(57)【要約】本発明はポリペプチドを確認する方法に関する。本方法は次の各段階を含む：（ａ）ポリペプチドのＮ−末端またはポリペプチドのペプチド１種またはそれ以上のＮ−末端を、活性化された酸部分に結合するスルホニル部分を含む酸性試薬１種またはそれ以上で誘導化して、ペプチド誘導体１種またはそれ以上を提供する段階；（ｂ）質量分析技術を使用して少なくとも１種のペプチド誘導体を分析して、フラグメンテーションパターンを提供する段階；および（ｃ）得られたフラグメンテーションパターンを解析する段階。  そのうえに、本発明方法は少なくとも段階（ａ）の間は該ペプチドまたはポリペプチドが固体の支持体に固定されていることを特徴とする。  さらに、本発明はまた、質量分析技術によってポリペプチドを確認するためのキットに関する。
2005518521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを確認する方法であって、次の各段階を含む方法：
（ａ）ポリペプチドのＮ−末端を、またはポリペプチドのペプチド１個またはそれ以上のＮ−末端を、活性エステル部分に結合するスルホニル部分またはスルホン酸部分を含み、水性溶液中での半減期が室温で１０分以上であり誘導体を１種またはそれ以上製造する酸性試薬少なくとも１種を用いて誘導化して、ペプチド誘導体を１種またはそれ以上提供する段階；
（ｂ）該誘導体少なくとも１種を質量分析の技術を用いて分析して、フラグメンテーションパターンを提供する段階；および
（ｃ）得られるフラグメンテーションパターンを解析してポリペプチドを確認する段階；
ただし、このペプチドまたはポリペプチドは少なくとも段階（ａ）の間は固体支持体に固定化されているものとする。
【請求項２】
固体支持体がＣ18で誘導化したシリカに基づく媒体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）をｐＨ８〜１２、たとえばｐＨ９〜１０の範囲に緩衝された溶液中で行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
誘導化ポリペプチドに求核試薬を１種またはそれ以上加え、続いて洗浄段階を加えることによって段階（ａ）の後の望ましくないエステル副生成物の量を削減またはエステル副生成物をなくする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
誘導化ポリペプチドにヒドロキシルアミン塩酸塩を加え、続いて洗浄段階を加えることによって段階（ａ）の後の望ましくないエステル副生成物の量を削減またはエステル副生成物をなくする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドに結合した時に酸性試薬がｐＫａ約２未満である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
段階（ｂ）で使用する質量分析技術がマトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
段階（ｂ）で使用する質量分析技術が電気スプレーイオン化（ＥＳＩ）法である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
段階（ｃ）においてフラグメンテーションパターンをソフトウエアプログラムまたはデータベースを使用して解析する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
全段階を自動化操作または半自動化操作の一部として行う、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
活性化された酸部分がＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）エステルである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
試薬が３−スルホプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
試薬が２−スルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ポリペプチドが酵素消化で得られる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
酵素がトリプシンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドと試薬とを遠心分離する間に段階（ａ）を行う、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
さらに、スルホン化段階の前にリジン残基を保護する段階を含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
段階（ａ）に従って行うスルホン化段階の前にリジン残基を保護する段階を含み、その保護も固体支持体に固定されたペプチドおよび／またはポリペプチドに対して行われる、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドをスルホン化反応の前に固体支持体に固定化し、固定化したままでグアニジン化する、ペプチドおよび／またはポリペプチドのリジン残基を保護する方法。
【請求項２０】
活性エステル部分と結合するスルホニル部分またはスルホン酸部分を含み、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法で使用するための、試薬。
【請求項２１】
ポリペプチドを固体支持体に固定化して行うペプチド誘導化方法であって、その試薬が３−スルホプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルおよび２−スルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルから構成される群から選択されるペプチド誘導化方法における、使用に適する試薬。
【請求項２２】
質量分析技術でポリペプチドを確認するためのキットであって、そのキットは活性化された酸部分に結合するスルホニル部分またはスルホン酸部分を有する形の試薬少なくとも１種を容器内に含み、その試薬は水性溶液中、室温での半減期が１０分以上、好ましくは約２０分以上、最も好ましくは約３０分以上である。
【請求項２３】
さらにｐＨ約８〜１２、たとえばｐＨ９〜１０の緩衝液を試薬と別の区画に含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
また別の区画にヒドロキシルアミン塩酸塩を含む、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２５】
該試薬がポリペプチドと結合した時にｐＫａ約２未満である、請求項２２〜２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
質量分析技術がマトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析である、請求項２２〜２５のいずれかに記載のキット。
【請求項２７】
質量分析技術が電気スプレーイオン化（ＥＳＩ）である、請求項２２〜２６のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
活性化された酸部分がＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）エステルである、請求項２２〜２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
ＮＨＳエステルを３−スルホプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルおよび２−スルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルから構成される群から選択される、請求項２２〜２８のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はポリペプチドを確認するための改良された方法に関し、その方法では酸性試薬を用いてペプチドを誘導化した後に質量分析を用いて分析する。本発明はまた本方法での使用に適する試薬を含むキットに関する。
【０００２】
発明の背景
ポリペプチドの確認および配列決定は蛋白質学分野の急速な発展と共にますます重要になっている。この分野では新遺伝子の発現産物をその機能および構成について研究する。
【０００３】
マトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析はペプチドおよびポリペプチドの配列決定のために開発された方法である（ＭＡＬＤＩ質量分析の原理を説明する参考文献としては、たとえばSpengler et al. "Peptide Sequencing by Matrix-assisted Laser-desorption Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Vol. 6, pp. 105-108 (1992) を参照）。ＭＡＬＤＩ質量分析は質量分析の領域に数々の利点を提供する。例えばこの方法は通常の電気スプレー三重四極装置よりも感度が高い。飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析器と組み合わせて使用する時には、ＭＡＬＤＩ質量分析は三重四極装置で分析できるものよりも高質量のペプチドにも使用できる。ＭＡＬＤＩ質量分析はまた最少なサンプル精製を用いて複雑な混合物を分析するためにも有用である。一方、電気スプレーイオン化法は液体クロマトグラフィー法（ＬＣ）および様々な型の毛細管電気泳動（ＣＥ）法を含む強力な分離技術と容易に連結できる。サンプルの精製にＬＣおよびＣＥを使用し、注入装置を用いれば高度に自動化した分析が可能である。
【０００４】
しかしながら最近のＭＡＬＤＩ法も、それ程ではないが電気スプレーイオン化質量分析法も、予想可能なタンデム質量分析フラグメンテーションパターンを適切に提供しない。例えば、多重イオンシリーズ（ａ−イオン、ｂ−イオンおよびｙ−イオンを含む）が観察されることが多く、効率的な解析および配列決定のためには複雑過ぎるＭＡＬＤＩ―ポスト・ソース・ディケイ・スペクトルを与える。多重イオンシリーズ（ｂ−イオンおよびｙ−イオン）プラス内部フラグメントおよび一重に荷電したイオンおよび多重に荷電したイオンが電気スプレーイオン化法によって発生する多重荷電前駆体イオンから形成され、得られるタンデム質量スペクトルは最初から解析が困難なことが多い。従って、フラグメンテーションに関する問題が質量分析を使用する迅速なポリペプチド配列決定法の性能を限定してきた。その結果、質量分析、殊にＭＡＬＤＩ質量分析術、はこの分野における評価が低かった。
【０００５】
いくつかの研究グループが化学的誘導化技術を用いてポリペプチド配列決定の分野における質量分析の有用性向上を試みてきた。この技術はペプチドのＭＳＭＳスペクトルでフラグメンテーションを促進し、誘導するために利用され、感度の向上および得られるスペクトルの複雑性低下を目指した。この研究は殆どがカチオン性誘導体を提供した。例えば、四級アンモニウム基を用いる誘導化および静電的ＳＩＭＳイオン化法を使用する分析が提案された。しかしながら、ＭＡＬＤＩ質量分析および低エネルギー衝突活性化による電気スプレーイオン化を使用するこの技術の利用は、一般的な効果を証明するに到らなかった。
【０００６】
最近、Keough ら（WO 00/43792、Procter & Gamble社）はアミノ酸配列決定のためにｐＫａ値２未満の酸部分１個またはそれ以上で被分析物ポリペプチドのＮ末端を誘導化した後に、たとえばＭＡＬＤＩ質量分析のような質量分析法で分析する方法を提案した。この酸性部分は、好ましくはスルホン酸またはジスルホン酸誘導体である。この誘導体は荷電部位から開始する骨格アミド結合の切断を促進し、ｙ−イオンを含む一連のフラグメントイオンのみを選択的に検出することを可能にする。しかしながら、Keoughらの反応は、彼らが使用した試薬が水に不安定なため、一般に非水条件下に行われる。従って、質量分析による商業的に有用なアミノ酸配列決定法のためには、なお操作法、中でも自動化操作法の要請を満たすような方法の改良が求められている。
【０００７】
発明の要約
本発明の目的の一つは質量分析技術を用いてペプチドまたはポリペプチドを確認する方法を提供することにあり、その方法はその堅牢さ、感度およびフラグメンテーションスペクトル解析の容易さのために、先行技術の方法よりも自動化に適するものである。この目的は酸性誘導化試薬を固体支持体上に固定されたポリペプチドと接触させることによって達成される。
【０００８】
そこで、本発明はポリペプチドを確認する方法に関し、この方法は次の各段階を含む：
（ａ）ポリペプチドのＮ−末端またはポリペプチドのペプチド１個またはそれ以上のＮ−末端を、活性化された酸部分に結合するスルホニル部分またはスルホン酸部分を含む酸性試薬少なくとも１種を用いて水性溶液中誘導化して、ペプチド誘導体を１種またはそれ以上提供する段階（ただし、この試薬は水溶液中での半減期が室温では１０分以上、好ましくは２０分以上、最も好ましくは３０分以上である）；
（ｂ）その誘導体少なくとも１種を質量分析技術で分析して、フラグメンテーションパターンを提供する段階；および
（ｃ）得られたフラグメンテーションパターンを解析する段階。
但し、本方法では少なくとも段階（ａ）の間はこのポリペプチドが固体支持体に固定化されているものとする。
【０００９】
本発明の各目的は、特定的には上記請求項に定義するようにして達成される。以下に本発明を特定的態様およびその具体的実施例も参照しつつ、さらに詳細に説明する。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１は、実施例２に記載するウマミオグロビンの未誘導化サンプル（ＭＡＬＤＩターゲット上、１５fmol）についてリフレクトロンスペクトルを示す。 
図２は、図１に関して記載したサンプルの誘導化サンプル（ＭＡＬＤＩターゲット上、＜１５fmol）についてリフレクトロンスペクトルを示す。
図３は、リジン末端ペプチド（図２、m/z 1271）の誘導化で生じたm/z 1449.5についてＰＳＤスペクトルを示す。
図４は、得られたｙ−イオン７種の質量（反応物から−42Ｄａ）を与えて前記プロテインをPepFrag でどのように同定したかを示す。
図５は、アルギニン末端ペプチド（m/z 1742.8）についてフラグメンテーションスペクトルを示す。
図６は、得られたｙ−イオン８種の質量を用いてプロテインをPepFragで確認したことを示す。
図７は、実施例３に記載するＢＳＡトリプシン消化ペプチド５００ fmol の固相スルホン化を示す。
図８は、実施例３に記載するＢＳＡトリプシン消化ペプチド４.５ pmol の溶液中でのスルホン化を示す。
図９Ａ〜図９Ｄは以下の実施例１２で検討するＮＭＲスペクトルを示す。
