(57)【要約】オリゴヌクレオチドの調製方法が提供される。本プロセスは、固体担体に結合されているオリゴヌクレオチドの構築を含む。固体担体は、重合性単位に結合されている保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖を含むモノマーの重合を含むプロセスにより調製される。保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は、2〜10個のC2-4 アルキレンオキシ基を含み、ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は、酸−レイビル保護基、好ましくは場合によっては置換されているトリチル基で保護されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体担体に結合しているオリゴヌクレオチドの構築を含むオリゴヌクレオチドの調製方法であって、固体担体は、重合性単位に結合している保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖を含むモノマーの重合を含むプロセスによって調製され、保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は2〜10個のC2-4 アルキレンオキシ基を含み、ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は酸−レイビル保護基、好ましくは場合によっては置換されているトリチル基で保護されている、方法。
【請求項２】
前記固体担体は、式（1）：
【化１】
2005534629.tif 000007
（式中、
R1 は、場合によっては置換されているエチレン基であり；
R2-4 は、独立に、水素、ヒドロカルビル、ハロゲンもしくはヒドロカルビルオキシであり；
R5 は、場合によっては置換されているトリチル基であり；
n は2〜10である）
のモノマーの重合を含むプロセスによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
R1 は式R5−O−［C2-4アルキレン−O］−の基に対してパラ位にあり、R1 は未置換エチレン基であり、R2-4 はそれぞれHであり、C2-4 アルキレン基は−CH2CH2−であり、n は4である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
重合は架橋を作る条件下で生じる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイトアプローチにより構築される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドは、開裂性リンカーを介して固体担体に結合している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
開裂性リンカーは、スクシニルリンカー、オキサリルリンカーもしくはトリチルリンカーである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、オリゴヌクレオチドを固体担体から開裂させることを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドは、固体担体からの開裂の前、固体担体からの開裂に伴い、もしくは固体担体からの開裂の後に、脱保護される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式Ps−Z−Q
（式中、
Psは、重合性単位に結合している保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖を含むモノマーの重合を含むプロセスによって得られたポリマーを表し、保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は2〜10個のC2-4 アルキレンオキシ基を含み、ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は酸−レイビル保護基、好ましくは場合によっては置換されているトリチル基で保護されている；
Zは、単結合もしくは開裂性リンカーを表し；
Qは、H、保護基、ヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドを表す、ただしZが単結合を表す場合にはQはHではない）
を有する化合物。
【請求項１１】
Zは、式−Y2−L−Y3（式中、Y2 は単結合、−C(O)−、−C(O)NR17−又は−C(O)O−を表し、Y3 は単結合、−C(O)−、−C(O)NR17−、−NR17−C(O)−、−C(O)O−、−O−C(O)−、−NR17−もしくは−O−を表し、R17 は−H、置換もしくは未置換脂肪族基又は置換もしくは未置換脂芳香族基であり、Lは結合基である）の基である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
LはC2-4 アルキレン基である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
式：
【化２】
2005534629.tif 000008
（式中、Rx は酸−レイビル保護基であり、Ry はH、F、アリル、OMe、OCH2CH2OMe又は塩基レイビルもしくはシリル−保護基により保護されているヒドロキシであり、BはH、保護されたアデニン部位、保護されたグアニン部位もしくは保護されたシトシン部位又は場合によっては保護されたチミン部位、場合によっては保護されたウラシル部位もしくは場合によっては保護されたヒポキサンチン部位である）
の請求項１２に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの調製方法及び該方法において使用するための化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
PCT/GB99/02193は、固相有機合成（SPOS）における担体としての使用が見いだされる一連の新規なポリマー樹脂担体を開示する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
我々は、特定のプロセスにより調製されたポリマーがオリゴヌクレオチドの調製に特に適することを知見した。
本発明の第１の側面によれば、重合性単位に結合されている保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖を含むモノマーの重合を含むプロセスにより調製される固体担体に付けられたオリゴヌクレオチドの構築を含むオリゴヌクレオチドの調製方法が提供される。ここで、保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は、2〜10個のC2-4 アルキレンオキシ基を含み、ヒドロキシポリC2-4アルキレンオキシ鎖は酸レイビル（acid labile）保護基、好ましくは場合によっては置換されているトリチル基で保護されている。
【０００４】
本発明によるモノマーに結合されているヒドロキシポリC24アルキレンオキシ鎖は、しばしば、ヒドロキシポリエチレンオキシ（HO（CH2CH2O）2-10−）鎖、ヒドロキシポリプロピレンオキシ（HO（CH2CH（CH3）O）2-10−）鎖及びヒドロキシポリブチレンオキシ（HO（CH2CH（C2H5）O）2-10−）鎖から選択される。本発明の好ましい実施形態において、ヒドロキシポリC2-4アルキレンオキシ鎖は、ヒドロキシポリエチレンオキシである。
【０００５】
ヒドロキシポリC2-4アルキレンオキシ鎖中のC2-4アルキレンオキシ基の数は、2〜10の範囲でよいが、好ましくは2〜8の範囲であり、より好ましくは3〜5の範囲である。最も好ましくは、ヒドロキシポリC2-4アルキレンオキシ鎖中に4個のC2-4アルキレンオキシ基がある。
【０００６】
本発明の非常に好ましい実施形態において、ヒドロキシポリC2-4アルキレンオキシ鎖は、ヒドロキシテトラエチレンオキシ（HO（CH2CH2O）4−）である。
本発明によるモノマーの重合性単位は、しばしば、場合によっては置換されているスチレン、アクリレート及びアクリルアミドから選択される。本発明の好ましい実施形態において、重合性単位は、場合によっては置換されているスチレン、場合によっては置換されているメチルスチレン、場合によっては置換されているエチル（メタ）アクリレート、場合によっては置換されているプロピル（メタ）アクリレート又は場合によっては置換されているN−メチル（メタ）アクリルアミドである。
【０００７】
本発明の非常に好ましい実施形態において、重合性単位は、場合によっては置換されているスチレン又は場合によっては置換されているメチルスチレンである。
重合性単位が場合によっては置換されているスチレン又は場合によっては置換されているメチルスチレンである場合、スチレンのフェニル環は、好ましくは、しばしばメチル、エチル、プロピル、フロロ、クロロ及びブロモから選択される1個もしくは2個の置換基で場合によっては置換されている。
