(57)【要約】本発明に従う方法の基本的な概念は、特定の特性を示す参照生物の探索および同定、ならびにその後の標的生物とのゲノム比較である。適切な参照生物の探索は、第１に、所望の生理学的機能（すなわち、生物学的効果または化学的効果）の規定を必要とする。第２に、その通常の生活への順応において自然に所望の機能を示す（すなわち、その生活様式において、生理学的課題に対処するため）生物が同定される。本発明の方法は、新規な生物学的活性物質を発見するための方法であって、ここで物質の所望される機能が、最初に規定され、この機能を自然に示す参照の生物が、選択される。
2005525107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物において薬理学的に活性である物質を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
所望される物質の好ましい生理学的特性を規定する工程
参照の生物または組織またはその部分を捜し求め、かつ選択する工程であって、該参照の生物または組織またはその部分が、所望される特性または少なくともそれに対して本質的に機能的に類似である特質を有する、工程
該参照の生物または組織またはその一部の該所望される特質の基礎となる生物学的に活性な物質またはその一部を同定し、かつ該生物学的物質をコードする遺伝情報またはその一部をおそらく同定する工程
該標的生物中の定向進化構造または定向進化遺伝子物質およびおそらく遺伝情報を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記選択された参照生物または組織またはその一部のＥＳＴライブラリーが確立され、そして該参照生物中の前記生物学的に活性な物質が同定される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記参照の生物のＥＳＴライブラリと前記標的生物の配列情報との間の比較できる構造および配列分析において特徴付けられる、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記標的生物中の前記定向進化遺伝子物質の同定において特徴付けられる、方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、少なくとも２つの参照の生物を利用することで特徴付けられる、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記参照の生物と該参照の生物の前記生物学的に活性な物質の基礎となる保存された構造の決定との間の比較できる構造および配列分析において特徴付けられる、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記保存された構造を、前記標的生物中の配列情報と比較することおよび該標的生物中の構造の同定に特徴付けられ、該構造が、実質的に該保護された構造に対する定向進化遺伝子である、方法。
【請求項８】
請求項４または７に記載の方法であって、前記標的生物の前記定向進化遺伝子物質の改変において特徴付けられる、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記定向進化遺伝子物質の所望される生物学的特徴を最適化するために、構造に基づく設計を用いることにおいて特徴付けられる、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により製造される、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドをコードする、オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
薬学的薬物の調製のための請求項１０に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１４】
薬物標的を同定し、確認するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法の使用または請求項１０に記載のポリペプチドの使用または請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
薬理学的に活性な物質のリード構造を同定するための、請求項１〜９の１項に記載の方法の使用または請求項１０に記載のポリペプチドの使用または請求項１１に従うオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１６】
請求項１０に記載のポリペプチドの使用または請求項１１に記載のポリヌクレオチドの使用において特徴付けられる確認された薬物標的を提供するための方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって供給される薬物標的。
【請求項１８】
薬理学的に活性な物質を提供するための方法であって、該物質が、以下の工程：
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドを調製する工程
薬物標的としてポリペプチドを確認する工程
該薬物標的の生物学的に活性なリガンドを開発する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によって製造される薬理学的に活性な物質。
【請求項２０】
請求項１９に記載の物質を含む薬理学的組成物。
【請求項２１】
薬物を製造するための請求項１９に記載の物質の使用。
【請求項２２】
配列番号２に記載のポリペプチドまたはその誘導体。
【請求項２３】
配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体。
【請求項２４】
配列番号３〜１５の配列のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項２５】
請求項１６または１８に記載される方法での、請求項２２または２４に記載のペプチドの使用または請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、商業的に適用可能な、特に薬理学的に活性な物質を同定するための方法に関し、そしてドイツ特許出願１０２  ０８  １８７．５（これはその開示が、本明細書中で十分に援用される）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
治療剤の効果は、通常、標的生物において生物学的機能を示す活性成分に基づく。この効果は、単に、身体内の認識構造体（例えば、酵素、チャネル、レセプターまたはシグナルペプチドおよび核酸）に対する慎重に標的化された部位特異的影響に起因する。従って、新規の薬剤の開発は、代替的に、新規の認識構造体（薬物標的）の同定に基づくか、または最適化された特徴を有するすでに公知の活性物質を提供することに基づく。しばしば、これらのアプローチは組み合わされる。
【０００３】
