(57)【要約】本発明は、遺伝子EYA4とそのプロモーター及び調節配列との分析により、結腸細胞増殖性疾患を検出、差別化、又は識別すると共に、これを治療するための方法及び核酸を提供する。本発明は、更に、前記遺伝子の細胞増殖性疾患に特異的な分析に有用な新しい核酸配列と、その方法、アッセイ、及びキットとを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、被検者の結腸細胞増殖性疾患を診断する方法：
（ａ）前記被検者の結腸組織又は血清或いはその両方から、１つ以上の試験試料を取得する；及び
（ｂ）EYA4遺伝子から発現するポリペプチドの量の減少又は発現の減少を検出する。
【請求項２】
前記結腸細胞増殖性疾患が、線癌と、扁平上皮細胞癌と、カルチノイド腫瘍と、肉腫と、リンパ腫とを含む群から選出される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検出が、イムノアッセイ、特にELISAによるものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイである請求項３記載の方法。
【請求項５】
以下のステップを含む、被検者の結腸細胞増殖性疾患を診断する方法：
（ａ）前記被検者の結腸組織又は血清或いはその両方から、１つ以上の試験試料を取得する；
（ｂ）免疫複合体を形成するために、前記試料をEYA4ポリペプチドとの免疫反応性を有する抗体に接触させる；
（ｃ）前記免疫複合体を検出する；
（ｄ）前記免疫複合体の量を、同じ抗体と結腸癌を有しないことが分かっている１人以上の被検者からの対照試料とにより同一の条件下で形成された免疫複合体の量と比較する；これにおいて前記対照試料と比較して前記被検者からの試料における前記免疫複合体の量の減少が結腸癌を示す。
【請求項６】
前記免疫複合体が、ウェスタンブロットアッセイにおいて検出される請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記免疫複合体が、ELISAにおいて検出される請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記検出が、発現分析によるものである請求項１記載の方法。
【請求項９】
患者からの試料におけるEYA4ポリペプチドをコード化するmRNAの存在又は欠如を検出することを含み、これにおいて健康な個人における濃度を超える前記mRNAの濃度減少が結腸細胞増殖性疾患細胞の存在を示す請求項８記載の方法。
【請求項１０】
以下のステップを含む、請求項８記載の方法：
（ａ）配列番号１からなるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、或いは同一であるポリヌクレオチドプローブを提供する；
（ｂ）mRNAと前記プローブとの間で特異的ハイブリダイゼーション複合体を形成するために、非常に厳密な条件下で前記試料を前記ポリヌクレオチドプローブと共に培養する；
（ｃ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する。
【請求項１１】
検出ステップが以下のステップを更に含む、請求項１０記載の方法：
（ａ）試料内のmRNAからcDNAを作成する；
（ｂ）cDNAの側方領域に特異的にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドを提供する；
（ｃ）cDNAセグメントを増幅するために、ステップ（ｂ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ステップ（ａ）のcDNAにおいてポリメラーゼ連鎖反応を実行する；及び、
（ｄ）増幅されたcDNAセグメントを検出する。
【請求項１２】
結腸細胞における形質転換を抑制する方法であって、形質転換表現型を阻害するのに有効な量のEYA4ポリペプチドに前記細胞を接触させることを含む方法。
【請求項１３】
前記EYA4ポリペプチドが前記EYA4ポリペプチドの直接導入によって前記細胞に導入される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記EYA4ポリペプチドがEYA4コード化ポリヌクレオチドの導入を通じて細胞に導入される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記EYA4コード化ポリヌクレオチドが前記EYA4コード化ポリヌクレオチドと操作可能な状態で結びつく制御配列を更に含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記EYA4コード化ポリヌクレオチドがベクター内に存在する請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
結腸細胞増殖性疾患の治療のための請求項１６記載のベクターの使用法。
【請求項１８】
EYA4に作用する治療的に有効な量の化合物を被検者に投与することを含む、被検者の結腸細胞増殖性疾患を予防又は処置する方法。
【請求項１９】
結腸細胞増殖性疾患を検出、差別化、又は識別するための、EYA4遺伝子から発現したポリペプチドの使用法。
【請求項２０】
結腸細胞増殖性疾患の治療のためのEYA4遺伝子から発現したポリペプチドの使用法。
【請求項２１】
前記検出が遺伝子EYA4、そのプロモーター、及び／又は調節エレメントのメチル化分析を含み、特に、配列番号１によるゲノムDNA配列のメチル化分析によるものである請求項８記載の方法。
【請求項２２】
配列番号２〜配列番号５及びこれに相補的な配列を含む群から選出された配列の１つによる化学的に処理されたゲノムDNAのセグメントの少なくとも18塩基長の配列を含む核酸。
【請求項２３】
オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（PNA）オリゴマーであって、いずれの場合においても配列番号２〜配列番号５及びこれに相補的な配列のうち１つによる前処理されたゲノムDNAと相補的である、或いは適度に厳密な条件下又は厳密な条件下でハイブリダイズする、少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を含むオリゴマー。
【請求項２４】
塩基配列が、少なくとも１つのCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む、請求項２３記載のオリゴマー。
【請求項２５】
CpGジヌクレオチドのシトシンが、ほぼオリゴマーの中央の３分の１に位置することを特徴とする請求項２４記載のオリゴマー。
【請求項２６】
請求項２３から２５のいずれか一項に記載の、少なくとも２つのオリゴマーを含む、オリゴマーの組。
【請求項２７】
配列番号２〜配列番号５及びこれに相補的な配列のDNA配列増幅に関するプライマーオリゴヌクレオチドとして使用することが可能な、請求項２３から２６記載の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの組。
【請求項２８】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが固相と結合することを特徴とする請求項２３記載のオリゴヌクレオチドの組。
【請求項２９】
配列番号１及びこれに相補的な配列による配列の１つにおけるシトシンメチル化状態及び／又は一塩基変異多型（SNP）を検出するための、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の少なくとも１０のオリゴマーを含むオリゴマープローブの組の使用法。
【請求項３０】
配列番号１及びこれに相補的な配列の１つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態に関連する疾患を分析するための、担体材料に固定された種々のオリゴマーのアレンジメント（アレイ）を製造する方法であって、請求項２３から２６及び２８のいずれか一項に記載の少なくとも１つのオリゴマーが固相に結合する方法。
【請求項３１】
請求項３０により得られる種々のオリゴマーのアレンジメント（アレイ）。
【請求項３２】
請求項３１記載の種々のオリゴヌクレオチド及び／又はPNAオリゴマー配列のアレイであって、これらが長方形又は六角形の格子形状で、平坦な固相上に配置されることを特徴とするアレイ。
【請求項３３】
固相表面が、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金により構成されることを特徴とする、請求項３１又は３２のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項３４】
以下を含む物質組成物：
−配列番号１〜配列番号５及びこれに相補的な配列を含む群から選出された配列の１つによる、化学的に前処理されたゲノムDNAのセグメントの少なくとも18塩基長の配列を含む核酸、及び
−以下の物質の少なくとも１つを含む緩衝剤：1〜5mM  塩化マグネシウム、100〜500μM dNTP、0.5〜5単位のtaqポリメラーゼ、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（PNA）オリゴマーで、いずれの場合においても配列番号２〜配列番号５及びこれに相補的な配列番号のうち１つによる前処理されたゲノムDNAと相補的である、或いは適度に厳密な条件下又は厳密な条件下でハイブリダイズする、少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を含むオリゴマー。
【請求項３５】
結腸細胞増殖性疾患を検出、差別化、又は識別するための遺伝子EYA4、そのプロモーター、及び／又は調節エレメントの使用法。
【請求項３６】
以下を含む請求項２１記載の結腸細胞増殖性疾患を検出、差別化、又は識別するための方法：
（ａ）被検者から被検者のゲノムDNAを有する生物学的試料を取得する；
（ｂ）5位の非メチル化シトシン塩基をウラシル又はハイブリダイゼーション特性に関して検出可能なシトシンとの相違点のあるその他の塩基に変換させるためにゲノムDNA又はその断片を１つ以上の試薬により処理する；
（ｃ）処理済みのゲノムDNA又は処理済みのその断片を、増幅酵素と、少なくとも２つのプライマーで、いずれの場合においても配列番号２〜配列番号５及びこれの相補物からなる群から選択された配列と相補的である、或いは適度に厳密な条件下又は厳密な条件下でハイブリダイズする、少なくとも18ヌクレオチドの長さの隣接する配列を含むものとに接触させ、これにおいて処理済みDNA又はその断片が増幅され１つ以上の増幅物を生成するか、或いは増幅されない；及び
（ｄ）前記増幅物の存在又は欠如、或いは特性に基づいて、配列番号１の少なくとも１つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態、或いは配列番号１の複数のCpGジヌクレオチド配列の平均メチル化状態又はこの平均メチル化状態を反映する値を決定する。
【請求項３７】
以下のステップを含む請求項２１記載の結腸細胞増殖性疾患を検出、差別化、又は識別するための方法：
（ａ）被検者から、被検者のゲノムDNAを有する生物学的試料を取得する；
（ｂ）5位の非メチル化シトシン塩基をウラシル又はハイブリダイゼーション特性に関して検出可能なシトシンとの相違点のあるその他の塩基に変換させるために、ゲノムDNA又はその断片を１つ以上の試薬により処理する；
（ｃ）結腸又は結腸細胞増殖性疾患細胞を起源とするDNAのみが増幅されるように、処理済みDNAの１つ以上の断片を増幅する；
（ｄ）増幅物又はその特性を検出し、これにより結腸細胞増殖性疾患の存在又は欠如に関して推論する。
【請求項３８】
ステップ（ａ）において、被検者から取得された生物学的試料が、組織学スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、血清、血漿、大便、尿、血液、及びそれらの組み合わせでからなる群から選択される請求項３６又は３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）において、ゲノムDNA又はその断片を処理することが亜硫酸水素塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された溶液の使用を含む請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
（ｂ）において処理することがDNAをアガロースに封埋することに続いて行われる請求項３６から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
（ｂ）において処理することがDNA変性剤又はラジカル捕捉剤の少なくとも一方が存在する状態での処理を含む、請求項３６から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ステップ（ｃ）において接触させること又は増幅することが耐熱性DNAポリメラーゼの増幅酵素としての使用と；5'-3'エクソヌクレアーゼ活性が欠如したポリメラーゼの使用と；ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用と、検出可能な標識を有する増幅核酸分子の生成と；これらの組み合わせとからなる群から選択された少なくとも１つの方法の使用を含む請求項３６から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
検出可能な増幅標識が、蛍光標識と；放射性核種又は放射標識と；質量分析計で検出できる増幅物の質量標識と；質量分析計で検出できる分離可能な増幅物断片の質量標識と；質量分析計で検出できる単一の正又は負の実効電荷を有する増幅物及び分離可能な増幅物断片の質量標識と；これらの組み合わせとからなる標識群から選択される請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
ステップ（ｄ）に、増幅物又は分離可能な増幅物断片の質量標識を検出するための質量分析計の使用が含まれる請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
質量分析手法がマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（MALDI）と、電子スプレ質量分析法（ESI）と、これらの組み合わせとからなる群から選択される請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
この方法のステップ（ｃ）において、６つ以上の異なる断片を増殖させる請求項３６から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記増幅物が、100〜200塩基対の長さである請求項３６から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記増幅物が、100〜350塩基対の長さである請求項３６から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
１つ以上の前記プライマーが、配列番号１１〜配列番号１５による群から選出された配列を含む請求項３６から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
１つ以上の前記プライマーが、１つ以上のCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む請求項３６から４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記プライマーが、２〜４個のCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記１つ以上のCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドが、プライマーの3'側の半分の中に位置する請求項５０又は５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記プライマーが、ステップ（ｂ）の処理において変換される位置にハイブリダイズする１つ以上の塩基を含む請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記塩基が、プライマーの3'側の半分の中に位置する請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記プライマーが、3'末端の最初の5塩基の中に２個を超えるシトシン又はグアニン塩基を含まない請求項５０から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ステップ（ｄ）において取得された前記増幅物が、３個以上のCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む少なくとも１つの20塩基対配列を含む請求項３６から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
ステップ（ｃ）に、１つ以上のCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む少なくとも18塩基対の長さの少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子の使用が更に含まれ、これにおいて前記分子の配列は、配列番号２〜５及びこれの相補物からなる群から選択された配列と相補的であるか、或いは同一であり、前記核酸分子又はペプチド核酸分子はそれがハイブリダイズする核酸の増幅を抑制する請求項３６から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記（複数の）核酸又は（複数の）ペプチド核酸の配列が、配列番号６〜配列番号１０及びこれに相補的な配列からなる群から選択される請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
ステップ（ｂ）の処理前にメチル化されていないDNAの増幅が抑制される請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸分子又はペプチド核酸分子が、いずれの場合においても、その5'末端で修飾され、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素による分解を不可能にする請求項５７から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸分子又はペプチド核酸分子が、いずれの場合においても3'水酸基を欠いている請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
増幅酵素が、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性の欠如したポリメラーゼである請求項５７から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
オリゴヌクレオチド又はPNAオリゴマーの結合部位が、プライマーのものと同一であるか、或いは重複し、これにより結合部位に対するプライマーのハイブリダイゼーションが妨げられる請求項５７から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも２つのオリゴヌクレオチド又はPNAオリゴマーの結合部位が、少なくとも２つのプライマーのものと同一であるか、或いは重複し、これにより結合部位に対するプライマーのハイブリダイゼーションが妨げられる請求項５７から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸オリゴマーのハイブリダイゼーションが、順方向プライマーのハイブリダイゼーションを妨げ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸オリゴマーのハイブリダイゼーションが、前記順方向プライマーの伸長産物と結合する逆方向プライマーのハイブリダイゼーションを妨げる請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記オリゴヌクレオチド又はペプチド核酸オリゴマーが、順方向及び逆方向プライマーの結合部位の間でハイブリダイズする請求項５７から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
ステップ（ｄ）において決定することが、１つ以上のCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む少なくとも9ヌクレオチド長の隣接配列をいずれの場合においても含んだ、少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸（PNA）分子のハイブリダイゼーションを含み、これにおいて前記分子の配列が配列番号２〜５及びこれの相補物からなる群から選択された配列に相補的であるか、或いは同１である請求項３６又は３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
少なくとも１つのこうしたハイブリダイズする核酸分子又はペプチド核酸分子が固相と結合する請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
複数のこうしたハイブリダイズする核酸分子又はペプチド核酸分子が、直線と、六角形と、長方形と、これらの組み合わせとからなるアレイ群から選択された核酸又はペプチド核酸アレイの形態で固相と結合する請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
ステップ（ｄ）において決定することが、増幅物の配列を決定することを含む請求項３６又は３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
ステップ（ｄ）において決定することが、配列番号２〜５及びこれの相補物からなる群から選択された配列と相補的であるか、或いは適度に厳密な条件又は厳密な条件下でハイブリダイズする、少なくとも9ヌクレオチド長の隣接配列を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズすることと；少なくとも１つのこうしたハイブリダイズした核酸分子を少なくとも１つのヌクレオチド塩基によって伸長させることとを含む請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項７２】
前記（複数の）核酸又は（複数の）ペプチド核酸の配列が、配列番号１１〜配列番号１５及びこれに相補的な配列からなる群から選択される請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
前記オリゴヌクレオチド又はPNAオリゴマーが蛍光標識され、これにおいてその検出が蛍光又は蛍光偏光の増加又は減少のいずれかによるものである請求項６７記載の方法。
【請求項７４】
オリゴヌクレオチド又はPNAオリゴマーのハイブリダイゼーションが、蛍光共鳴エネルギ転位によって検出されることができ、これにおいてこの検出が蛍光の増加又は減少のいずれかによるものである請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
バックグラウンドDNA濃度が、調査するDNAの濃度を100〜1000倍上回る請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項７６】
以下を含む請求項２１による結腸細胞増殖性疾患を検出する方法：
（ａ）被検者から被検者のゲノムDNAを有する生物学的試料を取得する；
（ｂ）ゲノムDNAを抽出する；
（ｃ）配列番号１又は厳密な条件下で配列番号１とハイブリダイズする配列を含むゲノムDNA又はその断片を、１つ以上のメチル化感受性制限酵素に接触させ、これによりゲノムDNAが消化され消化断片が生成される、或いは、これにより消化されない；及び
（ｄ）少なくとも１つのこうした断片の存在又は欠如、或いは特性に基づいて、配列番号１の少なくとも１つのCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態、或いは、配列番号１の複数のCpGジヌクレオチド配列の平均メチル化状態又はこの平均メチル化状態を反映する値を決定し、これにより前立腺細胞増殖性疾患を検出すること、或いは前立腺細胞増殖性疾患の起源の移行域と辺縁域とを識別することの少なくとも一方を、少なくとも部分的には提供する。
【請求項７７】
ステップ（ｄ）において決定することに先立って、消化済み又は未消化のゲノムDNAを増幅することを更に含む請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
増幅することが耐熱性DNAポリメラーゼの増幅酵素としての使用と；検出可能な標識を有する増幅核酸の生成と；これらの組み合わせとからなる群から選択された少なくとも１つの方法の使用を含む請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
検出可能な増幅標識が蛍光標識と；放射性核種又は放射標識と；質量分析計で検出できる増幅物の質量標識と；質量分析計で検出できる分離可能な増幅物断片の質量標識と；質量分析計で検出できる単１の正又は負の実効電荷を有する増幅物及び分離可能な増幅物断片の質量標識と；これらの組み合わせとからなる標識群から選択される請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
増幅物又は分離可能な増幅物断片の質量標識を検出するための質量分析計の使用が含まれる請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
質量分析法がマトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析法（MALDI）と、電子スプレ質量分析法（ESI）と、これらの組み合わせとからなる群から選択される請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
被検者から取得された生物学的試料が、組織学スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、尿、血清、血漿、大便、血液、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項７６記載の方法。
