(57)【要約】本発明は、先天性の非特異的免疫系を刺激するための医薬の製造のためのタンパク質の使用に関し、上記タンパク質は、ａ）アネキシンＶもしくはそれに非常に類似する分子、またはｂ）アネキシンＶの有効なフラグメントもしくはそれに非常に類似する分子を含む。
2005505567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
先天性の非特異的免疫系を刺激するための医薬の製造のためのタンパク質の使用であって、前記タンパク質は、
ａ）アネキシンＶもしくはそれに非常に類似する分子、または
ｂ）アネキシンＶの有効なフラグメントもしくはそれに非常に類似する分子を含む、使用。
【請求項２】
前記タンパク質はホスファチジルセリンに結合する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対応するか、またはそのいずれかと少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０％、特に好ましくは、少なくとも７０％、非常に特に好ましくは、少なくとも８０％の割合で同一である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
アネキシンＶは、非ヒトアネキシンＶである、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記非ヒトアネキシンＶは、ニワトリアネキシンＶである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記免疫応答の刺激は、細胞外膜局所化ホスファチジルセリンの遮断、被覆、遮蔽、および／または除去によって引き起こされる、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記タンパク質は、細菌、ウイルス、寄生生物、または腫瘍と戦うために使用される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記タンパク質は、好ましくは、腫瘍治療において、腫瘍ワクチンのために、ウイルス治療において、特にレトロウイルス感染、レンチウイルス感染、梅毒トレポネーマ感染、シンドビスウイルス感染、トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）感染、およびＨＩＶ感染の処置のために、ならびにマラリア処置およびマラリア免疫のために、補助剤として使用される、請求項１〜７に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬はさらに、ヒト腫瘍細胞を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記腫瘍細胞は、アポトーシスを起こした腫瘍細胞および／または壊死した腫瘍細胞である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記アポトーシスおよび／または壊死は、前記腫瘍細胞をエキソビボまたはインビボで放射線照射することによって誘発される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記アポトーシスおよび／または壊死は、前記腫瘍細胞を細胞増殖抑制剤と接触させることによって誘発される、請求項１０または請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞は、前記タンパク質と接触される、請求項９〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
先天性の非特異的免疫系をタンパク質で刺激するための医薬であって、
前記タンパク質は、
ａ１）アネキシンＶもしくはそれに非常に類似する分子、または
ａ２）アネキシンＶの有効なフラグメントもしくはそれに非常に類似する分子、および
ｂｂ）アポトーシスを起こした腫瘍細胞および／または壊死した腫瘍細胞を含む、医薬。
【請求項１５】
前記タンパク質は、ホスファチジルセリンに結合する、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
前記タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対応するか、またはそのいずれかと少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０％、特に好ましくは、少なくとも７０％、非常に特に好ましくは、少なくとも８０％の割合で同一である、請求項１４または請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
アネキシンＶは、非ヒトアネキシンＶである、請求項１４〜１６のいずれかに記載の医薬。
【請求項１８】
前記非ヒトアネキシンＶは、ニワトリアネキシンＶである、請求項１７に記載の医薬。
【請求項１９】
ヒト腫瘍細胞もまた含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載の医薬。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞はアポトーシスを起こした腫瘍細胞および／または壊死した腫瘍細胞である、請求項１９に記載の医薬。
【請求項２１】
前記腫瘍細胞は、前記タンパク質と接触している、請求項１９または２０に記載の医薬。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれかに記載の医薬の製造方法であって、
アポトーシスを起こした腫瘍細胞および／または壊死した腫瘍細胞を、
ａ）アネキシンＶもしくはそれに非常に類似する分子、または
ｂ）アネキシンＶの有効なフラグメントもしくはそれに非常に類似する分子を含む、タンパク質と接触させる、方法。
【請求項２３】
