(57)【要約】【課題】本発明は、インターフェロン受容体遺伝子の領域において見出され、インターフェロン療法の効果を評価するために使用できる多型マーカーを提供する。従って、本発明はまた、個体におけるインターフェロン療法の効果を評価する方法および前記方法を達成するための手段に関する。【解決手段】以下を具備するインターフェロンで治療されるべき個体においてインターフェロン療法の有効性を予測する方法：（１）前記個体からのサンプルにおけるインターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を決定すること、および（２）前記インターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を基にインターフェロン療法の有効性を予測すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を具備するインターフェロンで治療されるべき個体においてインターフェロン療法の有効性を予測する方法：
（１）前記個体からのサンプルにおけるインターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を決定すること、および
（２）前記インターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を基にインターフェロン療法の有効性を予測すること。
【請求項２】
前記インターフェロン受容体がインターフェロンα受容体またはインターフェロンβ受容体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（１）の決定することが、インターフェロン受容体遺伝子プロモーターにおけるＧＴ反復配列の反復回数を決定することを具備することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個体がＣ型肝炎ウイルスに感染していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記個体がＣ型肝炎ウイルスに感染していることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記個体における少なくとも１の対立遺伝子に少なくとも５のＧＴ反復が存在することが、当該インターフェロン療法が有効であることを示すことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記個体が両方の対立遺伝子において少なくとも５のＧＴ反復を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記個体が、第１の対立遺伝子に少なくとも５のＧＴ反復を、第２の対立遺伝子に少なくとも１４の反復を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記（１）の決定することが、前記個体から得たゲノムＤＮＡのサンプルと、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２およびそれらの相補的なポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドの８から５００の連続したヌクレオチドを含むプローブとをハイブリダイズすることを具備することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記（１）の決定することが、前記個体から得たゲノムＤＮＡのサンプルと、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３およびそれらの相補的なポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドとハイブリダイズすることを具備することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記（１）の決定することが、当該インターフェロン受容体遺伝子の領域を増幅することを具備し、前記領域は前記インターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を決定するために充分な数のヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブが核酸チップに固定化されていることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブが核酸チップに固定化されていることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
以下を具備するインターフェロンで治療されるべき個体においてインターフェロン療法の有効性を予測する方法：
（１）前記個体からのサンプルにおけるインターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型をデータ記録手段で記録すること、
（２）前記（１）の遺伝子型を、コンピュータに記憶され、前記インターフェロン療法の効果と前記インターフェロン受容体の遺伝子型とを関連付けたマトリックスに対して比較すること、および
（３）前記インターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を基に当該インターフェロン療法の効果を予測すること。
【請求項１５】
前記（３）の予測することが、前記（２）の比較することの結果を出力することを具備することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記（１）の記録することが、前記（２）における比較のために使用されるコンピュータへ当該遺伝子型を入力することを具備することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記出力することが当該結果をコンピュータスクリーンに表示することを具備することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記出力することが当該結果を印刷することを具備することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記インターフェロン受容体がインターフェロンα受容体またはインターフェロンβ受容体であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記（１）の比較することが、当該インターフェロン受容体遺伝子プロモーターにおけるＧＴ反復の回数と、前記マトリックスとを比較することを具備することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記個体がＣ型肝炎ウイルスに感染していることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記個体における少なくとも１の対立遺伝子に少なくとも５のＧＴ反復が存在することが、当該インターフェロン療法が有効であることを示すことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記個体が両方の対立遺伝子に少なくとも５のＧＴ反復を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記個体が第１の対立遺伝子に少なくとも５の反復を、第２の対立遺伝子に少なくとも１４の反復を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
以下を具備するコンピュータプログラム：
（１）個体におけるインターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を記録する手段、
（２）前記個体におけるインターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を、インターフェロン療法の効果と前記インターフェロン受容体の遺伝子型とを関連付けたマトリックスに対して比較するための手段、および
（３）前記遺伝子型と前記マトリックスとの比較を出力するための手段。
【請求項２６】
前記インターフェロン受容体がインターフェロンα受容体またはインターフェロンβ受容体であることを特徴とする請求項２５に記載のコンピュータプログラム。
【請求項２７】
前記（２）の比較することが、前記インターフェロン受容体遺伝子プロモータにおけるＧＴ反復の回数と、前記マトリックスとを比較することを具備することを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記個体がＣ型肝炎ウイルスに感染していることを特徴とする請求項２５に記載のコンピュータプログラム。
【請求項２９】
前記個体における少なくとも１の対立遺伝子に少なくとも５のＧＴ反復の存在することが、当該インターフェロン療法が有効であることを示すことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
