(57)【要約】本発明は、ＴｏｌＣをコードするヌクレオチド配列および一定のアミノ酸配列、ＴｏｌＣの許容膜外側領域の中に挿入される前記一定のアミノ酸配列およびそれらの、特にヌクレオチド配列のような細菌を含む幾つかの使用に関する。
2005517457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴｏｌＣをコードするヌクレオチド配列ならびに一定のアミノ酸配列において、この一定のアミノ酸配列がＴｏｌＣの許容膜外側領域の中に挿入されるヌクレオチド配列。
【請求項２】
ＴｏｌＣがＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｘ５４０４９によるＴｏｌＣタンパク質または好ましくはそのＮ末端部分配列またはタンパク質の突然変異体または部分配列であり、Ｎ末端部分配列または突然変異体に対してトランスポート機能性を得た、請求項１記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
一定のアミノ酸配列が片側または両側にスペーサー配列を介して挿入された、請求項１または２記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
一定のアミノ酸配列がＴｏｌＣのＮ末端領域で、特にアミノ酸５２ないし６１、および／または２５７ないし２７９の領域（それぞれＴｏｌＣタンパク質を基準）に挿入される、請求項１ないし３のいずれか一項記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか一項記載のヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか一項記載のヌクレオチド配列によってコードしたタンパク質またはペプチド。
【請求項７】
ＴｏｌＣが一定のアミノ酸配列のトランスポートを細菌の膜上に生じる、請求項１ないし４のいずれか一項記載のヌクレオチド配列を含む細菌。
【請求項８】
一定のアミノ酸配列が、ペプチド、タンパク質、作用物質、抗原、抗体、またはリガンドを表す、請求項７記載の細菌。
【請求項９】
サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）からなるグループから選択された、請求項７または８のいずれか一項記載の細菌。
【請求項１０】
請求項７ないし９のいずれか一項記載の細菌ならびに、別法により、少なくとも１種の生理学的に親和性のある担体物質を含む製薬組成物において、一定のアミノ酸配列が所定の生物体中の被結合物質に応じて選択された製薬組成物。
【請求項１１】
請求項７ないし９のいずれか一項記載の細菌ならびに、別法により、少なくとも１種の生理学的に親和性のある担体物質を含む製薬組成物において、一定のアミノ酸配列が免疫配列である製薬組成物。
【請求項１２】
請求項７ないし９のいずれか一項記載の細菌を含む診断キットにおいて、一定のアミノ酸配列が被決定マーカー物質を特異的に結合する診断キット。
【請求項１３】
請求項７ないし９のいずれか一項記載の細菌を含む調製結合剤において、一定のアミノ酸配列が溶液から分離される標的物質を特異的に結合する調製結合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴｏｌＣをコードするヌクレオチド配列、このようなヌクレオチド配列を含むプラスミド、このようなヌクレオチド配列によってコードするタンパク質またはペプチド、このようなヌクレオチド配列を含む細菌ならびにこのような細菌の様々な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
その菌力において減弱された、細胞内に定住する細菌は、生ワクチンとして長く持続する免疫性を誘導することができる。これまで特にチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ）ＴＹ１ａ（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｌａｎｃｅｔ  １：１０４９−１０５２、１９８７）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ（ＦｉｎｅおよびＲｏｄｒｉｇｕｅｓ、Ｌａｎｃｅｔ  ３３５：１０１６−１０２０、１９９０）およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）（ＬｅｖｉｎｅおよびＫａｐｅｒ、Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：２０７−２１２、１９９３）が生ワクチンとして使用された。
【０００３】
