(57)【要約】本発明は、細胞透過性ペプチドを提供し、このペプチドは、島−脳（ＩＢ）タンパク質によって制御されるＪＮＫシグナル伝達経路の分枝を選択的に遮断する。提供された細胞透過性ペプチドは、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達経路における中間体キナーゼの結合を防ぎ、それにより、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の下流での影響を減少させる。従って、本発明は、新規ＳＨ３結合タンパク質、およびペプチドを所望の細胞位置に指向するために使用され得る輸送ペプチドに結合する、ＳＨ３結合ペプチドを含むキメラペプチドを包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、島−脳タンパク質（ＩＢ）ポリペプチドを結合する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ＩＢポリペプチドが、ＩＢ１またはＩＢ２である、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、ＭＫＫ７キナーゼのＳＨ３ドメインポリペプチドへの結合を阻害する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが、Ｄ−鏡像異性体アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、５０アミノ酸長未満である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
共有結合で連結された第１のドメインおよび第２のドメインを含むキメラペプチドであって、該第１のドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、該第２のドメインは、ＳＨ３結合ペプチドを含む、キメラペプチド。
【請求項９】
前記ＳＨ３結合ペプチドが、配列番号１〜３４からなる群より選択される、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ＳＨ３結合ペプチドが、島−脳タンパク質（ＩＢ）ポリペプチドを結合する、請求項８に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号７〜１７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドが、島−脳タンパク質（ＩＢ）ポリペプチドを結合する、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記ＩＢポリペプチドが、ＩＢ１またはＩＢ２である、請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが、ＭＫＫ７キナーゼのＳＨ３ドメインポリペプチドへの結合を阻害する、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、Ｄ−鏡像異性体アミノ酸を含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドが、５０アミノ酸長未満である、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１７】
５０アミノ酸長未満であるペプチドであって、以下：
（ａ）ＳＸＳＶＧＸ（配列番号５）モチーフ；および
（ｂ）ＰＰＳＰＲＰ（配列番号６）モチーフ、
を含み、ここで、該ペプチドは、ＳＨ３ドメインポリペプチドを結合する、ペプチド。
【請求項１８】
前記ＳＨ３ドメインポリペプチドは、島−脳タンパク質（ＩＢ）ポリペプチドである、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
配列番号３６のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項２０】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２１】
請求項１に記載のペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２４】
請求項１に記載のペプチドおよびキャリアを含む、組成物。
【請求項２５】
細胞におけるアポトーシスを阻害する方法であって、該細胞と請求項１に記載のペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記細胞が、神経細胞または膵臓細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、インビトロ、インビボまたはエキソビボで提供される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
被験体におけるアポトーシス関連障害の症状を緩和する方法であって、該方法は、該被験体に請求項１に記載のペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記アポトーシス関連障害が、神経学的障害、神経変性障害、および膵臓障害からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
神経細胞増殖または再生を促進する方法であって、該細胞と請求項１に記載のペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、プロテインキナーゼインヒビターに関し、そしてより具体的には、プロテインキナーゼｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼシグナル伝達経路のインヒビターに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼのストレス活性化の群のメンバーである。ＪＮＫシグナル伝達経路は、環境のストレスに応答して、そしていくつかのクラスの細胞表面レセプター（例えば、サイトカインレセプター、蛇行レセプター、およびレセプターチロシンキナーゼ）によって、活性化される。ＪＮＫは、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、およびマップキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）からなるプロテインキナーゼカスケードによって媒介される、二重リン酸化によって活性される。ＪＮＫシグナル伝達経路は、例えば、転写因子ＡＴＦ２およびｃ−Ｊｕｎのような、転写因子を含む。
【０００３】
これらのキナーゼは、細胞の増殖および分化の制御、そしてより一般的には、環境刺激に対する細胞の応答に関連付けられてきた。哺乳動物細胞において、ＪＮＫは、癌遺伝子トランスフォーメーションのような生物学的プロセス、および環境ストレスに対する順応応答の媒介に関連付けられてきた。ＪＮＫはまた、免疫応答を調節すること（免疫細胞の成熟および分化、ならびに免疫系による破壊が同定された細胞におけるプログラムされた細胞死をもたらすことが挙げられる）にも関連付けられてきた。
【０００４】
研究は、アポトーシスおよび生存シグナル伝達におけるＪＮＫシグナル経路に関し、特に、ＪＮＫは、ストレス誘導アポトーシスシグナル伝達機構の成分であると認識されている。研究は、ＪＮＫが、ミトコンドリアシトクロムｃのストレス誘導放出のために必要とされること、および従って、ＪＮＫは、ミトコンドリア／カスパーゼ−９経路によって媒介される、ストレス誘導アポトーシスのために必要とされることを示した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、部分的には、島−脳（ＩＢ）タンパク質（インスリン結合（ＩＢ）タンパク質ともまた称される）によって制御されるＪＮＫシグナル伝達経路の分枝を選択的にブロックする、細胞浸透性ペプチドの発見に基づく。このペプチドは、本明細書中で、ＳＨ３結合タンパク質（ＳＨ３−ＢＰ）と称され、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル経路における中間キナーゼの結合をブロックし、これによって、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の下流効果を減少させる。
【０００６】
従って、本発明は、新規ＳＨ３結合タンパク質、およびペプチドを所望の細胞位置に指向するために使用され得る輸送ペプチドに結合する、ＳＨ３結合ペプチドを含むキメラペプチドを包含する。輸送配列を使用して、原形質膜を横切ってペプチドを直接輸送し得る。あるいは、またはさらに、輸送ペプチドを使用して、ペプチドを所望の細胞内位置（例えば、核）に指向し得る。
【０００７】
種々の局面において、本発明は、配列番号１〜３５のアミノ酸配列を有する、ＳＨ３結合ペプチドを包含する。ＳＨ３結合ペプチドは、島−脳（ＩＢ）ポリペプチド（例えば、ＩＢ１またはＩＢ２）に結合する。あるいは、ＳＨ３結合ペプチドは、ＭＫＫ７キナーゼの、ＳＨ３ドメインポリペプチドへの結合を阻害する。ＳＨ３結合ペプチドは、５００アミノ酸未満の長さ（例えば、４００以下、３００以下、２００以下、１００以下、５０以下、または２５以下のアミノ酸長）である。
【０００８】
別の局面において、本発明は、第一のドメインおよび第二のドメインを有するキメラペプチドを包含し、これらのドメインは、第一のドメインが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１  ＴＡＴポリペプチド由来のアミノ酸配列を含み、そして第二のドメインが、ＳＨ３結合ペプチド（例えば、配列番号１〜３５）を含むように、共有結合によって連結している。このキメラペプチドは、例えば、配列番号３〜４および２０〜２１を含む。いくつかの局面において、ＳＨ３結合ペプチドは、島−脳（ＩＢ）ポリペプチドを結合する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、ＳＸＳＶＧＸ（配列番号５）モチーフおよびＰＰＳＰＲＰ（配列番号６）モチーフを有し、そしてＳＨ３ドメインポリペプチド（例えば、島−脳（ＩＢ）ポリペプチド）を結合する、ペプチドを包含する。好ましくは、このペプチドは、５０アミノ酸未満の長さである。いくつかの局面において、このペプチドは、配列番号３６の輸送配列を含む。
【００１０】
ＳＨ３結合ペプチドは、Ｌ−アミノ酸のポリマーとして存在し得る。あるいは、このペプチドは、Ｄ−アミノ酸のポリマーとして存在し得る。別の実施形態において、このペプチドは、ペプチドのレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）異性体として存在し得る。
【００１１】
本発明にはまた、ＳＨ３結合ペプチド、およびＳＨ３結合ペプチドを特異的に認識する抗体を含有する、薬学的組成物が包含される。
【００１２】
別の局面において、本発明は、配列番号１〜３５のアミノ酸配列を含むＳＨ３結合ペプチドをコードする、単離された核酸を包含する。本発明はまた、配列番号１〜３５のアミノ酸配列を含むＳＨ３結合ペプチドをコードする、単離された核酸を含むベクター、ならびにこのようなベクターを含む細胞を包含する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、細胞（例えば、膵臓細胞または神経細胞）におけるアポトーシスを阻害する方法を包含し、この方法は、本発明のＳＨ３結合ペプチド（例えば、配列番号２）と細胞とを接触させることによる。この細胞は、ニューロン細胞または膵臓細胞である。別の実施形態において、この細胞は、インビトロ、インビボまたはエキソビボのいずれかで、接触される。
【００１４】
本発明にはまた、被験体において、アポトーシス関連障害（例えば、神経学的障害、神経変性障害、または膵臓障害）の症状を軽減する方法が包含され、この方法は、本発明のＳＨ３結合ペプチドを投与することによる。例えば、この被験体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、神経細胞の増殖または再生を促進する方法を包含し、この方法は、ＳＨ３結合タンパク質（例えば、配列番号２）と神経細胞とを接触させることによる。
【００１６】
本発明によって提供される利点のうちでも、ＳＨ３結合ペプチドが小さく、そして大量におよび高い純度で容易に生成され得ることである。結合ペプチドはまた、細胞内分解に対して耐性であり、そしてく免疫原性が弱い。従って、これらのペプチドは、ＪＮＫシグナル伝達の阻害が望ましいインビトロおよびインビボの適用に、よく適している。
【００１７】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものに類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。矛盾する場合には、本明細書（定義を含む）が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、説明的であるのみであり、そして限定することを意図されない。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から、明らかになる。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、部分的には、島−脳（ＩＢ）タンパク質（インスリン結合（ＩＢ）タンパク質ともまた称される）によって制御される活性化ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達経路の分枝を阻害する、細胞浸透性ペプチドの発見に基づく。これらの細胞浸透性ペプチドは、本明細書中で、ＳＨ３結合ペプチド（ＳＨ３−ＢＰ）と称される。さらに、本発明は、アポトーシスを阻害する方法、ならびにアポトーシス関連障害の症状を処置または軽減するための方法および薬学的組成物を提供する。本発明は、さらに、ニューロン細胞の増殖および再生を促進する（すなわち、増加させる）方法を提供する。細胞浸透性とは、ペプチドが、生体膜（例えば、細胞膜または核膜）を横切り得ることを意味する。
