(57)【要約】  本発明は、飲料水および表層水中の細菌を検出するための方法、詳細にはinsituハイブリダイゼーションによってレジオネラ種およびLegionellapneumophila種から、細菌を同時に特異的に検出するための方法に関する。本発明は、insituハイブリダイゼーションによってfaecalstreptococciを特異的に検出するための方法、および腸内細菌および大腸菌種の細菌を同時に特異的に検出するための方法、さらに対応するオリゴヌクレオチド・プローブ、および前記本発明の方法を行うことを可能にするキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）以下のヌクレオチド配列（それぞれの場合５’から３’方向）の１つを有するオリゴヌクレオチド
５’−ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｔａ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｔｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃｇ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｔ  ａｔｃ  ｔｇａ  ｃｃｇ  ｔｃｃ  ｃａｇ  ｇｔｔ  ａ
５’−ｃｃｃ  ｔｃｔ  ｇａｔ  ｇｇｇ  ｔａｇ  ｇｔｔ
５’−ｃｃｃ  ｔｃｔ  ｇａｔ  ｇｇｇ  ｃａｇ  ｇｔｔ
５’−ｔａｇ  ｇｔｇ  ｔｔｇ  ｔｔａ  ｇｃａ  ｔｔｔ  ｃｇ
５’−ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｔｃ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｃｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃａｃ  ａｃａ  ａｔｃ  ｇｔａ  ａｃａ  ｔｃｃ  ｔａ
５’−ａｇｇ  ｇａｔ  ｇａａ  ｃｔｔ  ｔｃｃ  ａｃｔ  ｃ
５’−ｃｃａ  ｃｔｃ  ａｔｔ  ｔｔｃ  ｔｔｃ  ｃｇｇ
５’−ｃｃｃ  ｃｃｇ  ｃｔｔ  ｇａｇ  ｇｇｃ  ａｇｇ
５’−ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｔｔｃ  ｃｃｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ
５’−ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｔｔｔ  ｃｃｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ  ｃ
５’−ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｃｃａ  ａｔｇ  ａ
５’−ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃｔ  ｔａｃ  ｔｔｇ  ｇｔｇ
５’−ｔａｇ  ｇｔｇ  ｃｃａ  ｇｔｃ  ａａａ  ｔｔｔ  ｔｇ
５’−ｃｃｃ  ｃｔｔ  ｃｔｇ  ａｔｇ  ｇｇｃ  ａｇｇ
５’−ｃｃｃ  ｃｃｔ  ｃｔｇ  ａｔｇ  ｇｇｃ  ａｇｇ
５’−ｃｇａ  ｃｔｔ  ｃｇｃ  ａａｃ  ｔｃｇ  ｔｔｇ
５’−ｃｇａ  ｃｔｔ  ｃｇｃ  ｇａｃ  ｔｃｇ  ｔｔｇ
５’−ｃｇａ  ｇｔｔ  ｃｇｃ  ａａｃ  ｔｃｇ  ｔｔｇ
５’−ｇａｃ  ｃｃｃ  ｃｔｔ  ｇｃｃ  ｇａａ  ａ
５’−ａｔｇ  ａｃｃ  ｃｃｃ  ｔａｇ  ｃｃｇ  ａａａ
５’−ｇｇｃ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａｇ  ｔｃｇ  ａｃ
５’−ｇｇａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｇｃｃ  ｔａｃ  ａｔｇ  ｃｔ
５’−ａｃａ  ａｇａ  ｃｔｃ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｇｃｃ
５’−ｃａｇ  ｇｃｇ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｔｔａ  ａｃｇ  ｃｇｔ  ｔ
５’−ｇｇｃ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａａ  ｔｃｇ  ａｃ
５’−ｇｇｃ  ｃａｃ  ａａｃ  ｃｔｃ  ｃａａ  ｇｔａ  ｇａ
５’−ａｃｃ  ａｃａ  ｃｔｃ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｇｃｃ
５’−ａｃａ  ａｇａ  ｃｔｃ  ｔａｇ  ｃｃｔ  ｇｃｃ
５’−ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｇａ  ｔｔｔ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｔｔ
５’−ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｔａ  ｃｔｔ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｔｔ
５’−ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｔａ  ｔｔｔ  ａａｔ  ｇｃｇ  ｔｔ
５’−ａｇｃ  ｔｃｃ  ｇｇａ  ａｇｃ  ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃａ
５’−ｇｇａ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａｇ  ｔｃｇ
５’−ｇｃｃ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａｇ  ｔａｇ
５’−ａｔｇ  ｇｃｃ  ｃｃｃ  ｔａｇ  ｃｃｇ  ａａａ
５’−ｇ  ａｔｇ  ａｃｃ  ｃｃｃ  ｔａｇ  ｃｃｇ  ａａａ
５’−ａａｃ  ｃｔｔ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｔａ  ｃｔｃ  ｃｃ，
ｉｉ）（ｉ）に記載のオリゴヌクレオチドと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％同一であり、飲料水と関連がある細菌の細胞の核酸配列との特異的なハイブリダイゼーションを可能にするオリゴヌクレオチド、
ｉｉｉ）欠失および／または付加によって（ｉ）に記載のオリゴヌクレオチドと異なり、飲料水と関連がある細菌の細胞の核酸配列との特異的なハイブリダイゼーションを可能にするオリゴヌクレオチド、および
ｉｖ）ｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）に記載のオリゴヌクレオチドと相補的な配列と厳密な条件下でハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
サンプル中の飲料水と関連がある細菌を検出するための方法であって、
ａ）サンプル中に存在する飲料水と関連がある細菌を培養する工程、
ｂ）サンプル中に存在する飲料水と関連がある細菌を固定する工程、
ｃ）固定した細菌を請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと共にインキュベートして、ハイブリダイゼーションを行う工程、
ｄ）ハイブリッド形成しなかったオリゴヌクレオチドを除去する工程、
ｅ）ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドを用いて、飲料水と関連がある細菌の細胞を検出および視覚化、および場合によっては定量化する工程、
からなる方法。
【請求項３】
ａ）蛍光マーカー、
ｂ）化学発光マーカー、
ｃ）放射性マーカー、
ｄ）酵素活性基、
ｅ）ハプテン、
ｆ）ハイブリダイゼーションによって検出可能な核酸、
からなる群から選択される検出可能なマーカーに、前記オリゴヌクレオチドを連結させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが飲料水サンプルまたは表層水サンプルである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
光学顕微鏡、エピ蛍光顕微鏡、化学発光測定装置、蛍光光度計またはフロー・サイトメーターによって前記検出を行う、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