【０００８】
重合性単位が場合によっては置換されているスチレン又は場合によっては置換されているメチルスチレンである場合、好ましくは保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は、フェノキシエーテル結合、すなわち、場合によっては置換されているスチレン又は場合によっては置換されているメチルスチレンのフェニル環に直接結合されている酸素原子を介して、場合によっては置換されているスチレン又は場合によっては置換されているメチルスチレンに結合されている。
【０００９】
酸レイビル（Acid labile）保護基は、酸性条件下で不安定な基である。酸レイビル（Acid labile）保護基としては、ポリ−アリールメタン保護基を挙げることができる。
ポリ−アリールメタン保護基としては、場合によっては置換されているジ−アリールメタン及び場合によっては置換されているトリ−アリールメタンを挙げることができる。任意の置換基は、アリール基の１種以上に存在していてもよく、各アリール基は１種以上の置換基を有していてもよい。ジ−アリールメタンは、さらに、2個のアリールが結合している炭素上で場合によっては置換されていてもよく、好ましくは任意の置換基はアルキル基である。
アリールとは、1個の環又は2個以上の縮合環を含み得るアリール基をいう。縮合環としては、場合によってはシクロアルキル環、アリール環又は複素環を含んでいてもよい。アリール基の例としては、フェニル基、トリル基、フロロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、トリフロロメチルフェニル基、アニシル基、ナフチル基、キサンチル（xanthyl）基、ピリジル基、ピリミジル基、チオフェニル基、フラニル基、インドリル基、キノリル（quinolyl）基及びイソキノリル（isoquinolyl）基を挙げることができる。
好ましいアリール基は、場合によっては置換されているフェニル基、場合によっては置換されているナフチル基及び場合によっては置換されているキサンチル（xanthyl）基である。
【００１０】
ジ−アリールメタンの炭素を置換してもよいアルキル基としては、20個までの炭素原子、特に1〜7個の炭素原子、好ましくは1〜5個の炭素原子、最も好ましくは1〜2個の炭素原子を含む直鎖及び分枝アルキル基を挙げることができる。例としては、メチル基、エチル基、プロピル基及びイソプロピル基を挙げることができる。
【００１１】
ポリ−アリールメタンが置換されている場合、置換基は、保護基の安定性もしくは酸性条件下で保護基を除く性能に不利な影響を与えないような置換基であるべきである。任意の置換基としては、ハロゲン基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロカルビル基、アミノ基、チオール基、アシル基、ヒドロカルビル基、過ハロゲン化ヒドロカルビル基、ヘテロシクリル（heterocyclyl）基、ヒドロカルビルオキシ基、ポリ（オキシアルキレン）オキシ基、モノもしくはジ−ヒドロカルビルアミノ基、ヒドロカルビルチオ基、エステル基、カーボネート基、アミド基、スルホニル基及びスルホンアミド基を挙げることができ、ここでヒドロカルビル基は一般に上述のようなアルキル基又はアリール基である。１種以上の置換基が存在していてもよい。
【００１２】
ポリ−アリールメタン保護基の例としては、ジフェニルメチル基、ナフチルジフェニルメチル基、フェニルキサンチル［ピキシル（pixyl）］基、トリフェニルメチル［トリチル］基、ジ−メトキシフェニルフェニルメチル［ジメトキシトリチル］基、メトキシフェニル−ジ−フェニルメチル［モノメトキシトリチル］基、及び2−クロロフェニルジ−フェニルメチル［2−クロロトリチル］基を挙げることができる。
【００１３】
場合によっては置換されているトリチル基としては、トリフェニルメチル［トリチル］基、ジ−メトキシフェニルフェニルメチル［ジメトキシトリチル］基、メトキシフェニル−ジ−フェニルメチル［モノメトキシトリチル］基及び２−クロロフェニルジ−フェニルメチル［２−クロロトリチル］基を挙げることができる。
本発明の好ましい実施形態において、モノマーは、式（1）：
【００１４】
【化１】
2005534629.tif 000002
【００１５】
（式中、
R1 は、場合によっては置換されているエチレン基であり；
R2-4 は、独立に、水素、ヒドロカルビル、ハロゲン、もしくはヒドロカルビルオキシであり；
R5 は、酸レイビル（acid labile）保護基であり；
n は、2〜10である）
の化合物である。
【００１６】
好ましくは、酸レイビル（acid labile）保護基は、ポリ−アリールメタン保護基である。より好ましくは、R5 は、式：−CR6R7R8（式中、R6 は、水素、場合によっては置換されているアルキル基もしくは場合によっては置換されているアリール基であり；R7 及びR8 はそれぞれ独立に、場合によっては置換されているアリール基であるか、又はR7 及びR8 は結合して、場合によっては置換されている環を形成し得る、場合によっては置換されているアリール基である）のポリ−アリールメタン保護基である。
【００１７】
R6 で表されてもよいアルキル基は、20個までの炭素原子、特に1〜7個の炭素原子、好ましくは1〜5個の炭素原子、最も好ましくは1〜2個の炭素原子を含む直鎖及び分枝アルキル基を含む。例としては、メチル基、エチル基、プロピル基及びイソプロピル基を挙げることができる。
【００１８】
R6、R7 及びR8 で表されてもよいアリール基は、1環又は2以上の縮合環を含んでいてもよく、縮合環は場合によってはシクロアルキル環、アリール環又は複素環を含んでいてもよい。アリール基の例としては、フェニル基、トリル基、フロロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル、トリフロロメチルフェニル基、アニシル基、ナフチル基、ピリジル基、ピリミジル基、チオフェニル基、フラニル基、インドリル基、キノリル（quinolyl）基及びイソキノリル（isoquinolyl）基を挙げることができる。
好ましいアリール基は、場合によっては置換されているフェニルである。
R7 及びR8 が、それらが取り付けられる炭素原子と一緒に環を形成するように結合されている、場合によっては置換されているアリール基である場合、環は５員環、６員環又は７員環であることが好ましい。R7 とR8 とが、場合によっては置換されている環を形成するように結合されている、場合によっては置換されているアリール基である例としては、キサンチル基を挙げることができる。
【００１９】
R6、 R7 又はR8 のいずれかが置換アルキル基又は置換アリール基である場合、置換基は、保護基の安定性又は酸性条件下で保護基を除く性能に不利な影響を与えないような置換基であるべきである。任意の置換基としては、ハロゲン基、シアノ基、ニトロ基、ヒドロカルビル基、アミノ基、チオール基、アシル基、ヒドロカルビル基、過ハロゲン化ヒドロカルビル基、ヘテロシクリル基、ヒドロカルビルオキシ基、ポリ（オキシアルキレン）オキシ基、モノもしくはジ−ヒドロカルビルアミノ基、ヒドロカルビルチオ基、エステル、カーボネート、アミド基、スルホニル基及びスルホンアミド基を挙げることができ、ヒドロカルビル基は一般にアルキル基、アリール基、アルカリル基及びアラルキル基であり、アルキル基及びアリール基は上述のものである。１種以上の置換基が存在していてもよい。
【００２０】
最も好ましくは、R5 は、式：−CR6R7R8（式中、R6 は、場合によっては置換されているアリール基であり；R7 及びR8 はそれぞれ独立に、場合によっては置換されているアリール基であるか、あるいはR7 とR8 とは結合して、場合によっては置換されている環を形成し得る、場合によっては置換されているアリール基である）のポリ−アリールメタン保護基である。
【００２１】
本発明の非常に好ましい実施形態において、酸レイビル（acid labile）保護基は、場合によっては置換されているトリチル基である。
本発明の最も好ましい実施形態において、モノマーは、式（1a）：
【００２２】
【化２】
2005534629.tif 000003
【００２３】
（式中、
R1 は、場合によっては置換されているエチレン基であり；
R2-4 は、独立に、水素、ヒドロカルビル、ハロゲン、もしくはヒドロカルビルオキシであり；
R5 は、場合によっては置換されているトリチル基であり；
nは、2〜10である）
の化合物である。
【００２４】
好ましくは、R1 は、CH=CH2、CH=CHCH3、又はC（CH3）=CH2基である。最も好ましくは、R1 は、CH=CH2である。
好ましくは、R5O−［−C2-4アルキレン−O−］n 基は、R1に対してパラ位にある。
【００２５】
好ましくは、［−C2-4アルキレン−O−］nは、［−CH2CH2O−］n、［−CH2CH（CH3）O−］n又は［−CH2CH（C2H5）O−］nであり、最も好ましくは［−CH2CH2O−］nである。
好ましくは、nは2〜8であり、より好ましくは、nは3〜5である。最も好ましくは、nは4である。
【００２６】