【請求項８３】
以下を含む結腸細胞増殖性疾患を検出、差別化、又は識別するのに有用なキット：
（ａ）亜硫酸水素塩試薬と；
（ｂ）配列番号１〜５及びこれの相補物からなる群から選択された配列と相補的であるか、或いは適度に厳密な条件又は厳密な条件下でハイブリダイズする、少なくとも9ヌクレオチド長の隣接配列をいずれの場合においても含む少なくとも１つの核酸分子又はペプチド核酸分子。
【請求項８４】
MS-SNuPEと、MSPと、MethylLightTMと、HeavyMethylTMと、COBRAと、核酸配列決定と、これらの組み合わせとからなる群から選択されたメチル化アッセイを実行するための標準的な試薬を更に備える、請求項８３記載のキット。
【請求項８５】
結腸細胞増殖性疾患又は結腸細胞増殖性疾患の素因の分類、差別化、及び／又は診断のための、請求項２２による核酸と、請求項２３から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はPNAオリゴマーと、請求項８３又は８４記載のキットと、請求項３２から３３のいずれか一項に記載のアレイと、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの組と、請求項３６から８２記載の方法との使用。
【請求項８６】
結腸細胞増殖性疾患の治療のための、請求項２２記載の核酸と、請求項２３から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はPNAオリゴマーと、請求項８３又は８４記載のキットと、請求項３２又は３３記載のアレイと、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの組と、請求項３６から８２記載の方法との使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
結腸直腸癌は、男女の癌による死亡の４番目の主な原因である。５年生存率は、すべてのステージで61%であり、この病気の治療には、早期発見が効果的である。すべての結腸直腸癌の95%までが、種々に分化した進行度の腺癌である。
【背景技術】
【０００２】
散発性大腸癌は、正常な結腸上皮から腺腫への病理的変化から始まり他段階課程で発達し、浸潤癌へ連続的に進行する。結腸腺腫の進行割合は、現在、それらの組織学的な外観、部位、拡散程度、および腸管併発の程度に基づいて予測される。例えば、管型良性腺腫が悪性腫瘍に進行することはめったにないが、絨毛状良性腺腫は直径が2cm以上であれば、かなり悪性の可能性がある。
【０００３】
良性増殖性病変から悪性新生物までの進行の間、いくつかの遺伝的および後成的変化が起こることが知られている。APC遺伝子の体細胞性突然変異は、結腸直腸腺腫および癌の75〜80%における最も早期の事象の１つのように思われる。K-RASの活性化は、悪性表現型に向かう進行における重要な段階であると考えられる。連続して、他の癌遺伝子の突然変異および腫瘍抑制遺伝子の不活性化に至る変化が蓄積する。
【０００４】
CpGアイランド内の異常なDNAメチル化は、遺伝子類の広域スペクトルの廃棄または過発現に至るヒトの癌における最も早期で最も一般的な変化の１つである。さらに、異常なメチル化は、いくつかの腫瘍に関する遺伝子のイントロンおよびコード部分におけるCpGが多い調節エレメントで起こることが示された。腫瘍抑制遺伝子の特異的過メチル化と比べて、DNAの全般的な低メチル化が、腫瘍細胞で観察され得る。全般的なメチル化のこの低下は、初期、明白な腫瘍形成・発達のずっと前に検出し得る。また、低メチル化と増加する遺伝子発現間の相関関係は、多くの癌遺伝子で報告されている。大腸癌では、異常なDNAメチル化は最も際立った変化の１つを構成し、p14ARF, p16INK4a, THBS1, MINT2, およびMINT31のような多くの癌抑制遺伝子およびhMLH1のようなDNAミスマッチ修復遺伝子を不活性化する。
【０００５】
結腸直腸癌の分子進化では、DNAメチル化のエラーは２つの特徴的な役割を果たすと提案されている。正常な結腸の粘膜細胞では、メチル化のエラーは、時間の関数として、または、これらの細胞を腫瘍性変化に前処理する時間依存的事象として蓄積する。例えば、いくつかの座の過メチル化は、腺腫、特に、細管絨毛状および絨毛状亜型で既に存在することを示すことができた。後の段階では、CpGアイランドの増加するDNAメチル化はいわゆるCpGアイランドメチレーター表現型(CIMP)によって影響される腫瘍の部分集合で重要な役割を果たす。ほとんどのCIMP(+)腫瘍(すべての散発性結直腸癌の約15%を構成する)が、hMLH1プロモーターおよび他のDNAミスマッチ修復遺伝子の過メチル化によるマイクロサテライトの不安定性(MIN)によって特徴付けられる。対照的に、CIMP(-)大腸癌は、より古典的な遺伝子不安定性経路(CIN)に沿ってp53変異と染色体変化が高率で発達する。
【０００６】
しかし、分子亜型は、分子変化に関して頻度を変えることを示しているだけではない。マイクロサテライトの不安定性または染色体異常型のどちらかの存在によれば、大腸癌を２つのクラスに分類することができ、これらは重要な臨床的差異を示す。ほとんどすべてのMIN腫瘍が近位結腸(上行と横行)に発症するが、CIN腫瘍の70%は遠位結腸と直腸に存在する。これは結腸の種々の部分での種々の発癌物質の種々の分布のためであるとされている。近位結腸に行き渡っている発癌物質を構成するメチル化発癌物質はMIN癌の病原性である役目を果たすことが提案された。他方、CIN腫瘍は、結腸と直腸の遠位末端により頻繁に現れる、より頻繁に付加物を形成する発癌物質によって引き起こされると考えられている。そのうえ、MIN腫瘍は、CIN表現型の腫瘍より予後が良く、助剤化学療法によりよく反応する。
【０００７】
大腸癌の分化と早期発見のためのマーカーの識別は現在の研究の主要な目標である。
【０００８】
EYA4は、脊椎動物のEya(目無し)の遺伝子ファミリー、すなわち正常な胚形成の発生を確実にするために保存された調節階層構造において他の蛋白質類と相互作用する４つの転写活性化因子のグループの最も最近同定された遺伝子である。EYA4の遺伝子は、6q22.3にマップされ、640アミノ酸のタンパク質をコードする。EYA4の構造はEYA1-3によって確立された原型に一致し、eya-相同領域(eyaHR; または、eyaドメインまたはeya相同ドメイン1と呼ばれる)と呼ばれる高く保存された271アミノ酸のC末端と、より分岐しているプロリンセリントレオニン(PST)リッチ(34-41%)トランスアクチベーションドメインをN末端に含む(Borsani G, et al., EYA4, a novel vertebrate gene related to Drosophila eyes absent. Hum Mol Genet 1999 Jan;8(1):11-23（非特許文献１）)。EYA蛋白質類は早期胎児発生の間、SIXとDACH蛋白質ファミリーのメンバーと相互作用する。EYA4の遺伝子における突然変異は、DFNA10座で後舌進行性常染色体優性聴力欠損の原因となる(Wayne S, Robertson NG, DeClau F, Chen N, Verhoeven K, Prasad S, Tranebjarg L, Morton CC, Ryan AF, Van Camp G, Smith RJ: Mutations in the transcriptional activator EYA4 cause late-onset deafness at the DFNA10 locus. Hum Mol Genet 2001 Feb 1;10(3):195-200（非特許文献２） その他の文献)。EYA4遺伝子のシトシン位置のメチル化と癌との関係はまだ確立されていない。
【０００９】
5-メチルシトシンは真核生物細胞のDNAで最も頻繁に起きる共有結合性塩基修飾である。例えば、それは転写調節、遺伝子刷込、および腫瘍形成である役割を果たす。したがって、遺伝情報の構成要素としての5-メチルシトシンの同定はかなり興味深い。しかし、5-メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対形成をするので、配列決定によって5-メチルシトシンの位置を決定することはできない。そのうえ、5-メチルシトシンによって運ばれる後成的情報はPCR増幅の間に完全に失われる。
【００１０】
DNAの5-メチルシトシンを分析するための比較的新しくて現在最も頻繁に使用される方法は、シトシンと亜硫酸水素塩との特異的反応に基づき、シトシンは、その後のアルカリ性の加水分解で、塩基対形成がチミジンに対応するウラシルに変換される。しかし、5-メチルシトシンは、これらの条件下では修飾されずに残る。その結果、元のDNAは、元来ハイブリダイゼーション形成によってはシトシンと区別できないメチルシトシンを、例えば、増幅およびハイブリダイゼーション形成または配列決定によって、「通常の」分子生物学的手法を用いて、残存するシトシンだけを検出できるような方法で変換される。これらの手法のすべては、現在完全に利用することができる塩基対形成に基づく。感度に関しては、従来技術はアガロースマトリックスで分析されるべきDNAを封入し、その結果、DNA(亜硫酸水素塩は一本鎖DNAと反応するだけである)の拡散と復元を防いで、すべての析出と精製段階を速い透析に置き換える方法によって定義される(Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6（非特許文献３）)。この方法を用いれば、個々の細胞を分析することができ、このことは、この方法の可能性を示す。しかしながら、現在、最大、約3,000塩基対の長さの個々の領域だけが分析されているに過ぎず、何千回もの可能なメチル化事象に関する細胞の網羅的解析は可能ではない。しかし、この方法では少ない試料由来の極めて小さい断片を確実に分析することはできない。これらは、拡散を保護しても、マトリックスを通して失われる。
【００１１】
5-メチルシトシンを検出する他の既知の方法の概観は次の総説から得られるであろう: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255（非特許文献４）。
【００１２】
これまで、わずかな例外(e.g., Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8（非特許文献５）) を除いて、亜硫酸水素塩手法が研究で使用されるに過ぎない。しかし既知遺伝子の短い特定の断片は、いつも亜硫酸水素塩処理の後で増幅され完全に配列決定され(Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6（非特許文献６）)、あるいは、個々のシトシン位置がプライマー伸長法反応 (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31（非特許文献７）, WO 95/00669（特許文献１）) によって、または酵素的消化(Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4（非特許文献８）)により検出される。さらに、また、ハイブリダイゼーションによる検出も説明されている(Olek他、WO 99/28498（特許文献２）)。
【００１３】
個々の遺伝子におけるメチル化検出のための亜硫酸水素塩手法の使用を扱うその他の出版物は以下の通りである：Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431（非特許文献９）; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95（非特許文献１０）; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6（非特許文献１１）; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4（非特許文献１２）; WO 97/46705（特許文献３） and WO 95/15373（特許文献４）。
【００１４】
オリゴマーアレイ製造における従来技術の概観は、1999年1月に発行されたNature Genetics (Nature Genetics補足、21巻、1999年1月)の特集号（非特許文献１３）とその引用文献から集めることができる。
【００１５】
固定化DNAアレイのスキャンには、蛍光ラベルプローブがしばしば使用される。特異的プローブの5'-OHへのCy3とCy5染料の単純な付着は蛍光ラベルに特に適している。ハイブリダイズしたプローブの蛍光の検出は例えば、共焦点顕微鏡を用いて行ってよい。多くの他のもの以外に、Cy3とCy5染料が利用可能である。
【００１６】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI-TOF)は生体分子の分析に極めて効率的である。(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301（非特許文献１４）)。検体は光吸収マトリックスに包埋される。マトリックスは短いレーザパルスによって蒸発させられ、断片化しないように、検体分子が気相に輸送される。検体はマトリックス分子との衝突でイオン化される。印加電圧はイオン類を無場飛行チューブの中に加速する。それらの異なる質量のため、イオン類は異なる速度で加速される。より小さいイオンは、より大きいイオンより早く検出器に達する。
【００１７】
MALDI-TOF質量分析はペプチドとタンパク質の分析に非常に適している。核酸の分析はいくらか困難である(Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57（非特許文献１５）)。核酸への感度はペプチド類より約100倍悪く、断片サイズが増加するのに比例して低下する。多重に負に荷電した骨格を有する核酸に関しては、マトリックスによるイオン化過程はあまり効率的ではない。MALDI-TOF質量分析では、マトリックスの選択が極めて重要な役割を果たす。ペプチド類の脱着に関しては、非常によい結晶化を起こすいくつかの非常に効率的なマトリックスが見出された。現在、DNAのための高感度なマトリックスがいくつかあるが、感度は低下していない。感度の差は、ペプチドと同様になるように化学的にDNAを修飾することによって減少させることができる。簡単なアルキル化化学を使用することで、骨格の普通のりん酸エステル類がチオりん酸エステルで置換されるチオりん酸塩核酸を中性電荷のDNAに変換することができる(Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73（非特許文献１６）)。この修飾化DNAへの電荷タグの結合は、ペプチド類に関して見出されるのと同じレベルへ感度増加をもたらす。電荷標識付けのさらなる利点は、修飾されていない基質の検出をさらに困難にする不純物に対する分析の安定性を増加させることである。
【００１８】
遺伝子DNAは、細胞、組織または他の測定用試料のDNAから標準的な方法を用いて得られる。この標準的な方法は、Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989（非特許文献１７）のような文献で見出すことができる。
【００１９】
【特許文献１】WO 95/00669
【特許文献２】WO 99/28498
【特許文献３】WO 97/46705
【特許文献４】WO 95/15373
【非特許文献１】Borsani G, et al., EYA4, a novel vertebrate gene related to Drosophila eyes absent. Hum Mol Genet 1999 Jan;8(1):11-23
【非特許文献２】Wayne S, Robertson NG, DeClau F, Chen N, Verhoeven K, Prasad S, Tranebjarg L, Morton CC, Ryan AF, Van Camp G, Smith RJ: Mutations in the transcriptional activator EYA4 cause late-onset deafness at the DFNA10 locus. Hum Mol Genet 2001 Feb 1;10(3):195-200
【非特許文献３】Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6)
【非特許文献４】Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255
【非特許文献５】Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8
【非特許文献６】Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6)
【非特許文献７】Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31,
【非特許文献８】Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4
【非特許文献９】Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431
【非特許文献１０】Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95
【非特許文献１１】Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6
【非特許文献１２】Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4
【非特許文献１３】1999年1月に発行されたNature Genetics (Nature Genetics補足、21巻、1999年1月)の特集号
【非特許文献１４】Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301
【非特許文献１５】Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry.Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57
【非特許文献１６】Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73
【非特許文献１７】Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989
【発明の開示】
【００２０】
（説明）
本発明は、細胞増殖性疾患の検出のための新規な方法を開示している。本発明は、結腸細胞増殖性疾患のマーカーとしての遺伝子EYA4およびそのプロモーターおよび調節エレメントを開示している。さらに詳しくは、開示されている事項は、種々のクラスの結腸細胞増殖性疾患を見分け、結腸細胞増殖性疾患を他の組織から発生する細胞増殖性疾患と区別し、当該遺伝子が結腸細胞増殖性疾患の検出に適用可能であることを示している。
【００２１】
発明の１つの局面では開示された事柄は前述の遺伝子の中でメチル化の分析に有用な新しい核酸配列を提供し、他の局面では遺伝子と遺伝子産物の新しい用途、結腸細胞増殖性疾患を検出、差別化、識別するための方法、分析評価、およびキット、その治療法、診断方法を提供する。
【００２２】
１つの実施態様では、この方法は結腸細胞増殖性疾患の分化、検出、および区別のためのマーカーとしての遺伝子EYA4の使用を開示している。遺伝子の前述の使用は遺伝子の発現の分析によって、mRNA発現分析か蛋白質発現分析によって可能になるであろう。しかしながら、発明の最も好ましい実施態様では、結腸細胞増殖性疾患の検出、差別化、および区別は遺伝子EYA4およびそのプロモーターまたは調節エレメントのメチル化状態の分析によって可能となる。
【００２３】
大腸癌検出システムでEYA4をコードするmRNAの存在を検出するために、試料を患者から入手する。試料は、組織生検試料か血液、血漿、血清または同様の試料でよい。試料は、それに含まれる核酸を抽出するために処理してよい。試料由来の核酸はゲル電気泳動か他の分離技術にかけられる。検出には、プローブとなるDNA配列と試料の核酸、特にmRNAとを接触させハイブリッド二本鎖を形成することが含まれる。ハイブリダイゼーションの厳密さは、ハイブリダイゼーションと洗浄手順の間の、温度、イオン強度、時間とホルムアミドの濃度などの多くの因子によって決定される。これらの因子は、例えば、Sambrook他に概説されている(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., 1989)。得られる二本鎖の検出は通常、標識プローブを用いて行う。あるいは、プローブはラベルされていないかもしれないが、しかし、直接または間接的にラベルされるリガンドとの特異的な結合によって検出可能であろう。標識化プローブとリガンドのための適当なラベルと方法は、当分野で知られている既知の方法(例えば、ニックトランスレーションかキナーゼ処理)が含まれてもよい、例えば、放射性のラベル、ビオチン、蛍光基、化学発光基(例えば、ジオキセタン類、特に誘起されたジオキセタン類)、酵素、抗体、および同様のものを含んでいる。
【００２４】
EYA4をコードするmRNAの試料中での検出感度を増加させるためには、EYA4をコードするmRNAから転写されるcDNAを増幅するのに逆転写/重合連鎖反応のテクニックを使用することができる。逆転写/ポリメラーゼ連鎖反応の方法は当分野でよく知られている(例えば、上記Watson and Flemingを参照)。
【００２５】
逆転写/PCR法は、以下のように実施することができる。細胞内総RNAは、例えば、標準のグアニジウムイソチオシアネート法によって単離され、そして、全RNAは逆転写される。逆転写法には、逆転写酵素と3'末端プライマーを使用し、RNAのテンプレート上でのDNA合成が含まれる。通常、プライマーはオリゴ(dT)配列を含む。このようにして作り出されるcDNAは、PCR法とEYA4特異的プライマーを用いて増幅される(Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press,N.Y., Vol.152, pp. 316-325, 1987、引用文献に含まれる)。
【００２６】
本発明は、生物試料を検査することにより、大腸癌疾病状態を検出する際に使用するためのキットとして、いくつかの実施形態で記述されうる。代表的なキットは、上述の選択的にEYA4 mRNAにハイブリダイズする１つ以上の核酸セグメントと１つ以上の核酸セグメントのそれぞれのための容器を含んでよい。ある実施形態では、核酸セグメントは単一のチューブの中に結合されてよい。また、さらなる実施形態では、核酸セグメントは目標mRNAを増幅するための１組のプライマーを含んでよい。また、そのようなキットはハイブリダイゼーション、増幅または検出反応のためのどんな緩衝剤、溶液、溶媒、酵素、ヌクレオチド、または他の成分も含んでよい。好ましいキット成分は、逆転写PCR、in situハイブリダイゼーション、ノーザン分析、および/又はRPAのための試薬を含んでよい。
【００２７】
本発明はさらに、患者から入手される試料中のポリペプチド、EYA4の存在を検出する方法を提供する。蛋白質を検出するために当分野で知られているどんな方法も使用することができる。そのような方法には、免疫拡散法、免疫電気泳動、免疫化学的方法、バインダーリガンド分析評価、免疫組織化学法、凝集、および補体分析評価が含まれるが、これらには限定されない(例えば、Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991を参照、引用文献に含まれる)。好ましいのは、EYA4のエピトープ（類）と抗体類を反応させて、標識EYA4タンパク質かその派生物と拮抗的に置き換わるものを含むバインダーリガンド免疫アッセイ法である。
【００２８】
本発明の実施形態には、EYA4の遺伝子によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体類の使用が含まれる。そのような抗体類は、患者の大腸疾病マーカー発現レベルを正常な個人における同じマーカーの発現と比べることによって疾病状態を検出する際に診断と予後適用に役立ちうる。ある実施形態では、抗原としてEYA4ポリペプチドを用いてモノクローナルまたはポリクローナル抗体の生産を引き起こすことができる。そのような抗体類は、今度は、ヒトの病気の状態のためのマーカーとして発現蛋白質を検出するのに使用されうる。患者の末梢血か前立腺組織試料中に存在するそのような蛋白質類のレベルは、従来の方法によって定量してよい。抗体蛋白質結合は、当分野で知られている蛍光の、または、放射性のリガンドでの標識化などのさまざまな手段によって、検出され、定量されてよい。発明はさらに上記の手順を実行するためのキットを含み、そのようなキットには、EYA4ポリペプチドに特異的な抗体類が含まれる。
【００２９】
多数の拮抗的、非拮抗的タンパク結合イムノアッセイが、当分野でよく知られている。そのような分析評価で使われる抗体類は、例えば凝集試験で使用されるようにラベルされなくてもよいし、さまざまな分析法での使用のためにラベルされてもよい。使用可能なラベルには、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学蛍光剤、酵素基質、コファクタ、酵素阻害剤、粒子、染料、放射標識免疫検定法(RIA)、エンザイムイムノアッセイ、例えば、酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)、蛍光免疫法における使用のための同様のものが含まれる。EYA4またはそのエピトープに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、当分野で知られている多くの方法のどれかによって、イムノアッセイで使用するために作ることができる。ある蛋白質に対する抗体を調製するための１つの方法は、その蛋白質のアミノ酸配列の全てまたは一部を選択して調製し、適当な動物、通常、ウサギまたはマウスにそれを注射することである(Milstein and Kohler Nature 256:495-497, 1975; Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981、引用文献に含まれている)。EYA4またはそのエピトープの調製のための方法には、化学合成、組換えDNA技術、生物試料からの単離が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
