベースのデータベーススクリーニングで使用した。最も高いDOCKスコアを有する上位250個の化合物を、潜在的なBcl-2およびBcl-XLインヒビターと見なした。最初に選択した分子のうち、9個の化合物が市販のものであり、さらなるインビトロ結合アッセイのために得た。
【０１０３】
潜在的な非ペプチド小分子インヒビターのさらなる試験を、感度が高くかつ定量的なインビトロ蛍光偏光（FP）ベースの結合アッセイを使用して行った。（I．J．Enyedyら、J．Med．Chem．、44、313〜4324、2001を参照のこと）。9種の候補化合物を、Bcl-2への結合においてBak BH3ペプチドと競合する能力についてこの方法を使用してスクリーニングした。9つの化合物から、3つの化合物が25μMよりも良好なIC50値を示すことが見出され、天然のBak BH3ペプチドのIC50値は、FP結合アッセイにおいて0.3μMであることが見出された。同定されたこれら3つの各小分子は、Bcl-2およびBak BH3ペプチドの結合を遮断することが示された。ゴッシポールのBcl-2に対する結合親和性は10Mであり、Bakペプチドと競合することが見出された。
【０１０４】
Bcl-XLおよびBcl-2は類似の3D構造を有し、いくつかの潜在的なBcl-2インヒビターをまたBcl-XLに結合することが推論された。したがって、上記のFPベースの結合アッセイを使用して、Bcl-XLの潜在的な非ペプチド小分子アンタゴニストの発見でさらなるスクリーニング効果を指示した。
【０１０５】
Bcl-2およびBcl-XLは共に抗アポトーシス機能を有するにもかかわらず、これら2つのタンパク質はヒト癌において異なる発現パターンを有する。さらに、Bcl-2およびBcl-XLは構造的に類似のBH3結合部位を共有するにもかかわらず、いくつかの相違が存在する。Bcl-2のいくつかの小分子インヒビターはBcl-XLに対して良好な結合親和性を有し、他のいくつかの小分子インヒビターはBcl-XLと弱くしか結合しない（弱い結合でも依然としてインヒビターとして使用することができる）ことが発見された。相互に、いくつかの相対的に弱いBcl-2小分子インヒビターは、Bcl-XLに対してさらにより高い結合潜在性を有する。特に、ゴッシポール（中程度強力なBcl-2のインヒビター）は、IC50値が0.4μMのBcl-XLに対する強力な結合活性を示すことが見出された（図3）。図3は、FPベースの結合アッセイで測定したゴッシポールによるBak BH3ペプチドとBcl-2（Bcl-XL）との間の直接結合阻害を示す。非FP標識BakペプチドのBcl-XLに対するIC50値は0.3μMである。
【０１０６】
本発明のFPベースのBcl-XL結合アッセイでは、BakペプチドのBcl-XLに対する結合のIC50値は0.3μMと決定した。したがって、ゴッシポールは、Bcl-XLの強力なインヒビターであり、Bakペプチドに類似の効力を有し、Bcl-2の中程度に強力なインヒビターである。
【０１０７】
III．癌細胞株におけるBcl-2ファミリータンパク質の特徴づけ
Bcl-2およびBcl-XLの小分子インヒビターの分子機構をより深く理解するために、種々の乳癌細胞株および国立癌研究所の抗癌薬スクリーニングプログラム由来の他の癌細胞株でのBcl-2ファミリータンパク質の発現を特徴付けた。5つの代表的な癌細胞株（すなわち、MDA-MB-231、T-47D、およびMDA-435、乳癌細胞株、HL-60白血病細胞株、およびHT-29結腸癌細胞株）および1つの正常な線維芽細胞株（WI-38）の結果を図4に示す。HL-60白血病細胞株のBcl-2発現レベルが最も高く、MDA-MB-231およびMDA-MB-435乳癌細胞株でも非常に高レベルのBcl-2を示した。乳癌細胞株MDA-MB-231およびT-47Dならびに結腸癌細胞株HT-29もまた、非常に高レベルのBcl-XL発現を示した。正常な線維芽細胞株は、低レベルのBcl-2およびBcl-XLを示した。
【０１０８】
タンパク質のBcl-2ファミリーは、プログラム細胞死の決定者として作用する。抗アポトーシス分子（例えば、Bcl-2およびBcl-XL）とプロアポトーシス分子（例えば、Bid、Bax、Bak、およびBad）との間の均衡は、アポトーシスにおいて重要な役割を果たす。この理由のために、癌細胞株MDA-MB-231、T-47D、MDA-435、HL-60、およびHT-29ならびに正常な線維芽細胞株WI-38におけるプロアポトーシスタンパク質Bid、Bax、Bak、およびBadの発現状態もまた決定した。（図4）。正常な線維芽細胞株WI-38を含む試験した全細胞株は、高レベルのBaxを発現し、ほとんどの癌細胞株もまた高レベルのBakを発現する。異なる細胞株間のBidおよびBadの発現レベルに有意な変動性が存在する。まとめると、試験した5つの癌細胞株は高レベルの抗アポトーシスおよびプロアポトーシスBcl-2ファミリータンパク質の両方を示し、正常な線維芽細胞株（WI-38）は、低レベルのBcl-2およびBcl-XLを示すが、高レベルのプロアポトーシスBcl-2ファミリータンパク質BaxおよびBadを示した。
【０１０９】
抗癌薬スクリーニング研究において国立癌研究所（NCI）によって使用されたいくつかの他の乳癌細胞株もまた試験した。これらの細胞株には、BT-549、HS 578T、MCF-7およびNCI/ADR-Resistantが含まれる。これらのうち、MCF-7およびBT-549は、高レベルのBcl-2タンパク質を有し、BT-549はまたは高レベルのBcl-XLタンパク質を有する。HS 578TおよびNCI/ADR-RESは、中程度のBcl-XLタンパク質レベルを有する。したがって、試験した7つのヒト乳癌細胞株（すなわち、MDA-MB-231、T-47D、MDA-435、BT-549、HS 578T、MCF-7、およびNCI/ADR-Resistant）のうち、5つの細胞株が高レベルのBcl-2およびBcl-XL発現のいずれかまたは両方を有する。2つの乳癌細胞株は、中程度のBcl-2またはBcl-XL発現レベルを有する。試験した7つの乳癌細胞株で低Bcl-2発現および低Bcl-XL発現を示すものは無かった。
【０１１０】
IV．ゴッシポールは細胞成長および増殖を阻害する
蛍光偏光アッセイは、ゴッシポールはBak BF3ペプチドのBcl-2およびBcl-XLへの結合を置換することを示した。したがって、本発明は、Bcl-2またはBcl-XL中のBH3結合ドメインに結合する小分子インヒビター（例えば、ゴッシポール）がこれらの分子の抗アポトーシス機能を遮断し、その後Bcl-2および／またはBcl-XL発現が増大した癌細胞中でアポトーシスを誘導することを意図する。小分子インヒビター（例えば、ゴッシポール）もまた高Bcl-2および／またはBcl-XL発現の癌細胞の生存度および増殖を減少させることをさらに意図する。ゴッシポールは、癌、より詳細にはヒト乳癌（例えば、MDA-MB-231）における細胞増殖（成長）を阻害する。MDA-MB-231乳癌細胞株は、Bcl-2およびBcl-XLの両発現レベルが高い。ゴッシポールがMDA-MB-231細胞成長を阻害する能力を、5日間のMTTアッセイで試験した。ゴッシポールは、2.0μMのIC50値でMDA-MB-231細胞成長を阻害することが示された。
【０１１１】
20μMのゴッシポールで24時間処理したMB-231およびWI-38細胞のHoechst Dyeアッセイで検出した結果を、図5Aおよび5Bにそれぞれ示す。ゴッシポールでのMDA-MB-231癌細胞の処理により、癌細胞でアポトーシスが誘導されるが、正常なWI-38線維芽細胞株では誘導されなかった。図5Aは、MDA-231細胞におけるアポトーシスの誘導を示す。図5Bは、ゴッシポール処理により、低レベル（基底レベル）のBcl-2およびBcl-XL発現を有する正常なWI-38線維芽細胞でアポトーシスは誘導されないことを示す。
【０１１２】
他の試験では、ゴッシポールは、高レベルのBcl-XL発現を有するが、Bcl-2発現レベルが低いT-47D乳癌細胞株におけるアポトーシスを誘導することが示された。ゴッシポールは高Bcl-XLの他の癌細胞株（ヒト結腸癌細胞株HT-29）でアポトーシスを誘導するが、Bcl-2およびBcl-XL発現の低い癌細胞株（前立腺癌細胞株DU-145など）では誘導しないことも見出された。
【０１１３】
ゴッシポールがMDA-MB-231乳癌細胞におけるアポトーシスを誘導する効力をより定量的に評価するために、Annexin-Vフローサイトメトリー（FACS）アッセイを使用したさらなる試験を行った。例えば、図6は、Annexin-Vフローサイトメトリーで検出したゴッシポールで24時間処理したヒトMDA-MB-231乳癌細胞のゴッシポール誘導アポトーシスを示す。5.0μMのゴッシポールが59％の細胞のアポトーシスを受けることを誘導することが認められた。ゴッシポールによるアポトーシスの誘導は、用量依存性である。10および20.0μMのゴッシポールにより、それぞれ74％および96％の癌細胞でアポトーシスを受けるように誘導した。MDA-231は、Bcl-2およびBcl-XLの両方を過剰発現する。
【０１１４】
ゴッシポールはBcl-XLの強力なインヒビターであるので、本発明は、ゴッシポールがBcl-XLレベルが高いがBcl-2レベルの低い癌細胞でアポトーシスを誘導することができることを意図する。実際、ゴッシポールは、上記のように、Bcl-XLレベルが高いがBcl-2レベルの低いヒトT-47D乳癌細胞で用量依存性にアポトーシスを誘導する。図7は、Annexin-Vフローサイトメトリーを使用して検出したゴッシポールで24時間処理したヒトTD-47癌細胞におけるアポトーシスの用量依存性誘導を示す。
【０１１５】
これらの試験は、ゴッシポールがBcl-XLの強力なインヒビターであり、高レベル（例えば、細胞型の通常例についての基底発現率と比べた過剰発現）のBcl-XLを発現する癌細胞のアポトーシスを受けるように誘導するが、通常レベルのBcl-2およびBcl-XL発現を有する細胞（例えば、WI-38）におけるアポトーシスは含まれないことを示す。
【０１１６】
本発明の好ましい態様は、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる病態を有する被験体に1つまたは複数のゴッシポール化合物を投与する工程を含む方法を提供する。本発明での使用が意図されるゴッシポール化合物には、(±)-ゴッシポール、(-)-ゴッシポール、(+)-ゴッシポール、(±)-ゴッシポロン、(-)-ゴッシポロン、(+)-ゴッシポロン、(±)-ゴッシポール酢酸、(-)-ゴッシポール酢酸、(+)-ゴッシポール酢酸、(±)-エチルゴッシポール、(-)-エチルゴッシポール、(+)-エチルゴッシポール、(±)-ヘミゴッシポロン、(-)-ヘミゴッシポロン、(+)-ヘミゴッシポロン、(±)-ゴッシポールのシッフ塩基、(-)-ゴッシポールのシッフ塩基、(+)-ゴッシポールのシッフ塩基、(±)-ゴッシポロンのシッフ塩基、(-)-ゴッシポロンのシッフ塩基、(+)-ゴッシポロンのシッフ塩基、(±)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基、(-)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基、(+)-ゴッシポール酢酸のシッフ塩基、(±)-エチルゴッシポールのシッフ塩基、(-)-エチルゴッシポールのシッフ塩基、(+)-エチルゴッシポールのシッフ塩基、(±)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基、(-)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基、および(+)-ヘミゴッシポロンのシッフ塩基ならびにゴッシポールの誘導体、代謝産物、またはゴッシポール分子の薬学的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
特に好ましい態様では、(-)-ゴッシポール鏡像異性体（その誘導体、代謝産物、シッフ塩基、および薬学的に許容される塩が含まれる）を患者に投与する。
【０１１８】
(-)-ゴッシポールおよび(+)-ゴッシポール鏡像異性体結合のNMR分析は、最終的に、(-)-ゴッシポール鏡像異性体および(+)-ゴッシポールの両方はBcl-XLに結合することを示す（図8Aおよび8B）。
【０１１９】
図9は、(-)-ゴッシポールおよび(+)-ゴッシポール鏡像異性体ならびにラセミ体ゴッシポールを比較したMDA-MB-231（2-LMP）乳癌細胞株の成長阻害実験由来のデータを示す（MTTアッセイ（5日間）を使用した3000/200μl/ウェル；ラセミ体ゴッシポール（IC503.2μM）；(-)-ゴッシポールIC50（IC501.7μM）；および(+)-ゴッシポール（IC5010μM））。以前の実験は、ヒトにおける(+)-ゴッシポール鏡像異性体除去T1/2は、(-)-ゴッシポールの29倍であることを示した。したがって、(+)-ゴッシポール鏡像異性体は、(-)-ゴッシポール鏡像異性体よりも潜在的に毒性が高い。したがって、いくつかの態様では、本発明は、(-)-ゴッシポール鏡像異性体の投与は、ゴッシポールのラセミ体または(+)-ゴッシポール鏡像異性体よりも潜在的に毒性が低いことを意図する。
【０１２０】
他の態様では、(-)-ゴッシポール（Super-G）を、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる頭頚部癌患者に投与する。下記の表1では、(-)-ゴッシポールおよびシスプラチン（標準的な頭頚部癌の治療薬）による多数の頭頚部癌細胞株の細胞成長の阻害を比較している。表1は、(-)-ゴッシポールは、Bcl-XLタンパク質が増加したヒト頭頚部癌細胞株における癌細胞成長を強力に阻害することを示す。これらの細胞株は、シスプラチン（標準的な頭頚部癌の化学療法）に非常に高い耐性を示す。
【０１２１】
【表１】
2005515158.tif 000002
【０１２２】
図10は、ゴッシポール、ゴッシポロン、ならびにゴッシポールおよびゴッシポロンのシッフ塩基の化学構造を提供する。
【０１２３】
V．ゴッシポール活性機構の提案
本発明の実施に機構の理解は必要なく、本発明はそのようにして制限されないにもかかわらず、Bcl-2/Bcl-XL媒介アポトーシス経路における重要な分子の1つがシトクロムc（Cyt-c）であることが意図される。したがって、Bcl-2/Bcl-XLの重要な機能の1つがBax、Bak、またはBadとヘテロ二量体を形成してミトコンドリアからのCyt-cの放出を遮断することがさらに意図される。したがって、ゴッシポールが癌細胞中のミトコンドリアから細胞質ゾルへのCyt-c放出を誘導する能力を試験した。乳癌細胞株MDA-231およびT47Dを、5または20μMゴッシポールで24時間処理した。図11は、MDA-231およびT47D乳癌細胞株（HM（重膜中で見出されたCyt-c）；細胞質ゾル（細胞質ゾルで見出されたCyt-c））における20μMのゴッシポールでの処理後にミトコンドリアから細胞質ゾルへCyt-cが放出されることを示す。
