(57)【要約】本発明は、ＤＮＡ組み換え技術の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＡＴＰを検出可能な実体に変換するポリペプチドに結合されたＡＴＰ生成ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。従って、本発明は、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質に着目する。本発明はまた、この融合タンパク質を含む薬学的組成物およびそれらを使用する方法に関する。さらなる局面において、本発明は、融合タンパク質を発現させるための発現ベクターを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
検出可能な実体へとＡＴＰを変換するポリペプチドに結合している、ＡＴＰ生成ポリペプチドを含む、
融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼ、およびＡＴＰシンターゼからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項３】
請求項２に記載の融合タンパク質であって、前記ＡＴＰスルフリラーゼが、配列番号１のヌクレオチド配列を含む熱安定性スルフリラーゼである、融合タンパク質。
【請求項４】
請求項３に記載の融合タンパク質であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号２のポリペプチド配列をコードする、融合タンパク質。
【請求項５】
請求項３に記載の融合タンパク質であって、前記熱安定性スルフリラーゼが、室温にて活性である、融合タンパク質。
【請求項６】
請求項２に記載の融合タンパク質であって、前記ＡＴＰスルフリラーゼが、好熱性生物由来である、融合タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の融合タンパク質であって、前記好熱性生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌である、融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドが、真核生物または原核生物に由来する、融合タンパク質。
【請求項９】
請求項８に記載の融合タンパク質であって、前記真核生物が、動物、植物、真菌、および酵母からなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の融合タンパク質であって、前記動物が、哺乳動物、齧歯類、昆虫、蠕虫、軟体動物、爬虫類、鳥類、および両生類からなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載の融合タンパク質であって、前記植物が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｃａｕｄａｔｕｓ、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ、Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ、またはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項９に記載の融合タンパク質であって、前記真菌が、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、およびＲｉｆｔｉａ  ｐａｃｈｙｐｔｉｌａである、融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項９に記載の融合タンパク質であって、前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、およびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．である、融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項８に記載の融合タンパク質であって、前記原核生物が、細菌または古細菌である、融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載の融合タンパク質であって、前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、フラボバクテリア、および緑色硫黄細菌からなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１４に記載の融合タンパク質であって、前記古細菌が、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記検出可能な実体が、化学発光、生体発光、および蛍光からなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼ、エクト−ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、およびＡＴＰアーゼからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１８に記載の融合タンパク質であって、前記ルシフェラーゼが、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ、およびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、親和性タグをさらに含む、融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項２０に記載の融合タンパク質であって、前記親和性タグが、Ｎ末端ポリヒスチジン、ＢＣＣＰ、プロテインＡ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、Ｐ物質、およびストレプトアビジン結合ペプチドからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記ポリペプチドが、リンカーによって結合されている、融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項２２に記載の融合タンパク質であって、前記リンカーが、ａｌａ−ａｌａ−ａｌａリンカーである、融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、前記ＡＴＰ変換ポリペプチドのＮ末端側にある、融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドのＮ末端側にある、融合タンパク質。
【請求項２６】
単離された核酸分子であって、
配列番号１、３、および５からなる群より選択される核酸配列
を含む、核酸分子。
【請求項２７】
単離されたポリペプチドであって、
配列番号２、４、および６からなる群より選択されるアミノ酸配列
を含む、ポリペプチド。
【請求項２８】
融合タンパク質であって、
ルシフェラーゼポリペプチドに結合しているスルフリラーゼポリペプチドと、
少なくとも１種の親和性タグと、
を含む、融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項２８に記載の融合タンパク質であって、配列番号４の配列を含む、融合タンパク質。
【請求項３０】
請求項２８に記載の融合タンパク質であって、配列番号３の配列を含む核酸によりコードされる、融合タンパク質。
【請求項３１】
融合タンパク質であって、
少なくとも１種の親和性タグに結合している熱安定性スルフリラーゼ
を含む、融合タンパク質。
【請求項３２】
請求項３１に記載の融合タンパク質であって、配列番号６の配列を含む、融合タンパク質。
【請求項３３】
請求項３１に記載の融合タンパク質であって、配列番号５の配列を含む核酸によりコードされる、融合タンパク質。
【請求項３４】
組換えポリヌクレオチドであって、
融合タンパク質のコード配列を含み、
該コード配列は、
ＡＴＰ生成ポリペプチド配列と、
ＡＴＰ変換ポリペプチド配列と、
を含む、組換えポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項３４に記載の組換えポリヌクレオチドであって、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼである、組換えポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３４に記載の組換えポリヌクレオチドであって、前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼである、組換えポリヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項３４に記載の組換えポリヌクレオチドであって、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、前記ＡＴＰ変換ポリペプチドのＮ末端側にある、組換えポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３４に記載の組換えポリヌクレオチドであって、前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドのＮ末端側にある、組換えポリヌクレオチド。
【請求項３９】
融合タンパク質を発現するための発現ベクターであって、
該ベクターは、融合タンパク質のコード配列を含み、
該コード配列は、
（ｉ）調節配列、
（ｉｉ）ＡＴＰ生成ポリペプチドの第１ポリペプチド配列、および
（ｉｉｉ）検出可能な実体へとＡＴＰを変換する第２ポリペプチド配列、
を有する、発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３９に記載の発現ベクターであって、親和性タグをさらに含む、発現ベクター。
【請求項４１】
請求項３９に記載の発現ベクターであって、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼである、発現ベクター。
【請求項４２】
請求項３９に記載の発現ベクターであって、前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼである、発現ベクター。
【請求項４３】
請求項３９に記載の発現ベクターであって、前記調節エレメントが、エンハンサーまたはプロモーターである、発現ベクター。
【請求項４４】
請求項４３に記載の発現ベクターであって、前記プロモーターが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、発現ベクター。
【請求項４５】
請求項３９に記載の発現ベクターを含む、形質転換宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４５に記載の形質転換宿主細胞であって、真核生物細胞である、形質転換宿主細胞。
【請求項４７】
請求項４６に記載の形質転換宿主細胞であって、前記真核生物細胞が、ヒト細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である、形質転換宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４５に記載の形質転換宿主細胞であって、原核生物細胞である、形質転換宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４８に記載の形質転換宿主細胞であって、前記原核生物細胞が、細菌細胞である、形質転換宿主細胞。
【請求項５０】
請求項３９の発現ベクターで形質転換された細胞により発現される、精製融合タンパク質。
【請求項５１】
移動可能な支持体に結合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
請求項５１に記載の融合タンパク質であって、共有結合相互作用または非共有結合相互作用によって結合している、融合タンパク質。
【請求項５３】
請求項５２に記載の融合タンパク質であって、結合により結合しており、該結合は、金属、ＣＯ２＋−ヘキサヒスチジン複合体、Ｎｉ２＋−ヘキサヒスチジン複合体、ビオチン結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／グルタチオン複合体、モノクローナル抗体／抗原複合体、マルトース結合タンパク質／マルトース複合体、およびプルロニックカップリングからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項５４】
請求項５３に記載の融合タンパク質であって、前記ビオチン結合タンパク質が、ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮＴＭ改変アビジン、ストレプトアビジン、およびアビジンからなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項５５】
請求項５１に記載の融合タンパク質であって、前記移動可能な支持体が、ビーズ、光ファイバー、およびガラス表面からなる群より選択される、融合タンパク質。
【請求項５６】
請求項５５に記載の融合タンパク質であって、前記ビーズが、ニッケル−アガロースビーズ、またはＭＰＧ−ストレプトアビジンビーズである、融合タンパク質。
【請求項５７】
請求項５１に記載の融合タンパク質であって、前記移動可能な支持体に、タンパク質  対  移動可能な支持体の比が１：３で結合している、融合タンパク質。
【請求項５８】
請求項５１に記載の融合タンパク質であって、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質である、融合タンパク質。
【請求項５９】
テンプレート核酸ポリマー中の核酸配列を決定するための方法であって、
（ａ）ヌクレオチドが添加された場合に該核酸ポリマーが相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する重合環境中に、該テンプレート核酸ポリマーを導入する工程；
（ｂ）該重合環境に一連の供給材料を連続的に提供する工程であって、該供給材料の各々は、該相補的核酸ポリマーが形成されるヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、該供給材料中のヌクレオチドが、配列決定されるべき該テンプレートポリマー中の次のヌクレオチドと相補的である場合には、該ヌクレオチドは、該相補的ポリマー中に組込まれ、無機ピロホスフェートが放出される、工程；
（ｃ）該重合環境から該供給材料の各々を別個に回収する工程；ならびに
（ｄ）該回収した供給材料の各々におけるＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いてＰＰｉの量を測定して、該相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの身元を決定し、それにより、該テンプレートポリマーの配列を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼ、およびＡＴＰシンターゼからなる群より選択される、方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法であって、前記ＡＴＰスルフリラーゼが、熱安定性スルフリラーゼである、方法。
【請求項６２】
請求項６０に記載の方法であって、前記ＡＴＰスルフリラーゼが、好熱性生物由来である、方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、前記好熱性生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌である、方法。
【請求項６４】
請求項５９に記載の方法であって、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドが、真核生物または原核生物に由来する、方法。
【請求項６５】
請求項６４に記載の方法であって、前記真核生物が、動物、植物、真菌、および酵母からなる群より選択される、方法。
【請求項６６】
請求項５９に記載の方法であって、前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼ、エクト−ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、およびＡＴＰアーゼからなる群より選択される、方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法であって、前記ルシフェラーゼが、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ、およびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、方法。
【請求項６８】
請求項５９に記載の方法であって、親和性タグをさらに含む、方法。
【請求項６９】
請求項５９に記載の方法であって、前記無機ピロホスフェートの量が、
（ａ）前記供給材料にアデノシン−５’−ホスホスルフェートを添加する工程；
（ｂ）該アデノシン−５’−ホスホスルフェートを含む回収した供給材料を、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質と合わせて、該回収した供給材料中のすべての無機ピロホスフェートと該アデノシン−５’−ホスホスルフェートとが反応してＡＴＰとスルフェートとを形成するようにする、工程；
（ｃ）該ＡＴＰ、スルフェート、および該融合タンパク質含有供給材料を、酸素存在下でルシフェリンと合わせて、該ＡＴＰが消費されてＡＭＰ、無機ピロホスフェート、二酸化炭素、および光を生成するようにする、工程；ならびに
（ｄ）生成した光の量を測定する工程、
によって測定される、方法。
【請求項７０】
請求項６９に記載の方法であって、前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼ、およびＡＴＰシンターゼからなる群より選択される、方法。
【請求項７１】
請求項７０に記載の方法であって、前記ＡＴＰスルフリラーゼが、熱安定性スルフリラーゼである、方法。
【請求項７２】
請求項７０に記載の方法であって、前記ＡＴＰスルフリラーゼが、好熱性生物由来である、方法。
【請求項７３】
請求項７２に記載の方法であって、前記好熱性生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌である、方法。
【請求項７４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドが、真核生物または原核生物由来である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記真核生物が、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼ、ｅｃｔｏ−ヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
前記ルシフェラーゼが、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
親和性タグをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７９】
請求項５９に記載の方法であって、各供給原料が、前記選択されたヌクレオチド塩基に加えて、アデノシン−５’−ホスホサルフェートおよびルシフェリンを含み、かつ無機ピロリン酸の量が、無機ピロリン酸含有供給原料をＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質と反応させ、それによって無機ピロリン酸の量に比例した量で光を生成し、そして該生成された光の量を測定することによって決定される、方法。
【請求項８０】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼおよびＡＴＰシンターゼからなる群より選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、熱安定性スルフリラーゼである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、好熱菌に由来する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
請求項８２に記載の方法であって、前記好熱菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌である、方法。
【請求項８４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドが、真核生物または原核生物由来である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記真核生物が、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼ、ｅｃｔｏ−ヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
前記ルシフェラーゼが、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
親和性タグをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８９】
核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）１つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；
（ｂ）平坦な表面上の複数のキャビティ内に配置された、複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程であって、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、５〜２００μｍの間の中心間間隔を有する、工程；
（ｃ）有効量の該核酸アンカープライマーを、少なくとも１つの該一本鎖環状テンプレートにアニーリングさせて、プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を得る工程；
（ｄ）該プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を、ポリメラーゼと結合させて、該環状核酸テンプレートに相補的な核酸の複数コピーに共有結合した伸長されたアンカープライマーを形成する工程；
（ｅ）有効量の配列決定プライマーを、該共有結合した相補的な核酸の１つ以上のコピーにアニーリングさせる工程；
（ｆ）ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて、該配列決定プライマーを伸長させ、配列決定産物を得る工程であって、該所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの３’末端上に組み込まれる場合、配列決定反応副産物を得る、工程；ならびに
（ｇ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、該配列決定反応副産物を同定し、それによって該核酸の配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９０】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼおよびＡＴＰシンターゼからなる群より選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、熱安定性スルフリラーゼである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、好熱菌に由来する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
請求項９２に記載の方法であって、前記好熱菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌である、方法。
【請求項９４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドが、真核生物または原核生物由来である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９５】
前記真核生物が、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼ、ｅｃｔｏ−ヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９７】
前記ルシフェラーゼが、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
親和性タグをさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９９】
核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）１つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；
（ｂ）少なくとも４００，０００個の別個の反応部位を有するアレイにおいて、複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程；
（ｃ）第一の量の該核酸アンカープライマーを、少なくとも１つの該一本鎖環状テンプレートにアニーリングさせて、プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を得る工程；
（ｄ）該プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を、ポリメラーゼと結合させて、該環状核酸テンプレートに相補的な核酸の複数コピーに共有結合した伸長されたアンカープライマーを形成する工程；
（ｅ）第二の量の配列決定プライマーを、該共有結合した相補的な核酸の１つ以上のコピーにアニーリングさせる工程；
（ｆ）ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて、該配列決定プライマーを伸長させ、配列決定産物を得る工程であって、該所定のヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの３’末端上に組み込まれる場合、配列決定反応副産物を得る、工程；ならびに
（ｇ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、該配列決定反応副産物を同定し、それによって核酸テンプレートを含む各反応部位において該核酸の配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１００】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼおよびＡＴＰシンターゼからなる群より選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、熱安定性スルフリラーゼである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、好熱菌に由来する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の方法であって、前記好熱菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌である、方法。
【請求項１０４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドが、真核生物または原核生物由来である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０５】