体液試料から大腸癌を検出するのに使用されるマーカーが現在ないので、本発明はかなりの改善を到達技術水準の上に提供する。結腸細胞増殖性疾患を検出し診断するのに使用される現在の方法には、大腸鏡検査、S字鏡検査、および便潜血大腸癌検査がある。これらの方法と比べて、開示された発明は、大腸鏡検査よりはるかに低侵略的で、S字鏡検査およびFOBTと少なくとも同程度に高感度である。文献における、これらのマーカーのこれまでの記述と比べて、本発明は高感度分析技術を使用する有利な組み合わせのため感度と特異性に関して重要な利点を提供する。
【００３１】
配列番号１とそれに相補的な配列によるゲノム配列内のCpGジヌクレオチドのメチル化状態の分析で本発明の目的を達成することができる。配列番号１は、遺伝子EYA4及びそのプロモーターおよび調節エレメントを開示し、前述の断片には疾病特異的メチル化パターンを示すCpGジヌクレオチドが含まれる。遺伝子EYA4、そのプロモーター、および調節エレメントのメチル化パターンはこれまで、細胞増殖性疾患に関しては分析されていない。遺伝暗号の縮重のため、配列番号１で特定される配列は、EYA4によってコードされるものの生物活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域の上流のすべての実質的に同様の、および同等な配列を含むと解釈すべきである。
【００３２】
方法の好ましい実施形態では、発明の目的は配列番号２〜５の１つによる少なくとも18塩基の長さの配列を含む核酸とそれに相補的な配列の分析で達成される。
【００３３】
配列番号２〜５は、配列番号１の核酸の改変体を提供し、ここで前述の配列の変換は独特であり以下の配列番号１とは異なった配列を持つ核酸の合成をもたらす（下の表１も参照）：配列番号１、EYA4遺伝子のセンスDNA鎖、そのプロモーター、および調節エレメント;配列番号２、変換された配列番号１、ここで「C」または「T」、しかし「cp.」は「cp.」のまま（すなわち、配列番号１に関してcpジヌクレオチド配列のすべての「C」残基がメチル化され、従って変換されない場合に対応する）; 配列番号３、配列番号１の相補鎖、ここでは「C」から「T」しかし「cp.」は「cp.」のまま（すなわち、配列番号１の相補鎖(アンチセンス鎖)に関してcpジヌクレオチド配列のすべての「C」残基がメチル化され、従って変換されない場合に対応する）；配列番号４、変換された配列番号１、ここで「cp.」ジヌクレオチド配列の残基を含むすべての「C」残基で「C」から「T」（すなわち、配列番号１に関して、cpジヌクレオチド配列のすべての「C」残基がメチル化されていない場合に対応する）；配列番号５、配列番号１の相補鎖、ここで、CpGジヌクレオチド配列の残基を含むすべての「C」残基について「C」から「T」（すなわち、配列番号１の相補鎖(アンチセンス鎖)についてCpGジヌクレオチド配列のすべての「C」残基がメチル化されていない場合に対応する）。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
配列番号１〜５の核酸配列および分子は、これまでほとんど、結腸細胞増殖性疾患の確認法とは関係も関連もなかった。
【００３６】
本発明は、さらに配列番号２〜５による前処理DNA中のシトシンのメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを開示する。前述のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは適度に厳しいか又は厳しい条件(本明細書において上で定義したように)のもとで配列番号２〜５および／または、それに相補的な配列により、前処理した核酸配列へハイブリダイズする少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する核酸配列を含む。
【００３７】
したがって、本発明は適度に厳しい、および/または、厳しいハイブリダイゼーション条件下で配列番号２〜５の配列の全てまたは部分、または、それの相補体とハイブリダイズする核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸(PNA)分子（PNA-オリゴマー））を含む。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分の長さは、通常少なくとも9、15、20、25、30または35ヌクレオチドである。しかしながら、より長い分子は、発明上の有用性を有し、本発明の範囲の中にある。
【００３８】
本発明のハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、配列番号２〜５の配列、またはその一部、またはその相補体と少なくとも95%、または少なくとも98%、または100%同じであるのが好ましい。
【００３９】
本明細書に記載のタイプのハイブリダイゼーション用核酸は、例えば、プライマー(例えば、PCRプライマー)か診断的および/または予後徴候的プローブ又はプライマーとして使用することができる。核酸試料へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを厳しい条件下で実行し、プローブは標的配列と100%同じであるのが好ましい。核酸の二本鎖、または、ハイブリッドの安定性は融点かTmとして表され、それは、プローブが目標のDNAから解離する温度である。この融点は、必要な厳しさの条件を定義するのに使用される。
【００４０】
同じであるというよりもむしろ配列番号１(EYA41対立遺伝子変異型やSNPsなどの)の対応する配列と関連していて実質的に同じである標的配列において、相同のハイブリダイゼーションだけが特定の塩濃度(例えば、SSCかSSPE)で起こる最低温度を最初に確立することが有用である。次に、Tmが1℃下がるのはミスマッチ1%の結果であると仮定して、ハイブリダイゼーション反応における、最終的な洗浄温度をそれに伴って下げる(例えば、プローブと95%を越える同一性を持っている配列を探すなら、最終的な洗浄温度を5℃下げる)。実際には、1%のミスマッチ当たりのTmの変化は0.5℃と1.5℃の間である。
【００４１】
例えば配列番号１のポリヌクレオチド位置で示すように、長さX(ヌクレオチドで)の発明のオリゴヌクレオチドに関する例は長さXの連続して重なっているオリゴヌクレオチドの組に対応するものを含んでおり、それぞれ連続して重なる組(与えられたX値に対応する)の中のオリゴヌクレオチドはヌクレオチド位置からZオリゴヌクレオチドの有限集合であると定義される：
nから(n + (X-1));
ここでn=1, 2, 3,…(Y-(X-1));
ここでYは配列番号１の長さ(ヌクレオチド又は塩基対)に等しい;
ここでXはその組(例えば、連続して重なる20量体の１組ではX=20)における、それぞれのオリゴヌクレオチドの共通の長さ(ヌクレオチドにおける)に等しい;
そして、ここで長さYの与えられた配列番号に関する長さXの連続して重なるオリゴマーの数(Z)はY-(X-1)に等しい。例えば、配列番号１のセンス又はアンチセンスの組のどちらかに関してはZ=2,785-19=2,766。ここでX=20。
【００４２】
その組を少なくとも１つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドから成るそれらのオリゴマーに制限するのが好ましい。
【００４３】
本発明は、配列番号２〜５(センス及びアンチセンス)のそれぞれに関して多重の連続して重なる組のオリゴヌクレオチド又は長さXの修飾オリゴヌクレオチドを含み、ここで例えばX= 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30又は 35 ヌクレオチド。
【００４４】
本発明によるオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、配列番号１に対応するゲノム配列の遺伝的及び後生的なパラメータを確かめるために有効な手段を構成する。そのようなオリゴヌクレオチド又は長さXの修飾オリゴヌクレオチドの好ましい組は、配列番号１〜５(およびそれらの相補体)に対応するオリゴマーの組を連続して重ね合わせるものである。前述のオリゴマーは少なくとも１つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むのが好ましい。これらの好ましい組に含まれているのは、配列番号１１〜１５に対応する好ましいオリゴマーである。
【００４５】
本発明による特に好ましいオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、CpGジヌクレオチド(または対応する変換されたTpG又はCpAジヌクレオチドの)配列のシトシンがオリゴヌクレオチドの中の1/3の中にあるものである; すなわち、例えばオリゴヌクレオチドが、長さが13塩基で、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドが5'末端から5〜9番目のヌクレオチド内にあるものである。
【００４６】
オリゴヌクレオチドの活性、安定性または検出を高めるために、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを１つ以上の部分又は結合体に化学的にリンクさせることによって修飾することができる。そのような部分又は結合体は、例えば、米国特許第5,514,758, 5,565,552, 5,567,810, 5,574,142, 5,585,481, 5,587,371, 5,597,696及び5,958,773号に開示されているコレステロール、胆汁酸、チオエーテル、脂肪鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール(PEG)、パルミチル部分などの発色団、蛍光体、脂質を含む。また、プローブは特に好ましい対合特性を有するPNA(ペプチド核酸)の形で存在してもよい。従って、オリゴヌクレオチドは、ペプチド類などの他の追加された基を含んでもよく、ハイブリダイゼーションで引き起こされる分裂剤(Krol et al., BioTechniques 6:958-976, 1988)やインターカレート剤を含んでもよい(Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988)。この末端まで、オリゴヌクレオチドは別の分子、例えば、発色団、蛍光体、ペプチド、ハイブリダイゼーションで引き起こされる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションで引き起こされる分裂剤などに抱合されてよい。
【００４７】
オリゴヌクレオチドは、また、少なくとも１つの当分野で既知の修飾糖および/又は塩基を含んでもよく、または修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含んでもよい。
【００４８】
本発明によるオリゴマーは、配列番号１及び配列番号１又は配列番号２〜５による前処理核酸及びそれらに相補的な配列内の対応するCG、TG又はCAジヌクレオチドに相補的な配列を含むゲノム配列のCpGジヌクレオチドの各々の分析のための少なくとも１つのオリゴマーを含む、いわゆる「組」で通常使用される。当該遺伝子、配列番号２〜５及び配列番号１の前処理版及びゲノム版の両方における遺伝子EYA4、そのプロモーター、および調節エレメント内のCpGジヌクレオチドの各々に対する少なくとも１つのオリゴマーを含む組が好ましい。しかしながら、経済的、又は、他のファクターのために、前述の配列内のCpGジヌクレオチドの限られた選択を分析するのが好ましいかもしれないと予想されており、オリゴヌクレオチドの組の内容はそれなりに変更されるべきである。従って、本発明はさらに、前処理されたゲノムDNA(配列番号２〜５及びそれに相補的な配列)及びゲノムDNA(配列番号１及びそれに相補的な配列)中のシトシンメチル化状態を検出するのに使用する少なくとも3nの組(オリゴヌクレオチド及び/又はPNA-オリゴマー)に関する。これらのプローブは、細胞増殖性疾患の遺伝的及び後生的なパラメータの診断及び/又は治療を可能にする。また、オリゴマーの組は、前処理されたゲノムDNA(配列番号２〜５、およびそれらに相補的な配列)及びゲノムDNA(配列番号１、およびそれに相補的な配列)中の一塩基変異多型(SNPs)を検出するのに使用されるかもしれない。
【００４９】
さらに、本発明は配列番号１〜５及びそれに相補的な配列又は、その断片のうちの１つのDNA配列を増幅するための、いわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用することができる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの組を利用できるようにする。
【００５０】
本発明によるオリゴヌクレオチドの組の場合では、オリゴヌクレオチドの組の少なくとも１つ、より好ましくは全部を固相に結合するのが好ましい。
【００５１】
本発明によれば、異なるオリゴヌクレオチド及び/又は、本発明によって利用可能にされるPNA-オリゴマー(いわゆる「アレイ」)のアレンジメントが、同様に固相に結合されるように存在するのが好ましい。異なるオリゴヌクレオチド-及び/又はPNA-オリゴマー配列のこのアレイは、それが固相に長方形の又は六角形の格子の形で配置されるという点で特徴付けることができる。固相の表面は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鉄鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、または金で構成するのが好ましい。しかし、ニトロセルロース、ペレットの形で存在できるナイロンなどのプラスチック又は樹脂マトリックスを使用してもよい。
【００５２】
従って、本発明のさらなる内容は細胞増殖性疾患に関する分析のための担体材料に固定されるアレイを製造するための方法であり、その方法では本発明による少なくとも１つのオリゴマーを固相と結合させる。そのようなアレイを製造するための方法には、例えば、固体相化学と光官能性保護基による米国特許第5,744,305号が知られている。
【００５３】
本発明のさらなる内容は、細胞増殖性疾患の分析のためのDNAチップに関する。DNAチップでは、例えば米国特許第5,837,832号が知られている。
【００５４】
本発明はさらに、検出、分別及び結腸細胞増殖性疾患を識別するために役に立つ物質組成物を提供する。当該組成物は、配列番号２〜５で開示された核酸配列の断片の長さが18塩基対の少なくとも１つの核酸から成り、以下の群から選ぶ１つ以上の物質から成る：
1〜5 mM の塩化マグネシウム、100〜500μMのdNTP、0.5〜5単位のtaqポリメラーゼ、ウシ血清アルブミン、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸(PNA)オリゴマー、ここで当該オリゴマーは、各場合で、配列番号２〜５の１つにより前処理されたゲノムDNA及びそれに相補的な配列に相補的であるか又は、適度に厳しい又は厳しい条件下でハイブリダイズする少なくとも9ヌクレオチドの長さを持つ少なくとも１つの塩基配列を含む。前述の組成物は水溶液中での前述の核酸の安定化に適切で前述の溶液中でのポリメラーゼベースの反応を可能にする緩衝液を含むのが好ましい。適当な緩衝剤は、当分野で知られており購入可能である。
【００５５】
本発明はさらに、遺伝子EYA4、そのプロモーター、および調節エレメントの遺伝的及び/又は後生的パラメータを確かめるために分析評価を行うための方法を提供する。以下の方法に従った分析評価を遺伝子EYA4中のメチル化を検出するのに使用するのが最も好ましく、ここで当該メチル化された核酸は過剰のバックグラウンドDNAを含む溶液中に存在し、当該バックグラウンドDNAは検出するDNA濃度の100〜1000倍存在する。前記方法は、少なくとも１つの試薬又は試薬群を用い前記被検者より得られた核酸試料への接触を含み、ここで当該試薬又は、試薬群は目標核酸中のメチル化されたCpGジヌクレオチドと及び非メチル化されたCpGジヌクレオチドを識別する。
【００５６】
当該方法は以下の段階から成るのが好ましい：第１段階では、分析する組織試料を入手する。起源は適当な起源でよいが、組織学スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、血漿、血清、大便、尿、血液、及びそれらの組み合わせから成る群から試料源を選ぶのが好ましい。起源は、生検、体液、尿、又は血液であるのが好ましい。
【００５７】
次に、DNAを試料から単離する。抽出は、洗剤の使用、音波処理、ガラスビーズとの撹拌など、当業者には標準的な手段で行ってよい。一度核酸を抽出したら、ゲノム二本鎖DNAを分析に使用する。
【００５８】
この方法の第２段階では、ゲノムDNA試料は、5'位置でメチル化されていないシトシン塩基がウラシル、チミン、又はハイブリダイゼーション特性がシトシンと異なる別の塩基に変換されるように処理される。これは、本明細書では、「前処理」と理解されよう。
【００５９】
ゲノムDNAの上記の処理は、亜硫酸水素塩(亜硫酸水素、ニ亜硫酸塩(disulfite))及びその後、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシル又は塩基対形成特性がシトシンと異なる別の塩基への変換が起こるアルカリ加水分解により実行されるのが好ましい。分析するDNAをアガロースマトリックスに封入し、それによって、DNA(亜硫酸水素塩は一本鎖DNAとだけ反応する)の拡散と復元を防ぎ、すべての析出及び精製段階を速い透析で置き換える(Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996)。亜硫酸水素塩処理は、ラジカル補足剤又はDNA変性剤存在下で行うのがさらに好ましい。
【００６０】
この方法の第３段階では、前処理されたDNA断片を増幅する。DNA源が血清由来のフリーなDNA、又はパラフィンから抽出されたDNAであれば、増幅断片の大きさは長さが100〜200塩基対であることが特に好ましく、当該DNA源が細胞起源(例えば、組織、生検、細胞系)から抽出される場合には、増幅断片の大きさは長さが100〜350塩基対であることが好ましい。当該増幅断片は少なくとも少なくとも３つのCpGジヌクレオチドを含む少なくとも１つの20塩基対の配列を含むのが特に好ましい。当該増幅は、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチドの組、及び好ましくは熱安定性ポリメラーゼを用いて行う。同時に全く同じ反応容器でいくつかのDNA断片の増幅を行うことができ、この方法の１つの実施形態では、６以上の断片を同時に増幅するのが好ましい。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて行う。プライマーオリゴヌクレオチドの組は、配列が配列番号２〜５の塩基配列及びそれに相補的な配列の少なくとも18塩基対長さの断片と逆相補、同一、又は厳しい又は非常に厳しい条件下でハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００６１】
この方法の別の実施形態では、配列番号２〜５を含む核酸配列中の予め選択したCpG位置のメチル化状態はメチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドを用いて検出してよい。この手法(MSP)は、Hermanへの米国特許第6,265,171号に記載されている。亜硫酸水素塩処理DNAの増幅のためのメチル化状態特異的プライマーを用いることにより、メチル化核酸と非メチル化核酸間の識別が可能になる。MSPプライマー対は、亜硫酸水素塩処理CpGジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含む。従って、当該プライマーの配列は、少なくとも１つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。非メチル化DNAに特異的なMSPプライマーは、CpG内のC位の3'位にTを含む。従って 、好ましくは、当該プライマーの塩基配列は、配列番号２〜５による前処理核酸配列とハイブリダイズする長さが少なくとも18ヌクレオチドの配列及びそれに相補的な配列を含む必要がある。ここで、当該オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。本発明によるこの方法の実施形態では、MSPプライマーが2〜4のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むことが特に好ましい。当該ジヌクレオチドがプライマーの3'側の半分の中にあるのがさらに好ましい。例えば、ここでプライマーは長さが18塩基であり、特定のジヌクレオチドが分子の3'端からの最初の9塩基の中にある。CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドに加えて、当該プライマーは、さらに数個の亜硫酸水素塩変換塩基を含むこと(すなわち、シトシンがチミンに変えられ、またはハイブリダイズする鎖上で、グアニンはアデノシンに変えられる)がさらに好ましい。さらに好ましい実施形態では、当該プライマーは、シトシン又はグアニン塩基が2を越えないように設計する。
【００６２】
この方法の１つの実施形態では、プライマーは、配列番号６〜１０からなる群から選んでよい。
【００６３】
増幅によって得られる断片は、直接又は間接的に検出可能なラベルを保有できる。好ましいのは、蛍光ラベル、放射性核種、または質量分析計で検出可能な典型的な質量を有する脱着可能な分子断片の形でのラベルである。当該ラベルが質量ラベルである場合には、ラベルされた増幅物は単一の正又は負の実効電荷を有し、質量分析計で、より良く検出できることが好ましい。検出は、例えばマトリックス支援レーザ脱離/イオン化質量分析法(MALDI)によって、又は電子スプレー質量分析法(ESI)を用いることにより実行され可視化されてよい。
【００６４】
マトリックス支援レーザ脱離/イオン化質量分析法(MALDI-TOF)は、生体分子の分析のための極めて効率的な開発産物である(Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988)。検体は光吸収マトリックスに埋め込まれる。マトリックスは短いレーザパルスによって蒸発させられ、その結果、断片化しないように検体分子を気相に輸送する。検体はマトリックス分子との衝突でイオン化される。印加電圧は、イオン類を無場飛行管の中に加速する。それらの異なる質量のため、イオン類は異なる速度で加速される。小さいイオン類は、大きいオン類より早く検出器に到達する。MALDI-TOFスペクトロメトリーは、ペプチドとタンパク質の分析に適している。核酸の分析はいくらか難しい(Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995)。核酸分析に関する感度は、ペプチド類より約100倍低く、断片サイズが増加するのに反比例して低下する。さらに、負に多荷電した骨格を有する核酸に関しては、マトリックスによるイオン化過程はあまり効率的ではない。MALDI-TOFスペクトロメトリーでは、マトリックスの選択が極めて重要な役割を演じる。ペプチド類の脱着に関しては、非常によい結晶化を起こす、いくつかの非常に効果的なマトリックスが発見された。現在、DNAのためのいくつかの敏感なマトリックスがあるが、ペプチドと核酸の間の感度の差は縮まっていない。しかし、感度のこの差は、ペプチドにより似るようにDNAを化学修飾することで縮めることができる。例えば、骨格の通常のりん酸エステル類をチオりん酸エステルで置換したチオりん酸塩核酸は、簡単なアルキル化化学を使用して電荷が中性のDNAに変換できる(Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995)。この修飾DNAへの電荷タグの結合は、MALDI-TOF感度をペプチド類に関して見つけられた感度と同じレベルまで高める。電荷タグ付けのさらなる利点は、未修飾の基質の検出を相当困難にする不純物に対する分析の安定性を高めることである。
【００６５】
この方法の特に好ましい実施形態では、ブロッカーオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの種の存在下で段階３の増幅を実行する。そのようなブロッカーオリゴヌクレオチドの使用は、Yu et al., BioTechniques 23:714-720, 1997に説明されている。ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用すれば、核酸の亜集団の増幅の特異性を改良できる。核酸にハイブリダイズするブロッキングプローブは、当該核酸のポリメラーゼ介在増幅を抑制又は阻止する。この方法の１つの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、バックグラウンドDNAにハイブリダイズするように設計される。この方法のさらなる実施形態では、当該オリゴヌクレオチドはメチル化された核酸と対照的に非メチル化核酸の増幅を阻止するか又は抑制するように、又は逆に設計される。
【００６６】
ブロッキングプローブオリゴヌクレオチドは、PCRプライマーと同時に亜硫酸水素塩処理核酸にハイブリダイズされる。核酸のPCR増幅は、ブロッキングプローブに相補的な配列が存在するところで核酸の増幅が抑圧されるようにブロッキングプローブの5'位置で終了される。プローブは、メチル化状態に特定であるように、亜硫酸水素塩処理核酸とハイブリダイズするように設計されてよい。例えば、非メチル化核酸の集団の中でのメチル化核酸の検出においては、問題の位置で非メチル化されている核酸の増幅の抑制は'CpG'と対照的に問題の位置で'TpG'を含むブロッキングプローブの使用によって実行されるであろう。この方法の１つの実施形態では、当該ブロッキングオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２〜５から成り、好ましくは１以上のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドからなる群から選択した、長さが少なくとも18塩基対の配列に相補的である又はそれと同一であるべきである。この方法の１つの実施形態では、当該オリゴヌクレオチドの配列を、配列番号１５及び１６並びにそれに相補的な配列から成る群から選ぶ。
