(57)【要約】本発明は、膵臓の癌を処置するための薬剤に関し、この薬剤はＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに適した２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓癌を処置するための医薬であって、該医薬が、ＲＮＡ干渉によってＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに好適な２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、前記医薬。
【請求項２】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、Ｋ−ｒａｓの恒常的な活性化をもたらすように変異している、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、コドン１２、１３または６１で変異している、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子において、コドン１２は、アルギニン、セリン、アラニン、バリン、システインまたはアスパラギン酸をコードし、コドン１３は、アスパラギン酸をコードし、または、コドン６１はヒスチジンまたはロイシンをコードする、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と少なくとも断片的に相補的な領域を有し、特に２５個より少ない連続したヌクレオチドからなる、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬。
【請求項６】
相補的な領域が、１９〜２４個、好ましくは２０〜２４個、特に好ましくは２１〜２３個、そして特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬。
【請求項７】
鎖Ｓ１が、３０個より少ない、好ましくは２５個より少ない、特に好ましくは２１〜２４個、そして特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを有する、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項９】
１本鎖のオーバーハングが、鎖Ｓ１の３’末端に位置する、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端に位置する末端のみに、１本鎖のオーバーハングを有する、請求項１〜９のいずれかに記載の医薬。
【請求項１１】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬。
【請求項１２】
鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
鎖Ｓ１が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物と相補的である、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬。
【請求項１４】
ｄｓＲＮＡが、添付の配列表に示すとおりの、配列番号１の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号２の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号３の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号４の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号５の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号６の配列を有する鎖Ｓ１とからなる、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬。
【請求項１５】
医薬中のｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容されるバッファーまたは生理食塩水中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、カプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項１〜１４のいずれかに記載の医薬。
【請求項１６】
医薬が、吸入、経口摂取、注入または注射、特に静脈内、腹腔内もしくは腫瘍内注入または注射に好適な製剤である、請求項１〜１５のいずれかに記載の医薬。
【請求項１７】
製剤が、特に、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水または生理学的に許容されるバッファー、特にリン酸緩衝食塩水とからのみなる、請求項１〜１６のいずれかに記載の医薬。
【請求項１８】
医薬が、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇ、そして最適には２５μｇの最大用量を達成するのが可能な量でｄｓＲＮＡを含む少なくとも１用量単位で存在する、請求項１〜１７のいずれかに記載の医薬。
【請求項１９】
ＲＮＡ干渉によってＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに好適な２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の、膵臓癌を処置するための医薬の製造への使用。
【請求項２０】
ＲＮＡ干渉によってＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに好適な２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の、膵臓癌を処置するための使用。
