(57)【要約】ニワトリのＶＬまたはＶＨと少なくとも８０％の相同性を有し、かつ合胞性融合を阻害する蛋白質、ならびに、ニワトリのＶＬまたはＶＨの配列からの、少なくとも１２個連続するアミノ酸を有するフラグメント。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリのＶＬまたはＶＨと少なくとも８０％の相同性を有し、かつ合胞性融合を阻害する蛋白質、ならびに、ニワトリのＶＬまたはＶＨの配列からの、少なくとも１２個連続するアミノ酸を有するフラグメント。
【請求項２】
ＶＬが、以下の配列を有する、請求項１に記載の蛋白質。
【化１】
2005504525.tif 000004
ここで、
X0 =未置換、モノもしくはジ置換アミノ基、または１つ以上のアミノ酸；
X1 =PまたはLまたは欠失；
X2 =GまたはEまたは欠失；
X3 =KまたはＥまたは欠失；
X4 =IまたはＬまたは欠失；
X5 =GまたはSまたは欠失；
X6 =SまたはGまたは欠失；
X7 =GまたはRまたはYまたは欠失；
X8 =SまたはRまたはYまたは欠失；
X9 =WまたはSまたは欠失；
X10 =SまたはKまたはYまたは欠失；
X11 =YまたはFまたは欠失；
X12 =SまたはAまたは欠失；
X13 =AまたはTまたは欠失；
X14 =VまたはDまたは欠失；
X15 =VまたはLまたは欠失；
X16 =NまたはVまたはSまたはDまたはEまたは欠失；
X17 =NまたはSまたは欠失；
X18 =NまたはTまたはDまたはKまたは欠失；
X19 =KまたはNまたは欠失；
X20 =DまたはNまたは欠失；
X21 =KまたはVまたは欠失；
X22 =TまたはAまたは欠失；
X23 =AまたはHまたはNまたは欠失；
X24 =DまたはEまたは欠失；
X25 =YまたはFまたは欠失；
X26 =NまたはSまたはGまたは欠失；
X27 =RまたはYまたはGまたは欠失；
X28 =Dまたは欠失；
X29 =Wまたは欠失；
X30 =DまたはKまたはAまたは欠失；
X31 =SまたはTまたはDまたは欠失；
X32 =SまたはAまたはGまたは欠失；
X33 =AまたはGまたは欠失；
X34 =GまたはRまたは欠失；
X35 =YまたはNまたは欠失；
X36 =VまたはAまたはTまたは欠失；
X37 =GまたはAまたはNまたは欠失；
X38 =IまたはAまたはMまたは欠失；および
X39 =カルボキシル基、カルボキシル誘導体または１つ以上のアミノ酸；
かつ、合胞性融合の阻害が保たれる限り、いずれかのアミノ酸の相互のコンサバティブな交換が許容され得る。
【請求項３】
ＶＨが、以下の配列を有する、請求項１に記載の蛋白質。
【化２】
2005504525.tif 000005
ここで、
X0 =未置換、モノもしくはジ置換アミノ基、または１つ以上のアミノ酸；
X1 =AまたはSまたはTまたは欠失；
X2 =GまたはRまたは欠失；
X3 =GまたはAまたはTまたは欠失；
X4 =AまたはGまたは欠失；
X5 =SまたはTまたはDまたは欠失；
X6 =FまたはMまたは欠失；
X7 =SまたはTまたは欠失；
X8 =SまたはDまたはNまたは欠失；
X9 =GまたはQまたはAまたはTまたは欠失；
X10 =NまたはAまたはQまたはGまたは欠失；
X11 =IまたはVまたは欠失；
X12 =FまたはWまたはYまたは欠失；
X13 =AまたはGまたは欠失；
X14 =GまたはAまたはRまたは欠失；
X15 =IまたはMまたは欠失；
X16 =SまたはNまたはGまたは欠失；
X17 =SまたはRまたはNまたは欠失；
X18 =Gまたは欠失；
X19 =FまたはTまたはSまたはNまたは欠失；
X20 =GまたはSまたはAまたは欠失；
X21 =NまたはSまたはRまたは欠失；
X22 =RまたはSまたはYまたは欠失；
X23 =GまたはAまたはNまたはYまたは欠失；
X24 =GまたはAまたは欠失；
X25 =SまたはAまたはPまたは欠失；
X26 =KまたはQまたは欠失；
X27 =RまたはLまたは欠失；
X28 =AまたはCまたは欠失；
X29 =TまたはHまたは欠失；
X30 =IまたはHまたは欠失；
X31 =SまたはLまたは欠失；
X32 =RまたはEまたは欠失；
X33 =DまたはGまたは欠失；
X34 =NまたはQまたはRまたはDまたはKまたは欠失；
X35 =GまたはRまたはWまたは欠失；
X36 =QまたはAまたは欠失；
X37 =SまたはEまたは欠失；
X38 =TまたはHまたは欠失；
X39 =VまたはSまたは欠失；
X40 =RまたはEまたは欠失；
X41 =LまたはAまたは欠失；
X42 =QまたはAまたは欠失；
X43 =LまたはAまたは欠失；
X44 =NまたはEまたはSまたは欠失；
X45 =NまたはQまたは欠失；
X46 =LまたはPまたは欠失；
X47 =RまたはQまたは欠失；
X48 =AまたはGまたは欠失；
X49 =EまたはGまたは欠失；
X50 =DまたはHまたは欠失；
X51 =TまたはRまたはLまたは欠失；
X52 =GまたはPまたは欠失；
