(57)【要約】ヒトＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子はｐ５３経路のモジュレーターとして同定されており、したがってこれらは欠陥ｐ５３機能に関連する疾患の治療上の標的である。ＬＲＲＣＡＰＳの活性を調節する作用剤を探すためにスクリーニングすることを含む、ｐ５３のモジュレーターを同定する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）精製したＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド又は核酸、あるいは機能的に活性のあるその断片又は誘導体を含むアッセイ系を提供するステップと、
（ｂ）試験剤が存在しない場合に系により対照活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させるステップと、
（ｃ）試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤を候補ｐ５３経路調節剤として同定するステップと
を含む、候補ｐ５３経路調節剤を同定する方法。
【請求項２】
アッセイ系がＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドを発現する培養細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養細胞がさらに欠陥ｐ５３機能を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アッセイ系がＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アッセイが結合アッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、及び低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アッセイ系がＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アッセイ系がＬＲＲＣＡＰＳ核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸モジュレーターがＰＭＯである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
（ｄ）（ｃ）で同定された候補ｐ５３経路調節剤を、ｐ５３機能に欠陥がある細胞を含むモデル系に投与し、ｐ５３機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
モデル系が欠陥ｐ５３機能を有するマウスモデルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｐ５３機能に欠陥がある細胞を、配列番号１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドと特異的に結合する候補モジュレーターと接触させることを含み、それによりｐ５３機能が修復される、細胞のｐ５３経路を調節する方法。
【請求項１４】
ｐ５３機能の欠陥に起因する疾病又は疾患を有することが事前に確定されている脊椎動物に候補モジュレーターを投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
候補モジュレーターが抗体及び小分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
（ｅ）ＬＲＲＣＡＰＳを発現している非ヒト動物又は培養細胞を含む二次アッセイ系を提供するステップと、
（ｆ）二次アッセイ系を（ｂ）の試験剤又はそれから誘導した作用剤と、試験剤又はそれから誘導した作用剤が存在しない場合に二次アッセイ系により対照活性がもたらされる条件下で接触させるステップと、
（ｇ）作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性を検出するステップと、
（ｈ）作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性と対照活性との差により試験剤又はそれから誘導した作用剤が候補ｐ５３経路調節剤であることが同定されるステップと、
（ｉ）第２アッセイが作用剤の影響を受けたｐ５３経路における変化を検出するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
非ヒト動物がｐ５３経路の遺伝子をミスエクスプレスする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物の細胞をＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド又は核酸と特異的に結合する作用剤と接触させることを含む、哺乳動物細胞内のｐ５３経路を調節する方法。
【請求項２１】
ｐ５３経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
作用剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、又は抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）患者から生体試料を得ること、
（ｂ）試料をＬＲＲＣＡＰＳ発現用のプローブと接触させること、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの結果を対照と比較すること、及び
（ｄ）ステップ（ｃ）が疾病の可能性を示しているかどうかを決定すること
を含む、患者の疾病を診断する方法。
【請求項２４】
前記疾病が癌である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌が、表２に＞２５％の発現レベルを有するとして示されている癌である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願への言及）
本出願は、２００１年１０月２２日出願の米国特許仮出願第６０／３３８，７３３号、２００２年２月１５日出願の米国特許仮出願第６０／３５７，６００、及び２００２年３月１日出願の米国特許仮出願第６０／３６１，１９６号の優先権を主張するものである。先行出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
ｐ５３遺伝子は、家族性及び自発性の癌を含めた５０種類を超える種類の異なるヒト癌にわたって変異しており、ヒト癌の中で最も広く変異した遺伝子であると考えられている（Zambetti及びLevine、FASEB、1993年、7:855〜865;Hollstein他、Nucleic Acids Res.、1994年、22:3551〜3555）。ｐ５３遺伝子中の変異のうち９０％を超えるものが、ｐ５３機能を不活性化させる、単一アミノ酸を変化させるミスセンス変異である。ヒトｐ５３の異常型は、予後不良、より活動性の高い腫瘍、転移、及び短期生存率に関連している（Mitsudomi他、Clin Cancer Res、2000年10月、6(10):4055〜63；Koshland、Science、1993年、262:1953）。
【０００３】
ヒトｐ５３タンパク質は通常、ＤＮＡ損傷、低酸素症、ヌクレオチド欠乏、及び発癌遺伝子活性化を含めたシグナルの中枢インテグレーター（central integrator）として機能する（Prives、Cell、1998年、95:5〜8）。これらのシグナルに応答して、ｐ５３タンパク質レベルが大きく上昇し、その結果、蓄積したｐ５３がこれらシグナルの性質及び強度に応じて細胞周期抑止又は細胞死を活性化させる。実際、複数系統の実験的証拠により、腫瘍抑制因子としてのｐ５３の主要な役割が指摘された（Levine、Cell、1997年、88:323〜331）。たとえば、ホモ接合性のｐ５３「ノックアウト」マウスでは、発生は正常であるが、生後１年のうちにほぼ１００％の新組織形成の発生率が示された（Donehower他、Nature、1992年、356:215〜221）。
【０００４】
正常細胞及び癌細胞内でｐ５３が機能する生化学的機構及び経路は完全には分かっていないが、ｐ５３機能の明らかに重要な一面は、遺伝子特異的な転写活性化因子としての活性である。既知のｐ５３応答エレメントを有する遺伝子の中には、ＧＡＤＤ４５、ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、サイクリンＧ、Ｂａｘ、ＩＧＦ−ＢＰ３、及びＭＤＭ２を含めた、細胞周期又は細胞死のいずれかの制御における役割がよく特徴づけられたものが、いくつか存在する（Levine、Cell、1997年、88:323〜331）。
【０００５】
ロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）は長さ２２〜２８残基の短いモチーフであり、様々な細胞質、膜、及び細胞外タンパク質に見られる（Rothberg, J.等, (1990) Genes Dev (12A):2169-87）。これらのタンパク質は多様な役割を果たすが、タンパク質−タンパク質の相互作用が最も一般的な特性である。ショウジョウバエＴｏｌｌタンパク質からの合成ＬＲＲのインビトロの研究は、拡張フィラメントを形成するβ−シート構造を取り入れることによりペプチドがゲルを形成することを示した。これらの結果は、ＬＲＲがタンパク質−タンパク質相互作用と細胞接着を媒介するという考えを支持するものである（Gay, N. (1991) FEBS Lett; 291(1):87-91）。ＬＲＲを含むタンパク質の他の機能には、酵素の結合（Tan, F.等, (1990) J Biol Chem; 256(1):13-9）、血管修復（Hickey, M. (1989) Proc Natl Acad Sci USA; 86(17):6773-7）、及び神経経路発見及びシナプス形成（Taniguchi H等 (2000) J Neurobiol 42:104-106）がある。１５ＬＲＲを含むタンパク質であるリボヌクレアーゼインヒビターの３次元構造が決定され、ＬＲＲがα／βフォールドの新規な分類であることが示された。ＬＲＲは細長い非球形の構造を形成し、多くの場合システインリッチドメインに隣接する。
【０００６】
Ｄ２Ｓ４４８はメラノーマ関連遺伝子及び腫瘍抗原であり、また場合によってはペルオキシダーゼであって、ｐ５３依存性のアポトーシス及び免疫反応に関与している場合がある。それはまた、癌予防接種の潜在的な原性ペプチドとしても期待される（Horikoshi, N.等, (1999) Biochem Biophys Res Commun; 261(3): 864-9）。
【０００７】
染色体１タンパク質上で増幅された神経膠腫（ＧＡＣ１）はロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）のスーパーファミリーのメンバーであり、シグナル伝達又は細胞接着に寄与する。この遺伝子の遺伝子増幅は、神経膠腫及び網膜芽細胞腫に見られる（Almeida, A.等, (1998) Oncogene 16:2997-3002）。ＧＡＣ１は１２の完全長ＬＲＲモチーフを含み、そのＬＲＲブロックはシステインリッチ配列と隣接している。ＧＡＣ１は、成人の脳と、それよりももっと低いレベルであるが成人の心臓及び腎臓に発現する（Almeida, A.等, (1998)、上掲）。
【０００８】
トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）は、進行の早くも９週目で全種類のトロホブラストにより発現されるもので、初めはモノクローナル抗体５Ｔ４により規定される細胞表面抗原として同定された。ＴＰＢＧは細胞接着及び運動性に寄与しており、転移、胎盤形成、及びトロホブラスト湿潤に関わっている可能性もある。胃癌及び大腸癌におけるＴＰＢＧの発現は、腫瘍転移及び予後の不良と関連している（Boyle, J.等, (1990) Hum. Genet 84:455-458）。ＴＰＢＧは複数の腫瘍細胞系に発現する（Myers, K.等, (1994) Biol. Chem. 269:9319-9324）。
【０００９】
ショウジョウバエなどモデル生物のゲノムを操作できると、顕著な進化的保存の数により複雑な脊椎動物との直接の関連性を有する生化学プロセスを分析する、強力な手段が提供される。遺伝子及び経路の保存レベルが高いこと、細胞プロセスの類似性が高いこと、ならびにこれらモデル生物と哺乳動物との間で遺伝子の機能が保存されていることにより、特定の経路における新規遺伝子の関与及びこのようなモデル生物中におけるその機能の同定は、哺乳動物中における相関経路及びこれらを調節する方法を理解するのに直接寄与することができる（たとえば、Mechler BM他、1985年、EMBO J、4:1551〜1557;Gateff E．、1982年、Adv.Cancer Res.、37:33〜74;Watson KL.他、1994年、J Cell Sci.、18:19〜33;Miklos GL及びRubin GM.、1996年、Cell、86:521〜529;Wassarman DA他、1995年、Curr Opin Gen Dev、5:44〜50;Booth DR.、1999年、Cancer Metastasis Rev.、18:261〜284参照）。たとえば、目に見える表現型がもたらされる遺伝子の過少発現（たとえばノックアウト）又は過剰発現（「遺伝的エントリーポイント（genetic entry point）」と呼ばれる）を有する脊椎モデル生物で、遺伝子スクリーニングを行うことができる。追加の遺伝子を、無作為に又は標的を定めた方式で変異させる。ある遺伝子の変異によって遺伝的エントリーポイントにより引き起こされた最初の表現型が変化する場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイントと同じ又は重複する経路に関与する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがｐ５３などの疾病経路に関係づけられているヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の魅力的な候補標的となり得るモディファイヤー遺伝子を同定することができる。
【００１０】
参照した特許、特許出願、公開公報、及びＧｅｎｂａｎｋ識別番号を含む本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【００１１】
（発明の概要）
本発明者らは、ショウジョウバエでｐ５３経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをＬＲＲＣＡＰＳ（カプリシャス関連ロイシンリッチリピート）と呼ぶ。本発明は、これらのｐ５３モディファイヤー遺伝子及びポリペプチドを利用して、欠陥又は不全ｐ５３機能及び／又はＬＲＲＣＡＰＳ機能に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるＬＲＲＣＡＰＳ調節剤を同定する方法を提供する。好ましいＬＲＲＣＡＰＳ調節剤（modulating agent）は、ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドに特異的に結合してｐ５３機能を修復する。他の好ましいＬＲＲＣＡＰＳ調節剤は、アンチセンスオリゴマーなど核酸モジュレーターや、たとえば対応する核酸（すなわちＤＮＡ又はｍＲＮＡ）に結合してそれを阻害することによってＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子発現又は生成物の活性を抑制するＲＮＡｉである。
【００１２】
ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤は、ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド又は核酸との分子相互作用のための任意の都合のよいin vitro又はin vivoのアッセイによって評価することができる。一実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド又は核酸を含むアッセイ系を用いて候補ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤を試験する。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる作用剤は、候補ｐ５３調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤には、ＬＲＲＣＡＰＳ関連タンパク質（たとえばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬）；ＬＲＲＣＡＰＳに特異的な抗体；ＬＲＲＣＡＰＳに特異的なアンチセンスオリゴマー及び他の核酸モジュレーター；ＬＲＲＣＡＰＳに特異的に結合するか、又はＬＲＲＣＡＰＳと相互作用するか、又はＬＲＲＣＡＰＳ結合パートナーと（例えばＬＲＲＣＡＰＳ結合パートナーに結合することにより）競合する化学剤が含まれる。特定の一実施形態では、結合アッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施形態では、スクリーニングアッセイは、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管形成アッセイ、及び低酸素誘発アッセイから選択される。
【００１３】
別の実施形態では、最初に同定した候補作用剤や最初の作用剤から誘導した作用剤によって生じた血管形成、細胞死、又は細胞増殖の変化など、ｐ５３経路における変化を検出する第２アッセイ系を使用して、候補ｐ５３経路調節剤をさらに試験する。第２アッセイ系には、培養細胞又は非ヒト動物を使用することができる。特定の実施形態では、この二次アッセイ系は、血管形成、細胞死、又は細胞増殖の疾患（たとえば癌）などｐ５３経路に関係づけられた疾病又は疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
【００１４】
本発明はさらに、哺乳動物細胞をＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド又は核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のＬＲＲＣＡＰＳ機能及び／又はｐ５３経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、又は抗体であってよく、ｐ５３経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【００１５】
（発明の詳細な記載）
翅中にｐ５３が過剰発現されていたショウジョウバエにおけるｐ５３経路のモディファイヤーを同定するために、遺伝子スクリーニングを設計し、遺伝子モディファイヤースクリーニングを実行した（Ollmann M他、Cell、2000年、101:91〜101）。ＣＡＰＳ遺伝子が、ｐ５３経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、これらモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ、好ましくはヒトのオルソログであるＬＲＲＣＡＰＳ（カプリシャス関連ロイシンリッチリピート）遺伝子（すなわち核酸及びポリペプチド）は、癌など欠陥ｐ５３シグナル伝達経路に関連する病状の治療における魅力的な薬剤標的である。
【００１６】
本発明では、ＬＲＲＣＡＰＳ機能を評価するin vitro及びin vivoの方法を提供する。ＬＲＲＣＡＰＳ又はその対応する結合パートナーの変調は、正常状態及び病態におけるｐ５３経路とそのメンバーとの関連性を理解し、ｐ５３に関連する病状の診断方法及び治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的又は間接的に、たとえば、結合活性などのＬＲＲＣＡＰＳ機能に影響を与えることにより、ＬＲＲＣＡＰＳの発現を阻害又は亢進することによって作用するＬＲＲＣＡＰＳ調節剤を同定することができる。ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤は、診断、治療、及び製薬の開発に有用である。
【００１７】
本発明の核酸及びポリペプチド
本発明で使用することができるＬＲＲＣＡＰＳ核酸及びポリペプチドに関連する配列は、核酸はＧＩ＃１８０７３０９７（配列番号１）、１６１５７５１０（配列番号３）、１４７５８１２５（配列番号４）、１４１４９９３１（配列番号５）、２０５４７３３５（配列番号７）、５４５３６５５（配列番号９）、３２５３２１２（配列番号１０）、２１７３４２１０（配列番号１２）、２１７０６５０５（配列番号１３）、１４７６４１９７（配列番号１４）、５７２９７１７（配列番号１５）、４３５６５４（配列番号１８）、ポリペプチドはＧＩ＃１１８７７２５７（配列番号１９）、１６１５７５１１（配列番号２０）、１４７５８１２６（配列番号２１）、５４５３６５６（配列番号２２）、１４７６４１９８（配列番号２３）、５７２９７１８（配列番号２４）として、Ｇｅｎｂａｎｋに開示されている（Ｇｅｎｂａｎｋ識別（ＧＩ）番号により参照）。これに加えて、配列番号２、６、８、１１、１６及び１７の核酸配列を本発明の方法に使用することができる。
【００１８】
用語「ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド」とは、完全長のＬＲＲＣＡＰＳタンパク質又はその機能的に活性のある断片又は誘導体を言う。「機能的に活性のある」ＬＲＲＣＡＰＳ断片又は誘導体は、抗原活性や免疫原性活性、酵素活性、天然の細胞基質に結合する能力など完全長の野生型ＬＲＲＣＡＰＳタンパク質に関連する機能活性を１つ又は複数示す。ＬＲＲＣＡＰＳタンパク質、誘導体及び断片の機能活性は、当業者に周知の様々な方法によって（Current Protocols in Protein Science、1998年、Coligan他編、John Wiley & Sons, Inc.、ニュージャージー州ソマーセット）また以下にさらに述べるようにアッセイすることができる。一実施形態では、機能的に活性のＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドは、細胞に基づくアッセイ又は動物アッセイなどにおいて、欠陥内因性ＬＲＲＣＡＰＳ活性を救助する能力を有するＬＲＲＣＡＰＳ誘導体である。救助誘導体は同一種由来のものでも異種由来のものでもよい。本発明の目的のために、機能的に活性のある断片には、レダクターゼドメインや結合ドメインなどＬＲＲＣＡＰＳの構造ドメインを１つ又は複数含む断片も含まれる。タンパク質ドメインは、ＰＦＡＭプログラムを使用して同定することができる（Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260）。たとえば、ＬＲＲ（ロイシンリッチリピート）のおおよそのアミノ酸の位置、及びＧＩ＃１１８７７２５７、１６１５７５１１、１４７５８１２６、５４５３６５６、１４７６４１９８、及び５７２９７１８（それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２、２３及び２４）のＬＲＲＣＡＰＳのＩＧドメインを、さらに実施例１の表１に列挙する。ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドを得る方法も、以下にさらに記載する。一部の実施形態では、好ましい断片は、機能的に活性のある、配列番号１９、２０、２１、２２、２３及び２４のいずれか１つ（ＬＲＲＣＡＰＳ）の少なくとも２５個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは７５個、最も好ましくは１００個の連続したアミノ酸を含むドメイン含有断片である。さらに好ましい実施形態では、この断片は機能的に活性のあるドメインの全体を含む。
【００１９】
用語「ＬＲＲＣＡＰＳ核酸」とは、ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子を言う。好ましくは、このＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド又は核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、ヒトＬＲＲＣＡＰＳと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するオルソログ又はその誘導体でもよい。オルソログの同定方法は当技術分野において既知である。通常、異なる種のオルソログは、１つ以上のタンパク質モチーフの存在及び／又は３次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイトシーケンスを使用し、ＢＬＡＳＴ分析のようなシーケンス相同分析により同定される。フォワードＢＬＡＳＴ結果のうち最も合致するシーケンスが、リバースＢＬＡＳＴの元のクエリシーケンスを取り出すのであれば、シーケンスを潜在的オルソログとして指定する（Huynen MA及びBork P, Proc Natl Acad Sci、1998年、95:5849-5856; Huynen MA他、Genome Research、2000年、10:1204-1210）。ＣＬＵＳＴＡＬ（Thompson JD他、1994年、Nucleic Acids Res 22:4673-4680）など、多重シーケンス整列のためのプログラムを使用して、オルソログのタンパク質の保存域及び／又は残基をハイライトし、系統樹を作成してもよい。多様種の多重相同シーケンス（例えばＢＬＡＳＴ分析により取り出されたもの）を表す系統樹において、２種のオルソログシーケンスは、それら２種のそれ以外の全シーケンスに対し、系統樹中最も接近して現われる。構造のスレッディング、又はタンパク質の折りたたみのその他分析法（例えばＰｒｏＣｅｒｙｏｎ（バイオサイエンス、オーストリア国ザルツブルク）を使用したもの）により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子重複が起こるとき、ショウジョウバエなど単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子に対応する場合がある（パラログ）。本明細書において、「オルソログ」という表現は、パラログも含む。対象配列又は対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメータを初期値に設定したプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Altschul他、J.Mol.Biol.、1997年、215:403〜410）によって作成されたギャップを導入した後の、対象配列（又はその特定の一部分）中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、目的配列と比較して検索する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。％同一性値は、一致する同一ヌクレオチド又はアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。
【００２０】
保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が顕著に影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミン及びアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジン及びヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システイン及びグリシンである。
【００２１】
あるいは、核酸配列のアラインメントは、Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される（Smith及びWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482〜489;database:European Bioinformatics Institute; Smith及びWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195〜197;Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)及びこれに引用される参考文献であるW.R.Pearson、1991年、Genomics、11:635〜650）。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され（Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第5補遺、3:353〜358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C.）、Gribskovによって正規化された（Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745〜6763）スコアマトリックス（scoring matrix）を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメータを用いたSmith-Watermanアルゴリズムを使用することができる（たとえば、ギャップ隙間ペナルティー（gap open penalty）１２、ギャップ伸張ペナルティー（gap extension penalty）２）。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【００２２】
対象核酸分子から誘導した核酸分子には、配列番号１ないし１８のいずれかの核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、温度、イオン強度、ｐＨ、ならびにハイブリダイズ及び洗浄中にホルムアミドなど変性剤を存在させることによって調節することができる。日常的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書に記載されている（たとえば、Current Protocol in Molecular Biology、第1巻、第2.10章、John Wiley&Sons, Publishers、1994年;Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、６×単位強度クエン酸（single strength citrate）（ＳＳＣ）（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０である）、５×デンハルト溶液、０．０５％のピロリン酸ナトリウム及び１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを８時間〜終夜、６５℃でプレハイブリダイゼーションを行うこと；６×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ及び０．０５％のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、１８〜２０時間、６５℃でハイブリダイゼーションを行うこと、及び；０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液で、６５℃で１時間フィルターを洗浄することを含む高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番１ないし１８のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