【００２０】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路（例えば、細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）−１／２、ｐ３８キナーゼ、およびｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達経路）は、３メンバーのプロテインキナーゼカスケードによって形成されるコア単位を有する。３キナーゼモジュールにおいて、ＭＡＰＫは、リン酸化され、そしてＭＡＰＫキナーゼ（ＭＫＫとして公知）によって活性化される。代表的に、ＭＫＫは、チロシン残基とスレオニン残基との両方におけるＭＡＰＫのリン酸化を触媒する、二重特異的キナーゼである。次に、ＭＫＫは、セリン／スレオニンキナーゼ（これは、ＭＫＫキナーゼとして機能し、ＭＫＫＫとして公知である）によって、リン酸化され、そして活性化される。Ｇａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：２１１−２１８（１９９１）を参照のこと。
【００２１】
ＪＮＫシグナル伝達経路において、このプロテインキナーゼカスケードは、３つの連続したキナーゼ（ＭＬＫ、ＭＫＫ７およびＪＮＫとして公知）によって形成される。これら３つの連続したキナーゼは、インスリン結合タンパク質または島−脳（ＩＢ）タンパク質として公知のスカフォールドタンパク質と相互作用し、そしてこのスカフォールドタンパク質によって組織化される。ＩＢタンパク質は、配列特異的ＤＮＡ結合活性を示す、転写因子である。ＩＢ１は、ＧＬＵＴ２のシス調節性エレメントおよびインスリンプロモーターとの相互作用を介して、グルコーストランスポーター遺伝子ＧＬＵＴ２およびインスリン遺伝子の制御に関与する、転写アクチベーターである。特に、ＩＢ１は、ＧＬＵＴ２のＧＴＩＩシスエレメントおよびインスリン遺伝子に結合する（例えば、米国特許第５，８８０，２６１号を参照のこと）。ＩＢタンパク質、および特に、ＩＢ１およびＩＢ２は、脳および膵臓において優先的に発現される。従って、本発明のＳＨ３−ＢＰは、ＪＮＫシグナル伝達経路を特異的に標的化する際に有用である。
【００２２】
３つのキナーゼモジュールの中間キナーゼＭＫＫ７は、ＩＢ１タンパク質およびＩＢ２タンパク質に含まれる、非常に保存されたＳｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメイン領域に結合する。ＳＨ３ドメインは、約５０〜６０アミノ酸残基を含む、小さいタンパク質モジュールである。これらのドメインは、種々の細胞内シグナル伝達および膜結合ポリペプチドにおいて同定されている。ＳＨ３ドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介することが見出されており、この相互作用は、細胞内シグナル伝達経路のカップリング、タンパク質の触媒活性の調節、酵素への基質の動員、および特定の細胞内区画へのタンパク質の局在化に関与する（Ｗｅｎｇら、Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５（１０）：５６２７−３４（１９９５）を参照のこと）。
【００２３】
ＳＨ３ドメインのコアの保存された結合モチーフは、Ｐｒｏ−ｘ−ｘ−Ｐｒｏ（配列番号３５）である。ＳＨ３ドメインは、一般に、プロリンリッチなペプチドに結合し、これによって、伸張した、左巻き螺旋のコンホメーションを形成する（ポリプロリン−２（ＰＰＩＩ）ヘリックスとして公知）。Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４（７）：１２５３−６３（２００１）を参照のこと。
【００２４】
本発明のＳＨ３結合ペプチドは、ファージディスプレイライブラリーを、ＧＳＴ−ＳＨ３ＩＢ１／２融合タンパク質に対してパニングし、ＩＢ１およびＩＢ２の高度に保存されたＳＨ３に結合するペプチドを特徴付けることによって、同定された（実施例１を参照のこと）。バイオパニング実験から得られたＳＨ３結合ペプチドは、図１に示されている。
【００２５】
図１に示されるような、ファージディスプレイバイオパニング実験から得られた配列の間の配列比較は、２つの保存された６アミノ酸配列モチーフ（ＳＸＳＶＧＸ（配列番号５）およびＰＰＳＰＲＰ（配列番号６））を明らかにした。後者の配列は、図１に示される、ＳＨ３結合コンセンサス配列（ＰＸＸＰ（配列番号３５））に対応する。
【００２６】
本発明のＳＨ３結合ペプチドは、ＪＮＫ信号伝達の阻害が望ましい任意の状況において使用され得る。これには、インビトロ増幅、エキソビボ増幅、およびインビボ増幅が挙げられる。ＪＮＫおよびその全てのアイソフォームは、病理学的状態または経路の発達および確立に関与するので、ＳＨ３結合ペプチドは、このような病理学的状態の発生を予防または阻害するために使用され得る。これには、疾患の症状の予防、処置および軽減、治療作用に対して二次的な状態の予防、処置、および軽減が挙げられる。本発明のＳＨ３−ＢＰは、膵臓障害、神経変性障害ならびに例えば膵臓および脳のアポトーシス関連障害の症状の処置、防止または軽減において、有用である。例えば、本発明のペプチドは、例えば、膵臓障害（例えば、糖尿病、膵炎、または膵臓癌）；神経変性障害および神経学的障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンティングトン病、アルツハイマー病、精神分裂症および発作）；電離放射線；免疫応答（自己免疫疾患が挙げられる）；虚血／再灌流障害；心肥大および心臓血管肥大；ならびにいくつかの癌（例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌトランスフォーメーション）の症状を処置または防止または軽減するために、使用され得る。
【００２７】
ＳＨ３−ＢＰはまた、活性ＪＮＫポリペプチドの存在下で発現が増加する、遺伝子および遺伝子産物（例えば、炎症誘発性サイトカイン）の発現を阻害するために使用される。炎症誘発性サイトカインは、全ての形態の炎症、自己炎症、免疫および自己免疫の障害、変性障害、ミオパシー、心臓ミオパシー、および移植片拒絶において見出される。
【００２８】
本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、分析、特徴付けまたは治療の用途のため；対応するペプチドが優先的に発現される組織のためのマーカー（構成的にか、または組織の分化もしくは発達もしくは疾患状態の特定の段階において）としての、組換えペプチドを発現するために使用される。核酸のための他の用途としては、例えば、核酸のゲル電気泳動ベースの分析における分子量マーカーが挙げられる。
【００２９】
本明細書中に開示されるＳＨ３結合ペプチドは、表１に提供される。この表は、ＳＨ３結合ペプチドの名称、ならびにその配列番号、長さ、およびアミノ酸配列を提供する。略語「ＲＶ」とは、本明細書中で使用される場合、ペプチドの「レトロインベルソ異性体」をいう。
【００３０】
【表１】
2005525096.tif 000002
（ＳＨ３結合ペプチド）
１つの局面において、本発明は、ＳＨ３結合ペプチドを提供する。例示的なＳＨ３結合ペプチドとしては、配列番号１〜３５のアミノ酸配列が挙げられる。用語「ペプチド」によって特定の長さを意味しない。幾つかの実施形態において、ＳＨ３結合ペプチドは、５００アミノ酸長未満（例えば、４５０，４００、３５０、３００、２５０，２００、１５０，１００、７５、５０、３５または２５アミノ酸長以下）である。好ましくは、このペプチドは、生物学的膜（例えば、核膜または細胞膜）を横切って輸送し得る。種々の実施形態において、ＳＨ３結合ペプチドとしては、配列番号１〜３５の１つ以上のアミノ酸配列が挙げられる。ＳＨ３結合ペプチドは、少なくとも１つのＩＢタンパク質（例えば、ＩＢ１またはＩＢ２）に結合する。少なくとも１つのＩＢタンパク質（例えば、ＩＢ１またはＩＢ２）の結合は、当該分野で公知の方法によって（例えば、親和性マトリックスのようにＧＳＴ−ＩＢ１融合タンパク質またはＧＳＴ−ＩＢ２融合たんぱく質を有する親和性結合アッセイによって）測定され得る。あるいは、このペプチドは、ＳＨ３ドメインポリペプチドへのＭＫＫ７結合を阻害する。ＭＫＫ７結合の阻害は、例えば、実施例３に記載のようなプルダウン実験を使用する、当該分野で公知の方法によって測定される。ＭＫＫ７結合の阻害はまた、ＪＮＫシグナル伝達（例えば、ＪＮＫ活性化）の阻害を観測することによって測定される。ＪＮＫシグナル伝達は、例えば、本明細書およびＢｏｎｎｙら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：７７−８２（２００１）に記載されるような固相ＪＮＫアッセイ（実施例７を参照のこと）を使用して決定される。用語「ＳＨ３ドメインポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、１つ以上のＳＨ３ドメインコンセンサス配列を含むポリペプチドを称することを意味する。Ｐｆａｍデータベースエントリーｐｆａｍ０００１８．６によって記載されるようなＳＨ３コンセンサス配列としては、アミノ酸配列ＰＫＶＶＡＬＹＤＹＱＡＲＥ−ＳＤＥＬＳＦＫ−ＫＧＤＩＩＩＶＬＥＫＳＤＤ−−ＧＷＷＫＧＲＬＫＧＴ−−ＫＥＧＬＩＰＳＮＹＶＥＰＶ（配列番号４０）が挙げられる。例示的なＳＨ３ポリペプチドとしては、細胞内シグナル伝達タンパク質（例えば、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、Ｃｓｋ）ならびにプロテインチロシンキナーゼのＺＡＰ７０ファミリー（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ１２９３１、Ｐ００５１９、Ｐ４１２４０およびＰ４３４０３、それぞれ、その全体が参考として本明細書で援用される）；哺乳動物ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ−γ−１およびＣ−γ−２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２６５２およびＮＰ＿００２６５１、それぞれ、その全体が参考として本明細書で援用される）；哺乳動物ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ調節ｐ８５サブユニット（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ａ３８７４８、それぞれ、その全体が参考として本明細書で援用される）；哺乳動物Ｒａｓ  ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ１１２３０、それぞれ、その全体が参考として本明細書で援用される）；グアニンヌクレオチド交換因子の成長因子レセプター（例えば、椎骨ＧＲＢ２���への結合を媒介するアダプタータンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ２９３５４およびＡＡＣ７２０７５、それぞれ、その全体が参考として本明細書で援用される）；ならびに細胞骨格タンパク質（例えば、フォドリン）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ５１７０２、ＡＡＡ５２４６８およびＡＡＢ２８３２４、それぞれ、その全体が参考として本明細書で援用される）ならびに酵母アクチン結合タンパク質ＡＢＰ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＬＬＢＹ、それぞれ、その全体が参考として本明細書で援用される）が挙げられる。
【００３１】
ＳＨ３結合タンパク質の例としては、表１に示される配列番号１〜３５の配列を（全体においてまたは部分的において）含むペプチドが挙げられる。本明細書で使用されるように、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。（Ｓ／Ｐ）によって表される単一の残基は、一般的配列においてＳｅｒまたはＰｒｏのいずれかであり得る。（Ｇ／Ｌ）によって表される単一の残基は、一般的配列においてＧｌｙまたはＬｅｕのいずれかであり得る。
【００３２】
ＳＨ３結合タンパク質は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または両方の組み合わせのポリマーであり得る。例えば、種々の実施形態において、これらのペプチドは、Ｄレトロ−インベルソペプチドである。用語「レトロ−インベルソ異性体」とは、配列の方向が逆転している直鎖ペプチドの異性体をいい、用語「Ｄ−レトロ−インベルソ異性体」とは、配列の方向が逆転し、かつ、各アミノ酸残基のキラリティーが反転している直鎖ペプチドの異性体をいう。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，６９２−６９３（１９９４）を参照のこと。Ｄ−鏡像異性体の混合および逆合成の正味の結果は、各アミド結合におけるカルボニル基およびアミノ基の位置が交換しており、一方、各α炭素における側鎖基の位置が、保存されているというものである。特に他に記述されない限り、本発明の任意の所定のＬ−アミノ酸配列は、対応する天然のＬ−アミノ酸配列についての逆の配列を合成することによって、Ｄレトロ−インベルソペプチドへと作製され得る。
【００３３】
ＳＨ３結合ペプチドは、当該分野で周知の方法（例えば、化学合成、以下に論じられるような遺伝子操作方法）によって得られ得るか、または生成され得る。例えば、所望の領域もしくはドメインを含むか、またはインビトロで所望の活性を媒介するＳＨ３結合ペプチドの一部に対応するペプチドは、ペプチド合成機の使用によって合成され得る。
【００３４】