X53 =TまたはPまたは欠失；
X54 =YまたはTまたは欠失；
X55 =YまたはSまたは欠失；
X56 =CまたはAまたは欠失；
X57 =AまたはPまたは欠失；
X58 =Kまたは欠失；
X59 =カルボキシル基、カルボキシル誘導体、または１つ以上のアミノ酸；
かつ、合胞性融合の阻害が保たれる限り、いずれかのアミノ酸の相互のコンサバティブな交換が許容され得る。
【請求項４】
請求項２および３に記載の配列を有する蛋白質が、リンカーによって互いに連結されている、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項５】
前記リンカーは、少なくともいずれか５つのアミノ酸からなるペプチド鎖である、請求項４に記載の蛋白質。
【請求項６】
Ｄ−アミノ酸が配列中に含まれる、請求項１〜５のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項７】
配列番号１〜１０のアミノ酸配列を有する、請求項１〜６の少なくとも１項に記載の蛋白質。
【請求項８】
配列番号１１の配列（コンセンサス配列）を有する蛋白質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の蛋白質をコードする核酸、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むプラスミドまたはベクター。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の少なくとも１つの蛋白質または請求項９に記載の少なくとも１つの核酸を含む薬剤。
【請求項１２】
哺乳動物における避妊のための薬剤の調製のための、請求項１〜８のいずれかに記載の少なくとも１つの蛋白質または請求項９に記載の少なくとも１つの核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト栄養芽層細胞(trophoblast cells)の合胞性融合(syncytial fusion)を阻害する蛋白質、そのような蛋白質を含む薬剤、および哺乳動物における避妊のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
合胞性融合の阻害は、避妊のために使用され得る作用の原理である。本明細書において、“避妊”という語は、毎月月経が起こり、かつ、性交にもかかわらず妊娠しないような臨床的な実際の態様において定義される。この一般的な定義は、今日臨床的に普通に使用されているほとんどの避妊薬(contraceptives)にも当てはまる。ヒトおよび他の哺乳動物における避妊は、多くの原理または物質のいずれかの適用によって達成され得る。既知の方法において、卵母細胞と精子の融合は、機械的または化学的手段によって阻害される。例えば、コンドーム、子宮内移植、または殺精子物質の使用によって、精子を不活性化することができ、または精子が受精するのを妨げることができる。更に、母親の卵巣における卵母細胞の成熟を妨げることができ、これは、ホルモンによる方法(hormonal methods)によって可能である。そのような方法は、当業者に知られている。
【０００３】
今日使用されているホルモンによる避妊薬（“ピル”）の大多数は、子宮内膜がもはや受容性でないため、胚盤胞の着床がもはや不可能なように、子宮の粘膜（子宮内膜）に作用する。これらの避妊の内分泌法は、所望の効果を得るためには、正確な時間および投与量でのホルモンの摂取を確保しなければならないという問題を含んでいる。ホルモン自体の半減期はせいぜい数時間から数日と短いので、この方法による避妊は、毎日摂取するか、または半減期が長い薬剤(depot preparations)の投与によってのみ成功し得る。これら解決法(solutions)のすべては、それらが、女性(female organism)の周期的な内分泌定常性(endocrine homeostasis)を妨害するかまたは妨げるという問題を含んでいる。子宮内膜は、母系生物の部分なので、母系生物は、望ましくない副作用が起こりやすい場所(preferred place)でもある。
【０００４】
従って、
ａ）着床した胚盤胞において作用する部位を有し、それにより更に母系生物における副作用を最少化することができ；
ｂ）女性の内分泌自己制御を妨害しない
方法および物質が望ましい。
【０００５】
図１は、融合アッセイ(fusion assay)の範囲内のフローサイトメトリー分析の例を示す。象限(quadrant)Ａには、ＤｉＩ（単独）の蛍光が示されており、一方、象限Ｃには、ＤｉＯ（単独）の蛍光が示されている。象限Ｂでは、融合により生じた２倍の蛍光を示す細胞が目に見えるようになっている。
【０００６】
図１Ａ、Ｂは、細胞が、それぞれ１つだけの蛍光色素で染色され、かつアッセイの条件下でインキュベートされた対照を示す。図１Ａでは、染色はＤｉＩによってのみ行われ、図１Ｂでは、ＤｉＯによってのみ行われた。ＤｉＩに関する測定値は、ＤｉＯに特異的な測定チャンネルではゼロである；よって、そこでのポイントは、Ｘ軸と一致する。