たとえば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）サルモネラ・エンテリカ・エスヴェー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｖ）ティフィムリウム（Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびチフス菌（Ｔｙｐｈｉ）、ならびにＢＣＧによってこの種の変形体が発疹チフスおよび結核症に対して良好な親和性の生接種物質として使用された。その減弱した突然変異体を含む前記細菌は一般に免疫刺激性であって、良好な細胞免疫反応を誘発することができるため、接種物質担体として使用された。
【０００４】
接種物質担体としての前記細菌の長所は、該細菌が特にいわゆるＴｈ１免疫反応を誘導することである（ＨｅｓｓおよびＫａｕｆｍａｎｎ、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２３：１６５−１７３、１９９９）。この免疫反応は細胞毒のリンパ球（ＣＴＬ）ならびに分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔ補佐細胞、Ｔｈとも呼ぶ）の特異的ＩＦＮガンマの存在を特徴とする（Ａｂｂａｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：７８７−７９３、１９９６）。
【０００５】
たとえばリステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は特にＴＨ１細胞の活性を介して細胞毒のＴリンパ球（ＣＴＬ）の増殖を刺激する。この細菌は分泌抗原を直接サイトソル抗原表出細胞（ＡＰＣ；マクロファージおよび樹状細胞）の中に供給し、この細胞が該細胞側で協同刺激性分子を発現し、Ｔ細胞の効果的な刺激を誘発する。そのためリステリア属は一部食作用胞の区画に分解され、前記担体細菌によって産生される抗原は、一方でＭＨＣクラスＩＩ分子を介して表出され、それによってＴ補佐細胞の誘導を惹起することができる。他方、リステリア属は食作用胞から遊離後ＡＰＣのサイトソル内で複写する；従って前記細菌から産生かつ分泌された抗原は有利にＭＨＣクラスＩ経路を介して表出され、それによってこの抗原に対するＣＴＬ反応が誘導される。さらに、マクロファージ、天然キラー細胞（ＮＫ）および好中球とリステリア属の相互作用によって、このようなサイトカイン（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、Ｉ１−２、ＩＬ−１２；Ｕｎａｎｕｅ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、９：３５−４３、１９９７；Ｍａｔａ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：１４４９−１４４５６、１９９９）の発現が誘導されることを示すことができ、それに対する抗腫瘍作用が検出された。
【０００６】
組換え細菌はそれに応じて異種腫瘍に対して保護することができた（Ｍｅｄｉｎａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：６９３−６９９、１９９９；Ｐａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：５２６４−５２６９、１９９９；Ｗｏｏｄｌｏｃｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２２：２５１−２５９、１９９９：Ｐａｇｌｉａら、Ｂｌｏｏｄ  ９２：３１７２−３１７６、１９９８；Ｐａｇｌｉａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：１５７０−１５７５、１９９７；Ｐａｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １：４７１−４７７、１９９５；Ｐａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：４７７６−４７７９、１９９５）。
【０００７】
このように形質導入されたリステリア・モノサイトゲネスの投与によって腫瘍抗原の発現のために抗原特異的に発現した腫瘍の成長を阻止することができた（Ｐａｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １：４７１−４７７、１９９５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：５２６４−５２６９、１９９９；Ｖｏｓｅｔら、Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８７：５８１−５８６、１９９５；ＢｅａｔｔｙおよびＰａｔｅｒｓｏｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５５０２−５５０８、２０００）。