【０１２４】
任意の特定の機構に制限されないが、一旦Cyt-cがミトコンドリアから放出されると、Bcl-2媒介アポトーシスはカスパーゼ（例えば、カスパーゼ3および9）カスパーゼ活性化を含むことも意図される。従って、ゴッシポールがカスパーゼ3を活性化するかどうかを決定するために試験を行った。MDA-231乳癌細胞中のカスパーゼ3の切断量を、ゴッシポール処理から12〜24時間後に測定した。図12は、カスパーゼ3がゴッシポールでの処理後に用量依存性様式で17および21kDフラグメントに切断されることを示す。ゴッシポールで処理したT-47Dヒト乳癌細胞およびHT-29結腸癌細胞で類似の結果が得られ、これらは共に発現処理後にBcl-XL発現は高く、Bcl-2発現は比較的低かった。対照的に、Bcl-2およびBcl-XL発現が低いヒトDU-145前立腺癌細胞の5、10、または20μMのゴッシポールの24時間の処理でカスパーゼ3活性に影響を与えなかった。したがって、ゴッシポールによるカスパーゼ3の活性化は特異的であり、癌細胞のBcl-XL発現レベルに相関する。
【０１２５】
VI．MDA-231異種移植片マウスのみおよび従来の抗癌薬と組み合わせたゴッシポールの活性
抗癌治療薬としてのゴッシポール化合物の潜在性を、ヌードマウスにおけるヒト乳癌MDA-MB-231（サブクローン2LMP）異種移植片モデルでさらに評価した。ゴッシポール治療レジメを、マウスの腫瘍直径が8〜10mmになった7日目から開始した。各治療群は、10個のヒト腫瘍（両端に1つずつの腫瘍）を保有する5匹のマウスを有していた。コントロール群は、ゴッシポールを投与していない5匹のマウスを有していた。処理マウスでは、2つの異なる経口用量（30mg/kgおよび90mg/kgの用量）で3週間ゴッシポールを毎日投与した。毎日30mg/kgおよび90mg/kgの用量では、ゴッシポールによって70％を超える腫瘍成長が阻害され、29日目には95％を超える信頼水準で阻害されることが見出された。ゴッシポール処理したマウスにおいて体重減少や死亡は認められなかった。30mg/kgおよび90mg/kgの用量のゴッシポールの抗癌活性においていかなる有意差も認められないようであった。これらの結果により、毎日30mg/kgの用量のゴッシポールは、ゴッシポール治療にアジュバントもしくはさらなる抗癌化合物または治療法を補足することなく腫瘍成長を首尾よく阻害することが示唆される。
【０１２６】
Bcl-XLの過剰発現は、癌細胞をいくつかの従来の抗癌治療（例えば、ドセタキセル）によって誘導されるアポトーシスから保護するようである。したがって、本発明のいくつかの態様は、少なくとも1つの従来の抗癌治療（例えば、デセタキセルなどの化学療法薬および／または放射線治療）と組み合わせた有効量のゴッシポール（およびその鏡像異性体、誘導体、および薬学的に許容される塩）を投与する工程を提供する。
【０１２７】
好ましい態様では、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XL）の過剰発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）を治療するための1つまたは複数の従来の抗癌治療薬と組み合わせてゴッシポールを投与する。
【０１２８】
本発明の実施に機構の理解は必要なく、本発明はそのようにして制限されないにもかかわらず、従来の抗癌治療（例えば、ドセタキセルなどの化学療法）と組み合わせた少なくとも1つのゴッシポール化合物の投与により、従来の抗癌治療に耐性を示すBcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XL）の発現レベルが高い癌細胞をゴッシポールおよび／またはさらなる抗癌薬（例えば、ドセタキセル）での治療に感受性を持たせることが意図される。しかし、本発明は、ゴッシポール化合物と抗癌治療薬とのいかなる特定の組み合わせの投与にも限定されず、本発明は任意の特定の配列または投与される薬剤レベルに制限されない。
【０１２９】
ゴッシポールは毎日約30mg/kgの用量で腫瘍成長を有意に阻害するので、この用量レベルを、ゴッシポールと他の従来の抗癌治療薬との組み合わせ試験に選択した。10匹のマウスからなる群に、7日目から4週間目まで毎日約30mg/kgの用量のゴッシポールを経口投与した。7日目に、同一の10匹のマウスに、毎週腹腔用量（7.5mg/kg）のドセタキセルを3週間投与した。この実験結果を、図13に示す。特に、図13は、ゴッシポールもしくはドセタキセルのみまたはヒト乳癌異種移植片MDA-MB-231ヌードマウスと組み合わせによる腫瘍成長の阻害を示す。各実験群は、10匹のマウスを有していた。図13は、ドセタキセルのみ（30mg/kgで毎日）または最適以下の用量（7.5mg/kgで毎週）のドセタキセルの投与により試験動物の腫瘍成長が有意に阻害されたが、ゴッシポールとドセタキセルとの組み合わせ療法を受けた試験マウスはさらにより高い腫瘍成長阻害を示すことを示す。重要には、この群では、ゴッシポールとドセタキセルとの組み合わせで治療した10匹中3匹のマウス（6腫瘍）は完全な腫瘍抑制を示した。全体として、コントロール群と比較して組み合わせ療養における腫瘍成長は90％を超えて阻害された。SAS（G．VerbekeおよびG．Molenberghs、「実際的な線形混合モデル：SAS指向型アプローチ(Linear mixed models in practice: An SAS-orientated approach)」、Springer-Verlag、第126巻、1997を参照のこと）プログラムを使用して統計分析を行い、結果を、以下の表2に示す。
【０１３０】
【表２】
2005515158.tif 000003
【０１３１】
結果は、ゴッシポールおよびドセタキセルの抗癌活性は、研究の41日目および47日目の両方でコントロールと比較し統計的に有意であることを示す。さらに、ゴッシポールとドセタキセルとの組み合わせの抗癌活性は、コントロール（非処置）群およびゴッシポールまたはドセタキセルのみで治療した群と比較して有意である。まとめると、これらのデータは、ゴッシポールは有意な抗癌活性のみを有するが、いくつかの態様では従来の抗癌薬（例えば、ドセタキセルなどの化学療法薬）と組み合わせて投与した場合にさらに高い活性を達成することを示す。
【０１３２】
本発明の実施に機構の理解は必要なく、本発明はそのようにして制限されないにもかかわらず、従来の抗癌薬とゴッシポール化合物とのいくつかの組み合わせで認められた相乗効果は、2つの化合物の異なる作用機構（例えば、ゴッシポールによるBcl-XL活性阻害およびデコタキセルによる微小管の標的）によることが意図される。
【０１３３】
他の態様では、さらに、本発明の実施に機構の理解は必要なく、本発明はそのようにして制限されないにもかかわらず、従来の抗癌薬とゴッシポール化合物とのいくつかの組み合わせで認められた相乗効果は、2つの化合物の類似の作用機構（例えば、ゴッシポールおよび1つまたは複数のさらなる抗癌薬の両方によるBcl-XL活性の阻害）によることが意図される。
【０１３４】
例えば、1つの態様では、従来の抗癌治療薬タキソールと同時投与した(-)-ゴッシポール鏡像異性体により、相乗的利点が得られる。図14は、(-)-ゴッシポール鏡像異性体とタキソールとの同時投与の相乗効果を示す。簡単に述べれば、この実験は、MCF-7乳癌細胞株において(-)-ゴッシポールおよび(+)-ゴッシポール鏡像異性体のタキソールとの比を100：1で使用した（(-)-ゴッシポール（IC508.71μM）；(+)-ゴッシポール（IC5022.88μM）；タキソール＋(-)-ゴッシポール（IC502.755μM）；およびタキソール＋(+)-ゴッシポール（IC5010.57μM））。同様に、図15Aおよび15Bは、(-)-ゴッシポールとタキソールおよび(+)-ゴッシポールとタキソールとの間の強力な相乗効果を示す併用指標を示す。図16は、ゴッシポールのBcl-XLへの結合を示す。図17は、(-)-ゴッシポールのエチルシッフ塩基の結合を示す。
【０１３５】
VII．ゴッシポールと組み合わせるか同時投与した治療薬
広範な治療薬が本発明で適用される。ゴッシポール化合物同時投与するかゴッシポール化合物と組み合わせることができる任意の治療薬は、本発明の使用に適切である。
【０１３６】
本発明のいくつかの態様は、有効量のゴッシポール（およびその鏡像異性体、誘導体、および薬学的に許容される塩）および少なくとも1つの抗癌薬（例えば、化学療法薬などの従来の抗癌薬および／または放射性治療）を被験体に投与する工程を提供する。いくつかのこれらの態様では、被験体は、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XL）の細胞内過剰発現によって特徴付けられる疾患を有する。
【０１３７】
本発明での使用に適切な抗癌薬機構には、アポトーシスを誘導する薬剤、核酸破壊を誘導／引き起こす薬剤、核酸合成を阻害する薬剤、微小管形成に影響を与える薬剤、およびタンパク質の合成および安定性に影響を与える薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明の組成物および方法での使用に適切な抗癌薬のクラスには、1）微小管インヒビター（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビンデシンなど）、微小管安定剤（例えば、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセルなど）、およびエピドフィロトキシン（例えば、エトポシド［VP-16］およびテニポシド［VM-26など］）などのトポイソメラーゼインヒビターを含むクロマチン機能インヒビター、ならびにトポイソメラーゼIを標的する薬剤（例えば、カムプトテシンおよびイシリノテカン［CPT-11］など）を含むアルカロイド；2）ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イフォスファミド、およびブスルファン［ミレラン］など）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、およびセムスチンなど）、および他のアルキル化剤（例えば、デカルバジン、ヒドロキシメチルメラミン、チオテパ、およびマイトマイシンなど）を含むDNA共有結合薬（アルキル化剤）；3）核酸インヒビター（例えば、ダクチノマイシン［アクチノマイシンD］など）、アントラシクリン（例えば、ダウノルビシン［ダウノマイシンおよびセルビジン］、ドキソルビシン［アドリアマイシン］、およびイダルビシン［イダマイシン］など）、アントラセンジオン（例えば、［マイトキサントロン］などのアントラシクリン類似物）、ブレオマイシン（ブレノキサン）など、およびプリカマイシン（マイトラマイシン）などを含むDNA非共有結合薬（抗腫瘍抗生物質）；4）葉酸代謝拮抗薬（例えば、メトトレキセート、フォレックス、およびメキサートなど）、プリン代謝産物拮抗薬（例えば、6-メルカプトプリン［6-MP、プリネトール］、6-チオグアニン［6-TG］、アザチオプリン、アシクロビル、グラシクロビル、クロロデオキシアデノシン、2-クロロデオキシアデノシン［CdA］、および2’-デオキシコフォルマイシン［ペントスタチン］など）、ピリミジンアンタゴニスト（例えば、フルオロピリミジン［例えば、5-フルオロウラシル（アドルシル）、5-フルオロデオキシウリジン（FdUed）（フロキシウリジン）］など）、およびシトシンアラビノシド（例えば、サイトサー［ara-C］およびフルダラビンなど）を含む代謝拮抗物質；5）L-アスパラギナーゼおよびヒドロキシ尿素などを含む酵素；6）抗エストロゲン（例えば、タモキシフェンなど）、非ステロイド系抗アンドロゲン（例えば、フルタミドなど）などの糖質コルチコイド、およびアロマターゼインヒビター（例えば、アナストロゾール［アリミデックス］など）を含むホルモン；7）白金化合物（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチンなど）；8）抗癌薬、毒素、および／または放射性核種と結合したモノクローナル抗体；9）生物反応修飾物質（例えば、インターフェロン［例えば、IFN-αなど］およびインターロイキン［例えば、IL-2など］など）；10）養子免疫療法；11）造血成長因子；12）腫瘍細胞分化を誘導する薬剤（例えば、全トランスレチノイン酸など）；13）遺伝治療技術；14）アンチセンス療法技術；15）腫瘍ワクチン；16）腫瘍転移に指向する治療（例えば、バチニスタットなど）；および17）血管新生のインヒビターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
好ましい態様では、本発明は、有効量のゴッシポールおよび被験体にアポトーシスを誘導する少なくとも1つの従来の抗癌薬の投与を提供する。いくつかの好ましい態様では、被験体は、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XL）の過剰発現によって特徴付けられる疾患を有する。さらに他の好ましい態様では、本発明は、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XL）の過剰発現によって特徴付けられる疾患を有する被験体への有効量のゴッシポールおよびタキサン（例えば、ドセタキセル）の投与を提供する。
【０１４０】
タキサン（例えば、ドセタキセル）は、有効な抗癌化学療法薬のクラスである。（例えば、K．D．MillerおよびG．W．Sledge，Jr．、Cancer Investigation、17、121〜136、1999を参照のこと）。本発明は任意の特定の機構に制限されることを意図しないが、タキサン媒介細胞死は、細胞内微小管安定化およびその後のアポトーシス経路の誘導によって進行すると考えられる。（例えば、S．Haldarら、Cancer Research、57、229〜233、1997を参照のこと）。多くの系では、Bcl-2およびBcl-XLは、この経路で負の制御として機能する。
【０１４１】
