(57)【要約】本発明はシグナル配列が無いある種の前炎症性サイトカインの細胞からの非伝統的輸送を、銅の錯化および／または細胞に塩基性残基部分を欠くＳ１００Ａ１３の短縮形を投与することにより阻害することができるという知見に関する。さらに銅の錯化はとりわけ、血管損傷に伴う新内膜形成、マクロファージ浸潤および付随する炎症、細胞増殖、分泌、マクロファージ浸潤および付随する炎症、細胞増殖、細胞外マトリックスの分泌、内膜肥厚化、血管外膜新生、再狭窄等を阻害する。このように本発明はそのような状態を防止および処置するための、およびそのような状態の治療薬として有用でもある新規化合物を同定するための新規方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のインターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１  ）放出インヒビターを細胞に投与し、これにより該細胞からのＩＬ−１  放出を阻害することを含んでなる、細胞からのＩＬ−１  放出を阻害する方法。
【請求項２】
上記放出がストレスに誘導され、そしてさらに上記ＩＬ−１  放出インヒビターが銅キレーターおよびＳ１００Ａ１３またはそのフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記Ｓ１００Ａ１３フラグメントがＳ１００Ａ１３  ＢＲ短縮化タンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項４】
上記銅キレーターがテトラチオモリブデート（ＴＴＭ）である請求項４に記載の方法。
【請求項５】
ストレスが誘導する細胞からのＩＬ−１  の放出により媒介される状態を処置する方法であって、有効量の銅キレーターを該細胞に投与し、これにより該状態を処置することを含んでなる上記方法。
【請求項６】
哺乳動物の血管損傷後の新内膜形成を阻害する方法であって、該哺乳動物にＩＬ−１  放出阻害量の銅キレーターを投与し、これにより該新内膜形成を阻害することを含んでなる上記方法。
【請求項７】
哺乳動物の血管損傷後のマクロファージの浸潤を阻害する方法であって、該哺乳動物に有効量の銅キレーターを投与し、これによりマクロファージの浸潤を阻害することを含んでなる上記方法。
【請求項８】
上記マクロファージの浸潤が炎症を伴う請求項７に記載の方法。
【請求項９】
動脈壁損傷に伴う細胞増殖を阻害する方法であって、有効量の銅キレーターを該哺乳動物に投与し、これにより細胞増殖を阻害することを含んでなる上記方法。
【請求項１０】
上記細胞が血管平滑筋細胞であり、そしてさらに上記銅キレーターがＴＴＭであり、そして上記損傷がバルーン血管形成術により生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
損傷部位における細胞からのＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの非−伝統的輸送を阻害することを含んでなる、哺乳動物の動脈壁損傷後の細胞外マトリックスの分泌を阻害する方法であって、該輸送が有効量の銅キレーターを該哺乳動物に投与することにより阻害され、これにより該哺乳動物中での細胞外マトリックスの該分泌を阻害する上記方法。
【請求項１２】
損傷部位における細胞からのＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの非−伝統的輸送を阻害することを含んでなる、哺乳動物の動脈壁損傷に伴う新内膜の肥厚化を阻害する方法であって、該輸送が有効量の銅キレーターを該哺乳動物に投与することにより阻害され、これにより該哺乳動物中での新内膜の肥厚化を阻害する上記方法。
【請求項１３】
損傷部位における細胞からのＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの非−伝統的輸送を阻害することを含んでなる、哺乳動物の動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害する方法であって、該輸送が有効量の銅キレーターを該哺乳動物に投与することにより阻害され、これにより該哺乳動物中での血管外膜新生を阻害する上記方法。
【請求項１４】
哺乳動物の動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害するために有用な化合物の同定法であって、細胞を化合物と接触させ、そして温度ストレスに応答した該細胞によるリーダーレス前炎症性サイトカインの放出レベルを、該温度ストレスに応答し、該化合物とは接触しなかった点以外は同一の細胞からの該サイトカインの該放出レベルと比較することを含んでなり、ここで該化合物と接触しなかった点以外は同一の該細胞からの該サイトカインの放出レベルに比べて該化合物との該接触による該リーダーレス前炎症性サイトカインの放出レベルの減少が、該化合物が該血管新生を阻害する指標となり、これにより哺乳動物における動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害するために有用な化合物を同定する上記方法。
【請求項１５】
上記リーダーレス前炎症性サイトカインがＦＧＦ−１およびＩＬ−１  からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法により同定される化合物。
【請求項１７】
有効量のＩＬ−１  放出インヒビターを含んでなる、細胞からのＩＬ−１  放出を阻害するためのキットであって、さらにその使用のためのアプリケーターおよび使用説明資料を含んでなる上記キット。
【請求項１８】
有効量の銅キレーターを含んでなる、ストレスが誘導する細胞からのＩＬ−１  放出により媒介される状態を処置するためのキットであって、さらにその使用のためのアプリケーターおよび使用説明資料を含んでなる上記キット。
【請求項１９】
ＩＬ−１  放出阻害量の銅キレーターを含んでなる、哺乳動物の血管損傷後の新内膜形成を阻害するためのキットであって、さらにその使用のためのアプリケーターおよび使用説明資料を含んでなる上記キット。
【請求項２０】
有効量の銅キレーターを含んでなる、哺乳動物の血管損傷後の再狭窄を阻害するためのキットであって、さらにその使用のためのアプリケーターおよび使用説明資料を含んでなる上記キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
インターロイキン１（ＩＬ１）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）遺伝子ファミリーの原型の員は、インビトロおよびインビボでそれらの受容体−依存的炎症および血管新生活性についてよく認識されているが（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、これらの原型は小胞体−ゴルジ装置により媒介される古典的な分泌経路を通るそれらの輸送を支配するためのシグナルペプチド配列を欠いている（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。興味深いことには、それらの取るに足りない配列類似性にもかかわらず（非特許文献１３）、結晶学的研究によりＩＬ１およびＦＧＦ遺伝子ファミリーの原型の員は高レベルの構造的相同性を表すことが示された（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。ＦＧＦ遺伝子ファミリーはシグナルペプチド配列を欠くわずか３つの遺伝子に進化したが（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）、ＩＬ１遺伝子ファミリーの１０の員のうちの８つがこの構造的特徴を欠いている（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｋｕｍａｒ，ｅｔ  ａｌ．２０００）。したがってこの情報は最終的には炎症および血管新生−依存的反応（ｅｖｅｎｔ）の臨床的管理に価値があるのは明らかなので、輸送に関してこれらのシグナルペプチドが無いサイトカインが利用する非−古典的経路を理解し、そして定めることは重要である。
【０００２】
ＦＧＦ１およびＩＬ１αの原型の放出は、これらのポリペプチドの細胞外区分への輸送を媒介するために細胞性のストレスを利用する集中的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ではあるが異なる経路により調節される（非特許文献１８；非特許文献１９）。ＦＧＦ１は３０位の保存システイン残基の細胞内酸化を必要とする潜在的なホモダイマーとして、ストレスに対応して放出されることが知られている（非特許文献１９）。この反応によりＦＧＦ１はシナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）（Ｓｙｔ）１の小胞外ｐ４０ドメインおよびＳ１００Ａ１３と相互作用できるようになり（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）、そしてこれらの相互作用がｐ４０Ｓｙｔ１およびＳ１００Ａ１３を含む多タンパク質凝集物（ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ）としてＦＧＦ１の放出を促進する（非特許文献２３）。興味深いことには、温度のストレスが成熟形の放出を誘導するが、ＩＬ１αの前駆体の放出は誘導せず、前駆体ＩＬ１αの発現はストレスに応答したＦＧＦ１の放出を抑える（非特許文献１８）。
【０００３】
Ｃｙｓ３０ＦＧＦ１ホモダイマーの形成に必要な酸化的ストレスには、古典的なストレスが誘導する転写的応答の誘導を含まない。むしろＣｕ２＋に会合するＳｙｔ１およびＳ１００Ａ１３の能力が、ストレスに応答したこの多タンパク質輸送複合体の形成を調節するために利用される（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３）。さらに（ｉ）ＦＧＦ１、Ｓ１００Ａ１３およびＳｙｔ１はＣｕ２＋−結合タンパク質であり（非特許文献２４；非特許文献２３；非特許文献２５）、（ｉｉ）Ｃｕ２＋が誘導する酸化は無細胞系でＦＧＦ１、ｐ４０Ｓｙｔ１およびＳ１００Ａ１３複合体の自己集成を促進し（非特許文献２３）、（ｉｉｉ）Ｓ１００Ａ１３発現は転写に関係なくＦＧＦ１の放出を促進し（非特許文献２３）、そして（ｉｖ）Ｃｕ２＋キレーターであるテトラチオモリブデート（ＴＴＭ）はストレスに応答したＦＧＦ１の放出を阻害する（非特許文献２３）ので、細胞内Ｃｕ２＋の代謝がＦＧＦ１の放出を促進するストレスが誘導する酸化的反応に役割を果たしているらしい。しかし様々なプロセスおよび条件でのＩＬ−１の重要性にもかかわらず、その放出のメカニズムは十分に解明されなかった。さらにＩＬ−１の非伝統的（ｎｏｎ−ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ）放出における銅の役割があるとしても、理解されなかった。このように細胞からＩＬ−１  の放出に関するメカニズムの解明の必要性、ならびに細胞からこのサイトカインの放出により媒介される状態を処置または防止するために、そのような放出を阻害する治療薬の必要性が長い間存在する。本発明はこれらの必要性を満たす。
【０００４】
さらに経皮的冠状脈インターベンション後の再狭窄は患者の１０〜５０％で起こり、そしてインターベンショナルカルジオロジー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）のアキレス腱が残る（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０および非特許文献３１）。イン−ステント再狭窄は、血管弾性収縮力（ｖｅｓｓｅｌ  ｅｌａｓｔｉｃ  ｒｅｃｏｉｌ）ならびにネガティブな血管リモデリング（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｖｅｓｓｅｌ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）および血管収縮がさらに関与するバルーン血管形成術後の再狭窄とは明らかに異なるが、それらの両方に共通する組織学的にはほとんどが新内膜形成からなる本質的な病理学的プロセスも存在する（非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４；および非特許文献３５）。
【０００５】
新内膜発生は損傷に対する動脈壁の自然な応答であり、そして時間−依存的な動脈壁の炎症細胞の浸潤、ならびに増殖因子および炎症性サイトカインのアップ−レギュレーション（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に基づく（非特許文献３６および非特許文献３７）。これは血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）の血管中膜から内膜への移動を導き、内膜でそれらは増殖し、そして細胞外マトリックスを蓄積し続ける（非特許文献３８、非特許文献３９および非特許文献４０）。
【０００６】
ＩＬ−１  およびＦＧＦ１、ＩＬ１およびＦＧＦ遺伝子ファミリーの原型の員も、インビトロおよびインビボにおけるそれらの受容体依存的炎症およびマイトジェン活性についてよく認識されている（非特許文献４１、非特許文献４２、非特許文献４３、非特許文献４４および非特許文献４５）。血管新生の重要なメディエーターとして認識されるようになったＦＧＦ１も、移動、増殖、分化および生存を含む細胞の活動範囲の重要なレギュレーターである。ＦＧＦ１はまた冠状平滑筋細胞の有力なマイトジェンでもあるので、冠状脈インターベンション後の再狭窄の病因にもかなり寄与している（非特許文献４６）。さらに細胞外タンパク質としてのＩＬ−１  は、前炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインおよび内皮細胞活動のレギュレーターの両方としての多数の役割により、再狭窄に対して重要となり得る（非特許文献４７）。体内のＦＧＦ１の最も豊富な細胞供給源であるマクロファージを、炎症および／または生理学的ストレスの部位に集めることができるのは、炎症作用物質としてのＩＬ１機能を介してである。実際にバルーン損傷後のマクロファージ群の浸潤と新内膜形成との間には直接的な相関がある（非特許文献４８および非特許文献４９）。
【０００７】
ＦＧＦ１およびＩＬ１  の放出は、これらのポリペプチドの細胞外区分への輸送を媒介するためにストレスを利用する集中的ではあるが異なる経路により調節される（非特許文献１９；非特許文献１８）。ＦＧＦ１は３０位の保存システイン残基間のジスルフィド結合を通して形成される生物学的に不活性なホモダイマーとして、ストレスに対応して放出されることが知られている（非特許文献１９、非特許文献１８および非特許文献２５）。この反応によりＦＧＦ１は小さいカルシウム結合タンパク質であるＳ１００Ａ１３およびシナプトタグミン１（Ｓｙｔ１）の小胞外ｐ４０ドメインと相互作用できるようになり、ＦＧＦダイマーを、ｐ４０Ｓｙｔ１およびＳ１００Ａ１３を含む非共有的に結合した多タンパク質複合体の成分とする（非特許文献５０；非特許文献２１；および非特許文献２３）。ＦＧＦ１のように、ＩＬ１  はシグナルペプチドが無いタンパク質であり、その放出は損傷、炎症および低酸素のようなストレス条件により刺激される。
【０００８】
ネガティブリモデリングおよび再狭窄におけるＦＧＦ１およびＩＬ−１の重要な役割を示唆するこれまでの研究、および血管疾患の処置においてこれらのプロセスに関連した死亡率および罹患率の増加にもかかわらず、細胞からのこれらリーダーレス（ｌｅａｄｅｒ−ｌｅｓｓ）タンパク質の放出、および哺乳動物における再狭窄の処置および予防のための治療薬の開発に関するメカニズムを解明する必要性があると長い間考えられている。本発明はこれらの必要性を満たす。
【非特許文献１】
Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９４，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：１３１４−１３２５
【特許文献２】
Ｋｒａｋａｕｅｒ，１９８６，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２１３−２４４
【非特許文献３】
Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９８，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：４５７−４９９
【非特許文献４】
Ｍａｉｎｉ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５１：２０７−２２９
【非特許文献５】
Ｂｌｕｍ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５２：１５−２７
【非特許文献６】
Ｂｕｒｇｅｓｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｉａｇ，１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５８：５７５−６０６
【非特許文献７】
Ｆｒｉｅｓｅｌ  ａｎｄ  Ｍａｃｉａｇ，１９９９，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：７４８−７５４
【非特許文献８】
ＭｃＫｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１３５−１７６
【非特許文献９】
Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１５：１７７−１８６
【非特許文献１０】
Ｊａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：５４１−５４５
【非特許文献１１】
Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：５４５−５４８
【非特許文献１２】
Ｌｏｍｅｄｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：４５８−４６２
【非特許文献１３】
Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６４０９−６４１３
【非特許文献１４】
Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３：１２１−１２９
【非特許文献１５】
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３４４６−３４５０
【非特許文献１６】
Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：９０−９３
【非特許文献１７】
Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３４４１−３４４５
【非特許文献１８】
Ｔａｒａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５１４７−５１５１
【非特許文献１９】
Ｔａｒａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９０３９−２９０４２
【非特許文献２０】
Ｔａｒａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２２０９−２２２１６
【非特許文献２１】
ＬａＶａｌｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２２１７−２２２２３
【非特許文献２２】
Ｃａｒｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２２２４−２２２３１
【非特許文献２３】
Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２２５４４−２２５５２
【非特許文献２４】
Ｓｈｉｎｇ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９０５９−９０６２
【非特許文献２５】
Ｅｎｇｌｅｋａ  ａｎｄ  Ｍａｃｉａｇ，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１１３０７−１１３１５
【非特許文献２６】
Ｌｉｂｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：４１８−４１９
【非特許文献２７】
Ｓｅｒｒｕｙｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４：１３−１７
【非特許文献２８】
Ｓｅｒｒｕｙｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：４８９−４９５
【非特許文献２９】
Ｅｒｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１６７２−１６７８
【非特許文献３０】
Ｋａｓｔｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ，８７：３４−３９
【非特許文献３１】
Ｓｅｒｒｕｙｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１１１７−１１２４
【非特許文献３２】
Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８４：４６２−４６６
【非特許文献３３】