飲料水と関連がある細菌は、レジオネラ属およびL. pneumophila種の細菌、またはfaecal streptococci 、または腸内細菌および大腸菌種の細菌である、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが
５’−ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｔａ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｔｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃｇ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｔ  ａｔｃ  ｔｇａ  ｃｃｇ  ｔｃｃ  ｃａｇ  ｇｔｔ  ａ．
からなる群から選択される、レジオネラ属およびL. pneumophila種の細菌を同時に特異的に検出するための、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが
５’−ｃｃｃ  ｔｃｔ  ｇａｔ  ｇｇｇ  ｔａｇ  ｇｔｔ
５’−ｃｃｃ  ｔｃｔ  ｇａｔ  ｇｇｇ  ｃａｇ  ｇｔｔ
５’−ｔａｇ  ｇｔｇ  ｔｔｇ  ｔｔａ  ｇｃａ  ｔｔｔ  ｃｇ
５’−ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｔｃ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｃｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃａｃ  ａｃａ  ａｔｃ  ｇｔａ  ａｃａ  ｔｃｃ  ｔａ
５’−ａｇｇ  ｇａｔ  ｇａａ  ｃｔｔ  ｔｃｃ  ａｃｔ  ｃ
５’−ｃｃａ  ｃｔｃ  ａｔｔ  ｔｔｃ  ｔｔｃ  ｃｇｇ
５’−ｃｃｃ  ｃｃｇ  ｃｔｔ  ｇａｇ  ｇｇｃ  ａｇｇ
５’−ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｔｔｃ  ｃｃｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ
５’−ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｔｔｔ  ｃｃｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ  ｃ
５’−ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｃｃａ  ａｔｇ  ａ
５’−ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃｔ  ｔａｃ  ｔｔｇ  ｇｔｇ
５’−ｔａｇ  ｇｔｇ  ｃｃａ  ｇｔｃ  ａａａ  ｔｔｔ  ｔｇ
５’−ｃｃｃ  ｃｔｔ  ｃｔｇ  ａｔｇ  ｇｇｃ  ａｇｇ
５’−ｃｃｃ  ｃｃｔ  ｃｔｇ  ａｔｇ  ｇｇｃ  ａｇｇ
５’−ｃｇａ  ｃｔｔ  ｃｇｃ  ａａｃ  ｔｃｇ  ｔｔｇ
５’−ｃｇａ  ｃｔｔ  ｃｇｃ  ｇａｃ  ｔｃｇ  ｔｔｇ
５’−ｃｇａ  ｇｔｔ  ｃｇｃ  ａａｃ  ｔｃｇ  ｔｔｇ．
からなる群から選択される、faecal streptococci を特異的に検出するための、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが
５’−ｇａｃ  ｃｃｃ  ｃｔｔ  ｇｃｃ  ｇａａ  ａ
５’−ａｔｇ  ａｃｃ  ｃｃｃ  ｔａｇ  ｃｃｇ  ａａａ
５’−ｇｇｃ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａｇ  ｔｃｇ  ａｃ
５’−ｇｇａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｇｃｃ  ｔａｃ  ａｔｇ  ｃｔ
５’−ａｃａ  ａｇａ  ｃｔｃ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｇｃｃ
５’−ｃａｇ  ｇｃｇ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｔｔａ  ａｃｇ  ｃｇｔ  ｔ
５’−ｇｇｃ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａａ  ｔｃｇ  ａｃ
５’−ｇｇｃ  ｃａｃ  ａａｃ  ｃｔｃ  ｃａａ  ｇｔａ  ｇａ
５’−ａｃｃ  ａｃａ  ｃｔｃ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｇｃｃ
５’−ａｃａ  ａｇａ  ｃｔｃ  ｔａｇ  ｃｃｔ  ｇｃｃ
５’−ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｇａ  ｔｔｔ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｔｔ
５’−ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｔａ  ｃｔｔ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｔｔ
５’−ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｔａ  ｔｔｔ  ａａｔ  ｇｃｇ  ｔｔ
５’−ａｇｃ  ｔｃｃ  ｇｇａ  ａｇｃ  ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃａ
５’−ｇｇａ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａｇ  ｔｃｇ
５’−ｇｃｃ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａｇ  ｔａｇ
５’−ａｔｇ  ｇｃｃ  ｃｃｃ  ｔａｇ  ｃｃｇ  ａａａ
５’−ｇ  ａｔｇ  ａｃｃ  ｃｃｃ  ｔａｇ  ｃｃｇ  ａａａ
５’−ａａｃ  ｃｔｔ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｔａ  ｃｔｃ  ｃｃ．
からなる群から選択される、腸内細菌および大腸菌種の細菌を同時に特異的に検出するための、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中の飲料水と関連がある細菌を検出するための、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが
５’−ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｔａ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｃａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｔｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔｃ  ｃｃｇ  ｔａｃ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔａｃ  ｃｃｔ  ｃｔａ  ｃｃａ  ｔａｃ
５’−ｔ  ａｔｃ  ｔｇａ  ｃｃｇ  ｔｃｃ  ｃａｇ  ｇｔｔ  ａ
からなる群から選択され、レジオネラ属およびL. pneumophila種の細菌を同時に特異的に検出するためにオリゴヌクレオチドを使用する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが
５’−ｃｃｃ  ｔｃｔ  ｇａｔ  ｇｇｇ  ｔａｇ  ｇｔｔ
５’−ｃｃｃ  ｔｃｔ  ｇａｔ  ｇｇｇ  ｃａｇ  ｇｔｔ
５’−ｔａｇ  ｇｔｇ  ｔｔｇ  ｔｔａ  ｇｃａ  ｔｔｔ  ｃｇ
５’−ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｔｃ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｔｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃ  ｃａｃ  ｔｃｔ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｃｃｃ  ｇｇｔ
５’−ｃａｃ  ａｃａ  ａｔｃ  ｇｔａ  ａｃａ  ｔｃｃ  ｔａ
５’−ａｇｇ  ｇａｔ  ｇａａ  ｃｔｔ  ｔｃｃ  ａｃｔ  ｃ
５’−ｃｃａ  ｃｔｃ  ａｔｔ  ｔｔｃ  ｃｇｇ
５’−ｃｃｃ  ｃｃｇ  ｃｔｔ  ｇａｇ  ｇｇｃ  ａｇｇ