【００２３】
他の実施形態では、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを６時間、４０℃で前処理すること；３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、及び１０％（重量／体積）のデキストラン硫酸を含む溶液中で、１８〜２０時間、４０℃でハイブリダイゼーションを行うこと；次いで、２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳを含む溶液で２度、１時間５５℃で洗浄することを含む、中程度の緊縮性のハイブリダイゼーション条件を使用する。
【００２４】
あるいは、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、８時間〜終夜、３７℃でインキュベートすること；同じ緩衝液中で１８〜２０時間、ハイブリダイゼーションを行うこと、及び；１×ＳＳＣで、約３７℃で１時間洗浄することを含む、低い緊縮性の条件を使用することができる。
【００２５】
ＬＲＲＣＡＰＳ核酸及びポリペプチドの単離、生成、発現、及びミスエクスプレッション
ＬＲＲＣＡＰＳ核酸及びポリペプチドは、ＬＲＲＣＡＰＳ機能を調節する薬剤の同定及び試験、ならびにｐ５３経路におけるＬＲＲＣＡＰＳの関与に関連する他の用途に有用である。ＬＲＲＣＡＰＳ核酸ならびにその誘導体及びオルソログは、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、ＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、目的のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、及び精製方法の詳細が規定される。たとえば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニング又は抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない（たとえば融合タンパク質の生成）。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などＬＲＲＣＡＰＳ機能を評価するのに使用するアッセイのためのＬＲＲＣＡＰＳタンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、及び精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる（たとえば、Higgins SJ及びHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク）。具体的な実施形態では、組換えＬＲＲＣＡＰＳは、欠陥ｐ５３機能を有することで知られている細胞系（たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスから入手可能なＳＡＯＳ−２骨芽細胞、Ｈ１２９９肺癌細胞、Ｃ３３Ａ及びＨＴ３子宮頚癌細胞、ＨＴ−２９及びＤＬＤ−１大腸癌細胞、）中で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
【００２６】
ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナル及び翻訳シグナルは、ネイティブＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子及び／又はそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、及び／又は特異的にプロセッシングする単離された宿主細胞系を使用することができる。
【００２７】
ＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子産物を検出するために、発現ベクターは、ＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子の核酸に発現可能に連結されたプロモーター、１つ又は複数の複製起点、及び１つ又は複数の選択可能なマーカー（たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など）を含むことができる。あるいは、in vitroアッセイ系（たとえば免疫アッセイ）におけるＬＲＲＣＡＰＳタンパク質の物理的又は機能的特性に基づいてＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子産物の発現をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することもできる。
【００２８】
たとえば精製又は検出を促進するために、ＬＲＲＣＡＰＳタンパク質、断片、又はその誘導体を、任意選択で融合体又はキメラタンパク質産物（すなわち、ＬＲＲＣＡＰＳタンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている）として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、たとえばペプチド合成機の使用（Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105〜111）によってキメラ産物を作製することもできる。
【００２９】
ＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子配列を発現する組換え細胞が同定された後は、標準の方法（たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及びゲル排除クロマトグラフィー；遠心分離；溶解度差；電気泳動、精製の文献を引用）を使用して遺伝子産物を単離及び精製することができる。あるいは、標準の方法（たとえば免疫親和性精製）によって、天然源からネイティブＬＲＲＣＡＰＳタンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、免疫アッセイ、バイオアッセイ、又は結晶学など他の物理的特性の測定など適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
【００３０】
本発明の方法では、ＬＲＲＣＡＰＳ又はｐ５３経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように（ミスエクスプレスされるように）操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用するミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、及び無発現（たとえば遺伝子のノックアウト又は通常は正常に引き起こされる発現の遮断による）を包含する。
【００３１】
遺伝子改変動物
候補ｐ５３調節剤の活性を試験するため、又は細胞死や細胞増殖などｐ５３経路のプロセスにおけるＬＲＲＣＡＰＳの役割をさらに評価するために、ＬＲＲＣＡＰＳの発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、in vivoアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したＬＲＲＣＡＰＳの発現により、正常なＬＲＲＣＡＰＳ発現を有する対照動物に比べて低減又は上昇した細胞増殖、血管形成、又は細胞死のレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、ｐ５３発現が変化していてもよい（たとえばｐ５３ノックアウト）。好ましい遺伝子改変動物は、特に、霊長類、げっ歯類（好ましくはマウス又はラット）などの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、及びショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物（たとえば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照）、又は異種核酸が生殖系列ＤＮＡ内（すなわち細胞のほとんど又はすべてのゲノム配列中）に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、たとえば宿主動物の胚又は胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
【００３２】
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である（トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438〜4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号、Wagner他による米国特許第４，８７３，１９１号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照；パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第４，９４５，０５０号参照；トランスジェニックショウジョウバエについては、Rubin及びSpradling、Science、1982年、218:348〜53及び米国特許第４，６７０，３８８号参照；トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal Marker for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370〜371参照；トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375〜3830参照）；魚、両生類卵及び鳥でのマイクロインジェクションについては、Houdebine及びChourrout、Experientia、1991年、47:897〜905参照；トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099〜1112参照；胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、直接注入などの方法を使用してＤＮＡをＥＳ細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製には、たとえばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照）。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる（Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810〜813；ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９７／０７６６８号及びＷＯ９７／０７６６９号参照）。
【００３３】
一実施形態では、このトランスジェニック動物は、好ましくはＬＲＲＣＡＰＳ発現が検出不可能又は僅かとなるようにＬＲＲＣＡＰＳ機能の低下をもたらす、内因性ＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子の配列中のヘテロ接合性又はホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は通常、ノックアウトする遺伝子の少なくとも一部分を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、追加、又は置換を導入しておく。この導入遺伝子はヒト遺伝子（たとえばヒトゲノムクローン由来）でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。たとえば、マウスゲノム中の内因性ＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するためには、マウスＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である（Capecchi、Science、1989年、244:1288〜1292;Joyner他、Nature、1989年、338:153〜156参照）げっ歯類でない哺乳動物及び他の動物のトランスジェニックを作製する手順も、利用可能である（Houdebine及びChourrout、上掲;Pursel他、Science、1989年、244:1281〜1288;Simms他、Bio/Technology、1988、6:179〜183）。好ましい実施形態では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる（Claesson MH他、1994年、Scan J Immunol、40:257〜264;Declerck PJ他、1995年、J Biol Chem.、270:8397〜400）。
【００３４】
別の実施形態では、このトランスジェニック動物は、たとえばＬＲＲＣＡＰＳの追加のコピーを導入することによって、又はＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を動作可能に挿入することによって、ＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子の発現の変化（たとえば発現の増大（異所性の増大を含む）及び低減）をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーター及びエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性又はヘテロ接合性であることができる。
【００３５】
導入遺伝子の発現を制限可能にする選択された系を含む非ヒト動物のトランスジェニックも、作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である（Lakso他、PNAS、1992、89:6232〜6236；米国特許第４，９５９，３１７号）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、たとえば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交配させることによって「ダブル」トランスジェニック動物を作製することによって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gorman他、1991年、Science、251:1351〜1355；米国特許第５，６５４，１８２号）。好ましい実施形態では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Ｃｒｅ−Ｌｏｘｐ及びＦｌｐ−Ｆｒｔの両方が同一系内で使用される（Sun X他、2000年、Nat Genet、25:83〜6）。
【００３６】
遺伝学の研究において欠陥ｐ５３機能に関係する疾病及び疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のin vivo試験のために、遺伝子改変動物を使用してｐ５３経路をさらに解明することができる。この候補治療剤をＬＲＲＣＡＰＳ機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物及び／又は候補治療剤を与えたＬＲＲＣＡＰＳ発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
