(57)【要約】本発明は、特定の治療的処置に対する被験者の応答を評価または査定するための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、被験者の応答を決定する方法、または治療用抗体で処置される被験者の治療プロトコールを適合させる方法を提供する。本発明は、被験者のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型の決定に基づく。本発明は、悪性腫瘍、特にリンパ腫の患者に使用することができ、最高の応答者を選択しかつ／または低応答者向けに処置条件またはプロトコールを調整するのに適する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型をインビトロで決定することを含む治療用抗体処置に対する被験者の応答を査定する方法。
【請求項２】
被験者のＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型をインビトロで決定することを含む治療用抗体処置に対する患者を選択する方法。
【請求項３】
被験者のＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型をインビトロで決定することを含む被験者における治療用抗体処置の効力または処置条件もしくはプロトコールを改良する方法。
【請求項４】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を決定することを含み、１５８位のバリンが、処置に対するより良好な応答を示し、１５８位のフェニルアラニンが、処置に対するより低い応答を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子もしくはＲＮＡまたはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むそれらの一部を配列決定する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子もしくはＲＮＡまたはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むそれらの一部を増幅する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
増幅を、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびネステッドＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で実施する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、対立遺伝子特異的制限酵素消化の工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子もしくはＲＮＡまたはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むそれらの一部と、遺伝子型バリンまたはフェニルアラニンに特異的な核酸プローブとのハイブリダイゼーション工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、
−生物学的サンプルからゲノムＤＮＡを得ること、
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子、またはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むその一部を増幅すること、及び
−前記ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子の１５８位のアミノ酸残基を決定すること、
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、
−生物学的サンプルからゲノムＤＮＡを得ること、
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子、またはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むその一部を増幅すること、
−対立遺伝子特異的制限部位を導入すること、
−前記制限部位に特異的な酵素で核酸を消化すること、及び
−消化産物を分析すること、すなわち、電気泳動で、消化産物の存在が対立遺伝子の存在を示すこと、
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、インビトロまたはエキソビボでの、細胞または生物学的サンプルもしくは流体からの総（またはメッセンジャー）ＲＮＡ抽出、場合によりｃＤＮＡ合成、特異的ＦＣＧＲＩＩＩａオリゴヌクレオチドプライマーによる（ＰＣＲ）増幅、およびＰＣＲ産物の分析を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定が、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体ポリペプチドまたはアミノ酸残基１５８を含むその一部を配列決定する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
被験者がヒト被験者である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
被験者が、腫瘍、ウイルス感染症、または同種もしくは病理学的免疫担当細胞と関連した疾患状態を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
被験者が腫瘍を有し、治療用抗体処置が腫瘍負担の減少を目標とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍がリンパ腫、特にＮＨＬである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ３である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
抗体が抗ＣＤ２０抗体、特にリツキシマブである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の治療的処置に対する被験者の応答を評価または査定するための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、被験者の応答を決定する方法、または治療用抗体で処置される被験者の治療プロトコールを適合させる方法を提供する。本発明は、悪性腫瘍、特にリンパ腫の患者に使用することができ、また最高の応答者を選択しかつ／または低応答者向けに処置条件またはプロトコールを調整するのに適する。
【背景技術】
【０００２】
序文
ヒトにおける様々な治療方針は、治療用抗体の使用を基本とする。これは、たとえば、標的細胞、特に罹患細胞、たとえばウイルス感染細胞、腫瘍細胞または同種異系免疫担当細胞を含む他の病原細胞を著減させるために開発された治療用抗体の使用を含む。一般に、このような抗体は、ＩｇＧ種、一般にＩｇＧ１およびＩｇＧ３の、モノクローナル抗体である。こうした抗体は、様々な種または起源由来の機能ドメインまたは特異性を含む、組換え抗体およびヒト化抗体であってもよい。このような治療用抗体の具体例は、ネズミ可変領域に連結したヒトγ１およびκ定常領域で作られるキメラ抗−ＣＤ２０  ＩｇＧ１モノクローナル抗体である、リツキシマブ（マブテラ（Mabthera）（登録商標）、リツキサン（Rituxan）（登録商標））である1。数年間にわたって、リツキシマブは、Ｂリンパ増殖性悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する治療方針をかなり修正してきた。原型を保ったヒト化ＩｇＧ１抗体の他の例としては、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に使用されるアレムツズマブ（alemtuzumab）（キャンパス１Ｈ（Campath-1H）（登録商標））、または乳癌の処置に使用されるトラスツズマブ（trastuzumab）（ハーセプチン（Herceptin）（登録商標））などがある。開発中の治療用抗体のさらなる例は、当該技術分野で開示されている。