【００６７】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するPCR法に関して、ポリメラーゼ介在増幅の効率的な中断には、ブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長されないことが必要である。3'-デオキシオリゴヌクレオチド又は3'位がフリーの水酸基以外で置換されたオリゴヌクレオチドであるブロッカーを用いてこれを達成するのが好ましい。例えば、3'-O-アセチルオリゴヌクレオチド類は、好ましい種類のブロッカー分子を代表している。
【００６８】
さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ介在分解は、排除されなければならない。そのような排除は5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用すること又は例えばブロッカー分子ヌクレアーゼ抵抗性を付与する5'-末端でのチオエート架橋を有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用することを含むのが好ましい。特殊適用では、ブロッカーのそのような5'修飾を必要としないかも知れない。例えば、もしブロッカーとプライマー結合部位が重なるなら、それによってプライマーの結合を排除し(例えば、過剰のブロッカーと)、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解は実質的に排除されるであろう。これはポリメラーゼがブロッカーに向かって、及びブロッカーを通って(5'-3'方向に)プライマーを伸ばさないからである−通常ハイブリダイズしたブロッカーオリゴヌクレオチドの分解をもたらす過程。
【００６９】
本発明の目的のために、そして本明細書で実行する際に特に好ましいブロッカー/PCRの実施形態は、オリゴヌクレオチドをブロックするためのペプチド核酸(PNA)オリゴマーの使用を含む。そのようなPNAブロッカーオリゴマーはポリメラーゼによって分解されず、また伸長もされないので理想的である。
【００７０】
この方法の実施形態ではブロッキングオリゴヌクレオチドの結合部位は、プライマーのそれと同じであるか、重なり、その結果、結合部位へのプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる。この方法のさらなる好ましい実施形態では、2つ以上のそのようなブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する。特に好ましい実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの１つのハイブリダイゼーションは順方向のプライマーのハイブリダイゼーションを妨げ、プローブ(ブロッカー)オリゴヌクレオチドの別のもののハイブリダイゼーションは当該順方向のプライマーの増幅産物に結合する逆方向プライマーのハイブリダイゼーションを妨げる。
【００７１】
この方法の別の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは処理されたバックグラウンドDNAの逆及び順方向プライマー位置の間の場所にハイブリダイズし、その結果、プライマーオリゴヌクレオチドの伸張を妨げる。
【００７２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドがプライマーの濃度の少なくとも５倍存在していることが特に好ましい。
【００７３】
この方法の第４段階では、処理の前のCpGジヌクレオチドのメチル化状態を確かめるために、この方法の第３段階の間に得られた増幅物を分析する。
【００７４】
MSP増幅及び/又はブロッキング用オリゴヌクレオチドよって増幅物が得られる実施形態では、増幅物の存在又は非存在自体が、その塩基配列によって、プライマー及び／又はブロッキング用オリゴヌクレオチドによってカバーされるCpG位のメチル化状態を示す。ゲル電気泳動、配列決定、液体クロマトグラフィー、ハイブリダイゼーション、リアルタイムPCR分析またはそれらの組み合わせ等の（しかしこれらに限定されない）あらゆる可能な既知の分子生物学的方法を、この検出に使用してよい。この方法のこの段階はさらに、前の段階の質的コントロールとして働く。
【００７５】
この方法の第４段階では、標準的及びメチル化特異的PCRの両方によって得られる増幅物をさらに分析し、この方法の第１段階で単離されたゲノムDNAのCpGメチル化状態を決定する。これは、アレイ技術及びプローブベース技術並びに配列決定やテンプレート依存伸長などの方法によって実施してよいが、これらには限定されない。
【００７６】
この方法の１つの実施形態では、段階３で合成される増幅物を次に、オリゴヌクレオチド及び/又はPNAプローブのアレイ又は組とハイブリダイズさせる。この場合には、ハイブリダイゼーションは以下のように行う：ハイブリダイゼーションの間に使用されるプローブの組は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド又はPNA-オリゴマーから成るのが好ましい；この過程では、増幅物は、固相に予め結合させたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプローブとなる；ハイブリダイズしない断片を次に取り除く；当該オリゴヌクレオチドは、配列番号２〜５の塩基配列の断片と逆相補的又は同一な少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を含む；そして、その断片は、少なくとも１つのCpG、TpG又はCpAジヌクレオチドを含む。
【００７７】
好ましい実施形態では、当該ジヌクレオチドが、オリゴマーの中央の３分の１に存在する。例えば、当該ジヌクレオチドは13量体の5'末端から5〜9番目のヌクレオチドであるのが好ましく、ここでオリゴマーは１つのCpGジヌクレオチドを含む。１つのオリゴヌクレオチドが、配列番号１内の各CpGジヌクレオチド、及び配列番号２〜５内の同等な位置の分析のために存在する。また、当該オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸の形で存在してもよい。次に、ハイブリダイズしない増幅物を取り除く。ハイブリダイズした増幅物を検出する。この場合には、増幅物に付けられたラベルはオリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位置で識別可能であることが好ましい。
【００７８】
この方法のさらなる実施形態では、CpG位のゲノムメチル化状態は、PCR増幅プライマーと同時に亜硫酸水素塩処理DNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブによって確かめられてよい(ここで当該プライマーはメチル化特異的でも標準的なものでもよい)。
【００７９】
この方法の特に好ましい実施形態は、蛍光ベースリアルタイム定量的PCRの使用である(Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996; 米国特許第6,331,393号も参照)。この方法を利用する２つの好ましい実施形態がある。TaqMan(商標)分析として知られる1つの実施形態では、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使う。TaqMan(商標) PCR反応は、TaqMan(商標)プローブと呼ばれ、順及び逆方向の増幅プライマーの間に位置するGpCリッチ配列にハイブリダイズするように設計された非伸長性探査オリゴヌクレオチドを使用する。TaqMan(商標)プローブはさらに、TaqMan(商標)オリゴヌクレオチドのヌクレオチド類に付けられたリンカ部分(例えば、フォスフォアミダイト類)に共有結合した蛍光「レポーター部分」及び「消光剤部分」を含む。ハイブリダイズされたプローブは、増幅反応のポリメラーゼによって置換・破壊され、その結果、蛍光が増大する。亜硫酸水素塩処理後の核酸内メチル化分析のためには、MethylLight分析として知られ、米国特許第6,331,393号（これによって本明細書に収録される）に記載されているように、そのプローブはメチル化特異的である必要がある。この技術の第２の好ましい実施形態は、二重プローブ技術(Lightcycler(登録商標）)であり、それぞれが供与性又は受容性の蛍光部分を有し、互いに接近する２つのプローブのハイブリダイゼーションが、増加又は蛍光増幅プライマーによって示される。これらの手法の両方は、亜硫酸水素塩処理DNAでの使用に、そしてさらに、CpGジヌクレオチド内のメチル化分析に適するように改変してよい。
【００８０】
この方法のさらなる好ましい実施形態では、この方法の第４段階は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997に記載のMS-SNuPEのようなテンプレート指示オリゴヌクレオチド伸長の使用を含む。当該実施形態では、Ms-SNuPEプライマーが配列番号２〜５の群から選ぶ配列の１つ以上の長さが少なくとも9ヌクレオチド、好ましくは25ヌクレオチドを越えない配列と同一又は相補的であることが好ましい。
【００８１】
この方法のさらなる実施形態では、この方法の第４段階には、この方法の第３段階で発生する増幅物の配列決定とその後の配列分析が含まれる(Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977)。
【００８２】
発明のさらなる実施形態は、前処理の必要なしで、発明(配列番号１)によるゲノムDNAのメチル化状態の分析のための方法を提供する。
【００８３】
そのようなさらなる実施形態の第１段階では、ゲノムDNA試料を組織又は細胞源から単離する。好ましくは、そのような単離源には細胞系、組織学的スライド標本、体液、又はパラフィン包埋組織が含まれる。抽出は、洗剤の使用、音波処理及びガラスビーズとの撹拌など当業者には標準的な手段で行って構わないが、これらには限定されない。核酸が抽出されれば、ゲノム二本鎖DNAを分析に使用する。
【００８４】
好ましい実施形態では、処理の前にDNAを分割してもよく、これは現状技術で標準的な手段、特にメチル化感受性制限酵素で行ってよい。
【００８５】
第２段階では、次に１以上のメチル化感受性制限酵素でそのDNAを消化する。制限部位におけるDNAの加水分解が特定のCpGジヌクレオチドのメチル化状態の情報を与えるように消化を行う。
【００８６】
任意ではあるが好ましい実施形態である第３段階で、制限酵素断片を増幅する。これはポリメラーゼ連鎖反応を用いて行うのが好ましく、当該増幅物は、蛍光発色団ラベル、放射性核種及び質量ラベルのような上述の適当な検出可能なラベルを有してよい。
【００８７】
最終段階では、増幅物を検出する。検出は、当分野で標準的な手段、例えば、ゲル電気泳動分析、ハイブリダイゼーション分析、PCR生成物内への検出可能なタグの取り込み、DNAアレイ分析、MALDIまたはESI分析で行ってよいが、これらには限定されない。
【００８８】
本発明は、EYA4遺伝子及びそのプロモーター又は調節エレメント中の重要な遺伝的及び/又は後生的パラメータをマーカーとして使ってよい患者又は個人に不利な出来事の診断及び/又は予後を可能にする。本発明によって得られる当該パラメータは、もう１組の遺伝的及び/又は後生的なパラメータと比べてよく、それらの差は患者又は個人に不利な出来事の診断及び/又は予後のための基礎となる。
【００８９】
特に本発明は、EYA4 CpGジヌクレオチド配列の特異なメチル化の測定に基づく診断的及び/又は予後的癌分析評価を提供する。そのような特異なメチル化を測定するために役に立つ好ましい遺伝子配列は、本明細書の配列番号１〜５で表される。典型的には、そのような分析評価は試験組織からの組織試料を得て、対照試料に対して組織試料由来の本発明のEYA4特異的CpGジヌクレオチド配列の少なくとも１つのメチル化状態を測定するためのアッセイを実行し、それに基づいて診断又は予後をすることを伴う。
【００９０】
特に好ましい実施形態では、例えば配列番号１１〜１５に相当する代表的な好ましいオリゴマーを含む、配列番号１〜５に基づく配列のような、発明のオリゴマー又はそれに基づくアレイ並びにそれに基づくキットは、EYA4特異的なCpGジヌクレオチドメチル化状態を評価するために使用され、癌及び/又は他の前立腺細胞の増殖疾患の診断及び/又は予後のために有用である。
【００９１】
本発明はさらに、結腸細胞増殖性疾患の診断及び/又は療法のための診断薬及び/又は治療薬に関し、この診断用薬及び/又は治療薬は、配列番号１〜５に基づく少なくとも１つのプライマー又はプローブが、可能ならば適当な添加物及び補助の薬剤と共にそれを製造するのに使用されるという点に特徴がある。１つの実施形態では、EYA4ポリペプチド又はその断片又は誘導体を、大腸癌を治療又は予防するために被検者に投与してよい。
【００９２】
別の実施形態では、EYA4を発現できるベクター又はその断片又は誘導体も、大腸癌を治療又は予防するために被検者に投与してよい。
【００９３】
別の実施形態では、EYA4に特異的な作用薬を、EYA4の活性を刺激するか、長引かせるのに使用してよく、大腸癌を治療又は予防するために被検者に投与してよい。
【００９４】
他の実施形態は、上記の治療用タンパク質又はベクターのどちらかを、他の適切な治療薬と組み合わせて投与してよい。組み合わせ療法での使用のための適切な医薬品の選択は、従来の製薬の原則に従い、当分野における通常の技術で行ってよい。治療薬の組み合わせは、大腸癌の治療又は予防に効果があるように相乗的に作用してよい。このアプローチを用いて、各薬剤をより少なく用い、不都合な副作用の可能性を低下させながら、治療効果を達成してよい。
【００９５】
レトロウイルス、アデノウィルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルス由来の又は様々の細菌プラスミド由来の発現ベクターを、標的器官、組織又は細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いてよい。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、薬学的に許容できる担体に関する医薬組成物の投与に関する。そのような医薬組成物は、EYA4又はEYA4の作用薬から成ってよい。その組成は、単独で又は安定剤のような他の少なくとも１つの薬剤と組み合わせて投与してよく、それは食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水等（しかしこれらには限定されない）の無菌で、生体適合性の薬学的担体注に混ぜて投与してよい。その組成物は、単独で、又は他の薬剤、薬又はホルモンと組み合わせて患者に投与してよい。
【００９７】
この発明で利用される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、又は直腸的手段等の種々の経路によって投与してよいが、これらに限定されない。
【００９８】
活性成分の他に、これらの医薬組成物は、薬学的に使用することができ、活性物質を薬剤に調製し易くする賦形剤と助剤を含む適当な、薬学的に許容できる担体を含んでよい。製剤と投与のための技術に関する詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)の最新版が参考になる。
【００９９】
更に、本発明の別の側面は、例えば以下のものから成るキットである：亜硫酸水素塩含有試薬、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、その配列が、いずれの場合においても、配列番号１〜５の配列の18塩基長のセグメントに対応するか、これに対して相補的であるか、或いは、厳密な条件又は極めて厳密な条件下でハイブリダイズするもの。前記キットは、更に、説明した方法を実行及び評価するための説明書を含んでもよい。更に好適な実施形態において、前記キットは、更に、CpG位置特異的メチル化分析を行うための標準的な試薬を備えてもよく、前記分析は、以下の手法のうち１つ以上を含む：MS-SNuPE、MSP、MethyLightTM、HeavyMethylTM、COBRA、及び核酸配列決定。しかしながら、本発明に沿ったキットは、前述の構成要素の一部のみを含むことができる。
【０１００】
COBRA分析の代表的な試薬（COBRAに基づく代表的なキットにおいて確認できるもの等）は、特異的遺伝子（或いはメチル化改変DNA配列又はCpGアイランド）に関するPCRプライマーと；制限酵素及び適切な緩衝剤と；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴと；対照ハイブリダイゼーションオリゴと；オリゴプローブ用キナーゼ標識キットと；放射性ヌクレオチドとを含むことができるが、これらに限定されない。加えて、亜硫酸水素塩変換試薬は、DNA変性緩衝剤と；スルホン化緩衝剤と；DNA回収試薬又はキット（沈殿、限外濾過、アフィニティカラム等）と；脱スルホン化緩衝剤と；DNA回収成分とを含むことができる。
【０１０１】
MethyLight（登録商標）分析の代表的な試薬（MethyLight（登録商標）に基づく代表的なキットにおいて確認できるもの等）は、特異的遺伝子（或いはメチル化改変DNA配列又はCpGアイランド）に関するPCRプライマーと；TaqMan（登録商標）プローブと；最適化PCR緩衝剤と；デオキシヌクレオチドと；Taqポリメラーゼとを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１０２】
MS-SNuPE分析の代表的な試薬（MS-SNuPEに基づく代表的なキットにおいて確認できるもの等）は、特異的遺伝子（或いはメチル化改変DNA配列又はCpGアイランド）に関するPCRプライマーと；最適化PCR緩衝剤と；デオキシヌクレオチドと；ゲル抽出キットと；陽性対照プライマーと；特異的遺伝子に関するMS-SNuPEプライマーと；反応緩衝剤（MS-SNuPE反応用）と；放射性ヌクレオチドとを含むことができるが、これらに限定されない。加えて、亜硫酸水素塩変換試薬は、DNA変性緩衝剤と；スルホン化緩衝剤と；DNA回収試薬又はキット（沈殿、限外濾過、アフィニティカラム等）と；脱スルホン化緩衝剤と；DNA回収成分とを含むことができる。
【０１０３】
MSP分析の代表的な試薬（MSPに基づく代表的なキットにおいて確認できるもの等）は、特異的遺伝子（或いはメチル化改変DNA配列又はCpGアイランド）に関するメチル化及び非メチル化PCRプライマーと、最適化PCR緩衝剤と、デオキシヌクレオチドと、特異的プローブとを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１０４】
（定義）
本発明において、「CpGアイランド」という用語は、（１）0.6を上回る「観測／予測比率」に対応するCpGジヌクレオチドの頻度を有し、（２）0.5を上回る「GC含有量」を有するという基準を満たすゲノムDNAの隣接領域を指す。CpGアイランドは、常にではないが、通常、約0.2〜約1ｋｂの長さである。
【０１０５】
本発明において、「メチル化状態」又は「メチル化状況」という用語は、DNA配列内の１つ又は複数のCpGジヌクレオチドにおける5-メチルシトシン（「5-mCyt」）の存在又は欠失を指す。DNA配列内の１つ以上の特定のパリンドロームCpGメチル化部位（それぞれが２つのCpG  CpGジヌクレオチド配列を有する）におけるメチル化状態は、「非メチル化」と、「完全メチル化」と、「ヘミメチル化」とを含む。
【０１０６】
本発明において、「ヘミメチル化」という用語は、パリンドロームCpGメチル化部位のメチル化状態で、パリンドロームCpGメチル化部位の２つのCpGジヌクレオチド配列のうち１つにおいて、単一のシトシンのみがメチル化されているものを指す（例えば、5'-CCMGG-3'（上鎖）、3'-GGCC-5'（下鎖））。
【０１０７】
本発明において、「高メチル化」という用語は、正常な対照DNA試料内の対応するCpGジヌクレオチドにおいて確認される5-mCytの量と比較して、試験DNA試料のDNA配列内の１つ又は複数のCpGジヌクレオチドにおける5-mCytの存在の増加に対応する平均的なメチル化状態を指す。
【０１０８】
本発明において、「低メチル化」という用語は、正常な対照DNA試料内の対応するCpGジヌクレオチドにおいて確認される5-mCytの量と比較して、試験DNA試料のDNA配列内の１つ又は複数のCpGジヌクレオチドにおける5-mCytの存在の減少に対応する平均的なメチル化状態を指す。
【０１０９】
本発明において、「マイクロアレイ」という用語は、広義には、この技術において認められているように、「DNAマイクロアレイ」及び「（複数の）DNAチップ」の両方を指し、この技術で認められた全ての固体支持体を包含し、これに対する核酸分子の付着又はその上での核酸の合成に関するあらゆる方法を包含する。
【０１１０】
「遺伝パラメータ」は、遺伝子及びその調節に更に必要となる配列の突然変異及び多型である。突然変異に指定されるものは、特に、挿入と、欠失と、点突然変異と、逆位と、多型とであり、特に好ましくは、SNP（一塩基変異多型）である。
【０１１１】
「後成的発現パラメータ」は、特に、シトシンメチル化である。その他の後成的発現パラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれるが、しかしながら、これは説明した方法を使用して直接分析することはできないが、その後、DNAメチル化と相関する。
【０１１２】
本発明において、「亜硫酸水素塩試薬」という用語は、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素、又はその組み合わせを含む試薬を指し、本明細書で開示するように、メチル化及び非メチル化CpGジヌクレオチド配列を識別するのに有用である。
【０１１３】
本発明において、「メチル化アッセイ」という用語は、DNAの配列内の１つ以上のCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態を判定する任意のアッセイを指す。
【０１１４】
本発明において、「MS. AP-PCR」（メチル化感受性自由刺激ポリメラーゼ連鎖反応）は、CGが豊富なプライマーを使用したゲノムの大域的なスキャンを可能にし、CpGジヌクレオチドを含む可能性が最も高い領域に注目する、この技術で認められたテクノロジを指し、Gonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997において説明されている。
【０１１５】
本発明において、「MethyLight」という用語は、当該技術分野で認められた蛍光に基づくリアルタイムPCR手法を指し、Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999において説明されている。
【０１１６】
本発明において、「HeavyMethylTM」アッセイという用語は、本明細書において実施されるその実施形態において、MethylLightアッセイのバリエーションであるHeavyMethylTM  MethylLightアッセイを指し、このMethylLightアッセイは、増幅プライマー間のCpG位置を対象とするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わせたものである。
【０１１７】
「MS-SNuPE」（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長法）という用語は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997において説明される、この技術で認められたアッセイを指す。
【０１１８】
「MSP」（メチル化特異的PCR）という用語は、Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996及び米国特許第5,786,146号において説明される、この技術で認められたメチル化アッセイを指す。
【０１１９】
「COBRA」（結合亜硫酸水素塩制限分析）という用語は、Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 22:2532-2534, 1997において説明される、この技術で認められたメチル化アッセイを指す。
【０１２０】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、二重構造の形成に至る、試料DNAにおけるワトソンクリック塩基対に従ったオリゴヌクレオチドの相補的配列との結合として理解される。
【０１２１】
「厳密なハイブリダイゼーション条件」とは、本明細書での定義において、5×SSC/5×デンハルト溶液／1.0％SDS内において68℃でハイブリダイズすることと、0.2×SSC/0.1％SDSにおいて室温で洗浄することとを伴い、或いは、これに相当する、この技術で認められた条件を伴う（例えば、2.5×SSC緩衝液において60℃でハイブリダイゼーションを実施し、その後、低緩衝剤濃度における37℃での数回の洗浄ステップを行い、安定した状態を保つという条件）。適度に厳密な条件は、本明細書での定義において、3×SSCにおいて42℃で洗浄することを含むことを伴い、或いは、これに相当する、この技術で認められた条件を伴う。塩濃度及び温度のパラメータは、プローブと標的核酸との間で最適な識別レベルを達成するために変化させることができる。こうした条件に関するガイダンスは、この技術において、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.及びAusubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) at Unit 2.10によって入手できる。
【０１２２】
「バックグラウンドDNA」は、本明細書での使用において、結腸細胞以外のソースを起源とする任意の核酸を指す。
【０１２３】
次に、本発明について、以下の実施例と、配列と、図面とに基づいて、これに限定されることなく、更に詳細に説明する。配列プロトコル及び図面において、
配列番号１は、ヒト遺伝子EYA4の配列を示し、
配列番号２〜５は、遺伝子EYA4の化学的に前処理された配列を示し、
配列番号６〜１０は、実施例において使用するプライマーの配列を示し、
配列番号１１〜１５は、実施例において使用するプローブの配列番号を示す。
【０１２４】
