(57)【要約】ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ９(ＭＴＳＰ９)ポリペプチドが本明細書において提供される。チモーゲンおよびこれらのポリペプチドの活性化型ならびにプロテアーゼドメインの単鎖および２本鎖型がまた提供される。ＭＴＳＰ９のプロテアーゼ活性を調整する化合物を同定するためにポリペプチドを使用する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＩ型膜型セリンプロテアーゼ９(ＭＴＳＰ９)のプロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分を含む、実質的に精製された単鎖もしくは２本鎖ポリペプチド。
【請求項２】
活性化された２本鎖タンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドであって、
配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９として示されるヌクレオチド配列によりコード化されるアミノ酸配列を含み、そして配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８5％のアミノ酸配列同一性を含む、ポリペプチド；
配列番号１７に示されるヌクレオチド配列によりによりコード化されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチド配列に高度のストリンジェンシーの条件下にその全長の少なくとも70％に沿ってハイブリダイズするヌクレオチド配列によりによりコード化されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
アミノ酸１１〜２４２もしくは配列番号１８として示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
配列番号６もしくは１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
配列番号１７に示される配列のスプライス変異体であるヌクレオチド配列によりコード化される、ポリペプチド
からなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドであって；
ポリペプチドのＭＴＳＰ９部分がＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分から本質的に成る、ポリペプチド。
【請求項５】
ＭＴＳＰ９がヒトのポリペプチドである、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項６】
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインもしくはＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインの触媒的に活性な部分から本質的に成る、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項７】
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインもしくはＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインの触媒的に活性な部分から本質的に成る、請求項３に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号６にアミノ酸１１〜２４２として示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチドであって、プロテアーゼドメインが配列番号６のアミノ酸１１〜２４２として示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の実質的に精製されたポリペプチドであって、配列番号６として示されるアミノ酸配列もしくは配列番号１８として示されるアミノ酸配列を含むところのポリペプチドと約８０％以上の配列同一性を有し、そこではポリペプチドがプロテアーゼである、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、プロテアーゼドメイン部分が核酸分子であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチド配列または少なくとも一つのそのドメインもしくはドメインの触媒的に活性な部分を含む核酸分子に高度のストリンジェンシーの条件下にその全長の少なくとも70％に沿ってハイブリダイズする核酸分子によりコード化される、ポリペプチド。
【請求項１３】
ドメインがプロテアーゼドメインである、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドが配列番号１８に示される完全な配列を含まないでそして配列番号１８の少なくともアミノ酸８５〜８７および／もしくは１６０〜１６５を含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
突然変異タンパク質である請求項３に記載のポリペプチドであって、
約５０％までのアミノ酸がさらに別のアミノ酸により置換され；
そして得られたポリペプチドが突然変異していないポリペプチドの少なくとも１０％の触媒活性を有する単鎖もしくは２本鎖のポリペプチドである：
ポリペプチド。
【請求項１６】
約１０％までのアミノ酸がさらに別のアミノ酸により置換される、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリペプチドであって、得られたポリペプチドが単鎖もしくは２本鎖のポリペプチドでありそして突然変異していないタンパク質の少なくとも５０％の触媒活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１８】
プロテアーゼドメイン中の遊離システインがさらに別のアミノ酸により置換される、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
置換するアミノ酸がセリンである、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインから本質的に成る、単離された実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸分子であって、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、１５もしくは１７に示される配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；および
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列：
からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含む、核酸分子。
【請求項２３】
請求項1５に記載の突然変異タンパク質をコード化する、単離された核酸分子。
【請求項２４】
請求項２１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２５】
発現ベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
真核性のベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２７】
請求項２４に記載のベクターであって、それに機能するように結合されたヌクレオチド配列によりコード化される任意のポリペプチドの分泌を指示するヌクレオチドの配列を含む、ベクター。
【請求項２８】
PichiaベクターもしくはＥ．coliベクターである、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２９】
請求項２４に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３０】
原核性の細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
真核性の細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３２】
細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞の中から選択される、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３３】
哺乳動物の細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３４】
請求項６に記載のポリペプチドをコード化する、核酸分子。
【請求項３５】
請求項３４に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３６】
請求項３５に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３７】
組み替え非ヒト動物であって、請求項１に記載のポリペプチドをコード化する内因性遺伝子が動物もしくはその祖先の相同性組み替えもしくは挿入突然変異誘発によリ欠失されるかもしくは不活性化されている、動物。
【請求項３８】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインを含む、ポリペプチドを製造する方法であって、
請求項２９に記載の細胞をそれによりコード化されたポリペプチドが細胞により発現される条件下で培養すること；および
発現されたポリペプチドを回収すること：
を含む、方法。
【請求項３９】
ポリペプチドが培養培地の中に分泌される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
細胞がPichia細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチドが宿主細胞の細胞質の中に発現される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ポリペプチドのプロテアーゼドメインを含むポリペプチドを製造する方法であって、
請求項３６に記載の細胞をそれによりコード化されたポリペプチドが細胞により発現される条件下で培養すること；および
発現されたポリペプチドを回収すること：
を含む、方法。
【請求項４３】
アンチセンス核酸分子であって、
請求項１に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に相補的である少なくとも１４個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含むか；または
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に相補的である少なくとも１６個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含むか：または
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に相補的である少なくとも３０個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含み、そこではアンチセンス分子は配列番号１８のヌクレオチド１１６２〜１２６２を含む、
アンチセンス核酸分子。
【請求項４４】
請求項４３に記載のアンチセンス分子であって、
配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列の相補体であるヌクレオチドの連続的配列を含む、アンチセンス分子。
【請求項４５】
二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)分子であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９をコード化するヌクレオチドの配列から少なくとも約２１個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含む、二重鎖ＲＮＡ分子。
【請求項４６】
抗体がポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であってよい、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドのプロテアーゼドメイン、またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体の単鎖型および／もしくは２本鎖型に特異的に結合する抗体。
【請求項４７】
ポリペプチドの酵素的活性を阻害する、請求項４６に記載の抗体。
【請求項４８】
抗体がポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であってよくそしてそれがポリペプチドの酵素的活性を阻害する、請求項３に記載のポリペプチドのプロテアーゼドメイン、またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体の単鎖型および／もしくは２本鎖型に特異的に結合する抗体。
【請求項４９】
抗体がポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であってよくそしてそれがポリペプチドの酵素的活性を阻害する、請求項６に記載のポリペプチドのプロテアーゼドメインの単鎖型および／もしくは２本鎖型、またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントまたは誘導体に特異的に結合する抗体。
【請求項５０】
結合体であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチド、および
ポリペプチドに直接的にもしくはリンカーを介して結合したターゲティング剤：
を含む、結合体。
【請求項５１】
請求項５０に記載の結合体であって、
ターゲティング剤が、
結合体の親和性単離および精製；
結合体の表面への付着；
結合体の検出；もしくは
選択された組織もしくは細胞への目標を定めた送達、
を許容する、結合体。
【請求項５２】
結合体であって、
請求項３に記載のポリペプチド、および
ポリペプチドに直接的にもしくはリンカーを介して結合したターゲティング剤：
を含む、結合体。
【請求項５３】
請求項５２に記載の結合体であって、
ターゲティング剤が、
結合体の親和性単離および精製；
結合体の表面への付着；
結合体の検出；もしくは
選択された組織もしくは細胞へターゲティングされた送達、
を可能とする、結合体。
【請求項５４】
結合体であって、
請求項６に記載のポリペプチド、および
ポリペプチドに直接的にもしくはリンカーを介して結合したターゲティング剤：
を含む、結合体。
【請求項５５】
請求項５４に記載の結合体であって、
ターゲティング剤が、
結合体の親和性単離および精製；
結合体の表面への付着；
結合体の検出；もしくは
選択された組織もしくは細胞へターゲティングされた送達、
を可能とする、結合体。
【請求項５６】
組合せであって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの触媒活性を阻害する剤もしくは処置；および
抗腫瘍性のもしくは抗血管新生性の処置または剤から選択されるさらに別な処置または剤：
を含む、組合せ。
【請求項５７】
請求項５６に記載の組合せであって、
阻害剤および抗腫瘍性のおよび／もしくは抗血管新生性の剤が単一の医薬組成物中に処方されるか、もしくはそれぞれが別々の医薬組成物に処方される、組合せ。
【請求項５８】
請求項５６に記載の組合せであって、
阻害剤が抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)から選択される、組合せ。
【請求項５９】
固体支持体であってそれに直接的にもしくはリンカーを介してのどちらかで結合した請求項１〜２０のいずれか１項に記載の二つもしくはそれ以上のポリペプチドを含む、固体支持体。
【請求項６０】
ポリペプチドがアレイを含む、請求項５９に記載の支持体。
【請求項６１】
ポリペプチドが複数の異なるプロテアーゼドメインを含む、請求項５９に記載の支持体。
【請求項６２】
オリゴヌクレオチドが少なくとも１６個のヌクレオチドを含有する、請求項２１に記載の二つもしくはそれ以上の核酸分子またはそれに直接的にもしくはリンカーを介してのどちらかで結合したそのオリゴヌクレオチド部分を含む、固体支持体。
【請求項６３】
核酸分子がアレイを含む、請求項６２に記載の支持体。
【請求項６４】
核酸分子が異なるプロテアーゼドメインをコード化する複数の分子含む、請求項６２に記載の支持体。
【請求項６５】
ポリペプチドのプロテアーゼ活性を調整する化合物を同定する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドをポリペプチドによりタンパク質分解的に切断される基質と接触させること、および、同時に、前にもしくは後でのどちらかで、一つの試験化合物またはその複数を添加すること；
試験化合物の存在下で切断された基質の量を測定すること；ならびに
対照に比較して切断された基質の量を変化させる化合物を選択すること：
を含み、それによりポリペプチドの活性を調整する化合物を同定する、
方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法あって、
試験化合物がポリペプチドの活性を調整するところの小分子、ペプチド、ペプチドミメティック、天然産物、抗体もしくはそれらのフラグメントである、方法。
【請求項６７】
複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
請求項６５に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、１５もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；および
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列
である：
ヌクレオチドの配列からなる群から選択されるヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項６９】
請求項６５に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９として示されるヌクレオチドの配列によりコード化されるアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
配列番号１７で示されるヌクレオチドの配列によりコード化されるアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列に高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズするところのヌクレオチドの配列によりコード化されるアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
配列番号６のアミノ酸１１〜２４２として示されるアミノ酸の配列を含む、ポリペプチド；
配列番号１６のアミノ酸１１〜２４２として示されるアミノ酸の配列もしくは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
配列番号１８に示される配列のスプライス変異体であるヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチド：
からなる群から選択されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項７０】
請求項６５に記載の方法あって、
切断された基質の量の変化が試験化合物の存在下で切断された基質の量を試験化合物の不在下で切断された基質の量と比較することにより評価される、方法。
【請求項７１】
複数のポリペプチドが直接的にもしくはリンカーを介してのどちらかで固体支持体に結合する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
ポリペプチドがアレイを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドの単鎖および／もしくは２本鎖のプロテアーゼドメインにならびに／または単鎖および／もしくは２本鎖のポリペプチドにならびに／またはその単鎖および／もしくは２本鎖型のタンパク質分解的に活性な部分に特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのタンパク質分解的に活性な部分を一つの試験化合物またはその複数とその結合に伝導性(conductive)の条件下で接触させること；および
ａ)単鎖および／もしくは２本鎖型のポリペプチドにまたはその単鎖および／もしくは２本鎖型のタンパク質分解的に活性な部分に特異的に結合する試験化合物を同定することか、または
ｂ)単鎖および／もしくは２本鎖型のポリペプチドにまたはその単鎖および／もしくは２本鎖型のタンパク質分解的に活性な部分に結合すると知られている化合物の結合を阻害するところの試験化合物を同定することか：
のどちらか：
を含み、そこでは既知の化合物をポリペプチドと試験化合物の以前に、と共に同時にまたは後に接触させる、方法。
【請求項７４】
ポリペプチドが直接的にもしくはリンカーを介して間接的にのどちらかで固体支持体に結合する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
請求項７３に記載の方法あって、
試験化合物がその小分子、ペプチド、ペプチドミメティック、天然産物、抗体もしくはそのフラグメントである、方法。
【請求項７６】
複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
複数のポリペプチドが固体支持体に結合する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
請求項７３に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、１５もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；および
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列：
によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項７９】
チモーゲン型のＭＴＳＰ９のアクチベーターを同定する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のチモーゲン型のＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはその潜在的にタンパク質分解的に活性な部分をポリペプチドの活性化型の基質と接触させること；
試験化合物が基質の添加の前に、後でもしくは同時に、添加されるところで、試験化合物を添加すること；および
基質の切断を検出すること：
を含み、それによりチモーゲンを活性化する化合物を同定する、方法。
【請求項８０】
基質が色素産生性の基質である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
基質がＬ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン塩酸塩である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
試験化合物が少分子、核酸もしくはポリペプチドである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
哺乳動物において、新生物形成性疾患を処置するか予防する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項８４】
請求項８３に記載の方法あって、
阻害剤がポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントもしくは誘導体であり、そこでは抗体がポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体である、方法。
【請求項８５】
請求項８３に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、１５もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；および
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列
である：
ヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項８６】
請求項８３に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；および
(ｅ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)もしくは(ｄ)の縮重コドン：
によりコード化されるポリペプチドを含む、方法。
【請求項８７】
腫瘍発生、成長もしくは進行を阻害するかまたは悪性腫瘍もしくは前がん性異常を処置する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のチモーゲン型のＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはその潜在的にタンパク質分解的に活性部分の活性化切断を阻害するかまたは活性化型のＭＴＳＰ９もしくはそのタンパク質分解的に活性な部分の活性を阻害するところの剤を投与することを含む、方法。
【請求項８８】
異常が乳房、子宮頚、前立腺、肺、卵巣もしくは結腸の異常である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
剤がアンチセンスオリゴヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)もしくは抗体である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
、抗腫瘍性および抗血管新生性の処置または剤から選択されるもう一つの処置または剤を投与することをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
請求項８７に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、１５もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；および
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列：
によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項９２】
請求項８７に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；および
(ｅ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)もしくは(ｄ)の縮重コドンである：
ヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドを含む、方法。
【請求項９３】
請求項に記載のＭＴＳＰ９ポリペプチドの単鎖および／もしくは２本鎖型にならびに／または請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９ポリペプチドの単鎖および／もしくは２本鎖型のタンパク質分解的に活性な部分に結合する化合物を同定する方法であって、
試験化合物を両方の型に接触させること；
化合物がどちらの型に結合するかを決定すること；ならびに
もしそれがポリペプチドの一つの型に結合するならば、化合物が以下の性質の少なくとも一つを有しているか否かをさらに決定すること：
(i)単鎖チモーゲン型のポリペプチドの活性化切断を阻害する；
(ii)二本鎖もしくは単鎖の型の活性を阻害する；および
(iii)タンパク質の二量体化を阻害する：
を含む、方法。
【請求項９４】
新生物形成性疾患を検出する方法であって、
生物学的試料の中で請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むポリペプチドを検出すること：を含み、そこでは検出される量、型および／もしくは活性が新生物形成性疾患を有しない対象から検出されるポリペプチドの量、型および／もしくは活性とは異なる、方法。
【請求項９５】
請求項９４に記載の方法あって、
生物学的試料が血液、尿、唾液、涙、滑液、汗、間質液、精液、脳脊髄液、腹水、腫瘍細胞生検材料、および循環腫瘍細胞からなる群から選択される、方法。
【請求項９６】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドの単鎖および／もしくは２本鎖型に結合する化合物を同定する方法であって、
試験化合物を両方の型に接触させること；
化合物がどちらの型に結合するかを決定すること；ならびに
もしそれがポリペプチドの一つの型に結合するならば、化合物が以下の性質の少なくとも一つを有しているか否かをさらに決定すること：
(i)単鎖チモーゲン型のポリペプチドの活性化切断を阻害する；
(ii)二本鎖もしくは単鎖の型の活性を阻害する；および
(iii)タンパク質の二量体化を阻害する：
を含む、方法。
【請求項９７】
請求項９６に記載の方法あって、
生物学的試料が血液、尿、唾液、涙、滑液、汗、間質液、精液、脳脊髄液、腹水、腫瘍細胞生検材料、および循環腫瘍細胞からなる群から選択される、方法。
【請求項９８】
両方の型がプロテアーゼドメインから本質的に成る、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
対象における前がん病変、悪性病変、もしくは他の病態の存在を診断する方法であって、
対象から生物学的試料を採取すること；および
それを２本鎖および／もしくは単鎖型のＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合する検出可能な剤に曝露させること：
を含み、そこでは病態は２本鎖および／もしくは単鎖型の存在もしくは不在を特徴とする、方法。
【請求項１００】
腫瘍進行および／もしくは治療的有効性をモニターする方法であって、
身体の組織または液体試料中のＭＴＳＰ９ポリペプチドのレベル、型および／もしくは活性を検出することならびに／または定量化することを含む、方法。
【請求項１０１】
腫瘍が乳房、子宮頚、前立腺、肺、卵巣もしくは結腸の腫瘍である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
体液が血液、尿、汗、唾液、脳脊髄液および滑液である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドが配列番号１８の少なくともアミノ酸８５〜８７および／もしくは１６０〜１６５を含む、ポリペプチド。
【請求項１０４】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼ活性を調整する化合物を同定する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドもしくはそのタンパク質分解的に活性な部分をポリペプチドによりタンパク質分解的に切断された基質と接触させることおよび、一つの試験化合物もしくはその複数を添加すると同時に、前にまたは後でのどちらかで；
試験化合物の存在下に切断された基質の量を測定すること；および
対照と比較して切断された基質の量を変化させる化合物を選択すること：
を含み、それによりポリペプチドの活性を調整する化合物が同定される、方法。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、１５もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；および
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドの配列である：
ヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドを含む、方法。
【請求項１０６】
請求項１０４に記載の方法あって、
ポリペプチドが、
(ａ)配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列；
(ｂ)ヌクレオチド配列であって配列番号５でヌクレオチド３１〜７２９としてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチドの配列にその全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％に沿って高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、ヌクレオチドの配列；
(ｃ)配列番号１６のポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列；
(ｄ)(ａ)、(ｂ)もしくは(ｃ)のスプライス変異体である、ヌクレオチドの配列；
(ｅ)配列番号５、１５もしくは１７に示される配列と少なくとも約８０％または８５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をコード化する、ヌクレオチドの配列；および
(ｆ)(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)もしくは(ｅ)の縮重コドンを含む、ヌクレオチドである：
ヌクレオチドの配列によりコード化されるポリペプチドから本質的に成る、方法。
【請求項１０７】
プロテアーゼドメインが配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１０８】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコード化する異種の核酸を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０９】
プローブもしくはプライマーであって、
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に同一である少なくとも１４個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含むか：または
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に同一である少なくとも１６個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含むか：または
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するヌクレオチドの連続的配列に同一である少なくとも３０個の連続的ヌクレオチドもしくは修飾したヌクレオチドを含み、そこではアンチセンス分子は配列番号１８のヌクレオチド１１６２〜１２６２を含む、プローブもしくはプライマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(関連出願)
２００１年３月２７日に出願された、米国仮出願一連番号第６０／２７９,２２８号、Edwin L. Madison and Edgar O. Ong、題名「膜貫通型セリンプロテアーゼ９をコード化する核酸分子、コード化されたポリペプチドおよびそれらに基づく方法」、ならびに２００１年５月１５日に出願された、米国仮出願一連番号第６０／２９１,５０１号、Edwin L. MadisonおよびEdgar O. Ong、題名「膜貫通型セリンプロテアーゼ９をコード化する核酸分子、コード化されたポリペプチドおよびそれらに基づく方法」、に対して優先権を請求中である。許可された場合には、これらの出願のそれぞれの対象事項は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
技術分野
プロテアーゼおよびその部分、特にプロテアーゼドメインをコード化する核酸分子が提供される。また、プロテアーゼおよびそのドメインならびにコード化する核酸分子を用いる予防の、診断のおよび治療の方法が提供される。
【０００３】
背景技術および発明の目的
米国において主な死因であるがんは、増殖して腫瘍塊を形成する異常な腫瘍性細胞数の増加、これらの新生腫瘍細胞による隣接組織への浸潤、ならびに血液もしくはリンパ系を介して局部のリンパ節および遠隔部に転移する悪性細胞の生成を特徴とする。がんの特質の中には、腫瘍細胞およびそれらの環境との間のコミュニケーションの破綻がある。正常細胞は促進的シグナルの不在下では分裂しないで、阻害的シグナルの存在下では分裂を停止する。増殖促進的および増殖阻害的なシグナルは、組織内の細胞間で日常的に取り交わされている。がん性、もしくは腫瘍性の状態では、細胞はこれらのシグナルを''無視''して正常細胞が成長しない条件下で増殖するする能力を獲得する。
【０００４】
腫瘍細胞を増殖するためには、遺伝的変化を反映する多数の特有の異常な特性を獲得する。特定の良く研究された腫瘍のゲノムは、活性化発がん遺伝子および不活性化腫瘍抑制遺伝子を含む、数個の異なる独立に変化した遺伝子を保有する。これらの遺伝子変化のそれぞれが、或る特性を付与する責任があり、これらが集まって完全な腫瘍性表現型を表していると思われる。
【０００５】
種々の生化学的因子が転移の異なる相に関連づけられてきている。コラーゲン、ラミニンのような糖タンパク質、およびプロテオグリカンに対する細胞表面受容体は、浸潤および転移における重要な段階である、腫瘍細胞の付着を促進する。付着は分解性酵素の放出を誘発し、これらが組織バリアーを超えて腫瘍細胞が侵入するのを促進する。一旦腫瘍細胞が標的組織に入っていると、さらなる増殖には特異的な増殖因子が要求される。腫瘍の浸潤および進行は複雑な一連の事象を伴って、そこにおいて腫瘍細胞は原発腫瘍から離脱し、それを囲んでいる正常組織を破壊し、そして血管もしくはリンパ管に移動して、遠隔部に運ばれる。正常組織のバリアーの破壊は、組織の基底膜および間質成分を作り上げている細胞外マトリックスのタンパク質を分解する、特異的な酵素の作用により達成される。
【０００６】
一つのクラスの細胞外マトリックス分解酵素が腫瘍の浸潤に関与すると考えられている。これらの中にマトリックスメタロプロティナーゼ(ＭＭＰ)がある。例えば、マトリックスメタロプロティナーゼであるストロメライシンの生産は、転移の潜在力を持つ悪性腫瘍に関連している(例えば、McDonnell et al. (1990) Smnrs. in Cancer Biology 1:107-115; McDonnell  et al. (1990) Cancer and Metastasis Reviews 9:309-319、を参照)。
【０００７】
がん細胞が転移して組織に浸潤する能力は、基底膜分解により促進される。ＭＭＰを含むいくつかのプロテイナーゼ酵素は、腫瘍細胞の浸潤プロセスを促進すると報告されている。ＭＭＰは、基底膜の分解を促進し、それによって腫瘍細胞が組織に浸潤するのを許容すると報告されている。例えば、約７０ｋＤａおよび９２ｋＤａの分子量を有する二つのの主要なメタロプロテイナーゼは、腫瘍の転移する活性を促進するようである。
【０００８】
ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ(ＴＴＳＰ)
ＭＭＰに加えて、セリンプロテアーゼが腫瘍疾患の進行に関連があるとされている。分泌性酵素であるかもしくは細胞質の貯蔵小器官中に隔離されているかのどちらかである、殆どのセリンプロテアーゼは、血液凝固、創傷治癒、消化、免疫応答、ならびに腫瘍浸潤および転移に役割を有する。さらに別の細胞外ドメインを持つ膜結合型タンパク質である、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼと呼称される一つのクラスの細胞表面タンパク質が同定されている。細胞表面タンパク質として、これらは、細胞内の情報伝達においておよび細胞表面のタンパク質分解事象の仲介において役割を果たすように位置づけられる。
【０００９】
細胞表面でのタンパク質分解は、種々の細胞機能を仲介する生物学的に活性なタンパク質の生成の機構である。膜関連プロテアーゼとしては、膜型メタロプロティナーゼ(ＭＴ−ＭＭＰ)、ＡＤＡＭ(ディスインテグリン様およびメタロプロテイナーゼドメインを含有するプロテアーゼ)、およびＴＴＳＰが挙げられる。哺乳動物では、ヒトにおける７個を含む、ＴＴＳＰファミリーの少なくとも１７個のメンバーが知られている(Hooper et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:857-860、を参照)。これらとしては：コリン(受け入れ番号ＡＦ１３３８４５およびＡＢ０１３８７４; Yan et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:14926-14938; Tomia et al. (1998) J. Biochem. 124:784-789; Uan et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:8525-8529、を参照)；エンテロペプチダーゼ(エンテロキナーゼとも呼称される; ヒトタンパク質の受け入れ番号Ｕ０９８６０; Kitamoto et al. (1995) Biochem. 27: 4562-4568; Yahagi et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 219:806-812; Kitamoto et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:7588-7592; Matsushima et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:19976-19982、を参照)；ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ(ＨＡＴ; 受入れ番号ＡＢ００２１３４; Yamaoka et al.  J. Biol. Chem. 273:11894-11901、を参照)；ＭＴＳＰ1およびマトリプターゼ(ＴＡＤＧ-１5とも呼称される; 配列番号1および2、を参照;受入れ番号ＡＦ１３３０８６／ＡＦ１１８２２４, ＡＦ０４２８００２２; Takeuchi et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:11054-1161; Lin et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18231-18236; Takeuchi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:26333-26342; and Kim et al. (1999) Immunogenetics 49:420-429)；ヘプシン(受け入れ番号Ｍ１８９３０, ＡＦ０３００６５, Ｘ７０９００; Leytus et al. (1988)  Biochem. 27: 11895-11901; Vu et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:31315-31320; and Farley et al. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1173:350-352; および米国特許第５,９７２,６１６号、を参照)；ＴＭＰＲＳ２(受け入れ番号Ｕ７５３２９およびＡＦ１１３５９６; Paoloni-Giacobino et al. (1997) Genomics 44:309-320; およびJacquinet et al. (2000) FEBS Lett. 468: 93-100、を参照)；ならびにＴＭＰＲＳＳ４(受け入れ番号ＮＭ ０１６４２５; Wallrapp et al. (2000) Cancer 60:2602-2606、を参照)が挙げられる。
【００１０】
膜貫通型セリンプロテアーゼおよび分泌プロテアーゼを含む、セリンプロテアーゼは、腫瘍発生および進行に関わるプロセスに関連するとされている。これらのプロテアーゼが腫瘍成長および進行を促進する詳細なメカニズムは解明されていないが一方、セリンプロテアーゼおよびその阻害剤は、腫瘍進行に関与する、がん細胞浸潤における分解作用、転移による拡散、および腫瘍の血管新生を含む、多くの細胞内および細胞外の生理学的プロセスの制御に関与している。プロテアーゼは、細胞外マトリックス(ＥＣＭ)の分解に関与して、組織の再構築に寄与して、そしてがんの浸潤および転移にとって必要であることが信じられている。或るプロテアーゼの活性および／発現は腫瘍の進行および発達と相関すると示されている。
【００１１】
例えば、上皮がんおよび正常組織に発現している(Takeucuhi et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1105461)、膜型セリンプロテアーゼＭＴＳＰ１(マトリプターゼとも呼称される;米国特許第５,９７２,６１６号からの配列番号１および２; ならびにGenBank受入れ番号第ＡＦ１１８２２４; (1999) J. Biol. Chem. 274:18231-18236; 米国特許第５,７９２,６１６号、を参照; また、Takeuchi (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:11054-1161、を参照)が同定されている。マトリプターゼは、初めヒト乳がんにおいて主要なゼラチナーゼとして同定され(米国特許第５,４８２,８４８号、を参照)、そして当初はマトリックスメタロプロティナーゼ(ＭＭＰ)の一つのタイプと考えられた。これが乳がんの転移において役割を演じていることが提唱されている。マトリプターゼはまた、ヒトの消化管および前立腺において高レベルの活性および／もしくは発現を持って、種々の上皮組織でも発現される。ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４、およびＭＴＳＰ６と呼称されるＭＴＳＰ類は、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０３４７１号に基づく公開国際ＰＣＴ出願第ＷＯ  ０１／５７１９４号に記載されている。
【００１２】
カリクレイン様プロテアーゼである前立腺特異抗原(ＰＳＡ)は、細胞外マトリックスの糖タンパク質であるフィブロネクチンおよびラミニンを分解して、前立腺がん細胞による浸潤を促進すると想定されてきた(Webber et al. (1995) Clin. Cancer Res., 1(10):108994)。ＰＳＡ特異的モノクローナル抗体によるＰＳＡのタンパク質分解活性の阻止は、高レベルのＰＳＡを分泌するヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａＰによる再構成基底膜マトリゲルの浸潤において用量依存性のインビトロにおける減少をもたらす。
【００１３】
肝がん細胞に同定された細胞表面セリンプロテアーゼであるヘプシンは、卵巣がんで過剰発現される(Tanimoto et al. (1997) Cancer Res., 57(14):28847)。ヘプシンの転写物は、がん組織には大量に存在するように見えて、そして、正常な卵巣を含む、正常な成人組織では殆ど全く発現していない。ヘプシンは、卵巣がんでしばしば過剰発現されており、それ故に、卵巣腫瘍細胞の浸潤プロセスおよび成長能力における候補プロテアーゼであり得ることが示唆されている。
【００１４】
正常上皮細胞特異的１(ＮＥＳ１)と呼称される、セリンプロテアーゼ様遺伝子(Liu et al., Cancer Res., 56(14):33719 (1996))が同定されている。ＮＥＳ１  ｍＲＮＡの発現は、全ての正常および不死化非腫瘍性上皮細胞株で観察されるが、ヒト乳がん細胞株の大部分は、その発現の著しい減少もしくは完全な欠失を示す。増殖因子活性を調節することが知られているポリペプチドとＮＥＳ１の構造類似性、およびＮＥＳ１発現の乳がん発生との負の相関は、腫瘍発生の抑制におけるこのプロテアーゼ様遺伝子産物の直接的なもしくは間接的な役割を示唆する。
【００１５】
したがって、膜貫通型セリンプロテアーゼは、腫瘍の病因および病理発生過程に関与していると思われる。これらのプロセスにおけるそれらの役割をさらに解明して、さらに別な膜貫通型プロテアーゼを同定する必要性がある。それ故に、腫瘍発生および／もしくは発がんの調節に関与するかまたはそれらに関係している膜貫通型セリンプロテアーゼ(ＭＴＳＰ)タンパク質ならびにそのようなＭＴＳＰプロテアーゼをコード化する核酸を提供することが、本明細書における目的である。そのようなプロテアーゼおよびそのようなプロテアーゼをコード化する核酸を用いる予後的、診断的ならびに治療的なスクリーニングの方法を提供することはまた、本明細書における目的である。
(発明の概要)
【００１６】
本明細書においては、膜貫通型セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、特にＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ(ＴＴＳＰ)ファミリー(本明細書においてはＭＴＳＰとも呼称する)、ならびにさらに特別にはそれらの機能活性および／もしくは発現が腫瘍細胞において同組織の非腫瘍細胞と異なるＴＴＳＰファミリーメンバーが提供される。本明細書において提供されるＭＴＳＰは、本明細書においてＭＴＳＰ９と呼称されるＭＴＳＰファミリーメンバーである。チモーゲンおよび活性化型を含む、プロテアーゼのドメインならびに完全長タンパク質、ならびにその使用がまた提供される。スプライス変異体によりコード化されるタンパク質がまた提供される。
【００１７】
低分子を含む化合物のような、エフェクターの同定用のアッセイ、ならびにＭＴＳＰ９の活性化、発現もしくは活性を調整するところのｐＨ、温度およびイオン強度のような条件が、本明細書において提供される。例示的アッセイにおいて、ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインが既知の基質を、典型的には蛍光的に、色素産生的にもしくはさもなければ検出可能なように標識された基質を、タンパク質分解的に切断する能力に及ぼす試験化合物の作用が、評価される。プロテアーゼドメインの活性を調整する剤、一般的に化合物、特に低分子、はＭＴＳＰ９の活性を調整する候補化合物である。プロテアーゼドメインをまた使用して、プロテアーゼ特異的抗体を生産することができる。本明細書に提供されるプロテアーゼのドメインとしては、例えば、腫瘍細胞において非腫瘍細胞とは異なるレベルで発現されるところのヒトを含む、哺乳動物に一般的に由来するＭＴＳＰ９を含む、任意のＭＴＳＰファミリーメンバーの、タンパク質分解活性を単鎖ポリペプチドとしてインビトロタンパク質分解アッセイで発揮する、チモーゲン活性化のための切断部位にあるＮ末端からＣ末端までを有する単鎖領域、もしくはそのＣ末端が切断された部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
タンパク質およびプロテアーゼドメインをコード化する核酸分子がまた、提供される。単鎖プロテアーゼドメインもしくはその触媒活性部分をコード化する核酸分子、およびまた完全長ＭＴＳＰ９をコード化するものが提供される。プロテアーゼドメインをコード化する核酸(ヌクレオチド３１〜７２９)および配列番号５で上流の核酸；ならびにＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインは、配列番号６(アミノ酸１１〜２３２)および配列番号１６に示される。完全長ＭＴＳＰ９のタンパク質配列およびコード化する核酸配列は、配列番号１８および１７に示される。
【００１９】
また、そのようなＭＴＳＰ９をコード化する核酸に、その完全長に沿って、もしくは完全長の少なくとも７０％、８０％もしくは９０％に沿ってハイブリダイズして、プロテアーゼドメインもしくはその一部をコード化する核酸分子が提供される。ハイブリダイゼーションは、少なくとも低度の、一般的には少なくとも中度の、およびしばしば高度のストリンジェンシーの条件下で、一般的に達成される。
【００２０】
単離核酸フラグメントは、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含む、ＤＮＡであるか、またはＲＮＡであるか、またはタンパク質核酸もしくは他のヌクレオチド類似体のような他の成分を含むことができる。単離核酸は、異種のもしくは天然のプロモーター、ならびに他の転写および翻訳調節配列のような、さらに別の成分を含有し得て、これらの遺伝子は、レポーター遺伝子もしくは他のインディケーター遺伝子またはインディケーターをコード化する遺伝子のような、他の遺伝子に連結され得る。
また、ＭＴＳＰ９をコード化するヌクレオチド配列もしくはその一部に相補的であるところの分子の配列を含有する、単離核酸分子が提供される。
【００２１】
また、プローブもしくはプライマーとして使用できて、配列番号５または１７(もしくはその相補体)に示される少なくとも約１０、１４、１６個のヌクレオチド、一般的には１０００未満または１００以下もしくは同一を含有するところの；または少なくとも約３０個のヌクレオチド(もしくはその相補体)を含有するかまたはその完全長(またはその少なくとも約７０、８０もしくは９０％)に沿ってそのようなフラグメントもしくはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するところのそのフラグメントもしくはオリゴヌクレオチドが、提供される。フラグメントの長さはそれが使用される目的および／もしくは興味のあるゲノムの複雑さの関数である。一般的にプローブおよびプライマーは、約５０、１５０もしくは５００個のヌクレオチド未満を含有する。
また、本明細書に提供される任意の核酸分子を含有するプラスミドが提供される。プラスミドを含有する細胞がまた、提供される。そのような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
また、それによりＭＴＳＰ９が細胞により発現され、発現したＭＴＳＰ９ポリペプチドを回収する、条件下で上記の細胞を増殖させることによりＭＴＳＰ９を生産する方法が、提供される。他のＭＴＳＰ９をコード化する核酸を単離する方法がまた、提供される。
【００２３】
また、ＭＴＳＰ９が細胞表面に発現される、細胞、一般的には哺乳動物細胞および酵母細胞のような、真核細胞が提供される。そのような細胞を剤スクリーニングアッセイに使用して、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を調整する化合物を同定する。インビトロ結合アッセイを含む、これらのアッセイ、およびＭＴＳＰ９による増殖因子前駆体の活性化を介するような、直接的にもしくは間接的に情報伝達を介するところの転写に基づくアッセイが評価される。
【００２４】
また、そのような核酸分子によりコード化されるペプチドが提供される。それらのポリペプチドの中には、ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインまたは特異性および／もしくはプロテアーゼ活性が実質的に不変なままであるアミノ酸の変化を持つポリペプチドが、含まれる。特に、セリンプロテアーゼの触媒ドメインを含有し、そして加えて他のドメインを含有し得るところの実質的に精製された哺乳動物のＭＴＳＰ９ポリペプチドが提供される。ＭＴＳＰ９は、ホモダイマーを形成することができて、そしてまた膜結合タンパク質のような、何らかの他のタンパク質とヘテロダイマーを形成することができる。また、ＭＴＳＰ９に少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する、アミノ酸配列を含有する実質的に精製されたタンパク質が、提供されて、そこではパーセント同一性は、標準的アルゴリズムおよびパーセンテージ同一性を最大にするギャップペナルティーを用いて決定される。他の哺乳動物のＭＴＳＰ９ポリペプチドが意図されるが、ヒトＭＴＳＰ９ポリペプチドが例示される。ＭＴＳＰ９のスプライス変異体、特にタンパク質分解的に活性なプロテアーゼドメインを持つもの、が本明細書において意図される。