５’−ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｔｔｃ  ｃｃｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ
５’−ｃｃｔ  ｃｔｔ  ｔｔｔ  ｃｃｇ  ｇｔｇ  ｇａｇ  ｃ
５’−ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃｔ  ｔｔｔ  ｃｃａ  ａｔｇ  ａ
５’−ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃｔ  ｔａｃ  ｔｔｇ  ｇｔｇ
５’−ｔａｇ  ｇｔｇ  ｃｃａ  ｇｔｃ  ａａａ  ｔｔｔ  ｔｇ
５’−ｃｃｃ  ｃｔｔ  ｃｔｇ  ａｔｇ  ｇｇｃ  ａｇｇ
５’−ｃｃｃ  ｃｃｔ  ｃｔｇ  ａｔｇ  ｇｇｃ  ａｇｇ
５’−ｃｇａ  ｃｔｔ  ｃｇｃ  ａａｃ  ｔｃｇ  ｔｔｇ
５’−ｃｇａ  ｃｔｔ  ｃｇｃ  ｇａｃ  ｔｃｇ  ｔｔｇ
５’−ｃｇａ  ｇｔｔ  ｃｇｃ  ａａｃ  ｔｃｇ  ｔｔｇ．
からなる群から選択され、faecal streptococci を検出するためにオリゴヌクレオチドを使用する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが
５’−ｇａｃ  ｃｃｃ  ｃｔｔ  ｇｃｃ  ｇａａ  ａ
５’−ａｔｇ  ａｃｃ  ｃｃｃ  ｔａｇ  ｃｃｇ  ａａａ
５’−ｇｇｃ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａｇ  ｔｃｇ  ａｃ
５’−ｇｇａ  ｃａａ  ｃｃａ  ｇｃｃ  ｔａｃ  ａｔｇ  ｃｔ
５’−ａｃａ  ａｇａ  ｃｔｃ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｇｃｃ
５’−ｃａｇ  ｇｃｇ  ｇｔｃ  ｔａｔ  ｔｔａ  ａｃｇ  ｃｇｔ  ｔ
５’−ｇｇｃ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａａ  ｔｃｇ  ａｃ
５’−ｇｇｃ  ｃａｃ  ａａｃ  ｃｔｃ  ｃａａ  ｇｔａ  ｇａ
５’−ａｃｃ  ａｃａ  ｃｔｃ  ｃａｇ  ｃｃｔ  ｇｃｃ
５’−ａｃａ  ａｇａ  ｃｔｃ  ｔａｇ  ｃｃｔ  ｇｃｃ
５’−ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｇａ  ｔｔｔ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｔｔ
５’−ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｔａ  ｃｔｔ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｔｔ
５’−ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｔａ  ｔｔｔ  ａａｔ  ｇｃｇ  ｔｔ
５’−ａｇｃ  ｔｃｃ  ｇｇａ  ａｇｃ  ｃａｃ  ｔｃｃ  ｔｃａ
５’−ｇｇａ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａｇ  ｔｃｇ
５’−ｇｃｃ  ａｃａ  ａｃｃ  ｔｃｃ  ａａｇ  ｔａｇ
５’−ａｔｇ  ｇｃｃ  ｃｃｃ  ｔａｇ  ｃｃｇ  ａａａ
５’−ｇ  ａｔｇ  ａｃｃ  ｃｃｃ  ｔａｇ  ｃｃｇ  ａａａ
５’−ａａｃ  ｃｔｔ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｔａ  ｃｔｃ  ｃｃ
からなる群から選択され、腸内細菌および大腸菌種の細菌を同時に特異的に検出するためにオリゴヌクレオチドを使用する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
少なくとも１つの請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２から９のいずれかに記載の方法を行うためのキット。
【請求項１５】
ハイブリダイゼーション溶液中に少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
洗浄溶液、および場合によっては１つまたは複数の固定溶液をさらに含む、請求項１４または１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飲料水および表層水中の細菌を検出するための方法、詳細にはin situ ハイブリダイゼーションによってレジオネラ属およびLegionella pneumophila種から、細菌を同時に特異的に検出するための方法、およびin situ ハイブリダイゼーションによってfaecal streptococci を特異的に検出するための方法、および腸内細菌および大腸菌種の細菌を同時に特異的に検出するための方法、および対応するオリゴヌクレオチド・プローブ、および前記本発明の方法を行うことを可能にするキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラは、長さ０．５〜２０μｍ、直径０．３〜０．９μｍの、グラム陰性の、胞子を形成しない、桿状体様の細菌である。レジオネラは、１〜３本のべん毛を有するその極部のべん毛配列のために、運動性である。レジオネラは、湿った土壌、およびあらゆる非海生水生環境の、遍在する生息動物である。レジオネラの増殖の理想的な条件は、２５℃と５５℃の間の温度である。したがってレジオネラは、たとえば温水および冷水装置、空気循環システムの冷却塔、および水加湿器などの、人間によって生成された生息地においても発見することが可能である。アメーバおよび繊毛虫の細胞内寄生虫として、レジオネラは、たとえば極端な温度および水の塩素化などの、好ましくない生活条件を生き抜くことも可能である。
【０００３】
レジオネラは病原体である。人体中においてレジオネラは、「レジオネラ症」として一般的に知られている、条件的致死過程を伴う急性細菌性肺炎を引き起こす。この名称は、１９７６年７月の「Pennsylvania Division of the American Legion」の年次総会において、約３０００人の代議員の中で肺炎の症例が著しく累積した（２９の死を含む１８９症例）という、調査に由来するものである。この調査によって、これまで知られていない細菌、L. pneumophila（McDade et al. 1977. Legionnaire's disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease． N. Engl. J. Med. 297 (22):1197-203 ）が単離され、これを新しい科、Legionellaceae（Brenner, D.J. 1979, Speciation in Yersinia, p.33-43. In: Carter, P.B., Lafleur, L. and Toma, S.(ed.), Contributions to microbiology and immunology, vol. 5. Karger, Basel, Switzerland）に割り当てた。一方、いわゆるポンティアック熱が、レジオネラによって引き起こされるこの疾患の他の形として知られており、これは流感様症状によって特徴付けられ、肺炎とは何の関係もない。患者において１つまたは他の疾患形が進行する理由は、知られていない。
【０００４】
レジオネラによって引き起こされるこの疾患からの生命に対する脅威、および好ましくない生活条件下において長時間レジオネラが生存する能力によって、迅速で確実な検出法に関する必要性が示される。
【０００５】
培養によるレジオネラの伝統的な検出は、非常にコストがかかる方法であり、７〜１４日間の異なる培地におけるいくつかの連続的な培養工程の後でのみ、結果がもたらされる。
【０００６】
関連した多くの尽力にもかかわらず、現在まで培養は、レジオネラを検出するために選択されている方法である。なぜなら異なる代替法が、それらに置かれる期待に添うことは可能ではないと思われるからである。
【０００７】
たとえば、ＨＰＬＣによるキノンのプロファイル、またはＧＬＣ−ＭＳによる脂肪酸組成の決定などの、生化学的パラメータに基づく疑わしいサンプルの分析（たとえば、Ehret et al. (1987) Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. [A], 266(1-2),261-75）は、時間および装置を非常に消耗するため、日常的な診断には適していない。さらに、これらの分析を適切に行うには、分析を行う人員の側に高度の技能が必要とされる。
【０００８】