図１０Ａ〜図１０Ｂは本発明に使用するＮＨＳエステルの安定性を図示する。より特に、図１０ＡはＤ２Ｏ中３−スルホプロピオン酸ＮＨＳエステルの安定性を示し、図１０ＢはＤ２Ｏ中３−スルホ安息香酸ＮＨＳエステルの安定性を示す。
図１１Ａ〜図１１Ｃは実施例１７に記載のようにスルホン化したペプチドについてＭＡＬＤＩ・ＰＳＤスペクトルおよび相対的反応性のデータを示す。
図１２は、EttanTMMALDI-TOFで得た４ＶＰ−ＢＳＡの未誘導化トリプシン消化物についてリフレクトロンスペクトル、ポジティブモード（平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
図１３は、４ＶＰ−ＢＳＡ（EttanTM MALDI-TOF）の誘導化トリプシン消化物についてリフレクトロンスペクトル（平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
図１４は、EttanTM MALDI-TOF で得た４ＶＰ−ＢＳＡの誘導化トリプシン消化物（図１３）から得たペプチド（Ｉ）の完全ｙ−イオンシリーズを示すＰＳＤスペクトル（ポジティブモード）を示す。
図１５は、４ＶＰ−ＢＳＡの誘導化トリプシン消化物（図１３）から得たペプチド（ＩＩ）についてＰＳＤスペクトル（ポジティブモード）を示す。
図１６は、４ＶＰ−ＢＳＡの誘導化トリプシン消化物（図１３）から得たペプチド（ＩＩＩ）m/z 1704 についてＰＳＤスペクトル（３００ショットシグナル蓄積）を示す。
図１７は、EttanTM MALDI-TOF で得たクーマジー染色２−Ｄゲルからの未誘導化プロテイン消化物についてリフレクトロンスペクトルの初回例（ポジティブモード、１００ショット蓄積、平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
図１８は、図１７と同じ２−Ｄサンプル（残りの９５％）であるがＮＨＳエステルでＮ−末端誘導化後のリフレクトロンスペクトル（ポジティブモード、平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
図１９は、誘導化ペプチド m/z 1927 についてＰＳＤスペクトル（３００ショット蓄積）を示す。
図２０は、EttanTM MALDI-TOF で得たクーマジー染色２−Ｄゲルから得たプロテインスポットの未誘導化トリプシン消化物についてリフレクトロンスペクトルの第二例（１００ショット蓄積、平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
図２１は、図１９と同じ２−Ｄサンプルであるが既述のようにZipTipTM で浄化し、水性溶液中でＮＨＳを用いて誘導化した後のリフレクトロンスペクトル（ポジティブモード、平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
図２２は、誘導化したペプチド m/z 1705（図１２参照）についてＰＳＤスペクトル（シグナルを３００ショット蓄積）を示す。
図２３は、後続する多重式スルホン化用に実験室用遠心分離機に入れたサンプル充填済 ZipTipsTM を示す。
図２４は、スルホン化反応後に遠心分離機内で行うサンプル洗浄を示す。
図２５は、ＭＡＬＤＩサンプルステージ上に固体支持体から誘導化サンプルの直接負荷を示す。
図２６は、固体支持体上でフィブリノペプチドＡをスルホン化して得たＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。各サンプルはペプチド三濃度（１０、１および０．１pmole）で、スルホン化は二重実験で行った。
図２７は、スルホン化反応中に形成される望ましくないエステル副産物を逆戻りさせるためのヒドロキシルアミン塩酸塩の使用を示す。上のスペクトルは遠心分離機内の固体支持体上でスルホン化したASHLGLARから得た。下のスペクトルはヒドロキシルアミン塩酸塩で処理した後の同じスルホン化ペプチドから得た。
図２８は、プロテイン消化物のスルホン化を示す。上のスペクトルは天然プロテイン消化物から得た。下のスペクトルはスルホン化後の消化物から得た。
【００１１】
定義
本明細書では用語「確認する」は、完全配列の決定とは必ずしも同義語ではなく、それは、ポリペプチドを確認するための部分配列決定または既知プロテインに由来するペプチドとの異同を確認するための部分配列決定も含むためである。さらに、この用語にはまた少数の可能性の中で最も可能性の高いものに基づく暫定的な確認を行うことも含む。
【００１２】
さらに、本明細書で使用する用語「イオン化」は、被分析物に電子単位プラス１またはそれ以上または電子単位マイナス１またはそれ以下の電荷を作製または保持する過程を示す。
【００１３】
本明細書で使用する用語「水性環境」は、水に基づくいかなる溶液、懸濁液またはその他の形をも含む。これには約２０％未満の有機溶媒を含有する。
【００１４】
本明細書で使用する用語「電気スプレーイオン化」はアースした対電極に対して高電圧の毛細管電極から静電的に溶液を噴霧することによって溶液からイオンを形成する過程を示す。この定義には電気スプレーイオン化および空気支援電気スプレーイオン化の両方を含むことが意図されており、後者はイオンスプレーとも称せられる。本明細書で使用する用語「電気スプレーイオン化」は全ての液体流速に適用され、また、マイクロスプレー実験およびナノスプレー実験も含むことが意図されている。さらに、この定義は分離せずにイオン源に直接注入されたペプチドの分析および電気スプレーイオン化の前に分離されたペプチドまたはペプチド混合物の分析にも適用することが意図されている。適当なオンライン分離法には、限定するものではないが、ＨＰＬＣ、毛細管ＨＰＬＣおよび毛細管電気泳動を含む。電気スプレーイオン化実験は、限定するものではないが、三重四極質量分析器、イオントラップ、直交加速飛行時間型分析装置およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴装置など、を含む種々の質量分析装置で実施できる。
【００１５】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」はアミノ酸残基２個またはそれ以上を有する分子を示す。
【００１６】
本明細書で使用する用語「野生型」は突然変異のない生体によって産生されるポリペプチドを示す。
【００１７】
本明細書で使用する用語「変異型」は野生型ポリペプチドの配列とは異なるアミノ酸配列を持つポリペプチドを示す。
【００１８】
本明細書で使用する用語「水に対して安定」は水溶液中室温では、１０分以上、好ましくは約２０分以上、最も好ましくは約３０分以上である半減期を持つ試薬を示す。
【００１９】
用語「活性化された酸」は水性環境下でアミド結合を形成することができる、酸の誘導体、好ましくはカルボン酸の誘導体を示す。
【００２０】
本明細書で使用する用語「固定化」はペプチドおよび／またはポリペプチドが固体支持体にどの程度吸着されるかを定義する用語で、ペプチドおよび／またはポリペプチドの結合が反応の間持続するに十分な強さであることを意味する。例えば支持体をＣｌ８でコーティングすると、ペプチドと支持体との間の疎水性結合は反応と浄化の段階を通じてペプチドを保持するために十分な強さを持つ。
【００２１】
本明細書では以下の略号を使用する：
【表１】
2005518521.tif 000003
【００２２】
本発明の詳細な説明
本発明の第一の側面はポリペプチドを確認する方法である。その方法は次の各段階を含む： 
（ａ）ポリペプチドのＮ−末端またはポリペプチドのペプチド１個またはそれ以上のＮ−末端を、活性化された酸部分に結合するスルホニル部分またはスルホン酸部分を含む酸性試薬少なくとも１種を用いて誘導化して、ペプチド誘導体を１種またはそれ以上提供する段階（ただし、この試薬は水溶液中での半減期が室温では１０分以上、好ましくは約２０分以上、最も好ましくは３０分以上である）；
（ｂ）その誘導体少なくとも１種を質量分析技術で分析してフラグメンテーションパターンを提供する段階；および
（ｃ）得られたフラグメンテーションパターンを解析する段階。
但し、本方法では少なくとも段階（ａ）の間にペプチドまたはポリペプチドが固体支持体に固定化されているものとする。
【００２３】
本発明で使用する固体支持体は本明細書に定義する条件下にペプチドまたはポリペプチドを固定化できる任意の適当なサブストレートでもよい。そこで、一態様では、前記固体支持体はＣｌ８で誘導化したシリカに基づく媒体からなる。この固体支持体は、たとえばマイクロタイタープレートのウェルのようなプラスチック表面に；たとえばＭＡＬＤＩスライドのような金属表面に；コンパクトディスクの表面（Gyros AB, Uppsala, Sweden）に；またはたとえば市販のZipTipTM（Millipore Corp, USA たとえば WO 98/37949参照）のような混合構造中に存在できる。本発明の固体支持体は結合性能が高いと、誘導化法の効率が高まる。またこの固体支持体は、たとえばＭＡＬＤＩマッピングの前に薄いペプチド消化物溶液を濃縮するためにまたは脱塩するために便利な手段であって、シグナル／ノイズ比を大幅に改善する。固体支持体へのポリペプチド固定化でもたらされる他の利点には反応時間を短縮すること；ペプチドおよびポリペプチドのグアニジン化および／またはスルホン化に必要なサンプル操作の数を削減すること；および操作全体の処理量を増加することなどがある。固体支持体上で誘導化されたプロテイン消化物のスペクトルはトリプシンペプチド数の増加、プロテイン配列範囲の改善、およびデータベース検索スコアの高度化を示すことが多い。事実、本発明者は固体支持体の代わりに溶液中で行う対応する化学反応で得られるよりも感度が５倍も高いことを証明することができた。
【００２４】
ZipTipTMのような物質は質量分析による配列決定をする前にペプチドまたはポリペプチドを誘導化するための支持体として以前に使用されたことがない。しかし、単に薄い溶液を濃縮するために、および単にたとえばアルカリ塩のような低分子量夾雑物を除去して溶液を浄化するだけのために使用されていた。
【００２５】
有利な態様では、所望に応じてたとえばヒロドキシルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトールまたは酢酸ヒドラジドのような、望ましくないエステル基を加水分解する適当な化学物質を添加することによって、段階（ａ）終了後に存在するエステル副産物の量を削減するかまたはなくす。誘導化したペプチドまたはポリペプチドを分析の前に洗浄して過剰な試薬を除去する。本明細書では用語「酸性」試薬はペプチドまたはポリペプチドに結合したときにｐＫａが２未満、好ましくは０未満、より好ましくは−２未満である部分を１個またはそれ以上含む試薬を意味する。
【００２６】
本方法はたとえば野生型ポリペプチド、変異型ポリペプチドおよび／または合成ポリペプチドのようなポリペプチドを配列決定するために有用である。本方法は、たとえば生物学分野および薬学分野などで使用する高分子量ポリペプチドを確認するために殊に有用である。さらに特定的には、本方法は以下に列挙する目的に使用できる：ペプチドまたはポリペプチドの迅速な配列決定を必要とする生物学研究を促進するために；プロテインの翻訳後修飾を確認するために；たとえば商業的洗濯および生産物浄化に使用するような変異型プロテインにおけるアミノ酸修飾を確認するために；遺伝子クローニングのためのオリゴヌクレオチドプローブの設計を支援するために；指向性エボリューション研究で生成する産物を迅速に確認するために；コンビナトリアルライブラリーおよびペプチドライブラリーの確認において；および蛋白質学において。
【００２７】
そこで段階（ｂ）では、本発明は誘導体を分析するために質量分析技術を利用する。この技術にはマトリックス支援レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析または電気スプレーイオン化を含むことができる。これらイオン化技術は、限定するものではないが、三重四極装置、イオントラップ、リフレクター飛行時間型分析器、直交加速飛行時間型質量分析機およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴装置などを含む様々な質量分析機で実施できる。得られたスペクトルは標準的操作法に従って常用的に改めて分析される。しかしながら、最も好適な態様では段階（ｂ）においてＭＡＬＤＩ質量分析を使用する。ＭＡＬＤＩ質量分析器は商業的に入手可能であって、文献にも記載されている。例えばKussmann M. and Roepstorff P., Spectroscopy 1998, 14: 1-27 を参照。
【００２８】
そこで、前記の通り先行技術ではＭＡＬＤＩ質量分析技術による配列決定を促進するためにスルホン酸基をペプチドのＮ−末端に付加してきた。以前に提案された試薬は水に対する安定性が低いものを含む（この点については、たとえばT. Keough, R. S. Youngquist, M. P. Lacey, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 7131 (1999); T. Keough, M. P. Lacey, A. M. Fieno, R. A. Grant, Y. Sun, M. D. Bauer, K. B. Begley, Electrophoresis, 66, 2252 (1999); T. Keough, M. P. Lacey, R. S. Youngquist, Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 2348 (2000) を参照）。本発明は酸性試薬を使用する方法に関し、その方法では以前に提案されたものと逆に固体支持体上に固定されたポリペプチドについて行う。最も有利な態様では、本発明はたとえばＮＨＳエステルのようなエステル部分に結合するスルホニルまたはスルホン酸部分を含有する酸性試薬を利用する。このような試薬については以下に詳記する。
【００２９】
そこで、一態様では、本発明は実際の質量分析段階の前の誘導化段階で水に対して安定な試薬を使用する改良された一段階法を提供する。水に可溶で水に安定な試薬を使い、有機溶媒を避ける利点は明白で、乾燥工程および溶媒変更が不要なために誘導化操作の自動化が容易な点を含む。
【００３０】
本発明が固体支持体に固定したトリプシン処理ポリペプチドを利用することはまた、自動化への適応性強化に寄与する。特に有利な態様では段階（ａ）および先行するグアニジン化段階の両方を固体支持体上で行う。この態様は、購入可能な自動化システム例えばProSpot（登録商標） (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)またはcompact disksのような微小流体(microfluidics)サンプル調製装置(Gyros AB, Uppsala, Sweden)に容易に適合されるため、例えば標準的９６穴フォーマットで多数のサンプルに同時に有利に行える。このような適合化にはたとえば固体支持体取出しピペット、インキュベーション、その他の段階を含むであろう。この態様ではグアニジン化反応およびスルホン化反応を、同じミクロタイタープレートのウェル内のペプチドまたはポリペプチド内容物について行い、続いてZipTipTM上に固定化する。従って、サンプルの固定化または結合する必要があるのは一度だけで、それが操作全体を単純化する。またこの態様が溶液中での対応する反応と比較して感度を５倍も向上することが証明された。当該目的のための溶液中のペプチドの使用と固体支持体に固定化したペプチドの使用との相違点についてはスルホン化段階で比較している実施例４を参照。