前記真核生物が、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼ、ｅｃｔｏ−ヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ルシフェラーゼが、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
親和性タグをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０９】
アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）平坦な平面上の複数のキャビティ内に各々配置された複数のサンプルＤＮＡを提供する工程であって、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、５〜２００μｍの間の中心間間隔を有する、工程；
（ｂ）プライマー鎖の３’末端への、活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下で、各反応チャンバ中の反応混合物に、１つの既知の窒素性塩基の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体を添加して、該プライマー鎖の３’末端にて各テンプレート中の少なくとも１つの対合していないヌクレオチドを形成する工程であって、各反応混合物は、テンプレート指向性のヌクレオチドポリメラーゼ、および該テンプレートよりも短い少なくとも１ヌクレオチド残基の相補的オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズした一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを含み、但し、該活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の該窒素性塩基は、該テンプレートの対合していないヌクレオチド残基の窒素性塩基と相補的である、工程；
（ｃ）該ヌクレオシド５’三リン酸前駆体が、該プライマー鎖中に取り込まれたか否かを、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いた配列決定副産物の検出によって決定する工程であって、従って、該テンプレートの対合していないヌクレオチド残基が、該取り込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基組成と相補的な組成を有することを示す、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）を連続して繰り返す工程であって、ここで、各連続した繰り返しが、既知の窒素性塩基組成の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の１つの型の取り込みを付加し、そして検出する、工程；ならびに
（ｅ）該ヌクレオシド前駆体の取り込みの配列から、各反応チャンバ中の該テンプレートの対合していないヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１０】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼおよびＡＴＰシンターゼからなる群より選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、熱安定性スルフリラーゼである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、好熱菌に由来する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
請求項１１２に記載の方法であって、前記好熱菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌である、方法。
【請求項１１４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドが、真核生物または原核生物由来である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１５】
前記真核生物が、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼ、ｅｃｔｏ−ヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ルシフェラーゼが、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
親和性タグをさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１９】
テンプレート核酸ポリマー中の核酸配列を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）平坦な平面上の複数のキャビティへと、複数のテンプレート核酸ポリマーを導入する工程であって、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、該反応チャンバは、５〜２００μｍの間の中心間間隔を有し、各反応チャンバは、ヌクレオチドが添加された場合に、該酸ポリマーが、相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する重合環境を有する、工程；
（ｂ）該重合環境に一連の供給材料を連続的に提供する工程であって、各供給材料は、該相補的核酸ポリマーが形成されるヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、該供給材料中の該ヌクレオチドが、配列決定されるべきテンプレートヌクレオチド中の次のヌクレオチドと相補的である場合には、該ヌクレオチドは相補的ポリマー中に取り込まれ、無機ピロリン酸が放出される、工程；
（ｃ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて無機ピロリン酸の形成を検出して、相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、従って、テンプレートポリマーの正体を決定する工程、
を包含する、工程。
【請求項１２０】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼおよびＡＴＰシンターゼからなる群より選択される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、熱安定性スルフリラーゼである、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、好熱菌に由来する、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
請求項１２２に記載の方法であって、前記好熱菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌である、方法。
【請求項１２４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドが、真核生物または原核生物由来である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２５】
前記真核生物が、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼ、ｅｃｔｏ−ヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ルシフェラーゼが、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
アフィニティータグをさらに包含する、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２９】
サンプルＤＮＡのＤＮＡ配列における標的位置で塩基を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）サンプルＤＮＡは、平坦な表面の複数の腔内に配置され、各々の腔は被験体反応チャンバを形成し、該反応チャンバは５〜２００μｍの間の中心間の間隔を有し、該ＤＮＡは反応チャンバに配置される前後いずれかで一本鎖にされる、
（ｂ）該標的位置にすぐに隣接する位置で、固定された該一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズされる伸長プライマーが提供される；
（ｃ）該固定された一本鎖ＤＮＡは、予め決定されたヌクレオチド三リン酸存在下で、ポリメラーゼ反応を供され、該予め決定されたヌクレオチド三リン酸が該配列決定プライマーの３’末端へ取り込まれ、次いで、配列決定反応副産物が形成される；および
（ｄ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、該配列決定反応副産物の同定し、それによる該標的位置で該塩基に相補的な該ヌクレオチドの決定する、
方法。
【請求項１３０】
ＡＴＰ生成ポリペプチドは、ＡＴＰスルフリラーゼ、加水分解酵素およびＡＴＰ合成酵素からなる群より選択される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、熱安定性スルフリラーゼである、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、好熱菌由来である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
前記好熱菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択された好熱菌である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドは、真核生物または原核生物由来である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３５】
前記真核生物は、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドは、ルシフェラーゼ、エクトヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ルシフェラーゼは、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
アフィニティータグをさらに包含する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３９】
サンプルＤＮＡ配列中の標的位置における塩基を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）サンプルＤＮＡは、平坦な表面の複数の腔内に配置されるサンプルを提供する工程であって、各々の腔は被験体反応チャンバを形成し、該反応チャンバは５〜２００μｍの間の中心間の間隔を有し、該ＤＮＡは反応チャンバに配置される前後のいずれかで一本鎖にされる工程；
（ｂ）該標的位置にすぐに隣接する該サンプルＤＮＡにハイブリダイズされる伸長プライマーを提供する工程；
（ｃ）ヌクレオチド三リン酸存在下で、ポリメラーゼ反応に該サンプルＤＮＡ配列および該伸長プライマーを供し、それにより、該標的位置で該塩基に相補的である場合は、該ヌクレオチド三リン酸は取り込まれ、ピロホスフェート（ＰＰｉ）を放出し、該ヌクレオチド三リン酸はサンプルプライマー混合物のアリコートを分離するために付加されるか、または同一サンプル−プライマー混合物に連続的に付加される工程；および
（ｄ）どのヌクレオチドが取り込まれるが示すために、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、ＰＰｉの放出を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４０】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、加水分解酵素およびＡＴＰ合成酵素からなる群より選択される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、熱安定性スルフリラーゼである、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、好熱菌由来である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４３】
前記好熱菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択された好熱菌である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドは、真核生物または原核生物由来である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４５】
前記真核生物は、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドは、ルシフェラーゼ、エクトヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ルシフェラーゼは、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
アフィニティータグをさらに包含する、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４９】
一本鎖サンプルＤＮＡ配列中の標的配置における塩基を同定する方法であって、該方法は、
（ａ）該標的位置にすぐに隣接するサンプルＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する工程であって、該サンプルＤＮＡは平坦な表面の複数の腔内に配置され、各々の腔は被験体反応チャンバを形成し、該反応チャンバは５〜２００μｍの間の中心間の間隔を有し、該ＤＮＡは反応チャンバに配置される前後いずれかで一本鎖にされる工程；
（ｂ）予め決定されたデオキシヌクレオチドもしくはジデオキシヌクレオチド存在下で、ポリメラーゼ反応に該サンプルＤＮＡおよび伸長プライマーを供し、それにより、該標的位置で該塩基に相補的である場合は、該デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは取り込まれ、ピロホスフェート（ＰＰｉ）を放出し、該予め決定されたデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドはサンプルプライマー混合物のアリコートを分離するために付加されるか、または同一サンプルプライマー混合物に連続的に付加される工程、
（ｃ）どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが取り込まれるかを示すために、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、ＰＰｉの放出を検出する工程；
を包含し、
ＰＰｉ検出酵素は、ポリメラーゼ反応の工程を包含し、デオキシ−またはジデオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の代わりに、該ＰＰｉ−検出酵素の基質として作動し得ないが、ポリメラーゼの基質として作動し得るｄＡＴＰもしくはｄｄＡＴＰアナログが使用されることを特徴とする、方法。
【請求項１５０】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドは、ＡＴＰスルフリラーゼ、加水分解酵素およびＡＴＰ合成酵素からなる群より選択される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、熱安定性スルフリラーゼである、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、好熱菌由来である、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５３】
前記好熱菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択された好熱菌である、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドは、真核生物または原核生物由来である、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５５】
前記真核生物は、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドは、ルシフェラーゼ、エクトヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ルシフェラーゼは、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
アフィニティータグをさらに包含する、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５９】
アレイ上で複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法であって、該方法は、
（ａ）複数のサンプルＤＡＮを提供する工程であって、各々は平坦な表面の複数の腔内に配置され、各々の腔は被験体反応チャンバを形成し、該反応チャンバは５〜２００μｍの間の中心間の間隔を持つ工程；
（ｂ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、ＰＰｉを光に変換する工程；
（ｃ）光学的に感受性のデバイスの各々の部分で、複数の反応部位から発せられた光レベルを検出する工程；
（ｄ）該光学的に感受性のデバイスの各々の該部分に衝突する光を電気シグナルに変換し、該電気シグナルが、別の領域全てからのシグナルから識別できる工程；
（ｅ）該対応電気シグナルからの各々の該別個の領域の光強度を決定する工程；および
（ｆ）時間にともなう該電気シグナルの変動を記録する工程
を包含する、方法。
【請求項１６０】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、加水分解酵素およびＡＴＰ合成酵素からなる群より選択される、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、熱安定性スルフリラーゼである、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、好熱菌由来である、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６３】
前記好熱菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択された好熱菌である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドは、真核生物または原核生物由来である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６５】
前記真核生物は、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドは、ルシフェラーゼ、エクトヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６７】
前記ルシフェラーゼは、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
アフィニティータグをさらに包含する、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６９】
核酸を配列決定する方法であって、該方法は、
（ａ）一つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；
（ｂ）平坦な表面の複数の腔内に配置される複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程であって、各々の腔は被験体反応チャンバを形成し、該反応チャンバは５〜２００μｍの間の中心間の間隔を有する工程；
（ｃ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、ＰＰｉを検出可能な実体に変換する工程；
（ｄ）光学的に感受性のデバイスの各々の部分で、複数の反応部位から発せられた光レベルを検出する工程；
（ｅ）該光学的に感受性のデバイスの各々の該部分に衝突する光を電気シグナルに変換し、該電気シグナルが、別の領域全てからのシグナルから識別できる工程；
（ｆ）該対応電気シグナルからの各々の該別個の領域の光強度を決定する工程；および
（ｇ）時間にともなう該電気シグナルの変動を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項１７０】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドは、ＡＴＰスルフリラーゼ、加水分解酵素およびＡＴＰ合成酵素からなる群より選択される、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、熱安定性スルフリラーゼである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼは、好熱菌由来である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記好熱菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択された好熱菌である、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドは、真核生物または原核生物由来である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７５】
前記真核生物は、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドは、ルシフェラーゼ、エクトヌクレオシド二リン酸キナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７７】
前記ルシフェラーゼは、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
アフィニティータグをさらに包含する、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７９】
核酸を配列決定する方法であって、該方法は、
（ａ）少なくとも一つの核酸アンカープライマーを提供する工程；
（ｂ）少なくとも４００，０００の別個の反応部位を有するアレイで、複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程；
（ｃ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、ＰＰｉを検出可能な実体に変換する工程；
（ｄ）光学的に感受性のデバイスの各々の部分で、複数の反応部位から発せられた光レベルを検出する工程；
（ｅ）該光学的に感受性のデバイスの各々の該部分に衝突する光を電気シグナルに変換し、該電気シグナルが、別の領域全てからのシグナルから識別できる、工程；
（ｆ）該対応電気シグナルからの各々の該別個の領域の光強度を決定する工程；および
（ｇ）時間にともなう該電気シグナルの変動を記録する工程
を包含する、方法。
【請求項１８０】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドが、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼ、およびＡＴＰシンターゼからなる群より選択される、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、熱安定スルフリラーゼである、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記ＡＴＰスルフリラーゼが、好熱生物由来である、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８３】
請求項１８２に記載の方法であって、前記好熱生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｅｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌である、方法。
【請求項１８４】
前記ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ペプチドが、真核生物由来または原核生物由来である、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８５】
前記真核生物が、動物、植物、真菌および酵母からなる群より選択される、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ＡＴＰ変換ポリペプチドが、ルシフェラーゼ、エクトヌクレオシドジホスフェートキナーゼおよびＡＴＰａｓｅからなる群より選択される、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８７】
前記ルシフェラーゼが、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａおよびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓからなる群より選択される、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
アフィニティータグをさらに含む、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８９】
請求項３９に記載されるとおりのスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質発現ベクターを含む、キット。
【請求項１９０】
以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の成熟形態の改変体；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列の改変体であって、ここで該改変体中の１つ以上のアミノ酸残基は、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、４％以下のアミノ酸残基において該アミノ酸配列と異なる、改変体；および
（ｅ）１つ以上の保存的アミノ酸置換をさらに含む、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１９１】
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、請求項１９０に記載のポリペプチド。
【請求項１９２】
前記改変体のアミノ酸配列が、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む、請求項１９０に記載のポリペプチド。
【請求項１９３】