【０００３】
これらの抗体は、特に腫瘍を処置するためのヒト治療の、新規な効果的な方法を代表するが、常に強力な効果を示すとは限らず、それらの使用は、それらに対する対象の応答を評価することにより改良することができる。たとえば、単独のまたは化学療法と併用したリツキシマブは、低中悪性度ＮＨＬ2〜8および高悪性度ＮＨＬ6,9の両者の処置に有効なことが証明されていたが、低悪性度ＮＨＬの患者の３０％〜５０％は、リツキシマブに対する臨床応答を示さなかった4,5。リンパ腫細胞上でのＣＤ２０発現レベル2、処置時における高い腫瘍負担の存在6または低い血清リツキシマブ濃度2が、一部の患者でリツキシマブの効果が欠如している理由であることが示唆されてきた。しかし、処置不成功の実際の原因は、大部分は不明のままである。
【０００４】
抗体処置に対する患者応答の評価を可能にする方法を利用できることにより、これらの製品の治療効力が大いに高められるであろう。しかし、このような治療用抗体の精確なインビボ（in vivo）作用様式は、明白に立証されていない。事実、インビトロ（in vitro）試験から、リツキシマブの様々な可能性のある作用様式（抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）10,11、補体依存性細胞傷害10,12,13、アポトーシスにつながる直接情報伝達14,15等々）が示唆されるが、インビボにおけるこれらの標的細胞著減抗体の明白な作用は、ヒトで立証されていない。さらに、ＡＤＣＣは細胞内病原体および腫瘍細胞の根絶における重要なエフェクター機構であるが、ＡＤＣＣの役割は未だ議論の余地がある12,13。
【０００５】
本発明は、ここで、治療用抗体に対する対象の治療的応答を査定するための新規な方法および組成物を提示する。本発明は、治療用抗体処置に対して最高の応答プロフィールを有する患者を選択する方法も提示する。本発明は、患者の応答を評価する事前工程を含む、治療用抗体で患者を処置する方法にも関する。本発明は、本発明を実施するのに適した組成物およびキットにも関する。本発明は、対象の応答を査定またはモニタリングするために、または抗体の作用様式を検証するために、臨床治験または実験環境でも使用することが可能である。
【０００６】
本発明は、ある程度、対象の遺伝子型と、治療用抗体処置に応答するその能力との間の相関関係の証明に基づく。より具体的には、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の遺伝子型が、治療用抗体処置に対する対象の応答と直接的な相関関係があることを示す。
【０００７】
３種類のＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩ）およびそれらのサブクラスは、ヒトでは、全て染色体１の長腕上に位置する、８つの遺伝子によりコード化されている。これらの遺伝子の幾つかは、異なる受容体特性を有するアロタイプを生成する機能的対立遺伝子多型を示す。これらの多型は、自己免疫性疾患または感染症19〜2ｌに対する罹病性を上昇させる遺伝因子として認定されてきた。これらの遺伝因子の１つは、アミノ酸１５８位にフェニルアラニン（Ｆ）またはバリン（Ｖ）のいずれかを有するＦｃγＲＩＩＩａをコード化する、ＦＣＧＲ３Ａにおける遺伝子二型性である22,23。この残基は、ＩｇＧ１−ＦｃγＲＩＩＩ共結晶化によって最近証明された24通り、ＩｇＧ１の下側のヒンジ領域と直接、相互に作用する。ヒトＩｇＧ１は、ホモ接合型ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆ型またはヘテロ接合型ナチュラル・キラー細胞（ＮＫ）よりホモ接合型ＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ型ＮＫに、より強く結合することが明白に証明されている22,23。
【０００８】
我々は、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型と、治療用抗体処置に対するインビボでの患者応答との間の、可能性がある相関関係の評価に着手した。我々の発明の根幹は、幾分は、上記遺伝子型と上記応答プロフィールとの間に非常に強い相関関係が存在し、１５８位にバリン残基が存在することは、高い応答率を示すという、予期せぬ発見に由来する。より具体的には、リツキシマブのみを受けており、応答率が非常に高い特殊な状況にある、以前に処置を受けていなかった濾胞性ＮＨＬ患者で、ＦＣＧＲ３Ａの遺伝子型特定を実施した5。ＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈ/Ｒは、ＦＣＧＲ３Ａと共に染色体１ｑ２２上に共局在化し、マクロファージＦｃγＲＩＩａ受容体をコード化するので、対照として決定した。
【０００９】
以前に処置を受けていなかった濾胞性非ホジキンリンパ腫のためにリツキシマブを受けていた患者４７例で、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ/Ｆ遺伝子型が決定された。２ヶ月（Ｍ２）および１年（Ｍ１２）に、臨床応答および分子応答を評価した。陽性の分子応答は、末梢血および骨髄の両者におけるＢＣＬ２−ＪＨ遺伝子再構成の消失として定義された。ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者は２１％であったが、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆホモ接合型およびヘテロ接合型患者（ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤー）は、それぞれ３４％および４５％であった。Ｍ２およびＭ１２における客観的応答率は、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者では１００％および９０％であったのに対して、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤーでは６５％（ｐ＝０．０２）および５１％（ｐ＝０．０３）であった。Ｍ１２で、ホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ患者の５/６に陽性の分子応答が確認されたのに対して、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤーではその５/１６であった（ｐ＝０．０４）。さらに、ホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ遺伝子型は、臨床応答および分子応答と関連した単一パラメーターであることが多変量解析で立証され、また低率の疾患進行度とも関連していた（ｐ＝０．０５）。
【００１０】
発明の効果
したがって、本発明は、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型と、治療用抗体に対する臨床応答および分子応答との間の関連を、初めて立証するものである。したがって、本発明は、患者の応答をモニター、評価または選択するために使用することができる第１の独特のマーカーを提供する。したがって、本発明は、悪性腫瘍、ウイルス感染症または病的細胞が対象に存在することに関連した他の疾患、特に非ホジキンリンパ腫の患者の管理に、新しい薬理遺伝学的方法を導入する。
【００１１】
