(57)【要約】ここに開示するのは、ポリペプチドをコードする核酸配列である。またポリペプチドならびに前記ポリペプチドの誘導体、変異体、突然変体またはフラグメントに免疫特異的に結合する抗体、ポリヌクレオチドまたは抗体を開示する。発明はさらに、これらの新規ヒト核酸、ポリペプチド、または抗体、またはそのフラグメントのいずれかに関係する障害の診断、処置または予防のための治療、診断および調査方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２ｎ(ｎは１〜４６の整数である)からなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２ｎ(ｎは１〜４６の整数である)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２ｎ(ｎは１〜４６の整数である)からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが、配列番号２ｎ(ｎは１〜４６の整数である)からなる群から選択されるアミノ酸配列において１または２以上の保存置換を含むアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項５】
当該ポリペプチドが天然に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドおよび担体を含む組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物を１つまたはそれ以上の容器内に含む、キット。
【請求項８】
ヒト疾患に付随する症候群を処置するための医薬の製造における治療剤の使用であって、該疾患が請求項１に記載のポリペプチドに付随する病理から選択され、ここで該治療剤が請求項１のポリペプチドを含む、使用。
【請求項９】
試料中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を測定する方法であって、その方法は：
(ａ)該試料を提供すること；
(ｂ)ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に該試料を導入すること；および
(ｃ)該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を測定し、それにより該試料中のポリペプチドの存在または量を測定すること
を含む、方法。
【請求項１０】
第１の哺乳動物対象中の請求項１に記載のポリペプチドの変化した発現レベルと付随した疾患の存在または素因を決定する方法であって、
ａ)第１の哺乳動物の対象由来の試料におけるポリペプチドの発現レベルを測定すること；および
ｂ)ステップ（a)の試料中の該ポリペプチドの発現を、該疾患または素因を有さないことが知られている第２の哺乳動物の対象由来の対照試料のポリペプチドの発現と比較することを含み、ここで対照試料に比較するときの第１の対象中のポリペプチドの発現レベルの変化は、疾患の存在または素因を示す、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する薬剤を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）該ポリペプチドを該薬剤に導入する、および
（ｂ）該薬剤が該ポリペプチドに結合するか決定すること
を含む方法。
【請求項１２】
該薬剤が細胞性受容体または下流エフェクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
病理の処置における使用のための潜在的治療剤の同定方法であって、ここで該病理は請求項１に記載のポリペプチドの異常発現または異常生理学的相互作用に関連し、該方法は、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを発現する、かつ該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を有する細胞を提供する、
（ｂ）細胞を、候補物質を含む組成物と接触させる、および
（ｃ）該物質が該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を変化させるかいなかを決定すること
を含み、ここで該物質の存在下で観察される変化が、もし細胞が該物質の不存在下で組成物に接触されるとき、観察されないならば、該物質は、潜在的治療剤として同定される、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドに付随する病理の活性または潜在性または素因の調節剤をスクリーニングする方法であって、当該方法は、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドに付随する病理の増加リスクにある試験動物に、試験化合物を投与する、
（ｂ）ステップ（ａ）の化合物を投与する後に、当該試験動物において当該ポリペプチドの活性を測定する、および
（ｃ）当該試験動物における当該ポリペプチドの活性を、当該ポリペプチドを投与されていない対照動物における当該ポリペプチドの活性と比較することを含み、ここで当該対照動物に対する当該試験動物における当該ポリペプチドの活性の変化が、該試験化合物が、請求項１に記載のポリペプチドに付随する病理の活性または潜在性または素因の調節剤であることを指摘する、方法。
【請求項１５】
当該試験動物が、試験タンパク質トランスジーンを発現し、または野生型試験動物に対して増加レベルのプロモーター制御下の、当該トランスジーンを発現する、組み換え体試験動物である、請求項１４に記載の方法であって、かつここで当該プロモーターが、当該トランスジーン本来の遺伝子プロモーターではない、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞試料を、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分量である当該ポリペプチドに結合する化合物と接触させることを含む方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドに付随する病理を処置または予防する方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを、そのような処置または予防が望まれる対象に、該対象の病理を処置または予防するのに十分量で、投与することを含む方法。
【請求項１８】
該対象がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物における病理学的状態を処置する方法であって、該哺乳動物に、該病理学的状態を緩和するのに十分である量のポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドは、配列番号２ｎ(ｎは１〜４６の整数である)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに少なくとも９５％同一である、アミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその生物学的活性フラグメントである、方法。
【請求項２０】
配列番号２ｎ−１(ｎは１〜４６の整数である)からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項２１】
該核酸分子が天然に存在する、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
該核酸分子が、配列番号２ｎ−１(ｎは１〜４６の整数である)からなる群から選択される核酸配列と、単一ヌクレオチドによって相違する核酸分子。
【請求項２３】
配列番号２ｎ(ｎは１〜４６の整数である)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟型をコードする単離核酸分子。
【請求項２４】
配列番号２ｎ−１(ｎは１〜４６の整数である)からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子。
【請求項２５】
当該核酸分子が、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または当該ヌクレオチド配列の相補物に、厳密条件下でハイブリダイズする、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項２０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
当該核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項２６に記載ののベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２９】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体。
【請求項３０】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
該抗体がヒト化抗体である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３２】
該抗体が十分にヒト抗体である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３３】
ポリペプチドの抗体に対する結合の該解離定数が、１ｘ１０−９Ｍより小さい、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３４】
該抗体がポリペプチドの活性を中和する、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３５】
ＮＯＶＸに付随する障害を処置または予防する方法であって、該方法は、そのような処置または予防が望まれる対象に、対象の病理を処置または予防するのに十分量の請求項２９に記載の抗体を投与することを含む方法。
【請求項３６】
該対象がヒトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
試料中の請求項２０に記載の核酸分子の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）当該試料を提供する、
（ｂ）当該試料を、当該核酸分子に結合するプローブに導入する、および
（ｃ）当該核酸分子に結合した当該プローブの存在または量を決定し、
それによって当該試料中の核酸分子の存在または量を決定することを含む方法。
【請求項３８】
核酸分子の存在または量が、細胞または細胞型についてのマーカーとして使用する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該細胞または細胞型が癌性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第一哺乳動物対象中の請求項２０に記載の核酸分子の変化した発現レベルに付随する疾患の存在または素因を決定する方法であって、
（ａ）第一哺乳動物対象からの試料中の核酸の発現のレベルを測定する、および
（ｂ）ステップ（ａ）の試料中の当該核酸の発現のレベルを、該疾患を有しないまたは素因がないのが既知である第二哺乳動物対象からの対象試料中に存在する核酸の発現のレベルと比較すること、
を含み、ここで、対象試料と比較したときの該第一対象における核酸の発現のレベルの変化が、疾患の存在または素因を指摘する、方法。
【請求項４１】
請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法であって、該方法はポリペプチドの発現につながる条件下で細胞を培養することを含み、ここで当該細胞が配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含む、方法。
【請求項４２】
該細胞が細菌細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
該細胞が昆虫細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
該細胞がコウボ細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
該細胞が哺乳動物細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
請求項２に記載のポリペプチドを生産する方法であって、該方法が該ポリペプチドの発現につながる条件下で細胞を培養することを含み、ここで当該細胞が配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含む、方法。
【請求項４７】
該細胞が細菌細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該細胞が昆虫細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
該細胞がコウボ細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
該細胞が哺乳動物細胞である、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ポリペプチドが、細胞、組織、器官または生物中の生化学的または生理学的応答に関する特徴的特性を有する、抗原性ポリペプチドに免疫特異的に結合する新規抗体に関する。新規ポリペプチドは、新規遺伝子の遺伝子産物であり、または、その特異的生物学的活性フラグメントまたは誘導体である。抗体の使用方法は、ポリペプチドの診断または予後アッセイのための手法、ならびに、種々の病理学的状態を処置する方法を包含する。
【０００２】
（背景技術）
真核細胞は、通常の条件下では細胞の維持および増殖を達成するために精妙にバランスを受けている、生化学的および生理学的方法を特色とする。そのような細胞が脊椎動物のような多細胞生物、またはさらに特別には哺乳動物のような生物の構成要素であるとき、生化学的および生理学的方法の調節には精緻な情報伝達経路を伴う。しばしば、そのような情報伝達経路は、細胞外の情報伝達タンパク質、情報伝達タンパク質に結合する細胞性受容体、および細胞内に局在する情報伝達構成要素に関与する。
【０００３】
情報伝達タンパク質は、内分泌性エフェクター、パラクリンエフェクターまたはオートクリンエフェクターに分類され得る。内分泌性エフェクターは特定の器官により循環系中に分泌される情報伝達分子であり、これは次いで遠隔の標的器官または標的組織へと輸送される。標的細胞は内分泌性エフェクターの受容体を含み、内分泌性エフェクターが結合すると情報伝達カスケードが誘導される。パラクリンエフェクターには、互いに近傍にある分泌細胞と受容細胞、例えば同じ組織または器官内の２つの異なるクラスの細胞が関与する。第１のクラスの細胞がパラクリンエフェクターを分泌し、これが次いで、例えば細胞外液を介する拡散により、第２のクラスの細胞に到達する。第２のクラスの細胞はパラクリンエフェクターに対する受容体を含有しており、エフェクターの結合は情報伝達カスケードを誘導し、これが対応する生化学的または生理学的作用をもたらす。オートクリンエフェクターは、オートクリンエフェクターを分泌する同じタイプの細胞が受容体をも含有していること以外は、パラクリンエフェクターと高度の類似性を有している。かくして、オートクリンエフェクターは、同じ細胞上でまたは近接する同じ細胞上で受容体に結合する。次いで、結合過程は特色的な生化学的または生理学的作用をひき起こす。
【０００４】
情報伝達過程は細胞および組織に対し、これらに限定されない例として、細胞または組織の増殖の誘導、成長または増殖の抑制、細胞または組織の分化または成熟の誘導、および細胞または組織の分化または成熟の抑制を含む多様な作用をひき起こし得る。
【０００５】
多くの病態には、重要なエフェクタータンパク質の発現の調節不全が関与している。特定のクラスの病態においては、調節不全は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の増加または過多として現れる。臨床現場において、対象が興味のあるタンパク質エフェクターレベルの増加または過多によりもたらされる異常に罹患していることを疑うことがある。
【０００６】
抗体は、特定の抗原に特異的に結合し、同族の抗原とは見なされない物質には弱く結合するか、または全く結合しない複数鎖タンパク質である。抗体は、Ｌ鎖と呼称する２本の短い鎖とＨ鎖と呼称する２本の長い鎖から成る。これらの鎖はイムノグロブリン領域より構成され、これらには一般的に２種類のクラス、即ち鎖１本当たり１個の可変領域およびＬ鎖の中には１個の定常領域、Ｈ鎖の中には３個以上の定常領域がある。免疫グロブリン分子の抗原特異的な部位は可変領域中に存在し、１本のＬ鎖および１本のＨ鎖の可変領域が互いに会合して抗原結合部分を形成する。同族のまたは標的の抗原に免疫特異的に結合する抗体は高親和性で結合する。従って、これらは試料中の抗原の存在を特異的にアッセイするのに有用である。加えて、これらは抗原の活性を不活化する潜在能力を有している。
【０００７】
それ故に、そのような対象由来の生物学的試料中の興味のあるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、そしてそのレベルを非病態的状態に特色的なものと比較する必要がある。特に、抗原に免疫特異的に結合する抗体の使用に基づくそのようなアッセイの必要性がある。さらに、病態が、エフェクターに免疫特異的に結合する抗体の使用に基づいてエフェクターのレベルの増加または過多によりひき起こされる症例において、タンパク質エフェクターの活性を阻害する必要がある。かくして、生産産物としての抗体の必要性がある。さらに抗体を対象に投与することに基づく興味のあるタンパク質エフェクターのレベルの増加または過多によりもたらされる病態の処置方法の必要性がある。
【０００８】
(発明の要約)
本発明は新規ポリペプチドをコード化する核酸配列の発見に部分的に基づく。新規核酸およびポリペプチドは、本明細書においては、ＮＯＶＸまたはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３等、核酸およびポリペプチドと呼ばれる。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにその誘導体、ホモログ、アナログおよびフラグメントは以後総称して「ＮＯＶＸ」核酸またはポリペプチド配列と呼ばれる。
【０００９】
一つの態様では、本発明はＮＯＶＸアミノ酸の成熟型を含む単離ペプチドを提供する。ポリペプチドは、例えば、ＮＯＶＸアミノ酸配列、または選択された配列に特定される任意のアミノ酸が、配列中においてアミノ酸残基の１５％未満が変更されるという条件で、異なるアミノ酸に変更されているＮＯＶＸアミノ酸配列の変異体であってもよい。本発明はまた、任意のＮＯＶＸポリペプチドのフラグメントを含む。もう一つの態様では、本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドをコード化する単離核酸、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体を含む。
【００１０】
本発明にはまた、ＮＯＶＸ配列の天然に存在する変異体であるＮＯＶＸポリペプチドが含まれる。一つの実施態様では、変異体は、ＮＯＶＸ核酸配列から１個のヌクレオチドだけ異なる核酸配列の翻訳物であるアミノ酸配列を含む。もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸポリペプチドはそこに記載される変異体ポリペプチドであり、そこでは選択された配列で特定される任意のアミノ酸が保存的置換を生じるように変更されている。
【００１１】
もう一つの態様では、本発明は、試料を提供すること；ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に試料を導入すること；そしてＮＯＶＸポリペプチドに結合した抗体の存在または量を測定し、それにより試料中のＮＯＶＸポリペプチドの存在または量を測定すること；により、試料中のＮＯＶＸポリペプチドの存在または量を測定する方法を提供する。
【００１２】
さらにもう一つの態様では、本発明は、哺乳動物の対象中のＮＯＶＸポリペプチドの変化したレベルと関連した疾患の存在または素因を測定する方法を含み、これは第１の哺乳動物の対象由来の試料中のポリペプチドの発現レベルを測定し；第１ステップの試料中のポリペプチドの量を、疾患または素因を有しないことが知られている第２の哺乳動物の対象由来の対照試料中に存在するポリペプチドの量と比較する。第１の対象中のポリペプチドの発現レベルの対照試料に比較する変化は、疾患の存在または素因を示す。
【００１３】
もう一つの態様では、本発明は治療上または予防上有効な量の医薬組成物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。治療薬は、例えば、ＮＯＶＡ核酸、ＮＯＶＡポリペプチド、またはＮＯＶＡポリペプチドに特異的な抗体であっても良い。さらなる態様では、本発明は、治療上または予防上有効な量の本医薬組成物を一つまたはそれ以上の容器内に含む。
【００１４】
さらにもう一つの態様では、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに関連するヒトの疾患に関連する症候群を処置する医薬品の製造における治療薬の使用を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドを発現する細胞試料を、ポリペプチドの活性を調整するのに十分な量でＮＯＶＸポリペプチドに結合する抗体と接触させることにより、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調整する方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドをコード化する単離核酸、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体を含む。好ましい実施態様では、核酸分子は天然に存在する対立遺伝子の核酸変異体のヌクレオチド配列を含む。もう一つの実施態様では、核酸は変異体ポリペプチドをコード化し、そこでは変異体ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。もう一つの実施態様では、核酸分子はＮＯＶＸ核酸配列から１個のヌクレオチドだけ異なる。一つの実施態様では、ＮＯＶＸ核酸分子は配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されたヌクレオチド配列または核酸配列の相補的配列（complement）に厳密（ストリンジェント）な条件下でハイブリダイズする。一つの実施態様では、本発明は、核酸が天然に存在する対立遺伝子の核酸変異体のヌクレオチド配列を含む、核酸分子を提供する。
【００１７】
また本発明は、本明細書で説明される一つまたはそれ以上の核酸を含有するベクター、および本明細書で説明されるベクターまたは核酸を含有する細胞を含む。本発明はまた、上述の核酸分子のいずれかを含むベクターで形質転換した宿主細胞に向けられている。
【００１８】
さらにもう一つの態様では、本発明は、試料をＮＯＶＸ核酸に結合するプローブと接触させ、そしてＮＯＶＸ核酸に結合するプローブの量を測定することにより、試料中の核酸分子の存在または量を測定する方法を提供する。例えば、ＮＯＶＸ核酸は癌性の細胞または組織タイプのような細胞または組織タイプに対するマーカーであり得る。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、第１の哺乳動物の対象中の核酸分子の変化したレベルに関連する疾患の存在または素因を測定する方法を提供し、そこでは対照試料と比較しての第１の対象中の核酸のレベルの変化は疾患の存在または素因を示す。
【００２０】
本発明はさらに、ＮＯＶＸポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を提供する。ＮＯＶＸ抗体は、モノクローナル、ヒト化、または完全なヒト抗体であっても良い。好ましくは、抗体はＮＯＶＸポリペプチドの抗体に対する１×１０−９Ｍ未満の解離定数を有する。さらに好ましくは、ＮＯＶＸ抗体はＮＯＶＸポリペプチドの活性を中和する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに関連したヒトの疾患に関連した症候群を処置する医薬品の製造における治療薬の使用を提供する。好ましくは、治療薬はＮＯＶＸ抗体である。
【００２２】
なおさらなる態様では、本発明は、疾患を処置しまたは予防するのに十分な量でＮＯＶＸ抗体を対象に投与することにより、ＮＯＶＸ関連疾患を処置または予防する方法、哺乳動物における病態の処置方法、およびポリペプチドに関連する病変を処置または予防する方法を提供する。
【００２３】
特に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野に通常の技能を有する業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許申請、特許、および他の参考文献は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。抵触がある場合には本明細書が、定義を含め優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示的なものであって限定することを意図しない。
本発明の他の特性および利点は以下の発明の開示および請求項より明らかであろう。
【００２４】
（発明の開示）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによりコードされたポリペプチドを提供する。本発明は、新規核酸配列、それらのコードされたポリペプチド、抗体、および他の関連化合物を含む。本明細書において、配列を「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と称する。別段の記述がない限り、「ＮＯＶＸ」は本明細書に開示される任意の新規配列を指すことを意味する。表１にＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドの要約を示す。
【００２５】
表１：ＮＯＶＸポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列および対応する配列番号
【表１】
2005506054.tif 000002
【表２】
2005506054.tif 000003
【００２６】
表１はＮＯＶＸポリペプチドの既知のタンパク質ファミリーとのホモロジーを示す。従って、表１の第１欄で特定されるＮＯＶＸに対応する本発明に従う核酸およりポリヌクレオチド、抗体および関連化合物は、例えば、表１の第５欄に特定される既知タンパク質ファミリーに関連する病変および疾患に関係する治療的応用および診断的応用において有用である。
【００２７】
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、前記タンパク質とのドメインおよび配列関連性の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを用いて、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定し得る。
【００２８】
表１の第５欄で特定されるタンパク質ファミリーの他の既知のメンバーと一致して、本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、そのようなタンパク質ファミリーの他のメンバーにホモロジーを示し、そしてそれらを特徴とするドメインを含有する。それぞれのＮＯＶＸについての配列関連性分析およびドメイン分析の詳細を実施例Ａに示す。
【００２９】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または促進する分子をスクリーニングするのに使用し得る。特に、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、表１に掲げたタンパク質ファミリーと関連する疾患を調整または阻害する低分子の同定用の標的として使用され得る。
【００３０】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、特定の細胞タイプを検出にも有用である。ＮＯＶＸそれぞれに対する発現分析の詳細を実施例Ｃに示す。従って、本発明に従うＮＯＶＸ核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、正常組織対疾患組織、例えば、種々のがんの検出、において異なる発現を有する種々の疾患の検出における診断的応用および治療的応用を有する。
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドのさらに別の利用法が本明細書に開示される。
【００３１】
ＮＯＶＸクローン
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、上記該タンパク質と関連するドメインおよび配列の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドが所属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用し得る。
【００３２】
ＮＯＶＸ遺伝子およびそれらの対応するコードされたタンパク質は、例えば、タンパク質治療または遺伝子治療により、医学的状態を予防、処置または緩和するのに有用である。病態を、試料中の新規タンパク質の量を測定または新規遺伝子中の変異の存在を測定することにより診断し得る。ＮＯＶＸ遺伝子が最も高発現する組織に基づいて、それぞれのＮＯＶＸ遺伝子に対する特異的な使用を説明する。使用は、種々の疾患および障害を診断または処置するための産物を開発することを含む。
【００３３】
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、潜在的な診断応用および治療応用、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的核酸、またはタンパク質、診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことを含む。ここで核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的な治療応用を評価する：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬の標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療的、診断的、薬のターゲティング／細胞毒性性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子送達／遺伝子手術）に有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防衛兵器。
【００３４】
一つの特定の実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体、但し、成熟型中の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ変異体、但し、選択された配列で特定される任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；およびｅ）ａ）ないしｄ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択したアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを含む。
【００３５】
もう一つの特別な実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）を与えられたアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体であり、選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であり、選択された配列中の特定されるアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；および(ｅ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部分、または選択された配列の任意のアミノ酸が、配列においてアミノ酸残基の１０％未満が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、ポリペプチドの任意の変異体をコードする核酸のフラグメント；および(ｆ) 核酸分子のいずれかの相補的分子、からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
【００３６】
なおもう一つの特別な実施態様では、本発明は単離核酸分子を含む。ここで該核酸分子は、(ａ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列；(ｂ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；(ｃ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択される配列を持つ核酸フラグメント；および(ｄ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメント、からなる群から選択したヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００３８】
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体型、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、また限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはたんぱく質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の修飾の工程から生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
【００３９】
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６，０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
【００４０】
