(57)【要約】本発明は、幹細胞の特定細胞系統、好ましくは、肺細胞への分化を誘発する方法に関する。特定的には、本発明は、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する in vitro 方法に関する。本発明は、特定細胞系統の分化幹細胞を生成させて回収する方法にも関する。本発明は、本発明の方法によって生成した分化幹細胞及び細胞系統も包含する。本発明の一側面では、幹細胞の特定細胞系統、好ましくは、肺細胞への分化を誘発する方法であって：幹細胞を、組織サンプル及び／又は組織サンプルの細胞外培地の存在下、該幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養することを包含し、その際、該分化した幹細胞が該組織サンプルと同じ細胞型である方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する方法であって：
幹細胞を、組織サンプル及び／又は組織サンプルの細胞外培地の存在下、該幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養することを含み、その際、該分化した幹細胞が該組織サンプルと同じ細胞型である方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、該幹細胞が、胚幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、局能性幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞、成体幹細胞、又は、遺伝的に修飾された幹細胞であって、胚幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、局能性幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞、又は成体幹細胞からなる群から選択される遺伝的に修飾された幹細胞からなる群から選択される方法。
【請求項３】
請求項１又は２の方法であって、該幹細胞が、胚細胞株、胚組織、又は体細胞核移動から誘導される方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項の方法であって、該幹細胞がヒト又はマウス胚幹細胞である方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、該幹細胞がヒト胚幹細胞である方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項の方法であって、該組織サンプル及び該幹細胞が類似のマーカーを発現する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項の方法であって、該組織サンプルが単細胞懸濁物である方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項の方法であって、該組織サンプルが該組織の器官形成中に選択される方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項の方法であって、該組織サンプルが、発育の偽腺又は小管段階で選択される方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項の方法であって、該組織サンプルが、上皮組織、内皮結合組織、骨格組織、筋肉組織、腺組織、又は神経組織を含む群から選択される組織細胞型を含んでなる方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項の方法であって、該組織サンプルが、呼吸器官、前立腺、生殖器官、腎臓、膵臓、乳腺、脳、心臓、筋肉、血管又は骨格器官を含む群から選択される器官から誘導される方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項の方法であって、該組織サンプルが、間葉組織と上皮組織の混合物である方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項の方法であって、該組織細胞が、肺の間葉組織から誘導される間葉細胞である方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項の方法であって、該特定細胞系統が、呼吸器系統、前立腺系統、膵系統、乳腺系統、腎系統、腸系統、神経系統、骨格系統、血管系統、肝系統、造血系統、又は心臓系統を含む群から選択される方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法であって、該特定細胞系統が、呼吸器細胞系統である方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法であって、該組織サンプルが、胎児間葉組織、又は胎児間葉組織と上皮組織の混合物を含んでなる方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６の方法であって、該組織サンプルが、胎児肺間葉組織、又は胎児肺間葉組織と上皮呼吸器組織の混合物を含んでなる方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項の方法であって、該幹細胞と該組織サンプルが同時培養されるが直接の細胞−細胞接触がない方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法であって、該幹細胞と該組織サンプルが、透過膜によって分けられる方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法であって、該透過膜が、ミリポア又はヌクレオポアフィルターである方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項の方法によって調製される特定幹細胞系統の分化した幹細胞。
【請求項２２】
請求項２１の分化した幹細胞であって、肺、腎臓、膵臓、乳腺、前立腺、心筋、骨格筋、神経、腸、肝臓、血管内皮細胞又は造血細胞を含む群から選択される分化幹細胞。
【請求項２３】
請求項２１又は２２の分化した幹細胞であって、肺細胞株である分化幹細胞。
【請求項２４】
請求項２１又は２２の分化した幹細胞であって、遺伝的に修飾された分化幹細胞。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか１項の分化した幹細胞を含んでなる細胞組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか１項に従う分化を含む方法によって調製される特定幹細胞系統の中間分化幹細胞であって、前記中間分化幹細胞が、胚内部細胞塊段階から終局分化段階まで部分的に分化されている中間分化幹細胞。
【請求項２７】
請求項２６の中間分化幹細胞であって、肺、腎臓、膵臓、乳腺、前立腺、心筋、骨格筋、神経、腸、肝臓、血管内皮細胞又は造血細胞を含んでなる群から選択される中間分化幹細胞。
【請求項２８】
