(57)【要約】本発明は、複製能力のあるベクターまたはウイルス生成に対して改良した安全性を有する、改良された条件付複製ベクターを提供する。ベクターを、作製する方法、増殖し選択的にパッケージングする方法、改変し使用する方法がまた開示される。改良されたベクターならびこのベクターを含む薬学的組成物および宿主細胞を用いた使用のための改良されたヘルパー構築物、宿主細胞、薬物をスクリーニングするためのベクター含有宿主細胞の使用、および遺伝子機能を決定するためのベクターの使用方法が含まれる。この方法はまた、疾患、特にウイルス感染（特にＨＩＶ感染）の予防処置および治療処置を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
条件付複製ベクター−ヘルパー系であって、以下：
ヘルパーベクターを用いる組換えの危険性を軽減する１つ以上の核酸配列、およびヘルパーベクターを含む、条件付複製ベクター、
を含有する、系。
【請求項２】
請求項１の系であって、組換えの危険性を軽減する前記１つ以上の核酸配列が、前記ヘルパーベクターを切断するリボザイム、ヘルパーベクターを用いる組換えの可能性を減少させる１つ以上の置換、挿入または欠損を含む配列、あるいは、ヘルパーベクターを用いた組換えの可能性を軽減するように変性されている配列から選択される、系。
【請求項３】
請求項１に記載の系であって、前記ヘルパーが、前記条件付複製ベクターでの組換えの可能性を軽減するためにヘルパーベクターの１つ以上の配列に関して変性された配列、またはスプライシングドナー部位を含み、その結果、該条件付複製ベクターとの同時局在性を防止するためにパッケージング配列およびＲＲＥ配列が除去される、系。
【請求項４】
前記ベクターが、ＭＧＭＴ遺伝子を含む、請求項１に記載の系。
【請求項５】
請求項１に記載の系であって、前記ヘルパーが、異種エンベロープタンパク質をコードし、そして／あるいは前記条件付複製ベクターと比較して異種であるＲＲＥ、または該ベクターと比較して異種であるｇａｇ配列を含む、系。
【請求項６】
請求項５に記載の系であって、前記異種エンベロープタンパク質が、Ｒｅｖ依存的制御下であり、そして／または、該異種エンベロープタンパク質が、ＶＳＶ−Ｇ、ＲＤ１１４、狂犬病ウイルス、ＧＡＬＶ、およびキメラエンベロープタンパク質から選択される、系。
【請求項７】
前記条件付複製ベクターが、ウイルスアクセサリータンパク質をコードも発現もしない、請求項１に記載の系。
【請求項８】
前記条件付複製ベクターが、ＨＩＶ−１由来である、請求項１に記載の系。
【請求項９】
前記条件付複製ベクターが、短縮型ＣＣＲ５タンパク質をコードする、請求項１に記載の系。
【請求項１０】
前記条件付複製ベクターが、該ベクターの導入を改良する配列を含む、請求項１に記載の系。
【請求項１１】
前記ベクターが、キメラＨＩＶ  ＣＴＬエピトープをコードする、請求項１に記載の系。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の系を含む、細胞。
【請求項１３】
条件付複製ベクターがパッケージングされる条件下で、請求項１２に記載の細胞をインキュベートする工程を包含する、該ベクターをパッケージングする、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって生成される、条件付複製ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターによって感染された、細胞。
【請求項１６】
前記細胞をＢＧおよびＢＣＮＵと接触させる工程を包含する、請求項１５に記載の細胞を選択する方法。
【請求項１７】
前記ベクターによって感染されていない腫瘍細胞が死滅される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスに感染した細胞中のウイルスＤＮＡの生成を防止または阻害する方法であって、該方法が、以下：
該細胞が、該ウイルスに感染される前に、該細胞に条件付複製ウイルスベクターを導入する工程、
を包含し、ここで、該ベクターが、ウイルスＤＮＡの生成を予防または阻害する、方法。
【請求項１９】
前記ウイルスＤＮＡが、前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウイルスが野生型ウイルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、ＣＤ４＋細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが、ＨＩＶ−１である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ベクターが、前記ウイルスによって使用されたプロセスと同じプロセスによって、前記細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１８に記載の方法であって、前記ベクターが、発現される遺伝子および１つ以上の第１のヌクレオチド配列を含み、ここで、該ベクターは、：  
（ａ）各々が該１つ以上の第１のヌクレオチド配列の存在に感受性であるウイルスの野生型株、ヘルパーウイルス、またはヘルパーベクターとの補完相補のみ細胞中で複製し；
（ｂ）該１つ以上の第１のヌクレオチド配列の存在に耐性であり；そして、
（ｃ）複製能力があるベクターを生成する可能性を減少する、１つ以上の置換、挿入、または欠損を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、改良された条件付複製ベクター、および、ウイルス感染、特にウイルス感染（特に、ＨＩＶ感染）ならびにこれらの感染に関連する疾患の予防的処置および治療的処置における、このベクターの使用のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因としてのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であるレンチウイルスの発見は、多数の研究を、ウイルス感染サイクルおよびウイルス病理学の根底の機構に助成した。これらの機構に対する研究は、研究者に、ＨＩＶだけでなく、ＨＩＶ産物、ＨＩＶゲノム、および他のウイルスに対しても有効である抗ウイルス剤の開発のための増加の一途をたどる標的をもたらした。これらの抗ウイルス剤（特に、ＨＩＶに対して指向される抗ウイルス剤）は、作用の様式に依存して、グループに分類分けされ得る。このようなグループとしては、逆転写酵素のインヒビター、細胞へのウイルスの侵入の競合物、ワクチン、およびプロテアーゼインヒビターが挙げられ、ならびに、より本明細書中で「遺伝的抗ウイルス剤」といわれる新しい群が挙げられる。
【０００３】
一般に、抗ウイルス剤の各型は、独自に関連する利点および制限を有しており、そして、特定の処置状況の要件の観点で評価されなければならない。抗ウイルス剤（例えば、ジドブジン（３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴとしても知られる））、プロテアーゼインヒビターなど）は、比較的容易に患者の体内の細胞に送達され得、そして、広範に研究されている。ウイルス感染サイクルにおけるある特定の因子の標的化において、このような薬剤は、ＨＩＶに対して比較的有効でないことが証明されている。これは、主に、ＨＩＶの株が迅速に変化し、そして、唯一の遺伝子座に対する効果（ｓｉｎｇｌｅ  ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔ）を有する薬剤に耐性となるという事実に起因する（Ｒｉｃｈｍａｎ，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．およびＨｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．，８，１０６５−１０７１（１９９２））。従って、ＨＩＶゲノムの遺伝的バリエーションおよび迅速な変異の問題は、ＨＩＶ感染を処置するために新規な抗ウイルスストラテジーの熟慮を強いる。これらの情報に従って、遺伝的抗ウイルス剤は、これらが、多くの異なるレベルで細胞内で作用するので、魅力的である。
【０００４】
遺伝的抗ウイルス剤は、これらが、分子エレメントとして標的細胞に移動されるという点で、他の治療剤とは異なり、ここで、これらの薬剤は、ウイルス感染から細胞を保護する（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ，３２５，３９５−３９６（１９９８）；およびＤｒｏｐｕｌｉｃ’ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５，９２７−９３９（１９９４））。遺伝的抗ウイルス剤は、任意の遺伝子配列であり得、そして、アンチセンス分子、ＲＮＡデコイ、トランスドミナント変異体、インターフェロン、毒素、免疫原およびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。特に、リボザイムは、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡ（ＨＩＶ  ＲＮＡを含む）を切断するアンチセンス様遺伝的抗ウイルス剤である。標的ＲＮＡのリボザイム媒介切断の特異性は、ウイルス複製（ＨＩＶ複製を含む）の治療的インヒビターとしてのリボザイムの潜在的用途を示唆する。異なる型のリボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイム）は、抗ＨＩＶストラテジーにおいて使用されている（例えば、米国特許第５，１４４，０１９号、同第５，１８０，８１８号および同第５，２７２，２６２号、ならびにＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９４／０１５４９およびＷＯ９３／２３５６９を参照のこと）。ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムの両方は、ＧＵＣ配列を含む任意の標的ＲＮＡを切断するように操作され得る（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５−５９１（１９８８）；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５（１９８７）；Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８，２９９−３０４（１９９０）；およびＳｙｍｏｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１，６４１−６７１（１９９２））。一般に言うと、ハンマーヘッドリボザイムは、２つの型の機能的ドメインである、２つのハイブリダイゼーションドメインによって隣接される保存的触媒ドメインを有する。このハイブリダイゼーションドメインは、ＧＵＣ配列の周辺の配列に結合し、そして、触媒ドメインは、ＲＮＡ標的をのＧＵＣ配列に対して３’で切断する（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７）前述；Ｈａｓｅｌｏｆｆら、（１９８８）前述；およびＳｙｍｏｎｓ（１９９２）前述）。
【０００５】
多数の研究は、リボザイムが、組織培養細胞におけるＨＩＶの増殖を阻害する際に、少なくとも部分的に有効であり得るということを確認した（例えば、Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５（１９９０）；Ｓａｒｖｅｒら、ＮＩＨ  Ｒｅｓ．，５，６３−６７（１９９３ａ）；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ’ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−１４４１（１９９２）；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ’ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，５，４３−４９（１９９３）；Ｏｊｗａｎｇら、ＰＮＡＳ，８９，１０８０２−１０８０６（１９９２）；Ｙｕら、ＰＮＡＳ，９０，６３４０−６３４４（１９９３）；およびＷｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−５５３４（１９９１）を参照のこと）。特に、Ｓａｒｖｅｒら（（１９９０）前述）は、ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子の転写された領域内で切断するように設計されたハンマーヘッドリボザイム（すなわち、抗ｇａｇリボザイム）が、インビトロで、特異的にＨＩＶ  ｇａｇ  ＲＮＡを切断し得るということを実証した。さらに、抗ｇａｇリボザイムを発現する細胞株がＨＩＶ−１で惹起された場合、５０倍〜１００倍のＨＩＶ複製阻害が観察された。同様に、Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、（（１９９１）前述）は、ＨＩＶ−１  ＲＮＡのＵ５配列内で切断するように設計されたリボザイムをコードするレトロウイルスベクターが、その後のＨＩＶでの惹起の際に、形質導入された細胞にＨＩＶ耐性を付与することを示した。形質導入された細胞の異なるクローンが、リボザイム発現を誘導するために使用されたプロモーター系によって決定された時に、異なるレベルの惹起耐性を実証したが、リボザイム発現細胞株の大半は、一定時間の培養後、ＨＩＶ発現に屈した。
【０００６】
（この遺伝子は、ＨＩＶのＵ５領域に特異的であるそのハイブリダイゼーションドメインなリボザイムに導入された）ｎｅｆ遺伝子（組織培養中のウイルス複製に不可欠でない）へのプロウイルスでの組織培養細胞の形質導入は、野生型プロウイルスで形質導入された細胞と比較して、形質導入された細胞内で１００倍のウイルス複製を阻害することがを示された（例えば、Ｄｒｏｐｈｕｌｉｃ’ら、（１９９２）および（１９９３）前述、を参照のこと）。同様に、ヘアピンリボザイムは、Ｕ５ヘアピンリボザイムを含むベクターで形質導入されかつＨＩＶで惹起されたＴ細胞においてＨＩＶ複製を阻害することが示された（Ｏｊｗａｎｇら、（１９９２）前述）。他の研究は、ｔＲＮＡプロモーターから発現されるリボザイムを含むベクターもまた、種々のＨＩＶ株を阻害することを示した（Ｙｕら、（１９９３）前述）。
【０００７】
リボザイムまたは他の遺伝的抗ウイルス剤の、ＨＩＶ感染の細胞標的（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞および単球マクロファージ）への送達は、ＡＩＤＳの有効な遺伝的治療処置についての主要な障害であった。造血系の細胞（すなわち、ＨＩＶ感染の主要な標的）を標的化するための現在のアプローチは、前駆体多能性幹細胞（これは、分化の際に、成熟Ｔ細胞を生じる）へか、または、成熟ＣＤ４＋Ｔ白血球自身への治療遺伝子の導入を必要とする。しかし、幹細胞は、インビトロで培養および形質導入することが困難なので、問題がある。循環Ｔ白血球は、とても広く流布しており、現在のベクター送達系を使用して全ての標的細胞に到達することが困難であるので、循環Ｔ白血球の標的化はまた、問題がある。さらに、マクロファージは、他の器官へのウイルス伝播のための主要なリザーバーであるので、細胞標的として見なされる必要がある。しかし、マクロファージは、末期分化され、従って、細胞分裂を受けないので、マクロファージは、通常に使用されるベクターでは容易に形質導入されない。
【０００８】
従って、ＨＩＶ処置に対して優勢な現在のアプローチは、特異的にウイルス複製を干渉するか、または、感染細胞の死を引き起こす外来遺伝子を、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）しやすい細胞に導入するために、複製不全ウイルスベクターおよびパッケージング（すなわち、ヘルパー）細胞株（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ，ＪＡＭＡ，２６９（２２），２８８０−２８８６（１９９３）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６，８０８−８１３（１９９２）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａａｔｕｒｅ，３５７，４５５−４６０（１９９２）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，９２６−９３１（１９９３）；Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２７５−１２８１（１９８９）；およびＣｏｕｒｎｏｙｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１，２９７−３２９（１９９３）を参照のこと）を利用する（Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ（１９９３）前述、により総説される）。このような複製不全ウイルスベクターは、目的の外来遺伝子に加えて、必須ウイルスタンパク質をコードする配列ではなく、ウイルス複製に必要なｃｉｓ作用性配列を含む。結果として、このようなベクターは、ウイルス複製サイクルを完了し得ず、そして、ヘルパー細胞株（そのゲノム内にウイルス遺伝子を含み、構成的にこの遺伝子を発現する）は、そのベクターを増殖さるために使用される。複製不全ウイルスベクターのヘルパー細胞株への導入に続いて、ウイルス粒子形成に必要なタンパク質は、ベクターにトランスで提供され、そして、標的細胞を感染し得、そして、その中で遺伝子（これは、ウイルス複製を干渉するか、またはウイルスに感染された細胞を死に至らす）を発現し得るベクターウイルス粒子が、生成される。
【０００９】
このような複製不全レトロウイルスベクターとしては、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、ならびに、ＨＩＶ遺伝子治療の臨床試験で使用されるこれらのレトロウイルスベクター、特に、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）として公知のマウス両種性レトロウイルスベクターが挙げられる。これらの不全ウイルスベクターは、遺伝的抗ウイルス剤（例えば、抗ＨＩＶリボザイム）でＣＤ４＋細胞を形質導入するために、種々の程度の成功を伴って使用されている（Ｓａｒｖｅｒら、（１９９０）前述；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら、（１９９１）前述；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ’ら、（１９９３）前述；Ｏｊｗａｎｇら、（１９９２）前述；およびＹｕら、（１９９３）前述）。しかし、これらのベクターは、ＨＩＶ遺伝子治療適用について本質的に制限される。例えば、高い形質導入頻度は、ＨＩＶの処置において特に重要であり、ここで、このベクターは、珍しいＣＤ３４＋創始造血幹細胞か、または、広範に流布された標的ＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかを形質導入しなければならず、これらのほとんどは、疾患の臨床的な「潜伏」期間の間に、既にＨＩＶで感染されている。しかし、ＭｕＬＶベクターは、高力価で取得することが困難であり、従って、低い形質導入を生じる。さらに、形質導入されたＤＮＡの長期発現は、特に、成熟Ｔ白血球への分化後に、ＣＤ３４＋創始幹細胞において得られていない。さらに、不全ウイルスベクターの使用は、エキソビボでの遺伝子導入ストラテジーを必要とし（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）、これは、高価であり得、そして、一般市民の費用を超え得る。
【００１０】
ＡＩＤＳの遺伝子治療処置について現在利用可能なベクターの使用に関連するこれらの欠点は、研究者に新規なウイルスベクターを探求させた。１つのこのようなベクターは、ＨＩＶ自身である。ＨＩＶベクターは、感染研究（Ｐａｇｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４，５２７０−５２７６（１９９０））、および、のＣＤ４＋細胞（特に、ＣＤ４＋  ＨＩＶ感染細胞）への遺伝子（例えば、自殺ベクター）導入のために、使用されている（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｒ．Ｔｈｅｒ．，３，３９１−３９７（１９９２）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，３９９７−４００５（１９９３）；Ｃａｒｒｏｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６８，６０４７−６０５１（１９９４）；およびＰａｒｏｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，３８８８−３８９５（１９９４）を参照のこと）。これらの研究のストラテジーは、遺伝子をＣＤ４＋Ｔ細胞および単球細胞に導入するためにＨＩＶベクターを使用することである。
【００１１】
しかし、現在のところ、これらのベクターは、非常に複雑である。さらに、これらのベクターの使用は、細胞内組換えを介した野生型ＨＩＶの生成の危険性が伴う。不全ベクター配列およびヘルパーウイルスの同時トランスフェクション／同時感染は、ウイルスゲノムの相同領域間で組換えを生じることが観察されている（Ｉｎｏｕｅら、ＰＮＡＳ，８８，２２７８−２８２（１９９１））。インビトロでの観察された補完は、類似の複製不全ＨＩＶベクターがインビボで組換えられ得、従って、既に存在するＨＩＶ感染を悪化させ得ることを示す。レトロウイルスが、２つのＲＮＡゲノムを、１つのビリオンにパッケージングするという事実は、研究者に、補完および／または組換えによって起こされた任意の遺伝的欠損を回避するために、レトロウイルスが２つのウイルスＲＮＡを有するということを示唆させる（Ｉｎｏｕｅら、（１９９１）前述）。
【００１２】
細胞内組換え（これによって野生型ＨＩＶを生じる）の危険性に加えて、ＨＩＶベクターは、インビボでの変異の関連した危険性を有し、これは、ウイルスベクターの病原性を増加させる。これは、Ｓａｒｖｅｒら（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．９，４８３−４８７（１９９３ｂ））を、複製可能であるが、なお非病原性である第２世代の組換えＨＩＶベクターの開発に関する推測に導いた。このようなベクターは、優先的に使用される非複製ベクター（すなわち、複製不全ベクター）と比較して、患者内で複製を続け、従って、野生型ＨＩＶとの不変の競合を提供する。しかし、これまでのところ、このようなベクターは利用可能でない。
【００１３】
理想的に、感染した個体を処置する最良の機会は、ウイルスが宿主にちょうど感染する前の予防接種のときに生じる。しかし、これは、多くの個体が、疾患の臨床的な潜伏期までＨＩＶに感染されていることに気付かないので、達成することが難しい。これに基づいて、抗ウイルス介入が最も必要とされる段階は、臨床的な潜伏期の間である。この段階での治療は、既に感染された多数のＣＤ４＋白血球（これは、ウイルスゲノムを保有する）によって提示されるチャレンジが直面することを必要とする。これまでに、ＨＩＶが治療可能でなく、そして、現在利用可能な治療によって処置可能性が乏しいだけであるという事実によって証明されるように、普通のチャレンジではない。有効なワクチンは用意されておらず、そして、逆転写酵素のインヒビターおよびプロテアーゼのインヒビターが組織培養物におけるＨＩＶ複製を予防することが示されているが、インビボでのウイルス耐性の開発は、処置の失敗を導いている。従って、ＨＩＶ遺伝子治療は、ＨＩＶ感染個体（これまでに３０００万人を超える）の大多数にとってほとんど有用でなかったかもしれない。
【００１４】
上記に関して、特定の病原体、特にウイルス（特に、例えば、ＡＩＤＳおよび癌に関連する）に対する長期間かつ持続的な免疫学的応答を開発することがまた、次第に重要になってきている。複製能力があるが非病原性であるウイルスを使用する弱毒化生ワクチン（ＬＡワクチン）が考慮されている（Ｄａｎｉｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，１９３８−１９４１（１９９２）；およびＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．，１０，３３１−３３２（１９９４））。しかし、このような非病原性ウイルス（１つ以上の遺伝子における欠損により、対応する野生型ウイルスとは異なる）は、（ｉ）抗原が持続しない（ＬＡウイルスは、効率的に複製しない）ので、防御免疫応答を誘発し得ないか；または（ｉｉ）若齢動物モデルで疾患を引き起こすＬＡウイルスの能力によって証明されるように、ＬＡウイルスは、複製するが、他の病原潜在性を有する（Ｂａｂａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７，１８２３−１８２５（１９９５））のいずれかである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の理由のために、特にＡＩＤＳおよび癌に関するウイルス感染の代替の予防的処置様態および治療処置様態の必要性が以前として存在する。本発明は、条件付複製ベクターを提供することによって、このような代替の方法を提供する。本発明はまた、このようなベクターが使用され得るさらなる方法を提供する。さらに、本発明によって、ウイルス粒子およびビリオンとして複製およびパッケージングを可能にするための条件付複製ベクターを補完するヘルパーベクター構築物が提供される。このようなヘルパーベクターは、条件付複製ベクターを用いた組換えが最小化されるように改変される。このようなヘルパーベクター構築物の様々な実施形態が、記載される。本発明のこれらの目的および利点および他の目的および利点、そしてさらなる本発明の特徴は、本明細書中に記載される本発明の記載から明らかである。
