(57)【要約】本発明は様々な実施態様によって、ヒト構造及び細胞骨格関連タンパク質（SCAP）及びSCAPを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の実施態様はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、SCAPの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-51（配列番号１乃至51）からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3-4, SEQ ID NO:7-9, SEQ ID NO:14-16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28-31, SEQ ID NO:33-34およびSEQ ID NO:39からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:27のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％が同一であるような天然アミノ酸配列を本質的に有するポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:48からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９８％が同一であるような天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｅ）SEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:24からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも９７％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｆ）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｇ）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一であるような天然アミノ酸配列を持つポリペプチド
（ｈ）SEQ ID NO:45のアミノ酸配列に少なくとも91％が同一であるような天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｉ）SEQ ID NO:47のアミノ酸配列に対して少なくとも92％同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド             
（ｊ）SEQ ID NO:17のアミノ酸配列に対して少なくとも91％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｋ）SEQ ID NO:18-20、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:37-38、SEQ ID NO:41-44、SEQ ID NO:49-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｌ）SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｍ）SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を持つ、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:52-102からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドへ機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを有する遺伝形質転換生物。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードする或るポリヌクレオチドへ機能的に連結されたプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程、とからなることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:52-102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:52-67, SEQ ID NO:69-75, SEQ ID NO:77-85, SEQ ID NO:88-97およびSEQ ID NO:99-101からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然アミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９８％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｄ）SEQ ID NO:68のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９７％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｅ）SEQ ID NO:76のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９３％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:98からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｇ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｈ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｉ）（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｊ）（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｋ）（ｅ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｌ）（ｆ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｍ）（ａ）乃至（ｌ）のRNA等価物
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを持つ、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を有する少なくとも２０の連続したヌクレオチド群を持つ或るプローブと前記サンプルとをハイブリダイズし、該プローブが、或るハイブリダイゼーション複合体が前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片群との間に形成される条件下で、前記標的ポリヌクレオチドへ特異的にハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-51からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
機能的SCAPの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項１７の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２０】
請求項１のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法で同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的SCAPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項２１に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能的SCAPの過剰な発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項２４の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを適切な諸条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１のポリペプチドの活性をモジュレート（調節）する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容された諸条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程とを含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項5の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な諸条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを有する或るサンプルを或る化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの、改変された発現を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸群を有する或る生体サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生体サンプルの核酸群と、請求項１２のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチド群を有する或るプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションが、前記プローブと前記生体サンプルの或る標的ポリヌクレオチドとの間で或る特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される諸条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項１２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその断片を有するポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量を、或る処理されていない生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、
前記処理された生体サンプル中の前記ハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示することを特徴とする方法。
【請求項３０】
SCAPの生体サンプル中での発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体が形成されるのに適した諸条件下で、前記生体サンプルを該抗体と混合する過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生体サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１１の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）一本鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F(ab')2断片
（ｅ）ヒト化抗体、のいずれかであることを特徴とする抗体。
【請求項３２】
請求項１１に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
被検者におけるSCAPの発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項３２に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者におけるSCAPの発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項３４に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１１の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を該ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドに特異結合するようなポリクローナル抗体を同定する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項３７のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体応答を誘発する諸条件下で、SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列またはその免疫原性断片を有する或るポリペプチドを用いて或る動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞を単離する過程と、
（ｃ）不死化した細胞と前記抗体産出細胞とを融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項４０に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを有する組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリのスクリーニングによって前記抗体を産出することを特徴とする、請求項１１に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出される、請求項１１に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）該抗体と該ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、サンプルと共に請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、
前記特異結合が、SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する或るポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）該抗体と該ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、サンプルと共に請求項１１に記載の抗体をインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも１つのエレメントが請求項１３に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド群を有する或るサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）該サンプルの該ポリヌクレオチド群を標識する過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項４６のマイクロアレイのエレメント群をサンプルの標識されたポリヌクレオチド群と接触させる過程と、
（ｃ）該サンプル中の該ポリヌクレオチド群の発現を定量化する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも１つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項１２に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも３０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項４８に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項４８に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項４８に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項４８に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項４８に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
SEQ ID NO:42のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９８】
SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９９】
SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１００】
SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０１】
SEQ ID NO:46のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
SEQ ID NO:47のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０３】
SEQ ID NO:48のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
SEQ ID NO:49のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
SEQ ID NO:50のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０６】
SEQ ID NO:51のアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
SEQ ID NO:52のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
SEQ ID NO:53のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
SEQ ID NO:55のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
SEQ ID NO:56のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
SEQ ID NO:57のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
SEQ ID NO:58のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
SEQ ID NO:59のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
SEQ ID NO:60のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
SEQ ID NO:61のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
SEQ ID NO:62のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
SEQ ID NO:63のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
SEQ ID NO:64のポリヌクレオチド配列を有する請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
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【請求項１２１】
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【請求項１２２】
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【請求項１２３】
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【請求項１２４】
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【請求項１２５】
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【請求項１２６】
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【請求項１２７】
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【請求項１２８】
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【請求項１２９】
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【請求項１３０】
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【請求項１３１】
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【請求項１３２】
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【請求項１３３】
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【請求項１３４】
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【請求項１３５】
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【請求項１３６】
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【請求項１３７】
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【請求項１３８】
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【請求項１３９】
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【請求項１４０】
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【請求項１４１】
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【請求項１４２】
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【請求項１４３】
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【請求項１４４】
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【請求項１４５】
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【請求項１４６】
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【請求項１４７】
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【請求項１４８】
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【請求項１４９】
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【請求項１５０】
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【請求項１５１】
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【請求項１５２】
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【請求項１５３】
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【請求項１５４】
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【請求項１５５】
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【請求項１５６】
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【請求項１５７】
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の核酸群、これら核酸がコードする構造及び細胞骨格関連タンパク質群ならびに、これらの核酸とタンパク質とを利用した、細胞増殖異常、ウイルス感染症、神経疾患、並びに心筋障害及び骨格筋障害の、診断、治療、及び予防に関する。本発明はまた、該核酸と、構造及び細胞骨格関連タンパク質群との発現への、外因性化合物の効果のアセスメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞骨格は、細胞の形態、構造及び運動を媒介するタンパク質線維の細胞質内ネットワークである。この細胞骨格は細胞膜を支え、細胞小器官(オルガネラ)や他の要素が細胞質ゾル内で移動するトラックを形成する。細胞骨格は動的な構造をしており、それによって細胞が種々の形態をとれ、定方向への移動が行える。主要な細胞骨格線維としては微小管、ミクロフィラメント、及び中間径フィラメントがある。ミオシン、ダイニン及びキネシンなどモータータンパク質は、線維の移動または線維に沿った移動を駆動する。モータータンパク質であるダイナミンは、膜小胞の形成を駆動する。アクセサリータンパク質または関連タンパク質は線維の構造または活性を修飾し、細胞骨格の膜アンカーは線維を細胞膜に結合する。
【０００３】
微小管及び関連タンパク質
チューブリン
直径約24nmの細胞骨格線維である微小管は細胞内で多数の役割を果たしている。束になった微小管は繊毛や鞭毛を形成し、両者は細胞膜の鞭状の伸長であり、繊毛は上皮上の物質を一掃するのに必要で、鞭毛は精子の遊泳に必要である。赤血球や血小板の微小管周辺帯は、これらの細胞の柔軟性(pliability)に重要である。細胞小器官、膜小胞及びタンパク質は、微小管のトラックに沿って細胞内で輸送される。例えば、微小管は神経細胞軸索の中を走行し、細胞体と神経末端の間で物質や膜小胞の双方向の輸送を可能にしている。神経末端にこれらの小胞を供給できないと、神経のシグナル伝達が遮断される。微小管はまた、細胞分裂中の染色体運動にも重要である。安定な微小管集団と短命な微小管集団の両方が細胞内に存在する。
【０００４】
微小管は、GTPを結合するチューブリンタンパク質サブユニットからなる重合体である。各々のサブユニットは、α-チューブリン及びβ-チューブリンのヘテロ二量体であり、各々には複数のイソ型が存在する。GTPの加水分解は、微小管の末端へのチューブリンサブユニットの付加に関連する。サブユニットは頭部と尾部どうしが相互作用してプロトフィラメントを形成し、プロトフィラメントは側面どうしが相互作用して微小管を形成する。微小管は極性があり、片方の末端はα-チューブリンに、他の末端はβ-チューブリンに取り囲まれており、この2つの末端はアセンブリの割合が異なっている。11または15のプロトフィラメントの微小管も時に見られるが、一般に各微小管は13のプロトフィラメントから構成される。繊毛と鞭毛はダブレット微小管を含んでいる。微小管は、中心体または微小管形成中心(MTOC)として知られている特殊構造体から成長する。微小管形成中心は１つまたは２つの中心小体(centriole)を含んでおり、中心小体は3連微小管の風車配列になっている。基底小体は繊毛または鞭毛の基部に位置する形成中心であり、１つの中心小体を含む。MTOCに存在するγチューブリンはαとβのチューブリンへテロ二量体の重合の核形成に重要であるが、微小管に重合しない。ペリセントリン（pericentrin）タンパク質はMTOCに見られ、微小管のアセンブリに関与している。
【０００５】
微小管結合タンパク質
微小管結合タンパク質(MAP)は微小管のアセンブリと安定化に関与している。微小管結合タンパク質の主要ファミリーの１つであるアセンブリMAPは、神経細胞及び非神経細胞において同定される。アセンブリMAPはサイトゾル(細胞質ゾル)内の微小管の架橋をも担っている。これらのMAPは、塩基性微小管結合ドメインと酸性プロジェクションドメインの２つのドメインに組織される。プロジェクションドメインは、膜、中間径フィラメントまたは他の微小管の結合部位である。配列解析に基づいて、アセンブリMAPをタイプIとタイプIIの2種類にグループ分け出来る。タイプIのMAPにはMAP1AとMAP1Bがあり、微小管で同時精製される大型の糸状分子であり、脳や精巣に多く発現する。タイプIのMAPは或る正に帯電したアミノ酸配列モチーフの幾つかのリピートを含むが、このモチーフは負に帯電したチューブリンに結合し中和して微小管の安定化をもたらす。MAP1A及びMAP1Bの各々は１つの前駆体ポリペプチドに由来しており、その前駆体ポリペプチドがタンパク分解処理され１つの重鎖と１つの軽鎖を産生する。
【０００６】
別の軽鎖であるLC3は16.4 kDaの分子であり、MAP1A、MAP1B及び微小管と結合する。LC3はMAP1AまたはMAP1B転写物以外の源泉から合成されること、またLC3の発現は細胞増殖時のMAP1A及びMAP1Bの微小管結合活性の調節に重要であり得ることが示唆されている（Mann, S. S.他(1994) J. Biol. Chem. 269:11492-11497）。
【０００７】
MAP2a、MAP2b、MAP2c、MAP4及びTauを含むタイプIIのMAPは、微小管結合ドメインに3コピーないし4コピーの18残基配列を有することが特徴である。MAP2a、MAP2b、及びMAP2cは樹状突起のみに、MAP4は非神経性細胞に見られ、Tauは神経細胞の軸索と樹状突起に見られる。TauのmRNAの選択的スプライシングによって、Tauタンパク質の複数の種類が存在する。アルツハイマー病、ピック病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、及び、17番染色体に連鎖する家族性前頭側頭痴呆とパーキンソニズムなど神経変性疾患では、Tauのリン酸化が変容している。Tauリン酸化が変容することによって微小管網が崩壊し、神経細胞内Tau凝集体が形成される(Spillantini, M.G.及びGoedert, M. (1998) Trends Neurosci. 21:428-433)。
【０００８】
STOP（stable tubule only polypeptide）は別の微小管結合タンパク質で、安定性を制御しカルモジュリンに制御されるタンパク質である（Denarier, E.他(1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 24:791-796）。神経細胞は長距離にわたる伝導性の接続を維持するために軸索樹状突起の伸長に依存しており、この伸長は微小管群によって支持される。STOPタンパク質は微小管ネットワークを安定化する機能をもつ。STOPタンパク質は軸索微小管と結合し、また神経細胞内にも豊富にある（Guillaud, L.他(1998) J. Cell Biol. 142:167-179）。STOPタンパク質は正常な神経突起形成に必要であり、in vitroで、低温に、カルシウムに、または薬剤によって誘導される解離に対し微小管を安定させることが観察されている（Margolis, R.L.他(1990) EMBO 9:4095-502）。
【０００９】
ミクロフィラメント及び関連タンパク質
アクチン
直径約7〜9nmの細胞骨格フィラメントであるミクロフィラメントは、細胞移動、細胞形態、細胞接着、細胞分裂及び筋収縮に重要である。ミクロフィラメントの集合と解離によって、細胞はその形態を変えることが可能になる。ミクロフィラメントは、真核細胞で最も豊富な細胞内タンパク質であるアクチンが重合したものである。ヒト細胞は、アクチンの６種のアイソフォーム(イソ型)を有する。３種のαアクチンが各種の筋肉に、非筋肉性βアクチン及び非筋肉性γアクチンは非筋肉細胞にあり、また他のγアクチンは腸の平滑筋細胞にある。単量体型のアクチンであるG-アクチンは、ATPからADPへの加水分解を伴って、極性をもつ螺旋形のF-アクチンフィラメントに重合する。アクチンフィラメントは会合して束及びネットワークを形成し、原形質膜を支持して細胞形態を決定するようなフレームワークを提供する。これらの束及びネットワークは、細胞膜に接続している。筋細胞では収縮時に、アクチンを含む細いフィラメントが、モータータンパク質ミオシンを含む太いフィラメントに対し滑る。アクチン細胞骨格の一部ではなく、微小管やダイニンに会合するアクチン関連タンパク質ファミリーが存在する。
【００１０】
アクチン結合タンパク質
アクチン結合タンパク質はアクチンフィラメントの架橋、切断及び安定化、またアクチン単量体の隔離に関与する。アクチン結合タンパク質の幾つかは複数の機能を有する。アクチンフィラメントの束やネットワークはアクチン架橋タンパク質によって結合されている。これらのタンパク質は各フィラメントに１個づつで合計２つのアクチン結合部位を有する。短い架橋タンパク質は束形成を促進し、長くてより柔軟性のある架橋タンパク質はネットワーク形成を促進する。アクチン相互作用タンパク質（AIP）は、アクチンフィラメント組織化の調節に関与する。新規なF-アクチン結合タンパク質であるTARAなど他のアクチン結合タンパク質は、アクチン細胞骨格組織化を調節することによる同様の能力で機能する。アクチン架橋タンパク質ではカルモジュリン様カルシウム結合ドメインによって架橋のカルシウム調節が可能となる。グループIの架橋タンパク質は独特のアクチン結合ドメインを持ち、30 kDタンパク質、EF-1a、ファシン(fascin)やスクルイン(scruin)等が含まれる。グループIIの架橋タンパク質は或る7,000MWアクチン結合ドメインを有し、ビリン(villin)やデマチン(dematin)等が含まれる。グループIIIの架橋タンパク質は１対の26,000MWのアクチン結合ドメインを有し、フィンブリン、スペクトリン、ジストロフィン、ABP120、及びフィラミンがある。
【００１１】
切断タンパク質は、アクチンフィラメントを短い小片に切るか、またはその端をブロックすることによって、アクチンフィラメントの長さを調節する。切断タンパク質には、gCAP39、セベリン（severin）(フラグミン（fragmin）)、ゲルゾリン及びビリンが含まれる。キャッピングタンパク質はアクチンフィラメントの端にキャップを形成し得るが、フィラメントを切断することはできない。キャッピングタンパク質には、CapZ及びトロポモジュリンがある。タンパク質のチモシンとプロフィリンはサイトゾル内でアクチン単量体を隔離し、重合しないアクチンのプールの存在を可能にする。アクチン結合タンパク質のトロポミオシン、トロポニン及びカルデスモンは、筋収縮をカルシウムに応答して調節する。
【００１２】
微小管とアクチンフィラメントのネットワークは、小胞と細胞小器官の輸送、分裂溝の配置、有向性の細胞遊走、紡錘体の回転、及び核の移動などのプロセスで協調する。微小管とアクチンは、小胞、細胞小器官、及び細胞運命決定因子の輸送を協同することがあり、または輸送には皮層（cortical）アクチン部位に微小管の端を向かわせることとその部位での微小管の捕捉を含み得る。これらの細胞骨格系は、ミオシン-キネシン複合体、ミオシン-CLIP170複合体、フォルミン相同性（FH）タンパク質、ダイニン、ダイナクチン複合体、Kar9p、コロニン（coronin）、ERMタンパク質、及びKelchリピート含有タンパク質によって架橋され得る（Goode, B.L.他(2000) Curr. Opin. Cell Biol. 12:63-71の概説を参照）。Kelchリピートは、ring canalと呼ばれる細胞質間架橋の形成に関与するKelchタンパク質で最初に観察されたモチーフである。種々の哺乳類Kelchファミリータンパク質と他のKelchファミリータンパク質が同定されているKelchリピートドメインは、アクチンとの相互作用を仲介すると考えられている（Robinson, D.N.及びL. Cooley (1997) J. Cell Biol. 138:799-810）。
【００１３】
ADF/コフィリンは保存された15〜18kDaアクチン結合タンパク質のファミリーであり、これらのタンパク質は、細胞質分裂、エンドサイトーシス、及び胚組織発生で役割を果たすと共に、組織再生、及び、虚血、酸化ストレス、または浸透圧ストレスのような病理でも役割を果たす。LIMキナーゼ1はADFを下方制御する（Carlier, M.F.他(1999) J. Biol. Chem. 274:33827-33830）。
【００１４】
LIMは、そのモチーフが最初に同定された、Lin-11、Isl-1、及びMec-3の３つの転写因子の頭文字である。LIMドメインは２重Znフィンガーのモチーフであり、転写因子、シグナル伝達タンパク質、及び細胞骨格関連タンパク質のタンパク質間相互作用を仲介する（Roof, D.J. 他 (1997) J. Cell Biol. 138:575-588）。これらのタンパク質は核、細胞質、または両方に分布している（Brown, S. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:27083-27091）。最近、ALP（アクチニン結合LIMタンパク質）がαアクチニン-2に結合することが示された（Bouju, S. 他 (1999) Neuromuscul. Disord. 9:3-10）。
【００１５】
Frabinタンパク質は、アクチンフィラメント結合タンパク質の別の例である（Obaishi, H. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:18697-18700）。Frabin（FGD1関連F-アクチン結合タンパク質）は1つのアクチンフィラメント結合（FAB）ドメイン、１つのDbl相同性（DH）ドメイン、２つのプレックストリン相同性（PH）ドメイン、及び１つのシステインリッチFYVE（Fab1p、YOTB、Vac1p、及びEEA1（初期エンドソーム抗原1））ドメインをもつ。FrabinはCdc42低分子量Gタンパク質（Cdc42）のGDP/GTP交換活性を示し、無傷細胞内でRac低分子量Gタンパク質（Rac）の活性化を間接的に誘導する。Cdc42とRacの活性化によって、Frabinは糸状仮足様突起と葉状仮足様突起の形成を誘導できる（Ono, Y. 他 (2000) Oncogene 19:3050-3058）。
【００１６】
Rhoファミリーの低分子量GTP結合タンパク質は、細胞の形態変化、接着、及び運動など、アクチン依存性細胞機能の重要な調節因子である。Rhoファミリーは、Cdc42、Rac、Rhoの３つの主要なサブファミリーから成る。Rhoファミリーメンバーは、GDP/GTP交換因子（GEF）によって、GDP結合した非活性型とGTP結合の活性型の間を循環する（Umikawa, M.他(1999) J. Biol. Chem. 274:25197-25200）。RhoGEFファミリーはミクロフィラメント組織化で重要である。
【００１７】
ネブリン関連タンパク質
ネブリンは、骨格筋内でアクチンフィラメントと相互作用する大きなサルコメア(筋節)構成タンパク質である(Wang, K.他(1996) J. Biol. Chem. 271:4304-4314)。ネブリンは、コンセンサス配列及び予測されたα螺旋構造を持つ、35残基モジュールのコピーを185以上含んでいる。35残基モジュールには１つのアクチン結合ドメインが含まれている。ネブリンの中心部分では、35残基モジュールが、7モジュールのスーパーリピートパターンを示している。このスーパーリピートパターンはネブリンのC末端100キロダルトン領域には存在しない。ネブリンのN末端領域には8個のリンカーモジュールと１つの8キロダルトン酸性ドメインが含まれている。このC末端領域は固有であり、１個のSH3ドメインを含む。筋節内でネブリンは、C末端がZ線に位置し、またN末端がアクトミオシン重複部分の細いフィラメントの尖った（pointed）低成長型末端に位置するように配向される。
【００１８】
