(57)【要約】本発明は、概して、新規の生物活性治療剤、栄養補助食品および化粧用剤を発見するためのＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭと呼ばれる技術基盤に関する。特に、本発明は、薬用植物の収集およびこれら植物に関する情報データベースの創設のための統合システムを含む。本発明はまた、改良された標準化された抽出および分画プロセスに関し、当該プロセスは、簡便さ、分離効率、ライブラリーの品質、プロセスの低コスト性、および、驚くべきスループットの面で、従来技術より顕著な利点を提供する。本発明は、ハイスループット生物学的試験データおよび国内の純粋な化合物ライブラリーと一緒にＨＰＬＣ／ＰＤＡ／ＭＳのような技術を利用することによって、構造デレプリケーションプロセスの詳細を提供する。本発明は、従来技術法に比べてかなり効率的かつ正確であることが証明された。最後に、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ基盤は、新規の栄養補助食品や化粧用製品としての天然のＣＯＸ−２およびチロシナーゼ阻害剤の発見および開発の全プロセスを決定することによる現実的かつ効率的なプロセスとして認証されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生物学的サンプルを同定し、収集する工程；
（ｂ）２種の溶媒系抽出法を用いてサンプルを抽出する工程；
（ｃ）２種の別々のハイスループット（ＨＴＰ）分画法を用いて抽出物を分離し、同時に、各ＨＴＰ分画の活性を決定する工程；
（ｄ）活性な分画をデレプリケーションし、化合物の存在を同定する工程；および、
（ｅ）工程（ｄ）で同定された各新規の化合物の指標、薬理学的および安全性プロフィールを得る工程、
を含む、新規の治療剤、栄養補助食品および化粧用剤を発見し開発する方法。
【請求項２】
生物学的サンプルが、植物、微生物、菌類、鉱物、海洋、動物またはヒト起源の材料からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルが植物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
収集されたサンプルの量が１ｇ〜１００００ｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、付記された薬用使用または作用機序に基づき選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
収集された各サンプルに関する収集フォームを作製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記収集フォームは、サンプルに関する特定の情報（ラテン名、分布、収集場所、治療に関する情報、従来の調合、植物の同定、および、公開された参考文献を含む）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記収集フォームに関する情報がデータベースに送られる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
データベースが、カスタマイズされたＡｃｃｅｓｓ、Ｏｒａｃｌｅ、Ｐｏｓｔｇｒｅｓｑｌ、Ｍｙｓｑｌ、および、Ｓｅｑｕｌで構成されるデータベースからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
データベース中の情報が、個々のフォームを用いて加入された個々の表に蓄積される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
データベースに保存された情報およびデータにアクセスするための特定のマクロおよび問い合わせを設計する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
収集された各サンプルに関して少なくとも２種の証拠標本を調製する工程をさらに含み、前記証拠標本は、自然に、および／または化学的に乾燥および／または保存された、十分な再生器官を含むサンプル全体を含み、同定目的のために分類学フォームが各証拠標本に添付された、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の溶媒抽出法が、
（ａ）適切な量のサンプルを摩砕する工程；
（ｂ）低極性溶媒と、高極性溶媒とからなる２種の有機溶媒の組み合わせを用いて摩砕したサンプルを抽出する工程；
（ｃ）有機抽出後にサンプルを乾燥させる工程；（ｄ）乾燥したサンプルを水性溶媒で抽出する工程；および、
（ｅ）両方の抽出液から溶媒を蒸発させ、抽出物を単離する工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルの量が、１ｇ〜１０００ｇから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記低極性が、６〜１０個の炭素を有するアルカン、１〜４個の炭素原子を有するハロゲン化アルカン（各炭素原子は、１〜４個のハロゲン原子を含む）、式Ｒ’ＣＯＯＲ”で示されるエステル（式中、Ｒ’は、１〜６個の炭素を有するアルキル基から選択され、Ｒ”は、１〜８個の炭素を有するアルキル基から選択される）、および、３〜１２個の炭素を有するケトンからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記低極性溶媒が、塩化メチレン、酢酸エチルおよびクロロホルムからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記高極性溶媒が、ＤＭＳＯ、ＴＨＦおよびアルコールからなる群より選択され、前記アルコールは１〜８個の炭素を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
両方の抽出における溶媒の量が、抽出されたサンプル重量の１〜１０倍の量である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
抽出が、振盪、音波破砕、還流、撹拌および加圧混合、ならびに、ろ過からなる群より選択された方法で行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）で得られた抽出物が、生物学的試験のために、以下の工程：
（ａ）有機抽出物の重量を測り、溶媒に溶解する工程；
（ｂ）水性抽出物の重量を測り、溶媒に溶解する工程；および、
（ｃ）各抽出溶液をサンプルマスタープレートの個々のセルに移す工程、
を含む方法により調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
有機抽出物を溶解させるための溶媒が、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、３〜１０個の炭素を有するケトン類、および、１〜５個の炭素を有するアルコール類からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
水性抽出物を溶解させるための溶媒が、水、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、３〜１０個の炭素を有するケトン類、および、１〜５個の炭素を有するアルコール類からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
各溶液における抽出物濃度が、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｍＬ溶媒の範囲である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
サンプルマスタープレートが、９６、１９２、３８４、５７６、７６８、９６０、１１５２、１３４４、および、１５３６ウェルプレートからなる群より選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
抽出物の分離が：
（ａ）パラレルクロマトグラフィーシステムまたはハイスループット精製（ＨＴＰ）システムを用いる工程；
（ｂ）有機抽出物を順相プレパックカラムで分離する工程；
（ｃ）水性抽出物を逆相プレパックカラムで分離する工程；
（ｄ）検出器で溶出液を検出する工程；
（ｅ）分画を収集する工程；および、
（ｆ）溶媒を蒸発させる工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
クロマトグラフィーシステムが、２〜４個の溶媒吐出ポンプ、溶媒ミキサー、および適切な自動ライン切り替え器を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
クロマトグラフィーが、周囲圧力、低圧、中間圧、または高圧の溶媒圧力で行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
クロマトグラフィーが、周囲温度、または２０〜８０℃の温度で行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
順相カラムが、シリカゲル、アルミナ、およびアミノプロピル、シアノプロピル、ジオールフロリジルまたはポリアミド、イオン交換樹脂からなる群より選択される樹脂で充填される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
逆相カラムが、Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１８、ＬＨ−２０、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６、およびポリスチレン−ジビニルベンゼンがベースの樹脂からなる群より選択された樹脂で充填される請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
クロマトグラフィーカラム中の樹脂の粒度が、１０〜２００μｍである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
クロマトグラフィーカラムが、１〜５００ｇの樹脂で充填される請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
順相クロマトグラフィーカラムが、６〜１０個の炭素を有するアルカン、式Ｒ１ＣＯＯＲ２を有する有機エステル（式中、Ｒ１は、１〜５個の炭素を有するアルキル基から選択され、Ｒ２は、１〜６個の炭素を有するアルキル基から選択される）、および式Ｒ３ＯＨで示されるアルコール（式中、Ｒ３は、１〜６個の炭素を有するアルキル基である）から選択された３種の有機溶媒の組み合わせで溶出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
逆相クロマトグラフィーカラムが、ＤＩ水と、１〜４個の炭素を有するアルコール、アセトニトリル、ＴＨＦ、または３〜１２個の炭素を有するケトンからなる群より選択された溶媒との２種の溶媒の組み合わせで溶出される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
検出器が、１００〜１０００ｎｍの範囲の単波長、連続波長または広帯域波長を用いたシングルまたはデュアルチャンネルを含む紫外線（ＵＶ）／可視光検出器である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
検出器が、エレクトロスプレーイオン化または数個のスプレーイオン化チャンバー；イオントラップ、または、ポジティブまたはネガティブモードを備えるシングルもしくはトリプル四重極質量検出を含むＭＳ検出器である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
検出器が、プロトンまたは炭素プローブを含む核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出器である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
検出器が、反射インデックス（ＲＩ）検出器である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
検出器が光散乱検出器（ＬＳＤ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｄ）の後に、生物学的試験のために抽出物分画を調製する工程をさらに含み、該調製する工程は、
（ａ）有機抽出物からの分画を溶媒に溶解させる工程；
（ｂ）水性抽出物からの分画を溶媒に溶解させる工程；および、
（ｃ）分画溶液をサンプルプレートに移す工程、
を含む方法が用いられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
有機抽出物および水性抽出物から得られた分画を溶解させるための溶媒が、それぞれ独立して、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、３〜１０個の炭素を含むケトン、１〜５個の炭素を含むアルコール、および、２〜３種の溶媒の組み合わせからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
溶液中の抽出物濃度が、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｍＬ溶媒である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
サンプルプレートが、９６、１９２、３８４、５７６、７６８、９６０、１１５２、１３４４、および、１５３６ウェルプレートからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
活性な分画のデレプリケーションが、
（ａ）サンプルの活性データを収集する工程；
（ｂ）サンプルの物理的特性、分光データおよび構造データを収集する工程；
（ｃ）収集されたデータを分析する工程；
（ｄ）サンプルの特性に関して商業的データベースを検索する工程；および、
（ｅ）活性な分画に関する結論を得る工程、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
測定された活性が、酵素阻害、受容体結合、遺伝子発現、細胞の機能調節、タンパク質生産、動物の機能調節、ならびに、動物生理学的、神経学的および挙動の機能調節、動物の病気モデルの操作、および、生物学的な機能のその他の測定からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
活性データが、抽出物、抽出物の分画、精製化合物、半合成および合成化合物から収集される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
デレプリケーションプロセスで収集された物理的特性データが、吸収に基づくクロマトグラムからの保持時間、または、ＵＶ／ＶＩＳ、屈折率、レーザー光散乱パターン、溶媒溶出量、質量；ｐＨ、溶解性、および、ｌｏｇＰの変化から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
収集された分光情報は、ＵＶ／ＶＩＳスペクトル、マススペクトル（分子イオンおよびフラグメンテーションイオンを含む）、ＮＭＲスペクトル、および、光散乱スペクトルから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
構造情報は、マスフラグメンテーションパターン、および、ドーター／グランドドーターイオンのマススペクトル；一次元および二次元核磁気共鳴分光データからの、プロトン、炭素、リンおよびその他の元素のケミカルシフト；赤外線スペクトル、および、ＵＶ吸収スペクトルから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
物理的特性、分光データおよび構造データが、溶出液の分画を１またはそれ以上の検出器に分割することにより抽出物を分離する際に収集される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
物理的特性、分光データおよび構造データが、個々の分画の分析からの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により収集される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
ＨＰＬＣが、２つの溶媒ポンプ、溶媒ミキサー、樹脂を含むステンレス鋼カラム、カラムオーブン、および、１またはそれ以上の検出器で構成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
カラムが、シリカゲル、アルミナ、ポリアミド、アミノプロピル、シアノプロピル、ジオールフロリジル、および、イオン交換樹脂からなる群より選択される順相樹脂で充填される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
カラムが、Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１８、ＬＨ−２０、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６、および、ポリスチレン−ジビニルベンゼンベースのポリマーからなる群より選択された逆相樹脂で充填される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
樹脂の粒度が、１〜１００μｍから選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
クロマトグラフィーカラムが、０．１〜５０ｇの樹脂を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
商業的データベースが、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ケミカルアブストラクトサービスのレジストレーションファイル、ＮＡＰＲＯＬＥＲＴ、ＭＥＤＬＩＮＥ、ＮＥＲＡＣ，ＤＥＲＥＰ、および、Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄａｔａｂａｓｅからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
新規の成分が、単離、精製および同定プロセスを対象とした生物学的試験により同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
薬理学プロフィールは、生物学的システムの活性および機能，生化学的材料、および遺伝子標的を調節する能力である、請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
活性および機能を調節する能力が、酵素阻害、受容体結合、遺伝子発現、細胞の機能調節、タンパク質生産、動物の機能調節、および、動物の病気モデルの操作からなる群より選択された生物学的な機能の測定により決定される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
遺伝子標的が、病気または代謝の発現、または、生理学に関連する遺伝子である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
遺伝子またはその部分がヒト起源である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
病気に関連する遺伝子が、心臓血管疾患、呼吸器疾患、腎臓疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、胃腸疾患、血液学的疾患、代謝病、神経疾患、老化、免疫疾患、生殖系疾患、感染症、および、骨疾患からなる群より選択された病気に関連する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
病気に関連する遺伝子が、炎症、免疫反応、エネルギー代謝、創傷治癒、アレルギー、閉経期、老化、酸化ストレス、および、ガンからなる群より選択された症状に関連する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
病気、代謝または生理学に関連する遺伝子の発現が、このような遺伝子のメッセンジャーＲＮＡのレベルにより測定される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
病気、代謝または生理学に関連する遺伝子の発現が、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション、および、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｇＰＣＲ）からなる群より選択された方法により測定される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
安全性プロフィールが、相当量の化合物を投与した際の、生物学的システム、生化学的材料、および分子生物学的な標的の正常な活性および機能を維持する能力の測定により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６９】
同定された新規の化合物を市販可能な製品に開発する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７０】
前記水性溶媒が、水、酸水溶液、塩基溶液、および、緩衝溶液からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項７１】
前記酸水溶液、塩基溶液、および、緩衝溶液が、ｐＨ範囲１〜１４の有機酸または無機酸、塩基、および塩から選択される、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、新規の生物活性を有する治療剤、栄養補助食品および化粧用剤の発見および開発に関する、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭと呼ばれる技術基盤に関する。本発明は、生物資源調査およびインフォマティックス、パラレルおよび予備精製技術，オンライン（ＨＴＰ／ＵＶ／ＭＳ）およびオフライン（ＨＰＬＣ／ＰＤＡ／ＭＳ）デレプリケーション、ハイスループット生物学的試験技術、コンピューター化データベース検索方法、ならびに、医薬、栄養補助食品および化粧分野における製品開発のための通常のアプローチに関する詳細を提供する。