好ましくは、R2-4 はすべて水素である。
ヒドロカルビルとしては、アルキル基、アリール基、アルカリル基及びアラルキル基を挙げることができる。好ましくは、R2-4 のいずれかがヒドロカルビル基又はヒドロカルビルオキシ基である場合、ヒドロカルビル基はアルキル基であり、最も好ましくはC1-4 アルキル基である。
【００２７】
場合によっては、本発明の方法において、保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖が2〜10個のC2-4 アルキレンオキシ基を含み、ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖が場合によっては置換されているトリチル基で保護されている、重合性単位に結合されている保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖を含むモノマーは、異性体の混合物を含んでいてもよい。
【００２８】
好ましくは、異性体の混合物が本発明の方法において用いられる場合には、モノマーは、式（1）又は（1a）の化合物である。最も好ましくは、モノマーは、R5O−［−C2-4アルキレン−O−］n 基及びR1 がフェニル環上の異性体位置（isomeric positions）を占める、異性体の混合物である。
【００２９】
モノマーは、好ましくは架橋を生ずる条件下で重合されて、オリゴヌクレオチドの調製に用いるに適切な固体担体を形成する。
好ましくは、重合性単位に結合されている保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖を含むモノマーは、架橋用モノマーの存在下で、共重合される。
【００３０】
ポリマーにおける架橋の程度は、重合反応における架橋用モノマーの濃度により決定することができる。一般に、架橋用モノマーの重量％は、0.1〜70wt%の範囲にあり、通常は1〜10wt%などの0.5〜20wt%の範囲にあり、最も好ましくは5wt%以下である。20wt%以下の架橋用モノマーを含むポリマーは、一般に膨潤性であり、一方、20wt%よりも多い架橋用モノマーを含むポリマーは一般に非膨潤性である。
【００３１】
適切な架橋用モノマーとしては、ジビニルベンゼン（DVB）又はジ／トリアクリレートもしくはジ／トリメタクリレートなどの多官能性（メタ）アクリレート、例えばエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチルプロパン（trimethylopropane）トリメタクリレート、トリビニルベンゼンもしくはN、N'−ビス−アクリロイルエチレンジアミンを挙げることができる。好ましくは、架橋用モノマーは、DVBである。
【００３２】
好ましくは、0.5〜5wt%のDVBが用いられる。最も好ましくは、1〜3wt%のDVBが用いられる。
本発明のいくつかの側面において、少なくとも5%のレベルの架橋用モノマーが、ポア形成剤（pore-forming agent）又は細孔形成剤（porogen）として作用することができる有機相と混和性である化合物と一緒に用いられてもよい。典型的な細孔形成剤（porogens）としては、制限されるものではないが、有機芳香族炭化水素、塩素化脂肪族もしくは芳香族炭化水素及び環式脂肪族エーテルなどのポリマーに対する良好な溶剤である有機化合物や、脂肪族アルコール、ケトン、脂肪族炭化水素、脂肪族カルボン酸及び直鎖ポリマーなどの得られるポリマーに対する貧溶剤である有機化合物を挙げることができる。好ましい細孔形成剤（porogens）は、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、2−エチル−1−ヘキサノール、2−オクタノール、1デカノール、1−ドデカノール、アセトン、ブタノン、n−ヘプタン、n−デカン、1−デカン酸及び分子量500〜5000000 g/molの直鎖ポリスチレンから選択され得る。得られるポリマーは、実質的に非膨潤性挙動を示し、一般にメソ−〜マクロ−細孔特性を有し、これによってモード試薬（mode reagents）は、ポリマー−結合官能基に近づくことができる。
【００３３】
場合によっては、本発明の方法において、重合性単位に結合されている保護ヒドロキシポリC2-4アルキレンオキシ鎖を含むモノマーは、スチレン、たとえばスチレン、ヒドロキシスチレン、メトキシスチレン、メチルスチレン、ヒドロキシメチルスチレン及びクロロメチルスチレン；アクリル酸のエステル及び（メタ）アクリル酸のエステル、たとえばメチルアクリレート、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート及びヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート；アクリルアミド、たとえばN−メチルアクリルアミド及びN−メチロール（メタ）アクリルアミドから選択される１種以上のコモノマーの存在下で、共重合される。ここで、スチレン中のフェニル環は、場合によっては、メチル、エチル、ピロピル、フロロ、クロロ及びブロモからしばしば選択される1又は2の置換基で置換されており、コモノマー中に存在し得るヒドロキシ基、特にフェノール性ヒドロキシ基は場合によっては保護され続いて脱保護されてもよい。用いられる任意のコモノマーは、保護ヒドロキシ基を含まないか又はヒドロキシ基で保護されていないことが好ましい。
【００３４】
好ましい重合において、保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖が2〜10個のC2-4 アルキレンオキシ基を含み、ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は場合によっては置換されているトリチル基で保護されている、重合性単位に結合されている保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖を含むモノマーは、１種以上の架橋用モノマー、及びスチレン、アクリル酸のエステル及び（メタ）アクリル酸のエステル、又はアクリルアミドから選択される１種以上のモノマーの存在下で共重合される。
【００３５】
非常に好ましい重合において、保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖が2〜10個のC2-4 アルキレンオキシ基を含み、ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は場合によっては置換されているトリチル基で保護されている、重合性単位に結合されている保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖を含むモノマーは、DVB及びスチレンの存在下で共重合される。
【００３６】
固体担体が、保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖が2〜10個のC2-4アルキレンオキシ基を含み、ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖が酸レイビル（acid labile）保護基、好ましくは場合によっては置換されているトリチル基で保護されている、重合性単位に結合されている保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖を含むモノマーと、スチレン、アクリル酸のエステル及び（メタ）アクリル酸のエステル、又はアクリルアミドから選択される１種以上のモノマーと、の混合物の重合により製造される場合、重合性単位に結合されている保護ヒドロキシポリC2-4アルキレンオキシ鎖を含むモノマーの重量％は、好ましくは1〜99%の範囲であり、より好ましくは5〜80%の範囲であり、最も好ましくは15%〜70%の範囲である。
【００３７】
本発明の方法は、好ましくは、水性懸濁重合により行われる。モノマーは、水中、液滴（1〜1000μm）として懸濁される。通常は、液滴の凝固を防止するために、たとえばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリアルキレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はエチルセルロースなどのセルロール誘導体、硫酸バリウム、硫酸マグネシウム又は硫酸ナトリウムなどの安定剤が添加される。懸濁液は、さらに通常は、懸濁を維持するために撹拌される。
【００３８】
場合によっては、有機非水混和性溶剤を重合プロセスに用いてもよい。有機非水混和性溶剤は、水性懸濁重合における液滴形成を補助し得るか、あるいは細孔形成剤（porogens）として作用し得る。
【００３９】
場合によっては、水性懸濁重合中、水相に無機塩を添加してもよい。無機塩は、水性媒体中でのモノマー溶解性を抑制することによって、液滴形成を補助し得る。
遊離ラジカル開始剤は、重合を開始するために、好ましく用いられる。開始剤のタイプは、一般に、用いられるモノマーに基づいて選択され得る。好ましい遊離ラジカル開始剤の例としては、ベンゾイルパーオキシド、ジオクタノイルパーオキシド、ラウロイルパーオキシド、2,2'−アゾビスイソブチロニトリル及び2,2'−アゾビス（2,4−ジメチルバレロニトリル）を挙げることができる。