前記タンパク質は、ホスファチジルセリンに結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列に対応するか、またはそのいずれかと少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０％、特に好ましくは、少なくとも７０％、非常に特に好ましくは、少なくとも８０％の割合で同一である、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アネキシンＶは、非ヒトアネキシンＶである、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記非ヒトアネキシンＶは、ニワトリアネキシンＶである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アポトーシスおよび／または壊死は、前記腫瘍細胞をエキソビボまたはインビボで放射線照射することによって誘発される、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記アポトーシスおよび／または壊死は、前記腫瘍細胞を細胞増殖抑制剤と接触させることによって誘発される、請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質は、大腸菌の形質転換株を介する発現によって製造され、次いで精製される、請求項２２〜請求項２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記大腸菌の形質転換株は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ｐＤＪ２−ＡｎＸＶは、発現プラスミドとして使用される、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
発現アネキシンＶの精製は、カラムクロマトグラフィーによって行われる、請求項２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記カラムクロマトグラフィーは、塩勾配を使用して行われる、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の製造のためのタンパク質の使用および先天性の非特異的免疫系を刺激するための医薬に関する。本発明はまた、上記医薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病理学的細胞死である壊死は、細胞器官および細胞自体の腫脹と関連する。細胞質膜は透過性になり、細胞の内容物が放出される。これとは対照的に、細胞膜は、プログラム化された細胞死であるアポトーシスの間、最初は無傷のままである。細胞は、それらの危険性を有する内容物が環境に放出される前に除去される。アポトーシスの初期の段階では、細胞は表面変化、例えば、細胞質膜の外側で炭化水素の修飾および陰イオン性リン脂質（特に、ホスファチジルセリン（ＰＳ））への曝露に供される。後者は、膜の外側から内側へとアミノリン脂質を特異的に輸送するＡＴＰ依存性アミノリン脂質転移酵素の下方調整によって引き起こされる。さらに、スクランブラーゼ（ｓｃｒａｍｂｌａｓｅ）として知られる非特異的脂質のフリップ部位が活性化され、これによりホスファチジルセリンのフリップフロップ機構の加速が引き起こされる。細胞質膜の外側に位置するホスファチジルセリンは、アポトーシスを起こした細胞の除去のための同定シグナルとして作用する。
【０００３】
アポトーシスを起こしたリンパ球をアネキシンＶ（ＡｘＶ）とプレインキュベーションすることにより、ネズミ腹膜マクロファージ、マウスＪ７７４細胞株のマクロファージ、および骨髄マクロファージによるアポトーシスを起こした細胞の吸収が効果的に遮断されることが知られている（非特許文献１）。さらに、アネキシンＶは、一般に、活性化および非活性化マクロファージの両方によるアポトーシスを起こした細胞の吸収をより強く阻害する。そのＣａ2+導管活性により、アネキシンＶはまた、ＣＥＭ細胞におけるアポトーシスを遅延させる。
【０００４】
アポトーシスを起こした細胞の除去は、通常、炎症も免疫反応も誘発しない。血漿に直接接触すると、アポトーシスを起こした細胞は、凝結促進を引き起こし得、そして特定の状況下では、炎症促進効果を引き起こし得る。しかし、アポトーシスを起こした細胞は、トロンボスポンジンを介して食細胞上のＣＤ３６と相互作用を起こすため、通常、単球／マクロファージに対しては、アポトーシスを起こした細胞の免疫調節効果が優勢である。
【０００５】
レクチン様分子（例えば、ビトロネクチンレセプター（ＣＤ５１／ＣＤ６１）、トロンボスポンジン、ＣＤ３６、およびＣＤ１４）は、アポトーシスを起こした細胞上の表面変化を認識するレセプターである。ＣＤ１４は、リンパ球の食細胞にとって、ならびに活性化または非活性化マクロファージを有する脂質対称性赤血球にとって必須であるように見える。
【０００６】
マクロファージによるアポトーシスを起こしたリンパ球の食作用は、ホスファチジル−Ｌ−セリン−リポソームによって立体特異的に阻害される。ホスファチジル−Ｌ−セリンの認識を担うレセプターは、ＴＧＦ−βおよびβ−グルカンで免疫することによって刺激したマクロファージによって産生される抗体によって規定される（非特許文献２）。アポトーシスを起こした細胞のこの認識のための他の重要なレセプターとしては、とりわけ、スカベンジャーレセプター、ＬＰＳレセプターＣＤ１４、トロンボスポンジンレセプターＣＤ３６、ビトロネクチンレセプターＣＤ５１／ＣＤ６１、補体レセプター、およびマクロシアリン（ｍａｃｒｏｓｉａｌｉｎ）ＣＤ６８が挙げられる。さらに、ペントラキシン（ｐｅｎｔｒａｘｉｎｅ）、コレクチン（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｅ）、異なる補体因子、β２−糖タンパク質、アネキシン、およびｇａｓ−６は、アダプタータンパク質として作用し得る。
【０００７】
アポトーシスを起こしたヒトＴ細胞を注射されたマウスは、生細胞を注射されたコントロールマウスと比較して、Ｔ細胞に対して顕著に減少した体細胞応答を示すこともまた知られている（非特許文献３）。アポトーシスを起こしたガン細胞での免疫は、生増殖遮断細胞と比較して、細胞障害性Ｔ細胞応答を劇的に減少させたこともまた、観察された（非特許文献４）。これは、アポトーシスを起こした細胞の飲み込み食作用は、効率的な抗原提示ならびにＴリンパ球およびＢリンパ球の活性化を導かないことを示す。マクロファージによるアポトーシスを起こした細胞の速い飲み込み食作用およびそれらの抗炎症応答は、樹状細胞による、アポトーシスを起こした細胞から生じる抗原の吸収および効率的な提示を阻害する可能性がある。アポトーシスを起こした細胞との接触後の単球／マクロファージによるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の産生とともに、これらの知見は、アポトーシスを起こした細胞を含有する癌ワクチンの効力の弱さを説明する。