【０００８】
腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列を導入した菌力減弱サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）株は、腫瘍抗原発現細菌担体として経口投与後種々の発現腫瘍に対する特異的保護を生ぜしめることができた（Ｍｅｄｉｎａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：７６８−７７７、２０００；ＺｏｌｌｅｒおよびＣｈｒｉｓｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：３４４０−３４４５０、２００１；Ｘｉａｎｇら、ＰＮＡＳ  ９７：５４９２−５４９７、２０００）。
【０００９】
組換えサルモネラ株は、ウィルス感染に対する予防ワクチン（ＨＰＶ；Ｂｅｎｙａｃｏｕｂら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７：３６７４−３６７９、１９９９）として、および腫瘍ウィルス（ＨＰＶ）によって不死化したマウス腫瘍の治療的処置のためにも効果的であった（Ｒｅｖａｚら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７９：３５４−３６０、２００１）。
【００１０】
接種物質担体として使用するために、細菌の中に導入した核酸配列の発現産物を前記細菌の細胞膜上に発現し、または前記細菌から分泌させる方法が開発された。この方法の基礎はグラム陰性菌のＩ型分泌系のプロトタイプを表す大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）溶血素系ＨｌｙＡｓである。このＨｌｙＡｓによってサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）の中のタンパク質抗原の効果的な排出を可能にする分泌ベクターが開発された。この種の分泌ベクターはＨｌｙＡｓシグナルペプチド、溶血素分泌器官、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤおよびｈｌｙ特異的プロモーターのためのヌクレオチド配列に結合した任意のタンパク質抗原のｃＤＮＡを含む。この分泌ベクターによってタンパク質を、たとえば前記細菌の表面上で発現させることができる。この種の遺伝子修飾細菌は、ワクチンとして、導入された核酸によって発現されたタンパク質が細胞内にとどまる細菌として非常に強力な免疫保護を誘発する（ＤｏｎｎｅｒらＥＰ  １０１５０２３Ａ；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖら、Ｇｅｎｅ  １７９：１３３−１４０、１９９６；Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２６２１−２６１８、２００１；Ｈｅｓｓら、ＰＮＡＳ  ９３：１４５８−１４６３、１９９６）。しかしながらこの系の欠点は、Ｈｌｙ特異的プロモーターの使用によって細菌により発現されたタンパク質の量が少なくなることである。
【００１１】
細菌中のその他のトランスポート系は、たとえばｉ）分泌および膜位発現のためにＣ末端Ｒｓａ  Ａトランスポートシグナルが使用される（Ｕｍｅｌｏ−Ｎｊａｋａら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１４０６−１４１５、２００１）カウロバクター・クレセントゥス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）のＳ層タンパク質（Ｒｓａ  Ａ）およびｉｉ）リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のインターナリンＡのためのトランスポートシグナルである。分泌のためにＮ末端トランスポートシグナルと膜位発現のためにＮ末端トランスポートシグナルが一緒に細胞壁係留に重要なＬＰＸＴＧモティーフを含むＣ末端部分に必要である（Ｄｈａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：３７２５−３７３３、２０００）。
【００１２】
