(57)【要約】  本発明は、インテグリン又はインテグリン・サブユニットに結合する1又は2種以上の作用物質の製薬上有効な量を投与することにより、アミロイド発生蛋白質毒性を阻害し、アミロイド発生蛋白質沈着物の形成を阻害し、且つ/又は、アミロイド発生疾患を治療するための方法及び組成物を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド沈着物の形成を阻害する方法であって、下記a)〜c):
a)α2、αv、α6及びβ1の中から選択されたインテグリン・サブユニット；
b)α2β1、α6β1及びαvβ1の中から選択されたインテグリン；及び
c)ラミニン
の中から選択された分子に結合する1又は2種以上の作用物質の有効量を、該1又は2種以上の作用物質がアミロイド沈着物形成を阻害するような条件下で投与することを含むことを特徴とする、アミロイド沈着物の形成を阻害する方法。
【請求項２】
該作用物質が該α2インテグリン・サブユニットに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該作用物質が該αvインテグリン・サブユニットに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該作用物質が該β1インテグリン・サブユニットに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該作用物質が該α6インテグリン・サブユニットに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該作用物質が該インテグリンα2β1に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該作用物質が該インテグリンαvβ1に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該作用物質が該インテグリンα6β1に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該作用物質がラミニンに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
α2、α6、αv及びβ1の中から選択された2種以上のインテグリン・サブユニットに結合する2種以上の作用物質の有効量が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
α2、α6、αv及びβ1の中から選択された3種以上のインテグリン・サブユニットに結合する3種以上の作用物質の有効量が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該インテグリン・サブユニットα2、α6、αv及びβ1に結合する4種以上の作用物質の有効量が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該作用物質が、RGD(Arg-Gly-Asp)モチーフを含むペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該作用物質が、αvβ1、α6β1又はα2β1インテグリンのリガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該作用物質が、フィブロネクチン又は超フィブロネクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該作用物質が、コラーゲンに対するα2インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該作用物質が、ビトロネクチン又はフィブロネクチンに対するαvインテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該作用物質が、フィブロネクチンに対するβ1インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該作用物質が、オステオポンチンに対するαvインテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
該作用物質が、オステオポンチンに対するα6インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
該作用物質がモノクローナル又はポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該作用物質が、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と同じエピトープを認識する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該作用物質が、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該作用物質が、該インテグリンα2β1又はαvβ1に対する結合を巡って、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と競合する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
該作用物質がヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
該作用物質がヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
該作用物質がマウス抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
該作用物質がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
該作用物質がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
該作用物質が抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
該作用物質が、抗体の1又は2以上の重鎖、軽鎖、F(ab)、F(ab)2、F(ab)c又はF(v)を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
該作用物質が抗体であり、該抗体のイソタイプがIgG1又はIgG4である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
該作用物質が抗体であり、該抗体のイソタイプがIgG2又はIgG3である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
該作用物質が抗体鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
該作用物質が抗体であり、該抗体が2対の軽鎖及び重鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
該作用物質が患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
該作用物質が抗体であり、該抗体の用量が、該患者の体重1kg当たり約0.01〜約10mgである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該作用物質が製薬組成物として、キャリヤと一緒に投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
該作用物質が、腹腔内、経口、鼻腔内、皮下、くも膜下、筋肉内、局所又は静脈内で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該患者が、アミロイド発生疾患患者である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
該疾患がアルツハイマー病である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
該疾患がII型糖尿病である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
該疾患がパーキンソン病である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
該疾患が全体的又は部分的にプリオン感染によって引き起こされる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
該疾患がアミロイドーシスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
該疾患が遺伝性又は全身性アミロイドーシスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
該疾患がダウン症候群である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
該作用物質をコード化する核酸が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
該作用物質がアンチセンスRNA分子、アンチセンスDNA分子、リボザイム、RNAi又は亜鉛フィンガー蛋白質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
アミロイド毒性の阻害方法であって、下記a)〜c):
a)α2、αv、α6及びβ1の中から選択されたインテグリン・サブユニット；
b)α2β1、α6β1及びαvβ1の中から選択されたインテグリン；及び
c)ラミニン
の中から選択された分子に結合する1又は2種以上の作用物質の有効量を、該1又は2種以上の作用物質がアミロイド毒性を阻害するような条件下で投与することを含むことを特徴とする、アミロイド毒性の阻害方法。
【請求項５１】
該作用物質が該α2インテグリン・サブユニットに結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
該作用物質が該αvインテグリン・サブユニットに結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
該作用物質が該β1インテグリン・サブユニットに結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
該作用物質が該α6インテグリン・サブユニットに結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
該作用物質が該インテグリンα2β1に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
該作用物質が該インテグリンαvβ1に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
該作用物質が該インテグリンα6β1に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
該作用物質がラミニンに結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
α2、α6、αv及びβ1の中から選択された2種以上のインテグリン・サブユニットに結合する2種以上の作用物質の有効量が投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
α2、α6、αv及びβ1の中から選択された3種以上のインテグリン・サブユニットに結合する3種以上の作用物質の有効量が投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
インテグリン・サブユニットα2、α6、αv及びβ1に結合する4種以上の作用物質の有効量が投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
該作用物質が、RGD(Arg-Gly-Asp)モチーフを含むペプチドである、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
該作用物質が、αvβ1、α6β1又はα2β1インテグリンのリガンドである、請求項５０に記載の方法。
【請求項６４】
該作用物質が、フィブロネクチン又は超フィブロネクチンである、請求項５０に記載の方法。
【請求項６５】
該作用物質が、コラーゲンに対するα2インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６６】
該作用物質が、ビトロネクチン又はフィブロネクチンに対するαvインテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６７】
該作用物質が、フィブロネクチンに対するβ1インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６８】
該作用物質が、オステオポンチンに対するαvインテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項５０に記載の方法。
【請求項６９】
該作用物質が、オステオポンチンに対するα6インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する、請求項５０に記載の方法。
【請求項７０】
該作用物質がモノクローナル又はポリクローナル抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７１】
該作用物質が、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と同じエピトープを認識する抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７２】
該作用物質が、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７３】
該作用物質が、インテグリンα2β1又はαvβ1に対する結合を巡って、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と競合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項７４】
該作用物質がヒト抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７５】
該作用物質がヒト化抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７６】
該作用物質がマウス抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７７】
該作用物質がポリクローナル抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７８】
該作用物質がモノクローナル抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７９】
該作用物質が抗体フラグメントである、請求項５０に記載の方法。
【請求項８０】
該作用物質が、抗体の1又は2以上の重鎖、軽鎖、F(ab)、F(ab)2、F(ab)c又はF(v)を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項８１】
該作用物質が抗体であり、該抗体のイソタイプがIgG1又はIgG4である、請求項５０に記載の方法。
【請求項８２】
該作用物質が抗体であり、該抗体のイソタイプがIgG2又はIgG3である、請求項５０に記載の方法。
【請求項８３】
該作用物質が抗体鎖である、請求項５０に記載の方法。
【請求項８４】
該作用物質が抗体であり、該抗体が2対の軽鎖及び重鎖を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項８５】
該作用物質が患者に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項８６】
該作用物質が抗体であり、該抗体の用量が、該患者の体重1kg当たり約0.01〜約10mgである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
該作用物質が製薬組成物として、キャリヤと一緒に投与される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
該作用物質が、腹腔内、経口、鼻腔内、皮下、くも膜下、筋肉内、局所又は静脈内で投与される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
該患者が、アミロイド発生疾患患者である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
該疾患がアルツハイマー病である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
該疾患がII型糖尿病である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
該疾患がパーキンソン病である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
該疾患が全体的又は部分的にプリオン感染によって引き起こされる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９４】
該疾患がアミロイドーシスである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
該疾患が遺伝性又は全身性アミロイドーシスである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９６】
該疾患がダウン症候群である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９７】
該作用物質をコード化する核酸が投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項９８】
該作用物質がアンチセンスRNA分子、アンチセンスDNA分子、リボザイム、RNAi又は亜鉛フィンガー蛋白質である、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2001年7月9日付けで出願された米国特許仮出願第60/304,315号明細書及び2001年12月17日付けで出願された米国特許仮出願第60/341,772号明細書の優先権を主張する。前記両明細書全体を参考のため本明細書に引用する。
【０００２】
アミロイド発生蛋白質は複数の疾患状態の病理に関与する。異常なアミロイド発生蛋白質沈着から生じる疾患の一例としては、アルツハイマー病、II型糖尿病、パーキンソン病、全体的又は部分的にプリオンによって引き起こされる疾患（例えばクロイツフェルト・ヤコブ病、スクレイピー、及び牛海綿状脳症）、及び、遺伝性又は全身性アミロイドーシスの両方を含むアミロイドーシスが挙げられる。
