(57)【要約】本発明は、非ウサギ宿主における改変ウサギ抗体の免疫原性が非改変親ウサギ抗体より低くなるように、改変ウサギ抗体をコードする改変核酸を生成する方法を提供する。本発明は、さらに、これらの方法によって作成された改変核酸、ならびに前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにコードされる改変抗体を製造する方法を提供する。本発明の核酸によってコードされる改変ウサギ抗体、および改変ウサギ抗体を含む組成物も提供される。本発明は、さらに、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウサギ抗体の表面を再建する方法であり、以下の段階を含む方法:
(a)親ウサギ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列と、非ウサギ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸配列を比較することによって、該非ウサギ抗体の対応する位置にあるアミノ酸とは異なる、該親ウサギ抗体の該フレームワーク領域の表面露出アミノ酸を同定する段階;および
(b)同定された該アミノ酸を、非ウサギ抗体の対応する位置にあるアミノ酸で置換して、該ウサギ抗体の表面を再建する段階。
【請求項２】
CDRに近い、親抗体のフレームワーク領域のアミノ酸を同定し、該CDRに近くないアミノ酸のみを置換する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
親抗体のD-Eループ領域にあるアミノ酸を同定し、D-Eループ領域にないアミノ酸のみを置換する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
同定段階が、表面露出アミノ酸を同定するための、親ウサギ抗体または非ウサギ抗体の分子モデリングを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
同定段階(a)が、複数のアミノ酸を同定する段階を含み、段階(b)が複数のアミノ酸を置換する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
複数のアミノ酸が少なくとも2個の非連続アミノ酸である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ウサギモノクローナル抗体をヒト化する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
アミノ酸が置換されたフレームワーク領域を含む改変ウサギ抗体の非ウサギ宿主における免疫原性が、ウサギ親抗体より低い、請求項1記載の方法。
【請求項９】
同定段階(a)が、親ウサギ抗体のフレームワーク領域に挿入され得るアミノ酸または親ウサギ抗体のフレームワーク領域から欠失され得るアミノ酸を同定する段階を含み、置換段階(b)が、核酸配列にアミノ酸を挿入する段階、または核酸配列からアミノ酸を欠失する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ウサギ抗体が、既知のVHアロタイプのウサギに由来する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ウサギ抗体が、VHアロタイプがホモ接合性のウサギに由来する、請求項10記載の核酸。
【請求項１２】
ウサギが、VH1-a1、VH1-a2、およびVH1-a3から選択されるアロタイプがホモ接合性のウサギである、請求項19記載の核酸。
【請求項１３】
表面が再建された抗体が、特異的抗原に対して108M-1またはそれ以上の結合親和性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
請求項1記載の方法によって表面が再建されたモノクローナル抗体。
【請求項１５】
請求項14記載のモノクローナル抗体をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項15記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項16記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
親ウサギ抗体と比較して非ウサギ宿主における免疫原性が低い改変ウサギ抗体を製造する方法であり、以下の段階を含む方法:
請求項17記載の宿主細胞を、該抗体を製造するのに十分な条件下でインキュベートする段階;および
該抗体を採取する段階。
【請求項１９】
請求項1記載の方法を実施するように機械を指示するための命令を記録している、コンピュータ可読媒体。
【請求項２０】
コンピュータにおいて使用するためのキットであり、以下(a)および(b)を含むキット:
(a)請求項19記載のコンピュータ可読媒体;および
(b)プログラミングに従って該コンピュータを動かすための説明書。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、2002年8月15日に出願された米国特許仮出願第60/404,117号の優先権を主張する。この出願は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、抗体、特に、ヒトおよびマウスなどの非ウサギ宿主における免疫原性が低下したウサギ抗体を作成する方法である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ウサギの免疫系はマウスの免疫系と根本的に異なる。例えば、マウスのゲノムは、D遺伝子断片および/またはJ遺伝子断片との組み合わせ断片結合によって多量の一次抗体レパートリーを作成するのに主に用いられる、数百個のマルチファミリー重鎖遺伝子可変断片(VH)を有すると見積もられている。次いで、結果として生じたVJおよびVDJ遺伝子再編成は、二次抗体レパートリーを発達させるために体細胞多様化によって多様化される。ウサギは、複数の生殖細胞VH遺伝子を有するが、実際には、大部分のBリンパ球では、これらのうち1つ(VH1)しか使用しない点でマウスとは全く異なる(KnightおよびBecker,Cell 60:963-970,1990)。ヒトおよびマウスの免疫系とは対照的に、複数のVH、D、およびJH遺伝子断片の組み合わせ結合は抗体多様性の発生にほとんど寄与せず、従って、ウサギの初期抗体レパートリーはかなり限られている。実際に、ウサギの重鎖免疫グロブリン分子の全可変ドメインの80〜90％がVH1によりコードされている。関連するが異なる配列を有する3種類の主なVH1アロタイプ(対立遺伝子)(VH1、VH1-a1、VH1-a2、およびVHl-a3)が存在するために、VH1-D-J組換え事象において配列にある程度の変化を加えることができる。VH断片バリエーションが明らかに欠如しているのにもかかわらず、ウサギにおいて生じた抗血清は、一般的に、多くの抗原について、マウスにおいて生じた抗血清より多種多様なエピトープを認識する高親和性の抗体を含んでいる(例えば、Krauseら,Adv Immunol 12:1-56(1970);Norrbyら,1987 Proc.Natl.Acad.Sci.;84:6572-6(1987);Raybouldら,Science 240:1788-90(1988);Bystrynら,Hybridoma 1:465-72(1982);Wellerら,Development.100:351-63(1987))。この現象がどのように行われるかは正確に分かっていないが、マウスにおいて見られる機構とは対照的に、ウサギにおける抗体多様性の多くは、ほぼ完全に、再編成VDJ遺伝子の体細胞遺伝子変換(BeckerおよびKnight,Cell 63:987-997,1990)によって生じると考えられている。
【０００４】
非ヒト抗体をヒトに導入すると、通常、外来タンパク質がヒト身体に存在するために特異的免疫応答が生じる。これらの応答を減少させるために、組換えDNA技術を用いて、元のマウス配列をできる限りヒト対応物で置き換える取り組みがなされてきた。このために、キメラ抗体には、マウス抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインに、ヒト抗体の軽鎖定常ドメインおよび重鎖定常ドメインが結合されている。キメラ抗体は、それでもなお、可変領域に多数の非ヒトアミノ酸配列を含み、従って、このような抗体に対して著しい免疫応答が生じる可能性がある。CDRグラフト技術は、組換えDNAによって、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部すなわち相補性決定領域(CDR)がヒト抗体重鎖および軽鎖のフレームワーク(すなわち、非CDR領域)をコードするDNA配列にグラフトされるヒト化技術である。CDRグラフト抗体の技術的問題の1つは、通常、親和性がかなり低いことである。元の親和性を取り戻すためには、CDRの高次構造の決定にまず間違いなく関与している、ある特定の重要な元のフレームワーク残基が再導入されなければならない。Roguskaらは、異なるヒト化アプローチを用いて、マウス抗体の「表面を再建する（resurfacing）」方法を考案した。この方法では、ヒト抗体の露出残基と異なる露出残基だけが置換される。
【０００５】
ヒトおよび他の哺乳動物宿主において免疫原性の低い非ヒト抗体(特に、ウサギ抗体)を作成する改善された方法が引き続き必要とされている。本発明は、この必要および他の必要に答える。
【０００６】
参考文献
関心対象の参考文献として、米国特許第6,331,415B1号、同第5,225,539号、同第6,342,587号、同第4,816,567号、同第5,639,641号、同第6,180,370号、同第5,693,762号、同第4,816,397号、同第5,693,761号、同第5,530,101号、同第5,585,089号、同第6,329,551号、および刊行物、Moreaら, Methods 20: 267-279 (2000), Ann. Allergy Asthma Immunol. 81: 105-119 (1998)、Raderら. J. Biol. Chem. 276: 13668-13676 (2000)、Steinbergerら, J. Bio. Chem. 275: 36073-36078 (2000)、Roguskaら、Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973 (1994)、Delagraveら, Prot. Eng. 12: 357-362 (1999)、Roguscaら, Prot. Eng 9: 895-904 (1996)、KnightおよびBecker, Cell 60: 963-970 (1990)、ならびにBeckerおよびKnight, Cell 63: 987-997 (1990)が挙げられる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、改変ウサギ抗体の非ウサギ宿主における免疫原性が非改変親ウサギ抗体より低くなるように、改変ウサギ抗体をコードする改変核酸を生成する方法を提供する。本発明は、さらに、これらの方法によって作成された改変核酸、ならびに前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにコードされている改変抗体を製造する方法を提供する。本発明の核酸によってコードされる改変ウサギ抗体、および改変ウサギ抗体を含む組成物も提供される。本発明は、さらに、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【０００８】
本発明の方法は、ウサギ抗体のフレームワーク配列のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドを、非ウサギ宿主抗体のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドで置換する段階を含む。ある態様では、非ウサギ宿主はヒトであるが、他の態様では、非ウサギ宿主はマウスである。多くの態様において、ウサギフレームワーク配列の残基の付加および/または欠失も行われる。本発明の抗体、核酸組成物、およびキットは、状態および癌などの疾患の診断および治療および研究を含む様々な応用分野において用いられる。
【０００９】