新規の薬剤の開発は、従来、天然で見出される物質または物質の組成物に基づくか、または単にランダムに合成された物質に基づき、このような物質は、細胞培養または動物実験において潜在的な生物学的活性または化学的活性についてスクリーニングされる。次いで、有望な候補と同定された物質（いわゆる、リード物質）は、それぞれの改変によって生じる生物学的活性または化学的活性の変化を測定しながら、徐々に改変され得る。この天然の物質由来の新規の薬剤をスクリーニングする様式（いわゆる、生体探査（ｂｉｏｐｒｏｓｐｅｃｔｉｎｇ））は、今日なお、薬物研究の重要な基礎である（Ｃｒａｇｇ  ＧＭ，Ｎｅｗｍａｎ  ＤＪ，Ｙａｎｇ  ＳＳ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９８  Ａｐｒ  ９；３９２（６６７６）：５３５−７，５３９−４０：Ｂｉｏｐｒｏｓｐｅｃｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇｓ；Ｂａｌｉｃｋ  ＭＪ．Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  １９９４；１８５：４−１８；考察１８−２４；Ｅｔｈｎｏｂｏｔａｎｙ，ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ−ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｎｋａｇｅｓ）。
【０００４】
自動化（いわゆる、ハイスループットスクリーニング、ＨＴＳ）および解明された物質の部位特異的改変についての知見の増加に起因して、活性物質についてのこの従来の「盲目的探索」の有効性が改善された（Ｒｏｓｅｌｌ  Ｓ．Ｌａｋａｒｔｉｄｎｉｎｇｅｎ  １９９７  Ｄｅｃ  １７；９４（５１−５２）：４９３８−４１：Ａｎ  ｅｎｔｉｒｅ  ｒａｉｎ  ｆｏｒｅｓｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｓｃｒｅｅｎｅｄ  ａｔ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ’ｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。しかし、このアプローチはなお、コスト−利益関係において不十分なままである：首尾良く開発されたある新規の薬物は、研究されたが最終的には拒絶された、多数のほとんど受容可能ではない物質と対向する（Ｇｒａｂｌｅｙ  Ｓ．，Ｔｈｉｅｒｉｃｋｅ  Ｒ．；「Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｎａｔｕｒａｌ  ｓｏｕｒｃｅｓ：ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９９；６４：１０１−５４；Ｌａｎｄｒｏ  ＪＡら：「ＨＴＳ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ；ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ」，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０００  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；４４（１）：２７３−８９）。さらに、しばしば、物質が、初期の合成および研究の間で最初は観察されなかった適応症に対する特定の効果を示すことが後に判明する。
【０００５】
コンビナトリアル化学の可能性が、この薬物発見のアプローチを改善する。しかし、この改善もまた、制限される。コンビナトリアル化学は、モジュールの系統的に種々の組合せに基づき、この組合せは多数の関連化合物（数百万個まで）を形成し、そして少なくとも部分的には、異なる程度まで所望の活性を示すことが予測される（Ｇａｙｏ  ＬＭ；「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｌｙ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １９９８  Ｓｐｒｉｎｇ；６１（２）：９５−１０６；Ｂｒａｄｌｅｙ  ＥＫら；「Ａ  ｒａｐｉｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｌｅａｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｌｐｈａ（１）−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０００  Ｊｕｌ  １３；４３（１４）：２７７０−４）。
【０００６】
新規の薬物物質についての系統的な探索（いわゆる、合理的薬物開発）は、「盲目的探索」のアプローチとは異なる。これは、処置されるべき疾患の分子機構についての先の知見、および分子ベースでそれぞれの薬物標的と相互作用する物質の特定の設計に基づく。さらに、合理的薬物開発は特に、適切な薬物候補についての系統的探索の目的のために、バイオインフォマティカル法とケモインフォマティカル法とを組み合わせる（Ｂａｊｏｒａｔｈ  Ｊ．：「Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒｅｖｉｓｔｅｄ：ｉｎｔｅｒｆａｃｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏ−  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏ−ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ」，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２００１  Ｏｃｔ  １；６（１９）：９８９−９９５）。従って、この方法は最初、病因に関与している構造（ほとんどは、タンパク質またはその遺伝群）の同定を必要とする。一旦、関連のタンパク質をコードする遺伝子が同定されると、これらは、例えば、ベクター、微生物、植物モデルまたは動物モデルに挿入され得、これらのモデルにおけるタンパク質の構造−機能の関係が研究される。特に、関連の結合部位を特徴付けするために、Ｘ線結晶解析を使用する構造分析がさらに用いられ得る。
【０００７】
標的の特性についてのデータは、将来の薬物物質としての十分に適合したリガンドの後の選択的探索、およびこのようなリガンドの最適化を可能にする。これは、いわゆる構造ベースの設計によって（これは標的に最もよく適合するリガンドのリード構造を誘導する）、標的（またはその結合部位）のコンピューターベースの三次元モデルならびに既知の分子および構造エレメントについての情報を用いることによって、またはペプチドをコードするＤＮＡライブラリーのような親和性選択法を使用することによって、可能になる。
【０００８】
この合理的薬物開発アプローチは、特に、病因の原因となる分子機構の従来の必須の知見に起因して、時間がかかり、費用がかかる。
【０００９】
ヒトゲノムの解読、およびほとんど完全に自動化されたスクリーニング法と組み合わせた標準的なモデル系のゲノムについての知見のかなりの増加は、より効率的でかつ時間のかからない薬物開発の可能性を新たに確立した。この薬物開発はますます、比較ゲノム分析（比較遺伝学）の系統的アプローチに基づく。
【００１０】