アルツハイマー病(AD)は、老人性痴呆症を発生させる進行性神経変性疾患であり、この疾患の患者数は米国内だけで4百万人である(総体的にはSloe,TINS,16:403-409(1993);Hardy他、国際公開第92/13069号パンフレット；Sloe,J.Neuropathol.Exp.Neurol., 53:438-447(1994);Duff他、Nature, 373:476-477(1995); Games他、Nature, 373:523(1995)を参照されたい)。大雑把に云えば、この疾患は2つのカテゴリ：老年期(65歳以上)に発生する後期発現；及び、老年期前、すなわち35歳〜60歳の間によく発生する早期発現、に分けられる。疾患の両タイプにおいて、病理は同じであるが、しかし、より若年時に発症する事例の方が異常性はより重篤で広範囲である傾向がある。この疾患の特徴は2以上のタイプの脳内損傷、すなわち老人斑及び神経原線維変化である。神経原線維変化は、対を成して互いにねじられている2本の線維から成る微小管結合タウ蛋白質の細胞内沈着物である。老人斑は、最大150ミクロン直径の無秩序な神経網から成る領域であり(脳組織区分の顕微鏡分析によって観察可能である）、中心に細胞外アミロイド沈着物を有する。このような老人斑の主要な成分はAβペプチドである(Forsyth Phys. Ther., 78:1325-1331(1998)参照）。老人斑内に見出される付加的な蛋白質は、Murtomaki他、J.Neurosci. Res., 32:261-273(1992)によって記載されているようなラミニン、アポE、アセチルコリンステラーゼ、及び、Yan他(Biochim. Biophys. Acta, 1502:145-57(2000))によって記載されているようなヘパリン硫酸プロテオグリカンを含む。Aβペプチドは、アミロイド前駆体蛋白質(APP)と呼ばれる前駆体蛋白質の39〜43アミノ酸の内部フラグメントである。APP蛋白質内部の幾つかの突然変異体が、アルツハイマー病の存在と関連付けられている（Goate他、Nature, 349:704-06(1991)(バリン717からイソロイシンへ）;Harlin他、Nature, 353:844-46(1991) (バリン717からグリシンへ）;Murrell他、Science, 254:97-99(1991)(バリン717からフェニルアラニンへ）;Mullan他、Nature Genet., 1:345-47(1992)(リシン595メチオニン596からアスパラギン595ロイシン596に変化する二重突然変異)。このような突然変異は、AβへのAPPプロセッシング量が増大又は変化することにより、特にAPPプロセッシングによってAβ長形(すなわちA1-42及びA1-43)の量が増加することにより、アルツハイマー病を引き起こすと考えられる。他の遺伝子、例えばプレセニリン遺伝子PS1及びPS2中の突然変異形は、APPの処理に間接的に影響を与え、これにより、長形Aβの量を増加させる(Hardy, TINS, 20:154(1997))。これらの所見は、Aβ及び特にその長形がアルツハイマー病における原因要素であることを示唆する(Velez-Pardo他、Gen. Pharm., 31(5):675-81(1998))。
【０００３】
染色体第21の過剰なコピーを有するダウン症候群患者の個体のほとんど全ては、40歳代まで生存した場合に、アルツハイマー病において見られるのと同様の神経病理学的変化を示す。このことは、βアミロイド蛋白質の過剰な生成に起因する。βアミロイド蛋白質は、染色体第21上のAPP遺伝子によってコード化される。
【０００４】
Aβとの生じ得る相互作用に関して、幾つかの蛋白質が研究されている。これらの蛋白質は、糖化最終産物のための受容体RAGE(Yan他、Nature, 382:685-91(1996)参照)、スカベンジャー受容体(Khoury他、Nature, 382:716-719(1996);及びParesce他、Neuron 17:553-65(1996))、小胞体関連アミロイド-ベータ結合蛋白質(ERAB)(Yan他、Nature, 389:689-695(1997))、α4又はα7ニコチン性アセチルコリン受容体(Wang他、J.Neurochem., 75:1155-1161(2000)及びWang他、J.Biol.Chem., 275:5626-5632(2000))、及び低親和性p75 NGF受容体(Yaar他、J.Clin.Invest., 100:2333-2340(1997))を含む。さらにAβはプレート上に塗被されると、β1インテグリン・サブユニットに依存して細胞の接着を媒介することが、Ghiso他、Biochem. J., 288:1053-59(1992);及びMatter他、J.Cell Bio., 141:1019-1030(1998)によって報告されている。
【０００５】
Aβと相互作用可能な種々の機能を有する異なる分子の数から見て、Aβが神経変性を媒介する機能は未だに明らかになっていない。プロセス中に役割を有するその他の細胞蛋白質の存在及び性質もまだ明らかでない。
【０００６】
世紀の変わり目以後、II型糖尿病における病理学的存在物として、島アミロイドが認識されている。島アミロイドはその固有成分として、島β-細胞ペプチド、島アミロイドポリペプチド(IAPP)、又は、インスリンと同時分泌されるアミリンを有する。この固有成分に加えて、島アミロイドは他の蛋白質、例えばアポリポ蛋白質E及びヘパリン硫酸プロテオグリカン・ペルルカンを含有する。これらの蛋白質は、典型的には全身性及び局在性アミロイドの他の形で観察される。島アミロイドは、病理試験においてII糖尿病個体の大部分に観察されるが、しかしグルコース代謝の障害のないヒトに観察されることは稀である。齧歯類由来のIAPPとは対照的に、ヒトIAPPは、アミロイド原線維をin vitroで形成することが判っている。全てのヒト患者がIAPPのアミロイド発生形を生成して分泌するものの、全てが島アミロイドを発生させるわけではないので、何らかの他の因子が島アミロイド形成に関与していると考えられる。1つの仮説は、β細胞機能の変更の結果生じる、IAPPの生成、プロセッシング及び/又は分泌の変化が、ヒト糖尿病における島アミロイド原線維の初期形成に関与することである。このようなアミロイド原線維形成は、次いでIAPP含有原線維の進行性蓄積を可能にする。アミロイドによるβ細胞集団の最終的な置換は、高血糖の発生に関与する。
【０００７】
アミロイド形成の開始を引き起こす、β細胞の変化を生じさせるのに関与する1つの要因は、食事脂肪の消費量の増大である。食事脂肪は、島β細胞ペプチドの生成、プロセッシング及び分泌に変更を加えることで知られており、ヒトIAPPを発現させる遺伝子組換えマウスにおける研究が、このようなメカニズムの働きを立証している。II型糖尿病においてβ細胞の機能を維持し、グルコース制御を改善することを目的として、このようなモデル及びその他のモデルを使用してさらに研究することにより、島アミロイド発生に関与するメカニズムを洞察し、アミロイド原線維形成を阻害又は逆転する治療薬の開発を可能にするべきである。Diabetes, 48:241-253(1999)。
【０００８】
伝染性海綿状脳症又はプリオン病は、感染性、急速進行性の常に致命的な神経変性疾患群を構成する。これらの疾患は、後天性、遺伝性又は特発性(散発性）疾患として出現し得る。これらの疾患は、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病、並びに動物におけるスクレイピー及び牛海綿状脳症(BSE)を含み、試験的又は偶発的な伝染後、最大数10年継続する長い潜伏期間を有することを特徴とする。プリオン病の典型的な病理学的特徴はスポンジ状変化、グリオーシス、及びニューロン損失を含む。ウィルスによって引き起こされる感染性疾患に典型的に見られるものとは異なり、プリオン病は有意な炎症性応答を欠く(Prusiner, Arch. Neurol., 50:1129-1153(1953), Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:13363-13383(1998)。
【０００９】
プリオン病は、伝染性作用物質「プリオン」(Prusier, Science, 216:136-144(1982))の固有の特性により、かなりの科学的注目を浴びている。この感染性作用物質は極めて小型であり、核酸を破壊してコンベンショナルなウィルスを不活性化する処理に対して極めて大きな耐性を有する(id.)が、しかし、蛋白質を変性する処理を受け易い。感染性作用物質を精製しようという試みにより、現在のところ未知の蛋白質が高度に富化されたフラクションが産出された。この蛋白質は、プリオン蛋白質(PrP)と呼ばれている(Bolton他、Science, 218:1309-1311(1982));Prusiner他、Cell, 38:127-134(1983); Oesch他、Cell, 40:735-746(1985))。これらの調製物には、作用物質特異的な核酸は見出されず(kellings他., J. Gen. Virol., 73:1025-1029(1992));Riesner他、Dev. Biol. Stand., 80:173-181(1993));むしろ、プリオン蛋白質は宿主ゲノム内でコード化される(Oesch他、Cell, 40:735-746(1985));Chesebro他、Nature, 315:331-333(1985); Basler他、Cell, 46:417-428(1986))。罹患個体の脳内において、特定の疾患に関連したプリオン蛋白質イソフォーム(PrPScと呼ばれる)の特徴的な蓄積が見出される（図1）。PrPScは、プリオン蛋白質(PrPCと呼ばれる)の正常細胞イソフォームからのコンフォメーション変化を伴う曖昧な翻訳後プロセスを介して誘導される(Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:13363-13383(1998))。PrPCとPrPScとは、同じアミノ酸配列を有する(Stahl他、Biochemistry, 32:1991-2002(1993))ものの、これらはコンフォメーションが異なる。PrPScはβシート構造含有率が高く(Pan他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:10962-10966(1993))、大型凝集体を形成する傾向があり、そしてプロテイナーゼKによる消化に対する部分抵抗性を有することにより、PrPCと区別することができる。
【００１０】
遺伝性アミロイドーシスは、細胞外マトリックスにおける不溶性蛋白質原線維の沈着物を特徴とする臨床的及び遺伝学的に異種の常染色体優性遺伝性疾患群を含む。これらの疾患は典型的には、多発ニューロパシー、手根管症候群、自律神経機能不全症、心筋症、及び、特には硝子体混濁が伴う胃腸の特徴及び腎臓機能不全症の症状をもたらす。その他の表現型の特徴は、ネフロパシー、胃潰瘍、脳神経機能障害、及び角膜格子状異栄養によって特徴付けされる。軟膜構造又は脳構造がまた臨床像に関与することは稀である。発症時年齢は早くは17歳、遅くは78歳である。アミロイド原線維の基本構成は、遺伝子学的に決定されたコンフォメーション変化を介してアミロイド発生性になった生理的蛋白質である。かつてはプレアルブミンと呼ばれた突然変異トランスサイレチン(TTR)が、遺伝性アミロイドーシスにおいて最も頻出する犯人である。同所性肝移植(OLT)は、アミロイド発生蛋白質の主な生成部位を除去することにより、さもなければ一般に致命的な疾患の進行を停止する。OLT及びその成長の指標は、外科手術時点の心血管及び自律神経機能障害の等級、年齢、共存性及び突然変異タイプに依存する。TTRの天然四量体コンフォメーションを安定化し、原線維形成を阻害する薬剤による、これに代わる治療様式が目下集中的に研究されている。
【００１１】
全身性アミロイドーシスの特徴は、実質性器官；血管；皮下、粘膜下及び腱周膜の脂肪；心臓；眼；及び髄膜における原線維性蛋白質凝集体の細胞外沈着物である。さらに、神経中枢、神経叢及び知覚神経節及び自律神経節を含む末梢神経系の任意の部分が関与することがある。末梢神経において、アミロイド沈着物は、普通は斑状分布及び局在化分布で、神経鞘、神経周膜又は神経内膜内に発生する。光学顕微鏡上でコンベンショナルな染色液を用いると、アミロイド沈着物は均質な好酸球状外観を有する。コンゴ・レッド染色によって、これらの沈着物は偏光下で特徴的な黄-青複屈折を示す。
【００１２】
アミロイド形成には種々の蛋白質が原因となる；実際には、全部で18種のアミロイド発生蛋白質がヒト・アミロイドーシスにおいて同定されている。(プラズマ細胞疾患におけるAL型)免疫グロブリン軽鎖、血清アミロイドAのフラグメント、(慢性炎症性疾患におけるAA型)急性期蛋白質、(老人性全身性アミロイドーシスにおける)トランスサイレチン(TTR)、及び(尿毒症及び透析を伴う患者における)β2-ミクログロブリンによって、非遺伝性全身性アミロイドーシスが引き起こされ得る。遺伝性アミロイドーシスは、TTR、及び極めて稀には、アポリポ蛋白質-A1、リゾチーム、フィブリノゲン、ゲルゾリン、アミロイド-β、及びシスタチンCを含む生理的蛋白質の遺伝変異形に起因する。かつてプレアルブミンと呼ばれたTTRは、血清サイロキシン及び網膜結合蛋白質の輸送に関与する正常な四量体血清蛋白質である。TTRは染色体第18上の単一の遺伝子によってコード化される。この染色体の種々異なる51部位で発生する71以上の常染色体優性遺伝性点突然変異が記述されている。これらの中では、位置30におけるメチオニン(Met30)によるバリンの置換が最頻発し、地理的に最も広範囲に伝播される。
【００１３】
パーキンソン病は振戦、筋肉硬直、及び平衡及び協調の問題によって特徴付けられる進行性神経障害である。化学ドーパミンを生成する脳細胞の破壊がこれらの症状の根底を成している。これらの異常細胞はまた、レービー小体と呼ばれる蛋白質沈着物によって特徴付けされる。なぜ細胞が死ぬのか、或いはレービー小体が細胞を殺すのを助けるのか否かは判っていない。パーキン及びα-シヌクレインと呼ばれる2種の蛋白質に対応する遺伝子の突然変異が、遺伝性パーキンソン病の別個の稀な形に連関する。しかしパーキン及びα-シヌクレイン双方は、全てのパーキンソン病患者の脳内に形成されたレービー小体に見出される。
【００１４】
最近の発見が示唆するように、パーキンは、α-シヌクレイン及びシンフィリンを含む、脳内レービー小体と関連する蛋白質を調整する上で重要な役割を演じる。通常、パーキンは、破壊のためにその他の蛋白質を「タグ」するのに、ユビキチンと呼ばれるさらに別の蛋白質を使用する。これらの蛋白質間の関係において何かの狂いが生じる場合、このことがパーキンソン病に見られる細胞死の基礎を成すこともあり得る。パーキン及びα-シヌクレインの双方は、レービー小体関連蛋白質のユビキチン化を伴う一般的な病原メカニズムにおいてシンフィリン-1と連関する。Dawson他、Nature Medicine, 7:1144-1150(2001)。従ってパーキンとの相互作用を考えると、α-シヌクレインの問題は、パーキンソン病の遺伝性形及び一般形双方の核心であると云える（同上）。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、アミロイド沈着物の形成を阻害する方法を提供する。これらの方法は、下記a)〜c):
a)α2、αv、α6及びβ1の中から選択されたインテグリン・サブユニット；
b)α2β1、α6β1及びαvβ1の中から選択されたインテグリン；及び
c)ラミニン
の中から選択された分子に結合する1又は2種以上の作用物質の有効量を、該1又は2種以上の作用物質がアミロイド沈着物形成を阻害するような条件下で投与することを含む。
【００１６】
幾つかの方法において、該作用物質は該α2インテグリン・サブユニットに結合する。
【００１７】
幾つかの方法において、該作用物質は該αvインテグリン・サブユニットに結合する。
【００１８】
幾つかの方法において、該作用物質は該β1インテグリン・サブユニットに結合する。
【００１９】
幾つかの方法において、該作用物質は該α6インテグリン・サブユニットに結合する。
【００２０】
幾つかの方法において、該作用物質は該インテグリンα2β1に結合する。
【００２１】
幾つかの方法において、該作用物質は該インテグリンαvβ1に結合する。
【００２２】
幾つかの方法において、該作用物質は該インテグリンα6β1に結合する。
【００２３】
幾つかの方法において、該作用物質はラミニンに結合する。
【００２４】
幾つかの方法において、α2、α6、αv及びβ1の中から選択された2種以上のインテグリン・サブユニットに結合する2種以上の作用物質の有効量が投与される。
【００２５】
幾つかの方法において、α2、α6、αv及びβ1の中から選択された3種以上のインテグリン・サブユニットに結合する3種以上の作用物質の有効量が投与される。
【００２６】
幾つかの方法において、該インテグリン・サブユニットα2、α6、αv及びβ1に結合する4種以上の作用物質の有効量が投与される。
【００２７】
幾つかの方法において、該作用物質は、RGD(Arg-Gly-Asp)モチーフを含むペプチドである。
【００２８】
幾つかの方法において、該作用物質は、αvβ1、α6β1又はα2β1インテグリンのリガンドである。
【００２９】
幾つかの方法において、該作用物質は、フィブロネクチン又は超フィブロネクチン(フィブロネクチンの多量体形)である。
【００３０】
幾つかの方法において、該作用物質は、コラーゲンに対するα2インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【００３１】
幾つかの方法において、該作用物質は、ビトロネクチン又はフィブロネクチンに対するαvインテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【００３２】
幾つかの方法において、該作用物質は、フィブロネクチンに対するβ1インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【００３３】
幾つかの方法において、該作用物質は、オステオポンチンに対するαvインテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【００３４】
幾つかの方法において、該作用物質は、オステオポンチンに対するα6インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【００３５】
幾つかの方法において、該作用物質はモノクローナル又はポリクローナル抗体である。
【００３６】
幾つかの方法において、該抗体は、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と同じエピトープを認識する。
【００３７】
幾つかの方法において、該抗体は、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択される。
【００３８】
幾つかの方法において、該作用物質は、インテグリンα2β1又はαvβ1に対する結合を巡って、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と競合する。
【００３９】
幾つかの方法において、該作用物質はヒト抗体である。
【００４０】
幾つかの方法において、該作用物質はヒト化抗体である。
【００４１】
幾つかの方法において、該作用物質はマウス抗体である。
【００４２】
幾つかの方法において、該作用物質はポリクローナル抗体である。
【００４３】
幾つかの方法において、該作用物質はモノクローナル抗体である。
【００４４】
幾つかの方法において、該作用物質は抗体フラグメントである。
【００４５】
幾つかの方法において、該作用物質は、抗体の1又は2以上の重鎖、軽鎖、F(ab)、F(ab)2、F(ab)c又はF(v)を含む。
【００４６】
幾つかの方法において、該抗体のイソタイプはIgG1又はIgG4である。
【００４７】
幾つかの方法において、該抗体のイソタイプはIgG2又はIgG3である。
【００４８】
幾つかの方法において、該作用物質は抗体鎖である。
【００４９】
幾つかの方法において、該抗体は2対の軽鎖及び重鎖を含む。
【００５０】
幾つかの方法において、該抗体の用量は、該患者の体重1kg当たり約0.01〜約10mgである。
【００５１】
幾つかの方法において、該作用物質は製薬組成物として、キャリヤと一緒に投与される。