【００４０】
重合は、典型的には、混合物を15℃〜160℃の範囲、好ましくは50℃〜90℃の範囲に加熱することにより補助される。混合物が加熱される温度は、用いられるモノマー及び開始剤のタイプに依存することが認められるであろう。
【００４１】
得られたポリマーは、次いで、テトラヒドロフラン、メタノール及び水などの適切な溶剤で洗浄されて、乾燥され、例えば篩い分けによってビーズ寸法で分級されてもよい。
オリゴヌクレオチドの調製において用いるために、酸−レイビル保護基は、遊離ヒドロキシ基を含む架橋ポリマーを与えるために、所与の保護基を除くための当該分野で公知の方法により、固体担体から除かれる。特に、場合によっては置換されているトリチル基の除去に適切な方法としては、たとえば酸加水分解を挙げることができる。一般に、溶剤中ジクロロ酢酸もしくはトリフロロ酢酸などの、場合によっては置換されている酢酸と、メチレンクロライドもしくはトルエンなどの混合物を用いることができる。反応条件及び試薬の一般的ガイダンスである「Advanced Organic Chemistry、第４版」Jerry March著、John Wiley & Sons 1992発行を参照されたい。理解されるように、他の方法も酸レイビル（acid labile）保護基を除くために用いられてもよく、たとえば中性条件下でヨウ素の使用はトリチル基を除くために用いられてもよく、光分解はピキシル（pixyl）基を除くために用いられてもよい。
【００４２】
遊離ヒドロキシ基を含む架橋ポリマーは、通常は、10μm〜2000μmの寸法範囲を有するビーズとして製造される。好ましくは、ビーズ寸法は、50μm〜1000μmの範囲であり、最も好ましくは75μm〜500μmの範囲である。架橋ポリマービーズは、一般に、水性懸濁重合プロセスにより製造される（たとえば、本願明細書に参照として組み込まれるJournal of Applied Polymer Science、1982、27、133-138参照）。
【００４３】
担体から保護基が除かれた際に得られるポリマー担体は、好ましくは、ポリマー１グラムあたり0.1〜約5 meq（ミリ当量）、たとえば4.8 meq以下、しばしば0.5〜3.5 meq、一般には1.0〜3.3 meq、たとえば1.5〜3meqのヒドロキシ官能基を有する。多くの実施形態において、保護基が除かれた際に得られるポリマー担体は、ポリマー１グラムあたり0.5〜2 meqのヒドロキシを有する。
【００４４】
オリゴヌクレオチド合成は、固体担体の官能基に直接取り付けることによって行うことができる。しかし、多くの実施形態において、開裂性リンカーを用いて、官能基を介してオリゴヌクレオチドを固体担体に取り付けることが好ましい。このようなリンカーの例は、当該分野において周知であり、特に、スクシニル（succinyl）リンカー、オキサロイル（oxaloyl）リンカー及びトリチルリンカーを挙げることができる。
【００４５】
本発明の方法により調製することができるオリゴヌクレオチドとしては、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、及びデオキシリボ−及びリボヌクレオシドの混合物を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができる。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド化学の分野で知られている１種以上の変性剤により変性されてもよく、たとえば、リボヌクレオシド部位は、メトキシ基又はメトキシエトキシ基などの2'−アルコキシ基の存在により、１個以上の2'−位にて変性されてもよい。デオキシリボヌクレオシド部位は、ハロ基、特にフロロ基などの置換基の存在により、又はアリル基などのアルケニル基により、2'−位にて変性されてもよい。脱塩（abasic）ヌクレオシド部位もまた存在していてもよい。１種以上の固定された（locked）ヌクレオシドが存在していてもよい。多くの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、天然のD−異性体の形態であろう。しかしオリゴヌクレオチドの数種もしくは全部が天然ではない異性体、たとえばL−異性体もしくはB−アノマーを全体としてもしくは部分的に表してもよい。インターヌクレオシド結合は、天然のホスフェートであってもよく、又は１以上の改質された結合、たとえばホスホロチオエートもしくはホスホアミダイト（phosphoramidate）結合が存在していてもよい。完全にホスホロチオエート化されたかもしくは完全にホスホアミダイト化されたオリゴヌクレオチドが存在していてもよい。
【００４６】
オリゴヌクレオチドは、１種以上の保護基を含むものでもよい。このような保護基の例及び保護するために用いることができる位置の例は、当業者には周知であり、トリチル基、モノメトキシトリチル基及びジメトキシトリチル基、レブリノイル（levulinoyl）基、イソブチリル基、ベンゾイル基、トリアルキルシリル基などのシリル基、たとえばt−ブチルジメチルシリル基、アセチル基及びBOC及び特にFMOCなどのカーボネート基を含む。
【００４７】
オリゴヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、7−デアザグアニン、7−デアザ−8−アザグアニン、5−プロピニルシトシン、5−プロピニルウラシル、7−デアザアデニン、7−デアザ−8−アザアデニン、7−デアザ−6−オキソプリン、6−オキソプリン、3−デアザアデノシン、2−オキソ−5−メチルピリミジン、2−オキソ−4−メチルチオ−5−メチルピリミジン、2−チオカルボニル−4−オキソ−5−メチルピリミジン、4−オキソ−5−メチルピリミジン、2−アミノプリン、5−フロロウラシル、2,6−ジアミノプリン、8−アミノプリン、4−トリアゾロ−5−メチルチミン、4−トリアゾロ−5−メチルウラシル及びヒポキサンチンを含む天然及び／又は非天然の核酸塩基（nucleobase）を含むものでもよい。
【００４８】
オリゴヌクレオチドは、固体担体上でのオリゴヌクレオチドの構築について当業者に知られた方法によって調製することができる。多くのこのようなアプローチにおいて、反応性リン−含有基は、新生オリゴヌクレオチド（oligonucleoide）における反応性サイトと結合して、インターヌクレオチドリン結合を形成する。適切な方法の例としては、ホスホトリエステルアプローチ、H−ホスホネートアプローチ、及び特にホスホアミダイトアプローチを挙げることができる。新生オリゴヌクレオチドは、一般に、最初は、ヌクレオシド、又はヌクレオシド類似体（analogue）を含み、好ましくは開裂性リンカーを介して固体担体に結合されている。多くの実施形態において、新生オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドを含み、最も好ましくは固体担体における3'位を介して結合されている。固体担体への結合の他の方法は当該分野で知られており、本発明において適用可能であり、たとえば核酸塩基を介しての結合、及びリボ−及びデオキシリボヌクレオシドの2'−位もしくは5'−位を介しての結合を含む。反応性サイトは、遊離アミノ又はチオール部位を含み得るが、好ましくは遊離ヒドロキシ基である。新生オリゴヌクレオチドは、適切な保護基で保護された反応性サイトで固体担体に結合されてもよい。したがって、保護基は、オリゴヌクレオチドの構築の前に取り除かれる。反応性サイトがデオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシドの5'−位であることが最も好ましい。
【００４９】
ホスホトリエステルアプローチが用いられる場合、典型的には、活性化された保護ヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドリン酸エステルがアルコールと反応して、インターヌクレオチドホスホジエステル結合を形成する。ホスホトリエステルアプローチにおいて用いるための活性化物質は、当該分野で周知であり、たとえばスルホニルクロライドを含む酸クロライドを挙げることができる。
【００５０】
H−ホスホネートアプローチが用いられる場合、典型的には、保護ヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドH−ホスホネートモノエステルは、遊離ヒドロキシ基を含む新生オリゴヌクレオチドと結合して、保護オリゴヌクレオチドH−ホスホネートジエステルを形成する。カップリングは、好ましくはカップリング剤の存在下で生じる。保護オリゴヌクレオチドH−ホスホネートジエステルは、脱保護されて、遊離ヒドロキシ基を含む新生オリゴヌクレオチドを形成してもよく、次いでヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドH−ホスホネートモノエステルとさらに結合することができる。プロセスは、所望のシーケンスが構築されるまで、必要な回数だけ繰り返すことができる。所望のシーケンスの構築の完了時に、H−ホスホネートジエステル結合は酸化もしくは硫化されて、ホスフェートもしくはホスフォロチオエートオリゴヌクレオチドを形成してもよい。あるいは、酸化もしくは硫化は、各カップリングの後に行われてもよい。H−ホスホネートアプローチにおいて用いるために適切なカップリング剤及び硫化剤は、当該分野で周知であり、本願明細書に参照として組み込まれるWO99/09041及び国際特許出願PCT/GB02/005177に開示されているものを挙げることができる。