【００１６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、改良された条件付複製ベクター、ならびに、このベクターの生成および使用のための改良された組成物および方法を提供する。条件付複製ベクターは、このベクターの複製を許容する宿主細胞においてのみ複製する能力によって、特徴付けられる。本発明によって提供された改良されたベクターは、回復する複製能力の危険性が軽減されることによる、増強された安全性を有する。このように、このベクターはまた、「軽減された組換え」ベクターといわれ得る。
【００１７】
本発明の１つの局面において、改良された条件付複製ベクターは、少なくとも１つの核酸配列を含み、この配列の存在、転写または翻訳が、このベクターが由来するウイルスに対応するウイルスの野生型株を超えた選択的利点を、複製許容的な宿主細胞中でそのベクターに与える。好ましくは、改良された条件付複製ベクターは、任意の他の競合するゲノムまたはゲノムエレメントを超える複製の選択的利点を、このベクターに与える、少なくとも１つの核酸配列を含む。本明細書中で使用される場合、ゲノムエレメントは、ベクターまたは任意の野生型ウイルスのいずれかに由来せず、そして、宿主細胞において、ベクター複製を競合、干渉または影響し得る、宿主細胞中の核酸配列と定義される。ゲノムエレメントはまた、ゲノム全体ではなく、例えば、宿主細胞のゲノム、または別のベクターのゲノムもしくはウイルスのゲノムである。複製のための選択的利点は、この核酸配列の存在、転写または翻訳によって与えられる。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、条件付複製ベクターは、レトロウイルス、特にレンチウイルスであり、そして、少なくとも１つの核酸配列を含み、この配列の存在、転写または翻訳が、このベクターで感染される宿主細胞に、このベクターが由来するウイルスに対応するウイルスの野生型株で感染された細胞を超える、選択的利点を与える。あるいは、このベクターは、完全に野生型株由来でないがキメラであり、１つより多い野生型ウイルス由来の成分を含む。１つより多い野生型のウイルスは、異なる（または、異種）ウイルス、または、１つのウイルスの異なる株もしくは単離物であり得る。好ましくは、この核酸配列は、この細胞において予防効果を提供するために発現され得る。これは、核酸配列が、細胞死をもたらすレベルまでの複製から感染するウイルスを防ぐので、生存利点を与えられた細胞を生じる。
【００１９】
別の好ましい実施形態は、改良された条件付複製プラスミドベクターであり、このベクターは、任意の他の競合ベクターまたはプラスミド分子を超える複製のための選択的利点を、このベクターに与える少なくとも１つの核酸配列を含む。例えば、このようなベクターは、競合ベクターまたはプラスミドがこのベクターと同時局在する場合、この競合ベクターまたはプラスミドを切断もしくは破壊し得るか、または、この競合ベクターまたはプラスミドの切断または破壊を生じ得る配列（例えば、リボザイムまたはアンチセンス配列）を含み得、その結果、これらの切断を生じ得る。競合ベクターおよびヘルパーが破壊される場合、次いで、本発明のベクターは、複製のための全ての選択的利点をこのベクターに提供するための他の配列を含むように操作される。例えば、本発明のベクターは、競合ベクターおよびヘルパーの両方を破壊するアンチセンス配列を含み得るが、このベクターは、条件付複製ベクターに選択的利点の全てを提供する、２番目の第１のヌクレオチド配列（例えば、競合ベクターＲＮＡよりもベクターＲＮＡをより生成するプロモーターで、形質導入細胞中のベクターのコピー数は、競合ゲノム、またはヘルパー中ではなくそのベクター中に存在するパッケージングシグナルよりも高い）をさらに含むので、このベクターは、複製のための選択的利点を有する。従って、少なくとも第１のヌクレオチド配列はさらに、２つの第１のヌクレオチド配列（すなわち、１番目の第１のヌクレオチド配列は競合ベクターおよび／またはヘルパーを標的化し、そして、２番目の第１のヌクレオチド配列は、複製のための選択的利点を提供する）が、選択的利点効果の全てを達成するように働くので、この実施形態において、本発明のベクターの全体的に選択的利点複製の全てを提供する。従って、複数の第１のヌクレオチド配列の相乗効果は、条件付複製ベクターについての顕著な選択条件を導き得、ここで、任意の個々の第１のヌクレオチド配列は、競合ゲノムを超える差別的選択を提供する。
【００２０】
競合ベクターまたはプラスミドの切断または破壊はまた、このベクターとの全長組換えの機会を減少させ、従って「減少した組換え」特性を有する。このベクターは、その配列を変性することによって切断から保護されて、リボザイムまたはアンチセンス配列によって標的化され得ない。このベクターは、さらに、ベクター、またはそのベクターのゲノムバージョンを操作することによって切断から保護されて、ＲＮＡを差示的に輸送（ｔｒａｃｋ）し得、その結果、ゲノムベクターＲＮＡが、競合ベクターまたはヘルパーによって有意に切断されない。あるいは、ヘルパーは、例えば、スプライシングエレメントを挿入することによって同様かつ単独で操作されて、このヘルパーを強制的にスプライセオソームにさせ得、一方、ベクターゲノムＲＮＡを操作することによって、スプライシングされていないベクターＲＮＡにのみ存在するが、スプライシングされたベクターＲＮＡには存在しない、第一の核酸配列を含み得る。このような改良されたベクターの非限定的な例は、ウイルス性ベクターまたはプラスミドベクターの産生およびこのようなベクターへの核酸配列のクローニングまたはサブクローニング、ならびに変異誘発、誘導性遺伝子発現などにおけるそれらの使用の間に使用される場合、特に有利である。
【００２１】
本発明の条件付複製ベクターおよび薬学的に受容可能なキャリヤを含む薬学的組成物もまた、本発明によって提供される。条件付きで複製するウイルス性ベクターを含む宿主細胞も、さらに提供される。ベクターはまた、本明細書中に記載されるように単離されたおよび精製された核酸分子として提供され、ここで、このベクターがＤＮＡである場合、配列番号２、３、４、５、６、１４（少なくとも１つのＮが変異した）、１５および１６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、そしてここで、このベクターがＲＮＡである場合、配列番号２、３、４、５、６、１４（少なくとも１つのＮが変異した）、１５および１６からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるヌクレオチド配列を含む。リボザイムを用いてベクターを生じる方法、ベクターを改変する方法、ならびにパッケージ化（ｐａｃｋａｇｅ）細胞株を用いずに、条件付複製ベクターを、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｅ）する方法および選択的にパッケージ化する方法が、同様に提供される。
【００２２】
本発明のなお別の局面において、宿主細胞をウイルス感染について治療および予防的に処置する方法が、提供される。特に好ましい実施形態において、このような処置は、ウイルス感染を阻害する優性表現型を付与することによってか、または他のウイルスによる感染を阻害する表現型を付与することによって、この宿主において達成される。好ましくは、阻害される他のウイルスは、広範なウイルス系統を含む。このような方法は、必要に応じて、ヘルパー−発現ベクター（「ヘルパーベクター」または「ヘルパーベクター構築物」としても言及される）、細胞傷害性薬物、タンパク質／因子（ｆａｃｔｏｒ）、またはプロテアーゼ／逆転写酵素インヒビターの使用をさらに含み得る。この方法は、例えば、ウイルスの複製を阻害するため、疾患（癌、遺伝性疾患、感染性疾患、血管性疾患および他の疾患を含む）を処置するため、効率的なエキソビボ遺伝子移入およびインビボ遺伝子移入を実施するため、安全なベクター産性を可能にするため、遺伝子の機能を決定するため、または宿主細胞において目的の遺伝子を発現させるために使用され得る。
【００２３】
本発明のなお別の局面において、本発明の条件付複製ベクターを含む宿主細胞を使用して、薬物／因子およびタンパク質との間の相互作用を検出する方法が提供される。このような方法は、ベクターによってコードされる所定のタンパク質に関する活性または物理的相互作用について、タンパク質の特徴付け、および薬物、因子、または他のタンパク質のスクリーニングを可能にする。この方法は、さらに、ベクターによってコードされる所定のタンパク質に機能的に関連するタンパク質の同定および特徴付けを可能にする。例えば、コードされたタンパク質が、転写因子である場合、本発明のベクターによるその発現は、その転写因子によって調節される遺伝子の同定を可能にする。
【００２４】
本発明はまた、ベクターの使用前に、種々の条件下でベクターの貯蔵のための組成物および条件を提供する。このような条件の例としては、種々のキャリヤの存在下、−８０℃、−２０℃、および４℃での貯蔵が挙げられる。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、複製コンピテントなベクターまたはウイルス（ＲＣＶ）を産生するための、一般的なレンチウイルス性ベクターである、条件付複製ベクターとのヘルパー−ベクターの組換えを減少、最小化、または排除するのに役立つ、ヘルパー−ベクター構築物の改変を含む。従って、本発明は、「減少した組換え」ベクターを調製するために役立つヘルパー−ベクターを含む。本発明のヘルパーベクターはまた、好ましくは、産生される条件付複製ベクターの力価を、１ｍｌあたり１０７形質導入単位より大きなレベルまで増加させる。他の実施形態は、濃縮および精製のための、高速（超ではない）遠心分離法およびクロマトグラフ法、限外濾過法およびダイアフィルトレーション法を用いて、ベクターを濃縮することを含む。
【００２６】
本発明のヘルパーベクター改変体は、リボザイム（例えば、アンチＵ５リボザイム）、またはアンチセンス配列の挿入を含み、条件付複製ベクターを切断するか、または破壊もしくは不活性化をもたらし、結果的に、ヘルパー−ベクターおよび条件付複製ベクターが、同時局在または同時にパッケージ化（ｃｏ−ｐａｃｋａｇｅ）される。１つの実施形態において、ヘルパー成分は、１つのプラスミド構築物上に完全に組込まれて、２つのプラスミドの機能性ベクター−ヘルパー系を生成し、この系は、力価が１ｍｌあたり１０７形質導入単位より大きい未濃縮のベクター上清を効率的に産生する（本明細書中における図３を参照のこと）。別の実施形態において、このヘルパー−ベクターのヌクレオチド配列は、変性されて、条件付複製ベクターとの組換えを最小化する。なお別の実施形態において、このヘルパー−ベクターは、条件付複製ベクターのパッケージ化において使用するための異種のトランス作動性エレメントを含む。このようなエレメントの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水疱性口内炎（ｓｔｏｍａｔｉｓ）ウイルスエンベロープタンパク質ＶＳＶ−Ｇ、ＲＤ１１４エンベロープタンパク質、狂犬病ウイルスエンベロープタンパク質、テナガザル類人猿白血病ウイルスエンベロープタンパク質（ＧＡＬＶ）およびキメラエンベロープタンパク質。さらなる改変体としてはまた、異種ｒｅｖ−応答性エレメント（ＲＲＥ）、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）または構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）が挙げられる。
【００２７】
なお別の実施形態において、ヘルパー−ベクター構築物は、さらに、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、または変性もしくはヒト化したヌクレオチド配列についての部位を含む。例えば、スプライス部位は、パッケージ化シグナルおよび／またはＲＲＥが、スプライシング事象によって転写されたＲＮＡから除去され得るように位置され得る。さらに、ベクター構築物またはヘルパー構築物へのイントロン挿入のための部位は、条件付複製ベクターとヘルパー（または他の競合ゲノムもしくはゲノムエレメント）との間の二量化、同時局在、または組換えが最小化されるように提供される。イントロンの挿入は、ベクターＲＮＡから離れてスプライセオソームへのヘルパーＲＮＡの輸送をもたらすように方向付けられ得る。驚くべきことに、いくつかのヘルパーベクター構築物は、条件付複製ベクターの力価を増加することが見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、改良された条件付複製ベクター、レンチウイルスベクター、およびそれらの使用を提供する。選択的に複製されることに加えて、これらベクターは、複製コンピテントになるベクターを生じる組換えの可能性を低減するための特異的改変を含む。ウイルスの野生型株の複製を阻害する方法、およびこのような改良されたベクターを含む細胞中への遺伝子送達のための方法が含まれる。この方法は、このようなウイルスの野生型株で感染されるリスクにあるか、または好適には実際に感染された、感染され得る宿主を、ベクターの複製を許容する宿主中でのみ増殖する改良されたベクター（すなわち、非病原性、または疾患非発生性条件付複製（ｃｒ）ベクター）と接触することを包含する。
【００２９】
本明細書にさらに記載されるものとして、この方法の特定の目的は、このような、非病原性、条件付複製ベクターで、宿主中に競争的感染を確立することである。一般に、本発明による条件付複製ベクターは、複製のために選択的利点を与え、そして野生型ウイルスと比較したとき、条件付複製ベクターに伝播する少なくとも１つの核酸配列、および／または野生型ウイルスを含む宿主細胞と比較したとき、条件付複製ベクターを含む宿主細胞に、ウイルス粒子の増殖のために選択的利点を与える少なくとも１つの核酸配列を含む。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態では、ベクターはＨＩＶ配列を含み、そしてＨＩＶ感染の処置のために採用される。従って、ベクター、またはこのベクターを含む宿主細胞は、（１）子孫ビリオン中に、すなわち、これら両方が存在する細胞中にパッケージするために、野生型ＨＩＶゲノムを超える選択的利点をもつｃｒＨＩＶゲノムを提供し、および／または（２）野生型ウイルスを生成する宿主細胞と比較したとき、ｃｒＨＩＶビリオンの生成のために選択的利点をもつ条件付複製ベクター（ウイルス）を生成する宿主細胞を提供する、少なくとも１つの核酸配列を含む。１つの方法（本発明はこれに限定されない）は、野生型ＨＩＶゲノムを切断し得る１つ以上のリボザイムをｃｒＨＩＶゲノムに提供することにより、パッケージングのために選択的利点をもつｃｒＨＩＶゲノムを与えることである。
【００３１】
本発明の別の局面では、ベクターは、複製コンピテントベクターを生じる野生型およびヘルパー構築物との組換えの低減された可能性を付与される。さらに、これもまた組換えの低減に寄与するヘルパーベクター、細胞、およびパッケージングシステムが提供され、生産的組換え事象の機会をさらに低減し、ベクターをもはや条件的に複製しないようにする。
【００３２】
（野生型ウイルス）
本発明によれば、「ウイルス」は、タンパク質と核酸とからなり、そしてウイルス核酸により特定されるウイルス産物を生成する宿主細胞の遺伝子機構を用いる感染性因子である。「核酸」は、一本鎖または二本鎖、線状または環状であるＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーをいい、そして必要に応じて、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中に取り込まれ得る合成ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、または改変されたヌクレオチドを含む。好ましくは、ＤＮＡポリヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列からなる。
【００３３】
「ウイルスの野生型株」は、本明細書に記載のような、ヒトが作製した任意の変異を含まない株、すなわち、天然から単離され得る任意のウイルスである。あるいは、野生型株は、実験室で培養されたが、なお、任意のその他のウイルスが存在せず、天然から単離されたような子孫ゲノムまたビリオンを生成し得る任意のウイルスである。例えば、以下の実施例に記載されるｐＮＬ４−３  ＨＩＶ−１分子クローンは、アメリカ国立衛生研究所によりＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｃａｔａｌｏｇから入手可能である野生型株である（Ａｄａｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５９、２８４−２９１（１９８６）もまた参照のこと）。ｐＰＳＸＢは、アメリカ国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭａｒｙｌａｎｄのＳｕｒｅｓｈ  Ａｒｙａ博士から好意により得たＨＩＶ−２分子クローンであり、そしてＡｒｙａら、遺伝子移入：発現およびヘルパーウイルスフリーパッケージングのための可能性のためのヒト免疫不全ウイルス２型レンチウイルスベクター、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９８  Ｊｕｎ  １０、９（９）：１３７１−８０中に記載された。
【００３４】
一般に、本発明の方法は、好ましくは、ウイルス感染から生じるウイルス疾患を処置するために採用される。望ましくは、ウイルス（および以下に論議されるようにベクター）はＲＮＡウイルスであるが、ＤＮＡウイルスであり得る。ＲＮＡウイルスは、原核動物（例えば、バクテリオファージ）、ならびに哺乳動物、および特にヒトを含む多くの真核動物に感染する多様な群である。少なくとも１つのファミリーは遺伝子物質として二本鎖ＲＮＡを有するが、大部分のＲＮＡウイルスは、それらの遺伝子物質として一本鎖ＲＮＡを有する。これらＲＮＡウイルスは、３つの主要なグループに分割される：ポジティブ鎖ウイルス（すなわち、このウイルスにより移入されたゲノムがタンパク質に翻訳され、そしてその除タンパク質核酸は、感染を開始するに十分であるウイルス）、ネガティブ鎖ウイルス（すなわち、このウイルスにより移入されたゲノムは、メッセージセンス（ｍｅｓｓａｇｅ  ｓｅｎｓｅ）に相補的であり、そして翻訳が起こり得る前にビリオン随伴酵素により転写されなければならないウイルス）、および二本鎖ＲＮＡウイルスである。本発明の方法は、好ましくは、ポジティブ鎖ウイルス、ネガティブ鎖ウイルス、および二本鎖ＲＮＡウイルスを処理するために採用される。
【００３５】
本明細書で採用されるとき、ＲＮＡウイルスは、Ｓｉｎｄｂｉｓ様ウイルス（例えば、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ、Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ、Ｉｌａｒｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ、およびＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）、Ｐｉｃｏｒｎａウイルス様ウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ、Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ、およびＰｏｔｙｖｉｒｕｓ）、マイナス鎖ウイルス（例えば、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、およびＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、二本鎖ウイルス（例えば、ＲｅｏｖｉｒｉｄａｅおよびＢｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、Ｆｌａｖｉウイルス様ウイルス（例えば、ＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅおよびＰｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）、Ｒｅｔｒｏウイルス様ウイルス（例えば、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、および制限されないでＮｏｄａｖｉｒｉｄａｅを含むその他のウイルス群を包含する。
【００３６】
本発明による好ましいＲＮＡウイルスは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、好ましくはＦｉｌｏｖｉｒｕｓ属のウイルス、そして特にＭａｒｂｕｒｇまたはＥｂｏｌａウイルスである。好ましくは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスは、ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒウイルス、ｄｅｎｇｕｅウイルス、Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅウイルス、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス、Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス、Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス、Ｒｏｃｉｏウイルス、ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルスなどのようなＦｌａｖｉウイルス属のウイルスである。
【００３７】
また好ましいのは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、好ましくはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、または非Ａもしくは非Ｂ肝炎ウイルスである。
【００３８】