【０００８】
非特許文献５から、アネキシンＶは、体細胞免疫応答を刺激することが知られている。この文献は、細胞性免疫応答または先天性の非特異的免疫系の刺激に関する情報を何ら含んでいない。
【非特許文献１】
Ｋｒａｈｌｉｎｇ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ６（１９９９），１８３−１８９
【非特許文献２】
Ｆａｄｏｋ，Ｖ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（６７８２）（２０００）、８５−９０
【非特許文献３】
Ｐｏｎｎｅｒ，Ｂ．Ｂ．ら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７（１９９８），３４３−３４７
【非特許文献４】
Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（１９９９），１３０−１３６
【非特許文献５】
Ｓｔａｃｈ  Ｃ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  （２０００）７，９１１−９１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上記現状技術による不利益を取り除くことである。特に、腫瘍、ウイルス、細菌、および寄生生物に対する使用および医薬を特定する。さらに、医薬の製造のための方法を特定する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この課題は、請求項１、請求項１４、および請求項２２の特徴によって解決される。本発明の有用な態様は、請求項２〜１３、請求項１５〜２１、および請求項２３〜３３の特徴により得られる。
【００１１】
本発明に従って、先天性の非特異的免疫系を刺激するための医薬の製造のためのタンパク質の使用が提供される。ここで、上記タンパク質は、ａ）アネキシンＶもしくはそれに非常に類似する分子、またはｂ）アネキシンＶの有効なフラグメントもしくはそれに非常に類似する分子を含む。
【００１２】
驚くべきことに、本発明により提供されるタンパク質を使用することにより、単球またはマクロファージの炎症促進性の応答を引き起こし、それによって、細胞性免疫の増大を引き起こすことが示された。使用されたタンパク質は、腫瘍、ウイルス、細菌、および寄生生物と戦うことに非常に適している。
【００１３】
本発明により提供されるタンパク質の効果は、アポトーシスを起こした細胞を、アネキシンＶを供給することにより変化させ、その結果、それらが先天性の非特異的免疫系、特に、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）およびマクロファージを活性化し得ることに明らかに基づいている。さらに、アネキシンＶの投与が、モノカインＴＮＫ−αの有効濃度を増大させる。モノカインＴＮＫ−αは、腹膜においてＮＫ細胞を収集するために特に重要である（Ｓｍｙｔｈ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９：１６１１−１６１９）。さらに、本発明により提供されるタンパク質の効果はまた、それがホスファチジルセリンに結合するという事実、およびその抗炎症力に特に基づいている。そのタンパク質のこの機能は、アネキシンＶが関与するときに実現されるだけではない。そのタンパク質がアネキシンＶに類似する分子、またはアネキシンＶの有効なフラグメントもしくはそのフラグメントに非常に類似する分子を含んでいるのみのときでさえも実現される。そのフラグメントは、ホスファチジルセリンに結合し、そして炎症促進性の細胞性免疫応答の刺激に寄与するときに、特に「有効」である。「類似する分子」という用語は、特にホスファチジルセリンに結合し、かつアネキシンＶと一定の同一性を有するような分子を意味する。
【００１４】
１つの実施形態によれば、上記タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列に対応し得るか、またはそれらに少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０％、特に好ましくは、少なくとも７０％、非常に特に好ましくは、少なくとも８０％の割合で同一であり得る。その同一性の決定は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２の方法に従って行われ得る。
【００１５】
「同一性」という用語は、本発明の場合、２つの核酸配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。
【００１６】
配列番号２のアミノ酸配列に関して、これは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端欠失変異であり、３位から１０位までの８個のアミノ酸（Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒを意味する）を欠失している。
【００１７】
アネキシンＶは、非ヒトアネキシンＶであり、好ましくは、ニワトリアネキシンＶであることが有用である。ニワトリアネキシンＶのアミノ酸配列と、ヒトアネキシンＶとの比較により、両方のタンパク質は７８．２％同一であることが示される。ニワトリアネキシンＶは、理論上の等電点（ｐＩ）５．６を有し、これに対して、ヒトアネキシンＶは、理論上の等電点４．９４を有する。ヒトアネキシンＶの配列は、「ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ」データベースにおいてアクセス番号Ｐ０８７５６のもとで呼び出し得る。両方のアネキシンは、動物モデルにおいて免疫原である。
【００１８】