いくつかの他の態様では、ゴッシポール化合物と使用するためのシスプラチンおよびタキソールが特に意図される。シスプラチンおよびタキソールは、腫瘍細胞におけるアポトーシスの十分に定義された誘導作用を有する。（例えば、Lanniら、Proc．Natl．Acad．Sci．、94、9679、1997；Tortoraら、Cancer Research、57、5107、1997；Zaffaroniら、Brit．J．Cancer、77、1378、1998を参照のこと）。しかし、これらおよび他の化学療法薬での治療は、有意な毒性を招くことなく達成することは困難である。現在使用されている薬剤は、一般に、水溶性が低く、毒性が高く、正常な細胞および罹患細胞に影響を与える用量で投与されている。例えば、パクリタキセル（タキソール）（最も有望な高癌化合物の1つ）は、水溶性が低い。パクリタキセルは、B16黒色腫、L1210白血病、MX-1乳腺腫瘍、およびCS-1結腸腫瘍異種移植片などの広範な種々の腫瘍モデルにおいて優れた抗腫瘍活性を有する。しかし、パクリタキセルの水溶性の低さがヒトへの投与での問題となる。したがって、現在使用されているパクリタキセル処方物には薬物を溶解するためのクレマフォアが必要である。ヒト臨床用量は、200〜500mgの範囲である。この用量を、エタノール：クレマフォアの1:1溶液に溶解し、静脈内投与される流動物で1リットルに希釈する。現在使用されているクレマフォアは、ポリエトキシル化ヒマシ油である。これは、クレマフォア混合物の溶解および大量の水性賦形剤での希釈による注入によって投与する。直接投与（例えば、皮下）により、毒性が局所的になり、活性が低い。
【０１４２】
本発明はまた、シスプラチンおよび／またはタキソールの被験体への送達後の治療の成功をモニターする機会を提供する。例えば、これらの薬物がインビトロでアポトーシスを誘導する能力の測定は、インビボでの有効性のマーカーであると報告されている（Gibb、Gynecologic Oncology、65，13、1997）。したがって、有効な抗腫瘍治療を得るためおよび毒性を減少させるための1つまたは両方のこれらの薬物のいずれかの標的化送達に加えて、治療の有効性を、アポトーシス誘導をモニターする本発明の技術によって評価することができる。重要には、両治療は、広範な腫瘍型（乳癌および結腸癌が含まれるが、これらに限定されない）に対して活性である（Akutsuら、Eur．J．Cancer、31A、2341、1995）。
【０１４３】
癌治療の状況で日常的に使用されている任意の医薬品が本発明で適用される。開示のゴッシポール化合物との投与に適切な従来の抗癌薬には、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、エトポシド、カンプトセシン、アクチノマイシンD、マイトマイシンC、より好ましくはシスプラチンが含まれるが、これらに限定されない。これらの薬剤を調製し、本明細書中に記載の免疫治療薬との組み合わせによる組み合わせ治療組成物またはキットとして使用する。
【０１４４】
本発明のいくつかの態様では、治療用ゴッシポール化合物治療は、さらに、相乗効果を示す本発明の抗新生物薬が得られる、DNA損傷を容易にするために核酸（例えば、DNA）に直接架橋した1つまたは複数の薬剤を含む。シスプラチンなどの薬剤および他のDNAアルキル化剤を使用することができる。シスプラチンは、臨床応用において20mg/M2の有効用量で3週間毎に5日間を全部で3治療単位投与して癌治療に広く使用されている。本発明の組成物を、任意の適切な方法（静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内、または局所（例えば、粘膜表面）が含まれるが、これらに限定されない）を介して送達させることができる。
【０１４５】
DNAを損傷させる薬剤には、DNA複製、有糸分裂、および染色体分離を妨害する化合物も含まれる。このような化学療法薬には、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても公知）、エトポシド、ベラパミル、およびポドフィロトキシンなどが含まれるが、これらに限定されない。これらの化合物は、新生物治療のための薬物使用状況で広く使用されており、ボーラス注射によってアドリアマイシンについては25〜75Mg/M2の用量範囲で21日間隔で静脈内投与し、エトポシドについては35〜50M2で静脈内投与するかこの倍の用量で経口投与する。
【０１４６】
核酸前駆体およびサブユニットの合成および忠実度を破壊する薬剤によってもDNAが損傷し、本発明で化学療法薬として適用される。多数の核酸前駆体が開発されている。広範に試験されかつ容易に利用可能な薬剤が特に有用である。したがって、5-フルオロウラシル（5-FU）などの薬剤は、新生物組織で優先的に使用され、この薬剤は、新生物細胞のターゲティングで特に有用となる。送達用量は、3〜15mg/kg/日の範囲であり得るが、疾患の段階、細胞の治療への感受性、および薬物耐性量を含む種々の要因にしたがって、他の用量に大きく変更することができる。
【０１４７】
好ましい態様では、本発明で使用される抗癌薬は、抗癌効果の忠実度を喪失することなく被験体、組織、または細胞に送達することができるように開示のゴッシポール化合物との同時投与が可能であるか、開示のゴッシポール化合物と組み合わせたものである。白金複合体、ベラパミル、ポドフィロトキシン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ピリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、タキソール、トランス白金、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセート、および他の類似の抗癌薬などの癌治療薬のより詳細な説明については、当業者は、かなり多数の有益なマニュアル（医師の卓上文献ならびにGoodmanおよびGilman、「治療薬の薬学的基本(Pharmaceutical Basis of Therapeutics)」、第9版、1996、Hardmanら編が含まれるが、これらに限定されない）を参照する。
【０１４８】
いくつかの態様では、薬物を、光分解性リンカーを使用してゴッシポール化合物に結合させる。例えば、本発明で適用されるいくつかのヘテロ二官能性光分解性リンカーは、Ottlら（Ottlら、Bioconjugate Chem．、9、143、1998）に記載されている。これらのリンカーは、水溶性でも溶媒溶解性でもよい。これらは、アミンまたはアルコールと反応することができる活性化エステルおよびチオール基と反応することができるエポキシドを含む。2基間に、近紫外光（365nm）に曝露した場合にインタクトな形態のアミンアルコールを放出する3,4-ジメトキシ-6-ニトロフェニル光異性化基が存在する。したがって、このようなリンカーを使用して本発明の組成物が連結している場合、治療薬を、標的領域の近紫外光への曝露により生物学的に活性または活性化可能な形態で放出することができる。
【０１４９】
例示的態様では、タキソールのアルコール基を、有機溶媒可溶性リンカーの活性化エステルと反応させる。この生成物を、次に、部分的にチオール化した適切なデンドリマー表面（デンドリマーの第一級アミンを、半化学量論的量の2-イミノチオラノとの反応によってチオール含有基に部分的に変換することができる）と反応させる。シスプラチンの場合、薬物のアミノ基を、水溶性形態のリンカーと反応させる。アミノ基が十分に反応しない場合、シスプラチンの第一級アミノ含有活性類似物（Pt（II）二塩化スルファジアジンジクロリドなど）（Pasaniら、Inorg．Chim．Acta、80、99、1983、およびAbelら、Eur．J．Cancer、9、4、1973）を使用することができる。このようにして結合した薬物は不活性であり、正常な細胞に有害ではない。結合物が腫瘍細胞内に局在する場合、適切な近紫外波長のレーザー光に曝露して、細胞に活性な薬物を放出させる。
【０１５０】
同様に、本発明の別の態様では、シスプラチン（またはその類似物）のアミノ基を、非常に疎水性の高い光分解性保護基（2-ニトロベンジルオキシカルボニル基など）と連結する（Pillai，V．N．R．Synthesis、1〜26、1980）。近UV光（約365nm）に曝露した場合、疎水性基が切断され、インタクトな薬物が放出される。薬物自体が親水性であるので、デンドリマーから腫瘍細胞に拡散し、アポトーシスを開始する。
【０１５１】
光分解性リンカーの代替物は、酵素分解性リンカーである。多数の光分解性リンカーが有効な抗腫瘍結合物として証明されており、ドキソルビシンなどの癌治療薬の適切な短鎖ペプチドリンカーを含む水溶性ポリマーへの結合によって調製することができる（例えば、Vaseyら、Clin．Cancer Res．、5、83、1999を参照のこと）。リンカーは細胞の外側で安定であるが、細胞内のチオプロテアーゼによって切断される。好ましい態様では、結合物PK1を使用する。光分解性リンカーストラテジーの代替物として、Gly-Phe-Leu-Glyなどの酵素分解性リンカーを使用することができる。
【０１５２】
本発明は、治療技術の性質によって制限されない。例えば、本発明で適用される他の結合物には、BNCTの結合ホウ素ダスター（Capalaら、Bioconjugate Chem．、7、7、1996）、放射性同位体の使用、およびリシンなどの毒素の結合物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
本発明の治療薬として抗菌治療薬を使用することもできる。微生物機能を死滅、阻害、または弱毒化することができる任意の薬剤ならびにこのような活性を有することが意図される任意の薬剤を使用することができる。抗菌薬には、天然および合成の抗生物質、抗体、阻害タンパク質、アンチセンス核酸、および膜破壊薬などが含まれるが、これらに限定されず、これらを単独または組み合わせて使用する。実際、任意の抗生物質型を使用することができ、抗菌薬、抗ウイルス薬、および抗真菌薬などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
なおさらなる態様では、本発明の別の成分は、ゴッシポール化合物が特定の細胞型（例えば、腫瘍）に特異的に標的することができる標的薬剤（ゴッシポール化合物ターゲティング薬物複合体）と組み合わされたものである。一般に、標的薬剤と組み合わされるゴッシポール化合物は、ターゲティング薬の細胞表面部分との相互作用を介して新生物細胞をターゲティングし、細胞が受容体媒介エンドサイトーシスを受ける。
【０１５５】
標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面上に存在することが公知の任意の部分は、本発明で適用される。例えば、このような部分に指向する抗体は、本発明の組成物をこの部分を含む細胞表面にターゲティングする。あるいは、ターゲティング部分は、細胞表面上に存在する受容体（逆もまた同様）に指向するリ癌ドであり得る。同様に、ビタミンを使用して、本発明の治療薬を特定の細胞にターゲティングすることもできる。
【０１５６】
本発明のいくつかの態様では、ターゲティング部分はまた、ターゲティング薬（リ癌ド）が例えば腫瘍特異的抗原（本発明で適用される癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、チロシナーゼ、ras、シアリリールイス抗原、erb、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、MN、gp100、gp75、p97、プロテイナーゼ3、ムチン、CD81、CID9、CD63、CD55、CD38、CO-029、CA125、GD2、GM2、およびO-アセチルGD3、M-TAA、M-胚、M-泌尿器）に結合する受容体の発現によって特徴付けられる特定の腫瘍を同定するための薬剤として機能することもできる。あるいは、ターゲティング部分は、腫瘍サプレッサー、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍特異的受容体リ癌ド、受容体、アポトーシスのインデューサー、または分化因子であり得る。
【０１５７】
ターゲティングが意図される腫瘍抑制タンパク質には、p16、p21、p27、p53、p73、Rb、ウィルムス腫瘍（WT-1）、DCC、神経線維腫症1型（NF-1）、フォン・ヒッペル-リンダウ（VHL）腫瘍サプレッサー、マスピン、ブラッシュ-1、BRCA-1、BRCA-2、多腫瘍サプレッサー（MTS）、ヒト黒色腫のgp95/p97抗原、腎細胞癌関連G250抗原、KS1/4膵臓癌抗原、卵巣癌抗原（CA125）、前立腺特異的抗原、黒色腫抗原gp75、CD9、CD63、CD53、CD37、R2、CD81、CO029、TI-1、L6、およびSASが含まれるが、これらに限定されない。勿論、これらは単なる例示的な腫瘍サプレッサーに過ぎず、本発明を、腫瘍サプレッサーとして当業者に公知であるか公知となる任意の他の薬剤と組み合わせて使用することができると想定される。
【０１５８】
本発明の好ましい態様では、ターゲティングは、癌遺伝子（例えば、bcl-2および／またはbcl-XL）によって発現する因子に関する。これらには、Srcファミリーのメンバーなどの膜会合および細胞質形態のチロシンキナーゼ、Mosなどのセリン／トレオニンキナーゼ、血小板由来成長因子（PDDG）などの成長因子および受容体、rasファミリーを含むSMALL GTPアーゼ（Gタンパク質）、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ（cdk）、c-myc、N-myc、およびL-mycを含むmycファミリーメンバーのメンバー、ならびにblc-2ファミリーメンバーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
本発明の文脈で適用される受容体およびその関連リ癌ドには、葉酸受容体、アドレナリン作動性受容体、成長ホルモン受容体、黄体形成ホルモン受容体、エストロゲン受容体、上皮成長因子受容体、および線維芽細胞成長因子受容体などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
本発明のターゲティング局面で適用されるホルモンおよびその受容体には、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、アンギオテンシンI、アンギオテンシンII、α-エンドルフィン、α-メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）、コレシストキニン、エンドセリンI、ガラニン、胃抑制ペプチド（GIP）、グルカゴン、インスリン、アミリン、リポトロピン、GLP-1（7-37）ニューロフィジン、およびソマトスタチンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
さらに、本発明は、ターゲティング剤として使用されるビタミン（脂溶性および非脂溶性ビタミン）を使用して、これらのビタミンの受容体を有するかこれらを取り込む細胞をターゲティングすることができることを意図する。この態様には、ビタミンDおよびその類似物、ビタミンE、およびビタミンAなどの脂溶性ビタミンまたはビタミンCなどの水溶性ビタミンが特に好ましい。
【０１６２】
本発明のいくつかの態様では、任意の数の癌細胞ターゲティング基をゴッシポール化合物と組み合わせる。したがって、ターゲティング基と組み合わせたゴッシポール化合物は、癌細胞のターゲティングに特異的である（すなわち、癌細胞に結合し、健常な細胞に結合しない傾向がより強くなる）。