【０００７】
図１Ｃ、Ｄは、クローンＰＨＳＫ０４の融合アッセイを示す。図１Ｃは、対照条件下（同じ発現系において発現させ、精製した非特異的蛋白質の存在下）での細胞の融合率を示し、図１Ｄは、１００ｎＭのＰＨＳＫ０４蛋白質の存在下での融合率を示す。
【０００８】
図２は、対照（同じ発現系において発現させ、精製したカルモデュリン）と比較した、融合アッセイにおける典型的なクローンの相対的な阻害率を示す。３回の測定からの平均値を示す。
【０００９】
図３は、配列番号１〜１０の本発明による好ましい蛋白質に対するコンセンサス配列を示す。ここに示した典型的な態様において、リンカーは、配列ＱＳＳＲＳＳである。ＶＬおよびＶＨに対するコンセンサス配列を、灰色で陰影を付けて、クローンの個々の配列の下に、一文字コードで示す。コンセンサス配列自体は、水平に読まれ得るのに対し、好ましい代わりの(alternative)アミノ酸は、一文字コードの各位置に垂直に示されている。この場所におけるハイフンは、コンセンサス配列と比較して、対応する位置が欠けていてもよいことを意味する。Xは、VLおよびVHに対するコンセンサス配列の一部が、この場所には存在しないことを意味する。
【００１０】
ＰＨＳＫ０４蛋白質の存在下で、融合率は低下する。
【００１１】
本発明の目的は、ニワトリのＶＬまたはＶＨと少なくとも８０％の相同性を有し、かつ合胞性融合を阻害する蛋白質、ならびに、ニワトリのＶＬまたはＶＨの配列からの、少なくとも１２個連続するアミノ酸を有するフラグメントによって達成される。好ましい態様において、本発明による蛋白質は、ニワトリのＶＬまたはＶＨと少なくとも８５％、または少なくとも９０％の相同性を有する。好ましい態様において、本発明によるフラグメントは、ニワトリのＶＬまたはＶＨからの、少なくとも２０または３０個連続するアミノ酸を有する。
【００１２】
好ましくは、本発明による蛋白質ＶＬは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１】
2005504525.tif 000002
【００１３】
ここで、
X0 =未置換、モノもしくはジ置換アミノ基、または１つ以上のアミノ酸；
X1 =PまたはLまたは欠失；
X2 =GまたはEまたは欠失；
X3 =KまたはＥまたは欠失；
X4 =IまたはＬまたは欠失；
X5 =GまたはSまたは欠失；
X6 =SまたはGまたは欠失；
X7 =GまたはRまたはYまたは欠失；
X8 =SまたはRまたはYまたは欠失；
X9 =WまたはSまたは欠失；
X10 =SまたはKまたはYまたは欠失；
X11 =YまたはFまたは欠失；
X12 =SまたはAまたは欠失；
X13 =AまたはTまたは欠失；
X14 =VまたはDまたは欠失；
X15 =VまたはLまたは欠失；
X16 =NまたはVまたはSまたはDまたはEまたは欠失；
X17 =NまたはSまたは欠失；
X18 =NまたはTまたはDまたはKまたは欠失；
X19 =KまたはNまたは欠失；
X20 =DまたはNまたは欠失；
X21 =KまたはVまたは欠失；
X22 =TまたはAまたは欠失；
X23 =AまたはHまたはNまたは欠失；
X24 =DまたはEまたは欠失；
X25 =YまたはFまたは欠失；
X26 =NまたはSまたはGまたは欠失；
X27 =RまたはYまたはGまたは欠失；
X28 =Dまたは欠失；
X29 =Wまたは欠失；
X30 =DまたはKまたはAまたは欠失；
X31 =SまたはTまたはDまたは欠失；
X32 =SまたはAまたはGまたは欠失；
X33 =AまたはGまたは欠失；
X34 =GまたはRまたは欠失；
X35 =YまたはNまたは欠失；
X36 =VまたはAまたはTまたは欠失；
X37 =GまたはAまたはNまたは欠失；
X38 =IまたはAまたはMまたは欠失；および
X39 =カルボキシル基、カルボキシル誘導体または１つ以上のアミノ酸；
かつ、合胞性融合の阻害が保たれる限り、いずれかのアミノ酸の相互のコンサバティブな(conservative)交換が許容され得る。
【００１４】
別の好ましい態様において、本発明による蛋白質は、ＶＨにおいて以下の配列を有する：
【化２】
2005504525.tif 000003
【００１５】
ここで、
X0 =未置換、モノもしくはジ置換アミノ基、または１つ以上のアミノ酸；
X1 =AまたはSまたはTまたは欠失；
X2 =GまたはRまたは欠失；
X3 =GまたはAまたはTまたは欠失；
X4 =AまたはGまたは欠失；
X5 =SまたはTまたはDまたは欠失；
X6 =FまたはMまたは欠失；
X7 =SまたはTまたは欠失；
X8 =SまたはDまたはNまたは欠失；
X9 =GまたはQまたはAまたはTまたは欠失；
X10 =NまたはAまたはQまたはGまたは欠失；
X11 =IまたはVまたは欠失；
X12 =FまたはWまたはYまたは欠失；
X13 =AまたはGまたは欠失；
X14 =GまたはAまたはRまたは欠失；
X15 =IまたはMまたは欠失；