【００３１】
さらに、本発明はまた、固体支持体に固定化してあるペプチドおよび／またはポリペプチドのリジン残基をグアニジン化で保護する方法に関する。
【００３２】
別の態様では、スルホン化段階の時間を短縮するため、および誘導化操作を効率化するためにスルホン化試薬を段階（ａ）の間に遠心してペプチドまたはポリペプチド−負荷Zip TipsTM、またはその他の使用する固相を通して液体を強制的に流す。この方法は固定化されたペプチドまたはポリペプチドの上に化学的試薬を流すための機械的に単純な手段を提供する。本発明者は予期に反してこの態様を使用すれば殆ど定量的な誘導化が可能であることを発見した。下記実施例３を参照。
【００３３】
この態様での方法がグアニジン化段階（以下に詳記）も含むなら、この反応は２−Ｄゲルからトリプシン消化物を溶離する間に行うのが好都合である。たとえば、 Hale et al. (Anal. Biochem. 28, (2000), 110-117)を参照。ゲルからペプチドを抽出する間のグアニジン化は自動装置で行うことができ、トリプシン消化ペプチドを次に固体支持体に固定化して前記のようにスルホン化する。
【００３４】
従って、特に有利な態様では、本方法はコンピュータに支援される方法であって、段階（ｃ）で適切なソフトウエアを利用する。そこで、質量分析で得られた質量対電荷の比率のデータ分析を用いて、得られたフラグメンテーションパターンを解析する。たとえばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ実験から得たペプチドの質量スペクトルとプロテインから得られる理論的スペクトルとを比較するために数種のソフトウエアプログラムが開発されている。この問題に関する総説は Kussmann, Roepstorff (Kussmann M. Roepstorff P., Spectroscopy 1998, 14: 1-27) を参照。
【００３５】
本方法で使用する一群の試薬の利点は容易に結晶形で保存できる点にある。そこで、保存中の安定性、従って試薬の寿命は大いに改善される。従って、本発明は多数の常用操作において安価な取扱が可能で簡単に実用化される試薬を利用する。
【００３６】
本方法で使用する酸性試薬はペプチドまたはポリペプチドと結合した時に約２未満、さらに好ましくは約０未満、最も好ましくは約−２未満のｐＫａを有し得る。この分野の熟練者は当技術分野でよく知られている標準的方法を用いてポリペプチドまたはペプチドに共有結合した酸性部分のｐＫａ値を測定できる。例えばその方法には滴定または電気化学的方法を含み得る。試薬内の活性化された部分は、たとえば３−スルホプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルまたは２−スルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルのようなＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）エステルでありうる。
【００３７】
この分野の熟練者が想起するように、緩衝液が酸性試薬に対して被分析物と有効に競合しない限り、この試薬を適当な緩衝液と組み合わせて使用できる。一態様では、この緩衝液は約８〜1２の範囲、例えば９〜１０の範囲、特定的態様では９.４のｐＨを提供する。適当な緩衝剤の一つは０.２５Ｍ−ＮａＨＣＯ３である。あるいは、試薬は単に水に溶解して使用するが、この場合は後続反応のために最終溶液は塩基性でなければならないので、最終溶液のｐＨを調節する。さらに本方法では通常実用上の見地から単一の試薬を使用するが、本発明は各々がＮＨＳエステル部分に結合するスルホニル部分またはスルホン酸部分を含むと定義される試薬２種またはそれ以上を混合して利用する方法も包含することを理解すべきである。
【００３８】
前記の例示した試薬の製造は本明細書の実験の部に例示する。本方法で使用する活性化された酸は当技術分野の通常な熟練者によく知られている技術に従って製造される。本発明の化合物を調製するために使用する出発物質は既知であるか、既知方法で製造されるかまたは出発物質として購入できる。
【００３９】
有機化学分野における熟練した通常の専門家はこれ以上の指示なしに有機化合物を容易に標準的な処理をすることができると認識される。そのような処理の例は、たとえば J. March著, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 1992 のような標準的教科書に記載されている。
【００４０】
通常の熟練した当業者は、化合物内の他の官能基をマスクまたは保護して反応収率を増加および／または望ましくない副反応回避をすると、ある種の反応は実施が最適になることを容易に認識する。通常の熟練者はしばしば収率の向上または望ましくない反応の回避を達成するために保護基を利用する。このような反応は文献にも記載され、普通の専門家の熟練範囲内にある。そのような取扱例の多数は、たとえばT. Greene, Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1981. に見出される。
【００４１】
本方法に使用する化合物は、当技術分野の通常の熟練者に知られている様々な操作法を使用して製造してもよい。限定を意図するものではないが一般的製造法には以下のものを含む：
【００４２】
本発明に従って使用する活性化された酸は下記一般構造の化合物内の酸基を活性化し、続いて本発明の水に安定な試薬を作製する反応に付すことによって製造できる。
【化１】
2005518521.tif 000004
［式中、Ｙは脂肪族および／または芳香族フラグメントを含み、要すれば別のスルホン酸を含んでいてもよいスペーサーである］
【００４３】
適当な酸の例は、限定するものではないが、たとえば２−スルホ酢酸、３−スルホプロピオン酸、３−スルホ安息香酸、４−スルホ安息香酸、２−ブロモ−５−スルホ安息香酸および２−スルホ安息香酸などである。ここに有用なスルホニル基に関する一般的な参考文献としてはたとえば WO 00/43792 を参照。
【００４４】
当業者はこれら化合物のプロトン化された酸に加え、限定するものではないが、ナトリウム塩およびカリウム塩を含む塩が本発明化合物の合成に有用であることに想到するであろう。活性化された酸は大部分が本技術分野の常法を用いて容易に製造できる。ペプチド合成および活性エステル製造に関する最近の総説および成書には次のものがある: a) Alberico, F., Carpino, L.A., Coupling reagents and activation., Method. Enzymol., 1997, 289, 104-126; b) Bodansky, M, Principles of Peptide Synthesis, 2ed., Springer-Verlag: Berlin, 1993; c) Humphrey, J.M., Chamberlin, A.R., Chemical Synthesis of Natural Product Peptides: Coupling Methods for the Incorporation of Noncoded Amino Acids into Peptides. Chem. Rev., 1997, 97, 2243-2266; d) Handbook of Reagents for Organic Synthesis: Activating Agents and Protecting Groups, Pearson, A J. andRoush, W.R., ed., John Wiley & Sons, 1999。この構造を持つ反応性誘導体には例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルのような活性エステル、たとえば塩酸およびスルホン酸のような有機酸または無機酸の混合無水物および該構造を持つ酸の対称無水物を含む。これらの活性化された物質は本発明の水に安定な試薬として直接有用でありうる。しかしながら、たとえば酸塩化物のような活性の高い物質は本明細書に定義する水に対する安定さはないかもしれないが、たとえばこれを更にＮ−ヒドロキシサクシンイミドのような試薬と反応させれば、本発明の水に安定な試薬である活性化された酸を生成させることができる。
【００４５】
文献に見出される無数の活性エステルの中で、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドに由来するエステル（Anderson, G.W., Zimmerman, J.E., Callahan, F.M., J Am. Chem. Soc., 1964, 86, 1839 [総説はKlausner, Y.S.; Bodansky, M.S., Synthesis, 1972, 453参照]、オルトおよびパラ−ニトロフェニルエステル（Bodansky, M., Funk, K.W., Fink, M.L., J. Org Chem., 1973, 38, 3565; Bodansky, M.; Du Vigneaud, V.; J Am. Chem. Soc., 1959, 81, 5688）、２,４,５−トリクロロフェニルエステル(Pless, J., Boissonnas, R.A. Helv. Chim. Acta, 1963, 46, 1609)、ペンタクロロフェニルエステル (Kovacs, J., Kisfaludy, L., Ceprini, M. Q., J. Am. Chem. Soc., 1967, 89, 183)およびペンタフルオロフェニルエステル (Kisfaludy, L., Roberts, J.E., Johnson R.H., Mayers, G.L., Kovacs, J., J. Org. Chem., 1970, 35, 3563) には最も実用的興味がある。他の活性化された酸部分としてはたとえば２−ピリジルチオエステル (Lloyd, K., Young, G.T., J Chem. Soc. (C), 1971, 2890) のようなチオエステル、シアノメチルエステル (Schwyzer, R., Iselin, B., Feurer M., Helv. Chim. Acta; 1955, 38, 69)、Ｎ−アシルイミダゾリド(Wieland, T., Vogeler, K., Angew. Chem., 1961, 73, 435)、アシルアジド(Curtius, T., Ber. dtsch. chem. Ges., 1902, 35, 3226; Fujii, N., Yajima, H., J, Chem. Soc. Perkin Trans I, 1981, 789)またはベンゾトリアゾール由来の中間体(Dormoy, J.R., Castro, B., Tetrahedron, 1981, 37, 3699) も考慮される。
【００４６】
この活性化されたエステルの使用は同様にして、たとえば４−ジメチルアミノピリジン（Hoefle, G., Steglich, W., Vorbrueggen, H., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1978, 17, 569; Scriven, E. F. V., Chem. Soc. Rev., 1983, 12, 129）のような選択されたアシル化触媒と組合せても可能である。本試薬の仔細な分子構造はスルホニル部分またはスルホン酸部分と活性化された酸部分とが存在し、水に対する安定性およびアミンとの化学的反応性が保持されている限り、本質的なものではない。続いてたとえば反応のために至適なｐＨを確認するために、またはたとえばヒドロキシル基での望ましくない副反応が少ない特定の活性化された酸を確認するために、常法の実験を行うことができる。
【００４７】
ポリペプチドまたはそのペプチドはどのような方法で得てもよい。例えば、必要ならば目的とするポリペプチドを分析のために分離する。分離には例えば一次元および二次元の電気泳動などを含む数種の操作法を利用してもよい。あるいは、このポリペプチドはこの技術分野でよく知られているコンビナトリアル化学の方法によって合成してもよい。この例では、生成ポリペプチドのＣ末端にまたはその付近に塩基性または疎水性残基、好ましくは塩基性残基（最も好ましくはアルギニンまたはリジン）を有するポリペプチドを合成することが最も好ましい。
【００４８】
消化はゲル内または膜上、好ましくはゲル内を含む様々な方法で行ってもよい（例えばShevchenko et al.,"Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels", Analytical Chemistry, Vol. 68, pp. 850-858 (1996) を参照）。そこで、有利な態様の一つでは本発明方法はゲル内消化を使用する。ポリペプチドに消化、すなわち酵素的消化または化学的消化のいずれか、好ましくは酵素的消化、を施すことが可能である。得られるペプチドのＣ−末端またはその付近に塩基性または疎水性残基、最も好ましくは塩基性を与える消化操作を利用するのが最も好ましい。
【００４９】
ポリペプチドは、たとえばトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓＣ、エンドプロテイナーゼＡｒｇＣまたはキモトリプシンなどを用いて酵素的に消化してもよい。トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓＣまたはエンドプロテイナーゼＡｒｇＣは、ポリペプチド自身のＣ末端を除いて、ポリペプチドから生成するペプチドでは典型的にはＣ末端がアルギニンまたはリジン残基（塩基性残基）で終結するので好適である。特に生成するペプチドのＣ−末端またはその付近に塩基性残基ができれば、他の酵素も使用できる。例えば典型的には疎水性アミノ酸残基で切断するキモトリプシンを使用してもよい。あるいは、たとえばシアノーゲンブロミドのような化学的消化（消化方法の一般的参考文献としては例えば U.S. Pat. No. 5 821 063を参照）も使用できる。
【００５０】
そこで、特定的態様では本方法を使用してポリペプチドまたはプロテインを確認する。この場合、第一段階は該ポリペプチドまたはプロテインを消化、好ましくは酵素的消化してペプチドを得ることを含む。好適な態様ではこの酵素はトリプシンである。
【００５１】