【０００２】
発明の背景
天然産物は、薬用植物の従来の使用のための科学的基礎を形成してきただけでなく、現代医学においても重要な役割を果たしてきた。（Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１７：２１５−２３４）。１９８３〜１９９４年の間に承認された薬物の再調査によれば、天然由来の薬物は、承認された７８％の抗菌剤、７５％の血小板凝集阻害剤、６１％の抗ガン剤、４８％の抗低血圧剤、４７．６％の抗潰瘍剤、および３２．５％の抗炎症剤に寄与している。（Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６０：５２−６０）。しかしながら、鎮痛剤、抗うつ剤、抗ヒスタミン剤、抗不安剤、強心性剤、抗菌類剤、および、催眠剤が、主に合成由来のものである。
【０００３】
天然産物は、可能性のある薬物の手がかりを発見するための、高度に多様化した構造的資源であることが証明されている。１６９，０００種以上の既知の天然産物がある。（Ｔｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ／ＣＲＣ，ｖｅｒｓｉｏｎ  １０：２  Ｆｅｂ．２００２）。１０，４９５種の天然産物と、５７５７種のトレード薬物の分析に基づき、天然産物が１７４８種の異なる環系を有することがわかり、すなわちトレード薬物で発見された８０７種の異なる環系より２倍多様である。（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｎｅｉｄｅｒ（２００１）Ｊ．Ｃｏｍ．Ｃｈｅｍ３：２８４−２８９）。また、トレード薬物で発見された環系の約３５％は、天然産物でも発見されたが、トレード薬物において天然産物で発見された環系のわずか１７％しか同一の対応物質がない。天然産物は、構造的な手がかりとして機能的なだけでなく、トレード薬物と非常に類似した構造的および薬理作用団特性を有する（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｎｅｉｄｅｒ，（２００１）Ｊ．Ｃｏｍ．Ｃｈｅｍ３：２８４−２８９；Ｂｅｍｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｒｃｋｏ（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２８８７−２８９３）。１０，４９５種の天然産物と５７５７種のトレード薬物との比較において、天然産物の平均計算分子量がトレード薬物の平均計算分子量とほぼ同一であること（３５６と３６０）；および、平均ｌｏｇｐ値が天然産物（２．９）のほうがトレード薬物（２．５）の値よりわずかに高いことがわかった。天然産物において、１分子あたりの水素供与体はトレード薬物より少なく、１分子あたりの窒素もトレード薬物より少ない；トレード薬物や合成薬物よりかなり多数のブリッジヘッド原子を有する；および、１分子あたりのキラル中心がより多い（Ｈｅｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３８：６４３−６４７）；しかしながら、天然産物およびトレード薬物は両方とも、１分子あたりの酸素の平均数が類似しており、少なくとも２つの「ｒｕｌｅ−ｏｆ−５」に背く化合物を同じパーセンテージで有する。（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２３：３−２５）。
【０００４】
コンビナトリアル合成、コンピューターを利用したドラッグデザインおよび超ハイスループットスクリーニングのような新しい技術の進歩と共に、テンプレートとして天然産物を用いた低分子物質ライブラリーの設計における感心が増してきている。（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ３（２）：１２５−１５０；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｍｎａｒａｙａｎ（１９９９）Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１：５２４−５３３）。コンビナトリアルライブラリーは溶液中で作製することができるが、これまでに作製されたほとんどのライブラリーは、固相抽出などの固相合成技術に依存しており、主に目的とする合成化合物の精製に用いられている。（Ｄｅｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．Ｒｅｓ．３３：１７４−１８８）。遺憾ながら、複数の天然産物テンプレートから、特に複数の環および複数のキラル中心骨格を含む化合物を含むライブラリーを作製するための合成アプローチにおいて、重大な制限がある。半合成アプローチに関する明らかな制限は、特定の骨格の改変や決定的な官能基位置を、多様化することが出来ない点である。これまで、公開された全ての化合物ライブラリーは、出発原料の収集、ならびに、特定の条件下で最適化されなければならない特定の反応または反応の順序を用いて作製されてきた。（Ｗｅｂｅｒ（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．４：２９５−３０２）。加えて、既知のリード天然産物から合成ライブラリーを開発するためには、改変され得る天然産物テンプレートの可能性のある部位を定義するために構造と活性との関係に関する相当量の情報を必要とする。従って、コンビナトリアル合成化学に対する一般的なアプローチは、利用可能な薬理学的プロフィールに基づく特定のタイプの天然産物の同定、および、足場またはテンプレートへの構造の解体を含む。
【０００５】
注目された天然産物ライブラリーの設計は、コンビナトリアル合成および計算機化学にそのルーツがある。（Ｗｅｓｓｊｏｈａｎｎ（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．４：３０３−３０９；Ｋｏｌｂ（１９９８）Ｐｒｏｇ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．５１：１８５−２１７）。特定のタイプの化合物を標的とする特定のタイプのライブラリーを設計する試みがなされており（Ｓｔａｈｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｏｄｅｌ６：５５０−５６２）、この試みは、特定の治療標的に焦点を当てているか、または、基準として生物学的利用能を含む（Ｓｈｕ（１９９６）Ｊ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．６１：１０５３−１０７１）。多くの異なるタイプの天然産物テンプレートが開発されおり、うまく作製された天然産物ライブラリーとしては、以下のような化合物からのアルカロイド様ライブラリー：ベンジルアミン（Ｇｒｅｅｎ（１９９５），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：４２８７−４２９０）、キナゾリン（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｇａｎｅｓａｎ（２０００）Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２：１８６−１９４）、インドリ（ｉｎｄｏｌｙ）ジケトピペラジン（Ｌｏｅｖｅｚｉｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：４７３７−４７４０）、マピシン（ｍａｐｐｉｃｉｎｅ）類似体（Ｊｏｓｉｅｎ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒａｎ（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ５３：８８８１−８８８６）、ヨヒンビン類似体（Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ３９：１６０１，Ａｔｕｅｇｂｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）４：１０９７−１１０６）およびオリゴ複素環（Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６３８２−６３９４）；ならびに、以下のような化合物から作製されたフラボノイド様ライブラリー：フラボン類似体（Ｍａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ２４９：４８１−４８５）、およびベンゾピラン（Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：９９３９−９９７６，Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３２５１−３２６４）が挙げられる。
【０００６】
概して、合成ライブラリーは、ＨＰＬＣに基づき約７０〜８０％の純度を有する精製された単一の化合物を１〜２ｍｇの量で含む。合成プロセスで生じるその他の化学成分が共存するために、誤ったポジティブ、誤ったネガティブおよびその他の厄介な問題により生物学的なスクリーニング分析が顕著に影響を受ける可能性がある。コンビナトリアルライブラリーの設計において、低収率、精製の困難さ、および、キラル中心の損失を防ぐために、反応選択性および効率の慎重な最適化が要求される。天然産物の特定の望ましい生物学的特性が、簡単な官能基修飾を含むかなり小さいライブラリーでも改善され得ることが実証されている。（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ．３（２）：１２５−１５０）。これまで、農業や食品産業におけるコンビナトリアルライブラリーの使用はほとんど報告されていない（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｂｉｎｔｓｏｎ（１９９９）ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｖｉａ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｈａｈｉｄｉ  ｅｄ．，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．Ｐｐ９１−１０５）。加えて、栄養補助食品や化粧品産業におけるこのようなライブラリーの用途に関する報告もない。
【０００７】
Ｇｒａｂｌｅｙ等は、天然産物をベースとしたライブラリーからの薬物発見に関する詳しい総評を公開した。（Ｇｒａｂｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ３２：２１７−２５２）。一般的に、天然産物のスクリーニングは、粗抽出物から始める。特に、植物のバイオマスは、複数の溶媒で数回抽出物され、溶媒は一般的にそれらの極性に基づき選択される。遺憾ながら、このような粗抽出物は多数の化合物を含み、それらは低濃度で存在する。一般的に、これは、主成分から生じる生物活性のみが同定されるという結果になる。有効な活性を有するが検出できる限界の濃度未満で存在する化合物は、まったく失われてしまう可能性がある。加えて、これは、類似の弱い活性成分による相乗効果や共通成分による非特異的な干渉のために誤ったポジティブ結果に導かれる可能性がある。
【０００８】
これまで、ハイスループットスクリーニングや生成物発見に適した天然の源から直接的に天然産物ライブラリーを作製する方法はほとんど報告されていない。その方法の一例が近年Ｇａｒｙ等のＷＯ００１３３１９３（２０００）により報告された。Ｇａｒｙ等の方法は、（ａ）生物学的な源材料を、アルコール／水またはヘキサン、続いてアルコール／水で徹底的に抽出する工程；（ｂ）ポリアミドカラムで抽出物を溶出させることにより生物学的試験の干渉物を溶媒抽出物から除去する工程；（ｃ）ポリアミドカラムからの溶出液を段階的な勾配で固相抽出プロセスで処理し、特定の分画（一般的に４）を収集する工程；（ｄ）これら分画をそれぞれＨＰＬＣでさらに精製し、生物活性化合物の検出に基づく化合物ライブラリーを作製する工程；および（ｅ）自動化システムにより作製した標準濃度で精製化合物を収集する工程を含む。この方法論はいくつか欠点がある。第一に、抽出溶媒としてアルコール／水混合物を使用すると、バイオマスから全ての可能性のある生物学的に活性な成分を抽出できない可能性がある。良い例が多糖類であり、これは、アルコール／水に溶解しない場合があるため、植物バイオマスから抽出されない可能性がある。しかしながら、多糖類は、免疫調節および抗腫瘍効果があることがわかっており、医薬、栄養補助食品および化粧品産業において用いられてきた非常に重要な天然産物分類である。第二に、ポリフェノールやタンニンは、生物学的に活性な成分であり（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．６７：８２５−８３２；Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６４：１０１０−１０１４）、これらは、多くのポピュラーな薬用植物産物の効能、例えば緑茶からのＥＧＣＧおよびその他のカテキンおよびフェノール化合物（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６５：ＰＬ２４１−２４６）、ブドウの種およびブドウの皮（Ｃａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４９：５０５２−８）の効能に寄与する。Ｇａｒｙ等が説明する方法を用いてこれら成分を植物抽出物から除去することにより、病気の予防および治療において有効で価値があることが実証された生物活性成分が相当失われる結果に陥る可能性がある。第三に、Ｇａｒｙ等により開示されたプロセスは、時間がかかり高価なプロセスであり、最終的な化合物ライブラリーを得るために、複数の固相抽出およびカラムクロマトグラフィーの使用が必要である。最終的に、発明者等は、可能性のある生物学的なプロフィールまたは価値を理解する前に、各ウェルに関する既知の濃度および構造情報に力を入れている。このような試みもまた、解析、分類および貯蔵することに関して非常に高価であり、時間がかかる可能性がある。
【０００９】
５ｍｇ以上の量で純度８０％以上の６，７００種の化学物質が収集された過剰でない純粋な化合物のライブラリーを作製するために計画された共同プロジェクトが、Ｂｉｎｄｓｅｉｌ等により報告された（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ６：８４０−８４７（２００１））。バイオマテリアルは、６７９種の植物、２６６５種の細菌株および１４２５種の真菌類の株からなる。非遍在的な二次代謝に関して、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤ／ＤＡＤおよびＬＣ／ＭＳを用いて、抽出前にバイオマテリアルをプレスクリーニングした。次に、フラッシュカラムクロマトグラフィーで単離を行い、構造情報を収集し、４００種のランダムに選択された化合物の完全な構造を決定した。構造デレプリケーション法は、保持時間およびＬＣ／ＭＳデータに基づく分子量を参照した検索、ならびに、市販のデータベース（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）との比較を含む。基礎構造をさらに定義し、完全な構造の解明を提供するために、２Ｄ−ＮＭＲおよびその他の技術を利用した。上記方法で作製された純粋な化合物のライブラリーを９種の異なる標的に対してスクリーニングしたところ、反応率および確証率の面で合成ライブラリーよりも優れていることが示された。
【００１０】
Ｓｔｅｗａｒｔ等は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎａｔｕｒｅ社で純粋な天然産物ライブラリーを作製する試みについて報告している。（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓａｐｏｎｉｎｓ，ｉｎ  Ｆｏｏｄ，Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｏｌｅｓｚｅｋ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｔｏｎ（ｅｄｓ．）ｐｐ．７３−７７）。このライブラリーに関する化合物は、パラレル順相カラムクロマトグラフィー、続いて、Ｃ−１８および／またはイオン交換クロマトグラフィーを用いて単離された。化合物をライブラリーに受け入れさせるために、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＭＳおよびＧＣ／ＭＳの組み合わせによる構造的な照合により化合物を＞９０％純粋にしなければならない。微生物培養液から二次代謝産物ライブラリーを作製する方法がＳｃｈｍｉｄ等により報告された（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ４：１５−２５（１９９９））。該ライブラリーは新規の自動化プロセスを用いて作製され、該自動化プロセスは、アンバーライトＸＡＤ−１６カラム、続いてスチレン−ジビニルベンゼン樹脂を用いたクロマトグラフカラム分画化、逆相Ｃ−８およびＣ−１８ならびにその他のタイプの固相抽出（ＳＰＥ）により上清を培養液から多段階で分画化することに基づく。この試みにおいて、自動法（部分的に手動の介入がある）に基づく各分画において、より高い純度の化合物が得られた。しかしながら、この方法は、いくつかの制限がある。例えば、ＳＰＥは、制限された分画数が大容量で得られる段階的な勾配を用いており、９６ウェル様式で分画を集める適切な方法ではない。最後に、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ博士は、抗ガン薬発見のための天然コンビナトリアルライブラリーの作製を開示した。（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（２００１）Ａｂｓ．Ｐａｐｅｒｓ  Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２２１：ＯＲＧＮ  １９９；（１９９７）Ａｂｓ．Ｐａｐｅｒｓ  Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２１４：ＡＧＲＯ１２４）。
【００１１】
ゲノミクス、酵素学および生物工学における技術的開発により、コンビナトリアル生合成を利用した天然産物の生産のための方法がもたらされた。（Ｋｈｏｓｉａ（２０００）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ６５：８１２７−８１３３，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｉｃｏｒｂ．１：３１９−３２９）。例えば、エリスロマイシンポリケチドシンターゼの複数の遺伝的改変により、新規の人為的な天然産物ライブラリーが作製された。（ＭｃＤａｎｉｅｌ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１８４６−１８５１）。コンビナトリアル生合成ライブラリーが、土壌から単離された大きいＤＮＡ断片をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ宿主にクローニングし（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２：２４０１−２４０４）、グリコシルトランスフェラーゼが触媒した形質転換（Ｔｈｏｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｂｓｔ．Ｐａｐｅｒｓ  Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２２１：Ｃａｒｂ１９）により構築された。
【００１２】
オンライン構造デレプリケーションのためのハイスループット精製、ＬＣ／ＰＤＡ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよびＬＣ／ＮＭＲにおける近年の開発、ならびに、インフォマティックデータベースの創設は、生物活性を有する天然産物を研究する方法を根本的に変えた。デレプリケーションの最初の目的は、活性な抽出物または分画から既知化合物を同定し、これら既知化合物の不必要な単離を回避することである。収集された情報を評価するのに十分な構造データベースの選択は、デレプリケーションプロセスにとって重要である。（Ｃｏｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｄｕｒｌｅｙ（１９９４）Ｊ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．５７：１４８４−１４９０）。ケミカルアブストラクトサービスのレジストレーションファイル（ＣＡ、ＮＡＰＲＯＬＥＲＴ、ＲＥＧＩＳＴＲＹ、ＢＥＩＬＳＴＥＩＮ、ＭＥＤＬＩＮＥ等のサブデータベースを含む）、およびＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ＤａｔａｂａｓｅおよびＤＥＲＥＰデータベースを含む）が、最も包括的なデータベースのうちの２つである。
【００１３】
ＨＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳを用いた活性粗抽出物のデレプリケーションが、サブトラクションで得られた生物活性データに加えて、ＣｏｒｄｅｌｌおよびＳｈｉｎにより報告された（Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．７１：１０８９−１０９４（１９９９））。この研究において、活性植物抽出物の分析は、ＨＰＬＣ  Ｃ−１８カラムを用いて、アセトニトリル／水勾配で３０分間溶出させ、単波長ＵＶ検出およびＥＳＩ−ＭＳをポジティブおよびネガティブのデュアルモードで用いて行われた。抽出物のイオンクロマトグラム（ＥＬＣ）からのＵＶ吸収特性、分子量およびイオンフラグメンテーション情報を、ＮＡＰＲＡＬＥＲＴおよびＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓを用いて分析した。Ｊｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：３２４９−３２５４により説明されたように、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ技術もまた、粗天然抽出物を量的に区別するのに利用された。簡単に言えば、菌類培養物からのエタノール／水抽出物の分離は、Ｃ−１８カラムを用いたデュアル−カラムＨＰＬＣシステムで、２５分間、アセトニトリル／水／酢酸アンモニウム勾配を用いて行われた。類似性インデックスは、ＥＳＩ−ＭＳ器具の陽イオンモードからの電荷率に対するＨＰＬＣ保持時間と質量に基づいている。しかしながら、この方法論は、ポジティブモードにおいて適度な分子イオンピークを与える限られた構造情報と限られたタイプの化合物に関するに関する定性的結果に限定されていた。Ｗｏｌｆｅｎｄｅｒの報告で実証されたように（Ｗｏｌｆｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒ．Ｒｅｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒ．Ｓ３５−Ｓ４６）、一つの粗植物抽出物中での全ての二次代謝産物の最適なイオン化を可能にする単一のイオン化干渉がない。ＥＳ、ＡＰＣＩ、ＴＳＰまたはＣＦ−ＦＡＢのような様々なイオン化技術が、ＬＣ／ＤＡＤおよびＭＳ／ＭＳと共に必要である。信頼できる再現性を有するＭＳ／ＭＳフラグメンテーションスペクトルの検索可能なライブラリーを作製するために、マススペクトロメトリーから収集された構造情報を拡張することが非常に有用である。（Ｂａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍ．Ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒ．１４：３４９−３５６）。
【００１４】
Ｂｒａｄｓｈａｗ等は、精製された天然産物ライブラリーのデレプリケーションのための迅速かつ容易な方法を開示した。（Ｂｒａｄｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６４：１５４１−１５４４）。該方法は、ＬＣ／ＭＳからのその分子量を含む各構造、および、ＮＭＲデータから得られたメチル、メチレンおよびメタン基の数の正確な総数をリンクさせたテキストファイルを検索することを含む。検索は、特定のフォーマット−ＳＭＩＬＥＳ（商業的データベースから変換されたもの）における化学構造情報を含む、カスタマイズされたソフトウェアを用いる。
【００１５】
天然産物の化学構造は、限定された量の材料を用いて、クライオプローブを含むＮＭＲ器具を利用して迅速に同定することができる（Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．６３：１０４７−１０４９）。より予測可能なケミカルシフトが、適量の公開された国内のＮＭＲデータ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．４１：１４６３−１４６９）と共に、構造解明プロセスの時間と正確さを顕著に改善する（Ｐａｔｃｈｋｏｖｓｋｉｉ  ａｎｄ  Ｔｈｉｅｌ（１９９９）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２０：１２２０−１２４５；Ｇｒｚｏｎｋａ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ（１９９８）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．３８：１０９６−１１０１；Ｓｃｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｆｒｅｓｅｍｕｓ  Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３５９：３３−４１）。加えて、ＨＰＬＣを、ＮＭＲおよびマススペクトロメトリー（ＭＳ）と直接つなげることにより、さらにより多くの構造情報が得られ、デレプリケーションプロセスにおける結論の質を顕著に高める（Ｌｉｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ７４８：２３３−２５８）。
【００１６】
ハイスループットスクリーニング技術の開発は、１９８０年代の中ごろに始まった。実験情報管理システムと一体化されたロボット操作によれば、小型化されたシグナルリーディングシステムと組み合わせて、１年あたりの分析につき事実上数百万のサンプルのスループットスクリーニングが可能になる（Ｌｉｎ（１９９５）Ｊ．Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ  Ａｎａｌ．３：２３３−２４２）。天然産物ライブラリーのスクリーニングが、多様な生物学的標的に対して（Ｖｉｒａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７０：２０７−２１９）、生化学的標的に対して（Ｎｏｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６１：２−７）および、ゲノム標的に対して（Ｇｈａｉ（１９９９）米国特許第５，９５５，２６９号）なされた。ｃＤＮＡ−ファージディスプレイを用いて天然産物受容体を機能同定するために、ディスプレイクローニング技術が開発されている（Ｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．６：７０７−７１６）。
【００１７】
酵素シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の阻害は、ほとんどの非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）に帰属する作用機序である。２つの別個のアイソフォーム、ＣＯＸ酵素（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）があり、これらは、約６０％の配列相同性を有するが発現プロフィールおよび機能において異なる。ＣＯＸ−１は、酵素の構成的形態であり、これは、正常な生理学的機能、例えば血小板凝集、胃における細胞機能の保護、および正常な腎臓機能の維持の調節を助ける生理学的に重要なプロスタグランジンの生産に関連する。（Ｄａｎｎｈａｒｄｔ  ａｎｄ  Ｋｉｅｆｅｒ（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１０９−２６）。第二のアイソフォーム、ＣＯＸ−２は、炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）やその他の成長因子により誘導される酵素の形態である。（Ｈｅｒｓｃｈｍａｎｎ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１３４：２４１−５６；Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．２５：２４９−６５）。このアイソフォームは、アラキドン酸（ＡＡ）からのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）生成を触媒する。ＣＯＸ−２の阻害は、通常のＮＳＡＩＤＳの抗炎症性の活動を引き起こす。
【００１８】
リウマチ様関節炎は、主として自己免疫疾患であり、変形性関節症は、関節における軟骨の分解により発症するが、それぞれに関連する炎症を減少させることによってこのような病気に罹った人々の生活水準をかなり高められる。（Ｗｉｅｎｂｅｒｇ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２２：３１９−４１；Ｗｏｌｌｈｉｅｍ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍ．１３：１９３−２０１）。リウマチ様関節炎に加えて、炎症は、一般的に、リウマチ病の構成要素である。それゆえに、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような病気（Ｇｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘ．１２：４８８−５００；Ｐａｔｒｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：１０１１−１０１８）、同様に、強皮症のようなリウマチ性の皮膚状態に対するＣＯＸ阻害剤の使用が広がっている。ＣＯＸ阻害剤はまた、リウマチ由来ではない炎症性の皮膚状態（例えば乾癬）の軽減に用いられ、この場合、プロスタグランジンの過剰生産による炎症を軽減することにより直接的な利益が提供される。（Ｆｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｏｌｏｇｉｃａ７３：１９１−３）。簡単に言えば、ＣＯＸ阻害剤は、慢性炎症性疾患の症状、同様に、一過性の炎症による不定期の疼痛や痛みの治療に有用である。
【００１９】
発明の要約
本発明は、概して、新規の生物活性治療剤、栄養補助食品および化粧用剤の発見および開発のための、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭと呼ばれる技術基盤に関する。本発明は、生物資源調査およびインフォマティックス、パラレルおよび予備精製技術、オンライン（ＨＴＰ／ＵＶ／ＭＳ）およびオフライン（ＨＰＬＣ／ＰＤＡ／ＭＳ）デレプリケーション、ハイスループット生物学的試験技術、コンピューター化データベース検索方法、ならびに、医薬、栄養補助食品および化粧分野における製品開発に対する通常のアプローチにおいて詳細を提供する。新規の治療剤、栄養補助食品および化粧用剤を発見し開発する方法は：（ａ）生物学的サンプルを同定し、収集する工程；（ｂ）２種の溶媒系抽出法を用いてサンプルを抽出する工程；（ｃ）２種の別々のハイスループット（ＨＴＰ）分画法を用いて抽出物を分離し、同時に、各ＨＴＰ分画の活性を決定する工程；（ｄ）活性な分画をデレプリケーションし、化合物の存在を同定する工程；および（ｅ）工程（ｄ）からの各新規の化合物に関する指標、薬理学的および安全性プロフィールを得る工程、を含む。サンプルは、天然の源のいずれからも選択することができ、該天然の源としては、これらに限定されないが、植物、微生物、菌類、鉱物、海洋、動物およびヒト起源の材料が挙げられる。好ましい実施形態において、サンプルは植物である。加えて、好ましい実施形態において、サンプルは、付記された従来の使用または既知の薬用特性に基づき予め選択されている。
【００２０】
収集された各サンプルに関して収集フォームが作製される。収集フォームは、サンプルに関する特定の情報を含み、情報としては、これらに限定されないが、ラテン名、分布、収集場所、治療に関する情報、従来の調合、植物の同定、および、公開された参考文献が挙げられる。次に、この情報は、データベースに送られる。この情報および蓄積されたデータにアクセスするための特定のマクロおよび問い合わせが設計される。
【００２１】
サンプルが収集された後、少なくとも２種の証拠標本が各サンプルに関して調製され、ここで、前記証拠標本は、自然に、および／または化学的に乾燥および／または保存された、十分な再生器官を含むサンプル全体を含み、同定目的のために分類学フォームが各証拠標本に添付される。証拠標本は重要であり、プロセスのリサーチ段階におけるサンプルの完全性および確実性を保証し、プロセスの製造段階における再収集および製造がうまくいく可能性を確実にするために独特のものである。
【００２２】
ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスの第二および第三の工程は、ハイスループット法を用いた多様な粗抽出物および分画ライブラリーの作製を可能にする複数の標準化した抽出および分画化プロトコールを含む。工程（ｂ）の溶媒抽出法は：（ａ）適切な量のサンプルを摩砕する工程；（ｂ）２種の有機溶媒の組み合わせを用いて摩砕したサンプルを抽出する工程（前記組み合わせは、低極性溶媒と、高極性溶媒とからなる）；（ｃ）有機抽出後にサンプルを乾燥させる工程；（ｄ）乾燥したサンプルを水性溶媒で抽出する工程；および（ｅ）両方の抽出液から溶媒を蒸発させ、抽出物を単離する工程、を含む。抽出されたサンプルの量は、一般的に１ｇ〜１０００ｇである。
【００２３】
有機抽出工程で用いられる低極性は、６〜１０個の炭素を有するアルカン、１〜４個の炭素原子を有するハロゲン化アルカン（各炭素原子は、１〜４個のハロゲン原子を含む）、式Ｒ’ＣＯＯＲ”で示されるエステル（式中、Ｒ’は、１〜６個の炭素を有するアルキル基から選択され、Ｒ”は、１〜８個の炭素を有するアルキル基から選択される）、および、３〜１２個の炭素を有するケトンからなる群より選択される。低極性溶媒は、塩化メチレン、酢酸エチルおよびクロロホルムからなる群より選択される。高極性溶媒は、ＤＭＳＯ、ＴＨＦおよびアルコールからなる群より選択され、ここで、前記アルコールは１〜８個の炭素を有する。好ましい実施形態において、アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールからなる群より選択される。水性溶媒は、これらに限定されないが、水、酸水溶液、塩基水溶液、または、水性緩衝液からなる群より選択され、ｐＨは１〜１４に調節される。抽出は、当業界既知の抽出法のいずれを用いても行うことができ、例えば、これらに限定されないが、振盪、音波破砕、還流、撹拌および加圧混合、ならびに、ろ過が挙げられる。
【００２４】
抽出プロセスで得られた抽出物は、生物学的試験のために、（ａ）有機抽出物の重量を測り、溶媒に溶解すること；（ｂ）水性抽出物の重量を測り、溶媒に溶解すること；および（ｃ）各抽出溶液をサンプルマスタープレートの個々のセルに移すことにより調製される。有機および水性抽出物を溶解させるための溶媒は、独立して、これらに限定されないが、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、３〜１０個の炭素を有するケトン類、および、１〜５個の炭素を有するアルコール類などの溶媒からなる群より選択される。
【００２５】
次に、得られた抽出物は、パラレルクロマトグラフィーシステムまたはハイスループット精製（ＨＴＰ）システムを用いて別々に分画化され、該分画化は、（ａ）有機抽出物を順相プレパックカラムで分離する工程；（ｂ）水性抽出物を逆相プレパックカラムで分離する工程；（ｃ）検出器で溶出液を検出する工程；（ｄ）分画を収集する工程；および（ｅ）溶媒を蒸発させる工程を含む方法によりなされる。クロマトグラフィー／ＨＴＰは、周囲圧力、低圧、中間圧、または高圧の溶媒圧力で、周囲温度または２０〜８０℃の温度で行われる。順相カラムは、シリカゲル、アルミナ、およびアミノプロピル、シアノプロピル、ジオールフロリジルまたはポリアミド、イオン交換樹脂からなる群より選択された樹脂で充填される。逆相カラムは、Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１８、ＬＨ−２０、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６、およびポリスチレン−ジビニルベンゼンがベースの樹脂からなる群より選択される樹脂で充填される。各クロマトグラフィーカラムにおける樹脂の粒度は、１０〜２００μｍであり、クロマトグラフィーカラムは、サンプルの量および分離の困難さに応じて、１〜５００ｇの樹脂で充填される。
【００２６】
順相クロマトグラフィーカラムは、６〜１０個の炭素を有するアルカン、式Ｒ１ＣＯＯＲ２で示される有機エステル（式中、Ｒ１は、１〜５個の炭素を有するアルキル基から選択され、Ｒ２は、１〜６個の炭素を有するアルキル基から選択される）、および式Ｒ３ＯＨで示されるアルコール（式中、Ｒ３は、１〜６個の炭素を有するアルキル基である）から選択された３種の有機溶媒の組み合わせで溶出される。逆相クロマトグラフィーカラムは、２種の溶媒の組み合わせで溶出させ、該２種の溶媒の組み合わとしては、脱イオン（ＤＩ）水と、１〜４個の炭素を有するアルコール、アセトニトリル、ＴＨＦ、または３〜１２個の炭素を有するケトンからなる群より選択された溶媒との組み合わせが挙げられる。
【００２７】
検出器は、このような目的のために当業界で用いられるどのような検出器でもよく、検出器としては、これらに限定されないが、紫外線（ＵＶ）／可視光検出器、マススペクトロメーター（ＭＳ）検出器、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出器、反射インデックス（ＲＩ）検出器、または、光散乱検出器（ＬＳＤ）が挙げられる。紫外線（ＵＶ）／可視光検出器は、１００〜１０００ｎｍの単波長、連続波長または広帯域波長を用いたシングルまたはデュアルチャンネルを含み得る。ＭＳ検出器は、エレクトロスプレーイオン化またはソニックスプレーイオン化チャンバー；イオントラップ、または、ポジティブまたはネガティブモードを備えるシングルもしくはトリプル四重極質量検出で構成され得る。ＮＭＲ検出器は、プロトンまたは炭素プローブで構成され得る。
【００２８】
ＨＴＰ分画化の後、各分画を生物活性に関して試験する。好ましい実施形態において、生物学的試験は、ＨＴＰ分画化と同時に行われる。生物学的試験のための個々の分画を調製する方法は：（ａ）有機抽出物からの分画を溶媒に溶解させる工程；（ｂ）水性抽出物からの分画を溶媒に溶解させる工程；および（ｃ）分画溶液をサンプルプレートに移す工程、を含む。有機抽出物および水性抽出物から得られた分画を溶解させるための溶媒は、独立して、これらに限定されないが、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＰ、３〜１０個の炭素を含むケトン、１〜５個の炭素を含むアルコール、および、２〜３種の溶媒の組み合わせからなる群より選択される。次に、一次スクリーニング法として標準的な生化学的（酵素的）、機能的または生物学的なモデルを用いて、特定の活性を有する抽出物および化合物を同定するために、各分画を分析する。
【００２９】
活性な植物抽出物および／または分画、および／または化合物が、作用機序および／または特定の治療的価値を有するものとして同定されれば、化学組成物のプロファイリングおよび活性成分の標準化が行われる。従って、一度同定された活性な分画はデレプリケーションプロセスを受けるが、デレプリケーションプロセスは：（ａ）サンプルに関する活性データを収集する工程；（ｂ）サンプルに関する物理的特性、分光データおよび構造データを収集する工程；（ｃ）収集されたデータを分析する工程；（ｄ）サンプルの特性に関して商業的データベースを検索する工程；および（ｅ）活性な分画の組成に関して結論を得る工程、を含む。
【００３０】
サンプルの活性は、標準的な手段を用いて測定され、該手段としては、これらに限定されないが、酵素阻害、受容体結合、遺伝子発現、細胞の機能調節、タンパク質生産、動物の機能調節、および、動物の病気モデルの操作およびその他の生物学的な機能の測定が挙げられる。活性データは、抽出物、抽出物の分画、精製化合物、半合成および合成化合物から収集することができる。デレプリケーションプロセスで収集された物理的特性データとしては、ただしこれらに限定されないが、ＵＶ／ＶＩＳの吸収または変化に基づくクロマトグラムの保持時間、屈折率、レーザー光散乱パターン、溶媒溶出量、質量、ｐＨ、溶解性およびｌｏｇＰが挙げられる。
【００３１】
収集された分光情報としては、ただしこれらに限定されないが、ＵＶ／ＶＩＳスペクトル、マススペクトル（分子イオンおよびフラグメンテーションイオンを含む）、ＮＭＲスペクトルおよび光散乱スペクトルが挙げられる。構造情報は、ドーター／グランドドーターイオンのマスフラグメンテーションパターンおよびマススペクトル；一次元および二次元核磁気共鳴分光データからの、プロトン、炭素、リンおよびその他の元素のケミカルシフト；赤外線スペクトルおよびＵＶ吸収スペクトルなどのデータから得られる。データ収集プロセスは、オンライン法（溶出液の一部を指定された検出器に分配することによる）、および／または、オフライン法（ＨＴＰ分離から収集した後に個々のサンプルを分析することによる）が可能である。次に、収集されたデータを様々なデータベースを用いて分析する。使用可能な商業的データベースとしては、ただしこれらに限定されないが、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ケミカルアブストラクトサービスのレジストレーションファイル、ＮＡＰＲＯＬＥＲＴ、ＭＥＤＬＩＮＥ、ＮＥＲＡＣ，ＤＥＲＥＰ、および、Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄａｔａｂａｓｅが挙げられる。
【００３２】
このプロセスにより、各分画における組成物がデレプリケーションされる。組成物が新規であると決定された場合、各新規の天然産物に関する指標、薬理学的および安全性プロフィールを作製するためにさらなる研究が行われる。これらの結果がポジティブである場合、次に、その化合物は、市販可能な製品に開発される。
【００３３】
前述の一般的な説明と、それに続く詳細な説明とはいずれも、単に典型および説明であって、特許請求された本発明を制限するものではないことが理解される。
【００３４】
発明の詳細な説明
本明細書において、本発明の観点に言及するための様々な用語が用いられる。本発明の構成要素に関する記載の説明を補助するために、以下の定義が提供される。
【００３５】
本明細書で用いられる「サンプル」は、植物、微生物、菌類、鉱物、海洋、動物またはヒト起源の材料からなる群より選択された生物学的材料または天然材料を意味する。本発明の好ましい実施形態において、サンプルは薬用植物である。用語「標本」および「バイオマス」は、用語「サンプル」と交換可能に用いられる。好ましい実施形態において、サンプルは植物である。
【００３６】