【０１６３】
本発明の好ましい態様では、ターゲティング基を、短い（例えば、直接結合）、中程度の（例えば、Pierce Chemical Companyから販売されているSPDPなどの小分子二官能性リンカーの使用）、または長い（例えば、Shearwater Polymerから販売されているPEG二官能性リンカー）結合を使用してゴッシポール化合物と組み合わせる（例えば、共有結合または非共有結合）。
【０１６４】
いくつかの態様では、ゴッシポール化合物を、デンドリマー（例えば、PAMAM）、リポソーム、または他のキャリアと組み合わせる。当業者は、デンドリマーの多価構造をうまく利用したデンドリマーゴッシポール化合物分子を容易にデザインすることができる。
【０１６５】
本発明の好ましい態様では、ターゲティング剤は、抗体または抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Fab単位）である。例えば、多数の癌（乳がんHER2を含む）の表面で見出される十分に研究された抗原は、悪性細胞で排他的に発現する糖タンパク質p185である（Pressら、Oncogene、5、953、1990）。組換えヒト化抗HER2モノクローナル抗体（rhuMabHER2）は、HER2過剰発現乳癌細胞の成長を阻害することが示されており、進行性乳癌治療のための第III相臨床試験で（従来の化学療法薬と組み合わせて）評価されている（Pegramら、Proc．Am．Soc．Clin．Oncol．、14、106、1995）。Parkらは、rhuMabHER2のFabフラグメントを単層小リポソームに結合させ、化学療法薬ドキソルビシン（dox）と共に負荷し、HER2過剰発現腫瘍異種移植片にターゲティングすることができる（Parkら、Cancer Lett．、118、153、1997およびKirpotinら、Biochem．、36、66、1997）。これらのdox負荷「免疫リポソーム」は、対応する非ターゲティングdox負荷リポソームまたは遊離のdoxと比較して腫瘍に対する細胞傷害性が増大し、遊離doxと比較して全身毒性が減少した。
【０１６６】
種々の生体標的上（例えば、病原体、腫瘍細胞、正常な組織）の抗原または免疫原（例えば、腫瘍、組織、または病原体特異的抗原）をターゲティングするために抗体を作製することができる。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６７】
いくつかの好ましい態様では、抗体は、腫瘍特異的エピトープ（例えば、TAG-72（Kjeldsenら、Cancer Res．、48、2214〜2220、1988；米国特許第5,892,020号、同第5,892,019号、および同第5,512,443号））；ヒト癌抗原（米国特許第5,693,763号、同第5,545,530号、および同第5,808,005号）；骨癌細胞由来のTP1およびTP3抗原（米国特許第5,855,866号）；腺癌細胞由来のトムセン-フリーデンライヒ（TF）抗原（米国特許第5,110,911号）；ヒト前立腺癌由来の「KC-4抗原」（米国特許第4,708,930号および同第4,743,543号）；ヒト結腸直腸癌抗原（米国特許第4,921,789号）；嚢胞腺癌由来のCA125抗原（米国特許第4,921,790号）；ヒト乳癌由来のDF3抗原（米国特許第4,963,484号および同第5,053,489号）；ヒト乳癌抗原（米国特許第4,939,240号）；ヒト黒色腫由来のp97抗原（米国特許第4,918,164号）；癌またはオロソムコイド関連抗原（CORA）（米国特許第4,914,021号）；ヒト扁平上皮癌に反応するがヒト小細胞癌に反応しないヒト肺癌抗原（米国特許第4,892,935号）；ヒト乳癌の糖タンパク質中のTおよびTnハプテン（Springerら、Carbohydr．Res．、178、271〜292、1988）（MSA乳癌糖タンパク質と呼ばれる（Tjandraら、Br．J．Surg．、75、811〜817、1988））；MFGM乳癌抗原（Ishidaら、Tumor Biol．、10、12〜22、1989）；DU-PAN-2膵臓癌抗原（Lanら、Cancer Res．、45、305〜310、1985）；CA125卵巣癌抗原（Hanischら、Carbohydr．Res．、178、29〜47、1988）；YH206肺癌抗原（Hinodaら、Cancer J．、42、653〜658、1988）を認識する。上記の各引例は、特に参照として本明細書に組み入れられる。
【０１６８】
当技術分野において公知の種々の手順を、ポリクローナル抗体の産生に使用する。抗体産生のために、種々の宿主動物を、所望のエピトープ（ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが含まれるが、これらに限定されない）に対応するペプチドでの注射によって免疫化することができる。好ましい態様では、ペプチドを、免疫原性キャリア（例えば、ジフテリア類毒素、ウシ血清アルブミン（BSA）、またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH））に結合させる。宿主の種に依存して種々のアジュバント（フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG（ウシ型弱毒結核菌ワクチン）およびコリネバクテリウム・パルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない）と使用して、免疫応答を増大させる。
【０１６９】
モノクローナル抗体調製のために、培養での連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することができる。（例えば、HarlowおよびLane、「抗体：実験マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照のこと）。これらには、KohlerおよびMilstein（KohlerおよびMilstein、Nature、256、495〜497、1975）によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozborら、Immunol．Today、4、72、1983を参照のこと）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら、「モノクローナル抗体と癌治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、Alan R．Liss，Inc．、77〜96、1985）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
本発明の態様に加えて、モノクローナル抗体を、最近のテクノロジー（例えば、PCT/US90/02545を参照のこと）を使用して、無菌動物中に産生することができる。本発明によれば、ヒト抗体を使用することができ、ヒトハイブリドーマ（Coteら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、80、2026〜2030、1983）の使用またはインビトロでのEBVウイルスでのヒトB細胞の形質転換（Coleら、「モノクローナル抗体と癌治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、Alan R．Liss、79〜96、1985）によって得ることができる。
【０１７１】
本発明によれば、単鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第4,946,778号（参照として本明細書に組み入れられる））を、特異的単鎖抗体を産生するように適合させることができる。本発明のさらなる態様は、Fab発現ライブラリー構築についての記載の技術（Huseら、Science、246、1275〜1281、1989）を使用して、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントを迅速かつ容易に同定可能である。
【０１７２】
抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体フラグメントを、公知の技術によって作製することができる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるF(ab')2フラグメント、F(ab')2フラグメントのジスルフィド結合の還元によって作製することができるFab'フラグメント、および抗体分子のパパインおよび還元剤での処理によって作製することができるFabフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
抗体産生では、所望の抗体のスクリーニングを、当技術分野において公知の技術（例えば、放射免疫アッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュー免疫アッセイ（例えば、金コロイド、酵素、または放射性同位体標識を使用）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなど）などによって行うことができる。
【０１７４】
乳癌のために、細胞表面を、葉酸、EGF、FGF、および抗体（または抗体フラグメント）を使用して、腫瘍関連抗原MUC1、cMet受容体、およびCD56（NCAM）にターゲティングすることができる。
【０１７５】
適切なペプチドターゲティング基を同定および選択するための非常に柔軟な方法は、市販のキットを使用して都合よく行うことができるファージディスプレイ技術（例えば、Corteseら、Curr．Opin．Biotechol．、6、73、1995を参照のこと）である。ファージディスプレイ手順により、ファージ表面に結合したペプチドの巨大かつ多様な組み合わせライブラリーが産生され、これを強固な結合について固定表面受容体をスクリーニングする。強固な結合後、ウイルス構築物を単離および配列決定をして、ペプチド配列を同定する。次のペプチドライブラリーの出発点として最良のペプチドを使用して、サイクルを繰り返す。最終的に、適切に高親和性のペプチドを同定し、生体適合性および標的特異性についてスクリーニングする。この方法では、デンドリマーに結合することができるペプチドを産生することが可能であり、標的細胞受容体（例えば、腫瘍細胞受容体）または他の所望の標的に高い結合性および親和性を有する多価結合物が産生される。
【０１７６】
「プレターゲティング」アプローチ（例えば、GoodwinおよびMeares、Cancer（増補版）、80、2675、1997を参照のこと）が上記のターゲティングアプローチに関連する。このストラテジーの例は、腫瘍特異的モノクローナル抗体とストレプトアビジンとの結合物での患者の最初の治療を含む。残存する溶解性結合物を、適切なビオチン化清澄化剤で血流から除去する。腫瘍局在化結合物が全て残存している場合、ゴッシポール連結ビオチン化剤を導入し、その後強力かつ特異的なビオチン-ストレプトアビジン相互作用によって腫瘍部位に局在化させる。
【０１７７】
本発明のいくつかの態様では、ターゲティング剤（一部）は、核酸（例えば、RNAまたはDNA）であることが好ましい。いくつかの態様では、核酸ターゲティング部分を、特定の核酸（例えば、染色体DNA、mRNA、またはリボゾームRNA）への塩基対合によってハイブリッド形成するようにデザインする。他の態様では、核酸はリ癌ドまたは生体標的に結合する。以下のタンパク質に結合する核酸を同定した：逆転写酵素、HIVのRevおよびTatタンパク質（Tuerkら、Gene、137（1）、33〜9、1993）；ヒト神経成長因子（Binkleyら、Nuc．Acids Res．、23（16）、3198〜205、1995）；および血管内皮成長因子（Jellinekら、Biochem．、83（34）、10450〜6、1994）。リ癌ドに結合する核酸を、SELEX手順（例えば、米国特許第5,475,096号；同第5,270,163号；同第5,475,096号、PCT公開公報WO97/38134、WO98/33941、およびWO99/07724（その全てが参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと）によって同定することが好ましいが、多数の方法が当技術分野において公知である。
【０１７８】
VIII．薬学的処方物、投与経路、および投薬の検討
治療薬の送達を例示するために、以下の考察では主に癌治療用のゴッシポール化合物およびドセタキセルの送達に注目するが、本発明は、ドセタキセルのゴッシポール化合物との同時投与を含む組成物および方法に制限されることを意図しない。
【０１７９】
本発明は、少なくとも1つのゴッシポール化合物、好ましい態様では、少なくとも1つの抗癌薬を含み得る薬学的組成物を提供し、ゴッシポール化合物および抗癌薬を任意の滅菌生体適合性薬学的キャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水が含まれるが、これらに限定されない）中で投与することができる。いくつかの態様では、本発明の薬学的組成物は、1つの薬剤（例えば、ゴッシポール化合物）を含み得る。他の態様では、薬学的組成物は、少なくとも2つの薬剤（例えば、ゴッシポール化合物および1つまたは複数の従来の抗癌薬）の混合物を含み得る。なおさらなる態様では、本発明の薬学的組成物は、1つまたは複数の以下の条件下（異なる周期、異なる持続時間、異なる濃度、異なる投与経路など）で患者に投与する少なくとも2つの薬剤（例えば、ゴッシポール化合物および1つまたは複数の従来の抗癌薬）を含む。
【０１８０】
本発明の組成物および方法は、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1/BFL-1、およびBOO-DIVAなど）の過剰発現によって特徴付けられる疾患の治療または生理学的状態の変化で適用される。本発明は、抗アポトーシスBcl-2ファミリータンパク質（Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1/BFL-1、およびBOO-DIVAが含まれるが、これらに限定されない）のアンタゴニストの投与によるアポトーシスの誘導方法を提供する。
【０１８１】
本発明は、許容可能な薬学的送達方法および調製技術に従ったゴッシポール化合物、いくつかの態様では、1つまたは複数の従来の抗癌薬の投与を意図する。例えば、ゴッシポール化合物および適切な抗癌薬を、生理学的食塩水などの薬学的に許容されるキャリア中で被験体に静脈内投与することができる。医薬品の標準的な細胞内送達方法（例えば、リポソームを介した送達）を使用することができる。このような方法は、当業者に周知である。
