(57)【要約】本発明は、ヒストン2B上のα−リン酸化セリン14残基に対する抗体の生成に関する。ヒストン2Bのアミノ末端の、この翻訳後修飾は、アポトーシスに入ろうとしているか、または既にアポトーシスを被っている細胞に関連する。これらの抗体は、アポトーシス細胞を同定するのに有用であり、そして診断、およびスクリーニングのツールとして働く。本発明はまた、Mst1キナーゼ、およびMst1の活性を調節する化合物の単離に関する。このキナーゼは、インビボにおいて、ヒストン2B上で、この翻訳後修飾を引き起こすことを担う酵素として同定されている。
2005506973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CSAPAPKKGSKK（配列番号3）、SAPAPKKGSKK（配列番号1）、およびSAPAPKKGSKK（配列番号2）からなる群より選択される抗原に特異的に結合する、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、配列SAPAPKKGSKK（配列番号1）に特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列SAPAPKKGSKK（配列番号2）に特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が標識される、請求項1に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、蛍光マーカーを用いて標識される、請求項5に記載の抗体。
【請求項７】
請求項1に記載の抗体、および希釈剤、または薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項８】
11〜20個のアミノ酸配列からなる精製されたペプチドであって、ここで該アミノ酸配列は、以下：SAPAPKKGSKK（配列番号1）、およびSAPAPKKGSKK（配列番号2）からなる群より選択される、配列を含む精製されたペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列CSAPAPKKGSKK（配列番号3）からなる、請求項8に記載の精製されたペプチド。
【請求項１０】
脊椎動物種におけるアポトーシス細胞の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
生物学的サンプルと、S14P抗体とを接触させる工程であって、ここで該サンプルが、該脊椎動物種から単離され、かつクロマチンを含む、工程；ならびに
該クロマチンと該S14P抗体との間で形成された免疫複合体を、該脊椎動物種におけるアポトーシス細胞の存在の指標として同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
S14P抗体が標識される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的サンプルが、前記脊椎動物種の前記細胞から単離された、本質的に精製されたクロマチンからなる、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫複合体が、免疫沈降によって同定される、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
請求項10に記載の方法であって、前記S14P抗体が、固体支持体上に固定され、前記免疫複合体を同定する工程が、以下：緩衝液を用いて該結合された抗体を洗浄する工程、次いで、該結合された抗体と、ヒストンH2Bに特異的に結合する第二の標識された抗体とを接触させる工程を、さらに包含する、方法。
【請求項１５】
アポトーシス細胞を同定するためのキットであって、該キットは、以下：CSAPAPKKGSKK（配列番号3）、およびSAPAPKKGSKK（配列番号1）からなる群より選択される、ペプチドに特異的に結合する抗体を含む、キット。
【請求項１６】
SAPAPKKGSKK（配列番号2）に特異的に結合する第二の抗体をさらに含む、請求項15に記載のキット。
【請求項１７】
アミノ酸配列SAPAPKKGSKK（配列番号2）を含むポリペプチドをさらに含む、請求項15に記載のキット。
【請求項１８】
Mst1キナーゼ活性のインヒビターについてのスクリーニングの方法であって、該方法は、以下の工程：
混合物であって、Mst1、配列SAPAPKKGSKK（配列番号2）を含むペプチド、およびMst1の潜在的インヒビターを含む混合物、を調製する工程；
キナーゼ活性を許容させる条件下で、所定の長さの時間、該混合物をインキュベートする工程；ならびに
潜在的なMst1インヒビターの阻害性効果の指標として、形成されたSAPAPKKGSKK（配列番号1）の量を定量する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項18に記載の方法であって、形成された前記SAPAPKKGSKK（配列番号1）の量が、前記インキュベーション工程の後に、前記ペプチドに結合するS14P抗体の量を測定することによって決定される、方法。
【請求項２０】
メチル化されたH3ヒストンの存在を検出する方法であって、該方法は、ヒストンタンパク質と、前記ペプチド配列SAPAPKKGSKK（配列番号1）に特異的に結合する抗体とを接触させる工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（米国政府の権利）
本発明は、助成金番号GM40922として、米国国立衛生研究所から与えられた、米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、その開示が本明細書において援用される、2001年8月3日出願、米国仮出願第60/310,015号、2002年3月14日出願同第60/364,386号、および2002年4月26日出願同第60/375,892号に対して、米国特許法第199条（e）項の規定のもとで優先権を主張する。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾によって作製されたヒストンエピトープに結合する抗体、このような抗体を含む組成物、ならびに診断およびスクリーニングのツールとしてのこのような組成物の使用に関する。より詳細には、本発明は、アポトーシスに関連するヒストン修飾に関する。
【０００４】
（背景技術）
アポトーシスは、プログラムされた細胞死であって、発生、および細胞の加齢の両方に関与する天然に存在するプロセスである。これは、身体が、望ましくない細胞、老齢の細胞、または損傷した細胞を、自ら取り除くことができるプロセスである。アポトーシスは、細胞増殖の生物学的な対応事象である。これは、正常な組織の代謝回転、胚発生、および免疫系の成熟のような生物学的プロセスであって、ホルモン欠乏、熱ストレス、および代謝ストレスのような病理学的プロセスを含むプロセスに必須である。（Bowen、およびLockshin（編）Cell Death in Biology and Pathology（Chapman、およびHall,1981）におけるWyllie,A.H.（9〜34頁））。
【０００５】
プログラムされた細胞死を深く研究するほど、プログラムされた細胞死が生じるのには、いくつかの異なる機構が存在し得るということが明らかになってきている。1つの実施形態において、細胞死は、アポトーシスの特徴である、細胞容積の低下、クロマチンの凝縮、細胞出芽、および3'−OH遊離末端を有する180塩基対（bp）のオリゴマーのラダーへのDNAの断片化によって特徴付けられる。細胞膜は、そのプロセスを通じて細胞膜の完全性を維持しており、そしてリソソームはインタクトなままである。炎症性応答は、アポトーシスのプロセスの間に生じる。罹患した細胞は、隣接する正常細胞による、およびおくつかのマクロファージによる食細胞作用を受ける。あるいは、細胞小器官自体が断片化されている、細胞死の他の機構が現在記載されている。本明細書において用いられる場合、「アポトーシス」という用語は、プログラムされた細胞死の全ての形態を包含することが意図される。
【０００６】
アポトーシスの機構の背景にある生化学的エフェクター経路は、依然として未知である。アポトーシス機構は、以下を含むということが示唆されている：1つ以上のCa2＋/Mg2＋依存性の内因性エンドヌクレアーゼ（Arendsら（1990）Am．J．Pathol．136：593〜608）；トランスグルタミナーゼ活性（Fesusら（1987）FEBS Lett．224：104〜108；Taressら（1992）J．Biol．Chem．Cell 75：653〜660）；および酸素ラジカルの生成（Hockenberryら（1993）Cell 75：241〜251；Butke、およびSandstrom（1994）Immun．Today 15：7〜10）。遺伝子発現はアポトーシスに必要であると考えられる。なぜならこのプロセスは、RNA、またはタンパク質合成のインヒビターによって停止され得るからである（Martinら（1988）J．Cell Biol．106：829〜844）。
【０００７】
アポトーシスは、多数の内因性のシグナル、または外因性のシグナルによって始動され得る。これらのシグナルとしては、以下が挙げられる：軽度の物理的シグナル（例えば、電離放射線、紫外線、または高熱）；低度〜中度の用量の毒性化合物（例えば、アジド、または過酸化水素）；化学療法剤（例えば、エトポシド、およびテニポシド）、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、およびトランスフォーミング成長因子）；ならびにT細胞レセプターの刺激。
【０００８】
