(57)【要約】本発明は、心臓の疾病または病態を診断および治療する方法、該疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定する方法、および該疾病または病態を治療または予防するためのこれら化合物の使用方法を提供する。また、スクリーニング法において使用可能な動物モデル系も本発明において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の試料の核酸分子を解析し、被験者がミオシン軽鎖2aをコードする遺伝子に変異を有するか否かを決定する段階を含み、変異の存在により該被験者がミオシン軽鎖2aに関連する疾病または病態を有するまたは発症する危険性があることが示される、被験者がミオシン軽鎖2aに関連する疾病または病態を有するか否かまたは発症する危険性があるか否かを決定する方法。
【請求項２】
被験者が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
被験者がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
疾病または病態が心臓の疾病または病態である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
疾病または病態が心不全である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ミオシン軽鎖2aをコードする遺伝子に変異を含みかつミオシン軽鎖2aに関連する疾病または病態に特有の表現型を有する生物に化合物を接触させる段階、および該化合物の該表現型への効果を決定する段階を含み、該表現型における改善の検出により心臓の該疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な化合物が同定されたことが示される、ミオシン軽鎖2aに関連する心臓の疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定する方法。
【請求項７】
心臓の疾病または病態が心不全である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
生物がゼブラフィッシュである、請求項6記載の方法。
【請求項９】
ミオシン軽鎖2aをコードする遺伝子の変異がtell tale heart変異である、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
請求項6記載の方法を用いて同定された化合物を患者に投与する段階を含む、患者のミオシン軽鎖2aに関連する心臓の疾病または病態を治療または予防する方法。
【請求項１１】
患者がミオシン軽鎖2aをコードする遺伝子に変異を有する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
機能的なミオシン軽鎖2aタンパク質または該タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターを患者に投与する段階を含む、患者のミオシン軽鎖2aに関連する疾病または病態を治療または予防する方法。
【請求項１３】
実質的に純粋なゼブラフィッシュのミオシン軽鎖2aポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号:2のアミノ酸配列を含む、請求項13記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号:2の配列、および配列番号:2の配列と少なくとも95%同一である配列を含みかつミオシン軽鎖2a活性を有するその変種を含む、実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項１７】
ゼブラフィッシュのミオシン軽鎖2aポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１８】
配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項17記載の核酸分子。
【請求項１９】
配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項17記載の核酸分子。
【請求項２０】
高ストリンジェンシー条件下で配列番号:1に示す配列の相補鎖と特異的にハイブリダイズし、ミオシン軽鎖2a活性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２１】
請求項17記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２２】
請求項21記載のベクターを含む細胞。
【請求項２３】
請求項17記載の核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２４】
動物がゼブラフィッシュである、請求項23記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２５】
ミオシン軽鎖2aポリペプチドをコードする対立遺伝子の一方または両方にノックアウト変異を有する非ヒト動物。
【請求項２６】
請求項25記載の非ヒトノックアウト動物由来の細胞。
【請求項２７】
変異型ミオシン軽鎖2aポリペプチドをコードする核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２８】
ゼブラフィッシュである、請求項27記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２９】
tell tale heart変異を含む、請求項27記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３０】
ミオシン軽鎖2aポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項３１】
ミオシン軽鎖2aの活性を促進または阻害するRNAを患者に投与する段階を含む、患者においてミオシン軽鎖2aポリペプチドの活性を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、心疾患を診断する方法および治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
心疾患とは、数多くの様々な心臓病を表すのに用いられる一般的な用語である。例えば、冠動脈疾患は最も一般的な心疾患であり、酸素の豊富な血液を心臓に供給する動脈の狭窄または狭小化を特徴とし、心筋の一部の壊死である心筋梗塞を引き起こす可能性がある。心不全とは、心臓が十分な量の血液を全身に送り出すことができなくなったために生じる病態である。心不全は心臓の活動が突然急に停止するのではなく、むしろ、心臓が血液を効率的に送り出す能力を次第に失うにつれて、何年も経てゆっくりと発症することが多い。心不全の危険因子には、冠動脈疾患、高血圧症、心臓弁膜症、心筋症、心筋疾患、肥満症、糖尿病、および心不全の家族歴が含まれる。
【０００３】
ゼブラフィッシュ、Danio rerioは、発生の遺伝解析および生化学的解析に用いるのに便利な生物である。扱いやすく透明な胚を有することから、発生の最も早い段階から器官機能を直接観察することができ、世代時間が短く、さらに繁殖力が旺盛である。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、「tell tale heart (tel)」変異と命名したゼブラフィッシュのミオシン軽鎖2a（MLC-2a）遺伝子の変異が、異常な心臓収縮性によって特徴づけられる表現型をゼブラフィッシュにもたらすという知見に基づいた診断、薬物スクリーニング、および治療の方法を提供する。
【０００５】
第一の局面において、本発明は、被験者（例えば、ヒト等の哺乳動物）がMLC-2aに関連する疾病または病態（例えば、心不全等の心臓の疾病または病態；以下も参照のこと）を有するか否かまたは発症する危険性があるか否かを決定する方法を提供する。この方法は、被験者由来の試料の核酸分子を解析し、被験者がMLC-2aをコードする遺伝子に変異（例えばtel変異；以下を参照のこと）を有するか否かを決定する段階を含む。そのような変異の存在により、被験者がMLC-2aに関連する疾患を有するまたは発症する危険性があることが示される。この方法はまた、ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子の核酸分子増幅のために、MLC-2aをコードする遺伝子に特異的な核酸分子プライマーを用いる段階を含んでもよい。この方法は、被験者由来のMLC-2aをコードする核酸分子のシークエンシングをさらに含んでもよい。
【０００６】
第二の局面において、本発明は、MLC-2aに関連する疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定する方法を提供する。この方法は、MLC-2a遺伝子に変異（例えばtell tale heart変異）を有しかつそのような疾病または病態に特有の表現型を有する生物（例えばゼブラフィッシュ）に化合物を接触させる段階、およびその化合物の表現型への効果を決定する段階を含む。その表現型において改善が認められれば、その疾病または病態を治療するのに使用可能な化合物が同定されたことが示される。
【０００７】
第三の局面において、本発明は、上述の方法により同定された化合物を患者に投与する段階を含む、患者（例えば、MLC-2a遺伝子に変異（例えばtell tale heart変異）を有する患者）のMLC-2aに関連する疾病または病態を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、そのような疾病または病態の治療または予防におけるそのような化合物の使用、およびそのような治療または予防のための医薬品の調製におけるこれらの化合物の使用も含む。
【０００８】
第四の局面において、本発明は、患者のMLC-2aに関連する疾病または病態を治療または予防するさらなる方法を提供する。この方法は、機能的なMLC-2aタンパク質またはそのタンパク質をコードする（例えば発現ベクター内の）核酸分子を患者に投与する段階を含む。本発明はまた、そのような疾病または病態の治療または予防におけるそのようなタンパク質または核酸分子の使用、およびそのような治療または予防のための医薬品の調製におけるこれらのタンパク質または核酸分子の使用も含む。
【０００９】
第五の局面において、本発明は、実質的に純粋なゼブラフィッシュのMLC-2aポリペプチドを含む。このポリペプチドは、例えば配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれらの配列からなっていてよい。本発明はまた、これらのポリペプチドの配列と少なくとも75%、85%、または95%（例えば、少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%）同一である配列を含み、かつMLC-2a活性を有するかまたはさもなくば本明細書の他所に記載する疾患および病態に特有である、これらのポリペプチドの変種を含む。これらのポリペプチドの断片もまた、本発明に含まれる。例えば、MLC-2aの任意の異なるドメインを様々な組み合わせで含む断片が含まれる。
【００１０】
第六の局面において、本発明は、ゼブラフィッシュMLC-2aポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸分子（例えばDNA分子）を提供する。この核酸分子は、配列番号:2のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むかまたは本質的にそれらの配列からなっているポリペプチドをコードし得る。本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で配列番号:1の相補鎖とハイブリダイズし、かつMLC-2a活性を有するかまたはさもなくば本明細書の他所で記載する疾患および病態に特有であるポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００１１】