【請求項２１】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、Ｋ−ｒａｓの恒常的な活性化をもたらすように変異している、請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、コドン１２、１３または６１で変異している、請求項１９〜２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子において、コドン１２は、アルギニン、セリン、アラニン、バリン、システインまたはアスパラギン酸をコードし、コドン１３は、アスパラギン酸をコードし、または、コドン６１はヒスチジンまたはロイシンをコードする、請求項１９〜２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と少なくとも断片的に相補的な領域を有し、特に２５個より少ない連続したヌクレオチドからなる、請求項１９〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
相補的な領域が、１９〜２４個、好ましくは２０〜２４個、特に好ましくは２１〜２３個、そして特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項１９〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
鎖Ｓ１が、３０個より少ない、好ましくは２５個より少ない、特に好ましくは２１〜２４個、そして特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項１９〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを有する、請求項１９〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
１本鎖のオーバーハングが、鎖Ｓ１の３’末端に位置する、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端に位置する末端のみに、１本鎖のオーバーハングを有する、請求項１９〜２８のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有する、請求項１９〜２９のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
鎖Ｓ１が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物と相補的である、請求項１９〜３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
ｄｓＲＮＡが、添付の配列表に示すとおりの、配列番号１の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号２の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号３の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号４の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号５の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号６の配列を有する鎖Ｓ１とからなる、請求項１９〜３２のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
ｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容されるバッファーまたは生理食塩水中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、カプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項１９〜３３のいずれかに記載の使用。
【請求項３５】
ｄｓＲＮＡが、吸入、経口摂取、注入または注射、特に静脈内、腹腔内もしくは腫瘍内注入または注射に好適な製剤中に存在する、請求項１９〜３４のいずれかに記載の使用。
【請求項３６】
製剤が、特に、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水または生理学的に許容されるバッファー、特にリン酸緩衝食塩水とからのみなる、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
ｄｓＲＮＡが、経口的に、吸入、注入または注射によって、特に静脈内、腹腔内もしくは腫瘍内注入または注射によって投与される、請求項１９〜３６に記載の使用。
【請求項３８】
ｄｓＲＮＡが、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇ、そして最適には２５μｇの最大用量で用いられる、請求項１９〜３７のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓癌を処置するための医薬および膵臓癌を処置するための使用、ならびにかかる医薬を製造するための使用に関する。
【０００２】
膵臓癌および膵臓の腺癌は、それぞれ、最も予後の不良な癌に含まれる。膵臓癌の原因についてはほとんど知られていない。現在まで、適切な処置法はない。他の遺伝子変化は別として、膵臓癌細胞は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に頻繁に変異を示す。変異は、特にコドン１２、１３および６１において検出された。Ｋ−ｒａｓ遺伝子は、ＧＴＰ結合Ｋ−ｒａｓタンパク質をコードする原癌遺伝子である。Ｋ−ｒａｓは、細胞の細胞膜の細胞質側に位置し、受容体チロシンキナーゼと会合している。ＧＴＰの結合はＫ−ｒａｓを活性化する。不活性化は、結合したＧＴＰのリン酸残基の加水分解によって生じる。この結果形成されたＧＤＰの遊離、そしてＧＴＰの新たな結合は、Ｋ−ｒａｓの再活性化をもたらすことができる。上記の変異は、Ｋ−ｒａｓの１個のアミノ酸の置換を、そして、その恒常的な活性化をもたらすことができる。Ｋ−ｒａｓの活性化は、とりわけプロテインキナーゼＣを活性化させる。
