(57)【要約】  本発明は、毛根間葉細胞を用いた真皮代替物に関する。繊維芽細胞に比べて、毛根から分離した間葉細胞、特にひげ毛根から分離した間葉細胞は、細胞の再生を促進させる成長因子、及び基質蛋白質は多くつくる反面、基質蛋白質を分解する酵素は少なくつくる。従って、本発明の間葉細胞を用いて作製された真皮代替物は、従来の先行技術に比べて細胞再生効果などが遥かに優れる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ)  ３次元保持枠で培養された毛根間葉細胞と、毛根間葉細胞から分泌される結合組織蛋白質とを含む生基質組織と、
ｂ)  前記基質組織に連結されたトランジショナルカーバリングとを含むことを特徴とする真皮代替物。
【請求項２】
前記毛根間葉細胞が、真皮乳頭細胞と結合組織鞘細胞であることを特徴とする請求項１に記載の真皮代替物。
【請求項３】
前記毛根が、頭皮またはひげの毛根であることを特徴とする請求項１または２に記載の真皮代替物。
【請求項４】
前記３次元保持枠が、ポリグラクチン酸 、キチン、キトサン、コットン、ポリグリコール酸、セルロース、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、およびデキストランからなる群より選択される１種類以上の生分解性物質を含有することを特徴とする請求項１に記載の真皮代替物。
【請求項５】
前記３次元保持枠が、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニルクロライド、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、およびニトロセルロースからなる群より選択される１種類以上の非生分解性物質で作製されることを特徴とする請求項１に記載の真皮代替物。
【請求項６】
前記トランジショナルカーバリングが、シリコーンまたはポリウレタンから作られることを特徴とする請求項１に記載の真皮代替物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生真皮代替物に関する発明であり、詳しくは毛根間葉細胞を用いて製造された真皮代替物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、深部火傷のような全層皮膚欠損部位を治すのに最も理想的な方法は、自分の全層皮膚を採取して移植する方法である。しかしながら、皮膚供与部を一次縫合しなければならないため、（傷創した皮膚に）使用できる（火傷していない）自家皮膚の量は非常に限られている。従って、部分層皮膚移植術が最善の治療方法と知られているが、広範囲の火傷の傷を覆うための生体ドレッシングとして冷凍保管された皮膚または生体皮膚を用いることもある(例えば、非特許文献１参照。)。このような傷に対する冷凍保管された皮膚の移植の性能は、冷凍、解凍といった冷凍保管による角質形成細胞及び繊維芽細胞の生存度の減少のために、新鮮な皮膚（の傷に対する性能）よりも劣っている。その他にも、冷凍保存過程によって、基底膜のような皮膚の物理的組成物のうち一部が破壊されることは、細胞の生存度を減少させる。
【０００３】
従って、このような場合に用いられる人工皮膚に対する研究が多く進んできた。人工皮膚は、初期に表皮と真皮層が別々に開発されて、部分的に臨床に用いられたが、共に問題点が提起されている。現在は、人工真皮移植後、部分層植皮片で覆ったり、培養した表皮細胞で覆ったりする方法が用いられている。人工真皮は、スポンジやゲル状のコラーゲンを用いたり、吸収性ポリマーを用いたりして、作製されている。
【０００４】
参考として、現在までの人工皮膚に対する研究を要約すると、次のようである。
１）培養された自家組織角質層の移植（Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒａｆｔ）
培養した表皮細胞を全層皮膚欠損部位に利用できるということは、１９５０年代から認識されてきた。１９７５年、ラインヴァルト（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）とグリーン（Ｇｒｅｅｎ）により、培養器の底に間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ）を敷き、表皮成長因子(ＥＧＦ)やコレラ毒素などの成長促進剤を添加すると、表皮細胞が迅速に増殖されることが報告された。これらの研究に基づき、少量の表皮細胞を３〜４週間培養すると、細胞は５０００倍に分裂増殖して、成人の体表面(１.７ｍ２)全部に塗布できる程度にまで増殖をする。
【０００５】
表皮細胞を移植用として用いるためには、正常的な分化過程を誘導しなければならない。しかしながら、表皮細胞を姑息的に培地内で培養すると、非正常的な分化が起きる。その結果、これらの細胞は移植用として用いられなくなる。即ち、角質層が形成されず、移植後表皮細胞は乾燥・損失される。加えて、生化学的な分化が不完全に起きて、表皮層の骨格維持と防御機能に問題が発生することになる。プルニラス（Ｐｒｕｎｉｅｒａｓ）等は（例えば、非特許文献２参照。）、培養段階で表皮層を大気に露出させると、形態学的分化が正常的に起きることを言及した。マルグチ（Ｍａｒｕｇｕｃｈｉ）等の研究によると（例えば、非特許文献３参照。）、繊維芽細胞を移植した人工真皮の上で培養すると、生化学的分化が正常的に起きることが分かった。従って、表皮細胞培養の際、人工真皮の上で大気に露出させて培養すると、移植後正常表皮の機能と構造を取り戻せることが分かった。