請求項２６又は２７の中間分化幹細胞であって、肺細胞系統のものである中間分化幹細胞。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか１項の中間分化幹細胞であって、遺伝的に修飾された中間分化幹細胞。
【請求項３０】
請求項２６〜２９のいずれか１項の中間分化幹細胞を含んでなる細胞組成物。
【請求項３１】
組織特異的障害を治療する方法であって：
分化幹細胞又は請求項２１〜２４のいずれか１項による分化幹細胞の生成物であって前記幹細胞が該組織特異的障害の組織に対応するものを得ること；及び
該分化幹細胞を、それを必要とする患者における該組織特異的障害の対応する組織に投与すること
を含んでなる方法。
【請求項３２】
組織特異的障害を治療する方法であって：
中間分化幹細胞又は請求項２６〜２９のいずれか１項による中間分化幹細胞の生成物であって前記幹細胞が該組織特異的障害の組織に対応するものを得ること；及び
該分化幹細胞を、それを必要とする患者における該組織特異的障害の対応する組織に投与すること
を含んでなる方法。
【請求項３３】
請求項３１又は３２の方法であって、該組織特異的障害が、膵嚢胞性繊維炎、気腫、慢性気管炎、先天性肺形成不全、及びウイルス感染症を含む群から選択され、そして、該幹細胞系統が呼吸器細胞系統である方法。
【請求項３４】
請求項３３の方法であって、該呼吸器細胞系統が肺細胞系統である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する方法に関する。特定的には、本発明は、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する in vitro 方法に関する。本発明は、特定細胞系統の分化幹細胞を生成させて回収する方法にも関する。本発明は、本発明の方法によって生成した分化幹細胞及び細胞系統も包含する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、成熟した一連の機能性細胞を生じさせることができる未分化細胞である。胚幹（ＥＳ）細胞は胚から誘導され、そして、マウスにおいては、in vitro で白血球阻害因子（ＬＩＦ）の存在下で維持されたときに多能性であるので、何らかの器官、細胞型又は組織型に発育できる能力を有している。更には、ＬＩＦの不存在下で細胞凝集物として吊り下がった滴（hanging drops）中で生育したときは、マウスＥＳ細胞は、３種全ての胚芽層、即ち、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の代表物に分化する。かくして、そのような凝集物は、胚様体（ＥＢ）と呼ばれる。
【０００３】
幹細胞における分化のプロセスは、未成熟細胞の、種々の細胞系統の遂げられかつ十分に成熟した細胞への選択的発育を包含する。そのような細胞系統の由来物には、呼吸器細胞、筋肉細胞、神経細胞、骨格細胞、血液（造血）細胞、内皮細胞及び上皮細胞が含まれる。幹細胞の分化は、種々の増殖因子及び調節分子によって惹起されることが知られている。分化の間、幹細胞特異的遺伝子及びマーカーの発現が失われることが多いので、細胞は、体細胞又はそれらの前駆体の遺伝子発現プロフィールを獲得する。幾つかの場合、“マスター”遺伝子が、分化ｖｓ自己更新を制御すると説明されている。
【０００４】
幹細胞の種々の細胞系統への分化はある程度の確実性で誘発され得るが、ある集団の幹細胞の分化成果物はあまり予測可能ではない。特定の細胞型を誘発する条件下に細胞を置くことは、分化成果物を調節する試みの一形態である。これら条件には、典型的には、細胞を高いか又は低い密度で生育すること、培地を変えること、サイトカイン、ホルモン及び増殖因子を導入するか又は除去すること、適する基質を提供するなどの特定の細胞型への分化に適する環境を創ることが含まれる。
【０００５】
一般に、幹細胞培養が誘発されて分化するとき、分化した集団は、特定の細胞型について、遺伝子、マーカーの発現又は表現型分析により分析される。次いで、それぞれの細胞型が、それらのパーセント集団率を豊富化して最終的に純粋な細胞型と培養物を得るために、典型的には選択的に培養される。しかしながら、このやり方で特定細胞系統の分化細胞を回収することは、時間がかかりかつ複雑である。
【０００６】
特定細胞系統の分化幹細胞の回収は、移植又は in vitro 及び in vivo での薬剤スクリーニング及び薬剤発見に有用であり得る。幹細胞の分化を誘発する方法及びそれから生成した分化細胞は、組織発育及び再生にある役割を果たす分化因子のような、遺伝子、タンパク質の発見のための、組織発育の細胞生物学及び分子生物学の研究に使用されることができる。
【０００７】
特に、幹細胞が特定細胞系統に分化されるように誘発することは、移植及び治療目的のために、並びに潜在的なヒトの疾患モデルを培養で提供するために（例えば、医薬品を試験するために）有用である。特定細胞系統への幹細胞の分化の誘発は、組織特異的疾患及び状態のための治療方法及び治療品を開発するのに特に有用である。
【０００８】
従って、in vitro での幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する効果的な方法を提供し、次いで、好ましくは、特定細胞系統の分化幹細胞を回収する効率的で信頼性のある方法を提供する必要性が存在している。
【発明の要旨】
【０００９】
本発明の一側面では、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する方法であって：
幹細胞を、組織サンプル及び／又は組織サンプルの細胞外培地の存在下、該幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養することを含み、その際、該分化幹細胞が該組織サンプルと同じ細胞型である方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、組織サンプルは、組織細胞を実質的に単細胞懸濁物に形成するように処理される。別のやり方では、組織サンプルは、幹細胞と一緒に培養する前にシートとして調製される。組織サンプルは、好ましくは、胚、胎児又は分娩後組織から誘導される。最も好ましくは、それら組織細胞は間葉細胞である。従って、それら組織細胞は、好ましくは、胚の肺間葉細胞から誘導される。
【００１１】
本発明の方法で使用される幹細胞は、好ましくは胚幹（ＥＳ）細胞である。本発明の方法で使用される組織細胞及び／又は幹細胞は、タグが付されていてもよい。好ましくは、使用される幹細胞は、分化した幹細胞の特定を可能にするトランスジェニックマーカータンパク質を発現する。それら幹細胞は、特定細胞系統へ、好ましくは、呼吸器、前立腺、膵臓、乳腺、腎臓、腸、神経、骨格、血管及び肝臓からなる群から選択される特定細胞系統へ分化するように誘発されることができる。
【００１２】
本発明の別の側面では、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する方法であって：
第１サンプルの幹細胞を第２サンプルの組織細胞と混合して細胞混合物を形成する段階；
