(57)【要約】本発明は、甘味またはアミノ酸の味覚レセプターの単離された核酸配列およびアミノ酸配列（感覚Ｇタンパク質共役型レセプターのＴ１Ｒファミリーに由来する２つの異種Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドを含む）、そのようなレセプターに対する抗体、このような核酸およびレセプターを検出する方法、ならびに甘味およびアミノ酸の味覚レセプターのモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドを含む単離された味覚レセプターに関し、ここで該Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ１Ｒ３ポリペプチドを含む単離された味覚レセプターであって、ここで該Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、単離された味覚レセプター。
【請求項２】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の単離されたレセプター。
【請求項３】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたレセプター。
【請求項４】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、配列番号１４、１９、２２、２４または２９のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の単離されたレセプター。
【請求項５】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが組換え体である、請求項１に記載の単離されたレセプター。
【請求項６】
請求項５に記載の単離されたレセプターを含む、宿主細胞。
【請求項７】
前記レセプターが、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドと異種ポリペプチドとを含む、請求項１に記載の単離されたレセプター。
【請求項８】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、請求項７に記載の単離されたレセプター。
【請求項９】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、共有結合により結合されている、請求項７に記載の単離されたレセプター。
【請求項１０】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、組換え体である、請求項７に記載の単離されたレセプター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換え体のレセプターを発現する、宿主細胞。
【請求項１２】
前記異種ポリペプチドが、配列番号１、２、３または２７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＴ１Ｒ１ポリペプチドである、請求項７に記載の単離されたレセプター。
【請求項１３】
前記異種ポリペプチドが、配列番号１、２、３または２７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＴ１Ｒ１ポリペプチドである、請求項７に記載の単離されたレセプター。
【請求項１４】
前記Ｔ１Ｒ１ポリペプチドが、配列番号１、２、３または２７のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の単離されたレセプター。
【請求項１５】
前記Ｔ１Ｒ１ポリペプチドが、配列番号４、５、６または２６のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１２に記載の単離されたレセプター。
【請求項１６】
前記レセプターがアミノ酸味覚リガンドに結合する、請求項１２に記載の単離されたレセプター。
【請求項１７】
前記味覚リガンドが、システイン、メチオニン、アルギニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アスパラギン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン、セリン、スレオニン、グリシン、グルタミン酸塩、グルタミン酸一ナトリウムおよびＬ−ＡＰ４からなる群より選択される、請求項１６に記載の単離されたレセプター。
【請求項１８】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ１ポリペプチドが、組換え体である、請求項１２に記載の単離されたレセプター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換え体のレセプターを発現する、宿主細胞。
【請求項２０】
前記異種ポリペプチドが、配列番号７、８または９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＴ１Ｒ２ポリペプチドである、請求項７に記載の単離されたレセプター。
【請求項２１】
前記異種ポリペプチドが、配列番号７、８または９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＴ１Ｒ２ポリペプチドである、請求項７に記載の単離されたレセプター。
【請求項２２】
前記Ｔ１Ｒ２ポリペプチドが、配列番号７、８または９のアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の単離されたレセプター。
【請求項２３】
前記Ｔ１Ｒ２ポリペプチドが、配列番号１０、１１、１２または２８のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項２０に記載の単離されたレセプター。
【請求項２４】
前記レセプターが甘味味覚リガンドに結合する、請求項２０に記載の単離されたレセプター。
【請求項２５】
前記甘味味覚リガンドが、スクロース、フルクトース、サッカリン、アセスルファーム−Ｋ、ズルチン、アスパルテーム、シクラミン酸塩、ならびにグアニジノ酢酸１およびグアニジノ酢酸２（ＧＡ−１およびＧＡ−２）からなる群より選択される、請求項２４に記載の単離されたレセプター。
【請求項２６】
前記レセプターがＤ−アミノ酸味覚リガンドに結合する、請求項２０に記載の単離されたレセプター。
【請求項２７】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ２ポリペプチドが、組換え体である、請求項２０に記載の単離されたレセプター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の組換え体のレセプターを発現する、宿主細胞。
【請求項２９】
前記レセプターが、Ｇタンパク質共役型レセプター活性を有する、請求項１に記載の単離されたレセプター。
【請求項３０】
前記レセプターが、配列番号１５、２０、２３、２５または３０に対して惹起された抗体に特異的に結合する、請求項１に記載の単離されたレセプター。
【請求項３１】
Ｔ１Ｒ３ポリペプチドとＴ１Ｒ１ポリペプチドとを含む単離された味覚レセプターであって、ここで該Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ；そしてここで、該Ｔ１Ｒ１ポリペプチドは、配列番号１、２、３または２７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、単離された味覚レセプター。
【請求項３２】
Ｔ１Ｒ３ポリペプチドとＴ１Ｒ２ポリペプチドとを含む単離された味覚レセプターであって、ここで該Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ；そしてここで、該Ｔ１Ｒ２ポリペプチドは、配列番号７、８または９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、単離された味覚レセプター。
【請求項３３】
請求項１に記載の味覚レセプターに対して特異的に結合する、抗体。
【請求項３４】
前記抗体が、Ｔ１Ｒ１とＴ１Ｒ３とを含む味覚レセプターに対して特異的に結合する、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３５】
前記Ｔ１Ｒ１ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
前記Ｔ１Ｒ１ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、共有結合により結合されている、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３７】
前記抗体が、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３とを含む味覚レセプターに対して特異的に結合する、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３８】
前記Ｔ１Ｒ２ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
前記Ｔ１Ｒ２ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、共有結合により結合されている、請求項３７に記載の抗体。
【請求項４０】
味覚細胞において味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）Ｔ１Ｒ３ポリペプチドを含む味覚レセプターと該化合物を接触させる工程であって、ここで、該Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、工程；および
（ｉｉ）該レセプターに対する該化合物の機能的効果を決定する工程であって、それにより味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する、工程
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記レセプターが、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドと異種ポリペプチドとを含む、請求項４０に記載の方法
【請求項４３】
前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記異種ポリペプチドが、配列番号１、２、３または２７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＴ１Ｒ１ポリペプチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記異種ポリペプチドが、配列番号１、２、３または２７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＴ１Ｒ１ポリペプチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｔ１Ｒ１ポリペプチドが、配列番号１、２、３または２７のアミノ酸配列を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記異種ポリペプチドが、配列番号７、８または９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＴ１Ｒ２ポリペプチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記異種ポリペプチドが、配列番号７、８または９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＴ１Ｒ２ポリペプチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｔ１Ｒ２ポリペプチドが、配列番号７、８または９のアミノ酸配列を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記レセプターが組換え体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記レセプターが、Ｇタンパク質共役型レセプター活性を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
前記機能的効果がインビトロで測定される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記機能的効果が物理的効果である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記レセプターが固相に結合されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記機能的効果が、前記レセプターに対する化合物の結合を測定することによって決定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記機能的効果が、前記レセプターの細胞外ドメインに対する化合物の結合を測定することによって決定される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記レセプターが、細胞または細胞膜において発現される、請求項４０に記載の方法。
【請求項５８】
前記機能的効果が物理的効果である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記機能的効果が、前記レセプターに対するリガンドの結合を測定することによって決定される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記機能的効果が、前記レセプターの細胞外ドメインに対する化合物の結合を測定することによって決定される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記機能的効果が、化学的効果または表現型的効果である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記機能的効果が、細胞内ｃＡＭＰ、ＩＰ３またはＣａ２＋における変化を測定することによって決定される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
味覚細胞において味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）Ｔ１Ｒ３ポリペプチドとＴ１Ｒ２ポリペプチドとを含む味覚レセプターを発現する細胞と該化合物を接触させる工程であって、ここで、該Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ；そしてここで、該Ｔ１Ｒ２ポリペプチドは、配列番号７、８または９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、工程；および
（ｉｉ）該レセプターに対する該化合物の機能的効果を決定する工程であって、それにより味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する、工程
を包含する、方法。
【請求項６６】
前記Ｔ１Ｒ２ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｔ１Ｒ２ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、共有結合により結合されている、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
味覚細胞において味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）Ｔ１Ｒ３ポリペプチドとＴ１Ｒ１ポリペプチドとを含む味覚レセプターを発現する細胞と該化合物を接触させる工程であって、ここで、該Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ；そしてここで、該Ｔ１Ｒ１ポリペプチドは、配列番号１、２、３または２７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、工程；および
（ｉｉ）該レセプターに対する該化合物の機能的効果を決定する工程であって、それにより味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する、工程
を包含する、方法。
【請求項６９】
前記Ｔ１Ｒ１ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記Ｔ１Ｒ１ポリペプチドおよび前記Ｔ１Ｒ３ポリペプチドが、共有結合により結合されている、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。
【請求項７２】
前記核酸が、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項７１に記載の核酸。
【請求項７３】
前記核酸が、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードする、請求項７１に記載の核酸。
【請求項７４】
前記核酸が、配列番号１４、１９、２２、２４または２９のヌクレオチド配列を有する、請求項７１に記載の核酸。
【請求項７５】
請求項７１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項７６】
請求項７５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項７７】
配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項７８】
前記ポリペプチドが、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
前記ポリペプチドが、配列番号１５、２０、２３、２５または３０のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされる、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
前記ポリペプチドが、配列番号１４、１９、２２、２４または２９のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる、請求項７７に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
請求項７７に記載のポリペプチドに対して特異的に結合する、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、ＵＳＳＮ  ６０／３０２，８９８（２００１年７月３日付け出願）、ＵＳＳＮ  ０９／９２７，３１５（２００１年８月１０日付け出願）、およびＵＳＳＮ  ６０／３５８，９２５（２００２年２月２２日付け出願）に対する優先権を主張する。この各々は、その全体において、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
本願はまた、ＵＳＳＮ  ６０／０９５，４６４（１９９８年７月２８日付け出願）；ＵＳＳＮ  ６０／１１２，７４７（１９９８年１２月１７日付け出願）；ＵＳＳＮ  ０９／３６１，６３１（１９９９年７月２７日付け出願）；ＵＳＳＮ  ６０／０９４，４６５（１９９８年７月２８日付け出願）；ＵＳＳＮ  ０９／３６１，６５２（１９９９年７月２７日付け出願）；ＷＯ  ００／０６５９２；およびＷＯ  ００／０６５９３に関連する。この各々は、その全体において、本明細書中で参考として援用される。
【０００３】
（政府に支援された研究および開発のもとでなされた発明に対する権利に関する陳述）
適用なし。
【０００４】
（発明の分野）
本発明は、甘味またはアミノ酸の味覚レセプターの単離された核酸配列およびアミノ酸配列（感覚Ｇタンパク質共役型レセプターのＴ１Ｒファミリーに由来する２つの異種Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドを含む）、そのようなレセプターに対する抗体、このような核酸およびレセプターを検出する方法、ならびに甘味およびアミノ酸の味覚レセプターのモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
味覚の感覚は、動物に、食物の品質および栄養価に関する貴重な情報を与える。哺乳動物は、糖類、塩類、酸、および広範な毒性物質を含む、化学的実体の多様なレパートリーを認識し得、そしてそれに応答し得る（例えば、Ｌｉｎｄｅｒｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：７１８−７６６（１９９６）を参照のこと）。我々の味覚の感覚は、甘味、苦味、酸味、塩味、および旨味（ｕｍａｍｉ）刺激を検出し得、そしてそれに応答し得る（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：７１８−７６６（１９９６））。この味覚の感覚はまた、種々の味覚の様相間を（例えば、トニック水の苦味からハチミツの甘みを；海洋の塩味から未成熟果実の酸味を）識別を担う。この識別能力が、有益な感覚のインプットを提供し：苦味レセプターは、有害物質に対する嫌悪挙動反応を誘発し、一方で、甘味レセプターは、高カロリー食物源の認識を可能にする。
【０００６】
本発明者らは、味覚のシグナル検出および情報のコード化に関する基本的な問題に関心を持ち、そして甘みおよび苦味の味覚レセプターをコードする遺伝子の単離および特徴付けに焦点を当てた。味覚レセプターの同定は、味覚レセプター細胞の機能のみならず、味覚のコード化に関する論理を研究するための強力な分子ツールを生み出す。例えば、レセプターレパートリーのサイズおよび多様性を規定することにより、どのくらい多数の化学感受性リガンドが認識され得るか（すなわち、分子多様性）に関する証拠が与えられ、一方で、レセプター発現のパターンの分析は、化学感受性の識別およびコード化に関する我々の理解に重要な洞察を与える。近年、本発明者らは、舌および口蓋の味覚レセプター細胞のサブセットにおいて発現される、２つの新規なＧタンパク質共役型レセプターファミリー（ＧＰＣＲ）の単離を記載した（Ｔ１ＲおよびＴ２Ｒ；Ｈｏｏｎら，１９９９；Ａｄｌｅｒら，２０００）。これらのうちの１つであるＴ２Ｒは、約３０個の異なる遺伝子のファミリーであり、これは、いくつかの機能的に確証された哺乳動物苦味味覚レセプターを含む（Ａｄｌｅｒら，２０００；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら，２０００；Ｍａｔｓｕｎａｍｉら，２０００）。ほぼすべてのＴ２Ｒ遺伝子は、苦味味覚レセプターとしてのその提唱される役割と一致して、ヒトおよびマウスにおいて、多様な苦味の味物質（ｔａｓｔａｎｔ）に対する応答の制御に遺伝的に関与しているゲノム領域にクラスター形成されている（Ａｄｌｅｒら，２０００）。
【０００７】
特に、大半のＴ２Ｒは、味覚レセプター細胞の同じサブセットにおいて共発現される（Ａｄｌｅｒら，２０００）。このことは、これらの細胞が、広範な一連の苦味化合物に応答し得るが、それらの間を識別し得ないことを示唆する。つまり動物は、多くの有害味物質を認識しそしてそれに反応する必要があるが、必ずしもそれらの間を識別する必要はない（すなわち、我々は、ある味物質が、良くないものであることを知る必要はあるが、何がそれを良くないものとしているかは必ずしも知る必要がない）というのが、苦味のような感覚様相についての論理である。この解釈は、種々の苦味味物質の間における限られた識別を示す、げっ歯類およびヒトにおける行動的知見および精神物理的知見と一致する（ＭｃＢｕｒｎｅｙおよびＧｅｎｔ，１９７９）。
【０００８】
どのようにして、甘味の味覚は特定されるのか？Ｇタンパク質共役型レセプターがまた、この味覚様相にも関与しているというかなりの証拠が存在する（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，１９９６）。苦味味覚とは対照的に、生物学的に関連する甘味の味物質の数は、さほど多くない。従って、本発明者らは、甘味レセプターファミリーが、かなり小さなものであると予期し得た。興味深いことに、精神物理的研究、行動的研究および電気生理学研究により、動物が種々の甘味味物質の間を識別し（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，１９８１；Ｎｉｎｏｍｉｙａら，１９８４；Ｎｉｎｏｍｉｙａら，１９９７）、このことがおそらく、甘味味覚系の異なる型の甘味レセプター細胞および経路への組織化を反映（そして、予測）していることが示唆されている。
【０００９】
甘味味覚に関する遺伝的研究により、マウスにおいて、種々の甘味物質への応答に影響を与える単一の主要な遺伝子座が同定された（Ｆｕｌｌｅｒ，１９７４；Ｌｕｓｈ，１９８９）。Ｓａｃと名付けられたこの遺伝子座は、サッカリン含有溶液を水から識別するいくつかの系統の能力において、閾値的差異を決定する（Ｆｕｌｌｅｒ，１９７４）。Ｓａｃのテイスター（ｔａｓｔｅｒ）は、「甘味非感受性」Ｓａｃ非テイスターマウスよりも、約１／５低濃度のサッカリンに応答し（Ｆｕｌｌｅｒ，１９７４；ＣａｐｅｌｅｓｓおよびＷｈｉｔｎｅｙ，１９９５）；さらに、Ｓａｃは、スクロース、アセスルファーム−Ｋおよびズルチンに対する嗜好に影響を与える（Ｌｕｓｈ，１９８９）。近年、いくつかのグループによって、Ｔ１Ｒ関連遺伝子であるＴ１Ｒ３が、Ｓａｃをコードし得ることが報告された（Ｋｉｔａｇａｗａら、２００１；Ｍａｘら、２００１；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら、２００１；Ｓａｉｎｚら、２００１）。本発明者らはここに、テイスター系統由来のＴ１Ｒ３のトランスジェニック発現が、甘味非感受性動物をテイスター動物へと形質転換し、Ｔ１Ｒ３をＳａｃ遺伝子として確認したことを実証する。次いで、本発明者らは、Ｔ１Ｒ（Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３）が、機能的なヘテロダイマー性の甘味味覚レセプターをコードすることを証明するための細胞ベースのレポーター系を開発した。最後に、本発明者らは、Ｔ１Ｒの発現パターンが、少なくとも３つの異なる細胞型に限定されることを示す。
【００１０】
いくつかのアミノ酸は、ヒトに対して甘いまたは美味い（旨味）味があり、そしてげっ歯類および他の動物に対して誘因性である。この特徴は注目すべきである。なぜなら、Ｌ−アミノ酸は、タンパク質のビルディングブロックとして機能し、多くの生物学的関連低分子の生合成前駆体として機能し、そして代謝燃料として機能するからである。従って、アミノ酸の検出に向けられた味覚経路を有することは、おそらく、重要な進化的意味を有した。本発明者らはここに、哺乳動物のアミノ酸味覚レセプターを同定し、そしてそれを特徴付ける。このレセプターは、Ｔ１ＲファミリーのＴ１Ｒ１  Ｇタンパク質共役型レセプターおよびＴ１Ｒ３  Ｇタンパク質共役型レセプターを含む、ヘテロダイマー性レセプターである。本発明者らは、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３が組み合わさって、Ｌ−アミノ酸センサーとして機能し、標準的な２０個のアミノ酸の大半に応答するが、それはこれらのアミノ酸のＤ−エナンチオマーにも他の化合物にも応答しないことを実証する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の簡単な要旨）
本発明者らはここに、哺乳動物の甘味およびアミノ酸の味覚レセプターの特徴付けを報告する。第１に、トランスジェニックレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）実験により、Ｓａｃ遺伝子座が、Ｔ１Ｒ３（候補味覚レセプターのＴ１Ｒファミリーのメンバー）をコードすることを証明する。第２に、異種発現系を使用して、本発明者らは、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３が、同じ細胞において発現される場合に、甘味レセプターとして機能し、スクロース、サッカリン、ズルチンおよびアセスルファーム−Ｋのような多様な甘味の味がする分子ならびに本明細書中に記載される他の分子を認識することを実証する。従って、Ｔ１Ｒファミリーは、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３のようなポリペプチドを含むヘテロダイマー性甘味レセプターを形成する。
【００１２】
さらに、異種発現系を使用して、本発明者らは、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３が、同じ細胞において発現される場合に、ヘテロダイマー性のアミノ酸レセプターとして機能し、標準的なＬ−アミノ酸の大半を認識するが、それらのＤ−エナンチオマーは認識しないことを実証する。いくつかのアミノ酸は、ヒトに対して甘いまたは美味い（旨味）味があり、そしてげっ歯類および他の動物に対して誘因性である（Ｉｗａｓａｋｉら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，３４：５３１−５４２（１９８５））。この特徴は注目すべきである。なぜなら、Ｌ−アミノ酸は、タンパク質のビルディングブロックとして機能し、多くの生物学的関連低分子の生合成前駆体として機能し、そして代謝燃料として機能するからである。従って、それらの検出に向けられた味覚経路を有することは、おそらく、重要な進化的意味を有した。ここに本発明者らは、哺乳動物のアミノ酸味覚レセプターを同定し、そしてそれを特徴付ける。このレセプター（Ｔ１Ｒ１＋３）は、味覚特異的なＴ１Ｒ１  Ｇタンパク質共役型レセプターおよびＴ１Ｒ３  Ｇタンパク質共役型レセプターのヘテロ二量体である。本発明者らは、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３が組み合わされて、標準的な２０個のアミノ酸の大半に応答する広範に調整されるＬ−アミノ酸センサーとして機能するが、それはそれらのＤ−エナンチオマーにも他の化合物にも応答しないことを実証する。本発明者らはまた、種（ヒトおよびマウス）内および種間におけるＴ１Ｒレセプターの配列差異が、味覚応答の選択性および特異性に有意に影響を及ぼし得ることを示す。最後に、本発明者らは、Ｔ１ＲおよびＴ２Ｒの発現パターンに関する詳細な分析を示し、それにより、末梢での甘味、アミノ酸および苦味の味覚の提示に関する見解を与える。
【００１３】
従って、本発明は、初めて、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドを含むヘテロマー性甘味味覚レセプター、およびＴ１Ｒ３ポリペプチドを含むヘテロマー性アミノ酸味覚レセプターを提供する。本発明は、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドとＴ１Ｒファミリーの異種メンバー（例えば、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２）とを含む、甘味味覚レセプターおよびアミノ酸味覚レセプターを提供し、これらは、Ｔ１Ｒ３と、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２のいずれかとが同じ細胞において共発現される場合に、甘味および／またはアミノ酸の味覚リガンドに応答してシグナルを伝達する。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび異種Ｔ１Ｒポリペプチドは、ヘテロダイマーを形成する。別の実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび異種Ｔ１Ｒポリペプチドは、非共有結合される。別の実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび異種Ｔ１Ｒポリペプチドは、共有結合される。
【００１４】
１つの局面において、本発明は、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドと異種ポリペプチドとを含む、甘味味覚レセプターおよび／またはアミノ酸味覚レセプターを提供し、このＴ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号３０のアミノ酸配列に対して約７０％より高いアミノ酸配列同一性を含むか、または配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度もしくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる。
【００１５】
１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３含有レセプターは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号３０に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合する。別の実施形態において、このレセプターは、Ｇタンパク質共役型レセプター活性を有する。別の実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号３０のアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、このレセプターは、ヒト由来、ラット由来またはマウス由来である。
【００１６】