本明細書で用いられる「栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）」は、「Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ａｃｔ  ｏｆ  １９９４（ＤＳＨＥＡ）」で定義されており、ヒト、同様にその他の動物を標的とした産業または市場を標的とした物質の組成物を意味する。
【００３７】
本明細書で用いられる「化粧用の（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）」は、ヒトおよびその他の動物の正常な機能や外観の予防、治療および維持、ならびに、皮膚、髪、形状、およびその他の物理的な外観の完全性を標的とした産業または市場に向けられた物質の組成物を意味する。
【００３８】
「天然産物」は、天然資源中に存在する元素、化合物、二次代謝産物または構造的成分を意味する。天然産物は、単一の化合物または複数の化合物の混合物であり得る。
「天然材料」は、天然資源から直接得られた原材料を意味する。植物全体または植物の部分、動物、海洋材料、微生物発酵バッチ、土壌サンプル、鉱物材料片などのいずれかが可能である。
【００３９】
「抽出」は、溶媒、超臨界流体を用いて、蒸溜、加圧、または昇華プロセスにより天然材料から天然産物を単離するのに用いられるプロセスを意味する。抽出プロセスの生産品は、「抽出物」と呼ばれる。既知の抽出法のいずれでも本発明の方法と共に用いることができる。
【００４０】
「分画化（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）」は、抽出物を、複数の部分に分けるプロセス、または、天然産物単独または天然産物の混合物を含む分画に分けるプロセスを意味する。
【００４１】
「デレプリケーション」は、国内および商業的データベースを用いて情報を比較するため；および、新規のおよび／または既知化合物の存在に関して結論を得るために、物理情報、分光情報および構造情報に関して、天然産物の単離を行わないで分画または抽出物を分析するプロセスを意味する。デレプリケーションは、さらなる調査をどのように方向付けるかを決定するのに用いられる。
【００４２】
「活性物質」および／または「生物学的に活性な物質」および／または「生理活性因子」は、天然産物の生物学的な機能を意味する。生物活性の例としては、ただしこれらに限定されないが、酵素阻害、受容体結合、遺伝子発現に対する影響、細胞の機能調節、タンパク質生産の変化、動物の機能調節、および、動物の病気モデルの操作、同様に、生物学的な生産品のその他の測定における効果が挙げられる。
【００４３】
「関係データベース」は、データを蓄積し検索する、情報を加工し提示する、および、繰り返しのタスクを自動化するコンピューター化データ管理システムを意味する。
「マクロ」は、コンピューターソフトウェアコードを意味し、例えば、データベースに特定のタスクまたは一連のタスクを自動化するために指定されたアクションを実行させることができる「Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ」または「ＶＢＡ  ｌａｎｇｕａｇｅ」がある。
【００４４】
「問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）」は、データベース中の表に蓄積された情報に関する関係データベースに送られた質問または問い合わせを意味する。特別に設計された問い合わせにより、特定の表からデータを選択し、データを分類しフィルターにかけ、計算を行い、表、フォーム、グラフおよびレポートを作製することが可能である。
【００４５】
「濃度」は、所定量の溶媒中の抽出物、分画または天然産物の量を意味する。抽出物プレートは抽出物と類似した濃度で調製され、分画プレートは、各セルで様々な濃度（その物理的特性およびカラムでの挙動に基づき天然産物の通常の分布を反映させる）で調製される。デレプリケーションプロセスで明らかになった生物学的なプロフィールと適合する濃度ピークは、生物活性成分を同定するための重要な情報である。天然産物の濃度は、生物学的試験またはスクリーニングモデルの感度および特性に基づき調節されなければならない。
【００４６】
「生物学的試験」または「生物学的なスクリーニング」は、インビトロおよび／またはインビボでの生物学的、生化学またはゲノムの機能モデル、および、天然産物の効果を測定する試験プロセスを意味する。
【００４７】
「ハイスループット精製」または「パラレルクロマトグラフィー」は、一式の複数のカラム分離を実行し、それと同時に他の一式のカラムを洗浄および平衡化するように設計された方法を意味する。このプロセスは、コンピューターソフトウェアで制御された器具で実行される。
【００４８】
「プレパックカラム」は、同じタイプ、量、樹脂の粒度を用いた標準化した充填プロトコールに基づき、同じサイズおよび直径のカラムに調製されたカラムを意味する。これは、国内で充填してもよいし、または、市販品を購入してもよい。
【００４９】
「クロマトグラム」は、溶出液を特定の検出器を通過させることにより検出され引き出された溶出液成分の、ＵＶ／ＶＩＳ吸収、イオン化強度、核磁気共鳴シグナル、光散乱能力、反射インデックスおよびその他の物理的特性に基づく、クロマトグラフ溶出液の図解を意味する。
【００５０】
「新規の化合物」は、未知の化学構造および組成物；および／または新規の生物活性／機能を有する既知の化学構造を有する天然産物を意味する。
「既知化合物」は、認識された生物活性／機能を有する公開された化学組成物／構造を有する天然産物を意味する。
【００５１】
「商業的データベース」は、予約金を支払いアクセスすることができるサービスおよび／または情報管理システムを意味する。このようなデータベースとしては、ただしこれらに限定されないが、ＮＥＲＡＣ、ＤＩＯＬＯＧ、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ケミカルアブストラクトサービスのレジストレーションファイル、ＮＡＰＲＯＬＥＲＴ、ＭＥＤＬＩＮＥ、ＤＥＲＥＰ、およびＢｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄａｔａｂａｓｅが挙げられる。
【００５２】
本明細書で用いられる「治療」は、治療および／または予防を含む。用いられる場合、治療は、ヒト、同様にその他の動物に言及する。
「医薬または治療プロフィール」は、有効量範囲内で顕著な毒性を示さない、生物学的システム、生化学的材料および遺伝子標的の活性および機能を調節するの能力を意味する。
【００５３】
「製薬上または治療上の有効量または量」は、望ましい生物学的な結果を誘導するのに十分な投与量レベルを意味する。その結果とは、薬剤の運搬、病気の兆候、症状もしくは原因の緩和、または、生物学的システムのその他のいかなる望ましい改変であり得る。
【００５４】
「宿主」は、本明細書で説明された組成物が投与される生きた検体、ヒトまたは動物である。
「安全性プロフィール」は、活性な栄養補助食品および／または化粧用剤が、相当量で投与された後、生物学的システム、生化学的材料、および分子生物学的な標的の正常な活性および機能を維持させるレベルを意味する。
【００５５】
「標準化した抽出物」は、定義された量の、個々のおよび／またはトータルの活性天然産物を有する特定の成分プロフィールまたはフィンガープリント化合物を含む、製造プロセスから得られた抽出物を意味する。
【００５６】
「候補産物」は、望ましい生物活性および安全性プロフィールを有し、栄養補助食品および／または化粧品産業における市販成分として適切な標準化した抽出物／分画／天然産物を意味する。
【００５７】
「プロトタイプ製品」は、化学プロフィールの明細および指定されたバイオマスからの活性物質濃度に基づき、製造規模で作製された試験産物を意味する。
「臨床評価」は、特別に設計された、かつ予め承認された臨床試験プロトコールに基づく、天然産物のヒトにおける有効性、安全性、副作用、および禁忌の研究を意味する。
【００５８】
本願を通して様々な引用がなされていることを特筆する。各引用は、その全体を参照により本願に加入させる。
ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ発見プロセスは、最も一般的には、新規の治療剤、栄養補助食品および化粧用剤を発見し開発するための包括的な方法と説明することができ、該方法は：（ａ）予め定義された生物学的サンプル同定し、収集する工程；（ｂ）２種の溶媒系抽出法を用いて生物学的サンプルを抽出する工程；（ｃ）２種の別々のハイスループット（ＨＴＰ）分画法を用いて抽出物を分離し、同時に、各ＨＴＰ分画の活性を決定する工程；（ｄ）活性な分画をデレプリケーションし、化合物の存在を同定する工程；および（ｅ）工程（ｄ）からの各新規の化合物に関する指標、薬理学的および安全性プロフィールを得る工程、を含む。収集しようとするサンプルの予備選択は、従来の使用に基づく。
【００５９】
ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ発見プログラムが成功したことを確かめるために、全世界から薬用植物およびその他の生物サンプルを収集することが必須であった。それゆえに、生物学的多様性に関する協定の国連条約に従って、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプログラムは、アジア、南アメリカ、北アメリカ、アフリカおよびその他の地質学的領域の国々を含む８の国際的な民族学的植物の収集の同意を打ち立てた。ランダム化した植物収集プログラムと対照的に、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭは、付記された薬用植物およびその他の付記されたバイオマテリアルに焦点を当てる。数千年の歴史的な使用により、これら薬用植物およびその他のバイオマテリアルは、すでに予備選択されており、ヒトの摂取に関して臨床的に試験されている。従って、ランダム化したバイオマテリアル収集と対照的に、これらにより、安全で有効な医薬、栄養補助食品および化粧用製品を得る可能性が最も高い。歴史的な使用に関して利用可能な情報により、薬用植物およびその他のバイオマテリアルに関する現代的なリサーチで提供される利用可能な情報と組み合わせて、可能性のある臨床的な指標、同様に予想される作用機序に関して相当量の証拠が提供される。この情報はまた、利用可能な民族学的薬用情報に基づくスクリーニングモデルを確立することにおいても役立つ。ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ発見のための、植物およびその他の天然のバイオマテリアルの従来の使用に基づく予備選択は、本発明に特徴的であり、高いポジティブヒット率、安全な産物および短い発見サイクルを確実にするのに重要である。好ましい実施形態において、サンプルは薬用植物である。
【００６０】
全てのサンプル収集は、実施例１で説明したような標準化した収集および証拠標本調製方法を用いて行われた。好ましい実施形態において、１ｇ〜１０，０００ｇのサンプルが収集される。収集された各サンプルに関して標準化した植物／サンプル収集フォームに記入し、実施例２および図２で説明したような検索可能なインフォマティックスデータベース情報を送った。一実施形態において、本発明は、特徴的なバイオマス登録システムを開示し、該システムは、独占的なコードを収集された各サンプルに対して与えることを伴う。指定されたコードは、実施例１で説明したようなバイオマスの天然の起源に直接的に関係し、インフォマティックデータベース中の全ての情報に一緒にリンクするための一次的なキーとして用いることができる。
【００６１】
本発明の他の実施形態は、収集された各サンプルに関して２種の証拠標本を作製することを含む。分類学フォームが同定目的のために各証拠標本に添付される。分類学フォームは、サンプル同定、サンプル収集、および、コレクター名などに関する情報を含む。このような試みは、プロセスのリサーチ段階の際のバイオマスの完全性および確実性を保証するために、および、本発明の製造段階の際に再収集および製造がうまくいく可能性を確実にするために、重要かつ特徴的である。実施例１で示すように、これまで、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ収集プロセスにより、１，１７０種の薬用植物およびその他の天然材料が入手された。実施例１で説明したように得られた２セットの証拠標本が各サンプルで作製された。加えて、バイオマスあたり５００〜２，０００ｇの乾燥材料が貯蔵された。この標本の収集は、全世界から収集された２６６種のファミリー、８０５種の属、および、９３２種の異なる種を含む。
【００６２】
本発明は、新規の薬用植物ライブラリーのバイオインフォマティックスが推進する評価を含む。現在の千種を超える収集、ならびに、１０，０００種を超える薬用植物およびその他の世界中からの生物学的な標本に対する可能性のあるアクセスと共に、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ発見プログラムは、民族学的指標および植物化学（これらに限定されないが）などの情報からなる関係データベースを含む。このデータベースにより、従来の使用に基づき最も可能性を有する薬用植物のスクリーニングを優先的に行うことを可能にする。この例は、表１で示され、関節炎痛のための新規の栄養補助食品製品の発見および開発の目標を説明する目的で用いられている。これを行うために、キーワードとして「関節炎」を用いてインフォマティックデータベースの検索を行う。検索結果により、関節炎痛の治療に伝統的に用いられてきた１８種の植物の列挙された（表１）。それゆえに、全ての植物のランダム化したスクリーニングとは対照的に、該発見プロセスは、これら１８種の植物の評価に焦点を当てることができる。この方法は、ランダム化したスクリーニング（スクリーニング法は伝統的に動物モデルを用いため、限られた数のサンプルしかスクリーニングすることができない）に比べて、顕著な利点を提供する。しかしながら、ランダム化したスクリーニングは、本発明の方法に従って排除されない。本発明の方法はまた、作用機序、同様に従来の使用に基づくハイスループットスクリーニング方法論にも及ぶ。本発明はまた、標準化した抽出物および９６ディープ−ウェルプレートでのＨＴＰ分画を提供することにより、ランダムスクリーニングを選択することもできる。
【００６３】
ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ発見プロセスは、複数の標準化した抽出および分画化プロトコールに依存し、限られたコストでハイスループットフォーマットにおける多様な抽出物および分画化ライブラリーを作製することができる。ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプログラムにおいて収集された全てのバイオマスは、実施例３で説明されるような標準化した抽出プロトコールに従って加工された。この抽出法は、これまで説明されていた抽出法論に比べた場合にいくつかの利点を提供する。まず第一に、本明細書で説明されるデュアル抽出法により、各バイオマスからさらにより完全で広範な天然産物プロフィールが得られる。このプロセスを用いれば、重要なタイプの天然産物の漏れは全くおこらない。
【００６４】
実施例３で説明したように、サンプル（好ましくは１ｇ〜１０００ｇ）が、中極性溶媒の組み合わせ（例えば１：１の割合の塩化メチレン：メタノール）で初めに抽出される。低極性溶媒の組み合わせ、例えば塩化メチレンと高極性溶媒（例えばメタノール）とを組み合わせることにより、低極性から中極性化合物、例えばテルペノイド、アルカロイド、脂肪酸、フラボノイド、ステロイド、リグナン、ベンゾフェノン、クロモン、およびアントラキノンを溶解させるだけでなく、高極性化合物、例えばテルペノイド、アルカロイド、脂肪酸、フラボノイド、ステロイド、リグナン、ベンゾフェノン、クロモン、およびアントラキノン等（複数の極性官能基および／またはモノ、ジおよびトリグリコシドを含む）を溶解させる溶媒系が得られる。低極性溶媒は、抽出を行うために当業界で用いられる全ての既知の低極性溶媒から選択することができる。好ましい実施形態において、低極性溶媒は、６〜１０個の炭素を有するアルカン、１〜４個の炭素原子を有するハロゲン化アルカン（各炭素原子は、１〜４個のハロゲン原子を含む）、式Ｒ’ＣＯＯＲ”で示されるエステル（式中、Ｒ’は、１〜６個の炭素を有するアルキル基から選択され、Ｒ”は、１〜８個の炭素を有するアルキル基から選択される）、および、３〜１２個の炭素を有するケトンからなる群より選択される。低極性溶媒の例としては、ただしこれらに限定されないが、塩化メチレン、酢酸エチルおよびクロロホルムが挙げられる。極性溶媒はまた、抽出を行うために当業界で用いられる全ての既知の極性溶媒から選択することができる。好ましい実施形態において、極性溶媒は、これらに限定されないが、ＤＭＳＯ、ＴＨＦおよび１〜８個の炭素を有するアルコールからなる群より選択される。アルコールの例としては、ただしこれらに限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、および、ブタノールが挙げられる。水溶性のより高い極性の成分、例えば第四イオン化アルカロイド、オリゴ糖、多糖類、有機酸塩、フェノール性塩、アントロシアニジン（ａｎｔｈｒｏｃｙａｎｉｄｎｓ）、アミノ酸、ペプチド、タンニン、鉱物およびその他の無機化合物は、水、酸水溶液、塩基水溶液、または水性緩衝液でのみ抽出される。それゆえに、デュアル有機溶媒系を用いた抽出に続いて、バイオマスは、バイオマスに含まれる水溶性成分を溶解させるために、水、酸水溶液、塩基水溶液、または水性緩衝液で抽出される。好ましい実施形態において、両方の抽出で用いられる溶媒の量は、抽出されたサンプルの重量の１〜１０倍の割合である。抽出は、既知の抽出方法のいずれかを用いて行うことが可能であり、該方法としては、これらに限定されないが、振盪、音波破砕、還流、撹拌および加圧混合、ならびに、ろ過が挙げられる。様々な植物種で行われた代表的な有機および水性抽出物を表２に示す。
【００６５】
本明細書で説明された抽出法論の効率は、実施例４で説明される。実施例３で説明された有機および水性抽出の後、メタノールでさらにバイオマスを抽出することにより、ほんの少量の抽出可能な材料が得られ（表３）、これはまったく同じＨＰＬＣクロマトグラムを示す（図５および６）。図５および６で示されたＨＰＬＣクロマトグラムは、２種の異なる検出法−フォトダイオードアレイ（図５）およびイオントラップマススペクトロメーター（図６）を用いて作製された。図５および６でみられるように、いずれの検出方法を用いても、メタノール抽出物中に特定のピークは存在せず、有機抽出物または水性抽出物のいずれにおいても存在しなかった。
【００６６】
本明細書で説明された抽出法論の他の利点は、抽出プロセスにより、さらなる分画化および生物学的試験には十分な材料が得られることである。例えば、６０ｇのバイオマスの抽出から、約１〜８ｇの有機抽出物、および、１〜６ｇの水性抽出物が得られる。これらの量は、多数のスクリーニングおよびＨＴＰ分画化に十分な材料が提供する。
【００６７】
本発明の一実施形態において、ハイスループット分析のための抽出物ライブラリーを調製する新規の方法が説明される。この方法は、有機および水性抽出物をＤＭＳＯおよび脱イオン（ＤＩ）水に、それぞれ濃度０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｍＬ溶媒で溶解させることにより、一連の抽出物マスタープレートを調製することを含む。好ましい実施形態において、抽出物濃度は、５０ｍｇ／ｍＬ溶媒である。サンプルマスタープレートは、これらに限定されないが、９６、１９２、３８４、５７６、７６８、９６０、１１５２、１３４４または１５３６ウェルプレートからなる群より選択される。好ましい実施形態において、９６ディープ−ウェルプレート（プレートあたり８８個のサンプルを含む）に溶液を保存した。次に、抽出物を定量で分配し、ハイスループットモデルでスクリーニングすることができる。５０〜１００の典型的なハイスループットスクリーニングを完了するのに十分な材料が各セルに存在する。有機および水性抽出物を溶解させるのに用いることができるその他の溶媒としては、ただしこれらに限定されないが、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、３〜１０個の炭素を有するケトン類、および、１〜５個の炭素を有するアルコール類が挙げられる。
【００６８】
本明細書で開示された重要な発見は、抽出物のクロマトグラフィーまたはハイスループット分画化（これらはいずれも効率的かつ経済的に健全である）のための新規の方法である。この方法は、実施例５および６で説明される。抽出物のハイスループット分画方法は：（ａ）パラレルクロマトグラフィーシステムまたはハイスループット精製（ＨＴＰ）システムを用いる工程；（ｂ）有機抽出物を順相プレパックカラムで分離する工程；（ｃ）水性抽出物を逆相プレパックカラムで分離する工程；（ｄ）溶出液を検出器で検出する工程；（ｅ）分画を収集する工程；および（ｆ）溶媒を蒸発させる工程、を含む。好ましい実施形態において、クロマトグラフィーシステムは、２〜４個の溶媒吐出ポンプ、溶媒ミキサー、および適切な自動ライン切り替え器を含む。クロマトグラフィーは、周囲圧力、低圧、中間圧、または高圧の溶媒圧力で、周囲温度または２０〜８０℃の温度で行われる。順相カラムは、これらに限定されないが、シリカゲル、アルミナ、およびアミノプロピル、シアノプロピル、ジオールフロリジルまたはポリアミド、イオン交換基結合樹脂からなる群より選択される樹脂で充填される。逆相カラムは、これらに限定されないが、Ｃ−２、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１８、ＬＨ−２０、ＸＡＤ−４、ＸＡＤ−１６またはポリスチレン−ジビニルベンゼンをベースとした樹脂からなる群より選択される樹脂で充填される。樹脂の粒度は、１０〜２００μｍである。クロマトグラフィーカラムは、１〜５００ｇの樹脂で充填される。
【００６９】