候補ＳＨ３結合ペプチドはまた、親水性分析によって分析され得（例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ，１９８１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８）、この親水性分析を利用して、ペプチドの疎水性領域および親水性領域を同定し得、従って、例えば、結合実験、抗体合成における実験操作についての基質の設計において役立ち得る。また、二次構造分析を実施して、特定の構造モチーフを想定するＳＨ３結合ペプチドの領域を同定し得る。例えば、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ，１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３：２２２−２２３を参照のこと。操作、翻訳、二次構造予測、親水性プロフィールおよび疎水性プロフィール、オープンリーディングフレーム予測およびプロット、ならびに配列相同性の決定は、当該分野で利用可能なコンピューターソフトウェアプログラムを用いて達成され得る。以下の構造分析の他の方法もまた、使用され得る：例えば、Ｘ線結晶学（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  １１：７−１３を参照のこと）；質量分析およびガスクロマトグラフィー（例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ，１９９７．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）ならびにコンピューターモデリング（ＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋおよびＺｏｌｌｅｒ編，１９８６．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，：ＣＵＲＲＥＮＴ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。
【００３５】
本発明はさらに、Ｌ−体アミノ酸を有するＳＨ３結合ペプチド（例えば、表１に示されるＬ−ペプチド）をコードする核酸ならびにこれらの配列の相補鎖に関する。ＳＨ３結合ペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の任意の方法によって（例えば、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、そして／または所定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド配列を使用するｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーからクローニングすることによって）得られ得る。
【００３６】
１つ以上のＳＨ３結合ペプチドの組換え発現について、このペプチドをコードするヌクレオチド配列の全部または一部を含む核酸は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたペプチドコード配列の転写および翻訳について必要なエレメントを含むベクター）に挿入され得る。幾つかの実施形態において、調節エレメントは、異種である（すなわち、ネイティブの遺伝子プロモーターでない）。あるいは、必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルはまた、遺伝子および／またはそれらの隣接領域についてのネイティブプロモーターによって供給され得る。
【００３７】
種々の宿主−ベクター系を利用して、ペプチドコード配列を発現し得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳動物細胞系；（ｉｉ）バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系；（ｉｉｉ）酵母ベクターを含む酵母または（ｉｖ）バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡにより形質転換された細菌。利用する宿主−ベクター系に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントのいずれか１つが、使用され得る。
【００３８】
発現ベクター内のプロモーター／エンハンサー配列は、本発明において提供されるように、植物、動物、昆虫、または真菌の調節配列を利用し得る。例えば、酵母および他の真菌由来のプロモーター／エンハンサーエレメント（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）が、使用され得る。あるいは、またはさらに、それらは、以下の動物転写制御領域を含み得る：例えば、（ｉ）膵臓β細胞内で活性なインスリン遺伝子制御領域（例えば、Ｈａｎａｈａｎら，１９８５．Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２を参照のこと）；（ｉｉ）リンパ細胞内で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４．Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８を参照のこと）；（ｉｉｉ）肝臓内で活性なアルブミン遺伝子制御領域（例えば、Ｐｉｎｃｋｅｒｔら，１９８７．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  １：２６８−２７６を参照のこと）；（ｉｖ）脳希突起膠細胞内で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御（例えば、Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７．Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２を参照のこと）；ならびに（ｖ）視床下部内で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（例えば、Ｍａｓｏｎら，１９８６．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８を参照のこと）など。
【００３９】
発現ベクターまたはそれらの誘導体としては、以下が挙げられる：例えば、ヒトウイルスまたは動物ウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、λファージ）；プラスミドベクターおよびコスミドベクター。
【００４０】
目的の挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で配列によってコードされる発現されたペプチドを改変もしくは処理する宿主細胞系統が、選択され得る。さらに、特定のプロモーターからの発現は、選択された宿主系統において、特定の誘発因子の存在下で増強され得る；従って、遺伝子操作されたペプチドの発現の制御を容易にする。さらに、異なる宿主細胞は、発現されたペプチドの転写および転写後のプロセッシングおよび改変（例えば、グリコシル化、リン酸化など）について特徴および特定の機構を保有する。従って、適切な細胞株または宿主系を選択して、外来ペプチドの所望の改変およびプロセッシングが達成されることを保証し得る。例えば、細菌系におけるペプチド発現を使用して、非グリコシル化コアペプチドを生成し得る；一方、哺乳動物細胞における発現は、異種ペプチドの「ネイティブ」のグリコシル化を保証する。
【００４１】
ＳＨ３結合ペプチドおよびこれらのペプチドをコードする核酸の誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログおよび改変体もまた、本発明に含まれる。本明細書に提供される核酸、誘導体、フラグメント、およびアナログは、少なくとも６個の（連続した）核酸の配列として規定され、そしてそれらは、特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さを有する。本明細書に提供されるアミノ酸、誘導体、フラグメント、およびアナログは、少なくとも４個の（連続した）アミノ酸の配列として規定され、エピトープの特異的認識を可能にするのに十分な長さである。
【００４２】
フラグメントの長さは、ＳＨ３結合ペプチドまたはＳＨ３結合ペプチドをコードする核酸が由来する、対応する全長核酸または全長ポリペプチドよりも短い。誘導体またはアナログが、改変された核酸またはアミノ酸を含む場合、誘導体およびアナログは、全長であっても、全長でなくてもよい。ＳＨ３結合ペプチドの誘導体またはアナログとしては、例えば、そのペプチドと実質的に相同（種々の実施形態において、同一のサイズのアミノ酸配列にわたって、または当該分野において公知のコンピュータホモロジープログラムによってアラインメントを行う整列された配列と比較される場合、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％あるいは９９％さえも同一）な領域を含む分子が挙げられる。例えば、配列同一性は、配列分析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  １７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．  ５３７０５のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）を、そのデフォルトのパラメーターで用いて測定され得る。
【００４３】
参照配列と１００％未満同一であるポリペプチド配列の場合、同一でない位置は、好ましくは（必須ではないが）参照配列との保存的置換である。保存的置換は、典型的には、以下の群の中の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。従って、本発明には、変異配列を有する結果、対応する親配列を有するタンパク質と相同であるもの（例えば、配列において、機能において、および抗原性の特徴または他の機能において）が含まれる。そのような変異は、例えば、保存的アミノ酸変化（例えば、広範に類似の分子的特性を有するアミノ酸間）を含む変異であり得る。例えば、脂肪族グループのアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン内の交換は、保存的であると考えられ得る。時として、グリシンのこれらの一つのアミノ酸への置換もまた、保存的であると考えられ得る。他の保存的交換としては、脂肪族群である、アスパラギン酸およびグルタミン酸内；アミド群である、アスパラギンおよびグルタミン内；ヒドロキシ群である、セリンおよびスレオニン内；芳香族群である、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン内；塩基性群である、リジン、アルギニンおよびヒスチジン内；ならびにイオウ含有群であるメチオニンおよびシステイン内、が挙げられる。時として、メチオニンとロイシンの群の間の置換もまた、保存的であると考えられ得る。好ましい保存的置換の群は、アスパラギン酸−グルタミン酸；アスパラギン−グルタミン；バリン−ロイシン−イソロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシン；およびリジン−アルギニン、である。
【００４４】
特定のポリペプチドが、規定された長さの参照ポリペプチドと、特定のパーセント同一であると言われる場合、そのパーセント同一性は、参照ペプチドに対する割合である。従って、１００アミノ酸長の参照ポリペプチドに対して５０％同一であるペプチドは、参照ポリペプチドの５０アミノ酸長の部分が完全に同一である５０アミノ酸のポリペプチドであり得る。そのようなポリペプチドはまた、参照配列の全長にわたって５０％同一なポリペプチドである１００アミノ酸長のポリペプチドであり得る。当然のことながら、他のポリペプチドも、同一の基準を満たす。
【００４５】
本発明はまた、開示されるポリヌクレオチドまたはペプチドの対立遺伝子改変体（すなわち、そのポリヌクレオチドによってコードされるペプチドと、同一な、相同な、または関連するペプチドをもまたコードする単離されたポリヌクレオチドの天然に生じる改変体形態）をも、包含する。あるいは、非天然の改変体は、変異誘発技術によってか、または直接的な合成によって、産生され得る。
【００４６】
開示されたポリヌクレオチドおよびペプチドの種ホモログもまた、本発明によって提供される。「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドやポリペプチドとは異なるが、その本質的な性質を保持する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一般に、改変体は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、全体として密接に類似であり、そして多くの領域において、同一である。改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方において、変化を含み得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、改変された配列は、挿入を含み、その結果、タンパク質が、輸送性質を保持しながら、全体のアミノ酸配列が延長されている。さらに、改変された配列は、タンパク質の輸送性質を保持しながら、全体のアミノ酸配列を短縮する、ランダムな、または設計された、内部の欠失を含み得る。
【００４８】