【０００３】
細胞内で標的遺伝子の発現を阻害する方法はDE 101 00 586 C1から知られており、該方法においては、２本鎖構造を有するオリゴリボヌクレオチドを細胞内に導入する。２本鎖構造の１鎖は、標的遺伝子と相補的である。なお、この阻害の基礎となる原理はＲＮＡ干渉と呼ばれる。
本発明の課題は、従来技術による欠点を克服することである。特に、有効な医薬および膵臓癌を処置するための使用を利用可能とする。さらに、かかる医薬を製造するための使用を利用可能とする。
【０００４】
この課題は、請求項１、１９および２０に記載の特徴によって解決される。有利な態様は、請求項２〜１８および２１〜３８に記載の特徴によりもたらされる。
この発明によれば、膵臓癌、特にヒトにおけるものを処置するための医薬が意図され、ここで、該医薬は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現をＲＮＡ干渉により阻害するのに好適な２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む。ｄｓＲＮＡ中のすべてのヌクレオチドが、標準的なワトソン−クリック塩基対を有する必要はない。特に、個々の、非相補的塩基対は、仮にあったとしても、有効性を損なうことはほとんどない。塩基対の可能な最大数はまた、ｄｓＲＮＡに含まれる最短の鎖におけるヌクレオチドの数でもある。
【０００５】
本医薬は、膵臓癌において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で、ｄｓＲＮＡを含むことができる。本医薬はまた、該医薬のいくつかの単位の合計が、合わせてこの十分な量を含むように設計することもできる。当該十分量は、投与の形態に依存する。必要な量を保証するために、ｄｓＲＮＡは、増大する量または投薬量で投与することができる。そして、この量でＫ−ｒａｓ遺伝子の発現の阻害が生じているかを決定するために、膵臓癌から採取した組織試料を既知の方法で試験することができる。これらの方法は、例えば、分子生物学的、生化学的、または免疫学的方法を含む。
【０００６】
驚くべきことに、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を選択的に阻害することができるｄｓＲＮＡで処置することにより、膵臓癌細胞の増殖を阻害することができ、そして生存腫瘍細胞数を減少させ得ることが示された。さらに驚くべきことに、非悪性細胞の増殖挙動は、かかる処置によってもおおむね影響を受けない。本医薬は、膵臓癌細胞のアポトーシス率を増加させることができる。かかる医薬を用い、in vivoで膵臓腫瘍の増殖を効果的に阻害することが可能である。
【０００７】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、Ｋ−ｒａｓの恒常的な活性化をもたらすように変異されていてもよい。本発明による医薬によるかかる遺伝子の発現の阻害は、膵臓癌の増殖の阻害において特に有効である。Ｋ−ｒａｓ遺伝子は、コドン１２、１３または６１において変異されていることができる。変異したＫ−ｒａｓ遺伝子において、コドン１２はアルギニン、セリン、アラニン、バリン、システインまたはアスパラギン酸をコードすることができ、または、コドン１３は、アスパラギン酸をコードすることができ、または、コドン６１はヒスチジンまたはロイシンをコードすることができる。野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子において、コドン１２およびコドン１３はそれぞれグリシンをコードし、コドン６１はグルタミン酸をコードする。
【０００８】
好ましくは、ｄｓＲＮＡの１つの鎖Ｓ１は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と少なくとも断片的に（segmentally）相補的である、特に２５個より少ない連続したヌクレオチドからなる領域を有する。かかるｄｓＲＮＡは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに特に好適である。「Ｋ−ｒａｓ遺伝子」は、腫瘍細胞内のＫ−ｒａｓをコードする２本鎖ＤＮＡのＤＮＡ鎖であって、転写のための鋳型（matrix）として用いられるすべての転写された領域を含むＤＮＡ鎖と相補的なものを意味すると解される。したがって、Ｋ−ｒａｓ遺伝子は一般的にはセンス鎖である。鎖Ｓ１は、したがって、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現中に形成される、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ転写物またはそのプロセシング産物と相補的であることができる。
【０００９】
相補的なｄｓＤＮＡ領域は、１９〜２４個、好ましくは２０〜２４個、特に好ましくは２１〜２３個、そして特に２２個または２３個のヌクレオチドを有することができる。この構造を有するｄｓＲＮＡは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子を阻害するのに特に有効である。ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１は、３０個より少ない、好ましくは２５個より少ない、特に好ましくは２１〜２４個、そして特に２３個のヌクレオチドを有することができる。これらのヌクレオチドの数はまた、ｄｓＲＮＡにおける塩基対の可能な最大数でもある。かかるｄｓＲＮＡは、細胞内で特に安定である。
【００１０】
ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを有する場合、特に有利であることが示された。かかるｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの末端に１本鎖のオーバーハングを有さないｄｓＲＮＡと比較して、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのにより優れた有効性を示す。ここで、１つの末端とは、５’および３’鎖末端が存在するｄｓＲＮＡの領域である。したがって、鎖Ｓ１のみからなるｄｓＲＮＡは、ループ構造および１つのみの末端を有する。鎖Ｓ１および鎖Ｓ２からなるｄｓＲＮＡは２つの末端を有する。いずれの場合においても、１つの末端は鎖Ｓ１上の、および鎖Ｓ２上の鎖末端により形成される。
