(57)【要約】本発明は、複製することができ、欠損しているタンパク質を相補するが感染性子孫ウイルスを生産しない、細胞内の感染性ウイルス粒子にパッケージングされうる新しいペスチウイルスＲＮＡゲノム（レプリコン）を提供する。そのようなレプリコンはワクチンのために有用でありうる。前記レプリコンは、ウイルスの大部分の、好ましくは全てのエンベロープタンパク質をコードするが、他方で、感染性子孫ウイルスを生産することができない。本発明は、機能性Ｃ又はＥ１タンパク質を除く全ての構造タンパク質を発現するペスチウイルスレプリコン、好ましくはウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）からのペスチウイルスレプリコンを提供する。好ましくは、Ｅ１又はＣタンパク質のコード配列の少なくとも一部が前記レプリコンから欠失している。発明者は、初めて、Ｃ及びＥ１構造タンパク質の両方が感染性ペスチウイルスの形成にとって必須であることを明らかにした。さらに、Ｃ及びＥ１の欠失はＲＮＡの自律複製能力に影響を及ぼさないことを示した。ペスチウイルス構造タンパク質を構成的に発現する細胞系を使用することにより、カプシド又はＥ１タンパク質を効率的にトランス相補することができる。生じるビリオンは、ウシ標的細胞に感染し、複製コンピテントウイルス子孫を生成することなくレプリコンを転移することができる。言い換えると、感染性子孫ウイルスは全く生産されない。相補されたビリオンは、ウイルス中和実験において野生型ペスチウイルスと識別できない。感染性野生型ＢＶＤＶを生じる組換えは、相補性実験のいずれにおいても検出されなかった。前記相補ウイルスは、ＢＶＤＶに対する安全で有効な免疫のために使用しうる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性Ｃ及び／又はＥ１タンパク質を除くペスチウイルスの全ての構造タンパク質を発現することを特徴とする、ペスチウイルスの１個以上の構造タンパク質を発現することができないペスチウイルスのレプリコン。
【請求項２】
Ｅ１又はＣタンパク質のコード配列の少なくとも一部が前記レプリコンから欠失している、請求項１に記載のレプリコン。
【請求項３】
前記レプリコンが機能性Ｃタンパク質をコードしないことを特徴とする、請求項１又は２に記載のレプリコン。
【請求項４】
前記レプリコンがウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）である、請求項１又は２に記載のレプリコン。
【請求項５】
Ｃタンパク質のアミノ酸位置２０１−２４３をコードするコード領域が欠失していることを特徴とする、請求項４に記載のレプリコン。
【請求項６】
前記レプリコンが機能性Ｅ１タンパク質をコードしないことを特徴とする、請求項１又は２に記載のレプリコン。
【請求項７】
Ｅ１タンパク質のアミノ酸位置４９８−６５３をコードするコード領域が欠失していることを特徴とする、請求項４に記載のレプリコン。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のレプリコンを含むことを特徴とする、ペスチウイルスの感染性ウイルス粒子。
【請求項９】
以下の工程：
ａ．ペスチウイルスに許容性であり、ペスチウイルスのＥ１及び／又はＣタンパク質を発現する細胞を提供すること、
ｂ．前記細胞を請求項１から７のいずれかに記載のレプリコンのインビトロ転写ＲＮＡでトランスフェクトすること、
ｃ．工程ｂで得たトランスフェクト細胞を培養すること、及び
ｄ．前記培養細胞からウイルス粒子を採集すること
を含むことを特徴とする、請求項８に記載のペスチウイルスのウイルス粒子の生産のための方法。
【請求項１０】
前記ペスチウイルスがＢＶＤＶであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞がＢＶＤＶのＥ１及び／又はＣタンパク質を発現することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の感染性ウイルス粒子及び医薬適合性の担体を含有するワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペスチウイルスの全ての構造タンパク質を発現しないペスチウイルスのレプリコン、前記レプリコンを含む感染性ウイルス粒子、前記感染性ウイルス粒子を生産する方法、及び前記ウイルス粒子を含有するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物はワクチン接種によってペスチウイルスから保護されうるが、従来の不活化又は改変生ワクチンは安全性ならびに効果に関して不都合な点がある。それ故、新しいタイプのワクチンが開発されるべきである。
【０００３】
ペスチウイルスは、２つの異なる生物型、それぞれ細胞病原性（ｃｐ）及び非細胞病原性（ｎｃｐ）ウイルスに分けられる。フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｄａｅ）ファミリー内のペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属の成員である、ウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）は、世界中で経済的に重要な牛の疾患であるウシウイルス性下痢の病原因子である。遺伝的及び構造的に密接に関連するウイルス種は、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）及びヒツジのボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）である。ペスチウイルスは世界中で著しい経済的損失を伴う重症疾患を誘発しうる。ＢＶＤＶ感染によって引き起こされる重大な経済的損失は、受精率の低下、流産及び致死的な「粘膜病」を発症しうる持続的感染子ウシの出産である。
【０００４】
ｃｐＢＶＤＶはアポトーシス及び細胞死を誘導し、非構造的タンパク質３（ＮＳ３）を発現するが、ｎｃｐＢＶＤＶの接種は細胞培養物の持続的感染を導き、ＮＳ３発現は検出できない。ペスチウイルスゲノムは正方向の一本鎖ＲＮＡから成る。そのＲＮＡは約１２．３ｋｂの長さを有し、両方のゲノム末端で非翻訳領域（ＮＴＲ）に隣接された１個の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ペスチウイルスＯＲＦは１個のポリタンパク質に翻訳され、前記ポリタンパク質はウイルス及び細胞プロテアーゼによって１１個（ｎｃｐＢＶＤＶ）又は１２個（ｃｐＢＶＤＶ）の成熟タンパク質へと同時又は翻訳後プロセシングされる。ペスチウイルスビリオンは、４個の構造タンパク質、１個のカプシド（Ｃ）タンパク質及び３個のグリコシル化エンベロープタンパク質（ＥＲＮＳ、Ｅ１、Ｅ２）から成る。ＢＶＤＶ抗体はＥＲＮＳ、Ｅ２及びＮＳ３に対して惹起される。中和活性は主としてＥ２特異的抗体に関して明らかにされた。
【０００５】
ペスチウイルスのレプリコンに関する研究は、逆遺伝学システム及び自律複製サブゲノムＲＮＡ（レプリコン）の発見によって大きく促進された（４、２６）。
【０００６】
欠失を有するペスチウイルスゲノムは、ＢＶＤＶ及びＣＳＦＶについての干渉性欠損粒子（ＤＩ）として最初に記述された（２４、２７）。