ネブリンは数種のアイソフォームとして存在し、その大きさの範囲は600から900キロダルトンである(Kruger, M.他(1991) J. Cell. Biol. 115:97-107)。ネブリンの大きさは組織及び種特異的であり、発生的に制御される。アイソフォームの大きさが骨格筋における細いフィラメントの長さと相関するという観察に基づくと、ネブリンは細いフィラメントの長さを調節する分子定規（molecular ruler）として或る役割を果たすと提案されている。各々のネブリン35残基モジュールが１つのアクチン単量体と会合し得るので、異なった数のモジュールを持つアイソフォームによって細いフィラメントの長さが決定され得る。ネブリンのN末端領域はトロポモジュリンと相互作用するが、トロポモジュリンはこの機能を補助している可能性がある(McElhinny, A.S.他(2001) J. Biol. Chem. 276:583-592)。トロポモジュリンは細いフィラメントの尖った末端でアクチンをキャップ（cap）して、アクチン単量体の解離または付加を防ぐことによってフィラメントの長さを維持する。
【００１９】
ネブリンは心筋には存在しないが、ネブリン様モジュールを有する関連するタンパク質によって類似の機能が果たされ得る。例えばネブレット（nebulette）は心臓で特異的に発現され、23個の35残基ネブリン様モジュールを持つC末端領域を有する(Moncman, C.L.及びK. Wang (2000) J. Muscle Res. Cell Motil. 21:153-169; Millevoi, S.他(1998) J. Mol. Biol. 282:111-123)。ネブレットはドメイン構造がネブリンに類似するが、わずか107キロダルトンの、より小さいタンパク質である。これは１つの酸性N末端ドメインを有し、このドメインは、ネブリン様モジュール、リンカードメイン及びSH3ドメインを含むリピートドメインである。ネブレットのリピートドメインはネブリンのリピートドメインの約10分の１の大きさである。ネブレットの35残基モジュール群は或るコンセンサスモチーフを有しており、モジュール15-22のサブファミリーは或る保存されたモチーフを共有する。ネブリンとは異なり、ネブレットモジュールはスーパーリピートパターンを示さない。ネブレットはアクチン及び他のサルコメア構成タンパク質(ミオシン、カルモジュリン、トロポミオシン、トロポニン及びα-アクチニン)に結合する(Moncman, C.L.及びK. Wang (1999) Cell Motil. Cytoskeleton 44:1-22)。筋節におけるネブレットの配向は、Z線にC末端、I帯にN末端を有し、ネブリンの配向に類似している。
【００２０】
ネブリン関連固着(anchoring)タンパク質(N-RAP)は心筋及び骨格筋に発現される(Luo, G.他(1997) Cell Motil. Cytoskeleton 38:75-90)。これは筋腱接合部及び介在板での筋原線維の末端に存在する133キロダルトンのタンパク質である。N-RAPのC末端領域には35残基ネブリン様モジュールのコピーが27個ある。17のモジュールは或るスーパーリピートパターンに組織されている。N末端領域には１つのシステインリッチLIMドメインが含まれる。LIMドメイン群は二つの隣接する亜鉛フィンガー様構造において２つの亜鉛イオンを結合し、タンパク質間相互作用を媒介することがわかっている。N-RAPは筋原線維のアクチンフィラメントと他のサルコメア構成タンパク質との間の相互作用を媒介しうる。N-RAPは、アクチン、タリン及びビンキュリンに結合する(Luo, G. 他(1999) Biochemistry 38:6135-6143)。N-RAPはそのスーパーリピート領域によってアクチン及びビンキュリンと相互作用し、そのLIMドメインによってタリンと相互作用する。タリン及びビンキュリンもまた筋腱接合部に存在し、N-RAPと共に筋原線維のアクチンフィラメントと筋細胞膜の間を連結して、張力を筋原線維から細胞外マトリックスに伝達しうる。
【００２１】
サルコメア構成タンパク質の突然変異は筋肉の弱化と疾患に関連している(Laing, N.G. (1999) Curr. Opin. Neurol. 12:513-518)。一部の症例の常染色体劣性ネマリンミオパチーはネブリン欠損によって生じる(Pelin, K.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96:2305-2310)。この疾患は筋線維にネマリン小体（nemaline bodies）が存在することを特徴とする。ネマリン小体には、Z盤と細いフィラメントとに通常は関連するタンパク質類が含まれている。ネブリンにおける欠損は明らかにサルコメア構成タンパク質間の相互作用を乱させ、その結果ネマリン小体におけるタンパク質の病理的凝集を生じる。
【００２２】
中間径フィラメント及び関連タンパク質
中間径フィラメント(IF)は直径約10nmの細胞骨格線維であり、ミクロフィラメントと微小管の直径の中間の大きさである。IFは細胞の構造的役割を果たしており、細胞を強化し、組織化する。IFは特に上皮細胞及び神経細胞に豊富である。IFは極めて安定であり、ミクロフィラメントや微小管とは異なり、細胞運動には関与しない。
【００２３】
哺乳類では、５つのタイプのIFタンパク質が知られている。I型及びII型のタンパク質は、各々酸性ケラチン及び塩基性ケラチンである。酸性ケラチン及び塩基性ケラチンのヘテロ二量体は、ケラチンIFの基礎単位である。ケラチンは、皮膚や角膜などの軟らかい上皮内、爪や髪などの硬い上皮内、及び体内腔を裏打ちする上皮内に豊富にある。ケラチン遺伝子群の突然変異は、単純型表皮水疱症、水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症（表皮剥離性角質増殖症）、非表皮剥離性及び表皮剥離性掌蹠角皮症、ジーメンス水泡型魚鱗癬、先天性爪肥厚症、及び白色海綿状母斑を含む、上皮疾患の原因となる。これらの疾患には、重症の皮膚水疱形成の原因となるものもある（Wawersik, M.他(1997) J. Biol. Chem. 272:32557-32565、Corden, L.D.及びW.H. McLean (1996) Exp. Dermatol. 5:297-307等を参照）。
【００２４】
III型のIFタンパク質には、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質、ビメンチン、及びペリフェリンが含まれる。筋細胞中のデスミンフィラメントは筋原線維を束に連結し、収縮時に筋肉内のサルコメアを安定化させる。グリア線維性酸性タンパク質フィラメントは、神経細胞と星状膠細胞とを囲むグリア細胞に見られる。ビメンチンフィラメントは血管内皮細胞、数種の上皮細胞、及び、線維芽細胞など間葉細胞に見られ、一般に微小管と結合している。ビメンチンフィラメントは、細胞内で核や他の細胞小器官を所定の位置に留める役割を持っている可能性がある。IV型のIFにはニューロフィラメントとネスチンが含まれる。ニューロフィラメントはNF-L、NF-M、及びNF-Hの３つのポリペプチドから構成され、しばしば軸索中の微小管に結合している。ニューロフィラメントは軸索の放射状成長とその直径に関与し、最終的には神経インパルス伝達の速度にも関係する。ニューロフィラメントのリン酸化と代謝の変化は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、及びアルツハイマー病など、神経変性疾患で観察される（Julien, J.P.及びW.E. Mushynski (1998) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 61:1-23）。V型IFであるラミンは核内で見られ、そこで核膜を支持する。
【００２５】
IF類は、短い非螺旋状リンカーのセグメント群が割り込んでいる、中心部のα螺旋桿状領域を有する。この桿状領域はたいてい、非螺旋状の頭部ドメインと尾部ドメインに挟まれている。中間径フィラメントタンパク質の桿状領域群は、会合して或るコイルドコイル二量体を形成する。極めて規則正しい集合過程によって、二量体からIFを生じる。ミクロフィラメントや微小管の集合とは異なり、IF集合にはATPまたはGTPのどちらも必要でない。
【００２６】
IF結合タンパク質(IFAP)はIF間の相互作用及び他の細胞構造との相互作用を媒介する。IFAPは束状またはネットワークにIFを架橋するか、あるいは原形質膜に架橋する。またIFをミクロフィラメントや微小管細胞骨格に架橋する場合がある。微小管とIFは特に密接に会合している。IFAPには、BPAG1、プラコグロビン、デスモプラキンI、デスモプラキンII、プレクチン(plectin)、アンキリン、フィラグリン(filaggrin)、及びラミンB受容体が含まれる。
【００２７】
細胞骨格膜アンカー
細胞骨格線維は特異的タンパク質によって原形質膜に付着している。これらの付着は細胞形態維持や筋収縮にとって重要である。赤血球において、スペクトリン-アクチン細胞骨格は３つのタンパク質、即ちバンド4.1、アンキリン及びアデュシン(adducin)によって細胞膜に付着される。この付着に欠陥があると異常な形状の細胞になり、それらの細胞は脾臓によってより急速に分解され、貧血を起こさせる。血小板においては、スペクトリン-アクチン細胞骨格はまたアンキリンによって膜に結合されており、２番目のアクチンネットワークがフィラミンによって膜に固着されている。筋細胞ではタンパク質ジストロフィンがアクチンフィラメントを原形質膜に結合しており、ジストロフィン遺伝子の突然変異によってデュシェンヌ型筋ジストロフィーが生じる。
【００２８】
接着斑
接着斑(focal adhesion)は、細胞外マトリックス(ECM)のような基質への細胞の接着に関与する原形質膜の特殊化した構造である。接着斑は細胞外基質と細胞骨格との間の接続を形成し、細胞形態、細胞運動性、及び細胞増殖のような機能に影響を与える。膜貫通のインテグリン分子が接着斑の基礎を形成する。インテグリンはリガンドに結合すると、原形質膜の平面内でクラスターを形成する。αアクチニン、タリン、テンシン、ビンキュリン、パキシリン、及びフィラミンといった、アクチン結合タンパク質など細胞骨格リンカー蛋白がそのクラスター部位に動員される。Rhoファミリータンパク質、Rasファミリータンパク質、接着斑キナーゼ、及びSrcファミリーメンバーのような重要な調節タンパク質もまた動員される。これらの事象によって、アクチンフィラメントが再編成されストレスファイバーが形成される。これらの細胞内再構成によって、さらにインテグリン-細胞外マトリックスの相互作用とインテグリンのクラスター化が促進される。このようにして、インテグリンは原形質膜の細胞質ゾル面と細胞外面の両方においてタンパク質複合体の凝集を媒介し、接着斑のアセンブリに至らせる。多くのシグナル伝達応答は、Src、FAK、パキシリン、及びテンシンなど、種々の接着複合体タンパク質によって仲介される（Yamada, K.M.及びB. Geiger, (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9:76-85の概説を参照）。
【００２９】
IFはまた細胞骨格膜アンカーによって膜に付着される。核ラミナはラミンB受容体によって核膜の内面に付着されている。ビメンチンIFはアンキリンとプレクチンによって原形質膜に付着されている。デスモソーム及びヘミデスモソームの膜接合部によって、臓器と皮膚との上皮細胞が結合されている。これらの膜接合部によってずり応力が上皮細胞層全体に分配され、したがって上皮に強度と硬性が与えられる。上皮細胞のIFはプラコグロビンとデスモプラキンによってデスモソームに付着している。IFをヘミデスモソームに結合するタンパク質はわかっていない。デスミンIFは筋肉においてサルコメアを包囲しており、パラネミン(paranemin)、シネミン(synemin)及びアンキリンによって原形質膜に結合している。
【００３０】
モータータンパク質
ミオシン関連モータータンパク質
ミオシンはATPの加水分解を運動に共役させアクチンに活性化されるATP分解酵素であり、真核細胞中に見られる。ミオシンは、筋収縮のモーター機能、及び、食作用や有糸細胞分裂（細胞質分裂）中に行われる細胞内容物の再配列などの細胞内運動のためのモーター機能を提供する。サルコメア(筋節)と称される骨格筋の収縮単位は、アクチンを含む細いフィラメント及びミオシンを含む太いフィラメントの高度に規則正しい配列から構成される。太いフィラメントと細いフィラメントの間に架橋が形成され、太いフィラメント内のミオシン頭部のATP依存性の運動が細いフィラメントを引っ張って筋節を短縮し、それによって筋線維を短縮する。
【００３１】
ミオシンは、１または２つの重鎖及びそれに会合する軽鎖を有する。ミオシン重鎖は、アミノ末端モータードメイン即ち頭部ドメインと、軽鎖結合の部位である頚部と、カルボキシ末端尾部ドメインとを有する。尾部ドメインは、α螺旋コイルドコイルの形成に関連している可能性がある。例えば筋組織に見られるような従来型ミオシンは２つのミオシン重鎖サブユニットを有し、各々が２つの軽鎖サブユニットに会合しており、軽鎖サブユニットは重鎖の頚部領域に結合し調節の役割を果たす。細胞内運動において機能すると思われる非従来型ミオシンは、１または２つの重鎖及びそれに会合する軽鎖を持つ場合がある。脊椎動物の約25のミオシン重鎖遺伝子について、半分以上が非従来型であるという証拠がある。
【００３２】
ダイニン関連モータータンパク質
ダイニンは微小管上で作用する(-)端指向性モータータンパク質である。細胞質型と軸糸型の2種のダイニンが同定されている。細胞質ダイニンは細胞質内の微小管に沿って物質の移行を担い、例えば、神経末端から細胞体への輸送やエンドサイトーシス小胞のリソソームへの輸送などに関与する。さらに、ウイルスはしばしば細胞質ダイニンを利用して核内に入り込み感染を成功させる（Sodeik, B.他(1997) J. Cell Biol. 136:1007-1021）。例えば単純ヘルペスウイルス1のビリオンタンパク質は細胞質ダイニンの中鎖と相互作用する（Ye, G.J. 他 (2000) J. Virol. 74:1355-1363）。細胞質ダイニンはまた、有子分裂にも関与が報告されている。軸糸ダイニンは鞭毛や繊毛の鞭打ち運動に関与する。１つの微小管ダブレット上のダイニンは、隣接する微小管ダブレットに沿って歩く。この滑る力によって、鞭毛または繊毛の鞭打ち運動を起こす屈曲が生じる。ダイニンは1000から2000キロダルトンの間の天然質量を有し、ATPの加水分解によって駆動される、力を生じる頭部が２個ないし３個ある。この頭部は柄（ストーク）を介して基部ドメインに連結しており、この基部ドメインは極めて可変の数からなる付属の中鎖や軽鎖から構成されている。細胞質ダイニンはモータータンパク質中で最大で最も複雑である。
【００３３】
キネシン関連モータータンパク質
キネシンは、微小管上で作用する(+)端指向性モータータンパク質である。基本型のキネシン分子は、膜で囲まれた小胞及び細胞小器官の輸送に関与している。この機能は、ニューロンにおける軸索輸送に特に重要である。キネシンはまた、全ての細胞タイプにおいてゴルジ体から小胞体への小胞の輸送にも重要である。この役割は、これら分泌性オルガネラの同一性及び機能性の維持にとって重大な意味を持つ。
【００３４】
キネシンは偏在性で保存されたファミリーの50以上のタンパク質を規定し、一次アミノ酸配列、ドメイン構造、運動速度及び細胞機能に基づき少なくとも8つのサブファミリーに分類できる(概説はMoore, J.D.及びS.A. Endow (1996) Bioessays 18:207-219;並びにHoyt, A.M. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6:63-68)。原型のキネシン分子は、２個のポリペプチド重鎖(KHC)と２個のポリペプチド軽鎖(KLC)からなるヘテロ四量体である。KHCサブユニットが通常「キネシン」と呼ばれる。KHCは長さが約1000アミノ酸であり、KLCは長さが約550アミノ酸である。２つのKHCが二量体化して、３つの異なる２次構造領域を有する棒状分子を形成する。棒状分子の一端に、ATP加水分解及び微小管結合において機能する或る球状のモータードメインがある。キネシンモータードメイン群は高度に保存され、７０％を超える同一性を共有する。モータードメインの先には二量体化を媒介するα螺旋コイルドコイル領域が１つある。棒状分子の他端は、積荷(cargo)分子に会合する扇形尾部である。尾部は、KHCのC末端と２つのKLCの相互作用により形成される。
【００３５】
キネシンのさらに分岐したサブファミリーのメンバーはキネシン関連タンパク質(KRP)と呼ばれ、これらの多くは真核生物の有糸分裂の際に機能する(Hoyt前出)。いくつかのKRPは、紡錘体の集合に必要である。in vivo 及びin vitro 分析で、これらのKRPは紡錘体を構成する微小管上で力を出し紡錘体極の分離を生じることが示唆されている。この活性のためには、KRPのリン酸化が必要である。紡錘体が集合できないと、有糸分裂が不成功に終わり染色体異数性が生じる。染色体異数性は癌細胞の特徴である。さらに、或るユニークなKRPであるセントロメアタンパク質Eはヒト有糸分裂染色体の動原体に局在するが、これは動原体の紡錘体両極への分離に関与している可能性がある。
【００３６】
ダイナミン関連モータータンパク質
ダイナミンは、「分子ピンチ酵素（molecular pinchase）」として機能する大型のGTP分解酵素モータータンパク質で、膜を切断するために使われるメカノケミカル的力を発生する。この活性は、エンドサイトーシスで被覆ピットからクラスリン被覆小胞を形成するため、また神経細胞のシナプス小胞の生合成に重要である。ダイナミンが膜に結合するとダイナミンの螺旋状への自己集合をもたらし、その螺旋は平らな膜表面を締め付けて細管状にするように作用しうる。GTPの加水分解はダイナミンポリマーのコンフォメーション変化を誘導し、それが膜細管を締め付けてその膜細管の切断と膜小胞の形成をもたらす。GDPと無機リン酸の放出がダイナミンの解離をもたらす。ダイナミンは解離の後、膜から離れるか、または小胞に会合したままで細胞の他の領域に輸送され得る。いくつかのダイナミン関連タンパク質に加え、３つの相同なダイナミン遺伝子が発見されている。保存されたダイナミン領域は、N末端のGTP結合ドメイン、膜に結合する、中心のプレックストリン相同性ドメイン、ダイナミンのGTP分解酵素活性を活性化する可能性のある中心のコイルドコイル領域、及び他のタンパク質のSH3ドメインに結合するいくつかのモチーフを含むC末端のプロリンリッチドメインである。幾つかのダイナミン関連タンパク質は、プレックストリン相同性ドメインまたはプロリンリッチドメインを持たない（McNiven, M.A. (1998) Cell 94:151-154; Scaife, R.M.及びR.L. Margolis (1997) Cell. Signal. 9:395-401を参照）。
【００３７】
細胞骨格については、Lodish, H.他 (1995) Molecular Cell Biology, Scientific American Books, New York NYに概説されている。
【００３８】
発現プロファイル作成
マイクロアレイは、生物分析に用いる分析ツールである。マイクロアレイには複数の分子を有し、それらは或る固体支持体の表面で空間的に分布し、その表面と安定して結合している。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び/または抗体のマイクロアレイが開発され、その種々の用途には例えば遺伝子配列決定、遺伝子発現モニタリング、遺伝子マッピング、細菌同定、創薬、コンビナトリアルケミストリがある。
【００３９】
特にマイクロアレイを用いる領域は遺伝子発現分析である。アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子またはその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性検定においてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、または、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、または障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【００４０】
大腸癌
大腸直腸癌は、米国で4番目に発生率の高い癌であり癌死の2番目に高い原因で毎年約13万人が新患となり5万5千人が死亡する。大腸癌と直腸癌は多くの環境危険因子を共有しており、両癌は、特有の遺伝的症候群を有する人々に見られる(大腸直腸癌の概説はPotter, JD (1999; J Natl Cancer Institute 91:916-932)を参照)。大腸癌は男女にほぼ等しい頻度で発症する唯一の癌である。また米国で大腸癌の診断後5年生存率は約55％である(Ries他(1990) National Institutes of Health, DHHS Publ No. (NIH)90-2789)。
【００４１】
大腸癌は遺伝子と環境の両者と因果関係がある。幾つかの分子経路が大腸癌の発生と関係があり、これらの経路いずれかの鍵遺伝子の発現は先天性または後天性突然変異或いは高メチル化により失われる可能性がある。発現における変化が大腸癌または大腸癌発生の素因の早期の指標となりうる遺伝子の同定が、特に必要とされている。
【００４２】
たとえば、異常なパターンのDNAメチル化がヒトの腫瘍に一貫して発生し、広範なゲノム低メチル化と、局在的にメチル化の増加した領域が同時に含まれることは周知である。特に大腸癌では、大腸癌に先行する前癌性ポリープ内など、腫瘍進行早期にこれらの変化が発生することが知られる。DNAメチル化を行う酵素であるDNAメチルトランスフェラーゼは大腸癌または癌に先行する良性ポリープの患者の組織学的に正常な粘膜で著しく増加し、この増加は大腸腫瘍の進行中は継続する(Wafik, S他(1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:3470-3474)。DNAメチル化の増加は「CpG島」と呼ばれるゲノムDNAのG+Cリッチ領域に生じ、この「CpG島」は遺伝子群周辺の「開いた」転写構造を維持するために重要で、これらの領域が高メチル化すると、遺伝子転写を沈黙させる「閉じた」構造になる。CpG島のこうした異常なメチル化による、分化遺伝子群の沈黙(サイレンシング)または下方制御は、不死化した細胞での分化を妨げ得ることが示唆されている(Anteguera, F.他(1990) Cell 62:503-514)。
【００４３】
家族性大腸腺腫症(FAP)は大腸癌に先行するまれな常染色体優性症候群であり、大腸腺腫性ポリポーシス(APC)遺伝子の先天性突然変異によって起こる。FAPは平均年令44才で癌に進行する多発性大腸直腸腺腫の早期発症を特徴とする。APC遺伝子は、APC-β-カテニン-Tcf (T-細胞因子)経路の一部である。この経路の機能障害により、大腸上皮細胞の規則的な複製、接着、遊走が失われ、ポリープの成長につながる。一連の他の遺伝子変化がAPC-β-カテニン-Tcf経路の活性化後に起こり、この変化に伴い正常な大腸粘膜が転移性癌腫に移行する。この変化としては、K-Rasプロトオンコジーンの突然変異や、メチル化パターンの変化、及び、腫瘍抑制遺伝子p53とSmad4/DPC4との突然変異または喪失がある。突然変異したAPC遺伝子の遺伝は稀な現象であるが、APCの喪失または突然変異や、APC-β-カテニン-Tcf経路への結果的効果は、一般的集団の大部分の大腸癌にとって中心的であると考えられる。
【００４４】
遺伝性非ポリポーシス大腸癌(HNPCC)は、FAPほどよく定義されていない表現型の、別の先天性常染色体優性症候群である。大腸直腸癌症例の約２％を占めるHNPCCは、癌の早期発症の傾向及び、他の癌、特に、子宮内膜、尿路、胃及び胆道系に波及する癌の発症によって区別される。HNPCCは、DNAミスマッチ修復(MMR)経路の1つ以上の遺伝子の突然変異から発生する。２つのヒトMMR遺伝子MSH2及びMLH1の突然変異は、これまでに同定されたHNPCCファミリーの大部分に見られる。DNA MMR経路は、複製時にDNAポリメラーゼの作用から生じるエラーを同定し修復する。さらに、MMR活性が喪失されると、アポトーシスを制御するBAX遺伝子及び細胞増殖を制御するTGFβ受容体II遺伝子の喪失などのような他の遺伝子の突然変異及び欠失の蓄積により、癌の進行に寄与する。DNA MMR欠損患者では、DNAへの修復できない損傷の可能性があるため、癌腫への進行は通常より急速である。
【００４５】
潰瘍性大腸炎は大腸癌に対する寄与度は小さいが、罹病した患者は癌を発症する危険性が約20倍になる。進行は、組織学的に正常な組織においても早期に現れ得る、p53遺伝子の喪失を特徴とする。潰瘍性大腸炎から中間のポリープ状態を経ないで異形成/癌腫へ疾患が進行することは、大腸粘膜内の増殖細胞の大腸内容物への曝露から生じる変異原活性が高度であることを示唆する。
【００４６】
ほとんどすべての大腸癌は、エストロゲン受容体(ER)遺伝子が沈黙した細胞から発生する。ER遺伝子転写の沈黙(サイレンシング)は年齢に関係しており、ER遺伝子の高メチル化に関連する(Issa, J-P J他(1994) Nature Genetics 7:536-540)。培養した大腸癌細胞に外因性ER遺伝子を導入すると、著しく成長が抑制される。大腸上皮細胞におけるERタンパク質の喪失とその後の癌発症との関係は確立されていない。
【００４７】
大腸癌に関連、また、本病の発生と進行に、特に遺伝子の下方制御または欠失に関連する、多数の遺伝子変容が存在することは明らかで、これら変容は癌発生の早期指標を提供する可能性があり、疾患進行モニタリングにまたは有望な治療標的の提供にも使用される可能性がある。大腸癌の或る特定症例で影響される特定の遺伝子群は、この疾患の分子的進行に依存する。大腸癌及び前癌状態に関連する更なる遺伝子群を同定することにより、本疾患の発症及び進行に関連する、より信頼できる診断的パターンが得られるであろう。
【００４８】
本発明は、大腸癌に関連するタンパク類をコードする遺伝子群の発現変化検出に用いる、複数のcDNAを有する或る組成を提供する。こうした組成は当分野での要望を、一組の差次的に発現される遺伝子であって全体または一部が大腸癌の診断、予後診断、または治療に利用されうる遺伝子群を提供することで満たす。
【００４９】
大腸癌の進展は多段階に経過し、これらの段階の中で前悪性大腸細胞が比較的明確な一連のイベントを経て腫瘍を形成する。腫瘍進行と悪性転換との過程に関与する因子としては、遺伝因子、突然変異、及び選択がある。大腸癌をもたらす分子事象を特徴づける努力にもかかわらず、腫瘍の発生及び進行の過程は描写に至らない。大腸癌で差次的に発現する遺伝子群の同定のため、正常及び腫瘍組織での遺伝子発現パターンが比較された。同じ個体からマッチさせた正常及び腫瘍サンプルが、競合ハイブリダイゼーションで比較された。この過程は、遺伝的背景による一部の個体変異を排除する。また疾患過程による相違を増強する。
【００５０】
C3A株は、成長での強力な接触阻害に関して選択されたHep G2肝癌細胞株（肝腫瘍の15才男子から単離）のクローン誘導体である。クローン集団の使用は、細胞の再現性を強化する。C3A株は、インスリン受容体とインスリン様成長因子II受容体とを発現する。プロゲステロンは天然プロゲスチンである。体内では、卵巣、精巣、胎盤、及び副腎皮質で合成される。ベクロメタゾンは、ステロイド依存性喘息を治療、アレルギーまたは非アレルギー（血管運動性）鼻炎に付随する症状を緩和、あるいは外科的除去に続く再発性鼻ポリープを予防するために使用される合成グルココルチコイドである。鼻腔内ベクロメタゾンの抗炎症作用及び血管収縮作用は、ヒドロコルチゾンによるものより5,000倍強力である。グルココルチコイドは天然ホルモンであり、薬理量で投与すると、炎症及び免疫応答を防止または抑制する。分子レベルでは、非結合グルココルチコイドは容易に細胞膜を越え、特異的細胞質レセプターと高親和性に結合する。結合後、転写に影響し、最終的にはタンパク合成に影響する。メドロキシプロゲステロン(MAH)は、プロゲステロンより約15倍も大きな薬理活性を有する合成プロゲスチンである。ブデソニド(Bude)は、アレルギー性鼻炎または喘息に付随する症状を制御するために使用されるコルチコステロイドである。ブデソニドは全身作用は弱いが、強い局所抗炎症作用を有する。プレドニゾンはコルチコステロイドであり、肝臓で代謝されて活性型であるプレドニゾロンになる。プレドニゾンはグルココルチコイドとしてヒドロコルチゾンの約4倍、強力である。プレドニゾンの作用期間はヒドロコルチゾンとデキサメタゾンの中間である。デキサメタゾン(DEX)は、抗炎症剤または免疫抑制剤として使用される合成グルココルチコイドである。中枢神経系への到達能が大きいので、DEXは、ヒドロコルチゾンより約20〜30倍、またプレドニゾンより5〜7倍強力である。最後にベタメタゾンは、抗炎症剤または免疫抑制剤として使用される合成グルココルチコイドである。
【００５１】
骨肉腫
骨肉腫は、小児では最も多い悪性骨腫瘍である。非転移性疾患患者の約30〜40%は治療後に再発がある。現在、初期診断時に用い得る、再発危険性が高い患者を予測するための予後因子は無い。
【００５２】
アルツハイマー病
アルツハイマー病は進行性神経変性障害であり、特徴は、アミロイドβペプチドを含有する、老人斑と神経原線維変化との形成である。これらの斑は、脳の辺縁皮質と連合皮質で見られる。海馬は辺縁系の一部であり、学習と記憶で重要な役割を果たす。アルツハイマー病の患者では、蓄積する斑が辺縁領域の神経構造を損傷し最終的に記憶プロセスを失わせる。世界で約2000万人がアルツハイマー病による痴呆にかかっている。本病は、30歳の若さでも起こりうる。家族性と散発性がある。家族性アルツハイマー病は、かつては厳密に常染色体優性形質であると考えられたが、この見解は、他の遺伝的決定因子が単離されるにつれ変化している。例えばアポリポ蛋白E (ApoE)(老人斑に見られる)の数種の通常の対立遺伝子変異体は、本病から保護する場合も、リスクを増す場合もある(Strittmatter他(1993) Proc Natl Acad Sci 90:1977-1981)。
【００５３】
４種の遺伝子での突然変異が、アルツハイマー病の素因になる。ApoE、アミロイド前駆体タンパク(APP)、プレセニリン-1及びプレセニリン-2である(Selkoe (1999) Nature 399:A23-A31)。ApoE遺伝子のe4対立遺伝子は、遅発性アルツハイマー病のリスクを増す。βアミロイド蛋白(Aβ)は老人斑の主要な成分であり、通常は、β及びγセクレターゼがAPPを切断して形成される。アルツハイマー病の患者では多量のAβが産生され、これら神経病理的斑で細胞外に蓄積する。Aβ沈着の根底にある機序を理解する努力は最近、APP切断セクレターゼに焦点を置いている。2種の酵母アスパルチルプロテアーゼが、APPをin vitro でプロセスすることが示された(Zhang他(1997) Biochim Biophys Acta 1359:110-122)。これらセクレターゼは膜内切断アスパルチルプロテアーゼである(Wolfe他(1999) Biochemistry 38:4720-4727)。プレセニリン1遺伝子は、APPカルボキシル末端を切断するγセクレターゼの候補遺伝子である。プレセニリンはAPPと共免疫沈降でき、プレセニリン遺伝子群での突然変異は42アミノ酸ペプチド型Aβの産生を増す。これらのミスセンス点突然変異の結果、特に攻撃的な早発型の本病が起きる(Haas及びDeStrooper (1999) Science 286:916-919)。
【００５４】
プロテアーゼであるBACE1及びBACE2（β部位APP切断酵素1及び2）はおそらくβセクレターゼであり潜在的治療標的であって、理由はAPP切断能である。BACE1はアスパルチルプロテアーゼであってβセクレターゼ活性を持ち、これはin vitro でAPPを切断しAβペプチドを産生する(Vasser他(1999) Science 286:735-741)。これは全ての脳の領域で中レベルに発現し、ニューロンに集中するが膠細胞には集中しない。BACE2は52%のアミノ酸同一性をBACE1に対して持つ(Saunders他(1999) Science 286:1255a)。BACE1は11番染色体長腕にマップし、BACE2は21番染色体のダウン症候群領域にマップする(Acquati他(2000) 468: 59-64; Saunders他、前出)。中年のダウン症候群患者は、増大したβアミロイド沈着を有する。Aβペプチドのアミノ末端は不均一に切断されるようなので、数種のβセクレターゼがAPPプロセシングに関与しうることを示している(Vasser (1999) Science 286:735-741)。
【００５５】
アルツハイマー病と多くの他の遺伝子及びタンパク質との関連性の報告がある。胎児アルツハイマー抗原(FALZ)とシヌクレインα(SNCA)は、脳の斑と神経原線維変化に見られる。数種の遺伝子多型の遺伝も、本病発症リスク増加に連鎖する。例えばβ2マクログロブリン(プロテアーゼ阻害因子として作用しうるタンパク質)をコードする遺伝子での多型性は、遅発型アルツハイマー病発症リスク増加に関連する。
【００５６】
乳癌
乳癌は米人女性が最も多く診断されるタイプの癌であり、癌死の2番目に多い原因である。米人女性が乳癌を発症する生涯リスクは8分の1であり、乳癌と診断された女性の3分の1は乳癌で死亡する。幾つかの危険因子が同定されており、例えばホルモン因子及び遺伝因子がある。乳癌に関連する1つの遺伝子欠損の結果、多数の遺伝子座(例えばp53、Rb、BRCA1及びBRCA2)でヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity：LOH)が起きる。別の遺伝子欠損は遺伝子増幅であり、関与する遺伝子は例えばc-myc及びc-erbB2 (Her2-neu遺伝子)である。ステロイドと成長因子との経路も乳癌で変容し、特にエストロゲン、プロゲステロン、及び上皮成長因子(EGF)経路が変容する。乳癌の進展は多段階に経過し、これらの段階の中で前悪性乳腺上皮細胞が比較的明確な一連のイベントを経て腫瘍を形成する。早期の腫瘍発達イベントとして導管過形成がある。急速な新生物成長中の細胞は次第に浸潤癌に進行し、肺、骨、また潜在的には他の臓器へ転移するようになる。腫瘍進行と悪性転換との過程に影響しうる変数としては、遺伝因子、環境因子、成長因子、及びホルモンがある。
【００５７】
肺癌
肺癌は米国男性の癌死の主因であり、女性の癌死の第2の原因である。肺癌は、4つの組織病理的に異なる群に分けられる。3群（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌）は、非小細胞肺癌(NSCLC)に分類される。第4群の癌は、小細胞肺癌(SCLC)という。3番染色体での欠失は肺癌に一般的であり、この領域に腫瘍抑制遺伝子の存在を示すと思われる。K-rasの活性化突然変異は肺癌で一般的に見られ、この疾患の1つのマウスモデルの基礎である。
【００５８】
卵巣癌
卵巣癌は婦人科癌の死亡の主な原因となっている。卵巣癌の大半は上皮細胞に由来しており、上皮卵巣癌の患者の70%は疾患の後期段階にある。その結果、この疾患に対する長期生存率は極めて低い。卵巣癌の早期マーカーを同定できれば、生存率を大きく増加できるであろう。卵巣癌の発症に関与する遺伝的変異には、p53の突然変異及び、マイクロサテライトの不安定性が含まれる。正常な卵巣を卵巣腫瘍と比較すると、おそらく遺伝子発現パターンが異なっている。
【００５９】
前立腺癌
大抵の腫瘍と同様、前立腺癌は多段階の進行を通して発達して、最終的に攻撃的腫瘍の表現型をもたらす。腫瘍進行の初めの段階には、正常な内腔及び/または基底上皮細胞の過剰増殖が関係する。アンドロゲン応答性細胞は過形成し、初期腫瘍に発展する。初期腫瘍はしばしばアンドロゲンに対して感受性がありアンドロゲン除去療法に反応するが、アンドロゲン非依存性細胞の集団が過形成集団から発展する。これらの細胞は、浸潤性となり骨、脳、または肺に転移する可能性がある、前立腺腫瘍のより進んだ形態を表す。多様な遺伝子が、腫瘍進行中に差次的に発現され得る。例えば、ヘテロ接合性の消失(LOH)は前立腺癌の第8p染色体において頻繁に観察される。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)によると29 (69%)の腫瘍では8p上の少なくとも1つの遺伝子座に欠失があり、8p21.2〜p21.1での欠失は進行した前立腺癌では局所前立腺癌より有意に高頻度であるので、8p22〜p21.3での欠失は腫瘍分化に重要な役割を果たし、一方8p21.2〜p21.1での欠失は前立腺癌の進展で役割を果たすとみられる(Oba, K.他(2001) Cancer Genet. Cytogenet. 124: 20-26)。
【００６０】
骨関節炎
骨関節炎(OA)は、限局的な軟骨喪失を伴う衰弱性関節疾患である。幾つかの研究が示すところでは、或る主要な遺伝的要素がOA発症に関与しうる。手、膝、及び股関節のX線撮影OAの双生児研究からの遺伝可能性の推計範囲は、36%〜68%である(MacGregor, A.J.及びSpector, T.D. (1999) Rheumatology 38:583-560)。数種のインターロイキン遺伝子及びインターロイキン関連遺伝子が、2q12〜q22に位置する(Leppavouri, J.他(1999) Am. J. Hum. Genet. 65:1060-1067)。インターロイキンは軟骨細胞外基質を分解する幾つかの酵素を制御し、数種のインターロイキン遺伝子(例えばIL-1β)の発現は、OA関節組織で変容している(Elson, C.J.他(1998) Br. J. Rheum. 37:106-107)。
【００６１】
当分野には、細胞増殖異常、ウイルス感染症、神経疾患、並びに心筋障害及び骨格筋障害の、診断、予防、及び治療のための、核酸とタンパク質とを含む新規組成の要望がある。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００６２】
発明の種々の実施態様は、総称して「SCAP」、個別にはそれぞれ「SCAP-1」、「SCAP-2」、「SCAP-3」、「SCAP-4」、「SCAP-5」、「SCAP-6」、「SCAP-7」、「SCAP-8」、「SCAP-9」、「SCAP-10」、「SCAP-11」、「SCAP-12」、「SCAP-13」、「SCAP-14」、「SCAP-15」、「SCAP-16」、「SCAP-17」、「SCAP-18」、「SCAP-19」、「SCAP-20」、「SCAP-21」、「SCAP-22」、「SCAP-23」、「SCAP-24」、「SCAP-25」、「SCAP-26」、「SCAP-27」、「SCAP-28」、「SCAP-29」、「SCAP-30」、「SCAP-31」、「SCAP-32」、「SCAP-33」、「SCAP-34」、「SCAP-35」、「SCAP-36」、「SCAP-37」、「SCAP-38」、「SCAP-39」、「SCAP-40」、「SCAP-41」、「SCAP-42」、「SCAP-43」、「SCAP-44」、「SCAP-45」、「SCAP-46」、「SCAP-47」、「SCAP-48」、「SCAP-49」、「SCAP-50」、「SCAP-51」と呼ぶ精製されたポリペプチドである構造及び細胞骨格関連タンパク質を提供し、またこれらタンパク質とそれらをコードするポリヌクレオチドとを用いる、疾患と病状との、検出、診断、及び治療の方法を提供する。幾つかの実施態様はまた、精製した構造及び細胞骨格関連タンパク質群、並びに/またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて創薬過程を促進する方法(例えば効力、用量、毒性、及び薬理の決定の方法)を提供する。関連する幾つかの実施態様は、精製した構造及び細胞骨格関連タンパク質、及び／またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて疾患と病状との病原を調査する方法を提供する。
【００６３】
或る実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択されたアミノ酸配列と90％以上同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-51とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、とで構成される群から選択された単離したポリペプチドを提供する。別の実施態様は、SEQ ID NO:1-51のアミノ酸配列を持つ単離したポリペプチドを提供する。
【００６４】
また別の実施態様は(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:52-102からなる群から選択される。
【００６５】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。更に別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換生物を提供する。
【００６６】