図１は、実施例１及び２によるMSP  MethyLightアッセイとHeavyMethyl  MethyLightアッセイとによって判定されたメチル化のレベルを示す。Ｙ軸線は、調査したEYA4遺伝子の領域内でのメチル化の度合いを示す。腫瘍試料は、白点により表され、正常な結腸組織試料は、黒点により表される。著しく高い度合いのメチル化は、健康な組織試料よりも腫瘍試料において観察された。ｔ−試験を使用して測定された有意レベルは、p=0.00000312（MSP−ML、実施例１）及びp=0.000000326（HM-ML、実施例２）となった。
【０１２５】
図２は、実施例１による、腺癌に関するMSP-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している。ROCは、診断試験の種々の潜在的カットポイントに関する、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。これは、選択されたカットポイントに依存する、感度と特異性との間でのトレードオフを示す（感度における任意の増加に特異性の減少が伴うことになる）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる（面積が大きいほど良く、1が最適であり、無作為試験では、ROC曲線は0.5の面積を有する対角線上に存在することになる）。MSP-Methyl-LightアッセイのAUCは：0.94である。
【０１２６】
図３は、実施例２による、腺癌に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる。HM-Methyl-LightアッセイのAUCは：0.91である。
【０１２７】
図４は、実施例２による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定されたメチル化のレベルを示し、結腸試料の追加的な組を試験している（腺癌25、正常33、及び腺腫13）。Ｙ軸線は、調査したEYA4遺伝子の領域内でのメチル化の度合いを示す。線癌試料は、白い正方形により表され、正常な結腸組織試料は、黒い菱形により表される。著しく高い度合いのメチル化は、健康な組織試料よりも腫瘍試料において観察された。ｔ−試験を使用して測定された有意レベルは、0.00424となった。
【０１２８】
図５は、実施例２による、腺癌及び腺腫に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している（試料の追加的な組）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる。HM-Methyl-LightアッセイのAUCは、0.81である。
【０１２９】
図６は、実施例２による、腺癌のみに関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している（試料の追加的な組）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる。HM-Methyl-LightアッセイのAUCは、0.844である。
【０１３０】
図７は、実施例２による、腺腫に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している（試料の追加的な組）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる。HM-Methyl-LightアッセイのAUCは、0.748である。
【０１３１】
図８は、実施例３による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、種々の腫瘍及び健康な組織におけるメチル化のレベルを示している。Ｙ軸線は、調査したEYA4遺伝子の領域内でのメチル化の度合いを示す。結腸癌試料以外では、二種類の乳癌組織のうち一方のみがメチル化されている。
【０１３２】
図９は、実施例３による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、種々の乳癌組織におけるメチル化のレベルを示している。一種類の組織のみがメチル化されている。
【０１３３】
図１０は、実施例４による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、血清試料におけるメチル化のレベルを示している。Ｙ軸線は、調査したEYA4遺伝子の領域内でのメチル化の度合いを示す。
【実施例１】
【０１３４】
MSP-MethyLightアッセイを使用した結腸癌内のメチル化分析
DNAは、Qiagen（登録商標）抽出キットを使用して、33の結腸線癌試料と43の結腸の正常な隣接組織から抽出した。各試料からのDNAは、アガロースビーズ法（オレク他、１９９６）に従って、亜硫酸水素塩溶液（亜硫酸水素、二亜硫酸塩）を使用して処理した。この処理は、試料内のメチル化していない全てのシトシンがチミジンに変換されるように行う。一方、試料内の5-メチル化シトシンは修飾されずに残る。
【０１３５】
メチル化状態は、当該CpGアイランドとベータアクチン遺伝子からの対照断片（イーズ他、２００１）とのために設計されたMSP-MethyLightアッセイにより判定した。このCpGアイランドアッセイは、プライマーとtaqmanスタイルプローブとの両方におけるCpG部位を対象とするが、対照遺伝子は対象にならない。この対照遺伝子は、全DNA濃度の尺度として使用され、CpGアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）は、その部位でのメチル化レベルを判定する。
【０１３６】
方法：EYA4遺伝子CpGアイランドアッセイは、以下のプライマー及びプローブを使用して実行した。
順方向プライマー：CGGAGGGTACGGAGATTACG（配列番号６）、
逆方向プライマー：CGACGACGCGCGAAA（配列番号７）、及び
プローブ：CGAAACCCTAAATATCCCGAATAACGCCG（配列番号１２）。
対応する対照アッセイは、以下のプライマー及びプローブを使用して実行した。
プライマー：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT（配列番号８）
プライマー：AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA（配列番号９）、及び
プローブ：ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA（配列番号１３）。
【０１３７】
反応は、以下のアッセイ条件において、各DNA試料について三重にして実行した：
反応溶液：（900 nM  プライマー、300 nM  プローブ、3.5 mM  塩化マグネシウム、1単位のtaqポリメラーゼ、200 μM  dNTPs、7μlのDNA、最終反応体積20μl）；
サイクリング条件：（95℃10分間の後、95℃15秒間及び60℃1分間を50サイクル）。データは、既に文献において説明されているPMR計算を使用して分析した（イーズ他、２００１）。
【０１３８】
結果：正常な試料の平均PMRは0.15で、標準偏差は0.18となった。腫瘍試料の平均PMRは17.98で、標準偏差は18.18となった。腫瘍試料と正常な試料との間でのメチル化レベルの全体的な差異は、ｔ試験において有意である（p=0.00000312）。この結果は、図１に表示されている。
【０１３９】
このアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）も判定した。ROCは、診断試験の種々の潜在的カットポイントに関する、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。これは、選択されたカットポイントに依存する、感度と特異性との間でのトレードオフを示す（感度における任意の増加に特異性の減少が伴うことになる）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる（面積が大きいほど良く、1が最適であり、無作為試験では、ROC曲線は0.5の面積を有する対角線上に存在することになる、参考：J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975）。MSP−Methyl−LightアッセイのAUCは、0.94である（図２）。
【実施例２】
【０１４０】
HeavyMethyl  MethyLightアッセイを使用して分析した結腸癌内のメチル化
同じDNA試料を使用して、HeavyMethylアッセイとも呼ばれる、HeavyMethyl  MethyLight（又はHM  MethyLight）アッセイにより、CpGアイランドのメチル化を分析した。メチル化状態は、当該CpGアイランドと上で説明したものと同じ対照遺伝子アッセイとのために設計されたHM  MethyLightアッセイにより判定した。このCpGアイランドアッセイは、ブロッカーとtaqmanスタイルプローブとの両方におけるCpG部位を対象とするが、対照遺伝子は対象にならない。
【０１４１】
方法：CpGアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）は、以下のプライマー及びプローブを使用して実行した。
順方向プライマー：GGTGATTGTTTATTGTTATGGTTTG （配列番号１０）
逆方向プライマー：CCCCTCAACCTAAAAACTACAAC（配列番号１１）
順方向ブロッカー：GTTATGGTTTGTGATTTTGTGTGGG（配列番号１５）
逆方向ブロッカー：AAACTACAACCACTCAAATCAACCCA（配列番号１６）
プローブ：AAAATTACGACGACGCCACCCGAAA（配列番号１４）
【０１４２】
反応は、以下のアッセイ条件において、各DNA試料について、それぞれ三重にして実行した。
反応溶液：（400 nM  プライマー、400 nM  プローブ、10μMの両ブロッカー、3.5 mM  塩化マグネシウム、1×  ABI  taqman緩衝剤、1単位のABI  TaqGoldポリメラーゼ、200μM  dNTPs、及び7μlのDNA、最終反応体積20μl）；
サイクリング条件：（95℃10分間）、（95℃15秒間、64℃1分間（2サイクル））、（95℃15秒間、62℃1分間（2サイクル））、（95℃15秒間、60℃1分間（2サイクル））、及び（95℃15秒間、58℃1分間、60℃40秒間（41サイクル））。
【０１４３】
結果：正常な試料の平均PMRは1.12で、標準偏差は1.45となった。腫瘍試料の平均PMRは38.23で、標準偏差は33.22となった。腫瘍試料と正常な試料との間でのメチル化レベルの全体的な差異は、ｔ試験において有意である（p=0.000000326）。この結果は、図１に表示されている。このアッセイのROC曲線も判定した。MSP-Methyl-LightアッセイのAUCは、0.91である（図３）。
【０１４４】
このアッセイでは、結腸試料の追加的な組を試験した（腺癌25、正常33、及び腺腫13）。この結果も、有意な差異を示した（図４）。ROCは、図５〜７に表示されている。
【実施例３】
【０１４５】
HeavyMethyl-MethyLightアッセイでは、その他の組織集団に対しても試験を行った（図８）。結腸癌試料以外では、二種類の乳癌組織のうち一方のみがメチル化された。しかしながら、21の追加的な（病期の異なる）乳腫瘍の集団では、一種類のみがメチル化された（図９）。そのため、この標識は、結腸腫瘍試料に特異的である。全てのプライマー、プローブ、ブロッカー、及び反応条件は、結腸癌試料の分析（実施例２）に使用したものと同一とした。
【実施例４】
【０１４６】
リアルタイムPCRによって分析された12の結腸組織も、外科処置の前に取得されたペア血清を有した。Qiagen  UltraSens（登録商標）  DNA抽出キットを使用して、この血清1mLからDNAを抽出し、このDNA試料に亜硫酸塩で処理し、これらの試料に対してHeavyMethyl-MethyLightアッセイを実行した。対照遺伝子は、三種類の癌血清試料と三種類の正常な血清試料に関して増幅されていないため、これらのケースにおいては、試料の調製が正しく機能しなかったと結論できる。その他のケースでは、癌試料において、正常な試料よりも高いメチル化の証拠が存在した（図１０）。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】実施例１及び２によるMSP  MethyLightアッセイとHeavyMethyl  MethyLightアッセイとによって判定されたメチル化のレベルを示す。
【図２】実施例１による、腺癌に関するMSP-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図３】実施例２による、腺癌に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図４】実施例２による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定されたメチル化のレベルを示す。
【図５】実施例２による、腺癌及び腺腫に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図６】実施例２による、腺癌のみに関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図７】実施例２による、腺腫に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図８】実施例３による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、種々の腫瘍及び健康な組織におけるメチル化のレベルを示す。
【図９】実施例３による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、種々の乳癌組織におけるメチル化のレベルを示す。
【図１０】実施例４による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、血清試料におけるメチル化のレベルを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月9日(2004.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
結腸直腸癌は、男女の癌による死亡の４番目の主な原因である。５年生存率は、すべてのステージで61%であり、この病気の治療には、早期発見が効果的である。すべての結腸直腸癌の95%までが、種々に分化した進行度の腺癌である。
【背景技術】
【０００２】
散発性大腸癌は、正常な結腸上皮から腺腫への病理的変化から始まり他段階課程で発達し、浸潤癌へ連続的に進行する。結腸腺腫の進行割合は、現在、それらの組織学的な外観、部位、拡散程度、および腸管併発の程度に基づいて予測される。例えば、管型良性腺腫が悪性腫瘍に進行することはめったにないが、絨毛状良性腺腫は直径が2cm以上であれば、かなり悪性の可能性がある。
【０００３】
良性増殖性病変から悪性新生物までの進行の間、いくつかの遺伝的および後成的変化が起こることが知られている。APC遺伝子の体細胞性突然変異は、結腸直腸腺腫および癌の75〜80%における最も早期の事象の１つのように思われる。K-RASの活性化は、悪性表現型に向かう進行における重要な段階であると考えられる。連続して、他の癌遺伝子の突然変異および腫瘍抑制遺伝子の不活性化に至る変化が蓄積する。
【０００４】
CpGアイランド内の異常なDNAメチル化は、遺伝子類の広域スペクトルの廃棄または過発現に至るヒトの癌における最も早期で最も一般的な変化の１つである。さらに、異常なメチル化は、いくつかの腫瘍に関する遺伝子のイントロンおよびコード部分におけるCpGが多い調節エレメントで起こることが示された。腫瘍抑制遺伝子の特異的過メチル化と比べて、DNAの全般的な低メチル化が、腫瘍細胞で観察され得る。全般的なメチル化のこの低下は、初期、明白な腫瘍形成・発達のずっと前に検出し得る。また、低メチル化と増加する遺伝子発現間の相関関係は、多くの癌遺伝子で報告されている。大腸癌では、異常なDNAメチル化は最も際立った変化の１つを構成し、p14ARF, p16INK4a, THBS1, MINT2, およびMINT31のような多くの癌抑制遺伝子およびhMLH1のようなDNAミスマッチ修復遺伝子を不活性化する。
【０００５】
結腸直腸癌の分子進化では、DNAメチル化のエラーは２つの特徴的な役割を果たすと提案されている。正常な結腸の粘膜細胞では、メチル化のエラーは、時間の関数として、または、これらの細胞を腫瘍性変化に前処理する時間依存的事象として蓄積する。例えば、いくつかの座の過メチル化は、腺腫、特に、細管絨毛状および絨毛状亜型で既に存在することを示すことができた。後の段階では、CpGアイランドの増加するDNAメチル化はいわゆるCpGアイランドメチレーター表現型(CIMP)によって影響される腫瘍の部分集合で重要な役割を果たす。ほとんどのCIMP(+)腫瘍(すべての散発性結直腸癌の約15%を構成する)が、hMLH1プロモーターおよび他のDNAミスマッチ修復遺伝子の過メチル化によるマイクロサテライトの不安定性(MIN)によって特徴付けられる。対照的に、CIMP(-)大腸癌は、より古典的な遺伝子不安定性経路(CIN)に沿ってp53変異と染色体変化が高率で発達する。
【０００６】
しかし、分子亜型は、分子変化に関して頻度を変えることを示しているだけではない。マイクロサテライトの不安定性または染色体異常型のどちらかの存在によれば、大腸癌を２つのクラスに分類することができ、これらは重要な臨床的差異を示す。ほとんどすべてのMIN腫瘍が近位結腸(上行と横行)に発症するが、CIN腫瘍の70%は遠位結腸と直腸に存在する。これは結腸の種々の部分での種々の発癌物質の種々の分布のためであるとされている。近位結腸に行き渡っている発癌物質を構成するメチル化発癌物質はMIN癌の病原性である役目を果たすことが提案された。他方、CIN腫瘍は、結腸と直腸の遠位末端により頻繁に現れる、より頻繁に付加物を形成する発癌物質によって引き起こされると考えられている。そのうえ、MIN腫瘍は、CIN表現型の腫瘍より予後が良く、助剤化学療法によりよく反応する。
【０００７】
大腸癌の分化と早期発見のためのマーカーの識別は現在の研究の主要な目標である。
【０００８】
EYA4は、脊椎動物のEya(目無し)の遺伝子ファミリー、すなわち正常な胚形成の発生を確実にするために保存された調節階層構造において他の蛋白質類と相互作用する４つの転写活性化因子のグループの最も最近同定された遺伝子である。EYA4の遺伝子は、6q22.3にマップされ、640アミノ酸のタンパク質をコードする。EYA4の構造はEYA1-3によって確立された原型に一致し、eya-相同領域(eyaHR; または、eyaドメインまたはeya相同ドメイン1と呼ばれる)と呼ばれる高く保存された271アミノ酸のC末端と、より分岐しているプロリンセリントレオニン(PST)リッチ(34-41%)トランスアクチベーションドメインをN末端に含む(Borsani G, et al., EYA4, a novel vertebrate gene related to Drosophila eyes absent. Hum Mol Genet 1999 Jan;8(1):11-23（非特許文献１）)。EYA蛋白質類は早期胎児発生の間、SIXとDACH蛋白質ファミリーのメンバーと相互作用する。EYA4の遺伝子における突然変異は、DFNA10座で後舌進行性常染色体優性聴力欠損の原因となる(Wayne S, Robertson NG, DeClau F, Chen N, Verhoeven K, Prasad S, Tranebjarg L, Morton CC, Ryan AF, Van Camp G, Smith RJ: Mutations in the transcriptional activator EYA4 cause late-onset deafness at the DFNA10 locus. Hum Mol Genet 2001 Feb 1;10(3):195-200（非特許文献２） その他の文献)。EYA4遺伝子のシトシン位置のメチル化と癌との関係はまだ確立されていない。
【０００９】
5-メチルシトシンは真核生物細胞のDNAで最も頻繁に起きる共有結合性塩基修飾である。例えば、それは転写調節、遺伝子刷込、および腫瘍形成である役割を果たす。したがって、遺伝情報の構成要素としての5-メチルシトシンの同定はかなり興味深い。しかし、5-メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対形成をするので、配列決定によって5-メチルシトシンの位置を決定することはできない。そのうえ、5-メチルシトシンによって運ばれる後成的情報はPCR増幅の間に完全に失われる。
【００１０】
DNAの5-メチルシトシンを分析するための比較的新しくて現在最も頻繁に使用される方法は、シトシンと亜硫酸水素塩との特異的反応に基づき、シトシンは、その後のアルカリ性の加水分解で、塩基対形成がチミジンに対応するウラシルに変換される。しかし、5-メチルシトシンは、これらの条件下では修飾されずに残る。その結果、元のDNAは、元来ハイブリダイゼーション形成によってはシトシンと区別できないメチルシトシンを、例えば、増幅およびハイブリダイゼーション形成または配列決定によって、「通常の」分子生物学的手法を用いて、残存するシトシンだけを検出できるような方法で変換される。これらの手法のすべては、現在完全に利用することができる塩基対形成に基づく。感度に関しては、従来技術はアガロースマトリックスで分析されるべきDNAを封入し、その結果、DNA(亜硫酸水素塩は一本鎖DNAと反応するだけである)の拡散と復元を防いで、すべての析出と精製段階を速い透析に置き換える方法によって定義される(Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6（非特許文献３）)。この方法を用いれば、個々の細胞を分析することができ、このことは、この方法の可能性を示す。しかしながら、現在、最大、約3,000塩基対の長さの個々の領域だけが分析されているに過ぎず、何千回もの可能なメチル化事象に関する細胞の網羅的解析は可能ではない。しかし、この方法では少ない試料由来の極めて小さい断片を確実に分析することはできない。これらは、拡散を保護しても、マトリックスを通して失われる。
【００１１】
5-メチルシトシンを検出する他の既知の方法の概観は次の総説から得られるであろう: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255（非特許文献４）。
【００１２】
これまで、わずかな例外(e.g., Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8（非特許文献５）) を除いて、亜硫酸水素塩手法が研究で使用されるに過ぎない。しかし既知遺伝子の短い特定の断片は、いつも亜硫酸水素塩処理の後で増幅され完全に配列決定され(Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6（非特許文献６）)、あるいは、個々のシトシン位置がプライマー伸長法反応 (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31（非特許文献７）, WO 95/00669（特許文献１）) によって、または酵素的消化(Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4（非特許文献８）)により検出される。さらに、また、ハイブリダイゼーションによる検出も説明されている(Olek他、WO 99/28498（特許文献２）)。
【００１３】
個々の遺伝子におけるメチル化検出のための亜硫酸水素塩手法の使用を扱うその他の出版物は以下の通りである：Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431（非特許文献９）; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95（非特許文献１０）; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6（非特許文献１１）; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4（非特許文献１２）; WO 97/46705（特許文献３） and WO 95/15373（特許文献４）。
【００１４】
オリゴマーアレイ製造における従来技術の概観は、1999年1月に発行されたNature Genetics (Nature Genetics補足、21巻、1999年1月)の特集号（非特許文献１３）とその引用文献から集めることができる。
【００１５】
固定化DNAアレイのスキャンには、蛍光ラベルプローブがしばしば使用される。特異的プローブの5'-OHへのCy3とCy5染料の単純な付着は蛍光ラベルに特に適している。ハイブリダイズしたプローブの蛍光の検出は例えば、共焦点顕微鏡を用いて行ってよい。多くの他のもの以外に、Cy3とCy5染料が利用可能である。
【００１６】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法(MALDI-TOF)は生体分子の分析に極めて効率的である。(Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301（非特許文献１４）)。検体は光吸収マトリックスに包埋される。マトリックスは短いレーザパルスによって蒸発させられ、断片化しないように、検体分子が気相に輸送される。検体はマトリックス分子との衝突でイオン化される。印加電圧はイオン類を無場飛行チューブの中に加速する。それらの異なる質量のため、イオン類は異なる速度で加速される。より小さいイオンは、より大きいイオンより早く検出器に達する。
【００１７】