その他の関連性から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の不可欠な膜タンパク質ＴｏｌＣが知られている。これは、たとえばコリシンＥ１（Ｍｏｒｏｎａら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １５３：６９３−６９９、１９８３）の吸収およびコリシンＶ（Ｆａｔｈら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７３：７５４９−７５５６、１９９１）の分泌のような機能のほかにＵ３ファージのためのレセプターとしても用いられる（Ａｕｓｔｉｎら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７２：５３１２−５３２５、１９９０）大腸菌の外部膜の多機能性多孔形成タンパク質である。このタンパク質は大腸菌の中に見出されるだけでなく、多数のグラム陰性菌の中にも見出される（Ｗｉｅｎｅｒ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ、８：１７１−５、２０００）。
【００１３】
ＴｏｌＣタンパク質の結晶構造は、これがホモトリマーとして約１２０オングストロームの長さをもつトンネルチャネルを形成し、ホモジマーの大部分、トンネルドメインがペリプラズマの中に局在定位されていて、２つの小さなループ（アミノ酸５２−６１および２５７−２７９）のみが細菌の表面上に定住している（Ｋｏｒｏｎａｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：９１４−９１９、２０００）。ｔｏｌＣ遺伝子はＮｉｋｉら、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｌＣ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１８）、５５４７（１９９０）によって公表されたヌクレオチド配列を有する。ＴｏｌＣは、細菌性タンパク質のエキスポートが可能になる膜トンネルを表すことによって、少なくとも４つの異なる細菌性エキスポート系の一部である。たとえば、ＨｌｙＡトランスポート系においてＨｌｙＤとＴｏｌＣのペリプラズマ末端との間の結合はＴｏｌＣの膜トンネルの中へのＨｌｙＤの溶血素のエキスポートを可能にする（ＧｅｎｔｓｃｈｅｖらＴｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：３９−４５、２００２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、トランスポート系によって細菌の外部細胞膜上に高い効率を有する発現産物を表出できるトランスポート系を提示する技術的問題を基礎においている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この技術的問題の解決のために、本発明はＴｏｌＣをコードするヌクレオチド配列ならびに一定のアミノ酸配列を教示し、この一定のアミノ酸配列がＴｏｌＣの許容膜外側領域の中に挿入される。
【００１６】
本発明により、新規トランスポート系によって従来公知のトランスポート系で可能であったよりも多い量の細菌内部の遺伝子によって発現されたタンパク質を細菌の外部細胞膜上にトランスポートできる新規のトランスポート系がグラム陰性菌の中に構築される。驚くべきことに、大腸菌のＴｏｌＣタンパク質のためのトランスポート系は、従来のトランスポートタンパク質から知られていた多数のグラム陰性菌よりもはるかに強力な（任意の）ペプチドまたはタンパク質の膜位発現を可能にする。一定のアミノ酸配列もしくは遺伝子産物の膜位発現は、この場合、単独でＴｏｌＣによって達成される。
【００１７】
一定のアミノ酸配列は、任意の所定のペプチドまたはタンパク質、任意の薬剤作用物質、任意の抗原、任意の抗体、または任意のリガンドとしてよい。
【００１８】
ＴｏｌＣは、本特許と明確に関係するＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｘ５４０４９による（野生型）ＴｏｌＣタンパク質またはその（好ましくはＮ末端の）部分配列またはタンパク質の突然変異体または部分配列としてよく、この部分配列または突然変異体にはトランスポート機能性が含まれている。Ｎ末端部分配列とは、この場合、Ｎ末端領域でＴｏｌＣタンパク質のアミノ酸１ないし５０で開始し、細菌の表面上に定住しているループのＣ末端の最後で終了する部分配列である。従って有利には、ＴｏｌＣのＮ末端トランスポートシグナル、さらにＴｏｌＣの細胞外領域を表すタンパク質の中央部分である。突然変異体は、そのトランスポート機能性が明らかに低減されない限り、挿入、欠質または置換を含んでよい。
【００１９】