薬物開発における比較ゲノム分析の可能な適用は、例えば、ヒトにおける病因に関連する遺伝子の先の同定を必要とする。次いで、モデル生物（例えば、マウス）の定向進化動物遺伝子が、ジーンバンクにおける相同性検索によって同定される。次いで、動物モデルの部位特異的操作および改変が、ヒトにおける病因の分子機構についての結論を与える。従って、特に、ノックアウトモデルが、潜在的な薬物標的の分子特性についての詳細な情報を提供する（Ｈａｒｒｉｓ  Ｓ．，Ｆｏｏｒｄ  ＳＭ．：「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０００  Ｎｏｖ；１（４）：４３３−４３）。
【００１１】
あるいは、この研究は、動物モデルにおける病因に関連する遺伝子の同定で始まり得、この遺伝子は後に、ヒトにおける定向進化遺伝子を同定するために、比較ゲノム分析に導入される。次いで、それぞれの遺伝子産物が、標的として使用され得るか、またはさらなる薬物開発のための基礎として役立ち得る。
【００１２】
このアプローチは、ＷＯ００／４５８４８において開示され、これはハリネズミタンパク質の使用を記載する。このハリネズミタンパク質は、ヒトにおける骨損傷および軟骨損傷ならびに神経損傷の処置について、発生生物学のモデル系において以前に特徴付けられた。従って、第１に、動物のハリネズミタンパク質に対して定向進化遺伝子であるヒト遺伝子産物が同定され、その後この物質が、従来の方法によって、薬物に対して最適化された。
【００１３】
比較ゲノム分析の可能性は、分子バックグラウンドの理解を容易にすることによって、前年に、いくつかの新たな衝撃を与え、初期の希望は、ほとんど無駄であることが判明した。このことは大部分が、疾患の分子機構についての情報を処理する場合でさえ、適切な治療物質の方向付けられた開発または同定が困難なままであるという事実に起因する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、本発明の課題は、特にヒトにおいて活性な生物学的に活性な物質の、改善され、標的化された同定を可能にする方法を提供することである。
【００１５】
この課題は、独立請求項に従う方法によって解決される。本発明のさらなる有利な事項は、従属請求項の事項である。
【００１６】
本発明に従う方法の基本的な概念は、特定の特性を示す参照生物の探索および同定、ならびにその後の標的生物とのゲノム比較である。適切な参照生物の探索は、第１に、所望の生理学的機能（すなわち、生物学的効果または化学的効果）の規定を必要とする。第２に、その通常の生活への順応において自然に所望の機能を示す（すなわち、その生活様式において、生理学的課題に対処するため）生物が同定される。従って、この参照生物は、特定の課題を解決するための生理学的機構を発達させ、この課題はまた、見出されるべき活性物質により解決されるはずである。あるいはまた、すでに同定された機能が、開始点として使用され得る。
【００１７】
合理的薬物開発の既知の方法とは対照的に、本発明に従う方法は、疾患の根底にある分子機構を研究するためには比較ゲノム分析を用いないが、標的生物において以前に規定された機能を示す身体内の新規の構造について標的化された探索のために、間接的にこの比較ゲノム分析を用いる。
【００１８】
本発明の方法の特定の利点は、新規の治療物質の同定および開発のために必要な時間の著しい短縮である。なぜなら、病因の分子機構および関連の構造の以前の理解は、必須ではないからである。さらに、身体が有する関連の活性物質または治療的に関連した構造は、ほとんどの場合において高い特異性を示し、それにより、起こり得る薬物の望ましくない副作用が軽減される。
【００１９】
従って、本発明に従う方法の第一工程は、所望の物質が有すべき（生理学的）特性を正確に有する参照生物体−その天然の生息環境に適応して−の選択である。参照生物体として、特に動物生物体、ならびに例えば植物または微生物が適切である。また、標的生物体の特化した組織、ならびに個々の亜集団も、「参照生物体」の表現の下で要約され得る。これらは、例えば、所望の特徴を有する特に適切な対立遺伝子変異体（単一ヌクレオチド多形、ＳＮＰ）を発現し得る。
【００２０】
動物学、植物学、微生物学、生理学、生化学、遺伝学または医学の分野のデータベースが、適切な参照生物体の同定に有利に使用され得る。適切なデータベースの例は、「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ（登録商標）」、「ＢＩＯＳＩＳ  Ｐｒｅｖｉｅｗｓ（登録商標）」、「ＣＡＢＣＤ」、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｎｔｅｎｔｓ  Ｓｅａｒｃｈ（登録商標）」、「Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」、「Ｍｅｄｌｉｎｅ」および「Ｐｌａｎｔ−Ｇｅｎｅ」である。言うまでもなく、さらなるデータの供給源（例えば、特定の文献、フィルム、マイクロフィルム、聴覚性データ記憶媒体および電子データ記憶媒体）が、適切なデータの供給源の範囲に含まれる。
【００２１】
少なくとも１つの適切な参照生物体の同定後に、所望の特性の発現を引き起こす遺伝子が同定される。まず、目的の組織の遺伝子発現パターンが、ディファレンシャルディスプレイまたはマイクロアレイを用いて研究され得る。さらに、通常、潜在的に興味深い遺伝子の制限が、既に存在する。その後、選択された生物学的モデルの組織および細胞の遺伝子発現パターンの正確なアイデアが、近代のハイスループットＤＮＡ配列決定（例えば、非常に効果的な分解法によって分離されたタンパク質のＥＳＩ−ＭＳ／質量分析と組み合わせて）を使用して作製され得る。この発現ライブラリーから始めて、確立した方法を用いてｃＤＮＡライブラリーが作製され得る。
【００２２】
続いて、データベースから入手可能な標的生物体の遺伝情報と、このｃＤＮＡライブラリーのゲノム比較が行われ得る。従って、当業者は、例えば、比較ゲノム分析のために開発された生命情報科学的ソフトウェアプログラムを適用し得る。標的生物体において同定された定向進化遺伝子から始めて、対応する遺伝子産物が同定され得る。この同定は、好ましくは、ＥＳＴ（発現された配列決定タグ）の比較によって可能になる。
【００２３】
この遺伝子産物（例えば、ヒト由来）は、続いて、治療剤として直接的に使用され得る。しかしながら、同定された遺伝的配列を前もって改変または調節すること（例えば、遺伝子が不活性な状態で存在する場合）、あるいは遺伝子産物を治療的物質の開発に使用することは、有利であり得る。
【００２４】
機能的改変の適用およびタンパク質構造に対するその影響、ならびにさらなる下流開発（ｄｏｗｎ  ｓｔｒｅａｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）は、好ましくは構造解析または分子モデリングの方法の使用によって支持され得る。
【００２５】