MALDI-TOF質量分析はペプチドとタンパク質の分析に非常に適している。核酸の分析はいくらか困難である(Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57（非特許文献１５）)。核酸への感度はペプチド類より約100倍悪く、断片サイズが増加するのに比例して低下する。多重に負に荷電した骨格を有する核酸に関しては、マトリックスによるイオン化過程はあまり効率的ではない。MALDI-TOF質量分析では、マトリックスの選択が極めて重要な役割を果たす。ペプチド類の脱着に関しては、非常によい結晶化を起こすいくつかの非常に効率的なマトリックスが見出された。現在、DNAのための高感度なマトリックスがいくつかあるが、感度は低下していない。感度の差は、ペプチドと同様になるように化学的にDNAを修飾することによって減少させることができる。簡単なアルキル化化学を使用することで、骨格の普通のりん酸エステル類がチオりん酸エステルで置換されるチオりん酸塩核酸を中性電荷のDNAに変換することができる(Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73（非特許文献１６）)。この修飾化DNAへの電荷タグの結合は、ペプチド類に関して見出されるのと同じレベルへ感度増加をもたらす。電荷標識付けのさらなる利点は、修飾されていない基質の検出をさらに困難にする不純物に対する分析の安定性を増加させることである。
【００１８】
遺伝子DNAは、細胞、組織または他の測定用試料のDNAから標準的な方法を用いて得られる。この標準的な方法は、Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989（非特許文献１７）のような文献で見出すことができる。
【００１９】
【特許文献１】
WO 95/00669
【特許文献２】
WO 99/28498
【特許文献３】
WO 97/46705
【特許文献４】
WO 95/15373
【非特許文献１】
Borsani G, et al., EYA4, a novel vertebrate gene related to Drosophila eyes absent. Hum Mol Genet 1999 Jan;8(1):11-23
【非特許文献２】
Wayne S, Robertson NG, DeClau F, Chen N, Verhoeven K, Prasad S, Tranebjarg L, Morton CC, Ryan AF, Van Camp G, Smith RJ: Mutations in the transcriptional activator EYA4 cause late-onset deafness at the DFNA10 locus. Hum Mol Genet 2001 Feb 1;10(3):195-200
【非特許文献３】
Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6)
【非特許文献４】
Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255
【非特許文献５】
Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8
【非特許文献６】
Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6)
【非特許文献７】
Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31,
【非特許文献８】
Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4
【非特許文献９】
Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431
【非特許文献１０】
Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95
【非特許文献１１】
Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6
【非特許文献１２】
Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4
【非特許文献１３】
1999年1月に発行されたNature Genetics (Nature Genetics補足、21巻、1999年1月)の特集号
【非特許文献１４】
Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301
【非特許文献１５】
Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry.Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57
【非特許文献１６】
Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73
【非特許文献１７】
Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989
【発明の開示】
【００２０】
（説明）
本発明は、細胞増殖性疾患の検出のための新規な方法を開示している。本発明は、結腸細胞増殖性疾患のマーカーとしての遺伝子EYA4およびそのプロモーターおよび調節エレメントを開示している。さらに詳しくは、開示されている事項は、種々のクラスの結腸細胞増殖性疾患を見分け、結腸細胞増殖性疾患を他の組織から発生する細胞増殖性疾患と区別し、当該遺伝子が結腸細胞増殖性疾患の検出に適用可能であることを示している。
【００２１】
発明の１つの局面では開示された事柄は前述の遺伝子の中でメチル化の分析に有用な新しい核酸配列を提供し、他の局面では遺伝子と遺伝子産物の新しい用途、結腸細胞増殖性疾患を検出、差別化、識別するための方法、分析評価、およびキット、その治療法、診断方法を提供する。
【００２２】
１つの実施態様では、この方法は結腸細胞増殖性疾患の分化、検出、および区別のためのマーカーとしての遺伝子EYA4の使用を開示している。遺伝子の前述の使用は遺伝子の発現の分析によって、mRNA発現分析か蛋白質発現分析によって可能になるであろう。しかしながら、発明の最も好ましい実施態様では、結腸細胞増殖性疾患の検出、差別化、および区別は遺伝子EYA4およびそのプロモーターまたは調節エレメントのメチル化状態の分析によって可能となる。
【００２３】
大腸癌検出システムでEYA4をコードするmRNAの存在を検出するために、試料を患者から入手する。試料は、組織生検試料か血液、血漿、血清または同様の試料でよい。試料は、それに含まれる核酸を抽出するために処理してよい。試料由来の核酸はゲル電気泳動か他の分離技術にかけられる。検出には、プローブとなるDNA配列と試料の核酸、特にmRNAとを接触させハイブリッド二本鎖を形成することが含まれる。ハイブリダイゼーションの厳密さは、ハイブリダイゼーションと洗浄手順の間の、温度、イオン強度、時間とホルムアミドの濃度などの多くの因子によって決定される。これらの因子は、例えば、Sambrook他に概説されている(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., 1989)。得られる二本鎖の検出は通常、標識プローブを用いて行う。あるいは、プローブはラベルされていないかもしれないが、しかし、直接または間接的にラベルされるリガンドとの特異的な結合によって検出可能であろう。標識化プローブとリガンドのための適当なラベルと方法は、当分野で知られている既知の方法(例えば、ニックトランスレーションかキナーゼ処理)が含まれてもよい、例えば、放射性のラベル、ビオチン、蛍光基、化学発光基(例えば、ジオキセタン類、特に誘起されたジオキセタン類)、酵素、抗体、および同様のものを含んでいる。
【００２４】
EYA4をコードするmRNAの試料中での検出感度を増加させるためには、EYA4をコードするmRNAから転写されるcDNAを増幅するのに逆転写/重合連鎖反応のテクニックを使用することができる。逆転写/ポリメラーゼ連鎖反応の方法は当分野でよく知られている(例えば、上記Watson and Flemingを参照)。
【００２５】
逆転写/PCR法は、以下のように実施することができる。細胞内総RNAは、例えば、標準のグアニジウムイソチオシアネート法によって単離され、そして、全RNAは逆転写される。逆転写法には、逆転写酵素と3'末端プライマーを使用し、RNAのテンプレート上でのDNA合成が含まれる。通常、プライマーはオリゴ(dT)配列を含む。このようにして作り出されるcDNAは、PCR法とEYA4特異的プライマーを用いて増幅される(Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press,N.Y., Vol.152, pp. 316-325, 1987、引用文献に含まれる)。
【００２６】
本発明は、生物試料を検査することにより、大腸癌疾病状態を検出する際に使用するためのキットとして、いくつかの実施形態で記述されうる。代表的なキットは、上述の選択的にEYA4 mRNAにハイブリダイズする１つ以上の核酸セグメントと１つ以上の核酸セグメントのそれぞれのための容器を含んでよい。ある実施形態では、核酸セグメントは単一のチューブの中に結合されてよい。また、さらなる実施形態では、核酸セグメントは目標mRNAを増幅するための１組のプライマーを含んでよい。また、そのようなキットはハイブリダイゼーション、増幅または検出反応のためのどんな緩衝剤、溶液、溶媒、酵素、ヌクレオチド、または他の成分も含んでよい。好ましいキット成分は、逆転写PCR、in situハイブリダイゼーション、ノーザン分析、および/又はRPAのための試薬を含んでよい。
【００２７】
本発明はさらに、患者から入手される試料中のポリペプチド、EYA4の存在を検出する方法を提供する。蛋白質を検出するために当分野で知られているどんな方法も使用することができる。そのような方法には、免疫拡散法、免疫電気泳動、免疫化学的方法、バインダーリガンド分析評価、免疫組織化学法、凝集、および補体分析評価が含まれるが、これらには限定されない(例えば、Basic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991を参照、引用文献に含まれる)。好ましいのは、EYA4のエピトープ（類）と抗体類を反応させて、標識EYA4タンパク質かその派生物と拮抗的に置き換わるものを含むバインダーリガンド免疫アッセイ法である。
【００２８】
本発明の実施形態には、EYA4の遺伝子によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体類の使用が含まれる。そのような抗体類は、患者の大腸疾病マーカー発現レベルを正常な個人における同じマーカーの発現と比べることによって疾病状態を検出する際に診断と予後適用に役立ちうる。ある実施形態では、抗原としてEYA4ポリペプチドを用いてモノクローナルまたはポリクローナル抗体の生産を引き起こすことができる。そのような抗体類は、今度は、ヒトの病気の状態のためのマーカーとして発現蛋白質を検出するのに使用されうる。患者の末梢血か前立腺組織試料中に存在するそのような蛋白質類のレベルは、従来の方法によって定量してよい。抗体蛋白質結合は、当分野で知られている蛍光の、または、放射性のリガンドでの標識化などのさまざまな手段によって、検出され、定量されてよい。発明はさらに上記の手順を実行するためのキットを含み、そのようなキットには、EYA4ポリペプチドに特異的な抗体類が含まれる。
【００２９】
多数の拮抗的、非拮抗的タンパク結合イムノアッセイが、当分野でよく知られている。そのような分析評価で使われる抗体類は、例えば凝集試験で使用されるようにラベルされなくてもよいし、さまざまな分析法での使用のためにラベルされてもよい。使用可能なラベルには、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学蛍光剤、酵素基質、コファクタ、酵素阻害剤、粒子、染料、放射標識免疫検定法(RIA)、エンザイムイムノアッセイ、例えば、酵素結合イムノソーベントアッセイ(ELISA)、蛍光免疫法における使用のための同様のものが含まれる。EYA4またはそのエピトープに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、当分野で知られている多くの方法のどれかによって、イムノアッセイで使用するために作ることができる。ある蛋白質に対する抗体を調製するための１つの方法は、その蛋白質のアミノ酸配列の全てまたは一部を選択して調製し、適当な動物、通常、ウサギまたはマウスにそれを注射することである(Milstein and Kohler Nature 256:495-497, 1975; Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981、引用文献に含まれている)。EYA4またはそのエピトープの調製のための方法には、化学合成、組換えDNA技術、生物試料からの単離が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
体液試料から大腸癌を検出するのに使用されるマーカーが現在ないので、本発明はかなりの改善を到達技術水準の上に提供する。結腸細胞増殖性疾患を検出し診断するのに使用される現在の方法には、大腸鏡検査、S字鏡検査、および便潜血大腸癌検査がある。これらの方法と比べて、開示された発明は、大腸鏡検査よりはるかに低侵略的で、S字鏡検査およびFOBTと少なくとも同程度に高感度である。文献における、これらのマーカーのこれまでの記述と比べて、本発明は高感度分析技術を使用する有利な組み合わせのため感度と特異性に関して重要な利点を提供する。
【００３１】
配列番号１とそれに相補的な配列によるゲノム配列内のCpGジヌクレオチドのメチル化状態の分析で本発明の目的を達成することができる。配列番号１は、遺伝子EYA4及びそのプロモーターおよび調節エレメントを開示し、前述の断片には疾病特異的メチル化パターンを示すCpGジヌクレオチドが含まれる。遺伝子EYA4、そのプロモーター、および調節エレメントのメチル化パターンはこれまで、細胞増殖性疾患に関しては分析されていない。遺伝暗号の縮重のため、配列番号１で特定される配列は、EYA4によってコードされるものの生物活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域の上流のすべての実質的に同様の、および同等な配列を含むと解釈すべきである。
【００３２】
方法の好ましい実施形態では、発明の目的は配列番号２〜５の１つによる少なくとも18塩基の長さの配列を含む核酸とそれに相補的な配列の分析で達成される。
【００３３】
配列番号２〜５は、配列番号１の核酸の改変体を提供し、ここで前述の配列の変換は独特であり以下の配列番号１とは異なった配列を持つ核酸の合成をもたらす（下の表１も参照）：配列番号１、EYA4遺伝子のセンスDNA鎖、そのプロモーター、および調節エレメント;配列番号２、変換された配列番号１、ここで「C」または「T」、しかし「cp.」は「cp.」のまま（すなわち、配列番号１に関してcpジヌクレオチド配列のすべての「C」残基がメチル化され、従って変換されない場合に対応する）; 配列番号３、配列番号１の相補鎖、ここでは「C」から「T」しかし「cp.」は「cp.」のまま（すなわち、配列番号１の相補鎖(アンチセンス鎖)に関してcpジヌクレオチド配列のすべての「C」残基がメチル化され、従って変換されない場合に対応する）；配列番号４、変換された配列番号１、ここで「cp.」ジヌクレオチド配列の残基を含むすべての「C」残基で「C」から「T」（すなわち、配列番号１に関して、cpジヌクレオチド配列のすべての「C」残基がメチル化されていない場合に対応する）；配列番号５、配列番号１の相補鎖、ここで、CpGジヌクレオチド配列の残基を含むすべての「C」残基について「C」から「T」（すなわち、配列番号１の相補鎖(アンチセンス鎖)についてCpGジヌクレオチド配列のすべての「C」残基がメチル化されていない場合に対応する）。
【００３４】
【表１】
2005518218.tif 000056
【００３５】
配列番号１〜５の核酸配列および分子は、これまでほとんど、結腸細胞増殖性疾患の確認法とは関係も関連もなかった。
【００３６】
本発明は、さらに配列番号２〜５による前処理DNA中のシトシンのメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを開示する。前述のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは適度に厳しいか又は厳しい条件(本明細書において上で定義したように)のもとで配列番号２〜５および／または、それに相補的な配列により、前処理した核酸配列へハイブリダイズする少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する核酸配列を含む。
【００３７】
したがって、本発明は適度に厳しい、および/または、厳しいハイブリダイゼーション条件下で配列番号２〜５の配列の全てまたは部分、または、それの相補体とハイブリダイズする核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸(PNA)分子（PNA-オリゴマー））を含む。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分の長さは、通常少なくとも9、15、20、25、30または35ヌクレオチドである。しかしながら、より長い分子は、発明上の有用性を有し、本発明の範囲の中にある。
【００３８】
本発明のハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、配列番号２〜５の配列、またはその一部、またはその相補体と少なくとも95%、または少なくとも98%、または100%同じであるのが好ましい。
【００３９】
本明細書に記載のタイプのハイブリダイゼーション用核酸は、例えば、プライマー(例えば、PCRプライマー)か診断的および/または予後徴候的プローブ又はプライマーとして使用することができる。核酸試料へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを厳しい条件下で実行し、プローブは標的配列と100%同じであるのが好ましい。核酸の二本鎖、または、ハイブリッドの安定性は融点かTmとして表され、それは、プローブが目標のDNAから解離する温度である。この融点は、必要な厳しさの条件を定義するのに使用される。
【００４０】
同じであるというよりもむしろ配列番号１(EYA41対立遺伝子変異型やSNPsなどの)の対応する配列と関連していて実質的に同じである標的配列において、相同のハイブリダイゼーションだけが特定の塩濃度(例えば、SSCかSSPE)で起こる最低温度を最初に確立することが有用である。次に、Tmが1℃下がるのはミスマッチ1%の結果であると仮定して、ハイブリダイゼーション反応における、最終的な洗浄温度をそれに伴って下げる(例えば、プローブと95%を越える同一性を持っている配列を探すなら、最終的な洗浄温度を5℃下げる)。実際には、1%のミスマッチ当たりのTmの変化は0.5℃と1.5℃の間である。
【００４１】
例えば配列番号１のポリヌクレオチド位置で示すように、長さX(ヌクレオチドで)の発明のオリゴヌクレオチドに関する例は長さXの連続して重なっているオリゴヌクレオチドの組に対応するものを含んでおり、それぞれ連続して重なる組(与えられたX値に対応する)の中のオリゴヌクレオチドはヌクレオチド位置からZオリゴヌクレオチドの有限集合であると定義される：
nから(n + (X-1));
ここでn=1, 2, 3,…(Y-(X-1));
ここでYは配列番号１の長さ(ヌクレオチド又は塩基対)に等しい;
ここでXはその組(例えば、連続して重なる20量体の１組ではX=20)における、それぞれのオリゴヌクレオチドの共通の長さ(ヌクレオチドにおける)に等しい;
そして、ここで長さYの与えられた配列番号に関する長さXの連続して重なるオリゴマーの数(Z)はY-(X-1)に等しい。例えば、配列番号１のセンス又はアンチセンスの組のどちらかに関してはZ=2,785-19=2,766。ここでX=20。
【００４２】
その組を少なくとも１つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドから成るそれらのオリゴマーに制限するのが好ましい。
【００４３】
本発明は、配列番号２〜５(センス及びアンチセンス)のそれぞれに関して多重の連続して重なる組のオリゴヌクレオチド又は長さXの修飾オリゴヌクレオチドを含み、ここで例えばX= 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30又は 35 ヌクレオチド。
【００４４】
本発明によるオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、配列番号１に対応するゲノム配列の遺伝的及び後生的なパラメータを確かめるために有効な手段を構成する。そのようなオリゴヌクレオチド又は長さXの修飾オリゴヌクレオチドの好ましい組は、配列番号１〜５(およびそれらの相補体)に対応するオリゴマーの組を連続して重ね合わせるものである。前述のオリゴマーは少なくとも１つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むのが好ましい。これらの好ましい組に含まれているのは、配列番号１１〜１５に対応する好ましいオリゴマーである。
【００４５】
本発明による特に好ましいオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、CpGジヌクレオチド(または対応する変換されたTpG又はCpAジヌクレオチドの)配列のシトシンがオリゴヌクレオチドの中の1/3の中にあるものである; すなわち、例えばオリゴヌクレオチドが、長さが13塩基で、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドが5'末端から5〜9番目のヌクレオチド内にあるものである。
【００４６】
オリゴヌクレオチドの活性、安定性または検出を高めるために、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを１つ以上の部分又は結合体に化学的にリンクさせることによって修飾することができる。そのような部分又は結合体は、例えば、米国特許第5,514,758, 5,565,552, 5,567,810, 5,574,142, 5,585,481, 5,587,371, 5,597,696及び5,958,773号に開示されているコレステロール、胆汁酸、チオエーテル、脂肪鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール(PEG)、パルミチル部分などの発色団、蛍光体、脂質を含む。また、プローブは特に好ましい対合特性を有するPNA(ペプチド核酸)の形で存在してもよい。従って、オリゴヌクレオチドは、ペプチド類などの他の追加された基を含んでもよく、ハイブリダイゼーションで引き起こされる分裂剤(Krol et al., BioTechniques 6:958-976, 1988)やインターカレート剤を含んでもよい(Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988)。この末端まで、オリゴヌクレオチドは別の分子、例えば、発色団、蛍光体、ペプチド、ハイブリダイゼーションで引き起こされる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションで引き起こされる分裂剤などに抱合されてよい。
【００４７】
オリゴヌクレオチドは、また、少なくとも１つの当分野で既知の修飾糖および/又は塩基を含んでもよく、または修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含んでもよい。
【００４８】
本発明によるオリゴマーは、配列番号１及び配列番号１又は配列番号２〜５による前処理核酸及びそれらに相補的な配列内の対応するCG、TG又はCAジヌクレオチドに相補的な配列を含むゲノム配列のCpGジヌクレオチドの各々の分析のための少なくとも１つのオリゴマーを含む、いわゆる「組」で通常使用される。当該遺伝子、配列番号２〜５及び配列番号１の前処理版及びゲノム版の両方における遺伝子EYA4、そのプロモーター、および調節エレメント内のCpGジヌクレオチドの各々に対する少なくとも１つのオリゴマーを含む組が好ましい。しかしながら、経済的、又は、他のファクターのために、前述の配列内のCpGジヌクレオチドの限られた選択を分析するのが好ましいかもしれないと予想されており、オリゴヌクレオチドの組の内容はそれなりに変更されるべきである。従って、本発明はさらに、前処理されたゲノムDNA(配列番号２〜５及びそれに相補的な配列)及びゲノムDNA(配列番号１及びそれに相補的な配列)中のシトシンメチル化状態を検出するのに使用する少なくとも3nの組(オリゴヌクレオチド及び/又はPNA-オリゴマー)に関する。これらのプローブは、細胞増殖性疾患の遺伝的及び後生的なパラメータの診断及び/又は治療を可能にする。また、オリゴマーの組は、前処理されたゲノムDNA(配列番号２〜５、およびそれらに相補的な配列)及びゲノムDNA(配列番号１、およびそれに相補的な配列)中の一塩基変異多型(SNPs)を検出するのに使用されるかもしれない。
【００４９】
さらに、本発明は配列番号１〜５及びそれに相補的な配列又は、その断片のうちの１つのDNA配列を増幅するための、いわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用することができる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの組を利用できるようにする。
【００５０】
本発明によるオリゴヌクレオチドの組の場合では、オリゴヌクレオチドの組の少なくとも１つ、より好ましくは全部を固相に結合するのが好ましい。
【００５１】
本発明によれば、異なるオリゴヌクレオチド及び/又は、本発明によって利用可能にされるPNA-オリゴマー(いわゆる「アレイ」)のアレンジメントが、同様に固相に結合されるように存在するのが好ましい。異なるオリゴヌクレオチド-及び/又はPNA-オリゴマー配列のこのアレイは、それが固相に長方形の又は六角形の格子の形で配置されるという点で特徴付けることができる。固相の表面は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鉄鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、または金で構成するのが好ましい。しかし、ニトロセルロース、ペレットの形で存在できるナイロンなどのプラスチック又は樹脂マトリックスを使用してもよい。
【００５２】
従って、本発明のさらなる内容は細胞増殖性疾患に関する分析のための担体材料に固定されるアレイを製造するための方法であり、その方法では本発明による少なくとも１つのオリゴマーを固相と結合させる。そのようなアレイを製造するための方法には、例えば、固体相化学と光官能性保護基による米国特許第5,744,305号が知られている。
