(57)【要約】  トコフェロール、レチノール、ビタミンK1及びこれらの混合物から成る群から選択されたビタミンの、患者の標的組織内での貯蔵形レベルを高める方法であって、該方法が、該ビタミンのリン酸塩誘導体の有効量を該患者に投与することにより、該標的組織内に貯蔵ビタミンを蓄積させることを含むことを特徴とする、ビタミンの、患者の標的組織内での貯蔵形レベルを高める方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トコフェロール、レチノール、ビタミンK1及びこれらの混合物から成る群から選択されるビタミンの、患者の標的組織内での貯蔵形レベルを高める方法であって、該方法が、該ビタミンのリン酸塩誘導体の有効量を該患者に投与することにより、該標的組織内に貯蔵ビタミンを蓄積させることを含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
該ビタミンがトコフェロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該患者がヒトである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該標的組織が、肝臓、皮膚及び脂肪組織から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該標的組織が脳である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
貯蔵ビタミン・レベルを高めることにより、治療レベルのビタミンが該動物に提供される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該治療レベルのビタミンが結果として、炎症性疾患を緩和又は治療する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該炎症性疾患が、冠状動脈性心臓病、関節硬化症及び糖尿病から成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該治療レベルのビタミンが結果として、癌を緩和又は治療する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
該治療レベルのビタミンが結果として、胎児発育の問題を緩和又は治療する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
該ビタミンの治療レベルが、健康又は正常な組織内に通常貯蔵されるレベルよりも少なくとも約50%高い、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
該ビタミンのリン酸塩誘導体の有効量が、該動物の体重1kg当たり約3mg以上である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該ビタミンのリン酸塩誘導体の有効量が、該動物の体重1kg当たり3〜50mgの範囲内にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該ビタミンのリン酸塩誘導体の有効量が、該動物の体重1kg当たり10mg以上である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該リン酸塩誘導体がホスファチドである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該リン酸塩誘導体が該ビタミンのリン酸塩誘導体の錯体である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ビタミン治療に反応する状態を患う患者を緩和又は治療する方法であって、該方法が、前記治療を必要とする患者に、トコフェロール、レチノール、ビタミンK1及びこれらの混合物から成る群から選択されるビタミンのリン酸塩誘導体を、治療量のトコフェロール、レチノール、ビタミンK1又はこれらの混合物を該患者の組織内に蓄積させるのに効果的な量だけ投与することを含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項１８】
該ビタミンがトコフェロールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該患者がヒトである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
該組織が肝臓である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該リン酸塩誘導体がホスファチドである、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
該リン酸塩誘導体が、該ビタミンのリン酸塩誘導体の錯体である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
有効量のビタミン・リン酸塩誘導体の使用であって、動物の標的組織内に貯蔵ビタミンを蓄積させるための栄養補助食品を製造する際に、トコフェロール、レチノール、ビタミンK1及びこれらの混合物から成る群から選択されたビタミンのリン酸塩誘導体を有効量だけ使用することを特徴とする、前記使用。
