(57)【要約】【課題】【解決手段】  固体状の高分子基質の表面に沈澱物質の堆積物を備えた方法であり、内部に分散した沈澱物質を備えた方法であって、表面析出したに高分子を可塑流体の混合物と接触させて、高分子と内部に分散した沈澱物質を可塑化および／または膨張させる可塑状態下で、可塑流体や高分子複合材料を得るための流体を放出する高分子複合材料の製造方法。高分子複合材料は、例えば９８％を越える高い均一性で多孔性または非孔性の高分子を有している。足場は内部に分散した沈澱物質を有する高分子複合材料を含み、ドラッグ運搬の為の足場や支持材としての使用や、バイオレメディエーションにおける人間や動物または植物に対する生体浄化や生体境界(biobarrier)としての使用や、例えば、医療もしくは外科的に挿入される補強材のように、構造的な構成材としての使用などを含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体状態の高分子基質の表面に沈殿物の堆積物を形成させ、その表面に析出した高分子を、高分子と内部に分散した沈澱物質を可塑化および／または膨張化させた可塑化条件の下で可塑流体や可塑流体の混合物と接触させ、可塑化流体や高分子複合材料を得るために流体を放出することを含む、内部に分散した沈殿物質を含む高分子複合材料の製造方法。
【請求項２】
大きい表面部分を有する高分子基質の表面（at the suerface of a high surface area polymer subustrate）に堆積物を形成し、より好ましくは粉末層または非常に高い多孔性（a high porosity）のマトリクスを有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
高分子基質の内部と外部の表面上に、さらに好ましくは露出しているいかなる表面孔をも含む、どんな表面上にも堆積物が、沈殿物質の沈殿層を含んでいる請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
第一段階において高分子を可塑化するための可塑化条件下において高分子と可塑化流体又は可塑流体の混合物と接触させ、そして固体状態の基質高分子を得るために流体を放出し、第二段階において高分子の表面で沈殿物の表面堆積物を形成し、第三段階において高分子と内部に分散した沈澱物質を可塑化し、および／または膨張させるために可塑化条件の下で可塑流体や可塑流体の混合物と接触させ、そして高分子複合材を得るために可塑流体や可塑流体の混合物を放出することを含む請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
堆積物は、ばらばらの粒子または、溶かされた沈殿物質から成り、その堆積物は、固体または流体状の沈殿物であり、沈殿物質が、沈澱物質のパウダーコーティング、ダスティング、ロリング、又は接着によって固体状態として存在するか、または沈澱物質が、沈殿物質の溶液への浸漬やスプレーなど、分散または懸濁によって流体状態として存在し、そして冷凍による乾燥、蒸発、加熱、ブロッティング（blottomg）することからなる請求項１から請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
浸漬は、１秒から順に最大４８時間である請求項５記載の方法。
【請求項７】
乾燥時間が最大４８時間である請求項５または請求項６いずれかに記載の方法。
【請求項８】
沈殿物質は微粒子か粉体形状であり、最大１ミリの粒径で、好ましくは５０から１０００ミクロンの粒径である請求項１から請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
高分子は固体状態であり、それは微粒子かモノリス構造である、もしくは非常に粘性が高い流体であり、可塑化流体の放出のときに微粒子の複合材料を形成するか、モノリス複合材料を形成することもある請求項１から請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
可塑状態が、マイナス２００℃から５００℃、好ましくはマイナス２００℃から２００℃であることを備えた請求項１から請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
可塑化状態は１バールを超えて１００００バール、望ましくは１バールから１０００バールの圧力であることを備えた請求項１から請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
流体が高分子と沈殿物質の接触より前に可塑条件下におかれるか、または表面に析出した高分子との接触により可塑条件下におかれる請求項１から請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
その方法において表面蒸着高分子と可塑流体との接触時間が１ミリ秒から最大５時間で実行される請求項１から請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
流体が加圧されるか、表面蒸着高分子に導入される原位置（in situ）または外の位置（ex situ）での加圧が１秒から３分間である請求項１から請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
減圧時間が１ミリ秒から１０分という急速、または１０分以上１２時間までにわたる長くゆるやかな流体の解放による減圧時間である請求項１から請求項１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
可塑流体は二酸化炭素、酸化二窒素、二硫化炭素や、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、エチレンなどの脂肪族の２〜１０の炭素原子数を有する炭化水素、例えば四フッ化炭素、塩化物、炭化一塩化三フッ化物などのハロゲン化派生物、そしてフルオロホルムやクロロホルム、またベンゼン、トルエン、キシレンなどの６〜１０の炭素原子数を有する芳香族化合物、メタノールやエタノールなどの１〜３の炭素原子数を有するアルコール、そして六フッ化硫黄、アンモニア、キセノン、クリプトンなどの硫黄ハロゲン化物や、それらの混合物を含んでいる請求項１から請求項１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
高分子に対して沈澱物質が１×１０-12ｗｔ%から９９．９ｗｔ%で存在する請求項１から請求項１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
沈澱物質が存在し、高分子中の沈殿物質の濃度１×１０1ｎｇ／ｍｇから１×１０3ｎｇ／ｍという範囲の少量で存在する請求項１から請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
沈殿物質が(医薬の)ドラッグ、動物用医薬品：病害虫に対する農薬や植物成長剤： 人間や動物の健康製品：人間や動物の成長促進や構造や、成長、修復、骨格や器官、歯の構造やそれに類するもののモデリング等を意図した製品を含んだ美容製品、毒薬、毒素、および同様のもののための吸収性の生物吸着材料を備えた請求項１から請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
沈殿物質は、自然に生じるものや人工的なものまたはその他の変性された（modified）成長促進物質、生体適合させるもの(biocompatiblisers)、ビタミン、タンパク質、糖蛋白質、酵素、核酸、炭水化物、無機化合物、栄養物、ステロイド、セラミック、同様のものなどを含む機能増進成分(funnction enhancing components)、および 胞子やウイルス、哺乳類、植物、バクテリアの細胞などのような機能物質（funnctioning matter)を含み、選択的にあるいは追加的なものである請求項１から請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
高分子は次から選択され；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ（エチレングリコール）と乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ(ｅ−カプロラクトン)、ポリ(３−ヒドロキシ酪酸塩)、ポリ(p−ジオキサノン)、ポリ(プロピレンフマレート)を含むポリエステル；ポリ(オルト  エステル)；ポリ酸無水物；ポリ(アミノ酸)； ポリアセタール; ポリケタール（polyketals）；ポリオルトエステル；ポリホスファゼン；アゾ高分子；次から選択される合成の非生分解性高分子：ポリエチレンを含むビニル高分子、ポリ(エチレン共ビニル酢酸塩)、ポリプロピレン、ポリ(塩化ビニル)、ポリ（ビニル  アセテート）、ポリ(ビニル・アルコール)、ビニルアルコールとビニルアセテートの共重合体、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸塩、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ジメチルシロキサン)、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリスチレン、および誘導体；そして炭水化物、ポリペプチド、タンパク質から選択される天然高分子である請求項１から請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜請求項２０のいずれかに記載の発明の方法で得られた高分子複合材料。
【請求項２２】
これまで述べたような微粒子の沈殿物質のいたるところに、必要な均等性、望ましくは８０％を超えた、例えば９８％を超えた高い均等性で分散された多孔性または非孔性の高分子を有する高分子複合材料。
【請求項２３】
高分子の沈澱物質の濃度として表されると卓越した水準の均等性とバッチ再現性で１×１０１から１×１０３ｎｇ／ｍｇという範囲の少量で、および／またはおよそ１０ミクロン、１ミクロン、または０．１ミクロンというとても小さい粒径を有する非常に少量の沈澱物質を備えた請求項２２記載の高分子複合材料。
【請求項２４】
粒状かモノリス形状である請求項２２及び２３いずれか記載の高分子複合材料。
【請求項２５】
請求項２２から２４のいずれかに記載の必要な用途にとって適度な大きさと形に換えられた内部に分散した沈澱物質を有する高分子複合材料を含む足場。
【請求項２６】