特に有利な態様では、本方法は誘導化段階の前に特定の残基を保護する段階も含む。例えばポリペプチドまたはプロテインをトリプシンで消化する場合、たとえば望ましくないスルホン化反応を避けるためにＬｙｓ残基を保護してもよい。グアニジン化によるこのような保護操作の一例は下記実験の部（実施例８参照）に詳記する。グアニジン化はたとえば地図作成実験のような後続する段階へのペプチド回収に悪影響なしにＬｙｓ側鎖を選択的に保護できるので有利に使用される。さらにその上、未処置プロテインにあるリジン残基はグアニジン化してもトリプシン消化を受けるので、リジン含有ペプチドは定量分析のために使用できる。例えば、一群の対照プロテインは天然同位元素存在度の硫酸水素Ｏ−メチルイソ尿素のような試薬でグアニジン化できる。処置群のプロテインは重同位元素を豊富化した同じ試薬、たとえば１３Ｃおよび／または１５Ｎ含有硫酸水素Ｏ−メチルイソ尿素など、でグアニジン化できる。プロテイン混合物を集め、分離後にトリプシン消化を行うことができる。興味深いプロテインがＭＡＬＤＩマッピングおよび配列決定で確認され、同位元素標識リジン含有ペプチドと同位元素無標識リジン含有ペプチドとにおける存在度の比率を比較して定量する。
【００５２】
本方法は好ましくはプロテイン消化物からのポリペプチドについて使用する。ポリペプチドとしては好ましくは約５０アミノ酸残基未満、より好ましくは約４０アミノ酸残基未満、更に好ましくは約３０アミノ酸残基未満、なおさら好ましくは約２０アミノ酸残基未満、最も好ましくは約１０アミノ酸残基未満、を含むものを使用できる。
【００５３】
本発明の第二の側面は３−スルホプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル化合物そのものである。この化合物は前記固体支持体上で行うペプチドの誘導化に用いる試薬として特に有用である。
【００５４】
本発明の第三の側面は２−安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル化合物そのものである。この化合物は前記固体支持体上で行うペプチドの誘導化に用いる試薬としてまた有用である。
【００５５】
本発明の第四の側面はポリペプチドを確認するためのキットであって、そのキットは酸性試薬を適当な容器内に含む。この酸性試薬は活性化された酸部分に結合するスルホニル部分またはスルホン酸部分を有しており、好ましくは固体の状態でキットに入れてある。一態様ではこの試薬は事前に秤量されており、別な態様ではバルク試薬として入れてある。このキットにはｐＨを８〜１１の範囲内にする緩衝液も入れてもよい。安定性の理由から緩衝液は末端使用者が使用直前に添加する。本発明のキットはモデルペプチドを含めることもできる。このキットにはその使用法に関するたとえばパンフレットの形での説明書を添付することもできる。
【００５６】
そこで、一態様では、本キットはペプチドまたはポリペプチドを確認する本発明の方法を行うために必要な装置および手段を含む。特定的態様の一つは、本発明の新規試薬１種またはそれ以上およびマトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析での使用に必要な手段を含むキットである。別の一態様は本発明の新規試薬１種またはそれ以上およびさらに電気スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）での使用に必要な手段を含むキットである。特別な態様の一つでは、本キットは試薬のコンパートメントとは別のコンパートメントに入れたヒドロキシルアミン塩酸塩を含む。この塩酸塩は誘導化終了後の反応物に添加して、側鎖にヒドロキシル基を持つ内部アミノ酸残基との反応で生成する望ましくないエステル副産物を戻すために使用する。
【００５７】
本発明の第五の側面は、質量分析技術において、たとえば３−スルホプロピオン酸Ｎ−ヒロドキシサクシンイミドエステルまたは２−スルホ安息香酸Ｎ−ヒロドキシサクシンイミドエステルなどのＮ−ヒロドキシサクシンイミド（ＮＨＳ）エステルのようなエステル部分に結合するスルホニル部分またはスルホン酸部分を含む酸性試薬の使用であって、誘導化の間は該ペプチドを固体支持体に固定するものである。さらに特定的には、本発明は本発明方法における前記試薬の使用に関する。
【００５８】
図面の詳細な説明
図１は下記実施例２に記載する未誘導化サンプルであるウマミオグロビン（ＭＡＬＤＩ標的上１５fmol）についてリフレクトロンスペクトルを示す。
【００５９】
図２は、図１に記載する誘導化サンプル（ＭＡＬＤＩ標的上＜１５fmol）についてリフレクトロンスペクトルを示す。固体支持体上での効率的リジン残基のグアニジン化のために、およびグアニジン化されたペプチドの良好な応答のために、未誘導化サンプルの分析に比べて誘導化サンプルのリフレクトロンスペクトルではリジンで終結するペプチドのシグナルが劇的に増大した。誘導化ペプチド２種（リジン終結ペプチド１種 m/z 1449.5；アルギニン終結ペプチド１種 m/z 1742.8）を使用してＰＳＤ分析を行った。
【００６０】
図３は m/z 1449.5のＰＳＤスペクトルを示す。
【００６１】
図４は観察された７個のｙ−イオン（グアニジン化反応による質量増加−４２Ｄａ）を与え、PepFrag でどのように前記プロテインを確認するかを示す。
【００６２】
図５はアルギニン終結ペプチド（m/z 1742.8）のフラグメンテーションスペクトルを示す。
【００６３】
図６は得られたｙ−イオン８個を使ってPep-Frag で行ったプロテインの確認を示す。
【００６４】
図７は実施例３に記載する固相上で行ったＢＳＡトリプシン消化物ペプチド５００fmolのスルホン化を示す。
【００６５】
図８は実施例３に記載する溶液中で行ったＢＳＡトリプシン消化物ペプチド４.５ pmolのスルホン化を示す。
【００６６】
図９Ａ〜９Ｄは下記実施例４に記載するＮＭＲスペクトルを示す。特定的には図９Ａは３−スルホプロピオン酸のスペクトルを示す；図９Ｂは３−スルホプロピオン酸無水物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す；図９Ｃは無水物炭素のスペクトルを示す；図９Ｄは３−スルホプロピオン酸無水物から製造したＮＨＳエステルのスペクトルを示す。
【００６７】
図１０Ａ〜１０Ｂは本発明ＮＨＳ-エステルの安定性を図示する。特定的には図１０Ａは３−スルホプロピオン酸ＮＨＳエステルのＤ２Ｏ中における安定性を示す；図１０Ｂは２−スルホ安息香酸ＮＨＳエステルのＤ２Ｏ中における安定性を示す。この分析は JEOLの２７０ＭＨｚ−ＮＭＲ装置で行った。ＮＨＳエステルをＮＭＲチューブに入れ、Ｄ２Ｏで７００μＬに希釈した。シングルパルス１Ｈ−ＮＭＲを行ってスペクトルを分析した。加水分解は３−スルホプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドの２.９２ｐｐｍシグナルの積分値または２−スルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドの３.０１ｐｐｍにあるシグナルの積分値とＮ−ヒドロキシサクシンイミドの２.７６ｐｐｍにあるプロトンシグナルとの比率から測定した。
【００６８】
図１１Ａ〜１１Ｃは各誘導体について得られたＭＡＬＤＩ−ＰＳＤ質量スペクトルおよび実施例７に記載のようにしてスルホン化したペプチドの相対的反応性を示す。
【００６９】
特に、図１１Ａは２−スルホ安息香酸アセトアミドを含むペプチド（上図）および３−スルホプロピオンアミドを含むペプチド（下図）についてのフラグメンテーションパターンの比較を示す。３−スルホプロピオンアミドは誘導体の損失（出発ペプチドを再生するので情報が得られない）が少なく、さらに低質量フラグメントの収率が高いので、好適である。図１１ＢはプロピオニルスルホネートＮＨＳエステル（上図）と２−スルホ安息香酸ＮＨＳエステル（下図）との１ｎＭ−モデルペプチドに対する反応性を比較する。３−スルホプロピオン酸ＮＨＳエステルは出発ペプチドから最終産物への変換が良好である。図１１Ｃは図１１Ｂと同じであるが、この反応にはモデルペプチドとして、ＦｉｂＡを１０ pmol使用した。
【００７０】
図１２はEttanTM MALDI-TOFで得た４ＶＰ−ＢＳＡの未誘導化トリプシン消化物２５０fmolについてリフレクトロンスペクトル、ポジティブモード（平均質量、濾過後、スムージング５）を示す。（３−スルホプロピオン酸無水物ＮＨＳエステルと反応させた後ペプチドＩ〜ＩＩＩを定量的に誘導化した（図１３参照））
【００７１】
図１３は４ＶＰ−ＢＳＡ（Ettan MALDI-ToFTM）の誘導化トリプシン消化物についてリフレクトロンスペクトル（平均質量、濾過後、スムージング５）を示す。このペプチドは前記水性条件下に３−スルホプロピオン酸ＮＨＳエステルで誘導化したものである。図中にＩ〜ＩＩＩと記号をつけた各ペプチドは定量的に誘導化され、ＰＳＤ分析を行った。
【００７２】
図１４はEttanTM MALDI-TOFで得た４ＶＰ−ＢＳＡの誘導化トリプシン消化物から得たペプチド（Ｉ）（図１３）の完全ｙ−イオンシリーズについてＰＳＤスペクトル（ポジティブモード）を示す。イオンゲートは誘導化親イオンの質量m/z 1064に設定し、３００ショットのシグナルを蓄積した。
【００７３】
図１５は４ＶＰ−ＢＳＡの誘導化トリプシン消化物（図１３）から得られたペプチド（ＩＩ）についてフラグメンテーションスペクトル（ＰＳＤ、ポジティブモード）を示す。ここではイオンゲートを m/z 1616 に設定し、３００ショットのシグナルを蓄積した。ギャップには×マークを付けた。
【００７４】
図１６は４ＶＰ−ＢＳＡの誘導化トリプシン消化物（図１３）から得られたペプチド（ＩＩＩ）m/z 1704についてＰＳＤスペクトル（３００ショットのシグナルを蓄積）を示す。ギャップには×マークを付けた。ペプチド MH+ m/z 1715 は誘導化ペプチドとともにイオンゲートを通過した。
【００７５】
図１７はEttan MALDI-TOFで得たクーマジー染色２−Ｄゲルから得た未誘導化プロテイン消化物のリフレクトロンスペクトル（ポジティブモード、１００ショット蓄積、平均質量、濾過後、スムージング５）の初回例を示す。全溶離トリプシン消化物の５％を用いてこのスペクトルを得た（丸でマークしたピークは図１８には完全に誘導化されて現れ得る）。
【００７６】
図１８は、図１７と同じ２−Ｄサンプル（残り９５％）であるがＮ−末端をＮＨＳエステルで誘導化した後のリフレクトロンスペクトル（ポジティブモード、平均質量、濾過後、スムージング５）を示す。このサンプルはμC18 ZipTipTM 上で浄化し、プロトコルに従って誘導化した。このペプチド m/z 1791（前図の値）は定量的に誘導化され、標識の質量が増加して m/z 1927 として観測された。
【００７７】
図１９は誘導化ペプチド m/z 1927 についてＰＳＤスペクトル（３００ショット蓄積）を示す。このフラグメント（ｙ−イオン）の質量を用いてPepFragで確認した。このプロテインはアクチンであることが確認された。
【００７８】
図２０はEttanTM MALDI-TOF由来クーマジー染色２−Ｄゲルから得たプロテインスポットの未誘導化トリプシン消化物のリフレクトロンスペクトル（１００ショット蓄積、平均質量、濾過後、スムージング５）の第二例を示す。サンプルの５％をこの分析に使用した。マークしたペプチドを誘導化した後にＰＳＤ分析を行った（図２１参照）。
【００７９】
図２１は図１９と同じ２−Ｄサンプルであるが既述のようなZipTipsTM 浄化および水溶液中ＮＨＳエステルで誘導化して得たサンプルについてのリフレクトロンスペクトル（ポジティブモード、平均質量、濾過後、スムージング５）を示す。ペプチド m/z 1569.9（図２０）を定量的に誘導化したものである。標識質量（＋１３６）が増加し、m/z 1705.9 が観察された。
【００８０】
図２２は誘導化ペプチド m/z 1705（図２０参照）についてＰＳＤスペクトル（３００ショットのシグナルを蓄積）を示す。このフラグメント質量（ｙ−イオン）を利用してPepFragでプロテインの確認を行った。このプロテインは大腸菌サクシニルＣｏＡシンセターゼであることが確認された。
【００８１】
図２３は続いて行う多重様式でのスルホン化のために、実験室用遠心分離機に装填したサンプル負荷 ZipTipsTM を示す。
【００８２】
図２４はスルホン化反応後に行った遠心分離機内でのサンプル洗浄を図示する。
【００８３】
図２５は固体支持体からＭＡＬＤＩサンプル台への誘導化サンプルの直接的な負荷を示す。
【００８４】
図２６は固体支持体上に固定したフィブリノペプチドＡをスルホン化した後に得られたＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。ペプチドサンプルを３段階の濃度（１０、１、０.１ pmol）でスルホン化の二重実験を行った。
【００８５】
図２７はヒドロキシルアミン塩酸塩の使用であってスルホン化反応中に形成された望ましくないエステル副産物を逆戻りさせるための使用を示す。上のスペクトルは遠心分離機内の固体支持体上でスルホン化したASHLGLARから得た。下のスペクトルは同じスルホン化したペプチドをヒドロキシルアミン塩酸塩で処理した後に得た。
【００８６】
図２８はプロテイン消化物のスルホン化を示す。上のスペクトルは天然プロテイン消化物から得られた。下のスペクトルはスルホン化した消化物から得られた。
【００８７】
実験の部
本実施例は例示目的のみを意図するものであって、請求項に記載する本発明を限定するものと解すべきではない。下記のまたは本明細書を通じて引用する参考文献は全て参考のために引用するものである。
【００８８】
実施例１  固体支持体上でのスルホン化、一般的方式
試薬
３−スルホプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル
【００８９】
緩衝液および試薬
硫酸水素Ｏ−メチルイソ尿素。 
０.２５Ｍ−ＮａＨＣＯ３、ｐＨ１１.９。
０.２５Ｍ−ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９.４。
５０％ヒドロキシルアミン溶液／１５Ｍ−溶液１μＬ。
アセトニトリル（ＡＣＮ）。
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）。
α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析用マトリックス。
脱イオン１８.２ＭΩ（ＤＩ）水から調製した緩衝液および溶液。
MilliporeのＣ１８ZipTipTM（ＺＴ）（μＣ１８ ZipTipsで代用もできる）。
【００９０】
一般操作：
サンプルを乾燥し、０．１％ＴＦＡ１０μＬ中に再構成する。あるいは、サンプルを約２０μＬまで乾燥する。この場合、サンプルをZipTipsに負荷する前に酸性にする。
【００９１】
Ｃ18ZipTipTM（ＺＴ）の形の固体支持体を５０％ＡＣＮ；０.５％ＴＦＡで活性化する。次にZipTipTM を０.１％ＴＦＡで平衡化させる。トリプシン消化ペプチドを含むサンプルをZipTip上のサンプルに負荷する（ピペットで１０回上下する）。
【００９２】
別の容器中で硫酸水素Ｏ−メチルイソ尿素溶液（８６ｍｇ／ｍＬ−ＭＱＨ２Ｏ）２μＬを８μＬの０.２５Ｍ−ＮａＨＣＯ３、ｐＨ１１.９と混合する。ZipTipTM に得られた混合物を負荷する（ピペットで〜５回上下する）。上部の溶液でチップを取り出し、エッペンドルフチューブに入れ、栓を閉めて、生成物を３７℃の加熱ブロックに２時間入れる。