当該個体が少なくとも５のＧＴ反復を両方の対立遺伝子に有することを特徴とする請求項２７に記載のコンピュータプログラム。
【請求項３１】
当該個体が第１の対立遺伝子に少なくとも５の反復を、第２の対立遺伝子に少なくとも１４の反復を有することを特徴とする請求項２７に記載のコンピュータプログラム。
【請求項３２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２およびそれらの相補鎖からなる群より選択されるポリヌクレオチドの８から５００の連続したヌクレオチドを含む核酸プローブ。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸プローブを具備する核酸検出用チップ。
【請求項３４】
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３およびそれらの相補鎖からなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブ。
【請求項３５】
請求項３４に記載の核酸プローブを具備する核酸検出用チップ。
【請求項３６】
配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択されるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インターフェロン受容体遺伝子の領域において発見され、インターフェロン療法の有効性を評価するために使用できる多型マーカーに関する。従って、本発明はまた、個体におけるインターフェロン療法の有効性を評価する方法およびその方法を達成するための手段に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本にはＣ型肝炎ウイルス（以下ＨＣＶ）感染者が約２００万人存在する。ＨＣＶ感染者の７０％近くは慢性肝炎を発症し、その一部は１０年から２０年を経た後に肝癌を発症すると考えられている。慢性肝炎の治療にはインターフェロン（以下ＩＦＮ）αないしβが有効である。しかしながら、ＩＦＮα／βの効果は、宿主およびウイルスの側の要因によって大きく左右されることが報告されている。
【０００３】
また、ＩＦＮでの治療には重大な副作用が伴うこと、治療期間が長期に及ぶこと、治療に係る費用が高額であることなどを考慮すると、効果が期待できない患者にＩＦＮを投与することは患者を苦しめるばかりではなく、無駄に多額の医療費を患者や国に負担させることになる。従って、個々の患者についてＩＦＮ療法で効果が期待できるかどうかを予め予測する技術の開発が強く望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の状況に鑑み、本発明の目的は、個々の患者についてＩＦＮ療法の効果が期待できるか否かを評価する方法を提供することである。
【０００５】
従って、本発明の１つの目的は、インターフェロンで治療されるべき個体におけるインターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を決定し、この遺伝子型を基に、インターフェロン療法の有効性を予測することにより、前記個体におけるインターフェロン療法の有効性を予測する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
当該方法の１態様において、決定される当該遺伝子型は、当該インターフェロン受容体遺伝子のプロモーターにおける−７７周辺の領域において見出されるＧＴ反復の回数を決定することを含み；好ましくは、インターフェロン治療から利益を受ける個体は、約５のＧＴ反復を有する少なくとも１の対立遺伝子を有する。
【０００７】
当該方法の更なる態様において、当該インターフェロン受容体遺伝子は、インターフェロンαおよび／またはインターフェロンβである。
【０００８】
当該方法の更なる態様において、当該個体は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染している。
【０００９】
当該方法の更なる態様において、当該遺伝子型の決定は、特異的プローブとのハイブリダイゼーションを含み、且つ幾つかの例では核酸増幅と組み合わされ；増幅はまた、当該検出のために設計された特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して当該遺伝子型を決定するためにも使用され得る。
【００１０】
当該方法の更なる態様において、当該決定の工程は、少なくとも部分的に核酸チップ上で行われる。
【００１１】
本発明のもう１つの目的は、コンピュータ、コンピュータプログラム、または他のデータ記録および分析装置の使用を介し、インターフェロンで治療されるべき個体におけるインターフェロン療法の有効性を評価するための自動化された方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的は、インターフェロン療法の有効性を評価するために個体の遺伝子型を決定するために使用することが可能な１以上の特異的なポリヌクレオチドプローブおよびプライマーを提供することである。この目的の１態様において、当該ポリヌクレオチドは、核酸チップ、例えば、ガラスまたはシリコンの核酸チップ上に含まれていても、または固定されていてもよい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、本発明者らがインターフェロンα受容体１型のマイクロサテライト多型の遺伝子型とインターフェロンαおよび／またはβ（以下、ＩＦＮα／βと記す）の効果との間に統計的に有意な関係があることを見出したことに基づく。
【００１４】
ＩＦＮαおよびβは細胞表面に存在するレセプターと結合し、シグナルを送ることで作用を及ぼす。インターフェロンαとβの受容体であるインターフェロンα受容体１型（以下、ＩＦＮＡＲ１と記す）の遺伝子構造は既知であり（Ｌｕｆａｌｌａ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９２；２６７， ２８０２）、プロモーター領域に存在する単塩基多型（以下、ＳＮＰと記す）とＧＴ反復配列よりなるマイクロサテライト多型に関しても報告がなされている（Ｍｕｌｄｏｏｎ，Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００１， ２， １５９−１６９）。
【００１５】
本発明者らは、ＩＦＮＡＲ１のプロモーター領域に存在するＳＮＰとマイクロサテライト多型とＩＦＮ療法の有効性との関係を解析した。その結果、転写開始点の約−７７番目のヌクレオチド（以下、−７７位と示す）より始まるＧＴ反復配列の反復の回数がインターフェロン療法の有効性に相関関係を有することを見出した。
【００１６】
図１にＩＦＮＡＲ１のプロモーター領域からイントロン１の領域までを示す。配列の左側の数字は、ｍＲＮＡの転写開始点を＋１とした場合の位置を示す。ＳＮＰは、−４０８位、−１８位および−３位に存在する。問題のマイクロサテライト多型は−７７位から−５０位に存在し、図１に記載された配列の反復回数は９である。しかしながらこの反復回数は、個体の遺伝子型によって異なる反復回数で存在する。従って、反復回数に応じてマイクロサテライト多型の存在部位は変わる。即ち、反復回数が５の場合、当該マイクロサテライト多型の部位は、転写開始点を＋１とした場合、−５９番目から−５０番目、即ち、−５９位から−５０位に存在する。
【００１７】
ここで、図１に示される配列において、ＩＦＮ感受性に関連する多型およびＩＦＮ感受性に関連のないＳＮＰ部位以外の領域は共通である。本明細書の配列表および図面に記載された各配列中で、任意の塩基を表す表記「Ｎ」または「ｎ」は、アデニン、チミン、グアニンまたはシトシンの何れかの塩基を示す。
【００１８】
対立遺伝子における当該マイクロサテライト多型の反復回数が５／５ホモ接合、または何れかの対立遺伝子の当該反復回数が５である５／ｍヘテロ接合（ここで「ｍ」は５以外の整数であり、好ましくは１４であり、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、２０、２５および２６以上の数値を含み、その間の数値および下の範囲も全て含む）である場合に、ＩＦＮを投与されるべき個体におけるＩＦＮ療法は有効である可能性が高い。それに対して、何れの対立遺伝子の当該反復回数も５ではない場合、特に、５／５ホモ接合、５／ｍヘテロ接合体、または５／１４ヘテロ接合の何れでもない場合、にはＩＦＮ療法が有効である可能性は低い。従って、本発明の態様に従うと、インターフェロンを投与されるべき個体においてインターフェロン療法の有効性を予測するためのマイクロサテライトマーカーとしてＩＦＮＡＲ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＧＴ反復配列が提供される。
【００１９】