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施態様において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、または０.１ｋｂ以下、のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、または培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００４１】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこの前記ヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
【００４２】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
【００４３】
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基であって、オリゴヌクレオチドが、ＰＣＲ反応で使用されるべきヌクレオチド塩基の十分数を有するものを指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列のｐ一部を含む。本発明の一つの実施態様では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
【００４４】
もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得る。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
【００４５】
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
【００４６】
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００４７】
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
【００４８】
誘導体および類似体は、もし誘導体または類似体が、以下に記載のような修飾された核酸またはアミノ酸を含むならば、全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当分野において公知のコンピューターホモロジープログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施態様において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が前記タンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
【００４９】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでのホモロジーを特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
【００５０】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
【００５１】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
【００５２】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施態様において、プローブはそれに付着された標識基をさらに含み、例えば、基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
【００５３】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
【００５４】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００５５】
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００５６】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかとは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
【００５７】
従って、もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施態様では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、または２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６０％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
【００５８】
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【００５９】
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【００６０】
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかの配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
【００６１】
第２の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardt'溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
【００６２】
第３の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
【００６３】
保存的変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当分野内で周知である。
【００６４】
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかとアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施態様では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）に少なくとも約９５％相同である。
【００６５】
配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
【００６６】
突然変異を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかの中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーを当分野内で定義された。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施態様では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のいずれかの突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
【００６７】
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
【００６８】
一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
【００６９】
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２ｎ（ｎは１〜４６の整数である）のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜４６の整数である）のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
【００７０】
一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
【００７１】
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
【００７２】
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
【００７３】
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
【００７４】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
【００７５】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
【００７６】
一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号２ｎ−１のいずれか（ｎは１〜４６の整数である）)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【００７７】
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
【００７８】
種々の実施態様において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個のヌクレオチド塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
【００７９】
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
【００８０】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra and Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
【００８１】
他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等に複合し得る。
【００８２】
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２ｎのいずれか（ｎは１〜４６の整数である）において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２ｎのいずれか（ｎは１〜４６の整数である）に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
【００８３】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
【００８４】
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施態様では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【００８５】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施態様では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
【００８６】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施態様では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
【００８７】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
【００８８】
一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)に示すアミノ酸配列を有する。他の実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)に実質的に相同であり、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【００８９】
２個またはそれ以上の配列間の相同性を測定すること
２個のアミノ酸配列または２個の核酸のホモロジーの割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
【００９０】
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【００９１】
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【００９２】
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【００９３】
一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【００９４】
もう一つの実施態様では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
【００９５】
なおもう一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【００９６】
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施態様では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
【００９７】
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施態様では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
【００９８】
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【００９９】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施態様では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１００】
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
【０１０１】
ＮＯＶＸ抗体
本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ' およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
【０１０２】
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
【０１０３】
本発明の特定の実施態様において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
【０１０４】
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数ＫＤが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＯＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
【０１０５】
当分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
【０１０６】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
【０１０７】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳動物から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
【０１０８】
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
【０１０９】
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【０１１０】
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳動物源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
【０１１１】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１１２】
ハイブリドーマが培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
【０１１３】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's Medium培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖し得る。
【０１１４】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
【０１１５】
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の通常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の通常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
【０１１６】
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレーム枠領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１１７】
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
【０１１８】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
【０１１９】
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施態様はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
【０１２０】
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
【０１２１】
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳動物宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳動物宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
【０１２２】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０１２３】
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１２５】
二重特異性抗体の作成方法は当分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１２６】
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの通常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の通常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１２７】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の通常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
【０１２８】
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
【０１２９】
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１３０】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変領域(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１３１】
３価以上の結合価をもつ抗体も考得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
【０１３２】
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
【０１３３】
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体依存性細胞溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１３４】
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１３５】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica charantia(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１３６】
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド誘導体(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１３７】
もう一つの実施態様では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１３８】
イムノリポソームリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl  Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
【０１３９】
特に有用なリポソームリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームリポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
【０１４０】
本発明のタンパク質に対して指向した抗体の診断応用
本発明のタンパク質に対して指向した抗体を、タンパク質の局在および／または定量(例えば、適切な生理的試料中のタンパク質レベルの測定における使用、診断法における使用、タンパク質のイメージングにおける使用等)に関する当分野内において公知の方法で使用し得る。ある一定の実施態様では、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に対する抗原結合ドメインを含有する抗体を、薬理学的に活性な化合物として利用する(下記を参照)。
【０１４１】
本発明のタンパク質に対して特異的な抗体を、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、タンパク質を単離するために使用し得る。そのような抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産した抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗体を使用して、抗原タンパク質の存在量またはパターンを評価するために抗原タンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。タンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
【０１４２】
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
【０１４３】
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的を、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
【０１４４】
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、特定の場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存するし、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週１回の範囲であり得る。
【０１４５】
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995、Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends,  Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa.,  1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker,  New Yorkに提供されている。
【０１４６】
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要なニつ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
【０１４７】
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ハイドロキシメチルセルローズまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
【０１４８】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
【０１４９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)２)を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
【０１５０】
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳動物のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳動物の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
【０１５１】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
【０１５２】
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
【０１５３】
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
【０１５４】
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
【０１５５】
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
【０１５６】
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
【０１５７】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
【０１５８】
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバクロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
【０１５９】
なおもう一つの実施態様では、本発明の核酸を、哺乳動物の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現し得る。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳動物細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０１６０】
もう一つの実施態様では、組換え哺乳動物表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
【０１６１】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０１６２】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０１６３】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０１６４】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０１６５】
哺乳動物細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
【０１６６】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施態様では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施態様では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０１６７】
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０１６８】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号２ｎ−１のいずれかの(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０１６９】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号２ｎ−１のいずれか(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施態様では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
【０１７０】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
【０１７１】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０１７２】
もう一つの実施態様では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０１７３】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
【０１７４】
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび脂肪油のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０１７５】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０１７６】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０１７７】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１７８】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０１７９】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０１８０】
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０１８１】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０１８２】
一つの実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０１８３】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
【０１８４】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０１８５】
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＮＯＶＸｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＮＯＶＸ活性を調整することができる。加えて、ＮＯＶＸタンパク質を用いて、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＮＯＶＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝的シンドロームＸならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＮＯＶＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を方法で使用して、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響させることができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０１８６】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
【０１８７】
一つの実施態様では、本発明は、膜結合型のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
【０１８８】
本明細書において使用する「低分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０１８９】
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当分野に見出し得る。
【０１９０】
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
【０１９１】
ある実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳動物由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施態様では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０１９２】
もう一つの実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＮＯＶＸあるＮＯＶＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶＸあるＮＯＶＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶＸの標的分子は、非ＮＯＶＸ分子または本発明のあるＮＯＶＸあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸあるＮＯＶＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＮＯＶＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