【００３７】
ＬＲＲＣＡＰＳ機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥ｐ５３機能（及びそれ以外は正常なＬＲＲＣＡＰＳ機能）を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。たとえば、以下に記載するin vitroアッセイのうち１つで同定された候補ｐ５３調節剤の活性をin vivoで評価するために、ｐ５３ノックアウトマウスを使用することができる。ｐ５３ノックアウトマウスは文献に記載されている（Jacks他、Nature、2001年;410:1111〜1116、1043〜1044;Donehower他、上掲）。好ましくは、候補ｐ５３調節剤をｐ５３機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、ｐ５３機能が修復されている、すなわち細胞が正常な細胞周期進行を示していることが示される。
【００３８】
調節剤
本発明は、ＬＲＲＣＡＰＳの機能及び／又はｐ５３経路と相互作用し及び／又はこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。本方法により同定される調節剤も本発明の一部である。このような作用剤は、ｐ５３経路に関連する様々な診断及び治療用途、ならびにＬＲＲＣＡＰＳタンパク質及びｐ５３経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用剤又は調節剤を投与することによってＬＲＲＣＡＰＳ活性を特異的に調節するステップを含む、ｐ５３経路を調節する方法も提供する。
【００３９】
ここで使用する「ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤」という表現は、ＬＲＲＣＡＰＳ機能を調節する任意の薬剤、たとえば、ＬＲＲＣＡＰＳと相互作用することによりＬＲＲＣＡＰＳ活性を阻害又は増強させるか、あるいはその他の方法によって正常なＬＲＲＣＡＰＳ機能に影響を与える薬剤である。ＬＲＲＣＡＰＳ機能に対する影響のレベルは、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性又は細胞外活性を含め、いずれのレベルでもよい。好ましい実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤はＬＲＲＣＡＰＳの機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド又は核酸に直接結合し、好ましくはＬＲＲＣＡＰＳの機能を阻害、増強、又は他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、これらの用語は、（たとえば、ＬＲＲＣＡＰＳの結合パートナーと、又はタンパク質／結合パートナー複合体と結合して機能を変調させることによって）ＬＲＲＣＡＰＳと結合パートナー、基質、又はコファクターとの相互作用を変化させる調節剤も包含する。さらなる好ましい実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤はｐ５３経路のモジュレーターであり（例えばｐ５３経路の回復及び／又は上方制御を行い）、よってｐ５３経路調節剤でもある。
【００４０】
好ましいＬＲＲＣＡＰＳ調節剤には、小分子化合物；ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質；及びアンチセンスやＲＮＡ阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、たとえば組合せ療法などにおけるような他の活性成分及び／又は適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、薬剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合又は投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第１９版に出ている。
【００４１】
小分子モジュレーター
小分子は多くの場合、酵素機能を有し及び／又はタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が１０，０００未満、好ましくは５，０００未満、より好ましくは１，０００未満、最も好ましくは５００未満である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、たとえばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知又は推定ＬＲＲＣＡＰＳタンパク質の特性に基づいて合理的に設計又は同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてＬＲＲＣＡＰＳ変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である（Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969;Radmann J及びGunther J、Science、2000、151:1947〜1948）。
【００４２】
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、ｐ５３経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、及び候補モジュレーターの改変及び試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的及び薬理的特性に特に注意を払って作製される。たとえば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、in vitro及びin vivoアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【００４３】
タンパク質モジュレーター
特異的なＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質は、ｐ５３経路及び関連疾患に関連する様々な診断上及び治療上の用途、ならびに他のＬＲＲＣＡＰＳ調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性又は細胞外活性を含めた正常なＬＲＲＣＡＰＳ機能に影響を与える。別の実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質は、癌などｐ５３に関連する疾患に関連性があるので、ＬＲＲＣＡＰＳタンパク質の機能に関する情報を検出及び提供するのに有用である（たとえば診断上の手段用）。
【００４４】
ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質は、ＬＲＲＣＡＰＳ発現、局在化、及び／又は活性を調節するＬＲＲＣＡＰＳ経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちＬＲＲＣＡＰＳと自然に遺伝学的又は生化学的に相互作用するものであってよい。ＬＲＲＣＡＰＳモジュレーターには、ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質及びＬＲＲＣＡＰＳタンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母２ハイブリッド及び変異体スクリーニングにより、内因性ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供されている（Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A Practical Approach、Glover D.及びHames B.D編、Oxford University Press、英国オックスフォード、ページ169〜203;Fashema SF他、Gene、2000年、250:1〜14;Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64〜70;Vidal M及びLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919〜29；米国特許第５，９２８，８６８号）。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である（たとえば、Pandley A及びMann M、Nature、2000年、405:837〜846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5〜8の総説）。
【００４５】
ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質は、ＬＲＲＣＡＰＳに特異的な抗体やＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でよい（たとえば、Harlow及びLane、1988年、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory; Harlow及びLane、1999年、Using antibodies:a laboratory manual.、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー:Cold Spring Harbor Loboratory Press参照）。ＬＲＲＣＡＰＳ抗体については以下でさらに論じる。
【００４６】
好ましい実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質はＬＲＲＣＡＰＳタンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤はＬＲＲＣＡＰＳ基質、結合パートナー、又はコファクターと結合する。
【００４７】
抗体
別の実施形態では、このタンパク質モジュレーターはＬＲＲＣＡＰＳに特異的な抗体アゴニスト又はアンタゴニストである。
この抗体は治療上及び診断上の用途を有しており、ＬＲＲＣＡＰＳモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにＬＲＲＣＡＰＳの通常のプロセッシング及び成熟を担当するＬＲＲＣＡＰＳ経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
【００４８】
周知の方法を使用してＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトＬＲＲＣＡＰＳに、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦＡｂ発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、及び上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。たとえば、配列番号１９ないし２４のいずれかに示すアミノ酸配列に対する抗原性を探すための通常のＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドスクリーニングによって、又はこれに対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を施用することによって、特に抗原性であるＬＲＲＣＡＰＳのエピトープを選択することができる（Hopp及びWood、1981年、Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.、78:3824〜28;Hopp及びWood、1983年、Mol.Immunol.、20:483〜89;Sutcliffe他、1983年、Science、219:660〜66）。記載の標準手順によって、１０８Ｍ−１、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、又はそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる（Harlow及びLane、上掲;Goding、1986年、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク；米国特許第４，３８１，２９２号；米国特許第４，４５１，５７０号；米国特許第４，６１８，５７７号）。ＬＲＲＣＡＰＳの粗細胞抽出物又は実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。ＬＲＲＣＡＰＳ断片を使用する場合は、これらは、好ましくはＬＲＲＣＡＰＳタンパク質の少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳに特異的な抗原及び／又は免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。たとえば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
【００４９】
固定した対応するＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など適切なアッセイによって、ＬＲＲＣＡＰＳに特異的な抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
【００５０】
異なる動物種由来の異なる部分を含む、ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。たとえば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はネズミ断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をネズミｍＡｂの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する（Morrison他、Proc.Natl.Acad.Sci.、1984、81:6851〜6855;Neuberger他、Nature、1984、312:604〜608;Takeda他、Nature、1985、31:452〜454）。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって（Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323〜327）マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域及び定常領域のバックグラウンドに移植することによって（Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068〜2101）作製することができる。ヒト化抗体は約１０％のネズミ配列及び約９０％のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下又は排除される（Co MS及びQueen C.、1991年、Nature、351:501〜501; Morrison SL.、1992年、Ann. Rev. Immun.、10:239〜265）。ヒト化抗体及びそれらを産生させる方法は当分野で周知である（米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号）。
【００５１】
アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるＬＲＲＣＡＰＳ特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird、Science、1988年、242:423〜426; Huston他、Proc. Natl. Acad. Sci.USA、1988年、85:5879〜5883;Ward他、Nature、1989、334:544〜546）。
【００５２】
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をin vitroで、抗原ポリペプチド、又は代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む（Huse他、Science、1989年、246:1275〜1281）。本明細書中で使用するＴ細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる（Harlow及びLane、1988年、上掲）。
【００５３】
本発明のポリペプチド及び抗体は、改変して又は改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質又は標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合又は非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する（Menard S他、Int J.Biol Markers、1989、4:131〜134）。幅広い種類の標識及びコンジュゲーション技術が知られており、科学文献及び特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分（moiety）、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる（米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；第４，３６６，２４１号）。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる（米国特許第６，０８６，９００号）。
【００５４】
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、又は静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量及び投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与には、薬学的に許容されるビヒクルを含む単位用量の注射可能な形態（たとえば溶液、懸濁液、乳濁液）で抗体を配合する。このようなビヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び５％のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、又はリポソーム担体などの非水性ビヒクルを使用してもよい。ビヒクルには、等張性や化学的安定性を高める又は他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなビヒクル中の抗体濃度は、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている（米国特許第５，８５９，２０６；国際公開公報ＷＯ００７３４６９号）。
【００５５】
特異的生物療法
好ましい実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質は生物療法に適用できる。生物療法剤は製薬的に許容可能な担体に形成され、シグナル伝達経路を活性化又は阻害するために投与できる。この調節は、リガンドと結合し、よって経路の活性を阻害するか、又は受容体と結合し、受容体の活性を阻害又は活性化することにより行うことができる。あるいは、生物療法剤自体を、受容体を活性化又は阻害可能なリガンドとしてもよい。生物療法剤及び生物療法剤の製造方法は、米国特許第６，１４６，６２８号に詳述されている。
【００５６】
ＬＲＲＣＡＰＳリガンド、リガンドの抗体、又はＬＲＲＣＡＰＳ自体を生物療法剤として使用して、ｐ５３経路のＬＲＲＣＡＰＳの活性を調節してもよい。
【００５７】
核酸モジュレーター
他の好ましいＬＲＲＣＡＰＳ調節剤としては、一般的にＬＲＲＣＡＰＳ活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、ＤＮＡの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのＬＲＲＣＡＰＳ  ＲＮＡの転位、ＬＲＲＣＡＰＳ  ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＬＲＲＣＡＰＳ  ＲＮＡをスプライシングして１つ又は複数のｍＲＮＡ種を得ること、又はＬＲＲＣＡＰＳ  ＲＮＡに関与し又はそれによって促進され得る触媒活性など、ＬＲＲＣＡＰＳ核酸の機能を妨げる。
【００５８】
一実施形態では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは５’非翻訳領域に結合することによってＬＲＲＣＡＰＳ  ｍＲＮＡと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。ＬＲＲＣＡＰＳに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも６〜約２００個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１０、１５、又は２０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは５０未満、４０、又は３０ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはそのキメラ混合物や誘導体又はそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、又はリン酸主鎖を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【００５９】
別の実施形態では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。ＰＭＯは、それぞれがモルフォリンの六員環に結合している４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）のうちの１つを含む、４種の異なるモルホリノサブユニットから組み立てられている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。ＰＭＯ及び他のアンチセンスオリゴマーの詳細な作成方法及び使用方法は、当分野で周知である（たとえば、国際公開公報ＷＯ９９／１８１９３号；Probst JC、Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design, Methods.、2000年、22(3):271〜281; Summerton J及びWeller D.、1997年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187〜95；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，３７８，８４１号参照）。
【００６０】
好ましい代替ＬＲＲＣＡＰＳ核酸モジュレーターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉは、動物及び植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、及びヒトで遺伝子をサイレンシングするためのＲＮＡｉの使用に関する方法は、当分野で周知である（Fire A他、1998年、Nature、391:806〜811;Fire, A.、Trends Genet.、15、358〜363、1999年;Sharp, P.A.、RNA interference 2001.、Genes Dev.、15、485〜490、2001年;Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110〜1119、2001年;Tuschl, T.、Chem.Biochem.、2、239〜245、2001年;Hamilton, A.他、Science、286、950〜952、1999年;Hammond, S.M.他、Nature、404、293〜296、2000年;Zamore, P.D.他、Cell、101、25〜33、2000年;Bernstein, E.他、Nature、409、363〜366、2001;Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188〜200、2001年；国際公開公報ＷＯ０１２９０５８号；国際公開公報ＷＯ９９３２６１９号；Elbashir SM他、2001年、Nature、411:494〜498）。
【００６１】
核酸モジュレーターは一般的に、探索試薬、診断薬、治療薬として使用される。たとえば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される（たとえば、米国特許第６，１６５，７９０号参照）。また、核酸モジュレーターは、たとえば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。たとえば、アンチセンスオリゴマーは、病態の動物及び人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた（Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、1993年、36:1923〜1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、1996年、14:54〜65）。したがって、本発明の一態様では、ｐ５３経路におけるＬＲＲＣＡＰＳの役割、及び／又はＬＲＲＣＡＰＳとこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、ＬＲＲＣＡＰＳに特異的な核酸モジュレーターを使用する。本発明の別の態様では、ｐ５３に関連する病態を処置する治療剤として、ＬＲＲＣＡＰＳに特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。
【００６２】
アッセイ系
本発明は、ＬＲＲＣＡＰＳ活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系及びスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出及び／又は測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、ＬＲＲＣＡＰＳ核酸又はタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果又は分子効果を同定又は確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたＬＲＲＣＡＰＳ調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がｐ５３経路に関連する方式でＬＲＲＣＡＰＳに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、ＬＲＲＣＡＰＳモジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
【００６３】
好ましい実施形態では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性（たとえば酵素活性）が系によってもたらされる条件下で、ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド又は核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がＬＲＲＣＡＰＳ活性を、したがってｐ５３経路を調節することが示される。アッセイに使用するＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド又は核酸は、上記の核酸又はポリペプチドのいずれを含んでもよい。
【００６４】
一次アッセイ
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【００６５】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせる又は保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91及び付随の参考文献に総説がある）。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、又は膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質（内因性又は組換えによって生成された）、部分的に精製した又は粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用（たとえば受容体−リガンド結合）、転写活性（たとえばレポーター遺伝子）、酵素活性（たとえば基質の特徴を介するもの）、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、及び細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、及び電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
【００６６】
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、ＬＲＲＣＡＰＳを組換えによって発現する系及び個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母２ハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニング及び質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにＬＲＲＣＡＰＳ相互作用タンパク質を使用する場合、ＬＲＲＣＡＰＳタンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理（たとえば候補ＬＲＲＣＡＰＳに特異的に結合する作用剤の、ＬＲＲＣＡＰＳ発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力）、結合平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）、免疫原性（たとえばマウス、ラット、ヤギ又はウサギなどの異種宿主中でＬＲＲＣＡＰＳに特異的な抗体を誘発する能力）など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素及び受容体について、結合はそれぞれ基質及びリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【００６７】