【００５２】
幾つかの方法において、該作用物質は、腹腔内、経口、鼻腔内、皮下、くも膜下、筋肉内、局所又は静脈内で投与される。
【００５３】
本発明は、アミロイド毒性の阻害方法をさらに提供する。これらの方法は、下記a)〜c):
a)α2、αv、α6及びβ1の中から選択されたインテグリン・サブユニット；
b)α2β1、α6β1及びαvβ1の中から選択されたインテグリン；及び
c)ラミニン
の中から選択された分子に結合する1又は2種以上の作用物質の有効量を、該1又は2種以上の作用物質がアミロイド毒性を阻害するような条件下で投与することを含む。
【００５４】
本発明はさらに、アミロイド・プラーク沈着を防止する活性に関して作用物質をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、細胞個体群と作用物質とを接触させ、個体群と1又は2種以上のアミロイド・ペプチド（例えばAβ又はアミリン)とを接触させ、そしてアミロイド沈着物の形成を監視することを含む。アミロイド沈着物形成の速度又は範囲が減少すると、これは作用物質が活性を有することを示す。
【００５５】
幾つかの方法において、該個体群は、該アミロイド・ペプチドの前に該作用物質と接触させられる。
【００５６】
本発明はさらに、
(1)α2、α6、αv、及びβ1の中から選択されたインテグリン・サブユニット；
(2)α2β1、α6β1及びαvβ1の中から選択されたインテグリン；及び
(3)ラミニン
の中から選択された分子に結合する作用物質と、
製薬上許容可能なキャリヤと
を含む組成物を提供する。
【００５７】
幾つかの組成物において、該作用物質は該α2インテグリン・サブユニットに結合する。
【００５８】
幾つかの組成物において、該作用物質は該αvインテグリン・サブユニットに結合する。
【００５９】
幾つかの組成物において、該作用物質は該β1インテグリン・サブユニットに結合する。
【００６０】
幾つかの組成物において、該作用物質は該α6インテグリン・サブユニットに結合する。
【００６１】
幾つかの組成物において、該作用物質は該インテグリンα2β1に結合する。
【００６２】
幾つかの組成物において、該作用物質は該インテグリンα6β1に結合する。
【００６３】
幾つかの組成物において、該作用物質は該インテグリンαvβ1に結合する。
【００６４】
幾つかの組成物において、該作用物質はラミニンに結合する。
【００６５】
幾つかの組成物は、α2、α6、αv及びβ1の中から選択された2種以上のインテグリン・サブユニットに結合する2種以上の作用物質の有効量を含む。
【００６６】
幾つかの組成物は、α2、α6、αv及びβ1の中から選択された3種以上のインテグリン・サブユニットに結合する3種以上の作用物質を含む。
【００６７】
幾つかの組成物は、該インテグリン・サブユニットα2、α6、αv及びβ1に結合する4種以上の作用物質を含む。
【００６８】
幾つかの組成物において、該作用物質は、RGD(Arg-Gly-Asp)モチーフを含むペプチドである。
【００６９】
幾つかの組成物において、該作用物質は、αvβ1、α6β1及びα2β1のリガンドである。
【００７０】
幾つかの組成物において、該作用物質は、フィブロネクチン又は超フィブロネクチン(フィブロネクチンの多量体形)である。
【００７１】
幾つかの組成物において、該作用物質は、コラーゲンに対するα2発現細胞の接着を阻害する。
【００７２】
幾つかの組成物において、該作用物質は、ビトロネクチン又はフィブロネクチンに対するαv発現細胞の接着を阻害する。
【００７３】
幾つかの組成物において、該作用物質は、フィブロネクチンに対するβ1発現細胞の接着を阻害する。
【００７４】
幾つかの組成物において、該作用物質は、オステオポンチンに対するαv発現細胞の接着を阻害する。
【００７５】
幾つかの組成物において、該作用物質は、オステオポンチンに対するα6発現細胞の接着を阻害する。
【００７６】
幾つかの組成物において、該作用物質はモノクローナル又はポリクローナル抗体である。
【００７７】
幾つかの組成物において、該抗体は、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と同じエピトープを認識する。
【００７８】
幾つかの組成物において、該抗体は、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択されている。
【００７９】
幾つかの組成物において、該作用物質は、該インテグリンα2β1又はαvβ1に対する結合を巡って、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と競合する。
【００８０】
幾つかの組成物において、該作用物質はヒト抗体である。
【００８１】
幾つかの組成物において、該作用物質はヒト化抗体である。
【００８２】
幾つかの組成物において、該作用物質はマウス抗体である。
【００８３】
幾つかの組成物において、該作用物質はポリクローナル抗体である。
【００８４】
幾つかの組成物において、該作用物質はモノクローナル抗体である。
【００８５】
幾つかの組成物において、該作用物質は抗体フラグメントである。
【００８６】
幾つかの組成物において、該作用物質は、抗体の1又は2以上の重鎖、軽鎖、F(ab)、F(ab)2、F(ab)c又はF(v)を含む。
【００８７】
幾つかの組成物において、該抗体のイソタイプはIgG1又はIgG4である。
【００８８】
幾つかの組成物において、該抗体のイソタイプはIgG2又はIgG3である。
【００８９】
幾つかの組成物において、該作用物質は抗体鎖である。
【００９０】
幾つかの組成物において、該抗体は2対の軽鎖及び重鎖を含む。
【００９１】
幾つかの組成物において、該抗体の用量は、該患者の体重1kg当たり約0.01〜約10mgである。
【００９２】
幾つかの組成物において、該作用物質は製薬組成物として、キャリヤと一緒に投与される。
【００９３】
幾つかの組成物は、腹腔内、経口、鼻腔内、皮下、筋肉内、くも膜下、局所又は静脈内で投与するように配合されている。
【００９４】
本発明はさらに、患者におけるアミロイド発生疾患を予防又は治療する方法であって、
(1)α2、α6、αv、及びβ1の中から選択されたインテグリン・サブユニット；
(2)α2β1、α6β1及びαvβ1の中から選択されたインテグリン；及び
(3)ラミニン
の中から選択された分子に結合する1又は2以上の作用物質の有効量を、患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００９５】
幾つかの方法において、該作用物質は該α2インテグリン・サブユニットに結合する。
【００９６】
幾つかの方法において、該作用物質は該αvインテグリン・サブユニットに結合する。
【００９７】
幾つかの方法において、該作用物質は該β1インテグリン・サブユニットに結合する。
【００９８】
幾つかの方法において、該作用物質は該α6インテグリン・サブユニットに結合する。
【００９９】
幾つかの方法において、該作用物質は該インテグリンα2β1に結合する。
【０１００】
幾つかの方法において、該作用物質は該インテグリンαvβ1に結合する。
【０１０１】
幾つかの方法において、該作用物質は該インテグリンα6β1に結合する。
【０１０２】
幾つかの方法において、該作用物質はラミニンに結合する。
【０１０３】
幾つかの方法において、α2、α6、αv及びβ1の中から選択された2種以上のインテグリン・サブユニットに結合する2種以上の作用物質の有効量が投与される。
【０１０４】
幾つかの方法において、α2、α6、αv及びβ1の中から選択された3種以上のインテグリン・サブユニットに結合する3種以上の作用物質の有効量が投与される。
【０１０５】
幾つかの方法において、該インテグリン・サブユニットα2、α6、αv及びβ1に結合する4種以上の作用物質の有効量が投与される。
【０１０６】
幾つかの方法において、該作用物質は、RGD(Arg-Gly-Asp)モチーフを含むペプチドである。
【０１０７】
幾つかの方法において、該作用物質は、αvβ1、α6β1又はα2β1インテグリンのリガンドである。
【０１０８】
幾つかの方法において、該作用物質は、フィブロネクチン又は超フィブロネクチン(フィブロネクチンの多量体形)である。
【０１０９】
幾つかの方法において、該作用物質は、コラーゲンに対するα2インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【０１１０】
幾つかの方法において、該作用物質は、ビトロネクチン又はフィブロネクチンに対するαvインテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【０１１１】
幾つかの方法において、該作用物質は、フィブロネクチンに対するβ1インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【０１１２】
幾つかの方法において、該作用物質は、オステオポンチンに対するαvインテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【０１１３】
幾つかの方法において、該作用物質は、オステオポンチンに対するα6インテグリン・サブユニット発現細胞の接着を阻害する。
【０１１４】
幾つかの方法において、該作用物質はモノクローナル又はポリクローナル抗体である。
【０１１５】
幾つかの方法において、該抗体は、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と同じエピトープを認識する。
【０１１６】
幾つかの方法において、該抗体は、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択される。
【０１１７】
幾つかの方法において、該作用物質は、インテグリンα2β1又はαvβ1に対する結合を巡って、1965、Lia1/2、Gi9、1950Z、VNR147及び1980の中から選択された抗体と競合する。
【０１１８】
幾つかの方法において、該作用物質はヒト抗体である。
【０１１９】
幾つかの方法において、該作用物質はヒト化抗体である。
【０１２０】
幾つかの方法において、該作用物質はマウス抗体である。
【０１２１】
幾つかの方法において、該作用物質はポリクローナル抗体である。
【０１２２】
幾つかの方法において、該作用物質はモノクローナル抗体である。
【０１２３】
幾つかの方法において、該作用物質は抗体フラグメントである。
【０１２４】
幾つかの方法において、該作用物質は、抗体の1又は2以上の重鎖、軽鎖、F(ab)、F(ab)2、F(ab)c又はF(v)を含む。
【０１２５】
幾つかの方法において、該抗体のイソタイプはIgG1又はIgG4である。
【０１２６】
幾つかの方法において、該抗体のイソタイプはIgG2又はIgG3である。
【０１２７】
幾つかの方法において、該作用物質は抗体鎖である。
【０１２８】
幾つかの方法において、該抗体は2対の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１２９】
幾つかの方法において、該抗体の用量は、該患者の体重1kg当たり約0.01〜約10mgである。
【０１３０】
幾つかの方法において、該作用物質は製薬組成物として、キャリヤと一緒に投与される。
【０１３１】
幾つかの方法において、該作用物質は、腹腔内、経口、鼻腔内、皮下、くも膜下、筋肉内、局所又は静脈内で投与される。
【０１３２】
幾つかの方法において、該作用物はポリペプチドであり、該作用物が、該ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを患者に投与することにより投与され、該ポリヌクレオチドが患者内で発現させられる。
【０１３３】
幾つかの方法において、該患者は、該患者の血中の投与済作用物質量に関してモニターされる。
【０１３４】
幾つかの方法において、該疾患はアルツハイマー病である。
【０１３５】
幾つかの方法において、該疾患はII型糖尿病である。
【０１３６】
幾つかの方法において、該疾患はパーキンソン病である。
【０１３７】
幾つかの方法において、該疾患は全体的又は部分的にプリオン感染によって引き起こされる。
【０１３８】
幾つかの方法において、該疾患はアミロイドーシス、例えば遺伝性又は全身性アミロイドーシスである。
【０１３９】
幾つかの方法において、該疾患はダウン症候群である。
【０１４０】
幾つかの方法において、該患者はヒトである。
【０１４１】
幾つかの方法において、該患者は無症候性である。
【０１４２】
幾つかの方法において、該患者は50歳未満であり、他の方法において、該患者は50歳以下である。
【０１４３】
幾つかの方法において、該患者は、アルツハイマー病に対する罹患し易さを示す遺伝性危険因子を有する。
【０１４４】
本発明はさらに、患者におけるアミロイド発生疾患を予防又は治療する方法であって、アミロイド蛋白質、例えばAβ又はアミリンの細胞外網構造の形成を阻害する作用物質の有効量を、患者に投与することを含む、方法を提供する。
【０１４５】
本発明はさらに、患者におけるアミロイド発生疾患を予防又は治療する方法であって、
(1)α2、αv、α6及びβ1の中から選択されたインテグリン・サブユニットをコード化する遺伝子；及び
(3)ラミニンをコード化する遺伝子
の中から選択された遺伝子の発現を抑制する作用物質の有効量を、患者に投与することを含む、方法を提供する。
【０１４６】
幾つかの方法において、該作用物質はアンチセンス核酸である。
【０１４７】
幾つかの方法において、該作用物質は亜鉛フィンガー蛋白質である。
【０１４８】
幾つかの方法において、該作用物質は、α2インテグリン・サブユニットをコード化する遺伝子の発現を抑制する。
【０１４９】
幾つかの方法において、該作用物質は、αvインテグリン・サブユニットをコード化する遺伝子の発現を抑制する。
【０１５０】
幾つかの方法において、該作用物質は、β1インテグリン・サブユニットをコード化する遺伝子の発現を抑制する。
【０１５１】
幾つかの方法において、該作用物質は、α6インテグリン・サブユニットをコード化する遺伝子の発現を抑制する。
【０１５２】
定義
本発明の治療剤は典型的には、不所望な汚染から実質的に精製される。これは、作用物質が典型的には約50重量%（重量/重量）以上の純度を有し、また、妨害蛋白質及び汚染物を実質的には含有しないことを意味する。作用物質は約60重量%以上、約70重量%以上、約80重量%以上、90重量%以上又は95重量%以上の純度である。コンベンショナルな蛋白質精製技術を用いて、99重量%以上の均質なペプチドを得ることもできる。
【０１５３】
2つの存在物の特異的結合は、106M-1以上、107M-1以上、108M-1以上、109M-1以上又は1010M-1以上の親和性を意味する。1実施態様の場合、親和性は約108M-1を上回る。
【０１５４】
「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、無傷の抗体及びこれらの結合フラグメントを含むように使用される。典型的には、フラグメントは、別個の重鎖、軽鎖Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c及びFvを含む抗原フラグメントに対する特異結合を巡って、フラグメントの由来源である無傷の抗体と競合する。組換えDNA技術によって、或いは、無傷の免疫グロブリンの酵素的又は化学的分離によって、フラグメントを生成することができる。「抗体」という用語は、他の蛋白質との融合蛋白質に化学的に共役された1又は2以上の免疫グロブリン鎖、又は他の蛋白質との融合蛋白質として発現させられた1又は2以上の免疫グロブリン鎖をも含む。「抗体」という用語は二重特異性抗体をも含む。二重特異性又は二官能性抗体は、2つの異なる重鎖/軽鎖対及び2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。ハイブリドーマの融合又はFab'フラグメントのリンクを含む種々の方法によって、二重特異性抗体を生成することができる(例えばSongsivilai及びLachmann、Clin. Exp. Immunol., 79:315-321(1990); Kostelny他、J.Immunol.,148:1547-53(1992))。
【０１５５】
APP695、APP751及びAPP770はそれぞれ、ヒトAPP遺伝子によってコード化された695、751及び770アミノ酸残基長ポリペプチドを意味する。Kang他、Nature, 325:733-36(1987);Ponte他、Nature, 331:525-27(1988);及びKitaguchi他、Nature, 331:530-32(1988)を参照されたい。ヒト・アミロイド前駆体蛋白質(APP)中のアミノ酸には、APP770イソフォームの配列に基づく番号が割り当てられる。Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42及びAβ43のような用語は、アミノ酸残基1-39, 1-40, 1-41, 1-42及び1-43を含有するAβペプチドを意味する。Aβ42は下記配列(SEQ ID NO:1)を有する：
【０１５６】
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glue-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH。Aβ41(SEQ ID NO:3）、Aβ40(SEQ ID NO:4）、及びAβ39(SEQ ID NO:5）はそれぞれ、C末端からAla、Ala-Ile及びAla-Ile-Valが欠落する点でAβ42(SEQ ID NO:1）と異なっている。Aβ43(SEQ ID NO:2）は、C末端にトレオニン残基が存在する点でAβ42(SEQ ID NO:1）と異なっている。
【０１５７】
「アミリン」は、当業者には良く知られた蛋白質、又は、ペプチド又はポリペプチド又はそのフラグメント、又は、前駆体蛋白質又はその蛋白質のポリマー、ペプチド又はポリペプチドを意味する。この用語は島アミロイドポリペプチドを包含する。アミリンの記述は、Cooper他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:7763(1988)及びLeighton他、Nature, 335:632(1988)のような箇所に見出すことができる。
【０１５８】
「アミロイド・ペプチド又はアミロイド蛋白質」は、アミリン及びAβを含む、アミロイド様沈着物を形成するペプチド及び蛋白質から成る群を意味する。
【０１５９】
「アミロイド沈着物又はアミロイド様沈着物」という用語は、構造において線維状又は非線維状であるアミロイド原線維並びにその他のアミロイド沈着物又はアミロイド様沈着物を含む。これらの沈着物は、アミロイド沈着物又はアミロイド様沈着物、例えば老人性アミロイドーシス(例えばAβ)、プリオン関連脳症(例えばPrP)、及び糖尿病患者の腎臓又は膵臓(例えばアミリン)における沈着物などとして当業者に認識されている。光学顕微鏡においてコンベンショナルな染色液を用いると、このような沈着物は均質な、好酸球状外観を有する。コンゴ・レッド染色によって、これらの沈着物は偏光下で特徴的な黄-青複屈折を示す。この用語はまた、プレアミロイド沈着物を含む。これらのプレアミロイド沈着物はアミロイド沈着物と異なり、コンゴ・レッドでは染色しない。
【０１６０】