特定の適用事例に対しては、一定のアミノ酸配列が片側または両側にスペーサー配列を介して挿入されている場合に推奨することができる。しかしこれは、一定のアミノ酸配列が特定の空間的構造を、たとえば抗原の場合で表示されるべきであるが、これが一定のアミノ酸配列自体によって立体的または構成上の理由から望ましい範囲で行われる場合にのみ役立つであろう。その場合はスペーサー配列を特に自然に一定のアミノ酸配列に接続される配列によって形成することができ、それによって一定のアミノ酸配列は天然の抗原の中のように折りたたまれる。さらにスペーサー配列は、それによって一定のアミノ酸配列の所望の表示および／または折りたたみが達成される場合、人工的にしてもよい。これはＴｏｌＣの中の挿入部位で空間的条件を考慮した理論的方法によって容易に計算することができる。
【００２０】
個別的には、一定のアミノ酸配列がＴｏｌＣのＮ末端領域で、特にアミノ酸５２ないし６１、および／または２５７ないし２７９の領域（それぞれＴｏｌＣタンパク質を基準）に挿入される場合に有利である。
【００２１】
本発明の目的は、さらに本発明によるヌクレオチド配列を含むプラスミドならびに本発明によるヌクレオチド配列によってコードしたタンパク質またはペプチドである。
【００２２】
本発明は、さらに本発明によるヌクレオチド配列を含む細菌を教示し、ＴｏｌＣは一定のアミノ酸配列のトランスポートを細菌の膜上に生じる。別の言葉で表現すると、細菌の中に遺伝子産物の膜位発現がＴｏｌＣタンパク質によって生ぜしめられる。従って本発明の目的は、少なくとも１種の一定のアミノ酸配列と少なくとも１種の大腸菌ＴｏｌＣ遺伝子産物をコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含むグラム陰性菌でもある。この大腸菌ＴｏｌＣ遺伝子産物は、有利には野生型である。しかしながら本発明の目的は、トランスポートシグナル活性を得て残留する突然変異した大腸菌ＴｏｌＣ遺伝子産物でもある。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．）からなるグループから選択された細菌が有利である。
【００２３】
本発明によるヌクレオチド配列もしくは細菌は様々な適用に使用可能である。そこで本発明は、本発明による細菌ならびに、別法により、少なくとも１種の生理学的に親和性のある担体物質を含む製薬組成物も教示し、一定のアミノ酸配列は所定の生物体中の被結合物質に応じて選択されている。このような製薬組成物によって、通常の細胞物質代謝を妨害する物質、たとえば外来性毒物または腫瘍形成遺伝子のような突然変異限定性内因性物質に結合し、そのように阻止することができる。また特定の細胞標的物質の結合によって通常のまたは疾病限定性の高調節錯体パートナーの除去によって物質代謝を調節することもできる。それによって、たとえば一定の会合が阻止され、それに関係するシャトルが下方調節される。このようなプロセスは再びその他の結合したプロセスの上方調節に利用することができる。その限りにおいて一定のアミノ酸配列は高い特異性で禁止される標的分子に応じて選択する必要があるだけである。従ってこのような製薬組成物は最終的に治療目的に利用される。
【００２４】
接種に好適な製薬組成物は本発明による細菌ならびに、別法により、少なくとも１種の生理学的に親和性のある担体物質を含み、その一定のアミノ酸配列は免疫配列である。免疫配列は生物体の中で部分配列として免疫配列を含みまたはそれらからなる天然の抗原に対する抗体の形成を刺激する。
【００２５】
診断目的のために、本発明は請求項７ないし９のいずれか一項記載の細菌を含む診断キットを教示し、一定のアミノ酸配列は被決定マーカー物質を特異的に結合する。たとえば生物体から組織−または流体試料が抽出され、この試料を、必要な場合は、望ましくない試料成分の分離による前処理後、細菌と共にインキュベートされる場合、結合発生を一定のアミノ酸配列で検出することができ、結合発生の場合は、一定のアミノ酸配列に特異的に結合する物質が試料中に含まれていることが確認されている。この場合、結合発生の検出は種々の、一般当業者によく知られている方法で行なってよい。
【００２６】
最後に本発明は、本発明による細菌を含む調製結合剤を教示し、一定のアミノ酸配列は溶液から分離される標的物質を特異的結合する。このような結合剤により、一方で細菌を含む溶液がインキュベートされ、細菌が分離後に投棄されることによって、受け器から望ましくない物質を特異的に除去することができる。他方、対応する方法で、すなわちインキュベーション後に標的物質が細菌から溶離されることによって、標的物質の分離もしくは濃縮を行うことができる。この関係においても本発明は、抗原、抗体、ペプチド、タンパク質またはリガンドの分離および／または濃縮に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（実施例１）  ＴｏｌＣベクターの製造