該細胞混合物を、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養する段階を含み、その際、該分化幹細胞が該組織サンプルと同じ細胞型である方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、組織細胞は、幹細胞と混合される前は、実質的に単細胞懸濁物中にある。別のやり方では、それら組織細胞は、未分化胚様体を包むためのシートとして調製される。未分化胚様体は、好ましくは、ＬＩＦの存在下でＥＳ細胞を吊り下がった滴中で培養することにより調製される。好ましくは、その培養段階は、細胞混合物を透過膜上で生育させることを包含し、その際、その膜は培地と接触しており、その結果、それら幹細胞が特定細胞系統へ分化するよう誘発される。
【００１４】
本発明の別の側面では、特定細胞系統の分化幹細胞を生成させる方法であって：
幹細胞を、組織サンプル及び／又は組織サンプルの細胞外培地の存在下、該幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養すること；及び
特定細胞系統の分化幹細胞を回収することを包含し、その際、該分化幹細胞が該組織サンプルと同じ細胞型である方法が提供される。
【００１５】
好ましくは、組織サンプルは、幹細胞と一緒に培養される前に、組織細胞を実質的に単細胞懸濁物に形成するように処理される。別のやり方では、それら組織細胞は、未分化胚様体を包むためのシートとして調製される。
【００１６】
本発明の好ましい側面では、特定細胞系統の分化幹細胞を生成させる方法であって：
幹細胞を、組織細胞の存在下、該幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養すること；及び
特定細胞系統の分化幹細胞を回収することを包含し、その際、該分化幹細胞が該組織細胞と同じ細胞型である方法が提供される。
【００１７】
好ましくは、組織細胞は、幹細胞と一緒に培養される前は、実質的に単細胞懸濁物中にある。別のやり方では、それら組織細胞は、未分化胚様体を包むためのシートとして調製される。
【００１８】
培養段階は、好ましくは、幹細胞が透過膜の第１表面上で生育されるようにし、そして組織細胞がその透過膜の反対側の第２表面上で生育されるようにすることを包含し、その際、その膜が培地と接触している結果、それら幹細胞が特定細胞系統へ分化するように誘発される。そうすると、特定細胞系統の分化幹細胞が、その透過膜の第１表面から回収されることができる。
【００１９】
本発明の方法では、組織細胞は、胚、胎児又は分娩後組織から誘導されることができる。好ましくは、それら組織細胞は、胚の間葉細胞である。より好ましくは、それら組織細胞は、肺間葉細胞、より好ましくは、胚の肺間葉細胞から誘導される。本発明の方法で使用される幹細胞は、好ましくは胚幹（ＥＳ）細胞である。本発明の方法で使用される組織細胞及び／又は幹細胞は、タグが付されていてもよい。好ましくは、使用される幹細胞は、分化幹細胞の特定を可能にするトランスジェニックマーカータンパク質を発現する。それら幹細胞は、好ましくは、呼吸器、前立腺、膵臓、乳腺、腎臓、腸、神経、骨格、血管及び肝臓からなる群から選択される特定細胞系統へ分化するように誘発されることができる。
【００２０】
本発明の方法では、培養段階は、好ましくは、幹細胞の分化を促進するために増殖因子を添加することを包含する。適する増殖因子は、好ましくは、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）又はステロイドホルモン（例えば、グルココルチコイド、ビタミンＡ、甲状腺ホルモン、アンドロゲン及びエストロゲン）から選択されることができる。
【００２１】
本発明の別の側面では、これまでに記載した方法に従って生成する特定細胞系統の分化幹細胞が提供される。好ましくは、分化幹細胞は、肺、腎臓、前立腺、心筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞又は造血細胞、乳腺細胞、唾液腺細胞、神経細胞、肝細胞、腸細胞又は膵臓細胞である。本発明は、本発明の方法に従って生成された分化幹細胞であって、組織修復、移植、細胞療法又は遺伝子療法に使用されることができる分化幹細胞も提供する。
【００２２】
本発明は、更に、本発明の方法によって生成された分化幹細胞、及び担体を含む細胞組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
本発明の一側面では、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する方法であって：
幹細胞を、組織サンプル及び／又は組織サンプルの細胞外培地の存在下、該幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養することを含み、その際、該分化幹細胞が該組織サンプルと同じ細胞型である方法が提供される。
【００２４】
本発明者らは、特定細胞型の組織サンプルの存在下で幹細胞を培養することが、特定細胞系統を偲ばせる分化幹細胞を生成させる有効な手段を提供することを見出した。本発明の方法では、幹細胞の分化成果物は、その分化幹細胞がその幹細胞との同時培養に使用された組織サンプルと同じ細胞型である（即ち、好ましくは類似の組のマーカーを発現する）として確認されることができる。
【００２５】
本発明の方法では、組織サンプルは、好ましくは、幹細胞と一緒に培養される前に、組織細胞が実質的な単細胞懸濁物を形成するように処理される。実質的な単細胞懸濁物にある組織細胞は、その組織細胞によって産生される分泌産物及び化学的キューの曝露と接触を増進して、同時培養における幹細胞の分化に作用しそれを誘発する。本発明者らは、幹細胞と同時培養される単細胞懸濁物中の組織細胞が、それら組織細胞と一緒に凝集した分化幹細胞を含んでなる異型組織を形成する傾向があり、その際、その分化幹細胞がその組織細胞と同じ細胞型であることを見出した。更には、組織細胞が、未分化胚様体がその中に包まれるところのシートとして調製されると、その幹細胞が、その組織シートがそれから誘導された組織の特徴を有するところの細胞から構成される異型組織を形成することを見出した。
【００２６】
本明細書で使用される“幹細胞の特定細胞系統への分化を・・・包含し”という用語は、幹細胞への直接的又は意図的な影響の結果として、その幹細胞を特定分化細胞系統に発育させることを意味する。幹細胞における分化を誘発できる影響因子には、イオン流入、ｐＨ変化、及び／又は、分化を調節又は惹起する増殖因子やサイトカインのような分泌タンパク質のような細胞外因子、などの細胞性パラメーターが含まれる。細胞を集密体にまで培養することも含まれ得、それは細胞密度によって影響を受け得る。
【００２７】
本発明の好ましい態様では、幹細胞の特定細胞系統への分化は、幹細胞を実質的に単細胞懸濁物中にある組織細胞と同時培養して、好ましくは異型組織（即ち、組織細胞と一緒に凝集した分化幹細胞）を形成させることにより達成される。組織細胞と一緒に凝集した分化幹細胞の異型再結合体が好ましくは形成され、その際、その分化幹細胞はその組織細胞と同じ細胞型になる。実質的に単細胞懸濁物中にある組織細胞が、幹細胞が分化してその組織細胞との異型再結合を in vitro で形成するのを大きく誘発する。
【００２８】