「アミロイド発生疾患」という用語は、蛋白質又はペプチドの不所望な沈着を特徴とする疾患を包含するものとする。この用語は具体的には、Kahn他、Diabetes 48:241-253(1999)；及びJohnson他、Laboratory Investigation, 66(5):522-535(1992)によって記載されているように、II型糖尿病(例えばアミリン)、アルツハイマー病(例えばAβ)、多発性骨髄腫、及びリューマチ様関節炎に発生するような不所望なアミロイド・ペプチド沈着を特徴とする疾患を包含する。この用語は具体的には、トランスサイレチン(TTR)沈着によって媒介されるアミロイドーシスを含む、Hund他、Neurology,56:431-435(2001)によって記載されているようなアミロイド発生蛋白質、例えばパーキンソン病、又は遺伝性又は全身性アミロイドーシスの不所望な沈着を特徴とする疾患をも包含する。さらに、この用語は、全体的又は部分的にプリオン、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病の感染により引き起こされた疾患を含む。このようなプリオン媒介性疾患の特徴は、Giese他、Curr. Topics Microbiology and Immunology, 253:203-217(2001)によって記載されているようなプリオン蛋白質の蓄積である。手短に云えば、この用語は、その病理が健康及び周囲細胞の良好な状態に悪影響を及ぼす不所望な蛋白質沈着物又はペプチド沈着物によって媒介されるような全ての疾患を含むものとする。
【０１６１】
「抗原」は、抗体が特異的に結合する存在物である。
【０１６２】
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、B及び/又はT細胞が応答する抗原上の部位を意味する。B細胞エピトープは、連続アミノ酸、又は、蛋白質の三次折畳みによって近接する非連続アミノ酸の双方から形成することができる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは典型的には、変性溶剤に晒されると保持され、これに対して三次折畳みによって形成されたエピトープは典型的には、変性溶剤による処理時に失われる。エピトープは固有の空間コンフォメーションにおいて典型的には3以上、より通常の場合には、5以上又は8〜10のアミノ酸を含む。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法は、例えば、x線結晶学特性及び二次元核磁気共鳴を含む。例えばEpitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology,第66巻、Glenn E. Morris編(1996)を参照されたい。同じエピトープ又はオーバーラップ・エピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する別の抗原の結合をブロックする1つの抗体の能力を示す単純なイムノアッセイにおいて、同定することができる。
【０１６３】
「ネイクド・ポリヌクレオチド」又は「ネイクドDNA」は、コロイド材料、例えば蛋白質と複合されていないポリヌクレオチドを意味する。ネイクド・ポリヌクレオチドは、プラスミド・ベクターにおいてクローニングされることがある。
【０１６４】
「患者」という用語は、予防又は治療を受けるヒト及びその他の哺乳動物被験者を含む。
【０１６５】
神経細胞は、in vivoで発生する、AβへのAPPの自然プロセッシングの結果として、或いは、in vitroアッセイにおいてAβの調整物と神経細胞とを接触させる結果として、Aβペプチドに暴露することができる。
【０１６６】
Aβペプチドのアミロイド沈着物は、おそらくは図1Aに示されているようにin vitroで、又はin vivoで皮質細胞上及び皮質細胞の周りに形成される原線維を含む、Aβペプチドの凝集体を意味する。
【０１６７】
文脈から特に他の意味が明らかでない限り、フィブロネクチンに言及するときには、超フィブロネクチンを含む。
【０１６８】
抗体間の競合は、試験下の免疫グロブリンが共通の抗原に対する基準抗体の特異的結合を阻害するアッセイによって決定される。多数のタイプの競合的結合アッセイ、例えば：固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ(RIA)、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli他、Methods in Enzymology, 9:242-53(1983)参照);固相直接ビオチン-アビジンEIA(Kirkland他、J.Immunol., 137:3614-19(1986)参照);固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチ・アッセイ(Harlow及びLane「Antibodies, A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Press (1988)参照);I-125標識を使用した固相直接標識RIA(Morel他、Molec. Immunol.,25(1):7-15(1988)参照);固相直接ビオチン-アビジンEIA(Cheung他、Virology, 176:546-52(1990));及び直接標識RIA(Moldenhauer他、Scand.J.Immunol., 32:77-82(1990))、が知られている。典型的には、このようなアッセイは、標識付けされていない試験免疫グロブリン又は標識付けされた基準免疫グロブリンを担持する固体表面又は細胞に結合された精製抗体を使用することを伴う。試験免疫グロブリンの存在において固体表面又は細胞に結合された標識量を決定することにより、競合的阻害が測定される。普通、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合アッセイによって同定された抗体(競合抗体)は、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体を含み、また、基準抗体によって結合されたエピトープに、立体障害が発生するのに十分に近接した隣接エピトープに結合する抗体を含む。通常、競合抗体が過剰に存在すると、この抗体は、共通の抗原に対する基準抗体の特異的結合を最小50%又は75%だけ阻害することになる。
【０１６９】
1又は2以上の列挙された要素を「含む」組成物又は方法は、具体的には列挙されていない他の要素を含んでよい。例えば、抗体を含む組成物は抗体だけを含有するか、或いは、他の成分との組み合わせで抗体を含有してよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１７０】
発明の詳細な説明
A.  概要
本発明は、アミロイド蛋白質、例えばアミリン及びAβの細胞外網構造の形成を阻害又は予防する方法、このような蛋白質の毒作用を媒介する方法、及びこれらの方法において使用するための作用物質を提供する。これらの方法は、アルツハイマー病、II型糖尿病、パーキンソン病、全身性及び遺伝性アミロイドーシス、並びに、全体的又は部分的にプリオン感染によって引き起こされる疾患を治療又は予防するのに用いることができる。これらの方法において使用するのに効果的な作用物質は、インテグリン・サブユニット、例えばβ1、α2、α6又はαvに結合する抗体及びその他の作用物質を含む。これらのサブユニットはヘテロ二量体受容体として会合して、インテグリン、例えばα2β1、α6β1及びαvβ1を形成する。上記作用物質は、インテグリンとAβペプチドとの相互作用を阻害するために個別に又は組み合わせて使用することができる。αvβ1インテグリン及びα2β1インテグリンの双方と、Aβとの相互作用を阻害する1又は2以上の作用物質を使用することが好ましい。インテグリンαvβ1のリガンドであるフィブロネクチンを作用物質として上記方法において使用することもでき、αvβ1のリガンドであるラミニンに対する抗体を使用することもできる。
【０１７１】
本発明は部分的には、α2、αv、α6及びβ1インテグリン・サブユニットに対する抗体が、アミロイド蛋白質、例えばアミリン及びAβペプチドの細胞外網状構造の形成を阻害するという観察に基づいている。これにより、このような抗体は、アミロイド蛋白質の毒性を阻止する。αvβ1リガンドであるフィブロネクチンはまた、網状構造形成を阻害する。α2β1リガンドであるラミニンは網状構造形成を阻害しないが、しかしラミニンに対する抗体は網状構造の形成及び毒性を阻害する。
【０１７２】
B.  インテグリン
インテグリンは、細胞表面接着性のヘテロ二量体型の膜貫通型受容体のスーパーファミリーである。これらの受容体は、細胞外マトリックス及び他の細胞の双方に対する細胞の付着を制御する。接着は、成長、移動及び分化のための足場及び信号を提供する。インテグリンは、約15本の既知のアルファ鎖のうちの1つと約8本の既知のベータ鎖のうちの1つとを組み合わせることにより形成される。全てのヒト細胞、但し赤血球は1又は2以上のインテグリンを発現させる。
【０１７３】
インテグリン・サブユニットα2、αv、α6及びβ1は全て良く知られている。例示的なヒト配列は、GenBank寄託番号AF062039, M14648, X59512及びX07979からそれぞれ検索することができる。特に断りのない限り、α2、αv、α6及びβ1について言及する時には、これらの例示的な配列、これらの対立遺伝子変異形、及びその他の種に由来する同系変異形を含む。天然配列のリガンドに対する特異的結合を巡って天然配列と競合するのに十分な、天然配列に対する配列同一性を有するこれらの配列の誘発変異体を、幾つかの方法において使用することもできる。αv及びβサブユニットβ1、β3、β5、β6又はβ8のうちの1つを含有するインテグリンは、RGDモチーフを担持するリガンドを認識するが、しかし、その結合特異性は、どのβサブユニットが存在するかに応じて変動する。αvβ1は、ビトロネクチン(GenBank寄託番号X03168)、フィブロネクチン(GenBank寄託番号M26179)及びオステオポンチン(GenBank寄託番号J04765)を認識することが知られている。フィブロネクチンは、結合組織中、細胞表面上、及び血漿及びその他の体液中に見出される大型多ドメイン糖蛋白質である。フィブロネクチンは、細胞骨格及び細胞外マトリックスの成分、血液凝固応答系、線溶系、急性期系及び補体系に関与する循環成分を含む種々のマクロ分子と一緒に作用し、また、線維芽細胞、ニューロン、食細胞及び細菌を含む種々の細胞上の細胞表面受容体と一緒に作用する。
【０１７４】
α2サブユニット及びβ1サブユニットを含有するインテグリンは、VLA-2（超遅発活性化抗原2(very late activation antigen 2))、GPIa-IIa(血小板上の糖蛋白質Ia-IIa)、及びECMRII(細胞外マトリックス受容体II）として知られている。α2β1インテグリンはコラーゲン-I〜VI、ラミニン及びおそらくはフィブロネクチンに結合する。受容体はB及びTリンパ球、血小板、線維芽細胞、内皮細胞及び黒色腫細胞上で発現させられ、そしてリガンドとしてコラーゲン及びラミニンを特異的に認識する。ラミニンは、共通の構造組織を有する大型の多ドメイン蛋白質である。ラミニン分子は、二重コイル・ドメインを介して接合されたアルファ、ベータ及びガンマ鎖サブユニットを有している。5以上のアルファ鎖、2以上のベータ鎖、及び3以上のガンマ鎖が知られており、これらの鎖の種々異なる組み合わせを有する12以上のラミニンが報告されている(国際公開第00/66730号パンフレット）。ラミニンはアルツハイマー病において、プラークを含む細胞外マトリックス中に見出される(Murtomaki他、J.Neuro.Res., 32:261-73(1992); Bronfinan他、Int. J. Exp. Clin. Invest., 5:16-23(1997);及びCastillo他、J.Neuro. Res., 62:451-62(2000))。コラーゲンは哺乳好物において最も豊かな蛋白質であり、皮膚、骨、腱、軟骨及び歯の主な線維成分である。23以上の既知のコラーゲン遺伝子がある(Adams他、Am.J.Respir.Cell.Molec.Biol.,1:161-168(1989))。
【０１７５】
α6/β1インテグリンは、血小板、リンパ球、単球、胸腺細胞、及び上皮細胞上に発現させられる。これらの細胞上で、α6/β1インテグリンは、in vivoにおけるラミニン-1、ラミニン-2及びラミニン-4のためのラミニン受容体として機能する。α6/β1インテグリンはまた、ラミニン-5のための受容体でもあるが、in vivoではその受容体ではない。ラミニン-1の場合、結合部位は、この細胞外マトリックス分子のE8ドメイン内に局在化されている。この受容体はまた、超遅発活性化抗原6(VLA-6)及び糖蛋白質Ic-IIa(血小板上のGPIc-IIa)として知られている。
【０１７６】
インテグリンは、セレクチン及び免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーの員をも含む接着蛋白質として知られている、大型クラスの蛋白質の例である(Springer, Nature, 346;425(1990); Osborn, Cell, 62:3(1990);Hynes, Cell, 69:11(1992)参照、これらの文献の全体をあらゆる目的で参考にするために引用する)。接着蛋白質又はこれらのリガンドに結合し、且つ/又は、これら双方の相互作用をブロックする抗体及びその他の作用物質は、下記スクリーニング法においてAβ沈着物の蓄積を防止又は阻害する活性に関して、スクリーニングすることができる。下記方法によるスクリーニングに適したその他のセレクチン及びこれらのリガンドの例は、インテグリンα2β5、αvβ5、α6β5、α2β6、αvβ6及びα6β6を含む。コラーゲンに結合する、α2β1以外のリガンドはスクリーニングすることもできる。
【０１７７】
C.  作用物質
本発明の治療薬は、α2、αv、α6及びβ1インテグリン・サブユニットに特異的に結合する抗体を含む。結合は、任意には固相に固定化された、分離されたインテグリン・サブユニット又はこれらのフラグメントで、又は、細胞の表面上に発現させられたインテグリン・サブユニットで評価することができる。しばしば結合は、ヘテロ二量体インテグリンを発現させる細胞を使用して分析される。例えば、薬剤が唯一のインテグリンとしてα2β1を発現させる細胞に結合するならば、この薬剤は、いずれかのサブユニットだけに結合するのではなく、α2又はβ1に、又はα2β1に結合すると推論することができる。これらの可能性は、同じ作用物質を、異なるヘテロ二量体インテグリンを担持する細胞に結合する試験を行うことにより、見分けることができる。例えば同じ作用物質が、存在する唯一のインテグリンとしてαvβ1を担持する細胞に特異的に結合するならば、その作用物質はβ1サブユニットに結合するものと考えられる。インテグリン及びインテグリン・サブユニットに対する種々の抗体は商業的に入手可能であり、これらのうちの幾つかを実施例に記述する。
【０１７８】
本発明の方法において、モノクローナル又はポリクローナル抗体を使用することができる。好ましい抗体は、これらのインテグリン・サブユニットと、これらの天然リガンドのうちの1又は2以上との相互作用をブロックする。すなわち、αvβ1に対するブロック抗体は、このインテグリンとフィブロネクチン、オステオポンチン及び/又はビトロネクチンとの相互作用をブロックする。例えば、国際公開第99/37683号パンフレットによって記載された14D9.F8抗体は、フィブロネクチンに対するαvの結合をブロックする。α2β1に対するブロック抗体は、インテグリンとコラーゲン又はラミニンとの相互作用をブロックする。抗体又は他の作用物質のブロック・キャパシティは、単純なアッセイによって認識することができる。抗体（又は他の作用物質）の存在又は不存在におけるリガンド塗布プレートに対する接着に関してインテグリン発現細胞が試験される。プレートに結合する細胞量の最小約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%の減少が、抗体がインテグリンに対して過剰のモルで存在する場合には、ブロック抗体（又は他の作用物質）を同定する。インテグリン・サブユニットの他の組み合わせに対する作用物質のブロック・キャパシティをさらに分析することにより、ヘテロ二量体インテグリンのどのサブユニットがブロックされているかを特定することができる。抗体又は他の作用物質の結合特異性は、競合アッセイによって決定することもできる。このアッセイにおいて、試験抗体は、インテグリン・サブユニット又は同じインテグリン・サブユニットを担持する細胞に対する結合を巡って、所期のエピトープ特異性を有することが知られている基準抗体と競合する。試験抗体及び基準抗体が競合するならば、これらの抗体は同じエピトープに結合するか、或いは、一方の抗体の結合が他方の抗体の結合を妨害するのに十分に近接したエピトープに結合する。幾つかの実施態様の場合、トランスフェクトされた細胞が単一タイプのインテグリンを発現させる。
【０１７９】
本発明において使用するための幾つかの抗体は、唯1つのタイプのインテグリン・サブユニットに結合する。幾つかの抗体は、2又は3以上のインテグリン・サブユニットに特異的に結合する。幾つかの抗体は、インテグリンのサブユニットがヘテロ二量体インテグリンとして会合されるときにのみ結合する。例えば、幾つかの抗体は、α2又はβ1だけに結合することなしに、α2β1に結合する。幾つかの抗体は、αv又はβ1だけに結合することなしに、αvβ1に結合する。幾つかの抗体は、自由な形で、且つサブユニットが二量体インテグリンの成分である場合に、サブユニットに結合する。上記抗体の同じ結合特異性を有するペプチド及び小分子を使用することもできる。
【０１８０】
本発明において使用するためのその他の治療薬は、フィブリノゲン、オステオポンチン、ビトロネクチン、これらのフラグメント、及びαvβ1に対する結合を巡ってフィブリノゲン又はビトロネクチンと競合するRGDペプチド・モチーフを含有するその他の天然又は合成ペプチドを含む。αvβ1に対する結合を巡ってフィブリノゲン、ビトロネクチン又はオステオポンチンと競合する小分子模倣体を使用することもできる。その他の治療薬は、ラミニンに対する抗体、及び同じ結合特異性を有するペプチド及び小分子を含む。
【０１８１】
候補治療薬は、下記のスクリーンの1又は2以上を実施することにより評価することができる。典型的には、インテグリン・サブユニットα2、αv、α6及びβ1、及び/又はへテロ二量体インテグリンα2β1、αvβ1、α6β1、又はラミニンに対する特異的結合に関して、作用物質が先ず評価される。好適な作用物質は、最小107、108、109又は1010M-1の特異的親和性を持って結合する。
【０１８２】
その後、候補は任意には、特定のエピトープ特異性に関して評価される。このことは、基準作用物質との競合アッセイによって、上記のような機能プレート・ブロッキング・アッセイによって、又は、エピトープ・マッピング試験によって、見極めることができる。エピトープ・マッピング試験の場合には、抗体又は他の作用物質がウェスタン・ブロッティング又はELISAによって、抗原の一連の欠失変異体に結合する能力に関して評価される。抗体又は他の作用物質に対する特異的結合を示すための最小フラグメントは、その抗体又は他の作用物質のエピトープを定義する。或いは、又はこれに加えて、候補作用物質は、アミロイド・ペプチドの細胞外網状構造の形成を阻害する能力に関して評価される。好適な作用物質は典型的には、対照に対する作用物質の存在において、アミロイド・ペプチド、例えばアミリン又はAβによって処理することから生じる毒性を、最小約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又はそれ以上だけ低減する。
【０１８３】