本発明の目的は、対象のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型および／または上記被験者のＦｃγＲＩＩＩａ受容体に多型が存在することをインビトロで決定することを含む、治療用抗体処置に対する被験者の応答を査定する方法にある。より具体的には、本方法は、上記対象のＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型をインビトロで決定することを含む。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、被験者のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型および／または上記対象のＦｃγＲＩＩＩａ受容体に多型が存在することをインビトロで決定することを含む、治療用抗体処置に対する患者を選択する方法である。より具体的には、本方法は、上記被験者のＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型をインビトロで決定することを含む。
【００１３】
本発明のもう１つの目的は、被験者のＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型および／または上記被験者のＦｃγＲＩＩＩａ受容体に多型が存在することをインビトロで決定することを含む、被験者における治療用抗体処置の効力または処置条件またはプロトコールを改良する方法である。より具体的には、本方法は、上記被験者のＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型をインビトロで決定することを含む。
【００１４】
より具体的には、被験者のＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型をインビトロで決定することは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基（またはＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の対応するコドン）を決定することを含み、１５８位のバリンが上記処置に対するより良い応答を示し、１５８位のフェニルアラニンが上記処置に対する低い応答を示す。
【００１５】
本発明の中で、用語「治療用抗体または抗体」は、より具体的には、患者において、標的細胞を著減させる役目を果たす抗体を示す。このような標的細胞の具体例には、アレルギー、自己免疫疾患、同種異系反応等々に関与する腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、同種異系細胞、病理学的免疫担当細胞（たとえば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、抗原提示細胞等々）、または健康な細胞（たとえば、抗血管形成治療方針における内皮細胞）さえも含まれる。本発明の脈絡の中で最も好ましい標的細胞は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞である。治療用抗体は、たとえば、特に抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により、細胞障害作用または細胞融解を仲介することが可能である。ＡＤＣＣは、ＩｇＧ感作抗原をＦｃγＲ担持細胞障害性細胞に連結し、細胞活性化機構を始動させる機能を有する、ＩｇＧのＦｃ部分（ＦｃγＲ）に対する白血球受容体を必要とする。この作用機序は、ヒトでは、インビボで立証されていないが、このような標的細胞除去治療用抗体の効力の説明となる。治療用抗体は、ポリクローナルによってもよく、好ましくは、モノクローナルによってもよい。治療用抗体は、ハイブリドーマ、または所望の可変領域および定常領域を発現するように操作された組換え細胞により産生することが可能である。抗体は、一本鎖抗体であってもよく、または抗原特異性および下側のヒンジ領域を保持する他の抗体誘導体またはその変異体であってもよい。これらは、多機能抗体、組換え抗体、ＳｃＦｖ、人化抗体、またはそれらの変異体であってもよい。治療用抗体は、表面抗原、たとえば、膜抗原に特異的である。最も好ましい治療用抗体は、腫瘍抗原（たとえば、腫瘍細胞に特異的に発現される分子）、たとえば、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥｒｂＢ２（またはＨＥＲ２/Ｎｅｕ）、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＫＤＲ、ａＶβ３等々、特にリンパ腫抗原（たとえば、ＣＤ２０）に特異的である。治療用抗体は、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ３であり、より好ましくはＩｇＧ１である。
【００１６】
本発明の治療用抗体の代表例は、リツキシマブ、アレムツズマブ（alemtuzumab）およびトラスツズマブ（trastuzumab）である。このような抗体は、ヒト対象での使用に関して認可された臨床プロトコールに従って使用することができる。治療用抗体のさらなる具体例としては、たとえば、下表に記載の通り、エプラツズマブ（epratuzumab））、バシリキシマブ、ダシリツマブ、セツキシマブ、ラベツズマブ（labetuzumab）、セビルマブ（sevirumab）、ツブリマブ（tuvurimab）、パリビズマブ（palivizumab）、インフリキシマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、ナタリズマブ（natalizumab）、クレノリキシマブ等々が挙げられる：
【００１７】
【表１】
2005506093.tif 000002
【００１８】
本発明の脈絡の中で、対象または患者は、哺乳動物対象または患者、より好ましくはヒト対象または患者を含む。
【００１９】
本発明によれば、用語ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子は、対象における、ＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドをコードする核酸分子を指す。この用語は、特に、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ（プレ−ｒＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ等々）等々、またはそれらの配列の全部または一部を含む合成核酸を含む。合成核酸は、ＲＮＡから調製され、たとえば１つ以上のイントロン、または１つ以上の突然変異を含む部分として、ＦＣＧＲ３ＡゲノムＤＮＡの配列の少なくとも一部を含む、ｃＤＮＡを含む。最も好ましくは、用語ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ、一般に、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを指す。ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子は、好ましくは、ヒトＦＣＧＲＩＩＩａ遺伝子または核酸である、すなわち、ヒトＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドの配列を有するＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドの全部または一部をコードする核酸の配列を含む。このような核酸は、既知の技術により単離または調製することができる。たとえば、このような核酸は、ハイブリダイゼーション技術で、遺伝子ライブラリーまたは遺伝子バンクから単離することが可能である。また、このような核酸は、遺伝学的または化学的に合成することもできる。ヒトＦＣＧＲＩＩＩａ遺伝子の遺伝子編成を図２に示す。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列は、図３に示す。アミノ酸１５８位は、成熟タンパク質の残基１から番号が付けられている。アミノ酸１５８位は、シグナルペプチドを有するプレタンパク質の残基１７６に対応する。野生型ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の配列を、図４に示す（部分配列については、ジーンバンク（Genbank）寄託番号ＡＬ５９０３８５またはＮＭ＿０００５６９を参照されたい）。
【００２０】