【０００７】
それ以来、ペスチウイルスのレプリコンに関する多くの報告が公表されてきた。フラビウイルスファミリーのウイルスの構造タンパク質のトランス相補性が報告されている。
【０００８】
ペスチウイルスの自律複製ＲＮＡは、ウイルスの複製、アセンブリ及び放出の理解のための重要なツールである。前記ゲノムの欠失部分のトランス相補性は、例えば、ペスチウイルスゲノムのトランス作用性エレメントを同定するために使用できる。
【０００９】
ＣＳＦＶ複製のための最小必要条件が、例えば、構造タンパク質についての遺伝子配列を持たない欠損ＣＳＦＶゲノムを作製することによって検討された。欠損ＣＳＦＶゲノムは、ヘルパーＡ１８７−ＣＡＴ  ＲＮＡと共にＳＫ−６細胞に導入したとき、まだ複製され、ウイルス粒子にパッケージングされうることが認められた（Ｍｏｓｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７８７−７７９４，１９９９）。Ｃ、Ｅｍｓ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７及びＮＳ２をコードする遺伝子を持たない自律複製欠損ＢＶＤＶゲノムが記述されている（Ｂｅｈｒｅｎｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２、２３６４−２３７２，１９９８）。クンジンウイルス（Ｋｕｎｊｉｎ  ｖｉｒｕｓ）（ＫＵＮ）レプリコンに関しては、構造領域に欠失を有するレプリコンは、ＢＨＫ−２１細胞を２回の連続する電気穿孔法によって、すなわち最初は突然変異ＫＵＮレプリコンで、及びその後組換えＫＵＮ構造タンパク質を発現するセムリキ森林ウイルスレプリコンでトランスフェクトした系を使用してビリオンにパッケージングされた（Ｋｈｒｏｍｙｋｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（７）、５９６７−５９７７，１９９８）。ＣＳＦＶについては、Ｅｍｓ欠失レプリコンを含むトランス相補性欠損ビリオンは潜在的にワクチンのための基剤として使用しうることが認識されてきた。ＣＳＦＶのＥＲＮＳ欠失レプリコンが、ＣＳＦＶ  ＥＲＮＳを構成的に発現するブタ腎細胞系（ＳＫ６）を用いて作製され、トランス相補された。生じたビリオンは、感染性ウイルス子孫を生産せずにＳＫ６細胞に感染することができ、ＥＲＮＳ発現ＳＫ６細胞に継代することができた。ブタは、相補ビリオンによる免疫後に致死的ＣＳＦＶ攻撃誘発に対して保護された（４０）。
【００１０】
これまで、ＢＶＤＶレプリコンのトランス相補性に関する報告はごくわずかしか存在しなかった。非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳＮＳ４ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５Ｂについてのコード領域内の欠損は相補不能であることが認められたが、ＮＳ５Ａユニットにおける欠損はトランスで相補することができた（Ｇｒａｓｓｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５、７７９１−７８０２，２００１）。（４、１８、３６）。ＢＶＤＶ  Ｅ２及び／又はｐ７を構成的に発現する細胞系を使用した、ＢＶＤＶ  Ｅ２及び／又はｐ７のトランス相補性も記述されている（Ｈａｒａｄａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４、９４９８−９５０６，２０００）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、複製することができ、欠損しているタンパク質を相補するが感染性子孫ウイルスを生産しない、細胞内の感染性ウイルス粒子にパッケージングされうる新しいペスチウイルスＲＮＡゲノム（レプリコン）を提供する。
【００１２】
ペスチウイルスの構造タンパク質をコードする全ての遺伝子が、複製する能力に影響を及ぼさずに欠失されうることが当技術分野において公知であったが（Ｂｅｈｒｅｎｓら、前出）、全ての構造タンパク質を欠損しているそのような突然変異体はワクチン目的には適さない。ワクチンは主として免疫応答を誘発することを目的とする。ワクチンは、一方では、防御免疫応答を惹起することができるべきであり、他方では、言うまでもなく、接種動物又は接触動物において（ウイルス性）疾患を誘発してはならない。誘発される免疫応答は通常、主としてウイルスのエンベロープタンパク質に対して起こる。しかし、全ての構造タンパク質、より特定すると全てのエンベロープタンパク質コード配列が欠失しているレプリコンを使用する場合、前記レプリコンからはそのようなタンパク質が生産されず、これらのタンパク質に対する免疫応答は得られない。
【００１３】
本発明者は、ウイルスの大部分の、好ましくは全てのエンベロープタンパク質をまだコードするが、他方で、感染性子孫ウイルスを生産することができないレプリコンを提供することを目指した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、機能性Ｃ及び／又はＥ１タンパク質を除くウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）の全ての構造タンパク質を発現する、ペスチウイルス、好ましくはウシウイルス性下痢性ウイルスのレプリコンを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
レプリコンは自律複製するＲＮＡ分子である。この場合、ＲＮＡ分子はＢＶＤウイルスのＲＮＡゲノムである。レプリコンはＢＶＤウイルスの完全長ｃＤＮＡクローンから、例えばｐＡ／ＢＶＤ／ｉｎｓ−のような完全長ＢＶＤＶ  ｃＤＮＡクローンから構築することができる（Ｍｅｙｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８６０６−８６１３，１９９６）。ＢＶＤＶ  ＲＮＡは、１個のポリタンパク質に翻訳される１個のＯＲＦを含み、前記ポリタンパク質はウイルス及び細胞プロテアーゼによって成熟タンパク質へとプロセシングされる。突然変異レプリコンを作製するときは、ＢＶＤＶ  ＯＲＦ内にフレームシフトを導入しないように注意しなければならない。さらに、構造タンパク質についてのコード配列が欠失しているとき、一部のＮ及び／又はＣ末端アミノ酸をコードする配列は前駆体ポリペプチドの翻訳後プロセシングを確実にするために保持されうる（プロテアーゼ開裂部位は保持される）。例えば、ＢＶＤＶ菌株ＮＣＰ７のカプシド（Ｃタンパク質）はアミノ酸（ＡＡ）１６９−２７０によってコードされる。Ｃ末端の約２５アミノ酸（ＡＡ２４５−２７０）は、ＥＲＮＳＥ１Ｅ２ポリタンパク質のトランスロケーションのためのシグナル配列として、及びカプシドタンパク質の推定上のアンカーとして機能する。カプシドタンパク質のＣ末端のシグナル配列は前記ポリタンパク質の下流のさらなるプロセシングのために必須である。機能性Ｃタンパク質の発現を、そのＣタンパク質をコードする遺伝子の部分を欠失させることによって妨げる場合、好ましくは、さらなる下流のプロセシングのために必須のタンパク質の部分をコードするコード配列は保持されるべきである。Ｃタンパク質については、好ましくは約３２ＡＡがＮ末端で保持されるべきである。下流プロセシングのために必要な配列の正確な長さは菌株又は細胞型ごとに異なりうる。