Ｍａｃｈ，２０００，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０：１６９９−１７００
【非特許文献３４】
Ｌａｆｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：９９６−１００２；
【非特許文献３５】
Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９３：１７１６−１７２４
【非特許文献３６】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７１：１３８−１４３
【非特許文献３７】
Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：２４６１−２４７０
【非特許文献３８】
Ｂｅｎｄｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：５３９−５４５
【非特許文献３９】
Ｆｉｓｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３７７−３８７
【非特許文献４０】
Ｗｅｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：２４７１−２４７８
【非特許文献４１】
Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５７５−６０６
【非特許文献４２】
Ｆｒｉｅｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：７４８−７５４
【非特許文献４３】
Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２：１０８−１１５
【非特許文献４４】
Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：１３１４−１３２５
【非特許文献４５】
Ｍａｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５１：２０７−２２９
【非特許文献４６】
Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１８９７−１９０５
【非特許文献４７】
Ｈａｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．，１４５：１００８−１０１４
【非特許文献４８】
Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：３０９８−３１０２
【非特許文献４９】
Ｐｉｅｔｅｒｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９１：１３２０−１３２５
【非特許文献５０】
Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５５４９−２５５５７
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
本発明は細胞からインターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１  ）の放出を阻害する方法を含む。この方法は有効量のＩＬ−１  放出インヒビターを該細胞に投与し、これにより該細胞からＩＬ−１  の放出を阻害することを含んでなる。
【００１０】
１つの観点では放出はストレスにより誘導され、そしてさらにＩＬ−１放出インヒビターは銅キレーターおよびＳ１００Ａ１３またはそのフラグメントからなる群から選択される。
【００１１】
さらに別の観点では、Ｓ１００Ａ１３フラグメントは短縮化タンパク質Ｓ１００Ａ１３  ＢＲである。
【００１２】
さらに別の観点では、銅キレーターはテトラチオモリブデート（ＴＴＭ）である。
【００１３】
本発明はストレスが誘導する細胞からのＩＬ−１  の放出により媒介される状態を処置する方法を含む。この方法は、有効量の銅キレーターを該細胞に投与し、これにより該状態を処置することを含んでなる。
【００１４】
本発明は哺乳動物の血管損傷後の新内膜形成を阻害する方法を含む。この方法は該哺乳動物にＩＬ−１  放出阻害量の銅キレーターを投与し、これにより該新内膜形成を阻害することを含んでなる。
【００１５】
本発明は哺乳動物の血管損傷後のマクロファージ浸潤を阻害する方法を含む。この方法は哺乳動物に有効量の銅キレーターを投与し、これによりマクロファージ浸潤を阻害することを含んでなる。
【００１６】
１つの観点では、マクロファージ浸潤は炎症を伴う。
【００１７】
本発明は動脈壁損傷に伴う細胞増殖を阻害する方法を含む。この方法は有効量の銅キレーターを該哺乳動物に投与し、これにより細胞増殖を阻害することを含んでなる。
【００１８】
１つの観点では、細胞は血管平滑筋細胞であり、そしてさらに銅キレーターはＴＴＭであり、そして損傷はバルーン血管形成術により生じる。
【００１９】
本発明は哺乳動物の動脈壁損傷後の細胞外マトリックスの分泌を阻害する方法を含む。この方法は損傷部位で細胞からＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの非−伝統的輸送を阻害することを含んでなり、そしてさらに輸送が有効量の銅キレーターを該哺乳動物に投与することにより阻害され、これにより該哺乳動物中での細胞外マトリックスの分泌を阻害する。
【００２０】
本発明は哺乳動物の動脈壁損傷に伴う新内膜の肥厚化を阻害する方法を含む。この方法は該損傷部位で細胞からＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの非−伝統的輸送を阻害することを含んでなり、そしてさらに輸送が有効量の銅キレーターを該哺乳動物に投与することにより阻害され、これにより該哺乳動物中での新内膜の肥厚化を阻害する。
【００２１】
本発明は哺乳動物の動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害する方法を含む。この方法は損傷部位で細胞からＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの非−伝統的輸送を阻害することを含んでなり、そしてさらに輸送が有効量の銅キレーターを哺乳動物に投与することにより阻害され、これにより該哺乳動物中での血管外膜新生を阻害する。
【００２２】
本発明は哺乳動物の動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害するために有用な化合物の同定法を含む。この方法は細胞を化合物と接触させ、そして温度ストレスに応答した細胞によるリーダーレス前炎症性サイトカインの放出レベルを、温度ストレスに応答して該化合物とは接触しなかった点以外は同一の細胞からの該サイトカインの放出レベルと比較することを含んでなり、ここで化合物と接触しなかった点以外は同一の細胞からのサイトカインの放出レベルに比べて化合物との接触によるリーダーレス前炎症性サイトカインの該放出レベルの減少は、化合物が血管新生を阻害する指標であり、これにより哺乳動物における動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害するために有用な化合物を同定する。
【００２３】
１つの観点ではリーダーレス前炎症性サイトカインはＦＧＦ−１およびＩＬ−１からなる群から選択される。
【００２４】
別の観点では、本発明はこの方法により同定される化合物を含む。
【００２５】
本発明は細胞からＩＬ−１  放出を阻害するためのキットを含む。このキットは有効量のＩＬ−１  放出インヒビターを含んでなり、キットはさらにその使用のためのアプリケーターおよび使用説明資料を含んでなる。
【００２６】
本発明は細胞からストレスが誘導するＩＬ−１  の放出により媒介される状態を処置するためのキットを含む。このキットは有効量の銅キレーターを含んでなり、キットはさらにその使用のためのアプリケーターおよび使用説明資料を含んでなる。
【００２７】
本発明は哺乳動物の血管損傷後の新内膜形成を阻害するためのキットを含む。このキットはＩＬ−１  放出阻害量の銅キレーターを含んでなり、キットはさらにその使用のためのアプリケーターおよび使用説明資料を含んでなる。
【００２８】
本発明は哺乳動物の血管損傷後の再狭窄を阻害するためのキットを含む。このキットは有効量の銅キレーターを含んでなり、キットはさらにその使用のためのアプリケーターおよび使用説明資料を含んでなる。
【００２９】
発明の詳細な説明
定義：
本明細書で使用するように、以下の用語はこの章でそれに関連する意味を有する。
【００３０】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１以上（すなわち少なくとも１）の文法的対象の物品を称する。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１要素または１より多くの要素を意味する。
【００３１】
本明細書で使用する用語「アプリケーター」は、分子または化合物（例えば限定するわけではないが化学化合物、抗体、核酸、タンパク質のようなＩＬ−１放出インヒビター）および／または本発明の組成物を哺乳動物に投与するために、限定するわけではないが皮下用シリンジ、ピペット、静脈内注入、局所用クリーム等を含む任意のデバイスを意味する。
【００３２】
「コードする」とは、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の定めた配列、またはアミノ酸の定めた配列およびそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子を合成するための鋳型として役立つ遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中の特別な配列に固有の特性をさす。すなわち遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物系であるタンパク質を生産する場合、そのタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、そして通常は配列表に提供されるコード鎖と、そして遺伝子またはｃＤＮＡの転写に鋳型として使用される非コード鎖は両方とも、タンパク質またはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードすると言うことができる。
【００３３】
本明細書で使用する用語「フラグメント」は核酸に適用する時、通常は少なくとも約２０個のヌクレオチド長、典型的には少なくとも約５０個のヌクレオチド、より典型的には約５０〜約２００個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約２００〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約３００個のヌクレオチド〜約４００個のヌクレオチド、より一層好ましくは少なくとも約４００〜約５００、さらにより一層好ましくは少なくとも約５００個のヌクレオチド〜約６００個のヌクレオチド、さらにより一層好ましくは少なくとも約６００個のヌクレオチド〜約７００個、さらにより一層好ましくは少なくとも約７００個〜約８００個のヌクレオチド、さらにより一層好ましくは少なくとも約８００〜約９００、さらにより一層好ましくは少なくとも約９００個のヌクレオチド〜約１０００個のヌクレオチド、さらにより一層好ましくは少なくとも約１０００〜約１１００、さらにより一層好ましくは少なくとも約１１００個のヌクレオチド〜約１２００個のヌクレオチド、さらにより一層好ましくは少なくとも約１２００〜約１３００、さらにより一層好ましくは少なくとも約１３００個のヌクレオチド〜約１４００個のヌクレオチド、さらにより一層好ましくは少なくとも約１４００〜約１５００、少なくとも約１５００〜約１５５０、さらにより一層好ましくは少なくとも約１５５０個のヌクレオチド〜約１６００個のヌクレオチド、さらにより一層好ましくは少なくとも約１６００〜約１６２０、そして最も好ましくは核酸フラグメントは約１６２５ヌクレオチド長よりも大きくなるだろう。
【００３４】
本明細書で使用する「相同的」とは２つの重合性分子の間、例えば２つの核酸分子の間、例えば２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子の間、または２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列類似性をさす。２つの両分子中のサブユニット位置が同じモノマー性サブユニットに占有されている時、例えば２つの各ＤＮＡ分子の１つの位置がアデニンで占められているならば、それらはその位置で相同的である。２つの配列間の相同性は対合するか、または相同的位置の数の直接的関数であり、例えば２つの化合物の配列で位置の半分（例えば１０個のサブユニット長のポリマー中の５個）が相同的ならば、２つの配列は５０％相同的であり、９０％の位置、例えば１０のうちの９が対合または相同的ならば、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’−ＡＴＴＧＣＣ−５’および３’−ＴＡＴＧＧＣ−５’は７５％の相同性を共有する。
【００３５】
本明細書で使用する「細胞からのＩＬ−１  放出を阻害する」とは、細胞のインビトロ培養から得た組織培養基中に検出され得るＩＬ−１  のレベルのような細胞外のＩＬ−１  のレベルの任意の検出可能な減少、またはインビボまたはインビトロで細胞に由来するか、または接触した体液中に検出され得るＩＬ−１  レベルの任意の減少を媒介することを意味する。
【００３６】
用語「ＩＬ−１  放出インヒビター」には限定するわけではないが、細胞に化合物を投与する前の同じ細胞から放出されたＩＬ−１  のレベルと比べて、または化合物を投与しない点以外は同一の細胞から放出されたＩＬ−１  のレベルと比べて、細胞から放出されるＩＬ−１  のレベルにおいて検出可能な減少を媒介する任意の物質または化合物を含む。
【００３７】
本明細書で使用する「使用説明資料」とは、本明細書で引用した種々の疾患または障害の緩和を行うために、キット中の本発明の核酸、ペプチドおよび／または組成物の実用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図表または他の任意の表現媒体を含む。任意に、または場合により使用説明資料は、哺乳動物の細胞または組織における疾患または障害を緩和し、および／または有用な化合物を同定するための１以上の方法を記載することができる。本発明のキットの使用説明資料は、例えば本発明の核酸、ペプチド、化学化合物および／または組成物を含む容器に貼ることができ、あるいはペプチド、化学化合物および／または組成物を含む容器と一緒に輸送することができる。あるいは使用説明資料は使用説明資料および化合物が受容者により協調して使用されることを意図して容器とは別に輸送してもよい。
【００３８】
「単離された核酸」とは自然に存在する状態でそれを挟む配列、例えばフラグメントに通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメント、例えば自然に存在するゲノム中のフラグメントに隣接する配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメントをさす。この用語は、核酸に自然に付随する他の成分、例えば通常は細胞中に付随するＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用する。したがってこの用語には、例えばベクターに、自律複製プラスミドまたはウイルスに、または原核または真核生物のゲノムＤＮＡに包含されるか、または他の配列から独立して別個の分子として存在する（ｃＤＮＡまたはゲノムもしくはＰＣＲまたは制限酵素消化により生成されるｃＤＮＡフラグメントのような）組換えＤＮＡを含む。またさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。
【００３９】
２つのポリヌクレオチドが「操作可能に連結された」と記載することは、一本鎖または二本鎖核酸部分が、２つのポリヌクレオチドの少なくとも１つの特徴とされる生理学的効果をもう１方に及ぼすことができる様式で、核酸部分内に配列されている２つのポリヌクレオチドを含んでなることを意味する。例として遺伝子のコード領域と操作可能に連結されたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。
【００４０】
好ましくは所望するタンパク質をコードする核酸がさらにプロモーター／調節配列を含んでなる時、プロモーター／調節配列は細胞中で所望するタンパク質の発現を駆動するように、所望のタンパク質コード配列の５’末端に配置される。所望のタンパク質をコードする核酸およびそのプロモーター／調節配列は一緒に「導入遺伝子」を構成する。
【００４１】
「構成的」発現は、遺伝子産物が細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で生きている細胞中で生産される状態である。
【００４２】
「誘導性」発現は、遺伝子産物が細胞中のシグナルの存在に応答して生きている細胞中で生産される状態である。
【００４３】
「組換えポリペプチド」は組換えポリヌクレオチドの発現で生産されるものである。
【００４４】
「ポリペプチド」は、アミノ酸残基からなるポリマー、関連する自然に存在する構造変異体、およびペプチド結合により連結されたそれらの合成の自然には存在しない同族体、関連する自然に存在する構造変異体、およびそれらの合成の自然には存在しない同族体をさす。合成ポリペプチドは、例えば自動化ポリペプチド合成機を使用して合成することができる。
【００４５】
用語「タンパク質」は典型的には大きなポリペプチドをさす。
【００４６】
用語「ペプチド」は典型的には短いポリペプチドをさす。
【００４７】
本明細書で使用する用語「トランスジェニック哺乳動物」は哺乳動物を意味し、その生殖細胞は外因性の核酸を含んでなる。
【００４８】
本明細書で使用する「処置する」とは、哺乳動物が経験する疾患または状態の症状の頻度を減少させること、または哺乳動物の疾患の自然な経過および／または進行を改変することを意味する。
【００４９】
本明細書で使用する用語「抗体」は、抗原上の特異的エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子をさす。抗体は自然な供給源または組換え源に由来する完全な免疫グロブリンであることができ、そして完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は典型的には四量体の免疫グロブリン分子である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む種々の形態で存在することができる（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、抗体を使用して：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、抗体：ア  ラボラトリーマニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６）。
【００５０】
本明細書で使用する用語「合成抗体」は、例えば本明細書に記載するバクテリオファージにより発現される抗体のような組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味する。この用語は抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により生成された抗体を意味するとも解釈すべきであり、そしてこのＤＮＡ分子は抗体タンパク質または抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここでＤＮＡまたはアミノ酸配列は当該技術分野で利用可能であり、しかも周知な合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技法を使用して既に得られている。
【００５１】
ポリヌクレオチドの「部分」は、ポリヌクレオチドの少なくとも約１５〜約５０個の連続的ヌクレオチド残基を意味する。ポリヌクレオチドの部分は、ポリヌクレオチドの各ヌクレオチド残基を含むことができると理解される。
【００５２】
本明細書で使用する用語「特異的に結合する」とは、キチナーゼ−様分子を認識し、そして結合するか、サンプル中の他の分子は実質的に認識せず、または結合しない抗体を意味する。
【００５３】
「予防的」処置は、疾患に関連する病状を発生する危険性を下げる目的で、疾患の徴候を表さないか、または疾患の初期の徴候を表す個体へ投与される処置である。
【００５４】
本明細書で使用する用語である疾患を「防止」するとは、キチナーゼ−様分子を投与した時に、インヒビターの不存在下での発生および／または症状と比べて疾患の発生が遅れること、および／または疾患の症状が強さおよび／または頻度において減少することを意味する。
【００５５】
「治療的」処置は、これらの徴候を縮小または排除するために、病理学的徴候を現す個体に投与される処置である。
【００５６】
説明
本発明は、ストレスに応答した細胞からリーダーレスペプチド、ＩＬ−１  の非伝統的輸送を阻害するための新規方法を提供する。この方法はとりわけ、リーダー配列を欠くＩＬ−１が、高分子量タンパク質複合体の形成を介してストレスに応答した細胞から放出されるという知見に基づく。さらに複合体の形成は銅および、ＩＬ−１  とＳ１００Ａ１３間の相互作用により媒介され、かつ／または要求する。さらに本発明はＩＬ−１  の放出を阻害するための銅キレーターの投与に関する。さらに本発明はＳ１００Ａ１３の少なくとも一部、好ましくは完全長分子の塩基性残基部分を欠くＳ１００Ａ１３の短縮化形を使用して、ＩＬ−１  の放出を阻害するための新規方法を提供する。