本発明の脈絡の中で、一部または部分は、少なくとも３ヌクレオチド（たとえば、コドン）、好ましくは少なくとも９ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドを意味し、１０００ヌクレオチドも含むことができる。このような部分は、当該技術分野で周知の技術、たとえば、酵素的および／または化学的切断、化学合成またはそれらの組合せによって得ることができる。明確にするために、アミノ酸１５８位をコード化するＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の一部の配列を以下に示す：
【００２１】
【表２】
2005506093.tif 000003
【００２２】
上述の通り、本発明は、上記対象のＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型をインビトロで決定する方法を含む。これは、より詳細には、ＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドの１５８位に存在する（またはコード化される）アミノ酸残基の性質を決定することを含む。
【００２３】
上記対象におけるＦＣＧＲ３Ａ遺伝子または対応するポリペプチドの遺伝子型特定は、コーディング核酸分子またはコード化されたポリペプチドの分析を含む、様々な技術で達成することが可能である。分析は、配列決定、移動、電気泳動、免疫技術、増幅、特異的消化またはハイブリダイゼーション等々を含んでも良い。
【００２４】
ある特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定は、ＦＣＧＲ３Ａ受容体遺伝子またはＲＮＡまたはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むその一部を配列決定する工程を含む。
【００２５】
他の特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基決定は、ＦＣＧＲ３Ａ受容体遺伝子またはＲＮＡまたはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むその一部を増幅する工程を含む。増幅は、たとえば、従来の方法およびプライマーを使用して、単純ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはネステッドＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、実施することが可能である。
【００２６】
この点に関して、本発明で使用するための増幅プライマーは、より好ましくは、約５０未満のヌクレオチド、さらにより好ましくは、３０未満のヌクレオチド、一般に約２５未満または２０未満のヌクレオチドを含む。また、好ましいプライマーは、特異性を確実にするために、通常は少なくとも５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８ヌクレオチドを含む。プライマーの配列は、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の配列に基づいて、好ましくは、それと共に完全な補足性を与えるように調製することができる。放射能、蛍光、酵素的、化学的等々の既知の技術を使用して、プローブを標識することが可能である。この標識は、たとえばホスファー３２（Phosphor 32）、ビオチン（16-dUTP）、ジゴキシゲニン（11-dUTP）を使用することができる。当然のことながら、本発明は、特定の検出または標識技術に束縛または限定されるものではない。以下に開示する通り、プライマーは、増幅された核酸に対立遺伝子特異的制限部位を導入するための、制限部位をさらに含むことができる。
【００２７】
このような増幅プライマーの具体例は、たとえば、配列番号１〜４である。
【００２８】
当然のことながら、当業者は、他のプライマー、たとえば増幅工程で使用するためのＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の断片、および特に順方向配列および逆方向配列を含む１対のプライマーであって、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子のある領域とハイブリダイズし、コドン１５８を含むＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の少なくとも一部の増幅を可能にする上記対の上記プライマーをデザインすることができる。好ましい実施形態において、各対のプライマーは、コドン１５８と相補的であり、コドン１５８と重複し、かつ１５８Ｖ（ｇｔｔ）と１５８Ｆ（ｔｔｔ）との間の判別を可能にする、少なくとも１つのプライマーを含む。当業者は、周知の一般知識および明細書に記載の指針に基づいて、増幅条件も調節することができる。
【００２９】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、このように、細胞または生物学的サンプル中の、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用したＦＣＧＲ３ａ  ｍＲＮＡまたはｇＤＮＡの一部のＰＣＲ増幅であって、上記部分がコドン１５８を含むＰＣＲ増幅と、たとえば、電気泳動、特に変性剤ゲル濃度勾配電気泳動（Denaturing Gel Gradient Electrophoresis(DGGE)）によるＰＣＲ産物の直接または間接的分析とを含む。
【００３０】
他の特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定は、対立遺伝子特異的制限酵素消化の工程を含む。これは、ある特定の対立遺伝子（たとえば、１５８Ｖ対立遺伝子）のコード配列を切断し、他の対立遺伝子（たとえば、１５８Ｆ対立遺伝子、またはその逆）を切断しない制限酵素を使用することにより実施できる。このような対立遺伝子特異的制限酵素部位が配列中に天然に存在しない場合、このような部位を配列中に含む対立遺伝子特異的増幅プライマーを用いて核酸を増幅することにより、人工的にその中に導入することができる。増幅時の、対立遺伝子の存在の決定は、たとえば、電気泳動で、消化産物を分析することにより実行することが可能である。この技術は、選択された対立遺伝子に関して、ホモ接合型またはヘテロ接合型である対象の判別を可能にする。
【００３１】
対立遺伝子特異的増幅プライマーの例としては、たとえば、配列番号３などが挙げられる。配列番号３は、Ｎｌａｍ部位の第１の３ヌクレオチドを導入する。（５′−ＣＡＴＧ−３′）。Ｇの後ろで切断が起きる。このプライマーは、増幅産物の電気泳動分析を容易にするために、プライマーを伸長する、ＦＣＧＲ３Ａとハイブリダイズしない１１塩基と、制限部位をもたらすヌクレオチド３１（Ａ）を除き、ＦＣＧＲ３Ａにハイブリダイズする２１塩基とを含む。
【００３２】
さらなる特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定は、ＦＣＧＲ３Ａ受容体遺伝子またはＲＮＡまたはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むその一部と、遺伝子型バリンまたはフェニルアラニンに特異的な核酸プローブとのハイブリダイゼーション工程、およびハイブリッドの有無の決定を含む。
【００３３】
当然のことながら、上記の方法は、単独または様々な組合せのいずれでも使用することができる。さらに、ＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型を決定するための、当業者に周知の他の技術、たとえば増幅（たとえばＰＣＲ）、特異的プライマー、特異的プローブ、移動等々を使用する方法、一般的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＴＭＡ（転写介在増幅）、ＰＣＥ（酵素増幅イムノアッセイ）およびｂＤＮＡ（分岐ＤＮＡシグナル増幅）アッセイを使用することが可能である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基の決定は、以下を含む：