別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、(ｄ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、(ａ)或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、(ｂ)そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００６７】
更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００６８】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、及び(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００６９】
また別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、及び(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、(a)サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも20の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、(ｂ)該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する過程を含む。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。或る関連した実施態様で本法は、該ハイブリダイゼーション複合体の量の検出を含みうる。また別の実施態様で該プローブは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００７０】
また更に別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、及び(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、(ａ)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(ｂ)前記増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出する過程からなる。或る関連した実施態様で本法は、該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の量の検出を含みうる。
【００７１】
別の実施態様は、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施態様で該組成物は、SEQ ID NO:1-51からなる群から選択された或るアミノ酸配列を持つ場合がある。別の実施態様は、機能的SCAPの低下したまたは異常な発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者に該組成物を投与する方法を提供する。
【００７２】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的SCAPの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００７３】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的SCAPの過剰発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００７４】
別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを少なくとも1つの試験化合物と適切な条件下で混合する過程と、(ｂ)該ポリペプチドと該試験化合物との結合を検出し、該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程からなる。
【００７５】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、及び(ｄ)SEQ ID NO:1-51からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、(ｂ)該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、(ｃ)この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００７６】
また更に別の実施態様は、SEQ ID NO:52-102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果に関し、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、(ａ)この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、(ｂ)この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、(ｃ)可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００７７】
別の実施態様は、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。(ａ)核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。(ｂ)処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。(i)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:52-102からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ場合がある。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。(ｃ)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(ｄ)処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【００７８】
(本発明の記載について)
本発明のタンパク質、核酸及び方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、機器、材料及び方法に本発明の実施様態が限定されるものではなく、変更され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００７９】
請求の範囲及び明細書中で用いる単数形の「或る」及び「その(この)」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もある。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００８０】
本明細書中で用いる全ての技術用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明の種々の実施態様に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００８１】
（定義）
用語「SCAP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など任意の出所からの、また任意の種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得た、実質的に精製されたSCAPのアミノ酸配列を指す。
【００８２】
用語「アゴニスト」は、SCAPの生物学的活性を増強または模倣する分子を指す。アゴニストとしては、SCAPと直接に相互作用、あるいはSCAPが関与する生物学的経路の各成分に作用してSCAPの活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００８３】
用語「対立遺伝子変異体」は、SCAPをコードする別の形の遺伝子を指す。対立遺伝子変異体群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る。また、変容したmRNA群を生じ得る。また、この変異体が生じ得るポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【００８４】
SCAPをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換がありながら、SCAPと同じポリペプチド、或いはSCAPの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、SCAPをコードするポリヌクレオチドにとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列群への不適当或いは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、SCAPをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なSCAPとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的あるいは免疫学的にSCAPの活性が保持される範囲で、残基群の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての、１つ以上の類似性に基づいて成され得る。例えば負の荷電アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正の荷電アミノ酸にはリジン及びアルギニンがありうる。親水性値が近似した極性無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、及びセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、及びフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【００８５】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指し得る。「アミノ酸配列」が或る天然タンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、記載したそのタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００８６】
「増幅」は、或る核酸の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には、当該分野で公知の、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術または他の核酸増幅技術を用いうる。
【００８７】
用語「アンタゴニスト」は、SCAPの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、SCAPと直接相互作用すること、あるいはSCAPが関与する生物学的経路の各成分に作用することによってSCAPの活性をモジュレートする、抗体などタンパク質、アンチカリン(anticalin)、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００８８】
用語「抗体」は、エピトープの決定基と結合できる、無傷の免疫グロブリン分子やそれらの断片例えばFab、F(ab')2、及びFv断片を指す。SCAPポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、無傷ポリペプチド群を用い、または当該の小ペプチド群を持つ断片群を用いて作製可能である。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、担体タンパク質に抱合し得る。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合する担体の例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、及び、スカシガイのヘモシアニン（KLH）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【００８９】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域(すなわちエピトープ)を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫する場合、該タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷の抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００９０】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する、核酸またはオリゴヌクレオチド分子を指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模なコンビナトリアルライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの組成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子(例えば高分子量キャリア)と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々の同族リガンドと特異的に架橋させうる（Brody, E.N.及びL. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13）。
【００９１】
用語「イントラマー(intramer)」は、in vivoで発現されるアプタマーを指す。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。
【００９２】
用語「スピーゲルマー(spiegelmer)」は、アプタマーの内、L-DNA、L-RNAなど左旋性ヌクレオチド誘導体または左旋性ヌクレオチド様分子などを指す。左旋性ヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に耐性がある。
【００９３】
用語「アンチセンス」は、或る特定核酸配列を持つ或るポリヌクレオチドの「センス」(コーディング)鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾された主鎖結合たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2'-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表示は或る参考DNA分子のアンチセンス鎖を指すことがあり、「正」または「プラス」という表示は或る参考DNA分子のセンス鎖を意味し得る。
【００９４】
用語「生物学的に活性」は、或る天然分子の構造的、調節的、あるいは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然、組換え体、または合成のSCAPまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【００９５】
「相補」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【００９６】
「〜のポリヌクレオチドを含む(持つ)組成物」または「〜のポリペプチドを含む(持つ)組成物」は、指定のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。SCAPをコード、若しくはSCAPの断片群をコードするポリヌクレオチド群を有する組成物類は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS)及び他の成分(例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNAなど)を有する水溶液中に、プローブを分散させ得る。
【００９７】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を除くためにDNA配列解析を繰り返し行い、XL-PCRキット(Applied Biosystems, Foster City CA)を用いて5'及び／または3'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEWフラグメント結合システム(Accelrys, Burlington MA)またはPhrap(University of Washington, Seattle WA)などのフラグメント結合用コンピュータプログラムを用い1つ以上のオーバーラップするcDNAやESTまたはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【００９８】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
【００９９】
2005520493.tif 000002
【０１００】
保存的なアミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分、を保持する。
【０１０１】
「欠失」は、結果として１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列内の変化、あるいは１個以上のヌクレオチドが欠如するヌクレオチド配列内の変化を指す。
【０１０２】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１０３】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合あるいは非共有結合するレポーター分子や酵素を指す。
【０１０４】
「差次的発現」は、少なくとも２例のサンプルを比較して判定する、増加（上方制御）、あるいは減少（下方制御）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１０５】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）群の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを意味し得るため、安定した下部構造群の新たな組合せによって新規のタンパク質群をアセンブリすることが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１０６】
「断片」は、SCAPまたはSCAPをコードするポリヌクレオチドの独特の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一でありうるが、親配列より長さが短い部分を指す。或る断片は、最長で定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さを有し得る。例えば或る断片は、約5〜約1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の、連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表及び図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１０７】
SEQ ID NO:52-102の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:52-102を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持ちうる。SEQ ID NO:52-102の或る断片を本発明の方法の1つ以上の実施態様、例えばハイブリダイゼーション及び増幅技術に、またはSEQ ID NO:52-102を関連ポリヌクレオチドから区別する類似の方法に用い得る。SEQ ID NO:52-102の或る断片の正確な長さは、また、その断片が対応するSEQ ID NO:52-102の領域は、その断片に意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定し得る。
【０１０８】
SEQ ID NO:1-51の或る断片は、SEQ ID NO:52-102の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-51の或る断片は、SEQ ID NO:1-51を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持ち得る。例えばSEQ ID NO:1-51の或る断片を、SEQ ID NO:1-51を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして用い得る。SEQ ID NO:1-51の或る断片の正確な長さは、また、この断片が対応するSEQ ID NO:1-51の領域は、その断片に意図する目的に基づき、本明細書に記載する、または当分野で既知の1つ以上の分析法で判定し得る。
【０１０９】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１１０】
「相同」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、また或いは配列同一性を意味する。
【０１１１】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」及び「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間での同一性の残基の一致の百分率を意味する。標準化アルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の2配列内にギャップ群を挿入し得るので、2つの配列をより有意に比較できる。
【０１１２】
ポリヌクレオチド配列間の一致率(同一性)を判定するには、当分野で既知の、または本明細書に記載の、１つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを用い得る。例えば一致率を判定するには、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、LASERGENEソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。CLUSTAL Vは、Higgins, D.G.及びP.M. Sharp (1989; CABIOS 5:151-153)、並びにHiggins, D.G. 他(1992; CABIOS 8:189-191)に記載がある。ポリヌクレオチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定される。「weighted」残基重み付け表がデフォルトで選択される。
【０１１３】
或いは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が、一般的に用いられ且つ入手自由な用い得る配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F.他(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）。BLASTは幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBI及び、インターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。「BLAST 2 Sequences」というツールも入手可能であり、これは２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用できる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用い得る。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ(gap)などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１１４】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１１５】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１１６】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝暗号の縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１１７】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の同一性の残基の一致の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。ポリペプチド配列に用いられる用語「類似率」または「〜％類似」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の残基の一致の百分率を指し、同一な残基の一致と保存的置換とを含む。一方、保存的置換は、ポリペプチド配列間の一致率の計算には含まれない。
【０１１８】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータ群を用いて判定できる(参照先と共に上述)。CLUSTAL Vを用いてポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。
【０１１９】
あるいは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１２０】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１２１】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定しうる。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１２２】
「ヒト人工染色体（HAC）」は直鎖状の微小染色体であり、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を持ち得る。また、染色体の複製、分離及び維持に必要な、全ての要素を持つ。
【０１２３】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列を改変した抗体分子を指す。
【０１２４】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、或る一本鎖ポリヌクレオチドが或る相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。許容的なアニーリング条件は、例えば、温度が68℃で、約6×SSC、約1%（w/v）のSDS、並びに約100μｇ/mlの、せん断して変性したサケ精子DNAの存在下である。
【０１２５】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸ハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook, J.及びD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版., 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 9章)に見られる。
【０１２６】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約0.2×SSC及び約0.1%のSDSの存在下、68℃で1時間の洗浄条件を含む。あるいは、温度は約65℃、60℃、55℃、または42℃を用い得る。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤の例として、約100〜200μg/mlの、せん断した変性サケ精子DNAがある。特定状況下たとえばRNA：DNAハイブリダイゼーションでは、有機溶剤たとえば約35〜50％v/v濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に、高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、及びヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１２７】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析など)。あるいは、一方の核酸が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板)に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０１２８】
用語「挿入」あるいは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基あるいはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列あるいはポリヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１２９】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患などに関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけ得る。
【０１３０】
「免疫原性断片」は、例えば哺乳類など生物に導入すると免疫応答を引き起こし得る、SCAPのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」にはまた、本明細書で開示するまたは当分野で既知のあらゆる抗体生産方法に有用な、SCAPの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも含む。
【０１３１】
用語「マイクロアレイ」は、或る基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または他の化合物の構成を指す。
【０１３２】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、または他の化合物を指す。
【０１３３】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、SCAPの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、SCAPのタンパク質活性の増減が、或いは結合特性の、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起き得る。
【０１３４】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を意味し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１３５】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１３６】
「ペプチド核酸(PNA)」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを持つ、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１３７】
SCAPの「翻訳後修飾」としては、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解切断及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、SCAPの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１３８】
「プローブ」とは、同一核酸、対立遺伝子核酸、または関連核酸の検出に用いる、SCAPをコードする核酸群、それらの相補配列、またはそれらの断片を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に付着した配列である。典型的な標識には、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、及び酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、核酸の増幅(及び同定)に用い得る。
【０１３９】
本発明に用いるプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列表を含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１４０】
プローブとプライマーとの調製及び使用方法は例えばSambrook, J.及びD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY), Ausubel, F.M.他(1999; Short Protocols in Molecular Biology, 第4版, John Wiley & Sons, New York NY)並びにInnis, M.他(1990; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CA)に記載がある。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１４１】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、最大で各１００ヌクレオチドのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチド及び、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって最大３２キロベースのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）を用いれば、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming library）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る)。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１４２】
「組換え核酸」は、天然核酸ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組合せた配列を持つ核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrook及びRussellの文献(前出)に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１４３】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１４４】
「調節エレメント」は或る遺伝子の非翻訳領域に通常は由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域(UTR)を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１４５】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いる、化学的または生化学的な成分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分がある。
【０１４６】
或るDNA分子に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA分子と同じ直鎖のヌクレオチド配列からなるが、生じる全ての窒素性塩基のチミンがウラシルに置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１４７】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。SCAP、SCAPをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１４８】
用語「特異結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基すなわちエピトープ)であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、或る抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」と抗体とを含む或る反応の中に、エピトープＡを持つポリペプチドが、あるいは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１４９】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離あるいは分離された核酸配列あるいはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約60％除去されたものであり、好ましくは約75％以上除去、最も好ましくは約90％以上除去されたものを指す。
【０１５０】
「置換」とは、１つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドを、それぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１５１】
「基板」は、任意の好適な固体あるいは半固体の支持物を指し、膜及びフィルタ、チップ、スライド、ウェハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１５２】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル」は、所定条件下での所定時間における、或る特定の細胞タイプまたは組織による、遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１５３】
「形質転換（transformation）」とは、外因性DNAが、或る受容細胞に導入されるプロセスを言う。形質転換は、当該分野で公知の種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが、自律的に複製するプラスミドとしてあるいは宿主染色体の一部として複製可能である、安定的に形質転換された細胞が含まれる。更に、限られた期間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１５４】
ここで用いる「遺伝形質転換生物(transgenic organism)」とは任意の生物体であって限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの介入によって、例えば本技術分野で公知のトランスジェニック技術によって導入された異種核酸を有するものである。細胞への核酸の導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって行う。これは、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によってあるいは組換えウイルスの導入によって行う。別の実施態様で核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872)。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいは体外受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて企図される遺伝形質転換生物には、細菌、藍藻、真菌、及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物に移入する技術は周知であり、前出のSambrook及びRussellなどの参照文献に提示される。
【０１５５】