ここにおいて治療効果に関連して使用される「高い」の語は、患者の血中アラニンアミノトランスフェラーゼがＩＦＮ治療の後の６ヶ月間の追跡期間に亘り、正常範囲内にあり、且つＨＣＶ  ＲＮＡ試験において陰性である患者を示し、並びにまた、当該治療に対して完全著効であるとも特徴付けされ得る。ここにおいて治療効果に関連して使用される「低い」の語は、同６ヶ月間の追跡期間に亘ってＨＣＶ  ＲＮＡが検出されるか、或いはアラニンアミノトランスフェラーゼの濃度が高い患者を示し、並びにまた、当該治療に対して非著効であると特徴付けられる。
【００２０】
また、本明細書において「インターフェロン」の語は、インターフェロンα、β、γおよび／またはωを示す語として使用する。また、「インターフェロン受容体遺伝子」の語はインターフェロンα、β、γおよび／またはωの受容体をコードする遺伝子を示し、ここではＩＦＮＲ遺伝子と略すことが可能である。「ＩＦＮＡＲ１遺伝子」の語はインターフェロンαとβの受容体をコードする遺伝子であり、特に、インターフェロンα受容体１型を示す。
【００２１】
ここにおいて「多型遺伝子」または「多型」の語は、１つの遺伝子座を占める複数種の対立遺伝子群、又はこのような対立遺伝子群に属する個々の対立遺伝子を指称する。また、多型部位の中で１塩基のみが異なるものは、特に「単塩基多型」（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）またはＳＮＰと指称する。
【００２２】
また、「遺伝子型」は、注目している遺伝子座の対立遺伝子の存在状態を示す。「インターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型」とは、インターフェロン受容体遺伝子のプロモーター領域に存在するＧＴ反復配列からなるマイクロサテライト多型の反復回数を示す。ここでは便宜的に、マイクロサテライト多型の「遺伝子型」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１６以上の整数、並びに全ての数値およびそれらの間の下位の範囲の数値による反復回数で示すものとする。ここで「ｍ」は５以外の整数を表す。
【００２３】
ここで「ＩＦＮ感受性関連多型」とは、ＩＦＮの有効性を左右する多型遺伝子をいう。
【００２４】
ここで「マイクロサテライトマーカー」とは、ＧＴの反復配列を指し、その反復回数を基にＩＦＮの治療効果を予測できる指標として使用されるマーカーである。具体的には、マイクロサテライトマーカーは、対象より採取されたサンプル中に含まれる特定の核酸の特定の部位である。これらのマーカーは、ＩＦＮの治療効果を予測するために使用することが可能である。
【００２５】
本発明の態様に従うと、ＩＦＮで治療されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法が提供される。
【００２６】
本発明の態様によれば、ＩＦＮ療法の開始に先立って、ＩＮＦを投与されるべき個体、特に、ＨＣＶ感染者において、前記マイクロサテライト多型の遺伝子型を決定することによって、該ＨＣＶ感染者に対して、インターフェロン療法が有効であるかどうかを予測することができる。この方法は、例えば、個体から得られたサンプルについてＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型を決定することと、次に、この遺伝子型からＩＦＮ療法の有効性の予測すること、を含んで実施することが可能である。
【００２７】
また、本発明の態様に従うと、ＨＣＶ感染者において、少なくとも１方の対立遺伝子における前記インターフェロン受容体遺伝子のプロモーター配列のＧＴ反復回数が５、即ち、ＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型が５／５のホモ接合または５／ｍのヘテロ接合（好ましくは、５／１４のヘテロ接合）である場合に、インターフェロン療法が有効である可能性は高いと予測されることを特徴とするＨＣＶ感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法が提供される。
【００２８】
更に、本発明は、ＨＣＶ感染者における何れの対立遺伝子の前記ＧＴ反復回数も５ではない場合に、即ち、５／５ホモ接合または５／ｍ、例えば、５／１４ヘテロ接合の何れでもない場合に、ＩＦＮ療法が有効である可能性は低いと予測されることを特徴とするＨＣＶ感染者においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法を提供する。
【００２９】
ＩＦＮ療法の適応症はＣ型肝炎ウイルス感染者に限られないので、本発明の態様に従うと、個体から得られたサンプルについて、ＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型を決定することと、次に、その遺伝子型からＩＦＮ療法の有効性の予測することにより、ＩＦＮで治療されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法が提供される。
【００３０】
本方法の恩恵を受け得る個体は、ＩＦＮ療法が有効である疾患、好ましくはＩＦＮα、βまたはωにより有効に治療され得る疾患に罹患した患者であり得る。また、１態様においては、前記個体は健康な者であってもよい。ＩＦＮα、βまたはωが有効である疾患には、膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、皮膚悪性黒色腫、Ｂ型肝炎、腎癌、多発性骨髄腫、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、亜急性硬化性全脳炎、ウイルス性脳炎、免疫抑制患者の全身性帯状疱疹及び水痘、上咽頭未分化癌、聴力低下を伴うウイルス性内耳感染症、ヘルペス性角膜炎、偏平コンジローマ、尖圭コンジローマ、アデノウイルス及びヘルペスウイルス感染による結膜炎、性器ヘルペス、口唇ヘルペス、子宮頸癌、癌性胸水症、角化棘細胞腫、基底細胞癌、δ型慢性活動性肝炎が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
図２を用いて本発明の１態様を説明する。以下の操作は全て実施者の手によって行われる。
【００３２】
ステップ２ａでは、実施者が、ＩＦＮを投与されるべき個体から血液サンプル等のサンプルを採取し、予測を開始する。採取されたサンプルは、必要に応じて精製および抽出などの処理がなされた後で、ＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型を順不同で決定し、ステップ２ｂへ移行する。
【００３３】
ステップ２ｂでは、ステップ２ａにおいて決定したＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型を判定し、当該マイクロサテライト多型の遺伝子型が５／５ホモ接合または５／１４ヘテロ接合である場合はステップ２ｃへ移行し、当該マイクロサテライト多型の遺伝子型がそれ以外である場合にはステップ２ｄへ移行する。
【００３４】
ステップ２ｃでは、ステップ２ｂの判定結果から、当該個体におけるＩＦＮ療法は有効である可能性が高いと予測し、全予測工程を終了する。
【００３５】
ステップ２ｄでは、ステップ２ｂの判定結果から、当該個体におけるＩＦＮ療法は有効である可能性が低いと予測し、全予測工程を終了する。
【００３６】
或いは、遺伝子型とＩＦＮ感受性を対応付けるもの、例えば、表１をスクリーニングするべき個体の遺伝子型を比較するために使用することが可能である。この比較から、当該個体のＩＦＮ感受性が評価される。
【００３７】
【表１】
2005505304.tif 000002
【００３８】
当該テーブルは、行列（即ち、マトリックス、ｍａｔｒｉｘ）、表（ｃｈａｒｔ）、グラフおよび遺伝子型とＩＦＮの効果を対応付けのために使用され得る相関的なデータを示すその他の手段であってもよい。例えば、表１は、当該遺伝子型とＩＦＮの効果の関係を示す表である。表中の「ＩＦＮＲの遺伝子型」の欄はインターフェロン受容体遺伝子の遺伝子型を示し、「有効性」はＩＦＮ療法の有効性を示す。
【００３９】
また、ここで使用される表１に記載される成分としての「高」および「低」の語は、遺伝子型とＩＦＮ感受性またはＩＦＮの効果を対応付けた情報を示す表示の１例であり、当該表に記載の文字に限定されるものではない。即ち、遺伝子型と著効または非著効との相関関係を実質的に示すことが可能な表記であれば、例えば、「○」、「×」、「△」であっても、数値、例えば、簡略化された数値によるスコア（例えば、１、２、３、４および５等）であってもよい。
【００４０】
ＩＦＮ感受性に関連する多型の遺伝子型を決定するために、それ自身公知の何れの手段を用いておこなってよい。例えば、試験されるべき個体からのサンプルより、目的の配列を含む核酸を調製し、遺伝子型を決定すればよい。
【００４１】
本発明の態様に従う方法の対象となる「個体」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物であり得るが、好ましくは当該個体は、ヒトである。