候補化合物は、アミロイド発生疾患に感染し易い形質転換動物における予防上及び治療上の有効性に関して試験することもできる。このような動物は例えば、Games他(前出)によって記載されたAPPの717突然変異体を担持するマウス、及び、McConlogue他、米国特許第5,612,486号明細書；Hsiao他、Science, 274:99(1996);Sturchler-Plerrat他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94:13287-92(1997);及びBorchelt他., Neuron, 19:939-45(1997)によって記載されているようなAPPの670/671 Swedish突然変異体を担持するマウスとを含む。形質転換マウスにおける活性を示す作用物質は、次いでヒト臨床試験において評価することができる。アルツハイマー患者におけるヒト臨床試験を実施するための例示的な形式は、国際公開98/24678号パンフレットに記載されている。このパンフレットを参考のため本明細書中に引用する。
【０１８４】
A.  抗体
1.  免疫グロブリンの一般的な特性
基本的な抗体構造ユニットは、サブユニットの四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一対から成っている。各対は1本の「軽鎖(約25kDa)」と1本の「重鎖(約50-70kDa)」とを有する。各鎖のアミノ末端は、主として抗原認識を担う約100〜110又はそれ以上のアミノ酸から成る可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクタ機能を担う定常領域を定義する。
【０１８５】
軽鎖はカッパ又はラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンとして分類され、抗体のイソタイプをそれぞれIgG, IgM, IgA, IgD及びIgEとして定義する。軽鎖及び重鎖内では、可変領域及び定常領域は、約12以上のアミノ酸から成る「J」領域によって接合され、重鎖はまた約10以上のアミノ酸から成る「D」領域を含む(概要については、Fundamental Immunology(Paul. W.,第2版、Raven Press, N.Y., 1989)第7章(この文献全体をあらゆる目的で参考にするために引用する)参照)。
【０１８６】
各軽/重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、無傷の抗体は2つの結合部位を有している。二重官能性又は二重特異性抗体の場合を除いて、2つの結合部位は同じである。鎖は全て、相補性決定領域又はCDRとも呼ばれる、3つの超可変領域によって接合された比較的保存性の高いフレームワーク領域(FR)の同じ一般構造を示す。各対の2本の鎖から成るCDRはフレームワーク領域によって整列させられ、特異的エピトープに対する結合を可能にする。N-末端からC-末端まで、軽鎖及び重鎖の双方は、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987及び1991)、又は、Chothia & Lest, J. Mol. Biol., 196:901-17(1987); Chotia他、Nature, 342:878-83(1989)の定義に基づく。
【０１８７】
2. 非ヒト抗体の生成
ヒト以外の、例えばネズミ、テンジクネズミ、霊長類、ウサギ又はラットのモノクローナル抗体の生成は、例えば、インテグリン、そのサブユニット、又はこれらのフラグメントで動物を免疫化するか、或いは、インテグリン又はそのサブユニットを担持する細胞で動物を免疫化することにより達成することができる。ラミニンを、ラミニンに対する抗体を生成するためのイムノゲンとして使用することもできる。Harlow及びLane, Antibodies, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press, NY, 1988, この文献を、あらゆる目的で参考にするために本明細書中に引用する)を参照されたい。このようなイムノゲンは、ペプチド合成又は組換え発現によって天然源から得ることができる。任意には、下記のように、イムノゲンはキャリヤ蛋白質と融合されるか、又はその他の形式で複合された状態で投与することができる。任意には、イムノゲンはアジュバントと一緒に投与することができる。幾つかのタイプのアジュバントを下記のように使用することができる。完全フロインドアジュバントに続いて不完全アジュバントを使用することが、実験動物の免疫化にとって好ましい。ポリクローナル抗体を形成するために、典型的には、ウサギ、ヤギ、羊又はテンジクネズミが使用される。モノクローナル抗体を形成するために、典型的にはマウスが使用される。所期のインテグリン又はそのサブユニット、又は他の抗原、例えばラミニンに対する特異的結合に関して、抗体がスクリーニングされる。上述のようにインテグリンのそのリガンドに対する結合をブロックするキャパシティに関して、抗体をスクリーニングすることもできる。上述とは別のスクリーニング手順を実施することもできる。
【０１８８】
3.  キメラ抗体及びヒト化抗体
キメラ抗体及びヒト化抗体は、キメラ抗体及びヒト化抗体を構成するための出発材料を提供するマウス抗体又はその他の非ヒト抗体と同じ又は類似の結合特異性及び親和性を有してよい。幾つかのキメラ抗体又はヒト化抗体の親和性は、マウスの親和性の2倍、5倍又は10倍のファクター内にある。キメラ抗体は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、典型的には遺伝子工学によって構成された軽・重鎖遺伝子を有する抗体である。例えば、マウス・モノクローナル抗体に由来する遺伝子の可変(V)セグメントは、ヒト定常(C)セグメント、IgG1, IgG2, IgG3, 又はIgG4に接合されてよい。従って典型的なキメラ抗体は、マウス抗体に由来するVドメイン又は抗原結合ドメインと、ヒト抗体に由来するCドメイン又はエフェクタ・ドメインとから成るハイブリッド蛋白質である。
【０１８９】
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプタ抗体と呼ばれる）に由来する可変領域フレームワーク残基と、実質的に非ヒト抗体、例えばマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）に由来する相補性決定領域とを有する。Queen他、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 86:10029-33(1989)及び国際公開第90/07861号パンフレット、米国特許第5,693,762号明細書、同第5,693,761号明細書、同第5,585,089号明細書、同第5,530,101号明細書、及びWinterの米国特許第5,225,539号明細書（これらの各文献全体をあらゆる目的で参考にするため、本明細書中に引用する）参照。定常領域はまた、もしこれが存在するならば、実質的又は全体的にヒト免疫グロブリンに由来する。ヒト可変ドメインは通常、ヒト抗体から選択され、これらのヒト抗体のフレームワーク配列は、CDRの起源となるマウス可変領域ドメインとの高度な配列同一性を示す。重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク残基は、同じ又は異なるヒト抗体配列から誘導することができる。ヒト抗体配列は、自然発生型ヒト抗体の配列であってよく、或いは、幾つかのヒト抗体のコンセンサス配列であってよい。Carter他、国際公開第92/22653号パンフレット参照。ヒト可変領域フレームワーク残基に由来する特定のアミノ酸が、CDRコンフォメーションに対して生じ得る影響に基づいて、且つ/又は、抗原に対する結合に基づいて、置換のために選択される。生じ得るこのような影響は、モデリングするか、特定の位置でアミノ酸の特性を試験するか、又は、特定のアミノ酸の置換又は突然変異生成の効果を実験に基づいて観察することによって調査される。
【０１９０】
例えば、アミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と、選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる時に、アミノ酸が：
(1)抗原に直接的に非共有結合し、
(2)CDR領域に隣接し、
(3)CDR領域と他の形式で相互作用し(例えばCDR領域の約6Å以内にある）、又は、
(4)VL-VH界面に関与する
ことが当然予期される場合には、ヒト・フレームワーク・アミノ酸は普通は、マウス抗体に由来する同等のフレームワーク・アミノ酸によって置換されることになる。
【０１９１】
その他の置換候補は、その位置におけるヒト免疫グロブリンにとっては普通でないアクセプタ・ヒト・フレームワーク・アミノ酸である。これらのアミノ酸は、ドナー抗体の同等の位置、又は、より多くの典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置に由来するアミノ酸で置換することができる。ヒト化免疫グロブリンの可変領域フレームワークは、通常、ヒト可変領域フレームワーク配列又はこのような配列のコンセンサスと85%以上の配列同一性を示す。
【０１９２】
4.  ヒト抗体
上記インテグリン又はラミニンに抗するヒト抗体が、下記の種々の技術によって提供される。特定のマウス抗体、例えば実施例に記載されたマウス・モノクローナルのうちの1つと同じエピトープ特異性を有するように、幾つかのヒト抗体が競合的結合試験などによって選択される。イムノゲンとしてインテグリン又はラミニンのフラグメントだけを使用することにより、且つ/又は、インテグリンの欠損変異体集合に抗する抗体をスクリーニングすることにより、特定のエピトープ特異性に関してヒト抗体をスクリーニングすることもできる。
【０１９３】
a.  トリオーマ法
基本的なアプローチ、及びこのアプローチにおいて使用するための例示的な細胞融合パートナーSPAZ-4は、Oestberg他、Hybridoma, 2:361-67(1983);Oestberg,米国特許第4,634,664号明細書；及びEngleman他、米国特許第4,634,666号明細書（これらの各明細書全体をあらゆる目的で参考にするため、本明細書に引用する）によって記載されている。この方法によって得られた抗体生成細胞系統はトリオーマと呼ばれる。なぜならば、これらの細胞系統は、3つの細胞、すなわち2つのヒト細胞及び1つのマウス細胞に由来するからである。最初に、マウス骨髄腫株をヒトB-リンパ球と融合することにより、非抗体を生成する異種ハイブリッド細胞、例えばOestberg(前出)によって記載されたSPAZ-4細胞系統を得る。次いで異種細胞を、免疫化ヒトB-リンパ球と融合することにより、抗体生成トリオーマ細胞系統を得る。トリオーマは、ヒト細胞から形成される普通のハイブリドーマよりも安定的に抗体を生成することが判っている。
【０１９４】
免疫化Bリンパ球をヒト・ドナーの血液、脾臓、リンパ節、又は骨髄から得る。特異的な抗原又はエピトープに抗する抗体が所望される場合には、免疫化に際してその抗原又はそのエピトープを使用することが好ましい、免疫化はin vivo又はin vitroで行うことができる。in vivoでの免疫化に際しては、Aβ、そのフラグメント、Aβ又はフラグメントを含有する大型ポリペプチド、又はAに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体で免疫化されたヒトからB細胞を分離するのが典型的である。幾つかの方法において、B細胞は、最終的に抗体治療を受けることになっている同一患者から分離される。in vitro免疫化の場合、10%ヒト血漿が補足された培地、例えばRPMI-1640(Engleman,前出参照）中で7〜14日間にわたって抗原にB-リンパ球を暴露するのが典型的である。
【０１９５】
免疫化されたB-リンパ球を、異種ハイブリッド細胞、例えばSPAZ-4に、良く知られた方法によって融合する。例えば、細胞を約37℃で約5〜10分間にわたってMW1000-4000の40〜50%ポリエチレングリコールで処理する。融合混合物から細胞を分離し、これらの細胞を、所望のハイブリッドに関して選択的な培地(例えばヒポキサンチン＋アメトプテリン＋チミジン(HAT培地)又はアメトプテリン＋ヒポキサンチン(AH培地) を含有する)において増殖する。所要の結合特異性を有する抗体を分泌するクローンを、Aβ又はそのフラグメントに対する結合能力に関してトリオーマ培地をアッセイすることにより同定する。所期の特異性を有するヒト抗体を生成するトリオーマを、限界希釈技術によりサブクローニングし、そして培地中でin vitroで成長させる。こうして得られたトリオーマ細胞系統を、次いでAβ又はそのフラグメントに対する結合能力に関して試験する。
【０１９６】
トリオーマは遺伝学的には安定性を有するものの、極めて高レベルで抗体を生成することはない。トリオーマから1又は2以上の発現ベクター中に抗体遺伝子をクローニングし、そしてベクターを標準的な哺乳動物、細菌又は酵母細胞系統中に形質転換することにより、発現レベルを増大させることができる。
【０１９７】
b.  形質転換非ヒト哺乳動物
ヒト免疫グロブリン座の少なくとも1セグメントをコード化する導入遺伝子を有する非ヒト形質転換哺乳動物から、インテグリン又はラミニンに抗するヒト抗体を生成することもできる。通常、このような形質転換哺乳動物の内生的な免疫グロブリン座は機能的に不活性化される。好ましくはヒト免疫グロブリン座のセグメントは、重鎖及び軽鎖成分から成る非リアレンジ配列を含む。内生的な免疫グロブリン遺伝子の不活性化及び外生的な免疫グロブリン遺伝子の導入の両方は、標的相同的組換えによって、又は酵母人工染色体(YAC)の導入によって達成することができる。このプロセスから生じた形質転換哺乳動物は、免疫グロブリン成分配列を機能的にリアレンジさせ、そしてヒト免疫グロブリン遺伝子によってコード化された種々のイソタイプの抗体のレパートリーを発現させることができ、しかもこの場合、内生的な免疫グロブリン遺伝子を発現させることはない。これらの特性を有する哺乳動物の生成及び特性は、例えばLonberg他、国際公開第93/12227号(1993)パンフレット；米国特許第5,877,397号、同第5,874,299号、同第5,814,318号、同第5,789,650号、同第5,770,429号、同第5,661,016号、同第5,633,425号、同第5,625,126号、同第5,569,825号、同第5,545,806号の各明細書、Nature 148, 1547-53(1994), Fishwild他、Nature Biotechnology, 14,845-51(1996), kucherlapati, 国際公開第91/10741(1991)（これらの各文献全体をあらゆる目的で参考にするため、本明細書中に引用する）によって詳細に記載されている。形質転換マウスが特に好適である。Lonberg又はKucherlapati(前出)によって記載されているような形質転換非ヒト哺乳動物を、インテグリン又はサブユニット又はそのフラグメントで免疫化することにより、抗インテグリン又は抗ラミニン抗体が得られる。例えばコンベンショナルなKohler-Milstein技術を用いて好適な骨髄腫細胞系統に、このような哺乳動物に由来するB-細胞を融合することにより、モノクローナル抗体が調製される。免疫原性作用物質で免疫化されたヒトから、ヒト・ポリクローナル抗体を血清の形で提供することもできる。任意には、このようなポリクローナル抗体は、インテグリン又はラミニンを親和性試薬として使用して、アフィニティ精製によって濃縮することができる。
【０１９８】
c.  ファージ表示法
ヒト抗インテグリン又は抗ラミニン抗体を得るための別のアプローチは、Huse他、Science, 246:1275-81(1989)によって概要を説明された一般的なプロトコルに従ってヒトB細胞からDNAライブラリをスクリーニングすることである。トリオーマ法に関して説明されているように、このようなB細胞は、インテグリン、サブユニット又はそのフラグメント、又はラミニン及びそのフラグメントで免疫化されたヒトから得ることができる。任意には、このようなC細胞は、最終的に抗体治療を受けることになっている患者から得られる。当該抗原又はそのフラグメントに結合する抗体が選択される。このような抗体（又は結合フラグメント）をコード化する配列は次いでクローニング又は増幅される。Huseによって記述されたプロトコルは、ファージ表示技術との組み合わせにおいてより効率的になる。例えばDower他、国際公開第91/17271号パンフレット及びMcCafferty他、国際公開第92/01047号パンフレット、米国特許第5,877,218号、同第5,871,907号、同第5,858,657号、同第5,837,242号、同第5,733,743号、同第5,565,332号、同第5,969,108号、同第6,172,197号の各明細書(これらの各文献全体をあらゆる目的で参考にするため、本明細書中に引用する）参照。蛋白質、又は特定のリガンドに結合するその他の蛋白質を選択して標識付けするための付加的な方法は、米国特許第5,994,519号明細書及び同第6,180,336号明細書に記載されている。
【０１９９】
ファージ表示法において、外面上の種々異なる抗体を表示する員を含むファージ・ライブラリが生成される。抗体は通常Fv又はFabフラグメントとして表示される。所期の特性を有するファージ表示抗体は、インテグリン、サブユニット又はそのフラグメントに対する親和力富化によって選択される。
【０２００】
ファージ表示法に変更を加えて、選択されたマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体を生成することができる。Winter,国際公開第92/20791号パンフレット参照。この方法において、選択されたマウス抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域が出発材料として使用される。例えば、軽鎖可変領域が出発材料として選択される場合、同じ軽鎖可変領域（すなわちマウス出発材料）と、異なる重鎖可変領域とを表示する員を有するファージ・ライブラリが構成される。重鎖可変領域は、リアレンジされたヒト重鎖可変領域のライブラリから得られる。Aβ(例えば約108M-1以上又は109M-1)に対して強い特異的結合を示すファージが選択される。このファージに由来するヒト重鎖可変領域は、更なるファージ・ライブラリを構成するための出発材料として作用する。このようなライブラリにおいて、各ファージは、同じ重鎖可変領域（すなわち第1の表示ライブラリから同定された領域）と、異なる軽鎖可変領域とを表示する。軽鎖可変領域はリアレンジされたヒト可変軽鎖領域のライブラリから得られる。やはりこの場合にも、所期のインテグリンに対して強い特異的結合を示すファージが選択される。これらのファージは、完全にヒトの抗インテグリン抗体の可変領域を表示する。これらの抗体は通常の場合、マウス出発材料と同じ又は類似のエピトープ特異性を有する。
【０２０１】
5.  定常領域の選択
キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体の重鎖及び軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部にリンクすることができる。定常領域の選択は、部分的には、抗体依存性補体が所望されるか、且つ/又は、細胞性毒性が所望されるかに応じて行われる。例えばイソタイプIgG1及びIgG3は補体活性を有し、イソタイプIgG2及びIgG4はこれを有さない。イソタイプの選択は、脳内への抗体の通過にも影響を与え得る。軽鎖定常領域はラムダ又はカッパであってよい。抗体は、2つの軽鎖及び2つの重鎖を含有する四量体として、別個の重鎖、軽鎖として、Fab, Fab', F(ab')2, 及びFvとして、又は、スペーサを介してリンクされた重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む単鎖抗体として、発現させることができる。
【０２０２】