真核生物のクロマチンの基本的単位は、ヌクレオソームであって、この粒子はヒストンコアの八量体（各々のヒストンH3、H4、H2A、およびH2Bの2つのコピー）の周囲を囲んだ146塩基対のDNAを含む。次に、ヌクレオソームのアレイが、どのように、高次のクロマチンファイバー（これが次に別個の機能的なドメインを規定する）中にパッケージングされるのかは、十分理解されていない。証拠がますます増えており、これによって、ヒストン翻訳後修飾（アセチル化、リン酸化、メチル化、など）が、いくつかの場合には、このプロセスの中心である機構の1つを提供するということが示唆される。さらに、最近の証拠では、共有結合的に改変されたヒストンの別個のパターンが、核因子（未知の機能によって下流の機能を媒介する）を補充し、かつ結合するための「シグナル伝達プラットフォーム」（すなわち、「ヒストンコード」として機能し得ることが示唆される。
【０００９】
ヒストンと、DNAとの間の親密な関連を考慮すれば、アポトーシスを特徴付けるDNAの完全性、およびクロマチンコンパクションの状態の変化は、ヒストン修飾によって媒介され得る。しかし、現在まで、アポトーシスの間に特異的に誘導されるヒストン修飾は、十分規定されていない。ミオチンクロマチンコンパクションは、例えば、セリン10におけるヒストンH3リン酸化に関連するが、この修飾は、アポトーシス誘導性クロマチンコンパクションの間に一貫して観察されてはいない（Cheungら（2000）Cell 103,263〜271において概説された）。対照的に、比較的マイナーなヒストン改変体であるH2A.Xのリン酸化は、アポトーシスにおけるDNA断片化の初期段階の間に増大する（Rogakouら（2000）J Biol Chem 275,9390〜9395）。しかし、H2A.Xリン酸化（セリン139における）は、全ての公知の二本鎖DNA分解と相関しており、これによって、このリン酸化が、アポトーシスプロセスに関連した特定のクロマチンマークよりも「DNA損傷センサー」として機能することが示唆される。
【００１０】
哺乳動物細胞において、アポトーシスに固有に関連している唯一の主なコアヒストン修飾は、ヒストンH2Bリン酸化であるが、アミノ末端におけるリン酸化の代表的な部位は十分には規定されていない。これを踏まえれば、H2Bアミノ末端テール（ただし、他のヒストンテールではない）は、クロマチンコンパクションを誘導するXenopusの無細胞系においてクロマチンコンパクションに必須である。
【００１１】
本発明は、ヒトHL60細胞における、アポトーシス性クロマチンコンパクション、およびDNA断片化の発生と特異的に相関する、特定のヒストン（H2B）翻訳後修飾（セリン14リン酸化）に関する。さらに、本発明は、アポトーシスマーカーに特異的に結合する抗体（本明細書において、以降は、「S14P抗体」）、ならびに種々の疾患を診断および処置するためのその抗体の使用を記載する。
【００１２】
アポトーシスが調節されない場合、疾患が生じる。調節されないアポトーシスは、ガン、心疾患、神経変性性障害、自己免疫障害、ならびにウイルス感染、および細菌感染のような疾患に関与する。ガンは例えば、細胞が増殖することを誘発するだけでなく、アポトーシスをブロックする。ガンは、部分的にはアポトーシスの不全であり、ここでは、アポトーシスによって細胞が自分自身を殺傷する順序がブロックされている。アポトーシスを誘導することを含む、新しいガンの処置が研究されている。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、プログラムされた細胞死に固有に関連するマーカーに関する。このマーカーは、ヒストンH2Bのアミノ末端の翻訳後修飾（セリン14のリン酸化）である。より詳細には、本発明は、ヒストンH2Bの修飾によって作製されたエピトープに特異的に結合し、かつアポトーシスを被る細胞のマーカーとして働く抗体に関する。本発明はまた、ヒストンH2Bのセリン14のリン酸化を担うキナーゼMst1、およびMst1活性を改変し得る化合物を同定するためのアッセイに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、S14P抗体が、H2Bホスホセリン14ペプチドのみを認識すること、そしてこの活性が、H2Bホスホセリン14ペプチドによって阻害され得るが、修飾されていないペプチドによっては阻害され得ないことを実証するELISAからのデータを示す。このペプチドは、4℃で、一晩、PBS中でペプチドをインキュベートすることによって、示した量で、ELISAプレート上にコーティングされた。このウェルをPBST（PBS含有0.5％Tween−20）を用いて1時間ブロックして、PBSTを用いて3回洗浄した。抗−phos（S14）H2B血清を、1：2000希釈で各ウェルに2時間添加し、続いてさらに洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ウサギ二次抗体を、1：5000で含有するPBSTを、各々のウェルに2時間添加した。PBSTを用いる3回の洗浄後、O−フェニレンジアミンジヒドロクロライドペルオキシダーゼ基質（Sigma）を添加して、492nmのODで吸光度によって定量した。固定し、かつ試験されたペプチドは、以下を含む：S14（配列番号2；□）；S14P（配列番号3；◇）；S14P（ELISAの前に1mg/mlのS14競合ペプチドを用いてプレインキュベートした血清を用いて行なったELISA）（○）；S14P（ELISAの前に1mg/mlのS14競合ペプチドを用いてプレインキュベートした血清を用いて行なったELISA）（△）。
【００１５】
（発明の詳細な記載）
（定義）
本発明の詳細な説明および特許請求の範囲において、以下の用語は、以下に記載の定義に従って用いられる。
【００１６】
本明細書において用いる場合、「核酸」という用語は、RNA、ならびに一本鎖および二本鎖のDNAおよびcDNAを包含する。さらに、「核酸」、「DNA」、「RNA」という用語、および同様の用語はまた、核酸アナログ、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有するアナログを包含する。例えば、いわゆる「ペプチド核酸」（当該分野で公知であり、かつその骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する）は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００１７】
「ペプチド」という用語は、3つ以上のアミノ酸の配列であって、ここでアミノ酸が天然に存在するか、または合成の（天然には存在しない）アミノ酸であるアミノ酸の配列を包含する。ペプチド模倣物としては、以下の改変の1つ以上を有するペプチドが挙げられる：
1．ペプチドであって、ここで1つ以上のペプチジル−−C（O）NR−−連結（結合）が、−−CH2カルバミン酸塩連結（−−CH2OC（O）NR−−）、亜リン酸塩／エステル連結、−CH2−−スルホンアミド（−CH2−−S（O）2SNR−）連結、尿素（−−NHC（O）NH−−）連結、−−CH2−二級アミン連結のような非ペプチジル連結によって置換されているか、またはアルキル化ペプチジル連結（−−C（O）NR−−）によって置換されており、ここでRは、C1−C4アルキルである、ペプチド；
2．ペプチドであって、ここでN末端が、NRR1基に対して、−−NRC（O）R基に対して、−−NRC（O）OR基に対して、−−NRS（O）2R基に対して、−−NHC（O）NHR基に対して、誘導体化されており、ここで、RおよびR1は、水素、またはC1−C4アルキルであり、ただしR、およびR1は、両方が水素ではないという条件下である、ペプチド；
3．ペプチドであって、C末端が、−−C（O）R2に対して誘導体化されており、ここでR2は、C1−C4アルコキシ、および−−NR3R4からなる群より選択され、ここで、R3およびR4は、水素、およびC1−C4アルキルからなる群より独立して選択される、ペプチド。
【００１８】
ペプチドにおいて天然に存在するアミノ酸残基は、以下のとおり、IUPAC−IUB生化学命名法委員会によって推奨されるように省略される：フェニルアラニンは、Phe、またはFである；ロイシンは、Leu、またはLである；イソロイシンは、Ile、またはIである；メチオニンは、Met、またはMである；ノルロイシンは、Nleである；バリンは、Vat、またはVである；セリンは、Ser、またはSである；プロリンは、Pro、またはPである；トレオニンは、Thr、またはTである；アラニンは、Ala、またはAである；チロシンは、Tyr、またはYである；ヒスチジンは、His、またはHである；グルタミンは、Gln、またはQである；アスパラギンは、Asn、またはNである；リジンは、Lys、またはKである；アスパラギン酸は、Asp、またはDである；グルタミン酸は、Glu、またはEである；システインは、Cys、またはCである；トリプトファンは、Trp、またはWである；アルギニンは、Arg、またはRである；グリシンは、Gly、またはGである、そしてXは、任意のアミノ酸である。他の天然に存在するアミノ酸としては、例えば、4−ヒドロキシプロリン、5−ヒドロキシリジン、などが挙げられる。
【００１９】
本明細書において用いる場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書においては、以下の5つの群のうちの1つの中での交換として、規定される：
I．小型の脂肪族の、非極性か、またはわずかに極性の残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II．極性の、負に荷電した残基、およびそれらのアミド；
Asp、Asn、Glu、Gln；
III．極性の、正に荷電した残基：
His、Arg、Lys；
IV．大型の脂肪族の非極性残基：