X16 =SまたはNまたはGまたは欠失；
X17 =SまたはRまたはNまたは欠失；
X18 =Gまたは欠失；
X19 =FまたはTまたはSまたはNまたは欠失；
X20 =GまたはSまたはAまたは欠失；
X21 =NまたはSまたはRまたは欠失；
X22 =RまたはSまたはYまたは欠失；
X23 =GまたはAまたはNまたはYまたは欠失；
X24 =GまたはAまたは欠失；
X25 =SまたはAまたはPまたは欠失；
X26 =KまたはQまたは欠失；
X27 =RまたはLまたは欠失；
X28 =AまたはCまたは欠失；
X29 =TまたはHまたは欠失；
X30 =IまたはHまたは欠失；
X31 =SまたはLまたは欠失；
X32 =RまたはEまたは欠失；
X33 =DまたはGまたは欠失；
X34 =NまたはQまたはRまたはDまたはKまたは欠失；
X35 =GまたはRまたはWまたは欠失；
X36 =QまたはAまたは欠失；
X37 =SまたはEまたは欠失；
X38 =TまたはHまたは欠失；
X39 =VまたはSまたは欠失；
X40 =RまたはEまたは欠失；
X41 =LまたはAまたは欠失；
X42 =QまたはAまたは欠失；
X43 =LまたはAまたは欠失；
X44 =NまたはEまたはSまたは欠失；
X45 =NまたはQまたは欠失；
X46 =LまたはPまたは欠失；
X47 =RまたはQまたは欠失；
X48 =AまたはGまたは欠失；
X49 =EまたはGまたは欠失；
X50 =DまたはHまたは欠失；
X51 =TまたはRまたはLまたは欠失；
X52 =GまたはPまたは欠失；
X53 =TまたはPまたは欠失；
X54 =YまたはTまたは欠失；
X55 =YまたはSまたは欠失；
X56 =CまたはAまたは欠失；
X57 =AまたはPまたは欠失；
X58 =Kまたは欠失；
X59 =カルボキシル基、カルボキシル誘導体、または１つ以上のアミノ酸；
かつ、合胞性融合の阻害が保たれる限り、いずれかのアミノ酸の相互のコンサバティブな交換が許容され得る。
【００１６】
本発明によれば、“コンサバティブな交換”とは、特に、極性、非極性、芳香族、帯電アミノ酸のグループ内でアミノ酸を交換するものを意味する。例えば、アラニンまたはバリンなどに対してグリシン、ヒスチジンなどに対してアルギニンまたはリジン、チロシンなどに対してフェニルアラニン。
【００１７】
本発明によれば、本発明による蛋白質は、リンカーによって互いに連結され得る。リンカーは、好ましくは、少なくともいずれか５つのアミノ酸のペプチド鎖である。それらアミノ酸は、ＶＬまたはＶＨ鎖との相互作用を形成しないか、またはわずかしか形成せず、好ましい。ペプチド鎖の代わりに、リンカーは、ヘテロ原子も含み得る、炭素原子の鎖から本質的に形成される有機化合物からなることもできる。この場合、リンカーの長さは、少なくとも９オングストロームであることが好ましい。
【００１８】
本発明による蛋白質に配列におけるＤ−アミノ酸の存在は、これにより、分解の進行を遅らせることができるので有利であり得る。
【００１９】
特に好ましいものは、配列番号１〜１０のアミノ酸配列を有する、本発明による蛋白質である。
【００２０】
これらの蛋白質は、配列番号１１の配列を有するコンセンサス配列によって記載され、本発明はそれにも関連している。
【００２１】
本発明は、本発明による蛋白質をコードする核酸、特にＤＮＡまたはＲＮＡ、および、そのような核酸を含むプラスミドまたはベクターにも関する。
【００２２】
本発明は、本発明による蛋白質または核酸を少なくとも１つ含む薬剤にも関する。
【００２３】
本発明により、哺乳動物における避妊のための薬剤の調製のための、本発明による蛋白質または核酸の少なくとも１つの使用もクレームされる(claimed)。本発明による薬剤は、典型的には、体重１ｋｇ当たり１００ｎｇ〜１０００μｇの量で投与される。注射によるか、または筋内もしくは皮下注射による、非経口的な投与経路が好ましい。更に可能な投与形式は、鼻内噴霧、坐薬、例えば、タンポンや、本草医学(galenics)の分野の当業者にそれ自体知られているか、または、簡単な実験で確立され得る他の適当な適用形式による膣への適用を含む。
【００２４】
胚盤胞の子宮内膜への着床の成功は、子宮内膜の受容性だけに依存するのではない。胚盤胞の外層中の細胞、いわゆる栄養芽層細胞が融合して合胞体を形成する場合にのみ、着床が可能である。合胞体の形成は、人体の生物学において、わずかな場所でのみ起こるプロセスである。例えば、これは、骨格筋繊維の形成および破骨細胞の形成において知られている。
【００２５】
筋芽細胞の合胞性融合において、または、破骨細胞の形成において、ＡＤＡＭ(ディスインテグリン・アンド・メタロプロテイナーゼ（a disintegrin and a metalloproteinase）; 調査のため（for a survey）、ヒュペルツ（Huppertz）ら、2001参照)のグループからの分子は、特に重要であり、一方、ヒトの栄養芽層は、内生レトロウイルスの蛋白質、いわゆるシンシチン(syncytin)、を使用する（ミー(Mi)ら、2000）。よって、栄養芽層細胞の融合を阻害することにより避妊効果を達成するための出発点がある。栄養芽層融合のプロセスは、栄養芽層に特異的であるので、その阻害は、選択的な栄養芽層に特異的な避妊のために使用され得る。