以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで該改変体中の１つ以上のアミノ酸残基は、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、４％以下のアミノ酸残基において該成熟形態のアミノ酸配列と異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列の改変体であって、ここで該改変体中の１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、４％以下のアミノ酸残基において、該アミノ酸配列と異なる、改変体；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドの改変体の少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、該改変体中の１つ以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体は、４％以下のアミノ酸残基が、該アミノ酸配列と異なる、核酸フラグメント；および
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む、核酸分子、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１９４】
前記核酸分子が、天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、請求項１９３に記載の核酸分子。
【請求項１９５】
前記核酸分子が、天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１９３に記載の核酸分子。
【請求項１９６】
請求項１９３に記載の核酸分子であって、ここで該核酸分子は、以下：
（ａ）第１のヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列をコードするコード配列と、１つ以上のヌクレオチド配列だけ異なるコード配列を含むが、ただし、該第１のヌクレオチド配列中のコード配列において１１％以下のヌクレオチドが、該コード配列と異なる、第１のヌクレオチド配列；
（ｂ）該第１のポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１９７】
請求項１９６に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１９８】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１９７に記載のベクター。
【請求項１９９】
請求項１９７に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２００】
請求項１９０に記載のポリペプチドに対して免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項２０１】
テンプレート核酸ポリマー中の核酸配列を決定するための方法であって、以下：
（ａ）該テンプレート核酸ポリマーを、重合環境に導入する工程であって、該重合環境において、該核酸ポリマーは、ヌクレオチドが加えられた場合に、相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する、工程；
（ｂ）一連の供給原料を該重合環境に連続的に提供する工程であって、各供給原料は、該相補的核酸ポリマーが形成されるヌクレオチドの中から選択されたヌクレオチドを含み、その結果、該供給原料中のヌクレオチドが、配列決定される該テンプレートポリマー中の次のヌクレオチドに相補的である場合、該ヌクレオチドは、該相補的ポリマー中に組み込まれ、そして無機ピロホスフェートが放出される、工程；
（ｃ）該供給原料の各々を、該重合環境から別々に回収する工程；および
（ｄ）該回収された供給原料の各々において熱安定スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを用いてＰＰｉの量を測定して、該相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの同一性を決定し、そしてそれにより該テンプレートポリマーの配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０２】
前記熱安定スルフリラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
請求項２０１に記載の方法であって、前記熱安定スルフリラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌由来である、方法。
【請求項２０４】
前記熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼが、融合タンパク質において連結されている、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０５】
前記熱安定性スルフリラーゼが、アフィニティータグに連結されている、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０６】
核酸を配列決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）１つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；
（ｂ）平坦な表面上の複数の空洞内に配置された複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程であって、各空洞が、分析物反応チャンバーを形成し、ここで該反応チャンバーは、５〜２００の間の中心間間隔に対する中心を有する、工程；
（ｃ）有効量の核酸アンカープライマーを少なくとも１つの一本鎖環状テンプレートにアニーリングして、プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を生じる工程；
（ｄ）該プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体をポリメラーゼと混合して、該環状核酸テンプレートに相補的な核酸の複数のコピーに共有結合で連結された伸長アンカープライマーを形成する工程；
（ｅ）有効量の配列決定プライマーを、該共有結合で連結された相補的核酸の１つ以上のコピーにアニーリングする工程；
（ｆ）ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸、を用いて配列決定プライマーを伸長して、配列決定産物、および該所定のヌクレオチド三リン酸が、該配列決定プライマーの３’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物、を生じる工程；ならびに
（ｇ）熱安定スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを使用して配列決定反応副産物を同定し、それにより該核酸の配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０７】
前記熱安定性スルフリラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
前記熱安定性スルフリラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌由来である、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０９】
前記熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼが、融合タンパク質において連結されている、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２１０】
前記熱安定性スルフリラーゼが、アフィニティータグに連結されている、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２１１】
核酸を配列決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）少なくとも１つの核酸アンカープライマーを提供する工程；
（ｂ）少なくとも４００，０００個の別個の反応部位を有するアレイにおいて複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程；
（ｃ）第１の量の核酸アンカープライマーを、少なくとも１つの該一本鎖環状テンプレートにアニーリングして、プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を生じる工程；
（ｄ）該プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体をポリメラーゼと混合して、該環状核酸テンプレートに相補的な核酸の複数のコピーに共有結合で連結された伸長されたアンカープライマーを形成する工程；
（ｅ）第２の量の配列決定プライマーを、該共有結合で連結された相補的核酸の１つ以上のコピーにアニーリングする工程；
（ｆ）ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて、該配列決定プライマーを伸長して、配列決定産物を生じ、そして該所定のヌクレオチド三リン酸が、該配列決定プライマーの３’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副産物を生じる工程；ならびに
（ｇ）熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを使用して配列決定反応副産物を同定し、それにより該核酸の配列を、核酸テンプレートを含む各反応部位において決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１２】
前記熱安定性スルフリラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
前記熱安定性スルフリラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌由来である、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１４】
前記熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼが、融合タンパク質において連結されている、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１５】
前記熱安定性スルフリラーゼが、アフィニティータグに連結されている、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１６】
アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）平坦な表面上の複数の空洞内にそれぞれ配置された複数のサンプルＤＮＡを提供する工程であって、各空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここで該反応チャンバーは、５〜２００μｍの間の中心間間隔に対する中心を有する、工程；
（ｂ）１つの既知の窒素塩基の活性化ヌクレオチド５’−三リン酸前駆体を、該活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の、該プライマー鎖の３’末端上への組み込みを可能にする反応条件下で、各反応チャンバー中の反応混合物に加える工程であって、各反応混合物は、テンプレート指向性ヌクレオチドポリメラーゼ、および該テンプレートよりも少なくとも１つのヌクレオチド残基短い相補的オリゴヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズした一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを含み、各テンプレートにおいて該プライマー鎖の３’末端に少なくとも１つの不対ヌクレオチド残基を形成し、ただし、該活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の窒素塩基は、該テンプレートの不対ヌクレオチド残基の窒素塩基に対して相補的である、工程；
（ｃ）熱安定スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを用いる配列決定副産物の検出により、該ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体が、該プライマー鎖に組み込まれたか否かを検出し、それにより該テンプレートの不対ヌクレオチド残基が、組み込まれたヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の窒素塩基組成と相補的な窒素塩基組成を有することを示す、工程；
（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）を連続的に繰り返す工程であって、ここで各連続的繰り返しは、既知の窒素塩基組成の１つの型の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体を付加し、そして該１つの型の活性化ヌクレオシド５’−三リン酸前駆体の組み込みを検出する、工程；ならびに
（ｅ）該ヌクレオシド前駆体の組み込みの配列から、各反応チャンバー中のテンプレートの該不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１７】
前記熱安定スルフリラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、請求項２１６の方法。
【請求項２１８】
前記熱安定スルフリラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａからなる群より選択される好熱性細菌由来である、請求項２１６に記載の方法。
【請求項２１９】
前記熱安定スルフリラーゼおよびルシフェラーゼが、融合タンパク質において連結されている、請求項２１６に記載の方法。
【請求項２２０】
前記熱安定性スルフリラーゼが、アフィニティータグに連結されている、請求項２１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、レポータータンパク質として有用な融合タンパク質に関し、特に、効率的なピロホスフェート（ＰＰｉ）の光への変換を達成するために利用される、ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼの融合タンパク質に関する。本発明はまた、無機ピロホスフェートの検出において、特に、核酸の配列決定において使用され得る、新規な熱安定性スルフリラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＡＴＰスルフリラーゼは、硫黄代謝に関与することが確認されている。これは、無機スルフェート（ＳＯ４−２）の代謝において、最初の反応を触媒する；例えば、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＬｉｐｍａｎｎ，１９５８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：６８６−６９０；ＨａｗｅｓおよびＮｉｃｈｏｌａｓ，１９７３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５４１−５５０を参照のこと。この反応において、ＳＯ４−２は、アデノシン５’−ホスホスルフェート（ＡＰＳ）に活性化される。ＡＴＰスルフリラーゼもまた、ピロホスフェート配列決定方法において通常使用される。増殖中のＤＮＡ鎖へのｄＮＭＰの添加から生じるピロホスフェート（ＰＰｉ）を光に変換するためには、ＡＴＰスルフリラーゼによって、ＰＰｉがＡＴＰにまず変換されなければならない。
【０００３】
ＡＴＰスルフリラーゼによって生成されるＡＴＰはまた、酵素反応を使用して加水分解され、光を発生させ得る。発光する化学反応（すなわち、化学発光）および生物学的反応（すなわち、生物発光）は、種々の代謝産物の感受性測定のために、分析生化学において広範に使用されている。生物発光反応において、光の放出をもたらす化学反応は、酵素により触媒される。例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系は、ＡＴＰの特異的アッセイを可能にする。従って、ＡＴＰ生成酵素（例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ）と発光酵素（例えば、ルシフェラーゼ）との両方が、流体および気体中の特定の物質の検出および／または濃縮のための多数の異なるアッセイにおいて、有用であり得る。高い物理的安定性および化学的安定性が、配列決定反応に関与する酵素について時々必要とされるので、熱安定性酵素が望ましい。
【０００４】
スルフリラーゼ反応の生成物は、ルシフェラーゼによって消費されるので、これら２つの酵素を融合タンパク質の形態で共有結合によって連結することによる、これら２つの酵素間の近位性は、基質のより効率的な使用を提供する。基質チャネリングは、基質が、同じ基質の他のプールとの平衡化なしで、効率的に酵素から酵素へと送達される現象である。実際に、このことは、細胞の他の領域において見出される濃度と比較して高い濃度での、代謝産物の局所的プールを生じる。従って、ＡＴＰ生成ポリペプチドとＡＴＰ変換ペプチドとの融合は、基質チャネリングの現象から利益を得ることができ、そして製造費用を低下させ、そして所定の期間の間に起こる酵素反応の数を増加させる。
【０００５】
本明細書全体にわたって引用される全ての特許および刊行物は、本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載する目的で、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、検出可能な実体へとＡＴＰを変換するポリペプチドに結合している、ＡＴＰ生成ポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。１つの局面において、本発明は、ルシフェラーゼポリペプチドに結合したスルフリラーゼポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。本発明は、新規な熱安定性スルフリラーゼポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を提供する。さらなる局面において、本発明は、少なくとも１つの親和性タグに結合した熱安定性スルフリラーゼを含む融合タンパク質を提供する。
【０００７】
別の局面において、本発明は、ルシフェラーゼポリペプチド配列に結合したスルフリラーゼポリペプチド配列を有する融合タンパク質に対するコード配列を含む、組換えポリヌクレオチドを提供する。さらなる局面において、本発明は、融合タンパク質を発現させるための発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、以下を有する融合タンパク質に対するコード配列を含む：（ｉ）調節配列、（ｉｉ）ＡＴＰ生成ポリペプチドの第１ポリペプチド配列、および（ｉｉｉ）検出可能な実体へとＡＴＰを変換する第２ポリペプチド配列。さらなる実施形態において、この融合タンパク質は、スルフリラーゼポリペプチドおよびルシフェラーゼポリペプチドを含む。別の局面において、本発明は、発現ベクターを含む形質転換された宿主細胞を提供する。さらなる局面において、本発明は、移動可能な支持体に結合した融合タンパク質を提供する。本発明はまた、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質発現ベクターを含むキットを包含する。
【０００８】
本発明はまた、テンプレート核酸ポリマー中の核酸配列を決定するための方法を包含し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ヌクレオチドが添加された場合に核酸ポリマーが相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する重合環境中に、テンプレート核酸ポリマーを導入する工程；（ｂ）この重合環境に一連の供給材料を連続的に提供する工程であって、各供給材料は、相補的核酸ポリマーが形成されるヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、供給材料中のヌクレオチドが、配列決定されるべきテンプレートポリマーにおいて隣のヌクレオチドと相補的である場合には、このヌクレオチドは、相補的ポリマー中に組込まれ、そして無機ピロホスフェートが放出される、工程；（ｃ）重合環境から供給材料の各々を別個に回収する工程；ならびに（ｄ）回収した供給材料の各々におけるＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いてＰＰｉの量を測定して、相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの身元を決定し、それにより、テンプレートポリマーの配列を決定する工程。１つの実施形態において、無機ピロホスフェートの量は、以下の工程によって測定される：（ａ）供給材料にアデノシン−５’−ホスホスルフェートを添加する工程；（ｂ）アデノシン−５’−ホスホスルフェートを含む回収した供給材料を、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質と合わせて、回収した供給材料中のすべての無機ピロホスフェートとアデノシン−５’−ホスホスルフェートとが反応してＡＴＰとスルフェートとを形成するようにする、工程；（ｃ）ＡＴＰおよびスルフェート含有供給材料を、酸素存在下でルシフェリンと合わせて、ＡＴＰが消費されてＡＭＰ、無機ピロホスフェート、二酸化炭素、および光を生成するようにする、工程；ならびに（ｄ）生成した光の量を測定する工程。
【０００９】
別の局面において、本発明は、各供給材料が、アデノシン−５’−ホスホスルフェートおよびルシフェリンを、選択されたヌクレオチド塩基に加えて含有し、そして無機ピロホスフェートの量が、無機ピロホスフェート供給材料を、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質と反応させ、これによって、無機ピロホスフェートの量に比例する量の光を発生させる工程、および発生した光の量を測定する工程によって決定される方法を包含する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、核酸を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；（ｂ）平坦な表面上の複数の空洞内に配置された、複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程であって、各空洞が、分析物反応チャンバを形成しており、ここで、これらの反応チャンバは、５〜２００μｍの中心から中心への間隔を有する、工程；（ｃ）有効量の核酸アンカープライマーを、少なくとも１つの一本鎖環状テンプレートにアニールさせて、プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を得る工程；（ｄ）プライマーアンカープライマー−環状テンプレート複合体を、ポリメラーゼと混合して、環状核酸テンプレートに相補的な核酸の複数のコピーに共有結合した伸張したアンカープライマーを形成する工程；（ｅ）有効量の配列決定プライマーを、共有結合した相補的核酸の１つ以上のコピーにアニールさせる工程；（ｆ）配列決定プライマーを、ポリメラーゼおよび予め決定されたヌクレオチド三リン酸を用いて伸張させて、配列決定生成物を得、そして予め決定されたヌクレオチド三リン酸が、この配列決定プライマーの３’末端に組み込まれる場合、反応副生成物を配列決定する工程；ならびに（ｇ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、配列決定反応副生成物を同定し、これによって、核酸の配列を決定する工程。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、核酸を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）少なくとも１つの核酸アンカープライマーを提供する工程；（ｂ）少なくとも４００，０００の不連続な反応部位を有するアレイにおいて、複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程；（ｃ）第一の量の核酸アンカープライマーを、少なくとも１つの一本鎖環状テンプレートにアニールさせて、プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を得る工程；（ｄ）プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を、ポリメラーゼと混合して、環状核酸テンプレートに相補的な核酸の複数のコピーに共有結合した、伸張したアンカープライマーを形成する工程；（ｅ）第二の量の配列決定プライマーを、共有結合した相補的核酸の１つ以上のコピーにアニールさせる工程；（ｆ）配列決定プライマーを、ポリメラーゼおよび予め決定されたヌクレオチド三リン酸で伸張させて、配列決定生成物を得、そして予め決定されたヌクレオチド三リン酸が、配列決定プライマーの３’末端に組み込まれる場合、配列決定反応副生成物を得る工程；ならびに（ｇ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて、配列決定反応副生成物を同定する工程であって、これによって、核酸テンプレートを含む各反応部位において、核酸の配列を決定する工程。
【００１２】
別の局面において、本発明は、１つのアレイ上で複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を包含し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供する工程であって、これらは各々、平坦な表面上の複数のキャビティ内に配置され、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、これらの反応チャンバは、中心から中心まで５〜２００μｍの間の間隔を有する、工程、（ｂ）プライマー鎖の３’末端への、活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下で、各反応チャンバ中の反応混合物に、１つの既知の窒素性塩基の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体を添加する工程であって、各反応混合物は、テンプレート指向性のヌクレオチドポリメラーゼ、およびこのテンプレートよりも短い少なくとも１ヌクレオチド残基の相補的オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズした一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを含んで、プライマー鎖の３’末端にて各テンプレート中の少なくとも１つの対合していないヌクレオチドを形成し、但し、活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基は、テンプレートの対合していないヌクレオチド残基の窒素性塩基と相補的である、工程；（ｃ）ヌクレオシド５’三リン酸前駆体が、プライマー鎖中に取り込まれたか否かを、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いた配列決定副産物の検出によって決定する工程、従って、テンプレートの対合していないヌクレオチド残基が、取り込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基組成と相補的な組成を有することを示す、工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）を連続して繰り返す工程であって、ここで、各連続した繰り返しが、既知の窒素性塩基組成の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の１つの型の取り込みを付加し、そして検出する、工程；ならびに（ｅ）このヌクレオシド前駆体の取り込みの配列から、各反応チャンバ中のテンプレートの対合していないヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、テンプレート核酸ポリマー中の核酸配列を決定するための方法を包含し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）平坦な平面上の複数のキャビティへと、複数のテンプレート核酸ポリマーを導入する工程であって、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、これらの反応チャンバは、中心から中心まで５〜２００μｍの間の間隔を有し、各反応チャンバは、ヌクレオチドが添加された場合に、核酸ポリマーが、相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する重合環境を有する、工程；（ｂ）重合環境に一連の供給材料を連続的に提供する工程であって、この各供給材料は、相補的核酸ポリマーが形成されるヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、供給材料中のヌクレオチドが、配列決定されるべきテンプレートヌクレオチド中の次のヌクレオチドと相補的である場合には、このヌクレオチドは相補的ポリマー中に取り込まれ、無機ピロリン酸が放出される、工程；（ｃ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて無機ピロリン酸の形成を検出して、相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体、従って、テンプレートポリマーの配列を決定する工程。