【請求項２４】
有効量のビタミン・リン酸塩誘導体の使用であって、ビタミン治療に反応する状態を患う患者を緩和又は治療するための薬品を製造する際に、トコフェロール、レチノール、ビタミンK1及びこれらの混合物から成る群から選択されたビタミンのリン酸塩誘導体を有効量だけ使用することを特徴とする、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リン酸塩誘導体の投与によって、動物中のビタミン・レベル、具体的にはトコフェロール(ビタミンE)、レチノール(ビタミンA)又はビタミンK1の内生的な貯蔵形のレベルを調節することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書において、公知の文献、行為又は物品が引用又は論議されているが、このような引用又は論議がなされているからといって、その公知の文献、行為又は物品又はこれらの組み合わせが優先日の時点で：
(a)  技術常識の一部；又は
(b)  本明細書が関わる課題を解決しようとする試みに該当するものとして知られているもの
とは認められない。
【０００３】
下記の論議はトコフェロール及びリン酸トコフェロール(TP)に関するものであるが、これが単に一例に過ぎず、本発明がトコフェロール又はTPに限定されるものではなく、本発明が同様にレチノール及びビタミンK1、並びに、これらの貯蔵形及び輸送形にも関することは明らかである。
【０００４】
ビタミンEは生物学的に極めて重要な抗酸化剤として広く認識されている。ビタミンEは、生体膜及び血漿リポタンパク質において多価不飽和脂肪アシル分を保護する能力を有することにより、細胞の完全性を維持する上で極めて重要な役割を有する強力なフリーラジカル・スカベンジャーである。ビタミンEは、「トコフェロール」として知られるイソプレノイドの群から成る。トコフェロールは、ヒト及び動物の健康に利益を与える。ビタミンE活性を有するいくつかの異なるトコフェロールが知られており、最も活性で豊富なトコフェロールはα-トコフェロールである。
【０００５】
ビタミンEの体内への食事摂取量を補おうとする試みが数多く行われている。生物学的に活性な種及び栄養物の栄養補助食品が臨床的な実践において有益であるためには、これらの栄養補助食品は、所定の特性を示すべきである。例えば、栄養補助食品は、十分な安定性、溶解度、透過性及び生体利用効率を有するべきである。
【０００６】
遊離トコフェロールは安定的でなく、従ってビタミンEの生体利用可能な送達形としては好適でない。このような理由から、トコフェロールの安定性及び生体利用効率を高める重要な手段として、誘導体化が以前から認識されているが、しかし一般には、これらの誘導体は依然として低い吸収率に甘んじている。トコフェロール有機エステル、例えば酢酸トコフェロール又は琥珀酸トコフェロールが、現在、広範囲にわたって商業的に使用されているこのような誘導体化種の例である。これらのエステルは製造コストが安く、遊離トコフェロールよりも安定的である。
【０００７】
トコフェロール誘導体はこれらが有用であるためには、ヒト又は動物の患者の体循環中に吸収された後で生物学的に活性な種に変換可能であることが望ましい。調製者は、トコフェロールの遊離形が生物学的に活性であると考え、ひいては、膵臓のエステラーゼ及びリパーゼの活性が小腸腔内のトコフェロールの有機エステルから遊離トコフェロールを放出すると、体内のビタミンEレベルが高められると考えた。
【０００８】
栄養補助食品として使用されるトコフェロール源としての種々のトコフェロール誘導体の効率を検査する場合、従来技術の分析技術は、これらの栄養補助食品が血漿及び組織内の遊離トコフェロール・レベルをいかに効率的に高めるかを測定することに集中している。従来技術のビタミンE栄養補助食品として、酢酸トコフェロールが好まれている。なぜならば、この酢酸トコフェロールは報告によれば、血漿遊離トコフェロール・レベルを迅速に、容易に測定可能に増大させるからである。
【０００９】
トコフェロール誘導体の水溶性を高めようと試みた調製者は、TP含有配合物を調製した。それというのは、TPの水溶性がトコフェロールの有機エステルの水溶性よりも著しく高いからである。TPはin vitroでのビタミンE水溶性源として使用されているが、TPは以前はビタミンEの好適なin vivo源として一般に使用されたことはなかった。なぜならばリン酸基はホスホリラーゼの基質であり、受動輸送に対して抵抗性を有し、ひいては吸収を妨げると考えられたからである。
【００１０】
現在まで、酢酸トコフェロール又はリン酸トコフェロールを含有するビタミンE栄養補助食品は、一人当たり7〜15mg/日の遊離トコフェロールの推奨一日摂取量を体内に提供することを目的としている。栄養補助食品は200〜600mgを含有した。それというのも、この量は成人において無害であると考えられるからであるが、このことに関しては或る程度限られた証拠しかない。
【００１１】