第七の局面において、本発明は上述の核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１２】
第八の局面において、本発明は上述のベクターを含む細胞を含む。
【００１３】
第九の局面において、本発明は、上述の核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物（例えばゼブラフィッシュまたはマウス）を提供する。
【００１４】
第十の局面において、本発明は、MLC-2aポリペプチドをコードする対立遺伝子の一方または両方にノックアウト変異を有する非ヒト動物を提供する。
【００１５】
第十一の局面において、本発明は、上述の非ヒトノックアウト動物由来の細胞を含む。
【００１６】
第十二の局面において、本発明は、例えばtell tale heart変異を有するポリペプチド等の変異型MLC-2aポリペプチドをコードする核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物（例えばゼブラフィッシュ）を含む。
【００１７】
第十三の局面において、本発明はMLC-2aポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００１８】
第十四の局面において、本発明は、ミオシン軽鎖2aポリペプチドの活性を促進または阻害するRNAを患者に投与することにより、患者においてこの活性を調節する方法を提供する。
【００１９】
「ポリペプチド」または「ポリペプチド断片」とは、いかなる翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、二つ以上(例えば10、15、20、30、50、100、もしくは200、またはそれ以上)のアミノ酸の鎖を意味し、これは自然界に存在するまたは自然界に存在しないポリペプチドのすべてまたは一部を構成する。「翻訳後修飾」とは、合成中または合成後のポリペプチドまたはポリペプチド断片に対する何らかの変化を意味する。翻訳後修飾は、（細胞内での合成中等に）自然に起こり得るか、または（組換えまたは化学的手段等によって）人工的に引き起こし得る。「タンパク質」は、一つ以上のポリペプチドで構成され得る。
【００２０】
「ミオシン軽鎖2aタンパク質」、「ミオシン軽鎖2aポリペプチド」、「MLC-2aタンパク質」、または「MLC-2aポリペプチド」とは、ヒト（配列番号:4）またはゼブラフィッシュ（配列番号:2）のMLC-2aポリペプチドの配列と少なくとも45％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも75％、および最も好ましくは少なくとも90％(例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％)のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを意味する。MLC-2a遺伝子配列のスプライシング変種および変異を含むMLC-2a遺伝子由来のポリペプチド産物も、この定義に含まれる。本明細書において定義するように、MLC-2aポリペプチドは、心臓の発生、モデリング、および機能に関与している。これは、MLC-2aに関連する心疾患等の疾患および状態のマーカーとして用いることができる（後述も参照のこと）。
【００２１】
「ミオシン軽鎖2a核酸分子」または「MLC-2a核酸分子」とは、先に定義したように、MLC-2aタンパク質（例えば、ヒト（配列番号:3によりコードされる）またはゼブラフィッシュ（配列番号:1によりコードされる）のMLC-2aタンパク質）、MLC-2aポリペプチド、またはその一部をコードするゲノムDNA、cDNA、またはRNA（例えばmRNA）分子等の核酸分子を意味する。MLC-2a核酸分子の変異は、例えばMLC-2a遺伝子内の任意の箇所での未熟な終止コドンの挿入、またはスプライス供与部位における変異によって特徴づけることができ、これにより異常な転写産物（例えば、未熟な終止コドンを有する転写産物（例えば、以下のtel変異の記載を参照のこと）が産生される。本発明は、tel変異および同様の変異であるこのゼブラフィッシュミオシン軽鎖2a変異（以下、「tel tale heart 変異」と称する）に加えて、異常なMLC-2aタンパク質の産生または機能をもたらすいかなる変異も含み、単なる例としてではあるがヌル突然変異および切断を引き起こすさらなる変異も含む。
【００２２】
「同一性」という用語は、本明細書において、特定の核酸分子またはポリペプチドの配列とそれと同じタイプの参照分子の配列との関係を示すために用いられる。例えば、整列させた参照分子と比較して、ポリペプチドまたは核酸分子がある位置で同じアミノ酸またはヌクレオチド残基を有する場合、その位置で「同一」であると言う。参照分子に対する核酸分子またはポリペプチドの配列同一性のレベルは、通常、最適な配列比較を行うためのギャップの導入等のそこに規定されたデフォルトパラメーターを使い、配列解析ソフトウェアを用いて測定する（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、ジェネティクスコンピューターグループの配列解析ソフトウェアパッケージ、1710 University Avenue,  Madison, WI 53705、BLAST、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）。これらのソフトウェアプログラムは、様々な置換、欠失、または他の修飾に同一性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を整合させる。保存的置換には、一般的に以下の群内での置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
【００２３】
核酸分子またはポリペプチドは、それが参照分子の配列に対して、その全長にわたって少なくとも51％、好ましくは少なくとも55％、60％、または65％、および最も好ましくは75％、85％、90%、または95％(例えば、少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または99％)の同一性を示す場合に、参照分子に対して「実質的に同一」であると言う。ポリペプチドに関しては、比較配列の長さは少なくとも16個のアミノ酸、好ましくは少なくとも20個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも25個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも35個のアミノ酸である。核酸分子に関しては、比較配列の長さは少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも110ヌクレオチドである。当然のことながら、比較の長さは、全長までのおよび全長を含む任意の長さでありうる。
【００２４】
MLC-2a核酸分子またはMLC-2aポリペプチドは、その生物活性の決定、またはそれが野生型であるかもしくは変異型であるかの決定をする試験方法が実施された場合に、「解析される」または「解析」に供される。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて動物のゲノムDNAを増幅し、次に、例えばヌクレオチド配列または制限酵素断片解析によって増幅されたDNAが例えばtell tale heart変異等の変異を含むか否かを決定することにより、動物（例えば、ヒトまたはゼブラフィッシュ）のMLC-2a遺伝子を解析することができる。
【００２５】
「プローブ」または「プライマー」は、相補的配列（「標的」）を含む第二のDNAまたはRNA分子と塩基対を形成することができる規定の配列の一本鎖DNAまたはRNA分子を意味する。形成されたハイブリッドの安定性は、塩基対形成の起こる程度に依存する。この安定性は、プローブと標的分子間の相補性の程度、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度等のパラメータによって影響を受ける。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの程度は、温度、塩濃度、およびホルムアミド等の有機分子の濃度のようなパラメータによって影響を受け、当業者に周知の方法によって決定される。MLC-2a核酸分子に特異的なプローブまたはプライマーは、ヒト(配列番号:3)またはゼブラフィッシュ（配列番号:1）のMLC-2a遺伝子の配列と好ましくは45％を超える配列同一性、より好ましくは少なくとも55〜75％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも75〜85％の配列同一性、さらにこれより好ましくは少なくとも85〜99％の配列同一性、および最も好ましくは100％の配列同一性を有する。
【００２６】
プローブは、当業者に周知の方法により、検出可能な程度に放射性標識または非放射性標識することができる。プローブは、核酸シークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖DNA高次構造多型（SSCP）解析、制限断片長多型（RFLP）解析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、および当業者に周知の他の方法等の、核酸ハイブリダイゼーションに関する方法に用いることができる。
【００２７】
分子、例えば、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマー、遺伝子もしくはその断片、cDNA分子、ポリペプチド、または抗体は、その存在が試料中で直接同定され得るように標識される場合に、「検出可能な程度に標識される」と言うことができる。検出可能な程度に分子を標識する方法は当技術分野で周知であり、放射性標識（例えば、32Pまたは35Sのような同位元素）および非放射性標識（例えば、フルオレセインのような蛍光標識）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然に付随するタンパク質および有機分子から分離されているポリペプチド（またはその断片）を意味する。一般に、ポリペプチドは、それが天然に会合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を重量で少なくとも60％含まない場合に、実質的に純粋である。好ましくは、ポリペプチドは重量で少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは少なくとも99％純粋であるMLC-2aスポリペプチドである。実質的に純粋なMLC-2aポリペプチドは、例えば天然源からの抽出、MLC-2aポリペプチドをコードする組換え核酸分子の発現、または化学合成によって得ることができる。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析等の何らかの適当な方法によって測定することができる。
【００２９】
ポリペプチドは、天然状態でこれに付随するタンパク質および有機分子から分離されている場合に、天然に会合する成分を実質的に含まない。このように、化学合成された、またはそれが天然に産生される細胞とは異なる細胞系において産生されたタンパク質は、天然に会合する成分を実質的に含まない。したがって、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物に由来するポリペプチドが含まれるのみならず、大腸菌、他の原核生物において、または他のそのような系において合成されたポリペプチドも含まれる。
【００３０】