【０１９３】
ＮＯＶＸタンパク質をあるＮＯＶＸあるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸあるＮＯＶＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＮＯＶＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
【０１９４】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０１９５】
なおもう一つの実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施態様では、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質がさらにあるＮＯＶＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
【０１９６】
なおもう一つの実施態様では、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
【０１９７】
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
【０１９８】
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施態様において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施態様では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
【０１９９】
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、ＮＯＶＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
【０２００】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に有意に多い)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に有意に少ない)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
【０２０１】
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶＸと結合または相互作用をしてＮＯＶＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流の要素としてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅に関与する。
【０２０２】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
【０２０３】
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
【０２０４】
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)であるＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＮＯＶＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
【０２０５】
略述すれば、ＮＯＶＸ遺伝子を、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を使用して、そのため増幅プロセスを複雑にする、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのが、増幅したフラグメントを生成する。
【０２０６】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
【０２０７】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＮＯＶＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
【０２０８】
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１,０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、そしてさらに好ましくは２,０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988を参照されたい。
【０２０９】
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
【０２１０】
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、in McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egeland, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
【０２１１】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
【０２１２】
組織タイピング
本発明のＮＯＶＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２１３】
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
【０２１４】
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に因る。
【０２１５】
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１,０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)の配列のような予想するコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２,０００である。
【０２１６】
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を挙げ得る。本発明はまた、個体がＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
【０２１７】
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
【０２１８】
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
【０２１９】
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜４６の整数である)の核酸のような全長ＮＯＶＸ核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＮＯＶＸｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
【０２２０】
ＮＯＶＸタンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶＸｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２２１】
一つの実施態様では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
【０２２２】
もう一つの実施態様では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
【０２２３】
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶＸの量を測定する手段；および試料中のＮＯＶＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
【０２２４】
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
【０２２５】
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
【０２２６】
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施態様において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＮＯＶＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＮＯＶＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＮＯＶＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＮＯＶＸ遺伝子の染色体再編成、(v)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＮＯＶＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２２７】
特定の実施態様では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
【０２２８】
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
【０２２９】
さらに別の実施態様では、試料細胞由来のあるＮＯＶＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
【０２３０】
他の実施態様では、ＮＯＶＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
【０２３１】
なおもう一つの実施態様において、当分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
【０２３２】
ＮＯＶＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当分野の技術は、野生型ＮＯＶＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得た潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施態様では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
【０２３３】
なおもう一つの実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施態様によれば、あるＮＯＶＸ配列、例えば、野生型ＮＯＶＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
【０２３４】
他の実施態様では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得た変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施態様では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
【０２３５】
なおもう一つの実施態様では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施態様では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
【０２３６】
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２３７】
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施態様では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２３８】
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
【０２３９】
さらに、ＮＯＶＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２４０】
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶＸ活性(例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、障害(障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、慢性疾患および種々のがんに関連した代謝性シンドロームＸならびに消耗性疾患を挙げ得る)を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基く予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。
【０２４１】
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
【０２４２】
例示的実施態様として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認した。
【０２４３】
従って、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＮＯＶＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２４４】
臨床試験の作用モニタリング
ＮＯＶＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
【０２４５】
限定しない例として、ＮＯＶＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または低分子)を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＮＯＶＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
【０２４６】
一つの実施態様において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
【０２４７】
処置方法
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患のリスクにある(感受性)かまたは疾患を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。疾患としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症(ＡＳＤ)、房室(Ａ−Ｖ)管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症(ＶＳＤ)、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、副腎白質萎縮症、先天性副腎過形成、前立腺がん、新生物、腺がん、リンパ腫、子宮がん、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全症、移植片対宿主病、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、アルブライト遺伝性骨ジストロフィーの処置ならびに類似の他の疾患、障害および異常を挙げ得る。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
【０２４８】
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２４９】
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２５０】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２５１】
予防的方法
一つの態様では、異常なＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０２５２】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施態様では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０２５３】
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有する状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
【０２５４】
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施態様において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
【０２５５】
種々の特定の実施態様において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
【０２５６】
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は：代謝性障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を限定することなく、含み、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。
【０２５７】
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、代謝性疾患、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異脂肪血症：に罹患した患者の処置に効果を有するであろう。
【０２５８】
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
【０２５９】
実施例
実施例１
ＮＯＶ１クローンを分析し、ヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表１Ａに示す。
【表３】
2005506054.tif 000004
【０２６０】
ＮＯＶ１ａタンパク質のさらなる分析は、表１ＢＣに示す以下の特性をもたらした。
【表４】
2005506054.tif 000005
【０２６１】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１ａタンパク質のサーチは、表１Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表５】
2005506054.tif 000006
【０２６２】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１ａタンパク質は、表１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表６】
2005506054.tif 000007
【０２６３】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１ａタンパク質が表１Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表７】
2005506054.tif 000008
【０２６４】
実施例２
ＮＯＶ２クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２Ａに示す。
【表８】
2005506054.tif 000009
【０２６５】
【表９】
2005506054.tif 000010
【０２６６】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１０】
2005506054.tif 000011
【０２６７】
ＮＯＶ２ａタンパク質のさらなる分析は、表２Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１１】
2005506054.tif 000012
【０２６８】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２ａタンパク質のサーチは、表２Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１２】
2005506054.tif 000013
【０２６９】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２ａタンパク質は、表２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１３】
2005506054.tif 000014
【０２７０】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２ａタンパク質が表２Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１４】
2005506054.tif 000015
【０２７１】
実施例３
ＮＯＶ３クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表３Ａに示す。
【表１５】
2005506054.tif 000016
【０２７２】
ＮＯＶ３ａタンパク質のさらなる分析は、表３Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１６】
2005506054.tif 000017
【０２７３】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ３ａタンパク質のサーチは、表３Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１７】
2005506054.tif 000018
【０２７４】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ３ａタンパク質は、表３ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１８】
2005506054.tif 000019
【０２７５】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ３ａタンパク質が表３Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１９】
2005506054.tif 000020
【０２７６】
実施例４
ＮＯＶ４クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表４Ａに示す。
【表２０】
2005506054.tif 000021
【０２７７】
【表２１】
2005506054.tif 000022
【０２７８】
前記タンパク質配列の配列比較は、表４Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表２２】
2005506054.tif 000023
【０２７９】
ＮＯＶ４ａタンパク質のさらなる分析は、表４Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表２３】
2005506054.tif 000024
【０２８０】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２ａタンパク質のサーチは、表４Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表２４】
2005506054.tif 000025
【０２８１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ４ａタンパク質は、表４ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表２５】
2005506054.tif 000026
【０２８２】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ４ａタンパク質が表４Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表２６】
2005506054.tif 000027
【０２８３】
実施例５
ＮＯＶ５クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表５Ａに示す。
【表２７】
2005506054.tif 000028
【０２８４】
ＮＯＶ５ａタンパク質のさらなる分析は、表５Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表２８】
2005506054.tif 000029
【０２８５】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ５ａタンパク質のサーチは、表５Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表２９】
2005506054.tif 000030
【０２８６】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ５ａタンパク質は、表５ＤＳのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表３０】
2005506054.tif 000031
【０２８７】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ５ａタンパク質が表５Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表３１】
2005506054.tif 000032
【０２８８】
実施例６
ＮＯＶ６クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表６Ａに示す。
【表３２】
2005506054.tif 000033
【０２８９】
【表３３】
2005506054.tif 000034
【０２９０】
【表３４】
2005506054.tif 000035
【０２９１】
【表３５】
2005506054.tif 000036
【０２９２】
【表３６】
2005506054.tif 000037
【０２９３】
【表３７】
2005506054.tif 000038
【０２９４】
前記タンパク質配列の配列比較は、表６Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表３８】
2005506054.tif 000039
【０２９５】
ＮＯＶ６ａタンパク質のさらなる分析は、表６Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表３９】
2005506054.tif 000040
【０２９６】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ６ａタンパク質のサーチは、表６Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表４０】
2005506054.tif 000041
【０２９７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ６ａタンパク質は、表６ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表４１】
2005506054.tif 000042
【０２９８】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ６ａタンパク質が表６Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表４２】
2005506054.tif 000043
【０２９９】
実施例７
ＮＯＶ７クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表７Ａに示す。
【表４３】
2005506054.tif 000044
【０３００】
【表４４】
2005506054.tif 000045
【０３０１】
ＮＯＶ７ａタンパク質のさらなる分析は、表７Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表４５】
2005506054.tif 000046
【０３０２】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ７ａタンパク質のサーチは、表７Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表４６】
2005506054.tif 000047
【０３０３】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ７ａタンパク質は、表７ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表４７】
2005506054.tif 000048
【０３０４】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ７ａタンパク質が表７Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表４８】
2005506054.tif 000049
【０３０５】
実施例８
ＮＯＶ８クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表８Ａに示す。
【表４９】
2005506054.tif 000050
【０３０６】
【表５０】
2005506054.tif 000051
【０３０７】
前記タンパク質配列の配列比較は、表８Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表５１】
2005506054.tif 000052
【０３０８】
ＮＯＶ８ａタンパク質のさらなる分析は、表８Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表５２】
2005506054.tif 000053
【０３０９】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ８ａタンパク質のサーチは、表８Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表５３】
2005506054.tif 000054
【０３１０】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ８ａタンパク質は、表８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表５４】
2005506054.tif 000055
【０３１１】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ８ａタンパク質が表８Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表５５】
2005506054.tif 000056
【０３１２】
実施例９
ＮＯＶ９クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表９Ａに示す。
【表５６】
2005506054.tif 000057
【０３１３】
ＮＯＶ９ａタンパク質のさらなる分析は、表９Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表５７】
2005506054.tif 000058
【０３１４】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ９ａタンパク質のサーチは、表９Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表５８】
2005506054.tif 000059
【０３１５】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ９ａタンパク質は、表９ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表５９】
2005506054.tif 000060
【０３１６】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ９ａタンパク質が表９Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表６０】
2005506054.tif 000061
【０３１７】
実施例１０
ＮＯＶ１０クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１０Ａに示す。
【表６１】
2005506054.tif 000062
【０３１８】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１０Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表６２】
2005506054.tif 000063
【０３１９】
ＮＯＶ１０ａタンパク質のさらなる分析は、表１０Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表６３】
2005506054.tif 000064
【０３２０】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１０ａタンパク質のサーチは、表１０Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表６４】
2005506054.tif 000065
【０３２１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１０ａタンパク質は、表１０ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表６５】
2005506054.tif 000066
【０３２２】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１０ａタンパク質が表１０Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表６６】