請求項１から請求項２１のいずれかに記載の高分子複合材料の製法であって、請求項２２から請求項２５のいずれかに記載の高分子複合材料または支持材としての使用するそれらの足場（scaffold）又は又はドラッグ運搬のための支持材や足場（scaffold）として使用するための高分子複合材料の足場（scaffold）、又は人間、動物または植物に対する生物学的触媒や生体境界（biobarrier）において、生物学的治療における使用や、又は例えば高分子や、任意の追加的な例えば合成のまたは天然の金属、プラスチック、炭素やガラスであって、繊維網、スクリム、ロッド等で、例えば骨か組織の中への固体のモノリスとして、または、骨や歯に対する湿式挿入に適した充填物やセメントとして、または例えばピンといった固体の骨材やモノリスなどの整形外科の移植片やあるいは王冠のような人工歯根として医療や外科的な補強の為の構造的な構成材として使用に対する高分子複合材料の足場の製造方法。
【請求項２７】
明細書に記載もしくは実施例で例証されるように、高分子複合材料を準備するため、高分子複合材料、足場（scaffold）、またはその使用ための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は可塑化流体や沈殿物と接触させ、内部の分散沈殿物（deposition matter）を含む単離した高分子複合材料の製造方法や、その方法により得られた高分子化合物、そしてその製造のための装置や、高分子の骨格(scaffold)、適当な大きさと形の混合物を形成する薬品搬送装置若しくはそれに類似するもの、医薬用または獣医薬用生成物としての使用、または人間や動物の健康や成長促進用、構造的(structural)、香料用または化粧用品、農薬または作物保護の生成物、生物医学的には触媒やアプリケーションのようなもの、特に生分解性でゆっくりと放出される生成物(release product)、または生分解性の手術による移植用、人工骨の合成物、臓器の各要素(organ  module)、及びそれらの類似物としてやバイオレメディエーション（bioremediation）用の生体触媒や生体のバリア(biobarrier)やその類似物に関する。
【背景技術】
【０００２】
可塑化、発泡または浄化の媒介として高分子の生成物に超臨界流体を使用することが知られている。超臨界流体(SCFs)は  高分子鎖の移動性を高め、多くの高分子にとって可塑剤として機能する。 これは高分子材料中で空隙率の増加をもたらす。
【０００３】
染料（dyes）や例えば無機の炭酸塩、および酸化物など超臨界流体に不溶の他の無機物を高分子へ混入する際に、超臨界流体は、質を高めるために良く分散した状態、特にスプレー塗装用塗料やそれに類するものなどの分散において用途を見出した。
【０００４】
そのうえ、多孔性の材料が得られることもある一方で非臨界状態の気体状態へ変えること（transition）により、高分子を発泡させるように流体が使用されうる。これはUS5,340,614、WO91/09,079、およびUS4,598,006で開示されている。
【０００５】
US5,340,614は、同時に接触高分子や飽和添加物およびSCFを開示している。US4,598,006は 臨界未満の状態への変遷で高分子を加え、流体を放出した(release)、ＳＣＦにおける溶解飽和添加物を開示している。
【０００６】
WO91/09,079(ディ  ポンティ)は小球体の添着を得るために溶剤中で高分子を溶解したり、活性成分の溶剤を添加したり、シリコン油で混合したり、といったことで、ドラッグとして活性成分を高分子小球体に前もって添着することを開示している。これらは、洗浄され、硬化される。そして、小球体は多孔性の構造を生成させるように処理されたＳＣＦである。
【０００７】
しかしながら、対照と比べて、いくつかの場合、WO91/09,079における二重乳剤の処理は、薬剤(drug)活性を維持したのは６８％だけであることを示した、そして、これは二重乳剤を均質化して、液滴やそれと同様のものを分散する(breaking-up)といった溶剤効果が原因である。
【０００８】
そのうえ、この処理は、２つの高分子加工段階を必要とし、かなり複雑であり、必ずしも適切に内部での分散を確実に行うというわけではない。
【０００９】
高分子は、生体適合性において好ましい組織反応を促進するのに影響を及ぼすことのできる材料を生産するために生物医学用途で使用されている、一方でまた好ましい機械的（mechanical）、表面的な性質の材料が生成されている。    生物機能上の複合材料、例えば様々な高分子の中で分散したカルシウム水酸化リン灰石、は整形外科の、歯科の、そして、他の用途において定評がある。これらの材料は無機の固体を、最大８０％の非常に高い添着(loading)することによって調整された、粉末形状で、そして合成物が固体または溶融状態の高分子の中への粉末の材料の活発な混入によって、または浮遊した無機の粉末があるときにモノマーの重合によって形成される。 どちらの場合も、材料は高分子マトリクス内で捕捉されるようになる。
【特許文献１】US5,340,614
【特許文献２】WO91/09,079
【特許文献３】US4,598,006
【特許文献４】WO98/51,347
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながらこれらの製造方法は、合成物が破砕する傾向があって、商業方法に適さないこともあるため、大きい集合体形成にいたるには不十分で非制御性(uncontrolled)の材料が混合される傾向がある。
【００１１】
WO98/51,347(ハウデル他)では、骨、軟骨、歯、組織構造などが整形法の骨や移植片、人工装具、歯の詰め物、修復用途や長く放出する用途（release application）や同様のこととして、外科的に埋め込まれるなどのような人間や動物の主構造への移植と商業処理の両方に必要とされる、機械的性質を有している生体機能（biofunctional）材料を備えた生体機能高分子を処理する、濃密状態の流体による調合を開示している。生体機能（Biofunctional）材料は、たとえば特に材料を吸収するあらゆる薬剤の、獣医の、農薬、人間や動物の健康と成長の促進のための、美容製品や毒素吸収用の物質、無機的または有機的な分子や、ペプチドや、タンパク質や、酵素や、少糖類や、炭水化物や、核酸や同様のものといった広範囲なものである。
【００１２】
特定用途とは、無機のカルシウム水酸化リン灰石がいたるところに均等に配されている生体機能高分子から形成した骨の合成物の形成においてである。この方法では、高分子中で微粒子材料の均質な取り込みを確実にするために高分子材料を可塑化し、高能率的な攪拌をするために二酸化炭素（ＣＯ2）を添加する。
【００１３】
同じ発明者らによる、この、また他の発明（work）でも高い均等性を示している。 しかしながら、より緩やかな生成状態で、高いもしくは低い添着水準のためにさらなる改良された均等性が必要である。 増殖因子と他のバイオテクノロジー薬品の治療できる濃度は、水酸化リン灰石などの生態適合のものがおよそ８０ｗｔ％であるところのｐｐｂ台である。より一定の長い放出、そして、より堅固なモノリス構造においてすぐれた均等性が現れる。
【００１４】
驚くべきことに、私たちは今や高分子複合材料中の制御された内部物質の分散が簡単で再現可能（reproducible）な方法で達成されるのを見出した。その方法はＳＣＦ処理の種々様々な利点を保ちながら、溶液中の少量または多量の生物学的に活性分子の正確で効果的な扱いを可能にする。本発明は第一段階において高分子の表面上に沈澱物質を、および第二の高分子可塑化段階において内部の分散と任意の気孔の生成を提供する。これは第一段階において高分子を溶解し、含有物（imprgnation）で乳化することや第二段階において可塑化を教示するWO91/09,079とは対照的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の最も広い局面では、固体状態の高分子基質の表面に沈殿物の堆積物を提供する方法を備え、その表面に析出した高分子が、高分子と内部に分散した沈澱物質を可塑化そして／または膨張化させた可塑化条件の下で可塑流体や可塑流体の混合物と接触させ、次いで、可塑化流体や高分子複合材料を得るための流体を放出することを含む方法である、内部に分散した沈殿物質を含む高分子複合材料の製造方法が含まれる。
【００１６】
その方法は表面積が大きい（a high surface area）高分子基質の表面に堆積物を、特に粉末層または高い多孔性のマトリクスを形成させることが好ましい。その方法は、高分子基質の内部とそして外部の表面に、更にはどのような露出表面孔をも含んで、いかなる露出している表面にでも堆積物の沈殿層を提供することが望ましい。 このような手段により小さい表面積上に同じ量の材料を堆積させる、より大きくて均等性のさらに希釈（dilute）された沈殿物が形成される。 表面全体や、一部分だけもしくはそのいくつかの部分上に沈殿物があることもある。
【００１７】
高分子と可塑化流体が接触することによって、多孔性の固体状態の高分子基質が得られ、続いて当該技術分野で知られているように適当な方法により高分子を発泡して放出流体を得ることが望ましい。従ってその方法の望ましい実施例では、第一段階においては高分子を可塑化するための可塑化条件下において高分子と可塑化流体又は可塑流体の混合物とを接触することを含むか、固体状態の基質高分子を得るために流体を放出することを含むことであり、第二段階においては高分子の表面で沈殿物の表面堆積物を与えることを含むことであり、第三段階においては、高分子や内部に分散した沈殿物質を可塑化し、そして/または膨らますために可塑化条件下で表面に析出した高分子を可塑流体や可塑流体の混合物と接触させ、そして高分子複合材を得るために可塑流体や可塑流体の混合物を放出する。好ましいくは第一段階において流体を可塑化もしくは放出して、高分子を発泡し、多孔性の固体状態の基質高分子を得て、第二段階において使用することである。
【００１８】
生成合成物は、多孔性の基質からできているとしても、多孔性であることもあるし非多孔性であることもある。 それは、有孔性が表面の沈殿を助長するのに役に立つこともあるという利点はあるが、逆もまた同様で、ほとんど生成物の合成において関係ないこともあるし、その両方の組み合わせということもある。
【００１９】
堆積物は、ばらばらの粒子または、溶かされた沈殿物質からできていることもある。そしてその堆積物は、固体または流体状相（phase）の沈殿物であることもある。 望ましくは、沈殿物質が流体状相中に存在し、沈殿物は、浸された状態や溶液へのスプレーやそれに類するもの、沈殿物質の分散または懸濁、冷凍による乾燥、蒸発、加熱、ブロッティング(blotting)等から成り立っていることである。
【００２０】
あるいは沈殿物質を固体状相に提供し、沈殿物は粉末塗布、ダスティング(dusting)、ロリング（rolling）または接着させることを含む。
【００２１】
沈殿物は、特に不溶性物質や乾燥状相の沈殿物質の沈殿物である場合に、表面高分子の軟化性や接着性の助けをかりることもある。
【００２２】