【００５１】
好ましい反応性リン−含有基は、ホスホアミダイト基である。ヌクレオシドホスホアミダイトは、新生オリゴヌクレオチド上の遊離ヒドロキシ基と有利に結合し、好ましくは3'−ヌクレオシドホスホアミダイトと遊離5'−ヌクレオシドヒドロキシ基とを結合させる。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレシド−3'−ホスホアミダイトもしくはリボヌクレシド−3'−ホスホアミダイトを遊離5'−ヒドロキシ基を含む新生オリゴヌクレオチドと結合させることにより、好ましくは調製される。しかし、本発明によるプロセスは、5'−ホスホアミダイトを遊離3'−ヒドロキシ基に結合させる場合にも同様に適用することができることは認識されるであろう。
【００５２】
好ましいホスホアミダイトは、式：
【００５３】
【化３】
2005534629.tif 000004
【００５４】
（式中、R4 は保護基、好ましくはトリチル基、モノメトキシトリチル基もしくはジメトキシトリチル基であり、B はヌクレオシド塩基であり、R5 は−H、−F −OR6、−NR7R8、−SR9、又はメチルもしくはアリルなどの置換もしくは未置換脂肪族基である）
の化合物である。PGは、リン保護基であり、一般的にオリゴヌクレオチド合成に用いられる開裂性リン保護基であり、好ましくは置換もしくは未置換脂肪族基又は式：−OCH2CH2CN、−SCH2CH2CN、−OR11、−SR11、−O−CH2CH2−Si(CH3)2C6H5、−O−CH2CH2−S(O)2−CH2CH3、−O−CH2CH2−C6H4−NO2、−S−CH2CH2−Si(CH3)2C6H5、−S−CH2CH2−S(O)2−CH2CH3、又は−S−CH2CH2−C6H4−NO2の基を表す。R6 は−H、置換もしくは未置換脂肪族基（例えば、メチル、エチル、メトキシエチル又はアリル）、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換アラルキル、アルコール保護基、特に塩基−レイビル（labile）もしくはシリル保護基、又は−(CH2)q−NR12R13を表す。R7 及びR8 はそれぞれ、独立に、−H、置換もしくは未置換脂肪族基、又はアミン保護基である。あるいは、R7 とR8 とはそれらが結合している窒素と一緒にヘテロシクリル（heterocyclyl）基を形成する。R9 は−H、置換もしくは未置換脂肪族基、又はチオール保護基を表す。R11 は、置換もしくは未置換脂肪族基、置換もしくは未置換アリール基又は置換もしくは未置換アラルキル基を表す。R12 及びR13 はそれぞれ、独立に、−H、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換ヘテロアリール基、置換もしくは未置換脂肪族基、置換もしくは未置換アラルキル基、置換もしくは未置換ヘテロアラルキル基又はアミン保護基である。あるいは、R12 とR13 とはそれらが結合している窒素と一緒にヘテロシクリル基を形成する。q は、1〜約6の整数である。各R16 は、独立に、C1-6 アルキル基、好ましくはイソプロピル基であり、または基N(R16)2 は複素環基を表す。用いられるホスホアミダイトは、一般に、βシアノエチルオキシ−N、N−ジイソプロピルホスホアミダイトである。
【００５５】
好ましいホスホアミダイトに存在し得るアミン、アルコール及びチオール保護基は、当業者には周知である。たとえば、アミン保護基については、Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis (1991)、John Wiley & Sons, Inc., pages 309-405参照、この教示内容は、全体として本願明細書に取り込まれる。好ましくは、アミンは、アミド又はカルバメートとして保護される。たとえばヒドロキシ保護基については、Id., pages 10-142参照、この教示内容は全体として本願明細書に取り込まれる。たとえばチオール保護基については、Id., pages 277-308参照、この教示内容は全体として本願明細書に取り込まれる。R4 によって表される以外に存在し得る保護基は、好ましくはR4で表される保護基に対して直交するように選択される。
【００５６】
本発明の方法において用いることができる活性化物質は、オリゴヌクレオチド合成の分野で周知である。適切な活性物質の例としては、テトラゾール、S−エチルテトラゾール及びS−フェニルテトラゾールなどの置換テトラゾール誘導体、及びジシアノイミダゾールなどの置換イミダゾール誘導体を挙げることができる。
【００５７】
好ましい活性化物質としては、ヘテロ芳香族環に４個以内の窒素原子を含むヘテロ芳香族化合物の塩、特に１個もしくは２個の窒素原子を含有する5員環もしくは6員環を含むヘテロ芳香族化合物を挙げることができる。例としては、PCT出願WO 99/62922（参照として組み込まれる）に開示されているようなピリジニウム、イミダゾリニウム及びベンズイミダゾリニウム塩、特にヘキサフロロホスフェート、テトラフロロボレート、トリフラート、ヒドロクロライド、トリフロロアセテート、ジクロロアセテート、O−メシル、O−トシル、ブロマイドもしくはトリフロロスルホニル塩；ベンゾトリアゾール及びその誘導体、特にヒドロキシベンゾトリアゾール；及びサッカリンもしくはサッカリン誘導体、好ましくは有機塩基と一緒に形成された塩−複合体として用いられるもの、特にサッカリンのN−メチルイミダゾール、ピリジンもしくは3−メチルピリジン塩を挙げることができる。
【００５８】
用いることができるサッカリンもしくはサッカリン誘導体は、好ましくは一般式I：
【００５９】
【化４】
2005534629.tif 000005
【００６０】
を有する。
式I中、pは0もしくは1〜4の整数である。各場合においてRは置換基であり、好ましくはそれぞれ独立に、ハロ、置換もしくは未置換脂肪族基、−NR1R2、−OR3、−OC(O)R3、−C(O)OR3、シアノ、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロシクリル、−CHO、−COR3、−NHCOR3、置換もしくは未置換アラルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、トリフロロメチル及びトリクロロメチル）、又は−SR3である。好ましくは、Rはハロ、置換もしくは未置換脂肪族基、−NR1R2、−OR3、−OC(O)R3、−C(O)OR3、又はシアノである。あるいは、２個の隣接するR基はそれらが結合している炭素原子と一緒に6員飽和環もしくは6員不飽和環を形成する。好ましくは、形成された6員環は芳香族環である。R1 及びR2 はそれぞれ、独立に、−H、置換もしくは未置換脂肪族基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換アラルキル基；またはそれらが結合している窒素と一緒にヘテロシクリル基を形成する。R3 は置換もしくは未置換脂肪族基、置換もしくは未置換アリール基、又は置換もしくは未置換アラルキル基である。XはO又はSである。好ましくは、XはOである。XがOでpが0であることが特に好ましい。
【００６１】
存在し得る適切な置換基としては、アリール基、ハロゲン化アリール基、アルキル基、ハロゲン化アルキル（例えば、トリフロロメチル及びトリクロロメチル）、脂肪族エーテル、芳香族エーテル、ベンジル、置換ベンジル、ハロゲン、特にクロロ及びフロロ基、シアノ、ニトロ、−S−（脂肪族基もしくは置換脂肪族基)、及び−S−（芳香族もしくは置換芳香族）基である。
【００６２】
好ましくはサッカリンもしくはサッカリン誘導体は、有機塩基との塩複合体として用いられる。
サッカリンもしくはサッカリン誘導体との塩−複合体を形成することができる有機塩基は、pH 7にてプロトンを受容する傾向を有する有機化合物である。好ましい有機塩基は、二級アミン、三級アミン又はアザヘテロシクリル塩基であり、これらの各々は１種以上の置換基で置換されているかもしくは未置換であってよい。非プロトン性有機塩基は、プロトンを受容する前にはその化学構造中に水素結合部位を有していない有機塩基である。三級アミンや非プロトン性アザヘテロシクリル化合物などの非プロトン性有機塩基は、本明細書に記載されているように、好ましくは式1の化合物と一緒に用いられる。
【００６３】