【００９３】
次にチップを０．１％ＴＦＡで洗浄する（ピペットで〜５回上下する）。
【００９４】
インキュベーション直前にスルホン化試薬溶液を新たに調製して、０.２５Ｍ−ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９.４（１０ｍｇ／１００μＬ）に溶解する。
【００９５】
次にスルホン化試薬溶液をピペットで１０回出し入れして ZipTipTM に通し、本方法の段階（ａ）を行う。この溶液は少なくとも３分間チップ上に残す。もしも反応をシングルポジションマイクロピペッタで手動によって行うなら、Ｃ１８カラム上部の溶液でチップを取り、マイクロピペッタを取り、片付けるのが好都合である。そうすれば段階（ａ）の完了を待つ間に次のサンプルに取掛かることが可能になる。
【００９６】
内部アミノ酸の望ましくないスルホン化の量を減らすために、１５Ｍ−ヒドロキシルアミン溶液１μＬを試薬溶液に加える。混合し、ＺＴに負荷し、ピペットで１０回出し入れする。別な態様では、ヒドロキシルアミン溶液少量をスルホン化したペプチドを含むＺＴに通す。そこで、直前に記載した態様では、ヒドロキシルアミンは本来の反応液には入らない。
【００９７】
好ましくはＺＴを０.１％ＴＦＡで洗い、サンプルを８０％アセトニトリル：０.５％ＴＦＡ１０μＬで溶離する。
【００９８】
得られる誘導体を分析するために、サンプルを乾燥し、０.１％ＴＦＡ３μＬに再構成する。この段階での完全な乾燥で、サンプル容積の差がなくなり、操作を標準化されので、より精密な分析が可能になる。これは自動化操作には特に望ましい。サンプルを飽和α−シアノ−マトリックスの５０％ＡＣＮ中０.５％溶液と１：１に混合する。次にサンプルをＭＡＬＤＩ標的に負荷し、分析する。
【００９９】
前記の通り低濃度の分析に特に適する一態様では、サンプルを乾燥しない。浄化産物をＺＴから例えばＭＡＬＤＩマトリックスを含む０.５％ＴＦＡ：５０％ＡＣＮ２.５μＬを用いてＭＡＬＤＩサンプルプレート上に直接溶離した。こうしてサンプル取扱中の損失が減少、好ましくは完全回避され、生成物全部をＭＳに移すことができる。
【０１００】
実施例２  固体支持体に固定化したウマミオグロビンの低濃度トリプシン消化物のグアニジン化およびスルホン化
プロテインのアルキル化およびトリプシン消化
ウマミオグロビン（Sigma）をＭＱ水に溶解して濃度１μｇ／μＬとし、その５０μＬを変性緩衝液（８Ｍ−尿素、５０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５０ｍＭ−ＤＴＴ（化合物は全てplusoneTM）４５０μＬと混合し、３７℃で１時間インキュベーションして、プロテインを変性し、スルフィド結合を切断した。システインＳＨ基を次にアルキル化緩衝液（８Ｍ−尿素、５０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１２５ｍＭ−２−ヨードアセトアミド）５００μＬを加えて２−ヨードアセトアミド（MERCK）で化学的に閉鎖した。反応は３７℃で１時間進行させた。次にサンプルを１０ｍＭ−ＮＨ４ＨＣＯ３１５ｍＬと平衡させたＮＡＰ−１０カラムで精製した。サンプルを加え（１０００μＬ）、１０ｍＭ−ＮＨ４ＨＣＯ３９００μＬで溶離した。溶離したサンプルにトリプシン（Promega, V511A）5μgを加えてプロテインを消化した。トリプシン消化反応物を３７℃で一夜（約１４時間）放置し、これに濃トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Pierce）5μＬを最終濃度０.５％まで加えて反応を停止した。消化サンプルを０.１％ＴＦＡで最終濃度１５fmol／μＬになるまで段階的に希釈した。得られた材料は−２０℃で保存した。
【０１０１】
固体支持体上でのグアニジン化およびスルホン化：
C18ZipTipTM（Millipore）（ＺＴ）を５０％アセトニトリル、０.５％ＴＦＡ（ピペットで２回上下する）で活性化した。次にこのＺＴを０.１％ＴＦＡで平衡化（ピペットで２回上下）させた。ウマミオグロビントリプシン消化物（０.１％ＴＦＡ１０μＬ中１５０ fmol）をＺＴ（ピペットでゆっくり１０回上下）に負荷した。Ｏ−メチルイソ尿素（８４ｍｇ／ｍＬ−ＭＱＨ２Ｏ）の保存溶液を調製した。このＯ−メチルイソ尿素保存溶液２μＬを０.２５Ｍ−ＮａＨＣＯ３ｐＨ１１.７緩衝液８μＬと混合し、この溶液をＺＴに負荷した。ＺＴをエッペンドルフチューブに３７℃に２時間封入してサンプルを反応させた。ＺＴを０.１％ＴＦＡ１０μＬで洗浄（ピペットで２回上下）した。３−スルホプロピオン酸無水物ＮＨＳエステルをｐＨ９.４の０.２５Ｍ−ＮａＨＣＯ３緩衝液に最終濃度１００ｍｇ／ｍＬまで溶解した。ＮＨＳエステル溶液１０μＬをＺＴに負荷した。サンプルを室温で３分間反応させた。１５Ｍ−ヒドロキシルアミン溶液１μＬをＮＨＳエステル試薬に加え、ＺＴに負荷した（ピペットで５回上下）。
【０１０２】
チップを０.１％ＴＦＡで洗浄し、サンプルを８０％アセトニトリル：０.５％ＴＦＡ１０μＬで溶離した。このサンプルを窒素下に乾燥し、５０％アセトニトリル３μＬ中に再構成した。Ettan MALDIスポッタを用いてサンプル０.３μＬをＭＡＬＤＩターゲットに負荷して、飽和α−シアノマトリックス溶液０.３μＬと混合した。このサンプルをEttan MALDI ToFを用いてＰＳＤモードのリフレクトロンで分析した。
【０１０３】
ウマミオグロビンのトリプシン消化物１５０fmoleの１０分の１量を、ZipTipTM に固定化した後グアニジン化およびスルホン化し、Ettan TM MALDI ToF を用いて分析した。比較として図１にウマミオグロビン未誘導化サンプル（ＭＡＬＤＩ標的上１５fmol）のリフレクトロンスペクトルを示し、図２は誘導化サンプル（ＭＡＬＤＩ標的上＜１５fmol）のリフレクトロンスペクトルを示す。固体支持体上のリジンの効率的なグアニジン化のために、リジンで終結するペプチドのリフレクトロンスペクトルに見られるシグナルは誘導化サンプルでは未誘導化サンプルの分析値と比較して劇的に増加した。誘導化ペプチド２種（一方はリジン末端ペプチド m/z 1449.5、他方はアルギニン末端ペプチド m/z 1742.8）のＰＳＤ分析を行った。図３はm/z 1449.5のＰＳＤスペクトルを示す。観測されたｙ−イオン質量（グアニジン化反応の−４２Ｄａ質量増加）を入力してプロテインを PepFrag で同定した（図４）。図５はアルギニン端末ペプチド m/z 1742.8 のフラグメンテーションスペクトルを示す。得られたｙ−イオン８個を用いて PepFrag でプロテイン同定を行った（図６）。
【０１０４】
固体支持体に固定化したペプチドまたはポリペプチドにこの反応を行う時にはグアニジン化およびスルホン化の反応時間が短縮する。誘導化操作の全効率が向上し、希薄な被分析物溶液を反応前に濃縮できるので、そして分析前のサンプル操作が少ないためサンプル損失が少ないので、良好な感度が得られる。この例は１５fmolと少量のプロテインから出発して誘導化ＰＳＤ分析法によるプロテイン確認を示す。
【０１０５】
実施例３  固体支持体に固定したペプチドおよびポリペプチドの別途スルホン化
溶液中のペプチドおよびポリペプチド混合物を最終容積１０μＬ〜５０μＬまで濃縮する。各溶液のｐＨを酸性にし、ペプチド／ポリペプチド溶液を C１８ZipTipsTM に負荷する。サンプルを負荷したZipTipsTM をドリルアウトし、栓をしたマイクロセントリフュージチューブに入れて図２３に示すように実験室用遠心分離機に装填する。サンプルを負荷したチップを０.１％ＴＦＡで洗浄する。これは０.１％ＴＦＡ２５μＬを各チップの上に加え、遠心分離することによって達成される。遠心力はチップ上の溶液を動かすのに十分である。溶液をマイクロセントリフュージチューブの底に集める。
【０１０６】
この洗浄段階をさらに２回反復する。次にサンプルをたとえばプロピオニルスルホネートＮＨＳエステルなどを用いてスルホン化する。使用直前にスルホン化試薬を濃度１０ｍｇ／１００μＬの塩基（Ｈ２Ｏ：ＤＩＥＡ＝１９：１、v/v）に調製する。試薬溶液のｐＨを調べ、必要ならば調整して使用直前に塩基性を確かめる。
【０１０７】
サンプルを負荷した各チップの上にスルホン化溶液５μＬを加えてサンプルをスルホン化する。再度サンプルを遠心分離してスルホン化試薬をチップから除く。遠心分離機内のサンプル全てを並行してこの方法を用いてスルホン化する。要すれば、サンプルを負荷したチップをさらにヒドロキシルアミン塩酸塩で処理してスルホン化段階の間に形成された望ましくないエステル副産物を戻す。この反応は新鮮ヒドロキシルアミン塩酸塩溶液（２Ｍ、Ｈ２Ｏ：ＤＩＥＡ＝１９：１v/v、使用前にｐＨを塩基性に調整）５μＬを各サンプル負荷チップの上に負荷することによって実施する。このサンプルを遠心し、チップ上の溶液を除く。次にこのサンプルを図２４に示すように０.１％ＴＦＡ２５μＬで３回洗浄する。誘導化されたサンプルを ZipTipsTM から分析用ＭＡＬＤＩサンプル台に直接負荷する。サンプルを図２５に示すようにα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸または２,５−ジヒドロキシ安息香酸のような適当なＭＡＬＤＩマトリックス１０ｍｇ／ｍＬを含む溶液少量（２.５μＬ、ＡＣＮ：０.１％ＴＦＡ＝１：１、v/v）でサンプル台上に溶離する。
【０１０８】
この方法の有用性は次の図面数枚に示すデータで例示する。例えば、図２６は上記本発明に従ってスルホン化したフィブリノペプチドＡ（ADSGEGDFLAEGGGVR）のさまざまな量で測定したＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。出発ＦｉｂＡのＭＨ＋質量は1536.7であって、所望のモノスルホネート産物の質量は1672.7Ｄａである。この実験では質量の目盛りを正確に補正しなかったので測定した分子量は約０.５Ｄａの誤差がある。このスペクトルからスルホン化が１００fmole濃度でも定量的に近いことがわかる。この２回の分析では質量分析装置に入れたサンプルが多すぎたので１０pmoleサンプル中に低質量イオン（低微量２個）が見られたことに注目すべきである。スルホン化生成物より低質量のイオンは主に分析の間にイオン源中で起きるフラグメンテーション過程で生成する。
【０１０９】
図２７では直前の記載に従ってスルホン化した小さなＡｒｇ末端ペプチド（ASHLGLAR）のＭＡＬＤＩ質量スペクトルを比較する。図中、上のスペクトルはスルホン化後に測定した。これは所望産物のシグナルを約m/z 960に、望ましくない二重スルホン化産物のシグナルを約m/z 1096に示す。下のスペクトルは同じスルホン化したペプチドを前記のようにヒドロキシルアミン塩酸塩で処理した後に得た。望ましくないスルホン化産物約m/z 1096には相対的存在度が著しく減少することに注目すべきである。図２８のスペクトルはこの方法を用いればプロテイン消化物が効率的にスルホン化できることを示す。図で上のスペクトルはスルホン化してない天然のトリプシン消化物のスペクトルである。下のスペクトルは本方法でスルホン化したプロテイン消化物のスペクトルである。上図のスペクトルに見られるペプチド質量は本方法でスルホン化した後に１３６Ｄａ上方にシフトした。この実験ではプロテイン消化物のスルホン化は定量的に近かった。
【０１１０】
実施例４  水溶液中のスルホン化と固体支持体上のスルホン化との比較
溶液中のスルホン化
一般的方法
サンプル（ＢＳＡトリプシン消化ペプチド）を水５μＬに溶解した。２０％ＤＩＥＡ溶液１０μＬ、続いてＮＨＳエステル溶液５μＬを加えた。１５分後、ヒドロキシルアミンを添加してスルホン化段階の間に生成したかもしれない望ましくないエステル基を加水分解した。得られた溶液に５０％ ＴＦＡを加えてｐＨを酸性（＜４）にした。反応したペプチドを逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）の固相支持体（ZipTipTM、Millipore）に注入し、０.５％ＴＦＡおよび８０％アセトニトリルを用い溶離した。溶離したサンプルを乾燥し、さらにＭＡＬＤＩでの分析のために０.５％ＴＦＡ、５０％ＡＣＮ３μＬ中に再構成した。
【０１１１】
サンプル：ＢＳＡトリプシン消化ペプチド。
反応容器：５００μＬエッペンドルフチューブ。
総容量：２０μＬ。
水：５μＬ。
塩基容量：２０％ ＤＩＥＡ（混り合わないのでピペットする前によく振盪する）１０μＬまたは純ＤＩＥＡ２μＬ。
ＮＨＳエステルの容量：５μＬ（１０ｍｇ／１００μＬ）。
反応時間：１５分またはそれ以上。
ヒドロキシルアミン添加量：２μＬ。
中和：ZipTipTM で浄化する前に５０％ＴＦＡ３μＬを加えて中和する。
ペプチドを結合するための ZipTipTM の調整：Ｃ１８マトリックスを５０％アセトニトリルで湿らせ、０.１％ＴＦＡと平衡させる。
溶離：別のチューブに入れた０.５％ＴＦＡおよび８０％アセトニトリル。
マトリックス製造用：０.５％ＴＦＡ、５０％アセトニトリル。
【０１１２】
固体支持体上のスルホン化
一般方法
サンプル（Ｃ末端にアルギニンまたはホモアルギニンを持つペプチド）を、好ましくは化学抵抗性マトリックス上のC18のような固体支持体に結合した。本発明者は Milliporeの Zip TipsTM C18を０.６μＬ使用している。これを反応混合物（ＮＨＳエステル＋塩基）と３分間またはそれ以上接触させた。反応混合物にヒドロキシルアミンを加えてスルホン化の間に形成したかもしれない望ましくないエステル副産物を加水分解し、ピペットで５回上下する。０.１％ＴＦＡで固体支持体を洗浄し、溶離してさらに分析した。
【０１１３】
ペプチド結合用ZipTipの調製：Ｃ18マトリックスを５０％アセトニトリルで湿らせ、０.１％ＴＦＡと平衡させる。
サンプル：ＢＳＡトリプシン消化ペプチド。
反応容器：５００μＬエッペンドルフチューブ。
プロピオン酸ＮＨＳエステルの容量：０.２５Ｍ−炭酸水素ナトリウム（１０ｍｇ／１００μＬ）溶液１０μＬ。
反応時間：最低３分間。
ヒドロキシルアミン添加量：１μＬ。
溶離：別のチューブに入れた０.５％ＴＦＡおよび８０％アセトニトリル。
マトリックス製造用：０.５％ＴＦＡ、５０％アセトニトリル。
【０１１４】
ＭＡＬＤＩ分析
このスルホン化反応にはアルギニンペプチド（下記の表および図７と図８参照）５種の強度を検討し、比較した。
【０１１５】
表１：検討したペプチド
【表２】
2005518521.tif 000005
【０１１６】
結果
前記図７および図８についての検討を参照。
【０１１７】
溶液中および固相上で行った反応結果の比較
１．固相の反応時間は約３分；溶液中の反応時間は１５分。
２．重炭酸ナトリウム溶液を液相で使用する時はスペクトルにノイズ比が非常に大きいシグナルが現れるが、固相ではベースラインには影響がない。
３．液相中でＤＩＥＡを塩基として使用する時は溶液の完全な混合が必要。
４．図７および図８に示すように、固相上の５００fmoleと溶液中のＢＳＡペプチド４.５ピコモルとはＭＡＬＤＩスペクトルに対して類似の感度を示した。
【０１１８】
実施例５  ３−スルホプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの製造