【００２６】
機能的には、本発明による蛋白質は、栄養芽層細胞の合胞性融合を阻害する、それらの能力を特徴とする。それらは、雌の哺乳動物、特に、齧歯類動物、イヌやネコのようなペット、およびヒトにおいて避妊効果を達成するために使用され得る。従って、本発明は、以下の成分を本質的に含む：好ましくは、
ａ）相同性の比較により、非哺乳動物、特にニワトリの抗体の誘導体として分類されることができ；特に、それらは、アミノ酸コンセンサス配列に言及することにより、本質的に特徴付けられる；
ｂ）哺乳動物の栄養芽層細胞の合胞性融合を阻害する性質によって機能的に特徴付けられる、免疫学的結合分子の状態であり得る蛋白質。
【００２７】
免疫学的結合分子の構成の阻害
好ましい態様において、本発明による蛋白質は、免疫学的結合分子の状態であり得る。本明細書に記載の実施例において、免疫学的結合分子は、組み換え型分子である。実施例に記載の免疫学的結合分子は、“一本鎖可変フラグメント”抗体（ｓｃＦｖ）のタイプのものである。そのような抗体分子は、組換え技術により挿入された、短い配列（リンカー）によって互いに連結されている、抗体分子の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域のみからなる。従って、ｓｃＦｖは、免疫学的結合分子の最低限の(minimalistic)態様と考えられ得る。重要な結合情報は、それらの連結の種類にではなく、個々の可変領域ＶＬおよびＶＨに含まれている。本発明の更なる態様は、いわゆるＦａｂ（抗原結合フラグメント）抗体または何らかの構成の他の抗体分子に関し、任意に、それらの配列内に含まれる可変領域の少なくとも１つを含む、非組み換え型の天然抗体分子にも関する。実施例でも示される、ｓｃＦｖの態様において、含まれるモジュール(modules)は、以下の配列であることができる：
ＶＬ−リンカー−ＶＨ
ＶＨ−リンカー−ＶＬ
【００２８】
他の担体構成物(support constructions)のために、構成体(constructs)におけるＶＬとＶＨの順序は、あらかじめ決定されないこと、および、構成体自体は、結合性に決定的には寄与しないことも事実である。本明細書で使用される“担体構成物”とは、それらが、最適な状態でそれらの結合パートナーを見つけ得るために、その上へｓｃＦｖ抗体またはそれら抗体の一部が載せられ得る、それら分子を意味する。
【００２９】
従って、本発明は、特に、すべての免疫学的結合分子、および、その特異的結合領域が、ＶＨおよびＶＬに対する以下に記載のコンセンサス配列有するか、ＶＬおよびＶＨに対するコンセンサス配列と、それぞれ少なくとも８０％、配列が一致し、かつ、栄養芽層細胞の融合を阻害し得る、それらの誘導体に関する。また、本発明では、いわゆるエピトープタグ（例えば、精製の向上のためのＨＩＳタグ、または免疫学的検出法における二次抗体の使用のためのｍｙｃタグ等）が、免疫学的結合分子の組み換え体発現において技術的理由のために導入されるかは、重要ではない。これらのタグは、純粋に技術的な性質のもの(purely technical nature)であり、ここで保護されるべき配列の一部ではない。
【００３０】
本明細書に記載したような免疫学的結合分子は、適当な状態のニワトリの免疫レパートリーを、分子生物学的ライブラリに変える(transferring)ことにより、ニワトリから得ることができる。適当な技術は、例えば、バルバス(Barbas) CF、バートン(Burton) DR、 スコット(Scott) JK、シルバーマン(Silverman) GJ; ファージディスプレイ(Phage Display):ラボラトリーマニュアル(A laboratory manual)、CSHL プレス(Press)、ニューヨーク、に記載されている。そのようなライブラリが利用可能であれば、融合の準備ができている栄養芽層細胞の表面に結合するそれら抗体を、既知の技術（例えば、バルバス(Barbas)ら、上記参照、に記載されているような技術）により、単離することによって、所望の分子を豊富に得ることができる。次いで、これら抗体をＤＮＡレベルで単離によりクローン化し、ＤＮＡレベルで配列決定する。その後、それらの融合阻害効果を確認するために、すべての抗体を、融合アッセイにおいて試験して特徴付けなければならない。確率的ライブラリから単離された、そのような融合阻害抗体の配列は、ここに記載のコンセンサス配列によって、高い確率で包含される。
【００３１】