逆説的に云えば、α-トコフェロールは強力なフリーラジカル・スカベンジャーであるとともに、身体に損傷を与える酸化促進剤及び潜在的なフリーラジカル源でもある。遊離トコフェロールは高濃度で酸化促進剤となり、従ってこの遊離トコフェロールは体内の生体貯蔵形又は生体輸送形となる見込みはない。天然形は膜安定性にとって基本的に重要であるが、効率的に輸送され、電子伝達物質として作用するように必要に応じて動態化されなければならない。現在まで、遊離α-トコフェロール及びタンパク質結合又はタンパク質会合α-トコフェロールしか生体組織内で検出されていない。タンパク質結合形又はタンパク質会合形は、輸送形を表すと考えられている。遊離トコフェロールは生物学的活性形ではあるが、しかし、貯蔵されるか又は身体を通して輸送される別の形がなければならないというコンセプトは、極めて重要な情報であるにもかかわらず誰も追求したことがない。ビタミンEの補給における全ての試みは、組織又は血漿中の遊離トコフェロール・レベルを高めることに焦点を当てている。貯蔵形又は輸送形のビタミンEを増大させるという試みはなされていない。
【００１２】
高レベルの遊離トコフェロールのこれらの不都合な効果は、一日推奨投与量を制限する。高摂取量の脂溶性栄養物が毒性を招くという懸念もある。その結果として、推奨一日摂取量は、栄養補助食品によって提供されるトコフェロール量を制限している。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
トコフェロール、レチノール及びビタミンK1の貯蔵形はそれぞれこれらのリン酸塩誘導体であるということが、本発明者によって今般発見された。これらのリン酸塩誘導体は、典型的にはフリーラジカル源ではない。驚くべきことに、本発明者は、トコフェロール、レチノール又はビタミンK1のリン酸塩誘導体を動物に投与することにより、治療上有用なレベルのトコフェロール、レチノール又はビタミンK1を貯蔵形及び輸送形で提供できることを発見した。
【００１４】
従って第1の観点において、本発明は、トコフェロール、レチノール、ビタミンK1及びこれらの混合物から成る群から選択されたビタミンの、患者の標的組織内での貯蔵形レベルを高める方法であって、該方法が、該ビタミンのリン酸塩誘導体の有効量を該患者に投与することにより、該標的組織内に貯蔵ビタミンを蓄積させることを含む、ビタミンの、患者の標的組織内での貯蔵形レベルを高める方法を提供する。
【００１５】
好ましくは、該ビタミンはトコフェロールである。
好ましくは、該患者は動物であり、より好ましくは該動物はヒトである。
好ましくは、該標的組織は肝臓である。なぜならば肝臓は、優先的な貯蔵器官であり、リポタンパク質コレステロールの発生部位であるからである。皮膚にはビタミンE活性があり、皮膚代謝においてTPが重要であることも知られている。ビタミンEはまた、脂肪組織にとって重要な場合もある。この脂肪組織において、ビタミンEは不飽和脂肪の分解を防止することができる。ビタミンEは脳内においても重要である。
【００１６】
好ましくは、貯蔵ビタミン・レベルが高められることにより、動物中に潜在的治療レベルのビタミンが生じる。
【００１７】
本発明は、ビタミンの貯蔵レベルを治療値レベルまで高めるのに特に好適である。ビタミン、具体的にはトコフェロールのレベルを高めることにより、炎症性疾患、例えば、冠状動脈性心臓病、関節硬化症及び糖尿病、並びに、トコフェロールによって影響を与えられる多数の疾患、例えば、トコフェロールが細胞粘着に影響を与える癌、及び胎児発育の治療に使用することができる。脳においては、ビタミン・レベルはアルツハイマー病の治療を助けることができる。
【００１８】
ビタミンの治療レベルは典型的には、健康又は正常な組織内に通常貯蔵されるレベルを約50%以上上回るオーダーになる。好ましくは、これらのレベルは約100%以上、より好ましくは約200%以上だけ増大し、すなわち、正常な血漿又は組織レベルの約2〜3倍である。本発明を用いて、体内へのビタミン「装入量を増大」することにより、より高レベルのビタミンを多数の方法で放出し、これにより、潜在的により高投与量の生体利用可能なビタミンを、必要に応じて体内の器官又は組織に提供することができる。
【００１９】
本発明は、通常の食事摂取又は食事プロセスによってビタミンを取得又は活用することができない患者の問題を治療又は克服するのにも好適である。貯蔵レベルを高める能力は、食事摂取量が低いか又は乏しい期間から生じる結果を克服するのにも有用である
【００２０】
トコフェロールは体内において3つの形
【００２１】
【表１】
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【００２２】
で使用される。
【００２３】
典型的には、レベルが増大した貯蔵形は、トコフェロール、レチノール又はビタミンK1の源として、患者の組織、器官又は細胞に作用する。
【００２４】
本発明者は、貯蔵レベルを有益な量に高めるには、約3mg/kg以上(80kgの成人の場合約240mg以上)、典型的には約3〜50mg/kgのビタミン・リン酸塩誘導体が必要となることを見出した。より好ましくは約3〜30mg/mgが提供される。より好ましくは体重1kg当たり10mg以上のトコフェロールがリン酸トコフェロールとして経口投与されることが、68%の絶対生体利用効率のレベルに達するのに好適であることが判った。この量は正常なヒト一人当たりの推奨一日摂取量(RDI)7〜15mg/日を有意に上回る。
【００２５】