【００１１】
１本鎖のオーバーハングは、好ましくは鎖Ｓ１の３’末端に位置する。この一本鎖オーバーハングの位置は、医薬の効力のさらなる増加をもたらす。１つの例において、ｄｓＲＮＡは１つの末端、特に鎖Ｓ１の３’末端に位置する末端のみに１本鎖のオーバーハングを有する。２つの末端を有するｄｓＲＮＡの他方の末端は平滑であり、すなわちオーバーハングがない。かかるｄｓＲＮＡは、種々の細胞培養培地中、ならびに血液および血清中で特に安定であることが示された。
【００１２】
好ましくは、ｄｓＲＮＡは鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有しており、すなわち、２本の１本鎖からなる。本医薬は、鎖Ｓ１（アンチセンス鎖）が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２ヌクレオチドで構成される１本鎖のオーバーハングを有する場合に、特に有効である。ここで、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である。鎖Ｓ１は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物と相補的であることができる。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、添付の配列表に示すとおりの、配列番号１の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号２の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号３の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号４の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号５の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号６の配列を有する鎖Ｓ１とからなる。かかるｄｓＲＮＡは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに特に有効である。
【００１３】
本医薬において、ｄｓＲＮＡは、溶液中に、特に生理学的に許容されるバッファーまたは生理食塩水中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、カプシド、カプソイド（capsoid）または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在することができる。
生理学的に許容されるバッファーは、リン酸緩衝生理食塩水であることができる。ミセル構造、リポソーム、カプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルは、ｄｓＲＮＡの腫瘍細胞への取り込みを促進することができる。高分子ナノもしくはマイクロカプセルは、ポリブチルシアノアクリレートなどの少なくとも１種の生分解性ポリマーからなる。高分子ナノもしくはマイクロカプセルは、それに含まれたまたは結合したｄｓＲＮＡを、体内で輸送し、放出することができる。
【００１４】
本医薬は、吸入、経口摂取、注入または注射、特に静脈内、腹腔内もしくは腫瘍内注入または注射に好適な製剤であることができる。吸入、注入または注射に好適な製剤は、最も単純には、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水または生理学的に許容されるバッファー、特にリン酸緩衝整理食塩水とからなることができる。驚くべきことに、かかる溶媒またはバッファーに単純に溶解され、投与されたｄｓＲＮＡは、当該ｄｓＲＮＡが特殊なビヒクルに包まれる（be packaged）ことを要することなく、腫瘍細胞に取り込まれ、そしてＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害することが示された。
【００１５】
好ましくは、本医薬は、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇ、そして最適には２５μｇの最大用量を達成するのが可能な量でｄｓＲＮＡを含む、少なくとも１用量単位で存在する。ｄｓＲＮＡが、この用量においてもＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに顕著な有効性を発揮することが示された。用量単位は、単回の１日用量の投与または摂取のために設計することができる。この場合、１日用量の全体が、単一の用量単位に含まれている。用量単位が１日数回投与または摂取されるように設計されている場合、各用量に含まれるｄｓＲＮＡ量は、１日の総用量を達成するために、相応してより少ない。用量単位はまた、単回の数日間におよぶ投与または摂取のために、例えば、ｄｓＲＮＡが数日にわたって放出されるように設計されることができる。この場合、用量単位は相応して複数の１日用量を含む。
【００１６】
さらに、本発明によれば、ＲＮＡ干渉によってＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するために好適な２本鎖リボ核酸の、膵臓癌を処置するための医薬を製造するための使用が意図される。さらにまた、本発明によれば、ＲＮＡ干渉によってＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するために好適な２本鎖リボ核酸の、膵臓癌を処置するための使用が意図される。
本発明の使用の有利な態様については、上述の記載を参照されたい。
【００１７】
以下において、本発明を図を用いて例示的に説明する。「Ｍ」の略字は、「ｍｏｌ／ｌ」の代わりに用いられ、濃度を示す。