【００１６】
ＢＶＤＶ菌株ＮＣＰ７のエンベロープタンパク質Ｅ１はアミノ酸４９８−６９２によってコードされる。Ｃ末端の約３３アミノ酸（ＡＡ６６０−６９２）は、Ｅ２エンベロープタンパク質のトランスロケーションのためのシグナル配列として、及びＥ１エンベロープタンパク質の推定上のアンカーとして機能する。
【００１７】
しかし、他のシグナル配列又は他のペスチウイルス種（例えばＣＳＦＶ）の類似配列が、例えばＢＶＤＶ配列の代わりに使用しうる。ＢＶＤＶのＥ１突然変異体については、Ｎ末端のＡＡはシグナル配列として機能を持たない。
【００１８】
Ｅ１及びＣ突然変異体の両方に関して、機能性タンパク質を発現しないレプリコンの構築のためのいくつかの方法が考えられる。例えば、そのような突然変異体は、シグナル配列が保持される部分的欠失によって、又はシグナル配列が類似シグナル配列によって置換される部分的又は完全な欠失によって、又は塩基対交換だけが起こる突然変異によって作製しうる。
【００１９】
本発明者は、初めて、Ｃ及びＥ１構造タンパク質の両方が感染性ペスチウイルスの形成にとって必須であることを明らかにした。さらに、Ｃ及びＥ１の欠失はＲＮＡの自律複製能力に影響を及ぼさないことを示した。ペスチウイルス構造タンパク質を構成的に発現する細胞系を使用することにより、カプシド又はＥ１タンパク質を効率的にトランス相補することができる。生じるビリオンは、標的細胞に感染し、感染性複製コンピテントウイルス子孫を生産することなくレプリコンを転移することができる。相補されたビリオンは、ウイルス中和実験において野生型ペスチウイルスと識別することができず、例えばＢＶＤＶの場合は、ＢＶＤＶ特異的血清ならびにＢＶＤＶ  Ｅ２特異的血清によって完全に中和されうる。感染性野生型ＢＶＤＶを生じる組換えは相補性実験のいずれにおいても検出されなかった。
【００２０】
相補されたウイルスは、ＢＶＤＶなどのペスチウイルスに対する安全で有効な免疫のために使用しうる。
【００２１】
トランス相補ウイルスによる細胞及び動物の感染は、感染細胞においてコードされた全てのタンパク質を発現するが、ウイルス粒子は生成しない複製性ＲＮＡを生じる。
【００２２】
それ故相補ビリオンは、ＢＶＤＶなどのペスチウイルスによる感染に対する免疫のために使用でき、ワクチン接種された動物をペスチウイルス関連疾患から保護することができる。
【００２３】
１つの好ましい実施態様では、本発明に従ったレプリコンは機能性Ｃタンパク質をコードしない。これは、前記Ｃタンパク質についてのコード配列の少なくとも一部を欠失させることによって実現できる。ＢＶＤＶの場合は、好ましくは前記Ｃタンパク質のアミノ酸位置２０１−２４３をコードするコード領域を欠失させる。
【００２４】
本発明のもう１つの実施態様では、レプリコンは機能性Ｅ１タンパク質をコードしない。ＢＶＤＶに関しては、好ましくは前記Ｅ１タンパク質のアミノ酸位置４９８−６５３をコードするコード領域を欠失させる。
【００２５】
ウイルスのカプシドタンパク質であるＣタンパク質ならびにＥ１タンパク質は、感染性ウイルスを得るために必須であることが認められた。Ｃ又はＥ１タンパク質についてのコード配列を欠く突然変異体は、それ故、感染性ではない。カプシド又はＥ１タンパク質をコードしないが、免疫応答の原因となる全ての（エンベロープ）タンパク質（特にＥ２及びＥｍｓ）をコードする突然変異体の利点は、全てのエンベロープタンパク質についてのコード配列がまだ存在するので、その免疫応答は全てのエンベロープタンパク質に対する応答をまだ含むということである。
【００２６】
本発明に従うレプリコンを含むペスチウイルスの感染性ウイルス粒子は、同様に本発明の一部である。そのような粒子は前記ペスチウイルス、例えばＢＶＤＶのためのワクチンに組み込むことができる。
【００２７】
本発明に従うウイルス粒子の生産のための方法は、同様に本発明の一部である。そのような方法は次の工程：
ａ．特定ペスチウイルス（例えばＢＶＤＶ）に許容性であり、ペスチウイルスのＥ１及び／又はＣタンパク質を発現する細胞を提供すること、
ｂ．前記細胞を本発明に従ったレプリコンでトランスフェクトすること、
ｃ．工程ｂで得たトランスフェクト細胞を培養すること、及び
ｄ．前記細胞培養物からウイルス粒子を採集すること
を含みうる。
【００２８】
好ましくは、工程ｄで生産される粒子は、再び、特定ペスチウイルス（例えばＢＶＤＶ）に許容性であり、ペスチウイルスのＥ１及び／又はＣタンパク質を発現するよう新鮮細胞を感染させるために使用される。
【００２９】
本発明に従うウイルス粒子の生産において使用できる細胞は、少なくとも、前記レプリコンが基づくペスチウイルス又はもう１つ別のペスチウイルスでありうる、ペスチウイルスのＣタンパク質及び／又はＥ１タンパク質を発現することができるべきである。ＢＶＤＶの場合は、前記細胞は好ましくはＢＶＤＶのＥ１及び／又はＣタンパク質を発現すべきである。適切な相補細胞系の例を実施例の中で開示する。
【００３０】
ＢＶＤＶの場合は、そのような細胞は好ましくはウシ起源、例えばウシ腎細胞又は二倍体ウシ食道細胞系である。
【００３１】
ＢＶＤＶなどのペスチウイルスのコード配列を前記細胞に導入することができる方法は当技術分野において公知である。例えば、ＢＶＤＶの構造タンパク質（少なくともＣ及び／又はＥ１）についてのコード配列は、前記タンパク質をコードする発現プラスミドによって又はヘルパーウイルスによって前記細胞に導入しうる。ウイルス粒子をワクチンにおいて使用することを意図するときは、ヘルパーウイルスの存在による複雑な精製方法を回避するために、発現プラスミドの使用が好ましい。適切な発現プラスミドは当技術分野において公知である。
【００３２】
レプリコンＲＮＡのトランスフェクション後に感染性ウイルス粒子が生産される。所望ウイルス力価が得られるまで当技術分野で公知の方法に従って細胞を増殖させることができる。細胞培養物の上清から又は全細胞溶解産物からウイルスを採集しうる。
【００３３】
細胞をトランスフェクトするために使用する方法及び様々なクローニング手順は当技術分野において公知である（例えば：Ｓａｍｂｒｏｃｋ，Ｊ＆Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。ペスチウイルスの複製に適する全ての永久細胞系が使用でき、ウシ起源の細胞が好ましい。好ましくはＤＮＡで容易にトランスフェクトできる細胞を使用する。大部分のペスチウイルスの構造タンパク質のコード配列は短いスプライシング部位を含む。それ故、ＢＶＤＶ菌株の大部分に関して、核内経路を使用するプロモーター（例えばＨＣＭＶプロモーター）による発現を確実にするために前記スプライシング部位を排除した合成オープンリーディングフレーム（ｓｙｎＯＲＦ）を構築しうる。しかし、他の発現系（ウイルス、他のウイルスからのレプリコン、異なる欠失を有するペスチウイルスレプリコン）はトランス相補性のための欠失タンパク質を提供しうる。
【００３４】
本発明に従う感染性ウイルス粒子を医薬適合性の担体と共に現有するワクチンは、同様に本発明の一部である。
【実施例１】
【００３５】
（ＢＶＤＶレプリコンの構築と特性決定）