原料
合成用試薬：
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）内部供給、Art-Nr 30070800。
ALDRICHの３−メルカプトプロピオン酸、99+％、CAS-107-96-0。
過酸化水素（３０％水溶液）。
KEBO の氷酢酸、１００％、CAS-64-19-7。
Merckの水酸化カリウムペレット。
Merckのｎ−ヘプタン、99％。
ALDRICHの塩化チオニル、99+％、CAS-7719-09-7。
Merckのｎ−ヘキサン、99％。
ALDRICHのジイソプロピルアミン、99％、CAS-7087-68-5。
ALDRICHのジクロロメタン、99.8％、無水、CAS-75-09-2。
Air Liquideのアルゴンガスチューブ。
KEBOの酢酸エチル、CAS-141-78-6。
KEBO,のメタノール、CAS-67-56-1。
MerckのTLC Silica gel 60 F254、プラスチックシート。
【０１１９】
分析用試薬：
Cambridge Isotope Laboratoriesの重クロロホルム 99.8％、CAS-865-49-6
Larodan Fine Chemicalsの重水（Ｄ２Ｏ）、CAS-7789-20-0
【０１２０】
方法
ＮＭＲ−分析：
この分析はJEOLの２７０ＭＨｚ−ＮＭＲ装置で行った。
【０１２１】
ＮＨＳエステル１０ｍｇをＮＭＲチューブ入れ、ＣＤＣｌ３で７００μＬに希釈した。シングルパルス１Ｈ−ＮＭＲを測定し、スペクトルを分析した。この分析は３−スルホプロピオン酸無水物の場合と同様に行った。３−スルホプロピオン酸の場合は、溶媒としてＣＤＣｌ３の代わりにＤ２Ｏを用いた。
【０１２２】
３−スルホプロピオン酸無水物について１Ｈ−ＮＭＲ（前記）と同様にして、デカップリングした１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。
【０１２３】
融点測定：
ＮＨＳエステル結晶の融点はBuechi Melting Point B-540装置で測定した。結晶数個をバイアルに入れ、溶融するまで加熱した。温度範囲は１６０℃から１８５℃、温度勾配は１℃／分であった。
【０１２４】
水中安定性試験：
ＮＨＳエステル１０ｍｇをＮＭＲチューブに入れ、Ｄ２Ｏ７００μＬを加えた。シングルパルス１Ｈ−ＮＭＲを測定し、スペクトルを分析した。同じサンプルを室温（２０〜２５℃）で保存し、次に５時間後および２４時間後に１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。
【０１２５】
空気中安定性試験：
ＮＨＳエステル１０ｍｇをＮＭＲチューブに入れ、前記のように重クロロホルムを溶媒にして分析した。次にＮＨＳエステル約１００ｍｇをフラスコに入れて、開栓して空気中室温（２０〜２５℃）で数日間保存した。エステルの加水分解はＮＭＲで追跡した。
【０１２６】
合成：
３−スルホプロピオン酸の合成。
【化２】
2005518521.tif 000006
【０１２７】
三頚丸底フラスコ（５００ｍＬ）に温度計、滴下濾斗、および脱ガス管を取り付けた。安全瓶２個（相互に直列に結合、後者に２５％ＫＯＨ溶液を入れる）のガストラップをパイプに取り付けた。反応中、窒素バルーンが系内を不活性雰囲気に維持した。酢酸（７０ｍＬ）および過酸化水素（７０ｇ、３０％水溶液、６２０ミリモル）をフラスコに入れ、この溶液を攪拌しつつ水浴上で５０℃に加熱した。３−メルカプトプロパン酸（８.２０ｍＬ、９４ミリモル）を滴下漏斗から約１時間にわたって非常に注意深く加えた。直ちに発熱反応が始まり、温度が約８０℃に上昇した。そこで溶液を温度が再び５０℃になるまでエタノール／ＣＯ２ 浴（−７２℃）で冷却した。この操作を滴下漏斗から３−メルカプトプロパン酸を添加し終わるまで反復した。次に反応物を５０℃で２時間および室温で一夜攪拌した。
【０１２８】
容積が３０ｍＬになるまでロータリーエバポレータ（水浴４０℃、１００ｍｂ）で溶媒を蒸発し、残留溶媒はヘプタン３×３００ｍＬとの共沸蒸留で除去した。得られた油状物を高真空下にデシケータで一夜乾燥した。粗製生成物は油状物中の白色沈殿となった。ＮＭＲスペクトルから推測すると収率は約５０％であった。図１参照。
【０１２９】
３−スルホプロピオン酸無水物の合成：
【化３】
2005518521.tif 000007
【０１３０】
三頚丸底フラスコに３−スルホプロピオン酸（前実験の粗生成物２０ｇ）を入れた。還流冷却器とセプタムをフラスコに取り付けた。磁気攪拌機で攪拌しつつＳＯＣｌ２（１４０ｍＬ）をセプタム経由で３０分間にわたって注意深く加えた。ＳＯＣｌ２の添加終了後混合物を３時間還流した。還流中に全内容物が溶解して褐赤色溶液となった。約５分間冷却後、ヘキサン（１４０ｍＬ）を添加した。直ちに白色固体が沈殿し、フラスコの底部に褐色の油が生成した。この溶液を白色固体が溶解するまで再加熱し、溶液を他のフラスコにデカンテーションして油を除いた。溶液を１時間かけて室温にまで冷やし、次に週末にわたって冷蔵庫中に置いて結晶化させた。
【０１３１】
沈殿を窒素雰囲気下に濾過し、冷ｎ−ヘキサン（冷蔵庫から）で洗浄し、デシケータ中で一夜高真空下に乾燥した。無水物は水に著しく敏感なので、濾過に使った装置全てを事前にオーブンで乾燥し、デシケータ中で冷却した。
【０１３２】
３−スルホプロピオン酸無水物からＮＨＳエステルの合成：
【化４】
2005518521.tif 000008
【０１３３】
使用する全装置を合成の前にオーブン（１００℃）で乾燥し、デシケータに入れた。
【０１３４】
ＮＨＳ（４２０ｍｇ、３.６８ミリモル）を秤量してセプタムとアルゴンバルーンを取り付けた丸底フラスコ（１００ｍＬ）に入れた。ＤＣＭ（２０ｍＬ、無水、９９.５％）を加え、マグネティックスターラで攪拌を開始した。攪拌しながらＤＩＥＡ（０.６４ｍＬ、３.６８ミリモル）と３−スルホプロピオン酸無水物（０.５０ｇ、３.６８ミリモル）とを注意深く添加した。反応物をアルゴン雰囲気下に３時間攪拌した。溶媒を蒸発（ＲＴ、１００ｍｂａｒ）し、生成物を真空オーブン中で一夜乾燥（ＲＴ、１ｍｂａｒ）した。得られた結晶を最少量の温ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝９：１に溶解した。全てが溶解した後に、溶液を約３時間かけて室温まで冷却し、次にフリーザー中で一夜冷却した。夜の間に白色結晶が形成され、これをガラスフィルター（ｐ３）で濾取、冷酢酸エチル（５℃）で洗浄した。最後に結晶を高真空下にデシケータ中で乾燥してＮＨＳエステルのＤＩＥＡ塩を白色結晶（収率４２％）をとして得た。
【０１３５】
結果および検討
合成
３−スルホプロピオン酸の合成：
【０１３６】
この合成は全く簡単で、粗製の３−スルホプロピオン酸が白色のスラリーとして得られた。肝心な点は反応温度を５０℃に維持することであって、これは氷浴と油浴を随時交換して行ったが、多分これが最も有効な方法だとは思われない。反応中に温度が２０℃から８０℃の間で変動した。もしも反応温度がもっとよく制御できていたらおそらく収率は高くなったであろう。次工程（無水物の合成）には必要なかったのでこれ以上の精製は行わなかったが収率の計算は難しくなった。ＮＭＲスペクトルによれば少なくとも１種の副産物およびおそらく出発物質（ＮＭＲ分析参照）の何れかが見出された。純度推測値は大体５０％であったと思われる。
【０１３７】
３−スルホプロピオン酸無水物の合成：
予期の通り、この無水物は水に対して著しく敏感で、装置を全て使用前にオーブンで乾燥することおよび反応と精製をアルゴン雰囲気下に行うことが必要であった。反応および再結晶は非常に毒性の高い溶媒であるＳＯＣｌ２中で行った。生成物、３−スルホプロピオン酸無水物は明褐色結晶として回収された。信頼できる収率計算のためには出発物質が純粋であることが必須である。
【０１３８】
３−スルホプロピオン酸無水物からＮＨＳエステルの合成：
今回も反応前に材料をオーブン中で乾燥し、反応はアルゴン雰囲気中で行った。反応は全く単純で、２時間攪拌後に溶媒を蒸発して粗製ＮＨＳエステル／ＤＩＥＡ塩を白色／黄色の固体として得た。精製後の収率は４２％であった。反応時間がさらに長く、ＮＨＳおよび／またはＤＩＥＡの量が過剰であったなら、収率は向上したかもしれない。収率は、１００％純３−スルホプロピオン酸無水物についても算出した。
【０１３９】
精製：
粗ＮＨＳエステル／ＤＩＥＡ塩を再結晶した。この操作は最初の試験ではＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝７：３で再結晶を試し、その後、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ＝９：１で行った。前試験では冷却後結晶は生じなかった。
【０１４０】
無水物の合成（前記）では、一種の再結晶をＳＯＣｌ２中で行った。しかしこれは実際には反応混合物の単なる再加熱と、フラスコの底に溜まった油を除去するためのデカンテーションであった。通常の再結晶でさらに純度の高い無水物が得られるであろう。
【０１４１】
キャラクタリゼーション：
融点測定
粗製ＮＨＳエステル／ＤＩＥＡ塩の融点は１４５〜１５５℃の間であった。しかし再結晶後の融点は１７６〜１７８℃になった。精製後に融点が高く、鋭くなったことは、生成物が実際に純粋になったことを示す。
【０１４２】
ＮＭＲ分析：
ＮＭＲ分析で得たスペクトルを図１に示す。
【０１４３】
３−スルホプロピオン酸：
表２  ３−スルホプロピオン酸の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）の解析
【表３】
2005518521.tif 000009
【０１４４】
このスペクトルはδ２.７８、δ２.８５、δ３.１８およびδ３.５２にピークを与える副産物および出発物質も含んでいた。これは未精製のときに予期されたものである。
【０１４５】
３−スルホプロピオン酸無水物：
表３  ３−スルホプロピオン酸無水物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）の解析
【表４】
2005518521.tif 000010
【０１４６】
表４  ３−スルホプロピオン酸のデカップリングした 13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの解析（ＣＤＣｌ３）
【表５】
2005518521.tif 000011
両スペクトルを比較し、標品のスペクトルで確認した。
【０１４７】
３−プロピオン酸無水物からのＮＨＳエステル：
表５  １Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）の解析
【表６】
2005518521.tif 000012
【０１４８】
粗製生成物中の典型的な不純物は、ＮＨＳおよびＤＩＥＡである。ＮＨＳはδ２.６８（ｓ）にピークを与え、ＤＩＥＡは表中の前記ppmと殆ど同じppmにピークを与える。そのためＤＩＥＡ不純物はＮＨＳ不純物よりも特定するのが困難であるが、ピークの積分値を観測すれば推測はできる。残留溶媒があれば、ＭｅＯＨはδ３.４９（ｓ）に、ＥｔＯＡｃはδ２.０５（ｓ）、δ１.２６（ｔ）およびδ４.１２（ｑ）に、ＤＣＭはδ５.３０（ｓ）にピークを与える。
【０１４９】
実施例６  ３-スルホプロピオン酸Ｎ-ヒドロキシサクシンイミドエステルの別途合成
３−スルホプロピオン酸の製造：
１Ｌ三頚フラスコに攪拌機、温度計、窒素導入口、滴下漏斗および加熱マントルを取付け、効率的なドラフト内に設置した。酢酸１６５.４ｍＬおよび３０％Ｈ２０２、１６５.４ｍＬ、１.４６モルを容器に加えた。この混合物を５０℃に加熱した。マントルを除去した後、５０℃で３−メルカプトプロピオン酸５０ｇ、０.４７１モルの滴下を開始した。この反応は発熱反応であって、外部から冷却する必要がある。ドライアイス／アセトン浴で温度を５０〜５５℃に維持した。添加終了後（約５分所要）も反応物は約３０分間発熱を続けた後冷え始めた。発熱が終わった時、マントルを付けて温度をさらに２時間５０℃に維持した。ヨード澱粉試験紙を使う過ヨード酸試験は溶液に過酸化水素の存在が続いていたことを示した。２時間後、透明な無色の溶液を放冷し、フラッシュエバポレーション用フラスコに移した。ロータリーエバポレータの浴温を５０℃に設定し、約５〜６ｍｍＨｇの真空源に接続した。この工程は後の酢酸エチル抽出を妨害しないように酢酸をできるだけ除去するために必要であった。この温度および真空度でこれ以上の酢酸／水／Ｈ２Ｏ２が留出しなくなった時（約１〜１.５時間）、サンプルを取り出すと重量は約１００−１２０ｇであった。これは生成物の理論重量７２ｇより多く、これは使用した蒸発技術では除去し難い水を表す。この物質は−２０℃でも凍結しないので、凍結乾燥では残留する水を除去できなかった。希薄に希釈すればおそらくこの物質はサンプルの凍結を持続するであろうが、余計な水を加えることは望ましくない操作である。濃厚溶液を水５００ｍＬで希釈し、酢酸エチル３００ｍＬづつで３回抽出した。酢酸エチル抽出物はＨ２Ｏ２陽性であったがその強度は抽出毎に減少した。水層を最後に約１００ｇまで濃縮した。この生成物は粘度の高い油状物であって白色沈殿を含んでいた。Ｄ２Ｏ中の１Ｈ−ＮＭＲは内部基準として加えた痕跡のアセトニトリル（２.０６ppm）の他にシングレットを３.２３ppmと２.７８ppmに示した。註：このピークは濃度に依存してシフトする。微量の不純物が３.５８、２.９および２.２３ppmに観測された。同じサンプルの１３Ｃ−ＮＭＲは１７４.８、４５.５および２８.４ppmにピークを示した。
【０１５０】
β−スルホプロピオン酸無水物の製造：
上記反応で得られたサンプル全体 （〜１００ｇ）を効率的なドラフト中、塩化チオニル６５２.４ｇ、５.４８モルで処理した。
残留水が激しい反応を起こす可能性があったので塩化チオニルは少量づつ加えた。激しい発煙はなかったが、塩酸と二酸化硫黄が発生したのでアダプターでコンデンサーの頭部に結合したtygon管を用いてドラフトの後に導いた。添加終了後、混合物を１２時間加熱還流しつつ磁気的に攪拌した。冷却、攪拌を続けている間に、β−スルホプロピオン酸無水物が沈殿した。フラスコに栓をして２時間フリーザに入れて沈殿量を最大にした。固体の無水物をグローブバッグ中Ｎ2下に濾過し、フィルターケーキを石油エーテル５０ｍＬづつで２回洗浄した。この無水物は水に対して極めて敏感に反応して出発物質３−スルホプロピオン酸に戻るのでグローブバッグ（ドライボックスでもよい）の使用は非常に重要である。無水物の固体をグローブバッグ内で密栓付フラスコに移し、真空デシケータに移し、栓を去り、Ｐ2Ｏ5上で１ｍｍ真空に暴露した。乾燥した無水物の重量は３９ｇ、収率は６１％であった。1Ｈ−ＮＭＲ分析はＣＤＣｌ3中で各々３.８および３.４５ppmにシングレットを示した。同じサンプルの13Ｃ−ＮＭＲは１６１.９、４８および３２ppmにピークを示した。融点：７４.６℃。文献値：７６〜７７℃。
【０１５１】
再現性：