本明細書で使用される“特定細胞系統”という用語は、特定の細胞型の祖先のことを言うものと解され、それには、祖先細胞及びその特定細胞型を産生するまでに発生したその後の全ての細胞分裂物を包含する。特定細胞系統の分化幹細胞は、同じ細胞型を有する細胞のグループである。同じ細胞型の細胞は、それらの関連細胞間物質とともに、相互に類似しているので、多細胞生物内で同じ機能を果たす。同じ細胞型の細胞は、好ましくは、類似の組のマーカーを発現する。主要な組織細胞型には、上皮、内皮結合、骨格、筋肉、腺、及び神経組織が含まれるが、これらに限定されない。本法では、幹細胞は、好ましくは組織細胞と同時培養されて、その幹細胞がその組織細胞と同じ細胞型である特定細胞系統に分化するよう誘導される。
【００２９】
本発明の方法では、幹細胞は培養前は未分化であり、分化を受けることができるどのような細胞であってもよい。幹細胞は、胚幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、局能性幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞、又は成体幹細胞を包含するがこれらに限定されない群から選択されることができる。幹細胞は、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはマウス又はヒトから誘導されるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の方法で使用される幹細胞は、好ましくは胚幹（ＥＳ）細胞である。この幹細胞は、好ましくは、胚から、胚幹細胞の培養物から、又は体細胞核移動から直接に誘導されることができる哺乳動物の胚幹細胞である。幹細胞は他の哺乳動物から誘導されてもよいが、それらは最も好ましくはヒト胚幹細胞である。本発明の方法で使用される胚幹（ＥＳ）細胞には、胚から誘導される胚細胞又は胚外組織から誘導される細胞が含まれる。適する胚幹細胞には、これまでに記載されたもののような商業的に入手可能なもの（Reubinoff et aL, 2000）又はｈＥＳ１、ｈＥＳ３、ｈＥＳ４、ｈＥＳ５、又はｈＥＳ６が含まれる。これら細胞は、ES Cell International Pte Ltd. から入手することができる。
【００３１】
本明細書で使用される“胚”という用語は、哺乳動物においては受胎後２週間までであってもよいあらゆる受精後の段階として定義される。マウスなどの哺乳動物についての胚体期間は、約４〜６日間である。胚は、細胞分裂の繰り返しから発育して、外部栄養外胚葉と内部細胞塊（ＩＣＭ）を含んでなる芽細胞段階の諸段階を含む。胚は、in vitro で受精した胚であっても、体細胞若しくは細胞核の、好ましくはヒト又は非ヒト起源の除核卵母細胞への移入によって誘導される胚であってもよい。胚外組織には、胎盤を構成する細胞であって胚によって産生された細胞が含まれる。
【００３２】
本発明の方法に使用できる適する胚幹（ＥＳ）細胞には、哺乳動物ＥＳ細胞が含まれる。ＥＳ細胞は、多能性を有することで知られており、制御された分化を受けて多様な細胞系統を in vitro で生成することができる。
【００３３】
幹細胞は、組織細胞の存在下で培養されて、その幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発することができる。胚幹細胞は、培養皿の表面へのそれらの付着を防ぐために、細菌グレードのペトリ皿中に培地を含有するメチルセルロース中で又は吊り下がった滴中のいずれかで培養されて、胚様体（ＥＢ）として知られる分化細胞のコロニーの発生を誘発する。ＥＢは、３種全ての胚芽層（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）の細胞代表物を含有し、特定の培養条件下では、特定細胞系統の純粋な調製物を発生するように導かれかつ操作されることができる。
【００３４】
本法で使用される幹細胞は、胚細胞株、胚組織、又は体細胞核移動から誘導されることができる。胚幹細胞は、培養されて未分化状態に維持された細胞であることができる。使用されるＥＳ細胞は、組織サンプルの単細胞懸濁物と一緒の培養が意図されるなら、単細胞懸濁物として使用されてもよい。また、ＥＳ細胞は、調製された組織シート内に包まれる培養が意図されるなら、それらが未分化凝集物を形成できるように、ＬＩＦの存在下で吊り下がった滴として生育されてもよい。これら凝集物は、未分化胚様体として知られている。
【００３５】
本法での使用に適する幹細胞は、患者自身の組織から誘導されることができる。このことは、幹細胞から誘導される分化組織移植片とその患者との適合性を増進させる。幹細胞は、使用前に、それらの胚細胞への又は胚細胞からの細胞外培地への曝露前、曝露中に又は曝露後にそれらの分化の状態を制御することができる遺伝子の導入により、遺伝子的に修飾されてもよい。それらは、Ｏｃｔ−４のような幹細胞特異的プロモーターの制御下で選択的マーカーを発現するベクターの導入により、遺伝子的に修飾されてもよい。
【００３６】
幹細胞は、あらゆる段階においてマーカーで遺伝的に修飾されて、それらマーカーがあらゆる培養段階を通して保持されるようにされることができる。マーカーは、あらゆる培養段階において分化又は未分化幹細胞集団を精製するために使用されることができる。トランスジェニックマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、誘発後に要求される時間における、蛍光励起分離捕集（ＦＡＣ）を利用する純粋な幹細胞由来物の単離を可能にする。本発明の方法により生成された分化幹細胞は、突然変異を有するように遺伝的に修飾されてもよい。特定細胞系統へ分化するように誘発された遺伝的に修飾された幹細胞は、有用な培養モデルであるので、遺伝子療法剤の送達のための経路を提供することができる。
【００３７】
本発明の方法では、幹細胞は、特定細胞系統へ、好ましくは、呼吸器、前立腺、膵臓、乳腺、腎臓、腸、神経、骨格、血管、肝臓、造血、筋肉又は心臓細胞系統からなる群から選択される特定細胞系統へ分化するように誘発されることができる。好ましくは、幹細胞は、呼吸器細胞系統へ分化するように誘発される。
【００３８】
本明細書で使用される“組織サンプル”という用語は、組織抽出物、細胞培養培地、生検片又は切除された組織を包含するがこれらに限定されない。組織サンプルには、好ましくは、組織細胞が含まれる。組織サンプルには、好ましくは、相互に類似している細胞のグループである組織細胞であって多細胞生物内で同じ機能を果たす組織細胞がそれらの関連細胞間物質と一緒に含まれる。主要な組織細胞型には、上皮、内皮結合、骨格、筋肉、腺、及び神経組織が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
組織サンプルは、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト対象から誘導される。より好ましくは、組織サンプルは、呼吸器、生殖器官、腎臓、脳、心臓、筋肉及び骨格器官のような種々の哺乳動物器官から誘導された組織であるがこれらに限定されない。組織サンプルには、好ましくは、胚、胎児又は分娩後組織から誘導された組織細胞が含まれる。胎児又は分娩後組織などの強力な誘発特性を有する組織サンプルが使用されるのが好ましい。
【００４０】