【００２５】
他の実施態様では、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分を含有するが、配列番号１８に示すアミノ酸の完全な配列を含有しないところの実質的に精製されたポリペプチドが、提供される。これらの中には、配列番号１６または１８に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含むポリペプチドがある。
【００２６】
特定の実施態様では、ＭＴＳＰ９と呼称されるＭＴＳＰをコード化する核酸が提供される。特に、核酸は、配列番号５に示される、特に配列番号５のもしくは配列番号１７のヌクレオチド３１〜７２９として示される、ヌクレオチド配列、または触媒的に活性なポリペプチドをコード化するその一部分を含む。
また、配列番号５もしくは１７またはその縮重体に少なくとも低度のストリンジェンシー、一般的には中度のストリンジェンシー、さらに典型的には高度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする核酸が、提供される。
【００２７】
一つの実施態様では、単離核酸フラグメントは、高度のストリンジェンシー下で配列番号５もしくは１７に示すヌクレオチド配列(またはその縮重体)にハイブリダイズし、一つの実施態様では、配列番号５および７に示すヌクレオチド配列を含有する。完全長ＭＴＳＰ９は配列番号１８に示されて、配列番号１７もしくはその縮重体によりコード化される。
【００２８】
また、ＭＴＳＰ９の単鎖プロテアーゼドメインの突然変異タンパク質、特にプロテアーゼドメイン中のフリーな(即ち、プロテアーゼドメイン中の他のＣｙｓ残基のいずれともジスルフィド結合を形成しない)Ｃｙｓ残基がさらに別のアミノ酸置換基、典型的に、必ずしもそうでなくてもよいが、保存的アミノ酸置換基もしくは活性を消失させない置換基で置換された突然変異タンパク質、および糖鎖形成部位が除去された突然変異タンパク質が、提供される。
【００２９】
したがって、Ｃｙｓ残基の一つもしくはそれ以上、特に活性化された二つのの形では対をなしているがプロテアーゼドメイン単独では対をなしていない残基(即ち、プロテアーゼドメイン中の２６番目の部位のＣｙｓ残基(配列番号５、６および１６を参照))が任意のアミノ酸、特に、必ずしもそうでなくてもよいが、Ｓｅｒのような保存的アミノ酸残基により置換されるところの突然変異タンパク質が意図される。ＭＴＳＰ９の突然変異タンパク質、特に、単鎖プロテアーゼドメイン中の不対ＣｙｓのようなＣｙｓ残基が活性を消失しないさらに別のアミノ酸で置換されているものが、提供される。触媒活性が保持されている他の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換を有する突然変異タンパク質がまた、意図される(例示的なアミノ酸置換については、例えば、表１を参照)。
【００３０】
そのスプライス変異体を含むが、それらに限定されない、ＭＴＳＰ９ポリペプチド、ならびにＭＴＳＰ、ならびにそれらのドメイン、誘導体およびその類似体をコード化する核酸が、本明細書において提供される。ＭＴＳＰ９のチモーゲン型の活性化により生成するものに機能的に等価なＮ末端を有する、単鎖プロテアーゼドメインがまた、提供される。ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインに対する切断部位は、アミノ酸Ｒ１８６およびアミノ酸Ｉ１８７の間(Ｒ（下矢）ＩＡＳＧ)にある。Ｎ１５３およびＮ３０３において二つのの潜在的糖鎖形成部位が存在する。Ｃｙｓ残基Ｃ１７５〜Ｃ２９２の間でジスルフィド結合が形成して、プロテアーゼドメインをもう一つのドメインと結合しているので、切断により得られるポリペプチドは二本鎖の分子となる。以下のような潜在的ジスルフィド結合がある：Ｃ２１２〜Ｃ２２８、Ｃ３３７〜Ｃ３５３、およびＣ３５４〜Ｃ３９３。したがって、Ｃ２９２は、二本鎖分子としても提供され得る、プロテアーゼドメインの単鎖ドメイン中のフリーなＣｙｓである。しかしながら、単鎖および二本鎖型はタンパク質分解的に活性であることが本明細書において示される。
【００３１】
したがって、ＭＴＳＰ９と呼称される膜貫通型セリンプロテアーゼ(ＭＴＳＰ)タンパク質のファミリーおよびその機能ドメイン、特にそのプロテアーゼ(もしくは触媒)ドメイン、突然変異タンパク質ならびにそれらの他の誘導体および類似体が、本明細書において提供される。また、ＭＴＳＰ９をコード化する核酸が、本明細書において提供される。
【００３２】
ＭＴＳＰは、それらが、腫瘍細胞中では正常細胞とは異なるレベルで発現されおよび／もしくは活性化され、または腫瘍細胞中ではその基質もしくは補因子の変化によるような、正常細胞とは異なる機能活性を有するらしいので、興味が持たれる。ＭＴＳＰ９は、それが腫瘍細胞で発現されもしくは活性であるので、興味が持たれる。したがって、本明細書において提供されるＭＴＳＰ９は、特定の腫瘍の診断マーカーとして役に立つことができる。
【００３３】
本明細書において興味の持たれるのは、肺、前立腺、結腸および乳房のがんのような特定の腫瘍もしくはがん細胞において発現または活性化される、ＭＴＳＰ９である。特に、ＭＴＳＰ９が、例えば、肺がん、白血病および子宮頚がんを含む、種々の腫瘍細胞でならびに特定の正常細胞および組織で発現されるおよび／もしくは活性化されていることが本明細書において示される(例えば、組織特異的発現プロフイールについての実施例、を参照)。ＭＴＳＰ９はまた、乳がん、前立腺がんおよび結腸がんのマーカーであり得る。対象中の細胞上もしくは近傍または体液中におけるＭＴＳＰ９の発現および／または活性化は、乳房の、前立腺の、肺の、結腸のならびに他のがんのマーカーとなり得る。
【００３４】
特定の実施態様では、ＭＴＳＰ９ポリペプチドは、腫瘍を有しない対象の体液中のレベルとは異なるレベルで体液中に検出可能である。他の実施態様では、ポリペプチドは腫瘍中に存在し；そしてポリペプチドの基質もしくは補因子は、同じタイプの組織において非腫瘍細胞におけるその発現レベルとは異なるレベルで発現される。他の実施態様では、腫瘍細胞中におけるＭＴＳＰ９ポリペプチドの発現および／もしくは活性のレベルは、非腫瘍細胞におけるその発現および／もしくは活性のレベルとは異なる。他の実施態様では、ＭＴＳＰ９は腫瘍中に存在し；そしてＭＴＳＰ９の基質もしくは補因子は、同じタイプの組織中において非腫瘍におけるその発現レベルとは異なるレベルで発現される。
【００３５】
また、ＭＴＳＰ９の活性を調整する化合物をスクリーニングする方法が提供される。化合物は、それらをＭＴＳＰ９もしくはそのプロテアーゼドメインおよびＭＴＳＰ９の基質と接触させることにより同定される。化合物の不在下と比較しての化合物の存在下で切断された基質の量の変化は、化合物がＭＴＳＰ９の活性を調整することを示す。そのような化合物は、さらなる分析のために、または阻害剤もしくはアゴニストのように、ＭＴＳＰ９活性を調整するのに使用するために、選択される。化合物はまた、基質をＭＴＳＰ９もしくはその細胞外ドメインまたはタンパク質分解的に活性なその部分を発現する、細胞と接触させることによって、同定されることができる。
【００３６】
また、ＭＴＳＰ９の活性を調整する方法、およびＭＴＳＰ９の活性を阻害し、拮抗し、作動し、さもなければ変化することを含む調節を行うところの化合物のスクリーニングが、本明細書において提供される。特に興味が持たれるのは、タンパク質のタンパク質分解活性(触媒的)部分を含む、ＭＴＳＰ９の細胞外ドメインである。
【００３７】
コード化する核酸を含有する細胞、組合せ、ＭＴＳＰ９ポリペプチド、そのドメイン、もしくはキットおよび製造品目がまた、本明細書において提供される。コード化されたＭＴＳＰ９ポリペプチドおよびその一部を細胞を用いて発現させる方法、および細胞表面にＭＴＳＰ９を発現する細胞が、また提供される。そのような細胞は、候補治療用化合物を同定する方法に使用される。
【００３８】
単鎖および二本鎖形のＭＴＳＰ９に特異的に結合する抗体、抗体を含有する細胞、組合せ、キットおよび製造品目が、加えて提供される。ＭＴＳＰ９、特に単鎖プロテアーゼドメイン、二本鎖型のプロテアーゼドメイン、チモーゲン、および活性化型のＭＴＳＰ９およびそれらの他のフラグメントに特異的に結合する抗体が、また提供される。生物活性、特にプロテアーゼ活性を阻害する、中和抗体がまた提供される。
【００３９】
ＭＴＳＰ９およびＭＴＳＰ９をコード化する核酸を用いる予後的、診断的、治療的スクリーニング方法が、本明細書においてさらに提供される。特に、予後的、診断的、および治療的スクリーニング方法は、肺がん、結腸がん、および卵巣がんのような腫瘍もしくはがんを予防し、処置するために、または、それらを予防しもしくは処置するのに有用な剤を見出すために、使用される。
また、ＭＴＳＰ９活性のモジュレーター、特に本明細書に提供されるスクリーニング方法により得られるモジュレーターが、本明細書に提供される。そのようなモジュレーターは、がん性異常および他の腫瘍性異常の処置に使用を有することができる。
【００４０】
対象中に異常なレベルのＭＴＳＰ９を検出することを特徴とする、疾患もしくは障害を診断する方法が、提供される。方法は、ＭＴＳＰ９のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質もしくは機能活性のレベルを測定することにより実施されることができる。疾患もしくは障害を有しない類似のサンプル(もしくは他の適当な対照)に見出されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質もしくは機能活性のレベルと比べて、ＭＴＳＰのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質もしくは機能活性のレベルの増加または減少は、対象もしくは相対的な任意の他の適当な対照における疾患もしくは障害の存在を示す。
【００４１】
また、単鎖および／もしくは二本鎖型のＭＴＳＰ９に結合する化合物を、試験化合物を両者の型と接触させること；化合物が結合する型を決定すること；および；もしそれがＭＴＳＰ９の一つの型に結合するならば、化合物が以下の性質の少なくとも一つを有しているか否かをさらに決定すること、により同定する方法が、提供される：
(i)単鎖チモーゲン型のＭＴＳＰ９の活性化を阻害する；
(ii)二本鎖もしくは単鎖の型の活性を阻害する；および
(iii)タンパク質の二量体化を阻害する。
型は完全長、または活性化切断部位(アミノ酸Ｒ１８５およびＩ１８６の間)での切断から；またはプロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分の発現から生じるプロテアーゼドメインを含むが、それに限定されない、切断型であり得る。
【００４２】
薬学的に許容される担体もしくは賦形剤中で、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインおよび／もしくは完全長または他のドメインを含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。
また、ＭＴＳＰ９ポリペプチドおよび単鎖型もしくは活性型にあるＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインを含有する、製造品目が、提供される。品目はａ)包装材；ｂ)ポリペプチド(もしくはコード化する核酸)、特にその単鎖プロテアーゼドメイン；およびｃ)ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性のモジュレーターを同定するためのアッセイに使用される品目がそこにおいて提供されることを示すたラベルを含有する。
【００４３】
ａ)ＭＴＳＰ９または単鎖もしくは二本鎖型のプロテアーゼドメイン；およびｂ)ＭＴＳＰに直接にもしくはリンカーを介して結合したターゲティング剤を含有する結合体が本明細書において提供されるが、そこではその剤は、i）結合体の親和性単離および精製；ii)結合体の表面への付着；iii)結合体の検出；またはIV)選択された組織もしくは細胞への目標を定めた送達、を容易にする。結合体は、それに結合された複数の剤を含有することができる。結合体は、化学的な結合体であり得て；そしてそれは融合タンパク質であり得る。ターゲティング剤は、タンパク質もしくはペプチドフラグメントであり得る。タンパク質またはペプチドフラグメントは、タンパク質結合配列、核酸結合配列、脂質結合配列、多糖類結合配列、もしくは金属結合配列を含み得る。
【００４４】
組合せが本明細書において提供される。組合せは、ａ)ＭＴＰＳＰ９の活性の阻害剤；およびｂ)抗がん処置剤もしくは剤を含み得る。ＭＴＳＰ９阻害剤および抗がん剤は単一の医薬組成物中に処方され得るか、もしくはそれぞれが別々の医薬組成物に処方される。ＭＴＳＰ９阻害剤は、プロテアーゼドメインに特異的に結合する抗体のようなＭＴＳＰに対して作成された抗体またはそのフラグメントもしくは結合部分、ＭＴＳＰ９生産の阻害剤、またはＭＴＳＰ９膜局在の阻害剤、もしくはＭＴＳＰ９活性化の阻害剤であり得る。他のＭＴＳＰ９阻害剤としては、アンチセンス核酸もしくはＭＴＳＰ９、特にプロテアーゼドメインをコード化するＲＮＡｉのような、二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)；異種の配列がコード化されたＭＴＳＰ９もしくはそれをコード化する遺伝子の生物活性を不活化するように異種の配列がその中に挿入された、異種の配列を持つＭＴＳＰ９をコード化する遺伝子の少なくとも一部をコード化する核酸、が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＭＴＳＰ９をコード化する遺伝子の一部が異種の配列に隣接して、ＭＴＳＰ９をコード化するゲノム遺伝子との相同組換えを促進することができる。
【００４５】
また、ＭＴＳＰ９の阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することにより哺乳動物中の腫瘍もしくはがんを処置もしくは予防する方法が、提供されて、これにより腫瘍またはがんが処置されるかもしくは予防される。処置もしくは予防のために使用されるＭＴＳＰ９阻害剤は、薬学的に許容される担体もしくは添加剤と共に投与される。処置される哺乳動物はヒトであり得る。これに加えて、処置もしくは予防の方法は、ＭＴＳＰ９阻害剤の投与と同時に、引き続いて、もしくは以前に抗がん処置剤もしくは抗がん剤を投与することを含む。
【００４６】
また、ＭＴＳＰをコード化する不活化遺伝子を保有しそして非天然のプロモーターの下でＭＴＳＰ９をコード化する遺伝子を保有する非ヒトトランスジェニック動物が提供される。そのような動物は、腫瘍の開始、成長および／もしくは進行モデルの動物モデルとして有用である。天然、非天然プロモーターの制御下で、またはプラスミドもしくは人工染色体のような外来性要素上で、異種の核酸ＭＴＳＰ９を含有する非ヒトトランスジェニック動物が、本明細書においてこれに加えて提供される。特に、非ヒト遺伝子組換え動物が本明細書において提供されるが、そこではＭＴＳＰ９の遺伝子は、遺伝子の天然のプロモーターではないか、もしくは非ヒト動物の遺伝子の天然のプロモーターではないプロモーターの制御下にあり、またはそこではＭＴＳＰ９をコード化する核酸は、非ヒト動物と異種であって、プロモーターは、天然もしくは非天然プロモーターであるか、またはＭＴＳＰ９は、プラスミドもしくは人工染色体のような、染色体外の要素上にある。遺伝子組換えおよびトランスジェニック動物を、相同組換えおよび異種組換え方法により生産することができる。
【００４７】
遺伝子治療の方法が提供される。そのような方法は、不活化型のＭＴＳＰ９をインビトロもしくはインビボで投与することにより、またはＭＴＳＰをコード化する核酸分子を投与することにより成し遂げられる。
また、腫瘍細胞、特にその機能活性が非腫瘍細胞におけるより腫瘍細胞においてより大きいものの中に発現されるかもしくは活性のあるＭＴＳＰ９により活性化される、プロドラッグを投与することによる腫瘍の処置方法が、提供される。プロドラッグが投与されると、投与に際して、細胞上に発現された活性なＭＴＳＰ９が、プロドラッグを切断して、活性な薬物を腫瘍細胞の近傍に放出する。活性な抗がん薬が腫瘍の近傍に蓄積する。ＭＴＳＰ９が、腫瘍細胞において他の細胞と比較してより大量に、高レベルにもしくは優勢に発現されるかまたは活性である場合に、これは特に有用である。
【００４８】
また、対象から生物学的試料を採取し；それを二本鎖および／もしくは単鎖の型のＭＴＳＰ９に結合する検出可能な剤に曝露させることにより、対象における前がん病変、悪性病変、もしくは他の病態の存在を診断する方法が、提供されるが、そこでは病態は二本鎖および／もしくは単鎖の型の存在または不在を特徴とする。
【００４９】
チモーゲン型のＭＴＳＰの活性化、もしくは活性型の活性を阻害する、剤を投与することにより腫瘍の浸潤もしくは転移を阻止するか、または悪性もしくは前がん性の異常を処置する方法が提供される。異常としては、乳房の、子宮頚の、前立腺の、肺の、卵巣のもしくは結腸の腫瘍のような異常が挙げられるが、これらに限定されない。
発明の詳細な説明
【００５０】
Ａ．定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により共通に理解されているのと同じ意味を有している。本明細書の全ての開示に亘って参照されている全ての特許、特許出願、公開出願および公表文献、Genbank配列、ウエブサイトおよび他の公表された資料は、別に記載のない限り、全体的な出典明示により本明細書の一部とする。本明細書の用語に複数の定義がある場合には、本項のものが優先する。ＵＲＬもしくは他のそのような識別子またはアドレスが参照される場合は、そのような識別子は変化し得て、そしてインターネット上の特定の情報は掲載されたり掲載されなくなったりし得るが、インターネットを検索することにより同等の情報を見出すことができることが理解される。それに対する参照はそのような情報の入手可能性おより公けにおける普及を立証する。
【００５１】
本明細書において使用されるように、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物の略号は、別に指示がない限り、共通の用法、認められた略号、もしくはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法( (1972) Biochem. 11:942-944、を参照)に一致する。
【００５２】
本明細書において使用されるように、セリンプロテアーゼとは、タンパク質もしくはペプチドの加水分解にセリン残基が関与する、プロテアーゼの種々のファミリーを指す。セリン残基は、触媒作用においてセリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸を含む触媒三つ組機構の一部、または触媒作用においてセリンおよびリジンを伴うヒドロキシル／ε−アミノもしくはヒドロキシル／α−アミンの触媒二つ組機構の一部であり得る。ヒトを含む哺乳動物起源のＳＰが特に興味深い。一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させないことを当業者は認識している(例えばWatson et al. (1987)、「遺伝子の分子生物学、第４版」、The Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224を参照)。
【００５３】
本明細書において使用されるように、''膜貫通型セリンプロテアーゼ(ＭＴＳＰ)''とは、本明細書に説明される共通な構造的特徴を共有する膜貫通型セリンプロテアーゼのファミリーを指す(Hooper et al. (2001) J. Biol. Chem.276:857-860をまた参照)。かくして、例えば''ＭＴＳＰ''への参照は、ＭＴＳＰ遺伝子ファミリーによりコード化される全てのタンパク質を包含し、ＭＴＳＰ３、ＭＴＳＰ４、ＭＴＳＰ６、ＭＴＳＰ７または他の任意の供給源より得られた同等の分子、もしくは合成的に調製されたもの、または同一の活性を発揮するものを含むが、これらに限定されない。他のＭＴＳＰとしては、コリン、エンテロペプチダーゼ、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ(ＨＡＴ)、ＭＴＳＰ１、ＴＭＰＲＳＳ２およびＴＭＰＲＳＳ４が挙げられるが、これらに限定されない。例示的ＭＴＳＰおよび／もしくはそのドメインのコード化する核酸分子の配列およびコード化されたアミノ酸配列を、例えば、米国出願一連番号第０９／７７６,１９１号 (その中の配列番号１〜１２、４９、５０および６１〜７２は国際ＰＣＴ出願第ＷＯ  ０１／５７１９４号として公開される)に示す。この用語はまた、それぞれのメンバーの活性を実質的に変化させないアミノ酸置換を持つＭＴＳＰおよびそのスプライス変異体を包含する。アミノ酸の保存的置換を必須でなく含む適当な置換は当業者に公知であり、得られる分子の触媒活性のような、生物活性を消失させることなく作成されることができる。
【００５４】
本明細書において使用されるように、ＭＴＳＰ９は、本明細書において参照される場合は常に、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列により、もしくは配列番号６のアミノ酸１１〜２３２をコード化するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によりによりコード化されるポリペプチド；
配列番号５のヌクレオチドとしてもしくは配列番号１７として示されるヌクレオチド配列に低度、中度、もしくは高度のストリンジェンシーの条件下にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチド；
配列番号６のアミノ酸１１〜２３２として示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号１７もしくは１８に示されるアミノ酸、または配列番号６のアミノ酸１１〜２３２として示されるアミノ酸の配列と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／もしくは
配列番号１７に示されるＭＴＳＰ９のスプライス変異体によりコード化されるポリペプチド：
の少なくとも一つもしくは全てまたは任意の組合せを含む。
【００５５】
特に、配列番号５、６、１６、１７および１８に示されるように、プロテアーゼドメインを持つ、ＭＴＳＰ９ポリペプチドが提供される。ポリペプチドは単鎖もしくは二本鎖ポリペプチドである。プロテアーゼ活性を保持するそのさらに小さなタンパク質がまた提供される。ＭＴＳＰ由来のプロテアーゼドメインは、表面ループにおける挿入および欠失を含んで、サイズおよび構成を異にする。それらは、活性部位三つ組(例えば、配列番号１８のＭＴＳＰ９の触媒三つ組は、Ｈ２２７、Ｄ２７２およびＳ３６８であることを参照)、主要特異性ポケット、オキシアニオンホールおよび／もしくはプロテアーゼのセリンプロテアーゼドメインの他の特徴の少なくとも一つを含む、保存された構造を保持する。かくして、本明細書の目的のためには、プロテアーゼドメインは、本明細書に規定されるＭＴＳＰの一部であり、そして先に同定されてはいたところのコリン、エンテロペプチダーゼ、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ(ＨＡＴ)、ＭＴＳＰ１、ＴＭＰＲＳＳ２およびＴＭＰＲＳＳ４のような他のＭＴＳＰのドメインに相同である；しかしながら、単離された単鎖型プロテアーゼドメインがインビトロアッセイでタンパク質分解的に機能し得たことは認識されていなかった。キモトリプシン(Ｓ１)フォールドのさらに大きなクラスの酵素(例えば、インターネットでアクセス可能なMEROPSデータベースを参照)と同様に、ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインは高度のアミノ酸配列同一性を共有する。活性に必要なＨｉｓ、ＡｓｐおよびＳｅｒ残基は保存モチーフ中に存在する。二本鎖型中の２番目の鎖のＮ末端をもたらす、活性化部位は、保存モチーフ中に位置して、容易に同定可能である。
【００５６】
ＭＴＳＰ９は任意の動物特に哺乳動物由来であり得て、そしてヒト、げっ歯類、鳥類、反芻動物、および他の動物が挙げられるが、これらに限定されない。完全長チモーゲンもしくは二本鎖活性化型、または二本鎖活性化型もしくは単鎖型であり得るプロテアーゼドメインを含むその任意のドメインが意図される。
【００５７】
本明細書において使用されるように、''ＭＴＳＰのプロテアーゼドメイン''とは、タンパク質分解活性を発揮しそしてキモトリプシン／トリプシンファミリーのプロテアーゼドメインと相同性および構造的特徴を共有する、ＭＴＳＰの細胞外プロテアーゼドメインを指す。したがってそれは、標準的なインビトロアッセイで評価されるタンパク質分解酵素活性を発揮するところのドメインの少なくとも最小部分である。そのようなプロテアーゼドメインおよびその触媒的に活性な部分が本明細書において意図される。また、単鎖型として触媒的に作用するところのその最小のフラグメントを含む、切断型のプロテアーゼドメインが提供される。
【００５８】
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインは、本明細書において参照される場合は常に、
配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列１５もしくは１７に示されるヌクレオチド配列に低度、中度、もしくは高度にストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチド；
配列番号６、１６もしくは１８に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号６、１６もしくは１８に示されるアミノ酸配列に少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／または
ＭＴＳＰ９のスプライス変異体によりコード化されるポリペプチドのプロテアーゼドメイン：
の触媒的に活性な部分の少なくとも一つもしくは全てまたは任意の組合せを含む。
【００５９】
ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインは、表面ループにおける挿入および欠失を含んでサイズおよび構成を異にする。それらは、活性部位三つ組、主要特異性ポケット、オキシアニオンホールおよび／もしくはプロテアーゼのセリンプロテアーゼドメインの他の特徴の少なくとも一つを含む、保存された構造を保持する。かくして、本明細書の目的のためには、プロテアーゼドメインは、本明細書に規定されるように、ＭＴＳＰの一部であって、他のＭＴＳＰのドメインに相同である。キモトリプシン(Ｓ１)フォールドのさらに大きなクラスの酵素(例えば、インターネットでアクセス可能なMEROPSデータベース、を参照)と同様に、ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインは高度のアミノ酸配列同一性を共有する。活性に必要なＨｉｓ、ＡｓｐおよびＳｅｒ残基は保存モチーフ中に存在する。その切断が二本鎖型中の２番目の鎖のＮ末端を創成する活性化部位は保存モチーフ中に位置して、容易に同定可能である。
【００６０】
活性型とは、インビボおよび／もしくはインビトロで活性な型を意味する。本明細書に説明されるように、プロテアーゼドメインはまた、二本鎖型としても存在し得る。少なくともインビトロにおいては、ＳＰの単鎖型およびその触媒ドメインもしくはそのタンパク質分解的に活性な部分(典型的にはＣ末端切断)がタンパク質分解活性を発揮することが本明細書に示される。したがって、ＳＰの単離された単鎖型プロテアーゼドメインおよびその活性を調整する剤の同定用のインビトロ剤スクリーニングアッセイにおけるそれらの使用が、本明細書において提供される。
【００６１】
本明細書において使用されるように、ＭＴＳＰの触媒活性ドメインとは、プロテアーゼドメインを指す。ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインへの参照は一般的に、タンパク質の単鎖型を指す。二本鎖型もしくは両者の型を意図するならば、そのように特定される。それぞれのタンパク質のチモーゲン型は単鎖型であり、それは活性化切断により活性な二本鎖型に変換される。
【００６２】
本明細書において使用されるように、活性化切断とは、切断に際してプロテアーゼドメインのＮ末端(この場合には、Ｒ１８５とＩ１８６の間；配列番号１２および１３を参照して)におけるプロテアーゼの切断を指す。切断に際して、プロテアーゼドメイン外のＣｙｓ(この場合、例えばＣ１７５)およびプロテアーゼドメイン内のＣｙｓ(この場合には、Ｃｙｓ２９２)との間のＣｙｓ−Ｃｙｓ対のお陰で、得られたポリペプチドは二本鎖(''Ａ''鎖およびプロテアーゼドメインである''Ｂ''鎖)を有する。切断は、さらに別のプロテアーゼにより、もしくは自己触媒的に行われることができる。
【００６３】
本明細書において使用されるように、二本鎖型のプロテアーゼドメインとは、二本鎖型のプロテアーゼから生成する二本鎖を指し、そこでは、この場合Ｃｙｓ１７５とＣｙｓ２９２の間のＣｙｓ対がプロテアーゼドメインをポリペプチドの残余である''Ａ''鎖と結合する。二本鎖プロテアーゼドメイン型とは、''ポリペプチドの残余''即ち''Ａ''鎖が短くなりＣｙｓ１７５からを含む任意の型を指す。
【００６４】
興味のあるＭＴＳＰは、非腫瘍細胞とは、典型的にはより高度に、異なる腫瘍細胞において活性化および／もしくは発現されているもの；およびそのための基質が腫瘍細胞において非腫瘍細胞と異なるか、または基質、補因子もしくは受容体に関して異なっている、またはそうでなければＭＴＳＰの活性もしくは特異性を変えているところの細胞由来のものを含む。
＾Ｆ^Ｆ  本明細書において使用されるように、ヒトタンパク質は、ヒトのゲノム中に存在するＤＮＡのような核酸によりコード化されるものであり、全ての対立遺伝子変異体および保存的変異体を、それらが他の哺乳動物に見出される変異体でない限りに、含む。
【００６５】
本明細書において使用されるように、''ＳＰのプロテアーゼドメインもしくは触媒的に活性な部分をコード化する核酸''とは、記述された単鎖プロテアーゼドメインもしくはその活性部分のみで、連続的配列としてＳＰの他の近接した部分ではなくコード化する核酸は指すものとする。
【００６６】
本明細書において使用されるように、触媒活性とは、セリンプロテアーゼとしてのＳＰの活性を指す。ＳＰの機能とは、腫瘍生物学におけるその機能を指し、腫瘍の開始、成長もしくは進行における促進もしくは関与、およびまた情報伝達における役割を含む。触媒活性とは、選択された基質のタンパク質分解を検出するインビトロタンパク質分解アッセイで評価されるプロテアーゼとしてのＳＰの活性を指す。
【００６７】
本明細書において使用されるように、チモーゲンとは、タンパク質分解酵素の不活性前駆体である。そのような前駆体は活性型よりも、必須ではないが、一般的により大きい。セリンプロテアーゼに関しては、チモーゲンは触媒的および自己触媒的切断を含む特異的切断により、もしくは活性酵素を生成する活性化補因子の結合により、活性な酵素に変換される。チモーゲンはかくして、活性化因子の作用によりタンパク質分解酵素に変換される、酵素的に不活性なタンパク質である。
本明細書において使用されるように、''疾患もしくは障害'' とは、例えば、感染もしくは遺伝的欠陥によりまたらされて同定可能な症状を特徴とする、生物における病態を指す。
【００６８】
本明細書において使用されるように、新生物形成(腫瘍形成)とは、異常な新たな成長を指し、かくして、良性もしくは悪性の腫瘍と同じ意味である。過形成とは異なり、新形成の増殖は元の刺激の不在下でも持続する。
本明細書において使用されるように、新生物形成性疾患とは、腫瘍発生、成長、転移および進行を含む、がんを伴う任意の障害を指す。
【００６９】
本明細書において使用されるように、がんとは、任意の種類の悪性腫瘍により引き起こされる疾患の一般的用語を指す。
本明細書において使用されるように、腫瘍に適用される悪性とは、成長制御および位置制御を消失した転移能力を有する原発腫瘍を指す。
【００７０】
本明細書において使用されるように、抗がん剤(''抗腫瘍もしくは抗新生物剤''と互換的に使用される)とは、抗がん処置において使用される任意の剤を指す。これらは、単独もしくは他の化合物との組合せで使用したときには、新生物形成性疾患、腫瘍およびがんと関連する臨床症状もしくは診断マーカーを軽減し、減少し、改善し、予防するか、または寛解の状態に置くかもしくは維持することのできる任意の剤を含み、そして本明細書に提供される方法、組合せおよび組成物で使用されることができる。抗新生物剤の限定されない例としては、抗血管新生剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、特定の天然産物、プラチナ配位結合錯体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、特定のホルモン、アンタゴニストおよび抗がん性多糖類が挙げられる。
【００７１】
本明細書において使用されるように、スプライス変異体とは、二つ以上のタイプのｍＲＮＡをもたらすＤＮＡのような、ゲノム核酸の一次転写物の示差処理により生産される変異体を指す。ＳＰのスプライス変異体が本明細書において提供される。
【００７２】
本明細書において使用されるように、血管新生とは、新しい血管系の確立および維持(新血管新生)に直接もしくは間接に関与する全てのプロセスを広く包含するものとし、腫瘍を伴う新血管新生を含むが、これに限定されない。
【００７３】
本明細書において使用されるように、抗血管新生的処置もしくは剤とは、単独または他の処置もしくは化合物との組合せで使用したときには、望ましくないおよび／もしくは制御されない血管新生に関連する臨床症状または診断マーカーを軽減し、減少し、改善し、予防するか、もしくは寛解の状態に置くかまたは維持する任意の治療レジメンおよび化合物を指す。かくして本明細書の目的には、抗血管新生剤とは、血管系の確立もしくは維持を阻害する剤を指す。そのような剤としては、抗腫瘍剤、ならびに糖尿病性網膜症、再狭窄、過剰増殖性障害およびその他のような、望ましくない血管新生に関連する他の障害の処置のための剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書において使用されるように、非抗血管新生性抗腫瘍剤とは、血管新生を阻害することにより主として作用しない、抗腫瘍剤を指す。
本明細書において使用されるように、血管新生促進剤とは、血管系の確立および維持を促進する剤である。そのような剤としては、心臓発作および脳卒中を含む、心臓血管系障害を処置する剤が挙げられる。
【００７５】
本明細書において使用されるように、望ましくないおよび／もしくは制御されない血管新生とは、血管新生促進剤の影響が血管新生阻害剤の影響に優っている、病的血管新生を指す。本明細書において使用されるように、欠陥のある血管新生とは、異常血管新生もしくは血管新生の不在もしくは実質的減少をもたらす正常な血管新生の欠陥が在る、障害に関与する病的血管新生を指す。
【００７６】
本明細書において使用されるように、ＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインとは、タンパク質分解活性を発揮するＳＰのプロテアーゼドメインを指す。したがってそれは、標準的なインンビトロアッセイで評価されるように、プロテアーゼ活性を発揮する、タンパク質の少なくとも最小の部分である。本明細書においてはそれは単鎖型およびまた二本鎖の活性型(二本鎖を意図する場合にはその旨記述する)を指す。例示的プロテアーゼドメインは、プロテアーゼ活性を発揮するために配列番号６に示すアミノ酸配列(配列番号５のヌクレオチドによりコード化される)の少なくとも十分な部分を含む。
【００７７】
また、インビトロタンパク質分解アッセイでタンパク質分解活性を有し、そしてＭＴＳＰ９ポリペプチドの完全長のプロテアーゼドメインに少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドをコード化するか、またはその完全長に沿ってもしくは完全長の少なくとも約７０％、８０％、もしくは９０％に沿って、プロテアーゼドメインをコード化するところの核酸と特に中度、一般的には高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズする、核酸分子が、意図される。
【００７８】
プロテアーゼドメインとしては、Ｎ末端の残基が活性に必須であり得る。ＭＴＳＰ９プロテアーゼの単鎖型のプロテアーゼドメインは触媒的に活性であることが、本明細書において示される。したがって、プロテアーゼドメインは一般的に、活性のためにそのＮ末端アミノ酸を必要とし；Ｃ末端部分は先端を切り得る。除去可能な量は、触媒的切断を評価するインビトロアッセイにおいてポリペプチドのプロテアーゼ活性を試験することにより経験的に決定されることができる。
【００７９】
したがって、プロテアーゼドメイン、特にプロテアーゼ活性を保持するその単鎖ドメインのさらに小さな部分が意図される。そのようなさらに小さな変種は一般的に、プロテアーゼドメインのＣ末端の先端を切った変種である。プロテアーゼドメインは、表面ループにおける挿入および欠失を含んで、サイズおよび構成を異にする。そのようなドメインは、活性部位三つ組、主要特異性ポケット、オキシアニオンホールおよび／もしくはプロテアーゼのセリンプロテアーゼドメインの他の特徴の少なくとも一つを含む、保存された構造を示す。かくして、本明細書の目的には、プロテアーゼドメインは、本明細書に規定されたＭＴＳＰ９の単鎖部分であるが、その構造的特徴および類似性もしくは相同性の配列の保持において、キモトリプシンもしくはトリプシンのプロテアーゼドメインと相同である。ポリペプチドは単鎖としてタンパク質活性を示す。
【００８０】
本明細書において使用されるように、相同性とは、２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％のような、約２５％より大きい核酸配列の同一性を意味する。必要な場合にはホモロジーのパーセンテージを特定する。用語''相同性''および''同一性''はしばしば互換的に使用される。一般に、配列は最も高度の一致が得られるように整列させる(例えば：「コンピューター分子生物学」、 Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；「バイオコンピューティング：インフォーマティックスとゲノムプロジェクト」、 Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；「配列データのコンピューター解析、第一部」、Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；「分子生物学における配列分析」、 von Heinje, G., Academic Press, 1987; および「配列分析プライマー」、Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073、を参照)。配列同一性により、保存されたアミノ酸の数が標準的なアライメントアルゴリズムプログラムで決定され、それぞれの提供者により確立されているデフォルトギャップペナルティーと共に使用される。実質的に相同な核酸分子は、核酸の全長に沿って、もしくは興味のある完全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％もしくは９０％に沿って、典型的に中度のストリンジェンシーもしくは高度のストリンジェンシーでハイブリダイズするであろう。また、ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子が意図される。
【００８１】
任意の二つの核酸分子が、少なくとも、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％で''同一''であるクレオチド配列を有するか否かは、例えば、Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444のデフォルトパラメータを用いる''ＦＡＳＴ  Ａ''プログラムのような既知のコンピューターアルゴリズムを使用して決定することができる。(他のプログラムとしては、GCGプログラムパッケージ (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)；「巨大コンピューターへの入門」、Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073が挙げられる)。例えば、National Center for Biotechnology InformationデータベースのＢＬＡＳＴ関数を用いて、同一性を測定することができる。他の市販もしくは公けに入手可能なプログラムとしては、DNAStar "MegAlign" プログラム (Madison, WI) および University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)の "Gap" プログラム (Madison WI))が挙げられる。
【００８２】
タンパク質および／もしくは核酸分子の相同性または同一性のパーセントを、例えば、ＧＡＰコンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することにより測定することができる(例えば、Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443のSmith and Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482による改良)。略述すれば、ＧＡＰプログラムは、同一性を整列した類似のシンボル(即ち、ヌクレオチドもしくはアミノ酸)の数を二つのの配列のうち短い方のシンボルの総数で割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータとしては、(１)単一比較マトリックス(同一の場合１、非同一の場合０の値を含む)およびSchwartz and Dayhoff, eds.、「タンパク質配列および構造アトラス」、 National Biomedical Research Foundation, pp. 353358 (1979)に記載されているような、Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の重みつき比較マトリックス；(２)それぞれのギャップあたり３.０のペナルティーおよびそれぞれのギャップ中のそれぞれのシンボルにつきさらに別な０.１のペナルティー；ならびに(３)エンドギャップにはペナルティーなし、が挙げられ得る。それ故に、本明細書において使用されるように、用語''同一性''とは、試験および参照ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド間の比較を表す。
【００８３】
本明細書において使用されるように、用語の少なくとも''９０％同一''とは、参照ポリペプチドと比べて９０〜９９．９９％のパーセント同一性を指す。９０％以上のレベルでの同一性とは、例示的目的のために１００アミノ酸長の試験および参照ポリヌクレオチドを比較したと仮定して、試験ポリペプチドのアミノ酸の１０％(即ち１００個のうちの１０個)以下が参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示している。同様の比較を試験および参照ポリヌクレオチド間で行うことができる。そのような差は、アミノ酸配列の全長に沿ってランダムに分布している点突然変異として表されるか、またはそれらは最大許容可能な、例えば、１０／１００個のアミノ酸の差(約９０％同一性)までの種々の長さの一つもしくはそれ以上の位置にクラスターを形成することができる。差はヌクレオチドもしくはアミノ酸の置換もしくは欠失として定義される。約８５〜９０％以上の相同性もしくは同一性のレベルでは、結果はプログラムもしくは設定されたギャップパラメータには無関係のはずである；そのような高レベルの同一性は容易に、しばしばソフトウエアに依存することなく、評価されることができる。
【００８４】
本明細書において使用されるように、プライマーとは、それからプライマー伸長産物の合成が開始され得る、二つもしくはそれ以上、典型的には４個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを指す。合成を助長する実験条件としては、ヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼのような重合および伸長用の剤、ならびに適当な緩衝液、温度およびｐＨの存在が挙げられる。
【００８５】
本明細書において使用されるように、動物としては、ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジ、げっ歯類、ブタおよびヒトのような任意の動物が挙げられるが、それらに限定されない。非ヒト動物は、意図される動物としてヒトを除外する。本明細書において提供されるＳＰは、任意の供給源、動物、植物、原核生物および真菌由来である。殆どのＭＴＳＰ９は、哺乳動物起源を含めて、動物起源である。
【００８６】
本明細書において使用されるように、遺伝子治療は、ＤＮＡのような異種の核酸の、そのような治療が求められている障害もしくは異状を有する動物、特にヒトの特定の細胞、標的細胞への移入を伴う。ＤＮＡのような核酸を、ＤＮＡのような異種核酸が発現されて、それによりコード化される治療用産物が生産されるような様式で、選択された標的細胞内に導入する。これに代えて、ＤＮＡのような異種タンパク質は、治療用産物をコード化するＤＮＡの発現を或る様式で仲介し得るか、または治療用産物の発現を直接もしくは間接に或る様式で仲介するペプチドまたはＲＮＡのような生産物をコード化し得る。遺伝子治療をまた用いて、欠陥遺伝子に置き換わるか、もしくはそれが導入された哺乳動物または細胞により生産される遺伝子産物を補充する遺伝子産物をコード化する核酸を送達することができる。導入された核酸は、哺乳動物宿主では通常生産されないかまたは治療的に有効な量でもしくは治療的に有用な時期に生産されないところの、その増殖因子阻害剤、または腫瘍壊死因子もしくはその受容体のようなその阻害剤のような、治療用化合物をコード化することができる。治療用産物をコード化するＤＮＡのような異種核酸は、生産物もしくはその発現を促進するかまたはさもなければ変化させるために、罹患宿主の細胞中への導入に先立って修飾され得る。遺伝子治療はまた、遺伝子発現の阻害剤もしくはリプレッサーまたは他のモジュレーターの送達を伴うことができる。
【００８７】
本明細書において使用されるように、異種の核酸とは、それが発現される細胞により通常はインビボで生産されないかまたは転写、翻訳、もしくは他の調節可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことにより、ＤＮＡのような内在性核酸の発現を変化させる仲介因子を仲介もしくはコード化するところの、核酸(ＤＮＡがＲＮＡをコード化するならば)およびタンパク質である。ＤＮＡのような異種核酸はまた、ＤＮＡのような外来性核酸と呼称される。それが発現される細胞にとって異種もしくは外来性であると当業者が認識しもしくは考える、ＤＮＡのような任意の核酸は、本明細書において異種性核酸に包含される；異種性核酸は、また内在的に発現されているところの外来性に添加された核酸を含む。
【００８８】
異種性核酸の例としては、剤耐性を付与するタンパク質のような追跡可能なマーカータンパク質をコード化する核酸、抗がん剤、酵素およびホルモンのような治療的に有効な物質をコード化する核酸、ならびに抗体のような他のタイプのタンパク質をコード化するＤＮＡのような核酸、が挙げられるが、これらに限定されない。異種核酸によりコード化される抗体は、異種核酸が導入された細胞の表面に分泌もしくは発現させることができる。異種核酸は一般的に、それが導入される細胞にとって内在性でないが、さらに別な細胞から得られているかもしくは合成的に調製されているかである。必須ではないが一般的に、そのような核酸は、それが発現される細胞により通常は生産されない、ＲＮＡおよびタンパク質をコード化する。
【００８９】
本明細書において使用されるように、治療的に有効な生産物は、異種核酸、典型的にはＤＮＡ、によりコード化される生産物であり、核酸が宿主に導入されると、遺伝性もしくは獲得性疾患の症状、発現を軽減もしくは消失させるかまたは疾患を治癒する生産物が発現される。
【００９０】
本明細書において使用されるように、ポリペプチドが実質的にプロテアーゼドメインより成るとの記述は、ポリペプチドの唯一のＳＰ部分がプロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分であることを意味する。ポリペプチドは任意におよび一般的にさらに別な非ＳＰ由来アミノ酸配列を含むであろう。
【００９１】
本明細書において使用されるように、がんもしくは腫瘍の処置もしくは剤は、単独もしくは他の処置もしくは化合物との組合せで使用したときに、欠陥のある血管新生と関連する臨床症状もしくは診断マーカーを軽減し、減少し、改善し、予防するか、もしくは寛解の状態に置くかまたは維持することのできる任意の治療レジメンおよび／または化合物を指す。
本明細書において使用されるように、ドメインとは、分子の他の部分とは構造的および／もしくは機能的に異なる、分子、例えばタンパク質またはコード化する核酸、の一部を指す。
【００９２】
本明細書において使用されるように、プロテアーゼとは、タンパク質もしくはペプチドの加水分解を触媒する酵素を指す。それはチモーゲン型およびその活性化型を含む。明確にするために、プロテアーゼへの参照は全ての型を指し、特定の型は具体的に指定される。本明細書の目的には、プロテアーゼドメインは、ＳＰタンパク質の単一および二本鎖型のプロテアーゼドメインを含む。ＭＴＳＰ９については、プロテアーゼドメインはまた、単一および二本鎖型のプロテアーゼドメインを含む。
【００９３】
本明細書において使用されるように、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質核酸(ＰＮＡ)を含むその類似体ならびにそれらの混合物を含む。核酸は単一鎖もしくは二重鎖であり得る。プローブもしくはプライマーに言及するとき、蛍光もしくは放射標識のような検出可能な標識で任意に標識された単鎖分子が意図される。そのような分子は典型的に、ライブラリーのプロービイングもしくはプライミングにおいてそれらの標的が統計的にユニークであるかまたは低いコピー数(典型的に５未満、一般的に３未満)を持つような長さである。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００個もしくはそれ以上の核酸の長さであり得る。
【００９４】
本明細書において使用されるように、ＳＰのフラグメントもしくは一部をコード化する核酸とは、ＳＰの記述されたフラグメントもしくは一部のみをコード化し、ＳＰの他の隣接する部分をコード化しない核酸を指す。
【００９５】
本明細書において使用されるように、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配列のような、ヌクレオチドの調節ならびにエフェクター配列への異種核酸の機能し得るような連結とは、ＤＮＡのようなそのような核酸、およびヌクレオチドのそのような配列との間の関係を指す。例えば、プロモーターへの異種ＤＮＡの機能し得るような連結とは、そのようなＤＮＡの転写が読みとり枠内のＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するところのＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるように、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的関係を指す。かくして、機能し得るように結合されたもしくは機能的に関連されたとは、ＤＮＡのような核酸の、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、および他のシグナル配列のような、ヌクレオチドの調節およびエフェクター配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーターへのＤＮＡの機能し得るような結合とは、そのようなＤＮＡの転写がＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによりプロモーターから開始されるように、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的な関係を指す。発現および／もしくはインビトロ転写を至適化するために、クローンの５’非翻訳部分を除去し、付加しもしくは変化して、転写もしくは翻訳のレベルのどちらかで、発現を妨害しもしくは減少させ得る、余分な潜在的に不適切なさらに別の翻訳イニシエーション(即ち開始)コドンもしくは他の配列を除去することが必要であり得る。これに代えて、コンセンサスリボゾーム結合部位(例えば、Kozak J. Biol. Chem. 266:19867-19870 (1991)を参照)を開始コドンの直ぐ５’側に挿入して、発現を促進することができる。そのような修飾の望ましさ(もしくは必要性)を経験的に決定することができる。
【００９６】
本明細書において使用されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列とは、ＲＮＡと一般的には中度ないし高度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができるほど十分な相補性を有する配列を意味する；二重鎖ＳＰアンチセンス核酸の場合には、二重らせんＤＮＡの単鎖(即ち、ｄｓＲＮＡ)をこのように試験することができるか、もしくは三重らせん形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さに依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、より多くの塩基がＳＰをコード化するＲＮＡとミスマッチして、それは安定な二重らせん(場合によっては、三重らせん)を含有しそしてなお形成することができる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を測定する標準的な手順の使用によりミスマッチの耐容度を確かめることができる。
【００９７】
本明細書の目的には、アミノ酸置換は、得られたタンパク質がプロテアーゼ活性を示す条件で、任意のＳＰおよびそのプロテアーゼドメイン中で行われ得る。意図されるアミノ酸置換は、タンパク質分解活性を消失させない、表１に示すような、保存的置換を含む。本明細書に説明するように、切断部位および他のそのような部位の除去のように、タンパク質の性質を変化させる置換がまた、意図される；そのような置換は一般的に非保存的であるが、当業者により容易に実施されることができる。
【００９８】
アミノ酸の適当な保存的置換は、当業者に公知であり、得られる分子の生物活性、例えば酵素活性、を変化させることなく、一般的に行うことができる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における１個のアミノ酸の置換は、実質的に生物活性を変化させない(例えば、Watson et al. 、「遺伝子の分子生物学、第４版」、1987, The Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224、を参照)ことを当業者は認識している。ＳＰの触媒的に活性なフラグメント、特に単鎖プロテアーゼ部分はまた定義内に含まれる。保存的アミノ酸置換は、例えば、以下の表１に示される置換にしたがって行われる。
【００９９】
【表１】
2005506047.tif 000002
他の置換はまた、許容可能であって、経験によりもしくは既知の保存的置換にしたがって決定されることができる。
【０１００】
本明細書において使用されるように、Ａｂｕは２−アミノ酪酸であり；Ｏｒｎはオルニチンである。
本明細書において使用されるように、本明細書に現れる種々のアミノ酸配列中に出てくるところのアミノ酸は、それらの周知の３文字もしくは１文字の略号にしたがって特定される。種々のＤＮＡフラグメント中に出てくるところのヌクレオチドは、当分野において日常使用される標準的な１文字呼称を用いて呼称される。
【０１０１】