同じスケールと技法を用いて全過程（両反応）を反復した。殆ど同一の結果を得られた。粗製物質の重量は８４ｇであった。註：塩化チオニル添加後の混合物を仔細に観察すると３０〜４５分間に過剰な塩化チオニルで反応物中の水が消費されるに従って、美しい白色の固体が沈殿することが判明した。これは無水の３−スルホプロピオン酸であると推測される。還流下に更に１時間攪拌するとこれが全て溶解し、以前に観察したように反応した。β−スルホプロピオン酸無水物の第二サンプルの最終重量は４０.７ｇであった。収率：６３.５％。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）分析は３.８ppm と３.４５ppmとにシングレットを示した。同じサンプルの13Ｃ−ＮＭＲは１６１.９、４８および３２ppmにピークを示した。
【０１５２】
３-スルホプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルジイソプロピルエチルアミン塩：
５００ｍＬ三頚フラスコにマグネティックスターラーバー、温度計、窒素導入口および滴下漏斗を装備した。室温でフラスコにＮ−ヒドロキシサクシンイミド３.９ｇ,０.０３３８モルを入れた。ＣＨ２Ｃｌ２１００mＬを加え、混合物を攪拌しながらジイソプロピルエチルアミン４.３７ｇ、５.９ｍＬ、０.０３３８モルを加えた。註：このＮ−ヒドロキシサクシンイミドは、ジイソプロピルエチルアミンを加えると溶解した。β−スルホプロピオン酸無水物４.６ｇ、０.０３３８モルをＣＨ２Ｃｌ２８０mＬに溶解し、この溶液を攪拌しつつ滴下漏斗を用いて添加した。添加が進行するにつれて反応混合物は暗色になった。添加完了後、混合物を更に３時間室温で攪拌した後、単頚フラスコに移し、溶媒をロータリーエバポレータで蒸発して明褐色固体残渣を得た。残渣をＣＨ２Ｃｌ２５０ｍＬに溶解し、活性炭２ｇとともに室温で１時間攪拌した。続いてガラス繊維濾紙およびセライト床で濾過した。セライトをＣＨ２Ｃｌ２２５ｍＬで一回洗浄した。ロータリーエバポレータでＣＨ２Ｃｌ２を除去した。固体の残渣をメタノール２０ｍＬに５０℃で溶解した。この溶液を酢酸エチル１８０ｍＬに注入し、溶液を一夜フリーザ中に置いた。翌朝、黄褐色固体が沈殿し、これを濾取した。冷酢酸エチル（フリーザ温度）約５０ｍＬを用いて固体を濾紙上で洗浄した。このエステルは出発無水物よりも水に対してはるかに安定であると思われたがこの濾過はＮ２を詰めたグローブバッグを用いて行った。乾燥したサンプルの重量は７.３ｇ、収率：８６％であった。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）分析は９.１７５（１Ｈ−ｂｓ）、３.６ppm（２Ｈ−ｍ）、３.１ppm（４Ｈ−ｓ）、３.０ppm（２Ｈ−ｍ）、１.３５ppm（１５Ｈ−ｍ）にピークを示した。  同じサンプルの13Ｃ−ＮＭＲは１７３.３、１６８.８、１６７.４、５３.９、４５.７、４２.２、２７.４、２５.３、１８.３、１７.１、１１.９ppmにピークを示した。サンプルの融点は１７５〜１７６℃であった。文献値：１７６〜１７８℃。
【０１５３】
註：再結晶段階には最少量のメタノール／酢酸エチル溶媒を使用するように注意すべきである。多すぎると生成物が全くまたは僅かしか沈殿しなくなり得る。
【０１５４】
実施例７  ２−スルホ安息香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの製造
２−スルホ安息香酸環状無水物のＮ−ヒドロキシサウシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、ＤＩＰＥＡ塩として反応式３に従って下記記載のようにして製造した。
【化５】
2005518521.tif 000013
【０１５５】
装置全てを使用前にオーブンで乾燥し、アルゴンを満たしたデシケータ中に移した。反応はアルゴン雰囲気下に行った。ＮＨＳおよび２−スルホ安息香酸環状無水物は使用前に真空乾燥した。ＮＨＳ（６７３.２、５.８５ミリモル）を入れた丸底フラスコに塩化メチレン（１.９ｍＬ）およびＤＩＥＡ（１.０１９ｍＬ、５.８５ミリモル）を加えた。次に２−スルホ安息香酸環状無水物（１.０７７ｇ、５.８５ミリモル）の塩化メチレン（１９ｍＬ）溶液を少量づつ（７×）反応液に加え、室温に２時間２０分放置した。反応混合物を二分し、各々濃縮して粘度の高い明黄色残渣（画分１：１.１１ｇおよび画分２：１.２４ｇ）を得た。
【０１５６】
画分１をＭＱ（１１.０９８ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、濾過し、３×１ｍＬを逆相分取ＨＰＬＣ（カラム：Supelcosil LC-18、１０ｃｍ×２１.２ｍｍ、２μ；流速１０ｍＬ／分。方法：０〜１０分、定常０.１％ＴＦＡ−Ｂ含有５％アセトニトリル水。２分、サンプル注入。１０〜１５分、５〜１２％勾配Ｂ水）に付した。各画分を蒸発させ、凍結乾燥して白色固体／粘性の透明油状物（合計２３７.７ｍｇ）として未精製産物ＤＩＥＡ塩、それに加えてＮＨＳ、ＤＩＥＡおよび副産物を得た。以前の実験ではもっと良い結果を得た。そこでは逆相分取ＨＰＬＣ（同じカラムと同じ系を用い、別の方法（０〜６分、定常０.１％ＴＦＡ Ｂ含有５％アセトニトリル水。２分、サンプル注入。６〜１８分、５〜２５％勾配Ｂ水）に付して、生成物をＤＩＥＡ塩として得た。これには約５％の残留ＮＨＳおよび芳香族構造部分での副産物が痕跡量混入していた。
【０１５７】
1H-NMR (D2O)δ: 8.0-8.1 (dd, 1H), 7.9-8.0 (dd, 1H), 7.7-7.8 (m, 2H), 3.6-3.8 (m, 2H), 3.1-3.2 (m, 2H), 3.0 (s, 4H), 1.2-1.3 (m, 15 H), 2.7 (s, 0.2 H, NHSピーク)。
【０１５８】
アセトン（２.５ｍＬ、０℃冷、氷水浴）を画分２に滴下し、室温２０分間および４℃２５分間後に白色沈殿を得た。この沈殿を濾取、アセトン（２４ｍＬ、０℃冷、氷水浴）で注意深く洗浄してＤＩＥＡ塩（６１２.７ｍｇ、４６.３％）として生成物を得た。
【０１５９】
1H-NMR (D2O)δ: 8.0-8.1 (dd, 1H), 7.9-8.0 (dd, 1H), 7.7-7.8 (m, 2H), 3.6-3.8 (m, 2H), 3.1-3.3 (m, 2H), 3.0 (s, 4H), 1.2-1.3 (m, 15 H)。
【０１６０】
実施例８  他種のＮＨＳエステルの合成
【化６】
2005518521.tif 000014
【０１６１】
２−ブロモ−５−スルホ安息香酸をジオキサン１ｍＬおよび水０.５ｍＬに溶解する。ジイソプロピルエチルアミン２当量を加える。溶液をよく攪拌しつつ、これにＯ−（Ｎ−サクシンイミジル）-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-テトラメチルウロニウムＢＦ4（ＴＳＴＵ）の固体１.２当量を加える。この反応物を３０分間攪拌し，次にロータリーエバポレータで濃縮し、続いて高真空下に乾燥する。２％水：アセトニトリルを移動相としてシリカゲルカラムを調製する。サンプルを２％水：アセトニトリルに負荷する。カラムは２％水：アセトニトリルから始め、極性を徐々に上げて５％水：アセトニトリルとし、最後に１０％水：アセトニトリル８０ｍＬで行う。生成物含有画分を１０％水アセトニトリル中、ＴＬＣで確認する。陰イオンＭＳでも確証する。ＮＭＲによればこの物質は約１当量のＤＩＥＡを含む。
【０１６２】
実施例９  ペプチドのスルホン化
モデルペプチドおよびさまざまなプロテインのトリプシン消化物を、脱イオン水とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）とを１９：１v/vの比率で混合して調製した塩基約２０μＬに溶解した。ゲル内消化物からのペプチド混合物を最終容積約２０μＬに濃縮してＤＩＥＡ１μＬを加え、溶液を塩基性とした。これにスルホン酸の活性エステル試薬１００ｍｇ／ｍＬを５μＬ加え、溶液をふりまぜる。各反応物のｐＨを測定して塩基性を確認し、必要なら調整する。反応をＲＴで３０分間進行させる。各サンプルを５μＬの１Ｎ−ＨＣｌで酸性とし、C18 mini-column（μC18 Zip TipsTM, Millipore, Bedford MA）を用いて直接精製する。スルホン化されたペプチドを０.１％ＴＦＡ含有アセトニトリル：Ｈ２Ｏ＝１：１v/v、４〜２０μＬでカラムから溶離する。
【０１６３】
実施例１０  トリプシン消化ペプチド内Ｌｙｓ側鎖のグアニジン化による保護および後続するスルホン化
モデルペプチドおよびさまざまなプロテインのトリプシン消化物を塩基約２０μＬに溶解した。この塩基は脱イオン水とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）とを１９：１v/vの比率で混合して調製したものである。ゲル内消化物からのペプチド混合物を最終容積約２０μＬに濃縮し、ＤＩＥＡ１μＬを加えて溶液を塩基性とした。０.５Ｍ−硫酸水素Ｏ−メチルイソ尿素水２μＬを加え、溶液をふりまぜた。各溶液のｐＨを測定して試薬の添加後にその塩基性を確認し、必要なら調整した。反応を室温（ＲＴ）で様々な長さの時間（数時間から２日間）進行させた。典型的には室温での反応は一夜進行させた。翌朝、１００ｍｇ／ｍＬスルホン酸活性エステル試薬を５μＬ加え、溶液をふりまぜる。各反応物のｐＨを測定してその塩基性を確認し、必要なら修正する。反応はＲＴで３０分進行させる。サンプルを５μＬの１Ｎ−ＨＣｌで酸性として、直接Ｃ18 mini-columns（μＣ18 Zip TipsTM, Millipore, Bedford MA）を用いて精製する。グアニジン化されたスルホン化ペプチドを０.１％ＴＦＡ含有アセトニトリル：Ｈ２Ｏ＝１：１v/v、４〜２０μＬづつでカラムから溶離させた。
【０１６４】
実施例１１  使用した装置の実験室的説明（図３）
誘導化ペプチドは、Applied Biosystems（Framingham、MA、01701）のVoyager ＤＥ−ＳＴＲ飛行時間型質量分析器にＮ２レーザー（３３７ｎｍ、パルス幅３nsec、反復速度２０Ｈｚ）を装着して分析した。質量スペクトルは全て遅延引き出し機構のリフレクトロンモードで得た。外部質量補正は低質量標準ペプチドで行ったが、質量測定の精度は典型的には±０.２Ｄａであった。ＰＳＤフラグメントイオンのスペクトルは適当な誘導化された前駆体イオンを時間イオン選択によって分離した後に観測した。リフレクトロンに次のような比で段階的に電圧を印加してフラグメントイオンを最終検出器にリフォーカスした：１.００００（前駆体イオンセグメント）、０.９１２６、０.６０４９、０.４１２５、０.２７３８、０.１９７５および０.１２７３（フラグメントイオンセグメント）。個々のセグメントは Applied Biosystems が開発したソフトウエアを用いてステッチした。前駆イオンセグメントは全て検出器の飽和を避けるために低レーザーパワー（変動減衰＝１８００）＜２５６レーザーパルスで観測した。ＰＳＤ捕捉の残りのセグメントではレーザーパワーを増強した（変動減衰＝２１００）。ＰＳＤのデータは２０ＭＨｚのデジタル化レートで得た；それ故フラグメントイオンは全て単一同位元素質量としてではなく、化学的平均として測定した。質量補正は標準ペプチドを外部基準として行った。全ＰＳＤ実験で準安定イオンの分解を測定した。
【０１６５】
ＰＳＤタンデム質量スペクトルはＮＣＢＩ非リダンダントプロテイン配列データベース（最新更新は本願出願時点では２００１年３月２日）について、二つの方法で検索した。第一の方法は、未解析ＰＳＤスペクトルをＵＣＳＦが開発した検索ツール（P.R. Baker, K.R. Clauser, http://prospector.ucsf.edu参照）のProtein Prospector suite のMS‐Tagプログラムで検索した。検索の入力には測定された前駆体イオン質量およびフラグメントイオン質量を含めた。観測されたグアニジン化ペプチドのフラグメントイオン質量はいずれのデータベースについても検索する前に添加されたグアニジウム基の質量４２Ｄａ差引いた。使用した中庸の誤差許容範囲は典型的には単一同位元素前駆体イオンでは±０.６Ｄａ、化学的平均フラグメントイオンでは±２.０Ｄａであった。ｙ-型フラグメントイオンのみに許容される可能性があった。ａ、ｂ、（ｂ+Ｈ２Ｏ）、（ｂ−ＮＨ３）および内部分解物イオンなどのような他種のフラグメントイオンはスルホン化後のＰＳＤスペクトルでは顕著ではないので、考慮しなかった。あるいはＰＳＤデータを手動で解析した。誘導した配列タグはProtein ProspectorソフトウエアパッケージのＭＳ−エドマンプログラムを用いて検索した。ＭＳ−エドマンでは入力に前駆体イオンまたはフラグメントイオンの質量を必要としない。ＭＳ−エドマンは観測された配列タグのみを使用する。このプログラムでは（Ｋ、ＱおよびＥ）または（Ｉ、Ｌ、ＮおよびＤ）のように類似の質量を持ち不鮮明な残基の組合せをすべて考慮する。
【０１６６】
実施例１２  データベースの説明
ポリペプチドおよびそのペプチドの配列は、未解析ｙ−イオンシリーズの質量またはｙ−イオン質量から誘導した配列タグのいずれか、質量スペクトルフラグメンテーションデータを配列データベース検索の入力として取り入れるソフトウエアを用いて効率的にかつ正確に決定できることもある。熟練した専門家が通常に利用する検索ソフトウエアは、限定するものではないが、"Protein Prospector"（米国サンフランシスコのカリホルニア大学またはhttp://prospector.ucsf.eduから購入できる）および"Peptide Search"（ドイツ国ハイデルベルグのEuropean Molecular Biology Laboratoryまたはhttp://www.mann.embl-heidelberg.deから購入できる）を含む。
【０１６７】
本発明で作成されたフラグメンテーションパターンは多数の配列データベースで検索できる。このようなデータベースには、限定するものではないが、次例を含む：NCBI non-redundant database (ncbi.nlm.nih.gov/blast/db.nr.z)；SWISPROT (ncbi.nlm.gov/repository/SWISS-PROT/sprot33.dat.z)；EMBL (FTP://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/peptidesearch/), OWL (ncbi.nlm.nih.gov/repository/owl/FASTA.z)；dbEST (ncbi.nlm.nih.gov/repository/dbEST/dbEST.weekly.fasta.mmddyy.z)；およびGenebank (ncbi.nlm.nih.gov/genebank/genpept.fsa.z)。目的とするポリペプチドの完全配列はしばしば配列データベースから本発明方法を使用して生成する関連ペプチド誘導体１種またはそれ以上から得られるフラグメンテーションデータを検索することによって検索できる。
【０１６８】