用いた２本鎖オリゴリボヌクレオチドは、配列表中配列番号１〜配列番号８として示した以下の配列を有する。
【００１８】
ＫＲＡＳ１は、コドン１２に第１の点突然変異を有するＹＡＰ  Ｃ細胞中のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の配列と相補的である。
【表１】
2005506385.tif 000002
ＫＲＡＳ１’は、コドン１２に第１の点突然変異を有する、ＮＭＲＩマウスに皮下移植されたヒト膵臓腺癌中のヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の配列と相補的である。
【表２】
2005506385.tif 000003
【００１９】
ＫＲＡＳ２は、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子からの野生型の配列と相補的である。
【表３】
2005506385.tif 000004
ＮＥＯは、ネオマイシン耐性遺伝子からの配列と相補的である。
【表４】
2005506385.tif 000005
【００２０】
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig (No. ACC 382)から得ることができる、ヒト膵臓癌細胞株ＹＡＰ  Ｃを、３７℃、５％ＣＯ２の恒常条件下で、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Biochrom, Berlin）中で培養した。
【００２１】
トランスフェクションは、６穴プレート中でオリゴフェクタミン（Invitrogen, Karlsruhe）を用いて行った。150,000個の細胞を各ウェルに入れた。２本鎖オリゴリボヌクレオチドのトランスフェクションは、オリゴフェクタミンについてInvitrogenにより推奨されているプロトコルに従って行った（データは、６穴プレート中の１ウェルに関する）。１０μｌの２本鎖オリゴリボヌクレオチド（０．１〜１０μＭ）を、添加物を含まない１７５μｌの細胞培養培地で希釈した。３μｌのオリゴフェクタミンを、添加物を含まない１２μｌの細胞培養培地で希釈し、室温で１０分インキュベートした。このようにして希釈したオリゴフェクタミンを、既に希釈してある２本鎖オリゴリボヌクレオチドに加え、混合し、室温で２０分インキュベートした。この間、トランスフェクトする細胞を、添加物を含まない細胞培養培地で１回洗浄し、８００μｌの新鮮な細胞培養培地を加えた。次に、上述のオリゴフェクタミン−ｄｓＲＮＡ混合液２００μｌを各ウェルに加え、最終トランスフェクション容量が１０００μｌになるようにした。
【００２２】
この結果、２本鎖オリゴリボヌクレオチドの最終濃度は１〜１００ｎＭとなる。トランスフェクションアッセイを、４時間、３７℃でインキュベートした。その後、３０％のＦＣＳを添加した５００μｌの細胞培養培地を各ウェルに加え、ＦＣＳの最終濃度が１０％となるようにした。次に、このアッセイを２４〜１２０時間、３７℃でインキュベートした。
アポトーシス率を決定するために、上清液をインキュベーション後に回収し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシンを用いて剥離し、１００ｇで１０分間遠心分離した。上清液を捨て、ペレットを低張なヨウ化プロピジウム溶液中、暗中にて、４℃で３０分インキュベートした。分析は、蛍光セルソーター（fluorescence-supported cell sorter）FACSCalibur （BD GmbH, Heidelberg）によるフローサイトメトリー法により行った。
【００２３】
図１は、増加する濃度のＫＲＡＳ１  ｄｓＲＮＡによるトランスフェクション後のインキュベーション時間に応じた、ヒト膵臓癌細胞ＹＡＰ  Ｃのアポトーシス率（パーセント）を示す。これから、ＫＲＡＳ１が、ヒト膵臓癌細胞において、濃度依存的なアポトーシスを誘導することを見ることができる。アポトーシス率は、インキュベーション時間と共に増加した。非処置ＹＡＰ  Ｃ細胞（コントロール）、および２本鎖オリゴリボヌクレオチドなしに上述のトランスフェクション法を行った細胞（模擬または偽トランスフェクション）も、１２０時間のインキュベーションの後、最大で５％のアポトーシスを示したにすぎないのに対し、１００ｎＭのＫＲＡＳ１によるトランスフェクションは、１２０時間後のアポトーシス率を２４％に増加させた。野生型Ｋ−ｒａｓと相補的なＫＲＡＳ２  ｄｓＲＮＡは、ＹＡＰ  Ｃ細胞において、同様の効率でアポトーシスを誘導した。
【００２４】
トランスフェクションの、増殖および生存細胞数への効果をそれぞれ決定するために、50,000個のＹＡＰ  Ｃ細胞を６穴プレートの各ウェルに入れ、上述のとおりにトランスフェクトした。生存細胞数は、２４〜１２０時間のインキュベーション後にトリパンブルー排除染色を行い、ノイバウエル計算版にて計数することにより決定した。結果を図２に示す。ＫＲＡＳ１は、ＹＡＰ  Ｃ細胞の増殖を濃度に依存して阻害することができた。生存細胞数は、わずか１ｎＭのＫＲＡＳ１を用いることにより、統計学的に有意に減少させることができた（１２０時間後、非処置コントロールに対してｐ＝０．００１）。
【００２５】
野生型Ｋ−ｒａｓと相補的なＫＲＡＳ２  ｄｓＲＮＡのトランスフェクションは、１００ｎＭの濃度で、生存細胞数の減少をもたらした。非悪性ヒト皮膚線維芽細胞は、ＫＲＡＳ１またはＫＲＡＳ２でトランスフェクトされても、その増殖挙動に変化を示さなかった。
【００２６】