蛍光標識した抗体を用いる直接的な染色（ＤＦＡ；直接的な蛍光抗体染色）によって、わずか数時間以内に結果が与えられるが、この方法は充分に感度があるわけではなく、充分に特異的なわけでもない。培養によって陽性反応を示したサンプルの２５％〜７０％のみが、ＤＦＡによっても陽性を示した（Zuravleff, J.L., V.L. Yu, J.L. Shonnard, 1983. Diagnosis of Legionnaires' disease and update of laboratory methods with new emphasis on isolation by culture. JAMA, Vol. 250, p.1981-1985;  ；Buesching, W.J., R.A. Brust, L.W. Ayers, 1983. Enhanced primary isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens by low pH treatment. J. Clin. Microbiol., Vol. 17, p.153-1155; Edelstein, P.H. 1987. The laboratory diagnosis of Legionnaires' disease. Sem. Respir. Infect., Vol. 2, p. 235-241）。さらに、レジオネラＤＦＡ複合体によっても誤って染色される、知られている多数の種、たとえばPseudomonas fluorescens 、P. aeruginosa およびP. putida 、および異なるBacteroides 種が存在する。これによって必然的に、偽陽性の結果が何度ももたらされる。さらに、非常にさまざまな異なるレジオネラの血清型は、これらの試験法を使用するとき、かつ、抗体の結合に基づく他のすべての方法（たとえば、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ）において問題である。すべての血清型を検出するために必要な、多数の抗血清はほとんど取り扱えないが、一方でわずか数個の抗血清を使用する場合、陰性の試験結果の信頼性は、容認できないほど低い。
【０００９】
多くの微生物学的分析は、いわゆるマーカー生物としての、大腸菌および腸内細菌の調査に関するものである。たとえば、食料品、飲料水および表層水の試験において、大腸菌はいわゆるインデックス生物として、潜在的な健康に関する危険性を示し、一方腸内細菌は、一般的に不充分な衛生状態の指標としてみなされる。インデックスおよび指標生物に関して微生物サンプルを試験することによって、さまざまな病原体に関して同じサンプルに手の込んだ試験をすることを、不要にすることが可能である。なぜなら、これらの細菌の存在は一般的に、糞便による汚染の指標だからである。したがって、他の病原体が存在する可能性が非常に高い。
【００１０】
腸内細菌は、非常にさまざまな群の細菌である。腸内細菌の群には、Escherichia 、Enterobacter、KlebsiellaおよびCitrobacter 属がある。したがって、細菌がこの群に属するか属さないかは、分類学的性質によっては定義されず、それぞれの検出法における細菌の挙動によって定義される。この程度まで、温度３０℃および３７℃で４８時間以内にラクトースの発酵生産、および気体および酸の生成が可能である、すべてのグラム陰性、好気性、条件的嫌気性、桿状体様の細菌を、腸内細菌に割り当てる。高温、すなわち４４℃〜４５．５℃においてラクトースの発酵生産することが可能な腸内細菌は、糞便腸内細菌、温度屈性腸内細菌、または推定大腸菌とも呼ばれる。
【００１１】
腸内細菌を検出する意義は、差し当たって非常に物議をかもすものとなっているが（Means, E.G., Olson, B.H., 1981. Coliforms inhibition by bacteriocin-like substances in drinking water distribution systems. Appl. Environ. Microbiol., Vol. 42, p. 506-512; Burlingame, G.A.;McElhaney, J.;Pipes, W.O., 1984. Bacterial interference with coliform colony sheen production on membrane filters. Appl. Environ. Microbiol., Vol. 47, p. 56-60; Schmidt-Lorenz et al. 1988, Kritische Uberlegungen zum Aussagewert von E. coli, Coliformen und Enterobacteriaceen in Lebensmitteln, Arch. Lebensmittelhyg. 39, 3-15.）、マーカー生物として大腸菌を検出することの価値に関して疑いの余地はない。
【００１２】
さらに大腸菌は、微生物の分析において指標細菌として働くだけでなく、この生物のいくつかの病原性菌株が知られている。これらの腸内毒性菌株は、異なる亜群（腸内毒素生成、腸内病原体、腸内出血性、腸内侵襲性、腸内付着性大腸菌）に分類される。これらの亜群のすべての細菌によって、生命を脅かすものに相当する、異なる重度の下痢疾患が引き起こされる。
【００１３】
一般に、大腸菌および腸内細菌の検出は培養によって行われ、異なる培地におけるいくつかの連続的な培養工程の後、２〜４日間以内に結果がもたらされる。代替的培養法として、Fluorocult LMX- 培養液での培養によって、わずか３０時間後に結果が与えられる。大腸菌を検出するための膜フィルタ法（この方法では腸内細菌の検出は不可能である）も、結果が得られるまで依然として２２〜３２時間を必要とする。しかしながらこの方法では、偽陽性の結果がしばしば得られる。なぜなら、特に鮮肉の場合、インドール陽性のKlebsiella oxytocaおよびProvidencia 種がしばしば見られるからである。
【００１４】
いわゆるfaecal streptococci は、飲料水および表層水の糞便による汚染の、他の指標としてみなされている。腸内細菌の場合、それらも不均一な群である。faecal streptococci は、系統発生学的にStreptococcus およびEnterococcus属に割り当てられる。これらは、典型的には双球菌または短鎖を生み出すグラム陽性菌であり、恒温動物の腸管中に一般的に見られる。
【００１５】
German Drinking Water and Water for Food Factories Ordinance (Deutsche Verordnung fur Trinkwasser und Wasser fur Lebensmittelbetriebe)の２００１年度版は、faecal streptococci に関する制限値を設定している。１００ｍｌの飲料水中にfaecal streptococci を見つけることは不可能であり、さもなければ試験した水は、もはや飲料水の性質ではない。
【００１６】
Drinking  Water   Ordinance において推奨されている検出法は、水サンプルを直接培養すること、または膜濾過し、次いで５０ｍｌのアジド−グルコース−培養液にフィルタを導入することに基づくものである。培養は少なくとも２４時間行わなければならず、陰性の結果の場合は３６℃で４８時間である。４８時間後に培養液の濁りまたは沈殿が依然として検出されない場合、試験したサンプル中にfaecal streptococci が存在しないことが証明されたとみなされる。濁りまたは沈殿が存在する場合、Slanetz-Barthleyのenterococci 選択寒天培地上への培養物の線条接種、および３６℃で２４時間の再度のインキュベーションを行う。赤みがかった茶色またはピンクのコロニーが形成される場合は、これらをさらに詳細に調べる。適切な液体培地に移し、３６℃で２４時間培養した後に、ｐＨ９．６において栄養培養液中で増殖が起こり、６．５％ＮａＣｌ培養液中での増殖が、エスクリン分解の場合と同様に可能であるとき、faecal streptococci が検出されたとみなされる。エスクリン分解は、エスクリンの培養液に、新鮮に調製した塩化鉄（ＩＩ）の７％水溶液を加えることによって調べる。分解した場合、茶色がかった黒色が発達する。グラム陰性球菌と細菌を識別するためのグラム染色、およびブドウ球菌と識別するためのカタラーゼ試験をさらに行うことが多い。faecal streptococci は、グラム陽性菌およびカタラーゼ陰性菌と反応する。したがって伝統的な検出手順は、冗長であり（４８〜１００時間）、疑わしい場合は非常に手の込んだ方法であることが示される。
【００１７】
レジオネラ、大腸菌および腸内細菌、およびfaecal streptococci を検出するための、前述の方法によって示される難点の理論上の結果として、核酸に基づく検出法が明確な解決策を示すようである。
【００１８】
ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応では、それぞれの細菌のゲノムの特徴的な断片を、特異的なプライマーを用いて増幅させる。プライマーがその標的部位を発見する場合、遺伝物質の断片の数百万の増幅物が生じる。後の分析によって、たとえばアガロースゲルにより分離したＤＮＡ断片によって、定性的評価を行うことが可能である。最も単純な場合は、これによって、使用したプライマーの標的部位が、試験したサンプル中に存在したという結論がもたらされる。他の結論は考えられない；これらの標的部位は、生きている細菌と死んだ細菌の両方、または裸のＤＮＡに由来する可能性があるからである。この方法に関しては、分化は考えられない。大腸菌および腸内細菌などの遍在する細菌についてサンプルを試験するとき、これは特に問題である。これによって、しばしば偽陰性の結果がもたらされる。なぜなら、死んだ細菌または裸のＤＮＡの存在下でも、ＰＣＲ反応が陽性であるからである。この技法のさらなる発展形は定量ＰＣＲであり、このＰＣＲでは、存在する細菌の量と増幅したＤＮＡの量の間の、相関関係を生み出すことを試みる。ＰＣＲの利点は、その高い特異性、適用のし易さ、および時間の支出が少ないことである。その主な欠点は、汚染に対するその高い感受性、したがって偽陽性の結果、および生きた細胞と死んだ細胞または裸のＤＮＡを、それぞれ区別する前述の能力の欠如である。
【００１９】
ＰＣＲなどの分子生物学的方法の特異性と、抗体法によって容易になる細菌を視覚化する可能性を組み合わせるための独特の手法は、蛍光in situ ハイブリダイゼーションの方法である（FISH; Amann, R.I., W. Ludwig, and K.-H. Schleifer, 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, p. 143-169）。この方法を使用して、細菌種、属または群を、非常に特異的に同定し視覚化することが可能である。
【００２０】
ＦＩＳＨ技法は、その必須機能のために、進化の過程においてわずかな程度でわずかに変異したいくつかの分子が、細菌細胞中に存在するという事実に基づくものである。これらは、１６Ｓおよび２３Ｓリボソーム・リボ核酸（ｒＲＮＡ）である。両方共にリボソームの一部分、タンパク質生合成の部位であり、その遍在的な分布、その大きさ、およびその構造および機能的不変性のために、特異的なマーカーとして働くことが可能である（Woese, C.R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, p. 221-271）。比較配列分析を使用して、これらのデータのみに基づいて系統発生の関係を確立することが可能である。この目的のために、配列データをアラインメントにしなければならない。このアラインメントは、これらのマクロ分子の２次および３次構造の知識に基づくものであり、リボソーム核酸の相同的な位置を互いに調整する。
【００２１】
これらのデータに基づいて、系統発生的な計算を行うことが可能である。最新のコンピュータ技術を使用することによって、さらに大規模な計算を迅速かつ有効にすることが可能であり、および１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡのアラインメント配列を含む、巨大なデータベースの確立が可能である。これらのデータの物質は迅速に入手することができるので、新たに得られた配列を、短時間で系統発生的に分析することが可能である。これらのｒＲＮＡのデータベースを使用して、種特異的および属特異的な遺伝子プローブを構築することが可能である。ここでは、利用可能なｒＲＮＡ配列すべてを互いに比較し、特定の配列部位用のプローブを設計し、このプローブは細菌の特定の種、属または群に適用される。
【００２２】
ＦＩＳＨ（蛍光in situ ハイブリダイゼーション）技法では、リボソーム標的配列上のある領域と相補的なこれらの遺伝子プローブを、細胞中に導入する。遺伝子プローブは一般に小さく、１６〜２０塩基の長さ、１本鎖のデスオキシリボ核酸断片であり、細菌種または細菌群に典型的な標的領域を対象とする。蛍光標識された遺伝子プローブが細菌細胞中でその標的配列を発見する場合、プローブはその標的配列に結合し、その蛍光性によって蛍光顕微鏡で細胞を検出することが可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
ＦＩＳＨによる分析は常にスライド上で行う。なぜなら評価するためには、高エネルギーの光を用いた照射によって細菌を視覚化するからである。しかしながら本明細書には、古典的なＦＩＳＨによる分析の欠点の１つをのせる：なぜなら本来、比較的少量の体積のみがスライド上で分析することが可能であり、この方法の感度は満足のいくものではなく、信頼ある分析には不充分である可能性があるからである。したがって本発明は、古典的なＦＩＳＨによる分析の利点と、培養の利点を組み合わせる。比較的短い培養工程によって、特異的なＦＩＳＨを使用して細菌を検出する前に、検出する細菌が充分な数存在することが確実になる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
レジオネラ属およびL. pneumophila種の細菌を同時に特異的に検出するため、あるいはfaecal streptococci を特異的に検出するため、あるいは腸内細菌および大腸菌種の細菌を同時に特異的に検出するための、本出願中に記載した方法の実施は、以下の工程からなる：
−試験するサンプル中に存在する細菌を培養する工程、
−サンプル中に存在する細菌を固定する工程、
−固定した細菌を核酸プローブ分子と共にインキュベートして、ハイブリダイゼーションを行う工程、
−ハイブリッド形成しなかった核酸プローブ分子を除去または洗浄する工程、および
−核酸プローブ分子とハイブリッド形成した細菌を検出する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の範囲内では、細菌の「培養」は、適切な培養培地中でサンプル中に存在する細菌を増殖させることを意味すると理解される。この目的に適した方法は、専門家にはよく知られている。
【００２６】
本発明の範囲内では、細菌の「固定」は、核酸プローブ用に細菌のエンベロープを透過性にする処理を意味すると理解される。固定用には、通常はエタノールが使用される。これらの技法を使用して、核酸プローブが細胞壁を透過し得ない場合、同じ結果をもたらす充分な数の他の技法を、専門家は知っているであろう。これらはたとえば、メタノール、アルコールの混合物、わずかなパーセンテージのパラホルムアルデヒドの溶液、または希釈されたホルムアルデヒド溶液、酵素処理剤などを含む。
【００２７】
本発明の範囲内では、「ハイブリダイゼーション」用の蛍光標識した核酸プローブと共に、固定した細菌をインキュベートする。オリゴヌクレオチドおよびそれに連結したマーカーからなる、これらの核酸プローブは、したがって細胞を透過して、細胞内の核酸プローブに対応する標的配列に結合することが可能である。結合は、相補的な核酸断片間の、水素結合の形成として理解すべきである。
【００２８】
核酸プローブはここでは、検出する微生物の染色体またはエピソームＤＮＡだけでなく、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡとも相補的であってよい。検出する微生物中に２つ以上のコピーで存在する領域と相補的である、核酸プローブを選択することが有利である。検出する配列は、細胞１個当たり５００〜１００，０００個のコピーで存在することが好ましく、１，０００〜５０，０００個のコピーで存在することが特に好ましい。この理由のため、標的部位としてｒＲＮＡを使用することが好ましい。なぜなら、それぞれの活性細胞中に、タンパク質生合成の部位としてのリボソームが、何千も存在するからである。
【００２９】
本発明の意味での核酸プローブはＤＮＡまたはＲＮＡプローブであってよく、１２〜１, ０００個のヌクレオチド、好ましくは１２個と５００個の間、より好ましくは１２個と２００個の間、特に好ましくは１２個と５０個の間、１５個と４０個の間、および最も好ましくは１７個と２５個の間のヌクレオチドを通常は含む。核酸プローブの選択は、相補配列が検出する微生物中に存在するかどうかという基準に従って行う。明確な配列を選択することによって、細菌種、細菌属、または細菌群全体を検出することが可能である。１５個のヌクレオチドからなるプローブでは、配列は１００％相補的でなければならない。ヌクレオチドが１５個より多いオリゴヌクレオチドでは、１個または数個のミスマッチが認められる。
【００３０】
厳密なハイブリダイゼーション条件を遵守することによって、核酸プローブ分子が標的配列と実際にハイブリッド形成することが確実になる。以下でより詳細に説明するように、本発明の意味での厳密な条件は、たとえば２０〜８０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション緩衝液中に溶かしたものである。