スクリーニングアッセイでは、ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチド、その融合タンパク質、又はこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞又は膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なＬＲＲＣＡＰＳ活性を保持しているその断片でもよい。ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドは、検出又は固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。ＬＲＲＣＡＰＳポリペプチドは、好ましくはヒトＬＲＲＣＡＰＳ、あるいは上記のようなそのオルソログ又は誘導体である。好ましい実施形態では、スクリーニングアッセイで、ＬＲＲＣＡＰＳと内因性タンパク質、外因性タンパク質、又はＬＲＲＣＡＰＳに特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子機能を評価することができる。
【００６８】
ＬＲＲＣＡＰＳモジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイは高スループット又は超高スループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する（Fernandes PB、Curr Opin Chem Biol、1998年、2:597〜603;Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、2000年、11:47〜53）。好ましい一実施形態では、スクリーニングアッセイで、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質又はＤＮＡ−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する（たとえば、Selvin PR、Nat Struct Biol、2000年、7:730〜4;Fernandes PB、上掲;Hertzberg RP及びPope AJ、Curr Opin Chem Biol、2000年、4:445〜451）。
【００６９】
候補ＬＲＲＣＡＰＳ及びｐ５３経路モジュレーターを同定するために様々な適切なアッセイ系を使用することができる（たとえば、米国特許第５，５５０，０１９号及び同第６，１３３，４３７号（アポトーシスアッセイ）；同第６，０２０，１３５号（ｐ５３の変調）、同第５，９７６，７８２号、同第６，２２５，１１８号及び同第６，４４４，４３４号（血管形成アッセイ））。好ましい特異的なアッセイを以下に詳述する。
【００７０】
アポトーシスアッセイ。細胞死用のアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに媒介されたジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって実施することができる。ＴＵＮＥＬアッセイは、フルオレセイン−ｄＵＴＰの取り込み（Yonehara他、1989、J.Exp.Med.、169、1747）を追跡することによって細胞死に特徴的な核ＤＮＡの断片化を測定すること（Lazebnik他、1994、Nature、371、346）に使用される。組織培養細胞のアクリジンオレンジ染色によって細胞死をさらにアッセイすることができる（Lucas, R.他、1998、Blood、15:4730〜41）。アポトーシスアッセイ系は、ＬＲＲＣＡＰＳを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ｐ５３機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてｐ５３が過剰発現又は過少発現されている）ものを含むことができる。このアポトーシスアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞死の誘発における変化により、候補ｐ５３調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞系を使用して最初に同定された候補ｐ５３調節剤を試験する二次アッセイとして、アポトーシスアッセイを使用することができる。また、ＬＲＲＣＡＰＳ機能が細胞死において直接役割を果たすかどうかを試験するためにアポトーシスアッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＬＲＲＣＡＰＳを過剰発現又は過少発現する細胞でアポトーシスアッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した細胞死応答の差により、ＬＲＲＣＡＰＳが細胞死応答において直接役割を果たすことが示唆される。アポトーシスアッセイは、米国特許第６，１３３，４３７号にさらに記載されている。
【００７１】
細胞増殖及び細胞周期アッセイ。細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取り込みを介してアッセイすることができる。このアッセイでは、新しく合成されたＤＮＡにＢＲＤＵが取り込まれることにより、ＤＮＡが合成されている細胞集団が同定される。その後、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて（Hoshino他、1986年、Int.J.Cancer、38、369;Campana他、1988年、J.Immunol.Meth.、107、79）、又は他の手段によって、新しく合成されたＤＮＡを検出することができる。
【００７２】
また、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる（Chen, J.、1996年、Oncogene、13:1395〜403;Jeoung, J.、1995年、J.Biol.Chem.、270:18367〜73）。このアッセイにより、Ｓ期のＤＮＡ合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、ＤＮＡを合成している細胞が新しく合成されるＤＮＡ中に［３Ｈ］−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器（たとえば、Beckman LS 3800液体シンチレーション計数器）による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。別の細胞増殖アッセイでは、染料アラマーブルー（Biosource Internationalから入手可能）を使用する。該染料は、生存細胞数が減少すると蛍光発光し、間接的な細胞数の測定を提供するものである（Voytik-Harbin SL等, 1998, In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46）。
【００７３】
また、軟寒天中のコロニー形成によって細胞増殖をアッセイすることもできる（Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。たとえば、ＬＲＲＣＡＰＳで形質転換させた細胞を軟寒天プレートに播種し、２週間インキュベートした後コロニーを測定して計数する。
【００７４】
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる（Gray JW他、1986年、Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med、49:237〜55）。ＬＲＲＣＡＰＳで形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリー（Becton Dickinsonから入手可能）で評価することができる。これにより、細胞周期の異なる段階における細胞の蓄積が示される。
【００７５】
したがって、細胞増殖又は細胞周期アッセイ系は、ＬＲＲＣＡＰＳを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ｐ５３機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてｐ５３が過剰発現又は過少発現されている）ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞増殖又は細胞周期の変化により候補ｐ５３調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞キナーゼアッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ｐ５３調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖又は細胞周期アッセイを使用することができる。また、ＬＲＲＣＡＰＳ機能が細胞増殖又は細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＬＲＲＣＡＰＳを過剰発現又は過少発現する細胞で細胞増殖又は細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖又は細胞周期の差により、ＬＲＲＣＡＰＳが細胞増殖又は細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。
【００７６】
血管形成。臍帯、冠動脈、又は真皮細胞など様々なヒト内皮細胞系を用いて血管形成をアッセイすることができる。適切なアッセイには、増殖を測定するアラマーブルーに基づいたアッセイ（Biosource Internationalから入手可能）；血管形成エンハンサー又はサプレッサーが存在する又は存在しない場合の細胞が膜を通り抜ける遊走を測定するBecton Dickinson Falcon HTS Fluoro Blockセルカルチャーインサートの使用など蛍光分子を用いた遊走アッセイ；Matrigel（登録商標）（Becton Dickinson）上の内皮細胞による管状構造の形成に基づいた細管形成アッセイが含まれる。したがって、血管形成アッセイ系は、ＬＲＲＣＡＰＳを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ｐ５３機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてｐ５３が過剰発現又は過少発現されている）ものを含むことができる。この血管形成アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した血管形成の変化により候補ｐ５３調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ｐ５３調節剤を試験する二次アッセイとして、血管形成アッセイを使用することができる。また、ＬＲＲＣＡＰＳ機能が細胞増殖において直接役割を果たすかどうかを試験するために血管形成アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＬＲＲＣＡＰＳを過剰発現又は過少発現する細胞で血管形成アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した血管形成の差により、ＬＲＲＣＡＰＳが血管形成において直接役割を果たすことが示唆される。たとえば、米国特許第５，９７６，７８２号、同第６，２２５，１１８号及び同第６，４４４，４３４号を参照のこと。
【００７７】
低酸素誘発。転写因子である低酸素誘発性因子−１（ＨＩＦ−１）のαサブユニットは、in vitroで低酸素に曝した後に腫瘍細胞中で上方制御される。低酸素条件下では、ＨＩＦ−１は、糖分解酵素やＶＥＧＦをコードする遺伝子など腫瘍細胞の生存に重要であることで知られている遺伝子の発現を刺激する。低酸素条件によるこのような遺伝子の誘発は、ＬＲＲＣＡＰＳで形質移入させた細胞を（たとえばＮａｐｃｏ７００１インキュベーター（Precision Scientific）で発生させた０．１％のＯ２、５％のＣＯ２、及び残りはＮ２を用いた）低酸素条件下及び正常酸素（normoxic）条件下で増殖させ、その後Ｔａｑｍａｎ（登録商標）によって遺伝子の活性又は発現を評価することによってアッセイすることができる。たとえば、低酸素誘発アッセイ系は、ＬＲＲＣＡＰＳを発現する細胞、及び任意選択で変異したｐ５３を有する（たとえば、野生型細胞に比べてｐ５３が過剰発現又は過少発現されている）ものを含むことができる。この低酸素誘発アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した低酸素応答の変化により候補ｐ５３調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ｐ５３調節剤を試験する二次アッセイとして、低酸素誘発アッセイを使用することができる。また、ＬＲＲＣＡＰＳ機能が低酸素応答において直接役割を果たすかどうかを試験するために低酸素誘発アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてＬＲＲＣＡＰＳを過剰発現又は過少発現する細胞で低酸素誘発アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した低酸素応答の差により、ＬＲＲＣＡＰＳが低酸素誘発において直接役割を果たすことが示唆される。
【００７８】
細胞接着。細胞接着アッセイでは、候補調節剤が存在する又は存在しない場合の、細胞と精製した接着タンパク質との接着、又は細胞の相互接着を測定する。細胞−タンパク質接着アッセイでは、細胞が精製したタンパク質に接着することを調節する作用剤の能力を測定する。たとえば、組換えタンパク質を生成し、ＰＢＳで２．５ｇ／ｍＬまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに使用する。陰性対照で使用するウェルはコーティングしない。その後、コーティングしたウェルを洗浄し、１％のＢＳＡで遮断し、再度洗浄する。化合物を２×最終試験濃度まで希釈し、ブロッキングした、コーティングしたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、結合しなかった細胞を洗い流す。カルセイン−ＡＭなど膜透過性蛍光色素を加えることによって保持された細胞をプレート上で直接標識し、蛍光マイクロプレート読取装置でシグナルを定量する。
【００７９】
細胞−細胞接着アッセイでは、ネイティブリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、自然に又は組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をＢＣＥＣＦなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。
【００８０】
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの１つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンド及びペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチド及びモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をin situで使用して測定される（Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346〜53）。
【００８１】