１つの実施形態において、上記の異種ポリペプチドは、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーである。別の実施形態において、この異種ポリペプチドは、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２である。１つの実施形態において、このＴ１Ｒ１ポリペプチドは、配列番号１、２、３もしくは２７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または配列番号４、５、６もしくは２６のヌクレオチド配列に対して、中程度もしくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ２ポリペプチドは、配列番号７、８、９もしくは２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または配列番号１０、１１、１２もしくは２８のヌクレオチド配列に対して、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、１８、２０、２３、２５、もしくは３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または配列番号１３、１４、１６、１７、１９、２１、２２、２４もしくは２９のヌクレオチド配列に対して、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる。１つの実施形態において、このレセプターは、生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合する。別の実施形態において、このレセプターは、Ｇタンパク質共役型レセプター活性を有する。別の実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号３０のアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、このレセプターは、ヒト由来、ラット由来またはマウス由来である。
【００１７】
１つの実施形態において、上記のヘテロマー性レセプターは、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３を含み、そしてＬ−アミノ酸味覚リガンドを認識する。別の実施形態において、このヘテロマー性レセプターは、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を含み、そして甘味味覚リガンド（例えば、スクロース、フルクトース、サッカリン、アセスルファーム−Ｋ、ズルチン、ならびにグアニジノ酢酸（ｇｕａｎｉｄｏｉｎｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）１および２（ＧＡ−１およびＧＡ−２））を認識する。別の実施形態において、このヘテロマー性レセプターは、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を含み、そしてＤ−アミノ酸味覚リガンド（例えば、システイン、メチオニン、アルギニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アスパラギン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびグリシン）を認識する。
【００１８】
１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびＴ１Ｒポリペプチドは、ヘテロダイマーを形成する。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびＴ１Ｒ異種ポリペプチドは、非共有結合される。別の実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびＴ１Ｒ異種ポリペプチドは、共有結合される。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびＴ１Ｒ１ポリペプチドは、ヘテロダイマーを形成する。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびＴ１Ｒ１異種ポリペプチドは、非共有結合される。別の実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびＴ１Ｒ１異種ポリペプチドは、共有結合される。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびＴ１Ｒ２ポリペプチドは、ヘテロダイマーを形成する。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびＴ１Ｒ２異種ポリペプチドは、非共有結合される。別の実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよびＴ１Ｒ２異種ポリペプチドは、共有結合される。
【００１９】
１つの局面において、本発明は、甘味および／またはアミノ酸のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供し、この細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号３０の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインに対して約７０％より高いアミノ酸配列同一性を含む。別の実施形態において、この細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインは、配列番号１５、２０、２３、２５、または３０のアミノ酸配列の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインに対して、中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００２０】
１つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号３０の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインをコードする。別の実施形態において、この細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインは、異種ポリペプチドに共有結合されて、キメラポリペプチドを形成する。別の実施形態において、このキメラポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型レセプター活性を有する。
【００２１】
１つの局面において、本発明は、甘味および／またはアミノ酸の味覚レセプターに選択的に結合する抗体を提供し、このレセプターは、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドおよび異種ポリペプチドを含み、この抗体は、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号３０のアミノ酸配列に対して約７０％より高いアミノ酸配列同一性を含むＴ１Ｒ３ポリペプチド、または配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドに対して、中程度もしくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＴ１Ｒ３ポリペプチドを含むレセプターに対して惹起される。１つの実施形態では、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドは、共有結合または非共有結合のいずれかによってＴ１Ｒポリペプチドとヘテロダイマー性レセプターを形成し、このレセプターに対して、抗体が特異的に結合する。
【００２２】
別の局面では、本発明は、味覚細胞において甘味および／またはアミノ酸の味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：（ｉ）化合物をＴ１Ｒ３ポリペプチドを含むレセプターと接触させる工程であって、このポリペプチドは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号３０の細胞外ドメインに対して約７０％より高いアミノ酸配列同一性を含むか；または配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度もしくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、工程；および（ｉｉ）そのレセプターに対するその化合物の機能的効果を決定する工程、を包含する。
【００２３】
１つの実施形態において、このレセプターは、Ｔ１Ｒ３を含み、ヘテロダイマー性レセプターであり、かつ共有結合または非共有結合のいずれかで異種ポリペプチドに結合されている。別の実施形態において、このレセプターは、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３を含む。別の実施形態では、このレセプターは、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を含む。別の実施形態において、このポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型レセプター活性を有する。別の実施形態において、この機能的効果は、インビトロで決定される。別の実施形態において、このレセプターは、共有結合または非共有結合のいずれかで、固相に連結される。別の実施形態において、この機能的効果は、細胞内ｃＡＭＰ、ＩＰ３、またはＣａ２＋の変化を測定することによって決定される。別の実施形態において、この機能的効果は、化学的効果または表現型的効果である。別の実施形態において、この機能的効果は、物理的効果である。別の実施形態において、この機能的効果は、レセプターの細胞外ドメインに対する化合物の結合を測定することによって決定される。別の実施形態では、このポリペプチドは組換え体である。別の実施形態では、このポリペプチドは、細胞または細胞膜において発現される。別の実施形態では、この細胞は、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））である。別の実施形態では、このレセプターは、甘味味覚リガンドを認識する。別の実施形態では、このレセプターは、アミノ酸味覚リガンド（例えば、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸、ならびに天然には存在しないアミノ酸）を認識する。
【００２４】
１つの局面では、本発明は、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、このポリペプチドは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号３０のアミノ酸配列に対して、約７０％より高いアミノ酸配列同一性を含む。
【００２５】
１つの実施形態において、この核酸は、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２４、または配列番号２９のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、この核酸は、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２４、または配列番号２９に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズするプライマーによって増幅される。
【００２６】
別の局面では、本発明は、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、ここでこの核酸は、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号３０をコードする核酸、または配列番号１４、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２４、もしくは配列番号２９の配列を有する核酸に対して、中程度もしくは高度にストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズする。
【００２７】
別の局面では、本発明は、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、このポリペプチドは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号３０の配列を有するポリペプチドに対して約７０％より高いアミノ酸同一性を含み、ここでこの核酸は、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２４、または配列番号２９のヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする。
【００２８】
別の局面では、本発明は、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインをコードする単離された核酸を提供し、この細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインは、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号３０の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインに対して、約７０％より高いアミノ酸配列同一性を有する。
【００２９】
別の局面では、本発明は、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２５、もしくは配列番号３０のアミノ酸配列に対して約７０％より高いアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。別の局面では、本発明は、この発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（序論）
Ｔ１ＲおよびＴ２Ｒは、味覚レセプター細胞のサブセットにおいて選択的に発現されるＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）の２つのファミリーである：（Ｈｏｏｎら，Ｃｅｌｌ  ９６：５４１−５５１（１９９９）；Ａｄｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １００：６９３−７０２（２０００）；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら，Ｃｅｌｌ  １００：７０３−７１１（２０００）；Ｍａｔｓｕｎａｍｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６０１−６０４（２０００）；Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）；Ｋｉｔａｇａｗａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｕｍｍｕｎ．２８３：２３６−２４２（２００１）；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：４９２−４９８（２００１）；Ｍａｘら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２８：５８−６３（２００１）；Ｓａｉｎｚら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：８９６−９０３（２００１））。Ｔ２Ｒは、苦味の味覚検出に関与し（Ａｄｌｅｒら，Ｃｅｌｌ  １００：６９３−７０２（２０００）；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら，Ｃｅｌｌ，１００：７０３−７１１（２０００））；Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３は、組み合わされて、本明細書中に記載されるように、甘味味覚レセプターとして機能する（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）もまた参考のこと）；そしてＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３は、組み合わされて、本明細書中に記載されるように、アミノ酸味覚レセプターとして機能する（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２００２年２月２４日；ＷＯ  ０１／６６５６３）もまた参考のこと）。これらのヘテロダイマー性味覚レセプターは、以下に記載されるように、ヘテロダイマーの形態にある。
【００３１】
甘味味覚検出に関与する味覚レセプターを同定するために、本発明者らは、マウスにおけるＳａｃ遺伝子座が、Ｔ１Ｒ３（味覚レセプターのＴ１Ｒファミリーのメンバー）をコードすることを示すトランスジェニック実験を実施した。テイスター系統由来のＴ１Ｒ３のトランスジェニック発現は、甘味非感受性動物をテイスターへと形質転換する。異種発現系を使用して、本発明者らは、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３が組み合わされて、ヘテロダイマー性の甘味レセプターとして機能し、スクロース、サッカリン、ズルチン、およびアセスルファーム−Ｋのような甘味の味がする分子を認識することを実証した。アミノ酸検出に関与する味覚レセプターを同定するために、本発明者らは、苦味および甘味の味覚レセプターの特徴付けに使用されたストラテジーと同様の発現スクリーニングストラテジーを使用した。候補レセプターを、Ｇα１６−ＧαｚおよびＧα１５の無差別なＧタンパク質（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）；Ｍｏｄｙら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：１３−２３（２０００））を含有するヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞において発現させ、そして細胞内カルシウムにおける刺激により惹起された変化についてアッセイした。この系において、レセプターの活性化は、ホスホリパーゼＣβの活性化を誘導する（ＰＬＣ−βおよび内部貯蔵からのカルシウムの放出（これらは、カルシウム指示薬色素を使用して単一細胞レベルでモニターされ得る（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら，Ｃｅｌｌ  １００：７０３−７１１（２０００）；Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）；Ｔｓｉｅｎら，Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｓｉｕｍ  ６：１４５−１５７（１９８５））））。この発現系を使用して、本発明者らは、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３が組み合わされて、ヘテロダイマー性のアミノ酸レセプターとして機能することを示した。示差的にタグ化されたＴ１Ｒレセプターを用いた免疫沈降実験によって、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２が、Ｔ１Ｒ３とヘテロダイマー性レセプターを形成することが実証された。実験により、Ｔ１Ｒ３の非テイスター形態が、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２の両方とのヘテロダイマー性レセプターへとアセンブルすることもまた示された。しかし、Ｔ１Ｒ３のテイスター対立遺伝子および非テイスター対立遺伝子を用いた実験により、Ｓａｃ遺伝子座が、Ｔ１Ｒ２＋３レセプターに選択的に影響を及ぼすことが示された。
【００３２】
本発明は、Ｇタンパク質共役型レセプターのＴ１Ｒファミリーのメンバーを含む甘味およびアミノ酸の味覚レセプターを提供する。好ましい実施形態において、本発明は、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドと、第２の異種Ｔ１Ｒポリペプチド（例えば、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２）とを含む、甘味および／またはアミノ酸の味覚レセプターを提供する。これらの甘味およびアミノ酸の味覚レセプターは、味覚伝達経路のＧＰＣＲ成分であり、そして同じ細胞において共発現される場合に、これらのポリペプチドは、甘味およびアミノ酸の味覚リガンドに応答してシグナルを伝達する。
【００３３】
これらのレセプターをコードするこれらの核酸およびタンパク質は、味覚細胞を同定するための有益なプローブを提供する。なぜなら、これらの核酸は、味覚細胞において特異的に発現されるからである。例えば、ＧＰＣＲポリペプチドおよびＧＰＣＲタンパク質についてのプローブを使用して、葉状細胞、口蓋細胞および有郭細胞のような味覚細胞のサブセット、または特定の味覚レセプター細胞（例えば、甘味またはアミノ酸の味覚レセプター細胞）を同定し得る。以下に記載されるように、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３、ならびにＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３は、特定の味覚レセプター細胞のサブセットにおいて共発現される。これらはまた、舌の味覚細胞と、脳の味覚中心へとつながる味覚感覚神経細胞との間の関係を解明する、味覚の局所解剖学的マップの作成のためのツールとして役立つ。さらに、核酸およびその核酸がコードするタンパク質をプローブとして使用して、味覚により誘導される行動を分析し得る。
【００３４】
本発明はまた、Ｔ１Ｒ３と、Ｔ１Ｒファミリーの別のメンバー（例えば、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２）とを含むこれらの新規な甘味およびアミノ酸の味覚レセプターのモジュレーター（例えば、アクチベーター、インヒビター、刺激物質、エンハンサー、アゴニスト、およびアンタゴニスト）をスクリーニングする方法を提供する。甘味および／またはアミノ酸の味覚伝達に関するこのようなモジュレーターは、甘味およびアミノ酸の味覚シグナル伝達経路の薬理学的調節および遺伝的調節のために、そして新規な甘味およびアミノ酸の味覚リガンドの発見のために有用である。これらのスクリーニング方法を使用して、甘味およびアミノ酸（旨味）味覚細胞活性の高親和性アゴニストおよびアンタゴニストを同定し得る。そうすると、これらの調節性化合物は、味をあつらえるために、食品産業および製薬産業において使用され得る。従って、本発明は、味覚調節のためのアッセイを提供し、ここでＴ１Ｒ３含有レセプターは、甘味およびアミノ酸の味覚伝達に対するモジュレーターの効果についての直接的または間接的なレセプター分子として作用する。ＧＰＣＲは、例えば、インビトロ、インビボおよびエキソビボでの、リガンドの結合、Ｇタンパク質の結合、調節性分子の結合、イオン濃度、膜電位、電流、イオンフラックス、転写、シグナル伝達、レセプター−リガンド相互作用、神経伝達物質、およびホルモン放出；ならびに第２メッセンジャー濃度における変化を測定するためのアッセイにおいて使用され得る。１つの実施形態では、Ｔ１Ｒ３を含有するレセプターは、緑色蛍光タンパク質のような第２のリポーター分子への結合を通して、間接的なリポーターとして使用され得る（例えば、Ｍｉｓｔｉｌｉ＆Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：９６１−９６４（１９９７）を参照のこと）。別の実施形態では、Ｔ１Ｒ３を含有するレセプターを細胞において組換え発現させて、ＧＰＣＲ活性を介した味覚伝達の調節が、Ｃａ２＋レベルの変化を測定することによってアッセイされる。
【００３５】
味覚伝達のモジュレーターについてアッセイする方法としては、以下が挙げられる：Ｔ１Ｒ３、その部分（例えば、細胞外ドメイン）またはＴ１Ｒ３の１つ以上のドメインを含むキメラタンパク質を含むレセプターを使用した、インビトロリガンド結合アッセイ、および卵母細胞Ｔ１Ｒ３レセプター発現のようなインビボ（細胞ベースおよび動物での）アッセイ；組織培養細胞のＴ１Ｒ３レセプター発現；Ｔ１Ｒ３の転写活性化；ＧＰＣＲのリン酸化および脱リン酸化；ＧＰＣＲへのＧタンパク質の結合；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化；イオンフラックスアッセイ；細胞内第２メッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰおよびイノシトール三リン酸）の変化；細胞内カルシウムレベルの変化；および神経伝達物質の放出。
【００３６】
（定義）
「Ｔ１Ｒファミリー味覚レセプター」は、Ｇタンパク質共役型レセプターのＴ１Ｒファミリーのなかの１つのメンバー（例えば、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、およびＴ１Ｒ３）またはそれらの任意の組み合わせを含むレセプターをいう。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒファミリーレセプターは、Ｔ１Ｒ３（「Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター」または「Ｔ１Ｒ３含有甘味味覚レセプター」または「Ｔ１Ｒ３含有アミノ酸味覚レセプター」）およびＴ１Ｒファミリーの異種ポリペプチドを含む。１つの実施形態において、このレセプターは、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３を含む。別の実施形態において、このレセプターは、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を含む。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３含有レセプターは、これらのレセプターの２つのメンバー（例えば、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３、または、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３）が同じ細胞において共発現される場合に活性である。別の実施形態では、Ｔ１Ｒポリペプチドが、同じ細胞において共発現され、そしてヘテロダイマー性レセプターを形成し、ここでレセプターのＴ１Ｒポリペプチドは、非共有結合または共有結合されている。このレセプターは、例えば、本明細書中に記載されるような、甘味の味がする分子（例えば、スクロース、サッカリン、ズルチン、アセスルファーム−Ｋ）ならびに他の分子（例えば、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸（甘味および非甘味））を認識する能力を有する。これらの分子は、Ｔ１Ｒ３を含有する味覚伝達Ｇタンパク質共役型レセプターに対してリガンドとして作用することによって、「甘味およびアミノ酸の味覚シグナル伝達を調節する」化合物の例である。
【００３７】
用語「ＧＰＣＲ−Ｂ３またはＴ１Ｒ１」、「ＧＰＣＲ−Ｂ４またはＴ１Ｒ２」、および「Ｔ１Ｒ３」または、「ＧＰＣＲ−Ｂ３またはＴ１Ｒ１」をコードする核酸、「ＧＰＣＲ−Ｂ４またはＴ１Ｒ２」をコードする核酸、および「Ｔ１Ｒ３」をコードする核酸とは、Ｇタンパク質共役型レセプターのＴ１Ｒファミリーのメンバーである核酸およびポリペプチドの多型性改変体、対立遺伝子、変異体および種間ホモログをいい、そしてこれらは：（１）配列番号１、２、３、７、８、９、１５、１８、２０、２３、２５、２７、または３０によってコードされるアミノ酸配列に対して、好ましくは、少なくとも約２５アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸、２００アミノ酸、５００アミノ酸、１０００アミノ酸またはそれより多いアミノ酸の領域にわたって、約６０％より高いアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有し；（２）配列番号１、２、３、７、８、９、１５、１８、２０、２３、２５、２７、または３０によってコードされるアミノ酸配列およびそれらの保存的に改変された改変体を含む免疫原に対して惹起された抗体（例えば、ポリクローナル抗体）に結合し；（３）Ｔ１Ｒタンパク質をコードする核酸配列（例えば、配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１９、２１、２２、２４、２６、２８、または２９）およびそれらの保存的に改変された改変体に対応するアンチセンス鎖に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズし；（４）配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１９、２１、２２、２４、２６、もしくは２８、または２９に対して、好ましくは、少なくとも約２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチドまたはそれより多いヌクレオチドの領域にわたって、約６０％より高い配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれより高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する。本発明のＴ１Ｒファミリーポリペプチド（例えば、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３）またはＴ１Ｒ３含有レセプター（例えば、Ｔ１Ｒ１＋３またはＴ１Ｒ２＋３）はさらに、単独で、もしくは同じ細胞において共発現される場合に、または別のＴ１Ｒファミリーのメンバーとヘテロダイマーとして共発現される場合のいずれかで、Ｇタンパク質共役型レセプター活性を有する。ヒト、ラットおよびマウスのＴ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、およびＴ１Ｒ３のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列についての登録番号は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて見出され得る（ヒトのＴ１Ｒ１アミノ酸配列については、例えば、登録番号ＤＡＡ０００１２およびＮＰ＿６１９６４２を参照のこと；ヒトＴ１Ｒ１ヌクレオチド配列については、例えば、登録番号ＢＫ０００１５３を参照のこと；ヒトＴ１Ｒ２アミノ酸配列については、例えば、登録番号ＤＡＡ０００１９、ＡＡＭ１２２３９およびＮＰ＿６１９６４２．１を参照のこと；ヒトＴ１Ｒ２ヌクレオチド配列については、例えば、登録番号ＢＫ０００１５１、ＮＭ＿１３８６９７．１、ＡＦ４５８１４９Ｓ１−６を参照のこと；ヒトＴ１Ｒ３アミノ酸配列については、例えば、登録番号ＤＡＡ０００１３を参照のこと；ヒトＴ１Ｒ３ヌクレオチド配列については、例えば、登録番号ＢＫ０００１５２を参照のこと）。Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列については、ＷＯ００／０６５９２、ＷＯ００／０６５９３およびＷＯ０１／６６５６３もまた参照のこと。
【００３８】
Ｔ１Ｒタンパク質は、「Ｇタンパク質共役型レセプター活性」を有し、例えば、Ｔ１Ｒタンパク質は、リガンド結合（例えば、甘味リガンドまたはアミノ酸リガンド）のような細胞外刺激に応答してＧタンパク質に結合し、そしてホスホリパーゼＣおよびアデニル酸シクラーゼのような酵素の刺激を介して、ＩＰ３、ｃＡＭＰおよびＣａ２＋のような第２メッセンジャーの産生を促進する。このような活性は、Ｇタンパク質または無差別なＧタンパク質（例えば、Ｇα１５）およびＰＬＣのような酵素のいずれかに、ＧＰＣＲ（または、キメラＧＰＣＲ）をカップリングすること、そして、（Ｏｆｆｅｒｍａｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５））を使用して、細胞内カルシウムの増加を測定することによって、異種細胞において測定され得る。レセプター活性は、例えば、蛍光性Ｃａ２＋−指示薬色素および蛍光定量的画像化を使用して、［Ｃａ２＋］ｉにおけるリガンド誘導性の変化を記録することによって、効率的に測定され得る。
【００３９】
このようなＧＰＣＲは、当業者に公知の方法（例えば、疎水性ドメインおよび親水性ドメインを同定する配列分析プログラム（例えば、Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）を参照のこと））を使用して、構造的に同定され得る膜貫通ドメイン、細胞外ドメインおよび細胞質ドメインを有する。このようなドメインは、キメラタンパク質を作製するために、および本発明のインビトロアッセイのために、有用である（例えば、ＷＯ９４／０５６９５および米国特許第５，５０８，３８４号を参照のこと）。
【００４０】
甘味味覚レセプターおよび／またはアミノ酸味覚レセプターあるいは本発明のタンパク質の活性（例えば、シグナル伝達）を調節する化合物を試験するためのアッセイの文脈における、句「機能的効果」は、間接的にまたは直接的に、ＧＰＣＲまたは甘味および／もしくはアミノ酸の味覚レセプターの影響下にあるパラメーター（例えば、物理的効果、表現型的効果または化学的効果）（例えば、リガンド結合のような外部刺激に応答して細胞性シグナルを伝達する能力、またはリガンドを結合する能力）の測定を含む。これは、結合活性およびシグナル伝達を含む。「機能的効果」は、インビトロ活性、インビボ活性およびエキソビボ活性を含む。
【００４１】
「機能的効果を決定する」とは、間接的にまたは直接的に、Ｔ１Ｒ  ＧＰＣＲタンパク質、または１つ以上のＴ１Ｒ  ＧＰＣＲタンパク質を含む甘味および／もしくはアミノ酸の味覚レセプターの影響下にあるパラメーター（例えば、物理的効果、および化学的効果または表現型的効果）を増加または減少させる化合物についてアッセイすることを意味する。このような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段（例えば、分光器的な特徴（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）における変化；流体力学（例えば、形状）；クロマトグラフ；またはタンパク質に対する溶解度特性；誘導可能なマーカーまたはタンパク質の転写活性の測定；結合活性または結合アッセイ（例えば、抗体に対する結合）の測定；リガンドまたはそのアナログ（天然物または合成物のいずれか）の結合活性における変化の測定；細胞増殖の測定；細胞表面マーカー発現の測定、Ｔ１Ｒ関連配列についてタンパク質レベルでの変化の測定；ＲＮＡの安定性の測定；Ｇタンパク質結合；ＧＰＣＲのリン酸化または脱リン酸化；シグナル伝達（例えば、レセプター−リガンド相互作用、第２メッセンジャー濃度（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、ＰＩまたは細胞内Ｃａ２＋））；神経伝達物質の放出；ホルモンの放出；電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化；イオンフラックス；調節性分子の結合；例えば、化学発光性反応、蛍光性反応、比色反応、抗体結合および誘導可能なマーカーを介した、下流の遺伝子またはリポーター遺伝子の発現の同定（例えば、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、β−ｇａｌ、ＧＦＰなど））によって測定され得る。