【００５７】
本発明は銅キレーターを使用して、細胞から前炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１  およびＦＧＦ１の非伝統的放出を阻害する新規方法を提供する。さらに本発明は、血管に対する損傷後に中でもとりわけ再狭窄、マクロファージ浸潤、新内膜形成、新内膜の肥厚化、細胞増殖、細胞外マトリックスの蓄積等の阻害に関する。これは本明細書中のいたるところでより詳細に説明するように、本明細書に開示するデータが、銅錯化化合物を使用した例えばＩＬ−１  および／またはＦＧＦ１の放出阻害が再狭窄、マクロファージ浸潤、新内膜形成、細胞増殖、細胞外マトリックスの蓄積等を含む細胞性応答を抑制することを示すからである。そのようなプロセスの阻害はそれに伴う様々な状態を処置し、または防止し、したがって発明は細胞ストレスおよび損傷に応答する細胞からサイトカインの非伝統的輸送により媒介される状態を処置し、または防止するために有用な新規治療薬を提供する。
【００５８】
Ａ．細胞からの非−伝統的タンパク質輸送の阻害法
本発明は細胞からのインターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１  ）の放出を阻害する新規方法を提供する。この方法はＩＬ−１  放出インヒビターを投与し、これにより細胞からＩＬ−１  の非伝統的輸送を防止することを含んでなる。そのようなインヒビターには限定するわけではないが、銅キレーター、Ｓ１００Ａ１３分子またはそのフラグメントを含む。これは本明細書に開示するデータが、リーダー配列を欠き、しかも伝統的なＥＲ−ゴルジタンパク質放出メカニズムを介して細胞から放出されないＩＬ−１  の非伝統的輸送に高分子量タンパク質複合体の形成が必要であり、そしてＩＬ−１  の輸送は銅キレーターの投与により、あるいはタンパク質の塩基性残基ドメインを欠くＳ１００Ａ１３の短縮変更体を投与することより阻害されることを初めて証明するからである。
【００５９】
当業者は本明細書に提供された開示に基づき、ＩＬ−１  輸送の阻害を示すために使用するキレーターはＴＴＭであったが、本発明はこの特定の銅キレーターの使用には全く限定されないと理解するだろう。むしろ当業者は、本発明が細胞中で生物学的に利用可能な銅のレベルを下げる任意の銅キレーターを包含すると考えるだろう。すなわち銅キレーターは金属が細胞プロセスに参加できないように銅に結合する。当業者は本明細書の教示から着手すれば、銅キレーターが細胞中で生物学的プロセスに銅の参加を阻害する当該技術分野で周知の広い多量の化合物、および将来開発されるそのような化合物を包含すると容易に考えるだろう。このようにＴＴＭはそのような銅キレーターの１例にすぎず、本発明はこの、または他の銅キレーターに限定されない。
【００６０】
同様に当業者は本明細書に提供する開示に基づき、本発明が細胞からのＩＬ−１  輸送を阻害するためにＳ１００Ａ１３の特定のフラグメント（すなわちＳ１００Ａ１３  ＢＲ）に限定されないことを理解するだろう。すなわち当業者は本明細書に提供する教示から着手すれば、Ｓ１００Ａ１３の種々のフラグメントはＩＬ−１  の輸送が阻害されるようにＳ１００Ａ１３とＩＬ−１との相互作用を阻害するために使用できると考えるだろう。これは本明細書に提供する開示が、Ｓ１００Ａ１３のフラグメントまたは変異体がＩＬ−１  の輸送を阻害するかどうかを決定する方法を提供するからであり、そして当業者は評価されるＳ１００Ａ１３フラグメントまたは変異体の不存在下でストレスに応答した細胞からのＩＬ−１  輸送レベルに比べて、ＩＬ−１  の輸送を阻害する所望する特徴を現すＳ１００Ａ１３のフラグメントおよび変異体を同定し、そして単離することができる。そのような実験は当該技術ではそのような所望の特性を有するものについて、日常的にそのようなタンパク質変異体をおよびフラグメントをスクリーニングしているので、当業者にとって不当ではない。すなわち本明細書に説明するアッセイ、または細胞からタンパク質の輸送を検出するために当該技術分野で既知のようなアッセイを使用して、日常業務をする人がストレスに応答した細胞からＩＬ−１  の輸送を阻害するＳ１００Ａ１３のさらなるフラグメントまたは変異体を単離することができる。したがって本発明はタンパク質として、またはタンパク質をコードする核酸のいずれかとしてＳ１００Ａ１３  ＢＲ、および本発明に提供する開示に基づき当業者により容易に同定され得るそれら種々のフラグメントを投与することを包含する。
【００６１】
さらに本発明は、ストレスが細胞を高温に暴露することであるストレスに応答したＩＬ−１  の放出を選択的に阻害することができることを証明するが、本発明はこの種のストレスに限定されない。すなわち当業者は本明細書に提供する開示に基づき、限定するわけではないがストレスにより媒介される熱（例えば熱ショック）を含む種々の細胞性ストレッサーに応答したＩＬ−１  の放出を阻害することを包含する。代わりに当業者は、本発明が限定するわけではないが熱を含む広範な種々のストレスの結果として細胞からＩＬ−１  の放出を阻害する方法を包含する。
【００６２】
本発明はさらに細胞からのＩＬ−１  のストレスが誘導する放出により媒介される状態の処置法を包含する。この方法は有効量の銅キレーターを細胞に投与することを含んでなる。これは既に本明細書のいたるところで検討しているように、例えば中でもＴＴＭを使用して銅を錯化することにより生物学的に利用可能な銅のレベルを下げることが細胞からＩＬ−１  の放出を阻害するこが見いだされたからである。したがって当業者は状態が細胞からのＩＬ−１  放出により媒介される場合、そのような状態は処置が細胞からＩＬ−１  の輸送を阻害するので銅キレーターを投与することにより処置できると理解するだろう。
【００６３】
当業者は投与するキレーターの同一性および／または量は、製薬分野で既知の十分に確立された基準に従い容易に決定できると考えるだろう。同様に投与経路および投薬処方も、本明細書に提供する開示に基づき当業者により容易に決定できる。例えば本明細書に開示するデータは、血漿セルロプラスミンのレベルが銅のレベルの指標として役立つことができ、そしてまた銅錯化治療の効力を評価するためにも使用でき、これにより用量、投与経路等を決定することができることを示す。さらにインヒビターの有効用量は処置の前、最中および後に細胞からのＩＬ−１  放出のレベルを測定することにより評価することができ、これによりＩＬ−１  放出インヒビターの効果的レベルを評価する。
【００６４】
特定の投与または処置計画に限定されることは望まないが、本明細書に開示するデータは当業者がいったん本発明の教示から着手すれば、技術的に認識されているヒトの再狭窄の動物モデルを使用して、本明細書に例示する投与および処置計画を決定することができることを示す。すなわちいったん本明細書に提供する教示から着手すれば、当業者は薬理学的分野で周知な種々のパラメーターから考えて特別に使用する各銅キレーターについて、本明細書に開示されるように用量、投与経路、投与処方等を決定することができる。そのようなパラメーターは限定するわけではないが、処置する状態、処置する哺乳動物の年齢、体重および状態、および当業者には周知であるこれらのおよび他の因子を含む。したがって当業者は細胞からＩＬ−１  の放出を阻害することにより処置される各状態について、用量および処方を容易に決定できる。
【００６５】
Ｂ．処置および防止法
本発明は哺乳動物の血管損傷後の新内膜形成を阻害する方法を包含する。この方法は哺乳動物にＩＬ−１  放出阻害量の銅キレーターを投与することを含んでなる。これはすでに本明細書中のいたるところで検討したように、銅キレーターの投与は細胞からのＩＬ−１  放出を阻害するので、哺乳動物への銅キレーターの投与が細胞からのＩＬ−１  放出の輸送により媒介される疾患を処置または防止するからである。そのような疾患には限定するわけではないが血管損傷後の新内膜形成を含む。特定の理論に拘束されることを望まないが、本明細書に開示するデータは、バルーン血管形成術により媒介される血管損傷後のヒト再狭窄の技術的に認識されているモデルで、銅キレーター、ＴＴＭの投与が新内膜形成を阻害したことを証明する。このように当業者は本発明の教示から着手すれば、本発明が銅キレーターを哺乳動物に投与することにより哺乳動物における新内膜形成を阻害する方法を含むと理解するだろう。
【００６６】
すでに本明細書のいたるところで指摘したように、本明細書に開示するデータは高分子量タンパク質複合体の形成、そして引き続いて前炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１  およびＦＧＦ１）の放出には銅およびＩＬ−１  とＳ１００Ａ１３との相互作用が必要であることを示す。より具体的にはデータは、例えば有力なキレーターであるＴＴＭを使用した銅の錯化が、ストレスに応答した細胞からのＩＬ−１  放出を阻害したことを初めて証明する。
【００６７】
また当業者は本明細書に提供し、そして本明細書のいたるところで検討した開示に基づき、本発明が細胞からＩＬ−１  およびＦＧＦ１の非伝統的輸送を阻害するための広範な種類の銅錯化化合物の使用を包含すると考えるだろう。すなわちいったん本発明の教示から着手すれば、当業者は本発明が将来開発されるかもしれないそのような化合物を含め、細胞中で利用できる銅のレベルを低下させるＴＴＭ以外の化合物の使用を含むと理解するだろう。当業者は本明細書のいたるところで初めて証明するように、銅キレーターが細胞からのＩＬ−１  およびＦＧＦ１放出を阻害することができると理解するだろう。これらの教示から着手すれば、当業者は本発明がＴＴＭ、または特に任意の他の銅キレーターの使用に限定されることは全く無いと理解し；代わりに当業者は本発明が限定するわけではないがＴＴＭを含む広範で膨大な数の銅−錯化化合物の使用を含むと理解するだろう。
【００６８】
さらに当業者は、投与されるキレーターの量が製薬分野で知られている十分に確立された基準に従い容易に決定できると理解するだろう。同様に、投与経路および投与処方も本明細書に提供する開示に基づき当業者により容易に決定することができる。例えば本明細書に開示するデータは、血漿セルロプラスミンのレベルが生物学的に利用可能な銅（例えば細胞のプロセスに参加することができる銅）のレベルの指標として役立つことができ、そしてまた銅錯化治療の効力を評価するための用量、投与経路等を決定するために使用することができることを示す。
【００６９】
特定の用量または処置計画に限定されることを望まないが、本明細書に開示するデータは当業者がいったん本発明の教示から着手すれば、ヒト再狭窄の技術的に認識された動物モデルを使用して本明細書に例示されるように用量および処置計画を決定することができることを示す。すなわち本明細書に開示するデータは、さまざまな量の銅キレーター、ＴＴＭの投与、および種々の投薬用量および処置計画により、バルーン血管形成術に伴う血管傷害のラットモデルにおいて、新内膜形成の成功裏の阻害を示す。さらに本明細書に開示するデータは、銅キレーターが単に飲料水に化合物を含めることにより経口的に投与することができることを示す。しかし当業者は本発明が特定の用量または投与経路に限定されないと考えるだろう；むしろ化合物は広いさまざまな経路および投与用量および計画を介して投与することができ、本発明はそれらも包含する。
【００７０】
すなわちいったん本明細書に提供する教示から着手すれば、当業者は本明細書に開示するように使用する各銅キレーターについて、そして薬理学的分野で周知の種々のパラメーターに従い決定して、用量、投与経路、投与処方等を調整することができる。そのようなパラメーターには限定するわけではないが、処置する状態、および処置する哺乳動物の年齢、体重および状態を含む。
【００７１】
当業者は本発明の教示から着手すれば、再狭窄のラットモデルを使用して本明細書に例示されるような処置する各哺乳動物に関する用量および処置計画は、関連分野で周知の方法を使用して容易に決定することができると理解するだろう。すなわち当業者は形成される新内膜のレベルを、例えば本明細書のいたるところに開示されているように、とりわけキレーターが投与された動物の血清セルロプラスミン活性、Ｉ／Ｍ比、マクロファージによる浸潤、細胞外マトリックスの蓄積、細胞増殖のレベル等をキレーターが提供されていない点以外は同一である動物中のレベルと比較することにより測定できると考えるだろう。当業者は本明細書に提供される開示に基づき、キレーターの量を容易に調整でき、そしてその治療効果は処置の過程中に監視することができ、そして最適なパラメーターを試験する各哺乳動物について決定することができると理解するだろう。
【００７２】
当業者は本明細書に詳細に記載する方法を含む本開示から着手する時、本発明が一度再狭窄が起こった新内膜形成の阻害に限定されるものではないと考えるだろう。特に、再狭窄が起こる必要はなく、そしてキレーターは新内膜形成を防止するために予防的に投与することができる。このように本明細書に開示するデータは、血管損傷前および後に投与される銅キレーターが新内膜の形成を防止することができるので、新内膜形成そしてその任意の再狭窄または悪影響を防止することができるので、本発明の方法はいったん再狭窄が起こった時にそれを処置するだけではなく実際に再狭窄を防止できることを証明する。
【００７３】
当業者は本明細書の開示から着手する時、ＩＬ−１  および／またはＦＧＦ１の放出を阻害することがそのような前−炎症性サイトカインの放出により媒介される疾患または状態を防止するために使用できると考えるだろう。そのような疾患または状態には限定するわけではないが、新内膜形成、再狭窄、マクロファージ浸潤、細胞増殖、内膜／中膜比の上昇等を含む。これらの病因および本明細書のいたるところに開示した方法を考慮すると、当業者は疾患が銅キレーターの投与により阻害することができる前−炎症性応答に関連する哺乳動物の炎症性疾患を認識し、そして防止できると認識することができる。これは本明細書に開示されたデータが、限定するわけではないがＴＴＭを含む銅キレーターの投与により哺乳動物の再狭窄ならびに他の応答（すなわちマクロファージ浸潤、内膜／中膜比の上昇、細胞外マトリックスの蓄積および細胞増殖）を防止したことを証明するからである。したがって当業者は本明細書のいたるところに提供する開示に基づき、本発明が哺乳動物の疾患を防止し、そして銅キレーターを投与することを含んでなる方法を含むと考えるだろう。
【００７４】
本発明は本発明の方法を実施するためにＩＬ−１  インヒビターの投与を包含する：当業者は本明細書に提供する開示に基づき、適当なＩＬ−１  ／ＦＧＦ１インヒビター、例えば銅キレーター（例えばＴＴＭ）をどのように配合し、そして哺乳動物に投与するかを理解するだろう。実際に本明細書に例示されるように、銅キレーターの成功裏の投与が徹底的に適合されて実施された。しかし本発明は特定の投与法または処置計画に限定されない。技術的に認識された血管損傷のモデルを使用して実施するための徹底的な適合を含め、本明細書に提供する開示を授けられた当業者が、銅キレーターの投与法を薬理学的分野における１つの技術により容易に決定できると考えるのは真実である。
【００７５】
より具体的には、本明細書に開示するデータはＩＬ−１  ／ＦＧＦ１の非伝統的輸送が、細胞増殖、マクロファージ浸潤、細胞外マトリックスの蓄積、再狭窄、新内膜形成、Ｉ／Ｍ比の上昇等を媒介し、または相関し、そしてそのような輸送が銅キレーターを使用して阻害できることを証明する。したがって本明細書に提供する開示に基づき、当業者は銅キレーターがこれら種々の疾患を処置するために使用できると考えるだろう。
【００７６】
本明細書で使用する用語「製薬学的に許容され得る担体」とは、適当なＩＬ−１  放出−インヒビターと合わせることができ、そして合わせた後に適当なＩＬ−１  放出インヒビター、例えば銅キレーターを哺乳動物に投与するために使用できる化学的組成物を意味する。
【００７７】
本発明を実施するために有用な製薬学的組成物は、約０．１ｎｇ／ｋｇ／日から１００ｍｇ／ｋｇ／日の間の用量を送達するために投与され得る。
【００７８】
本発明の方法に有用な製薬学的組成物は、経口固体製剤、眼病用、座薬、エーロゾル、局所用または他の類似製剤で全身的に投与することができる。適当なＩＬ−１  放出インヒビターに加えて、そのような製薬学的組成物は製薬学的に許容され得る担体および薬剤の送達を強化し、そして促進することが知られている他の成分を含んでよい。ナノ粒子、リポソーム、再封入（ｒｅｓｅａｌｅｄ）赤血球のような他の可能な製剤、および免疫学的に基づく系も、本発明の方法に従い適当なＩＬ−１  放出インヒビターを投与するために使用することができる。
【００７９】
問題の疾患を処置し、かつ／または防止するために潜在的に有用な化合物として、本明細書に記載の方法を使用して同定される化合物を配合し、そして本明細書に開示する疾患を処置するために哺乳動物に投与することができ、これから記載する。
【００８０】
本発明は有効成分として本明細書に開示する疾患の処置に有用な化合物を含んでなる製薬学的組成物の調製および使用を包含する。そのような製薬学的組成物は個体への投与に適する状態の有効成分のみからなることができ、または製薬学的組成物は有効成分および１以上の製薬学的に許容され得る担体、１以上のさらなる成分、またはこれらの幾つかの組み合わせを含んでなることができる。有効成分は当該技術分野で周知であるように、製薬学的組成物中に生理学的に許容され得るカチオンまたはアニオンとの組み合わせのような生理学的に許容され得るエステルまたは塩の状態で存在することができる。
【００８１】
本明細書で使用する用語「製薬学的に許容され得る担体」とは、有効成分と組み合わせることができ、そして組み合わせた後に個体に有効成分を投与するために使用できる化学的組成物を意味する。
【００８２】
本明細書で使用する用語「生理学的に許容され得る」エステルまたは塩とは、製薬学的組成物の他の成分と適合性があり、そして組成物が投与される個体に対して有害ではない有効成分のエステルまたは塩の状態を意味する。
【００８３】
本明細書に記載する製薬学的組成物の製剤は、既知の、または薬理学の分野でこれから開発される方法により調製することができる。一般にそのような調製法は有効成分を担体または１以上の補助成分と合わせるようにし、ついで必要または望むならば、生成物を所望の単−または多−用量単位に成形または包装する工程を含む。
【００８４】
本明細書に提供する製薬学的組成物の説明は、原理的にはヒトへの倫理的投与に適する製薬学的組成物を対象としているが、当業者はそのような組成物が一般にすべての種類の哺乳動物に対する投与に適することを理解するだろう。組成物を種々の動物へ投与するために適するようにするために、ヒトへの投与に適する製薬学的組成物を修飾することは十分に理解されており、そして標準的な技術を持つ獣医薬理学者はそのような修飾を、もし行うならば単に通常の実験で計画し、そして行うことができる。本発明の製薬学的組成物の投与を意図する個体には、限定するわけではないがヒトおよび他の霊長類、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に意味のある哺乳動物、およびニワトリ、アヒル、ガチョウおよび七面鳥のような商業的に意味のある鳥を含む。
【００８５】
本発明の方法に有用な製薬学的組成物は経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、口中、静脈内、眼、くも膜下または他の投与経路に適する製剤に調製し、包装し、または販売することができる。他の意図する製剤には有効成分を含有する射出用ナノ粒子、リポソーム調製物、再封入赤血球、および免疫学的に基づく系を含む。
【００８６】
本発明の製薬学的組成物は１つの単位用量として、または複数の単位用量としてバルクで調製し、包装し、そして販売することができる。本明細書で使用する「単位用量」は、予め定めた量の有効成分を含んでなる製薬学的組成物の別個の量である。有効成分の量は一般に個体に投与される有効成分の投薬用量、あるいは例えばそのような投薬用量の半分または３分の１のようなそのような投薬用量の画分に等しい。
【００８７】
本発明の製薬学的組成物中の有効成分の相対的量、製薬学的に許容され得る担体、および任意のさらなる成分は、処置する個体の同一性、サイズおよび状態に依存して、そしてさらに組成物を投与する経路に依存して変動するだろう。例として組成物は０．１％から１００（重量／重量）％の間の有効成分を含んでなることができる。
【００８８】
有効成分に加えて、本発明の製薬学的組成物は１以上のさらに製薬学的に活性な作用物質を含んでなることができる。特に意図するさらなる作用物質には、シアニドおよびシアネートスカベンジャーのような抑吐薬およびスカベンジャーを含む。
【００８９】
本発明の製薬学的組成物の放出制御または徐放性製剤は、通例の技術を使用して作成することができる。
【００９０】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の製剤は、限定するわけではないが各々が予め定めた量の有効成分を含有する錠剤、硬質または軟質カプセル、カシェ剤、トローチまたはロゼンジを含む別個の固体の用量単位の状態に調製し、包装し、または販売することができる。経口投与に適する他の製剤には限定するわけではないが、粉末化または粒状製剤、水性または油性懸濁液、水性または油性溶液、または乳液を含む。
【００９１】
本明細書で使用する「油性」液体は、炭素を含有する液体分子を含んでなり、そして水よりも低い極性を現すものである。
【００９２】
