(57)【要約】本発明は、候補サンプルをインビトロのニューロン組織サンプルに導入する前および後のネットワークレベルの生理学的特性の変化を分析することによって、精神活性化合物を検出および特徴付するための方法およびデバイスに関する。本発明は、操作者が時間設定された電気パルスを、自発的振動または誘導性振動における特定の点で送達することを可能にするソフトウェアパッケージをさらに提供する。このような時間的刺激は、予想外の有用なネットワークレベル精神活性応答を誘発する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロのニューロン組織サンプル中の精神活性化合物の検出のためのプロセスであって、以下：
ａ）該インビトロのニューロン組織サンプルから少なくとも１つの自発的振動または少なくとも１つの誘導性振動を測定する工程；
ｂ）候補サンプル組成物と接触された該インビトロのニューロン組織サンプルのネットワークレベルの電気応答と、ネットワークレベルの電気ベースラインとを比較して、該ネットワークレベルの電気応答と該ネットワークレベルの電気ベースラインとの間の差異を決定する工程；および
ｃ）該候補サンプル組成物中の精神活性化合物の存在または非存在を、該ネットワークレベルの電気応答と該ネットワークレベルの電気ベースラインとの間の該差異に基づいて検出する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２】
前記ネットワークレベルの電気的応答と前記ネットワークレベルの電気ベースラインとの間の差異を比較することによって、前記精神活性化合物を特徴付ける工程をさらに包含する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記インビトロのニューロン組織サンプルに少なくとも１つの時間設定された電気パルスを送達する工程をさらに包含する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記誘導性振動が、化学組成物の導入によって生成される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記化学組成物が、アセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を模倣する、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記化学組成物が、カルバコールを含む、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
前記化学組成物が、刺激組成物である、請求項４に記載のプロセス。
【請求項８】
前記誘導性振動が、電気刺激によって生成される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項９】
前記振動が、共析出ニューロン組織によって生成される、請求項４に記載のプロセス。
【請求項１０】
高速フーリエ変換分析を前記少なくとも１つの自発的振動または誘導性振動に適用する変換工程をさらに包含する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１１】
電流源密度分析を、少なくとも１つの自発的振動または誘導性振動に適用する変換工程をさらに包含する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
インビトロのニューロン組織サンプル中の精神活性化合物の検出および特徴付けのためのデバイスであって、以下：
ａ）絶縁基材の測定領域上に位置する複数の測定微小電極を有する細胞電位測定電極アレイであって、該微小電極は、該インビトロのニューロン組織サンプルのネットワークレベルの電気応答を検出するように適合されている、細胞電位測定電極アレイ；
ｂ）該絶縁基材上に位置する複数の参照電極であって、該複数の参照電極の各々は、該測定微小電極の各々より低いインピーダンスを有する、参照電極；および
ｃ）該細胞電位測定電極アレイに接続されたコンピューターであって、該コンピューターは、ｉ）該インビトロのニューロン組織サンプルに精神活性化合物候補サンプル組成物を接触させる前および後の両方の、該インビトロのニューロン組織サンプル中のネットワークレベルの電気応答を検出するため；ｉｉ）該前および後のネットワークレベルの電気応答を比較して、精神活性化合物の存在または非存在を検出し、そして検出された場合、該精神活性化合物を、該前および後のネットワークレベルの電気応答の間の差異に基づいて特徴付けするため、のソフトウェアを備える、コンピューター、
を備える、デバイス。
【請求項１３】
前記アレイが、１００〜４５０マイクロメートルの中心ピッチで、８行および８列で配置される６４個の微小電極を備える、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記複数の測定電極の各々および前記複数の参照電極の各々が、前記測定領域の外側の位置に接続可能である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記測定領域が、壁によって囲まれている、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記測定電極および参照電極が、ニッケルメッキ、金メッキ、および白金黒をインジウム−スズ酸化物フィルム上に層状にすることによって形成される、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１７】
インビトロのニューロン組織サンプル中の精神活性化合物を検出および特徴付けするためのデバイスであって、以下：
ａ）絶縁基材の測定領域上に位置する複数の測定微小電極を有する細胞電位測定電極アレイであって、該微小電極は、時間設定された電気パルスに供された該インビトロのニューロン組織サンプルのネットワークレベルの応答を検出するように適合されている、細胞電位測定電極アレイ；
ｂ）該微小電極を接続するための伝導性パターン；
ｃ）該伝導性パターンの端部に接続される電気接触点；
ｄ）該伝導パターンの表面を覆う絶縁フィルム；
ｅ）該絶縁フィルムの該表面上の微小電極を備える該領域を囲む壁；および
ｆ）該細胞電位測定電極アレイに接続されるコンピューターであって、該コンピューターは、ｉ）該インビトロのニューロン組織サンプルに精神活性化合物候補サンプル組成物を接触させる前および後の両方の、該インビトロのニューロン組織サンプル中のネットワークレベルの電気応答を検出するため；ｉｉ）該前および後のネットワークレベルの電気応答を比較して、精神活性化合物の存在または非存在を検出し、そして検出された場合、該精神活性化合物を、該前および後のネットワークレベルの電気応答の間の差異に基づいて特徴付けするため、のソフトウェアを備える、コンピューター、
を備える、デバイス。
【請求項１８】
前記アレイが、１００〜４５０マイクロメートルの中心ピッチで、８行および８列で配置される６４個の微小電極を備える、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
インビトロのニューロン組織サンプル中の神経活性化合物の検出および特徴付けのための方法であって、該方法は、以下：
ａ）該インビトロのニューロン組織サンプルによって生成される少なくとも１つの自発的振動を測定する工程；
ｂ）該インビトロのニューロン組織サンプルにおけるベースラインネットワークレベルの電気応答を測定する工程；
ｃ）該インビトロのニューロン組織サンプルと、候補サンプル組成物とを接触させる工程；
ｄ）該インビトロのニューロン組織サンプルにおいて生じたネットワークレベルの電気応答を測定する工程；および
ｅ）該生じたネットワークレベルの電気応答を、ベースラインネットワークレベルの電気応答と比較して、該候補サンプル組成物中の該精神活性化合物の存在または非存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
高速フーリエ変換分析を、前記少なくとも１つの自発的振動に適用する変換工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記変換工程が、予測ソフトウェアにより実行される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
電流源密度分析を、前記少なくとも１つの自発的振動に適用する変換工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記変換工程が、予測ソフトウェアによって実行される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記インビトロのニューロン組織サンプルに、少なくとも１つの時間設定された電気パルスを送達する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記時間設定された電気パルスが、前記自発的振動における特定の時点で送達される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記特定の時点が、予測ソフトウェアによって決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記特定の時点が、前記自発的振動のピークである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ベースラインネットワークレベルの電気応答の検出の前に、前記インビトロのニューロン組織サンプルに化学組成物を添加する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学組成物が、アセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を模倣する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化学組成物が、コリン模倣性化合物を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記化学組成物が、カルバコールを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ベースラインネットワークレベルの電気応答の検出の前に、ニューロン組織を、前記インビトロのニューロン組織サンプルと共に共析出させる工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ベースラインネットワークレベルの電気応答の検出の前に、電気刺激を前記インビトロのニューロン組織サンプルに送達する工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ベースラインネットワークレベルの電気応答および前記生じるネットワークレベルの電気応答が、θＥＥＧ波、βＥＥＧ波およびγＥＥＧ波からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