別の好ましいＲＮＡウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科（すなわちレトロウイルス）のウイルス、特に、Ｏｎｃｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ、Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ、およびＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓの属または亜科のウイルスである。Ｏｎｃｏｖｉｒｉｎａｅ亜科のＲＮＡウイルスは、望ましくは、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型または２型（すなわち、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−２）またはウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、トリ白血病−肉腫ウイルス（例えば、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、およびＲｏｕｓ随伴ウイルス（ＲＡＶ；ＲＡＶ−０〜ＲＡＶ−５０）、哺乳動物Ｃ型ウイルス（例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ））、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（ＨａＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）、ＡＫＲ−ＭｕＬＶ、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、サル肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、Ｂ型ウイルス（例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ））、およびＤ型ウイルス（例えば、Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス（ＭＰＭＶ）および「ＳＡＩＤＳ」ウイルス）である。Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ亜科のＲＮＡウイルスは、望ましくは、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型（すなわち、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２、ここで、ＨＩＶ−１は、以前には、リンパ節腫脹症随伴ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）および後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）、またはＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患で同定およびそれに関連するＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に関連する別のウイルスと呼ばれていた）である。頭字語「ＨＩＶ」または用語「ＡＩＤＳウイルス」または「ヒト免疫不全ウイルス」は、本明細書中でこれらのＨＩＶウイルス、およびＨＩＶ関連ウイルスおよびＨＩＶ随伴ウイルスを包括的に言及するために用いられる。さらに、Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ亜科のＲＮＡウイルスは、好ましくは、（例えば、ヒツジに感染するような）Ｖｉｓｎａ／ｍａｅｄｉウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血症ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）である。
【００３９】
本発明によるウイルスはまた、望ましくはＤＮＡウイルスである。好ましくは、このＤＮＡウイルスは、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、ワクチニアウイルスなどである。
【００４０】
これらウイルスの多くは、「Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｌｅｖｅｌ  ４」（すなわち、世界保健機構（ＷＨＯ）「Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐ  ４」）病原体として分類され、それに対しては、すべての実験室作業について最大の閉じ込め施設が要求される。しかし、当業者は、これらのウイルスについて必要な安全性予防策に親しみ、かつ固守し得る。
【００４１】
「宿主細胞」は任意の細胞であり得、そして好ましくは、真核生物細胞である。望ましくは、この宿主細胞は、リンパ球（Ｔリンパ球のような）またはマクロファージ（単球マクロファージのような）であるか、または、これら細胞のいずれかの前駆体（造血幹細胞のような）である。好ましくは、これら細胞は、細胞表面上にＣＤ４＋糖タンパク質を含み、すなわち、ＣＤ４＋である。しかし、望ましくは、ＡＩＤＳウイルスで感染されたＣＤ４＋Ｔリンパ球は、いまだ活性化されていない（すなわち、好ましくは、ｎｅｆの発現はまだ起こらず、そしてなおより好ましくは、ＣＤ４遺伝子発現は、さらに以下に論議されるように下方制御されていない）。さらに、好ましくは、宿主細胞は、ＣＤ４マーカーを欠いているがなお、本発明によるウイルスにより感染され得る細胞である。このような細胞は、制限されずに、星状細胞、皮膚線維芽細胞、腸上皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、単球、造血幹細胞、胎児幹細胞、精子または卵母細胞になる細胞、間質細胞、粘膜細胞などを含む。好ましくは、宿主細胞は、真核生物、（例えば、単細胞酵母細胞とは対照的に）多細胞種であり、そしてなおより好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞である。
【００４２】
細胞は、単一の実体として存在し得るか、または細胞のより大きなコレクションの一部分であり得る。このような「細胞のより大きなコレクション」は、例えば、細胞培養（混合または純粋のいずれか）、組織（例えば、内皮、上皮、粘膜または上記のＣＤ４欠如細胞を含む組織を含むその他の組織）、器官（例えば、心臓、肺、肝臓、筋肉、胆嚢、膀胱、生殖腺、眼およびその他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系、胃腸管系、泌尿器系、神経系、外皮系またはその他の器官系）、または生物（例えば、トリ、哺乳動物など）を含み得る。好ましくは、標的されるこの器官／組織／細胞は、循環器系（例えば、制限されずに、心臓、血管、および血液（白血球および赤血球を含む）を含む）、呼吸器系（例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺など）、胃腸管系（例えば、口、咽頭、食道、胃、小腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢、およびその他を含む）、泌尿器系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道など）、神経系（例えば、制限されずに、脳および脊髄、ならびに眼のような特別の感覚器官を含む）および外皮系（例えば、皮膚、表皮、および皮下組織または真皮組織の細胞）のものである。なおより好ましくは、標的される細胞は、心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、膀胱および眼の細胞からなる群から選択される。これら標的細胞は、正常細胞である必要はなく、そして疾患細胞であり得る。このような疾患細胞は、制限されずに、腫瘍細胞、感染細胞、遺伝子異常細胞、または腫瘍血管内皮細胞のような異常組織に近接または接触する細胞であり得る。
【００４３】
（ベクター）
「ベクター」は、宿主細胞中にパッセンジャー核酸配列配列（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を移入するために供される核酸分子（代表的には、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。３つの一般的な型のベクターは、プラスミド、ファージおよびウイルスを含む。好ましくは、ベクターは、ベクター核酸のキャプシドに包まれた形態、およびその中にベクター核酸がパッケージされたウイルス粒子を含むウイルスである。
【００４４】
望ましくは、このベクターは、ヒトが作製した変異または改変を含むので、ウイルスの野生型ではない。従って、代表的には、このベクターは、遺伝子操作により（すなわち、欠失により）野生型ウイルス株に由来し、本明細書でさらに記載されるように、条件付で複製するウイルスを含む。最適には、このウイルスベクターは、処置される感染を引き起こす野生型ウイルスと同じ型のウイルスの株を含み、これは、好ましくは、前記の野生型ウイルスの１つである。従って、好ましくは、このベクターはＲＮＡウイルス由来であり、なおより好ましくは、このベクターはレトロウイルス由来であり、そして最適には、このベクターは、ヒト免疫不全ウイルスに由来する。ヒト免疫不全ウイルス由来のこのようなベクターは、本明細書では、包括的に「ｃｒＨＩＶ」ベクターとよばれる。
【００４５】
好ましくは、ベクターはまた、例えば、ＨＩＶ配列の、１つ以上のその他のウイルス（これは、望ましくは、野生型ウイルス株由来であり、条件付複製ベクターを含む）との組合せのような、例えば、ウイルスベクターの、その他の配列との組合せである「キメラベクター」である。特に、望ましくは、ＨＩＶ配列は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、Ａｌｐｈａｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルス、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルス、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルス、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルス、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルス、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルス、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルス、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルス、またはＯｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ、Ｓｐｕｍａ−ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓおよびＬｅｎｔｉ−ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓを含む、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科からのウイルスの改変された（すなわち、非野生型）株の配列と連結され得る。これらのウイルス科から派生または随伴するウイルスゲノムまたはウイルス様ゲノムもまた含まれる。
【００４６】
ベクター配列（すなわち、タンパク質、フラグメントをコードするか、または非コード配列のいずれかの配列）が非レンチウイルスに由来するとき、好ましいキメラベクターは、レンチウイルスベクター中に挿入される。好ましくは、非ＨＩＶ配列は、ＨＩＶ由来ベクター中に挿入される。
【００４７】
本明細書に包含されるように、ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含み得る。例えば、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターのいずれかが、ウイルスを誘導するために用いられ得る。同様に、ｃＤＮＡコピーが、ウイルスＲＮＡゲノムから作製され得る。あるいは、ｃＤＮＡ（またはウイルスゲノムＤＮＡ）部分が、インビトロで転写されてＲＮＡを生成し得る。これらの技法は当業者に周知であり、そしてまた以下の実施例に記載される。
【００４８】
「条件付複製ウイルス」は、特定の条件下でのみ欠損している複製欠陥ウイルスである。特に、このウイルスは、許容宿主細胞においてその複製サイクルを終了し得、そして制限宿主細胞においてその複製サイクルを終了し得ない。「宿主細胞」は、ウイルスの野生型株または偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ベクターで感染し得るか、または実際に感染した細胞である。このような野生型ウイルス感染は、本発明による条件付複製ウイルスでの感染前後のいずれかで生じ得る。あるいは、「宿主細胞」は、ウイルス複製に必要な野生型ウイルスまたヘルパー遺伝子産物をコードするものである。従って、本発明による条件付複製ベクターは、ウイルスの野生型株（またはヘルパー）との相補に際してのみ、または野生型ウイルスが条件付複製ベクターゲノムを含む細胞に感染するとき複製するウイルスである（これは、好ましくは、処置される感染と同じ型のウイルスである）。
【００４９】
好ましい実施形態では、ベクターは、ＤＮＡの形態で導入される、ＲＮＡウイルス（例えば、条件付複製ＨＩＶウイルス）を含む。この好ましい実施形態は、病原性野生型ＨＩＶゲノムに対し選択的利点をもつ、非病原性ｃｒＨＩＶ−１ベクターゲノムを与える複製ＨＩＶ−１（ｃｒＨＩＶ）ベクター戦略を提供する。具体的には、野生型ＨＩＶおよびｃｒＨＩＶゲノムの両方を含む細胞において、ｃｒＨＩＶ  ＲＮＡは、ビリオン中へのパッケージングのために選択的利点を有している。なぜなら、それらは、例えば、野生型ＲＮＡを切断するが、ｃｒＨＩＶ  ＲＮＡを切断しないリボザイムを含むからである。このような非病原性ｃｒＨＩＶは、野生型ヘルパーウイルスの存在下でＨＩＶ感染（例えば、ＣＤ４＋細胞）を受けやすい非感染細胞に拡散し得る。このようにして、ｃｒＨＩＶの選択的パッケージングおよび拡散が野生型ＨＩＶ複製を妨害する。
【００５０】
さらに好ましい実施形態は、ベクターを病原性にする（制限されずに、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、ＶｐｒまたはＮｅｆ、あるいはその組合せまたはそのフラグメントのような）ウイルスアクセサリータンパク質配列の任意の組合せを含まないため非病原性である、非病原性ｃｒＨＩＶベクターである。あるいは、これら配列は存在し得るが、転写的にサイレントであっても、翻訳されなくてもよい。必要に応じて、ベクターは、ベクターを病原性にする（制限されないで、ＴａｔまたはＲｅｖ、あるいはそのフラグメントのような）調節タンパク質配列の任意の組合せを含まない。あるいは、これらの配列は存在し得るが、転写的にサイレントであっても、翻訳されなくてもよい。
【００５１】
しかし、これらベクターは、好ましくは、（ｇａｇ、またはそのフラグメントのような）構造タンパク質配列、（ｐｏｌ、またはそのフラグメントのような）酵素タンパク質配列、および／または（ｅｎｖ、またはそのフラグメントのような）エンベロープタンパク質配列の任意の組合せを、翻訳されるように活性またはサイレントのいずれかであり得る形態で含む。従って、この条件付複製ベクターは複製し得るが、所定の宿主中で病原性であるレベルまで複製できない。その代わりに、ベクターは、必要な治療、予防または生物学的効果を誘導するために十分なレベルまで複製するために、野生型ウイルス由来の必要な配列を含む（ヘルパーベクターのような）ヘルパー成分との相補を必要とする。最適な生物学的効果を提供するためのベクターおよびヘルパー中に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列の正確な組合せを決定することは、ベクターまたはヘルパー構築物中へのヌクレオチド配列の種々の組合せの付加またはサブトラクションを含む単純なスクリーニングプロセスの簡単な適用のみを含み、これらのプロセスは当業者にとって慣用的である。
【００５２】
さらに、上記のヌクレオチド配列は、生物学的効果を改変するため、または例えば、ヘルパー構築物との組換えの機会を低減するために改変または変異誘発され得る。より最適化された構築物を得るためのベクターおよびヘルパー構築物の改変または変異誘発のための多くのプロトコールは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈａｒｃｏｕｒｔ  ＢｒａｃｅおよびＪｏｖａｎｏｖｉｃｈ、２０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｓａｍｂｒｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；およびＳｏｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：４３６−４３９、２０００、両方ともそれらの全体が本明細書に援用される）。
【００５３】
上記のベクターで許容されるアプローチは、アクセサリータンパク質を欠く複製コンピテントウイルスを使用する生存弱毒化（ＬＡ）ワクチンの使用とは異なる（Ｄａｎｉｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８、１９３８−１９４１（１９９２）；およびＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．＆Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．、１０、３３１−３３２（１９９４）参照のこと）。なぜなら、ＬＡワクチンを用いては、例えば、有効な免疫応答の効率的な生産を妨げ、なお安全性を維持する欠陥のために相補する努力はなされていないからである。例えば、多重に欠失したＬＡ  ＳＩＶワクチンは、有効な免疫応答を惹起し得ず、その一方単一の欠失（Ｎｅｆネガティブ）ＬＡ  ＳＩＶワクチンは、幼マカクザルにおいて病原性であることが知られている（Ｂａｂａら，１９９５）。
【００５４】
上記に記載のような、本発明により提供されるＬＡ  ＨＩＶワクチンへの代替のアプローチは、少なくとも２つのベクターを用いることであり、ここで、少なくとも１つは、多重欠失ＨＩＶベクターであり、そして第２（ヘルパー）ベクターは、Ｎｅｆを除くすべてのアクセサリータンパク質を発現する。従って、多重に弱毒化したＨＩＶベクターは、制御された様式でヘルパーベクターからのＶｉｆ、ＶｐｒおよびＶｐｕで相補される一方で疾患を生じることなく、条件付の様式で複製し得る。第１のベクターは、野生型ＨＩＶの複製および拡散を妨害するように、遺伝的アンチウイルスを含むように構築され得る。あるいは、このような第１のベクターを用いて、野生型ウイルスに対する有効な免疫応答を惹起し得る。単純なスクリーニングプロセスが、第１のベクターから欠失されるがヘルパーベクターには存在する配列のどの実際の組合せ（単数または複数）が治療または予防応答を最適に提供し、そしてなお非病原性であることにより安全性を維持する第１のベクターを許容するという評価を可能にすることは当業者に平易である。
【００５５】
条件付複製ベクター−ヘルパー系のさらなる好ましい実施形態は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔおよびｒｅｖを発現するためにＨＩＶ−１ベクターを用い、その一方、例えば、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、および必要に応じてＮｅｆ遺伝子を発現するためにＨＩＶ−２由来ヘルパーベクターを用いることである。本発明は、この実施例に限定されない。なぜなら、逆ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２またはキメラＨＩＶフォーマットを含む、任意の適合するベクターの組合せで配置される上記の遺伝子の任意の組合せが等しく可能であるからである。ＨＩＶ−１骨格からのＴａｔの発現は、互いとの相補のためにＨＩＶ−１  ＬＴＲおよびＨＩＶ−２  ＬＴＲの両方をトランス活性化し、ＨＩＶ−１ベクターゲノムまたはＨＩＶ−２ベクターゲノムのいずれかを含むベクター粒子を生成する。しかし、この２つのゲノムＲＮＡは、効率的に二量体化せず、それ故、妨げなければ両方とも１つのビリオン粒子中にパッケージされる、ベクターおよびヘルパーゲノム両方の共存を妨げる。同じビリオン粒子中に同時にパッケージされるとき、ベクターゲノムとヘルパーゲノムとの間の組換えが、この粒子が次の標的細胞に感染した後の逆転写の間に起こり得る複製能力を有するベクター（ＲＣＶ）を産生する。
【００５６】
同時にパッケージされる構築物の可能な産生にさらに指向するため、これらベクターは、任意の組換えのリスクを低減する１つ以上の核酸配列をさらに含み得る。例えば、第１のベクターは、ヘルパーベクターの切断のために特異的なリボザイム（またはアンチセンス／リボザイム）配列を含み得る。このようなベクターの、同じ細胞、細胞内または細胞外位置における同時局在化は、ヘルパーベクターの切断を生じ、これらベクターの二量体化または同時局在化を破壊することにより安全性を増加し、組換え後不活性なゲノムを生じるか、またはそうでなければＲＣＶの産生が現れることを防ぐ。このアプローチは、かわりにヘルパーベクター上のリボザイムを含むことにより改変され得るか、または両方のベクター中にリボザイムを含めることによりさらに改善され、さらなる安全性を提供する。
【００５７】
あるいは、アンチセンス分子を用いて、上記のリボザイムを置換し得、その結果、二本鎖ＲＮＡハイブリッドの形成は、細胞内エンドヌクレアーゼにより迅速に分解される。さらなる好ましい実施形態は、アンチセンス配列が、標的化のために用いられるリボザイムＲＮＡの約１６塩基位置より長さが長いことである。
【００５８】
改変されたアプローチでは、上記の例のヘルパーベクターは、異種ウイルス（好ましくは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、マウスオンコレトロウイルス、または非ＨＩＶレンチウイルスに由来する上記の任意のウイルスおよびウイルス科のような）に由来し得、それによって、これらタンパク質が構成的に発現され得る。あるいは、異種ヘルパーベクターが、ＨＩＶ−１ベクター発現をトランス活性化するように、Ｔａｔの誘導可能な発現または自己調節発現のためのＨＩＶ−ＬＴＲを利用するために構築され得る。異種ウイルスヘルパーベクターにより提供される利点は、第１のベクターのゲノムと第２のベクターのゲノムとの間の制限的会合であり、それ故、可能なＲＣＶを生成する組換えの機会をさらに低減する。
【００５９】
別の実施形態では、ベクターは、ヘルパーゲノム上に存在するか、またはヘルパーゲノム中に挿入されるアンチセンス配列を含む。非制限的な例は、アンチセンス配列が、野生型ＨＩＶ上に存在するｅｎｖ配列に加えてか、またはその代わりに、ヘルパーベクター上に存在するｇａｇ配列に指向される以外は、ｐＮ１ｃｐｔＡＳｅｎｖベクターに類似である、ｐＮ１ｃｐｔＡＳｇａｇベクターで見られる。このアンチｇａｇアンチセンス配列は、ベクター中に存在するＲＲＥ配列の下流に存在するスプライスアクセプター部位の上流に配置される。従って、このｇａｇ配列は、サブゲノムではなくゲノム、またはベクターＲＮＡのスプライスされた種中にのみパッケージされる。従って、ＶＩＲＰＡＣ系のヘルパーゲノムのような、ヘルパーを含むイントロンのヘルパーゲノムは、細胞のスプライセオソームに優先的に標的化され、その一方、アンチｇａｇアンチセンス配列を含むゲノムベクターＲＮＡは、スプライス機構を優先的にバイパスする。
【００６０】
細胞中のベクターおよびヘルパーゲノムの差次的輸送は、ベクター力価に最小の影響を生じ、なおベクターおよびヘルパーゲノムが、うまく同時局在化し、次いで、ベクターとヘルパーゲノムの塩基対合ハイブリダイゼーションは、このようなベクターおよびヘルパーゲノム含有粒子の不活性化または破壊を生じ、そしてＲＣＶを生成するベクター−ヘルパー組換えを防ぐはずである。代替の実施形態では、ヘルパーは、条件付複製ベクター中に見出されるＵ５配列を指向するアンチＵ５ベクターアンチセンス配列を含むように遺伝子操作され得る。本発明のこの局面の性質を制限することなく、このアンチ−Ｕ５アンチセンス配列は、ヘルパーコード配列の遠位方向ではあるが、転写終結部位の前に挿入され得る。それ故、ベクターおよびヘルパーＲＮＡがうまく同時局在化し、そして同時パッケージングを受け、そして恐らくは組換えを受けるとき、次いで、アンチセンス配列は、このような同時パッケージされたウイルス粒子を破壊または不活性化し、そして組換えを防ぐ。
【００６１】
なお別の実施形態では、ヘルパーは、ベクター上に存在する第１のヌクレオチド配列のための標的配列を含み得る。非限定的な例は、ｐＮ１ｃｐｔＡＳｅｎｖベクターを含んだ２つのプラスミド対のヘルパー中にセンスｅｎｖフラグメントを配置することによる。従って、ベクターおよびヘルパーＲＮＡが同時局在化するとき、ヘルパー中のｅｎｖセンス配列は、ベクター中のｅｎｖアンチセンス配列と塩基対合を行い得、組換えを防ぐ。上記に提供された例は、本発明を、ほんの１つまたは２つの型の遺伝子アンチウイルス配列に限定する意味ではない。多くの遺伝子アンチウイルス配列、およびそれらの同族標的配列が、ベクターおよび／またはヘルパー構築物中に挿入され得ることは当業者に平易である。さらなる非制限的な例として、センスｇａｇおよびｅｎｖフラグメント配列を含んだｐＮ１ｃｐｔＡＳｇａｇＡＳｅｎｖベクターおよびヘルパーが、互いと組み合わせて用いられ得、ＲＣＶを生成する同時パッケージングおよび組換えの可能性を低減することによって安全性を増加する。
【００６２】
ベクターまたはヘルパー成分の発現のための別の好ましい実施形態では、これら成分は一時的に発現される。そのゲノムまたはゲノム成分を一時的に発現するベクターまたはヘルパーを作製する１つの手段は、例えば、インテグラーゼネガティブＰｏｌ遺伝子を用いてベクターまたはヘルパーベクターを構築することである。このようなレンチウイルスインテグラーゼ変異体は当該分野で公知であり、そして感染性でないことが報告されている（Ｈｉｒｓｃｈら、１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５７３−５７４）。従って、インテグラーゼネガティブ生産体細胞から産生されるベクターおよび／またはヘルパーゲノムは、組み込まないが、ベクターまたはヘルパー複製の量を調節するように一時的様式で発現され得る。ベクターまたはヘルパーのいずれかからの一時的発現のためのなお別の手段は、ベクターＬＴＲ中のＡＡＴ部位を破壊することである。これらの部位は、宿主細胞の染色体中への逆転写されたゲノムベクターＤＮＡの活性な組込みを担う。