最も好ましくは、組織細胞は間充織細胞である。間充織細胞は間葉組織から誘導され、その間葉組織とは、細胞外基質内に含有される細胞から構成される胚結合組織である。間充織組織は、より多くの容認性細胞集団が組織特異的なやり方で分化するよう誘発するように作用する強力な誘発シグナルを係留している。例えば、マウスの肺の間充織は、マウス唾液腺上皮及び正常なら分枝状ではない仔マウス気嚢上皮へ移植されたときにマウス様分枝パターンを誘発することができる。更には、分枝状呼吸管から単離された胎児の間充織は、正常なら表面活性タンパク質Ｃ非産生性である予定胎児の気管上皮と組み合わせたときに、表面活性タンパク質Ｃ産生を誘発することができる。同じく、予定胎児の気管から単離された胎児の間充織は、正常なら表面活性タンパク質Ｃ産生性である呼吸管上皮と組み合わせたときに、表面活性タンパク質Ｃ産生を阻害することができる。後者の場合には、この呼吸器上皮は、気管上皮の形態に似始める。
【００４１】
しかしながら、どのような間充織が、胚幹細胞株、神経幹細胞株又は間葉幹細胞株などの原始細胞株の分化を導くことができるかは、これまで明らかではなかった。
理論に拘束されるものではないが、成体上皮は、間充織からの誘発シグナル又は指示シグナルに応答して全く新しい器官型の表現型を生じさせる能力を有する成体幹細胞集団に該当するかもしれない上皮細胞の多能性集団を含有するようである。しかしながら、間充織の誘発シグナル又は指示シグナルの特性が胚幹細胞の直接の分化に十分であるという考えは、これまで知られていないので意外なことであった。
【００４２】
本発明の方法で肺の分化に適用されるときの使用に適する組織細胞は、好ましくは、肺の間充織胚組織、つまり胚組織から誘導される。それら組織細胞は、好ましくは、全肺組織サンプル、シートとしての肺の上皮及び／又は間充織、又は単細胞懸濁物中の肺の間充織及び／又は上皮であることができる。本発明の方法では、培養段階に、胎児又は分娩後組織サンプル（上皮又は間葉組織を含む組織の全組織供給源又は一部）が関与する埋め込み技術が含まれる。
【００４３】
組織は、器官形成中に、好ましくは、興味の対象である器官が現実に発育しているときに選択されるのが最も好ましい。その器官について期間が特定されると、そのＥＳ細胞の分化について組織を選択するのに最適な発育期間を決定することができる。そのような最適化は、その組織型及び発育期間を知ることにより及び区分した期間から組織を選択することにより行われることができる。幹細胞における呼吸器系統分化を指示するための最適段階として偽腺 (pseudoglandular) 及び小管 (canalicular) 段階が最も好ましい。
【００４４】
正常な間葉組織も疾患のある間葉組織も、幹細胞の分化を誘発するのに使用されることができる。組織が腫瘍組織などのしかしそれに限定されない疾患のある組織である場合には、催腫瘍性間葉組織又は間質組織が使用されてもよい。これらには、疾患患者からの悪性、前悪性又は良性の間質が含まれ得る。好ましくは、テストステロン及び／又はエストロゲン治療のようなホルモン治療が、幹細胞をこれら病的状態に誘導するために本誘発プロセスに伴う。
【００４５】
本明細書で使用される“細胞外培地”という用語は、組織細胞をこれまでに記載したように培地中で、その組織細胞によって産生される分泌タンパク質などの細胞外因子がその培地中に存在するようになる時間だけ生育させることから生成される馴化培地を意味する。その培地は、細胞の生育を励起する成分を含むことができ、例えば、ダルベッコ最少必要培地、ＢＧＪＢ−Fitton Jackson 修飾培地、Ham's F12、又はウシ胎児血清などの基本培地が含まれる。細胞外培地は、好ましくは、幹細胞の分化を誘発することができる分泌タンパク質などの細胞性因子を含むことができる。そのような分泌タンパク質は、典型的には、細胞表面上のレセプターに結合して、その細胞の分化を開始させることができる細胞内経路の引き金となる。適する細胞外因子の例には、ＨＧＦ及びＦＧＦが含まれる。細胞外培地は、ステロイドのような極性分子をも含有することができる。それら極性分子は、細胞膜及び／又は核膜を通過して細胞内因子と結合することができ、そうすると、それら因子は、ある応答の引き金を引いてその細胞の分化を開始させる。適する極性分子の例には、レチノイド、グルココルチコイド、エストロゲン及びアンドロゲンが含まれる。
【００４６】
本発明の方法で使用される組織細胞及び／又は幹細胞は、タグが付されていてもよい。好ましくは、使用される幹細胞及び／又は組織細胞は、分化した幹細胞の特定を可能にするトランスジェニックマーカータンパク質を発現する。幹細胞によって発現されるリポーター遺伝子、及び組織特異的マーカーについての二重染色が、培養中の分化幹細胞の誘発性組織細胞に関する部分を確認するのに使用されることができる。例えば、サイトケラチンなどの上皮特異的マーカー、ビメンチンなどの間葉マーカー、又は表面活性タンパク質Ｃなどの系統特異的マーカーが使用されることができる。
【００４７】
本発明の方法では、培養段階は、培養中の組織細胞の増殖により生成する組織細胞単層に幹細胞を導入することを包含することができる。好ましくは、その組織細胞単層が集密体にまで生育され、そして、幹細胞は、その組織細胞の細胞外培地の存在下でその幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発するのに十分な時間生育するようにされ、その際、その分化幹細胞はその組織細胞と同じ細胞型になる。また、幹細胞は、十分に分化した組織細胞からみると中間前駆体である状態までの分化を誘発するだけの時間生育されてもよい。また、幹細胞は、組織細胞の細胞外培地を含有するが組織細胞が存在しない培養液中で生育されてもよい。組織細胞と幹細胞は、フィルター又は寒天などの無細胞マトリックスにより互いに分離されることができよう。
【００４８】
分化幹細胞を誘導するのに適する条件は、幹細胞の更新には非容認性であるが、幹細胞を死滅させたりそれらを専ら胚外細胞系統に分化させたりしない条件である。幹細胞の生育にとって最適な条件から徐々に引き離すことは、その幹細胞の特定細胞型への分化に有利である。適する培養条件には、分化速度及び／又は分化効率を高めることができるレチノイド、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン又は増殖因子の同時培養液への添加が含まれる。例えば、図２及び３は、そのような増殖因子が、マウスＥＳ及び神経幹細胞が in vitro で呼吸器系統分化を受けるのを誘発できることを証明している。
【００４９】
他の適する培養条件には、細胞密度などの要因を考慮することが含まれる。組織細胞がプレートされるなら、それらが集密体にまで生育されるのが好ましい。次いで、幹細胞が好ましくは分散され、次いで、組織細胞の単層に導入されることができる。その単層は、好ましくは、ＤＭＥＭ又はＭ１６培地のような適する培地中で集密体にまで生育される。より好ましくは、幹細胞と組織細胞は、幹細胞の実質的な部分が分化されるまで同時培養される。
【００５０】
本発明の別の側面では、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する方法であって：
第１サンプルの幹細胞を第２サンプルの組織細胞と混合して細胞混合物を形成する段階；
該細胞混合物を、幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養する段階を含み、その際、該分化幹細胞が該組織サンプルと同じ細胞型である方法が提供される。