免疫応答の刺激は、細胞外膜局在化ホスファチジルセリンの遮断、被覆、遮蔽、および／または除去によって引き起こされ得る。よって、上記タンパク質は、細菌、ウイルス、寄生生物、または腫瘍と戦うために有用に使用され得る。好ましくは、そのタンパク質は、補助剤として使用される。これに関して、腫瘍治療において、腫瘍ワクチンのために、ウイルス治療において、特にレトロウイルス感染、レンチウイルス感染、梅毒トレポネーマ感染、シンドビスウイルス感染、トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）感染、およびＨＩＶ感染の処置のために、ならびにマラリアの処置およびマラリア免疫のために、好ましく、使用され得る。
【００１９】
この物質に加えて、上記医薬はまた、ヒト腫瘍細胞を含み得、ここで、その腫瘍細胞は、アポトーシスを起こした腫瘍細胞および／または壊死した腫瘍細胞であり得る。腫瘍細胞のアポトーシスおよび／または壊死は、自発的に生じ得るか、または誘導されたものであり得る。アポトーシスおよび／もしくは壊死を誘発するものとして、腫瘍細胞をエキソビボまたはインビボで放射線照射すること、または腫瘍細胞を細胞増殖抑制剤と接触させることが考慮され得る。これに関して、Ｈ2Ｏ2またはスタウロスポリンのような化学物質、副腎皮質ステロイドのような医薬、ドキロルビシン、シスプラチン、もしくはヒドロキシウレアのような化学療法剤、ＵＶＢおよびＵＶＣ照射、ならびにβ、γ、またはＸ線が、特に適している。好ましくは、アポトーシスを起こした腫瘍細胞および／または壊死した腫瘍細胞は、その物質と接触させられる。
【００２０】
さらに、本発明に従って、先天性の非特異的免疫系をタンパク質で刺激するための医薬が提供され、これは、ａ１）アネキシンＶもしくはそれに非常に類似する分子、またはａ２）アネキシンＶの有効なフラグメントもしくはそれに非常に類似する分子、ならびにｂｂ）アポトーシスを起こした腫瘍細胞および／または壊死した腫瘍細胞を含む。
【００２１】
有利な実施形態について、前述の説明が参照される。そこで言及した特徴もまた、同様にして医薬の実施形態になり得る。
【００２２】
さらに、本発明にしたがって、本発明によって提供される医薬の製造のための方法が提供され、その方法では、アポトーシスを起こした腫瘍細胞および／または壊死した腫瘍細胞は、ａ）アネキシンＶまたはそれに非常に類似する分子、もしくはｂ）アネキシンＶの有効なフラグメントまたはそれに非常に類似する分子、を含むタンパク質と接触させられる。
【００２３】
有利な実施形態について、前述の説明が参照される。そこで特定した特徴もまた、上記方法の実施形態のために使用され得る。
【００２４】
この方法において使用するタンパク質は、好ましくは、大腸菌の形質転換株を介する発現によって製造され、次いで、精製される。好ましくは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株が使用される。使用される大腸菌の株は、ニワトリアネキシンＶまたはその有効なフラグメントを発現し得る発現プラスミドで形質転換され得る。例えば、発現プラスミドは、ｇｅｎ発現ニワトリアネキシンＶに加えて、ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモーターおよび抗生物質耐性カセットを含むｐＤＪ２−ＡｎＸＶである。カナマイシンは、好ましくは、形質転換されていない細菌を形質転換された細菌から分離するための抗生物質として使用される。
【００２５】
培養培地中での培養後のニワトリアネキシンＶを含有する大腸菌の形質転換株を使用して得られた細胞は、緩衝液中で破壊される。このようにして得られたニワトリアネキシンＶを含んだ溶液を、塩勾配（塩化ナトリウム勾配が有用であることが示されている）を使用するカラムクロマトグラフィーで精製する。物質は、９５％を超える純度で得られる。
【００２６】
ニワトリアネキシンＶまたはその有効なフラグメントが上記物質としての適合するか否かは、この物質を用いてホスファチジルセリンを遮蔽することによって、アポトーシスを起こした細胞および／または壊死した細胞の炎症促進性の効果を引き起こし、したがって、アポトーシスを起こした細胞に対する細胞性免疫応答を支持するという判定に基づく。ニワトリアネキシンＶは、自己または同系のアポトーシスを起こした細胞の免疫原性を有意に増大する。したがって、それは、アポトーシスを起こした細胞を含有するワクチンの効力を増大させるのに適している。このことは、細胞がワクチンの注射の前に放射線照射されたときに特に重要である。ニワトリアネキシンＶという物質を使用しなければ、これらの細胞の免疫原性は低い。なぜなら、アポトーシスを起こした細胞を吸収することで、ヒト単球／マクロファージの抗炎症性反応を引き起こすからである。その細胞がニワトリアネキシンＶで処置されると、このアポトーシスを起こした細胞および／または壊死した細胞のこの抗炎症性効果が減少し、それらの免疫原性は有意に増大する。
【００２７】
本発明により提供されるタンパク質は、ホスファチジルセリン提示細胞の抗炎症効果を遮断するために使用され得る。さらに、このタンパク質は、細胞外、好ましくは、膜局在化のホスファチジルセリンの遮断、被覆、遮蔽、および／または除去を通じて免疫刺激を引き起こし得る。よって、このタンパク質は、細胞性免疫応答を調節するために使用され得る。
【００２８】
ホスファチジルセリン提示細胞の抗炎症効果の遮断のために使用される重要な領域は、これに起因する特異的な「補助剤効果」である。抗炎症の作用要素を遮断した後、ホスファチジルセリンを有する細胞は、著しく増大した免疫応答を引き起こす炎症促進性の免疫刺激性代替経路を介してプロセスされる。この「補助剤効果」は、最も広範な適用領域（例えば、ヒトの医療において）に使用され得る。一方、これによって腫瘍ワクチンの免疫原性が増大され得るのは、これらが放射線照射され、それによって、大部分がアポトーシスを起こした腫瘍細胞からなる場合である。さらに、治療的な理由から細胞増殖抑制剤で処置されたか、またはインサイチュ放射線照射されたような腫瘍細胞に対しては、細胞性免疫応答を得ることが可能である。この場合、腫瘍特異的細胞性免疫応答は、残存する腫瘍塊の除去の間の治療の成功を増大する。また、ウイルス（例えば、ホスファチジルセリンを曝露する被覆されたウイルス）感染の処置とともに、ホスファチジルセリン依存性抗炎症効果を遮断することにより、特異的な免疫刺激を引き起こす。レンチウイルスおよびＨＩＶによる感染の処置は、この意味で特に重要な例と見なされなければならない。細胞に「知られないうちに」進行するホスファチジルセリン依存性のウイルスの侵襲は、長寿の単球／マクロファージプールにおいてウイルス耐性を引き起こす。ウイルス耐性は、いくぶん長い潜在期間の後に、ほとんどすべての感染された細胞において死を引き起こす。ニワトリアネキシンＶは、炎症性、貪食性の、アポトーシスを起こした材料が、食細胞において「レスピラトリーバースト」を誘発し、それによって、ウイルスゲノムを破壊することから、ＨＩＶ感染者の処置に適している。