あるいは、そしてさらに、同定された生物学的に活性な物質から導かれたデータは、この物質と相互作用するリード構造の同定に使用され得るか、または同定につながり得る。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態において、定向進化遺伝子物質または標的分子（薬物標的）の同定は、まず、選択された参照生物体の関連する組織のＥＳＴライブラリーの確立で始まる。ライブラリーが確立されると、これらの組織は、好ましくは生理的状態にあるべきであり、最も好ましくは、−実際の生活環境への生物体の適応に起因して−生理的機能のペプチドまたはタンパク質が発現され、これは、標的生物体において所望される生物学的に活性な物質と−少なくとも大部分−類似している。続いて、関連するペプチドまたはタンパク質が同定され得る。その後、それを用いて作製されたＥＳＴ−ライブラリーならびに標的生物体の比較ゲノム分析から導かれた情報が、定向進化構造の同定に使用され得る（例えば、ヒトにおいて）。これらの構造の例は、薬理学的に活性な物質、リード構造または標的分子（薬物標的）である。
【００２７】
（実施例：）
（Ｉ．ヒトＢＰＰ）
ヒトにおける血圧の制御は、主に、いわゆるレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系によって達成され、この系は、特に血圧低下の場合に活性化される：
循環の適応に起因して、肉体ストレスの場合には、アドレナリンおよびノルアドレナリンは、健康な人において迅速に増大する。急性心不全の患者において、動脈圧は、心臓タイムボリューム（heart time volume）の大きい減少の結果として低下する。神経液性反作用の反射において、副腎からのノルアドレナリンの分泌は、圧受容器反射によってか、そして交感神経線維によって、刺激される。さらに、神経伝達物質として作用する少量のノルアドレナリンが、シナプス接合部から放出され、血液循環に入る。アドレナリン性刺激の増大の結果として、ナトリウム再吸収が増加し、それにより、また腎臓からの水の停留も増大する。
【００２８】
血漿でのカテコールアミンの循環をますます増大させることにより、傍糸球体装置のβレセプタを刺激し、レニンの放出を増大させる。また、動脈圧の低下または低下したナトリウムの血漿レベルも、既にレニンの放出の刺激を引き起こしている。
【００２９】
タンパク質鎖の触媒的切断によって、レニンは、アンギオテンシノゲンからのアンギオテンシンＩの遊離を引き起こす。アンギオテンシンＩは、それ自体、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によってアンギオテンシンＩＩに形質転換される。これにより、特異的アンギオテンシンＩＩレセプタを活性化することによって強力な血管収縮が開始され、低下した心臓タイムボリュームの場合には末梢抵抗が増大し、その結果、動脈圧を高める。
【００３０】
さらに、中枢神経系のレセプターにおいて、アンギオテンシンＩＩは、枯渇中心を刺激し、これによって、水取り込みの増加を導く神経伝達物質の機能を示す。さらに、アンギオテンシンＩＩは、副腎からの、ステロイドホルモンであるアルドステロンの放出を刺激し、カリウムを犠牲にして、ナトリウムの吸収の増加を生じる。
【００３１】
従って、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系の刺激は、特に、動脈の血圧の低下に反して、２つの調節機構を導く：一方では、心臓の前負荷が、水およびナトリウムの増加した保持によって増大し、心不全において、より高い心拍体積を生じる。他方で、増加した末梢抵抗は、必須の器官に十分な血液循環を供給するために、低下した心臓時間体積の場合に、動脈血圧の標準化に寄与する。
【００３２】
従って、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系は、時間制限された身体的消耗または下痢の条件下でさえも、血液の体積が減少し、そして血圧が低下した場合に、安定な血圧を維持することを可能にする。しかし、特定の個体において、この調節系は過剰活性であり、病理学的範囲まで増加した血圧を生じる。この増加した血圧は、血管の損傷を引き起こし得、従って、長期間の、例えば、心臓病または発作をもたらし得る。
【００３３】
従って、病理学的高血圧を処置するために適切な治療剤の探索は、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系のインヒビターとして働く、生物学的に活性な物質に関した。
【００３４】
この物質の所望の生理学的特性（すなわち、レニン−アンギオテンシン−アルドステロン系の阻害）を規定した後に、首尾よい調査のための次の本質的な工程は、この所望の特性を有する物質を、その天然の生活様式に適合して発現する、適切な参照生物の選択であった。
【００３５】
このプロセスにおいて、６０日目からの日付の報告に戻って参照し、そしてブラジルの農場の労働者の衰弱（これらは、ｐｉｔ  ｖｉｐｅｒのＢｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａに咬まれることによって引き起こされた）を記載することが可能であった。英国の研究チームは、これらの症状が、ヘビ毒内のペプチドによって引き起こされたことを、後に明らかにした。これらのペプチドは、Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＢＰＰ）と称された。なぜなら、これらは、キニンであるブラジキニンの影響を刺激したからである。
【００３６】
ＢＰＰは、身体独自のブラジキニンの血管拡張性およびナトリウム排泄増加効果を増強し、これによって、低下した血圧を導く（図８）。この効果は、主として、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の阻害に起因し、これは、アンギオテンシンＩＩ（すなわち、高血圧症を引き起こす際に本質的に含まれる物質）の産生の終結を引き起こす。ＡＣＥは、ブラジキニンの加水分解による分解を触媒するので、ＡＣＥの阻害は、そうでなければ迅速に分解するブラジキニンの延長された半減期に付随し、従って、ブラジキニンの増強された拡張効果に付随する。
【００３７】
その数年後に、ブラジキニン増強効果を有する、他のヘビ毒（例えば、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｉｎｓｕｌａｒｉｓ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｈａｌｙｓ  ｂｌｏｍｈｏｆｆｉおよびＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｈａｌｙｓ  ｐａｌｌａｓ；図１）から単離されたペプチドの配列および構造の分析は、ＢＰＰの以下の一般的な構造特徴の推定を導く：
全ての既知のＢＰＰは、約１３アミノ酸残基の最大長さを有するオリゴペプチドであり、これは、プロリンリッチな配列、およびＮ末端に環状アミノ酸であるピログルタミン酸（これは、遺伝的にはグルタミンとしてコードされる）を有する。ほんのいくつかの例外があるが、Ｃ末端においては、３アミノ酸ペプチド（イソリシル−プロリル−プロリン、非常に稀には、セリル−プロリル−プロリン）が、遊離カルボン酸基−ＣＯＯＨが末端を構築して、見出され得る。
【００３８】
比較文献調査と組み合わせた、比較データベース分析のさらなる工程において、ヘビ毒およびトカゲ毒は両方、タンデム配向で、前駆体配列中にコードされ、そのＣ末端において、ナトリウム排泄増加効果を有するペプチドを含むことが見出された。例えば、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａの２５６アミノ酸配列は、ＢＰＰ前駆体タンパク質であり、これは、Ｎ末端において、シグナル配列に続いてＢＰＰをコードし、一方で、Ｃ型のナトリウム排泄増加性ペプチドが、Ｃ末端方向に続く（ＣＮＰ；図２）。