植物抽出物の分画化のための多くの様々な方法が報告されている。このような方法のいくつかはなお、シリカゲルおよび逆相Ｃ−１８カラムのような本明細書で説明されたのと類似の固相を利用する。しかしながら、発明の背景で前述したように、ほとんどの従来技術法は、段階的勾配を用いるために限られた数の分画（通常、２０分画未満）および不完全な分離しか得られず、さらなるクロマトグラフ精製が必要となる。本発明は、３種の有機溶媒の特徴的な組み合わせの勾配を用いて順相カラムでの分離を行う点で従来技術法より優れており、該有機溶媒としては、６〜１０個の炭素を有するアルカン、Ｒ１ＣＯＯＲ２で示されるエステル（Ｒ１は、１〜５個の炭素を有するアルキル基から選択され、Ｒ２は、１〜６個の炭素を有するアルキル基から選択される）、およびＲ３ＯＨで示されるアルコール（式中、Ｒ３は１〜６個の炭素を有するアルキル基である）。図７および８で説明するように、この３種の溶媒系の組み合わせは、分離および各ウェルにおける分画の質を顕著に改善する。本発明で実証したように、有機（実施例５）および／または水性抽出物（実施例６）から、シングルカラムを用いて天然産物を精製することができる。その上、産物は、限られた数のセル／分画（通常は２〜８個のセルに）に分配される。逆相カラムでの分離は、２種の溶媒の組み合わせで行われ、例えば、ＤＩ水と、１〜４個の炭素を有するアルコール、アセトニトリル、ＴＨＦ、または３〜１２個の炭素を有するケトンからなる群より選択された溶媒との組み合わせである。
【００７０】
しかしながら、いくつかの既知の方法が、勾配能およびより優れた分離能力を有するＨＰＬＣシステムを用いており、カラムにローディングできる量の材料および分画化のスループットは、本発明とは比較にならない。実施例５および６で説明されたように、有機および水性抽出物は、市販のプレパックカラムにローディングすることができ、一般的に、有機抽出にはシリカゲルカラム、および、水性抽出にはＣ−１８カラムを１００ｍｇ〜２０００ｍｇの量で用いられる。このような量でのハイスループット精製で得られた各分画は、濃度１〜１０ｍｇ／ｍＬで溶液に溶解させることができる材料を数ミリグラム含み得る。従って、本発明は、天然産物リサーチにおける２つの主要な問題を解決するが、その一つは、活性はわずかだが新規の化合物が生物学的試験の検出限界またはポジティブの閾値を下回ってしまう誤ったネガティブ結果をどのように防ぐか、という問題である。もう一方の解決された問題は、望ましい生物学的な効力より低い効力を有する複数の化合物の混合物からの相乗効果に起因する誤ったポジティブをどのように除去するか、である。本明細書で開示された方法は、粗抽出物中に存在する個々の成分を分離するだけでなく、植物抽出物中の低活性の成分を顕著に高め、それにより、これら少ない成分がスクリーニングプロセスで検出される機会をより大きくする。
【００７１】
検出器は、このような目的のために当業界で用いられるいずれの検出器でもよく、これらに限定されないが、紫外線（ＵＶ）／可視光検出器、マススペクトロメーター（ＭＳ）検出器、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出器、反射インデックス（ＲＩ）検出器、または、光散乱検出器（ＬＳＤ）が挙げられる。紫外線（ＵＶ）／可視光検出器は、１００〜１０００ｎｍの単波長、連続波長または広帯域波長を用いたシングルまたはデュアルチャンネルを含み得る。ＭＳ検出器は、エレクトロスプレーイオン化、ソニックスプレーイオン化、または、化学イオン化チャンバー；イオントラップ、または、ポジティブまたはネガティブモードを備えるシングルまたはトリプル四重極質量検出で構成されてもよい。ＮＭＲ検出器は、プロトンまたは炭素プローブで構成されてもよい。
【００７２】
本発明のその他の特徴は、オンライン構造情報収集である。本発明は、パラレルプロセシングモードにおける高圧クロマトグラフィーシステム、すなわちロボット制御の液体操作システムに組み込まれた複数の同時のカラム稼働を利用し、これを作動させて、クロマトグラフ溶出液（個々の化合物を含む）を、予めプログラムされた時間または容量、または、化学反応パターン、好ましくは紫外光吸収スペクトルもしくはイオン化パターンに基づき遂行する。このパターンは、コンピューター分析によりパターンのライブラリーと比較した場合、その化合物が既知または未知の化学物質のいずれであるかを決定することができる。図１４〜１６は、１つのＨＴＰ分画のオンラインマス分光データ、および、同分画のオフライン分析を示す。この方法において、分光データが分離の時に収集されるため、収集された分画を別々のプロセスで分析するよりもずっと効率的である。加えて、該方法は、まさに正確であることが示された。図１４〜１６で説明された例において、ＨＴＰシステムにより、サンプルは、液体操作システム（溶出液のアリコートがマイクロタイタープレートに分配された場合）、および、超音波イオン化チャンバーを備えるイオントラップマススペクトロメーター（化合物の分子イオンおよびフラグメンテーションパターンが決定された場合）の両方へ同時に導かれた。マススペクトルから、分画の成分に関する分子量および一般構造情報を得ることが可能である。この情報は、純度と仮の同定を確かめるために、コンピューター分析により化学ライブラリーと比較される。
【００７３】
実施例５および６で示したように、本明細書で開示された方法は、高効率であることが証明される。分画化プロセスのスループットは、１日で、１４種の有機抽出物から１２３２個の分画を、または、３２種の水性抽出物からの２６１８個の分画を得ることができる。このスループットは、発明の背景で述べたいずれの既知の方法よりも１０倍高い。
【００７４】
最後に、本明細書で開示された方法論の重要な利点は、操作のコストが低いことである。消耗品のコストの詳細な分析は、表４および５に示される。有機または水性抽出物から、サンプルの１つの分画を作製するための材料コストは、それぞれたったの１６セントおよび３２セントである。順相カラムは、１回しか使用できないが、逆相カラムは、各稼働の間に適切な洗浄を行い６０回まで再使用することができる。Ｃ−１８カラムの実行を、アロエクロモンの既知化合物混合物を用いて厳密にモニターした（データは示さず）。図９で示すように、同じ水性抽出物での１２のＣ−１８カラム分画化を行うことによって、分離が高度に再現可能であることが示された。従来技術では、このように低コスト性かつハイスループットで、このような高品質の天然産物分画ライブラリーが得られる匹敵する方法はない。
【００７５】
一旦生物学的なおよび／または指標標的が定義されれば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実行するためのＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭアプローチは、抽出物をスクリーニングする一次的な手段として、生化学（酵素的な受容体結合分析）、遺伝子発現、機能的または生物学的なモデルを適用することにより達成され、特定の活性を有する抽出物中の化合物を同定することができる。好ましい実施形態において、用いられるモデルとしては、ただしこれらに限定されないが、酵素阻害、受容体結合、遺伝子発現、細胞の機能調節、タンパク質生産、動物生理学的、神経学的および挙動の機能調節、ならびに、動物の病気モデルの操作、ならびに、その他の当業界で既知の生物学的な機能測定が挙げられる。分画の活性に関するデータは、抽出物、抽出物の分画、精製化合物、半合成および合成化合物から収集することができる。
【００７６】
本発明の方法を用いて作製された抽出物ライブラリーの価値を実証するために、実施例７で、酵素的スクリーニング、および、得られた結果を説明する。作用機序がシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素の阻害である抗炎症性化合物を同定するために、ＣＯＸ酵素阻害分析を行い、中国、インド、およびその他の国々から収集された６１５種の薬用植物からの１２３０種の抽出物を含む抽出物ライブラリーを評価した。これら抽出物を調製するのに用いられる一般的な方法は、実施例３で説明される。抽出プロセスにより、試験された各種に関する有機および水性抽出物が得られた。これら一次抽出物は、酵素のペルオキシダーゼ活性（シクロオキシゲナーゼの主要な機能的活性の一つでありＰＧＧ２をＰＧＨ２に変換し最終的にはＰＧＥ２にすることにより炎症を引き起こす）の阻害剤を同定するための予備分析において用いられる原材料である。この分析は実施例７で説明されており、結果は図１０に要約される。図１０を参照すると、１２３０種の植物抽出物をスクリーニングした後、トータルで１５種の有機抽出物（１．２％）、および、７種の水性抽出物（０．６％）が、６０％を超過する阻害を有し、以下で説明するような別の実験で確認された用量反応を有することを確認した。個々の植物抽出物における代表的な活性測定は、表６に示される。表６を参照すると、２種のＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａ、および、３種のその他の植物種（これら全て、共通成分として遊離Ｂ環フラボノイドを含む）が、一次スクリーニングにおいて、程度は異なるものＣＯＸ−２のペルオキシダーゼ活性に対して阻害活性を示したことがわかる。ＣＯＸ−２阻害活性は、主として、有機抽出物（ほとんどの中極性の遊離Ｂ環フラボノイドを含む）中に発見される。粗抽出物の一次分析からのＣＯＸ−２阻害活性は、用量反応およびＩＣ５０（５０％の酵素活性を阻害するのに必要な濃度）を測定することによって確認された。ＩＣ５０値は、表７に示される。表７からわかるように、この分析において、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｏｒｔｈｏｃａｌｙｘの根抽出物、および、Ｍｕｒｉｃａ  ｎａｎａの葉抽出物が最も有効であった（ＩＣ５０＝６〜１０μｇ／ｍＬ）。ＣＯＸ−１に比べてＣＯＸ−２に対して最も高い選択性を示したＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａ種からの抽出物は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｌａｔｅｒｉｆｌｏｒａから得られた抽出物であった（ＣＯＸ−２のＩＣ５０：３０μｇ／ｍＬ；ＣＯＸ−１のＩＣ５０：８０μｇ／ｍＬ）。従って、ＣＯＸ酵素の阻害剤に関して一次スクリーニングすることにより、２２種の抽出物が同定され、これらはインビトロで有効であり、そのいくつかはＣＯＸ−１に比べてＣＯＸ−２酵素に特異的であることを示した。
【００７７】
実施例８は、化粧品として使用するための新規の皮膚用白色化剤を同定する試みにおいて、酵素チロシナーゼの阻害剤に関して植物抽出物ライブラリーをスクリーニングすることを示す。この分析から、５．６％のヒット率に相当する４３種の有機抽出物がチロシナーゼ阻害活性を有すると同定された。これは、７７４種の植物抽出物のスクリーニングに基づき、水性抽出物に関して０．７８％より顕著に高いヒット率を示した。結果は、図１１に示される。標的化された指標は、皮膚用白色化剤として用いるための化粧用製品であるため、より低い極性を有する化合物がより優れた皮膚への浸透力を有するはずである。スクリーニング結果により、不要な物理的特性を有する天然産物を抽出と生物学的試験プロセスとの両方の選択性により自動的に除去した抽出物ライブラリーの品質が実証された。
【００７８】
分画化ライブラリーの直接スクリーニングは、それ自身価値があり、なぜなら、各分画が、共通して粗抽出物が有する問題である誤ったポジティブおよび誤ったネガティブを得る可能性が除去されるのに十分な高い濃度で１つの主要な化合物を含むためである。加えて、少量の生物活性成分が検出される可能性がより高くなり、なぜなら、これら成分は、それらが検出されるのに十分な程濃縮されるためである。実施例９は、実施例７で説明するように単離された生物活性抽出物のスクリーニングを説明する。この実施例において、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２両方のペルオキシダーゼ活性を阻害するその能力に関して各ＨＴＰ分画を試験した。Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉの水性抽出物から得られた分画の代表的なＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを、図１２に示す。９６ウェルプレートからの全ての８８個の分画をスクリーニングした後、図１３で示すように、トータルで８個のＨＴＰ分画が、６０％を超過するＣＯＸ阻害を示した。実施例１１で説明されたデレプリケーションプロセスに続いて、ＣＯＸ活性に寄与する分画と、その分画の前後で、１０の別々の化合物が同定された。粗水性抽出物中に分析を邪魔したり効力を覆い隠すような多くの成分が存在する。しかしながら、本発明では、これら成分を他のウェルに析出させた。このプロセスは、粗抽出物中の単一のデータポイントからの、複数の生物活性化合物が同定された８個のポジティブ分画に対するポジティブヒット率を大いに高める。
【００７９】
本明細書で開示された方法を用いて作製されたＨＴＰ分画ライブラリーの主要な利点の一つは、顕著に改善されたデレプリケーションの効率および正確さである。デレプリケーションは、サンプル中に新規の化合物が存在する可能性を調べるために、活性なサンプルの構造および物理的特性プロフィールを最大限可能な限り同定するに用いられる方法である。新規の化合物が存在する可能性があるという決定は、さらに単離および同定する試みの正当性を示す。この目的を達成するために、国内の構造および分光学的特徴データベースを、代表的な共通の天然産物の構造骨格を有する２５０種を超える既知の純粋な化合物を用いて開発した。実施例１０は、このデータベースを構築するのに用いられた方法を説明する。実施例１０で説明したように、これら化合物の分析に用いられたＨＰＬＣ法は、既知の方法より改善されている。該方法は、より短時間であり（分析あたりトータルで８．５分間）、より小さい粒度のＣ−１８樹脂、より小さい直径を有するが、より長いカラムを用いた結果として分離能力を犠牲にすることがない。目下、この国内のデータベースは、ｃｏｎｔａｉｎｓ  それぞれ個々の化合物に関する６のフィールド、すなわち化合物のタイプ、化合物名、分子量、化学構造、ＵＶスペクトルおよび保持時間を含む。表８は、フラボノイド、アルカロイド、コーヒー酸、テルペノイド、クロモン、アントラキノン、イリドイド、アセトフェノン、およびクマリンに関するデータベースにおける代表的な情報を示す。上述した標準化したＨＰＬＣ法を用いて、勾配溶媒系を用いた逆相および／または順相カラムで活性なサンプルが分離される。ＰＤＡおよびＭＳから検出されたピークは、以下のように分析される：ピークのＵＶスペクトルは、構造骨格または化合物のタイプ、すなわちフラバン、イソフラボノイド、テルペノイド、コーヒー酸誘導体などに関する国内のスペクトルデータベースおよび国外のデータベースに対して検索される；次に、その他の検索可能なフィールド、例えば植物ラテン名、化合物のタイプ、ＵＶスペクトルと共に、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓのようなデータベースを用いた分子量を検索させるために、ピークの分子イオンを用いる；および、最後に、極性、ｌｏｇＰ、溶解性、およびその他の化合物の物理的特性に関する一般概念を得るために、保持時間を用いる。
【００８０】
ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭデレプリケーションプロセスの特徴を、実施例１０および１１に示す。実施例１１は、ＣＯＸペルオキシダーゼの阻害剤に関して緑茶の水性抽出物から得られたＨＴＰ分画ライブラリーデレプリケーションを説明する。図１３で示されるＣＯＸ阻害ピーク周辺のトータルで２４個の分画を標準化したＨＰＬＣを用いて分析した。保持時間、ＵＶおよびＭＳデータを得て評価した後、各２４個のセルにおける全ての主成分がデレプリケーションされ、既知のカテキンおよびフラボノイド系の化合物であることが同定された。結果は、図１７に示される。各化合物を３〜４個の別々のセルに分配した。カテキンおよびフラボノイドのＣＯＸ阻害活性はよく知られているため、デレプリケーションプロセスからの結論は、これらの活性な分画は追求する価値がないということである。
【００８１】
実施例１２は、Ｂ１６細胞系におけるメラニン形成阻害に関するＨＴＰ分画ライブラリーのデレプリケーションの結果を説明する。簡単に言えば、阻害および細胞の生存能力分析に続いて、実施例５で説明するように、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓの植物全体からの活性な有機抽出物をＨＴＰを用いて分画化した。全てのＨＴＰ分画をチロシナーゼ阻害活性に関して試験し、結果を、図１８に示す。図１８を参照すると、メラニン合成の＞５０％阻害を示す３つの主要なピーク、および、より弱い阻害を示す７つのその他のピークが存在する。鋭い活性ピークは、活性成分を３〜５個のセルに分配した分離の品質を示す。
【００８２】
メラニン形成分析が細胞の生存能力分析に対して行われたため、分画Ｄ１１での最大活性ピークは、細胞毒性による可能性が高い。分画Ｄ２〜Ｄ７に存在するその他の活性なピークのデレプリケーションを、図１９に示す。全ての活性な分画をＨＰＬＣで分析した。各分画のＨＰＬＣクロマトグラムにおいてＲｔ＝１６．３３分間でピークが存在した。このピークは、これら分画のメラニン阻害活性により示された傾向として、同じ増加〜減少強度を示した。さらなるＵＶスペクトル分析により、この化合物が没食子酸誘導体であることが明らかになった。分子イオンおよび植物の属名に関するＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ検索により、既知化合物であるプテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂが同定され、その構造を図１９Ｈに示す。該構造におけるポリヒドロキシル基は、メラニン合成阻害を引き起こすものである。これが既知化合物であるため、さらなる単離は必要なかった。
【００８３】
結論として、促進された活性の同定プロセス（デレプリケーションと呼ばれる）、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓおよびその他の国外のデータベース（ＮＥＲＡＣサービスを介してアクセス可能）の使用と組み合わされた国内の構造および分光学的データベースにより、高効率かつ迅速な構造同定が提供され、これにより、既知の成分、誤ったポジティブおよび誤ったネガティブを除去することができ、単離を目的とした分析を行うことによって新規の活性天然産物が発見される。本明細書で説明された方法論は、既知の方法に対して顕著な利点を有し、特に精製化合物ライブラリーの開発および使用である。第一に、特徴的な分離条件および一回のクロマトグラフィーアプローチを用いるため、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ  ＨＴＰ分画ライブラリーは、発明の背景で説明したようなその他の既知のライブラリーに比べて、かなり簡単かつ廉価で作製できる。実証されたように、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭＨＴＰライブラリーにおいて、高純度の天然産物を、多数のハイスループット分析を実行するのに十分な量で個々のセルに含む。第二に、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ基盤に従ったデレプリケーションプロセスは、生物学的試験結果に厳密に関連する。従って、活性な分画および狭い周囲の分画のみが分析され、これはいずれも時間を節約し、試みに焦点をあてており、従来技術で説明するような全ての分画のデレプリケーションおよび／またはいくつかの分画のランダム化したデレプリケーションとは対照的である。第三に、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭデレプリケーションは、ＵＶまたはＭＳクロマトグラムから得られた活性な分画の天然の重量分布曲線を、生物活性プロフィールと適合させることにより利用し、それにより、活性成分をよりいっそう正確かつ迅速に同定することができる。最後に、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスからのより短時間のオフラインＨＰＬＣ法およびオンラインデータ収集は、コスト効率と時間効率がより高い方法と同じ結果および結論が得られることが実証されている。
【００８４】
デレプリケーションプロセスから、活性なＨＴＰ分画が新規の化合物または化合物を含むことが決定される場合、実施例１３で説明されるように、広範な単離、精製および同定プロセスが行われる。この実施例は、ＣＯＸ酵素活性を阻害する化合物バイカレインの単離、精製および同定を示す。精製された後、純粋な化合物の抗炎症性活性が確認された。結果を、図２０に示す。
【００８５】
活性な植物抽出物および／または分画および／または化合物において新規の作用機序および／または特定の治療的価値を有することが同定されれば、化学組成物のプロファイリングおよび活性成分の標準化が完了する。化合物の安全性および治療効率の評価および確認は、タンパク質、細胞、遺伝子および動物モデルを用いた二次スクリーニングで達成される。実施例１４は、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ基盤を用いて同定および開発された標準化した植物抽出物の抗炎症性活性の確認を説明する。結果を、図２１に示す。確認プロセスは、インビトロおよびインビボ両方での効能、安全性および毒性に関する情報、生物学的利用可能性および投与量を確率できるように設計された。全体的としてみれば、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ発見プロセスは、競争力のある利点を有する新規の成分の市場同定および識別を確立する。
【００８６】
ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ発見プロセスの最後の工程は、知的財産の位置付けのためのバイオインフォマティックデータベース、原料の調達、および、パイロット規模のプロセス最適化により方向付けられた製品開発法である。製造後の製品の医薬活性および安全性／毒物学プロファイリングを再確認することによって、規定承認に関して準備し、顧客に対して規定ガイダンスおよび効果的な要求の具体化を提供することができる。
【００８７】