【００４２】
「サンプル」とは、個体から採取した血液、血清、リンパ液および組織などの生物試料をいう。また、「サンプル」は必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出等の前処理を行って得た試料であってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって任意に選択され得るであろう。
【００４３】
生物試料から調製される目的の配列を含む核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡから調製すればよい。例えば、個体からゲノムＤＮＡを準備する手段は、例えば、フェノール−クロロホルム、塩析などを使用する細胞抽出を含む、一般的に使用される何れの手段を使用してもよい。更なる例は、末梢血中の白血球、単球、リンパ球および顆粒球等の血球細胞にフェノールクロロホルム法、塩析法または市販のキット等を用いることも含んでもよい。ｍＲＮＡが分析のために使用されるサンプルである場合には、オリゴｄＴカラムを用いて選択的にｍＲＮＡを濃縮してもよい。
【００４４】
ポリヌクレオチドの量が少ないまたは評価のために不十分であるときには、ポリヌクレオチドを増幅する操作を行ってもよい。増幅操作は、例えば、逆転写ポリメラーゼ反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略記する）などを含む、それ自身公知の方法によって行い得る。
【００４５】
抽出操作及び／又は増幅操作を行った後に、目的とする多型部位の遺伝子型を決定してもよい。遺伝子型を決定するためには、一般的に使用される何れの方法を使用してもよい。例えば、直接シークエンス法、ＳＳＣＰ法、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法、特異的プライマー法および核酸検出用チップ等の一般的に使用される何れの手段を使用してもよい。
【００４６】
決定すべきヌクレオチドが、制限酵素の認識部位の中に存在している場合には、制限酵素断片長多型法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ， ＲＦＬＰ）を用いてもよい。
【００４７】
その他、多型を決定する方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＰ（ＰＣＲ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｉｍｅｒｓ）法、ドットプロット法とＰＣＲを組み合わせたＰＣＲ−ＳＳＯ（ＰＣＲ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、及びＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等の周知の方法を使用することもできるが、これらに限定されない。
【００４８】
なお、ドットブロット法とは、配列が既知の核酸プローブを用いて、試料中に含まれる核酸配列を検出する一つの方法である。この方法では、例えば有機基板上に一本鎖核酸の試料を固定化し、次に、例えば、蛍光物質等で標識した一本鎖のプローブ核酸鎖の溶液をこの基板上の試料に接触させる。固定化された配列が、プローブ核酸鎖と相補的な配列であれば、それらはハイブリダイズし、二本鎖を形成するので、結果として当該基板上にプローブが固定される。したがって、洗浄により未反応のプローブを除去した後、プローブに付された標識を検出することにより、プローブに対して相補的な配列を有する試料核酸鎖を検出することができる。従って、本発明は、ＩＦＮ感受性関連多型遺伝子の検出において使用され得るプローブも提供する。また更に、本発明は、これらのプローブを含有することを特徴とする、個体に対してインターフェロン療法が有効であるか否かを予測するための試験薬または核酸検出用チップも提供する。
【００４９】
例えば、ＨＣＶ感染患者に対するＩＦＮα／βの治療効果に影響を与える更なる因子は、次のようなことが知られている。まず、ウイルスの因子に関しては、血中のウイルス量が多い患者ほどＩＦＮα／βの効果が低いこと、また、タイプ１よりタイプ２のウイルスに感染している患者の方が治療効果の高いことが知られている（Ａ．Ｔｓｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９， １０８８−１０９４ １９９４）。
【００５０】
また、マンノース結合レクチンをコードするＭＢＬ遺伝子の２箇所のＳＮＰでは、ＸＢタイプの遺伝子型の患者の方がＹＡタイプの遺伝子型の患者よりも、ＩＦＮα／βの効き目の悪いことが知られている（Ｍ．Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２９，６９５−７００， １９９８）。また、ＭｘＡタンパクをコードするＭｘＡ遺伝子プロモーター内に存在するＳＮＰが、Ｃ型慢性肝炎患者のインターフェロン治療感受性に関係していることも知られている（Ｍ． Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３， １２４−１２７， ２０００）。これらＳＮＰの決定は、ＳＮＰを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し、その塩基配列を決定することで行われ得る。
【００５１】
本発明の態様に従うと、これら従来のＩＦＮ感受性関連多型遺伝子およびウイルスの型の情報を当該マイクロサテライト多型の遺伝子型の情報と共に考慮することによって、ＩＦＮを投与されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法も提供される。
【００５２】
更に、本発明の態様に従うと、上述した解析は、コンピュータを用いて行うことも可能である。即ち、本発明はまた、コンピュータを用いてＩＦＮを投与されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法も提供する。この方法では、オペレータによって前記個体に由来するサンプルを用いて決定されたＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型の情報がコンピュータに入力され、それにより当該入力された遺伝子型に基づいて、上述したような遺伝子型とＩＦＮの有効性を対応付けた表、テーブルまたはその類似物と比較することにより、ＩＦＮ療法の有効性が評価され得る。１態様において、当該表は、当該コンピュータの記憶手段に記憶されてもよく、または適切な時期に当該コンピュータに入力され得る取り外し可能な記憶媒体に記憶させてもよい。当該対比の後、その比較または評価結果を当該コンピュータ上、若しくは、例えばコンピュータモニターなどの表示装置に表示してもよく、或いは、例えば、プリンターなどに出力してもよい。
【００５３】
図３に、本発明の態様の方法を実施するための装置の１態様の構成図を示す。ここで処理手段４は、入力手段２、表示手段３および記憶手段５に接続されている。図３に示す通り、本態様であるコンピュータ１は、コンピュータ１に人がデータを入力するための入力手段２と、種々の情報を表示する表示手段３と、当該コンピュータを制御したり種々の処理を行うためのプロセッサまたはＣＰＵなどの処理手段４と、プログラムおよびテーブル等を記憶する記憶手段５を少なくとも具備する。
【００５４】
コンピュータを用いてＩＦＮを投与されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測する方法の例を以下に説明する。
【００５５】
ここで処理手段４は、当該コンピュータの各部を統括して制御する主制御部であり、記憶部に記憶されるプログラムを実行してＩＦＮ療法の有効性を予測する。
【００５６】
ステップ４ａでは、オペレータが、ＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型の情報を入力手段２から入力すると、入力された情報は、記憶手段５に記録され、ステップ４ｂへ移行する。ここで、入力される遺伝子型の情報は、具体的な遺伝子型であっても生データであってもよく、目的とする遺伝子型を特徴付ける何れかの情報であればよい。
【００５７】
ステップ４ｂでは、処理手段４が、記録された情報から、記憶手段５に予め記憶されている遺伝子型とＩＦＮ有効性を対応付けたテーブル１を読み出し検索することによって対応するＩＦＮ有効性を抽出し、ステップ４ｃに移行する。
【００５８】
ステップ４ｃでは、処理手段４が、ステップ４ｂにおいて決定されたＩＦＮ有効性から、当該有効性が「高」であればステップ４ｄへ移行することを判定し、「低」であればステップ４ｅへ移行することを判定する。
【００５９】
ステップ４ｄでは、処理手段４がステップ４ｃの結果から当該個体においてＩＦＮが有効である可能性は高いと予測し、ステップ４ｆに移行する。
【００６０】