沈殿物が高分子の表面との間に物理的な相互作用をすることもあるが、しないこともある。沈殿物質の溶液、分散液または懸濁液と高分子基質に接触するとき、特に好まれる実施例では、沈澱物質は液体層から高分子表面上に吸着し、希望する水準で沈殿物質の吸着層を形成する。例えば、もしそれ以降に表面が液体で洗浄されても、この層は溶解力や影響効果および同様のものはそのまま変わらない。
【００２３】
浸漬時間は、使用される材料によっては１秒から順番に最大４８時間まであることもある。 乾燥時間は極端な熱、凍結またはそれに類するものへの感度によっては、最大４８時間となることもある。
【００２４】
沈殿物質は、微粒子か粉末形状で、最大１ミリの粒径で、好ましくは５０から１０００ミクロンのものという条件が望ましい。 沈殿物質は、実際の使用時上の制約と必要な分散によっては均一か粒径の混ざったものからなることもあれば、同じ物質か異なる物質のものからなることもある。
【００２５】
高分子は固体状態であるか、または非常に粘性の流体であり、限られた性質或いはよく混合した性質を表すこともある。 固相高分子は微粒子、例えば顆粒、ペレット、小球体、粉といった形状、または例えばマトリクス形状のモノリス構造のこともある。可塑状態とは高分子を可塑化そして/または、膨潤するために粘性を減らす状態のこともある。微粒子の高分子が可塑化により、さらに大きい構造に凝集することが知られている。 これは、後で定義するように可塑流体を放出するときに微粒子の合成物に戻るか、またはモノリス合成物を形成することもある。５もしくは１０ミリグラムから、グラム、多キログラムといった規模の量の高分子が使用されることもある。
【００２６】
ここで、可塑化流体とは、自然な状態か超臨界または臨界に近い、または密集した状態または臨界未満といった状態において高分子を可塑化することができる流体である。  流体は、液体または気体であるかもしれなく、そして与えられた高分子を可塑化できるのに適した密度によって選択されるのが望ましく、例えば、流体密度は０．００１ｇ／ｍｌから１０ｇ／ｍｌの範囲で例えば０．００１ｇ／ｍｌから最大２ｇ／ｍｌであるかもしれない。
【００２７】
可塑状態は高温もしくは常温そして／または高圧もしくは大気圧で成立している。沈殿物質を受けいれやすい状態下で与えられた高分子が効果的に可塑化するために選択されるか、あるいはふさわしい化学タイプによって流体が選択されることもある。そしてその流体のために適した可塑状態が選択され、最初の受け入れやすい状態(Ｔ)を選択して、必要な密度を得るために第二状態(Ｐ)で補填することが望ましい。
【００２８】
可塑状態が、マイナス２００℃から５００℃、好ましくはマイナス２００℃から２００℃、さらに好ましくはマイナス１００℃から１００℃の間で、例えば（下は）マイナス８０℃からマイナス２０℃の間の温度から（上は）２００℃若しくは１００℃までという範囲の流体臨界温度より低い温度か同じ温度または高い温度の必要な温度を備えていることが望ましい。ほとんどの流体にとって、およそ１０から１５℃、１５から２５℃、２５から３０℃、３０から３５℃、３５から４５℃、４５から５５℃の範囲であり、最も望ましくはだいたい２８から３３℃である（ＣＯ2）。その他の代替範囲も考えられるかもしれず、それも発明の範囲内である。可塑化を達成するために高分子Ｔｇの充分な低下と相性がよい最低気温が採用されることが望ましい。常温で作動するために、本発明の過程では圧力の増加による補填(compensation)を必要とすることもある。
【００２９】
可塑流体は１バールを超えて１００００バール、望ましくは１から１０００、より望ましくは２から８００バール、より望ましくは２から４００バール、より望ましくは５から２６５バール、最も望ましくは１５から７５バールといった可塑流体臨界圧(Ｐｃ)より低い圧力か同じ圧力または高い圧力といった、必要な圧力から成ることが望ましい。 ほとんどの流体は、これがおよそ３０から４０バールの範囲、４０から５０バール、５０から６０バール、６０から７５バールまたは８０から２１５バールの範囲であって、密集した状態や超臨界の二酸化炭素（ＣＯ2）に対して最も望ましくはおよそ３４から７５バールの範囲である。その他の代替範囲も考えられるかもしれず、それも発明の範囲内である。
【００３０】
流体は高分子や沈殿物質との接触よりも前に可塑状態であるか、または表面に析出した高分子との接触により可塑状態がもたらされることもある。
【００３１】
その処理は、表面に析出した高分子と可塑流体とが1ミリ秒から最大５時間の接触時間で実行されることが好ましい 。例えば、短い接触時間であれば２ミリ秒から１０分までが望ましく、さらには２０ミリ秒から５分が望ましく、またさらには１秒から１分、２秒から３０秒が望ましく、２秒から１５秒が最も好ましいかもしれない。あるいは、好ましくは例えば１５分から２時間、１５分から４０分または３０分から１時間という長い接触時間により、容器の加圧による有害な影響を最小として、優れた分散ができる。
【００３２】
可塑流体の加圧は、これまで述べたような表面に析出した高分子と接触する前から原位置（in situ）または外の位置（ex situ）であることもある。流体が加圧される位置、または表面に析出した高分子に導入される原位置（in situ）または外の位置（ex situ）での加圧における加圧時間は１秒から３分が望ましく、さらには１秒から１分が望ましく、もっと言えば１秒から４５秒が望ましい。
【００３３】
攪拌もしくは混合の有無にかかわらずその処理は実行されることもある。可塑化を助ける、または必要な均等性と添着（loading）の分散に応じることができるよう混合や条件が選択されることもある。均等な分散が必要な場合に、その方法には長い期間そして／またはとても激しく混合することが含まれるのが望ましい。 不均等な分散が考えられる場合には、その処理は単にかき混ぜられるだけこともある。
【００３４】
混合とは物理的な混合、揚水、または例えば通気や流体ガス流れや層状流動あるいは可塑流体の飽和(impregnation)または拡散といった表面に析出した高分子を通じた攪拌によることもある。攪拌には通常、スターラーやインペラ、望ましくはさらなる混合や同様のもののためにヘリカルリボン翼などのヘリカル翼を使用する。
【００３５】
混合は、１ミリ秒から最大５時間といった、可塑流体やその他のものとの接触時間となることもある。攪拌または混合は、可塑流体との接触時間やこれまで述べてきた可塑流体の接触時間に応じた攪拌または混合時間との実質的な接触時間であることが望ましい。
【００３６】
その処理は、つづいて可塑流体を放出することを含んでいる。可塑状態は、減圧状態下で行われる高められた圧力放出を含み、必要な減圧時間以上の処理がなされて、このとき内部的に分散された沈殿物質を含む高分子複合材料が得られる。高分子複合材料のモノリスブロックがもたらされるように実行される方法で圧力容器を減圧することによって、減圧は移し替えないで、そのまま（in situ）で達成されることもある。あるいはその処理が実行される圧力容器の中身は、より低い圧力で２番目の圧力容器に放出されるかもしれず、それによってこれまで述べたような高分子複合材料の均質の粉末が既知の手段で得られる。
【００３７】
流体の放出は、沈殿物質が高分子マトリクスと内部の孔の表面のいたるところに分散している状態で高分子基質を発泡させて多孔性の構造を作る方法で行っても良い。通常、これは最長２分間にわたる急速な放出で達成される。
【００３８】
減圧期間は、必要があれば高分子を発泡させることが選択されることもあり、したがって、合成物の多孔性を定める。高い多孔性（high porosity）高分子のために１ミリ秒から１０分まで、さらには１秒から３分、さらには１から３秒までの時間にわたる転移(transition)が急速であることが望ましい。あるいは無孔構造にするために、高分子の外に流体拡散させて、発泡するのを避けようとして、可塑流体が放出されることもある。 通常、これは１０分以上最大１２時間にわたる流体の緩慢で段階的な放出で達成される。好ましくは、大気圧すなわち実質的には１気圧(１０１．３２５ｋＰａ)に近づけることである。
【００３９】
その方法は追加溶剤または流体をともなって実行されることもあるし、それらが無い場合もある。高分子表面と沈殿物質の物理的な相互作用の場合では、一定の沈殿層に影響することなく、追加溶剤または流体が使用されることもある。しかしながら、その処理は沈殿物質を溶解できる溶剤が無い場合に実行されるのが望ましい。適当なキャリヤ、添加剤(agent)、保存剤、および同様のものが必要であれば使用されることもある。
【００４０】
これまで述べてきたような可塑流体は必要な高分子を可塑化することのできるどんな流体も含んでいても良い。先行技術において既知のそのような流体は、密度が増すにつれて、液体と蒸気領域の間の平衡線が見えなくなる臨界点までもしくは臨界点を超えて高い温度や圧力状態にさらされることもある。超臨界そして濃い状相（dense phase）の流体は、気体のような、液体のような両方の特性によって特徴付けられている。特に、流体密度と溶解度の特性は液体の特徴に類似しており、一方で粘性、表面張力、および流体拡散率は、気体が媒体を浸透するように、気体の性質に似ている。
【００４１】
これまで述べてきたような可塑流体は必要な高分子を可塑化できる流体を備えていることもある。可塑流体は二酸化炭素、酸化二窒素、二硫化炭素や、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、エチレンなどの脂肪族のＣ2-10炭化水素、また例えば四フッ化炭素、塩化物、炭化一塩化三フッ化物などのハロゲン化誘導体、そしてフルオロホルムやクロロホルム、またベンゼン、トルエン、キシレンなどのＣ6-10芳香族化合物、メタノールやエタノールなどのＣ1-3アルコール、そして六フッ化硫黄、アンモニア、キセノン、クリプトンなどの硫黄ハロゲン化物や、それらの混合物を含んでいる。通常、これらの流体はこれまで述べてきたようにマイナス２００℃からプラス５００℃の間の温度と１バールから１００００バールの圧力条件により可塑状態がもたらされる。例えば拡散や高分子の可塑化といった流体の特性によって流体が選択されることが好まれる。流体はこれまで述べたような高分子や沈殿物に対してではなく、これまで述べたような高分子複合材料の残りの構成要素に対する溶剤として作用することが望ましい。これまで述べたように高分子の商業的な生成を容易にする臨界状態に関して流体の選択がなされることもある。超臨界の状態は表１におけるいくつかの流体について示される;
【表１】
2005520025.tif 000002
【００４２】
望ましくは、可塑流体は二酸化炭素と、これまで述べたようなさらなる流体との任意の混合剤や従来の溶剤いわゆる「モディファイヤ」と混合されることを含む。二酸化炭素は一般に、医療用途のために取締機関によって承認されており、化学的に不活性であり、残留物を全く残さないで、自由に利用可能である。
【００４３】