【０００６】
オ’コナー（Ｏ'ｃｏｎｎｏｒ）は(例えば、非特許文献４参照。)、火傷患者に培養した表皮細胞を最初に用い、（培養した表皮細胞を）潰瘍、母斑、表皮水疱症の部位に移植した。オ’コナー（Ｏ’ｃｏｎｎｏｒ）は、それらの生着率が１５％から５０％までの範囲であることを報告した。しかしながら、それらは、真皮の残っている部位にはよく生着できるが、脂肪、慢性創傷や感染創傷にはよく生着できなかった。
【０００７】
培養した表皮細胞は、生着されても創傷の大きさが３０％程に収縮され、肥厚性瘢痕が部分層植皮術よりよく生じる。また、移植部位が容易に剥がれたり、水脹れが生じたりする。このような現象は、表皮層が不安定で表皮-真皮の結合部が遅く形成されるからである。
【０００８】
２)無細胞性人工真皮
この無細胞性人工真皮は、ヤンナス（Ｙａｎｎａｓ）とバーク（Ｂｕｒｋｅ）により開発されたものである(例えば、非特許文献５参照。)。この人工真皮は、コラーゲンにグリコサミノグリカンを混合し急速に凍結乾燥させた後、高温で真空乾懆させて作製された。創傷部位には表皮層がないため、最初にシラスティックシート（Ｓｉｌａｓｔｉｃ  ｓｈｅｅｔ）で創傷部位を覆ってから、移植後創傷部位に人工真皮が生着すると、シートを剥いで、創傷部位を部分層植皮片で覆う二段階の外科的手術方法を用いなけばならなかった。
【０００９】
この人工真皮は、細孔のあるスポンジ状の構造を有している。移植後、この細孔内に血管、繊維芽細胞、および繊維組織が育ち込む。その結果、新たな真皮構造が形成され、人工真皮は正常細胞に固着する。したがって、細孔の大きさが人工真皮の生着に重要な役割を果たす。細孔の大きさは、グリコサミノグリカンの種類や含量、交差結合方法、冷凍速度、およびコラーゲンの濃度に依存している。細孔の大きさは、５０〜１５０μｍが好適である。この人工真皮は、移植後生着率が５０〜７０％という範囲の相対的に低い生着率を有することが報告されていた。移植部位に血腫がよく淀み、感染率が３８％と高く、体内酵素により早期分解されるという点が、低い生着率の原因として挙げられている。しかしながら、この人工真皮が利用できない最も重要な原因は、移植後新たな真皮の構造が形成される前に、体内のコラーゲナーゼにより人工真皮の骨格が早期分解されるからである。このような問題点を解決するため、人工真皮をグルタルアルデヒドで交差結合させた後に用いたが、このグルタルアルデヒドには、細胞毒性が強いという別の問題があった。一方、移植後細胞が迅速に増殖して新たな真皮が迅速に製造される方法として、グリコサミノグリカンのうち既存のコンドロイチン-６-硫酸の代わりに細胞親和性のよいヘパランスルフェートを用いる方法があり、グルタルアルデヒドの代わりに細胞毒性のないアスコルベイト銅イオンを用いる方法などがあるが、所望の交差結合を誘導するのは困難である。
【００１０】
３)細胞性人工皮膚
細胞性人工皮膚とは、（無細胞性人工真皮の）二回の手術を要するという短所を解決するために、培養した表皮細胞で無細胞性人工真皮を覆って作った二層構造となった人工皮膚である。この人工真皮は、スポンジ状であるため、細孔内に細胞の落ち込む可能性があるため、人工真皮の表面をコラーゲンゲルやシートで覆い、その後表皮細胞をその上に広げる。この人工皮膚は、無細胞性人工真皮のみ移植した場合より創傷収縮が遥かに少なく起きる。培養後１１日から正常基底層（ｌａｍｉｎａ）に類似な構造が形成されると報告されている。
【００１１】
また、この人工皮膚の真皮部位に、培養した繊維芽細胞を植えて、移植後に新たな真皮が迅速に形成されるようにしている。この方法は、７０％の生着率を示したことが報告されており（例えば、非特許文献６参照。）、移植後９日に定着した原繊維（ｆｉｂｒｉｌ）と基底膜が形成されるようになる。この方法は全層皮膚欠損部位に用いられるが、真皮部位の交差結合に使用するグルタルアルデヒドの毒性などの問題が残っている。
【００１２】
４)培養された合成皮膚の移植
培養合成皮膚は、ベル（Ｂｅｌｌ）により開発され、生皮膚等価物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）またはハイブリッド皮膚として知られている人工皮膚である。表皮部位は、コラーゲン溶液に繊維芽細胞を植え収縮させて製造したコラーゲンゲル状の真皮部位の上で、表皮細胞を培養することにより製造される。真皮部位の繊維芽細胞は、コラーゲンゲルを成熟させて人工皮膚の機械的張力を増加させ、操作し易くし、コラゲナーゼ分解作用に抵抗性を持たせ、表皮細胞の増殖を促進させる。また、繊維芽細胞は、新たな基質を生産し、移植後に血管や創傷治癒に関与する細胞が迅速に育ち込ませる。従って、この繊維芽細胞は、人工皮膚の生着に重要な役割を果たす。しかしながら、以下に示す通り、ベル（Ｂｅｌｌ）の方法にはいくつかの問題がある。ベル（Ｂｅｌｌ）の方法で作った真皮部位の細胞間基質は、不規則的に配列している。時間が経つとともに移植部位の細胞の数が減り、手術の際に操作し難くなる。移植後、真皮部位は容易に分解し、それらは表皮細胞の生着率が低いという問題がある。