−生体サンプルからゲノムＤＮＡを得ること、
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子、またはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むその一部を増幅すること、および
−上記ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子の１５８位のアミノ酸残基を決定すること。
【００３５】
増幅は、上述の特異的プライマーを使用して、ネステッド（nested）ＰＣＲを含むＰＣＲのような特定の技術で遂行することができる。最も好ましい実施形態において、１５８位のアミノ酸残基の決定は、対立遺伝子特異的制限酵素消化により実施される。その場合、本方法は以下を含む。
−生体サンプルからゲノムＤＮＡを得ること、
−ＦｃγＲＩＩＩａ受容体遺伝子、またはアミノ酸残基１５８をコード化するヌクレオチドを含むその一部を増幅すること、
−対立遺伝子特異的制限部位を導入すること、
−上記制限部位に特異的な酵素で核酸を消化すること、および
−消化産物を分析すること、すなわち、電気泳動で、消化産物の存在は対立遺伝子の存在を示す分析。
【００３６】
他の特定の実施形態において、遺伝子型は以下を含む方法で決定される：インビトロまたはエキソビボ（ex vivo）での、細胞または生物学的サンプルまたは流体からの総（またはメッセンジャー）ＲＮＡ抽出、場合によりｃＤＮＡ合成、ＦＣＧＲ３Ａ−特異的オリゴヌクレオチドプライマーによる（ＰＣＲ）増幅、およびＰＣＲ産物の分析。
【００３７】
本発明の方法は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体ポリペプチド、またはアミノ酸残基１５８を含むその一部を配列決定することによって、またはＦｃγＲＩＩＩａポリペプチドの各対立遺伝子に特異的な試薬を使用することによって、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体の１５８位のアミノ酸残基を直接決定することも含んでもよい。これは、イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、ＲＩＡ等々）を含む、当業者に周知の適当な技術で決定することができる。これは、ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８ポリペプチドに特異的な親和性試薬、より好ましくは抗体またはその断片または誘導体を使用して、成すことができる。ある特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８ポリペプチドは、ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８ＶとＦｃγＲＩＩＩａ  １５８Ｆとを判別する抗ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８抗体（またはその断片）で、より好ましくはモノクローナル抗体で、検出される。抗体（または親和性試薬）は、任意の適当な方法（放射能、蛍光、酵素的、化学的等々）で標識することが可能である。あるいは、たとえば、抗ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８抗体に結合する、標識された、第２の試薬（たとえば、抗体）を使用して、ＦｃγＲＩＩＩａ  １５８抗体免疫複合体を明らかに（かつ／または定量化）してもよい。
【００３８】
上記の方法は、被験者の生体サンプル中のＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子型特定に基づく。生体サンプルは、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子または対応するポリペプチドを含む任意のサンプル、特に血液、骨髄、リンパ節または流体、特に血液またはＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子またはポリペプチドを含む尿であってもよい。さらに、ＦＣＧＲ３Ａ１５８遺伝子は一般に上述の細胞、組織または流体の中に存在するため、本発明の方法は通常、遺伝子またはポリペプチドを検出または分析に使用できるように処理したサンプルを使用する。処理は、従来の固定技術、細胞融解（機械的または化学的または物理的）、または、たとえば、免疫組織学または生物学で使用される他の従来の方法を含んでもよい。
【００３９】
本方法は、抗腫瘍治療用抗体処置に対する対象の応答を決定するのに特に適する。この点に関して、ある特定の実施形態において、対象は腫瘍を有し、治療用抗体処置は腫瘍負担の減少を目標とし、特に腫瘍細胞の著減を目標とする。より好ましくは、腫瘍はリンパ腫、たとえば、より好ましくはＢリンパ腫、特にＮＨＬである。上述の通り、抗体は好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ３、特に抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１またはＩｇＧ３であり、さらに好ましくはヒト化抗体、たとえば、リツキシマブである。
【００４０】
本発明は、二重特異性抗体にも関し、上記二重特異性抗体がＣＤ１６および腫瘍抗原、たとえば、ＣＤ２０抗原を特異的に結合することを特徴とする。本発明は、このような二重特異性抗体および薬学的に許容し得る賦形剤またはアジュバントを含む医薬組成物も包含する。
【００４１】
本発明のさらなる態様および利点は、本願を説明するものとみなすべきであり、本願をの範囲を限定するものとみなしてはならない、以下の実施例で開示する。
【実施例】
【００４２】
材料および方法
患者および処置
臨床治験デザイン、適格基準およびエンドポイント査定は、既報の通りである5。簡単に記載すると、ＲＥＡＬ分類26による、以前に処置を受けていない濾胞性ＣＤ２０陽性ＮＨＬを有していた場合、患者は、本試験に含めるのに適格であった。患者は、Ａｎｎ−Ａｒｂｏｒ分類による、ステージＩＩ〜ＩＶの疾患および少なくとも１つの測定可能な疾患部位を呈することが必要であった。全ての患者が、ＧＥＬＦ基準27による低い腫瘍負担を有することが必要であった。合計４回の、用量３７５mg/m2のリツキシマブ（フランスのヌイイにあるロシュ（Roche,Neuilly,France)）を静脈内注入で投与した（１、８、１５、２２日）。注入および有害事象の管理は、既報の通りである5。試験プロトコールは倫理委員会に承認され、全ての患者がインフォームドコンセントを与えた。
【００４３】
モニタリングおよびエンドポイント
ベースライン評価は、臨床検査、胸部Ｘ線、胸部、腹部および骨盤のコンピューター断層撮影（ＣＴ）、および片側の骨髄生検を含んでいた。含まれた患者の全ＣＴスキャンを再吟味した、独立した放射線医師団が、応答を査定した。一次効力エンドポイントは、客観的応答率、すなわち、国際専門委員会が最近提唱した基準による、完全寛解（ＣＲ）、未確認のＣＲ（ＣＲｕ）または部分的応答（ＰＲ）のいずれかを達成している患者の比率であった28。臨床応答は、５０日および７８日に評価した。最大の応答のみを考慮に入れ、その査定時点をＭ２と名づけた。１年（Ｍ１２）における進行について、全患者を評価した。Ｍ２に骨髄浸潤が消失し、かつＭ１２に、骨髄にリンパ腫細胞が再発したＣＲまたはＣＲｕの患者を、「進行性」と考え；Ｍ２に骨髄生検陰性であり、かつＭ１２に生検陽性であったＰＲの患者を、ＰＲ状態であると考えた。診断時に得たリンパ節、および診断時、Ｍ２およびＭ１２の、末梢血および骨髄の両者に対して、ＢＣＬ２−ＪＨ遺伝子再構成の分子分析を、前述5の通りに、ＰＣＲにより実施した。
【００４４】
ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ/Ｆ遺伝子型特定