【００５３】
本発明のさらなる内容は、細胞増殖性疾患の分析のためのDNAチップに関する。DNAチップでは、例えば米国特許第5,837,832号が知られている。
【００５４】
本発明はさらに、検出、分別及び結腸細胞増殖性疾患を識別するために役に立つ物質組成物を提供する。当該組成物は、配列番号２〜５で開示された核酸配列の断片の長さが18塩基対の少なくとも１つの核酸から成り、以下の群から選ぶ１つ以上の物質から成る：
1〜5 mM の塩化マグネシウム、100〜500μMのdNTP、0.5〜5単位のtaqポリメラーゼ、ウシ血清アルブミン、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸(PNA)オリゴマー、ここで当該オリゴマーは、各場合で、配列番号２〜５の１つにより前処理されたゲノムDNA及びそれに相補的な配列に相補的であるか又は、適度に厳しい又は厳しい条件下でハイブリダイズする少なくとも9ヌクレオチドの長さを持つ少なくとも１つの塩基配列を含む。前述の組成物は水溶液中での前述の核酸の安定化に適切で前述の溶液中でのポリメラーゼベースの反応を可能にする緩衝液を含むのが好ましい。適当な緩衝剤は、当分野で知られており購入可能である。
【００５５】
本発明はさらに、遺伝子EYA4、そのプロモーター、および調節エレメントの遺伝的及び/又は後生的パラメータを確かめるために分析評価を行うための方法を提供する。以下の方法に従った分析評価を遺伝子EYA4中のメチル化を検出するのに使用するのが最も好ましく、ここで当該メチル化された核酸は過剰のバックグラウンドDNAを含む溶液中に存在し、当該バックグラウンドDNAは検出するDNA濃度の100〜1000倍存在する。前記方法は、少なくとも１つの試薬又は試薬群を用い前記被検者より得られた核酸試料への接触を含み、ここで当該試薬又は、試薬群は目標核酸中のメチル化されたCpGジヌクレオチドと及び非メチル化されたCpGジヌクレオチドを識別する。
【００５６】
当該方法は以下の段階から成るのが好ましい：第１段階では、分析する組織試料を入手する。起源は適当な起源でよいが、組織学スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、血漿、血清、大便、尿、血液、及びそれらの組み合わせから成る群から試料源を選ぶのが好ましい。起源は、生検、体液、尿、又は血液であるのが好ましい。
【００５７】
次に、DNAを試料から単離する。抽出は、洗剤の使用、音波処理、ガラスビーズとの撹拌など、当業者には標準的な手段で行ってよい。一度核酸を抽出したら、ゲノム二本鎖DNAを分析に使用する。
【００５８】
この方法の第２段階では、ゲノムDNA試料は、5'位置でメチル化されていないシトシン塩基がウラシル、チミン、又はハイブリダイゼーション特性がシトシンと異なる別の塩基に変換されるように処理される。これは、本明細書では、「前処理」と理解されよう。
【００５９】
ゲノムDNAの上記の処理は、亜硫酸水素塩(亜硫酸水素、ニ亜硫酸塩(disulfite))及びその後、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシル又は塩基対形成特性がシトシンと異なる別の塩基への変換が起こるアルカリ加水分解により実行されるのが好ましい。分析するDNAをアガロースマトリックスに封入し、それによって、DNA(亜硫酸水素塩は一本鎖DNAとだけ反応する)の拡散と復元を防ぎ、すべての析出及び精製段階を速い透析で置き換える(Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996)。亜硫酸水素塩処理は、ラジカル補足剤又はDNA変性剤存在下で行うのがさらに好ましい。
【００６０】
この方法の第３段階では、前処理されたDNA断片を増幅する。DNA源が血清由来のフリーなDNA、又はパラフィンから抽出されたDNAであれば、増幅断片の大きさは長さが100〜200塩基対であることが特に好ましく、当該DNA源が細胞起源(例えば、組織、生検、細胞系)から抽出される場合には、増幅断片の大きさは長さが100〜350塩基対であることが好ましい。当該増幅断片は少なくとも少なくとも３つのCpGジヌクレオチドを含む少なくとも１つの20塩基対の配列を含むのが特に好ましい。当該増幅は、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチドの組、及び好ましくは熱安定性ポリメラーゼを用いて行う。同時に全く同じ反応容器でいくつかのDNA断片の増幅を行うことができ、この方法の１つの実施形態では、６以上の断片を同時に増幅するのが好ましい。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて行う。プライマーオリゴヌクレオチドの組は、配列が配列番号２〜５の塩基配列及びそれに相補的な配列の少なくとも18塩基対長さの断片と逆相補、同一、又は厳しい又は非常に厳しい条件下でハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００６１】
この方法の別の実施形態では、配列番号２〜５を含む核酸配列中の予め選択したCpG位置のメチル化状態はメチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドを用いて検出してよい。この手法(MSP)は、Hermanへの米国特許第6,265,171号に記載されている。亜硫酸水素塩処理DNAの増幅のためのメチル化状態特異的プライマーを用いることにより、メチル化核酸と非メチル化核酸間の識別が可能になる。MSPプライマー対は、亜硫酸水素塩処理CpGジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含む。従って、当該プライマーの配列は、少なくとも１つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。非メチル化DNAに特異的なMSPプライマーは、CpG内のC位の3'位にTを含む。従って 、好ましくは、当該プライマーの塩基配列は、配列番号２〜５による前処理核酸配列とハイブリダイズする長さが少なくとも18ヌクレオチドの配列及びそれに相補的な配列を含む必要がある。ここで、当該オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。本発明によるこの方法の実施形態では、MSPプライマーが2〜4のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むことが特に好ましい。当該ジヌクレオチドがプライマーの3'側の半分の中にあるのがさらに好ましい。例えば、ここでプライマーは長さが18塩基であり、特定のジヌクレオチドが分子の3'端からの最初の9塩基の中にある。CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドに加えて、当該プライマーは、さらに数個の亜硫酸水素塩変換塩基を含むこと(すなわち、シトシンがチミンに変えられ、またはハイブリダイズする鎖上で、グアニンはアデノシンに変えられる)がさらに好ましい。さらに好ましい実施形態では、当該プライマーは、シトシン又はグアニン塩基が2を越えないように設計する。
【００６２】
この方法の１つの実施形態では、プライマーは、配列番号６〜１０からなる群から選んでよい。
【００６３】
増幅によって得られる断片は、直接又は間接的に検出可能なラベルを保有できる。好ましいのは、蛍光ラベル、放射性核種、または質量分析計で検出可能な典型的な質量を有する脱着可能な分子断片の形でのラベルである。当該ラベルが質量ラベルである場合には、ラベルされた増幅物は単一の正又は負の実効電荷を有し、質量分析計で、より良く検出できることが好ましい。検出は、例えばマトリックス支援レーザ脱離/イオン化質量分析法(MALDI)によって、又は電子スプレー質量分析法(ESI)を用いることにより実行され可視化されてよい。
【００６４】
マトリックス支援レーザ脱離/イオン化質量分析法(MALDI-TOF)は、生体分子の分析のための極めて効率的な開発産物である(Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988)。検体は光吸収マトリックスに埋め込まれる。マトリックスは短いレーザパルスによって蒸発させられ、その結果、断片化しないように検体分子を気相に輸送する。検体はマトリックス分子との衝突でイオン化される。印加電圧は、イオン類を無場飛行管の中に加速する。それらの異なる質量のため、イオン類は異なる速度で加速される。小さいイオン類は、大きいオン類より早く検出器に到達する。MALDI-TOFスペクトロメトリーは、ペプチドとタンパク質の分析に適している。核酸の分析はいくらか難しい(Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995)。核酸分析に関する感度は、ペプチド類より約100倍低く、断片サイズが増加するのに反比例して低下する。さらに、負に多荷電した骨格を有する核酸に関しては、マトリックスによるイオン化過程はあまり効率的ではない。MALDI-TOFスペクトロメトリーでは、マトリックスの選択が極めて重要な役割を演じる。ペプチド類の脱着に関しては、非常によい結晶化を起こす、いくつかの非常に効果的なマトリックスが発見された。現在、DNAのためのいくつかの敏感なマトリックスがあるが、ペプチドと核酸の間の感度の差は縮まっていない。しかし、感度のこの差は、ペプチドにより似るようにDNAを化学修飾することで縮めることができる。例えば、骨格の通常のりん酸エステル類をチオりん酸エステルで置換したチオりん酸塩核酸は、簡単なアルキル化化学を使用して電荷が中性のDNAに変換できる(Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995)。この修飾DNAへの電荷タグの結合は、MALDI-TOF感度をペプチド類に関して見つけられた感度と同じレベルまで高める。電荷タグ付けのさらなる利点は、未修飾の基質の検出を相当困難にする不純物に対する分析の安定性を高めることである。
【００６５】
この方法の特に好ましい実施形態では、ブロッカーオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの種の存在下で段階３の増幅を実行する。そのようなブロッカーオリゴヌクレオチドの使用は、Yu et al., BioTechniques 23:714-720, 1997に説明されている。ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用すれば、核酸の亜集団の増幅の特異性を改良できる。核酸にハイブリダイズするブロッキングプローブは、当該核酸のポリメラーゼ介在増幅を抑制又は阻止する。この方法の１つの実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、バックグラウンドDNAにハイブリダイズするように設計される。この方法のさらなる実施形態では、当該オリゴヌクレオチドはメチル化された核酸と対照的に非メチル化核酸の増幅を阻止するか又は抑制するように、又は逆に設計される。
【００６６】
ブロッキングプローブオリゴヌクレオチドは、PCRプライマーと同時に亜硫酸水素塩処理核酸にハイブリダイズされる。核酸のPCR増幅は、ブロッキングプローブに相補的な配列が存在するところで核酸の増幅が抑圧されるようにブロッキングプローブの5'位置で終了される。プローブは、メチル化状態に特定であるように、亜硫酸水素塩処理核酸とハイブリダイズするように設計されてよい。例えば、非メチル化核酸の集団の中でのメチル化核酸の検出においては、問題の位置で非メチル化されている核酸の増幅の抑制は'CpG'と対照的に問題の位置で'TpG'を含むブロッキングプローブの使用によって実行されるであろう。この方法の１つの実施形態では、当該ブロッキングオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２〜５から成り、好ましくは１以上のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドからなる群から選択した、長さが少なくとも18塩基対の配列に相補的である又はそれと同一であるべきである。この方法の１つの実施形態では、当該オリゴヌクレオチドの配列を、配列番号１５及び１６並びにそれに相補的な配列から成る群から選ぶ。
【００６７】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するPCR法に関して、ポリメラーゼ介在増幅の効率的な中断には、ブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長されないことが必要である。3'-デオキシオリゴヌクレオチド又は3'位がフリーの水酸基以外で置換されたオリゴヌクレオチドであるブロッカーを用いてこれを達成するのが好ましい。例えば、3'-O-アセチルオリゴヌクレオチド類は、好ましい種類のブロッカー分子を代表している。
【００６８】
さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ介在分解は、排除されなければならない。そのような排除は5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用すること又は例えばブロッカー分子ヌクレアーゼ抵抗性を付与する5'-末端でのチオエート架橋を有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用することを含むのが好ましい。特殊適用では、ブロッカーのそのような5'修飾を必要としないかも知れない。例えば、もしブロッカーとプライマー結合部位が重なるなら、それによってプライマーの結合を排除し(例えば、過剰のブロッカーと)、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解は実質的に排除されるであろう。これはポリメラーゼがブロッカーに向かって、及びブロッカーを通って(5'-3'方向に)プライマーを伸ばさないからである−通常ハイブリダイズしたブロッカーオリゴヌクレオチドの分解をもたらす過程。
【００６９】
本発明の目的のために、そして本明細書で実行する際に特に好ましいブロッカー/PCRの実施形態は、オリゴヌクレオチドをブロックするためのペプチド核酸(PNA)オリゴマーの使用を含む。そのようなPNAブロッカーオリゴマーはポリメラーゼによって分解されず、また伸長もされないので理想的である。
【００７０】
この方法の実施形態ではブロッキングオリゴヌクレオチドの結合部位は、プライマーのそれと同じであるか、重なり、その結果、結合部位へのプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる。この方法のさらなる好ましい実施形態では、2つ以上のそのようなブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する。特に好ましい実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの１つのハイブリダイゼーションは順方向のプライマーのハイブリダイゼーションを妨げ、プローブ(ブロッカー)オリゴヌクレオチドの別のもののハイブリダイゼーションは当該順方向のプライマーの増幅産物に結合する逆方向プライマーのハイブリダイゼーションを妨げる。
【００７１】
この方法の別の実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは処理されたバックグラウンドDNAの逆及び順方向プライマー位置の間の場所にハイブリダイズし、その結果、プライマーオリゴヌクレオチドの伸張を妨げる。
【００７２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドがプライマーの濃度の少なくとも５倍存在していることが特に好ましい。
【００７３】
この方法の第４段階では、処理の前のCpGジヌクレオチドのメチル化状態を確かめるために、この方法の第３段階の間に得られた増幅物を分析する。
【００７４】
MSP増幅及び/又はブロッキング用オリゴヌクレオチドよって増幅物が得られる実施形態では、増幅物の存在又は非存在自体が、その塩基配列によって、プライマー及び／又はブロッキング用オリゴヌクレオチドによってカバーされるCpG位のメチル化状態を示す。ゲル電気泳動、配列決定、液体クロマトグラフィー、ハイブリダイゼーション、リアルタイムPCR分析またはそれらの組み合わせ等の（しかしこれらに限定されない）あらゆる可能な既知の分子生物学的方法を、この検出に使用してよい。この方法のこの段階はさらに、前の段階の質的コントロールとして働く。
【００７５】
この方法の第４段階では、標準的及びメチル化特異的PCRの両方によって得られる増幅物をさらに分析し、この方法の第１段階で単離されたゲノムDNAのCpGメチル化状態を決定する。これは、アレイ技術及びプローブベース技術並びに配列決定やテンプレート依存伸長などの方法によって実施してよいが、これらには限定されない。
【００７６】
この方法の１つの実施形態では、段階３で合成される増幅物を次に、オリゴヌクレオチド及び/又はPNAプローブのアレイ又は組とハイブリダイズさせる。この場合には、ハイブリダイゼーションは以下のように行う：ハイブリダイゼーションの間に使用されるプローブの組は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド又はPNA-オリゴマーから成るのが好ましい；この過程では、増幅物は、固相に予め結合させたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプローブとなる；ハイブリダイズしない断片を次に取り除く；当該オリゴヌクレオチドは、配列番号２〜５の塩基配列の断片と逆相補的又は同一な少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を含む；そして、その断片は、少なくとも１つのCpG、TpG又はCpAジヌクレオチドを含む。
【００７７】
好ましい実施形態では、当該ジヌクレオチドが、オリゴマーの中央の３分の１に存在する。例えば、当該ジヌクレオチドは13量体の5'末端から5〜9番目のヌクレオチドであるのが好ましく、ここでオリゴマーは１つのCpGジヌクレオチドを含む。１つのオリゴヌクレオチドが、配列番号１内の各CpGジヌクレオチド、及び配列番号２〜５内の同等な位置の分析のために存在する。また、当該オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸の形で存在してもよい。次に、ハイブリダイズしない増幅物を取り除く。ハイブリダイズした増幅物を検出する。この場合には、増幅物に付けられたラベルはオリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位置で識別可能であることが好ましい。
【００７８】
この方法のさらなる実施形態では、CpG位のゲノムメチル化状態は、PCR増幅プライマーと同時に亜硫酸水素塩処理DNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブによって確かめられてよい(ここで当該プライマーはメチル化特異的でも標準的なものでもよい)。
【００７９】
この方法の特に好ましい実施形態は、蛍光ベースリアルタイム定量的PCRの使用である(Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996; 米国特許第6,331,393号も参照)。この方法を利用する２つの好ましい実施形態がある。TaqMan(商標)分析として知られる1つの実施形態では、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使う。TaqMan(商標) PCR反応は、TaqMan(商標)プローブと呼ばれ、順及び逆方向の増幅プライマーの間に位置するGpCリッチ配列にハイブリダイズするように設計された非伸長性探査オリゴヌクレオチドを使用する。TaqMan(商標)プローブはさらに、TaqMan(商標)オリゴヌクレオチドのヌクレオチド類に付けられたリンカ部分(例えば、フォスフォアミダイト類)に共有結合した蛍光「レポーター部分」及び「消光剤部分」を含む。ハイブリダイズされたプローブは、増幅反応のポリメラーゼによって置換・破壊され、その結果、蛍光が増大する。亜硫酸水素塩処理後の核酸内メチル化分析のためには、MethylLight分析として知られ、米国特許第6,331,393号（これによって本明細書に収録される）に記載されているように、そのプローブはメチル化特異的である必要がある。この技術の第２の好ましい実施形態は、二重プローブ技術(Lightcycler(登録商標）)であり、それぞれが供与性又は受容性の蛍光部分を有し、互いに接近する２つのプローブのハイブリダイゼーションが、増加又は蛍光増幅プライマーによって示される。これらの手法の両方は、亜硫酸水素塩処理DNAでの使用に、そしてさらに、CpGジヌクレオチド内のメチル化分析に適するように改変してよい。
【００８０】
この方法のさらなる好ましい実施形態では、この方法の第４段階は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997に記載のMS-SNuPEのようなテンプレート指示オリゴヌクレオチド伸長の使用を含む。当該実施形態では、Ms-SNuPEプライマーが配列番号２〜５の群から選ぶ配列の１つ以上の長さが少なくとも9ヌクレオチド、好ましくは25ヌクレオチドを越えない配列と同一又は相補的であることが好ましい。
【００８１】
この方法のさらなる実施形態では、この方法の第４段階には、この方法の第３段階で発生する増幅物の配列決定とその後の配列分析が含まれる(Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977)。
【００８２】
発明のさらなる実施形態は、前処理の必要なしで、発明(配列番号１)によるゲノムDNAのメチル化状態の分析のための方法を提供する。
【００８３】
そのようなさらなる実施形態の第１段階では、ゲノムDNA試料を組織又は細胞源から単離する。好ましくは、そのような単離源には細胞系、組織学的スライド標本、体液、又はパラフィン包埋組織が含まれる。抽出は、洗剤の使用、音波処理及びガラスビーズとの撹拌など当業者には標準的な手段で行って構わないが、これらには限定されない。核酸が抽出されれば、ゲノム二本鎖DNAを分析に使用する。
【００８４】
好ましい実施形態では、処理の前にDNAを分割してもよく、これは現状技術で標準的な手段、特にメチル化感受性制限酵素で行ってよい。
【００８５】
第２段階では、次に１以上のメチル化感受性制限酵素でそのDNAを消化する。制限部位におけるDNAの加水分解が特定のCpGジヌクレオチドのメチル化状態の情報を与えるように消化を行う。
【００８６】
任意ではあるが好ましい実施形態である第３段階で、制限酵素断片を増幅する。これはポリメラーゼ連鎖反応を用いて行うのが好ましく、当該増幅物は、蛍光発色団ラベル、放射性核種及び質量ラベルのような上述の適当な検出可能なラベルを有してよい。
【００８７】
最終段階では、増幅物を検出する。検出は、当分野で標準的な手段、例えば、ゲル電気泳動分析、ハイブリダイゼーション分析、PCR生成物内への検出可能なタグの取り込み、DNAアレイ分析、MALDIまたはESI分析で行ってよいが、これらには限定されない。
【００８８】
本発明は、EYA4遺伝子及びそのプロモーター又は調節エレメント中の重要な遺伝的及び/又は後生的パラメータをマーカーとして使ってよい患者又は個人に不利な出来事の診断及び/又は予後を可能にする。本発明によって得られる当該パラメータは、もう１組の遺伝的及び/又は後生的なパラメータと比べてよく、それらの差は患者又は個人に不利な出来事の診断及び/又は予後のための基礎となる。
【００８９】
特に本発明は、EYA4 CpGジヌクレオチド配列の特異なメチル化の測定に基づく診断的及び/又は予後的癌分析評価を提供する。そのような特異なメチル化を測定するために役に立つ好ましい遺伝子配列は、本明細書の配列番号１〜５で表される。典型的には、そのような分析評価は試験組織からの組織試料を得て、対照試料に対して組織試料由来の本発明のEYA4特異的CpGジヌクレオチド配列の少なくとも１つのメチル化状態を測定するためのアッセイを実行し、それに基づいて診断又は予後をすることを伴う。
【００９０】
特に好ましい実施形態では、例えば配列番号１１〜１５に相当する代表的な好ましいオリゴマーを含む、配列番号１〜５に基づく配列のような、発明のオリゴマー又はそれに基づくアレイ並びにそれに基づくキットは、EYA4特異的なCpGジヌクレオチドメチル化状態を評価するために使用され、癌及び/又は他の前立腺細胞の増殖疾患の診断及び/又は予後のために有用である。
【００９１】
本発明はさらに、結腸細胞増殖性疾患の診断及び/又は療法のための診断薬及び/又は治療薬に関し、この診断用薬及び/又は治療薬は、配列番号１〜５に基づく少なくとも１つのプライマー又はプローブが、可能ならば適当な添加物及び補助の薬剤と共にそれを製造するのに使用されるという点に特徴がある。１つの実施形態では、EYA4ポリペプチド又はその断片又は誘導体を、大腸癌を治療又は予防するために被検者に投与してよい。
【００９２】
別の実施形態では、EYA4を発現できるベクター又はその断片又は誘導体も、大腸癌を治療又は予防するために被検者に投与してよい。
【００９３】
別の実施形態では、EYA4に特異的な作用薬を、EYA4の活性を刺激するか、長引かせるのに使用してよく、大腸癌を治療又は予防するために被検者に投与してよい。
【００９４】
他の実施形態は、上記の治療用タンパク質又はベクターのどちらかを、他の適切な治療薬と組み合わせて投与してよい。組み合わせ療法での使用のための適切な医薬品の選択は、従来の製薬の原則に従い、当分野における通常の技術で行ってよい。治療薬の組み合わせは、大腸癌の治療又は予防に効果があるように相乗的に作用してよい。このアプローチを用いて、各薬剤をより少なく用い、不都合な副作用の可能性を低下させながら、治療効果を達成してよい。
【００９５】