【００１３】
５)同種皮膚から製造された人工真皮
同種真皮が、全層皮膚欠損部位に移植され、拒否反応なしに皮膚に生着すると、（同種真皮が）真皮層の厚さを補充するため、全層皮膚移植をしたときのように優れた結果が得られる。同種皮膚の免疫反応は細胞により起き、真皮の細胞間基質は拒否反応を起こさない。それゆえ、同種真皮は、細胞間基質の構造を維持するために、細胞が全部除去され凍結乾燥されると移植用として利用可能になる。
このような方法で処理した同種真皮が「ＡｌｌｏＤｅｒｍ」という製品で市販されている。しかしながら、この製品は価格が高く、生きている細胞組織を用いるため、無菌室で大量に培養された生細胞を、医者の処方により患者に迅速に供給する注文生産体系に依存する。
従って、外国で開発された製品を輸入して患者に供給することは、長い期間が掛かる供給過程での細胞壊死現象が問題になる恐れがある。
【００１４】
６)生分解性ポリマーから製造された人工真皮
ランジャー（Ｌａｎｇｅｒ）とヴァカンティ（Ｖａｃａｎｔｉ）により、吸収性ポリマーを用いて、所望の組織を生成する組織工学技法が紹介された後、この技術は、人工皮膚に適用された。生分解性ポリマーで作った人工真皮は、コラーゲンで作製した人工真皮が移植後に炎症がよくでき新たな真皮の骨格がつくられる前に分解される問題点を解決するために、コラーゲンの代わりにポリマーで骨格を作り、そこに繊維芽細胞を植えることにより製造した人工真皮である。米国のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅでポリグラクチンを用いて作製した人工真皮が「Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ」という製品で市販されており、米国特許第５、４６０、９３９号に登録されている。「Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ」は、シラスティックシートで覆われており、生体に移植してから２週後に血管化が完了する。従って、シラスティックシートを除去し部分層植皮片で覆うと、生着率は５１％と報告されている。一方、ポリグラクチンは、生体内で６０日以内に加水分解により分解されるが、人工真皮製作の際は、培地内で培養している間に分解し始める。その結果、移植後のポリグラチンは、はやい時間内に分解されてなくなるため、人工真皮の役割をよく果たせない。
【００１５】
【非特許文献１】Ａｔｎｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂ．Ｓｕｒｇ．”１９８３，２０，ｐ．６２３
【非特許文献２】Ｐｒｕｎｉｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．”１９８３，８１，ｐ．２８
【非特許文献３】Ｍａｒｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．”１９９４，９３，ｐ．５３７
【非特許文献４】Ｏ’ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｌａｎｃｅｔ”１９８１，１，ｐ．７５
【非特許文献５】Ｙａｎｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．”１９８０，１４，ｐ．１０７
【非特許文献６】Ｈａｎｓｂｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，”ＪＡＭＡ”１９８９，２６２，ｐ．２１２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、３次元保持枠で培養された生基質組織及びトランジショナルカーバリング（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖｅｒｉｎｇ）を含む真皮代替物を提供することを目的とする。
本発明の基質組織は、毛根間葉細胞と毛根間葉細胞から分泌される結合組織蛋白質と成長因子を含むことを特徴とする。
本発明の毛根間葉細胞は毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ）と結合組織鞘細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｅｌｌ）を意味する。
【００１７】
毛乳頭１００は、毛髪の成長と維持に重要な役割を果たすと知られている。しかしながら、毛嚢の下半部を取り囲んでおり、微細血管を多く含んでいる結合組織鞘１０２の役割は知られたことがない(図１参照)。
【００１８】
本発明に用いられる毛根間葉細胞は、全ての毛根間葉細胞が可能であるが、頭皮毛根またはひげ毛根の間葉細胞が望ましく、本発明の実施例ではひげ毛根間葉細胞を用いた。
また、参考例１からわかるように、筋繊維芽細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）に特徴的に存在するα-平滑筋蛋白質ＳＭ２２とα-平滑筋アクチンは、繊維芽細胞では殆ど検出されないが、毛根間葉細胞では多く検出される。従って、本発明の毛根間葉細胞は、繊維芽細胞よりは筋繊維芽細胞に近い性質を有する。