インビトロのニューロン組織サンプルにおいてネットワークレベルの応答を生成するためのシステムであって、以下：
ａ）該インビトロのニューロン組織サンプルからの少なくとも１つの振動を測定するための多重電極ディッシュ；および
ｂ）コンピューター、
を備え、該コンピューターが、少なくとも１回の時間設定された電気パルスを該インビトロのニューロン組織サンプルに送達して、ネットワークレベルの応答を生成するためのソフトウェアプログラムを備える、システム。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの振動が、自発的振動である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの振動が、誘導性振動である、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの振動が、化学組成物によって誘導される、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記化学組成物が、アセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を模倣する、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記化学組成物が、カルバコールを含む、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記化学組成物が、刺激組成物である、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの振動が、電気刺激によって誘導される、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの振動が、共析出ニューロン組織によって誘導される、請求項３７に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、精神活性化合物の検出および特徴付けのための方法およびデバイスに関する。詳細には、ニューロン組織サンプルにおけるネットワークレベルの応答を用いる精神活性化合物の検出および特徴付けが記載される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
海馬中の大多数のシナプスは、グルタメートを伝達物質として用いる、連合性かつ皮質性の求心性神経から生じる。その他の終脳領域でのように、海馬はまた、グルタメート以外の伝達物質のアレイを利用するいくつかの皮質下構造からの顕著な投射（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）を受容する。海馬への皮質下投射の最大および最良の研究は、内側中隔／対角帯からのコリン作動性の入力である。これらの求心性神経は、現在ではかなり良好に理解されている機構により、４〜７Ｈｚのθリズムを生成する（Ｖｅｒｔｅｓら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８１：８９３〜９２６（１９９７））。コリン作動性入力が、どのように、グルタミン酸作動性の活性化に対する海馬応答を調整するかについて知られていることはかなり少ない。
【０００３】
いくつかの研究は、海馬切片中へのコリン作動性アゴニストの注入が、ほぼ即時のリズム振動の出現を引き起こすことを示したが、活性の優勢な振動数に関して不一致が存在する。カルバコールの付与によって引き起こされるθ、β（１３〜３０Ｈｚ）およびγ（約４０Ｈｚ）リズムの各々が報告されている（Ｋｏｎｏｐａｃｋｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ４０５：１９６〜１９８（１９８７）；Ｈｕｅｒｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：７２３〜７２５（１９９３）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ７８：２６３１〜２６４０（１９９７）；Ｆｉｓａｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：１８６〜１８９（１９９８）；Ｆｅｌｌｏｓら、Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  １０：１８７〜１９７（２０００）；Ｓｈｉｍｏｎｏら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０：８４６２〜８４７３（２０００））。複数電極記録技法を用いる最近の研究は、カルバコールが、大多数の切片で、しばしばγ波をともなうβ活性を局部的に惹起することを見出している。二次元定電流源密度分析は、錐体細胞の破裂が、付随的な投射を通じて励起の拡散を放出し、そして尖端方向のフィードバック介在ニューロンの活性化が、β波を生成することを示唆している（Ｓｈｉｍｏｎｏら、前述）。これらの見解は、カルバコールの作用の単一細胞研究から得られた結論（Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：３０２２〜３０２６（１９８６）；Ｍａｄｉｓｏｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７：７３３〜７４１（１９８７）：Ｂｅｈｒｅｎｄｓら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ６９：６２６〜６２９（１９９３））、および海馬におけるムスカリンレセプターの分布に関する最近の研究からの結論（Ｌｅｖｅｙら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５：４０７７〜４０９２（１９９５）；Ｈaｊｏｓら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８２：３５５〜３７６（１９９８））と広く一致している。
【０００４】
その結果、カルバコール誘導リズム振動を用いる精神活性化合物の特徴付けおよび検出のための方法およびデハイスを開発する相当な努力がなされている。このような努力において遭遇する問題は、低濃度では、多くの精神活性化合物が、単一ニューロンまたはなお小グループのニューロンの活性（例えば、電流、発火頻度）を変える相対的に小さな可能性を有することである。このような観察レベルの化合物で誘導される変化が存在し得るが、これら変化は、検出するには弱すぎ得るか、および／またはこのような変化は、低い確率で生じ得る。皮質リズムでのように、多くのニューロンの活動が同調するとき、個々の細胞は、システムとして一緒に作用し得る。この特徴は、単一細胞レベルでの機能的変化の小さな確率を増幅するために供され、検出可能な変化のより高い可能性を生じる。これは、例えば、ネットワークを基礎にしたスクリーニングデバイスにより、試薬が検出され得る閾値濃度を下げるために供される。同様に、これら閾値は、認識効果および挙動作用を生成することが知られている濃度に近付けられ得る。しかし、多くのインビボおよびインビトロモデルは、これら重要な特徴のいくつかまたはすべてを欠いている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような、増大した診断特徴、および改良された検出属性、および精神活性化合物を発見し、調査し、特徴付け、および開発する新規な方法を生成し得るアッセイ系を論議する引用文献はない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、インビトロのニューロン組織サンプルにおけるネットワークレベル応答を分析することによる、精神活性化合物の検出および特徴付けのための方法およびデバイスを提供する。
【０００７】
１つの改変例では、本発明の方法およびデバイスは、インビトロのニューロン組織サンプルから少なくとも１つの自然振動を捕捉（測定）することを含む。次いで、この振動の電圧ピークおよびトラフが決定され、そして少なくとも１つの指定時刻に作動する電気的パルスが、この振動の特定の点で送達され、ネットワークレベルの電気的ベースラインを生成する。
【０００８】
別の改変例では、自然振動の代わりに誘導された振動が捕捉され、そして少なくとも１つの指定時刻に作動する電気的パルスが、ネットワークレベルの電気的ベースラインを生成するようにする。この振動は、化学的組成物、同時沈着ニューロン組織、または電気的刺激によって誘導され得る。代表的には、これら化学的組成物は、アセチルコリン、セロトニン、またはカテコールアミンの作用を模倣する。好ましい改変例では、化学的組成物は、カルバコールである。化学的組成物は、通常、刺激性組成物である。
【０００９】
一旦、ネットワークレベルの電気的ベースラインが得られると、上記インビトロのニューロン組織は、候補サンプル組成物と接触され、そしてネットワークレベルの電気的応答が測定される。このネットワークレベルの電気的ベースラインおよびネットワークレベルの電気的応答は、次いで、候補サンプル組成物中の精神活性化合物の存在または不在を検出するために比較され、そして候補サンプル組成物を特徴付ける。
【００１０】
代表的には、種々の振動は、細胞外電圧で見出されるような振動である。例えば、それらは、θ、β、またはγＥＥＧ波であり得る。ネットワークレベルの電気的ベースラインおよびネットワークレベルの電気的応答、代表的には、細胞外電位から構成される。例えば、それらは、ゆっくりと負に進む電位のための１００マイクロボルトであり得るか、または初期の急速に負に進む電位のための５０マイクロボルトであり得る。
【００１１】