2005506054.tif 000067
【０３２３】
実施例１１
ＮＯＶ１１クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１１Ａに示す。
【表６７】
2005506054.tif 000068
【０３２４】
ＮＯＶ１１ａタンパク質のさらなる分析は、表１１Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表６８】
2005506054.tif 000069
【０３２５】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１１ａタンパク質のサーチは、表１１Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表６９】
2005506054.tif 000070
【０３２６】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１１ａタンパク質は、表１１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表７０】
2005506054.tif 000071
【０３２７】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１１ａタンパク質が表１１Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表７１】
2005506054.tif 000072
【０３２８】
実施例１２
ＮＯＶ１２クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１２Ａに示す。
【表７２】
2005506054.tif 000073
【０３２９】
【表７３】
2005506054.tif 000074
【０３３０】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１２Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表７４】
2005506054.tif 000075
【０３３１】
ＮＯＶ１２ａタンパク質のさらなる分析は、表１２Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表７５】
2005506054.tif 000076
【０３３２】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１２ａタンパク質のサーチは、表１２Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表７６】
2005506054.tif 000077
【０３３３】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１２ａタンパク質は、表１２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表７７】
2005506054.tif 000078
【０３３４】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１２ａタンパク質が表１２Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表７８】
2005506054.tif 000079
【０３３５】
実施例１３
ＮＯＶ１３クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１３Ａに示す。
【表７９】
2005506054.tif 000080
【０３３６】
【表８０】
2005506054.tif 000081
【０３３７】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１３Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表８１】
2005506054.tif 000082
【０３３８】
ＮＯＶ１３ａタンパク質のさらなる分析は、表１３Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表８２】
2005506054.tif 000083
【０３３９】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１３ａタンパク質のサーチは、表１３Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表８３】
2005506054.tif 000084
【０３４０】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１３ａタンパク質は、表１３ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表８４】
2005506054.tif 000085
【０３４１】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１３ａタンパク質が表１３Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表８５】
2005506054.tif 000086
【０３４２】
実施例１４
ＮＯＶ１４クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１４Ａに示す。
【表８６】
2005506054.tif 000087
【０３４３】
【表８７】
2005506054.tif 000088
【０３４４】
ＮＯＶ１４ａタンパク質のさらなる分析は、表１４Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表８８】
2005506054.tif 000089
【０３４５】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１４ａタンパク質のサーチは、表１４Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表８９】
2005506054.tif 000090
【０３４６】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１４ａタンパク質は、表１４ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表９０】
2005506054.tif 000091
【０３４７】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１４ａタンパク質が表１４Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表９１】
2005506054.tif 000092
【０３４８】
実施例１５
ＮＯＶ１５クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１５Ａに示す。
【表９２】
2005506054.tif 000093
【０３４９】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１５Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表９３】
2005506054.tif 000094
【０３５０】
ＮＯＶ１５ａタンパク質のさらなる分析は、表１５Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表９４】
2005506054.tif 000095
【０３５１】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１５ａタンパク質のサーチは、表１５Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表９５】
2005506054.tif 000096
【０３５２】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１５ａタンパク質は、表１５ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表９６】
2005506054.tif 000097
【０３５３】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１５ａタンパク質が表１５Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表９７】
2005506054.tif 000098
【０３５４】
実施例１６
ＮＯＶ１６クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１６Ａに示す。
【表９８】
2005506054.tif 000099
【０３５５】
ＮＯＶ１６ａタンパク質のさらなる分析は、表１６ＢＣに示す以下の特性をもたらした。
【表９９】
2005506054.tif 000100
【０３５６】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１６ａタンパク質のサーチは、表１６Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１００】
2005506054.tif 000101
【０３５７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１６ａタンパク質は、表１６ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１０１】
2005506054.tif 000102
【０３５８】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１６ａタンパク質が表１６Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１０２】
2005506054.tif 000103
【０３５９】
実施例１７
ＮＯＶ１７クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１７Ａに示す。
【表１０３】
2005506054.tif 000104
【０３６０】
ＮＯＶ１７ａタンパク質のさらなる分析は、表１７Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１０４】
2005506054.tif 000105
【０３６１】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１７ａタンパク質のサーチは、表１７Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１０５】
2005506054.tif 000106
【０３６２】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１７ａタンパク質は、表１７ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１０６】
2005506054.tif 000107
【０３６３】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１７ａタンパク質が表１７Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１０７】
2005506054.tif 000108
【０３６４】
実施例１８
ＮＯＶ１８クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１８Ａに示す。
【表１０８】
2005506054.tif 000109
【０３６５】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１８Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１０９】
2005506054.tif 000110
【０３６６】
ＮＯＶ１８ａタンパク質のさらなる分析は、表１８Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１１０】
2005506054.tif 000111
【０３６７】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１８ａタンパク質のサーチは、表１８Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１１１】
2005506054.tif 000112
【０３６８】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１８ａタンパク質は、表１８ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１１２】
2005506054.tif 000113
【０３６９】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１８ａタンパク質が表８１Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１１３】
2005506054.tif 000114
【０３７０】
実施例１９
ＮＯＶ１９クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１９Ａに示す。
【表１１４】
2005506054.tif 000115
【０３７１】
前記タンパク質配列の配列比較は、表１９Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１１５】
2005506054.tif 000116
【０３７２】
ＮＯＶ１９ａタンパク質のさらなる分析は、表１９Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１１６】
2005506054.tif 000117
【０３７３】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ１９ａタンパク質のサーチは、表１９Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１１７】
2005506054.tif 000118
【０３７４】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ１９ａタンパク質は、表１９ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１１８】
2005506054.tif 000119
【０３７５】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ１９ａタンパク質が表１９Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１１９】
2005506054.tif 000120
【０３７６】
実施例２０
ＮＯＶ２０クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２０Ａに示す。
【表１２０】
2005506054.tif 000121
【０３７７】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２０Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１２１】
2005506054.tif 000122
【０３７８】
ＮＯＶ２０ａタンパク質のさらなる分析は、表２０Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１２２】
2005506054.tif 000123
【０３７９】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２０ａタンパク質のサーチは、表２０Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１２３】
2005506054.tif 000124
【０３８０】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２０ａタンパク質は、表２０ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１２４】
2005506054.tif 000125
【０３８１】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２０ａタンパク質が表２０Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１２５】
2005506054.tif 000126
【０３８２】
実施例２１
ＮＯＶ２１クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表１９Ａに示す。
【表１２６】
2005506054.tif 000127
【０３８３】
ＮＯＶ２１ａタンパク質のさらなる分析は、表２１Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１２７】
2005506054.tif 000128
【０３８４】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２１ａタンパク質のサーチは、表２１Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１２８】
2005506054.tif 000129
【０３８５】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２１ａタンパク質は、表２１ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１２９】
2005506054.tif 000130
【０３８６】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２１ａタンパク質が表２１Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１３０】
2005506054.tif 000131
【０３８７】
実施例２２
ＮＯＶ２２クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２２Ａに示す。
【表１３１】
2005506054.tif 000132
【０３８８】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２２Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１３２】
2005506054.tif 000133
【０３８９】
ＮＯＶ２２ａタンパク質のさらなる分析は、表２２Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１３３】
2005506054.tif 000134
【０３９０】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２２ａタンパク質のサーチは、表２２Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１３４】
2005506054.tif 000135
【０３９１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２２ａタンパク質は、表２２ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１３５】
2005506054.tif 000136
【０３９２】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２２ａタンパク質が表２２Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１３６】
2005506054.tif 000137
【０３９３】
実施例２３
ＮＯＶ２３クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２３Ａに示す。
【表１３７】
2005506054.tif 000138
【０３９４】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２３Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１３８】
2005506054.tif 000139
【０３９５】
ＮＯＶ２３ａタンパク質のさらなる分析は、表２３Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１３９】
2005506054.tif 000140
【０３９６】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２３ａタンパク質のサーチは、表２３Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１４０】
2005506054.tif 000141
【０３９７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２３ａタンパク質は、表２３ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１４１】
2005506054.tif 000142
【０３９８】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２３ａタンパク質が表２３Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１４２】
2005506054.tif 000143
【０３９９】
実施例２４
ＮＯＶ２４クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２４Ａに示す。
【表１４３】
2005506054.tif 000144
【０４００】
ＮＯＶ２４ａタンパク質のさらなる分析は、表２４Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１４４】
2005506054.tif 000145
【０４０１】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２４ａタンパク質のサーチは、表２４Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１４５】
2005506054.tif 000146
【０４０２】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２４ａタンパク質は、表２４ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１４６】
2005506054.tif 000147
【０４０３】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２４ａタンパク質が表２４Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１４７】
2005506054.tif 000148
【０４０４】
実施例２５
ＮＯＶ２５クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２５Ａに示す。
【表１４８】
2005506054.tif 000149
【０４０５】
ＮＯＶ２５ａタンパク質のさらなる分析は、表２５Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１４９】
2005506054.tif 000150
【０４０６】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２５ａタンパク質のサーチは、表２５Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１５０】
2005506054.tif 000151
【０４０７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２５ａタンパク質は、表２５ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１５１】
2005506054.tif 000152
【０４０８】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２５ａタンパク質が表２５Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１５２】
2005506054.tif 000153
【０４０９】
実施例２６
ＮＯＶ２６クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２６Ａに示す。
【表１５３】
2005506054.tif 000154
【０４１０】
前記タンパク質配列の配列比較は、表２６Ｂに示す以下の配列関連性をもたらす。
【表１５４】
2005506054.tif 000155
【０４１１】
ＮＯＶ２６ａタンパク質のさらなる分析は、表２６Ｃに示す以下の特性をもたらした。
【表１５５】
2005506054.tif 000156
【０４１２】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２６ａタンパク質のサーチは、表２６Ｄに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１５６】
2005506054.tif 000157
【０４１３】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２６ａタンパク質は、表２６ＥのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１５７】
2005506054.tif 000158
【０４１４】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２６ａタンパク質が表２６Ｆに示すドメインを含むことを予測する。
【表１５８】
2005506054.tif 000159
【０４１５】
実施例２７
ＮＯＶ２７クローンを、分析し、ヌクレオチドおよびコードポリペプチド配列は、表２７Ａに示す。
【表１５９】
2005506054.tif 000160
【０４１６】
ＮＯＶ２７ａタンパク質のさらなる分析は、表２７Ｂに示す以下の特性をもたらした。
【表１６０】
2005506054.tif 000161
【０４１７】
特許および特許公開で公開された配列を含む専売データベースである、Geneseqデータベースに対するＮＯＶ２７ａタンパク質のサーチは、表２７Ｃに示すいくつかの相同性タンパク質をもたらした。
【表１６１】
2005506054.tif 000162
【０４１８】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴサーチにおいて、ＮＯＶ２７ａタンパク質は、表２７ＤのＢＬＡＳＴＰデータに示すタンパク質に相同性を有すると見出された。
【表１６２】
2005506054.tif 000163
【０４１９】
ＰＨａｍ分析は、ＮＯＶ２７ａタンパク質が表２７Ｅに示すドメインを含むことを予測する。
【表１６３】
2005506054.tif 000164
【０４２０】
実施例Ｂ：配列決定方法論およびＮＯＶＸクローンの同定
１．GeneCalling [商標登録]技法：これは、CuraGenで開発した２個またはそれ以上の試料間の差次的遺伝子発現プロフィール化を実施する専売方法であり、Shimkets, et al.，"Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query" Nature Biotechnology 17:198-803 (1999)に記載されている。ｃＤＮＡを、多重組織型、正常および病的状態、生理学的状態ならびに異なるドナーからの発達状態を表す種々のヒト試料から誘導した。試料を、組織全体、一次細胞または組織培養一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物学的薬剤または化学的薬剤、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイド、で処置されていてもよい。次いで、このように誘導したｃＤＮＡを、１２０対もの多数の制限酵素で消化し、それぞれ対の制限酵素に特異的なリンカー−アダプターの対を適切な末端に連結した。制限消化は、独特のｃＤＮＡ遺伝子フラグメントの混合物を生成する。限定ＰＣＲ増幅を、一つのプライマーがビオチン化されかつ他方が蛍光的に標識されているリンカーアダプター配列に相同的なプライマーにより実施する。二重標識した物質を単離し、蛍光的に標識した一本鎖をキャピラリーゲル電気泳動により分割した。コンピューターアルゴリズムは、それぞれの制限消化に対する実験および対照群からの電気泳動を比較する。このおよびさらに別な配列由来の情報を用いて、種々のゲノムデータベースを用いてそれぞれの差次的発現遺伝子フラグメントの同一性を予測する。遺伝子フラグメントの同一性を、追加的、遺伝子−特異的競合的ＰＣＲによりまたは遺伝子フラグメントの単離およびシークエンシングにより確認した。
【０４２１】
２．SeqCalling[登録商標]技術：ｃＤＮＡを、多重組織型、正常および病的状態、生理学的状態ならびに異なるドナーからの発達状態を表す種々のヒト試料から誘導した。試料を、組織全体、一次細胞または組織培養一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物学的薬剤または化学的薬剤、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイド、で処置されていてもよい。次いで、このように誘導したｃＤＮＡを、CuraGenの専売SeqCalling技術を用いてシークエンスした。配列トレースを手動で評価し、妥当であれば訂正のために編集した。すべての試料からのｃＤＮＡ配列を、公的なヒト配列を時には含むバイオインフォマチックプログラムを用いて、一緒に集め、それぞれのアセンブリに対する共通配列を生産した。それぞれのアセンブリは、Curagen Corporationのデータベースに含まれる。他の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたり少なくとも９５％であったときには、配列はアセンブリの成分として含めた。それぞれのアセンブリは、遺伝子またはその一部分を表し、そしてスプライス形態の単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)、挿入、欠失および他の配列変異のような変異体についての情報を含む。
【０４２２】
３．PathCalling[登録商標]技術：
ＮＯＶＸ核酸配列を、２ハイブリッドアプローチによるｃＤＮＡライブラリーの実験室スクリーニングによって誘導する。ＤＮＡ配列の全長またはその配列の部分のいずれか一方または両方をカバーするｃＤＮＡフラグメントをシークエンスした。インシリコ予測は、Curagen Corporationの専売配列データベースまたは公的ヒト配列データベース中で利用できる配列に基づいており、全長ＤＮＡ配列またはその或る部分のどちらかを提供した。
【０４２３】
実験室スクリーニングを、以下に要約した方法を用いて実施した：
ｃＤＮＡライブラリーを、多重組織型、正常および病的状態、生理的状態ならびに異なるドナーからの発達状態を表す種々のヒト試料から誘導した。試料を、組織全体、一次細胞または組織培養一次細胞または細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生物的薬剤または化学的薬剤、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイド、で処置されていてもよい。次いで、このように誘導したｃＤＮＡを、適当な２ハイブリッドベクター(Ｇａｌ４−活性化ドメイン(Ｇａｌ４−ＡＤ)融合体)の中へ指向的にクローン化した。そのようなｃＤＮＡライブラリーならびにClontech(Palo Alto, CA)から商業的に入手可能なｃＤＮＡライブラリーを、次いで、E. coliからCuragen Corporationの専売酵母株(米国特許６,０５７,１０１および６,０８３,６９３(全体的な出典明示により本明細書の一部とする)に開示した)へ移入した。
【０４２４】
Curagen Corporationの専売ヒト配列ライブラリーのＧａｌ４−結合ドメイン(Ｇａｌ４−ＢＤ)融合体を用いて、多重のＧａｌ４−ＡＤ融合体ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、それぞれにおいてＧａｌ４−ＡＤ融合体が個別のｃＤＮＡを含む酵母ハイブリッド二倍体の選択をもたらした。それぞれの試料を、ｃＤＮＡ挿入境界域において非特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いて増幅した。そのようなＰＣＲ生成物をシークエンスした；配列トレースを手動で評価し、妥当であれば訂正のため編集した。公的ヒト配列を時には含むバイオインフォマチックプログラムを用いて、すべての試料からのｃＤＮＡ配列を一緒に集め、それぞれのアセンブリに対する共通配列を生産した。それぞれのアセンブリを、Curagen Corporationのデータベースに含める。他の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたり少なくとも９５％であったときには、配列をアセンブリの成分として含んだ。それぞれのアセンブリは、遺伝子またはその一部分を表し、そしてスプライス形態の単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)、挿入、欠失および他の配列変異のような変異体についての情報を含む。
【０４２５】
物理的クローン：全オープンリーディングフレームをカバーするスクリーニング手順により誘導したｃＤＮＡフラグメントを、組換えＤＮＡとして用いたｐＡＣＴ２プラスミド(Clontech)の中へクローン化し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その組換えプラスミドを宿主に挿入して、Curagen Corporationの専売酵母株Ｎ１０６´およびＹＵＬＨ(米国特許６,０５７,１０１および６,０８３,６９３)両方の掛け合わせによるスクリーニング手順の間に生成した酵母二倍体により選択した。