本明細書において使用されるように、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づくプローブもしくはプライマーは、配列番号５のヌクレオチドの少なくとも１０、１４、典型的には少なくとも１６個の連続的配列、および配列番号５のヌクレオチドの少なくとも３０、５０もしくは１００個の連続的配列のプローブを含む。ユニークなハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーの長さは興味のあるゲノムの複雑さの関数である。
本明細書において使用されるように、特定の医薬組成物の投与による特定の障害の症状の軽減とは、組成物の投与に帰することのできるかもしくはそれと関連する、永続的もしくは一時的にせよ、持続的または一過性の任意の緩和を指す。
【０１０２】
本明細書において使用されるように、アンチセンスポリヌクレオチドとは、ｍＲＮＡもしくは二重鎖ＤＮＡのセンス鎖に相補的なヌクレオチド塩基の合成的配列を指す。適切な条件下におけるセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの混合は、両分子の結合、即ちハイブリダイゼーションに至る。これらのポリヌクレオチドがｍＲＮＡに結合(とハイブリダイズ)するときに、タンパク質合成(翻訳)の阻害が起こる。これらのポリヌクレオチドが二重鎖ＤＮＡに結合するときに、ＲＮＡ合成(転写)の阻害が起こる。翻訳および／もしくは転写の得られた阻害は、センス鎖によりコード化されたタンパク質の合成の阻害に至る。アンチセンス核酸分子は典型的に、十分な数のヌクレオチドを含有して、標的核酸、少なくとも５個の隣接ヌクレオチド、しばしば、興味のある遺伝子をコード化する核酸分子、例えば、ＳＰの単鎖プロテアーゼドメイン、をコード化する核酸のコード化部分に相補的な少なくとも１４もしくは１６または３０個の隣接する、ヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドに特異的に結合する。
【０１０３】
本明細書において使用されるように、アレイとは、３個以上のメンバーを含む、抗体のような、要素の集まりを指す。アドレス可能なアレイは、典型的には固相支持体上の位置により、アレイのメンバーが確認し得るものである。したがって、一般にアレイのメンバーは、固相表面上の別々の確認し得る位置に固定化される。
【０１０４】
本明細書において使用されるように、抗体とは、天然または部分的にもしくは完全に合成的に調製されたものであれ、イムノグロブリンを指し、抗体の特異的結合能を保持しているその任意の誘導体も含む。したがって、抗体は、イムノグロブリンの結合ドメインと相同もしくは実質的に相同であるところの結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、任意のイムノグロブリンクラスのメンバーが挙げられる。
【０１０５】
本明細書において使用されるように、抗体フラグメントとは、完全長の抗体の特異的結合能の少なくとも一部を保持している、完全長より短い抗体の任意の誘導体を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ)２、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦＶ)、ＦＶ、ｄｓＦＶディアボディーおよびＦｄフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。フラグメントは、ジスルフィド橋のように、互いに結合した複数の鎖を含むことができる。抗体フラグメントは一般的に、少なくとも約５０個のアミノ酸、典型的には少なくとも２００個のアミノ酸を含有する。
【０１０６】
本明細書において使用されるように、Ｆｖ抗体フラグメントは、非共有結合的相互作用で結合した一つの可変重鎖ドメイン(ＶＨ)および一つの可変軽鎖ドメインより成る。
本明細書において使用されるように、ｄｓＦＶとは、ＶＨ−ＶＬ対を安定化させる、工学的に操作された分子間ジスルフィド結合を持つＦｖを指す。
【０１０７】
本明細書において使用されるように、Ｆ(ａｂ)２フラグメントとは、イムノグロブリンをペプシンによりｐＨ４.０〜４.５で消化した結果得られる抗体フラグメントである；それは組換え的に発現させて、同等のフラグメントを生産することができる。
本明細書において使用されるように、Ｆａｂフラグメントはイムノグロブリンをパパインで消化した結果得られる抗体フラグメントである；それらを組換え的に発現させて、同等のフラグメントを生産することができる。
【０１０８】
本明細書において使用されるように、ｓｃＦＶとは、ポリペプチドリンカーにより任意の順序に連結された可変軽鎖(ＶＬ)および可変重鎖(ＶＨ)を含有する、抗体フラグメントを指す。リンカーは、２個の可変ドメインが実質的な妨害なしに架橋されるような長さを持つ。含まれるリンカーは、溶解性を増すために全体に亘って分散させた幾つかのＧｌｕもしくはＬｙｓ残基を持つ(Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ残基である。
【０１０９】
本明細書において使用されるように、ヒト化抗体とは、ヒトへの投与が免疫応答を惹起しないように、アミノ酸のヒト配列を含有するように修飾された抗体を指す。そのような抗体の調製方法は公知である。例えば、そのような抗体を生産するためには、モノクローナル抗体を発現する、ハイブリドーマまたはＥ．ｃｏｌｉもしくはＣＨＯ細胞のような他の原核もしくは真核細胞を、組換えＤＮＡテクニックにより変化させて、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づくところの抗体を発現させる。そのような領域を特定するためにコンピュータープログラムがデザインされている。
本明細書において使用されるように、ディアボディーは２量体のｓｃＦＶである；ディアボディーは、典型的にｓｃＦｖより短いペプチドリンカーを有して、それらは一般的に二量体化する。
【０１１０】
本明細書において使用されるように、組換えＤＮＡ方法を用いる組換え手段による生産とは、クローン化ＤＮＡによりコード化されるタンパク質を発現するための分子生物学の周知の方法の使用を意味する。
本明細書において使用されるように、用語の評価とは、試料中に存在するＳＰもしくはそのドメインの活性の絶対値を得るという意味において、およびまた、活性レベルを示す、指標、比率、パーセンテージ、視覚的もしくは他の値を得るという意味において、定量的および定性的測定を含むものとする。評価は直接的でも間接的でもあり得て、そして実際に検出される化学種は、勿論タンパク質分解産物そのものである必要はないが、例えばその誘導体もしくは或るさらなる物質であり得る。
【０１１１】
本明細書において使用されるように、生物活性とは、化合物のインビボ活性、即ち化合物、組成物もしくは他の混合物のインビボ投与の結果として得られる生理学的応答を指す。かくして、生物活性は、そのような化合物、組成物および混合物の治療効果および薬学的活性を包含する。生物活性は、そのような活性を試験しもしくは使用するようにデザインされたインビトロシステムにおいて観察されることができる。かくして、本明細書の目的のためには、ルシフェラーゼの生物活性は、そのオキシゲナーゼ活性であり、それによって基質の酸化に際し光が生成される。
【０１１２】
本明細書において使用されるように、機能的活性とは、完全長タンパク質に関連する一つもしくはそれ以上の活性を示す、ポリペプチドまたはその一部を指す。機能的活性としては、生物活性、触媒もしくは酵素活性、抗原性(抗ポリペプチド抗体に結合するポリペプチドと結合するかもしくは競合する能力)、免疫原性、多量体形成能、ポリペプチドに対する受容体もしくはリガンドに特異的に結合する能力、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本明細書において使用されるように、結合体とは、ＭＴＳＰ９を含む一つもしくはそれ以上のＳＰ、特にその単鎖プロテアーゼドメイン、および一つもしくはそれ以上のターゲティング剤を含む、本明細書において提供される化合物を指す。これらの結合体としては、組換え手段により融合タンパク質として生産されたもの、例えばスルフヒドリル基へのカップリングによる、化学的カップリングによるような化学的手段により生産されたもの、および任意の他の方法により生産されたものが挙げられるが、それによって少なくとも一つのＳＰもしくはそのドメインが、直接にもしくはリンカーを介して間接的に、ターゲティング剤に結合される。
【０１１４】
本明細書において使用されるように、ターゲティング剤は、結合体もしくはそのＳＰ部分を細胞内に取り込むことができる細胞表面受容体への結合体の特異的結合を提供する、タンパク質またはその有効な部分のような、任意の部分である。ターゲティング剤はまた、例えば、結合体の親和性による単離もしくは精製；表面への結合体の付着；または結合体もしくは結合体を含有する複合体の検出を促進するか容易にするものであり得る。
本明細書において使用されるように、抗体結合体とは、ターゲティング剤が抗体である結合体を指す。
本明細書において使用されるように、分子の誘導体もしくは類似体とは、分子から誘導された部分もしくは分子の修飾体を指す。
【０１１５】
本明細書において使用されるように、特定の疾患を処置するための化合物の有効量は、疾患に関連する症状を軽減するか何らかの様式で減少するのに十分な量である。そのような量は、有効であるならば、単回投与され得るかもしくはレジメンにしたがって投与され得る。その量は、疾患を治癒し得るが、典型的には、疾患の症状を軽減させるために投与される。症状の所望の軽減を達成するために反復投与が必要とされることがあり得る。
【０１１６】
本明細書において使用されるように、同等とは核酸の二つのの配列へ言及するときは、問題の二つのの配列が、アミノ酸もしくは同等なタンパク質の同じ配列をコード化することを意味する。二つののタンパク質もしくはペプチドに言及する際に同等を用いるときには、それは二つののタンパク質もしくはペプチドが、タンパク質もしくはペプチドの活性または機能を実質的に変化させない、アミノ酸置換のみ(これらに限定されないが上述の表１に示したような保存的変化のような)を持つ実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。性質について同等を言及するときには、性質は同程度に存在する必要はない(例えば、二つののペプチドは同じタイプの酵素活性の異なる速度を示し得る)が、活性は通常は、実質的に同じである。相補性は、二つののヌクレオチドについて言及するときには、二つののヌクレオチドの配列がハイブリダイズする能力があって、相対するヌクレオチド間に典型的には２５％、１５％、５％もしくは０％のミスマッチを持つことを意味する。必要があるならば、相補性のパーセンテージが特定されるであろう。典型的には、二つのの分子は、それらが高度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするであろうように選択される。
【０１１７】
本明細書において使用されるように、タンパク質の活性または遺伝子もしくは核酸の発現を調整する剤は、タンパク質の活性を、減少させもしくは増加させるかまたはさもなければ変化させるか、または細胞中の核酸の発現を何らかの様式で上方もしくは下方制御するかまたはさもなければ変化させる。
【０１１８】
本明細書において使用されるように、ＳＰ活性の阻害剤は、ＳＰの生産、翻訳後修飾（複数を含む)、成熟、もしくは膜局在化を阻害する任意の物質、または、特にインビトロスクリーニングアッセイにおいて単鎖型の、そのタンパク質分解効率を妨害もしくは減少させる任意の物質を包含する。
【０１１９】
本明細書において使用されるように、新生物形成性疾患の処置もしくは予防する方法とは、腫瘍、その転移、腫瘍の血管新生のような任意の症状、または疾患が特徴づけられる他のパラメータが減少され、改善され、予防され、寛解の状態に置かれるかもしくは寛解の状態に維持されることを意味する。それはまた、新生物形成性疾患および転移の特質を、処置により消失し、減少しもしくは予防し得ることを意味する。特質の非限定的例としては、基底膜および近接部位の細胞外マトリックスの制御されない分解、内皮細胞の移動、分裂、および組織化による新しい機能性毛細管の生成、およびそのような機能性毛細管の存続が挙げられる。
【０１２０】
本明細書において使用されるように、結合体の薬学的に許容される塩、エステルもしくは他の誘導体としては、そのような誘導体化の公知の方法を用いて当業者により容易に調製することができて、実質的な毒性作用なしに動物もしくはヒトに投与可能な化合物を生産し、そして薬学的に活性であるかもしくはプロドラッグであるところの任意の塩、エステルもしくは誘導体が挙げられる。
【０１２１】
本明細書において使用されるように、プロドラッグは、インビボでの投与により化合物の生物学的に、薬学的に、もしくは治療的に活性な型に代謝されるかまたはさもなければ変換されるところの化合物である。プロドラッグを生産するためには、活性な化合物が代謝的なプロセスにより再生されるように、薬学的に活性な化合物を修飾する。プロドラッグは、剤の代謝安定性もしくは輸送特性を変化させるように、副作用もしくは毒性をマスクするように、剤の風味を改善するように、または剤の他の特色もしくは性質を変さらするようにデザインされることができる。インビボでの薬物動態学的プロセスおよび薬物代謝の知識のお陰で、一旦薬学的に活性な化合物が知られれば、当業者は化合物のプロドラッグをデザインすることができる(例えば、Nogrady (1985)、「メディシナルケミストリー生化学的アプローチ」、 Oxford University Press, New York, pages 388-392、を参照)。
【０１２２】
本明細書において使用されるように、本明細書において提供されるスクリーニング方法により同定される薬物とは、治療薬としてもしくは治療薬のデザイン用のリード化合物としての使用の候補である、任意の化合物を指す。そのような化合物は、有機低分子、ペプチド、ペプチドミメティク、アンチセンス分子もしくはＲＮＡｉのようなｄｓＲＮＡ、抗体、抗体のフラグメント、組換え抗体、および薬物候補もしくはリード化合物として役立ち得る他のそのような化合物を含む、低分子であり得る。
【０１２３】
本明細書において使用されるように、ペプチドミメティックは、生物学的に活性な型の特定のペプチドのコンフォーメーションおよび特定の立体化学的特徴を模倣する化合物である。一般に、ペプチドミメティックは化合物の特定の所望の性質を模倣するが、生物学的に活性なコンフォーメーションの消失および結合の破壊に導く柔軟性のような望ましくない性質を模倣しないようにデザインされる。ペプチドミメティックは、生物学的に活性な化合物から、望ましくない性質を有する特定の基もしくは結合を生物学的等価物に置換することにより調製され得る。生物学的等価物は当業者に公知である。例えば、メチレン系生物学的等価物であるＣＨ２Ｓはエンケファリン類似体中のアミドの置換に使用されてきた(例えば、Spatola (1983) pp. 267-357、「アミノ酸、ペプチド、およびタンパク質の化学と生化学」、 Weistein, Ed. volume 7, Marcel Dekker, New York、を参照)。経口的に投与され得るモルヒネは、ペプチドであるエンドルフィンのペプチドミメティックである。本明細書の目的には、環状ペプチドはペプチドミメティックの中に含まれる。
【０１２４】
本明細書において使用されるように、プロモーター領域もしくはプロモーター要素とは、それが機能し得るように結合しているＤＮＡもしくはＲＮＡの転写を制御する、ＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントを指す。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始に十分である特定の配列を含む。プロモーター領域のこの部分をプロモーターと呼称する。加えて、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写開始活性を調整する配列を含む。これらの配列はシスに作用し得るかもしくはトランス作用因子に応答し得る。プロモーターは、調節の性質に依存して、構成的もしくは調節性であり得る。原核生物で使用されるための例示的に意図されるプロモーターとしては、バクテリオファージのＴ７およびＴ３プロモーターが挙げられる。
【０１２５】
本明細書において使用されるように、受容体とは、与えられたリガンドに親和性を有する分子を指す。受容体は天然に存在するかもしくは合成的な分子であり得る。受容体は、当分野において抗リガンドとも呼称される。本明細書において使用されるように、受容体および抗リガンドは互換可能である。受容体を、その変更されていない状態でもしくは他の種との凝集体として使用することができる。受容体を、結合メンバーに直接的にまたは特定の結合物質もしくはリンカーを介して間接的に、共有結合的にもしくは非共有結合的に付着させ、または物理的に接触させることができる。受容体の例としては、抗体、細胞膜受容体、表面受容体および内部移行性受容体、特定の抗原決定基［ウイルス、細胞もしくは他の物質上にあるような］と反応するモノクローナル抗体および抗血清、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖、多糖類、細胞、細胞膜、およびオルガネラが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
受容体およびそのような受容体を用いた応用の例としては、
ａ)酵素：抗生物質［リガンド］選択の標的として役立ち得る、微生物の生存に必須の特定の輸送タンパク質もしくは酵素；
ｂ)抗体：興味のある抗原のエピトープと結合する抗体分子上のリガンド結合部位の同定を研究することができる；抗原エピトープを模倣する配列の決定は、免疫原が一つもしくはそれ以上のそのような配列に基づくワクチンの開発に至るかまたはは関連診断剤の開発もしくは自己免疫疾患のためのような治療的処置に有用な化合物の開発に至ることができる；
ｃ)核酸：部位に結合する、タンパク質もしくはＲＮＡのような、リガンドの同定；
ｄ)触媒性ポリペプチド：一つもしくはそれ以上の反応物質の一つもしくはそれ以上の生産物への変換に関与する化学反応を促進する能力があるところのポリペプチドを含むポリマー；そのようなポリペプチドは一般的に、少なくとも１個の反応物質もしくは反応中間物に特異的な結合部位および結合部位に近接して活性な機能部位を含有しており、そこでは機能性は、結合した反応物質を化学的に修飾する能力がある(例えば、米国特許第５,２１５,８９９号、を参照)；
ｅ)ホルモン受容体：受容体に高親和性で結合するリガンドの測定は、ホルモン代替療法の開発に有用である；例えば、そのような受容体に結合するリガンドの同定は、血圧を制御するための薬物の開発に至り得る；ならびに
ｆ)オピエート受容体：脳中でオピエート受容体に結合するリガンドの測定は、モルヒネおよび関連薬に代わるより耽溺性の少ない代替物の開発に有用である：
が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２７】
本明細書において使用されるように、試料とは、アナライトのアッセイが望まれているアナライトを含有し得る任意のものを指す。試料は、生物学的流動体もしくは生物学的組織のような生物学的試料であり得る。生物学的流動体の例としては、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙、粘液、精液、羊水等が挙げられる。生物学的組織は、通常は、結合の、上皮の、筋肉のおよび神経の組織を含む、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、もしくはウイルスの構造の構造物質の一つを形成するそれらの細胞間物質と一緒になった特定の種類の細胞の凝集物である。生物学的組織の例としてはまた、器官、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞が挙げられる。
【０１２８】
本明細書において使用されるように、ミスマッチのパーセンテージの測定におけるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは次の通りである。
１)高度のストリンジェンシー：０.１×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、６５℃
２)中度のストリンジェンシー：０.２×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、５０℃
３)程度のストリンジェンシー：１.０×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、５０℃
【０１２９】
当業者は、洗浄段階が安定なハイブリッドを選択することを知り、そしてＳＳＰＥの成分を知っている(例えば、「分子クローニング：実験室マニュアル」中の、Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), vol. 3, p. B.13、を参照、また、通常に使用される実験室用溶液を記載する多数のカタログ、を参照)。ＳＳＰＥは、ｐＨ７.４のリン酸緩衝０.１８M  ＮａＣｌである。さらに、当業者はハイブリッドの安定性はＴｍによって測定されることを認識するが、これはイオン濃度と温度の関数であるので(Ｔｍ = ８１．５度−１６.６(ｌｏｇ10[Ｎａ+]) + ０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−６００/ｌ))、洗浄条件においてハイブリッドの安定性に決定的に重要な単なるパラメータは、ＳＳＰＥ(もしくはＳＳＣ)中のナトリウムイオン濃度と温度である。
【０１３０】
さらに別な緩衝液、塩および温度を用いて、同等のストリンジェンシーを達成し得ることは理解されている。例として、限定しないで、低度のストリンジェンシー条件を使用する手順は次の通りである(Shilo and Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792 (1981)、をまた参照)：ＤＮＡを含有するフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１％ＰＶＰ、０.１％Ficoll、１％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ(１０×ＳＳＣは、１．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０.１５Ｍクエン酸ナトリウムをｐＨ７に調整)を含有する溶液中で、４０℃で６時間前処理する。
【０１３１】
ハイブリダイゼーションは以下の修正を行った同じ溶液で行う：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ficoll、０.２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン、および５〜２０×１０６ｃｐｍ  ３２Ｐ−標識プローブを用いる。フィルターを、ハイブリダイゼーション用混液中４０℃で１８〜２０時間インキュベートして、次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳを含有する溶液中５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄液を新しい液に代えて、６０℃でさらに１.５時間インキュベートする。フィルターを吸い取り紙で乾かして、オートラジオグラフィーに曝露する。必要ならば、フィルターを６５〜６８℃で３回目の洗浄を行って、再びフィルムに曝露する。使用できる低度のストリンジェンシーの他の条件は当分野において周知である(例えば、種間ハイブリダイゼーションに使用されるように)。
【０１３２】
例として、限定しないで、中度のストリンジェンシー条件を使用する手順としては、例えば、次のような中度のストリンジェンシー条件を使用する手順が挙げられるが、これに限定されない：ＤＮＡを含有するフィルターを、６×  ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、５５℃で６時間前処理する。ハイブリダイゼーションを同じ溶液中で行い、５〜２０×１０６ cpm 32P−標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混液中に５５℃で１８〜２０時間インキュベートし、次いで１×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳを含有する溶液中で、６０℃で３０分２回洗浄する。フィルターを吸い取り紙で乾かして、オートラジオグラフィーに曝露する。使用され得る他の中度のストリンジェンシー条件は当分野において周知である。フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳを含有する溶液中で、３７℃で１時間行う。
【０１３３】
例として、限定しないで、高度のストリンジェンシー条件を使用する手順は以下の通りである：ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ficoll、０.０２％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから成る緩衝液中で、６５℃で８時間〜一夜の間行う。フィルターを、１００μｇ/mlの変性サケ精子DNAおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混液中で、６５℃で４８時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄を、２×ＳＳＣ、０.０１％ＰＶＰ、０.０１％Ficollおよび０.０１％ＢＳＡを含有する溶液中で、３７℃で１時間行う。これに引き続いて０.１×ＳＳＣ中で５０℃で４５分間洗浄の後、オートラジオグラフィーを行う。使用できる他の高度のストリンジェンシー条件は当分野において周知である。
【０１３４】
実質的同一または実質的に相同もしくは類似という用語は当業者により理解されているように文脈によって異なり、一般的には、少なくとも６０％もしくは７０％の同一性を意味し、好ましくは少なくとも８０％、８５％もしくはさらに好ましくは少なくとも９０％の同一性を意味し、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を意味する。
本明細書において使用されるように、生産物と実質的に同一とは、興味のある性質が十分に不変のままであるように、実質的に同一な生産物が生産物の代わりに使用し得るように、十分に類似していることを意味する。
【０１３５】
本明細書において使用されるように、実質的に純粋とは、そのような純度の評価に当業者が使用する薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィーのような、標準的な分析方法で容易に検出可能な不純物を含まないように見えるほど十分に均一であること、もしくはさらなる精製が物質の酵素及び生物活性のような物理的及び化学的性質を検出できるほどには変化させないと思われるほど十分純粋であること、を意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を生産するための化合物の精製方法は当業者に周知である。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体もしくは異性体の混合物であり得る。そのような場合には、さらなる精製は化合物の比活性を増加させるであろう。
本明細書において使用されるように、標的細胞とは、インビボでＳＰを発現する細胞を指す。
【０１３６】
本明細書において使用されるように、試験物質(もしくは試験化合物)とは、ＳＰ、特にプロテアーゼドメインもしくはその十分な部分を含む単鎖型、に対するその作用が本明細書において提供さるアッセイのようなインビトロ法により測定されるところの、化学的に規定された化合物(例えば有機分子、無機分子、有機／無機分子、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、脂質、多糖類、糖類、もしくは糖タンパク質のようなこれらの分子のハイブリッド、等)または化合物の混合物(例えば試験化合物のライブラリー、天然抽出物、もしくは培養上清、等)を指す。
【０１３７】
本明細書において使用されるように、用語の治療薬、治療レジメン、放射線防護剤および化学療法剤とは、当業者に周知である、ワクチンを含む、従来の薬物および薬物療法を意味する。放射線治療剤は当分野において周知である。
本明細書において使用されるように、処置とは、異常、障害もしくは疾患の症状が軽減されるかまたはさもなければ有益なように変化される、任意の様式を意味する。処置はまた、本明細書における成分の任意の薬学的使用を包含する。
【０１３８】
本明細書において使用されるように、ベクター(もしくはプラスミド)とは、異種核酸をその発現もしくは複製のどちらかのために細胞内に導入するために使用される個別的な要素を指す。ベクターは典型的には、エピゾームのままであるが、ゲノムの染色体内に遺伝子もしくはその一部を組み込ませるようにデザインされることもできる。酵母の人工染色体および哺乳動物の人工染色体のような人工染色体である、ベクターもまた意図される。そのようなビークルの選択および使用は当業者に周知である。発現ベクターとしては、そのようなＤＮＡフラグメントの発現を効果的にする能力があるところのプロモーター領域のような、調節配列に機能し得るように結合されたＤＮＡを発現する能力のあるベクターが挙げられる。かくして、発現ベクターとは、適切な宿主細胞の中への導入に際して、クローン化ＤＮＡの発現をもたらすところのプラスミド、ファージ、組換えウイルスもしくは他のベクターのような、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を指す。適切な発現ベクターは当業者に周知であって、真核細胞および／もしくは原核細胞において複製可能であるものならびにエピゾームのままであるもの、または宿主のゲノム内に組み込まれるものが挙げられる。
【０１３９】
本明細書において使用されるように、タンパク質結合配列とは、他のタンパク質もしくはペプチド配列に一般的に、特定のセットのタンパク質もしくはペプチド配列に、または特定のタンパク質もしくはペプチド配列に、特異的に結合する能力のあるタンパク質またはペプチド配列を指す。
【０１４０】
本明細書において使用されるように、エピトープタグとは、エピトープタグを付けたタンパク質もしくはペプチドの以後の生物学的および免疫学的分析を容易にするための、エピトープに相当するアミノ酸残基の短い一続きを指す。エピトープタギングは、エピトープタグの配列を適切な発現ベクター中のタンパク質コード化配列に含ませることにより達成される。エピトープタグを付けたタンパク質は、タグに対して育成した高度に特異的な抗体を用いてアフィニティー精製されることができる。
本明細書において使用されるように、金属結合配列とは、金属イオンに一般的に、特定のセットの金属イオンに、もしくは特定の金属イオン、に特異的に結合する能力のある、タンパク質またはペプチド配列を指す。
【０１４１】
本明細書において使用されるように、組合せとは、二つの間もしくはさらに多くの品目の間の任意の集まりを指す。
本明細書において使用されるように、組成物とは、任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、糊状物、水溶液、非水溶液、もしくはそれらの任意の組合せであり得る。
【０１４２】
本明細書において使用されるように、流動体とは、流れることのできる任意の組成物を指す。かくして、流動体は、半固形物、糊状物、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物を包含する。
本明細書において使用されるように、細胞抽出物とは、溶解もしくは破壊した細胞から作製された調製物もしくはフラクションを指す。
【０１４３】
本明細書において使用されるように、剤が、タンパク質単独もしくはその会合した基質、結合相手、等と一緒での会合に関与する特定の配列を考慮することなくランダムに選択されたときには、剤はランダムに選択されたと言われる。ランダムに選択された剤の例は、ケミカルライブラリーもしくはペプチドのコンビナトリアルライブラリー、または生物の培養液もしくは馴化培地の使用である。
【０１４４】
本明細書において使用されるように、剤の作用との関連で標的部位の配列および／もしくはそのコンフォーメーションを考慮に入れる、非ランダム基準で剤が選択されるときには、剤は合理的に選択されるもしくはデザインされると言われる。実施例に記載されるように、配列番号３もしくは配列番号４を有するタンパク質中にセリンプロテアーゼに対する提案された結合部位および(触媒)部位が存在する。剤は、これらの部位を作り上げているペプチド配列を利用することにより合理的に選択されるかもしくは合理的にデザインされ得る。例えば、合理的に選択されたペプチド剤は、そのアミノ酸配列がドメインのＡＴＰもしくはカルモジュリン結合部位と同一である、ペプチドであり得る。
開示を明確にするために、限定という目的ではなく、詳細な説明を以下のサブセクションに分類する。
【０１４５】
Ｂ．ＭＴＳＰ９ポリペプチド、その突然変異タンパク質、誘導体および類似体
ＭＴＳＰ
ＭＴＳＰは、哺乳動物およびまた他の動物種にも見出される、膜貫通型セリンプロテアーゼのファミリーである。ＭＴＳＰは、それらが腫瘍細胞中で通常細胞中とは異なるレベルで発現および／もしくは活性化されているか、または腫瘍細胞中で正常細胞中とは、それの基質、または補助因子もしくは受容体の変化によるように異なる、機能活性を有しているらしいために、興味深い。
【０１４６】
ＭＴＳＰは、タンパク質分解活性を有する細胞外Ｃ末端ドメイン；Ｎ末端近くに疎水性ドメインを持つ膜貫通ドメイン；短い細胞質内ドメイン；およびさらに別なモジュラードメインを含有し得る、異なる長さの幹領域：を含む多数の共通の構造的特徴を共有する。タンパク質分解活性ドメインは、保存されているモチーフ中に存在する、触媒活性に必要な保存されたＨｉｓ、Ａｓｐ、およびＳｅｒ残基を含む配列ホモロジーを共有している。ＭＴＳＰは通常、チモーゲンとして合成されて、切断により２本鎖型に活性化されることができる。単鎖タンパク質分解活性ドメインがインビトロで機能することができ、したがってこのファミリーのメンバーの活性を調節する、剤を同定するためのインビトロアッセイに有用であることが、本明細書において示される。
【０１４７】
本明細書における目的には、ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインは、２本鎖活性化生成物を生産する活性化切断によりもたらされる必要はなくて、むしろ単鎖ポリペプチドを含み、そこではＮ−末端としては、コンセンサス配列（下矢）ＶＶＧＧ、（下矢）ＩＶＧＧ、（下矢）ＶＧＬＬ、（下矢）ＩＬＧＧ、（下矢）ＩＶＱＧもしくは（下矢）ＩＶＮＧ（下矢）ＩＡＳＧまたは他のそのようなモチーフが挙げられる。そのようなポリペプチドは、活性化切断の結果ではなくそして２本鎖型ではないが、タンパク質分解(触媒)活性を示す。これらのプロテアーゼドメインポリペプチドをアッセイに使用して、ＭＴＳＰ９の活性を調節する剤をスクリーニングする。
【０１４８】
ＭＴＳＰファミリーは治療的介入のための標的であり、そして或るメンバーはまた、腫瘍発生、成長および／もしくは進行の診断マーカーとして役立つことができる。議論したように、このファミリーのメンバーは、腫瘍発生、成長および／もしくは進行に関係している、タンパク質分解過程に関与している。この関係は、ＥＣＭの分解および／もしくはリモデリング、ならびに増殖因子前駆体、プロホルモンもしくは血管新生性化合物前駆体の活性化に関連した過程におけるタンパク質分解酵素としてのそれらの機能に基づいている。加えて、それらの発現のレベルもしくは活性化のレベルまたは基質レベル、もしくは基質およびそのレベルの変化によりもたらされるそれらの見かけの活性は、同一組織中の腫瘍細胞および非腫瘍細胞で異なる。同様に、これらのプロテアーゼの補助因子もしくは受容体のレベルは、腫瘍および非腫瘍細胞間で異なり得る。したがって、それらのタンパク質分解活性およびシグナル伝達のようなそれらの活性、ならびに／またはそれらの活性および／もしくは発現を調整する化合物とそれらを接触させることによるような、それらの発現を変化させるプロトコールおよび処置は、腫瘍発生、成長および／もしくは進行に影響を及ぼすことができであろう。また、或る場合には、活性化および／もしくは発現のレベルは、肺癌、結腸腺癌ならびに卵巣癌のような腫瘍において変化し得る。
【０１４９】
ＭＴＳＰ９
ＭＴＳＰ９は、それが腫瘍細胞中で発現されるかもしくは活性であるため興味深い。本明細書において提供されるＭＴＳＰは、新生物形成性疾患を有しない単数もしくは複数の対象と比較しての、新生物形成性疾患を持つ対象(即ち哺乳動物、特にヒト)における活性および／または発現もしくは機能のレベルのお陰で、特定の腫瘍の診断マーカーとして役立つことができる。加えて、特定の組織における活性(および／もしくは発現)の検出は、新生物形成性疾患を示し得る。本明細書において提供されるＭＴＳＰ９は、特定の腫瘍において発現および／もしくは活性化されている；したがってそれらの活性化もしくは発現は腫瘍の発生、成長および／もしくは進行の診断マーカーとして役立つことができることが、本明細書において示される。他の場合には、ＭＴＳＰポリヌクレオチドは、補助因子、基質もしくは受容体の活性もしくは発現の変化のお陰で変化した活性を示すことができる。加えて、いくつかの場合には、これらのＭＴＳＰおよび／もしくはその突然変異体は細胞表面から脱落することができる。血清、血液、唾液、脳脊髄液、滑液および間質液、尿、汗ならびに他のそのような流動体および分泌物のような体液中の、脱落したＭＴＳＰ、特に細胞外プロテアーゼドメイン、の検出は、診断用腫瘍マーカーとして役立つことができる。特に、任意の新生物形成性疾患をも有していないことが知られている対象と比較して、もしくは同一対象の初期のサンプルと比較して、対象中のそのような脱落ポリペプチドのより高いレベルの検出は、対象における新生物形成性疾患を示し得る。
【０１５０】
ポリペプチドおよび突然変異タンパク質
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインを含有する、単離された、実質的に純粋な単鎖および２本鎖ポリペプチドが、本明細書において提供される。ポリペプチドはまた、アミノ酸の他の非ＭＴＳＰ配列を含有することができるが、本明細書において提供される任意のような、そのようなプロテアーゼ活性を評価する任意のインビトロアッセイにおいて触媒活性を示すために、プロテアーゼドメインもしくはその充分な部分を含む。
本明細書において提供されるＭＴＳＰ９は、典型的にはそれらが同じタイプの非腫瘍細胞において発現もしくは活性化されるレベルとは異なったレベルで、腫瘍細胞によりもしくはその中で発現または活性化される。したがって、例えば、もしＭＴＳＰが子宮頚部腫瘍において発現しているならば、それは非腫瘍子宮頚部細胞におけるものとは異なるレベルで発現しているかもしくは活性である。ＭＴＰＳ９の発現もしくは活性化は子宮頚部、肺、食道、結腸、前立腺、子宮、膵臓、乳房および他の腫瘍を示し得る。
【０１５１】
プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分を含む、単離された、実質的に純粋なプロテアーゼが提供される。ＭＴＳＰ９の単鎖型および２本鎖型が提供される。プロテアーゼドメインはさらに長いタンパク質に含有されることができて、そのようなさらに長いタンパク質は、任意にＭＴＳＰ９チモーゲンである。例示的なＭＴＳＰ９コード化核酸およびプロテアーゼドメインのタンパク質配列は、配列番号５および６に示され、そして完全長タンパク質およびコード化する核酸の配列は配列番号１８および１７に示される。かくして、ＭＴＳＰ９ポリペプチドは、配列番号６、１６もしくは１８に示されるアミノ酸配列を含む。プロテアーゼ活性を保持するそのより小さいタンパク質が意図される。そのプロテアーゼドメインは配列番号１６に示される。
【０１５２】
実質的に精製されたＭＴＳＰ９は、配列番号５もしくは１７のいずれに示されるヌクレオチド配列によりコード化されるプロテアーゼドメインを含有する核酸分子と、そのプロテアーゼドメインをコード化する核酸がその全長、または完全長の少なくとも７０％、８０％もしくは９０％に沿ってハイブリダイズするような、少なくとも中等度の、一般的には高度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするところの核酸によりコード化される。特定の実施態様では、実質的に精製されたＭＴＳＰプロテアーゼは、配列番号６もしくは１８に示されるアミノ酸配列またはそのプロテアーゼドメイン部分、またはその触媒的に活性な部分を実質的に含むところの単鎖ポリペプチドである。
【０１５３】
また、実質的に精製されたＭＴＳＰ９チモーゲン、活性化された２本鎖型、単鎖プロテアーゼドメインおよび２本鎖プロテアーゼドメインが含まれる。これらのポリペプチドは、タンパク質分解酵素活性を示すプロテアーゼドメインをコード化する配列を含むところの、そして配列番号５もしくは７に示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子と、典型的には中等度の、一般的には高度のストリンジェンシー下で、そして一般的には完全長に沿って、もしくはプロテアーゼドメインの完全長の少なくとも約７０％、８０％もしくは９０％(もしくは実質的に完全長)に沿ってハイブリダイズするところの、核酸によりコード化される。スプライスバリアントもまた、本明細書において意図される。
【０１５４】
プロテアーゼドメイン
ＭＴＳＰプロテアーゼドメインとしては、ＭＴＳＰ９の単鎖プロテアーゼドメインが挙げられる。任意のＭＴＳＰ、特にＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインである、ＭＴＳＰの部分を含むところのプロテアーゼドメインもしくはタンパク質が、提供される。タンパク質はまた、アミノ酸の他の非ＭＴＳＰ配列をも含むことができるが、本明細書において提供される任意のような、そのようなプロテアーゼ活性を評価する任意のインビトロアッセイにおいて触媒活性を示すように、プロテアーゼドメインもしくはその充分な部分を含む。また、完全長プロテアーゼの２本鎖活性化型およびまたプロテアーゼドメインの２本鎖型が、提供される。
【０１５５】
かくして、プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分をＳＰの単鎖型として含む、単離された、実質的に純粋なプロテアーゼが、提供される。プロテアーゼドメインは、さらに長いタンパク質中に含まれることもできて、そのようなさらに長いタンパク質は、任意にＭＴＳＰ９チモーゲンである。
特に、例示的なプロテアーゼドメインは、配列番号１６中のアミノ酸２０６〜４３８に示されるアミノ酸配列(配列番号１５および１７によりコード化される)の少なくとも充分な部分を含有する。
【０１５６】
記述のように、ＭＴＳＰのプロテアーゼドメインは、チモーゲンが活性化されるとき切断部位(一般的には、矢印は切断部位を表す、コンセンサス配列Ｒ（下矢）ＶＶＧＧ、Ｒ（下矢）ＩＶＧＧ、Ｒ（下矢）ＩＶＱ、Ｒ（下矢）ＩＶＮＧ、Ｒ（下矢）ＩＬＧＧ、Ｒ（下矢）ＶＧＬＬ、Ｒ（下矢）ＩＬＧＧもしくはそのバリエーション；Ｎ末端Ｒ（下矢）ＶまたはＲ（下矢）Ｉ)において生成したＮ末端(ＩＶ、ＶＶ、ＩＬおよびＩＩのような)を持つ、単鎖ポリペプチドまたは２本鎖ポリペプチドである。Ｒ１８５およびＩ１８６の間の活性化切断(Ｒ（下矢）Ｉ)により生成された例示的ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインは、配列番号１７および１８に示すように、配列Ｒ（下矢）ＩＡＳＧを含む。
【０１５７】
突然変異タンパク質および誘導体
完全長ＭＴＳＰ９、チモーゲンおよびその活性化型ならびにＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメイン、その部分、ならびにそのようなポリペプチドの突然変異タンパク質および誘導体が、提供される。機能的に活性であり、そしてセリンプロテアーゼ活性、免疫原性および抗原性のような、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに関連する一つもしくはそれ以上の機能活性を示す能力のあるところのＭＴＳＰ９のドメイン、フラグメント、誘導体もしくは類似体が提供される。
【０１５８】
誘導体の中には、マウスおよびラットのようなげっ歯類；ニワトリのような鳥類；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジのような反芻動物；ブタのような豚；およびヒトを含むが、それらに限定されない、動物のＭＴＳＰ９に基づくものがある。例えば、ＭＴＳＰ誘導体は、それらの配列を置換、付加もしくは欠失により変化することにより作成することができる。ＭＴＳＰ９誘導体としては、一次アミノ酸配列として、機能的に同等なアミノ酸残基が配列中の残基と置換されてサイレントな変化をもたらす変化した配列を含む、ＭＴＳＰ９のアミノ酸配列の全部もしくは一部を含有するものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、配列内の一つもしくはそれ以上のアミノ酸残基は、機能的同等物として作用する類似の極性のもう一つのアミノ酸により置換されて、サイレントな変化をもたらすことができる。配列内のアミノ酸の代替品は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した(酸性)アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる(例えば表１を参照)。アミノ酸の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％までが他のアミノ酸で置換された、ＭＴＳＰ９の突然変異タンパク質またはプロテアーゼドメインのようなそのドメインが、提供される。一般的には、そのような突然変異タンパク質は、突然変異していないタンパク質のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％を保持する。
【０１５９】
アミノ酸の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％までが、さらに別なアミノ酸で置換されたところのＭＴＳＰ９の突然変異タンパク質またはプロテアーゼドメインのようなそのドメイン、が提供される。一般的には、そのような突然変異タンパク質は、突然変異していないタンパク質のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％を保持している。
【０１６０】
本明細書において提供されるポリペプチドの中には、特異性およびプロテアーゼ活性が実質的に不変であるか、もしくは１０、２０、３０、４０、５０％のような特定のパーセントだけ変化する(増加するもしくは減少する)ようなアミノ酸変化を持つＭＴＳＰ９プロテアーゼドメインもしくはポリペプチドが含まれる。特に、膜貫通ドメインを有し、それに加えて膜貫通(ＴＭ)ドメイン、ＳＥＡドメインおよびセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含むことができる、実質的に精製された哺乳動物ＭＴＳＰポリペプチドが提供される。
【０１６１】
また、ＭＴＳＰ９と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含有する実質的に精製されたタンパク質が提供されて、そこではパーセンテージ同一性は、パーセンテージ同一性を最大にする標準的なアルゴリズムおよびギャップペナルティーを用いて測定される。他の哺乳動物のＭＴＳＰ９ポリペプチドが意図されるが、ヒトＭＴＳＰ９が含まれる。同一性の正確なパーセンテージは、もし必要ならば、特定されることができる。
【０１６２】
一つもしくはそれ以上のＣｙｓ残基、特に活性化２本鎖型中では対をなしているがプロテアーゼドメインのみの中では対をなしていない残基、が任意のアミノ酸、必ずしもではないが、典型的にはセリンのような保存的アミノ酸残基、により置換された突然変異タンパク質が意図される。ＭＴＳＰ９におけるジスルフィド結合対は次の通りである：Ｃ１７５−Ｃ２９２、Ｃ２１２−Ｃ２２８、Ｃ３３７−Ｃ３５３、Ｃ３６４−Ｃ３９３。Ｃｙｓ２９２はプロテアーゼドメイン内にあって、単鎖型のプロテアーゼドメイン内では対をなしていない。ＭＴＳＰ９の突然変異タンパク質、特に単鎖プロテアーゼドメイン内のＣｙｓ２９２のようなＣｙｓ残基が、活性を消失させないＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａのようなもう一つのアミノ酸で置換されたものが、提供される。また、配列番号１６に示すアミノ酸配列を含むプロテアーゼドメインもしくはその触媒活性部分、または配列番号１８に示すアミノ酸配列を含むプロテアーゼもしくはそのドメインと少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するところの触媒活性ドメインもしくはその部分を含む、実質的に精製されたＭＴＳＰ９ポリペプチドおよびその機能性ドメインが、提供される。
【０１６３】
アミノ酸が他のアミノ酸で置換された、タンパク質の突然変異タンパク質もまた提供される。突然変異タンパク質の中には、Ｃｙｓ残基がセリンのような保存的アミノ酸残基で典型的に置換されたものがある。そのような突然変異タンパク質はまた、本明細書において提供される。アミノ酸の１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％もしくはそれ以上が置換されているが、得られたポリペプチドが同じ基質に対して非修飾型の触媒活性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、３５％,  ４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％を保持しているところの突然変異タンパク質が提供される。
【０１６４】
突然変異タンパク質は、保存的アミノ酸置換およびまた非保存的アミノ酸置換を行うことにより作成させることができる。例えば、タンパク質の性質を望ましく変化させるアミノ酸置換を行うことができる。一つの実施態様ではは、ポリペプチドの分解を予防する突然変異を行うことができる。多くのプロテアーゼは、ＲおよびＫのような塩基性残基の後で切断する；そのような切断をなくすために、塩基性残基が非塩基性残基で置換される。また、プロテアーゼドメイン外のアミノ酸における非保存的変化を、プロテアーゼ活性を変化させることなく実施することができる。プロテアーゼ活性以外の活性に責任があるアミノ酸の非保存的変化は、望ましいであろう。例えば、阻害剤のプロテアーゼとの相互作用部位における非保存的な変化を行うことにより、触媒活性を保持しつつ、プロテアーゼの阻害剤との相互作用をブロックすることができる。同様に、受容体とプロテアーゼとの相互作用部位における非保存的なもしくは保存的な置換を行うことにより、触媒活性を変えることなく受容体結合を変えることができる。
【０１６５】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０個、および典型的に１０〜１５個のアミノ酸を含む抗原エピトープが、提供される。これらの抗原エピトープは、例えば、抗体を育成するために使用される。それぞれのエピトープに特異的な抗体もしくはその組合せ、ならびに単鎖および２本鎖型に対して特異的な抗体がまた、提供される。
【０１６６】
核酸分子、ベクターおよびプラスミド、細胞およびＭＴＳＰ９ポリペプチドの発現
核酸分子
ヌクレオチドのコード配列の縮重性により、ＭＴＳＰのような実質的に同一のアミノ酸配列をコード化する、他のヌクレオチド配列が意図される。これらとしては、配列内のアミノ酸残基をコード化する異なるコドンの置換により変更され、かくしてサイレントな変化を生成する、ＭＴＳＰ９コード化遺伝子の全部もしくは一部を含むところの核酸分子が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６７】
核酸
また、ＭＴＳＰ９をコード化する核酸分子およびコード化されたタンパク質が、本明細書において提供される。特に、そのスプライスバリアントを含む、動物由来のＭＴＳＰ９をコード化する核酸分子が提供される。また、コード化されたタンパク質が提供される。また、その機能ドメインが提供される。提供されるそれぞれの核酸分子について、核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは他の核酸類似体であり得て、または非天然ヌクレオチド塩基を含み得る。また、ＭＴＳＰ９をコード化するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドの配列を含む、単離核酸分子が、提供される。
【０１６８】
また、インビトロタンパク質分解酵素アッセイにおいてタンパク質分解活性を有し、そしてＭＴＳＰ９ポリペプチドの完全長プロテアーゼドメインと少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％,、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するところの、またはプロテアーゼドメインをコード化する核酸と、特に中等度、一般的には高度のストリンジェンシーで、それらの完全長に沿って、もしくは完全長核酸の少なくとも約７０％、８０％もしくは９０％に沿ってハイブリダイズするところの単鎖もしくは２本鎖ＭＴＳＰプロテアーゼをコード化する核酸分子が、提供される。上のように、コード化されたポリペプチドは、プロテアーゼを単鎖として含有する；その活性化型を生産し提供することができる。
【０１６９】
一つの実施態様では、ＭＴＳＰ９と呼称されるＭＴＳＰをコード化する核酸分子が、提供される。核酸分子は、配列番号１７に示すヌクレオチド配列内のオープンリーディングフレームを含む。また、少なくとも程度、中等度のストリンジェンシー、そして一般的には高度のストリンジェンシーの条件下で、以下の核酸配列(配列番号５もしくは１７)に、特にその単鎖プロテアーゼドメインにもしくはＭＴＳＰ９の任意のドメインをコード化する、ヌクレオチドにより包含されるオープンリーディングフレームに、ハイブリダイズする核酸分子が、提供される。
【０１７０】
特定の実施態様では、単離核酸フラグメントは、配列番号５もしくは１７に示されるヌクレオチド配列を有する核酸と高度なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし、そして一般的には配列５また１７に示されるヌクレオチド配列を含有する。タンパク質は、膜貫通ドメイン(ＴＭ)およびセリンプロテアーゼドメインを含有する。
【０１７１】
また、アミノ酸が他のアミノ酸で置換される、ポリペプチドをコード化する核酸分子の突然変異タンパク質が提供される。突然変異タンパク質の中には、Ｃｙｓ残基をコード化するコドンが、セリンをコード化するコドンのような、他のアミノ酸残基で置換されるものがある。そのような突然変異タンパク質がまた、本明細書において提供される。そのようなドメインのそれぞれ、およびそのようなドメインをコード化するヌクレオチド配列を含む、核酸分子が本明細書において提供される。これに加えて、或るＭＴＳＰは、ＬＤＬＲドメイン、スカベンジャー受容体のシステインに富む(ＳＲＣＲ)ドメインおよび他のドメインを含むことができる。
【０１７２】
単離核酸フラグメントは、ゲノムもしくはｃＤＮＡを含むＤＮＡ、またはＲＮＡであり、またはタンパク質核酸および他のヌクレオチド類似体のような他の成分を含むことができる。単離核酸は、異種的なもしくは固有のプロモーターのようなさらに別な成分、ならびに他の転写および翻訳調節配列を含むことができて、これらの遺伝子は、受容体遺伝子もしくは他のインディケーター遺伝子またはインディケーターをコード化する遺伝子のような、他の遺伝子に連結することができる。
【０１７３】
また、ＭＴＳＰ９をコード化する上述のヌクレオチド配列と、少なくとも低度のストリンジェンシー、中等度のストリンジェンシー、および典型的には高度のストリンジェンシーでハイブリダイズし、そしてプロテアーゼドメインおよび／もしくは完全長または完全長プロテアーゼドメイン、もしくはＭＴＳＰ９の他のドメインまたはそのスプライスバリアントもしくは対立遺伝子突然変異体の少なくとも７０％、８０％もしくは９０％をコード化するところの核酸分子が、提供される。一般的には、分子は、そのような条件下で少なくとも一つのドメインに対する完全長に沿って、または完全長の少なくとも７０％、８０％もしくは９０％に沿ってハイブリダイズし、そしてポリペプチドのプロテアーゼもしくは細胞外ドメインのような少なくとも一つのドメインをコード化する。特に、そのような核酸分子は、膜セリンプロテアーゼドメインの少なくとも一つのドメインをコード化する任意の単離核酸フラグメントを含み、それは、(１)プロテアーゼもしくはそのドメインをコード化するヌクレオチド配列を含有し、そして(２)、