可塑流体は高分子に関していかなる有効な量で存在していても良い。望ましくは、反応槽での必要な濃度のときに必要な高分子の可塑化および／または高分子の膨張を与えるために可塑流体を提供する。そのような範囲は、例えば、高分子の重量に対して１０％から４０％余分に吸収することができるくらい充分な可塑流体とともに、高分子重量の１％から２００％にわたっても良い。
【００４４】
沈殿物質は高分子に対していかなる有効な量で存在しているかもしれない。したがって、通常の値が１×１０-12ｗｔ％から９９．９ｗｔ％、望ましくは０．０１ｗｔ％か０．１ｗｔ％から９９．０ｗｔ％であるか、さらに望ましくは０．５ｗｔ％または１．０ｗｔ％から５０ｗｔ％である。 したがって、特に好ましい実施例では、その処理は５ｇという大量の高分子におよそピコグラムやナノグラムといったレベルの少量で実行される。例えば、高分子中の沈殿物質の濃度として表すと１×１０1ｎｇ／ｍｇから１×１０3ｎｇ／ｍという範囲で少量、例えば５０ｎｇ／ｍｇから１５０ｎｇ／ｍｇ存在することもある。それらの治療上有効な濃度（therapeutic concentrations）が非常に低いので、酵素分子やタンパク質分子などのほとんどの生物学的な活性分子に、これは有益である。 例えば増殖因子（growth factor）であるＨＧＦ(肝細胞成長因子)が肝臓再生処理の間、再生医工学（ヒト組織工学tissue engineering）で肝細胞に治療上有効な反応がみられるために必要とする増殖因子の治療量（therapeutic amount）は１０ｎｇ／ｍｌである。(ツボウチ、ニイタニ他  １９９１年)
沈殿物質は、生理活性であったり、生理不活性であったり、殺虫剤やその類のものでも良く、染料や添加物やそれと同様のものを含んだ非生物機能物質の生命体を構成するかまたは生命体と関わる必要な遺伝子座上で、機能するのに適した必要な物質から選択されることもある。
【００４５】
沈殿物質は移植（implantation）や混入（incorporation）が必要となるホスト構造(host structure)の構成物や前駆物質、それらの誘導体や類似物から選択されるのが好ましい。そしてその沈殿物質は人間や動物や植物や他の生物主構造の、例えば骨格や器官や歯の構造および同様のものの成長や修復、遮へい、保護、改善、変化やモデリングなど(for growth or repaire,,・・・)、または抑制因子と戦うこと（to combat）；または毒薬や毒素、廃棄物（waste）や同様のものの代謝(for metabolism)；またはバイオレメディエーション、生合成、生体触媒作用または同様のものといった自然の過程で役に立つ製品の合成（for synthesis）を意図した物質（matter intended ）を含むことが好ましい。
【００４６】
より明確には沈殿物質は (医薬の)ドラッグ、動物用医薬品として通常分類される次の例、病害虫（pest）に対する農薬や植物成長剤；人間や動物の健康製品;骨や、器官や、歯の構造等の成長、修復、モデリングを意図した人や動物の成長促進用、身体用（structural）及び美容用の生成物；毒薬、毒素、および同様のもののための吸収性の生物吸着材料などを含むが、それに制限されるものではない。
【００４７】
医薬品と動物用医薬品すなわちドラッグは、治療、病気予防、回復、（症状）緩和、または病気の診断といった目的によって生理学的処理が変わる薬理学的に活性の化合物と定義されることもある。
【００４８】
ドラッグは無機または有機の分子、ペプチド、タンパク質、酵素、少糖類、炭水化物、核酸、および同様のもので構成されることもある。
【００４９】
ドラッグは次の治療の為に作用する化合物を含むこともあるが、それに制限されるものではない:
抗ウイルス剤、抗菌ドラッグ、抗真菌薬、抗原虫性ドラッグ、駆除薬などの感染症（infections）
筋収縮薬、利尿剤、抗不整脈薬、ベータアドレナリン受容体ブロッキング薬、カルシウムチャンネルブロッカー、交感神経興奮薬、抗凝血剤、抗血小板薬、  線維素溶解薬、脂質低下薬といった心臓血管系;
酸中和剤、鎮痙薬、潰瘍治療薬、下痢止め薬、下剤、中枢神経系、催眠薬、および抗不安剤、抗精神病薬、抗うつ剤、中枢神経系興奮剤、食欲抑制剤  などの胃腸系薬下剤、吐き気と嘔吐の治療に使用される薬、鎮痛剤、抗てんかん薬、パーキンソン病に使用される薬、麻薬依存症に使用される薬;
細胞毒性薬、免疫反応修飾因子（modulator）や、性ホルモンや悪性の病気の拮抗薬のような悪性の病気や免疫抑制剤;
気管支拡張剤や副腎皮質ホルモンやクロモグリク酸や関連する療法、抗ヒスタミン剤、呼吸促進薬、肺表面活性剤、全身性(systemic)鼻づまりの薬などの呼吸器系剤;
リウマチ性疾患に使用される薬、神経筋異状に使用される薬などの筋骨格や、関節疾患の薬; そして
免疫学的製品とワクチン。
【００５０】
農薬と作物保護製品は、病害虫や成長をコントロールする薬、植物病害をコントロールする薬、土壌改良剤とおよび同様のものと定義されることもある。例えば、病害虫成長抑制剤には、殺虫剤、殺ダニ剤、殺鼠剤、軟体動物駆除剤、ナメクジ駆除剤、殺虫剤(線虫、駆虫薬)、土燻蒸剤、病害虫忌避剤、およびフェロモンのような誘引剤など、化学作用による駆除剤や、微生物、食肉動物、自然の生成物といった生物学的コントロールをするものが含まれる;  
植物成長コントロールエージェントは、除草剤、除草剤、枯葉剤、乾燥剤、落果を含み、コントローラ、発根複合物（rooting compounds）、発芽抑制剤、成長刺激剤、成長遅延剤、こけおよび地衣類のコントローラや植物遺伝子コントローラまたはエージェントなどを定めており；  
植物病害コントロールエージェントは防カビ剤、殺ウイルス剤、材木防腐剤、および殺菌剤を含み; そして
土壌改良エージェントは肥料、わずかな金属添加物、バクテリアの動作コントロール刺激剤、および土壌強化剤を含む。
【００５１】
沈殿物質は、自然発生的又は人工的、その他の変化させた（naturally occuring or synthetic otherwise moidified ）成長促進物質、生体適合させるもの、ビタミン、タンパク質、糖蛋白質、酵素、核酸、炭水化物、無機化合物、栄養物、ステロイド、セラミック、同様のものなどを含む機能増進成分(funnction enhancing components)、及び胞子、ウイルス、哺乳類、植物、バクテリアの細胞などのような機能物質（matter）を含み、機能を強化する成分を選択的に（alternatively）あるいは追加的に含むこともある。好ましい沈殿物質(matter)は、生体適合させるもの、ビタミン、タンパク質、糖蛋白質、酵素、核酸、炭水化物、無機化合物、栄養物、ステロイド、セラミック、および同様のものから選択された増殖因子を含んでいる; 特に基本の線維芽細胞増殖因子、酸性の線維芽細胞増殖因子、表皮増殖因子、ヒト増殖因子、インシュリン様成長因子、血小板の派生している増殖因子、神経増殖因子、形質転換増殖因子などの増殖因子や骨形成タンパク質; ''ＢＣＮＵや１又は３−ビス−(２クロロエチル)-１-ニトロソ尿素、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、４−デメトキシダウノルビシン  ３'−デスアミノ−３'−(３シアノ−４-モルホリニル)ドキソルビシン、４-デメトキシダウノルビシン−３'−デスアミノ−３'−(２-メトキシ−４-モルホリニル)−ドキソルビシン、エトポシド、およびテニポシドなどの抗腫瘍性の; 黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）や黄体形成ホルモン放出ホルモン類似体（ＬＨＲＨ  analogues）などのホルモン; 酢酸メドロキシプロゲステロンか酢酸メゲストロールなどの産児制限および/または抗腫瘍作用のためのステロイド（steroideals）;例えば、骨や歯の構成物として機能し、その生体適合性を促進するカルシウム水酸化リン灰石のようなリン酸三カルシウムや、燐灰石（apatite）誘導体類; 組織モデル化成分として機能するシリコンや類似物、前駆物質やそれらの機能的な誘導体、コラーゲンやバイオガラス、バイオセラミック、他の無機化合物、ヒアルロン（hyaluran）、ポリエチレンオキシド、ＣＭＣ(カルボキシメチルセルロース)、タンパク質、有機高分子、その同様のものといった生理活性種、そして半月板、軟骨、組織、および同様のものに移植して取り込み適合させた成分（構成材料）、そして成長、モデルリング、コラーゲンの増加や補強、線維芽細胞、およびこれら主構造の他の自然構成要素などを促進させるのが望ましい。
【００５２】
毒、毒素、および同様のものに対する吸収性沈殿物質は、自然に生じるか人工的に導入された毒や毒素の吸収、相互作用、反応やそれ以外によって固定化（immobilising）することができるすべての自然のまたは人工の生成物として定義されることもある。
【００５３】
沈殿物質は、例えば固体中においてチキソトロープ剤やゲル形状のように半固体で機能したり、ペーストや液体形状などのように半流体や流体として機能したりといったその機能に対して適した必要な形状や、混和性あるいは不混和性で良いが、例えば懸濁液として高分子や可塑流体において不溶性である。実行する処理や機能に応じて沈澱物質を希望の形状に適用させるのは便利である。その物質は、必要な用途に応じて粒径を選択させる、固体の粒子形状が好ましい。粒径は任意の高分子複合材料の粒径と同じ大きさか、より小さく、任意の気孔は、１０-9ｍから１０-2ｍ、例えばおよそピコメートル、ナノメートル、マイクロメートル、ミリメートルまたはセンチメートルであるのが望ましい。
【００５４】
高分子複合材料は今まで述べた用途に適した望み通りの形状でしても良い。生物に対する用途としては、乾燥または湿ったスプレー、粉状、ペレット、小さな粒、モノリス、および同様のものとして、例えばこれまで述べられたような農薬や、殺虫剤の、またはその同様のものに使用する際には、溶解、蒸発または同様の放出可能な方法で沈殿物質基質を含んで、高分子複合材料が導入されることもある。人間や動物体への健康管理の（healthcare）、製薬の、または同様の合成物としての投与(administration)において、その構成は従来のプラクティスに従ってうまく定式化しても良い。
【００５５】
本発明の方法を用いて作られた製薬品や動物用医薬品としての使用のために、合成物は、局所、経口、直腸、非経口、パッチテスト（epicutaneous）、粘膜、静脈、筋肉内、脊髄内などによる投与に関して、クリーム、ゲル、シロップ、ペースト、スプレー、固体、懸濁液、粉末、マイクロ粒子、小さな粒、錠剤、カプセル、タブレット、ペレット、座薬、ペッサリー、コロイド性のマトリクス、モノリス、大きい丸薬などの形状で良い。
【００５６】
合成物は、非孔性で良く、開放気泡孔もしくは独立気泡孔を備えても良い。非常に開放多孔性構造を備え、微小核体（microcellular）として知られている合成物は、長期もしくは段階的な放出や、製薬品や動物の健康などこれまで述べてきたような用途や、また例えばマトリクス中で血管と膠原線維の成長を支え、骨、半月板、軟骨、組織、および同様のものに類似した構造を形成し、生物学的浄化や環境触媒などに対する基質の処理能力に関する構造を提供するといった生物医学そして生物学的触媒（biocatalytic）の用途にとって、理想的である。