有効成分を含んでなる錠剤は、例えば有効成分を場合により１以上のさらなる成分と共に圧縮または成形することにより作成することができる。圧縮錠剤は適当なデバイス中で粉末または粒状調製物のような自由に流動する状態の有効成分を、場合により１以上の結合剤、潤滑剤、賦形剤、表面活性剤および分散剤と混合して圧縮することにより調製することができる。成形した錠剤は適当なデバイス中で、有効成分、製薬学的に許容され得る担体、および混合物を湿らせるために少なくとも十分量の液体の混合物を成形することにより作成することができる。錠剤の製造に使用する製薬学的に許容され得る賦形剤には、限定するわけではないが不活性な希釈剤、造粒剤および崩壊剤、結合剤および潤滑剤を含む。既知の分散剤には限定するわけではないがジャガイモ澱粉およびグリコール酸ナトリウム澱粉を含む。既知の表面活性剤には限定するわけではないがラウリル硫酸ナトリウムを含む。既知の希釈剤には限定するわけではないが炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを含む。既知の造粒剤および崩壊剤には限定するわけではないが、トウモロコシ澱粉およびアルギン酸を含む。既知の結合剤には限定するわけではないが、ゼラチン、アラビアガム（ａｃａｃｉａ）、糊化済トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。既知の潤滑剤には限定するわけではないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクを含む。
【００９３】
錠剤はコートされていないか、または個体の胃腸管での分解を遅らせるために既知の方法を使用してコートしてもよく、これにより有効成分の徐放性および吸収を提供する。例としてモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような材料を使用して錠剤をコートすることができる。さらなる例として、錠剤は米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号明細書に記載されている方法を使用してコートして、浸透を制御した放出錠剤を形成することができる。錠剤は製薬学的に洗練され、そして口にあった調製物を提供するために、さらに甘味剤、風味剤、着色剤、保存剤、またはこれらの幾つかの組み合わせを含んでなることができる。
【００９４】
有効成分を含んでなる硬質カプセルは、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。そのような硬質カプセルは有効成分を含んでなり、そしてさらに例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンのような不活性な固体希釈剤を含むさらなる成分を含んでなることができる。
【００９５】
有効成分を含んでなる軟質ゼラチンカプセルは、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。そのような軟質カプセルは、水またはピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油のような油媒質と混合することができる有効成分を含んでなる。
【００９６】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の液体製剤は、液体状態または使用前に水または他の適当な補形剤で再構成することを意図する乾燥生成物の状態で調製、包装、そして販売され得る。
【００９７】
液体懸濁液は常法を使用して調製して有効成分の懸濁液を水性または油性補形剤中に形成することができる。水性補形剤には、例えば水および等張性の塩水を含む。油性補形剤には、例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマまたはヤシ油のような植物油、分別植物油、および液体パラフィンのような鉱物油を含む。液体懸濁液は限定するわけではないが沈殿防止剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、バッファー、塩、香料、着色剤および甘味剤を含む１以上のさらなる成分をさらに含んでなることができる。油性懸濁液はさらに増粘剤を含んでなることができる。既知の沈殿防止剤には限定するわけではないが、ソルビトールシロップ、水素化可食性脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アラビアガムおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を含む。既知の分散および湿潤剤には限定するわけではないがレシチンのような自然に存在するホスファチド、アルキレンオキシドと脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの、または脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物（例えばそれぞれポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）を含む。既知の乳化剤には限定するわけではないが、レシチンおよびアラビアガム（ａｃａｃｉａ）を含む。既知の保存剤には限定するわけではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸およびソルビン酸を含む。既知の甘味剤には例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、シュクロースおよびサッカリンを含む。油性懸濁液用の既知の増粘剤には、例えば蜜蝋、硬質パラフィンおよびセチルアルコールを含む。
【００９８】
水性または油性溶媒中の有効成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的には類似様式で調製することができ、主な相違は有効成分を溶媒に懸濁するというよりむしろ溶解する点である。本発明の製薬学的組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載した各成分を含んでなることができ、溶媒に有効成分を溶解するために沈殿防止剤は必要ないと考えられる。水性溶媒には例えば、水および等張性の塩水を含む。油性溶媒には例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマまたはヤシ油のような植物油、分別植物油、および液体パラフィンのような鉱物油を含む。
【００９９】
本発明の製薬学的調製物の粉末化および粒状製剤は、既知の方法を使用して調製することができる。例えば錠剤を形成するために、カプセルに充填するために、またはそれらに水性もしくは油性補形剤を加えることにより水性もしくは油性懸濁液または溶液を調製するために使用されるそのような製剤は、個体に直接投与してもよい。これらの各製剤はさらに１以上の分散または湿潤剤、沈殿防止剤および保存剤を含むことができる。充填剤および甘味剤、香料または着色剤のようなさらなる賦形剤をこれらの製剤に含めてもよい。
【０１００】
本発明の製薬学的組成物は、水中油型乳液または油中水型乳液の状態に調製し、包装し、そして販売することができる。油相はオリーブまたは落花生油のような植物油、液体パラフィンのような鉱物油またはこれらの組み合わせでよい。そのような組成物は、アラビアガムまたはトラガカントガムのような自然に存在するガム、大豆またはレシチンホスファチドのような自然に存在するホスファチド、ソルビタンモノオレートのような脂肪酸と無水ヘキシトールの組み合わせから誘導されるエステルまたは部分エステル、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレートのようなそのような部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物のような１以上の乳化剤をさらに含んでよい。これらの乳液は例えば甘味剤または風味剤を含むさらなる成分も含むことができる。
【０１０１】
本発明の製薬学的組成物は、直腸投与に適する製剤に調製し、包装し、または販売することができる。そのような組成物は例えば座薬、滞留浣腸調製物および直腸または結腸潅注用の溶液の状態でよい。
【０１０２】
座薬製剤は、有効成分を通常の室温（すなわち約２０℃）で固体であり、そして個体の直腸温度（すなわち健康なヒトでは約３７℃）で液体の非−刺激性の製薬学的に許容され得る賦形剤と混合することにより作成できる。適当な製薬学的に許容され得る賦形剤には、限定するわけではないがカカオ脂、ポリエチレングリコールおよび種々のグリセリドを含む。座薬製剤は限定するわけではないが、酸化防止剤および保存剤を含む種々のさらなる成分をさらに含んでもよい。
【０１０３】
直腸または結腸の潅注用の滞留浣腸調製物または溶液は、有効成分を製薬学的に許容され得る液体担体と組み合わせることにより作成することができる。当該技術分野では周知であるように、浣腸調製物は個体の直腸の解剖学的構造に合わせた送達デバイスを使用して投与され、そしてその中に包装することができる。浣腸調製物は限定するわけではないが、酸化防止剤および保存剤を含む種々のさらなる成分をさらに含んでもよい。
【０１０４】
本発明の製薬学的組成物は膣投与に適する製剤に調製し、包装し、そして販売することができる。そのような組成物は例えば座薬、タンポンのような含浸またはコートした膣に挿入可能な物質、膣洗浄調製物、または膣潅注用のゲルもしくはクリームもしくは溶液の状態でよい。
【０１０５】
物質を化学的組成物で含浸またはコートするための方法は当該技術分野では知られており、そして限定するわけではないが化学組成物を表面に沈積または結合させる方法、化学組成物を物質（すなわち生理学的に分解可能な物質）の合成中に物質の構造に包含させる方法、および水性または油性の溶液または懸濁液を吸収材料に吸収させ、続いて乾燥させるかまたはさせない方法を含む。
【０１０６】
膣潅注用の膣洗浄調製物または溶液は、有効成分を製薬学的に許容され得る液体の担体と組み合わせることにより作成できる。当該技術分野では周知であるように、洗浄調製物は個体の膣の解剖学的構造に合わせた送達デバイスを使用して投与され、そしてその中に包装することができる。膣洗浄調製物は、限定するわけではないが、酸化防止剤、抗生物質、抗菌・カビ剤および保存剤を含む種々のさらなる成分をさらに含んでもよい。
【０１０７】
本明細書で使用する製薬学的組成物の「非経口投与」には、個体の組織の物理的破壊を特徴とする投与、および組織中の傷を通した製薬学的組成物の投与の任意の経路を含む。非経口投与にはこのように、限定するわけではないが組成物の注入による、外科的切開を通した組成物の適用による、組織を浸透する非外科的創傷を通した組成物の適用による等の製薬学的組成物の投与を含む。特に非経口投与は限定するわけではないが、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、くも膜下内注射、および腎臓透析注入法を含むことを意図する。
【０１０８】
非経口投与に適する製薬学的組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張塩水のような製薬学的に許容され得る担体と組み合わせた有効成分を含んでなる。そのような製剤は、ボーラス投与用に、または連続投与用に適する状態に調製、包装、または販売することができる。注射可能な製剤は保存剤を含むアンプルまたは多用量容器のような単位剤形に調製し、包装し、または販売することができる。非経口投与用の製剤には、限定するわけではないが油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液、乳液、ペーストおよび移植可能な徐放性または生分解性製剤を含む。そのような調製物は限定するわけではないが、沈殿防止剤、安定化剤または分散剤を含む１以上のさらなる成分をさらに含んでもよい。非経口投与用の製剤の一態様では、有効成分は再構成組成物の非経口投与前に、適当な補形剤（例えば滅菌した発熱物質を含まない水）で再構成するために、乾燥（すなわち粉末または粒状）状態で提供される。
【０１０９】
製薬学的組成物は滅菌された注射可能な水性または油性懸濁液または溶液の状態に調製し、包装し、または販売することができる。この懸濁液または溶液は既知の技術に従い配合され、そして有効成分に加えて本明細書に記載する分散剤、湿潤剤または沈殿防止剤のようなさらなる成分を含むことができる。そのような滅菌された注射可能な製剤は、例えば水、１，３−ブタンジオールのような非−毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒を使用して調製することができる。他の許容され得る希釈剤および溶媒には限定するわけではないがリンゲル溶液、等張性の塩化ナトリウム溶液および合成モノ−またはジ−グリセリドのような固定油を含む。有用な他の非経口的に投与可能な製剤は、微晶質状態中に、リポソーム調製物中に、または生分解性ポリマー系の成分として有効成分を含んでなるものを含む。徐放性または移植用の組成物は、乳液、イオン交換樹脂、溶解し難いポリマーまたは溶解し難い塩のような製薬学的に許容され得るポリマー性または疎水性の材料を含むことができる。
【０１１０】
局所投与に適する製剤には、限定するわけではないが塗布剤、ローションのような液体または半−液体調製物、クリーム、軟膏またはペーストのような水中油型もしくは油中水型乳液、および溶液または懸濁液を含む。局所的に投与可能な製剤は、例えば約１％〜約１０（重量／重量）％の有効成分を含んでなることができるが、有効成分の濃度は溶媒中の有効成分の溶解性の限界まで高くてもよい。局所投与用の製剤は、本明細書に記載する１以上のさらなる成分をさらに含んでもよい。
【０１１１】
本発明の製薬学的組成物は、頬面窩洞を介して肺投与に適する製剤に調製し、包装し、または販売することができる。そのような製剤は有効成分を含み、そして約０．５〜約７ナノメーター、そして好ましくは約１〜約６ナノメーターの範囲の直径を有する乾燥粒子を含んでなることができる。そのような組成物は乾燥粉末リザーバを含んでなるデバイスを使用して投与するために都合のよい乾燥粉末状態であり、このリザーバへの推進薬の流れが粉末を分散するように向けることができ、あるいは密閉容器中の低沸点推進薬に溶解または懸濁された有効成分を含んでなるデバイスのような自己−推進溶媒／粉末−分散容器を使用する。好ましくはそのような粉末は粒子を含んでなり、ここで重量で少なくとも９８％の粒子が０．５ナノメーターよりも大きな直径を有し、そして数で少なくとも９５％の粒子が７ナノメーターよりも小さい直径を有する。より好ましくは重量で少なくとも９５％の粒子が１ナノメーターよりも大きな直径を有し、そして数で少なくとも９０％の粒子が６ナノメーターよりも小さい直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは糖のような固体の微細な粉末希釈剤を含み、そして単位剤形で都合良く提供される。
【０１１２】
低沸点推進薬は一般に、大気圧で６５゜Ｆ未満の沸点を有する液体推進薬を含む。一般に推進薬は組成物の５０〜９９．９（重量／重量）％を構成することができ、そして有効成分は組成物の０．１〜２０（重量／重量）％を構成することができる。推進薬はさらに液体の非イオンまたは固体のアニオン性表面活性剤または固体の希釈剤（好ましくは有効成分を含んでなる粒子と同じ次元の粒子サイズを有する）のようなさらなる成分をさらに含むことができる。
【０１１３】
肺送達用に配合された本発明の製薬学的組成物は、溶液または懸濁液の液滴状態の有効成分を提供することもできる。そのような製剤は、有効成分を含んでなる場合により滅菌性の水性または希釈されたアルコール溶液または懸濁液として調製、包装または販売されることができ、そして噴霧化または霧化デバイスを使用して都合良く投与することができる。そのような製剤はさらに限定するわけではないが、サッカリンナトリウム、揮発性油のような風味剤、緩衝剤、表面活性剤またはメチルヒドロキシベンゾエートのような保存剤を含む１以上のさらなる成分をさらに含んでよい。この投与経路により提供される液滴は、好ましくは約０．１〜約２００ナノメーターの範囲の平均直径を有する。
【０１１４】
肺送達に有用である本明細書に記載する製剤は、本発明の製薬学的組成物の鼻内送達にも有用である。
【０１１５】
鼻内投与に適する別の製剤は、有効成分を含んでなり、そして約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗い粉末である。そのような製剤は鼻から吸入、すなわち鼻孔付近に保持した粉末の容器から鼻の通路を通して迅速に吸引することによる様式で投与される。
【０１１６】
鼻投与に適する製剤は、例えばわずか約０．１（重量／重量）％から最大１００（重量／重量）％の有効成分を含んでなることができ、そしてさらに本明細書に記載する１以上のさらなる成分をさらに含んでなることができる。
【０１１７】
本発明の製薬学的組成物は、バッカル投与に適する製剤に調製、包装または発売することができる。そのような製剤は、例えば常法を使用して作成された錠剤またはロゼンジ形態でよく、そして例えば０．１〜２０（重量／重量）％の有効成分、口内で溶解もしくは分解可能な組成物を含んでなるバランス、および場合により本明細書に記載するさらなる１以上の成分を含むことができる。あるいはバッカル投与に適する製剤は、有効成分を含んでなる粉末またはエーロゾル化もしくは霧化溶液または懸濁液を構成する。そのような粉末化、エーロゾル化またはエーロゾル化製剤は、分散した時に好ましくは約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の平均粒子または液滴サイズを有し、そして本明細書に記載するさらなる１以上の成分をさらに含んでよい。
【０１１８】
本発明の製薬学的組成物は、眼の投与に適する製剤に調製、包装または販売することができる。そのような製剤は例えば水性もしくは油性の液体担体中に０．１〜１．０（重量／重量）％の有効成分の溶液または懸濁液を含む点眼薬の状態でよい。そのような液滴はさらに緩衝剤、塩または本明細書に記載する１以上の他のさらなる成分をさらに含んでなることができる。他の有用な目に投与可能な製剤には、微晶質状態またはリポソーム調製物中に有効成分を含んでなるものを含む。
【０１１９】
本明細書で使用する「さらなる成分」には、限定するわけではないが１以上の以下のものを含む：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；粒状化および崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；風味剤；着色剤；保存剤；ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物；水性賦形剤および溶媒；油性賦形剤および溶媒；沈殿防止剤；分散または湿潤剤；乳化剤；粘滑剤；バッファー；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗菌・カビ剤；安定化剤；および製薬学的に許容され得るポリマー性もしくは疎水性物質。本発明の製薬学的組成物に含めることができる他の「さらなる成分」は当該技術分野において既知であり、そして例えばＧｅｎａｒｏ編集、１９８５、レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、イーストン、ペンシルベニア州に記載されており、これは引用により本明細書に編入する。
【０１２０】
典型的には動物、好ましくはヒトに投与することができる本発明の化合物の投薬用量は、動物の体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇ〜約１００ｇの量の範囲である。投与する正確な投薬用量は限定するわけではないが、動物の種類および処置する疾患状態の種類、動物の年齢および投与経路を含む多数の因子に依存して変動する。好ましくは化合物の投与用量は動物の体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜約１００ｍｇで変動する。より好ましくは投薬用量は動物の体重１ｋｇあたり約１μｇ〜約１ｇで変動する。化合物は１日に数回の頻度で動物に投与することができ、あるいは化合物は１日に１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１月に１回のようなより低頻度で、あるいは数カ月に１回または１年に１回以下のようなさらに低頻度で投与することができる。投与の頻度は当業者には明白であり、そして限定するわけではないが処置する疾患の種類および重篤度、動物の種類および年齢等のような多数の因子に依存する。
【０１２１】
本発明は、哺乳動物における血管損傷後のマクロファージ浸潤を阻害する方法も含む。この方法は有効量の銅キレーターを哺乳動物に投与することを含んでなる。これは本明細書のいたるところでより詳細に説明しているように、細胞中で生物学的に利用可能な銅のレベルの減少が前炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−１  およびＦＧＦ１の非伝統的な輸送を阻害するので、限定するわけではないが炎症および／または血管損傷部位でのマクロファージ浸潤を含む種々の細胞プロセスが阻害されるからである。したがって疾患または状態がマクロファージの浸潤により媒介される場合、細胞中で生物学的に利用可能な銅の量を減少させる銅キレーターの投与は、マクロファージの浸潤が阻害されるので疾患または状態を処置する。
【０１２２】
当業者はいったん本明細書に提供する教示から着手すれば、マクロファージ浸潤が炎症を伴い、そして本発明はそのような浸潤が炎症に関係するマクロファージ浸潤により媒介される疾患または障害を処置する方法を含むことを理解するだろう。
【０１２３】