【００６３】
上記のことを達成するさらなる手段は、融合タンパク質を利用して、機能性インテグラーゼ分子をウイルス粒子の中にパッケージングすることである。この実施形態において、条件付複製ベクター（例えばレンチベクター）も、ヘルパーベクターもインテグラーゼをコードしないが、機能性インテグラーゼ融合タンパク質は、別のプラスミド構築物（例えば、ヘルパーベクター）からの発現、または使用されるパッケージング細胞中に融合された１コピーからの発現によって、ヘルパー構築物の産生またはパッケージングの間に利用可能であり、このようにして感染に際して機能性インテグラーゼ活性を提供する。あるいは、このインテグラーゼタンパク質は、これをコードするヘルパー構築物からの発現を介して、イントランスで（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）提供される。本発明のこの実施例において、この条件付複製ベクターまたはレンチベクターは、インテグラーゼをコードしない。その融合タンパク質は、ｖｐｒアミノ酸配列とインテグラーゼアミノ酸配列との間の連結部にプロテアーゼ切断部位を含むｖｐｒ−インテグラーゼ融合タンパク質であり得るが、これに限定されない。
【００６４】
２つのベクター−ヘルパー系についての上記の記載は、本発明を２つのベクター構築物またはヘルパー構築物に限定するべきではない。ベクターの産生のための必要な成分を提供するために、２つ、３つもしくはそれ以上のベクターおよび／またはヘルパーの任意の組み合わせを、使用し得る。必要なゲノムエレメントを、より多くのベクター成分またはヘルパー成分へと分割することは、複数のベクターまたはヘルパーのゲノムが組換えを介してＲＣＶを生成することがより難しくなるので、安全性を増加させる効果を有する。安全性は、ベクターおよびヘルパーを、それらの間で相同性領域をほとんど含まないかまたは全く含まないように構築することにより、さらに増強され得、このことはさらに、好ましい実施形態である。２つのみのゲノムと比較して、２つより多くのゲノムが宿主細胞内で同時に存在することは可能性がより低いので、必要なゲノムエレメントを複数の成分に分割することもまたさらに、条件付複製ベクターの複製を制限し得る。必要とされる最適な数のベクターおよびヘルパーは、異なる組み合わせの簡単なスクリーニングによって容易に決定され得、そして使用される特定のウイルスベクター系に依存して変動し得る。
【００６５】
ベクターとヘルパーとの間の相同性領域を限定または除去する１つの簡単な手段は、単純にヌクレオチド配列を変性させるが、コードされるアミノ酸配列を維持することによってであるが、これに限定されない。配列を変性させる技術は、当該分野で公知であり、そして慣用的である。１つの好ましい方法は、治療的使用がヒトにおいてである場合、その配列をヒト化することである。コドンの利用は、霊長類について表にされており、そしてＷａｄａら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８巻追補：２３６７〜２４１１、１９９０）（これは本明細書によって記載されるままに援用される）において記載される。
【００６６】
変性をまた使用して、ヘルパーとパッケージされるベクターを標的化するよう設計される因子の効果から、ヘルパー構築物を保護し得る。このことは単純に、ヘルパー構築物上に見出される同属の標的配列を、存在する場合に、変性させることによって達成され得る。さらに、ベクター構築物およびヘルパー構築物の両方の変性は、他のウイルス配列との組換えを低減させるよう設計され得、細胞中でベクター配列またはヘルパー配列を用いて同時に見出され得る他の野生型配列のうちの配列を含む。例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に基づいたパッケージング系において、ベクターとヘルパーの対の使用は、そのベクターおよびヘルパー対が内在性のレトロエレメントについてもまた変性されるように、改変され得る。従って、ベクターまたはヘルパーのどちらかの核酸配列を変性することは、推定の組換え体の同時の配置を低減して、従ってベクターゲノムとヘルパーゲノムとの間、またはベクターゲノムもしくはヘルパーゲノムの間の複製コンピテントウイルス、ならびに内在性のレトロエレメントのような競合ゲノムを生成する危険性を低減する。
【００６７】
特に、ｃｒＨＩＶゲノムを、ウイルスに感染した細胞または非感染細胞の中に導入する。感染された細胞は、子孫ビリオンのキャプシド形成および産生に必要とされるタンパク質を有するｃｒＨＩＶゲノムを提供する。ｃｒＨＩＶゲノムは、好ましくは直接的に輸送（例えば、これは、例えばｃｒＨＩＶ  ＤＮＡのリポソーム媒介性輸送によってか、またはキメラのウイルスベクターのトランスフェクションによって成され得る）によるか、または野生型ＨＩＶ感染細胞からの結果であるｃｒＨＩＶ粒子の感染によってのいずれかで、非感染細胞中に導入される。本発明の改良されたｃｒＨＩＶベクターを含む非感染細胞は、宿主に病因性である量のｃｒＨＩＶ粒子を産生しない。ｗｔ−ＨＩＶで重感染されてないｃｒＨＩＶベクター細胞のいくつかの実施形態は、いくらかのｃｒＨＩＶ粒子を産生するが、宿主に対して病因性ではないレベルである。本発明の任意のベクターを含む細胞は、野生型ウイルスでの重感染に対して感受性のままで有り得、これは、ｃｒＨＩＶ粒子のさらなる産生に必要とされるタンパク質を提供する。この意味において、本発明に従って、相補的な野生型の重感染の存在下でベクターを条件付で複製することはまた、「ウイルスの送達ベクター」の１つの型として機能し、これによって、例えば、複数回のｃｒＨＩＶ感染（すなわち、野生型のＨＩＶでの同時感染の存在下において）が起こり得る。このようなベクターは、免疫応答のような生物学的な応答を導くレベルまでの、１回より多いウイルス複製、そしてこれによる他の細胞の感染のためのウイルス供給源、または複数回の複製のためのウイルス供給源を、提供する。本発明の改善は、他のベクター（例えば、標準的なパッケージング細胞株と共に使用されるベクター、そしてこれらは１回のみの複製または複数回の複製を提供し、これらは適切な生物学的応答を導くのに不十分であるか、または宿主に対して病原性である）と対照的である。
【００６８】
所望される場合（例えば、インビトロでのベクターの使用に役立つように）、野生型ウイルス遺伝子産物は、条件付複製ベクターで感染される細胞に共提供され得る。野生型ウイルス遺伝子産物は、野生型ウイルス株（またはｃＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスのプロウイルス）を用いる共感染によるだけでなく、発現ベクター中にサブクローニングされたそれら生成物の遺伝子の形状（例えば、「ヘルパー」または「ヘルパーベクター」）で、細胞にそれら生成物を供給することによってもまた供給され得、そのベクターは宿主細胞に対してその配列（調節配列、または構造配列）の転写または翻訳を伝え得るか、あるいはその遺伝子産物は外因性で（すなわち、細胞にタンパク質産物を添加することにより）供給され得る。
【００６９】
例えば、例えば、Ｔａｔコード配列を除いて野生型ＨＩＶ由来の全てのタンパク質を含むｃｒＨＩＶベクターを構築し得る。Ｔａｔを発現するヘルパー構築物を使用する代わりに、このＴａｔタンパク質自体をヘルパーとして使用し得る。ヘルパー構築物の代わりにタンパク質を使用することの利点は、組換えのための核酸配列が全く存在しないので、野生型ウイルスを生成する理論的可能性が全くないことである。従って、このｃｒＨＩＶを、Ｔａｔタンパク質を使用することによって増殖し得、そしてヘルパー核酸構築物自体によっては増殖し得ない。Ｔａｔ１またはＴａｔ２（Ｔａｔの第１エキソン、または第１および第２エキソンいそれぞれ対応する）は、ヘルパーとして使用され得る。このようなタンパク質の産生および精製は、当該分野で公知である。
【００７０】
１つの好ましい実施形態において、キメラＴａｔタンパク質が使用される。Ｔａｔを融合タンパク質に作製して（例えば、Ｔａｔ−ＶＰ１６）、そしてＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターのトランス活性化作用を保持することを示している。他のキメラＴａｔタンパク質は、所望される生物学的効果を増強させるために創作され得る。例えば、所望の生物学的効果が免疫応答を増強することである場合、Ｔａｔ−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質が構築され得る。このアプローチは、１つの型のキメラタンパク質に限定されずに、そして少なくとも第２のキメラ（または非キメラ）Ｔａｔタンパク質（例えば、Ｔａｔ−ＩＦＮ−α、Ｔａｔ−ＴＮＦ−α、Ｔａｔ−ＩＬ−４、Ｔａｔ−Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−αが挙げられるが、２、３の可能性が企図される）が加えられることが望ましくあり得る。他の等価なキメラタンパク質を構築および試験すること、および同時にベクターに対してヘルパー機能を提供する間に免疫応答を増強する能力について、それらをスクリーニングすることは、当業者に容易に明らかになる。別の好ましい実施形態は、Ｔａｔ−Ｒｅｖ融合タンパク質構築物、または天然のＨＩＶ  Ｔａｔ−Ｒｅｖ融合タンパク質（例えば、Ｔｒｅｖ）である。従って、キメラＴａｔタンパク質の上記の記載は、サイトカインタンパク質または細胞タンパク質のみの包含物に限定されるのではないが、ウイルスタンパク質（同系または異種のウイルス融合タンパク質を産生する）もまた、所望の生物学的効果に依存する本発明において使用され得る。
【００７１】
「ヘルパーベクター」に関して、その発現は細胞特異的であり得るか、または細胞特異的であり得ず、そしてこれは、本明細書において規定される、条件付で複製するウイルスベクターと合わせて宿主細胞中へと導入され得、これによって条件付で複製するウイルスベクターの継続的な複製を可能とし得る。
【００７２】
本発明の「ヘルパーベクター」は、単一のベクターまたは複数のベクターによって、複製のために必要な遺伝子構築物を供給し得る。このようなベクターは好ましくは、一過性のトランスフェクション系において使用される。あるいは、その遺伝子産物はまた、宿主細胞または宿主細胞株のゲノム中に融合され得る。本発明に従って、単一のベクターまたはプラスミド（これは、宿主細胞中でモノシストロン性、バイシストロン性またはマルチシストロン性であり得る）は、同一細胞内にコトランスフェクションするヘルパーベクターおよび条件付複製ベクターの増強された可能性から生じる増大されたウイルス力価に起因して、好ましくあり得る。同一細胞中に２つより多くの異なるベクターを同時にトランスフェクションすることの低減される可能性は、単一のヘルパーベクターの使用をより望ましくする。トランスフェクション系において関係する、ベクターまたはプラスミドの数を減少することはまた、レトロウイルス構築物をパッケージするための、従来の３つのプラスミドのトランスフェクション系と比較した場合、より少ないプラスミドが作製されなければならないので、コストに効率が高い。
【００７３】
本明細書において使用される場合、「補完」とは、細胞において異なる供給源由来のウイルス遺伝子産物の非遺伝子的な相互作用をいう。具体的には、混合感染を使用して、補完は片方または両方の親ゲノムからのウイルス産生の増強を含むが、親ゲノムの遺伝子型は変化されないままである。補完は、非対立遺伝子的（すなわち、遺伝子内的、ここで、異なる機能について欠損した変異体が、他のウイルスにおいて欠損している機能を供給することによってウイルス複製においてお互いに補助して機能する）であり、または対立遺伝子的（すなわち、遺伝子間的、ここで、この２つの親はマルチメーターの（ｍｕｌｔｉｍｅｔｒｉｃ）タンパク質の異なるドメインの欠損を有する）であり得る。
【００７４】
望ましくは、ｃｒＨＩＶ  ＤＮＡで感染され得る（導入され得る）（すなわち、上記のように、リポソームによってか、またはキメラベクターを作製するための異種構造のベクターを使用することによって）細胞型は、ＨＩＶ感染細胞またはＨＩＶ非感染細胞のいずれかであり得る。ＨＩＶ感染細胞は、活性化される得るか、または活性化され得ない。それらの細胞が活性化される場合、それらは直ちに野生型ＨＩＶ  ＲＮＡおよびｃｒＨＩＶ  ＲＮＡを転写して、子孫ビリオン中へのｃｒＨＩＶ  ＲＮＡの選択的パッケージングを生じる。ＨＩＶ感染細胞が活性化されない場合、そのｃｒＨＩＶ  ＤＮＡは活性化される（例えば、マイトジェン、抗原などによる刺激を介して）までその細胞内で存在し、この場合も、子孫のビリオン中へのｃｒＨＩＶ  ＲＮＡの選択的パッケージングを生じる。ｃｒＨＩＶ  ＤＮＡでトランスフェクションされた、活性化非感染細胞および活性化されない非感染細胞の両方は、それら細胞が野生型ＨＩＶで重感染されて、そして刺激により活性化されるまで、ビリオンを産生せず、この場合も、ｃｒＨＩＶ  ＲＮＡの選択的パッケージングを行い、子孫ビリオンを生じる。
【００７５】
本発明のベクターで形質導入される宿主細胞の１つの実施形態は、その細胞が、宿主細胞またはその細胞を含む宿主組織のどちらかに対して有意には有毒ではない、最大数のベクターコピーを含む場合である。ベクターで形質導入される宿主細胞の別の実施例は、その細胞が少なくとも１コピーのベクターを含むが、好ましくは生物学的効果を生成するために必要とされる、最小数のベクターコピーを含む場合である。細胞中のコピー数は、例えば、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによって決定され得、そして所望の生物学的効果および毒性の欠如の両方にとって適切である、受容可能なコピー数またはコピー数の範囲は、当業者によって容易に決定され得る。受容可能なコピー数は、形質導入される細胞型、ベクターの性質（例えば、ウイルス源）および所望の生物学的効果を含む因子に依存して、変動し得るが、当業者による日常的なスクリーニングによって容易に決定されるままである。
【００７６】
ｃｒＨＩＶゲノムを含む（例えば、トランスフェクションまたは感染の結果として）細胞の重感染が生じるのは、ｃｒＨＩＶゲノムが重感染をブロックするウイルスタンパク質（例えば、ｅｎｖおよびｎｅｆ）をコードしないためである。生じたｃｒＨＩＶビリオンは、非感染細胞に感染し得るのは、それらのウイルス粒子が逆転写酵素分子を含み、この酵素を完全なＨＩＶ粒子が運搬する結果、それらのウイルス粒子は自身のゲノムＲＮＡからＤＮＡプロウイルスを生成可能となる。このプロセスは、逆転写と呼ばれる。一旦、ｃｒＨＩＶビリオンが非感染細胞に感染すると、そのビリオンは逆転写を受け得、そしてそれらのゲノムＲＮＡからプロウイルスを産生し得る。従って、それらの非感染細胞は、ｃｒＨＩＶ  ＤＮＡで直接的に形質導入される非感染細胞と同等である。それら細胞は、野生型ＨＩＶで重感染されて活性化されるまでｃｒＨＩＶ粒子を産生し得ず、次いで、もう一度繰り返すと、子孫ビリオン中へのｃｒＨＩＶ  ＲＮＡの選択的パッケージングが生じる。ｃｒＨＩＶ粒子がまた、既にＨＩＶで感染したいくらかの細胞に感染し得る（Ｙｕｎｏｋｉら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１１６，１４３−１５８（１９９１）；Ｗｉｎｓｌｏｗら、Ｖｉｒｏｌ．１９６，８４９−８５４（１９９３）；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−４５８９（１９９２）；およびＫｉｍら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．＆Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．９，８７５−８８２（１９９３）を参照のこと）。しかし、この感染が起こると、これらのＨＩＶ感染細胞はＣＤ４発現を下方調節するタンパク質を発現してはならない。なぜなら、このことはｃｒＨＩＶビリオンをこれらの細胞に感染することから妨げられるからである。活性化されたＨＩＶ感染細胞は一般的に、ＣＤ４発現を下方調節する。従って、活性化されないＨＩＶ感染細胞は、ｃｒＨＩＶ重感染に対して潜在的に感受性であり、従って、ｃｒＨＩＶ粒子の産生のための別の供給源であり得る。本発明に従う好ましいｃｒＨＩＶベクターに関して、このベクターは、ＲＮＡ転写、ｔＲＮＡプライマーの結合、二量体化およびパッケージングのために必要とされる配列を含み、そして野生型ＨＩＶでの重感染をブロックするタンパク質（例えば、ｎｅｆタンパク質またはｅｎｖタンパク質）をコードする配列を欠損するか、またはそのような配列を含むが機能性タンパク質には転写されないかもしくは翻訳されずに、それら配列の発現が「サイレント」とみなされるかのいずれかである。さらにより好ましくは、このベクターは、ｇａｇコード配列の中からｎｅｆ遺伝子を含めるまでの、野生型ＨＩＶの領域をコードする領域または配列を欠損する。しかし、最適であるのは、このベクターは実際にｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含み、これがベクターの除去領域または他のいくらかの好都合な領域にクローニングされる。このような好ましいＨＩＶベクターは、このベクターが、これまでの記載のように、その発現ＲＮＡにおいて、または代替的にＤＮＡとして投与され得るので、「その領域をコードする領域または配列を欠損する」ことが述べられる。
【００７７】
本発明に従って、条件付複製ベクターと連結したヘルパーベクターを利用する系において良好な補完を達成するために、ウイルスパッケージングに必要であるが条件付複製ベクターからは発現されない任意のウイルス成分が、ヘルパーウイルスによって提供されなけばならない。従って、二つ以上のベクターが一緒になって必要なウイルス成分の完全な補完を有する限り、個々のベクターの組成は多くの並べ換えに供される。これらの並べ換えの各々は、本発明内に含まれる。例として、良好なパッケージングおよび複製に必要なｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子は共に、ヘルパーベクターもしくは条件付複製ベクターのどちらかに組み込まれ得るか、またはこの２つの遺伝子は独立して各ベクターの一方上に存在し得る。さらに、単一のヘルパーベクター構築物は、単一セットの転写調節エレメント（そのプロモーターを含む）の制御の下、または分離したプロモーターエレメントの制御下で、ｇａｇ／ｐｏｌ配列およびｅｎｖ配列（異種性のｅｎｖ配列を含む）の両方を含み得る。例えば、ＬＴＲを使用して、本発明のベクター中の遺伝子産物を発現し得る。誘導性プロモーターを含む異なるプロモーターの使用によって、例えばｇａｇ／ｐｏｌ配列およびｅｎｖ配列の異なる制御の可能性があり得る。従って、ｅｎｖ配列、特に異種性のｅｎｖ配列（例えば、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ配列）は、より高レベルで発現され得る。
【００７８】
ベクター構築は、当業者に周知である。これらの技術を使用して、条件付複製ベクターおよびヘルパーベクターの両方を構築し得る。従って、本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、両方のベクターの型を称し得る。さらに、この用語ベクターは、必ずしも条件付複製ベクターであり得ない、任意のレンチウイルスベクターを包含する。このようなベクターはまた、一般的なレンチウイルスベクターとしていわれ得る。しかし、本発明の好ましい実施形態において、このベクターは条件付で複製するレンチウイルスベクターである。例えば、実施例１において記載されるように、ＲＮＡウイルス（例えば、ＨＩＶ）の発現ＤＮＡを、Ｕ３領域（ｎｅｆが後に続く）内のｇａｇコード領域中からのＨＩＶコード配列を切り出すように、制限酵素を使用して切断する。複数の制限部位を含むポリリンカーから構成されるクローニングカセットを、ライゲーション前に除去領域に挿入して、ベクター中にクローニングするために好都合な制限部位を提供する。ＲＲＥを含むＤＮＡフラグメントを、これらの部位のうちの１つにサブクローニングする。生じたベクターは短縮化されたｇａｇ転写物を生成し、そして野生型Ｇａｇタンパク質も他の野生型ＨＩＶタンパク質も全く生成しない。さらに、ｇａｇの翻訳開始配列がその翻訳を妨げるよう変異され得るので、そのベクターは、短縮化されたｇａｇタンパク質を発現することすら十分ではない。
【００７９】
同じアプローチを使用して、ｃｒＨＩＶ配列を他の配列（例えば、ウイルスまたは他のベクターの配列）に連結して、上記のようにキメラベクターを導き得る。例えば、ｃｒＨＩＶ配列を、いくつか挙げると、シンドビスウイルス、ＡＡＶ、アデノウイルス、または両種性レトロウイルスの配列にライゲーションされ得る。さらなる使用され得るウイルス配列としては、ヘルペス、ポックス、および本明細書中に記載される他のウイルスの配列が挙げられ、これらはｃｒＨＩＶ配列の送達に対して提供するために使用され得る全てのウイルスを含む。このようなキメラベクターは、細胞侵入のために結合されたウイルスのメカニズム（例えば、アデノウイルスのレセプター媒介性エンドサイトーシス）を使用するか、または他の手段（例えば、リポソーム）を使用して、細胞中に導入され得る。
【００８０】
好ましくは、本発明に従い、ベクター（すなわち、好ましくはｃｒＨＩＶベクターである、条件付で複製するウイルス）は少なくとも１つの核酸配列を含み、その配列の所有（すなわち、存在、転写または翻訳）は選択的利点を付与する。ベクター中への包含が企図される、以下の２つの型のそのような核酸配列が存在する：（１）核酸配列、この配列の所有は、最適であるのは、野生型株のウイルス（すなわち、好ましくは、そのベクターが由来し、そしてその配列を含まない野生型株）上のそのような配列を含むベクターに、ウイルスの複製および伝播に関する選択的利点を付与し、そして（２）核酸配列、この配列の所有は、最適であるのは、所望の予防的、治療的または生物学的な結果を達成するよう、例えば、細胞の生存を促進すること、ベクター粒子の産生および／もしくは繁殖を促進すること、ｃｒＨＩＶベクターを産生する細胞からｃｒＨＩＶベクタービリオンの産生を促進すること、アポトーシスを誘導すること、タンパク質生産を促進すること、または免疫機能もしくは標的化を促進することによって、野生型株のウイルス（すなわち、好ましくは、そのベクターが由来する野生型株（そしてまた、例えば、非感染宿主細胞中でベクターの複製および／もしくは機能を促進する、ヘルパー発現ベクター）であり、そしてその配列を含まない）で感染された細胞または感染されない細胞と比較される場合、その配列を含むベクターで感染された細胞に、選択的利点を付与する。各々のこれらの配列、または各々のこれれの配列の複数（すなわち、好ましい予防的、治療的、および／もしくは生物学的結果を可能とするために、単独でまたは他の因子と組み合わせて、ベクターの繁殖を促進し、そして／または特定の宿主細胞機能を促進する配列）は、他の配列の非存在下または存在下のいずれかにおいて、ベクター中に含まれ得る（すなわち、ベクターは「少なくとも１つの核酸配列」および「少なくとも１つのさらなる核酸配列」を含み得る）。
【００８１】
第３の型の核酸配列は、ウイルス感染を減少、最低化、または防止する、宿主細胞の表現系を付与する配列である。このような核酸配列は、発現される場合に宿主細胞をウイルス感染から保護する遺伝子産物をコードする配列を含む。例えば、ＣＣＲ５タンパク質のΔ３２対立遺伝子についてホモ接合体の個体は、細胞表面上の短縮化されたＣＣＲ５タンパク質を発現する細胞の中へのＨＩＶ−１の侵入のための主要な副レセプターの欠損に起因して、ＨＩＶ−１感染に対して保護された。ヘテロ接合体の個体を用いた研究によって、Δ３２対立遺伝子が、野生型（ｗｔ）ＣＣＲ５の細胞表面の発現に対して対立優性な（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）効果を有することが示唆されている。このことは、ｗｔタンパク質と二量体化そして細胞表面上のＣＣＲ５の正確な発現を妨げる、Δ３２対立遺伝子の能力に起因し得る。
【００８２】
このΔ３２対立遺伝子は、短縮化されたＣＣＲ５タンパク質を生じるフレームシフト変異を引き起こす、３２ヌクレオチドの欠損を含む。この短縮化は、Δ３２対立遺伝子のＣ末端に、ｗｔタンパク質中には存在しない３１アミノ酸を発生させて、そして細胞表面に提示される場合に所望されない免疫応答を生成し得るので、本発明は、潜在的な免疫原の３１アミノ酸を欠損する、短縮化されたＣＣＲ５Δ３２変異タンパク質（ＣＣＲ５Δ３２Ｔ）の発現を含む。このタンパク質は、ＨＩＶ感染に対する保護を細胞に提供する対立優性な効果を付与するその能力を保持する。ＣＣＲ５Δ３２Ｔをコードする配列は、ｗｔＣＣＲ５およびＣＣＲ５Δ３２の両方に共通する最後のアミノ酸の直後（１８４位のチロシンの後）に終止コドンを導入することによって、容易に作製され得る。
【００８３】
さらなる実施形態において、別の第３の型の核酸配列は、ウイルス感染を低下、最小化または防止する、付与される表現形をさらに増強する配列である。このような核酸配列は、例えば、細胞内遺伝子に標的化される遺伝子性の抗ウイルス性配列をコードし得る。例えば、ベクターは、上記のＣＣＲ５Δ３２Ｔ変異タンパク質を発現し得、そしてさらに、野生型ＣＣＲ５分子に標的化されるアンチセンスまたはリボザイム分子（Ｕ１プロモーターに由来し、そしてＵ１  ｓｎＲＮＡ内に含まれる（米国特許第５，８１４，５００号に記載される））を発現し得る。野生型ＣＣＲ５を標的化するアンチセンス領域は、対立優性な変異ＲＮＡを、抗ＣＣＲ５アンチセンスまたはリボザイム分子の効果に耐性にさせるように、ベクターが有するＣＣＲ５Δ３２Ｔ配列において変性されるが、機能性ＣＣＲ５Δ３２Ｔタンパク質を生産する正確なアミノ酸配列に依然として翻訳される。