改変された配列は、追加的に、または、代替的に、ＳＨ３結合ペプチドが由来するポリペプチドまたはペプチドをコードする天然に存在するポリヌクレオチドの適切な鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。改変体ペプチドは、本明細書において記載されるアッセイを使用して、ＩＢ結合およびＪＮＫによって媒介される活性について試験され得る。「ストリンジェントな条件」は、配列に依存し、そして異なる環境において異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融点（ＴＭ）よりも、約５℃低いように選択され得る。ＴＭは（規定されたイオン強度およびｐＨにおいて）、標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブに対してハイブリダイズする温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が少なくとも約０．０２モル、ｐＨ７であり、そして温度が少なくとも約６０℃である条件である。他の因子（とりわけ、相補鎖の塩組成およびサイズ）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し得るので、有機溶媒の存在および塩基ミスマッチの程度、パラメータの組み合わせは、いずれか１つの絶対的な尺度よりも重要である。
【００４９】
高度なストリンジェンシーは、例えば、以下を含む、ステップ１：ＤＮＡを含むフィルターを、８時間から一晩、６５℃で、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝液中で前処理する。ステップ２：フィルターを、４８時間、６５℃で、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、および５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した上記のプレハイブリダイゼーション混合液中で、ハイブリダイズする。ステップ３：フィルターを、１時間、３７℃で、２×ＳＳＣ、０．０１％  ＰＶＰ、０．０１％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０１％  ＢＳＡを含む溶液中で洗浄する。次に、０．１×ＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄する。ステップ４：フィルターをオートラジオグラフする。使用され得る高ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野において周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編集）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。
【００５０】
中程度のストリンジェンシーは、以下を含み得る：ステップ１：ＤＮＡを含むフィルターを、６時間から一晩、５５℃で、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で前処理する。ステップ２：フィルターを、１８〜２０時間、５５℃で、５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した同一の溶液中で、ハイブリダイズする。ステップ３：フィルターを、１時間、３７℃で、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で洗浄する。ステップ４：フィルターをブロット乾燥して、オートラジオグラフィーに曝露する。使用され得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野において周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編集）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。
【００５１】
低ストリンジェンシーは、以下を含み得る：ステップ１：ＤＮＡを含むフィルターを、６時間、４０℃で、３５％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＰＶＰ、０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ、１％  ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で前処理する。ステップ２：フィルターを、１８〜２０時間、４０℃で、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、1００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸、および５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを添加した同一の溶液中で、ハイブリダイズする。ステップ３：フィルターを、１．５時間、５５℃で、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％  ＳＤＳを含む溶液中で洗浄する。この洗浄溶液は、新鮮な溶液と置換され、そしてさらに１．５時間、６０℃でインキュベートされる。ステップ４：フィルターをブロット乾燥して、オートラジオグラフィーに曝露する。必要であれば、フィルターを、３回目に、６５〜６８℃で洗浄し、そしてフィルムに再度曝露する。使用され得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野において周知である（例えば、種間ハイブリダイゼーションについて例示されるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編集）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。
【００５２】
（ＳＨ３結合ドメインおよび輸送ドメインを含むキメラペプチド）
別の局面において、本発明は、第１および第２のドメインを含むキメラペプチドを提供する。この第１ドメインは、輸送配列を含み、一方、この第２のドメインは、第１のドメインと共有結合（例えば、ペプチド結合）によって連結された、ＳＨ３結合ペプチドを含む。この第１および第２のドメインは、ペプチドにおいて、任意の順番で生じ得、そしてペプチドは、各ドメインを１つ以上含み得る。
【００５３】
輸送配列は、その輸送配列がその中に存在するペプチドを、所望の細胞の目的地へと指向する、任意のアミノ酸配列であり得る。従って、輸送配列は、ペプチドを、形質膜を横切って指向し得る（例えば、細胞の外から、形質膜を通り、そして細胞質内へ）。あるいは、または、さらに、輸送配列は、ペプチドを細胞内の所望の位置（例えば、核、リボゾーム、ＥＲ、リソソーム、またはペルオキシソーム）へと指向し得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、輸送ペプチドは、公知の膜移動配列由来である。例えば、輸送ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１のＴＡＴタンパク質由来の配列を含み得る。このタンパク質は例えば、米国特許第５，８０４，６０４号および第５，６７４，９８０号に記載される（これらの各々が、参考として援用される）。ＳＨ３結合ペプチドは、ＴＡＴタンパク質を構成する全８６アミノ酸のいくつか、または全てと、連結され得る。例えば、８６アミノ酸よりも少ない、機能的に有効な、ＴＡＴタンパク質のフラグメントまたは部分（細胞への取り込み、および必要に応じて細胞核への取り込みを示す）を、使用し得る。１つの実施形態において、フラグメントは、ＴＡＴの４９〜５７残基（例えば、ＮＨ２−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（配列番号３６）または一般的なＴＡＴ配列ＮＨ２−Ｘｎ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘｎ−ＣＯＯＨ（配列番号３７）を含むペプチドを含む。細胞内への侵入および取り込みを媒介する領域を含むＴＡＴペプチドは、さらに公知の技術によって規定され得る。例えば、Ｆｒａｎｋｅｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ８６：７３９７−７４０１（１９８９）を参照のこと。
【００５５】
ＴＡＴ配列は、ＳＨ３結合ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結され得る。２つのプロリン残基のヒンジを、ＴＡＴおよびＳＨ３結合ペプチドの間に添加して、全体としての融合ペプチドを作製し得る。例えば、アミノ酸融合ペプチドは、ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチド（配列番号３）または一般的なＴＡＴ−αＳＨ３ペプチド（配列番号４）であり得る。レトロ−インベルソ融合ペプチドは、ＲＶ−ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチド（配列番号２０）または一般的なＲＶ−ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチド（配列番号２１）であり得る。ＴＡＴペプチドは、配列ＮＨ２−Ｘｎ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘｎ−ＣＯＯＨ（配列番号３８）を有するレトロ−インベルソペプチドであり得るかまたはＴＡＴ−ペプチドは、配列ＮＨ２−Ｘｎ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘｎ−ＣＯＯＨ（配列番号３９）を有する一般的なレトロ−インベルソペプチド。配列番号３〜４および３８〜３９において、「Ｘ」残基の数は、示される数に限定されず、また、所定のペプチドにおけるＸの数は、示される数に限定されない。従って、「Ｘ」残基は、上記のように変化し得る。融合ペプチドは、配列番号１〜３５のＳＨ３−ＢＰの１つ以上を含み得る。例えば、融合ペプチドは、配列番号７の配列に共有結合された配列番号３６を含むキメラペプチドであり得るか、あるいは、キメラペプチドは、配列番号２４の配列に共有結合された配列番号３８の配列を含み得る。例えば、融合ペプチドは、配列番号７〜１７から選択される配列に共有結合された配列番号３６の配列を含むキメラペプチドを含み得るか、あるいは、キメラペプチドは、配列番号２４〜３４からなる群より選択されるアミノ酸配列に共有結合された配列番号３８の配列を含み得る。ＳＨ３結合ペプチドおよび輸送配列（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の任意の組み合わせは、本発明の範囲内である。
【００５６】
融合ペプチドはまた、ＳＸＳＶＧＸ（配列番号５）モチーフおよびＰＰＳＰＲＰ（配列番号６）モチーフを含むペプチドに共有結合された配列番号３６のアミノ酸配列を含むペプチドを含み得る。あるいは、この融合ペプチドは、ＸＧＶＳＸＳ（配列番号２２）モチーフおよびＰＲＰＳＰＰ（配列番号２３）モチーフを含むペプチドに共有結合された配列番号３８のアミノ酸配列を含むキメラペプチドであり得る。一実施形態において、この融合ペプチドは、５０アミノ酸未満の長さを有する。
【００５７】
輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）配列は、ＴＡＴ配列中に存在する単一（すなわち、連続した）アミノ酸配列であり得る。あるいは、この輸送配列は、ＴＡＴタンパク質中に存在するが、天然に存在するタンパク質において、他のアミノ酸配列によって隔てられている２つ以上のアミノ酸配列であり得る。本明細書中で使用される場合、ＴＡＴタンパク質は、天然に存在するＴＡＴタンパク質、その機能的に等価なタンパク質またはその機能的に等価なフラグメント（ペプチド）の配列と同じ天然に存在するアミノ酸配列を含む。このような機能的に等価なタンパク質または機能的に等価なフラグメントは、細胞および細胞核への取込み活性を有し、これは天然に存在するＴＡＴタンパク質の取込み活性と実質的に類似している。ＴＡＴタンパク質は、天然に存在する供給源から得られ得るか、または遺伝子操作技術もしくは化学合成を使用して生成され得る。
【００５８】
天然に存在するＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、天然に存在するＴＡＴタンパク質中に存在する少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失および／または置換によって改変されて、改変ＴＡＴタンパク質（本明細書中で、ＴＡＴタンパク質とも呼ばれる）を生成し得る。上昇または低下した安定性を有する改変ＴＡＴタンパク質またはＴＡＴペプチドアナログは、公知の技術を使用して生成され得る。いくつかの実施形態において、ＴＡＴタンパク質またはＴＡＴペプチドは、天然に存在するＴＡＴタンパク質またはその部分のアミノ酸配列と実質的に類似しているが同一ではないアミノ酸配列を含む。さらに、コレステロールまたは他の脂質誘導体が、増加した膜溶解性を有する改変ＴＡＴを生成するために、ＴＡＴタンパク質に加えられ得る。
【００５９】
ＴＡＴタンパク質の改変体は、ＴＡＴ−ＳＨ３結合ペプチドの細胞内局在化を調節するように設計され得る。外因的に添加される場合、このような改変体は、ＴＡＴが細胞に侵入する能力が保持されるように、設計される（すなわち、改変体ＴＡＴタンパク質または改変体ＴＡＴペプチドの細胞への取込みは、天然に存在するＨＩＶ  ＴＡＴ細胞への取込みと実質的に類似している）。例えば、核局在化に重要であると考えられている基本領域の変化（例えば、ＤａｎｇおよびＬｅｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８０１９−１８０２３（１９８９）；Ｈａｕｂｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１１８１−１１８７（１９８９）；Ｒｕｂｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１−８（１９８９）を参照のこと）は、ＴＡＴ、従って、ＳＨ３結合ペプチドの細胞質局在化または部分的な細胞質局在化を生じ得る。あるいは、細胞質または任意の他の成分もしくは区画（例えば、小胞体、ミトコンドリア、ｇｌｏｏｍ装置、リソソーム小胞）を結合するための配列を、ＴＡＴに導入して、この細胞質または任意の他の区画中にＴＡＴおよびＳＨ３結合ペプチドを保持して、このＴＡＴおよびＳＨ３結合ペプチドの取込みの際の調節を確認し得る。