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、本明細書で使用する用語である銅キレーターの「有効量」が、細胞中の銅のレベルを検出可能に下げる量を意味すると考えるだろう。そのような量には限定するわけではないが、セルロプラスミンのレベルが細胞中の生物学的に利用可能な銅のレベルに相関するので、血清セルロプラスミンのレベルの検出可能な減少を媒介するために十分な銅キレーターの量を含む。当業者は本明細書に提供する開示に基づき、細胞中の銅のレベルまたは生物学的に利用可能な銅のレベルは、当該技術分野で周知の広い様々な方法を使用して評価でき、そして本発明は細胞中の銅の唯一の尺度としてセルロプラスミンのレベルの評価に限定されないと考えるだろう。むしろセルロプラスミンのレベルを評価することは、生物学的に利用可能な銅のレベルを評価する単に１つの方法であり、本発明がこれまたは他の特定の方法に制約されることは全くない。さらに当業者は本明細書に提供する開示に基づき、有効量の銅キレーターが次に細胞からとりわけサイトカイン（例えばＦＧＦ１およびＩＬ−１  ）の放出レベルの検出可能な低下を媒介することを理解するだろう。
【０１２４】
本発明は動脈壁損傷に伴う細胞増殖を阻害する方法を含む。この方法は有効量の銅キレーターを哺乳動物に投与することを含んでなる。これは本明細書中のいたるところですでに示し、そして検討したように、哺乳動物の細胞中で生物学的に利用可能な銅のレベルの低下を媒介する銅キレーターの哺乳動物への投与が、リーダーレス前炎症サイトカイン（例えばＩＬ−１  、ＦＧＦ１等）の非伝統的輸送（すなわちＥＲ−ゴルジタンパク質輸送メカニズムにより媒介されないタンパク質輸送）を阻害するので、血管損傷の部位の細胞増殖は銅キレーターの不存在下の損傷で検出される細胞増殖に比べて低下するからである。このように当業者は本明細書に提供する開示に基づき、哺乳動物において血管損傷から生じる細胞増殖は動物に銅キレーターを投与することにより阻害することができ、ここでキレーターは生物学的に利用可能な銅のレベルを減少させ、これによりＩＬ−１  およびＦＧＦ１の非伝統的輸送を阻害すると考えるだろう。
【０１２５】
より具体的には、この方法は細胞が血管平滑筋細胞である細胞増殖の阻害を提供する。好ましくは銅キレーターはＴＴＭであり、そして血管損傷はバルーン血管形成術により引き起こされる。これらの方法はバルーン血管形成術後の再狭窄の処置および防止に有用である。これらの方法は、そのような手順の後の細胞増殖に伴う、および再狭窄に伴う高度な死亡率および罹病率を考えると特に有用である。しかし本発明は特定の種類の血管損傷に伴う細胞増殖により媒介される特定の疾患または状態の処置に限定されない。むしろバルーン血管形成術の結果としての血管ＳＭＣの増殖は、そのような状態を研究するために技術的に認識されている非ヒト動物モデルにおける再狭窄を防止するための本発明の成功的使用の１例である。
【０１２６】
本発明は哺乳動物における動脈壁損傷後の細胞外マトリックスの分泌を阻害する方法を含む。この方法は損傷部位の細胞からＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの非伝統的輸送を阻害することを含んでなり、ここで輸送は哺乳動物に有効量の銅キレーターを投与することにより阻害される。これは本明細書に開示するデータにより示されるように、哺乳動物に銅キレーターを投与することにより、動脈壁損傷後のＩＬ−１  および／またはＦＧＦ１放出を阻害することが、細胞外マトリックスの分泌を阻害したからである。この方法は血管損傷後の細胞外マトリックスの分泌が悪影響を伴い、かつ／または媒介し、そして損傷部位での再狭窄を伴う点で有用である。したがって本発明は血管損傷後の細胞外マトリックスの沈積およびそのような沈積に伴う悪影響を防止するために重要な新規方法を提供する。
【０１２７】
また本発明は哺乳動物における動脈壁損傷に伴う新内膜の肥厚化を阻害する方法を提供する。この方法は哺乳動物に有効量の銅キレーターを投与することにより、損傷部位の細胞からのＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの非伝統的輸送を阻害することを含んでなる。これは本明細書のいたるところですでにより完全に説明しているように、本明細書に開示するデータが、銅の錯化が例えば前炎症性サイトカインの非伝統的輸送を阻害し、これにより血管損傷の技術的に認識されている動物モデルにおいて、とりわけ新内膜の肥厚化を阻害することを証明するからである。このように本発明は投与が必要な動物に有効量（例えば、ストレスに応答した細胞からのＩＬ−１  および／またはＦＧＦ１放出の輸送レベルにおける検出可能な減少が存在するように、細胞中の生物学的に利用可能な銅のレベルを検出可能に減少させるために十分な量）の銅キレーターを投与することにより、新内膜の肥厚化を阻害し、これにより動脈壁損傷に伴う新内膜の肥厚化を阻害する方法を包含する。
【０１２８】
本発明は哺乳動物における動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害する方法も含む。この方法は哺乳動物に有効量の銅キレーターを投与することにより、損傷部位の細胞からのＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの非伝統的輸送を阻害することを含んでなる。これは本明細書ですでにより完全に説明しているように、例えばＴＴＭのような銅キレーターを使用することによるような細胞中の生物学的に利用可能な銅のレベルを下げることが、細胞からＦＧＦ−１およびＩＬ−１  の少なくとも１つの輸送を阻害し、これにより血管損傷に応答した血管外膜新生を阻害するからである。より具体的には、本発明の実施に対して徹底的な低減を示す本明細書に開示するデータは、技術的に認識されている動物モデルにおいて哺乳動物への銅キレーターの投与が、動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害することを支持する。
【０１２９】
本明細書中のいたるところでより完全に説明するように、当業者は本発明の教示から着手すれば、本発明が細胞中で生物学的に利用可能な銅のレベルを減少させるために、銅を錯化する広範な多数の化合物の使用を包含することを理解するだろう。さらに当業者は本明細書に提供する開示に基づき、用量、投与経路および処置計画を、技術的に認識されている動物モデルで本明細書の至るところに例示したような製薬分野で周知の方法を使用して容易に決定できると考えるだろう。そのような方法は当業者には知られており、そして本明細書に包含される。
【０１３０】
Ｃ．有用な化合物の同定法
本発明は哺乳動物における動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害するために有用な化合物を同定する方法を含む。この方法は細胞を化合物と接触させ、そして温度ストレスに応答した細胞によるリーダーレス前炎症性サイトカインの放出レベルを、温度ストレスに応答した、化合物とは接触しなかったがそれ以外は同一である細胞からの同じサイトカインの放出レベルと比較することを含んでなる。接触しなかった以外は同一の対照による放出と比較した時、化合物と接触した細胞によるサイトカインの放出レベルの減少は、化合物が哺乳動物における動脈壁損傷に伴う血管外膜新生を阻害するために有用であることを示す。
【０１３１】
これは本明細書中のいたるところで既により完全に説明したように、接触しなければストレスに応答して放出されるリーダーレス前炎症性サイトカインの放出阻害が、とりわけ血管外膜新生、細胞外マトリックスの沈積、細胞増殖、マクロファージ浸潤、再狭窄、新内膜の肥厚化等を防止するからである。次にこれはストレスに応答した細胞からのそのようなリーダーレスタンパク質の非伝統的放出が、中でもサイトカインの放出を媒介する複合体の銅−依存的形成により媒介されるからである。このように本明細書中のいたるところでより完全に検討するように、細胞中の生物学的に利用可能な銅のレベルを、とりわけ銅の錯化により減少させることが複合体の形成を阻害し、したがって細胞からのサイトカイン（例えばＦＧＦ１およびＩＬ−１  ）の放出を阻害する。サイトカインの放出阻害は、次に限定するわけではないが、血管外膜新生のような様々なサイトカインが媒介する反応を阻害する。
【０１３２】
本発明はさらにこの方法により同定される化合物が、中でも血管に対する損傷後の血管外膜新生、再狭窄、マクロファージ浸潤、新内膜形成、細胞増殖、細胞外マトリックスの沈積等を処置および防止するために潜在的治療薬として有用となるので、そのような化合物もさらに含む。
【０１３３】
同様に、本発明は血管に対する損傷後の再狭窄、マクロファージ浸潤、新内膜形成、細胞増殖、細胞外マトリックスの沈積等を処置し、または阻害するために有用な化合物の同定法を含む。この方法は細胞を化合物と接触させ、そして細胞からリーダーレス前炎症性サイトカイン（例えばＦＧＦ−１およびＩＬ−１）の放出レベルを、化合物と接触しなかった点以外は同一の細胞からのサイトカインの放出レベルと比較することを含んでなる。当業者は本明細書に提供される開示に基づき、化合物と接触しなかった同一の細胞からの放出レベルと比較して化合物と接触した細胞からのサイトカイン（例えばＦＧＦ−１およびＩＬ−１  ）の放出レベルの減少は、化合物が中でも血管に対する損傷後の再狭窄、マクロファージ浸潤、新内膜形成、細胞増殖、細胞外マトリックスの沈積等の処置または防止に有用であることを示すと考えるだろう。これは本明細書中のいたるところでより完全に説明するように、サイトカインの放出を阻害することがこれらのプロセスを阻害するので、放出のインヒビターはこれらの状態の処置または防止に有用な潜在的治療薬だからである。
【０１３４】
ＩＩ．キット
本発明はリーダーレス前炎症性サイトカインの放出を阻害することに関する種々の有用なキットを包含し、これは本明細書のいたるところに開示するように、そのような放出を阻害することが哺乳動物の血管外膜新生、細胞外マトリックスの沈積、細胞増殖、マクロファージ浸潤、再狭窄、新内膜の肥厚化等を処置し、または防止する方法を提供するので有用である。このように１つの観点では、本発明は細胞からＩＬ−１  の放出を阻害するためのキットを含む。このキットは細胞からＩＬ−１  放出の有効量のインヒビターを含んでなる。このキットはさらに本明細書に提供される教示に従い、キットを使用するためのアプリケーターおよび使用説明資料を含んでなる。
【０１３５】
また本発明は、例えば銅キレーター、およびＳ１００Ａ１３のフラグメント、好ましくはＳ１００Ａ１３  ＢＲならびにそのようなペプチドをコードする核酸のような化合物を含んでなるＩＬ−１  放出インヒビター、アプリケーター、および本発明の方法を行うための化合物の使用を記載する使用説明資料を含んでなる種々のキットも含む。これは本明細書に開示するデータにより示すように、ＩＬ−１  と例えば銅キレーターおよび／またはＳ１００Ａ１３との相互作用の阻害が、細胞からＩＬ−１  の放出を阻害し、これにより限定するわけではないが血管に対する損傷後の再狭窄、マクロファージ浸潤、新内膜形成、細胞増殖、細胞外マトリックスの沈積等を含む種々のプロセスを阻害するからである。したがって当業者は本明細書に提供する教示から着手すれば、細胞からＩＬ−１  の放出は、限定するわけではないが銅キレーターおよびＳ１００Ａ１３のフラグメントを含むそのような放出のインヒビターを細胞に投与することにより阻害できると考えるだろう。当業者はさらに本明細書に提供される開示を考慮すれば、細胞からＩＬ−１  の放出を阻害するためにＩＬ−１  放出の種々のインヒビターを細胞に協調して、または順次投与することができる（例えば数種の銅キレーターを例えばＳ１００Ａ１３のフラグメントと同時に、一緒に投与することができる）と考えるだろう。このように当業者は本明細書に提供する開示に基づき、本発明が細胞からＩＬ−１  の放出を阻害するために、種々のＩＬ−１  放出インヒビターを一緒にまたは順次の様式で一時的に投与する使用を包含することを理解するだろう。
【０１３６】
本発明は動脈壁損傷に伴う細胞増殖を阻害するためのキットを含む。このキットは有効量の銅キレーター、アプリケーターおよびキットを使用するための使用説明書を含んでなる。これは本明細書のいたるところですでに示し、そして検討したように、銅キレーターの哺乳動物への投与が哺乳動物における細胞中の生物学的に利用可能な銅のレベルの減少を媒介し、これが次にリーダーレス前炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１  、ＦＧＦ１等）の非伝統的輸送を阻害するので、血管損傷の部位での細胞増殖は銅キレーターの不存在下で損傷に検出される細胞増殖に比べて減少するから有用である。このように当業者は本明細書に提供する開示に基づき、哺乳動物における血管損傷から生じる細胞増殖が動物に銅キレーターを投与することにより阻害でき、ここでキレーターは生物学的に利用可能な銅のレベルを減少させ、これによりＩＬ−１  およびＦＧＦ１の非伝統的輸送を阻害すると考えるだろう。さらにキットはアプリケーターおよびキットを使用するための使用説明資料を含んでなる。これらの使用説明は単に、本明細書に提供する例を具体化しているだけである。
【０１３７】
キットはさらに製薬学的に許容され得る担体を含んでなることができ、そして銅キレーターは本明細書のいたるところで説明した適当な量で提供される。さらに投与経路および投与頻度は、本明細書のいたるところですでに説明した通りである。
【０１３８】
例示的キットを以下に記載するが、他の有用なキットの内容物は、本開示を考慮すれば当業者には明白であろう。これらの各キットは本発明に含まれる。
【０１３９】
［実施例］
本発明を今、以下の実施例を参照にして記載する。これらの実施例は具体的説明の目的のみに提供し、そして本発明がこれらの実施例に限定されると解釈すべきではなく、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかになる任意の、そしてすべての変更を包含すると解釈すべきである。
【実施例１】
【０１４０】
前炎症性サイトカインであるインターロイキン１アルファのストレスが誘導する放出はＣｕ２＋−依存性である
銅はインビボで血管新生および炎症反応の促進に関与し、そして最近の臨床的データではヒトのガンの治療においてＣｕ２＋−キレーターの有力な治療的役割が示されたが、この活性のメカニズムは未知のままである。ＦＧＦ１およびＩＬ１αは類似の結晶学的構造を表し（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：９０−９３；Ｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：２６７９−２６８４）、ＦＧＦ１およびＩＬ１αの両方がストレスに応答して放出され（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５１４７−５１５１）、そしてＣｕ２＋−キレーターであるＴＴＭは充実性腫瘍の増殖の臨床的な管理に効果的であることが示された（Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：１−１０；Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １１１：６９６−７０１；Ｍｅｒａｊｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，私信およびＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．に提出された）ので、ＩＬ１αの放出がＳ１００Ａ１３の発現により修飾できるかどうか、そして細胞内Ｃｕ２＋が熱ショックに応答したＩＬ１αの放出に関与するかどうかを調査した。
【０１４１】
本明細書に開示するデータは、ＦＧＦ遺伝子ファミリーのシグナルペプチドを持たない原型の員のように、リーダーレスＩＬ−１原型もＣｕ２＋−結合タンパク質であることを示す。さらに本明細書に開示するデータは、細胞性ストレスに応答した細胞外ＩＬ１αの出現も、Ｃｕ２＋−結合タンパク質であるＳ１００Ａ１３の細胞内機能が関与し、そしてＣｕ２＋−キレーターであるテトラチオモリブデート（ＴＴＭ）により抑制されることを示す。さらに本明細書に開示するデータは、この遺伝子産物に新規な配列が無いＳ１００Ａ１３の突然変異体の発現がＩＬ１α放出のドミナント−ネガティブリプレッサーとして機能するが、野生型Ｓ１００Ａ１３の発現はストレスが誘導する転写に関する要件を排除するように機能することを示す。
【０１４２】
この実施例に提示する実験に使用する材料および方法をこれから記載する。
【０１４３】
材料および方法
細胞系および組換えタンパク質
安定なＮＩＨ３Ｔ３細胞トランスフェクション体は、ｐＭＥＸｎｅｏにクローン化した以下のｃＤＮＡ構築物を用いて生成した（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８；ＬａＶａｌｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｃａｒｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）：６Ｍｙｃ  Ｔａｇへのアミノ−末端融合を含むヒトＳ１００Ａ１３（Ｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３）（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）；ヒトＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３ΔＢＲ（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）；ヒトｍＩＬ１α（残基１１３−２７１）；βガラクシトダーゼタグに対してカルボキシ末端融合を含むヒトｍＩＬ１α（ｍＩＬ１α−βＧａｌ）（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）；およびβガラクシトダーゼタグに対してカルボキシ末端融合を含むｐＩＬ１α（残基１−２７１）（ｐＩＬ１α−βＧａｌ）（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。組換えヒトｍＩＬ１αはホフマン−ラロッシュ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）により提供された。組換えヒトＳ１００Ａ１３ならびにＳ１００Ａ１３ΔＢＲ（塩基性残基が豊富なドメイン（残基８８〜９８）が削除されたＳ１００Ａ１３の構築物）はすでに記載したように作成した（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１４４】
超遠心分析
ＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３またはＳ１００Ａ１３ΔＢＲのいずれかを、１：１、１：５および１：１０のモル比（ＩＬ１α：Ｓ１００Ａ１３）でリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で１ｍＭのＣｕＣｌ２の存在または不存在下にて３０分間、４２Ｃにインキューベーションし、続いて２８０，０００ｘｇで１８時間、４Ｃで遠心し、そしてＬａｎｄｒｉｓｃｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）により記載されたようにＳ１００Ａ１３イムノブロット分析によるペレット画分の解析を行った。
【０１４５】
硫酸アンモニウム分画および熱−ショック−コンディショニング培地中でのタンパク質相互作用の分析
ＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３は超遠心分析について記載したようにインキューベーションし、続いて４Ｃ、３０分間の１００％（ＮＨ４）２ＳＯ４中での反応物のインキューベーション、１０，０００ｘｇで３０分間の遠心、そしてＬａｎｄｒｉｓｃｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されているようなＳ１００Ａ１３イムノブロット分析によるペレットおよび上清画分の解析を行った。