(ａ)配列１５もしくは１７に示されるヌクレオチド配列を含む、プロテアーゼもしくはそのドメインをコード化するヌクレオチドの配列；
(ｂ)そのような部分もしくは完全長のプロテアーゼをコード化し、そしてそのようなタンパク質またはそのフラグメントをコード化する、哺乳動物中に存在するｍＲＮＡ転写物に相補的である核酸に一般的には、高度のストリンジェンシー下でハイブリダイズするところのヌクレオチドの配列；
(ａ)配列番号５、１５もしくは１７に示される配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、プロテアーゼまたはそのドメインをコード化するところのヌクレオチド配列；
(ｃ)そのような部分もしくは完全長のオープンリーディングフレームによりコード化されるアミノ酸の配列を含む、膜貫通プロテアーゼもしくはそのドメインをコード化するところのヌクレオチドの配列；
(ｄ)配列番号５、１５もしくは１７に示される配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の配列同一性を有するヌクレオチドの配列を含む、プロテアーゼもしくはそのドメインをコード化するところのヌクレオチドの配列；および
(ｅ)そのようなサブユニットをコード化するヌクレオチドの配列によりコード化されるアミノ酸の配列を含む膜貫通プロテアーゼをコード化し、そしてｍＲＮＡ転写物に相補的であるＤＮＡに低度、中等度、もしくは高度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするところのヌクレオチドの配列：
の中から選択される。
【０１７４】
単離された核酸は、ＭＴＳＰ９コード化配列の少なくとも１０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、もしくは２００ヌクレオチドまたはそれより多くの連続したヌクレオチド、または完全長ＳＰコード化配列を含有することができる。もう一つの実施態様では、核酸は、３５、２００もしくは５００ヌクレオチド長より小さい。ＭＴＳＰ９コード化核酸分子とハイブリダイズするかもしくは相補的である核酸は、単鎖もしくは2本鎖であり得る。例えば、ＭＴＳＰ９コード化核酸の少なくとも１０、２５、１００もしくは２００ヌクレオチドもしくは全コード領域、特にそのプロテアーゼドメインに相補的な(特に逆の相補体である)配列を含む核酸が、提供される。ＭＴＳＰ９については、完全長タンパク質またはそのドメインもしくは活性フラグメントがまた、提供される。
【０１７５】
プローブ、プライマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｄｓＲＮＡ
また、プローブもしくはプライマーとして使用することができて、そして少なくとも約１０ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、一般的には少なくとも約１６ヌクレオチド、しばしば少なくとも約３０ヌクレオチドを含有する、そのフラグメントが、提供される。プローブもしくはプライマーの長さは、探索されるゲノムのサイズの関数である；ゲノムが長ければ長いほど、単一の部位への特異的ハイブリダイゼーションに必要なプローブもしくはプライマーは長くなる。当業者は適切なサイズのプローブおよびプライマーを選択することができる。一般的には、説明されるプローブおよびプライマーは単鎖である。２本鎖のプローブおよびプライマーは、もしそれらが使用するときに変性されるならば、使用されることができる。
【０１７６】
核酸分子から由来したプローブおよびプライマーが、提供される。そのようなプローブおよびプライマーは、一般的には配列番号５のヌクレオチド６３４〜７１もしくは配列番号１７のヌクレオチド１１６２〜１２７９を除くＭＴＳＰ９の連続したヌクレオチドと同一性を持つ少なくとも８、１４、１６、３０、１００個もしくはそれより多い連続したヌクレオチド、および配列番号５のヌクレオチド６３４〜７３４を除く(配列番号１８のヌクレオチド１１６２〜１２６２を除く)、配列番号５のヌクレオチドの少なくとも３０、５０もしくは１００個の連続した配列をを持つプローブを含有する。プローブおよびプライマーは、放射標識もしくは蛍光タグのような検出可能な標識で任意に標識され、または質量分析もしくは他の方法による検出用に質量を異にすることができる。
【０１７７】
また、ＭＴＳＰ９をコード化するヌクレオチド配列もしくはその部分に相補的である分子の配列を含む、単離核酸分子が、提供される。ＲＮＡｉのような２重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)がまた、提供される。
【０１７８】
プラスミド、ベクターおよび細胞
核酸分子を含有するプラスミドおよびベクターがまた、提供される。コード化されたタンパク質を発現する細胞を含む、ベクターを含有する細胞が、提供される。細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、もしくは動物細胞であり得る。例えば、コード化されたＭＴＳＰが細胞により発現される条件下で細胞を成長させ、そして発現したタンパク質を回収することにより、ＭＴＳＰもしくはその単鎖型のプロテアーゼドメインを生産する方法が、本明細書において提供される。記述のように、ＭＴＳＰ９については、完全長のチモーゲンおよび活性化タンパク質ならびに活性化(２本鎖)プロテアーゼおよび単鎖プロテアーゼドメインが、提供される。本明細書において説明されるように、細胞は、分泌されるかもしくは細胞質中で発現されることができるタンパク質の発現に使用される。
【０１７９】
以下に議論するように、ＭＴＳＰ９ポリペプチド、およびその触媒的に活性な部分、を細胞の表面上で発現することができる。加えて、その全部もしくは一部を、天然もしくは異種のシグナルを用いて分泌タンパク質として発現することができる。これに代えて、ポリペプチドの全部もしくは一部を細胞質中に封入体として発現させて、それから単離することができる。得られたタンパク質は、必要ならば、折りたたみ直すように処理することができる。
上の議論は、例示したＭＴＳＰ９の概観および若干の詳細を提供する。
【０１８０】
Ｃ．腫瘍特異性および組織発現プロフイール
それぞれのＭＴＳＰは、特徴的な組織発現プロフイールを有している；特に、ＭＴＳＰはひたすら腫瘍中に限って発現されるかもしくは活性化されているわけではないが、特徴的な主要組織発現もしくは活性化のプロフイールを示す。或る場合には、ＭＴＳＰの見かけの機能的活性を変えるところのその基質もしくは補助因子または受容体の変化のお陰で、ＭＴＳＰは腫瘍細胞中において非腫瘍細胞とは異なる活性を有し得る。したがって、新生物形成性疾患を有しない単数もしくは複数の対象と比較しての、新生物形成性疾患を持つ対象(即ち哺乳動物、特にヒト)における活性および／もしくは発現のレベルのお陰で、それぞれが特定の腫瘍の診断マーカーとして役立ち得る。加えて、特定の組織における活性(および／もしくは発現)の検出は、新生物形成性疾患を示し得る。体液中の脱落したＭＴＳＰは、新生物形成性疾患を示し得る。また、それぞれの活性および／発現プロフイールのお陰で、それらはその活性のモジュレーターの投与、もしくはＭＴＳＰの一つにより特異的に活性化されるプロドラッグの投与によるような、治療の標的として役立ち得る。
【０１８１】
組織発現プロフイール
ＭＴＳＰ９
ＭＴＳＰ９は食道に高レベルで発現し、多くの他の組織では低レベルで発現する。ＭＴＳＰ９の転写物は、腎臓(成人および胎児)、脾臓(成人および胎児)、胎盤、肝臓(成人および胎児)、胸腺、末梢血リンパ球、肺(成人および胎児)、膵臓、リンパ節、骨髄、気管、子宮、前立腺、精巣、卵巣ならびに腺器官(乳腺、副腎、甲状腺、脳下垂体および唾液腺)に見出される。ＭＴＳＰ９はまた、食道腫瘍組織中に、肺癌中に、および低レベルで結腸直腸癌、リンパ腫、子宮頚癌(ＨｅＬａＳ３)ならびに白血病細胞株中にで発現されている。
【０１８２】
Ｄ．ＭＴＳＰ９ポリペプチド遺伝子の同定および単離
ＭＴＳＰポリペプチドおよび／もしくはそのドメインは、タンパク質精製ならびに組換えタンパク質発現のための当分野において公知の方法により得られることができる。所望の遺伝子をコード化する核酸の同定のための当業者周知の任意の方法を、使用することができる。当分野において利用できる任意の方法を使用して、ＭＴＳＰポリペプチドをコード化する完全長(即ち、全コード領域を包含する)ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡクローンを得ることができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用して、正常および腫瘍細胞または組織中に発現される配列、例えばゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリー中のＭＴＳＰポリペプチド(配列番号５および１７)をコード化する核酸、を増幅することができる。同定された配列の３’および５’末端で配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーをプライマーとして使用して、適切な供給源(例えば腫瘍もしくは癌細胞)からの核酸のサンプル(ＲＮＡもしくはＤＮＡ)、一般的にはｃＤＮＡライブラリー、をＰＣＲで増幅することができる。
【０１８３】
ＰＣＲは、例えばPerkin-Elmer CetusサーマルサイクラーおよびＴａｑポリメラーゼ(Gene Amp[登録商標])を用いて実施されることができる。増幅されるＤＮＡは、任意の真核生物種よりのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。ＰＣＲ反応における使用のために、いくつかの異なる縮重プライマーを合成することを選択することができる。既知のヌクレオチド配列および単離される核酸同族体の間の、大きなもしくは小さな程度のヌクレオチドの類似性を許容することにより、核酸同族体を増幅するために(例えば、ヒト以外の生物種からのＭＴＳＰポリペプチド種を得るために、もしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドに相同なヒト配列を得るために)、ＰＣＲ反応のプライミングにおいて使用されるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることが、また可能である。種間ハイブリダイゼーションのためには、低いストリンジェンシーから中等度のストリンジェンシーの条件が、使用される。同種のハイブリダイゼーションのためには、中等度のストリンジェンシーから高度のストリンジェンシーの条件が、使用される。条件を、経験的に決定することができる。
【０１８４】
同定されたＭＴＳＰポリペプチド配列の全部もしくは一部を含有する核酸、もしくはＭＴＳＰポリペプチド同族体の全部もしくは一部をコード化する核酸の成功裏の増幅後、そのセグメントを分子的にクローニングしてシークエンシングし、完全なｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡを単離するために使用することができる。これは今度は、遺伝子の完全なヌクレオチドの決定、その発現の分析、および機能分析のためのそのタンパク質生成物の生産を可能にする。一旦ヌクレオチド配列が決定されれば、ＭＴＳＰポリペプチド遺伝子のタンパク質産物をコード化するオープンリーディングフレームを、オープンリーディングフレームの決定のための当分野において公知の任意の方法、例えば公けに利用可能なヌクレオチド配列分析のためのコンピュータープログラムを用いて、決定することができる。一旦オープンリーディングフレームが規定されれば、オープンリーディングフレームによりコード化されるタンパク質のアミノ酸配列を決定することは、日常的である。この方式で、全ＭＴＳＰポリペプチド遺伝子のヌクレオチド配列ならびにＭＴＳＰポリペプチドタンパク質および類似体のアミノ酸配列を、同定することができる。
【０１８５】
任意の真核細胞は潜在的に、ＭＴＳＰポリペプチドの遺伝子の分子クローニングのための核酸供給源として役立ち得る。核酸を、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、ならびにさらに別な霊長類供給源、昆虫、植物および他の生物から、単離することができる。ＤＮＡを、クローン化ＤＮＡ(例えばＤＮＡ''ライブラリー'')から化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、もしくは所望の細胞より精製されたゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメントのクローニングにより、当分野において公知の標準的手順で得ることができる(例えば、Sambrook et al. 1989、「分子クローニング、実験室マニュアル、第２版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985、「ＤＮＡクローニング：実際的アプローチ」、MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II、を参照)。ゲノムＤＮＡから由来したクローンは、コード化領域に加えて調節およびイントロンのＤＮＡ領域を含有し得る；ｃＤＮＡから由来したクローンは、エクソン配列のみを含有しているであろう。任意の供給源についても、遺伝子は、その増幅のために適当なベクターの中にクローン化される。
【０１８６】
ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいては、ＤＮＡフラグメントが作成され、そのいくつかが所望の遺伝子をコード化するであろう。ＤＮＡを、種々の制限酵素を用いて特定の部位で切断することができる。これに代えて、マンガンの存在下にＤＮＡアーゼを使用して、ＤＮＡを断片化することができるか、もしくはＤＮＡを、例えば、超音波処理により物理的に剪断することができる。線状のＤＮＡフラグメントは次いで、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーを含むが、それらに限定されない、標準的な技法により、サイズにしたがって分離することができる。
【０１８７】
一旦ＤＮＡフラグメントが生成されれば、所望の遺伝子を含有する特定のＤＮＡフラグメントの同定を、多数の方式で達成することができる。例えば、ＭＴＳＰポリペプチド(任意の背栄物種の)の遺伝子(例えば、上述のようにして得られたＰＣＲ増幅産物、もしくは既知のヌクレオチド配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチド)またはその特異的ＲＮＡもしくはその断片を、精製して、標識し、そして生成されたＤＮＡフラグメントを標識されたプローブとの核酸のハイブリダイゼーションにより、スクリーニングすることができる(Benton and Davis, Science 196:180 (1977); Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961 (1975))。プローブに実質的に相同性を持つこれらのＤＮＡフラグメントは、ハイブリダイズするであろう。
【０１８８】
制限酵素消化(複数を含む)、そして、それが利用可能ならば、既知の制限マップにしたがって予想されるサイズとのフラグメントのサイズを比較することにより、もしくはＤＮＡ配列分析およびＭＴＳＰポリペプチドの既知のヌクレオチド配列との比較により、適切なフラグメントを同定することがまた、可能である。さらなる選択を、遺伝子の性質に基づいて行うことができる。これに代えて、遺伝子の存在を、その発現された産物の物理的、化学的、もしくは免疫学的性質に基づくアッセイにより検出することができる。例えば、例えば類似のもしくは同一の電気泳動移動度、等電点電気泳動の挙動、タンパク質分解酵素による消化マップ、抗原的性質、セリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生産するところの、適切なｍＲＮＡとハイブリッドを形成して選択するｃＤＮＡクローンもしくはＤＮＡクローンを選択することができる。もし抗ＭＴＳＰポリペプチド抗体が利用可能ならば、タンパク質は、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検査法)タイプの手順により、推定的にＭＴＳＰポリペプチドを合成するクローンへの標識抗体の結合によって同定されることができる。
【０１８９】
ＭＴＳＰ９ポリヌクレオチドのゲノムＤＮＡの単離に対する代替法としては、既知の配列からの遺伝子配列を化学的に合成すること、もしくはＭＴＳＰポリペプチドをコード化するｍＲＮＡに合わせてｃＤＮＡを作成することが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＭＴＳＰポリペプチド遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡを、タンパク質を発現している細胞から単離することができる。次いで、同定されて、単離された核酸を、適切なクローニングベクター内に挿入することができる。当分野において公知の多数のベクター宿主系を、使用することができる。可能なベクターとしては、プラスミドもしくは修飾されたウイルスが挙げられるが、これらに限定されないが、しかしベクターシステムは使用する宿主細胞と適合性でなければならない。そのようなベクターとしては、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体またはBluescriptベクター(Stratagene, La Jolla, CA)のようなプラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的な付着末端を有するクローニングベクター中にＤＮＡフラグメントを結合することにより、達成されることができる。もしＤＮＡを断片化させるために使用した相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しないならば、ＤＮＡ分子の末端を、酵素的に修飾することができる。これに代えて、所望の任意の部位を、ヌクレオチド配列(リンカー)をＤＮＡ末端上に結合することにより、作成することができる；これらの結合したリンカーは、制限酵素認識配列をコード化する特異的な化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。さらに別な方法では、切断されたベクターおよびＭＴＳＰポリペプチド遺伝子を、ホモポリマーの尾部を付けることにより、修飾することができる。組換え分子を、形質転換、形質移入、感染、エレクトロポレーション、カルシウム沈殿および他の方法を介して宿主細胞内に導入することができるので、遺伝子配列の多数のコピーが作成される。
【０１９０】
特別の態様では、単離されたＭＳＰポリペプチドの遺伝子、ｃＤＮＡ、もしくは合成されたＤＮＡ配列を組み込むところの組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の複数のコピーの作成を可能にする。かくして、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要なときには、単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、遺伝子を大量に得ることができる。
【０１９１】
Ｅ．ＭＴＳＰポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインをコード化する核酸を含有するベクター、プラスミドおよび細胞、ならびにＭＴＳＰポリペプチドの発現
ベクターおよび細胞
一つもしくはそれ以上のＭＴＳＰポリヌクレオチドの組換え発現のために、ＭＴＳＰポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含有する核酸を、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質コード化配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクター、の中に挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルはまた、ＭＴＳＰ遺伝子用の天然のプロモーター、および／もしくはそれらの隣接領域、により供給されることができる。
【０１９２】
また、ＭＴＳＰをコード化する核酸を含有するベクターが提供される。ベクターを含有する細胞がまた、提供される。細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、そしてベクターは、その中での使用のために任意の適当のものである。
内皮細胞を含み、ベクターを含有する、原核細胞および真核細胞が提供される。そのような細胞としては、は細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられる。細胞を使用して、(ａ)コード化されたＭＴＳＰポリペプチドもしくはＭＴＳＰポリペプチドのプロテアーゼドメインが細胞により発現される、条件下で、上述の細胞を成長させて、そして次いで(ｂ)発現されたプロテアーゼドメインタンパク質を回収することにより、ＭＴＳＰポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインを生産する。例示される実施態様では、プロテアーゼドメインは、培地中に分泌される。
【０１９３】
一つの実施態様では、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコード化し、そしてＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインの全部もしくは一部だけ、またはその複数のコピーを含有するポリペプチドをコード化する、ヌクレオチドの配列を含むところのベクターが提供される。また、ＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインおよび完全長ＳＰタンパク質を含むまでのさらに別な部分、ならびにその複数コピーをコード化するヌクレオチドの配列を含むところのベクターが、提供される。ベクターは、細胞中におけるＳＰタンパク質もしくはそのプロテアーゼドメインの発現を求めて、またはＳＰタンパク質が分泌タンパク質として発現されるように、選択されることができる。これに代えて、ベクターは、コード化されたタンパク質の分泌に必要なシグナルを含むことができる。プロテアーゼドメインが発現されるときには、核酸は、Saccharomyces cerevisiaeのα接合因子もしくはその一部分、または固有のシグナル配列のような分泌シグナル、をコード化する核酸に連結している。
【０１９４】
種々のホスト−ベクターシステムを使用して、タンパク質をコード化する配列を発現させることができる。これらとしては、ウイルス(例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、等)で感染した哺乳動物細胞システム；ウイルス(例えばバキュロウイルス)で感染した昆虫細胞システム；酵母のベクターを含有する酵母のような微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性において異なる。使用される宿主−ベクターシステムに依存して、多数の適当な転写および翻訳エレメントの任意の一つを使用することもできる。
【０１９５】
核酸フラグメントをベクターの中に挿入するための、当業者に公知の任意の方法を使用して、適切な転写／翻訳調節シグナルおよびタンパク質コード化配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成的技法ならびにインビボ組換え(遺伝的組換え)を含むことができる。ＭＴＳＰポリペプチド、またはそのドメイン、誘導体、フラグメントもしくは同族体をコード化する核酸配列の発現は、遺伝子もしくはそのフラグメントが、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように、第２の核酸配列によって調節されることができる。例えば、タンパク質の発現を、当分野において公知の任意のプロモーター／エンハンサーによっても調節することができる。
【０１９６】
使用することができるプロモーターとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981))、Rousサルコーマウイルスの３’側の長末端反復に含有されるプロモーター(Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980))、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982))；ベータ−ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731 1978))もしくはｔａｃプロモーター(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983))のような原核生物の発現ベクター；''組換え細菌からの有用タンパク質'': Scientific American 242:79-94 (1980)も参照のこと；ノパリン合成酵素プロモーターを含有する植物の発現ベクター(Herrar-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984))もしくはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター(Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981))、および光合成酵素リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ(Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984))；Ｇａｌ４プロモーターのような酵母および他の真菌からのプロモーターエレメント、アルコール脱水素酵素プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示して、トランスジェニック動物に使用されてきた以下の動物の転写制御領域：膵臓の腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域(Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987))；膵臓ベータ細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985))、リンパ球中で活性なイムノグロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987))、精巣、乳腺、リンパ球および肥満細胞中で活性なマウス乳癌ウイルスの制御領域(Leder et al., Cell 45:485-495 (1986))、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御遺伝子(Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987))、肝臓中で活性なアルファ−フェトタンパク質遺伝子の制御領域(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987))、肝臓で活性なアルファ−１アンチトリプシン遺伝子の制御領域(Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987))、骨髄細胞中で活性なベータグロブリン遺伝子の制御領域(Mogram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986))、脳の乏突起膠細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子の制御領域(Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987))、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子の制御領域(Sani, Nature 314:283-286 (1985))、および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞中で活性な生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子の制御領域(Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))、挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９７】
特定の実施態様では、ＭＴＳＰポリペプチド、またはそのドメイン、フラグメント、誘導体もしくは同族体、をコード化する核酸に機能しうるように結合されたプロモーター、一つもしくはそれ以上の複製開始点、および任意に一つもしくはそれ以上の選択可能なマーカー(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子)を含有するところのベクターが使用される。ＭＴＳＰポリヌクレオチドのコード配列もしくはその一部分を含有する発現ベクターは、例えば、コード化部分を３個のｐＧＥＸベクター(グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ発現ベクター(Smith and Johnson, Gene 7:31-40 (1988))のそれぞれのＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローン化することにより、作成される。これは、正しい読み取り枠での生成物の発現を可能にする。ＭＴＳＰポリペプチドのプロテアーゼドメインの発現のための例示的なベクターおよびシステムとしては、公知のPichiaベクター(例えばInvitrogen, San Diego, CAから入手可能)、特にコード化されたタンパク質の分泌用にデザインされたもの、が挙げられる。タンパク質を、封入体中のように、細胞質内で発現することができる。一つの例示的なベクターが実施例中で説明される。
【０１９８】
E. coli細胞の形質転換のためのプラスミドとしては、例えば、ｐＥＴ発現ベクター(米国特許第４,９５２,４９６号を参照; NOVAGEN, Madison, WIより入手可能;システムを記載したNovagen社発行の文献をまた、参照)が挙げられる。そのようなプラスミドとしては、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性E. coli ｌａｃオペレーター、およびｌａｃリプレッサー遺伝子を含有するｐＥＴ１１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、およびE. coli ｏｍｐＴ分泌シグナルを含有するｐＥＴ１２ａ−ｃ；ならびに、Ｈｉｓカラムによる精製における使用のためのＨｉｓ−Ｔａｇ[登録商標]リーダー配列、およびカラムによる精製に続いて切断を可能にするトロンビン切断部位、を含有するｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ(NOVAGEN, Madison, WI)；Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域ならびにＴ７ターミネーター、が挙げられる。
【０１９９】
ベクターは、Pichia細胞および、E. coliのような、細菌細胞のような宿主細胞に導入されて、その中でタンパク質が発現される。例示的なPichia株としては、例えば、ＧＳ１１５が挙げられる。例示的な細菌宿主としては、ｌａｃＵＶプロモーター(米国特許第４,９５２,４９６号を参照)のような誘導性プロモーターに機能しうるように結合したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼコード化ＤＮＡの染色体コピー、が挙げられる。そのような宿主としては、溶原性E. coli株ＢＬ２１(ＤＥ３)が挙げられるが、これに限定されない。
【０２００】
タンパク質の発現および生産
ＭＴＳＰドメイン、誘導体および類似体は、当分野において公知の種々の方法によって生産されることができる。例えば、一旦ＭＴＳＰポリペプチド、またはそのドメイン、フラグメントもしくは誘導体を発現する組換え細胞が同定されれば、個別の遺伝子産物を単離して、分析することができる。これは、生産物の放射能標識に続けてゲル電気泳動による分析、イムノアッセイ、マーカー標識産物への架橋、およびタンパク質分解活性を含むが、それらに限定されない、タンパク質の物理的および／もしくは機能的性質に基づくアッセイにより達成される。
【０２０１】
ＭＴＳＰポリペプチドは、カラムクロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニティー、ゲル排除、逆相高速および迅速タンパク質液体)、分別遠心、分別溶解性を含むが、それらに限定されない、当分野において公知の標準的な方法により、もしくはタンパク質の精製のために使用される任意の他の標準的技法により、単離して、精製することができる(天然の供給源または複合体もしくはタンパク質を発現している組換え宿主細胞から)。
【０２０２】
これに代えて、一旦ＭＴＳＰポリペプチドまたはそのドメインもしくは誘導体が同定されれば、それをコード化する遺伝子のヌクレオチド配列から、タンパク質のアミノ酸配列を推定することができる。その結果、タンパク質またはそのドメインもしくは誘導体を、当分野において公知の標準的な化学的方法(例えば、Hunkapiller et al, Nature 310:105-111 (1984)、を参照)により合成することができる。
【０２０３】
ＭＴＳＰポリペプチド配列の操作を、タンパク質レベルで行うことができる。また、翻訳中もしくは後に、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子もしくは他の細胞性リガンドへの結合により、差別的に修飾されるところのＭＴＳＰポリペプチドタンパク質、そのドメイン、誘導体または類似体もしくはフラグメントが、本明細書において意図される。任意の夥しい数の化学的修飾を、臭化シアンによる特異的化学切断、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンおよび他のそのような剤の存在下での代謝的合成を含むが、それらに限定されない、既知の技法により実施することができる。
【０２０４】
加えて、ＭＴＳＰポリペプチドのドメイン、類似体および誘導体を、化学的に合成することができる。例えば、所望のドメインを含むかもしくはインビトロで所望の活性を仲介するところのＭＴＳＰポリペプチドの一部分に相当するペプチドを、ペプチド合成機の使用により合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸もしくは化学的アミノ酸類似体を、ＭＴＳＰポリペプチド配列中に置換もしくは付加として導入することができる。非古典的アミノ酸としては、通常のアミノ酸のＤ異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ε−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、およびアミノ酸類似体一般、が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ(右旋性)もしくはＬ(左旋性)であり得る。
【０２０５】
天然の生産物が突然変異体であることが疑われるかもしくは新しい生物種より単離される場合には、天然の供給源から単離されたＭＴＳＰポリペプチド、およびインビトロで発現されたＭＴＳＰポリペプチド、またはインビボもしくはインビトロで合成された発現ベクター由来のＭＴＳＰポリペプチドのアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列の分析から、もしくはこれに代えて単離されたタンパク質の直接シークエンシングにより、決定することができる。そのような分析を、手作業のシークエンシングもしくは自動化アミノ酸シーケンサーの使用により実施することができる。
【０２０６】
修飾
ＭＴＳＰポリペプチドおよびドメインの種々の修飾が、本明細書において意図される。ＭＴＳＰコード化核酸分子は、当分野において公知の夥しい数の戦略のいずれによっても修飾されることができる(例えば、Sambrook et al. 1989、「分子クローニング、実験室マニュアル、第２版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、を参照)。配列を、制限エンドヌクレアーゼにより適切な部位で切断することができて、続いて、所望により、さらなる酵素的修飾を行い、単離し、インビトロで結合する。ＭＴＳＰのドメイン、誘導体もしくは類似体をコード化する遺伝子の生産においては、修飾された遺伝子が、所望の活性がコード化されている遺伝子領域において、翻訳停止シグナルにより中断されていない元の翻訳用リーディングフレームを保持していることを保証するよう注意を払うべきである。
【０２０７】
加えて、ＭＴＳＰコード化核酸分子は、翻訳、開始、および／もしくは終結配列を創成しならびに／または破壊するために、またはコード領域内に突然変異を創成しならびに／またはさらなるインビトロ修飾を容易にするために、新しいエンドヌクレアーゼ部位を形成しまたは既存のものを破壊するために、インビトロまたはインビボで突然変異させることができる。また、本明細書において説明されるように、Ｃｙｓ残基の置換およびグリコシル化部位の除去もしくは付加のような一次配列の変化を持つ突然変異体が意図される；配列番号１８のＭＴＳは、二つの潜在的グリコシル化部位を有している。そのような突然変異は、化学的突然変異誘発およびインビトロの部位特異的突然変異誘発(Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253:6551-6558 (1978))、ＴＡＢ（登録商標）リンカー (Pharmacia)を含むが、それらに限定されない、当分野において公知の突然変異誘発のための任意の技法によって、達成されることができる。一つの実施態様では、例えば、ＭＴＳＰポリペプチドもしくはそのドメインは、蛍光標識を含むように修飾される。別の特定の実施態様では、ＭＴＳＰポリペプチドは、ヘテロ２機能性試薬を有するように修飾され、そのようなヘテロ２機能性試薬は、複合体のメンバーを架橋するために使用される。
【０２０８】
加えて、ＭＴＳＰのドメイン、類似体および誘導体を、化学的に合成することができる。例えば、所望のドメインを含むかもしくはインビトロで所望の活性を仲介するところのＭＴＳＰの一部分に相当するペプチドを、ペプチド合成機の使用により合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸もしくは化学的アミノ酸類似体を、ＭＴＳＰ配列中に置換もしくは付加として導入することができる。非古典的アミノ酸としては、通常のアミノ酸のＤ異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ε−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、およびアミノ酸類似体一般、が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ(右旋性)もしくはＬ(左旋性)であり得る。
【０２０９】
Ｆ．スクリーニング法
本明細書に示すように、単鎖プロテアーゼドメインを、その活性を調節する化合物を同定するために種々の方法で使用することができる。腫瘍細胞中においてさらに高い活性もしくは発現を示すＳＰについては、タンパク質分解活性を阻害する化合物が、特に興味深い。腫瘍細胞中においてさらに低いレベルで活性であるＳＰについては、活性を促進する化合物もしくは剤が、潜在的に興味深い。全ての場合において、同定された化合物は、癌処置の候補である剤を含む。
【０２１０】
いくつかの種類のアッセイが本明細書において例示されそして説明される。プロテアーゼドメインは他のアッセイに使用できることが、理解されている。しかしながら、単鎖プロテアーゼドメインが触媒活性を示すことが、本明細書において示される。したがって、それらは、インビトロのスクリーニングアッセイのために理想的である。それらはまた、結合アッセイにも使用されることができる。
【０２１１】
ＭＴＳＰ９の完全長チモーゲン、活性化酵素、単鎖および２本鎖プロテアーゼドメインが、本明細書において提供されるアッセイを含めて、当業者周知の任意のスクリーニングアッセイにおける使用のために意図される。したがって、以下の説明は、タンパク質分解アッセイに向けられるならば、ＭＴＳＰ９を含む任意のＳＰの単鎖プロテアーゼドメインもしくはその触媒的に活性な部分に適用するものとする。特に、そのスプライスバリアントのような任意の変異体を含むＭＴＳＰ９との使用のために、結合アッセイのような他のアッセイが、本明細書において提供される。
【０２１２】
１．ＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインを調整する剤の同定のための触媒的アッセイ
ＳＰ、特にその単鎖プロテアーゼドメインもしくは触媒的に活性な部分、の触媒活性のモジュレーターを同定するための方法が、本明細書において提供される。方法は、ＭＴＳＰ９、完全長チモーゲンもしくは活性化型、および特にその単鎖ドメインを試験物質の存在下にＭＴＳＰ９の基質と接触させること、ならびに基質のタンパク質分解を検出し、それによってＭＴＳＰの活性を評価し、そして活性を対照と比較すること：により、実行される。例えば、対照は、完全長のチモーゲンもしくは活性化型、および特にその単鎖ドメイン、特にその単鎖ドメインを含むＭＴＳＰ９をＭＴＳＰ９の基質と接触させること、ならびに基質のタンパク質分解を検出し、それによってＭＴＳＰ９の活性を評価すること、により評価されるＭＴＳＰ９の活性であり得る。試験化合物の存在および不在下における結果が比較される。活性の差は、試験物質がＭＴＳＰ９の活性を調整することを示す。ＭＴＳＰ９の活性化切断の活性化因子がまた、意図される；そのようはアッセイは以下に議論される。
【０２１３】
一つの実施態様では、上のスクリーニング法において複数の試験物質が同時にスクリーニングされる。もう一つの実施態様では、標的細胞に潜在的に特異的である、剤を次いで同定するための手段として、ＭＴＳＰ９が標的細胞から単離される。
もう一つの実施態様では、試験物質は治療用化合物であり、そしてそれによって試験物質の存在下および不在下で測定されたＭＴＳＰ９活性の差は、標的細胞が治療用化合物に応答することを示す。
【０２１４】
一つの方法は、(ａ)ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインを一つまたは複数の試験化合物と、リガンドおよび化合物の間の相互作用を助長する条件下で接触させること、ならびに(ｂ)リガンドに特異的に結合する一つもしくは複数の化合物を同定することのステップを含む。
【０２１５】
本明細書において提供されるもう一つの方法は、ａ)ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインをＭＴＳＰ９の基質と接触させ、そして基質のタンパク質分解を検出し、それによってＭＴＳＰ９の活性を評価すっること；ｂ)ＭＴＳＰ９ポリペプチドを試験物質の存在下にＭＴＳＰ９ポリペプチドの基質と接触させ、そして基質のタンパク質分解を検出し、それによってＭＴＳＰ９の活性を評価すること；ならびにｃ)ステップａ)およびｂ)において評価したＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を比較することのステップを含み、それによってステップａ)において測定された活性がステップｂ)で測定された活性と異なることは、試験物質がＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を調整することを示す。
【０２１６】
もう一つの実施態様では、複数の試験物質が同時にスクリーニングされる。試験物質がＭＴＳＰ９ポリペプチドのモジュレーターであるか否かを評価するために、試験物質の存在下および不在下でのＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を比較する際に、活性を並行してアッセイすることは、そのような並行測定が典型的ではあるが、不必要である。ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を一つの時点で測定して、測定された活性をＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性の歴史的な値と比較することが可能である。
【０２１７】
例えば、試験物質の存在下にＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を測定し、そして試験物質の不在下に先に測定したＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性の歴史的な値と比較すること、およびその逆を行うことができる。これは例えば、アッセイを行うためのキットと共に提供される折込みもしくはパンフレットに、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を提供することによって達成することができる。
特定のＳＰのための基質を選択するための方法が実施例に説明されて、そして特定のタンパク質分解アッセイが例示される。
【０２１８】
組合せおよびアッセイを実施するための説明書を任意に含む組合せを含有するキットが提供される。組合せは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドおよびアッセイするべきＭＴＳＰ９ポリペプチドの基質；ならびに任意に基質のタンパク質分解を検出するための試薬を含む。タンパク質を含む、特定のＭＴＳＰ９ポリペプチドによるタンパク質分解に供される、色素生産性もしくは蛍光発生的分子であり得るところの基質は、試験基質を切断するＭＴＳＰ９ポリペプチドの能力を試験することにより経験的に同定されることができる。最も効率よく(即ち、最も低い濃度および／もしくは最も早い速度で、または好ましい条件で)切断される基質が同定される。
【０２１９】
これに加えて、上述の組合せを含有するキットが、本明細書において提供される。キットは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性のモジュレーターを同定するための説明書を任意に含む。任意のＭＴＳＰ９ポリペプチドは、その活性のモジュレーターを同定するための標的として意図される。
【０２２０】
２．結合アッセイ
剤、特にＭＴＳＰ９に結合する化合物、の同定および単離のための方法が、本明細書において提供される。アッセイは、チモーゲン型、単鎖の単離されたプロテアーゼドメイン(もしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインを含有する、ＭＴＳＰ９ポリペプチド以外のタンパク質)に、および完全長チモーゲンからまたは伸長されたプロテアーゼドメインから由来した活性化型を含む活性化型に結合する剤を同定するようにデザインされる。同定された化合物は、腫瘍ならびに他の障害および異常な血管新生を含む疾患の処置のための化合物の同定のための候補物もしくはリードである。方法において使用されるＭＴＳＰ９ポリペプチドは、本明細書において規定した、ＭＴＳＰ９の単鎖プロテアーゼドメインもしくはそのタンパク質分解的に活性な部分を含む、任意のＭＴＳＰ９ポリペプチドを含む。
【０２２１】
種々の方法が、本明細書において提供される。これらの方法は、溶液中において、またはＭＴＳＰ９ポリペプチド(複数を含む)もしくはそのプロテアーゼドメイン(複数を含む)が固体支持体に直接またはリンカーを介して間接的に結合された固相反応において、実施され得る。スクリーニングアッセイは実施例に説明され、そしてこれらのアッセイは、候補化合物を同定するために使用されてきている。本明細書における目的には、上述の全ての結合アッセイがＭＴＳＰ９のために提供される。
【０２２２】
ＭＴＳＰ９の単鎖プロテアーゼドメイン、チモーゲンまたは完全長の活性化ＭＴＳＰ９もしくはその２本鎖プロテアーゼドメインに特異的に結合する、化合物のような剤を同定するための方法が、本明細書において提供される。方法を、(ａ)ＭＴＳＰ９と剤との間の結合を助長する条件下で、ＭＴＳＰ９を一つもしくは複数の試験剤と接触させること；そして(ｂ)ＭＴＳＰ９に特異的に結合する、多数の中の一つもしくはそれ以上の剤を同定することにより、実施することができる。
【０２２３】
例えば、そのような方法を実施するに際して、ＭＴＳＰ９ポリペプチドは、潜在的結合相手または細胞の抽出物もしくはフラクションと、潜在的結合相手とポリペプチドとの会合を許容する条件下で混合される。混合した後、ＭＴＳＰ９と会合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくは他の分子を、混合物から分離する。次いで、ＭＴＳＰ９に結合した結合相手を取り外して、さらに分析することができる。結合相手を同定しそして単離するために、全タンパク質、例えば、配列番号６の開示されたタンパク質全体、を使用することができる。これに代えて、タンパク質のフラグメントを使用することができる。
【０２２４】
細胞抽出物、もしくは血液、血清、尿、汗、滑液、ＣＳＦおよび他のそのような流動体のような体液、を得るために、種々の方法を使用することができる。物理的な破壊法の例としては、超音波処理および機械的剪断が挙げられるが、これらに限定されない。化学的溶解の例としては、界面活性剤による溶解および酵素溶解が挙げられるが、これらに限定されない。熟練者は、細胞抽出物を調製するための方法を、本法における使用のための抽出物を得るために容易に適合させることができる。
【０２２５】
一旦細胞の抽出物が調製されれば、抽出物は、タンパク質と結合相手との会合が起こり得る条件下で、ＭＴＳＰ９と混合される。ヒトの細胞の細胞質中、もしくは血液のような、体液中に見出される条件に類似した条件を含む、種々の条件を使用することができる。浸透圧、ｐＨ、温度、および使用される細胞抽出物の濃度のような特性を、タンパク質と結合相手との会合を至適化するように変化させることができる。同様に、体液からの興味のある分子の単離のための方法は公知である。
【０２２６】
適切な条件下で混合した後、結合した複合体を混合物から分離する。種々の技法を使用して、混合物を分離することができる。例えば、ＭＴＳＰ９に特異的な抗体を使用して、結合相手との複合体を免疫沈殿させることができる。これに代えて、クロマトグラフィーおよび密度／沈降遠心のような標準的な化学的分離技法を使用することもできる。
抽出物中の非会合細胞成分を除去した後、結合相手を、従来の方法を用いて複合体から解離させることができる。例えば、解離を、混合物の塩濃度もしくはｐＨを変化させることにより達成することができる。
【０２２７】
混合抽出物から会合した結合相手との対を分離するのを支援するために、ＭＴＳＰ９を固体支持体上に固定化することができる。例えば、タンパク質をニトロセルローズマトリックスもしくはアクリルビーズに付着させることができる。タンパク質もしくはそのフラグメントの固体支持体への付着は、抽出物中に見出される他の成分からペプチド／結合相手の対を分離するのを支援する。同定された結合相手は、単一のタンパク質または二つもしくはそれ以上のタンパク質から作製される複合体のどちらかであり得る。
【０２２８】
これに代えて、単鎖のプロテアーゼをコード化する核酸分子を、酵母の二ハイブリッドシステムで使用することができる。酵母の二ハイブリッドシステムは、他のタンパク質対を同定するために使用されてきており、本明細書において説明する核酸分子を使用するように容易に適合させることができる。
【０２２９】
もう一つのインビトロ結合アッセイは、特にＭＴＳＰ９のためには、これらのタンパク質の一つの少なくとも触媒ドメインを含有するポリペプチドおよび一つもしくはそれ以上の候補結合標的または基質との混合物を使用する。混合物を適切な条件下でインキュベートした後、ＭＴＳＰ９もしくは触媒ドメインを含有するそのポリペプチドフラグメントが基質候補と相互作用する能力を評価する。無細胞系アッセイのためには、成分の一つは、検出可能な標識を含むかもしくはこれに連結される。標識は、放射活性、蛍光、吸光度もしくは電子密度等のように直接の検出を、またはエピトープタグ、酵素等のような間接的検出、を提供する。種々の方法を使用して、標識の性質および他のアッセイ成分に依存して、標識を検出することができる。例えば、固体の基質に結合した標識を検出することができるか、もしくは標識を含有する結合した複合体の一部を固体の基質から分離し、そして標識をその後検出することができる。
【０２３０】
３．シグナル伝達の検出
膜貫通タンパク質であるＭＴＳＰ９は、シグナル伝達に直接的にもしくは間接的に、細胞表面受容体として直接的に、またはシグナル伝達を開始し得る増殖因子の前駆体のようなタンパク質を活性化することにより間接的に、関与し得る。
【０２３１】
加えて、ＭＴＳＰ９の細胞外ドメインのようなＭＴＳＰ９の分泌物は、細胞表面の受容体と結合もしくは相互作用することにより直接的に、もしくはシグナル伝達を開始し得る増殖因子の前駆体のようなタンパク質を活性化することにより間接的にのどちらかで、シグナル伝達に関与し得る。シグナル伝達を評価するためのアッセイは、当業者に周知であって、ＭＴＳＰ９ポリペプチドとの使用のために適合させることができる。
【０２３２】
細胞の表面上のＭＴＳＰ９、特にＭＴＳＰ９の完全長、もしくはその細胞外ドメインもしくは機能部分を繋ぎとめるために充分な部分により、直接的に、もしくは増殖因子前駆体の活性化を介するような間接的に仲介されるシグナル伝達に影響するかもしくはこれを変化させる剤の同定のためのアッセイが、提供される。そのようなアッセイは、例えば、転写に基づくアッセイを含み、そこでは伝達されたシグナルの調整が、レポーター遺伝子からの発現に対する効果を検出することにより評価される(例えば、米国特許第５,４３６,１２８号、を参照)。
【０２３３】
４．ＭＴＳＰ９をコード化する核酸の発現を調整する剤を同定する方法
もう一つの実施態様は、ＭＴＳＰ９をコード化する核酸の発現を調整する、剤を同定するための方法を提供する。そのようなアッセイは、ＭＴＳＰ９をコード化する核酸の発現レベルの変化をモニターする任意の利用可能な手段を使用する。
【０２３４】
一つのアッセイフォーマットでは、ＭＴＳＰ９もしくはそのドメイン、特にプロテアーゼドメインのオープンリーディングフレームおよび任意のアッセイ可能な融合相手との間のレポーター遺伝子融合体を含有するところの細胞株を調製することができる。ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子(Alam et al., Anal. Biochem. 188: 245-54 (1990))を含む、夥しい数のアッセイ可能な融合相手が公知であり、容易に入手可能である。次いで、レポーター遺伝子融合体を含有する細胞株は、適切な条件下および時間で、検査すべき剤に曝露される。剤に曝露したサンプルと対照サンプルとの間のレポーター遺伝子の差次的発現が、ＭＴＳＰ９をコード化する核酸の発現を調整する剤を同定する。
【０２３５】
さらに別なアッセイフォーマットを使用して、ＭＴＳＰ９をコード化する核酸の発現を調整する剤の能力をモニターすることができる。例えば、核酸へのハイブリダイゼーションにより、ｍＲＮＡ発現を直接モニターすることができる。細胞株を適切な条件下および時間で、試験すべき剤に曝露し、そして標準的な手順により総ＲＮＡもしくはｍＲＮＡを単離する(例えば、Sambrook et al. 1989、「分子クローニング、実験室マニュアル、第２版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、を参照)。剤に曝露した細胞と対照細胞との間のＲＮＡ発現レベルの差を検出するプローブを、核酸から調製することができる。高度のストリンジェンシーの条件下で標的核酸とのみハイブリダイズするところのプローブをデザインすることは、典型的であるが必要ではない。高度のストリンジェンシーの条件下では、高度に相補的な核酸のみがハイブリダイズする。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーが、ハイブリッドを形成するために二つの核酸鎖の間に存在するべき相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドと潜在的プローブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性の差を最大化するように選択されるべきである。