【０１８２】
いくつかの態様では、本発明の処方物は、静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内などの非経口投与に有用である。いくつかの意図される抗癌薬（例えば、治療用ポリペプチド）の治療のための同時投与もまた、上記の遺伝子治療を使用して行うこともできる。
【０１８３】
医学分野で周知のように、任意のある患者の投薬量は、多数の要因（患者のサイズ、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、投与の時間および経路、身体全体の健康、および現在投与されている他の薬物との相互作用が含まれる）に依存する。
【０１８４】
したがって、本発明のいくつかの態様では、ゴッシポール化合物を、患者に単独もしくは1つまたは複数の従来の抗癌薬（例えば、ヌクレオチド配列、薬物、ホルモンなど）または賦形剤もしくは他の薬学的に許容されるキャリアと混合した薬学的組成物と組み合わせて投与する。本発明の1つの態様では、薬学的に許容されるキャリアは、薬学的に不活性である。
【０１８５】
治療条件に依存して、これらの薬学的組成物を処方し、全身または局所的に投与することができる。処方および投与の技術は、「レミントンの薬学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」（Mack Publishing Co．、Easton Pa）の最新版で見出すことができる。適切な経路には、例えば、経口もしくは経粘膜投与ならびに非経口投与（筋肉内、皮下、骨髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が含まれる）を含み得る。
【０１８６】
注射のために、本発明の薬学的組成物を、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理学的緩衝化生理食塩水などの生理学的に適合する緩衝液中で処方することができる。組織または細胞投与のために、処方物中で透過すべき特定の障壁に適切な浸透剤を使用する。このような浸透剤は、当技術分野において一般に公知である。
【０１８７】
他の態様では、本発明の薬学的組成物を、経口投与に適切な投薬量で当技術分野において周知の薬学的に許容されるキャリアを使用して処方することができる。このようなキャリアにより、薬学的組成物を、治療される患者による経口または鼻腔内摂取のための錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、および懸濁液などに処方することができる。好ましい態様では、ゴッシポール化合物を、患者に経口投与する。
【０１８８】
本発明での使用に適切な薬学的組成物には、意図する目的の達成に有効な量で有効成分を含む組成物が含まれる。例えば、ゴッシポール化合物の有効量は、特定の細胞または組織の正常な非病理学的例と比較してBcl-2ファミリータンパク質レベルが上昇した細胞または組織においてアポトーシスを誘導する量であり得る。有効量の決定は、特に本明細書中の開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１８９】
有効成分に加えて、好ましい薬学的組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の処理を容易にする賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に許容されるキャリアを含み得る。経口投与用に処方された調製物は、錠剤、糖衣丸、カプセル、溶液の形態であり得る。
【０１９０】
本発明の薬学的組成物を、それ自体が公知である様式（例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣丸作製、粉末化、乳化、カプセル化、トラッピング、または凍結乾燥プロセスの手段による）で製造することができる。
【０１９１】
非経口投与のための薬学的処方物には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、適切な油性注射用懸濁液として活性化合物の懸濁液を調製することができる。適切な親油性溶媒または賦形剤には、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質（カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど）を含み得る。選択的に、懸濁液はまた、高濃度の溶液の調製のために化合物の溶解性を増加させる適切な安定剤または薬剤を含み得る。
【０１９２】
経口用の薬学的調製物を、活性化合物（例えば、ゴッシポール化合物）と固体賦形剤との組み合わせ、選択的に、得られた混合物の磨砕、所望ならば錠剤または糖衣丸のコアを得るための適切な助剤の添加後の混合物の顆粒化によって得ることができる。適切な賦形剤は、糖類（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールが含まれる）；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモなど由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；およびアラビアガムおよびトラガカントを含むガム；およびゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物またはタンパク質充填剤である。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊材または可溶化剤を添加することができる。
【０１９３】
本発明の組成物の摂食用処方物には、一般に安全であると認識される（GRAS）食品および物質中の混入物（食品添加物、香料、着色料、ビタミン、ミネラル、および植物性栄養素など）について米国農務省によって承認された任意の材料をさらに含み得る。本明細書中で使用される、用語「植物性栄養素」は、生物学的効果を有する植物から単離した有機化合物（以下のクラスの化合物：イソフラボン、プロアントシアニンのオリゴマーインドール-3-カルビノール、スルホラフォン、繊維状リ癌ド、植物性フィトステロール、フェルラ酸、アントシアノシド、トリテルペン、オメガ3/6脂肪酸、ポリアセチレン、キノン、テルペン、カテキン、没食子酸塩、およびケルシチンが含まれるが、これらに限定されない）をいう。
【０１９４】
濃縮糖溶液などの適切なコーティングを使用して糖衣丸コアが得られ、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物もまた含み得る。製品の識別または有効化合物の量（すなわち、投薬量）を特徴付けるために、染料または色素を錠剤または糖衣丸コーティングに添加することができる。
【０１９５】
経口で使用することができる薬学的調製物には、ゼラチン製のプッシュ-フィットカプセルならびにゼラチン製の軟密封カプセル、およびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングが含まれる。プッシュ-フィットカプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および選択的に安定剤と混合した有効成分を含み得る。軟カプセルでは、活性化合物を、安定剤を含むか含まない脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁することができる。
【０１９６】
薬学的に許容されるキャリア中に処方した本発明の化合物を含む組成物を調製し、適切なコンテナに入れ、標示された病態の治療についての標示付けを行うことができる。ゴッシポール化合物のために、ラベル上の標示された病態には、不完全なアポトーシスの制御、高増殖性疾患、癌、後天性免疫不全症候群（AIDS）、変性病態、および血管疾患に関する病態の治療を含み得る。薬学的組成物を塩として得ることができ、多数の酸（塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが含まれるが、これらに限定されない）で形成することができる。塩は、水溶液または対応する遊離塩基形態であるプロトン酸溶媒中でより溶解性が高い傾向がある。他の場合では、好ましい調製物を、pH範囲4.5〜5.5の1mM〜50mMのヒスチジン、0.1％〜2％のスクロース、2％〜7％のマンニトール中で凍結乾燥することができ、使用前に緩衝液と合わせる。
【０１９７】
本発明の方法で使用される任意の化合物のために、最初に細胞培養アッセイから治療有効量を評価することができる。次いで、好ましくは、投薬量を、Bcl-2ファミリータンパク質レベルが上昇した細胞においてアポトーシスを誘導する望ましい循環濃度を達成するために動物モデル（特に、マウスモデル）で処方することができる。治療有効量は、病態（例えば、無秩序な細胞増殖疾患（癌を含むが、これに限定されない））の症状を改善するゴッシポール化合物（およびいくつかの態様では、1つまたは複数のさらなる従来の抗癌薬）の量をいう。このような化合物の毒性よび治療有効性を、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、LD50（50％の集団が死滅する用量）およびED50（50％の集団が治療効果を示す用量）の決定）によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比で示すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよびさらなる動物研究から得たデータを、投薬量範囲の処方に使用することができる（例えば、哺乳動物での使用（例えば、ヒト、Equus caballus、Felis catus、およびCanis familiarisなど））。ほとんど毒性を示さないかまったく毒性を示さないED50を含む循環濃度範囲内のこのような化合物の投薬量が好ましいが、本発明はこの範囲に制限されない。投薬量は、使用した投薬形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。
【０１９８】
正確な投薬量を、治療を受ける患者を考慮して各医師が選択する。投薬量および投与を、十分なレベルの活性部分が得られるか、所望の効果が維持されるように調整する。考慮することができるさらなる要因には、患者の病態の重症度、年齢、体重、性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療への耐性／応答性が含まれる。持続性薬学的組成物を、特定の処方物の半減期およびクリアランス速度に依存して3〜4日毎、1週間毎、2週間に1回投与することができる。他の薬学的組成物を、毎日または1日に数回投与することができる。
【０１９９】
正常な投薬量は、投与経路に依存して、0.1〜100,000μg、全投与量は約1gまでで変化させることができる。特定の投薬量および送達方法についてのガイダンスは、文献（米国特許第4,657,760号、同第5,206,344号、または同第5,225,212号（その全てが参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと）に記載されている。いくつかの薬剤の患者の骨髄への投与は、静脈内注射と異なる様式での送達が必要であり得る。
【０２００】
本発明の好ましい態様は、薬学的組成物および細胞（例えば、癌細胞）の増殖阻害有効量のゴッシポールを患者に投与する方法を提供する。いくつかの他の態様では、本発明は、さらに、薬学的組成物および細胞（例えば、癌細胞）増殖が阻害されるように、ゴッシポールに加えて有効量の少なくとも1つの従来の抗癌薬を患者に同時投与する方法を提供する。
【０２０１】
好ましい態様では、被験体は、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1/BFL-1、およびBOO-DIVAなど）の過剰発現によって特徴付けられる疾患を有する。いくつかの態様では、Bcl-2ファミリータンパク質の過剰発現によって特徴付けられる疾患には、異常増殖性疾患、癌、後天性免疫不全症候群（AIDS）、変性病態、および血管疾患が含まれるが、これらに限定されない。なおさらなる態様では、本発明の組成物および方法による治療に適切な癌には、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、脳腫瘍、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頚癌、骨髄腫、副腎癌、白血病、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫が含まれるが、これらに限定されない。しかし、本発明は、いかなる特定型の癌型の治療に制限されることを意図しない。
【０２０２】
いくつかの態様では、本発明の治療に適切なBcl-2ファミリータンパク質レベルの上昇によって特徴付けられると疑われる疾患を、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1/BFL-1、およびBOO-DIVAなど）のレベルが高いと疑われる関心対象のサンプル（例えば、細胞、組織、流動物など）を得ること、1つまたは複数の十分に確立された免疫組織化学技術（例えば、ELISAおよびウェスタンブロットなど）を使用してサンプル中のBcl-2ファミリータンパク質レベルを測定すること、およびサンプル中のBcl-2ファミリータンパク質レベルと関連する基準非病理学的サンプル中のBcl-2ファミリータンパク質レベルとの比較によって選択する。他の態様では、1つまたは複数のBcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1/BFL-1、およびBOO-DIVAなど）レベルの上昇によって特徴付けられると疑われる疾患を、非病理学的サンプルに関連するこれらのマーカーのレベルと比較したサンプル中のBcl-2ファミリータンパク質レベルの上昇を直接または間接的に示すサンプル（例えば、細胞、組織、流動物など）中の1つまたは複数のマーカー（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質など）のレベルの比較によって選択する。なおさらなる態様では、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、A1/BFL-1、およびBOO-DIVAなど）レベルの上昇によって特徴付けられると疑われる疾患を、1つまたは複数の従来の抗癌治療（例えば、化学療法、放射線治療、および/または外科的介入）を用いた治療に応答しないか応答を停止させる疾患から選択する。
【０２０３】
本発明は、被験体への薬剤の送達のために選択した投与経路に制限されることを意図しない。実際、多数の適切な投与経路が当業者の範囲内で選択されることが意図される。