【０４２６】
４．ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅(ＲＡＣＥ)のようなポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術を用いて、本発明のｃＤＮＡの予測した配列を単離または完結した。通常は、多重クローンを一つまたはそれ以上のヒト試料からシークエンスし、フラグメントのための配列を誘導した。異なるドナーからの種々のヒト組織試料を、ＲＡＣＥ反応に用いた。これらの手順から誘導した配列を、先章で記載したSeqCalling Assembly方法に含めた。
【０４２７】
５．エクソン連結：本発明で同定したＮＯＶＸ標的配列をエクソン連結方法に供し、配列を確認した。ＰＣＲプライマーは、順方向プライマーについては利用可能な最上流の配列から、そして逆方向プライマーについては利用可能な最下流の配列から出発することでデザインした。それぞれの場合において、特有なまたは高選択的などちらかである適当な配列に出会うまで、または逆方向プライマーの場合には停止コドンに到達するまで、それぞれの末端からコーディング配列に向かって内側にウォーキングして配列を検討した。そのようなプライマーを、全長ｃＤＮＡ、標的配列のＤＮＡまたはタンパク質配列の部分(一つまたはそれ以上のエクソン)に対するインシリコの予測に基づいて、または他の種からの緊密に関連したヒト配列に対する予測エクソンの翻訳した相同性によりデザインした。次いで、これらのプライマーを以下のヒトｃＤＮＡプールに基づいたＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全縁、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺臓、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。通常は、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローン化し、そして高度重複性に至るまでシークエンスした。エクソン結合から誘導したＰＣＲ産物を、InvitrogenのｐＣＲ２.１ベクターの中にクローン化した。得た細菌性クローンは、ｐＣＲ２.１ベクター中へクローン化された完全オープンリーディングフレームをカバーする挿入断片を有する。すべてのクローンから得た配列を、それ自体と、CuraGen Corporationデータベース中の他のフラグメントと、および公的ＥＳＴと共に集合させた。フラグメントおよびＥＳＴを、アセンブリの他の成分とのそれらの同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％であったとき、集合体の成分として含んだ。加えて、配列トレースを手動で評価し、妥当であれば訂正のため編集した。これらの手順が本明細書において報告する配列を提供する。
【０４２８】
６．物理的クローン：エクソンを相同性により予測し、そして標準的遺伝法則を用いてイントロン／エクソン境界域を決定した。エクソンをさらに選択し、そして多重ＢＬＡＳＴ(例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸおよびＢｌａｓｔＮ)をおよび、或る場合には、GeneScanおよびGrailを用いる類似性測定手段により精錬した。利用できるときには、公的および専売データベース両方からの発現配列をまた追加して、遺伝子配列をさらに定義し、完成した。次いで手動で、ＤＮＡ配列を、明白な矛盾について訂正し、それによって全長タンパク質をコード化する配列を得た。
全オープンリーディングフレームをカバーするエクソン結合により誘導したＰＣＲ産物を、InvitrogenのｐＣＲ２.１ベクターにクローン化して、発現およびスクリーニングの目的に用いるクローンを提供した。
【０４２９】
実施例Ｃ：種々の細胞および組織におけるクローンの定量的発現分析
種々の正常および病変由来の細胞、細胞株、および組織からのＲＮＡ試料を含むマイクロタイタープレートを用い、リアルタイム定量的ＰＣＲ(ＲＴＱ  ＰＣＲ)を用いて、種々のクローンの定量的な発現を評価した。ＲＴＱ  ＰＣＲは、Applied Biosystems ABI PRISM [登録商標] 7700 またはABI PRISM [登録商標] 7900 HT Sequence Detection System上で実施された。種々の収集試料をプレート上で集め、パネル１(正常組織およびがん細胞株を含有する)、パネル２(正常およびがん起源の組織由来の試料を含有する)、パネル３(がん細胞株を含有する)、パネル４(正常組織からの細胞および細胞株ならびに炎症異常に関連する細胞を含有する)、パネル５Ｄ／５Ｉ(代謝性疾患を強調するヒト組織および細胞株を含有する)、ＡＩ_包括的_パネル(正常組織および自己免疫疾患からの試料を含有する)、パネルＣＮＳＤ.０１(正常および疾患脳からの中枢神経系試料を含有する)、ならびにＣＮＳ_神経変性_パネル(正常およびアルツハイマー病の脳からの試料を含有する)と示す。
【０４３０】
２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡ染色強度比を指針(２：１〜２.５：１  ２８ｓ：１８ｓ)として用いるアガロースゲル電気泳動図および分解生成物を示唆するであろう低分子量ＲＮＡの不在の目視査定によって、すべての試料からのＲＮＡの完全性を品質制御する。単一エクソンの区間に渡って増幅するようにデザインされたプローブおよびプライマーのセットを用い、逆転写酵素の不在下で行われるＲＴＱ  ＰＣＲ反応によりゲノムＤＮＡ汚染に対して、試料を制御する。
【０４３１】
最初に、ＲＮＡ試料を、構成的に発現される遺伝子(例えば、β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ)のような参照核酸へ規格化した。規格化されたＲＮＡ(５μｌ)をｃＤＮＡに変換して、製造元の指示にしたがって、One Step RT-PCR Master Mix Reagents (Applied Biosystems; Catalog No. 4309169)および遺伝子−特異的プライマーを用いるＲＴＱ  ＰＣＲにより分析した。
【０４３２】
他の場合では、規格化されていないＲＮＡ試料を、製造元の指示にしたがって、Superscript II (Invitrogen Corporation; Catalog No. 18064-147)および無秩序な６量体を用いて、単鎖ｃＤＮＡ(ｓｓｃＤＮＡ)に変換した。１０μｇまでの全ＲＮＡを含む反応を２０μｌの容積で実施し、４２℃で６０分間インキュベートした。この反応は、１００μｌの最終容積で５０μｇの全ＲＮＡにまでスケールを拡大し得る。次いで、ｓｓｃＤＮＡ試料を、製造元の指示にしたがって、1X TaqMan [登録商標] Universal Master mix (Applied Biosystems; catalog No. 4324020)を用いて、先に記載したように参照核酸へ規格化する。
【０４３３】
プローブおよびプライマーを、Applied Biosystems Primer Express Software package (Apple Computer's Macintosh Power PC用１版)または標的配列を入力として用いる類似のアルゴリズムにしたがって、それぞれのアッセイに対してデザインした。反応条件に対してデフォルト設定を使用し、以下のパラメーターを設定し、プライマーを選択した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマー融解温度(Ｔｍ)範囲＝５８°〜６０℃、プライマー最適Ｔｍ＝５９℃、最大プライマー差＝２℃、プローブは５´Ｇを持たない、プローブＴｍはプライマーＴｍよりも１０℃大きくなければならない、アンプリコン(増幅産物)のサイズは７５ｂｐ〜１００ｂｐ。選択されたプローブおよびプライマー(下を参照)は、Synthegen (Houston, TX, USA)により合成された。プローブをＨＰＬＣで二回精製して未カップリングの染料を除去し、質量分析法により評価して、レポーターおよび消光剤の染料がプローブのそれぞれ５'および３'末端にカップリングしていることを立証した。それらの最終濃度は、順方向および逆方向プライマーでそれぞれ９００ｎＭ、ならびにプローブで２００ｎＭであった。
【０４３４】
ＰＣＲ条件：ＲＮＡ試料で作業するとき、それぞれの組織およびそれぞれの細胞株からの規格化されたＲＮＡを、９６穴または３８４穴のＰＣＲプレート(Applied Biosystems)のいずれか一方のそれぞれの穴の中にスポットした。ＰＣＲカクテルには、単一の遺伝子特異的プローブとプライマーのセットまたは二つの多重プローブとプライマーのセット(標的クローンに特異的なセットおよび標的プローブによって多重化されているもう一つの遺伝子特異的なセット)のどちらかが含まれる。製造元の指示にしたがい、TaqMan [登録商標] One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems; Catalog No. 4313803)を用いて、ＰＣＲ反応をセットアップした。逆転写を、４８℃で３０分間実施し、引き続いて以下のように増幅／ＰＣＲサイクルを実施した：９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクル。結果をｌｏｇ尺度を用いてＣＴ値(与えられた試料が蛍光の閾値をクロスするサイクル)として記録し、与えられた試料と２のデルタＣＴ乗として表わされる最低ＣＴ値を有する試料との間のＲＮＡ濃度の差とした。次いで、百分率相対発現は、このＲＮＡ差の逆数を取り１００倍することによって得られる。
【０４３５】
ｓｓｃＤＮＡ試料で作業するときは、先にＲＮＡ試料について記載したように、規格化したｓｓｃＤＮＡを用いた。製造元の指示にしたがって、1X TaqMan [登録商標] Universal Master mix (Applied Biosystems; catalog No. 4324020)を用いて、一つまたは二つのセットのプローブとプライマーを含むＰＣＲ反応をセットアップした。ＰＣＲ増幅を以下のように実施した：９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクル。結果を分析し、先に説明したように処理した。
【０４３６】
パネル１、１.１、１.２、および１.３Ｄ
パネル１、１.１、１.２、および１.３Ｄのためのプレートは、２個の対照穴(ゲノムＤＮＡ対照および化学対照)ならびに種々の試料からのｃＤＮＡを含有する９４穴を含む。これらのパネルにおける試料は、二つのクラス：培養細胞株由来の試料および一次正常組織由来の試料、に区分される。細胞株は、以下のタイプのがんに由来する：肺がん、乳がん、黒色腫、結腸がん、前立腺がん、ＣＮＳがん、扁平上皮細胞がん腫、卵巣がん、肝臓がん、腎臓がん、胃がんおよび膵臓がん。これらのパネルで用いられる細胞株は、培養細胞株のための保管所の、the American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)を通じて広く入手でき、そしてＡＴＣＣにより推奨された条件を用いて培養された。これらのパネルで見られる正常組織は、単一の成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来する試料から成っている。これらの試料は以下の器官に由来する：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺臓、胎児肺臓、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
【０４３７】
パネル１、１.１、１.２、および１.３Ｄについての結果では、以下の略語を用いる。
ｃａ．：がん腫
＊：転移から確立される
ｍｅｔ：転移
ｓ  ｃｅｌｌ  ｖａｒ：小細胞変異体
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ：小さくない
ｓｑｕａｍ：扁平
pl.eff＝pl  effusion：胸膜浸出液
ｇｌｉｏ：神経膠腫
ａｓｔｒｏ：星細胞腫
ｎｅｕｒｏ：神経芽細胞腫
【０４３８】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１.４
パネル１.４のためのプレートは、２個の対照穴(ゲノムＤＮＡ対照および化学対照)ならびに種々の試料からのｃＤＮＡを含有する９４穴を含む。パネル１.４における試料は、二つのクラス：培養細胞株由来の試料および一次正常組織由来の試料、に分けられる。細胞株は、以下の型のがんに由来する：肺がん、乳がん、黒色腫、結腸がん、前立腺がん、ＣＮＳがん、扁平上皮細胞がん腫、卵巣がん、肝臓がん、腎臓がん、胃がんおよび膵臓がん。パネル１.４で用いられる細胞株は、培養細胞株のための保管所の、the American Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)を通じて広く入手でき、ＡＴＣＣにより推奨された条件を用いて培養した。パネル１.４で見られる正常組織は、２〜５人の種々の成人個体または胎児のすべての主要器官系に由来する試料プールから成っている。これらの試料は以下の器官に由来する：成人骨格筋、胎児骨格筋、成人心臓、胎児心臓、成人腎臓、胎児腎臓、成人肝臓、胎児肝臓、成人肺臓、胎児肺臓、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。略語は、パネル１、１.１、１.２、および１.３Ｄについて記載された通りである。
【０４３９】
パネル２Ｄおよび２.２
パネル２Ｄおよび２.２のためのプレートは、一般的に２個の対照穴およびthe National Cancer Institute's Cooperative Human Tissue Network (ＣＨＴＮ)またはthe National Disease Research Initiative (ＮＤＲＩ)と密接に協力して働く外科医によって調達されたヒト組織から単離されたＲＮＡまたはｃＤＮＡから成る９４個の試験試料を含む。組織はヒト悪性腫瘍に由来し、指示された場合には、多くの悪性腫瘍組織は、腫瘍の直ぐ横に隣接した非がん性組織から得られる「対応辺縁」を有する。これらを正常隣接組織と呼称し、以下の結果では「ＮＡＴ」と表す。腫瘍組織および「対応辺縁」は、二人の独立した病理学者(外科病理学者さらにＮＤＲＩまたはＣＨＴＮの病理学者)により評価される。この分析は、腫瘍分化のグレードの組織病理学的評価を提供する。さらに、大部分の試料は、患者の臨床段階に関する情報を提供するところの外科病理学的報告原本を含む。これらのマッチド周縁は、手術領域を取り囲む組織(即ち、直接隣接部)から取られる(表ＲＲでは、正常隣接組織の場合「ＮＡＴ」と表記される)。加えて、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ試料は、高齢者または突然死犠牲者(事故、など)で実施された剖検由来の種々のヒト組織から得られた。これらの組織は無疾患であることが確認されており、Clontech (Palo Alto, CA)、Research GeneticsおよびInvitrogenのような種々の商業的供給者から購入された。
【０４４０】
パネル３Ｄ
パネル３Ｄのプレートは、９４個のｃＤＮＡ試料および２個の対照試料から成る。特に、これらの試料のうち９２個は培養ヒトがん細胞株由来であり、２個のヒト一次小脳組織の試料、および２個の対照である。ヒト細胞株は、一般的にＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)、ＮＣＩまたはドイツがん細胞バンクから得られ、以下の組織群に入る：舌の扁平上皮細胞がん腫、乳がん、前立腺がん、黒色腫、類表皮がん腫、肉腫、膀胱がん腫、膵臓がん、腎臓がん、白血病／リンパ腫、卵巣／子宮／子宮頚部、胃、結腸、肺およびＣＮＳがん細胞株。加えて、２個の独立した小脳の試料がある。これらの細胞をすべて標準的な推奨された条件下で培養し、ＲＮＡを標準的な手法を用いて抽出する。パネル３Ｄおよび１.３Ｄにおける細胞株は、科学的な文献で用いられる最も普通の細胞株である。
【０４４１】
パネル４Ｄ、４Ｒ、および４.１Ｄ
パネル４は、炎症疾患に関連する種々のヒト細胞株または組織から単離されたＲＮＡ(パネル４Ｒ)またはｃＤＮＡ(パネル４Ｄ／４.１Ｄ)から成る、９６穴プレート(２個の対照穴、９４個の試験試料)上の試料を含む。結腸および肺(Stratagene, La Jolla, CA)ならびに胸腺および腎臓(Clonetech)のような対照正常組織からの全体のＲＮＡを使用した。肝硬変患者の肝臓組織およびエリトマトーデス患者の腎臓からの全体のＲＮＡは、BioChain (Biochain Institute, Inc., Hayward, CA)から入手された。クローン病および潰瘍性大腸炎を持つと診断された患者からのＲＮＡ標本用の腸組織は、the National Disease Research Interchange (ＮＤＲＩ) (Philadelphia, PA)から入手された。
【０４４２】
星状膠細胞、肺線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、冠動脈平滑筋細胞、小気道上皮、気管支上皮、微小血管皮膚内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺動脈内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞は、すべてClonetics (Walkersville, MD)から購入され、これらの細胞タイプのためにCloneticsから供給された培地中で発育させた。これらの一次細胞タイプを、指示されたとおり、６時間および／または１２〜１４時間、種々のサイトカインまたはサイトカインの組合せで活性化した。以下のサイトカインが用いられた：凡そ１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１ベータ、凡そ５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ、凡そ２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮガンマ、凡そ５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、凡そ５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、凡そ５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。時には内皮細胞を、０.１％血清を有するCloneticsからの基本培地中での培養により種々の時間飢餓状態においた。
【０４４３】
単核細胞を、CuraGen Corporationの従業員の血液からFicollを用いて調製した。これらの細胞から、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco/Life Technologies, Rockville, MD)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびインターロイキン２中で４〜６日間での培養によってＬＡＫ細胞を調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮガンマならびに５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかで６時間活性化した。或る場合には、単核細胞を４〜５日間、凡そ５μｇ／ｍｌのＰＨＡ(フィトヘマグルチニン)またはＰＷＭ(アメリカヤマゴボウマイトジェン)と共に、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)中で培養した。試料をＲＮＡ調製のために２４、４８および７２時間で採取した。ＭＬＲ(混合リンパ球反応)試料は、二人のドナーから血液を採取し、Ficollを用いて単核細胞を単離し、そして単離された単核細胞を１：１で、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール(５.５×１０−５Ｍ)(Gibco)、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)中で凡そ２×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で混合することによって、得られた。ＭＬＲを培養し、そしてＲＮＡ調製のために試料を１〜７日の範囲にわたる種々の時点で採取した。
【０４４４】
単核細胞から、製造元の指示にしたがってＣＤ１４Miltenyi Beads、正ｖｅＶＳ選択カラムおよびVario Magnetを用いて、単球を単離した。単球を、ＤＭＥＭ５％ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)(Hyclone, Logen, UT)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)、５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭＣＳＦおよび５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４中で５〜７日間での培養によって樹状細胞に分化させた。単球をＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)および１０％ＡＢヒト血清または凡そ５０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で５〜７日間での培養によって、マクロファージを調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖(ＬＰＳ)で６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞をまた、１０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４０モノクローナル抗体で６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０４４５】
単核細胞から、製造元の指示にしたがってＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６  Miltenyi Beads、正ＶＳ選択カラムならびにVario Magnetを用いて、ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞をまた単離した。ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９Miltenyi Beadsならびに正の選択を用いて、単核細胞からＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９細胞を除去することによって、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを用いてＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を単離すると、残存する細胞はＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４リンパ球であった。ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)の中に入れて、１０６細胞／ｍｌで、ＰＢＳ中の０.５μｇ／ｍｌ抗−ＣＤ２８ (Pharmingen)および３μｇ／ｍｌ抗−ＣＤ３(ＯＫＴ３、ＡＴＣＣ)で終夜コーティングされたFalcon ６穴組織培養プレート上へ平板培養した。６および２４時間後に、ＲＮＡ調製のため細胞を集めた。慢性的に活性化されたＣＤ８リンパ球を調製するために、我々は単離されたＣＤ８リンパ球を抗−ＣＤ２８および抗−ＣＤ３でコーティングされたプレート上で４日間活性化し、次いで細胞を集め、それらをＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびＩＬ−２中で増殖させた。次いで、増殖したＣＤ８細胞を、プレートに結合された抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で４日間再び活性化し、前記のように増殖した。第二の活性化後６および２４時間ならびに第二の拡大培養４日後にＲＮＡを単離した。単離されたＮＫ細胞を、ＲＮＡの調製前の４〜６日間に、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、ならびに１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびＩＬ−２中で培養した。
【０４４６】
Ｂ細胞を得るために、扁桃腺をＮＤＲＩから取得した。扁桃腺を無菌解剖ハサミで切り裂き、次いで篩いに通過させた。次いで、扁桃腺細胞を遠心沈殿し、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)中に、１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を活性化させるために、我々は５μｇ／ｍｌのＰＷＭまたは凡そ１０μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４０(Pharmingen)および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を用いた。ＲＮＡ調製のために、細胞を２４、４８および７２時間にて収穫した。
【０４４７】
一次および二次のＴｈ１／Ｔｈ２およびＴｒ１細胞を調製するために、６−穴Falconプレートを１０μｇ／ｍｌ抗−ＣＤ２８(Pharmingen)および２μｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３(ＡＴＣＣ)で終夜コーティングして、次いでＰＢＳで二回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球(Poietic Systems, German Town, MD)を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびＩＬ−２(４ｎｇ／ｍｌ)中に、１０５〜１０６細胞／ｍｌで培養した。Ｔｈ１に対してはＩＬ−１２(５ｎｇ／ｍｌ)および抗−ＩＬ４(１μｇ／ｍｌ)を用いた一方で、Ｔｈ２に対してはＩＬ−４(５ｎｇ／ｍｌ)および抗−ＩＦＮガンマ(１μｇ／ｍｌ)を用い、そしてＴｒ１に対しては５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０を用いた。４〜５日後、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１のリンパ球をＤＭＥＭ中で一回洗浄し、そしてＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)およびＩＬ−２(１ｎｇ／ｍｌ)中で４〜７日間培養した。これに続いて、活性化したＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１のリンパ球を、抗−ＣＤ２８／ＯＫＴ３および上記のようなサイトカインで、ただしアポトーシスを阻止するために抗−ＣＤ９５Ｌ(１μｇ／ｍｌ)を加えて、５日間再刺激した。４〜５日後、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１のリンパ球を洗浄し、次いでＩＬ−２で４〜７日間再び培養した。活性化Ｔｈ１およびＴｈ２のリンパ球を、最大３サイクルの間このように維持した。一次および二次のＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１から、プレートに結合された抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８ｍＡｂによる第二および第三活性化の後６および２４時間後、ならびにインターロイキン２中での第二および第三の拡大培養開始から４日後に、ＲＮＡを調製した。
【０４４８】
ＡＴＣＣから以下の白血球細胞株を入手した：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。ＥＯＬ細胞を、０.１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ中に５×１０５細胞／ｍｌで三日毎に培地を交換し、かつ細胞濃度を５×１０５細胞／ｍｌに調整しながら、８日間での培養によって、さらに分化させた。これらの細胞を培養するために、我々は、５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)を添加して、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ(ＡＴＣＣによって推奨されたように)を用いた。ＲＮＡを、休眠細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６および１４時間活性化した細胞のいずれかから、調製した。角化細胞株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２をまた、ＡＴＣＣから取得した。両方を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ(Hyclone)、１００μＭ非必須アミノ酸(Gibco)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール５.５×１０−５Ｍ(Gibco)、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Gibco)中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を凡そ５ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦアルファおよび１ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１ベータで６および１４時間活性化する一方で、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を以下のサイトカインで６および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３および２７ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮガンマ。
【０４４９】
これらの細胞株および血液細胞については、Trizol (Gibco BRL)を用い凡そ１０７細胞／ｍｌを溶解してＲＮＡを調製した。手短に言えば、１／１０容量のブロモクロロプロパン(Molecular Research Corporation)をＲＮＡ試料に加え、ボルテックスし、室温にて１０分後に管をSorvall SS34回転器中で１４,０００ｒｐｍで遠心した。水相を除去し、１５ｍｌのFalcon Tubeの中に入れた。等容積のイソプロパノールを加えて、−２０℃で終夜放置した。沈殿したＲＮＡをSorvall SS34回転器中、９,０００ｒｐｍで、１５分間、遠心沈殿し、７０％エタノール中で洗浄した。ペレットをＲＮアーゼの無い水３００μｌに再溶解させ、緩衝液(Promega) ３５μｌ、ＤＴＴ５μｌ、ＲＮＡｓｉｎ７μｌおよびＤＮアーゼ８μｌを加えた。管を３７℃で３０分間インキュベートし、汚染しているゲノムＤＮＡを除去し、フェノール／クロロホルムで一回抽出し、１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容積の１００％エタノールで再沈殿した。ＲＮＡを遠心沈殿し、ＲＮアーゼの無い水中に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保存した。
【０４５０】
ＡＩ_包括的_パネル_ｖ１.０
ＡＩ_包括的_パネル_ｖ１.０のためのプレートは、Backus HospitalおよびClinomics (Frederick, MD)から取得した手術および検死ヒト組織から単離されたｃＤＮＡから成る２個の対照穴および８９個の試験試料を含む。Backus Hospitalからの組織試料から、全ＲＮＡをCuraGenの施設で抽出した。他の組織からの全ＲＮＡは、Clinomicsから取得した。
【０４５１】
滑液、滑膜、骨および軟骨を含む関節組織を、Backus Hospitalで全膝または臀部置換手術を行った患者から取得した。直ぐ後で、組織試料を液体窒素中で素早く凍結し、単離されたＲＮＡが最適な品質であり分解していないことを保証した。変形性関節炎および慢性関節リウマチの関節組織のさらに別の試料を、Clinomicsから取得した。正常な対照組織はClinomicsから供給され、そして外傷犠牲者の剖検の間に取得された。
【０４５２】
乾癬組織および隣接のマッチド組織の手術標本は、全ＲＮＡとしてClinomicsから取得した。二人の男性および二人の女性患者を年齢２５歳から４７歳から選択した。いずれの患者も、試料が単離されたときには、処方薬剤を服用していなかった。
【０４５３】
潰瘍性大腸炎およびクローン病を持つ患者からの疾患結腸ならびに隣接のマッチド組織の手術標本は、Clinomicsから取得した。年齢４１〜６９歳の間の三人の女性および三人の男性のクローン病患者からの腸組織を用いた。二人の患者は処方医薬品を受けていなかった一方で、他はデキサメタゾン、フェノバルビタールまたはタイレノールを服用していた。潰瘍性大腸炎組織は、三人の男性および四人の女性患者からのものであった。患者のうち四人はレブビドを服用し、二人はフェノバルビタールを受けていた。
【０４５４】
無疾患または肺気腫、喘息またはＣＯＰＤを持つ外傷被害者の検死肺組織からの全ＲＮＡを、Clinomicsから購入した。年齢４０〜７０歳の範囲にわたる肺気腫患者は、すべて喫煙者であって、この年齢範囲は、タバコ関連の肺気腫を持つ患者に焦点を当てかつアルファ−１抗−トリプシン欠乏症を持つそれらの患者を除外するために、選択された。喘息患者は、年齢３６〜７５歳の範囲にわたり、そしてＣＯＰＤを持つ可能性のあるそれらの患者を阻止するために喫煙者を除外した。ＣＯＰＤ患者は、年齢３５〜８０歳の範囲にわたり、喫煙者および非喫煙者の両方を含んでいた。大部分の患者は、コルチコステロイドおよび気管支拡張剤を服用していた。
【０４５５】
ＡＩ_包括的_パネル_V１.０パネルの中の組織を同定するために使用するラベルの中で、以下の略語を用いる。