ある態様では、元の結合特性を著しく変えることなく抗体可変領域の表面が非ウサギ宿主抗体可変領域の表面に似るように、抗体可変領域が改変される。一般的に、CDR、埋もれている残基、およびCDRと接触する残基は、この改変プロセスの間に変更されない。これにより、改変された抗体フレームワークドメインの表面が非ウサギ抗体に似るので、非ウサギ宿主抗体による認識は最小限になる。多くの態様において(但し、類似するヒト抗体を同定する検索が行われていることを条件とする)、このプロセスにおいて残基はほとんど変化しない。それにもかかわらず、これらの変化は親水性タンパク質表面上で行われるので、免疫原性を最小限にするのに非常に重要である可能性が高い。
【００１０】
本発明の利点は、前記の方法がウサギモノクローナル抗体を再現可能にかつ系統的にヒト化またはマウス化(murinize)し、それにより、抗体に対する著しい免疫応答を生じることなく、改変ウサギ抗体をヒト宿主またはマウス宿主において使用することを可能にするシステムを提供することである。
【００１１】
本発明の別の利点は、改変されたウサギ抗体が、一般的に、マウス抗体より親和性が高い抗体であり、そのために治療的価値が高いことである。
【００１２】
本発明のこれらのおよび他の利点および特徴は、以下でさらに十分に説明される本発明の詳細を読めば当業者に明らかになるであろう。
【００１３】
定義
本発明をさらに説明する前に、本発明は、説明される特定の態様に限定されず、もちろん、変化してもよいことを理解すべきである。本明細書で使用する用語は特定の態様を説明しているのにすぎず、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定を目的としないことも理解すべきである。
【００１４】
値の範囲が定められている場合、その範囲の上限と下限との間の、間のそれぞれの値(特に文脈によってはっきりと規定されていない限り下限の単位の1/10まで)も詳細に開示されることが理解される。述べられた範囲内の任意の述べられた値または間の値と、その述べられた範囲内の他の任意の述べられた値または間の値との間のそれぞれの狭い範囲が本発明に含まれる。これらの狭い範囲の上限および下限は独立してこの範囲に含まれても、排除されてもよく、狭い範囲において一方の限界を含む、または両方の限界を含む、またはいずれの限界も含まないそれぞれの範囲も、述べられた範囲においてはっきり限定して排除される任意の限界に応じて本発明に含まれる。述べられた範囲が限界の一方または両方を含む場合、含まれる限界のいずれかまたは両方を排除する範囲も本発明に含まれる。
【００１５】
特に定めのない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料に類似する、または等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下で説明する。本明細書で述べた全ての刊行物は、引用された刊行物に記載されている方法および／または材料を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する、単数形「1個の（a）」、「1個の（an）」、および「その（the）」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数の指示物を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、1個の「抗体」についての言及は複数のこのような抗体を含み、1個の「フレームワーク領域」についての言及は、1個または複数のフレームワーク領域および当業者に周知のその等価物などについての言及を含む。
【００１７】
本明細書で述べられる刊行物は、本願の出願日前の刊行物の開示のためだけに提供される。本明細書から、先行発明によって本発明がこのような刊行物に先行する権利がないことが認められると解釈されるべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は実際の発行日とは異なることがあり、実際の発行日を別途に確認する必要があり得る。
【００１８】
用語「宿主生物」は、ウサギ抗体と構造的に類似する可変領域を有する抗体を産生する任意の動物を意味する。例示的な宿主生物として、ヒト、マウス、ラット、ニワトリなどが挙げられる。
【００１９】
別のアミノ酸残基に「近接している」、別のアミノ酸残基の「近傍の」、または別のアミノ酸残基の「近傍にある」アミノ酸残基は、別のアミノ酸の側鎖に近い(すなわち、7、6、5、または4オングストローム内にある)側鎖を有するアミノ酸残基である。例えば、CDRの近くにあるアミノ酸は、CDRのアミノ酸の側鎖に近い側鎖を有する非CDRアミノ酸である。
【００２０】
抗体重鎖または軽鎖の「可変領域」は、これらの鎖のN末端成熟ドメインである。全てのドメイン、CDR、および残基の番号は、配列アラインメントおよび構造知識に基づいて指定される。フレームワーク残基の識別および番号付けは、Chothiaら(Chothia Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain. J Mol Biol 1998;278:457-79)で述べられている。
【００２１】
VHは抗体重鎖の可変ドメインである。VLは抗体軽鎖の可変ドメインである。軽鎖はκ(K)アイソタイプでもよく、λアイソタイプでもよい。K-1抗体はκ-1アイソタイプを有するが、K-2抗体はκ-2アイソタイプを有し、VLはλ軽鎖可変ドメインである。
【００２２】
「埋もれている残基（buried residue）」は、相対溶媒接近性（relative solvent accessibility）が50％未満の側鎖を有するアミノ酸残基である。相対溶媒接近性は、伸長したGGXGG(配列番号:63)ペプチドに配置された同じ残基Xの溶媒接近性に対する溶媒接近性パーセントとして計算される。溶媒接近性を計算する方法は当技術分野において周知である(Connolly 1983 J.appl.Crystallogr,16,548-558)。
【００２３】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は本明細書において互換的に用いられる。これらの用語は、当業者によく理解されており、抗原に特異的に結合する1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。抗体の一形態は抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、同じ2対の抗体鎖からなる。それぞれの対には1本の軽鎖および1本の重鎖がある。それぞれの対において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は共に抗原結合を担っており、定常領域は抗体エフェクター機能を担っている。
【００２４】
認められている免疫グロブリンポリペプチドとして、κ軽鎖およびλ軽鎖、ならびにα重鎖、γ重鎖(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ重鎖、ε重鎖、μ重鎖、または他種の等価物が挙げられる。完全長免疫グロブリン「軽鎖」(約25kDaまたは約214アミノ酸)は、NH2末端に約110アミノ酸の可変領域およびCOOH末端にκ定常領域またはλ定常領域を含む。完全長免疫グロブリン「重鎖」(約50kDaまたは約446アミノ酸)も同様に、可変領域(約116アミノ酸)および前記重鎖定常領域の1つ(例えば、γ(約330アミノ酸))を含む。
【００２５】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、抗原に対する特異的結合を保持する抗体断片(Fab、Fv、scFv、およびFd断片を含むが、これに限定されない)、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体の抗原結合部と非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識されてもよい。抗体は、さらに、特異的結合対のメンバー(例えば、ビオチン(ビオチン-アビジン特異的結合対のメンバー))などの他の部分に結合されてもよい。抗体はまた固体支持体にも結合されてもよい。固体支持体として、ポリスチレンプレートまたはビーズなどが挙げられるが、これに限定されない。この用語には、Fab'、Fv、F(ab')2、および/または抗原に対する特異的結合を保持する他の抗体断片も含まれる。
【００２６】
抗体は、例えば、Fv、Fab、および(Fab')2、ならびに二機能性(すなわち、二重特異性)ハイブリッド抗体(例えば、Lanzavecchiaら, Eur. J. Immunol. 17, 105(1987))を含む様々な他の形態で、ならびに単鎖で存在してもよい(例えば、Hustonら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883(1988)およびBirdら, Science, 242, 423-426(1988),これらは参照として本明細書に組み入れられる)。(概論については、Hoodら,「Immunology」, Benjamin, N.Y., 第2版(1984)ならびにHunkapillerおよびHood, Nature, 323, 15-16(1986)を参照のこと)。
【００２７】
免疫グロブリン軽鎖可変領域または重鎖可変領域は、3つの超可変領域(「相補性決定領域」またはCDRとも呼ばれる)によって中断される「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域およびCDRの範囲は正確に特定されている(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」E. Kabatら, U.S. Department of Health and Human Services, (1983)を参照のこと)。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成成分である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域が組み合わさったものであり、CDRを配置し、整列するように働く。CDRは、主に抗原エピトープへの結合を担う。
【００２８】
キメラ抗体は、その軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、一般的に、遺伝子工学によって、異なる種に属する抗体可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から構築された抗体である。例えば、ウサギモノクローナル抗体に由来する遺伝子の可変断片を、ヒト定常断片(例えば、γ1およびγ3)に結合することができる。治療用キメラ抗体の一例が、ウサギ抗体に由来する可変ドメインすなわち抗原結合ドメインとヒト抗体に由来する定常ドメインすなわちエフェクタードメインから構成されるハイブリッドタンパク質(例えば、A.T.C.C.寄託アクセッション番号CRL9688の細胞より生成される抗Tacキメラ抗体)であるが、他の哺乳動物種も使用することができる。
【００２９】
本明細書で使用する用語「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」は、ウサギ抗体に由来する1つまたは複数のCDR;ならびにヒト抗体配列に基づいてアミノ酸が置換および/または欠失および/または挿入されたウサギフレームワーク領域を含む抗体を意味する。CDRを提供するウサギ免疫グロブリンは「親」または「アクセプター」と呼ばれ、フレームワーク変化をもたらすヒト抗体は「ドナー」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合、通常、ヒト抗体定常領域と実質的に同一である(すなわち、少なくとも約85〜90％同一、好ましくは約95％またはそれ以上同一である)。従って、ある態様において、完全長ヒト化ウサギ重鎖または軽鎖免疫グロブリンは、ヒト定常領域、ウサギCDR、および以下に詳細に説明される多数の「ヒト化」アミノ酸置換を有する実質的にウサギのフレームワークを含む。多くの態様において、「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖可変領域および/またはヒト化重鎖可変領域を含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、前記で定義されたような一般的なキメラ抗体を含まない。その理由の例として、キメラ抗体の可変領域が全て非ヒトであることが挙げられる。「ヒト化」プロセスによって「ヒト化」された改変抗体は、CDRを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、通常、親抗体と比較してヒトでの免疫原性が低い。
【００３０】