6.  組換え抗体の発現
キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体は、組換え発現によって生成されるのが典型的である。組換えポリヌクレオチド構造は、典型的には発現制御配列を含む。発現制御配列は、自然会合プロモータ領域又は異種プロモータ領域を含む、抗体鎖のコード配列に作用連関されている。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすることができるベクター内の真核細胞プロモータ系である。ベクターが適正な宿主中に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現及び交差反応抗体の捕集及び精製に適した条件下に維持される。
【０２０３】
これらの発現ベクターは宿主生物中で、エピソームとして、又は宿主染色体DNAの一体部分として複製するのが典型的である。一般的に、発現ベクターは選択マーカー、例えばアンピシリン耐性又はヒグロマイシン耐性を含有することができ、これにより、所期のDNA配列で形質転換されたこれらの細胞の検出が可能になる。
【０２０４】
Escherichia coliは、本発明のDNA配列をクローニングするのに特に有用な1原核宿主である。微生物、例えば酵母も発現に有用である。Saccharomycesは好ましい酵母宿主であり、この場合好適なベクターは所望の通り、発現制御配列、複製起源、及び末端配列などを有する。典型的なプロモータは、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ・プロモータ、及びその他の解糖酵素由来のプロモータを含む。誘発性酵母プロモータは、中でも、アルコール脱水素酵素、イソシトクロムC、及びマルトース及びガラクトースの活用に寄与する酵素に由来するプロモータを含む。
【０２０５】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリン又はそのフラグメントをコード化するヌクレオチド・セグメントを発現させるための好ましい宿主である。Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NT, 1987)参照。無傷の異種蛋白質を分泌することができる好適な多数の宿主細胞系統が当業者において開発されており、これらはCHO細胞系統、種々のCOS細胞系統、HeLa細胞、L細胞及び骨髄腫細胞系統を含む。好ましくは、これらの細胞は非ヒト細胞である。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起源、プロモータ、エンハンサー(Queen他、Immunol. Rev., 89:49-68(1986))、及び所要のプロセッシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネータ配列を含むことができる。好ましい発現制御配列は、内生的な遺伝子、サイトメガロウィルス、SV40、アデノウィルス及びウシ乳頭腫ウィルス等に由来するプロモータである。Co他、J.Immunol. 148:1149-54(1992)参照。
【０２０６】
或いは、形質転換動物のゲノム中に導入し、続いて形質転換動物乳中に発現させるために、抗体コード配列を導入遺伝子中に組み込むこともできる(米国特許第5,741,957号、同第5,304,489号、同第5,849,992号の各明細書）。好適な導入遺伝子は、乳腺特異的遺伝子、例えばカゼイン又はベータ・ラクトグロブリンに由来するプロモータ及びエンハンサーと作用連関された軽鎖及び/又は重鎖のコード配列を含む。
【０２０７】
当該DNAセグメントを含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて、良く知られた方法によって宿主細胞に移すことができる。例えば、原核細胞の場合には塩化カルシウム・トランスフェクションが一般に利用され、これに対して、その他の細胞宿主の場合には、リン酸カルシウム処理、エレクトポレーション、リポフェクション、バイオリスティクス、又はウィルス性トランスフェクションを利用することができる。哺乳動物細胞を形質転換するために用いられるその他の方法は、ポリブレン、原形質融合、リポソーム及びマイクロインジェクションを含む。形質転換動物を生成する際には、導入遺伝子を受精卵母細胞中にマイクロインジェクトし、或いは胚幹細胞のゲノム中に組込み、そしてこのような細胞の核を除核卵母細胞中に移すことができる。
【０２０８】
抗体は発現させられると、HPLC精製、カラム・クロマトグラフィ及びゲル泳動法などを含む、当業者に良く知られた標準的な手順に従って精製することができる(概略的には、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)参照)。
【０２０９】
B.  その他の作用物質
作用物質は天然発生型分子又は合成分子であってよい。スクリーニングされるべき作用物質は天然源、例えば海洋微生物、藻、植物及び菌類から得ることもできる。例えば米国特許第6,096,707号明細書には、ハララギン由来ペプチド、ピットバイパーBothrops jararaca由来のメタロプロテイナーゼが記載されている。これらのペプチドは、アミノ酸モチーフArg-Lys-Lys(RKK)を含有し、そして、ヒトα2β1インテグリンとコラーゲンとの相互作用を減少させる。或いは、スクリーニングされるべき作用物質は、ペプチド又は小分子を含む作用物質の組み合わせライブラリ、又は、例えば化学、製薬、環境、農業、海洋、美容用製薬、薬剤及びバイオテクノロジーの業界において合成された化合物の既存のレパートリーから得ることができる。作用物質は、例えば医薬品、治療薬、環境用、農業用又は工業用作用物質、汚染物質、美容用薬品、薬剤、有機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗体、ペプチド、蛋白質、糖、炭水化物及びキメラ分子を含むことができる。
【０２１０】
ペプチド・ライブラリを生成するには種々の方法が利用可能である(例えばLam他、Nature, 354:92, 1991及び国際公開第92/00091号パンフレット；Geyse他、J. Immunol. Meth.,102:259(1987); Houghten他、Nature, 354:84(1991);国際公開第92/09300号パンフレット；及びLebl他、Int. J. Pept. Prot. Res., 41:201(1993)参照）参照)。ファージ表示法によってペプチド・ライブラリを生成することができる。例えばDevlin,国際公開第91/18980号パンフレット参照。
【０２１１】
ステップ・バイ・ステップ状に合成することができる多くのタイプの化合物に関しては、組み合わせライブラリを生成することができる(例えばEllman及びBunin, J. Amer. Chem. Soc., 114:10997, 1992(ベンゾジアゼピン鋳型)、国際公開第95/32184号パンフレット(オキサゾロン及びアミニジン鋳型)、国際公開第95/30642号パンフレット(ジヒドロベンゾピラン鋳型)、及び国際公開第95/35278号パンフレット(ピロリジン鋳型)参照）。化合物ライブラリは通常、固相化学反応によって合成される。しかし、溶液相ライブラリ合成が有用な場合もある。組み合わせ合成の戦略が、Dolle及びNelson, J. Combinatorial Chemistry, 1:235-282(1999)(この文献の全体をあらゆる目的で参考にするために引用する)によって記載されている。合成は典型的にはサイクル状に実施されるとともに、異なるモノマー又はその他の成分が各合成ラウンドで添加される。初期プールを連続的に断片化することにより、幾つかの方法が実施される。例えば、第1合成ラウンドが全ての支持体上で実施される。次いで、これらの支持体を分割して2つのプールにし、別個の合成反応が各プール上で実施される。次いでこれら2つのプールはさらに分割され、それぞれのプールがさらに2つに分割され、これがさらに続けられる。その他の方法はスプリット及び再プールの両方を採用する。例えば、初期合成ラウンド後、化合物プールは第2ラウンドにおける別個の合成のために分割されて2つになる。その後、別個のプールから得られたアリコートが第3合成ラウンドのために組換えられる。分割・プール法の結果、混合化合物のプールが得られる。これらの方法は、以下により詳しく説明するように特にタグ付けに対して敏感である。このような方法によって生成されるライブラリのサイズは、2〜106又は1010種の異なる化合物であり、又はこれらの間の任意の範囲で変化する。
【０２１２】
Needels他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:10700(1993); Ni他、J. Med. Chem., 39:1601(1996),国際公開第95/12608号、同第93/06121号、同第94/08051号、同第95/35503号及び同第95/30642号の各パンフレット（各文献全体をあらゆる目的で参考にするため本明細書中に引用する）を含む種々の刊行物には、コード化ライブラリの調製が記載されている。コード化ライブラリ合成法は典型的には、ランダムな組換えアプローチ及びモノマー単位の化学的及び/又は酵素的集成を伴う。例えば、この方法は典型的には：(a)複数の反応器の間で複数の固形支持体を割り当てる工程と；(b)それぞれ異なる反応器内の第1モノマーと第1タグとの種々異なる組み合わせを用いて、各反応器内の支持体に第1モノマー及び第1タグをカップリングする工程と；(c)支持体をプールする工程と；(d)複数の反応器の間で支持体を割り当てる工程と；(e)それぞれ異なる反応器内の第2モノマーと第2タグとの種々異なる組み合わせを用いて、第1モノマーに第2モノマーをカップリングし、そして固形支持体又は第1タグに第2タグをカップリングするステップと；そして任意には、種々異なるタグ及び種々異なるモノマーによるカップリング・割り当て工程を1〜20回以上繰り返すステップ、とを含む。セットされるモノマーは工程毎に拡張又は縮小させることができ；或いは、セットされるモノマーは次の工程で完全に変化させることもできる（例えば1工程ではアミノ酸、別の工程ではヌクレオシド、さらに別の工程では炭水化物）。ペプチド合成のためのモノマー単位は、例えば、単アミノ酸又は大型ペプチド単位、又はその両方を含むことができる。
【０２１３】
このような方法によって合成可能な化合物は、ポリペプチド、βターン模倣体、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN置換型グリシン及びオリゴカルバメートを含む。調製済組み合わせライブラリは、商業的供給元(例えばChemRx, South San Francisco, CA)からも入手可能である。
【０２１４】
組み合わせライブラリ及びその他の化合物は、α2β1、α6β1及びαvβ1インテグリンに結合するか、又はラミニンに結合するキャパシティを決定することにより、好適性に関して最初にスクリーニングする。上述の付加的なスクリーニング手順を用いることもできる。
【０２１５】
C.  遺伝子抑制物質
遺伝子発現を抑制する作用物質を用いて、インテグリン・サブユニットβ1、α2、α6又はαvをコード化する遺伝子の発現を抑制することができる。アンチセンス作用物質を使用して、これらに対する特定リガンド、例えばラミニンの発現を抑制することもできる。ラミニン発現の抑制は、ラミニンに抗する抗体による処理と同様の効果を達成することができる。標的細胞又は患者に対して本発明のアンチセンス試薬が投与される結果、上記インテグリン遺伝子又はそのリガンドのうちの1つの活性が低減される。アンチセンス・ポリヌクレオチドに関連する一般的な方法に関しては、例えばAntisense RNA and DNA (1988), D.A. Melton編、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)；Dagle他、Nucleic Acids Research, 19:1805(1991); Uhlmann他、Chem. Reviews, 90:543-584(1990)を参照されたい。リボザイムは、遺伝子発現を抑制することができるもう1つのアンチセンス作用物質である。
【０２１６】
センスmRNAに結合してその翻訳を妨害するか、mRNAをヌクレアーゼ消化に対して敏感にさせるか、転写を妨害するか、RNA前駆物質のプロセッシング又は局在化を妨害するか、mRNAの転写を抑制するか、又は他の何らかのメカニズムを介して作用することにより、アンチセンス・オリゴヌクレオチドが抑制を引き起こすことができる。アンチセンス分子が発現を低減する特定のメカニズムは重大ではない。
【０２１７】
典型的には、アンチセンス・ポリヌクレオチドは、最小7〜10、典型的には最小7〜20以上のヌクレオチドから成るアンチセンス配列を含む。これらのヌクレオチドは、遺伝子のmRNAに由来する配列と特異的にハイブリッド形成する。幾つかのアンチセンス・ポリヌクレオチドは約10〜約50のヌクレオチド長であるか、又は約14〜約35のヌクレオチド長である。いくつかのアンチセンス・ポリヌクレオチドは、約100未満のヌクレオチド又は約200未満のヌクレオチドから成るポリヌクレオチドである。一般に、このアンチセンス・ポリヌクレオチドは、安定的なデュプレックスを形成するのに十分に長いが、しかし、所望の場合には、送達様式に応じて、in vivoで投与するのに十分に短くあるべきである。標的配列との特異的ハイブリッド形成に必要なポリヌクレオチドの最小長さは、いくつかの因子、例えば数ある因子の中で、G/C含量、(もしあるならば)ミスマッチ塩基の位置、標的ポリヌクレオチド個体群に対する配列の違い全体、及びポリヌクレオチドの化学的性質（例えばメチルホスホネート主鎖、ペプチド核酸、ホスホロチオエート)に依存する。
【０２１８】
相補核酸分子をハイブリッド形成するのに適した条件は当業者に良く知られている。例えば典型的な高緊縮条件下でのハイブリッド形成を、5x SSPE, 5x Denhart溶液、0.5% SDS(w/v)及び100μm/mlサケ精子DNAを含有する混合物中で実施することができる。DNAを、特定の時間にわたって約68℃でハイブリッド形成させておく。典型的には膜又はフィルタに結合された、ハイブリッド形成されたDNAを、次いで、2x SSPE, 0.1%SDS(w/v)中で10分間にわたって室温で2回洗浄した。次いで、膜(又はフィルタ)を1x SSPE, 0.1%SDS(w/v)の溶液中に15分間にわたって68℃で浸漬し、最後に1x SSPE, 0.1%SDS(w/v)の溶液中に15分間にわたって68℃で浸漬した。
【０２１９】
特異的にハイブリッド形成を保証するために、アンチセンス配列は、標的mRNA又はこの標的mRNAをコード化する遺伝子に対して少なくとも実質的に相補的である。いくつかのアンチセンス配列は、これらの所期の標的配列に対して正確に相補的である。しかしアンチセンス・ポリヌクレオチドは、RNA又はその遺伝子に対応する当該標的配列に対する特異的結合がポリヌクレオチドの機能特性として維持される限り、ヌクレオチド置換、添加、削除、トランジション、トランスポジション、又は修飾、又はその他の核酸配列又は非核酸分を含むこともできる。
【０２２０】
幾つかのアンチセンス配列は、比較的アクセスされ易いmRNA配列(二次構造が相対的に欠けている）に対して相補的である。このことは、例えばMFOLDプログラム(Genetics Computer Group, Madison WI)を使用して予期されるRNA二次構造を分析し、そして当業者に良く知られているようにin vitro又はin vivoで試験することにより見極めることができる。効果的なアンチセンス組成物を認識するための別の有用な方法は、オリゴヌクレオチドの組み合わせアレイを使用する(例えばMilner他、Nature Biotechnology, 15:537(1997)参照）。
【０２２１】
遺伝子発現を阻害する1つの技術は、抑制性RNA(RNAi)とも呼ばれる二本鎖RNAの、細胞内への導入を伴う。RNAiは、二重鎖RNA分子を形成するために互いにアニールされたRNA（センス鎖及びアンチセンス鎖）の2本の相補鎖を含む。RNAiは、典型的には、阻害の標的にされている遺伝子のエキソン又はコード配列に由来する。RNAiは、RNAi分子の配列に対して相補的なmRNAの破壊を招く。RNAi及び生体におけるこれらの使用の例が、例えばFire他、Nature, 391:806-811(1998);Nykanen他、Cell, 107:309-321(2001);及び国際公開第01/29058号、同第01/75164号、同第99/32619号の各パンフレットによって記載されている。幾つかの方法において、RNAiは約100bp〜1000bp、例えば約100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000又はこれよりも多い塩基対である。幾つかの方法において、RNAiはエキソンに由来する。その他の方法において、RNAiはイントロン又は信号配列に由来する。
【０２２２】
いくつかの方法において、アンチセンス・ポリヌクレオチドは、アンチセンス配列を発現させるプロモータ及びその他の調節配列を含む、アンチセンス配列に加えた配列を有する。プロモータ、及び好ましくは終止信号及びポリアデニル化信号が適正に配置されるのであれば、非コーティング鎖に対応する、挿入された配列の鎖は転写され、そしてアンチセンス・オリゴヌクレオチドとして作用する。いくつかの方法において、ポリヌクレオチドは主として、アンチセンス配列から成るか、或いはアンチセンス配列である。任意の好適な核酸生成法、例えば化学合成及び本明細書中に開示された組換え法を用いて、アンチセンス核酸(DNA、RNA、修飾された核酸及び類似体など)を形成することができる。例えば、de novo化学合成又はクローニングによって、アンチセンスRNA分子を調製することができる。
【０２２３】
アンチセンス・ポリヌクレオチドの代わりに、又はアンチセンス・ポリヌクレオチドに加えて、β1、α2、α6又はαvインテグリン・サブユニットをコード化する遺伝子の発現を抑制するために、亜鉛フィンガー蛋白質を使用することができる。これらのインテグリン・サブユニットの特定のリガンド、例えばラミニンの発現を抑制するために、亜鉛フィンガー蛋白質を使用することもできる。それ自体を本発明の方法において作用物質として使用できるその他のリガンド、例えばフィブロネクチンの発現を活性化又は向上させるために、亜鉛フィンガー蛋白質を使用することもできる。標的遺伝子内部の任意の所期標的部位に結合するために、亜鉛フィンガー蛋白質を工学的に製造するか、又は選択することができる。いくつかの方法において、標的部位はプロモータ又はエンハンサーの内部にある。その他の方法において、標的部位は構造遺伝子内部にある。幾つかの方法において、亜鉛フィンガー蛋白質は、転写リプレッサー、例えばヒトKOX-1蛋白質由来のKRAB抑制ドメイン(Thiesen他、New Biologist, 2, 363-374(1990);Margolin他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 4509-4513(1994);Pengue他、Nucl. Acids Res., 22:2908-2914(1994); Witzgall他、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 4514-4518(1994)にリンクされる。活性化を達成するための好ましいドメインは、HSV VP16活性化ドメイン(例えばHagmann他、J.Virol., 71:5952-5962(1997)参照)、核ホルモン受容体(例えばTorchia他、Curr. Opin. Cell. Biol., 10:373-383(1998)参照)；核因子カッパBのp65因子(Bitko & Barik, J. Virol., 72:5610-5618(1998)及びDoyle & Hunt, Neuroreport, 8:2937-2942(1997));(Liu他、Cancer Gene Ther., 5:3-28(1998))、又は人工的なキメラ機能ドメイン、例えばVP64(Seifpal他、EMBO J., 11;4961-4968(1992))を含む。亜鉛フィンガー蛋白質によるターゲッティングに適した標的部位の選択法、及び、選択された標的部位に結合するように亜鉛フィンガー蛋白質を構成する方法が、国際公開第00/00388号パンフレットに記載されている。ファージ表示を用いて標的に結合するように亜鉛フィンガー蛋白質を選択する方法が欧州特許出願公開第95908614号明細書によって記載されている。内生的な遺伝子を調節するための亜鉛フィンガー蛋白質の使用方法は、国際公開第00/00409号パンフレットに記載されている。蛋白質、又は、亜鉛フィンガーをコード化して好適な調節の配列を有する核酸の形で投与することができる。