「単離された核酸分子」とは、それが天然に存在する環境から取り出された核酸分子を意味する。例えば、細胞のゲノム中または遺伝子バンクの一部として存在する天然型の核酸分子は単離されていないが、例えばクローニング事象（増幅）の結果としてゲノムの残りの部分から分離された同じ分子は「単離されている」。典型的に、単離された核酸分子は、天然型ゲノムにおいて5'または3'末端で直接隣接している核酸領域（例えばコード領域）を含まない。そのような単離された核酸分子はベクターまたは組成物の一部であってよく、そのようなベクターおよび組成物はその天然環境の一部ではないためやはり単離されていると言える。
【００３１】
抗体は、例えば天然にポリペプチドを含む生体試料等の試料において、このポリペプチド（例えばMLC-2aポリペプチド）を認識して結合するが、他の分子（例えば非MLC-2a関連ポリペプチド）を実質的に認識せず結合しない場合に、ポリペプチドに「特異的に結合する」と言う。
【００３２】
「高ストリンジェンシー条件」とは、0.5 M NaHPO4、pH 7.2、7％SDS、1 mM EDTA、および1％BSA（フラクションV）を含む緩衝液において65℃で、または48％ホルムアミド、4.8 × SSC、0.2 Mトリス-Cl、pH 7.6、1 × デンハルツ溶液、10％硫酸デキストラン、および0.1％SDSを含む緩衝液において42℃で、少なくとも100、例えば200、350、または500ヌクレオチド長のDNAプローブを用いて起こるハイブリダイゼーションに匹敵するハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。（これらは、高ストリンジェンシーのノーザンまたはサザンハイブリダイゼーションの典型的な条件である。）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはまた、高ストリンジェンシーPCR、DNAシークエンシング、一本鎖DNA高次構造多型解析、およびインサイチューハイブリダイゼーション等の分子生物学者によって日常的に行われる多数の手法の確立に貢献している。ノーザンおよびサザンハイブリダイゼーションとは対照的に、これらの手法は通常比較的短いプローブを用いて行われる（例えば、PCRまたはシークエンシングに関しては通常16ヌクレオチド以上、およびインサイチューハイブリダイゼーションに関しては40ヌクレオチド以上）。これらの手法において用いられる高ストリンジェンシー条件は分子生物学の当業者に周知であり、その例は例えば、参照として本明細書に組み入れられるAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1998に見ることができる。
【００３３】
「試料」とは、患者または被験者から得られた組織生検、羊水、細胞、血液、血清、尿、便、またはその他の検体を意味する。試料は、当技術分野において周知の方法によって、MLC-2a遺伝子における変異またはMLC-2a遺伝子の発現レベルを検出するために解析することができる。例えば、患者の試料に由来するPCR産物にシークエンシング、一本鎖DNA高次構造多型（SSCP）解析、または制限断片長多型（RFLP）解析等の方法を用いてMLC-2a遺伝子における変異を検出することができ、ELISAおよび他のイムノアッセイ法を用いてMLC-2aポリペプチドのレベルを測定することができ、およびPCRを用いてMLC-2a核酸分子のレベルを測定することができる。
【００３４】
「ミオシン軽鎖2a-関連疾患」、「MLC-2a関連疾患」、「ミオシン軽鎖2a-関連病態」または「MLC-2a関連病態」とは、MLC-2a遺伝子の不適当に高いもしくは低い発現、またはMLC-2a核酸分子もしくはポリペプチドの生物活性を変化させるMLC-2a遺伝子における変異（プロモーターなどの調節配列を含む）が原因で起こる疾病または病態を意味する。MLC-2a関連疾患および病態は、MLC-2aが出生前または出生後に発現されるいかなる組織においても起こり得る。MLC-2a関連疾患および病態には、心臓の疾病または病態（例えば心不全、肥大、ミオパシー）が含まれ得る。
【００３５】
本発明はいくつかの利点を提供する。例えば、本発明の診断方法を用いて、患者における心臓の疾病などのMLC-2aに関連した疾病または病態が起こる可能性の増大を検出することが可能であり、よって何らかの症状が見られる以前に適切な処置を行うことが可能である。これは、例えばそのような疾病または病態の危険性の高い群の患者に有効となり得る。また、本発明の診断方法により、患者における既存のそのような疾病または病態の病因決定が容易になり、適切な治療法が選択され得る。さらに、本発明のスクリーニング方法は、こうした疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定するのに用いることが可能である。本発明はまた、本発明より以前は唯一の治療法が臓器移植のみであり、ドナーの臓器の入手可能性および臓器拒絶の可能性により制限されていた疾病または病態（例えば心不全）を治療するために用いることができる。
【００３６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【００３７】
詳細な説明
本発明は、心臓の疾病または病態等のMLC-2aに関連する疾患および病態（以下も参照のこと）を診断、予防、および治療する方法、およびそのような疾患および病態を治療または予防するのに使用可能な化合物を同定するスクリーニング方法を提供する。具体的には、本発明者らは、初期胚の心臓収縮性を撹乱させる遺伝子変異、tell tale heart (tel)を同定した。本明細書で、tel遺伝子がミオシン軽鎖2a（MLC-2a）をコードすることを示す。
【００３８】
したがって、本発明の診断方法は、MLC-2aタンパク質をコードする遺伝子における変異の検出に関連し、化合物の同定方法は、MLC-2aをコードする遺伝子に変異を有する生物または他の適切な疾患および病態モデルの表現型に影響を与える化合物のスクリーニングに関連する。このようにして同定された化合物、ならびにMLC-2a遺伝子、タンパク質、およびその抗体は、MLC-2aに関連する疾患および病態を治療または予防する方法において用いることができる。
【００３９】
本発明はまた、上述のスクリーニング方法に使用可能な動物モデル系（例えば、MLC-2aに変異（例えばtell tale heart変異）を有するゼブラフィッシュ、またはそのような変異を有するマウス（または他の動物））、ならびにMLC-2aタンパク質およびこのタンパク質をコードする遺伝子を提供する。また、変異型ゼブラフィッシュMLC-2aタンパク質をコードする遺伝子（例えば、tell tale heart変異を有する遺伝子）およびこれらの遺伝子にコードされるタンパク質も本発明に含まれる。これらのタンパク質（野生型または変異型）に特異的に結合する抗体も、本発明に含まれる。
【００４０】
本発明に従って診断、予防、または治療され得るMLC-2aに関連する疾患および病態について簡単に説明した後に、本発明の診断、スクリーニング、および治療方法、ならびに本発明の動物モデル系、タンパク質、および遺伝子についてさらに以下で説明する。
【００４１】
MLC-2a関連疾患また病態
MLC-2a遺伝子またはタンパク質における異常は任意の多種多様な疾病または病態と関連している可能性があり、したがって、本発明の方法によりそれらすべてを診断、予防、または治療することができる。例えば、上記のように、ゼブラフィッシュのtell tale heart変異は異常な心臓収縮性によって特徴づけられる。よって、MLC-2遺伝子またはそれらの発現における異常の検出を、心臓の疾病または病態（例えば、心不全または心臓肥大）を診断する方法、またはそれらの治療または進行をモニターする方法に使用することができる。さらに、本明細書に記載するスクリーニング方法で同定される化合物、ならびにMLC-2a核酸分子、タンパク質、およびそれらの抗体を、そのような疾病または病態を予防または治療する方法に使用することができる。
【００４２】
本発明の方法を用いて診断、予防、または治療できる心不全の例には、肺内部または体内の液体貯留を特徴とし、心臓のポンプとしての機能障害に起因するうっ血性心不全、右心室のポンプ作用の障害を特徴とし、体、特に足および腹部のむくみを起こす右心不全（右心室）、心臓の左側のポンプ作用の障害により、肺のうっ血を起こす左心不全（左心室）、安静時または運動時に、心臓が体の酸素要求を満たすに十分な速度で前方に血液を送り出すことができないことを特徴とする前方心不全、心充満圧が異常に高い場合に限り、心臓が体の要求を満たすことができることを特徴とする後方心不全、血液の拍出量を維持できないことを特徴とする低心拍出量、ならびに心拍出量が高いにもかかわらず心不全の症状があることを特徴とする高心拍出量が含まれる。ミオシン軽鎖2aはまた、冠動脈疾患、心臓細動（例えば心房細動）、または弁形成の異常に関連する病態等の心不全以外の心循環器疾患にも関与する可能性があり、よってこれらの病態を診断およびモニターする方法にも、MLC-2a遺伝子またはその発現における異常の検出が利用できる。
【００４３】
診断方法 
MLC-2aタンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子によってコードされるポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに特異的な抗体は、このタンパク質をコードする遺伝子における変異またはその不適当な発現に関連する疾患および病態を診断またはモニターする方法において用いることができる。
【００４４】
本発明の診断方法は、例えば、MLC-2aに関連した疾病または病態を患う患者にその病因を決定するために用いることができ、そのため適切な治療過程の選択が容易になる。この診断方法はまた、そのような疾病または病態をまだ発症していないが今後発症する危険性がある患者、または該疾病または病態を発症する初期段階にある患者について用いることができる。同様に、本発明の診断方法は出生前遺伝子スクリーニングに用いることができ、例えば、MLC-2aタンパク質をコードする遺伝子において劣性変異を保因する可能性のある親が同定される。さらに、本方法を用いて、患者のMLC-2a遺伝子が変異を含むか否かを決定することにより、患者においてMLC-2a変異が疾病または病態（例えば心疾患）の原因となっている可能性があるか否かを調べることができる。本発明の方法を用いて、例えばヒト、ペット、または家畜等の任意の哺乳動物において、本明細書に記載する疾患を診断（または予防もしくは治療）することができる。
【００４５】
本発明の診断方法を用いて検出できるMLC-2aの異常には、例えば、（i）異常なMLC-2aタンパク質の産生を起こす変異を含むMLC-2aタンパク質をコードする遺伝子、（ii）異常なMLC-2aポリペプチド自身（例えば切断された型のタンパク質）、および（iii）異常な量のこのタンパク質の産生を引き起こすMLC-2a遺伝子の変異、を特徴とする異常が含まれる。該異常の検出は、心臓に影響を及ぼすものなどMLC-2aに関連した、ヒトの疾病または病態の診断において利用できる。MLC-2a遺伝子の変異の典型的な例はtell tale heart変異であり、これについては以下で詳述する。
【００４６】
MLC-2a遺伝子の変異は、たとえこのタンパク質が発現されていなくても、被験者のいかなる組織において検出できる。これらのタンパク質が発現されている組織の数はおそらく限られており、限られた期間であるため、およびアッセイのための該組織（例えば心臓の組織）の試料採取はおそらく望ましくないため、血液または羊水試料等のより容易に得られる別のタイプの試料において、変異型遺伝子を検出することが好ましいと思われる。
【００４７】