本明細書で使用する用語「マウス化抗体」または「マウス化免疫グロブリン」は、ウサギ抗体に由来する1つまたは複数のCDR;ならびにマウス抗体配列に基づいてアミノ酸が置換および/または欠失および/または挿入されたウサギフレームワーク領域を含む抗体を意味する。CDRを提供するウサギ免疫グロブリンは「親」または「アクセプター」と呼ばれ、フレームワーク変化をもたらすマウス抗体は「ドナー」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、もし存在すれば、通常、マウス抗体定常領域と実質的に同一である(すなわち、少なくとも約85〜90％同一、好ましくは約95％またはそれ以上同一である)。従って、ある態様において、完全長マウス化ウサギ重鎖または軽鎖免疫グロブリンは、マウス定常領域、ウサギCDR、および以下に詳細に説明される多数の「マウス化」アミノ酸置換を有する実質的にウサギのフレームワークを含む。多くの態様において、「マウス化抗体」は、マウス化軽鎖可変領域および/またはマウス化重鎖可変領域を含む抗体である。例えば、マウス化抗体は、前記で定義されたような一般的なキメラ抗体を含まない。その理由の例として、キメラ抗体の可変領域が全て非マウスであることが挙げられる。「マウス化」プロセスによって「マウス化」された改変抗体は、CDRを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、通常、親抗体と比較してマウスでの免疫原性が低い。
【００３１】
「表面を再建する（resurfacing）」は、ウサギ抗体を非ウサギ宿主において低免疫原性にするように、ウサギ抗体表面にあるフレームワーク領域残基が変更される(すなわち、表面が再建される)プロセスである。従って、「表面を再建すること」は、一種のヒト化法である。
【００３２】
本発明の方法によって設計および作成されたヒト化抗体は、抗原結合または他の抗体機能に実質的に影響を及ぼさない、さらなる保存的アミノ酸置換を有してもよいことが理解される。保存的置換は、gly、ala; val、ile、leu; asp、glu; asn、gln; ser、thr; lys、arg; およびphe、tyrなどの組み合わせを意味する。
【００３３】
本明細書で使用する用語「決定する」、「測定する」および「評価する」、ならびに「アッセイする」は互換的に用いられ、定量的決定および定性的決定の両方を含む。
【００３４】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸重合体を意味し、コードされているアミノ酸およびコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含んでもよい。この用語は融合タンパク質を含む。融合タンパク質として、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種リーダー配列および相同リーダー配列との融合(N末端メチオニン残基を含む、またはN末端メチオニン残基を含まない);免疫学的にタグ化されたタンパク質;検出可能な融合パートナーとの融合タンパク質(例えば、融合パートナーとして蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書で使用する用語「単離された」は、「単離された抗体」の中で用いられる場合、精製前に抗体に関連している他の成分を少なくとも60％含まない、少なくとも75％含まない、少なくとも90％含まない、少なくとも95％含まない、少なくとも98％含まない、さらに少なくとも99％含まない関心対象の抗体を意味する。
【００３６】
用語「治療」、「治療する」などは、哺乳動物(特に、ヒトまたはマウス)における任意の疾患または状態の任意の治療を指すために本明細書で用いられ、(a)疾患にかかる可能性があるが、疾患を有すると診断されていない被検体において、疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状が生じないようにすること;(b)疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状を阻害すること(例えば、患者における発症を止める、および/または発病もしくは発現を遅らせること);ならびに/または(c)疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状を緩和すること(例えば、状態もしくは疾患、および/またはその症状を後退させること)を含む。
【００３７】
用語「被検体」、「宿主」、「患者」、および「個体」は、診断または治療することが望ましい任意の哺乳動物被検体(特に、ヒト)を指すために本明細書で互換的に用いられる。他の被検体として、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどを挙げることができる。
【００３８】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、改変ウサギ抗体の表面が非ウサギ宿主抗体の表面により類似し、それにより非ウサギ宿主における免疫原性が非改変親ウサギ抗体より低くなるように、改変ウサギ抗体をコードする改変核酸を生成する方法を提供する。本発明は、さらに、これらの方法によって作成された改変核酸、ならびに前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにコードされる改変抗体を製造する方法を提供する。本発明の核酸によってコードされる改変ウサギ抗体、および改変ウサギ抗体を含む組成物も提供される。本発明は、さらに、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００３９】
本発明の抗体、核酸組成物、およびキットは、状態および疾患(例えば、癌)の診断および治療および研究を含む様々な応用分野において用いられる。
【００４０】
本発明のさらなる説明では、非ウサギ宿主における免疫原性が低下したウサギ抗体をコードする改変核酸を生成する方法、この方法によって生成される核酸、ならびに改変核酸によってコードされる改変抗体が最初に説明され、その後に、前記の方法、本発明のシステムが用いられる代表的な応用分野、および本発明のシステムを含むキットが概説される。
【００４１】
ウサギ抗体の表面を再建する方法
本発明は、非ウサギ宿主抗体の表面に似た表面を有する改変ウサギ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む改変核酸を生成する方法を提供する。通常、これらの抗体は、所定の抗原に高親和性で特異的に結合しながらも、非ウサギ宿主において、改変されていない親ウサギ抗体より低免疫原性である。これらの方法によって、非ウサギ宿主(例えば、ヒトまたはマウス)での免疫原性が非改変親ウサギ抗体と比較して低く、かつ非改変親抗体が結合する抗原に対して少なくとも約107M-1、5×107M-1、108M-1の結合親和性、またはより通常では109M-1〜1010M-1の結合親和性、またはそれより高い結合親和性を有する抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が得られる。改変核酸によりコードされる改変ウサギ抗体は、非ウサギ免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(VH)または免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)(λ可変ドメインもしくはκ可変ドメイン)のフレームワーク配列に由来する少なくとも2個の連続アミノ酸または2個の非連続アミノ酸(すなわち、1個もしくは複数のアミノ酸で分けられているアミノ酸)で置換されたウサギフレームワーク配列を有する。ほとんどの態様では、置換されるアミノ酸は、非ウサギ抗体の表面に存在する。改変ウサギ抗体は経済的に大量に生産することができ、例えば、様々な技法によって様々なヒト疾患およびマウス疾患の治療および診断に使用することができる。
【００４２】
改変核酸を生成する方法
本発明の方法において、改変ウサギ抗体をコードする核酸が作成される。1つの態様では、前記方法によって、親ウサギ抗体のVHおよび/またはVLフレームワークアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列またはコドンの少なくとも1個のヌクレオチドが、高度のアミノ酸配列同一性を有する非ウサギVHおよび/またはVLフレームワークに由来するアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列またはコドンのヌクレオチドで置換される。多くの態様において、1個より多いアミノ酸が置換される場合、置換されるコードアミノ酸は連続したアミノ酸であり、フレームワーク領域全体を含んでもよいが、他の態様では、置換されるコードアミノ酸は非連続である(すなわち、一対の置換アミノ酸のアミノ酸は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個以上の置換されないアミノ酸で分けられてもよい)。他の態様において、置換されるアミノ酸は、連続アミノ酸および非連続アミノ酸の混合物である。この場合、2個、3個、4個、または5個の連続アミノ酸が置換されてもよく、1個、2個、3個、4個、または5個より多い非連続アミノ酸も置換されてよい。
【００４３】
一般的に、前記方法は、(1)親ウサギ抗体フレームワーク領域のアミノ酸配列と非ウサギ抗体フレームワーク領域のアミノ酸配列を比較することによって、非ウサギ抗体の対応する位置のアミノ酸とは異なる親ウサギ抗体のフレームワーク領域のアミノ酸を同定する段階;および(2)同定されたアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の少なくとも1個のヌクレオチドを置換して、対応するアミノ酸をコードする改変ウサギ核酸配列を得る段階を含む。ほとんどの態様において、前記方法では、ウサギ抗体表面にあるVH鎖およびVL鎖フレームワークアミノ酸を同定し、その残基をコードする核酸配列中のヌクレオチドと、非ウサギVH鎖およびVL鎖フレームワーク領域の対応する位置にあるアミノ酸をコードする核酸配列のヌクレオチドを交換する。これらの段階のさらなる詳細を以下に示す。
【００４４】
ウサギ免疫グロブリンVH鎖およびVL鎖の配列
前記プロセスの第1の段階として、ウサギ抗体フレームワーク領域のアミノ酸配列と非ウサギ抗体の抗体フレームワーク領域が比較される。この非ウサギ抗体フレームワーク領域はウサギ抗体フレームワークと高度のアミノ酸配列同一性を有する。ある態様において、ウサギ抗体は既知のウサギ抗体である。他の態様において、ウサギ抗体は既知の方法を用いて作成される。
【００４５】
ウサギ抗体は、1種類の抗原または抗原の混合物でウサギを免疫することによって作成される。ウサギ免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変ドメインフレームワーク配列は、通常、これらをコードする核酸(特に、cDNA)の配列決定によって特定される。これらの核酸は、免疫したウサギに由来する任意の抗体産生細胞または細胞の混合物(例えば、骨髄、脾臓など)から単離することができる。ほとんどの態様において、抗体をコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または逆転写PCR(RT-PCR)などの標準的な分子生物学的技法を用いて、これらの細胞から単離される(Ausubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, Wiley＆Sons, 1995; Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.)。
【００４６】
しかしながら、多くの態様において、ウサギ抗体をコードする核酸はウサギ抗体産生ハイブリドーマ細胞から単離される。ウサギ抗体産生ハイブリドーマ株を得るためには、ウサギを抗原で免疫し、ウサギの特異的免疫応答が確立されたら、免疫したウサギの脾臓細胞と、240Eなどのプラズマ細胞腫細胞株を融合する(Spieker-Poletら, Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 9348-9352, 1995)。融合後、ハイブリドーマ増殖について選択するために、細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(HAT)を含む培地において増殖させ、2〜3週間後にハイブリドーマコロニーが現れる。これらのハイブリドーマ培養細胞の上清を、酵素結合免疫測定法(ELISA)によって抗体分泌についてスクリーニングし、抗原に特異的なモノクローナル抗体を分泌する陽性クローンを選択し、標準的な手順(Harlowら,Antibodies. A Laboratory Manual, 第1版 (1988) Cold spring Harbor, N.Y.; およびSpieker-Poletら, 前記)に従って増やすことができる。