実施例１５において、栄養補助食品製品として天然のＣＯＸ阻害剤を開発することにおいて実際の例を利用する全プロセスが要約される。生産品は、関節痛および炎症を標的とした、ＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭと呼ばれる物体の新規の組成物である。この物質の組成物は、２００２年３月２２日付けで出願された米国特許出願第１０／１０４，４７７号、表題「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｕａｌ  ＣＯＸ−２  ａｎｄ  ５−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ａｃａｃｉａ」で説明されており、その全体を参照により本発明に加入させる。この産物は、現在市販されており、図２２および２３は、販売シートおよびこの産物の分析の証明書を示す。
【００８８】
ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセス一般的な要約を、実施例１６で示し、図２４〜２７で説明する。図２４は、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ発見プロセスを図式的に示す。植物収集ライブラリーおよび市場の要求の分析から、優先的な植物抽出物を分析するようにハイスループットスクリーニングモデルを開発した。生物活性を同定した後、標準化した抽出物／濃縮した分画／純粋な化合物に基づき、薬理学的および安全性プロフィールを作製した。このプロセスの生産品が、候補産物である。図２５は、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ開発プロセスを図式的に示す。図２５を参照すると、候補産物、情報検索および製品開発により、製品使用のための植物源が同定され、知的財産の位置付けおよび市場の利点に関する推奨が得られる。製造プロセス開発、および、パイロット規模プロトタイプ製品の製造に続き、効率および安全性プロフィールの確認が行われる。臨床試験がうまくいくことや、最終産物の発売をもって、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスの完了とする。
【００８９】
図２６は、重要なタスクのチェックリストを示し、これは、重要な活性の経過を追い、データ作製を続けるために、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスで利用することが可能である。
【００９０】
図２７は、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスにおける、時間、コスト見積もり、および意思決定法を示す。該図は、フルタイムの従業員の必要性、ならびに、発見および開発の各段階でかかる時間およびコストを示す。これは、プロジェクトマネージャーに、重要な意思決定ポイントそれぞれにおけるプロジェクトの進行を評価する機会を与える。
【００９１】
以下の実施例は、単に説明の目的で提供されるのであって、本発明の範囲を限定することは意図しない。
【００９２】
実施例
実施例１．植物および証拠標本の収集
最初に、収集しようとする植物を同定し、次に、新鮮な植物を野原または植物農園のいずれかから収集した。場合によっては、植物全体から植物の部分を切断した。十分な材料が収集され、１０〜１２ｋｇの新鮮な葉、７〜８ｋｇの新鮮な実もしくは種または植物全体、もしくは、５〜６ｋｇの新鮮な茎または根が提供された。植物全体または植物部分（以下、植物／植物部分と称する）を水で洗い、昆虫、泥およびその他の不純物を除去した。次に、植物／植物部分を、野外で、または、６０℃未満の温度で機械式ドライヤーを用いて、乾燥させた。植物／植物部分の総重量を乾燥の前後で記録された。加えて、乾燥プロセスの結果として生じた植物サンプルにおけるいかなる変化に関して記録を続けた。パッキングする前に、乾燥、昆虫および菌類の感染ならびに清浄度などの様々な条件に関して植物／植物部分を評価した。次に、植物／植物部分を、証拠番号，植物名，植物部分および重量で標識した清潔なバッグに置いた。可能であれば、各植物サンプルを一つのバッグにパックした。しかしながら、植物サンプルが数個のバッグにパクされた場合、バッグの数も、サンプルのラベルに提示された。次に、植物収集フォーム（図１）を書き込み、パッケージされた植物を記入した。数種の個々の植物バッグを板紙箱に置いた。パッキングリストは、パッキングの日付、植物の名前、証拠番号、各植物あたりのバッグの数、および、各植物の重量を含み、該リストを各ボックスに対して作製した。乾燥バッグをボックスに置いき、そのボックスを密封した。輸送と取り扱いのプロセスにおける損失またはダメージを防ぐために、収集フォームのコピー（図１）とパッキングリストを郵便で送った。
【００９３】
証拠標本を準備するため、花および実などの成熟した植物全体を収集した。新鮮な植物を平坦に圧縮し、新聞またはその他の種類の生紙（ｒａｗ  ｐａｐｅｒ）の間に置いた。植物が全体的に乾燥するまで紙を毎日変えた。植物の花および種を別々に小さいバッグに置いた。稔性の植物が利用不可能な場合は、植物の花および／または実に関する情報は、コレクターから得た。しかしながら、植物が開花しているとき、および結実しているときの証拠標本を収集する試みがなされた。個々の証拠番号は、各植物に対して付与された。植物の証拠番号、ラテン名、地域名、収集場所、日付およびコレクター名をラベルに記録し、そのラベルを植物の証拠内に置いた。証拠の２つのセットを準備し、一つは同定目的の植物と共に研究施設に送り、もう一つは、さらなる比較のためにコレクター名と共にファイルに入れた。
【００９４】
研究施設による植物材料を受領した際に、証拠標本を取り、収集記録またはその他の関連する文書のいずれかに添付した。植物サンプルの状態を調べ、植物記録フォームを各サンプルに関して記入した。各サンプルに個別のナンバーを、以下のように割り当てた；植物にはＰｘｘｘｘ、海洋材料にはＭｘｘｘｘ、細菌および微生物にはＢｘｘｘｘ、菌類にはＦｘｘｘｘ、土壌にはＳｘｘｘｘ、動物にはＡｘｘｘｘ、昆虫にはＩｘｘｘｘ、ならびに、鉱物にはＭｘｘｘｘ、ビタミンにはＶｘｘｘｘ、有機合成化合物にはＯｘｘｘｘ、および、ゲノムで調節された二次代謝産物にはＧｘｘｘｘ。このナンバーを証拠標本に添付した。
【００９５】
植物サンプルが全体的に乾燥していなかった場合，それをより小さい部分に刻むか砕くかして、できる限りすぐに凍結乾燥させた。標本（１０ｇ、標本＃１）を各植物サンプルから保存し、その後砕いた。標本を標識したビン（１２５ｍＬ）に置き、使用前に−２０℃で保存した。標本＃１は、植物を肉眼および顕微鏡で同定する目的のみに用いた。砕いた後、乾燥粉末の標本（１００ｇ、標本＃２）を保持し、標識したビン（２５０ｍＬ）に置き、使用前に−２０℃で保存した。標本＃２を、植物化学的に同定し比較することに用いた。証拠標本を、収集記録のコピーと植物サンプル（１０ｇ）と共に、植物同定のために植物研究所に送った。この同定の結果を植物情報フォームに記録した。植物の状態を再び調べ、植物が乾燥しており、外的要因による荒れ（ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ）がないことを確かめた。次に、砕いた植物サンプルを広口ポリプロピレンビンに置いた。材料の重さを量り、重量をラベルに記録した。次に、植物記録フォーム、植物探索記録および植物情報フォームを適切な職員に提出した。次に、これら全てのフォームからの情報をコンピューターデータベースに入力し、次に、全てのフォームを安全な場所で適切にファイルした。２００２年６月の時点で、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭライブラリーは、３００種を超過する異なる科、９００種の属、および、１１００種を超過する異なる種から、トータルで１１７０種の植物およびその他の天然材料を含む。これら植物は、中国、インド、ガーナ、アメリカ合衆国、ならびに、アジア、南アメリカ、北アメリカ、およびアフリカのその他の国から収集された。
【００９６】
実施例２．データベースの作製
カスタマイズされたＡｃｃｅｓｓデータベースを、薬用植物およびその他の天然材料に関する収集された全ての情報を取り扱うために開発した。データベースは、多数の表で構成され、これら表の間の特別に設定された関係も含む。図２で説明されるように、典型的な表は、記録、植物の民族学的な指示、Ｅｘｔ，分画，Ｅｘｔ．トラッキング，貯蔵、化合物タイプ，化合物登録，発送人，活性、活性などの情報が含まれる。収集された各サンプルについての情報、例えば、ＥＤ＃、証拠ＩＤ、属、種、科、植物部分、植物状態、植物の新鮮な重量、乾燥重量、地質学的分布、植物の同定、植物収集フォーム、抽出物情報、民族学的指示、分析結果などが、そのそれぞれの表に保存された。情報をそのそれぞれの表に入力したら、特別に設定したマクロ（図３）および問い合わせを用いて情報を分析し、検索した。情報を図４で説明されたようなレポートのフォームにまとめた。表１は、リウマチ様関節炎および関節炎を治療するのに従来から用いられている薬用植物の検索結果を示す。このような情報は、特定の標的に関して限定された数の植物（２０〜５０）に焦点を当てることによってリサーチ努力を優先させるのに役立ち得る。この「インフォマティックスデータベース」は、発見プロセスに向けられており、産物発見および開発のリスク、コストおよび時間を顕著に減少させ、本当に新規で有効な産物を発見する可能性を高め得る。
【００９７】
実施例３．植物抽出物ライブラリーの作製
植物材料を２ｍｍ以下の粒度に砕いた。次に、乾燥した砕いた植物材料（６０ｇ）をＥｒｉｅｎｍｅｙｅｒフラスコに移し、メタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）を加えた。混合物を１時間振盪し、ろ過し、バイオマスを新しいメタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）で再び抽出した。有機抽出物を合わせ、４０℃の真空下で蒸発させ、有機抽出物を得た（以下の表２を参照）。有機抽出の後、バイオマスを風乾し、超純水（６００ｍＬ）で１度抽出した。水溶液をろ過し、凍結乾燥し、水性抽出物を得た（以下の表２を参照）。サンプル（１００〜２００ｍｇ）を各抽出物（水性および有機性）から保存し、将来的な参照のために−２０℃で保存した。
【００９８】
生物学的試験のための抽出物マスタープレートの調製
７０±２５ｍｇの範囲の各抽出物のサンプルを、バイアルに置き、ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）または超純水（１．５ｍＬ）を各バイアルに加え、固体が完全に溶解するまで混合物を音波破砕した。次に、溶液を、各バイアルから９６ディープウェルブロック中のウェルに移した。位置と対応するサンプルコードを付記した。９６ディープ−ウェルブロックを使用前にフリーザーで−７０℃で保存した。生物学的試験を実施するために、サンプルを融解させ、５０〜２００ｍＬのサンプルを、各生物学的試験に用いた。
【００９９】
実施例４．抽出法論の確認
植物材料を２ｍｍ以下の粒度に砕いた。次に、乾燥した砕いた植物材料（６０ｇ）をＥｒｉｅｎｍｅｙｅｒフラスコに移し、メタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）を加えた。混合物を１時間振盪し、ろ過し、バイオマスをメタノール：ジクロロメタン（１：１）（６００ｍＬ）で再び抽出した。有機抽出物を合わせ、真空下で蒸発させ、有機抽出物を得た（以下の表３を参照）。有機抽出の後、バイオマスを風乾し、超純水（６００ｍＬ）で１度抽出した。水溶液をろ過し、凍結乾燥し、水性抽出物を得た（以下の表３を参照）。水性抽出の後、バイオマスを乾燥させ、メタノール（６００ｍＬ）で２回抽出した。合わせたメタノール溶液を４０℃の真空下で蒸発させ、ＭｅＯＨ抽出物を得た。同じ植物からの有機、水性およびメタノール抽出物を、フィンガープリント化合物の比較のために、ＨＰＬＣ／ＰＤＡ／ＭＳで分析した。代表的な結果を図５および６に示す。
【０１００】
実施例５．有機抽出物からのＨＴＰ分画ライブラリーの作製
有機抽出物（４００ｍｇ）を音波破砕下で最少量のＭｅＯＨ（約１〜１．５ｍＬ）に溶解させ、手動でプレパックフラッシュカラムにローディングした。（２ｃｍの内径×８．２ｃｍ，１０ｇのシリカゲル）。全ての溶媒が蒸発するまでカラムを真空下で乾燥させた。カラムの溶出は、パラレルで、日立ハイスループット精製（ＨＴＰ）システムを用いて、（Ａ）５０：５０のＥｔＯＡｃ：ヘキサンと（Ｂ）メタノールとの１００％Ａ〜１００％Ｂの単一の勾配移動相で、３０分間で、流速５ｍＬ／分で、行った。分離を広帯域波長ＵＶ検出器を用いてモニターし、溶出液を、９６ディープ−ウェルプレートから、ウェルあたり１．９ｍＬで、Ｇｉｌｓｏｎの分画コレクターを用いて８８分画回収（収集）した。サンプルプレートを低真空下で乾燥させ、ＳａｖａｎｔのＳｐｅｅｄＶａｃ  Ｐｌｕｓ（モデル＃ＳＣ２５０ＤＤＡ）で遠心分離した。図７Ａおよび７Ｂは、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いたＨＴＰ分画の分析を説明する。この図は、ＨＴＰにより、異なるタイプの化合物が見事に分離されたことを示す。分離された成分は、６〜１０のセルに分配することができ、ほとんどの場合、各セルは、単一の化合物またはせいぜい３種未満化合物のいずれかを含んでいた。
【０１０１】
図８は、各ウェルにおけるサンプルの重量分布を示す。ＴＬＣ化合物スポットに対する重量分布プロフィールにおいて、互いに適合するいくつかのピークが存在した。ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）を各ウェルに加えてサンプルを溶解させ、９６ディープ−ウェルプレートを−７０℃で保存した。マスター分画プレートを室温で融解させ、各溶液の一部（５０〜２００μＬ）を各ウェルから取り、設定された生物学的試験いずれについても娘プレートを作製した。２つのＨＴＰカラム分画を完了するのに約４０分間かかり、８個の９６ディープ−ウェルプレートを乾燥させるのに約５時間かかった。有機抽出物のための毎日のスループットは、１４個のカラムおよび１２３２個の分画である。表４は、有機抽出物のハイスループット分画のコスト分析を示す。
【０１０２】
実施例６．水性抽出物からのＨＴＰ分画ライブラリーの作製
水性抽出物（７５０ｍｇ）を脱イオン（ＤＩ）水（５ｍＬ）に溶解させ、１μｍのシリンジフィルターでろ過し、４ｍＬのＨＰＬＣバイアルに移した。次に、溶液を、オートサンプラーで、プレパック逆相カラムの上に注入した。（Ｃ−１８、１５μｍ粒度，プレカラムインサートを有する２．５ｃｍの内径×１０ｃｍ）。カラムの溶出は、日立ハイスループット精製（ＨＴＰ）システムを用いて、（Ａ）水と（Ｂ）メタノールとの１００％Ａ〜１００％Ｂの勾配移動相で、２０分間、続いて、１００％メタノールで５分間、流速１０ｍＬ／分で行った。分離を広帯域波長ＵＶ検出器を用いてモニターし、溶出液を、９６ディープ−ウェルプレートから、１．９ｍＬ／ウェルで、Ｇｉｌｓｏｎの分画コレクターを用いて、８８個の分画を収集した。メタノールを低真空下で除去し、ＳａｖａｎｔのＳｐｅｅｄＶａｃ  Ｐｌｕｓ（モデル＃ＳＣ２５０ＤＤＡ）を用いて遠心分離し、プレートを凍結乾燥した。滅菌ろ過しエンドトキシン試験した超純水（１．５ｍＬ）を各ウェルに加え、サンプルを溶解させ、使用前に９６ディープ−ウェルプレートを−７０℃で保存した。マスター分画プレートを室温で融解させ、溶液の一部（５０〜２００μＬ）を各ウェルから取り、設定された生物学的試験いずれについても娘プレートを作製した。図９Ａ〜９Ｌは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体からの水性抽出物のＨＴＰ分離の再現性を説明する。水性抽出物を、４種のパラレルＣ−１８カラムで、ＨＴＰで、３回分離し、トータルで１２個の９６ディープウェルプレートを作製した。１２のカラム分離からのＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムは同一であり、１２個のプレートからの同じウェルの位置に基づきサンプルを合わせた。
【０１０３】
２種のＨＴＰカラム分画を完了するのに約２０分間かかり、８個の９６ディープ−ウェルプレートを乾燥させるのに約１０時間かかる。水性抽出物のための毎日のスループットは、３２個のカラム、および、２６１８個の分画である。表５は、水性抽出物のハイスループット分画のコスト分析を示す。
【０１０４】
実施例７．ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１の天然阻害剤に関する植物抽出物ライブラリーのスクリーニング
特定のＣＯＸ−２阻害剤を同定するためのスクリーニングプロセスに向けられた生物学的試験を設定し、以下で説明するように酵素のペルオキシダーゼ活性を分析した。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の活性を阻害する化合物をスクリーニングするために、両方の酵素ペルオキシダーゼ活性阻害を利用したハイスループットのインビトロ分析が開発されている（Ｒａｚ  ａｎｄ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６０３−６０７）。簡単に言えば、既知の濃度のＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭおよび／またはその個々の成分（遊離Ｂ環フラバノイドまたはフラバン）を、それぞれ固定量のＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素に対して滴定した。各酵素のペルオキシダーゼ活性を補因子としてアラキドン酸の存在下で可視化するために、開裂可能なペルオキシド発色団が分析に含まれた。一般的に、９６ウェルフォーマットで分析を行った。各阻害剤は、１００％ＤＭＳＯの１０ｍｇ／ｍＬのストックから得て、室温で、以下の濃度範囲：０、０．１、１、５、１０、２０、５０、１００、および５００μｇ／ｍＬを用いて三重に試験された。各ウェルに、１５０μＬの１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を、１０μＬの２２μＭのヘマチン（トリス緩衝液で希釈した）、１０μＬの阻害剤（ＤＭＳＯで希釈した）、および２５ユニットのＣＯＸ−１またはＣＯＸ−２酵素のいずれかと共に加えた。成分を回転基盤上で１０秒混合し、その後、２０μＬの２ｍＭのＴＭＰＤおよび２０μＬの１．１ｍＭのアラキドン酸を加え、反応を開始させた。プレートを１０秒振盪させ、次に、５分間インキュベートし、その後、５７０ｎｍでの吸光度を読み取った。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーを用いて発光を読み取った。％阻害に対する阻害剤濃度をプロットし、ＩＣ５０は、等温線に沿って最大ポイントの半分をとり、ｘ軸上で濃度を交叉させることによって決定された。次に、ＩＣ５０を、分析における酵素ユニット数に基準化した。図１０は、１２３０種の植物抽出物のスクリーニングから得られたポジティブヒット率を示す。代表的な植物種からの抽出物によるＣＯＸ−２ペルオキシダーゼの阻害を表６に示す。表６におけるデータは、組換えヒツジＣＯＸ−２酵素および基質単独と比較したペルオキシダーゼ活性のパーセントとして示される。代表的な有機抽出物によるパーセント阻害は、３０％〜９０％の範囲であった。
【０１０５】
ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２アイソフォームの相対的な阻害の比較のために、これら酵素それぞれに対するＩＣ５０値を得ることが必要である。ＩＣ５０は、特定の阻害剤により酵素活性がコントロールに対して５０％阻害される濃度と定義される。簡単な例において、ＩＣ５０値は、表７に示されるように、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１酵素に関して、それぞれ６〜５０μｇ／ｍＬ、および、７〜８０μｇ／ｍＬの範囲で見出される。ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１のＩＣ５０値を比較することにより、様々な植物種からの有機抽出物の、これら酵素それぞれに対する特異性が示される。例えば、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｌａｔｅｒｉｆｌｏｒａの有機抽出物は、ＣＯＸ−１よりＣＯＸ−２に対して優先的な阻害を示し、ＩＣ５０値はそれぞれ３０μｇ／ｍＬ（ＣＯＸ−２）および８０μｇ／ｍＬ（ＣＯＸ−１）である。Ｗｈｉｌｅ  いくつかの抽出物がＣＯＸ−２に対して優先的な阻害を示し、その他は示さなかった。ＨＴＰ分画の試験、および、これら分画から単離された精製化合物が、これら抽出物および化合物に対する阻害の本当の特異性を測定するのに必要である。
【０１０６】
実施例８．天然阻害剤チロシナーゼに関する植物抽出物ライブラリーのスクリーニング
チロシナーゼ活性をＰｏｍｅｒａｎｔｚの改変法を用いて測定した（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ（１９９１）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：１６１〜８）。簡単に言えば、粗抽出物を、ＤＭＳＯに、濃度３０ｍｇ／ｍＬで溶解させた。次に、サンプルを、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で１：１０に希釈した。１０％ＤＭＳＯ／緩衝液でさらに希釈した。大規模スクリーニングのために、分析を９６ウェルフォーマットに改変した。サンプル試験ウェルは、５０μＬの緩衝液、５０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬの抽出物、５０μＬの２ｍＭのＬ−ｄｏｐａ、および、５０μＬの５０Ｕ／ｍＬのマッシュルームチロシナーゼからなる。ポジティブコントロールは、サンプルを１０％ＤＭＳＯ／緩衝液で置き換えた以外は上述の通りである。最後に１２チャンネルのマルチウェルピペットで基質を加え、反応を開始させた。即座に、９６ウェルプレートリーダーで、４５０ｍｎでプレートを読み取り、ドーパクロム形成を検出した。次に、プレートを室温でインキュベートし、正確に１分後に再び読み取った。吸光度の変化は、２分間直線的であった。
【０１０７】
コントロール率（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒａｔｅ）は、Δ０．２Ａ／分、４５０ｎｍで最適であると測定された。試験サンプルに関するパーセント阻害が、以下の式を用いて計算された：