MLC-2aタンパク質をコードする遺伝子における変異の検出は、標準的な診断手法のいずれかを用いて行うことができる。例えば、患者から得られた生体試料は、ミスマッチ検出法により、MLC-2aタンパク質をコードする核酸分子における一つ以上の変異（例えばtell tale heart変異）に関して解析することができる。一般に、この方法には患者の試料からの核酸分子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅が含まれ、それに続いて、ハイブリダイゼーションの変化、異常な電気泳動ゲル移動、結合、もしくはミスマッチ結合タンパク質によって媒介される切断の検出により、または直接核酸分子シークエンシングにより、変異（すなわちミスマッチ）の同定が行われる。MLC-2aタンパク質をコードする変異型遺伝子の検出を容易にするためには、これらの手法のいずれもが利用でき、それぞれ当技術分野で周知である。例えばこれらの手法の例は、Oritaら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:2766-2770, 1989）およびSheffieldら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:232-236, 1989）によって記載されている。
【００４８】
上述したように、変異の検出アッセイ法は、既存の疾病または病態の診断を容易にする上、MLC-2a遺伝子の変異に関連する疾患の素因を、症状が発現する前に診断する機会も提供する。例えば、正常なMLC-2a生物活性または発現を抑制する異常なMLC-2aタンパク質（またはその異常な量）をコードする遺伝子に関してヘテロ接合である患者は、該タンパク質に関連した疾患の臨床症状を示さない可能性があるが、なおもこのような疾病を発症する確率は正常より高い。そのような診断が仮定されれば、患者は有害な環境因子に対する曝露を最小限にするように予防することができ、例えば頻繁に健康診断を受けることにより、その病状を注意深くモニターすることができる。上術のように、このタイプの診断法は、出生前スクリーニングにおいてMLC-2aをコードする遺伝子の変異を検出するためにも用いることができる。
【００４９】
上述したように容易に入手できる組織由来のゲノムDNAを使用して、MLC-2a遺伝子の変異を検出する診断方法を実施することが好ましいと思われるが、このタンパク質をコードするmRNAまたはタンパク質自身を、このタンパク質を発現する組織試料からアッセイすることもできる。患者の該組織試料におけるMLC-2aをコードする遺伝子の発現レベルは、当技術分野で周知の多くの標準的な手法のいずれかを用いて決定することができ、この手法にはノーザンブロット解析および定量的PCR（例えば、Ausubelら、前記；PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Ehrlich, Ed., Stockton Press, NY；Yapら、Nucl. Acids. Res. 19:4294, 1991を参照のこと）が含まれる。
【００５０】
本発明のもう一つの診断方法においては、イムノアッセイを用いて、生体試料中のMLC-2aタンパク質のレベルを検出またはモニターする。MLC-2aタンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を標準的なイムノアッセイフォーマット（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、またはRIA；例えばAusubelら、前記を参照のこと）のいずれかにおいて用いることにより、MLC-2aタンパク質のポリペプチドレベルを測定することができる。これらのレベルは、健常人由来の試料におけるMLC-2aタンパク質のレベルと比較することができる。この方法を用いてMLC-2aタンパク質の産生が減少していることが検出されれば、例えば、MLC-2aタンパク質の不十分な生物活性に関与する病態または病態に対する素因があることが示唆されるかもしれない。
【００５１】
患者の試料におけるMLC-2aタンパク質の検出には、免疫組織化学的手法も用いることができる。例えば、患者から組織試料を得て、切片にし、抗MLC-2aタンパク質抗体および何らかの標準的な検出系（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素に結合した二次抗体を含む系）を用いてMLC-2aタンパク質の存在に関して染色することができる。そのような手法に関する一般的な手引きは、例えば、Bancroftら、Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, 1982、およびAusubelら、前記に見ることができる。
【００５２】
MLC-2aに関連した疾病または病態を治療または予防するのに使用可能な分子の同定
異常な心臓の収縮性をもたらす表現型を引き起こすようなMLC-2aをコードする遺伝子における変異を同定することにより、心不全等の心疾患を治療または予防するのに使用可能な分子（例えば、小さな有機もしくは無機分子、抗体、ペプチド、または核酸分子）の同定が容易になる。候補化合物が、上述したMLC-2aに関連する疾病または病態にもたらす効果は、例えばゼブラフィッシュの系を用いて調べることができる。上述したように、ゼブラフィッシュ、Danio rerioは、血管発生の遺伝解析に用いるのに便利な生物である。その胚は扱いやすく透明であることから、発生の初期段階から臓器機能を直接観察することができ、世代期間も短く多産である。以下に詳述するように、tell tale heart変異のようなMLC-2a変異を有するゼブラフィシュをはじめとする動物は、これらの方法において用いることができ、よって本発明にはこれらの動物も含まれる。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法の一例として、MLC-2aタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するゼブラフィッシュ（例えば、tell tale heart変異を有するゼブラフィッシュ）を候補化合物と接触させ、異常な心臓の収縮性の発症に及ぼすその化合物の影響、またはそのような既存の異常な状態に及ぼすその化合物の影響を、未治療の全く同一の変異型対照と比較してモニターする。
【００５４】
ゼブラフィッシュ系において化合物が望ましい効果を有することが示された後、心疾患の他のモデル、例えばMLC-2aをコードする遺伝子に変異を有するマウスまたは他の動物において、この化合物を試験することができる。または、ゼブラフィッシュの試験をやらずに、そのような動物モデル系における試験を実施してもよい。
【００５５】
MLC-2aのレベルまたは生物活性を上昇または低下させる分子の同定には、細胞培養に基づくアッセイも利用できる。ある方法では、MLC-2amRNAを発現する細胞の培養液に種々の濃度で候補分子を添加する。次に、標準的な手法によりMLC-2aの生物活性を測定する。生物活性の測定には、MLC-2aタンパク質レベルおよびMLC-2a核酸分子レベルの測定が含まれ得る。
【００５６】
一般に、MLC-2aをコードする遺伝子における変異に関連する疾患の予防または治療に用いられる新規薬剤は、天然物、合成（または半合成）抽出物、および化学物質ライブラリーの大規模ライブラリーから、当技術分野で周知の方法により同定することができる。薬剤の探索および開発分野の技術者には、被験抽出物または被験化合物の詳細な供給源が本発明のスクリーニング法に重要ではないこと、および脱反復(dereplication)法、または心疾患に対する治療活性が既に明らかな物質の反復もしくは繰り返しの除去を必要に応じて行い得ることが理解されると思われる。
【００５７】
被験候補化合物には、精製した（または実質的に精製した）分子または化合物の混合物（例えば、細胞由来の抽出物または上清；Ausubelら、前記）の一つ以上の成分が含まれ、該化合物には、さらに天然型または人工的な化学物質と既存の化合物の修飾物質の両方が含まれる。例えば、候補化合物は、ポリペプチド、合成有機または分子、天然有機または無機分子、核酸分子、およびそれらの成分であってよい。
【００５８】
天然の候補化合物の供給源には、当業者にとって容易に入手できるものが多数ある。例えば、天然化合物は、細胞（植物、真菌、原核生物、および動物を含む）抽出物、哺乳動物の血清、哺乳動物細胞を培養した増殖培地、タンパク質発現ライブラリー、または発酵培養液に見出され得る。さらに、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の状態である天然化合物のライブラリーは多くの業者から市販されており、これには、バイオティックス（Biotics）（英国、サセックス）、ゼノバ（Xenova）（英国、スラウ）、ハーバーブランチ海洋研究所（Harbor Branch Oceanographic Institute）（フロリダ州、フォートピアス）、およびファルママー（PharmaMar）、U.S.A.（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）が含まれる。さらに、例えば標準的な抽出および分画法のような当技術分野で周知の方法により、必要に応じて天然化合物のライブラリーを作製することができる。
【００５９】
人工的な候補化合物も、当業者にとって容易に入手できる。非常に多くの化合物をランダム合成または標的合成（例えば、半合成または全合成）する方法が多数あり、この化合物には糖類、脂質、ペプチド、および核酸分子に由来する化合物が含まれる。また、合成化合物ライブラリーは、ブランドンアソシエイツ（Brandon Associates）（ニューハンプシャー州、メリマク）およびアルドリッチケミカルズ（Aldrich Chemicals）（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から市販されている。例えば標準的な抽出および分画法のような当技術分野で周知の方法により、必要に応じて合成化合物のライブラリーも作製することができる。さらに、必要に応じて、標準的な化学的、物理的、または生化学的方法により、いかなるライブラリーまたは化合物も容易に修飾することができる。コンビナトリアル・ケミストリーを含む現代の合成化学の技術も使用することができる（Schreiber, Bioorganic and Medicinal Chemistry 6: 1172-1152, 1998; Schreiber, Science 287: 1964-1969, 2000に概説されている）。
【００６０】
粗抽出物がMLC-2a関連疾患の発症および持続に影響を与えることが判明したら、陽性を示すリード抽出物の分画をさらに行い、観察された効果をもたらす化学成分を単離することができる。つまり、抽出、分画、および精製過程の目的は、所望の活性を有する粗抽出物に含まれる化学物質の特性を慎重に決定して同定することにある。本明細書に記載の、化合物混合物中における活性を検出するアッセイ法と同様のアッセイ法を用いて、活性成分を精製し、それらの化合物の誘導体を試験することができる。このような不均一な抽出物の分画法および精製法は、当技術分野で周知である。治療に有用な薬剤であることが判明した化合物は、必要に応じて、当技術分野で周知の方法に従って化学的に修飾することができる。
【００６１】
一般に、MLC-2aの発現および活性を活性化させることが知られている化合物は、異常な増殖もしくは発生、または心不全により特徴付けられるような、心臓の疾病または病態を予防または治療するのに用いることができる（上記も参照のこと）。
【００６２】
動物モデル系
本発明はまた、上述のスクリーニング方法を行うのに用いられる動物モデル系を提供する。これらのモデル系の例には、MLC-2a遺伝子に変異（例えばtell tale heart変異）を有するゼブラフィッシュ、およびマウスをはじめとする他の動物が含まれる。例えば、本発明に用いることができるゼブラフィッシュモデルには、MLC-2aタンパク質を産生しない変異、または切断型（例えば、終止コドンまたはスプライス部位変異の導入による）もしくは他の変化したMLC-2a遺伝子産物を産生する変異が含まれ得る。具体的な例として、tell tale heart変異を有するゼブラフィッシュを用いることができる（以下を参照のこと）。