【００４２】
Ｔ１Ｒファミリーのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列ならびにＴ１Ｒファミリーの味覚レセプターの「インヒビター」、「アクチベーター」および「モジュレーター」は、インビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して同定される、Ｔ１Ｒのポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列ならびにＴ１Ｒファミリー味覚レセプター（ヘテロダイマー性レセプターを含む）の活性化分子、阻害化分子、または調節分子をいうために使用される。インヒビターは、例えば、Ｔ１Ｒファミリーの味覚レセプター（例えば、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドを含むレセプター）に、部分的にかまたは完全に、活性をブロックするか、減少させるか、妨げるか、活性化を遅延させるか、不活化するか、脱感受性化するかまたはその活性もしくは発現をダウンレギュレートするように結合する化合物（例えば、アンタゴニスト）である。「アクチベーター」は、Ｔ１Ｒファミリーの味覚レセプター（例えば、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドを含むレセプター）を増加させるか、開放状態にするか、活性化するか、促進するか、活性化を増強するか、感受性化するか、アゴナイズするか、またはアップレギュレートする化合物（例えば、アゴニスト）である。インヒビター、アクチベーター、またはモジュレーターはまた、Ｔ１Ｒファミリーの味覚レセプターの遺伝的に改変されたバージョン（例えば、改変された活性を有するバージョン）、ならびに天然物または合成物のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、アンチセンス分子、リボザイム、化学低分子などを含む。インヒビターおよびアクチベーターについてのこのようなアッセイは、例えば、インビトロ、細胞もしくは細胞膜においてＴ１Ｒファミリーの味覚レセプターを発現させる工程、推定モジュレーター化合物を適用する工程、次いで、上記のようにして、活性に対する機能的効果を決定する工程を包含する。１つの実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドを含む味覚レセプターは、スクロース、サッカリン、ズルチン、アセスルファーム−Ｋのような甘味の味がする分子を認識する能力を有する。別の実施形態において、Ｔ１Ｒ３ポリペプチドを含む味覚レセプターは、本明細書中に記載されるような他の分子（例えば、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸）を認識する能力を有する。これらの分子は、このＧタンパク質共役型レセプターに対する細胞外リガンドとして作用すること、そしてそのレセプターを活性化することによって、味覚シグナル伝達を調節する化合物の例である。他の実施形態において、味覚シグナル伝達を調節する化合物は、レセプターの細胞内リガンドとして作用するか、または細胞外リガンドの結合を阻害もしくは活性化するか、またはレセプターの細胞内リガンドの結合を阻害もしくは活性化する分子である。
【００４３】
Ｔ１Ｒファミリーの味覚レセプターを含むサンプルまたはアッセイは、可能性のあるアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターで処理され、そのインヒビター、アクチベーターまたはモジュレーターを伴わないコントロールサンプルと比較されて、阻害の程度を試験される。コントロールサンプル（インヒビターで処理されていない）に、１００％の相対的タンパク質活性値を割り当てる。Ｔ１Ｒファミリーレセプターの阻害は、コントロールと比較した活性値が、約８０％、好ましくは、５０％、より好ましくは、２５〜０％である場合に達成される。Ｔ１Ｒファミリーレセプターの活性化は、コントロール（アクチベーターで処理されていない）と比較した活性値が、１１０％、より好ましくは、１５０％、より好ましくは、２００〜５００％（すなわち、コントロールと比較して、２〜５倍高い）、より好ましくは、１０００〜３０００％高い場合に達成される。
【００４４】
用語「試験化合物」または「薬物候補」または「モジュレーター」または文法上の等価物は、本明細書中で使用される場合、直接的または間接的に味覚を調節する能力について試験される、天然物または合成物のいずれかの任意の分子（例えば、タンパク質、オリゴペプチド（例えば、約５〜約２５アミノ酸長、好ましくは、約１０〜２０アミノ酸長または１２〜１８アミノ酸長、好ましくは、１２アミノ酸長、１５アミノ酸長、または１８アミノ酸長）、有機低分子、ポリサッカリド、脂質（例えば、スフィンゴリピド）、脂肪酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドなど）を記載する。試験化合物は、試験化合物のライブラリー（例えば、十分な範囲の多様性を提供する、コンビナトリアルライブラリーまたはランダム化ライブラリー）の形態であり得る。試験化合物は、必要に応じて、融合パートナー（例えば、標的化化合物、レスキュー化合物、ダイマー化化合物、安定化化合物、アドレス可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）化合物、および他の機能的な部分）に結合される。従来的に、有用な特性を有する新規な化学的実体が、いくらかの所望される特性または活性（例えば、阻害活性）を有する試験化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定すること、このリード化合物の改変体を作製すること、そしてこれらの改変体化合物の特性および活性を評価することによって生成される。しばしば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）方法が、このような分析のために使用される。
【００４５】
「有機低分子」は、約５０ダルトンより大きくかつ約２５００ダルトン未満（好ましくは、約２０００ダルトン未満）、好ましくは、約１００〜約１０００ダルトンの間、より好ましくは、約２００〜約５００ダルトンの間の分子量を有する、天然物または合成物のいずれかの有機分子をいう。
【００４６】
「生物学的サンプル」は、生検サンプルおよび剖検サンプルのような組織の切片、ならびに、組織学的目的のために採取された凍結切片を含む。このようなサンプルとしては、血液、痰、組織、培養細胞（例えば、初代培養物）、外植片、および形質転換された細胞、糞便、尿など挙げられる。生物学的サンプルは、代表的には、真核生物から、最も好ましくは、哺乳動物類（例えば、霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）；ウシ；イヌ；ネコ；げっ歯類（例えば、モルモット、ラット、マウス）；ウサギ）；または鳥類、爬虫類；または魚類から得られる。
【００４７】
「ヘテロダイマー」は、２つの異なる分子（例えば、２つの異なるポリペプチド）を含むダイマーであって、ここで、これらの分子は、共有結合（例えば、リンカーまたは化学的結合を通して）または非共有結合（例えば、イオン結合、ファン・デル・ワールス結合、静電的結合または水素結合）の結合のいずれかを介して結合される。本発明のＴ１Ｒ３含有レセプターは、同じ細胞において共発現される場合に、好ましくは、それらが共有結合または非共有結合のいずれかで結合されたヘテロダイマーを形成するように共発現される場合に、機能する。例えば、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３がヘテロマー性レセプターを形成し、ならびに、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３がヘテロマー性レセプターを形成する。
【００４８】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」または％「同一性」は、同一であるか、あるいは、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを以下に記載されるデフォルトパラメーターで使用して測定される場合または手動の整列および視覚的検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトなどを参照のこと）によって、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する（すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大一致のために比較および整列された場合に、特定された領域（例えば、配列番号１〜２５のヌクレオチド配列）に対して約６０％の同一性、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれより高い同一性である）、２つ以上の配列または部分配列をいう。このとき、このような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）をいうか、または試験配列の相補体に対して適用され得る。この定義はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列を含む。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮し得る。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸長もしくは約２５ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは、５０〜１００アミノ酸長もしくは５０〜１００ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００４９】
配列比較については、代表的に、１つの配列が参照配列として機能し、この参照配列に対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用して、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、部分配列の座標が指定され、（必要ならば）そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、あるいはパラメーターが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の％配列同一性を算出する。
【００５０】
「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用される場合、２０〜６００、一般的には約５０〜約２００、より一般的には、約１００〜約１５０からなる群より選択される数の連続位置のいずれか１つのセグメントであって、ここで配列が、２つの配列が最適に整列された後で、同数の連続位置の参照配列に対して比較され得る、セグメントに対する参照を含む。比較のための配列の整列の方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法についての検索によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化されたインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動によるアラインメントおよび視覚的検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年、補遺）を参照のこと）によって、実施され得る。
【００５１】
％配列同一性および％配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本明細書中に記載されるパラメーターを用いて使用され、本発明の核酸およびタンパク質についての％配列同一性を決定する。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、一致するかまたはいくらかのポジティブ値の閾値Ｔを満たすかのいずれかである、クエリー配列におけるショートワードの長さＷを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを包含する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。このワードヒットを、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致した残基対の報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に０より大きい）およびＮ（一致しない残基のペナルティースコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列について、スコア付けマトリクスが、累積スコアを算出するために使用される。各方向におけるそのワードヒットの伸長は、以下の場合停止される：累積アラインメントスコアが、最大達成値から量Ｘだけ減少する場合；１つ以上の負のスコア残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアが、ゼロ以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２のスコア付けマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。
【００５２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然には存在しないアミノ酸ポリマーに対応して適用する。
【００５３】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、エナンチオマー（Ｄ−形態およびＬ−形態）およびアキラルアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸、ならびに後に改変されたこれらのアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素に結合されるα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。そのようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたぺプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似した様式で機能する化学化合物をいう。
【００５４】
アミノ酸は、本明細書中で、それらの通常知られている三文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される一文字の記号のいずれかで言及され得る。同様にヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている一文字コードにより言及され得る。
【００５５】
「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸および核酸の両方の配列に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変される改変体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするか、またはその核酸が本質的に同一な配列に対するアミノ酸配列をコードしない核酸をいう。遺伝コードの縮重性により、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵの全ては、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定化されているあらゆる位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変更せずに、記載された任意の対応コドンに変更され得る。そのような核酸のバリエーションは、「サイレントなバリエーション」であり、これは保存的に改変されたバリエーションの１種である。本明細書中でポリペプチドをコードするすべての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレントなバリエーションを記載する。当業者は、核酸における各コドン（ＡＵＧ（これは、通常メチオニンに対する唯一のコドンである）およびＴＧＧ（これは、通常、トリプトファンに対する唯一のコドンである）を除く）が改変されて、機能的に同一な分子を生じ得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレントなバリエーションは、実際のプローブ配列に関してではなく発現産物に関してそれぞれ記載された配列において含意される。
【００５６】
アミノ酸配列に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の配列に対する、個々の置換、欠失または付加（これらは単一のアミノ酸もしくはコードされる配列中の少数の割合のアミノ酸を改変、付加または欠失する）が、「保存的に改変された改変体」であり、ここで、この改変が、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じることを理解する。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換に関する表は、当該分野において周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型性改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子体に加えられ、そしてそれらを排除するものではない。
【００５７】
以下の８つの群の各々は、互いについての保存的置換体であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００５８】
ポリペプチド構造のような高分子構造は、組織化の種々のレベルで記載され得る。この組織化に関する一般的考察について、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）ならびにＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照のこと。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは局所的に整列されたポリペプチド内の三次元構造をいう。これらの構造は、ドメイン（例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン）として一般的に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密なユニットを形成し、かつ代表的には１５〜３５０のアミノ酸長である、ポリペプチドの部分である。典型的なドメインは、β−シートおよびα−ヘリックスのストレッチのようなより小さい組織化の区画から構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次ユニットの非共有結合的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー用語としても公知である。
【００５９】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドでありかつ一本鎖または二本鎖のいずれかの形態であるそれらのポリマー、ならびに任意のそのような配列の相補体をいう。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドなどもまた含まれる。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは結合を含む核酸（これらは、合成したもの、天然に存在するもの、および天然に存在しないものであり、参照核酸と類似した結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似した様式で代謝される）を含む。そのようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を含意する。同様に、核酸によってコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によってコードされる任意のタンパク質を含む。「スプライス改変体」は、その名称が示唆するように、遺伝子の選択的スプライシングの生成物である。転写後、最初の核酸転写物は、スプライシングを受け得、その結果、異なる（代替的な）核酸スプライス生成物が異なるポリペプチドをコードする。スプライス改変体の生成に関するメカニズムは変動するが、これはエキソンの選択的スプライシングを含む。リードスルー転写によって同じ核酸から導き出される代替的なポリペプチドもまた、この定義によって包含される。スプライシング反応の任意の生成物（スプライス生成物の組換え形態を含む）が、この定義の中に含まれる。
【００６１】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的な手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えば、放射性標識をそのペプチドへ組込むことによって検出可能にされ得るか、またはそのペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用されるタンパク質が挙げられる。
【００６２】
例えば、細胞または核酸、タンパク質、もしくはベクターを参照して使用される場合、用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入か、またはネイティブな核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、あるいはその細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態では見出されない遺伝子を発現するか、または他に異常なように発現されるか、過小発現されるか、もしくは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００６３】
核酸の部分を参照して使用される場合、用語「異種」とは、核酸が天然で互いに同じ関連で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するよう配置された関連の無い遺伝子由来の２つ以上の配列（例えば、１つの供給源に由来するプロモーターおよび別の供給源に由来するコード領域）を有する核酸が、代表的には組換え的に生成される。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が天然では互いに同じ関連では見出されない２つ以上の部分配列を含む（例えば、融合タンパク質）ことを示す。
【００６４】
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが代表的には核酸の複合混合物中のその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、そして異なる状況において異なる。より高い温度であればあるほど、より長い配列が特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択される。このＴｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態（Ｔｍで標的配列が過剰に存在する場合、プローブの５０％が平衡状態で占められる）で標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下）である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加により達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、ポジティブシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは、バックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のようなものあり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳで４２℃でのインキュベーションまたは５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で６５℃での洗浄。
【００６５】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、なお実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝コードにより許容される最大のコドン縮重性を用いて作製される場合に生じる。そのような場合、核酸は、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で代表的にハイブリダイズする。例示的な「中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中３７℃でのハイブリダイゼーションと、１×ＳＳＣ中４５℃での洗浄とを含む。ポジティブハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用して、類似したストリンジェンシーの条件を提供し得ることを容易に理解する。ハイブリダイゼーションのパラメーターを決定するためのさらなる指針は、多数の文献（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編）に提供される。
【００６６】
ＰＣＲについて、約３６℃の温度は、低いストリンジェンシーの増幅について代表的であるが、アニーリング温度は、プライマー長に依存して約３２℃と約４８℃との間で変動し得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅について、約６２℃の温度は代表的であるが、高いストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して、約５０℃〜約６５℃の範囲であり得る。高いストリンジェンシーの増幅および低いストリンジェンシーの増幅の両方について代表的なサイクル条件は、３０秒間〜２分間にわたる９０℃〜９５℃の変性相、３０秒間〜２分間続くアニーリング相、および１〜２分間にわたる約７２℃の伸長相を含む。低いストリンジェンシーの増幅反応および高いストリンジェンシーの増幅反応についてのプロトコールおよび指針は、例えば、Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９０）に提供される。
【００６７】
「抗体」は、抗原に特異的に結合および認識する免疫グロブリン遺伝子からのフレームワーク領域を含むポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは順にそれぞれ免疫グロブリンのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。代表的に、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において最も重要である。
【００６８】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、その各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原の認識を主に担う約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）との用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００６９】
抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼを用いた消化により生成される十分に特徴付けられた多くのフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合のもとで抗体を消化し、Ｆ（ａｂ）’２を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、Ｆａｂ自体がジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合された軽鎖であるＦａｂのダイマーである。このＦ（ａｂ）’２は、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊するために穏かな条件下で還元され得、それによってＦ（ａｂ）’２ダイマーはＦａｂ’モノマーに変換される。Ｆａｂ’モノマーは、ヒンジ領域の部分を有する本質的にＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３を参照のこと）。種々の抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化の点において規定されるが、当業者は、そのようなフラグメントが化学的もしくは組換えＤＮＡ方法論を用いてのいずれかによりデノボで合成され得ることを理解する。従って、本明細書中で使用される場合、抗体との用語はまた、抗体全体の改変により生成される抗体フラグメントか、または組換えＤＮＡ方法論を用いてデノボで合成される抗体フラグメント(例えば、単鎖Ｆｖ）か、またはファージディスプレイライブラリー（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照のこと）を用いて同定される抗体フラグメントのいずれかを含む。
【００７０】
抗体（例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）の調製のために、当該分野で公知の多くの技術が使用され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）の７７〜９６頁，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；およびＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版，１９８６）を参照のこと）。単鎖抗体の生成のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を生成するために適合され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物（例えば、他の哺乳動物）を使用して、ヒト化抗体を発現させ得る。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマー性Ｆａｂフラグメントを同定し得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９〜７８３（１９９２）を参照のこと）。
【００７１】
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域またはその部分が、改変、置換または交換され、その結果、抗原結合部位（可変領域）が異なるかもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域に連結されるか、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物など）に連結されるか；あるいは（ｂ）可変領域またはその部分が、異なるかまたは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換、または交換された、抗体分子である。
【００７２】
１つの実施形態において、抗体は、「エフェクター」部分に結合体化される。このエフェクター部分は、かなり多数の分子（放射性標識または蛍光性標識のような標識化部分を含む）であり得るか、または治療的部分であり得る。１つの局面において、この抗体は、タンパク質の活性を調節する。
【００７３】
抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」、または「〜と特異的に（または選択的に）免疫反応性」との句は、タンパク質またはペプチドに対して言及される場合、しばしば、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団において、そのタンパク質の存在に決定的である結合反応をいう。従って、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、特定のタンパク質に結合し、そしてより代表的には、バックグラウンドの１０〜１００倍より高く特定のタンパク質に結合する。このような条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質についてその特異性について選択された抗体を必要とする。例えば、配列番号１〜２５の配列または配列番号１〜２５によってコードされる配列を含む、Ｔ１Ｒタンパク質またはヘテロダイマー性Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター、多型性改変体、対立遺伝子、オルトログ、および保存的に改変された改変体またはスプライス改変体に対して惹起されたポリクローナル抗体、またはその部分は、Ｔ１Ｒタンパク質および／またはヘテロダイマー性Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターと特異的に免疫反応性のポリクローナル抗体のみを得、そして他のタンパク質と反応性のものは得ないように、選択され得る。１つの実施形態において、抗体は、ヘテロダイマー性Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターと反応性であるが、Ｔ１Ｒファミリーの個々のタンパク質メンバーとは反応性ではない。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成され得る。種々のイムノアッセイ様式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために慣用的に使用される（特異的な免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ様式および条件の説明については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照のこと）。