in vivo実験のために、２〜３ｍｍの直径を有するヒト膵臓腺癌組織片をＮＭＲＩマウス（Harlan Winkelmann GmbH, Borchen）に皮下移植した。腫瘍が６〜７ｍｍの大きさに増殖した後、それぞれ生理食塩水に溶解した、体重ｋｇあたり２００μｇのＫＲＡＳ１’またはＮＥＯを、毎日腹腔内注射した。生理食塩水を、コントロールとして注射した。腫瘍は、毎日スライドゲージまたは標準テンプレート（standardized template）を用いて測定した。図３は、腹腔内注射による処置の開始からの日数（i.p.日数）として計った時間に応じて測定した腫瘍体積を、平均値±平均値の標準誤差としてｍｍ３で示している。これから、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と相補的なｄｓＲＮＡが、腫瘍の増殖を阻害する能力を有することを見ることができる。腫瘍の増殖は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と相補的なｄｓＲＮＡの、２００μｇ／ｋｇの用量での毎日の腹腔内適用によって阻害され、２４日間の処置後の腫瘍体積は、コントロール群で見られた腫瘍体積の６２％でしかなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の一次配列と相補的なｄｓＲＮＡでトランスフェクトした後のインキュベーション時間に応じた、ヒト膵臓癌細胞ＹＡＰ  Ｃのアポトーシス率（パーセント）を示した図である。
【図２】ｄｓＲＮＡでトランスフェクトした後の生存細胞数を示した図である。
【図３】ＮＭＲＩマウスにおける、皮下に移植したヒト膵臓腺癌の体積を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
2005506385.tif 000009
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月11日(2003.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓癌を処置するための医薬であって、該医薬が、ＲＮＡ干渉によってＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに好適な２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と少なくとも断片的に相補的な領域を有し、ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１の３’末端に位置する末端のみに１本鎖のオーバーハングを有する、前記医薬。
【請求項２】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、Ｋ−ｒａｓの恒常的な活性化をもたらすように変異している、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、コドン１２、１３または６１で変異している、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子において、コドン１２は、アルギニン、セリン、アラニン、バリン、システインまたはアスパラギン酸をコードし、コドン１３は、アスパラギン酸をコードし、または、コドン６１はヒスチジンまたはロイシンをコードする、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
少なくとも断片的に相補的な領域が、２５個より少ない連続したヌクレオチドからなる、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬。
【請求項６】
相補的な領域が、１９〜２４個、好ましくは２０〜２４個、特に好ましくは２１〜２３個、そして特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬。
【請求項７】
鎖Ｓ１が、３０個より少ない、好ましくは２５個より少ない、特に好ましくは２１〜２４個、そして特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
１本鎖のオーバーハングが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬。
【請求項９】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の医薬。
【請求項１０】
鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
鎖Ｓ１が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物と相補的である、請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬。
【請求項１２】
ｄｓＲＮＡが、添付の配列表に示すとおりの、配列番号１の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号２の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号３の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号４の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号５の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号６の配列を有する鎖Ｓ１とからなる、請求項１〜１１のいずれかに記載の医薬。
【請求項１３】
医薬中のｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容されるバッファーまたは生理食塩水中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、カプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬。
【請求項１４】
医薬が、吸入、経口摂取、注入または注射、特に静脈内、腹腔内もしくは腫瘍内注入または注射に好適な製剤である、請求項１〜１３のいずれかに記載の医薬。
【請求項１５】
製剤が、特に、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水または生理学的に許容されるバッファー、特にリン酸緩衝食塩水とからのみなる、請求項１〜１４のいずれかに記載の医薬。
【請求項１６】