【００６３】
MLC-2a関連疾病または病態の治療または予防
上記のスクリーニング方法により同定された化合物を用いて、心臓の疾病または病態（例えば心不全または心臓の肥大）がある患者またはそのような心疾患を発症する危険性がある患者を治療することができる。MLC-2aタンパク質をコードする核酸分子およびこれらのタンパク質自身も、そのような方法において使用できる。治療は短期間必要であるに過ぎないか、または患者の生涯にわたって何らかの形で必要である可能性がある。しかし、治療が継続的に必要であるか否かは、例えば上述の診断方法により決定され得る。様々な治療を考えるに当たって、そのような治療は、好ましくは罹患器官または罹患している可能性のある器官（例えば心臓）を対象に行うことを理解すべきである。そのような標的化は標準的な方法を用いて達成できる。
【００６４】
MLC-2a変異遺伝子に起因する疾患の治療または予防は、例えば変異型MLC-2aタンパク質の機能を調節することにより行うことができる。正常なMLC-2aタンパク質を適当な細胞に送達することにより、正常もしくは変異型MLC-2aタンパク質のレベルを変化させることにより、MLC-2aタンパク質をコードする変異型遺伝子をMLC-2aタンパク質をコードする正常遺伝子に置換することにより、またはMLC-2aタンパク質をコードする正常遺伝子を投与することにより、治療することもできる。同様に、MLC-2aタンパク質が関与する生理的経路（例えばシグナル伝達経路）を修飾することにより、MLC-2aタンパク質をコードする遺伝子における欠陥の影響を修正することが可能である。
【００６５】
変異型MLC-2aタンパク質をコードする遺伝子に関してヘテロ接合であると診断された患者、または該変異もしくは異常なMLC-2a発現を起こす可能性がある（たとえ、それらの変異または発現パターンがMLC-2aの発現または生物活性に未だ変化を生じていなくても）と診断された患者において、本明細書に記載のいずれかの治療をその疾患の表現型が生じる前に行うことができる。特に、変異型の表現型に対して効果を有することが示されている化合物、またはMLC-2aの発現を調節することが示されている化合物は、いずれかの標準的用量およびいずれかの投与経路によって、潜在的な疾患または実際の疾患であると診断された患者に投与することができる。
【００６６】
本発明に従って、上述したようにMLC-2a遺伝子、タンパク質、または抗体が同定された化合物を投与するには、適切な投与経路のいずれかを用いることができる。例えば、投与は、非経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、脳室内投与、関節内投与、髄腔内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアゾルによる投与、坐剤による投与、または経口投与が可能である。
【００６７】
本発明の治療用化合物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤に含めて単位剤形として投与することができる。投与は、患者の症状が出現する前または後に行うことができる。当技術分野で周知の製剤化法は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton PA. に記載されている。治療用の剤形は、溶液状または懸濁液状とすることができる。非経口投与用の剤形には、例えば、賦形剤、滅菌水、または生理食塩水のほか、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、植物性油、または水素化ナフタレンが含まれ得る。化合物の放出を制御するには、生体適合性があり生物分解性のある、ラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレン共重合体を用いることができる。有用と考えられる非経口送達系には、他に、エチレン‐ビニルアセテート共重合体粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが含まれる。経口投与する場合は、錠剤またはカプセル剤とすることができる。吸入用の剤形には、例えばラクトースなどの賦形剤を含むことができ、または例えばポリオキシエチレン‐9‐ラウリルエーテル、グリココール酸、およびデオキシコール酸を含む水溶液とすることができ、または点鼻薬またはゲル剤として投与する油性溶液とすることができる。または、鼻腔内投与用の剤形は、粉末剤またはエアゾル剤とすることができる。
【００６８】
変異型タンパク質を正常タンパク質に置換するため、または十分量のMLC-2aもしくは正常なMLC-2aタンパク質を発現しない細胞にタンパク質を加えるためには、MLC-2aタンパク質が発現される培養系から大量の純粋な該タンパク質を得る必要があり得る（例えば以下を参照のこと）。次に、適当なパッケージングまたは投与系を用いて、罹患組織への該タンパク質の送達を行うことができる。
【００６９】
遺伝子治療は、MLC-2a遺伝子の欠陥によって引き起こされる疾患を予防または回復させるためのもう一つの治療アプローチである。野生型MLC-2aタンパク質をコードする核酸分子を、十分な正常MLC-2aタンパク質生物活性を欠損する細胞（例えば、MLC-2a遺伝子に変異（例えばtell tale heart変異）を有する細胞）に送達することができる。該核酸分子は、細胞に取り込まれる形でそれらの細胞に送達されなければならず、それにより、有効なMLC-2aタンパク質機能を提供するのに十分なレベルのタンパク質が産生される。または、いくつかのMLC-2a変異に関して、該遺伝子において第二の変異を有する相同的な遺伝子の別のコピーを導入することにより、結果として生じた疾患の進行を遅らせることもしくはMLC-2aタンパク質活性を調節すること、変異を変化させること、または負の影響のいずれかを遮断するために別の遺伝子を使用することができるかもしれない。
【００７０】
形質導入するウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のベクターは、特にそれらの感染、安定な組込み、および発現の効率が高いことから、体細胞遺伝子治療に用いることができる（例えば、Cayouetteら、Human Gene Therapy 8:423-430, 1997； Kidoら、Current Eye Research 15:833-844, 1996； Bloomerら、Journal of Virology 71:6641-6649, 1997； Naldiniら、Science 272:263-267, 1996；およびMiyoshiら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997を参照のこと）。例えば、完全長のMLC-2a遺伝子またはその一部をレトロウイルスベクターにクローニングし、その内在性プロモーター、レトロウイルス末端反復配列、または目的の標的細胞のタイプに特異的なプロモーターから発現を開始させることができる。使用可能なウイルスベクターには、他に、例えば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはエプスタイン・バーウイルス等のヘルペスウイルスが含まれる（同様に、例えば、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990； Friedman, Science 244:1275-1281, 1989； Eglitisら、BioTechniques 6:608-614, 1988；Tolstoshevら、Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990；Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991； Cornettaら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987； Anderson, Science 226:401-409, 1984； Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991； Millerら、Biotechnology 7:980-990, 1989； Le Gal La Salleら、Science 259:988-990, 1993；およびJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995のベクターも参照のこと）。レトロウイルスベクターは、特に十分に開発され、臨床状況において用いられてきている（Rosenbergら、N. Engl. J. Med. 323:370, 1990； Andersonら、米国特許第5,399,346号）。
【００７１】
非ウイルスアプローチも同様に、MLC-2aタンパク質に関連する疾患になりやすいと予測される細胞に治療的DNAを導入するために用いることができる。例えば、MLC-2a核酸分子またはアンチセンス核酸分子は、リポフェクション（Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987；Onoら、Neuroscience Letters 17:259, 1990； Brighamら、Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989； Staubingerら、Methods in Enzymology 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド‐ポリリジン結合（Wuら、Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988； Wuら、Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）、または外科的状況下でのマイクロインジェクション（Wolffら、Science 247:1465, 1990）によって細胞に導入することができる。
【００７２】
遺伝子導入は、インビトロでのトランスフェクションを含む非ウイルス手段を用いても行うことができる。そのような方法には、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、およびプロトプラスト融合の使用が含まれる。リポソームもまた、細胞にDNAを送達するためにおそらく有用となり得る。エクスビボで培養可能なタイプの細胞（例えば自系または異種の初代培養細胞またはその後代）に正常なMLC-2aタンパク質を導入し、その後、該細胞（またはその子孫）を標的組織に注入することにより、正常な遺伝子を患者の罹患組織に移植することもできる。
【００７３】
遺伝子治療法において用いられるMLC-2acDNA発現は、任意の適当なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、またはメタロチオネインプロモーター）から促すことができ、任意の適当な哺乳類調節エレメントによって調節することができる。例えば、必要に応じて、特定のタイプの細胞において選択的に遺伝子発現を促進することが知られているエンハンサーを用いて、MLC-2a発現を促進することができる。用いるエンハンサーには、組織または細胞特異的エンハンサーとしての特徴を有するエンハンサーが含まれ得るが、これらに限定されない。または、MLC-2aゲノムクローンを治療構築物として用いる場合（本明細書に記載するように、そのようなクローンはMLC-2acDNAとのハイブリダイゼーションによって同定可能である）、同族の調節配列、または必要ならば上述のプロモーターもしくは調節エレメントのいずれかを含む異種起源に由来する調節配列によって、調節することができる。
【００７４】