ＢＶＤＶ  ＣＰ７についての感染性クローンの樹立後、ｎｃｐ  ＢＶＤＶ（２６）の回収を可能にする、２７ヌクレオチド挿入物の欠失を有する構築物の変異体を作製した。ｐＡ／ＢＶＤＶ／Ｉｎｓ−と称するこの構築物に基づき、ＢＶＤＶ  ＯＲＦ内にフレームシフトを導入することなくＣ及びＥ１をコードする配列を欠失させることによってレプリコンを構築した（図１）。図１に示す突然変異体ＢＶＤＶクローンは、完全長ｃＤＮＡクローンｐＡ／ＢＶＤＶ／ｉｎｓ−に基づいて構築した。制限部位の位置は、ＢＶＤＶ／ＣＰ７ゲノム内のそれらの開列位置に相当する肩付き文字で指示している（図１）。
【００３６】
（プラスミド構築物）
ＮＣＰ７ΔＣ及びＮＣＰ７ΔＥ１プラスミドを２段階クローニング手順によって構築した。２個のＰＣＲフラグメントを、ＸｈｏＩ２０９及びＫｐｎＩ２４４７、３７９７で消化したプラスミドｐＡ／ＢＶＤＶ／ｉｎｓ−に挿入した（表１）。
【００３７】
プラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において増幅した。制限酵素消化及びクローニング手順は標準プロトコールに従って実施した。プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ，Ｍｉｄｉ又はＭａｘｉキットによって精製した。ＰＣＲ又は配列決定のために使用したプライマー（ＩＲＤ  ８００で標識）はあつらえ合成した（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）。それぞれの構築物の作製のためのプライマー対を表１に要約する。
【００３８】
生じたレプリコンは、カプシド領域の一部（ＮＣＰ７ΔＣ、アミノ酸位置２０１−２４３）（図１）又はＥ１コード領域の一部（ＮＣＰ７ΔＥ１、アミノ酸位置４９８−６５３）（図１）の欠失を含んだ。
【００３９】
生じたｃＤＮＡクローンのＰＣＲ及びヌクレオチド配列決定により、全ての欠失を確認した。
【００４０】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び配列決定）
ＰＣＲのために、ＰＴＣ−２００熱サイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を使用した。ＤＮＡに基づく増幅を、供給者のプロトコールに従ってＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によって実施した。ＲＴ−ＰＣＲについては、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してウイルス感染細胞の全ＲＮＡを抽出した。逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び配列特異的プライマーを使用してＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを増幅した。合成したｃＤＮＡを熱安定なＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で増幅し、ＰＣＲ産物を直接配列決定した。配列決定は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。ヌクレオチド配列をＬＩＣＯＲ自動シーケンサー（ＮＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で読み取り、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウエアパッケージバージョン９．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
【００４１】
（インビトロ転写及び電気穿孔法）
その後、インビトロ転写した完全長レプリコンＲＮＡをＢＶＤＶ陰性ＰＴ細胞にトランスフェクトした。
【００４２】
線状完全長ｃＤＮＡ構築物及びレプリコンのインビトロ転写は、製造者の指示に従ってＴ７  ＲｉｂｏＭａｘ（商品名）  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって実施した。ＲＮＡの量は、アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色によって評価した。トランスフェクションのために、トリプシン溶液を用いて１×１０７ＰＴ、ＰＴ＿８０５又はＫＯＰ−Ｒ細胞を分離し、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ−）で洗浄して、インビトロ合成したＲＮＡ  １−５μｇと混合し、ＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐｌｕｓ（ＥｑｕｉＢｉｏ）トランスフェクションキットを使用して電気穿孔した（８５０Ｖ、２５μＦ、１５６Ωで２パルス）。
【００４３】
（レプリコンの特性決定）
ＢＶＤＶタンパク質の検出のために、モノクローナル抗体（ｍａｂ）ＷＢ２１０（抗ＥＲＮＳ、ＣＶＬ、Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ）、ＷＢ２１５（抗Ｅ２、ＣＶＬ、Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ）、ＣＡ３（抗Ｅ２、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ＴｉＨｏ  Ｈａｎｎｏｖｅｒ）、ｍａｂ混合物ＷＢ１０３／１０５（抗ＮＳ３、ＣＶＬ、Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ）、及びＣ１６（抗ＮＳ３、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ＴｉＨｏ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ）を使用した（１５、１６、３１）。
【００４４】
ＮＳ３の一過性発現が、全てのレプリコンについてトランスフェクションの２４時間後からＩＦによって検出することができた。さらに、ＥＲＮＳ及びＥ２特異的免疫蛍光も明らかになった。しかし、高度に感受性のＫＯＰ−Ｒ細胞を使用した連続継代及び同時継代（ｃｏ−ｐａｓｓａｇｅ）後も、感染性組換えＢＶＤＶは回収できなかった（表２）。ＮＣＰ７ΔＣ及びＮＣＰ７ΔＥ１トランスフェクトＰＴ細胞のＮＳ３特異的免疫染色の強度は、完全長ＮＣＰ７  ＲＮＡでトランスフェクトした細胞に比肩し得、細胞の８５％以上がＩＦで陽性であった（表２）。完全長ＮＣＰ７  ＲＮＡのＰＴ細胞へのトランスフェクションは、１０３ＩＵ／ｍｌまでのウイルス力価を生じた。予想されたように、原型レプリコンＤＩ９（４）のＲＮＡによる細胞の電気穿孔は感染性ＢＶＤＶの回収を導かなかったが、ＮＳ３染色後に強い免疫蛍光が認められた。レプリコン又は完全長ＮＣＰ７でトランスフェクトしたＰＴ細胞のＲＴ−ＰＣＲは、正しい欠失を含む予想されたサイズのＢＶＤＶ特異的ＲＮＡの存在を明らかにした。要約すると、複製コンピテントであるがウイルス子孫を生成する能力を持たない欠失ＢＶＤＶゲノムが構築され、ウシ細胞に効率的にトランスフェクトすることができた。
【００４５】
【表１】
2005535338.tif 000003
【００４６】
【表２】
2005535338.tif 000004