臨床治験に含まれた患者５０例のうち１例を、組織学的再吟味後に除外し、他の２例について、ＤＮＡを入手できなかった。したがって、患者４７例を、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型分析に使用できた。全サンプルを同一試験室で分析し、交差汚染を回避するための予防措置を含む標準手順を使用して、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを、末梢血（ｎ＝４３）、骨髄（ｎ＝３）またはリンパ節（ｎ＝１）から単離した。Ｋｏｅｎｅら22による記載通りに、ネステッドＰＣＲに続いて対立遺伝子特異的制限酵素消化を用いて、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ/Ｆ多型の遺伝子型特定を実施した。簡単に記載すると、２種のＦＣＧＲ３Ａ特異的プライマー（５′−ＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧ−３′、配列番号１；５′−ＧＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＴＴＧＡＡ−３′、配列番号２）（フランスのLesUlisにあるユーロバイオ（Eurobio, Les Ulis, France)）を使用して、多型部位を含む１．２ｋｂの断片を増幅した。製造会社の推奨通り、ゲノムＤＮＡ  １．２５μg、各プライマー２００ng、２００μmol/Lの各ｄＮＴＰ（リトアニアのビリニュスにあるＭＢＩ・ファーメンタス（MBI Fermentas, Vilnius,Lithuania)）および１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（フランスのシャルボニエールにあるプロメガ（Promega,Charbonniere,France））を用いて、ＰＣＲアッセイを実施した。この第１のＰＣＲは、９５℃にて１０分、次いで３５サイクル（それぞれ、９５℃  １分間、５７℃  １．５分間、７２℃  １．５分間の３工程からなる）および完全な伸張を達成するための７２℃にて８分で構成されていた。第２のＰＣＲは、９４ｂｐの断片を増幅し、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ対立遺伝子のみにＮｌａＩＩＩ制限部位を作るプライマー（５′−ＡＴＣＡＧＡＴＴＣＧＡＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＧＧＧＣＡＴ−３′、配列番号３；５′ＡＣＧＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣ−３′、配列番号４）（ユーロバイオ（Eurobio））を使用した。このネステッドＰＣＲは、増幅されたＤＮＡ  １μl、各プライマー１５０ng、２００mol/Lの各ｄＮＴＰおよび１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼで実施した。第１のサイクルは、９５℃にて５分、次いで３５サイクル（それぞれ、９５℃  １分間、６４℃  １分間、７２℃  １分間の３工程からなる）および完全な伸張を達成するための７２℃にて９．５分で構成されていた。次いで、増幅されたＤＮＡ（１０μl）を、１０ＵのＮｌａＩＩＩ（イギリスのヒッチンにあるニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs,Hitchin,England)）で、３７℃にて１２時間消化し、８％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分離した。臭化エチジウムで染色した後、ＤＮＡバンドをＵＶ光で可視化した。ホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆ患者の場合、唯一の未消化バンド（９４ｂｐ）が見られた。ヘテロ接合型患者では３つのバンド（９４ｂｐ、６１ｂｐおよび３３ｂｐ）が見られたが、ホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ患者では、２つの消化されたバンド（６１ｂｐおよび３３ｂｐ）が得られただけであった。
【００４５】
ＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈ/Ｒ遺伝子型特定
Ｌｉａｎｇら28に従って、ＰＣＲに続く対立遺伝子特異的制限酵素消化により、ＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈ/Ｒの遺伝子型特定を実施した。Ｒ対立遺伝子の場合には、ＢｓｔＵＩ制限部位を作るために、センスプライマー（５′−ＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＣＧＣ−３′、配列番号５）（ユーロバイオ（Eurobio））を修飾しておき、内部コントロールの役目をする第２のＢｓｔＵＩ制限部位を担持するために、アンチセンスプライマー（５′−ＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＴＡＣＣＴＡＴＴＡＣＧＣＧＧＧ−３′、配列ＩＤ番号６）（ユーロバイオ（Eurobio））を修飾しておいた。ＰＣＲ増幅は、ゲノムＤＮＡ  １．２５μg、各プライマー１７０ng、２００μmol/Lの各ｄＮＴＰ、０．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および製造会社の緩衝液を用いて、５０μl反応で実施した。第１のサイクルは、９４℃にて３分に続いて３５サイクル（それぞれ、９４℃にて１５秒間、５５℃３０秒間、７２℃  ４０秒間の３工程からなる）および伸張を完成するための７２℃にて７分で構成されていた。次いで、増幅されたＤＮＡ（７μl）を、２０ＵのＢｓｔＵＩ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（MewEnglandBiolabs））で、６０℃にて１２時間消化した。ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型特定に関する記載の通りに、さらなる分析を実施した。ＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈおよび−１３１Ｒ対立遺伝子は、それぞれ３３７ｂｐおよび３１６ｂｐのＤＮＡ断片として、可視化された。
【００４６】
統計解析
適切な場合、χ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）を使用して、異なる遺伝子型群の患者の、臨床上の特徴および生物学的特徴ならびに臨床応答および分子応答を比較した。診断時の性別、年齢、（＞または≦６０才）、冒された節外部位数（２または＜２）、骨髄関与、ＢＣＬ２−ＪＨ構成状態およびＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型を含むロジスティック回帰分析を使用して、臨床応答および分子応答に影響する予後の独立変数を同定した。カプラン及びマイヤー（Kaplan and Meier）29の方法に従って無進行性生存率を算出し、処置開始から進行／再発または死亡までを測定した。ログランク（log-rank）検定を使用して、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型による無進行性生存率の比較を実施した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に有意であると考えた。
【００４７】
結果
臨床応答
ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ/Ｆ多型について試験した患者４９例のうち１０例（２０％）および１７例（３５％）が、それぞれ、ホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖおよびホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆであり、２２例（４５％）がヘテロ接合型であった。診断時の、性別、病期、骨髄関与、冒された節外部位数または末梢血および骨髄におけるＢＣＬ２−ＪＨ再構成の存在に関して、３つのグループに差はなかった（表１）。ホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ患者を、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤー（ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆホモ接合型およびヘテロ接合型患者）と比較したとき、またはホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆ患者を、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖキャリヤー（ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型およびヘテロ接合型患者）と比較したとき、差は認められなかった。ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆホモ接合型およびヘテロ接合型患者の、Ｍ２における客観的応答率は、それぞれ１００％（ＣＲ+ＣＲｕ＝４０％）、７０％（ＣＲ+ＣＲｕ＝２９％）および６４％（ＣＲ+ＣＲｕ＝１８％）であった（Ｐ＝０．０９）。ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者とＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤーとの間で、客観的応答率に有意差が認められ、この後者のグループの客観的応答率は６７％（ＣＲ+ＣＲｕ＝２３％）であった（相対危険度＝１．５；９５％ＣＩ、１．２〜１．９；Ｐ＝０．０３）（表２）。ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆホモ接合型患者とＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖキャリヤーとの間に、差は認められなかった。Ｍ１２における、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆホモ接合型およびヘテロ接合型患者の客観的応答率は、それぞれ、９０％（ＣＲ+ＣＲｕ＝７０％）、５９％（ＣＲ+ＣＲｕ＝３５％）および４５％（ＣＲ+ＣＲｕ＝３２％）であった（Ｐ＝０．０６）。処置後１年に、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型群とＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤーとの間で、客観的応答率に依然として差が存在し、この後者のグループでは、客観的応答率は５１％（ＣＲ+ＣＲｕ＝３３％）であった（相対危険度＝１．７；９５％ＣＩ、１.２〜２．５；Ｐ＝０．０３）。ロジスティック回帰分析から、ホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ遺伝子型は、Ｍ２（Ｐ＝０．０２）でもＭ１２（Ｐ＝０．０１）でも、臨床応答に関する唯一の予測因子であることが分かった。３年における無進行性生存率（平均フォローアップ：３５ヵ月；３１−４１）（図１）は、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者で５６％であり、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤー（ｎｓ）では３５％であった。ＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈ/Ｒ多型に関して分析した患者４５例のうち、９例（２０％）および１３例（２９％）が、それぞれＦＣＧＲ２Ａ−１３１ＲおよびＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈに関してホモ接合型であり、２３（５１％）例がヘテロ接合型であった。これらの３グループで、またはホモ接合型ＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈ患者とＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｒキャリヤーで、またはホモ接合型ＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｒ患者とＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈキャリヤーで、包含時の特徴またはリツキシマブ処置に対する臨床応答に、差はなかった（データ示さず）。
【００４８】
分子応答
診断時に、患者３０例（６４％）で、ＢＣＬ２−ＪＨ再構成が末梢血および骨髄の両者で検出されたため、さらなるフォローアップが可能になった。Ｍ２およびＭ１２において、患者２５例（ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者６例およびＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤー１９例）および患者２３例（ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者６例およびＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤー１７例）を、末梢血および骨髄の両者におけるＢＣＬ２−ＪＨ再構成について分析した（表３）。Ｍ２において、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者の３/６、およびＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤー（ｎｓ）の５/１９で、ＢＣＬ２−ＪＨ再構成の浄化が確認された。対照的に、Ｍ１２におけるＢＣＬ２−ＪＨ再構成浄化率は、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤー（５/１７）よりＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者（５/６）で高かった（相対危険度＝２．８；９５％ＣＩ、１.２〜６．４；Ｐ＝０．０３）。ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型遺伝子型は、Ｍ１２における、ＢＣＬ２−ＪＨ再構成浄化を示すより大きい確率と関連した唯一の因子である（Ｐ＝０．０４）ことが、ロジスティック回帰分析から分かった。Ｍ１２において、末梢血および骨髄で、依然としてＢＣＬ２−ＪＨ再構成を呈していたこのホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ患者１例は、リツキシマブ処置の２３ヵ月後にＣＲであった。対照的に、Ｍ２およびＭ１２における分子応答は、ＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈ/Ｒ多型による影響を受けなかった（データ示さず）。
【００４９】
考察
Ｂ細胞リンパ増殖性悪性腫瘍でリツキシマブの使用が増加しているため、処置不成功およびリツキシマブの作用様式について理解を深めることが必要である。この点に関して、我々は、明確な臨床上のおよび検査室的特徴を有する濾胞性ＮＨＬ患者でＦＣＧＲ３Ａを遺伝子型特定し、リツキシマブのみを投与した5。特に、診断時およびフォローアップの間に、この試験に含まれた全ての患者が、低い腫瘍負担ＮＨＬおよびＢＣＬ２−ＪＨａｔの分子分析を示した。この集団におけるＦＣＧＲ３Ａ対立遺伝子頻度は、一般的な白人集団のものに似ていた23,24。我々の結果から、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型と、リツキシマブに対する応答との間の関連が分かる。事実、集団の５分の１を占めるホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ患者は臨床応答を経験する確率が大きく、Ｍ２およびＭ１２に、それぞれ、１００％および９０％の客観的応答率を示した。さらに、ＢＣＬ２−ＪＨ再構成について分析を実施したＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者６例中５例が、Ｍ１２に分子応答を示したのに対して、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤーでは１７例中５例であった。ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合性は、臨床応答および分子応答と関連した唯一の因子であった。しかし、これらのより高い臨床応答および分子応答は、ホモ接合型ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ患者の無進行性生存率を有意に改善するためには、未だ不十分であった。