【００１４】
一つの局面において、本発明は、サンプルＤＮＡのＤＮＡ配列中の標的位置において塩基を同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）平坦な平面上の複数のキャビティ内にサンプルＤＮＡを配置する工程であって、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、これらの反応チャンバは、中心から中心まで５〜２００μｍの間の間隔を有し、このＤＮＡは、反応チャンバに配置される前または後のいずれかに、一本鎖にされる、工程、（ｂ）標的位置に直ぐ隣接する位置にて、固定化された一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する工程；（ｃ）固定化された一本鎖ＤＮＡを、所定のヌクレオチド三リン酸の存在下で、ポリメラーゼ反応に供する工程であって、ここで、この所定のヌクレオチド三リン酸が配列決定プライマーの３’末端に取り込まれる場合、配列決定副産物が形成される、工程；ならびに（ｄ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いて配列決定副産物を同定し、それによって、標的位置の塩基に相補的なヌクレオチドを決定する、工程。
【００１５】
本発明はまた、サンプルＤＮＡ配列中の標的位置の塩基を同定する方法を包含し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）平坦な平面上の複数のキャビティ内に配置されたサンプルＤＮＡを提供する工程であって、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、これらの反応チャンバは、中心から中心まで５〜２００μｍの間の間隔を有し、このＤＮＡは、反応チャンバに配置される前または後のいずれかに、一本鎖にされる、工程；（ｂ）標的位置に直ぐ隣接するサンプルＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する工程；（ｃ）サンプルＤＮＡ配列および伸長プライマーを、ヌクレオチド三リン酸の存在下でポリメラーゼ反応に供する工程であって、それにより、ヌクレオチド三リン酸は、取り込まれるだけであり、そして標的位置の塩基に相補的である場合に、ピロリン酸（ＰＰｉ）を放出し、このヌクレオチド三リン酸は、サンプル−プライマー混合物の別個のアリコートに添加されるか、または同じサンプル−プライマー混合物へと連続して添加されるかのいずれかである、工程；（ｄ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いてＰＰｉの放出を検出して、どのヌクレオチドが取り込まれたかを示す、工程。
【００１６】
一つの局面において、本発明は、一本鎖サンプルＤＮＡ配列中の標的位置の塩基を同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：（ａ）標的位置に直ぐ隣接するサンプルＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを提供する工程であって、このサンプルＤＮＡは、平坦な平面上の複数のキャビティ内に配置され、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、これらの反応チャンバは、中心から中心まで５〜２００μｍの間の間隔を有し、このＤＮＡは、反応チャンバに配置される前または後のいずれかに、一本鎖にされる、工程；（ｂ）サンプルＤＮＡおよび伸長プライマーを、所定のデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供する工程であって、それにより、このデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、取り込まれるだけであり、そして標的位置の塩基に相補的である場合に、ピロリン酸（ＰＰｉ）を放出し、このデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドは、サンプル−プライマー混合物の別個のアリコートに添加されるか、または同じサンプル−プライマー混合物へと連続して添加されるかのいずれかである、工程；（ｃ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いてＰＰｉの放出を検出して、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが取り込まれたかを示す工程、を包含し；この方法は、ＰＰｉ検出酵素が、ポリメラーゼ反応工程中に含まれ、そしてデオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）またはジデオキシアデノシン三リン酸の代わりに、ポリメラーゼの基質として作用できるが、このＰＰｉ検出酵素の基質として作用できない、ｄＡＴＰアナログまたはｄｄＡＴＰアナログが使用される点で特徴づけられる、方法。
【００１７】
別の局面において、本発明は、一つのアレイ上で複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を包含し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供する工程であって、これらは各々、平坦な表面上の複数のキャビティ内に配置され、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、これらの反応チャンバは、中心から中心まで５〜２００μｍの間の間隔を有する、工程、（ｂ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を用いてＰＰｉを光へと転換する工程；（ｃ）光学的に感受性なデバイスのそれぞれの部分で、複数の反応部位から放出された光レベルを検出する工程；（ｄ）この光学的に感受性なデバイスの部分の各々に衝突する光を、全ての他の領域からの信号から識別され得る電気信号へと転換する工程；（ｅ）対応する電気信号から、別個の領域の各々についての光強度を決定する工程；（ｆ）経時的に、これらの電気信号の変動を記録する工程。
【００１８】
一つの局面において、本発明は、核酸を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；（ｂ）平坦な表面上の複数のキャビティ内に配置された、複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程であって、各キャビティは、分析物反応チャンバを形成し、ここで、これらの反応チャンバは、中心から中心まで５〜２００μｍの間の間隔を有する、工程、（ｃ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質の使用を介して、ＰＰｉを検出可能な実体へと転換する工程；（ｄ）光学的に感受性なデバイスのそれぞれの部分で、複数の反応部位から放出された光レベルを検出する工程；（ｅ）この光学的に感受性なデバイスの部分の各々に衝突する光を、全ての他の領域からの信号から識別され得る電気信号へと転換する工程；（ｆ）対応する電気信号から、別個の領域の各々についての光強度を決定する工程；（ｇ）経時的に、これらの電気信号の変動を記録する工程。
【００１９】
別の局面において、本発明は、核酸を配列決定するための方法を包含し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；（ｂ）少なくとも４００，０００の別個の反応部位を有する一つのアレイ中に、複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程；（ｃ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質の使用を介して、ＰＰｉを検出可能な実体へと転換する工程；（ｄ）光学的に感受性なデバイスのそれぞれの部分で、複数の反応部位から放出された光レベルを検出する工程；（ｅ）この光学的に感受性なデバイスの部分の各々に衝突する光を、全ての他の領域からの信号から識別され得る電気信号へと転換する工程；（ｆ）対応する電気信号から、別個の領域の各々についての光強度を決定する工程；（ｇ）経時的に、これらの電気信号の変動を記録する工程。
【００２０】
別の局面において、本発明は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを包含する：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列の成熟形態；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の成熟形態の改変体；配列番号２のアミノ酸配列；（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列の改変体（ここで、この改変体中の１つ以上のアミノ酸残基が、この成熟形態のアミノ酸配列とは異なり、但し、この改変体は、このアミノ酸配列とは、５％以下のアミノ酸残基が異なる）；ならびに（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のアミノ酸配列に対する、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換。本発明はまた、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を包含する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含む：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列の成熟形態；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、上記改変体中の１つ以上のアミノ酸残基は、上記成熟形態のアミノ酸配列とは異なり、ただし、上記改変体は、上記成熟形態のアミノ酸配列とは、わずかに５％のアミノ酸残基で異なる；（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列の改変体であって、ここで、上記改変体中の１つ以上のアミノ酸残基は、上記成熟形態のアミノ酸配列とは異なり、但し、上記改変体は、上記アミノ酸配列とは、わずかに１５％のアミノ酸残基で異なる；配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または上記ポリペプチドの改変体の少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、上記改変体中の１つ以上のアミノ酸残基は、上記成熟形態のアミノ酸配列とは異なり、ただし、上記改変体は、上記アミノ酸配列とは、わずかに５％のアミノ酸残基で異なる；（ｅ）および（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補鎖を含む核酸分子。さらなる局面において、本発明は、核酸分子を提供し、この核酸分子は、以下からなる群より選択される核酸配列を含む：（ａ）上記アミノ酸配列をコードするコード配列と１つ以上のヌクレオチド配列で異なるコード配列を含む、第１のヌクレオチド配列であって、但し、上記第１のヌクレオチド配列におけるコード配列中のヌクレオチドの２０％のみが、上記コード配列と異なる；第１のポリヌクレオチドの相補鎖である単離された第２のポリヌクレオチド；（ｂ）ならびに（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント。本発明はまた、（ａ）または（ｂ）の核酸分子を含むベクターを含む。別の局面において、本発明は、ベクターを含む細胞を含む。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、テンプレート核酸ポリマー中の核酸配列を決定するための方法を含み、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）テンプレート核酸ポリマーを重合環境に導入する工程であって、ここで、この核酸ポリマーは、ヌクレオチドが添加された場合に、相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして働く、工程；（ｂ）重合環境に一連の供給原料を連続的に提供する工程であって、各供給原料は、相補的核酸ポリマーが形成されるヌクレオチドのうちから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、供給原料中のヌクレオチドが、配列決定されるテンプレートポリマー中の次のヌクレオチドに相補的である場合、上記ヌクレオチドは、相補的ポリマーに組み込まれ、そして無機ピロホスフェートが、放出される、工程；（ｃ）重合環境から各々の供給原料を別々に回収する工程；ならびに（ｄ）各回収された供給原料中のＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼを有するＰＰｉの量を測定して、相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの同一性、すなわちテンプレートポリマーの配列を決定する工程。
【００２３】
別の局面において、本発明は、核酸を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）１つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；（ｂ）平面表面上のアレイにおける複数の空洞内に配置された複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程であって、各空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここで、この反応チャンバーは、５〜２００μｍの間隔を中心とするための中心および少なくとも４００，０００の別個の部位を有する、工程；（ｃ）有効量の核酸アンカープライマーを少なくとも１つの一本鎖環状テンプレートにアニーリングして、プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を得る工程；（ｄ）プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体とポリメラーゼとを合わせて、環状核酸プレートに相補的な核酸の複数のコピーに共有結合された伸長したアンカープライマーを形成する工程；（ｅ）有効量の配列決定プライマーを上記共有結合した相補的核酸の１つ以上のコピーにアニーリングする工程；（ｆ）ポリメラーゼと所定のヌクレオチド三リン酸とを有する配列決定プライマーを伸長して、配列決定産物を得る工程および、所定のヌクレオチド三リン酸が、上記配列決定プライマーの３’末端上に組み込まれる場合には、配列決定反応副産物を得る工程；ならびに（ｇ）ＡＴＰスルフリラーゼおよびルシフェラーゼを使用して、配列決定反応副産物を同定し、それにより、核酸の配列を決定する工程。
【００２４】
別の局面において、本発明は、核酸を配列決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）少なくとも１つの核酸アンカープライマーを提供する工程；（ｂ）少なくとも４００，０００の別個の反応部位を有するアレイにおいて複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程；（ｃ）第１の量の核酸アンカープライマーを少なくとも１つの一本鎖環状テンプレートにアニーリングして、プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を得る工程；（ｄ）プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体とポリメラーゼとを合わせて、環状核酸プレートに相補的な核酸の複数のコピーに共有結合された伸長したアンカープライマーを形成する工程；（ｅ）第２の量の配列決定プライマーを共有結合した相補的核酸の１つ以上のコピーにアニーリングする工程；（ｆ）ポリメラーゼと所定のヌクレオチド三リン酸とを有する配列決定プライマーを伸長して、配列決定産物を得る工程および、所定のヌクレオチド三リン酸が、配列決定プライマーの３’末端上に組み込まれる場合には、配列決定反応副産物を得る工程；ならびに（ｇ）熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを使用して、配列決定反応副産物を同定し、それにより、核酸テンプレートを含む各反応部位における核酸の配列を決定する工程。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を含み、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供する工程であって、各々は、平面表面上の複数の空洞内に配置され、各空洞は、分析物反応チャンバーを形成し、ここで、この反応チャンバーは、５〜２００μｍの間隔を中心とするための中心を有する、工程、（ｂ）１つの既知の窒素性塩基の活性化されたヌクレオシド５’三リン酸前駆体を、各反応チャンバー中の反応混合物に添加する工程であって、各反応混合物は、テンプレート特異的ヌクレオチドポリメラーゼおよびテンプレートよりも少なくともヌクレオチド残基が１つ短い相補的オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズされた一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを含み、プライマー鎖の３’末端上への活性化されたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の組み込みを可能にする反応条件下で、プライマー鎖の３’末端での各テンプレートにおいて少なくとも１つの不対ヌクレオチド残基を形成し、但し、活性化されたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基は、テンプレートの不対ヌクレオチド残基の窒素性塩基に相補的である、工程；（ｃ）ヌクレオシド５’三リン酸前駆体が、熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼによる配列決定副産物の検出を介して、プライマー鎖に組み込まれたか否かを決定する工程であって、従って、テンプレートの不対ヌクレオチド残基が、組み込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基に相補的な窒素性塩基組成物を有することを示す工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を連続的に反復する工程であって、ここで、各連続的な反復は、既知の窒素性塩基組成物の１つの型の活性化されたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の組み込みを加え、そして検出する；ならびに（ｅ）上記ヌクレオシド前駆体の組み込みの配列由来の各反応チャンバーの不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＡＴＰを検出可能な存在にするポリペプチドに結合したＡＴＰ生成ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」とは、別の外因性タンパク質フラグメントに結合された外因性タンパク質フラグメントを含むキメラタンパク質をいう。この融合タンパク質は、タンパク質の固体支持体への結合を可能にするか、または宿主細胞もしくは培養物上清、またはその両方から組換え融合タンパク質の精製を可能にする親和性タグを含み得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチドは、真核生物由来または原核生物由来である。真核生物は、動物、植物、真菌または酵母であり得る。幾つかの実施形態において、動物は、哺乳動物、齧歯類、昆虫、虫、軟体動物、爬虫類、鳥類、および両生類である。ポリペプチドの植物源としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｃａｕｄａｔｕｓ、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ、Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ、Ｕｌｍｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎａ、またはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍが挙げられるが、これらに限定されない。真菌の例としては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａおよびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉが挙げられるが、これらに限定されない。酵母源の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、およびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
原核生物源は、細菌または始生菌（ａｒｃｈａｅａ）であり得る。幾つかの実施形態において、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、フラボバクテリア（ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ）または緑色硫黄細菌である。他の実施形態において、始生菌は、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉである。
【００２９】
ＡＴＰ生成ポリペプチドは、ＡＴＰスルフリラーゼ、ヒドロラーゼまたはＡＴＰシンターゼであり得る。好ましい実施形態において、ＡＴＰ生成ポリペプチドは、ＡＴＰスルフリラーゼである。１つの実施形態において、ＡＴＰスルフリラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）由来のクローニングされた熱安定性スルフリラーゼであり、そして配列番号１のヌクレオチド配列を含む。この推定遺伝子を、ＡＴＣＣ（カタログ番号１２９８０Ｄ）から取得したゲノムＤＮＡを用いてクローニングした。親和性タグを有する融合タンパク質として発現され得る機能的ＡＴＰスルフリラーゼをコードする遺伝子が、示される。開示されたＢｓｔスルフリラーゼ核酸（配列番号１）は、１２４７ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧコドンに始まり、ヌクレオチド１１５９〜１１６１のＴＡＡコドンで終わる成熟タンパク質についてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、同定した。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンは、太字で強調してある。推定非翻訳領域に下線を引いてあり、開始コドンの上流および終止コドンから下流に見出される。
【００３０】
【化１】
2005517397.tif 000002
【００３１】
Ｂｓｔスルフリラーゼポリペプチド（配列番号２）は、長さが３８６アミノ酸残基であり、３文字コードを使用して以下に示される。
【００３２】
【化２−１】
2005517397.tif 000003
【００３３】
【化２−２】
2005517397.tif 000004
【００３４】
【化２−３】
2005517397.tif 000005
【００３５】
１つの実施形態において、熱安定性スルフリラーゼは、周囲温度を超える温度から少なくとも５０℃までで活性である。この特性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または配列決定反応において一般的に利用されるより高い温度で変性しないので有益である。１つの実施形態において、ＡＴＰスルフリラーゼは、好熱性生物由来である。この熱安定性スルフリラーゼは、好熱性細菌由来であり得、これらとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
１２のＡＴＰスルフリラーゼの相同性が、表１において、ＣｌｕｓｔａｌＷ分析において図示され得る。このアラインメントは、以下の種に由来するＡＴＰスルフリラーゼのアラインメントである：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｋｌａｈｏｍａ−株１０（Ｕｎｉｖ  ｏｆ  ＯＫ）、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ（Ａａｅ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓｏ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（Ｐａｅ）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆｕ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ（Ｐｃｈ）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘ（Ａｐｅ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓｃｅ）、およびＴｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆｕｓｃａ（Ｔｆｕ）。
【００３７】
【表１−１】
2005517397.tif 000006
【００３８】
【表１−２】
2005517397.tif 000007
【００３９】
【表１−３】