細胞移動。侵入／移動アッセイ（移動アッセイとも呼ぶ）では、細胞の、物理的障壁を克服して血管形成促進シグナルへ向かって移動する能力を試験する。移動アッセイは当技術分野で周知である（たとえば、Paik JH他、2001年、J Biol Chem. 276:11830-11837）。典型的な実験設定では、培養した内皮細胞を通常の細胞より小さい径の孔を有する基質で被覆した薄膜に埋め込む。上述したように、基質は通常細胞外マトリックスの環境を刺激する。薄膜は典型的にはトランスウェル（transwell）ポリカーボネート膜（Corning Costar Corporation, マサチューセッツ州ケンブリッジ）などの膜であり、通常血管形成促進刺激物を含む下部チャンバと液体接点を有する上部チャンバの一部である。通常、刺激物で一晩インキュベートしてから移動をアッセイするが、これよりも長い、又は短い時間を採用してもよい。移動の評価は薄膜を通過した細胞の数で行い、ヘモトキシリン（hemotoxylin）溶液（VWR Scientific, カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）で染色した細胞を使用して検出するか、細胞の数を決定するためのその他任意の方法で検出することができる。別の例示的設定では、細胞を蛍光標識し、Falcon HTS FluoroBlok（Becton Dickinson）などの蛍光読み取りを使用して移動を検出する。刺激物がなくても観察できる移動はあるが、血管形成促進因子に反応して移動が大きく増加する。上述したように、移動／侵入の好ましいアッセイ系は、腫瘍血管形成及び炎症性血管形成剤を含む様々な血管形成促進因子に対するＬＲＲＣＡＰＳの反応を試験すること、及び無血清培地での細胞培養を含む。
【００８２】
出芽アッセイ。出芽アッセイは、ゲルベースのコラーゲン基質に埋め込まれた内皮細胞の細胞数決定スフェロイド凝集（「スフェロイド」）を使用する３次元のin vitro血管形成アッセイである。スフェロイドは、細胞外マトリックスへの侵入（「細胞出芽」と呼ぶ）による毛細血管状構造の出芽の開始点、及びそれに続く複合網状ネットワーク形成の役割を果たす（Korff及びAugustin、1999年、J Cell Sci 112:3249-58）。一例示的実験設定では、非接着性９６ウェルプレートの１つのウェルにつき、ヒト臍帯静脈内皮細胞４００個をピペットで取り分け、一晩スフェロイド凝集を行うことによりスフェロイドを調製する（Korff及びAugustin: J Cell Biol 143:1341-52、1998年）。スフェロイドを回収し、９００μｌのメトセル(methocel)コラーゲン溶液に蒔き、２４ウェルプレートの核ウェルにピペットで取り分け、コラーゲンゲル重合させる。３０分後、１０倍に濃縮した試験物質の作用希釈液１００μｌをゲル頂部にピペットで取ることにより試薬を加える。プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。パラホルムアルデヒドを添加することにより、実験的インキュベーション期間の最後にディッシュを固定する。自動化画像分析系により１スフェロイド当たりの累積発芽長を測定することにより、内皮細胞の発芽強度を定量化することができる。
【００８３】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、ＬＲＲＣＡＰＳタンパク質に対する抗体の親和性及び特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性及び特異性を試験する方法は当分野で周知である（Harlow及びLane、1988年、1999年、上掲）。ＬＲＲＣＡＰＳに特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。他の方法には、ＦＡＣＳアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び蛍光アッセイが含まれる。
【００８４】
場合によっては、小分子モジュレーターに関して記載したスクリーニングアッセイも抗体モジュレーターの試験に使用できる。
【００８５】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子の発現、好ましくはｍＲＮＡの発現を阻害又は増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下又は非存在下の細胞の類似集団（たとえば、内因的に又は組換えによってＬＲＲＣＡＰＳを発現する２種の細胞プール）中のＬＲＲＣＡＰＳ発現を比較することが含まれる。ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。たとえば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（たとえばＴａｑＭａｎ（登録商標）、PE Applied Biosystemsを使用）、又はマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でＬＲＲＣＡＰＳ  ｍＲＮＡの発現が低減していることを確認することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;Blohm DH及びGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはＬＲＲＣＡＰＳタンパク質又は特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体又は抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、in situ検出を含めた様々な手段が利用可能である（Harlow E及びLane D、1988年及び1999年、上掲）。
【００８６】
場合によっては、特にＬＲＲＣＡＰＳ  ｍＲＮＡの発現を伴うアッセイ系において、小分子モジュレーターに関して記載したスクリーニングアッセイも核酸モジュレーターの試験に使用できる。
【００８７】
二次アッセイ
調節剤がｐ５３経路に関連する様式でＬＲＲＣＡＰＳに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したＬＲＲＣＡＰＳ調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するＬＲＲＣＡＰＳ調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物又は他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的又は生化学的経路における調節剤の活性を試験するために、あるいは調節剤がＬＲＲＣＡＰＳと相互作用する特異性を試験することもできる。
【００８８】
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下又は非存在下において、細胞や動物の類似集団（たとえば、内因的に又は組換えによってＬＲＲＣＡＰＳを発現する２種の細胞プール）を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない（あるいはモック処置又は偽薬で処置した）細胞や動物と比較してｐ５３経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、ｐ５３又は相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。
【００８９】
細胞に基づいたアッセイ
細胞に基づいたアッセイでは、欠陥ｐ５３機能を有することで知られている様々な哺乳動物細胞系（たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスから入手可能であるＳＡＯＳ−２骨芽細胞、Ｈ１２９９肺癌細胞、Ｃ３３Ａ及びＨＴ３子宮頚癌細胞、ＨＴ−２９及びＤＬＤ−１大腸癌細胞）を使用してもよい。細胞に基づいたアッセイでは内因性ｐ５３経路活性を検出するか、あるいはこれはｐ５３経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入する又は任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
【００９０】
動物アッセイ
候補ＬＲＲＣＡＰＳモジュレーターを試験するために、正常又は欠陥のあるｐ５３経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥ｐ５３経路のモデルでは、ｐ５３経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる（たとえば過剰発現又は発現が欠けている）ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
【００９１】
好ましい実施形態では、新血管新生及び血管形成をモニターすることによってｐ５３経路の活性を評価する。Matrigel（登録商標）アッセイにおける、ＬＲＲＣＡＰＳに対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるｐ５３及び正常なｐ５３を有する動物モデルを使用する。Matrigel（登録商標）は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンＩＶ、及びヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、４℃の無菌的な液体として提供されるが、３７℃で迅速にゲルを形成する。液体のMatrigel（登録商標）を、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦなど様々な血管形成剤、又はＬＲＲＣＡＰＳを過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス（Taconic、ニューヨーク州ジャーマンタウン）に皮下注入（ＳＣ）する。Matrigel（登録商標）ペレットを有するマウスに、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）、又は静脈内（ＩＶ）経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後５〜１２日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにMatrigel（登録商標）ペレットを回収する（Sigma plasma hemoglobin kit）。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新血管新生の程度と相関していることが判明した。
【００９２】
別の好ましい実施形態では、ＬＲＲＣＡＰＳにおける候補モジュレーターの効果を腫瘍形成アッセイによって評価する。一例では、既存の腫瘍由来又は腫瘍細胞由来のヒト細胞を含む異種移植を使用する。腫瘍異種移植アッセイは当技術分野において既知である（例えばOgawa K等, 2000, Oncogene 19:6043-6052を参照）。異種移植片は、通常、既存の腫瘍由来又はin vitro培養物由来の単一細胞懸濁液として、６〜７週齢の雌の無胸腺マウスに移植されたＳＣである。内因的にＬＲＲＣＡＰＳを発現する腫瘍を、マウス１匹あたり１×１０５〜１×１０７個の細胞を１００μＬの体積で、２７ゲージの針を用いて脇腹に注入する。その後、マウスの耳に札をつけ、週２回腫瘍を測定した。平均腫瘍重量が１００ｍｇに達した日に候補モジュレーターによる処置を開始した。候補モジュレーターは、ボーラス投与によってＩＶ、ＳＣ、ＩＰ、又はＰＯで送達される。それぞれの独特な候補モジュレーターの薬理動態に応じて、１日に複数回投薬を行うことができる。腫瘍の重量を、カリパーを用いて垂直直径を測定することによって評価し、２つの次元の直径の測定値を掛け合わせることによって計算した。実験の最後に、切除した腫瘍をさらなる分析用のバイオマーカーの同定に利用することができる。免疫組織化学染色では、異種移植腫瘍を４％のパラホルムアルデヒド、０．１Ｍのリン酸、ｐＨ７．２で６時間、４℃固定し、ＰＢＳ中３０％のショ糖に浸し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させる。
【００９３】
別の好ましい実施形態では、ホローファイバーアッセイを使用して腫瘍形成能をモニターする。ホローファイバーアッセイは米国特許第５，６９８，４１３号に開示されている。要約すると、本方法は、実験動物に対し、標的細胞を含む生体適合性の半透明なカプセル封入器を埋め込むこと、実験動物を候補調節剤で処置すること、及び候補モジュレーターに対する反応について標的細胞を評価することを含む。埋め込まれる細胞は、通常、既存の腫瘍又は腫瘍細胞系由来のヒト細胞である。適当な時間、通常約６日を置いて、埋め込んだ細胞を回収し、候補モジュレーターの評価に使用する。腫瘍形成能とモジュレーターの有効性は、マクロカプセル中に存在する生細胞の量をアッセイすることにより評価してもよく、これは、当技術分野において既知の試験、例えばＭＴＴ染色変換アッセイ、ニュートラルレッド染色取り込み、トリパンブルー染色、生細胞計算、軟寒天中に形成されたコロニーの数、細胞の回復能及びin vitroでの複製能等により決定できる。
【００９４】
別の好ましい実施形態では、腫瘍形成能アッセイは、組織特異性の制御配列の制御の下で、優性オンコジーン、又は腫瘍サプレッサー遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物、特にマウスを使用する。これらのアッセイは通常トランスジェニック腫瘍アッセイと呼ばれる。好ましい用途では、トランスジェニックモデルにおける腫瘍の進行の特徴づけ又は制御が良好に行われる。例示的なモデルでは、「ＲＩＰ１−Ｔａ２」導入遺伝子は、インスリン遺伝子制御領域の制御の下でＳＶ４０大型Ｔ抗原オンコジーンを有し、膵臓β細胞に発現し、結果的に島細胞悪性腫瘍となる（Hanahan D, 1985, Nature 315:115-122; Parangi S等, 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:2002-2007; Bergers G等, 1999, Science 284:808-812）。通常過剰増殖性の島細胞のサブセット中の静止毛細血管が血管形成性となるので、「血管形成スイッチ（angiogenic switch）」は、約５週目に起こる。ＲＩＰ１−ＴＡＧ２マウスは１４週で脂肪する。候補モジュレーターは、血管形成スイッチの直前（例えば腫瘍防護のモデルの場合）、小規模腫瘍の成長期（例えば処置のモデルの場合）、又は大規模及び／又は湿潤性腫瘍の成長期（例えば退行のモデルの場合）を含め、様々な段階において投与できる。腫瘍形成能及びモジュレーターの有効性は、腫瘍の数、腫瘍の大きさ、腫瘍の形態、血管密度、アポトーシス指数などを含め、寿命延長及び／又は腫瘍特性の評価であってもよい。
【００９５】
診断及び治療上の使用
特異的なＬＲＲＣＡＰＳ調節剤は、疾病又は疾病予後が血管形成、細胞死、又は増殖疾患などｐ５３経路の欠陥に関連している様々な診断及び治療用途に有用である。したがって、本発明は、ＬＲＲＣＡＰＳ活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与するステップを含む、細胞、好ましくは欠陥又は不全ｐ５３機能（例えば、ｐ５３の過剰発現、過少発現、又はミスエクスプレッション、或いは遺伝子の突然変異による）を有することが事前に確定されている細胞におけるｐ５３経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、ｐ５３機能が修復されたこと、すなわち、たとえば細胞が正常な増殖又は進行で細胞周期を経ることが示される。本明細書で使用する「機能が修復された」という表現、及び同等の表現は、所望の表現型が達成された、又は非処理細胞と比較して正常に近い状態になったということを意味する。たとえば、修復されたｐ５３機能により、細胞増殖及び／又は細胞周期の進行が正常化されるか、又は非処理細胞と比較して正常に近い状態になり得る。また、本発明は、ｐ５３経路を調節する治療上有効な量のＬＲＲＣＡＰｓ調節剤を投与することにより、ｐ５３機能不全に関連する疾病又は疾患を治療する方法を提供する。本発明は、更に、ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤を投与することにより、細胞、好ましくはＬＲＲＣＡＰＳ機能の欠陥又は不全を有することが事前に決定されている細胞におけるＬＲＲＣＡＰＳ機能を調節する方法を提供する。加えて、本発明は、治療上有効な量のＬＲＲＣＡＰＳ調節剤を投与することにより、ＬＲＲＣＡＰＳ機能の不全に関連する疾病又は疾患を治療する方法を提供する。