【０１４６】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクション体は７０〜８０％の集密度に成長させ、そして温度ストレス前に、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄した。熱ショックはすでに記載したように（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、無血清ＤＭＥＭ中で４２℃で１１０分間行った。対照カルチャーは３７℃で無血清ＤＭＥＭ中にてインキューベーションした。各トランスフェクションから２つの独立したクローンを評価し、同様な結果を得た。Ｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３の放出の分析について、成熟ＩＬ１α−βＧａｌおよび前駆体ＩＬ１α−βＧａｌ、ＤＴＴ−処理コンディショニング培地（３７℃で２時間）および適当なＮＩＨ３Ｔ３細胞トランスフェクション体からの細胞ライゼートを調製し、そして２つの部分に分け、その１つをＭｙｃレポーター配列のＳ１００Ａ１３イムノブロット分析について記載したように処理し（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、そしてもう１つは成熟ＩＬ１α−βＧａｌおよび前駆体ＩＬ１α−βＧａｌイムノブロット分析について記載したように処理した（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．２００１）。簡単に説明すると、１つの部分を濃縮し、そして成熟ＩＬ１α−βＧａｌ放出を評価するために抗−ＩＬ１α抗体と免疫沈降させ、そしてＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３放出を評価するために２つ目の部分をヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに吸着させ、そして１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。免疫沈降および溶出したタンパク質は、それぞれ８％および１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥで解像し、そしてＩＬ１α（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．２００１）またはＭｙｃ（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．２００１）イムノブロット分析のいずれかで評価した。コンディショニング培地中での乳酸デヒドロゲナーゼの活性はすでに報告されているように（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．２００１）、すべての実験で細胞溶解の評価として利用した。Ｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３と成熟ＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）から放出された成熟ＩＬ１α−βＧａｌのヘパリン親和性の分析について、硫酸アンモニウム飽和をすでに記載されているように行った（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．２００１）。アクチノマイシンＤ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、セントルイス、モンタナ州）、シクロヘキサミド（シグマ）およびテトラチオモリブテート（シグマ−アルドリッチ）のＩＬ１α放出に及ぼす効果を、すでに報告されているように評価した（ＬａＶａｌｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０１４７】
この実施例で提示した実験結果をこれから記載する。
【０１４８】
ＩＬ１αはＣｕ２＋−結合タンパク質である
ＦＧＦ１とは異なり（Ｊａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）、ヒトＩＬ１αは種間で保存されていない１つのＣｙｓ残基を含むが（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９４；Ｋｒａｋａｕｅｒ，１９８６：Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，１９９８）、結晶学的証拠では溶媒に接近可能な３つのヒスチジン残基の存在が示唆されている（Ｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ヒスチジン残基はＣｕ２＋−結合に関与しているので（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７；Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）、ＩＬ１αが固定化Ｃｕ２＋に結合する能力を評価した。図１Ａに示すように、組換えヒトＩＬ１αは強い（ａｖｉｄ）Ｃｕ２＋−結合タンパク質であり、溶出に６０ｍＭイミダゾールを必要とする。同様な溶出データが組換えヒトＩＬ１βを使用しても得られた。ＩＬ１原型のこのＣｕ２＋−結合特性は、ＦＧＦ１、Ｓ１００Ａ１３およびｐ４０  Ｓｙｔ１が固定化Ｃｕ２＋から４０ｍＭのイミダゾールで溶出するので、極めて驚くべきことであった（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【０１４９】
温度ストレスに応答して放出されたＩＬ１αが同様なＣｕ２＋−結合性を現すのかどうかを示すために、ＩＬ１αＮＩＨ３Ｔ３細胞トランスフェクション体をそれらがストレスに応答してＣｕ２＋−結合タンパク質としてＩＬ１α形を放出する能力について評価した。３７Ｃでコンディショニングした細胞培養ではなく熱ショックによりコンディショニングした細胞培養のＩＬ１αイムノブロット分析では、Ｃｕ２＋−結合タンパク質としてＩＬ１αの存在が表された。驚くべきことには、組換えポリペプチドとは異なり、ＩＬ１αのイミダゾール溶出特性が改変され、これは４０ｍＭのイミダゾールで溶出した（図１Ｂ）。
【０１５０】
ＩＬ１αはストレスが誘導する放出にＳ１００Ａ１３を利用する
ＦＧＦ１はストレスに応答するその放出を促進するためにＳ１００Ａ１３遺伝子産物の機能を利用するので（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．２００１）、ＩＬ１αもＳ１００Ａ１３を利用できるのかどうかを調査した。この前提に取り組むために、ＩＬ１αの組換えヒト形とＳ１００Ａ１３が相互作用し、そして超遠心で分画されるＣｕ２＋−およびモル比−依存的な多タンパク質凝集物を形成する能力を調査した。図２Ａに示すように、Ｓ１００Ａ１３はＩＬ１αとインキューベーションし、そしてＣｕ２＋が存在する時のみ、２８０，０００ｘｇで１８時間遠心した後のペレット画分に存在した。さらにペレット画分に存在するＳ１００Ａ１３のレベルは、ＩＬ１α対Ｓ１００Ａ１３のモル比の関数として増加し、１：５〜１：１０のモル比の間で最大であり、ＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３がＣｕ２＋−依存的様式で相互作用できることを示唆する。
【０１５１】
Ｓ１００遺伝子ファミリーは１００％（ＮＨ４）２ＳＯ４中でのその溶解性により命付けられ（Ｍｏｏｒｅ，１９６５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９：７３９−７４４）、そしてＩＬ１αは塩分別できるので（Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：５１７−５２２；Ｍｉｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：８３４−８３７）、ＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３をＣｕ２＋の存在および不存在下で、モル比を変えて飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４とインキューベーションした。遠心後、上清画分はＳ１００Ａ１３イムノブロット分析を使用して分析した。図２Ｂに表すように、Ｓ１００Ａ１３はＣｕ２＋−およびＩＬ１α−依存的様式でペレット画分中に存在し、そしてペレット画分中でのその存在は、ＩＬ１α対Ｓ１００Ａ１３のモル比の関数であり、最大は１：５から１：１０のモル比の間で起こった。
【０１５２】
ＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３は無細胞系でＣｕ２＋−依存的様式で相互作用できるので、ＩＬ１αの前駆体および成熟形の発現も細胞内Ｓ１００Ａ１３の構成的放出を抑制できるのかどうかを調査した。すなわちＮＨ２−末端Ｍｙｃエピトープタグを含むＳ１００Ａ１３を前駆体ＩＬ１α−βＧａｌと成熟ＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクション体に安定にトランスフェクトし（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．２００１）、そしてコトランスフェクション体を３７Ｃで２時間維持するか、あるいは熱ショックにかけた。挿入物を含まないベクターおよび成熟ＩＬ１α−βＧａｌ、ならびに挿入物を含まないベクターおよび前駆体ＩＬ１α−βＧａｌ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体を対照として役立てた。図３Ａに示すように、ＩＬ１αの前駆体または成熟形のいずれかの発現は、３７ＣでＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３の構成的放出を抑制することができた。さらにデータではＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３および前駆体ＩＬ１αＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体から熱ショックによりコンディショニングした培地中にＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３の存在が示され（図３Ａ）、Ｓ１００Ａ１３がＩＬ１α放出から独立して細胞外区分への接近を獲得できることを示唆している。
【０１５３】
ＦＧＦ１とは異なり（Ｍａｃｉａｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２５：９３２−９３５）、ＩＬ１αの成熟形は固定化ヘパリンに結合しないが（Ｔａｒａｎｔｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５１４７−５１５１）、Ｓ１００Ａ１３はヘパリン−結合タンパク質として特徴付けられてきた（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２２５４４−２２５５２）。このようにもしＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３が複合体として細胞外区分に存在するならば、ＩＬ１αはＳ１００Ａ１３との会合の結果として１００％（ＮＨ４）２ＳＯ４分画後にヘパリン親和性および溶解性の両方を獲得するはずである。この前提を評価するために、Ｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３とＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体を熱ショクにかけ、そしてコンディショニング培地を１００％（ＮＨ４）２ＳＯ４分画に供した。ペレットおよび上清画分を固定化ヘパリンに吸着させ、１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出し、そしてＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３の存在をＩＬ１αおよびＭｙｃイムノブロット分析により分析した。図３Ｂに示すように、Ｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３とＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体は、ヘパリン結合複合体としてＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３およびＩＬ１α−βＧａｌを放出することができ、そして両タンパク質は１００％（ＮＨ４）２ＳＯ４分画後の上清画分に存在したが、Ｓ１００Ａ１３はペレット画分にも存在した。Ｃｕ２＋−依存的無細胞系（図２Ｂ）も、等モル濃度でペレットおよび上清画分にＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３の存在を示したので、いかなる理論に拘束されることも望まないが、これらのデータはＩＬ１α−βＧａｌおよびＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３が１：１のモル比で細胞外区分に存在できることを示唆している。
【０１５４】
塩基性残基が豊富なドメインを欠くＳ１００Ａ１３突然変異体は、ストレスが誘導するＩＬ１α放出のドミナントネガティブレギュレーターである
データはＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３が会合できることを示唆しているので、この会合の原因となるＳ１００Ａ１３中のドメインを評価した。Ｓ１００Ａ１３のカルボキシ末端の塩基性残基（ＢＲ）が豊富なドメイン（Ｗｉｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９６）を調査した。すなわちＳ１００Ａ１３の最後の１１残基を削除し、そしてＳ１００Ａ１３ΔＢＲを組換え体がＣｕ２＋−依存的様式でＩＬ１αと会合する能力を無細胞系で評価した。図４Ａに示すように、Ｓ１００Ａ１３ΔＢＲはＣｕ２＋およびＩＬ１αの存在下で沈殿できなかった。さらにＳ１００Ａ１３のように（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．２００１）、Ｓ１００Ａ１３ΔＢＲの組換え体は固定化Ｃｕ２＋から４０ｍＭイミダゾールで溶出した。さらに多数のＭｙｃエピトープタグを含むＳ１００Ａ１３ΔＢＲの欠失変異体（Ｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３ΔＢＲ）を作成し、そしてＩＬ１α−βＧａｌとのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体を生産するために使用した。ＩＬ１α−βＧａｌとＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３ΔＢＲのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体が、温度ストレスに応答してＩＬ１α−βＧａｌを放出する能力を評価した。図４Ｂに示すように、ＩＬ１α−βＧａｌはＩＬ１α−βＧａｌとＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３ΔＢＲのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体から熱ショクによりコンディショニングされた培地中に検出されなかった。
【０１５５】
Ｃｕ２＋キレーター、テトラチオモリブデート（ＴＴＭ）はＩＬ１αのストレスが誘導するＩＬ１αの放出を阻害する
Ｃｕ２＋がＩＬ１αとＳ１００Ａ１３との間の相互作用を媒介する能力は、細胞内Ｃｕ２＋がＩＬ１αのストレスが誘導する放出の調節に関与していることを示唆する。この前提を調査するために、Ｃｕ２＋キレーターであるＴＴＭが熱ショクに応答してＩＬ１αの放出を押さえる能力を評価した。図５Ａに示すように、ＴＴＭは２５０ｎＭでＩＬ１αの放出を阻害し、そしてこの濃度は臨床的試験で使用されたＴＴＭの濃度と一致する（Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：１−１０；Ｃｏｘ，ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ１１１：６９６−７０１；Ｍｅｒａｊｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，私信そしてＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２００１に提出された）。同様な結果はストレスに対応したＦＧＦ１放出の阻害についても観察された。
【０１５６】
Ｓ１００Ａ１３のＣｕ２＋−結合タンパク質としての発現が熱−ショックが誘導する転写の要件を克服できるかどうかも、アクチノマイシンＤがＳ１００Ａ１３バックグラウンドで発現した時、ＩＬ１αの細胞外区分への輸送を抑制する能力を調査することにより調査した。図５Ｂに示すように、アクチノマイシンＤは挿入物を含まないベクターとＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体からのＩＬ１α−βＧａｌの放出を抑制することができたが、アクチノマイシンＤは熱ショックに応答したＭｙｃ−Ｓ１００Ａ１３とＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体からのＩＬ１α−βＧａｌの輸送は抑制することはできなかった（図５Ｂ）。しかしＴＴＭをこの系に導入することにより、温度ストレスに応答してＩＬ１α−βＧａｌの放出を抑制することができ、そして同様の結果が翻訳を阻害するためにシクロヘキサミドを使用した時にも得られた。
【０１５７】
二価の銅は多くの正常な生理学的および病理学的プロセスでその役割が益々認識されるようになって来ている。実際にＳ１００Ａ１３（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２２５４４−２２５５２）およびＦＧＦ１（Ｅｎｇｌｅｋａ  ａｎｄ  Ｍａｃｉａｇ．１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１１３０７−１１３１５）は、Ｃｕ２＋−結合タンパク質であると特徴付けられているが、ＩＬ１遺伝子ファミリーの原型員は、ＦＧＦ１およびＩＬ１原型間の高度な構造的保存（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｇｒａｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９０）ならびに銅へタンパク質を結合させるのに重要であると従来から見なされている３つの溶媒に接近可能なヒスチジン残基の存在にもかかわらず（Ｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９０）、これまでにＣｕ２＋−結合タンパク質と特性付けられたことはなかった（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９７９）。驚くべきことには組換えＩＬ１αはＣｕ２＋−アフィニティーカラムから６０ｍＭイミダゾールで溶出したが、熱ショックによりコンディショニングした培地から得たＩＬ１αは４０ｍＭイミダゾールで溶出した。組換え体とＩＬ１αの放出形との間の溶出特性におけるこの変化は、温度ストレスによりコンディショニングした培地中に存在するＩＬ１αの放出形の溶出特性がＣｕ２＋−誘導ＦＧＦ１、ｐ４０  Ｓｙｔ１およびＳ１００Ａ１３多タンパク質凝集物の溶出特性に似ている（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．２００１）ことから興味深く、特定の理論に拘束されることは望まないが、細胞外ＩＬ１αがＦＧＦ１のストレスが誘導する放出の調節に関与するタンパク質の１つと会合できることを示唆する。実際にこの示唆は、ｍＩＬ１αおよびＳ１００Ａ１３が、１００％（ＮＨ４）２ＳＯ４飽和でＳ１００Ａ１３の沈降および溶解性を変える多タンパク質Ｃｕ２＋−依存的複合体を形成することができることを示唆するデータと一致する。さらに本明細書に開示するデータは、ＩＬ１αの成熟形および前駆体の両方が細胞内Ｓ１００Ａ１３に接近できることを示す。
【０１５８】
本明細書に開示するデータは、Ｓ１００Ａ１３のカルボキシ末端の塩基性リッチ（ＢＲ）ドメインがＩＬ１αの成熟形との相互作用を媒介することができることも示唆する。他のＳ１００遺伝子ファミリー員のカルボキシ―末端は、タンパク質と相互作用するそれらの能力を媒介することが示唆されている（Ｓｃｈａｆｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｉｚｍａｎｎ．１９９６，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｈｉ．２１：１３４―１４０；Ｋｉｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｒｅ  ４：１０４１―１０５２；Ｐｏｚｄｎｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７：１０７０１−１０７０８；Ｒｅｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：８９―９５）。興味深いことには、他のＳ１００遺伝子ファミリーとは異なり、Ｓ１００Ａ１３は他のＳ１００遺伝子ファミリー員には存在しない９アミノ酸の塩基性残基が豊富なドメインを含む（Ｓｃｈａｆｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｉｚｍａｎｎ．１９９６；Ｗｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２７：５９４―５９９）。このように本明細書に開示するデータは、ＩＬ１αの成熟形とＳ１００Ａ１３のＢＲドメインとの間のストレスが誘導する相互作用が、Ｃｕ２＋―依存的複合体として両タンパク質の放出を促進することを初めて示す。
【０１５９】
またＩＬ１αのバックグラウンドでのＳ１００Ａ１３の発現が、転写インヒビターであるアクチノマイシンＤに対するＩＬ１α放出経路の感度を弱めることも注目に値する。特定の理論に拘束されることを望まないが、Ｓ１００Ａ１３遺伝子の転写は熱ショックにより調節されないので、ＩＬ１αの成熟形の輸送における細胞ストレスの役割は古典的なストレス―媒介転写応答の誘導によらないのかもしれない；むしろストレス応答はＳ１００Ａ１３を修飾する翻訳後活性の調節を含むのかもしれない。この推定される翻訳後活性の調節は未だに知られていないが、本明細書に開示するデータは細胞内Ｃｕ２＋の酸化的特性はこの調節の特徴に関与し得ることを示唆している。
【０１６０】
銅キレーターであるテトラチオモリブデート（ＴＴＭ）は最近の臨床試験でヒトのガンの管理において評価されたが、銅欠乏中の全組織で機能し得る分子メカニズムは未知のままであった。特に血管新生の免疫が媒介するパラ分泌刺激の阻害、腫瘍の増殖の場所で阻害に対して重要と予想される現象における銅欠乏の潜在的役割は報告されなかった。本明細書に開示するデータは、前―炎症性および前―血管新生サイトカインであるＩＬ―１αの放出における銅の予想されなかった役割を初めて証明する。特定の理論に拘束されることを望まないが、ＴＴＭはＦＧＦ１の放出も抑制するので、Ｃｕ２＋キレーターが効果的な臨床的抗ガン剤として作用する能力は、これらの前炎症および血管新生シグナルペプチドレスポリペプチドホルモンを細胞外区分へ輸送することを制約するそれらの能力に関係し得る。