パーセント阻害＝（Ｒｃ−Ｒｓ）／Ｒｓ×１００、
Ｒｃ：Δ吸光度／分（４５０ｎｍ）、サンプル（コントロール）非含有、
Ｒｓ：Δ吸光度／分（４５０ｎｍ）、サンプル含有。
【０１０８】
粗有機および水性植物抽出物を、９６ウェルプレートフォーマットで、精製マッシュルームチロシナーゼに対して試験した。Ｐｏｍｅｒａｎｔｚの改変法を用いて、Ｌ−Ｄｏｐａ基質およびチロシナーゼ酵素の濃度を、直線的にスケールダウンさせた。図１１は、様々な植物種から得られた３９６種の有機抽出物のチロシナーゼ阻害結果を示す。７７４種の植物抽出物のなかから、＞６０％阻害（５．６％ポジティブヒット）を示す４３種の抽出物が存在し；６種の植物が、ＩＣ５０＜１００μｇ／ｍＬ（０．７８％確認されたヒット）を示す活性な分画で同定され；および、６種の活性化合物が単離され、同定された。
【０１０９】
実施例９．ＣＯＸペルオキシダーゼの阻害剤に関するＨＴＰ分画ライブラリーのスクリーニング
実施例７からの個々の生物活性な有機および水性抽出物を、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２組換え酵素の両方のペルオキシダーゼ活性を阻害する能力に関して、実施例７で説明された方法を用いてそれぞれをＨＴＰ分画で試験することによってさらに特徴付けた。図１２は、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐ０６０５）の水性抽出物のＨＴＰ分画の広帯域波長ＵＶクロマトグラムを示す。代表的なＣＯＸ阻害の結果は、図１３で示され、実施例３および６で説明したように調製されたＣａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐ０６０５）からのＨＴＰ分画により、ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−１活性阻害を示す。図１３で示されたプロフィールは、阻害のピークを示し、これは、特定のレベルのＣＯＸ−１に対する選択性を有する分画Ｃ４〜Ｅ４（トータルで１６分画）に存在する。ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素両方は、複数の阻害のピークを示し、これは、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐ０６０５）からの水性抽出物の初期の阻害プロフィールに寄与する１を超過する化合物が存在することを示す。
【０１１０】
実施例１０．構造および分光学的特徴からなるデータベースの作製
代表的な構造タイプを含み、量が５〜５００ｍｇで純度が＞９０％（ＨＰＬＣ）の、２５０種の純粋な天然産物からなるデータベースを、化合物の国内での単離によって、および、市販の源から化合物を購入することによって作製した（例えばＳｉｇｍａ，Ｉｎｄｏｆｉｎｅ、およびＣｈｒｏｍａｄｅｘから）。各化合物をメタノール（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた。場合によっては、異なるＵＶ吸収およびマスイオン化特性のために、個々の化合物に応じてさらなる希釈および濃度が必要である。ＬｕｎａＣ１８カラム（２×５０ｍｍ，３μｍ）を用いて、流速０．４ｍＬ／分、および、温度３５℃で、サンプル溶液をＨＰＬＣで分析した。カラムの溶出は、８．５分間行われ、すなわち、１０％〜９０％アセトニトリル（ＡＣＮ）水溶液で０〜４分間、１００％ＡＣＮで４．１〜６．０分間の勾配システム、および、１０％ＡＣＮ水溶液で６．１〜８．５分間平衡することによって行われた。溶出液の分析は、フォトダイオードアレイ検出器を波長２００〜５００ｎｍで用いて；および、以下の条件でイオントラップＭＳを用いてなされた：検出器４７５ｖ、フォーカス３５ｖ、ドリフト４０ｖ、ＳＳＩチャンバー０．５ｋｖ、開口度１が１５０℃、開口度２が１２０℃、カバープレート２５０℃、および、ネガティブまたはポジティブ検出。保持時間、ＵＶスペクトル、分子イオンおよびフラグメンテーションを記録し、検索可能なライブラリーに保存した。表８は、構造および分光学的データベースに含まれる典型的な情報を示す。デレプリケーションプロセスにおいて、未知の分画を同じ条件下で分析し、ＰＤＡ検出からのＨＰＬＣピークを構造骨格および化合物タイプに関するＵＶライブラリーで検索した。分子イオンおよび保持時間を用いて、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  ＰｒｏｄｕｃｔｓおよびＮＥＲＡＣデータベースを検索することによって既知化合物を同定した。
【０１１１】
実施例１１．ＣＯＸペルオキシダーゼの阻害剤に関するＨＴＰ分画ライブラリーのデレプリケーション
ＨＴＰプレートからの生物学的試験結果を得た後、デレプリケーションプロセスを開始させた。結果を、図１３に示し、これは、ＣＯＸ阻害活性が分画Ｃ４〜分画Ｅ４（トータルで１６分画）に存在したことを示す。これら分画を実施例１０で説明したようにＬＣ／ＰＤＡ／ＭＳで別々に分析した。結果を図１４に示し、これは、生物活性分画Ｄ３のオンラインＰＤＡ／ＭＳベースイオンクロマトグラム（ＢＩＣ）を示す。図ｌ５Ａおよび１５Ｂは、分画が収集された後、分画Ｄ３のＵＶおよびＭＳクロマトグラムがオフラインで分析されたことを示す。分画Ｄ３に関する分子イオンスペクトルは、図１６Ａで示されるように、分析がオンラインで実行されてもオフラインで実行されても関係なく、同一であった。実験データおよびＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから得られた情報を用いた、構造および分光ライブラリーの検索に基づき、分画Ｄ３は、１つの主要な既知化合物である没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）を含んでおり（図１６Ｂ）、これはよく知られたＣＯＸ阻害剤である。同じ方法を用いて、全ての１６個の活性なＨＴＰ分画を、デレプリケーションし、図１７で示したように、既知のカテキンおよびフラボノイドを含むことがわかった。
【０１１２】
実施例１２．チロシナーゼ阻害剤に関するＨＴＰ分画ライブラリーのデレプリケーション
メラニン形成の阻害を、ＳｉｅｇｒｉｓｔおよびＥｂｅｒｌｅ（ｘ）の改変法により調べた。Ｂ１６Ｆ１マウス黒色腫細胞（２．０×１０４細胞／ｍＬ）をＧｉｂｃｏＢＫＬ改変イーグル媒体（１０％ＦＢＳ、１％Ｇｉｂｃｏ  非必須アミノ酸、１％ＰＳＧ、１．５％Ｇｉｂｃｏビタミン溶液）で継代培養した。インキュベーション（３７℃，５％ＣＯ２）してから３日後、９６ウェルの滅菌培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に細胞を接種させ（２５００細胞／ウェル，２００μＬ）、一晩インキュベートした（３７℃，５％ＣＯ２）。次の日、細胞培地を、１００μＬの新しい培地で置き換えた。抽出物サンプルを、ＤＭＳＯに濃度３０ｍｇ／ｍＬで溶解させ、細胞培地で、別々の滅菌９６ウェルプレートに、１：１０００に希釈した。サンプル（５０μＬ）を１２ウェルのマルチウェルピペットを用いて希釈プレートから細胞培養プレートへ移した。α−メラノサイト刺激ホルモン（ａ−ＭＳＨ）（Ｓｉｇｍａ）を全てのポジティブウェル（１５０μＭ，５０μＬ）に加え、メラニン形成を刺激した。α−ＭＳＨ非含有のサンプルウェルを用いて、コントロールとしてのメラニン色素形成とは無関係の４５０ｎｍでサンプル吸光度を測定した。４日後にメラニン色素形成が見られた。メラニン形成の程度は、９６ウェルプレートリーダーで、４５０ｎｍで測定された。サンプルのパーセント阻害は、以下の式により測定された。
【０１１３】
【数１】
2005504958.tif 000002
【０１１４】
ＡｃＭＳＨ＋：サンプル非含有ＭＳＨ含有のセルの４５０ｎｍでの吸光度、
ＡｃＭＳＨ−：サンプル非含有ＭＳＨ非含有のセルの４５０ｎｍでの吸光度、
ＡｓＭＳＨ＋：サンプル含有ＭＳＨ含有のセルの４５０ｎｍでの吸光度、
ＡｓＭＳＨ−：サンプル含有ＭＳＨ非含有のセルの４５０ｎｍでの吸光度。
【０１１５】
実施例５で説明するように、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（植物全体）（Ｐ０３６８）から単離された活性な有機抽出物をＨＴＰで分画化した。全てのＨＴＰ分画を細胞毒性に対するチロシナーゼ阻害活性に関して試験し、結果を、図１８に示した。図１８からわかるように、複数のピークが存在し、これは、粗抽出物に多数の活性成分が存在することを示す。分画Ｃ１０〜Ｄ１０に存在する最大活性ピークは、酵素阻害といよりむしろ細胞毒性による可能性がある。最も興味深い活性は、分画Ｄ２〜Ｄ７のピークに存在し、これらは細胞毒性を有していなかった。これら分画（図１９Ａ〜Ｐ）のＨＰＬＣ／ＰＤＡ／ＭＳ分析は、ネガティブイオン強度（保持時間１６．３３分間）において増加を示し、これは、チロシナーゼ阻害活性の位置と一致する。このピークの紫外線およびマススペクトロメトリーによるさらなる分析は（図１９Ｇ）、この化合物の骨格が、没食子酸塩の骨格であることを示した。実験データおよびＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから得られた情報を用いた、構造および分光ライブラリーの検索に基づき、このピークが、既知のポリフェノール、プテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂに対応することが決定された。この化合物の構造は、図１９Ｈで示される。ポリフェノールは、チロシナーゼ阻害活性を有することがよく知られている。従って、デレプリケーションプロセスにより、粗抽出物およびＨＴＰ分画からのポジティブヒットは、既知の源からのいくらかの細胞毒性に加えて、主として既知化合物によるものであることが迅速に同定された。この植物抽出物をさらに追跡する必要はなかった。
【０１１６】
実施例１３．Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｏｒｔｈｏｃａｌｙｘの有機抽出物からの活性な遊離−Ｂ環フラボノイドの単離および精製
実施例３で説明したように単離されたＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｏｒｔｈｏｃａｌｙｘの根からの有機抽出物（５ｇ）を、プレパックフラッシュカラム（１２０ｇのシリカ、粒度３２〜６０μｍ、２５ｃｍ×４ｃｍ）にローディングし、（Ａ）５０：５０のＥｔＯＡｃ：ヘキサンと（Ｂ）メタノールとの１００％Ａ〜１００％Ｂの勾配移動相で、６０分間で、流速１５ｍＬ／分で溶出させた。分画を試験管に１０ｍＬ／分画で収集した。溶媒を真空下で蒸発させ、各分画中のサンプルを、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させ、２０μＬのアリコートを９６ウェルシャローディッシュプレートに移し、ＣＯＸ阻害活性に関して試験した。ＣＯＸ分析結果に基づき、活性な分画＃３１〜＃３９を合わせ、蒸発させた。ＨＰＬＣ／ＰＤＡおよびＬＣ／ＭＳによる分析によれば、保持時間８．９分間、および、ＭＳピーク２７２ｍ／ｚの主要な化合物が示された。産物の精製は、Ｃ１８半調製カラム（２５ｃｍ×１ｃｍ）で、（Ａ）水と（Ｂ）メタノールとの勾配移動相を用いて、４５分間にわたり流速５ｍＬ／分で行われた。８８個の分画を収集し、５．６ｍｇの白色固体を得た。ＨＰＬＣ／ＰＤＡおよびＬＣ／ＭＳ、ならびに、標準とＮＭＲデータとの比較により純度を測定した。１ＨＮＭＲ：δｐｐｍ．（ＤＭＳＯ−ｄ６）８．０８８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，５’），７．５７７（３Ｈ，ｍ，Ｈ−２’，４’，６’）、６．９３２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８），６．６１３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−３）．ＭＳ：［Ｍ＋１］＋＝２７１ｍ／ｅ．化合物をバイカレインと同定した。ＣＯＸ−１に関するＩＣ５０は、０．１８μｇ／ｍＬ／ユニット酵素であり、一方で、ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．２８μｇ／ｍＬ／ユニットであった（図２０）。
【０１１７】
実施例１４．標準化した栄養補助食品用抽出物のＣＯＸ阻害活性のインビボでの研究
インビボでの炎症の阻害を２つのモデルシステムを用いて測定した。第一のシステム（耳膨張モデル）は、アラキドン酸で直接誘導された炎症を測定する。これは、ＣＯＸ−２阻害の優れた測定法であるが、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）による細胞膜のリン脂質からのアラキドン酸遊離の上流で生じ得る細胞性の現象はまったく測定しない。それゆえに、より生物学的に関連する反応において阻害剤がどのように機能するかを調べるために、エアーパウチ（ａｉｒ  ｐｏｕｃｈ）モデルが用いられた。このモデルは、強い細胞浸潤、および、サイトカインやアラキドン酸代謝産物などの炎症性メディエイター生産を特徴とする炎症性反応を誘導するために、補体の強い活性化剤を利用する。
【０１１８】
耳膨順耳膨張モデルは、アラキドン酸代謝阻害の直接的な測定法であり、以前に説明されている（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：１６４−１７２；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔ．８２：３６７−３７１）。アセトン中のアラキドン酸をマウスの耳に局所塗布する。アラキドン酸代謝により、ＣＯＸ−２のような酵素の作用により生産された炎症性メディエーターが生産される。膨張阻害は、この経路に関与する酵素の阻害の直接的な測定法である。５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの７つのグループに、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）または経口（強制栄養による）のいずれかにより、アラキドン酸（ＡＡ）適用の２４時間および１時間前に、試験化合物の３種の用量を投与した。アセトン中のＡＡ（２ｍｇ／１５μＬ）を左耳に適用し、ネガティブコントロールとしてアセトン（１５μＬ）を右耳に適用した。１時間後、動物をＣＯ２吸入により屠殺し、エンジニアのマイクロメーターを用いて耳の厚さを測定した。コントロールは、ＡＡ投与されたが抗炎症剤で処理されていない動物、および、ＡＡとインドメタシン（Ｉ．Ｐ．）５ｍｇ／ｋｇとで処理された動物、であった。
【０１１９】
結果は、図２１に示され、それによれば、２つの時点（２４時間および１時間）に、経口（強制栄養による）または腹腔内（ＩＰ）のいずれかにより投与された３種の抽出物の効果を示す。ＩＰおよび強制栄養両方で運搬した場合、Ｓ．ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓから単離された遊離Ｂ環フラボノイドは、膨張を抑制し、ＩＰがより有効であった（図２１Ａおよび２１Ｂ）。Ｓ．ｏｒｔｈｏｃａｌｙｘから単離された遊離Ｂ環フラボノイドは、これら代謝産物の生産を抑制したｗｈｅｎ経口ではなくＩＰで投与したが、それに反して、Ｓ．ｌａｔｅｒｉｆｌｏｒａから単離された抽出物は、インビトロで有効であるにもかかわらず、インビボでは効果を示さなかった（データは示さず）。
【０１２０】
実施例１５．ＰｈｖｔｏＬｏｇｉｘＴＭ基盤の結果に基づき栄養補助食品製品としての天然のＣＯＸ−２阻害剤を開発すること
数年間、ＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の化学的特徴を有する新規の栄養補助食品成分を発見するために、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスを用いて数千もの植物抽出物をスクリーニングしていた。複数の酵素的および細胞型分析に対して、１２３０種の植物抽出物ライブラリーを天然のＣＯＸ−２阻害剤に関してスクリーニングし、１．８％のポジティブヒットが得られた。２２種の活性な抽出物を上述したハイスループット精製システムを用いてさらに試験し、単離された純粋な化合物を上述したＣＯＸ分析を用いて試験した。純粋な化合物および植物抽出物の生物活性を、ヒツジＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２酵素、ヒトＣＯＸ−２酵素、ミツバチ毒ＰＬＡ２、ヒト５−ＬＯ、ヒト末梢血液細胞、およびＴＨＰ−１細胞系分析を用いて確認した。次に、インビトロモデルに基づき有効であることが決定されたこれら抽出物を、エアーパウチおよび局所的耳膨張モデルの両方を用いて、複数の経路（ＩＰおよび経口）で投与された場合のインビボで炎症を阻害する能力に関して試験した。これまで、これら研究により、全ての試験レベルにわたって活性を有する抗炎症剤として遊離Ｂ環フラボノイドおよびフラバンが同定されている。
【０１２１】
これら広範囲な試みにより物質の新規の組成物が発見され、該物質はＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭと呼ばれ、２００２年３月２２日付けで出願された米国特許出願第１０／１０４，４７７号、表題「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｕａｌ  ＣＯＸ−２  ａｎｄ  ５−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ａｃａｓｉａ」で説明されている。この物質の組成物は、特定の化合物の２つのクラス、遊離Ｂ環フラボノイドおよびフラバンの混合物を含む。この物質の組成物は、ＣＯＸ−２酵素を直接抑制するだけでなく、５−リポキシゲナーゼ活性も抑制し、遺伝子発現レベルで影響を有することが示されている。ＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭの炎症性プロセスを阻害する能力は、試験モデルの４つのレベル、すなわち遺伝子発現、精製酵素、細胞に基づく分析、および、インビボでの動物モデルで実証された。この産物の効率は、医薬およびその他の標準化した植物抽出物に対して評価された。ＣＯＸ−２阻害に関して、一般的に、ＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭは、インビボにおいて、イブプロフェンより８〜１０倍優れて作用し、処方箋によってのみ利用可能な効力のある抗炎症性剤であるインドメタシンと同等か、またはそれより優れている。加えて、ＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭは、これら２種の薬物より利点を有し、すなわち、炎症反応が起こっている細胞においてＬＴＢ４生産も抑制し、それに反して、イブプロフェンやインドメタシンは、細胞からの放出を抑制することしか出来ない。これは、遊離Ｂ環フラボノイドとＣＯＸ−２阻害活性との相関性の初めての報告であると考えられている。また、とも考えられている。これは、フラバンが５−ＬＯ経路を抑制することに関する初めての報告である。ＣＯＸ−２および５−ＬＯが介在する病気や症状を予防および治療するための、この新規の２種の特定な化合物クラスの混合物は、数種の炎症性疾患を治療するための栄養補助食品の新規のクラスを代表する。産物およびその成分は、細胞および動物モデルにおける安全性に関して評価された。急性プロトコールにおいて、高濃度の遊離Ｂ環フラボノイドおよびフラバンを含む個々に標準化した抽出物、同様に、ＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭ製品を、投与量２ｇ／ｋｇ（ヒト一日量５００ｍｇに対して２０回）で投与したところ、重量の増加、外観、挙動、器官の全般的な検死外観、胃および肝臓の組織学、ならびに、血液研究において異常は起こらなかった。
【０１２２】
図２２は、栄養補助食品製品−ＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭの販売シートの例を示し、図２３は、該製品の分析証明書（ＣＯＡ）である。
【０１２３】
実施例１６．栄養補助食品および化粧用製品を発見するためのＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセス
新規の栄養補助食品および化粧用組成物を発見するためのＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスは、図２４および２５で図式的に示される２種の別々のプロトコールで説明することができる。図２４に示すように、ＰｈｙｔｏＬｏｇｉｘによる発見は、薬用植物ライブラリーに貯蔵された千の薬用植物の収集から始められる。指標および使用に基づくインフォマティックデータベース検索により、似たような伝統的な用途を有する２０〜５０種の薬用植物が得られる可能性がある。次に、これら植物を実施例３で説明したように抽出し、開発された生化学的、生物学的および遺伝子発現標的に対して、好ましくはハイスループットモデルで、上述の選択された標的および指標に基づき、有機および水性抽出物をスクリーニングすることができる。可能であれば、植物全体ライブラリーは、可能性のあるヒット数を最大化するために、抽出物および／またはＨＴＰ分画の形態で、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）システムによりスクリーニングしてもよい。次に、ポジティブヒットに、上述した分画化、デレプリケーション、単離、および、再分析を行い、上記実施例で説明したような新規の活性天然産物の同定を可能にする。次に、植物抽出物の標準化および／または濃縮および／または精製を、活性プロフィールおよび化学フィンガープリントに基づき続けることができる。インビトロおよびインビボモデルでの、標準化した抽出物および／または濃縮した成分および／または精製された活性化合物の、安全性および毒性の二次効率分析および評価により、複数の可能性を限られた数の候補産物に最適化することができる。
【０１２４】