【００２９】
これは、同様に、ホスファチジルセリン提示細菌（例えば、梅毒トレポネーマ）の感染、またはホスファチジルセリンの感染宿主細胞（例えば、シンドビスウイルス、熱帯熱マラリア原虫、トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ））に対する曝露を引き起こす感染および寄生生物病の処置にもあてはまる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
次に、本発明を、図面に基づいてより詳細に説明する。
【００３１】
（Ａ．ニワトリアネキシンＶの発現および精製）
（Ａ１．ニワトリアネキシンＶの発現）
ニワトリアネキシンＶ（ｃＡｎｘＶ）の発現のために、ｐＤＪ２−ＡｎｘＶを、発現プラスミドとして使用した。これは、ｃＡｎｘＶコーディング遺伝子以外に、ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモーターおよびカナマイシン耐性カセットを含有する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、その発現プラスミドで形質転換し、そして発現キネティクスを行った。２ｘＹＴおよび５０ｍｇ／ｌカナマイシンを、このための培養培地として使用した。
【００３２】
ｃＡｎｘＶを製造するために、１００ｍｌ予備培養物に、新たに形質転換させたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を注入し、３７℃で８時間振盪した。５ｌの主要培養物を、５ｍｌの予備培養物と混合し、３７℃で１６〜２０時間振盪した。ＩＰＴＧは加えなかった。なぜなら、この場合、同じ発現収量を、誘導ありまたはなしで得たからである。次いで、その細胞を遠心分離により収集した。この細胞の湿潤質量は、１６〜２１ｇであった。発現キネティクスを図１に示す。その発現キネティクスは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）もまた、ＩＰＴＧを誘導せずに使用された培地においてｃＡｎｘＶの発現のために適していることを示した。
【００３３】
（Ａ２．ニワトリアネキシンＶの精製）
番号１に従って得られた細胞を、緩衝液Ａ１（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＣＬ１  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で再懸濁し、高圧（ｇａｕｌｉｎ）で分解した。その分解懸濁液の不溶性の成分を高速遠心分離によって除去した。このｃＡｎｘＶを含有する可溶性の上清を、緩衝液Ａ１（２５ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）中で平衡化したＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｉｓ−ｆｆカラム（カラム１）に適用した。目的のタンパク質の溶出を、ＮａＣｌの直線勾配で行った。ｃＡｎｘＶを含有する画分を混合し、そして緩衝液Ａ２（５０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５．６）によって透析した。そこ透析液を、Ａ２（６ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）中で平衡化させたリソースＳカラム（カラム２）に適用し、ｃＡｎｘＶをＮａＣｌの直線勾配で溶出した。ｃＡｎｘＶを含有するその組み合わせた画分を、限外濾過（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ、ＵＳＡ）によって濃縮し、そして１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラム（カラム２）に適用した。均一なｃＡｎｘＶを、カラムから溶出した。２０ｇの細胞（湿潤質量）から、３０ｍｇのｃＡｎｘＶを９５％を超える純度で単離した。図２は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、カラム１から３を使用して精製した結果を示す。
【００３４】
代替的に、明記したカラムの代わりとしては、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｉｓ  ＸＬが、カラム１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）の代わりに使用され得、ＳＰ−ｓｅｐｈａｓｏｓｉｓ  ＨＰは、カラム２（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）の代わりに使用され得、そして／あるいは、ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００  ＨＲは、カラム３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）の代わりに使用され得る。
【００３５】
代替的に、疎水性カラムが、カラム３によるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の代わりに使用され得る。この場合、カラム２から溶出するｃＡｎｘＶを含有する画分は一体化され、固体の硫安で１．５Mまで増大させられる。そのタンパク質溶液を、フェニルｓｅｐｈａｒｏｓｉｓ  ｆｆ−カラム（１５ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に適用し、ｃＡｎｘＶを、１．５〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線勾配によって溶出する。
【００３６】
（Ｂ．アネキシンＶで処置したアポトーシスを起こした腫瘍細胞によるマウスの免疫化）
（Ｂ１．マウスおよび腫瘍細胞）