【０１６１】
本明細書に開示するデータは、ＩＬ−１αの放出が銅錯化により、および／またはＳ１００Ａ１３の短縮形を投与することにより選択的に阻害できることを初めて証明する。より具体的には本明細書に開示するデータは、ＴＴＭおよびＳ１００Ａ１３  ＢＲがＩＬ−１αのストレスが誘導する放出を阻害することができ、これは本明細書中のいたるところでより完全に開示するように、最終的にはＦＧＦ１のような血管新生促進因子を積んだ（ｌａｎｄｅｎ  ｗｉｔｈ）単核細胞の腫瘍環境への浸潤を防止することができることを初めて証明する。これらの結果は哺乳動物の腫瘍疾患の治療的管理へのＴＴＭの使用を支持するだけでなく、ＩＬ−１受容体アンタゴニストも同様の臨床的能力を現すことができることを示している。
【実施例２】
【０１６２】
再狭窄および新内膜形成
冠状脈インターベンション後の血管再狭窄に伴う新内膜形成は、血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）の移動および増殖を調節する炎症性サイトカインおよび増殖因子活性により媒介される複雑なプロセスである。細胞内の銅の代謝は、ＳＭＣの増殖および炎症細胞移動について重要であることが知られているＦＧＦ−１およびＩＬ−１αのストレスが誘導する放出に重要な役割を果たすので、ＴＴＭを使用して銅のインビボ効果を技術的に認識されているラットの頸動脈モデルにおいてバルーンが誘導した新内膜形成を使用して評価した。
【０１６３】
この実施例で提示する実験で使用する材料および方法をこれから記載する。
【０１６４】
動物
１２〜１６週齢で体重３５０〜４５０グラムの７９匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙのオスラット（チャールズリバーラボラトリーズ：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に含めた。この実験のすべてのラットはメインメディカルセンターリサーチインスティチュート（Ｍａｉｎｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の動物保護規則（ａｎｉｍａｌ  ｗｅｌｆａｒｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に従い取り扱い、そして実験プロトコールはその団体の動物の管理および使用委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可された。ラットはアメリカ生理学学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）の動物使用則に従い人の世話を受けた。すべてのラットは同一条件の温度（２１±１℃）、湿度（６０±５％）および明／暗サイクル下で維持し、そして普通のラット用の餌を自由に与えた。
【０１６５】
実験計画
銅キレーター、テトラチオモリブデン酸アンモニウム（シグマアルドリッチ）は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与した。１日の総量を新しく４５ｍｌの水に溶解し、そして飲料水中でラットに分配した。銅の錯化が総頸動脈露出後の新内膜形成に及ぼす効果を評価するために、ＴＴＭを以下のように与えた：６匹のラットにはＴＴＭ投与を損傷の２週間前に始めた；６匹のラットでは損傷の１週間前；５匹のラットはＴＴＭでの前損傷処置をしなかった。これらすべてのラットはバルーン損傷後、２週間、ＴＴＭで処置した。外科的手順を施され、そしてＴＴＭで処置しなかった５匹のラットを対照とした。
【０１６６】
損傷に関連して新内膜形成に及ぼす銅の錯化の効果のタイムコースを評価するために、さらに５群のラットを実験した。それらすべてが損傷の２週間前にＴＴＭで処置し、そして次いでＴＴＭを以下のように抑えた：損傷の日（ｎ＝６）ならびにバルーン露出から４日後（ｎ＝５）、６日後（ｎ＝７）、８日後（ｎ＝６）および１０日後（ｎ＝６）。
【０１６７】
銅の錯化が新内膜形成におよぼす効果の元にあるメカニズに取り組むために、ＴＴＭをバルーン損傷の２週間前、そしてその後毎日、動物を外科的手順後第４および第７日に安楽死させるまで投与した。したがって損傷から４および７日後に安楽死させたＴＴＭ無しの動物を対照として使用した。
【０１６８】
外科的手順および組織調製
ラットにケタミン（５０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（２．２ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔をかけた。頸動脈の血管形成術はバルーン塞栓摘出カテーテルを用いてすでに記載したように行った。簡単に説明すると、バルーンカテーテル（２Ｆ  Ｆｏｇａｒｔｙ、エドワーズ  ラボラトリーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を左外頸動脈を通して大動脈に導入し、そしてバルーンを膨らませた。血管は膨らませたバルーンを管腔に３回通すことにより損傷させた。カテーテルは引き戻す時に回転させた。最後の実験時に、動物は麻酔後に安楽死させた。遠位腹部大動脈を露出する正中腹部切開を作成した。腹部大動脈の分岐点で１８−ゲイジの静脈内カテーテルを用いて後方に動くカニューレ挿入後、動脈樹の血液は１００ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）を潅流することにより除き、続いてリン酸緩衝化生理食塩水中の４％ホルムアルデヒドまたは１：１比のアセトン／エタノール溶液のいずれかでインビボ固定を行った。大動脈弓、腕頭動脈および左大動脈分岐を含む全体の左および右頸動脈を回収し、そして個々の固定液にさらに浸漬した。損傷左総頸動脈を近位、中央および遠位部分から少なくとも４ｍｍ長で３つの切片に切断した。各実験群から未処理の対側性の右総頸動脈（対照）の一部も採取した。次いで検体は順次に等級化したエタノールを通して脱水し、そして切片とするためにパラフィンに包埋した。他の動脈は潅流固定を行わなかったが、直ちに凍結した。左頸動脈の３種のセグメントを組織学、形態計測学および免疫組織化学的実験に使用した。
【０１６９】
組織形態計測学的実験
動脈セグメントの形態計測学的分析は、ヘマトキシリン−エオシンで染色した断面について、ブラインド様式で行った。各動物に関して、損傷した血管の近位、中央および遠位セグメントから生じた少なくとも３つの区分を定量的に測定した。コンピューター化されたデジタル顕微鏡用の面積測定アルゴリズム（Ｏｐｔｉｍａｓ、５．２２バージョン）を使用して、外部弾性板（ｌａｍｉｎａ）（ＥＥＬ面積）、内部弾性板（ＩＥＬ面積）、および板面積を測定した。他の面積は以下のように計算した：中膜面積＝ＥＥＬ面積−ＩＥＬ面積；新内膜面積＝ＩＥＬ面積−板面積；新内膜−対−中膜（Ｉ／Ｍ）比＝新内膜面積／中膜面積。
【０１７０】
内膜細胞計数は、当該技術分野で標準であるすでに記載した方法に従い行った。簡単に説明すると、分析はヘマトキシリン−エオシンで染色した断面について、ｘ４０の顕微鏡倍率下で行った。内膜内の無作為の面積（全内膜断面積の２０〜４０％を包含する）を選択し、そして細胞核を強化し、そして動的な色の閾値化（ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｌｏｒ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）後に計数した。これらの既知の面積中の平均細胞核カウントを使用して、細胞密度を算出した（細胞／ｍｍ２）。
【０１７１】
免疫組織化学
バルーン−損傷動脈でのＳ１００Ａ１３、ＦＧＦ１、ｐ４０およびＩＬ−１α発現を評価するために、損傷から４、７および１４日後のパラフィン−包埋検体を５−μｍの切片に切り、そしてガラススライド上に乗せた。これらの切片を１０％過酸化水素中で９０分間インキューベーションして、内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断した。非特異的結合は切片をＰＢＳ中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ）とプレインキューベーションすることにより防止した。切片は順次、１：２００の濃度のポリクローナルウサギ抗−Ｓ１００Ａ１３抗体；１：５００の濃度のポリクローナルウサギ抗−ＦＧＦ１抗体；１：１００の濃度のモノクローナルマウス抗−ｐ４０抗体；１：５０の濃度のポリクローナルウサギ抗−ＩＬ−１α抗体；ホスファチジルセリン（ＰＳ）抗体とインキューベーションした。それらをＰＢＳで洗浄した後、切片を抗−ウサギおよび抗−マウスＩｇＧ−結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（バイオラッド：Ｂｉｏｒａｄ）とさらに３０分間、室温でインキューベーションした。各インキューベーションに続いてＰＢＳで洗浄した。染色は色原体である０．０６％３，３’−ジアミノベンジジン／５％過酸化水素（０．０５モル／リットルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中）を使用して視覚化した。対照切片は１：２００の濃度の免疫性のないウサギＩｇＧとインキューベーションした。
【０１７２】
増殖している細胞の核抗原（ＰＣＮＡ）分析を使用して、バルーン損傷部位での細胞の増殖活性を定量し、そしてこれはＳｉｉｔｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌに従い行った。簡単に説明すると、ＰＣＮＡ−陽性細胞を、接眼網線付き（倍率ｘ１０）およびｘ４０の対物レンズを備えた標準的な光学顕微鏡を使用して、容器の断面積中で計数した。少なくとも５００個の核を各スライドから計数した。切片は低出力下で写真を取り、画像をビデオ−デジタル化し、そして画像分析システムに保存した（Ｑｗｉｎ  Ｌｉｔｅ２．２、ライカ（Ｌｅｉｃａ））。染色結果はＰＣＮＡ−免疫反応性細胞核の割合として表した。同じ組織切片中に見られるわずかに拡散した核の染色は、ＰＣＮＡスコアに含めなかった。
【０１７３】
マクロファージの移動は、アセトン／エタノール固定切片中でマクロファージ−特異的モノクローナル抗体ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１）で免疫染色することにより評価した。マクロファージ浸潤の程度を定量するために、新内膜の全面積の割合としてＭＡＣ１−陽性細胞により占有された領域を測定した。損傷した動脈のＳＭＣの数は、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．の改良方法により４、７および１４日に計数した。簡単に説明すると、断面は市販されている検出系（ＤＡＫＯ）を使用してα−平滑筋アクチンに対して免疫組織染色に供し、そしてヘマトキシリンでカウンター染色した。α−平滑筋アクチン−陽性の細胞質を伴った核の数は、各ラットから１０個の独立した切片中をｘ４０の倍率でブラインド様式にて観察者により計数した。
【０１７４】
血清化学アッセイ
ＴＴＭで処置した哺乳動物中の銅の状態は、錯化された銅を検出するので総血清銅レベルを測定することによっては確かに追跡することができない。血清セルロプラスミンは合成が肝臓に対して生物学的に利用可能な銅により直接調節される、遊離の銅のより正確な指標であり、そして遊離銅状態の代用マーカーとして使用される  Ｓｃｈｏｓｉｎｋｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０：１５５６−１５６３。血清セルロプラスミンはベースラインレベルとしてＴＴＭ−処置前に、ならびに損傷の日および最終日に評価した。麻酔後に尾の静脈から得た血液（０．５〜１ｍｌ）は１０分間、２０００ｘＧで遠心し、そして血清はアッセイまで−２０℃で凍結した。セルロプラスミンの酸化活性は既に記載されているように測定した（Ｓｃｈｏｓｉｎｋｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０：１５５６−１５６３）。
【０１７５】
統計分析
すべての変数は平均＋ＳＥＭとして表す。スチューデントｔ−検定を使用して実験群間の差異を調査した。処置前後のセルロプラスミンレベルのタイムコースを、反復測定に関してＡＮＯＶＡにより比較した。ｐ＜０．０５の値を有意と考えた。
【０１７６】
この実施例で提示した実験の結果をこれから記載する。
【０１７７】
銅錯化はバルーン損傷後の新内膜形成を弱める
バルーン損傷、そしてＴＴＭで毎日処置してから１４日後、内膜／中膜比により予測される新内膜形成は、ＴＴＭ−適用を損傷の２週間前（ｎ＝６）または１週間前（ｎ＝６）から始めたラットにおいて、対照（ｎ＝５）ならびにＴＴＭ適用をバルーン損傷の同日から始めたラット（ｎ＝５）よりも顕著に防止された（それぞれ０．８３±０．００６および０．９６±０．１２１対１．７６±０．１０５、および１．２７±０．０４、Ｐ＜０．０５）（図６）。このように損傷前後のＴＴＭ投与はラットの頸動脈での新内膜形成において最高５３％の減少を導いた。
【０１７８】
Ｉ／Ｍ比を損傷の日に血清セルロプラスミンに対して、またはＴＴＭ−処置後のセルロプラスミンにおける変化に対してプロットした時、有意な直線関係が観察された（それぞれｒ＝０．８４、ｐ＜０．０００１およびｒ＝０．７８５、ｐ＜０．０００１）（図７）。
【０１７９】
ＴＴＭでの２週間の処置では、銅錯化および新内膜形成阻害に関して最高結果が示された。最終的にバルーン損傷後の異なる時点で、ＴＴＭ−抑制の効果を評価した。損傷の２週間前にＴＴＭ投与を始め、そして損傷から６、８または１０日後のいずれかまで続けた時、対照と比べて内膜／中膜比における有意な減少が観察された（それぞれ０．７６±０．０６、０．８３±０．１、０．７９±０．０１３）。しかしこの効果はＴＴＭ投与を損傷の日（１．２９±０．１９）または４日後（０．９３±０．０３４）に止めた時に縮小した（図８）。
【０１８０】
銅錯化は動脈壁へのマクロファージ浸潤を減少させる
大規模なマクロファージの浸潤は、ＴＴＭ−無しの動物において損傷から４日後に血管の回りの外膜および新内膜中に検出された（図９）。損傷から７日後までに、マクロファージは中膜にも見いだされ、そしてそれら動物では壁全体がマクロファージで充満した（図９）。しかしＴＴＭで処置したラットの動脈壁内では、損傷後のいかなる時点でも大変わずかなマクロファージしか存在しなかった（図９）。マクロファージはいずれの時点でも内膜にわずかにしか見いだされなかった。図９は損傷から４日後、新内膜中のマクロファージが対照群（図９Ｅ）とＴＴＭ−処置群（図Ａ）との間で検出できるほどの差はなかったことを表す。損傷から７日後、マクロファージはＴＴＭ−処置群（図９Ｂ）よりも対照（図９Ｆ）でより顕著であった。
【０１８１】
銅錯化は損傷動脈壁中の細胞増殖を阻害する
ＳＭＡ−陽性細胞は、損傷から７および１４日後のＴＴＭ−無しラットから得た組織と比べた時、ＴＴＭ−処置ラットの新内膜中で有意に少なかった（図１０）。バルーン損傷から４日後まで群間に有意差はなかった。
【０１８２】
ＰＣＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼデルタのコファクターとしてＤＮＡ合成に関与する３６−ｋＤａの酸性核ポリペプチドである。ＰＣＮＡは細胞増殖の開始に重要な役割を果たし、そしてその発現は細胞サイクルのＳ期中、ほとんど専ら上昇する。ＰＣＮＡ−陽性細胞は非−損傷頸動脈の切片では観察されなかった。分析したすべての損傷頸動脈分析において、中膜中のＰＣＮＡ−陽性細胞の割合は＜１％であるので、新内膜中で陽性に染色された細胞の割合のみを使用して、群間の増殖活性を比較した。ＴＴＭ−処置群（損傷の２週間前／２週間後）に比べて、対照群（ｎ＝５）ではバルーン血管形成術から１４日に新内膜領域中のＰＣＮＡ−陽性細胞は少なかった（図１０）。このようにＴＴＭは１０ｍｇ／ｋｇの用量で、にＰＣＮＡ−陽性細胞の有意な減少を引き起こした（ｎ＝５；Ｐ＜０．０５）。
【０１８３】
銅キレーターＴＴＭで処置したラットのバルーン−損傷血管壁におけるＳ１００ａ１３、ＩＬ１  、ｐ４０、ＰＳ発現
バルーン損傷から４、７および１４日後に、損傷および非損傷動脈セグメントの切片を、Ｓ１００Ａ１３、ＩＬ１  、ｐ４０およびＰＳについて免疫組織化学分析により分析した（各ｎ＝５）。バルーン損傷動脈では、新内膜および外膜でＳ１００Ａ１３、ＩＬ１  およびＰＳの時間依存的な拡散発現があったが、ＴＴＭ−処置損傷では、陽性染色は損傷から４および７日後に新内膜には検出されず、そして損傷から１４日後にわずかな細胞が陽性染色されただけであった（図１１）。
【０１８４】
本明細書に開示するデータは、バルーン損傷後の再狭窄の防止のための治療的道具として銅錯化の役割を初めて証明する。開示したデータは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、バルーン損傷前後の銅錯化が細胞からのＦＧＦ１およびＩＬ１  の阻害によるように、強力な抗−増殖および抗−炎症効果により新内膜創傷の形成を５３％まで阻害することを証明する。
【０１８５】
銅欠乏の終点を促進（ｅｘｐｅｄｉｔｅ）し、そして維持（ｓｕｓｔａｉｎ）するために、テトラチオモリブテン酸アンモニウム（有力で新規なキレーター）を利用した。ＴＴＭはウィルソン病の処置に最初は開発され、そしてオーファンドラッグとしてＦＤＡに認可された（Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５１：５４５−５５４；Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４８：４２−４７；Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３：１０１７−１０２５）。ＴＴＭは銅およびアルブミンと高親和性の３部複合体を形成して銅を血流から錯化する（Ｏｇｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：４９−５５；Ｏｇｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １０６：７５−８３）。ＴＴＭはヒトでは２〜４週間以内に銅の欠乏を安全に誘導する。ガン患者のフェイズＩおよびフェイズＩＩ臨床試験の予備結果からの証拠では、ヒトはＴＴＭにより誘導される、セルロプラスミンがベースラインの２０％まで減少した有意な銅欠乏に数カ月から数年耐えることができることを示す（Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：１−１０）。本明細書に開示するデータは、ベースラインの０〜２０％にセルロプラスミンが低下したラットにおける銅欠乏が、１０ｍｇ／ｋｇのＴＴＭの毎日の４週間以内の投与により動物の視診に検出できる影響無しで誘導され、そして維持されたことを示す。
【０１８６】
バルーン損傷後の新内膜形成は、多くが血管平滑筋細胞増殖、移動、分化および同時に分泌される細胞外マトリックスでの活性化による。理論的には新内膜中のＳＭＣ数は細胞移動、細胞増殖およびアポトーシス細胞死に依存する。本明細書に開示するデータは、ＴＴＭが損傷から７および１４日後までに内膜中のＳＭＡ−陽性細胞数を有意に減らすが、４日目までは細胞数に差異は検出されなかったことを示す。
【０１８７】
さらに処置した血管の組織学的分析では、完全な血管壁構造、および全体的なすべての形態学に変化が無いことが示された。しかしバルーン損傷動脈では、内膜中のＳＭＣが損傷から３から４日の間に初めて観察される（Ｆｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒ．１５：４３７−４４４）。４日にＳＭＣはわずかに限定されたＳＭＣ増殖を受けただけなので、損傷後４日の内膜ＳＭＣ数は中膜からのＳＭＣ移動の程度、あるいは外膜から筋芽細胞の移動の程度をより表すらしいと考えられる（Ｆｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒ．１５：４３７−４４４；Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：１６５５−１６６４）。ＳＭＣ移動はラットにおいて損傷後の新内膜形成における重要な段階と思われるが、ＳＭＣ−リッチアテローム硬化症斑によりすでに細くなった血管でバルーン血管形成術が行われるヒトでのこの役割はむしろ小さい。これに関して、ＳＭＣ増殖はヒトにおいて新内膜発生に関してより一層重要である。
【０１８８】
特定の理論に拘束されることは望まないが、バルーン損傷後の内膜の肥厚化はＦＧＦマイトジェン活性を通る高度にＦＧＦ−依存的プロセスであるので（Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｚ．Ｋａｒｄｉｏｌ．８４：１３７−１４４；Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４４−８４６）、ＦＧＦ放出の阻害は損傷に応答した新内膜発生を防ぐことができる。さらにＦＧＦ１およびＦＧＦ２がそれらの血管新生活性を通じて新内膜発生に及ぼす役割も考えるべきである（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：４６５−４７３）。さらに活性な血管新生によりバルーン損傷後早期に外膜の微細血管密度に上昇があり、これは損傷から１日を越えて、しかし１週間以内に起こるように見える（Ｐｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：２２９−２３８）。この時間枠は動脈修復のための炎症性細胞および間充識新内膜前駆体細胞の送達に最適である。炎症性細胞群はこれらの細胞および／または外膜繊維芽細胞の筋芽細胞への分化、そして続いてそれらの新内膜への移動を誘起する（Ｐｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：２２９−２３８：Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９３：２１７８−２１８７）。ＦＧＦ１の豊富な供給源として、炎症性細胞群は損傷後の動脈壁の増殖活性を増強させる。興味深いことには、動脈壁の微細血管の量は、新内膜塊の蓄積が急激に上昇すると同時に退行し始める。したがって特定の理論に拘束されることを望まないが、本明細書に開示するデータは、バルーン損傷後早期の血管外膜新生が血管壁に修復機能を誘起し、新内膜形成を導くことを示唆する。