【００３９】
具体的には、これらの結論は以下の概念およびに問題に基づく。
【００４０】
Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｈｏｒｒｉｄｕｍ  ｈｏｒｒｉｄｕｍの唾液腺由来のｃＤＮＡライブラリーにおけるハイスループットの配列決定は、以下のｃＤＮＡ配列を導いた：
【００４１】
【化１】
2005525107.tif 000003
このｃＤＮＡ配列の、公共のデータベースにおける配列の比較は、以下の結果を見込んだ：
【００４２】
【化２】
2005525107.tif 000004
この結果は、Ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｍ  ｈｏｒｒｉｄｕｍから見出されたｃＤＮＡ配列が、ナトリウム排泄増加性ペプチドの前駆体タンパク質をコードするという結論を導いた。さらに、ナトリウム排泄増加性ペプチドは、ヘビ毒において見出され得（Ｓｃｈｗｅｉｔｚ  Ｈ，Ｖｉｇｎｅ  Ｐ，Ｍｏｉｎｉｅｒ  Ｄ，Ｆｒｅｌｉｎ  Ｃ，Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ  Ｍ．Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ｍａｍｂａ  Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ  ａｎｇｕｓｔｉｃｅｐｓ；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２  Ｊｕｌ  １５：２６７（２０）：１３９２８−３２）、これらの前駆体配列もまた、ＢＰＰをコードする（Ｍｕｒａｙａｍａ  Ｎ，Ｈａｙａｓｈｉ  ＭＡ、Ｏｈｉ  Ｈ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＬＡ，Ｈｅｒｍａｎｎ  ＶＶ，Ｓａｉｔｏ  Ｈ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｙ，Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｓ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ＢＬ，Ｙａｍａｎｅ  Ｔ，ｄｅ  Ｃａｍａｒｇｏ  ＡＣ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎ  ｂｒａｋｙｋｉｎｉｎ−ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９７  Ｆｅｂ  １８；９４（４）：１１８９−９３）ことが、文献において公知である。
【００４３】
以下の配列は、Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｈｏｒｒｉｄｕｍ  ｈｏｒｒｉｄｕｍ由来のナトリウム排泄増加性ペプチドの前駆体のプレプロ形態を示す。
【００４４】
【化３】
2005525107.tif 000005
（ナトリウム排泄増加性ペプチド）
この配列は、潜在的なナトリウム排泄増加性ペプチド（相同性によって決定された）よりＮ末端側に位置する領域が、互いに非常に類似であるかまたは同一の配列エレメントを含むことを示す。ヘビ由来のナトリウム排泄増加性ペプチドおよびＢＰＰ（ブラジキニン増強ペプチド）の既知の前駆体配列に対する類似性において、これらの配列セクションは、ブラジキニンの生理学的効果を増強するペプチドをコードし、そしてまた、ヘビ由来のＢＰＰと同様に、ＡＣＥ（アンギオテンシン変換酵素）を阻害することが仮定される。
【００４５】
試験のために、これらのペプチドがＡＣＥインヒビターを構築する場合、２つのペプチドが合成された（Ｓ６８２およびＳ６８３。配列については以下を参照のこと）。ヘビ毒由来のＢＰＰから既知であるように、Ｃ末端を、プロリル−プロリンであるように選択した。前駆体タンパク質において、３つの配列セクションは、同一である。このアミノ酸配列を、ペプチド（Ｓ６８３）について選択した。第二のペプチド（Ｓ６８２）は、同じ配列を含む。しかし、Ｎ末端において、これはさらに５アミノ酸伸長している。このペプチドにおいて、Ｎ末端グルタミンを、ピログルタミンで置き換えた。ピログルタミンは、グルタミンとしてコードされる。これは、酵素的改変によって構築される。ヘビにおいて見出される全ての公知のＢＰＰは、ピログルタミンをＮ末端として含むので、これもまた、Ｈｅｌｏｄｅｒｍａについて仮定される。
【００４６】
２つのＨｅｌｏｄｅｒｍａペプチドを、それらのＡＣＥ阻害活性について試験した（ヒトＢＰＰにおいてと同じアッセイ；以下を参照のこと）。
【００４７】
ブタ腎臓由来のＡＣＥインヒビターについてのＩＣ５０値は、以下の表（表６）に提示される。
【００４８】
【表６】
2005525107.tif 000006
これらの知見を出発点として用いて、ヒトナトリウム排泄増加性ペプチドの（プロ）前駆体配列を、これらの一般的構造特徴に関して分析した。これによって、動脈ナトリウム排泄増加性ホルモン（ＡＮＰ）の（プロ）前駆体タンパク質において、プロリンリッチ配列モチーフを同定することが可能であり、これは、ヘビＢＰＰにおいて見出されるものと同じプロリンパターン（すなわち、Ｃ末端プロリル−プロリンおよびＮ末端方向の２つのさらなるプロリン残基）を示す。
【００４９】
（ＡＮＦ＿ヒト心房性ナトリウム利尿因子前駆体（ＡＮＦ））
配列１５３ａａ；１６７０８ＭＷ
シグナル    １．．．．２５            シグナルペプチド
ペプチド    ２６．．．．５５          心臓膨張関連ペプチド（ＣＤＰ）
ペプチド    ７３．．．．８２          ヒトＢＰＰ
ペプチド    １２４．．．．１５１    心房性ナトリウムペプチド（ＡＮＰ）
ジスルフィド  １３０．．．１４６      類似性による
改変体      １５２．．．１５３        欠いている（２つの遺伝子のうち１つにおいて）
【００５０】
【化４】
2005525107.tif 000007
ヒトＡＮＰ前駆体タンパク質についての概観は、図３において示される。シグナル配列の解剖後、前駆体配列ｐＡＮＰは残り、２５アミノ酸残基によって短くされる。
【００５１】
この短い配列切片において、１０アミノ酸より多くを有する振とう毒液の特徴的なプロリンパターンを、実施し得る：
アミノ酸同一性：１００＞＝７５      ＞＝７５      ＞＝５０    ＜５０
【００５２】
【化５】
2005525107.tif 000008
番号１〜７は、振とう毒液由来のＢＰＰであり、番号８は、ヒトプロＡＮＰからの２２アミノ酸配列切片であり；ここで、ＡＳ位置６１〜８２を含む。
【００５３】
ヒトｐＡＮＰ（前駆体ＡＮＰ）の検出されたアミノ酸配列から始まる場合、Ｃ末端にプロリル−プロリンを含む全てのペプチドは、合成される。これらのペプチドは、全長７〜１５のアミノ酸配列において変化する。これらのペプチドの配列は、表１において示される。
【００５４】
【表１】