または、上記の方法によって、ファージディスプレイにおいてニワトリの抗体をクローニングし、個々のクローンを任意に選択して配列決定することにより、既知の配列の抗体ＤＮＡが調製され得る。ニワトリの抗体のフレームワーク(framework)配列は、本明細書中のＶＨおよびＶＬフレームワーク配列との相同性が高く、わずかだけ異なる(deviate)。１つの抗体と別の抗体とで顕著に異なる“相補性決定領域”（ＣＤＲ）によって、結合特異性が確保される。個々の部分(segments)を選択的に交換することにより、主にＣＤＲ領域で、既知の分子生物学的技術を用いて、この方法で、クローニングしたニワトリの配列を変更して、所望の配列の抗体を得ることもできる。
【実施例】
【００３２】
抗体分子
実施例に記載のｓｃＦｖ抗体は、ＤＮＡにおいてコードされる、ベクターｐＡＣに含まれている。このベクターは、ｆ１開始点(origin)、アラビノース制御ｐＢＡＤプロモーター、およびアンピシリンに対する耐性をもたらす遺伝子からなる、大腸菌に適した発現ベクターである。免疫学的結合分子をコードするＤＮＡ配列は、それらの発現がｐＢＡＤプロモーターによって制御されるように、ベクター内へ挿入される。ベクター中に含まれるシグナルペプチドは、発現された蛋白質を大腸菌の周辺質へ送り、そして、金属アフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にするために、６ｘＨＩＳタグを、発現されるべき配列に結合させる。使用したＤＮＡ配列が正確にベクター内に構成されたことを間違いなく立証するために、すべてのクローンを、発現前に配列決定によって確認する。
【００３３】
それら配列は、例えば、適当な再クローニング後に、大腸菌およびサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の両方において、蛋白質の発現に適した発現系において、蛋白質として合成され得る。対応する工程は、分子生物学およびバイオテクノロジーの多くのテキスト本に記載されており、原則として、それらのすべてを、本配列に適用することができる。そのような技術は、当業者に知られている。以下に、大腸菌(菌株トップテン(Top Ten)、インビトロゲン(Invitrogen)、グロニンゲン(Groningen)、オランダ)におけるベクターｐＡＣによる発現、ならびに、発現された蛋白質の精製および特徴化を記載する。
【００３４】
発現されるべき配列を含むｐＡＣ誘導体は、最初に、エレクトロポレーションによって大腸菌トップテン(Top Ten)に形質転換され、そして、形質転換混合物は、寒天プレート上で平板培養され（ＬＢ培地、５０μｇ／ｍｌ アンピシリン）、３０℃で一晩インキュベートされる。
【００３５】
翌日、それぞれ５ｍｌのＬＢ培地（組成はサンブロック(Sambrook)ら、１９８９を参照；５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有）に、個々のコロニーから採取したバクテリアを接種する。この培養液を、１分当たり３００回転で（３００ｒｐｍ）、インキュベーションシェーカーにおいて、３７℃で一晩インキュベートする。翌日、１：１００に希釈した、この一晩前培養した培養液からの発現培養液を接種させ、光学濃度（６００ｎｍで測定：ＯＤ６００）が０．５に達するまで、ファーンバック(Fernbach)フラスコ中で、３００ｒｐｍで、３７℃でインキュベートする。一般に、これは、約２．５時間後の場合である。所望のＯＤ６００に達した後、Ｌ−アラビノースを添加することによって（最大濃度０．０２％まで；予備実験において、各クローンそれぞれについて、最適濃度を定めなければならない）、発現を引き起こす。ここで、発現は、２６℃、３００ｒｐｍで、４〜６時間行われる。試料を採取し、ＯＤ６００を測定することによって、バクテリアの成長の様子を記録する。この発現段階に続いて、培養液を、４℃、４０００×ｇで、２０分間遠心分離し、２ｍｌのＴＥＳバッファー（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５Ｍ スクロース）中に、ペレットを再懸濁させる。ここで、３ｍｌの１／５ ＴＥＳバッファー（１容量部(volume part)のＴＥＳバッファープラス４容量のアクア・バイデスティラータ(aqua bidestillata）)を、この懸濁液にゆっくり添加し、これを混合し、氷上で３０分間、インキュベートする。その後、試料を、１．５ｍｌの反応容器へ分け、４℃、１０，０００×ｇで、１０分間、遠心分離する。その後、上清は、周辺質蛋白質を含み、更に、それにより所望の発現生成物も含む。
【００３６】
更なる処理のために、等張のリン酸塩によって緩衝処理された食塩水（ｐＨ７．４、１０ｍＭのイミダゾール含有）に対して、４℃で一晩、上清を透析する。ニッケルアフィニティークロマトグラフィーのための市販のキット（例えば、キアゲン社(Qiagen GmbH)、ヒルデン(Hilden)、ドイツ）を用いて、ここで、所望の蛋白質を精製することができる。精製を、ゲル電気泳動によって制御し、蛋白質濃度を決定する（ハーロー(Harlow)およびレーン(Lane)、1988）。濃度の決定および配列から得られた式量から、モル濃度を決定した。
【００３７】