個々の振動またはネットワークレベルのベースラインおよびネットワークレベルの応答を、ニューロンサンプル上の多くの異なる活性部位またはより少ない活性の部位が、同時または連続的にサンプリングされ得るように測定するために、複数電極デッシュ（「ＭＥＤ」）を用いることもまた、所望される。ＭＥＤの使用は、空間的相関関係；測定値および理論値の両方、とりわけ、ニューロン振動の値；の測定および算出を可能にする。このＭＥＤの複数電極性質はまた、所定のインビトロニューロンサンプル内の領域特異的影響の決定と特徴付けを可能にする。
【００１２】
細胞外電位の振動の適切な数学的分析は、単一の空間点で測定された振動の迅速フーリエ変換（ＦＦＴ）を含み得、単一部位測定の前後の振幅および振動数における差異を増加する。同様に、時間の関数としてアレイで得られた細胞外電位の振動のシークエンスは、定電流源密度（ＣＳＤ）分析に供され得、インビトロのニューロン組織サンプル内の電流パターンを生成し、かつ描写する。さらに、ネットワークレベルの応答は、これらの波形を迅速成分および遅延成分に分割すること、および局所的最大値および局所的最小値、減衰時間などを算出することによって分析され得る。
【００１３】
本発明の方法の別の部分は：１）ネットワーク構造を保存する組織調製方法の使用、２）全ネットワークを横切るニューロンの持続時間経過および分布活性により特徴付けられる、ネットワークレベル、広範囲のニューロン応答を刺激または誘導する傾向の電気的刺激パターンを含む。
【００１４】
本発明の方法のなお別の部分は、筋肉の電気的活性のインビトロ測定を包含する。ニューロン組織と同じ様式で、筋肉は、自然の電気的波形を示し、そして「励起可能」である。筋肉、例えば、平滑筋における電気的活性における変化は、それ故、インビトロのニューロン組織サンプルについて本明細書中に記載されたプロセスおよび方法に類似の候補サンプル組成物を検出し、かつ特徴付けるために用いられ得る。
【００１５】
添付の図面は、本発明の原理を例示および説明する。これらは、いかなる方法においても本発明の範囲を制限する意図はない。
【００１６】
（詳細な説明）
インビトロの神経組織サンプルにおける細胞外電圧（電位）のリズム振動を使用する、精神活性化合物の検出および／または特徴づけのための、プロセスおよびデバイスが列挙される。これらの振動は、一般に、刺激または誘導されて、以下でより詳細に考察される特定の電気刺激技術を使用することによって、「ネットワークレベル応答」を生じる。
【００１７】
神経サンプルの空間的配置にわたる、インビトロの神経組織における電気波形の測定は、Ｓｕｇｉｈａｒａらに対する米国特許第５，５６３，０６７号および同第５，８１０，７２５号（これらの全体が、参考として援用される）中に見出されるこのようなデバイスの種々の記載中に見出され得る。本発明のために本明細書中に記載されるデバイス、方法およびプロセスに関するさらなる詳細は、米国特許出願番号０９／６０２，６２９（その全体が、本明細書中で参考として援用される）中にも見出され得る。
【００１８】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「シンク」は、細胞外媒体から神経要素へと吸収される電流をいう。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「供給源（源）」は、神経要素内から細胞外媒体へと注入される電流をいう。または、言い換えると、この電流は、神経要素「によって供給され（ｓｏｕｒｃｅｄ  ｂｙ）」る、すなわち、神経要素に由来し、次いで細胞外媒体へ転移される。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「海馬」とは、側頭葉の後ろに位置し、そしてヒトおよび他の動物における記憶の形成および回復に関与する、終脳の領域をいう。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、用語「海馬スライス」とは、本明細書中に記載される電気生理学的記録装置で使用され得る、約１００〜５００μｍの厚さの海馬組織の身体スライスをいう。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＡ１」、「ＣＡ２」、「ＣＡ３」および「ＣＡ４」とは、海馬の４つの領域の１つをいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「樹状突起」とは、神経細胞の細胞体から広がる高度に分枝した構造をいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ネットワークレベル」は、システムのレベル観察をいう；例えば、単一の細胞によって示される分離された挙動および特徴と、同時に反対に作用する細胞の群をいう。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「ネットワークレベル応答」、「ネットワークレベル電気応答」および「ネットワークレベルにより誘発された応答」は、互換可能に使用され、そしてニューロンの群を含むポリシナプス応答および／または候補サンプル組成物への曝露後にニューロンの群を取り込むポリシナプス応答をいう。
【００２６】
用語「ネットワークレベルベースライン」および「ネットワークレベル電気ベースライン」は、互換可能に使用され、そして少なくとも１つの時間測定された電気パルスに供された神経サンプルからの、同時または誘導された振動をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｓｃｈａｆｆｅｒ側副枝」および／または「Ｓｃｈａｆｆｅｒ連通部」とは、ＣＡ３錐体細胞およびＣＡ１錐体細胞を連結する軸索通路をいう。
【００２８】
（測定装置）
１つのバリエーションにおいて、本発明のプロセスは、絶縁基材の測定領域上の複数の測定微小電極、微小電極領域の外側のいくらかの領域に微小電極を接続するための導電性パターン、この導電性パターンの端部に接続された電気接触、この導電性パターンの表面を覆う絶縁フィルム、およびこの絶縁フィルムの表面上に微小電極を備える領域を封入する壁、を備える、細胞電位測定電極アレイを使用する。
【００２９】
このアレイはまた、測定微小電極のインピーダンスよりも比較的低いインピーダンスを有し得る、複数の参照電極を備える。これらの参照電極は、壁によって封入された領域中の種々の位置に、そしてしばしば、微小電極から特定の距離で、配置され得る。さらに、電気接触は、通常、各参照電極の配線のための導電性パターンと、この導電性パターンの端部との間を接続する。これらの参照電極の配線のための導電性パターンの表面は、通常、絶縁フィルムによって覆われる。
【００３０】
代表的に、微小電極は、例えば、０．８〜２．２ｍｍ（３００μｍの微小電極ピッチの場合）または０．８〜３．３ｍｍ（４５０の微小電極ピッチの場合）の辺を有する長方形のマトリクス配置に配置される。４つの参照電極が、１辺が５〜１５ｍｍの長方形の４つの角に配置される。より具体的には、６４個の微小電極が、約１００〜４５０個の微小電極、好ましくは約１００〜３００個の微小電極の中心ピッチにて、８列および８行で配置される。好ましくは、これらの微小電極および参照電極は、ニッケルめっき、金めっき、および酸化インジウム錫（ＩＴＯ）上の白金黒の層から形成される。
【００３１】
絶縁基材（例えば、ガラス基材）は、ほぼ正方形であり得る。複数の電気接続は、導電性パターンの端部に接続され得、そして、好ましくは、絶縁基材の４つの辺に配置され得る。結果として、複数の微小電極および参照電極の配線パターンのレイアウトは、かなり単純である。電気接触のピッチは、比較的大きくされ得るので、外部ユニットとの、これらの電気接触を介した電気接続もまた、単純である。
【００３２】
微小電極領域は、通常、非常に小さい。顕微鏡でサンプルを観察すると、縦方向および横方向の両方で位置を識別することは、困難である。微小電極領域近傍に索引微小マークを配置して、方向、軸および位置の、顕微鏡による種々の視覚認識を可能にすることが所望される。
【００３３】
インビトロのニューロンサンプルの解剖学的相関に対して電極位置を決定するために、以下の一連の事象を実施することが、なおより好ましい：１）アレイが、サンプルの重要な領域をカバーし得るように、コントロールのインビトロニューロンサンプルをアレイ上に配置する工程；２）このアレイ上のコントロールサンプルの写真を撮る工程；３）このコントロールサンプルからの電気活性を記録する工程；４）アレイ上の試験サンプルを、可能な限り正確に、コントロールサンプルと同じ相対位置に配置する工程；５）アレイ上の試験サンプルの写真を撮る工程；６）この試験サンプルからの電気活性を記録する工程；７）コントロール写真と試験写真とを比較する工程；ならびに８）コントロールサンプルからの電気活性と試験サンプルからの電気活性とを比較する工程。
【００３４】
代替的方法は、対象認識アルゴリズム（ここで、対象物は、インビトロのニューロンサンプルの巨視的解剖学的構造である）を使用して、対象認識アルゴリズムデータを比較し、そしてコントロールサンプルからの電気活性と試験サンプルからの電気活性とを比較することである。
【００３５】
別のバリエーションにおいて、細胞電位測定装置は、細胞電位測定電極、電気接触と接触するための接触部位、および上と下とから挟むことによって絶縁基材を固定するための電極ホルダを有する、細胞配置デバイスから作製される。これらの細胞電位測定電極は、細胞配置アセンブリデバイスに電気的に接続されて、サンプルによって生成され、そしてこのような微小電極の各々と参照電極との間で測定される、電圧または電位の処理を可能にする。この細胞電位測定アセンブリは、サンプルのニューロン細胞またはニューロン組織を培養するための、壁によって封入された領域を備え得る。この細胞電位測定アセンブリはまた、壁によって封入された領域中で培養された細胞または組織を拡大し、そして光学的に観察するための光学デバイスを、必要に応じて備え得る。この細胞電位測定装置はまた、この光学デバイスによって獲得された拡大画像を保存するための、画像記憶デバイスをさらに備え得る。
【００３６】
一般に、インストールされた測定ソフトウェアを有するパーソナルコンピュータが、測定された細胞電位を受容するために備えられる。コンピューターおよび細胞配置デバイスは、代表的に、測定のためのＩ／Ｏボードを介して連結される。このＩ／Ｏボードは、Ａ／Ｄ変換器およびＤ／Ａ変換器を備える。このＡ／Ｄ変換器は、通常、得られた電位を測定しそして変換するためのものであり；Ｄ／Ａ変換器は、必要な場合、サンプルに刺激信号を送るためである。
【００３７】