MLC-2a関連疾病の治療と同様に、MLC-2aタンパク質の遺伝子機能を調べるため、治療薬デザインの基礎として、アンチセンスに影響を及ぼす分子に基づく戦略を用いることができる。これらの戦略は、遺伝子発現の（転写または翻訳による）配列特異的抑制が、ゲノムDNAまたはmRNAと相補的アンチセンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションによって行われ得るという原理に基づいている。ハイブリッドRNA二本鎖の形成により、標的MLC-2aタンパク質コードゲノムDNA分子の転写、または標的MLC-2amRNA分子のプロセシング、輸送、翻訳、もしくは安定性が妨げられる。
【００７５】
様々な方法により、アンチセンス戦略を実現させることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスRNAは、（例えば、静脈内注射により）細胞に取り込まれる形で被験者に直接投与することができる。または、アンチセンスRNA（またはアンチセンスRNA断片）をコードするウイルスまたはプラスミドベクターを、インビボまたはエクスビボで細胞に導入することができる。アンチセンス効果は対照（センス）配列によって誘導することができるが、表現型の変化の程度は非常に多様である。アンチセンス分子によって誘導される表現型への効果は、タンパク質レベル、タンパク質活性の測定、および標的mRNAレベル等の基準の変化に基づく。
【００７６】
MLC-2a遺伝子治療は、野生型または変異型MLC-2aタンパク質の発現によって負の影響を受けると予測される細胞に、アンチセンスMLC-2amRNAを直接投与することによっても行うことができる。アンチセンスMLC-2amRNAは、標準的な技術のいずれかにより産生および単離することが可能であるが、効率の高いプロモーター（例えばT7プロモーター）の制御下にあるアンチセンスMLC-2acDNAを用いてインビトロ転写することにより、最も容易に産生される。核酸分子を直接投与する上記方法のいずれかにより、アンチセンスMLC-2amRNAを細胞に投与することができる。
【００７７】
遺伝子治療を用いてMLC-2aタンパク質機能を阻害する方法には、他に、抗MLC-2aタンパク質抗体または抗MLC-2aタンパク質抗体の一部を細胞内で発現させることが含まれる。例えば、MLC-2aタンパク質に特異的に結合し、その生物活性を阻害するモノクローナル抗体をコードする遺伝子（または遺伝子断片）を、組織特異的遺伝子制御配列の転写制御下に置くことができる。
【００７８】
本発明に包含される別の治療法には、罹患している可能性のある組織もしくは実際の罹患組織の部位に直接（例えば、注射によって）、または全身に（例えば、従来の組換えタンパク質投与手法によって）、組換えMLC-2aポリペプチドを投与することが含まれる。MLC-2aタンパク質の用量は、個々の患者の体格および健康状態を含む多数の要因に依存するが、一般に、薬学的に許容される剤形のいずれかで、一日当たり0.1 mgから100 mgを成人に投与する。
【００７９】
MLC-2a調節化合物、MLC-2aタンパク、またはMLC-2a核酸を患者に投与する段階を含む本明細書に記載する治療法に加えて、本発明はそのような分子の存在下で器官を培養する方法を提供する。具体的には、上記のように、MLC-2a変異は異常な心臓収縮性に関連している。したがって、これらの分子の存在下で心臓組織を培養することにより、その適切な収縮性を促進することができる。この組織は、例えば同種または異種ドナーおよび合成組織または器官から移植片として調製される組織であってよい。
【００８０】
MLC-2aタンパク質、ポリペプチド、およびポリペプチド断片の合成
分子生物学の当業者は、多種多様な発現系を用いて、組換えMLC-2aタンパク質を生産し得ることを理解されよう。以下に詳述するように、使用する宿主細胞の詳細は本発明に重要ではない。MLC-2aタンパク質は、原核生物宿主（例えば大腸菌）、または真核生物宿主（例えば、酵母（S. cerevisiae）、Sf9細胞等の昆虫細胞、またはCOS-1、NIH 3T3、もしくはHeLa細胞等の哺乳類細胞）において産生させることができる。これらの細胞は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、バージニア州、ロックビルから市販されている（Ausubelら、前記も参照のこと）。形質転換法および発現媒体（例えば発現ベクター）の選択は、選択した宿主系によって変わるであろう。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えばAusubelら、前記に記載されており、発現媒体は、例えばPouwelsら、Cloning Vectors: A laboratory Manual, 1985, Supp. 1987において提供される発現媒体から選択することができる。本発明に使用可能な発現系の具体例については、以下に詳述する。
【００８１】
タンパク質を発現させるために、プラスミドをはじめとするベクターにMLC-2a遺伝子配列を導入し、次にこれを用いて生細胞を形質転換するという、真核生物または原核生物の発現系を構築することができる。発現プラスミドに正しい方向に挿入された全読み枠を含む完全長のMLC-2acDNAを有する構築物を用いて、タンパク質を発現させることができる。あるいは、野生型または変異型のMLC-2a配列を含む、MLC-2a遺伝子の一部を挿入してもよい。原核生物または真核生物の発現系では、MLC-2aタンパク質の種々の重要な機能ドメインを必要であれば融合タンパク質として回収してから、結合試験、構造試験、および機能試験に使用することが可能であり、さらに抗体作製にも使用できる。
【００８２】
典型的な発現ベクターは、ベクターに挿入された核酸分子に対応する、大量のmRNAの合成を促すプロモーターを含む。ベクターはまた、宿主細胞内における自律的な複製を可能とする真核生物または原核生物に由来する複製起点、ベクターを含む細胞を薬剤存在下で選択可能とする、通常は毒性作用をもたらす薬剤に対する耐性を付与する配列、および合成されたmRNAの翻訳効率を高める配列も含む。長期安定型ベクターは、例えばウイルスの制御エレメント（例えば、エプスタイン・バーウイルスゲノム由来のOriP配列）を用いることで、遊離の複製分子として維持される。ベクターが細胞のゲノムDNAに組み込まれた形で存在する細胞株を作製することも可能であり、この方法では、遺伝子産物を細胞内で連続的に生産することができる。
【００８３】
大腸菌等の細菌内において外来分子を発現させるためには、外来核酸分子、例えばMLC-2a核酸分子を細菌の発現ベクターに挿入する必要がある。そのようなプラスミドベクターには、細菌内におけるプラスミドの増殖、およびプラスミド内に含まれる外来DNAの発現に必要ないくつかのエレメントが含まれる。プラスミドを保持する細菌のみを増殖させるためには、毒性薬剤の存在下でプラスミドを保持する細菌の増殖を可能とする、選択マーカーコード遺伝子をプラスミド内に導入する。該プラスミドは、外来DNAから大量のmRNAの合成を促し得る転写プロモーターも含む。このようなプロモーターは、適切な条件下（例えば、プロモーターを活性化する薬剤の存在下）での培養による誘導に応じて転写を開始する誘導性プロモーターとすることができるが、それ以外のプロモーターでもよい。プラスミドはまた、遺伝子をベクター内で正しい方向に挿入しやすくするポリリンカーを含むことが好ましい。
【００８４】
MLC-2a遺伝子、もしくはその断片、融合体、またはその変異体を含む適切な発現ベクターを構築したら、例えばカルシウムリン酸トランスフェクション、DEAEデキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、またはリポソームを用いたトランスフェクション等の形質転換手法により、そのベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。本発明のベクターを導入可能な宿主細胞には、大腸菌をはじめとする細菌、酵母、真菌、昆虫細胞（例えば、発現用バキュロウイルスベクターを使用して）、マウス、ヒトをはじめとする動物由来の細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。哺乳類細胞を使用して、例えばAusubelら、前記に記載されるウイルス発現系（例えばワクシニアウイルス発現系）によりMLC-2aタンパク質を発現させることもできる。
【００８５】
クローン化されたDNAにコードされるMLC-2aタンパク質、融合体、ポリペプチド断片、または変異型は、T7後期プロモーター発現系を用いて、インビトロで発現させることもできる。この系は、バクテリオファージT7のDNAにコードされる酵素である、T7 RNAポリメラーゼの制御型の発現に基づく。T7 RNAポリメラーゼは、T7後期プロモーターと呼ばれる特定の23塩基対のプロモーター配列から転写を開始する。T7後期プロモーターのコピーはT7ゲノム上の複数の部位に位置するが、大腸菌の染色体DNA上には存在しない。その結果として、T7を感染させた大腸菌では、T7 RNAポリメラーゼはウイルス遺伝子の転写を触媒するが、大腸菌遺伝子の転写は触媒しない。この発現系では、最初に、lacプロモーターの隣にT7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子をもつように、組換え大腸菌細胞を操作しておく。これらの細胞はIPTG存在下でT7ポリメラーゼ遺伝子を高率で転写し、大量のT7 RNAポリメラーゼを合成する。次に、これらの細胞をT7後期プロモータータンパク質のコピーを有するプラスミドベクターで形質転換する。これらの形質転換された大腸菌細胞を含む培養液にIPTGを添加すると、大量のT7 RNAポリメラーゼが産生される。このポリメラーゼは次に、プラスミド発現ベクター上のT7後期プロモーターに結合し、挿入されたcDNAの転写を高率で触媒する。個々の大腸菌細胞は多コピーの発現ベクターを含むので、クローン化されたcDNAに対応する大量のmRNAをこの系で産生させることが可能であり、結果として得られるタンパク質は放射性標識することができる。
【００８６】
後期プロモーターを含むプラスミドベクターならびにT3、T5、およびSP6等の類縁バクテリオファージ由来の対応するRNAポリメラーゼを使用して、クローン化したDNAからインビトロでタンパク質を生産することができる。大腸菌はまた、mGPI-2等のM13ファージを用いた発現にも使用することができる。さらに、ラムダファージの制御配列を含むベクター、または融合タンパク質の発現を促すベクター、例えばマルトース結合タンパク質の融合タンパク質もしくはグルタチオンSトランスフェラーゼの融合タンパク質も大腸菌における発現に使用できる。
【００８７】
真核生物の発現系は、発現タンパク質を適切に翻訳後修飾するために有用である。MLC-2aタンパク質を含む真核生物の発現プラスミドを真核生物の宿主細胞に一過性トランスフェクションすることにより、トランスフェクションされた宿主細胞でMLC-2aタンパク質を一過性に産生させることができる。MLC-2aタンパク質は、安定性トランスフェクションした真核生物（例えば哺乳類）の細胞株で産生させることもできる。哺乳類細胞の安定性トランスフェクションに適した多くのベクターが一般に利用でき（例えば、Pouwelsら、前記を参照のこと）、このような細胞を含む細胞株の構築法についても同様である（Ausubelら、前記を参照のこと）。
【００８８】