ＡＩ：  自己免疫
Ｓｙｎ：  滑液
Normal：  明白な疾患なし
Ｒｅｐ２２／Ｒｅｐ２０：個別の患者
ＲＡ：  慢性関節リウマチ
Backus：  Backus Hospitalから
ＯＡ：  変形性関節炎
(ＳＳ)(ＢＡ)(ＭＦ)：個別の患者
Ａｄｊ：隣接組織
Match control：隣接組織
−Ｍ：  男性
−Ｆ：  女性
ＣＯＰＤ：  慢性閉塞性肺疾患
【０４５６】
パネル５Ｄおよび５Ｉ
パネル５Ｄおよび５Ｉのためのプレートは、２個の対照穴および代謝性疾患を強調するヒト組織および細胞株から単離された種々のｃＤＮＡを含む。代謝組織を、Gestational Diabetes(妊娠性糖尿病)研究に登録された患者から取得した。ヒト間葉幹細胞からの脂肪細胞の分化の種々の段階中で、細胞を取得した。また、ヒト膵臓島細胞も取得した。
【０４５７】
Gestational Diabetes(妊娠性糖尿病)研究では対象は、若くて(１８〜４０歳)、日常的な(選択的)帝王切開術を行う妊娠性糖尿病の有無以外は健康な婦人である。幼児出産後、外科的切開が修復／縫合されているとき、産科医がそれぞれの外科的レベルの縫合中に露出された代謝組織の小量の試料(＜１ｃｃ)を摘出した。生検物質は、無菌生理食塩液ですすぎ洗いされ、水分を吸取り、摘出時から５分以内に迅速凍結された。次いで、組織は液体窒素中で急速冷凍され、個別に無菌のねじ蓋管に入れられて保存され、CuraGenへの輸送のためにまたは採取されるまでドライアイス上に置かれた。興味のある代謝組織としては、子宮壁(平滑筋)、内臓脂肪、骨格筋(直筋)および皮下脂肪が挙げられる。患者の説明は以下の通りである。
患者２        糖尿病ラテンアメリカ系、過体重、インスリン非服用
患者７〜９    非糖尿病白人系で肥満(ＢＭＩ＞３０)
患者１０      糖尿病ラテンアメリカ系、過体重、インスリン服用
患者１１      非糖尿病アフリカ系米国人で過体重
患者１２      インスリン服用の糖尿病ラテンアメリカ系
【０４５８】
脂肪細胞の分化を、二つの複製のみを有するところのドナー３Ｕを除き、Osirus(Clonetics/Bio Whittakerの一部門)から３部で得られたドナー前駆細胞中で誘導した。Cloneticsの科学者は、CuraGenのためにヒト間葉幹細胞(ＨｕＭＳＣ)を、Mark F. Pittenger, et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells Science Apr 2 1999: 143-147に見られる公開されたプロトコルに基づいて単離し、成長させ、分化させた。Cloneticsから、ｍＲＮＡの単離およびｄｓ  ｃＤＮＡの生産に適するTrizol溶解物または凍結ペレットを得た。それぞれのドナーの一般的説明は、以下の通りである。
ドナー２および３Ｕ：  間葉幹細胞、未分化脂肪
ドナー２および３ＡＭ：  脂肪、中途分化脂肪
ドナー２および３ＡＤ：  脂肪、分化脂肪
【０４５９】
ヒト細胞株は、一般的にＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)、ＮＣＩまたはドイツがん細胞バンクから得られ、以下の組織群に入る：近位曲尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝臓ＨｅｐＧ２がん細胞、心臓一次間質細胞および副腎皮質腺腫細胞。これらの細胞をすべて標準的な推奨された条件下で培養し、ＲＮＡを標準的な手順を用いて抽出した。すべての試料をCuraGenで加工して、単鎖ｃＤＮＡを生産した。
【０４６０】
パネル５Ｉは、先に記載したすべての試料にDiabetic Research Institute at the University of Miami School of Medicineから取得した、５８歳女性患者からの膵島の追加を含む。膵島組織は外部業者で全ＲＮＡに加工されて、パネル５Ｉに加えるためにCuraGenに運ばれた。
【０４６１】
５Ｄおよび５Ｉパネル中の組織を確認するために使用されるラベルでは、以下の略語を用いる：
ＧＯ Adipose：  大網膜脂肪
ＳＫ：  骨格筋
ＵＴ：  子宮
ＰＬ：  胎盤
ＡＤ：  分化脂肪
ＡＭ：  中途分化脂肪
Ｕ：  未分化幹細胞
【０４６２】
パネルＣＮＳＤ.０１
パネルＣＮＳＤ.０１のためのプレートは、２個の対照穴とthe Harvard Brain Tissue Resource Centerから取得した検死ヒト脳組織から単離されたｃＤＮＡから成る９４個の試験試料を含む。脳を、死後４〜２４時間の間のドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者が切片にし、液体窒素蒸気中−８０℃で凍結した。神経病理学者がすべての脳を切片にし、検査して、明確な関連する神経病理学で診断を確認する。
【０４６３】
疾患診断は患者記録からを取られる。パネルは以下の診断のそれぞれからの二つの脳を含む：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティントン病、進行性核上性麻痺、抑鬱、および「正常対照」。これらのそれぞれの脳内で、以下の領域が提示される：帯状回、側頭極、淡蒼球、黒質、Brodman４野(一次運動野)、Brodman７野(頭頂皮質)、Brodman９野(前前頭皮質)およびBrodman１７野(後頭皮質)。すべての場合において、脳領域のすべては提示されていない；例えば、ハンティントン病は、部分的に淡蒼球における神経変性を特徴とし、かくしてこの領域は確認されたハンティントン病の症例から取得することは不可能である。同じくパーキンソン病は、黒質の変性を特徴とし、この領域を取得するのをさらに困難にしている。正常対照脳の神経病理学検査を行い、神経変性と一致するいかなる病理もないことを見い出した。
【０４６４】
ＣＮＳパネル中の組織を確認するために使用するラベルでは、以下の略語を用いる。
ＰＳＰ：  進行性核上麻痺
Sub Nigra：  黒質
Glob Palladus：  淡蒼球
Temp Pole：  側頭極
Cing Gyr：  帯状回
ＢＡ４：  Brodman４野
【０４６５】
パネルＣＮＳ_神経変性_Ｖ１.０
パネルＣＮＳ_神経変性_Ｖ１.０のためのプレートは、２個の対照穴とthe Harvard Brain Tissue Resource Center (McLean Hospital)およびthe Human Brain and Spinal Fluid Resource Center (VA Greater Los Angeles Healthcare System)から取得した検死ヒト脳組織から単離したｃＤＮＡから成る４７個の試験試料を含む。脳を、死後４〜２４時間の間のドナーの頭蓋冠から取り出し、神経解剖学者が切片にし、液体窒素蒸気中−８０℃で凍結した。神経病理学者がすべての脳を切片にし、検査して明確な関連する神経病理学で診断を確認する。
【０４６６】
疾患診断は患者記録からを取られる。パネルは、アルツハイマー病(ＡＤ)疾患からの６個の脳および死亡前に痴呆の形跡を示さなかったところの「正常対照」からの８個の脳を含む。８個の正常対照脳は、二種の範疇に区分される：痴呆およびアルツハイマー様病理(対照)を持たない対照ならびに痴呆を持たないが重症アルツハイマー様病理、(特に０〜３の尺度でレベル３として評価される老人斑負荷；０＝斑形跡なし、３＝重症ＡＤ老人斑負荷)、の証拠を持つ対照。これらのそれぞれの脳内で、以下の領域が提示される：海馬、側頭皮質(Brodman２１野)、頭頂皮質(Brodman７野)および後頭皮質(Brodman１７野)。これらの領域は、ＡＤにおける全てのレベルを包含するために選択された。海馬はＡＤにおける初期および重症神経損失の領域であり；側頭皮質は海馬の後でＡＤにおいて神経変性を呈すと知られており；頭頂皮質は病気の後期段階で中程度の神経死を呈し；後頭皮質はＡＤにおいて生き長らえ、それ故にＡＤ患者内で「対照」領域として働く。すべての場合において、脳領域のすべては提示されていない。
【０４６７】
ＣＮＳ_神経変性_Ｖ１.０パネル中の組織を確認するために使用するラベルでは、以下の略語を用いる。
ＡＤ：  アルツハイマー病脳；患者は痴呆になり、剖検でＡＤ様病理を呈した。
Control：  対照脳；痴呆でない患者、神経病理を呈さない
Control(Path)：  対照脳；痴呆ではないが重症ＡＤ様病理を呈する患者
Sup  Temporal  Ctx：上側頭皮質
Inf  Temporal  Ctx：下側頭皮質
【０４６８】
Ａ．ＧＧ１００１００４０４−０１：フィブロネクチン−マレエートデヒドロゲナーゼ
遺伝子ＣＧ１００１０４−０１の発現は、表ＡＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ４１６２を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果は、表ＡＢおよびＡＣに示す。
【０４６９】
【表１６４】
2005506054.tif 000165
【０４７０】
【表１６５】
2005506054.tif 000166
【０４７１】
表ＡＢの続き
【表１６６】
2005506054.tif 000167
【０４７２】
【表１６７】
2005506054.tif 000168
【０４７３】
表ＡＣの続き
【表１６８】
2005506054.tif 000169
【０４７４】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１６２
ＣＧ１００１０４−０１遺伝子の非常に高い発現性は、排他的に精巣から検出される(ＣＴ＝２８.５)。したがって、この遺伝子の発現は、精巣試料をこのパネルで使用されている他の試料と区別するのに使用され得る。さらに、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、精巣関連疾患、例えば生殖能力および性機能低下症の処置において有用であり得る。
【０４７５】
さらに、この遺伝子の低発現性はまた、卵巣癌ＯＶＣＡＲ−８−セルラインで検出される(ＣＴ＝３３.４)。したがって、このタンパク質生成物の治療的モジュレーションは、卵巣癌の処置において有用であり得る。
【０４７６】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１６２
ＣＧ１００１０４−０１遺伝子の非常に高い発現性は、腎臓で検出される(ＣＴ＝２９.９)。この遺伝子の発現は、正常な肺、胸腺および腎臓で排他的に見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの組織試料をこのパネルにおける他の試料と区別するのに使用され得る。さらに、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、肺および腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患の処置に有益であり得る。
【０４７７】
Ｂ．ＣＧ５６７８５−０１：ミトコンドリアＧＴＰ：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ
表ＢＡに記載した通り、プライマー‐プローブセットＡｇ３０３６を用いて遺伝子ＣＧ５６７８５−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＢＢ、ＢＣおよびＢＤに示す。
【０４７８】
【表１６９】
2005506054.tif 000170
【０４７９】
【表１７０】
2005506054.tif 000171
【０４８０】
【表１７１】
2005506054.tif 000172
【０４８１】
表ＢＣの続き
【表１７２】
2005506054.tif 000173
【０４８２】
【表１７３】
2005506054.tif 000174
【０４８３】
表ＢＤの続き
【表１７４】
2005506054.tif 000175
【０４８４】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ３０３６
このパネルは、アルツハイマー病ではＣＧ５６７８５−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳におけるこの遺伝子の存在を示している。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０４８５】
パネル１.３Ｄ要約：Ａｇ３０３６
ＣＧ５６７８５−０１遺伝子の発現は、骨髄で排他的に検出される(ＣＴ＝３４.６)。この遺伝子は、様々な血液疾患でダウンレギュレーションされることが示された(Waller HD、Klin Wochenschr １９７８年５月１５日、５６(１０)：４８３−９１)、アデニル酸キナーゼファミリーの推定構成員をコードする。すなわち、この遺伝子の発現は、この試料とこのパネルにおける他の試料とを区別し、骨髄および赤血球のマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、血液疾患および白血病の処置に有用であり得る。
【０４８６】
パネル４Ｄ要約：Ａｇ３０３６
ＣＧ５６７８５−０１遺伝子の発現は、休止単核細胞で排他的に見られる(ＣＴ＝３３.３)。この発現は、パネル１.３Ｄでの発現と一致する。この系統の休止細胞におけるこの遺伝子の発現は、この転写物によりコードされるタンパク質が免疫ホメオスタシスに伴う正常な免疫学的プロセスに関与し得ることを示唆している。
【０４８７】
Ｃ．ＣＧ５６９１４−０１：トロンボスポンジン
表ＣＡおよびＣＢに記載された、プライマープローブセットＡｇ３１０８およびＡｇ３８９９を用いて、遺伝子ＣＧ５６９１４−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＣＣ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＨおよびＣＩに示す。
【０４８８】
【表１７５】
2005506054.tif 000176
【０４８９】
【表１７６】
2005506054.tif 000177
【０４９０】
【表１７７】
2005506054.tif 000178
【０４９１】
表ＣＣの続き
【表１７８】
2005506054.tif 000179
【０４９２】
【表１７９】
2005506054.tif 000180
【０４９３】
表ＣＤの続き
【表１８０】
2005506054.tif 000181
【０４９４】
【表１８１】
2005506054.tif 000182
【０４９５】
表ＣＥの続き
【表１８２】
2005506054.tif 000183
【０４９６】
【表１８３】
2005506054.tif 000184
【０４９７】
表ＣＦの続き
【表１８４】
2005506054.tif 000185
【０４９８】
【表１８５】
2005506054.tif 000186
【０４９９】
表ＣＧの続き
【表１８６】
2005506054.tif 000187
【０５００】
【表１８７】
2005506054.tif 000188
【０５０１】
表ＣＨの続き
【表１８８】
2005506054.tif 000189
【０５０２】
【表１８９】
2005506054.tif 000190
【０５０３】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ３８９９／Ａｇ３９６０／Ａｇ４３３８
２種の異なるプライマーおよびプローブセットによる３実験の結果は極めて一致しており、ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現はＣＮＳ癌(アストロ)ＳＮＢ−７５セルラインで見られる(ＣＴ＝２３〜２６)。さらに、この遺伝子の非常に高度の発現は、ＣＮＳ癌セルライン、結腸癌組織、腎臓癌セルラインＵＯ−３１、乳癌および黒色腫セルラインで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの試料をパネルにおける他の試料と区別し、またこれらの癌の検出用マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の活性の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通し、これらの癌の処置において有益なものであり得る。
【０５０４】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において低〜中度レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０５０５】
興味深いことに、この遺伝子は、対応する成人組織(ＣＴ＝３３〜３５)と比べた場合、胎児肝臓(ＣＴ＝３１〜３２)および肺(ＣＴ＝２８)においてかなり高いレベルで発現される。この観察結果は、この遺伝子の発現がこれらの胎児組織を対応する成人組織と区別するのに使用され得ることを示唆している。
【０５０６】
ＨＡＳＳパネルｖ１.０要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子は、このパネルにおけるＭＣＦ−７細胞および神経膠腫試料により発現される。この遺伝子の発現は、ＭＣＦ−７細胞では血清依存的である。このため、発現は、血清から見出されるサイトカインおよび細胞外分子により調節され得る。この遺伝子のモジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗生物質の使用を通して、神経膠腫の処置に有益なものであり得る。
【０５０７】
パネル１.３Ｄ要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで検出される(ＣＴ＝２７)。さらに、この遺伝子の発現はまた、黒色腫、乳癌、肺癌、星状細胞腫セルラインおよび結腸癌の十分〜中程度分化(ＯＤＯ３８６６)組織で見られる。この遺伝子の記載についてはパネル１.４参照。
【０５０８】
パネル２.１要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫転移試料で検出される(ＣＴ＝２９)。さらに、この遺伝子の発現は、隣接癌腫組織と比べ正常肝臓において、および乳癌(ＯＤ０４５９０−０１)(ＣＴ＝３６.７)と比べて転移乳癌(ＯＤ０４５９０−０３)(ＣＴ＝３３)において高くなっている。すなわち、この遺伝子の発現は、潜在的に癌転移マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、肺癌、乳癌および黒色腫の処置において有用であり得る。
【０５０９】
パネル４.１Ｄ要約Ａｇ３８９９
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、肺で見られる(ＣＴ＝３０.３)。さらに、この遺伝子の中〜低レベルの発現は、ＨＵＶＥＣ細胞、肺および皮膚線維芽細胞で見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質で設計された抗体または小分子治療薬は、炎症性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫並びに乾癬を含む皮膚疾患の処置において重要であり得る。
【０５１０】
パネル４Ｄ要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は肺で見られる(ＣＴ＝２８.６)。一般的に、このパネルにおける発現は、パネル４.１Ｄでの発現と正当に一致している。この遺伝子の顕著な発現はまた、ＨＰＡＥＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、肺線維芽細胞、ＴＮＦアルファ＋ＩＬ１ベータ処置気管支上皮および皮膚線維芽細胞でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、炎症性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫並びに乾癬を含む皮膚疾患の処置において重要であり得る。
【０５１１】
さらに、この遺伝子の低発現性はまた、腎臓および結腸でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患、例えば狼瘡および糸球体腎炎、並びに炎症性腸疾患、例えばクローン病の処置で重要であり得る。
【０５１２】
興味深いことに、この遺伝子の発現は、休止好塩基性細胞と比べると(ＣＴ＝３６)ＰＭＡ／イオノマイシン処置好塩基性細胞において刺激される(ＣＴ＝３０)。好塩基性細胞は、アレルゲンに応答してヒスタミンおよび他の生物学的修飾因子を放出し、喘息および過敏性反応の病理において重要な役割を演じる。したがって、この遺伝子によりコードされる推定タンパク質に対して設計された治療薬は、これらの病気における好塩基性細胞の機能を遮断することにより、炎症を低減化または阻害し得る。さらに、これらの細胞は、様々な炎症性肺および腸疾患、例えば喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎に関与する炎症性細胞についての論理的モデルである。したがって、この遺伝子産物の機能を調節する治療薬は、喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎に罹った患者の徴候を低減化または排除し得る。
【０５１３】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ３１０８／Ａｇ３９６０
異なるプローブおよびプライマーセットによる２実験は、極めて一致した結果をもたらす。ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は、転移性黒色腫(ＣＴ＝３０〜３１)で見られる。この結果はパネル２Ｄと一致している。さらに、この遺伝子の発現は、正常隣接組織と比べた場合、腎臓および肺癌で高くなっている。すなわち、この遺伝子の発現は、このパネルにおける他の試料からこれらの試料を識別するのに、そしてこれらの癌についてのマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子または遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有用であり得る。
【０５１４】
Ｄ．ＣＧ５６９１４−０２：ＴＳＰ、ＩＧ ＥＧＦドメイン含有タンパク質
表ＤＡ、ＤＢ、ＤＣ、ＤＤ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＤＩ、ＤＪおよびＤＫに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ１３１５ｂ、Ａｇ１３１６ｂ、Ａｇ１９２４、Ａｇ３１０８、Ａｇ７７１、Ａｇ７７２、Ａｇ９００、Ａｇ３８９９、Ａｇ３９６０、Ａｇ４３３８およびＡｇ３４３を用いて遺伝子ＣＧ５６９１４−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行結果を表ＤＬ、ＤＭ、ＤＮ、ＤＯ、ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ、ＤＳおよびＤＴに示す。
【０５１５】
【表１９０】
2005506054.tif 000191
【０５１６】
【表１９１】
2005506054.tif 000192
【０５１７】
【表１９２】
2005506054.tif 000193
【０５１８】
【表１９３】
2005506054.tif 000194
【０５１９】
【表１９４】
2005506054.tif 000195
【０５２０】
【表１９５】
2005506054.tif 000196
【０５２１】
【表１９６】
2005506054.tif 000197
【０５２２】
【表１９７】
2005506054.tif 000198
【０５２３】
【表１９８】
2005506054.tif 000199
【０５２４】
【表１９９】
2005506054.tif 000200
【０５２５】
【表２００】
2005506054.tif 000201
【０５２６】
【表２０１】
2005506054.tif 000202
【０５２７】
表ＤＬの続き
【表２０２】
2005506054.tif 000203
【０５２８】
表ＤＬの続き
【表２０３】
2005506054.tif 000204
【０５２９】
【表２０４】
2005506054.tif 000205
【０５３０】
表ＤＭの続き
【表２０５】
2005506054.tif 000206
【０５３１】
【表２０６】
2005506054.tif 000207
【０５３２】
表ＤＮの続き
【表２０７】
2005506054.tif 000208
【０５３３】
【表２０８】
2005506054.tif 000209
【０５３４】
表ＤＯの続き
【表２０９】
2005506054.tif 000210
【０５３５】
【表２１０】
2005506054.tif 000211
【０５３６】
表ＤＰの続き
【表２１１】
2005506054.tif 000212
【０５３７】
【表２１２】
2005506054.tif 000213
【０５３８】
表ＤＱの続き
【表２１３】
2005506054.tif 000214
【０５３９】
【表２１４】
2005506054.tif 000215
【０５４０】
表ＤＲの続き
【表２１５】
2005506054.tif 000216
【０５４１】
表ＤＲの続き
【表２１６】
2005506054.tif 000217
【０５４２】
【表２１７】
2005506054.tif 000218
【０５４３】
表ＤＳの続き
【表２１８】
2005506054.tif 000219
【０５４４】
【表２１９】
2005506054.tif 000220
【０５４５】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ３８９９／Ａｇ３９６０／Ａｇ４３３８
２種の異なるプライマーおよびプローブセットによる３実験の結果は極めて一致しており、ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、ＣＮＳ癌(アストロ)ＳＮＢ−７５セルラインで見られる(ＣＴ＝２３〜２６)。さらに、この遺伝子の非常に高度の発現は、ＣＮＳ癌セルライン、結腸癌組織、腎癌セルラインＵＯ−３１、乳癌および黒色腫セルラインで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの試料をパネルにおける他の試料と区別し、またこれらの癌の検出用マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の活性の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通し、これらの癌の処置において有益なものであり得る。
【０５４６】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において低〜中度レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０５４７】
興味深いことに、この遺伝子は、対応する成人組織(ＣＴ＝３３〜３５)と比べた場合、胎児肝臓(ＣＴ＝３１〜３２)および肺(ＣＴ＝２８)においてかなり高いレベルで発現される。この観察結果は、この遺伝子の発現がこれらの胎児組織を対応する成人組織と区別するのに使用され得ることを示唆している。
【０５４８】
ＨＡＳＳパネルｖ１.０要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０２遺伝子は、このパネルにおけるＭＣＦ−７細胞および神経膠腫試料により発現される。この遺伝子の発現は、ＭＣＦ−７細胞では血清依存的である。このため、発現は、血清から見出されるサイトカインおよび細胞外分子により調節され得る。この遺伝子のモジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗生物質の使用を通して、神経膠腫の処置に有益なものであり得る。
【０５４９】
パネル１要約：Ａｇ３４３
ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は、乳癌ＭＤＡ−Ｎセルラインで検出される(ＣＴ＝２６)。さらに、この遺伝子の非常に高度の発現はまた、黒色腫、星状細胞腫、および肺癌セルラインで観察される。この遺伝子の記載についてはパネル１.４参照。
【０５５０】
パネル１.２要約：Ａｇ７７１／Ａｇ７７２
２実験は非常に一致した結果をもたらし、ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで見られる(ＣＴ＝２５)。高レベルの発現はまた、黒色腫、胸部および脳の癌セルラインからの試料のクラスターで見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、黒色腫試料およびこのパネルにおける他の試料を区別するため、そしてこれらの癌の存在を検出するマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、黒色腫、胸部および脳の癌の処置において有効であり得る。
【０５５１】
パネル１.３Ｄ要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで検出される(ＣＴ＝２７)。さらに、この遺伝子の発現はまた、黒色腫、乳癌、肺癌、星状細胞腫セルラインおよび結腸癌の十分〜中程度分化(ＯＤＯ３８６６)組織で見られる。この遺伝子の記載についてはパネル１.４参照。
【０５５２】
パネル２.１要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫転移試料で検出される(ＣＴ＝２９)。さらに、この遺伝子の発現は、隣接癌腫組織と比べ正常肝臓において、および乳癌(ＯＤ０４５９０−０１)(ＣＴ＝３６.７)と比べて転移乳癌(ＯＤ０４５９０−０３)(ＣＴ＝３３)において高くなっている。すなわち、この遺伝子の発現は、潜在的に癌転移マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、肺癌、乳癌および黒色腫の処置において有用であり得る。
【０５５３】
パネル４.１Ｄ要約Ａｇ３８９９／Ａｇ３９６０／Ａｇ４３３８
２種の異なるプライマーおよびプローブセットによる３実験の結果は極めて一致しており、ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は肺で見られる(ＣＴ＝３０〜３１)。さらに、この遺伝子の顕著な発現は、ＨＵＶＥＣ細胞、肺線維芽細胞および皮膚線維芽細胞で見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質で設計された抗体または小分子治療薬は、炎症性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫並びに乾癬を含む皮膚疾患の処置において重要であり得る。
【０５５４】
さらに、この遺伝子の低発現性はまた腎臓でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、腎機能を調節し、腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患、例えば狼瘡および糸球体腎炎の処置で重要であり得る。
【０５５５】
パネル４Ｄ要約：Ａｇ３１０８
ＣＧ５６９１４−０１遺伝子の非常に高度の発現は肺で見られる(ＣＴ＝２８.６)。一般的に、このパネルにおける発現は、パネル４.１Ｄでの発現と相応に一致している。この遺伝子の顕著な発現はまた、ＨＰＡＥＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、肺線維芽細胞、ＴＮＦアルファ＋ＩＬ１ベータ処置気管支上皮および皮膚線維芽細胞でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、炎症性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび肺気腫並びに乾癬を含む皮膚疾患の処置において重要であり得る。
【０５５６】
さらに、この遺伝子の低発現性はまた、腎臓および結腸でも見られる。したがって、この遺伝子によりコードされるタンパク質により設計された抗体または小分子治療薬は、腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患、例えば狼瘡および糸球体腎炎、並びに炎症性腸疾患、例えばクローン病の処置で重要であり得る。
【０５５７】
興味深いことに、この遺伝子の発現は、休止好塩基性細胞と比べると(ＣＴ＝３６)ＰＭＡ／イオノマイシン処置好塩基性細胞において刺激されている(ＣＴ＝３０)。好塩基性細胞は、アレルゲンに応答してヒスタミンおよび他の生物学的修飾因子を放出し、喘息および過敏性反応の病理において重要な役割を演じる。したがって、この遺伝子によりコードされる推定タンパク質に対して設計された治療薬は、これらの病気における好塩基性細胞の機能を遮断することにより、炎症を低減化または阻害し得る。さらに、これらの細胞は、様々な炎症性肺および腸疾患、例えば喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎に関与する炎症性細胞についての論理的モデルである。したがって、この遺伝子産物の機能を調節する治療薬は、喘息、クローン病および潰瘍性大腸炎に罹った患者の徴候を低減化または排除し得る。
【０５５８】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ３１０８／Ａｇ３９６０
異なるプローブおよびプライマーセットによる２実験は、極めて一致した結果をもたらす。ＣＧ５６９１４−０２遺伝子の非常に高度の発現は、転移性黒色腫(ＣＴ＝３０〜３１)で見られる。この結果はパネル２Ｄと一致している。さらに、この遺伝子の発現は、正常隣接組織と比べた場合、腎臓および肺癌で高くなっている。すなわち、この遺伝子の発現は、このパネルにおける他の試料からこれらの試料を識別するのに、そしてこれらの癌についてのマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子または遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有用であり得る。
【０５５９】
Ｅ．ＣＧ５７２４２−０１：ＫＩＡ００９０
表ＥＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ３１４６を用いて遺伝子ＣＧ５７２４２−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＥＢ、ＥＣおよびＥＤに示す。
【０５６０】
【表２２０】
2005506054.tif 000221
【０５６１】
【表２２１】
2005506054.tif 000222
【０５６２】
【表２２２】
2005506054.tif 000223
【０５６３】
表ＥＣの続き
【表２２３】