【００５１】
好ましくは、組織細胞は、幹細胞と混合される前は、実質的に単細胞懸濁物中にある。別のやり方では、それら組織細胞は、未分化胚様体を包むためのシートとして調製される。好ましくは、その培養段階は、その細胞混合物を透過膜上で生育させることを包含し、その際、その膜は培地と接触しており、その結果、それら幹細胞が特定細胞系統へ分化するよう誘発される。その透過膜が培地上に浮いており、かつその細胞混合物が空気との界面にあるのが好ましい。そのような目的に適する膜は、好ましくは０.２２μｍ未満の気孔サイズを有するミリポアフィルター又はヌクレオポアフィルターである。
【００５２】
本発明の別の側面では、特定細胞系統の分化幹細胞を生成させる方法であって：
幹細胞を、組織サンプル及び／又は組織サンプルの細胞外培地の存在下、該幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養すること；及び
特定細胞系統の分化幹細胞を回収することを包含し、その際、該分化幹細胞が該組織サンプルと同じ細胞型である方法が提供される。
【００５３】
好ましくは、組織サンプルは、幹細胞と一緒に培養される前に、組織細胞を実質的に単細胞懸濁物に形成するように処理される。別のやり方では、それら組織細胞は、未分化胚様体を包むためのシートとして調製される。
【００５４】
幹細胞又は誘発性組織がＧＦＰなどの蛍光マーカーを含有するなら、純粋な分化幹細胞がＦＡＣＳによって回収され得る。別のやり方では、誘発性組織が幹細胞とは反対のフィルター表面で生育されるなら、分化幹細胞の純粋な集団が、そのフィルターからの機械的解離によって回収され得る。
【００５５】
本発明の好ましい側面では、特定細胞系統の分化幹細胞を生成させる方法であって：
幹細胞を、組織細胞の存在下、該幹細胞の特定細胞系統への分化を誘発する条件下で、in vitro で培養すること；及び
特定細胞系統の分化幹細胞を回収することを包含し、その際、該分化幹細胞が該組織細胞と同じ細胞型である方法が提供される。
【００５６】
好ましくは、組織細胞は、幹細胞と一緒に培養される前は、実質的に単細胞懸濁物中にある。別のやり方では、それら組織細胞は、未分化胚様体を包むためのシートとして調製される。
【００５７】
培養段階は、好ましくは、幹細胞が透過膜の第１表面上で生育させるようにし、そして組織細胞がその透過膜の反対側の第２表面上で生育させるようにすることを包含し、その際、その膜は培地と接触しており、その結果、それら幹細胞が特定細胞系統へ分化するよう誘発される。そうすると、特定細胞系統の分化幹細胞は、その透過膜の第１表面から回収されることができる。透過膜は、好ましくは、誘発性組織と幹細胞がその膜フィルターの反対側に載せられるトランスフィルターであるが、これに限定されない。
【００５８】
本発明の方法では、幹細胞と組織細胞は、培養中に互いに直接に細胞−細胞接触している必要はない。幹細胞と組織細胞は、その膜を通って可溶性の伝達可能シグナルが拡散できる透過膜により隔てられていてもよい。適する透過膜には、好ましくは、ミリポアフィルター又はヌクレオポアフィルターなどのトランスフィルター膜が含まれる。これまでに記載した培養液中でのトランスフィルター膜の使用は、特定細胞系統への分化が誘発された幹細胞の、分離しかつ純粋な集団を得るための便利で効率的な手段を提供する。
【００５９】
特定系統の純粋な分化幹細胞の単離を容易にするために、先に記載した分化幹細胞と誘発性組織細胞の異型再結合体が、ヌクレオポアフィルター又はミリポアフィルターなどの透過膜によって分離されることができる。分化幹細胞の特定細胞型を評価するために二重染色が行われることもできる。
【００６０】
これまでに記載した方法において、組織細胞は、胚、胎児又は分娩後組織から誘導されることができる。好ましくは、組織細胞は胚の間葉細胞である。より好ましくは、それら組織細胞は、肺の間充織組織から誘導される。本発明の方法で使用される幹細胞は、好ましくは胚幹（ＥＳ）細胞である。本発明の方法で使用される組織細胞及び／又は幹細胞は、タグが付されていてもよい。好ましくは、使用される幹細胞は、分化した幹細胞の特定を可能にするトランスジェニックマーカータンパク質を発現する。それら幹細胞は、特定細胞系統へ、好ましくは、呼吸器、前立腺、膵臓、乳腺、腎臓、腸、神経、骨格、血管又は肝臓からなる群から選択される特定細胞系統へ分化するように誘発されることができる。
【００６１】
本発明の方法では、培養段階は、好ましくは、幹細胞の分化を増進するために増殖因子を添加することを包含する。適する増殖因子は、好ましくは、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）又はステロイドホルモン（例えば、グルココルチコイド、ビタミンＡ、甲状腺ホルモン、アンドロゲン及びエストロゲン）、又は、インスリン、血清若しくはコレラ毒素などの他の適する増殖促進因子から選択されることができる。例えば、幹細胞の前立腺細胞系統への分化を促進するには、ＦＧＦ及びＴＧＦβスーパーファミリーなどの増殖因子を培養液に添加してもよい。
【００６２】
本発明の方法から生成された特定細胞系統の分化幹細胞は、その分化幹細胞を適する哺乳動物宿主内に導入することによって培養で拡大させることができ、その結果、それら細胞が in vivo で生育するようになる。例えば、呼吸器細胞系統へ分化するように誘発された幹細胞は、in vivo 指示された分化のために宿主の腎臓カプセル内に移されることができる。例えば、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの腎臓が、ポケットを創るために行われる外面化と浅い切開とによって露出されることができる。このポケット内に組織／幹細胞凝集物を入れることができる。その組織／幹細胞凝集物を含有する腎臓を元通りに押し込んで傷ついた皮膚を閉じた後、その組織／幹細胞凝集物が in vivo でインキュベートされることになる。これは、典型的には２〜４週間行われる。そのような様式での動物血液供給体への曝露は、誘発性組織の自然の生理学的状態に関連する濃度にほぼ等しい濃度で血液中に存在する増殖因子及び分化因子によるその凝集物の持続的誘発を可能にする。そのような濃度は、その幹細胞凝集物内で推進される幹細胞の誘発にある関連する役割を果たすと考えられる。好ましくは重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの使用は、外来幹細胞凝集物の移植に付随する免疫学的許容性に起因してその移植片が拒絶される可能性を最小限にする。
【００６３】
本発明の別の側面では、これまでに記載した方法に従って生成された特定細胞系統の分化幹細胞が提供される。好ましくは、その分化幹細胞は、肺、腎臓、膵臓、乳腺、前立腺、心筋、骨格筋細胞、神経細胞、腸細胞、肝臓細胞、血管内皮細胞又は造血細胞であるが、それらに限定されない。本発明は、本発明の方法に従って生成された、組織修復、移植、細胞療法若しくは遺伝子療法のために使用されることができる分化幹細胞をも提供する。
【００６４】