ステップ４ｆでは、処理手段４が、ステップ４ｄで予測した結果を表示手段３に表示しおよび／または記憶手段５に記録し、全ての予測工程を終了する。ここでの表示は、予め記憶手段５に記憶したＩＦＮ療法の有効性を示す画像として出力されてもよい。また、必要に応じてステップ４ｆから４ａに移行するようなループを設定してもよい。
【００６１】
ステップ４ｅでは、処理手段４がステップ４ｃの結果からＩＦＮが有効である可能性は低いと予測し、ステップ４ｇに移行する。
【００６２】
ステップ４ｇでは、処理手段４が、ステップ４ｅで予測した結果を表示手段３に表示しおよび／または記憶手段５に記録し、全ての予測工程を終了する。ここでの表示は、予め記憶手段５に記憶したＩＦＮ療法の有効性を示す画像として出力されてもよい。また、必要に応じてステップ４ｇから４ａに移行するようなループを設定してもよい。
【００６３】
また、上述の方法では、当該ＩＦＮ受容体遺伝子のマイクロサテライト多型の遺伝子型のみを決定し情報として入力して予測を行っているが、当該遺伝子型の情報に加えて、ＩＦＮ療法の有効性と結びつく公知の他のＩＦＮ感受性関連多型および／またはＣ型肝炎ウイルスの型感受性マーカーも、本発明におけるＩＦＮ遺伝子の問題とされる遺伝子型についての情報と組み合わせて評価されてもよく、当該判断のための関連情報として入力されてもよい。その場合、入力する情報に応じてそれに応じて使用するテーブルの構成を変更すればよい。
【００６４】
ここで記載される方法は、本願発明の範囲を逸脱しない範囲において変更することが可能である。
【００６５】
更に、ここで記載された方法を実行するためのコンピュータプログラムも本発明の範囲内である。そのようなプログラムは、例えば、ＩＦＮを投与されるべき個体においてＩＦＮ療法の有効性を予測するための目的のために使用される。このコンピュータプログラムは、コンピュータに当該方法を実行させることが可能であり、且つ、個体に由来するサンプルから決定されたＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型の情報を記録させる手段、記録された遺伝子型を基に、当該遺伝子型をＩＦＮの効果と当該遺伝子型を対応付けたテーブルと比較することによって、ＩＦＮ療法の有効性を評価する手段を含むことが望ましい。このテーブルは、当該コンピュータプログラムそれ自身の一部であっても、当該コンピュータまたは他の取り外し可能な記憶媒体に別個に記憶されてもよい。当該コンピュータプログラムは、また、当該比較の結果を出力する手段を含むことが望ましい。
【００６６】
更に、上述した当該コンピュータプログラムは、コンピュータを当該遺伝子型の情報を入力する入力手段として機能させてもよい。当該コンピュータプログラムは、それ自身が当該コンピュータに記憶されていても良く、取り外し可能な記憶装置に、または当業者に公知の他の何れかの手段に記憶されていてもよい。ここで記載される方法、好ましくは上述の当該コンピュータプログラムを実行することが可能なコンピュータ装置は、遺伝子型とＩＦＮの有効性を対応付けたテーブルを記憶する記憶手段と；ＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型の情報を入力する入力手段と；入力された当該遺伝子型と、前記記憶手段が記憶するテーブルとに基づいて、ＩＦＮ療法の有効性を予測する予測手段と；前記予測手段による予測結果を表示する表示手段と；を含む。
【００６７】
従って、このことから、本発明の１態様は、ここで記載される方法を実行することである。そのような方法は、ＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型の情報を記録すること、予めコンピュータに記憶されている遺伝子型とＩＦＮの有効性を対応付けたテーブルに対して当該記録された遺伝子型を比較することによって、ＩＦＮ療法の有効性を予測すること、当該予測結果を出力すること、を含む。
【００６８】
また更に、ＩＦＮ療法の有効性を予測することは、ＩＦＮ受容体遺伝子の遺伝子型の情報を入力する入力工程と；当該入力された遺伝子型と、遺伝子型をＩＦＮの有効性に対応付けた記憶されたテーブルとに基づいて、ＩＦＮ療法の有効性を予測する予測工程と；当該予測の結果を表示する表示工程とを含み得る。
【００６９】
本発明の態様は、ＩＦＮ療法の有効性を予測するためのポリヌクレオチドも提供する。
【００７０】
「ポリヌクレオチド」の語は、２以上のヌクレオシドがリン酸エステル結合で結合されてなる物質を意味する。「ヌクレオシド」には、デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明において「ポリヌクレオチド」とは、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ−オリゴ核酸などの人工合成核酸も指称するものとする。
【００７１】
なお、「プロモータ領域」の語は、ＴＡＴＡボックス等の転写開始反応に直接関与する領域のみを指すのではなく、該領域の近傍または遠隔に存在して転写開始反応の効率に影響を与える調節配列を含む配列も指称するものとする。従って、「プロモータ領域」なる語には、転写開始反応に関与する配列のみ、調節配列のみ、及びその両者が連結された配列が含まれることに留意しなければならない。
【００７２】
ポリヌクレオチドは、生体試料から得ても、特定の所望する配列で合成されてもよい。生体試料から調製する場合、個体から試料を採取した後、通常は、該試料からポリヌクレオチドを抽出する操作を行えばよい。生体成分からポリヌクレオチドを抽出する方法としては、例えばフェノール抽出、エタノール沈澱の他、任意の抽出方法を使用し得る。ｍＲＮＡを抽出する場合には、オリゴｄＴカラムにかけてもよい。
【００７３】
本発明の態様に従って提供されるポリヌクレオチドは個体に由来するサンプルのポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのプローブやプライマーとして使用できる。
【００７４】
本発明の態様に従って提供されるポリヌクレオチドには、以下の（ａ）〜（ｆ）が含まれる。
【００７５】
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２のいずれか１に示されるポリヌクレオチド。
【００７６】
（ｂ）前記（ａ）に示されるポリヌクレオチドにおいて、当該プロモーター領域のマイクロサテライト多型部位を除く１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、または付加された修飾ポリヌクレオチド。
【００７７】
（ｃ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２に示される前記ポリヌクレオチドの塩基配列のうち、インターフェロン療法の有効性に関与しているのは当該プロモーター領域のマイクロサテライト多型部位に存在するヌクレオチドであるので、本発明の態様に従うポリヌクレオチドは、前記マイクロサテライト多型部位を含むポリヌクレオチドの断片であってもよい。（ｃ）で示される断片は個体に由来するサンプルのポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのプローブとして好適に利用され得る。例えば、プローブ核酸鎖として好ましい断片は、ＩＦＮ受容体遺伝子のプロモーター領域の塩基配列であって少なくとも目的のマイクロサテライト多型部位を含む８から５００の核酸鎖及びその相補鎖が挙げられる。さらに好ましくは１０ヌクレオチド以上１００ヌクレオチド以下、特に、塩基配列検出用チップのプローブとして用いる場合、ＰＮＡプローブでは１０ヌクレオチド以上１５ヌクレオチド以下、ＤＮＡプローブでは１１ヌクレオチド以上３０ヌクレオチド以下が望ましい。ポリヌクレオチド断片の長さが過度に長いと、１個のヌクレオチドの相違を識別することが困難になる。一方、基板のポリヌクレオチドの長さが過度に短いと試料中に含まれるポリヌクレオチドの塩基配列の決定が困難になる。
【００７８】
ここで記載されたポリヌクレオチド以外の更なるポリヌクレオチドは、例えば、類似率または相同率を評価するための何れかの公知のアルゴリズムを用いて、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の同一性を有したポリヌクレオチドを含む。
【００７９】
更に、ここで記載される当該方法においてプローブとして使用され得るポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、ここで記載される当該ポリヌクレオチドおよびその相補配列に対してハイブリダイズする。ストリンジェントな条件は、当業者によって評価され、典型的には、０．１ Ｘ ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳにおける６５℃でのハイブリダイゼーション反応における洗浄工程を含む。
【００８０】