【００８４】
遺伝子産物に対して標的化されるリボザイムまたはアンチセンスを同時に発現すること、およびリボザイムまたはアンチセンスの結合または切断を抑制するために標的化部位中の遺伝子を変性することの上記の方法は、ＣＣＲ５またはウイルス複製を最小限にし得る分子にさえ限定されない。治療的適用のための別の非限定的な例は、癌遺伝子タンパク質（例えば、慢性骨髄性白血病についての病因的因子である、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質）の標的化である。Ｂｃｒ遺伝子もしくはＡｂｌ遺伝子またはその両方を含むベクター構築物は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ転写物に沿った任意の部位に標的化されるアンチセンスまたはリボザイムの発現と同時に、これらの遺伝子を発現し得る。従って、異常なＢｃｒ−Ａｂｌ転写物は破壊されるが、本来のＢｃｒ遺伝子もしくはＡｂｌ遺伝子またはその両方は発現されて、異常な欠損を取り除く。従って、このＢｃｒ遺伝子またはＡｂｌ遺伝子は、野生型遺伝子または異常なＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子の増幅のために、選択的利点を有する。好ましいベクターは、それらの天然のプロモーターからＢｃｒ構築物および／またはＡｂｌ構築物を発現するが、抗Ｂｃｒ−Ａｂｌリボザイムまたは抗Ｂｃｒ−Ａｂｌアンチセンスは、Ｕ１プロモーターより発現され、そしてＵ１  ｓｎＲＮＡ配列中に含まれる。
【００８５】
上記のＢｃｒ−Ａｂｌの例は、標的化癌遺伝子に対する本発明を限定するものではなく、そしてこのアプローチが、目的の、発現される全ての異常遺伝子、所望されない遺伝子、または所望の遺伝子でさえも、治療的または予防的な置換のために使用され得ることは、当業者には明かである。標的遺伝子は、遺伝子性抗ウイルス分子の効果に耐性である、改変遺伝子に対して同種性または異種性であり得る。本方法によって標的化され得る他の疾患状態は、医療分野および臨床分野の当業者に明らかである。例えば、本明細書中で開示される本発明の実践によって血液疾患を処置するための分子標的は、「Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」（Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ、Ｍａｊｅｒｕｓ、ＰｅｒｌｍｕｔｔｅｒおよびＶａｒｍｕｓ、第３版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，版権１９８７年、１９９４年および２００１年、これらの全てが本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【００８６】
本発明はまた、臨床的適用に限定されるものでもない。このアプローチを使用して、目的の遺伝子配列の融合を決定し得る。例えば、目的とする領域において改変された目的遺伝子配列は、対応する非改変領域を標的化することによって、全ての非改変遺伝子配列の発現を抑制または破壊するアンチセンスまたはリボザイムと、同時に発現され得る。従って、目的の改変遺伝子配列は、非改変の遺伝子配列の増幅発現について、選択的利点を有し、当該分野で公知のアッセイ手順によって、改変された遺伝子配列またはそれにコードされる遺伝子産物の機能を決定し得る。
【００８７】
「核酸」は、これまでに記載されるようである。「核酸配列」は特に、可能性ある任意のサイズ（すなわち、ベクターによって課される制限に無論限定される）の任意の遺伝子またはコード配列（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含み、その配列の所有は、本明細書中でさらに定義されるような選択的利点を付与する。「遺伝子」は、タンパク質または新生のｍＲＮＡ分子をコードする任意の核酸配列（その配列が転写および／または翻訳されるか否かには関係無い）である。遺伝子はコード配列および非コード配列（例えば、調節配列）を含む一方で、「コード配列」は非コードＤＮＡを全く含まない。
【００８８】
１．核酸配列、この配列の所有は、野生型株のウイルス上のそのような配列を含むか、またはベクターの増幅を阻害または影響するゲノム配列と競合するベクターに対して、宿主細胞において選択的利点を付与する。
【００８９】
核酸配列は、野生型株のウイルスに対して宿主細胞においてベクターに選択的利点を付与し、好ましくは、野生型ウイルスより伝播されるウイルス粒子と比較する場合、ベクターから伝播されるウイルス粒子が選択的に産生されるかまたはパッケージングされ得る任意の配列である。このような配列としては、野生型のゲノムと比較する場合細胞内で産生されたウイルスゲノムの数の増加を生じる配列、および抗ウイルス性核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。またこのような配列としては、野生型ゲノムと比較した場合、同属の野生型ウイルス由来でない、細胞内で産生されるベクターゲノムの数、特性または状態の増加を生じる配列が挙げられるが、これに限定されない。
【００９０】
野生型株のウイルスと比較する場合、宿主細胞において配列を含むベクターに選択的利点を付与する核酸配列の第１のカテゴリーは、プロモーターのような配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を導き、それによってＲＮＡ合成を促進する配列であり、そして１つ以上のエンハンサーを含み得る配列である。「エンハンサー」は、隣接する遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーはまた、「サイレンサー」と称される。サイレンサーはまた、ニワトリ赤血球インシュレーターエレメントのＤＮＡｓｅ高感受性部位中に見出されるような、「インシュレーター」エレメントであり得る。エンハンサーは、エンハンサーがいずれかの方向で、そして数キロベース対（ｋｂ）までの距離を隔てて、転写される領域の下流位置からでさえ機能し得る、プロモーター（これはまた、「プロモーターエレメント」とも称される）中にのみ見出される、配列特異的なＤＮＡ結合性タンパク質に対するＤＮＡ結合部位とは異なる。
【００９１】
従って、そして好ましくは、条件複製ＨＩＶベクターのプロモーター（例えば、長い末端反復配列（ＬＴＲ））は、このベクターが特定のサイトカインに対して野生型のＨＩＶ株よりも反応性であるように、改変される。例えば、インターロイキン２の存在下で増大した転写活性を実証した改変ＨＩＶプロモーターが利用可能である。ベクターへのこのプロモーターの組み込みおよび野生型のＨＩＶに感染した細胞へのこのベクターの導入によって、この野生型ＨＩＶゲノムと比較したときに、このベクターゲノムに由来する子孫ビリオンの増大した産生およびパッケージングが生じる。他のサイトカインおよびケモカイン（例えば、インターフェロンα、腫瘍壊死因子α、ＲＡＮＴＥＳ、などが挙げられるがｌこれらに限定されていない）は同様に、このベクターによってコードされるビリオンの選択的なパッケージングを促進する為に使用される得る。サイトカインに対するＨＩＶ−ＬＴＲ応答をなすエレメントの配置は、決して、本発明の範囲をこのような実施形態に限定しない。任意のヌクレオチド配列は、このプロモーターの応答性を改変する為にＨＩＶ−ＬＴＲに挿入され得る。ＨＩＶ−ＬＴＲ中に挿入され得るＤＮＡ部位に結合する因子の列挙が、ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／ｌｉｓｔｓ／ｂｒｏｗｓｅ．ｈｔｍｌ（２０００年９月８日にアクセス）（これは、本明細書中において、完全に示されるがごとく参考として援用される）に見出され得る。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓに対するＤＮＡ結合因子の列挙  （ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／ｌｉｓｔｓ／ｆａｃｔｏｒ／ｓｐｅｃｉｅｓ／ｈｕｍａｎＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ．ｈｔｍｌ）は、２０００年９月８日にアクセスされたように、同様にして本明細書中で参考として援用される。
【００９２】
同様に、サイレンサーまたはインシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）は、ネイティブレンチウイルスＬＴＲまたは改変レンチウイルスＬＴＲ（例えば、ＨＩＶ−ＬＴＲ）のプロモーター領域またはエンハンサー領域へと挿入され得、その結果、このようなプロモーターからの発現が緊密に調節し得る。特定の場合において、ＨＩＶ−ＬＴＲにエレメントを挿入することによって、野生型ウイスルとの感染に関して選択的に不利な点にこのベクターを位置付け得る。しかし、この型のベクターの適用は、子孫ビリオンにパッケージングするために野生型ウイルスと競合せずに、むしろ、目的の核酸配列（または「ペイロード遺伝子（ｐａｙｌｏａｄ  ｇｅｎｅ）」）を発現するべきあり得、例えば、この目的の核酸は競合することなしにＨＩＶ複製を阻害する。この場合、第１の核酸は、このベクターに選択的利点を与えないが、極僅かに、例えば、このベクターの産生の間に、このベクターとヘルパーとの間の組換えを阻害するはずである。
【００９３】
野生型のウイルスと比較したときに、この配列を含むベクターについての選択的利点を与え得る核酸配列の第２のカテゴリーは、好ましい核酸配列として、抗ウイルス核酸配列を含む。「抗ウイルス剤」は、それらの作用様式（例えば、逆転写酵素のインヒビター、ウイルスの細胞への侵入に対する競争物（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）、ワクチン、プロテアーゼインヒビター、および遺伝的抗ウイルス剤）によって分類される。「遺伝的抗ウイルス剤」は、細胞にトランスフェクトされ、そしてそれらの細胞内標的に、直接的（すなわち、細胞内導入として）または、ＲＮＡまたはタンパク質のいずれかへのこれらの変換後に影響を与えるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である（これらは、Ｄｒｏｐｕｌｉｃら（１９９４）前出によって概説されている）。遺伝的抗ウイスル配列はまた、好ましい核酸配列である。遺伝的抗ウイルス剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アンチセンス分子、ＲＮＡデコイ、トランスドミナント変異体（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ  ｍｕｔａｎｔ）、トキシン、ＲＮＡおよびタンパク質のスプライシングの改変剤および調節剤、ＥＧＳ（単独またはＭ１エレメント、Ｕ１エレメント、ＰＲＥまたはＣＴＥエレメントと直接結合する）、免疫原、ＲＮＡｉ（Ｚａｍｏｒｅら  Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３，２０００を参照のこと）、スプライシングを改変または調節するヌクレオチド配列または分子、構成的輸送エレメント（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ；ＣＴＥ）、核輸送（ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｍｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｅｘｐｏｒｔ）因子、ＤＮＡ組み込み因子（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、ＲＮＡ安定化エレメントまたはＲＮＡ脱安定化エレメント、転写後調節因子（ＰＲＥ）、ウイスル複製を干渉するタンパク質、インターフェロン、トキシン、免疫原（これは、免疫学的に関連する任意の遺伝子によって定義される）、抗体（抗体全体、単鎖抗体、リガンド提示分子）、リボザイム、またはベクターの任意の局面または野生型ウイルス複製に影響を与える任意のエレメント、ならびにリボザイム。所望される場合、遺伝的抗ウイルス剤は、アンチセンス分子、トランスドミナント変異体、免疫原およびリボザイムである。従って、ベクターに対して、野生型のウイルスを超える選択的利点を与える好ましい核酸配列は、アンチセンス分子、免疫原、およびリボザイムからなる群より選択される遺伝的抗ウイルス剤の核酸配列である。
【００９４】
本発明で使用される遺伝的抗ウイルス剤は、ウイルス配列を標的化することのみに限定され、特にこれらがウイルスベクターの条件ウイルスベクターに位置付けられない場合の標的化に限定される。非限定的な例として、遺伝的抗ウイルス配列は、レチンウイルスベクターにおいて位置付けられ得、その結果、この因子が、ウイルス標的または非ウイルス標的（例えば、細胞標的、細菌標的、または病原体標的）に指向される。この場合、このレチンウイルスベクターは、未改変ＨＩＶ−ＬＴＲまたは改変ＨＩＶ−ＬＴＲ（発現された、スプライスされたか、またはスプライスされていないＲＮＡ）に作動可能に連結された目的の遺伝子を含み、そして、さらに、ＨＩＶ−ＬＴＲに作動可能に連結されていないプロモーター配列に連結される遺伝的抗ウイルス剤または遺伝的抗ウイルス配列を含み得る。好ましい配列は、ｓｎＲＮＡ（好ましくは、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ、Ｕ２  ｓｎＲＮＡ、Ｕ３  ｓｎＲＮＡ、Ｕ４  ｓｎＲＮＡ、Ｕ５またはＵ６  ｓｎＲＮＡ）とのキメラであるアンチセンスまたはリボザイムである。
【００９５】
また、この遺伝的抗ウイスル因子は、ベクター配列またはヘルパー配列のいずれかに存在する単一の配列または単一の型の配列に限定されない。２以上の因子が、ベクター構築物またはヘルパー構築物に同じに存在し得、これらは遠位に位置付けられるか、または、好ましくは、タンデムに連結されるかのいずれかであり得る。好ましくは、２以上の異なる遺伝的抗ウイルス剤が、タンデムに連結されている。本発明の用途のためのさらなる遺伝的抗ウイルス剤の実施形態は、２つの異なる型の遺伝的抗ウイルス剤を連結する任意のものである。
【００９６】
「アンチセンス分子」は、塩基対規則および塩基対の「ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）」の利用可能性に基づいて、その発現がブロックされるべき遺伝子の短いセグメントを「映す（ｍｉｒｒｏｒ）」分子である。ＨＩＶに対して指向されるアンチセンス分子は、野生型のＨＩＶ  ＲＮＡにハイブリダイズし、細胞性ヌクレアーゼによるその選択的な分解を可能にする。アンチセンス分子は、好ましくは、約２０塩基対〜約２００塩基対の長さ、好ましくは、約２０塩基対〜約５０塩基対の長さ、そして、最適であるのは、２５塩基対未満の長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドである。アンチセンス分子は、ゲノムの野生型ＲＮＡに選択的に結合するｃｒＨＩＶ  ＲＮＡから発現され得、それによって、子孫ビリオンへのパッケージングのための選択的利点をｃｒＨＩＶ  ＲＮＡに提供し得る。
【００９７】
ＲＮＡとしてベクター中で発現されるアンチセンス分子は、任意のサイズまで、好ましくは、２０００塩基長までの、少なくとも２０塩基対で、より好ましくは、約５０〜約５００塩基長で存在する。このようなアンチセンス分子は、好ましくは、ゲノム野生型ＲＮＡに結合するが、ベクターＲＮＡには結合せず、野生型ウイルス超える、ベクターの選択的利点に提供する。ＨＩＶ由来のベクターにおいてアンチセンス分子を生成するために好ましい領域は、例えば、エンベロープ領域（ｅｎｖ）、Ｔａｔタンパク質領域またはＲｅｖタンパク質領域、アクセサリー遺伝子領域（Ｖｉｆ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ）、ｐＮＬ４−３上のＮｓｉ  Ｉ制限酵素に対して３’にあるＧａｇの領域、および以下に示すようにＰｏｌにおける５４５塩基領域を含まないＰｏｌの領域由来である。
【００９８】
「免疫原」は、任意の免疫関連遺伝子およびそれにコードされる遺伝子産物をいう。歴史的に、用語「免疫原」は、ワクチン接種のために使用されるアジュバントを参照して使用されるが、用語「免疫（イムノ）（ｉｍｍｕｎｏ−）」および「原（ゲン）（−ｇｅｎ）」は、本明細書中で、免疫関連遺伝子およびそれにコードされる遺伝子産物をいう。例えば、免疫原は、ウイルス構造タンパク質に対して指向される単鎖抗体（ｓｃＡｂ）をコードし得るか、またはこれは、細胞によって細胞外に分泌される抗体をコードし得る。免疫原が、核酸として移入され、そして、細胞内で発現される。同様に、免疫原は、任意の抗原、表面タンパク質（クラスが制限されたタンパク質を含む）またはディスプレイ（提示）様抗体をコードし得、これらは、ベクターおよび／または宿主選別を促進する。好ましいベクターにおいて、核酸配列は、野生型ＨＩＶ  Ｒｅｖタンパク質に結合するｓｃＡｂコード配列を含む。これは、好ましくは、小胞体における貯蔵を生じることによってＲｅｖタンパク質の変異を妨げる。具体的には、単独であるかまたは他の細胞因子と組み合わされたＲｅｖタンパク質が、スプライシングされていないＨＩＶ  ＲＮＡおよび僅かにスプライシングされたＨＩＶ  ＲＮＡを、ＲＲＥ（Ｒｅｖに対して高度に構造化されたシス作用ＲＮＡ標的配列であり、Ｒｅｖ応答エレメントと呼ばれる）に結合させ、次いで、ＨＩＶ  ＲＮＡを取り囲むようにオリゴマー化することによって核から細胞質へと輸送する。Ｒｅｖと複合体化するＨＩＶ  ＲＮＡは、細胞質に輸送され、そして、細胞のスプライシング機構をバイパスする。従って、野生型Ｒｅｖが野生型ＲＲＥに結合しない場合、野生型ＨＩＶ  ＲＮＡはその細胞質に輸送されず、そして、子孫ビリオン中へとキャプシド化されない。
【００９９】
最適には、ｓｃＡｂ核酸配列を含むベクターはさらに、改変ＲＲＥ配列を包含し、そして、改変され、野生型でない、ＲＲＥを認識する変異Ｒｅｖタンパク質をコードする。従って、野生型ＨＩＶを含む細胞およびｓｃＡｂ核酸配列を含むベクターにおいて、このベクターは、優先的にビリオンにパッケージされる。野生型ＨＩＶマトリックスまたはヌクレオキャプシドのタンパク質（すなわち、ウイルスＲＮＡのキャプシド化に影響をあたえるタンパク質／ＲＮＡ相互作用に関連する任意のタンパク質）がｓｃＡｂの標的である類似のストラテジーが、好ましくは、使用される。
【０１００】
「リボザイム」は、触媒活性を有するアンチセンス分子であり、すなわち、ＲＮＡに結合し、そして、翻訳を阻害する代わりに、リボザイムは、ＲＮＡに結合し、そして、この結合したＲＮＡ分子の部位特異的切断を与える。一般的に、以下の４つのリボザイムの群が存在する：テトラヒメナ群Ｉ介在配列、ＥＧＳ（外部ガイド配列）、ならびにハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイム。しかし、さらなる触媒モチーフはまた、他のＲＮＡ分子（例えば、デルタ型肝炎ウイルスおよび真菌類ミトコンドリア内にあるリボソームＲＮＡ）においても存在する。
【０１０１】
好ましいリボザイムは、触媒ドメインが３’ヌクレオチドＮＵＨ配列を切断し、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチド（すなわち、Ｇ、Ａ、ＵまたはＣ）であり、そして、Ｈは、Ａ、Ｃ、またはＵのいずれかであり得るリボザイムである。しかし、このようなリボザイムによって最も効率的に切断される配列は、ＧＵＣ部位であり、好ましくは、ＮＵＨ配列は、ＧＵＣ部位を含む。
【０１０２】
望ましくは、このようなリボザイムは、野生型のウイルスの領域またはその転写物において切断するが、ベクターの領域またはその転写物においては切断しない。このリボザイムは、上述したように、このようなウイルスまたはベクターがＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得るという意味で、ウイルスまたはその転写物を切断する。「領域における」切断によって、標的領域における切断、すなわち、好ましくは、ウイルス増殖に必要であるウイルスの領域における切断を意味する。望ましくは、（すなわち、全てがベクター中に存在する場合）標的化された特定の領域がリボザイムによって切断されないように、このベクターは改変される。必要に応じて、このリボザイムが、切断がウイルス（例えば、ｃｒＨＩＶ粒子）の増殖のために必要とされる領域において生じない場合にこのベクターを切断し得る。
【０１０３】
最適であるのは、このリボザイムは、以下からなる群より選択される配列によってコードされる：配列番号３（すなわち、ＣＡＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＡ）ならびに配列番号４  （すなわち、ＡＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＧＡＧＴＣ）。配列番号３は、野生型ＨＩＶ  ＵＳ領域の＋１１５部位（すなわち、転写の開始点の下流にある多くの塩基）に標的化されたリボザイムを含むが、配列番号４は、ＨＩＶ  Ｕ５  領域の＋１３３部位に標的化されるリボザイムを含む。
【０１０４】
このようなリボザイムは、野生型ＨＩＶゲノム（また、その転写物）の中で切断し得るが、ベクターゲノム（または、その転写物）を切断せず、それゆえ、ベクターＵ５配列は、インビトロ部位特異的突然変異によって改変され、このようなことは、当該分野で公知であり、そして、実施例１に記載される。特に、このベクター配列は、好ましくは、改変され、その結果、このベクターは、以下からなるからなる群より選択される配列を含む：配列番号２（すなわち、ＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧＡＡＣ）、配列番号５（すなわち、ＧＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣ）、配列番号６（すなわち、ＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣ）、配列番号１４（ここで、少なくとも１つのＮが変異されている）、配列番号１５および配列番号１６。ＲＮＡの形態にて、このベクターは、好ましくは、以下からなる群より選択される配列を含む配列によってコードされる：配列番号５、配列番号６、配列番号１４（ここで、少なくとも１つのＮが変異されている）、配列番号１５および配列番号１６。対照的に、野生型ＨＩＶは、以下の配列番号１の配列によってコードされるＵ５配列を含む：ＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣ。全体としての改変および野生型Ｕ５配列（ＤＮＡの形態である）に対する比較を、図２に示した。
【０１０５】
さらに、ウイルスおよび特にＨＩＶゲノムの他の領域に標的化される他のリボザイムは、単独または併用のいずれかで使用され得る。例えば、このリボザイムは、記載されるように、ウイルス複製に必要とされる他のＲＮＡ配列（例えば、逆転写酵素の中、プロテアーゼの中、またはトランスアクチベータータンパク質の中、Ｒｅｖの中、または他の必要な配列）中で切断し得る。好ましくは、ベクターは、（例えば、複数の部位に標的化された）複数のリボザイムを含む。このような場合、このベクター中の類似配列は、部位特異的突然変異、または、当該分野で公知のいくつかの他の手段によって改変され、このようなリボザイム切断に対して耐性であるベクターを駆動する。
【０１０６】
ベクターがヒト免疫不全ウイルスである場合、好ましくは、このベクターは、ｔａｔ遺伝子およびその５’スプライス部位を欠如しており、そして、その場所に、三重抗Ｔａｔリボザイムカセットを含み、ここで、三重触媒カセットの各リボザイムの触媒ドメインは、野生型ヒト免疫不全ウイルス核酸分子における異なる部位、特に、ｔａｔ中の異なる部位を切断する。好ましくは、リボザイムの各々の触媒ドメインは、野生型ヒト免疫不全ウイルスの核酸分子の領域におけるヌクレオチド配列を切断し、このウイルスについて、リボザイム感受性対応物がベクター中にそれ自体存在しない。
【０１０７】
遺伝的抗ウイルス剤としてのリボザイムのさらなる実施形態は、ワトソン−クリック塩基対形成だけではなく、Ｇ−Ｕ揺らぎ塩基対形成による、配列を標的化するリボザイムにおいて利用可能である。これまでの研究によって、二本鎖ＲＮＡのＧ−Ｕ揺らぎが、ワトソン−クリック塩基対形成と類似の特徴を有していることが示されている。この高い変異率が与えられた場合に、ＨＩＶにおける保存性の高い領域でさえ、異なるＨＩＶ株を生じ、複数の部位を標的化するリボザイムを設計する能力によって、劇的な利益が本発明に提供される。例えば、ｔａｔ遺伝子における高度に保存された標的領域は、本発明のリボザイムの標的配列として使用され得、４０の十分に規定されたＨＩＶ−１株の中に「Ｇ」または「Ａ」のいずれかを有している。従って、この領域を標的化するリボザイムは、「Ｇ」残基または「Ａ」残基のいずれかと対形成することを可能にするために適切な標的化配列の中に「Ｃ」の代わりに「Ｕ」を含むように設計され得る。これは、対応する位置にリボザイムが「Ａ」を有しているＨＩＶ−１株を標的化する能力を低減する標的化配列における「Ｃ」の使用と比較され得る。リボザイム認識のための標的位置においてＧ、Ａの改変が存在するいずれかの場所で「Ｕ」を使用するアプローチは、有意に、本発明のリボザイムの有用性を増大する。