【００３１】
これ以外に、厳密なハイブリダイゼーション条件は、当然ながら文献および標準的作品中で発見することも可能である（たとえばManual of Sambrook et. Al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY など）。一般に、「特異的ハイブリッド形成」は、厳密な条件下で、ある分子がいくつかのヌクレオチド配列に優先的に結合することを意味し、その場合この配列は、（たとえば全）ＤＮＡまたはＲＮＡの複合混合物中に存在する。「厳密な条件」という語は、プローブが優先的にその標的配列に結合し、他の配列には著しく低い程度で結合するか、あるいはまったく結合しない条件を表す。厳密な条件は部分的には配列依存性であり、異なる条件下において変わるであろう。長い配列は、高温において特異的にハイブリッド形成する。一般に、明確なイオン強度および明確なｐＨにおいて特定の配列用に、熱融点（Ｔｍ）よりも温度が約５℃低いように、厳密な条件を選択する。Ｔｍは（明確なイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度での）温度であり、この温度において、標的配列と相補的なプローブ分子の５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリッド形成する。（通常標的配列は過剰であるので、平衡状態では５０％のプローブが占めている。典型的には、厳密な条件とは、ｐＨ７．０と８．３の間で塩濃度が少なくとも約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（たとえば１０〜５０個のヌクレオチドを意味する）用に、温度が少なくとも約３０℃である条件である。さらに、前述の厳密な条件は、不安定化剤、たとえばホルムアミドを加えることによって得ることが可能である。
【００３２】
本発明の方法の範囲内では、本発明の核酸プローブ分子は、以下の長さおよび配列を有する（配列はすべて、５’から３’方向である）。
レジオネラ属およびL. pneumophila種の細菌を同時に特異的に検出するための方法。
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faecal streptococci を特異的に検出するための方法：
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腸内細菌および大腸菌種の細菌を同時に特異的に検出するための方法：
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５’−ａａｃ  ｃｔｔ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｔａ  ｃｔｃ  ｃｃ
本発明の他の目的は、配列および／または長さが改変されているにもかかわらず、それぞれの細菌の標的核酸配列との特異的なハイブリダイゼーションを示し、したがって本発明の方法において使用するのに適した、前述のオリゴヌクレオチド配列の改変である。これらは特に以下のものを含む：
ａ）核酸分子、（ｉ）塩基の少なくとも８０％、８４％、８７％、好ましくは少なくとも９０％、９２％、特に好ましくは少なくとも９４％、９６％、９８％が、前述のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１〜配列番号４７）の１つと同一であり、（前述のオリゴヌクレオチドの１つの配列領域（配列番号１〜配列番号４７）に対応する、核酸分子の配列領域が考えられ、前述のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号４７）と比較して、１個または複数個の塩基分だけ配列が伸長している可能性がある核酸分子の全体の配列は考えられない）、あるいは（ｉｉ）前述のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１〜配列番号４７）と１個または数個の欠失および／または付加分だけ異なり、レジオネラ属およびL. pneumophila種の細菌、faecal streptococci 、または腸内細菌および大腸菌種の細菌の核酸配列との特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。この脈絡において「特異的なハイブリダイゼーション」は、ここに記載したハイブリダイゼーション条件下で、あるいはin situ ハイブリダイゼーション技法に関する分野の当業者に知られている条件下で、標的生物のリボソームＲＮＡのみがオリゴヌクレオチドに結合し、非標的生物のｒＲＮＡは結合しないことを意味する。
【００３３】
ｂ）ａ）で述べた核酸分子、またはプローブ配列番号１〜配列番号４７の１つと相補的であり、すなわち厳密な条件下でそれらと特異的にハイブリッド形成する核酸分子。
ｃ）核酸分子、配列番号１〜配列番号４７のオリゴヌクレオチド配列、あるいはａ）またはｂ）に記載の核酸分子の配列を含み、ａ）またはｂ）に記載の前述の配列またはその変形以外に少なくとも１つの他のヌクレオチドを有し、かつ標的生物の核酸配列との特異的なハイブリダイゼーションが可能である核酸分子。
【００３４】
核酸分子とプローブ配列番号１〜配列番号４７の配列同一性の程度は、通常のアルゴリズムを使用して決定することが可能である。この点において、たとえば、http://www.Ncbi.nlm.nih.Gov/BLAST （このページには、たとえばリンク「Standard nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] が存在する）の下で利用可能である、配列同一性を決定するためのプログラムが適切である。
【００３５】
本発明の範囲内の、「ハイブリダイゼーション」は、「相補的」と同義であってよい。本発明の範囲内には、本発明の配列番号１〜４７の変形も含めた、本発明のオリゴヌクレオチドの（理論上の）アンチセンス鎖にハイブリッド形成する、オリゴヌクレオチドも含まれる。
【００３６】
本発明の核酸プローブ分子は、本発明の検出法の範囲内において、さまざまなハイブリダイゼーション溶液と共に使用することが可能である。０〜８０％の濃度で、さまざまな有機溶媒を使用することが可能である。厳密なハイブリダイゼーション条件を維持することによって、核酸プローブ分子が標的配列と実際にハイブリッド形成することが確実になる。本発明の意味での適度な条件は、以下に記載したように、たとえば０％ホルムアミドをハイブリダイゼーション緩衝液中に溶かしたものである。本発明の意味での厳密な条件は、たとえば２０〜８０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション緩衝液中に溶かしたものである。
【００３７】
レジオネラ属およびL. pneumophila種の細菌を同時に特異的に検出するための、本発明の方法の範囲内では、典型的なハイブリダイゼーション溶液は、０％〜８０％のホルムアミド、好ましくは２０％〜６０％のホルムアミド、特に好ましくは３５％のホルムアミドを含む。さらにハイブリダイゼーション溶液は、０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．５ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、塩は塩化ナトリウムであることが好ましい。さらに、ハイブリダイゼーション溶液は、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗浄剤を、０．００１％〜０．２％の濃度、好ましくは０．００５％〜０．０５％の濃度、より好ましくは０．０１％〜０．０３％、特に好ましくは０．０１％の濃度で通常含む。ハイブリダイゼーション溶液を緩衝するために、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの、さまざまな化合物を使用することが可能であり、これらは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度、６．０〜９．０、特に好ましくは７．０〜８．０のｐＨ範囲で通常使用される。特に好ましい本発明のハイブリダイゼーション溶液の実施形態は、０．０２ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む。
【００３８】