本明細書にて用いられているようなアザヘテロシクリル塩基としては、芳香族環中に１個以上の窒素原子を有するヘテロアリール基や、非芳香族環系に少なくとも１個の窒素原子を有するヘテロアリシクリル（alicyclyl）基を挙げることができる。好ましくは、アザヘテロアリール塩基は、芳香族環中の１〜３個の窒素に起因する5員もしくは6員の芳香族環を有する。好ましくは、アザヘテロアリシクリル（alicyclyl）化合物は、5員環もしくは6員環であり、一般に環中に１個又は２個の窒素を含む。アザヘテロシクリル塩基の例としては、ピリミジン、1−アルキルピラゾール、特に1−（C1-4 アルキル）ピラゾール、1−アリールピラゾール、1−ベンジルピラゾール、ピラジン、N−アルキルプリン、特にN−（C1-4 アルキル）プリン、N−アリールプリン、N−ベンジルプリン、N−アルキルピロール、特にN−（C1-4 アルキル）ピロール、N−アリールピロール、N−ベンジルピロール、ピリジン、N−アルキルイミダゾール、特にN−（C1-4 アルキル）イミダゾール、N−アリールイミダゾール、特にN−フェニルイミダゾール、N−ベンジルイミダゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン（quinoxaline）、キナゾリン（quinazoline）、N−アルキルインドール、特にN−（C1-4 アルキル）インドール、N−アリールインドール、N−ベンジルインドール、N−アルキルベンズイミダゾール、特にN−（C1-4 アルキル）ベンズイミダゾール、N−アリールベンズイミダゾール、N−ベンジルベンズイミダゾール、トリアジン、チアゾール、1−アルキル−7−アザインドール、特に1−（C1-4 アルキル）−7−アザインドール、1−アリール−7−アザインドール、1−ベンジル−7−アザインドール、ピローリジン、モルフォリン、ピペリジン、及びピペラジンを挙げることができる。特に好ましいアザヘテロシクリル塩基は、ピリジンや3−メチルピリジンなどのピリジン、及びN−メチルイミダゾールなどのN−（C1-4 アルキル）イミダゾールである。
三級アミンは、３個の炭素原子、しばしば３個のアリール、一般にフェニル及び／又はアルキル基、一般に３個のアルキル基に結合している窒素原子を有する有機塩基であり、たとえば、トリメチルアミン、トリエチルアミン及びジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミンを挙げることができる。加えて、三級アミンは、窒素原子が非プロトン性であるアザヘテロシクリル基であってもよい。アザヘテロシクリル基である三級アミンが好ましい。アザヘテロシクリル三級アミンの例としては、N−アルキルピロリジン、N−アリールピロリジン、N−アルキルピロール、N−アリールピロール、N−アルキルモルフォリン、N−アリールモルフォリン、N−アルキルピペリジン、N−アリールピペリジン、N,N−ジアルキルピペラジン、N,N−ジアリールピペラジン、N−アルキル−N−アリール−ピペラジン、キヌクリジン（quinuclidine）、1,5−ジアザビシクロ［4.3.0］ノン−5−エン及び1,8−ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデク−7−エンを挙げることができる。三級アミンは、さらに、アザヘテロアリールもしくはアザヘテロアリシクリル（alicyclyl）化合物であってもよい。
二級アミンは、単独の水素及び２個の炭素原子に結合している１個の窒素を含む有機塩基である。一般に、窒素原子は、２個のアルキル基もしくはアリール基に結合しているか、又はアザ複素環基の部分を形成する。二級アミン化合物の例としては、ジエチルアミン及びジイソプロピルアミンを挙げることができる。
特に好ましい有機塩基としては、ピリジン、3−メチルピリジン及びN−メチルイミダゾールを挙げることができる。
【００６４】
本発明によるプロセスは、硫化工程、酸化工程及びキャッピング工程を含むホスホアミダイト化学を用いるオリゴヌクレオチドの固相合成のために慣用的に行われるようなプロセス工程を用いることができる。
【００６５】
硫化剤を用いる場合、好ましくは、硫化剤は有機硫化剤である。
有機硫化剤の例としては、3H−ベンゾジチオール−3−オン1,1−ジオキサイド（"Beaucage 試薬"とも呼ばれる）、ジベンゾイルテトラスルフィド、フェニルアセチルジスルフィド、N,N,N',N'−テトラエチルチウラムジスルフィド、原子状硫黄及び3−アミノ−［1,2,4］−ジチアゾール−5−チオン（本願明細書に参照として取り込まれる米国特許U.S. Patent No. 6,096,881参照）を挙げることができる。
【００６６】
上述の薬剤を用いるオリゴヌクレオチドの硫化のための典型的な反応条件は、 Beaucage, et al., Tetrahedron (1993)、49:6123（本願に参照として組み込まれる）に見いだすことができる。
【００６７】
好ましい硫化試薬は、キサンタン（xanthane）ヒドライド、3−アミノ−［1,2,4］−ジチアゾール−5−チオン及びフェニルアセチルジスルフィドである。
オリゴヌクレオチドの硫化は、たとえば、ピリジン／アセトニトリル（1：9）混合物もしくはピリジンなどの有機溶剤中、約0.05 M〜約0.2 M濃度の3−アミノ−［1,2,4］−ジチアゾール−5−チオン溶液を用いて、行うことができる。
【００６８】
用いることができる酸化剤の例としては、ヨウ素及びt−ブチルヒドロパーオキシドなどの過酸化物を挙げることができる。
所望のオリゴヌクレオチドは、たとえば、一般には5'−保護である保護ヌクレオシドホスホアミダイトを遊離ヒドロキシ基と結合させる工程と、結合工程において形成された保護リン酸トリエステルを酸化もしくは硫化させてホスフェートもしくはホスフォロチオエートオリゴヌクレオチドを形成する工程と、オリゴヌクレオチドから保護基を取り除く工程と、所望のシーケンスが構築されるまで、サイクルを繰り返す工程と、を含む逐次工程により調製することができる。オリゴヌクレオチドは、固体担体から開裂させることができ、核酸塩基及びリン保護基等の任意の残余保護基は当該分野で公知の条件を用いて取り除くことができる。
【００６９】
本発明によるプロセスは、好ましくは固体担体を膨潤させる溶剤の存在下で行われる。溶剤の性質は、用いられる固体担体の性質に基づいて選択されるであろうことは認識されるであろう。適切な溶剤の例は、当該分野で周知であり、特にアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、N−メチルピロリドン、ジクロロメタン、THF及びピリジンを挙げることができる。
【００７０】
本発明によるプロセスは、たとえば、カラム、撹拌容器及び固定床反応器を含む広範囲な適切な反応容器内で行うことができる。
本発明によるプロセスは、別のヒドロキシアルキレンオキシ誘導固体担体を用いるプロセスと比較して、オリゴヌクレオチドの合成をより効率的に行うことができる。
【００７１】
本発明の別の側面によれば、式：Ps−Z−Q（式中：Psは、重合性単位に取り付けられた保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖（ここで、保護ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は2〜10個のC2-4 アルキレンオキシ基を含み、ヒドロキシポリC2-4 アルキレンオキシ鎖は酸−レイビル保護基、好ましくは場合によっては置換されているトリチル基で保護されている）を含むモノマーの重合を含むプロセスにより得られたポリマーを表し；Zは、単結合もしくは開裂性リンカーを表し；QはH、保護基、ヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドを表す、ただし、Zが単結合を表す場合にQはHではない）を有する化合物が提供される。
【００７２】
Psによって表すことができるポリマーは、上述のものである。
Zが開裂性リンカーを表す場合には開裂性リンカーはポリ（アルキレンオキシ）鎖の末端原子に結合し、同様にZが単結合を表す場合には基Qがポリ（アルキレンオキシ）鎖の末端原子に結合していることは認識されるであろう。この原子は、最も一般的には酸素原子であるが、ポリマーが誘導されたものである場合には異なる原子、たとえば窒素原子であってもよい。
【００７３】
Zは、好ましくは式 −Y2−L−Y3（式中、Y2 は単結合、−C(O)−、−C(O)NR17−もしくは−C(O)O−を表し、Y3 は単結合、−C(O)−、−C(O)NR17−、−NR17−C(O)−、−C(O)O−、−O−C(O)−、−NR17−もしくは−O−を表し、Lは好ましくは置換もしくは未置換脂肪族基又は置換もしくは未置換脂芳香族基、典型的には6個までの炭素原子を含む結合基を表す）の基である。より好ましくは、Lは、C2-4 アルキレン基、特にエチレン基である。R17 は−H、C1-4 アルキル、特にメチル基などの置換もしくは未置換脂肪族基又は特にフェニル基などの置換もしくは未置換芳香族基を表す。最も好ましくは、Zは式−CO−CH2CH2−CO−O−の基である。
【００７４】
Qにより表すことができる保護基は、Zの性質に従って選択され、アミン保護基及びヒドロキシ保護基、好ましくは酸レイビルヒドロキシ保護基、特にモノ−及びジ−メトキシトリチル基などの場合によっては置換されているトリチル基を含む。
【００７５】