2005517397.tif 000008
【００４０】
熱安定性スルフリラーゼポリペプチドは、熱安定性スルフリラーゼ核酸のオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によってコードされる。ＯＲＦは、潜在的にポリペプチドに翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、終止コドンによって中断されない。完全タンパク質についてのコード配列を示すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始コドン」で始まり、３つの「終止」コドン（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）のうちの１つで終結する。本発明の目的のために、ＯＲＦは、開始コドン、終止コドン、またはその両方ありまたはなしのコード配列の任意の一部であり得る。細胞タンパク質コードについての良好な候補として考えられるＯＲＦに関して、最小サイズの要件は、しばしば、例えば、５０アミノ酸以上のタンパク質をコードするＤＮＡのストレッチを設定する。
【００４１】
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、従って、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる熱安定性スルフリラーゼタンパク質と同じ熱安定性スルフリラーゼをコードする、配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。配列番号１に示される熱安定性スルフリラーゼヌクレオチド配列に加えて、熱安定性スルフリラーゼポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、細菌集団）内に存在し得ることが当業者に理解される。熱安定性スルフリラーゼ遺伝子におけるこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子バリエーションに起因して、集団内の個体の中で存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、熱安定性スルフリラーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子バリエーションは、代表的には、熱安定性スルフリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列中に１−５％の分散を生じ得る。熱安定性スルフリラーゼポリペプチドにおける任意のおよび全てのこのようなヌクレオチドバリエーションおよび得られたアミノ酸多型（これは、天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、熱安定性スルフリラーゼポリペプチドの機能的な活性を変化させない）は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００４２】
さらに、他の種に由来する熱安定性スルフリラーゼタンパク質をコードする核酸分子、従って、配列番号１の配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であることが意図される。本発明の熱安定性スルフリラーゼｃＤＮＡの天然の対立遺伝子およびホモログに対応する核酸分子は、ストリンジェントな条件下での標準的なハイブリダイゼーション技術に従って、ハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡ、またはその一部を使用して、本明細書中に開示される熱安定性スルフリラーゼ核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離され得る。本発明はさらに、配列番号１の核酸配列ならびにその成熟形態および改変体形態の核酸配列を含む。ここで、第１のヌクレオチド配列は、このコード配列において１１％以下がコード配列と異なるのであれば、上記アミノ酸配列をコードするコード配列とは１以上のヌクレオチド配列が異なるコード配列を含む。
【００４３】
本発明の別の局面は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含む熱安定性スルフリラーゼタンパク質をコードする核酸分子に関する。このような熱安定性スルフリラーゼタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。別個の実施形態において、この単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ここでこのタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％相同なアミノ酸配列を含む。配列番号２のタンパク質に相同な熱安定性スルフリラーゼタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列に１個以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作製され得る。その結果、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【００４４】
変異は、標準的な技術（例えば、部位指向性変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号２に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の、推定非必須アミノ酸残基において作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野内で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、シスチン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン、）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。従って、熱安定性スルフリラーゼタンパク質における推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、熱安定性スルフリラーゼコード配列の全てまたは一部に沿って、例えば、飽和変異誘発によって無作為に導入され得、得られる変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、熱安定性スルフリラーゼの生物学的活性についてスクリーニングされ得る。配列番号１の変異誘発の後に、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の組換え技術によって発現され得、このタンパク質の活性が決定され得る。
【００４５】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下の群のうちのいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ（ここで一文字アミノ酸コードは、互いについて置換され得るアミノ酸によって分類される）。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のうちのいずれか１つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ（ここで各群内のこの文字は、一文字アミノ酸コードを示す）。
【００４６】
本発明の熱安定性スルフリラーゼ核酸は、その配列が本明細書中に提供される核酸またはそのフラグメントを含む。本発明はまた、変異体または改変体の核酸を含み、その塩基のいずれかが、スルフリラーゼ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードすると同時に、本明細書中に示される対応する塩基またはこのような核酸のフラグメントから変化され得る。本発明はさらに、その配列がまさに記載される核酸配列に相補的な核酸配列（まさに記載される核酸のいずれかに相補的な核酸フラグメントを含む）を含む。本発明はさらに、その構造が、化学的改変を含む核酸または核酸フラグメント、あるいはそれらの相補体を含む。このような改変としては、改変塩基、およびその糖リン酸骨格が改変または誘導体かされている核酸が挙げられるが、これらに限定されない。これらの改変は、改変核酸の化学的安定性を少なくとも一部増強するように行われ得、その結果、これらの改変は、例えば、被験体における治療適用においてアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【００４７】
熱安定性スルフリラーゼ核酸配列は、成熟熱安定性スルフリラーゼポリペプチドをコードし得る。本明細書中で使用される場合、本発明において開示されるポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態またはプロタンパク質の産物である。この天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、例えば、対応する遺伝子によってコードされる全長遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、これは、本明細書中に記載されるＯＲＦによってコードされるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として規定され得る。産物の「成熟形態」は、繰り返すが、非限定的な例によって、この遺伝子産物が生じる細胞、すなわち宿主細胞内で生じ得る場合、１つ以上の天然に存在するプロセシング工程の結果として、生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態をもたらすこのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニン残基の切断またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解性切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（ここで残基１は、Ｎ末端メチオニンである）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残る残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで残基１〜ＭまでのＮ末端シグナル配列は、切断される）を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎまでの残基を有する。さらに、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解性切断事象以外の翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスは、グリコシル化、ミリスチル化、またはリン酸化が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらのプロセスの１つのみ、またはそれらのいずれかの組み合わせの操作から生じ得る。
【００４８】
用語「単離された」核酸分子は、本明細書中で使用される場合、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の天然で核酸に隣接する配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離された熱安定性のスルフリラーゼ核酸分子は、この核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然で隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂより小さいヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術によって生成された場合、他の細胞物質または培養培地を実質的に含み得ないか、または化学的に合成された場合、化学前駆体または他の化学物質を含み得ない。
【００４９】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこの前記ヌクレオチド配列の相補体）は、標準的な分子生物学技術および本明細書中で提供される配列情報を使用して、単離され得る。配列番号１の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、熱安定性スルフリラーゼ分子が、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌ，ら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３に記載されるような）。
【００５０】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡを、テンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして使用して、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングされ得、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴付けされ得る。さらに、熱安定性スルフリラーゼヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドが、標準的な合成技術によって、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を使用して、調製され得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチド単位の間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対形成をいい、そして用語「結合」とは、２つのポリペプチドもしくは化合物、または関連のポリペプチドもしくは化合物、またはそれらの組合せの間の物理的または化学的な相互作用を意味する。結合としては、イオン的相互作用、非イオン的相互作用、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。物理的相互作用は、直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の効果を介してまたはこの効果に起因し得る。直接結合とは、別のポリペプチドまたは化合物の効果を介してまたはこの効果に起因して起こらないが、その代わり、他の実質的な化学的中間体を伴わない相互作用をいう。
【００５２】
本明細書中で提供されるフラグメントは、少なくとも６の（連続した）核酸または少なくとも４の（連続した）アミノ酸の配列（それぞれ、核酸の場合、特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに充分な長さ、またはアミノ酸の場合、エピトープの特異的認識を可能にするのに充分な長さ）として定義され、そして全長配列未満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続した部分由来であり得る。誘導体は、ネイティブの化合物から直接的に、または改変もしくは部分的置換によって形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブの化合物に類似しているが同一ではない構造を有するものの、特定の成分または側鎖に関してネイティブの化合物と異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成アナログであっても、異なる進化起源由来であってもよく、そして野生型と比較して類似した代謝活性を有していても反対の代謝活性を有していてもよい。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００５３】
誘導体およびアナログは、全長であるか、または、この誘導体またはアナログが、下記のように、改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、種々の実施形態において、同一のサイズの核酸配列またはアミノ酸配列にわたり少なくとも約８９％の同一性だけ、またはアライメントが当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによって行われる整列された配列と比較した場合、本発明の核酸またはタンパク質と実質的に相同な領域を含む分子、あるいはそのコード核酸が、ストリンジェント、中程度にストリンジェントまたは低ストリンジェントな条件下で上記のタンパク質をコードする核酸の相補体にハイブリダイズし得る分子、が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９３および以下を参照のこと。
【００５４】
「相同核酸配列」もしくは「相同アミノ酸配列」またはそれらのバリエーションは、上記のようなヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同ヌクレオチド配列は、熱安定性スルフリラーゼポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシング結果として、同じ生物体の異なる組織において発現し得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同ヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物を含むが、これに限定されない）の熱安定性スルフリラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物を含み得る。相同ヌクレオチド配列としてはまた、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子バリエーションおよび変異が挙げられるが、これらに限定されない。相同核酸配列としては、配列番号１における保存的アミノ酸置換をコードする核酸配列、および熱安定性スルフリラーゼ生物学的活性を有するポリペプチドが挙げられる。熱安定性スルフリラーゼタンパク質の種々の生物学的活性が、以下に記載される。
【００５５】
本発明の熱安定性スルフリラーゼタンパク質は、その配列が本明細書中に示されるスルフリラーゼタンパク質を含む。本発明はまた、その残基が本明細書中に示される対応する残基から変更され得るが、なおそのスルフリラーゼ様活性および生理学的機能を保持するタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする、任意の変異体または改変体タンパク質を含む。本発明は、本発明の任意のタンパク質に免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）を包含する。本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列の改変体または成熟形態を含み、ここで改変体中の１つ以上のアミノ酸残基は、成熟形態のアミノ酸配列とは、アミノ酸残基の４％未満が異なる。
【００５６】
順方向ＡＴＰスルフリラーゼ反応の検出のためのいくつかのアッセイが、開発されている。比色モリブドリシス（ｍｏｌｙｂｄｏｌｙｓｉｓ）アッセイは、ホスフェート検出に基づき（例えば、ＷｉｌｓｏｎおよびＢａｎｄｕｒｓｋｉ，１９５８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３３：９７５−９８１を参照のこと）、一方、連続分光光度的モリブドリシスアッセイは、ＮＡＤＨ酸化の検出に基づく（例えば、Ｓｅｕｂｅｒｔ，ら、１９８３．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２５：６７９−６９１；Ｓｅｕｂｅｒｔ，ら，１９８５．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４０：５０９−５２３を参照のこと）。後者のアッセイは、いくつかの検出酵素の存在を必要とする。
【００５７】
ＡＴＰを光に変換するための適切な酵素としては、ルシフェラーゼ（例えば、昆虫ルシフェラーゼ）が挙げられる。ルシフェラーゼは、触媒の最終生成物として、光を生成する。最も公知の発光酵素は、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ））の発光酵素である。対応する遺伝子は、クローニングされ、そして細菌（例えば、ｄｅ  Ｗｅｔ，ら、１９８５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７８７０−７８７３を参照のこと）および植物（例えば、Ｏｗ，ら、１９８６．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：８５６−８５９を参照のこと）、ならびに昆虫（例えば、Ｊｈａ，ら、１９９０．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２７４：２４−２６を参照のこと）および哺乳動物細胞（例えば、ｄｅ  Ｗｅｔ，ら、１９８７．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７３；Ｋｅｌｌｅｒ，ら、１９８７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３２６４−３２６８を参照のこと）において発現されている。さらに、Ｊａｍａｉｃａｎコメツキムシ（Ｐｙｒｏｐｌｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｉｈａｌａｍｕｓ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ））由来の多数のルシフェラーゼ遺伝子が、最近、クローニングされ、そして部分的に特徴付けられている（例えば、Ｗｏｏｄ，ら，１９８９．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：２８９−３０１；Ｗｏｏｄ，ら、１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７００−７０２を参照のこと）。別個のルシフェラーゼは、時折、異なる波長の光を生成し、これは、異なる波長の発光の同時モニタリングを可能にし得る。従って、これらの上記の特徴は、固有であり、そして現在のレポーター系の利用に関する新たな広がりを追加する。
【００５８】
ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリン、アデノシン５’トリホスフェート（ＡＴＰ）、マグネシウムイオンおよび酸素の存在下で、生物発光を触媒し、０．０８の量子収率を生じる（例えば、ＭｃＥｌｒｏｙおよびＳｅｌｉｎｇｅｒ，１９６０．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８８：１３６−１４５を参照のこと）。ホタルルシフェラーゼ生物発光反応は、ＡＴＰの検出のためのアッセイとして利用され得、この検出限界は、約１×１０−１３Ｍである（例えば、Ｌｅａｃｈ．１９８１．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：４７３−５１７を参照のこと）。さらに、ルシフェラーゼ媒介検出システムの感度および簡便さの全程度は、ホタルルシフェラーゼベースのバイオセンサの開発において、大きな関心をもたれている（例えば、ＧｒｅｅｎおよびＫｒｉｃｋａ，１９８４．Ｔａｌａｎｔａ  ３１：１７３−１７６；Ｂｌｕｍ，ら、１９８９．Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：５４３−５５０を参照のこと）。
【００５９】
新たな試薬の開発は、ＡＴＰの濃度に比例する安定な発光を得ることを可能にする（例えば、Ｌｕｎｄｉｎ，１９８２．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ；Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙｓ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。このような安定な発光試薬を用いて、終点アッセイを実施すること、および既知の量のＡＴＰの添加によって、各々個々のアッセイを較正することが可能である。さらに、安定な発光系はまた、ＡＴＰ変換系の連続的なモニタリングを可能にする。
【００６０】
好ましい実施形態において、ＡＴＰ生成−ＡＴＰ変換融合タンパク質は、親和性タグに付着される。用語「親和性タグ」は、ポリペプチドの精製または検出を提供するため、あるいはポリペプチドの基材への付着のための部位を提供するために、ポリペプチドに付着され得るペプチドセグメントを示すために本明細書中において使用される。原則として、抗体または他の特異的結合剤が利用可能である任意のペプチドまたはタンパク質は、親和性タグとして使用され得る。親和性タグは、ポリヒスチジントラクト（ｔｒａｃｔ）またはビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）ドメイン、プロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１０７５，１９８５；Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３，１９９１）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ  ６７：３１，１９８８）、サブスタンスＰ（Ｐ物質）、Ｆｌａｇ．ＴＭ．ペプチド（Ｈｏｐｐら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４−１２１０，１９８８；Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．から入手可能）、ストレプトアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインが挙げられる。一般的に、Ｆｏｒｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７，１９９１を参照のこと。親和性タグをコードするＤＮＡは、商業的供給業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から入手可能である。
【００６１】
本明細書中において使用される場合、用語「ポリヒスチジンタグ」は、融合タンパク質を参照して使用される場合、目的のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおける、２〜１０個のヒスチジン残基の存在をいう。６〜１０個の残基のポリヒスチジントラクトが好ましい。ポリヒスチジントラクトはまた、ニッケル−キレートカラムまたはＩＤＡカラムでの得られる融合タンパク質のアフィニティー精製を可能にする、目的のタンパク質に付加される連続的な複数のヒスチジン残基であるとして機能的に規定される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、スルフリラーゼポリペプチドが、ルシフェラーゼポリペプチドに対してＮ末端側にあるような方向を有する。他の実施形態において、ルシフェラーゼポリペプチドは、スルフリラーゼポリペプチドに対してＮ末端側にある。本明細書中において使用される場合、用語スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質は、これらの方向のいずれかをいう。用語「アミノ末端」（Ｎ末端）および「カルボキシ末端」（Ｃ−末端）は、ポリペプチドおよびタンパク質内の位置を示すために、本明細書中において使用される。文脈が許す場合、これらの用語は、近位または相対的な位置を示すために、ポリペプチドまたはタンパク質の特定の配列または部分を参照して使用される。例えば、タンパク質内の参照配列に対してカルボキシル末端側に位置する特定の配列は、参照配列のカルボキシ末端に対して近位に位置するが、完全タンパク質のカルボキシ末端にある必要はない。