Met Leu、Ile、Val、Cys
V．大型の、芳香族残基：
Phe、Tyr、Trp
【００２０】
本明細書において用いる場合、「精製された」という用語、および同様の用語は、それが天然には関連している、他の成分を実質的に含まない（すなわち、少なくとも60％、好ましくは80％、そして最も好ましくは90％を超えて含まない）形態である、分子または化合物の単離物に関する。
【００２１】
「作動可能に連結された」とは、並列(juxtaposition)であって、その成分が、それらの有用な機能を実施するように構成される、並列をいう。例えば、コード配列に作動可能に連結された制御配列、またはプロモーターは、コード配列の発現を発効し得る。
【００２２】
本明細書において用いる場合、「固体支持体」という用語は、可溶性分子との連結（好ましくは共有結合）を形成し得る溶媒不溶性の基質に関する。この支持体は、事実上生物学的な粒子（例えば、限定はしないが、細胞、またはバクテリオファージ）、または合成の粒子（例えば、限定はしないが、アクリルアミド誘導体、ガラス、プラスチック、アガロース、セルロース、ナイロン、シリカ、または磁気化された粒子）のいずれであってもよい。支持体は、粒子状形態であっても、またはモノリシックなストリップ、もしくはシートであってもよい。このような支持体の表面は、固体であっても、多孔性であっても、任意の都合のよい形状であってもよい。
【００２３】
本明細書において用いる場合、「相補的な」、または「相補性」という用語は、塩基対規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して用いられる。例えば、「A−G−T」という配列は、「T−C−A」という配列に相補的である。
【００２４】
「治療剤」、「薬剤」、または「薬物」という用語は、患者における病気、苦痛、疾患、または傷害の処置（予防、診断、軽減、または治療を含む）において用いられ得る、任意の治療用因子、または予防用因子をいう。
【００２５】
本明細書において用いる場合、「処置する」という用語は、特定の障害、もしくは状態に関連する症状を軽減する工程、および／またはこの症状を予防もしくは排除する工程を包含する。例えば、ガンを処置するとは、ガン細胞の増殖、および／もしくは分裂を防止、または減速する工程、ならびにガン細胞を殺傷する工程を包含する。
【００２６】
本明細書において用いる場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、任意の標準的な薬学的な担体（例えば、リン酸緩衝化食塩水、水、およびエマルジョン（例えば、油／水エマルジョンまたは水／油エマルジョン））、ならびに種々のタイプの湿潤剤を包含する。
【００２７】
本明細書において用いる場合、「H2Bセリン14の抗原性フラグメント」という用語は、ヒストンH2Bのアミノ末端の天然のペプチドフラグメント（ペプチドフラグメントSAPAPKKGSKK（配列番号1）、およびSAPAPKKGSKK（配列番号2）を含む）、ならびにそれらのフラグメントの合成等価物の両方を包含する。
【００２８】
本明細書において用いる場合、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、もしくはモノクローナル抗体、またはそれらの結合フラグメント（例えば、Fab、F（ab'）2、およびFvフラグメント）をいう。
【００２９】
本明細書において用いる場合、太字の（訳注；アンダーラインで表す）文字S（S）は、アミノ酸配列の状況において用いる場合、リン酸化されているセリンアミノ酸に相当する。本明細書において用いる場合、「S（P）」の「Ser（P）」という用語はまた、アミノ酸セリンのリン酸化型をいう。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「S14P抗体」という用語は、配列CSAPAPKKGSKK（配列番号3）に特異的に結合する抗体である；そして「S14抗体」という用語は、配列CSAPAPKKGSKK（配列番号2）に特異的に結合する抗体である。
【００３１】
本明細書において用いる場合、S14P抗体の「生物学的に活性なフラグメント」という用語は、ペプチドCSAPAPKKGSKK（配列番号3）に特異的に結合し得るそれぞれの全長抗体の天然部分、または合成部分を包含する。
【００３２】
「リンカー」は、2つの別個の実体を化学的に連結するように機能する分子（または分子の基）である。例えば、ペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して2つのポリペプチドを化学的に連結する。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「非経口の」という用語は、皮下、静脈内、または筋肉内の投与を包含する。
【００３４】
（本発明）
本発明は、ヒストンH2Bタンパク質、および他の種に由来する同種のタンパク質のアミノ末端の修飾が、アポトーシスのマーカーとして働き得るという発見に関する。より詳細には、出願人らは、クロマチンの表面からヒストンH2Bのアミノ末端が突出していること、およびこのアミノ末端から14番目の位置のセリンアミノ酸（Ser14）が、アポトーシスのプロセスを被るかまたは既にアポトーシスのプロセスを開始している細胞において、選択的にインビボでリン酸化されるということを発見した。従って、本発明の1つの局面に従って、ヒストンH2BのSer14のリン酸化は、脊椎動物種におけるアポトーシスのマーカーとして働き、そしてこのタンパク質のこの部分を認識する抗体は、重要な診断ツールとしての用途を有する。
【００３５】
本発明の1つの局面は、リン酸化されたヒストンH2Bタンパク質（PhosH2B）のアミノ末端に特異的な抗体を産生するために用いられる抗原に関する。1つの実施形態において、Phos H2Bのアミノ末端の精製された抗原性フラグメント、またはその合成的な等価物が提供される。この抗原は、配列CSAPAPKKGSKK（配列番号3）を含むアミノ酸フラグメントを含み、ここでCは、ネイティブなH2B配列に付加された人工的なシステイン残基である。1つの好ましい実施形態において、この抗原は、配列SAPAPKKGSKK（配列番号1）、またはSAPAPKKGSKK（配列番号1）とは1つ以上の保存的アミノ酸置換ずつ異なるアミノ酸配列から構成される。本発明はまた、リン酸化されていないH2B配列：SAPAPKKGSKK（配列番号2）を含む抗原を包含する。別の実施形態において、精製された抗原は、ウシ血清アルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニンのような、安定な担体に連結されたポリペプチドを含む。本発明はまた、ペプチド配列SAPAPKKGSKK（配列番号2）をコードする核酸配列に関連する。
【００３６】
1つの好ましい実施形態において、配列CSAPAPKKGSKK（配列番号3；「S14P抗体」）に特異的に結合するPhos H2B抗体が提供され、そして配列CSAPAPKKGSKK（配列番号2；「S14 抗体」）に特異的に結合する未修飾のH2B抗体が提供される。
【００３７】
S14P抗体、またはS14抗体を生成するために用いられた1つの方法は、この抗原に特異的な抗体の産生を誘発するための、実験動物（代表的には、ウサギ）に対する各々の抗原の投与を包含する。抗体産生を誘発するための抗原投与の用量およびレジメン、ならびに抗体の精製のための方法は、当業者に周知である。代表的には、このような抗体は、免疫前の血清を得るために最初に採血済みの、ニュージーランド白色ウサギに、目的の抗原を皮下投与することによって産生され得る。抗原は、6つの異なる部位で1部位あたり100μlの総容積で注射されてもよい。各々の注射された材料は、合成のサーファクタントアジュバントプルロニックポリオール、または微粉砕されたアルリルアミドゲル（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のタンパク質またはポリペプチドを含む）を含む。
【００３８】
次いで、このウサギは最初の注射の2週間後に採血され、そして6週間ごとに、3回、同じ抗原を用いて定期的にブーストされる。次いで、血清のサンプルを各ブーストの10日後に収集する。次いで、抗体を捕獲するための対応する抗体を用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって血清からポリクローナル抗体を回収する。最終的に、このウサギをペントバルビタール150mg/Kg IVを用いて安楽死させる。ポリクローナル抗体を産生するためのこの手順、および他の手順は、E．Harlowら、編集、Antibodies：A Laboratory Manual（1988）（これは、参考として本明細書において援用される）に開示されている。抗体の特異性は、酵素結合免疫吸着アッセイ、もしくはイムノブロッティングによって、または当業者に公知の同様の方法によって決定され得る。
【００３９】
本発明はまた、H2B S14P抗原（すなわち、リン酸化セリン14アミノ酸を含む、ヒストンH2Bのアミノ末端のフラグメント）、または未修飾のH2B S14抗原（すなわち、未リン酸化セリン14アミノ酸を含む、ヒストンH2Bのアミノ末端のフラグメント）のいずれかに特異的に結合するモノクローナル抗体を包含する。モノクローナル抗体産生は、当業者に周知の技術を用いて発効されてもよい。基本的に、このプロセスは、最初に、インビボ、またはインビトロのいずれかで目的の抗原を用いて事前に免疫されている哺乳動物（例えば、マウス）の脾臓から免疫細胞（リンパ球）を得る工程を包含する。次いで、この抗体分泌リンパ球を、細胞培養物中で無期限に複製可能である、ミエローマ細胞、または形質転換された細胞と融合させ、これによって不死の、免疫グロブリン分泌細胞株を産生する。得られた融合細胞、すなわちハイブリドーマを培養して、得られたコロニーを、所望のモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングする。このような抗体を産生するコロニーを、クローニングして、インビボ、またはインビトロのいずれかで増殖させて、大量の抗体を産生する。本発明の1つの実施形態は、H2B S14P抗原、またはH2B S14抗原に結合する、モノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞株に関する。このような細胞を融合する理論的根拠、および実際的な方法論の説明は、本明細書において参考として援用される、Kohler、およびMilstein、Nature、256：495（1975）に記載されている。