【００４７】
他の態様において、ウサギ抗体をコードする核酸は、任意の既知の方法によって単細胞を単離することによって個々のB細胞から単離される。例示的な方法として、(1)ウサギ脾臓、骨髄、リンパ節、または他のリンパ器官から得られた細胞集団のフローサイトメトリーを行い、その後に単細胞プレーティングを行う方法(例えば、細胞を標識抗ウサギIgGとインキュベートし、標識された細胞を、FACSVantage SEセルソーター(ベクトンディキンソン(Becton-Dickinson), San Jose, CA)を用いて選別する方法); および(2)マルチウェルプレートにおいてプラズマ細胞を限界希釈でプレートする方法が挙げられる。細胞を、RT-PCR緩衝液を含む96ウェルプレートまたは34ウェルプレートに直接選別し、IgG重鎖および軽鎖に特異的なネスティッドプライマーを用いたRT-PCRにかけることができる。細胞選別の代わりとして、シングルB細胞を得るために、限界希釈細胞プレーティングを使用することができる。
【００４８】
本発明の方法は任意のウサギ抗体を改変するのに適しているが、通常、「天然」抗体を改変するのに用いられる。「天然」抗体では、人工的に対となった抗体(例えば、ファージディスプレイによって作成された抗体)とは対照的に、抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が多細胞生物の免疫系によって天然に選択されている。従って、本発明の親抗体は、通常、どのウイルス由来配列(例えば、バクテリオファージM13に由来する配列)も含まない。
【００４９】
単離されたウサギ核酸は「親」抗体のフレームワーク領域をコードする。
【００５０】
配列比較
ウサギ免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖の可変ドメインフレームワークアミノ酸配列が決定されたら、非ウサギ抗体の対応するフレームワーク配列を同定するために、通常、非ウサギ免疫グロブリン鎖の配列データベースと比較される。一般的に、親フレームワーク配列とのアミノ酸配列同一性(パーセント同一性またはP値による)に関して最も類似性の高い10個のフレームワーク領域配列の1つがアミノ酸残基ドナーとして用いられる。通常、親フレームワーク配列とのアミノ酸配列同一性(パーセント同一性またはP値)に関して最も類似性の高い3個のフレームワーク領域配列の1つがアミノ酸残基ドナーとして用いられる。選択された表面残基ドナーフレームワーク領域は、一般的に、親フレームワーク領域に対して、フレームワーク領域において少なくとも約55％、少なくとも約65％同一性、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有する。多くの態様において、データベース内の類似配列を同定するために、少なくとも1つのフレームワーク領域を含む重鎖または軽鎖免疫グロブリンの可変ドメインを含む配列がデータベースと比較される。ある態様では、配列は、データベースに保存されていないアミノ酸配列(例えば、新たに配列決定された抗体の配列)と比較される。
【００５１】
ある態様では、同じ非ウサギ抗体に由来する軽鎖および重鎖の両方を表面残基ドナーとして使用することができる。
【００５２】
ある特定のウサギ免疫グロブリン配列に対して最も相同性の高い非ウサギ抗体免疫グロブリンを同定するために、様々な抗体データベースを検索することができる。米国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)データベースの他に、最も一般的に用いられるデータベースのいくつかを以下に列挙する。
【００５３】
V BASE-Database of Human Antibody Genes:このデータベースは医療審議会(MRC)(英国、ケンブリッジ)によって管理され、ウェブサイトwww.mrc-cpe.cam.ac.ukを通じて提供されている。このデータベースは、GenbankおよびEMBLデータライブラリーの最新リリースに含まれる配列を含む1000個以上の公表された配列からまとめられた、全てのヒト生殖細胞可変領域配列の総合ディレクトリである。
【００５４】
Kabat Database of Sequences of Proteins of Immunological Interest (Johnson, GおよびWu, TT (2001) Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Research, 29:205-206)はノースウェスタン大学(シカゴ)のウェブサイト(immuno.bme.nwu.edu)で見られる。kabatデータベースはnih/ncbiサイトでも利用可能である。
【００５５】
Immunogenetics Database: 欧州バイオインフォマティクス研究所(European Bioinformatics Institute)により管理され、そのウェブサイトwww.ebi.ac.ukで見られる。このデータベースは、免疫系機能に重要な遺伝子のヌクレオチド配列情報を含む統合専門データベースである。このデータベースは、免疫認識に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する配列を集め、注釈をつけている。
【００５６】
ABG:マウスの生殖細胞遺伝子ディレクトリ-マウスVHおよびVK生殖細胞断片のディレクトリ, UNAM(National Univfrsity of Mexico)Instituto de Biotecnologia抗体グループのウェブページの一部。
【００５７】
アミノ酸配列相同性に関して最も類似性の高い配列を検索するために、内蔵サーチエンジンを使用することができる。本発明の方法では、BLAST(Altschulら, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)が、デフォルトパラメータ(BLOSUM62マトリックス、予想閾値10、低複雑度フィルターオフ、ギャップ許可、およびワードサイズ3の選択を含む)を用いて行われる。
【００５８】
類似するヒトまたはマウスの免疫グロブリンフレームワーク領域を検索するために、ウサギ免疫グロブリンフレームワーク領域を使用することができる。ウサギVH-1遺伝子のBLAST検索例を図1および図2に示す。溶媒が接近可能な残基の相同性を強調して、同じ検索プロセスを行うこともできる。
【００５９】
ウサギ抗体フレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列の改変
多くの態様において、抗体分子表面に見られるアミノ酸残基をコードする核酸のヌクレオチドが置換される。「表面アミノ酸残基」は、成熟抗体において溶媒が接近可能なアミノ酸残基である。「表面アミノ酸残基」はまた、溶媒が接近可能であるために、宿主免疫系によって異物と認識される可能性の高い、従って、宿主において免疫応答をまず間違いなく惹起するアミノ酸残基でもある。非ウサギ宿主「ドナー」抗体フレームワークまたは親ウサギ「アクセプター」抗体フレームワークの表面にある残基は、これらの抗体のVH鎖もしくはVL鎖フレームワーク配列の配列と既知構造の抗体のVH鎖もしくはVL鎖フレームワーク配列とを比較することによって、または分子モデリングによって同定される。本発明の多くの態様において、ウサギまたは非ウサギフレームワーク配列は既知構造の抗体の配列と整列され、非ウサギフレームワーク残基の表面残基に対応するウサギフレームワーク残基が同定される。
【００６０】
抗体配列と既知構造の抗体の配列を整列する方法は説明されている(Padlanら, Mol. Immunol. 28: 489-98 (1991); Pedersen J. Mol. Biol. 235: 959-73 (1994); Roguskaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-73 (1994))。通常、残基は、その相対接近性が30％を超えれば表面残基である(Pedersonら, 1994, 前記)。既知構造の抗体は以下のデータベースにおいて見付けることができる:(1)Antibodies-Structure and Sequence-データベース(Kabat抗体配列データに対するクエリーインターフェース、抗体および結晶構造に関する一般的な情報、ならびに他の抗体関連情報へのリンクを提供する)、(2)BMCD(Biological Macromolecular Crystallization Database)およびNASA Archive for Protein Crystal Growth Data(バージョン2.00)、(3)Macromolecular Structure Database for Crystallographic Laboratories、(4)PDB(Protein Data Bank, ブルックヘブン国立研究所(Brookhaven National Laboratory))(実験により決定された生物学的高分子三次元構造のアーカイブ)。
【００６１】
アミノ酸残基の相対接近性はまた、DSSP法(Dictionary of Secondary Structure in Proteins; KabschおよびSander 1983 Biopolymers 22: 2577-637)を用いて計算することもでき、溶媒が接近可能なアミノ酸表面積は、当技術分野において周知のアルゴリズムを用いて抗体の三次元モデルに基づいて計算することができる(例えば、Connolly, J. Appl. Cryst. 16, 548 (1983)ならびにLeeおよびRichards, J. Mol. Biol. 55, 379 (1971)、いずれも参照として本明細書に組み入れられる)。
【００６２】
本発明のほとんどの態様において、コードされるウサギ抗体のフレームワークの少なくとも1個のアミノ酸が非ウサギ抗体の対応する位置にある少なくとも1個のアミノ酸で置換されるように、親核酸が改変される。多くの態様において、置換されるアミノ酸の数は2〜100個またはそれ以上(例えば、2〜5個、6〜10個、11〜15個、16〜20個、21〜40個、41〜50個、51〜60個、61〜70個、71〜80個、81〜90個もしくは91〜100個、またはそれ以上)である。置換されるアミノ酸は、重鎖可変ドメインフレームワーク領域のアミノ酸でもよく、軽鎖可変ドメインフレームワーク領域のアミノ酸でもよく、または両方のアミノ酸でもよい。ある態様において、置換されるアミノ酸は連続したアミノ酸である。この場合、連続したひと続きのアミノ酸の長さはフレームワーク領域配列全体であるか、またはその連続したサブ配列である(この場合、サブ配列内のアミノ酸の長さは2〜5、6〜10、11〜15、もしくは16〜20またはそれ以上である)。
【００６３】
ほとんどの態様において、置換されるコードアミノ酸は非連続であり、親抗体またはドナー抗体の表面にあると予想される一群の非連続アミノ酸からなってもよい。これらの態様において、通常、親ウサギ抗体フレームワークのアミノ酸が非ウサギドナー抗体の対応するアミノ酸で置換される。これに関して、「対応する」は、ドナー配列と親配列が整列された時に、ドナー配列のアミノ酸残基が親配列の残基の向かいに配置されていることを意味する。もちろん、当技術分野において周知なように(例えば、Roguskaら, P.N.A.S. 91: 969-973, 1994; Kabat 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, DHHS, Washington, DC)、整列を行うために、抗体フレームワーク配列をコードする核酸の一方または両方に、1個、2個もしくは3個のギャップおよび/または1個、2個、3個もしくは4個までのコドンの挿入を加えなければならない時もある。従って、多くの態様において、親ウサギ配列と非ウサギ配列を整列するために、コドンが親ウサギ核酸に挿入されるか、または親ウサギ核酸から欠失される。
【００６４】
特に図2を参照して、本発明の方法を以下のように説明する。 
【００６５】
段階1、2、3