2005525107.tif 000009
これによって、全長１５アミノ酸配列は、より大きくならない。なぜなら、より長い配列は、潜在的に第二構造を形成し、活性を減少するからである。これを、振とうＢＰＰを使用する実験においてすでに示した。制御する場合、２２アミノ酸残基のペプチドを、合成した。
【００５５】
これらのペプチドを、ブタの腎臓由来のアンギオテンシン転換酵素を用いるインビトロＡＣＥインヒビターアッセイを使用するそれらのインヒビター効果について調査した。ヒプリル（ｈｉｐｐｕｒｙｌ）ヒスチジルロイシンを、基質として使用した。アッセイの概略表示を、図４において示す；ＩＣ５０値の代表的なグラフ測定を、図５に供する。具体的な実験的説明を、以下に得る。各々のＩＣ５０値を、表１において示す。
【００５６】
これらのペプチド（Ｂｉｏｓｙｎｔａｎから合成され、そして購入された）に加え、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ（Ｓｉｇｍａ）およびＣａｐｔｏｐｒｉｌ（Ｓｉｇｍａ）由来のＢＰＰ９ａ−振とうＢＰＰ調査の基礎において開発された第一号性ＡＣＥインヒビター−を、ＡＣＥを阻害するため、それらの特性について分析した。
【００５７】
【表２】
2005525107.tif 000010
2005525107.tif 000011
すでに２．４μＭの濃度であるデカペプチドＳ５４５が、最大値の半分を有する阻害効果を示すことを要約し得る。さらに、このペプチドを９、８または７アミノ酸に短縮することは、ＩＣ５０値の増加へ導く。同様のことは、ペプチドを１５アミノ酸に伸長することも生じる。例えば、ＢＰＰ  Ｓ５４１についてのＩＣ５０値は、４８μＭである。インビトロにおいてピログルタミン酸塩にＮ末端の形質転換を含む２２アミノ酸にペプチドを伸長することは、３００μＭより大きいＩＣ５０値を生じ、従って、ほとんど不活性である（表２）。これらの結果を、表５ａ−５ｋおよび図５ａ−５ｋにおいて示す。
【００５８】
最高の活性を示すデカペプチドＳ５４５（これは、Ｓ６０５の異名である）をさらなる実験に使用して、ブラジキニン相乗作用効果を証明した。正常血圧ラットを用いてこれらの実験を行い、ブラジキニンによって誘導される短期間での血圧低下（および血管拡張によって引き起こされる短期間での血圧低下）を測定した。これらの実験は、このペプチドの濃度依存性ブラジキニン相乗作用を示す。さらに、Ｓ５４５（ｐｒｏＡＮＰ４８−５７にも対応している）もまた、高血圧ラットにおいて、インビボで試験した（図７）。
【００５９】
正常血圧ラットを用いたインビボでの試験において、これらの動物に先に麻酔し、そして血圧の安定後に、一定量のブラジキニンで処置した。その後、カプトプリルまたはヒトＢＰＰのいずれかを投与し、続いて、一定量のブラジキニンで再度処置した。その後、最大血圧低下を決定し、第１因子としてブラジキニンに基づいて、その相乗作用因子を決定した。結果を、表３ａおよび表３ｂに示す。同様に、収縮期血圧および拡張期血圧、中間圧力低下率および基準値まで戻るのに必要とされる時間を測定した（表４ａ〜４ｊを参照のこと）。詳細な実験の記述を、以下で与える。
【００６０】
興味深いことに、インビボでのブラジキニン相乗作用効果は、カプトプリルと比較して、１０倍高い分子濃度のみを必要とするのに対して、ＡＣＥアッセイにおいては、カプトプリルと同じ効果を達成するために、１０００倍よりも高い用量が必要である、このことは、ＡＣＥ阻害に加えて、インビボにおいてブラジキニン相乗作用に対する二次活性が存在しているはずであるという結論を導く。
【００６１】
考えられる解釈は、膜結合レセプターとのＢＰＰ相互作用（例えば、すなわち、ブラジキニンＢ２レセプターにおけるアロステリック調節因子としての作用）によって与えられ得る（図６）。従って、本発明に従うペプチドを用いて行った研究から得られた知見は、新規の薬物標的（すなわち、膜結合レセプター）の確証のために役立ち得、従って、高血圧症の処置のための新規療法の開発のために役立ち得る。
【００６２】
（実験手順：）
（１．ＡＣＥ阻害アッセイ）
ＡＣＥ阻害アッセイの原理は、Ｃｈｅｊｕｎｇ，Ｈ．Ｓ．，Ｃｕｓｈｍａｎ，Ｄ．Ｗ．：「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔ  ｌｕｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｖｅｎｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ２９３，４５１−５６３（１９７３）によって確立された。
【００６３】
このアッセイにおいて使用されるペプチドを、合成し、Ｂｉｏｓｙｎｔｈａｎ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入し、そしてこのペプチドは、９２％より高い純度を示した。カプトプリルおよび既知のヘビＢＰＰ  ＢＰＰ９ａを、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００６４】
このアッセイを、９６ウェルＨＴＲＦプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）において行った。各ウェルについて使用した濃度は、以下である：３０μｌのアッセイ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．２）中、１ｍＵのブタ腎臓由来ＡＣＥ（ＥＣ  ３．４．１５．１（Ｓｉｇｍａ））、およびアッセイ緩衝液（０．３５〜２００μＭ）中に溶解した２０μｌインヒビター。アッセイ緩衝液中、２ｍＭ  ヒプリル（ｈｉｐｐｕｒｙｌ）−ヒスチジル−ロイシン（Ｓｉｇｍａ）（５０μｌ）を加えることによって、反応を開始した。この反応を、室温（２２℃）にて３０分間行い、１Ｍ  ＮａＯＨ（５０μｌ）を加えることによって終了した。その後、メタノール中、０．５％オルトフタルアルデヒド（ｏｒｔｈｏ−ｐｈｔａｌａｌｄｅｈｙｄ）（Ｓｉｇｍａ）（５０μｌ）を加え、５分後に、２．５Ｍ  ＨＣｌ溶液（５０μｌ）を加えて、発生した蛍光生成物を安定化した。１４２０  Ｖｉｃｔｏｒ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ）（λ＝３５５±３０ｎｍの活性波長およびλ＝５１５ｎｍの放出波長を有する）を使用して、１５分以内に、蛍光を測定した。
【００６５】
それらの結果を使用して、阻害％を算出した。用量反応速度を示す曲線から、図式的にＩＣ５０値を決定した。
【００６６】
時間依存的な差異に起因した誤差を最小にするために、全てのピペッティング工程を正確な時間計画で行った。
【００６７】
（２．正常血圧ラットおよび高血圧ラットの血圧測定）
麻酔した正常血圧のＷｉｓｔｅｒ雌ラット（２１０〜２４０ｇの範囲の体重を有する）について、試行を行った。
【００６８】
インビボアッセイについて使用されるペプチドｐＡＮＰ４８−５７を、Ｂｉｏｓｙｎｔｈａｎ（Ｂｅｒｌｉｎ）によって合成し、ＨＰＬＣによって９８％純度であることを決定した。
【００６９】
１ｍｌ／ｋｇ  Ｋｅｔａｖｉｔ（１００ｍｇ／ｍｌ）＋Ｒａｍｐｕｎ（２％）のｉ．ｐ．投与によって、麻酔を行った。
【００７０】