図２５で説明するように、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスは、薬理学的、化学的および安全性プロフィールが以前の発見プロセスで作製された候補産物から始められる。候補に関する情報のさらなる検索は、知的財産の位置付け、可能性のある製造のための原料植物の調達、市場および規定に焦点を当てる。これら試みにより、産物の新規制，市場での可能性、および、さらなる開発計画に関する結論を得ることができる。開発の最終フェーズは、製造プロセス、品質制御方法論、プロトタイプ製品、プロトタイプ製品に基づく効率および安全性のさらなる確認、臨床評価、ならびに、最終産物の発売を行うことである。
【０１２５】
産物発見および開発の試みを目的とした実践的なガイドラインを含むＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスを、時間効率的かつコストに敏感にするために、２つのプロセス制御メカニズムが開発された。図２６で示すように、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭタスクチェックリストは、様々な段階の発見および開発プロセスの際に用いることができ、重要なタスクを実行するのに有用であり、最終産物に関する重要な情報やデータの見落としを防ぐことができる。図２７で説明されたように、コストおよび時間見積もりの作製が作製され、全プロセスで必要な労働、予算および時間の一般的なアウトラインを用いてプロジェクトを管理することができる。分析の最も重要な部分は、プロジェクトの進行および重要なデータポイントから得られた結論に基づく意思決定プロセスである。
【０１２６】
【表１】
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【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
【表３】
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【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
【表５】
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【０１３１】
【表６】
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【０１３２】
【表７】
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【０１３３】
【表８】
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【０１３４】
【表９】
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【０１３５】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、薬用植物コレクターにより提出された代表的な収集フォームを示す。示された収集フォームは、植物起源、植物の同定、地質学的分布、民族学的指標、化学成分および参考文献に関する情報を含む。
【図２】図２は、植物、リサーチデータおよび参考文献に関する全ての情報を含むデータベース中の、表およびそれら表の関係を示す。
【図３】図３は、特定の問い合わせに基づく最終報告を作製するために、データベース中の表から情報を引き出すように設計されたマクロを示す。
【図４】図４は、植物の情報、植物の重量、抽出物の重量および民族学的指標を含むＰｏｌｙｇｏｎｕｍ  ｖｉｖｉｐａｒｕｍに関する代表的な植物情報の概要を示す。
【図５Ａ】図５は、Ｄａｐｈｎｅ  ｇｅｎｋｗａ（Ｐ０４９０）の花からの有機抽出物（図５Ａ）、水性抽出物（図５Ｂ）およびメタノール抽出物（図５Ｃ）のＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラムを示す。メタノール抽出物において特定のピークは存在せず、有機抽出物または水性抽出物のいずれにも存在しなかった。
【図５Ｂ】図５は、Ｄａｐｈｎｅ  ｇｅｎｋｗａ（Ｐ０４９０）の花からの有機抽出物（図５Ａ）、水性抽出物（図５Ｂ）およびメタノール抽出物（図５Ｃ）のＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラムを示す。メタノール抽出物において特定のピークは存在せず、有機抽出物または水性抽出物のいずれにも存在しなかった。
【図５Ｃ】図５は、Ｄａｐｈｎｅ  ｇｅｎｋｗａ（Ｐ０４９０）の花からの有機抽出物（図５Ａ）、水性抽出物（図５Ｂ）およびメタノール抽出物（図５Ｃ）のＨＰＬＣ／ＵＶクロマトグラムを示す。メタノール抽出物において特定のピークは存在せず、有機抽出物または水性抽出物のいずれにも存在しなかった。
【図６Ａ】図６は、Ｄａｐｈｎｅ  ｇｅｎｋｗａ（Ｐ０４９０）の花からの有機抽出物（図６Ａ）、水性抽出物（図６Ｂ）およびメタノール抽出物（図６Ｃ）の、ＨＰＬＣ／ＭＳのトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示す。メタノール抽出物において特定のピークは存在せず、有機抽出物または水性抽出物のいずれにおいても存在しなかった。
【図６Ｂ】図６は、Ｄａｐｈｎｅ  ｇｅｎｋｗａ（Ｐ０４９０）の花からの有機抽出物（図６Ａ）、水性抽出物（図６Ｂ）およびメタノール抽出物（図６Ｃ）の、ＨＰＬＣ／ＭＳのトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示す。メタノール抽出物において特定のピークは存在せず、有機抽出物または水性抽出物のいずれにおいても存在しなかった。
【図６Ｃ】図６は、Ｄａｐｈｎｅ  ｇｅｎｋｗａ（Ｐ０４９０）の花からの有機抽出物（図６Ａ）、水性抽出物（図６Ｂ）およびメタノール抽出物（図６Ｃ）の、ＨＰＬＣ／ＭＳのトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を示す。メタノール抽出物において特定のピークは存在せず、有機抽出物または水性抽出物のいずれにおいても存在しなかった。
【図７】図７は、Ｐｕｌｓａｔｉｌｌａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓの根からの有機抽出物に関するハイスループット精製システムの分離効率を示す。その他のＨＴＰ分画をいずれもシリカゲルＴＬＣプレートにスポットして展開し、ヘキサン中の６０％ＥｔＯＡｃで展開した。ＴＬＣプレートに硫酸中の着色剤ニコチンアルデヒド（ａｎｉａｌｄｅｈｙｄｅ）を広げた。
【図８】図８は、Ｐｕｌｓａｔｉｌｌａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓの根からの有機抽出物の分画化から収集された９６ディープウェルプレートにおける各ＨＴＰ分画の重量分布を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｅ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｆ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｇ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｈ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｉ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｊ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｋ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図９Ｌ】図９Ａ〜９Ｌは、本明細書で開示されたハイスループット精製システム再現性を示す。特に、これらは、Ａｉｎｓｌｉａｅａ  ｈｅｎｒｙｉの植物全体から単離された同じ水性抽出物の１２の逆相Ｃ−１８カラム分画化からの１２のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図１０】図１０は、ＣＯＸ阻害活性に関する１２３０種の植物抽出物のスクリーニングから得られたポジティブヒット率を示す。ポジティブヒット率は、有機抽出物に関して１．２％ポジティブであり、水性抽出物に関して０．６％であった。このスクリーニングにより、２２種の活性な植物抽出物が同定された。
【図１１】図１１は、様々な植物種からの３９６種の有機抽出物のチロシナーゼ阻害分布パターンを示す。トータルで３６種の植物抽出物が、チロシナーゼ活性の＞６０％阻害を示し、９．１％のポジティブヒット率を有していた。
【図１２】図１２は、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐ０６０５）の葉からの水性抽出物の逆相分画化のＨＴＰ／ＵＶクロマトグラムを示す。
【図１３】図１３は、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐ０６０５）の葉の水性抽出物からの様々なＨＴＰ分画により、ＣＯＸ−１（■）およびＣＯＸ−２（◆）の阻害を図示する。
【図１４】図１４は、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐ０６０５）の葉の水性抽出物から得られた生物活性ＨＴＰ分画Ｄ３のオンラインＰＤＡ／ＭＳベースイオンクロマトグラム（ＢＩＣ）を示す。
【図１５Ａ】図１５は、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐ０６０５）の葉の水性抽出物から得られたＨＴＰ生物活性分画Ｄ３のオフライン分析からのＨＰＬＣ／ＰＤＡクロマトグラム（図ｌ５Ａ）およびＨＰＬＣ／ＭＳトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）（図１５Ｂ）を示す。
【図１５Ｂ】図１５は、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐ０６０５）の葉の水性抽出物から得られたＨＴＰ生物活性分画Ｄ３のオフライン分析からのＨＰＬＣ／ＰＤＡクロマトグラム（図ｌ５Ａ）およびＨＰＬＣ／ＭＳトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）（図１５Ｂ）を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、オンラインＨＴＰ／ＭＳおよびオフラインＨＰＬＣ／ＭＳからのデータ収集に基づくＨＴＰ生物活性分画Ｄ３の同一なマススペクトルを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、実施例１１で説明されたデレプリケーション法の結果を示す。図１６Ｂからわかるように、分画Ｄ３は、単一の既知化合物−没食子酸エピガロカテキン（その構造を図中に示す）を含んでいた。
【図１７】図１７は、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐ０６０５）の水性抽出物からの１６種の生物活性ＨＴＰ分画全てのデレプリケーションの結果を示す。１０種の化合物が２４個のＨＴＰ分画中に存在し、その全ての構造は既知であり、図１７に示される。
【図１８】図１８は、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（Ｐ０３６８）の植物全体の有機抽出物からのＨＴＰ分画の、細胞毒性に対するメラニン生成阻害活性を示す。メラニン生成阻害活性を示す複数のピークは、多数の活性成分が粗抽出物中に存在することを示す。分画Ｃ１０〜Ｄ１２にわたり存在するピークは、細胞毒性により生じた誤ったピークである。
【図１９Ａ】図１９は、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（植物全体）（Ｐ０３６８）から得られた表題の有機抽出物のＨＴＰ分画のメラニン阻害分析から同定された活性ピークのデレプリケーションの結果を示す。図１９Ａ〜Ｆは、オフラインＬＣ／ＭＳから収集された活性な分画Ｄ２〜Ｄ７トータルイオンクロマトグラムを示す。保持時間１６．３３分に存在するピークは、分画Ｄ３〜Ｄ６で出現しており、チロシナーゼ阻害のピークと正確に適合する。図１９Ｇは、分画Ｄ４からのこのピークのマススペクトル（Ｒｔ＝１６．３３分）を示す。デレプリケーションにより、既知のポリフェノールプテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂ（図１９Ｈ）が同定された。
【図１９Ｂ】図１９は、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（植物全体）（Ｐ０３６８）から得られた表題の有機抽出物のＨＴＰ分画のメラニン阻害分析から同定された活性ピークのデレプリケーションの結果を示す。図１９Ａ〜Ｆは、オフラインＬＣ／ＭＳから収集された活性な分画Ｄ２〜Ｄ７トータルイオンクロマトグラムを示す。保持時間１６．３３分に存在するピークは、分画Ｄ３〜Ｄ６で出現しており、チロシナーゼ阻害のピークと正確に適合する。図１９Ｇは、分画Ｄ４からのこのピークのマススペクトル（Ｒｔ＝１６．３３分）を示す。デレプリケーションにより、既知のポリフェノールプテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂ（図１９Ｈ）が同定された。
【図１９Ｃ】図１９は、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（植物全体）（Ｐ０３６８）から得られた表題の有機抽出物のＨＴＰ分画のメラニン阻害分析から同定された活性ピークのデレプリケーションの結果を示す。図１９Ａ〜Ｆは、オフラインＬＣ／ＭＳから収集された活性な分画Ｄ２〜Ｄ７トータルイオンクロマトグラムを示す。保持時間１６．３３分に存在するピークは、分画Ｄ３〜Ｄ６で出現しており、チロシナーゼ阻害のピークと正確に適合する。図１９Ｇは、分画Ｄ４からのこのピークのマススペクトル（Ｒｔ＝１６．３３分）を示す。デレプリケーションにより、既知のポリフェノールプテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂ（図１９Ｈ）が同定された。
【図１９Ｄ】図１９は、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（植物全体）（Ｐ０３６８）から得られた表題の有機抽出物のＨＴＰ分画のメラニン阻害分析から同定された活性ピークのデレプリケーションの結果を示す。図１９Ａ〜Ｆは、オフラインＬＣ／ＭＳから収集された活性な分画Ｄ２〜Ｄ７トータルイオンクロマトグラムを示す。保持時間１６．３３分に存在するピークは、分画Ｄ３〜Ｄ６で出現しており、チロシナーゼ阻害のピークと正確に適合する。図１９Ｇは、分画Ｄ４からのこのピークのマススペクトル（Ｒｔ＝１６．３３分）を示す。デレプリケーションにより、既知のポリフェノールプテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂ（図１９Ｈ）が同定された。
【図１９Ｅ】図１９は、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（植物全体）（Ｐ０３６８）から得られた表題の有機抽出物のＨＴＰ分画のメラニン阻害分析から同定された活性ピークのデレプリケーションの結果を示す。図１９Ａ〜Ｆは、オフラインＬＣ／ＭＳから収集された活性な分画Ｄ２〜Ｄ７トータルイオンクロマトグラムを示す。保持時間１６．３３分に存在するピークは、分画Ｄ３〜Ｄ６で出現しており、チロシナーゼ阻害のピークと正確に適合する。図１９Ｇは、分画Ｄ４からのこのピークのマススペクトル（Ｒｔ＝１６．３３分）を示す。デレプリケーションにより、既知のポリフェノールプテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂ（図１９Ｈ）が同定された。
【図１９Ｆ】図１９は、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（植物全体）（Ｐ０３６８）から得られた表題の有機抽出物のＨＴＰ分画のメラニン阻害分析から同定された活性ピークのデレプリケーションの結果を示す。図１９Ａ〜Ｆは、オフラインＬＣ／ＭＳから収集された活性な分画Ｄ２〜Ｄ７トータルイオンクロマトグラムを示す。保持時間１６．３３分に存在するピークは、分画Ｄ３〜Ｄ６で出現しており、チロシナーゼ阻害のピークと正確に適合する。図１９Ｇは、分画Ｄ４からのこのピークのマススペクトル（Ｒｔ＝１６．３３分）を示す。デレプリケーションにより、既知のポリフェノールプテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂ（図１９Ｈ）が同定された。
【図１９Ｇ】図１９は、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（植物全体）（Ｐ０３６８）から得られた表題の有機抽出物のＨＴＰ分画のメラニン阻害分析から同定された活性ピークのデレプリケーションの結果を示す。図１９Ａ〜Ｆは、オフラインＬＣ／ＭＳから収集された活性な分画Ｄ２〜Ｄ７トータルイオンクロマトグラムを示す。保持時間１６．３３分に存在するピークは、分画Ｄ３〜Ｄ６で出現しており、チロシナーゼ阻害のピークと正確に適合する。図１９Ｇは、分画Ｄ４からのこのピークのマススペクトル（Ｒｔ＝１６．３３分）を示す。デレプリケーションにより、既知のポリフェノールプテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂ（図１９Ｈ）が同定された。
【図１９Ｈ】図１９は、Ｍａｌｌｏｔｕｓ  ｒｅｐａｎｄｕｓ（植物全体）（Ｐ０３６８）から得られた表題の有機抽出物のＨＴＰ分画のメラニン阻害分析から同定された活性ピークのデレプリケーションの結果を示す。図１９Ａ〜Ｆは、オフラインＬＣ／ＭＳから収集された活性な分画Ｄ２〜Ｄ７トータルイオンクロマトグラムを示す。保持時間１６．３３分に存在するピークは、分画Ｄ３〜Ｄ６で出現しており、チロシナーゼ阻害のピークと正確に適合する。図１９Ｇは、分画Ｄ４からのこのピークのマススペクトル（Ｒｔ＝１６．３３分）を示す。デレプリケーションにより、既知のポリフェノールプテロカリアニン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｙａｎｉｎ）Ｂ（図１９Ｈ）が同定された。
【図２０】図２０は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ（Ｐ０４８３）の根から単離された遊離Ｂ環フラボノイド、バイカレインによる、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の阻害プロフィールを図示する。該化合物を、組換えヒツジＣＯＸ−１（◆）またはヒツジＣＯＸ−２（□）のそのペルオキシダーゼ活性阻害に関して試験した。データを阻害剤を用いない分析のパーセント阻害で示す。ＣＯＸ−１に関するＩＣ５０は、０．１８μｇ／ｍＬ／酵素ユニットであり、一方、ＣＯＸ−２に関するＩＣ５０は、０．４８μｇ／ｍＬ／ユニットであった。
【図２１Ａ】図２１は、Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓの根から単離された標準化した遊離Ｂ環フラボノイド抽出物により、アラキドン酸阻害が炎症を誘導したことを示す。インビボでの効率の評価は、アラキドン酸の直接適用により誘導された膨張を阻害する能力に基づきなされた。処理した耳とコントロールの耳との間の膨張における平均の差を図２１Ａに示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、アラキドン酸処理コントロールと比較した各グループパーセント阻害を示す。
【図２２】図２２は、本発明のＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ技術基盤を用いて発見および開発された栄養補助食品ＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭの販売シートを示す。
【図２３】図２３は、栄養補助食品および化粧品市場で売られている市販品としてのＵｎｉｖｅｓｔｉｎＴＭある代表的なバッチに関する分析の証明書（ＣＯＡ）を示す。
【図２４】図２４は、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ発見プロセスを図式的に示す。植物収集ライブラリーの分析および市場の要求から、優先的な植物抽出物を分析するためにハイスループットスクリーニングモデルを開発した。生物活性を同定した後、標準化した抽出物／濃縮した分画／純粋な化合物に基づき、薬理学的および安全性プロフィールを作製した。このプロセスの生産品は、候補産物である。
【図２５】図２５は、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭ開発プロセスを図式的に示す。候補産物、情報検索および製品開発により、製品使用のための植物源が同定され、知的財産の位置付けおよび市場の利点に関する推奨が得られる。製造プロセス開発、および、パイロット規模プロトタイプ製品の製造に続き、効率および安全性プロフィールの確認が行われる。臨床試験がうまくいくことや、最終産物の発売をもって、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスの完了とする。
【図２６】図２６は、重要なタスクのチェックリストを示し、これは、重要な活性の経過を追い、データ作製を続けるために、ＰｈｙｔｏｌｏｇｉｘＴＭプロセスで利用することが可能である。
【図２７】図２７は、Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｘ基盤における、時間、コスト見積もり、および意思決定法を示す。該図は、フルタイムの従業員の必要性、ならびに、発見および開発の各段階でかかる時間およびコストを示す。これは、プロジェクトマネージャーに、重要な意思決定ポイントそれぞれにおけるプロジェクトの進行を評価する機会を与える。
【図１】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｌ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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