【００４０】
全抗体に加えて、抗体のフラグメントは、特定の抗原に対する結合特異性を保持し得る。抗体フラグメントは、組み換えDNA技術を用いる、タンパク質分解、または合成を含むが、これに限定されない、いくつかの方法によって生成することができる。このような実施形態の例は、H2B S14P抗体、またはH2B S14抗体の選択的タンパク質分解であって、Fabフラグメントを生成するためのパパインによる、またはF（ab'）2フラグメントを生成するためのペプシンによる、選択的タンパク質分解である。これらの抗体フラグメントは、本明細書において参考として援用される、J．Goding、Monoclonal Antibodies：Principles and Practice、第98〜118頁（N．Y．Academic Press1983）に記載されるような、従来の手順によって作製することができる。抗体全体の特定の結合を保持するH2B S14P抗体、またはH2B S14抗体の他のフラグメントは、当業者に公知の他の手段によって生成することができる。
【００４１】
1つの実施形態において、抗体を標識する。本発明が、任意の特定の検出システム、または標識に限定されることは意図されない。抗体は、発蛍光団、放射性同位体、または非同位体標識試薬（例えば、ビオチン、またはジゴキシゲニン）を用いて標識されてもよい；ビオチンを含む抗体は、蛍光色素のような任意の所望の標識に結合体化された、アビジンのような「検出試薬」を用いて検出され得る。1つの実施形態において、本発明のヒストン特異的抗体は、二次抗体の使用によって間接的に標識され、ここでこの二次抗体は、標識されており、そして一次（ヒストン特異的）抗体に特異的である。あるいは、このヒストン特異的抗体は、FITC、またはローダミンのような放射性同位体、または蛍光色素を用いて間接的に標識されてもよい；このような場合、二次検出試薬は、標識されたプローブの検出のために必要でなくてもよい。血中での修飾されたヒストンの存在は、次いで、関連の標識された抗体の使用によって検出され得る。
【００４２】
本発明の抗体、またはフラグメントは、組成物を形成するために、担体、または希釈剤と合わされてもよい。1つの実施形態において、この担体は、薬学的に許容可能な担体である。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルであって、活性因子とともに投与されるものをいう。このような担体、および希釈剤としては、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油、およびエマルジョン（例えば、油／水エマルジョン、または水／油エマルジョン）のような滅菌液、ならびに種々のタイプの湿潤剤であって、ヒトを含む動物における使用のために、米国連邦政府の監督官庁によって承認されるか、または米国薬局方に列挙された薬剤を含むものが挙げられる。この組成物はさらに、サーファクタント、および他の薬理学的にかつ生物学的に許容可能な担体（アジュバント、賦形剤、または安定剤を含む）の添加を含んでもよい。例示的な油は、石油、動物由来、植物由来、または合成起源の油、例えば、ピーナツ油、大豆油、または鉱油である。一般に、水、食塩水、デキストロース水溶液、および関連の糖溶液、ならびにグリコール（例えば、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）が、特に注射溶液に、好ましい液体担体である。
【００４３】
VP16を用いて処理し、S14P抗体（ペプチドCSAPAPKKGSKKに対する抗体）を用いて染色したHL−60細胞の免疫蛍光は、H2B S14リン酸化が、断片化されたDAPI染色核によって示されるとおり、アポトーシス細胞に局在することを示す染色パターンを、明らかにした。アポトーシスは、エトポシドを用い、そしてKozo Ajiroの文献（Ajiro K．Histone H2B phosphorylation in mammalian apoptotic cells：An association with DNA fragmentation,J Biol Chem．2000 Jan 7；275（1）：439〜43）のプロトコールに従って誘導された。
【００４４】
興味深いことに、アポトーシスに関するH2B Ser14リン酸化の機能は、脊椎動物種にのみあてはまるようである。なぜなら、Ser14および周囲の配列は、カエルからヒトまで、よく保存されているが、ハエでも、ぜん虫でも観察されないからである。このクロマチン修飾は、ヒト、マウス、およびXenopus細胞において実証されているが、α−Phos（Ser14）H2B（S14P抗体）での染色は、C．elegansのような無脊椎動物では示されなかった。興味深いことに、H2BにおけるSer32はまた、「脊椎動物付加」であるようであり、そしてこれがまた、少なくともHL−60細胞において、アポトーシスのH2Bリン酸化の部位であり得るといういくつかの証拠が示唆されている。注目に値するのはまた、H2Bアミノ末端のSer36であり、その部位は、酵母からヒトまで保存されており、ハエおよびぜん虫に存在する。H2BにおけるSer36、または無脊椎動物における等価な残基が、アポトーシスプログラムの間にリン酸化されるか否かは未知である。しかし、酵母がこの部位を含むらしいという事実によって、リン酸化は、ここで、それが仮にも存在すれば、アポトーシス以外の生物学的機能を有するという可能性が高くなる。
【００４５】
経時的研究に基づけば、ヒストンH2Bセリン14リン酸化が、DNAラダー化の直前に生じ、このことは、ヒストンH2Bリン酸化が、アポトーシスの間のDNA断片化のための「トリガー」に関与するか、または「トリガー」として作用するということを示唆する。アポトーシスの間にヌクレオソーム間のDNAを切断するいくつかのヌクレアーゼが同定されている。少なくともインビトロにおいては、ヒストンH1、およびHMGが、ヌクレアーゼ機能を増強し、従って、リン酸化されたH2Bは、クロマチンに対する重要なDNase活性の接近可能性を増強するか、クロマチンに対するそれらの補充を促進する、クロマチンの構造的変化をもたらし得る。
【００４６】
S14P抗体、またはその生物活性フラグメント、および担体、または希釈剤を含む組成物を、アポトーシスに入ることが運命付けられている細胞、または既にアポトーシスにある細胞を検出するための方法と組み合わせて、用いることができる。さらに本発明の抗体は、アポトーシスプロセスへ誘導され得ない細胞を検出するために用いることが可能であり、従って、前ガン／ガンの細胞および組織を同定するためのマーカーとして機能し得る。この実施形態に従って、細胞を、アポトーシス誘導性因子（例えば、エトポシド、VP−16）の存在下で培養し、次いで、この細胞を固定して、染色し、細胞のかなりの集団が、細胞のコントロールの集団に比べてアポトーシスに入ることができないか否かを決定する。このような方法を、生検において回収された細胞を分析するために用いて、悪性度を診断して、腫瘍の攻撃性、および従って処置のストラテジーの選択を決定することができる。
【００４７】
1つの実施形態に従って、脊椎動物種（ヒトを含む）における、アポトーシス細胞、またはアポトーシスになりそうな細胞の存在を検出するための方法が提供される。本発明は、脊椎動物種から生物学的サンプルを単離するための最初の工程を包含する。ここでは、生物学的サンプルは、種のクロマチンを含む。代表的には、生物学的サンプルは、個々の脊椎動物種から単離された組織または細胞を含む。1つの実施形態において、クロマチン（すなわち、ヒストンに関連するゲノムDNA）、または個々のヒストンを、生物学的サンプルから精製して、その後に、精製されたクロマチン／ヒストンと、S14P抗体とを接触させる。あるいは、脊椎動物種から単離された細胞は固定されて、抗体を用いて直接染色されてもよい。
【００４８】
アポトーシス細胞の存在を決定するために、個体から単離されたクロマチン、またはヒストンを、標的に対する抗体の特異的結合のための安定な条件下で、S14P抗体と接触させる。非特異的な結合したS14Pは、引き続いて除去されて、クロマチンとS14P抗体との間で形成された免疫複合体は、脊椎動物種におけるアポトーシス細胞の存在の指標として同定および定量される。1つの実施形態において、S14P抗体を標識するか、あるいは標識された二次抗体（S14P抗体、またはヒストンH2Bに特異的）を用いて、免疫複合体の形成を同定し、かつ定量する。形成された免疫複合体の量は、サンプル中に存在するリン酸化されたS14ヒストンH2Bの量に直接比例しており、従ってこの生物学的サンプルの供給源として働いた個体における、アポトーシス活性の指標である。アポトーシス活性の異常なレベルの検出は、ガンを含む種々の疾患状態の診断として働く。
【００４９】