次いで、等モル条件下での融合アッセイにおいて、精製されて定量的に分析された蛋白質が、ヒト栄養芽層細胞の融合を阻害し得るかを確認する。
【００３８】
以下に、実施例において発現させて分析したクローンを記載し、ＤＮＡ配列から翻訳したアミノ酸配列を、一直線上に(in alignment)示す。
【００３９】
融合アッセイ、実施および結果
自発的に融合するヒト栄養芽層細胞系ＡＣ−１Ｍ１７を用いて、融合阻害効果を証明する。この細胞系の細胞は、新たな培養容器内へ入れた(seeding)直後に、２０〜３０％の初期融合率を示す。
【００４０】
最初に、この細胞系の細胞を、十分な数に増殖させ、次いで、２つの集団に分け、異なる市販の蛍光色素（DiIおよびDiO、供給者モレキュラー・プローブス(Molecular Probes) BV、ライデン(Leiden)、オランダ、の指示に従って染色）によって染色する。
【００４１】
それら細胞を、十分に洗浄し（５×１０分）、細胞膜内へ組み込まれていない、付着した色素の残りをすべて洗い流した後、２つの細胞群を混合し、Ham's F12（10% ウシ胎仔血清および抗生物質）中で、標準的な培養条件下（5% 二酸化炭素、３８℃、湿度９０％以上）で、２４時間、低細胞密度で、普通にインキュベートする。この培養段階後、トリプシンによって、培養フラスコの底部から、細胞を引き離し、懸濁させ、そして、フローサイトメーターにおいて、存在する細胞のどの程度が、融合によって２倍の蛍光を示す（adopted）かを決定する。図１は、そのような融合アッセイの評価の例を示す。図２に、実施例に記載の個々のｓｃＦｖクローンについて測定した場合の、これら栄養芽層細胞の融合の阻害率を要約する。図は、様々なクローンにおける融合阻害効果の濃度依存性も示す。
【００４２】
参考文献のリスト
ハーロー(Harlow) E、レーン(Lane) D（１９８８） アンチボディズ(Antibodies)：ラボラトリー・マニュアル(A laboratory manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、NYヒュペルツ(Huppertz) B、テウズ(Tews) DS、カウフマン(Kaufmann) P (2001) ヒト胎盤栄養芽層および骨格筋におけるアポトーシスおよび合胞性融合(Apoptosis and syncytial fusion in human placental trophoblast and skeletal muscle.) Int Rev Cytol 205:215-253ミー(Mi) S、リー(Lee) X、リ(Li) X、ベルドマン(Veldman) GM、フィナティ(Finnerty) H、 ラシー(Racie) L、ラバリイ(LaVallie) E、タン(Tang) X-Y、エドワード(Edouard) P、ホウズ(Howes) S、キース(Keith) JC、マッコイ(McCoy) JM (2000) シンシチンは、ヒト胎盤形態形成に関連する、捕獲されたレトロウイルスエンベロープ蛋白質である(Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis.) ネイチャー(Nature) 403:785-789サンブロック(Sambrook) J、フリッシュ(Fritsch) EF、マニアティス(Maniatis) T (1989) モレキュラー・クローニング(Molecular cloning): ラボラトリー・マニュアル(a laboratory manual)、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor laboratory)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、N.Y
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、融合アッセイの範囲内のフローサイトメトリー分析の例を示す。
【図２】図２は、対照（同じ発現系において発現させ、精製したカルモデュリン）と比較した、融合アッセイにおける典型的なクローンの相対的な阻害率を示す。
【図３】図３は、配列番号１〜１０の本発明による好ましい蛋白質に対するコンセンサス配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月3日(2002.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリのＶＬまたはＶＨと少なくとも８０％の相同性を有し、かつ哺乳動物栄養芽層の合胞性融合を阻害する蛋白質であって、
ＶＬが、以下の配列：
【化１】
2005504525.tif 000034
（ここで、
X0 =未置換、モノもしくはジ置換アミノ基、または１つ以上のアミノ酸；
X1 =PまたはL；
X2 =GまたはE；
X3 =KまたはＥ；
X4 =IまたはＬ；
X5 =GまたはS；
X6 =SまたはG；
X7 =GまたはRまたはY；
X8 =SまたはRまたはYまたは欠失；