faecal streptococci を特異的に検出するための、本発明の方法の範囲内では、典型的なハイブリダイゼーション溶液は、０％〜８０％のホルムアミド、好ましくは２０％〜６０％のホルムアミド、特に好ましくは３５％のホルムアミドを含む。さらにハイブリダイゼーション溶液は、０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．５ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、塩は塩化ナトリウムであることが好ましい。さらに、ハイブリダイゼーション溶液は、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗浄剤を、０．００１％〜０．２％の濃度、好ましくは０．００５％〜０．０５％、より好ましくは０．０１％〜０．０３％の濃度、特に好ましくは０．０１％の濃度で通常含む。ハイブリダイゼーション溶液を緩衝するために、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの、さまざまな化合物を使用することが可能であり、これらは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度、６．０〜９．０、特に好ましくは７．０〜８．０のｐＨ範囲で通常使用される。特に好ましい本発明のハイブリダイゼーション溶液の実施形態は、０．０２ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む。
【００３９】
腸内細菌および大腸菌種を同時に特異的に検出するための、本発明の方法の範囲内では、典型的なハイブリダイゼーション溶液は、０％〜８０％のホルムアミド、好ましくは２０％〜６０％のホルムアミド、特に好ましくは５０％のホルムアミドを含む。さらにハイブリダイゼーション溶液は、０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、塩は塩化ナトリウムであることが好ましい。さらに、ハイブリダイゼーション溶液は、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗浄剤を、０．００１％〜０．２％の濃度、好ましくは０．００５％〜０．０５％の濃度、より好ましくは０．０１％〜０．０３％、特に好ましくは０．０１％の濃度で通常含む。ハイブリダイゼーション溶液を緩衝するために、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの、さまざまな化合物を使用することが可能であり、これらは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度、６．０〜９．０、特に好ましくは７．０〜８．０のｐＨ範囲で通常使用される。特に好ましい本発明のハイブリダイゼーション溶液の実施形態は、０．０２ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む。
【００４０】
専門家によって、ハイブリダイゼーション反応の必要な厳密度が得られるような方法で、ハイブリダイゼーション緩衝液の成分の所与の濃度を選択することが可能であることは理解されるであろう。特に好ましい実施形態は、特に厳密なハイブリダイゼーション条件に厳しく映る。これらの厳密な条件を使用して、専門家は、特定の核酸分子によって標的生物の核酸配列の特異的な検出が可能であり、したがって本発明の範囲内において信頼して使用することが可能であるかどうかを決定することが可能である。
【００４１】
プローブの濃度は、標識および予想される標的構造体の数に依存して、大きく変わる可能性がある。迅速かつ有効なハイブリダイゼーションを可能にするために、プローブの量は、標的構造体の数を数倍超えなければならない。しかしながら、蛍光in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）では、過剰に高レベルの蛍光標識されたハイブリダイゼーション・プローブによって、バックグランド放射線の蛍光の増大がもたらされることを考慮する必要がある。したがってプローブの量は、０．５ｎｇ／μｌと５００ｎｇ／μｌの間、好ましくは１．０ｎｇ／μｌと１００ｎｇ／μｌの間、特に好ましくは１．０〜５０ｎｇ／μｌの間でなければならない。
【００４２】
本発明の方法の範囲内では、好ましい濃度は、ハイブリダイゼーション溶液１μｌ当たり、使用するそれぞれの核酸分子が１〜１０ｎｇである。使用するハイブリダイゼーション溶液の体積は８μｌと１００ｍｌの間でなければならず、本発明の方法の特に好ましい実施形態では、それは４０μｌである。
【００４３】
ハイブリダイゼーションは通常、１０分と１２時間の間続ける。ハイブリダイゼーションは、約１．５時間続けることが好ましい。ハイブリダイゼーション温度は、好ましくは４４℃と４８℃の間、特に好ましくは４６℃であり、ハイブリダイゼーション温度、およびハイブリダイゼーション溶液中の塩および洗浄剤の濃度のパラメータは、核酸プローブ、特にその長さ、および検出する細胞中の標的配列との相補性の度合いに基づいて、最適化することが可能である。専門家は、適切な計算法に精通している。
【００４４】
ハイブリダイゼーション後、ハイブリッド形成しなかった過剰の核酸プローブ分子は除去するかあるいは洗浄しなければならず、通常これは従来の洗浄溶液によって行われる。望むならば、この洗浄溶液は０．００１〜０．１％、好ましくは０．０１％のＳＤＳなどの洗浄剤、および０．００１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．０２ｍｏｌ／ｌの濃度のＴｒｉｓ−ＨＣｌを含むことが可能であり、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨ値は６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０の範囲であり、特に好ましくは８．０である。洗浄剤が含まれてよいが、それが絶対に必要なわけではない。さらに、洗浄溶液は通常、必要な厳密度に応じて、０．００３ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌの濃度でＮａＣｌも含む。０．０７ｍｏｌ／ｌ（レジオネラ属およびL. pneumophila種の細菌を同時に特異的に検出するための方法）、または０．０７ｍｏｌ／ｌ（faecal streptococci を特異的に検出するための方法）、または０．０１８ｍｏｌ／ｌ（腸内細菌および大腸菌種の細菌を同時に特異的に検出するための方法）の、ＮａＣｌ濃度が特に好ましい。さらに洗浄溶液は、０．０１ｍｏｌ／ｌまでの濃度でＥＤＴＡを含んでよく、その濃度は０．００５ｍｏｌ／ｌであることが好ましい。洗浄溶液は、適切な量の専門家に知られている防腐剤を、さらに含むことが可能である。
【００４５】
一般に、緩衝溶液は洗浄工程で使用され、原則としてこれはハイブリダイゼーション緩衝液（緩衝塩化ナトリウム溶液）に非常に類似したものであってよい。ただし、洗浄工程が低塩濃度または高温の緩衝液中で行われることは除く。
【００４６】
ハイブリダイゼーション条件を理論的に評価するために、以下の式を使用することが可能である：
Ｔｄ＝８１．５＋１６．６ｌｇ［Ｎａ＋］＋０．４×（％ＧＣ）−８２０／ｎ−０．５Ｘ（％ＦＡ）
Ｔｄ＝解離温度、℃
［Ｎａ＋］＝ナトリウムイオンのモル濃度
％ＧＣ＝塩基の合計数に対する、グアニンおよびシトシン・ヌクレオチドの割合
ｎ＝ハイブリッドの長さ
％ＦＡ＝ホルムアミドの割合
この式を使用して、たとえば洗浄緩衝液のホルムアミド含量（その毒性のためにこれは可能な限り低くなければならない）を、対応する低い塩化ナトリウム含量と交換することが可能である。しかしながら当業者は、in situ ハイブリダイゼーション法に関する広範囲の文献から、前述の成分を変えることが可能であるという事実、およびその方法が分かっている。ハイブリダイゼーション条件の厳密度に関して、ハイブリダイゼーション緩衝液に関して前述したのと同じことが当てはまる。
【００４７】
非結合核酸プローブ分子の「洗浄」は通常、４４℃〜５２℃、好ましくは４４℃〜５０℃の範囲の温度、特に好ましくは４６℃で、１０〜４０分間、好ましくは１５分間行われる。
【００４８】
本発明の方法の他の実施形態では、前述の標的生物を特異的に検出するための、いわゆるＦａｓｔ−ＦＩＳＨ法において、本発明の核酸プローブ分子を使用する。Ｆａｓｔ−ＦＩＳＨ法は専門家に知られており、たとえばドイツ特許出願ＤＥ１９９３６８７５．９号および国際出願ＷＯ９９／１８２３４号中に記載されている。これらに記載された検出法を行うことに関する、これらの書物中に含まれる開示を本願明細書に明確に援用する。
【００４９】