1つの実施形態に従って、免疫複合体の形成を同定／定量する方法は、細胞、または精製されたクロマチンを固体支持体に固定、または結合させる工程、および標識されたS14P抗体を用いてプローブする工程であって、ここで非特異的に結合した抗体は、緩衝液を用いた洗浄によって除去される工程、を包含する。あるいは、免疫複合体の形成は、免疫沈降によって同定されてもよい。別の実施形態において、S14P抗体は、固体支持体上に固体され、そして固定された抗体は、単離されたクロマチン／ヒストンと接触させられる。次いで、免疫複合体の形成は、緩衝液を用いて、結合された抗体を洗浄すること、およびS14Pエピトープとは別の離れた部位でヒストンH2Bに特異的に結合する二次標識抗体と、この結合抗体とを接触させる工程によって同定される。
【００５０】
Mstl（哺乳動物Ste20様キナーゼ1；mammalian Ste20-like kinase 1）キナーゼは、その細胞性機能が未知である、遍在的に発現されるセリン／トレオニンキナーゼである。Mst1は、ステライル20様スーパーファミリーのメンバー（その約30までの関連のキナーゼが、ヒトに存在する）である。このキナーゼは、代表的には、アポトーシス、形態形成、および細胞骨格再配列において役割を有する、MAPK経路の上流調節因子としてみなされる。キナーゼは、活性化されたエフェクターカスパーゼ3（C末端調節領域、および活性化されたN末端触媒性ドメインを遊離する）によって切断されることが公知である。次いで、この活性化されたドメインは、生物学的な基質が以前に未知である経路において、アポトーシスを誘導する。出願人らは、ここで、Mst1の基質の1つが、ヒストン2Bの14番目のセリン残基であることを発見した。
【００５１】
本出願におけるデータに基づいて、Mst1のカスパーゼ切断型は、アポトーシスの間のその生物学的標的の1つとして、ヒストンH2Bをリン酸化すると考えられる。次いで、ヒストン末端の共有的修飾は、アポトーシスのクロマチンコンパクション、およびDNA断片化を促進して、まだ十分に解明されていない機構による細胞死をもたらす。例えば、Ser14でのヒストンH2Bリン酸化が、アポトーシスの間にクロマチン構造にどのように影響し得るのかは、未知であるが、以前の研究によって、ヒストンH2Bアミノ末端テールが、インビトロクロマチンコンパクションに必須であることが示されている。従って、H2Bリン酸化は、アポトーシスの間のクロマチンコンパクションに関与することが予測される。
【００５２】
アポトーシスの間のクロマチン変化の機構を理解することは、薬物標的化のための別の手段であって、細胞死を誘導または阻害し得る手段を提供する。凝縮、およびDNA断片化のようなクロマチンの変化は、アポトーシスの最後の方向付けられた段階とみなされている。アポトーシスを被ることによってストレス下で多くの細胞が死ぬということを示唆する、かなりの証拠が存在する。しかし、カスパーゼインヒビターの使用は、最初のストレス（例えば、虚血）が生じた後の細胞死の減少に対して有効ではない。おそらく、エフェクターであるカスパーゼが、規定されたクロマチン変化をもたらす死亡経路を起動した後、カスパーゼはもはや必要ではない。従って、細胞死の有効な防止は、カスパーゼインヒビターを、アポトーシスの間のクロマチン変化に影響するMst1のような下流の活性を標的する薬物と合わせることによって、最高にもたらされ得る。1つの実施形態によれば、カスパーゼインヒビター、およびMst1のインヒビターを用いて細胞を処理することによって細胞死を阻害するための方法が提供される。
【００５３】
1つの実施形態において、サンプルのキナーゼ活性、より詳細にはMst1活性を検出するための方法が提供される。この方法は、配列CSAPAPKKGSKK（配列番号2）を含むペプチドと、キナーゼ活性を有することが疑われるサンプルとを、所定の長さの時間接触させる工程を包含する。基質に結合するS14P抗体の量は、基質が、所定の時間の間、リン酸化された程度と直接、相関しており、従ってこのサンプルのキナーゼ活性を示す。このアッセイはまた、Mst1活性の潜在的な調節因子（インヒビターを含む）、およびMst1活性の刺激因子についてスクリーニングするために用いることもできる。例えば、1つの実施形態において、Mst1活性のインヒビターについてのスクリーニングの方法は、以下の工程：サンプルを提供する工程であって、ここでこのサンプルが、キナーゼ（すなわち、Mst1）、およびそのキナーゼによってメチル化される基質（例えば、ペプチドCSAPAPKKGSKK；配列番号2が、Mst1活性についての基質として用いられる）を含む工程、キナーゼの潜在的なインヒビターをサンプルに投与する工程、ならびにこのサンプルを、代表的には（すなわち、インキュベート化合物の非存在下で）、キナーゼ活性について、好ましい／許容される条件下で、所定の長さの時間インキュベートする工程、を包含する。好ましい実施形態において、このサンプルは、最大キナーゼ活性を仮定して、この基質の少なくとも半分が修飾される時間でインキュベートされる。Mst1キナーゼが基質を修飾することを可能にするのに十分な時間の後に、この基質を、回収して、リン酸化された基質（ただし、リン酸化されていない基質ではない）に特異的に結合する抗体と接触させる。1つの実施形態では、この抗体は、ペプチドCSAPAPKKGSKK（配列番号3）に特異的に結合する。基質ペプチドに結合されるS14P抗体の量を定量することは、サンプル中のキナーゼの活性レベルと直接相関する。同様に、Mst1活性の刺激因子は、同じアッセイ、および同定化合物（基質がリン酸化される速度を増強する）を用いて同定されてもよい。
【００５４】
本発明の1つの実施形態に従って、Mst1活性の変更因子を単離するための化合物のライブラリーをスクリーニングする方法が提供される。この方法は、均等に分割されたMst1基質を、別の反応チャンバ（代表的には、マイクロタイターディッシュの別のウェル）中に、最初に提供する工程を包含する。好ましくは、Mst1基質は、配列SAPAPKKGSKK（配列番号2）を含むタンパク質／ペプチドであって、そして1つの実施形態において、このペプチドは、リンカーを直接、または間接的のいずれかで介してマイクロタイターディッシュの表面に共有結合される。次いで、Mst1基質は、Mst1酵素、および多数の化合物ライブラリーと接触させられて、キナーゼ反応混合物を形成する。1つの実施形態において、化合物を調整する単一の候補物を、各々のウェルに添加するが、別の実施形態では、2つ以上の化合物ライブラリーのメンバーを、各々の個々の反応チャンバに添加する。このキナーゼ反応混合物（Mst1基質、Mst1、および化合物を調節する候補物を含む）を、Mst1キナーゼ活性について代表的に許容される条件下（すなわち、Mst1インヒビターの非存在下）でインキュベートする。Mst1基質のリン酸化を可能にするのに十分な適切な長さの時間後に、反応を停止させて基質を回収する。基質がリン酸化される程度（Mst1活性についての確立された標準曲線、またはコントロールの反応試行に対して、同時に）は、Mst1酵素の活性に対する、添加されたライブラリー化合物の効果を調整することに直接関連する。このようなMst1調整化合物は、不適切なアポトーシス活性と関連する疾患（ガンを含む）を処置するための治療剤として用いられ得る。
【００５５】
Mst1基質のリン酸化を測定することは、アミノ酸配列SAPAPKKGSKK（配列番号2）を基質として、およびS14P抗体を含むポリペプチドを用いて達成することができる。1つの実施形態に従って、共有結合、イオン結合、水素結合、または他の化学的結合を介して、反応容器の表面に直接、または間接的に（すなわち、連結部分を介して）この基質を連結する。1つの実施形態では、この基質は、反応チャンバにMst1基質を添加すること、およびPBS中で4℃で一晩インキュベートすることによって、この反応チャンバの表面に結合される。あるいは、このペプチドは、当業者に公知の標準的な反応基、および反応を用いて、この反応チャンバの表面に共有結合される。Mst1酵素、および潜在的なインヒビターの存在下で、この基質をインキュベートした後、反応混合物を、この反応チャンバから除いて、このチャンバを緩衝液を用いて必要に応じて洗浄する。次いで、その基質への特定の結合を可能にする条件下で、S14P抗体をこの反応チャンバに添加し、次いで、この反応チャンバを、緩衝液を用いて洗浄して、非特異的に結合した材料を取り除く。1つの実施形態に従って、このペプチドに対する抗体の特定の結合は、ELISA反応を通じて検出される。別の実施形態において、この基質は、反応チャンバに結合されず、そしてこのペプチドに対する抗体の特異的な結合は、免疫沈降によって検出される。
【００５６】
本発明の抗体は、アポトーシスのマーカーとしての使用を含む、多数の潜在的用途を有する。アポトーシスは、ガン、神経変性性疾患、発作などにおいて生じることが公知である。さらに、このマーカーはまた、治療処置の進行を評価、およびモニターするために用いることができる。S14P抗体はまた、アポトーシスの間に生じる、クロマチンの変化のマーカーとして用いることができる。この抗体はまた、ヒストン修飾（H2B ser 14リン酸化）を担うシグナル、およびこの修飾がアポトーシスにどのように関与するのかを研究するために用いることができる。
【００５７】
本発明の1つの実施形態において、アポトーシス細胞を検出するためのキットが提供される。このキットは、配列SAPAPKKGSKK（配列番号1）を含むリン酸化されたセリン修飾ペプチドに特異的に結合する抗体を含む。1つの実施形態において、このキットは、配列SAPAPKKGSKK（配列番号2）を含むヒストンH2Bペプチドの非リン酸化アミノ末端に特異的に結合する抗体をさらに含む。1つの実施形態において、この抗体は、不溶性の支持体に付着される。ここでこの支持体は、モノリスの固体であるか、または特定の形態のいずれかである。1つの好ましい実施形態において、この抗体は、モノクローナル抗体であり、そしてさらなる実施形態においては、この抗体は、標識される。この目的を達成するために、本発明の抗体は、種々の容器（例えば、バイアル、チューブ、マイクロタイターウェルプレート、ボトル、など）内にパッケージングされてもよい。他の試薬は、別の容器に含まれてもよく、キットとともに提供されてもよい；例えば、陽性コントロールサンプル、陰性コントロールサンプル、緩衝液、細胞培養培地など。