また、配列番号１は当該マイクロサテライト多型の反復回数が５の場合の配列である。配列番号２から配列番号１２は反復回数が６から１６の場合の配列であり、これは当該マイクロサテライト多型の反復回数が５以外の場合の配列の例として示した。従って当該マイクロサテライト多型の反復回数が１〜４、または１６以上の場合の配列も、当然本発明の範囲内に含まれ、ここに示したポリヌクレオチドと同様に好ましく使用することが可能である。
【００８１】
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）に示されるポリヌクレオチドの相補鎖であってもよい。
【００８２】
プローブとして使用される好ましいポリヌクレオチドは、下記に記載のものを含む。
【００８３】
（ｅ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２３のポリヌクレオチド；
配列番号１９は、その３’末端側に反復回数５のＧＴ反復配列を含む全長３０塩基のポリヌクレオチドである；
配列番号２０は、その３’末端側に反復回数６のＧＴ反復配列を含む全長３２塩基のポリヌクレオチドである。配列番号２０に示す配列は、反復回数が５以外のＧＴ反復配列を含むポリヌクレオチドの１例として示した。従って、当該ＧＴ反復回数が５以外の配列も配列番号２０と同様に本発明の態様に従って使用することが可能であり、且つ好ましいポリヌクレオチドである；
配列番号２２は、ＩＦＮ受容体遺伝子の２本鎖のうちのＧＴ反復マイクロサテライトを含む側の１本鎖の一部分の配列を有し、且つ当該プロモーター領域の当該ＧＴ反復マイクロサテライトは含まず、当該ＧＴ反復マイクロサテライトの３’側に隣接する塩基から２０塩基までを含み、更にその配列の３’側にＡＴ反復配列を含む全長４０塩基のポリヌクレオチドである；
配列番号２３は、ＩＦＮ受容体遺伝子の２本鎖のうちのＧＴ反復マイクロサテライトを含む側の１本鎖の一部分の配列を有し、且つプロモーター領域の当該ＧＴ反復マイクロサテライトは含まず、当該ＧＴ反復マイクロサテライトの３’側に隣接する塩基から２０塩基までを含み、更にその配列の３’側にフェロセンを含む全長２０塩基のポリヌクレオチドである。
【００８４】
前記（ｅ）の配列は、配列番号１９および２３を、夫々に配列番号２２または２６と組み合わせて使用することがより好ましい。例えば、前記プローブ核酸鎖として目的のマイクロサテライト多型部位の配列に予め設定された数を有するものを用い、試料とのハイブリダイゼーションの有無を検知するか、もしくは、目的のマイクロサテライト多型部位を有するプローブにハイブリダイズした試料の塩基配列の長さの違いを検知することによりマイクロサテライト多型部位の繰り返し数を検出することができる。プローブ核酸鎖に結合した塩基配列の長さの違いは例えば電流検出型ＤＮＡチップの場合、添加した挿入剤に由来する電流値の違いを測定することにより検知できる。更なる詳細は、後述する実施例に記載する。
【００８５】
また、配列番号２３の配列に含まれるフェロセンは電流値を測定するために付加した物質である。検出手段に応じて、フェロセンに換えて他の標識物質、例えば、色素、蛍光物質、発光物質および放射性同位元素等の他の標識物質を付与してもよい。
【００８６】
（ｆ）  さらに、ＰＣＲ反応のプライマーとして使用されるポリヌクレオチドの例は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８、並びにそのポリヌクレオチドの相補鎖である。
【００８７】
本発明の態様に従うと、ここにおける前記ポリヌクレオチドまたは断片を具備する核酸検出用チップも提供される。そのような核酸検出用チップも本発明の範囲内である。
【００８８】
そのようなチップは、例えば、蛍光検出用ＤＮＡチップおよび電流検出型ＤＮＡチップ等であるが、これに限られるものではない。前記ポリヌクレオチドまたはその相補鎖をプローブとして配置した塩基配列検出用チップを使用することにより当該有効性の評価（または予測）を行えば、当該方法は簡便化および効率化できる。核酸検出用チップは、以下の手順により作成することができる。
【００８９】
（ａ）  蛍光検出用塩基配列検出用チップの作製
ポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチド断片、またはそれらの配列に相補的な配列を有したポリヌクレオチド断片をプローブ３１として基板３０に固定化すればよい（図８を参照されたい）。当該基板は、例えば、ガラス基板およびシリコン基板等、従来用いられる何れの基板も使用することが可能である。固定化は、スポッター等の使用、または半導体技術等、当業者に公知の手段を用いて行うことが可能である。
【００９０】
（ｂ）電流検出型塩基配列検出用チップの作製
ポリヌクレオチド、その一部の配列を有する断片、または相補的なポリヌクレオチドをプローブ４１として、基板４０、例えば、電極４２を具備する基板等、に共有結合、イオン結合、物理吸着または化学吸着等によって固定化すればよい（図９を参照されたい）。電流検出型ＤＮＡチップの例は、平成８年１０月２４日に登録された特許番号第２５７３４４３号の遺伝子検出装置等である。当該文献は引用することによりここに組み込まれる。
【００９１】
ＩＦＮ受容体遺伝子のためのプローブに加えて、ウイルス遺伝子の型を検出するプローブおよび／または他の公知のＩＦＮ感受性関連多型の遺伝子型を決定するプローブ等が、１つのチップに共に固定化され得る。それにより罹患したウイルスの遺伝子型や他の関連多型の遺伝子型も同時に検出することが可能である。
【００９２】
遺伝子型を検出可能なプローブを用いる際は、異なる遺伝子型に対応する複数のプローブを基板上に同時に固定化して用いることにより精度の高い検出が可能である。
【００９３】
試料物質中の病原微生物の遺伝子型を検出するには、試料物質中の病原微生物の遺伝子に対して予めその遺伝子型に特徴的なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、その後ユニバーサルプローブを固定化したチップで検出することも可能である。
【００９４】
本発明の態様に従って、ポリヌクレオチド類を具備するプローブおよび塩基配列検出用チップを用いて検出を行えば、その検出を簡便且つ効率よく行える。
【００９５】
また、ここで記載された当該核酸チップは、ここで記載されたコンピュータプログラムおよび／またはコンピュータと共に使用され、本発明の方法を実行するために有用である。
【００９６】
【実施例】
１．ＩＦＮＡＲ１遺伝子とＩＦＮ療法の有効性の確認
１−１．その１
個々の患者について、ウイルスのタイプ、ＩＦＮＡＲ１遺伝子のＳＮＰおよびマイクロサテライトマーカーのタイプを決定し、これらの指標と治療効果の関係を調べた。
【００９７】
（１）概要
１３８人のＨＣＶ感染患者より採取した血液よりＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、解析用サンプルとした。ＲＮＡ画分を用いてウイルスのタイピングを行い、ＤＮＡを用いてＩＦＮＡＲ１遺伝子のＳＮＰ解析およびマイクロサテライトマーカーのタイピングを行った。そして、ＩＦＮα／βの治療効果とウイルスのタイプおよびＩＦＮＡＲ１遺伝子のＳＮＰ、またはマイクロサテライトマーカーとの関連を調べた。
【００９８】
（２）患者
肝臓の血液生化学的・組織学的・画像診断学的検査により慢性Ｃ型肝炎であることが証明された１３８人のＨＣＶ感染患者のサンプルをこの研究に使用した。なお、全ての患者から本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを取得した。ＩＦＮα／β療法を行った後の６ヶ月の追跡期間中に、血中のアラニンアミノトランスフェラーゼが正常範囲であり、且つＨＣＶのＲＮＡが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、この追跡期間中にＨＣＶのＲＮＡが検出されたり、或いはアラニンアミノトランスフェラーゼが高値を示した患者は非著効とした。
【００９９】
（３）ＨＣＶ、ＳＮＰおよびマイクロサテライトのタイピング
上述したＣ型肝炎患者でインターフェロン治療効果が有効だった症例３９サンプル、無効だった症例９９サンプル（合計１３８サンプル）の血液、または血清から抽出したＤＮＡを用いて解析を行った。血液より抽出したＲＮＡからｃＤＡＮを作成し、その一部分をＰＣＲにより増幅し、塩基配列を決定しＨＣＶ遺伝子のタイピングを行った（Ｋ．Ｃｈａｙａｍａ ｅｔ  ａｌ．， Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｌｏ． Ｈｅｐａｔｏｌ． ８，４０−４４， １９９３）。血液より抽出したＤＮＡを用いてＩＦＮＡＲ１プロモーターの２箇所（ｎｔ−４０８，ｎｔ−１８）のＳＮＰｓと１箇所のマイクロサテライト（ＧＴ：−７９〜−５６）の多型（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００１； ２：１５９−１６０）についても検討した。
【０１００】