この投与量は、ビタミンのリン酸塩誘導体を単回投与することにより達成することができ、或いは、数分間、数時間又は数日間にわたって投与してビタミンの所要貯蔵量に達することもできる。
【００２６】
ビタミンのリン酸塩誘導体は、任意の好適なルート、例えば経口又は非経口で投与することができる。
【００２７】
第2の観点において、本発明は、ビタミン治療に反応する状態を患う患者を緩和又は治療する方法であって、該方法が、前記治療を必要とする患者に、トコフェロール、レチノール、ビタミンK1及びこれらの混合物から成る群から選択されたビタミンのリン酸塩誘導体を、治療量のトコフェロール、レチノール、ビタミンK1又はこれらの混合物を該患者の組織内に蓄積させるのに効果的な量だけ投与することを含む、ビタミン治療に反応する状態を患う患者を治療又緩和する方法を提供する。
【００２８】
好ましくは、ビタミン治療に反応することが期待される状態は、炎症性疾患、例えば、冠状動脈性心臓病、関節硬化症及び糖尿病、並びに、トコフェロールによって影響を与えられる多数の疾患、例えば、トコフェロールが細胞粘着に影響を与える癌、及び胎児発育である。
【００２９】
好ましくは、該ビタミンはトコフェロールである。
好ましくは、該患者は動物であり、より好ましくは、該動物はヒトである。
【００３０】
好ましくは、標的組織は肝臓である。それというのはこの組織は、異なる組織内に遍在する種々の代謝活性のための十分な貯蔵場所があるのを示すために使用することができるからである。
【００３１】
ビタミンのリン酸塩誘導体は、任意の好適なルート、例えば経口又は非経口で投与することができる。
【００３２】
本発明者は、貯蔵レベルを有益な量に高めるには、約3mg/kg以上(80kgの成人の場合約240mg以上)、典型的には約3〜30mg/kgのビタミン・リン酸塩誘導体が必要となることを見出した。この有益な量は結果としてビタミンの治療レベルをもたらすことができる。より好ましくは体重1kg当たり約10mgのトコフェロールがリン酸トコフェロールとして経口投与されることが、68%の絶対生体利用効率のレベルに達するのに好適であることが判った。この量は正常なヒトの推奨一日摂取量(RDI)7〜10mg/日を有意に上回る。
【００３３】
第3の観点において、本発明は、有効量のビタミン・リン酸塩誘導体の使用であって、動物の標的組織内に貯蔵ビタミンを蓄積させるための栄養補助食品を製造する際に、トコフェロール、レチノール、ビタミンK1及びこれらの混合物から成る群から選択されたビタミンのリン酸塩誘導体を有効量だけ使用する、有効量のビタミン・リン酸塩誘導体の使用を可能にする。
【００３４】
第4の観点において、本発明は、有効量のビタミン・リン酸塩誘導体の使用であって、ビタミン治療に反応する状態を患う患者を緩和又は治療するための薬品を製造する際に、トコフェロール、レチノール、ビタミンK1及びこれらの混合物から成る群から選択されたビタミンのリン酸塩誘導体を有効量だけ使用する、有効量のビタミン・リン酸塩誘導体の使用を可能にする。
【００３５】
「ビタミン・リン酸塩誘導体」という用語は、本明細書中では、リン酸化されたトコフェロール、レチノール又はビタミンK1の酸形、ナトリウム、マグネシウム、カリウム及びカルシウムのような金属塩を含むリン酸塩、並びに、リン酸プロトンがエチル基、メチル基又はホスファチジル基のようなその他の置換基によって置換されているその他の任意の誘導体を意味する。
【００３６】
いくつかの状況において、水溶度の増大のような付加的な特性が好ましいホスファチドのようなリン酸塩誘導体を使用する必要がある場合がある。ホスファチジル誘導体は、有機リン酸塩のアミノアルキル誘導体である。これらの誘導体は、R1R2N(CH2)nOHの構造を有するアミンから調製することができる。前記式中、nは1〜6の整数であり、R1及びR2はHであるか、或いは炭素原子数3以下の短アルキル鎖であってよい。R1及びR2は同じであるか、又は異なるものであってよい。ホスファチジル誘導体は、電子伝達物質のヒドロキシル・プロトンをリン酸塩の存在と置換することによって調製される。このリン酸塩の存在は次いでアミン、例えばエタノールアミン又はN,N'ジメチルエタノールアミンと反応させられ、これにより、電子伝達物質のホスファチジル誘導体が発生する。ホスファチジル誘導体の1調製方法は、塩基性溶剤、例えばピリジン又はトリエチルアミンをオキシ塩化リンと共に使用し、これにより、中間体を調製する。この中間体は次いでアミンのヒドロキシル基と反応させられ、これにより相応のホスファチジル誘導体、例えばリン酸二水素PコリルPトコフェロールが生成される。
【００３７】
いくつかの状況において、付加的な特性、例えば改善された安定性又は送達可能性が有用である場合に、ビタミン・リン酸塩誘導体の錯体を利用することもできる。「ビタミン・リン酸塩誘導体の錯体」という用語は、トコフェロール、レチノール又はビタミンK1及びこれらの混合物の1又は2種以上の誘導体と、両性界面活性剤、カチオン系界面活性剤、窒素官能基を有するアミノ酸、及び、国際特許出願第PCT/AU01/01476号明細書に開示されているような、これらのアミノ酸が豊富なタンパク質から選択された1又は2種以上の錯化剤との反応生成物を意味する。
【００３８】
好ましい錯化剤は、アルギニン、リシン及び第3置換型アミン、例えば下記式：