【００６３】
本発明の融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従って（例えば、連結のための平滑末端または「粘着（ｓｔｉｃｋｙ）」末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合の付着末端の充填（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望でない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素連結を使用することによって）、インフレームで一緒に連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成器を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的な突出を生じるアンカープライマーを使用して実施され得、これらのフラグメントは、キメラ遺伝子配列を作製するために後にアニールされそして再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。融合タンパク質の２つのポリペプチドはまた、クローニング手順の間、特定のプライマーを用いて操作されるリンカー（例えば、独特の制限部位）によって結合され得る。１つの実施形態において、スルフリラーゼポリペプチドおよびルシフェラーゼポリペプチドは、リンカー（例えば、ＮｏｔＩ制限部位によってコードされるａｌａ−ａｌａ−ａｌａリンカー）によって結合される。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ生成ポリペプチド配列およびＡＴＰ変換ポリペプチド配列を有する融合タンパク質についてのコード配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、組換えポリヌクレオチドは、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼタンパク質をコードする。用語「組換えＤＮＡ分子」または「組換えポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、分子生物学的技術によって、一緒に結合されたＤＮＡのセグメントから構成されるＤＮＡ分子をいう。用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子をいう。
【００６５】
１つの局面において、本発明は、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグおよびＢＣＣＰタグを有するスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を開示する。開示されるＮ末端ヘキサヒスチジン−ＢＣＣＰルシフェラーゼ−スルフリラーゼ遺伝子（Ｈｉｓ６−ＢＣＣＰ  Ｌ−Ｓ）遺伝子の核酸配列を、以下に示す：
Ｈｉｓ６−ＢＣＣＰ  Ｌ−Ｓヌクレオチド配列（配列番号３）：
【００６６】
【数１−１】
2005517397.tif 000009
【００６７】
【数１−２】
2005517397.tif 000010
【００６８】
開示されるＨｉｓ６−ＢＣＣＰ  Ｌ−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列を、三文字アミノ酸コードを使用して示す（配列番号４）。
Ｈｉｓ６−ＢＣＣＰ  Ｌ−Ｓアミノ酸配列（配列番号４）
【００６９】
【数２−１】
2005517397.tif 000011
【００７０】
【数２−２】
2005517397.tif 000012
【００７１】
【数２−３】
2005517397.tif 000013
【００７２】
【数２−４】
2005517397.tif 000014
【００７３】
【数２−５】
2005517397.tif 000015
【００７４】
【数２−６】
2005517397.tif 000016
【００７５】
従って、１つの局面において、本発明は、少なくとも１つのアフィニティータグに結合された熱安定スルフリラーゼを含む融合タンパク質を提供する。開示されるＮ末端ヘキサヒスチジン−ＢＣＣＰ  Ｂｓｔ  ＡＴＰスルフリラーゼ（Ｈｉｓ６−ＢＣＣＰ  Ｂｓｔスルフリラーゼ）遺伝子の核酸配列が、以下に示される：
Ｈｉｓ６−ＢＣＣＰ  Ｂｓｔスルフリラーゼ核酸配列（配列番号５）
【００７６】
【数３】
2005517397.tif 000017
【００７７】
Ｈｉｓ６−ＢＣＣＰ  Ｂｓｔスルフリラーゼポリペプチドのアミノ酸配列を、表６において三文字アミノ酸コードを使用して示す（配列番号６）。
【００７８】
Ｈｉｓ６−ＢＣＣＰ  Ｂｓｔスルフリラーゼ核酸配列（配列番号６）
【００７９】
【数４−１】
2005517397.tif 000018
【００８０】
【数４−２】
2005517397.tif 000019
【００８１】
【数４−３】
2005517397.tif 000020
【００８２】
本発明の別の局面は、ＡＴＰ生成ポリペプチドおよびＡＴＰ変換ポリペプチド、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログをコードする核酸を含むベクター（好ましくは、発現ベクター）に関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、このウイルスベクターにおいて、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、これらが導入される宿主細胞において自律複製し得る（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書中において、「発現ベクター」と呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが、ベクターの最も一般的に使用される形態であるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価な機能を提供する、このような他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス））を含むことを意図する。
【００８３】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の核酸を含み、これは、発現される核酸配列に作動可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を、その組換え発現ベクターが含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系、またはベクターが宿主細胞に導入される場合にはその宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、調節配列に連結されることを意味することが意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を指向する配列および特定の宿主細胞においてのみそのヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者によって理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され得、それによって、融合タンパク質を作製し得る。
【００８４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における融合タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞）において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳され得る。
【００８５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、発現を指向する構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中で最もしばしば実施される。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的に役に立つ：（１）組換えタンパク質の発現を増加させること；（２）組換えタンパク質の溶解度を増加させること；および（３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位は、融合部分と組換えタンパク質との接合点に導入され、融合部分からの組換えタンパク質の分離、続いての融合タンパク質の精製を可能にする。
【００８６】
別の実施形態において、ＡＴＰ生成−ＡＴＰ変換融合タンパク質発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）が挙げられる。
【００８７】
あるいは、融合タンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞において発現され得る。昆虫培養細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【００８８】
さらに別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物細胞発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＵ  Ｊ  ６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス制御エレメントによって提供される。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方に対して他の適切な発現系について、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版の第１６章および第１７章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと。
【００８９】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的制御エレメントは、核酸を発現するために使用される）。組織特異的制御エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １：２６８−２７７）、リンパ球特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプターのプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ  ８：７２９−７３３）および免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイ（ｍｉｌｋ  ｗｈｅｙ）プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願第２６４，１６６号）が挙げられる。発生調節プロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ３：５３７−５４６））がまた、含まれる。
【００９０】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入される宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験体細胞をいうだけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。特定の改変が、変異の影響または環境の影響のいずれかに起因して首尾よく生成し得るので、このような子孫は、実際、親細胞と同一であり得ないが、本明細書中で使用されるような用語の範囲内になお含まれる。本発明はまた、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質発現ベクターを含むキットを包含する。
【００９１】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞））中で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００９２】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって、原核細胞または真核細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための種々の当該分野で理解される技術（リン酸カルシウム共沈法または塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる）をいうことが意図される。宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクションするために適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルにおいて見出され得る。
【００９３】
哺乳動物細胞の適切なトランスフェクションについて、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さな画分のみが、これらのゲノムに外来ＤＮＡを組込み得ることが知られている。これらの組込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般的に、目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーとしては、薬物に対する耐性を付与するマーカー（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート）が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、ＯＲＦＸをコードする同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、または別々のベクターで導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択（例えば、選択マーカー遺伝子を組込まれた細胞は、生存するが、他の細胞は死滅する）によって同定され得る。
【００９４】
本発明の宿主細胞（例えば、培地中の原核宿主細胞または真核宿主細胞）は、融合タンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を使用して、融合タンパク質を産生する方法をさらに提供する。１つの実施形態において、本方法は、適切な培地中で、本発明の宿主細胞（その中に、融合タンパク質をコードする組換え発現ベクターが、導入されている）を培養し、その結果、融合タンパク質を産生する工程を包含する。別の実施形態において、本方法は、培地または宿主細胞から融合タンパク質を単離する工程をさらに包含する。
【００９５】
本発明はまた、可動性支持体に結合された融合タンパク質を包含する。好ましい実施形態において、融合遺伝子は、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合遺伝子である。別の実施形態において、可動性支持体は、ストレプトアビジンである。可動性支持体は、ビーズであっても、光ファイバーであってもよい。好ましい実施形態において、ビーズは、ニッケル−アガロースビーズまたはＭＰＧ−ストレプトアビジンビーズである。１つの実施形態において、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質は、タンパク質  対  ビーズの比が１：３でビーズに結合される。このタンパク質は、共有結合または非共有結合によって固体支持体に結合され得る。一般的に、当該分野で理解される任意の結合が、使用され得る。当該分野において共通のこのような結合の例としては、任意の適切な金属（例えば、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋）−ヘキサヒスチジン錯体、ビオチン結合タンパク質（例えば、ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮＴＭ改変アビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／グルタチオン、モノクローナル抗体／抗原、およびマルトース結合タンパク質／マルトース、ならびにプルロニックカップリング技術が挙げられる。適切なタグを含むサンプルは、増感性基質とインキュベートされ、その結果、０個の分子、１個の分子、または多くの分子が、各々の増感部位に結合する。
【００９６】
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）は、デノボ脂肪酸生合成における第１の関係する段階を触媒する。このＡＣＣａｓｅは、ビオチンを補因子として、そして重炭酸塩をカルボキシル基の供給源として使用するカルボキシラーゼの群に属する。２つの型のＡＣＣａｓｅが存在する：原核生物ＡＣＣａｓｅ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓおよびおそらくナシ葉緑体）（ここで、３つの機能的ドメイン（ビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）およびカルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ））が、別々のサブユニット上に位置される）ならびに真核生物ＡＣＣａｓｅ（例えば、ラット、ニワトリ、酵母、珪藻類およびコムギ）（ここで、全てのドメインは、１つの大きなポリペプチド上に位置される）。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのサブユニットとしてＢＣＣＰが、Ｅ．ｃｏｌｉ中のビオチンホロ酵素シンテターゼの作用によって１２２位のＬｙｓ残基でビオチン化されることは公知である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６３，６４６１（１９８８））。本発明の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ＢＣＣＰドメインに結合され、次いで、アビジンの結合のために使用され；従って、これは、ストレプトアビジン可動性支持体に結合され得る。１つのビオチン−（ストレプト−）アビジンベースのアンカリング法は、固体支持体上で乾燥された光活性化可能なビオチンアナログの薄相を使用する（ＨｅｎｇｓａｋｕｌおよびＣａｓｓ，１９９６．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：２４９−２５４）。次いで、ビオチンアナログは、マスクを通る白色光に曝露され、規定された活性化ビオチンの領域を作成する。次いで、アビジン（またはストレプトアビジン）が、添加され、活性化ビオチンへの結合を可能にする。アビジンは、遊離ビオチン結合部位を保有し、この部位は、ビオチン−（ストレプト−）アビジン結合を介するビオチン化タンパク質を「アンカー」するために使用され得る。
【００９７】
あるいは、融合タンパク質は、光除去可能な保護基を保有するビオチン誘導体を有する固体支持体に結合され得る。この部分は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に共有結合され、このＢＳＡは、固体支持体（例えば、ガラス表面）に結合される。ＰｉｒｒｕｎｇおよびＨｕａｎｇ，１９９６．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：３１７−３２１を参照のこと。次いで、マスクが使用され、規定された照射領域内に活性化ビオチンを生成する。次いで、アビジンは、照射領域に局在化され得、ビオチン化されたスルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質は、続いて、ＢＳＡ−ビオチン−アビジン−ビオチン結合を介して結合される。
【００９８】
結合の別の方法は、プルロニクス（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）ベースの結合の使用を伴う。プルロニクスは、疎水性表面とポリプロピレンオキシドとの間の反応によって疎水性表面に結合する。残りのポリペプチドオキシド基は、表面から離れて伸長し、それによって親水性環境を作る。ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）は、ポリエチレンオキシド鎖の末端に結合体化され得、ヘキサヒスチジン化タグ化タンパク質が結合されるようにする。
【００９９】
本発明は、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチドの融合タンパク質を、検出のために利用する配列決定の方法を提供する。好ましい実施形態において、配列決定産物のヌクレオチド配列は、ｄＮＭＰが延長配列プライマー中に組み込まれる際に、ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）から遊離する無機リン酸（ＰＰｉ）を測定することによって、決定される。この配列決定の方法は、ＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＴＭ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰｙｒｏＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）と呼ばれる。溶液（液相）中で実行され得るか、または固相技術として実行され得る。ＰＰｉ配列決定方法を含む、種々の配列決定方法は、例えば、ＷＯ９８１３５２３Ａ１、Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９、およびＲｏｎａｇｈｉら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３−３６５（１９９８）、米国特許６，２７４，３２０ならびに特許出願ＵＳＳＮ１０／１０４，２８０（２００１年３月２１日出願（２１４６５−５０１ＣＩＰ３））に記載される。これらの配列決定の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０１００】
これらの条件下で遊離されるピロリン酸は、酵素的に（例えば、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応における発光によって）検出され得る。このような方法は、電気泳動の必要性および潜在的に危険な放射標識の使用を回避する一方で、目的の標的位置におけるヌクレオチドの同定および容易かつ迅速なＤＮＡの配列決定を可能にする。
【０１０１】
本発明はまた、核酸の配列決定のための方法であって、一般に、以下の工程：（ａ）複数の反応チャンバーおよび反応キャビティ内に配置された１つ以上の核酸アンカープライマーおよび複数の１本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程；（ｂ）有効量の核酸アンカープライマーを、１本鎖環状テンプレートの少なくとも１つにアニーリングさせ、プライムされた（ｐｒｉｍｅｄ）アンカープライマー−環状テンプレート複合体を生じさせる工程；（ｃ）プライムされたアンカープライマー−環状テンプレート複合体をポリメラーゼと合わせ、環状核酸テンプレートに相補的な核酸の複数コピーに共有結合的に連結された延長されたアンカープライマーを形成する工程；（ｄ）有効量の配列決定プライマーを、前記共有結合的に連結された相補的な核酸の１つ以上のコピーにアニーリングさせる工程；（ｅ）ポリメラーゼおよび所定のヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長させ、配列決定産物（およびこの所定のヌクレオチド三リン酸が前記配列決定プライマーの３’末端上に組み込まれる場合は、配列決定反応副産物）を生じさせる工程；ならびに（ｆ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチドの融合タンパク質を用いてＰＰｉ配列決定反応副産物を同定し、それによってこの核酸の配列を決定する工程；を包含する、方法を提供する。１つの実施形態において、ｄＡＴＰまたはｄｄＡＴＰアナログが、デオキシまたはジデオキシアデノシン三リン酸の代わりに使用される。このアナログは、ポリメラーゼの基質として作用し得るが、ＰＰｉ検出酵素の基質としては作用し得ない。この方法は、水性環境における個別の平行した一般反応（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｏｍｍｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）において実行され得る。
【０１０２】
別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を含み、この方法は、一般的に以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む：（ａ）各々が平面表面上の複数のキャビティ内に配置された、複数のサンプルＤＮＡを提供する工程；（ｂ）プライマー鎖の３’末端への、活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下で、各反応チャンバ中の反応混合物に、１つの既知の窒素性塩基の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体を添加して、該プライマー鎖の３’末端にて各テンプレート中の少なくとも１つの対合していないヌクレオチドを形成する工程であって、各反応混合物は、テンプレート指向性のヌクレオチドポリメラーゼ、および該テンプレートよりも短い少なくとも１ヌクレオチド残基の相補的オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズした一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを含み、但し、該活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の該窒素性塩基は、該テンプレートの対合していないヌクレオチド残基の窒素性塩基と相補的である、工程；（ｃ）ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチドの融合タンパク質を用い、ヌクレオシド５’三リン酸前駆体がプライマー鎖中に取り込まれたかどうかを検出する工程であって、このヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みは、テンプレートの不対ヌクレオチド残基が、取り込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の不対ヌクレオチド残基に相補的である窒素塩基組成を有することを示す、工程；（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を連続して繰り返す工程であって、ここで、各連続的な繰り返しが、公知の窒素塩基組成の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の１つの型を添加し、そしてその取り込みを検出する、工程；ならびに（ｅ）該ヌクレオシド前駆体の取り込みの配列から、各反応チャンバー中のテンプレートの不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程。
【０１０３】