【００７４】
（Ｔ１Ｒファミリーのメンバーをコードする核酸の単離）
本発明は、組換え遺伝学の分野における慣用的な技術による。本発明において使用される一般的方法を開示する基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。
【００７５】
本明細書中に開示されるアミノ酸配列と実質的に同一であるＴ１Ｒ核酸、多型性改変体、オルトログ、および対立遺伝子は、スクリーニングライブラリーによって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｔ１Ｒ核酸プローブおよびオリゴヌクレオチドを使用することによって単離され得る。あるいは、発現ライブラリーは、ヒトＴ１Ｒまたはその部分に対して作製された抗血清または精製抗体を用いて免疫学的に発現ホモログを検出することによって、Ｔ１Ｒタンパク質、多型性改変体、オルトログ、および対立遺伝子をクローン化するために使用され得る。
【００７６】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためには、Ｔ１Ｒ  ＲＮＡの豊富な供給源（例えば、有郭、葉状、茸状および口蓋のような味蕾）を選択すべきである。次いで、ｍＲＮＡは、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡにされ、組換えベクターに連結され、そして増殖、スクリーニングおよびクローニングのために組換え宿主にトランスフェクトされる。ｃＤＮＡライブラリーを作製およびスクリーニングする方法は、周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ  ２５：２６３〜２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【００７７】
ゲノムライブラリーについて、ＤＮＡは、組織から抽出され、そして約１２〜２０ｋｂのフラグメントを生じるように、機械的に剪断されるかまたは酵素的に消化されるかのいずれかである。次いで、フラグメントは、勾配遠心分離によって望ましくないサイズから分離され、そしてバクテリオファージλベクター中において構築される。これらのベクターおよびファージは、インビトロでパッケージングされる。組換えファージは、Ｂｅｎｔｏｎ＆Ｄａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０〜１８２（１９７７）に記載されるようなプラークハイブリダイゼーションによって分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、一般に、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：３９６１〜３９６５（１９７５）に記載されるように実施される。
【００７８】
Ｔ１Ｒ核酸およびそのオルトログ、対立遺伝子、変異体、多型性改変体および保存的に改変された改変体を単離する代替的な方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用と、ＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートの増幅とを組み合わせたものである（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような方法は、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから直接的にヒトＴ１Ｒの核酸配列を増幅するために使用され得る。縮重オリゴヌクレオチドは、本明細書で提供される配列を使用してＴ１Ｒホモログを増幅するように設計され得る。制限エンドヌクレアーゼ部位が、プライマーへ組み込まれ得る。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅方法もまた、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローン化するために、生理学的サンプル中でｍＲＮＡをコードするＴ１Ｒの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作製するために、核酸の配列決定のために、または他の目的のために、有用であり得る。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子は、アガロースゲルから精製され得、そして適切なベクターにクローン化され得る。
【００７９】
Ｔ１Ｒの遺伝子発現はまた、当該分野で公知の技術（例えば、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、総ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプロテクション、高密度ポリヌクレオチドアレイ技術などのような）によって分析され得る。
【００８０】
Ｔ１Ｒタンパク質をコードする核酸は、本発明において、高密度オリゴヌクレオチドアレイ技術（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ）と共に使用されて、Ｔ１Ｒタンパク質、オルトログ、対立遺伝子、保存的に改変された改変体、および多型性改変体を同定し得る（例えば、Ｇｕｎｔｈａｎｄら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １４：８６９〜８７６（１９９８）；Ｋｏｚａｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３〜７５９（１９９６）；Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：１１０〜１０６（１９９５）；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１６７５〜１６８０（１９９６）；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．８：４３５〜４４８（１９９８）；Ｈａｃｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３８６５〜３８６６（１９９８）を参照のこと）。
【００８１】
Ｔ１Ｒについての遺伝子は、代表的に、複製および／または発現のために、原核生物細胞もしくは真核生物細胞への形質転換の前に、中間体ベクターへクローン化される。これらの中間体ベクターは、代表的に、原核生物ベクター（例えば、プラスミド）、またはシャトルベクターである。
【００８２】
（原核生物および真核生物における発現）
クローン化された遺伝子（例えば、Ｔ１Ｒタンパク質をコードするｃＤＮＡ）の高レベルの発現を得るために、代表的には、Ｔ１Ｒを、転写を指示するための強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸に対する場合には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターへサブクローン化する。Ｔ１Ｒ核酸は、同じベクターまたは異なるベクターにおいて、共発現され得るかまたは別々に発現され得、好ましくは、共発現され得る。適切な細菌性プロモーターは、当該分野で周知であり、そして例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら（前出）に記載されている。Ｔ１Ｒタンパク質を発現するための細菌性発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ  ２２：２２９〜２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ３０２：５４３〜５４５（１９８３））。このような発現系についてのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そしてまた、市販されている。１つの好ましい実施形態において、レトロウイルス発現系が本発明において使用される。
【００８３】
異種核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターの選択は、特定の適用に依存する。プロモーターは、好ましくは、それがその天然の設定における転写開始部位からの距離とほぼ同じである、異種転写開始部位からの距離に位置づけられる。しかし、当該分野で公知であるように、この距離におけるいくらかのバリエーションが、プロモーター機能を欠損させることなく適応され得る。
【００８４】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に、宿主細胞においてＴ１Ｒをコードする核酸の発現のために必要とされるさらなるエレメントを全て含む転写単位または発現カセットを含む。従って、代表的な発現カセットは、Ｔ１Ｒをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、ならびに転写物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、および翻訳終結部位を含む。カセットのさらなるエレメントとしては、エンハンサー、そしてゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合には、機能的スプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロンが挙げられ得る。
【００８５】
プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、効率的な終結を提供するために構造遺伝子の下流に転写終結領域を含むべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られてもよいし、または異なる遺伝子から得られてもよい。
【００８６】
遺伝情報を細胞へ輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核生物細胞または原核生物細胞における発現のために使用される任意の従来のベクターが、使用され得る。標準的な細菌性発現ベクターとしては、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ）、および融合発現系（例えば、ＭＢＰ、ＧＳＴおよびＬａｃＺ）が挙げられる。エピトープタグもまた、簡便な単離方法を提供するために組換えタンパク質に付加され得る（例えば、ｃ−ｍｙｃ）。配列タグは、核酸レスキューのために発現カセットに含められ得る。蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質、β−ｇａｌ、ＣＡＴなどのようなマーカーが、ベクター導入のためのマーカーとしてベクター中に含められ得る。
【００８７】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、代表的に、真核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）において使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーター、または真核生物細胞における発現のために有効であると示されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【００８８】
真核生物ベクターからのタンパク質の発現はまた、誘導性プロモーターを使用して調節され得る。誘導性プロモーターでは、発現レベルは、プロモーターにこれらの因子の応答エレメントを組み込むことによって、誘導因子（例えば、テトラサイクリンまたはエクジソン）の濃度と関連付けられる。一般的には、高レベルの発現は、誘導因子の存在下においてのみ、誘導性プロモーターから得られる；基本的な発現レベルは、最少である。
【００８９】
１つの実施形態において、本発明のベクターは、調節性プロモーター（例えば、ｔｅｔ−調節系およびＲＵ−４８６系（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ＆Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４９１−４９６（１９９８）；Ｗａｎｇら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら，Ｂｌｏｏｄ  ８８：１１４７−１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１（１９９８）を参照のこと））を有する。これらは、候補標的核酸の発現に対して低分子制御を与える。この有益な特徴を使用して、所望の表現型が、体細胞変異ではなくトランスフェクトされたｃＤＮＡによって引き起こされていることを決定し得る。
【００９０】
いくつかの発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー（例えば、チミジンキナーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ）を有する。あるいは、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクター（ポリへドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下にＴ１Ｒコード配列を有する）を使用するような、遺伝子増幅に関与しない高収率発現系もまた適切である。
【００９１】
代表的に発現ベクターに含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にするための抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物の配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域中の特有の制限部位を含む。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当該分野で公知の多くの任意の耐性遺伝子が適切である。真核生物の配列は、好ましくは、それらが、必要に応じて真核生物細胞におけるＤＮＡの複製を妨害しないように選択される。
【００９２】
標準的なトランスフェクション方法が、大量のＴ１Ｒタンパク質を発現する細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を生成するために使用され、次いで、このタンパク質は、標準的な技術を使用して精製される（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９〜１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）を参照のこと）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９〜３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７〜３６２（Ｗｕら編、１９８３）を参照のこと）。
【００９３】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するための任意の周知の手順が使用され得る。これらとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポソーム、マイクロインジェクション、血漿ベクター、ウイルスベクター、およびクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞へ導入するための任意の他の周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）の使用が挙げられる。使用される特定の遺伝子操作手順は、少なくとも１つの遺伝子を、Ｔ１Ｒを発現し得る宿主細胞へ首尾よく導入し得ることのみが必要とされる。
【００９４】
発現ベクターが細胞へ導入された後、トランスフェクトされた細胞は、Ｔ１Ｒの発現に有利な条件下で培養され、このＴ１Ｒは、以下で同定される標準的な技術を使用して培養物から回収される。
【００９５】
（Ｔ１Ｒポリペプチドの精製）
天然に存在するかまたは組換えのＴ１ＲポリペプチドまたはＴ１Ｒ３含有レセプターのいずれかは、機能的アッセイにおける使用のために精製され得る。天然に存在するＴ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターは、例えば、ヒト組織から精製され得る。組換えＴ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターは、任意の適切な発現系から精製され得る。Ｔ１Ｒポリペプチドは代表的に、Ｔ１Ｒ３含有レセプターを形成するように、同じ細胞中において共発現される。
【００９６】
Ｔ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターは、標準的な技術（硫酸アンモニウムのような物質を用いる選択的沈殿；カラムクロマトグラフィー、免疫精製方法などを含む）によって実質的に純粋となるまで精製され得る（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。
【００９７】
多くの手順が、組換えＴ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターが精製されている場合に利用され得る。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質は、可逆的にＴ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターに融合され得る。適切なリガンドを用いて、Ｔ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターは、選択的に精製カラムに吸着され得、次いで、比較的純粋な形態でカラムから遊離され得る。次いで、融合されたタンパク質は、酵素活性によって除去される。最終的に、Ｔ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターは、イムノアフィニティーカラムを使用して精製され得る。
【００９８】
（Ａ．組換え細菌からのＴ１Ｒの精製）
組換えタンパク質は、大量に、代表的にはプロモーター誘導後に、形質転換された細菌によって発現される；しかし、発現は構成的であり得る。ＩＰＴＧによるプロモーター誘導は、誘導性プロモーター系の一例である。細菌は、当該分野で標準的な手順に従って増殖される。新鮮な細菌細胞または凍結された細菌細胞が、タンパク質の単離のために使用される。
【００９９】
細菌において発現されるタンパク質は、不溶性の凝集物（「封入体」）を形成し得る。いくつかのプロトコルは、Ｔ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターの封入体の精製のために適切である。例えば、封入体の精製は、代表的に、細菌細胞の破壊による（例えば、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣＬ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、および１ｍＭ  ＰＭＳＦの緩衝液中でのインキュベーションによる）封入体の抽出、分離および／または精製を包含する。細胞懸濁物は、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓに２〜３回通過させて溶解され得るか、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してホモジナイズされ得るか、または氷上で音波破砕され得る。細菌を溶解する代替的な方法は、当業者に明らかである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【０１００】
必要であれば、封入体は可溶化され、そして溶解された細胞懸濁物は、代表的に、望ましくない不溶性物質を除去するために遠心分離される。封入体を形成したタンパク質は、適合性の緩衝液を用いて希釈または透析することによって再生され得る。適切な溶媒としては、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、容量／容量基準）、およびグアニジン塩酸塩（約４Ｍ〜約８Ｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。凝集物形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの溶媒（例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、７０％ギ酸）は、免疫原性および／または活性の欠失に付随する、タンパク質の不可逆的変性があり得ることから、この手順での使用には不適切である。グアニジン塩酸塩および類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、そして、変性剤の除去（例えば、透析による）または希釈によって、再生が生じ得、これにより免疫学的および／または生物学的に活性なタンパク質の再形成が可能となる。他の適切な緩衝液は、当業者に公知である。ヒトＴ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターは、標準的な分離技術（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を用いる）によって、他の細菌性タンパク質から分離される。
【０１０１】
あるいは、細菌ペリプラズムからのＴ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターを精製することが可能である。細菌の溶解後、Ｔ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターが細菌のペリプラズムへ輸送される場合、この細菌のペリプラズムの画分は、当業者に公知の他の方法の他に、低温浸透圧ショックによって単離され得る。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞は、ペレットを形成するように遠心分離される。このペレットは、２０％スクロースを含有する緩衝液中に再懸濁される。細胞を溶解するために、細菌は遠心分離され、そしてペレットは氷冷の５ｍＭ  ＭｇＳＯ４中に再懸濁され、そして約１０分間氷浴中に置かれる。細胞懸濁液は遠心分離され、そして上清はデカントされそして保存される。この上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技術によって宿主タンパク質から分離され得る。
【０１０２】
（Ｂ．Ｔ１Ｒタンパク質を精製するための標準的なタンパク質分離技術）
（溶解度分画）
しばしば最初の工程として、特に、タンパク質混合物が複合体である場合、最初の塩分画は、目的の組換えタンパク質から、望ましくない宿主細胞タンパク質（または細胞培養培地由来のタンパク質）の多くを分離し得る。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水分量を効率的に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質は、これらの溶解度に基づいて沈殿される。タンパク質が疎水性になるにつれ、このタンパク質はより低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する確率が高まる。代表的なプロトコルとしては、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が、２０〜３０％の間であるように、タンパク質溶液に対して飽和硫酸アンモニウムを添加することを含む。この濃度は、ほとんどの疎水性のタンパク質を沈殿させる。次いで、沈殿物がデカントされ（目的のタンパク質が疎水性でないかぎり）、そして目的のタンパク質を沈殿させることが知られている濃度まで、硫酸アンモニウムをこの上清に添加する。次いで、沈殿物は、緩衝液中に可溶化され、そして、必要であれば、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって、過剰な塩が除去される。タンパク質の溶解度に依存する他の方法（例えば、冷エタノール沈殿）は当業者に周知であり、そして複合体タンパク質混合物を分画するために使用され得る。
【０１０３】
（サイズ差（ｓｉｚｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）濾過）
Ｔ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターの分子量は、異なる孔サイズの膜（例えば、Ａｍｉｃｏｎの膜またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅの膜）を通す限外濾過を使用して、Ｔ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターを、より大きなサイズおよびより小さなサイズのタンパク質から単離するために利用され得る。第１工程として、タンパク質混合物は、目的のタンパク質の分子量よりも低分子量のカットオフを有する孔サイズを有する膜を通して限外濾過される。次いで、限外濾過の保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は、目的のタンパク質の分子量よりも大きな分子カットオフを有する膜に対して限外濾過される。組換えタンパク質は、その膜を通過して濾液へと行く。次いで、この濾液が、以下で記載されるようにクロマトグラフィーされ得る。
【０１０４】
（カラムクロマトグラフィー）
Ｔ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有レセプターはまた、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離され得る。さらに、タンパク質に対して惹起される抗体は、カラムマトリクスに結合体化され得、そしてタンパク質が免疫精製され得る。これらの方法の全ては、当該分野で周知である。クロマトグラフィー技術が任意のスケールで実施され得、そして多くの異なる製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの装置を使用し得ることが、当業者に明らかである。
【０１０５】
（Ｔ１Ｒタンパク質のモジュレーターについてのアッセイ）
（Ａ．アッセイ）
Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターの調節、および味覚に関する対応する調節は、種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して評価され得る。このようなアッセイは、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターのインヒビターおよびアクチベーター、そして結果として味覚のインヒビターおよびアクチベーターについて試験するために使用され得る。Ｔ１Ｒ３を含有する甘味および／またはアミノ酸の味覚レセプターのこのようなモジュレーターは、味覚シグナル伝達に関与する。Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターのモジュレーターは、組換えＴ１Ｒ３含有味覚レセプターまたは天然に存在するＴ１Ｒ３含有味覚レセプターのいずれか（好ましくは、ヒトレセプター）を使用して試験される。
【０１０６】
好ましくは、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターは、本明細書中に提供される配列またはその保存的に改変された改変体によってコードされるような配列を有する。あるいは、アッセイのＴ１Ｒ３含有味覚レセプターは、真核生物由来であり、かつ本明細書中に提供される配列に対してかなりのアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸部分配列を含むか、または本明細書中に記載されるようなヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件（中程度または高度）下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる。一般的に、このアミノ酸配列同一性は、少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％である。
【０１０７】
組換え体または天然物のいずれかのＴ１Ｒ３含有味覚レセプターまたはＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを発現する細胞における、甘味および／またはアミノ酸の味覚シグナル伝達の測定または甘味味覚シグナル伝達表現型の欠損の測定は、本明細書中に記載されるような、インビトロ、インビボおよびエキソビボの種々のアッセイを使用して実施され得る。活性または結合に影響を及ぼす適切な物理的変化、化学的変化または表現型的変化が、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の効果を評価するために使用され得る。機能的効果をインタクトな細胞または動物を使用して決定する場合、当業者はまた、種々の影響（例えば、シグナル伝達の場合には、例えば、リガンドの結合、ホルモンの放出、既知の遺伝子マーカーおよび未だ特徴付けられていない遺伝子マーカーの両方に対する転写的変化（例えば、ノーザンブロット）、細胞代謝の変化（例えば、ｐＨ変化）、および細胞内第２メッセンジャー（例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、またはｃＡＭＰ）の変化）を測定し得る。
【０１０８】
（インビトロアッセイ）
Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター調節活性を有する化合物を同定するためのアッセイは、インビトロで実施され得る。このようなアッセイは、全長Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターもしくはその改変体、またはキメラを形成するように異種タンパク質に融合されたＴ１Ｒ３含有味覚レセプターのフラグメント（例えば、細胞外ドメイン）を使用し得る。精製された組換えＴ１Ｒ３含有味覚レセプターまたは天然に存在するＴ１Ｒ３含有味覚レセプターは、本発明のインビトロ方法において使用され得る。精製されたＴ１Ｒ３含有味覚レセプターに加えて、組換えまたは天然に存在するＴ１Ｒ３含有味覚レセプターは、細胞溶解産物または細胞膜の部分であり得る。以下に記載されるように、結合アッセイは、固相または可溶性のいずれかであり得る。好ましくは、タンパク質または膜が、共有結合または非共有結合のいずれかによって固体支持体に結合される。しばしば、本発明のインビトロアッセイは、非競合的または競合的（本明細書中に記載されるような既知の細胞外リガンドとかまたは既知の細胞内リガンドＧＴＰと）のいずれかである、リガンド結合アッセイまたはリガンド親和性アッセイである。他のインビトロアッセイは、タンパク質についての分光学的特徴（例えば、蛍光性、吸着度、屈折率）、流体力学特性（例えば、形状）、クロマトグラフィーの特性、または可溶度特性における変化の測定を含む。
【０１０９】
１つの実施形態では、ハイスループット結合アッセイが実施され、ここでは、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターまたはそのフラグメントを含むキメラを、潜在的なモジュレーターと接触させ、そして適切な量の時間にわたってインキュベートする。１つの実施形態では、潜在的なモジュレーターを固体支持体に結合し、そしてＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを添加する。別の実施形態では、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターを、固体支持体に結合させる。以下に記載されるように、広範な種々のモジュレーターが使用され得、これには、有機低分子、ペプチド、抗体、およびＴ１Ｒ３含有味覚レセプターリガンドアナログが挙げられる。広範な種々のアッセイが、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター−モジュレーター結合を同定するために使用され得、これには、標識化タンパク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度のシフト、イムノアッセイ、酵素的アッセイ（例えば、リン酸化アッセイ）などが挙げられる。いくつかの場合、候補モジュレーターの結合は、競合的結合アッセイの使用を通して決定され、ここでは、既知のリガンドの結合による干渉を、潜在的なモジュレーターの存在下において測定する。Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターに対するリガンドは、本明細書中に提供される。モジュレーターまたは既知のリガンドのいずれかがまず結合され、次いで、競合因子が添加される。Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターを洗浄した後に、潜在的なモジュレーターまたは既知のリガンドのいずれかの結合による干渉を決定する。しばしば、この潜在的なモジュレーターまたは既知のリガンドのいずれかは、標識化される。