【００１９】
また、真皮代替物において最も重要なものは、コラーゲン、フィブロネクチン、デコリン、オステオネクチンのような基質蛋白質と、ＣＴＧＦ、ＰＥＤＦ、ＰＤＧＦ-α、ＩＧＦ、ＴＧＦなどの成長因子と、グリコサミノグリカンなどであるため、本発明は、参考例２からわかるように、先行技術の基質細胞として用いた繊維芽細胞に比べて基質蛋白質および成長因子は多く生産され、基質蛋白質を分解するコラゲナーゼ活性は繊維芽細胞よりも少ない毛根間葉細胞を用いて、皮膚細胞再生能力に優れた真皮代替物が提供できる。
【００２０】
本発明はトランジショナルカーバリングに連結されている３次元の生基質組織を保持枠として含む。
上記トランジショナルカーバリングはポリウレタンまたはシラスティックシートのようなシリコーンゴムで形成されたものが用いられる。
また、３次元保持枠は細胞がそこに付かなければならなく、細胞が一層以上成長できるようにしなければならない。
保持枠には、ナイロン(ポリアミド)、ダクロン(ポリエステル)、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニルクロライド(ＰＶＣ)、ポリカーボネート(ＰＣ)またはニトロセルロースのような非生分解性物質が用いられ、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で使用するためにはポリグラクチン酸、ポリグリコール酸、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、コットン、セルロース、キトサンまたはデキストランなどの生分解性物質を用いらなければならない。
本発明の実施例では、真皮代替物は、コラーゲン-キトサン-グリコサミノグリカンからなった３次元基質保持体中にひげから分離された間葉細胞を培養することにより、作製した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
参考例１: 毛根間葉細胞の分類学上の繊維芽細胞との差異実験
１)  根間葉細胞および繊維芽細胞の培養
男性型の脱毛症患者からひげのある組織を生検してひげ毛根を分離した。分離したひげ毛根の上部２/３を除去した後、残った下部１/３を５％二酸化炭素の下で培養した。繊維芽細胞は、包茎手術時得た皮膚から分離した。培養液はペニシリン(１００Ｕ/ｍｌ)、ストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)、グルタミン(０.５８４ｍｇ／ｍｌ)、２０％牛胎血清が入っている「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ」(ＤＭＥＭ;Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ)を用いた。培養液は３日ごとに交換した。培養４週間後の各細胞を０.２５％トリプシンと０.０２％ＥＤＴＡ溶液にて採取した後、継代培養した。３回継代培養された細胞を用いて１０日間細胞の成長速度を測定した。
【００２２】
２)  免疫組織染色
（３回継代）培養された細胞をメタノールに５分間固定した後、α-平滑筋アクチンに対する単抗体と室温で１時間反応させた。ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ-ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）にて洗浄した後、ビオチン化された坑-マウス抗体（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で１時間、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンで１時間反応させた。１％過酸化水素と５％ジアミノベンジジンにて発色させた後、ヘマトキシリンにて背景染色した。
【００２３】
上記の実験結果は次のようである。
図２ａ及び図２ｂに示したように、繊維芽細胞は、細胞の模様が紡錘状であるが、ひげの間葉細胞は細胞質突起が多く、平らに広がった模様で細胞同士に塊になる特徴を見せた。
また、図３に示したように、細胞の成長速度は、繊維芽細胞がひげの間葉細胞より速かった。
また、図４ａ及び図４ｂに示したように、繊維芽細胞とひげの間葉細胞をα-平滑筋アクチンに対する抗体で免疫染色を施した結果、繊維芽細胞はほとんど染色がなされなかったが、ひげの間葉細胞は染色が濃くなった。これは、ひげの間葉細胞が、繊維芽細胞よりは筋繊維芽細胞に近いことを意味する。
【００２４】
参考例２:毛根間葉細胞および繊維芽細胞からのｃＤＮＡライブラリー作製およびｃＤＮＡ分析を用いた遺伝子発現の頻度差異に関する実験