【００５７】
非孔性である開放気泡もしくは独立気泡合成物は、内外への浸出や他の手段を必要としない沈殿物質の生物分解的な段階的または長期の放出や、運搬用途の役に立つこともある。放出は、生体外か生体内（in vitro or in vivo）でも良いし、非経口、経口、そして、静脈による施用で良いし、、または治療部位の中央に近い放出、たとえば組織腫瘍治療における、または体温上昇の（hyperthermic）骨腫瘍治療に関する外科的なものであることもある。
【００５８】
多孔性の高分子複合材料は、均質のまたは様々な多孔度を有すしても良いし、高分子複合材料の総空隙率の１〜９９％の量で各々存在する、例えばミクロとマクロタイプといった少なくとも２桁大きさが異なる孔を提供することが望ましい。
【００５９】
それゆえ、ここではミクロとマクロで引用したが、孔はそれぞれどんな単位寸法とそれに対応する１０n倍数の孔であると理解されるべきである。例えば、ミクロ孔１０-(10-7)ｍ、に対してそれぞれのマクロ孔が１０-(7-5)ｍ、好ましくは１０-(8-7)ｍおよび１０-(6-5)ｍであることもあるし、例えば、５０から２００ミクロンといったミクロンと１０2ミクロンの大きさがより好ましいこともある。孔は望ましい構造（configuration）であればどんなものでもかまわない。その孔はねじれて連結したチャネルをもつネットワークを形成し、さらにマクロ孔の間にミクロ孔を連結することが望ましい。
【００６０】
沈殿物質は比較的小さい孔と比較的大きい孔中で分散されるか、またはより大きい孔に閉じ込められることもある。沈殿物質は、孔壁に包埋されるか、自由に支持(supported)されるが、高分子マトリクス中に入れられない（be not encased）。
【００６１】
長期の放出に対して流体の内外に浸出するために、または特定の流体と放出物質における材料の供給や除去のために、開放気泡（open cell）構造は高分子複合材料中にチャネル構造を形成することもある。 異なる粒径の沈殿物質は、より小さい孔とより大きい孔の間で選択的に分散されることもある。
【００６２】
この様に形成された合成物は、不均質な分散や無機物質の大きな凝集体を含んでいることが知られている高分子とは対照的に、高分子の生力学的な（biomechanical）特性を高めることもある。
【００６３】
本方法は、最終生成物のミクロ孔とマクロ孔の寸法と空隙率、およびその形態（morphology）を決定するように制御（control）されることもある。可塑化流体放出のための期間は多孔性の度合いを一部決定する。さらに、圧力の違いは多孔性に比例している。 また、より高い臨界温度は、より高い多孔性を与える。合成物は１５％から７５％の多孔性もしくはそれ以上の、望ましくは５０％から９７％の多孔性で適切に得られる。
【００６４】
流体によって誘引された多孔性構造を保持するために、高分子は可塑流体の放出後、固体または非常に粘性の流体形状をうまくとどめいている。
【００６５】
本ポリマーの製法は、例えば当技術分野で周知である超臨界流体や、他の抽出剤を用いた追加抽出法である、高分子や後重合(post-polymerisation）や架橋結合のさらなる処理は、必要なものとして、また当技術分野で周知であるものとして、それ以降実施しても良い。
【００６６】
本高分子は、人間や動物体、植物または他の生物への導入に適しており、協調性(associate)があり、または生体外で（in vitor)非毒性の方法による環境下での使用に適している架橋されたかそれ以外のどのような既知の高分子、共重合体（またはブロック共重合体）、混合物、およびそれらの混合から選択されても良い。 適した高分子材料は、「高分子の生体機能材料」編纂セビリアン  ダミトリュ（Severian Dumitriu）ISBN0-8247-8969-5、出版 マルセル・デッカー、ニューヨーク、米国、1994）にて開示されているような合成の生分解性高分子や、生体吸収可能（bioresorbable）高分子合成物、非生分解性高分子、そして天然高分子から選択される。 高分子はホモポリマー、ブロック共重合体、ランダム共重合体、高分子の混合、および、直鎖であるか（非常に）分岐しているか、または架橋処理されたモノマー合成物から選択されることが望ましい。
【００６７】
高分子は、必要な用途に対して、どんな分子の重量であるかもしれなく、１〜１，０００，０００の範囲で適当に構成単位を繰り返している。より高い分子重量は、より長い放出パターンか、よりゆっくりとした分解に役立つこともある。
【００６８】
高分子は、例として挙げられる次のことを含むが、それだけに制限されるものではない。  
合成の生分解性高分子は選択されることもある:
ポリエステルは、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ（エチレングリコール）と乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリ、(ｅ−カプロラクトン)と、ポリ(３−ヒドロキシ酪酸塩)と、ポリ(p−ジオキサノン)、ポリ(プロピレンフマレート)を含み;  
望ましくは、ポリ乳酸はＤＤ、ＤＬ、ＬＬエナンチオマー（鏡像異性体）を含んで、Ｄ乳酸とＬ乳酸とグリコール酸モノマーか、もしくはそれらの組み合わせか、アルファオキシ酪酸の３−プロピオラクトンテトラメチルグリコリドや、ｂ−ブチロラクトンや、４−ブチロラクトンや、ピバロラクトン（pivavolactone）などのモノマー、そしてアルファオキシ酪酸や、アルファ−オキシイソ酪酸、 アルファ−オキシ吉草酸、アルファ-オキシイソ吉草酸、アルファ-オキシカプロン酸、アルファ−オキシ−アルファ-エチル酪酸、アルファ−オキシイソカプロン酸、アルファオキシ３−メチル吉草酸、アルファ−オキシヘプタン酸(hydroxyheptanoic acid)、アルファ−オキシオクタノ酸、アルファ-オキシデカノル酸（hydroxydecanoic  acid）、アルファ−オキシミリスチン酸、アルファ−オキシステアリン酸、アルファ−オキシリグノセリン酸などのアルファオキシ分子間環状からなる。単体モノマーとして乳酸を使用するか、共重合体としてのグリコール酸とともに主要単体モノマー(principal monomer)として乳酸を使用することが最も好まれる。 後者がポリ(ラクチド共グリコリド)共重合体と呼ばれる。; 特にふさわしいのが、乳酸単体や、グリコール酸単体または１００：０から４０：６０のモル比でグリコール酸が共重合体として存在する乳酸とグリコール酸からなる高分子である。
【００６９】
以下にヘレルによってＡＣＳシンポジウムシリーズ567、292-305、1994に説明されるようなポリオル／ジケトンアセタール添加高分子を含むポリ(オルソエステル);
生体機能材料科学高分子版、3、315-353、1992年の刊行物にてタマダとランガーによって説明されているような、また  ドム  エー．ジェー．（Domb A.J.）、ワイズマン  アール.エム編纂、ハルウッドアカデミック出版による生分解性高分子のハンドブックの第８章のドムによって説明されているようなポリ(セバシン酸無水物) (ＰＳＡ)を含むポリ酸無水物、 ポリ(カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキサン)（carboxybisbarboxyphenoxyphenoxyhexane）(ＰＣＰＰ)、ポリ〔ビス(p-カルボキシフェノキシ)メタン〕(ＰＣＰＭ)、ＳＡ、ＣＰＰ、およびＣＰＭの共重合体;
ポリ(アミノ酸); ポリアセタール; ポリケタール; ポリオルトエステル;  
米国化学会(ワシントン  ディー．シー．)  規制医薬品運搬の挑戦と戦略の３８９から４０３ページにおいてジェームスとコーンによって記載されたものを含むポリ(疑似アミノ酸)。;
「バイオテクノロジーとバイオエンジニアリング」５２ページ、１０２から１０８ページ  １９９６年でシャハトにより述べられた、ポリ〔(二塩化) ホスファゼン〕（phosphazene）、ポリ〔(有機)ホスファゼン〕の誘導体を含むポリホスファゼン、高分子; そして
「調剤学」１０６ページ、２５５から２６０ページ  １９９４年に記載されたルロイドによって記載されたものを含むアゾ高分子  
合成の非生分解性高分子が次から選択されることもある:  
ポリエチレンを含むビニル高分子、ポリ(エチレン共ビニル酢酸塩)、ポリプロピレン、ポリ(塩化ビニル)、ポリ(ビニルアセテート)、ポリ(ビニルアルコール)、ビニルアルコールとビニルアセテートの共重合体、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸塩、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ジメチルシロキサン)、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリスチレン、および誘導体。
【００７０】
天然高分子は次のものを含む炭水化物、ポリペプチド、およびタンパク質から選択されることがある。 
でんぷん、セルロース、およびエチルセルロース、メルセルロース、エチルオキシエチルセルロース（ethylhydroxyethylcellulose）、ナトリウムカルボキシメチルセルロースを含む誘導体; コラーゲン; ゼラチン; デキストランと誘導体;アルギン酸塩;キチン質;キトサン; 
非生分解性高分子は、エステルウレタンやエポキシ、ビス−マレイミド、メチルかグリシジルメタクリル酸などのメタクリル酸塩、トリ−メチレン炭酸塩、ジ−メチレン−トリ−メチレン炭酸塩などの高分子や; グリコール酸や、グリコリドや、乳酸や、ラクチドや、p-ジオキサノンや、ジオキセパノン（dioxepanone）や、アルキレン蓚酸塩やガンマ−カプロラクトンのようなカプロラクトンなどの生物分解性合成高分子から選択されることが望ましい。
【００７１】
本発明の方法で前駆物質から高分子基質が得られることもある。前駆物質は、可塑流体の処理中または処理後に原位置(in situ)で高分子基質を形成するために反応することもある。
【００７２】
本高分子は、例えば必要な解重合や放出や流体アクセスや屈曲的で一般的な機械的性質や電気特性や同様のものに対する架橋結合の程度と性質を決定するように、効果を高めさせるか制御させる機能を有した追加の高分子複合材料を備えているても良い。
【００７３】
高分子複合材料の生成中に組み入れられるかもしれない追加材料、例えば、他の活性剤や、開始剤、促進剤、硬化剤、安定剤、酸化防止剤、接着促進剤、充填剤および同様のもの、は高分子内に組み入れられることもある。追加材料は沈殿物質が接触する前または後に高分子に混合されるか、内部に分散した沈殿物質を有する生成合成物の次の(subsequent)浸漬や浸透で取り込まれることもある。