【０１１０】
（細胞ベースのインビボアッセイ）
別の実施形態において、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターは、細胞において発現され（例えば、Ｔ１Ｒファミリーの２つの異種のメンバー（例えば、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３、または、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３）を共発現させることによって）、そして機能的（例えば、物理的および化学的または表現型的）な変化をアッセイして、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターの味覚モジュレーターを同定する。Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターを発現する細胞はまた、結合アッセイにおいて使用され得る。任意の適切な機能的効果が、本明細書中に記載のようにして、測定され得る。例えば、リガンドの結合、Ｇタンパク質の結合およびＧＰＣＲシグナル伝達（例えば、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化）はすべて、細胞ベースの系を使用して、潜在的なモジュレーターを同定するために適切なアッセイである。このような細胞ベースのアッセイのために適切な細胞は、本明細書中に記載されるような、初代細胞および細胞株の両方を含む。Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターは、天然物または組換え体であり得る。また、上記のように、ＧＰＣＲ活性を有するキメラＴ１Ｒ３含有味覚レセプターが、細胞ベースのアッセイにおいて使用され得る。例えば、Ｔ１Ｒタンパク質の細胞外ドメインが、異種タンパク質の膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインに融合され得、好ましくは、異種ＧＰＣＲに融合され得る。このようなキメラＧＰＣＲは、ＧＰＣＲ活性を有し、そして本発明の細胞ベースのアッセイにおいて使用され得る。
【０１１１】
別の実施形態では、細胞のＴ１Ｒポリペプチドレベルを、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルで測定することによって決定する。Ｔ１Ｒシグナル伝達に関連するＴ１Ｒタンパク質（１つまたは複数）のレベルは、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターまたはそのフラグメントに選択的に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどのようなイムノアッセイを使用して測定される。ｍＲＮＡの測定のためには、増幅（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲを使用する）またはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅプロテクション、ドットブロッティング）が好ましい。タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルは、本明細書中に記載されるように、直接的または間接的に標識された検出因子（例えば、蛍光標識された核酸または放射性標識された核酸、放射性標識された抗体または酵素的に標識された抗体など）を使用して、検出される。
【０１１２】
あるいは、Ｔ１Ｒ３含有レセプターの発現は、リポーター遺伝子系を使用して測定され得る。このような系は、リポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ）に作動可能に連結されたＴ１Ｒタンパク質プロモーターを使用することにより工夫され得る。さらに、目的のタンパク質が、赤色蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質のような第２リポーターへの結合を介して、間接的にリポーターとして使用され得る（例えば、Ｍｉｓｔｉｌｉ＆Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：９６１−９６４（１９９７）を参照のこと）。リポーター構築物は代表的に、細胞にトランスフェクトされる。潜在的なモジュレーターで処理した後に、リポーター遺伝子の転写物、翻訳物または活性の量を、当業者に公知の標準的な技術によって測定する。
【０１１３】
別の実施形態では、ＧＰＣＲシグナル伝達に関連した機能的効果を測定し得る。活性化または阻害化されたＴ１Ｒ３含有Ｇ共役型タンパク質レセプターは、標的酵素、第２メッセンジャー、チャネルおよび他のエフェクタータンパク質の特性を変更する。この例としては、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ、アデニル酸シクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、ＩＰ３の活性化、およびＧタンパク質による多様なチャネルの調節が挙げられる。ホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロールおよびＩＰ３の生成、そして次ぐ、ＩＰ３によるカルシウム動員のような、下流の結果もまた試験され得る。活性化されたＧＰＣＲレセプターは、レセプターのＣ末端テイルを（そしておそらく、他の部位も）リン酸化するキナーゼの基質となる。従って、アクチベーターは、γ標識化ＧＴＰからレセプターへの３２Ｐの転移を促進し、この転移が、シンチレーション計数器を用いてアッセイされ得る。Ｃ末端テイルのリン酸化は、アレスチン様タンパク質の結合を促進し、そしてＧタンパク質への結合に干渉する。ＧＰＣＲシグナル伝達およびシグナル伝達をアッセイする方法に関する一般的な概論については、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２３７巻および第２３８巻（１９９４）および第９６巻（１９８３）；Ｂｏｕｒｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  １０：３４９：１１７−２７（１９９１）；Ｂｏｕｒｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：１２５−３２（１９９０）；Ｐｉｔｃｈｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：６５３−９２（１９９８）を参照のこと。
【０１１４】
上記のように、いくつかのＧタンパク質共役型レセプターの活性化は、ホスファチジルイノシトールのホスホリパーゼＣ媒介性加水分解を通して、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ＆Ｉｒｖｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：３１５−２１（１９８４））。次いで、ＩＰ３は、細胞内カルシウムイオン貯蔵物の放出を刺激する。従って、細胞質カルシウムイオンレベルにおける変化、または第２メッセンジャーレベル（例えばＩＰ３）における変化が、Ｇタンパク質共役型レセプター機能を評価するために用いられ得る。このようなＧタンパク質共役型レセプターを発現する細胞は、細胞内貯蔵物およびイオンチャネルの活性化経由の両方による寄与の結果として、増加した細胞質カルシウムレベルを示し得る。この場合、内部貯蔵物からのカルシウム放出から生じる蛍光応答を区別するために、必要に応じて、キレート剤（例えば、ＥＧＴＡ）を補充したカルシウム非含有緩衝液においてこのようなアッセイを行うことが所望され得るが、これは必須ではない。
【０１１５】
１つの例において、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターのＧＰＣＲ活性は、このレセプターをホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に結び付ける無差別なＧタンパク質（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）を参照のこと）を有する異種細胞においてＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを発現させることによって測定される。シグナル伝達の調節は、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターと関連する分子の投与を介したＧＰＣＲシグナル伝達経路の調節に応答して変化する、細胞内Ｃａ２＋レベルの変化を測定することによってアッセイされる。Ｃａ２＋レベルにおける変化は、必要に応じて、蛍光性Ｃａ２＋指示薬色素および蛍光定量的な画像化を用いて測定される。
【０１１６】
別の例では、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解を、米国特許第５，４３６，１２８号（本明細書中で参考として援用される）に従って分析し得る。簡潔には、このアッセイは、４８時間以上にわたる３Ｈ−ミオイノシトールでの細胞の標識化を含む。この標識化細胞は、試験化合物を用いて１時間にわたり処理される。処理された細胞は、溶解され、そしてクロロホルム−メタノール−水において抽出され、その後、イノシトールリン酸は、イオン交換クロマトグラフィーによって分離され、そしてシンチレーション計数によって定量された。倍数刺激（ｆｏｌｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は、緩衝液コントロールの存在下でのｃｐｍに対する、アゴニストの存在下でのｃｐｍの比を計算することによって決定される。同様に、倍数阻害は、緩衝液コントロール（これは、アゴニストを含んでもよいし、含まなくてもよい）の存在下でのｃｐｍに対する、アンタゴニストの存在下でのｃｐｍの比を計算することによって決定される。
【０１１７】
他のアッセイは、レセプターの活性を決定することを包含し得、このレセプターは、活性化された場合に、アデニル酸シクラーゼのような酵素を活性化または阻害化することによって、細胞内サイクリックヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ）のレベルにおける変化を生じる。レセプターの活性化がサイクリックヌクレオチドレベルにおける減少を生じる場合、アッセイにおいて細胞にレセプター活性化化合物を添加する前に、細胞内サイクリックヌクレオチドのレベルを増加させる因子（例えば、フォルスコリン）に細胞を曝露することが好適であり得る。
【０１１８】
１つの例において、細胞内ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰにおける変化は、イムノアッセイを用いて測定され得る。Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ＆Ｓｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）に記載される方法は、ｃＡＭＰのレベルを決定するために用いられ得る。Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１５９−１６４（１９９４）に記載される方法もまた、ｃＧＭＰのレベルを決定するために用いられ得る。さらに、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰを測定するためのアッセイキットは、米国特許第４，１１５，５３８号（本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１１９】
１つの例において、Ｇタンパク質共役型レセプター活性についてのアッセイは、レセプター活性をリポートするためのイオン感受性色素または電圧感受性色素を負荷した細胞を含む。このようなレセプターの活性を決定するためのアッセイはまた、試験される化合物の活性を評価するために、ネガティブコントロールまたはポジティブコントロールとして、他のＧタンパク質共役型レセプターに対する公知のアゴニストおよびアンタゴニストを使用し得る。調節性化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイにおいて、細胞質におけるイオンのレベルの変化または膜電圧の変化が、イオン感受性、または膜電圧蛍光指示薬をそれぞれ用いてモニターされる。とりわけイオン感受性指示薬および電圧プローブの中でも用いられ得るのは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ１９９７カタログに開示されるものである。Ｇタンパク質共役型レセプターについて、無差別なＧタンパク質（例えば、Ｇα１５およびＧα１６）が、選り抜きのアッセイにおいて用いられ得る（Ｗｉｌｋｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１００４９−１００５３（１９９１））。このような無差別なＧタンパク質は、広範囲のレセプターのカップリングを可能にする。
【０１２０】
（動物モデル）
味覚に関する動物モデル（例えば、本明細書中に記載されるような、Ｓａｃテイスターマウス系統および非テイスターマウス系統）はまた、味覚のモジュレーターについてのスクリーニングにおける用途を見出す。同様に、トランスジェニック動物技術（例えば、適切な遺伝子標的化ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子の過剰発現の結果としての遺伝子ノックアウト技術を含む）は、Ｔ１Ｒ３含有レセプターまたはその成分の発現の欠損または増加を引き起こす。所望される場合には、Ｔ１Ｒ３含有レセプターまたはその成分の組織特異的な発現またはノックアウトが必要とされ得る。このような方法によって作製されたトランスジェニック動物は、味覚の調節に関する動物モデルとしての用途を見出し、そして味覚調節のモジュレーターのためのスクリーニングにおいてさらに有用である。
【０１２１】
（Ｂ．モジュレーター）
Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターのモジュレーターとして試験される化合物は、任意の有機低分子か、または生物学的実体（例えば、タンパク質（例えば、抗体またはペプチド）、糖、核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム）または脂質）であり得る。あるいは、モジュレーターは、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターの遺伝子改変されたバージョンであり得る。代表的には、試験化合物は、有機低分子、ペプチド、脂質および脂質アナログである。
【０１２２】
本質的に任意の化学物質が、本発明のアッセイにおいて潜在的なモジュレーターまたはリガンドとして使用され得るが、最も頻繁には、水溶液または有機（特に、ＤＭＳＯ−ベース）溶液中に溶解され得る化合物が用いられる。このアッセイは、アッセイ工程を自動化し、そして任意の都合の良い供給源からアッセイに化合物を提供することによって大きな化学ライブラリーをスクリーニングするように設計される。これは、代表的には、並行して（例えば、ロボットアッセイにおいてマイクロタイタープレートにおけるマイクロタイター形式において）実行される。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを含む多くの化学物質の供給業者が存在することが理解される。
【０１２３】
１つの好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニング方法は、多数の潜在的な治療用化合物（潜在的モジュレーターまたはリガンド化合物）を含むコンビナトリアル有機低分子ライブラリーまたはコンビナトリアルペプチドライブラリーを提供することを含む。次いで、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」は、本明細書中に記載されるような、１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングされて、所望の特徴的な活性を提示するこれらのライブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）が同定される。従って、同定された化合物は、従来の「リード化合物」として役割を果たし得るか、またはそれ自体が、潜在的もしくは実際の治療剤として用いられ得る。
【０１２４】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学合成かまたは生合成のいずれかにより、多数の化学的「ビルディングブロック」（例えば、試薬）を組み合わせることによって生成される多様な化学物質の収集物である。例えば、線形コンビナトリアル化学ライブラリー（例えば、ポリペプチドライブラリー）は、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について可能なあらゆる様式において、一組の化学的ビルディングブロック（アミノ酸）を組み合せることによって形成される。何百万もの化学的化合物が、化学的ビルディングブロックのこのようなコンビナトリアル混合を通して合成され得る。
【０１２５】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８８（１９９１）を参照のこと）が挙げられるが、これに限定されない。化学的に多様なライブラリーを作製するための他の化学もまた用いられ得る。このような化学としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプトイド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５）、コード化ペプチド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格を有する非ペプチド性のペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子化合物ライブラリーのアナログ有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、全て前出、を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、炭水化物ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、ＢａｕｍＣ＆ＥＮ，１月１８日、３３頁（１９９３））；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号などを参照のこと）。
【０１２６】
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ、４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡを参照のこと）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーは、それ自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ，３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなどを参照のこと）。
【０１２７】
（Ｃ．固体および可溶性のハイスループットアッセイ）
１つの実施形態では、本発明は、天然物または組換え体のいずれかの、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター、またはＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを発現する細胞もしくは組織を用いる可溶性アッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は、ハイスループット様式にある固相ベースのインビトロアッセイを提供し、ここでは、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターを固相基材に結合させる。本明細書中に記載されるアッセイのいずれもが、ハイスループットスクリーニング（例えば、リガンドの結合、細胞増殖、細胞表面マーカーのフラックス（例えば、スクリーニング）、放射性標識ＧＴＰの結合、第２メッセンジャーのフラックス（例えば、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰまたはｃＡＭＰ、サイトカイン生成など））のために適合され得る。
【０１２８】
本発明のハイスループットアッセイでは、可溶性または固体のいずれかで、一日で数千までもの異なるモジュレーターまたはリガンドをスクリーニングすることが可能である。この方法論が、インビトロでＴ１Ｒ３含有味覚レセプターについて、または、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターを含有する細胞ベースのアッセイもしくは膜ベースのアッセイについて、使用され得る。詳細には、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択される潜在的モジュレーターに対して別々のアッセイを実行し得るか、または濃度もしくはインキュベーション時間の効果が観察されるべきである場合には、５〜１０ウェルごとに１つのモジュレーターを試験し得る。従って、単一の標準的なマイクロタイタープレートは、約１００個（例えば、９６個）のモジュレーターをアッセイし得る。１５３６ウェルプレートが用いられる場合、単一のプレートは、約１００〜約１５００の異なる化合物を容易にアッセイし得る。一日当たり多くのプレートをアッセイすることが可能であり；約６，０００、２０，０００、５０，０００までのまたは１００，０００より多くの異なる化合物についてのアッセイスクリーニングが、本発明の統合システム（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて可能である。
【０１２９】
固体反応のために、目的のタンパク質もしくはそのフラグメント（例えば、細胞外ドメイン）、または目的のタンパク質もしくはそのフラグメントを融合タンパク質の部分として含む細胞もしくは膜が、固体成分に、直接的にかまたは間接的に、共有結合もしくは非共有結合を介して（例えば、タグを介して）結合され得る。このタグは、任意の種々の成分のものであり得る。一般に、タグを結合する分子（タグバインダー）は、固体支持体に固定され、そして目的のタグ化分子は、タグとタグバインダーとの相互作用によって固体支持体に結合される。
【０１３０】
多数のタグおよびタグバインダーが、文献に十分に記載される公知の分子相互作用に基づいて用いられ得る。例えば、タグが天然のバインダー（例えば、ビオチン、プロテインＡ、またはプロテインＧ）を有する場合、それは、適切なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、免疫グロブリンのＦｃ領域など）との結合において用いられ得る。ビオチンのような天然のバインダーを有する分子に対する抗体はまた、広く入手可能であり、そして適切なタグバインダーである；ＳＩＧＭＡ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９８カタログ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯを参照のこと。
【０１３１】
同様に、任意のハプテン化合物または抗原性化合物が、タグ／タグバインダー対を形成するために適切な抗体と組み合わせて用いられ得る。数千の特異的抗体が市販されており、そして多くのさらなる抗体が文献に記載されている。例えば、１つの共通の配置では、このタグは、一次抗体であり、そしてタグバインダーは、一次抗体を認識する二次抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、レセプター−リガンド相互作用もまた、タグとタグバインダーとの対として適切である。例えば、細胞膜レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、トランスフェリン、ｃ−ｋｉｔ、ウイルスレセプターリガンド、サイトカインレセプター、ケモカインレセプター、インターロイキンレセプター、免疫グロブリンレセプターおよび抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどのような細胞レセプター−リガンド相互作用；例えば、ＰｉｇｏｔｔおよびＰｏｗｅｒ，Ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ  Ｉ（１９９３）を参照のこと）。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、アヘン剤、ステロイドなど）、細胞内レセプター（例えば、これは、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤを含む、種々の小さなリガンドの効果を媒介する；ペプチド）、薬物、レクチン、糖類、核酸（直鎖配置および環状ポリマー配置の両方）、オリゴサッカリド、タンパク質、リン脂質および抗体はすべて、種々の細胞レセプターと相互作用し得る。
【０１３２】
合成ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテート）もまた、適切なタグまたはタグバインダーを形成し得る。多くの他のタグ／タグバインダー対がまた、この開示を見て当業者に明らかであるように、本明細書中に記載されるアッセイ系において有用である。
【０１３３】
一般的なリンカー（例えば、ペプチド、ポリエーテルなど）もまた、タグとしての役割を果たし得、そしてこれは、ポリペプチド配列（例えば、約５〜２００アミノ酸のポリｇｌｙ配列）を含む。このような可撓性リンカーは、当業者に公知である。例えば、ポリ（エチレン（ｅｔｈｅｌｙｎｅ）グリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可能である。これらのリンカーは、必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能性結合を有する。
【０１３４】
タグバインダーは、現在利用可能な種々の方法のいずれかを用いて固体基材に固定される。固体基材は、タグバインダーの一部と反応性である表面に化学基を固定する化学試薬に、基材の全部または一部を曝露することによって、一般に誘導体化もしくは官能化される。例えば、より長い鎖の部分に結合させるために適切な基としては、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基が挙げられる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、種々の表面（例えば、ガラス表面）を官能化するために用いられ得る。このような固相バイオポリマーアレイの構築は、文献に十分に記載されている。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）（例えば、ペプチド、の固相合成を記載する）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１０２：２５９−２７４（１９８７）（ピン上での固体成分の合成を記載する）；ＦｒａｎｋおよびＤｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４４：６０３１６０４０（１９８８）（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載する）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）；Ｓｈｅｌｄｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９（４）：７１８−７１９（１９９３）；およびＫｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（７）：７５３７５９（１９９６）（全てが、固体基材に固定されたバイオポリマーのアレイを記載する）を参照のこと。基材にタグバインダーを固定するための非化学的アプローチとしては、他の一般的方法（例えば、加熱、ＵＶ照射による架橋など）が挙げられる。
【０１３５】
（Ｔ１Ｒ３含有レセプターの免疫学的検出）
Ｔ１Ｒ遺伝子の検出、および核酸ハイブリダイゼーション技術を使用する遺伝子発現に加えて、本発明のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを検出するために、イムノアッセイがまた使用され得る。このようなアッセイは、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターのモジュレーターについてスクリーニングするため、ならびに治療的適用および診断的適用のために、有用である。イムノアッセイは、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターを定性的または定量的に分析するために使用され得る。適用可能な技術の一般的な概要は、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）に見出され得る。
【０１３６】
（Ａ．抗体の生成）
Ｔ１Ｒタンパク質およびＴ１Ｒ３含有味覚レセプターと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、前出；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）；ならびにＫｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５）を参照のこと）。このような技術としては、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体の調製、ならびにウサギまたはマウスを免疫することによるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が挙げられる（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６（１９８９）を参照のこと）。
【０１３７】
Ｔ１Ｒタンパク質またはＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの部分を含む多数の免疫原が、Ｔ１Ｒタンパク質特異的に反応する抗体を生成するために使用され得る。例えば、組換えＴ１Ｒタンパク質またはその抗原性フラグメントは、本明細書で記載されるようにして単離され得る。組換えタンパク質は、上記のように真核生物細胞または原核生物細胞において発現され得、そして一般に上記のように精製され得る。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の生成のための好ましい免疫原である。あるいは、本明細書に開示される配列に由来し、そしてキャリアタンパク質に結合体化された合成ペプチドが、免疫原として使用され得る。天然に存在するタンパク質はまた、純粋な形態または不純な形態のいずれかにおいて使用され得る。次いで、この生成物は、抗体を生成し得る動物へ注射される。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかが、タンパク質を測定するためのイムノアッセイにおいて以後使用するために、生成され得る。
【０１３８】
ポリクローナル抗体を生成する方法は、当業者に公知である。マウスの近交系系統（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギを、標準的なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）および標準的な免疫プロトコールを使用して、このタンパク質で免疫する。免疫原性調製物に対する動物の免疫応答を、試験採血を行うことおよびβサブユニットに対する反応性の力価を測定することによってモニターする。この免疫原に対して適切な高力価の抗体が得られた場合、この動物から血液を収集し、そして抗血清を調製する。所望される場合には、タンパク質に対して反応性の抗体を富化させるために、抗血清のさらなる分画が実施され得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出を参照のこと）。
【０１３９】
モノクローナル抗体は、当業者に周知の種々の技術によって得られ得る。簡潔には、所望される抗原で免疫された動物由来の脾臓細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）を参照のこと）。不死化の代替の方法としては、エプスタイン−バーウイルス、オンコジーン、もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当該分野において周知の他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から生じたコロニーを、抗原に対する所望の特異性および親和性を有する抗体の生成についてスクリーニングする。そしてこのような細胞によって生成されるモノクローナル抗体の収率は、種々の技術（脊椎動物宿主の腹膜腔内への注入を含む）によって増大され得る。あるいは、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって概説された一般的プロトコールに従って、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離し得る。