【０２３６】
プローブを、当分野において公知の方法により核酸からデザインすることができる。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含量およびプローブの長さは、その標的配列へのプローブの結合に影響を及ぼし得る。プローブの特異性を至適化するための方法は、一般的には利用可能である(例えば、Sambrook et al. 1989、「分子クローニング、実験室マニュアル、第２版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; およびAusubel et al. (1995)、「分子生物学における最新のプロトコール」、Greene Publishing Co., NY、を参照)。
【０２３７】
ハイブリダイゼーションの条件は、それぞれのプローブについて要求されるように、既知の方法を用いて修飾される(例えば、Sambrook et al. 1989、「分子クローニング、実験室マニュアル、第２版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; およびAusubel et al. (1995)、「分子生物学における最新のプロトコール」、Greene Publishing Co., NY、を参照)。総細胞ＲＮＡもしくはポリＡを富化したＲＮＡのハイブリダイゼーションを、任意の利用可能なフォーマットにおいて達成することができる。例えば、総細胞ＲＮＡもしくはポリＡを富化したＲＮＡを固体支持体に貼り付け、そして固体支持体を、核酸分子の少なくとも一つもしくは一つの一部を含む少なくとも一つのプローブに、プローブが特異的にハイブリダイズする条件下で曝露する。これに代えて、配列の少なくとも一つ、もしくは一つの一部を含む核酸フラグメントを多孔性のガラスウエーハのような固体支持体に貼り付けることができる。次いで、ガラスウエーハを、サンプルからの総細胞ＲＮＡもしくはポリＡ  ＲＮＡに、貼り付けた配列が特異的にハイブリダイズする条件下で、曝露することができる。例えば、Beattie (ＷＯ  ９５／１１７５５号)に開示されているような、そのようなガラスウエーハおよびハイブリダイゼーション方法は、広く利用可能である。無処理の細胞集団からのおよび剤に曝露された細胞集団からのＲＮＡサンプルに、与えられたプローブが特異的にハイブリダイズする能力を調べることにより、ＭＴＳＰ９ポリヌクレオチドをコード化する核酸の発現を上方もしくは下方調節するところの剤が同定される。
【０２３８】
一つのフォーマットにおいては、曝露されていない対照細胞集団と比較して、検査するべき剤に曝露された細胞集団との間でのタンパク質の相対量をアッセイすることができる(例えば、前立腺癌細胞株、肺癌細胞株、結腸癌細胞株もしくは乳癌細胞株)。このフォーマットにおいては、特異的抗体のような、プローブを使用して、異なる細胞集団もしくは体液中のタンパク質の差次的発現もしくは活性のレベルをモニターする。細胞株もしくは集団または体液を、検査すべき剤に適切な条件下および時間で曝露する。細胞溶解物または体液は、曝露された細胞株もしくは集団および対照、曝露されていない細胞株もしくは集団または曝露されていない体液から、調製することができる。次いで、細胞溶解物もしくは体液をプローブで分析する。
【０２３９】
例えば、ＭＴＳＰ９のＮおよびＣ末端フラグメントをバクテリア中で発現させ、そしてこれらのフラグメントに結合するタンパク質を探索するために使用することができる。ＭＴＳＰ９のＮもしくはＣ末端領域へのＨｉｓ−タグまたはＧＳＴ融合体のような融合タンパク質を、基質としての使用のために調製することができる。これらの融合タンパク質を、例えば、グルタチオン−セファロースビーズに結合させ、次いで、細胞溶解物もしくは体液を用いて探索することができる。溶解に先立って、ＭＴＳＰ９を調整できる候補剤、もしくはその上のドメインと相互作用するタンパク質で、細胞もしくは体液を処理することができる。融合タンパク質に結合した溶解物のタンパク質を、当分野において公知のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、単離し、そしてタンパク質シークエンシングもしくは質量分析により同定することができる。
【０２４０】
抗体プローブは、もしそれらが充分な長さであれば(例えばＭＴＳＰ９ポリペプチドの４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０個もしくはそれより多い連続したアミノ酸)、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を用いて、または、もし免疫原性を増強することが必要であれば、適当な担体と結合して、適切な免疫プロトコールにおいて、適当な哺乳動物宿主を免疫にすることによって調製される。ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、スカシガイのヘモシアニン(ＫＬＨ)のような担体、もしくは他の担体タンパク質との免疫原性結合体を調製するための方法は、当分野において周知である。或る状況では、直接的な結合、例えばカルボジイミド試薬を使用する結合が有効であり得る；他の場合には、Pierce Chemical Co., Rockford, ILにより提供されるような結合試薬がハプテンへの接触性を提供するために望ましい。ハプテンペプチドは、Ｃｙｓ残基を用いてアミノもしくはカルボキシ末端のいずれかで伸長するか、もしくは、例えば、担体への結合を容易にするためにシステイン残基を挿入することができる。免疫原の投与は、当分野において一般的に理解されるように、適当な期間に亘って、、そして適当なアジュバントを使用して注射により、一般的には行われる。免疫スケジュールの間、抗体生成の適切さを測定するために抗体の力価を調べる。
【０２４１】
抗ペプチド抗体を、例えば、ＭＴＳＰ９のカルボキシ末端アミノ酸に相当する合成ペプチドを用いて生成することができる。合成ペプチドは、１〜３個のアミノ酸の長さ、一般的には少なくとも４個もしくはそれ以上のアミノ酸残基の長さ、ほどに小さくあり得る。ペプチドを、標準的な方法を用いてＫＬＨに結合させ、そしてウサギもしくは有蹄動物のような動物に免疫することができる。次いで、ポリクローナル抗体を、例えば、共有結合したペプチドを含有するActigelビーズを用いて精製することができる。
【０２４２】
この方法で生産されたポリクローナル抗血清は、或る応用のためには申し分ない一方で、医薬組成物のためにはモノクローナル製品が、一般的には使用される。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株を、一般的に公知のように、リンパ球もしくは脾臓細胞の不死化に影響を及ぼすKohler et al., (Nature 256: 495-7 (1975))の標準的方法または変形方法を用いて調製することができる。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がペプチドハプテン、ポリペプチドもしくはタンパク質である、イムノアッセイによりスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切な不死化培養細胞が同定されるときには、細胞を、インビトロでもしくは、腹水を介するインビボの生産によるかのどちらかで培養する。特に興味深いのは、ＭＴＳＰ９の触媒ドメインもしくは活性化切断部位(領域)を認識する、モノクローナル抗体である。
【０２４３】
これに加えて、ＭＴＳＰ９のチモーゲンもしくは２本鎖型を用いて、コンホーメーションエピトープを認識するモノクローナル抗体を作成することができる。次いで、所望のモノクローナル抗体を、培養上清み液もしくは腹水上清み液から回収する。免疫学的に有意な部分を含有する、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗血清のフラグメントを、無傷の抗体と共に、アゴニストとして使用することができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ(ａｂ’)２のような免疫学的に反応性のフラグメントは、これらのフラグメントが一般的にはイムノグロブリン全体よりも免疫原性が少ないため、特に治療の場面において、しばしば使用される。
【０２４４】
抗体もしくはフラグメントをまた、生産することができる。複数種の起源のキメラとの関連で、受容体の所望の領域に特異的に結合する領域をまた、生産することができる。
上の方法でアッセイされる剤は、ランダムに選択され、もしくは合理的に選択され、またはデザインされることができる。
【０２４５】
剤は、例えば、ペプチド、低分子、および炭水化物であり得る。熟練者は、剤の構造的性質に制限がないことを容易に認識するであろう。
剤は、当分野において公知のように、標準的な固相(もしくは液相)ペプチド合成法を用いて調製されることができる。加えて、これらのペプチドをコード化するＤＮＡを、市販のオリゴヌクレオチド合成機を用いて合成し、標準的な組換え生産システムを用いて組換え的に合成することができる。固相ペプチド合成を用いる生産は、遺伝子にコード化されないアミノ酸を含もうとするならば、必要となる。
【０２４６】
Ｇ．ＭＴＳＰ９ポリペプチドの少なくとも一つの活性を調整する試験物質のアッセイフォーマットおよび選択
ＭＴＳＰ９の少なくとも一つの活性を調節する剤を同定するための方法が提供される。方法としては、ＭＴＳＰ９の活性の変化を評価するための、ファージディスプレーおよび他の方法が挙げられる。そのような方法もしくはアッセイは、所望の活性をモニターしもしくは検出する任意の手段を使用することができる。スクリーニングアッセイを実施するための、種々のフォーマットおよび検出プロトコールが公知である。任意のそのようなフォーマットおよびプロトコールを、ＭＴＳＰ９ポリペプチド活性のモジュレーターを同定するために適合させることができる。以下は、例示的なプロトコールの議論を含む。
【０２４７】
１．ハイスループットスクリーニングアッセイ
単鎖ＭＴＳＰ９ポリペプチドをスクリーニングする場合、および／もしくは１回のアッセイで単一の試験物質をスクリーニングする場合には、上述のアッセイを実施することができるが、アッセイは典型的には、ハイスループットスクリーニングモードで実施され、即ち複数のＳＰタンパク質に対してスクリーニングが行われ、そして／もしくは複数の試験化合物が同時にスクリーニングされる(一般的には、「ハイスループットスクリーニング：生物活性物質の発見」、(Devlin, Ed.) Marcel Dekker, 1997; Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91 (1997); and Silverman et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:397-403 (1998)を参照)。例えば、アッセイを、マルチウエル(例えば２４、４８、９６、３８４、１５３６個のウエルもしくはさらに高密度)、チップまたはアレイフォーマットで行うことができる。
【０２４８】
ハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)は、疾患標的に対する多数の様々な化学構造を試験して''ヒット''を同定する方法である(Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91 (1997))。現在の最先端のＨＴＳ操作は、サンプル調製、アッセイ手順、およびそれに続く大量のデータのプロセシングを取り扱うように高度に自動化されて、コンピューター化されている。
【０２４９】
ハイスループットスクリーニングで使用される検出技術は、検討されている生化学的経路のタイプに依存する(Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91 (1997))。これらの方法としては、種々の酵素アッセイに適合させることができる、シンチレーション近接アッセイ(ＳＰＡ)のような放射化学的方法(Lerner et al., J. Biomol. Screening, 1:135-143 (1996); Baker et al., Anal. Biochem., 239:20-24 (1996); Baum et al., Anal. Biochem., 237:129-134 (1996); and Sullivan et al., J. Biomol. Screening 2:19-23 (1997))、およびタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ(Braunwalder et al., J. Biomol. Screening 1:23-26 (1996); Sonatore et al., Anal. Biochem. 240:289-297 (1996); and Chen et al., J. Biol. Chem. 271:25308-25315 (1996))、ならびに比色および発光検出法、共鳴エネルギー移動(ＲＥＴ)法、時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)法、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)手順(例えば、Gonzalez et al., Biophys. J., 69:1272-1280 (1995)、を参照)のような細胞に基づく蛍光アッセイ、蛍光偏光もしくはアニソトロピー法(例えば、Jameson et al., Methods Enzymol. 246:283-300 (1995); Jolley, J. Biomol. Screening 1:33-38 (1996); Lynch et al., Anal. Biochem. 247:77-82 (1997)、を参照)、蛍光相関分光法(ＦＣＳ)および他のそのような方法を含むが、それらに限定されない、非同位元素的検出方法、が挙げられる。
【０２５０】
２．試験物質
ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を調整する化合物を同定するために、低分子、抗体、タンパク質、核酸、ペプチドを含む試験化合物、ならびにそのライブラリーおよび収集物を、上述のアッセイおよび下記のアッセイでスクリーニングすることができる。コンピューター化学に依存する合理的な薬物デザイン方法論を用いて、候補化合物をスクリーニングして、同定することができる。
スクリーニング法により同定される化合物は、拮抗物質を含む阻害剤を含み、そしてアゴニストであり得る。スクリーニングのための化合物としては、入手可能な、既知の、もしくは調製することのできる、任意の化合物および化合物の収集物が挙げられる。
【０２５１】
ａ．化合物の選択
化合物を、セリンプロテアーゼ、特にＭＴＳＰ９ポリペプチドの阻害のそれらの力価および選択性について、選択することができる。本明細書において説明したように、そして公知のように、標的セリンプロテアーゼおよびその基質を、プロテアーゼとその基質との反応を許容するアッセイ条件下で結合する。アッセイを、試験化合物の不在下で、そして増加する濃度の試験化合物の存在下で、実施する。セリンプロテアーゼ活性の５０％が試験化合物により阻害される試験化合物の濃度が、その化合物のＩＣ５０値(阻害濃度)もしくはＥＣ５０(有効濃度)値である。一連のもしくは一群の試験化合物群の中で、より低いＩＣ５０もしくはＥＣ５０値を有するものが、より高いＩＣ５０もしくはＥＣ５０値を有する化合物よりセリンプロテアーゼのより強力な阻害剤と考えられる。ＩＣ５０測定は、さらに単純なアッセイにしばしば使用されるが、一方では、ＥＣ５０は、細胞を用いるアッセイのようなさらに複雑なアッセイにしばしば使用される。
【０２５２】
典型的には、候補化合物は、ＭＴＳＰ９ポリペプチド活性の阻害のためのインビトロアッセイにおいて測定したときに、１００ｎＭ以下のＩＣ５０値を有する。試験化合物はまた、セリンプロテアーゼに対する選択性について評価される。本明細書において説明されるように、そして一般的に公知のように、試験化合物を、セリンプロテアーゼおよび他の酵素のパネルに対するその力価についてアッセイし、それぞれのアッセイシステムにおいてＩＣ５０値もしくはＥＣ５０値をそれぞれの試験化合物について測定する。標的酵素、例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチド、に対して低いＩＣ５０値もしくはＥＣ５０値を示し、そして試験パネル中の他の酵素(例えばウロキナーゼ組織プラスミノーゲン活性化因子、トロンビン、第Ｘａ因子)に対してより高いＩＣ５０値もしくはＥＣ５０値を示すところの化合物は、標的酵素に対して選択的であると考えられる。一般的には、標的酵素アッセイにおけるＩＣ５０値もしくはＥＣ５０値が、酵素の選択性パネル中で測定された次に小さなＩＣ５０値またはＥＣ５０値よりも少なくとも１桁小さいならば、化合物は選択性であると見なされる。
【０２５３】
化合物はまた、インビボでそれらの活性を評価される。試験化合物の評価のために選択されるアッセイの種類は、化合物の使用により処置もしくは予防されるべき病態、ならびに試験化合物について評価されるべき投与経路に依存する。
【０２５４】
例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの阻害を通して腫瘍増殖を減少させる化合物の活性を評価するためには、ＰＡＩ−１を評価するためにJankun et al., Canc. Res. 57:559-563 (1997)によって記載されている手順を使用することができる。略述すれば、ＡＴＣＣ細胞株ＤＵ１４５およびＬｎＣａＰをＳＣＩＤマウスに注射する。腫瘍が確立された後、化合物のインビトロの特性から決定された投与法にしたがって、試験化合物をマウスに与える。Jankun et al.化合物は水溶液で与えられた。腫瘍体積の測定を週２回、約５週間行う。適切な対照化合物の投与を受けた動物と比較して、化合物を投与された動物が減少した腫瘍体積を示したならば、化合物は活性と見なされる。
腫瘍体積の減少に対するブタプロテアーゼの阻害剤ｐ−アミノベンズアミジンの作用を評価するためにデザインされたもう一つのインビボ実験モデルが、Billstroem et al., Int. J. Cancer 61:542-547 (1995)によって記載されている。
【０２５５】
化合物が転移の発生を減少させもしくは転移を阻害する能力を評価するために、Kobayashi et al. Int. J. Canc. 57:727-733d (1994)によって記載された手順を使用することができる。略述すれば、高い肺定着能について選択されたマウスの異種移植片を、Ｃ５７Ｂ１／６マウスの中に静脈注射する(実験的転移)かもしくは腹壁の中に皮下注射する(自発的転移)。注射に先立って、検査すべき種々の濃度の化合物をマトリゲル中で混合することができる。腫瘍接種の１〜６もしくは７〜１３日後のどちらかに試験化合物の連日腹腔内投与を行う。腫瘍接種の約３もしくは４週間後に動物を屠殺し、そして肺腫瘍の集落を計数する。得られたデータの評価は、試験化合物の効力、至適投与量および投与経路の決定を可能にする。
【０２５６】
腫瘍体積および転移の減少に対する試験化合物の活性を、それらの阻害剤を評価するためにRabbani et al., Int. J. Cancer 63:840-845 (1995)に記載されているモデルで評価することができる。そこでは、Ｍａｔ  ＬｙＬｕ腫瘍細胞が、コペンハーゲンラットの側腹部に注射された。種々の用量の試験化合物を３週間まで投与するために、浸透圧ミニポンプを動物に埋め込んだ。実験および対照動物の腫瘍重量ならびに体積、そして転移性増殖を実験中評価した。得られたデータの評価は、試験化合物の効力、至適投与量および投与経路の決定を可能にする。これらの著者の幾人かは、関連プロトコールをXing et al., Canc. Res. 57:3585-3593 (1997)に記載した。
【０２５７】
化合物の抗血管新生活性を評価するために、ウサギ角膜血管新生モデルを使用することができる(例えばAvery et al. (1990) Arch. Ophthalmol., 108:1474-147を参照)。Avery 等 はニュージーランドアルビノウサギの麻酔、次いで、中央角膜切開および放射状の角膜ポケットの形成を記載している。徐放性プロスタグランジンペレットをポケット内に置いて、新血管新生を誘導させた。試験化合物を５日間腹腔内投与し、５日目に動物を屠殺した。輪部について撮影した定期的な写真の観察により、試験化合物の効果を評価し、写真を用いて、新血管新生応答、それ故に、輪部血管新生の範囲を計算した。適切な対照と比較しての新血管新生の減少した範囲は、試験化合物が新血管新生を減少するかもしくは阻害するのに有効であることを示す。
【０２５８】
血管形成の阻害における試験化合物の効果を評価するために使用される血管形成モデルは、Min et al. Canc. Res. 56:2428-2433 (1996)によって記載されている。Ｃ５７ＢＬ６マウスは、血管形成誘導因子としてのｂＦＧＦを試験化合物と共にもしくは無しで含有するマトリゲル混合物の皮下注射を受ける。５日後に動物を屠殺し、そして新血管新生が視認できるところのマトリゲルプラグを写真撮影する。マトリゲルおよび有効用量の試験化合物の投与を受けた実験動物は、対照動物またはより少ないかもしくは無効の量の化合物を投与された実験動物より少ない血管新生を示す。
【０２５９】
原発腫瘍の拡散を制限する能力について試験化合物を試験するためにデザインされたインビトロシステムが、Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5021-5025 (1993)によって記載されている。ＣＡＴ(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)を発現するように工学操作された腫瘍細胞(ＰＣ３)を、ヌードマウスに注射する。腫瘍のサイズおよび／もしくは転移を減少させるそれらの活性について試験するための化合物を動物に投与し、そしてその後で腫瘍サイズならびに／または転移性増殖の測定を行う。加えて、種々の臓器中で検出されるＣＡＴのレベルは、試験化合物が転移を阻害する能力の指標を提供する；対照動物に対して処置動物の組織中のより少ないＣＡＴの検出は、より少ないＣＡＴ−発現細胞がその組織に移行したことを示す。
【０２６０】
高度に侵襲性であることが知られている腫瘍細胞株Ｆ３ＩＩを用いる、試験セリンプロテアーゼ阻害剤の阻害能を評価するために、インビボ実験モデルがデザインされた (例えば、Alonso et al., Breast Canc. Res. Treat. 40:209-223 (1996)、を参照)。Alonsoは、毒性測定、腫瘍成長、侵襲性、自発的転移、実験的肺転移、および血管形成アッセイについてのインビトロの研究を記載している。
【０２６１】
L. Ossowskiにより1998に (J. Cell Biol. 107:2437-2445 (1988))最初に記載されたＣＡＭモデル(ニワトリ胚絨毛尿膜モデル)は、試験化合物の阻害活性を評価するためのもう一つの方法を提供する。ＣＡＭモデルにおいては、腫瘍細胞は、ＣＡＭを含有する絨毛尿膜を通して侵入する(いくつかのセリンプロテアーゼ阻害剤の存在下での腫瘍細胞では、膜を通しての腫瘍細胞のより少ないかもしくは無い侵入をもたらす)。かくして、ＣＡＭアッセイは、種々の濃度の試験化合物の存在下および不在下に、ＣＡＭならびに腫瘍細胞により行われる。腫瘍細胞の侵襲性は、化合物の阻害活性の指標を提供するような条件下で測定される。阻害活性を有する化合物は、より少ない腫瘍侵入と相関する。
【０２６２】
ＣＡＭモデルはまた、血管形成(即ち、新しい血管の形成に対する作用)の標準的アッセイに使用される(Brooks et al. Methods in Molecular Biology 129:257-269 (1999))。このモデルにしたがえば、塩基性線維芽細胞増殖因子(ｂＦＧＦ)のような血管形成誘導因子を含有するフィルターディスクをＣＡＭ上に置く。ＣＡＭ中へのサイトカインの拡散が局所的な血管形成を誘導し、これを、フィルターディスク直下のＣＡＭ内の血管の分岐点の数を数えるような、いくつかの方法で測定することができる。同定された化合物がサイトカイン誘導性血管形成を阻害する活性を、この方法を用いて試験することができる。試験化合物は、血管形成誘導因子を含有するフィルターディスクに添加されるか、もしくは膜上に直接置かれるか、または全身的に投与されるかのいづれかである。試験化合物の存在および／もしくは不在下での新しい血管形成の程度を、このモデルを用いて比較することができる。試験物質の存在下におけるさらに少ない新しい血管の形成は、抗血管形成活性を示すであろう。ＭＴＳＰ９ポリペプチドの阻害剤に対する抗血管形成活性の実証は、そのＳＰタンパク質についての血管形成における役割を示す。
【０２６３】
b．既知のセリンプロテアーゼ阻害剤
スクリーニングのための化合物は、ＭＴＳＰ９の活性を阻害するそれらの能力について試験することができるところのセリンプロテアーゼ阻害剤であり得る。、スクリーニングアッセイにおける使用のための例示的なセリンプロテアーゼ阻害剤としては、セリンプロテアーゼ阻害剤３(ＳＰＩ−３)(Chen, et al. Citokine, 11:856-862 (1999))；アプロチニン (Iijima, R., et al., J. Biochem. (Tokyo) 126:912-916 (1999))；Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤様タンパク質(Niimi, et al. Eur. J. Biochem., 266:282-292 (1999))；Kunitz型セリンプロテアーゼ阻害剤(Ravichandran, S., et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 55:1814-1821 (1999))；組織因子経路阻害因子−２／マトリックス関連セリンプロテアーゼ阻害剤(ＴＦＰＩ−２／ＭＳＰＩ) (Liu, Y. et al. Arch. Biochem. Biophys. 370:112-8 (1999))；Bukunin (Cui, C.Y.  et al.  J. Invest. Dermatol. 113:182-8 (1999))；メシル酸ナフモスタット(Ryo, R. et al.  Vox Sang. 76:241-6 (1999))；ＴＰＣＫ (Huang et al. Oncogene 18:3431-3439 (1999)); 合成綿結合セリンプロテアーゼ阻害剤(Edwards et al. Wound Repair Regen. 7:106-18 (1999)); ＦＵＴ−１７５ (Sawada, M. et al. Stroke 30:644-50 (1999)); セリンプロテアーゼ阻害剤ＦＵＴ−０１７５およびトロンボキサン合成酵素阻害剤ＯＫＹ−０４６の組合せ(Kaminogo et al. Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 38:704-8; 議論 708-9 (1998))；ラットセリンプロテアーゼ阻害剤２.１遺伝子(LeCam, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 253:311-4 (1998))；ラット脳下垂体中に発現される新規細胞内セリンプロテアーゼ阻害剤とグランザイムＢとの複合体(Hill et al. FEBS Lett. 440:361-4 (1998))；３,４−ジクロロイソクマリン(Hammed et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 219:132-7 (1998))；ＬＥＸ０３２(Bains et al. Eur. J. Pharmacol. 356:67-72 (1998))；Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロルメチルケトン(Dryjanski et al. Biochemistry 37:14151-6 (1998))；セリンプロテアーゼ阻害剤ニューロセルピン(Ｐ１１２)のマウス遺伝子(Berger et al. Gene, 214:25-33 (1998))；ラットセリンプロテアーゼ阻害剤２．３遺伝子(Paul et al. Eur. J. Biochem.  254:538-46 (1998))；エコチン(Yang et al. J. Mol. Biol. 279:945-57 (1998))；１４ｋＤａ植物関連セリンプロテアーゼ阻害剤(Roch et al. Dev. Comp. Immunol. 22(1):1-12 (1998))；マトリックス関連セリンプロテアーゼ阻害剤ＴＦＰＩ−２／３３  ｋＤａ  ＭＳＰＩ(Rao et al. Int. J. Cancer 76:749-56 (1998))；ＯＮＯ−３４０３(Hiwasa et al. Cancer Lett. 126:221-5 (1998))；ブデラスタチン(Moser et al. Eur. J. Biochem. 253:212-20 (1998))；ブキニン(Xu et al. J. Mol. Biol. 276:955-66 (1998))；メシル酸ナファモスタット(Mellgren et al. Thromb. Haemost. 79:342-7 (1998))；成長ホルモン依存性セリンプロテアーゼ阻害剤Ｓｐｉ  ２．１(Maake et al. Endocrinology 138:5630-6 (1997))；Kunitz型セリンプロテアーゼ阻害剤である２型成長因子アクチベーター阻害剤(Kawaguchi et al. J. Biol. Chem., 272:27558-64 (1997))；サバクトビバッタSchistocerga gregariaの卵巣由来の熱安定性セリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質(Hamdaoui et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 238:357-60 (1997))；Kunitz型プロテアーゼ阻害剤であるヒト胎盤幹細胞成長因子アクチベーター阻害剤(Shimomura et al. J. Biol. Chem. 272:6370-6 (1997))；経口セリンプロテアーゼ阻害剤ＦＵＴ−１８７(Shiozaki et al. 癌と化学療法, 23(14): 1971-9 (1996))；細胞外マトリックス関連セリンプロテアーゼ阻害剤(Ｍｒ  ３３,０００,  ３１,０００および２７,０００(Rao, C.N., et al., Arch. Biochem. Biophys., 335:82-92 (1996))；不可逆的イソクマリンセリンプロテアーゼ���害剤(Palencia, D.D., et al., Biol. Reprod., 55:536-42 (1996))；フッ化4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニル(ＡＥＢＳＦ) (Nakabo et al. J. Leukoc. Biol. 60:328-36 (1996))；ニューロセルピン(Osterwalder, T., et al., EMBO J. 15:2944-53 (1996))；ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤であるアルファ−１−アンチトリプシン(Forney et al. J. Parasitol.. 82:496-502 (1996))；ラットセリンプロテアーゼ阻害剤２．３(Simar-Blanchet, A.E., et al., Eur. J. Biochem., 236:638-48 (1996))；メシル酸ゲバキセート(parodi, F., et al., J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 10:235-7 (1996))；組換えセリンプロテアーゼ阻害剤ＣＰＴＩ  ＩＩ(Stankiewicz, M., et al., (Acta Biochim. Pol., 43(3):525-9 (1996))；システイン富化セリンプロテアーゼ阻害剤(グアメリンII)(Kim, D.R., et al., J. Enzym. Inhib., 10:81-91 (1996))；ジイソプロピルフルオロホスフェート(Lundqvist, H., et al., Inflamm. Res., 44(12):510-7 (1995))；ネキシン１(Yu, D.W., et al., J. Cell Sci., 108(Pt 12):3867-74 (1995))；ＬＥＸ０３２(Scalia, R., et al., Shock, 4(4):251-6 (1995))；プロテアーゼネキシンI(Houenou, L.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92(3):895-9 (1995))；キマーゼ指向性セリンプロテアーゼ阻害剤(Woodard S.L., et al., J. Immunol., 153(11):5016-25 (1994))；Ｎ−アルファ−トシル−Ｌ−リジル−クロロメチルケトン(ＴＬＣＫ)(Bourinbaiar, A.S., et al., Cell Immunol., 155(1):230-6 (1994))；Ｓｍｐｉ５６(Ghendler, Y., et al., Exp. Parasitol., 78(2):121-31 (1994))；Schistosoma haematobiumのセリンプロテアーゼ(Blanton, R.E., et al., Mol. Biochem. Parasitol., 63(1):1-11 (1994))；Ｓｐｉ−１(Warren, W.C., et al., Mol. Cell Endocrinol., 98(1):27-32 (1993))；ＴＡＭＥ(Jessop, J.J., et al., Inflammation, 17(5):613-31 (1993))；アンチトロンビンIII(Kalaria, R.N., et al., Am. J. Pathol., 143(3):886-93 (1993))；ＦＯＹ−３０５(Ohkoshi, M., et al., Anticancer Res., 13(4):963-6 (1993))；メシル酸カメオスタット(Senda, S., et al., Intern. Med., 32(4):350-4 (1993));色素上皮由来因子(Steele, F.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(4):1526-30 (1993))；アンチスタチン(Holstein, T.W., et al., FEBS Lett., 309(3):288-92 (1992))；ワクシニアウイルスＫ２Ｌ遺伝子がセリンプロテアーゼ阻害剤をコード化する(Zhou, J., et al., Virology, 189(2):678-86 (1992))；Bowman-Birkセリンプロテアーゼ阻害剤(Werner, M.H., et al., J. Mol. Biol., 225(3):873-89 (1992)；ＦＵＴ−１７５(Yanamoto, H., et al., Neurosurgery, 30(3):358-63 (1992))；ＦＵＴ−１７５(Yanamoto, H., et al., Neurosurgery, 30(3):351-6, 議論 356-7 (1992))；ＰＡＩ−Ｉ(Yreadwell, B.V., et al., J. Orthop. Res., 9(3):309-16 (1991))；３,４−ジクロロイソクマリン(Rusbridge, N.M., et al., FEBS Lett., 268(1):133-6 (1990))；アルファ１−アンチキモトリプシン(Lindmark, B.E., et al., Am. Rev. Respir. Des., 141(4 Pt 1):884-8 (1990))；Ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンメチルエステル(ＴＡＭＥ)(Scuderi, P., J. Immunol., 143(1):168-73 (1989))；アルファ−１−アンチキモトリプシン(Abraham, C.R., et al., Cell, 52(4):487-501 (1988))；コントラプシン(Modha, J., et al., Parasitology, 96 (Pt 1):99-109 (1988))；アルファ２−アンチプラスミン(Holmes, W.E., et al., J. Biol. Chem., 262(4):1659-64 (1987))；３,４−ジクロロイソクマリン(Harper, J.W., et al., Biochemistry, 24(8):1831-41 (1985))；ジイソプロピルフルオロホスフェート (Tsutsui, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 123(1):271-7 (1984))；メシル酸ガベキセート(Hesse, B., et al., Pharmacol. Res. Commun., 16(7):637-45 (1984))；フッ化フェニルメチルスルホニル(Dufer, J., et al., Scand. J. Haematol., 32(1):25-32 (1984))；プロテアーゼ阻害剤ＣＩ−２(McPhalen, C.A., et al., J. Mol. Biol.,  168(2):445-7 (1983))；フッ化��ェニルメチルスルホニル(Sekar V., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 89(2):474-8 (1979))；ＰＧＥ１(Feinstein, M.D., et al., Prostaglandine, 14(6):1075-93 (1977)、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６４】
ｃ．コンビナトリアルライブラリーおよび他のライブラリー
スクリーニングアッセイのための化合物の供給源は、コンビナトリアルライブラリーを含むが、それらに限定されない、ライブラリーであり得る。コンビナトリアルライブラリーを合成するための方法およびそのようなコンビナトリアルライブラリーの特色は、当分野において公知である(一般的には、「コンビナトリアルライブラリー：合成、スクリーニングおよび応用可能性」、(Cortese Ed.) Walter de Gruyter, Inc., 1995; Tietze and Lieb, Curr. Opin. Chem. Biol., 2(3):363-71 (1998); Lam, Anticancer Drug Des., 12(3):145-67 (1997); Blaney and Martin, Curr. Opin. Chem. Biol., 1(1):54-9 (1997); and Schultz and Schultz, Biotechnol. Prog., 12(6):729-43 (1996)、を参照)。
【０２６５】
種々のライブラリー、主としてペプチドおよびヌクレオチドに基づくオリゴマーライブラリー、を作成するための方法および戦略は、分子生物学的方法ならびに／もしくは同時化学合成の方法論を用いて開発されてきた(例えば、Dower et al., Annu. Rep. Med. Chem., 26:271-280 (1991); Fodor et al., Science, 251:767-773 (1991); Jung et al., Angew. Chem. Ind. Ed. Engl., 31:367-383 (1992); Zuckerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4505-4509 (1992); Scott et al., Science, 249:386-390 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); and Gallop et al., J. Medicinal Chemistry, 37:1233-1251 (1994)、を参照)。得られたコンビナトリアルライブラリーは、潜在的に数百万の化合物を含有しており、それを、選択された活性を示す化合物を同定するためにスクリーニングすることができる。
【０２６６】
ライブラリーは、大まかに次の３つのカテゴリーに分類される：ファージ粒子もしくはプラスミドから発現されたタンパク質の表面にランダムなペプチドまたはタンパク質が提示されている、融合タンパク質がディスプレーされるペプチドライブラリー；個別の化合物もしくは化合物の混合物がレジンビーズ(例えば、Lam et al., Nature, 354:82-84 (1991)、を参照)および綿の支持体(例えば、Eichler et al., Biochemistry 32:11035-11041 (1993)、を参照)のような、不溶性マトリックス上に提示される、支持体に結合された合成化学ライブラリー；ならびに化合物が溶液中で使用される方法(例えば、Houghten et al., Nature, 354:84-86 (1991); Houghten et al., BioTechniques, 313:412-421 (1992); and Scott et al., Curr. Opin. Biotechnol., 5:40-48 (1994)、を参照)、である。合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーの夥しい例があり、そして非ペプチド性有機低分子を含有するライブラリーを生産するための多数の方法がある。そのようなライブラリーは、種々の有機分子の混合物を形成するように組合せることができるところの、もしくは選択されたファルマコフォアモノマーに基づくライブラリーを形成するように組合せることができるところの、モノマーの基底セットに基づくことができる。
【０２６７】
ランダムなもしくは確定的なコンビナトリアルライブラリーのいずれかを、本明細書において開示され、そして／もしくはクレームされるスクリーニング法によってスクリーニングすることができる。これらの二つのライブラリーのいずれかにおいても、ライブラリーのそれぞれのユニットは、固体支持体上で単離されおよび／もしくは固定化される。確定的なライブラリーでは、それぞれの固体支持体上の特定のユニットの位置が予め判っている。ランダムライブラリーでは、それぞれの位置はやはり単一の独特のユニットを含有しているが、特定のユニットの位置は予め判っていない。ライブラリーを調製するための多数の方法が、当業者に周知である(例えば、Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1984), Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5131-5135 (1985)、を参照)。スクリーニングのために、当業者に周知の任意の技法により作成されたコンビナトリアルライブラリーが意図される(例えば、スクリーニングについては、Schultz and Schultz, Biotechnol. Prog., 12(6):729-43 (1996)の表１、を参照); Bartel et al., Science, 261:1411-1418 (1993); Baumbach et al. BioPharm, (Can):24-35 (1992); Bock et al.  Nature, 355:564-566 (1992); Borman, S.、「コンビナトリアルケミストは低分子の分子認識および自動化に焦点を当てる」、 Chem. Eng. News, 2(12):29 (1996); Boublik, et al.、「真核生物ウイルスディスプレー：ウイルス表面上に異種タンパク質を提示するためのAutographa California核多角体ウイルス(ＡＣＮＰＶ)の主要表面糖タンパク質の工学操作」、Bio/Technology, 13:1079-1084 (1995); Brenner, et al.、「コード化されたコンビナトリアルケミストリー」、Proc. Natl. Acad Sci. 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【０２６８】
例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはＳＰタンパク質のプロテアーゼドメインに結合するペプチドを、ファージディスプレーライブラリーを用いて同定することができる。例示的実施態様では、この方法は、ａ)ファージライブラリーからのファージをＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインと接触させること；(ｂ)タンパク質に結合するファージを単離すること；そして(ｃ)単離されたファージによりコード化される少なくとも一つのペプチドの正体を決定して、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合するペプチドを同定すること、を含む。
【０２６９】
Ｈ．ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性のモジュレーター
ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはプロテアーゼドメインを用いて、他のスクリーニング法でスクリーニングにより同定された、もしくは生産された、ＭＴＳＰ９の活性を調整する化合物が、本明細書において提供される。これらの化合物は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドと直接相互作用することにより、またはその転写もしくは翻訳を変化させることにより、作用する。そのような分子としては、ＭＴＳＰ９ポリペプチドと、特にそのプロテアーゼドメインと、特異的に反応する抗体、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの発現を変化させるところのアンチセンス核酸もしくはＲＮＡｉのような二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、抗体、ペプチドミメティックおよび他のそのような抗体、が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２７０】
１．抗体
本明細書において提供されるＭＴＳＰ９ポリペプチド、特にその単鎖プロテアーゼドメイン、もしくは完全長の活性化型、またはプロテアーゼドメイン、またはチモーゲン型に特異的に結合する、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む抗体が提供される。
【０２７１】
一般的には抗体は、モノクローナル抗体であって、典型的には抗体は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインに特異的に結合する。特別な実施態様では、ＭＴＳＰ９の単鎖もしくは２本鎖型のプロテアーゼドメインのそれぞれに対する抗体が提供される。また、ＭＴＳＰ９の任意のドメインおよびその２本鎖型に特異的に結合する抗体が提供される。
【０２７２】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドならびにそのドメイン、フラグメント、同族体および誘導体を免疫原として使用して、そのような免疫原に特異的に結合する抗体を作成することができる。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様では、ヒトＭＴＳＰ９ポリペプチドに対する抗体が生産される。もう一つの実施態様では、フラグメントがセリンプロテアーゼドメインを含有するところのＭＴＳＰ９ポリペプチドのフラグメントから生成した複合体が、抗体生産のための免疫原として使用される。
【０２７３】
ＭＴＳＰ９ポリペプチド、そのドメイン、誘導体、フラグメントもしくは類似体に対するポリクローナル抗体の生産のために、当分野において公知の種々の手順を使用することができる。抗体の生産のために、天然のＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくは合成物、または架橋したＭＴＳＰ９ポリペプチドのような、前述の事項を注射することにより、種々の宿主動物を免疫することができる。そのような宿主動物としては、ウサギ、マウス、ラット等が挙げられるが、これらに限定されない。宿主動物種に依存して免疫応答を増強するために、種々のアジュバントを使用することができて、そしてそれらとしては、フロイント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プロロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール、ならびにカルメット-ゲラン杆菌(ＢＣＧ)およびCorynebacterium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバント、が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２７４】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドまたはそのドメイン、誘導体、フラグメントもしくは類似体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培地の中で連続細胞株培養による抗体分子の生産を提供するところの任意の技法を使用することができる。そのような技法としては、Kohler and Milstein (Nature 256:495-497 (1975))により始めに開発されたハイブリドーマ技法、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法(Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983))、およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶハイブリドーマ技法(Cole et al.、「モノクローナル抗体および癌治療」中、Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985))、が挙げられるが、それらに限定されない。さらに別なな実施態様では、モノクローナル抗体を、無菌動物中で最近の技術を用いて生産することができる(ＰＣＴ/米国特許第９０／０２５４５号)。ヒト抗体は用いられて、そしてヒトハイブリドーマを使用することにより(Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030 (1983))、もしくはインビトロでＥＢＶでヒトＢ細胞を形質転換させることにより(Cole et al., 「モノクローナル抗体および癌治療」中, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985))、得られることができる。ＭＴＳＰ９ポリペプチドに特異的なマウスの抗体分子からの遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライスすることによる、''キメラ抗体''の生産のために開発された技法(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))を使用することができる。
【０２７５】
ＭＴＳＰ９をコード化する核酸分子もしくはその部分をＤＮＡ免疫プロトコールにおいて使用して、ＭＴＳＰ９に結合する抗体を生産することができる(例えば、米国特許第５,７９５,８７２号および米国特許第５,６４３,５７８号ならびに米国特許第６,３３７,０７２号、を参照)。
【０２７６】
単鎖抗体の生産のために記載されている技法(米国特許第４,９４６,７７８号)を、ＭＴＳＰ９ポリペプチド特異的単鎖抗体を生産するように適合させることができる。さらに別な実施態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載された技法(Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989))を使用して、ＭＴＳＰ９ポリペプチドまたはそのドメイン、誘導体、もしくは類似体に所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で簡便な同定を可能にする。非ヒト抗体を、既知の方法(例えば、米国特許第５,２２５,５３９号、を参照)によって''ヒト化''することができる。
【０２７７】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのエピトープに特異的に結合する抗体フラグメントを、当分野において公知の技法により生成することができる。例えば、そのようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により生産することのできるＦ(ａｂ’)２フラグメント；Ｆ(ａｂ’)２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作成することのできるＦａｂ’フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成されるＦａｂフラグメント、ならびにＦｖフラグメント：が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２７８】
抗体の生産において、所望の抗体のためのスクリーニングは、当分野において公知の技法、例えばＥＬＩＳＡ(酸素結合免疫吸着検査法)、によって達成される。ＭＴＳＰ９ポリペプチドの特定のドメインに対して特異的な抗体を選択するために、そのようなドメインを含有するＭＴＳＰ９ポリペプチドのフラグメントに結合するところの生産物を求めて、生成されたハイブリドーマをスクリーニングことができる。
【０２７９】
上述の抗体は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドタンパク質の局在化および／もしくは定量に関する、例えば、例えば診断方法における、これらのタンパク質の撮像、適切な生理学的サンプル中におけるそのレベルの測定について、当分野において公知の方法に使用されることができる。もう一つの実施態様では、抗ＭＴＳＰ９ポリペプチド抗体、もしくは結合ドメインを含有するそのフラグメントは治療薬として使用される。
【０２８０】
２．ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティック
ＳＰタンパク質に結合して、活性を調整するところの分子を同定する方法が、本明細書において提供される。ＳＰ、特にそれらの単鎖プロテアーゼドメインもしくは触媒的に活性なフラグメント、に結合する分子の中には、環状ペプチドを含む、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックが含まれる。ペプチドミメティックとは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのような標的分子に特異的に結合するために必要な、リガンドもしくはポリペプチドの分子配座を模倣する分子もしくは化合物である。例示的な実施態様では、ペプチド、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックもしくはペプチドミメティックは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインに結合する。そのようなペプチドおよびペプチドミメティックとしては、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに特異的に結合し、典型的には、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインに結合するところの抗体のそれらが、挙げられる。本明細書において提供される方法によって同定されるペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストであり得る。