【０２２４】
D.  治療薬をコード化する核酸
抗体鎖又は抗体ペプチドをコード化する核酸の形で、抗体又はその他のペプチド試薬を投与することができる。このような核酸は典型的に、調節要素、例えばプロモータ又はエンハンサーにリンクされる。これらの要素は、患者の所期標的細胞におけるDNAセグメントの発現を可能にする。軽鎖又は重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来するプロモータ及びエンハンサー要素、又は、サイトメガロウィルす(CMV)主要中間体早期プロメータ及びエンハンサーが、直接的な発現に適している。幾つかの方法において、脳内の発現を引き起こすプロモータが使用される。プロモータ、例えば血小板由来増殖因子(PDGF)、プリオン、又は神経エノラーゼ・プロモータが好適である。
【０２２５】
リンクされた調節要素及びコード配列はしばしばベクター内にクローニングされる。二重鎖抗体の投与の際には、2本の鎖を同じ又は別個のベクター内にクローニングすることができる。
【０２２６】
レトロウィルス系(例えばLawrie及びTumin, Curr. Opin. Genet. Develop., 2:102-109(1993)参照);アデノウィルス・ベクター(例えばBett他、J.Virol., 67:5911(1993)参照);アデノ随伴ウィルス・ベクター(例えばZhou他、J.Exp.Med., 179:1867-75(1994))、ワクシニア・ウィルス及び禽痘ウィルスを含むポックス群に由来するウィルス・ベクター、アルファ・ウィルス遺伝子由来ウィルス・ベクター、例えばシンドビス・ウィルス及びセムリキ森林熱ウィルスに由来するウィルス(例えば、Dubensky他、J.Virol., 70:508-19(1996))、ベネズエラウマ脳炎ウィルス(米国特許第5,643,576号明細書)、ラブドウィルス、例えば水疱性口内炎ウィルス(国際公開第96/34625号パンフレット参照)、及び乳頭腫ウィルス(Ohe他、Human Gene Therapy, 6:325-33(1995);Woo他、国際公開第94/12629号パンフレット；及びXiao 及びBrandsma, Nucleic Acids. Res., 24:2630-22(1996))を含む、多数のウィルスベクター系が利用可能である。
【０２２７】
DNAはリポソーム内にパッケージングすることができる。好適な脂質及び関連同族体が、米国特許第5,208,036号、同第5,264,618号、同第5,279,833号及び同第5,283,185号の各明細書に記載されている。ベクター、及び、イムノゲンをコード化するDNAを、粒子状キャリヤに吸着させ、又は会合させることもできる。これらのキャリヤの例は、ポリメチルメタクリレート・ポリマー、ポリラクチド及びポリ(ラクチド-コ-グリコリド)を含む。
【０２２８】
個々の患者に投与することにより、典型的には全身投与(例えば静脈内、腹腔内、鼻腔、胃、皮内、筋内、くも膜下、皮下又は頭蓋内輸液)又は局所適用によって、遺伝子治療ベクター又はネイクドDNAをin vivoで送達することができる(例えば米国特許第5,399,346号明細書参照)。このようなベクターはさらに、促進剤、例えばブピバカイン(米国特許第5,593,970号明細書)を含むことができる。遺伝子銃を使用して、DNAを投与することもできる。Xiao及びBrandsma(前出)参照。DNAは、微細な金属ビードの表面上に沈澱させられる。ミクロプロジェクタイルは衝撃波又は膨張ヘリウムガスで加速させられ、組織を幾つかの細胞層の深さに貫通する。例えば、Agacetus, Inc., Middleton, WIによって製造されたAccel(登録商標)Gene Delivery Deviceが好適である。或いは、化学的又は機械的な刺激で皮膚上にDNAをスポット付けするだけで、ネイクドDNAは皮膚を通過して血流中に達することができる(国際公開第95/05853号パンフレット参照)。
【０２２９】
更なる実施態様の場合、ex vivoの細胞、例えば個々の患者から外植された細胞(例えばリンパ球、骨髄吸引物、生検組織)、又は、普遍ドナーの造血幹細胞に核酸を送達し、続いて、普通はベクターを組込んだ細胞を選択した後、細胞を患者に再移植することができる。
【０２３０】
IV.  治療に反応し易い患者
本発明の方法は、アミロイド蛋白質沈着物、例えばアミリン又はAβペプチドの存在を特徴とする幾つかのアミロイド発生疾患及びアミロイド発生状態の予防又は治療に有用である。このような疾患はアルツハイマー病、ダウン症候群及び認知障害、II型糖尿病、パーキンソン病、アミロイドーシス、例えば遺伝性又は全身性アミロイドーシス、及び全体的及び部分的にプリオン感染によって引き起こされる疾患を含む。
【０２３１】
治療に反応し易い患者は、疾患のおそれはあるが、しかし症状を示してはいない個体、並びに、現在症状を示している患者を含む。アルツハイマー病の場合、長寿であるならば、事実上誰もがアルツハイマー病に罹るおそれがある。本発明の方法は、アルツハイマー病の周知の遺伝学的リスクを有する個体にとって特に有用である。このような個体は、この疾患を患ったことのある親類を持ち、遺伝子マーカー又は生化学マーカーの分析によって見極められるリスクを有するような個体である。アルツハイマー病に対するリスクの遺伝子マーカーは、APP遺伝子における突然変異、例えばHardy突然変異と呼ばれる位置717における突然変異、及びSwedish突然変異と呼ばれる位置670及び671における突然変異を含む(Hardy, TINS(前出))。リスクのその他のマーカーは、プレセニリン遺伝子PS1及びPS2、及びApoE4における突然変異、ADの家系、高コレステロール血、動脈硬化である。現在アルツハイマー病に罹患している個体は、特徴的な痴呆、並びに上述のリスク因子の存在から認識することができる。さらに、ADの個体を同定するために、多数の診断試験が利用可能である。これらは、脳脊髄液(CSF)タウ及びAβ42レベルの測定を含む。タウの増加及びAβ42レベルの減少が、ADの存在を表す。アルツハイマー病に罹っている個体は、ADRDA基準によって診断することもできる。無症候患者の場合、治療は何歳（例えば約10歳、約20歳、約30歳)からでも始めることができる。しかし普通は、患者が約40歳、約50歳、約60歳、約70歳、約80歳又は約90歳に達するまで治療を始める必要はない。治療は典型的には、所定の時間にわたって複数回投与を伴う。ダウン症候群患者の場合には、治療薬を母親に投与することにより、治療を出生前に開始することができ、或いは、誕生後すぐに治療が始まってもよい。
【０２３２】
V．  治療計画
予防を目的とした用途の場合、製薬組成物又は医薬品は、アミロイド発生疾患が発生し易い患者、又はその他の形式でその発生リスクを有する患者に、リスクを排除又は低減し、重篤な状態を軽減し、又は、疾患の開始を遅らせるのに十分な量で投与される。この疾患は、疾患の生化学的、組織学的及び/又は行動上の症状、疾患の発生中に生じるその合併症及び中間病理学的表現型を含む。
【０２３３】
治療を目的とした用途の場合、組成物又は医薬品は、このような疾患が疑われる患者、又は既にこのような疾患に罹っている患者に、この疾患の症状（生化学的、組織学的及び/又は行動上の症状)を治療するか、又は少なくとも部分的に制止するのに十分な量で投与される。この症状は、その合併症及び中間病理学的表現型を含む。治療又は予防を達成するのに十分な量が、治療上又は予防上有効な用量として定義される。治療計画の場合、作用物質は通常、疾患の症状が消えるか又は有意に減少するまで、所定のインターバルで投与される。任意には、投与を続けて再発を防止することができる。予防計画の場合、作用物質はやはり、普通は所定のインターバルで、例えば患者が死亡するときまで投与される。投与された作用物質のレベルをアッセイすることにより、又は患者の反応をモニターすることにより、治療をモニターすることができる。応答は、ADRDA基準、及び、患者の脳内のプラークを画像形成することによりモニターすることができる(国際公開第00/14810号パンフレット)。
【０２３４】
上記状態を治療するための本発明の組成物の有効量は、種々異なる多くの因子に応じて変化する。これらの因子は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与されるその他の薬剤、及び、治療が予防を目的としたものか、又は治療を目的としたものか、という因子を含む。通常、患者はヒトであり、形質転換哺乳動物を含むヒト以外の哺乳動物を治療することもできる。治療用量は、安全性及び効率を最適化するように滴定されるのが典型的である。
【０２３５】
抗体、ペプチド及び小分子の投与量は、宿主体重1kg当たり、約0.0001mg/kg〜約100mg/kg、より典型的には約0.01 mg/kg〜約20mg/kgの範囲にある。例えば、投与量は、約1mg/体重kg〜約20mg/体重kg、又は約1mg/kg〜約10mg/kgの範囲内にある。治療計画の一例は、2週間に1回ずつ、或いは、1か月毎に1回又は3〜6か月毎に1回ずつの投与を伴う。幾つかの方法において、異なる結合特異性を有する2,3又は4以上のモノクローナル抗体が同時に投与される。この場合、投与される各抗体の用量は、指示通りの範囲にある。例えば、幾つかの方法において、β1インテグリン、α2インテグリン、及びαvインテグリンのサブユニットのうち2種又は3種全てに対する抗体が同時に投与される。幾つかの方法において、α6インテグリン・サブユニットに対する抗体も投与される。抗体は複数回投与されるのが普通である。各単回投与間のインターバルは、週、月又は年単位であってよい。インターバルは、患者体内のインテグリンに対する抗体の血液レベルを測定することにより示されるように、不規則的であってもよい。幾つかの方法において、抗体の投与量は、約1〜約1000μg/mlの血漿抗体濃度を達成するように調節される。幾つかの方法においては、その濃度は約25〜約300μg/mlである。或いは、抗体は、徐放性製剤として投与することができ、この場合、所要の投与頻度はより少なくなる。投与量及び頻度は、患者体内の抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、これにヒト化抗体、キメラ抗体及び非ヒト抗体が続く。投与量と投与頻度は、その処置が予防目的であるか又は治療目的であるかに応じて変動することがある。予防目的の用途の場合、長時間にわたる比較的低頻度のインターバルで、比較的低用量が投与される。或る患者は、死亡時まで治療を受け続ける。治療目的の用途の場合、疾患の進行が低減又は終了するまで、また好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短いインターバルでの比較的高い投与量が必要となることがある。その後、患者に対しては予防計画を実施することができる。
【０２３６】
作用物質コード化核酸の投与量は、1患者当たり約10ng〜1ng、約100ng〜約100mg、約1μg〜約10mg、又は約30〜約300μg DNAの範囲にある。感染性ウィルス・ベクターの投与量は投与1回当たり、約10〜約100、又は約103、約104、約105、約106、約107、約108、約109又は約1010ビリオン以上であってよい。
【０２３７】
本発明の作用物質は、予防及び/又は治療のために、腸管外、局所、静脈内、経口、皮下、くも膜下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内又は筋内手段によって投与することができる。幾つかの方法の場合、作用物質は、沈着物が蓄積している特定組織内に直接的に、例えば頭蓋内で注射される。幾つかの方法において、抗体の投与のために、筋内注射又は静脈内輸液が採用される。幾つかの方法の場合、特定の治療用抗体が頭蓋内に直接的に注射される。幾つかの方法の場合、徐放性組成物又はMedipad(登録商標)機器のような機器として、抗体が投与される。
【０２３８】
本発明の作用物質は任意には、アミロイド発生疾患の治療に少なくとも部分的に有効なその他の作用物質との組み合わせで投与することができる。アミロイド沈着物が脳内に発生するアルツハイマー病及びダウン症候群の場合、本発明の作用物質は、血液脳関門を横切る本発明の作用物質の通過量を増大させるその他の作用物質との関連において投与することもできる。
【０２３９】
本発明の作用物質は、活性治療薬と、製薬上許容可能なその他の種々の成分とを含む組成物としてしばしば投与される。Remington's Pharmaceutical Science (第15版、Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980)参照。採用される具体的な配合は、所期の投与様式及び治療用途に依存する。組成物は、所期の配合に応じて、製薬上許容可能な非毒性キャリヤ又は希釈剤を含むこともできる。これらのキャリヤ又は希釈剤は、動物又はヒトへの投与のために製薬組成物を調製するために一般的に使用されるビヒクルと定義される。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に不都合な影響を与えないように選択される。このような希釈剤の一例としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及びハンク液が挙げられる。さらに、製薬組成物又は製薬配合物は、その他のキャリヤ、アジュバント、又は非毒性、非治療性、非免疫原性安定剤などを含むこともできる。
【０２４０】
製薬組成物は、大型の遅速代謝マクロ分子、例えば蛋白質、多糖類、例えばキトサン、ポリアクチン酸、ポリグリコール酸、コポリマー(例えば、ラテックスで機能化されたSepharose(登録商標)ビード、寒天及びセルロースなど)、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び脂質凝集体(例えば油滴又はリポソーム)を含むこともできる。
【０２４１】
腸管外投与の場合、本発明の作用物質は、注射可能な投与量の物質の溶液又は懸濁液として投与することができる。この溶液又は懸濁液は、無菌液、例えば水、油、食塩水、グリセロール又はエタノールであってよい製薬キャリヤを有する、生理学的に許容可能な希釈剤溶液又は希釈剤懸濁液である。ヒトへの投与のための腸管外組成物は無菌であり、実質的に等張性であり、GMP条件下で形成される。さらに、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤及びpH緩衝物質などが組成物中に存在していてよい。製薬組成物のその他の成分は、石油、動物、植物又は合成起源から成る組成物、例えば落花生油、大豆油、及び鉱物油である。一般に、グリコール、例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコールは、特に注射可能な溶液のための好ましい液状キャリヤである。抗体は、蓄積注射剤又はインプラント調製物の形で投与することができる。これらの注射剤又は調製物は、活性成分の徐放を可能にするように配合することができる。例示的な組成物は、水性緩衝液中で配合された5mg/mLのモノクローナル抗体を含む。この水性緩衝液は、50mM L-ヒスチジン（任意）、150mMのNaClを含有し、HClで好適なpHに調節されている。
【０２４２】
典型的には、組成物は、溶液又は懸濁液として、注射可能な組成物として調製され、注射前に液状ビヒクル中に溶解又は懸濁するのに適した固形形態を調製することもできる。この調製物は、上述のように、リポソーム又は微粒子、例えばポリアクチド、ポリグリコリド又はコポリマー中でアジュバント効果を向上させるために乳化又はカプセル化することもできる(Langer, Science, 249:1527-33(1990)及びHanes他、Advanced Drug Delivery Reviews, 28:97-119(1997))。本発明の作用物質は、蓄積注射剤又はインプラント調製物の形で投与することができる。これらの注射剤又は調製物は、活性成分の徐放又は脈動的な放出を可能にするように配合することができる。
【０２４３】
他の投与様式に適した付加的な配合物は、経口、鼻孔内及び肺投与用配合物、座剤、及び経皮投与用配合物を含む。座剤の場合、バインダー及びキャリヤは例えばポリアルキレングリコール及びトリグリセリドを含み、このような座剤は、約0.5%〜約10%の範囲、又は約1%〜約2%の範囲で活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口投与用配合物の一例としては、賦形剤、例えば製薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース及び炭酸マグネシウムが挙げられる。これらの組成物は典型的には、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性配合物、又は散剤の形態を成し、そして約10%〜約95%、又は約25%〜約70%の活性成分を含有する。
【０２４４】
典型的な使用により、経皮又は内皮送達をもたらすことができる。コレラ毒素又は解毒誘導体又はこれらのサブユニット又はその他の類似の細菌毒素と作用物質を同時投与することによって、局所投与を容易にすることができる(Glenn他、Nature, 391:851(1998)参照）。同時投与は、混合物として成分を使用することにより達成するか、或いは、化学架橋によって又は融合蛋白質として発現させることによって得られた結合分子として成分を使用することにより達成することができる。或いは、皮膚用パッチ剤を使用して、又は浸透導入剤を使用することにより、経皮送達を達成することができる(Paul他、Eur.J.Immunol., 25:3521-24(1995);Cevc他、Biochem. Biophys, Acta, 1368:201-15(1998))。
【実施例】
【０２４５】
実施例
【表１】
2005512955.tif 000002
【０２４６】
組織培養
150mMホウ酸ナトリウム(pH8.5)中のポリエチレンイミン(PEI)を組織培養皿に塗布し、一晩室温でインキュベートした。細胞を添加する前に、ウェルをPBSで洗浄し、細胞の平板培養の準備ができるまで、最小必須培地(10% FBS含有MEM)を添加した。ヒト胎児大脳皮質(E13-E16)をハンク平衡塩類溶液(HBSS)で濯いた。組織をHBSS中のDNAse 1mg中で粉砕した。この懸濁液は、100ミクロンのナイロン細胞ストレータを通して濾過し、250 x gで5分間にわたって回転させる。細胞をトリプシン中に再懸濁し、37℃で20分間でインキュベートした。改質最小必須培地(10% FBS及び1mgのDNaseを含有するMMEM)を添加し、細胞を最懸濁し、次いで、遠心分離によって再び捕集した。B27を含有するMMEM中に細胞を最懸濁し、96ウェル・プレートにおいて125,000個の細胞/ウェルで、又は、6ウェル・プレートにおいて2,500,000個の細胞/ウェルで、洗浄されたPEI塗布プレート内でこれらの細胞を平板培養した。ヒト皮質培地(HCC)を、処理前に隔週で培地交換しながら3週間にわたってインキュベートした。