【０１４０】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清は収集され、そしてイムノアッセイ（例えば、固体支持体に固定された免疫原を用いる固相イムノアッセイ）において、免疫原タンパク質に対して力価決定される。代表的には、１０４以上の力価を有するポリクローナル抗血清が選択され、そして競合的結合イムノアッセイを使用して、非Ｔ１Ｒタンパク質または非Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプタータンパク質に対するそれらの交差反応性について試験される。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、一般的には、少なくとも約０．１ｍＭ、より一般的には少なくとも約１μＭ、好ましくは、少なくとも約０．１μＭ以下、そして最も好ましくは、０．０１μＭ以下のＫｄで結合する。特定のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターのオルトログ（例えば、ヒトＴ１Ｒ３含有味覚レセプター）に対してのみ特異的な抗体はまた、非ヒト哺乳動物のような種から他の交差反応性オルトログを差し引くことによって作製され得る。さらに、個々のＴ１Ｒタンパク質は、このレセプターおよび個々のＴ１Ｒタンパク質の両方に結合する抗体を差し引くために使用され得る。この様式において、ヘテロダイマー性レセプターにのみ結合する抗体が得られ得る。
【０１４１】
一旦、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターに対して特異的抗体が利用可能になると、このタンパク質は、種々のイムノアッセイ方法によって検出され得る。さらに、この抗体は、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターのモジュレーターとして、治療的に使用され得る。免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の概説については、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照のこと。さらに、本発明のイムノアッセイは、いくつかの立体配置のいずれでも実施され得る。この立体配置は、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；およびＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（前出）に広範に概説される。
【０１４２】
（Ｂ．免疫学的結合アッセイ）
Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターは、十分に容認された多くの免疫学的結合アッセイ（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，１６８号を参照のこと）のいずれかを使用して、検出および／または定量化され得る。一般的なイムノアッセイの概説については、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９３）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）もまた参照のこと。免疫学的結合アッセイ（すなわち、イムノアッセイ）は、代表的に、選択されたタンパク質または抗原（この場合、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターまたはその抗原性部分配列）に特異的に結合する抗体を使用する。抗体（例えば、抗Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター）は、当業者に周知でありかつ上記のような多くの手段のいずれかによって生成され得る。
【０１４３】
イムノアッセイはまた、しばしば、抗体および抗原によって形成される複合体に特異的に結合し、そしてそれを標識する標識化剤を使用する。この標識化剤は、それ自体が、抗体／抗原複合体を含む部分の１つであり得る。従って、標識化剤は、標識されたＴ１Ｒ３含有味覚レセプターまたは標識された抗Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター抗体であり得る。あるいは、標識化剤は、抗体／Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター複合体に特異的に結合する二次抗体のような第３の部分であり得る（二次抗体は、代表的に、一次抗体が由来する種の抗体に特異的である）。免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合し得る他のタンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）もまた、標識化剤として使用され得る。これらのタンパク質は、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域との強力な非免疫原性反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１−１４０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２（１９８５）を参照のこと）。標識化剤は、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合し得る検出可能部分（例えば、ビオチン）で改変され得る。種々の検出可能部分が当業者に周知である。
【０１４４】
アッセイ全体を通して、試薬の各配合の後に、インキュベーション工程および／または洗浄工程が必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒間から数時間まで、必要に応じて、約５分間から約２４時間まで変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイの様式、抗原、溶液の容量、濃度などに依存する。通常、アッセイは、周辺温度にて実施されるが、これらは、一定範囲の温度（例えば、１０℃〜４０℃）にわたって実施され得る。
【０１４５】
（非競合的アッセイ様式）
サンプル中のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的のいずれかであり得る。非競合的イムノアッセイとは、抗原の量を直接的に測定するアッセイである。１つの好ましい「サンドウィッチ」アッセイでは、例えば、抗Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター抗体を、固体基材に直接結合し得、この固体支持体上で抗体を固定する。次いで、これらの固定された抗体が、試験サンプル中に存在するＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを捕捉する。次いで、このように固定されたＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを、標識化剤（例えば、標識を保有する第２のＴ１Ｒ３含有味覚レセプター抗体）に結合させる。あるいは、二次抗体は標識を欠いてもよいが、これは、次いで、二次抗体が由来する種の抗体に対して特異的な標識化三次抗体に結合され得る。二次抗体または三次抗体は、代表的には、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合する検出可能な部分（例えば、ビオチン）で改変されて、検出可能部分を提供する。
【０１４６】
（競合的アッセイ様式）
競合的アッセイにおいては、サンプル中に存在するＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの量は、サンプル中に存在する未知のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターによって、抗Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター抗体から置換される（競合により取り除かれる（ｃｏｍｐｅｔｅｄ  ａｗａｙ））既知の添加された（外因性）Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターの量を測定することによって、間接的に測定される。１つの競合的アッセイにおいて、既知の量のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターがサンプルに添加され、次いでこのサンプルを、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターに特異的に結合する抗体と接触させる。この抗体に結合する外因性のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの量は、サンプル中に存在するＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの濃度に反比例する。特に好ましい実施形態において、抗体は固体基材に固定される。抗体に結合するＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの量は、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター／抗体の複合体中に存在するＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの量を測定することによって、あるいは残存している未複合体化タンパク質の量を測定することによってのいずれかで決定され得る。Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターの量は、標識されたＴ１Ｒ３含有味覚レセプター分子を提供することによって検出され得る。
【０１４７】
ハプテン阻害アッセイは、別の好ましい競合的アッセイである。このアッセイでは、既知のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターが固体基材に固定される。既知の量の抗Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター抗体がサンプルに添加され、次いでこのサンプルを、固定されたＴ１Ｒ３含有味覚レセプターと接触させる。既知の固定されたＴ１Ｒ３含有味覚レセプターに結合した抗Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター抗体の量は、サンプル中に存在するＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの量と反比例する。同じく、固定された抗体の量は、抗体の固定された画分または溶液中に残存する抗体の画分のいずれかを検出することによって検出され得る。検出は、直接的であり得るか（ここでは、抗体が標識される）、または上記のように抗体に特異的に結合する標識化部分の引き続く添加によって、間接的であり得る。
【０１４８】
（交差反応性の測定）
競合的結合様式におけるイムノアッセイはまた、交差反応性の測定のために使用され得る。例えば、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターが、固体支持体上に固定され得る。タンパク質（例えば、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターおよびホモログ）は、この固定化された抗原への抗血清の結合について競合するアッセイに添加される。添加されたタンパク質が、固定されたタンパク質への抗血清の結合に対して競合する能力が、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターがそれ自体と競合する能力と比較される。上記のタンパク質についての交差反応性の％は、標準的な計算を使用して算出される。上記に列挙される添加されたタンパク質の各々と１０％未満の交差反応性を有する抗血清を選択し、そしてプールする。必要に応じて、交差反応性抗体は、考慮される添加されたタンパク質（例えば、遠縁のホモログ）での免疫吸着によって、プールされた抗血清から取り除かれる。
【０１４９】
次いで、免疫吸着されそしてプールされた抗血清を、上記のような競合的結合イムノアッセイにおいて使用して、免疫原タンパク質に対して、おそらくＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの対立遺伝子または多型性改変体と考えられる第２のタンパク質と比較する。この比較を行うために、２つのタンパク質は各々、広範な濃度でアッセイされ、そして固定されたタンパク質への抗血清の結合の５０％を阻害するために必要とされる各タンパク質の量が決定される。結合の５０％を阻害するために必要とされる第２のタンパク質の量が、結合の５０％を阻害するために必要とされるＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの量の１０倍未満である場合、この第２のタンパク質はＴ１Ｒ３含有味覚レセプター免疫原に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合するといわれる。
【０１５０】
（他のアッセイ様式）
ウェスタンブロット（イムノブロット）分析が、サンプル中のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの存在を検出および定量化するために使用される。この技術は一般に、以下の工程を包含する：分子量に基づいてゲル電気泳動によってサンプルのタンパク質を分離させる工程、分離されたタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルター）に転写する工程、およびＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを特異的に結合する抗体とサンプルをインキュベートする工程。抗Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター抗体は、固体支持体上のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターに特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識され得るか、あるいは抗Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプター抗体に特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて、引き続き検出され得る。
【０１５１】
他のアッセイ様式としては、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられ、これは特定の分子（例えば、抗体）に結合し、そしてカプセル化された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する。次いで、この放出される化学薬剤が、標準的技術によって検出される（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１（１９８６）を参照のこと）。
【０１５２】
（非特異的結合の低減）
当業者は、イムノアッセイにおいて非特異的結合を最小化することが多くの場合に所望されることを理解する。特に、アッセイが固体基材に固定化された抗原または抗体を含む場合、この基材への非特異的結合の量を最小化することが所望される。このような非特異的結合を低減する手段は、当業者に周知である。代表的には、この技術は、基板をタンパク質様組成物でコーティングすることを含む。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチンのようなタンパク質組成物が広範に用いられ、粉乳が最も好ましい。
【０１５３】
（標識）
このアッセイで使用される特定の標識または検出可能な基は、それがこのアッセイにおいて使用される抗体の特異的結合を有意に阻害しない限り、本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的特性または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野においてよく開発されており、そして一般的に、このような方法において有用な大半の任意の標識が、本発明に適用され得る。従って、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出され得る任意の組成物である。本発明において有用な標識としては、以下が挙げられる；磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他の酵素）、および比色標識（例えば、金コロイド、または着色ガラスビーズもしくは着色プラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）。
【０１５４】
標識は、当該分野において周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に対して、直接的または間接的に結合され得る。上記のように、広範な種々の標識が使用され得、ここで標識の選択は、必要とされる感度、化合物との結合の容易さ、安定性の要件、利用可能な設備、および廃棄設備に依存する。
【０１５５】
非放射能性標識は、しばしば、間接的手段によって結合される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）が、この分子に共有結合される。次いで、このリガンドは、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合する。この別の分子は、固有に検出可能であるか、またはシグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光性化合物、または化学発光化合物）に共有結合されるかのいずれかである。リガンドおよびそれらの標的は、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターを認識する抗体、または抗Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターを認識する二次抗体との任意の適切な組み合わせにおいて使用され得る。
【０１５６】
この分子はまた、シグナルを生成する化合物に直接的に結合体化され得る（例えば、酵素または発蛍光団と結合体化することによって）。標識としての目的の酵素は主に、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）、特にぺルオキシダーゼである。蛍光性化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光性化合物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例えば、ルミノール）が挙げられる。使用され得る種々の標識系またはシグナル生成系の概説として、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【０１５７】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性標識である場合、検出のための手段は、オートラジオグラフィーにおける場合のようなシンチレーションカウンターまたは写真フィルムを含む。標識が蛍光標識である場合、これは適切な波長の光で蛍光色素を励起すること、および生じた蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、写真フィルムを利用して、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などのような電子検出器の使用によって、可視的に検出され得る。同様に、酵素標識は、その酵素に適切な基質を提供すること、および生じた反応産物を検出することによって検出され得る。最後に、単純な比色標識は、標識に関連する色を観察することによって単純に検出され得る。従って、種々のディップスティックアッセイにおいて、結合体化された金はしばしばピンクのように見え、一方で種々の結合体化されたビーズは、そのビーズの色に見える。
【０１５８】
いくつかのアッセイ様式は、標識された成分の使用を必要としない。例えば、凝集体化アッセイは、標的抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合、抗原をコーティングされた粒子が、標的抗体を含有するサンプルによって凝集体化される。この様式においては、いかなる成分も標識される必要がなく、そして標的抗体の存在は、単純な可視的検査によって検出される。
【０１５９】
（薬学的組成物および投与）
薬学的に受容可能なキャリアは、投与される特定の組成物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、有機低分子、脂質、炭水化物、粒子、または形質導入された細胞）によって、およびこの組成物を投与するために用いられる特定の方法によって一部決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な処方が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版、１９８９を参照のこと）。投与は、任意の都合の良い様式（例えば、注射、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与による）であり得る。
【０１６０】
経口投与のために適切な処方物は、（ａ）液体溶液（例えば、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはＰＥＧ４００）中に懸濁された有効量のパッケージングされた核酸）；（ｂ）液体、固体、顆粒またはゼラチンとして予め決められた量の活性成分を各々含む、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤；（ｃ）適切な液体中にある懸濁液；および（ｄ）適切なエマルジョン、からなり得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、バインダー、希釈剤、緩衝化剤、湿潤剤、防腐剤、風味剤、色素、崩壊剤、および薬学的に受容可能なキャリアのうちの１つ以上を含み得る。ロゼンジ形態は、風味における活性成分（例えば、スクロース）を含み得、そして錠剤（ｐａｓｔｉｌｌｅ）は、不活性基剤における活性成分を含む（例えば、活性成分の他に、当該分野で公知のキャリアを含む、ゼラチンとグリセリンとのまたはスクロースとアカシアとのエマルジョン、ゲルなど）を含み得る。
【０１６１】
選択された化合物は、単独でかまたは他の適切な成分との組み合わせにおいて、吸入を介して投与されるエアロゾル処方物（すなわち、これらは、「噴霧」され得る）にされ得る。エアロゾル処方物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような、加圧された受容可能な噴霧剤のもとに配置され得る。
【０１６２】
例えば、関節内（関節中）、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および皮下の経路によるような、非経口投与のために適切な処方物としては、水性および非水性の等張性滅菌注射溶液が挙げられ、これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液（これは、懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤および防腐剤を含み得る）を含み得る。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注射によって、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に投与され得る。非経口投与および静脈内投与が、好ましい投与方法である。推奨される処方物は、アンプルおよびバイアルのような、単回用量または複数回用量の密封された容器中に提示され得る。
【０１６３】
注射溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。エキソビボ治療のために核酸によって形質導入された細胞はまた、上記のように、静脈内投与され得るかまたは非経口投与され得る。
【０１６４】
本発明の状況において、患者に投与される用量は、長期間にわたり患者において有利な治療応答をもたらすのに十分な量であるべきである。この用量は、用いられる特定のベクターの効果および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の患者における特定のベクターまたは形質導入された細胞型の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。
【０１６５】
Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターの減少した発現または異常発現に起因する状態の処置または予防において投与されるベクターの有効量を決定する際に、医師は、ベクターの循環血漿レベル、ベクターの毒性、疾患の進行度、および抗ベクター抗体の生成を評価する。一般に、ベクター由来の裸の核酸の用量等価量は、代表的な７０ｋｇの患者に対して約１μｇ〜１００μｇであり、そしてベクター（これは、レトロウイルス粒子を含む）の用量は、治療用核酸の等価量を生じるように算出される。
【０１６６】
投与について、本発明の化合物および形質導入細胞は、患者の体重および全体的な健康状態に適合するように、インヒビター、ベクターまたは形質導入細胞型のＬＤ−５０、および種々の濃度でのインヒビター、ベクターまたは細胞型の副作用によって決定される割合で投与され得る。投与は、単回用量または分割用量によって達成され得る。
【０１６７】
（細胞のトランスフェクションおよび遺伝子治療）
本発明は、インビトロおよびインビボにおいて細胞をトランスフェクションするためのＴ１Ｒ３含有味覚レセプターの核酸を提供する。これらの核酸は、以下に記載されるような、標的細胞および生物体のトランスフェクションのための任意の多数の周知のベクターに挿入され得る。核酸は、ベクターと標的細胞との相互作用を通して、エキソビボまたはインビボで細胞にトランスフェクトされる。次いで、プロモーターの制御下にある核酸は、Ｔ１Ｒファミリーの２つのメンバーを共発現することによって、本発明のＴ１Ｒ３含有味覚レセプターを発現し、それにより、Ｔ１Ｒ３含有味覚レセプターの異常な影響、部分的な不活性化、または異常な発現を緩和する。この組成物は、患者において治療的な応答を誘発するために十分な量で、患者に投与される。これを達成するために十分な量を、「治療的に有効な用量または量」として規定する。
【０１６８】
このような遺伝子治療手順を使用して、多くの状況下における後天性遺伝子欠損および遺伝性遺伝子欠損、ならびに他の疾患を矯正し得る。ヒトにおいて人工遺伝子を発現する能力は、他の治療による処置を受け入れなかった多くの疾患を含む、多くの重要なヒト疾患の予防および／または治癒を促進する（遺伝子治療手順の概説として、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９２６−９３２（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９９８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ＆Ｂｏｅｈｍ編，１９９５）；およびＹｕら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照のこと）。
【０１６９】
参考文献
【０１７０】
【表１Ａ】
2005505262.tif 000003
【０１７１】
【表１Ｂ】
2005505262.tif 000004
【０１７２】
【表１Ｃ】
2005505262.tif 000005
【０１７３】
【表１Ｄ】
2005505262.tif 000006
【０１７４】
【表１Ｅ】
2005505262.tif 000007
【実施例】
【０１７５】
（実施例）
以下の実施例を、例示のために提供するが、これは本願発明を制限するために提供されるのではない。
【０１７６】
（実施例１：Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３は、ヘテロダイマー性甘味味覚レセプターを形成する）
（結果）
（Ｔ１Ｒ３は、Ｓａｃ遺伝子座によってコードされる）
以前の研究において、本発明者らは、舌および口蓋上皮の味覚レセプター細胞のサブセットにおいて選択的に発現されるＴ１Ｒファミリーの２つの新規なＧタンパク質共役型レセプター（Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２）を同定した（Ｈｏｏｎら，１９９９；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ０３２６２０−ＡＹ０３２６２３）。本発明者らはまた以前に、機能的な苦味味覚レセプター遺伝子であるＴ２Ｒファミリーを同定した（Ａｄｌｅｒら，２０００；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら，２０００）。Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２は共に、最初は、第４染色体遠位端のＳａｃの近位にマッピングされた（Ｈｏｏｎら、１９９９）。しかし、放射線ハイブリッド分析および高分解能遺伝子マッピングによって、これらのレセプターは、Ｓａｃ遺伝子区画（Ｌｉら、２００１）と分離され、これにより、候補Ｓａｃ遺伝子としてそれらは排除された（図１）。近年、６つの独立したグループが、関連のレセプター遺伝子であるＴ１Ｒ３が、Ｓａｃ遺伝子座と密接に連鎖していること（Ｋｉｔａｇａｗａら，２００１；Ｍａｘら，２００１；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，２００１；Ｓａｉｎｚら，２００１およびＬｉら，２００１  Ａｃｈｅｍｓ  ＸＸＩＩＩ，Ｓａｒａｓｏｔａ  ＦＬ）、およびこのＴ１Ｒ３の多型性改変体が、Ｓａｃのテイスター対立遺伝子および非テイスター対立遺伝子と共分離することを報告した。この遺伝子連鎖は、Ｔ１Ｒ３が、Ｓａｃ遺伝子に対応するという仮定を立てるために使用された。本発明者らはまた、Ｔ１Ｒ３を単離し、そしてＴ１Ｒ３を特徴付け、そして、Ｓａｃが実際にＴ１Ｒ３をコードするのであれば、この候補レセプターのテイスター対立遺伝子の導入が、Ｓａｃ非テイスターマウスの味覚欠損をレスキューするはずであると考えた。
【０１７７】
Ｓａｃテイスター系統（Ｃ５７ＢＬ／６）由来のＴ１Ｒ３配列を含む１５ｋｂのゲノムクローンを使用して、トランスジェニックレスキュー構築物を操作した（図２ａ）。導入遺伝子  対  内因性のＴ１Ｒ３対立遺伝子の存在および発現を追跡するために、本発明者らは、その３’−ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナルを、ウシ成長ホルモンのものと置き換えた。本発明者らのストラテジーは、Ｔ１Ｒ３非テイスター対立遺伝子についてホモ接合性であるがテイスター由来の導入遺伝子を保有した子孫を作製することであった。本発明者らは、４匹の初代（ｆｏｕｎｄｅｒ）マウスを得、そして２つの独立した系統を、その導入遺伝子の適切な発現について試験し、そしてスクロースおよびサッカリンの味覚に関する行動的なレスキューをアッセイした（Ｆｕｌｌｅｒ、１９７４）。この導入遺伝子を欠く、年齢および性別の一致した同胞を、すべての実験においてコントロールとして使用した。図２ｂは、内因性Ｔ１Ｒ３レセプターを発現するすべての細胞が（そして、これらの細胞のみが）、この導入遺伝子を発現することを示す（同一の結果が、テイスターの遺伝的背景および非テイスターの遺伝的背景において得られた；データは示さず）。
【０１７８】
Ｔ１Ｒ３テイスター対立遺伝子がＳａｃ非テイスターの味覚欠損をレスキューするのであれば、そのサッカリンおよびスクロースの用量応答は、Ｓａｃテイスター動物において観察される感度を再現するようにシフトするはずである（Ｆｕｌｌｅｒ，１９７４；Ｂａｃｈｍａｎｏｖら，１９９７）。図２は、Ｔ１Ｒ３導入遺伝子が、Ｓａｃ非テイスターの味覚欠損を完全にレスキューすることを示す。導入遺伝子を有さない動物は、非テイスター１２９／Ｓｖコントロールマウスと識別不可能である（図２ｃおよびｄ、塗り潰されていない黒円）。対照的に、同じＳａｃ非テイスター背景を有するが導入遺伝子を発現する同胞は、ここで、テイスターＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスと等価となる（図２ｃおよびｄ、赤色トレース）。この導入遺伝子の存在は、他の味覚様相には影響を有さず（図２ｅ〜ｈ）、テイスター系統の甘味感受性も改変しなかった（データは示さず）。等価な結果が、２つの独立したトランスジェニック系統で得られた。これらの結果は、Ｓａｃ遺伝子座としてＴ１Ｒ３を確証付け、そしてＴ１Ｒ３が、甘味味覚レセプターとして機能し得ることを示唆する。
【０１７９】
（Ｔ１Ｒの発現）
近年、Ｔ１Ｒ３は、種々の味覚乳頭にある味覚レセプター細胞のサブセットにおいて発現されることが示された（Ｋｉｔａｇａｗａら，２００１；Ｍａｘら，２００１；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，２００１；Ｓａｉｎｚら，２００１）。しかし、報告された発現パターンの間にはかなりの矛盾が存在し、結果は、舌の前方で発現があるとしてもほとんど無いというもの（茸状乳頭；Ｓａｉｎｚら，２００１）から、すべての味蕾でかなり発現するというもの（Ｋｉｔａｇａｗａら，２００１）までに及ぶ。本発明者らは、有郭、葉状、茸状および口蓋の味蕾におけるＴ１Ｒ３の発現を試験し、そしてＴ１Ｒ３が、すべての型の味蕾から、約３０％の細胞において発現されることを見出した（図３；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，２００１もまた参照のこと）。この局所解剖学的な発現パターンは、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２の発現の凝集と密接に近似し（図３、Ｈｏｏｎら、１９９９）、そしてＴ１Ｒ１とＴ１Ｒ３との、および、Ｔ１Ｒ２とＴ１Ｒ３との、共発現の可能性を示唆する。有郭乳頭（Ｍａｘら，２００１；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，２００１）および葉状乳頭（Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，２００１）におけるＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の共発現が近年、ＲＴ−ＰＣＲおよびインサイチュハイブリダイゼーションによって試験されたが、異なるクラスの味蕾における３つすべてのＴ１Ｒに関する包括的な研究は欠如していた。従って、本発明者らは、二色蛍光性インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、二重標識化実験を実施した。本発明者らの結果は、Ｔ１Ｒ３が、すべての有郭、葉状および口蓋の味蕾においてＴ１Ｒ２と共発現され、すべてのＴ１Ｒ２ポジティブ細胞がＴ１Ｒ３も発現することを実証した（図４）。同様に、Ｔ１Ｒ１は、茸状および口蓋の味覚レセプター細胞においてＴ１Ｒ３と共発現される。しかし、茸状および口蓋の味蕾には、Ｔ１Ｒ３が重複せずに発現する細胞の画分が存在する。従って、本発明者らは、そのＴ１Ｒ発現プロフィールに基づいて、主要な３つのクラスの細胞型を規定し得る：Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３（Ｔ１Ｒ１＋３）、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３（Ｔ１Ｒ２＋３）、およびＴ１Ｒ３。