一例として、MLC-2aタンパク質、融合体、変異型、またはポリペプチド断片をコードするcDNAを、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子を含む発現ベクターにクローン化する。プラスミドの宿主細胞染色体への組み込み、つまりtell tale heartタンパク質コード遺伝子の宿主細胞染色体への組み込みは、細胞培養液中に0.01〜300 μMのメトトレキセートを添加することで選択する（Ausubelら、前記）。この優性選択法は、たいていの細胞種で行うことができる。DHFRを用いてトランスフェクションされた遺伝子を増幅することにより、組換えタンパク質の発現を増加させることができる。遺伝子増幅した細胞株の選択法は、Ausubelら、前記に記載されている。このような方法は、一般に、メトトレキセート濃度を徐々に増加させた培養液中で長時間培養することに関連する。最も広く使用されているDHFR含有発現ベクターは、pCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV(A)である（例えばAusuelら、前記に記載されている）。上述の宿主細胞、または好ましくはDHFR欠損CHO細胞株（例えばCHO DHFR細胞、ATCCアクセッション番号CRL 9096）は、安定にトランスフェクションされた細胞株のDHFR選択またはDHFRによる遺伝子増幅に極めて好ましい細胞株の例である。
【００８９】
真核生物の別の好ましい発現系には、例えばクロンテック（Clontech）（カリフォルニア州、パロアルト）から入手可能なpBacPAK9ベクター等のベクターを用いるバキュロウイルスの系がある。必要であれば、この系は、例えばEvanら（Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616, 1985）に記載のmycタグ法等の他のタンパク質発現手法と併せて使用することができる。
【００９０】
組換えタンパク質が発現したら、細胞溶解とそれに続くアフィニティクロマトグラフィー等のタンパク質精製手法により、発現細胞からこの組換えタンパク質を単離することができる。この例では、本明細書に記載の方法で作製可能な抗MLC-2aタンパク質抗体をカラムに結合させ、組換えMLC-2aの単離に使用することができる。アフィニティクロマトグラフィーに先行するMLC-2aタンパク質を有する細胞の溶解および分画は、標準的な方法で行うことができる（例えばAusubelら、前記を参照のこと）。単離後、必要に応じて、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC；例えばFisher、Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, Work and Burden, Eds.,  Elsevier, 1980を参照のこと）により組換えタンパク質をさらに精製することができる。
【００９１】
本発明のポリペプチド、特に短いMLC-2a断片、ならびにMLC-2aのN末端およびC末端のより長い断片も、化学合成により（例えばSolid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford ILに記載の方法により）作製することができる。本明細書に記載したように、ポリペプチドを発現させて精製するこれらの一般的な手法を用いても、有用なMLC-2a断片または類似体を作製し単離することができる。
【００９２】
MLC-2aタンパク質断片
MLC-2aタンパク質の様々な部分を含むポリペプチド断片は、生物学的活性に重要な役割を果たすMLC-2aのドメインを同定する際に有用である。本明細書で提供するヌクレオチド配列を用いてこのような断片を作製する方法は、当技術分野で周知である（例えばAusubelら、前記を参照のこと）。例えば、MLC-2aタンパク質断片は、MLC-2a核酸配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、所望のMLC-2a核酸分子の断片をPCR増幅することにより作製できる。オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅後の断片を発現ベクター（例えば哺乳類の発現ベクター、上記を参照のこと）のクローニング部位へ容易に挿入するそれぞれ1か所しかない制限酵素切断部位を含むことが好ましい。このベクターは、次に、本明細書に記載された方法をはじめとする当技術分野で周知の様々な手法のいずれかを用いて、細胞（例えば哺乳類細胞、上記を参照のこと）に導入することができ、その結果、発現ベクターを含む細胞内でMLC-2aタンパク質断片が産生される。MLC-2aタンパク質断片（例えばキメラの融合タンパク質）は、例えば後述する方法により、MLC-2aタンパク質の様々な領域に特異的な抗体を産生させる際にも使用することができる。いくつかの例において、断片中に保存されたドメイン（例えばカルシウム結合ドメイン）を含め、一方、他にはあまり保存されないドメインを含めることが望ましい場合がありうる。
【００９３】
MLC-2aタンパク質抗体 
ポリクローナル抗体を調製するためには、MLC-2aタンパク質、MLC-2aタンパク質の断片、またはMLC-2aタンパク質の特定の部分を含む融合タンパク質を、例えば細菌中で適切なクローニング媒体に含まれる対応DNA配列を発現させることによって合成することができる。通常は、抗体産生に用いられる抗原の供給源として融合タンパク質が使用される。大腸菌で広く用いられている発現系には、pURシリーズのベクターを用いるlacZ融合とpATHベクターを用いるtrpE融合の二つがある。タンパク質は精製後に担体タンパク質と結合させ、被接種動物における抗原応答を促進するためにフロイントアジュバントと混合し、ウサギをはじめとする実験動物に注入することができる。または、タンパク質は、MLC-2aを発現する培養細胞から単離することができる。2週間毎に行うブースター注射に続いて、ウサギをはじめとする実験動物から採血して血清を分離する。この血清は直接使用できるほか、プロテインAセファロース、抗原セファロース、および抗マウスIgセファロース等の試薬を用いるアフィニティクロマトグラフィーを含む様々な方法で使用前に精製することができる。次にこの血清を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画したMLC-2a発現組織由来のタンパク質抽出物を精査し、MLC-2aタンパク質を同定することができる。または、タンパク質の抗原性部分に対応する合成ペプチドを作製して、動物への接種に用いることができる。
【００９４】
ペプチドまたは完全長のタンパク質を例えばMLC-2a特異的抗体産生用に作製するためには、MLC-2aをコードする配列をグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST；Smithら、Gene 67:31-40, 1988）とのC末端またはN末端融合体として発現させてもよい。融合タンパク質はグルタチオン‐セファロースビーズ上で精製し、グルタチオンで溶出し、さらにトロンビンまたはファクターXa等のプロテアーゼで（作出された切断部位において）切断し、さらにウサギを良好に免疫化するのに必要な程度まで精製する。初回免疫はフロイント完全アジュバントを用いて実施し、それに続く免疫はフロイント不完全アジュバントを用いて実施するとよい。抗体の力価は、GST−MLC-2aタンパク質をプロテアーゼで切断したMLC-2aタンパク質断片を用いてウェスタンブロットおよび免疫沈降解析することにより、評価できる。免疫血清は、CNBrセファロースに結合させたMLC-2aを用いてアフィニティ精製することができる。抗血清の特異性は、関連のないGST融合タンパク質のパネルを用いて決定することができる。
【００９５】
または、モノクローナルMLC-2a抗体は、MLC-2aを発現する培養細胞から単離されたMLC-2aタンパク質または組織から単離されたMLC-2aタンパク質を抗原として用いることにより、作製することができる。MLC-2aを含む細胞抽出物または組換えタンパク質抽出物は、例えば、フロイントアジュバントと共にマウスに注射することができる。注射から数日後にマウスの脾臓を切除し、組織をばらばらにし、脾臓細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）に懸濁する。脾臓細胞はリンパ球の供給源となり、リンパ球の一部は適当な特異性をもつ抗体を産生すると考えられる。次に、これらを永久に増殖するミエローマ細胞と融合し、融合した細胞を多数の組織培養用ウェルにヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT）等の選択薬剤の存在下でプレーティングする。次にこれらのウェルを対象にELISAによりスクリーニングを行い、MLC-2aタンパク質、ポリペプチド断片、またはその変異型に結合可能な抗体を産生する細胞を含むウェルを同定する。次にこれらの細胞を再プレーティングして成長させた後に、同細胞を含むウェルのスクリーニングを再び行って抗体産生細胞を同定する。続いてこれらの細胞を再度プレーティングし、増殖させた後、これらの細胞を含むウェルを再度スクリーニングして抗体産生細胞を同定する。90％を越えるウェルが特異的抗体産生について陽性を示す単一のクローンを含むようになるまで、複数のクローニング法を実施してもよい。この手順により、抗体を産生する安定なクローン株を樹立することができる。次に、プロテインAセファロースを用いるアフィニティクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー、ならびにこれらの手法を改変または組み合わせることにより、モノクローナル抗体を精製することができる。モノクローナル抗体の産生が認められたら、ウェスタンブロットまたは免疫沈降解析により、MLC-2aタンパク質に対する認識の特異性についても検討を行う（例えば、Kohlerら、Nature 256:495, 1975；Kohlerら、European Journal of Immunology 6:511, 1976；Kohlerら、European Journal of Immunology 6:292, 1976；Hammerlingら、In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, New York, NY, 1981；Ausubelら、前記を参照のこと）。
【００９６】
GST融合タンパク質に対する代替または補助的な免疫源として、MLC-2aの比較的特有な親水性領域に対応するペプチドを作製し、C末端に導入したリシンを介してキーホールリンペットヘモシニアン（KLH）に結合させることができる。個々のこれらペプチドに対する抗血清は、BSAに結合させたペプチド上で同様にアフィニティ精製することが可能であり、その特異性は、ペプチド複合物を用いるELISAおよびウェスタンブロッティング、ならびに例えばGST融合タンパク質として発現させたMLC-2aを用いるウェスタンブロッティングおよび免疫沈降により調べることができる。
【００９７】
本発明の抗体は、Jamesoら、CABIOS 4:181, 1988のアルゴリズムを用いたペプチド構造プログラム（ジェネティクスコンピューターグループ配列解析パッケージ、Program Manual for the GCG Package, Version 7, 1991）により提供されるような基準に基づく解析から、高度に保存された領域内には存在せず抗原性が強いと考えられるMLC-2aアミノ酸配列を用いて作製することができる。これらの断片は、標準的な手法、例えばPCRやpGEX発現ベクターへのクローン化によって作製することができる。GST融合タンパク質は、大腸菌で発現させ、グルタチオン‐アガロースのアフィニティマトリックス（Ausubelら、前記）を用いて精製することができる。ウサギのポリクローナル抗体を作製するため、およびMLC-2aに対して非特異的な抗血清または親和性の低い結合を示す抗血清が得られる可能性を最小限にするためには、各タンパク質について2、3種の融合体を作製し、各融合体を少なくとも2匹のウサギに注射する。好ましくは少なくとも3回のブースター注射を含む連続的な注射を行うことで、抗血清が得られる。
【００９８】