大腸菌由来のｔｏｌＣ遺伝子をその野生型プロモーターを含みポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって（１分間９４℃、１分間６６℃、１分３０秒間７２℃）オリゴヌクレオチド５’ＴｏｌＣ（５’−ＴＡＡＣＧＣＣＣＴＡＴＧＴＣＧＡＣＴＡＡＣＧＣＣＡＡＣＣＴＴ−３’）および３’ＴｏｌＣ（５’−ＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＡＴＴＧＡＡＧＣＧＡＧＡ−３’）を用いてプラスミドｐＡＸ６２９（Ｃ．Ｗａｎｄｅｒｓｍａｎ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｐａｒｉｓ）から増幅した。この場合、両端に付加的なＳａｌＩインタフェースを導入した。洗浄したＰＣＲ生成物（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット−キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）は、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩによって消化させ、ＳａｌＩで前分裂したベクターｐＢＲ３２２でクローニングした。このように構成したベクターはｐＢＲ３２２ｔｏｌＣと呼ぶ。クローンｔｏｌＣ遺伝子の機能性はそれに続き複数の試験で検査した。
【００２８】
（実施例２）  ＴｏｌＣタンパク質の配列の中への抗原配列の挿入
細胞外ループの１つをコードするｔｏｌＣ配列の中でＫｐｎＩインタフェースを同定した。これはリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のｐ６０タンパク質（ｉａｐ遺伝子）の抗原ペプチド配列のクローニングに使用し、成熟したＴｏｌＣタンパク質のアミノ酸２７１による外部抗原の挿入を可能にした。
【００２９】
Ｂ細胞エピトープ（アミノ酸２９１−３０１）およびｐ６０タンパク質のＣＤ４収縮Ｔ細胞エピトープ（アミノ酸３０１−３１２）をコードするｉａｐ配列は、ＫｐｎＩ断片としてＫｐｎＩ前切断ベクターｐＢＲ３２２ｔｏｌＣでクローニングした（図１）。このように生成したプラスミドはｐＢＲ３２２ｔｏｌＣ：：ＬｉｓＴＢと呼ぶ。
【００３０】
図１は、ベクターｐＢＲ３２２上の野生型プラスミドコード大腸菌ｔｏｌＣ遺伝子の中へｐ６０特異的エピトープ配列の挿入のためのクローニング方式である。これは次のとおりである：ｂｌａアンピシリン抵抗遺伝子；Ｔｃテトラシクリン；Ｔリステリア・モノサイトゲネスｐ６０Ｔ細胞エピトープ（ＡＳ  ３０１−３１２）；Ｂリステリア・モノサイトゲネスｐ６０Ｂ細胞エピトープ（ＡＳ  ２９１−３０１）；ＰｔｏｌＣ野生型大腸菌ｔｏｌＣ−プロモータ。
【００３１】
（実施例３）  グラム陰性菌（エッシャリキア・コリ）の膜上の抗原の発現
ＴｏｌＣタンパク質内部のリステリア・モノサイトゲネス由来のｐ６０タンパク質のエピトープの発現はウェスターン・ブロット法で検出した。そのために大腸菌ＣＣ１１８ｔｏｌＣ、大腸菌ＣＣ１１８ｔｏｌＣ／ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣおよび大腸菌ＣＣ１１８ｔｏｌＣ／ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣ：：ＬｉｓＴＢの細胞溶解物タンパク質を後の対数相で単離した。塗布した全細胞タンパク質は約１億の細菌に相当した。タンパク質は１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分離し、キメラＴｏｌＣタンパク質もしくは挿入したエピトープの発現は一方でＴｏｌＣタンパク質に対するポリクロナール血清を用いて、他方では特異的にリステリア・モノサイトゲネス（図２Ｂ）由来のＢ細胞エピトープに向けたモノクロナール抗体Ｋ３１７（Ｒｏｗａｎら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３８：２６４３−２６４８、２０００）を用いて検出した。
【００３２】
予想どおり大腸菌ＣＣ１８ｔｏｌＣの細胞溶解物の中にＴｏｌＣタンパク質を検出できず、これは前記株中の染色体ｔｏｌＣ遺伝子中の突然変異に還元される（Ｓｃｈｌｏｒら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２５６：３０６−３１９、１９９７）。ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣとの相補性は前記株中で５２ｋＤａの大きいＴｏｌＣタンパク質の発現を惹起した。ＴｏｌＣタンパク質へのリステリア・モノサイトゲネス−エピトープの挿入はＴｏｌＣの発現に影響を与えず、約３ｋＤａのキメラタンパク質の僅かな大きさの変化をもたらした。