【０２０４】
いくつかの好ましい態様では、ゴッシポール化合物を、約1〜200mg/日、約5〜50mg/日、最も好ましくは約10〜40mg/日の投薬量範囲で患者に投与する。特に好ましい態様では、ゴッシポール化合物を、いくらかの生物活性（例えば、RbおよびサイクリンD1レベルの変化）を示す耐容1日用量（例えば、30〜40mg/日）で患者に（例えば、経口）投与する。
【０２０５】
さらに他の好ましい態様では、タキサン（例えば、ドセタキセル）を、ゴッシポール化合物と組み合わせて患者に投与する。古典的なドセタキセル投与計画は、80〜100mg/m2q3週間である。しかし、最近の研究により、タキサンをq週間の計画でおそらくより高い用量で安全に投与することができることが示唆される。（例えば、J．D．Hainsworthら、J．Clin．Oncology、16、2164〜2168、1998；J．D．Hainsworthら、J．Clin．Oncology、19、3500〜3505、2001；およびC．Kouroussisら、Cancer Chemo．Pharm．、46、488〜492、2000を参照のこと）。タキサン投与に関する患者の毒性には、好中球減少症、無気力、脱毛症、過敏症、皮膚への毒性、および浮腫が含まれる。本発明の好ましい態様は、患者の毒性を減少させる一方で薬物の有効性を保持するためのタキサンの1週間毎の投与を提供する。他の態様では、開示のゴッシポール化合物での患者の治療単位の間の1週間に1回を超える頻度でのタキサン（例えば、ドセタキセル）の投与により、相乗効果が得られると予想される。
【０２０６】
本発明は、任意の特定の機構や投与される薬剤のいかなる作用の理解に制限されないが、以下の実施例は、使用した例示的試験手順の説明を提供し、ゴッシポール化合物とゴッシポールとの同時投与の候補である1つまたは複数の抗癌薬との間の相互作用を決定する。
【０２０７】
ドセタキセルは、CYP3A4（特異的シトクロムp450酵素）によって広範に代謝される。ドセタキセルから得た薬物動態学的データは、そのクリアランスは患者間で非常に変動することを示す。不十分なドセタキセルのクリアランスにより、濃度曲線下面積（AUC）が増加して患者の毒性が増大し得る。いくつかの介入でゴッシポールがシトクロムP450および混合した機能オキシダーゼを減少させることを報告しているにもかかわらず、これらの結果を疑い、この問題に特に取り組んでいるヒトにおける研究は行われていない。したがって、患者によってはゴッシポールがCYP3A4活性を阻害して有毒なドセタキセルが蓄積する可能性がある。
【０２０８】
1つの態様では、最初のドセタキセルの投与前に患者に1日量のゴッシポールを1週間投与する。患者の系におけるドセタキセルの薬物動態学的プロフィールは、患者が最初のドセタキセル投与後に上昇した。（R．Brunoら、J．Clin．Oncol．、16、187〜196、1998を参照のこと）。約15mg/m2/週に用量を減少させてドセタキセル投与を開始する。ドセタキセルの用量を、約35mg/m2/週の最大耐量に段階的に増加させる。同時に、CYP3A4の表現型発現に対するゴッシポール投与の効果についての情報を収集する。
【０２０９】
CYP3A4の表現型発現を、エリスロマイシン呼気検査を使用して容易かつ再現性があるように（ERMBT）測定することができる。（例えば、P．Watkins、Pharmacogenetics、4、171〜184、1994およびJ．Hirthら、Clin．Cancer Res．、6、1255〜1258、2000を参照のこと）。ERMBT試験は、血中CYP3A4基質レベルにより定常状態を予想することが示された。従って、本発明のいくつかの態様は、ゴッシポールとドセタキセルとの間の潜在的な薬物相互作用を決定するためにERMBTを使用したゴッシポール化合物とタキサン（例えば、デセタキセル）との同時投与に関する。当業者は、類似の試験方法を使用して同時投与のためのゴッシポール化合物と候補化合物との間の潜在的相互作用を決定することができると認識する。
【０２１０】
いくつかの態様では、Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2、Bcl-XL、およびBaxなど）のレベルの変化を決定するために、本発明の方法および組成物での治療後または治療中に患者から得られたサンプルに対して標準的な免疫組織化学技術を使用する。例えば、いくつかの態様では、Bcl-2（DAKO、Carpinteria、CA）、Bcl-XLおよび／またはBax（Zymed、South San Francisco、CA）の抗体を使用した免疫組織化学技術を使用して、患者サンプルにおけるこれらのBcl-2タンパク質レベルを決定する。好ましい態様では、免疫組織化学研究由来の結果を、当業者に公知の十分に確立された基準を使用して解釈し、任意の細胞質または核染色が陽性と見なされた。Bcl-2、Bcl-XL、およびBaxの発現レベルを、各症例における少なくとも1,000個の新生物細胞の計数によって決定し、百分率で示す。陽性細胞の比率がBcl-2およびBcl-XLについては25％超、およびBaxについては50％超である場合、高発現と見なす。（例えば、G．Rassidakisら、Amer．J．Path．、159、527〜535、2001およびS．Shiら、J．Histochem．Cytochem．、39、741〜748、1991を参照のこと）。他の態様では、断続的な全血サンプルを、末梢血リンパ球（PBL）におけるBcl-2およびBcl-XL発現の蛍光標示式細胞分取器（FACS）分析用および循環上皮細胞の免疫磁性選択用に得る。
【０２１１】
好ましい態様では、特定の抗癌併用療法の候補と組み合わせて投与するゴッシポール化合物の最大耐量（特定の1日量（例えば、30mg/日））が確立された場合、投薬研究の始点が得られる。いくつかの態様では、所与のサンプル（例えば、細胞、組織、または流動物サンプル）が500個を超える好中球を示すか患者が研究される間はいつでもグレード3または4である任意の他の毒性を示す場合、用量制限毒性（DLT）が確立される。
【０２１２】
さらにいくつかの他の態様では、用量の増加を評価するために、各用量レベルで開始した2人の患者について最低9週間の治療が必要である。最大耐量（MTD）を、33％の患者がDLTを経験した時点の用量と定義する。特定の用量でMTDに到達しない場合、この用量レベルを、MTDと定義する。好ましい態様では、時間事象CRMまたは（TITE-CRM）と呼ばれる連続再評価法（J. O' Quigleyら、Biometrics、46、33〜48、1990）に記載の基準にしたがって患者に用量を割り当てる。（K．CheunおよびR．Chapell、Biometerics（印刷中））。簡単に述べれば、TITE-CRM法は、用量の関数としての毒性応答の発生に対する時間についてのモデルを仮定し、新規の患者を用量レベルに割り当てる場合に試験に含まれる全患者からの情報を使用する。この方法は各用量で治療した患者数に関して非常に柔軟性があるので、患者を安全プロフィールと一致した用量で治療している限り、試験を通して補充を中断することなく被験体を連続的に補充することができる。
【０２１３】
好ましい態様では、治療後、罹患細胞および組織を、細胞生存度、アポトーシスの誘導（形態学的変化など）、DNAの完全性、ミトコンドリア経路、Bcl-2ファミリータンパク質の発現の変化、およびカスパーゼ活性化ならびにカスパーゼおよびカスパーゼインヒビターの上流および下流エフェクターのためのアッセイに供する。当業者は、治療細胞および組織におけるこれらおよび多数の他の細胞および生化学パラメータを試験するためのアッセイを容易にデザインおよび実行することができる。
【０２１４】
実施例
本発明の一定の好ましい態様を証明およびさらに例示するために以下の実施例を提供するが、これらは本発明の範囲を制限すると解釈されない。
【０２１５】
実施例1：相同性モデリング
ヒトBcl-2配列を、GeneBank（エントリーgi4557355）（配列番号：1）から得た。Bcl-2と45％のアミノ酸配列同一性、56％配列類似性、および3％ギャップを含むBcl-XLのNMR構造（pdbコード：タンパク質データバンク由来のIBXL）を、テンプレートとして使用した。相同性モデリングプログラムMODELLER（バージョン4.0）（A．Saiら、Structure、Function and Genetics、23、318〜326、1995およびA．Sali、Curr．Opin．Biotech．、6、437〜451、1995）を使用してBcl-2の構造を構築した。分子力学プログラムCHARMM（バージョン27b2）（B．R．Brooks，J．Comput．Chem．、4、187〜217、1983）を使用してさらに精密化した。プログラムQUANTA（Molecular Simulations Inc．、San Diego、CA）を使用して水素原子をモデリングした構造に割り当てた。Bak BH3ペプチドを、Bak BH3ペプチド（タンパク質データバンク中の1BXL）との複合体中にBcl-XLのNMR構造と同一の方向でBcl-2 BH3ドメイン結合部位に置いた。（S．Michaelら、Science、275、983〜986、1997）。直径60ÅのTIP3P水の球面への挿入および任意のタンパク質重原子由来の2.5Å未満の重原子を有する溶媒分子の除去によって複合体構造を解析した。
【０２１６】
QUANTA98におけるMSI CHARMM力場（ref23）から設定した全原子パラメータ（定誘電体、ε＝1および一定温度、T＝300K）を使用して、MDシミュレーションを行った。1 fs時間ステップを使用するリープフロッグ法を、数値積分法に適用した。長期的な静電気力を、8〜12Åの切り替え範囲の場切り替え法を使用して処理した。（B．R．Brooksら、J．Comput．Chem．、4、187〜217、1983を参照のこと）。シフト法およびカットオフ12Åを使用してファンデルワールス力を計算した。非結合リストを、14Åに維持し、試行錯誤で更新した。溶媒水を、CHARMM（B．R．Brook、前出）で実行される球体ミセレイニアス平均場ポテンシャルの使用によって蒸発しないようにした。100サイクルのSteepest Descent法およびさらに1000サイクルのAdopted-Basisニュートンラプソン法を使用して、溶媒和タンパク質のエネルギーを最小にした。これに、3.0nsのMDシミュレーションを行った。国立衛生研究所の応用生化学コンピューティングセンターのOrigin2000コンピュータでシミュレーションを行った。
【０２１７】
実施例2：Bcl-XLタンパク質の発現および精製
N末端Hisタグを有する組換えBcl-XLタンパク質を、pET15b発現ベクター（Novagen、Darmstadt、Germany）から過剰発現させた。この構築物では、推定C末端膜固定領域（残基214〜273）およびヘリックス1とヘリックス2との間のループ（残基49〜88）を、タンパク質精製を容易にするために除去した。このループは、タンパク質の抗アポトーシス活性に可欠であることが以前に示されている。（S．W．Muchmoreら、Nature、381、335〜341、1996を参照のこと）。現在のBcl-XL構造は、1Lの細胞培養から20mgの精製Bcl-XLタンパク質を産生する。
【０２１８】
M．Janssonら、J．Biomol．NMR、7、131〜141、1996およびM．L．Caiら、J．Biomol．NMR、11、97〜102、1998に記載の方法に従って、NMR研究のためのタンパク質サンプルを、スクリーニングのために15Nで均一に標識し、構造の特徴づけのために15Nおよび13Cで均一に二重標識した。
【０２１９】
実施例3：ヒト癌細胞におけるBcl-2ファミリータンパク質の発現
種々のレベルのBcl-2および／またはBcl-XLタンパク質を発現するいくつかの癌細胞株（表3）を、ヒト癌細胞の増殖を阻害するためのゴッシポール活性を試験するために選択した。
【０２２０】
【表３】
2005515158.tif 000004
【０２２１】
表3に示す十分に特徴付けられた癌細胞株を使用した実験により、潜在的な抗癌薬としてのゴッシポールのいくつかの重要な特徴を試験可能である。第1に、種々のレベルのBcl-2ファミリータンパク質を発現する多数の癌細胞型を使用した結合アッセイにおけるゴッシポールの活性および選択性は、ゴッシポールでの治療に適切な候補である癌型の範囲を示すと予想される。第2に、Bcl-2およびBcl-XLレベルが高い癌細胞におけるゴッシポール試験は、1つのタンパク質のみでの阻害でアポトーシス誘導に十分であるかまたは両タンパク質の同時阻害の潜在性が高いのかどうかを示す。第3に、種々のレベルのBcl-2ファミリータンパク質を発現する多数の癌細胞型を使用したアッセイは、ゴッシポールがBcl-2およびBcl-XL発現の両方が低い癌細胞において選択性を示すかどうかを示す。
【０２２２】
実施例4：蛍光偏光ベースの結合アッセイ
本発明は、Bcl-2およびBcl-XLの両方の小分子インヒビター（例えば、ゴッシポール化合物）のインビトロ結合親和性を決定するために、確立された高感度で定量的なインビトロ蛍光偏光（FP）ベースの結合アッセイを使用する。（例えば、J．L．Wangら、Cancer Res．、60、1498〜1502、2000；J．L．Wangら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、97、7124〜7129、2000；A．Degterevら、Nat．Cell Biolog、3、173〜182、2001；およびI．J．Enyedyら、J．Med．Chem．、44、4313〜4324、2001を参照のこと）。このアッセイは、組換えBcl-2またはBcl-XLタンパク質由来の蛍光標識BH3ドメインペプチドの置換をモニターする。一旦ペプチドがBcl-2またはBcl-XLタンパク質に結合すると、蛍光偏光が増強する。小分子インヒビターがBcl-2またはBcl-XLに結合して蛍光標識BH3ドメインペプチドに交換された場合、蛍光偏光は減少する。両タンパク質に対する結合親和性の決定は、その選択性の決定に重要である。Bcl-2およびBcl-XLの構造が非常に類似しているにもかかわらず、これら2つのタンパク質には一定の相違が存在する。Bcl-2/Bcl-XLの小分子インヒビターは、これら2つのタンパク質間で一定の選択性を示し得る。したがって、ゴッシポールのBcl-2およびBcl-XLへの結合をさらに決定し、本明細書中に概説のNMR法を使用して確認する。
【０２２３】