特定の核酸配列の「変異体」とは、核酸配列１本の或る長さ全体について、該特定核酸配列に対し少なくとも４０％の配列同一性を有する核酸配列として決定された配列である。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9(1999年5月7日)を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。変異体は、例えば、「対立遺伝子」変異体(上述)、「スプライス」変異体、「種」変異体、または「多型」変異体と記述され得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型変異体は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異体にはまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「一塩基多型」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の集団、病態または病態性向を示し得る。
【０１５６】
特定のポリペプチド配列の「変異体」とは、ポリペプチド配列１本の或る長さ全体について、該特定ポリペプチド配列に対し少なくとも４０％の配列同一性または配列類似性を有するポリペプチド配列として定義される。決定には、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性または配列類似性を示し得る。
【０１５７】
（発明）
本発明の様々な実施態様は、新規のヒト構造及び細胞骨格関連タンパク質群(SCAP)、SCAPをコードするポリヌクレオチド群を含み、また、これらの組成物を利用した、細胞増殖異常、ウイルス感染症、神経疾患、並びに心筋障害及び骨格筋障害の、診断、治療、または予防を含む。
【０１５８】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド実施態様及びポリペプチド実施態様の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列６は、本発明のポリペプチド配列とポリヌクレオチド配列とに対応する物理的完全長クローン群のIncyte ID番号を示す。完全長クローンは、列３に示すポリペプチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。
【０１５９】
表２は、GenBankタンパク質(genpept)データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１及び列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列3は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号(GenBank ID NO:)と、最も近いPROTEOMEデータベース相同体のPROTEOMEデータベース識別番号(PROTEOME ID NO:)とを示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５はGenBank及びPROTEOMEデータベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これらすべては特にこの参照により開示に含まれる。
【０１６０】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１及び列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４は、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Accelrys, Burlington MA)によって決定された、リン酸化及びグリコシル化の可能性のある部位を示し、また、シグネチャ配列群、ドメイン群、モチーフ群を有するアミノ酸残基を示す。列5はタンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に用いた検索可能なデータベースを示す。
【０１６１】
表２及び３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが構造及び細胞骨格関連タンパク質であることを確立している。例えばSEQ ID NO:3は、残基R80から残基M1045までが、アナウサギ(Oryctolagus cuniculus)のトリコヒアリン(1種の中間径フィラメント結合蛋白)(GenBank ID g1747)に対し２３％同一であると、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)で判定された（表2参照）。BLAST確率スコアは3.1E-57であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:3は、細胞表層に局在し、ここでケラチン中間径フィラメントに結合及び架橋し、おそらく足場タンパクとしてケラチン中間径フィラメントを細胞表層にアンカーする中で作用し、トリコヒアリンであると、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:3はまた、１つのZnフィンガーC-x8-C-x5-C-x3-H型ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。追加BLAST解析にPRODOM及びDOMOデータベースを用いてのデータは、SEQ ID NO:3がトリコヒアリンである補強証拠を提供する。
【０１６２】
別の例でSEQ ID NO:8は、残基M1から残基Q1064まで８２％、また残基D1070から残基P1490まで８１％、マウスのミオシンVIIb(GenBank ID g13506797)との同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:8は、ミオシン領域に局在し、MY07A機能を持ち、細胞骨格モーター蛋白であると、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:8はまた、１つのIQカルモジュリン結合モチーフドメイン、１つのMyTH4ドメイン、及び１つのミオシン頭部(モーター)ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、BLAST-PRODOM、BLAST-DOMO及びMOTIFS解析からのデータは、SEQ ID NO:8が細胞骨格関連タンパク質である更なる補強証拠を提供する。
【０１６３】
別の例でSEQ ID NO:12は、残基M1から残基K1253まで、ヒトのミオシンVI (GenBank ID g9280816)との９９％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:12は、細胞質に局在し、モーター蛋白機能を持ち、クラスVIミオシンであると、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:12はまた１つのミオシン頭部ドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、及び追加BLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:12がミオシンVIである、更なる補強証拠を提供する。
【０１６４】
別の例でSEQ ID NO:22は、残基M1から残基N1006まで、ラットのミオシンI (GenBank ID g3724141)との９７％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.00であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:22は、細胞質領域に局在し、モーター蛋白、ATPアーゼ及びヒドロラーゼ機能を持ち、ミオシン蛋白であると、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:22はまた、１つのミオシン頭部ドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、BLAST及びMOTIFS解析よりのデータは、SEQ ID NO:22がミオシン分子である更なる補強証拠を提供する。
【０１６５】
別の例でSEQ ID NO:29は、残基H34から残基L589まで、マウスのアクチン結合タンパク(GenBank ID g2282582)との２６％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは3.7e-49であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:29はまた、ヒトENC1(核マトリクス結合リン蛋白であり、一次ニューロンで特異的に発現し、ニューロン分化時に網膜芽細胞腫p110(RB)タンパクの活性型と相互作用する)への相同性を持つと、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:29はまた、１つのBTB/POZ及び１つのKelchモチーフドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS解析及び追加BLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:29がアクチン結合タンパク質である補強証拠を提供する。
【０１６６】
別の例でSEQ ID NO:39は、残基M1から残基G983まで、ヒトの微小管結合タンパク4 (GenBank ID g641916)との７７％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:39はまた微小管結合タンパク4への相同性を持つと、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:39はまた1つのタウ及びMAPのチューブリン結合蛋白ドメインを持つが、これは隠れマルコフモデル(HMM)を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて統計的に有意な一致を検索して判定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:39が微小管結合タンパク質である更なる補強証拠を提供する。
【０１６７】
別の例でSEQ ID NO:51は、残基Q43から残基F334まで、ヒトのαアクチン(GenBank ID g28330)との９９％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.6e-176であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:51はまた、細胞質に局在し筋肉特異的アクチンファミリーのメンバーであるタンパク群への相同性を持つと、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:51はまた１つのアクチンドメインを持つが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて統計的に有意な一致を検索して判定された（表3参照）。BLIMPS、BLAST、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析からのデータは、SEQ ID NO:51がアクチンである更なる補強証拠を提供する。
【０１６８】
SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:4-7、SEQ ID NO:9-11、SEQ ID NO:13-21、SEQ ID NO:23-28、SEQ ID NO:30-38及びSEQ ID NO:40-50については、同様の方法で分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-51の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１６９】
表４に示すように、完全長ポリヌクレオチド実施態様は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード(エキソン)配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組合せてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）及び対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、及び塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、完全長ポリヌクレオチド実施態様のアセンブリに用いたcDNA配列及び／またはゲノム配列の、また、例えばSEQ ID NO:52-102を同定するため、或いはSEQ ID NO:52-102と、関連するポリヌクレオチド群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチドの断片の、開始ヌクレオチド（５'）位置及び終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０１７０】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に例えば組織特異的cDNAライブラリ群やプールしたcDNAライブラリ群に由来するIncyte cDNA群を指す場合もある。或いは列２に記載のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチドのアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。更に、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースに由来する配列を同定する場合もある（すなわち「ENST」の命名を含む配列）。あるいは、列２に記載したポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Recordsデータベースに由来する場合もあり(すなわち「NM」または「NT」の命名を含む配列)、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsに由来する場合もある(すなわち「NP」の命名を含む配列)。または列２に記したポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予測エキソン群の両方からなるアセンブリ体を指す場合がある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 として同定される配列は「スティッチされた」配列で、その内、XXXXXXは該アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号であり、YYYYYは該アルゴリズムが作成する予測の数であり、N1,2,3...がある場合には、解析中に手動で編集された特定のエキソン群を表す（実施例５参照）。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、ポリヌクレオチド配列の内、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定される配列は「ストレッチ」配列の識別番号である。ここでXXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号、またはNCBI RefSeq識別番号、N は特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。或るRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、「NM」、「NP」、または「NT」によって表されるRefSeq識別子が、GenBank識別子（すなわち、gBBBBB）の代わりに使用され得る。
【０１７１】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2005520493.tif 000003
【０１７２】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNA適用範囲が得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１７３】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチドのための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これら配列は、上記ポリヌクレオチドをアセンブリ及び確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１７４】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型(SNP)を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。列１及び列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（SEQ ID NO:）及びそれに対応するIncyteプロジェクト識別番号（PID）を示す。列3はSNPが検出されたESTのIncyte識別番号(EST ID)を示し、列4はSNPの識別番号(SNP ID)を示す。列5はEST配列内のSNP位置(EST SNP)を示し、列6は完全長ポリヌクレオチド配列内のSNPの位置(CB1 SNP)を示す。列7は、EST配列内で見られたアレル(対立遺伝子)を示す。列8と列9は、SNP部位で見られた2種のアレルを示す。列10はSNP部位を含むコドンがコードするアミノ酸をEST内で見られたアレルに基づき示す。列11-14は4群のヒト集団でのアレル1頻度を示す。エントリがn/d(非検出)であれば該集団でのアレル1頻度が検出できないほど低すぎたことを示し、n/a(利用不可)は該集団のアレル頻度判定が無かったことを示す。
【０１７５】
本発明はまた、SCAPの変異体群をも含む。SCAP変異体の種々の実施態様は、SCAPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを持ちうる他、該SCAPアミノ酸配列に対し、少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を持ちうる。
【０１７６】
種々の実施態様はまた、SCAPをコードするポリヌクレオチドをも含む。或る特定の実施態様において本発明は、SCAPをコードする、SEQ ID NO:52-102からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:52-102のポリヌクレオチド配列は配列表に示されるように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースから構成されている。
【０１７７】
本発明はまた、SCAPをコードするポリヌクレオチドの変異体群を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチドは、SCAPをコードする或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約70％、或いは少なくとも約85％、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る態様では、SEQ ID NO:52-102からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％、或いは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％もの一致率を有するようなSEQ ID NO:52-102からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチドの変異体を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、SCAPの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドをコードし得る。
【０１７８】
更に或いは別法では、本発明の或るポリヌクレオチド変異体は、SCAPをコードするポリヌクレオチドのスプライス変異体である。或るスプライス変異体はSCAPをコードするポリヌクレオチドとの顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、約７０％未満、または約６０％未満、あるいは約５０％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、SCAPをコードするポリヌクレオチドとの間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、SCAPをコードするポリヌクレオチドの各部との、少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％、なおまたは１００％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えば、SEQ ID NO:59の配列を持つポリヌクレオチド及びSEQ ID NO:60の配列を持つポリヌクレオチドは互いにスプライス変異体であり、またSEQ ID NO:90の配列を持つポリヌクレオチドとSEQ ID NO:95の配列を持つポリヌクレオチドは互いにスプライス変異体である。上記したスプライス変異体は何れも、SCAPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るポリペプチドをコードし得る。
【０１７９】
遺伝暗号の縮重により、SCAPをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列バリエーションを企図する。これらの組み合わせは、天然SCAPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られる。また、このような全ての変異が明確に開示されていると考慮されたい。
【０１８０】
SCAPとその変異体とをコードするポリヌクレオチドは一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然SCAPのポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有するSCAP或いはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づき、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようコドンを選択し得る。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、SCAP及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることもある。
【０１８１】
本発明にはまた、SCAPとその誘導体とをコードする、ポリヌクレオチド群またはそれらの断片の、完全に合成化学による作製も含む。作製後にこの合成ポリヌクレオチドを、当分野で公知の試薬を用いて、多くの入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、SCAPまたはその任意の断片をコードするポリヌクレオチドの中に突然変異を導入することも可能である。
【０１８２】
本発明の実施態様群には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載のポリヌクレオチド、特に、SEQ ID NO:52-102に示す配列を持つポリヌクレオチド、及びそれらの断片群に、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド群が含まれうる(Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol.152:507-511)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１８３】
DNAシークエンシングの方法は当分野では周知であり、本発明のいずれの実施態様にも、DNAシークエンシング方法を用い得る。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野で既知の他のシステムを用いてシークエンシングを行う。結果として得た配列を、当分野で周知の種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel他、前出、7章; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ）。
【０１８４】
当分野で既知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、SCAPをコードする核酸を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である(Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic.2:318-322)。別の方法にインバースPCR法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(Triglia, T. 他(1988) Nucleic Acids Res.16:8186)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これにはヒト及び酵母人工染色体DNAの既知の配列群に隣接するDNA断片群をPCR増幅する方法を含む(Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic.1:111-119)。この方法では、PCRを行う前に、複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る別の複数の方法も当分野で既知である（Parker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060）。更に、PCR、ネステッドプライマー類、及びPROMOTERFINDERライブラリ類（Clontech, Palo Alto CA）を用いて、ゲノムDNAをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）あるいは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０１８５】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更にランダムプライマーのライブラリは遺伝子群の5'領域を有する配列群をしばしば含んでおり、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、5'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１８６】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチド特異的な、レーザーで刺激される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１８７】
本発明の別の実施態様では、SCAPをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、SCAP、その断片または機能的等価物を適切な宿主細胞内に発現させる組換えDNA分子にクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドを産生し、これらの配列をSCAPの発現に利用し得る。
【０１８８】
種々の目的で、SCAPをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に既知の複数の方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列群を組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシング及び／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムな断片化及びPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異導入を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン選択性の変更、スプライス変異体の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０１８９】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen, Santa Clara CA;米国特許第5,837,458号; Chang, C.-C.他(1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C.他(1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A.他(1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリング技術を用いてシャッフリングし、SCAPの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのSCAPの生物学的特性を改変或いは改良することができる。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種及び急速な分子の進化によって、多様な遺伝子が作られる。例えば、ランダムな点突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組換えて、自然に生じる複数遺伝子の遺伝的多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化できる。
【０１９０】
別の実施態様によれば、SCAPをコードするポリヌクレオチドは、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である（Caruthers, M.H.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232）。或いはSCAP自体またはその断片の合成に、当分野で既知の化学的方法を用い得る。例えば種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る(Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60; Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204)。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更に、SCAPのアミノ酸配列、または任意のその一部を、直接合成の際に改変することにより、及び／または他のタンパク質からの配列群または任意のその一部と組み合わせることにより、変異体ポリペプチドを作製、または、或る天然ポリペプチドの１配列を有するポリペプチドを作製し得る。
【０１９１】
このペプチドは分取用高速液体クロマトグラフィーで実質的に精製し得る(Chiez, R.M.及びF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421)。この合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングで確認できる(前出Creighton, 28-53ページ)。
【０１９２】
生物学的に活性なSCAPを発現させるために、SCAPをコードするポリヌクレオチドまたはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入し得る。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントとしては、ベクター内及びSCAPをコードするポリヌクレオチドにおける調節配列（例えばエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻訳領域など）が含まれる。必要なエレメント群は、強度及び特異性が様々である。特異的な開始シグナル類を用いて、SCAPをコードするポリヌクレオチド群の、より効率的な翻訳を達成することもできる。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。SCAPとその開始コドンとをコードする或るポリヌクレオチド配列と上流の制御配列群とが適切な発現ベクターに挿入される場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入される場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(Scharf, D.他(1994) Results Probl.Cell Differ. 20:125-162)。
【０１９３】
当業者に周知の方法を用いて、SCAPをコードするポリヌクレオチドと、好適な転写及び翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝的組換えがある(Sambrook及びRussell,前出、1-4,及び8章; Ausubel他、前出、1、3,及び15章)。
【０１９４】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、SCAPをコードするポリヌクレオチドの保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌など微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMVまたはタバコモザイクウイルス、TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系がある(Sambrook及びRussell前出; Ausubel他前出; Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509; Engelhard, E.K.他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther.7:1937-1945; Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311; The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York NY, 191-196ページ; Logan, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659; Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを標的器官、組織または細胞集団へ送達できる（例えばDi Nicola, M.他（1998）Cancer Gen. Ther. 5（6）:350-356、Yu, M.他（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（13）:6340-6344、Buller, R.M.他（1985）Nature 317（6040）:813-815; McGregor, D.P.他（1994）Mol. Immunol. 31（3）:219-226、Verma, I.M.及びN. Somia（1997）Nature 389:239-242を参照）。本発明は使用する宿主細胞によって限定されない。
【０１９５】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、SCAPをコードするポリヌクレオチド群の使用目的に応じて選択できる。例えば、SCAPをコードするポリヌクレオチドの日常的なクローニング、サブクローニング及び増殖は、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成することができる。SCAPをコードするポリヌクレオチドをこのベクターのマルチクローニング部位にライゲーションするとlacＺ遺伝子が撹乱され、組換え分子を持つ形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう（Van Heeke, G. 及び S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）。例えば抗体類の産生などに多量のSCAPが必要な場合は、SCAPの発現をハイレベルで指示するベクター類が使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０１９６】
SCAPの産生には、酵母発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを有する多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来ポリヌクレオチド配列群を組み込むことを可能にする(Ausubel他、前出; Bitter, G.A.他(1987) Methods Enzymol.153:516-544; Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184)。
【０１９７】
植物系を使用してSCAPを発現することも可能である。SCAPをコードするポリヌクレオチドの転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独であるいはTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進し得る（Takamatsu, N.（1987）EMBO J 6:307-311）。あるいは、RuBisCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（Coruzzi, G.他.（1984）EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他（1984）Science 224:838-843;及びWinter, J.他（1991）Results Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これらの作成物を、植物細胞に、直接DNA形質転換または病原体媒介した形質移入で導入できる（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology)(1992) McGraw Hill, New York NY,191-196ページ）。
【０１９８】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に、SCAPをコードするポリヌクレオチド群をライゲーションし得る。アデノウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域への挿入を用いれば、宿主細胞内でSCAPを発現する感染ウイルスを得ることができる(Logan, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１９９】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNA断片群を送達し得る。治療のために約6kb〜10MbのHACが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355)。
【０２００】
哺乳類系内の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株におけるSCAPの安定した発現が望ましい。例えば、SCAPをコードするポリヌクレオチドを細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じベクター上の或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素、及び／または内因性の発現要素を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列の発現に成功するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖できる。
【０２０１】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M.他(1977) Cell 11:223-232; Lowy, I.他(1980) Cell 22:817-823)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(Wigler, M. 他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F.他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)。更なる選択可能な遺伝子、例えばtrpBとhisDとが記載され、これらは代謝物についての細胞要求を変容させる（Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因しうる一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することも可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【０２０２】
マーカー遺伝子発現の有無によって当該の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、SCAPをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、SCAPをコードするポリヌクレオチド群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定できる。または、単一プロモーターの制御下で、或るマーカー遺伝子を、SCAPをコードする１配列とタンデムに配置することもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２０３】
一般に、SCAPをコードするポリヌクレオチドを持ち、SCAPを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定できる。これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０４】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてSCAPの発現の検出と計測とを行うための免疫学的方法は、当分野で既知である。このような技術の例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、蛍光活性化細胞選別(FACS)などが挙げられる。SCAP上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体群を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合試験も用い得る。これらのアッセイ及び他のアッセイは、当分野で公知である（Hampton, R.他（1990）Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press. St. Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E.他（1997）Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D.（1998）Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ）。
【０２０５】
多岐にわたる標識方法及び抱合技術が当業者に知られており、様々な核酸アッセイ及びアミノ酸アッセイにこれらの技術を用い得る。SCAPをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング(末端標識化)、または、標識したヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、SCAPをコードするポリヌクレオチド群、またはその任意の断片群を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングできる。このようなベクターは当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどの種々の市販キットを用いて実行できる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体などがある。
【０２０６】
SCAPをコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞を、細胞培地での該タンパク質の発現と回収とに好適な条件下で培養しうる。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。SCAPをコードするポリヌクレオチド群を持つ発現ベクター類は、原核細胞膜または真核細胞膜を透過してのSCAPの分泌を指示するシグナル配列群を持つように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２０７】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入したポリヌクレオチドの発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ、及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞機構及び特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０２０８】
本発明の別の実施態様では、SCAPをコードする天然ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを或る異種配列に結合させ、上記した任意の宿主系内で、或る融合タンパク質の翻訳を生じ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を持つキメラSCAPタンパク質が、SCAP活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分はまた、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープタグを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質が、SCAPをコードする配列と異種タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を持つように遺伝子操作すると、精製後にSCAPが異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現及び精製の方法は、Ausubel他(前出10章及び16章)で考察されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０２０９】
別の実施態様では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで、放射標識SCAPを合成しうる。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターに機能的に連結したタンパク質コード配列群の、転写と翻訳とを共役させる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２１０】
SCAP或いはその断片または変異体を用いて、SCAPに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。１つ以上の試験化合物を、SCAPへの特異的な結合についてスクリーニングすることが可能である。種々の実施態様で、1、2、3、4、5、10、20、50、100、または200個の試験化合物をSCAPへの特異結合に関しスクリーニングできる。試験化合物の例として、抗体、アンチカリン、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドや受容体）、または小分子が挙げられる。
【０２１１】
関連の実施態様群で、SCAP変異体を用いて試験化合物たとえば抗体の、SCAPへの結合や、SCAP変異体へ、または組み合わせたSCAP及び/または1つ以上のSCAP変異体への結合をスクリーニングできる。或る実施態様で或るSCAP変異体を用いて、SCAP変異体に結合するがSEQ ID NO:1-51の正確な配列を持つSCAPには結合しない化合物をスクリーニングできる。こうしたスクリーニングの実施に用いるSCAP変異体は、約50％〜約99％のSCAPへの配列同一性の範囲を持つ場合があり、種々の実施態様は60％、70％、75％、80％、85％、90％、及び95％の配列同一性を持ち得る。
【０２１２】
或る実施態様で、SCAPへの特異結合スクリーニングで同定された化合物は、SCAPの天然リガンドに密接に関連する場合があり、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである(Coligan, J.E.他(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章)。別の実施態様では、こうして同定した化合物は受容体SCAPの天然リガンドでありうる(Howard, A.D.他(2001) Trends Pharmacol.Sci.22:132-140; Wise, A.他(2002) Drug Discovery Today 7:235-246)。
【０２１３】
別の実施態様群でSCAPへの特異結合スクリーニングで同定した化合物は、SCAPが結合する天然受容体に、或いは少なくとも該受容体の或る断片に、または例えばリガンド結合部位や結合ポケットの全体または一部を含む該受容体の或る断片に、密接に関連し得る。例えば該化合物は、シグナルを伝播可能なSCAP受容体の場合や、シグナルを伝播できないSCAPおとり受容体の場合がある(Ashkenazi, A. 及びV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol.11:255-260; Mantovani, A.他(2001) Trends Immunol.22:328-336)。該化合物は既知の技術を用いて合理的に設計できる。こうした技術の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Amgen Inc., Thousand Oaks CA)作製に用いた技術を含む。エタネルセプトは、ヒトのリウマチ様関節炎の治療に有効である。エタネルセプトは遺伝子操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体ダイマーであり、ヒトIgG1 のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他(2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０２１４】
１つの実施態様で、2種以上の、同様のまたは或いは異なる特異性を持つ抗体を、SCAPまたはその断片あるいは変異体への特異結合に関しスクリーニングできる。こうしてスクリーニングした抗体の結合特異性を選択し、SCAPの特定の断片または変異体を同定できる。１つの実施態様で、SCAPの特定の断片または変異体を優先的に同定できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。別の実施態様で、SCAP産生の増加、低下、或いは異常を有する特定の疾患または病状を優先的に診断できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。
【０２１５】
或る実施態様で、アンチカリンを、SCAPまたはその断片あるいは変異体への特異結合につきスクリーニングできる。アンチカリンはリポカリン足場に基づいて作成されたリガンド結合タンパク質である(Weiss, G.A. 及び H.B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184、Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。リポカリン類のタンパク構造には８本鎖逆平行βストランドを持つ或るβバレルを含むことがあり、このバレルはその開放端で4つのループを支持する。これらのループはリポカリンの天然リガンド結合部位を形成し、この部位はin vitroでアミノ酸置換によって再度人工操作して、新規な結合特異性を与えることができる。このアミノ酸置換は当分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて行うことができる。また、保存的置換(例えば、結合特異性を変えないような置換)、あるいは、結合特異性を少し、中等度、または大きく変えるような置換を行うこともできる。
【０２１６】
一実施態様では、SCAPに特異的に結合、刺激、あるいは阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質として、あるいは細胞膜上でSCAPを発現する、適切な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞としては、哺乳類、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれうる。次に、SCAPを発現する細胞、またはSCAPを含む細胞膜分画を試験化合物と接触させて、結合、刺激、或いはSCAPまたは試験化合物の何れかの活性の阻害を分析する。
【０２１７】
或るアッセイでは単に試験化合物がポリペプチドに結合するのを試験でき、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体または他の検出可能な標識により検出する。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持体に固定されたSCAPと混合するステップと、SCAPとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法で該アッセイは、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出または測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０２１８】
アッセイを用いて、或る化合物が、その天然リガンドに結合する能力、及び／または、その天然リガンドの、その天然受容体への結合を阻害する能力を評価しうる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号及び第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(Matthews, D.J. 及び J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30)。別の関連した実施態様では、１つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(リガンドなど)に導入され、その天然受容体に結合する能力を向上または改変しうる(Cunningham, B.C.及びJ.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B.他(1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988)。
【０２１９】
SCAP或いはその断片または変異体を用いて、SCAPの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングしうる。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。一実施態様では、SCAPが少なくとも１つの試験化合物と結合する、SCAPの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのSCAPの活性を、試験化合物不在下でのSCAPの活性と比較する。試験化合物の存在下でのSCAPの活性の変化は、SCAPの活性をモジュレートする化合物の存在を標示する。別法では、試験化合物を、SCAPの活性に適した条件下で、SCAPを有するin vitro系または無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、SCAPの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２２０】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、SCAPまたはその哺乳類相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(例えば米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号を参照)。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R.(1989)Science 244:1288-1292)などのマーカー遺伝子で破壊した、当該の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002、Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res.25:4323-4330)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的移植し、得られるキメラ子孫の遺伝子型を決定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒物で検査されうる。
【０２２１】
SCAPをコードするポリヌクレオチドを、in vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する（Thomson, J.A. 他 (1998) Science 282:1145-1147）。
【０２２２】
SCAPをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組み換え動物（マウスまたはラット）を作製することも可能である。ノックイン技術を用いて、SCAPをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばSCAPを乳汁内に分泌するなどSCAPを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J.他(1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２２３】
（治療）
SCAPの領域と、構造及び細胞骨格関連タンパク質の領域との間には、例えば配列及びモチーフに関する、化学的及び構造的類似性が存在する。またSCAPの発現は以下と密に関連する。即ち脳組織(例えば前帯状回、脳幹組織)、大腸癌及び骨肉腫、胎児肝臓組織、樹状細胞(臍帯由来)、胃組織、腫瘍随伴回腸組織、十二指腸組織、小腸組織、精巣組織、下頭頂葉皮質、罹患乳房組織、Ｓ状結腸組織、前腕筋組織、脛骨筋組織、心房組織、腹膜腫瘍組織、上皮細胞組織、骨芽細胞組織、胎児脾臓組織、前立腺腫瘍、及び、初代骨原性肉腫細胞株(ATCC HTB-85)内である。またSCAPを発現する組織の数例は、表６と実施例１１とを参照されたい。したがってSCAPは、細胞増殖異常、ウイルス感染症、神経疾患、並びに心筋障害及び骨格筋障害において役割を果たすと考えられる。SCAPの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、SCAPの発現または活性を低下させることが望ましい。SCAPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、SCAPの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０２２４】
従って、一実施態様では、SCAPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にSCAPまたはその断片や誘導体が投与され得る。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、ウイルス感染症、神経疾患、心筋・骨格筋障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。ウイルス感染症は例えばアデノウイルス性(急性呼吸器疾患、肺炎)、アレナウイルス(リンパ球性脈絡髄膜炎)、ブニアウイルス(ハンタウイルス)感染、コロナウイルス(肺炎、慢性気管支炎)、ヘパドナウイルス（肝炎）、ヘルペスウイルス（単純疱疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）感染、フラビウイルス（黄熱病）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、パピローマウイルス（癌）、パラミクソウイルス（麻疹、おたふく風邪）、ピコルナウイルス（ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、ポリオーマウイルス（BKウイルス、JCウイルス）、ポックスウイルス（天然痘）、レオウイルス（コロラドダニ熱）、レトロウイルス（ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトTリンパ指向性ウイルス）感染、ラブドウイルス（狂犬病）、ロタウイルス（胃腸炎）及びトガウイルス（脳炎、風疹）がある。神経疾患には、癲癇、虚血性脳血管疾患、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管症候群、精神遅滞その他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパチーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病がある。心筋・骨格筋障害は例えば心筋症、心筋炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性異栄養症(筋強直性ジス��ロフィー)、セントラルコア病、ネマリンミオパチー、中心核ミオパチー、脂質ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、感染性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒性ミオパチー、エタノールミオパチーがある。
【０２２５】
別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、SCAPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、SCAPまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与し得る。
【０２２６】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上記した疾患を含む、SCAPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたSCAPを有する組成物を好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与し得る。
【０２２７】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、SCAPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、SCAPの活性を調節するアゴニストを被験者に投与し得る。
【０２２８】
更なる実施態様では、SCAPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にSCAPのアンタゴニストを投与し得る。限定はされないが、こうした疾患の例には上記の、細胞増殖異常、ウイルス感染症、神経疾患、並びに、心筋障害及び骨格筋障害が含まれる。一実施態様では、SCAPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはSCAPを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的化機構、或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２２９】
別の実施態様では、SCAPをコードするポリヌクレオチドの相補物を発現するベクターを被験者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、SCAPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防を成し得る。
【０２３０】
別の実施態様では、任意のタンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、相補配列、またはベクター実施態様を、別の適切な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で治療効力を得ることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２３１】
SCAPのアンタゴニストは、当分野で一般に既知の方法を用いて製造し得る。具体的には、精製されたSCAPを用いて抗体を作るか、治療薬のライブラリをスクリーニングして、SCAPと特異結合するものを同定し得る。SCAPへの抗体も、当分野で周知の方法を用いて産生され得る。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。或る実施態様では、中和抗体（すなわち二量体形成を阻害する抗体）を治療に用い得る。一本鎖抗体（例えばラクダまたはラマ由来）は強力な酵素阻害剤である可能性があり、ペプチド擬態物質の設計において、また免疫吸着剤とバイオセンサーとの開発において適用を持つようである(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２３２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、SCAPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、界面活性剤(リゾレシチン等)、プルロニックポリオール(pluronic polyol)、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)及びコリネバクテリウム‐パルバム(Corynebacterium parvum)が特に好ましい。
【０２３３】
SCAPに対する抗体を誘導するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸からなり、一般的には約１０個以上のアミノ酸からなるものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と実質的に同一であることが望ましい。SCAPアミノ酸類の短いストレッチ群は、KLHなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０２３４】
SCAPに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続継代性細胞株によって抗体分子群を産生する、任意の技術を用いて作製できる。限定するものではないが、このような技術としては、ハイブリドーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法、及びEBVハイブリドーマ法がある(Kohler, G.他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:20262030; Cole, S.P.他(1984) Mol.Cell Biol. 62:109-120)。
【０２３５】
更に、「キメラ抗体」作製のために開発された技術、例えば、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術を、好適な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るために使用できる(Morrison, S.L. 他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他(1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他(1985) Nature 314:452-454)。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、SCAP特異的一本鎖抗体を産生する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムなコンビナトリアルの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137）。
【０２３６】
抗体類の産生はまた、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは高度に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリ類またはパネル類のスクリーニングによっても行え、これは文献に開示がある(Orlandi, R.他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter, G.他(1991) Nature 349:293-299)。
【０２３７】
SCAPに対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF（ab'）2 断片と、F（ab'）2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる(Huse, W.D.他(1989) Science 246:1275-1281)。
【０２３８】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合結合試験、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、SCAPとその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。２つの非干渉性SCAPエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体群を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合試験も利用できる(Pound、前出)。
【０２３９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、SCAPに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性を結合定数Kaで表す。Kaの定義は、平衡状態下の、SCAP抗体複合体のモル濃度を、遊離抗体と遊離抗原とのモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なSCAPエピトープに対して親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、SCAPに対する抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。特定SCAPエピトープに対してモノクローナル抗体は単一特異的であり、モノクローナル抗体の或る製剤について判定したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が１０９〜１０１２L/molの高親和性抗体製剤は、SCAP抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７L/molの低親和性抗体製剤は、SCAPが抗体から最終的に（好ましくは活性化状態で）解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい（Catty, D.（1988）Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. 及び Cryer, A.（1991）A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY）。
【０２４０】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う数種の適用例に対するこのような製剤の品質及び適合性を決定することができる。例えば、少なくとも1〜2mg/mlの特異的な抗体、好ましくは5〜10mg/mlの特異的な抗体を有するポリクローナル抗体製剤は一般に、SCAP抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、及び結合力の評価手順、並びに、様々な適用例における抗体の品質と使用に対する指針については、一般に入手可能である(Catty, 前出; Coligan他、前出)。
【０２４１】
本発明の別の実施態様では、SCAPをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補物が、治療目的で使用される。ある実施態様では、SCAPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片を、SCAPをコードする配列の制御領域またはコード領域に沿った様々な位置から設計可能である(Agrawal, S.編集(1996) Antisense Therapeutics, Humana Press, Totawa NJ)。
【０２４２】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る(Slater, J.E.他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102:469-475; Scanlon, K.J.他(1995) 9:1288-1296)。アンチセンス配列はまた、細胞内に、ウイルスベクター例えばレトロウイルス及びアデノ随伴ウイルスのベクターを用いて導入しうる(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271; Ausubel他、前出; Uckert, W.及びW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63:323-347)。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工ウイルスエンベロープ及び、当分野で既知の他のシステムがある（Rossi, J.J.（1995）Br. Med. Bull. 51（1）:217-225; Boado、R.J.他（1998）J. Pharm. Sci. 87（11）:1308-1315、Morris, M.C.他（1997）Nucleic Acids Res. 25:2730-2736）。
【０２４３】
本発明の別の実施態様では、SCAPをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療により、（i）遺伝子欠損症を治療し（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他(2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M.他(1995) Science 270:475-480、Bordignon, C.他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他(1993) Cell 75:207-216: Crystal, R.G.他(1995) Hum. Gene Therapy 6:643-666、Crystal, R.G.他(1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症や、第８因子若しくは第９因子欠損に起因する血友病（Crystal, R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. 及び N. Somia (1997) Nature 389:239-242）、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生生物(例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poeschla, E.他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫及びクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫)に対する防御機能を与えるタンパク質を発現させることができる。SCAPの発現若しくは調節における遺伝子欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の適切な集団からSCAPを発現させて、遺伝子欠損によって起こる臨床症状を緩和することが可能である。
【０２４４】
本発明の更なる実施態様では、SCAPの欠損による疾患や障害を、SCAPをコードする哺乳類発現ベクターを作製し、これらのベクターを機械的手段によってSCAP欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(ii)金粒子遺伝子銃、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子導入、及び(v)DNAトランスポゾンの使用がある(Morgan, R.A. 及び W.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501-510; Boulay, J.-L.及びH. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450)。
【０２４５】
SCAPの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。SCAPを発現させるために、（i）構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子など）、(ii)誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M.及びH. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M.他(1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V.及びH.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456）、市販のT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれる）、エクジソン誘導性プロモーター（市販のプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれる：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V.及びH.M. Blau,前出）、または（iii）正常な個体に由来する、SCAPをコードする内因性遺伝子のネイティブプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いうる。
【０２４６】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. 及び A.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, E.他（1982）EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、これら標準化された哺乳類形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２４７】