Qにより表すことができるヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドは、上述のものであり、好ましくは脱塩基（abasic） ヌクレオシドを含むリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドである。ヌクレオシドもしくはオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の異なる位置を介して担体に結合していてもよい。好ましくは、カップリングは、リボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオシド部位の5'−位もしくは3'−位、最も好ましくは3'−位を介するものである。
【００７６】
脂肪族基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、アザヘテロアリール基及びヘテロアリシクリル（alicyclyl）基に対する適切な任意の置換基としては、アリール基、ハロゲン化アリール基、アルキル基、ハロゲン化アルキル（たとえば、トリフロロメチル及びトリクロロメチル）、脂肪族エーテル、芳香族エーテル、ベンジル、置換ベンジル、ハロゲン、特にクロロ基及びフロロ基、シアノ、ニトロ、−S−(脂肪族基もしくは置換脂肪族基）、及び−S−(芳香族基もしくは置換芳香族基）を挙げることができる。
【００７７】
好ましい化合物は式：
【００７８】
【化５】
2005534629.tif 000006
【００７９】
（式中、Psは上述のものであり、Rx は酸−レイビル保護基、好ましくは場合によっては置換されているトリチル基、特にジメトキシトリチル基であり、Ry はH、F、アリル、OMe、OCH2CH2OMe、又は塩基レイビルもしくはシリル−保護基によって保護されたヒドロキシであり、BはH、保護されたアデニン部位、保護されたグアニン部位もしくは保護されたシトシン部位、又は場合によっては保護されたチミン部位、場合によっては保護されたウラシル部位もしくは場合によっては保護されたヒポキサンチン部位である）
の化合物である。
【００８０】
本発明による化合物は、開裂性リンカー及びヌクレオシドを重合性担体に取り付けるための当該分野で公知の方法を、本発明の第１の側面によるオリゴヌクレオチドを調製するプロセスにおいて用いられるポリマーに適用することにより調製することができる。
【００８１】
本発明を以下の非限定的実施例により説明する。
【実施例】
【００８２】
［実施例１  トリチル−テトラエチレングリコキシスチレンの調製］
ステージ１
テトラエチレングリコール（174g、0.9mol）を熱量計及び還流コンデンサ付きの3首丸底フラスコ中に置いた。ピリジン（11cm3、0.135mol）を添加して、混合物を撹拌した。トリフェニルメチルクロライド（25g、0.09mol）をトルエン（30cm3）中に溶解させ、この溶液を混合物にゆっくり添加した。混合物を50℃まで加熱して、温度を1時間保持した。
【００８３】
混合物を冷却して、トルエン（200cm3）をフラスコに添加した。溶液を水（500cm3）で抽出した。水相をトルエン（2×100cm3）で逆抽出した。有機相を水（2×100cm3）と合わせて洗浄し、MgSO4 で乾燥して濾過した。トルエンを減圧下で蒸発させて除去して、淡黄色油（收率：38.5g、トリチル基準98% ）を得た。
【００８４】
ステージ２
モノ（トリチル）テトラエチレングリコール（30g、0.069mol）、4−トルエンスルホニルクロライド（14.4g、0.076mol）及び乾燥テトラヒドロフラン（THF、50cm3）を熱量計及び還流コンデンサ付きの3首丸底フラスコ中に置いた。フラスコをドライアイス浴中に置いて、混合物を−20℃以下に冷却した。温度を＜0℃に維持しながら、水（100cm3）中KOH（25.2g、0.45mol）溶液を１時間かけて滴加した。添加に続いて、溶液を周囲温度まで暖めながら反応混合物を１時間撹拌した。
【００８５】
溶液をジエチルエーテル（3×150cm3）で抽出した。エーテル相をMgSO4で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。固体をMeOHで洗浄し、真空下で乾燥させた（收率：34.3g、85%）。
【００８６】
ステージ３
NaOMe（0.55g、10.2mmol）を最小量のN,N−ジメチルホルムアミド（DMF）中に溶解させ、丸底フラスコ中の4−アセトキシスチレン（1.3cm3、8.5mmol）に添加した。この溶液を周囲温度で45分間撹拌し、次いでDMF中モノ（トリチル）テトラエチレングリコールのトシル誘導体（5g、8.5mmol）溶液を添加した。反応を周囲温度で一晩持続させた。
【００８７】
DMFを減圧下蒸発により除いた。残留油をイソプロピルアセテート中に溶解させて、水で抽出した。有機相を合わせて、MgSO4で乾燥させ、濾過した。溶剤を減圧下蒸発により取り除いて、そのままで結晶化する（crystallised on standing）淡黄色油を残した（收率：3.5g、77%）。
【００８８】
［実施例２  トリチル−テトラエチレングリコキシスチレンの10リットル規模調製］
ステージ１
テトラエチレングリコール（4188g、21.5 mol）を窒素雰囲気下で、機械的攪拌機付き10リットル容器に添加して、60 rpmで撹拌した。ピリジン（544g、6.9 mol）を容器に添加して、混合物を50℃まで加熱した。トリフェニルメチルクロライド（1000g、3.6 mol）をN2 雰囲気下でトルエン（3000ml）中に溶解させ、60℃以下の温度を維持しながら、グリコールにゆっくりと添加した。温度を50℃に２時間維持し、次いで室温まで冷却した。2リットルのトルエンを添加して、混合物を6リットルの脱イオン水で抽出し、水相を5リットルのトルエンで抽出した。合わせた有機抽出物を2×4リットルの脱イオン水（DI water）で洗浄し、硫酸ナトリウム500gで乾燥させ、減圧下で溶剤を除去して、94.3%純度（NMR）の淡黄色油1230g（トリチル基準74%）を得た。
【００８９】
ステージ２
モノ（トリチル）テトラエチレングリコール（1766.4g、3.8 mol）を3リットルTHFと一緒に10リットル容器に添加し、撹拌下で−12℃まで冷却した。p−トルエンスルホニルクロライド（945g、5 mol）をグリコール／THF混合物に添加した。温度を−5℃以下に維持しながら、１時間かけて脱イオン水（3リットル）中KOH（880g、15.7 mol）溶液を溶液に添加した。添加完了後、容器を25℃まで暖めて、12時間保持した。相を分離して、より低い水相を2×2.5リットルのTHFで洗浄し、有機相を合わせて、溶剤を減圧下で除去した。7.5リットルイソプロピルアセテート中有機物／茶色の油を10リットルの水で、次いで5×2リットルの水で抽出し、硫酸マグネシウム（500g）で乾燥させ、溶剤を除去して、純度95.3%（NMR）の粘性有機油として生成物1837g（78.0%）を得た。
【００９０】
ステージ３
脱イオン水（1.5リットル）及びTHF（2.1リットル）を10リットル容器に添加して、100rpmで撹拌を開始した。容器を−12℃まで冷却して、水酸化カリウム（535g、9.5 mol）をゆっくりと添加した。THF（1リットル）中アセトキシスチレン（575ml、3.7 mol）を冷却しながら約30分間かけて容器に添加した。容器を30℃まで加熱して、１時間保持し、次いで20℃まで冷却した。1050 ml THF中ステージ2生成物（1800g、2.9 mol）を反応容器に15分かけて添加し、次いで混合物を60℃にて40時間加熱した。反応物を冷却し、相を分離して、有機相を8M水性水酸化カリウムの2×2リットルで洗浄した。溶剤を減圧下で除去し、残留物をトルエン（5リットル）中に溶解させ、脱イオン水3×2リットルで洗浄し、次いで1M水性水酸化ナトリウム2×2リットルで洗浄し、最後に脱イオン水2×3リットルで洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム（500g）で乾燥させ、溶剤を減圧下で除去して、NMRによる純度79.7%の有機物油として生成物1471g（75%）を得た。
【００９１】
［実施例３  ポリマーの合成及び続く脱保護］
脱イオン水（1181 ml）を含み、機械的撹拌装置付きの2リットルの円筒状バッフル付き反応器に、部分加水分解ポリ（ビニルアルコール）（Airvol 540、2.5 wt% 水溶液34.9 g）及び塩化ナトリウム（31.2 g）を入れた。ステージ3生成物（79.7%、87.2 g）、スチレン（59.1 g）、ジビニルベンゼン（80%、1.4g）及びラウロイルパーオキシド（5.2 g）の混合物を反応器に装填して、400 rpmにて撹拌した。20分後、撹拌速度を300 rpmに減速させて、水浴で80℃まで50分間、加熱した。16時間後、反応混合物を冷却し、50μmフィルター布袋に通して、脱イオン水（5×1リットル）で洗浄した。次いで、ポリマービーズをTHF（4×1リットル）及びジクロロメタン（DCM、2×1リットル）で洗浄し、ジクロロメタン（1800 ml）、トリフロロ酢酸（128 g）及びトリエチルシラン（51.5 g）の混合物を有する5リットルのフランジフラスコ／オーバーヘッド撹拌装置内で窒素雰囲気下、室温にて、４時間、撹拌した。次いで、真空オーブン内で一定重量まで乾燥する前に、生成物をジクロロメタン（4×1リットル）及びヘキサン（5×1リットル）で洗浄して、0.97 mmol/gのヒドロキシ配合量（loading）を有する白色ポリマービーズ78gを得た。