【実施例２】
【００４７】
Ｃ−Ｅｍｓ−Ｅ１−Ｅ２発現細胞の樹立
（Ｃ−ＥＲＮＳ−Ｅ１−Ｅ２発現ＰＴ細胞の樹立）
ＢＶＤＶレプリコンに関する相補性研究を行うために、ＢＶＤＶ構造タンパク質を構成的に発現するウシ細胞系を確立した。
【００４８】
永久ウシ腎細胞系、ＰＴ細胞（ＲＩＥ１１  ＣＣＶＬ）を、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｅｌ  Ｒｉｅｍｓ（ＣＣＬＶ）の獣医学科における細胞系統コレクションから入手した。ＰＴ細胞は、ＤＮＡ／ＲＮＡトランスフェクション及び構成的発現細胞系の作製に対するそれらの適応性の故に選択した。１０％ＢＶＤＶ不含ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で細胞を増殖させた。
【００４９】
ＢＶＤＶ菌株ＰＴ８１０（４１）の構造タンパク質（Ｃ−ＥＲＮＳ−Ｅ１−Ｅ２）をコードするゲノム領域を化学合成オープンリーディングフレーム（Ｓｙｎ−ＯＲＦ；Ｔｏｂｉａｓ  Ｓｃｈｌａｐｐ，Ｂａｙｅｒ  ＡＧ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎの好意により提供された）としてクローン化した。これはＢＶＤＶ菌株ＮＡＤＬ（９）のヌクレオチド配列のヌクレオチド８９０から３５８４までに及ぶ２６９４ヌクレオチドから成り、それを、制限部位ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩを使用してｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。Ｓｙｎ−ＯＲＦのヌクレオチド配列はスプライス部位を除くように変更されていたが（３５）、ＢＶＤＶ菌株ＰＴ８１０のもとのアミノ酸配列を保持していた。さらに、ｐｃＤＮＡ３．１内に存在するＨＣＭＶ即時型プロモーターの制御下のポリタンパク質を発現させるためにＳｙｎ−ＯＲＦの最初のコドンをメチオニンに変更し、最後のコドンの後に終結コドンを挿入した。
【００５０】
生じた構築物ｐＣＤＮＡ＿Ｃ−Ｅ２（１μｇ）を使用して、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）でＰＴ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後２日目に、細胞培地を、１０％ウシ血清及びＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１ｍｇ／ｍｌを添加したＤＭＥＭに変えた。Ｇ４１８耐性コロニーを単離し、数回プレートした。
【００５１】
Ｇ４１８選択と継代後、耐性細胞クローンを、ｍａｂ  ＷＢ２１０及びＷＢ２１５をそれぞれ使用してＢＶＤＶ  ＥＲＮＳ及びＥ２発現に関して試験した。陽性細胞をクローン化し、Ｇ４１８選択下で継代し、再びＥＲＮＳ及びＥ２発現に関して試験した。ＩＦ分析において、Ｇ４１８耐性細胞クローンＰＴ＿８０５は９０％以上のＥＲＮＳ及びＥ２発現細胞を含んだ。Ｇ４１８の存在下で６ヶ月間にわたるＰＴ＿８０５細胞のさらなる継代の間、ＥＲＮＳ及びＥ２発現細胞の部分は安定なままであった。ＥＲＮＳ及びＥ２特異的ｍａｂによる免疫沈降実験は、糖タンパク質Ｅ１がＥ２特異的ｍａｂと共沈降する、ＢＶＤＶ感染ＰＴ細胞と同一であるタンパク質パターンを示した（データは提示していない）。これらのデータ及びヌクレオチド配列決定によって得たデータから、全てのＢＶＤＶ構造タンパク質がＰＴ＿８０５細胞において構成的に発現されると結論された。前記細胞系をトランス相補性実験のため、及び感染性ビリオンの作製のため、ならびに欠失レプリコンのパッケージングと形質導入のために使用した。
【００５２】
（トランス相補組換えＢＶＤＶの回収と特性決定）
トランス相補性実験のために、インビトロ転写したＢＶＤＶレプリコンＲＮＡ又は完全長ＮＣＰ７  ＲＮＡを電気穿孔によってＰＴ＿８０５細胞の単層にトランスフェクトした。トランスフェクション後（ｐ．ｔ．）２４、４８及び７２時間目に細胞培養上清を収集し、遠心分離（１０，０００×ｇ、５分間）によって清澄化して、高度感受性ＫＯＰ−Ｒ細胞を用いて力価測定した。ＫＯＰ−Ｒ細胞（ＲＩＥ２４４、ＣＣＶＬ）は、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｅｌ  Ｒｉｅｍｓ（ＣＣＬＶ）の獣医学科における細胞系統コレクションから入手した、二倍体ウシ食道細胞系の細胞である。ＫＯＰ−Ｒ細胞は、それらのＢＶＤＶ感染に対する感受性及びＢＶＤＶ増殖のための適合性の故に選択した。細胞をＰＴ細胞について前述したように増殖させた。複製に関する陰性対照として、複製不能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）対照を使用した（欠失突然変異体ＮＣＰΔＮＳ５及びＮＣＰ７Δ３’ｎｔｒａａｔｌｌ）。
【００５３】
収集の当日、ＢＶＤＶの複製をＩＦ染色によってモニターした。相補ウイルスのウイルス力価を感染単位（ＩＵ）として測定した。細胞培養物上清をｌｏｇ１０段階で３重に力価測定し、１ｍｌを２４穴プレートに植え付けたＫＯＰ−Ｒ細胞に接種した。３７℃で１２時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、トリプシン溶液で分離して、計数した。前記細胞のアリコートをＢＶＤＶ  ＮＳ３特異的ｍａｂを用いてＩＦによって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。以下の式：
ウエル中の細胞数×ＩＦ陽性細胞％×希釈係数＝ＩＵ／ｍｌでの力価
に従って感染単位（ＩＵ）を算定した。算定については、＞５％及び＜３０％ＩＦ陽性細胞を含むウェルだけを考慮した。
【００５４】
全てのレプリコン及び完全長ＮＣＰ７に関して、ＲＮＡトランスフェクション後のＮＳ３染色は、ＰＴ細胞で得られたのと同様の免疫蛍光パターンを導いた。感染細胞の８０％〜９５％がＮＳ３特異的抗体と反応性であった。ＫＯＰ−Ｒ細胞の感染によって示されるように、ＮＣＰ７ΔＣ、ＮＣＰ７ΔＥ１及びＮＣＰ７でトランスフェクトされたＰＴ８０５細胞の上清において感染性組換えＢＶＤＶが検出された。生じた相補ウイルスＮＣＰ７ΔＣ＿ｔｒａｎｓ及びＮＣＰ７ΔＥ１＿ｔｒａｎｓのウイルス力価はトランスフェクション後２４時間目で１０４．０−１０６．６ＩＵ／ｍｌの範囲であった（表２）。完全長ＮＣＰ７  ＲＮＡを相補性ＰＴ＿８０５細胞にトランスフェクトした後、トランスフェクション後２４時間目で１０７．３ＩＵ／ｍｌまでのウイルス力価が検出できた（表２）。それ故、トランスフェクション後２４時間目に収集した上清からのトランス相補ウイルスは、完全長ＮＣＰ７  ＲＮＡの非相補ＰＴ細胞へのトランスフェクション後に得られたウイルス力価よりも約１００００倍高かった（表２）。さらに、ＤＩ９レプリコンＲＮＡでトランスフェクトしたＰＴ＿８０５細胞培養上清の継代後、トランスフェクション後の全ての時点で相補ＢＶＤＶは検出されなかった（Ｂｅｈｒｅｎｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２、２３６４−２３７２，１９９８）（表２）。
【００５５】