本発明の方法は、膵嚢胞性繊維炎、気腫、慢性気管炎、先天性肺形成不全及びウイルス感染症を包含する呼吸器特異的障害などの組織特異的障害のための細胞に基づく治療法を開発する基礎をも提供する。例えば、幹細胞を肺組織細胞と同時培養して中間的呼吸器細胞系統に分化された幹細胞を得ることができる。中間的細胞系統は、胚内細胞塊からの派生と望まれる細胞型の終局分化前との間の段階におけるあらゆる細胞型を代表する。次いで、それら中間的に分化した幹細胞は、拡大してその数を拡大させることができる。次いで、中間細胞は、薬剤発見プログラムのために培養皿中で終局的な分化に付されることができる。別のやり方では、それら中間的に分化された幹細胞は、損傷し又は最適に機能しなくなった呼吸器組織の in vivo での置換を必要とする細胞置換療法において、宿主（即ち、例えば、呼吸器疾患を患ったマウス又はヒト）に移されてもよい。
【００６５】
本発明は、前立腺構造などの特定組織構造を作り上げるための基礎も提供する。間質に囲まれた前立腺構造が、上皮新形成の原因となるメカニズムを特定及び描写するために作り上げられることができる。更に、本発明の技術は、細胞を他の系統の特定細胞型（例えば、膵臓、乳腺、腎臓、腸及び肝臓系統）へ in vitro で制御して分化させるための基礎を提供する。
【００６６】
分化細胞及びそれらの中間体は、増殖因子、分化因子又は組織再生を制御する因子を含むがこれらに限定されない新規な遺伝子産物の単離又は特定のための源として、又は新規なエピトープに対する抗体を発生させるために使用されることができる。
【００６７】
本発明の方法に従って生成する分化細胞はコロニーにまで拡大されることができる。特定の分化細胞型が、他の細胞型の混合物から選択的に培養され、その後に拡大されてもよい。コロニーにまで拡大した特定の分化細胞型は、移植療法に十分な細胞の生産、遺伝子発見の研究に十分なＲＮＡの生産等の種々の用途に有用であり得る。それら分化細胞は、慣用的な方法に従って細胞株を樹立するのに使用されることができる。
【００６８】
本発明の方法に従って生成する分化細胞は、遺伝的に修飾されてもよい。例えば、遺伝子構築物が、培養のいずれかの段階で分化細胞に挿入されてもよい。遺伝的に修飾された細胞は、遺伝子療法の途中に標的器官中に遺伝子を保持させて発現させるために移植後に使用されることができる。
【００６９】
本発明の方法に従って生成する分化幹細胞は、生物学的材料の保管に適するどのような方法によっても保存され又は維持されることができる。分化細胞の効果的な保存は、将来の複数回使用のための細胞の継続的保管を可能にするので、非常に重要である。細胞株の低温保存のために広く利用される伝統的低速凍結法が、分化細胞を低温保存するために使用されることができる。
【００７０】
本発明は、更に、本発明の方法に従って生成する分化細胞と担体とを含む細胞組成物を提供する。担体は、細胞を維持するあらゆる生理学的許容性担体であってもよい。それはＰＢＳであっても当業者に知られている他の最少必要培地であってもよい。本発明の細胞組成物は、生物学的分析又は移植などの医療目的のために使用されることができる。加えて、本発明の細胞組成物は、呼吸器又は前立腺疾患などの疾患又は状態を治療する方法に使用されることができる。
【００７１】
本発明は、添付の図面を参照しながらより十分に説明される。しかしながら、以下の記載は例示のためだけであって、上記の発明の広さに関する制限として解釈されるべきではないことが理解されなければならない。
【実施例】
【００７２】
実施例１：肺凝集物への胚幹細胞の分化
４〜８の胎児マウスの肺が、胚日数１１.５（Ｅ１１.５）、Ｅ１２.５又はＥ１３.５のいずれかでＰＢＳ中に集められ、そして、単細胞懸濁物に機械的に解離させるために、ｐ２００ Gilson ピペット及びピペットチップを使用する吸引により、０.２５％トリプシン／０.０４％ＥＤＴＡに移された。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で洗浄することによりトリプシンが不活性化された。細胞と培地が１.５ｍｌエッペンドルフ試験管に移されて、３００ｇで４分間遠心分離された。上澄み液がデカンテーションされ、その細胞ペレットが、１５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含有し５％ＦＣＳ及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンが補充された３００μｌのＢＧＪＢ Fitton Jackson 修飾培地（ＧＩＢＣＯ）（以下、培地という）中に再懸濁された。
【００７３】
次いで、２０,０００又は１０,０００のＺＩＮ４０又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）胚幹（ＥＳ）細胞が、その３００μｌの胚肺細胞懸濁物と一緒にゆっくり混合された。次いで、その細胞混合物は、再度、３００ｇで４分間遠心分離され、そして１μｌの培地中に再懸濁された。次いで、この１μｌの濃縮された細胞懸濁物は、予め平衡にされた培地上に浮いているミリポアフィルター上に、微細に引き延ばされたガラスピペットを使用して移され、そして５％ＣＯ2中３７℃でインキュベートされた。培地は２日ごとに替えられた。決められた培養期間後、胚の肺／ＥＳ細胞懸濁物は、ピンセットでミリポアフィルターから剥がされ、そして、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を含有する２ｍｌ丸底エッペンドルフ試験管に移された。凝集物は、培地を除くためにＰＢＳ中で３回洗浄され、そして４％パラホルムアルデヒド中４℃で１時間ロッキングステージ上に定着された。次いで、凝集物は、定着剤を除くためにＰＢＳ中で３回洗浄され、そして細胞分析のために加工された。
【００７４】
実施例２：呼吸器系統への神経幹細胞の分化
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジェニック胎児マウスの脳から培地中に誘導された神経球 (neurosphere) が、神経幹（ＮＳ）細胞マーカーであるネスチン及びムサシの発現について分析された。Ｚｉｎ４０ＥＳ細胞及びＥＢが先に記載された通りに培養された（Munsie et al., 2000）。胚胎が、Ｅ１２.５ＥＧＦＰ＋／−マウス交配（Jackson laboratories）から回収され、そして、ＥＧＦＰ陽性神経球が、Reynolds and Weiss (1992) に従って発生された。
【００７５】
培養４日後、５０の胚様体又は５０の神経球が集められ、そして３５ｍｍ培養皿中にＤＭＥＭ中でプレートされた。ＨＧＦ又はＮＧＦのいずれかが、２０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で、３５ｍｍ皿中へのプレート後８日間の幹細胞に加えられた。別の処理では、それら胚様体又は神経球は、ＨＧＦ＋培地（３％チャコールストリップドウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌインスリン、１μｇ／ｍｌコレラ毒素、２５ｎｇ／ｍｌ表皮増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌ肝細胞増殖因子及び２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７を含有するＤＭＥＭ）が補充されたＤＭＥＭで処理された。細胞は、標準操作に従って染色された。
【００７６】
結果