【００９２】
［実施例４  5'−DMTrOABz−3'−スクシネートのポリマーとのカップリング］
実施例３の方法により調製したポリマー（0.51 g、0.357 mmol）を小型の磁石撹拌子を具備する50mlの丸底フラスコに入れた。5'−DMTrOABz−3'−スクシネート（1.28 g、4 eq）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT、0.29 g、6 eq）をN−メチルピロリドン（NMP、約5ml）中に溶解させ、この溶液にジイソプロピルカルボジイミド（DIC、0.19 g、4.2 eq）を添加した。DICを添加した後約２分後に、この溶液にジイソプロピルエチルアミン（0.19 g、4.1 eq）を添加した。この溶液全体を振とうさせ、樹脂を含有するフラスコに速やかに添加した。DICで汚染されたガラス容器及び設備機器を2 Mの水酸化ナトリウム浴中で解毒した。
【００９３】
フラスコを止めて、混合物を約70時間かけてゆっくりと撹拌した。赤／茶色の混合物を焼結炉に移して、吸引濾過し、樹脂をNMP（3×〜20 ml）で洗浄した。任意の残留遊離ヒドロキシル基をNMP（〜30ml）中無水酢酸（0.29 g、8 eq）及びジメチルアミノピリジン（DMAP、0.02 g、0.5 eq）の溶液を添加することによってキャップし、1時間保持し、窒素ガスで樹脂床を上向きにバブリングして、撹拌させた。試薬を排出させて、樹脂をDMF（5×10ml）、DCM（5×10ml）で洗浄し、最後にジエチルエーテル（3×20ml）で崩壊させた。樹脂を窒素ストリームでブロー乾燥させ、真空オーブン中で室温にて一晩、乾燥させた。使用済み試薬溶液を解毒のためNaOH溶液で処理した。
【００９４】
生成物の重量：0.739 g
［実施例５  5'−HOABz−3'−スクシネートポリマーの調製］
実施例４で調製した5'−DMTrOABz−3−スクシネートポリマー（0.739 g）を隔壁入口及びRotafloタップを装備する窒素雰囲気下での運転に適するジャケット付き焼結反応器を含む固相反応器に入れた。窒素入口及び出口の両者とも、P2O5自動表示を装備するインライン（in-line）乾燥管を装備していた。5'−DMTrOABz−3−スクシネートポリマーをDCM（〜10ml）で洗浄した。反応器ジャケットを流体循環器で0℃まで冷却した。DCM（60ml）中3 % v/v ジクロロ酢酸（DCA）を吸引下、樹脂床に通過させた。赤色はビーズ上で展開したが、溶液中には迅速に拡散しなかった。ビーズはまた、溶液の上部に浮いていた。一度、酸溶液の全量を反応器に通過させてしまってから、樹脂をDMF（5×〜5ml）で洗浄し、次いでDCM（5×〜5ml）で洗浄した。樹脂を洗浄することは、窒素ガス流を樹脂床に上向きに通過させて、溶剤を添加し、次いで窒素供給を真空で置換して、樹脂を乾燥させることにより、行った。
【００９５】
樹脂床を上向きに流れる窒素ガスで、DCM（15ml）中3% v/v DCA溶液を反応器に装填した。深い赤色は速やかに展開した。1分後、窒素流は真空のために掃引され、酸溶液は排出された。さらに3 %酸溶液の30mlを吸引下で樹脂に通過させた。吸引下で排出する前に、第３の3%酸溶液の15mlアリコートを1分間、窒素バブリングしながら、樹脂で保持した。樹脂をDMF（5×〜5ml）及びDCM（5×〜5ml）で洗浄した。
【００９６】
さらに「保持−洗浄−保持（hold-flush-hold）」処理を前記段落に記載したように行い、樹脂を洗浄した後、ジエチルエーテル（3×〜10ml）で洗浄することにより崩壊させた。
【００９７】
濾過物のHPLC分析は、A ヌクレオシドのデブリネイションが生じたならば予想されるようなN−ベンゾイルアデニンの存在を示さなかった。
［実施例６  GTACAオリゴヌクレオチドの合成］
これは、以下のカップリング及び脱トリチル化条件を用いるホスホアミダイト化学を用いてなされた。慣用の5'−ジメトキシトリチルデオキシリボヌクレオシド−3'−βシアノエチルオキシ−N,N−ジイソプロピルホスホアミダイトを用いた。
【００９８】
カップリング
カップリング反応におけるすべての「乾燥」工程について（すなわち、プレカップリング洗浄工程から硫化を含む工程まで）、用いたDMFは市販の無水DMF（たとえばAldrich）であり、必要に応じて、約100mlバッチ中4Åモレキュラーシーブで一晩乾燥させた。これは、5〜50ppmの水分含量を有するDMFを与えた（Karl-Fischer）。参考として、初期供給時には〜150ppmであった。溶液の排出は、これらの工程において、Rotaflo タップを介してN2ガスの正圧を反応器の上部に与え、焼結機の下方より吸引することによって、なされた。反応のこのシリーズにおいて最初に用いた担体は、上記実施例５で調製した5'−HOABz−3'−スクシネートポリマーであった。
【００９９】
シリーズ（dCbzアミダイト（amidite）＋5'−HOABz−3'−スクシネートポリマー）における第１のカップリング及び脱トリチル化について詳細を説明する。続くカップリング及び脱トリチル化は、対応するホスホアミダイト試薬（dAbz、dT及びdGibu アミダイト（amidite））の当量と同じ数量を用いる同じ態様にて実行した。
【０１００】
5'−HOABz−3'−スクシネートポリマー（0.320 mmol）を、隔壁入口及びRotaflo タップを装備し、窒素雰囲気下での運転に適する固相反応器に入れた。窒素入口及び出口の両者とも、P2O5自己表示を備えるインライン（in-line）乾燥管を装備していた。樹脂を乾燥DMF（3×〜5ml）及び乾燥DCM（2×〜5ml）で洗浄した。アミダイト（0.67 g、0.8 mmol、2.5 eq）をMeCN（2×10ml）で共沸的に乾燥させ、乾燥DCM（〜3ml）中に溶解させた。隔壁を装備したオーブン乾燥バイアルに、国際特許出願International Patent Application WO03/004512の方法により調製したサッカリンメチルイミダゾール塩（SMI、0.21 g、0.8 mmol、2.5 eq）を入れて、乾燥DMF（〜0.5ml）及び乾燥DCM（〜2.5ml）中に溶解させた。次いで、アミダイト（amidite）及びSMI溶液をこの順番で、隔壁入口を介してプレ膨潤樹脂に入れた。
【０１０１】
N2ガスによる混合物の緩やかなバブリングを2時間保持した後、乾燥メタノール（〜2ml）を添加した。約5分後、溶液を反応器から排出させて、樹脂を乾燥DMF（3×〜5ml）及び乾燥ピリジン（2×〜5ml）で洗浄した。使用済み試薬溶液をHPLCにより分析して、反応終了時に残留する活性アミダイト（amidite）の量を概算した。
【０１０２】
乾燥ピリジン（〜4ml）中キサンタン（xanthane）ヒドライド（0.12 g、0.8 mmol、2.5 eq）溶液を樹脂に入れて、これを緩やかなN2 バブリングに、1時間保持して、その後、溶液を排出した。上部は反応器から取り除き、樹脂はbench DMF（5×〜5ml）及びDCM（5×〜5ml）で洗浄し、次いでCap A 溶液（5：3：2 MeCN：Py：NMI、2×〜5ml）で洗浄した。次に、Cap A 溶液（2.5 ml）及びCap B 溶液（4：1 MeCN：Ac2O、2.5ml）を反応器に入れて、混合物を1時間、保持した。
【０１０３】
使用済みキャッピング溶液を排出して、次に樹脂をDMF（5×〜5ml）及びDCM（5×〜5ml）で洗浄し、最後にジエチルエーテル（3×〜5ml）で洗浄した。次に、脱トリチル化の前に、樹脂を一晩、放置した。
【０１０４】
脱トリチル化
脱トリチル化の前に、反応器ジャケットを0℃まで冷却し、樹脂をDCMで洗浄／プレ膨潤させた。DCM中3 %（v/v）DCA（「酸溶液」）を用いて樹脂を脱トリチル化した。各脱トリチル化サイクルについて、用いた酸溶液の容積は、樹脂に結合すると予想されるDMTのmmolあたり167mlを基準とした。
【０１０５】
焼結機下方からの窒素ガスによる撹拌を行いながら、酸溶液（12 ml）を樹脂で１分間保持した。明るい赤色の溶液を 吸引により排出し、さらに25mlの酸溶液を樹脂床に通過させた。排出の前に、酸溶液の第３の12mlアリコートを樹脂で1分間、保持した。樹脂をDMF（5×〜5ml）及びDCM（5×〜5ml）で洗浄した。
【０１０６】
この酸処理／洗浄のサイクルを１回以上繰り返した。最後のDCM洗浄の後、樹脂をジエチルエーテル（3×〜5ml）で洗浄することによって崩壊させた。
4回のカップリング工程全体での平均カップリング收率は、トリチル分析により97.5%と算出された。
【国際調査報告】
2005534629.tif 000009
2005534629.tif 000010
2005534629.tif 000011