６〜８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、ヨーロッパ共同体のガイドラインに従って、病原体を含まない動物実験施設に保持する。同系の（ｓｙｎｇｅｎｏｕｓ）Ｈ−２ｂリンパ腫株ＲＭＡは、Ａｎｇｅｌｏ  Ａ．Ｍａｎｆｒｅｄｉ（Ｈｏｓｐｉｔａｌｅ  Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ，２０１３２  Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）によって利用可能になった。Ｈ−２ｂ黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。その細胞株をマイコプラズマ感染について定期的に試験した。
【００３７】
（Ｂ２．細胞死）
ＲＭＡ細胞を、Ｂｅｌｌｏｎｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（１９９７）、５３９１−５３９９に記載されるように紫外線で照射し、次いで、１時間、３７℃で５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで処理し、洗浄した。ホスファチジルセリンの外在化を、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｌｔｅｒ  Ｏｃｃｈｉｅｎａ，Ｔｏｒｉｎｏ，Ｉｔａｌｙ）で着色することによって追跡した。細胞質膜のイオン密度を、ヨウ化プロピジウムを用いて決定した。細胞を、放射線照射の０、３、９、および１８時間後に分析した。アネキシンＶ結合の特異性を、漸増濃度（１５００ｍｇ／ｍｌ）の非標識アネキシンＶまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で放射線照射した細胞を処理することによって決定し、次いで、残存アネキシンＶ−フルオレセイン−イソチオ−シアナト結合をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）によって決定した。
【００３８】
（Ｂ３．マクロファージ）
マクロファージを、チオグリコレートの注射によって誘導した炎症性腹膜洗浄液からプラスチックへの接着によって単離した（Ｆａｄｏｋ，Ｖ．Ａ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（２０００）、８５−９０）。
【００３９】
（Ｂ４．放射線照射した腫瘍細胞との共培養後におけるマクロファージのサイトカイン放出の決定）
マクロファージを、異なる条件下で、照射した腫瘍細胞と共培養した。培養上清において、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βを、特定的な市販のＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて測定した。
【００４０】
（Ｂ５．免疫および治癒）
マウスの免疫化を、１、５、または１０×１０6個の照射されたＲＭＡ細胞を、足の母指球へ皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって行った。１００μｇ／ｍｌのニワトリアネキシンＶなし、またはありで、照射した細胞を、２０分間室温で、Ｃａ2+を含有する等張緩衝液中で予備インキュベートした。１５日目に、マウスの右側にブースター注射を与えた。３０日目に、免疫化の有効性を、２．５×１０4個の生ＲＭＡ細胞を反対側にｓ．ｃ．注射することによって試験した。そして、一週間に二回、それを触診によってチェックし、腫瘍が動物内で増大しているか否かを決定した。動物は、互いに垂直な２つの直径の平均値が２ｍｍよりも大きい場合、腫瘍陽性であると見なされた。腫瘍が１０ｍｍよりも大きく成長するか、潰瘍になった場合、その冒された動物を殺した。生ＲＭＡ細胞を注射した後１０週間以内に腫瘍が感じられない動物は、腫瘍陰性と判断された。次いで、これらの腫瘍を有さないマウスに、さらに２．５×１０4個のＲＭＡ細胞を反対側に注射し、防御の継続期間を試験した。抗腫瘍効果の特異性を、２．５×１０4個の同系Ｂ１６Ｆ１黒色腫細胞をｓ．ｃ．投与することによって試験した（Ｂｅｌｌｏｎｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（１９９７）、７８３−７８９）。樹立されたＲＭＡリンパ腫の処置における差異の効果を決定するために、２．５×１０4個の生ＲＭＡ細胞を、左側にｓ．ｃ．注射した。腫瘍を３日間成長させた後、その動物の反対側に、ニワトリアネキシンＶなし、もしくはありの１または５×１０6個の照射したＲＭＡ細胞で処置した（一週間に一回のワクチン接種を三週間）。腫瘍の成長は、上記のように判定した。
【００４１】
（Ｂ６．結果）
ネズミ腹膜マクロファージを、予めニワトリアネキシンＶで処理されたか、またはニワトリアネキシンＶで処理されていない、異なる量の放射能照射した腫瘍細胞（ｂＴＺ）（同系ＲＭＡ腫瘍細胞）とともにインキュベートした。２４時間後、その培養上清を収集し、サイトカインＴＮＧ−α、ＩＬ−１−β、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの放出を、ＥＬＩＳＡで測定した。図３は、５対１の比のｂＴＺ／Ｍｐｈでの試験の結果を示す。黒いバーは、ニワトリアネキシンＶで処理された照射された腫瘍細胞の結果を示す。白いバーは、ニワトリアネキシンＶで処理されていない照射された腫瘍細胞の結果を示す。下記の表１において、個々の測定値を再び要約する。
【表１】
2005505567.tif 000003
アポトーシスを起こした細胞をニワトリアネキシンＶで処理することにより、食細胞のサイトカインパターンが炎症側にシフトする。
【００４２】
ニワトリアネキシンＶで処理された照射された同系腫瘍細胞は、致死性の腫瘍用量を注射されたマウスを防御し、治癒させる。処置は、長期の特異的な抗腫瘍免疫を創り出す。
【００４３】
図４ａおよび図４ｂは、それぞれ、時間、および照射後にニワトリアネキシンＶあり、またはなしでインキュベートされた異なる量の照射された腫瘍細胞（ｂＴＺ）の注射に依存する腫瘍を含まない動物の割合を示す。図４ａおよびｂにおいて黒塗りの記号で示される結果は、ニワトリアネキシンＶで処理された照射された細胞に関する。白抜きの記号は、ニワトリアネキシンVなしで処理された照射された細胞の結果に関する。
【００４４】