【０１８０】
（Ｔ１Ｒは、機能的な甘味味覚レセプターをコードする）
Ｔ１Ｒが甘味レセプターをコードするということを証明するには、機能的な確証が必要である。形質膜に対するレセプターのトランスロケーションをモニターするために、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３に対する抗体を惹起し、そして、ネイティブおよびエピトープタグ化されたマウス、ヒトおよびラットのレセプターの、種々の組織培養細胞株における発現を試験した。本発明者らは、ラットのＴ１Ｒが効率的に発現されることを観察した；従って、本発明者らは、すべての異種発現の研究においてこのラット遺伝子を使用した。機能をアッセイするために、本発明者らは、Ｔ１Ｒを、Ｇα１６−ＧｚキメラおよびＧα１５（共に、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑおよびガストデューシン連結型レセプターをホスホリパーゼＣβに効率的に結合させる２つのＧタンパク質αサブユニット）と共に発現させた（ＯｆｆｅｒｍａｎｎｓおよびＳｉｍｏｎ、１９９５；Ｋｒａｕｔｗｕｒｓｔら、１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら、２０００；Ｍｏｄｙら、２０００）。この系において、レセプターの活性化は、細胞内カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの増加を導き、この増加は、ＦＵＲＡ−２カルシウム指示薬色素を使用して、単一細胞レベルでモニターされ得る（Ｔｓｉｅｎら、１９８５）。
【０１８１】
Ｔ１Ｒ３と、Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２との見かけ上の共発現に基づいて、本発明者らは、種々のラットＴ１Ｒを、単独および組み合わせ（共発現のために）において、無差別なＧα１５タンパク質およびＧα１６−Ｇｚタンパク質を発現するＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした。ＦＵＲＡ−２を細胞に負荷した後、本発明者らは、広範な甘味味物質（糖類、アミノ酸、および人工甘味料を含む）に対する応答についてアッセイした；本発明者らはまた、いくつかの苦味味物質を試験した（実験手順を参照のこと）。ラットＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を発現する細胞（Ｔ１Ｒ２＋３）は、スクロース、フルクトース、サッカリン（しかし、非甘味サッカリン誘導体であるＮ−メチル−サッカリンではない）、アセスルファーム−Ｋ、ズルチン、および２つの新規な強度に甘味の化合物（Ｎａｇａｒａｊａｎら、１９９６、グアニジノ酢酸１および２（ＧＡ−１およびＧＡ−２という）；図５および６ａ）を含む、甘味化合物のサブセットに強力に応答した。この応答は、レセプター依存性およびＧα依存性であった。なぜなら、これらの成分のいずれかを欠損する細胞は、非常に高濃度の味物質であっても、［Ｃａ２＋］ｉの変化を誘発しなかったからである（図５）。注目すべきことに、Ｔ１Ｒ２＋３の活性化は、極めて選択的である。他方で、このレセプターの組み合わせは、グルコース、ガラクトース、マルトースおよびアスパルテームを含む多数のモノサッカリドおよびジサッカリドならびに人工甘味料には応答しなかった（図６ａ）。他方、この応答は、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の両方の存在に依存し；いずれかのレセプター単独では、その生物学的に適切な作用範囲を極端に超える濃度であっても、これらの研究においてアッセイされたいかなる化合物にも応答しなかった（データは示さず）。これらの結果により、Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３が、同じ細胞において共発現される場合に、甘味味覚レセプターとして機能することが実証される。
【０１８２】
ポリペプチドの結合またはヘテロマー化が、機能的なＴ１Ｒレセプターの形成に必要とされるという証拠が、ドミナントネガティブ性のＴ１Ｒの共発現によって得られた。Ｃ末端の短縮化を有するＴ１Ｒ２レセプターを用いた、野生型Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３の共発現（Ｓａｌａｈｐｏｕｒら、２０００）は、Ｔ１Ｒ２＋３の応答をほぼ無効にした（８５％よりも大きな低下、データは示さず）。
【０１８３】
Ｔ１Ｒ２＋３の応答が、ネイティブの甘味レセプターの機能を反映するのであれば、本発明者らは、細胞ベースアッセイにおいて観察される感度閾値が、インビボにおけるこれらの甘味味物質の検出についての行動的閾値と対応するはずであると考えた。実際、図６ｂは、ＧＡ−２（インビボ閾値約２μＭ）、サッカリン（インビボ閾値約０．５ｍＭ）、アセスルファーム−Ｋ（インビボ閾値約０．５ｍＭ）およびスクロース（インビボ閾値約２０ｍＭ）に対する用量応答を示し、これは、細胞ベースの応答と、その生物学的閾値との間の良好な一致を実証する。苦味味物質または旨味刺激のパネルに対しては、いかなる応答も検出されなかった。
【０１８４】
甘味味覚応答を詳細に試験するために、Ｔ１Ｒ２＋３でトランスフェクトされた細胞を、微小灌流チャンバーに配置し、そして種々の条件下で試験溶液を灌流した。図６ｃは、甘味味物質に対する応答が、刺激物の適用に密接に追随することを示す（潜時は１秒未満）。予期されたように、味物質が取り除かれた場合、［Ｃａ２＋］ｉはベースラインに戻った。甘味化合物に対する延長した曝露（１０秒より長い）は、順応を生じた；［Ｃａ２＋］ｉの急速な増加に続いて、静止レベルへの迅速ではあるが不完全な低下。同様に、この味物質の連続的な適用は、脱感作化（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚら，１９９２）を示す有意な応答の減少を導いたが、静止状態の期間延長（５分間より長い）が、完全な応答の回復に必要とされた。予期されたように、Ｔ１Ｒ２＋３が、種々の甘味化合物（すなわち、ＧＡ−２、スクロースおよびアセスルファーム−Ｋ）に対する応答を媒介する場合、このパネルからの異なる味物質の連続的な適用は、完全な交差脱感作化へと導いた（図６ｃ）が、このレセプター複合体を活性化しなかった甘味味物質（例えば、グルコースおよびシクラミン酸塩）は、応答の動態、振幅または時間経過に対して全く影響を有さなかった。まとめると、これらの結果は、甘味味覚レセプターとしてのＴ１Ｒ２＋３を確証付ける。
【０１８５】
本発明者らは、すべてのＴ１Ｒが、甘味レセプターをコードすることを提唱する；第１に、これらはすべて、同じレセプターファミリーのメンバーである。第２に、Ｔ１Ｒ１、Ｔ１Ｒ２、およびＴ１Ｒ３は、別々のサブセットの細胞において密接に共発現される。第３に、本明細書に提示されるデータは、３つのＴ１Ｒのうちの２つが組み合わされて、確証付けられた甘味レセプターとして機能することを実証している。
【０１８６】
（Ｔ１ＲおよびＴ２Ｒの発現に関する空間的マップ）
他の味覚様相と絡めたＴ１Ｒの発現の研究によって、末梢における甘味味覚のコード化の提示に関する見解が与えられ得る。近年、本発明者らは、苦味味覚レセプターのＴ２Ｒファミリーのメンバーが、茸状味蕾において稀に発現されるが、有郭、葉状および口蓋のすべての味蕾の細胞では１５〜２０％で存在することを示した。Ｔ１Ｒもまた同じ味蕾において発現されることを考慮し、本発明者らは、Ｔ１Ｒを発現する細胞とＴ２Ｒを発現する細胞との間に重複が存在するか否かを試験した。Ｔ１ＲプローブおよびＴ２Ｒプローブの混合物を使用した二重標識化実験によって、Ｔ２Ｒが、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーのいずれとも共発現しないことが示された（図７、Ａｄｌｅｒら、２０００もまた参照のこと）。これは、すべての味蕾において観察され、そして２０個もの多いＴ２Ｒを含んだ混合物を用いて観察された。これらの２つのレセプターファミリーの発現プロフィールにおける強度の分離は、甘味および苦味が、異なる細胞型の活性化によってコードされるという、味蕾レベルでの味覚のコード化および識別の論理に関する重要な予測を築き上げた。
【０１８７】
この研究の予測は、すべての味覚乳頭中の味蕾が甘味レセプター細胞を含み、そして口腔における甘味感受性の解剖学的な提示が、Ｔ１Ｒレセプターの発現の局所解剖学的な分布と一致するはずであるというものである。例えば、舌および口蓋の背面は、Ｔ１Ｒ２＋３発現細胞のすべてを含み、そしてそのようにしてそれらは、このレセプターの組み合わせのリガンドに対して高い感受性を示す。逆に、舌の前面は、Ｔ１Ｒ１＋３の組み合わせに対して応答するが、Ｔ１Ｒ２＋３に特異的なレパートリーに対する応答は貧弱である。さらに、舌の前面および背面は、異なる神経節に由来する神経によって神経支配されているので（ＭｉｓｔｒｅｔｔａおよびＨｉｌｌ、１９９５）、本発明者らは、Ｔ１Ｒ２＋３甘味細胞が、Ｔ１Ｒ１＋３細胞の接続経路とは異なる接続経路を示すに違いないと結論付けた。興味深いことに、ラットは、舌の前面の刺激に対してよりも、舌および口蓋の背面に適用されたスクロースに対してより感受性が高いことが公知である（ＳｍｉｔｈおよびＦｒａｎｋ、１９９３）。本発明者らの発現および機能に関する研究は、ここに、これらの知見に対する分子的な説明を与える。
【０１８８】
（方法）
（Ｔ１Ｒ３の分子クローニング）
ヒトＴ１Ｒ３を、Ｔ１Ｒ１に対する相同性によって、ＢＡＣクローンＲＰ５−８９０Ｏ３のドラフト配列において同定した。ラットＴ１Ｒ３のフラグメントを、このヒト配列に基づいて設計された縮重ＰＣＲプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲにより導き出されたプローブを使用して、有郭ｃＤＮＡライブラリーから、全長ラットＴ１Ｒ３を同定し（Ｈｏｏｎら、１９９９）、そしてマウスのＢＡＣフィルターアレイ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を探索した。Ｓａｃテイスターマウス系統および非テイスターマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６および１２９／Ｓｖ）のＴ１Ｒ３の配列を、ゲノムクローンから決定した。甘味感受性である他のマウス系統（ＳＷＲ，ＳＴ，Ｃ５７Ｌ，ＦＶＢ／Ｎ）および甘味非感受性である他のマウス系統（ＤＢＡ／ｌＬａｃ，ＤＢＡ／２，Ｃ３Ｈ，ＡＫＲ，ＢＡＬＢ／ｃ）の遺伝子のコード領域全体の配列を、増幅されたゲノムＤＮＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から決定した。ＳＷＲマウスについて、Ｔ１Ｒ３はまた、増幅された味覚組織ｃＤＮＡからも配列決定された。１１の近交系系統のなかで、本発明者らは、２つのテイスター対立遺伝子（テイスター１：Ｃ５７ＢＬ／６，Ｃ５７Ｌ，およびテイスター２：ＳＷＲ，ＳＴ，ＦＶＢ／Ｎ）、および１つの非テイスター対立遺伝子（ＤＢＡ／ｌＬａｃ，ＤＢＡ／２，Ｃ３Ｈ，ＡＫＲ，ＢＡＬＢ／ｃ，１２９／Ｓｖ）を見出した。テイスター１対立遺伝子およびテイスター２対立遺伝子は、６つのアミノ酸位置（Ｐ６１Ｌ、Ｃ２６１Ｒ、Ｒ３７１Ｑ、Ｓ６９２Ｌ、Ｉ７０６Ｔ、Ｇ８５５Ｅ；このうちの１つであるＧ８５５Ｅは、（Ｋｉｔａｇａｗａら、２００１；Ｍａｘら、２００１）では見逃された。これはおそらく、彼らの増幅反応に使用されたプライマー中にそれが含まれていたことに起因する）で、互いと異なる。非テイスターは、６つの残基（Ａ５５Ｔ、Ｔ６０Ｉ、Ｌ６１Ｐ、Ｑ３７１Ｒ、Ｔ７０６Ｉ、Ｅ８５５Ｇ）でテイスター１対立遺伝子と異なり、そして４つのアミノ酸残基（Ａ５５Ｔ、Ｔ６０Ｉ、Ｒ２６１Ｃ、Ｌ６９２Ｓ）でテイスター２と異なる。
【０１８９】
マウスＴ１Ｒを、マウス／ハムスター放射線ハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を使用してマッピングした。Ｔ１Ｒ３の物理的マッピングは、ＳＴＳ−マーカーの存在に関するＴ１Ｒ３ポジティブＢＡＣクローンのＰＣＲベースのタイピングを含んだ。
【０１９０】
（インサイチュハイブリダイゼーション）
組織を、成体マウスから得た。発現パターンの性別特異的な差異は観察されなかった。従って、雄性動物および雌性動物を、交換可能に使用した。葉状切片について、乳頭間で発現パターンの差異は観察されなかった。新鮮凍結切片（１６μｍ／切片）を、シラン処理したスライドに取り付け、そして以前に記載されたように（Ｈｏｏｎら、１９９９）、インサイチュハイブリダイゼーションのために調製した。すべてのインサイチュハイブリダイゼーションを、高ストリンジェンシー（ハイブリダイゼーション、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、６５〜７２℃；洗浄、０．２×ＳＳＣ、７２℃）で行った。単一標識検出のために、シグナルを、ジゴキシゲニンに対するアルカリホスファターゼ結合体化抗体および標準的な発色基質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、顕色化した。センスプローブを用いたコントロールハイブリダイゼーションは、すべての味覚乳頭で、特異的なシグナルを生成しなかった。細胞を、以前に記載されたようにして（Ｂｏｕｇｈｔｅｒら，１９９７）、その核の位置に基づいてカウントした。二重標識蛍光性検出のために、プローブを、フルオレセインまたはジゴキシゲニンのいずれかで標識した。少なくとも３つの異なる動物由来の少なくとも５０個の味蕾を、任意のプローブの組み合わせで分析した。アルカリホスファターゼ結合体化抗フルオレセイン抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ジゴキシゲニン抗体を、ファストレッド（ｆａｓｔ−ｒｅｄ）およびチラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）の蛍光発生基質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍおよびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）と組み合わせて使用した。共焦点画像を、アルゴン−クリプトンレーザーを使用して、Ｌｅｉｃａ  ＴＳＣ共焦点顕微鏡により得た；１〜２μｍの光学切片を記録し、すべての重複シグナルが単一の細胞に由来することを確実にした。
【０１９１】
（Ｔ１Ｒ３トランスジェニックマウスの作製および行動アッセイ）
Ｔ１Ｒ３の６つのコードエキソンおよび開始ＡＴＧの上流の約１２ｋｂを含む約１５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを、Ｃ５７ＢＬ／６  ＢＡＣクローンから単離した。このフラグメントは、Ｔ１Ｒ３コード配列の停止コドンを含むが、３’−ＵＴＲの大半を欠失する。１５ｋｂクローンの全体の配列を、テイスター系統および非テイスター系統から決定した。このフラグメントはまた、Ｔ１Ｒ３の約３ｋｂ上流に糖脂質トランスフェラーゼ様の遺伝子についての全長配列を含むが、Ｓａｃテイスター（ＳＷＲ）系統間または非テイスター（１２９／Ｓｖ）系統間で、この遺伝子には、発現上の差異もアミノ酸配列上の差異も存在しない。導入遺伝子構築物において、ｐＣＤＮＡ３．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ）シグナルを、Ｔ１Ｒ３遺伝子の３’末端に連結した。この改変により、マウスのＰＣＲに基づく遺伝子型決定が可能となり、そして導入遺伝子由来のＴ１Ｒ３の発現と、通常の遺伝子由来の発現とを直接的に比較することが可能になる。トランスジェニックマウスを、ＦＶＢ／Ｎ卵母細胞の前核注入によって作製した。本発明者らは、ＦＶＢ／Ｎマウスが甘味味物質に感受性でありかつＴ１Ｒ３テイスター対立遺伝子を有することを決定したので、トランスジェニック初代動物を、１２９／ＳｖＪと交雑した。次いで、この導入遺伝子を有するＦ１マウスを、１２９／ＳｖＪに戻し交雑した。Ｆ２マウスを、ＢＧＨタグを使用して、導入遺伝子の存在についてタイピングし、そして、ＦＶＢ／Ｎと１２９／ＳｖＪとの間のＢｓｐ１２０Ｉ制限多型性を使用して、内因性の非テイスターＴ１Ｒ３対立遺伝子のホモ接合性についてタイピングした（図２ａを参照のこと）。４つすべての遺伝子群を、行動について試験した。マウスを３週間目に離乳させ、そして、試験を開始する前に、２本の水のボトルから飲むことに対して、７〜１０日間訓練した。
【０１９２】
行動アッセイのために、１ケージあたり２匹または３匹のマウスを飼育し；異なるトランスジェニック初代動物に由来する（ならびに雄性および雌性の）マウスを、別々に配置して、生データの比較を可能にした。アッセイに使用された群のサイズは、４以上のケージからなり、各々が最少で２匹の動物を有した。マウスは常に、まず低い濃度でアッセイされた（Ｆｕｌｌｅｒ、１９７４）。すべての場合において、動物には、濃度シリーズの間に、少なくとも２日間の水を与えられた。各試験は、４８時間の期間にわたる２本のボトルの選択アッセイからなり；ボトルの提供を２４時間後に切り替えた。嗜好の比率を、総摂取量で試験溶液の消費量を除算することによって算出した。各ケージからのデータを個別に分析して、系統的な偏りを回避した。同じアッセイを使用して、１２９／Ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６およびＦＶＢ／Ｎコントロールマウスの味覚嗜好を分析した。
【０１９３】
（Ｔ１Ｒの異種発現）
すべてのレセプターを、ｐＥＡＫ１０哺乳動物発現ベクター（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＤ）にクローン化した。改変されたＨＥＫ−２９３細胞（ＰＥＡＫｒａｐｉｄ細胞；Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，ＭＤ）を、５％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌ硫酸ゲンタマイシン（Ｆｉｓｈｅｒ）、１μｇ／ｍｌアンホテリシンＢおよび２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ  Ｉ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充されたＵｌｔｒａ  Ｃｕｌｔｕｒｅ培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）において、３７℃にて増殖および維持した。トランスフェクションのために、細胞を、マトリゲルコーティングされた６ウェル培養プレート、２４ウェル培養プレートまたは３５ｍｍ記録チャンバーに播種した。３７℃で２４時間後に、細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において洗浄し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション効率を、ＧＦＰリポータープラスミドの同時トランスフェクションによって概算した。トランスフェクション効率は、代表的に、７０％より高かった。活性アッセイを、２４ウェル培養プレートおよび３５ｍｍ記録チャンバーにおいてトランスフェクトされた細胞について、トランスフェクションから３６〜４８時間後に実施した；６ウェル培養プレートにおいてトランスフェクトされた細胞は、一晩増殖され、トリプシン処理され、９６ウェル培養プレートに移され、そして再播種から３６〜４８時間後にアッセイされた。
【０１９４】
（カルシウム画像化）
トランスフェクトされた細胞を、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（アッセイ緩衝液）を含むハンクス平衡塩溶液中で一旦洗浄し、そして室温で１時間にわたり２μＭ  ＦＵＲＡ−２  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を負荷した。負荷溶液を取り除き、そして２４ウェルプレートの細胞を、１時間にわたり、２５０μｌのアッセイ緩衝液と共に培養し（９６ウェルプレートの細胞は、５０μｌと共に培養された）、ＡＭエステルの切断を可能にした。２４ウェル組織培養プレートにおいてＴ１ＲおよびＧタンパク質（ＯｆｆｅｒｍａｎｎｓおよびＳｉｍｏｎ，１９９５；Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒら，２０００；Ｍｏｄｙら，２０００）を発現する細胞を、２５０μｌの２×味物質溶液で刺激した（９６ウェルプレートの細胞は、５０μｌの２×味物質溶液で刺激された）。Ｇα１５およびＧα１６−Ｇｚシグナル伝達についてのコントロールとして、１セットのプレートを、ｍＧｌｕＲ１およびμ−オピオイドレセプターで同時トランスフェクトし、そしてＡＣＰＤおよびＤＡＭＧＯに対する応答についてアッセイした。
【０１９５】
２つの画像化ステーションのうちの１つを使用して、［Ｃａ２＋］ｉの変化を測定した。１つのシステムは、１０×／０．５ｆｌｕｏｒ対物レンズ、ＴＩＬＬ画像化システム（Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ）および冷却ＣＣＤカメラを備えたＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ  ２００顕微鏡を備える。これらの蛍光画像の取得および分析は、ＴＩＬＬ−Ｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用した。また、１０×／０．５ｆｌｕｏｒ対物レンズ、可変フィルターホイール（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）および増感ＣＣＤカメラ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０／ＦＬＡ顕微鏡を利用した。ＶｉｄｅｏＰｒｏｂｅソフトウェア（Ｉｎｓｔｒｕｔｅｃｈ）を、これらの蛍光画像の取得および分析のために使用した。一般的に、個々の応答は、６０秒間測定された。Ｆ３４０／Ｆ３８０比を分析して、［Ｃａ２＋］ｉを測定した。
【０１９６】
活性化および脱活性化の動態を、浴灌流システムを使用して測定した。細胞を、１５０μｌ微小灌流チャンバーに播種し、そして試験溶液を、ｐｉｃｏｓｐｒｉｔｚｅｒ装置（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖａｌｖｅ，Ｉｎｃ．）を用いて圧力駆出した。流速を、４秒間で浴溶液が完全に交換されることを確実にするように調整した。応答を、８０個の個別の応答細胞から測定した。
【０１９７】
（味物質の一覧表）
以下の味物質を、以下の代表的な最大濃度で用いて、試験した：スクロース（２５０ｍＭ）、サッカリンナトリウム（２５ｍＭ）、Ｎ−メチルサッカリン（５ｍＭ）、ズルチン（２ｍＭ）、アスパルテーム（２ｍＭ）、パラチノース（２５０ｍＭ）、シクラミン酸ナトリウム（１５ｍＭ）、グアニジノ酢酸−１（１ｍＭ）、グアニジノ酢酸−２（１ｍＭ）、グアニジノ酢酸−３（１ｍＭ）、アセスルファーム−Ｋ（１０ｍＭ）、グルコース（２５０ｍＭ）、マルトース（２５０ｍＭ）、ラクトース（２５０ｍＭ）、フルクトース（２５０ｍＭ）、ガラクトース（２５０ｍＭ）、キシリトール（２５０ｍＭ）、ラフィノース（２５０ｍＭ）、ソルビトール（２５０ｍＭ）、トレハロース（２５０ｍＭ）、タウマチン（０．１％）、モネリン（０．１％）、アラニン（２０ｍＭ）、グリシン（２０ｍＭ）、アルギニン（２０ｍＭ）、グルタミン酸一ナトリウム（２０ｍＭ）、シクロヘキシミド（５μＭ）、デナトニウム（１０ｍＭ）、フェニル−チオカルバミド（２．５ｍＭ）。
【０１９８】
（実施例２：Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３は、ヘテロマー性のアミノ酸味覚レセプターを形成する）
（結果）
Ｔ１Ｒ味覚レセプターは、アミノ酸のグルタミン酸塩（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：５９７−６０３（１９９２））（向代謝性グルタミン酸塩レセプター，ｍＧｌｕＲ）、ＧＡＢＡ（Ｋａｕｐｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３８６：２３９−２４６（１９９７））（γ−アミノ酪酸；ＧＡＢＡ−Ｂレセプター）およびアルギニン（Ｓｐｅｃａら，Ｎｅｕｒｏｎ，２３：４８７−４９８（１９９９））（Ｒ５−２４レセプター）と別々に関連付けられるので、本発明者らは、Ｔ１Ｒファミリーのメンバーを試験することから始めた。Ｔ１Ｒの発現パターンは、少なくとも３つの異なる細胞型を規定する：Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を共発現する細胞（Ｔ１Ｒ２＋３、甘味レセプター）、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３を共発現する細胞（例えば、Ｔ１Ｒ１＋３）、およびＴ１Ｒ３のみを発現する細胞（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，１０６：３８１−３９０（２００１））。まず、本発明者らは、２０種すべての標準的なアミノ酸および種々のＤ−アミノ酸に対するＴ１Ｒ２＋３甘味味覚レセプターの応答をアッセイした。ヒトに甘味の味がし、そしてマウスに誘因性であるいくつかのＤ−アミノ酸は、Ｔ１Ｒ２＋３甘味味覚レセプターの強力な活性化を誘発する（図１ａ、ｂ）。しかし、試験されたＬ−アミノ酸はいずれも、このレセプターを活性化しない。
【０１９９】
マウスＴ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３を、単独または組み合わせにおいてトランスフェクトし、そしてＬ−アミノ酸による刺激について試験した。個々のレセプターは全く応答を示さなかった。対照的に、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３は組み合わされて、広範に調整されるＬ−アミノ酸レセプターとして機能し、甘味として感知されるアミノ酸（例えば、アラニン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびグリシン（Ｉｗａｓａｋｉら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．，３４：５３１−５４２（１９８５））の大半がＴ１Ｒ１＋３を活性化する（図１）。この応答は、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３の組み合わされた存在に厳密に依存しており、そしてＬ−アミノ酸に対して高度に選択的である；Ｄ−アミノ酸ならびに他の天然甘味料および人工甘味料は、Ｔ１Ｒ１＋３レセプターの組み合わせを活性化しなかった。これらの結果は、Ｔ１Ｒ１＋３をＬ−アミノ酸についてのレセプターとして立証し、そしてサブユニットの組み合わせ配置によってその選択性を急激に改変するヘテロマー性ＧＰＣＲレセプターの特筆すべき例を提供する。
【０２００】
Ｔ１Ｒ１＋３が、インビボにおいて主要なＬ−アミノ酸味覚センサーとして機能する場合、本発明者らは、その細胞ベースの行動が、インビボレセプターのいくつかの生理的機能をまとめることを予期し得る。ラットにおける神経記録は、Ｌ−アミノ酸に対する味覚応答が、イノシン一リン酸（ＩＭＰ）のようなプリンヌクレオチドによってかなり増強されることを示している（Ｙｏｓｈｉｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３６７：４５−５１（１９８６））。ＩＭＰの効果をアッセイするために、Ｔ１Ｒ１＋３レセプターの組み合わせを発現するＨＥＫ細胞を、ＩＭＰの存在下または非存在下において、アミノ酸で刺激した、実際に、ほぼすべてのＬ−アミノ酸に対するＴ１Ｒ１＋３応答は、低用量のＩＭＰによって劇的に増強された（図１および２ａ）；この効果は、０．１〜１０ｍＭの範囲にわたって増加した（図２ｂ）。しかし、ＩＭＰ単独では、本発明者らのアッセイにおいて試験された最高濃度でも応答を誘発せず、そしてこれは、Ｔ１Ｒ２＋３によって媒介される応答に対して効果を有さなかった（甘味料に対して、またはＬ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸に対してのいずれか；データは示さず）。
【０２０１】
Ｔ１Ｒ１＋３は、鼓索線維によって神経支配される茸状味蕾（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１））において顕著に発現される。従って、本発明者らは、ＩＭＰの存在下または非存在下において、種々のアミノ酸を用いて、舌の前面にあるマウス茸状乳頭を刺激し、そして鼓索線維からの味物質誘導性のスパイクを記録した。予期されたように、Ｌ−アミノ酸に対する神経応答は、ＩＭＰによって有意に増強された（Ｙｏｓｈｉｉら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．３６７：４５−５１（１９８６））（図３）。しかし、ＩＭＰは、Ｄ−アミノ酸に対する応答にも、非アミノ酸刺激物に対する応答にも有意な効果を有さなかった。
【０２０２】
甘味の味覚に関する遺伝的研究により、マウスにおいて、種々の甘味物質に対する応答に影響を与える単一の主要な遺伝子座が同定されている（Ｓａｃ遺伝子座（Ｆｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈｅｒｅｄ．６５，３３−３６（１９７４）；Ｌｕｓｈ，Ｇｅｎｅｔ．Ｒｅｓ．５３：９５−９９（１９８９）））。Ｓａｃ「テイスター」マウスは、Ｓａｃ非テイスターよりも、スクロース、サッカリンおよび他の甘味料に対して約５倍高感度である。Ｓａｃは、Ｔ１Ｒ３（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）；Ｋｉｔａｇａｗａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｕｍｍｕｎ．２８３：２３６−２４２（２００１）；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：４９２−４９８（２００１）；Ｍａｘら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２８：５８−６３（２００１）；Ｓａｉｎｚら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：８９６−９０３（２００１）；Ｂａｃｈｍａｎｏｖら，Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ，２６：９２５−９３３（２００１））をコードする。テイスター対立遺伝子および非テイスター対立遺伝子を規定する２つのアミノ酸差異が存在する（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：４９２−４９８（２００１）；Ｍａｘら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２８：５８−６３（２００１））。これらの変化の１つであるＩ６０Ｔは、レセプターのダイマー化を回避することによってレセプターの機能を排除することが提唱された潜在的なグリコシル化部位を導入する（Ｍａｘら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２８：５８−６３（２００１））。これは謎を提起する。なぜなら、Ｌ−アミノ酸に対する応答は、Ｓａｃ遺伝子座によって影響を受けないからである（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）；Ｂａｃｈｍａｎｏｖら，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３０：９３５５−９４１５（２０００））。従って、Ｔ１Ｒ３が、甘味レセプターおよびアミノ酸レセプターの共通のパートナーとして機能するならば、本発明者らは、Ｔ１Ｒ３非テイスター対立遺伝子は、Ｔ１Ｒ２＋３の組み合わせに選択的に影響を与えるはずであると考えた。
【０２０３】
本発明者らは、生化学的アッセイおよび機能的アッセイを使用して、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２に対するＳａｃ非テイスター対立遺伝子の効果を試験した。最初に、本発明者らは、共免疫沈降する示差的にタグ化されたＴ１Ｒレセプターによって、レセプターのヘテロマー化を試験した。要するに、ＨＥＫ細胞を、Ｔ１Ｒ３のテイスター対立遺伝子および非テイスター対立遺伝子と、血球凝集素（ＨＡ）タグ化Ｔ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２のいずれかとを同時トランスフェクトした。次いで、レセプター複合体を、抗ＨＡ抗体を使用して免疫沈降し、そして、Ｔ１Ｒ３との会合を、抗Ｔ１Ｒ３抗体を使用してアッセイした。他の結果により、Ｔ１Ｒ３の非テイスター形態が、そのテイスター対応物とほぼ同様に、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２とのヘテロマー性レセプターへとアセンブルすることが実証された（図４ａ）。これは、Ｓａｃ非テイスター動物の甘味味覚欠損が、ヘテロマー性レセプターにアセンブルできないことから生じるとする可能性に対して異論を唱える。第２に、本発明者らは、Ｔ１Ｒ３のテイスター対立遺伝子または非テイスター対立遺伝子のいずれかを有する、Ｔ１Ｒ２＋３（甘味）およびＴ１Ｒ１＋３（アミノ酸）レセプターの機能的応答を試験した。Ｔ１Ｒ３のテイスター対立遺伝子および非テイスター対立遺伝子は、Ｔ１Ｒ１と組み合わされた場合には、機能的に類似したレセプターを生成するが、Ｔ１Ｒ２と組み合わされた場合に、非テイスター形態は、有意に欠損した応答を示す（図４ｂ）。従って、Ｌ−アミノ酸に対する応答は、マウスにおいてＳａｃ遺伝子座によって影響を受けない。なぜなら、Ｓａｃは選択的に、Ｔ１Ｒ２＋３レセプターの組み合わせに影響を与えるからである。