ＮＣＰ７ΔＣ＿ｔｒａｎｓ及びＮＣＰ７ΔＥ１＿ｔｒａｎｓで感染させたＫＯＰ−Ｒ細胞のＩＦを使用して、ＥＲＮＳ、Ｅ２及びＮＳ３の発現を検出することができた（表２）。発現パターンは、トランスフェクトしたＰＴ＿８０５細胞の上清が、ＫＯＰ−Ｒ細胞を感染し、その中で複製することができる感染性ウイルスを含むことを指示した。力価測定実験及びその後のＩＦ染色は、細胞から細胞への伝播が起こらなかったこと及びＮＣＰ７ΔＣ＿ｔｒａｎｓあるいはＮＣＰ７ΔＥ１＿ｔｒａｎｓのいずれもがこれらの細胞においてＮＳ３陽性プラーク又は二次感染を形成できなかったことを明らかにした（表２）。より高い希釈では、単一細胞又は小さな細胞病巣だけがＮＳ３に関するＩＦ染色によって陽性であった。ＫＯＰ−Ｒ細胞でのＢＶＤＶ  ＮＣＰ７を用いた対照実験は、ＥＲＮＳ、ＮＳ３及びＥ２について明らかにされた抗原陽性ウイルスプラークを生じた。
【００５６】
トランス相補ウイルスによるＫＯＰ−Ｒ細胞の感染はＢＶＤＶ中和抗血清（Ｓ−ＢＶＤ＿ｐｏｓ、Ｓ−ＢＶＤ＿Ｅ２）で阻止することができ、ＫＯＰ−Ｒ細胞の接種後に感染性は検出されなかった（１００％中和）。ＢＶＤＶの中和のために、ウイルス懸濁液（１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）１００μｌを２４穴プレートにおいて非希釈血清５０μｌと混合し、３７℃でインキュベートした。２時間後、ＫＯＰ−Ｒ細胞（２×１０４）を前記混合物に移し、３７℃で３日間インキュベートした。その後、単層を間接免疫蛍光法（ＩＦ）によってＢＶＤＶ−ＮＳ３に関して染色した（１９）。（Ｓ−ＢＶＤ＿ｐｏｓ）は、ＢＶＤＶ菌株ＰＴ８１０で実験的に感染させたウシから採集したプールした抗ＢＶＤＶ血清であった（３）。この血清の同種中和力価は１：４，０９６であった。Ｅ２特異的中和については、Ｅ２発現改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）で免疫したヒツジからの血清を使用した（Ｓ−ＢＶＤ＿Ｅ２、Ｂｅｅｒら、未公表データ）。対照反応において、ＢＶＤＶ抗体不含ウシ血清（Ｓ−ＢＶＤ＿ｎｅｇ）とのインキュベーションはウイルス中和を生じなかった（表３）。
【００５７】
【表３】
2005535338.tif 000005
【実施例３】
【００５８】
Ｃ−ＥＲＮＳ発現ＰＴ細胞（ＰＴ８７５）の樹立
ＢＶＤＶレプリコンに関する相補性研究を行うために、ＢＶＤＶ構造タンパク質、Ｃａｐｓｉｄ及びＥＲＮＳを構成的に発現するウシ細胞系を確立した。
【００５９】
ＢＶＤＶ菌株ＰＴ８１０の構造タンパク質、Ｃ及びＥＲＮＳをコードするゲノム領域（４１）を、Ｃ−ＥＲＮＳ−Ｅ１−Ｅ２をコードする合成ＯＲＦ（Ｓｙｎ−ＯＲＦ、ヌクレオチド１７−１０００；「Ｃ−Ｅｍｓ−Ｅ１−Ｅ２発現細胞の樹立」参照）からのＣ−ＥＲＮＳ配列のＰＣＲ増幅後にクローン化した。そのＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマーに含めておいた制限部位ＮｏｔＩ及びＸｂａＩを使用してｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。
【００６０】
生じた構築物ｐＣＤＮＡ＿Ｃ−ＥＲＮＳ（１μｇ）を使用して、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）でＰＣ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後２日目に、細胞培地を、１０％ウシ血清及びＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１ｍｇ／ｍｌを添加したＤＭＥＭに変えた。Ｇ４１８耐性コロニーを単離し、数回再プレートした。Ｇ４１８選択と継代後、耐性細胞クローンを、ｍａｂ  ＷＢ２１０を使用してＢＶＤＶ  ＥＲＮＳ発現に関して試験した。陽性細胞をクローン化し、Ｇ４１８選択下で継代し、再びＥＲＮＳ発現に関して試験した。ＩＦ分析において、Ｇ４１８耐性細胞クローンＰＴ＿８７５は８０％以上のＥＲＮＳ発現細胞を含んだ。ＰＴ＿８７５細胞系を、カプシドをコードする領域内に欠失を有するＢＶＤＶレプリコンに関するトランス相補性実験のために使用した。
【００６１】
（ＰＴ＿８７５細胞に関するＮＣＰ７＿ΔＣのトランス相補性）
ＮＣＰ７＿ΔＣによるトランスフェクションは、ＰＴ細胞で得られたのと同様の免疫蛍光パターンを導いた。トランスフェクト細胞の８０％〜９５％がＮＳ３特異的抗体と反応性であった。ＫＯＰ−Ｒ細胞の感染によって示されるように、ＮＣＰ７ΔＣでトランスフェクトされたＰＴ８７５細胞の上清において感染性組換えＢＶＤＶが検出された。生じた相補ウイルスＮＣＰ７ΔＣ＿ｔｒａｎｓのウイルス力価は、トランスフェクション後２４時間目で１０３．０〜１０５ＩＵ／ｍｌの範囲であった（データは示していない）。
【実施例４】
【００６２】
トランス相補ＮＣＰ７ΔＣによるウシの免疫：免疫後のデータ
（試験材料及び方法）
免疫のためのトランス相補したＮＣＰ７ΔＣレプリコン（ＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓ）
インビトロ転写したＮＣＰ７＿ΔＣ  ＲＮＡをＰＴ＿８０５ヘルパー細胞にトランスフェクトした。ヘルパー細胞の上清をトランスフェクション後２４及び４８時間眼に収集し、−７０℃で保存した。ＫＯＰ−Ｒ細胞を使用してトランス相補ビリオンを力価測定し、ＩＵでの力価を決定した。免疫のために使用するビリオン製剤を細菌及びウイルス夾雑物に関して試験した。さらに、ＫＯＰ−Ｒ細胞での継代とＲＴ−ＰＣＲ分析を使用することにより、復帰突然変異型ＢＶＤＶならびに野生型ＢＶＤＶを除外した。
【００６３】
試験動物、免疫プロトコール、攻撃誘発感染、試料採集及び臨床所見
ＢＶＤＶ及びＢＨＶ−１に血清陰性な３〜５ヶ月齢の１０頭の健常ウシ（「Ｓｉｍｍｅｎｔａｌ」品種）をこの実験において使用した。５頭の動物に、２９日の間隔を置いて２回、筋肉内（ｉ．ｍ．）及び鼻内（ｉ．ｎ．）経路でワクチン接種した。ワクチン群の各々の動物（動物番号１７３、５３７、５５４、７５８、９７７）は、１０６ＩＵ／ｍｌのＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓを含有するウイルス懸濁液４ｍｌ（ＭＵＴＯ（商品名）注射器に取り付けたエーロゾルディスペンサーを使用して２ｍｌ  ｉ．ｎ．及び２ｍｌ  ｉ．ｍ．）を接種した。５頭の仔ウシを非ワクチン接種対照（動物番号９７、９９、１７２、６１０、６１１）として使用した。全ての動物を、初回免疫から６２日目にＭＵＴＯ（商品名）注射器に取り付けたエーロゾルディスペンサーを使用して野生型ＢＶＤＶ菌株ＳＥ５５０８で攻撃誘発した（Ｗｏｌｆｍｅｉｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４２、２０４９−２０５７，１９９７）。各々の動物は、１０６ＴＩＣＩＤ５０の力価で各鼻孔当りウイルス懸濁液１ｍｌを接種した。各々の免疫後及び攻撃誘発感染後（ｐ．ｃｈａｌｌ．）最初の１０日間毎日鼻スワブ及びＥＤＴＡ血液試料を採取した。それぞれ免疫後／攻撃誘発後１４、２１及び２８日目に追加試料を採集した。免疫後／攻撃誘発後０、３、７、１４、２１及び２９日目に全ての動物から血清試料を採集した。
【００６４】
Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ３７００分析器（Ａｂｂｏｔｔ）でのサイズ分布分析によって総白血球数（ＷＢＣ）を測定した。各免疫後１４日間及び攻撃誘発感染後２８日間、体温を含む臨床スコアを測定した。
【００６５】
（血清学）
中和アッセイ
全ての動物からの血清をＢＶＤＶ菌株ＣＰ７及びＳＥ５５０８に対する標準血清中和試験（ＳＮＴ）において試験した。血清を不活性化し（３０分間、５６℃）、９６穴プレートにおいて細胞培地（ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ）を使用して３倍に希釈した（ｌｏｇ２；５０μｌ）。５０μｌ中１００ＴＣＩＤ５０ＢＶＤＶを添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。２時間のインキュベーション後、細胞培地１００μｌ中２×１０４／穴のＢＶＤＶ陰性ＫＯＰ−Ｒ細胞を添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。ＢＶＤＶ抗体陽性及び陰性血清を対照として使用し、ウイルス力価を逆滴定（ｌｏｇ１０、ｎ＝８）によって確認した。間接免疫蛍光染色によって細胞におけるＢＶＤＶ感染を検出した。中和力価を、ＩＦシグナルが全く認められなかった逆最終希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｌａｓｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（ｎ＝３）の幾何平均値として算定した。
【００６６】
ＢＶＤＶ抗体ＥＬＩＳＡ
間接ＢＶＤＶ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ）及びＮＳ３遮断ＢＶＤＶ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＣＥＤＩ−ＴＥＳＴ（Ｃｅｄｉ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＢＶＤＶ特異的ならびにＢＶＤＶ  ＮＳ３特異的抗体を測定した。どちらのアッセイも製造者の指示に従って使用した。
【００６７】
（ウイルス単離）
ＫＯＰ−Ｒ細胞と血液白血球の共培養又はＫＯＰ−Ｒ細胞の単層への鼻スワブの接種を使用してウイルスを単離した。４〜６日間のインキュベーション期間後、ＩＦ染色を使用することによって細胞をＢＶＤＶ  ＮＳ３に関して分析した。
【００６８】
血液白血球からのウイルス単離
１０７白血球を含むＥＤＴＡ血液を溶血後に遠心分離し、氷冷ＰＢＳで２回洗い、ＰＢＳ１ｍｌに再懸濁した。ＰＢＳ１００μｌ中１０６洗浄白血球（ｎ＝２）を使用してＫＯＰ−Ｒ細胞培養物を接種し、４〜６日間インキュベートした。ＮＳ３特異的ｍａｂでのＩＦ染色を用いてＢＶＤＶを検出した。
【００６９】
鼻スワブからのウイルス単離
鼻スワブ（約１００ｍｇ分泌物／スワブ）を、抗生物質及び５％ＢＶＤＶ抗体不含ウシ血清を含むＰＢＳ１ｍｌ中で安定化した。２０秒間攪拌した後、１００μｌアリコートをＫＯＰ−Ｒ細胞培養物（ｎ＝２）に接種した。４〜６日間のインキュベーション期間後、ＩＦ染色を使用して細胞をＢＶＤＶ  ＮＳ３−抗原に関して検討した。
【００７０】
ＥＲＮＳ捕獲ＥＬＩＳＡ
攻撃誘発感染後のＢＶＤＶ抗原の検出のために、全ての動物からの血液試料を、製造者の指示に従って市販のＥＲＮＳ捕獲ＥＬＩＳＡシステム（Ｃｈｅｃｋｉｔ  ＢＶＤＶ  ＩＩＩ、Ｄｒ．Ｂｏｍｍｅｌｉ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で試験した。
【００７１】
（試験結果）
（ＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓの適用後の健康状態）
全ての動物がＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓによる免疫後健康なままであり、異常な臨床スコアは全く認められなかった。白血球減少あるいは体温上昇は測定されなかった（データは示していない）。
【００７２】
（免疫後の血清学）
全ての動物が実験開始時にはＢＶＤＶ抗体を有しておらず（ＢＶＤＶ抗体ＥＬＩＳＡ及びＢＶＤＶ  Ｉ型及びＩＩ型に対する中和アッセイ）、また全ての対照動物がＢＶＤＶ攻撃誘発感染までＢＶＤＶ抗体陰性のままであった。ＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓによる初回免疫後、ワクチン群の全ての動物が免疫後２９日目にＮＳ３特異的抗体に関して陽性スコアだった（平均値：６６％）が、間接ＢＶＤＶ  ＥＬＩＳＡでは陰性であった（平均値：０．１３）。ＮＳ３特異的抗体応答は、ワクチン接種動物からの血清では免疫後１４日目に早くも検出することができた（図２ａ）。初回免疫後、ＢＶＤＶ菌株ＳＥ５５０８に対する１：３〜１：１２の中和抗体力価が検出できた（図３）。
【００７３】
第２回免疫後、全ての免疫動物がＮＳ３遮断及び間接ＥＬＩＳＡの両方において陽性スコアを得た（図２）。第２回免疫後７日目〜２９日目までの間に約１００％（ＮＳ３遮断ＥＬＩＳＡ）及び約０．８（間接ＥＬＩＳＡ）の平均ＥＬＩＳＡ値が検出できた（図２ａ及びｂ）。間接ＥＬＩＳＡでは、著明なブースター効果が認められた（図２ｂ）。
【００７４】
攻撃誘発感染の時点で（初回免疫後６２日目）、全てのワクチン接種動物が１：２５６以上のＢＶＤＶ遺伝子型１攻撃誘発株に対する中和力価を有していた（図３）。
【００７５】
（免疫後の血液白血球及び鼻スワブからのウイルス単離）
ＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓ接種後のいずれの動物においても複製ＢＶＤＶは単離できなかった。ＫＯＰ−Ｒ細胞を使用した血液白血球及び鼻スワブに関する全てのウイルス検出アッセイが陰性スコアだった（表４）。
【００７６】
攻撃誘発感染後の臨床スコア、ウイルス単離及びＢＶＤＶ抗原検出
攻撃誘発感染後、感染の臨床的徴候、白血球減少あるいは発熱は、トランス相補レプリコンでワクチン接種した動物のいずれにおいても検出できなかった（図４ａ及びｂ）。これに対し、ナイーブ対照動物の大部分が呼吸器症状（鼻分泌物、咳）及び抑うつを伴うＢＶＤＶ感染の臨床的徴候を呈した（データは示していない）。全ての対照動物において、攻撃誘発感染後３日目〜８日目まで著明な白血球減少ならびに４０℃以上の高い体温が認められた（図４ａ及びｂ）。
【００７７】
攻撃誘発感染後２日目〜１０日目まで全ての対照動物の血液白血球及び鼻スワブからＢＶＤＶ攻撃誘発ウイルスが単離された（表５）。しかし、ワクチン接種したウシの血液白血球及び鼻スワブからはＢＶＤＶが単離できなかった（表５）。さらに、市販のＥＲＮＳ捕獲ＥＬＩＳＡによるＥＲＮＳ抗原検出は、攻撃誘発後全てのワクチン接種動物について陰性であったが、５日目〜９日目まで対照群の全ての動物について高いＥＬＩＳＡ値が測定され（図５）、５頭の対照ウシのうち３頭は３５％以上のＥＬＩＳＡ値で陽性スコアだった。（データは示していない）。
【００７８】
（攻撃誘発感染後の血清学）