NR1R2R3
から成る群から選択される。
【００３９】
上記式中、R1はC6〜C22の直鎖又は分枝混合型アルキル基、及びこれらのカルボニル誘導体を含む群から選択され；
【００４０】
R2及びR3は、H、CH2COOX、CH2CHOHCH2SO3X、CH2CHOHCH2OPO3X、CH2CH2COOX、CH2COOX、CH2CH2CHOHCH2SO3X、CH2CH2CHOHCH2OPO3Xを含む群から独立して選択され、R2及びR3の両方がHでないならば、XはH、Na、K又はアルカノールアミンであり；そして
上記式中、R1がRCOである場合、R2はCH3であってよく、そしてR3は(CH2CH2)N(C2H4OH)-H2CHOPO3であってよく、或いはR2及びR3は互いに結合してN(CH2)2N(C2H4OH)CH2COO-であってよい。
【００４１】
好ましい錯化剤は、アルギニン、リシン又はラウリルイミノ二プロピオン酸を含む。この場合、錯化はアルカリ窒素の中心とリン酸エステルとの間に発生し、これにより安定的な錯体が形成される。
【００４２】
「治療効果」を提供するためのビタミン・リン酸塩誘導体の投与は、治癒的、予防的又はその他の有益な健康上の効果を達成するための投与を含む。例えば、患者に対する投与は、ビタミンの欠乏を治療するため、疾患又は障害を改善又は治癒するため、疾患又は障害の症状を改善又は除去するため、又は、患者の血漿及び組織におけるビタミン・レベルを高めるために行い、これにより、有益な効果を提供することができる。
【００４３】
ビタミン・リン酸塩誘導体は、種々の投与形態、例えば栄養補助食品、腸溶性供給物、非経口投与形、座剤、鼻腔送達形、パッチ、クリームを含む皮膚送達形、及び、天然貯蔵形及び電子伝達物質の輸送形にビタミンを補給することができる任意のその他のデリバリー・システムを通して、ヒト又は動物に投与することができる。
【００４４】
例えば、ビタミンのリン酸塩誘導体は、経口又は非経口投与形態により投与することができる。これらの投与形態は錠剤、散剤、チュアブル錠、カプセル剤、経口懸濁液、懸濁液、エマルジョン又は流体、小児用配合物、腸溶性供給物、栄養補給食品、及び機能性食品を含む。
【００４５】
投与形態はさらに、澱粉又は高分子バインダー、甘味剤、着色剤、乳化剤及びコーティングなどのような投与形態の調製に日常的に使用される任意の添加剤を含む。その他の好適な添加剤が当業者には容易に明らかである。
【００４６】
1実施態様の場合、投与形態は、国際特許出願PCT/AU01/01206号明細書に開示されているような腸溶性コーティングを有する。
別の実施態様の場合、投与形態は、国際特許出願PCT/AU02/01003号明細書に開示されているような局所用配合物である。
【００４７】
「内生的」という用語は、ビタミン又はその誘導体の補給を伴わない食事からの摂取の結果として体内に発生するビタミンを意味する。この場合、典型的な代謝プロセスだけが食事性ビタミンを転換する。
本発明をより明白に理解できるように、下記の図面及び実施例を参照しながら好ましい形態を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
発明を実施するための態様
生体組織の範囲において、α-トコフェロールのモノリン酸エステル、リン酸α-トコフェロールが有意な量(8〜147μg/g)で存在することが今や実証された。リン酸α-トコフェロールは酸化に対して抵抗性を有し、ひいては抗酸化剤としては不活性であり；リン酸α-トコフェロールは酸及びアルカリ加水分解に対しても抵抗性を有しているので、ビタミンEに対する標準的なアッセイによっては検出することができない。ビタミンEのこのような貯蔵形の発見は、体内のこの必須ビタミンの役割を再評価する必要性を告げる。
【００４９】
例えば、理論に縛られることなしに述べるならば、初期の貯蔵形としてのTPは、高濃度で不所望なフリーラジカル又は酸化促進剤の強力な源となる遊離トコフェロールとは著しく異なり、フリーラジカル源ではないと考えられる。例えばアデノシン二リン酸の活性リン酸化による酸化が知られており、この酸化は、リン酸α-トコフェロールが、リン酸化された二次メッセンジャーを生成することができる還元剤であり得ることを示唆している。このことは、トコフェロールに割り当てられた非抗酸化剤の役割を明らかにする。
【００５０】
やはり理論に縛られることなしに述べるならば、組織内のリン酸α-トコフェロールの役割を理解する助けとなるように、下記モデルが提案される。リン酸α-トコフェロールは、親油性タンパク質と関連するリポタンパク質環境内で、又はグリセロリン酸塩誘導体として貯蔵される。フリーラジカルに近接し、酸化的環境が発生すると、リン酸α-トコフェロールの脱リン酸化及び遊離α-トコフェロールの放出が刺激される。酸化攻撃が中和されると、過剰の抗酸化剤(α-トコフェロール)はリン酸化により貯蔵部中に引き戻される。この保守的な戦略は酸化促進を回避する。リン酸α-トコフェロールに関して提案されたこのような作用様式は、その他の親油性の生体活性化合物にも当てはまり、in vivoでのその機能に関する新しい説明を可能にする。
次に本発明を下記の実施例においてさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００５１】