可変領域のタンパク質配列を可変領域の各DNA配列から推定する(段階1)。次いで、タンパク質配列を分析し、Kabatにより説明されたように、CDRの位置を特定し、フレームワーク残基に残基番号を指定する(段階2)。段階2を行う方法は数種類あり、残基番号を自動的に指定するプログラムが存在する。これらのプログラムのいくつかはインターネット上で見られる。しかしながら、これらのプログラムは、ウサギ抗体配列よりマウス抗体配列およびヒトを用いて良好に働く。Kabatデータベースのblast検索を行い、次いで、新たなウサギ抗体配列をKabat配列として番号付けすることもできる。別の態様では、段階2は、ウサギ配列、ヒト配列、マウス配列間の既存の多重配列アラインメント(例えば、図1A、1Bに示す多重配列アラインメント)を用いて行い、保存残基をアンカーとして用いて新たな配列を整列してもよい。例えば、κ鎖およびλ鎖の位置23および88は、それぞれ、システイン残基でなければならない。他の保存されているフレームワーク残基が説明されている(Chothia C, Gelfand I, Kister A. Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain. J Mol Biol 1998 May 1; 278(2): 457-79)。残基番号が指定されたら、β鎖の位置が判明すると考えられる(図1A、図1Bを参照のこと)。次いで、段階3に進み、標的宿主の抗体配列を見付けることができる。これは、宿主の生殖細胞配列に対する、または宿主の既知抗体配列の全てに対するblast検索によって行うことができる。標的宿主配列の選択肢が複数あれば、宿主においてより一般的に見出される配列を選ぶべきである。例えば、ヒトVH3鎖はヒトVH2鎖より頻繁に見られる。次いで、ウサギ配列と標的宿主配列とのアラインメントを調べ、全てのギャップおよび挿入がCDRの中にまたはβシート外の領域になければならない。βシート領域に挿入または欠失がある場合、そのアラインメントは正しくない可能性が高い。多くの場合、ヒトVHと比較して、ウサギVHのD-Eループには1個または2個の残基欠失があると予想される。多くの態様において、このような欠失はアラインメントが正しいことを示している。
【００６６】
図1Aおよび図1Bは、ウサギ、ヒト、およびマウスの可変領域フレームワークの多重配列アラインメントである。重要な情報をよりコンパクトに示すために、CDR配列を除いたが、CDRを挿入する点は正確に示した。フレームワーク(FR)は示していないが、以下: FR1、CDR1、FR2、CDR3、FR3、CDR3、FR4のようにCDRと交互に配列に配置される。β鎖が示されている(A、A'、B、C、C'、D、E、F、G)。β鎖C''は、図示していないCDR2の一部であるために示していない。FR4の中の配列は、必ずしも前の可変領域配列(FR1、FR2、FR3)の続きとは限らない。なぜなら、最初のフレームワークをコードする生殖細胞V領域とFR4をコードするJ領域も連続していないからである。標準的なKabat配列番号を上に示した。これらの番号は構造上の位置を示すので重要である。pdb構造ファイルは必ずしもこの約束に従わないことに留意のこと。他の番号付けシステムも存在する。原則的に、手順全体を通じて首尾一貫して行われる限り、任意の番号付けシステムを使用することができるが、Kabat番号付けシステムが最も一般に受け入れられている。
【００６７】
図1Aおよび図1Bは、特に、異なる哺乳動物種の抗体間の相同性を証明している。第2に、図1Aおよび図1Bは、ある特定の違いをはっきりと示している(例えば、ウサギVH鎖は、大部分のヒト抗体鎖およびマウス抗体鎖と比較してD-Eループから1個または2個の残基を欠如していることがある)。第3に、図1Aおよび図1Bは、抗体モデリングの必要条件であるCDRおよびβ鎖の場所を正確に示している。これらの図はまた、ウサギ抗体鎖と標的宿主配列またはモデリングに用いられる構造テンプレートの配列とのアラインメントを得るのに非常に役立つ。
【００６８】
段階4
次に、スレッディング(threading)またはホモロジーモデリングを行うための適切な構造を見つけるために、ウサギ配列をpdbデータベースと比較する(例えば、pdbデータベースに対してblast検索する)。実際には、Igスーパーファミリーに属するタンパク質のどの構造も有用であるが、利用可能な抗体構造が数百種類あるために、通常、タンパク質配列がウサギ抗体のタンパク質配列に非常に似ているVH/VL鎖対の構造を見つけることができる。もちろん、配列間の類似性が最も高ければ、結果として生じるモデルがより良くなると考えられる。
【００６９】
段階5、6
相同性によってモデルを構築するのに使用可能なプログラムはいくつか存在する。これらのプログラムの一部は購入することができるが、インターネットを介して利用可能なものもある。例えば、Swiss Pdb Viewerは「Deep View」としても知られ、相同性によってタンパク質をモデリングするのに使用することができる。テンプレート構造のループと比較してウサギ抗体のループにギャップまたは挿入があれば、他の構造を用いてモデリングすることができる。CDRは、既知の標準構造に属する場合、モデルに直接合わせてもよい。これは、例えば、まず間違いなくCDR L2に常に当てはまる。しかしながら、標準構造をウサギCDRにあてがうことが不可能なことがよくあり、ウサギCDRをモデリングするために優れたテンプレート構造を見つけることが難しい場合がある。特に、CDRS L3およびH3に対する優れた構造テンプレートを見付けることは非常に難しいと予想される。D-Eループに対する優れたモデルを見つけることも難しい場合がある。しかしながら、CDRループおよびD-Eループのモデリングは完璧である必要はない。なぜなら、これらのループは本発明の方法によって変更されないからである(段階9、10)。表面残基がCDRと接触する可能の高い他の抗体構造から分かっている限り、実際には、CDRおよびD-Eループのモデリングは本発明には全く必要でない。しかしながら、CDRおよびD-Eループのモデリングが妥当な信頼度まで(特に、フレームワークに隣接する領域において)行われれば、段階7におけるモデルの視覚化および計算が容易になるだろう。重要なのは、残基側鎖が溶媒に暴露されるか、暴露されないかである。溶媒暴露は、主に、βシートにおける残基の特定の位置およびその周囲の残基によって決定される。言い換えると、残基側鎖は、β炭素からのみ回転する自由を有する。しかし、β炭素の位置それ自体は、βシートにおける残基の特定の配列位置によって決定される所定の位置に固定されている。例えば、β炭素は180度向きを変え、埋もれることができない。従って、露出残基は、残基番号の指定が正確である限りモデルの正確さに関係なく、ほぼ間違いなく常に、露出していると検出される。同じことが大きなループ領域に必ずしも当てはまらないことは明らかである。なぜなら、ループ配列には多くの可能性のある高次構造が存在するからである。それぞれの鎖の「上部」には4つのループがある。これらのうち3つはCDRと部分的に重なっているか、またはCDRである。4番目のループーはD-Eループである。何度も、ウサギ抗体のこれらのループの一部は正確にモデリングできなかったが、これらのループはいずれも本発明では変更されない。ヒト抗体またはマウス抗体のより大きなことが多いループに適合させるためにD-Eループを変更することができるが、これは予測される危険(calculated risk)である。D-Eループの残基は時としてCDR残基と接触する。そのため、このループのアミノ酸を確かに変更することはできるが、場合によって、結果として生じる改変抗体の親和性が元の抗体より低くなることがあるのは、驚くべきことではない。
【００７０】
例示的なモデリング結果を図3A〜3Dに示す。溶媒が接近可能な残基を、陰付きの囲みで示した。
【００７１】
下部ループはA'-B、C-C'、C''-D (C''はCDR2にあり、そのため図示していない)、およびE-Fである。A-A'はループでないが、この領域は異なるシートに属するβ鎖を接続している。これらの領域の残基の数は通常変化しないので、これらの領域の全てを相同性によってモデリングすることができる。
【００７２】
段階7-13
モデルが作成されたら、相対表面接近性または全ての残基を計算することができる。例えば、プログラムSwiss Pdb Viewerによって、これらの計算を行うことができる。表面残基がCDRにない限り、またはCDRと接触しない限り(接触距離は5Aである)、相対表面接近性が30％を超えると特定された全ての表面残基をヒト化することができる。従って、残基が、ウサギのものから対応する標的配列のものに変更される。
【００７３】
言い換えると、前記の方法を用いて、(a)ウサギ抗体フレームワークの表面残基が決定される。ある態様において、これらの残基(図3に示す)は、VHの場合、2、3、11、13、23、26、28、41、42、72、76、84、105、108、113であり、VKの場合、1、3、7、9、15、18、22、40、41、42、45、57、60、67、70、77、80、106、107である。(b)類似する非ウサギ宿主抗体の対応する表面残基とは異なる表面残基のリストが決定される。(c)D-Eループのアミノ酸およびCDRに近いアミノ酸はリストから除かれる。
【００７４】
従って、多くの態様において、ウサギ抗体をヒト化/マウス化するために、前記アミノ酸グループの2個もしくはそれ以上、4個もしくはそれ以上、6個もしくはそれ以上、8個もしくはそれ以上、または10個もしくはそれ以上の残基のサブセットをコードするヌクレオチド配列が置換される。
【００７５】
ウサギ抗体の表面残基の予測を確かめるための選択肢として、元の抗体およびヒト化抗体またはマウス化抗体の三次元モデルを構築することができる。これは、マウス抗体およびヒト抗体をモデリングするための既知方法(例えば、Martinら, Proc Natl Acad Sci 86: 9268-72 (1989);Martinら, Methods Enzymol 203: 121-53 (1991)に記載の方法)をシミュレートすることによって行うことができる。この方法は、抗体ループモデリングのための組み合わせアルゴリズム(Combined Algorithm for Modeling Antibody Loops) (CAMEL)と呼ばれ、抗体結合部位の6つ全てのCDR骨格高次構造を予測し、フレームワーク領域と組み合わせることができる。この方法はヒト抗体およびマウス抗体に等しく適用される。
【００７６】
親核酸の1個または複数のヌクレオチドを前記のように置換することによって、改変フレームワーク領域をコードする改変核酸が生成される。従って、改変抗体のフレームワーク領域をコードする核酸を生成するために、親フレームワーク領域の少なくとも1個のヌクレオチド(すなわち、約1〜5個、約6〜10個、約11〜15個、約16〜20個、約21〜30個、約31〜40個、またはさらに約50個より多いヌクレオチドが変更される。ほとんどの態様において、改変フレームワークをコードする配列を得るために、親抗体フレームワークコード配列をコードする核酸配列において適切なヌクレオチドを置換、欠失、および/または付加するには、標準的な組換えDNA技術(Ausubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, Wiley＆Sons, 1995; Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.)が用いられる。
【００７７】
抗体をコードする核酸を生成するために、いくつかの方法が当技術分野において周知である。このような方法として、米国特許第6,180,370号、同第5,693,762号、同第4,816,397号、同第5,693,761号、および同第5,530,101号に見られる方法が挙げられる。例えば、変異したポリヌクレオチドが改変フレームワーク領域をコードするように、親抗体フレームワーク領域をコードするポリヌクレオチドにおいて核酸残基を導入/欠失/置換するために、部位特異的変異誘発を使用することができる。他の方法では、PCRが用いられる。あるPCR法では、改変されたウサギVHおよびVLフレームワーク領域をコードする配列を作成するために、「重複伸長PCR(overlapping extension PCR)」(Hayashiら, Biotechniques. 1994: 312, 314-5)が用いられる。この方法では、改変ポリペプチドにおいて置換/挿入/欠失アミノ酸残基をコードする核酸残基コドンがPCRプライマーに導入される。テンプレートとして親核酸配列を用いた重複PCR反応を複数回行うと、改変フレームワーク領域が得られる。これらの方法の多くの産物は改変フレームワーク領域である。しかしながら、これらの方法の実施において、多くの場合、少なくとも1つの改変ウサギフレームワーク配列およびウサギCDRを含む、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインの全体をコードするアミノ酸を生成することが可能である。
【００７８】