【０１０８】
開示された発明の実施のためのさらなる実施形態は、それがベクター内で直接的に反復した配列がでないように縮退させたリボザイムカセット（これは、タンデムに連結された１より多いリボザイムを含む）を使用することである。縮退した配列の存在によって、レトロウイスルおよび他の核酸に観察されるような直接的な反復配列の欠失が防止される。従って、タンデムに配列した直接反復配列から構成されるリボザイムカセットは、複製の複数回サイクルの間で欠失され得る。縮退したリボザイム配列は、この問題を乗り越えるために使用される得る。なぜならば、ハンマーヘッドリボザイム分子の触媒ドメインにおける配列は、活性の有意な損失をすることなく、揺らぎ塩基対形成に基づいて他のヌクレオチドに置換され得るからである。ハンマーヘッドリボザイムの突然変異誘発は、以前のように実施され、そして縮退され得る部位が決定された（Ｒｕｆｆｎｅｒ  Ｄ  Ｅ，Ｓｔｏｒｍｏ  Ｇ  Ｄ，Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ  Ｏ  Ｃ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  ＲＮＡ  ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９０，Ｎｏｖ．  ２７；２９（４７）：１０６９５−７０２）。欠失の可能性を減少させる別の手段は、標的ＲＮＡの異なる部位を標的化するためのカセットの個々のリボザイムを指向することによる。従って、このカセットは、直接反復配列の存在を含まない。
【０１０９】
「トランスドミナント」核酸または「ドミナントネガティブ」核酸は、野生型（ｗｔ）配列の存在下においても、そのコードされた表現型を与える。短縮型ＣＣＲ５タンパク質（上記）の議論は、１つの例である。他の例は、トランスドミナント表現型を与える任意の変異レトロウイルス配列または変異レンチウイルス配列を含む。例としては、ｒｅｖ遺伝子およびｇａｇ遺伝子が挙げられる。
【０１１０】
選択的利点ならびに感染性野生型ウイルスの阻害を提供する用途のための１つの実施形態は、おそらく、キャプシドアセンブリを阻害することによって、ＨＩＶ−１複製を阻害することが示されたトランスドミナントｇａｇ配列を伴う。従って、このような配列を、好ましくは、非ＨＩＶ−１に基づくレトロウイルスベクターと併用して、そのトランスドミナント配列からの阻害なしに複製およびパッケージを可能にする。例えば、ＨＩＶ−２ｇａｇ遺伝子およびＨＩＶ−２ｐｏｌ遺伝子を含むレトロウイスルベクターは、トランドミナントＨＩＶ−１ｇａｇ配列を含み得る。このようなベクターは、適切なＨＩＶ−２ヘルパーベクター構築物との相補性を介して、複製され得、そしてパッケージされ得る。しかし、ＨＩＶ−１感染に供された細胞の展開の後に、このトランスドミナントｇａｇ配列は、ＨＩＶ−１感染の際の発現あＨＩＶ−１ウイルスの移動をブロックする。しかし、このレトロウイルスベクターにコードされたＨＩＶ−２ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子は、なお、このベクターのキャプシド形成および起動に利用可能である。
【０１１１】
２．その配列を含むベクターで感染したかまたは感染していない細胞に、野生型のウイルスで感染させた細胞と比較して選択的利点を与える核酸配列。
【０１１２】
その核酸配列は、その配列を含むベクターを含有する細胞に、ウイルスの野生型株を含むか、またはそれを含まない（すなわち、その配列を欠如する）細胞を超える選択的利点を与え、その配列を含むベクターを含む細胞は、核酸配列は、好ましくは、野生型ウイルスを含む細胞またはその核酸配列が不在である細胞と比較しときに、そのベクターを含む細胞が生存し、そして、ウイルス粒子（すなわち、ｃｒＨＩＶウイルス粒子）を増加することを可能にする任意の配列である。このような配列としては、この細胞またはその細胞に含まれているベクターが破壊を免れることを可能する任意の配列、細胞生存を促進する配列、アポトーシスを誘導する配列、タンパク質産生を促進する配列、または免疫機能もしくは標的化を促進する配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１３】
例えば、好ましくは、ベクターに含まれるこのような核酸配列は、多剤耐性遺伝子をコードする（例えば、Ｕｅｄａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４１，９５６−９６２（１９８６）；Ｕｅｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，５０５−５０８（１９８７）；およびＵｅｄａら，ＰＮＡＳ，８４，３００４−３００８（１９８７）を参照のこと）。（例えば、癌化学療法のために使用されるような）添加された細胞傷害性薬物の存在下で、これは、このベクターを含む細胞が生存し、一方、野生型ウイルス（例えば、ＨＩＶ）を含む細胞は生存しないのを可能にする。このような細胞傷害性薬物としては、アクチノマイシンＤ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ＢＣＮＵ（ＢＧ条件化を含むかまたは含まない）、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ＶＰ−１６およびＡＭＳＡが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１４】
このような核酸配列の別の例は、Ｏ６−メチルグアニン−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）の任意の配列改変体である。ＭＧＭＴは、造血前駆体をアルキル化剤の毒性から防御するために用いられ得る。野生型ＭＧＭＴは、Ｏ６−ベンジルグアニン（ＢＧ）（これは、アルキル化剤毒性を強化する）によって阻害される。ＢＧ媒介不活化に耐性でかつアルキル化剤に対して防御し得るＭＧＭＴ改変体は、本発明によって任意の細胞型に対して提供され得る。このような改変体の例は、Ｇ１５６Ａ  ＭＧＭＴである。
【０１１５】
例えば、本発明によってこのような改変体で形質導入された造血前駆体細胞は、ＢＧおよびＯ６−グアニンメチル化剤またはＯ６−グアニンクロロエチル化剤の投与によって選択され得る。本発明において使用するためのこのようなメチル化剤の例としては、臨床的に関連するテモゾロミド、ニトロソ尿素、テトラジン（ｔｅｔｒａｚｉｎｅ）、トリアジン（ｔｒｉａｚｉｎｅ）、デカバジン（ｄａｃａｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、プロカルバジンが挙げられるがこれらに限定されない。クロロエチル化剤の例としては、ＢＣＮＵ（１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素）、ＣＣＮＵ（３−シクロヘキシル−１−クロロエチル−ニトロソ尿素）、ＡＣＮＵ（１−（４−アミノ−２−メチル−５−ピリミジニル）メチル−３−（２−クロロ）−３−ニトロソ尿素）およびＭｅＣＣＮＵ（１−（２−クロロエチル）−３−（４−メチルシクロヘキシル）−１−ニトロソ尿素が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、アルキル化剤は、ＢＣＮＵである。
【０１１６】
ＢＣＮＵは、静止細胞および細胞周期進行中の細胞の両方において、永続的な、共有結合による鎖間ＤＮＡ架橋損傷を形成することが示されている。これらの損傷は、ＤＮＡ複製の間の細胞に対して細胞傷害性である。ＭＧＭＴは、ＢＣＮＵ損傷の主なＤＮＡ修復機構である。静止細胞に対するその毒性を考慮すると、本発明のレンチウイルスベクターによって送達されるＭＧＭＴ改変体を用いた選択はまた、全能性造血幹細胞（ＨＳＣ）（これは、主に、細胞周期のＧ０にあるが、断続的に細胞周期を行ってより多くの幹細胞および血液前駆体細胞を産生する）についての選択を可能にし得る。幹細胞は一般に、レトロウイルス形質導入に抵抗するが、これらがＧ０周期状態のみにあるのでなければ、レトロウイルスベクターを用いて形質導入され得る。オンコレトロウイルスと同様に、本発明のレンチウイルスベクターを用いて、造血幹細胞（アッセイ可能な造血ＥＬＴＣ−ＩＣを含む）およびＮＯＤ−ＳＣＩＤまたはＳＣＩＤ−ｈｕ再増殖細胞を形質導入し得る。しかし、オンコレトロウイルスとは異なり、幹細胞の分化を伴わずに幹細胞を形質導入するために必要とされるサイトカイン状態は、レンチウイルスベクターに好都合であるようである。なぜなら、レンチウイルス（例えば、  ＨＩＶ）は、感染時に活性には分裂していない細胞に感染し得るからである。ＨＳＣ選択は、細胞周期進行中の造血前駆体について選択する他のストラテジーを用いては、可能ではない。従って、本発明のＭＧＭＴ改変体およびレンチウイルスベクターによって媒介される選択は、選択のための長期の薬物投与の必要性を伴わずに、形質導入全能性ＨＳＣの存在を増大させ得る。
【０１１７】
上記の考察は、インビトロおよびエキソビボ、ならびにインビボでの造血細胞の関係において考察され得る。従って、ＭＧＭＴ改変体を用いてインビボで細胞を形質導入することに加えて、被験体の造血細胞は、エキソビボで形質導入され、続いてエキソビボまたはインビボのいずれかで薬物処理され得る。次いで、このようなエキソビボ処理細胞は、（必要に応じて、形質導入細胞を用いた骨髄の再増殖の一部として）被験体中に注入され得る。
【０１１８】
上記の移植の前に、アルキル化剤ＢＣＮＵをまた用いて、ＨＩＶ陽性被験体におけるＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞を概して低減し得る。上記で述べたように、ＢＣＮＵ（内因性ＭＧＭＴの枯渇後）は、静止細胞および増殖細胞の両方において細胞傷害性損傷を形成する。このような損傷は、薬物用量が機能的ＡＧＴタンパク質のレベルを圧倒的に超えた場合、ＭＧＭＴの強制枯渇なしでさえ形成される。ＢＣＮＵでの反復全身処置は、累積骨髄抑制および汎血球減少症を引き起こす。リンパ系細胞の中でも、ＣＤ４＋細胞は、ＢＣＮＵに対して著しく感受性であるようである。従って、レトロウイルスに感染した被験体（例えば、ＨＩＶ感染患者）では、ＢＣＮＵ投与（所望の場合、骨髄抑制を回避するための低用量のものを含む）は、総ＣＤ４＋細胞集団を低減し、それゆえ、ウイルス負荷量を低減する。このアプローチに続いて、上記で考察した通り、造血前駆体の注入を行い得る。
【０１１９】
ＢＣＮＵは、静止細胞においてさえ、細胞傷害性損傷を形成することによって「ステルス」様式で作用し得るので、このアプローチは、反復処置の必要性を低減するという、付加された利点を有する。もちろん、このアプローチは、ＢＧの使用と組み合わされて、ＢＣＮＵの効果を強化し得る。あるいは、このアプローチは、本発明のベクターを用いたＭＧＭＴ改変体の導入と組み合わせて使用されて、形質導入ＣＤ４＋細胞の防御を提供し得る。この後者の手段は、上記で考察した通りの造血細胞の処置から独立しているかまたは造血細胞の処置と関連しているかのいずれかであり得る。それゆえ、本発明の好ましい実施形態は、抗ＨＩＶアンチセンスまたはリボザイム（第一核酸配列）を含むベクターが、それぞれ、野生型ＨＩＶ感染細胞を超える選択的利点および野生型ＨＩＶウイルスを超える選択的利点の両方を提供するように、このベクターにおいて変異体ＭＧＭＴ（第二核酸配列）を発現することである。さらなる好ましい実施形態は、このベクターが、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターを含まないＭＧＭＴ遺伝子（または第二核酸配列）を、スプライスされたｍＲＮＡとして発現することである。
【０１２０】
最後に、このベクターは、抗ＨＩＶリボザイムまたはアンチセンス配列を発現するとはいえ、本発明は、そのようには限定されない。なぜなら、当業者は、任意の阻害性ヌクレオチド配列を、特定の治療効果、予防効果または生物学的効果のためにベクター中に容易に挿入し得るからである。阻害性配列を発現するための好ましい方法は、この阻害性配列を、Ｄｉｅｔｚ（米国特許第５，８１４，５００号）に記載した通りのＵ１  ｓｎＲＮＡ／プロモーターカセットに含めることである。
【０１２１】
あるいは、このような核酸配列は望ましくは、変異した（すなわち、変異体）プロテアーゼの配列（またはそれをコードする配列）および変異した（すなわち、変異体）逆転写酵素の配列（またはそれをコードする配列）からなる群より選択される配列を含む。好ましくは、変異した逆転写酵素は、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターおよび非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターに対して耐性であるように操作され、そして変異したプロテアーゼは、通常用いられるプロテアーゼインヒビターに対して耐性であるように操作される。
【０１２２】
このベクターと関連した、これらのプロテアーゼインヒビターまたは逆転写酵素インヒビターの宿主への投与は、野生型ウイルスを産生する細胞とは反対に、このベクターを産生する細胞について選択するために用いられる。同様に、このアプローチは、ウイルスが変異して阻害から逃れ得るように、ウイルス複製を阻害する任意の薬物を用いた使用のために改変される。従って、ＨＩＶの処置に関して、このベクターに取り込まれた選択的核酸配列は、好ましくは、変異したＨＩＶ配列を含む。しかし、最適には、これらの配列は、野生型ＨＩＶでの重感染を防御しない。
【０１２３】
好ましくは、このベクターは、上記のベクターのうちの１つであり、そして特に、図１Ａ〜図１Ｋに示される、改良された条件複製ベクターである。もちろん、本発明の方法において用いられる場合、ＧＦＰコード配列は、欠失され得るかまたは他の配列で置換され得る。ＧＦＰコード配列は、このベクターまたはこのベクターからの遺伝子発現の存在のマーカーまたは指示薬としてこれらの例示的ベクター実施形態において存在する。
【０１２４】
本発明の好ましいベクターは、本開示に記載される種々のエレメントを含み得る。特に、レンチウイルスベクターは、ｔａｔ遺伝子を欠き得、そして少なくとも１つのアンチセンス配列を含み得る。さらに、このベクターは、ＨＩＶの中央ポリピリミジントラクトまたはこれを含むさらに大きな核酸フラグメントのような配列を含み得る。
【０１２５】
最適には、ベクターは、ベクターが導入される細胞に適合性である（例えば、ベクターがコードする核酸配列の発現を細胞に付与し得る）。望ましくは、このベクターは、その細胞において機能的な複製起点を含む。核酸配列が、（例えば、それ自体のプロモーターを含む完全な遺伝子の形態に対して）そのＤＮＡコード配列の形態で移入される場合、最適には、このベクターはまた、そのコード配列の発現を駆動し得、かつそのコード配列に作動可能に連結された、プロモーターを含む。コード配列は、このプロモーターがこのコード配列の転写を指向し得る場合、（例えば、このコード配列およびこのプロモーターの両方が一緒になってネイティブな遺伝子または組換え遺伝子を構成する場合）プロモーターに「作動可能に連結」される。
【０１２６】
本発明の組換えベクターにおいて、好ましくは全ての適切な転写（例えば、開始シグナルおよび終止シグナル）、翻訳（例えば、リボソームの参加または結合部位など）、プロセシングシグナル（例えば、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位、および必要な場合、ポリアデニル化シグナル）、転座、アセンブリ、組み込み部位、リボ核（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｒ）複合体の参加、安定性およびシスまたはトランスの転座エレメントが、ベクター上に正確に配置され、その結果、任意の遺伝子またはコード配列は、このベクターが導入された細胞中で適切に転写（および／または所望の場合、翻訳）される。宿主細胞での適切な発現を確実にするためにこのようなシグナルを操作することは、完全に、当業者の知識および経験の範囲内である。
【０１２７】
好ましくは、ベクターは、安定な形質導入（これは、宿主細胞ゲノム中のベクターコピーの組み込みによって規定される）の効率を増大するＰｏｌ配列を含む。Ｚｅｎｎｏｕら（Ｃｅｌｌ  １０１：１７３−１８５（２０００））によって、中心的ＤＮＡフラップとして以前に同定された配列（ｐＮＬ４−３上の４７５７位〜４９３５位に対応する、ｐＬＡＩ３上の４７９３位〜４９７１位の１７８塩基対のフラグメント）は、形質導入効率を増大させることが報告されており、安定な形質導入の効率を有意に増大するには不十分であることが見出された。本発明は、この小フラグメントが、安定な形質導入の効率を有意に増大させるには不十分であるが、米国特許第５，８８５，８０６号に記載されるような、より大きい５４５塩基対のフラグメント（ｐＮＬ４−３中の４４５１位〜５０９６位）またはこれを含むなおより大きいフラグメントが、本発明の一部として安定な形質導入を増大し得た。安定な形質導入効率の増大は、ＧＦＰ発現分析およびＦＡＣＳ分析、ならびにベクターゲノムの組み込まれたコピーのＴａｑｍａｎ分析によって検出された。
【０１２８】
形質導入効率を増大させるさらなる手段は、２０００年８月３１日出願の同時係属中の米国特許出願番号（いまだ割り当てられていない）（代理人事件番号３９７２７２０００４００）（これは、完全に示されるかのように、本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１２９】
本発明において使用されるウイルスベクターはまた、「偽型」形成から生じ得、異なるウイルスによる細胞の同時感染は、別のウイルスのエンベロープタンパク質の１以上を含む外層内にカプセル化された１種のウイルスのゲノムを含む、子孫ビリオンを生じる。この現象は、目的のウイルスベクターおよび少なくとも１種の別のウイルスのエンベロープタンパク質または細胞表面分子をコードする遺伝物質の両方を用いて、パッケージング細胞を同時トランスフェクションまたは同時感染させることによって、「偽型」ビリオン中に目的のウイルスベクターをパッケージングするために使用されてきた。米国特許第５，５１２，４２１号を参照のこと。このような混合ウイルスは、使用される１種以上の異種エンベロープタンパク質に対する抗血清によって中和され得る。偽型形成において一般に使用される１つのウイルスは、ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。偽型の使用は、使用される異種ウイルスのウイルス侵入機構のエレメントを含むことによって、ウイルスの宿主細胞範囲を広くする。本発明において使用されるウイルスベクターおよびＶＳＶの偽型化は、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を含む膜によって取り囲まれるヌクレオカプシド中にカプセル化されたウイルスベクター核酸を含むウイルス粒子を生じる。このヌクレオカプシドは、好ましくは、ウイルスベクターと通常関連するタンパク質を含む。周囲のＶＳＶ  Ｇタンパク質を含む膜は、このウイルスベクターをパッケージングするために使用される細胞からの放出の際に、ウイルス粒子の一部を形成する。パッケージング細胞の例は、米国特許第５，７３９，０１８号に記載される。本発明の好ましい実施形態において、このウイルス粒子は、ＨＩＶに由来し、そしてＶＳＶ  Ｇタンパク質によって偽型化される。ＶＳＶ  Ｇタンパク質を含む偽型ウイルス粒子は、両栄養性ウイルスベクターよりも高い効率を有する細胞型の多様なアレイに感染し得る。宿主細胞の範囲には、哺乳動物種および非哺乳動物種（例えば、ヒト、げっ歯類、魚類、両生類および昆虫）が含まれる。
【０１３０】
好ましくは、このベクターはまた、ベクターまたはベクターに含まれるサブクローニングされた配列が同定および選択される、いくつかの手段を含む。ベクターの同定および／または選択は、当業者に公知の種々のアプローチを使用して達成される。例えば、特定の遺伝子またはコード領域を含むベクターは、好ましくは、ハイブリダイゼーション、ベクター上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる所謂「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および／または特定の配列の発現によって同定される。第一のアプローチにおいて、ベクター中の特定の配列の存在は、関連の配列に相同な配列を含むプローブを使用するハイブリダイゼーション（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション）によって検出される。第二のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、特定のマーカー遺伝子機能（例えば、抗生物質に対する耐性、チミジンキナーゼ活性など）（これは、ベクター上に存在するこれらの機能をコードする特定の遺伝子によってもたらされる）の存在または非存在に基づいて同定および選択される。第三のアプローチにおいて、ベクターは、このベクターによってコードされる特定の遺伝子産物についてアッセイすることによって同定される。このようなアッセイは、遺伝子産物の物理的特性、免疫学的特性または機能的特性に基づく。
【０１３１】
従って、本発明はまた、ベクターを提供し、これはＤＮＡである場合、配列番号２、４、５、６、７、１５、１７および１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み、そしてＲＮＡである場合、配列番号４、５、６、７からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるヌクレオチド配列を含む。
【０１３２】
本発明はさらに、リボザイムを用いてベクターを生成する方法を提供し、このベクターは、野生型ヒト免疫不全ウイルスに由来し、そしてこのベクターの複製について許容性の宿主細胞においてのみ複製し得る。ベクター内に含まれるかまたはベクターによってコードされるリボザイムは、野生型ヒト免疫不全ウイルスの核酸を切断するが、ベクター自体および存在する場合にはその転写物を切断しない。この方法は、以下の工程を包含する：ベクターを得る工程であって、このベクターは、野生型ヒト免疫不全ウイルスに由来し、そしてこのベクターの複製について許容性の宿主細胞においてのみ複製し得る、工程、およびこのベクター中に核酸配列を組み込む工程であって、この核酸配列は、リボザイムを含むかまたはリボザイムをコードし、その触媒ドメインは、野生型ヒト免疫不全ウイルスの核酸を切断するが、ベクター自体および存在する場合にはその転写物を切断しない、工程。このような方法において、野生型ヒト免疫不全ウイルスのＵ５配列を含むかまたはコードするヌクレオチド配列は、ベクターから欠失され得、そしてベクターがＤＮＡである場合、配列番号２、５、６、１４（ここで、少なくとも１つのＮが変異している）、１５および１６からなる群より選択されるヌクレオチド配列、ならびにベクターがＲＮＡである場合、配列番号２、５、６、１４（ここで、少なくとも１つのＮが変異している）、１５および１６からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるヌクレオチド配列によって置換され得る。好ましくは、ベクターは、１回より多いこれらのベクターの複製を許容する宿主細胞において複製する。
【０１３３】
ベクターを改変する方法もまた、本発明によって提供される。この方法は、ベクターを得る工程、そしてベクターがＤＮＡである場合、配列番号２、２、３、４、５、６、１４（ここで、少なくとも１つのＮが変異している）、１５および１６からなる群より選択されるヌクレオチド配列、ならびにベクターがＲＮＡである場合、配列番号２、４、５、６、７、１５、１６、１７および１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるヌクレオチド配列を、ベクターに導入する工程を包含する。
【０１３４】
パッケージング細胞株を使用せずに条件付複製ベクターを増殖および選択的にパッケージングする方法が、本発明によりさらに提供される。この方法は、以下の工程を包含する：条件付複製ベクターを、別のベクターによって感染され得る細胞と接触させる工程であって、この別のベクターは、条件付複製ベクターと同じ型のベクターであり、そして複製コンピテンシーについて野生型であることによって条件付複製ベクターとは異なる、工程；引き続いて、この細胞を他のベクターと接触させる工程；および次いで条件付複製ベクターの増殖を導く条件下でこの細胞を培養する工程。上記で議論され、そして以下でより詳細に記載されるヘルパーベクターは、このような補完的ベクターの１つである。
【０１３５】