【０２０４】
Ｔ１Ｒレセプターサブユニットの一方における多型性が、レセプター機能に示差的に影響を及ぼすという知見は、アミノ酸および甘味のレセプターにおける他の配列バリエーションが、味物質の感受性または選択性に有意に影響を及ぼし得ることを示唆する。例えば、ヒトは、げっ歯類が味わい得ない多数の人工甘味料（例えば、アスパルテーム、シクラミン酸塩、および種々の甘味タンパク質（Ｂａｃｈｍａｎｏｖら，Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ  ２６：９０５−９１３（２００１）））を味わい得る。げっ歯類のＴ１ＲとヒトのＴ１Ｒとは、わずかに約７０％同一である（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１））。従って、本発明者らは、ヒトおよびげっ歯類のＴ１Ｒサブユニットからなるヘテロマー性レセプターを作製し、そしてアミノ酸および人工甘味料による活性化についてアッセイした。実際に、ヒトのＴ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２の存在は、アミノ酸甘味レセプターの感受性（図４ｃ）および特異性（図４ｄ）を著しく改変した。ヒトＴ１Ｒ１を発現する細胞は、他のアミノ酸に対するよりもグルタミン酸塩に対して、一桁より大きく高感度であり、そしてヒトＴ１Ｒ２を発現する細胞は、アスパルテーム、シクラミン酸塩、および強度に甘味のタンパク質に対して強く応答する（図４ｄおよび不載データ）。従って、固有のパートナーの性質が、レセプター複合体が甘味レセプターとして機能するかアミノ酸レセプターとして機能するかを決定し、そして種間または種内におけるＴ１Ｒの配列差異（例えば、Ｓａｃにおける多型性）が、甘味の知覚に著しく影響し得る。
【０２０５】
ヒトにおいて、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）は、旨味と呼ばれる固有の風味の良い味覚感覚を誘発する（Ｉｋｅｄａ、Ｊ．Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３０：８２０−８３６（１９０９）；Ｋｕｒｉｈａｒａら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５５：３９３−３９７（１９９８））。旨味味覚の特質は、プリンヌクレオチドによるその増強およびｍＧｌｕＲ−アゴニストであるＬ−ＡＰ４による活性化である（Ｋｕｒｉｈａｒａら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５５：３９３−３９７（２０００））。ｍＧｌｕＲ４スプライス改変体が、候補旨味レセプターとして近年同定された（Ｃｈａｕｄｈａｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１１３−１１９（２０００））。本発明者の結果は、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ３が組み合わされて、広範に調整されるアミノ酸レセプターとして機能することを実証する。注目すべきことに、Ｔ１Ｒ１＋３は、Ｌ−ＡＰ４に応答し（図１）、ＭＳＧおよび他のアミノ酸は、プリンヌクレオチドによって著しく増強される。従って、本発明者らは、Ｔ１Ｒ１＋３が、旨味レセプターの構成要素であることを提案する。苦味、甘味、そしてここでアミノ酸の味覚レセプターの同定は、種々の味覚様相の間の相互作用の解明、および末梢（味覚レセプター細胞）での事象と中枢神経系（認知および行動）との間の関係の解明の助けとなる強力な土台を提供する。
【０２０６】
（方法）
（異種発現およびカルシウム画像化）
細胞を、全く以前に記載されたようにして（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１））、増殖し、維持し、そしてトランスフェクトした。トランスフェクション効率を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）リポータープラスミドでの同時トランスフェクションによって概算した。トランスフェクション効率は、代表的に、７０％より高かった。ＦＵＲＡ−２アセトメチルエステルを使用して、細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を測定し、そしてアッセイ条件は、以前に記載された条件（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１））と同一であった。応答を、６０秒間測定し、そして３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの波長における蛍光比（Ｆ３４０／Ｆ３８０）を使用して、［Ｃａ２＋］ｉを測定した。データ分析のために、応答は、約３００個のトランスフェクトされた細胞の視野において応答する細胞の数を言及する。細胞を、Ｆ３４０／Ｆ３８０が、味物質の添加後に０．２７より上に上昇した場合に、応答動物としてカウントした。一般に、応答する細胞の９０％より多くが、０．３５より高いＦ３４０／Ｆ３８０を有した。用量応答関数を、記号論理式を使用して当てはめた。Ｔ１Ｒ３のテイスター対立遺伝子および非テイスター対立遺伝子に関する研究は、それぞれ、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９／Ｓｖマウス由来のＴ１Ｒ３についての相補的ＤＮＡコードの構築物を使用した（Ｎｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）；Ｋｉｔａｇａｗａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｕｍｍｕｎ．２８３：２３６−２４２（２００１）；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：４９２−４９８（２００１）；Ｍａｘら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２８：５８−６３（２００１）；Ｓａｉｎｚら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：８９６−９０３（２００１）；Ｂａｃｈｍａｎｏｖら，Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ，２６：９２５−９３３（２００１））。
【０２０７】
（免疫沈降）
Ｔ１Ｒ３に対する抗体を、マウスレセプターの残基８２４〜８４５に対応するペプチドを用いて作製した。ＰＥＡＫｒａｐｉｄ細胞（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に、ＨＡ−Ｔ１Ｒ１、ＨＡ−Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を種々の組み合わせでトランスフェクトし、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウムおよびプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含有する緩衝液中に集め、そして破壊した。溶解産物を、一晩４℃で、マウスモノクローナル抗ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と共にインキュベートし、そして免疫複合体を、タンパク質ＡＧ−アガロースビーズを用いて収集した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ニトロセルロース膜に移し、そして抗Ｔ１Ｒ３抗体を用いて探索した。相互作用の特異性についてのコントロールとして、本発明者らは、Ｔ１Ｒ３を発現する細胞由来の抽出物と、タグ化されたＴ１Ｒ１またはＴ１Ｒ２を発現する細胞由来の抽出物を人為的に混合したものが、複合体を生成しないことを示した。同様に、Ｒｈｏ−タグ化されたｍＧｌｕＲ１レセプター（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：５９７−６０３（１９９２）の同時トランスフェクションは、Ｔ１Ｒ−ＧｌｕＲ１複合体を生じない。
【０２０８】
（神経記録）
舌の刺激および記録の手順を、以前に記載されたようにして（Ｄａｈｌら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７５６：２２−３４（１９９７））実施した。神経シグナルを、Ｇｒａｓｓ  Ｐ５１１  ＡＣ増幅器（Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ）を使用して増幅し（２，０００×）、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １２００Ｂ  Ａ／Ｄコンバーター（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してデジタル化し、そして０．５秒の時間定数で積分した（ｒ．ｍ．ｓ．電圧）。味覚刺激を、２０秒間の間隔（提示の間に、２分間のリンスにより中断される）に４ｍｌ／分間の一定流速で提示する。すべてのデータ分析は、刺激適用直後の２５秒間にわたる積分応答を使用した。各実験シリーズは、記録の安定性を保証するための０．１Ｍクエン酸の提示により一纏めにされる、６回の味物質の適用からなった。０．１Ｍクエン酸に対する応答平均を、各実験シリーズに対する応答を正規化するために使用した。
【０２０９】
本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示目的のみのためであること、そしてそれらに照らして、種々の改変または変更が当業者に示唆され、そして本願の意図および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書中で引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的のために、それらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図１．Ｓａｃ遺伝子座に対するＴ１Ｒ３のマッピング。（ａ）放射線ハイブリッドおよびＳＴＳマッピングは、３つすべてのＴ１Ｒ遺伝子を第４染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）の遠位端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）に位置づけた。Ｔ１Ｒ３遺伝子は、Ｓａｃ遺伝子区画内のＳＴＳマーカーであるＤ１８３４６（Ｋｉｔａｇａｗａら，２００１；Ｌｉら，２００１；Ｍａｘら，２００１；Ｍｏｎｔｍａｙｅｕｒら，２００１；Ｓａｉｎｚら，２００１）と密接に連鎖する。（ｂ）ヒト（ｈ）Ｔ１Ｒとマウス（ｍ）Ｔ１Ｒと関連レセプター（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，１９９２；Ｂｒｏｗｎら，１９９３；ＨｅｒｒａｄａおよびＤｕｌａｃ，１９９７；ＭａｔｓｕｎａｍｉおよびＢｕｃｋ，１９９７；ＲｙｂａおよびＴｉｒｉｎｄｅｌｌｉ，１９９７；Ｋａｕｐｍａｎｎら，１９９７；Ｈｏｏｎら，１９９９）との間における配列類似性を示す分岐図；マウスＶ２Ｒは、ヒト対応物を有さない。
【図２Ａ】図２．Ｔ１Ｒ３は、Ｓａｃをコードする。（ａ）Ｔ１Ｒ３遺伝子およびトランスジェニック構築物の構造を示す概略図。遺伝子型決定およびインサイチュハイブリダイゼーションのために使用される代替的な３’−ＵＴＲを、緑色および赤色で強調表示する。（ｂ）インサイチュハイブリダイゼーションによって、Ｔ１Ｒ３導入遺伝子（赤色）および内因性遺伝子（緑色）の発現パターンにおける完全な一致が示された。破線は、選択された味蕾の輪郭を示し；切片を、図３に示される平面に対して垂直に切り出した。（ｃ〜ｈ）コントロール動物およびトランスジェニック動物の味覚嗜好（塗り潰された赤色円）を、標準的な２ボトル嗜好試験を使用して測定した。サッカリンおよびスクロースに対するＴ１Ｒ３導入遺伝子発現マウスの行動的応答（パネルｃおよびｄ）は、コントロールテイスターマウス（Ｃ５７ＢＬ／６；塗り潰されていない赤色円）と識別不可能であった。導入遺伝子を有さない同胞（塗り潰された黒色円）は、１２９／Ｓｖ非テイスターコントロールマウス（塗り潰されていない黒色円）のように挙動した。苦味、塩味、酸味、および旨味の刺激に対する応答（パネルｅ〜ｈ）は、この導入遺伝子の存在によって影響を受けなかった。
【図２Ｂ】図２．Ｔ１Ｒ３は、Ｓａｃをコードする。（ａ）Ｔ１Ｒ３遺伝子およびトランスジェニック構築物の構造を示す概略図。遺伝子型決定およびインサイチュハイブリダイゼーションのために使用される代替的な３’−ＵＴＲを、緑色および赤色で強調表示する。（ｂ）インサイチュハイブリダイゼーションによって、Ｔ１Ｒ３導入遺伝子（赤色）および内因性遺伝子（緑色）の発現パターンにおける完全な一致が示された。破線は、選択された味蕾の輪郭を示し；切片を、図３に示される平面に対して垂直に切り出した。（ｃ〜ｈ）コントロール動物およびトランスジェニック動物の味覚嗜好（塗り潰された赤色円）を、標準的な２ボトル嗜好試験を使用して測定した。サッカリンおよびスクロースに対するＴ１Ｒ３導入遺伝子発現マウスの行動的応答（パネルｃおよびｄ）は、コントロールテイスターマウス（Ｃ５７ＢＬ／６；塗り潰されていない赤色円）と識別不可能であった。導入遺伝子を有さない同胞（塗り潰された黒色円）は、１２９／Ｓｖ非テイスターコントロールマウス（塗り潰されていない黒色円）のように挙動した。苦味、塩味、酸味、および旨味の刺激に対する応答（パネルｅ〜ｈ）は、この導入遺伝子の存在によって影響を受けなかった。
【図２Ｃ】図２．Ｔ１Ｒ３は、Ｓａｃをコードする。（ａ）Ｔ１Ｒ３遺伝子およびトランスジェニック構築物の構造を示す概略図。遺伝子型決定およびインサイチュハイブリダイゼーションのために使用される代替的な３’−ＵＴＲを、緑色および赤色で強調表示する。（ｂ）インサイチュハイブリダイゼーションによって、Ｔ１Ｒ３導入遺伝子（赤色）および内因性遺伝子（緑色）の発現パターンにおける完全な一致が示された。破線は、選択された味蕾の輪郭を示し；切片を、図３に示される平面に対して垂直に切り出した。（ｃ〜ｈ）コントロール動物およびトランスジェニック動物の味覚嗜好（塗り潰された赤色円）を、標準的な２ボトル嗜好試験を使用して測定した。サッカリンおよびスクロースに対するＴ１Ｒ３導入遺伝子発現マウスの行動的応答（パネルｃおよびｄ）は、コントロールテイスターマウス（Ｃ５７ＢＬ／６；塗り潰されていない赤色円）と識別不可能であった。導入遺伝子を有さない同胞（塗り潰された黒色円）は、１２９／Ｓｖ非テイスターコントロールマウス（塗り潰されていない黒色円）のように挙動した。苦味、塩味、酸味、および旨味の刺激に対する応答（パネルｅ〜ｈ）は、この導入遺伝子の存在によって影響を受けなかった。
【図３】図３．味覚レセプター細胞のサブセットにおけるＴ１Ｒの発現。ジゴキシゲニン標識化アンチセンスＲＮＡプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによって、Ｔ１Ｒ３が、マウスの味覚レセプター細胞のサブセットにおいて発現されることが示された（上段パネル）。茸状（ｆｕｎｇｉｆｏｒｍ）、有郭、葉状（ｆｏｌｉａｔｅ）および口蓋の味蕾における約３０％の細胞がＴ１Ｒ３を発現する。比較のために示された、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２で標識された切片は、類似しているが連続物ではない（中段および下段のパネル；Ｈｏｏｎら，１９９９および図４もまた参照のこと）。破線は、サンプル味蕾の輪郭を示す。Ｔ１Ｒ３の発現の選択性が、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２の発現の選択性と密接に類似していることに注目されたい。
【図４】図４．Ｔ１Ｒ発現パターンは、３つの細胞型を規定する。二重標識蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、Ｔ１Ｒの細胞発現における重複を直接的に試験した。２チャネル蛍光画像（１〜２μｍの光学切片）を、差異干渉対照画像（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｉｍａｇｅ）に重ね合わせた。（ａ）Ｔ１Ｒ１（赤色）およびＴ１Ｒ３（緑色）の共発現を示す茸状乳頭。Ｔ１Ｒ１を発現する細胞のうち少なくとも９０％が、Ｔ１Ｒ３も発現する；同様の結果が、口蓋において観察された。いくつかのＴ１Ｒ３ポジティブであるがＴ１Ｒ１ネガティブな細胞が存在することに注目されたい。（ｂ）Ｔ１Ｒ２（緑色）およびＴ１Ｒ３（赤色）の共発現を示す有郭乳頭。すべてのＴ１Ｒ２ポジティブな細胞がＴ１Ｒ３を発現する。
【図５】図５．Ｔ１Ｒ２＋３は、甘味の味物質に応答する。無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）なＧタンパク質ならびにラットのＴ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３を共発現するＨＥＫ−２９３細胞を、種々の甘味化合物により刺激した。［Ｃａ２＋］ｉにおける強い増加が、２５０ｍＭのスクロース（ｄ、ｇ）、１８０μＭのＧＡ−２（ｅ、ｈ）および１０ｍＭのアセスルファーム−Ｋ（ｆ、ｉ）の添加に際して観察された。パネルａ〜ｃは、刺激を受ける前の細胞を示す。レセプターなし（パネルｊ）または無差別なＧタンパク質（パネルｋ）では、応答は検出されなかった。グルコースおよびいくつかの他の甘味味物質（次の図面を参照のこと）は、このレセプターの組み合わせを活性化しなかった（パネルｌ）；スケールは、ＦＵＲＡ−２  Ｆ３４０／Ｆ３８０の比から決定される［Ｃａ２＋］ｉ（ｎＭ）を示す。トレース線（ｇ〜ｉ）は、パネル（ｄ〜ｆ）からの代表的な細胞についての［Ｃａ２＋］ｉ変化の動態を示す。バーは、刺激の時点および持続期間を示す。
【図６Ａ】図６．Ｔ１Ｒ２＋３は、広範な甘味化合物に選択的に応答する。（ａ）Ｔ１Ｒ２＋３のレセプターの組み合わせの応答は、スクロース、フルクトース、および５つの人工甘味料に特異的であった。以下の濃度を使用した：ＧＡ−１（５００μＭ）；ＧＡ−２（５００μＭ）；スクロース（２５０ｍＭ）；フルクトース（２５０ｍＭ）、アセスルファーム−Ｋ（１０ｍＭ）；ズルチン（２ｍＭ）、サッカリンナトリウム（５ｍＭ）；Ｎ−メチルサッカリン（５ｍＭ）、グルコース（２５０ｍＭ）；マルトース（２５０ｍＭ）；ラクトース（２５０ｍＭ）；ガラクトース（２５０ｍＭ）；パルチノース（２５０ｍＭ）；タウマチン（０．１％）；シクラミン酸ナトリウム（１５ｍＭ）；アスパルテーム（２ｍＭ）。カラムは、１６個の独立した定量の最低値の平均±ＳＥＭを示す。（ｂ）スクロース、サッカリン、アセスルファーム−ＫおよびＧＡ−２に対するＴ１Ｒ２＋３の用量応答。［Ｃａ２＋］ｉにおける相対的な変化を、各化合物の最高濃度について得られた応答に対して正規化されたＦＵＲＡ−２（Ｆ３４０／Ｆ３８０）の比として示す。各点は、２０個のアッセイの最低値の平均±ＳＥＭを示す。（ｃ）Ｔ１Ｒ２＋３の甘味応答の動態および脱感受性。Ｔ１Ｒ２＋３を発現する細胞を、甘味味物質の複数のパルスにより刺激した；ＧＡ−２（３６０μＭ）、スクロース（ｓｕｃ：２５０ｍＭ）、アセスルファーム−Ｋ（ａｃｅ：１０ｍＭ）、シクラミン酸塩（ｓｉｃ：１５ｍＭ）、グルコース（ｇｌｕ：２５０ｍＭ）およびアスパルテーム（ａｓｐ：２ｍＭ）。点および水平線は、刺激の時点および持続期間を示す。スクロース、ＧＡ−２およびアセスルファーム−Ｋは、強力な応答を誘発する；これらの味物質（例えば、ＧＡ−２）のいずれか１つによる反復刺激または延長刺激により、脱感受性を示す応答の減少が生じる。ＧＡ−２の直後にスクロースまたはアセスルファーム−Ｋで刺激することにより、弱められた応答が生じ、これは交差脱感受性を示唆する。トレースは、視野の中の８０個の応答細胞より導き出した。
【図６Ｂ】図６．Ｔ１Ｒ２＋３は、広範な甘味化合物に選択的に応答する。（ａ）Ｔ１Ｒ２＋３のレセプターの組み合わせの応答は、スクロース、フルクトース、および５つの人工甘味料に特異的であった。以下の濃度を使用した：ＧＡ−１（５００μＭ）；ＧＡ−２（５００μＭ）；スクロース（２５０ｍＭ）；フルクトース（２５０ｍＭ）、アセスルファーム−Ｋ（１０ｍＭ）；ズルチン（２ｍＭ）、サッカリンナトリウム（５ｍＭ）；Ｎ−メチルサッカリン（５ｍＭ）、グルコース（２５０ｍＭ）；マルトース（２５０ｍＭ）；ラクトース（２５０ｍＭ）；ガラクトース（２５０ｍＭ）；パルチノース（２５０ｍＭ）；タウマチン（０．１％）；シクラミン酸ナトリウム（１５ｍＭ）；アスパルテーム（２ｍＭ）。カラムは、１６個の独立した定量の最低値の平均±ＳＥＭを示す。（ｂ）スクロース、サッカリン、アセスルファーム−ＫおよびＧＡ−２に対するＴ１Ｒ２＋３の用量応答。［Ｃａ２＋］ｉにおける相対的な変化を、各化合物の最高濃度について得られた応答に対して正規化されたＦＵＲＡ−２（Ｆ３４０／Ｆ３８０）の比として示す。各点は、２０個のアッセイの最低値の平均±ＳＥＭを示す。（ｃ）Ｔ１Ｒ２＋３の甘味応答の動態および脱感受性。Ｔ１Ｒ２＋３を発現する細胞を、甘味味物質の複数のパルスにより刺激した；ＧＡ−２（３６０μＭ）、スクロース（ｓｕｃ：２５０ｍＭ）、アセスルファーム−Ｋ（ａｃｅ：１０ｍＭ）、シクラミン酸塩（ｓｉｃ：１５ｍＭ）、グルコース（ｇｌｕ：２５０ｍＭ）およびアスパルテーム（ａｓｐ：２ｍＭ）。点および水平線は、刺激の時点および持続期間を示す。スクロース、ＧＡ−２およびアセスルファーム−Ｋは、強力な応答を誘発する；これらの味物質（例えば、ＧＡ−２）のいずれか１つによる反復刺激または延長刺激により、脱感受性を示す応答の減少が生じる。ＧＡ−２の直後にスクロースまたはアセスルファーム−Ｋで刺激することにより、弱められた応答が生じ、これは交差脱感受性を示唆する。トレースは、視野の中の８０個の応答細胞より導き出した。
【図７】図７．Ｔ１ＲおよびＴ２Ｒは、味覚レセプター細胞の異なる集団に分離される。二重標識蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、甘味および苦味の味覚レセプターのＴ１ＲファミリーとＴ２Ｒファミリーとの間の重複程度を試験した。（ａ）Ｔ１Ｒ３（緑色）およびＴ２Ｒ（２０個のレセプターの混合物、赤色）は決して共発現しない。（ｂ）有郭乳頭を通る切片を、パネル（ａ）におけるように、（ｂ）に示すが、葉状乳頭では、３つすべてのＴ１Ｒの混合物（緑色）  対  ２０個のＴ２Ｒであった。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｃ：Ｔ１Ｒレセプターの組み合わせは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸に示差的に応答する。Ｔ１Ｒレセプターの組み合わせは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸に示差的に応答する。（ａ）：無差別なＧタンパクと、ヘテロマー性のマウスＴ１Ｒ２＋３レセプターまたはＴ１Ｒ１＋３レセプターとを共発現するＨＥＫ−２９３細胞を、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸で刺激した。Ｔ１Ｒ２＋３甘味味覚レセプターは、甘味の味がするＤ−アミノ酸により活性化されるが、Ｌ−アミノ酸によっては活性化されない（左側）。対照的に、Ｔ１Ｒ１＋３は、Ｌ−アミノ酸により活性化され、そして応答は、ＩＭＰにより増強される（右側）。アミノ酸は５０ｍＭであり、そしてＩＭＰは２．５ｍＭであった；色のスケールは、Ｆ３４０／Ｆ３８０比を示す（方法を参照のこと）。（ｂ）（ｃ）：Ｔ１Ｒ２＋３（ｂ）およびＴ１Ｒ１＋３（ｃ）についてのアミノ酸応答の定量。アミノ酸は５０ｍＭであり、そしてＩＭＰおよびＬ−ＡＰ４は２．５ｍＭであった；コントロールは、２．５ｍＭ  ＩＭＰ単独を指す。各カラムは、少なくとも１０個の独立した定量の平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。ＩＭＰは、Ｔ１Ｒ２＋３に対して効果を有さなかった（データは示さず）。Ｄ−アミノ酸（ＩＭＰの存在下におけるＤ−Ａｌａの例外を除く）および天然甘味料または人工甘味料は、Ｔ１Ｒ１＋３を活性化しなかった。Ｔｒｐは応答を誘発せず、そしてＴｙｒは、高濃度で不溶性であったのでアッセイされなかった。アキラルなアミノ酸Ｇｌｙが、両方のレセプター複合体を活性化することに注目されたい。すべてのカルシウム測定および定量を、方法およびＮｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）に記載のようにして実施した。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｃ：Ｔ１Ｒレセプターの組み合わせは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸に示差的に応答する。Ｔ１Ｒレセプターの組み合わせは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸に示差的に応答する。（ａ）：無差別なＧタンパクと、ヘテロマー性のマウスＴ１Ｒ２＋３レセプターまたはＴ１Ｒ１＋３レセプターとを共発現するＨＥＫ−２９３細胞を、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸で刺激した。Ｔ１Ｒ２＋３甘味味覚レセプターは、甘味の味がするＤ−アミノ酸により活性化されるが、Ｌ−アミノ酸によっては活性化されない（左側）。対照的に、Ｔ１Ｒ１＋３は、Ｌ−アミノ酸により活性化され、そして応答は、ＩＭＰにより増強される（右側）。アミノ酸は５０ｍＭであり、そしてＩＭＰは２．５ｍＭであった；色のスケールは、Ｆ３４０／Ｆ３８０比を示す（方法を参照のこと）。（ｂ）（ｃ）：Ｔ１Ｒ２＋３（ｂ）およびＴ１Ｒ１＋３（ｃ）についてのアミノ酸応答の定量。アミノ酸は５０ｍＭであり、そしてＩＭＰおよびＬ−ＡＰ４は２．５ｍＭであった；コントロールは、２．５ｍＭ  ＩＭＰ単独を指す。各カラムは、少なくとも１０個の独立した定量の平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。ＩＭＰは、Ｔ１Ｒ２＋３に対して効果を有さなかった（データは示さず）。Ｄ−アミノ酸（ＩＭＰの存在下におけるＤ−Ａｌａの例外を除く）および天然甘味料または人工甘味料は、Ｔ１Ｒ１＋３を活性化しなかった。Ｔｒｐは応答を誘発せず、そしてＴｙｒは、高濃度で不溶性であったのでアッセイされなかった。アキラルなアミノ酸Ｇｌｙが、両方のレセプター複合体を活性化することに注目されたい。すべてのカルシウム測定および定量を、方法およびＮｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）に記載のようにして実施した。
【図８Ｃ】図８Ａ〜Ｃ：Ｔ１Ｒレセプターの組み合わせは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸に示差的に応答する。Ｔ１Ｒレセプターの組み合わせは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸に示差的に応答する。（ａ）：無差別なＧタンパクと、ヘテロマー性のマウスＴ１Ｒ２＋３レセプターまたはＴ１Ｒ１＋３レセプターとを共発現するＨＥＫ−２９３細胞を、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸で刺激した。Ｔ１Ｒ２＋３甘味味覚レセプターは、甘味の味がするＤ−アミノ酸により活性化されるが、Ｌ−アミノ酸によっては活性化されない（左側）。対照的に、Ｔ１Ｒ１＋３は、Ｌ−アミノ酸により活性化され、そして応答は、ＩＭＰにより増強される（右側）。アミノ酸は５０ｍＭであり、そしてＩＭＰは２．５ｍＭであった；色のスケールは、Ｆ３４０／Ｆ３８０比を示す（方法を参照のこと）。（ｂ）（ｃ）：Ｔ１Ｒ２＋３（ｂ）およびＴ１Ｒ１＋３（ｃ）についてのアミノ酸応答の定量。アミノ酸は５０ｍＭであり、そしてＩＭＰおよびＬ−ＡＰ４は２．５ｍＭであった；コントロールは、２．５ｍＭ  ＩＭＰ単独を指す。各カラムは、少なくとも１０個の独立した定量の平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。ＩＭＰは、Ｔ１Ｒ２＋３に対して効果を有さなかった（データは示さず）。Ｄ−アミノ酸（ＩＭＰの存在下におけるＤ−Ａｌａの例外を除く）および天然甘味料または人工甘味料は、Ｔ１Ｒ１＋３を活性化しなかった。Ｔｒｐは応答を誘発せず、そしてＴｙｒは、高濃度で不溶性であったのでアッセイされなかった。アキラルなアミノ酸Ｇｌｙが、両方のレセプター複合体を活性化することに注目されたい。すべてのカルシウム測定および定量を、方法およびＮｅｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  １０６：３８１−３９０（２００１）に記載のようにして実施した。
【図９】図９Ａ〜Ｂ：Ｌ−アミノ酸およびＩＭＰに対するＴ１Ｒ１＋３の用量応答。（ａ）塗り潰されていない記号を有する破線は、Ｌ−アミノ酸によるＴ１Ｒ１＋３の用量応答を示す（四角、Ａｌａ；円、Ｇｌｕ；三角、Ｓｅｒ）。２．５ｍＭ  ＩＭＰの存在（塗り潰された記号を有する直線）により、少なくとも１桁の大きさだけ左側に応答がシフトする。等価な結果が、大半のＬ−アミノ酸で得られた（図１ｂもまた参照のこと）。（ｂ）：ＩＭＰは、Ｔ１Ｒ１＋３の応答を増強する。Ａｌａ（２ｍＭ、四角）、Ｇｌｕ（４ｍＭ、円）、Ｓｅｒ（２ｍＭ、三角）、Ｇｌｙ（４ｍＭ、菱形）およびＩＭＰ（逆三角）についての用量応答を示す。応答を、最高濃度での応答平均に対して正規化した。各点は、少なくとも１０個のアッセイの平均±ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂ：ＩＭＰは、マウスにおいて、アミノ酸に対する鼓索神経の応答を刺激する。ＩＭＰは、マウスにおいて、アミノ酸に対する鼓索神経の応答を刺激する。（ａ）：Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＡｌａ（それぞれ、３０ｍＭ）に対するＣ５７ＢＬ６マウスの統合的な神経応答を、０．５ｍＭのＩＭＰの存在下および非存在下において記録した。１００ｍＭクエン酸および０．５ｍＭ  ＩＭＰ単独に対する応答を、上段のトレースで示す。等価な結果が、大半のＬ−アミノ酸について得られた。（ｂ）：（ａ）において示される応答のような、統合的な神経応答を、１００ｍＭクエン酸の応答に対して正規化した。黒色のバー、味物質単独；灰色のバー、味物質＋０．５ｍＭ  ＩＭＰ。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝５）である。スクロースを、１００ｍＭで使用し、そして他のすべての味物質を３０ｍＭで使用した。アスタリスクは、統計的有意差（Ｐ＜０．０５）を示す。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄ：Ｔ１Ｒにおける多型性差異が、レセプターの機能に影響を与える。Ｔ１Ｒにおける多型的差異が、レセプターの機能に影響を与える。（ａ）免疫沈降およびウェスタンブロット分析によって、Ｔ１Ｒ３のＳａｃ非テイスター対立遺伝子およびテイスター遺伝子が、Ｔ１Ｒ１およびＴ１Ｒ２とヘテロマー性の複合体を形成することが示される。細胞を、示されるように、Ｔ１Ｒの組み合わせでトランスフェクトした。すべての抽出物を、抗ＨＡ抗体で免疫沈降し、そして生じたタンパク質複合体を抗Ｔ１Ｒ３抗体でプローブした。Ｍｒは、数千単位（Ｋ）での相対分子質量である。ｂ〜ｄは、細胞ベースのカルシウム画像化アッセイの結果である。（ｂ）：Ｓａｃ対立遺伝子は、Ｔ１Ｒ２＋３ヘテロマー性レセプターに選択的に影響を及ぼす。応答を、テイスター対立遺伝子（黒色のバー）で得られた応答平均に対して正規化した。甘味化合物に対するＴ１Ｒ２＋３の応答は、非テイスターＴ１Ｒ３対立遺伝子を使用する場合に有意に減少されたが、アミノ酸に対するＴ１Ｒ１＋３の応答は、ＩＭＰの存在下であっても、影響を受けなかった。（ｃ）：ヒトＴ１Ｒ１は、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウムに対する感受性に影響を及ぼす。低濃度のＭＳＧは、ヒトＴ１Ｒ１を含むレセプターを強力に活性化し（塗り潰されていない円）、そしてＩＭＰは、その応答を増強する（塗り潰された円）。Ａｌａ（四角）およびＳｅｒ（三角）についての用量応答もまた比較のために示す。各シリーズについて、応答を、最高濃度での応答平均に対して正規化した。（ｄ）：マウスＴ１Ｒ２＋３（黒色のバー）は、スクロースならびに他の天然甘味料および人工甘味料に応答するが、アスパルテームには応答しない。しかし、げっ歯類のＴ１Ｒ２＋３レセプターにおいてマウスＴ１Ｒ２の代わりにヒトＴ１Ｒ２で置換すると（灰色のバー）、アスパルテーム感受性が与えられる。
【図１２】図１２は、ｈＴ１Ｒ１のヌクレオチド配列（配列番号２６）を提供する。
【図１３】図１３は、ｈＴ１Ｒ１のアミノ酸配列（配列番号２７）を提供する。
【図１４Ａ】図１４は、ｈＴ１Ｒ２のヌクレオチド配列（配列番号２８）を提供する。
【図１４Ｂ】図１４は、ｈＴ１Ｒ２のヌクレオチド配列（配列番号２８）を提供する。
【図１５】図１５は、ｈＴ１Ｒ２のアミノ酸配列（配列番号９）を提供する。
【図１６】図１６は、ｈＴ１Ｒ３のヌクレオチド配列（配列番号２９）を提供する。
【図１７】図１７は、ｈＴ１Ｒ３のアミノ酸配列（配列番号３０）を提供する。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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