X9 =WまたはSまたは欠失；
X10 =SまたはKまたはYまたは欠失；
X11 =YまたはF；
X12 =SまたはAまたは欠失；
X13 =AまたはTまたは欠失；
X14 =VまたはD；
X15 =VまたはL；
X16 =NまたはVまたはSまたはDまたはE；
X17 =NまたはS；
X18 =NまたはTまたはDまたはK；
X19 =KまたはN；
X20 =DまたはN；
X21 =KまたはV；
X22 =TまたはA；
X23 =AまたはHまたはN；
X24 =DまたはE；
X25 =YまたはF；
X26 =NまたはSまたはG；
X27 =RまたはYまたはGまたは欠失；
X28 =Dまたは欠失；
X29 =Wまたは欠失；
X30 =DまたはKまたはAまたは欠失；
X31 =SまたはTまたはD；
X32 =SまたはAまたはG；
X33 =AまたはGまたは欠失；
X34 =GまたはRまたは欠失；
X35 =YまたはNまたは欠失；
X36 =VまたはAまたはT；
X37 =GまたはAまたはN；
X38 =IまたはAまたはM；および
X39 =カルボキシル基、カルボキシル誘導体または１つ以上のアミノ酸；
かつ、哺乳動物栄養芽層の合胞性融合の阻害が保たれる限り、いずれかのアミノ酸の相互のコンサバティブな交換が許容され得る。）
を有し、
ＶＨが、以下の配列：
【化２】
2005504525.tif 000035
（ここで、
X0 =未置換、モノもしくはジ置換アミノ基、または１つ以上のアミノ酸；
X1 =AまたはSまたはT；
X2 =GまたはR；
X3 =GまたはAまたはT；
X4 =AまたはG；
X5 =SまたはTまたはD；
X6 =FまたはM；
X7 =SまたはT；
X8 =SまたはDまたはNまたは欠失；
X9 =GまたはQまたはAまたはT；
X10 =NまたはAまたはQまたはG；
X11 =IまたはV；
X12 =FまたはWまたはY；
X13 =AまたはG；
X14 =GまたはAまたはR；
X15 =IまたはM；
X16 =SまたはNまたはG；
X17 =SまたはRまたはN；
X18 =Gまたは欠失；
X19 =FまたはTまたはSまたはN；
X20 =GまたはSまたはA；
X21 =NまたはSまたはR；
X22 =RまたはSまたはY；
X23 =GまたはAまたはNまたはY；
X24 =GまたはA；
X25 =SまたはAまたはP；
X26 =KまたはQ；
X27 =RまたはL；
X28 =AまたはC；
X29 =TまたはH；
X30 =IまたはH；
X31 =SまたはL；
X32 =RまたはE；
X33 =DまたはG；
X34 =NまたはQまたはRまたはDまたはK；
X35 =GまたはRまたはW；
X36 =QまたはA；
X37 =SまたはE；
X38 =TまたはH；
X39 =VまたはS；
X40 =RまたはE；
X41 =LまたはA；
X42 =QまたはA；
X43 =LまたはA；
X44 =NまたはEまたはS；
X45 =NまたはQ；
X46 =LまたはP；
X47 =RまたはQ；
X48 =AまたはG；
X49 =EまたはG；
X50 =DまたはH；
X51 =TまたはRまたはL；
X52 =GまたはPまたは欠失；
X53 =TまたはPまたは欠失；
X54 =YまたはTまたは欠失；
X55 =YまたはSまたは欠失；
X56 =CまたはAまたは欠失；
X57 =AまたはPまたは欠失；
X58 =Kまたは欠失；
X59 =カルボキシル基、カルボキシル誘導体、または１つ以上のアミノ酸；
かつ、栄養芽層細胞の合胞性融合の阻害が保たれる限り、いずれかのアミノ酸の相互のコンサバティブな交換が許容され得る。）
を有し、
配列ＶＬおよびＶＨを有する蛋白質が、リンカーによって相互に連結されている、前記蛋白質。
【請求項２】
前記リンカーは、少なくともいずれか５つのアミノ酸からなるペプチド鎖である、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
Ｄ−アミノ酸が配列中に含まれる、請求項１または２に記載の蛋白質。
【請求項４】
配列番号１〜１０のアミノ酸配列を有する、請求項１〜３の少なくとも１項に記載の蛋白質。
【請求項５】
配列番号１１の配列（コンセンサス配列）を有する蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の蛋白質をコードする核酸、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含むプラスミドまたはベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の少なくとも１つの蛋白質または請求項６に記載の少なくとも１つの核酸を含む薬剤。
【請求項９】
哺乳動物における避妊のための薬剤の調製のための、請求項１〜５のいずれかに記載の少なくとも１つの蛋白質または請求項６に記載の少なくとも１つの核酸の使用。
【国際調査報告】
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