【００７４】
接着促進剤を高分子複合材料に取り込む必要があるなら、高分子複合材料へ取り込む前に、これまで述べられたような流体の有無に関わらず、単なる混合や、スプレーによる、または他に知られているコーティング手段などによる方法で、その促進剤に沈殿物質の粒子を充満させるか、コーティングするために使用しても良い。優れたコーティングを得るために、これまでの述べたような流体との混合とともにコーティングされるのが望ましい。例えば接着促進剤はこれまでの述べたような流体中に溶解し、そしてその溶液はこれまでの述べたような沈殿物質の粒子と接触する。あるいは、接着促進剤は、必要な方法で沈殿物質の粒子に接触するように、混合そして/または重合段階の間、オートクレーブに取り入れられる。
【００７５】
望ましくは、沈殿物質を含む充填材の総量が０．０１−９９．９ｗｔ％の領域にあり、望ましくは０．１−９９ｗｔ％、より望ましくは５０ｗｔ％から６０ｗｔ％以上、例えば、７０ｗｔ％または８０ｗｔ％までである。
【００７６】
場合によっては、流体の放出の前か後に(部分的な)硬化を開始するために、開始剤か促進剤を導入することが望ましく、その開始は、導入と同時でも良いし、遅れても良く、温度の上昇で活性化されることもある。 代わりにスプレー乾燥方法が、硬化方法に代わって、流体の放出と同時かそれよりも前に使用されることもある。この場合、硬化後使用されることもある。これには生成の容易さと装置の簡単さによる利点がある。
【００７７】
本発明のさらなる局面には、これまで述べたような本発明の方法で得られた高分子複合材料が提供される。 
本発明のさらなる局面では、これまで述べたような微粒子の沈殿物質中に、必要な均等性、望ましくは８０％を超えた、例えば９８％を超えた高い均等性で分散された多孔性または非孔性の高分子を有する高分子複合材料を含んでいる。本高分子複合体は、特別に有利なことに、５ｇの高分子当たりおよそ数ピコグラムや数ナノグラムのオーダーで沈殿物質の非常に少量で、または均等性とバッチ再現性が卓越した水準において少量の容量で１×１０１から１×１０３ｎｇ／ｍｇという範囲の高分子上の沈殿物質濃度として表され、および／またはおよそ１０ミクロン、１ミクロンまたは０．１ミクロンというとても小さい粒径を有する。
【００７８】
さらなる利点としては、封入方法(例えば、二重エマルジョン)や、時間とともに不均一な放出を生じる比較的大きい粒子が得られる生体物質を導入する方法と比較して、本発明の方法によって沈殿物質の非常に小さい粒子を内部に分散することが可能になり、その結果多くの均等な放出プロフィール(バーストフェーズ効果を減少させる)を与える。そのうえ、発明の合成物は数カ月(several months)の期間にわたって放出を与えることがわかり、これはそれと対応する表面に析出した高分子が数日の経過で表面に析出した状態を失うかもしれないこととは対照的である。
【００７９】
本発明の合成物は簡単な注入技術（impregnation techniques）や、WO91/09079で注入（impregnation）物の塊を示した技術で生じる従来技術の合成物とは区別されることもある。
【００８０】
高分子と沈殿物質の一定の形態のおかげで既知の方法では不可能であったが、本発明の方法によって非常に低くて非常に高い添着(loading)が得られるかもしれず、また沈殿物質の添着は１×１０-12 − ９９．９ｗｔ％の範囲、例えば、１×１０-12 〜１×１０-9ｗｔ％のあたり、２０〜５０ｗｔ％の中域、５０ｗｔ％以上、または８０ｗｔ％以上を得られることもある、ということがわかる。
【００８１】
高分子複合材料はこれまで述べた用途に適した必要な形状であるかもしれない。合成物は、粒状かモノリス形状で得られるかもしれないが、足場（scaffold）やドラッグ分散デバイスとして使用するにはモノリス形状が望ましい。
【００８２】
人間や動物や植物に対する生物学的浄化(bioremediation)、生体触媒または生体バリア（biobarrier）として、その合成物は、バリア・フィルム、膜、層、衣服またはシートを供給するために、ふさわしく成形した形状であるか、または成形した生成物に取りいれられることもある。
【００８３】
構造的な合成物としての使用は、例えば、医学のまたは外科的挿入（insertion）のための高分子や任意の追加的合成のまたは天然の金属、プラスチック、炭素、ガラスであって、繊維メッシュ、スクリム（scrim）、ロッド等での補強を含み、複合材料は必要な主構造によって乾燥して挿入させられるか、湿った状態で挿入させられることもあり、例えば、それは粉状かペレットか小さな粒であることもあるし骨や細胞組織の中への固体モノリスとして、あるいは挿入に適したモノリス形状か骨や歯に対する湿式挿入に適した充填物やセメントとして、固形物あるいはピンなどの整形外科の移植や王冠などの人工歯根のモノリスとして、挿入に対して適したモノリス形状であっても良い。挿入は注射や、外科的なものによる挿入などのものであることもある。要検討
高分子複合材料は０．１か１ミクロンの範囲の粉状で必要な粒径のものからなり、およそ２０センチメートルの大きさのモノリスまでのさらに大きい粒径の沈殿物質とともに使用するには５０ミクロンから２００ミクロンの粒径が望ましい。高分子複合材料が、粉末やペレットや同様のものなどといった均一サイズの粒子において、必要な形状で得られることが本発明特有の利点である。その結果、粒径がばらばらで別々の分散を得るのが必要であるなら、高分子複合材料は、製粉されるか、または異なるサイズのバッチから混合されることもある。
【００８４】
従来技術によると、複合材料の粒径は可塑流体の除去制御で制御されることもある。微粒子の複合材料を得る必要があるなら、処理混合物（process mixture）は必要な粒径を与えるために可塑状態下で混合室から適切に取り除かれて、周囲条件(ambient condition)の下でノズルや必要な孔の開口部のようなものを通して、別の容器へ移され、必要とされる異なる条件や除去レートの下で必要な粒径を提供させる。スプレー乾燥の装置と技術が一般的にその技法として使われることもある。
【００８５】
モノリス形状で高分子複合材料を得るのが必要であるなら、可塑流体は、高分子を発泡させる既知の技術を使用して取り除かれるのがふさわしい。それに従って、高分子混合物(mix)は反応槽で保有され、状態は可塑化から周囲条件へと、高分子混合物から流体を除去するために必要なレートで変化する。高分子の性質によって、もし必要であれば互いに連結した孔と可塑流体の除去により形成されたチャネルを有する、または単に発泡状態を保つために適合させられる高分子濃度(consistency)を選択することによって、多孔性の発泡した状態でモノリスを得ることが可能である。
【００８６】
例えば、混合容器や鋳型内部から必要なモノリス形状を有する混合容器へと可塑流体を取り除くとによって、モノリスはその処理の間に必要な形に形成されることもある。あるいはモノリスは混合容器から除去され必要な形へカットされるか鋳型へ直接移されることもある。
【００８７】
本発明のさらなる局面において、これまで述べてきたような必要な用途にとって適度な大きさと形に換えられ、これまで述べてきたような内部に分散した沈殿物質を有した高分子複合材料を備えた足場（scaffold）を提供している。
【００８８】
本発明による足場（scaffold）は、外科的な移植や人工骨構成物、器官モジュール、治療や接骨（synthesis）や同様のものに対する生物学的触媒といった形がふさわしい。その足場は体内における生分解、自然細胞の内成長、あるいは高分子を取り除いた後の作業に必要な生分解回避の完了後の環境における生分解、といった生分解性のものでも良く、それ以外のものでも良い。
【００８９】
本発明のさらなる局面において、今まで述べたような高分子複合材料の生成において使用する装置を提供する。その装置には温度や圧力上昇や内容物を混合する手段にあわせて適した１つ以上の圧力容器が備えられている。 圧力容器は減圧手段や、より低圧で２番目の圧力容器に内容物を放出するための手段を含むこともある。従来技術で知られているように容器は加圧型であり、その装置には高分子や沈殿物質や可塑流体および他のいかなる材料の導入のための手段も備えている。
【００９０】
本発明のさらなる局面では、これまで述べた高分子複合材料、又はドラッグ運搬のための支持材や足場（scaffold）として使用するための高分子複合材料の足場（scaffold）、又は人間、動物または植物に対する生物学的触媒や生体境界(biobarrier)において、生物学的治療における使用や、又は例えば高分子や、任意の追加的な例えば合成のまたは天然の金属、プラスチック、炭素やガラスであって、繊維網、スクリム、ロッド等で、例えば骨か組織の中への固体のモノリスとして、または、骨や歯に対する湿式挿入に適した充填物やセメントとして、または例えばピンといった固体の骨材やモノリスなどの整形外科の移植片やあるいは王冠のような人工歯根として医療や外科的な補強のための構造的な構成材として使用するために提供されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９１】
本発明を以下の例に関して例証し図示するが、これに制限されるものではない。  
図１Ａ−Ｄは本発明で使われたＷＯ９８／５１３４７(ハウデル他)で開示されている方法で生成された複合材料のスキャン電子顕微鏡写真イメージを示す; カルシウム水酸化リン灰石(４０ｗｔ％)とＰＬＧＡ(６０ｗｔ％)のモノリス合成物の内部の破砕のイメージＡとＢにおいて、低い倍率では、マトリクス中のカルシウム水酸化リン灰石の分散と孔の生成が明白であり、より高い倍率では、客粒子（gest particle）と高分子の密接な混入が観察される;イメージＣで、カタラーゼ(５０ｗｔ％)はＰＬＧＡマトリクス(５０％)に取りこまれ、高分子中のミクロ大の孔と特有のタンパク質粒子形態が明らかであることが示される; イメージＤで、マイクロ粒子合成物(フルオレセイン(ナトリウム塩)(８ｗｔ％)とポリカプロラクトン（polycaprolactone）(９２ｗｔ％)が観察される高い表面部分は、直接噴霧、言い換えれば孔を通じた素速い除圧の後生成される。
【００９２】
図２と図３は除圧状態を変えることによってＰＬＡ気孔構造のコントロールとともに本発明で使用されたＷＯ９８／５１３４７(ハウデル他)の方法で加工されたＰＬＡ合成物のためのスキャンした電子顕微鏡写真イメージと対応する水銀細孔解析法データを示す;図２において、イメージは２時間を越える除圧(「ゆっくり」)によって得られた大きい孔の少ない個体群の存在を示す; 図３において、イメージは２分を越える除圧(「速い」)によって得られた、有孔性の増加とより不均質な分散を示す;水銀細孔解析法によって得られたデータは、ミクロ細孔分散の上の細かい制御が除圧率による変更のみで達成されることを示し、「ゆっくりした」除圧が５０ｎｍから５００ｎｍの範囲で孔を作成している一方、「速い」除圧はきわだって異なり、５００ｎｍから５μｍの範囲で孔を形成している。