多くの態様において、改変可変ドメインをコードする核酸は、適切な重鎖をコードする核酸(通常、ヒトまたはマウスなどの非ウサギ種に由来する核酸)と融合される。これも、通常、PCR、連結、サブクローニングなどの組換えDNA技術を用いて行われる。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabatら((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H.発行番号91-3242)で見つけることができ、ヒト定常領域をコードする配列は、(例えば、A.T.C.Cからの)既知のクローンから容易に入手することができる。アイソタイプの選択は、補体結合または抗体依存性細胞傷害性の活性などの望ましいエフェクター機能に左右される。多くの態様において、選択される定常領域はIgG1、IgG3、およびIgG4から選択される。
【００７９】
Fv、F(ab)2、およびFabなどの抗体断片は、例えば、プロテアーゼまたは化学切断によって、インタクトなタンパク質を切断することによって調製することができる。または、改変核酸は抗体断片をコードする。例えば、F(ab)2断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、H鎖のCH1ドメインおよびヒンジ領域をコードするDNA配列の後に、短縮分子を生じさせる翻訳停止コドンを含む。
【００８０】
もちろん、改変フレームワークをコードする核酸、改変可変ドメインをコードする核酸、あるいは改変重鎖もしくは改変軽鎖の全体をコードする核酸またはその断片は化学合成されてもよい。
【００８１】
多くの態様において、本発明の方法は、コンピュータまたはコンピュータシステムによってアルゴリズムを用いて実施される。これらの態様では、使用者は、少なくとも、ウサギ抗体のフレームワーク領域または可変ドメインのアミノ酸配列をグラフィカルユーザーインターフェースに入力し、コンピュータは前記のように方法を実施し、アルゴリズムを用いて、改変ウサギフレームワークもしくは改変可変ドメインのアミノ酸配列または改変ウサギフレームワークもしくは改変可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を出力する。このようなプログラミングは十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８２】
本発明によるプログラミングはコンピュータ可読媒体(例えば、コンピュータによって直接読み取りおよびアクセスすることが可能な任意の媒体)に記録することができる。このような媒体として、磁気記憶媒体(例えば、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ);光学記憶媒体(例えば、CD-ROM);電気記憶媒体(例えば、RAMおよびROM);ならびにこれらのカテゴリーのハイブリッド(例えば、磁気/光学記憶媒体)が挙げられるが、これに限定されない。当業者は、前記の方法を実施するための本発明のプログラミング/アルゴリズムの記録を含む製品を作成するために、現在知られているどのコンピュータ可読媒体でも、どのように使用できるかを容易に理解することができる。
【００８３】
改変ウサギ抗体をコードする核酸
本発明は、さらに、本発明の改変ウサギ抗体ならびにその一部(重鎖または軽鎖、軽鎖可変ドメインもしくは重鎖可変ドメイン、または軽鎖可変ドメインもしくは重鎖可変ドメインのフレームワーク領域を含む)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は本発明の方法によって生成される。多くの態様において、核酸は定常ドメインのコード配列も含む。遺伝暗号が既知であり、改変ウサギ抗体の重鎖可変ドメインフレームワーク領域および/または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域の配列を決定することができるので、これらの核酸の設計および生成は十分に当業者の技術の範囲内である。
【００８４】
ほとんどの態様において、本発明の核酸は、フレームワーク領域をコードする核酸のコドンによりコードされるアミノ酸がドナーフレームワーク領域の対応するアミノ酸をコードするように、フレームワーク領域をコードする核酸の少なくとも1個のコドンの少なくとも1個のヌクレオチドによって置換される。多くの態様において、2個またはそれ以上の連続したコドンのヌクレオチドが置換されるが、他の態様において、2個またはそれ以上の非連続コドンのヌクレオチドが置換される。
【００８５】
本発明の核酸断片はまた、通常、改変抗体をコードする核酸の構築を容易にするために、制限部位、マルチクローニングサイト、プライマー結合部位、連結末端、組換え部位なども含んでよい。
【００８６】
さらに、DNA断片は、一般的に、ヒト化免疫グロブリンコード配列に作動可能に連結された発現制御DNA配列(天然または異種のプロモーター領域およびターミネーターを含む)を含む。ある態様において、発現制御配列は、真核細胞宿主を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクターの真核生物プロモータ系であるが、原核生物宿主用の制御配列も使用することができる。抗体鎖が分泌されるように、ヒト免疫グロブリンリーダーペプチド(例えば、MGWSCIILFLVATAT、配列番号:27)をコードする核酸を操作してもよい。
【００８７】
ベクター
さらに、本発明は、本発明の核酸を含むベクター(「構築物」とも呼ぶ)を提供する。本発明の多くの態様において、改変ウサギ抗体をコードする核酸配列が発現制御配列(例えば、プロモーターを含む)に作動可能に連結された後、宿主において発現される。本発明の核酸はまた、一般的に、エピソームまたは宿主染色体DNAの構成部分として宿主生物において複製可能な発現ベクターに配置される。通常、発現ベクターは、望ましいDNA配列で形質転換された細胞が検出できるように選択マーカー(例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシン)を含む(例えば、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,704,362号を参照のこと)。1個および2個の発現カセットベクターを含むベクターが当技術分野において周知である(Ausubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, Wiley＆Sons, 1995; Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.)。適切なベクターとして、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体(ヒト人工染色体、細菌人工染色体、酵母人口染色体など)、ミニ染色体などが挙げられる。
【００８８】
発現ベクターは転写開始領域および翻訳開始領域を提供し、これらの開始領域は誘導性でも構成的でもよい。ここで、コード領域は、転写開始領域ならびに転写終結領域および翻訳終結領域の転写制御下で作動可能に連結される。これらの制御領域は、本発明のペプチドをコードする遺伝子に天然にあるものでもよく、外部供給源に由来するものでもよい。
【００８９】
一般的に、発現ベクターには、異種タンパク質をコードする核酸配列を挿入するために、便利な制限部位がプロモーター配列の近くに配置されている。発現宿主において機能する選択マーカーが存在してもよい。発現ベクターは融合タンパク質の生成に使用することができる。この場合、外因性融合ペプチドは、さらなる機能(すなわち、タンパク質合成の増大、安定性、特定の抗血清との反応性、酵素マーカー(例えば、β-ガラクトシダーゼ)など)をもたらす。
【００９０】
宿主細胞
ほとんどの態様において、ヒト化モノクローナル抗体をコードする本発明の核酸は宿主細胞に直接導入され、細胞は、コードされる抗体の発現を誘導するのに十分な条件下でインキュベートされる。
【００９１】
発現カセットの発現に適した任意の細胞を宿主細胞として使用することができる。例えば、酵母、昆虫、植物などの細胞。多くの態様において、通常、抗体を産生しない哺乳動物宿主細胞株が用いられる。哺乳動物宿主細胞株の例は以下の通りである:サル腎細胞(COS細胞)、SV40によって形質転換されたサル腎CVI細胞(COS-7, ATCC CRL 165 1); ヒト胚腎細胞(HEK-293, Grahamら, J. Gen Virol. 36: 59(1977)); ベビーハムスター腎細胞(BHK, ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO, UrlaubおよびChasin, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 77: 4216, (1980); マウスセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980)); サル腎細胞(CVI ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頚癌細胞(HELA, ATCC CCL 2);イヌ腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34); バッファローラット肝細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞(hep G2, HB 8065); マウス乳房腫瘍(MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI細胞(Matherら, Annals N.Y. Acad. Sci 383: 44-68(1982)); NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658); およびマウスL細胞(ATCC CCL-1)。さらなる細胞株は当業者に明らかになるであろう。アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection) 10801 University Boulevard, Manassas, Va.20110-2209から多種多様な細胞株を入手することができる。
【００９２】
核酸を細胞に導入する方法は当技術分野において周知である。適切な方法として、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが挙げられる。方法の選択は、一般的に、形質転換される細胞のタイプおよび形質転換が行われる状況(すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ)によって決まる。これらの方法の概要は、Ausubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, Wiley＆Sons, 1995で見られる。ある態様では、リポフェクタミンおよびカルシウムを介した遺伝子導入法が用いられる。
【００９３】
本発明の核酸が細胞に導入された後、抗体を発現させるために、一般的に、細胞は通常37℃で約1〜24時間(時として選択された状態で)インキュベートされる。ほとんどの態様において、抗体は、一般的に、細胞が増殖している培地の上清に分泌される。
【００９４】
本発明の抗体を発現させるために、哺乳動物宿主細胞では多数のウイルスに基づく発現系を使用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、関心対象の抗体コード配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複合体(例えば、後期プロモーターおよびトリパータイルリーダー配列(tripartite leader sequence)に連結することができる。次いで、インビトロ組換えまたはインビボ組換えによって、キメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)に挿入すると、感染宿主において抗体分子を発現することができる生存可能な組換えウイルスが得られる(例えば、Logan＆Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359 (1984)を参照のこと)。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって、発現効率を高めることができる(Bittnerら, Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)を参照のこと)。
【００９５】