コンピューターにインストールされた測定ソフトウェアは、刺激信号を与え、この刺激信号を生成し、そしてニューロン細胞またはニューロン組織スライスから得られた検出信号を処理し、そして記録するための条件を設定するためのソフトウェアを備え得る。このコンピューターはまた、任意の光学観察デバイス（ＳＩＴカメラおよび画像記憶デバイス）および細胞培養システムを制御し得る。
【００３８】
１つのバリエーションにおいて、ニューロン組織サンプルから検出された細胞外電位は、リアルタイムで表示され得る。別のバリエーションにおいて、記録された自発的電気活性または誘導された電位は、望ましくは、波形記録を細胞の顕微鏡画像に重ねることによって、表示される。代替のバリエーションは、画像処理能力（例えば、特徴認識能力、エッジ検出能力、エッジ増強能力またはアルゴリズム能力）を有するソフトウェアを備える。電位を測定する場合、記録された波形全体が、通常、可視的に表示され、次いで、ニューロン組織サンプルにおける波形の一部と関連付けられる。
【００３９】
データの分析または処理に関して、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）分析、コヒーレンス分析および相関分析のようなアプリケーションが使用され得る。以下で考察されるバリエーションにおいて、定電流密度分析（ＣＳＤ）が使用される。他の有用な機能としては、波形識別を使用する単一スパイク分離機能、一時的プロフィール表示機能、およびトポグラフィー表示機能が挙げられ得る。他の機能としてはまた、種々の多変量信号処理技術（例えば、時系列モデリング）が挙げられ得る。これらの分析結果は、画像記憶デバイス中に保存されたニューロンサンプルの表示された画像上に重複されて表示され得る。
【００４０】
刺激信号がコンピューターから発せられる場合、この刺激信号は、Ｄ／Ａ変換器および絶縁体を介して細胞配置デバイスに送られる。この細胞配置デバイスは、例えば、ガラス基板上の６４の微小電極からマトリックス形態で形成され得る細胞電位測定電極を備え、そしてニューロンサンプル（例えば、細胞または組織のスライス）を微小電極およびその培養流体と接触して維持するための包囲壁を有する。好ましくは、細胞配置デバイスに送られた刺激信号は、６４個の微小電極のうちの任意の電極に適用され、次いでサンプル（単数または複数）に適用される。
【００４１】
各微小電極と参照電位（これは、培養流体の電位にある）との間に生じる、誘導（誘発）電位または自発電位は、６４チャネル高感度増幅器およびＡ／Ｄ変換器を通過して、コンピュータに入る。この増幅器の増幅因子は、例えば、約０．１〜１０ｋＨｚの周波数帯、または約０．１〜２０Ｈｚの周波数帯において、約８０〜１００ｄＢであり得る。しかし、刺激信号によって誘導される電位を、低カットフィルタを使用することによって測定する場合、周波数帯は、好ましくは、１Ｈｚ〜２０ｋＨｚである。
【００４２】
別のバリエーションにおいて、この装置は、温度制御装置、培養流体循環デバイス、ならびに例えば、空気および二酸化炭素の混合気体を供給するための供給器を有する、細胞培養システムを備え得る。この細胞培養システムは、市販のマイクロインキュベーター、温度制御装置、およびＣＯ２シリンダーから作製され得る。マイクロインキュベーターは、０℃〜５０℃の範囲の温度において、ペルチエ要素によって制御するために使用され得、そして３．０ｍｌ／分以下の液体供給速度および１．０リットル／分以下の気体流速に適用可能である。あるいは、温度制御装置を組み込むマイクロインキュベーターが使用され得る。
【００４３】
（データの測定および分析）
一般に、本明細書中に記載されるプロセスおよび方法は、空間的にかつ時間的に測定部位の各々で、ニューロンサンプルの電気的活性の同時の測定および記録を包含する。さらに、これらは、空間的アレイにおける測定部位の各々において信号の周波数および振幅を観察することを包含する。さらに、これらのプロセスおよび方法は、光学デバイスもしくは電子感知デバイス、または当業者によって理解され得る他のデバイスのような機器を使用して、ニューロン組織サンプルの配置および固有の物理的境界（周縁は、センサの位置に相関する）を見ることを包含する。
【００４４】
使用の際に、ニューロン組織サンプルは、インビトロ細胞電位測定電極アレイ上に配置され、そして試験の間これらのサンプルの生存性を維持するための、当業者に公知である手順を使用する。ニューロンサンプルは、所望であれば、培養され得る。代表的な手順は、実施例に関して以下に議論されている。微小電極の各々が、時間の関数として、および周波数の関数としての両方で、細胞外電圧または細胞外電位の律動性振動（ｒｈｙｔｈｍｉｃ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）について、およびパルスにより誘発され、そして／または精神活性物質の誘導から誘発される応答について、モニタリングされる。これは、周波数信号および振幅信号のアレイを、時間の関数として生じる。２ＨｚでのほぼＤＣの領域から３５Ｈｚを超える領域までの振動を測定することが好ましい。このことにより、神経律動活性において見いだされる代表的な３つの周波数帯の測定保持が可能になる：１）４〜２０Ｈｚ（θＥＥＧ）；２）１５〜２５Ｈｚ（βＥＥＧ）；および３）３０Ｈｚ超（γＥＥＧ）。１０〜５０Ｈｚのより高い周波数帯もまた、かなり有益である。
【００４５】
誘導または刺激される振動が所望される場合、本発明者らは、化学的方法、生理学的方法、または解剖学的方法によって、細胞外電圧または電位のこれらの振動を様々に誘導または刺激することが望ましいことを見出した。１つのバリエーションにおいて、ニューロン組織は、化学組成物と接触される。この化学組成物は、例えば、アセチルコリン、セロトニン、またはカテコールアミンの作用を促進するかまたは模倣する、１種以上の化合物を含有する；しかし、他の組成物との接触が、受容可能である。別のバリエーションにおいて、この化学組成物は、１種以上のコリン作用性化合物（例えば、カルバコール（カルビルコリンクロリド））を含む。
【００４６】
本発明者らはまた、細胞外電圧または電位の振動を、種々の生理学的刺激パターンを使用して誘発することによって、ネットワークレベルのニューロン応答を誘導または刺激することが望ましいことを見出した。１つのバリエーションにおいて、組織サンプルの局所的領域（例えば、貫通通路、苔状線維、またはＳｃｈａｆｆｅｒ交連領域）に対する生理学的刺激が使用される。
【００４７】
なお別のバリエーションにおいて、本発明のプロセスは、予測刺激制御システムの使用によって、このような刺激パターンが組織振動に送達される（例えば、５回の１００マイクロ秒パルスが、よりゆっくり継続している振動の上昇相の間に送達される）べきである時点を正確に決定する工程を包含する。振動活動がない場合、ニューロンサンプルへの刺激送達の正確な時間は、重要ではない。しかし、ニューロンサンプルが振動性挙動を示す場合、基本的な振動周波数に対する刺激送達の正確な時間は、重要であり得る。なぜなら、送達される電気パルスの列は、代表的には、ニューロンサンプルの将来的な電気的挙動に影響を及ぼすからである。従って、電気的パルスの列が、そのサンプルの振動性挙動に対して送達される場合に正確な時間を制御する能力は、この方法の識別能力を顕著に高める。さらに、モニタリング、分析および予測のプロセスは、好ましくは、将来的なパルスが、以前のパルスと同期化することを保証するために、連続的に行われる。プロセス全体をリアルタイムで行うことが特に望ましい。
【００４８】
刺激制御システムの根底にある概念は、一般的に、以下のアルゴリズムに従う：１）ニューロンサンプル由来の自発的振動が、ノイズ信号内で同定され、捕獲される；２）振動の基本的な周波数および相が決定される；３）振動の将来的な挙動が、時間間隔を合わせた電気的パルスの送達または電気的パルスの列の送達を同期化するために、推定される；および４）電気的パルスまたは電気的パルスの列が誘発され、ネットワークレベルの電気的ベースラインを得るために適切な時間で送達される。次いで、候補サンプル組成物は、インビトロニューロン組織サンプルに添加され得、得られた振動が、ネットワークレベルの電気的応答を得るために測定される。
【００４９】
より具体的には、ニューロン組織サンプルからの自発的振動（ＥＥＧ波）は、ＭＥＤ（捕獲された信号）により測定される。次いで、機器および環境に由来する電気的ノイズが、フィルタリングされる。各基本波の分離およびノイズのフィルタリングは、代表的には、フーリエ変換分析を使用して、パワースペクトル（振動数の関数としてのエネルギー）を計算することにより達成される。パワースペクトルの分析は、異なるＥＥＧ波のエネルギー含量を定量する。次いで、各波は、より狭いバンドフィルタをフーリエ変換に適用し、次いで、振動の時間表示を得るためにこれを逆数にすることによって、分離され得る。次いで、刺激制御システムに備えられるソフトウェアは、通常、独立した律動を同定および分離し、それらの関連パラメーターを測定し、そして最新のデータが電気的パルスもしくは電気的パルスの列を特定の律動を有する相において送達するときに使用されるように、実験推移として情報を更新するために、プログラムされる。図１−２（Ａ）は、いくらかの量のノイズを有する単一の波を有する捕獲された信号の例であり、一方図１−２（Ｂ）は、高周波数フィルタを適用して、自発的振動波を強調した結果を示す。
【００５０】
次いで、図１−２（Ｃ）に例示されるように、フィルタリングした波形の最大電位および最小電位は、フィルタリングされた波形の第１の導関数の近似を使用して計算される。応答の確率特性は、「偽」極大および「偽」極小（すなわち、プラトーを示すのであって、真の極大を示すのではない局所極大または局所極小）を作りだし得る。２つのこのような「偽」極大（これは、丸で囲まれている）はまた、図１−２（Ｃ）に示される。次いで、本来のフィルタリングされた波形の第２の導関数の近似を使用して、変曲点として「偽」極大値を同定し、それらを適切に排除することが可能である。図１−２（Ｄ）は、この排除プロセスが適用された後の真の極大および極小を示す。
【００５１】
図１−２（Ｅ）に見られるように、次いで、真の極大および極小は、２つの棒グラフ（一方は極大値について、他方は、極小値について）を作るために使用され得る。これらの棒グラフから、正の累積確率分布および負の累積確率分布の両方を得ることが可能である。これらの分布は、任意の極大（あるいは極小）が、特定の閾値電圧より大きい（小さい）規模を有する確率を示す。
【００５２】