【００９３】
図４は、タンパク質が高分子の表面に閉じ込められ、バルク（bulk）を通過しない高分子表面に蛍光タンパク質溶液が吸収される本発明の方法の概要を示す;一番上の表面から高分子を通る共焦点断面図はＰＬＡ足場（scaffold）の縁と外部孔に閉じ込められたタンパク質を示す;その後、高分子: タンパク質複合物は二酸化炭素で可塑化され、そして、タンパク質はサンプル中で分散される、結果として起こる蛍光発光はタンパク質が表面から高分子の束（bulk）まで再分散されるとともに均質である。  
図５は二酸化炭素における二重処理後のタンパク質活性の回復を示す。 
図６は図４の複合材料と本発明によらない比較複合材料の時間の経過によるタンパク質放出を示す。
【００９４】
方法と材料  
細胞培養  
骨髄サンプルは(合計で１６人の患者;平均年齢６３．８歳で１４歳から８３歳までの１１人の女性と５人の男性)、通常の人工股関節代替手術を受ける患者から得た。処分される組織だけを倫理上の承認を得て使用した。
【００９５】
ポリ(乳酸) 組換え型の人間のＢＭＰ−２の有無にかかわらず封入された多孔性の足場（scaffold）またはｒｈＢＭＰ−２と共に吸着されたＰＬＡ足場（scaffold）の上に、人間の骨髄細胞は培養された。そして生体内の分析評価では、組換え型の基礎となる(１０％αＭＥＭ)と骨形成条件(１００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩と１０ｎｍのデキサメサゾンが補われた１０％αＭＥＭ)において人間のＢＭＰ−２(５０ｎｇ/ミリリットル)の添加の有無にかかわらず人間の骨髄細胞を含んでいた。
【００９６】
絨毛尿膜分析評価  
加湿下の大気中、３７℃の状態でマルチハッチ自動孵卵器(ブリンシア製品、スタンフォード、イギリス)を使用して受精した卵は、１０日から１８日間で孵化された。足場（scaffold）構造物が欠陥位置を満たす（fill the defect site）ため、ひよこの大腿骨は１８日目のひよこの胚（embryo）と大腿骨の中央で形成されたくさび形の断片的な欠陥から切除された。ひよこの骨と足場（scaffold）(２９個のサンプル)は１０日目の卵のＣＡＭ(骨組みの中で１ｃｍ2の正方形区分にカットされたものを通して)上に直接配置され、さらに７日間インキュベーションが続けられた。次に、大腿骨／足場（scaffold）移植片はそのＣＡＭ上に配置され、さらに７日間、３７℃でインキュベーションが続けられた。それから移植片は取りだされ、ひよこの胚（embryo）は斬首により始末された。次に組織化学的な分析の前に、足場（scaffold）と移植片のサンプルは９５％のエタノール中にとどめられ、パラフィンワックス処理され、そして、５μｍの切片が組織学のために用意された。
【実施例１】
【００９７】
高分子材料の準備  
ポリ(ＤＬ乳酸)(アルケルメス メディソーブ、低Ｉ．Ｖ．Ｍｗ＝８５ｋＤ、多分散度=１．４)は 乳棒と乳鉢で細かい粒径粉に研摩された。あるいは、粒子はポリ(ＤＬ乳酸)を押し込めて、導管の外に開口部を通して二酸化炭素で加圧して、粒子が形成された。粒子はサイクロン（低気圧）コレクタから取り出され、前述の二酸化炭素は再加圧されて、再使用しても良い。その方法（methology)は超臨界懸濁液（suspension）(ＰＧＳＳ)からの粒子生成の「反-溶剤」の技術に基づいている。
【００９８】
また、高分子は、超臨界流体処理を用いて非常に多孔性のモノリスとして製造しても良い。この場合、多孔性の足場（scaffold）は４８ウェル（well）組織培養法プレート(コスター、米国)から製造されたモールド（moulds）で製造された。ウェル（well）へ１２×１００ｍｇ(±１ｍｇ)のＰＬＡを量り分け、そして、そのモールド（moulds）はオートクレーブ内に密封された。３０分以上にわたって２０７バールの圧力まで二酸化炭素で満たされる前に、オートクレーブは３５℃まで加熱された;この長い充填時間によって、システムが加圧されるにつれ、生物学的な活性基質において過度のジュール-トンプソン加熱の潜在的に有害な効果を最小とした。８分以上大気圧へ放出する前に、可塑化二酸化炭素-高分子混合物は２０分間均衡化することができた。圧力は、製造の間ＪＡＳＣＯ  ＢＰ−１５８０−８１プログラマブル背圧レギュレーターを使用し、制御された。オートクレーブ温度は充填段階を通してずっと３８℃未満を保っていた、そして、均衡化段階の間の二酸化炭素の流速は１２ｃｍ3ｍｉｎ-1であった。二酸化炭素処理の後に、発泡した高分子を含むモールド（moulds）はオートクレーブと２時間流出にあてられた(escape)残留気体から除去された。
【実施例２】
【００９９】
生体物質の添加-タンパク質  
タンパク質、この実施例では蛍光分子ローダミン(シグマ)を付したアビジン、は水中で１マイクログラムの濃度、１ｍｌあたり１０マイクログラム、で溶解させるために蒸留水中に溶かされた。その液体は、生物学的分子（biological molecule）は溶かすが、高分子は溶かさない液体であればどんなものからも代替的に選ばれても良い。タンパク質溶液の０．５ｃｍ3 アリコート（aliquots）は高分子材料の約２５０ｍｇのサンプル上へピペットでとられて、１秒から４８時間の間、そのサンプルに接触して留まった。この接触（exposure）の間、液体を取り除くのにフリーズ・ドライ方法が用いられた。 私たちは一連のアビジンローダミンとＲＮＡ分解酵素溶液(１マイクログラム−２５０ｍｇ／ｍｌ)を最大４８時間の間、多孔性の足場（scaffold）上と高分子粉末上の両方で凍結乾燥させた。全くタンパク質添加のない制御足場（scaffold）が準備された。
【０１００】
この材料の共焦点蛍光顕微鏡検査法で、アビジンローダミンが高分子材料の表面に閉じ込められて、高分子の固体の固まりで分散されなかったことが確認された（図４）。
【実施例３】
【０１０１】
生体物質の再分散-タンパク質  
実施例２におけるそれぞれのタンパク質濃縮サンプルのうち、１つの足場（scaffold）が、コントロールとして作用するためにウェル（well）から除去された。残りのサンプルは、高圧オートクレーブ内に配置されて、３５℃まで加熱され、上記実施例２と同じ手順を用いた二酸化炭素で再可塑化された。 図４は可塑化処理における概略図を示す。この再処理された材料は共焦点蛍光顕微鏡検査法によって、アビジンローダミンが高分子の嵩の中で再分散されたことを示された（図４)。共焦点顕微鏡法は、ライカのＤＭＲＢＥの直立蛍光顕微鏡とアルゴンクリプトンレーザを伴ったライカＴＣＳ４Ｄシステムを用いて実行された。ＴＲＩＴＣアビジンローダミンの赤色蛍光は５６８ｎｍのレーザ線で活性化された。
【実施例４】
【０１０２】
生体物質の添加-酵素  
生体物質の活性がこの処理で影響を受けなかったことを立証するために、酵素ＲＮＡ分解酵素Ａ(シグマ)の２５０ｍｇ／ｍｌの１００マイクロリットルが上記実施例の方法を用いて、１００ｍｇのポリ(ＤＬ乳酸)粉末の８バッチ上に吸着され、凍結乾燥された。
【実施例５】
【０１０３】
生体物質の再分散-酵素  
実施例４の粉末は、高分子発泡複合材料を生成する実施例３の状態を用いて処理された。
【実施例６】
【０１０４】
活性の保有に関する証拠  
ＲＮＡ分解酵素は、生理的温度でトリスバッファ(ペーハー７.１３)において実施例５で得られた発泡体から放出された。'シチジン−２’：３’−モノリン酸（monophospate）といった特定のＲＮＡ分解酵素基質を用いて、活性の回復は紫外域分光光度計(表１)で検出することができる形式へと基質が変換することによりモニターされた。十分なタンパク質の生物学的活性が維持された。
【０１０５】
結果  
図４は超臨界流体処理における概略図を示す。 蛍光アビジンローダミン複合物の濃度のプロファイル(concentration profile)は凍結乾燥段階後と可塑化二酸化炭素再処理の後に現れる。はじめの凍結乾燥に続いて、蛍光は最高表面の足場（scaffold）の接触している表面、すなわち一番上の表面と孔壁に局在化される。二酸化炭素再処理の後、その複合体はサンプル中で分散され、結果として起こる蛍光は均質である。
【０１０６】
概略図は共焦点顕微鏡法からのデータによって支持される。 最初の凍結乾燥段階後、一番上の表面から７７．４μｍの深さまで１サンプルにおける孔の縁がわかる８つのイメージが左にある。そのイメージは、孔の縁で局在化された狭い領域を除き、一番上の表面からの距離が離れるに従って、蛍光の強度が減少していることを示す
右の一組（series）は可塑化した二酸化炭素で再処理されたサンプルについての描写である。 ここでまた、その一組（series）はその表面下８２．５μｍの深さまで、孔の縁がわかる。未処理の足場（scaffold）と対照的に、蛍光は嵩と孔の表面の両方に見られるかなりの強度の足場（scaffold）中で観察される。
【０１０７】
ＲＮＡ分解酵素活性はscＣＯ2で処理後、足場（scaffold）からトリス緩衝液に放出後に測定された(図５)。シチジン−２’やシチジン−３’に対する３’モノリン酸の転換反応速度は、２８４ｎｍでの吸収における変化によって測定された。黒色サークル(サンプル)は、その標準(オープンサークル)と比較した酵素の活性を表す。活性の中間的な回復は、酵素活性が処理中で維持されていることを示す１００．８％（±９．８％）であった。サンプルと標準活性の間の相関関係は高い(Ｒ2＝０．９９５９)。
【表２】
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【実施例７】
【０１０８】
制御放出に関する例証  
図６は時間の関数として実施例６からタンパク質放出特性(behaviour)を見せる。第二の可塑化二酸化炭素処理段階なしで高分子足場（scaffold）上に乾燥させられたタンパク質では、２日後には(黒三角)何も残っていなくらいに、タンパク質は非常にすばやく放出された。 ＳＣＦ再処理段階にさらされたサンプルでは、放出はさらに長引く。最初の「突発(burst)」状相(０−１日間)の後に、タンパク質が流出できる高分子マトリクスの分解前、放出速度はおよそ３週間安定している。 そして次に、そのプロフィールはおよそ８０日後にタンパク質を消耗するまで直線の関係に続く。
【実施例８】
【０１０９】
生体物質の添加-増殖因子  
足場（scaffold）発生とｒｈＢＭＰ−２封入化