【００６０】
輸送ペプチドの他の供給源は、当該分野で周知である。例えば、ＶＰ２２（例えば、ＷＯ９７／０５２６５；ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  ８８：２２３−２３３（１９９７）に記載される）または非ウイルスタンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎら，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０６９１−１０６９５（１９９２））。他の適切な輸送ペプチドとしては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）ホメオティック転写因子由来のペプチド、Ｋａｐｏｓｉ線維芽細胞増殖因子（ＭＴＳ）のシグナル配列のｈ領域由来のペプチド、およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のタンパク質ＰｒｅＳ２由来のペプチドが挙げられる（Ｋｅｌｅｍｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１０）：８７４１−８７４８（２００２））。あるいは、輸送ペプチドは、カチオン性高分子のポリマー、またはポリアルギニン反復を含むアルギニンリッチなペプチドである。
【００６１】
ＳＨ３結合ペプチドおよび輸送配列は、当該分野で公知の任意の適切な様式で、化学的結合によって連結され得る。多くの公知の化学的架橋法は、非特異的である。すなわち、これらは、結合点を、輸送ポリペプチドまたはカーゴ高分子上の任意の特定の部位へ指向しない。結果として、非特異的架橋剤の使用は、機能的部位を攻撃するか、または活性部位を立体的にブロックして、結合体化タンパク質を、化学的に不活性し得る。
【００６２】
結合特異性を増大させるための１つの方法は、架橋されるべきポリペプチドの一方または両方において、一回のみまたは数回見出される官能基への直接的な化学結合である。例えば、多くのタンパク質において、チオール基を含む唯一のタンパク質アミノ酸であるシステインは、数回のみ現れる。また、例えば、ポリペプチドがリジン残基を含まない場合、１級アミンに特異的な架橋試薬は、このポリペプチドのアミノ末端に対して選択的である。結合特異性を増大させるためのこのアプローチの首尾良い利用は、このポリペプチドが、適切に稀でかつ反応性の残基を、分子の生物学的活性を損なうことなく変更され得る分子領域に有することを必要とする。
【００６３】
システイン残基は、これらがポリペプチド配列の部分に生じる場合に置換され得、そうでなければ、このポリペプチド配列の部分において、架橋反応へのその参加が生物学的活性を妨害する可能性がある。システイン残基が置換される場合、代表的に、ポリペプチドの折り畳みにおいて生じる変化を最小限にすることが望ましい。ポリペプチドの折り畳みにおける変化は、この置換が化学的および立体的にシステインと類似している場合に最小化される。これらの理由のため、セリンは、システインの代わりとして好ましい。以下の実施例に示されるように、システイン残基は、架橋の目的のために、ポリペプチドのアミノ酸配列に導入され得る。システイン残基が導入された場合、アミノ末端もしくはカルボキシ末端への、またはアミノ末端付近もしくはカルボキシ末端付近への導入が好ましい。目的のポリペプチドが、化学合成によって生成されようと、組換えＤＮＡの発現によって生成されようと、従来の方法は、このようなアミノ酸配列の改変に利用可能である。
【００６４】
２つの構成要素の結合は、結合剤または結合体化剤によって達成され得る。利用され得るいくつかの分子間架橋試薬がある。例えば、ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ，ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，１９７４，ｐｐ．３９−４３を参照のこと。これらの試薬には、例えば、Ｊ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（これらの両方は、スルフヒドリル基に対して非常に特異的であり、かつ不可逆的結合を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６〜１１炭素のメチレン架橋を有する他のこのような試薬（これらは、スルフヒドリル基に対して比較的特異的である）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（これは、アミノ基およびチロシン基と不可逆的結合を形成する）がある。この目的のために有用な他の架橋試薬としては、以下が挙げられる：ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（これはアミノ基およびフェノール基と不可逆的架橋を形成する）；ジメチルアジピミデート（これはアミノ基に対して特異的である）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（これは、主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートもしくはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（これは主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（これはいくつかの異なる側鎖と反応する）およびビスジアゾベンジジン（ｄｉｓｄｉａｚｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（これは主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）。
【００６５】
架橋試薬は、ホモ二官能性（すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有する）であり得る。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、２つのマレイミド官能基を含み、これらの官能基は、穏やかな条件下（ｐＨ６．５〜７．７）で、スルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する。これら２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって連結されている。従って、ＢＭＨは、システイン残基を含むポリペプチドの不可逆性架橋に有用である。
【００６６】
架橋試薬はまた、ヘテロ二官能性であり得る。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの異なる官能基（例えば、アミン反応性基およびチオール反応性基であって、これらは、それぞれ、遊離のアミンおよびチオールを有する２つのタンパク質を架橋する）を有する。ヘテロ二官能性架橋剤の例は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、およびスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）（ＭＢＳの伸長鎖アナログ）である。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、１級アミンと反応し、そしてチオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００６７】
架橋試薬はしばしば、水に対する低い溶解度を有する。親水性部分（例えば、スルホネート基）が、その水溶性を改善するために、この架橋試薬に付加され得る。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性が改変された架橋試薬の例である。
【００６８】
多くの架橋試薬が、細胞条件下で本質的に非切断性の結合体を生成する。しかし、いくつかの架橋試薬は、細胞条件下で切断可能な共有結合（例えば、ジスルフィド）を含む。例えば、Ｔｒａｕｔ試薬である、ビチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）は、周知の切断可能架橋剤である。切断可能架試薬の使用によって、カーゴ部分は、標的細胞への送達の後に、輸送ポリペプチドから分離され得る。直接ジスルフィド結合もまた有用であり得る。
【００６９】
多数の架橋試薬（上記の架橋試薬を含む）が、市販されている。これらの使用の詳細な指示書は、商業的供給業者から容易に入手可能である。タンパク質架橋および結合体の調製に関する一般的な参考文献は、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）である。
【００７０】
化学的架橋は、スペーサーアームの使用を包含し得る。スペーサーアームは、分子内可撓性を提供するか、または結合体化された部分の間の分子内距離を調整し、それにより、生物学的活性を保存するのを助け得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸（例えば、プロリン）を含むポリペプチド部分の形態であり得る。あるいは、スペーサーアームは、架橋試薬の一部（例えば、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，ｃａｔ．Ｎｏ．２１６５１Ｈ）中）であり得る。
【００７１】
あるいは、キメラペプチドは、輸送配列を含む融合ペプチド、および公知の適切な宿主細胞において都合良く発現され得るＳＨ３結合ペプチドとして、生成され得る。本明細書中に記載されるような融合ペプチドは、上記の様な標準的な組換えＤＮＡ技術と類似の様式で、またはこのような技術から容易に適応可能な様式で、形成され、そして使用され得る。
【００７２】
（ＳＨ３結合ペプチドに特異的な抗体の産生）
ＳＨ３結合ペプチド（ＳＨ３結合ペプチドを含むキメラペプチド（例えば、表１に示されるアミノ酸配列を含むペプチド）を含む）、ならびにそれらのペプチドまたは誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、これらのペプチド成分に免疫特異的に結合する抗体を生成するために、免疫原として利用され得る。このような抗体としては、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリが挙げられる。特定の実施形態において、ヒトペプチドに対する抗体が、開示される。別の特定の実施形態において、ＳＨ３結合ペプチドのフラグメントが、抗体産生のための免疫原として使用される。当該分野で公知の種々の手順が、ＳＨ３結合ペプチド、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生するために使用され得る。
【００７３】
ポリクローナル抗体の産生について、種々の宿主動物が、ネイティブのペプチドもしくはその合成改変体、またはこれらの誘導体を注射することによって、免疫され得る。種々のアジュバントが、免疫学的応答を増大するために使用され得、これらのアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェノールなど））アジュバント、およびヒトアジュバント（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
ＳＨ３結合ペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するモノクローナル抗体の調製について、連続した細胞株培養物による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術としては、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５．Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，１９８３．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照のこと）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用によって（Ｃｏｔｅら，１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはエプスタイン−バーウイルスでヒトＢ細胞をインビトロで形質転換することによって（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）を参照のこと）産生され得る。
【００７５】
本発明に従って、技術は、ＳＨ３結合ペプチドに特異的な一本鎖抗体の生成に適応され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。加えて、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適応され得（例えば、Ｈｕｓｅ，ら，１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、ＳＨ３結合ペプチドまたはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有する、モノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能にする。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術によって「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＳＨ３結合ペプチドに対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、当該分野で公知の技術により生成され得；このフラグメントとしては、例えば、（ｉ）抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理により生成したＦａｂフラグメント；および（ｉｖ）Ｆｖフラグメントが挙げられる。