200μMでBcl-2インヒビター（例えば、ゴッシポール、その鏡像異性体、誘導体、および薬学的に許容される塩）の最初のスクリーニングを行う。インヒビターで有意な阻害が認められた場合（50％超）、そのIC50値を決定する。5mlの試験化合物を含む反応緩衝液を、トレーサーおよび同一の濃度で得られたBcl-2またはBcl-XLタンパク質を含むウェルに添加する。全化合物中の最終DMSO濃度は、0.5％未満にすべきである。室温で10分間のインキュベーション後、最後の読み取りを行う。最初の活性化合物のIC50決定では、1nMと200μMとの間の9〜10種の濃度を使用する。非標識Bakペプチドを、陽性コントロールとして使用し、不活性化合物を陰性コントロールとして使用する。
【０２２４】
1つの態様では、Bcl-2蛍光偏光アッセイを、以下のように使用した。フルオレセイン標識した16量体ペプチドトレーサーFlu-Bak-BH3（Bak BH3ドメイン由来の配列GQVGRQLAIIGDDINR（配列番号：2））を合成し、アミノ酸末端を標識した。46kDaの組換え可溶性GST融合Bcl-2タンパク質を、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz、CA）から購入した。10μlの1×リン酸緩衝化生理食塩水、5μlのGST-Bcl-2タンパク質、および5μlのペプチドトレーサーを含むウェルあたり全体積20μlで反応を行った。反応物を、室温で20分間インキュベートした。Ultra Reader（Tecan U．S．Inc．、Research Triangle Park、NC）を使用して、485nmおよび535nmを読み取った。バックグラウンド、緩衝液、Bcl-2タンパク質、トレーサー、およびBcl-2タンパク質とトレーサーとの混合物から得た最大および最小のシグナルの分析によって一連の検証試験を行った。Bcl-2タンパク質と16量体フルオレセイン標識ペプチドとの間の結合のKdを、5.4nM〜540nMの濃度範囲のBcl-2タンパク質および0.145nM〜1450nMの濃度範囲の蛍光トレーサーの滴定によって決定した。最終濃度290nMの蛍光トレーサーおよび270nMのBcl-2タンパク質で至適な結合が得られた。特異性を検証するために、蛍光標識ペプチドの結合を、非標識16量体ペプチドと比較した。データは、非標識16量体ペプチドが約0.3μMのIC50（文献で報告された値と類似の値）で標識トレーサーの結合を破棄することができることを示す。
【０２２５】
ゴッシポールおよびゴッシポール類似物の最初のスクリーニングを200μMで行った。5μlの試験化合物を含む反応緩衝液を、予め決定した同一濃度のトレーサーおよびBcl-2タンパク質を含む各ウェルに添加した。全化合物中の最終のDMSO濃度は、1％未満であった。室温で10分間のインキュベーション後、最終読み取りを行った。活性化合物のIC50の決定のために、200μMから開始した3連の6〜7点の連続希釈を行った。
【０２２６】
細胞および試薬。ヒト乳癌細胞株（T47D、MDA-231、MDA-453）およびヒト白血病細胞HL-60を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から入手した。全腫瘍細胞株を成長させ、基礎培地としてダルベッコ改変イーグル培地を使用した10％FCSを含むRPMI 1640中でMDA-MB-231以外の全腫瘍細胞株を成長および維持した。培養物を、加湿インキュベーターにて37℃で5％CO2で維持した。
【０２２７】
実施例5：NMRによるBcl-XLへのゴッシポール結合の確認
ゴッシポールのBcl-XLへの結合を、高分解能NMR技術を使用して決定した。pH7.2でNMR実験を行うので、ウォーターフリップバックを含むパルスフィールド勾配（PFG）HSQCを使用して、シグナル強度を最大にし（S．GrzesiekおよびA．Bax、J．Am．Chem．Soc．、115、12593〜12594、1993およびG．S．Sheppardら、Abstracts of Papers of the Amer．Chem．Soc．、213、81、1997）、水シグナル由来の破壊を最小にした。Bcl-XLのHSQCスペクトルを、濃縮インヒビター溶液の添加前（遊離のBcl-XL）および添加後に記録した。ついで、2つのスペクトルを比較して、インヒビターの添加によって誘導された化学シフトを同定した。nmrPipe、pipp、およびnmrDrawソフトウェアを使用してデータ処理を行った（D．S．Garrettら、J．Magn．Reson．Ser．．、B95、214〜220、1991およびF．Delaglioら、J．Biomol．NMR、6、277〜293、1995を参照のこと）。シフトしたピークを割り当て表と相互参照してインヒビターの存在によって影響を受ける残基を明らかにした。
【０２２８】
実施例6：NMRによるゴッシポールのBcl-XLへの結合親和性の決定
nMからmMの濃度の滴定によって小分子インヒビターの結合親和性を得るためにBcl-XLの類似のHSQC実験を行う。小分子インヒビターがNMRタイムスケールでの高速交換限度でBcl-XLタンパク質に結合するので、インヒビター量が増加するにつれて最大シフトの位置に対して段階的様式でいくつかのピークシフトが起こる。インヒビター濃度に対する化学シフト値の変化を分析してKd値を得る。（例えば、P．E．Johnsonら、Biochemistry、35、13895〜13906、1996を参照のこと）。
【０２２９】
実施例7：ゴッシポールによって誘導されたアポトーシス機構の調査
Bcl-2ファミリータンパク質（例えば、Bcl-2および／またはBcl-XL）の小分子インヒビターとしてゴッシポール化合物の作用機構を決定するために一連の生化学アッセイを行う。本発明の実施に機構の理解は必要なく、本発明はそのようにして制限されないにもかかわらず、ゴッシポール化合物がBcl-2ファミリータンパク質を過剰発現する細胞および組織に対して作用する機構の理解は本発明に有利であることが意図される。
【０２３０】
種々の用量および時間のゴッシポール化合物で治療した細胞におけるBcl-2タンパク質の発現およびリン酸化状態を決定する。特に、Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-Xs、Bak、Bad、Bax、Bidの発現レベルを、ウェスタンブロット分析を使用した特異的抗体によって決定する。Bcl-2、Bcl-XL、およびBadなどのタンパク質のリン酸化状態を、リン酸化タンパク質を認識する特異的抗体を使用したウェスタンブロットで決定する。
【０２３１】
細胞ミトコンドリアに対するゴッシポールの効果を、いくつかの方法によって試験する。2つの最も重要なアッセイは、シトクロムc放出および空隙形成アッセイである。細胞を、インヒビターで24〜48時間治療し、いくらか修正したR．M．Kluckら、Science、275、1132〜1136、1997に記載のように細胞分画を行う。簡単に述べれば、細胞を採取し、氷冷PBSで1回洗浄し、1ml氷冷緩衝液C（10mM Hepes-KOH（pH7.4）、0.42M NaCl、2.5％（v/v）グリセロール、1.5mM MgCl2、0.5mM EDTAナトリウム、0.5mM EGTA、1mMジチオスレイトール）およびプロテアーゼインヒビター混合物（PIM）に再懸濁する。細胞懸濁液を、氷上で22ゲージニードルに15回通すことによってホモジナイズする。ホモジネートを、4℃で10分間750gで2回遠心分離して核を除去する。核後上清を、10,000gにて4℃で15分間遠心分離し、得られたミトコンドリア富化ペレットを、100ml緩衝液C＋PIM（冷）に再懸濁する。ミトコンドリア後上清を、10,000gにて4℃で1時間遠心分離して膜夾雑物を除去し、得られた上清（可溶性タンパク質）を、細部質ゾルのシトクロムc放出検出に使用し、ペレットはミトコンドリア膜（重膜タンパク質）部分である。可溶性画分のタンパク質および同量の重膜タンパク質を、SDS-PAGEに供し、シトクロムcに対する抗体（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）、電圧依存性アニオンチャネル（VDAC）（Calbiochem、La Jolla、CA）、Smac、およびAIF（アポトーシス誘導因子）（Santa Cruz Bitoechnology、Santa Cruz、CA）を使用したウェスタンブロットによって分析する。これは、3つのミトコンドリア経路（cyto-c放出、Smac放出、およびAIF放出）により細胞のゴッシポール化合物での治療後のアポトーシスシグナル伝達を決定する。
【０２３２】
カスパーゼの活性化を、PBS処置細胞の回収および洗浄によって決定し、処置後25mM HEPES（pH7.5）、5mM MgCl2、5mM EDTA、5mM ジチオチオン、2mMフェニルメタンスルホニルフルオリド、10g/mLペプスタチンA、および10g/mLロイペプシン中に懸濁する。治療した細胞を溶解する。細胞溶解物を、12000xgでの4℃で20分間の遠心分離によって明澄化する。上清中のカスパーゼ-1、-2、-3、-6、-8、および-9活性を、蛍光発光CaspACEアッセイシステム（Promega Corp．、Madison、WI）によって決定する。簡単に述べれば、ビシンコニン酸アッセイ（Promega Corp．）によって決定した50mgの全タンパク質を、50mMの基質Ac-YVAD-AMC、Ac-VDVAD-AMC、Ac-DEVD-AMC、Ac-VEID-AMC、Ac-IETD-AMC、またはAc-LEHD-AMCと30℃で1時間インキュベートする。メチルクマリル-7-アミン（AMC）の放出を、G．Deneckerら、Cell Mol．Life Sci．、58、356〜370、2001およびV．M．Kolenkoら、Apoptosis、5、17〜20、2000に従って蛍光分光計（Hitachi F-4500）を使用して360nmの励起および460nmの放射によって測定する。
【０２３３】
標準的なカスパーゼインヒビターアッセイを使用したゴッシポール化合物の活性に対するカスパーゼインヒビター（例えば、Z-VAD-FMK（非特異的）、Z-DEVD-FMK、カスパーゼ-3、-6、-7、-8、および-10ならびにZ-LEHD-FMK、カスパーゼ-9）の効果。これら全てのカスパーゼインヒビターは、市販されている（Enzyme System Products、Livermore、CA）。
【０２３４】
実施例8：細胞生存アッセイ
細胞を、24または96ウェルプレートに播種し、培地で2〜10倍に希釈したゴッシポール化合物を調製する。細胞生存度の阻害を、細胞のゴッシポール化合物での24時間の治療によって決定し、トリパンブルーアッセイによって決定する。細胞成長阻害を、細胞のインヒビターとの3〜6日間の処理によって決定し、MTTアッセイによって決定する。
【０２３５】
MTTアッセイは、迅速、正確、および信頼のおける細胞生存度測定法である。MTTアッセイは、Mosmann（Mosmann、J．Immunol．Meth．、65、55、1983）によって最初に開発された。これは毒性の結果を得るために多くの研究所で使用されている単純な比色アッセイである。（例えば、Kuhlmannら、Arch．Toxicol．、72、536、1998を参照のこと）。簡単に述べれば、ミトコンドリアは、細胞に十分なエネルギーを供給するためにATPを産生する。これを行うために、ミトコンドリアは、ピルビン酸を代謝してアセチルCoAを産生する。ミトコンドリア内で、アセチルCoAはトリカルボン酸サイクルにおいて種々の酵素と反応し、その後ATPが得られる。MTTアッセイで特に有用な酵素の1つはコハク酸デヒドロゲナーゼである。MTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、コハク酸デヒドロゲナーゼによって切断されて紫色のホルマザン生成物が形成される黄色の基質である。色素の変化により、ミトコンドリア機能の変化を同定する。非ウイルス細胞はホルマザンを形成できないので、生成量は、生きている細胞の量に直接相関する。540nmでの吸光度を使用して、ホルマザン生成物の量を測定する。
【０２３６】
動物の生存条件を推定するために、インビトロ試験の結果をインビボ毒性試験と比較することができる。典型的には、単回用量の物質由来の急性の毒性を評価する。いくつかの態様では、毒性の任意の徴候（体温の上昇、呼吸困難、死など）について動物を14日間モニターする。従来的には、急性毒性の基準は、半数致死用量（LD50）であり、これは治療集団の半数が死亡すると予想される用量である。制御された条件下での試験動物の幾何学的な一連の用量への曝露によってこの用量が決定される。他の試験には、14日間以内のゴッシポール化合物（または1つまたは複数の従来の抗癌薬）の反復投与に対する動物の応答を測定する亜急性毒性試験が含まれる。亜慢性毒性試験は、90日間の反復投与試験を含む。慢性毒性試験は、亜慢性試験に類似しているが、90日を超えて試験し得る。一定の組織に応答する毒性を決定するために、インビボ試験を行うことができる。例えば、本発明のいくつかの態様では、腫瘍毒性（すなわち、腫瘍組織の生存度に対する本発明の組成物の効果）を決定する（例えば、腫瘍組織のサイズおよび／または成長の検出による）。
【０２３７】
インヒビターでの細胞の治療後、細胞形態学を定量的に評価して、細胞膨張、核膨張、膜の気泡化、空胞変性、およびアポトーシス性身体形成などのアポトーシスに関する特徴を決定する。
【０２３８】
いくつかの態様では、アポトーシスのDNAレベルの検出を、TUNELアッセイを使用したDNA断片化の検出によって行う。細胞がアポトーシスを引き起こしている場合、アポトーシスエンドヌクレアーゼは、古典的なDNAラダーの産生によって細胞DNAに影響を与えるだけでなく、これらのDNAフラグメントの末端で遊離の3'-OH基を作製する。分子生物学ベースの技術、末端標識技術、組織化学的技術、または細胞化学技術を使用してアポトーシスを検出可能なTdT-FragFLTM DNA断片化キット（Oncogene、Boston、MA）によってこれらの基を末端標識する。このアッセイの合理性は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）がアポトーシスシグナルに応答して作製されたDNAフラグメントの露呈した3'-OH末端に結合してビオチン標識および非標識デオキシヌクレオチドの付加を触媒することである。ビオチン化ヌクレオチドを、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合物を使用して検出する。ジアミノベンジジンは、標識サンプルと反応して、DNA断片化部位で不溶性着色基質を作製する。（例えば、L．Lagneauxら、Br．J．Haematol．、112、344〜352、2001およびK．Kitamura、Leukemia、14、1743〜1750、2000を参照のこと）。
【０２３９】