配列番号２、５、６、１４（ここで、少なくとも１つのＮが変異している）、１５および１６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、ならびに配列番号２、６、７、１５、１６、１７および１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子、からなる群より選択される単離および精製された核酸分子もまた、提供される。
【０１３６】
（使用方法）
上記ベクターは、好ましくは、ベクター維持を容易にするため、ならびに他の理由のために、ウイルス感染の予防的処置および治療的処置のために宿主細胞に導入される。従って、本発明は、本発明に従うベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞の単離、および／またはこの宿主細胞に由来するこのような細胞もしくは細胞株の培養物中での維持は、慣用的な事項になっており、当業者は十分精通している。
【０１３７】
特に、上記のような条件付複製ウイルスベクター、または好ましくはレンチウイルスベクターは、好ましくは、ウイルス感染の予防的処置および治療的処置において使用され、好ましくは、例えば、この感染は、野生型ウイルス、好ましくは野生型ＲＮＡウイルス由来であり、さらにより好ましくは、野生型レトロウイルス由来であり、そして最適には野生型ＨＩＶ由来である。
【０１３８】
この方法は、以下の工程を包含する：宿主細胞（この宿主細胞は、野生型ウイルスで感染され得る）を条件付複製ベクター（このベクターは、このベクターの複製について許容性の宿主細胞においてのみ複製し得、その存在、転写または翻訳は、宿主細胞中の野生型株のウイルスの複製を阻害する）と接触させる工程を包含する。望ましいことに、このベクターは、１回以上複製し、そして少なくとも１つの核酸配列を含み、その所有（すなわち、存在、転写または翻訳）は、野生型株のウイルスを上回る、宿主細胞における選択的利点をこのベクターに付与し、この野生型株は、最適には、このベクターが由来する株である。
【０１３９】
この方法に従って、この核酸配列は、好ましくは、遺伝的抗ウイルス剤（これは、このベクター以外のウイルスの複製および／または発現に悪影響を与える）を含むかまたはコードする、ヌクレオチド配列を含む。望ましいことに、この遺伝的抗ウイルス剤は、アンチセンス分子、リボザイムおよび免疫原からなる群より選択される。最適には、この遺伝的抗ウイルス剤は、リボザイムであり、好ましくは、その触媒ドメインは、３’ヌクレオチドＮＵＨ配列（すなわち具体的にはＧＵＣ配列）にて切断する。必要に応じて、リボザイムは、少なくとも一部、配列番号３および配列番号４からなる群より選択される配列によってコードされる。望ましいことに、このリボザイムは、野生型株のウイルスまたはその転写物の領域において切断するが、ベクターまたはその転写物の領域においては切断しない。好ましくは、これは、野生型株のウイルスが、配列番号１によってコードされる配列を含むからであるが、一方、ベクターが、ＤＮＡである場合、配列番号２、５、６、１４（ここで、少なくとも１つのＮが変異している）、１５および１６からなる群より選択されるヌクレオチド配列、なＲＮＡである場合、配列番号２、５、６、１４（ここで、少なくとも１つのＮが変異している）、１５および１６からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるヌクレオチド配列を含むからである。
【０１４０】
この方法はまた、望ましく実行され、ここで、このベクターは、少なくとも１つの核酸配列を含み、その所有（すなわち、存在、転写または翻訳）は、野生型株のウイルスが感染した細胞を上回る、このベクターが感染した宿主細胞における選択的利点をこのベクターに付与し、この野生型株は、最適には、このベクターが由来するウイルス株である。これに関して、ベクターは、少なくとも１つの核酸配列を含み得、この核酸配列は、このウイルスおよび少なくとも１つの核酸配列に感染した宿主細胞に対する選択的利点を付与し、このベクターが由来するウイルスに対応する野生型ウイルス株を上回る、ベクターに対する選択的利点を付与する。
【０１４１】
従って、この核酸配列が多剤耐性遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、好ましくは実行される。あるいは、この核酸配列が変異した（変異体）プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列および変異した（変異体）逆転写酵素をコードするヌクレオチド配列を含む方法が実行される（例えば、予防的または治療的に処置されるウイルス感染がレトロウイルスである場合）。
【０１４２】
この方法は、好ましくは、細胞傷害性薬物、プロテアーゼインヒビターおよび逆転写酵素インヒビターからなる群より選択される薬剤を宿主細胞に投与する工程をさらに（すなわちベクターの投与に加えて）包含する。
【０１４３】
従って、ベクターは、ウイルス感染を治療的に処置するだけでなく、ウイルス感染から潜在的宿主を保護（すなわち、ウイルス感染を予防的に処置する方法、または目的のウイルス（例えば、ＲＮＡウイルス、特にＨＩＶのようなレトロウイルス）に対する「ワクチン接種」）するために、上記の方法に従って使用され得る。この方法は、宿主細胞が野生型ウイルス株と接触する前に、野生型ウイルス株の複製を本質的に阻害する。これに関して、このベクターは、野生型ウイルスによる重複感染をブロックするタンパク質を含み得るかまたはコードし得る。この方法は、宿主細胞を、上記のような条件付複製ベクターおよび「ヘルパー発現ベクター」（すなわち、非感染宿主における「ベクター」の複製を促進するウイルスゲノム）に接触させる工程を包含する。条件付複製ベクターは、パッケージングおよび／または増殖のための選択的利点を含む。さらに、このベクターは、例えば、細胞生存を増強し得るか、ウイルス産生を促進し得るか、アポトーシスを誘導し得るか、タンパク質産生を促進し得るか、そして／または免疫機能および／もしくは標的化を促進し得る。「ヘルパー発現ベクター」構築物は、「ベクター」が複製できないことを補完する、任意の発現ベクターである。このようなヘルパー発現ベクターは、一般的であり、そして当業者に容易に構築される。ヘルパー発現ベクターは、ベクターのようにビリオンにパッケージングされ得るか、パッケージングを要さずに発現され得る。「ベクター」は、パッケージングおよび／または増殖について選択的利点を有するので、この系は、生きた弱毒化ウイルスが潜在的に引き起こし得る可能な病原性効果なしに、このウイルスの高い複製を達成するために安全な手段を提供する。さらに、このベクターは、免疫原性を増大するために、非特異的アジュバントと混合され得る。このようなアジュバントは、当業者に公知であり、そしてこのアジュバントには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、細菌細胞壁成分およびミコバクテリア細胞壁成分から構成されるエマルジョンなど。
【０１４４】
本発明の条件付複製ウイルスベクター、または好ましくはレンチウイルスベクターはまた、ウイルス感染の処置において免疫治療のために使用され得るか、または例えば、腫瘍形成障害の処置のために使用され得る。樹状細胞またはその前駆体（例えば、ＣＤ３４＋造血細胞または血液単球であるが、これらの細胞型に限定されない）ならびに他の抗原提示細胞は、主要エピトープ（これにより、宿主がウイルスのような外来因子に対する免疫応答を備える）を含むＨＩＶタンパク質またはタンパク質配列を発現するベクターを用いて形質導入され得る。ＨＩＶについてのこのようなタンパク質エピトープは、「ＨＩＶ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  １９９８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆａｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ＆Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（これは、完全に示されるかのように、本明細書によって援用される）に記載される。ＨＩＶエピトープタンパク質についての好ましい実施形態は、以下の実施例１４に示される、組み込まれたＣＴＬ配列または複合ＣＴＬ配列（またはそれらのフラグメント）である。同様に発現され得る他のエピトープは、他のウイルス、細菌、真菌、寄生生物、腫瘍細胞および遺伝子改変細胞に由来する。１つより多いエピトープは、１つのタンパク質配列に統合され得、その結果、タンパク質コード配列は、ひどく断絶するので、非免疫原性部位が排除されて、安全性の増大したベクターが作製される。断絶配列の好ましい実施形態は、免疫学的に適切なエピトープをコードする、変性断絶配列（必要に応じて、タンパク質構造を安定化するための適切なリンカーアミノ酸を含むかまたは含まない）である。変性配列の使用は、組換えの危険性を低減する。別の好ましい実施形態は、レトロウイルスＬＴＲ（例えば、ＨＩＶ−ＬＴＲ）により駆動されるスプライシングされたメッセージを介した、記載されるタンパク質配列（またはそのフラグメント）の発現である。
【０１４５】
しかし、ヒトの感染および疾患の処置におけるレトロウイルスベクターの使用について考慮すべきことは、複製コンピテントウイルス（ＲＣＶ）の生成の可能性である。ヘルパーベクターと条件付複製ベクターとの間の相同組換えは、おそらく、ＲＣＶ生成についての主な経路の１つである。従って、本発明は、相同組換えの可能性を最小化または排除するために、ヘルパーベクター構築物の改変を提供する。ヘルパーベクターと条件付複製ベクターとの二量体化、同時パッケージングおよび／または組換えの可能性を低減するように作用する任意の改変が、本発明によって意図される。
【０１４６】
本発明の実施形態は、１以上の抗ウイルスリボザイムまたはアンチセンス配列（必要に応じて、リボザイムに関して縦列に連結した、少なくとも２つのこのような配列として規定され、そしてアンチセンス配列に関して縦列に連結し、かつ標的化ベクター核酸の断絶領域に対して標的化される少なくとも２つの配列として規定される、カセット形態で）を、ヘルパー遺伝子コード配列の３’側であるが、転写終結部位の５’側に挿入することである。ベクターへのヘルパーゲノムの非特異的パッケージングが生じ得、おそらく、このようなパッケージングは、ベクター依存的である。従って、多数のストラテジーを使用して、ベクター粒子へのヘルパーベクターのパッケージング（これは、さもなければＲＣＶの潜在的生成における第一工程である）を減少し得る。
【０１４７】
好ましいヘルパー構築物としては、抗ベクターリボザイムまたは構造タンパク質コード配列もしくはエンベロープ（同種または異種の）コード配列の３’末端のアンチセンス分子が挙げられる。より好ましいヘルパー構築物としては、抗ベクターリボザイムまたは構造タンパク質コード配列およびエンベロープコード配列の３’末端へのアンチセンス分子が挙げられる。この核酸配列がアンチセンス分子である場合、これは、細胞性ヌクレアーゼによって、同時局在する二本鎖ベクター−ヘルパー分子を破壊するために、共に細胞内で作用し得る。このヘルパーが、ベクターＲＮＡと共にウイルス粒子へとパッケージングされる場合、これらの分子は、完全な逆転写を経てＲＣＶを生成することができない。
【０１４８】
別の好ましい実施形態は、ベクターの核酸から離れて、ヘルパー核酸の異なるトラッキングまたは局在を促進するヘルパー構築物上に配列を置く。例としては、これらに限定されないが、異種イントロンおよびポリＡ配列を、ヘルパー構築物中に含むことである（例えば、図６に示される）。これらの配列は、異なる細胞位置または細胞下位置への、ベクター核酸およびヘルパー核酸の異なるトラッキングを促進する。好ましくは、生成されたベクターの力価は、１００倍以下の影響を受け、より好ましくは１０倍以下、そして最も好ましくはこのようなヘルパー改変によって影響を受けない。
【０１４９】
図７は、１つのリボザイム（ｐＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ）の存在、またはリボザイムおよびヘルパーＲＮＡの細胞トラッキングに影響を与えるように設計されたイントロン（ｐＶｉｒＰａｃ１．２ＲｚＩｎ）の存在が、ベクター力価に対して有意な影響を有さなかったことを示す。図１２は、同時パッケージングされたヘルパー構築物についての力価サンプルのＰＣＲ分析が、リボザイムの非存在下での高い同時パッケージングに対して、リボザイムの存在下で減少した同時パッケージングを示した。２つのリボザイムの存在は、ベクターウイルス粒子へのヘルパーベクターの同時パッケージングを完全に防止した。従って、本発明は、ヘルパーベクターの同時パッケージングを低減または排除することによって、高いベクター力価を生じるため、およびこのようなベクターの安全性を改善する両方のための、２つのプラスミドパッケージング系を使用する有効な手段を含む。
【０１５０】
このデータは、ビリオンへのヘルパーパッケージングがランダムではなく、ベクター依存性であることを示唆する。ベクターの核酸とのヘルパー核酸の同時パッケージングを防止するための代替的な好ましい実施形態は、ヘルパー配列およびベクター配列の会合に重要な領域においてヘルパー構築物を変性することである。このアプローチは、ヘルパー配列を完全に変性させてヘルパー配列およびベクター配列の同時パッケージングを防止することによって、さらに改変され得る。
【０１５１】
例えば、ヘルパーベクターのヌクレオチド配列は、一部または全部のいずれかで変性され得る。このような変性は、ヘルパーベクターと条件付複製ベクターとの相同対合および相同組換えの可能性をかなり低減または排除するが、このヘルパーベクターが、ウイルス複製およびウイルスパッケージングについて必要なタンパク質産物をコードする能力に影響を与えない。この変性は、全ての可能な遺伝子、およびヘルパーベクターと条件付複製ベクターとの間で相同であるか、または特定の遺伝子に、もしくは特定の遺伝子内に、より特異的に標的化されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）あるいはヘルパーベクター内のＯＲＦにおいて、指向され得る。１８ヌクレオチド長より長い配列相同性の欠如が十分であるはずなので、相同組換えの可能性を低減するために完全な変性は必要でないことに留意すべきである。１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７または６ヌクレオチド以下が配列間で同一であるようなレベルまでのこのような変性は、組換えを抑制または防止する。これらの配列は、所望の場合、ヒトまたは特定の細胞型での優先的発現を有するコドンを使用して変性され得る。
【０１５２】
例として、ｇａｇ、ｒｅｖおよび／またはｔａｔをコードするヌクレオチド配列は、全部または一部のいずれかが変性され得る。他の例としては、ｇａｇ配列の最初の４２ヌクレオチド、ｒｅｖ配列の最初の２０８ヌクレオチド、ｔａｔ配列の最後の１８３ヌクレオチド、Ｐｏｌ配列の最後の５４５ヌクレオチドの変性が挙げられる。このような変性を有するヘルパーベクターの例は、ｐＶｉｒＰａｃ１．２、ｐＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ、ｐＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ２およびｐＶｉｒＰａｃ１．２ＲｚＩｎまたはこれらの誘導体である。もちろん、任意の他のウイルス遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列がまた、本発明に従って変性され得、それにより、相同組換えの可能性を減少、最小化または排除し得る。
【０１５３】
本発明の代替的実施形態は、２つのベクターが同時局在するか、同時パッケージングされるかまたはその他の対合をする事象において、条件付複製ベクターを標的化および変性する、ヘルパーベクター中のエレメントの組み込みである。リボザイムは、このようなエレメントの例である。条件付複製ベクターを選択的に標的化する任意のリボザイムが、本発明によって意図される。複数のリボザイム（例えば、本明細書中に記載されるような二重リボザイムカセットまたは三重リボザイムカセット）もまた、使用され得る。例えば、このリボザイムは、条件付複製ベクターのＵ５領域（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２または条件付複製ベクターにおいて使用される別のレトロウイルスのＵ５領域）を標的化し得る。条件付複製ベクターの切断は、条件付複製ベクターとの組換え事象によりＲＣＶ（これは、２つのベクターが同時パッケージングされる場合に生じ得る）が生成されることを防ぐ。リボザイムを含むヘルパーベクターの例は、図６に示されるような、ｐＶＩＲＰＡＣ−１．１ＲｚおよびｐＶＩＲＰＡＣ−１．２Ｒｚ２である。
【０１５４】
本発明のなお別の実施形態は、任意のレトロウイルスＲＲＥを含むが、好ましくは別のレンチウイルスＲＲＥを含む、ヘルパーベクターにおける異種ＲＲＥの置換（例えば、ＨＩＶ−２  ＲＲＥのＨＩＶ−１  ＲＲＥ、ＣＴＥまたはＰＲＥでの置換）である。このアプローチは、異なる配列を有する異なるＲＲＥに基づく、相同組換えの可能性の減少、最小化または排除に寄与する。本発明に従うこのような置換のさらなる利点は、約５倍程度高い条件付複製ベクターの生成における、驚くべき予期せぬ増加である。理論に縛られることなく、ヘルパーベクターと条件付複製ベクターとの間の異なるＲＲＥの存在は、量において限定され得る１以上の異なる細胞性因子によって結合され得る。従って、異なるＲＲＥの使用は、限定された細胞性因子について、２つのベクター間での競合を低減し得る。ＨＩＶ−１ベースのレトロウイルスベクターをパッケージングするためにＨＩＶ−２  ＲＲＥを含むヘルパーベクターの例は、図６に示されるような、ｐＶＩＲＰＡＣ−１．２およびｐＶＩＲＰＡＣ−１．２Ｒｚ２である。
【０１５５】
なお別の実施形態は、異種ｅｎｖタンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇ、狂犬病Ｇタンパク質、ＧａＬＶ、アルファウイルスＥ１／２糖タンパク質、またはネコ内因性ウイルス由来のｅｎｖタンパク質であるＲＤ１１４）をコードするヌクレオチド配列のヘルパーベクターへの組込みである。これは、条件付複製ベクターが、異種ｅｎｖタンパク質を有する粒子へとパッケージングされるのを可能にする。さらに、リガンドは、必要に応じてエンベロープタンパク質に挿入されて、所望の場合、形質導入の間の標的細胞の刺激を促進し得る。エンベロープタンパク質を改変することは、その結合能力を破壊し得るので、好ましい実施形態は、生成の間の未改変の偽型化エンベロープタンパク質と共にキメラエンベロープタンパク質を含む、両方の改変リガンドを発現することである。従って、両方の型のエンベロープタンパク質が細胞表面上に存在し得、一方は標的細胞を刺激するため、他方は結合および侵入を媒介するために存在する。細胞刺激のためのキメラレセプターもまた発現する好ましい偽型化レンチウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質およびＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質である。より好ましいキメラエンベロープタンパク質は、キメラＶＳＶ−Ｇ／ＲＤ１１４キメラエンベロープタンパク質である（図１４Ａおよび１４Ｂを参照のこと）。ＶＳＶ−Ｇとのキメラを作製するための他の好ましいタンパク質（またはそのフラグメント）としては、ノッチ、デルタ、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯ、Ｋｉｔリガンド、ＣＤ３に結合するリガンド、ＣＤ２８に結合するリガンドおよびＧＭ−ＣＳＦに結合するリガンドが挙げられる。
【０１５６】
異種ｅｎｖタンパク質をコードする配列は、必要に応じて、ウイルスパッケージングのためのｅｎｖタンパク質のより多量の補充を確実にするために、第二の誘導性プロモーターと作動可能に連結され得る。このアプローチは、さらに、特にｅｎｖタンパク質産生が律速因子である条件下で、ウイルス産生をさらに増加させ得る。この異種ｅｎｖタンパク質コード配列は、他の補完的ウイルスタンパク質と同じヘルパーベクター上に含まれるか、または別個のベクター上に含まれるかのいずれかであり得る。必要に応じて、これはまた、産生宿主細胞または産生宿主細胞株中に組み込まれ得る。
【０１５７】
本発明のさらなる実施形態は、ヘルパーベクター上のスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位の選択的位置づけであり、その結果、特定のウイルス成分の選択的スプライスアウトは、条件付複製との相同組換えの可能性を最小化または排除するために働く。例えば、スプライス部位は、ＲＲＥおよび／またはスプライシング事象の結果としてのパッケージングシグナルもしくは二量体化シグナルの欠失を可能にするように位置し得る。従って、核酸が発現されるかどうかの関係は、ベクター中のスプライス部位の配置によって制御され得る。例えば、スプライス部位は、リボザイムまたはアンチセンス配列に対して遠位に位置づけられ得、その結果、リボザイムまたはアンチセンスは、例えば、未スプライスであるがスプライスされていないＲＮＡに組み込まれる。あるいは、リボザイムまたはアンチセンスは、目的が、特定のサブタイプではなく、全てのｍＲＮＡ分子からリボザイムまたはアンチセンス分子を発現することである場合、このリボザイムまたはアンチセンスは、スプライス部位の下流に配置され得る。
【０１５８】
ベクターがウイルス感染の予防処置のような上述の方法に従って使用される場合、このベクターは、野生型ウイルスによってコードされないタンパク質（例えば、変異ウイルスタンパク質または非ウイルスタンパク質）である抗原をコードし得る。従って、このベクターによってコードされる抗原は、例えば、細菌起源、または癌細胞起源であり得る。さらに、条件付複製ウイルスベクター、または好ましくは、レンチウイルスベクターもまた、宿主免疫系に対する抗原の適切な提示のためにＭＨＣ遺伝子をコードし得る。従って、このようなベクターは、潜在的な病原体および／または異常な細胞において選択的に発現される内因性タンパク質（例えば、腫瘍特異的抗原）の多様なアレイに対する持続的な免疫学的応答を促進するために使用され得る。
【０１５９】
上記のような例は、免疫治療のための樹状細胞に対する抗原送達に対して、本発明の使用を制限しない。対照的に、本発明は、任意の所望される細胞型において、目的の任意の遺伝子が送達され、そして発現されるための手段および方法を提供する。さらに、本発明はまた、複数の遺伝子が、単一ベクターによって送達され、そして発現されることを可能にする。複数の遺伝子は、遺伝子発現のために任意の適切なストラテジーを使用することによって発現され得る。非限定的例は、発現されることが必要な第１の遺伝子に対して遠位に位置し得る内部リボソーム侵入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ；ＩＲＥＳ）の使用である。好ましい例は、改変体ＭＧＭＴ遺伝子の遠位にあるＩＲＥＳ配列に対して目的の遺伝子を発現することである。より好ましいベクターの実施形態は、目的の遺伝子および目的の遺伝子に連結したＩＲＥＳを、スプライシングされたメッセージから離れた、非改変ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターまたは改変ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターから発現する。さらに好ましいベクターは、非改変ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターまたは改変ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターから２つの目的の遺伝子を発現し、このプロモーターは、改変されている場合、転写因子に結合する配列において改変されている。当然のこととして、任意の非改変レンチウイルスＬＴＲまたは改変レンチウイルスＬＴＲは、ＨＩＶ  ＬＴＲに加えて使用され得る。
【０１６０】
別の非限定的例は、ＨＩＶに由来するスプライシング部位を使用して目的の遺伝子をＨＩＶ−ＬＴＲから発現することである。例えば、１つの目的の遺伝子は、Ｎｅｆスプライスアクセプター部位から発現され得るが、目的の第２の遺伝子はＴａｔスプライスアクセプター部位から発現され得る。この方法において、ＩＲＥＳエレメントを必要性とすることなく、２つの遺伝子が発現され得る。Ｔａｔ遺伝子、Ｒｅｖ遺伝子、Ｖｉｆ遺伝子、Ｖｐｒ遺伝子、Ｖｐｕ遺伝子、Ｎｅｆ遺伝子およびＥｎｖ遺伝子のスプライス部位を含む、任意のスプライス部位が使用され得る。Ｅｎｖタンパク質は、単独でスプライシングされたメッセージから発現されるので、このスプライス部位を介して目的の遺伝子を発現することは、目的の遺伝子の有意な発現が必要とされる場合に、Ｒｅｖを必要とし得る。さらに、ＨＩＶ−ＬＴＲからの発現は、所望される場合、ＴａｔおよびＲｅｖに依存的となり得る。
【０１６１】