【００７６】
一つの実施形態において、所望の特異性を有する抗体のスクリーニング方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および当該分野で公知の他の免疫学的媒介技術が挙げられるが、これらに限定されない。特別な実施形態において、ＳＨ３結合ペプチドの特定のドメインに特異的な抗体の選択は、このようなドメインを有するＳＨ３結合ペプチドのフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。ＳＨ３結合ペプチド、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ中のドメインに特異的な抗体がまた、本明細書中で提供される。
【００７７】
抗ＳＨ３結合ペプチド抗体は、ＳＨ３結合ペプチドの局在化および／または定量化に関連する当該分野で公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル中のペプチドのレベルの測定における使用、診断方法における使用、ペプチドの画像化における使用のためのなど）。所定の実施形態において、結合ドメイン由来の抗体を含有する、ＳＨ３結合ペプチド、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する抗体は、薬理学的に活性な化合物として利用される（本明細書中以下「治療剤」）。
【００７８】
（アポトーシスを阻害する方法）
本発明はまた、細胞内でアポトーシスを阻害する方法、被験体においてアポトーシス関連障害を処置する方法またはアポトーシス関連障害の病徴を軽減する方法を包含する。アポトーシス（プログラムされた細胞死としても知られる）は、発達、老化および様々な病理的状態において役割を果たす。
【００７９】
アポトーシス関連障害としては、例えば、免疫不全疾患（ＡＩＤＳ／ＨＩＶを含む）、老化、膵臓障害（例えば、糖尿病（すなわち、Ｉ型またはＩＩ型）、膵炎、および膵臓癌）、神経障害（例えば、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病））および発作、任意の変性疾患、神経分裂病、虚血性細胞死および再灌流性細胞死、急性虚血性損傷、不妊症、創傷治癒などが挙げられる。
【００８０】
神経変性疾患は、緩やかな進行性神経細胞死により特徴付けられる。他の神経障害としては、神経障害（例えば、糖尿病性神経障害、脳炎および髄膜炎）が挙げられる。神経障害は、代表的に、医師により、当業者に公知の標準方法を用いて診断される。このような方法としては、神経学的病歴および神経学的検査が挙げられる。神経学的検査は、大脳、末梢神経および筋肉のすべての機能の系統的身体検査により達成される。診断はまた、コンピュータ連動断層撮影法、磁気共鳴画像法、脊髄造影法、および陽電子断層撮影法を用いて、神経系を画像化する技術を使用してなされる。
【００８１】
いくつかの膵臓障害（例えば、糖尿病または膵炎）は、緩やかな進行性膵細胞死により特徴付けられる。例えば、糖尿病において、インシュリン生成細胞（例えば、β細胞）は、破壊され、インシュリン欠乏症を生じる。膵炎において、局所的炎症および全身性炎症が、膵細胞死の原因となるサイトカインの放出を生じる。膵臓障害は、代表的に、医師により、当業者に公知の標準方法を用いて診断される。このような方法としては、血清アミラーゼレベルおよびリパーゼレベルの上昇、高血糖症、低カルシウム血症、または高ビリルビン血症が挙げられる。
【００８２】
アポトーシス関連障害に関連する病徴は、特定の疾患に関連する患者が経験した身体機能の任意の感覚または変化を含むことが意図されている。例えば、糖尿病において、障害に関連する病徴としては、低血清インスリンレベル、高血清グルコース、膵臓β細胞死、神経障害、およびケトアシドーシスが挙げられる。あるいは、神経変性障害において、病徴としては、例えば、ニューロン細胞死、ニューロン変性、ニューロン機能障害、大脳萎縮症、脳内のアミロイド斑の蓄積、および糸状構造物の蓄積（例えば、レヴィー小体、タウリッチ神経細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ））が挙げられる。
【００８３】
アポトーシスを測定する多くの方法（本明細書中記載される方法が含まれる）は、当業者に公知であり、ゲル電気泳動によるＤＮＡラダー形成および電子顕微鏡による形態的な検査といった古典的な方法が挙げられるが、これらに限定されない。アポトーシス測定に使用される、より最新かつ容易な方法は、フローサイトメトリーである。フローサイトメトリーは、アポトーシス細胞の迅速かつ定量的な測定を可能にする。細胞内のアポトーシスの評価のための多くの異なるフローサイトメトリー法が記載されている（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：７９５−８０８，１９９２）。これらの方法のほとんどは、細胞におけるアポトーシスの変化を、様々なＤＮＡ色素（すなわち、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、３３３４２）で染色されることにより測定するが、しかし、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴＵＮＮＥＬ）またはニック翻訳アッセイを用いる技術がまた、開発された（Ｇｏｒｃｚｙｃａら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：１９４５−１９５１，１９９３）。最近、アポトーシスのマーカーとして、細胞表面へのホスファチジルセリンの曝露の検出のためにアネキシンＶを使用する迅速なフローサイトメトリー染色法が市販されている。
【００８４】
ＳＨ３結合ペプチド、ＳＨ３キメラペプチド、またはＳＨ３結合ペプチドをコードする核酸をアポトーシスを阻害するために十分な量で、細胞と接触させることにより、アポトーシスは、細胞内で阻害される。例えば、細胞を、配列番号１〜３５のいずれか１つと接触させる。この細胞は、膵臓細胞（例えば、膵臓β細胞）またはニューロン細胞である。ＳＨ３結合ペプチドに曝される（すなわち、接触される）細胞集団は、多数の細胞（すなわち、１つ以上の細胞）であり、そしてインビトロ、インビボまたはエキソビボで提供され得る。
【００８５】
例えば、化合物が細胞死を阻害し得るか否かを決定するために、化合物を初期細胞および固定化細胞とともにインキュベートし、細胞の酸化ストレス状態を誘導し（例えば、これらをＨ２Ｏ２とともにインキュベートすることにより）、そして標準方法により細胞生存度を測定することにより、化合物を試験する。コントロールとして、この細胞を化合物の非存在下でインキュベートし、次いで処理した細胞をこの化合物の非存在下でインキュベートし、次いで酸化ストレスの状態を誘導するために処理をする。化合物処理サンプルにおける、細胞死の減少（または、生存可能な細胞数の増加）は、その化合物が、酸化ストレス誘導細胞死（すなわち、アポトーシス）を阻害することを示している。この試験は、異なる用量の化合物を使用して反復され、化合物がアポトーシスを阻害するように機能する用量範囲を決定する。
【００８６】
被験体でアポトーシス関連障害は、このような障害の処置を必要とする被験体に、生物学的活性治療化合物（本明細書中以下「治療剤」）を投与することにより、処置されるか、またはアポトーシスの病徴が軽減される。
【００８７】
治療剤としては、例えば：（ｉ）ＳＨ３結合ペプチドまたはＳＨ３キメラペプチド、およびそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログの１つ以上のいずれか；（ｉｉ）ＳＨ３結合ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）ＳＨ３結合ペプチドまたはＳＨ３キメラペプチド、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログをコードする核酸；（ｉｖ）ＳＨ３結合ペプチドをコードする配列に対するアンチセンス核酸、および（ｖ）モジュレータ（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）が挙げられる。例えば、治療剤とは、配列番号１〜３５を含む。
【００８８】
用語「治療的に有効」とは、例えば、使用されるＳＨ３−ＢＰの量が、アポトーシス関連障害を回復するために十分な量であることを意味する。
【００８９】
被験体は、例えば、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）である。
【００９０】
本発明はまた、ＪＮＫの活性化に関連する細胞増殖障害の処置の方法を包含する。用語「細胞増殖障害」とは、周囲の組織と形態学的および機能的に異なるような、悪性細胞集団および非悪性細胞集団を意味する。例えば、この方法は、ＪＮＫの活性化がしばしば示される種々の器官系（例えば、肺、乳房、リンパ、胃腸、および尿生殖管の悪性腫瘍ならびに腺（例えば、結腸癌、腎臓癌細胞癌、前立腺癌、肺の非小細胞癌、小腸癌および食道癌のような悪性腫瘍が挙げられる））の処置に有用である。ＪＮＫの活性化を明らかに必要とするＢｃｒ−Ａｂｌオンコジーン形質転換を有する癌もまた、含まれる。基本的に、ＪＮＫキナーゼ活性と病原学的に関連する任意の障害は、処置に影響されやすいと考えられる。
【００９１】
（ニューロン細胞増殖および再生を促進する方法）
本発明はまた、細胞を本発明のＳＨ３結合ペプチド、キメラペプチド、または核酸と接触させることにより、ニューロン細胞増殖または再生を促進する（すなわち、増加する）方法を包含する。例えば、細胞を、配列番号１〜３５のペプチドと接触させる。
【００９２】
ニューロン細胞は、中枢神経系または末梢神経系に由来する任意の細胞（例えば、ニューロン、神経突起または樹状突起）である。本発明のＳＨ３結合ペプチド、融合ペプチドまたは核酸に曝した（すなわち、接触させた）細胞集団は、多数の細胞（すなわち、１つ以上の細胞）であり得、インビトロ、インビボ、またはエキソビボにおいて提供され得る。細胞がインビボまたはエキソビボにおいて提供される場合、被験体は、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）であり得る。
【００９３】
ニューロン細胞増殖を測定する多くの方法が、当業者に公知であり、これには、細胞生存度測定が挙げられるが、これに限定されない。
【００９４】
例えば、化合物がニューロン細胞増殖または再生を促進し得るか否かを決定するために、化合物を初期神経細胞および固定化神経細胞細胞とともにインキュベートし、細胞のストレス状態を誘導（例えば、本明細書中に記載されるように、これらをＨ２Ｏ２またはＮＭＤＡとともにインキュベートすることにより）、そして細胞生存度を測定することにより、化合物を試験する。コントロールとして、細胞をこの化合物の非存在下でインキュベートし、次いで処置した細胞をこの化合物の非存在下でインキュベートし、次いでストレス状態を誘導するために処理する。化合物処理サンプルにおける、細胞死の減少（または、生存可能な細胞数の増加）は、その化合物が、細胞増殖または再生を促進することを示す。
【００９５】
（薬学的組成物）
本発明のＳＨ３結合ペプチド、融合ペプチドおよび核酸は、薬学的組成物において処方され得る。これらの組成物は、上記の物質の１つに加え、薬学的に受容可能な賦形剤、キャリア、緩衝液、安定剤または当業者に周知の他の物質を含み得る。このような物質は、非毒性であり得、そして活性成分の効果を妨げ得ない。キャリアまたは他の物質の正確な性質は、投与の経路に基づき得る（例えば、経口経路、静脈内経路、皮膚経路または皮下経路、経鼻経路、筋肉内経路、腹腔内経路またはパッチ経路）。
【００９６】
経口投与のための薬学的組成物は、錠剤形態、カプセル剤形態、散剤形態または液体形態であり得る。錠剤は、固形キャリア（例えば、ゼラチンまたはアジュバンド）を含み得る。液体薬学的組成物としては、一般的に、液体キャリア（例えば、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油）を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他のサッカライド溶液またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）もまた、含まれ得る。
【００９７】
静脈内注射、皮膚注射または皮下注射、または苦痛のある部位での注射について、活性成分は、非経口的に受容可能な水溶液の形態であり、この溶液は、発熱性物質を含まず、そして適切なｐＨ、等張性および安定性を有する。当業者は、例えば、等張性ビヒクル（例えば、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を使用して、適切な溶液を容易に調製し得る。保存料、安定剤、緩衝液、抗酸化剤および／または他の添加剤が、必要であれば含まれ得る。
【００９８】