胎児マウスの肺の凝集物は、マウス及びヒトＥＳ細胞両方の呼吸器特異的マーカーＳＰＣへの免疫反応性を誘発した。凝集物として培養された全てのマウスＥＳ細胞由来物のうち、２８％がＳＰＣ特異抗体への免疫反応性を示した。凝集物として培養された僅かなヒトＥＳ細胞由来物がＳＰＣ特異抗体への免疫反応性を示したに過ぎないが、培養条件は最適化されたままであり、そして呼吸器特異的分化を受けた正確な数が分かった。凝集物中のマウス及びヒトの両方のＳＰＣ免疫反応性ＥＳ細胞由来物は、機能性呼吸器細管を偲ばせる細管構造を取り込んだ。細管は、ＥＳ細胞由来物単独か又は内因性呼吸器上皮とＥＳ細胞由来物が混ざった混合物からなるものであった。更には、ＥＳ細胞由来物ＳＰＣの所在が先端表面に偏在していることが見出された。これは、正常な機能性呼吸器細胞型であることを示すものである。
【００７７】
胚様体として単独で培養されたマウス及びヒトＥＳ細胞の両方が、３種の胚芽層（中胚葉、外胚葉及び内胚葉）の由来物に分化した（データは示されていない）ことは、身体の全組織を形成するそれらの能力を証明している。しかしながら、本発明者らは、まだ、これら凝集物中にＳＰＣ免疫反応性ＥＳ細胞由来物をいかなる有意なレベルでも特定していない。本発明者らの凝集物系は２８％の発生率でマウスＥＳ細胞由来物ＳＰＣ免疫反応性の誘発をもたらしたので、本発明者らの凝集物系は両方のＥＳ細胞の分化を推進すると言える。
【００７８】
ＨＧＦ又はＮＧＦ中のいずれかに高密度でプレートされたＥＢ及び神経球の形態は、コントロール培地中で培養された８日後のＥＢ及び神経球と類似していた（データは示されていない）。ＨＧＦ＋培地中で培養された神経球は、コントロールと比較したときに、比較的低い、単層として張り付く傾向を示したが、代わりに、皿の内部に新規な点 (de novo foci) を形成した（図３Ａ，Ｂ）。二重 Hoechst 染色（核）及び抗表面活性物質Ｃ免疫細胞化学（細胞質）は、これら点の多くが表面活性物質Ｃ Ａｂ反応性細胞を含有していることを示した（図３Ｃ，Ｄ）。高密度で培養した後、ＲＴ−ＰＣＲは、全ての培養条件において、α−フェトプロテイン（内胚葉特異的マーカー）及びＮｋｘ２.１（肺、甲状腺、脳下垂体及び間脳発育の初期マーカー）転写産物の増幅を示した（図４）。半定量的ＰＣＲは、ＮＧＦ又はＨＧＦ＋培地のいずれかの存在下で培養された神経球内の表面活性物質Ａ転写産物のアップレギュレーションを示した。同じく、表面活性物質Ｃ転写産物のアップレギュレーションが、ＨＧＦ＋培地の存在下で培養されたＥＢ及び神経球の両方で観察されたが、表面活性物質Ｄ転写産物は、ＨＧＦ、ＮＧＦ又はＨＧＦ＋培地での処理によりアップレギュレーションされただけであった。α１−抗トリプシン及びクララ (clara) 細胞分泌タンパク質（ＣＣ１０）転写産物が全てのＥＢ培養条件下で検出されたが、それらは神経球では試験された培養条件下で検出されなかった。これら研究は、in vitro で、ＮＳ及びＥＳ細胞が、十分に分化した呼吸器系統を代表するマーカーを発現するように誘発され得ることを示すものである。
【００７９】
この明細書の記載及び特許請求の範囲の全体を通して、“含んでなる”という用語及びその変形した用語は、他の追加の成分、整数又は段階を排除することを意図するものではない。
【００８０】
先行技術文献、先行技術行為、先行技術装置等の説明は、単に本発明の前後関係を提供する目的でこの明細書中に含められている。それは、これら事柄のいずれか又は全てが、先行技術の基礎を形成していたか又はこの出願の出願日前にオーストラリアで存在していた本発明に関連する分野における共通の一般的知識であった、ということを示唆するものではない。
【００８１】
最後に、これまでに記載してきた発明には、具体的に記載してきたものより他の変更、修飾及び／又は付加を施すことができるので、本発明は、そのような行い得る変更、修飾及び／又は付加の全てを包含するものである。他の種々の修飾及び／又は付加がこれまでに記載してきた説明の範囲内に入るものと理解されるべきである。
【００８２】
参考文献
Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, Trounson A, Bongso A. (2000) Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.  Nat Biotechnol. 18(4):399-404。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】マウスＥＳ細胞／呼吸器組織凝集物。二重ｂ−ガラクトシド染色（青色染色）及び表面活性物質Ｃ免疫組織化学（褐色染色）が、ＥＳ細胞由来物が誘導されて、呼吸器特異的マーカーに免疫反応性である細気管支導管様構造を形成することを示している（Ａ〜Ｄ）。注目すべきは、培養６日後（Ａ及びＢ）に、ＥＳ細胞由来物の細胞質全体を通して、表面活性物質Ｃ免疫反応性が細気管支様導管全体に観察され得ることである。培養１２日後では、表面活性物質Ｃ免疫反応性は、細気管支様導管集団の部分集団とこれら導管内とにまで、つまりＥＳ細胞由来物の細胞表面にまで縮小されている（Ｃ及びＤの赤の矢印を参照）。
【図２】ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞が推進する表面活性物質Ｃ（Ｓｐ−Ｃ）発現。ｈＥＳ細胞／マウス肺凝集物が in vitro で６日間生育された。細胞核が包括的核染色 Hoechst 33342（青）によって特定され、ｈＥＳ細胞由来物が緑色蛍光によって特定され、そしてＳｐ−Ｃの所在が抗マウス及びヒトＳｐ−Ｃ特異的抗体（赤）によって特定される。Ｓｐ−Ｃの所在がマウス組織内及びｈＥＳ由来物内に観察される。
【図３】３５ｍｍ皿にプレートした後の５０の神経球を示す。（Ａ）コントロール培地、及び（Ｂ）ＨＧＦ＋含有培地（ＨＧＦ＋培地は、３％チャコールストリップドウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌインスリン、１μｇ／ｍｌコレラ毒素、２５ｎｇ／ｍｌ表皮増殖因子、１０ｎｇ／ｍｌ肝細胞増殖因子及び２５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ７を含有するＤＭＥＭである）−点に注目。（Ｃ）呼吸器分化を明らかにするための二重 Hoechst（青）及び抗表面活性物質Ｃ（赤）蛍光。（Ｄ）単細胞の二重標識を明示するための（Ｃ）のハイパワー（ｈｐ）拡大図。
【図４】ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で８日間培養されたマウス胚様体及び神経球の内胚葉及び呼吸器マーカーについての逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と各々の示された増殖因子補給物を示す。
【図１】
2005520516.tif 000003
【図２】
2005520516.tif 000004
【図３】
2005520516.tif 000005
【図４】
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【国際調査報告】
2005520516.tif 000007
2005520516.tif 000008
2005520516.tif 000009