一旦閾値が計算されると、電気的パルスまたは電気的パルスの列を、極大ピークまたは極小ピークのいずれかに対して送達することが可能である。例えば、ソフトウェアは、組織サンプルに由来する自発的電気的波形を連続的に捕獲し、それらを分析し、関連するパラメーターを更新する。刺激制御システムユーザーは、実行するための特定の刺激パターンおよび特定の刺激部位を選択する。１回を超える自発的振動律動が存在する場合、ユーザーはまた、特定の律動を選択して、刺激のための正の相および負の相に対して同期化させ得、そして確率閾値を同期化させる。確率レベルおよび対応する累積確率分布から、後者を逆数にすることによって、選択された確率閾値を満たす予測極大値を計算することが可能である。多くのデータ獲得カードに存在するソフトウェア制御出力誘発設備を使用して、刺激パターンの送達をプログラムして、計算された閾値電圧の達成と同期化させることが可能である。同様に、引き起こされた応答の記録は、同じ誘発設備を使用して開始され得る。
【００５３】
その後、精神活性化合物を含んでも、含まなくてもよい候補サンプル組成物は、次いで、インビトロでニューロン組織サンプルと接触される。次いで、ネットワークレベルの電気的応答（すなわち、細胞外電圧または電位のアレイ）は、測定される。刺激パルスの導入および／または精神活性化合物の導入の前および後でのネットワークレベルの電気的波形の比較は、精神活性組成物の存在および／または特徴付けに対する情報を提供することを本発明者らは見いだした。特定の化合物に対するさらなる詳細は、実施例において以下に提供される。
【００５４】
精神活性化合物の存在または特徴付けに関して重要な情報を提供する１つの適用は、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）の使用である。ＦＦＴは、種々の異なる領域において使用され、スペクトル分析器として公知のデバイスにおいて一般に使用される。測定アレイにおける特定の測定値に対するＦＦＴの適用および（その同じ位置での候補組成物の導入の前に）特定の測定値に対するその結果の比較は、精神活性化合物の存在、特徴付け、または薬理学的活性に関して重要である。具体的には、この候補が、分析されるニューロンサンプルの領域において精神活性である場合、そのように分析された信号の比較は、ピーク周波数、振幅、この２つの、または他の生理学的効果との組み合わせにおけるシフトを示し得る。
【００５５】
電流源密度（ＣＳＤ）分析は、別の有用な適用である。この分析手順の議論は、例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、「Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｔｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ａｎｕｒａｎ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ３８（２）：３５６−６８（１９７５）において見いだされる。この分析手順は、本明細書中に記載のデバイスにより測定される電位または電圧を変換するために使用され得、これらの電位または電圧を電流の類似の構成されたアレイに変換し、より重要なことには、電流規模に変換する。電流の規模と方向を時間の関数として相関させることにより、電流「シンク」および電流「源」が観察され得る。このような「シンク」および「源」は、インビトロでニューロンサンプルに添加される精神活性薬物の存在、特徴付け、または薬理学的活性を決定するにあたって重要である。
【００５６】
一般に、そして文脈がその用語について別の意味を示さない限り、本発明者らが、精神活性化合物または組成物に言及する際に用語「特徴付け」または「特徴付ける」を使用する場合、本発明者らは、引き続く化合物または組成物の実用的な局面、医学的局面、または機能的局面（例えば、これらの化合物または組成物の化学的同定、特異的精神活性作用、疑われる心理学的分岐および／または生じた心理学的分岐など）を可能にする、特定の形態または形式を有するデータベースを作製するために、本明細書中に記載される一連の観察測定および分析工程を本発明者らが使用したことを意味する。一旦、観察されたデータが、記載される手順を使用して分析されると、データセットの形態または形式は、次いで、既知の精神活性化合物と接触されそして同じ様式で分析された、インビトロニューロン組織サンプルから生成された、対応するデータと容易にかつ正確に比較され得るようなものである。さらに、特定の精神活性からの特徴付けデータセットは、さらに分析され得、そして他の方法論によるデータ（例えば、非インビトロアッセイで生成されたデータ）と対比または比較され得る。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例は、精神活性化合物が、インビトロでニューロン組織サンプルにおいてネットワークレベルの応答を測定することにより、検出および特徴付けられ得ることを示すために提供される。当業者は、特定の実施形態が説明および記載されるものの、種々の改変および変化が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることを認識する。
【００５８】
（実施例１）
（多電極アレイの調製）
現在導入されているＭｕｌｔｉ−Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  Ｄｉｓｈ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ：ＭＥＤプローブ）の調製のための手順は、Ｏｋａら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９３：６１−６７（１９９９）によって記載されている。このデバイスは、６４の平坦な微小電極のアレイを有し、各電極が、５０×５０μｍの大きさを有し、８×８のパターンで配置されている。以下に記載の実験に使用したプローブは、３００μｍの電極間間隔を有する媒体アレイ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ：ＭＥＤ−Ｐ５３０ＡＰ）であった。
【００５９】
プローブへのスライスの十分な接着のために、ＭＥＤプローブの表面を、２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）中０．１％のポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ：Ｐ−３１４３）で、室温で８時間処理した。このプローブ表面を、滅菌蒸留水で３回リンスした。次いで、プローブ（チャンバー）に、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２混合培地（１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ：１６１４１−０７９）および１０％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ：１６０５０−１２２）を含有する）を、３７℃で少なくとも１時間満たした。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２混合培地とは、Ｎ２補充物（ＧＩＢＣＯ：１７５０２−０１４）およびヒドロコルチゾン（２０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ，Ｈ０８８８）を補充された、ダルベッコ改変イーグル培地およびハムＦ−１２の１：１混合物（ＧＩＢＣＯ：Ｄ／Ｆ−１２培地、１２４００−０２４）である。
【００６０】
（実施例２）
（海馬スライスの調製）
１７〜２５日齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、ハロタン（２−ブロモ−２−クロロ−１，１，１−トリフルオロエタン；Ｓｉｇｍａ；Ｂ４３８８）での麻酔後に断頭して屠殺し、そして脳全体を取り出した。この脳をすぐに、以下の組成（ｍＭで）の氷冷酸素化調製緩衝液中に約２分間浸漬した：１２４  ＮａＣｌ、２６  ＮａＨＣＯ３、１０  グルコース、３  ＫＣｌ、１．２５  ＮａＨ２ＰＯ４、１．５  ＣａＣｌ２、および０．５  ＭｇＳＯ４。脳の適切な部分を切り取り、そして振動組織スライサー（Ｌｅｉｃａ，ＶＴ−１０００Ｓ）の氷冷ステージに配置した。このステージに、酸素化調製緩衝液と凍結調製緩衝液との両方をすぐに満たした。各組織スライスの厚さは、３５０μｍであった。各スライスを、鈍い端部のピペットを使用して刃から穏やかに剥がし、そしてすぐに、酸素化調製緩衝液に、室温で少なくとも１時間浸漬した。次いで、スライスを、ＭＥＤプローブの中央に配置した。このスライスを、８×８のアレイを覆うように配置した。スライスを配置した後に、ＭＥＤプローブをすぐに、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２で満たした箱に入れ、３２℃で１時間、回復および接着させた。
【００６１】
（実施例３）
（電気生理学的記録）
電気生理学的記録の間、ＭＥＤプローブ上のスライスを、３２℃の小さいＣＯ２インキュベーター（Ｙａｍａｔｏ：モデルＩＣ４００）に入れた。このスライスをＭＥＤプローブ上に維持し、これを、記録インターフェースに取り付け、そして湿らせた９５％Ｏ２および５％ＣＯ２の気体混合物を、上方から吹き込んだ。この条件において、応答を、２時間より長くにわたって記録した。
【００６２】
カルバコールを、Ｓｉｇｍａから入手した。カルバコール溶液を、２５μＭまたは５０μＭのいずれかの既知の濃度で、ニューロンサンプルに適用した。低い方の濃度を、２つの場合を除く全てにおいて使用した。これらの２つの場合において、２５μＭが強力な振動を誘導するために不十分であることがわかった後に、濃度を５０μＭに上昇させた。カルバコール溶液を、凍結アリコートから毎日調製した。
【００６３】
６４の全ての部位における、自発的な場の電位および誘発される場の電位を、マルチチャネル記録システム（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ：ＭＥＤ６４システム）を用いて、２０ｋＨｚのサンプリング速度で同時に記録した。誘発される応答の場合、利用可能な６４個のうちの１つまたは２より多くの微小電極を、刺激のために選択した。双極性定電流パルス（２０〜４０μＡ、０．１ミリ秒）を、アイソレータを介してデータ獲得ソフトウェアによって発生させた。刺激微小電極を、６４スイッチボックスによって選択した。
【００６４】
（実施例４）