個体に与えられるべきものが、本発明によるポリペプチド、ペプチド、または核酸分子、他の薬学的に有用な化合物のいずれであっても、投与は、好ましくは、「予防有効量」または「治療有効量」であり（場合にもよるが、予防は、治療としてみなされ得る）、このことは、個体に利益を示すのに十分である。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間経過は、処置されるものの性質および重症度に依存する。処置の処方箋（例えば、決定または投薬量など）は、一般的な臨床医および他の医学的医師の責任内であり、代表的に、処置されるべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法ならびに臨床医に既知の他の因子を考慮する。上記の技術およびプロトコルの例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ（編）、１９８０に見出され得る。
【００９９】
あるいは、標的化治療を使用して、標的化システム（例えば、抗体または細胞特異的リガンド）の使用によって、特定の型の細胞により特異的に活性薬剤を送達し得る。標的化は、以下の種々の理由から望ましい；例えば、薬剤が、受容できない毒性がある場合、またはそうでなければ、非常に高投薬量が必要である場合、またはそうでなければ、標的細胞に進入し得ない場合。
【０１００】
これらの薬剤を直接投与する代わりに、それらを、細胞に導入されたコード遺伝子（例えば、ウイルスベクターにおいて（ＶＤＥＰＴ技術の改変体−以下を参照のこと））からの発現によって標的細胞内で産生し得る。ベクターは、処置されるべき特定の細胞に標的化され得るか、または調節エレメントを含み得、これは、標的細胞によって多少は選択的に切り換えられる。
【０１０１】
あるいは、処置されるべき細胞において産生されるか、またはそれに標的化される薬剤を活性化することによる活性形態への変化のために、薬剤は、前駆体形態で投与され得る。この型のアプローチは、時おり、ＡＤＥＰＴまたはＶＤＥＰＴとして知られる；前者は、細胞特異的抗体への結合体化による細胞への活性化薬剤の標的化に関与し、一方、後者は、ウイルスベクター中のコードＤＮＡからの発現によるベクターにおける、活性化薬剤（例えば、ＳＨ３結合ペプチド）の生成に関与する（例えば、ＥＰ−Ａ−４１５７３１およびＷＯ９０／０７９３６を参照のこと）。
【０１０２】
本発明の特定の実施形態において、核酸は、ＳＨ３結合ペプチドをコードする配列またはその機能的誘導体を含み、遺伝子治療によって活性化されたＪＮＫシグナル伝達経路を調節するために投与される。より特定の実施形態において、核酸もしくはＳＨ３結合ペプチドをコードする核酸、またはその機能的誘導体は、遺伝子治療によって投与される。遺伝子治療は、被験体への特定の核酸の投与によって実施される治療をいう。本発明のこの実施形態において、この核酸は、そのコードされたペプチドを産生し、次いで、疾患または障害の機能を調節することによる治療効果を発揮するように働く。当該分野で利用可能な遺伝子治療に関連する任意の方法論は、本発明の実施において使用され得る。例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，１９９３．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  １２：４８８〜５０５を参照のこと。
【０１０３】
好ましい実施形態において、この治療薬は、適切な宿主内で、αＳＨ３関連ペプチド、またはそのフラグメント、誘導体、もしくはアナログのいずれか１つ以上を発現する発現ベクターの部分である核酸を含む。特定の実施形態において、このような核酸は、ＳＨ３結合ペプチドのコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを保有する。このプロモーターは、誘導性であり得るか、または構築性であり得、そして必要に応じて、組織特異的であり得る。別の特定の実施形態において、コード配列（および任意の他の所望の配列）が、ゲノム内の所望の部位での相同性組換えを促進する領域に隣接する核酸分子が、使用され、従って、核酸の染色体内発現を提供する。例えば、ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２〜８９３５を参照のこと。
【０１０４】
治療核酸の患者への送達は、直接（すなわち、患者は、この核酸または核酸含有ベクターに直接曝される）であっても、間接（すなわち、まず、細胞が、インビトロで核酸により形質転換され、次いで、患者に移植される）であってもよい。これらの２つのアプローチは、それぞれ、インビボ遺伝子治療またはエキソビボ遺伝子治療として公知である。本発明の特定の実施形態において、核酸は、インビボで直接的に投与され、ここで、核酸は、コード産物を産生するように発現される。このことは、当該分野で公知の以下の任意の多数の方法によって達成され得る：例えば、核酸を適切な核酸発現ベクターの部分として構築して、核酸が細胞内にあるような様式で投与する（例えば、不完全または弱毒化されたレトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターを使用しての感染；例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）；裸のＤＮＡを直接注入；微粒子衝撃の使用（例えば、「Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ（登録商標）」；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，ＤｕＰｏｎｔ）；脂質での核酸のコーティング；関連する細胞表面レセプター／トランスフェクト因子の使用；リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルへのカプセル化；核に進入することが公知のペプチドと結合した核酸の投与；あるいは、レセプター媒介エンドサイトーシスへの素因を与えられたリガンドと結合した核酸の投与による（例えば、ＷｕおよびＷｕ，１９８７．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９〜４４３２）、これらを使用して、目的のレセプターなどを特異的に発現する細胞型を「標的化」し得る。
【０１０５】
本発明の実施における遺伝子治療に対するさらなるアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ウイルス感染などのような方法によって、インビトロ組織培養において、遺伝子を細胞内に移入する工程を包含する。一般に、この移入方法は、この細胞への選択マーカーの同時移入を包含する。次いで、この細胞は、この移入された遺伝子を取り込みそして発現する細胞の単離を容易にするように、選択圧（例えば、抗生物質抵抗圧）下に配置される。次いで、これらの細胞は、患者に送達される。特定の実施形態において、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、当該分野で公知の任意の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、目的の核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、マイクロセル媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合、ならびにこれらの移入によって分裂しないレシピエント細胞の必要な発達機能および生理学的機能を確実にする、類似の方法論が挙げられる）によって、核酸が細胞に導入される。例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ、１９９３．Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：５９９−６１８を参照のこと。選択された技術は、細胞への核酸の安定な移入を提供するべきであり、その結果、核酸は、この細胞によって発現可能である。好ましくは、この移入された核酸は、遺伝性であり、かつその細胞子孫によって発現可能である。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態において、得られた組み換え細胞は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、上皮細胞の注射（例えば、皮下注射））、皮膚移植片としての組み換え皮膚細胞の、患者への適用、および組換え血球（例えば、造血幹細胞または前駆体細胞）の静脈内注射が挙げられる）によって、患者に送達され得る。使用を想定した細胞の総量は、所望の効果、患者の状態などに依存しており、当業者によって決定され得る。
【０１０７】
遺伝子治療の目的で核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の利用可能な細胞型を包含し、異種細胞、異種遺伝子型細胞、同系細胞、または自己移植片細胞であり得る。細胞型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：分化細胞（例えば、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞および血球）、または種々の幹細胞もしくは前駆体細胞、特に、胚性心筋細胞、肝臓幹細胞（国際特許公開ＷＯ  ９４／０８５９８）、神経幹細胞（ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２、Ｃｅｌｌ  ７１：９７３−９８５）、造血性幹細胞もしくは前駆体細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる）。好ましい実施形態において、遺伝子治療のために用いられる細胞は、患者に対して自己である。
【実施例】
【０１０８】
（特定の実施形態）
（実施例１：ＳＨ３結合ペプチドの同定）
ＪＮＫシグナル伝達経路における中間体キナーゼＭＫＫ７が、ＩＢ１タンパク質およびＩＢ２タンパク質の高度に保存されたＳＨ３ドメインに結合することを決定した後、ＪＮＫシグナル伝達経路をブロックする効果的な方法が、ＩＢ１とＩＢ２との両方へのＭＫＫ７キナーゼの結合を防止することを結論付けた。ＩＢ１およびＩＢ２のＳＨ３ドメインとの有効な相互作用に重要なアミノ酸配列を、ＧＳＴ−ＳＨ３ＩＢ１／２融合タンパク質に対するファージディスプレイライブラリーをバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）することによって同定した。この同定したアミノ酸配列を、図１に示す。このバイオパニング実験からの配列間での配列比較は、２つの保存的な結合モチーフＳＸＳＶＧＸ（配列番号５）およびＰＰＳＰＲＰ（配列番号６）を規定した（図１）。後者の配列は、ＰＸＸＰ  ＳＨ３結合コンセンサス（配列番号３５）に一致する。このバイオパニング実験の間に得られた配列間での配列比較はまた、コンセンサスαＳＨ３配列ＳＶＳＶＧＭＰＰＳＰＲＰ（配列番号１）および属性αＳＨ３配列ＳＸ（Ｓ／Ｐ）Ｖ（Ｇ／Ｌ）ＸＰＰＳＰＲＰ（配列番号２）も明らかにした。本明細書中で使用される場合、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。（Ｓ／Ｐ）によって表される単一残基は、属性配列において、ＳｅｒまたはＰｒｏのいずれかであり得る。（Ｇ／Ｌ）によって表される単一残基は、属性配列において、ＧｌｙまたはＬｅｕのいずれかであり得る。
【０１０９】
（実施例２：ＳＨ３結合融合タンパク質の調製）
ＳＨ３結合融合タンパク質を、ＨＩＶ−ＴＡＴ４９−５７由来のＮ末端の９アミノ酸長のキャリアペプチドにαＳＨ３のＣ末端を共有結合させることによって合成した（Ｖｉｖｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０（１９９７））。これらの調製物を、それぞれ、ＴＡＴ（配列番号３６）およびＴＡＴ−αＳＨ３（配列番号３）と命名した。全てのレトロインベルソＴＡＴ融合ペプチドもまた合成し、それぞれ、ＲＶ−ＴＡＴ（配列番号３８）およびＲＶ−ＴＡＴ−αＳＨ３（配列番号２０）と命名した。全てのＤペプチドおよびＬペプチドを、古典的なＦモック合成によって作製し、質量分光計によってさらに分析した。これらを、最終的に、ＨＰＬＣによって精製した。
【０１１０】
保存されたアミノ酸残基を示す属性ペプチドを、表１で与える。「Ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。所定のペプチドにおけるＸの数は、表される１つに限定されず、変更され得る。属性配列のより詳細な説明については、上記を参照のこと。
【０１１１】
（実施例３：αＳＨ３ペプチドによる、ＩＢ１およびＩＢ２へのＭＫＫ７結合の阻害）
次いで、ＪＮＫ生物学的活性に対するαＳＨ３の効果を研究した。プルダウン実験を使用して、αＳＨ３ペプチドがＩＢ１とＩＢ２との両方へのＭＫＫ７の結合を効果的にブロックすることを示した（図２）。このプルダウン実験において、ＩＢ１およびＩＢ２のＳＨ３ドメインを、ＰＣＲを使用して、ＧＳＴを有するインフレームで、ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター中にサブクローニングした（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。その組み換えタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌで作製した。グルタチオンアガロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、ネイティブ状態で精製を行った。次いで、３５Ｓ−標識化ＭＫＫ７を、古典的なプルダウン実験において使用した。
【０１１２】
（実施例４：ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチドによる、ＩＬ−１β誘導膵臓β細胞死の阻害）