2005506054.tif 000224
【０５６４】
【表２２４】
2005506054.tif 000225
【０５６５】
表ＥＤの続き
【表２２５】
2005506054.tif 000226
【０５６６】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ３１４６
このパネルは、アルツハイマー病ではＣＧ５７２４２−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳におけるこの遺伝子の存在を確認している。この遺伝子の記載についてはパネル１.３Ｄ参照。
【０５６７】
パネル１.３Ｄ要約：Ａｇ３１４６
ＣＧ５７２４２−０１の非常に高度の発現は、脳の癌セルラインで見られる(ＣＴ＝２９)。この遺伝子はこのパネルで遍在的に発現され、顕著なレベルの発現はまた、卵巣、肺、肝臓および脳の癌由来のセルラインのクラスターで見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの癌についてのマーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、肺、肝臓、卵巣および脳の癌の処置において有用であり得る。
【０５６８】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺および成人および胎児骨格筋、心臓および肝臓において中〜低レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範囲に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０５６９】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０５７０】
パネル４Ｄ要約：Ａｇ３１４６
ＣＧ５７２４２−０１の非常に高度の発現は、イオノマイシンで処理したＢセルラインＲａｍｏｓで見られる(ＣＴ＝２６.５)。この遺伝子はこのパネルで遍在的に発現され、休止Ｔ細胞と比べた場合活性化Ｔ細胞で僅かに高いレベルの発現が見られる。さらに、顕著なレベルの発現は、ＰＷＭ処理ＰＢＭＣおよびＢリンパ球で見られる。顕著なレベルの発現はまた、健康な状態および病気における免疫応答で重要な細胞型の範囲、例えばｄ内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに肺および皮膚からの上皮および線維芽細胞型、および腸、肺、胸腺および腎臓により表される正常組織で見られる。この遍在的発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程にかかわり得ることを示唆している。このパターンはパネル１.３における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０５７１】
Ｆ．ＣＧ５７２７９−０２およびＣＧ５７２７９−０４およびＣＧ５７２７９−０５：補体崩壊促進因子
表ＦＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０６０を用いて、遺伝子ＣＧ５７２７９−０２、変異体ＣＧ５７２７９−０４および完全長物理的クローンＣＧ５７２７９−０５の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行結果を表ＦＢおよびＦＣに示す。
【０５７２】
【表２２６】
2005506054.tif 000227
【０５７３】
【表２２７】
2005506054.tif 000228
【０５７４】
表ＦＢの続き
【表２２８】
2005506054.tif 000229
【０５７５】
【表２２９】
2005506054.tif 000230
【０５７６】
表ＦＣの続き
【表２３０】
2005506054.tif 000231
【０５７７】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４０６０
ＣＧ５７２７９−０１遺伝子の発現は、肺癌セルラインで非常に高い(ＣＴ＝１９.４)。すなわち、この遺伝子の発現は、このパネル上の他の試料からこの試料を識別するのに、そして肺癌マーカーとして使用され得る。発現はまた、成人肺における発現と比べた場合(ＣＴ＝２５)、胎児肺および前立腺癌セルラインで顕著に高い(ＣＴ＝２０.８)。すなわち、この遺伝子の発現は、成人および胎児肺組織間の識別に使用され得る。セルラインおよび胎児組織は正常成人組織より増殖性が高いため、この発現プロファイルは、この遺伝子が細胞増殖に掛かり合い得ることを示唆している。さらに、この遺伝子は、ヒト肺癌で過剰発現されることが示されており、癌が免疫監視機構を回避するのを助けると考えられている(Varsano S, Am J Respir Cell Mol Biol １９８８年９月、１９(３)：５２２−９)、崩壊促進因子と相同性を有する。したがって、この遺伝子の発現または機能のモジュレーションは、肺および前立腺癌の処置に有用であり得る。
【０５７８】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、胎児肝臓および成人および胎児骨格筋および心臓において高レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範囲に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。さらに、この遺伝子は、成人対応組織(ＣＴ＝２８.９)における発現と比較した場合、胎児肝臓組織(ＣＴ＝２５)においてかなり高レベルで発現される。すなわち、この遺伝子の発現は、この組織の胎児および成人供給源間の識別に使用され得る。
【０５７９】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜高レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０５８０】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０６０
ＣＧ５７２７９−０１遺伝子はこのパネルで遍在的に発現され、顕著に高い発現レベルはＴＮＦ−アルファ／ＩＬ−１ベータ刺激好中球で見られる(ＣＴ＝２３.６)。すなわち、この遺伝子の発現は、このパネル上の他の試料からこの試料を識別するのに、そして活性化好中球マーカーとして使用され得る。この遺伝子は、崩壊促進因子と相同的な分子、補体調節タンパク質をコードする。ヒト多型核白血球(ＰＭＮ)は、相同性補体による損傷からそれらを保護するタンパク質を発現する。ＴＮＦ−ａおよびＬＰＳで処理した好中球におけるＣＧ５７２７９−０１遺伝子産物のアップレギュレーションは、炎症組織における防御機構の指標であり得る。したがって、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、炎症の分解、創傷治癒の促進および免疫複合体仲介疾患の処置において有効であり得る。さらに、この遺伝子産物の発現プロファイルおよび相同性に基くと、この遺伝子および／または遺伝子産物の治療的モジュレーションはまた、臓器移植の免疫抑制剤として作用し得る。
【０５８１】
Ｇ．ＣＧ９４６３０−０１：ＭＨＣクラスＩ抗原
表ＧＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ３９３１を用いて遺伝子ＣＧ９４６３０−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＧＢ、ＧＣ、ＧＤおよびＧＥに示す。
【０５８２】
【表２３１】
2005506054.tif 000232
【０５８３】
【表２３２】
2005506054.tif 000233
【０５８４】
【表２３３】
2005506054.tif 000234
【０５８５】
表ＧＣの続き
【表２３４】
2005506054.tif 000235
【０５８６】
【表２３５】
2005506054.tif 000236
【０５８７】
表ＧＤの続き
【表２３６】
2005506054.tif 000237
【０５８８】
【表２３７】
2005506054.tif 000238
【０５８９】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ３９３１
このパネルは、独立した個体群の脳における低レベルでのＣＧ９４６３０−０１遺伝子の発現を確認している。しかしながら、この遺伝子の差次的発現は、この実験においてアルツハイマー罹患剖検脳および非痴呆対照の剖検脳間からは検出されなかった。この遺伝子の記載についてはパネル１.４を参照。
【０５９０】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ３９３１
ＣＧ９４６３０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、乳癌Ｔ４７Ｄセルラインで検出される(ＣＴ＝２２.７)。一般に、この遺伝子の高い発現は、胸部、卵巣、胃、腸、膵臓およびＣＮＳ癌セルラインのクラスターで検出される。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌についての診断マーカーとして使用され得る。また、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の活性の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通し、これらの癌の処置に有益であり得る。
【０５９１】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０５９２】
興味深いことに、この遺伝子の発現は、対応する成人または胎児組織(ＣＴ＝３１)と比べた場合、胎児肺および成人骨格筋(ＣＴ＝２７)において高いレベルで発現される。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの胎児および成人組織間の区別に使用され得る。
【０５９３】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む被験中枢神経系の全領域において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子は、中枢神経系疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病においてある一定の役割を演じ得る。
【０５９４】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ３９３１
ＣＧ９４６３０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、休止ＬＡＫ細胞において検出される(ＣＴ＝２５)。この遺伝子は、健康な状態および病気における免疫応答で重要な広範囲の細胞型において高〜中レベルで発現される。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに肺および皮膚からの上皮および線維芽細胞型、および腸、肺、胸腺および腎臓により表される正常組織の構成員が含まれる。この遍在的発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程に掛かり合い得ることを示唆している。このパターンは一般的スクリーニングパネルｖ１.４における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０５９５】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ３９３１
この遺伝子はこのパネルの組織の大部分において中レベルで発現され、最高レベルは腎臓癌試料で見られる(Ｃｔ＝２６.４８)。この遺伝子は、正常隣接組織と比べると、腸、肺および腎臓癌で高いレベルで発現される。この遺伝子の発現は、腫瘍を正常組織と区別するのに使用され得る。さらに、この遺伝子の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通して、腎臓、肺または腸癌の処置に有益であり得る。
【０５９６】
Ｈ．ＣＧ９４８３１−０１およびＣＧ９４８３１−０２：テトラスパン
表ＨＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ３９５７を用いて、遺伝子ＣＧ９４８３１−０１および完全長物理的クローンＣＧ９４８３１−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＨＢおよびＨＣに示す。ＣＧ９４８３１−０２は、ＣＧ９４８３１−０１遺伝子の完全長物理的クローンを表すものとし、遺伝子配列の予測を確認している。
【０５９７】
【表２３８】
2005506054.tif 000239
【０５９８】
【表２３９】
2005506054.tif 000240
【０５９９】
表ＨＢの続き
【表２４０】
2005506054.tif 000241
【０６００】
【表２４１】
2005506054.tif 000242
【０６０１】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ３９５７
ＣＧ９４８３１−０１遺伝子の非常に高度の発現は、卵巣癌セルラインで見られる(ＣＴ＝２７.２)。中レベルの発現はまた、腸癌セルラインで見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの試料をこのパネル上の他の試料と区別するのに、そして腸および卵巣癌のマーカーとして使用され得る。この遺伝子は、テトラスパニンと相同的である分子をコードし、それは、恐らく膜生物学において重要な役割を演じ、細胞活性化および増殖、接着および運動性、分化、および癌を含む多くの多様な過程で掛かり合うと思われる。テトラスパニンファミリーの構成員は、腫瘍血管新生に関係しており(Longo N,Blood ２００１年１２月１５日、９８(１３)：３７１７−２６)、癌によってはアップレギュレーションされる場合もあることが示された(Kanetaka K,J Hepatol ２００１年１１月、３５(５)：６３７−４２)。すなわち、この遺伝子の発現およびテトラスパニンとのその相同性に基くと、この遺伝子の発現または機能のモジュレーションは、卵巣および腸癌の処置に有用であり得る。
【０６０２】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、膵臓、甲状腺、胎児肝臓および成人および胎児骨格筋および心臓において中〜低レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範囲に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０６０３】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０６０４】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ３９５７
この遺伝子の発現は、正常腸試料では非常に高いと思われる(ＣＴ＝２８.１７)。さらに、正常隣接組織および黒色腫試料と比べると、肺、膀胱および前立腺癌試料での発現は実質的に増加していると思われる。すなわち、この遺伝子の発現は、これらの組織において正常細胞と腫瘍を区別するのに使用され得る。さらに、この遺伝子の治療的モジュレーションは、小分子薬剤または抗体の使用を通して、これらの癌の処置に有益であり得る。
【０６０５】
Ｉ．ＣＧ９４８９２−０１:Ｃｕｂドメイン含有膜タンパク質
表ＩＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０６１を用いて遺伝子ＣＧ９４８９２−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＩＢおよびＩＣに示す。
【０６０６】
【表２４２】
2005506054.tif 000243
【０６０７】
【表２４３】
2005506054.tif 000244
【０６０８】
表ＩＢの続き
【表２４４】
2005506054.tif 000245
【０６０９】
【表２４５】
2005506054.tif 000246
【０６１０】
表ＩＣの続き
【表２４６】
2005506054.tif 000247
【０６１１】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４０６１
ＣＧ９４８９２−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで見られる(ＣＴ＝２５.２)。すなわち、この遺伝子の発現は、この試料をこのパネル上の他の試料と区別するのに、そして黒色腫マーカーとして使用され得る。中レベルの発現はまた、腎臓、卵巣、前立腺および肺癌に由来するセルラインで見られる。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、腎臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌および黒色腫の処置に有用であり得る。
【０６１２】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０６１３】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０６１
ＣＧ９４８９２−０１遺伝子の非常に高度の発現は、腎臓で見られる(ＣＴ＝３１.６)。低いが顕著なレベルの発現はまた、活性化および未処理皮膚線維芽細胞およびケラチノサイト、ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−４活性化Ｂリンパ球および正常胸腺で検出される。すなわち、この遺伝子の発現は、腎臓をこのパネル上の他の試料と識別するのに、そして腎臓組織のマーカーとして使用され得る。さらに、この臓器におけるこの遺伝子の顕著な発現は、この遺伝子産物が腎臓の正常なホメオスタシスに関与し得ることを示唆している。したがって、このタンパク質の発現または機能の治療的モジュレーションは、狼瘡、糸球体腎炎および他の疾患による炎症中にこの臓器に対して機能を維持または回復させるのに有用であり得る。
【０６１４】
Ｊ．ＣＧ９５２２７−０１：コラーゲンアルファ２(VIII)鎖
表ＪＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０６２を用いて遺伝子ＣＧ９５２２７−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＪＢ、ＪＣおよびＩＤに示す。
【０６１５】
【表２４７】
2005506054.tif 000248
【０６１６】
【表２４８】
2005506054.tif 000249
【０６１７】
【表２４９】
2005506054.tif 000250
【０６１８】
表ＪＣの続き
【表２５０】
2005506054.tif 000251
【０６１９】
【表２５１】
2005506054.tif 000252
【０６２０】
表ＪＤの続き
【表２５２】
2005506054.tif 000253
【０６２１】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４０６２
このパネルは、独立した個体群の脳における低レベルでのＣＧ９５２２７−０１遺伝子の発現を確認している。しかしながら、この遺伝子の差次的発現は、この実験においてアルツハイマー罹患剖検脳および非痴呆対照の剖検脳間からは検出されなかった。この遺伝子の記載についてはパネル１.４を参照。
【０６２２】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４０６２
ＣＧ９５２２７−０１遺伝子の非常に高度の発現は、黒色腫セルラインで検出される(ＣＴ＝２４.５)。この遺伝子の中〜高度発現は、黒色腫、扁平上皮癌、胸部、卵巣、肺、腎臓、腸およびＣＮＳ癌セルラインで見られる。したがって、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の活性の治療的モジュレーションは、小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体の使用を通し、これらの癌の処置に有益であり得る。
【０６２３】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０６２４】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む被験中枢神経系の全領域において高レベルで発現される。したがって、この遺伝子は、中枢神経系疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病においてある一定の役割を演じ得る。
【０６２５】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０６２
ＣＧ９５２２７−０１遺伝子の非常に高度の発現は、休止マクロファージで検出される(ＣＴ＝２７.３)。興味深いことに、この遺伝子の発現は、休止細胞(ＣＴ＝２７〜３０)と比べて、ＬＰＳ処理マクロファージ(ＣＴ＝３０.３)およびサイトカイン処理ＬＡＫ細胞(ＣＴ＞３７)でダウンレギュレーションされている。さらに、この遺伝子の中〜低度発現は、活性化ＣＤ４５ＲＡ ＣＤ４リンパ球、ＰＭＡ／イオノマイシン処理ＬＡＫ細胞、ツーウェイＭＬＲ、樹状細胞、ＨＰＡＥＣ、肺および皮膚線維芽細胞並びに腸、肺、胸腺および腎臓により表される正常組織で検出される。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０６２６】
Ｋ．ＣＧ９６３８４−０１およびＣＧ９６３８４−０２：新規原形質膜タンパク質
表ＫＡおよびＫＢに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０９３およびＡｇ４０９２を用いて、遺伝子ＣＧ９６３８４−０１および完全長物理的クローンＣＧ９６３８４−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＫＣ、ＫＤおよびＫＥに示す。ＣＧ９６３８４−０２は、ＣＧ９６３８４−０１遺伝子の完全長物理的クローンを表すものとし、遺伝子配列の予測を確認している。
【０６２７】
【表２５３】
2005506054.tif 000254
【０６２８】
【表２５４】
2005506054.tif 000255
【０６２９】
【表２５５】
2005506054.tif 000256
【０６３０】
【表２５６】
2005506054.tif 000257
【０６３１】
表ＫＤの続き
【表２５７】
2005506054.tif 000258
【０６３２】
【表２５８】
2005506054.tif 000259
【０６３３】
表ＫＥの続き
【表２５９】
2005506054.tif 000260
【０６３４】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４０９３
このパネルは、アルツハイマー病におけるＣＧ９６３８４−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳におけるこの遺伝子の存在を確認しており、非常に高度の発現は対照患者の頭頂皮質で見られる(ＣＴ＝３２.３)。この遺伝子の記載についてはパネル１.４を参照。
【０６３５】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４０９２
ＣＧ９６３８４−０１遺伝子はこのパネルにおいて広範に発現され、非常に高い発現は腎臓で見られる(ＣＴ＝２９.４)。
【０６３６】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、胎児肝臓および成人および胎児骨格筋および心臓において中〜低レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０６３７】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０６３８】
この遺伝子の発現は、正常脳組織におけるよりも脳癌セルラインのクラスターにおける方が高いと思われる。すなわち、このタンパク質の発現または機能の治療的モジュレーションは、脳の癌の処置に有効であり得る。
【０６３９】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０９２
ＣＧ９６３８４−０１遺伝子はこのパネルで広範に発現され、非常に高度の発現は一次活性化Ｔｈ２細胞において検出される(ＣＴ＝３２.７)。この遺伝子はまた、健康な状態および病気における免疫応答で重要な広範囲の細胞型において高〜中レベルで発現される。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに皮膚線維芽細胞および胸腺および腎臓から表される正常組織の構成員が含まれる。この発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程に掛かり合い得ることを示唆している。このパターンは一般的スクリーニングパネルｖ１.４における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０６４０】
Ｌ．ＣＧ９６４３２−０１：ナトリウム／プロトン交換体
表ＬＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０５６を用いて、遺伝子ＣＧ９６４３２−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＬＢに示す。
【０６４１】
【表２６０】
2005506054.tif 000261
【０６４２】
【表２６１】
2005506054.tif 000262
【０６４３】
表ＬＢの続き
【表２６２】
2005506054.tif 000263
【０６４４】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０５６
ＣＧ９６４３２−０１遺伝子の発現は、休止単球およびＬＰＳ処理マクロファージに限られている(ＣＴ＝３４.２〜３４.８)。これらの細胞の機能は、膿瘍および腫瘍により生成された酸性微小環境にある間それらの要求される細胞質ｐＨを維持するナトリウム／プロトン交換体の活性に依存的である(Grinstein S,Clin Biochem １９９１年６月、２４(３)：２４１−７)。この特異的発現パターンは、このタンパク質の活性または機能の治療的モジュレーションが自己免疫疾患および癌の処置に有効であり得ることを示唆している。
【０６４５】
Ｍ．ＣＧ９７１０１−０１：関連するベンゾジアゼピン受容体
表ＭＡおよびＭＢに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４３４４およびＡｇ４３４３を用いて、遺伝子ＣＧ９７１０１−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＭＣに示す。
【０６４６】
【表２６３】
2005506054.tif 000264
【０６４７】
【表２６４】
2005506054.tif 000265
【０６４８】
【表２６５】
2005506054.tif 000266
【０６４９】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４３４４
このパネルは、独立した個体群の脳における低レベルでのＣＧ９７１０１−０１遺伝子の発現を確認している。この遺伝子の発現は、正常対照よりもアルツハイマー病脳の側頭皮質における方が高い(統計的信頼度レベル＞０.０６)。ＣＧ９７１０１−０１遺伝子は、ベンゾジアゼピン受容体関連タンパク質と類似したタンパク質をコードする。ベンゾジアゼピンは、脳シナプスに位置するタイプＡ ＧＡＢＡ(ガンマ‐アミノ酪酸)受容体でシグナル伝達を調節する。アルツハイマー病患者の側頭皮質におけるＧＡＢＡの既知喪失を仮定すると(Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol ２００１年２月、３６３(２)：１３９−４５)、ＣＧ９７１０１−０１遺伝子発現の改変は代償的(compensitory)であり得る。したがって、医薬によるＣＧ９７１０１−０１モジュレーションは、アルツハイマー病の処置において治療的価値を有し得る。
【０６５０】
Ｎ．ＣＧ９７１６８−０１：ＡＴＰ−結合カセット輸送体Ａ様
表ＮＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４０９４を用いて、遺伝子ＣＧ９７１６８−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＮＢに示す。
【０６５１】
【表２６６】
2005506054.tif 000267
【０６５２】
【表２６７】
2005506054.tif 000268
【０６５３】
表ＮＢの続き
【表２６８】
2005506054.tif 000269
【０６５４】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４０９４
ＣＧ９７１６８−０１遺伝子の発現は、ＩＬ−４処置皮膚線維芽細胞で排他的に見られる(ＣＴ＝３２)。したがって、この遺伝子の発現は、この試料をこのパネルにおける他の試料と区別するのに使用され得る。したがって、この遺伝子の治療的モジュレーションは、炎症性皮膚病、例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、潰瘍性皮膚炎、潰瘍性大腸炎の処置に有益であり得る。
【０６５５】
ＣＧ９７１６８−０１遺伝子は、ＡＴＰ結合性カセット(ＡＢＣ)輸送体をコードする。ＡＢＣ輸送体遺伝子は、細菌からヒトまでほとんどの生物体で遍在的に存在する。それらは、ＡＴＰを加水分解し、分子の広いアレイを輸送するかまたは他の輸送機構を刺激することにより分子の輸送を誘導する「トラフィックアデノシントリホスファターゼ」である。多くのＡＢＣ輸送体は、ヒト遺伝または散発性疾患、例えば嚢胞性線維症、副腎脳白質ジストロフィー、シュタルガルト病、薬剤耐性腫瘍、デュービン‐ジョンソン症候群、バイラー病、進行性家族性肝臓内胆汁うっ滞、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血および運動失調、幼児の持続性高インシュリン(hyperinsulimenic)低血糖症などに関与している(Efferth T.,２００１年、Curr Mol Med １(１)：４５−６５、PMID:１１８９９２４２)。
【０６５６】
線維芽細胞は、皮膚での炎症プロセス中におけるサイトカインの重要な供給源を構成する。インターロイキン−１は、活性化ヒト皮膚線維芽細胞で誘導される強力な多面発現性サイトカインである。さらにインターロイキン−１は、ケモカインのインターロイキン−８を含む多くの炎症メディエーターを誘導する。インターロイキン−１アルファおよびインターロイキン−１ベータは、シグナルペプチドを欠き、ＡＢＣ輸送体タンパク質を含む第二分泌経路を用いて原形質膜で輸送される。ＡＢＣ輸送体阻害剤グリベンクラミドは、ヒト皮膚線維芽細胞においてインターロイキン−１の外面化およびそれに続くインターロイキン−８のオートクリン誘導を阻止することが最近立証された(Lottaz et al.,２００１、J Invest Dermatol １１７(４)：８７１−６、PMID：１１６７６８２５)。すなわち、この遺伝子によりコードされるＡＢＣ輸送体の機能に拮抗する抗体および小分子は、皮膚の炎症性疾患に罹った患者における徴候を低減化または排除し得る。
【０６５７】
Ｏ．ＣＧ９７４２０−０１およびＣＧ９７４２０−０２：ＭＡＧＥ−ドメイン含有タンパク質
表ＯＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１２６を用いて、遺伝子ＣＧ９７４２０−０１および完全長物理的クローンＧ９７４２０−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＯＢ、ＯＣおよびＯＤに示す。ＣＧ９７４２０−０２は、ＣＧ９７４２０−０１遺伝子の完全長物理的クローンを表すものとし、遺伝子配列の予測を確認している。
【０６５８】
【表２６９】
2005506054.tif 000270
【０６５９】
【表２７０】
2005506054.tif 000271
【０６６０】
【表２７１】
2005506054.tif 000272
【０６６１】
表ＯＣの続き
【表２７２】
2005506054.tif 000273
【０６６２】
【表２７３】
2005506054.tif 000274
【０６６３】
表ＯＤの続き
【表２７４】
2005506054.tif 000275
【０６６４】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４１２６
このパネルは、アルツハイマー病においてＣＧ９７４２０３−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳におけるこの遺伝子の存在を確認している。この遺伝子の記載についてはパネル１.４を参照。
【０６６５】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１２６
ＣＧ９７４２０３−０１遺伝子の非常に高度の発現は、肺癌セルラインで見られる(ＣＴ＝３１.３)。高いレベルの発現はまた、正常組織試料での発現と比べた場合このパネル上の全セルラインでも見られる。この分布は、推定ＭＡＧＥドメインタンパク質としてのこのタンパク質の同定結果と一致している。ＭＡＧＥファミリー黒色腫抗原コード化遺伝子の構成員は、広く多様な腫瘍で発現されることが報告されている(Kirkin、Cancer Invest ２００２、２０(２)：２２２−３６)。すなわち、この遺伝子の発現は、癌のマーカーとして使用され得る。さらに、このタンパク質の発現または機能の治療的モジュレーションは、癌の処置において有用であり得る。
【０６６６】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、副腎、膵臓、甲状腺、胎児肝臓および成人および胎児骨格筋および心臓において低いが顕著なレベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０６６７】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１２６