実施例
実施例1：
この実施例において、ビタミンEの貯蔵形を種々の組織において検査した。
組織の試料及び栄養素中のα-トコフェロールを検出するための標準的な分析法は、通常の場合、抽出プロセスの一部として加水分解ステップを含む。加水分解は、α-トコフェロール・エステル、例えば添加された酢酸α-トコフェロールが、分析前に遊離α-トコフェロールに変換されることを保証する。
【００５２】
リン酸α-トコフェロールの分析に関する文献は数少ない。最新の報告は、ペーパー・クロマトグラフィを利用した、その他のリン酸エステルから合成リン酸α-トコフェロールを分離する方法であると思われる。この文献の著者は良好な感受性を報告しているが、ラット肝臓におけるリン酸α-トコフェロールの天然レベルの検出には失敗している。リン酸α-トコフェロールは、タンパク質がホモジェネートから除去されるプロトコルにおけるステップで失われたと考えられる。
【００５３】
驚くべきことに、リン酸α-トコフェロールは、これらの手順において直面するアルカリ及び酸加水分解条件のすべてに対して抵抗性を有し、その結果、典型的な分析では、遊離α-トコフェロールと一緒には含まれない。実際に、強アルカリ性条件又は強酸性条件下で24時間を超える長時間にわたってリン酸α-トコフェロールを還流しても、リン酸結合のいかなる開裂をも導くことはない。我々は、リン酸α-トコフェロールを加水分解することにより遊離α-トコフェロールを産出することができる条件を発見することはできなかった。リン酸α-トコフェロールはまた、酸化に対して抵抗性を有し、標準的な比色α-トコフェロール分析の条件下では陽性の発色をもたらさないことも判った。
【００５４】
リン酸α-トコフェロールの安定性は、組織からこれを分離するのに強力な条件を用いることができるほどであるが、しかしリン酸α-トコフェロールの検出は極めて困難であり、最も一般的な装置では不十分である。ガスクロマトグラフィ/質量分析(GCMS)は、α-トコフェロール分析の選択法であるが、しかしこの技術は、リン酸α-トコフェロールの分析に特に適しているわけではない。我々は最終的には、ジアゾメタンを使用してジメチルリン酸トコフェロールに誘導体化したあと、GCMSによってリン酸α-トコフェロールを検出することができた。この方法は、組織試料中の内生的リン酸α-トコフェロールの存在を確認するのに使用された。内生的物質は、合成リン酸α-トコフェロールと同じ保持時間、分子イオン(m/z 538)及び基準ピーク(m/z 273)を有した(図2参照)。しかしこの方法は、日常的な定量分析には適していないことがわかった。我々は多数の分析技術を試し、エレクトロスプレー質量分析(ESMS)が明らかにリン酸α-トコフェロールの最良の分析法であることを見極めた(図3参照)。リン酸α-トコフェロールは容易にイオン化可能であり、高pHで水溶性であって、低pHで有機溶剤中に可溶性である。これらのことはESMSに理想的に適した特性である。好適な内部標準を加えることにより、組織中のリン酸α-トコフェロール・レベルはESMSによって規定通りに見極められた(図4参照)。
【００５５】
リン酸α-トコフェロールに適したアッセイ技術の開発に続いて、効果的な抽出プロトコルを開発することも必要である。それというのも、リン酸α-トコフェロールはビタミンE決定に一般に採用される抽出法を用いては検出することができなかったからである。我々が開発した手順の場合、内部標準、リン酸ジ-α-トコフェロールを含有するジクロロメタン中で組織を均質化した。混合物を遠心分離し、ジクロロメタン層を除去し、タンパク質の大部分を残した。ジクロロメタンの蒸発後に残った残留物を次いで水酸化カリウムで、1時間にわたって室温で加水分解した。試料を加水分解しないと、リン酸α-トコフェロールを検出することはできなかった。このことはリン酸α-トコフェロールがタンパク質又はその他の何らかの化合物と会合していること(例えば、リン酸α-トコフェロールは、グリセロリン酸塩又は類似のエステルとして存在していてよい)、及び、遊離リン酸α-トコフェロールを解放するのに加水分解が必要であることを示唆している。次いで、加水分解されたものをヘキサンで洗浄し、これにより有機可溶性物質の全てを除去した。この段階で遊離α-トコフェロールは除去され、標準的な技術を用いて容易に分析することができた。リン酸α-トコフェロールはカリウム塩として存在し、水溶性リン酸α-トコフェロールは抽出されなかった。水性層を酸性化することにより、リン酸α-トコフェロールを遊離酸に変換した。この遊離酸はヘキサン中に容易に抽出された。
【００５６】
抽出プロセス中のアルカリ加水分解によって遊離リン酸α-トコフェロールを解放するための要件と相俟って、リン酸α-トコフェロールが加水分解及び酸化に対して抵抗性を有するという我々の発見は、リン酸α-トコフェロールとして存在するα-トコフェロールが、標準的なビタミンEアッセイによって以前は検出されなかった理由の説明となる。試料中に存在する「全α-トコフェロール」の報告された量は結果としていつも過小評価されていたことになる。
【００５７】
この抽出プロトコル及びESMS分析を用いて、動物及びヒト組織の範囲のリン酸α-トコフェロール含量を測定した。表1はこれらの分析の結果を示す。