本発明の別の実施態様では、SCAPの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害を、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは或る独立プロモーターのコントロール下でSCAPをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナル群と、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列と、効率的なベクター増殖に必要なコーディング配列とを伴うRev応答性エレメント（RRE）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療する。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販され刊行データ（Riviere, I.他（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737）に基づき、該データは参照により開示に含まれる。このベクターは、適切なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖される。VPCLは、標的細胞上の受容体への向性を持つ或るエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D.他(1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A.他(1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A.及びA.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T.他(1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R.他(1998) J. Virol. 72:9873-9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）にレトロウイルスパッケージング細胞株を得る方法が開示されており、該特許は参照により本願に含まれる。レトロウイルスベクター類の増殖や、細胞集団（例えばCD4+T細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ranga, U. 他（1997）J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他（1997）Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L.（1997）J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他（1998）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L.（1997）Blood 89:2283-2290）。
【０２４８】
或る実施態様では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、SCAPの発現に関連する１或いは複数の遺伝子異常を有する細胞にSCAPをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製及びパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無傷の膵島内にインポートする目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他(1995) Transplantation 27:263-268）。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Antinozzi, P.A.他(1999; Annu. Rev. Nutr. 19:511-544)並びにVerma, I.M.及びN. Somia (1997; Nature 18:389:239-242)も参照されたい。
【０２４９】
別の実施態様では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、SCAPの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する標的細胞に、SCAPをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純ヘルペスウイルス（HSV）系ベクター類の使用は、HSVが向性を持つ中枢神経細胞にSCAPを導入する際に、特に価値を持ち得る。ヘルペス系ベクター類の作製及びパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）1型系ベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus swains for gene transfer」）に開示されており、該特許は参照により本願に含まれる。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的に好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外因性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F.他(1999; J. Virol. 73:519-532)及びXu, H.他(1994; Dev. Biol. 163:152-161)も参照されたい。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２５０】
別の実施態様ではαウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いて、SCAPをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類はSFVゲノムに基づく（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが産生される。このサブゲノムRNAは完全長ゲノムRNAよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、SCAPのコード配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のSCAPをコードするRNAが産生され、高いレベルでSCAPが合成される。αウイルスの感染は通常、数日以内の細胞溶解を伴うが、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療用途の必要に応じて改変できることを示す（Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83）。αウイルスの宿主域は広いので、様々なタイプの細胞にSCAPを導入できることとなる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの操作方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２５１】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または制御分子と結合できるように十分に開こうとする、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E.他（1994）in Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページ）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を妨害するように設計することができる。
【０２５２】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用の機序は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こるヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人為操作されたハンマーヘッド型リボザイム分子は、SCAPをコードするRNA分子のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する可能性がある。
【０２５３】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへの到達性をテストすることによって行い得る。
【０２５４】
相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のための当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、RNA分子は、SCAPをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によって産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的RNAを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのcDNA構築物を、細胞株、細胞または組織内に導入できる。
【０２５５】
細胞内の安定性を高め半減期を延ばすためRNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡張できる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾型や、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を含める。
【０２５６】
本発明の別の実施態様では、本発明の1つ以上の選択したポリヌクレオチドの発現を改変、阻害、低減、または沈黙させるため、RNA干渉(RNAi)または、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)法を利用でき、これらは当該分野で既知である。RNAiは遺伝子サイレンシングの転写後モードであり、ここでは標的細胞に導入した二本鎖RNA (dsRNA)が相同遺伝子(即ちdsRNAの相補配列を持つ遺伝子)の発現を特異的に抑制する。これは標的遺伝子の発現を効果的にノックアウト、または実質的に低減する。PTGSはまた、DNAまたはDNA断片を用いても達成できる。RNAi法の記載はFire, A.他(1998; Nature 391:806-811)及びGura, T. (2000; Nature 404:804-808)がある。PTGSを開始するにはまた、選択した組織にDNAの相補セグメントを導入して行え、これには本願記載の、または当該分野で既知の、遺伝子送達及び/またはウイルスベクター送達法を用いる。
【０２５７】
RNAiを哺乳類細胞内で誘導するには、低分子干渉(small interfering)RNA、略称siRNAの利用で可能となる。siRNAはdsRNAの短いセグメント(通常、約21〜23ヌクレオチド長)であり、in vivo で、導入したdsRNAが内因性リボヌクレアーゼの作用で切断されて生じる。siRNAは、哺乳類でのRNAi効果のメディエータであると思われる。最も有効なsiRNAは、21ヌクレオチドdsRNAで2ヌクレオチドの3'オーバーハングを持つRNAのようである。siRNAを用いたRNAiの哺乳類細胞での誘導は、Elbashir, S.M.他(2001; Nature 411:494-498)に記載がある。
【０２５８】
siRNAを産生するには、直接にdsRNAを標的細胞に導入するか、間接的に、本願記載または当該分野で既知の哺乳類トランスフェクション法及び媒介物(例えば、リポソームを介したトランスフェクション、ウイルスベクター法、または他のポリヌクレオチド送達/導入法)で可能である。好適なsiRNAを選ぶには、AUG開始コドンから下流のヌクレオチド配列群について標的ポリヌクレオチドの転写物(例えばmRNA)を検討し、各ヌクレオチドと3'側の隣接する19〜23ヌクレオチドの出現を潜在的siRNA標的部位として記録して可能であり、21ヌクレオチド長を持つ配列が好ましい。標的siRNA部位として避けるべき領域としては、5'と3'の非翻訳領域(UTR)、及び開始コドンに近い領域(75塩基以内)があり、理由は、これらは調節タンパク質結合部位が、より豊富なためである。UTR結合タンパク及び/または翻訳開始複合体は、siRNPエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉しうる。siRNAのために選択した標的部位は次に、適切なゲノムデータベース(例えばヒト等のもの)と比較でき、これにはBLASTまたは他の、当該分野で既知の配列比較アルゴリズムを用いる。標的配列の内、他のコード配列への有意な相同性を持つ配列は、考慮から除外できる。選択したsiRNAを産生するには、当該分野で既知の化学合成法で、またはin vitro転写に市販の方法とキット例えばSILENCER siRNA作製キット(Ambion, Austin TX)を用いて可能である。
【０２５９】
別の実施態様で、長期の遺伝子サイレンシング及び/またはRNAi効果を、選択した組織で誘導でき、これにはsiRNAを持続的に発現する発現ベクターを用いる。これを達成するには、操作してヘアピンRNA (short hairpin RNA：shRNA)を発現するようにした発現ベクターを用い、これには当該分野で既知の方法を用いる(例えばBrummelkamp, T.R.他(2002) Science 296:550-553; 及びPaddison, P.J.他(2002) Genes Dev. 16:948-958参照)。これら及び関連の実施態様でshRNAを標的細胞に送達するには、当該分野で既知の発現ベクターを用い得る。siRNAの送達に好適な発現ベクターの一例はPSILENCER1.0-U6 (circular)プラスミド(Ambion)である。標的組織に送達されると、shRNAはin vivo でプロセスされてsiRNA様分子となり、これは遺伝子特異的サイレンシングを行える。
【０２６０】
種々の実施態様で、RNAiまたはPTGS法が標的にする遺伝子の発現レベルの判定は、mRNA及び/またはタンパク質解析用のアッセイで行える。或る標的遺伝子のmRNAの発現レベル判定は、ノーザン解析法に例えばNORTHERNMAX-GLYキット(Ambion)を用いて、またマイクロアレイ法で、PCR法で、リアルタイムPCR法で、また他の、当該分野で既知または本願記載のRNA/ポリヌクレオチドアッセイで行える。標的遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの判定は、ウェスタン解析に当該分野で既知の標準技術を用いて行える。
【０２６１】
本発明の更なる実施態様には、SCAPをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチドや、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、及び、特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学物質がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはプロモーターのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、SCAPの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、SCAPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、SCAPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、SCAPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２６２】
種々の実施態様で、或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、１つ以上の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化学物質のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化学物質のライブラリから選択する場合とである。SCAPをコードするポリヌクレオチドを持つサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。SCAPをコードするポリヌクレオチドの発現の改変は、当分野で公知の任意の方法でアッセイする。通常、或る特定ヌクレオチドの発現を検出するには、SCAPをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を持つプローブとのハイブリダイゼーションを用いる。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの発現改変に有効な化合物のためのスクリーニングには、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D.他(1999)米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L.他(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いうる。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド群（例えばデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の或るコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることに関する（Bruice, T.W.他(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２６３】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリポソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K. 他（1997）Nat. Biotechnol. 15:462-466）。
【０２６４】
上記の治療方法はどれも例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含め、そうした治療が必要な任意の被験体に適用できる。
【０２６５】
本発明の或る更なる実施態様は、薬剤的に許容される或る賦形剤と共に処方される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、SCAP、SCAPの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターなどからなる。
【０２６６】
種々の実施態様で本願記載の組成物(例えば医薬組成物)は任意の数の経路によって投与でき、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸法がある。
【０２６７】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近発達したことにより、インスリンなどの薬物を実用的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与でき、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２６８】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２６９】
SCAPを有する、またはその断片群を有する高分子群を直接、細胞内に送達すべく、特殊な種々の形状の組成物群が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を有するリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。或いは、SCAPまたはその断片を、HIV Tat-1タンパク質から得た短い陽イオンN末端部に結合し得る。このようにして産生された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R.他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０２７０】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ例えば新生物細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは動物モデル例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、治療有効用量を推定できる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２７１】
治療有効量とは、症状や容態を回復させる活性成分の量、たとえばSCAPまたはその断片、SCAPの抗体、SCAPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの量を指す。治療有効性及び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）の統計を計算するなどして決定することができる。毒性効果の、治療効果に対する用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性及び投与の経路によってこの範囲内で変わる。
【０２７２】
正確な投与量は、治療が必要な被検者に関する要素を考慮して、実務医が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法及び用量を調整する。被検者に関する要素としては、病態の重症度、被検者の全身健康状態、患者の年齢、体重及び性別（ジェンダー）、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮しうる。長時間作用性の組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度によって３〜４日毎に１度、毎週、或いは隔週の間隔で投与し得る。
【０２７３】
通常の投与量は投与経路にもよるが約0.1〜100,000μgで、合計で約1gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、当該分野の実務医は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２７４】
（診断）
別の実施態様では、SCAPに特異的に結合する抗体を、SCAPの発現によって特徴付けられる疾患の診断に、またはSCAPやSCAPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いることがある。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作成される。SCAPの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体及び標識を用いてSCAPを検出する方法が含まれる。この抗体は、修飾して、または修飾せずに使用される。また、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２７５】
ELISA、RIA及びFACSなど、SCAPを測定するための種々のプロトコルは当分野では周知であり、変容した或いは異常なレベルのSCAP発現を診断するための基盤を提供する。正常あるいは標準的なSCAPの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳類、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞抽出物と、SCAPに対する抗体とを混合することによって確定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験体、対照、及び、生検組織からの疾患サンプルでの、SCAP発現の量を標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２７６】
本発明の別の実施態様では、SCAPをコードするポリヌクレオチドを、診断目的で用い得る。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、SCAPの発現が疾患と相関し得る生検組織群における遺伝子発現を検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、SCAPの存在の有無、更には過剰な発現を判定し、治療時のSCAPレベルの調節を監視し得る。
【０２７７】
一態様では、SCAPをコードまたは近縁分子群をコードする、ゲノム配列などポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブ類とのハイブリダイゼーションを用いて、SCAPをコードする核酸配列を同定することができる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているというプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとによって、そのプローブがSCAPをコードする天然配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子変異配列や関連配列を同定するかどうかが決まることとなる。
【０２７８】
プローブはまた、関連する配列の検出に用い得る。また、SCAPをコードする任意の配列との少なくとも５０％の配列同一性を有し得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブ類はDNAまたはRNAであることがあり、SEQ ID NO:52-102の配列に由来、或いはゲノム配列群、例えばSCAP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンなどに由来し得る。
【０２７９】
SCAPをコードするポリヌクレオチド群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ群の作製手段としては、SCAPまたはSCAP誘導体群をコードするポリヌクレオチド群を、mRNAプローブ群の作製のためのベクター類にクローニングする方法を含む。mRNAプローブ作製のためのベクターは当該分野で既知であり、市販されており、適切なRNAポリメラーゼ及び適切な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター基によって標識され得る。レポーター基の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２８０】
SCAPをコードするポリヌクレオチド群を、SCAPの発現に関係する疾患の診断に用い得る。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、ウイルス感染症、神経疾患、心筋・骨格筋障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。ウイルス感染症は例えばアデノウイルス性(急性呼吸器疾患、肺炎)、アレナウイルス(リンパ球性脈絡髄膜炎)、ブニアウイルス(ハンタウイルス)感染、コロナウイルス(肺炎、慢性気管支炎)、ヘパドナウイルス（肝炎）、ヘルペスウイルス（単純疱疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）感染、フラビウイルス（黄熱病）、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、パピローマウイルス（癌）、パラミクソウイルス（麻疹、おたふく風邪）、ピコルナウイルス（ライノウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス）、ポリオーマウイルス（BKウイルス、JCウイルス）、ポックスウイルス（天然痘）、レオウイルス（コロラドダニ熱）、レトロウイルス（ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトTリンパ指向性ウイルス）感染、ラブドウイルス（狂犬病）、ロタウイルス（胃腸炎）及びトガウイルス（脳炎、風疹）がある。神経疾患には、癲癇、虚血性脳血管疾患、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、及びGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管症候群、精神遅滞その他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパチーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病がある。心筋・骨格筋障害は例えば心筋症、心筋炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性異栄養症(筋強直性ジストロフィー)、セントラルコア病、ネマリンミオパチー、中心核ミオ���チー、脂質ミオパチー、ミトコンドリアミオパチー、感染性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、甲状腺中毒性ミオパチー、エタノールミオパチーがある。SCAPをコードするポリヌクレオチド群は、変容したSCAP発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術や、PCR法や、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、及びマルチフォーマットのELISA式アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２８１】
或る特定の実施態様では、SCAPをコードするヌクレオチド群を、関連する障害、特に上記した障害を検出するアッセイ類に用い得る。SCAPをコードする配列に相補的なポリヌクレオチドを、標準的な方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者サンプル中のシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変化している場合は、該サンプル内の、SCAPをコードするポリヌクレオチド群のレベル変化の存在が、関連する疾患の存在を示す。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２８２】
SCAPの発現に関連する疾患の診断の基準を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下で、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から採取された体液或いは細胞抽出物と、SCAPをコードする配列或いはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被検体から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２８３】
障害の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。経時的なアッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２８４】
癌に関しては、個体からの生検組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防処置または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２８５】
SCAPをコードする配列群から設計されたオリゴヌクレオチド群の、更なる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはSCAPをコードするポリヌクレオチドの断片を、或いはSCAPをコードするポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNAあるいはRNA配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０２８６】
或る特定態様で、SCAPをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用い一塩基多型(SNP)を検出し得る。SNPは、頻回にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定はされないがSNPの検出法は、SSCP（single-stranded conformation polymorphism:一本鎖高次構造多型）と蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、SSCPをコードするポリヌクレオチド配列に由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。このDNAは例えば、患部組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状のPCR生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSSCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、または統計モデルとDNA配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２８７】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば少なくとも16種の一般的SNPが、インスリン非依存型糖尿病と関連している。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、慢性肉芽腫症等の単一遺伝子病の転帰の違いを研究するために有用である。例えば、マンノース結合レクチンであるMBL2における変異体群は、嚢胞性線維症における有害な肺の転帰との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノム学においても有用性を持つ。薬理ゲノム学は、患者の薬物への応答（例えば命を脅かす毒性）に影響する遺伝的変異体の同定を行う。例えばNアセチル転移酵素における或る変異は、抗結核薬であるイソニアジドに応答しての末梢ニューロパシーの高い発症率と関連する。一方、ALOX5遺伝子のコアプロモータにおける或る変異の結果、5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする或る抗喘息薬での治療に対する臨床応答が低下する。異なる集団群におけるSNPの分布の分析は、遺伝的浮動、突然変異、遺伝子組換え、遺伝子選択の調査に有用であり、集団の起源とその移動との追跡にも有用である(Taylor, J.G.他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512; Kwok, P.-Y.及びZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543; Nowotny, P.他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０２８８】
SCAPの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、調節核酸の共増幅（coamplification）、及び、標準曲線から得た結果の補間もある(Melby, P.C.他(1993) J. Immunol. Methods 159:235-244; Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。当該のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈度で存在し、分光応答または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数サンプルの定量速度を加速できる。
【０２８９】
更に別の実施態様では、本願に記載した任意のポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／退行をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用の最も少ない治療薬を選択することができる。
【０２９０】
別の実施態様では、SCAP、SCAPの断片群または、SCAPに特異的な抗体類を、或るマイクロアレイ上のエレメント群として用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質間相互作用、薬物−標的相互作用及び遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定できる。
【０２９１】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号 「Comparative Gene Transcript Analysis」;この参照により特に開示に含まれる）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供するであろう。
【０２９２】
転写イメージは、組織、細胞株、生検、または他の生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２９３】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、in vitroモデル系及び医薬品の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャと称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F.他（1999）Mol. Carcinog. 24:153-159、Steiner, S.及びN.L. Anderson（2000）Toxicol. Lett. 112-113:467-471）。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ精緻である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子も重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない(例えばNational Institute of Environmental Health SciencesのPress Release 00-02、2000年2月29日, http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm参照)。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０２９４】
或る実施態様では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定しうる。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、無処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２９５】
別の実施態様は、本発明で開示するポリペプチド群を用いた、或る組織または細胞タイプのプロテオームの分析に関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析にかけることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析する。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施態様では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出Steiner及びAnderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、当該のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２９６】