ＣＧ９７４２０３−０１遺伝子の非常に高度の発現は慢性活性化Ｔｈ２細胞において検出される(ＣＴ＝３０.６)。さらに、この遺伝子はまた、健康な状態および病気における免疫応答で重要な広範囲の細胞型において中〜低レベルで発現される。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに肺および皮膚からの上皮および線維芽細胞型、および腸、肺、胸腺および腎臓により代表される正常組織の構成員が含まれる。この遍在的発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程に掛かり合い得ることを示唆している。このパターンは一般的スクリーニングパネルｖ１.４における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。さらに、ＭＡＧＥファミリーの構成員は、自己免疫疾患に関与し得る(McCurdy DK、Mol Genet Metab １９９８年１月、６３(１)：３−１３)。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０６６８】
Ｐ．ＣＧ９７４３０−０１：コラーゲンおよびスカベンジャー受容体ドメイン
表ＰＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１０８を用いて、遺伝子ＣＧ９７４３０−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＰＢおよびＰＣに示す。
【０６６９】
【表２７５】
2005506054.tif 000276
【０６７０】
【表２７６】
2005506054.tif 000277
【０６７１】
表ＰＢの続き
【表２７７】
2005506054.tif 000278
【０６７２】
【表２７８】
2005506054.tif 000279
【０６７３】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１０８
ＣＧ９７４３０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、肺癌セルラインＮＣＩ−Ｈ４６０で検出される(ＣＴ＝２７.７)。さらに、この遺伝子の高い発現はまた、乳癌、黒色腫、前立腺癌、２種の肺癌およびＣＮＳ癌セルラインで見られる。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌についての診断マーカーとして使用され得、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、小分子または抗体の使用を通し、これらの癌の処置において有用であり得る。
【０６７４】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０６７５】
ＣＧ９７４３０−０１遺伝子は、ウシマクロファージアセチル化ＬＤＬ受容体ＩおよびIIと類似したスカベンジャー受容体タンパク質をコードする。遺伝子操作が加えられたマウス系統を用いた最近の試験は、ＳＲ−ＢＩ、すなわちスカベンジャー受容体群の一員が、ＨＤＬ代謝、ステロイド合成組織へのコレステロール輸送および胆汁コレステロール分泌の調節において重要な役割を演じることを示している。さらに、ＳＲ−ＢＩは、アテローム性動脈硬化症の発現に対して防御し、正常な雌性生殖能力に必要とされる(Trigatti BおよびRigotti A.、２０００、Int J Tissue React ２２(２−３)：２９−３７、PMID：１０９３７３５２)。したがって、この試験と相関させると、この遺伝子によりコードされるスカベンジャー受容体タンパク質は、ＨＤＬ代謝においてある一定の役割を演じ得、すなわち、アテローム性動脈硬化心血管疾患の阻止および／または処置用の新規標的を表し得る。
【０６７６】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ４１０８
ＣＧ９７４３０−０１遺伝子は、このパネルにおける試料では低レベルで発現され、非常に高度の発現は正常腸試料で見られる(ＣＴ＝３２.１９)。それはまた、黒色腫試料およびこのパネル上の腎臓癌の単一試料で発現されている(ＣＴ＝３２〜３３)。すなわち、この遺伝子の発現は、黒色腫細胞についての診断マーカーとして、そして正常な腸または腎臓と腸または腎臓癌を区別するのに使用され得る。小分子薬剤、タンパク質治療薬または抗体を用いることによるこの遺伝子の治療的モジュレーションは、黒色腫、腎臓または腸癌の処置に有益なものであり得る。
【０６７７】
Ｑ．ＣＧ９７４４０−０１:ＣＵＢドメイン含有
表ＱＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１０９を用いて遺伝子ＣＧ９７４４０−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＱＢおよびＱＣに示す。
【０６７８】
【表２７９】
2005506054.tif 000280
【０６７９】
【表２８０】
2005506054.tif 000281
【０６８０】
表ＱＢの続き
【表２８１】
2005506054.tif 000282
【０６８１】
【表２８２】
2005506054.tif 000283
【０６８２】
表ＱＣの続き
【表２８３】
2005506054.tif 000284
【０６８３】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１０９
ＣＧ９７４４０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、脳癌セルラインで見られる(ＣＴ＝２５.９)。高いレベルの発現はまた、腸、胃、肺、肝臓、胸部、卵巣癌および黒色腫に由来する試料を含むこのパネルにおけるセルラインの多くで見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、癌マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子またはそのタンパク質生成物の発現または機能の治療的モジュレーションは、癌の処置において有用であり得る。
【０６８４】
代謝機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、および成人および胎児骨格筋、心臓、および肝臓において中〜低レベルで発現される。これらの組織間におけるこの広範に及ぶ発現は、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能においてある一定の役割を演じ得ること、およびこの遺伝子の発現の調節が乱れると、神経内分泌疾患または代謝疾患、例えば肥満および糖尿病が誘発され得ることを示唆している。
【０６８５】
この遺伝子はまた、海馬、視床、黒質、扁桃、小脳および大脳皮質を含むＣＮＳにおいて中〜低レベルで発現される。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置に有用であり得る。
【０６８６】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１０９
ＣＧ９７４４０−０１遺伝子の非常に高度の発現は、未処理肺微小血管内皮細胞で見られる(ＣＴ＝２９.１)。さらに、顕著なレベルの発現は、肺および皮膚由来の内皮および線維芽細胞から誘導された処理および未処理試料のクラスターで見られる。すなわち、この遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、喘息、気腫、アレルギーおよび乾癬を含む、肺および皮膚の炎症および病的状態に苦しむ患者における徴候を低減化または排除し得る。
【０６８７】
Ｒ．ＣＧ９７４５１−０１：グリシン−濃厚膜タンパク質
表ＲＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１１０を用いて、遺伝子ＣＧ９７４５１−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＲＢおよびＲＣに示す。
【０６８８】
【表２８４】
2005506054.tif 000285
【０６８９】
【表２８５】
2005506054.tif 000286
【０６９０】
表ＲＢの続き
【表２８６】
2005506054.tif 000287
【０６９１】
【表２８７】
2005506054.tif 000288
【０６９２】
表ＲＣの続き
【表２８８】
2005506054.tif 000289
【０６９３】
一般的スクリーニングパネル１.４要約：Ａｇ４１１０
ＣＧ９７４５１−０１遺伝子の発現は、脳癌セルライン由来の試料に制限されている(ＣＴ＝３１.１)。すなわち、この遺伝子の発現は、この試料およびこのパネル上の他の試料間の区別に、および脳癌存在検出用マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、脳癌の処置において有効であり得る。
【０６９４】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１１０
ＣＧ９７４５１−０１遺伝子は、腎臓において検出可能レベルで発現されるだけである(ＣＴ＝３２.５)。すなわち、この遺伝子の発現は、この試料およびこのパネル上の他の試料間の識別に、および腎臓組織マーカーとして使用され得る。さらに、この遺伝子または遺伝子産物の治療的モジュレーションは、腎臓機能を調節し、狼瘡および糸球体腎炎を含む、腎臓を冒す炎症性または自己免疫疾患の処置において重要であり得る。
【０６９５】
Ｓ．ＣＧ９７８５２−０１：ガレクチン−９様１
表ＳＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１８３を用いて、遺伝子ＣＧ９７８５２−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＳＢ、ＳＣ、ＳＤおよびＳＥに示す。
【０６９６】
【表２８９】
2005506054.tif 000290
【０６９７】
【表２９０】
2005506054.tif 000291
【０６９８】
表ＳＢの続き
【表２９１】
2005506054.tif 000292
【０６９９】
【表２９２】
2005506054.tif 000293
【０７００】
【表２９３】
2005506054.tif 000294
【０７０１】
表ＳＤの続き
【表２９４】
2005506054.tif 000295
【０７０２】
【表２９５】
2005506054.tif 000296
【０７０３】
表ＳＥの続き
【表２９６】
2005506054.tif 000297
【０７０４】
ＡＩ包括的パネルｖ１.０要約：Ａｇ４１８３
ＣＧ９７８５２−０１遺伝子の非常に高度の発現は、潰瘍性大腸炎患者から誘導された試料で見られる(ＣＴ＝３１.３)。低いが顕著なレベルの発現はまた、気腫、クローン病および慢性関節リウマチ患者から誘導された試料でも見られる。すなわち、この遺伝子の発現は、潰瘍性大腸炎のマーカーとして使用され得る。この遺伝子は、ガレクチン９に相同的であるタンパク質をコードする。ガレクチンは、免疫応答においてある一定の役割を演じ得る炭水化物結合タンパク質である。さらに、この遺伝子または遺伝子産物の発現または機能の治療的モジュレーションは、気腫、クローン病、慢性関節リウマチおよび潰瘍性大腸炎に苦しむ患者における徴候を低減化または排除し得る。。
【０７０５】
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ４１２６
このパネルは、アルツハイマー病においてＣＧ９７８５２−０１遺伝子の差次的発現を示さない。しかしながら、この発現プロファイルは、脳における低いが顕著なレベルでのこの遺伝子の発現を立証している。この遺伝子は、推定ガレクチンをコード化する。レクチンファミリーの構成員は、軸策成長、神経移動、シナプス形成および髄鞘形成を含む、脳での細胞接着および細胞認識機構並びに細胞シグナル伝達において機能することが示されている。神経膠ガレクチンイソ型、ガレクチン３は、細胞マトリックス相互作用および新規形成軸策の安定化に関与する(Mahoney,SA.Neuroscience２０００、１０１(１)：１４１−５５)。脳におけるこのガレクチン相同体の発現は、それが神経機能にも寄与し得ることを示唆している。したがって、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、神経学的疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、多発性硬化症、卒中および癲癇の処置において有用であり得る。
【０７０６】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１８３
ＣＧ９７８５２−０１遺伝子、ガレクチン相同体は、腸癌セルラインで非常に非常に高度のに発現される(ＣＴ＝２８.５)。さらに、膵臓、胃、胸部および卵巣癌からの癌セルラインは、この遺伝子の顕著な発現を示す。ガレクチン−９の発現は、腸癌セルラインに随伴している(Lahm H. J Cancer Res Clin Oncol ２００１、１２７(６)：３７５−８６)。すなわち、この遺伝子の発現は、腸、膵臓、胃、胸部および卵巣癌のマーカーとして使用され得る。ガレクチンファミリーの構成員は、細胞成長調節および接着監視に関与する。したがって、このタンパク質の発現または機能の治療的モジュレーションは、癌の処置において有効であり得る。
【０７０７】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１８３
同じプローブおよびプライマーを用いた２実験は、極めて一致した結果をもたらし、ＣＧ９７８５２−０１遺伝子の非常に高度の発現は休止ＮＫ細胞において検出される(ＣＴ＝２９)。これらの細胞におけるこの顕著な発現は、この遺伝子が、これらの細胞の免疫調節機能および自己免疫疾患の阻止に関わり得ることを示唆している。この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、多発性硬化症、狼瘡およびＮＫ細胞機能と関連した他の疾患の処置に有用であり得る(Baxter AG、Autoimmuity ２００２年２月、３５(１)：１−１４)。さらに、この遺伝子産物の調節は、異種移植に対する応答で見られるＮＫ仲介応答の縮小において有用であり得る。
【０７０８】
中〜定レベルの発現はまた、このパネルにおける他の試料でも見られ、処理および未処理ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、ＬＡＫ細胞、慢性活性化Ｔｈ２細胞、ＴＨＦ−アルファおよびＩＬ−１ベータ活性化小気道および気管支上皮および正常腎臓、胸腺および腸のクラスターが含まれる。すなわち、この遺伝子産物は、肺炎症疾患、例えばＴｈ２細胞が仲介する喘息および慢性閉塞性肺疾患を含むこれらの細胞型を伴う炎症プロセスに関与し得る。したがって、この遺伝子によりコードされたタンパク質に対して設計された治療薬は、肺炎症性疾患の処置に有用であり得る。
【０７０９】
この遺伝子は、ガレクチン９との相同性を伴うタンパク質、強力な好酸球化学誘引物質をコードする。したがって、この遺伝子産物の調節は、喘息の処置に有用であり得る。
【０７１０】
Ｔ．ＣＧ９９５７５−０１およびＣＧ９９５７５−０２：Ｔ細胞表面糖蛋白質ＣＤ１
表ＴＡおよびＴＢに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１７６およびＡｇ４８０４を用いて、完全長物理的クローンＣＧ９９５７５−０１および変異体ＣＧ９９５７５−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＴＣに示す。プローブおよびプライマーセットＡｇ４８０４は変異体ＣＧ９９５７５−０２にのみ対応するものとする。
【０７１１】
【表２９７】
2005506054.tif 000298
【０７１２】
【表２９８】
2005506054.tif 000299
【０７１３】
【表２９９】
2005506054.tif 000300
【０７１４】
表ＴＣの続き
【表３００】
2005506054.tif 000301
【０７１５】
表ＴＣの続き
【表３０１】
2005506054.tif 000302
【０７１６】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１７６
同じプローブおよびプライマーを用いた２実験は、極めて一致した結果をもたらし、ＣＧ９９５７５−０１遺伝子の非常に高度の発現は抗ＣＤ４０処理樹状細胞において検出される(ＣＴ＝２８〜３２)。この遺伝子の中〜低発現は、活性化一次および二次Ｔｈ１細胞、ＣＤ４リンパ球、ＬＡＫ細胞、休止ＰＢＭＣ細胞、好酸球、樹状細胞、ＩＬII処理ＨＵＶＥＣ細胞、休止単球、胸腺、腸、肺および腎臓で見られる。したがって、この遺伝子の治療的モジュレーションは、これらの細胞型を伴う自己免疫および炎症性疾患、例えばエリテマトーデス、喘息、気腫、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、変形性関節症および乾癬の処置において有益であり得る。Ａｇ４８０４：異なるプローブおよびプライマーセットによるこの実験は、上記結果と完全に一致している。このプローブおよびプライマーセットは、ＣＧ９９５７５−０２遺伝子に特有であるものとする。
【０７１７】
Ｕ．ＣＧ９９６０８−１：糖輸送体
表ＵＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１５０を用いて、遺伝子ＣＧ９９６０８−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＵＢ、ＵＣ、ＵＤおよびＵＥに示す。
【０７１８】
【表３０２】
2005506054.tif 000303
【０７１９】
【表３０３】
2005506054.tif 000304
【０７２０】
【表３０４】
2005506054.tif 000305
【０７２１】
表ＵＣの続き
【表３０５】
2005506054.tif 000306
【０７２２】
【表３０６】
2005506054.tif 000307
【０７２３】
表ＵＤの続き
【表３０７】
2005506054.tif 000308
【０７２４】
【表３０８】
2005506054.tif 000309
【０７２５】
Ａｇ４１５０
ＣＮＳ神経変性ｖ１.０要約：Ａｇ３９３１
このパネルは、独立した個体群の脳における低レベルでのＣＧ９９６０８−０１遺伝子の発現を確認している。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質において僅かにアップレギュレーションされていることが見出された。この受容体の遮断は、この病気の処置に有用であり、神経細胞死を減少させ得る。
【０７２６】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１５０
ＣＧ９９６０８−０１遺伝子の非常に高度の発現は、腸癌ＣａＣｏ−２セルラインで検出される(ＣＴ＝２４.５)。この遺伝子は、黒色腫、卵巣、胸部、前立腺、扁平上皮癌、肺、腎臓、腸、ＣＮＳおよび膵臓癌セルラインのクラスターにおいて顕著なレベルで検出される。すなわち、小分子または抗体を通したこの遺伝子の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有用であり得る。
【０７２７】
代謝または内分泌機能をもつ組織の中で、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において高〜中レベルで発現される。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置に有用であることが証明され得る。
【０７２８】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質および脊髄を含む被験中枢神経系の全領域において高レベルで発現される。したがって、この遺伝子は、中枢神経系疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、精神分裂病およびうつ病においてある一定の役割を演じ得る。
【０７２９】
パネル４.１Ｄ要約：Ａｇ４１５０
ＣＧ９９６０８−０１遺伝子の非常に高度の発現は、ＩＬ−９処理ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において検出される(ＣＴ＝２８)。この遺伝子は、健康な状態および病気における免疫応答で重要な広範囲の細胞型において高〜中レベルで発現される。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球、および末梢血単核細胞ファミリー、並びに肺および皮膚からの上皮および線維芽細胞型、および腸、肺、胸腺および腎臓により表される正常組織の構成員が含まれる。この遍在的発現パターンは、この遺伝子産物がこれらおよび他の細胞型および組織についてのホメオスタシス過程に掛かり合い得ることを示唆している。このパターンは一般的スクリーニングパネルｖ１.４における発現プロファイルと一致しており、また細胞生存および増殖における遺伝子産物についてのある一定の役割を示唆している。興味深いことに、この遺伝子の発現は、活性化一次および二次Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１細胞で刺激される。したがって、機能性治療薬による遺伝子産物のモジュレーションにより、これらの細胞型に伴う機能の改変が誘導され、自己免疫および炎症性疾患、例えば喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチおよび変形性関節症に苦しむ患者の徴候の改善が誘導され得る。
【０７３０】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ４１５０
ＣＧ９９６０８−０１遺伝子の非常に高度の発現は腎臓癌試料で検出される(ＣＴ＝２８)、顕著な発現はまた黒色腫、肺、扁平上皮癌、膀胱、前立腺および腸癌で見られる。さらに、この遺伝子の発現は、正常隣接組織におけるより癌において高くなっている。したがって、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するマーカーであり得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有効であり得る。
【０７３１】
Ｖ．ＣＧ９９７３２−０２：マクロファージレクチン２
表ＶＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４１９８を用いて、完全長物理的クローンＣＧ９９７３２−０２の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＶＢおよびＶＣに示す。
【０７３２】
【表３０９】
2005506054.tif 000310
【０７３３】
【表３１０】
2005506054.tif 000311
【０７３４】
表ＶＢの続き
【表３１１】
2005506054.tif 000312
【０７３５】
【表３１２】
2005506054.tif 000313
【０７３６】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４１９８
ＣＧ９９７３２−０２遺伝子の非常に高度の発現は、腸プールで検出される(ＣＴ＝３１)。さらに、この遺伝子の顕著な発現は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管を含む、代謝または内分泌機能をもつ組織で見られる。したがって、この遺伝子の活性の治療的モジュレーションは、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満および糖尿病の処置において有用であることが判る。
【０７３７】
興味深いことに、この遺伝子の中度発現はまた、腸癌組織で検出される(ＣＴ＝３２)。したがって、この遺伝子の治療的モジュレーションは、腸癌の処置に有用であり得る。
【０７３８】
一般的腫瘍学スクリーニングパネルｖ２.４要約：Ａｇ４１９８
ＣＧ９９７３２−０２遺伝子の非常に高度の発現は、転移性黒色腫試料で検出される(ＣＴ＝３１.４)。さらに、この遺伝子の低〜中度発現はまた、腸、肺、前立腺および腎臓を含む全癌試料で見られる。したがって、この遺伝子産物の治療的モジュレーションは、これらの癌の処置に有用であり得る。
【０７３９】
Ｗ．ＣＧ９９７６７−０１:Ｉ型膜タンパク質
表ＷＡに記載されている、プライマー‐プローブセットＡｇ４２４８を用いて遺伝子ＣＧ９９７６７−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表ＷＢに示す。
【０７４０】
【表３１３】
2005506054.tif 000314
【０７４１】
【表３１４】
2005506054.tif 000315
【０７４２】
表ＷＢの続き
【表３１５】
2005506054.tif 000316
【０７４３】
一般的スクリーニングパネルｖ１.４要約：Ａｇ４２４８
ＣＧ９９７６７−０１遺伝子の発現は、骨格筋試料で排他的に検出される(ＣＴ＝３３.５)。したがって、この遺伝子の発現は、この試料をこのパネルにおける他の試料と区別するのに使用され得る。さらに、小分子標的または抗体を通したこの遺伝子の治療的モジュレーションは、筋骨格疾患および／または障害の処置において有益であり得る。
【０７４４】
実施例D:NOVX核酸配列での単一ヌクレオチド多型性の同定
変異体配列がまた、この応用にふくまれる。変異体配列は、単一ヌクレオチド多型性(SNP)を含むことができる。SNPは、幾つかの例で、「cSNP」として言及され、SNPを含むヌクレオチド配列がcDNAとして起源することをいう。SNPは、いくつかのやり方で生じ得る。例えば、SNPは、多型性部位の1ヌクレオチドの、他との置換のためであり得る。そのような置換は、トランジションまたはトランスバージョンであることができる。SNPはまた、参照アリルからのヌクレオチドの欠失または挿入から生じることができる。この場合には、多型性部位は、１のアリルが他のアリルの特定のヌクレオチドについてギャップを有する１部位である。遺伝子ないに存在するSNPは、SNPの位置での遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化という結果となり得る。遺伝子内SNPはまた、サイレントであり得、このときSNPを含むコドンは、遺伝的コードの縮重の結果として同じアミノ酸をコードする。遺伝子の領域外にまたは遺伝子内のイントロンに存在するSNPは、タンパク質の任意のアミノ酸配列に変化を生じないが、発現パターンの調節は変化し得る。例は、一時的発現、生理学的応答調節、細胞型発現調節、発現の強度、および転写伝令の安定性を含む。
【０７４５】
エキソンリンキングプロセスによって生産されるSeqCallingアセンブリは、選択され、以下の基準を使用して、伸長させた。すべてまたは一部の当初または伸長配列への９８％同一性を有する領域を有するゲノムクローンは、クエリーヒトゲノムデータベースへの関連配列を使用して、ＢＬＡＳＴＮサーチによって同定した。得られるゲノムクローンは、さらなる分析のために選択され、というのは、この同一性は、これらのクローンがSeqCallngアセンブリについてのゲノム遺伝子座を含むことを指摘するからである。これらの配列を推定コード領域について並びに既知DNAおよびタンパク質配列への類似性について分析した。これらの分析のために使用されたプログラムは、Grail、Genscan,BLAST,HMMER,FASTA,Hybridおよび他の関連プログラムを含む。
【０７４６】
いくつかの追加的ゲノム領域はまた、同定され、というのはそれらの領域ヘのSeqCallingアセンブリマップを選択したからである。そのようなSeqCalling配列は、相同性またはエキソン予測によって定義された領域とオーバーラップした。これらがまた含まれ得、というのは、フラグメントの位置は、本来予測配列中に含まれた、類似性またはエキソン予測によって同定された、ゲノム領域の近傍であったからである。そのように同定された配列は手動でアセンブリし、それからCuraGenコーポレーションのヒトSeqCallingデータベースから取られる１または２以上の追加的配列を使用して伸長され得た。包含に好適なSeqCallingフラグメントを、CuraTools（登録商標）プログラムSeqExtendによって、または分析したゲノムクローンの適当な領域へのSeqCallingフラグメントマッピングを同定することによって同定した。
【０７４７】
前記手法によって定義した領域を次いで、手動で統合し、そして例えば本来のフラグメント中のミスコール性塩基から、または予測エキソン結合、EST位置および配列類似性の領域間の食い違いから生じられ得る明白な矛盾について更正し、ここに開示の最終配列を誘導した。必要なときに、SwqCallingアセンブリおよびゲノムクローンを同定および分析するためのプロセスは反復し、完全長配列を誘導した(Alderborn et al.,Determination of Single nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing.Genome Research.10(8)1249-1265,2000)。
【０７４８】
変異体は、個別に報告するが、すべてのまたは選択サブセットの変異体の任意の組み合わせはまた、本発明の企図NOVX実施態様として包含される。
【０７４９】
ＮＯＶ１  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１の２多型性変異体を同定し、表２８Ａに示す。
【表３１６】
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【０７５０】
ＮＯＶ１の１多型性変異体を同定し、表２８Ｂに示す。
【表３１７】
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【０７５１】
ＮＯＶ３  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ３の２多型性変異体を同定し、表２８Ｃに示す。
【表３１８】
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【０７５２】
ＮＯＶ４  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ４の２多型性変異体を同定し、表２８Ｄに示す。
【表３１９】
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【０７５３】
ＮＯＶ６  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ６の６多型性変異体を同定し、表２８Ｅに示す。
【表３２０】
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【０７５４】
ＮＯＶ７  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ７の２多型性変異体を同定し、表２８Ｆに示す。
【表３２１】
2005506054.tif 000322
【０７５５】
ＮＯＶ８  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ８の３多型性変異体を同定し、表２８Ｇに示す。
【表３２２】
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【０７５６】
ＮＯＶ１０  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１０の１多型性変異体を同定し、表２８Ｈに示す。
【表３２３】
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【０７５７】
ＮＯＶ１１  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１１の４多型性変異体を同定し、表２８Ｉに示す。
【表３２４】
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【０７５８】
ＮＯＶ１２  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１２の５多型性変異体を同定し、表２８Ｊに示す。
【表３２５】
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【０７５９】
ＮＯＶ１５  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１５の２多型性変異体を同定し、表２８Ｋに示す。
【表３２６】
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【０７６０】
ＮＯＶ１９  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ１９の１０多型性変異体を同定し、表２８Ｌに示す。
【表３２７】
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【０７６１】
ＮＯＶ２３  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ２３の１多型性変異体を同定し、表２８Ｍに示す。
【表３２８】
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【０７６２】
ＮＯＶ２５  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ２５の１多型性変異体を同定し、表２８Ｎに示す。
【表３２９】
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【０７６３】
ＮＯＶ２６  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ２６の９多型性変異体を同定し、表２８Ｏに示す。
【表３３０】
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【０７６４】
ＮＯＶ２７  ＳＮＰデータ
ＮＯＶ２７の１多型性変異体を同定し、表２８Ｐに示す。
【表３３１】
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【０７６５】
（他の実施態様）
特定の実施態様は、詳細にここに開示されるが、これは例示のみの目的のためになされ、そして続く添付クレームの範囲について限定を意図しない。特に、発明者によって種々の置換、変更および修飾が本発明に、クレームによって定義の本発明の精神および範囲から離れることなくなしうることが企図される。核酸出発材料、所望のクローン、またはライブラリー型の選択は、ここに記載の実施態様の知識を有する当業者の日常的事項であると信じられる。提示クレームは、ここに開示の発明の代表である。その他、非クレーム発明はまた企図される。出願人は、以下のクレームのそのような発明を追及する権利を保存する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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