【０１８９】
銅の代謝は、細胞外区分へのＦＧＦ１のストレスが誘導する放出に必須であるらしいので（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５５４９−２５５５７）、このメカニズムはラット頸動脈のバルーン損傷後に観察されたＴＴＭの抗−増殖能力の説明を提供することができる。この結果に従い、本明細書に開示するデータはＰＣＮＡを発現している細胞の数が、対照に比べてＴＴＭ−処置したラットの新内膜および中膜で有意に減少したことを示す。加えて、抗−血管新生因子としてのＴＴＭの潜在的役割を考慮すると（Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：１−１０；Ｆｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒ．１５：４３７−４４４；Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：１６５５−１６６４；Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｚ．Ｋａｒｄｉｏｌ．８４：１３７−１４４；Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４４−８４６；Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：４６５−４７３；Ｐｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：２２９−２３８；Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９３：２１７８−２１８７；Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １１１：６９６−７０１）、損傷から１４日後のＴＴＭ−処置ラットにおける新内膜形成の減少を一部説明することができ、そして特定の理論に拘束されることを望まないが、これは銅の錯化による血管外膜新生の低下による。
【０１９０】
マクロファージ浸潤の程度により評価される炎症の阻害は、本明細書に開示するデータにより証明されるように、対照と比較してＴＴＭ処置ラットで観察された。この知見はバルーン損傷後のマクロファージ誘引に及ぼす銅の錯化の役割を証明している。新内膜中のマクロファージの蓄積は、動脈壁を通って進んだ単球の「受動的」滞留から生じるか、またはより多くはＩＬ１、ＭＣＰ１（単球の化学誘引タンパク質）、ＩＬ−８等を含む単球の化学誘引物質の放出を活発な集合からもたらすことができる（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：２２２８−２２３５；Ｌｉｂｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８６：１１１４７−１１１５２）。これらのケモカインはアテローム硬化症の創傷部位およびバルーン損傷後に高度に発現し、そしてＳＭＣ移動および増殖を促進することが見いだされた（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：２２２８−２２３５）。患者の血管形成術後の管腔損失も循環している白血球の活性化と相関することがすでに記載された。さらにアテレクトミーを受けた患者の再狭窄は、アテレクトミーの時点で回収された組織中のマクロファージの割合と相関する（Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：３０９８−３１０２）。
【０１９１】
最近、インターロイキン受容体アンタゴニスト（受容体結合についてＩＬ１  と競合するタンパク質）に関する遺伝子の多型が再狭窄の低下と関係していることが見いだされた（Ｋａｓｔｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３６：２１６８−２１７３；Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｈｅａｒｔ  ８６：３３６−３４０）。さらにＭＡＣ−１欠乏マウスでの血管損傷は、白血球の蓄積の低下および新内膜形成の低下と関係する（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６：４３４−４４０）。本明細書で開示するデータで考察される、ＴＴＭで処置したマウスにおいて、マクロファージが浸潤した弱くなった動脈壁は、銅の錯化がインビトロでＩＬ１  放出を縮小させる本明細書中のいたるところで既に開示したデータと一致する（例えば上の実施例１）。実際に本明細書に開示するデータはＴＴＭ−処置ラットではバルーン損傷から７および１４日のＩＬ１  陽性染色にほぼ完全な阻害が示される一方、ＴＴＭ無しのラットのＩＬ１  染色は高度に陽性であったことを示す。この知見と一致して、損傷から７および１４日後の対照に比べて、ＴＴＭ処置ラットではＳ１００Ａ１３の存在は有意に低下する。
【０１９２】
ＩＬ１  およびＦＧＦ１放出は両方とも、Ｓ１００Ａ１３を含む多タンパク質放出複合体の形成に参加する遊離銅イオンに依存している（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２２５４４−２２５５２）。ＴＴＭによる銅の錯化はＦＧＦ１およびＩＬ１  放出の両方を阻害し、続いて単球誘引の阻害、そしてさらに動脈壁中に存在するのＳ１００Ａ１３、ＦＧＦ１およびＩＬ１  を減少させることができる。
【０１９３】
ＦＧＦ原型は、小胞体−ゴルジ装置により媒介される通常の細胞外経路を通って細胞外区分への分泌を支配するための、古典的なシグナルペプチド配列を含まないことは十分に知られている。しかしＦＧＦ原型の放出は、ＦＧＦ１輸送経路だけが誘導性であるので、すでに多様化している。ＦＧＦ１ホモダイマーならびにＩＬ１  が形質膜の細胞内面への接近を得るために、通常の細胞内小胞の細胞質面の使用を利用できるようにする個々の成分が、ホスファチジルセリン（ｐＳ）−結合タンパク質として個別に特徴つけられた。実際にはＩＬ１  、ＦＧＦ１、Ｓ１００遺伝子ファミリー、ｐ４０Ｓｙｔ１、およびアネキシン２は、無細胞条件下でｐＳと会合することができる。ホスファチジルセリンは酸性リン脂質であり、これは細胞のストレスに応答して形質膜の内面から外面へ位置を変える（ｆｌｉｐ）ことが知られている。ｐＳフリッピング（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）は内因性の凝集系の重要な成分であり、そしてアネキシン５結合の結果として細胞のアポトーシス挙動に関する証拠としてその誇張された形態が広く使用されている。ＦＧＦ１−またはＩＬ１  −ｐＳ結合複合体が細胞のストレスに応答して細胞外区分へそれらを輸送するためにｐＳフリッピングを使用するならば、それらのストレス放出は形質膜の外葉中のｐＳの出現に強く共役するはずである。実際に本明細書に開示するデータは、ＴＴＭ処置ラットがホスファチジルセリンのフリッピングを示さないが対照は示し、これらサイトカインの細胞からの放出がｐＳフリッピングに関連および／または媒介されていることを示す。
【０１９４】
これらの実験は銅の錯化がインビボで新内膜形成を効果的に減少させ、そして銅の錯化が顕著な抗増殖および抗炎症効果に対応することを示唆している。本明細書に開示するデータはまた、銅の錯化が血管再狭窄の治療的管理にも有用な道具となり得ることを示唆している。
【０１９５】
本明細書に引用した各特許、特許出願および公報の開示は全部、本明細書に編入する。
【０１９６】
本発明を具体的な態様に関して開示してきたが、本発明の他の態様および変更も当業者により本発明の精神および範囲から逸脱することなく考案され得る。添付する特許請求の範囲はすべてのそのような態様および均等な変更を含むと解釈するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
本発明を具体的に説明するために、本発明の特定の態様を図面に表す。しかし本発明は図面に表す態様のまさにその組み合わせ方および手段に限定されない。
【図１】図１Ａおよび１Ｂから成る図１は、固定化Ｃｕ２＋に結合するＩＬ１αを表すゲルの像である。図１Ａは、「ｍＭイミダゾール」により示すイミダゾール濃度の関数としてＣｕ２＋−キレーターアフィニティークロマトグラフィー（Ｈｉ  トラップ錯化；アマーシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を使用して解像された組換えヒトＩＬ１α（１μｇ）のＩＬ１αイムノブロット分析を表す像である。素通り（“ｆｌｏｗ”）および５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（“ＥＤＴＡ”）溶出画分も示す。図１Ｂは、パネルＡに記載したようにＩＬ１αイムノブロット分析に供したＣｕ２＋−キレーターアフィニティークロマトグラフィーにより解像された熱−ショックＩＬ１α（成熟形）ＮＩＨ３Ｔ３細胞トランスフェクション体から得たコンディショニング培地を表す像である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂから成る図２は、ＩＬ１αとＳ１００Ａ１３のカルボキシ−末端とのＣｕ２＋−依存的相互作用を表す像である。図２Ａは組換えヒトＩＬ１αとＳ１００Ａ１３との相互作用を表す像であり、これはこれらのタンパク質をＰＢＳ中でインキューベーションし、続いて超遠心そしてペレット画分のＳ１００Ａ１３−イムノブロット分析により評価した。データはＳ１００Ａ１３がＣｕ２＋の存在下でインキューベーションした時にはペレット画分中には存在しなかったが、ＩＬ１αの不存在下では存在したことを示す。図２ＢはＳ１００Ａ１３とＩＬ１αとの相互作用を示す像であり、これは本明細書のいたるところで記載するように組換えタンパク質を１００％（ＮＨ４）２ＳＯ４中でインキューベーションすることによりさらに分析した。
【図３】図３Ａおよび３Ｂから成る図３は、Ｓ１００Ａ１３がＩＬ１αの放出に関与することを表す像である。図３Ａは熱ショックに応答してＩＬ１α放出に及ぼすｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３発現の効果を証明する像である。簡単に説明するとｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３と成熟（ｍ）ＩＬ１α−βＧａｌ、ｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３と前駆体（ｐ）ＩＬ１α−βＧａｌ、挿入物が無いベクターとｐＩＬ１α−βＧａｌ、挿入物が無いベクターとｍＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体を熱ショックに供した。コンディショニング培地を集め、そしてＬａＶａｌｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）により記載されたように処理した。免疫沈降および溶出したタンパク質をそれぞれ８％および１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、そしてＩＬ１α（上パネル）およびＭｙｃ（下パネル）イムノブロット分析により評価した。図３Ｂはｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３およびｍＩＬ１αがヘパリンと会合する能力を表す像である。簡単に説明すると、ｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３とｍＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体および挿入物が無いベクターとｍＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体を熱ショックに供した（４２  Ｃで２時間）。コンディショニング培地を集め、１００％（ＮＨ４）２ＳＯ４画分に供し、遠心し、そしてヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−アフィニティーにより分析した（ＬａＶａｌｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．１９９８）。溶出したタンパク質を１０％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、そしてＩＬ１α（上パネル）およびＭｙｃ（下パネル）イムノブロット分析により評価した。
【図４】図４Ａおよび４Ｂから成る図４は、塩基性残基が豊富なカルボキシ−末端（Ｓ１００Ａ１３の約９アミノ酸残基）の削除が、突然変異体をＩＬ１α放出のドミナントネガティブエフェクターとして機能させることを媒介することを示す像である。図４Ａは、Ｓ１００Ａ１３の塩基性残基が豊富な（ＢＲ）ドメインを欠いているＳ１００Ａ１３の組換え形（“Ｓ１００Ａ１３ΔＢＲ”と命名）を、示したモル比で図２Ａに記載したように組換えＩＬ１αとインキューベーションしたことを表す像である。図４Ｂは欠失変異体、Ｓ１００Ａ１３ΔＢＲとＩＬ１αのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体を熱ショックに供し、そしてＤＴＴ処理後、コンディショニング培地を濃縮し、そしてＩＬ１α放出の評価用の抗−ＩＬ１α抗体との免疫沈降を表す像である。免疫沈降したタンパク質は、それぞれ１２（重量／容量）％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解像し、そしてＩＬ１αイムノブロット分析を使用して評価した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂから成る図５は、ＩＬ１α放出におけるＣｕ２＋の関与を表す。図５ＡはｍＩＬ１α−βＧａｌで安定にトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用して得た結果を表す像である。細胞は３７  Ｃで１８時間、Ｃｕ２＋キレーター、テトラチオモリブデート（ＴＴＭ）の不存在および存在下で示したようにインキューベーションし、そして未処理および処理細胞を３７  Ｃで維持するか、または図３に記載したように熱ショックに供した。コンディショニング培地はＩＬ１αイムノブロット分析によりＩＬ１α−βＧａｌの放出を評価し、そしてＴＴＭ−処理細胞からの細胞ライゼートをＩＬ１α−βＧａｌ発現の細胞内レベルを監視するために使用した。ＴＴＭ−陰性対照細胞ライゼートは同様レベルのＩＬ１α−βＧａｌ発現を現した。図５Ｂは、示したようなアクチノマイシンＤ（１０μｇ／ｍｌ）の存在および不存在下で、熱ショックに応答してｍｙｃ−Ｓ１００Ａ１３とＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞コトランスフェクション体中および挿入物が無いベクターとｍＩＬ１α−βＧａｌのＮＩＨ３Ｔ３細胞トランスフェクション体中のＩＬ１α−βＧａｌの放出を表す像である。コンディショニング培地を処理し、そしてＴａｒａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されているようにＩＬ１α−βＧａｌイムノブロット分析について評価した。
【図６】図６Ａから６Ｆから成る図６は、バルーン損傷から１４日後の新内膜形成を表す。図６Ａ−６Ｄは、ヘマトキシリン−エオシンで染色した頸動脈の横断面の各顕微鏡写真を表す像である（ｘ１０倍）。図６ＡはＴＴＭで処理していない対照群の各断面を表す像である。図６Ｂは損傷の２週間前および２週間後のＴＴＭ投与の効果を表す像である。図６Ｃは損傷の１週間前および２週間後のＴＴＭ投与の効果を表す像である。図６Ｄは損傷から２週間後（損傷前は無し）のＴＴＭ投与の効果を表す像である。図６Ｅはすべての４群のラットにおける内膜／中膜（Ｉ／Ｍ）比（平均＋ＳＥＭ）を表す棒グラフである。示したデータは各ＴＴＭ処方が対照と比較した時にＩ／Ｍ比に有意な低下を導いたことを証明する。さらに最高の結果は損傷の２週間前および２週間後にＴＴＭで処置した群で生じた。図６Ｆはすべての４群の損傷前後のセルロプラスミンレベルを表す直線グラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂから成る図７は、回帰分析である。データはＩ／Ｍ比が図７Ａに示したように損傷の日のセルロプラスミンレベルに依存し、ならびに図７Ｂに示したようにＴＴＭ処理後の血清セルロプラスミンの変化にも依存することを示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂから成る図８は、ＴＴＭ投与の効果を表す。図８Ａは５群のラットにおける内膜／中膜比（平均＋ＳＥＭ）を示す棒グラフであり、これらは損傷の２週間前からＴＴＭで処置し、そして次にバルーン損傷から４、６、８および１０日後のいずれかで抑えた。Ｉ／Ｍ比により予想される新内膜形成の阻害に関する最高の結果は、ＴＴＭで２週間前から処置し、そして損傷から６日後以上ＴＴＭで処置した群で起こる。図８Ｂは損傷前後の５群すべてにおけるセルロプラスミンレベルを示す直線グラフを表す。
【図９】図９Ａ−９Ｊから成る図９は、動脈バルーン損傷後のＴＴＭの効果を表す像である。図９Ａ−９Ｄは動脈バルーン損傷から４日後のラット頸動脈の顕微鏡写真を表す像である。図９Ｆ−９Ｉは動脈バルーン損傷から７日後のラット頸動脈の顕微鏡写真の像を表す。ヘマトキシリン−エオシン染色は、損傷から４日後の対照（図９Ａ）とＴＴＭ処置したラット（図９Ｂ）との間で新内膜発生における差異がないことを示した。しかし損傷から７日後までに新内膜の発生が、ＴＴＭ処置群（図９Ｇ）よりも対照群（図９Ｆ）でより顕著になった。図９Ｃおよび９Ｄおよび図９Ｈおよび９Ｉは以下を表す像である：図９ＣはＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ１）免疫染色（ｘ２０倍）を表し；図９Ｄは損傷から４日後のＴＴＭ−無しのラットの動脈を表し（対照）；図９Ｈは損傷から７日後のＴＴＭ−無しのラットの動脈を表し（対照）；そして図９Ｉは損傷から７日後のＴＴＭ処置ラットの動脈を表す（対照）。データはＴＴＭ処置ラットに比べて対照で、損傷から４および７日後にＭＡＣ１陽性細胞の顕著な上昇を示す。  棒グラフは、対照およびＴＴＭ−処置ラットにおいて損傷から４日後（図９Ｅ）および７日（図９Ｊ）後の新内膜で計数されるＣＤ１１ｂ−陽性細胞を示す。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｈから成る図１０は、ＴＴＭの効果を表す顕微鏡写真を表す像である。動脈バルーン損傷から４日後（図１０Ａおよび１０Ｂ）、７日後（図１０Ｄおよび１０Ｅ）および１４日後（図１０Ｇおよび１０Ｈ）のラット頸動脈の顕微鏡写真。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｄおよび１０Ｅは、抗−ＳＭ−α−アクチン抗体で免疫標識したスライドを表し、一方図１０Ｇおよび１０ＨはＰＣＮＡで免疫標識したスライドを表す像である。すべての像について、倍率はｘ２０であった。図１０Ａ、１０Ｄおよび１０ＥはＴＴＭ無しの動物を表す像であり、一方１０Ｂ、１０Ｅおよび１０ＨはＴＴＭ−処置ラットから得た頸動脈を表す。図１０Ｃは４日の新内膜中で計数されたαＳＭＡ細胞を示す棒グラフを表し、そして図１０Ｆは対照およびＴＴＭ−処置ラットにおいて損傷から７日後に新内膜で計数されたαＳＭＡ細胞を表す。図１０Ｊは対照およびＴＴＭ−処置ラットにおいて損傷から１４日後に計数されたＰＣＮＡ陽性細胞の差を示す棒グラフを表す。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｈから成る図１１は、動脈バルーン損傷から１４日後のラット頸動脈の顕微鏡写真を表す像である。図１１Ａおよび１１Ｂは、抗−Ｓ１００Ａ１３抗体を使用して免疫標識したスライドを表す像である（倍率ｘ２０）。図１１Ｃおよび１１Ｄは、抗ＩＬ１α抗体を使用して免疫標識したスライドを表す像である。図１１Ｅおよび１１Ｆは、抗ｐ４０抗体で標識したスライドを表す像である。図１１Ｇおよび１１Ｈは抗ホスファチジルセリン抗体で免疫標識したスライドを表す像である。データはＴＴＭ−処置ラット（図１１Ｂ、１１Ｄ、１１Ｆおよび１１Ｈ）と比べると、対照（図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｄおよび１１Ｇ）において、損傷から１４日後の陽性細胞間に差異を示す。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005504060.tif 000091
2005504060.tif 000092
2005504060.tif 000093
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