【００３３】
大腸菌ＣＣ１１８ｔｏｌＣ／ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣ：：ＬｉｓＴＢ中のｐ６０特異的エピトープの発現は、モノクロナールｐ６０抗体Ｋ３１７で確認することができた。
【００３４】
（実施例４）  腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ＳＭ６Ｔ（ｔｏｌＣ）中のリステリア・モノサイトゲネスｐ６０エピトープの露出局在定位の検出
両方のリステリア属ｐ６０エピトープの挿入部位は成熟したタンパク質のアミノ酸２７１の後のＴｏｌＣの細胞外ループにあるので、前記ｐ６０エピトープは腸炎菌ＳＭ６Ｔ（Ｓｔｏｎｅら、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １７：７０１−７１２、１９９５）の表面に露出して存在するものとみられる。腸炎菌ＳＭ６Ｔ中のｐ６０特異的エピトープの決定的な細胞外定位は間接的な免疫蛍光法によって検査した。
【００３５】
腸炎菌ＳＭ６Ｔ／ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣおよび腸炎菌ＳＭ６Ｔ／ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣ：：ＬｉｓＴＢの一晩培養液各２５μｌをスライド上に滴下し、空気乾燥した。この細胞をモノクロナールｐ６０抗体Ｋ３１７（１：２００）で染色し、結合した抗体をそれに続きＦＩＴＣ標識した２次抗マウス血清（ディアノバ社、ドイツ、ワークタイター：１：４０）で検出した。
【００３６】
蛍光顕微鏡解析は、腸炎菌株ＳＭ６Ｔ／ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣ：：ＬｉｓＴＢの中のリステリア・モノサイトゲネス特異的エピトープの細胞外定位を確認した。
【００３７】
（実施例５）  グラム陰性菌による免疫試験および野生型リステリア・モノサイトゲネスによる感染後の保護免疫反応の解析
ネズミ科のリステリア症モデル中のリステリア・モノサイトゲネスのｐ６０タンパク質由来のＴ細胞エピトープの露出発現が保護をもたらすか否かを検査するため、６週齢の８メスバルブ／ｃ−マウス（チャールズ・リバー社、ズルツフェルト、ドイツ）を１×１０７腸炎菌／ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣ：：ＬｉｓＴＢの用量で経口的に免疫した。対照のために５メスマウスを腸炎菌ＳＭ６Ｔで経口的に免疫した。これらの動物は３週間後同じ細菌用量で２回目の免疫をした。
【００３８】
免疫の成果は第１回の免疫から５週間後リステリア・モノサイトゲネスの上清タンパク質を塗布した免疫ブロットで検査した。ここで抗ｐ６０特異的抗体を腸炎菌／ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣ：：ＬｉｓＴＢで免疫したマウスの血清で検出できた。
【００３９】
第２回目の免疫より３週間後、この動物に５×１０４リステリア・モノサイトゲネスＥＧＤを、５倍ＬＤ５０で静脈接種した。腸炎菌／ｐＢＲ３２２ｔｏｌＣ：：ＬｉｓＴＢで免疫したバルブ／ｃ−マウスにおける生存率がリステリア・モノサイトゲネスＥＧＤで静脈接種後８８％になったのに対し、対照グループにおける生存率はわずか２０％であった。
【００４０】
それによってｐ６０特異的エピトープの発現はＴｏｌＣの細胞外ループの内部で減弱した腸炎菌担体株ＳＭ６Ｔに、バルブ／ｃ−マウスを一般的な致死感染に対して保護できたリステリア・モノサイトゲネス特異的免疫反応の誘導をもたらした。ｐ６０タンパク質由来のＢ細胞エピトープに対する抗体の誘導は、ウェスターン・ブロット法で検出できたので、免疫反応が抗体の参加によってここで観察されたリステリア・モノサイトゲネスによるそれ以外は致死感染からマウスの保護を生ぜしめたことは想到容易である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ベクターｐＢＲ３２２上の野生型プラスミドコード大腸菌ｔｏｌＣ遺伝子の中へｐ６０特異的エピトープ配列の挿入のためのクローニング方式を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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