（刺激制御システム）
図１−１および１−２は、振動の正のピークまたは負のピークと同期して、ニューロン組織スライスに対して電気パルスの刺激パターンを送達する、刺激制御システムのフローチャートおよびアルゴリズムを示す。振動は、自発的な振動、または電気パルス、化学組成物、もしくは共析出ニューロン組織によってそれ自体が誘導される振動であり得る。
【００６５】
この刺激制御システムの効果を、図１−３にまとめる。第一に、刺激を、このシステムを用いずに送達し、そして５つの連続した応答を捕捉した（図１−３Ａ）。第二に、刺激を、正のピークにおいて送達し、そして５つの連続した応答を捕捉した（図１−３Ｂ）。最後に、刺激を、負のピーク（谷）において送達し、そして５つの連続した応答を捕捉した（図１−３Ｃ）。
【００６６】
刺激を正のピークにおいて送達した場合、この応答の第一の負のピークの振幅は、約−２０ｕｖであった。刺激を負のピークにおいて送達した場合、この応答の第一の負のピークの振幅は、約−４０ｕｖであった。これらの２つの応答の間に、第二の負のピーク時間の差異もまた存在した（５２４ｍｓ対５２０ｍｓ）。刺激がランダムに送達された場合、その応答は、これらの２つの群の間で分配された。
【００６７】
本明細書中以下に記載される実施例において、パルスの列を、振動のピークにおいて送達した；しかし、代替のパルス送達パターンが、当業者によって認識される。
【００６８】
（実施例５）
（コリン作用性β律動）
コリン作用的に駆動されるβ波の例を、図２に示す。パネルＡは、６４の電極のアレイ上に配置された、海馬スライスを示す。パネルＢは、パネルＡに示されるスライスからの、バックグラウンド活性のコントロール記録を示す。何らかの自発的な単一ユニットの活性が観察されたが、同期した場の電位振動は存在しなかった。パネルＣは、パネルＡに示されるスライスから、コリン作用性律動の誘導後に採取された、２秒のサンプルについて比較された、高速フーリエ変換を示す。２６Ｈｚにおける垂直な点線は、この特定の時間サンプルについて、電力が最大であった周波数を示す。スライス内の律動活性の変動は、試行にわたって存在し、そしてこの特定のスライスにおいて、最大電力は、１８〜３０Ｈｚの範囲内で、約１１０００±４０００ｍＶ２（平均±標準偏差）であった。パネルＤは、パネルＣにおけるパワースペクトルに対応する、時間サンプルについての場の電位の振動を示す。パネルＣとＤとの両方に示されるように、電力は、先端突起場において最大であり、そして場ＣＡ１の錐体細胞体のすぐ上であった。予測通り、律動の位相は、パネルＤにおいて電極Ｃ２およびＣ４からの追跡で例示されるように、細胞体層にわたって逆であった。
【００６９】
（実施例６）
（持続されたネットワーク応答の層状プロフィールおよび局所的分布）
図３は、律動活性の非存在下での応答を、コリン作用的に駆動されるβ波の間に誘発された、ネットワーク応答と比較する。パネルＢに示されるように、コントロールの場合における優勢応答は、場ＣＡ１（例えば、電極Ｄ２）の先端突起における、迅速に発生し、そして持続時間が短い、負で発生する電位である。これは、Ｓｃｈａｆｆｅｒ交連（Ｓ−Ｃ）突起の過去の生理学的研究において記載された、従来の場のＥＰＳＰに対応する。スライスにおける他の箇所での応答は、場ＣＡ１において記録される応答よりずっと小さい。カルバコールを添加すると、単一パルス刺激に対して２つの型の応答が発生する。８つのスライスからの５３のうちの１６の記録において、応答は、上記コントロール応答に類似するようである（パネルＣ）。しかし、同じ８つのスライスからの５３の追跡のうちの３７において、カルバコールは、以下の２つの明らかな変化を生じる：１）単一のパルスが、場ＣＡ３の錐体細胞層において、スパイクのバーストを誘発する；そして２）ＣＡ１とＣＡ３との両方において、電位が顕著な特徴になる（パネルＤ）。４つのスライスのさらなるセットを、分析から排除した。なぜなら、遅延した応答が場ＣＡ１において観察されなかったからである。これはおそらく、弱いＣＡ３→ＣＡ１突出を生じる、スライス調製におけるわずかな差異に起因する。
【００７０】
これらの結果は、図３および４に示される単一の追跡において、より明らかに見られ得る。場ＣＡ１におけるコントロール応答（灰色で示される）は、放射状層（刺激される線維の末端；図４、下）と上昇層（図４、上）との間で極性が逆転する、代表的な二相の応答を含んだ。場ＣＡ１におけるＳｃｈａｆｆｅｒ交連応答は、カルバコールの存在下で、大いに改善された（黒色追跡、図４）。遅い負の電位および引き続く遅い正の電位からなるシーケンスを、先端突起において記録された潜伏の短い場ＥＰＳＰ（例えば、図２の電極Ｅ３）に追加した。負で起こる成分（これは、最初の応答の約１ミリ秒後および刺激の２５ｍｓ後に開始した）は、高周波数のスパイキングの証拠を伴った。これはおそらく、場ＣＡ３における錐体細胞体における活性の反映であった。なぜなら、これらのスパイクは、この領域において最大であったからである。おそらく、ＣＡ１の先端突起における遅延した応答は、ＣＡ３錐体細胞の延長したスパイキング（これは、Ｓｃｈａｆｆｅｒ交連線維を反応性にし、以下により詳細に議論される）に起因した。Ｓｃｈａｆｆｅｒ交連線維の先端突起末端場における、改善された応答の全ての成分は、上昇層における極性を逆転させた（黒色追跡、図４、上）。
【００７１】
カルバコールはまた、場ＣＡ３において記録された誘発された電位に対して、非常に大きい効果を有した（図５）。ＣＡ３ａの先端突起におけるコントロール応答は、代表的な場ＥＰＳＰであり（図５、左下、灰色追跡）、一方で対応する基底樹状領域（上昇層）は、予測された極性の逆転を示した（図５、左上、灰色追跡）。カルバコールの添加は、正で起こる遅い電位の出現を生じ、これは、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）が依然として存在する間に開始し、そして最終的に、ＣＡ３の先端突起における負で起こる遅い電位で置き換えられた（図５、左下、黒色追跡）。ＣＡ３における遅い電位の先端突起シーケンス（正−負）は、ＣＡ１におけるものと逆であることに注目のこと。先端突起応答の位相が逆転したバージョンは、ＣＡ３の基底樹状突起で起こった（図５、左上、黒色追跡）。スパイクのバーストは、ＣＡ３におけるカルバコール依存性の遅い電位の最初のものを伴った（図５、右のパネル、黒色追跡）；これらは、細胞体層において顕著であり、そしてこの層からの距離と共に、振幅が減少した。このバーストは、１００〜２００Ｈｚの周波数を有し、そしてポストＥＰＳＰの遅い波の最初のものの、最も早い段階で開始した。細胞発射のバーストは、近くでの脱分極電流を伴わなければならないので、細胞スパイキングに対応する、ＣＡ３基底樹状突起における負で起こる波形は、最も、脱分極波形でありそうであり（以下の電流源密度分析で確証した）、ＣＡ３細胞を反復的に発射に駆動した。ＣＡ３錐体細胞の延長した発射は、おそらく、Ｓ−Ｃ線維の二次的な活性化を引き起こし、ＣＡ１放射状層において記録される遅延した、遅い、負で起こる電位を生じた。コントロール条件下で、ＣＡ３の錐体細胞層において、細胞スパイキングが存在しなかったことに注目のこと（図５、右のパネル、灰色追跡）。
【００７２】
検出可能な応答は、コントロール条件において、場ＣＡ３ｂおよびＣＡ３ｃにおいて事実上非存在であったが、コリン作用性β振動の存在下では、ＣＡ３の全体にわたって、応答が反響した。細胞スパイキングが、改善されたカルバコール応答の間に、ＣＡ３の錐体細胞層の全体にわたって観察された（図５、右のパネル、黒色追跡）。ネットワーク応答は、コントロール応答より空間的に分布したのみでなく、これらは、ずっとより長い期間にわたって拡張した。この論題は、以下でさらに詳細に取り組まれる。
【００７３】
図３および４に示される記録は、コリン作用性活性化の間にＳ−Ｃ刺激によって駆動される遅い応答が、場ＣＡ３において蓄積し、次いで、場ＣＡ１に伝播することを示唆する。このことの試験を、先に記載された細胞スパイクのバーストを使用して実施した。１００Ｈｚの応答を高域濾波して遅いシナプス電位を除去することにより、バーストが、場ＣＡ１においてより場ＣＡ３において、より大きいことが明らかになった（図６）。相互相関は、ＣＡ１におけるスパイクがＣＡ３におけるスパイクから２〜４ミリ秒（ＣＡ３からＣＡ１への、Ｓｃｈａｆｆｅｒ交連突起の既知の導電速度とよく一致する値）遅延する場合に、ＣＡ１およびＣＡ３におけるスパイクが、よく相関することを示した。これらの結果は、刺激によって誘発されるスパイキングバーストが、場ＣＡ３において生じ、次いで、そこからＣＡ１へと伝播するという概念を確認する。
【００７４】
（実施例７）
（応答の時間経過）
速い成分の、最小の負で起こる電位は、場ＣＡ３の先端突起において平均５．５±０．７ミリ秒で、そしてＣＡ１先端突起場において平均５．３±１ミリ秒（平均±標準偏差、８のスライスからのｎ＝３７の刺激試行）で起こった。ＣＡ３基底樹状突起の負で起こる電位の遅い成分の最小は、２４±１０．５ミリ秒で起こった。ＣＡ１において、先端突起において負で起こる遅い電位の最小値は、５２．４±１９ミリ秒で、有意により遅く起こった（対比ｔ検定、両側、ｐ＜０．０００１）。遅い電位における高度な変動性は、スライスにわたる個々のバリエーションに起因した。また、遅延した電位は、コントロールの単シナプスＥＰＳＰとは異なり、複数のシナプス事象を統合し、従って、さらなる程度の変動を導入した。
【００７５】
ＣＡ３基底樹状突起における、負で起こる遅い電位に対応する、ＣＡ３先端突起における、正で起こるピーク電位は、１７±７．４ミリ秒で起こった。このピークは、おそらく、基底樹状突起における脱分極電流と、フィードバック介在ニューロンによって発生する反射された過分極電流との両方の源であった。その最大は、ＣＡ３の基底樹状突起場における、最小の負で起こる遅い電位より、応答の有意により短い時間の後に起こった（対比ｔ検定、両側、ｐ＜０．００１）。このことは、正で起こる波形が、基底樹状突起波形の単なる逆ではないことを示した。さらに、そのピークの時間経過は、ＣＡ３先端突起における主要な速い応答に応答してフィードバック介在ニューロンによって発生される、ＩＰＳＰと一致した。
【００７６】
（実施例８）
（応答の大きさ）