攻撃誘発感染後、全ての対照動物がＥＬＩＳＡシステム（図２ａ及びｂ）及び中和アッセイ（データは示していない）において陽性スコアだった。攻撃誘発感染後１４日目からＢＶＤＶ抗体が検出できた（図２ａ及びｂ）。ワクチン接種群では、間接ＥＬＩＳＡで著明なブースター効果が検出できたが（攻撃誘発感染後０日目の０．８から２８日目の１．９までの平均値）、ＮＳ３遮断ＥＬＩＳＡでは検出できなかった（図２ａ及びｂ）。
【００７９】
（考察）
全てのワクチン接種動物がＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓの接種後健康なままであった。臨床症状は認められず、発熱も白血球減少も検出されなかった。ワクチン接種後、鼻スワブからも血液白血球からもＢＶＤＶは再単離できなかった。合わせて考えると、復帰突然変異型ＮＣＰ７様ウイルスの発生は除外することができない。本発明者らは、それ故、ＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓはウシにとって非病原性であり、第二周期ビリオンにおける欠損（ＤＩＳＣ）又は複製不能の「偽ビリオン」のように作用すると結論する。
【００８０】
全ての対照動物が攻撃誘発感染後ＢＶＤＶ抗体陰性のままであった。これに対し、全てのワクチン接種動物が初回免疫後ＮＳ３特異的抗体を生じ、ＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓによるブースター接種後の間接ＢＶＤＶ抗体ＥＬＩＳＡにおいて陽性スコアだった。
【００８１】
遺伝子型１のＢＶＤＶによる攻撃誘発感染後、全ての対照動物が著明な白血球減少と発熱を有していた。さらに、対照の一部は数日間呼吸器症状を発症し、抑うつ状態であった。これに対し、ワクチン接種動物のいずれもが、攻撃誘発感染後にいかなる臨床的徴候、白血球減少あるいは発熱も発現しなかった。加えて、攻撃誘発感染ウイルスが全ての対照動物から数日間にわたって血液白血球及び鼻スワブから再単離された。しかし、ワクチン接種動物のいずれからもＢＶＤＶは単離できなかった。本発明者らは、それ故、ＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓによる免疫はＢＶＤＶの臨床的徴候、ウイルス血症及びウイルス発散からの完全な防御を提供すると結論する。
【００８２】
【表４】
2005535338.tif 000006
【００８３】
【表５】
2005535338.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】作製した構築物の図式的表示。黒い箱はＢＶＤＶ構造領域を示す。点線は欠失領域を示し、数字はＢＶＤＶ完全長ＲＮＡ内のヌクレオチド位置を示す。矢印は欠失に隣接する制限酵素部位を指示する。左端及び右端の直線は非翻訳領域を支持する。Ｎｐｒｏ、オートプロテアーゼ；Ｃ、カプシドタンパク質；ＥＲＮＳ、Ｅ１及びＥ２、エンベロープタンパク質；ｐ７、非構造タンパク質；Ｎ２−ＮＳ５、非構造タンパク質；３’−ＵＴＲ及び５’ＵＴＲ、非コード領域。ｋｂで表わした縮尺を提示している。
【図２】間接ＥＬＩＳＡシステム（Ａ）及びＮＳ３遮断ＥＬＩＳＡ（Ｂ）を使用した、ＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓによる免疫及びＢＶＤＶ１型による攻撃誘発感染後のＢＶＤＶ特異的抗体の検出。動物群の平均値を示している。免疫後６２日目の中和力価は１：２５６以上である。
【図３】ＮＣＰ７＿ΔＣ＿ｔｒａｎｓによる免疫後のＢＶＤＶ特異的中和抗体力価の検出。動物群の平均値を示している。
【図４】攻撃誘発感染後の相対白血球数及び体温（平均値）。
【図５】市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｃｈｅｃｋｉｔ  ＢＶＤ  Ｖｉｒｕｓ  ＩＩＩ，Ｄｒ．Ｂｏｍｍｅｌｉ  ＡＧ）を用いたＢＶＤＶ  ＥＲＮＳ抗原の検出。動物群の平均値を示している。
【配列表】
2005535338.tif 000008
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【図１】
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【図２】
2005535338.tif 000011
【図３】
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【図４】
2005535338.tif 000013
【図５】
2005535338.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月21日(2004.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性Ｃ及び／又はＥ１タンパク質を除くペスチウイルスの全ての構造タンパク質を発現するが、さらなる下流のプロセシングに必須であるＣ及び／又はＥ１タンパク質の部分をコードするコード配列が保持されているか又は別種のペスチウイルス由来の類似シグナル配列をコードするコード配列によって置換されていることを特徴とする、ペスチウイルスの１個以上の構造タンパク質を発現することができないペスチウイルスのレプリコン。
【請求項２】
Ｅ１又はＣタンパク質のコード配列の少なくとも一部が前記レプリコンから欠失している、請求項１に記載のレプリコン。
【請求項３】
前記レプリコンが機能性Ｃタンパク質をコードしないことを特徴とする、請求項１又は２に記載のレプリコン。
【請求項４】
前記レプリコンがウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）である、請求項１又は２に記載のレプリコン。
【請求項５】
Ｃタンパク質のアミノ酸位置２０１−２４３をコードするコード領域が欠失していることを特徴とする、請求項４に記載のレプリコン。
【請求項６】
前記レプリコンが機能性Ｅ１タンパク質をコードしないことを特徴とする、請求項１又は２に記載のレプリコン。
【請求項７】
Ｅ１タンパク質のアミノ酸位置４９８−６５３をコードするコード領域が欠失していることを特徴とする、請求項４に記載のレプリコン。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のレプリコンを含むことを特徴とする、ペスチウイルスの感染性ウイルス粒子。
【請求項９】
以下の工程：
ａ．ペスチウイルスに許容性であり、ペスチウイルスのＥ１及び／又はＣタンパク質を発現する細胞を提供すること、
ｂ．前記細胞を請求項１から７のいずれかに記載のレプリコンのインビトロ転写ＲＮＡでトランスフェクトすること、
ｃ．工程ｂで得たトランスフェクト細胞を培養すること、及び
ｄ．前記培養細胞からウイルス粒子を採集すること
を含むことを特徴とする、請求項８に記載のペスチウイルスのウイルス粒子の生産のための方法。
【請求項１０】
前記ペスチウイルスがＢＶＤＶであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞がＢＶＤＶのＥ１及び／又はＣタンパク質を発現することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の感染性ウイルス粒子及び医薬適合性の担体を含有するワクチン。
【国際調査報告】
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