組換え抗体を長期間、高収量で生成するために、安定発現を使用してもよい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を操作してもよい。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を免疫グロブリン発現カセットおよび選択マーカーで形質転換することができる。外来DNAが導入された後、操作された細胞を強化培地において1〜2日間増殖させることができ、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミドに含まれる選択マーカーによって、選択に対する耐性が付与され、細胞はプラスミドを染色体に安定に組込み、増殖してフォーカスを形成することが可能になる。次に、フォーカスをクローニングおよび増殖させて細胞株にすることができる。このような操作された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【００９６】
本発明の抗体分子が生成されたら、免疫グロブリン分子を精製するための当技術分野において周知の任意の方法によって(例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー(特に、プロテインA後の特異的抗原に対するアフィニティクロマトグラフィー)、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度の差(differential solubility)、または他の任意の標準的なタンパク質精製法によって)精製することができる。多くの態様において、抗体は細胞から培地に分泌され、培地から採取される。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を複製および/または発現するために、前記宿主細胞のいずれかまたは他の適切な宿主細胞もしくは生物が用いられた時、結果として生じる複製された核酸、RNA、発現されたタンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物の産物として本発明の範囲内にある。産物は当技術分野において周知の任意の適切な手段によって回収される。
【００９８】
改変ウサギ抗体の生成
本発明は、本発明の改変ウサギ抗体を製造する方法を提供する。この方法は、一般的に、本発明の宿主細胞を適切な培養条件下で、適切な期間、培養する段階; および抗体を回収する段階を含む。
【００９９】
関心対象のDNA断片を含む本発明のベクター(例えば、プロモーターおよびターミネーターなどの発現制御配列に作動可能に連結された重鎖および軽鎖をコードする配列を含む発現カセット)は、細胞宿主のタイプによって異なる周知の方法によって宿主細胞に導入することができる。例えば、一般的に、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションが用いられるが、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが用いられてもよい(一般的には、参照として本明細書に組み入れられる、Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1982)を参照のこと)。
【０１００】
ベクターが適切な宿主に取り込まれたら、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され(例えば、誘導性プロモーターが用いられる場合、適切な誘導条件下で維持される)、所望であれば、その後に、改変抗体またはそのバリアントの収集および精製が行われる。
【０１０１】
多くの態様において、重鎖ベクターおよび軽鎖ベクターが細胞株に同時トランスフェクトされ、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を両方とも発現する安定な細胞株を選択するために、ELISAが用いられる(Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, 第1版 (1988) Cold spring Harbor, N.Y.)。または、2つの鎖が連続して細胞にトランスフェクトされ、ゼオシンおよびハイグロマイシンなどの異なるマーカーによって選択される。3番目の選択肢として、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子が一過的に発現細胞に同時トランスフェクトされ、抗体精製には条件培地が用いられる。
【０１０２】
本発明の抗体全体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態が発現されたら、硫安沈殿、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、または前記の1つもしくは複数の組み合わせなどを含む当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる(一般的には、R. Scopes,「Protein Purification」, Springer-Verlag, N.Y. (1982)およびHarlowら, 前記を参照のこと)。
【０１０３】
多くの態様において、約98％〜約99％純粋な抗体または約100％純粋な抗体が必要とされる。しかしながら、通常、90％〜95％純粋な抗体、96％〜98％純粋な抗体、約50％純粋な抗体が十分であり、または精製されていない抗体でも十分である。
【０１０４】
改変ウサギ抗体
本発明は、本発明の方法によって作成された改変ウサギ抗体を提供する。
【０１０５】
一般的に、改変ウサギ抗体は、親抗体と比較して抗原に対する特異性を保持し、実質的な親和性(例えば、少なくとも107M-1、少なくとも108M-1、または少なくとも109M-1〜1010M-1もしくはそれ以上)を有し、親ウサギ抗体と比較して非ウサギ宿主における免疫原性が低い。多くの態様において、改変ウサギ抗体は、マウス抗体またはヒト抗体などの非ウサギ抗体に由来する少なくとも1組の連続アミノ酸または非連続アミノ酸を含む。
【０１０６】
親ウサギ抗体と比較した改変ウサギ抗体の非ウサギ宿主における免疫原性レベルは、多数の任意の手段(1匹の非ウサギ宿主に、等モル量の2種類の単離抗体を含む処方物を投与し、それぞれ抗体に対する非ウサギ宿主の免疫応答を測定することを含む)によって決定することができる。または、親抗体および改変抗体は別々に異なる非ウサギ宿主に投与され、宿主の免疫応答が測定される。それぞれの抗体に対する非ウサギ宿主の免疫応答を測定するのに適した方法の1つがELISA(Ausubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, Wiley＆Sons, 1995, ユニット11-4に記載)による方法である。ELISAでは、適切な等量の各抗体がマイクロタイタープレートのウェルにスポットされ、非ウサギ宿主からのポリクローナル抗血清を用いてアッセイが行われる。ほとんどの態様において、改変抗体の免疫原性は、改変されていない親抗体より約10％低い、約20％低い、約30％低い、約40％低い、約50％低い、約60％低い、約80％低い、約90％低い、またはさらに約95％低い。
【０１０７】
多くの態様において、改変ウサギ抗体は基本抗体(すなわち、2つの同じ抗体鎖対からなる四量体、それぞれの対は1本の軽鎖と1本の重鎖を有する)である。または、改変ウサギ抗体は特異性を保持し、実質的な親和性を有し、親抗体と比較して非ウサギ宿主における免疫原性が低い限り、基本抗体の任意のバリアント(例えば、二機能抗体、単鎖抗体、Fab、Fv、F(ab')2抗体など)でもよい。
【０１０８】
もちろん、改変ウサギ抗体は特異性を保持し、実質的な親和性を有し、親抗体と比較して非ウサギ宿主における免疫原性が低い限り、ある程度のアミノ酸変化(例えば、保存的アミノ酸置換)に対応してもよい。
【０１０９】
改変ウサギ抗体の結合親和性の決定
改変抗体が発現されたら、通常、任意の既知の方法、例えば、(1)標識(放射性標識または蛍光標識)親ウサギ抗体、改変抗体、および親抗体によって認識される抗原を使用する競合結合分析; (2)表面プラズモン共鳴(例えば、抗体の結合特性を得るビアコア(BIACore)装置を使用する。この方法を用いた場合、抗原は固相チップに固定化され、液相中の抗体の結合がリアルタイムに測定される); および(3)フローサイトメトリー(例えば、細胞表面抗原への抗体結合を試験するために蛍光活性化細胞選別(FACS)分析を使用する); (4)ELISA; (5)平衡透析またはFACSを用いて、親和性が試験される。このFACS法では、抗体結合を試験するために、トランスフェクト細胞および抗原を発現する天然細胞の両方を試験することができる。結合親和性を測定する方法は、Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, 第1版(1988) Cold spring Harbor, N.Y.; Ausubelら, Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, Wiley＆Sons, 1995)において概説されている。
【０１１０】
親和性分析によって、改変抗体の抗体結合が親抗体と比較して低下したことが明らかになった場合、親和性を高めるためにフレームワークの「微調整(fine tuning)」を行うことができる。これを行う方法の1つは、改変された残基一つ一つを部位特異的変異誘発によって系統的に元に戻す方法である。これらの逆突然変異抗体を発現および分析することによって、親和性を低下させない場合を除いて改変することができない重要な残基が予測される。
【０１１１】
逆突然変異を必要とする可能性のある残基を予測する別の方法は分子モデリングによる方法である。元の抗体構造とヒト化またはマウス化抗体構造の三次元モデルを比較することによって、CDR残基に近すぎる(例えば、5オングストロームよ未満)表面残基に由来する任意の残基は、ウサギの残基または両種の共通の残基に逆突然変異させるべきである。
【０１１２】
用途
本発明は、改変ウサギ抗体の非ウサギ宿主における免疫原性が非改変親ウサギ抗体より低くなるように改変ウサギ抗体を製造する方法、およびこれらの方法によって作成された改変ウサギ抗体を提供する。これらの方法および組成物にはいくつかの用途があり、用途の多くを以下に説明する。
【０１１３】
本発明の改変ウサギ抗体は、診断、抗体イメージング、およびモノクローナル抗体に基づく治療に感受性のある疾患の治療に用いられる。特に、ヒト化ウサギ抗体は、受動免疫または望ましくない細胞もしくは抗原の除去(例えば、補体依存性溶解もしくは抗体依存性細胞傷害性(ADCC)による除去)に使用することができる。これらの全てが、多くの以前の抗体に関連する実質的な免疫反応(例えば、アナフィラキシーショック)を伴わない。例えば、本発明の抗体は、望ましくない細胞の表面が、抗体により認識されるタンパク質(例えば、HER2)を特異的に発現する疾患の治療薬として使用することができる。または、本発明の抗体は、望ましくない毒素、刺激物、または病原体を中和するのに使用することができる。ヒト化ウサギ免疫グロブリンには、ある特定の細胞マーカーの発現と関連する多くの種類の癌(例えば、結腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌など)の治療に特に有用である。全てではないが大部分の疾患関連細胞および病原体には、抗体の標的となり得る分子マーカーがあるので、多くの疾患がヒト化抗体薬物の潜在的な適応症である。これらの疾患として、ある特定の種類の免疫細胞が自己抗原を攻撃する自己免疫疾患(例えば、インシュリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、悪性貧血、アレルギーおよび慢性関節リウマチ);移植に関連する免疫活性化(例えば、移植片拒絶および移植片対宿主病);他の免疫系疾患(例えば、敗血症ショック);感染症(例えば、ウイルス感染または細菌感染);心血管疾患(例えば、血栓症)、ならびに神経学的疾患(例えば、アルツハイマー病)が挙げられる。
【０１１４】
マウス化ウサギ抗体は、ヒト疾患のマウスモデル(例えば、マーカー発現と相関するマウスモデル)における試験治療薬およびイメージング抗体として用いられる。当技術分野において周知なように、前記の疾患例の多くには対応するマウスモデルがある。抗体が結合する分子マーカーは、免疫細胞(例えば、IL-2R、IL-4Rがこれらの細胞のマーカーである)、内皮細胞(例えば、flt-1およびflk-1がこれらの細胞のマーカーである)などのダウンレギュレートされた「正常」細胞に存在することがある。または、マーカーは、腫瘍細胞または病原体細胞などの疾患細胞上または疾患細胞の中に存在することがある(例えば、B16マウス黒色腫モデルのmdr-1およびp-糖タンパク質)。