【０２８１】
そのようなペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックは、哺乳動物においてＭＴＳＰ９ポリペプチドと関連する疾患もしくは障害について、診断すること、処置すること、予防することおよびスクリーニングすることに有用である。加えて、ペプチドおよびペプチドミメティックは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を調整するか、もしくはＭＴＳＰ９ポリペプチド、一般的にはＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメイン、に特異的に結合するところの分子または化合物を同定すること、単離すること、そして精製することに有用である。低分子量ペプチドおよびペプチドミメティックは、標的分子、例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメイン、に強力に結合する性質を有することができる。
【０２８２】
本明細書において説明されるようなＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合する、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを、ＭＴＳＰ９ポリペプチド活性を調整するために、ヒトを含む哺乳動物に、投与することができる。かくして、そのような活性を調整するために十分な量において、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチド模倣化合物を投与することを含む、新生物形成性疾患の療法的処置および予防のための方法が提供される。かくしてまた、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドの模倣化合物を、対象に治療的に有効な用量もしくは量で投与する、そのような疾患もしくは障害を持つ対象を処置する方法が、本明細書において提供される。
【０２８３】
ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを含有する組成物を、予防的および／もしくは治療的処置のために、投与することができる。治療的な適用においては、組成物を、上記のように、疾患にすでに罹患している患者に、疾患もしくはその合併症の症状を治癒するかもしくは少なくとも部分的に停止させるために十分な量で、投与することができる。この用途のための有効量は、疾患の重症度ならびに患者の体重および一般的状態に依存するであろうし、そして経験的に決定され得る。
【０２８４】
予防的な適用では、特定の疾患に罹りやすいかもしくはさもなければ危険性にある患者に、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを含む組成物を投与することができる。そのような量を、''予防的有効服用量''であると定義する。この用途では、正確な量は、患者の健康状態および体重に再び依存する。したがって、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合する、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを用いて、医薬担体もしくは希釈剤と共同で、少なくとも一つのペプチドもしくはペプチドミメティックを活性成分として含有する、医薬組成物を調製することができる。化合物を、例えば経口的、経肺的、非経口的(筋肉内、腹腔内、静脈内(ＩＶ)もしくは皮下の注射)、吸入(微細粉末製剤を介して)、経皮的、経鼻的、経膣的、経直腸的、または舌下的な投与経路によって投与することができて、そしてそれぞれの投与経路に適当な投与剤型で処方することができる(例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９３／２５２２１号および第ＷＯ  ９４／１７７８４号；ならびに欧州特許出願第６１３,６８３号、を参照)。
【０２８５】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合するところのペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの生産に影響しそして影響されると考えられる多くの因子の評価を含む、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの生物学的な役割を理解するための特有なツールとして、インビトロで有用である。また、そのようなペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合しそしてその活性を調整する、他の化合物の開発において、かかる化合物がそのような開発を促進するにちがいないところの構造と活性相関についての重要な情報を提供するので、有用である。
【０２８６】
また、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックは、新規なＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドアゴニストを求めてスクリーニングするためのアッセイにおいて、競合的結合剤として有用である。そのようなアッセイの実施態様では、化合物を修飾することなく使用することができるか、または種々の方式で；例えば、検出可能なシグナルを直接的にもしくは間接的に提供するところの部分を、共役結合的にもしくは非共役結合的に接合するような標識化によって、修飾することができる。任意のこれらのアッセイにおいて、物質はそこへ直接的もしくは間接的に標識され得る。直接的標識化の可能性としては、以下のような標識基が挙げられる：ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような１２５Ｉ酵素(米国特許第３,６４５,０９０号)のような放射性標識ならびに蛍光強度、波長シフトもしくは蛍光分極における変化をモニターする能力のある蛍光標識(米国特許第３,９４０,４７５号)である。間接的標識化の可能性としては、一つの構成要素のビオチン化に引き続いて上の標識基の一つにカップリングされたアビジンへ結合することが挙げられる。また、化合物は、化合物が固体支持体に付着されるはずである場合には、スペーサーもしくはリンカーを含むことができる。
【０２８７】
さらに、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合するそれらの能力に基づいて、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを、生存細胞、固定化された細胞中で、生体液中で、組織ホモジェネート中で、および精製された天然生体物質中で、ＭＴＳＰ９ポリペプチドを検出するための試薬として使用することができる。例えば、そのようなペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを標識することにより、ＭＴＳＰ９ポリペプチドを有する細胞を同定することができる。加えて、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合するそれらの能力に基づいて、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを、インシツ染色、ＦＡＣＳ(蛍光標示式細胞分取)、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡおよび他の分析プロトコールで使用することができる。ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合するそれらの能力に基づいて、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの精製において、もしくはＭＴＳＰ９ポリペプチド、例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインをコード化するポリペプチド、を発現する細胞の精製において、使用することができる。
【０２８８】
また、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを、種々の医学的研究および診断的使用のための商業的試薬として使用することができる。ペプチドおよびペプチドミメティックの活性を、McDonald (1992) Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14: 821に記載される多数のモデルの一つで、インビトロもしくはインビボのどちらかで評価することができる。
【０２８９】
３．ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティック治療
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの性質に類似した性質を持つ非ペプチド薬物として製薬産業で一般的に用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、''ペプチドミメティック''もしくは''ペプチド性ミメティック''(Luthman et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14: 386406, 2nd Ed., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:16991720; Fauchere (1986) J. Adv. Drug Res., 15: 29; Veber and Freidinger (1985) TINS, p. 392; and Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229)と呼称される。治療的に有用なペプチドに構造的に類似するところのペプチドミメティックを用いて、同等なもしくは強化された治療的または予防的効果を生成することができる。ペプチド性ミメティックの調製およびそれらの構造は、当業者に公知である。
【０２９０】
コンセンサス配列を持つ一つもしくはそれ以上のアミノ酸の、同型Ｄ−アミノ酸による系統的な置換(例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン)を用いて、より安定なペプチドを生成することができる。加えて、コンセンサス配列もしくは実質的に同等なコンセンサス配列変異を含む連結式ペプチドを、当分野において公知の方法(Rizo et al. (1992) An. Rev. Biochem., 61: 387、(出典明示により本明細書の一部とする))によって；例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド橋を形成する能力のある内部システイン残基を付加することによって、生成することができる。
【０２９１】
当業者は、ペプチドの生物学的もしくは機能的活性に有害な影響を与えることなく、ペプチドもしくはミメティックに修飾を行い得ることを認識する。さらに、当業者は、標的分子、例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくは、一般的には、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメイン、に結合するところのペプチドを模倣する、三次元項での非ペプチド構造をデザインする仕方を承知しているであろう(例えば、Eck and Sprang (1989) J. Biol. Chem., 26: 17605-18795、を参照)。
【０２９２】
診断目的に用いるときには、ペプチドおよびペプチドミメティックを、検出可能な標識で標識し得て、したがってそのような標識のないペプチドおよびペプチドミメティックは、標識化されるペプチドおよびペプチドミメティックの調製において中間体として役立つ。検出可能な標識は、ペプチドおよびペプチドミメティックに共役結合的に結合されるとき、インビボ、例えば、ペプチドおよびペプチドミメティックが投与されている患者中で、もしくはインビトロ、例えば、試料もしくは細胞中で、ペプチドおよびペプチドミメティックの検出を許容するところの、分子もしくは化合物であり得る。適当な検出可能な標識は当分野において周知であり、そして、例として、放射性同位元素、蛍光標識(例えば、フルオレセイン)等が、挙げられる。使用される特定の検出可能な標識は、重大ではなくて、無毒性レベルで検出されるために選択される。そのような標識の選択は、当分野の技術内に十分にある。
【０２９３】
検出可能な標識のペプチドもしくはペプチドミメティックへの共役結合的な付着は、当分野において周知の従来の方法により、達成される。例えば、１２５I放射性同位元素を検出可能な標識として使用するとき、ペプチドもしくはペプチドミメティックへの１２５Iの付着を、アミノ酸チロシンをペプチドもしくはペプチドミメティックへ組み込んで、そして次いでペプチドをヨウ素化することにより達成することができる(例えば、 Weaner et al. (1994) Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds, pp. 137140、を参照)。もしチロシンがペプチドもしくはペプチドミメティック中に存在しないならば、ペプチドもしくはペプチドミメティックのＮもしくはＣ末端へのチロシンの組み込みを、周知の化学によって達成することができる。同様に、３２Ｐを、例えば、従来の化学を使用してペプチドもしくはペプチドミメティック上の水酸基、を通してリン酸部分として、ペプチドまたはペプチドミメティック中に組み入れることができる。
【０２９４】
ペプチド性ミメティックの標識化は、普通、定量的構造−活性データおよび／もしくは分子モデルによって予測されるところの、ペプチドミメティック上の非−妨害位置への、直接的にもしくはスペーサー(例えば、アミド基)を通した、一つもしくはそれ以上の標識の共役結合的な付着を伴う。一般的に、そのような非−妨害位置は、ペプチド性ミメティックが結合して治療効果を生成する、高分子との直接的接触を形成しない位置である。ペプチド性ミメティックの誘導体化(例えば、標識化)は、ペプチド性ミメティックの所望の生物的もしくは薬理学的活性を実質的に妨害してはならない。
【０２９５】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインに結合するおよび／もしくはその活性を調整するか、またはＭＴＳＰ９ポリペプチド活性を示することができるところの、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを、新生物形成性疾患の処置に用いることができる。ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを、インビボもしくはエクスビボで、処置を必要とする対象の細胞に送達することができる。さらに、ＭＴＳＰ９ポリペプチド活性を有するペプチドを、インビボもしくはエクスビボで、ＭＴＳＰ９ポリペプチド遺伝子をコード化している突然変異体もしくは欠損対立遺伝子を保持しているところの細胞に、送達することができる。本明細書において説明されもしくは当業者に公知である任意の技法を、他のヒトタンパク質が実質的に存在しないところのそのようなペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックの調製、ならびにインビボもしくはエクスビボでの送達のために、用いることができる。例えば、微生物中での発現もしくはインビトロでの合成によって、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを容易に調製することができる。
【０２９６】
ペプチドまたはペプチドミメティックを、インビボもしくはエクスビボで、例えば、マイクロインジェクションによりまたは、リポソームを用いて、細胞中へ導入することができる。これに代えて、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックを、インビボもしくはエクスビボで、能動的にまたは拡散で、細胞により取り込ませるることができる。加えて、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックの細胞外適用は、新生物形成性疾患の処置を効果的にするのに十分であり得る。１)ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインに結合する；または、２)ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインと類似の機能または活性を有する、ところの薬物もしくは有機化合物のような他の分子を、処置のための方法で用いることができる。
【０２９７】
４.合理的ドラッグデザイン
合理的ドラッグデザインの目標点は、例えば、それらのより活性なもしくは安定形態であるところの；または例えば、インビボでポリペプチド(例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチド)の機能を強化するかもしくは妨害するところの、薬物を作り上げるために、生物学的に活性なポリペプチドもしくは興味のあるペプチドの、またはそれらが相互作用するところの小分子もしくはペプチドミメティック(例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト)の構造類似体、を生産することである。一つのアプローチでは、最初に、興味のあるタンパク質(例えば、プロテアーゼドメインを有するＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはポリペプチド)または、例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチド−リガンド複合体、の三次元構造を、Ｘ−線結晶解析、コンピューターモデリングもしくは、最も典型的には、アプローチの組合せ(例えば、Erickson et al. 1990、を参照)により決定する。また、相同的なタンパク質の構造に基づくモデリングにより、ポリペプチドの構造に関する有用な情報を取得することができる。加えて、アラニン走査により、ペプチドを分析することができる。この技法では、アミノ酸残基をＡｌａで置換して、ペプチド活性へのその効果を測定する。ペプチドのそれぞれのアミノ酸残基を、この様式で分析して、ペプチドの重要な領域を決定する。
【０２９８】
また、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合する、ポリペプチドもしくはペプチドまたは、一般的には、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインを、機能的アッセイにより選択して、次いでこのポリペプチドもしくはペプチドの結晶構造を決定することができる。ポリペプチドは、例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドのタンパク質ドメインに対する特異的な抗体であり得る。このアプローチは、以後のドラッグデザインの基礎となり得る薬理活性団を与えることができる。さらに、抗イディオタイプのポリペプチドもしくはペプチド、(ａｎｔｉ−ｉｄｓ)を、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインに結合するところの機能的、薬理学的に活性なポリペプチドまたはペプチドに対して生成させることによって、結晶解析を完全に迂回することが可能である。鏡像の鏡像として、ａｎｔｉ−ｉｄｓの結合部位は、元の標的分子、例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドを有するポリペプチド、の類似体であると予期される。次いで、ａｎｔｉ−ｉｄｓを用いて、化学的もしくは生物学的に生産されたペプチドのバンクのバンクからペプチドを同定し、単離することができる。次いで、選択されたペプチドは、薬理活性団として作用するであろう。
【０２９９】
かくして、例えば、改良された活性もしくは安定性を有するところの、またはＭＴＳＰ９ポリペプチド活性のモジュレーター(例えば、阻害剤、アゴニストもしくはアンタゴニスト)として作用して、方法、特に新生物形成性疾患の診断、処置、予防およびスクリーニングのための方法、において有用であるところの薬物を、デザインすることができる。ＭＴＳＰ９ポリペプチドをコード化する核酸が入手可能なお陰で、Ｘ−線結晶解析のような分析研究を実施するのために十分な量のＭＴＳＰ９ポリペプチドを、入手可能にすることができる。加えて、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメイン、例えば、配列番号：５および６のアミノ酸配列によってコード化されるプロテアーゼドメイン、のアミノ酸配列の知識が、Ｘ−線結晶解析の代わりのもしくはそれに加えた、コンピューターモデリング技法上の指針を提供することができる。
【０３００】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合する、ペプチドおよびペプチドミメティックを同定する方法
本明細書において提供されるＭＴＳＰ９ポリペプチド(例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインを有するポリペプチド)に結合親和性を有するペプチドを、例えば、親和性強化法と組合わせたランダムなペプチド多様性発生システムによって、容易に同定することができる。特に、ランダムなペプチド多様性発生システムとしては、''プラスミド上のペプチド''システム(例えば、米国特許第５,２７０,１７０号および第５,３３８,６６５号、を参照)；''ファージ上のペプチド''システム(例えば、米国特許第６,１２１,２３８号およびCwirla,et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 63786382、を参照)；''ポリソームシステム''；''コード化された合成的ライブラリー (ESL)''システム；ならびに''超大規模固定化ポリマー''システム(例えば、米国特許第６,１２１,２３８号；およびDower et al. (1991) An. Rep. Med. Chem. 26: 271280、を参照)が挙げられる。
【０３０１】
例えば、上記の手順を用いて、ランダムなペプチドを、通常規定された数のアミノ酸の長さ(例えば、１２)を持つように、デザインすることができる。ランダムなペプチドをコード化するオリゴペプチドの収集を作成するためには、ＮがヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧもしくはＴ(当モル；使用する方法論に依存する、他のヌクレオチドを使用することができる)であり、ＫがＧもしくはＴであり(当モル)、ｘはペプチド(例えば１２)中のアミノ酸数に対応する整数である、コドンモチーフ(ＮＮＫ)ｘを用いて、ＮＮＫモチーフから生じる３２の可能なコドンの任意の一つ：それぞれの１２個のアミノ酸に対して１個、それぞれの５個のアミノ酸に対して２個、それぞれの３個のアミノ酸に対して３個および三つの停止コドンのただ１個、を特定することができる。かくして、ＮＮＫモチーフはすべてのアミノ酸をコード化し、唯一の停止コドンをコード化し、そしてコドンのバイアスを減少する。
【０３０２】
ランダムなペプチドを、例えば、ファージ粒子の表面上に、ファージｆｄ誘導体のｐＩＩＩもしくはｐＶＩＩＩコーティングタンパク質のどちらかを含む融合タンパク質の部分(ファージ上のペプチド)としてまたはプラスミドに結合したＬａｃｌペプチド融合タンパク質との融合タンパク質(プラスミド上のペプチド)としてのどちらかで、提示することができる。プロテアーゼドメインを有する固定化されたＭＴＳＰ９ポリペプチドを用いる親和性強化法によって、ペプチドをコード化するＤＮＡを含むファージもしくはプラスミドを同定しそして単離することができる。時には''パニング''と呼称される親和性強化法は典型的には、固定化されたＭＴＳＰ９ポリペプチドを持つファージ、プラスミド、もしくはポリソームをインキュベートすること、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合する、ファージ、プラスミド、もしくはポリソーム(付随するＤＮＡもしくはｍＲＮＡとともに)を収集すること、およびより多くの収集されたファージもしくはプラスミド(付随するＬａｃｌ−ペプチド融合タンパク質と共に)を生産すること、の多回の繰り返しを伴う。
【０３０３】
ペプチドおよびペプチドミメティックの特色
治療的適用のためのペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティックの中には、約２５０〜約８,０００ダルトンの分子量を有するものがある。もしそのようなペプチドが、親水性ポリマーによるオリゴマー化、もしくは二量体化および／もしくは誘導体化されるならば(例えば、化合物の親和性および／もしくは活性性を増大するために)、そのようなペプチドの分子量は、実質的にはより大きく成り得て、約5００〜約１２０,０００ダルトンまで、通常、約８,０００〜約８０,０００ダルトンまでのどこかの範囲にあり得る。そのようなペプチドは、天然起源もしくは合成的(非天然起源)アミノ酸であるところの９個もしくはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。当業者は、治療的および／もしくは診断的目的に適するペプチドおよびペプチドミメティックの親和性および分子量を決定することができる(例えば、Dower et al., 米国特許第６,１２１,２３８号、を参照)。
【０３０４】
ペプチドを、一つもしくはそれ以上の種々の親水性ポリマーに共役結合的に結合することができる。適当な親水性ポリマーとしては、、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって例示されるポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニールアルコール、ポリビニールピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体が、挙げられるが、それに限定されない。ペプチド化合物をそのようなポリマーで誘導化するとき、それらの安定性および循環半減期を、それらの結合活性を、もしあるとしても、殆ど減少することなく、増加させることができる。ペプチド化合物を二量体化して、その二量体サブユニットのそれぞれを親水性ポリマーに共有結合的に付着させることができる。ペプチド化合物をＰＥＧ化、即ちポリエチレングリコール(ＰＥＧ)に共役結合的に付着させることができる。
【０３０５】
５．ペプチドおよびペプチドミメティックを調製する方法
ＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合するペプチドを、当分野で公知な古典的方法により、例えば、標準的な固相技法を用いることにより、調製することができる。標準的な方法としては、完全固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合、古典的溶液合成、および組換えＤＮＡ技法(例えば、Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149(典明示により本明細書の一部とする)、を参照)によるものさえも、が挙げられる。
【０３０６】
''コードされた合成的ライブラリー''もしくは''超大規模固定化ポリマー合成''システム(例えば、米国特許第５,９２５,５２５号および第５,９０２,７２３号、を参照)を用いて、興味ある活性を持つ最少サイズのペプチドを決定することができる。加えて、所望のモチーフ(もしくはそのモチーフの最小サイズ)から１個、２個もしくはそれ以上の残基で異なるところのペプチドの群を形成するすべてのペプチドを調製することができる。次いで、このプチドの収集物を、標的分子、例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくは、通常、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメイン、に結合する能力に対しスクリーニングすることができる。また、この固定化ポリマー合成システムもしくは他のペプチド合成法を用いて、ペプチド化合物の先端切断類似体および欠失類似体ならびに先端切断類似体および欠失類似体の組合せを合成することができる。
【０３０７】
また、これらの手順を用いて、２０個の天然起源の、遺伝的にコード化されたアミノ酸以外のアミノ酸が、ペプチドの一つ、二つもしくはそれ以上の位置で、置換されている、ペプチドを合成することができる。例えば、合成を促進する、ナフチルアラニンを、トリプトファンの代わりに置換することができる。ペプチド中へ置換することができる、他の合成的アミノ酸としては、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３,４−ジヒドロキシ−フェニルアラニル、Ｌ−ｄ−ヒドロキシリジルおよびＤ−ｄ−メチルアラニルのようなｄアミノ酸、Ｌ−α−メチルアラニル、β−アミノ酸ならびにイソキノリルが挙げられる。また、Ｄアミノ酸および非天然起源の合成的アミノ酸をペプチドに組み込むことができる(例えば、Roberts et al. (1983) Unusual Amino/Acids in Peptide Synthesis, 5(6):341-449、を参照)。
【０３０８】
また、リン酸化によって(例えば、W. Bannwarth et al. (1996) Biorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6(17): 2141-2146、を参照)、およびペプチド誘導体を作製するための他の方法(例えば、Hruby et al. (1990) Biochem. J., 268(2): 249262、を参照)によって、ペプチドを修飾することができる。かくして、ペプチド化合物は、類似のもしくは改良された生物活性を持つペプチドミメティックを調製するための基盤として、また役立つ。
【０３０９】
当業者は、種々の技法が対応するペプチド化合物と同様もしくは類似の所望の生物活性を持つが溶解度、安定性、ならびに加水分解およびタンパク分解に対する感受性に関してペプチドよりもより好ましい活性を持つ、ペプチドミメティックを構築するために利用可能であること、を認識する(例えば、Morgan et al. (1989) An. Rep. Med. Chem., 24:243-252、を参照)。Ｎ−末端アミノ基、Ｃ−末端カルボキシル基で修飾されたペプチドミメティックを調製し、および／もしくはペプチド中の一つもしくはそれ以上のアミド結合を非アミド結合に変更するための方法は、当業者に公知である。
【０３１０】
アミノ末端の修飾としては、アルキル化、アセチル化およびカルボベンゾイル基の付加、サクシンイミド基を形成すること(例えば、Murray et al. (1995) Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Vol. 1, Manfred E. Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc.、を参照)が挙げられるが、それらに限定されない。Ｃ−末端の修飾としては、Ｃ−末端カルボキシル基がエステルもしくはアミドによって置換される、ミメティックまたは環状ペプチドを形成する修飾が挙げられる。
【０３１１】
アミノ末端およびＣ−末端の修飾に加えて、ペプチドミメティックを含むペプチド化合物を、一つもしくはそれ以上の種々の親水性ポリマーでによって、有益に、修飾するかもしくはそれらに共有結合的にカップリングすることができる。ペプチド化合物を親水性ポリマーで誘導体化するときには、その溶解度および循環半減期を増強し、そしてそれらの免疫原性を、それらの結合親和性を、もしあっても、殆ど減少することなく、遮蔽することができるということが見出されている。適当な非タンパク質様のポリマーとしては、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールによって例示されるポリアルキルエーテル、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン、ポリビニールアルコール、ポリビニールピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。通常、そのような親水性ポリマーは、約２,０００〜約４０,０００ダルトンを含めて、約5００〜約１００,０００ダルトンおよび約５,０００〜約２０,０００ダルトンの範囲にある平均分子量を有する。また、親水性ポリマーは、約５,０００ダルトン、１０,０００ダルトンおよび２０,０００ダルトンの平均分子量を有することができる。
【０３１２】
ペプチド化合物を誘導化するかもしくはペプチドをそのようなポリマーにカップリングするための方法が記載されている(例えば、Zallipsky (1995) Bioconjugate Chem., 6: 150165； Monfardini et al. (1995) Bioconjugate Chem., 6: 6269；米国特許番号第４,６４０,８３５号；米国特許番号第４,４９６,６８９号；米国特許番号第４,３０１,１４４号；米国特許番号第４,６７０,４１７号；米国特許番号第４,７９１,１９２号；米国特許番号第４,１７９,３３７号およびＷＯ  ９５／３４３２６(それらのすべてをその全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照)
【０３１３】
ペプチド誘導体を作製する他の方法は、例えば、Hruby et al. (1990), Biochem J., 268(2): 249262 (出典明示により本明細書の一部とする)、に記載されている。かくして、また、ペプチド化合物は、類似の生物活性を持つ非ペプチド化合物のための構造的モデルとして役立つ。当業者は、種々の技法が特定のペプチド化合物と同様もしくは類似の所望の生物活性を持つが、溶解度、安定性、加水分解およびタンパク分解に対する感受性に関してより好ましい活性を持つ化合物を構築するために利用可能であること、を認識する(例えば、Morgan et al. (1989) An. Rep. Med. Chem., 24: 243-252(出典明示により本明細書の一部とする)、を参照)。これらの技法としては、ペプチド主鎖を、ホスホネート、アミデート、カルバメート、スルホンアミド、二級アミン、およびＮ−メチルアミノ酸から成る主鎖で置換することが、挙げられる。
【０３１４】
ペプチド化合物は、システインのチオール基の間に分子内ジスルフィド結合を持つ環化形態で存在することができる。これに代えて、システインのチオール基の間に分子内ジスルフィド結合を形成して、二量体(もしくはより高級なオリゴ体の)化合物を与えることができる。また、一つもしくはそれ以上のシステイン残基をホモシステインで置換することができる。
【０３１５】
Ｉ．結合体
ａ)ＭＴＳＰ９ポリペプチドの単鎖プロテアーゼドメイン(もしくはそれらのタンパク質分解的に活性な部分)または全長のチモーゲン、その活性形態、またはそれらの二本もしくは単鎖プロテアーゼドメイン；ならびにｂ)直接的にもしくはリンカーを介してＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合されたターゲッティング剤であって、そこではその剤が：i）結合体のアフィニティー単離もしくは精製；ii)結合体の表面への付着；iii)結合体の検出；またはiv)選択した組織もしくは細胞への目標を定めた送達を促進するところのもの、を含む結合体が、本明細書において提供される。結合体は、化学的結合体もしくはそれらの融合タンパク質混合物であり得る。
【０３１６】
ターゲッティング剤は、組織特異的もしくは腫瘍特異的なモノクローナル抗体または成長因子またはＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインに、直接的にもしくはリンカーを介するかのどちらかで結合するそのフラグメントのような、タンパク質またはペプチドフラグメント、であり得る。また、ターゲッティング剤は、タンパク質結合配列、核酸結合配列、脂質結合配列、多糖類結合配列もしくは金属結合配列、または固体の支持体に付着するためのリンカーを含むところのタンパク質またはペプチドであり得る。特定の実施態様では、結合体は、ａ)本明細書において説明されるＭＴＳＰ９もしくはその部分；およびｂ)直接的にもしくはリンカーを介してＭＴＳＰ９ポリペプチドに結合されたターゲッティング剤を含む。
【０３１７】
例えば、ＭＴＳＰ９ポリペプチドドメインのアフィニティー単離もしくは精製、表面へのＭＴＳＰ９ポリペプチドドメインの付着、またはＭＴＳＰ９ポリペプチドドメインの検出、を促進するために機能するところのタンパク質もしくはペプチドフラグメント(もしくはそれらの複数)とＭＴＳＰ９ポリペプチとの、融合タンパク質および化学的結合体のような、結合体が提供される。結合体を、チオール結合を介するような化学的結合により生産することができて、そして組換え手段により融合タンパク質として生産することができる。融合タンパク質では、ペプチドもしくはそのフラグメントは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドドメインのＮ−末端もしくはＣ−末端のどちらかに結合される。化学的結合体では、ペプチドもしくはそのフラグメントを、結合を効果的にすることができるところのどこかに結合し得て、そして単一のＭＴＳＰ９ポリペプチドドメインもしくはその複数に結合されたそのようなペプチドもしくはフラグメントの複数があり得る。
【０３１８】
ターゲッティング剤は、細胞もしくは組織へのインビトロまたはインビボ送達のためであって、そして細胞もしくは組織特異的な抗体、成長因子、および特異的な細胞に発現された部分に結合するところの他の因子のような剤；ならびに結合されたタンパク質の指向した送達を促進するところの、細胞もしくは組織特異的な他の剤が、挙げられる。ターゲッティング剤は、細胞表面タンパク質との相互作用および結合体もしくはそのＭＴＳＰ９ポリペプチド部分の内部移行によって、ＭＴＳＰ９ポリペプチドを、選択された細胞へ特異的に送達するものであり得る。
【０３１９】
これらの結合体は、種々の方法で用いられて、そして目標を定めた細胞もしくは組織に局在するかまたは近傍にいるところの特定のＭＴＳＰによる切断で、細胞毒性となるプロドラッグのような、プロドラッグを活性化する方法における使用に特に適している。プロドラッグは、結合体の以前に、もしくはそれと同時に、もしくはその以後に、投与される。目標を定めた細胞への送達に際して、プロテアーゼがプロドラッグを活性化し、それが次いで、細胞毒性のような、治療効果を示す。
【０３２０】
１．結合
結合されたＭＴＳＰ９ポリペプチドドメインとの結合体を、化学的結合、組換えＤＮＡ技法、もしくは組換え発現および化学的結合の組合せのいずれかによって調製することができる。ＭＴＳＰ９ポリペプチドドメインおよびターゲッティング剤を、任意の配向で結合することができて、二つ以上のターゲッティング剤および／もしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドドメインが、結合体中に存在することができる。
【０３２１】
a．融合タンパク質
融合タンパク質が、本明細書において提供される。融合タンパク質は：ａ)ＭＴＳＰ９ポリペプチドの一つもしくは複数のドメイン、およびｂ)ターゲッティング剤、を含有する。一般的に、融合タンパク質は、融合タンパク質をコード化する核酸の組換え発現によって生産される。
【０３２２】
ｂ．化学的結合
本明細書において化学的結合を効果的にするために、ＭＴＳＰ９ポリペプチドドメインを、一つもしくはそれ以上の選択されたリンカーを介してもしくは直接的に、ターゲッティング剤に結合する。もし目標を定めた剤が、核酸もしくは非−ペプチド薬物のような、ペプチドもしくはタンパク質以外であるならば、化学的結合を用いなければならない。選択された部分を化学的に結合するための当業者に公知の任意の手段を用いることができる。
【０３２３】
２．リンカー
二つの目的でリンカーが、本明細書において意図される。結合体は、ＭＴＳＰ９ポリペプチド部分とターゲッティング剤の間に一つもしくはそれ以上のリンカーを含むことができるる。これに加えて、ハイスループット固相スクリーニングプロトコールのためのような、マイクロタイタープレート、シリコンもしくはシリコン−コーティングされたチップ、ガラスもしくはプラスチック支持体、のような個体支持体上へのＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはその部分の固定化を促進するかもしくは増大させるために、リンカーを用いることができる。
結合体の調整のための、当業者に公知の任意のリンカーを、本明細書において用いることができる。典型的には、これらのリンカーを化学結合体の調製に使用することができる：ペプチドリンカーを融合タンパク質に組み込むことができる。
【０３２４】
リンカーは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのドメインおよびターゲッティング剤を会合させるために適当な任意の部分であり得る。そのようなリンカーおよび結合としては、ペプチド結合、典型的には１〜約６０個のアミノ酸、より一般的には約１０〜３０個のアミノ酸、を含むアミノ酸およびペプチド結合、ヘテロ二官能性の切断可能な交差−リンカーのような化学的リンカーが挙げられるが、それに限定されないで、そこでは、化学的リンカーとしては、 (４−ヨードアセチル)−アミノ安息香酸Ｎ−スクシンイミジル、(４−ヨードアセチル)−アミノ安息香酸スルホスクシンイミジルエステル、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−ａ−(２−ピリジルジチオ)トルエン、６−[ａ−メチル−ａ−(ピリジルジチオ)−トルアミド] ヘキサン酸スルホスクシンイミジル、Ｎ−スクシンイミジル−３−(−２−ピリジルジチオ)−プロピオン酸、６[３(−(−２−ピリジルジチオ)−プロプリオンアミド)ヘキサン酸スクシンイミジルエステル、６[３(−(−２−ピリジルジチオ)−プロプリオンアミド)ヘキサン酸スルホスクシンイミジルエステル、３−(２−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド、Ellman試薬、ジクロロトリアジン酸、およびＳ−(２−チオピリジル)−Ｌ−システイン、を含むものが、挙げられるが、これらに限定されない。他のリンカーとしては、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのドメインとターゲッティング剤との間の立体障害を減少するペプチドおよび他の部分、細胞内酵素基質、結合体の柔軟性を増加するリンカー、結合体の溶解度を増加するリンカー、結合体の血清安定性を増加するリンカー、光切断性リンカーならびに酸切断性リンカーが、挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２５】
化学的に結合された結合体に適当な、他の典型的なリンカーおよび結合としては、ジスルフィド結合、チオエステル結合、障害のかかったジスルフィド結合、ならびに、アミンおよびチオール基のような遊離した反応性基の間の共有結合が挙げられるが、これらに限定されない。これらの結合は、ポリペプチドの一方もしくは両者に反応性チオール基を生成するためにヘテロ二官能性試薬を用い、次いで、一つのポリペプチド上のチオール基を、反応性マレインイミド基もしくはチオール基が他のものの上でそれに付着され得るところの反応性のチオール基もしくはアミン基と反応させて、形成される。他のリンカーとしては、ビスマレインイミドエトキシプロパンのような酸切断性リンカー、酸不安定性−トランスフェリン結合体およびさらに酸性の細胞内区画中で切断されるであろうところのアジピン酸ジヒドラジド；ＵＶもしくは可視光線への露出で切断するところの交差リンカー、ならびにヒトＩｇＧ１の定常域からのＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３(Batra et al. Molecular Immunol., 30: 379-386 (1993)を参照)のような種々のドメインのようなリンカー、が挙げられる。或る実施態様では、それぞれのリンカーの所望の性質を利用するために、幾つかのリンカーを挙げることができる。
【０３２６】
リンカーを共有結合的にカップリングさせることによって、化学的リンカーおよびペプチドリンカーを、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのドメインおよびターゲッティング剤に挿入することができる。下記のヘテロ二官能性剤を用いて、そのような共有結合的カップリングを効果的にすることができる。また、ペプチドリンカーは、リンカーおよび治療剤(ＴＡ)、リンカーおよび目標を定めた剤、もしくはリンカー、目標を定めた剤ならびに融合タンパク質としての治療剤(ＴＡ)、をコード化するＤＮＡを発現することによって結合されることができる。また、結合体の溶解度を増加する柔軟なリンカーおよびリンカーは、単独もしくは他のリンカーと共にのどちらかでの使用のために本明細書において意図される。
【０３２７】
ａ)酸切断性、光切断性および熱感受性リンカー
ＭＴＳＰ９ポリペプチドのドメインを切断しそれがより容易に反応し易くなることを許容することが必要になり得る場合には特に、酸切断性リンカー、光切断性および熱感受性リンカーをまた用いることができる。酸切断性リンカーとしては、ビスマレインイミドエトキシプロパン；アジピン酸ジヒドラジドリンカー(例えば、Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60: 584-589、を参照)および分子内トランスフェリン環化経路への参入を許容するに十分な部分のトランスフェリンを含むところの酸不安定性トランスフェリン結合体(例えば、Welhoener et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 4309-4314、を参照)、が挙げられるが、それらに限定されない。
【０３２８】
光切断性リンカーは、光に露出すると切断されるリンカーであって(例えば、(それらのリンカーを出典明示により本明細書の一部とする)、Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107、を参照)、それにより光に露出すると目標を定めた剤を放出する。光に露出すると切断する光切断性リンカーは、公知であって(例えば、システインのための光切断性保護基としてニトロベンジル基の使用を記載する、Hazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th, Brunfeldt, K (Ed), pp. 105-110；ヒドロキシプロピルメタアクリルアミド共重合体、グリシン共重合体、フルオレセイン共重合体およびメチルローダミン共重合体、を含む水溶性の光切断性共重合体を記載する、Yen et al. (1989) Makromol. Chem 190: 69-82；交差−リンカーおよび近ＵＶ光(３５０ｎｍ)に露出すると光分解を受けるところの試薬を記載する、Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3: 104-107；ならびに光切断性結合を生成するところの塩化ニトロベンジルオキシカルボニル交差結合試薬を記載する、Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42: 231-237、を参照)、それにより光に露出すると目標を定めた剤を放出する。そのようなリンカーは、光ファイバーを用いて光に露出され得るところの皮膚もしくは眼科的な異常の処置において、特別な用途を有するであろう。結合体の投与後に、目もしくは皮膚または他の身体部分を光に露出して、結合体から目標を定めた部分の放出を惹起することができる。そのような光切断性リンカーは、ターゲッティング剤を除去して、動物の身体からの急速な排泄を許容することが望ましいところの診断的なプロトコールと関連して有用である。
【０３２９】
ｂ)化学的結合のための他のリンカー
他のリンカーとしては、トリチルリンカー、特に、種々の酸性度もしくはアルカリ性度での治療剤の放出に備えるところの結合体の属を生成するために誘導化されたトリチル基、が挙げられる。かくして、治療剤が放出されるところのｐＨ範囲を、予め選択する能力によって与えられる柔軟性は、治療剤の送達を必要とする組織間の公知の生理学的差異に基づくリンカーの選択を、可能にする(例えば、米国特許番号第５,６１２,４７４号、を参照)。例えば、腫瘍組織の酸性度は、正常組織のものよりもより低いと思われる。
【０３３０】
ｃ)ペプチドリンカー
リンカー部分は、ペプチドであり得る。融合タンパク質において、また化学的に結合された結合体において、ペプチドリンカーを使用することができる。典型的には、ペプチドは、約２〜約６０個のアミノ酸残基、例えば、約５〜約４０個の、もしくは約１０〜約３０個のアミノ酸残基を有する。選択される長さは、そのためにリンカーが含まれるところの用途のような因子に依存する。
【０３３１】
ペプチドリンカーは、ターゲッティング剤がタンパク質性であるときは有利である。例えば、リンカー部分は、単鎖抗体研究において公知なもののような、柔軟なスペーサーアミノ酸配列であり得る。このような公知のリンカー部分の例としては、(ＧｌｙｍＳｅｒ)ｎおよび(ＳｅｒｍＧｌｙ)ｎ(式中、ｎは１〜４および２〜４を含む１〜６であって、ｍは１〜４および２〜４を含む１〜６である)、のようなペプチド、酵素切断性リンカーならびに他のもの、が挙げられるが、それらに限定されない。
【０３３２】
さらに別な結合部分は、例えば、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879-5883, 1988; Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6: 989-995, 1993; Newton et al., Biochemistry 35: 545-553, 1996; A. J. Cumber et al., Bioconj. Chem. 3: 397-401, 1992; Ladurner et al., J. Mol. Biol. 273: 330-337, 1997；および米国特許番号第４,８９４,４４３号、に記載されている。或る実施態様では、それぞれのリンカーの所望の性質を利用するために、幾らかのリンカーを含むことができる。
【０３３３】
３．ターゲッティング剤
結合体の検出、固定化もしくは精製を促進するところの任意の剤が、本明細書における使用のために意図される。化学的結合体については、そのような性質を有するところの任意の部分が意図される；融合タンパク質については、ターゲッティング剤は、タンパク質、ペプチドもしくはターゲッティング活性を効果的にするに十分なところのそのフラグメントである。意図されるターゲッティング剤としては、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはその部分を、選択された細胞および組織に送達するところのものが挙げられる。そのような剤としては、腫瘍特異的モノクローナル抗体およびその部分、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦのような成長因子、ケモカインを含むサイトカイン、ならびに他のそのような剤が挙げられる。
【０３３４】
４．核酸、プラスミドおよび細胞
融合タンパク質をコード化する単離された核酸フラグメントが提供される。融合タンパク質をコード化するところの核酸フラグメントとしては：ａ)ＭＴＳＰ９ポリペプチドのプロテアーゼドメインをコード化する核酸；ならびにｂ)タンパク質、ペプチドまたはその有効なフラグメントをコード化する核酸が挙げられるが、それは：i）融合タンパク質のアフィニティー単離もしくは精製；ii)表面への融合タンパク質の結合；iii)融合タンパク質の検出、を促進する。一般的には、核酸はＤＮＡである。
【０３３５】
また、複製のためのプラスミドおよび上の核酸フラグメントを含むところの発現のためのベクターが提供される。また、プラスミドおよびベクターを含む細胞が提供される。細胞は、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞を含むが、それらに限定されない、任意の適当な宿主であり得る。本明細書において説明される任意のものを含む当分野における公知の方法にしたがって、核酸、プラスミド、およびプラスミドを含有する細胞を調製することができる。
【０３３６】
上の融合タンパク質を生産するための方法がまた、提供される。例示的な方法は、成長させること、例えば、それらが増殖するような細胞、融合タンパク質が細胞によって発現されるところの条件下で融合タンパク質をコード化するプラスミドを含む細胞、を培養すること、ならびに発現された融合タンパク質を回収すること、の工程を含む。組換えタンパク質を発現し、回収するための方法は、当分野において周知であり(一般的には、「分子生物学における最近のプロトコール」、(1998) § 16, John Wiley & Sons, Inc.、を参照)そしてそのような方法を、発現された融合タンパク質を発現し、回収するために用いることができる。
【０３３７】
回収された融合タンパク質を、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー、電気泳動、免疫沈降、および他のそのような方法、のような当分分野において公知の方法によって、もしくはそれらの組合せによって、単離するかもしくは精製することができる(一般的には、「分子生物学における最近のプロトコール」、(1998) § 16, John Wiley & Sons, Inc.、を参照)。一般的には、回収された融合タンパク質は、タンパク質もしくは融合タンパク質のペプチドフラグメントおよび親和性結合部分との間の親和性結合を通して単離もしくは精製される。融合タンパク質の構築に関して上のセクションで考察したように、任意の親和性対を構築し、融合タンパク質の単離もしくは精製で用いることができる。例えば、親和性対は、タンパク質結合配列／タンパク質、ＤＮＡ結合配列／ＤＮＡ配列、ＲＮＡ結合配列／ＲＮＡ、脂質結合配列／脂質、多糖類結合配列／多糖類、もしくは金属結合配列／金属、であり得る。
【０３３８】
５．固定化とそれらのための支持体もしくは基質
表面への結合のためにターゲッティング剤がデザインされる、特定の実施態様では、イオン的もしくは共有結合的、非−共有結合的または他の化学的相互作用のような結合によって、ＭＴＳＰ９ポリペプチドを支持体の表面もしくはマトリックス物質に付着させることができる。直接的にもしくはリンカーを介して、固定化を効果的にすることができる。シリコンチップ、ならびに本明細書において説明されて、当業者に公知の他の支持体を含むが、それらに限定されない、任意の適当な支持体の上に、ＭＴＳＰ９ポリペプチドを固定化することができる。複数のＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそれらのプロテアーゼドメインを、シリコンチップもしくはハイスループットのプロトコールおよびフォーマットで使用するための他のチップ、の表面上の結合体のアレイ(即ち、二つもしくはそれ以上のパターン)のような支持体に付着させることができる。
また、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのドメインを、表面に直接的にもしくは結合されたターゲッティング剤を持たないリンカーを介してそれに、結合することができることが注目される。したがって、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのドメインの列を含んでいるチップ。
【０３３９】
本明細書において意図されるマトリックス物質もしくは固体支持体は、一般的に、リガンドおよび他の分子を固定化するための当業者に公知の任意の不溶性物質であって、多くの化学的合成および分離で使用されるものである。そのような支持体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーで、生物活性物質の固定化で、およびタンパク質、アミノ酸および他の有機分子およびポリマーを含む生体分子の化学的合成の間で、用いられる。支持体の調製および用途は、当業者には周知である；多くのこのような物質およびそれらの公知の調製がある。例えば、アガロースおよびセルロースのような、天然起源の支持物質を、それらのそれぞれの起源から単離し、公知のプロトコールにしたがって処理することができて、そして合成的物質を公知のプロトコールにしたがって調製することができる。