勿論、データベース検索技術を用いる時は、ｙ−イオンまたは（ｙ−ＮＨ３）イオンのみが許容されるフラグメントであると特定して検索を限定することが最も効率的である。その理由はｙ−および（ｙ−ＮＨ３）イオンは本方法を利用するフラグメンテーションパターンに観察される最も顕著な分子種だからである。ａ−、ｂ−、（ｂ＋Ｈ２Ｏ）、（ｂ−Ｈ２Ｏ）、（ｂ−ＮＨ３）および内部分解物イオンなどのような他種のフラグメントイオン型は本発明方法を使用して誘導化したペプチドのスペクトルでは顕著ではないので許容しなくてもよい。本発明で生成する誘導体は単純なフラグメンテーションパターンを提供し、これが誘導化のない同じペプチドのスペクトルでの検索と比較してしばしば優れたデータベース検索特異性を与える。
【０１６９】
実施例１３  ＮＨＳエステル誘導化ペプチドのｄＰＳＤ
モデルプロテイン・トリプシン消化物のＮＨＳエステル誘導化体のｄＰＳＤ：
４−ビニルピリジンアシル化ウシ血清アルブミン（４ＶＰ−ＢＳＡ）（Sigma）をＮＨＳエステルによるｄＰＳＤのためのモデルプロテインとして使用した。
【０１７０】
ビニルピリジンを用いるアシル化：
凍結乾燥プロテイン（２.４ｍｇ）を８Ｍ−尿素、５０ｍＭ−トリスＨＣｌ、ｐＨ８.０および５０ｍＭ−ＤＴＴを含む緩衝液８００μＬに溶解し、３０℃で３０分間インキュベーションした。４−ビニルピリジン１０μＬを加え（ジスルフィド結合形成阻止用）、サンプルを３０℃で１時間インキュベーションした。１００ｍＭ−ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．８と平衡させた NAP-10 column (Amersham Pharmacia Biotech) を用いて脱塩し、サンプルを１.２ｍＬで溶離した。このサンプルをトリプシン（Promega、トリプシン１μｇ／１００μｇプロテイン）を用いて３０℃で６時間消化し、ＴＦＡを最終濃度１％まで加えて反応を止めた。最終濃度１００ｎｇ／μＬ（１.５pmole／μＬ）になるまで０.５％ＴＦＡ：５０％ＡｃＮで消化物を希釈した。
【０１７１】
３−スルホプロピオン酸無水物のＮＨＳエステルを用いるＮ−末端誘導化：
４ＶＰ−ＢＳＡのトリプシン消化物（３pmole）をスピードバックで乾燥し、脱イオン水：ジイソプロピルエチルアミン＝１９：１v/v１０μＬに再構成した。ＮＨＳエステルを脱イオン水に溶解し（ＮＨＳエステル１０ｍｇ／Ｈ２Ｏ１００μＬ）、その５μＬを各サンプルに加えた。反応混合物をふりまぜ、室温に１５分間放置して反応させた。サンプルに１０％ＴＦＡ１μＬを加えて酸性とし、製造社の説明書に従ってμＣ18 Zip TipsTM（Millipore）で精製した。ＭＡＬＤＩ標的にサンプルを直接α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の５０％ＡｃＮ：０.１％ＴＦＡ飽和溶液で溶離し、リフレクトロンポジティブモードおよびＰＳＤポジティブモードの EttanTM MALDI-TOF で分析した。
【０１７２】
大腸菌由来プロテインの誘導化トリプシン消化物のＮＨＳエステルのｄＰＳＤ
大腸菌低速上清物の製造：大腸菌（E. coli）（４０μｇ、Ｂ株、ATCC11303）を８Ｍ−尿素、４％chaps、２％３〜１０pharmalyt、６５ｍＭ−ＤＴＴを含む還元緩衝液２０ｍＬに入れ、細胞を超音波（７×２０秒間、氷冷下）で破壊した。溶解物を１００００×ｇ、８℃で４０分間遠心分離した。低速上清（ＬＳＳ）は使用まで−２０℃で保存した。
【０１７３】
二次元（２Ｄ）電気泳動による分離：大腸菌のＬＳＳ（１ｍｇ）をＩＰＧレヒドレーション緩衝液（８Ｍ−尿素／２％ＣＨＡＰＳ／２％ＩＰＧ緩衝液４〜７／１０ｍＭ−ＤＴＴ）で希釈し、ＩＰＧストリップ（２４ｃｍ、ｐＨ３−１０、NL Amersham Pharmacia Biotech）に一夜レヒドレーションした。製造社説明書に従って二次元電気泳動を行った。二次元（２―Ｄ）電気泳動で分離後、ゲルを４０％エタノール（ＥｔＯＨ）、１０％酢酸（ＨＡｃ）で１時間固定し、４０％ＥｔＯＨ、１０％ＨＡｃ中、０．１％クーマジーブリリアントブルーで３０分間染色し、２０％ＥｔＯＨ、５％ＨＡｃ中で一夜脱色した。
【０１７４】
トリプシン消化：中強度（低pmole）から低強度（高fmole）までのプロテインスポット（直径１.４ｍｍ）を取り、EttanＴＭspot picker（Amersham Pharmacia Biotech）を用いてミクロタイタープレートに移した。各プロテインを５０％メタノール、５０ｍＭ−炭酸水素アンモニウム（AMBIC）１００μＬで３×３０分間脱色し、Tubo-Vap中で１５分間乾燥した。これをトリプシン（40ng／μＬ、２０ｍＭ−ＡＭＢＩＣ、Promega）５μＬで EttanＴＭTA Digester（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて３７℃で６０分間消化した。０．５％ＴＦＡ,５０％アセトニトリル３５μＬで２×２０分間ペプチドを抽出した。抽出物を室温で一夜乾燥した。
【０１７５】
Ｎ−末端の誘導化：各サンプルを脱イオン水２０μＬ中に再構成した。各サンプル（２０％）１μＬをα−シアノマトリックス溶液と１：１混合し、EttanTM MALDI-TOF を用いてリフレクトロンポジティブモードで分析した。各サンプルの残り１９μＬにＤＩＥＡ１μＬとスルホプロピオン酸ＮＨＳエステル１０ｍｇ／１００μＬ溶液５μＬを加えた。サンプルをピペットで完全に混合し、室温で１５分間反応させた。ＴＦＡ（１μＬ、１０％）を各サンプルに加え、μC18Zip TipsTM（Millipore）で精製した。α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸の５０％ＡｃＮ：０.１％ＴＦＡ飽和溶液でサンプルをＭＡＬＤＩターゲット上に直接溶離し、EttanTM MALDI-TOF を用いてリフレクターポジティブモードおよびＰＳＤポジティブモードで分析した。
【０１７６】
ＮＨＳエステルを用いる自動化ｄＰＳＤ：
最近の化学は自動化に適している。EttanTM Digester とEttanTM Spotter を用いればサンプルの取扱いおよび反応混合物は自動的に操作できる。実験的には、マイクロタイタープレートの各ウェルに入れたモデルペプチドまたはペプチド混合物を水（１８ＭΩまたはそれ以上の品質、Omega）１００μＬ中に再構成する。この時点で液体ハンドラーはサンプルを反応物２個に二分できる。一方は５μＬをＭＳによる直接分析に、他方は化学修飾に用いる。化学修飾用に設計した物質を室温で１時間乾燥する。ハンドラー（たとえばGilson 215 multiprobe）は次に乾燥した物質にＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）含有緩衝液中、反応性誘導化試薬１０μＬを加えて再構成する。吸引を繰返して反応物を混合する。この化学修飾段階を室温で約１５分間進行させる。最後に各サンプルを前記と同様に後処理し、ＭＳで分析する。
【０１７７】
結果：
４ＶＰ−ＢＳＡ・トリプシン消化ペプチドの定量的Ｎ−末端誘導化は水溶液中、３−スルホプロピオン酸無水物のＮＨＳエステルで得られた。図４、図５は各々未誘導化および誘導化４ＶＰ−ＢＳＡのリフレクトロンスペクトルを示す。ペプチドＩ〜ＩＩＩをｄＰＳＤ分析に使用した（図６〜図８）。フラグメンテーションスペクトルはｙ−イオンのみを示した。ペプチド三種の各フラグメンテーションデータを用いて NCBInr protein sequence database (PepFrag、www.proteometric.com) に対する明確な確認のために使用できた。
【０１７８】
クーマジー染色２Ｄゲルから得た大腸菌プロテインを含むゲルプラグ２個を、ＮＨＳエステルを用いてｄＰＳＤで同定した。このプロテインをトリプシンで消化し、ゲルプラグから抽出し、記載の通りに誘導化した。図９および図１０は一方のゲルプラグから得た未誘導化サンプルおよび誘導化サンプルのリフレクトロンスペクトルを示す。丸印を付けたペプチドを定量的に誘導化し、ＰＳＤ分析（図１１）に付した。このフラグメントイオン（ｙ−イオン）の質量を用いてPepFragでプロテイン確認を行った。PepFragが示唆した候補はProFound (proteometrics.com) のトリプシン消化地図を検索して得た候補と一致した。第二ゲルプラグから得た未誘導化サンプルおよびＮＨＳエステル誘導化サンプルのリフレクトロンスペクトルを図１２と図１３に示す。ペプチド m／z 1569を定量的に誘導化し（m／z 1705）、ＰＳＤ分析（図１４）に用いた。得られたｙ−イオンを用いてPepFragでプロテイン確認を行った結果、ProFound のペプチドマスで得られた候補と同じ候補を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】図１は、実施例２に記載するウマミオグロビンの未誘導化サンプル（ＭＡＬＤＩターゲット上、１５fmol）についてリフレクトロンスペクトルを示す。
【図２】図２は、図１に関して記載したサンプルの誘導化サンプル（ＭＡＬＤＩターゲット上、＜１５fmol）についてリフレクトロンスペクトルを示す。
【図３】図３は、リジン末端ペプチド（図２、m/z 1271）の誘導化で生じたm/z 1449.5についてＰＳＤスペクトルを示す。
【図４】図４は、得られたｙ−イオン７種の質量（反応物から−42Ｄａ）を与えて前記プロテインをPepFrag でどのように同定したかを示す。
【図５】図５は、アルギニン末端ペプチド（m/z 1742.8）についてフラグメンテーションスペクトルを示す。
【図６】図６は、得られたｙ−イオン８種の質量を用いてプロテインをPepFragで確認したことを示す。
【図７】図７は、実施例３に記載するＢＳＡトリプシン消化ペプチド５００ fmol の固相スルホン化を示す。
【図８】図８は、実施例３に記載するＢＳＡトリプシン消化ペプチド４.５ pmol の溶液中でのスルホン化を示す。
【図９Ａ】図９Ａは以下の実施例１２で検討するＮＭＲスペクトルを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは以下の実施例１２で検討するＮＭＲスペクトルを示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは以下の実施例１２で検討するＮＭＲスペクトルを示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは以下の実施例１２で検討するＮＭＲスペクトルを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは本発明に使用するＮＨＳエステルの安定性を図示する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは本発明に使用するＮＨＳエステルの安定性を図示する。
【図１１Ａ】図１１Ａは実施例１７に記載のようにスルホン化したペプチドについてＭＡＬＤＩ・ＰＳＤスペクトルおよび相対的反応性のデータを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは実施例１７に記載のようにスルホン化したペプチドについてＭＡＬＤＩ・ＰＳＤスペクトルおよび相対的反応性のデータを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは実施例１７に記載のようにスルホン化したペプチドについてＭＡＬＤＩ・ＰＳＤスペクトルおよび相対的反応性のデータを示す。
【図１２】図１２は、EttanTMMALDI-TOFで得た４ＶＰ−ＢＳＡの未誘導化トリプシン消化物についてリフレクトロンスペクトル、ポジティブモード（平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
【図１３】図１３は、４ＶＰ−ＢＳＡ（EttanTM MALDI-TOF）の誘導化トリプシン消化物についてリフレクトロンスペクトル（平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
【図１４】図１４は、EttanTM MALDI-TOF で得た４ＶＰ−ＢＳＡの誘導化トリプシン消化物（図１３）から得たペプチド（Ｉ）の完全ｙ−イオンシリーズを示すＰＳＤスペクトル（ポジティブモード）を示す。
【図１５】図１５は、４ＶＰ−ＢＳＡの誘導化トリプシン消化物（図１３）から得たペプチド（ＩＩ）についてＰＳＤスペクトル（ポジティブモード）を示す。
【図１６】図１６は、４ＶＰ−ＢＳＡの誘導化トリプシン消化物（図１３）から得たペプチド（ＩＩＩ）m/z 1704 についてＰＳＤスペクトル（３００ショットシグナル蓄積）を示す。
【図１７】図１７は、EttanTM MALDI-TOF で得たクーマジー染色２−Ｄゲルからの未誘導化プロテイン消化物についてリフレクトロンスペクトルの初回例（ポジティブモード、１００ショット蓄積、平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
【図１８】図１８は、図１７と同じ２−Ｄサンプル（残りの９５％）であるがＮＨＳエステルでＮ−末端誘導化後のリフレクトロンスペクトル（ポジティブモード、平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
【図１９】図１９は、誘導化ペプチド m/z 1927 についてＰＳＤスペクトル（３００ショット蓄積）を示す。
【図２０】図２０は、EttanTM MALDI-TOF で得たクーマジー染色２−Ｄゲルから得たプロテインスポットの未誘導化トリプシン消化物についてリフレクトロンスペクトルの第二例（１００ショット蓄積、平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
【図２１】図２１は、図１９と同じ２−Ｄサンプルであるが既述のようにZipTipTM で浄化し、水性溶液中でＮＨＳを用いて誘導化した後のリフレクトロンスペクトル（ポジティブモード、平均質量、濾過後、スムーシング５）を示す。
【図２２】図２２は、誘導化したペプチド m/z 1705（図１２参照）についてＰＳＤスペクトル（シグナルを３００ショット蓄積）を示す。
【図２３】図２３は、後続する多重式スルホン化用に実験室用遠心分離機に入れたサンプル充填済 ZipTipsTM を示す。
【図２４】図２４は、スルホン化反応後に遠心分離機内で行うサンプル洗浄を示す。
【図２５】図２５は、ＭＡＬＤＩサンプルステージ上に固体支持体から誘導化サンプルの直接負荷を示す。
【図２６】図２６は、固体支持体上でフィブリノペプチドＡをスルホン化して得たＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図２７】図２７は、スルホン化反応中に形成される望ましくないエステル副産物を逆戻りさせるためのヒドロキシルアミン塩酸塩の使用を示す。
【図２８】図２８は、プロテイン消化物のスルホン化を示す。
【０１８０】
本明細書に示す本発明の修正および変形の多くが本発明の精神および範囲から逸脱することなしに行えるであろうことは明白である。記載された特定的態様は単なる実例であって、本発明は添付する請求項の記載によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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