プロテオームのプロファイルは、SCAPに特異的な抗体を用いてSCAP発現レベルを定量することによっても作成可能である。一実施態様ではマイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A.他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111、Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２９７】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. 及び J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼でき、情報価値があり得る。
【０２９８】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２９９】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０３００】
マイクロアレイは、当分野で既知の方法で調製、使用、分析しうる（Brennan, T.M.他（1995）米国特許第5,474,796号、Schena, M.他（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他（1995）PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他（1995）PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A.他（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J.他（1997）米国特許第5,605,662号）。様々なタイプのマイクロアレイが周知であり、詳細はSchena, M., 編集(1999; DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, London)に記載がある。
【０３０１】
本発明の別の実施態様では、SCAPをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工染色体構成、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1構成、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134; Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149-154)。一度マッピングすると、核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型(RFLP)と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る(Lander, E.S.及びD. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357)。
【０３０２】
蛍光切片上ハイブリッド形成(FISH)は、他の物理地図及び遺伝地図データと相関し得る(Heinz-Ulrich他(1995) in Meyers、前出、965-968ページ)。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図上の、SCAPをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０３０３】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖解析などの物理的マッピング技術、及び染色体標本の切片上ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域へ遺伝連鎖によって大まかに限局されると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは制御遺伝子を提示している可能性がある(Gatti, R.A.他(1988) Nature 336:577-580)。転座、反転などに起因する、健常者、保因者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０３０４】
本発明の別の実施態様では、SCAP、その触媒作用断片あるいは免疫原性断片またはそのオリゴペプチド群を、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における、化合物のライブラリ群のスクリーニングに用い得る。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持体に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。SCAPと、試験する薬物との結合による複合体の形成を測定し得る。
【０３０５】
別の薬剤スクリーニング技術は、当該のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen他(1984) PCT出願WO84/03564)。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、SCAP、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、結合したSCAPが、当分野で周知の種々の方法で検出される。精製されたSCAPはまた、前記した薬物スクリーニング技術に用いるプレート上に直接、被覆し得る。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持体に固定することもできる。
【０３０６】
別の実施態様では、SCAPと特異結合可能な中和抗体がSCAPとの結合について試験化合物と競合する、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、SCAPと１つ以上の抗原決定基を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３０７】
別の実施態様では、SCAPをコードするヌクレオチド配列群を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列群の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用など)に依存する新技術に用い得る。
【０３０８】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３０９】
上述及び後述の全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、米国特許出願第60/360,681号、第60/328,931号、第60/343,896号、第60/346,308号、第60/332,385号、第60/340,776号、及び第60/347,703号を含め、特に参照により本願に含まれる。
【実施例】
【０３１０】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネートに溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの一相溶液である。結果として得たライセート(溶解物)は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、ライセートからRNAを沈殿させた。
【０３１１】
RNAの純度を高めるため、フェノールによるRNAの抽出及び沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、DNA分解酵素でRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd（T）連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ（A）+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY（A）PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３１２】
場合によってはStratagene社にRNAを提供し、同社が、対応するcDNAライブラリ群を作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨手順または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出Ausubel他、5章）。逆転写は、オリゴd（T）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結し、適切な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対しcDNAのサイズ選択（300〜1000bp）には、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Biosciences）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いた。cDNAは或る好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションした。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE(Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３１３】
２  cDNAクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid及びQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。
【０３１４】
別法ではハイスループットフォーマットで直接結合PCRを用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B.(1994)Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルをプロセスして384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFLUOROSKAN II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光定量した。
【０３１５】
３  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミド中に回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。シークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）を、HYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離と、標識したポリヌクレオチドの検出とには、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルとベースコーリングソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出Ausubel他、7章）を用いて同定した。いくつかのcDNA配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０３１６】
Incyte cDNAに由来のポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクして検証した。その際、BLASTと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド分析(dinucleotide nearest neighbor analysis)とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次にIncyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共データベース群(例えばGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM)と、ヒト、ラット、マウス、線虫(Caenorhabditis elegans)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)及びCandida albicansからの配列群を持つPROTEOMEデータベース群(Incyte Genomics, Palo Alto CA)、隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、例えばPFAM、INCY、及びTIGRFAM (Haft, D.H. 他(2001) Nucleic Acids Res.29:41-43)、及びHMMベースのタンパク質ドメインデータベース例えばSMART (Schultz, J.他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I.他(2002) Nucleic Acids Res.30:242-244)である(HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えばEddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365参照)。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列をアセンブリし、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４及び５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体群を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を得た。あるいは、或るポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、及びTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（MiraiBio, Alameda CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、MEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組込まれたCLUSTALアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０３１７】
表７は、Incyte cDNAと完全長配列との分析とアセンブリとに用いたツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献の全体が参照により開示に含まれる。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０３１８】
完全長ポリヌクレオチド配列群とポリペプチド配列群とのアセンブリと分析とに用いた上記プログラム群は、SEQ ID NO:52-102のポリヌクレオチド配列断片群の同定にも用いた。ハイブリダイゼーション技術と増幅技術とに有用な約20〜約4000ヌクレオチドの断片群を、表４の列2に示した。
【０３１９】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上の構造及び細胞骨格関連タンパク質は、先ず公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）に対しGenscan遺伝子同定プログラムを実行して同定された。Genscanは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する（Burge, C. 及び S. Karlin（1997）J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. 及び S. Karlin（1998）Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、アセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が構造及び細胞骨格関連タンパク質をコードするかを決定するために、コードされるポリペプチドをPFAMモデルに対し構造及び細胞骨格関連タンパク質について問合せて分析した。潜在的な構造及び細胞骨格関連タンパク質はまた、既に構造及び細胞骨格関連タンパク質として注釈されていたIncyte cDNA配列への相同性を基に同定された。これら選択したGenscan予測配列を、次にBLAST分析により、公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNA適用範囲の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載のアセンブリプロセスを用い、Incyte cDNA配列及び／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のGenscan予測コード配列に、完全に由来する。
【０３２０】
５  ゲノム配列データのcDNA配列データとのアセンブリ
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列群を伸長させるため、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したようにアセンブリした部分cDNA群を、ゲノムDNAにマッピングし、また、関連するcDNA群と、１つ以上のゲノム配列からGenscan予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。cDNAとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論及び動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、潜在的スプライス変異体群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのcDNAと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、cDNA配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定した区間を、それらの親配列（parent sequences）に沿って現われる順にスティッチアルゴリズムで「縫い合わせ」、可能な限り最長の配列と配列変異体群とを生成した。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加cDNA配列群を用いるかゲノムDNAの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０３２１】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列群を、BLAST分析に基づく１アルゴリズムで完全長まで伸長した。先ず、BLASTプログラムを用い、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載のようにアセンブリした部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。得られた高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラ蛋白質を産出し、翻訳した配列をGenBank蛋白質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を有するか否かを判定した。
【０３２２】
６  SCAPをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:52-102をアセンブリするために用いた配列を、BLAST他のSmith-Watermanアルゴリズムの実装を用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベース群の配列と比較した。SEQ ID NO:52-102と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、近接及びオーバーラップした配列のクラスターにアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３２３】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、1cMはヒトDNAの1メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/）など公共で入手可能なヒトゲノム地図などの資源を用いて、既に同定された疾患遺伝子類が、上記の区間内若しくは近傍にマップされているかを判定できる。
【０３２４】
SCAPポリヌクレオチド群と骨関節炎との関連
特定の疾患に関連する領域にマップするマーカー群を用いて、診断及び治療ツールを開発できる。或る染色体遺伝子座の疾患関連性は、LOD(logarithm of odds)スコアで表現する。 LODスコアは、10を底とする、連鎖が存在する確率(odds)の対数である。連鎖の定義は、同一染色体上の2種の遺伝子が減数分裂を通じて共に遺伝される傾向である(Genetics in Medicine, Fifth Edition, (1991) Thompson, M.W.他、W.B. Saunders Co. Philadelphia)。連鎖のオッズ比の対数(LOD)スコアが2であれば、100分の1の確率で、該マーカーが単に偶然によって罹患個体で見られることを示す。骨関節炎(OA)を患う48家系の研究で、Loughlin他(Rheumatology (2000) 39:377-381)はD2S202とD2S117を2種の遺伝子マーカーとして同定し、これらはマルチプルLODスコア2.19を股関節OAへの連鎖に関して有する。
【０３２５】
制限断片長多型(RFLP)マーカーであってDNAの配列タグ部位(STS)として知られる領域群の近くに在る事が示されたマーカー群が、ヒトゲノムプロジェクトによって産生されたNT_コンティグ群に、ePCRを用いてマップされている(Schuler, G.D. (1997) Genome Research 7: 541-550、及び(1998) Trends Biotechnol. 16(11):456-9)。したがって、既知の疾患関連マーカー群を持つDNAの領域を有するコンティグ群を用いて、ゲノムの疾患関連領域にマップするSCAP配列群が同定される。
【０３２６】
SCAPをコードするポリヌクレオチド群が、NT_コンティグ群にマップされた。1Mbより長いコンティグは、1Mb長で、オーバーラップする100kbのセクション群を有するサブコンティグ群に分割した。予備ステップは、或るアルゴリズム(MEGABLASTに類似)を用いて、mRNA配列/マスクしたゲノムDNAコンティグのペアリングを規定した。第一アルゴリズムで同定したcDNA/ゲノムのペアリングの確認と、SCAPポリヌクレオチド群のDNAコンティグ群へのマッピングには、SIM4 (Florea, L.他(1998) Genome Res. 8:967-74, version May 2000)を用いたが、これは高処理プロセシングとストランド割当て信頼度(strand assignment confidence)のために最適化していた。mRNA配列/ゲノムコンティグの各ペアのSIM4出力を更に処理し、SCAPポリヌクレオチド群のゲノムコンティグ上の正確な位置と、それらのストランド同一性を判定した。
【０３２７】
SEQ ID NO:71はGenbankの2002年2月リリースからのNT_Contig GBI:NT_005428_001.7にマップされ、これはOA関連遺伝子マーカーD2S202及びD2S72をも有する、ゲノムの或る6.45Mb領域をカバーする。SEQ ID NO:71とD2S202及びD2S72との最大距離は従って、6.45Mbである。 このようにSEQ ID NO:71は、OAと一貫して関連が示される遺伝子座に近接する。
【０３２８】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン解析は遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合している或る膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(Sambrook及びRussell前出7章、Ausubel他前出4章)。
【０３２９】
類似の、BLASTを応用したコンピュータ技術を用いて、GenBankやLIFESEQ（Incyte Genomics）などのデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン解析は、多数の膜に基づくハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正できる。検索の基本は積スコアであり、次式で定義する。
【０３３０】
【数１】
2005520493.tif 000004
【０３３１】
積スコアは、2つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を２つの配列の短い方の長さの5倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３３２】
或いは、SCAPをコードするポリヌクレオチドを、由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリする(実施例３を参照)。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎児構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー、すなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、SCAPをコードするcDNAの組織特異的及び疾患特異的な発現を反映する。cDNA配列及びcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３３３】
８  SCAPをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長ポリヌクレオチドを、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させ産生する。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはOLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上となり、約68〜約72℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０３３４】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３３５】
高忠実度の増幅を当業者に周知の方法でのPCRで得た。PCRはPTC-200サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)での96穴プレートで行った。反応混液は、鋳型DNAを有し、また、200 nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と(NH4)2SO4と2-メルカプトエタノールとを含有する反応バッファーと、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)と、ELONGASE酵素(Invitrogen)と、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)とを含有する。プライマー対であるPCI AとPCI Bとに対し、以下のパラメータで増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：57℃で1分間。ステップ4：68℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3及び4を20回繰り返す。ステップ6：68℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。
【０３３６】
各ウェルのDNA濃度は、１×TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分注し、DNAが試薬と結合できるようにして測定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３３７】
伸長したヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化して音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位オーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞群の選択は抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、LB/2Xカルベニシリン培養液中の384ウェルプレート群に37℃で一晩培養した。
【０３３８】
細胞を溶解し、Taq DNAポリメラーゼ（Amersham Biosciences）及びPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて以下のパラメータでDNAをPCR増幅した。ステップ1：94℃で3分間。ステップ2：94℃で15秒間。ステップ3：60℃で1分間。ステップ4：72℃で2分間。ステップ5：ステップ2、3及び4を29回繰り返す。ステップ6：72℃で5分間。ステップ7：4℃で保存。DNAの定量化には、上記したようにPICOGREEN試薬（Molecular Probes）を用いた。DNA回収率が低いサンプルは、上記同一条件で再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２,v/v）で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYEターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンスした。
【０３３９】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチドを検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０３４０】
９  SCAPをコードするポリヌクレオチドにおける一塩基多型の同定
一塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体が、SEQ ID NO:52-102において、LIFESEQデータベース（Incyte Genomics）を用いて同定された。同じ遺伝子からの配列群は共にクラスター化され、実施例３に述べたようにアセンブリされて、その遺伝子における全ての配列変異体の同定を可能にした。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルタは、最小限Phredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラ及びスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍におけるオリジナルのクロマトグラムファイルが解析された。クローンエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。最後のフィルタ群によって、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在する重複(duplicates)とSNPが除去された。
【０３４１】
幾つかのSNPは、更なる特徴付けの為に選択された。選択は高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc.）を用いた質量分析によって行い、４群の異なるヒト集団におけるSNP部位での対立遺伝子頻度を分析した。白人集団は92個体（46名の男子、46名の女子）からなり、83名はユタ出身、4名はフランス人、3名はベネズエラ人、2名はアーミッシュの人々である。アフリカ集団は194個体（97名の男子、97名の女子）からなり、全員がアフリカ系アメリカ人である。ヒスパニック集団は324個体（162名の男子、162名の女子）からなり、全員がメキシコのヒスパニックである。アジア集団は126個体（64名の男子、62名の女子）からなり、報告された親の内訳は43％が中国人、31％が日本人、13％がコリアン、5％がベトナム人、8％が他のアジア人である。対立遺伝子頻度の分析は先ず白人集団においてなされ、幾つかの場合、SNPの内、対立遺伝子変異をこの集団において示さなかったSNPは、更に他の３集団においてテストされることは無かった。
【０３４２】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:52-102由来のハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー50pmolと、[γ-32P]アデノシン三リン酸(Amersham Biosciences)250μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)とを化合させることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba IまたはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを有するアリコットを用いる。
【０３４３】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、40℃で16時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば0.1×クエン酸ナトリウム食塩水及び0.5％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３４４】
１１  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出Baldeschweiler他などを参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである(Schena, M., 編集(1999) DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, London)。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る（Schena, M.他（1995）Science 270:467-470、Shalon. D. 他（1996）Genome Res. 6:639-645、Marshall, A. 及び J. Hodgson（1998）Nat. Biotechnol. 16:27-31）。
【０３４５】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。一実施態様におけるマイクロアレイの調製及び使用について、以下に詳述する。
【０３４６】
組織または細胞サンプルの調製
総RNAを組織サンプルから単離するためグアニジニウムチオシアネート法を用い、ポリ(A)+RNA精製にオリゴ(dT)セルロース法を用いる。各ポリ（A）+RNAサンプルを逆転写するため、MMLV逆転写酵素を用い、また、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1×第一鎖バッファ、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いる。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte Genomics）を用い、200ngのポリ（A）+RNAを含有する体積25mlで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル（1つはCy3、もう1つはCy5標識）は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプル精製には、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（Clontech, Palo Alto CA）を用いる。混合後、２つの反応サンプルをエタノール沈殿させるため、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、60mlの酢酸ナトリウム、及び300mlの100％エタノールを用いる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、14μlの5×SSC/0.2％SDS中で再懸濁する。
【０３４７】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサート群と、ベクター群とを含有する細菌細胞群から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのPCRによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量まで、アレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３４８】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、0.1％のSDS及びアセトン中で超音波洗浄し、処理の間及び処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、110℃のオーブンで硬化させる。
【０３４９】
米国特許第5,807,522号に記載の手順で、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は参照により開示に含まれる。平均濃度１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを、高速ロボット装置（robotic apparatus）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３５０】
マイクロアレイに、STRATALINKER UVクロスリンク機（Stratagene）を用いてUV架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝食塩水（PBS）（Tropix, Inc., Bedford MA）中に０.２％カゼイン、６０℃で３０分間行った後、前記のように０.２％SDS及び蒸留水で洗浄する。
【０３５１】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、65℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して1.8cm2のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバー内を湿度100％に保つため、140μlの5×SSCをチェンバーの１コーナーに加える。アレイを入れたチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,0.1％SDS）において45℃で10分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（0.1×SSC）において45℃で10分間ずつ３回洗浄して乾燥させる。
【０３５２】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを有するスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０３５３】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを順に励起する。発光された光は波長に基づき分割され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザー源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３５４】