別の態様では、核レベル検出法（例えば、蛍光色素hoechst 33258おおびヨウ化プロピジウム染色）を使用して、処置細胞におけるアポトーシスの徴候を定量した。アポトーシスを引き起こした細胞の核クロマチンの形態学的変化を、2.5μg/mlビスベンズイミド Hoechst33258フルオロフォア（Calbiochem、LaJolla、CA）での染色およびその後の蛍光顕微鏡での試験によって検出した。いくつかの実験では、アポトーシス細胞と壊死細胞とを区別するために、細胞をヨウ化プロピジウム（PI、2.5μg/ml）およびHoechst33258（2.5μg/ml）で二重染色した。インタクトな青色の核、濃縮／断片化された青色核、濃縮／断片化されたピンク色の核、およびインタクトなピンク色の核は、それぞれ生存、初期アポトーシス、後期アポトーシス、および壊死細胞であった。（例えば、B．R．Gastmanら、Cancer Res．、60、6811〜6817、2000およびN．Hail Jr．および R．Lotan，R．、Cancer Epidemiol．Biomarkers Prev．、9、1293〜1301、2000を参照のこと）
【０２４０】
なおさらなる態様では、本発明は、フローサイトメトリーによるアポトーシス事象の細胞レベル検出を使用する。アポトーシスを引き起こした細胞を、488nmのレーザーラインを備えたFACSCAN（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）を使用したフローサイトメトリーによって検出し、Cell Questソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して分析した。細胞の外側に露呈したホスファチジルセリン（アポトーシスの主な特徴の1つ）を、TACSTM Annexin V-FITCキット（Trevigen、Gaithersburg、MD）によって決定する。Annexin V-FITC蛍光を、FL-1中で検出し、ヨウ化プロピジウムをFL-2中で検出する。（Hail Jr．および R．Lotan、R．、Cancer Epidmiol．Biomarkers Prev．、9、1293〜1301、2000）。
【０２４１】
実施例9：軟アガロースにおけるコロニー形成
軟寒天コロニー形成アッセイを使用して、癌細胞の形質転換能力を直接測定する。このアッセイは、インビボ腫瘍形成性に十分に相関することが公知である。
【０２４２】
以前に、Bcl-2アンチセンスG3139のみで細胞増殖を阻害する場合、より良好な結果を得るために化学療法薬での併用治療が意図されることが報告された。併用治療を使用して実験を行って、公知の化学療法薬と組み合わせてBcl-2インヒビターの細胞増殖のアポトーシス効果または阻害を評価する。好ましい態様では、これらの結果を使用して、相乗効果薬剤の組み合わせを選択する。
【０２４３】
実施例10：インビボ抗腫瘍活性
予備インビボ研究は、ゴッシポールが潜在的なBcl-XLインヒビターであり、単独およびさらなる従来の抗癌薬（例えば、ドセタキセル）と組み合わせて有意な抗腫瘍活性を示すことを示した。本発明の好ましい態様は、ヒト癌異種移植片モデルを使用したインビボでの抗腫瘍有効性および選択性研究を提供する。
【０２４４】
ゴッシポール治療の至適用量計画をデザインするために、研究は、最初にヒト乳癌細胞株MDA-231（クローン2LMP）を使用し、その後MDA-435（LCC6）およびT47Dなどのさらなる腫瘍異種移植片モデルを使用する。MDA-231は、Bcl-2およびBcl-XLの両方を高レベルで発現し、MDA-435はBcl-2を高レベルで発現するが、Bcl-XLを低レベルで発現し、T47DはBcl-2を低レベルで発現するが、Bcl-XLを高レベルで発現する。試験した7つ全ての乳癌細胞株のうち、Bcl-2およびBcl-XLの両方の発現が低いものは無かった。しかし、ヒト前立腺DU-145マウス異種移植モデルは、Bcl-2およびBcl-XLを共に低レベルで発現するので、いくつかの態様では、ゴッシポールおよびゴッシポール誘導体の特異性を試験するための負のコントロールである。
【０２４５】
MDA-231モデルでは、一連の総括的用量および計画の調査を行って以下を決定する。1）統計的信頼レベルが95％のコントロールと比較して50％の腫瘍成長の阻害として定義した最小活性用量；2）腫瘍成長を阻害する一方で25％を超える重量の減少によって定義される毒性を起こさない最適な投与計画；3）巨大腫瘍（2,000mm3超）に対するゴッシポールの効果4；罹患率または死亡率（例えば、体重の減少）を増加させること無くコントロール群のマウスにどのくらいの期間ゴッシポールを投与することができるか）。
【０２４６】
至適な用量および計画の同定後、少なくとも1つのさらなる従来の化学療法薬（1）ドキソルビシン（4mg/kg）、2）5-FU（10mg/kg）、3）VP-16/エトポシド（40mg/kg）、4）シクロホスファミド（100mg/kg）、5）シスプラチン（10mg/kg）が含まれるが、これらに限定されない）との併用療法の試験を行う。正のコントロールとして、タキソテアを7.5mg/kgの用量で使用する。コントロール群マウスは治療を行わないか賦形剤を与える。統計有意性を達成するために、併用レジメで群あたり最少で10匹のマウスを使用する。
【０２４７】
全試験のために、マウスを任意抽出し、無血清培地で調製した1〜5×106細胞を脂肪塊に注射する。動物を治療期間中各週2回測定および秤量し、その後さらに4〜6週間1週間に2回測定する。脂肪または最後の屠殺時に各動物の総目視剖検を行う。
【０２４８】
組織および細胞中のアポトーシスを検出するために、組織中のアポトーシス率を、TUNEL法（ターミナルデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ［TdT］媒介dUTP-ジゴキシゲニンニック末端標識）を使用して決定する。この方法は、非常に感度が高く、非常に少ないアポトーシス細胞をインサイチューで決定可能である。（Y．Gavrieliら、J．Cell Biol．、119、493〜501、1992およびM．Dowsettら、Cytometry、32、291〜300、1998を参照のこと）。パラフィン包埋組織を切断し、標識緩衝液中でスライドを5分間インキュベートし、その後加湿チャンバー中でTdT、dNTP混合物、およびMg＋＋を含む標識緩衝液と共にインキュベートする。ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを、各サンプルに10分間アプライし、洗浄し、メチルグリーンまたはヘマトキシリンで対比染色する。40倍の光学顕微鏡で認められたアポトーシス細胞数を全細胞数で割る計算によってアポトーシス率を計算し、％で示す。
【０２４９】
実施例11：ゴッシポールとドセタキセルとの間の薬物相互作用
エリスロマイシン乳癌試験（ERMBT）（CYP3A4代謝の表現型試験）に対するゴッシポールのみの効果を、ベースラインでのベースラインERMBTレベルおよびゴッシポールでの1週間の予備治療後との比較によって評価する。（例えば、P．Watkins、Pharmacogenetics、4、171〜184、1994およびJ．Hirthら、Clin．Cancer Res．、6、1255〜1258、2000を参照のこと）。ERMBTにより、1時間あたりに発散された14Cの比率が測定され、通常、正常な分布を使用して起算する。（D．Wagner、Clin．Pharm．Therap．、64、129〜130、1998を参照のこと）。平均14C発散レベル／時を、標準的な（α＝0.05）両側ペアードt検定を使用して比較する。ベースライン平均14C発散/hについての以前の研究（J．Hirthら、Clin．Cancer Res．、6、1255〜1258、2000）の計算値（n＝21、平均＝2.41）、その標準偏差（SD＝1.08）、長期間のERMBT測定値の相関（r＝0.81））を使用し、各測定値での分散を予想して、30被験体由来のデータを使用した現在の研究の平均ERMBTレベルにおいて20％減少の検出力は96％であり（2.41〜1.93）、15％減少の検出力は81％である（2.41〜2.05）。平均、標準偏差、ERMBT値の範囲を、ペアードt検定の有意性と共に集計および報告する。
【０２５０】
実施例12：患者サンプルにおけるドセタキセルの薬物動態学による説明
最適なサンプリングストラテジーを使用してゴッシポールと組み合わせて治療した場合のドセタキセルの薬物動態学による説明のために採血する。（P．Bailleら、Clin．Cancer Res．、3、1535〜1538、1997を参照のこと）。ドセタキセルの注入終了（EOI）前、EOIから0.25、0.75、3.00、6.50、および24時間後に直接採血する。全サンプルを同時にアッセイする。Bayesianの基準を使用して、NONMEMソフトウェア（S．L．Beal および L．B．Shener、「Nonlinear Mixed Effects Model Users Guides」（San Francisco、CA、NONMEM Project Group、University of California、 San Francisco）、1999）を使用してドセタキセルのみについて以前に評価した測定した薬物レベルおよび集団薬物動態学パラメータ（R．Brunoら、J．Clin．Oncol．、16、187〜196、1998を参照のこと）に基づいたドセタキセル血漿濃度曲線下面積を計算する。クリアランス（CL）を、非線形混合効果モデルの適合によって直接評価する。（R．Brunoら、J．Clin．Oncol．、16、187〜196、1998）。AUCを、用量およびクリアランスの関数として計算し、AUC＝用量/CLと定義する。ベースラインおよび1週間のゴッシポール前処理後由来のERMBT値を、クリアランスに対して個別にプロットする。最小二乗回帰推定法を使用して、デセタキセルCLとERMBTまたは天然のERMBTの対数との間の関係を定義する。単一の薬剤投与に対するゴッシポールと組み合わせて投与した場合のドセタキセルCLにおける任意の相違を説明するために、単一治療ドセタキセルCLについての以前に公開された値（J．Hirthら、Clin．Cancer Res．、6、1255〜1258（2000））と共に評価した勾配を示す。
【０２５１】
実施例13：患者サンプルにおけるBcl-2ファミリータンパク質の発現
パラフィンブロックから回収した組織サンプルにおけるBcl-2およびBcl-XLの発現を、標準的な免疫組織化学（IHC）アッセイ法を使用してアッセイする。これらのマーカーを発現する患者の比率を報告するために、IHCの結果を2つに分けて集計する。χ二乗統計およびフィッシャーの直説法を行って、得られた表の予想細胞数のサイズに依存して、発現と抗腫瘍応答との間の関係を評価する。
【０２５２】
実施例14：末梢血リンパ球研究
研究治療前の研究関係者から採取した血液サンプル、8日目（1週間のゴッシポール前処理後）、および9週目（ゴッシポール＋ドセタキセルの1サイクル終了後）を、末梢血リンパ球（PBL）および循環上皮細胞（CEC）を含む調査研究のために使用する。蛍光標示式細胞分取器（FACS）を使用して、PBLを、ゴッシポール投与前後のBcl-2およびBcl-XLの発現について特徴付ける。発現およびその標準偏差を使用したPBLの平均数を、各測定点で報告する。以前に記載の免疫磁性分離法を使用して（T．Walkerら、Proc．Amer．Soc．Clin．Oncology、19、54b、2001を参照のこと）、認められたCECの実行可能性を各患者で決定する。各測定点での患者についての採取した10ml血液あたりのCECの平均数およびその標準偏差を報告する。
【０２５３】
上記明細書中で言及した全ての刊行物および特許は、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の記載の方法および系の種々の修正形態および変形形態は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は特に好ましい態様に関して記載しているが、特許請求の範囲に記載の本発明はこのような特定の態様に過度に制限されないと理解すべきである。実際、関連分野の当業者に自明の本発明の記載の実施様式の種々の修正形態は、以下の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】Bcl-2（配列番号：1）およびBcl-XL（配列番号：2）の配列アラインメントを示す図である。
【図２】Bak BH3ペプチドとの複合体における全Bcl-2構造のリボン図である。
【図３】ゴッシポールによるBak BH3ペプチドとBcl-2（Bcl-XL）との間の直接阻害を示す図である。
【図４】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図５Ａ】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図５Ｂ】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図６】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図７】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図８Ａ】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図８Ｂ】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図９】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図１０】ゴッシポール、ゴッシポロン、ならびにゴッシポールおよびゴッシポロンのシッフ塩基を示す図である（本発明の1つの態様での細胞ベースのアッセイの結果）。
【図１１】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図１２】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図１３】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図１４】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図１５Ａ】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図１５Ｂ】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図１６】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図１７】本発明の1つの態様における結合アッセイの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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