血圧測定を行うために、ポリエチレン製カテーテルを、Ａｏｒｔａ  ｆｅｍｕｒａｌｉｓに導入し、圧力変換器に接続した。Ｓｔａｔｈａｍ−Ｐ２３Ａ圧力変換器を、Ｇｏｕｌｄ  Ｐｏｌｙｇｒａｐｈに連結し、そしてこれを使用して、動脈血圧を測定した。Ｈｇ圧力計を使用して、この系を較正した。
【００７１】
全ての物質を溶解し、生理学的塩化ナトリウム溶液中で希釈し、そしてカテーテルを介して、Ｖｅｎａ  ｊｕｇｕｌａｒｉｓに導入した。
【００７２】
血圧の安定後（約１０分後）、体重１ｋｇあたり１ｍｇの２．５μＭブラジキニン溶液（Ｓｉｇｍａ）を投与した。５分間の時間間隔の後、１ｍｇ／ｋｇ用量のカプトプリル（Ｓｉｇｍａ）またはｐＡＮＰ４８−５７を投与し、その直後に、１ｍｇ／ｋｇの２．５μＭブラジキニン溶液を投与した。
【００７３】
測定した拡張期（ｐｄ）血圧および収縮期（ｐｓ）血圧から、以下の式：ｐｍ＝（ｐｓ−ｐｄ）×０．４２＋ｐｄを使用することによって、中間圧力を測定した。
【００７４】
高血圧ラットを使用した実験手順は、正常血圧Ｗｉｓｔａｒラットを使用した実験に対応した（図６を参照のこと）。実験用動物は、Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏラットであった。左腎臓動脈を狭めることによって、これらのラットを高血圧症にした。この古典的な高圧モデル（２個の腎臓のうち１個のクリップ腎血管による高血圧症）は、使用するラット幹とは無関係である。
【００７５】
（ＩＩ．ｅｘｅｎｄｉｎ）
過去２０年間に、哺乳動物組織の細胞膜レセプターと相互作用する多数のペプチド（Ｈｅｌｏｄｅｒｍｉｎ、Ｈｅｌｏｓｐｅｃｔｉｎｅ、ｅｘｅｎｄｉｎ３およびｅｘｅｎｄｉｎ４）が、トカゲ科Ｈｅｌｏｄｅｒｍａｔｉｄａｅ（種Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍおよびＨｅｌｏｄｅｒｍａ  ｈｏｒｒｉｄｕｍを含む）の毒液中で発見された。ｅｘｅｎｄｉｎ−３（Ｓｅｒ２−Ａｓｐ３）は、２アミノ酸について、ｅｘｅｎｄｉｎ−４（Ｇｌｙ２−Ｇｌｕ３）とは異なる。この構造的差異はまた、活性の差異も生じる。Ｅｘｅｎｄｉｎ−３は、ＶＩＰレセプターおよびＧＬＰ−１レセプターと相互作用し、そしてｅｘｅｎｄｉｎ−４は、ＧＬＰ−１レセプターとだけ相互作用する。
【００７６】
グルカゴンと類似の生化学的効果を有するこれらのペプチドは、明確な生理学的反応（例えば、糖尿病のげっ歯類における、ｅｘｅｎｄｉｎ−４による増大したインスリン分泌および膵臓の島細胞の刺激）を誘導する。
【００７７】
これらのペプチドの活性を調査することにより、新規のレセプターおよびレセプター型が明らかにされ、そして哺乳動物の生理学の理解が広がった。グルカゴン／血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）／セクレチンスーパーファミリーのペプチドと、トカゲペプチド間には、顕著な類似性が存在する。
【００７８】
Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｈｏｒｒｉｄｕｍの唾液腺由来のｃＤＮＡライブラリーのハイスループット配列決定の過程において、以下のｃＤＮＡ配列が同定された：
【００７９】
【化６】
2005525107.tif 000012
【００８０】
【化７】
2005525107.tif 000013
公開データベース中に存在する既知の配列との、これらの配列の比較は、以下の結果を生じた：
【００８１】
【化８】
2005525107.tif 000014
【００８２】
【化９】
2005525107.tif 000015
【００８３】
【化１０】
2005525107.tif 000016
【００８４】
【化１１】
2005525107.tif 000017
配列比較の結果は、以下を示す：ｈｅｌｏ＿ａｌｌ．０．１０８５は、これまで未知のｅｘｅｎｄｉｎ−１の前駆タンパク質（＝Ｈｅｌｏｓｐｅｃｔｉｎ）をコードし、そしてｈｅｌｏ＿ａｌｌ．０．５６４は、Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｈｏｒｒｉｄｕｍにおける、これまで未知のｅｘｅｎｄｉｎ−３の前駆タンパク質をコードする。
【００８５】
これらの配列の、ＶＩＰおよびグルカゴンに対するさらなる類似性が存在し、これは、以下の図から明らかである：
【００８６】
【化１２】
2005525107.tif 000018
ｅｘｅｎｄｉｎ−１は、Ｈ．ｓｕｓｐｅｃｔｕｍの毒液から元々単離されたといわれている。しかし、これらの結果は、ｅｘｅｎｄｉｎ−１が、Ｈ．ｈｏｒｒｉｄｕｍによって産生されることを示す。毒液のプローブを、Ｓｉｇｍａから購入した。おそらく、これらのプローブは、交換されているか、または混ざり合って、この誤った分類を生じている。
【００８７】
ヒトｃＤＮＡライブラリーにおけるＨ．ｈｏｒｒｉｄｕｍの２つのｃＤＮＡ配列を使用する検索を用いて、上記ヒトペプチドの前駆タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンが見出され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】（なし）
【図２】（なし）
【図３】（なし）
【図４】（なし）
【図５】（なし）
【図６】（なし）
【図７】（なし）
【図８】（なし）
【図９ａ】（なし）
【図９ｂ】（なし）
【図９ｃ】（なし）
【図９ｄ】（なし）
【図９ｅ】（なし）
【図９ｅｅ】（なし）
【図９ｆ】（なし）
【図９ｇ】（なし）
【図９ｈ】（なし）
【図９ｉ】（なし）
【図９ｊ】（なし）
【図９ｋ】（なし）
【図１０】（なし）
【図１１】（なし）
【図１２】（なし）
【図１３】（なし）
【図１４】（なし）
【図１５】（なし）
【図１６】（なし）
【図１７】（なし）
【図１８】（なし）
【図１９】（なし）
【図２０】（なし）
【図２１】（なし）
【図２２】（なし）
【図２３】（なし）
【図２４】（なし）
【図２５】（なし）
【図２６】（なし）
【図２７】（なし）
【図２８】（なし）
【図２９】（なし）
【図３０】（なし）
【図３１】（なし）
【図３２】（なし）
【図１】
2005525107.tif 000019
【図２】
2005525107.tif 000020
【図３】
2005525107.tif 000021
【図４】
2005525107.tif 000022
【図５】
2005525107.tif 000023
【図６】
2005525107.tif 000024
【図７】
2005525107.tif 000025
【図８】
2005525107.tif 000026
【図９ａ】
2005525107.tif 000027
【図９ｂ】
2005525107.tif 000028
【図９ｃ】
2005525107.tif 000029
【図９ｄ】
2005525107.tif 000030
【図９ｅ】
2005525107.tif 000031
【図９ｅｅ】
2005525107.tif 000032
【図９ｆ】
2005525107.tif 000033
【図９ｇ】
2005525107.tif 000034
【図９ｈ】
2005525107.tif 000035
【図９ｉ】
2005525107.tif 000036
【図９ｊ】
2005525107.tif 000037
【図９ｋ】
2005525107.tif 000038