実施例１のようにして得られた高分子を増殖因子組換え型の人間の骨形成タンパク質-２(ｒｈＢＭＰ−２)に添着（be loaded）させた。ポリ(ＤＬ乳酸)とｒｈＢＭＰ−２(１００ｎｇ／ｍｇＰＬＡ)は、多孔性(５０−２００μｍ)の足場（scaffold）を発生させるのに従来の溶液と超臨界の二酸化炭素処理の組み合わせを用いて一緒に混合された。組換え型ＢＭＰ−２は、１００ｎｇ／ｍｇの濃度の高分子において、ポリ(Ｄ，Ｌ-乳酸)粉末(アルカメス社（Alkermes Inc.）米国、低固有（inherent）粘性、Ｍｗ８４ｋＤａ、多分散度=１．４)へと吸着された。高分子: タンパク質混合物は、２０７バールまで加圧するために超臨界の二酸化炭素を用いて処理され、高圧容器内で２０分間３５℃まで加熱された。減圧では、タンパク質は、炭酸ガスの放出による高分子マトリクス中に形成された高分子と孔に封入される。機能的に活性組換え型ヒトＢＭＰ−２は、大きな均質の形状で９８％以上の純度でＥコリー（E-Coli）から抽出された。この手順において、環境温度付近でのscＣＯ2における液化した高分子の効率的な処理は高分子マトリクス中の生物活性要因の均一な分散という結果になった。これらの穏やかな処理状態のおかげで熱や溶媒に敏感である増殖因子は生物活性に対するさらなる分離や損傷が無くてすむ。
【実施例９】
【０１１０】
ＰＬＡの細胞の成長  
人骨骨髄細胞／ＰＬＡ構造物は、培養期間の最後の４８時間、５ｍＭの無機燐酸塩とフォンコッサ染色で検出された石灰化を含む骨形成触媒を補った１０％のＦＣＳαＭＥＭにて培養された。
【０１１１】
組織化学と免疫細胞化学  
組織化学的分析の前に、ＰＬＡ足場（scaffold）のサンプルは、染色プロトコルにより、４％のパラホルムか９５％のエタノールに固定され、適宜パラフィンワックスと用意された５μｍの切片で処理された。全ての調査においてネガティブコントロール（controls）が含まれていた。
【０１１２】
i) アルカリ性ホスファターゼ活動： メーカーの説明書に基づき、シグマアルカリ性ホスファターゼキット(ｎｏ．８５)を使用して培養物を染色した。 
ii) アルシアンブルー/シリウスレッド： サンプルは、ワイゲルトのヘマトキシリン、０．５％のアルシアンブルー(酢酸１％中)、およびシリウスレッド(飽和ピクリン酸中) を使用して染色した。 
iii)トルイジンブルーとフォンコッサ染色： 黒い沈殿物が目に見えるまで、サンプルを２０分間紫外域光の下の1％の硝酸銀（ＡｇＮＯ3）で染色し、風乾燥の後に、スライドをトルイジンブルーで対比染色した。
【０１１３】
Ｃ２Ｃ１２アルカリ・ホスファターゼ分析評価  
ＢＭＰ−２には、骨芽細胞系(33,34,35)へのＣ２Ｃ１２ プロミオブラスト（promyoblast）分化を引き起こす能力がある。ＰＬＡ足場（scaffold）内の０．０１％ (w/w)のｒｈＢＭＰ−２の封入後、高分子から放出されたｒｈＢＭＰ−２の生物活性はＣ２Ｃ１２細胞を用いて決定する。簡単に言えば、ヒト骨髄間質性細胞はＰＬＡ足場（scaffold）を封入したｒｈＢＭＰ−２が存在するか欠乏したなかで培養されるか、または３日間５％の二酸化炭素と３７℃で１０％のＦＣＳ  ＤＭＥＭ中にＰＬＡ足場（scaffold）を封入したｒｈＢＭＰ−２上もしくはＰＬＡ足場（scaffold）単体上を通過する。サンプルはエタノールで固定され、アルカリ性ホスファターゼで染色される。
【０１１４】
ＰＬＡ足場（scaffold）を封入したｒｈＢＭＰ−２の生物活性。 
ＰＬＡ足場（scaffold) (１００ｎｇ／ｍｇＰＬＡ内)のｒｈＢＭＰ−２の封入後に、ＰＬＡ足場（scaffold）から放出されたｒｈＢＭＰ−２の生物活性は、アルカリ性ホスファターゼ式（expression）で検出されるように骨形成系にＣ２Ｃ１２promyoblast細胞株の誘導を用いて決定された。アルカリ性ホスファターゼポジティブ細胞はＰＬＡ足場（scaffold）を封入したｒｈＢＭＰ−２上に、または、その中に存在して次のＣ２Ｃ１２細胞の培養で観察された(図１Ａ、Ｃ)。アルカリ性のホスファターゼポジティブ細胞の誘導はブランクの足場（scaffold）(図１Ｂ、Ｄ)を用いては全く観察されなかった。予想されるように、ＰＬＡに吸着されたｒｈＢＭＰ−２(５０ｎｇ／ｍｌ)はＳＥＭや共焦点顕微鏡法、およびタイプＩコラーゲン組織化学形式(データは例示せず)で観察されるようにＰＬＡの多孔性の足場（scaffold）で生体外にヒト骨髄間質性細胞癒着や、伝播、増殖、および分化を促進した。
【０１１５】
足場（scaffold）を封入したｒｈＢＭＰ−２における人間の骨芽前駆細胞の増殖  
次のｒｈＢＭＰ−２の封入したＰＬＡ足場（scaffold）を使用するとＣ２Ｃ１２promyoblastの分化が造骨細胞系に対して促進される可能性の論証に続いて、ｒｈＢＭＰ−２足場（scaffold）がヒト骨髄間質性細胞の分化と石灰化（mineralisation）を引き起こす可能性を生体外および生体内で調べた。
【０１１６】
i)ＣＡＭ培養  
ひよこの絨毛尿膜モデル上のＰＬＡ足場（scaffold）を封入したｒｈＢＭＰ−２における人間の骨芽前駆培養は、封入されたｒｈＢＭＰ−２がＰＬＡ足場（scaffold）でヒト骨髄間質性細胞の成長と分化を促進したことを示した（図２Ｂ−Ｄ）。新しい血管の成長によって証明(evidenced)される大規模な血管形成は、足場（scaffold）／細胞組成物の上にＣＡＭから移植された組成物まで７日間以上、観察された(図２Ａ)。新しい軟骨と骨は、アルシアンブルーとシリウスレッドの染色(図２Ｂ、Ｃ)で検出されたひよこの骨の欠如と新たに形成されたマトリクス(図２Ｄ)中にコラーゲン複屈折を示すことが偏光顕微鏡法を用いて観察された。
【０１１７】
皮下移植  
集密的な原始（primary）ヒト骨髄細胞は、１５時間ｒｈＢＭＰ−２またはＰＬＡ足場（scaffold）を封入したｒｈＢＭＰ−２を吸着したＰＬＡ足場（scaffold）上にトリプシン処理されて、散布された(２×１０6細胞／無血清αＭＥＭ細胞中)。 ブランク(ＰＬＡだけ)の足場（scaffold）は細胞を欠如して組成された。１５時間たった後、先に説明されているようにＭＦ１−ｎｕ／ｎｕマウス(mice)(２０−２４ｇ、生後４−５週間)への皮下移植に先立ち、組成物はさらに３日間骨形成媒体に配置された。４−６週間後、組織化学分析（histochemical analysis）のためマウスは殺され、試験片が集められ、９５％エタノールで固定された。
【０１１８】
ii) 皮下移植モデル  
原始（primary）ヒト骨髄細胞は、ｒｈＢＭＰ−２で封入されたＰＬＡ足場（scaffold）上に散布され、６週間ヌードマウスに皮下移植した(８サンプル) (ＰＬＡだけがネガティブコントロールとして機能した)。 細胞の成長が悪く、わずかな骨マトリクス合成物（synthesis）は線維組織と脂肪組織のみが観察されたヌードネズミに移植されたＰＬＡ足場（scaffold）上で単独(ｒｈＢＭＰ−２が欠如して)で観察された（図３Ｅ）。対照的に、足場（scaffold）を封入したｒｈＢＭＰ−２は、軟骨や骨のそれぞれに対してアルシアンブルー／シリウスレッドによる染色により検出されるような新しい骨マトリクス沈殿物の大きな証拠とともに、ヒト骨髄間質性細胞の癒着、増殖、分化を促進した(図３Ａ、３Ｂ)。その上、封入された組成物中の組織化された新しい線維性骨に関する証拠が、偏光顕微鏡(図３Ｂ)を用いたコラーゲンの複屈折によって確認された。骨形成を引き起こすｒｈＢＭＰ−２の効力は成長中のＨＢＭ細胞とアルシアンブルーおよびシリウスレッド染色(図３Ｃ)、および(図３Ｄ)タイプIコラーゲン染色により検出されたＰＬＡ足場（scaffold）を吸着したｒｈＢＭＰ−２によって確認された。 線維組織と脂肪組織だけがブランク(ＰＬＡだけ)の足場（scaffold）で観察された(図３Ｅ)。
【０１１９】
内部(intra)腹膜の移植  
拡散チャンバー(１３０μlの容量)モデルは、骨格の派生した細胞集団の骨形成容量を研究するためにホスト動物の中で囲まれた環境を提供し、それはホスト対ドナーの骨組織の発生の問題を解決する。 細胞はコラゲナーゼ(ヒストリチクム菌、タイプIV；２５Ｕ／ミリリットル)とトリプシン/ＥＤＴＡ消化により作られた(recover)。ヒト骨髄細胞がｒｈＢＭＰ−２の有無にかかわらず封入、または吸着されたＰＬＡの多孔性の足場（scaffold）と共にチャンバーで密封された、(２×１０6細胞／チャンバー)；チャンバーにはＭＦ１−ｎｕ／ｎｕマウスの内部腹膜が植えつけられ、１０週間後にマウスは殺されて、チャンバーは取り除かれ、４℃で９５％エタノールで固定される前にエックス線分析で調べられた。高分子のサンプルは、カルシウムを除かれた状態で（undercalcified）、５μｍで区分されて、フォンコッサによるトルイジンブルー、タイプＩコラーゲン、オステオカルシン、および石灰化（mineralisation）で染色され処理された。
【０１２０】
iii) 拡散チャンバーモデル 
人間の骨芽前駆細胞とともに散布され、ＰＬＡ足場（scaffold）を封入した組換え型の人間のＢＭＰ−２は拡散チャンバー内で移植後１０週間経過した後、アルシアンブルーとシリウスレッド染色(図３Ｇ、３Ｊ)とエックス線分析(図３Ｉ) で調べられるような新しい骨と軟骨マトリクス形成の形態学的な証拠を示した。異染色の染色にはトルイジンブルーを使用して観察され、そして、複屈折顕微鏡法(図３Ｈ)でコラーゲン沈殿物と新しいマトリクス合成が確認された。 足場（scaffold）構造物(図３Ｊ)を通して人間の骨芽前駆の浸透を確認しながら、ＰＬＡ足場（scaffold）を封入したｒｈＢＭＰ−２内で軟骨形成を観察することができた。 骨形成は細胞/ＰＬＡ足場（scaffold）構造物(図３ Ｆ単体)の上には全く観察されなかった。  
さらなる局面と発明の利点は上記から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】本発明で使われたＷＯ９８／５１３４７(ハウデル他)で開示されている方法で生成された複合材料のスキャン電子顕微鏡写真イメージを示す。
【図２】除圧状態を変えることによってＰＬＡ気孔構造のコントロールとともに本発明で使用されたＷＯ９８／５１３４７(ハウデル他)の方法で加工されたＰＬＡ合成物のためのスキャンした電子顕微鏡写真イメージと対応する水銀細孔解析法データを示す。
【図３】除圧状態を変えることによってＰＬＡ気孔構造のコントロールとともに本発明で使用されたＷＯ９８／５１３４７(ハウデル他)の方法で加工されたＰＬＡ合成物のためのスキャンした電子顕微鏡写真イメージと対応する水銀細孔解析法データを示す。
【図４】タンパク質が高分子の表面に閉じ込められ、バルク（bulk）を通過しない高分子表面に蛍光タンパク質溶液が吸収される本発明の方法の概要を示す
【図５】二酸化炭素における二重処理後のタンパク質活性の回復を示す。
【図６】図４の複合材料と本発明によらない比較複合材料の時間の経過によるタンパク質放出を示す。
【図１】
2005520025.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
2005520025.tif 000010
2005520025.tif 000011
2005520025.tif 000012
2005520025.tif 000013
2005520025.tif 000014