図４ａは、マウスが、照射後に、ニワトリアネキシンＶありまたはなしでインキュベートされた照射された腫瘍細胞を注射した後に、生腫瘍細胞を注射された（ワクチン試行）試験の結果を示す。生存する動物について、生腫瘍細胞の注射を、０日目（１番目の矢印）および７２日目（２番目の矢印）に行った。
【００４５】
Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、以下のパターンに基づいて、右側に２回、皮下注射した。
【００４６】
ＰＢＳとともに
１×１０6個の照射した腫瘍細胞（ｂＴＺ）とともに
５×１０6個の照射した腫瘍細胞（ｂＴＺ）とともに
１×１０7個の照射した腫瘍細胞（ｂＴＺ）とともに
【００４７】
０日目に、最後にブースター注射した２週間後、２．５×１０4個の生ＲＭＡ腫瘍細胞を、マウスの反対側である左側に注射した。７２日目に、その注射を生存しているマウスについて繰り返した（矢印）。図４ａは、ニワトリアネキシンＶ（黒塗り三角）が、処理されていない、照射された腫瘍細胞（白三角）を用いて注射と比較して、すべてのグループにおいて明らかに腫瘍拒絶を増大させることを示している。
【００４８】
予め確立した腫瘍に対する効果を試験するために、２．５×１０4個の生ＲＮＡ腫瘍細胞を、Ｃ５７Ｂ１／６マウスの左側に皮下注射した。各コホートは、１０匹のマウスを含んでいた。４日後、１×１０6個または５×１０6個のいずれかの照射したＲＭＡ腫瘍細胞を、右側に注射した。この注射は、照射した細胞を、ニワトリアネキシンＶあり（塗りつぶした記号）か、またはなし（白抜きの記号）で処理した後に行った。図４ｂは、腫瘍を含まない動物の時間経過を示す。５×１０6個の腫瘍細胞の注射により、照射された腫瘍細胞のニワトリアネキシンＶを用いた処理は、それらの免疫原性を有意に増大し、それによって腫瘍の拒絶をもたらした。
【００４９】
図５に示すように、完全に防御されなかったマウスについては、照射された腫瘍細胞が注射前にニワトリアネキシンＶで処理された場合、腫瘍の潜在期間（図５ａ）および生存時間の両方が上昇した。
【００５０】
（Ｃ．ＳＣＩＤマウスのデータ）
（Ｃ１．目的）
先天性の非特異的免疫系に対するアポトーシスを起こした細胞のＡｘＶ処理の効果の決定
【００５１】
（Ｃ２．材料及び方法）
（Ｃ２．１．細胞）
ヒト形質細胞株ＩＮＡ−６を、形質細胞白血病の８０歳の患者の胸膜液から樹立した。それは単一細胞懸濁液として成長し、形質芽球の形態を示す。亜細胞株ＩＮＡ−６  Ｔｕｌは、ＳＣＩＤマウスにおける継代に由来する。元々の細胞株とは対照的に、ＩＮＡ−６  Ｔｕｌは、インターロイキン−６にかかわらず増殖し、ＳＣＩＤマウスにおける腹腔内（ｉ．ｐ．）注射後に、有意に速いと感じられ得る腫瘍を形成する（Ｂｕｒｇｅｒ，Ｒ．ら、（２００１）Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｊ．２：４２−５３）。
【００５２】
（Ｃ２．２．ＩＮＡ−６  Ｔｕｌ細胞におけるアポトーシスの誘導）
アポトーシスを起こしたＩＮＡ−６  Ｔｕｌ細胞の創出を、４０秒間のＵＶ照射およびその後の１２時間のさらなる培養によって行った。この用量で、細胞は、約９０％のアポトーシス率を示し、ここで、照射用量の増大は、わずかにとるに足らないほどにその率を変化させたにすぎない。
【００５３】
（Ｃ２．３．ＳＣＩＤマウス）
６週齢のＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｗｉｇａ  ＧｍｂＨ）のメス３０匹を実験に使用した。先天性の欠損により、ＳＣＩＤマウスは、成熟ＴおよびＢリンパ球の形態での機能的に特異的な免疫系を有さない。しかし、その動物の非特異的な免疫系は影響を受けない。ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）に存在するあらゆる活性を排除するために、その動物を、個々の線量２Ｇｙで全身ガンマ照射により照射した。
【００５４】
（Ｃ２．４．ＩＮＡ−６  Ｔｕｌでの接種）
照射の２４時間後、その動物の各々に、１ｍｌの培養培地（２０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０）中の２×１０7個の活性の（約９０％の活性率）ＩＮＡ−６  Ｔｕｌ細胞をｉ．ｐ．で注射した。
【００５５】
（Ｃ２．５．治療免疫）
腫瘍接種の２４時間後に、マウスを同じサイズの３つのグループに分けた。コントロールグループの動物は、各々、１ｍｌのＨａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）のｉ．ｐ．注射を受けた。第二のグループの動物は、各々、１ｍｌのＢＨＳＳを、２×１０7個のアポトーシスを起こしたＩＮＡ−６細胞とともに、ｉ．ｐ．で注射された。次いで、第三のグループの動物は、各々、１ｍｌのＨＢＳＳを、２×１０7個のアポトーシスを起こしたＩＮＡ−６  Ｔｕｌ細胞とともに注射された（ここで、その細胞は、ｉ．ｐ．投与前に、１００μｇのニワトリアネキシンＶとともに室温で３０分間インキュベートされた）。
【００５６】
（Ｃ２．６．データの統計学的分析）
データの統計学的分析を、ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．のソフトウェアパッケージＳＰＳＳ１０．０．７を用いて、Ｌｏｇ−Ｒａｎｋテストによって行った。
【００５７】
（Ｃ２．７．補助実験）
アネキシンのＩＮＡ−６  Ｔｕｌ細胞に対する直接的毒性効果を排除することができるように、増殖試験を行った。このために、１０4個のＩＮＡ−６  Ｔｕｌ細胞を、平底マイクロタイタープレートにおいて、小さなボウルの各々について、０．２ｍｌの培地（１０％  ウシ胎仔血清および２．５ｎｇ／ｍｌのヒト組み換えインターロイキン−６を含むＲＰＭＩ−１６４０）および異なる量のアネキシンＶ（６ｐｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）を７２時間インキュベートした。ここで、その細胞を、最後の６時間、１ボウルあたり１μＣｉの［3Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でパルスした。次いで、その細胞を収集し、βシンチレーションカウンターにおいて分析した。図８における値は、３つの実験値からのｃｐｍ（一分あたりのカウント）での平均「3Ｈ］チミジン取り込みを示し、エラーバーは単純標準偏差を示す。曲線は、アネキシンＶがＩＮＡ−６  Ｔｕｌ細胞の増殖に対して何らの効果もないことを明らかに示す。