【０２４７】
Aβ生成
二重蒸留水(ddH2O)をAβに添加することによりAβを生成し、これにより1mMストックを形成した。このストックを3日間にわたって37℃でエージングし、アリコートし、そして-20℃で凍結させた状態で保存した。DMSOをAβに添加することにより可溶性Aβを生成し、これにより7.5mMストックを形成した。30分間にわたって超音波処理を施し、アリコートし、-20℃で凍結した。ddH2OをAβに添加し、アリコートし、そして-20℃で凍結することにより、神経毒性Aβを生成した。
【０２４８】
HCCライゼートに由来するインテグリン免疫沈降
6ウェル・プレート内のHCCを、メチオニン非含有培地中の100μCi/mlの35S-メチオニンで一晩にわたって標識付けした。細胞を洗浄し、25mM Hepes, pH 7.5, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTAで溶解し、そして26ゲージ・ニードル中を3回通過させた。15,000rpmで15分間にわたって4℃で遠心分離することにより、不溶性材料を除去した。ライゼートを、蛋白質Aビーズにカップリングされたラビット抗マウス(RAM)抗体上でプレクリアし、インテグリン・サブユニット特異的抗体(β1に対応するLia 1/2、α1に対応するTS2/7、α2に対応するGi9、α3に対応するP1B5、α4に対応するAN100226m、α5に対応するAb0771、α6に対応するGoH3、α9に対応するY9A2、及びαvに対応するVNR147)で免疫沈降させた。免疫沈降物を、1 mlの25mM Hepes, pH 7.5, 1% Triton X-100 150mM NaCl, 0.5mM EDTA,及び0.5mM EGTAで、3回洗浄した。免疫沈降試料を、8%トリス-グリシン・ゲル(Novex)上で分離し、そして固定した。そしてゲル内の35S標識付け蛋白質をラジオオートグラフィによって視覚化した。
【０２４９】
Aβ免疫蛍光法
72時間にわたってAβで処理されたHCCを、4%パラホルムアルデヒドで固定し、5μg/ml抗Aβ-3D6-ビオチンで染色し、そして10μg/mlストレプトアビジン-FITC(Jackson)で視覚した。
【０２５０】
ヒト皮質ニューロンにおけるAβ神経毒性
グルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシン(基礎培地）を補足されたニューロン培地(MEM)中で、30分間にわたって抗体又はリガンドで、HCCを前処理した。基礎培地中の1μmのAβを1時間にわたって添加した。培地を除去し、そしてHCCを抗体又はリガンド及び基礎培地中の20μM可溶性Aβで、3日間にわたって処理した。3日後、基礎培地中の10%アラマー・ブルー中に2時間にわたってインキュベートすることにより、毒性を見極めた。蛍光レベルを対照に対して測定し、そしてAβで処理されたウェルを3部作成した。
【０２５１】
インテグリン・へテロ二量体の会合
N-2(Bottenstein N-2配合、例えば品番17502、Invitrogen Corp., Carlsbad, California)が補足されたMMEM培地中の、6ウェル・プレート内のHCCを、濡れた氷上に置き、PBSで洗浄し、25mM Hepes(pH 7.5)、1% Triton X-100, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTAで溶解し、そして26ゲージ・ニードル中を3回通過させた。15,000rpmで15分間にわたって4℃で遠心分離することにより、不溶性材料を除去した。ライゼートを蛋白質Aビーズ上でプレクリアし、抗β1インテグリン、Lia 1/2(Immunotech)、及びRAM/蛋白質Gビーズ(Pharmacia)を使用して、β1インテグリン免疫沈降させた。免疫沈降物を、1 mlの25mM Hepes, pH 7.5, 1% Triton X-100 150mM NaCl, 0.5mM EDTA,及び0.5mM EGTAで、3回洗浄した。免疫沈降試料を、4〜12%トリス-グリシン・ゲル(Novex)上で分離し、そして抗α2インテグリン(Chemiconから入手可能なAB 1936)又は抗αvインテグリン、MAB 1960(Chemicon)でウェスタン・ブロットした。
【０２５２】
パキシリン・リン酸化反応のAβ誘発
N-2が補足された基礎培地中の、6ウェル・プレート内のHCCに、0分〜24時間にわたって神経毒性Aβを添加した。HCCを、濡れた氷上に置き、PBSで洗浄し、25mM Hepes, pH 7.5, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 0.5mM EGTAで溶解し、そして26ゲージ・ニードル中を3回通過させた。15,000rpmで15分間にわたって4℃で遠心分離することにより、不溶性材料を除去した。ライゼートを蛋白質Aビーズ上でプレクリアし、それぞれ抗Fak(UBI)又は抗Pyk2抗体(UBI)及び蛋白質Aビーズを使用して、Fak又はPyk2免疫沈降させた。免疫沈降物を、1 mlの25mM Hepes, pH 7.5, 1% Triton X-100 150mM NaCl, 0.5mM EDTA,及び0.5mM EGTAで、3回洗浄した。免疫沈降試料を、8%トリス-グリシン・ゲル(Novex)上で分離し、そして抗ホスホチロシン(Transduction labsから入手可能なRC20)及び抗パキシリン(Transduction labs)でウェスタン・ブロットした。
【０２５３】
実施例1：ヒト皮質ニューロン上の免疫蛍光パターン
この実施例は、Aβプラークのin vitro組織培養モデルを生成する。これらのAβプラークは、アルツハイマー病(AD)において海馬ニューロン及び皮質ニューロン上に形成され、関連神経毒性を示す。このモデルは、ADに罹ったニューロンをできる限り厳密に表すために、初代ヒト皮質ニューロンAβを使用する。これらの培養にAβを添加すると、再現可能なAβ網状構造が生じる。Aβ網状構造はニューロン上に1〜3日間にわたって形成され、続いてこれらのニューロンに毒性を引き起こす。HCCなしでプレート上にインキュベートされたAβも、網状構造として着色されるが、しかし一貫してより均一なパターンを示し、HCC上に見られるよりも短く、薄く、そしてより直線的な延びを伴う。図1A及び図1Bは、HCCの存在及び不存在における網状構造を比較する。
【０２５４】
実施例2: β1インテグリンがAβ網状構造及び神経毒性を媒介する。
網状構造は、インテグリンにより形成されたものと同様に、細胞外マトリックスと似ているので、インテグリンがHCC中に存在しているかどうかを調査し、そしてもし存在しているならば、インテグリンがHCC上のAβ網状構造形成を容易にするかどうかを調査した。ゲル電気泳動法により、β1インテグリンがHCC中に発現させられることが判った。また、MAB1965を含むβ1インテグリン・ブロック抗体が、Aβ網状構造パターンがHCC上に形成されるのをブロックできることが判った（図2A(抗体なし)と図2B(抗体あり）とを比較のこと)。これらの培養中のAβによって発生する毒性にとって網状構造が必要か否かも調査した。これを試験するために、Aβ網状構造をブロックすることが判っているβ1インテグリン・ブロック抗体(AIIB2及びMAB1965)で、HCCをインキュベートした(図2C)。これらの抗体はまた、用量に応じて、Aβによって誘発された毒性をブロックした(図2C）。抗体AIIB2は、Aβ毒性の極めて強力なブロッカーであり、170ng/ml又は1nMのIC50を示す。これとは異なり、対照抗体は毒性に対して何の影響も与えなかった。
【０２５５】
実施例3: α2インテグリン及びαvインテグリンに結合する作用物質が、網状構造形成及びAβ媒介性神経毒性を阻害する。
β1インテグリンはαサブユニットと対を成して、種々異なるヘテロ二量体を形成することができる。従って、HCC中にどのαインテグリン・サブユニットが存在するかを試験した。HCC中には、α2、α3、α4、α5、α6及びαvインテグリンが発現させられた。α1インテグリン及びα9インテグリンはHCC中では発現させられなかった。これら全てのアルファ・インテグリン・サブユニットに抗する阻害抗体を、Aβ網状構造形成を阻害する能力、及びその神経毒性を阻害する能力に関して試験した。α2及びαvに対する阻害抗体はAβ網状構造形成を阻害した(図3A)。これらの抗体はまた、HCCにおけるAβの神経毒性効果を阻害した(図3B)。これらの特定のインテグリンに対する特異性を示すために、これらのインテグリンのそれぞれに対して、またその他のインテグリン・サブユニットに対しても、2〜3種の阻害抗体を試験した。網状構造形成及び神経毒性の両方を媒介するα1, α2及びαvインテグリンに対する極めて明白な特異性が見出された(表1)。
【０２５６】
【表２】
2005512955.tif 000003
【０２５７】
毒性に対する抗α6抗体の弱くはあるがしかし再現可能な効果が観察された。最後に、これらの効果がインテグリンに向けられるものであり、Aβ重合を非特異的には妨害していないことを確認するために、ヒト及びマウスの皮質培養においてAβ毒性を並行して分析した。これらのアッセイにおいて使用される抗体は、マウス皮質インテグリンと交差反応することはない。非ヒト・インテグリン抗体は、Aβ毒性をヒト培養中で阻害することできたが、しかしマウス培養中では阻害することはできなかった。このことは、抗体が毒性を阻害するためにAβと非特異的には相互作用していないことを示唆する。β1抗体でHCCライゼートを免疫沈降させ、次いでα2及びαvに対応する抗体で沈降物質をブロッティングすることにより、α2及びαvがHCC細胞中でβ1インテグリンと会合されることが確認された。これらの結果は、α2β1及びαvβ1のヘテロ二量体が、Aβ網状構造形成及び神経毒性の機能的メディエータであることを示す。
【０２５８】
実施例4:フィブロネクチン及び抗ラミニン抗体がAβ網状構造形成及び神経毒性を阻害する。
Aβ網状構造形成及び神経毒性の媒介への関与に関して、インテグリン/細胞外網状構造のその他の成分を調査した。これらのその他の成分は、αvβ1インテグリン・リガンド、フィブロネクチン及び超フィブロネクチン(網状構造を形成するフィブロネクチン・ドメインの多量体)、及びα2β1リガンド、コラーゲン及びラミニンを含んだ。ラミニンは2つの鎖β1及びγ1を有する。β1及びγ1は両方とも、アルツハイマー病プラークにおいて増大する(Murtomaki他、J.Neur. Res., 32:261-73(1992))。フィブロネクチン及び超フィブロネクチンは、Aβ網状構造形成及び神経毒性を阻害することができた(表1）。この結果は、αvβ1機能に影響を及ぼすことを巡ってAβと競合するフィブロネクチンにより説明することができる。対照的に、αvβ1リガンド、ラミニンは、Aβ網状構造形成及び神経毒性を阻害することができなかった(表1)。αvβ1リガンドがAβ網状構造形成及び神経毒性を阻害できない場合に、αvβ1リガンドがなぜ防御性なのかを見極めるために、抗ラミニン抗体を網状構造形成及び神経毒性アッセイで試験した。2種のラミニン抗体は、Aβ網状構造形成(図5A)及びAβ媒介性神経毒性(図5B)の双方において高防御性であった。抗ラミニン抗体#AB19012は、1nM未満のIC50を示した。対照的に、抗コラーゲン抗体はAβ網状構造形成及び神経毒性に対して何の効果も与えなかった(図5C)。
【０２５９】
実施例5: Aβはパキシリン・チロシン・リン酸化反応、インテグリン信号経路における早期事象を活性化する。
細胞外マトリックス・リガンドによるインテグリン活性化は、局所性接着キナーゼ、例えばFakの活性化、及びその基質パキシリンのチロシン・リン酸化反応を引き起こす。Aβがインテグリン信号経路を同様に刺激するかどうかを見極めるために、HCCへのAβ添加時のFak関連パキシリンのチロシン・リン酸化反応パターンを分析した(図6A)。Fak関連パキシリン・チロシン・リン酸化反応の一貫性のある活性化は見出されなかった。しかし、Aβ刺激に続くPyk2関連パキシリン・チロシン・リン酸化反応において、一貫性のある増加が観察された。Pyk2も局所性接着キナーゼであり、そして神経毒性(図6B)をもたらす異常なAβ/インテグリン信号経路を媒介することができる。これらの条件において毒性応答を引き起こすのは、Fak関連パキシリン・チロシン・リン酸化反応よりもむしろPyk2関連パキシリン・チロシン・リン酸化反応であると云える。いずれの場合にも、Aβはパキシリン・チロシン・リン酸化反応、インテグリン信号経路における早期事象を活性化する。このことは、Aβ神経毒性信号が、α2β1及びαvβ1インテグリン信号経路の直接的な関与により媒介されることを示す。
【０２６０】
実施例6:アミリン2成分毒性
200μlの水/粉末mgを添加し、次いで37℃で3日間にわたって溶液をエージングすることにより、CPR, Inc.(641-80, lot NG-0213) から入手したシード・アミリン又は凝集アミリン(1mM)を形成した。40μl DMSO/mg粉末を添加して、水浴内で30分間にわたって混合物を超音波処理することにより、可溶性アミリン(5mM)を調製した。両ストック溶液をアリコートし、使用の準備ができるまで凍結しておいた。使用直前に可溶性アミリン・ストックを培地中20μMに希釈し、そして水で予め洗浄したAmicon 30フィルタを通して濾過した。次いで、濾過された物質を希釈してその適正な濃度にした。
【０２６１】
ヒト皮質ニューロン（125,000細胞/96ウェル)を1時間にわたって、100μl/ウェル当たり5μMのシード・アミリンで処理した。細胞を吸引し、100μl/ウェル当たり5μMで可溶性アミリンを戻し添加した。化合物研究に際して、可溶性アミリンを添加する前に、２X化合物50μlを添加した。
【０２６２】
図6は、1時間にわたってヒト皮質ニューロンをシーディングし、これに続いて吸引して可溶性アミリンで処理してから1日後の毒性を示している。毒性を阻害するために、シード・アミリン及び可溶性アミリンの存在において細胞にインテグリン抗体を添加した。図7は、幾つかのインテグリン抗体、つまり2034抗ラミニン、1965抗β1インテグリン、1958抗αv(VNR)及び1950抗α2が、アミリン2成分の毒性から細胞を防御したことを示している。図8は、アミリン2成分毒性が、抗αvβ3及び抗αvを含む付加的なインテグリン抗体、及びサイトカラシンDによってさらに阻害される。
【０２６３】
上記全ての刊行物及び特許出願明細書の全体を、あらゆる目的で参考にするため本明細書に引用する。この場合、それぞれ個々の刊行物及び特許出願明細書は、本明細書におけるその引用が具体的且つ個別に指示されているのと同程度に引用されるものとする。判りやすさ及び理解し易さのために例を挙げることにより本発明を詳細に説明してきたが、云うまでもなく、添付の特許明細書の範囲内で、或る特定の変更及び改変を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０２６４】
【図１】図1は、プレートに塗布されたヒト皮質培養(HCC)（上）又はポリエチレンイミン(PEI)（下）中のAβ網構造を示す図である。
【図２Ａ】図2は、HCC中のAβ網構造形成及び神経毒性に対するβ1インテグリン・サブユニットの効果を示す図である。図2AはHCC中のβ1インテグリン・サブユニット発現を示す図である。
【図２Ｂ】図2Bは、抗β1抗体、1965の不存在（上）又は存在（下）におけるHCC中の72時間Aβ網状構造形成を示す図である。
【図２Ｃ】図2Cは、β1インテグリン・サブユニットをブロックする抗体と共に前インキュベートされたHCC中の神経毒性の阻害を示す図である。誤差バーは(n=3)ウェルからの標準偏差を表す。
【図３Ａ】図3Aは、HCC中のAβ網構造形成及び神経毒性に対するα2及びαvインテグリン・サブユニットの効果を示す図である。
【図３Ｂ】図3Bは、抗α2抗体及び抗αv抗体の不存在（上）、又は抗α2抗体の存在（中）又は抗αv抗体の存在（下）におけるHCC中の72時間Aβ網状構造形成を示す図である。
【図３Ｃ】図3Cは、β1インテグリン・サブユニットをブロックする抗体と共に前インキュベートされたHCC中の神経毒性を示す図である。
【図４】図4は、HCC中のα2及びαvの発現を示す図である。
【図５Ａ】図5は、Aβ網構造形成及び神経毒性を阻害する上での抗ラミニン抗体の効果を示す図である。図5Aは、抗ラミニン抗体の不存在（上）又は不存在（下）におけるHCC中の72時間Aβ網状構造形成を示す図である。
【図５Ｂ】図5Bは、抗ラミニン抗体と共に前インキュベートされたHCC中の神経毒性を示す図である。誤差バーは(n=3)ウェルからの標準偏差を表す図である。
【図５Ｃ】図5Cは、抗コーラゲン抗体と共に前インキュベートされたHCC中の神経毒性を示す図である。誤差バーは(n=3)ウェルからの標準偏差を表す図である。
【図６Ａ】図６は、HCC中のAβシグナル経路の活性化を示す図である。図6Aは、Aβ処理HCC中の局所性接着キナーゼ(Fak)関連パキシリンのチロシン・リン酸化反応を示す図である。
【図６Ｂ】図6Bは、Aβ処理HCC中の高プロリン型チロシンキナーゼ(Pyk2)関連パキシリンのチロシンリン酸化反応を示す図である。
【図７】図7は、ヒト皮質ニューロンを1時間にわたってシーディングするのに続いて吸引し、そして可溶性アミリンで処理してから1日後の毒性を示す図である。このシード・アミリン及び可溶性アミリンの存在においてこれらの細胞にインテグリン又はインテグリン・サブユニット抗体を添加することにより、毒性を阻害することができる。シード・アミリン及び可溶性アミリンだけでは毒性ではない。しかし、1時間にわたって細胞がシーディングされ、続いて吸引され及びアミリンで処理されると、アミリンは毒性になる。
【図８】図8は、インテグリン及びインテグリン・サブユニット抗体、特に抗ラミニン、抗β1、抗αv及び抗α2抗体がアミリン毒性を防止することを示す図である。
【図９Ａ】細胞が1時間にわたってシード・アミリンに晒されたあとのアミリン2成分毒性の阻害率(%)によって実証されるように、アミリン毒性を防止する上での、抗αvβ3、抗αv及びサイトカラシンDを含むインテグリン又はインテグリン・サブユニット抗体の効果を示す図である。
【図９Ｂ】細胞が1時間にわたってシード・アミリンに晒されたあとのアミリン2成分毒性の阻害率(%)によって実証されるように、アミリン毒性を防止する上での、抗αvβ3、抗αv及びサイトカラシンDを含むインテグリン又はインテグリン・サブユニット抗体の効果を示す図である。
【配列表】
2005512955.tif 000004
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2005512955.tif 000007
2005512955.tif 000008
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2005512955.tif 000019
【図６Ａ】
2005512955.tif 000020
【図６Ｂ】
2005512955.tif 000021
【図７】
2005512955.tif 000022
【図８】
2005512955.tif 000023
【図９Ａ】
2005512955.tif 000024
【図９Ｂ】
2005512955.tif 000025
【国際調査報告】
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