【００５０】
これは、リツキシマブに対する臨床応答および分子応答の両者に関する、容易に査定できる遺伝学的予測因子の第１報である。しかし、遺伝学的関連では、ＦｃγＲＩＩＩａを含むリツキシマブの作用様式が証明されてない。ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型と、リツキシマブに対する応答との間で認められた関連は、連鎖不平衡にある別の遺伝子多型に起因するのかもしれない。ＦＣＧＲ３Ａは、３つのＦＣＧＲ２遺伝子およびＦＣＧＲ３Ｂを含む染色体１の長腕上に位置する32ため、これらの多型は、３対立遺伝子ＦＣＧＲ３Ａ−４８Ｌ/Ｈ/Ｒ多型31のようにＦＣＧＲ３Ａそれ自体に位置することも、他のＦｃγＲ−コード化遺伝子に位置することもあり得る。ＦＣＧＲ２ＡとＦＣＧＲ３Ｂとの間で連鎖不平衡が報告されている33。しかし、ＦＣＧＲ２Ａ−１３１Ｈ/Ｒ多型はリツキシマブに対するより良好な応答と関連していなかったことにより、ＦＣＧＲ３Ａに非常に近い遺伝子またはＦＣＧＲ３Ａそれ自体が、直接関与することが強く裏付けられる。
【００５１】
幾つかのin vitro試験は、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ/Ｆ多型の直接関与を支持して論じている。第１に、Koeneら23は、先に報告した、３つのＦｃγＲＩＩＩａ−４８Ｌ/Ｈ/Ｒアイソフォーム31間のＩｇＧ結合の差は、連結したＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｖ/Ｆ多型の結果であることを示し、幾つかのチームは、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖアロタイプに関して個々のホモ接合型に由来するＮＫ細胞は、ヒト複合ＩｇＧ１に対してより高いアフィニティを有し、ＩｇＧ１感作標的に対して、より細胞障害性であることを証明した23,24,34。我々の今回の結果は、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者は、たぶん、そのキメラ・ヒトＩｇＧ１がＦｃγＲＩＩＩａにより良くインビボ結合するため、リツキシマブに対して、より良好な応答を示すことを実証するものである。第２に、ＮＫ細胞−およびマクロファージ介在ＡＤＣＣは、インビトロ8,11,12ならびにネズミ・モデルのインビボにおいて17〜19抗ＣＤ２０抗体により誘発される機構の１つであり、リツキシマブ介在アポトーシスは、ＦｃγＲ発現細胞により増幅される15,ｌ6。全てのＦｃγＲの中で、ＦｃγＲＩＩＩａはＮＫ細胞およびマクロファージに共有される唯一の受容体である。そこで我々は、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖ患者は、リンパ腫細胞に対してより良好なＡＤＣＣ活性を有するため、リツキシマブに対してより良好な応答を示すという仮説を立てた。ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆキャリヤーの５０％より多くが、それでもなおリツキシマブに対して臨床応答を示すという事実は、低いものの、それでも十分なＡＤＣＣ活性によって、または、より公算が高い、in vivoで機能する他の機構、たとえば、補体依存性細胞傷害、補体依存性細胞介在性細胞傷害1ｌ,ｌ3,ｌ4および／またはアポトーシス15,ｌ6によって、説明されるであろう。ＡＤＣＣは、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｖホモ接合型患者で特に有効なリツキシマブに対する応答における、補足的な機構と考えられる。
【００５２】
ＦＣＧＲ３Ａヘテロ接合型ドナー由来のＮＫ細胞へのＩｇＧ１結合レベルを有する「遺伝子用量」効果は、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８ＶおよびＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆホモ接合体23からのＮＫ細胞で見られたものの中間にあることがインビトロ試験から示唆される。しかし、ヘテロ接合型患者の臨床応答は、ＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆホモ接合型患者のものに似ているようである。より大きい患者群で実施されるさらなる試験は、インビボ「遺伝子用量」効果に不利な結論を下さなければならないであろう。
【００５３】
ＦｃγＲＩＩＩａは、リツキシマブに対するより良好な応答と強く関連しているため、ＣＤ２０抗原を標的とする新薬を開発する際に、考慮に入れる必要がある。たとえば、Ｂ細胞リンパ腫に罹ったＦＣＧＲ３Ａ−１５８Ｆ−キャリヤー患者を処置するために、遺伝子操作されたリツキシマブを使用できる可能性がある。事実、ＩｇＧ１の下側のヒンジ領域の様々な残基を修飾することによって、Ｓｈｉｅｌｄｓらは、最近、天然のＩｇＧ１より強力にＦｃγＲＩＩＩａ−１５８Ｆに結合するＩｇＧ１突然変異体を得た34。
【００５４】
総合すると、これらの結果から、患者ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子型の事前決定に基づいて、Ｂリンパ増殖性疾患に対する新たな治療方針を設定することが可能になる。この多型は、黒人および日本人を含む様々な民族集団で同一分布を有するため、このような方針は、世界的に応用することが可能である23,35,36。さらに、このような薬理遺伝学的方法は、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置に使用される他の原型を保ったヒト化ＩｇＧ１抗体、たとえば、キャンパス１Ｈ（Campath-lH）、または他の悪性腫瘍の処置に使用されるもの、たとえば、トラスツズマブ（trastuzumab）（ハーセプチン（Herceptin）（登録商標））にも応用することができる。さらに一般的には、この方法は、標的細胞を激減させるために開発された、他の原型を保った（ヒト化）治療用（ｌｇＧ１）抗体に応用することが可能である。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
【表４】
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【００５７】
【表５】
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【００５８】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＦｃγＲ３ａ−１５８Ｖ/Ｆ遺伝子型による、リツキシマブ処置後の無進行性生存率の調整済カプラン−マイヤー推定量（ｐ＝０．０５）を示す図である。
【図２】ヒトＦＣＧＲ３Ａ遺伝子の遺伝子編成を示す図である。
【図３】ヒトＦｃγＲＩＩＩａ１５８Ｆ（配列番号７）のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】ヒトＦＣＧＲ３Ａ１５８Ｆ（配列番号８）の核酸配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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