本発明のアンカープライマーは、一般に、ストーク（ｓｔａｌｋ）領域および少なくとも１つのアダプター領域を含む。好ましい実施形態において、アンカープライマーは、少なくとも２つの近接するアダプター領域を含む。このストーク領域は、アンカープライマーの５’末端に存在し、そしてアンカープライマーを固体基材に付着させるための、ヌクレオチドの領域を含む。
【０１０４】
このアダプター領域は、核酸配列の集合の１つ以上のメンバー中に存在する相補的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、このアンカープライマーは、２つの隣接するアダプター領域を含み、このアダプター領域は、標的核酸配列の別個の末端に連結する相補的領域にハイブリダイズする。さらなる実施形態において、このアンカープライマー中のアダプター領域は、第２の核酸配列中に存在する配列の非隣接的領域に相補的である。例えば、各アダプター領域は、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって生成されるフラグメントの各終端に相同であり得る。このフラグメントは、例えば配列多型性を含むことが公知であるかまたは含むと推測される配列を含み得る。さらに、このアンカープライマーは、標的核酸配列のギャップ化領域（ｇａｐｐｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）（すなわち、１つ以上のヌクレオチドの欠失のせいで、非隣接的である）に相同な２つのアダプター領域を含み得る。これらの配列を有するアダプター領域が使用される場合、ギャップ化配列に対応するアラインするオリゴヌクレオチドは、テンプレート核酸分子の集合と共にアンカープライマーにアニールされ得る。
【０１０５】
このアンカープライマーは、必要に応じて、さらなる要素（例えば、１つ以上の制限酵素認識部位、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（例えば、Ｔ７ポリマー部位）、または同定されたＤＮＡ配列中に存在する配列（例えば、公知の遺伝子中に存在する配列））を含み得る。このアダプター領域はまた、配列多型性に隣接することが公知の配列を含み得る。配列多型性は、他の点では同一の２つの核酸配列間の配列相違を生じるヌクレオチド置換、挿入、欠失、または他の再配列を含む。配列多型性の一例は、単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）である。
【０１０６】
一般に、塩基対合可能な任意の核酸が、アンカープライマーとして使用され得る。いくつかの実施形態において、アンカープライマーはオリゴヌクレオチドである。本明細書中で使用される場合、用語オリゴヌクレオチドは、天然または改変モノマーまたは連結（例えば、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、これらのアノマー型、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）の直鎖状オリゴマーを含み、これらは、モノマー対モノマー相互作用の定型パターンを手段として、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する能力を有する。これらの相互作用のタイプは、例えば、ワトソン−クリックタイプの塩基対合、塩基スタッキング、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎタイプまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎタイプの塩基対合などを含み得る。一般に、これらのモノマーは、リン酸ジエステル結合またはそれらのアナログによって連結され、例えば３〜２００、８〜１５０、１０〜１００、２０〜８０、または２５〜５０単量体単位のサイズにわたるオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、文字の配列によって示される時はいつでも、ヌクレオチドは、左から右へ、５’→３’方向に向かうこと、そして、本明細書中において、他に記載がない限り、文字「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、文字「Ｔ」はチミジンを示し、文字「Ｃ」はデオキシシトシンを示し、文字「Ｇ」はデオキシグアノシンを示すことが理解される。本発明のオリゴヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドアナログを含み得る。しかし、例えば、酵素によるプロセシングが必要な場合などには、天然に存在するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが、一般に、生物学的機能の維持に必要である。
【０１０７】
アンカープライマーは、感作性部位で固体基材に連結される。これらのアンカープライマーは、固体支持体への融合タンパク質について記載される方法と同じ連結方法によって、連結され得る。連結されたプライマーを含む固体基材の領域は、本明細書中でアンカーパッドと言われる。従って、固体支持体上の感作性状態を特定することによって、アンカーパッドのアレイまたはマトリックスを形成し得る。これらのアンカーパッドは、例えば、固体支持体上に、均等に間隔を置いた配置でエッチングされた小さな直径の点であり得る。これらのアンカーパッドは、上記のようにこの基材が空洞化されるか、エッチングされるか、または他のマイクロマシン化される場合、キャビテーションまたはウェルの底面に位置され得る。
【０１０８】
１つの実施形態において、このアンカープライマーは、粒子に連結される。このアンカープライマーは、伸長されたアンカープライマーの形成前または伸長されたアンカープライマーの形成後に、この粒子に連結され得る。
【０１０９】
固体支持体上の各感作性部位は、複数のアンカープライマーに付着する能力を潜在的に有する。従って、各アンカーパッドは、１つ以上のアンカープライマーを含み得る。単一生産的反応中心のみを有するパッドの数（例えば、伸長反応後、アンカープライマーから伸長される単一配列のみを有するパッドの数）を、最大化することが好ましい。これは、以下の（ｉ）〜（ｖ）を含む技術によって成就され得るが、これらに限定されない：（ｉ）この表面にわたって洗浄されるビオチン化アンカープライマーの希釈を変化させること；（ｉｉ）ビオチン化プライマーがアビジン表面と接触するインキュベーション時間を変化させること；（ｉｉｉ）平均して、各パッド上の１つのみのプライマーが、配列決定テンプレートを生成するために伸長されるように、開環状または閉環状のテンプレートの濃度を変化させること；（ｉｖ）１つのアンカーの結合が別のアンカーの結合を阻害またはブロックするように（例えば、小さな点の光活性化によって）、アンカーパッドのサイズを単一分子の大きさ（＜１μｍ）に近づくように減少させること；あるいは（ｖ）１つの環状テンプレートの結合が、第２の環状テンプレートの結合を阻害またはブロックするように、アンカーパッドのサイズを減少させること。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、各独立したパッドは、一つだけに連結された固定プライマーを含む。一つだけの固定プライマーを有するパッドを、固体支持上で選択された固定プライマーの限外希釈を実施することによって生成し得、その結果、平均して、一つだけの固定プライマーを、各パッド上に蓄積する。パッドに適用されるための固定プライマーの濃度を、例えば、Ｐｏｉｓｓｏｎ分配モデルを利用して計算し得る。
【０１１１】
単一固定プライマーを含む反応パッドの数を最大化するために、一連希釈実験を、固定プライマー濃度または円形テンプレート濃度の範囲を、変化させて実施する。プライマーの高い希釈濃度について、同じパッドに結合するプライマーおよび円形テンプレートは、互いに独立であり、そしてＰｏｉｓｓｏｎ分配は、任意の一つのパッド上で伸長される固定プライマーの数を特徴付ける。実際に伸長されるプライマーの数に関する変動性が存在するが、最大でパッドの３７％が、単一の伸長された固定プライマーを有する（単一固定オリゴヌクレオチドを有するパッドの数）。
【０１１２】
他の実施形態において、複数の固定プライマーを、アレイ中で任意の一つの独立したパッドに接着する。複数の円形核酸テンプレートの限外希釈（以下により詳細に記載される）を、そのように固定された固定プライマーにハイブリダイズし得、その結果、平均して、各パッド上の一つだけのプライマーを、核酸テンプレートにハイブリダイズする。使用されるべきライブラリー濃度を、例えば、限外希釈およびＰｏｉｓｓｏｎ分配モデルを利用して計算し得る。
【０１１３】
本発明に従い配列決定され得る核酸テンプレート（例えば、核酸ライブラリー）は、一般的に、開環核酸分子または閉環核酸分子を含み得る。「閉環」とは、共有結合により閉じられた環核酸分子（例えば、環状ＤＮＡ分子または環状ＲＮＡ分子）である。「開環」とは、５’リン酸基および３’ヒドロキシル基を有する直鎖の一本鎖核酸分子である。一つの実施形態において、一本鎖核酸は、核酸配列の少なくとも１００コピーを含み、各コピーは、末端から末端へと共有結合的に連結される。いくつかの実施形態において、開環を、直鎖二重鎖核酸分子からインサイチュで形成する。得られた開環核酸分子の末端を、ＤＮＡリガーゼによって結合し得る。開環分子の５’末端および３’末端での配列は、第二核酸分子中で隣接ヌクレオチドの２つの領域（例えば、固定ポリマーのアダプター領域）に対して、または第二ＤＮＡ分子中でほぼ隣接している２つの領域に対して相補的である。従って、開環分子の末端を、ＤＮＡリガーゼを使用して結合し得、または間隙充填反応におけるＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る。開環は、Ｌｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号に詳細に記載されている。開環を、以下のＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡについて）またはＲＮＡリガーゼの存在下で閉環に転換し得る（例えば、固定プライマーに対する開環のアニ−リング）。
【０１１４】
所望の場合、核酸テンプレートを、パッドロックプローブとして提供し得る。パッドロックプローブは、各末端に配置された標的相補的配列を含む直鎖オリゴヌクレオチドであり、そしてリンカー配列によって分離される。リンカーを、例えば、制限エンドヌクレアーゼで物理的にせん断されたまたは消化された、核酸配列のライブラリーのメンバーの末端に結合し得る。標的配列に対するハイブリダイゼーションの際に、これらのリンカーオリゴヌクレオチドの５’末端領域および３’末端領域は、近接する。この近位は、２つのプローブセグメントが（適切にハイブリダイズされる場合）酵素的結合（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて）によって共有結合することを可能にし、従って、特定の標的配列にカテネイトされる環閉鎖分子にプローブを転換する（Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２０８５−２０８８を参照のこと）。生じるプローブは、遺伝子配列変異体についてのそれらの特異性および選択性の両方のため、多くの遺伝子配列の刺激的分析に適切であり（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９７．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１６：２５２−２５５を参照のこと）、そして生じる反応生成物が、特定の標的配列に限局されたままであるという事実に起因する。さらに、多くの異なるプローブの分子内結合は、複数のＰＣＲベース方法論より非特異的交差反応性に対し少ない感受性であることが予期され、そしてプライマーの非同源の対は、無関係な増幅生成物を生じ得る（ＬａｎｄｅｇｒｅｎおよびＮｉｌｓｓｏｎ、１９９７．Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２９：５８５−５９０を参照のこと）。
【０１１５】
出発ライブラリーを、一本鎖核酸分子または二重鎖核酸分子のいずれかを含むように構成し得る（核酸配列が、ライブラリー中に存在する場合、アニーリングについて利用可能であり得、または固定プライマー配列に対し、アニーリングについて利用可能にし得る領域を含むことを提供する限り）。例えば、ローリングサークル増幅についてテンプレートとして使用される場合、二本鎖テンプレートの領域は、固定プライマーの伸長についてテンプレートとして活動するために、少なくとも一時的に一本鎖であることが必要である。
【０１１６】
ライブラリーテンプレートは、複数の要素（固定プライマーに相補的である一つ以上の領域を含むが、これらに限られない）を含み得る。例えば、テンプレートライブラリーは、配列決定プライマー、コントロールヌクレオチド領域と相補的な領域を含み得、そして挿入配列は、引き続き特徴づけられるべき配列決定テンプレートを含み得る。以下により詳細に説明されるように、コントロールヌクレオチド領域は、副産物の量と取り入れられたヌクレオチドの数との間の関係を検定するために使用される。本明細書中で利用される場合、用語「補体」とは、対応複合体を形成するための特定のヌクレオチド配列に対しハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をいう。
【０１１７】
一つの実施形態において、ライブラリーテンプレートは、以下：（ｉ）固定プライマーと相補的である２つの別個の領域、（ｉｉ）配列決定プライマーに相同な一つの領域、（ｉｉｉ）一つの任意のコントロールヌクレオチド領域、（ｉｖ）配列決定されるべきである、例えば、３０〜５００、５０〜２００、または６０〜１００ヌクレオチドの挿入配列を含む。テンプレートは、もちろん、２つ、３つまたは４つの全てのこれらの特性を含み得る。
【０１１８】
テンプレート核酸を、核酸の任意の供給源（例えば、任意の細胞、任意の組織、または任意の有機体）から構成し得、そして当該分野で認識されている任意の方法によって生じ得る。適切な方法は、例えば、ゲノムＤＮＡの超音波破砕および一つ以上の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）を用いた消化を含み、核酸分子の最初の母集団から所望の長さの範囲のフラグメントを生じる。好ましくは、一つ以上の制限酵素は、異なる四塩基の認識配列を有する。このような酵素の例としては、例えば、Ｓａｕ３Ａ１、ＭｓｐＩ、およびＴａｑＩが挙げられる。好ましくは、酵素は、相当する制限酵素についての認識配列を含む領域を有する固定プライマーと同時に使用される。いくつかの実施形態において、固定プライマーの一つまたは両方のアダプター領域は、公知の制限酵素認識配列を接続するさらなる配列を含み、従って、固定プライマーに対する目的の特定の制限フラグメントの固定プライマーへの捕捉またはアニーリングを可能にする。他の実施形態において、制限酵素は、ＩＩＳ型制限酵素と共に使用される。
【０１１９】
あるいは、テンプレートライブラリーは、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを生じることによって作製され得る。所望の場合、ｃＤＮＡライブラリーは、制限エンドヌクレアーゼを用いてさらに処理され、特定のＲＮＡに特徴的な３’末端、内部フラグメント、または単離されたＲＮＡの３’末端を含むフラグメントを生じる。固定プライマー中のアダプター領域は、テンプレートライブラリー中で生じると考えられる目的の配列（例えば、エンドヌクレアーゼ消化によって生じるフラグメント中の公知のまたは疑わしい多型性の配列）と相補的であり得る。
【０１２０】
一つの実施形態において、指標オリゴヌクレオチドを、テンプレート核酸と、テンプレート核酸の由来となった核酸の母集団とのその後の相関作用を可能にするためのテンプレートライブラリーのメンバーに接着し得る。例えば、出発ＤＮＡ母集団の一つ以上のサンプルを、以前に開示されたいくつかの方法（例えば、制限消化、音波破砕）を使用して別々にフラグメント化し得る。各サンプルについての特定の指標オリゴヌクレオチド配列を、フラグメント化された母集団のメンバーの末端に接着（例えば、結合）する。指標オリゴヌクレオチドは、環化、増幅および必要に応じて、配列決定についての領域として活動し得、そしてそれに由来する出発サンプルを同定するために核酸を指標またはコード化するために使用されることを可能にする。
【０１２１】
複数の区別可能な指標プライマーで作製された別のテンプレートライブラリーを、その次の反応物と一緒に混合し得る。ライブラリーのメンバーの配列を決定することは、指標オリゴヌクレオチドに相当する配列の同定を可能にする。この情報に基づいて、いくつかの生じたフラグメントの起源を、推論し得る。
【０１２２】
核酸のライブラリーを、認識された技術を使用して固定プライマー配列にアニーリングする（Ｈａｔｃｈら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０；Ｋｏｏｌ、米国特許第５，７１４，３２０号およびＬｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号を参照のこと）。一般的に、テンプレート核酸配列に固定プライマーをアニーリングするためのいくつかの手順は、それが、固定プライマー配列中のアダプター領域とテンプレートライブラリーに存在する配列との間の特定の（すなわち、完全なまたはほぼ完全な）相補性の形成を生じる限り、適切である。
【０１２３】
多くのインビトロ核酸増幅技術を、固定プライマー配列を伸長するために利用し得る。増幅されたＤＮＡのサイズは、好ましくは、固定パッドのサイズより小さく、そしてまた、固定パッドの間の距離より小さい。
【０１２４】
増幅を、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、およびヌクレオチド三リン酸の１つ、２つ、３つ、または４つの型、ならびに必要に応じて、補助的結合タンパク質）の存在下で代表的に実施する。一般的には、プライム化された３’−ＯＨ基を伸長することができるいくつかのポリメラーゼを、それが、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠いている限り使用し得る。適切なポリメラーゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ４およびバクテリアファージＴ７、ならびにＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメントが挙げられる。適切なＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素、Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素、およびＨｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ−Ｉ由来の逆転写酵素が挙げられる。
【０１２５】
多数のインビトロでの核酸の増幅技術が、記載されている。これらの増幅方法論は、以下の方法に区分され得る：（ｉ）温度循環を要求する方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｓａｉｋｉら、１９９５.Ｓｃｉｅｎｓｅ  ２３０：１３５０−１３５４を参照のこと）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒａｎｙ、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら、１９９０．Ｇｅｎｅ  ８９：１１７−１２２を参照のこと）および転写ベース増幅（例えば、ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７を参照のこと））ならびに（ｉｉ）等温増幅システム−自己維持、配列複製（例えば、Ｇｌａｔｅｌｌｉら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）；Ｑβリプリカーゼシステム（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２を参照のこと）；鎖置換増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｖ．１９９２  ４月１１日；２０（７）：１６９１−６）；およびＰＮＡＳ  １９９２  １月１日；８９（１）３９２−６；およびＮＡＳＢＡ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ.１９９１  １２月；３５（３）２７３−８６に記載の方法）。
【０１２６】
等温増幅はまた、ローリングサークル（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ）ベース増幅（ＲＣＡ）を含む。ＲＣＡは、例えば、Ｋｏｏｌ，米国特許第５，７１４，３２０号およびＬｉｚａｒｄｉ，米国特許第５，８５４，０３３号；Ｈａｔｃｈら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０に議論される。ＲＣＡの結果は、アンカープライマーの３’末端から伸長される（従って固体支持マトリックスに結合される）単一のＤＮＡ鎖であり、プライマー配列にアニールされる環状テンプレートの複数コピーを含むコンカテマーを含む。代表的には、１，０００〜１０，０００以上の環状テンプレートのコピーは、各々が、例えば、約３０−５００、約５０−２００、または約６０−１００のヌクレオチドサイズ範囲のサイズを有し、ＲＣＡを用いて得られ得る。
【０１２７】
インビボで、ＲＣＲは、いくつかの生物学的システムにおいて、利用される。例えば、いくつかのバクテリオファージのゲノムは、一本鎖の環状ＤＮＡである。複製の間、環状ＤＮＡを、最初に二本鎖形態に変換し、次いで、前述のローリングサークル複製機構によって複製した。この置換された末端は、一連のゲノムユニットを生成し、このゲノムユニットは、切断され得、ファージ粒子に挿入され得る。加えて、置換されたローリングサークルの一本鎖は、相補的なＤＮＡ鎖の合成によって二重鎖ＤＮＡに変換され得る。この合成は、特定のファージＤＮＡの成熟に必要な連鎖状二本鎖分子を生成するために使用され得る。例えば、これは、λバクテリオファージが成熟する主要経路を提供する。ＲＣＲはまた、インビボで、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞中で増幅されたｒＤＮＡを生成するために使用され、この事実は、増幅されたｒＤＮＡが、なぜ多くの同一の反復単位から構成されるかを説明する補助となり得る。この場合において、単一ゲノム反復単位は、ローリングサークルに変換される。次いで、置換された末端は、二重鎖ＤＮＡに変換され、この二重鎖ＤＮＡは、次にサークルから切断され、その結果、２つの末端は、ｒＲＮＡの増幅されたサークルを生成するために一緒に連結され得る。
【０１２８】
ＲＣＡ反応の使用を通じて、環状化された分子に対する相補対の多くの縦列コピーを提示する鎖が、生成され得る。例えば、ＲＣＡは、最近、インビトロで、ヒトゲノムＤＮＡサンプル中の単一コピー遺伝子を検出するための、環状化パドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブの等温カスケード増幅反応を得るために利用されている（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ.１９：２２５−２３２を参照のこと）。加えて、ＲＣＡはまた、固相ベースアッセイにおいて、単一ＤＮＡ分子を検出するために利用されているが、この技術がインサイチュ−ハイブリダイゼーションに適用された場合、差異が、生じた（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ.１９：２２５−２３２を参照のこと）。
【０１２９】
所望ならば、ＲＣＡは、上昇された温度（例えば、３７℃、４２℃、４５℃、５０℃、６０℃または７０℃より高い温度で）で、実施され得る。加えて、ＲＣＡは、最初に低い温度（例えば、室温）で実施され得、次いで、上昇された温度に移行され得る。上昇された温度ＲＣＡは、好ましくは、熱安定性核酸ポリメラーゼを用いて実施され、安定的にアニールし得る、上昇された温度で特異性を有するプライマーを用いて実施される。
【０１３０】
ＲＣＡはまた、非天然に生じるオリゴヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸）を用いて、実施され得る。さらに、ＲＣＡは、補助タンパク質（例えば、一本鎖結合タンパク質）の存在下で実施され得る。
【０１３１】
固体支持体に固定化された短いＤＮＡ分子を増幅する方法の開発は、ＲＣＡと称され、最近、論文中に記載されている（例えば、Ｈａｔｃｈら、１９９９．Ｇｅｎｅｔ.Ａｎａｌ.Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．１５：３５−４０；Ｚｈａｎｇら、１９９８．Ｇｅｎｅ２１１：２７７−８５；Ｂａｎｅｒら、１９９８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：５０７３−５０７８；Ｌｉｕら、１９９５．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７−１５９４；ＦｉｒｅおよびＸｕ、１９９５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４６４１−４６４５；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２０８５−２０８８を参照のこと）。ＲＣＡは、ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡリガーゼ反応を通じて、特異的ＤＮＡ配列を標的する。次いで、環状生成物は、後にローリングサークル複製反応において、テンプレートとして使用される。
【０１３２】
ＤＮＡポリメラーゼによって駆動されるＲＣＡは、等温条件の下、線形動力学的かまたは幾何動力学的かのいずれかで、環状化オリゴヌクレオチドプローブを複製し得る。２つのプライマー（１つは、ＤＮＡの＋鎖にハイブリダイスし、他方は、ＤＮＡの−鎖にハイブリダイズする）の存在下で、ＤＮＡ鎖置換の複雑なパターンが、短時間（すなわち、９０分未満）において、１×１０９コピー以上の各サークルを生成するための能力を有することを保証し、ヒトゲノム内の単一点変異の検出を可能にする。単一プライマーを使用することで、ＲＣＡは、数分間で、共有結合的に閉じたサークルの何百もの無作為に連結するコピーを生成する。固体支持体に結合する場合、ＤＮＡ生成物は、合成の部位で結合したままであり、この部位で、それは標識され、濃縮され、そして点光源として画像化され得る。例えば、線形オリゴヌクレオチドプローブは、ＲＣＡシグナルを生成し得、ガラス表面上に共有結合する。これらのプローブによって生成されるシグナルの色は、特異的な標的指示連結事象の結果に依存して、標的の対立遺伝子状態を示す。ＲＣＡが、何百万もの別個のプローブ分子が、数えられ、分類されることを許容するので、それは、まれな体細胞変異の分析に特に耐えられる。ＲＣＡはまた、細胞学的調製物中の単一コピー遺伝子に結合するパドロックプローブの検出についての見込みを示す。
【０１３３】
加えて、固相ＲＣＡ方法論はまた、溶液中の構成成分を検出するための効果的な方法を提供するように開発されてきた。最初に、認識工程が、表面に結合される環状テンプレートである複合体を生成するために使用される。次いで、ポリメラーゼ酵素が、結合複合体を増幅するために使用される。ＲＣＡは、検出方法を使用して強いシグナルを提供するために増幅されるちいさなＤＮＡプローブを使用し、この検出方法は、以下により詳細に記載される方法を含む。
【０１３４】