【図１０】
2005525107.tif 000039
【図１１】
2005525107.tif 000040
【図１２】
2005525107.tif 000041
【図１３】
2005525107.tif 000042
【図１４】
2005525107.tif 000043
【図１５】
2005525107.tif 000044
【図１６】
2005525107.tif 000045
【図１７】
2005525107.tif 000046
【図１８】
2005525107.tif 000047
【図１９】
2005525107.tif 000048
【図２０】
2005525107.tif 000049
【図２１】
2005525107.tif 000050
【図２２】
2005525107.tif 000051
【図２３】
2005525107.tif 000052
【図２４】
2005525107.tif 000053
【図２５】
2005525107.tif 000054
【図２６】
2005525107.tif 000055
【図２７】
2005525107.tif 000056
【図２８】
2005525107.tif 000057
【図２９】
2005525107.tif 000058
【図３０】
2005525107.tif 000059
【図３１】
2005525107.tif 000060
【図３２】
2005525107.tif 000061
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月10日(2004.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物標的および標的生物を同定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
所望される薬物標的の好ましい生理学的特性を規定する工程
参照の生物または組織またはその部分を捜し求め、かつ選択する工程であって、該参照の生物または組織またはその部分が、所望される特質または少なくともそれに対して本質的に機能的に類似である特質を有する、工程、あるいは該参照の生物のゲノムｐｔタンパク質データベースを捜し求め、かつ選択する工程
該参照の生物または組織またはその一部の該所望される特質の基礎となる生物学的に活性な物質またはその一部を同定し、かつ該生物学的物質をコードする遺伝情報またはその一部をおそらく同定する工程
該標的生物中の定向進化構造または定向進化遺伝子物質およびおそらく遺伝情報を同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記選択された参照生物または組織またはその一部のＥＳＴライブラリーが確立され、そして該参照生物中の前記生物学的に活性な物質が同定される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記参照の生物のＥＳＴライブラリと前記標的生物の配列情報との間の比較できる構造および配列分析において特徴付けられる、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記標的生物中の前記定向進化遺伝子物質の同定において特徴付けられる、方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、少なくとも２つの参照の生物を利用することで特徴付けられる、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記参照の生物と該参照の生物の前記生物学的に活性な物質の基礎となる保存された構造の決定との間の比較できる構造および配列分析において特徴付けられる、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記保存された構造を、前記標的生物中の配列情報と比較することおよび該標的生物中の構造の同定に特徴付けられ、該構造が、実質的に該保護された構造に対する定向進化遺伝子である、方法。
【請求項８】
請求項４または７に記載の方法であって、前記標的生物の前記定向進化遺伝子物質の改変において特徴付けられる、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記定向進化遺伝子物質の所望される生物学的特徴を最適化するために、構造に基づく設計を用いることにおいて特徴付けられる、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により製造される、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドをコードする、オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
薬学的薬物の調製のための請求項１０に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１４】
薬物標的を同定し、確認するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法の使用または請求項１０に記載のポリペプチドの使用または請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
薬理学的に活性な物質のリード構造を同定するための、請求項１〜９の１項に記載の方法の使用または請求項１０に記載のポリペプチドの使用または請求項１１に従うオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１６】
請求項１０に記載のポリペプチドの使用または請求項１１に記載のポリヌクレオチドの使用において特徴付けられる確認された薬物標的を提供するための方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって供給される薬物標的。
【請求項１８】
薬理学的に活性な物質を提供するための方法であって、該物質が、以下の工程：
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドを調製する工程
薬物標的としてポリペプチドを確認する工程
該薬物標的の生物学的に活性なリガンドを開発する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によって製造される薬理学的に活性な物質。
【請求項２０】
請求項１９に記載の物質を含む薬理学的組成物。
【請求項２１】
薬物を製造するための請求項１９に記載の物質の使用。
【請求項２２】
配列番号２に記載のポリペプチドまたはその誘導体。
【請求項２３】
配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその誘導体。
【請求項２４】
配列番号３〜１５の配列のいずれか１つに記載のペプチド。
【請求項２５】
請求項１６または１８に記載される方法での、請求項２２または２４に記載のペプチドの使用または請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【国際調査報告】
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