参考例１の毛根間葉細胞と繊維芽細胞の培養方法と同様の培養方法で、これらの細胞が７０％程度密生状態に育ったとき、ｐｏｌｙ(Ａ＋)ＲＮＡを抽出した。各細胞から抽出したｐｏｌｙ(Ａ＋)ＲＮＡ（５μｇ）およびＵｎｉ-Ｚａｐ  ＸＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用いて、λＺＡＰ  ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングして、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ファージライブラリーは、ＥｘＡｓｓｉｓｔ/ＳＯＬＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたｍａｓｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎにより、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔパージミドｃＤＮＡライブラリーに変換させて、プラスミドクローンにて得た。ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡライブラリーは、Ｘ-ｇａｌ、ＩＰＴＧ、およびアンピシリンを含むＬＢプレートに接種して、白色のコロニーが生じることで確認することができた。各々のコロニーをランダムに選択し、選択したクローンのプラスミドＤＮＡは、プラスミド抽出キット（ＱＩＡｗｅｌｌ-８  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ-ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット）(ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ)を用いて分離された。このＤＮＡの塩基配列は、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡシーケンシングキット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、米国）を用いて決定された。その結果を、ＢＬＡＳＴを用いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースと比較検討することにより、選択されたクローンが既存のどの遺伝子と相同性を有するかを確認した。各々のｃＤＮＡライブラリーからの１４００個のクローンを分析して、基質蛋白質、成長因子、および基質蛋白質の分解酵素に対する遺伝子を比べた。その結果は第１表に示した。
【００２５】
毛根から分離した間葉細胞および皮膚から分離した繊維芽細胞における成長因子、基質蛋白質、および基質蛋白質の分解酵素の遺伝子発現頻度
【表１】
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【実施例】
【００２６】
毛根間葉細胞を用いた真皮代替物の製造
１)ひげから間葉細胞の培養
男性型の脱毛症患者からひげのある組織を生検してひげ毛根を分離した。分離したひげ毛根の上部２/３を除去した後、残った下部１/３を５％二酸化炭素、３７℃の条件で培養した。培養液はペニシリン(１００Ｕ/ｍｌ)、ストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)、グルタミン(０.５８４ｍｇ／ｍｌ)、２０％牛胎血清が入っている「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ」(ＤＭＥＭ;Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ)を用いた。培養液は３日ごとに交換した。培養４週間後の各細胞を０.２５％トリプシンと０.０２％ＥＤＴＡ溶液にて採取した後、継代培養した。
【００２７】
２)皮膚代替物の製造
図５に示したように、コラーゲン-キトサン-グリコサミノグリカンシートを５×８ｃｍに切った後、その上に上記のように培養したひげ間葉細胞５×１０５個をシートの上に載せて、４〜５週間培養した。
図６に示したように、ひげ間葉細胞が３次元保持枠に付いて、よく培養されたことが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明からわかるように、毛根、特にひげ毛根から分離した間葉細胞は、細胞の再生を促進させる成長因子、及び基質蛋白質を繊維芽細胞よりも多くつくる反面、基質蛋白質を分解する酵素は繊維芽細胞よりも少なくつくる。従って、本発明の間葉細胞を用いて作製された真皮代替物は、従来の先行技術に比べて細胞再生効果などが遥かに優れる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、毛根の構造を示す図面。
【図２ａ】図２ａは、培養状態でひげ間葉細胞の様子を示した写真。
【図２ｂ】図２ｂは、培養状態で繊維芽細胞の様子を示した写真。
【図３】図３は、ひげ間葉細胞と繊維芽細胞を１０日間培養したときの成長速度を示したグラフ。
【図４ａ】図４ａは、培養状態でひげ間葉細胞をα-平滑筋アクチンに対する抗体で免疫染色した結果を示した写真。
【図４ｂ】図４ｂは、培養状態で繊維芽細胞をα-平滑筋アクチンに対する抗体で免疫染色した結果を示した写真。
【図５】図５は、３次元保持枠でひげ間葉細胞を培養した結果を示した写真。
【図６】図６は、３次元保持枠で培養されたひげ間葉細胞を染色した結果を示した図面。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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