【００９６】
ＬＲＲＣＡＰＳがｐ５３経路に関係しているという発見により、ｐ５３経路の欠陥に関与する疾病及び疾患の診断及び予後評価、ならびにこのような疾病及び疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。
【００９７】
特定の試料でＬＲＲＣＡＰＳが発現されるかどうかを診断するために、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、及びマイクロアレイ分析など様々な発現分析方法を使用することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;Blohm及びGuiseppi-Elie、Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。ＬＲＲＣＡＰＳを発現する欠陥ｐ５３シグナル伝達に関係づけられている疾病又は疾患を有する組織は、ＬＲＲＣＡＰＳ調節剤を用いた処置を受け入れることが同定されている。好ましい用途では、ｐ５３欠陥組織は正常組織に比べてＬＲＲＣＡＰＳを過剰発現する。たとえば、完全又は部分ＬＲＲＣＡＰＳ  ｃＤＮＡ配列をプローブとして使用した、腫瘍及び正常細胞系由来、又は腫瘍及び同一患者からの対応する正常組織試料由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、具体的な腫瘍がＬＲＲＣＡＰＳを発現又は過剰発現するかどうかを決定することができる。あるいは、細胞系、正常組織及び腫瘍試料中のＬＲＲＣＡＰＳ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、TaqMan（登録商標）を使用する（PE Applied Biosystems）。
【００９８】
たとえばＬＲＲＣＡＰＳオリゴヌクレオチドなどの試薬、及びＬＲＲＣＡＰＳに対する抗体を利用して、上に記載した（１）ＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子変異の存在の検出、又は疾患でない状態と比較したＬＲＲＣＡＰＳ  ｍＲＮＡの過剰発現又は過少発現のいずれかの検出、（２）疾患でない状態と比較したＬＲＲＣＡＰＳ遺伝子産物の過剰存在又は過少存在のいずれかの検出、ならびに（３）ＬＲＲＣＡＰＳに媒介されたシグナル伝達経路における摂動又は異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。
【００９９】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、（ａ）患者から生体試料を得ること、（ｂ）試料をＬＲＲＣＡＰＳ発現用のプローブと接触させること、（ｃ）ステップ（ｂ）からの結果を対照と比較すること、及び（ｄ）ステップ（ｃ）が疾病又は疾患の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、ＬＲＲＣＡＰＳ発現の変調に関連する患者の疾病又は疾患を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは表２に示す癌である。プローブは、ＤＮＡ又は抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【０１００】
以下の実験セクション及び実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【０１０１】
Ｉ．ショウジョウバエｐ５３のスクリーニング
痕跡翅マージンクアドラントエンハンサー（vestigial margin quadrant enhancer）を用いて、ショウジョウバエのｐ５３遺伝子を翅中に特異的に過剰発現させた。ショウジョウバエのｐ５３の量を増加させることにより（様々な強度のトランスジェニックインサートを１又は２コピー使用して力価を測定）、翅毛のパターン及び極性が破壊されること、翅脈が短縮及び肥厚されること、翅に進行的なしわが寄ること、翅翼（wing blade）に暗色の「死」の封入体が現れることを含む表現型を伴う、正常な翅形態の中程度から強度の劣化が引き起こされた。ショウジョウバエのｐ５３のエンハンサー及びサプレッサーを同定するために設計されたスクリーニングでは、ｐ５３を２コピー保有しているホモ接合性の雌を、piggyBacトランスポゾンの無作為なインサートを含む５６３３雄と交配させた（Fraser M他、Virology、1985年、145:356〜361）。ｐ５３表現型の亢進又は抑制について、インサートを含む子孫をインサートを含まない兄弟子孫（sibling progeny）と比較した。piggyBac挿入部位の周囲の配列情報を使用してモディファイヤー遺伝子を同定した。翅の表現型のモディファイヤーはｐ５３経路のメンバーとして同定された。ショウジョウバエのＬＲＲＣＡＰＳは翅の表現型のエンハンサーであった。このモディファイヤーのヒトにおけるオルソログを、本明細書中ではＬＲＲＣＡＰＳと呼ぶ。
【０１０２】
ＢＬＡＳＴ分析（Altschul他、上掲）を行ってショウジョウバエのモディファイヤーのターゲットを同定した。タンパク質の様々なドメイン、シグナル、及び機能的サブユニットを、ＰＳＯＲＴ（Nakai K.及びHorton P.、Trends Biochem Sci、1999年、24:34-6; Kenta Nakai、Protein sorting signals and prediction of subcellular localization, Adv. Protein Chem. 54, 277-344、2000年）、ＰＦＡＭ（Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260-2）、ＳＭＡＲＴ（Ponting CP他、SMART: identification and annotation of domains from signaling and extracellular protein sequences.  Nucleic Acids Res.、1999年1月 1;27(1):229-32）、ＴＭ−ＨＭＭ（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne、及びAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences.  In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, P175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press、1998年）、及びクラスト（clust）（Remm M及びSonnhammer E. Classification of transmembrane protein families in the Caenorhabditis elegans genome and identification of human orthologs. Genome Res. 2000年11月;10(11):1679-89）プログラムを使用して分析した。例えば、表１に示すように、ＰＦＡＭを使用して、ＧＩ＃１１８７７２５７、１６１５７５１１、１４７５８１２６、５４５３６５６、１４７６４１９８、及び５７２９７１８（それぞれ配列番号１９、２０、２１、２２、２３、及び２４）のＬＲＲ及びＩＧドメインのアミノ酸のおよその位置を決定した。
【０１０３】
2005506844.tif 000002
【０１０４】
ＩＩ．ハイスループットのIn Vitro蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したＬＲＲＣＡＰＳペプチド／基質を、試験緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６）中の試験剤と共に９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Fluorolite FPM-2 Fluorescence Polarization Microtiter System(Dynatech Laboratories, Inc）を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がＬＲＲＣＡＰＳ活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【０１０５】
ＩＩＩ．ハイスループットのIn Vitro結合アッセイ
３３Ｐ標識のＬＲＲＣＡＰＳペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤の反応混液）中で、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ−アビジンでコーティングしたアッセイプレートに加え、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補ｐ５３調節剤として同定された。
【０１０６】
ＩＶ．免疫沈降及び免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、ＬＲＲＣＡＰＳタンパク質を含む３×１０６個の適切な組換え細胞を１０ｃｍのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入で総ＤＮＡ量を一定に保った。２４時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのグリセロホスフェート、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸、２ｍＭのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤（complete, Roche Molecular Biochemicals）、及び１％のノニデットＰ−４０を含む溶解緩衝液１ｍｌ中、氷上で２０分間溶解させた。１５，０００×ｇ、１５分間の遠心分離２回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を２５μｌのＭ２ビーズ（シグマ）と共に２時間、４℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
【０１０７】
溶解緩衝液でよく洗浄した後、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、標識した抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼ及び高感度化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システム（アマシャム ファルマシア バイオテク）によって、反応性のあるバンドを可視化させた。
【０１０８】
Ｖ．発現分析
以下の実験で使用したすべての細胞系はＮＣＩ（米国立癌センター）の系であり、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、２０１１０〜２２０９）から入手可能である。正常組織及び腫瘍組織は、Ｉｍｐａｔｈ、カリフォルニア大学デービス校（UC Davis）、クローンテック（Clontech）、ストラタジーン（Stratagene）、及びAmbionから得た。
【０１０９】
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、ＴａｑＭａｎ分析を使用した。
【０１１０】
Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）のRNeasy kitを使用し、製造者のプロトコルに従って各組織試料からＲＮＡを抽出して最終濃度５０ｎｇ／μｌにした。その後、ランダムの六量体及び各反応５００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、アプライド バイオシステムズ （Applied Biosystems）（カリフォルニア州フォスターシティー、http://www.appliedbiosystems.com/）のプロトコル４３０４９６５に従ってＲＮＡ試料を逆転写させることによって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１１１】
ＴａｑＭａｎプロトコルならびに以下の基準に従って、ＴａｑＭａｎアッセイ（アプライド バイオシステムズ 、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、ａ）ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設計すること、及びｂ）各プライマーの対が１つの産物のみを生成することである。
【０１１２】
製造者のプロトコルに従って、３００ｎＭのプライマー及び２５０ｎＭのプローブならびに約２５ｎｇのｃＤＮＡを、９６ウェルプレートでは２５μｌの全体積、３８４ウェルプレートでは１０μｌの全体積で使用して、Ｔａｑｍａｎ反応を実施した。標的が大量に存在する可能性が高くなるように広範囲の組織由来のｃＤＮＡを含む混合物である、ヒトｃＤＮＡ試料のユニバーサルプール（universal pool）を使用して結果分析用の標準曲線を作成した。１８ＳのｒＲＮＡ（すべての組織及び細胞中で普遍的に発現される）を使用して生データを正規化した。
【０１１３】
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが２倍以上高い場合に、ある遺伝は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、ｃＤＮＡ試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差（すなわち、腫瘍−平均（すべての正常試料）＞２×ＳＴＤＥＶ（すべての試料））の２倍を超える場合に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
【０１１４】
結果を表２に示す。腫瘍の各種類について、２つ１組となった試料の数、及び同一患者から採取した正常組織の一致数を示す。腫瘍の各種類について、少なくとも２倍の過剰発現を示した試料の割合（％）を提示した。「ＮＤ」は、実験を行わなかったことを示す。遺伝子が過剰発現されている腫瘍に投与することによって、本明細書中に記載したアッセイによって同定されたモジュレーターの治療上の効果をさらに検証することができる。腫瘍増殖の低下により、モジュレーターの治療上の有用性が確認される。患者から腫瘍試料を得、モジュレーターが標的としている遺伝子の発現をアッセイすることによって、モジュレーターを用いて患者を処置する前に患者が処置に応答する可能性を診断することができる。この遺伝子（又は複数の遺伝子）の発現データも、疾病の進行を診断する上でのマーカーとして使用することができる。このアッセイは、上記の発現分析によって、遺伝子標的に対する抗体によって、又は任意の他の利用可能な検出方法によって実施することができる。
【０１１５】
2005506844.tif 000003
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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