通常、各スキャンの感度を較正するため、cDNA対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比1：100,000と相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するcDNAのサンプルを２種のフルオロフォアで標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３５５】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールした12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いる。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起及び測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３５６】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルが次に統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte Genomics）である。少なくとも約２倍の発現変化を示し、シグナル/バックグラウンド比が少なくとも2.5で、エレメントスポットサイズが少なくとも約40％であるアレイエレメントが、差次的発現を示すとされる。
【０３５７】
発現
例えば、大腸癌で差次的に発現する遺伝子の同定のため、正常及び腫瘍組織での遺伝子発現パターンが比較された。同じ個体からマッチさせた正常及び腫瘍サンプルが競合ハイブリダイゼーションで比較された。この過程は、遺伝的背景による一部の個体変異を排除する。また疾患過程による相違を増強する。SEQ ID NO:55は、８ドナー中１名で少なくとも2分の1に下方制御が見られた。したがってSEQ ID NO:55は、大腸癌の検出アッセイ及び治療に用い得る。
【０３５８】
別例で、APCの突然変異を反映しうる大腸腫瘍形成に関与する何らかの初期遺伝子発現変化を判定するため、或るFAP患者からのポリープ群を、同じ患者からの正常な大腸組織と比較した。この実験の目的は、大腸直腸癌の発症で直接の役割を果たしうる、APCの突然変異によって影響される遺伝子群の同定であった。SEQ ID NO:55は、試験した唯一の患者で2分の1に下方制御が見られた。実験結果は、実験を反復しても同様であった。したがってSEQ ID NO:55は、大腸結腸癌の早期発見アッセイ及び治療に用い得る。
【０３５９】
別の例でSEQ ID NO:61とSEQ ID NO:67は差次的発現を乳癌組織で示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。乳房腫瘍の組織学的及び分子的評価が示しているところでは、乳癌の発達の展開が経る多段階プロセスにおいて、前悪性の乳腺上皮細胞は、腫瘍形成に導く比較的確定した一連の事象を経験する。腫瘍発達早期には導管過形成が見られる。急速な新生物成長中の細胞は次第に浸潤癌に進行し、肺、骨、また潜在的には他の臓器へ転移するようになる。幾つかの因子(限定はされないが環境因子から遺伝因子まで)が、腫瘍進行と悪性転換に影響する。
【０３６０】
乳癌の種々のステージに関連する分子と表現型との特徴のより良い判定のため、腫瘍進行の様々な段階の乳癌細胞株群を、初代ヒト乳腺上皮細胞群と比較した。乳癌細胞株は以下がある。MCF7、乳腺癌細胞株で69才女性の胸水に由来。T-47D、乳癌細胞株で54才の浸潤性乳管癌の女性から得た胸水由来。Sk-BR-3、乳腺癌細胞株で43才の女性の悪性胸水から単離。BT-20、乳腺癌で74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片から遊出した細胞からin vitro単離。MDA-mb-435S、紡錘状の細胞株で、それが導かれた元の細胞株は31才の転移性乳管腺癌の女性の胸水から単離、以上の株である。初代乳腺上皮細胞株HMECは、正常なヒト乳腺組織に由来する(Clonetics, San Diego, CA)。すべての細胞培養は既知組成培地で供給者の推奨に従い70〜80%のコンフルエンスにまで増殖した後、RNA単離した。マイクロアレイ実験が示したところでは、SEQ ID NO:67の発現は初代乳腺上皮細胞に対して５種すべての乳癌株(MCF7、T-47D、Sk-BR-3、BT20及びMDA-mb-435S)で少なくとも2分の1に低下し、SEQ ID NO:61の発現は少なくとも2分の1の低下がMDA-mb-435S以外すべての細胞株で見られた。従ってSEQ ID NO:61とSEQ ID NO:67は、乳癌の診断アッセイ及び病期分類アッセイに、また乳癌治療での潜在的生体マーカー及び治療薬として有用である。
【０３６１】
別の例でSEQ ID NO:62は差次的発現を同じドナーから単離の乳房腫瘍組織と正常な乳房組織とで示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。浸潤性小葉癌腫組織を或る43才女性から取得し、これを同じドナーから得た正常乳房組織(Huntsman Cancer Institute)と比較した。腫瘍は高分化型で、2つ（13の内）のリンパ節に転移していた。SEQ ID NO:62の発現は、腫瘍組織内で、無波及の乳房組織に比して少なくとも2.5分の１に減少した。したがってSEQ ID NO:62は、乳癌の診断アッセイに、また乳癌治療での潜在的生体マーカー及び治療薬として有用である。
【０３６２】
別の例でSEQ ID NO:62とSEQ ID NO:63は差次的発現を肺癌組織で示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。対比較を行い、同じドナーからの正常組織と腫瘍組織とを比較した。SEQ ID NO:62の発現は、或る60才ドナーからの中分化腺癌肺組織において、同じドナーの肉眼上無波及の組織と比べて2.5分の1未満に減少した。SEQ ID NO:63の発現は、或る73才男性ドナーからの肉眼上無波及の組織と比べ、扁平上皮癌組織(60%が顕性の腫瘍細胞)において少なくとも2分の1に減少した。従ってSEQ ID NO:62とSEQ ID NO:63は、肺癌の診断アッセイに、また肺癌治療での潜在的生体マーカー及び治療薬として有用である。
【０３６３】
別の例でSEQ ID NO:67は差次的発現を大腸癌組織で示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。大腸癌の発達は多段階に経過し、これらの段階の中で前悪性大腸細胞が比較的明確な一連のイベントを経て腫瘍を形成する。腫瘍進行と悪性転換との過程に寄与する因子としては、遺伝因子、突然変異、及び選択がある。同じ個体からマッチさせた正常及び腫瘍サンプルを比較し、大腸癌で差次的に発現する遺伝子群を同定した。SEQ ID NO:67の発現は、或る73才女性ドナーからの大腸癌組織において、同じドナーの肉眼上無波及の組織と比べて少なくとも2分の1に減少した。SEQ ID NO:67の発現はまた、或る56才女性(診断は低分化転移性腺癌で卵巣起源の可能性)から単離した大腸腺癌組織において、正常な組織と比べて少なくとも2分の1に減少した。したがってSEQ ID NO:67は、大腸癌の診断アッセイに、また大腸癌治療での潜在的生体マーカー及び治療薬として有用である。
【０３６４】
別例でSEQ ID NO:73は、癌性大腸組織において、正常大腸組織と比べて差次的に発現した。SEQ ID NO:73は、大腸腫瘍組織において、同じドナーの正常大腸組織と比べて少なくとも2分の1に低発現した。したがってSEQ ID NO:73は、細胞増殖性障害(例えば大腸癌)の病期分類及び診断アッセイに有用である。
【０３６５】
別例でSEQ ID NO:77は、正常なヒト骨芽組織と、同様の組織(生検標本、骨肉腫組織、初代培養、または転移した組織からのもの)とを比べて差次的に発現した。SEQ ID NO:77の正常な骨芽細胞での発現と比較して、SEQ ID NO：77は下記で少なくとも2分の1に低発現された。即ち或る骨肉腫からの軟骨芽骨腫瘍細胞、或る大腿骨肉腫からの軟骨/骨芽骨腫瘍細胞、脛骨からの紡錘細胞骨腫瘍細胞、或る大腿骨肉腫からの軟骨芽細胞骨腫瘍組織、或る大腿骨肉腫からの線維芽細胞、軟骨芽細胞及び軟骨/骨芽細胞の骨腫瘍組織、或る大腿骨肉腫からの軟骨芽細胞軟骨腫瘍組織、脛骨からの紡錘細胞軟骨腫瘍組織、或る骨肉腫大腿からの軟骨/骨芽細胞の正常な軟骨、或る骨肉腫からの肺腫瘍転移組織、及び、或る骨肉腫患者からの正常な骨格筋の紡錘細胞である。したがってSEQ ID NO:77は、細胞増殖性障害(例えば骨肉腫)の病期分類及び診断アッセイに有用である。
【０３６６】
別例でSEQ ID NO:79は、肝臓腫瘍C3A株(種々のステロイドで処理)において、無処理C3A細胞と比べて差次的に発現した。SEQ ID NO:79は、プロゲステロン処理C3A細胞では全ての時点(1、3、及び6時間)の各用量(1、10、及び100μM)で無処理C3A細胞に比べ少なくとも2分の1に低発現された。SEQ ID NO:79は、ベクロメタゾン処理C3A細胞では全ての時点(1、3、及び6時間)の2種の低用量(1及び10μM)で無処理C3A細胞に比べ少なくとも2分の1に低発現された。SEQ ID NO:79は、MAH処理C3A細胞では全ての時点(1、3、及び6時間)の各用量(1、10、及び100μM)で無処理C3A細胞に比べ少なくとも2分の1に低発現された。SEQ ID NO:79は、bude処理C3A細胞では全ての時点(1、3、及び6時間)の各用量(1、10、及び100μM)で無処理C3A細胞に比べ少なくとも2分の1に低発現された。SEQ ID NO:79は、プレドニゾン処理C3A細胞では各時点(1、3、及び6時間)の各用量(1、10、及び100μM)で無処理C3A細胞に比べ少なくとも2分の1に低発現された(例外は10μM用量で3時間の時点である)。SEQ ID NO:79は、DEX処理C3A細胞では各時点(1、3、及び6時間)の各用量(1、10、及び100μM)で無処理C3A細胞に比べ少なくとも2分の1に低発現された(例外は10μM用量で3時間の時点と100μM用量で1及び3時間の時点である)。最後にSEQ ID NO:79は、ベタメタゾン処理C3A細胞では各時点(1、3、及び6時間)の各用量(1、10、及び100μM)で無処理C3A細胞に比べ少なくとも2分の1に低発現された(例外は1μM用量で1及び6時間の時点である)。したがってSEQ ID NO:79は、ステロイド治療関連肝臓障害の病期分類及び診断アッセイに有用である。
【０３６７】
例えばSEQ ID NO:93は低下した発現をアルツハイマー病にかかった脳組織において正常脳組織に対して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。したがってSEQ ID NO:93は、アルツハイマー病及び他の神経疾患の治療モニタリングと診断アッセイとに有用である。
【０３６８】
別の例でSEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:93及びSEQ ID NO:95は発現低下を乳癌細胞において非悪性乳腺上皮細胞に対して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。非悪性乳腺上皮細胞の遺伝子発現プロファイルを、腫瘍進行の様々な段階の乳癌株群の遺伝子発現プロファイルと比較した。細胞はRNA収集前に無血清限定H14培地で70%〜80%のコンフルエンスにまで増殖した。比較した細胞株は、ａ）正常なドナーから単離された初代乳房上皮細胞株であるHMECと、ｂ）36才の線維嚢胞性乳房疾患の女性から単離された乳腺細胞株であるMCF-10Aと、ｃ）69才女性の胸水から単離された非悪性乳腺癌細胞株であるMCF7と、ｄ）54才の浸潤性乳管癌の女性から得た胸水から単離された乳癌細胞株であるT-47Dと、ｅ）43才の女性の悪性胸水から単離された乳腺癌細胞株であるSk-BR-3と、ｆ）74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片からin vitroで遊出した細胞に由来する乳癌細胞株であるBT-20と、ｇ）51才の女性の胸水から単離された乳房腫瘍細胞株であるMDA-mb-231と、ｈ）31才の転移性乳管腺癌の女性の胸水からR. Cailleauによって単離された親株(435)から進化した紡錘状の細胞株であるMDA-mb-435Sとを含む。またSEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90及びSEQ ID NO:95の発現は、或る43才女性の右乳房腫瘍(診断は浸潤性小葉癌腫)において、同じドナーの肉眼上無波及の乳房組織(Huntsman Cancer Institute, Salt Lake City, UT)と比べて減少した。腫瘍は高分化型で、2つ（13の内）のリンパ節に転移していた。したがってSEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:93及びSEQ ID NO:95は、乳癌及び他の細胞増殖性障害の、治療モニタリング及び診断アッセイに有用である。
【０３６９】
別の例でSEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90及びSEQ ID NO:95は発現低下を肺腺癌にかかった組織において正常肺組織に対して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。或る60才ドナー(Huntsman Cancer Institute)からの肉眼上無波及の肺組織と、右肺の中分化腺癌を比較した。したがってSEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、及びSEQ ID NO:95は、肺癌及び他の細胞増殖性障害の、治療モニタリング及び診断アッセイに有用である。
【０３７０】
別の例でSEQ ID NO:90及びSEQ ID NO:95は発現低下を初代前立腺上皮細胞に比較して前立腺癌細胞で示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。初代前立腺上皮細胞を、腫瘍進行の様々な段階を示す前立腺癌と比較した。比較した細胞株は、ａ）正常なドナーから単離した初代前立腺上皮細胞株であるPrECと、ｂ）広範囲な転移性前立腺癌の69才男性の脳内転移部位から単離した前立腺癌細胞株であるDU-145と、ｃ）50才の転移性前立腺癌の男性のリンパ節生検から単離した前立腺癌細胞株であるLNCaPと、ｄ）骨に転移したグレード4の前立腺癌を患う62才男性の骨内転移部位から単離した前立腺癌細胞株であるPC-3とを含む。拘束性条件下で成長した癌腫細胞を、拘束性条件下で成長した正常なPrECと比較した。したがってSEQ ID NO:90及びSEQ ID NO:95は、前立腺癌及び他の細胞増殖性障害の、治療モニタリング及び診断アッセイに有用である。
【０３７１】
別の例でSEQ ID NO:102は差次的発現を乳癌に関して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。或る非悪性乳腺上皮細胞株の遺伝子発現プロファイルを、或る乳癌株の遺伝子発現プロファイルと比較した。Hs 578T乳管癌細胞株は乳癌を持つ或る74才の女性から単離された株であり、これをHMEC(或る正常ドナーから単離した初代乳腺上皮細胞株)と比較した。初代乳腺上皮細胞(HMEC)は基礎培地中、成長因子とホルモンとの不在下で24時間成長させた後、Hs578T細胞(基礎培地または最適成長条件下、成長因子及び栄養素の存在下で成長)と比較した。どちらの場合もSEQ ID NO:102の発現は、初代上皮細胞株に比べてHs578T癌腫細胞株で少なくとも2.5倍に増加していた。したがってSEQ ID NO:102は、乳癌の診断アッセイ及び病期分類アッセイに、また乳癌治療での潜在的生体マーカー及び治療薬として有用である。
【０３７２】
別の例でSEQ ID NO:102は差次的発現を、大腸、肺及び卵巣癌に関して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。5名のドナーからのマッチさせた正常及び腫瘍組織の対比較(3例の大腸と、1例の肺及び1例の卵巣)でSEQ ID NO:102の発現は、大腸腫瘍組織で少なくとも2分の1、肺腺癌組織で少なくとも3.5分の1、卵巣腫瘍組織で少なくとも4.5分の1に下方制御された。したがってSEQ ID NO:102はまた、大腸癌、肺癌、卵巣癌の診断アッセイ及び病期分類アッセイに、また大腸癌、肺癌、卵巣癌治療での潜在的生体マーカー及び治療薬として有用である。
【０３７３】
別の例でSEQ ID NO:98とSEQ ID NO:102は差次的発現を前立腺癌に関して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。初代前立腺上皮細胞を、腫瘍進行の様々な段階を示す前立腺癌と比較した。比較した細胞株は下記である。即ちa) PrEC、或る正常なドナーから単離した初代前立腺上皮細胞株。b) DU-145、広範囲な転移性前立腺癌の或る69才男性の脳内転移部位から単離した前立腺癌細胞株。c) LNCaP、或る50才の転移性前立腺癌の男性のリンパ節生検から単離した前立腺癌細胞株。d)PC-3、骨に転移したグレード4の前立腺癌を患う或る62才男性の骨内転移部位から単離した前立腺癌細胞株、である。SEQ ID NO:98の発現は、DU145、LNCaP及びPC3細胞株ではPrEC細胞に比して少なくとも２分の1に減少した。SEQ ID NO:102の発現は、DU145及びLNCaP細胞株ではPrEC細胞に比して少なくとも２分の1に減少した。従ってSEQ ID NO:98とSEQ ID NO:102は、前立腺癌の診断アッセイ及び病期分類アッセイに、また前立腺癌治療での潜在的生体マーカー及び治療薬として有用である。
【０３７４】
１２  相補的ポリヌクレオチド
SCAPをコードする配列群あるいは其の任意の一部に対して相補的な配列群は、天然SCAPの発現を、検出、低減、または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチド群を設計するため、Oligo 4.06ソフトウェア(National Biosciences)及び、SCAPのコード配列を用いる。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコード配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、SCAPをコードする転写物にリボソームが結合するのを防ぐ。
【０３７５】
１３  SCAPの発現
SCAPの発現及び精製は、細菌もしくはウイルスを基にした発現系を用いて成される。細菌内でSCAPを発現させるには、抗生物質耐性遺伝子と、cDNA転写レベルを高める誘導性プロモーターとを持つ、好適なベクターに、cDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、及びtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌は、イソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されるとSCAPを発現する。真核細胞でのSCAPの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え、或いはトランスファープラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、SCAPをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合はバキュロウイルスへの更なる遺伝子修飾が必要になる（Engelhard. E. K.他（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他（1996）Hum. Gene Ther. 7:1937-1945）。
【０３７６】
殆どの発現系では、SCAPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)と、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を、迅速に１ステップで行い得る。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製後、GST部分を、特異的に操作した諸部位において、SCAPからタンパク分解的に切断できる。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ausubel他(前出10章及び16章)で考察されている。これらの方法で精製したSCAPを直接用いて、実施例１７及び１８に示す、適用可能なアッセイを行える。
【０３７７】
１４  機能的アッセイ
SCAPの機能は、哺乳類細胞培養系において生理的に高められたレベルでの、SCAPをコードする配列の発現によって算定する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを持つ哺乳類発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORTプラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）及びPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株(例えば内皮由来または造血由来の細胞株)へ、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方制御、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変容、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G. (1994; Flow Cytometry, Oxford, New York NY)に記述がある。
【０３７８】
遺伝子発現に与えるSCAPの影響は、SCAPをコードする配列群と、CD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いてアセスできる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質移入された細胞と形質移入されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率よく分離できる(DYNAL, Lake Success NY)。mRNAは、これら細胞から、当業者に周知の方法で精製できる。SCAPと当該の他の遺伝子群とをコードするmRNAの発現は、ノーザン解析やマイクロアレイ技術で分析できる。
【０３７９】
１５  SCAP特異抗体の産生
実質的に精製されたSCAPを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE；例えば、Harrington, M.G.（1990）Methods Enzymol. 182:488-495を参照）または他の精製技術で作製し、これを用いて標準的なプロトコルで動物(例えばウサギ、マウス等)を免疫しまた抗体を作り出す。
【０３８０】
あるいは、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてSCAPアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者に既知の方法で抗体を産生する。C末端付近あるいは親水性領域内などの、適切なエピトープの選択方法については、当分野に記述が多い（前出Ausubel他11章）。
【０３８１】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、FMOCケミストリを用いるABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）との反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出Ausubel他）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗SCAP活性を検査するには例えば、ペプチドまたはSCAPを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、更に、放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３８２】
１６  特異抗体を用いる天然SCAPの精製
天然SCAP或いは組換えSCAPは、SCAPに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィによって実質的に精製される。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗SCAP抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３８３】
SCAPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、SCAPを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とSCAPとの結合を切るような条件で（例えば、或るpH２〜３のバッファー、あるいは高濃度の、例えば尿素またはチオシアン酸イオンなどのカオトロープで）溶出させ、SCAPを回収する。
【０３８４】
１７  SCAPと相互作用する分子の同定
SCAPまたはその生物学的活性断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する（Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539）。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子を、標識したSCAPと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたSCAP複合体を有する任意のウェルをアッセイする。様々なSCAP濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したSCAPの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３８５】
別法では、SCAPと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989；Nature 340:245-246)に記載の酵母２-ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）や、MATCHMAKERシステム(Clontech)などの２-ハイブリッドシステムに基づく市販キットを用いて分析する。
【０３８６】
SCAPはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定し得る（Nandabalan, K.他(2000)米国特許第6,057,101号）。
【０３８７】
１８  SCAP活性の実証
SCAPの或る微小管運動性アッセイは、運動(motor)タンパク質活性を測定する。このアッセイでは、組換えSCAPをガラススライドまたは同様の基板に固定する。ATP及び細胞質ゾル抽出物を含む溶液に入れた、タキソールで安定化されたウシ脳の微小管(市販品)をスライド上に灌流する。SCAPのモーター活性によって駆動される微小管の運動は、ビデオ光学顕微鏡及び画像解析技術を用いて視覚化及び定量化できる。SCAPの活性は微小管運動の頻度及び速度に正比例する。
【０３８８】
或いは、SCAPの或るアッセイでは、in vitroでタンパク質フィラメントの形成を測定する。ポリマー集合の「臨界濃度」より高い濃度のSCAP溶液を、カーボンでコートされたグリッドに置く。溶液中には、適切な核形成部位を供給し得る。グリッドを0.7%(w/v)の水性酢酸ウラニルでネガティブ染色し、電子顕微鏡で検査する。約25nm(微小管)、約8nm(アクチン)、または約10nm(中間径フィラメント)のフィラメントが現れると、SCAP活性が実証される。
【０３８９】
別法では、SCAPの活性は、SCAPのタンパク質フィラメントへの結合によって測定される。35S-メチオニンで標識されたSCAPサンプルが適切なフィラメントタンパク質（アクチン、チューブリン、または中間径フィラメントタンパク質）とインキュベーションされ、そのフィラメントタンパク質に対する或る抗体を用いる免疫沈降によって複合体タンパク質が収集される。この免疫沈降は、その後SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で完了し、結合したSCAPの量がオートラジオグラフィーで測定される。
【０３９０】
当業者には、本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない限りの、記載した本発明の、組成物、方法及びシステムの、種々の修正及び変更については自明であろう。本発明が、新規かつ有用なタンパク質群及びそれらをコードするポリヌクレオチド群を提供し、これらを創薬過程に利用しうること、また本発明が、これらの組成を用いた、疾患と病態との検出、診断、及び治療の方法を提供することは理解されよう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施態様に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施態様に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。このような実施態様の記載は完全であると考慮されるべきでなく、また本発明を開示したとおりの形態に限定するものでもない。更に、1つの実施態様の要素は、他の1つ以上の実施態様の要素と容易に組み換え得る。このような組合わせによって本発明の範囲内で多数の実施態様が形成され得る。本発明の範囲は、添付した請求の範囲及びそれらの等価物によって規定されるよう意図される。
【０３９１】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長のポリヌクレオチド実施態様及びポリペプチド実施態様の命名の概略である。
【０３９２】
表２は、本発明のポリペプチド実施態様のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈(annotation)と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３９３】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインなど、ポリペプチド実施態様の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３９４】
表４は、ポリヌクレオチド実施態様をアセンブリするために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、該ポリヌクレオチドの選択された断片と共に示す。
【０３９５】
表５は、ポリヌクレオチド実施態様の代表的cDNAライブラリを示す。
【０３９６】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３９７】
表７は、ポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０３９８】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。
【０３９９】
【表１−１】
2005520493.tif 000005
【０４００】
【表１−２】
2005520493.tif 000006
【０４０１】
【表１−３】
2005520493.tif 000007
【０４０２】
【表２−１】
2005520493.tif 000008
【０４０３】
【表２−２】
2005520493.tif 000009
【０４０４】
【表２−３】
2005520493.tif 000010
【０４０５】
【表２−４】
2005520493.tif 000011
【０４０６】
【表２−５】
2005520493.tif 000012
【０４０７】
【表２−６】
2005520493.tif 000013
【０４０８】
【表２−７】
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【０４０９】
【表２−８】
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【０４１０】
【表２−９】
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【０４１１】
【表２−１０】
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【０４１２】
【表２−１１】
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【０４１３】
【表２−１２】
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【０４１４】
【表２−１３】
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【０４１５】
【表２−１４】
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【０４１６】
【表２−１５】
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【０４１７】
【表２−１６】
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【０４１８】
【表２−１７】
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【０４１９】
【表２−１８】
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【０４２０】
【表２−１９】
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【０４２１】
【表２−２０】
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【０４２２】
【表２−２１】
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【０４２３】
【表２−２２】
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【０４２４】
【表２−２３】
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【０４２５】
【表２−２４】
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【０４２６】
【表２−２５】
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【０４２７】
【表２−２６】
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【０４２８】
【表２−２７】
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【０４２９】
【表２−２８】
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【０４３０】
【表２−２９】
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【０４３１】
【表３−１】
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【０４３２】
【表３−２】
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【０４３３】
【表３−３】
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【０４３４】
【表３−４】
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【０４３５】
【表３−５】
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【０４３６】
【表３−６】
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【０４３７】
【表３−７】
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【０４３８】
【表３−８】
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【０４３９】
【表３−９】
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【０４４０】
【表３−１０】
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【０４４１】
【表３−１１】
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【０４４２】
【表３−１２】
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【０４４３】
【表３−１３】
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【０４４４】
【表３−１４】
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【０４４５】
【表３−１５】
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【０４４６】
【表３−１６】
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【０４４７】
【表３−１７】
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【０４４８】
【表３−１８】
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【０４４９】
【表３−１９】
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【０４５０】
【表３−２０】
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【０４５１】
【表３−２１】
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【０４５２】
【表３−２２】
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【０４５３】
【表３−２３】
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【０４５４】
【表３−２４】
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【０４５５】
【表３−２５】
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【０４５６】
【表３−２６】
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【０５００】
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【０５０１】
【表７−１】
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【０５０２】
【表７−２】
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【０５０３】
【表７−３】
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【０５０４】
【表８−１】
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【０５０５】
【表８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005520493.tif 000113
2005520493.tif 000114
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