【００５８】
1つの実施形態に従って、このキットは、キナーゼ活性の基質として作用するペプチドをさらに含む。より詳細には、このペプチドは、配列SAPAPKKGSKK（配列番号2）を含む。1つの好ましい実施形態では、このペプチド基質は、固体基質に対して、直接、または連結部分を介してのいずれかで、共有結合される。
【００５９】
本発明のキットは、一旦標的抗原に結合されれば、抗体を検出するための試薬をさらに備えてもよい。必要に応じて、核タンパク質を、免疫学的結合のために接近可能にさせるように、細胞または組織を処理するための試薬（ペプシン、希釈塩酸）がまた、免疫蛍光検出試薬（抗免疫グロブリン抗体、または抗ヒストンH2B抗体（フルオレセインまたはローダミンで誘導体化された）、またはビオチン化抗免疫グロブリン抗体（フルオレセインまたはローダミンと誘導体化されたアビジンまたはストレプトアビジンと一緒になって））、免疫組織化学、または免疫細胞化学検出試薬（抗免疫グロブリン抗体、または抗ヒストンH2B抗体（アルカリホスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼと誘導体化された）、またはビオチン化抗免疫グロブリン抗体（アルカリホスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼと誘導体化されたアビジン、またはストレプトアビジンと一緒になって））と同様に含まれてもよい。1つの実施形態において、このキットは、免疫ペルオキシダーゼ染色のための1つ以上の試薬（西洋ワサビペルオキシダーゼと誘導体化された抗免疫グロブリン抗体、またはビオチン化された抗免疫グロブリン抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼと誘導体化されたアビジン、またはストレプトアビジンと一緒になって））を、それらのための色素生産性基質（例えば、ジアミノベンジジン）と一緒に、含む。
【００６０】
（実施例１）
（アポトーシスのマーカーとしてのH2Bのリン酸化セリン14の同定）
（実験手順）
細胞培養、薬物、およびUV処理、ならびにタンパク質およびDNAの収集：HL−60細胞を、10％FBSを用いてRPMI中で培養し、一方293T、HeLa、HepG2、およびIMR90を、10％FBSを含むDMEM中で増殖させた。エトポシド、アニソマイシン、および抗Fasを、Sigmaから購入した。アポトーシスを誘導するために、エトポシドについては、20μg／mL、25ng/mlのアニソマイシン、および15ng/mlの抗Fasの濃度で、薬物を用いた。アポトーシスのUV誘導については、40〜100J/m2を用いた（Biorad GS Gene Linker UVチャンバ）。アポトーシスの誘導後、増殖培地を変えて、種々の時間後に収集した。コントロール細胞を、DMSOで処理するか、または偽の処理のいずれかをした。
【００６１】
所望の処置の後に、細胞を以下のうちのいずれかに供した：SDS溶解緩衝液（レムリのサンプル緩衝液）における再懸濁、核抽出、ヒストンの酸抽出、またはゲノムDNA抽出。Strahlら（2001）Curr Biol 11,996〜1000に記載のように、界面活性剤中での溶解、および低速スピンによって核を単離した。これらの核を、核タンパク質（以下を参照のこと）について塩抽出するか、または0.4N H2SO4中で酸抽出してもよい。氷上での2〜4時間のインキュベートの後、高速の遠心分離を行なって、不溶性のペレットを除去する。5.4％の過コール酸を、上清に添加して、沈殿したヒストンを水に再懸濁した。
【００６２】
細胞ペレットを10mM Tris pH 9.0,1mM EDTA、10mM NaCl、1％ w/v SDS、1mg/mLのプロテイナーゼKに、4〜5時間、50℃で溶解することによって、ゲノムDNAを収集した。タンパク質を除去するために、フェノール／クロロホルム抽出を実施し、次いで、0.3M酢酸ナトリウムおよび70％エタノール中にDNAを沈殿させた。遠心分離後、ペレットをTEに再懸濁して、1mg/mL Rnase Aに室温で1時間添加することによって、RNAを消化した。1.2％アガロースTAEゲルにおいて、DNAを分離した。
【００６３】
（塩での核抽出、およびインゲルのキナーゼアッセイ）
HL−60由来の核を、20mM Hepes pH7.8、0.42M NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、0.5mM PMSF、0.5mM DTT、25％（v/v）グリセロール中で、氷上で3〜4時間抽出した。14Kで20分間の遠心分離後、可溶性画分を単離して、インビトロにおけるキナーゼアッセイ、インゲルのキナーゼアッセイ、およびウエスタンブロットに用いた（以下を参照のこと）。SDS−PAGEは、Laemmliによって記載されたとおり行なった。インゲルアッセイのために、10〜12％ SDS−PAGEゲルを、0.1 mg/mLのニワトリのコアヒストン、または0.1mg/mLの精製ニワトリH2Bを用いて重合化した。インゲルは、本質的に、（Sasson−Corsiら（1999）Science 285,886−891）に記載のように行なった。要するに、核抽出物、または画分をこれらのゲル中に泳動させた。次いで、SDSを除去するために、このゲルを30mM Tris HC1 pH 7.4、1mM DTT、O.1mM EDTA、20％（v/v）イソプロパノール中で、各回について20分間、繰り返し（3回）洗浄した。タンパク質を変性するために、このゲルを8M尿素中、30mM Tris HC1（pH 7.4）、1mM DTT、O.1mM EDTA中で1時間インキュベートした。次いで、このゲルを30mM Tris HC1（pH 7.4）、5mM MgCl2、2mM MgCl2、1mM DTT、100mM NaCl、0.05％ Tween 40中に、4℃で一晩浸漬して、タンパク質を変性させた。変性後、50mCiのg−ATPを含有する30mM Tris HC1 pH 7.4、5mM MgCl2、2mM MnCl2、1mM DTTを用いて、30℃で2時間、インビトロのキナーゼ反応を実施した。次いで、このゲルをクマーシーブルーを用いて染色し、脱染して、オートラジオグラフィー用に乾燥させた。
【００６４】
（核抽出分画、インビトロキナーゼアッセイ、およびウエスタンブロット）
核抽出物を、Pharmacia SMARTシステムを用いて、superose 6 PC 3.2/300 カラム（Amersham/Pharmacia）において分画した。この溶出物は、200mM NaCl、50mM NaP04（pH7.0）、5mM MgC12、20％ v/vグリセロールから構成される。流速は、4℃で40mL/分であった。カスパーゼ切断Mst1を含有するアポトーシス画分は、約66kDaの分子量で外れるが、全長のMst1では約150kDaで外れる。10mLの画分を、インビトロキナーゼ反応、およびウエスタンブロッティングのために用いた。インビトロキナーゼアッセイのために、0.5mgのヒストンH2Bを、30mM Tris（pH 7.5）、5mM MgCl2、10mM DTT、0.1mg/mL マイクロシスチン、10mM ATPに加えて0.5 mCiのg−P32 ATP中で用いた。この反応を30℃で20分間インキュベートして、P81濾紙上にスポットした。次いで、この濾紙を0.75％ H3PO4中で洗浄して、シンチレーションカウンターを用いて、P32取り込みを測定した。非放射性反応（コールド）について、g−P32 ATPは用いなかった。そしてこの反応は、ウエスタンブロット解析のためにSDS−PAGEゲル中で行なった。
【００６５】
記載されたとおり（Briggsら（2001）Genes Dev 15、3286−3295）、ウエスタンブロット分析を実施した。1：1000のα−phos（S14）H2B、1：2500のα−N−Mstl、1：400のα−myc（Santa Cruzの9E10）、1：800のα−PARP（UBI）、1：1000のα−phos H2A. X（UBI）、および1：5000のα−Acetyl H4一次抗体を用いた。HRP結合体化ウサギ二次（Amersham Pharmacia）を1：5000で用いた。化学発光については、ECLプラスキット（Amersham Pharmacia）を検出に用いた。
【００６６】
（アポトーシス細胞培養、およびXenopusの尾部に対する免疫蛍光）
細胞を4％パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、次いでPBS中で洗浄した。0.2％ Triton X−100で5分間細胞を浸透させ、次いで細胞を2％ヤギ血清PBS中でブロックした。1：500〜1：1000のα−phos（S14）H2Bを用いて、37℃で細胞を1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ブロックで3回洗浄した。洗浄後、細胞を、1：500〜1：800のヤギ抗ウサギCy3結合体化二次抗体中で1時間インキュベートして、ブロック中で3回洗浄した。次いで、細胞を含有するカバーガラスを、DAPIを含有するVectashield封入培地中に据え付けた。
【００６７】