等温増幅システムの他の例としては、例えば、（ｉ）自己維持、配列複製（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０.Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、（ｉｉ）Ｑβリプリカーゼシステム（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２を参照のこと）および（ｉｉｉ）核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡＴＭ；Ｋｉｅｖｉｔｓら、１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：２７３−２８６を参照のこと）が挙げられる。
【０１３５】
上記のような核酸テンプレートの増幅は、アンカープライマーに共有結合されるテンプレート核酸配列の複数コピーを生じる。１つの実施形態において、配列生成物の領域は、テンプレート核酸の領域に対して配列決定プライマーをアニールし、次いで、ＤＮＡポリメラーゼおよび公知のヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰまたはそれらのヌクレオチド内の１つのアナログ）に配列決定プライマーを接触させることによって決定される。この配列は、以下に記載のように、シークエンス反応の副産物を検出することによって決定され得る。
【０１３６】
配列プライマーは、増幅された核酸テンプレートの領域に対して特異的にアニ−リングし得る限り、あらゆる長さ、または塩基組成であり得る。配列決定プライマーのための特定の構造は、増幅されたテンプレート核酸上の領域を特異的にプライムすることが可能である限り必要とされない。好ましくは、配列決定プライマーは、特徴付けられる配列とアンカープライマーに対してハイブリダイズ可能である配列の間にあるテンプレート領域に相補的である。配列決定プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長され、配列生成物を形成する。伸長は、１つ以上の型のヌクレオチド三リン酸および所望ならば、補助的な結合タンパク質の存在下で実施される。
【０１３７】
方法は、以下の工程：（ａ）ヌクレオチドが添加される場合、核酸ポリマーが、相補的な核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する重合環境に、テンプレート核酸ポリマーを導入する工程；（ｂ）一連の供給材料を重合環境に連続的に提供する工程であって、各々の供給材料が、相補的核酸ポリマーが、形成されるヌクレオチドの中から選択されるヌクレオチドを含み、その結果、供給材料中のヌクレオチドが、配列決定されるべきテンプレートポリマー中の次のヌクレオチドに相補的である場合、前述のヌクレオチドは、相補的プライマーに組み込まれ、無機ピロホスフェートが、放出される工程（ｃ）重合環境から供給材料の各々を、別個に回復する工程；および（ｄ）回復した供給材料の各々において、相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの同一性を決定し、従って、テンプレートポリマーの配列を決定するために、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質を利用することによって無機ピロホスフェートの量を測定する工程、を含包する。
【０１３８】
この配列プライマーは、増幅された核酸テンプレートの領域に対して特異的にアニーリング可能である限り、あらゆる長さ、または塩基組成であり得る。特定の構造は、増幅されたテンプレート核酸上の領域を特異的にプライムすることができる限り、配列決定プライマーに必要でない。好ましくは、配列決定プライマーは、特徴づけられるべき配列とアンカープライマーにハイブリダイズ可能な配列との間にあるテンプレートの領域に対して相補的である。配列決定プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長され、シークエンス生成物を形成する。伸長は、１つ以上の型のヌクレオチド三リン酸、および所望ならば、補助的な結合タンパク質の存在下で実施される。
【０１３９】
本発明はまた、無機ピロホスフェートの量が、以下によって測定される方法を含む：（ａ）アデノシン−５’−ホスホスルフェートを、供給材料に添加すること；アデノシン−５’−ホスホスルフェートを含む回復されたフードストックと、ＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質とを組み合わせ、その結果、回復された供給材料中のあらゆる無機ピロホスフェートおよびアデノシン−５’−ホスホスルフェートが、最初に反応して、ＡＴＰおよびスルフェートを形成し、次いで、酸素の存在下でルシフェリンと反応し、その結果、ＡＴＰは消費され、ＡＭＰ、無機ピロホスフェート、二酸化炭素および光を生成すること；および（ｂ）生成された光の量を測定することによって、測定する方法。好ましい実施形態において、テンプレートポリマーおよびＡＴＰ生成ポリペプチド−ＡＴＰ変換ポリペプチド融合タンパク質は、固体支持体上に固定される。
【０１４０】
本発明はまた、テンプレート核酸ポリマー中の核酸配列を決定するための方法を包含し、この方法は、以下：（ａ）重合環境の中にテンプレート核酸ポリマーを導入する工程であって、ヌクレオチドが、加えられる場合、核酸ポリマーは、相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして作用する、工程；（ｂ）重合環境に一連の供給材料を連続的に提供する工程であって、各供給材料は、相補的核酸ポリマーが形成されるヌクレオチドの間から選択されるヌクレオチドを含み、その結果、供給材料中のヌクレオチドが、配列決定されるべきテンプレートポリマー中の次のヌクレオチドに対し相補的である場合、該ヌクレオチドは、相補的ポリマーの中に取り込まれ、そして無機ピロリン酸塩が、放出される、工程；（ｃ）重合環境から各供給材料を別々に回収する工程；および（ｄ）相補的なポリマーの各ヌクレオチドの正体、従ってテンプレートポリマーの配列を決定するため、回収された各供給材料中で、熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを用いてＰＰｉの量を測定する工程を包含する。一つの実施形態において、熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼは、融合タンパク質中で結合される。別の実施形態において、熱安定性スルフリラーゼは、親和性タグに結合される。
【０１４１】
本発明は、核酸を配列決定するための方法をさらに提供し、この方法は、以下：（ａ）一つ以上の核酸アンカープライマーを提供する工程；（ｂ）平坦な表面上の複数の空洞の中に配置された複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程であって、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、反応チャンバは、中心から中心まで５〜２００の間の間隔を有する、工程；（ｃ）プライム化されたアンカープライマー環状テンプレート複合体を生じるために、少なくとも一つの一本鎖環状テンプレートに核酸アンカープライマーの有効な量をアニーリングする工程；（ｄ）環状核酸テンプレートに対し相補的な核酸の複数のコピーに共有結合された伸長されたアンカープライマーを形成するため、ポリメラーゼとプライム化されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体とを合わせる工程；（ｅ）この共有結合された相補的な核酸の一つ以上のコピーに、配列決定プライマーの有効な量をアニーリングする工程；（ｆ）配列決定生成物、および所定ヌクレオチド三リン酸が、該配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合、配列決定反応副生成物を生じるために、ポリメラーゼおよび所定ヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長する工程；ならびに（ｇ）熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼの使用によって、配列決定反応副生成物を同定し、それによって核酸の配列を決定する工程を包含する。一つの実施形態において、熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼは、融合タンパク質中で結合される。別の実施形態において、熱安定性スルフリラーゼは、親和性タグに結合される。
【０１４２】
また、本発明中に包含されるのは、核酸を配列決定する方法であり、この方法は、以下：（ａ）少なくとも一つの核酸アンカープライマーを提供する工程；（ｂ）少なくとも４００，０００個の別個の反応部位を有する１つのアレイ中に、複数の一本鎖環状核酸テンプレートを提供する工程；（ｃ）プライム化されたアンカープライマー−環状テンプレート複合体を生成するため、少なくとも一つの一本鎖環状テンプレートに核酸アンカープライマーの第一の量をアニーリングする工程；（ｄ）環状核酸テンプレートに対し相補的な核酸の複数のコピーに共有結合された伸長されたアンカープライマーを形成するため、ポリメラーゼとプライム化されたアンカープライマー環状テンプレート複合体と合わせる工程；（ｅ）共有結合された相補的な核酸の一つ以上のコピーに配列決定プライマーの第二の量をアニーリングする工程；（ｆ）配列決定生成物、および所定ヌクレオチド三リン酸が、該配列決定プライマーの３’末端上に取り込まれる場合、配列決定反応副生成物を生じるために、ポリメラーゼおよび所定ヌクレオチド三リン酸を用いて配列決定プライマーを伸長する工程；ならびに（ｇ）熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼの使用によって配列決定反応副生成物を同定し、それによって、核酸テンプレートを含む各反応部位で核酸の配列を決定する工程を包含する。一つの実施形態において、熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼは、融合タンパク質中で結合される。別の実施形態において、熱安定性スルフリラーゼは、親和性タグに結合される。
【０１４３】
本発明はまた、１つのアレイ上で複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を包含し、この方法は、以下：（ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供する工程であって、このＤＮＡは、平坦な表面上の複数の空洞の中にそれぞれ配置され、各空洞は、分析物反応チャンバを形成し、ここで、反応チャンバは、中心から中心まで５〜２００μｍの間の間隔を有する、工程、（ｂ）各反応チャンバ中の反応混合物に一つの既知の窒素塩基の活性化ヌクレオチド５’三リン酸前駆体を加える方法であって、各反応混合物は、プライマー鎖の３’末端に活性ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下で、テンプレート指向性ヌクレオチドポリメラーゼおよびテンプレートより短い少なくとも一ヌクレオチド残基の相補的なオリゴノヌクレオチドプライマー鎖にハイブリダイズされた一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを含んで、プライマー鎖の３’末端にて各テンプレート中の少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを形成し、但し、活性ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素塩基は、テンプレートの非対合ヌクレオチド残基の窒素塩基に相補的である、工程；（ｃ）ヌクレオシド５’三リン酸前駆体が、熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼを用いた配列決定副生成物の検出を通じてプライマー鎖中に取り込まれたかどうかを検出する方法であって、従って、テンプレートの非対合ヌクレオチド残基が、取り込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素塩基組成と相補的である窒素塩基組成を有することを示す、工程、ならびに（ｄ）連続して工程（ｂ）および工程（ｃ）を反復する方法であって、ここで、各連続する反復が、次いで既知の窒素塩基組成の一つの型の活性ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを付加および検出する、工程；ならびに（ｅ）該ヌクレオシド前駆体の取り込みの配列から、各反応チャンバ中のテンプレートの非対合ヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程、を包含する。一つの実施形態において、熱安定性スルフリラーゼおよびルシフェラーゼは、融合タンパク質中で結合される。別の実施形態においては、熱安定性スルフリラーゼは、親和性タグに結合される。
【０１４４】
本発明は、以下の非限定的実施例においてさらに示される。以下の実施例において使用されるいくつかの略語がある：ＦＵＳは、融合遺伝子を表し、Ｓは、スルフリラーゼを表し、Ｌは、ルシフェラーゼを表し、ＴＬは、熱安定性ルシフェラーゼを表し、Ｘは、ＸｈｏＩを表し、Ｈは、ＨｉｎｄＩＩＩを表し、Ｎは、ＮｏｔＩを表し、そしてＢは、ＢａｍＨＩを表す。例えば、ＦＵＳ−Ｌ／Ｓ  Ｘ  Ｆは、融合遺伝子、ルシフェラーゼ−スルフリラーゼ  Ｘｈｏ順方向についてのプライマーを意味する、など。プライマー１〜６は、Ｓ融合に対するＬまたはＴＬについてであり、そしてプライマー７〜１３は、ＬまたはＴＬ融合に対するＳについてである。
【実施例】
【０１４５】
（実施例１：Ｂｓｔスルフリラーゼ遺伝子を得るためのクローニングストラテジー）
制限部位リンカーを組み込んだ遺伝子特異プライマーを、ＥＲＧＯ中でＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の推定ＡＴＰスルフリラーゼについての配列に基づいて設計し、ＥＲＧＯは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＯｋｌａｈｏｍａでＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔを包含したＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＧｅｎｏｍｉｃｓによるＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上で利用可能にされたゲノムＤＮＡの小型（ｃｕｒａｔｅｄ）データベースである（ＮＳＦ  Ｇｒａｎｔ  ＃ＥＰＳ−９５５０４７８）。利用下順方向プライマーは、５’−ＣＣＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＡＧＣ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＧ−３’（配列番号７）であり、そして使用した逆方向プライマーは、５’−ＣＣＣ  ＧＴＡ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＴＡＧ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＴＣＧ  ＣＧＴ  ＴＣＴ  ＴＧ−３’（配列番号８）であった。ＰＣＲ増幅のための反応混合物は、５．０μＬ  １０×ポリメラーゼ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ＃８７１４）、２．０μＬ  ５Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｂ０３００）、１．０μＬ  ｄＮＴＰ混合（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．８μＬ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ＃８７１４）、０．２μＬ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ＃Ｋ１９１４）、１０ｐｍｏｌ順方向プライマー、１０ｐｍｏｌ逆方向プライマー、１００ｎｇ（または未満）ＢｓｔゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ、カタログ＃１２９８０Ｄ）、および全用量を５０μＬにするために十分な蒸留水を含んだ。ＢｓｔゲノムＤＮＡの１ｎｇ程度の少量は、ＰＣＲ産物を生じるのに十分であった。ゲノムＤＮＡからのＢｓｔ  ＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅は、３分間９６℃の最初の工程、次いで１５秒間９６℃、３０秒間６０℃、６分間７２℃の３５サイクル、１０分間７２℃の最終工程、そして最終的に取り出すまでの１４℃からなった。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して清浄化した。
【０１４６】
（実施例２：スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を得るためのクローニングストラテジー）
全ての化学物質を、別の記載がない限りＳｉｇｍａから購入した。ラセミ的に純粋なＤ−ルシフェリンを、Ｐｉｅｒｃｅから注文した。ＡＴＰスルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性を測定するためのアッセイ緩衝液は、Ｔａｑポリメラーゼを含んだ。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）媒介アプローチを、ルシフェラーゼおよびスルフリラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に連結するために利用した。クローニングストラテジーを、図１において概要を示す。簡潔には、これは、発現ベクター中にインフレームで融合遺伝子をクローン化するための便利な制限部位（ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）を含むプライマーならびに２つのポリペプチドの結合部での稀な制限部位（Ｎｏｔ  Ｉ）の設計を使用する、ＰＣＲによるルシフェラーゼおよびスルフリラーゼのＯＲＦの増幅に関し、その結果、ルシフェラーゼ（例えば、熱安定性ルシフェラーゼ（ＴＬ））、およびスルフリラーゼの他のバージョンを、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ（Ｓ−Ｌ）融合タンパク質またはルシフェラーゼ−スルフリラーゼ（Ｌ−Ｓ）融合タンパク質のいずれかを得るために簡便に交換し得る。ＮｏｔＩ部位を、生存可能な融合タンパク質を生じるため、ルシフェラーゼに抗体の可変重鎖を融合するために使用した。これらのプライマーをまた、２つのＯＲＦの結合部の一部を形成するプライマーが、ヌクレオチドの十分な重複範囲を含むこのような方法で設計した。例えば、ＦＵＳ−Ｌ／Ｓ  Ｎｏｔ  Ｒの５’末端は、酵母スルフリラーゼのＮ末端１０アミノ酸をコードする逆平行配置においてデオキシヌクレオチドを含む。従って、このプライマーを使用して生じるＰＣＲ産物は、酵母スルフリラーゼＯＲＦの５’末端にアニールし、そして融合タンパク質、Ｌ−Ｓを生じる。
【０１４７】
ボックス中の産物を、図２で詳しく述べたＰＣＲによって得た。図３に示すように、ＰＣＲ産物を、電気泳動に供した。次いで、ＰＣＲ産物を精製し、Ｘｈｏ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、Ｘｈｏ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ消化されたｐＲＳＥＴＡ−ＢＣＣＰ中にサブクローニングした。ｐＲＳＥＴＡ−ＢＣＣＰは、ＮｈｅＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位との間の配列が、残基８７〜１６５をコードするＥ．ｃｏｌｉ由来のビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ８０４５８）の部分によって置き換えられた、ｐＲＳＥＴ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体である。８７アミノ酸ＢＣＣＰドメインを、ＰＣＲによって得、ｐＲＳＥＴＡのＮｈｅＩおよびＢａｍ  ＨＩにクローニングしてｐＲＳＥＴＡ−ＢＣＣＰを得た。連結された融合タンパク質およびｐＲＳＥＴＡ−ＢＣＣＰを、ＢＬ２１ＤＥ３細胞およびＴＯＰ１０細胞に形質転換した。ＢＬ２１ＤＥ３細胞は、Ｌ−Ｓについてのコロニーを生じ、そしてＴＯＰ１０細胞は、ＴＬ−Ｓについてのコロニーを生じた。
【０１４８】
以下のプライマーの一覧を使用して、融合タンパク質を構築した：
【０１４９】
【表１Ａ−１】
2005517397.tif 000021
【０１５０】
【表１Ａ−２】
2005517397.tif 000022
【０１５１】
これらのプライマーを、ＰＣＲを実施するために利用した。以下のＰＣＲ条件を用いた。
【０１５２】
（ＰＣＲ条件）
９６℃で３時間；９６℃で１５分間；７６℃で３０分間；１サイクル当たり−１℃；７２℃で６時間；
以下を１５サイクル；９６℃で１５分間；６０℃で３０分間；７２℃で６時間；
以下を２９サイクルについて；７２℃で１０時間；
絶えず１４℃
（実施例３：Ｈｉｓ６−ＢＣＣＰ  Ｂｓｔ  ＡＴＰスルフリラーゼ融合タンパク質のクローニング）
Ｂｓｔ親和性融合構築物は、ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントが、ＢＣＣＰドメインによって置き換わりそしてＡＴＰスルフリラーゼが、ＢＣＣＰドメインの後に挿入されるｐＲＳＥＴＡの誘導体である。
【０１５３】
簡潔に、実施例１に記載されるように、ＢｓｔＳｕｌｆ  ＰＣＲ産物を、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重に消化し、１％アガロース／ＴＡＥゲル上で単離し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、製造者の指示書に従ってＮＥＢからのＱｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてｐＲＳＥＴＡ−ＢＣＣＰの大きなＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに連結した。実施例２に述べられるように、ｐＲＳＥＴＡ−ＢＣＣＰは、ＮｈｅＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位との間の配列は、残基８７〜１６５についてコードするＥ．ｃｏｌｉ由来のビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号；Ｍ８０４５８）によって置き換わった、ｐＲＳＥＴ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の誘導体である。
【０１５４】
２ｕＬ連結反応を使用して、５０  ｕＬ  ＴＯＰ１０有能細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、そしてＬＢ−Ａｐプレート上に置いた。１０個のクローンからのプラスミド挿入物の配列決定を使用して、ＡＴＣＣ  １２９８０からのＡＴＰスルフリラーゼ遺伝子についてコンセンサス配列を決定した。
【０１５５】
プラスミド ｐＲＳＥＴＡ−ＢＣＣＰ−ＢｓｔＳｕｌｆを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、そしてＢｓｔＨＢＳｕｌｆ誘導発現を、製造者の指示書に従って、実行した。細胞を、回収し、凍ったペレットとして保存した。ペレットを、製造者の指示書に従って、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅを用いて溶解し、そしてタンパク質を、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ番号；１７−０５７５−０２）で充填された２０ｍＬカラムで精製し、ニッケル（ＩＩ）で荷電した。タンパク質を、０〜５００ｍＭイミダゾール勾配を用いて溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、正しい大きさの単一のバンドを示した。
【０１５６】
（実施例４：ビーズへの酵素の結合）
ＢＣＣＰドメインは、Ｅ．ｃｏｌｉが特定のリジン残基上に単一のビオチン分子を加えることを可能にする。このように、これらの融合タンパク質は、ストレプトアビジンを含む固体支持体に結合し得る。ＴＬ−Ｓを、ＴＡベクターに首尾良くクローニングした。２５μｌのＭＰＧストレプトアビジン（ＣＰＧ、Ｉｎｃ．）またはＮｉｃｋｅｌ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を、１．５ｍｌチューブに取りこみ、マグネット上に置いた。上清を取り除き、ビーズを２５μｇのＨｉｓ６−ＢＣＣＰ−スルフリラーゼおよび７５μｇのＨｉｓ６−ＢＣＣＰ−ルシフェラーゼ中に再懸濁した。融合タンパク質を試験するために、１００μｌの透析された融合タンパク質を、２５μｌのビーズに結合した。ビーズを、１時間室温で混合し、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ  トリシン（ｐＨ７．８）、５ｍＭ  酢酸マグネシウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）で洗浄し、１ｍＭ  ＰＰｉ、４ｍＭ  ＡＰＳおよび３００ｍＭ  Ｄ−ルシフェリンで酵素活性についてアッセイした。ニッケル−アガロースビーズにより、ＥＤＴＡを、アッセイ緩衝液から除いた。
【０１５７】
図４に示されるように、これらの融合タンパク質は、ＮＴＡ−アガロースおよびＭＰＧ−ＳＡビーズの両方に対して活性を示した。Ｓ：Ｌ  １：３は、ビーズに１：３の比で個々に結合したスルフリラーゼおよびルシフェラーゼを表す。Ｎｉ−ＡｇおよびＭＰＧ−ＳＡは、それぞれｎｉｃｋｅｌ−アガロースおよびＭＰＧ−ストレプトアビジンビーズである。ＰＬは、Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼであり、これは、その上にポリヒスチジンタグまたはビオチンタグを有さず、従ってネガティブコントロールとして働く。画分１９は、融合タンパク質を含み、ビーズの両方の種類において活性である。これは、融合タンパク質が、融合タンパク質のＢＣＣＰドメイン上のポリヒスチジンタグおよびビオチン分子で合成されたことを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、ルシフェラーゼ−スルフリラーゼ配列を得るためのクローニングストラテジーについての１つの実施形態である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ルシフェラーゼおよびスルフリラーゼならびにルシフェラーゼ−スルフリラーゼ融合遺伝子の調製アガロースゲルを示す。
【図３】図３は、ＮＴＡ−アガロースおよびＭＰＧ−ＳＡ固体支持体上のルシフェラーゼ−スルフリラーゼ融合タンパク質の活性を決定するための実験結果を示す。
【図１】
2005517397.tif 000023
【図２】
2005517397.tif 000024
2005517397.tif 000025
【図３】
2005517397.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月8日(2005.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005517397000001.app
【国際調査報告】
2005517397.tif 000027
2005517397.tif 000028
2005517397.tif 000029
2005517397.tif 000030