また、これらプライマーに用いた配列はＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｘ６０４５９であるＩＦＮＡＲの配列に基づき作成し、転写開始部位をｎｔ１と記述している。プライマーはＤＮＡ約１ｎｇを鋳型とし、−６２９Ｆ（５’−ＴＣＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＣ−３’）と＋２０５Ｒ（５’−ＣＡＧＣＴＧＣＧＴＧＣＣＣＴＡＣＣＴＣＣ−３’）プライマーを用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ９６００（Ｒｏｃｈ）でＩＦＮＡＲ１プライマー断片の増幅を行った。
【０１０１】
ＳＮＰｓ解析には、その増幅断片をＭｉｉｌｉＰｏｒｅ  ９６ｗｅｌｌ  ｃｌｅａｎ  ｕｐフィルタを用いて精製し、直接シーケンス法（ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法）によりＡＢＩ３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて塩基配列を決定した。また、（ＧＴ）リピート数の決定は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析法を用いた。−６２９Ｆと＋２０５Ｒプライマーで得られたＰＣＲ断片を鋳型とし、更に片方のプライマーに蛍光色素（６−ＦＡＭ）をラベルした６ＦＡＭ＋９２Ｒと−２４５Ｆプライマーを用いて、再度ＰＣＲを行いＡＢＩ３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ（ｖｅｒ．３．７）で行った。なお、ＰＣＲは９５℃で１０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒、を３０〜３５サイクル行い、その前に９５℃で２分、後に７２℃７分の処理を行った。
【０１０２】
（４）結果
ＨＣＶに感染し、慢性肝炎を示した患者１３８例にＩＦＮα／β療法を施した。その効果とＳＮＰとの関係を表２に示す。
【０１０３】
【表２】
2005505304.tif 000003
【０１０４】
タイプ１ＨＣＶ感染者９２人中、完全著効を示したのが１２人（１３％）、非著効が８０人（８７％）であり、タイプ２ＨＣＶ感染者４６人中完全著効は２７人（５７％）で非著効は１９人（４３％）であった（表２）。また、この結果からも明かであるように、タイプ２のＨＣＶに感染した患者の方がタイプ１のＨＣＶに感染した患者よりＩＦＮα／βに対する治療効果は高い。
【０１０５】
また、ＩＦＮＡＲ１の２箇所のＳＮＰと治療効果の関係を見ると、タイプ１のＨＣＶに感染した患者では特別の関係は認められなかった（表２）。タイプ２のＨＣＶに感染した患者では、完全著効の患者ではＴのタイプが相対的に多い傾向が示された（表２）。なお、２つのＳＮＰ（−４０８Ｃ／Ｔと−３Ｃ／Ｔ）は完全にリンクしており、完全に一致しているので、表２には１つの遺伝子型のみ示してある。なお、−４０８Ｃ／ＴのＳＮＰを報告している文献（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００１；２：１５９−１６０）は、欧米人においては−１８Ｃ／Ｔの位置にＳＮＰが存在することも報告されている。しかしながら、日本人では、この位置にはＳＮＰは存在せず、−３Ｃ／Ｔの位置に新たなＳＮＰが見つかった。従って上述の通りに分析を行った。
【０１０６】
マイクロサテライトのＧＴ反復配列により表される遺伝子型とＩＦＮα／βの治療効果の関係を表３を示す。遺伝子型は５、６、９、１１〜１６の９種類存在するが、そのうちで５が大半を占める。従って、５／５のホモ接合の割合も多い。ウイルスのタイプに関係なく全サンプルで比較してみると、５／５のホモ接合では完全著効が２４人（４０％）、非著効が４０人（６０％）であるのに対して、それ以外では完全著効が１５人（２０％）、非著効が５９人（８０％）であった。この結果は５／５のホモ接合の人では効果が高いことを示す（ｐ＜０．０２５）。また、５／５のホモ接合あるいは５を含む、即ち、５／ｍのヘテロ接合とそれ以外の人を比較すると、前者では完全著効が３９人（２８％）、非完全著効が８５人（７２％）であり、後者では完全著効は０人（０％）、非著効が１４人（１００％）であった。このことは当該個体における少なくとも１の対立遺伝子に５の遺伝子型または５ＧＴ反復を持つ患者の方がＩＦＮα／βに対する効果が高いことを示す（ｐ＜０．０３０）。また、５の遺伝子型のない完全著効の例が全く見られなかったことは特筆に値する（表３）。
【０１０７】
【表３】
2005505304.tif 000004
【０１０８】
この結果は、対象となる患者数が比較的少数（１４／１３８＝１０．１％）であるとはいえ、ＩＦＮα／βによる無駄な治療を回避できるということで高い応用価値があることを示す。ＩＦＮαはＩＦＮＡＲ１のようなレセプターに結合してその作用を生ずると考えられる。今回解析したマイクロサテライトはこのレセプターの発現に関与するプロモーター領域に存在するので、このマイクロサテライトの遺伝子型がＩＦＮＡＲ１の発現に影響を与えた結果、ＩＦＮα／βの治療効果に影響を及ぼした可能性は充分にある。
【０１０９】
１−２．その２
新たな患者サンプル１９人と上述の１−１．その１において用いたサンプル１３８人とを合わせた１５７名の患者サンプルについて、その１に記載の方法と同様に試験を行った。即ち、ウイルスのタイプ、ＩＦＮＡＲ１遺伝子のＳＮＰおよびマイクロサテライトマーカーのタイプを決定し、これらの指標と治療効果の関係を調べた。
【０１１０】
（１）概要
１５７人のＨＣＶ感染患者より採取した血液よりＤＮＡおよびＲＮＡを抽出し、解析用サンプルとした。ＲＮＡ画分を用いてウイルスのタイピングを行い、ＤＮＡを用いてＩＦＮＡＲ１遺伝子のＳＮＰ解析およびマイクロサテライトマーカーのタイピングを行った。そして、ＩＦＮα／βの治療効果とウイルスのタイプおよびＩＦＮＡＲ１遺伝子のＳＮＰ、或いはマイクロサテライトマーカーとの関連を調べた。
【０１１１】
（２）患者
肝臓の血液生化学的・組織学的・画像診断学的検査により慢性Ｃ型肝炎であることが証明された１５７人のＨＣＶ感染患者のサンプルをこの研究に使用した。なお、全ての患者から本研究の対象となることに関してのインフォームドコンセントを取得した。ＩＦＮα／β療法を行った後の６ヶ月の追跡期間中に、血中のアラニンアミノトランスフェラーゼが正常範囲であり、且つＨＣＶのＲＮＡが陰性であった患者を完全著効と判定した。一方、この追跡期間中にＨＣＶのＲＮＡが検出されたり、或いはアラニンアミノトランスフェラーゼが高値を示した患者は非著効とした。
【０１１２】
（３）ＨＣＶ、ＳＮＰおよびマイクロサテライトのタイピング
上述したＣ型肝炎患者でインターフェロン治療効果が有効だった症例５０サンプル、無効だった症例１０７サンプル（合計１５７サンプル）の血液、または血清から抽出したＤＮＡを用いて解析を行った。血液より抽出したＲＮＡからｃＤＡＮを作成し、その一部分をＰＣＲにより増幅し、塩基配列を決定しＨＣＶ遺伝子のタイピングを行った（Ｋ．Ｃｈａｙａｍａ ｅｔ  ａｌ．， Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｌｏ． Ｈｅｐａｔｏｌ． ８，４０−４４， １９９３）。血液より抽出したＤＮＡを用いてＩＦＮＡＲ１プロモーターの２箇所（ｎｔ−４０８，ｎｔ−１８）のＳＮＰｓと１箇所のマイクロサテライト（ＧＴ：−７９￣−５６）の多型（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００１； ２：１５９−１６０）についても検討した。
【０１１３】
また、これらプライマーに用いた配列はＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｘ６０４５９であるＩＦＮＡＲの配列に基づき作成し、転写開始部位をｎｔ１と記述している。プライマーはＤＮＡ約１ｎｇを鋳型とし、−６２９Ｆと＋２０５Ｒプライマーを用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ９６００（Ｒｏｃｈ）でＩＦＮＡＲ１プライマー断片の増幅を行った。
【０１１４】
ＳＮＰｓ解析には、その増幅断片をＭｉｉｌｉＰｏｒｅ  ９６ｗｅｌｌ  ｃｌｅａｎ  ｕｐ  フィルタにて精製し、直接シーケンス法（ｄｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法）によりＡＢＩ３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて塩基配列を決定した。また、（ＧＴ）リピート数の決定は、ＧｅｎｅＳｃａｎ解析法を用いた。−６２９Ｆと＋２０５Ｒプライマーで得られたＰＣＲ断片を鋳型とし、更に片方のプライマーに蛍光色素（６−ＦＡＭ）をラベルした６ＦＡＭ＋９２Ｒと−２４５Ｆプライマーを用いて、ＡＢＩ３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ（ｖｅｒ．３．７）を用いて再度ＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは９５℃で１０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒、を３０〜３５サイクル行い、その前に９５℃で２分、後に７２℃７分の処理を行った。