退縮している尾部を、64期のカエルの仔から切り出して、Bouin fixative（Sigma）中で2時間固定して、70％エタノール中で一晩洗浄し、脱水し、Histoclear中で浄化して、パラプラスト中に包埋した。10mmの切片を脱パラフィン処理して、水和して、30分間、0.1％ BSA含有PBS−0.05％ Tween20中でブロックした。切片をα−phos（S14）H2B（1％ BSA含有PBS−0.05％ Tween20中で、1：5000希釈）を用いて、30分間インキュベートして、PBS−Tween中で、各10分間、2回洗浄した。洗浄後、抗ウサギフルオレセイン結合体化二次抗体（1％BSA含有PBS−Tween中で、1：200希釈）を用いて、切片を30分間インキュベートして、PBS−Tween中で、各10分間、2回洗浄した。切片を、Hoechst（2μg/ml）含有Antifade（分子プローブ）中に据え付けた。
【００６８】
（一過性トランスフェクション、免疫沈降、およびキナーゼアッセイ）
リポフェクタミンプラスキット（Gibco Invitrogen）によってトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの24〜48時間後、293T細胞を、40mM Hepes（pH 7.5）、1％ Triton X−100、0.05％ NP−40、150mM NaCl、50mM NaF、1mM EDTA、1mM EGTA、10％（v/v）グリセロール、1mM フッ化フェニルメチルスルホニル、0.5mg/mL ミクロシスチン、1mg/mL アプロチニン、1mg/mL ペプスタイン、1mg/mL ロイペプチン中で収集した。上清を14,000rpmでの20分間の遠心分離後に保管した。免疫沈降（IP）のために、1mgのα−myc（Santa Cruzの9E10）を、4℃で2時間、上清とともにインキュベートし、次いで、タンパク質G−Sepharose（Amersham Pharmacia）を用いて、4℃でさらに2時間沈殿させた。IPを、TBST（20mM Tris pH 7.5、150mM NaCI、0.1％ Tween 20）中で5〜6回洗浄した。次いで、ビーズを、1mgのH2B、40mM Hepes 7.5、20mM MgCl2、0.1mg/mL ミクロシスチン、10mM ATP、1mCi g−P32 ATP中で、30℃で30分間インキュベートした。この反応物を、15％SDS−PAGEゲル上で分離して、オートラジオグラフィー用に乾燥させた。
【００６９】
（結果）
（セリン14でのH2Bのリン酸化は、アポトーシスを被っているHL−60細胞中で強力に誘導される）
以前に、インビボの標識研究によって、H2Bリン酸化が、アポトーシスの間、アミノ末端のテールで特異的に起こることが示されている。従って、部位特異的な、H2Bセリン14リン酸−特異的抗体（S14P抗体）を、生成して、これらの関係をさらに検討した。最初に、HL−60（ヒト白血球細胞株）細胞をエトポシド（VP−16）を用いて処理して、アポトーシスを誘導する。種々の長さの時間の処理の後、ヒストンを、酸抽出によって単離して、S14P抗体を用いてウエスタンブロットによって検討した。H2Bリン酸化シグナルは、VP−16処理後約4時間で強力に増強される。アポトーシスの誘導を確実にするため、同一の時点で、並行のサンプルから、可溶性DNAを抽出した。「DNAラダー」の出現（アポトーシスのDNAフラグメントの指標）は、処理後4時間で、H2B Ser14リン酸化の出現と正確に同時に発生する。さらに、H2B S14リン酸化の増大は、エトポシドに対する曝露時間と相関することが観察された。これらのデータによって、2つの事象が時間的に関連していたことが実証される。
【００７０】
セリン14でのH2Bのリン酸化が、アポトーシス細胞において特異的に生じることを確認するため、VP−16処理したHL−60細胞を、S14P抗体を用いて免疫染色した。著しいことに、大部分のS14P抗体シグナルが、DAPI染色によって同定される、特徴的なアポトーシス性染色質体に局在したことが見出される。これらのデータによって、セリン14でのH2Bのリン酸化が、アポトーシスのHL−60細胞において特異的に生じることが示唆される。対照的に、他のヒストン抗体（「有糸分裂の」H3（Ser10）ホスホ抗体を含む）は、これらのアポトーシス核を染色しない。同様に、S14P抗体は、凝集した有糸分裂の染色体を染色できず、これらの別個のヒストンリン酸化事象の生物学的特異性（有糸分裂対アポトーシス）を連想させる。VP16の予期されないあらゆる効果を除外するために、他のアポトーシス誘導因子を、異なる細胞株で試験した。表1に要約したとおり、異なる細胞株、および周知のアポトーシス誘導因子がまた、アポトーシスの間、種々の程度にかかわらず、H2B（Ser14）リン酸化をもたらした。従って、本発明者らのデータによって、セリン14でのヒストンH2Bリン酸化が、複数の哺乳動物細胞株において、凝縮したアポトーシスクロマチンに関連していることが明白に実証される。
アポトーシスを被っている種々の細胞株が、H2B S14リン酸化の増大を示す
【表１】2005506973.tif 000003
細胞傷害性因子の処理後、細胞を収集した。α−Phos（S14）H2Bを用いるウエスタンブロットによって、H2B S14リン酸化のレベルを決定する。
【００７１】
（H2B（Ser14）リン酸化は、発生上のスカルプチャリング事象の間のプログラムされた細胞死の間に増大される）
H2B（Ser14）リン酸化がまた、より生物学的なモデルにおいてアポトーシスに関連しているか否かを決定するために、プログラムされた細胞死が周知であり、そして十分特徴付けられている動物において、この修飾を検討した。ヒストンH2Bアミノ末端の一次アミノ酸配列の検査によって、セリン14が、Xenopusを含む、脊椎動物種の中で保存されていることが明らかになる。形態発生の間、再吸収が、Xenopus laevisの尾部で生じ、これらの細胞のクラスターは、発生上のプログラムされたアポトーシスによって死ぬ。64期のカエルの仔由来の退縮中の尾部を、S14P抗体を用いる免疫蛍光によって検討した。この抗体からのシグナルは代表的に、この尾部におけるアポトーシス細胞のポケットを染色し、そしてHoechst−denseアポトーシス凝縮核と、正確に同時局在する。これらのデータによって、H2B（Ser14）リン酸化がまた、正常なXenopusの発生の間にアポトーシス細胞において生じることが示される。対照的に、非アポトーシスの染色は、S14P抗体を用いて、Caenorhabditis、またはDrosophilaにおいて、セリンがこれらの無脊椎動物において存在しないという観察と一致して観察される。
【００７２】
（アポトーシス細胞由来の核抽出物は、34kDa H2B Ser14キナーゼを含む）
H2B（Ser14）リン酸化と、アポトーシスとの間の関連をさらに理解するため、このリン酸化事象の責任を担うキナーゼを同定するための試みを行なった。HL−60細胞が、これらの研究の開始点として選択された。なぜなら、H2BのSer14リン酸化は、VP−16処理されたHL−60細胞中で強力に増大されるからである。偽の処理をしたHL−60細胞、およびVP−16処理をしたHL−60細胞由来の核抽出物を、予備的なキナーゼアッセイ、およびウエスタンブロットのために用いた。最初に、「アポトーシスの」核抽出物が、刺激された細胞で大きく増大される、H2B Ser14キナーゼ活性を含むことが決定された。
【００７３】
ヒストンH2Bに基づく、インゲルキナーゼアッセイを用いて、粗アポトーシス抽出物における、潜在的なアポトーシスH2Bキナーゼの分子量を、研究して、観念的に決定する。基質として、H2B、またはコアヒストンの混合物のいずれかを用いて、突出したアポトーシス誘導性ヒストンキナーゼを検出した。多数のバンドが、共通して、H2B含有ゲルと、「基質なし」ゲルとの間に出現するが（自己リン酸化に起因する可能性が高い）、約34kDaの見かけの分子量を有する、1つのバンドが、H2B含有ゲルにおいて一貫して検出される。これらのデータによって、刺激された（アポトーシスの）HL−60核抽出物が、誘導された34kDa H2Bキナーゼ（本明細書において、以降は、34H2BapoK）を含むことが示唆される。
【００７４】
Mst1（哺乳動物ステライル20）は、約34kDaのカスパーゼ活性化Ser/Thrタンパク質キナーゼであり、その活性は、いくつかの生物学的設定下でアポトーシスを誘導するのに原因となる役割を果たす。しかし、プログラムされた細胞死に対する、このキナーゼの生物学的標的は、以前には未知であった。34H2BapoKが、実際にMst1であるか否かを決定するため、VP−16刺激されたHL−60細胞から調製された核抽出物を、最初にMst1に対するアミノ末端抗体（α−N−Mst1；この抗体は、Mst1のN末端触媒性ドメインを検出する（Gravesら（1998）EMBO 17,2224〜2234））を用いてプローブして、Mst1のカスパーゼ切断型が、インゲルH2Bキナーゼアッセイによって検出されるように、34H2BapoKを含有する画分中に存在するか否かを決定した。ウエスタンブロット解析によって、Mst1の切断型が、これらの核抽出物に存在すること、およびその分子量が、アポトーシス誘導性H2Bキナーゼに対して、もし同一でなくても、同様であることが示される。
【００７５】
（Mst1のカスパーゼ切断型は、H2B（Ser14）キナーゼ活性で同時断片化する）