【０３４０】
支持体は典型的には、固体、多孔性、可変性、もしくは硬性であるところの不溶性物質であり、そしてビーズ、ペレット、円盤、キャピラリー、中空構造繊維、針状、固体繊維、無秩序形状、薄フィルムおよび膜、を含むが、それらに限定されない、任意の要求される構造および形状を有する。かくして、品目は、マトリックス物質から加工され得るか、または表面のすべてもしくは部分をコーティングするかまたは粒子に含浸させることによるように、それと連結され得る。
【０３４１】
典型的には、マトリックスが粒状であるときには、粒子は少なくとも約１０〜２０００μｍであるが、選択された応用に依存して、さらに小さくても大きくてもあり得る。マトリックスの選択は、少なくとも部分的には、溶解度、官能基、機械的安定性、表面積膨潤性、疎水的もしくは親水的性質および意図する用途のような、それらの物理的および化学的性質によって支配される。
【０３４２】
もし必要ならば、支持マトリックス物質を処理して、適当な反応性部分を含有することができる。或る場合においては、反応性部分を既に含有する支持マトリックス物質を、商業的に入手することができる。反応性部分を含有する支持マトリックス物質は、それによって、その上に分子が結合されるところのマトリックス支持体として役立ち得る。アミノシラン結合、ヒドロキシ結合もしくはカルボキシシラン結合のような反応性表面部分を含有する物質を、シラン化反応等を含む、よく確立された界面化学技法によって生産することができる。このような物質の例は、ガンマ−アミノ−プロピルシランに共有結合的に結合された表面酸化ケイ素部分、ならびに他の有機部分；Ｎ−[３−(トリエトキシシリル)プロピル]フタラミン酸；およびビス−(２−ヒドロキシエチル)アミノプロピルトリエトキシシラン、を有するものである。アミノ基反応性官能基を含有する容易に入手することができる物質の例示としては、パラ−アミノフェニルトリエトキシシランが挙げられるが、それに限定されない。また、誘導化されたポリスチレンおよび他のそのようなポリマーは周知であり、容易に当業者には利用可能である(例えば、Tentagel[商標登録]樹脂は多数の官能基について利用可能であり、Rapp Polymere, Tubingen, Germanyにより販売されている;米国特許第４,９０８,４０５号および米国特許第５,２９２,８１４号、を参照;また、Butz et al., Peptide Res., 7: 20-23 (1994);ならびにKleine et al., Immunobiol., 190: 53-66 (1994)、を参照)。
【０３４３】
これらのマトリックス物質としては、興味のある分子を付着させるための支持マトリックスとして働き得るところの任意の物質が挙げられる。そのような物質は、当業者には公知であり、支持マトリックスとして用いられるものが挙げられる。これらの物質としては、無機物、天然ポリマーおよび、合成的ポリマーが挙げられるが、それらに限定されないで、それらとしては、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドの共重合体、ジビニルベンゼンと交差−結合したポリスチレンおよび他のもの(Merrifield, Biochemistry, 3: 13851390 (1964)を参照)、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然スポンジ、が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書において特に興味があるものは、高多孔性ガラス(例えば、米国特許第４,２４４,７２１号、を参照)ならびにホウケイ酸塩、アルコールおよび水を混合することにより調製される他のものである。
【０３４４】
合成的な支持体としては、アクリルアミド、デキストラン誘導体およびデキストラン共重合体、アガロース−ポリアクリルアミド混合物、種々の官能基を持つ他のポリマーおよび共重合体、メタアクリル酸エステル誘導体および共重合体、ポリスチレンおよびポリスチレン共重合体(例えば、Merrifield, Biochemistry, 3: 13851390 (1964); Berg et al., in Innovation Perspect. Solid Phase Synth. Collect. Pap., Int. Symp., 1st, Epton, Roger (Ed), pp. 453459 (1990); Berg et al., Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 20th, Jung, G. et al. (Eds), pp. 196-198 (1989); Berg et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 80248026 (1989); Kent et al., Isr. J. Chem., 17: 243247 (1979); Kent et al., J. Org. Chem., 43: 28452852 (1978); Mitchell et al., Tetrahedron Lett., 42: 37953798 (1976)；米国特許第４,５０７,２３０号；米国特許第４,００６,１１７号；および米国特許第５,３８９,４４９号を参照)、が挙げられるが、これらに限定されない。そのような物質としては、ポリビニルアルコールのようなポリマーおよび共重合体、ポリエチレン−共−アクリル酸、ポリエチレン−共−メタアクリル酸、ポリエチレン−共−エチルアクリル酸エステル、ポリエチレン−共−メチルアクリル酸エステル、ポリプロピレン−共−アクリル酸、ポリプロピレン−共−メチル−アクリル酸、ポリプロピレン−共−エチルアクリル酸エステル、ポリプロピレン−共−メチルアクリル酸エステル、ポリエチレン−共−ビニル酢酸エステル、ポリプロピレン−共−ビニル酢酸エステル、ポリエチレン−共−無水マレイン酸のようなアクリル酸エステルおよびアクリル酸、から作製されるもの、ならびにポリプロピレン−共−無水マレイン酸のような酸無水物基を含むもの、が挙げられる。また、リソソームは、アフィニティ−精製のための固体支持体として用いられている(Powell et al. Biotechnol. Bioeng., 33: 173 (1989))。
【０３４５】
多数の方法が、タンパク質および他の生体分子の固体もしくは液体支持体への固定化のために、開発されてきた(例えば、Methods in Enzymology, 44 (1976); Weetall、「固定化された酵素、抗原、抗体およびペプチド」、(1975); Kennedy et al.、「固相生物学、分析的および合成的概観」、Scouten, ed., pp. 253391 (1983)、を参照；一般的には、「アフィニティー技法、酵素精製：第Ｂ部」、Methods in Enzymology, Vol. 34, ed. W. B. Jakoby, M. Wilchek, Acad. Press, N.Y. (1974)；および「固定化した生化学物質およびアフィニティークロマトグラフィー」、Advances in Experimental Medicine and Biology, vol. 42, ed. R. Dunlap, Plenum Press, N.Y. (1974)、を参照)。
【０３４６】
最も普通に用いられる方法の中では、吸収および吸着または、直接的にもしくは、多数のジスルフィド結合、チオール結合、障害のかかったジスルフィド結合、アミンおよびチオール基のような遊離の反応性基間の共有結合のようなリンカーを介するか、のどちらかでの支持体への共有結合的結合であり、それらは当業者には公知である(例えば、試薬の調製および使用を記載し、そしてそのような試薬の商業的供給源を提供するところの、the PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993; Wong、「たんぱく質結合および架橋化の化学」、CRC Press (1993)；また、光感受性リンカーを記載するところの、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 6909 (1993); Zuckermann et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 10646 (1992); Kurth et al., J. Am. Chem. Soc., 116: 2661 (1994); Ellman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 4708 (1994); Sucholeiki, Tetrahedron Lttrs., 35:7307 (1994); Su-Sun Wang, J. Org. Chem., 41: 3258 (1976); Padwa et al., J. Org. Chem., 41: 3550 (1971)；およびVedejs et al., J. Org. Chem., 49:575 (1984)、を参照)。
【０３４７】
固定化を効果的にするために、タンパク質もしくは他の生体分子を含む組成物を、アルミナ、炭素、イオン交換樹脂、セルロース、ガラスもしくはセラミックのような支持物質と接触させる。フッ化炭素ポリマーは、生体分子を吸着によって付着させているところの支持体として使用されている(米国特許第３,８４３,４４３号；公開国際ＰＣＴ出願第ＷＯ／８６  ０３８４０号)。
【０３４８】
Ｊ．予後および診断
ＭＴＳＰ９ポリペプチドタンパク質、ドメイン、類似体、およびそれらの誘導体、ならびにコード化する核酸(およびそれに相補的な配列)、ならびに抗ＭＴＳＰ９ポリペプチド抗体を、診断法で、特に、肺、食道腫瘍のような頭部および頚部、前立腺、結腸、卵巣、子宮頚部、乳房および膵臓の癌の診断で、用いることができる。そのような分子をイムノアッセイのようなアッセイで用いて、ＭＴＳＰ９ポリペプチド発現に影響する種々の異常、疾患、および障害を、検出し、予知し、診断し、もしくはモニターするか、またはそれらの治療をモニターすることができる。本明細書における目的のためには、体液もしくは腫瘍組織中のＭＴＳＰ９の存在が、特に興味が持たれる。
【０３４９】
特に、そのようなイムノアッセイを、患者由来の試料を特異的結合が起こるような条件下で抗ＭＴＳＰ９ポリペプチド抗体と接触させること、および抗体によるいかなる特異的結合の量を検出するかもしくは測定することを含む方法によって、実施することができる。組織区画におけるそのような抗体の結合を使用して、異常なＭＴＳＰ９ポリペプチドの局在化もしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドの異常な(例えば、増加した、減少したもしくは不在の)レベルを検出することができる。特定の実施態様では、ＭＴＳＰ９ポリペプチドに対する抗体を用いて、患者組織もしくは血清のような体液中で、試料を、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの異常なレベルが疾患状態の指示となる、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの存在についてアッセイすることができる。
【０３５０】
用いることができるイムノアッセイとしては、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検査法)、''サンドイッチ''イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体−結合アッセイ、イムノラジオメトリーアッセイ、蛍光イムノアッセイおよびタンパク質Ａイムノアッセイのような、技法を用いる競合的および非競合的アッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５１】
相補的配列を含む、ＭＴＳＰ９ポリペプチド遺伝子ならびに関連する核酸配列および部分列をまた、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いることができる。ＭＴＳＰ９ポリペプチド核酸配列、または約少なくとも８個のヌクレオチド、一般的には１４もしくは１６または３０個もしくはそれ以上の、一般的には１０００個以下もしくは１００個までの連続的なヌクレオチドを含むその部分列を、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイを用いて、本明細書において説明されるように、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの発現および／もしくは活性における異常な変化に関連する異常、障害、および疾患状態を検出し、予知し、診断するか、もしくはモニターすることができる。特に、そのようなハイブリダイゼーションアッセイは、核酸を含む試料をＤＮＡもしくはＲＮＡをコード化するＭＴＳＰ９ポリペプチドにハイブリダズする能力のある核酸プローブと、そのようなハイブリダイゼーションが起こり得るような条件下で接触させること、および任意の得られたハイブリダイゼーションを検出するかもしくは測定することによる方法によって実施される。
【０３５２】
特定の実施態様では、対象由来の試料中におけるＭＴＳＰ９ポリペプチドのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質もしくは機能的活性のレベルを測定することにより、対象における異常なレベルのＭＴＳＰ９ポリペプチドを検出することを特徴とする、疾患もしくは障害を診断する方法が、本明細書において提供されるるが、そこでは、疾患もしくは障害を有しない類似の試料中に見出されるＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質または機能的活性のレベルと比べて、ＭＴＳＰ９ポリペプチドのＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質もしくは機能的活性のレベルの増加または減少が、対象における疾患もしくは障害の存在を示す。
【０３５３】
また、抗ＭＴＳＰ９ポリペプチド抗体および任意に、標識化されたその抗体への結合パートナーを一つもしくはそれ以上の容器中に含むところの診断的使用のためのキットが、提供される。これに代えて、抗ＭＴＳＰ９ポリペプチド抗体を標識化することができる(検出可能なマーカー、例えば、化学発光、酵素的、蛍光的、もしくは放射活性部分によって)。また、一つもしくはそれ以上の容器中で、ＭＴＳＰ９ポリペプチドをコード化する核酸にハイブリダイズする能力のある核酸プローブを含むところのキットが、提供される。特定の実施態様では、キットは、一つもしくはそれ以上の容器中に、増幅をプライミングする能力のある[例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(例えば、Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CAを参照)、リガーゼ連鎖反応(ＥＰ  ３２０,３０８を参照)、Ｑβレプリカーゼのの使用、環状プローブ反応、もしくはＭＴＳＰ９ポリペプチドを−コード化する核酸の少なくとも一部分の適切な反応条件下で当分野で公知の他の方法によって]ところの一対のプライマー(例えば、それぞれ６〜３０個のヌクレオチドのサイズ範囲にある)を含むことができる。キットは、容器中に予め決められた量の精製されたＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくは核酸を、例えば、標準もしくは対照としての使用のために、さらに任意に含むことができる。
【０３５４】
Ｋ.  医薬組成物および投与形式
１．組成物の成分
ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を調整する、同定された化合物を含有する医薬組成物が、本明細書において提供される。また、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を調整するところの化合物および、化学療法化合物のような、新生物形成性障害の処置のためのさらに別な処置剤もしくは化合物との組合せが、本明細書において提供される。
【０３５５】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドモジュレーターおよび抗腫瘍剤を、同時のもしくは逐次的または間欠的な投与のために、別個の組成物として包装することができる。これに代えて、それらを投与用の単一組成物として、もしくは単一組成物として投与するための二つの組成物として提供することができる。組成物はキットとして包装されることができる。
【０３５６】
a．ＭＴＳＰ９ポリペプチド阻害剤
単独もしくは他の化合物との組合せで用いるとき、本明細書において説明されるものを含めて、非所望のおよび／もしくは非制御の血管新生を含む、新生物形成性疾患に関連する臨床症状もしくは診断マーカーを軽減し、減少し、改善し、予防するか、または寛解の状態に置くかもしくは維持することのできる、任意のＭＴＳＰ９ポリペプチド阻害剤を、本組合せで用いることができる。
【０３５７】
一つの実施態様では、ＭＴＳＰ９ポリペプチド阻害剤は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインと特異的に反応するところの抗体もしくはそのフラグメント、ＭＴＳＰ９ポリペプチド生産の阻害剤、ＭＴＳＰ９ポリペプチド膜−局在化の阻害剤、またはＭＴＳＰ９ポリペプチドの発現もしくは、特に、活性の任意の阻害剤である。
【０３５８】
ｂ．抗血管新生剤および抗腫瘍剤
単独もしくは他の化合物との組合せで用いるとき、本明細書において説明されるものを含めて、非所望のおよび／もしくは非制御の血管新生および／もしくは腫瘍成長および転移、特に固形新生物形成、血管奇形および心血管系障害、慢性炎症性疾患および異常創傷修復、循環系障害、ｃｒｅｓｔ症候群、皮膚障害、または眼障害に関連する臨床症状もしくは診断マーカーを軽減し、減少し、改善し、予防するか、または寛解の状態に置くかもしくは維持することのできる、任意の抗血管新生剤および抗腫瘍剤を、組合せで用いることができる。また、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの阻害剤と組合せで使用するための抗腫瘍剤が意図される。
【０３５９】
c．抗腫瘍剤および抗血管新生剤
本明細書において提供される方法によって同定されるかもしくは本明細書において提供される化合物を、抗腫瘍剤および／もしくは抗血管新生剤との組合せで用いることができる。
【０３６０】
２．製剤および投与経路
本明細書の化合物および剤を、医薬組成物、典型的には、単一用量投与用に、処方することができる。製剤中の化合物の濃度は、投与において、意図する処置に有効であるところの量の送達に有効なものである。典型的には、組成物は、単一用量投与用に処方される。組成物を処方するためには、重量分の化合物もしくはその混合物を、処置される異常を軽減するかもしくは改善するような有効な濃度で、選択したビークル中に溶解し、懸濁し、分散するかまたはさもなければ混合する。本明細書において提供される化合物を投与するために適当な医薬担体もしくはビークルとしては、その特有の投与様式に対して適当であると当業者に公知である任意のそのような担体が挙げられる。
【０３６１】
加えて、化合物を、組成中の唯一の医薬活性成分として処方するか、もしくは他の活性成分と組合せることができる。組織に目標を定めたリポソームを含めて、リポソーム懸濁物はまた、薬学的に許容される担体として適当であり得る。これらを、当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。例えば、リポソーム製剤を、米国特許第４,５２２,８１１号に記載されるように調製することができる。
【０３６２】
活性化合物は、処置する患者において望ましくない副作用がなく治療的に有益な効果を表すのに十分な量で、薬学的に許容される担体中に含められる。治療的に有効な濃度を、本明細書において提供するアッセイのような公知のインビトロおよびインビボシステムで化合物を試験することによって、経験的に決定することができる。
【０３６３】
薬の組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化および排泄速度、化合物の物理化学的特性、投与スケジュール、ならびに投与量、ならびに当業者に公知の他の因子に依存する。
【０３６４】
典型的には、治療的に有効な投与量が意図される。投与される量は、血液容積当たり、約０.００５〜０.０５ｍｇ／ｍｌおよび約０.０１ｍｇ／ｍｌを含む、０.００１〜１ｍｇ／ｍｌの程度であり得る。医薬単回剤型を、単回剤型当たり必須活性成分もしくは必須成分の組合せの、約1０ｍｇ〜約５００ｍｇを含むおよび約２５〜７５ｍｇを含む、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、を与えるように調製する。正確な投与量を、経験的に決定することができる。
【０３６５】
活性成分は、一回で投与されるか、もしくは多数のより小さな投与用量に分割して時間間隔をおいて投与され得る。正確な投与量および処置期間は、処置される疾患の関数であって、公知の試験プロトコールを用い経験的にまたはインビトロもしくはインビボの試験データから外挿によって決定されることができることが理解される。濃度および投与量の値はまた、軽減すべき異常の重症度によって変動し得ることは注目すべきである。任意の特定の対象に対して、特異的な投与レジメンを個人の必要性および組成物を投与するかもしくは投与を指導する人の専門的な判断にしたがって、経時的に調整すべきであること、ならびに本明細書に示される濃度範囲は単に例示的なものであって、クレイムされる組成物もしくはそれらを含む組合剤の範囲もしくは用途を、なんら限定するものではないことを、さらに理解すべきである。
【０３６６】
薬学的に許容される誘導体としては、酸、塩、エステル、水和物、溶媒和物およびプロドラッグ形態が挙げられる。典型的には、誘導体を、その薬物動態的性質が対応する中性化合物より優れているように選択する。
【０３６７】
かくして、一つもしくはそれ以上の、本明細書において提供される化合物もしくはその薬学的に許容される誘導体の有効濃度もしくは量を、全身的、局所的、もしくは局部的投与に適当な医薬担体もしくはビークルと混合して、医薬組成物を形成する。化合物は、処置が意図されるところの障害を改善するかもしくは処置するための有効量で含まれる。組成物中の活性化合物の濃度は、活性化合物の吸収、不活性化、排泄速度、投与スケジュール、投与量、特定の処方、ならびに当業者に公知の他の因子に依存する。
【０３６８】
非経口的、皮内的、皮下的もしくは局所的適用のために用いられる溶液もしくは懸濁液は、任意の以下の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩溶液、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成的溶媒のような無菌希釈剤；ベンジルアルコールおよびメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩およびリン酸塩のような緩衝剤；ならびに塩化ナトリウムもしくはデキストロースのような等張化剤である。非経口的製剤は、ガラス、プラスチックもしくは他の適当な物質製の、アンプル、使い捨て注射器または単回もしくは多回用量バイアル中に封入されることができる。
【０３６９】
化合物が不十分な溶解度を示す例では、化合物を溶解するための方法を用いることができる。そのような方法は、当業者に公知であって、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)のような共溶媒の使用、Tween[登録商標]のような界面活性剤の使用、もしくは炭酸水素ナトリウム水溶液への溶解が、挙げられるが、それらに限定されない。また、化合物のプロドラッグのような化合物の誘導体を、効果的な医薬組成物で処方するために用いることができる。眼科的適用のためには、化合物を眼科的に許容される担体中で処方する。本明細書における眼科的使用のためには、局所投与もしくは注射のどちらかによる、局部投与が意図される。徐放性製剤もまた望ましい。典型的には、組成物は、単回用量が有効量を投与するように、単回投与用に処方される。
【０３７０】
化合物のビークルとの混合もしくは添加に際して、得られる混合物は溶液、懸濁液、乳剤もしくは他の組成物であり得る。得られる混合物の形態は、意図する投与様式および選択した担体もしくはビークルにおける化合物の溶解度を含む、多数の因子に依存する。もし必要ならば、化合物の薬学的に許容される塩もしくは他の誘導体を調製する。
【０３７１】
化合物は、薬学的に許容される担体中に、処置する患者において望ましくない副作用がなく、治療的に有益な効果を示すのに十分な量で、含められる。副作用の数と程度は、そのために化合物が投与されるところの異常に依存することが、理解される。例えば、さらに低い予後の障害を処置するときには許容されないであろうところの特定の有害かつ望ましくない副作用は、生命にかかわるな病気を処置するときには許容される。
【０３７２】
また、化合物を、所望の作用を損なわない他の活性物質、もしくは当業者に公知の所望の作用を補助するところの物質、と混合することができる。本明細書における用途のための化合物および剤の製剤としては、経口的、直腸的、局所的、吸入的、口腔的(例えば、舌下)、非経口的(例えば、皮下的、筋肉内、皮内もしくは静脈内)、経皮的な投与、または任意の経路に適するものが、挙げられる。任意の与えられた場合における最適な経路は、処置される異常の性質および重症度に、ならびに使用する特定の活性化合物の性質に依存する。製剤は、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒、無菌の非経口的溶液もしくは懸濁液、および経口的溶液もしくは懸濁液、ならびに化合物もしくは薬学的に許容されるその誘導体の適当な量を含有する油−水乳化液のような、単回剤型にて、ヒトおよび動物へ投与するために供与される。薬学的に治療活な化合物およびそれらの誘導体は、典型的には単回剤型もしくは多回剤型で処方されて、投与される。本明細書において用いられるように、単回剤型とは、ヒトおよび動物の対象に適当でありかつ当分野で公知であるように個別に包装される物理的に明確な単位をいう。
【０３７３】
それぞれの単回用量は、所望の治療効果を生成するに十分な治療的活性化合物の予め決められた量を、必要とされた医薬担体、ビークルもしくは希釈剤と共同して含有する。単回剤型の例としては、アンプルおよび注射器、ならびに個別に包装された錠剤もしくはカプセルが、挙げられる。単回剤型は分画してもしくは多回で投与され得る。多回剤型は、区分された単回剤型で投与されるために、単一の容器中に包装された複数の同一な単回剤型である。多回剤型の例としては、バイアル、錠剤もしくはカプセルの瓶、またはパイントもしくはガロンの瓶が挙げられる。したがって、多回剤型は、包装では区分されないところの多数の単位用量である。
【０３７４】
組成物は、以下の活性成分と一緒に含有し得る：ラクトース、蔗糖、リン酸二カルシウムもしくはカルボキシメチルセルロースのような希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはタルクのような滑沢剤；ならびにデンプン、アカシアゼラチンゴムのような天然ゴム、ブドウ糖、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンのような結合剤ならびに当業者に公知の他のそのような結合剤である。液体の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、それによって溶液もしくは懸濁液を形成するように、上で定義される活性化合物および、任意の薬学的補助剤を、例えば、水、生理食塩液、水性デキストロース、グリセリン、グリコール、エタノール等のような担体中で、溶解し、分散し、もしくはそうでなければ混合することによって調製されることができる。
【０３７５】
もし所望されるならば、投与すべき医薬組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、もしくは可溶化剤、ｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタンエステル、酢酸ナトリウムトリエタノールアミン、オレイン酸トリエタノールアミンおよび他のそのような剤のような、少量の非毒性補助物質を含有することができる。そのような剤型を調製する方法は、当業者には公知であるかもしくは明白であろう(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975、を参照)。投与すべき組成物もしくは製剤は、処置される対象の症状を軽減するに十分な量で、活性化合物の量を含有する。
【０３７６】
非毒性担体から作り上げられる均衡でもって０.００５％〜１００％の範囲で活性成分を含有する剤型もしくは組成物を調製することができる。経口投与に対しては、医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；増量剤(例えば、ラクトース、結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム)；滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸エステルナトリウム)；または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)のような薬学的に許容される添加剤と共に、従来の手段で調製される錠剤もしくはカプセルの形態を取り得る。錠剤を、当分野において周知の方法でコーティングすることができる。
【０３７７】
医薬製剤はまた、液体形態、例えば溶液、シロップもしくは懸濁液、であり得るし、または使用前に水もしくは他の適当なビークルで再構成するための原薬として提供され得る。そのような液体製剤を、懸濁剤(例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体もしくは硬化食用脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンもしくはアカシア)；非水ビークル(例えば、アーモンド油、油状エステルもしくは分溜植物油)；ならびに防腐剤(例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸)のような薬学的に許容される添加物と共に、従来の手段で調製することができる。
【０３７８】
直腸投与に適当な製剤は、単回用量坐剤として提供され得る。これらを、活性化合物を一つもしくはそれ以上の従来の固体担体、例えば、ココアバター、と混合し、次いで、生じた混合物を成形することによって、調製することができる。
【０３７９】
皮膚もしくは眼への局所適用に適当な製剤は、一般的には、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、噴霧剤、エアロゾルおよび油として処方される。使用することができる担体としては、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコールおよびそれらの二つもしくはそれ以上の組合せが、挙げられる。局所製剤は、ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ／ヒドロキシアルキル、メタアクリル酸エステルもしくはポリメタアクリルアミドから選択される粘稠化剤の０.０５〜１５重量パーセントを、さらに有利に含有し得る。局所製剤は、しばしば、滴注もしくは結膜サックに入れた軟膏として塗布される。それをまた、眼、顔洞および外耳道の洗浄もしくは潤滑に用いることができる。それをまた、前眼房および他の場所に注入することができる。液体状態の局所製剤をまた、そこから活性成分が放出される、細片、コンタクトレンズ等の形態で、親水性三次元ポリマーマトリックス中で提供することができる。
【０３８０】
吸入による投与のためには、本明細書における用途のための化合物を、適当な噴射剤、例えば、二塩化二フッ化メタン、三塩化フッ化メタン、二塩化四フッ化エタン、二酸化炭素もしくは他の適当な気体、を用いて、加圧されたパックもしくはネブライザーからのエアロゾル噴霧提供の形態で、送達することができる。加圧されたエアロゾルの場合には、投与単位を、計量された量を送達すべきバルブを提供することによって、決定することができる。吸入器もしくは注入器で用いるための、例えば、ゼラチン、のカプセルおよびカートリッジを、化合物およびラクトースもしくはデンプンのような適当な粉末基盤の粉末混合物を含有して、処方することができる。
【０３８１】
口腔(舌下)投与に適当な製剤としては、例えば、風味をつけた基剤、通常は蔗糖およびアカシアもしくはトラガカント、中に、活性化合物を含有するトローチ剤；ならびに化合物を、ゼラチンおよびグリセリンもしくは蔗糖およびアカシアのような不活性基剤中に含む、香錠が挙げられる。
【０３８２】
化合物を、注射による、例えば大量注射もしくは連続注入による、非経口的投与のために処方することができる。注射用の製剤を、単回剤型で、例えば、アンプルもしくは多回用量容器中で、添加した防腐剤とともに提供することができる。組成物は、油性もしくは水性ビークル中の懸濁液、溶液もしくは乳濁液であって、懸濁化、安定化および／もしくは分散化の剤のような処方剤を含有し得る。これに代えて、活性成分は、使用前に適当なビークル、例えば、無菌でパイロジェンフリーの水もしくは他の溶媒、で再構成するための粉末形態であり得る。
【０３８３】
経皮的投与に適する製剤を、長時間の期間の間、受容者の表皮と緊密に接触して保つために適合した、別個のパッチとして提供することができる。そのようなパッチは、活性化合物を、例えば、活性剤に関して０.１〜０.２Ｍ濃度の、任意に緩衝化された水溶液として適当に含有する。また、経皮的投与に適する製剤を電離療法(例えば、Pharmaceutical Research 3 (6), 318 (1986)、を参照)によって送達して、そして典型的には、活性化合物の任意に緩衝化された水溶液の形態を取ることができる。
【０３８４】
また、医薬組成物を、制御された放出手段および／もしくは送達装置(例えば、米国特許第３,５３６,８０９号；第３,５９８,１２３号；第３,６３０,２００号；第３,８４５,７７０号；第３,８４７,７７０号；第３,９１６,８９９号；第４,００８,７１９号；第４,６８７,６１０号；第４,７６９,０２７号；第５,０５９,５９５号；第５,０７３,５４３号；第５,１２０,５４８号；第５,３５４,５６６号；第５,５９１,７６７号；第５,６３９,４７６号；第５,６７４,５３３号および第５,７３３,５６６号を参照)により、投与することができる。
【０３８５】
所望の血中レベルを、血漿レベルによって確認されるように、活性剤の連続注入によって維持することができる。付き添いの医師は、毒性、または骨髄、肝臓もしくは腎臓機能不全により、投与量を少なくするために、治療を、停止し、中断し、もしくは調整する仕方および時期を承知しているであろうということは注目すべきである。逆に、付き添いの医師はまた、もし臨床応答が適切でないならば、処置をさらに高レベルに調整する仕方および時期を承知しているであろう(有害な副作用が起きないようにして)。
【０３８６】
また、単独もしくは他の剤との組合せにおける、ＭＴＳＰ９ポリペプチド阻害剤(複数を含む)の有効性および／もしくは毒性を、当分野において公知の方法によって評価することができる(一般的には、O'Reilly, Investigational New Drugs, 15: 5-13 (1997)、を参照)。
活性化合物もしくは薬学的に許容される誘導体を、徐放性製剤もしくはコーティングのような、身体からの急速な除去に対して化合物を保護するところの担体と共に調製することができる。
【０３８７】
組成物および／もしくは組合せを、その投与の指示書とともに含むキット、が提供される。キットは、その複合体を注射するための、典型的には無菌形態で包装された注射針もしくは注射器、および／もしくは包装されたアルコールパッドを、さらに含み得る。指示書は、臨床家もしくは患者による活性剤の投与のために、任意に含められる。
【０３８８】
最後に、化合物またはＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメインまたは任意の先出の剤を含有する組成物を、包装材料、本明細書において意図される疾患もしくは障害の処置に有効であるところの本明細書において提供される化合物もしくはその適当な誘導体を包装材料内に、ならびに、化合物もしくはその適当な誘導体が本明細書において意図される疾患もしくは障害を処置するためであることを示すところのラベル、を含む製造品目として、包装することができる。ラベルは、それに対する治療が保証される障害を、任意に収録することができる。
【０３８９】
L．処置方法
ヒトを含む動物、特に哺乳動物、における新生物形成性疾患を処置するかもしくは予防するために、本明細書において使用される方法によって確認される化合物が、本明細書において提供される。一つの実施態様では、方法は、哺乳動物への効果的な量のＭＴＳＰ９ポリペプチドの阻害剤を投与することを含み、それによって疾患もしくは障害が処置されるかもしくは予防される。
【０３９０】
一つの実施態様では、処置もしくは予防において用いられるＭＴＳＰ９ポリペプチド阻害剤を、薬学的に許容される担体もしくは添加剤とともに、投与する。処置される哺乳動物は、ヒトであり得る。本明細書において提供される阻害剤は、スクリーニングアッセイによって同定されるものである。加えて、抗体およびアンチセンス核酸、もしくはＲＮＡｉのような二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)が意図される。
【０３９１】
処置もしくは予防の方法は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの活性を阻害することが確認されている任意の化合物であり得るところのＭＴＳＰ９ポリペプチド阻害剤と、同時に、以前にもしくは以後に、抗血管新生処置剤もしくは剤または抗腫瘍剤を投与することを、さらに含み得る。そのような化合物としては、小分子モジュレーター、抗体またはＭＴＳＰ９ポリペプチドに対するその結合領域を含有するそのフラグメントもしくは誘導体、アンチセンス核酸または、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの一部をコード化するかもしくはそれに相補的なＲＮＡｉのような、二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、ならびにその中でＭＴＳＰ９ポリペプチドをコード化する遺伝子の一部が異種の配列の側面にあって、ＭＴＳＰ９ポリペプチドをコード化するゲノム遺伝子との異種の組換えを促進するところの、ＭＴＳＰ９ポリペプチドをコード化する遺伝子の少なくとも一部の生物活性を異種のヌクレオチド配列が不活性化するように、異種のヌクレオチド配列がそれに挿入されたところの、ＭＴＳＰ９ポリペプチドをコード化する遺伝子の一部を少なくとも含む核酸、が挙げられる。加えて、そのような分子は、一般的に、約１０００ｎｔ長以下である。
【０３９２】
１．アンチセンス処置
特定の実施態様では、上記のように、新生物形成性疾患を処置するかもしくは予防するために、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの機能は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドアンチセンス核酸によって減少されるかもしくは阻害される。ＭＴＳＰ９ポリペプチドもしくはその部分をコード化する遺伝子またはｃＤＮＡに対してアンチセンスであるところの、少なくとも６個のヌクレオチド、一般的には約１５０個のヌクレオチドまで、の核酸の治療的もしくは予防的な用途、が提供される。本明細書において使用されるように、ＭＴＳＰ９ポリペプチド''アンチセンス''核酸とは、何らかの配列相補性のお陰でおよび一般的に、高度の緊縮性条件下で、ＭＴＳＰ９ポリペプチドＲＮＡ(一般的に、はｍＲＮＡ)の一部にハイブリダイズする能力のある核酸を指す。アンチセンス核酸は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドｍＲＮＡのコード化および／もしくは非コード化領域に相補的であり得る。そのようなアンチセンス核酸は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの機能を減少するかもしくは阻害するところの治療剤として有用性を有して、上記のような障害の処置もしくは予防に用いられることができる。
【０３９３】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドアンチセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチドを持っていて、そして一般的にはオリゴヌクレオチド(６〜５０個のヌクレオチドを含む６〜約１５０個のヌクレオチドまでの範囲にある)である。アンチセンス核酸は、プロテアーゼドメインのすべてもしくは部分に相補的であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１５個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌクレオチド、もしくは少なくとも１２５個のヌクレオチド、である。オリゴヌクレオチドは、一本鎖もしくは二重鎖の、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはキメラ混合物もしくは誘導体またはそれらの修飾されたもの、であり得る。オリゴヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、もしくはリン酸主鎖で修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付随する基、または細胞膜(例えば、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 648-652 (1987); ＰＣＴ公開第ＷＯ  ８８／０９８１０号、１９８８年１２月１５日公開、を参照)もしくは血液−脳関門(例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ８９／１０１３４号、１９８８年４月２５日公開、を参照)を越えて通過を促進する剤、ハイブリダイゼションを引き起こす切断剤(例えば、Krol et al., BioTechniques 6: 958-976 (1988)、を参照)、またはインターカレーション剤(例えば、Zon, Pharm. Res. 5: 539-549 (1988)、を参照)を、含むことができる。
【０３９４】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドアンチセンス核酸は、一般的にオリゴヌクレオチド、典型的には、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれの類似体もしくはそれらの混合物である。例えば、オリゴヌクレオチドとしては、ヒトＭＴＳＰ９ポリペプチドをコード化するところの核酸の一部に対してアンチセンスである配列が挙げられる。オリゴヌクレオチドを、その構造上の任意の位置において、当分野において一般的に公知である置換基により修飾することができる。
【０３９５】
ＭＴＳＰ９ポリペプチドアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５´−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)，ワイブトキソシン、擬似ウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２,６−ジアミノプリン、を含むが、これらに限定されない、群から選択されるところの、少なくとも一つの修飾された塩基部分を含むことができる。
【０３９６】
もう一つの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロースおよびヘキソースを含むが、それらに限定されない、群から選択される少なくとも一つの修飾された糖部分を含む。オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールもしくはそれらの類似体から選択される、少なくとも一つの修飾されたホスフェート主鎖を含むことができる。
【０３９７】
オリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドであり得る。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、鎖が互いに並行に走るところの相補的なＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成する(Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641 (1987))。
【０３９８】
オリゴヌクレオチドを、ペプチド、ハイブリダイゼーションを引き起こす交差−結合剤、輸送剤、ハイブリダイゼションを引き起こす切断剤のような、しかしそれらに限定されない、他の分子に結合することができる。オリゴヌクレオチドを、当分野において公知の標準的な方法、例えば、自動化ＤＮＡ合成機(Biosearch, Applied Biosystems等から商業的に入手可能であるような)の使用により、合成することができる。例として、Steinらの方法(Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988))によって、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成することができて、制御された多孔性ガラスポリマー支持体(Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988))の使用により、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【０３９９】
特定の実施態様では、ＭＴＳＰ９ポリペプチドアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、触媒性ＲＮＡもしくはリボソーム(例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９０／１１３６４、１９９０年１０月４日公開；Sarver et al., Science 247: 1222-1225 (1990)、を参照)が挙げられる。もう一つの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、２´−０−メチルリボヌクレオチド(Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148 (1987))もしくはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327-330 (1987))である。これに代えて、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉのような二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)であり得る。
【０４００】
さらに別の実施態様では、ＭＴＳＰ９ポリペプチドアンチセンス核酸は、外来性の配列からの転写によって細胞内で生産される。例えば、ベクターをそれが細胞によって取り込まれるようにインビボで導入することができて、その細胞内でベクターもしくはその一部が転写されて、アンチセンス核酸(ＲＮＡ)を生産する。そのようなベクターは、ＭＴＳＰ９ポリペプチドアンチセンス核酸をコード化する配列を含むであろう。そのようなベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生産することができる限り、エピソーム的なままであるかもしくは染色体的に統合されるように成ることができる。そのようなベクターを、本分野において標準的な組換えＤＮＡ技術方法によって構築することができる。ベクターは、哺乳動物細胞中での複製および発現に用いられるプラスミド、ビールス性、もしくは当分野で公知の他のものであり得る。そのようなプロモーターは、誘導的もしくは構成的でもあり得る。そのようなプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, Nature 290: 304-310 (1981)、Rous肉腫ウイルスの３´長末端配列に含まれるプロモーター(Yamamoto et al., Cell 22: 787-797 (1980)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981)、メタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)等、が挙げられるが、それらに限定されない。
【０４０１】
アンチセンス核酸としては、ヒトＭＴＳＰ９ポリペプチド遺伝子を含む、ＭＴＳＰ９ポリペプチド遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に相補的な配列が挙げられる。絶対的な相補性は要求されない。
新生物形成性疾患の処置もしくは予防において有効であるところのＭＴＳＰ９ポリペプチドアンチセンス核酸の量は、疾患の性質に依存して、標準的な臨床技法によって経験的に決定され得る。可能なところでは、アンチセンス細胞毒性を、細胞中インビトロで次いで、ヒトでの試験および使用に先立って有用な動物モデルシステムで測定することが望ましい。
【０４０２】
２．ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)(例えば、Chuang et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 4985、を参照)を使用して、ＭＴＳＰ９をコード化する遺伝子の発現を阻害することができる。干渉性ＲＮＡ (ＲＮＡｉ)フラグメント、特に二重鎖(ｄｓ)ＲＮＡｉ、を用いて、ＭＴＳＰ９−喪失機能を生成することができる。哺乳動物、C. elegans、ショウジョウバエおよび植物、ならびにヒトを含む生物におけるＲＮＡｉの沈黙遺伝子に対する使用に関しての方法は公知である(例えば、Fire et al. (1998) Nature 391: 806-811 Fire (1999) Trends Genet. 15: 358-363; Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-490; Hammond, et al. (2001) Nature Rev. Genet.2: 110-1119; Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2: 239-245; Hamilton et al. (1999) Science 286: 950-952; Hammond et al. (2000) Nature 404: 293-296; Zamore et al. (2000) Cell 101: 25-33; Bernstein et al. (2001) Nature 409: 363-366; Elbashir et al. (2001) Genes Dev. 15: 188-200; Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-498；国際ＰＣＴ出願第ＷＯ  ０１／２９０５８号；国際ＰＣＴ出願第ＷＯ  ９９／３２６１９号、を参照)。
【０４０３】
二重鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を発現する構築物は、エピソーム的のままであるかもしくはゲノムに統合されるところの複製可能なベクターを用いて、動物もしくは植物のような宿主に導入される。適切な配列を選択することによって、ｄｓＲＮＡの発現は、ＭＴＳＰ９をコード化する内在性ｍＲＮＡの蓄積に干渉することができる。また、ＲＮＡｉを用いて、インビトロで発現を阻害することができる。ＭＴＳＰ９を使用して、ＲＮＡｉを調製するので、領域は、選択的(即ち、ユニーク)であるところの少なくとも約２１個(もしくは２１個)のヌクレオチドを含む。約２１個のヌクレオチドのより小さなフラグメントは、直接的に(即ち、インビトロでもしくはインビボで)細胞へ形質転換され得る；より大きなＲＮＡｉ  ｄｓＲＮＡ分子は、一般的にそれらをコード化するベクターを用いて、導入される。ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも約２１ｂｐ長、もしくは５０、１００、１５０、２００およびそれより長い、のようにより長い、ものである。核酸分子をインビトロでおよびインビボで細胞に導入するための方法、試薬およびプロトコールは、当業者に公知である。
【０４０４】
３．遺伝子治療
例示的な実施態様では、ＭＴＳＰ９ポリペプチドまたはその機能的ドメインもしくは誘導体をコード化する、ヌクレオチドの配列を含むところの核酸を、遺伝子治療という目的で投与して、ＭＴＳＰ９ポリペプチド機能を促進する。遺伝子治療とは、対象への核酸の投与により実施される治療をいう。この実施態様では、核酸は、ＭＴＳＰ９ポリペプチド機能を促進することによって治療効果を仲介するところのそのコード化されたタンパク質を生産する。当分野において利用可能な遺伝子治療のための任意の方法を使用することができる(Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, An. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); and Morgan and Anderson, An. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIBTECH 11(5): 155-215 (1993)、を参照)。
【０４０５】
例えば、遺伝子治療のための一つの治療的組成物は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドまたはそのドメイン、フラグメントもしくはキメラタンパク質誘導体を、適当な宿主中で発現する発現ベクターの部分であるところの、ＭＴＳＰ９ポリペプチドをコード化する核酸を含む。特に、そのような核酸は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドコード化領域に機能することができるように結合されたプロモーターを有して、プロモーターは誘導的もしくは構成的であって、かつ任意に、組織特異的である。もう一つの特定の実施態様では、その中でＭＴＳＰ９ポリペプチドコード化配列および任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位で相同的な組換えを促進するところの領域を側面に持ち、かくしてＳＰタンパク質核酸の染色体内発現に備えているところの核酸分子が用いられる(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989))。
【０４０６】
患者への核酸の送達は、直接的に、その場合には患者は、核酸もしくは核酸−運搬ベクターに直接的に露出される、または、間接的に、その場合には細胞を最初インビトロで核酸にて形質転換し、次いで患者へ移植する、のどちらかであり得る。これらの二つのアプローチは、それぞれ、インビボもしくはエクスビボ遺伝子治療として、公知である。
【０４０７】