天然発生型リン酸α-トコフェロールがブタ、テンジクネズミ、ニワトリ及びラットの肝臓において、また、ヒト、ブタ及びテンジクネズミの脂肪組織において検出されている。肝臓及び脂肪は、α-トコフェロールを貯蔵するための2つの主な貯蔵部位であると報告されている。従ってこれらの組織内にリン酸α-トコフェロールも存在するのは驚くべきことではない。我々の試験結果が示すように、リン酸α-トコフェロールは、存在するα-トコフェロールにおいて有意な比率を占める。
【００５８】
TPは、これがトコフェロールの貯蔵形として留まることができる組織内に直接的に堆積することはできないと、これまで考えられていた。しかし、下記の実施例は、ヒト及び動物の組織における摂取されたTPの検出を示す。
【００５９】
内部標準としてリン酸ジトコフェロール(T2P)を使用して、TPレベルを見極めた。T2Pは天然発生型物質ではない。ES/MSを使用してTP対T2Pに関して校正曲線を決定した(図1)。図1から判るように、応答は事実上線状である。
【００６０】
TPの最大回収率をもたらす抽出法を開発した。抽出法に対するTPの安定性を、純粋TPに抽出プロトコルを施すことにより試験し、事実上100%の回収率を得た。抽出プロトコルの概要を下記に説明する：
1.  1gを秤量し、10mlのジクロロメタン中で均質化する。
2.  内標準として0.1mgのT2P(50% テトラヒドロフラン中1mg/ml)を添加する。
3.  ホモジナイザーを使用して試料を混合し、そして遠心分離する。
4.  ジクロロメタンを除去して蒸発させる。
5.  9mlの2M KOH(2M)を添加し、1時間にわたって室温で撹拌する。
6.  10mlのヘキサンを添加し、震盪して、ヘキサン(上)層を除去する。
7.  10mlの2M HCl(2M)を9ml KOH(2M)溶液に添加する。
8.  10mlのヘキサンを添加し、震盪して、ヘキサン層を除去する。
9.  乾燥するまで蒸発させる。
10. ESMS、ESI(-veモード)で分析する。
【００６１】
ESMS条件
1% NH3を含有する1mlのTHF中に試料を溶解し、20μlを試料ループ中に注入した。試料をTHF:H2O(9:1)20μl/分で溶離した。veイオンモードにおいてコーン電圧40VでMS分析を行った。
【００６２】
肝臓抽出物及びTP標準とのジアゾメタン反応
水(8ml)及びエタノール(10ml)中の水酸化カリウム(5g)の溶液を水浴内で65℃まで予加熱した。エーテル(40ml)中のDiazld(登録商標)(3.0g, 13.8mmol)の溶液を水酸化カリウム溶液にゆっくり添加し、全体的に蒸留した。Diazld(登録商標)の添加が完了したときに、10mlのエーテルを添加してやはり全体的に蒸留した。最終エーテル蒸留物は、約420mg(9.95mmol)のジアゾメタンを含有した。
【００６３】
10gのラット肝臓から抽出してTHF中に予め溶解させておいた肝臓試料にこのジアゾメタン溶液の半分を直ちに添加し、このジアゾメタン溶液のもう半分を、エーテル中に溶解させておいた100μgのTP(TP)標準に添加した。2つの反応混合物を密閉し、暗い戸棚内に約30分間置き、その後肝臓抽出物及びTP標準から減圧下で溶剤及びジアゾメタンを除去した。メチル化された肝臓抽出物試料を100μlのクロロホルム中に溶解させた。TP標準も同様に処理した。次いで、このTP溶液30μlを採取し、1.5mlのクロロホルム中に再溶解させ、これにより、肝臓抽出物中のTP濃度を模倣した。次いで、ガスクロマトグラフ質量分析(GC-MS)を用いて、肝臓抽出物及びTP標準の両方を直ちに分析した。
【００６４】
GCMS条件
Schimadsu AOC-20i オート・インジェクターを内蔵するSchimadsu GCMS-QP5000ガスクロマトグラフ質量分析計を使用して、メチル化された肝臓抽出物及びTP標準を分析した。1分当たり3℃の勾配をつけた260℃から最大300℃までの温度プログラムを利用して、厚さ0.25μm、内径0.25mmの15m SGE.BP1毛管カラム上に1μlの試料を注入した。インジェクター及び界面の温度を両方とも300℃に設定した。使用するキャリヤガスはヘリウムであり、カラム入口の圧力を156kPaに設定し、総流量は144ml/分であり、線速度86.5cm/秒でカラム流量2.4ml/分を示した。試料をスプリット比56:1のスプリット・モードで流動させた。
【００６５】
質量分析計の獲得モードはSIM(単イオン・モニタリング)モードであり、チャネル1-m/z=538.00であり、チャネル2-m/z=273.00であった。この獲得のための検出器ゲインを1.5キロボルトに設定した。
【００６６】
ラット肝臓内のTP
処理を施されていないラット肝臓を使用して、天然発生型TPを抽出し、その量を検出して定量化した。Sprague-dawley及びWistarラット(週齢10〜11週、体重約120〜180g)に由来する新鮮な肝臓をそれぞれの抽出のために使用した。ラット肝臓内の天然発生型TPの量は、12.5μg/肝臓g(n=15)であることが見出された。
ヒトの腹部脂肪、テンジクネズミ及びラットの脂肪組織、ブタ及びテンジクネズミの肝臓においてもTPを検出した。これらのヒト及び動物にはいずれもTPは投与されていない。表1は各器官内に検出されたTPの量を概略を示す。