したがって、特異的にハイブリッド形成した核酸プローブ分子を、それぞれの細胞中で検出することが可能である。ただし、たとえばプローブ分子がマーカーに共有結合によって連結することによって、核酸プローブ分子は検出可能である。たとえば検出可能なマーカーとして、たとえばＣＹ２［アメルシャムライフサイエンス社、アーリントンハイツ、米国（Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA）から入手可能である］］、ＣＹ３［（これもアメルシャムライフサイエンス（Amersham Life Sciences）から入手可能である）］、ＣＹ５［（これもアメルシャムライフサイエンス（Amersham Life Sciences）から入手可能である）］、ＦＩＴＣ［モレキュラープローブ社、ユージーン、米国（Molecular Probes Inc. Eugene, USA ）］、ＦＬＵＯＳ［シュディアグノスティク社、マンハイム、ドイツ（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany ）から入手可能である］、ＴＲＩＴＣ［モレキュラープローブ社、ユージーン、米国（Molecular Probes Inc., Eugene, USA）から入手可能である］、６ＦＡＭまたはＦＬＵＯＳ−ＰＲＩＭＥなどの蛍光基が使用されており、これらは当業者によく知られている。化学マーカー、放射性マーカー、またはホースラディシュペルオキシダーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素マーカーを使用することも可能である。それぞれのこれらの酵素に関する、いくつかの色原体が知られており、これらを天然基質の代わりに転換させ、着色または蛍光生成物に変換することが可能である。このような色原体の例を、以下の表に列挙する。
【００５０】
【表１】
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最後に、５’または３’端にハイブリダイゼーションに適した、他の核酸配列が存在するように、核酸プローブ分子を生成させることが可能である。したがって、この核酸配列は約１５〜１, ０００個、好ましくは１５〜５０個のヌクレオチドを含む。したがってこの第２の核酸領域は、前述の物質の１つによって検出可能な、核酸プローブ分子によって検出することが可能である。
【００５１】
他に考えられることは、検出可能な核酸プローブ分子のハプテンへの結合であり、したがって核酸プローブ分子は、ハプテンを認識する抗体に接触させることが可能である。このようなハプテンの一例として、ジゴキシゲニンを述べることが可能である。前述したもの以外の他の例が、専門家によく知られている。
【００５２】
最終的な評価は、使用するプローブの標識の種類に依存し、光学顕微鏡、エピ蛍光顕微鏡、化学発光測定装置、蛍光光度計などを用いて行うことが可能である。
前に記載した検出法と比較した、レジオネラ属およびL ．pneumophila 種の細菌を同時に特異的に検出するため、あるいはfaecal streptococci を特異的に検出するため、あるいは腸内細菌および大腸菌種の細菌を同時に特異的に検出するための、本出願中に記載した方法の重要な利点は、その速度である。レジオネラを検出するために７〜１４日、faecal streptococci を検出するために４８〜１００時間、および腸内細菌および大腸菌を検出するために３０〜９６時間をそれぞれ必要とする、従来の培養法と比較して、本発明の方法を使用すると、２４〜４８時間以内に結果が得られる。
【００５３】
他の利点は、レジオネラ属およびL. pneumophila種の細菌の同時の検出である。現在まで一般的な方法では、L. pneumophila種の細菌のみを、ある程度確実に検出することが可能であると思われる。しかしながら、疫学的調査によって、L. pneumophilaだけでなくレジオネラ属の他の種、たとえばLegionella micdadei も、危険なレジオネラ症を引き起こす可能性があることが示されてきている。現在入手可能な情報に従うと、L. pneumophilaのみの検出は、もはや充分であるとはみなし得ない。
【００５４】
他の利点は、レジオネラ属の細菌とL. pneumophila種の細菌の間の識別が可能であることである。これは、異なる標識をした核酸プローブ分子を使用することによって、容易かつ確実に可能である。
【００５５】
他の利点は、これらの方法の特異性である。使用する核酸プローブ分子によって、特異的にレジオネラ属のすべての種だけでなく、L. pneumophila種のみも、非常に特異的に検出し視覚化することが可能である。同様に確実に、faecal streptococci および腸内細菌の異種群のすべての種、および大腸菌種の亜群すべてを検出することが可能である。細菌を視覚化することによって、目に見える対照を同時に行うことが可能である。したがって、偽陽性の結果は除かれる。
【００５６】
本発明の方法の他の利点は、その使用し易さである。たとえばこの方法を使用することによって、前述の細菌の存在に関して、多量のサンプルを容易に試験することが可能である。
【００５７】
本発明の方法は、さまざまな方法で使用することが可能である。
たとえば環境サンプルを、レジオネラの存在に関して試験することが可能である。これらのサンプルは、たとえば水から、あるいは土壌から回収することが可能である。
【００５８】
本発明の方法をさらに使用して、医療用サンプルを試験することが可能である。本発明の方法は、たん、気管支−肺胞洗浄液、または気管内吸引物から得たサンプルを分析するのに適している。さらに本発明の方法は、組織サンプル、たとえば肺、腫瘍または炎症性組織から、汗、唾液、精液などの分泌物、鼻、尿道または膣からの放出物からのバイオプシー材料、および尿および便サンプルを分析するのに適している。
【００５９】
本発明の他の適用分野は、水、たとえばシャワーおよび風呂の水、または飲料水の分析である。
本発明の方法の他の適用分野は、食料品の調節である。好ましい実施形態では、乳または乳製品（ヨーグルト、チーズ、スイート・チーズ、バター、バター・ミルク）、飲料水、飲料（レモネード、ビール、ジュース）、パン製品または肉製品から、食品サンプルを得る。
【００６０】
本発明の方法の他の適用分野は、薬剤または化粧品、たとえば軟膏、クリーム、チンキ剤、ジュース、溶液、滴剤などの分析である。
さらに、本発明によって、それぞれの方法を行うための３つのキットを提供する。これらのキット中に含まれるハイブリダイゼーション配列は、たとえばドイツ特許出願１００６１６５５．０中に記載されている。in situ ハイブリダイゼーション配列に関する、この書物中に含まれる開示を本願明細書に明確に援用する。
【００６１】
記載のハイブリダイゼーション配列（ＶＩＴ反応器と呼ばれる）以外に、キットの最も重要な成分は、前に記載したような検出する微生物に特異的な核酸プローブ分子を含む、それぞれのハイブリダイゼーション溶液（ＶＩＴ溶液と呼ばれる）である。それぞれのハイブリダイゼーション緩衝液（溶液Ｃ）、およびそれぞれの洗浄溶液（溶液Ｄ）の濃縮物が、さらに含まれる。場合によっては、固定溶液（溶液Ａおよび溶液Ｂ）、および包埋溶液（仕上げ剤）も含まれる。仕上げ剤は市販されており、これらは特に蛍光顕微鏡下での蛍光プローブの迅速な漂白の保護を妨げる。場合によっては、陽性対照と陰性対照を並行して行うための溶液が含まれる。
【００６２】
以下の実施例は、本発明を制限せずに、本発明を例示することを意図するものである。
実施例
サンプル中の飲料水と関連がある細菌の、特異的かつ迅速な検出
適切な方法で、サンプルを２０〜４４時間培養する。さまざまな適切な方法が、専門家によく知られている。この培養物の等分試料に、同じ体積の固定溶液（溶液Ａ、５０％エタノール）を加える。
【００６３】
ハイブリダイゼーション用に、固定した細胞の適切な等分試料（好ましくは４０μｌ）をスライドに施し、乾燥させる（４６℃、３０分間、あるいは完全に乾燥するまで）。次いで乾燥させた細胞を、他の固定溶液（溶液Ｂ、無水エタノール、好ましくは４０μｌ）を加えることによって、完全に脱水させる。スライドを再び乾燥させる（室温で３分間、あるいは完全に乾燥するまで）。
【００６４】
次いで、検出する微生物に特異的な前に記載した核酸プローブ分子を含む、ハイブリダイゼーション溶液（ＶＩＴ溶液）を、固定および脱水させた細胞に施す。好ましい体積は４０μｌである。次いでスライドを、ハイブリダイゼーション緩衝液（プローブ分子を含まないハイブリダイゼーション溶液に対応する、溶液Ｃ）で湿らせたチャンバ、好ましくはＶＩＴ反応器内で、インキュベートする（４６℃、９０分間）。
【００６５】
次いでスライドをチャンバから除去し、このチャンバを洗浄溶液（溶液Ｄ、蒸留水に１：１０で希釈させたもの）で充満させ、スライドをそのチャンバ中でインキュベートする（４６℃、１５分間）。
【００６６】
次いでチャンバを蒸留水で充満させ、スライドを軽く浸し、次いで空気により横方向の位置で乾燥させる（４６℃、３０分間、あるいは完全に乾燥するまで）。
次いでスライドを、適切な媒質（仕上げ剤）で包埋する。
【００６７】
最後に、蛍光顕微鏡によって、サンプルを分析する。
【国際調査報告】
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