特定の実施態様では、それを発現してコード化された生成物を生産するところへ、核酸をインビボで直接的に投与する。これは、当分野で公知の多数の方法のうち任意のものにより、例えば、適切な核酸発現ベクターの部分としてそれを構築して、それが細胞内に入るように、例えば、欠損化もしくは弱毒化されたレトロウイルス性もしくは他のウイルス性ベクター(米国特許第４,９８０,２８６号を参照)を用いる感染により、または裸のＤＮＡの直接的注射により、または微粒子爆撃(例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont)、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質転換剤によるコーティング、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセル中への封入の使用により、それを投与することによって、または核に入ることが公知であるところのペプチドへ結合してそれを投与することによって、受容体−仲介性エンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)、を参照)(受容体を特異的に発現する細胞タイプを標的とするために使用され得るところの)を受けるリガンドへ結合してそれを投与することによって等で、達成することができる。
【０４０８】
もう一つの実施態様では、リガンドはエンドソームを妨害するための紡錘菌産生のウイルス性ペプチドであって、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にするところの核酸−リガンド複合体が形成される。なおもう一つの実施態様では、特異的な受容体をターゲッティングすることによって、核酸を、インビボで細胞特異的な取り込みおよび発現に目標に定めることができる(例えば、１９９２年４月１６日の日付けのＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０６１８０ (Wu et al.)；１９９２年１２月２３日の日付けのＷＯ  ９２／２２６３５ (Wilson et al.)；１９９２年１１月２６日の日付けのＷＯ  ９２／２０３１６ (Findeis et al.)；１９９３年７月２２日の日付けのＷＯ  ９３／１４１８８ (Clarke et al.)、１９９３年１０月１４日の日付けのＷＯ  ９３／２０２２１ (Young)、を参照)。これに代えて、核酸を細胞内的に導入し、そして発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に相同的組換え(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435-438 (1989))により組み込むことができる。
【０４０９】
特定の実施態様では、ＭＴＳＰ９ポリペプチド核酸を含むところのウイルス性ベクターが用いられる。例えば、レトロウイルス性ベクターを用いることができる(Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)、を参照)。これらのレトロウイルス性ベクターは、ウイルス性ゲノムのパッケジングおよび宿主細胞ＤＮＡへの統合のために必要でないところのレトロウイルス性配列を欠失するように修飾されている。遺伝子治療において用いられるべきＭＴＳＰ９ポリペプチド核酸は、患者への遺伝子の送達を促進する、ベクター中にクローン化される。レトロウイルス性ベクターについてのさらに多くの詳細は、Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)に見出され、それは幹細胞を化学療法により抵抗性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するようにレトロウイルスベクターの使用を記載している。遺伝子治療におけるレトロウイルス性ベクターの使用を例示している他の参照文献は：Clowes et al., J. Clin. Invest. 93: 644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83: 1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); and Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114 (1993)、である。
【０４１０】
アデノウイルスは、遺伝子治療で用いられ得る他のウイルス性ベクターである。アデノウイルスは、気道上皮へ遺伝子を送達するための特に魅力的なビークルである。アデノウイルスは、それらが軽い疾患を引き起こす気道上皮を自然に感染させる。アデノウイルスを基盤とする送達システムのための他の標的は、肝臓、中枢系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分割細胞を感染する能力があるという利点を有する。Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 (1993)は、アデノウイルス−を基盤とする遺伝子治療の総説を提示する。Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994)は、アデノウイルスベクターの使用がアカゲザルの気道上皮に遺伝子を移送することを立証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992)；and Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993)中に見られ得る。
また、アデノ−随伴ウイルス(ＡＡＶ)が、遺伝子治療での使用のために提唱されている(Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993).)。
【０４１１】
遺伝子治療への他のアプローチは、遺伝子を組織培養中の細胞に、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、もしくはウイルス感染のような方法によって移送することを伴う。普通、移送の方法としては、選択可能なマーカーの細胞への移送が挙げられる。次いで、細胞を選択下に置いて、移送された遺伝子を取り込み、発現しているところのそれらの細胞を単離する。次いで、それらの細胞を患者に送達する。
【０４１２】
この実施態様では、核酸は、得られた組換え細胞のインビボ投与に先立って細胞へ導入される。そのような導入を、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルス性もしくはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体−仲介遺伝子移送、微小核体−仲介遺伝子移送、スフェロプラスト融合等、を含むが、それらに限定されない、当分野において公知の任意の方法によって、実施することができる。外来遺伝子を細胞に導入するための多数の技法が、当分野において公知であって(例えば、Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217: 599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29: 6992 (1985)、を参照)、受け入れ細胞の必要な発育的および生理的機能が妨害されない条件で、用いられることができる。技法は、核酸が細胞によって発現可能であって、一般的に遺伝性であり、かつその細胞の子孫によって発現可能であるように、細胞への核酸の安定な移送に備えるべきである。
【０４１３】
得られた組換え細胞を、当分野において公知の種々の方法によって、患者に送達することができる。一つの実施態様では、内皮細胞を、例えば、皮下的に注射することができる。もう一つの実施態様では、組換え皮膚細胞を、患者への皮膚移植片として適用することができる。組換え血液細胞(例えば、造血幹もしくは前駆細胞)を、静脈内に投与することができる。使用を考慮する細胞の量は、所望の効果、患者の状態等に依存し、当業者によって決定されることができる。
【０４１４】
その中に核酸を遺伝子治療の目的で導入することができるところの細胞は、任意の所望の、利用可能な細胞型を包含し、そして、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血液細胞；種々の幹もしくは前駆細胞、特に、骨髄、臍帯血、末梢血、胎仔性肝臓、およびそれらの他の供給源から得られる幹細胞のような、造血幹もしくは前駆細胞、が挙げられるが、それらに限定されない。
【０４１５】
例えば、遺伝子治療に用いられる細胞は、患者の自己由来である。組換え細胞を遺伝子治療に用いるところの実施態様では、ＭＴＳＰ９ポリペプチド核酸を細胞内に、それが細胞もしくはその前駆体によって発現されるように、導入し、次いでその組換え細胞を、治療効果のためにインビボで投与する。特定の実施態様では、幹細胞もしくは前駆細胞を用いる。単離されて、そしてインビトロで保持されるところの任意の幹および／もしくは前駆細胞を、潜在的にはこの実施態様にしたがって用いることができる。そのような幹細胞としては、造血幹細胞(ＨＳＣ)、皮膚および腸管の被膜のような上皮組織の幹細胞、胎仔性心筋細胞、肝臓幹細胞(１９９４年４月２８日の日付けのＰＣＴ公開ＷＯ  ９４／０８５９８)および神経幹細胞(Stemple and Anderson, Cell 71: 973-985 (1992))が、挙げられるが、それらに限定されない。
【０４１６】
上皮幹細胞(ＥＳＣ)もしくは表皮細胞を、皮膚および腸管の被膜のような組織から、公知の手順(Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980))によって得ることができる。皮膚のような層状化した上皮組織では、再生は、基底板に最も接近した層である基底層の中の幹細胞の有糸分裂によって起こる。腸管の被膜内の幹細胞は、この組織の急速な再生速度に備えている。患者もしくはドナーの皮膚および腸管の被膜から得られるＥＳＣもしくは表皮細胞を、組織培養で生長させることができる(Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A: 229 (1980); Pittelkow and Scott, Cano Clinic Proc. 61: 771 (1986))。もしＥＳＣが、ドナーによって提供されるならば、宿主対移植片反応の抑制方法(例えば、穏かな免疫抑制を促進するための照射、剤もしくは抗体の投与)をまた、用いることができる。
【０４１７】
造血幹細胞(ＨＳＣ)に関しては、ＨＳＣの単離、増殖およびインビトロでの保持に備えるところの任意の技法を、この実施態様において用いることができる。これを達成することができる技法としては、(ａ)将来の宿主、もしくはドナー、から単離される骨髄細胞からのＨＳＣ培養株の単離および確立、または(ｂ)同種もしくは異種であり得るところの、以前に確立された、長期ＨＳＣ培養株の使用、が挙げられる。一般的には、非自己ＨＳＣが、将来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法で用いられる。特定の実施態様では、ヒト骨髄細胞を針穿刺吸引(例えば、Kodo et al., J. Clin. Invest. 73: 13771384 (1984)、を参照)による後部腸骨稜から取得することができる。例えば、ＨＳＣを高度に富化されたかもしくは実質的に純粋な形態にすることができる。この富化を、長期培養の以前に、間に、もしくは以後に、達成して、当分野において公知の任意の技法で行うことができる。骨髄細胞の長期培養株を、例えば、修飾されたDexterの細胞培養技法(Dexter et al., J. Cell Physiol. 91: 335 (1977))もしくはWitlock-Witteの培養技法(Witlock and Witte, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 36083612 (1982))を用いて確立し、保持することができる。
【０４１８】
特定の実施態様では、遺伝子治療の目的で導入される核酸としては、転写の適切な誘導物質の存在もしくは不在を制御することによって核酸の発現が制御可能となるように、コード化領域に機能し得るように結合された誘導性プロモーターが挙げられる。
【０４１９】
３．プロドラッグ
腫瘍を処置するための方法が提供される。この方法は、活性部位でＭＴＳＰ９によって切断されて、活性薬物を放出するところのプロドラッグもしくはインビボ活性薬物に変換され得るところの前駆体をを投与することによって、実行される。ＭＴＳＰ９活性を発現するところの細胞と接触すると、プロドラッグは活性剤に変換される。プロドラッグは、薬物もしくは剤が結合体中では不活性であるかもしくは細胞に入ることができないが、切断で活性化されるように、目標を定めたＭＴＳＰのための基質に結合された、細胞毒性剤のような抗腫瘍薬もしくは他の治療剤(ＴＡ)のような、活性剤を含有するところの結合体であり得る。プロドラッグは、例えば、目標を定めたＭＴＳＰによってタンパク質分解的に切断されるところのオリゴペプチド、典型的には、比較的短い、約１０個以下のアミノ酸ペプチド、を含有することができる。細胞毒性剤としては、アルキル化剤、抗増殖剤およびチュービリン結合剤が挙げられるが、これらに限定されない。他のものとしては、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシンおよびタキサンが挙げられる。
【０４２０】
Ｍ．動物モデル
マウスおよびラットを含むゲッシ類、ウシ、ニワトリ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ゴリラを含むサル、ならびに他の霊長類のような、トランスジェニック動物モデルおよび動物が、本明細書において提供される。特に、ＭＴＳＰ９ポリペプチドをコード化する異種核酸を含むところのトランスジェニック非ヒト動物またはそのポリペプチドの発現が、内在性遺伝子のプロモーター領域もしくは他の制御領域を置換するかもしくは修飾することによるように、変更されているところのトランスジェニック動物が、提供される。内在性核酸および、相同的なもしくは他の組換え事象を介する、強力なプロモーターのもとでの発現によるように、過剰−発現もしくは誤−発現され得るであろうところの外来性ＭＴＳＰ９遺伝子との間の組換えを促進することによって、そのような動物を生産することができる。
【０４２１】
トランスジェニック動物を、マイクロインジェクション、リポフェクションおよび生殖系列細胞もしくは、胎仔性幹細胞のような体細胞への遺伝子送達の他の様式、を含むが、それらに限定されない、送達の任意の公知の方法を用いて核酸を導入することにより、生産することができる。典型的には、核酸を、胎児性幹細胞(ＥＳ)のような細胞中へ導入し、引き続いてＥＳ細胞を胞胚へ注射し、胞胚を代理母へ移植するが、それはトランスジェニック動物の誕生に続く。一般的には、動物の染色体への異種核酸分子の導入は、異種のＭＴＳＰ９−コード化核酸および内在性核酸との間の組換えによって起こる。異種核酸を、特定の染色体に目標を定めさせることができる。或る例においては、ノックアウト動物を生産することができる。そのような動物を、その染色体中のＭＴＳＰ９ポリペプチド遺伝子および生物学的に不活性に変えられている(典型的には異種配列、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子、の挿入によって)ところの外来性ＭＴＳＰ９ポリペプチド遺伝子との間の相同的組換えを促進することによって、初めに生産することができる。
【０４２２】
一つの実施態様では、相同的組換えが起こり、引き続いてＥＳ細胞を胞胚へ注射して、胞胚を代理母の中に移植し、ＭＴＳＰ９ポリペプチド遺伝子が不活性化されている(Capecchi, Science 244: 12881292 (1989)を参照)ところのキメラ動物(''ノックアウト動物'')の誕生に引き続くように、挿入的に不活性化されたＭＴＳＰ９ポリペプチド遺伝子を含むベクターで、胎仔由来の幹(ＥＳ)細胞を形質転換することによって、この相同的組換えを実施する。キメラ動物を飼育して、同型接合ノックアウト動物を生産することができて、次いで、それを用いて、さらに別のノックアウト動物を生産することができる。ノックアウト動物としては、マウス、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシ、および他の非ヒト哺乳動物が、挙げられるが、それらに限定されない。例えば、ノックアウトマウスが生産される。得られた動物は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの過少発現を示すところの、がんのような特異的な疾患のモデルとして役立ち得る。そのようなノックアウト動物を、そのような疾患の動物モデルとして用いて、例えば、そのような疾患もしくは障害を処置するかもしくは予防する能力に対して、分子をスクリーニングするかまたは試験することができる。
【０４２３】
また、ＭＴＳＰ９ポリペプチドを過剰発現するところのものを含む、他の型のトランスジェニック動物を生産することができる。そのような動物としては、正常な遺伝子が、突然変異体、過剰発現形態もしくは他の形態のような、変異体によって置換されている動物であるところの''ノック−イン''動物が、挙げられる。例えば、げっし類のものような一つの種の内在性遺伝子を、ヒトからのような、他の種からの遺伝子によって置換することができる。また、染色体中の他の部位への異種的組換えによって、動物を生産することができる；複数の組み込み事象を有するところの動物を含む。
【０４２４】
第一世代のトランスジェニック動物の生産の後で、キメラ動物を飼育して、過剰−発現されたもしくは誤−発現されたＭＴＳＰ９ポリペプチドを持つさらに別の動物を生産することができる。そのような動物としては、、マウス、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシ、および他の非ヒト哺乳動物が、挙げられるが、これらに限定されない。得られた動物は、ＭＴＳＰ９ポリペプチドの過剰−発現もしくは誤−発現を示すところの、がんのような特異的な疾患のモデルとして、役立ち得る。そのような動物を、そのような疾患の動物モデルとして用いて、例えば、そのような疾患もしくは障害を処置するかもしくは予防する能力にたいして、分子を、スクリーニングするかまたは試験することができる。特定の実施態様では、過剰−発現されたもしくは誤−発現されたＭＴＳＰ９ポリペプチドを持つマウスが生産される。
【０４２５】
以下の実施例は、単に例証的な目的のために含まれて、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０４２６】
ＭＴＳＰ９の同定
マトリプターゼ(ＭＴＳＰ１；受け入れ番号ＡＦ１１８２２４)のプロテアーゼドメインのタンパク質配列を用いて、ヒトＨＴＧＳ(ハイスループットゲノム配列)データベースをtblastnアルゴリズムを使用して検索した。この検索およびアライメントアルゴリズムは、タンパク質問い合わせ配列を全ての６つのリーディングフレーム(両方の鎖)中で動的に翻訳されるヌクレオチド配列データベースに対して比較する。本明細書においてＭＴＳＰ９と呼称するものを含む、いくつかの潜在的なセリンプロテアーゼが同定された。
【０４２７】
ＭＴＳＰ９の翻訳された配列は、マトリプターゼと３６％の同一性を有する。ＭＴＳＰ９は、第１５染色体上に局在しているように見える(ＡＣＯ１２５７１クローン)。GenBankに預託されている配列の検索は、同一の配列は預託されていないことを示した。ヒトＥＳＴデータベースのさらなる検索は、１個のＥＳＴクローン(ＨＳＵ７７０５４と呼称される；GenBank受入れ番号Ｕ７７０５４)が、３個のヌクレオチドのミスマッチを除いて、ＭＴＳＰ９配列の短いセグメント(配列番号５のｎｔ６３１〜ｎｔ７５４、もしくは配列番号１７の完全長クローンｎｔ．１１６２〜１２７９中の相当する配列)にほぼ完全にマッチすることを示した。
【０４２８】
ＭＴＳＰ９のクローニングのための組織源の同定
ゲノム配列から由来したＭＴＳＰ９のヌクレオチド配列を用いて、二つの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。５’末端のプライマーの配列は、
５’ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧ３’(配列番号７)であり、３’末端のプライマーの配列は、５’ＡＡＴＧＡＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＡＴＣＴＴＴＣＡＧＡＴＣＣＣＴＴＧ３’(配列番号８)である。これらのプライマーを用いて、正常ヒト組織由来の８つのｃＤＮＡライブラリーのパネル(ヒト多重組織ｃＤＮＡパネルＩ；Clontech, Palo Alto, CA; カタログ番号Ｋ１４２０１)をスクリーニングした。ヒト膵臓中に一つのバンド(約７００ｂｐ)が検出されて、そしてそれに続く配列分析は、このＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列がゲノムのＭＴＳＰ９のエキソン配列のそれにマッチすることを示した。
【０４２９】
正常な、腫瘍細胞および細胞株中におけるＭＴＳＰ９の遺伝子発現プロフイール
ＭＴＳＰ９転写物の遺伝子発現プロフイールを得るために、ヒト膵臓から得たＭＴＳＰ９のｃＤＮＡフラグメントを用いて、７６の異なるヒト組織(ヒト多重組織発現(ＭＴＥ)アレイ；Clontech, Palo Alto, CA；カタログ番号７７７５１)から抽出したＲＮＡより成るドットブロットを調べた。この分析の結果は、ＭＴＳＰ９は、食道において高度に発現し、多くの他の組織において低レベルで発現していることを示した。ＭＴＳＰ９転写物は、腎臓(成人、胎児)、脾臓(成人、胎児)、胎盤、肝臓(成人、胎児)、胸腺、末梢血リンパ球、肺(成人、胎児)、膵臓、リンパ節、骨髄、気管、子宮、前立腺、食道、精巣、卵巣ならびに腺器官(乳腺、副腎、甲状腺、脳下垂体および唾液腺)に見出される。ＭＴＳＰ９はまた、食道腫瘍組織、肺癌(Ａ５４９細胞株)、ならびに低レベルで結腸直腸癌(ＳＷ４８０)、リンパ腫(ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ)、子宮頚癌(ＨｅＬａＳ３)および白血病(ＨＬ−６０、Ｋ−５６２およびＭＯＬＴ−４)細胞株で発現される。
【０４３０】
ＭＴＳＰ９の完全長プロテアーゼドメインをコード化するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するｃＤＮＡフラグメントを得るために、遺伝子特異的プライマーおよびヒト食道由来のｃＤＮＡを用いる終端間ＰＣＲ増幅を使用した。使用した二つのプライマーは：５’末端用は、５’ＣＧＡＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＴＡＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡＧＣ３’  (配列番号９)、そして３’末端用は、５’ＧＣＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＴＣＧＴＧ  ３’(配列番号１０)である。両プライマーのための配列は、ＭＴＳＰ９のゲノム配列から得られた。５’プライマーは、ＭＴＳＰ９プロテアーゼドメインの開始のすぐ上流の領域をコード化する配列(ＲＶＶＰＬＮＶＮＲＩＡ；配列番号１２)を含んでいた。３’プライマーは、推定停止コドンの直後の配列に対応する。約７５０ｂｐのフラグメントが、ヒト食道ｃＤＮＡライブラリーから増幅された。ＰＣＲ産物を単離して、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA; カタログ番号２８７０４)を用いることにより精製した。ＭＴＳＰ９産物を用いて、PichiaベクターのｐＰＩＣ９Ｋ中にサブクローン化するための適切な制限部位を含有するｃＤＮＡフラグメントを増幅した。使用した遺伝子特異的プライマーは
５’末端で、５’ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＴＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣＡＡＧ３’(配列番号１３)、および
３’末端で、５’ＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＡＧＡＴＧＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣ３’(配列番号１４)である。５’末端のプライマーは、Pichiaプロテアーゼ切断部位のすぐ上流にＸｈｏｌ部位(下線部)、およびＭＴＳＰ９プロテアーゼドメインの一部(ＫＲＩＡＳＧＶＩＡＰＫ；配列番号１５)を含有している一方で、３’末端は、停止コドン(太字)のすぐ下流にＮｏｔＩ部位(下線部)を含有していた。
【０４３１】
ＲＡＣＥによるＭＴＳＰ９の完全長ｃＤＮＡのクローニング
ＲＡＣＥ対応のｃＤＮＡライブラリーを、ヒト正常および腫瘍食道のポリＡ＋ＲＮＡからＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット(Clontech；カタログ番号Ｋ１８１１１)およびFirst  Choice  ＲＬＭＲＡＣＥキット(Ambion, Austin, TX；カタログ番号１７００)を用いて調製した。５’−ＲＡＣＥ反応には、アンチセンス遺伝子特異的プライマー(５’  ＡＡＴＧＡＧＡＴＡＣＣＡＣＧＴＡＴＣＴＴＴＣＡＧＡＴＣＣＣＴＴＧ３’配列番号１９)を、ｃＤＮＡの５’末端に存在するアダプターにハイブリダイズするセンスプライマーと一緒に使用した。一つのバンド(約１.３ｋｂｐ)を増幅し、そしてＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインからなるプローブに対してサザン分析により同定した。３’−ＲＡＣＥ反応は、使用したセンス遺伝子特異的プライマーが５’ＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＣＣＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧ３’(配列番号２０)であったことを除いて、類似の様式で行った。一つのバンド(約０.８ｋｂｐ)を増幅して、アガロースゲルから単離した。二つのＲＡＣＥ産物を、ＴＡクローニング(ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット； Invitrogen, Carlsbad, CA；カタログ番号Ｋ４５０００１)を用いて、E. coliベクター中に別々にサブクローン化した。形質転換後、代表的なクローンからのプラスミドＤＮＡを単離して、精製し、そしてＥｃｏＲＩで消化して、挿入体の存在をチェックした。プラスミドＤＮＡを、最初はＭ１３順方向および逆方向プライマーで、次いで全挿入体に亘る両方向の遺伝子特異的プライマーでシークエンシングした。
【０４３２】
ＭＴＳＰ９のセリンプロテアーゼドメインおよび他のプロテアーゼとの相同性
ＭＴＳＰ９の翻訳されたコード領域の配列分析は、Ｎ末端における膜貫通ドメインおよびＣ末端におけるトリプシン様セリンプロテアーゼドメインの存在を示した。これらのドメインの間には、既知の識別可能なドメインを持たないで、そしてエンドセリナーゼ１中の同じ一続きと２０％の同一性を共有する、一続きのタンパク質配列(１４９個のアミノ酸残基長)がある。全体として、ＭＴＳＰ９の完全長タンパク質配列は、ヒトエンドセリナーゼ１(ＤＥＳＣ１；Genbank受入れ番号ＡＦ０６４８１９)と４２％の同一性を、そしてもう一つのＩＩ型膜型セリンプロテアーゼ、ヒト気道トリプシン様セリンプロテアーゼ(Genbank受入れ番号ＮＰ００４２５３)と４０％の同一性を共有する。ＭＴＳＰ９プロテアーゼドメイン配列の分析は、それが、ドメインの初めにプロテアーゼ活性化切断部位、および触媒ドメインの３つの高度に保存されている領域中に触媒３残基(ヒスチジン、アスパラギン酸およびセリン)の存在を特徴とするトリプシン様セリンプロテアーゼドメインであることを示した。プロテアーゼドメイン配列のアライメントは、エンドセリナーゼ１との５６％同一性およびヒト気道トリプシン様プロテアーゼドメインとの４８％同一性を示した。
【０４３３】
配列分析
ＭＴＳＰ９のｃＤＮＡおよびタンパク質配列を、MacVector (version 6.5; Oxford Molecular Ltd., Madison, WI)を用いて分析した。ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するｃＤＮＡは、２３２個のタンパク質に翻訳されるところの６９９ｂｐ長である。プロテアーゼドメインのヌクレオチド配列およびＭＴＳＰ９の翻訳されたタンパク質配列は、次の通りである(配列番号５、６および１６を参照)：
プロテアーゼドメイン配列範囲を含むMTSＰ９−ｃＤＮＡ：１ないし７７７（プロテアーゼコーディングドメイン３１−７２９）
【化１】
2005506047.tif 000003
【化２】
2005506047.tif 000004
【０４３４】
プロテアーゼドメイン配列を含有するＭＴＳＰ９−ｃＤＮＡ  範囲：１〜７７７(プロテアーゼコード化ドメイン３１〜７２９)
【化３】
2005506047.tif 000005
【化４】
2005506047.tif 000006
【０４３５】
ＭＴＳＰ９のｃＤＮＡおよびタンパク質の配列を、MacVector(version 6.5; Oxford Molecular Ltd., Madison, WI)を用いて分析した。クローンをコード化する完全長は、１,４２２ｂｐ長であって、１,２４７ｂｐ長のコード領域を有する。翻訳されたタンパク質配列は、４１８アミノ酸残基長である。ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化するＤＮＡは、２３２個のアミノ酸のタンパク質に翻訳されるところの６９９ｂｐ長である。
【０４３６】
ＭＴＳＰ９の完全長ｃＤＮＡ配列
配列範囲：１〜１４２２
【化５】
2005506047.tif 000007
【化６】
2005506047.tif 000008
ＭＴＳＰ９の完全長コード配列
配列範囲：１〜１２５７
【化７】
2005506047.tif 000009
【化８】
2005506047.tif 000010
ＭＴＳＰ９の完全長タンパク質配列
配列範囲：１〜４１９
【化９】
2005506047.tif 000011
【実施例２】
【０４３７】
プロテアーゼＭＴＳＰドメインの発現
ＭＴＳＰ９およびそのプロテアーゼドメインのそれぞれをコード化する核酸を、Pichia pastorisのベクターｐＰＩＣ９Ｋ(Invitrogenより入手可能；配列番号１１を参照)の誘導体中にクローン化した。プラスミドｐＰＩＣ９Ｋの特徴は、１〜９４８における５’ＡＯＸ１プロモーターフラグメント；８５５〜８７５における５’ＡＯＸ１プライマー部位；９４９〜１２１８におけるアルファ因子分泌シグナル(複数を含む)；１１５２〜１１７２におけるアルファ因子プライマー部位；１１９２〜１２４１における多重クローニング部位；１３２７〜１３４７における３’ＡＯＸ１プライマー部位；１２５３〜１５８６における３’ＡＯＸ１転写終結領域；４５１４〜１９８０におけるＨＩＳ４  ＯＲＦ；５７４３〜４９２８におけるカナマイシン抵抗性遺伝子；６１２２〜６８７９における３’ＡＯＸ１フラグメント；７９６１〜７２８８におけるＣｏｌＥ１起点；および８９６６〜８１０６におけるアンピシリン抵抗性遺伝子、を含む。プラスミドは、ｐＰＩＣ９Ｋからカナマイシン抵抗性遺伝子中のＸｈｏｌ部位を除去することにより誘導されて、ここで得られたベクターは、本明細書においてｐＰＩＣ９Ｋｘと呼称される。
【０４３８】
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインのＣ１２２Ｓ突然変異誘発
ＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインをコード化する遺伝子をＰＣＲ  ＳＯＥ(オーバーラップ伸長によるＰＣＲに基づくスプライシング)により突然変異を起こさせることによって、１２２位(キモトリプシンの番号付けシステム；ＭＴＳＰ９ではＣｙｓ２９２)の対をなしていないシステインをセリンで置換した。それぞれ１２２位にセリンに対するＡＧＴコドンを含有する、二つのオーバーラッピング遺伝子フラグメントを、次ぎのプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：５’遺伝子フラグメントには、ＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＴＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧＣＡＣＣＣ(配列番号１３)およびＡＧＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡＡＴＣＣＧＧＣＧＴＡＴＧＴＣ(配列番号１４)；３’遺伝子フラグメントには、ＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＡＴＧＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴ(配列番号２１)およびＧＡＣＡＴＡＣＧＣＣＧＧＡＴＴＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＣＴ(配列番号２２)である。増幅された遺伝子フラグメントを１％アガロースゲル上で精製し、混合し、ＰＣＲで再増幅して、ＭＴＳＰ９  Ｃ１２２Ｓのプロテアーゼドメインに対する完全長コード化配列を生産した。次いで、この配列を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで切断し、そしてベクターｐＰｉｃ９ＫＸ中に連結した。
【０４３９】
ＭＴＳＰ９発酵および初期産物回収
発酵
ＭＴＳＰ９のＣ１２２Ｓ突然変異体を発現するP. pastorisクローンＧＳ１１５／ｐＰＩＣ９Ｋ：ＭＴＳＰ９  Ｃ１２２Ｓ  Ｓａｃ  ＭＣ２を、５リットルのスケールで発酵した。２００ｍｌの１夜培養液(およそ２５のＯＤ６００)を用いて、４つのBioflo容器(New Brunswick Scientific, Edison, NJ)のそれぞれの中で３.２リットルの発酵用培地に接種した。バッチ相の複合培地は、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、ペプトン２０ｇ／ｌ、グリセリン４０ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／ｌ、硫酸カルシウム(２水和物)０.２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム(６水和物)２ｇ／ｌ、硫酸カリウム２ｇ／ｌ、ヘキサメタリン酸ナトリウム２５ｇ／ｌ、および４.３５ｍｌ／ｌのＰＴＭ１(ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ６.０ｇ／ｌ、ＮａＩ０.０８ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ３.０ｇ／ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０.２ｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３０.０２ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２０.５ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ２２０.０ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ６５.０ｇ／ｌ、ビオチン０.２ｇ／ｌ、Ｈ２ＳＯ４５.０ｍｌ／ｌ)を含んでいた。培養物を、ｐＨ５.０および温度２８℃でバッチ相で成長させた。濃水酸化アンモニウムを用いて、培養液のｐＨを維持した。ＫＦＯ  ８８０(KABO Chemicals, Cheyenne,WY)を使用して、必要に応じて、泡立ちを制御した(例えば、Zhang et al. (2000) 「Pichia pastoris成長のメタノールへの適応および組換えタンパク質生産の最適化、血清型Ａのボツリヌス神経毒の重鎖フラグメントＣ」、 Biotechnology and Bioengineering Vol. 70, No 1、を参照)。
【０４４０】
バッチ相の発酵は約２２時間続き、このときには培養物は、培地中の初めのグリセリンの全てを消費してしまっていた。この時点で、５０％(ｗ／ｖ)グリセリンの基質制限供給バッチを１８ｍｌ／ｌ×時間で開始した。グリセリン供給バッチに入って２時間で、培養液のｐＨを、濃水酸化アンモニウムの添加により２時間に亘って５.０から７.０に直線的に増加させた。グリセリン供給バッチの持続時間は約４.５時間であった。培養物はこの時点までに２２０〜２５０ｇ／ｌ細胞未乾重量の密度に到達した。
【０４４１】
グリセリン供給バッチの終了に続いてメタノール誘導を開始した。Zhang et al.の方法に従い、培養液１リットル当り１.５ｍｌのメタノールを添加して、グリセリン供給速度を１８ｍｌ／ｌ*時間から０ｍｌ／ｌ*時間に３時間に亘って減少させることにより、培養液をメタノール利用に移行させた。メタノール添加は、誘導を通して発酵槽を制御するために使用したＭｅＯＨセンサー(Raven Biotech, Vancouver, BC, Canada)のオンライン較正として役立った。初期量のメタノールが消費されたことがＭｅＯＨセンサーで示された後に、さらに別の１５ｍｌ／ｌを培養液に添加し、そしてＭｅＯＨセンサーを用いて、発酵槽中のメタノール濃度を誘導相を通してそのレベルに制御した。発酵槽に供給したメタノールには、２ｍｌ／ｌのＰＴＭ４溶液(ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ２０ｇ／ｌ、ＮａＩ０.０８ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ３.０ｇ／ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０.２ｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３０.０２ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０.５ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ２７.０ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２２.０ｇ／ｌ、ビオチン０.２ｇ／ｌ、Ｈ２ＳＯ４１.０ｍｌ／ｌ)を補充した。誘導相は約４２.５時間持続した。
【０４４２】
初期産物回収
それぞれの発酵からの上清み液を遠心により収穫し、プールし、次いで、ＳＲＴ５限外濾過システム(North Carolina SRT, Cary, NC)上で１０ｋＤａの限外濾過カートリッジ(A/G Technologies Corp., Needham, MA)を用いて約０.５リットルに濃縮した。濃縮物をシステムから排出させ、次いでシステムを濃縮物と等容量の５０ｍＭ  Hepes、ｐＨ７.０でゆすいだ。濃縮物とゆすぎ液とを合して約１リットルの最終限外濾過産物を得た。上清み液の最終澄明化を、SartoBran  ３００  ０.４５＋０.２μｍカプセルフィルター(Sartorius Separations Div., Edgewood, NJ)を用いて行った。
【０４４３】
タンパク質精製−ＭＴＳＰ９
グリコシル化されたＭＴＳＰ９の濃縮発酵上清み液を、５０ｍＭ  Hepes、ｐＨ７.０に対して透析し、ろ過し、そして５０ｍＭ  Hepes、ｐＨ７で予め平衡化させた１４７ｍＬのセファロース陽イオン交換樹脂カラム(Amersham-Pharmacia Biotech)に直接に充填した。７カラム用量に亘り、０〜５００ｍＬ  ＮａＣｌの直線勾配を用いて、５ｍＬ／分の流速でタンパク質を溶出した。
【０４４４】
活性フラクションをプールし、次いで５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ５.５に対し一夜透析した。次いで、精製されたグリコシル化ＭＴＳＰ９を、タンパク質１ｍｇ当り０.１ｍｌのエンドグリコシダーゼＨ(ProZyme、５Ｕ／ｍｌ)を添加して、一夜４℃で穏やかに回旋させながらインキュベートすることにより脱グリコシル化した。次いで、透析したタンパク質溶液を、ｐＨ７に調整し、ろ過し、１４７ｍＬのＳＰセファロース陽イオン交換カラム上に直接に充填して、上述のように溶出した。活性フラクションをプールし、ベンズアミジンを加えて、最終濃度を１０ｍＭとした。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べ、タンパク質濃度をＯＤ２８０の測定および２.０１７ｍｌ／(ｍｇ×ＯＤ２８０)の理論吸光係数の使用により測定した。
【実施例３】
【０４４５】
ＭＴＳＰの活性を調整する候補化合物の同定のためのアッセイ
阻害剤同定のためのアッセイ
試験化合物がＭＴＳＰ９の触媒活性の阻害剤として作用する能力を、アミド分解活性で評価することができる。組換えＭＴＳＰもしくはそのプロテアーゼドメインによるアミド分解活性の阻害剤誘発性阻害を、そのようなアッセイにおいてＩＣ５０値により測定することができる。
【０４４６】
上述のように発現されたＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインを、種々の試験化合物による阻害についてCostar９６穴組織培養プレート(Corning NY)中で、以下のようにアッセイする。阻害剤無しで、もしくは１００００ｎＭの阻害剤および７段階の１：６希釈と共に１Ｘ直接緩衝液(２９.２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.４、２９.２ｍＭのイミダゾール、２１７ｍＭ  ＮａＣｌ(最終容積１００μＬ))の中に、およそ１〜１０ｎＭのプロテアーゼを添加して、室温で３０分間インキュベートさせた。４００μＭの基質Ｓ  ２３６６(Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン塩酸塩；DiaPharma, Westchester, OH)を添加して、そして反応をSpectraMAX  Plusマイクロプレートリーダー (Molecular Devices, Sunnyvale CA)中で、３７℃で２０分間、４０５ｎｍの吸光度の変化を追うことによりモニターする。
【０４４７】
基質の同定
アッセイに使用する特定の基質を、基質を試験することにより経験的に同定することができる。次の基質のリストは、試験されることのできるものの例示的である。
【表２】
2005506047.tif 000012
【表３】
2005506047.tif 000013
ｐＮＡ＝パラニトロアニリド(色素生産性)
ＡＭＣ＝アミノメチルクマリン(蛍光性)
【０４４８】
もし上記の基質のどれも切断されなければ、上述の結合アッセイを使用することができる。略述すれば、プロテアーゼが、プラスミノーゲンおよびトリプシノーゲンのような、酵素を活性化する能力を試験する。これらのアッセイを行うために、単鎖プロテアーゼを、リス−プラスミノーゲンのような、チモーゲンに対する既知の基質の存在下にプラスミノーゲンもしくはトリプシノーゲンのような、チモーゲンと共にインキュベートする。もし単鎖がチモーゲンを活性化すれば、プラスミンおよびトリプシンのような、活性化された酵素が、それに対する基質を分解するであろう。
【０４４９】
モジュレーターをスクリーニングするためのＭＴＳＰ−９アッセイ
Pichia pastoris中で発現されるＭＴＳＰ９のプロテアーゼドメインを、種々の試験化合物による阻害についてCostar９６穴組織培養プレート(Corning NY)中でアッセイした。阻害剤無しで、もしくは１００００ｎＭの阻害剤および７段階の１：６希釈と共に１Ｘ直接緩衝液(２９．２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.４、２９.２ｍＭのイミダゾール、２１７ｍＭ  ＮａＣｌ(最終容量１００μＬ))に、およそ１〜２０ｎＭのＭＴＳＰ９を添加して、室温で３０分間インキュベートさせた。４００μＭの基質petachromeＦＶＩＩａ(Pentapharm,, Norwalk, CT)を添加し、そして反応をSpectraMAX  Plusマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale CA)中で、３７℃で２０分間、４０５ｎｍの吸光度の変化を追うことによりモニターした。
【実施例４】
【０４５０】
他のアッセイ
これらのアッセイはＭＴＳＰ１に関して記載されるが、そのようなアッセイはＭＴＳＰ９での使用に容易に適合させることができる。
【０４５１】
マトリプターゼ即ちＭＴＳＰ１のセリンプロテアーゼ活性の阻害を測定するためのアミド分解アッセイ
試験化合物がｒＭＡＰの触媒活性の阻害剤として作用する能力を、ＩＣ５０値で測定されるように、ＭＡＰによるアミド分解活性の阻害剤で誘発された阻害の測定により評価した。アッセイ用緩衝液は、ＨＢＳＡ(１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７.４、０.１％ウシ血清アルブミン)であった。別に記載が無い限り、全ての試薬はSigma Chemical Co. (St. Louis, MO)からであった。
【０４５２】
二つのＩＣ５０アッセイを、(ａ)一つは３０分もしくは６０分時のどちらかで(試験化合物および酵素の３０分もしくは６０分のプレインキュベーション)、および(ｂ)一つは０分時(試験化合物および酵素のプレインキュベーション無し)で、実施した。３０分もしくは６０分時のＩＣ５０アッセイでは、以下の試薬をCorningマイクロタイタープレートの適切なウエル中で結合させて：５０マイクロリットルのＨＢＳＡ、ＨＢＳＡ中で希釈した(広い濃度範囲をカバー)５０マイクロリットルの試験化合物(もしくは阻害されない速度の測定のためのＨＢＳＡ単独)、および緩衝液中に希釈した、ｒＭＡＰ(Corvas International)５０マイクロリットル、活性部位ろ過で測定した２５０ｐＭの終酵素濃度を得た。環境温度で３０分もしくは６０分のインキュベーションの後、それぞれのウエルへの５０マイクロリットルの基質Ｓ−２７６５((Ｎ-α−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリンニ塩酸塩；DiaPharma Group, Inc.; Franklin, OH)の添加により、アッセイを開始して、２００マイクロリットルの最終アッセイ容積および１００μＭ(Ｋｍの約４倍)の最終基質濃度を得た。アッセイ混合物への添加の前に、Ｓ−２７６５を脱イオン水中で水溶液に戻し、そしてＨＢＳＡ中で希釈した。０分時でのＩＣ５０アッセイのためには；同じ試薬を結合させた：５０マイクロリットルのＨＢＳＡ、ＨＢＳＡ中で希釈した(広い濃度範囲をカバー)５０マイクロリットルの試験化合物(もしくは阻害されない速度の測定のためのＨＢＳＡ単独)、および５０マイクロリットルの基質Ｓ−２７６５である。アッセイを、５０マイクロリットルのｒＭＡＰの添加により開始した。全ての成分の最終濃度は、両方のＩＣ５０アッセイ(３０もしくは６０分および０分時)において同一であった。
【０４５３】
色素生産性基質の加水分解の初速度を、両アッセイにおいて、Thermo Max[登録商標]キネティックマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて４０５ｎＭの吸収の変化で５分間測定したが、そこでは添加した基質の５％未満が使用された。加水分解の初速度の５０％減少をもたらすところの添加された阻害剤の濃度を、二つのアッセイ(３０もしくは６０分および０分時)のそれぞれにおけるそれぞれのＩＣ５０値として定義した。
【０４５４】
特異性測定のためのインビトロ酵素アッセイ
化合物がマトリプターゼ活性の選択的阻害剤として作用する能力を、マトリプターゼの活性を５０％阻害する試験化合物の濃度、即ち上の実施例で説明したような(ＩＣ５０)、を測定すること、およびマトリプターゼについてのＩＣ５０値を、以下のセリンプロテアーゼの全てもしくはいくつかについてのＩＣ５０値と比較することにより評価した：トロンビン、組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター(ｒｔ−ＰＡ)、プラスミン、活性化タンパク質Ｃ、キモトリプシン、第Ｘａ因子およびトリプシンである。
全てのアッセイに使用した緩衝液は、ＨＢＳＡ(１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０.１％ウシ血清アルブミン)であった。
【０４５５】
ＩＣ５０測定のアッセイは、Corningマイクロタイタープレートの適切なウエル中で、５０マイクロリットルのＨＢＳＡ、ＨＢＳＡ中で希釈した(広い濃度範囲をカバー)特定濃度の５０マイクロリットルの試験化合物(もしくはＶ０(阻害されない速度)の測定のためのＨＢＳＡ単独)、ＨＢＳＡで希釈された５０マイクロリットルの酵素を結合させることによって実施した。環境温度で３０分のインキュベーションの後、以下に特定した濃度の基質の５０マイクロリットルをウエルに添加し、２００マイクロリットルの最終総容積を得た。色素生産性基質の加水分解の初速度を、Thermo  Max[登録商標]キネティックマイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎＭの吸収の変化で５分間測定したが、そこでは添加した基質の５％未満が使用された。加水分解の初速度の５０％減少をもたらすところの添加された阻害剤の濃度を、ＩＣ５０値として定義した。
【０４５６】
トロンビン(ｆｌｌａ)アッセイ
酵素活性は色素生産性基質、Pefachrome ｔＰＡ(ＣＨ３ＳＯ２Ｄヘキサヒドロチロシン−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン、Pentapharm Ltd.より入手)、を用いて測定された。基質を使用前に脱イオン水で水溶液に戻した。精製したヒトα−トロンビンはEnzyme Research Laboratories, Inc.から入手した。全てのアッセイに使用した緩衝液は、ＨＢＳＡ(１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０.１％ウシ血清アルブミン)であった。
【０４５７】
ＨＢＳＡ(５０μＬ)、α−トロンビン(５０μｌ)(最終酵素濃度は０.１ｎＭ)および阻害剤(５０μｌ)(広い濃度範囲をカバーする)を適切なウエル中で結合させて、室温で３０分インキュベートした後、基質Pefachrome−ｔ−ＰＡ(５０μｌ)(最終基質濃度は２５０μＭ、Ｋｍの約５倍)を添加する、ＩＣ５０測定を実施した。Pefachrome−ｔ−ＰＡの加水分解の初速度を、Thermo Max[登録商標]キネティックマイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎＭの吸収の変化で５分間測定したが、そこでは添加した基質の５％未満が使用された。加水分解の初速度の５０％減少をもたらすところの添加された阻害剤の濃度を、ＩＣ５０値として定義した。
【０４５８】
第Ｘａ因子
第Ｘａ因子の触媒活性は、DiaPharma Group (Franklin, OH)から入手した色素生産性基質Ｓ−２７６５(Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アルギニン−Ｌ−グリシン−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン)を用いて測定された。全ての基質を使用前に脱イオン水で水溶液に戻した。Ｓ−２７６５の最終濃度は２５０μＭ(Ｋｍの約５倍)であった。精製されたヒト第Ｘ因子はEnzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN)から入手し、そして第Ｘａ因子(ＦＸａ)を、記載にしたがって[Bock, P.E., Craig, P.A., Olson, S.T., and Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273:375388 (1989)]、それから活性化して、調製した。酵素をアッセイ前にＨＢＳＡ中に希釈し、そこでは最終濃度は０.２５ｎＭであった。
【０４５９】
組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター(ｒｔ−ＰＡ)アッセイ
ｒｔ−ＰＡの触媒活性は、基質Pefachrome ｔＰＡ(ＣＨ３ＳＯ２Ｄヘキサヒドロチロシン−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン、Pentapharm Ltd.より入手)を用いて測定された。アッセイの前に基質を脱イオン水に溶かし、次いでＨＢＳＡ中で希釈し、そこでは最終濃度は５００マイクロモル濃度(Ｋｍの約３倍)であった。ヒトｒｔ−ＰＡ(Activase[登録商標])は、Genentech Inc.から入手された。酵素を、アッセイの前に脱イオン水で水溶液に戻して、ＨＢＳＡの中に希釈し、そこでは最終濃度は１.０ｎＭであった。
【０４６０】
プラスミンアッセイ
プラスミンの触媒活性は、DiaPharma groupから入手した色素生産性基質Ｓ−２３６６(Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン塩酸塩)を用いて測定された。アッセイの前に基質を脱イオン水に溶かし、次いでＨＢＳＡ中で希釈して、そこでは最終濃度は３００マイクロモル濃度(Ｋｍの約２.５倍)であった。精製ヒトプラスミンは、Enzyme Research Laboratories, Inc.から入手された。酵素を、アッセイの前にＨＢＳＡの中に希釈し、そこでは最終濃度は１.０ｎＭであった。
【０４６１】
活性化タンパク質Ｃ(ａＰＣ)アッセイ
ａＰＣの触媒活性は、色素生産性基質Pefachrome  ＰＣ(デルタ−カルボベンジルオキシ−Ｄ−リジン−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン二塩酸塩、Pentapharm Ltd.より入手)を用いて測定された。アッセイの前に基質を脱イオン水に溶かし、次いでＨＢＳＡ中で希釈し、そこでは最終濃度は４００マイクロモル濃度(Ｋｍの約３倍)であった。精製ヒトａＰＣは、Hematologic Technologies, Inc.から入手された。酵素をアッセイの前にＨＢＳＡの中に希釈し、そこでは最終濃度は１.０ｎＭであった。
【０４６２】
キモトリプシンアッセイ
キモトリプシンの触媒活性は、DiaPharma Groupから入手した色素生産性基質Ｓ−２５８６(メトキシ−サクシニル−Ｌ−アルギニン−Ｌ−プロピル−Ｌ−チロシル−ｐ−ニトロアニリド)を用いて測定された。アッセイの前に基質を脱イオン水に溶かし、次いでＨＢＳＡ中で希釈し、そこでは最終濃度は１００マイクロモル濃度(Ｋｍの約９倍)であった。精製した(３Ｘ結晶化；ＣＤＩ)ウシ膵臓アルファ−キモトリプシンは、Worthington Biochemical Corp. から入手された。酵素をアッセイの前に脱イオン水で水溶液に戻し、ＨＢＳＡの中に希釈し、そこでは最終濃度は０.５ｎＭであった。
【０４６３】
トリプシンアッセイ
トリプシンの触媒活性は、DiaPharma Groupから入手した色素生産性基質Ｓ−２２２２(ベンゾイル−Ｌ−イソロイシン−Ｌ−グルタミン酸−［ガンマメチルエステル］−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド)を用いて測定された。アッセイの前に基質を脱イオン水に溶かし、次いでＨＢＳＡ中で希釈し、そこでは最終濃度は２５０マイクロモル濃度(Ｋｍの約４倍)であった。精製した(３Ｘ結晶化；ＴＲＬ３)ウシ膵臓トリプシンは、Worthington Biochemical Corp. から入手された。酵素をアッセイの前に脱イオン水で水溶液に戻し、ＨＢＳＡの中に希釈し、そこでは最終濃度は０.５ｎＭであった。
修飾は当業者に明らかであろうから、本発明は、添付の請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【国際公開パンフレット】
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2005506047.tif 000212
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506047.tif 000213
【国際調査報告】
2005506047.tif 000214
2005506047.tif 000215
2005506047.tif 000216
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