【０１１５】
キット
前記のように本発明の方法を実施するためのキットも本発明によって提供される。本発明のキットは、少なくとも、以下:非ウサギ種における免疫原性が低い改変ウサギ抗体の少なくとも1つのフレームワーク配列をコードする核酸、このような核酸によりコードされる抗体、このような核酸を含むベクター、このような核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、非ウサギ種の定常ドメインをコードする核酸またはこのような核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、および改変ウサギ抗体を発現するためのベクターの1つまたは複数を含む。キットの他の任意の成分として、以下:制限酵素、対照プライマーおよびプラスミド;緩衝液などが挙げられる。キットの核酸はまた、非ウサギ抗体CDRコード核酸への連結を容易にするために、制限部位、マルチクローニングサイト、プライマー部位などを有してもよい。キットの様々な成分が別個の容器に入れられてもよく、所望であれば、ある特定の相溶性成分を予め混合して1個の容器に入れてもよい。
【０１１６】
前記の成分に加えて、本発明のキットは、一般的に、キットの成分を使用して本発明の方法を実施するための説明書をさらに含む。本発明の方法を実施するための説明書は、一般的に、適切な記録媒体に記録されている。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの支持層に印刷されてもよい。従って、説明書は、パッケージ挿入物としてキットの中に存在してもよく、キットの容器またはキット成分の容器のラベルなどに存在してもよい(すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付属してもよい)。他の態様において、説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体(例えば、CD-ROM、ディスケットなど)に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の態様では、実際の説明書はキットに存在せず、遠方の情報源から(例えば、インターネットを介して)説明書を得る手段が提供される。この態様の一例は、説明書を見ることができる、および/または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同じように、説明書を入手するこの手段は適切な支持層に記録される。
【０１１７】
前記のプログラミングおよび説明書を含む少なくとも1つのコンピュータ可読媒体を含むキットも本発明によって提供される。説明書は、インストールまたはセットアップの手順を含んでもよい。説明書は、前記の選択肢または選択肢の組み合わせと共に、本発明を使用するための手順を含んでもよい。ある特定の態様において、説明書は両方のタイプの情報を含む。
【０１１８】
ソフトウェアおよび説明書をキットとして提供することは多くの目的にかなうことがある。この組み合わせは、非ウサギ宿主における免疫原性が親抗体より低いウサギ抗体またはそのヌクレオチド配列を生成するための手段として包装および購入されてもよい。
【０１１９】
説明書は、一般的に、適切な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの支持層に印刷されてもよい。従って、説明書は、パッケージ挿入物としてキットの中に存在してもよく、キットの容器またはキット成分の容器のラベルなどに存在してもよい(すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付属してもよい)。他の態様において、説明書は、例えば、CD-ROM、ディスケットなどの適切なコンピュータ可読記憶媒体(プログラムが存在する同じ媒体を含む)に存在する電子記憶データファイルとして存在する。
【０１２０】
実施例
以下の実施例は、当業者に本発明を作成および使用する方法を完全に開示および説明するために示されるが、本発明者らが本発明と考えるものの範囲を制限することを目的とせず、以下の実験が実施される全ての実験または唯一の実験であることを示すことを目的としない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を保証するように努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が占められるはずである。特に定めのない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧であるか、または大気圧に近い。
【０１２１】
実施例1
ウサギモノクローナル抗体の表面の再建
ウサギ抗インテグリンβ6モノクローナル抗体B1のκ鎖および重鎖の可変領域を、以下のPCRプライマーおよび条件を用いてPCRでクローニングした。いくつかの独立したPCRを行い、PCR産物を配列決定した。
【０１２２】
ハイブリドーマ細胞懸濁液の調製
-増殖しているB1細胞1mlを1100RPMで5分間遠心分離する。
-1×PBSで洗浄する。
-細胞を計数し、400,000細胞/mlに調整する。
【０１２３】
RNAの調製
-氷上で細胞1μlを緩衝液A 9μlに添加する。
-冷緩衝液B 5μlを添加する。
-ヒートブロック上で65℃まで1分間加熱する。****どこで？
-サーモサイクラーで徐々に冷却する
2005535341.tif 000002
-冷緩衝液C(チューブ1個につき5μl)を添加する。
-42℃で42分間インキュベートする。
-氷中に戻す。
【０１２４】
緩衝液A、B、C
緩衝液A
-2μl DTT(0.1M)
-2μl 5×第一鎖緩衝液
-5μl DEPC処理H2O
緩衝液B
-1.0μl 0.1％NP40
-1.0μl 第一鎖緩衝液
-1.0μl オリゴdT
-0.5μl RNAseOUT 40U/ml
-1.5μl DEPC処理H2O
緩衝液C
-1μl 10mM dNTPミックス
-1μl 5×第一鎖緩衝液
-1μl スーパースクリプト(Superscript)RTII
-2μl DEPC処理H2O
【０１２５】
PCR
プライマー濃度:3pmole/μl
2.50μl 10×緩衝液
0.75μl 50mM MgCl2
3.00μl プライマー1
3.00μl プライマー2
0.50μl 10mM dNTPミックス
0.25μl Taqまたは他のポリメラーゼ
10.00μl 水
5.00μl テンプレート
-------
25.00μl
2005535341.tif 000003
1回目:
H鎖には、プライマー1＋プライマー10を使用する
L鎖には、プライマー12＋プライマー19を使用する
ネスティッドPCR  H鎖のみに、プライマー2＋プライマー8
2005535341.tif 000004
【０１２６】
B1抗体の推定タンパク質配列は以下の通りである:
2005535341.tif 000005
【０１２７】
残基番号を指定するために、図2に示した順序を用いて配列を整列させ、次いで、適切なヒト標的配列および適切な構造配列も整列させた。アラインメントを図4に示す。図4において、各鎖の上から3つの配列は、それぞれ、ホモロジーモデリング用の構造配列、望ましい標的ヒト配列、および元のB1配列である。残りの配列は図1に示したものである。比較のために、B1のCDRも挿入点の上に示した。
【０１２８】
構造1IGTを用いて、アラインメントに示した配列にスレッディングを行って、ウサギB1抗体VH/VK鎖のモデルを作成した。この最初のモデルを得るために、ならびに一部のCDRの新たなループおよびVH D-Eループを計算するために、プログラムSwiss PDB Viewerを使用した。
【０１２９】
相対表面接近性を計算した(図3のB1 mdlの列を参照のこと;CDR残基は既に除かれていることに留意のこと)。
【０１３０】
図3(A-D)は、高分解能構造ならびにウサギIgG1,κ抗体(B1)モデルに対する相対表面接近性の計算値を示す。構造名および分解能は、それぞれ、12E8/1.9Å、6FAB/1.9Å、1A2Y/1.5Å、2FB4/1.9Å、8FAB/1.8Å、および2FBJ/1.95Åである。フレームワークのみが示され、軽鎖と重鎖との間で構造的に整列されている。すなわち、β鎖(軽鎖または重鎖の各セットの左にある太字の番号の残基として示した)が整列されている。30％を超える相対表面接近性の値を太字にした。この図は、表面の位置が保存され(位置が一致している)、ウサギ抗体モデルを使用して、どの残基が表面にあるかを計算できることを証明している。
【０１３１】
ある構造では、短い残基を有する別の残基と比較して、長い側鎖を有する残基が露出することもある。例えば、ウサギ抗体B1の位置VH19はアラニンであり、本発明者らの計算では露出しないが、3種類全ての構造のVH19はアルギニンであり、露出している。アラニン側鎖(-CH3)がアルギニン側鎖(CH2-CH2-CH2-NH-CN2H4+)より短く、非常に親水性が低いので、これは当然のことである。これは、特定の残基の変化に関して決定を下すために露出残基の位置の一致を考慮する必要があることが多々あることを示しているので、重要な点である。
【０１３２】
このモデルを使用すると、露出残基は、以下の通りである。
2005535341.tif 000006
【０１３３】
ヒト配列(1IGT)の対応する残基と同一の露出残基は、以下の通りである。
2005535341.tif 000007
【０１３４】
これらの同一のアミノ酸を最初のセットから除いた場合、以下が残る。
2005535341.tif 000008
【０１３５】
VH76はD-Eループ中にあるので、VH76を除くと、以下が残る。
2005535341.tif 000009
【０１３６】
これらのうち、CDRと接触する残基は、以下の通りである。
2005535341.tif 000010
【０１３７】
これらの残基を前のセットから除くと、ヒト化抗体の表面の大部分がヒト「のように見える」ように(すなわち、ウサギ抗体の表面が再建されるように)変更することができる最終的な残基セットが残る。
2005535341.tif 000011
【０１３８】
表面が再建されたヒト化ウサギ鎖の最終的な配列を以下に示し、変更した残基を小文字で示す。
2005535341.tif 000012
【０１３９】
もちろん、さらなる残基を変更することができる。例えば、E-Fループの中の3個のECAをQPDに変更してもよい。なぜなら、これらの残基はCDRから離れており、ループの真上にあるからである。もちろん、本発明は、予測される危険として、さらなる残基の変更を排除しない。
【０１４０】
本発明がウサギモノクローナル抗体の表面を再建するための重要で新しい手段を提供することは、前記の結果および説明から明らかである。詳細に述べると、本発明は、ウサギ抗体の表面残基を同定し、抗体の表面が非ウサギ宿主抗体の表面により似るように表面残基を変更するシステムを提供する。従って、本発明は当技術分野に多大な貢献をする。
【０１４１】
本発明は本発明の特定の態様に関して説明されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を加え、等価物で置換できることを当業者は理解すべきである。さらに、特定の状況、材料、組成物、プロセス、1つまたは複数のプロセス段階を本発明の目的、精神、および範囲に合わせるように、多くの修正を加えることができる。このような全ての修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１Ａ】ウサギ、ヒト、およびマウスの可変領域フレームワークの多重配列アラインメントを示す。上から下の順に、配列を配列表に配列番号:1〜9として並べた。
【図１Ｂ】ウサギ、ヒト、およびマウスの可変領域フレームワークの多重配列アラインメントを示す。上から下の順に、配列を配列表に配列番号:10〜26として並べた。
【図２】本発明の方法の一態様のフローチャート:ウサギ抗体ヒト化のアルゴリズムを示す。ウサギ抗体をマウスまたは他の任意の哺乳動物において低免疫原性にしたければ、その哺乳動物に由来する抗体可変領域を段階3に使用する変更を加えて、同じアルゴリズムを適用する。
【図３Ａ−Ｄ】数種類の高分解能構造およびウサギIgG1κ抗体(B1)モデルの相対表面接近性の計算値を示す。
【図４】ウサギ抗体配列および類似する非ウサギ配列の多重配列アラインメントを示す。上から下の順に、配列を配列表に配列番号:36〜62として並べた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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