本発明は、完全な形のモノクローナルおよびポリクローナルの抗MLC-2a抗体に加え、遺伝子操作した様々な抗体、ヒト化抗体、およびF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、およびsFvの各断片を含む抗体断片を扱う。例えば切断型のモノクローナル抗体は、組換え法を使って、所望のモノクローナル抗体断片（断片群）を適切な宿主で発現するプラスミドを作製することにより産生できる。抗体は当技術分野で周知の方法でヒト化することができ、例えば所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体は外注でヒト化できる（スコットジーン（Scotgene）、スコットランド；オックスフォードモレキュラー（Oxford Molecular）、カリフォルニア州、パロアルト）。トランスジェニック動物で発現される抗体等の完全なヒト抗体も、本発明に含まれる（Greenら、Nature Genetics:13-21, 1994）。
【００９９】
Ladner（米国特許第4,946,778号および第4,704,692号）は、1本鎖ポリペプチド抗体の調製法を記載している。Wardら、Nature 341, 544-546, 1989は、彼らが「シングルドメイン抗体」と呼ぶ、高い抗原結合親和性を有する重鎖可変ドメインの調製法を記載している。McCaffertyら、Nature 348:552-554, 1990は、完全な抗体Vドメインがfdバクテリオファージの表面に呈示可能であること、該ファージが抗原に特異的に結合すること、および極めて少数のファージ（100万個に1つ）がアフィニティクロマトグラフィーで単離可能であることを示している。Boss（米国特許第4,816,397号）は、単一の宿主細胞内で、免疫グロブリンならびに少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む免疫学的に機能するそれらの断片を作製するさまざまな方法を記載している。Cabillyら、米国特許第4,816,567号は、キメラ抗体の調製法を記載している。
【０１００】
MLC-2a抗体の使用 
上述した通り、MLC-2aに対する抗体を用いてMLC-2aを検出することができるほか、MLC-2aの生物活性を抑制することができる。例えば、抗体または抗体の一部をコードする核酸分子を細胞内で発現させ、MLC-2aの機能を抑制することができる。また、診断または治療に用いるために、抗体を放射性核種およびリポソーム等の化合物に結合させることができる。本明細書に記載したMLC-2aポリペプチドの活性を抑制する抗体は、野生型または変異型のMLC-2a遺伝子の不適当な発現に起因する疾患の発症を防いだり緩やかにするためにも有用である。
【０１０１】
MLC-2a遺伝子発現の検出
上述したように、上記抗体を用いてMLC-2a遺伝子の発現を観察することができる。RNAのインサイチューハイブリダイゼーションにより、MLC-2a遺伝子の発現を検出することができる。RNAインサイチューハイブリダイゼーション手法は、特異的に標識された核酸プローブと、個々の細胞または組織内における細胞RNAとのハイブリダイゼーションに基づく。したがって、RNAインサイチューハイブリダイゼーションは、組織特異的および時間特異的な遺伝子発現を調べる強力な方法である。この方法では、MLC-2a遺伝子の特有の部分に対応するオリゴヌクレオチド、クローン化されたDNA断片、またはクローン化されたDNA断片のアンチセンスRNA転写産物を用いて、例えばマウス等の動物組織内で様々な発生段階において、特定のmRNA種を検出する。当業者に周知の他の遺伝子発現検出手法を用いて、MLC-2a遺伝子の発現を検出することもできる。
【０１０２】
さらなるMLC-2a遺伝子の同定 
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAハイブリダイゼーション等の標準的な手法を用いて、他の種におけるMLC-2a相同体、およびヒトにおけるMLC-2a関連遺伝子をクローン化することができる。MLC-2a 関連遺伝子および相同体は、ヒトのMLC-2aプローブまたはプライマーを用いて、ストリンジェンシーの低いDNAハイブリダイゼーションまたはストリンジェンシーの低いPCRで容易に同定することができる。ヒトのMLC-2aアミノ酸配列またはヒトのMLC-2a関連アミノ酸配列をコードする縮重プライマーを用いてRT-PCRすることにより、さらなるMLC-2a関連遺伝子および相同体をクローン化することができる。
【０１０３】
トランスジェニック動物およびノックアウト動物の作製
MLC-2a遺伝子の特性解析を行うことで、相同組換えによりMLC-2aノックアウト動物モデルを作製可能とするための情報が得られる。MLC-2aノックアウト動物は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはマウスである。同様に、MLC-2a を過剰に生産する動物モデルは、標準的なトランスジェニック手法により、一つ以上の複数のMLC-2a 配列を動物のゲノムに組み込むことで作製することができる。さらに、MLC-2a変異の影響（例えば優性遺伝子突然変異）は、変異したMLC-2aの導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いることで、または標準的な相同組換え法でそのような変異を内在性のMLC-2a遺伝子に導入することで、検討可能である。
【０１０４】
ノックアウトモデルの作製に使用可能な置換型の標的ベクターは、例えば129/Sv（ストラタジーン社（Stratagene Inc.）、カリフォルニア州、ラホーヤ）等のマウス系統に由来する同質遺伝子のゲノムクローンを用いて構築することができる。胚幹（ES）細胞の適切に派生された系統に標的ベクターをエレクトロポレーションにより導入することで、末端が大きく切断された型のMLC-2a遺伝子を有するES細胞株を作ることが可能である。キメラの創始マウスを作製するためには、標的細胞株をマウスの胞胚期の胚に注入する。ヘテロ接合の子孫を同系交配することにより、ホモ接合の個体を得ることができる。MLC-2aノックアウトマウスは、MLC-2aが胚発生および疾患に果たす役割を調べるためのツールとなる。またこのようなマウスは、MLC-2aに依存する経路またはMLC-2aが影響を及ぼす経路にかかわる疾病または病態を回復させる治療化合物をインビボにて試験する手段を提供する。
【０１０５】
心臓の幹細胞マーカーとしてのMLC-2aの使用
発生の過程において、心臓を生じる細胞でMLC-2aが発現されることから、MLC-2aを心臓の幹細胞マーカーとして使用することができる。例えば、MLC-2aを用いて、そのような幹細胞を同定、選別、または標的することができる。例えば、候補細胞のプールをMLC-2a発現について解析し、心臓幹細胞の同定を容易にすることが可能であり、この同定に基づきこの細胞をプールから分離することができる。単離された幹細胞は、当技術分野で周知の多くの目的に使用され得る。例えば、幹細胞は、新しい器官の産生において、器官培養において、または損傷したまたは移植された器官を強化するために使用され得る。
【０１０６】
実験結果
tell tale heart（telm225）は、初期胚の心臓収縮性を選択的に撹乱させる、ENUに誘導されるゼブラフィッシュの劣性胚性致死変異である。tel変異胚は、解剖学的に正しい位置に内心膜層および心筋層の両方を含む、外見上形態学的に正常な心管を形成する。これらの変異の第一に明らかな欠陥は、心管を横切る蠕動収縮波の劇的な減少である。tel変異体は、受精後72時間にループを形成し正常な細胞数および大きさを示す2つの心腔を生じる。しかし、心臓収縮性は著しく障害され、房室管においてのみ律動収縮が観察され得る。心室の心筋細胞は全く収縮しないものの、心房においては弱い局所的な収縮が観察され得る。血液循環は確立されず、tel変異胚は受精後7日目に死亡する。
【０１０７】
バルク法（bulked segregant analysis）により、telをゼブラフィッシュ連鎖群8に割り当てた。微細な減数分裂マッピングにより、tel遺伝子座はマイクロサテライトマーカーZ25210間の1.4 cM区間に位置づけられた。その区間へのESTマッピングについて組換え事象をさらに試験したところ、ESTクローンfb57f10では4498回の減数分裂事象において1回しか組換えが起こらなかった。
【０１０８】
fb57f10を含むBACクローンを単離し、ショットガンシークエンスを行った。このBAC上に4つのオープンリーディングフレームが検出され、1つは高度に保存されたゼブラフィッシュ調節ミオシン軽鎖遺伝子（MLC-2a）（図2）をコードしていた。候補gDNAおよびcDNAのシークエンシングにより、ゼブラフィッシュミオシン軽鎖2a（MLC-2a）遺伝子のスプライス供与部位変異が明らかになった（図3）。tel変異型cDNAにおいて3つの異なる変異型スプライス産物が検出されたが、どの転写産物もそれぞれエクソン3または4の前で翻訳の未熟な終結を生じるものであった（図3）。アンチセンスモルフォリノ（morpholino）改変オリゴヌクレオチド（モルフォリノ）を用いたゼブラフィッシュMLC-2aの翻訳阻害により、高い浸透度でtel変異胚と識別不能な表現型を生じた。ゼブラフィッシュMLC-2a mRNAは14体節における心臓前駆細胞で発現され、発生4日目まで心臓の全体にわたって発現され続ける。これらのデータに基づき、本出願者らは、ゼブラフィッシュMLC-2aにおける機能喪失変異がtel表現型の原因であると結論づけた。2つの主要なミオシン軽鎖2（MLC2）アイソフォームが脊椎動物の心発生の初期段階において同時に発現され、心室アイソフォームおよび心房アイソフォームはそれぞれ胚形成の過程で筋細胞種特異的な様式で厳重に制御されている。マウスにおいてミオシン軽鎖2v（MLC 2v）遺伝子を破壊すると、胚齢12.5日で初期胚が死亡する。ホモ接合体変異体の心室では、MLC-2aタンパク質レベルの上方制御が観察され得るが、マウスは筋節構築における欠陥、および左心室の駆出率の顕著な減少により特徴づけられる拡張型心筋症の胚形態を示す。MLC-2vにおける点変異はヒト心筋症の遺伝子形態と関連することが示されており、また心肥大および心不全において心房MLC-2アイソフォーム（MLC-2a）の誘導が起こることが示されている。本出願者らのデータにより、はじめて、脊椎動物の胚発生における心室収縮性および心房収縮性においてのMLC-2aの重要な役割が示された。これらのよく見られる疾患の新規治療標的を同定する際に、心肥大および/または心不全において、胎児性遺伝子の再発現に関与する制御過程の解析を本発明に従って用いることが可能である。
【０１０９】
その他の態様 
本明細書に記載したすべての刊行物および特許出願は、それぞれの独立した刊行物または特許出願が参照として組み入れられることが特におよび個々に示されている場合と同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１１０】
本発明をその特定の態様とともに説明してきたが、本発明はさらなる改変が可能であり、本出願は、本発明の原理に一般に準拠しつつ、および本発明に関する技術分野の範囲内にある周知または慣習的な実践の中で起こるような本開示からの逸脱を含みつつ、本発明のいかなる変更、使用、または適合にわたることが意図されており、本明細書に上述した基本的な特徴に適用可能であり、添付の特許請求の範囲に従うことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ゼブラフィッシュおよびヒト野生型ミオシン軽鎖2aのcDNAおよびアミノ酸配列の略図である。同様に図1に、以下のゼブラフィッシュミオシン軽鎖2変異型のcDNAおよびアミノ酸配列を提供する：エクソン3欠損、エクソン3〜5欠損、およびイントロン3挿入。
【図２】アフリカツメガエル、ヒト、マウス、およびショウジョウバエオーソログとの、ゼブラフィッシュミオシン軽鎖2aのアミノ酸配列アラインメントである。
【図３】telm225におけるスプライス供与部位変異の影響を示す略図である。
【配列表】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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