アポトーシス誘導性H2Bキナーゼをさらに特徴付けるため、アポトーシス核抽出物を、サイズ排除カラム（Superose 6）を用いて分画して、このキナーゼを部分的に精製した。「アポトーシスの」、および「正常な」核抽出物からのH2Bキナーゼ活性の比較によって、アポトーシス抽出物の画分18は、偽の処理をした抽出物由来の同じ画分よりも、H2Bキナーゼ活性が2〜3倍濃いことが示された。この濃さは、画分18におけるポリペプチドの自己リン酸化の増大には起因しない。なぜなら、基質なしに実施したキナーゼアッセイでは、コントロールと、アポトーシス画分との間の変化が示されなかったからである。他の画分は、ヒストンH2Bキナーゼ活性を示すが、偽の処理をした抽出物と、VP16処理をした抽出物との間では有意な相違は検出されず、このことは、アポトーシス誘導性H2Bキナーゼが、これらの画分に存在しないことを示唆する。画分18を含んだH2Bキナーゼ活性が、Ser14でH2Bをリン酸化することを確認するため、基質として非放射性ATP、およびH2Bを用いるキナーゼ反応を実施して、S14P抗体を用いるウエスタンブロットによって解析した。予想通り、画分18のみが、セリン14キナーゼ活性を増強した。
【００７６】
α−N−Mst1を用いた、画分18のすぐ周辺の画分のウエスタンブロットによって、アポトーシス抽出物由来の画分18のみが、Mst1のカスパーゼ切断型を含むことが示される。まとめると、アポトーシスの核抽出物から調製された画分18における、H2B Ser14キナーゼ活性の増大、およびMst1のカスパーゼ活性型の存在の同時出現によって、Mst1切断産物が、34H2Bapokであることが強力に示唆される。この仮説をさらに立証するため、基質としてニワトリH2Bを用い、正常な核抽出物、およびアポトーシスの核抽出物からの画分18を用いて、インゲルのキナーゼアッセイを、実施した。このインゲルのキナーゼアッセイによって、この画分が実際に、コントロール画分には存在しない、34kDaのH2Bキナーゼ活性を含むことが示される。従って、これらのデータは、34H2BapoKが、Mst1の切断型であることと一致する。
【００７７】
（Mst1は、インビトロ、およびインビボにおいて、セリン14でヒストンH2Bをリン酸化し得る）
Mst1が、ヒストンH2Bをリン酸化し得るか否かを直接試験するため、myc−タグ化全長（FL）型のMst1、キナーゼ死滅（KD）型のMst1、またはC末端短縮型（DC）のMst1のいずれかを含有する、CMV駆動プラスミドを、293T細胞にトランスフェクトした。次いで、mycに対する抗体を用いる、これらの型のMst1の免疫沈降（IP）を、g（32P）−ATPの存在下で、またはコールドATPとともに、そしてヒストンH2Bを基質として用いて、実施したインビトロキナーゼアッセイによって解析した。コールドの反応を、α−myc、およびα−phos（S14）H2Bを用いたウエスタンブロッティングによって解析した。H2Bの強力なリン酸化を、全長のMst1、およびDC Mst1の両方を用いて検出した。その結果は、DC Mst1がMst1のカスパーゼ切断型を模倣するという知見と一致する。対照的に、キナーゼ死滅型Mst1（シングルポイントミューテーションを含む）は、H2Bをリン酸化せず、このことは、Mst1 IPに関連する他のヒストンキナーゼの可能性に反論する。Mst1によるヒストン優先を決定するために、基質として個々のコアヒストンを用いて、同様のIPキナーゼ反応を実施した。ここでも、Mst1 FL、およびDCは、ヒストンH2Bについて強力な優先を示す。まとめると、これらのデータによって、H2Bが、インビボにおいてMst1の生物学的に関連する核基質であることが示唆される。
【００７８】
Mst1が、Ser14でH2Bをリン酸化し得るか否かを試験するため、H2B、および非放射性ATPを用いて、同様のIPキナーゼ反応を実施した。次いで、Mst1タンパク質発現レベルについてはα−myc、そしてS14P抗体を用いて、ウエスタンブロッティングによって反応を解析した。予想どおり、Mst1のFL、およびDCの両方が、S14P抗体によって検出されるとおり、Ser14でH2Bをリン酸化するが、キナーゼ死滅Mst 1はリン酸化しない。従って、全長のMst1、および短縮型Mst1は、Ser14でヒストンH2Bを直接リン酸化し得る。
【００７９】
Mst1は、HeLa細胞において過剰発現される場合、アポトーシス様クロマチンコンパクションを誘導し得る。Mst1が、HeLa細胞で発現される場合、H2Bをリン酸化し得るか否かを決定するため、全長Mst1、およびキナーゼ死滅バージョンのMst1を、HeLa細胞にトランスフェクトして、次いで、S14P抗体を用いて、細胞抽出物のウエスタンブロットをプローブした。H2B Ser14リン酸化の増大は、Mst1全長構築物（WT）を保有する細胞においてのみ検出された。キナーゼ死滅変異体を用いた場合、かなり少ないシグナルが検出される。これらのデータによって、Mst1が、これらのアッセイ条件下で、細胞中で、H2B Ser14キナーゼとして機能すること、およびH2Bが、Mst1についての重要な生物学的な基質であり得る（なぜなら、それは、アポトーシスの染色体凝縮に関連するから）ことが示唆される。
【００８０】
（H2B Ser14リン酸化の反応速度論は、アポトーシスの間のMst1の切断と同様である）
Mst1切断が、アポトーシスの間にH2B Ser14リン酸化を確立するのに重要である場合、両方の事象の反応速度論は、同様であるはずである。HL−60細胞を、アポトーシスを被るように誘導し、そしてウエスタン解析のために30分間隔で収集した。経時的解析（S14P抗体、およびα−N−Mst1抗体を用いてウエスタンブロットをプローブする）によって、H2Bリン酸化の発現が、誘導後2時間でカスパーゼ切断Mst1の最初の出現と同時に出現することが示される。アポトーシスのためのマーカーとして、同一のブロットをまた、細胞がアポトーシスを被るときに切断する、α−PARP（ポリ（ADP−リボース）ポリメラーゼを用いてプローブし、そして単離されたゲノムDNAを、特徴的なDNAラダーの出現について評価した。興味深いことに、PARPの切断、およびDNAラダーの出現は、H2Bリン酸化、およびMst1の切断の両方の直後に（誘導後約2.5時間）生じる。タイミングの相違は、これらのアポトーシスマーカーの間の検出感度の相違を反映し得るが、このデータによって、H2Bリン酸化が、DNAラダー化に先行し、従って、依然として未知の機構によってアポトーシスDNA断片化を確立することにおいて役割を果たし得ることが示唆される。より重要なことには、カスパーゼ切断Mst1の発現は、アポトーシス誘導の時間経過の間のH2B Ser14リン酸化の出現に密接に関連している。
【００８１】
（アポトーシスの間のH2Bセリン14リン酸化と、他のヒストン修飾との間の反応速度論の比較）
ヒストンH4のアセチル化は、アポトーシスの間に低下する。なぜなら、細胞が、凝縮、およびDNA断片化を被り、そしてより詳細には、ヒストンH4脱アセチル化が、H2Bリン酸化の出現の直後に生じるからである。従って、H2Bリン酸化が、アポトーシスのクロマチンコンパクションの間の過剰アセチル化された（活性の）クロマチンドメインの損失に起因して生じるという可能性は低いようである。H2A.Xリン酸化はまた、二本鎖DNA分解に関連している。VP16（エトポシド）も、DNA分解を生じるので、H2A.Xリン酸化の反応速度論をまた評価した。予想どおり、H2A.Xリン酸化は、VP16処理の1時間内に生じ、このことは、VP16によって誘導されるDNA分解が、アポトーシス経路の初期に生じることを示唆する。H2B（Ser14）リン酸化は、H2A.Xリン酸化よりも後に、ただし他の周知のアポトーシスマーカーの前に（または同時に）生じるので、これらのデータによって、H2Bリン酸化は、DNA分解に単純に関連しないことが示唆される。むしろ、H2Bリン酸化は、HL−60細胞において、アポトーシスについての固有のクロマチンマーカーであると考えられる。
【００８２】
（H2B Ser14リン酸化、およびMst1の切断は、カスパーゼ3依存性である）
カスパーゼは、アポトーシスプログラムの多くの不可欠の部分に関与しているので、本発明者らは、もし存在するなら、H2B Ser14リン酸化がどの程度まで、活性化されたエフェクターカスパーゼによって制御されるかを決定しようと努力した。さらに、Mst1切断は、カスパーゼ3に依存性であり、次いで、核輸出シグナル（NES；活性化されたカスパーゼ3によって脱落される）を失っているMst1のN末端切断型は、核に転位される。次いで、短縮されたMst1は、核に移動して、クロマチンコンパクション、およびアポトーシスを誘導する。
【００８３】
H2B（Ser14）リン酸化が、Mst1の切断に依存する場合、このヒストン修飾は、DEVDペプチドのような立証されたカスパーゼ3インヒビターに感受性であるはずである。この予測を試験するため、HL−60細胞を、種々の量のz−DEVD−fmk（Trevigen）を用いてプレインキュベートし、その後に引き続いて、VP16を用いて4時間処理した。次いで、細胞抽出物を、ウエスタン解析のために収集した。Mst1 N末端、およびH2B S14 phos抗体を用いるウエスタンブロットによって、200mMのz−DEVD−fmkを用いたインキュベーションが、Mst1切断、およびH2B Ser14リン酸化の両方を阻害したことが示された。さらに低用量の、20mMのz−DEVD−fmkでは、全長のMst1、およびH2Bリン酸化を超える短縮されたMst1の割合のごく軽度の低下が観察される。これらのデータによって、H2B Ser14リン酸化は、アポトーシスの間のMst1自体の切断と同様に、カスパーゼ3依存性であることが実証される。従って、H2Bは、カスパーゼ3生成された型のMst1によって、Ser14でインビボでリン酸化される可能性が高い。さらに、このデータによって、H2Bが、この活性についての以前に認識されていない核基質であること、およびSer14におけるH2Bのリン酸化が、少なくとも脊椎動物において、アポトーシスの「ヒストンコード」の一部であるという可能性の示唆が示される。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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