【０１１５】
（４）結果
マイクロサテライトのＧＴ反復配列より表される遺伝子型とＩＦＮα／βの治療効果の関係を示す。遺伝子型は５、６、１０〜１８の１１種類存在する。５又は１４の何れかの遺伝子型を持つ場合には、完全著効は非著効を上回る率で観察され、それ以外では、非著効が完全著効を上回る率で観察された（図７）。
【０１１６】
これらのことを基に、５又は１４の遺伝子型を持つ場合、即ち、５／５ホモ接合または５／１４ヘテロ接合の場合には、ＩＦＮ療法は有効であることが期待される。当該遺伝子型とＩＦＮα／βの治療効果とのこのような関係は、さらに詳しく表４に示した。
【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
ウイルスタイプ１型に感染した患者の中で完全著効に至った１６人中、５／５のホモ接合と５／１４のヘテロ接合を持つ者は１３人（８１％）であるのに対し、それ以外の遺伝子型を持つものは３人（１９％）であった。また、ウイルスタイプ２型に感染している患者においても、完全著効者３４人中２７人（７９％）が５／５のホモ接合と５／１４のヘテロ接合を持つ者で、それ以外の遺伝子型を持つ者７人（２１％）を大きく上回っていた。一方、非著効者１０７人における５／５のホモ接合と５／１４のヘテロ接合を持つ者およびそれ以外の遺伝子型を持つ者の割合は、ウイルス両タイプを合わせるとそれぞれ５９％（６３人）と４１％（４４人）である。その結果、完全著効を示す患者における５／５のホモ接合と５／１４のヘテロ接合を有する患者の出現頻度（８０％）は統計的に有意であった（Ｐ＝０．００９）。これらのことから、当該遺伝子型が５／５のホモ接合または５／１４のヘテロ接合の場合には、ＩＦＮα／β治療によって完全著効に至る可能性が高いことを示している。一方、５または１４の遺伝子型を持たない人の中に完全著効を認めなかったことは、対象となる患者数（４／１５７）が少なかったとは言え、注目に値することである。
【０１１９】
２．繰り返し配列検出用ＤＮＡチップ１
配列番号１９、２０および２２のポリヌクレオチドを含むプローブを用いた繰り返し配列検出（または核酸検出チップ）の例を図５を用いて説明する。この例では、配列番号１９のポリヌクレオチドを含むプローブ１９と配列番号２０のポリヌクレオチドを含むプローブ２０を固定化したＤＮＡチップを用いる。また、ここでは繰り返し数６の配列を検出する例を説明する。また本例は、ＤＮＡチップとして電流検出型塩基配列検出用チップを利用する例である。
【０１２０】
まず、ＧＴ反復配列の繰り返し数５であり、かつその上流の塩基配列を有するプローブ１９を固定化した電極１８Ｃ（これはＤＮＡチップに具備される）と、ＧＴ反復配列の繰り返し数６である以外は、プローブ１９と同様の配列を有するプローブ２０を固定化した電極１８Ｅ（これはＤＮＡチップに具備されて存在する）を作製する。
【０１２１】
これらのプローブに対してターゲット配列を含む試料核酸鎖２１をハイブリさせる。その後、配列番号２２の核酸鎖２２を反応させる。次にライゲースを添加しライゲーション反応を行う。続いて、電極を９５℃に加熱して一本鎖に変性する。前記のライゲーション反応では、電極１８Ｃにおけるライゲーション反応が進行しないため電極表面の核酸鎖２２は脱離し、これに対して、電極１８Ｅ上には、核酸鎖２２とプローブ１９とが結合した状態の核酸２４が残る。最後に、挿入剤からの電流値を測定すると、電極１８Ｅからは電流値の上昇が観察される。これにより、この検体の繰り返し数は６であることが確認できる。同様の方法によって６以外の繰り返し数の検出も可能である。
【０１２２】
３．繰り返し配列検出用ＤＮＡチップ２
配列番号１９、２０および２３のポリヌクレオチドを含むプローブを用いた行う繰り返し配列検出（核酸検出チップ）の例を図６を用いて説明する。この例では、配列番号１９のポリヌクレオチドを含むプローブ１９と配列番号２０のポリヌクレオチドを含むプローブ２０を固定化したＤＮＡチップを用いる。また、ここでは繰り返し数６の配列を検出する例を説明する。また本例は、ＤＮＡチップとして電流検出型塩基配列検出用チップを利用する例である。ここでは繰り返し数６の配列を検出する例で説明する。
【０１２３】
まず、繰り返し数５のプローブ１９を固定化した電極１８Ｃと繰り返し数６のプローブ２０を固定化した電極１８Ｅを作製する。ここにターゲット配列を含む核酸鎖２１をハイブリさせた後、フェロセン標識した配列番号２３の核酸鎖２３を反応させ、続いてライゲースを添加しライゲーション反応を行う。次に電極を９５℃に加熱する。このとき、電極１８Ｃではライゲーション反応が進行しないので電極表面の核酸鎖は脱離し、これに対して、電極１８Ｅ上では核酸鎖２３とプローブ１９とが結合した状態の核酸２５が残る。最後に、フェロセンからの電流値を測定すると、電極１８Ｅからは電流値の上昇が観察されることから、この検体の繰り返し数は６であることが確認できる。同様の方法によって６以外の繰り返し数の検出も可能である。
【０１２４】
４．繰り返し配列検出用ＤＮＡチップ及びその検出方法の望ましい例
上述の繰り返し配列検出用ＤＮＡチップ１および２の方法は、以下の通りに変更してもよい。
【０１２５】
試料のインターフェロンαレセプター遺伝子のプロモーター領域における反復配列の数を検出するためのＤＮＡチップは、前記遺伝子のプロモーター領域の塩基配列であって、検出対象となる所定の数の繰り返し数を有する反復配列と、その上流（または下流）５〜５０の塩基配列からなる核酸鎖及び／またはその相補鎖からなるプローブ核酸鎖を固定化したＤＮＡチップを用いればよい。また、１種の試料に対して、前記所定の数の繰り返し数が異なる複数のプローブ核酸鎖を用いてそれぞれ検出を行うことが望ましい。
【０１２６】
試料の繰り返し配列の数を検出するには、上記のＤＮＡチップを用いて、試料核酸鎖のハイブリダイゼーション反応を行う。続いて、前記遺伝子のプロモーター領域の塩基配列であって、反復配列から下流（または上流）の塩基配列及び／またはその相補鎖からなる、例えば、５〜５０の補助核酸鎖を添加し、続いてライゲース（Ｌｉｇａｓｅ）を添加し、ライゲーション反応を行う。このときプローブ核酸鎖と試料核酸鎖の反復配列の数が同じであればライゲーション反応は進行し、プローブ核酸鎖の下流（または上流）に補助核酸鎖が結合するが、反復配列の数が異なれば、ライゲーション反応が進行しないため補助核酸鎖はプローブ核酸鎖に結合しない。
【０１２７】
このように試料核酸鎖の反復配列の数によって、最終的にＤＮＡチップ上に結合した核酸鎖の塩基配列の長さは異なる。この長さの違いをプローブ核酸鎖からの電気信号、例えば、核酸鎖に特異的に結合する挿入剤を添加し、ＤＮＡチップに流れる電流値等で検出することにより、試料核酸鎖がプローブ核酸鎖と同様の反復配列の繰り返し数を持つか否かが検出できる。
【０１２８】
ＤＮＡチップ上に結合した核酸鎖の塩基配列の長さの違いをＤＮＡチップからの電流値の違いで検出する際、その精度を向上させるために、補助核酸鎖の下流に、挿入剤の結合を促進させる物質、例えばフェロセンや、ＡＴ反復配列等を結合させることが望ましい。
【０１２９】
更なる利点および変更は、当業者によって容易に見出されるであろう。従って、その広範な側面において本発明は、ここに示した詳細な説明および代表的な態様によって限定されるものではない。従って、添付された請求の範囲およびその均等物により明示される一般的な発明の思想の精神または範囲から逸脱することなく種々の変更が可能である。
【０１３０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＩＮＦＡＲ１遺伝子（配列番号４に示す）の一部を示す図。
【図２】
本発明の１態様に従う方法の１例を示すフローチャート。
【図３】
本発明の１態様に従い使用され得る装置の１例を示すブロック図。
【図４】
本発明の１態様に従う方法の１例を示すフローチャート。
【図５】
本発明の１態様に従う方法の１例を示す図（塩基配列には、配列表に示した配列番号と一致する番号の符号を付した）。
【図６】
本発明の１態様に従う方法の１例を示す図。
【図７】
完全著効および非著効であったインターフェロンで治療される患者において認められたＩＦＮＡＲ１のマイクロサテライト（ＧＴ）の数の出現頻度を示すグラフ。
【図８】
本発明の１態様に従うＤＮＡチップの１例を示す模式図。
【図９】
本発明の１態様に従うＤＮＡチップの１例を示す模式図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005505304.tif 000123
2005505304.tif 000124
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