負で起こる速い電位の最小振幅は、ＣＡ３先端突起場において−６０±４０μＶであり、そしてＣＡ１先端突起場において−７０±５０μＶあった。これらの値のいずれも、ＣＡ１先端突起において負で起こる遅い電位の最小振幅（−１０５±４３μＶ）とも、ＣＡ３先端突起における遅い負で起こる電位（−１８０±８８μＶ）とも、有意に相関しなかった。平均すると、遅い成分の最小振幅は、ＣＡ３とＣＡ１との両方において、速い成分の最小振幅より負であった（対比ｔ検定、両側、ｐ＜０．０１）。ＣＡ３先端突起における正で起こる大きい波形の、平均最大振幅は、１７０±１３５μＶであった。振幅測定のいずれも、振動の電力に有意に相関することが見出されなかった。
【００７７】
（実施例９）
（電流源密度分析）
使用された、連続的な二次元電流源密度の方法は、以前に記載されている（Ｓｈｉｍｏｎｏら、前出）。電極の二次元アレイは、スライスの平面内の任意の二方向において、電流の同時の推定を可能にする。データを、１００Ｈｚで低域濾波し、そして３×３の重み付けをした平均カーネル（０  １／８  ０、１／８  １／２  １／８、および０  １／８  ０）によって空間的に平滑化した。この結果を、３×３のラプラスカーネルで巻き込み、二次空間微分の不連続な近似を生じる。この技術の制限は、大きい空間パターン（電極間距離の半分以上の半径を有する）のみが、正確に分解され得ることである。さらに、低域濾波は、高周波数のデータを除去し、観察され得る細部の量を制限する。
【００７８】
図７は、Ｓ−Ｃ経路の刺激に続いて、３０ｍｓの時間ウィンドウにおける選択された時点についての、二次元電流源密度分析の結果を示す。２５μＭのカルバコールの存在下で維持されたネットワーク応答についての、推定された電流シンク（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｉｎｋ）（灰色）および源（白色）を、上の４つのパネルに示し、そしてコリン作用性活性の非存在下で誘発された応答についてのものを、下の４つのパネルに示す。刺激後４ｍｓにおいて、応答は非常に類似していたが、コリン作用性律動の存在下での刺激は、ネットワークの大部分にわたって広がる応答を誘発した。両方の場合において、主要な脱分極電流シンクは、ＣＡ１およびＣＡ３の先端突起場に生じた。対応する電流源双極子は、細胞体層にわたって記録されたが、カルバコール応答についてＣＡ３基底樹状突起場においては、顕著ではなかった。その代わりに、脱分極電流は、ＣＡ３の細胞体において発生し、そして電流シンクを作製し始めるようである。カルバコールの場合、刺激後１０ｍｓまでに、ネットワーク全体が、完全に可動化された。この時点での、コリン作用性応答とコントロール応答との間の２つの主要な差異は、カルバコール応答の間に、ＣＡ３先端突起における大きい電流源、およびＣＡ３基底樹状突起において良好に形成された電流シンクの出現であった。コントロール条件において、ＣＡ３の双極子は、ＣＡ１における双極子（先端シンク／基底源）と同じであり、一方で、カルバコールが存在した場合に、双極子の関係は、ＣＡ３において逆転された（ＣＡ３先端源／基底シンク、ＣＡ１先端シンク／基底源）。活性の広がりは、カルバコールなしで見られたものよりカルバコールが存在する場合において、はるかにより大きいこと（特に、活性が錐体細胞層の末端（すなわち、場Ｃａ３ｃ）に達する場ＣＡ３において）もまた、明らかである。より大きい広がりに確かに関連して、活性の強度は、カルバコールの存在下で顕著に増加した。刺激後２３ｍｓにおいて、誘発された応答の興奮性成分は、コントロール条件において存在せず、ＣＡ１およびＣＡ３ａの先端突起場において、過分極電流源によって置き換えられた。対照的に、コリン作用性応答は、場ＣＡ１の先端突起において、持続した興奮性電流シンクを示した。電流シンクはまた、この時点で、ＣＡ３の基底樹状突起および細胞体において観察された。刺激後３０ｍｓにおいて、ＣＡ１における持続した先端電流シンクおよびその対応する基底源は、カルバコール応答において強力なままであったが、一方で、ほんの弱い先端電流源が、コントロール条件において持ちこたえた。
【００７９】
電流源密度分析は、刺激後約５、１０、２０および３０ｍｓの時点で、８のスライスのうちの７のスライスにおいて一致したパターンを生じた。３０ｍｓ後、推定電流における大きな程度の時間的可変性が、ＣＡ３における細胞スパイクを示す顕著に高振動数の成分の遅い電位および発生におけるタイミングの可変性におそらく起因して、スライスにわたって生じた。従って、刺激の３０ｍｓ後に計算された刺激電流源は、本明細書中で考察されない。
【００８０】
（実施例１０）
（応答可変性）
コリン作用性リズムの存在下におけるＳｃｈａｆｆｅｒ側副枝系に対する刺激は、刺激試行の約７０％において、持続性のネットワーク応答を引き起こし、一方、他の刺激試行において、コントロールＥＰＳＰに類似した応答が引き起こされた。分析は、振動の段階（刺激パルスが送達される段階）が、この可変性の原因であることを示した。分析は、ネットワーク応答が引き起こされる４７回の刺激試行のうち３４試行において、１８の刺激パルスが、ＣＡ３の基底樹状領域において明らかに極小に減少したことを示した。ネットワーク応答が生じる１１の刺激試行において、ＣＡ３基底樹状突起における電位がゼロに近づいた場合に、刺激が生じた。持続性の応答がカルバコールの存在下で生成されない１３の記録のうちわずか２つのみが、基底樹状突起において極小に達する刺激パルスを示した。
【００８１】
ネットワーク測定は、密接に関連した化合物の間のわずかな差違に対して感受性であるだけでなく、これらは非常に低い濃度に対しても感受性である。図８は、危険な環境レベルに近い濃度のヘプタクロル（認識を損なう殺虫剤）の、Ｓｃｈａｆｆｅｒ交連刺激に対する効果の例を示す。示されるように、上記のネットワークの複雑な誘発応答の遅い成分は、１００ｎＭのヘプタクロルの存在下で劇的に変化するが、従来の誘発応答に対応する速い成分は、変化しない。興味深いことに、観察された正確な変化は、波形の遅い成分の脱分極期の完全な排除である。この持続性の活性化期の排除は、認識機能が減じられるという予測を導く。ヘプタクロルの曝露の認識効果は、記憶の欠損および錯乱を引き起こす。
【００８２】
図９〜１１は、認識増強薬学的クラスの化合物が、低濃度で種々の効果を誘導することを証明する。このクラスで試験される全ての化合物は、細胞発射および興奮性電位の両方を増大し、このことは、これらの薬物が、興奮性伝達を促進することによって作用することを示す。しかし、個々の化合物の効果の間の小さなタイミングの差異が存在した。
【００８３】
図９は、試験された認識増強剤の１つであるＣＸ１０３６の存在下（灰色）および非存在下（黒色）における海馬ネットワークを横切るネットワーク誘発応答を示す。スパイキングおよび負に向かう電位の特徴的な増加が現れ；さらに、この特定の化合物は、遅い電位の開始時間を加速することが見出された。
【００８４】
図１０は、ＣＡ３層状錐体におけるネットワーク誘発応答に対する、別の認識エンハンサーの効果を示す。このクラスにおける他の化合物の場合と同様に、細胞スパイキングおよび興奮性電位は、増強されたが；応答のタイミングは、この化合物によって影響を受けなかった。
【００８５】
図１１は、単シナプス応答の閾値よりも２桁小さい濃度で試験された最近の認識増強化合物の、ＣＡ３先端領域および基底樹状突出領域におけるネットワーク誘発応答に対する効果を示す。このクラスにおける薬物が、細胞発射を増加し、そして興奮性電位を増幅することがまた、明らかである。しかし、この場合、遅い電位の開始が遅れることが見出された。
【００８６】
密接に関連した化合物の間の応答のタイミングにおけるこれらのわずかな差違は、これらの薬物の各々が、異なる認識欠損を処置するのに比類なくよく適し得ることを示唆する。これらの３つの薬物の、単シナプス応答に対する効果が、互いに識別不可能であることが観察されることが興味深い。
【００８７】
（データ分析）
実施例において提供されるデータは、リズム活性が、興奮性刺激によって生成される応答に対する著しい影響を有し得、さらに、このような相互作用の性質に関する情報を提供し得ることを示唆する。Ｓｃｈａｆｆｅｒ交連突出部（海馬の主要な連合系）の刺激に対する応答は、コリン作用性アゴニストの導入後の標準的な領域のＥＰＳＰよりもはるかに複雑になる。
【００８８】
Ｓ−Ｃ刺激に対する応答の大きさおよび持続時間は、リズム活性の開始後の試行にわたって大きく変化し、この可変性の多くは、リズム期に関する刺激パルスのタイミングに起因し得る。従って、脳において、リズム活性に関連する同期化は、信頼性のある予測可能な時間ウインドウを作製するためのストラテジーであり得、このストラテジーの中で、適切な時間に達成する求心性が、ニューロンネットワーク全体の処理能を利用し得る。
【００８９】
これらの結果は、ある程度の同期化が、リズム活性と興奮性インプットとの間で必要であることを示唆する。内皮質の浅層は、一次海馬求心性であり、そしてコリン作用性アゴニストを注射された場合にβ波を発生することが報告されている（Ｓｈｉｍｏｎｏら、前出）。興味深いことに、海馬および鉤状回の重要な標的である、内皮質の深部層は、同じ条件下で、γリズムを生成する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  ８２（５）：２４４１−２４５０（１９９９））。Ｉｉｊｉｍａらは、内皮質から海馬への情報の伝達が、周波数依存性であることを報告し、この周波数依存性の伝達は、海馬への情報の侵入を選択的にゲーティングすることに関与し得ることを提唱した（Ｉｉｊｉｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１１７６−１１７９（１９９６））。同様に、γ活性は、カルバコール注射の後の海馬において生じることが報告され（Ｆｉｓａｈｎら、前出；Ｆｅｌｌｏｕｓら、前出）、海馬と内皮質との間のγ干渉は、インビボで比較的高い（Ｃｈａｒｐａｋら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７：１５４８−１５５７（１９９５）；Ｃｈｒｏｂａｋら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １８：３８８−３９８（１９９８））。いずれにしても、海馬および後海馬皮質は、十分に類似の局所回路を有するようであり、その結果、コリン作用性中隔突出物は、β活性により必要とされる同期化を提供し得る。
【００９０】
皮質リズムは、通常、求心性を同期化し、それによってこれらの求心性を、これらの求心性が時間的に分散した様式に達成する場合よりも効果的にすると考えられる。他の研究は、特定の天然に存在するリズムが、シナプス形成性との深い関係を有することを示した。本結果は、リズム活性が求心性の機会のウインドゥを示し、その結果、穏やかなインプットの適切に弛緩設定された到達が、大きくかつ時間的に分散した応答を生じ得ことを示すことによって、電位機能のリストに加えられる。このような応答およびこのような応答の特徴付けは、中枢的に活性な薬剤の強力な検出および特徴付け手段を提供する。