これらの結果は、組織のTPレベルが種全体にわたって同じ規模を有することを実証する。興味深いことに、リン酸塩形は、その動物の寿命に応じて、異なる組織において異なるレベルで同じように使用されると考えられるが、しかしこれは驚くべきことではない。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
実施例2：
この実施例では、酢酸トコフェロール及びリン酸トコフェロールが投与された後、貯蔵部位におけるリン酸トコフェロール・レベルが高められるか否かを検査する。
【００６９】
用いられる手順を以下に要約する：
(a)  単回投与量の化合物を雄Sprague-Dawleyラットに投与する(表参照；18g強制栄養法用針及び1mlシリンジを用いた経口強制栄養法、又は26g皮下注射針及び1mlシリンジを用いた皮下注射)。
(b)  投与から24時間後に、ラットをネンブタール(60mg/kg i.p.)で麻酔する。
(c)  ラットが深い知覚麻痺状態になったら、血液試料を尾の静脈から採取し、そして大腿静脈を露出し、500単位のヘパリンを注入した。腹腔を開き、ラットを食塩水で灌流した。肝臓、心臓及び精巣上体脂肪パッドを取り出し、液体窒素中で凍結した。後肢筋及び脳も捕集して凍結した。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
下記方法に従って肝臓を抽出した。ESMSによって抽出物をTP(μg)含量に関して分析して定量化する。試験終了時に残ったいかなる組織試料も-80℃で凍結しておいた。
【００７２】
肝臓抽出
10mlのジクロロメタン（分析的等級)中に1gの肝臓を均質化した。0.1mgを二リン酸トコフェロール(内部標準)に添加した。2分間にわたって試料を均質化し、遠心分離し、上層を除去し、そして窒素下で蒸発させた。9mlのKOH(2M)を添加し、そして1時間にわたって室温で撹拌した(又は80℃で20分間)。10mlのヘキサンを添加し、震盪し、そして上層を除去した。10ml HCL(2M)を添加し、そして震盪した。10mlのヘキサンを溶液に添加し、上層を除去した。乾燥するまで最上層を蒸発させた。
【００７３】
エレクトロスプレー分析
1mlのテトラヒドロフラン(THF)を添加し、20μlの25%アンモニアを試料に添加し、そして分析した。
【００７４】
結果
【００７５】
【表４】
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【００７６】
TPをIVにより投与することによって、絶対生体利用効率に対応する値を提供した。括弧内の量は、IV値と比較したときのパーセンテージである。
【００７７】
結論
表3における上記結果が明らかに実証しているように、
(a)  トコフェロール類似体を吸収することにより、24時間以内に組織のTPレベルを向上させることができ、このことから、酢酸基が生物学的に除去され、リン酸基によって置換されていることを推察することができ、
(b)  リン酸塩への転換が必要とならないので、TPは酢酸トコフェロールよりも高い生体利用効率を有する。
【００７８】
このことは、TPの生体利用効率を高めると、組織の電子伝達物質濃度を治療上有効なレベルにまで急速に上昇させ得ることを意味する。
【００７９】
実施例3：
この実施例により、実施例1において概要を示した分析法を用いて、通常の食事における一般消費用食品中に、リン酸トコフェロールが存在するか否かを検査する。
表4は、ニワトリの脂肪、筋肉及び卵におけるTP分析の結果を示す。
【００８０】
【表５】
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【００８１】
【表６】
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【００８２】
種々の一般消費用チキン製品において明らかに大量のTPが検出された。このことは、鶏肉、脂肪及び卵を含有する通常の食事においてTPが消費されることを意味し、この化合物が、長年にわたって安全に使用されていることに関連していることを示唆する。しかし重要なのは、疾患に介入するのに必要なレベルが、これらの源に由来するものでは不十分であり、TPの付加的な投与が必要となる点である。
【００８３】
本明細書及び特許請求の範囲に使用された「含む」という語及び「含む」という語の形は、変更形又は付加形を排除するように本発明を限定するものではない。
【００８４】
本発明の変更形及び改善形が当業者には容易に明らかとなる。このような変更形及び改善形は、本発明の範囲内に入るものとする。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図1は、ESMSを使用したTP対T2Pの校正曲線を示す図である。
【図２】図2は、メチル化肝臓抽出物及びTP標準のGCMSを示す図である。
【図３】図3は、ESMSスペクトルの例を示す図である。
【図４】図4は、肝臓抽出物のESMSスペクトルの例を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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