【００５８】
（Ｃ３．動物研究の間の観察）
腫瘍接種の４８時間後、第二グループの動物、および主に第三グループの動物は、強い、一般的な病気の兆候（例えば、粗毛および体重減少）を示したが、一方、コントロールグループは、外面的には健康に見えた。腫瘍接種後３日目および５日目に、第三グループの動物が各１匹ずつ死に、腫瘍接種後１８日目に、第二グループの１匹の動物が死んだ。特定の死因は、判定できなかった。しかし、この早い時期に、それらの動物が誘導された骨髄腫疾患によって死亡したということは、かなりの確信をもって排除することができる。この理由により、第二グループおよび第三グループからの残りの９又は８匹の動物のみが、実験の分析において考慮された。疾患の最終段階にある動物については、さらなる実験を行う前に殺した。
【００５９】
（Ｃ４．結果）
接種の２９日目に、コントロールグループの１０匹の動物のうち７匹は、接種部位においてエンドウ豆サイズの腫瘍が現れた。第二グループについても同様の観察を行い、９匹の動物のうち７匹に明らかな腫瘍成長が現れた。驚くべきことに、この時には、アネキシンＶを負荷したアポトーシスを起こしたＩＮＡ−６  Ｔｕｌ細胞で処置した８匹の動物のいずれにおいても（グループ３）、腫瘍は判定され得なかった。グループ３とグループ２（ｐ＝０．０００１）またはコントロールグループ（ｐ＝０．００４）との間の腫瘍増殖に関するデータにおける差異は、統計学的に有意である（図９，表）。
【００６０】
腫瘍接種後の平均生存期間は、コントロールグループについて５４．８日である一方、第二グループのマウスは、平均５０．４日のわずかに短い生存期間を示した。対照的に、第三グループの８匹のマウスのうちの６匹の平均生存期間は、７１．３日と、明らかに高かった。さらに、第三グループの残りの２匹の動物は、以前に特定した観察期間（９５日）の後、さらに９日間生きた。腫瘍が現れるのが遅れた動物は、主に肝臓の浸潤および腹水の形成を示す。一方、初期に現れた腫瘍の成長は、大部分は局所的であった。グループ３とグループ２（ｐ＝０．０００４）またはコントロールグループ（ｐ＝０．００９５）との間の生存データにおける差異は、統計学的に有意である（図６、７、表）。
【００６１】
（Ｃ５．結論）
首尾よい腫瘍耐性において、特異的抗原に指向された細胞障害性Ｔ細胞に加えて、非特異的ＮＫ細胞が加わることは、一般的な知識である。
【００６２】
遺伝子的な欠陥に起因して、ＳＣＩＤマウスは、特異的な免疫系を有さず、それゆえ、機能的な細胞障害性Ｔ細胞も有さない。しかし、それらは、一酸化窒素代謝および／またはパーフォリンが引き起こす細胞障害性を介するそれらのマクロファージおよびＮＫ細胞の働きによって、腫瘍増殖を抑制することができる（Ｃｉｆｏｎｅ，Ｍ．Ｇ．，Ｕｌｉｓｓｅ，Ｓ．，およびＳａｎｔｏｎｉｎ，Ａ．（２００１）  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １（８）：１５１３−１５２４）。
【００６３】
これらのデータは、アネキシンを負荷したアポトーシスを起こした細胞の治療的投与が、ＳＣＩＤマウスにおいてヒト腫瘍の樹立を顕著に遅延させ得、したがって、生存期間を引き延ばし得ることを示している。
【００６４】
明らかに、アポトーシスを起こした細胞は、アネキシンを負荷することによって変化し、その結果、それらは、ＳＣＩＤマウスの機能的な非特異的免疫系（特に、ＮＫ細胞およびマクロファージ）を活性化し得る。
【００６５】
主として、アネキシンを負荷したアポトーシスを起こした細胞によるモノカインＴＮＦ−αの上方制御（図６，７）は、ここではＮＫ細胞の活性化を担い得る。ＴＮＦ−αは、腹膜においてＮＫ細胞を集めるのに特に重要であるので、ＴＮＦ−α欠損マウスは、ここでは欠損を示す（Ｓｍｙｔｈ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ９：  １６１１−１６１９）。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づく形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＢＥ３）におけるニワトリアネキシンＶの発現のキネティクスを示す図である。
【図２】形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）からのニワトリアネキシンＶの個々の精製工程のサンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図である。
【図３】ニワトリアネキシンＶで処理されたか、またはニワトリアネキシンＶで処理されていない放射能照射した腫瘍細胞でインキュベーションしたネズミ腹膜マクロファージに依存する分泌したサイトカインの関係を示すグラフである。
【図４ａ】時間、および放射能照射の後にニワトリアネキシンＶで処理されたか、または処理されていない放射能照射した異なる量の腫瘍細胞の注射に依存する腫瘍を含まない動物の割合を示すグラフである（ここで、動物は注射の前に生腫瘍細胞で処置された）。
【図４ｂ】時間、および照射後にニワトリアネキシンＶで処理されたかまたは処理されていない放射能照射された腫瘍細胞の注射に依存する腫瘍を含まない動物の割合を示すグラフである（ここで、その動物は、生腫瘍細胞を処理前に注射された）。
【図５ａ】照射された腫瘍細胞の用量およびアネキシンＶの投与に依存する腫瘍を拒絶しなかったマウスの腫瘍潜在期間を示すグラフである。
【図５ｂ】照射された腫瘍細胞の用量およびアネキシンＶの投与に依存する腫瘍を拒絶しないマウスの生存率を示すグラフである。
【図６】腫瘍接種後の継続時間に依存する腫瘍を有する動物の割合を示すグラフである。
【図７】腫瘍接種後の継続時間に依存する生存率の割合を示すグラフである。
【図８】ＡｘＶ濃度に依存するＩＮＡ６  ＴＵ１細胞の［3Ｈ］−チミジン吸収を示すグラフである。
【図９】動物群を試験した結果を要約する表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2005505567.tif 000059
【国際調査報告】
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