【００９１】
本願において引用された全ての刊行物および特許出願は、本明細書中でそれらの全体が参考として援用される。上述の発明は、明確化および理解の目的のために例証および実施例として記載されるが、本発明の教示において、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなしに特定の変更および改変がなされ得ることが、当業者によって容易に理解されるものである。
【００９２】
（参考文献）
【００９３】
【数１】
2005505761.tif 000002
【００９４】
【数２】
2005505761.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１−１】図１−１は、オペレーターに、特定の時間における振動応答を示すニューロン組織切片を、それらの基本的振動活性に対して刺激することを可能にする、制御システムのフローチャートである。
【図１−２】図１−２は、刺激制御システムのためのアルゴリズムを示す：Ａ）捕捉された自然応答；Ｂ）ハイカットフィルターされた自然応答；Ｃ）検出されたポジティプピークおよび負ピーク（偽ピークは丸で囲む）；Ｄ）偽ピークの除去；Ｅ）ポジティプピークおよび負ピークのヒストグラム；およびＦ）ポジティプピークおよび負ピークに対する蓄積確率分布。
【図１−３】図１−３は、刺激制御システムの効果を示す：Ａ）このシステムを用いることなく、時間５００ｍｓにおいて送達された刺激、および５つの連続的応答の捕捉；Ｂ）ポジティプピークにおける刺激の送達、および５つの連続的応答の捕捉；およびＣ）負ピーク（トラフ）における刺激の送達および５つの連続的応答の捕捉。
【図２】図２は、海馬組織におけるカルバコールで誘導されたβリズムを示す：Ａ）６４電極（電極間間隔：３００μｍ）の媒体アレイ上に配置された海馬切片；Ｂ）カテコール注入前の自然活性；単一ユニットの活性が検出可能であったが、同調した細胞発射は存在しなかった；Ｃ）βリズムの迅速フーリエ変換；２５μＭのカルバコールの注入後、６４すべての電極について算出した補正出力スペクトルは、優勢振動がβ範囲にあり、そして出力が尖端樹状突起場で最大であったことを示した；およびＤ）カルバコール注入後記録されたβリズム；このリズムの波形は、細胞体層を横切って逆転し（例えば、Ｃ２対Ｃ４）、活性が局所的に生成されたことを示した；振幅は、尖端樹状突起（例えば、電極Ｃ４）中、および細胞体上で直接（例えば、電極Ｅ３）大きかった。リズムは２時間に亘って安定なままであった。較正棒：２５０ｍｓ、１００μＶ。
【図３】図３は、カルバコールの存在下および不在下にＳｃｈａｆｆｅｒ側副枝の刺激後の海馬ネットワークを通じて誘起された応答を示す：Ａ）電極の媒体アレイ上に配置された海馬切片（電極間間隔：３００μｍ）；電極Ｆ３をＳ−Ｃ刺激のために選択した；Ｂ）コントロール条件で６４すべての部位を横切って誘起された電位；応答が全ネットワークを通じて伝播しなかったことに注目のこと；活性は、ＣＡ３（例えば、電極Ｆ４）およびＣＡ１（例えば、電極Ｅ３）の尖端樹状突起場に限定されなかった；相逆転が、ＣＡ１中の細胞体層を横切って優勢であった（例えば、電極Ｅ１対Ｅ３）；Ｃ）カルバコール存在下で誘起された電位、ここで、複雑な応答は生成されなかった；応答および領域分布は、コントロール条件に類似していた；バックグラウンドβリズム活性は、刺激後ほぼ直ちに再開した；およびＤ）β波の存在下で誘起された応答、ここで、複雑な、反射応答が生成された；初期の急速に負に進む電位が、ＣＡ３およびＣＡ１の尖端樹状突起場で観察された；しかし、リズム活性への迅速な戻りの代わりに、持続する応答が観察された。恐らくは、ＣＡ３の基礎樹状突起場（例えば、電極Ｅ６）中の随伴する負に進む波形によって駆動される、高振動数の細胞スパイキングが、ＣＡ３椎体細胞から記録された（例えば、電極Ｇ５）。ＣＡ３の尖端樹状突起場は、ゆっくりと負に進む電位が続く、ゆっくりと正に進む電位を示した。これらの尖端基礎遅延電位相相関関係は、ＣＡ１では逆転した。遅延した負に進む遅延電位がＣＡ１の尖端樹状突起場（例えば、電極Ｅ３）で記録され、基礎樹状突起場における対応する遅延した正に進む遅延電位（例えば、電極Ｅ１）をともなった。この複合応答の間に全ネットワークを横切る増加した活性の拡散に注目のこと。較正棒：１００ｍｓ、２００μＶ。刺激アーティファクトは、各トレースの遠く左にある垂直線として見える。
【図４】図４は、カルバコール誘導β波の存在下（黒）および非存在下（灰）のＳｃｈａｆｆｅｒ側副枝経路への刺激後の海馬のＣＡ１領域中で誘起された電位を示す。各トレースの中心にある水平の点線は、０μＶを示す。任意のリズム活性の不在下の刺激は、急速なナガティブに進む電位、それに続くＣＡ１放射状膜（下）中の正に進む後電位からなる、立体型応答を生じた。応答の相逆転が、ＣＡ１のｏｒｉｅｎｓ層（上）で記録された。全体の事象は、刺激後４０ｍｓで終了した。コリン作動性により誘導されたリズムの存在下で、顕著に異なる応答が記録された。ＣＡ１の尖端樹状突起場では（下）、第１の迅速な応答の後に、ゆっくりとした電位のシークエンスが続いた。最初は、負に進み、そして高振動数スパイキングをともなった。第２のゆっくりとした電位は、ポジティプに進み、そして刺激後１４０ｍｓまでベースラインに戻らなかった。ＣＡ１放射状膜中の応答は、多形層で、正に進むゆっくりとした電位の後に負に進むゆっくりとして電位が続くように相逆転し、そして刺激後１４０ｍｓでベースラインに戻った。
【図５】図５は、Ｓｃｈａｆｆｅｒ側副枝経路への刺激後の、カルバコール駆動βリズムの存在下（黒）および不在下（灰）の海馬の場ＣＡ３領域における誘起された電位を示す。各トレース中の点線の水平線は０μＶを示す。ＣＡ３の基礎樹状突起場では（左上）、コントロール応答は無視できた。カルバコール応答の迅速成分であったからである。このカルバコール応答のゆっくりとした電位の初期の相は、高振動数スパイキングが見える負に進む波形であった。この負に進むゆっくりとした電位の後には、約１２５ｍｓでベースラインに戻る正に進む電位が続いた。尖端樹状突起では（左下）、迅速な負に進む波形、それに続く過分極化電位からなる、代表的なコントロール応答が記録された。カルバコールの存在下では、尖端樹状突起応答は、正に進む波形にそれる前（刺激後約１０ｍｓ）の短時間（刺激後５ｍｓ未満）の応答に似ていた。ここで再び、高振動数のスパイクがこの相の間に見えた。先端応答は、初期の正に進む波形の後に負に進む波形が続くような、基礎応答の相逆転であった。高振動数スパイキングもの供給源は、ＣＡ３椎体細胞であり（右のトレース、上および下）、そしてスパイキングは、ＣＡ３三角骨層の全範囲を横切って観察された。細胞体におけるコントロール応答は有意でなかったことに注目のこと。ＣＡ３基礎樹状突起場における負に進む波形は、ＣＡ３の密な随伴システムを通じて、ＣＡ３椎体細胞の高振動数発射を駆動しているようであった。
【図６】図６は、複雑な応答の間の、高頻度の発火を示す。単一の刺激パルスを、２５μＭのカルバコールの存在下で、Ｓ−Ｃ経路に送達した。左側のパネルに示された海馬スライスから記録された応答を、刺激の１０〜８０ｍｓ後の時間セグメントの間に、遅い電位を除去するために、１００Ｈｚにて高いパスのフィルタにかけた（右側のパネル）。発火が、場ＣＡ３において、特に錐体細胞層において最も優勢であることが明らかであった。校正バー：５０ｍｓ、０．５ｍＶ。
【図７】図７は、カルバコール誘導性リズムの存在下（上）および非存在下（下）で誘発された応答についての、２次元電流源密度の概算を示す。脱分極電流シンクは灰色で示され、過分極電流源は白で示される。錐体細胞体の輪郭は、白の三角形として示され、より大きい細胞体は、場ＣＡ３を描写し、そしてより小さい細胞体は、ＣＡ１にある。Ｓ−Ｃ経路への刺激の４ｍｓ後、コントロールとカルボポール応答との間の差異は、最小であった。カルボポール応答の間、刺激の１０ｍｓ後、大きい電流源が、ＣＡ３の先端突起中に現れ、電流シンクが基底突起において現れる場合には、特にＣＡ３ｃにおいて現れた。コントロール応答において、活性は、ＣＡ３の全体にわたって広がらず、そしてＣＡ３先端／基底シンク双極子は、存在しなかった。２３ｍｓで、ＣＡ３細胞体および基底突起場は、電流シンクにより支配されたままであったが、ＣＡ３先端源もまた、そのままであった。延長された脱分極電流シンクは、ＣＡ１の先端突起場において観察され、対応する電流源は、ＣＡ１多形細胞層において観察された。他方で、コントロール応答は、識別特徴のみとしてのＣＡ１先端突起における後過分極（ａｆｔｅｒ−ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）と共に、この時点で弱い活性化を示した。この弱い過分極電流源は、３０ｍｓのコントロール応答のＣＡ先端突起において残存し、そしてカルボポール応答の間に同じ時点で同じ位置で観察された強い脱分極電流シンクと対照的であった。
【図８】図８は、成体汚染化合物であるヘプタクロルの注入の際の、ネットワークレベルにより誘発された単一パルスＳｃｈａｆｆｅｒ交連刺激の変化に対する応答を示す。
【図９】図９は、アンパキン（ａｍｐａｋｉｎｅ）ＣＸ１０３６の注入の際の、ネットワークレベルにより誘発された単一パルスＳｃｈａｆｆｅｒ交連刺激の変化に対する応答を示す。
【図１０】図１０は、アンパキンＣＸ５５４の注入の際の、ネットワークレベルにより誘発された単一パルスＳｃｈａｆｆｅｒ交連刺激の変化に対する応答を示す。校正バーは、５０ｍｓおよび０．４ｍＶである。
【図１１】図１１は、アンパキンＣＸ６８２の注入の際の、ネットワークレベルにより誘発された単一パルスＳｃｈａｆｆｅｒ交連刺激の変化に対する応答を示す。
【図１−１】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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2005505761.tif 000012
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2005505761.tif 000064
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505761.tif 000065
【国際調査報告】
2005505761.tif 000066