レトロウイルス、アデノウィルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルス由来の又は様々の細菌プラスミド由来の発現ベクターを、標的器官、組織又は細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いてよい。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、薬学的に許容できる担体に関する医薬組成物の投与に関する。そのような医薬組成物は、EYA4又はEYA4の作用薬から成ってよい。その組成は、単独で又は安定剤のような他の少なくとも１つの薬剤と組み合わせて投与してよく、それは食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水等（しかしこれらには限定されない）の無菌で、生体適合性の薬学的担体注に混ぜて投与してよい。その組成物は、単独で、又は他の薬剤、薬又はホルモンと組み合わせて患者に投与してよい。
【００９７】
この発明で利用される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、又は直腸的手段等の種々の経路によって投与してよいが、これらに限定されない。
【００９８】
活性成分の他に、これらの医薬組成物は、薬学的に使用することができ、活性物質を薬剤に調製し易くする賦形剤と助剤を含む適当な、薬学的に許容できる担体を含んでよい。製剤と投与のための技術に関する詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)の最新版が参考になる。
【００９９】
更に、本発明の別の側面は、例えば以下のものから成るキットである：亜硫酸水素塩含有試薬、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドであって、その配列が、いずれの場合においても、配列番号１〜５の配列の18塩基長のセグメントに対応するか、これに対して相補的であるか、或いは、厳密な条件又は極めて厳密な条件下でハイブリダイズするもの。前記キットは、更に、説明した方法を実行及び評価するための説明書を含んでもよい。更に好適な実施形態において、前記キットは、更に、CpG位置特異的メチル化分析を行うための標準的な試薬を備えてもよく、前記分析は、以下の手法のうち１つ以上を含む：MS-SNuPE、MSP、MethyLightTM、HeavyMethylTM、COBRA、及び核酸配列決定。しかしながら、本発明に沿ったキットは、前述の構成要素の一部のみを含むことができる。
【０１００】
COBRA分析の代表的な試薬（COBRAに基づく代表的なキットにおいて確認できるもの等）は、特異的遺伝子（或いはメチル化改変DNA配列又はCpGアイランド）に関するPCRプライマーと；制限酵素及び適切な緩衝剤と；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴと；対照ハイブリダイゼーションオリゴと；オリゴプローブ用キナーゼ標識キットと；放射性ヌクレオチドとを含むことができるが、これらに限定されない。加えて、亜硫酸水素塩変換試薬は、DNA変性緩衝剤と；スルホン化緩衝剤と；DNA回収試薬又はキット（沈殿、限外濾過、アフィニティカラム等）と；脱スルホン化緩衝剤と；DNA回収成分とを含むことができる。
【０１０１】
MethyLight（登録商標）分析の代表的な試薬（MethyLight（登録商標）に基づく代表的なキットにおいて確認できるもの等）は、特異的遺伝子（或いはメチル化改変DNA配列又はCpGアイランド）に関するPCRプライマーと；TaqMan（登録商標）プローブと；最適化PCR緩衝剤と；デオキシヌクレオチドと；Taqポリメラーゼとを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１０２】
MS-SNuPE分析の代表的な試薬（MS-SNuPEに基づく代表的なキットにおいて確認できるもの等）は、特異的遺伝子（或いはメチル化改変DNA配列又はCpGアイランド）に関するPCRプライマーと；最適化PCR緩衝剤と；デオキシヌクレオチドと；ゲル抽出キットと；陽性対照プライマーと；特異的遺伝子に関するMS-SNuPEプライマーと；反応緩衝剤（MS-SNuPE反応用）と；放射性ヌクレオチドとを含むことができるが、これらに限定されない。加えて、亜硫酸水素塩変換試薬は、DNA変性緩衝剤と；スルホン化緩衝剤と；DNA回収試薬又はキット（沈殿、限外濾過、アフィニティカラム等）と；脱スルホン化緩衝剤と；DNA回収成分とを含むことができる。
【０１０３】
MSP分析の代表的な試薬（MSPに基づく代表的なキットにおいて確認できるもの等）は、特異的遺伝子（或いはメチル化改変DNA配列又はCpGアイランド）に関するメチル化及び非メチル化PCRプライマーと、最適化PCR緩衝剤と、デオキシヌクレオチドと、特異的プローブとを含むことができるが、これらに限定されない。
【０１０４】
（定義）
本発明において、「CpGアイランド」という用語は、（１）0.6を上回る「観測／予測比率」に対応するCpGジヌクレオチドの頻度を有し、（２）0.5を上回る「GC含有量」を有するという基準を満たすゲノムDNAの隣接領域を指す。CpGアイランドは、常にではないが、通常、約0.2〜約1ｋｂの長さである。
【０１０５】
本発明において、「メチル化状態」又は「メチル化状況」という用語は、DNA配列内の１つ又は複数のCpGジヌクレオチドにおける5-メチルシトシン（「5-mCyt」）の存在又は欠失を指す。DNA配列内の１つ以上の特定のパリンドロームCpGメチル化部位（それぞれが２つのCpG  CpGジヌクレオチド配列を有する）におけるメチル化状態は、「非メチル化」と、「完全メチル化」と、「ヘミメチル化」とを含む。
【０１０６】
本発明において、「ヘミメチル化」という用語は、パリンドロームCpGメチル化部位のメチル化状態で、パリンドロームCpGメチル化部位の２つのCpGジヌクレオチド配列のうち１つにおいて、単一のシトシンのみがメチル化されているものを指す（例えば、5'-CCMGG-3'（上鎖）、3'-GGCC-5'（下鎖））。
【０１０７】
本発明において、「高メチル化」という用語は、正常な対照DNA試料内の対応するCpGジヌクレオチドにおいて確認される5-mCytの量と比較して、試験DNA試料のDNA配列内の１つ又は複数のCpGジヌクレオチドにおける5-mCytの存在の増加に対応する平均的なメチル化状態を指す。
【０１０８】
本発明において、「低メチル化」という用語は、正常な対照DNA試料内の対応するCpGジヌクレオチドにおいて確認される5-mCytの量と比較して、試験DNA試料のDNA配列内の１つ又は複数のCpGジヌクレオチドにおける5-mCytの存在の減少に対応する平均的なメチル化状態を指す。
【０１０９】
本発明において、「マイクロアレイ」という用語は、広義には、この技術において認められているように、「DNAマイクロアレイ」及び「（複数の）DNAチップ」の両方を指し、この技術で認められた全ての固体支持体を包含し、これに対する核酸分子の付着又はその上での核酸の合成に関するあらゆる方法を包含する。
【０１１０】
「遺伝パラメータ」は、遺伝子及びその調節に更に必要となる配列の突然変異及び多型である。突然変異に指定されるものは、特に、挿入と、欠失と、点突然変異と、逆位と、多型とであり、特に好ましくは、SNP（一塩基変異多型）である。
【０１１１】
「後成的発現パラメータ」は、特に、シトシンメチル化である。その他の後成的発現パラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれるが、しかしながら、これは説明した方法を使用して直接分析することはできないが、その後、DNAメチル化と相関する。
【０１１２】
本発明において、「亜硫酸水素塩試薬」という用語は、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素、又はその組み合わせを含む試薬を指し、本明細書で開示するように、メチル化及び非メチル化CpGジヌクレオチド配列を識別するのに有用である。
【０１１３】
本発明において、「メチル化アッセイ」という用語は、DNAの配列内の１つ以上のCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態を判定する任意のアッセイを指す。
【０１１４】
本発明において、「MS. AP-PCR」（メチル化感受性自由刺激ポリメラーゼ連鎖反応）は、CGが豊富なプライマーを使用したゲノムの大域的なスキャンを可能にし、CpGジヌクレオチドを含む可能性が最も高い領域に注目する、この技術で認められたテクノロジを指し、Gonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997において説明されている。
【０１１５】
本発明において、「MethyLight」という用語は、当該技術分野で認められた蛍光に基づくリアルタイムPCR手法を指し、Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999において説明されている。
【０１１６】
本発明において、「HeavyMethylTM」アッセイという用語は、本明細書において実施されるその実施形態において、MethylLightアッセイのバリエーションであるHeavyMethylTM  MethylLightアッセイを指し、このMethylLightアッセイは、増幅プライマー間のCpG位置を対象とするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わせたものである。
【０１１７】
「MS-SNuPE」（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長法）という用語は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997において説明される、この技術で認められたアッセイを指す。
【０１１８】
「MSP」（メチル化特異的PCR）という用語は、Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996及び米国特許第5,786,146号において説明される、この技術で認められたメチル化アッセイを指す。
【０１１９】
「COBRA」（結合亜硫酸水素塩制限分析）という用語は、Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 22:2532-2534, 1997において説明される、この技術で認められたメチル化アッセイを指す。
【０１２０】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、二重構造の形成に至る、試料DNAにおけるワトソンクリック塩基対に従ったオリゴヌクレオチドの相補的配列との結合として理解される。
【０１２１】
「厳密なハイブリダイゼーション条件」とは、本明細書での定義において、5×SSC/5×デンハルト溶液／1.0％SDS内において68℃でハイブリダイズすることと、0.2×SSC/0.1％SDSにおいて室温で洗浄することとを伴い、或いは、これに相当する、この技術で認められた条件を伴う（例えば、2.5×SSC緩衝液において60℃でハイブリダイゼーションを実施し、その後、低緩衝剤濃度における37℃での数回の洗浄ステップを行い、安定した状態を保つという条件）。適度に厳密な条件は、本明細書での定義において、3×SSCにおいて42℃で洗浄することを含むことを伴い、或いは、これに相当する、この技術で認められた条件を伴う。塩濃度及び温度のパラメータは、プローブと標的核酸との間で最適な識別レベルを達成するために変化させることができる。こうした条件に関するガイダンスは、この技術において、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.及びAusubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) at Unit 2.10によって入手できる。
【０１２２】
「バックグラウンドDNA」は、本明細書での使用において、結腸細胞以外のソースを起源とする任意の核酸を指す。
【０１２３】
次に、本発明について、以下の実施例と、配列と、図面とに基づいて、これに限定されることなく、更に詳細に説明する。配列プロトコル及び図面において、
配列番号１は、ヒト遺伝子EYA4の配列を示し、
配列番号２〜５は、遺伝子EYA4の化学的に前処理された配列を示し、
配列番号６〜１０は、実施例において使用するプライマーの配列を示し、
配列番号１１〜１５は、実施例において使用するプローブの配列番号を示す。
【０１２４】
図１は、実施例１及び２によるMSP  MethyLightアッセイとHeavyMethyl  MethyLightアッセイとによって判定されたメチル化のレベルを示す。Ｙ軸線は、調査したEYA4遺伝子の領域内でのメチル化の度合いを示す。腫瘍試料は、白点により表され、正常な結腸組織試料は、黒点により表される。著しく高い度合いのメチル化は、健康な組織試料よりも腫瘍試料において観察された。ｔ−試験を使用して測定された有意レベルは、p=0.00000312（MSP−ML、実施例１）及びp=0.000000326（HM-ML、実施例２）となった。
【０１２５】
図２は、実施例１による、腺癌に関するMSP-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している。ROCは、診断試験の種々の潜在的カットポイントに関する、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。これは、選択されたカットポイントに依存する、感度と特異性との間でのトレードオフを示す（感度における任意の増加に特異性の減少が伴うことになる）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる（面積が大きいほど良く、1が最適であり、無作為試験では、ROC曲線は0.5の面積を有する対角線上に存在することになる）。MSP-Methyl-LightアッセイのAUCは：0.94である。
【０１２６】
図３は、実施例２による、腺癌に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる。HM-Methyl-LightアッセイのAUCは：0.91である。
【０１２７】
図４は、実施例２による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定されたメチル化のレベルを示し、結腸試料の追加的な組を試験している（腺癌25、正常33、及び腺腫13）。Ｙ軸線は、調査したEYA4遺伝子の領域内でのメチル化の度合いを示す。線癌試料は、白い正方形により表され、正常な結腸組織試料は、黒い菱形により表される。著しく高い度合いのメチル化は、健康な組織試料よりも腫瘍試料において観察された。ｔ−試験を使用して測定された有意レベルは、0.00424となった。
【０１２８】
図５は、実施例２による、腺癌及び腺腫に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している（試料の追加的な組）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる。HM-Methyl-LightアッセイのAUCは、0.81である。
【０１２９】
図６は、実施例２による、腺癌のみに関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している（試料の追加的な組）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる。HM-Methyl-LightアッセイのAUCは、0.844である。
【０１３０】
図７は、実施例２による、腺腫に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示している（試料の追加的な組）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる。HM-Methyl-LightアッセイのAUCは、0.748である。
【０１３１】
図８は、実施例３による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、種々の腫瘍及び健康な組織におけるメチル化のレベルを示している。Ｙ軸線は、調査したEYA4遺伝子の領域内でのメチル化の度合いを示す。結腸癌試料以外では、二種類の乳癌組織のうち一方のみがメチル化されている。
【０１３２】
図９は、実施例３による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、種々の乳癌組織におけるメチル化のレベルを示している。一種類の組織のみがメチル化されている。
【０１３３】
図１０は、実施例４による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、血清試料におけるメチル化のレベルを示している。Ｙ軸線は、調査したEYA4遺伝子の領域内でのメチル化の度合いを示す。
【実施例１】
【０１３４】
MSP-MethyLightアッセイを使用した結腸癌内のメチル化分析
DNAは、Qiagen（登録商標）抽出キットを使用して、33の結腸線癌試料と43の結腸の正常な隣接組織から抽出した。各試料からのDNAは、アガロースビーズ法（オレク他、１９９６）に従って、亜硫酸水素塩溶液（亜硫酸水素、二亜硫酸塩）を使用して処理した。この処理は、試料内のメチル化していない全てのシトシンがチミジンに変換されるように行う。一方、試料内の5-メチル化シトシンは修飾されずに残る。
【０１３５】
メチル化状態は、当該CpGアイランドとベータアクチン遺伝子からの対照断片（イーズ他、２００１）とのために設計されたMSP-MethyLightアッセイにより判定した。このCpGアイランドアッセイは、プライマーとtaqmanスタイルプローブとの両方におけるCpG部位を対象とするが、対照遺伝子は対象にならない。この対照遺伝子は、全DNA濃度の尺度として使用され、CpGアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）は、その部位でのメチル化レベルを判定する。
【０１３６】
方法：EYA4遺伝子CpGアイランドアッセイは、以下のプライマー及びプローブを使用して実行した。
順方向プライマー：CGGAGGGTACGGAGATTACG（配列番号６）、
逆方向プライマー：CGACGACGCGCGAAA（配列番号７）、及び
プローブ：CGAAACCCTAAATATCCCGAATAACGCCG（配列番号１２）。
対応する対照アッセイは、以下のプライマー及びプローブを使用して実行した。
プライマー：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT（配列番号８）
プライマー：AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA（配列番号９）、及び
プローブ：ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA（配列番号１３）。
【０１３７】
反応は、以下のアッセイ条件において、各DNA試料について三重にして実行した：
反応溶液：（900 nM  プライマー、300 nM  プローブ、3.5 mM  塩化マグネシウム、1単位のtaqポリメラーゼ、200 μM  dNTPs、7μlのDNA、最終反応体積20μl）；
サイクリング条件：（95℃10分間の後、95℃15秒間及び60℃1分間を50サイクル）。データは、既に文献において説明されているPMR計算を使用して分析した（イーズ他、２００１）。
【０１３８】
結果：正常な試料の平均PMRは0.15で、標準偏差は0.18となった。腫瘍試料の平均PMRは17.98で、標準偏差は18.18となった。腫瘍試料と正常な試料との間でのメチル化レベルの全体的な差異は、ｔ試験において有意である（p=0.00000312）。この結果は、図１に表示されている。
【０１３９】
このアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）も判定した。ROCは、診断試験の種々の潜在的カットポイントに関する、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。これは、選択されたカットポイントに依存する、感度と特異性との間でのトレードオフを示す（感度における任意の増加に特異性の減少が伴うことになる）。ROC曲線の下の面積（AUC）は、診断試験の精度の尺度となる（面積が大きいほど良く、1が最適であり、無作為試験では、ROC曲線は0.5の面積を有する対角線上に存在することになる、参考：J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975）。MSP−Methyl−LightアッセイのAUCは、0.94である（図２）。
【実施例２】
【０１４０】
HeavyMethyl  MethyLightアッセイを使用して分析した結腸癌内のメチル化
同じDNA試料を使用して、HeavyMethylアッセイとも呼ばれる、HeavyMethyl  MethyLight（又はHM  MethyLight）アッセイにより、CpGアイランドのメチル化を分析した。メチル化状態は、当該CpGアイランドと上で説明したものと同じ対照遺伝子アッセイとのために設計されたHM  MethyLightアッセイにより判定した。このCpGアイランドアッセイは、ブロッカーとtaqmanスタイルプローブとの両方におけるCpG部位を対象とするが、対照遺伝子は対象にならない。
【０１４１】
方法：CpGアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）は、以下のプライマー及びプローブを使用して実行した。
順方向プライマー：GGTGATTGTTTATTGTTATGGTTTG （配列番号１０）
逆方向プライマー：CCCCTCAACCTAAAAACTACAAC（配列番号１１）
順方向ブロッカー：GTTATGGTTTGTGATTTTGTGTGGG（配列番号１５）
逆方向ブロッカー：AAACTACAACCACTCAAATCAACCCA（配列番号１６）
プローブ：AAAATTACGACGACGCCACCCGAAA（配列番号１４）
【０１４２】
反応は、以下のアッセイ条件において、各DNA試料について、それぞれ三重にして実行した。
反応溶液：（400 nM  プライマー、400 nM  プローブ、10μMの両ブロッカー、3.5 mM  塩化マグネシウム、1×  ABI  taqman緩衝剤、1単位のABI  TaqGoldポリメラーゼ、200μM  dNTPs、及び7μlのDNA、最終反応体積20μl）；
サイクリング条件：（95℃10分間）、（95℃15秒間、64℃1分間（2サイクル））、（95℃15秒間、62℃1分間（2サイクル））、（95℃15秒間、60℃1分間（2サイクル））、及び（95℃15秒間、58℃1分間、60℃40秒間（41サイクル））。
【０１４３】
結果：正常な試料の平均PMRは1.12で、標準偏差は1.45となった。腫瘍試料の平均PMRは38.23で、標準偏差は33.22となった。腫瘍試料と正常な試料との間でのメチル化レベルの全体的な差異は、ｔ試験において有意である（p=0.000000326）。この結果は、図１に表示されている。このアッセイのROC曲線も判定した。MSP-Methyl-LightアッセイのAUCは、0.91である（図３）。
【０１４４】
このアッセイでは、結腸試料の追加的な組を試験した（腺癌25、正常33、及び腺腫13）。この結果も、有意な差異を示した（図４）。ROCは、図５〜７に表示されている。
【実施例３】
【０１４５】
HeavyMethyl-MethyLightアッセイでは、その他の組織集団に対しても試験を行った（図８）。結腸癌試料以外では、二種類の乳癌組織のうち一方のみがメチル化された。しかしながら、21の追加的な（病期の異なる）乳腫瘍の集団では、一種類のみがメチル化された（図９）。そのため、この標識は、結腸腫瘍試料に特異的である。全てのプライマー、プローブ、ブロッカー、及び反応条件は、結腸癌試料の分析（実施例２）に使用したものと同一とした。
【実施例４】
【０１４６】
リアルタイムPCRによって分析された12の結腸組織も、外科処置の前に取得されたペア血清を有した。Qiagen  UltraSens（登録商標）  DNA抽出キットを使用して、この血清1mLからDNAを抽出し、このDNA試料に亜硫酸塩で処理し、これらの試料に対してHeavyMethyl-MethyLightアッセイを実行した。対照遺伝子は、三種類の癌血清試料と三種類の正常な血清試料に関して増幅されていないため、これらのケースにおいては、試料の調製が正しく機能しなかったと結論できる。その他のケースでは、癌試料において、正常な試料よりも高いメチル化の証拠が存在した（図１０）。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】実施例１及び２によるMSP  MethyLightアッセイとHeavyMethyl  MethyLightアッセイとによって判定されたメチル化のレベルを示す。
【図２】実施例１による、腺癌に関するMSP-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図３】実施例２による、腺癌に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図４】実施例２による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定されたメチル化のレベルを示す。
【図５】実施例２による、腺癌及び腺腫に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図６】実施例２による、腺癌のみに関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図７】実施例２による、腺腫に関するHM-Methyl-Lightアッセイの受診者動作特性曲線（ROC曲線）を示す。
【図８】実施例３による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、種々の腫瘍及び健康な組織におけるメチル化のレベルを示す。
【図９】実施例３による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、種々の乳癌組織におけるメチル化のレベルを示す。
【図１０】実施例４による、HeavyMethyl  MethyLightアッセイによって判定された、血清試料におけるメチル化のレベルを示す。
【配列表】
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【国際調査報告】
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