医薬が、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇ、そして最適には２５μｇの最大用量を達成するのが可能な量でｄｓＲＮＡを含む、少なくとも１用量単位で存在する、請求項１〜１５のいずれかに記載の医薬。
【請求項１７】
ＲＮＡ干渉によってＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに好適な２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の、膵臓癌を処置するための医薬の製造への使用であって、該医薬は、ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子と少なくとも断片的に相補的な領域を有し、ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１の３’末端に位置する末端のみに１本鎖のオーバーハングを有する、前記使用。
【請求項１８】
ＲＮＡ干渉によってＫ−ｒａｓ遺伝子の発現を阻害するのに好適な２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の、膵臓癌を処置するための使用。
【請求項１９】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、Ｋ−ｒａｓの恒常的な活性化をもたらすように変異している、請求項１７または１８に記載の使用。
【請求項２０】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、コドン１２、１３または６１で変異している、請求項１７〜１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
Ｋ−ｒａｓ遺伝子において、コドン１２は、アルギニン、セリン、アラニン、バリン、システインまたはアスパラギン酸をコードし、コドン１３は、アスパラギン酸をコードし、または、コドン６１はヒスチジンまたはロイシンをコードする、請求項１７〜２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
少なくとも断片的に相補的な領域が、２５個より少ない連続したヌクレオチドからなる、請求項１７〜２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
相補的な領域が、１９〜２４個、好ましくは２０〜２４個、特に好ましくは２１〜２３個、そして特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項１７〜２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
鎖Ｓ１が、３０個より少ない、好ましくは２５個より少ない、特に好ましくは２１〜２４個、そして特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項１７〜２３のいずれかに記載の使用。
【請求項２５】
１本鎖のオーバーハングが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる、請求項１７〜２４のいずれかに記載の使用。
【請求項２６】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有する、請求項１７〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
鎖Ｓ１が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物と相補的である、請求項１７〜２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
ｄｓＲＮＡが、添付の配列表に示すとおりの、配列番号１の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号２の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号３の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号４の配列を有する鎖Ｓ１、または、配列番号５の配列を有する鎖Ｓ２と配列番号６の配列を有する鎖Ｓ１とからなる、請求項１７〜２８のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
ｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容されるバッファーまたは生理食塩水中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、カプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項１７〜２９のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
ｄｓＲＮＡが、吸入、経口摂取、注入または注射、特に静脈内、腹腔内もしくは腫瘍内注入または注射に好適な製剤中に存在する、請求項１７〜３０のいずれかに記載の使用。
【請求項３２】
製剤が、特に、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水または生理学的に許容されるバッファー、特にリン酸緩衝食塩水とからのみなる、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
ｄｓＲＮＡが、経口的に、吸入、注入または注射によって、特に静脈内、腹腔内もしくは腫瘍内注入または注射によって投与される、請求項１７〜３２に記載の使用。
【請求項３４】
ｄｓＲＮＡが、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇ、そして最適には２５μｇの最大用量で用いられる、請求項１７〜３３のいずれかに記載の使用。
【国際調査報告】
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