ＩＬ−１βによって誘導される膵臓β細胞アポトーシスに対するＴＡＴ−αＳＨ３ペプチド構築物の効果を、評価した。膵臓βＴＣ−３細胞を、ＩＬ−ｌβ（１０ｎｇ／ｍＬ）とともに、ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチドの存在下または非存在下で４８時間インキュベートした（図３）。以下に記載されるように、ヘキスト／Ｐ染色の後に、アポトーシスの計数を行った。ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチドは、ＩＬ−１β誘導死に対してインスリン分泌細胞を保護することを決定した。
【０１１３】
インスリン分泌細胞株であるＩＮＳ−１（Ａｓｆａｒｉら、１９９２）およびβＴＣ−３（Ｅｆｒａｔら、１９８８）を、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００単位／ｍｌペニシリン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭグルタミンおよび１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールを補充した、ＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ＴＡＴペプチド、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドおよびＴＡＴ−ＩＢ２ペプチドを、１μＭの濃度で加え、３０分後、各々に、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＦＮ−γ（１００単位／ｍｌ）を加えた。ヨウ化プロピジウム染色およびヘキスト３３３４２染色（以下を参照のこと）の使用によって、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２５、Ｚｅｉｓｓ）の下で、サイトカインの添加から４８時間後に、アポトーシス細胞を計数した。細胞のトランスフェクションを、「リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）」（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。
【０１１４】
以下の手順を使用して、アポトーシスβ細胞の正確な測定を確実にした。培地中の膵臓β細胞を、Ｈｏｏｒｅｎｓらによって詳細に記載されるように正確に調製して、膵臓β細胞の壊死を最小にした（Ｈｏｏｒｅｎｓら、１９９６）。以前に記載したように（Ａｍｍｅｎｄｒｕｐら、２０００；Ｈｏｏｒｅｎｓら、１９９６）、β細胞を最適化する条件を使用して、ヘキスト３３３４２（ＨＯ  ３４２）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で細胞を染色した後に、光学顕微鏡を使用した。この染色の組み合わせを使用して、生存細胞または壊死細胞は、それぞれ青色（ＨＯ  ３４２）蛍光または黄色（ＨＯ  ３４２＋ＰＩ）蛍光を有するインタクトな核を有した。アポトーシス細胞は、そのプロセスの段階に依存して、青色（ＨＯ  ３４２）蛍光または黄色（ＨＯ  ３４２＋ＰＩ）蛍光のいずれかを有する断片化された核を有した。光学顕微鏡アッセイのために、最小１０００個の細胞を、各条件について計数した。次いで、生存細胞、壊死細胞およびアポトーシス細胞の割合を、表した。
【０１１５】
（実施例５：ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチドによる、ニューロンにおけるアポトーシスの阻害）
発達中のラット皮質ニューロンを、ＪＮＫＩ（１μＭ）（図４Ａ〜４Ｃ）またはＴＡＴ−αＳＨ３（１μＭ）（図４Ｄ〜４Ｆ）のいずれかとともにインキュベートした。コントロールの発達中のラット皮質ニューロンと比較した場合（図４Ａ）、ＪＮＫＩは、残りの壊死体の出現（矢印によって示される）によって証明されるように、発達中のニューロンに対して毒性であることが見出された（図４Ｂ〜４Ｃ）。コントロールの発達中のラット皮質ニューロンと比較した場合（図４Ｃ）、ＴＡＴ−αＳＨ３（１μＭ）の存在下でインキュベートしたニューロンは、残りの壊死体を欠損した（図４Ｅ〜４Ｆ）。
【０１１６】
ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチド（図４Ｅ）は、コントロール（図４Ｄ）を超えて、得られる発達中のニューロンの数を再現可能に増加させることもまた、見出された。
【０１１７】
（実施例６：ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチドによる、ニューロンにおけるＮＭＤＡ誘導アポトーシスの阻害）
培地中のラット皮質ニューロンを、ＴＡＴ−αＳＨ３（１μＭ）ペプチドを用いてかまたは用いずにかのいずれかで、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラテート（ＮＭＤＡ）とともにインキュベートした。次いで、これらの細胞を、ヘキスト／ＰＩ（図５Ａ）または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のいずれかで染色した。培地中に放出されるＬＤＨレベルを測定して、細胞死を定量した（図５Ｂ）。ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチドは、ＮＭＤＡによって誘導される死に対してニューロンを完全に保護することが見出された。
【０１１８】
（実施例７：インビトロ固相ＪＮＫアッセイ）
βＴＣ−３および他のインスリン分泌細胞を、サイトカイン処理によって活性化し、その後、この細胞を、細胞抽出物調製のために使用して、記載されるように（Ｂｏｎｎｙら、２０００）プロセスした。簡潔には、溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート、１ｍＭ  ジチオスレイトール）中で、コントロールと活性化細胞とをスクレーピング（ｓｃｒａｐｉｎｇ）することによって、細胞抽出物を調製する。細片を、ＳＳ−３４ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）において１５’０００ｒｐｍにて５’遠心分離することによって取り除く。１００μｇの抽出物を、４℃にて１時間、１μｇ  ＧＳＴ−Ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）または他のＧＳＴ融合タンパク質および１０μｌのグルタチオンアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートする。スクレーピング緩衝液で４回洗浄した後、このビーズを、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５μＣｉγ３３Ｐ−ＡＴＰを補充した同じ緩衝液中に再懸濁し、そして３０℃にて３０分間インキュベートする。次いで、反応生成物を、変性した１２％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離する。このゲルを乾燥し、続いてＸ線フィルムに曝す（Ｋｏｄａｋ）。
【０１１９】
組み換えＪＮＫを、網状赤血球の転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）において作製する。ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘＬ、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、ＰＰＡＲγ、τおよびＩＲＳ−１の関連ドメインを、ＰＣＲを使用して、ＧＳＴを有するインフレームで、ｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクター中にサブクローニングする（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。その組み換えタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで作製し、そしてグルタチオン−アガロースカラムを使用して、ネイティブの状態で精製する（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。詳細に記載されるように（Ｂｏｎｎｙら、２００１）、この組換えＪＮＫとＧＳＴ基質とを混合することによって、キナーゼアッセイを行う。
【０１２０】
（実施例８：全Ｄレトロインベルソペプチドの合成）
本発明のペプチドは、天然のタンパク質分解を防止するために逆に合成された全Ｄアミノ酸ペプチド（すなわち、全Ｄレトロインベルソペプチド）であり得る。本発明の全Ｄレトロインベルソペプチドは、天然のペプチドと類似の機能的特性を有するペプチドを提供する。ここで、その成分アミノ酸の側鎖は、天然のペプチドアラインメントに対応するが、プロテアーゼ耐性骨格を維持する。
【０１２１】
本発明のレトロインベルソペプチドは、ペプチド鎖中でアミノ酸を結合させることによって、Ｄアミノ酸を使用して合成されたアナログであり、その結果、このレトロインベルソペプチドアナログにおけるアミノ酸配列は、モデルとして働く選択されたペプチドにおけるアミノ酸配列と正反対である。例示のために、（Ｌアミノ酸から形成された）天然に存在するＴＡＴタンパク質が配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３６）を有する場合、（Ｄアミノ酸から形成された）このペプチドのレトロインベルソペプチドアナログは、配列ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（配列番号３８）を有する。Ｄアミノ酸の鎖を合成して、レトロインベルソペプチドを形成するための手順は、当該分野で公知である。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８，７４４−７４６（１９９４）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８，６９２−６９３（１９９４）；Ｇｕｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，２０３０−２０３９（１９９６）を参照のこと。詳細には、このレトロペプチドを、古典的なＦモック合成によって作製し、質量分光計によってさらに分析する。これらを、最終的に、ＨＰＬＣによって精製する。
【０１２２】
ネイティブペプチドを用いる固有の問題は、天然のプロテアーゼによる分解および固有の免疫原性であるので、本発明のヘテロ二価化合物またはへテロ多価化合物は、所望のペプチドの「レトロインベルソ異性体」を含むように調製される。従って、天然のタンパク質分解からペプチドを保護することは、両方の半減期を延長させることによって、特定のヘテロ二価化合物またはヘテロ多価化合物の有効性を増加させ、かつペプチドを活発に破壊することを目的とした免疫応答の範囲を減少させるはずである。
【０１２３】
（他の等価物）
本発明は、その詳細な説明とともに記載されているが、前出の説明は、例示することを意図しており、本発明の範囲を制限しない。この説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定される。他の局面、利点および改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、ＩＢ１／２のＳＨ３ドメインを結合するアミノ酸配列の整列を示す図である。
【図２】図２は、ＩＢ１、ＩＢ２、ＩＢ１−ＴＡＴ（１μＭ）、ＩＢ１−ＴＡＴ−αＳＨ３（０．１μＭ）、ＩＢ１−ＴＡＴ−αＳＨ３（１μＭ）、ＩＢ２−ＴＡＴ−αＳＨ３（１μＭ）の、ＭＫＫ７のＩＢ１／２への結合に対する効果を示す図である。
【図３】図３は、インスリン分泌膵臓β−細胞におけるＩＬ−１β誘導死の、ＴＡＴ−αＳＨ３ペプチドによる阻害を表すヒストグラムである。
【図４】図４Ａ〜Ｆは、残余の壊死体（矢印として示される）の出現によって明らかであるような、発生中のラット皮質ニューロンの発達に対する、ＪＮＫ１（１μＭ）ペプチドおよびＴＡＴ−αＳＨ３（１μＭ）ペプチドの効果を示す図である。パネルＢおよびＣは、パネルＡに示されるコントロールの発生中のラット皮質ニューロンと比較される場合の、発生中のラット皮質ニューロンに対するＪＮＫ１（１μＭ）の毒性を示す。パネルＤは、コントロールの発生中のラット皮質ニューロンを示す。パネルＥおよびＦは、パネルＤに示されるコントロールの発生中のラット皮質ニューロンと比較される場合、ＴＡＴ−αＳＨ３（１μＭ）ペプチドが、発生中のラット皮質ニューロンに対して毒性ではないことを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＰＩで染色したニューロンにおける、ＴＡＴ−αＳＨ３（１μＭ）ペプチドによる、ＮＭＤＡ誘導死の阻害を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）で染色したニューロンにおける、ＴＡＴ−αＳＨ３（１μＭ）ペプチドによる、ＮＭＤＡ誘導死の阻害を示すヒストグラムである。
【図１】
2005525096.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
2005525096.tif 000012
【図５Ｂ】
2005525096.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月21日(2005.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005525096000001.app
【国際調査報告】
2005525096.tif 000014
2005525096.tif 000015
2005525096.tif 000016
2005525096.tif 000017
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2005525096.tif 000019
2005525096.tif 000020
2005525096.tif 000021