さらに、「ヘルパーウイルス」（これはまた、本明細書中で「ヘルパー」と呼称される）発現ベクターは、細胞特異的ベクターな複製および伝播を可能にする（ベクターまたはヘルパーウイルス発現構築物のいずれかの中の）特定の遺伝的エレメント／遺伝的因子を付加または除去することにより、特定の細胞型（例えば、幹細胞、専門的な抗原提示細胞、および腫瘍細胞）においてのみ発現するように操作され得る。従って、このベクターは、ヘルパーウイルス構築物での補完によって、なお伝播するが、特定の遺伝的エレメント／遺伝的因子が、ベクターまたはヘルパーウイルス発現構築物に付加されるか、またはそれらから除去されるかに依存して、この伝播は細胞特異的である。これは、単独または、上述のストラテジーのうちの他のものと組み合わせて使用され得る。
【０１６２】
例えば、条件付複製ＨＩＶベクターは、Ｔ細胞ではなくマクロファージにおいて特異的に複製するように設計され得る。Ｔａｔ欠損ＨＩＶを構成するベクター（このベクターは、他のＨＩＶタンパク質をコードするが、Ｔａｔ転写トランスアクチベーターの非存在に起因して発現されない）は、野生型ＨＩＶを切断するが、条件付複製ＨＩＶ  ＲＮＡを切断していないリボザイムをコードし得る。このベクターのためのヘルパー発現ベクターは、マクロファージ特異的プロモーターのから発現するｔａｔ遺伝子をコードし得る。従って、ｃｒＨＩＶは、マクロファージ細胞においてのみ条件的に複製するが、Ｔ細胞または他の細胞型において複製することはできない。
【０１６３】
あるいは、ｔａｔ遺伝子は、腫瘍特異的プロモーターに作動可能に連結され得；従って、次いで、ｃｒＨＩＶは腫瘍ＣＤ４細胞においてのみ複製し、正常ＣＤ４細胞では複製しない。遺伝的エレメント／遺伝的因子はまた、ベクターのプロモーター配列の、「ヘルパー−ウイルス」発現構築物と協力して特定の細胞型において発現されるのみであり、他の細胞型では発現しないような改変であり得る。
【０１６４】
別の実施形態において、このヘルパー−発現構築物またはベクター構築物のエンベロープタンパク質は（このような構築物が、エンベロープタンパク質を含むように操作される場合）、ベクター−ビリオンが特定の細胞型（例えば、腫瘍細胞）に特異的に感染するが、他の細胞型（例えば、正常細胞）に感染できないように改変され得る。なお別の実施形態において、アデノウイルス（１つまたはいくつかの主要な複製要因を欠いている）は、ヘルパー構築物（腫瘍特異的プロモーターに連結されるこのような因子を提供する）を用いることによって補完され得る。従って、アデノウイルスの複製を補完する因子は、腫瘍細胞においてのみ発現し、これによって（細胞を殺傷するために必要とされるタンパク質の発現を伴って）腫瘍細胞においてウイルス複製を可能にするが、正常細胞では可能にしない。
【０１６５】
さらなる実施形態において、ベクターは、ネガティブ選択薬物として、ＢＣＮＵ（またはＢＣＮＵの機能的アナログ）のようなＯ６−グアニンアルキル化因子（しかし、これに限定されない）を使用することによって、細胞の殺傷のためのネガティブ選択遺伝子を発現し得る。ＭＧＭＴ遺伝子に標的化されたアンチセンスまたはリボザイムを発現するレンチウイルスベクターは、正常細胞に送達され得る。後の所望の時点で、細胞は、ベクターを形質導入した細胞を殺傷するために、ＢＣＮＵまたはそのアナログを用いて、エキソビボまたはインビボのいずれかで処理され得る。好ましい実施形態において、正常細胞は、予防的にベクターを発現するＭＧＭＴアンチセンスで形質導入され得、そしてこの細胞が異常になった場合、後に殺傷される。この後者のアプローチの例は、形質導入された細胞が癌になり、次いで、ＢＣＮＵまたはその機能的アナログでの細胞の処理によって殺傷され得る場合である。別の好ましい実施形態は、Ｕ１プロモーター由来であり、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ内に含まれる抗ＭＧＭＴアンチセンスまたはリボザイム分子を発現することである。なおより好ましい実施形態は、造血細胞（例えば、リンパ球、幹細胞および樹状細胞）の集団中に抗ＭＧＭＴレンチウイルスベクターを形質導入することである。
【０１６６】
別の好ましい実施形態において、正常細胞は造血細胞であり、好ましくは、同種異系間宿主への移植の前に、ベクターを用いて形質導入されたＴ細胞である。このような細胞は、この細胞が宿主に対して有害になった場合（例えば、移植片対宿主反応が生じた場合）、ＢＣＮＵまたはその機能的アナログでの処置によって殺傷され得る。なお別の実施形態において、レンチウイルスベクターを発現する同一の抗ＭＧＭＴアンチセンスまたはリボザイムが、混合した細胞集団から所望でない細胞をパージするために使用され得る。非限定的な例は、移植のために準備される、癌細胞で汚染された骨髄の場合である。腫瘍細胞は、形質導入の単一ラウンドにおいて比較的低いＭＯＩで非常に効率的に形質導入されることが観察されている（図１３Ａを参照のこと）。対照的に、正常細胞（特に、ＣＤ３４＋造血幹細胞であるが、これに限定しないが）は、効果的に形質導入することがより困難であり、高い効率のために形質導入の複数ラウンドを必要とする（図１３Ｂを参照のこと）。それゆえ、魅力的なパージストラテジーは、正常細胞ではなく汚染した腫瘍細胞を効率よく形質導入するＭＯＩを使用して、ベクターを含む抗ＭＧＭＴアンチセンスを用いる、汚染された骨髄の形質導入を介する。この例は、エキソビボ用途または単に癌関連適用のいずれかに、本発明の範囲を制限しない。他の適用は、インビボでの選択的遺伝子送達（特に、脳の癌の処置であるが、これに限定されない）および任意の他の疾患を含み、ここで、病的な細胞と正常細胞との間に形質導入の差示的な効率が存在し、これは本発明による標的化のために活用され得る。
【０１６７】
従って、本発明はまた、癌を処置する（特に、Ｔ細胞白血病を処置する）方法を提供する。本発明によると、「癌を処置する（こと）」は、治療的応答をもたらす目的のために本明細書に記載されるような、さらに改変されたベクターを宿主細胞に投与すること含む。このような応答は、例えば、腫瘍増殖の減退および／または腫瘍退行をモニターすることによって評価され得る。「腫瘍増殖」は、腫瘍の大きさおよび／または腫瘍の数における増大を含む。「腫瘍退行」は、腫瘍質量（ｍａｓｓ）の減縮を含む。
【０１６８】
本発明によると、「癌」は、異常な細胞増殖および接触阻止の非存在によって特徴付けられる癌を含み、これは、腫瘍形成によって証明され得る。この用語は、腫瘍に位置付けられる癌および腫瘍に位置付けられない癌（例えば、浸潤によって腫瘍から局所的にか、または転移によって全身的に拡大した癌細胞のような）を含む。理論的には、任意の型の癌が本発明に従う処置のために標的化され得る。しかし、好ましくは、癌はウイルス起源である。
【０１６９】
最後に、上記のベクターは、インビボでの遺伝子治療のために直接使用され得る。遺伝子治療のための現在のストラテジーは、大きな割合の細胞への遺伝子送達を媒介できないので、苦悩している；特定の割合の細胞のみが感染される。これは、全体の腫瘍集団の遺伝子形質導入が重要である抗腫瘍ストラテジーにおいて特に重要である。「ヘルパー」と協力して「ベクター」を添加することによって、直ちに形質転換された細胞が隣接する細胞に感染し得るウイルス粒子を産生し、従って、高くかつ可能な完全な形質導入効率が可能である。本発明についての１つの実施形態において、ヒトレトロウイルス（これは、ＨＩＶまたはレトロトランスポゾンエレメントであり得る）は、「ヘルパー」構築物と共に組織内（またはインビトロの細胞）に送達され得る。ベクターおよびヘルパーを隣接して（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ）含む細胞は、ウイルスを産生し、そしてベクターをビリオン中に条件的にパッケージする。これらのビリオンは、隣接細胞の形質導入を高い効率で媒介し得る（細胞−細胞接触は、細胞を形質導入するための最も効果的な手段であるので）。迅速に形質転換された細胞は、ベクター／ヘルパーの組合せが細胞溶解性感染を生じるか否かに依存して、死滅してもしなくてもよい。レトロトランスポゾンの場合、正常または腫瘍細胞は、ビリオン中にキャップシド形成するために必要な特定のタンパク質／因子を含み得るので、ヘルパーは構造タンパク質を含む必要はないかもしれない。この場合、ヘルパーは単なるトランスアクチベータータンパク質（これは、レトロトランスポゾンキャプシド形成にとって必要とされる因子の転写を活性化する）であり得るが、これに限定されない。ＨＩＶの場合、他の因子は、必ずではないが、細胞の感染／形質転換のための子孫ビリオン中へのＨＩＶゲノムのキャプシド形成のために必要とされ得る。
【０１７０】
上記のベクターはまた、反生物学的および反化学的戦闘ストラテジー（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗａｒｆａｒｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）において使用され得る。例えば、条件付複製ベクターは、非常に病原性のウイルスまたは細菌あるいは化学薬剤（例えば、毒素）に最近感染した個体に送達され得る。このベクターは、先に記載されるように、病原性ウイルスの複製を妨害する。しかし、条件付複製ベクターはまた、ヘルパー発現ベクター（「ヘルパー」）と協力して抗細菌または抗化学的ストラテジーのために使用され得る。
【０１７１】
例えば、条件付複製ベクターは、「ヘルパー」がその発現および増殖を可能にした後に、抗菌抗体または抗毒素抗体を分泌し得る。「ヘルパー」は、必要ではないが、細菌、サイトカイン（細菌感染に応答して）、抗生物質（テトラサイクリン誘導可能プロモーター系（Ｐａｕｌｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，６２−６７（１９９６）と共に）あるいは化学物質（例えば、毒素それ自体）によって活性化される際に、その発現を可能にする誘導性プロモーターから外れ得る。従って、条件付複製ベクターは、被った病原体または毒素に応答して「ヘルパー」の補助を伴って選択的に増殖する（ヘルパー活性化の結果として）だけでなく、腫瘍抗原、病原体または化学物質（例えば、毒素）の病理学的効果を阻害するために抗病原体抗体または抗毒素抗体もまた分泌する。従って、任意のタンパク質、因子、または遺伝的要素（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のいずれかに転写され得る）は、「ヘルパー」と協力して病原的応答を阻害するために、条件付複製ベクター中に挿入され得る。これは、このベクターの選択的増殖および発現を促進する（なぜなら、ヘルパーの産物は、条件付（例えば、限定しないが、（ａ）誘導性プロモーター系−−腫瘍細胞中の因子は、ヘルパー因子の産生、またはヘルパー因子を発現する毒素応答性配列を活性化する、（ｂ）ヘルパーＲＮＡ／タンパク質／因子は、特定の細胞において選択的に安定化され、そして他の細胞では安定化されない、ならびに（ｃ）ヘルパーウイルスタンパク質の産生、シャペロニング、標的化、構造または他の生物機能に影響を与える第３群遺伝子の間接的な誘導）に発現されるので選択的である）。このようなストラテジーは、病原から植物および動物を保護するために、トランスジェニック植物および動物において使用され得る。同様に、このようなストラテジーは、価値のある異種のタンパク質／因子を生成するためにトランスジェニック系において使用され得る。
【０１７２】
本発明に従う方法の別の実施形態において、細胞株は、例えば、タンパク質／因子のどの部分が特定の機能について重要であるかを決定するために、薬物／因子をスクリーニングするために開発され得る。ベクターは、所定の細胞株内で目的の変異誘発したタンパク質を発現させるために作製され得る。しかし、変異誘発したタンパク質をコードするＲＮＡは、例えば、サイレント点変異の挿入によってリボザイムに対する耐性を生じさせる。しかし、野生型タンパク質発現は、細胞株内で阻害される。目的のタンパク質に対するリボザイムを発現するベクターはまた、変異試験タンパク質を発現するように構築され得る。ベクターが細胞内に形質導入される場合、正常タンパク質をコードする大部分のネイティブＲＮＡは切断されるが、変異試験タンパク質は発現される。この方法は、所定のタンパク質がどの程度機能するか、そして所定のタンパク質が因子／薬物とどの程度相互作用するかを決定するための、迅速かつ強力な方法として、最近開発された送達技術および選択技術と一緒に使用され得る。
【０１７３】
血液−骨疾患を処置するためのベクターの適用のための、なお別の実施形態において、患者は、血液から十分な量の白血球を抽出するように、白血球除去を受ける。白血球除去の後、所望される細胞は単離され、ベクターで形質導入され、次いで所望の細胞数まで培養物中で増殖される。所望の細胞型のエキソビボでの増殖の間、十分な量の所望される細胞型の増殖と同時発生的な期間の間に、これらの細胞を破壊することを目的として、所望の細胞型上の細胞表面タンパク質に標的化された抗体が患者に注入される。次いで形質導入された細胞は、インビボでの抗体媒介性の細胞の損失について補償するために患者に再注入される。
【０１７４】
上記を実施する好ましい手段は、白血球除去した材料からのＣＤ４＋Ｔ細胞の単離、次いでＨＩＶベクター（エキソビボでの増殖に対する抗ＨＩＶアンチセンス配列またはリボザイム配列を含む）で細胞を形質導入することによる。細胞のエキソビボでの増殖の間、患者の内因性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、例えば、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｍｅｒｉｅｕｘ  Ｓｅｒｕｍｓ  ｅｔ  Ｖａｃｃｉｎｓ，Ｌｙｏｎ，ＦｒａｎｃｅおよびＳａｎｇＳｔａｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡによって市販される）またはＡｔｇａｍ（Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ，ＵＳＡ）の投与によって破壊されるが、任意の細胞減少性抗体は、当該分野の通常の開業医にとって明らかな適切なスクリーニングの後に使用され得る。増殖後、次いで、形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞は、患者に再び注入し戻される。好ましい実施形態において、ＣＤ４ポジティブ細胞の単離の間に獲得されるＣＤ４ネガティブ細胞は維持され、凍結され、そして形質導入したＣＤ４ポジティブ細胞が患者に再び注入されるとき、注入のために解凍される。
【０１７５】
上記の例は、ＡＴＧもＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれに対しても本発明の範囲を制限しない。任意の細胞型は、この細胞上の細胞表面タンパク質に結合して、そして細胞破壊的である抗体の使用によって標的化され得る。抗体は、患者に外因性に導入され得るか、または抗体をスクリーニングする第２のベクターが体内に導入され得る。このベクターは構成的に（細胞の寿命にわたって）、一過性に（例えば、インテグラーゼ  マイナス（−）  ベクターであるが、これに限定されない）または誘導性（例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター系であるが、これに限定されない）のいずれかで抗体を生成し得る。
【０１７６】
本発明のなお別の実施形態において、本発明の任意のベクターが、ウイルスＤＮＡの産生を阻害することによって増殖性のウイルス複製を防止または阻害するために使用され得る。理論によって束縛されないが、このような妨害は、ＤＮＡの産生または複製（逆転写過程またはＤＮＡポリメラーゼ媒介複製における第１または第２のＤＮＡ鎖合成のような）の破壊、宿主細胞のゲノム内へのウイルスＤＮＡ組み込みの阻害、あるいは、ウイルスＤＮＡの分解または不安定性の増大によってなされ得る。
【０１７７】
ウイルスＤＮＡは、ウイルスライフサイクルの一部分として産生される任意のＤＮＡである。非原的な例としては、レトロウイルス（レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含む）、ヘルペスウイルスおよびヘパドナウイルスが挙げられる。宿主細胞ゲノム中への組み込みを含むライフサイクルを有するウイルスについて、ウイルスＤＮＡはまた、宿主細胞ゲノム中に組み込まれるか、またはすでに込みまれているウイルスゲノムの形態をいう。
【０１７８】
ウイルス組み込みを直接的に阻害するために、本発明は、それらの複製サイクルにおいて組み込み工程を有するそれぞれのウイルスベクターの使用を含む。好ましくは、ベクターの組み込みは、ウイルス感染の前に生じる。ベクターの組み込みは、好ましくは、１より大きく、より好ましくは、約２〜約１０、約２〜約２０、または約２〜約５０の感染多重度（「ＭＯＩ」）でもたらされる。約１００または２００までのＭＯＩはまた、高度に濃縮したベクター調製物と共に、そして細胞型に依存して使用され得る。約２〜約２０、約２〜約１５、約２〜約１０または約２〜約５のＭＯＩ値が特に好ましい。これらの値は、初代細胞との使用に適切である。このような値の治療的適用は、インビボまたはエキソビボで宿主細胞を処理すること、次いで、患者または被験体にそれらを導入または戻すことによって実施され得る。
【０１７９】
このベクターはまた、抗ウイルス性遺伝的負荷を含むように構築され得るか、またはこれを必要としない場合、このような負荷を欠くように構築され得る。さらに、ベクターは、野生型ウイルス（ウイルスベクターが由来するウイルスとは異なる）のウイルスＤＮＡの産生を阻害するために使用され得る。例えば、ヒト免疫不全ウイルス由来のベクターは、肝細胞において、Ａ型肝炎ウイルスＤＮＡまたはＢ型肝炎ウイルスＤＮＡの産生または組み込みを阻害し得る。
【０１８０】
ウイルスＤＮＡ産生の阻害が生じる機構に関して、いずれの理論にも束縛されずに、そして以下の図１９および実施例１２に示されるように、ベクターは、感染性ｗｔ−ＨＩＶの侵入による野生型ＨＩＶ−１（ｗｔ−ＨＩＶ）ＤＮＡ形成を阻害し、野生型ウイルスにそのライフサイクルにおいて重要な工程を与えないことによって、増殖的野生型複製を防止する。図１９は、ＨＩＶベースのベクター（上記のようなｃＰＴ２）の、初代ヒトＣＤ４  Ｔリンパ球に導入されたｗｔ−ＨＩＶのＤＮＡ形成に対する影響を示す。この図において使用された、ｗｔ−ＨＩＶを検出する方法はまた、ＤＮＡの組込み形態をも検出するので、このベクターは、その組込みを（例えば、ＨＩＶ組込み部位を飽和状態にすることによって）防止し、従って、このベクターが分解させるかまたはさもなければ細胞から失わせることによって、ｗｔ−ＨＩＶ  ＤＮＡ形成を妨害し得る。
【０１８１】
本発明はまた、ウイルスベクターの使用に限定されないが、その代わり、ウイルスのライフサイクルにおける任意の時点で、増殖的ウイルス感染（野生型ウイルス組込みまたは増殖的複製を含む）を阻害する他の抗ウイルス剤（例えば、薬物レジメン）と併用され得る。代替的かつ補完的な（例えば、薬物＋ベクター併用）様式によって野生型ウイルス組込みを防止することは、ベクターをあまり必要としないが、なおインビボで増殖的ウイルス複製を効果的に阻害する、併用ベクターおよび薬物用量を可能にする。
【０１８２】
本発明のインビトロでの方法およびベクターの多数の用途もまた存在する。例えば、これらのベクターは、ウイルス複製およびリボザイム機能の特定のニュアンスを確認するために使用され得る。同様に、リボザイム含有ベクターは、例えば、疾患細胞に存在する変異を評価するため、または遺伝的変動を試験するために、診断ツールとして使用され得る。これらのベクターはまた、遺伝子の機能が以前に既知であるか、未知であるか、または単に示唆もしくは意図されているかにかかわらず、この遺伝子の機能を決定または確認するために使用され得る。この上記の考察は、本発明の使用に関して決して包括的ではない。
【０１８３】
（発明の利益）
ＡＩＤＳおよび他の疾患の遺伝子治療処置のためにｃｒＨＩＶストラテジーを使用する利点は、かなりのものである。例えば、ベクターをＨＩＶ感染細胞に標的化する問題が解決される。感染ＣＤ４＋細胞へのｃｒＨＩＶのインビボトランスフェクション後、ｃｒＨＩＶは、内因性感染性ＨＩＶエンベロープタンパク質を使用して、子孫ビリオンへとパッケージングされる。従って、ｃｒＨＩＶ  ＲＮＡは、子孫ビリオンの内側に沿ってタグ化し、そして特定のＨＩＶ株によって通常は感染されない細胞型に感染して、非病原性ビリオンを生成する。このことは、細胞（例えば、脳の小グリア細胞（これは、中枢神経系のＨＩＶ感染についての主要な受け手である））を標的化するための困難を含む。ｃｒＨＩＶベクターによって、ウイルスタンパク質はコードされていないので、おそらく、未感染ＣＤ４＋細胞に感染するｃｒＨＩＶベクターに伴う毒性は、ほとんどない。さらに、野生型ＨＩＶとのｃｒＨＩＶベクターの競合の結果として、減少したウイルス負荷を生じる非病原性粒子の産生が生じる。病原性ＨＩＶ−１負荷を減少させることは、感染個体の生存時間を増加させるだけでなく、未感染の個体に対する伝達速度を減少し得る。なぜなら、ｃｒＨＩＶ粒子もまた、全身的に伝播するからである（すなわち、感染性ＨＩＶが行うように）。血液中の減少した病原性ＨＩＶ−１負荷は、妊娠中にＨＩＶ感染した個体において特に重要であり得る。なぜなら、ｃｒＨＩＶの産生はまた、子宮内における感染母体から胎児へのＨＩＶ−１の伝達を減少させ得るからである。
【０１８４】
宿主細胞にｃｒＨＩＶベクターを導入するために使用され得るプラスミドＤＮＡ／脂質混合物は、製造のために、安定であり、かつ高価なエキソビボストラテジーを回避するように安価であるべきである。もちろん、本発明の方法は、所望されるべきエキソビボの遺伝子送達のためにも使用され得る限りは、本質的に可変的である。それにもかかわらず、リポソーム媒介性のアプローチの利用可能性は、しばしば現在の遺伝子治療ストラテジーに適さない、一般集団の処置のための可能性を開いている。ｃｒＨＩＶベクターはまた、いくつかのリボザイムを含むように操作され得、このリボザイムは、ＨＩＶゲノム上の異なる標的に対して作製され得る。このことは、感染性ＨＩＶが変異して、抗ＨＩＶリボザイムの効果を回避し得る可能性を低減する。さらに、条件付複製コンピテントウイルスストラテジーは、他のウイルス感染、特にウイルスのターンオーバーが高いウイルス感染を処置するために適用され得る。
【０１８５】
ｃｒＨＩＶベクターの特に有用な特徴は、これらのベクターが、遺伝的抗ウイルス剤（例えば、リボザイム）を転写後に発現するために使用され得ることである。従って、ｃｒＨＩＶベクターによる非感染細胞の感染は、低い毒性を生じる。なぜなら、Ｔａｔタンパク質の非存在下では、ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターからの発現は、ほとんど生じないからである。高レベルのｃｒＨＩＶ発現およびその引き続く抗ウイルス活性は、Ｔａｔタンパク質が、野生型ＨＩＶによる補完によって提供される場合にのみ生じる。従って、ｃｒＨＩＶベクターは、ＨＩＶ感染から細胞を保護するようには設計されないが、非病原性ｃｒＨＩＶ粒子の選択的蓄積によって、全体的野生型ＨＩＶウイルス負荷を低下させるように設計される。
【０１８６】
本発明の実施および機能に関して、いずれの特定の理論にも束縛されることを追求せずに、以下の実施例において確認されるようにリボザイムが使用されて、以下の２つの有用な特性に起因する選択的利点を有するｃｒＨＩＶゲノムを提供し得ると考えられる：（１）リボザイムは、高程度の特異性を有する、および（２）リボザイムは、標的ＲＮＡと同時局在する能力に依存して、相対的有効性を有する（Ｃｅｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３６１５３２−１５３９（１９８７））。リボザイムの特異性は、ＸＵＹ部位を含む相補的標的配列に対するそれらの特異的ハイブリダイゼーションによって確認される。リボザイムは、標的ＲＮＡと効果的に同時局在した場合にのみ、高い有効性で標的ＲＮＡを切断するので、相対的に有効である。混合ＨＩＶ／ｃｒＨＩＶ感染において、ＨＩＶ  ＲＮＡゲノムは、子孫ビリオンにパッケージングされる前に二量体化するので、リボザイム含有ｃｒＨＩＶ  ＲＮＡと野生型ＨＩＶ  ＲＮＡとの同時局在が生じるはずである。ウイルスタンパク質の産生に必要な、非ゲノム種の野生型ＨＩＶ  ＲＮＡの切断は、非ゲノムＲＮＡが二量体化しない限り、野生型ＨＩＶ  ＲＮＡゲノムよりもおそらく効率が低い。ｃｒＨＩＶ  ＲＮＡに付与される選択的利点は、ウイルス粒子へのｃｒＨＩＶの選択的パッケージングに起因したことが、本明細書に記載される実験において発見された。これらの結果は、最も効果的な切断が、二量体化の間に細胞内で生じ、宿主ヌクレアーゼによる野生型ＨＩＶ  ＲＮＡの選択的破壊を生じることを示唆する。このことが、ウイルス粒子へのｃｒＨＩＶ  ＲＮＡの優先的パッケージングを可能にする。
【０１８７】
ＨＩＶ治療のためのｃｒＨＩＶベクターの適用は、ｃｒＨＩＶのゲノム選択性だけでなく、ｃｒＨＩＶ粒子を産生する細胞の細胞性選択をも含む。さもなければ、野生型ＨＩＶ産生細胞は、ｃｒＨＩＶ粒子産生細胞を超える選択的利点で、野生型ＨＩＶ粒子を産生し、そして迅速に優位に立つ。選択的利点は、（薬物の存在下で）野生型ＨＩＶ発現細胞を上回る生存的利点をｃｒＨＩＶ発現細胞に付与する遺伝子（例えば、多剤耐性遺伝子）をｃｒＨＩＶゲノム中に挿入することによって、ｃｒＨＩＶ発現細胞に付与され得る。これらの条件下で、野生型ＨＩＶ発現細胞は、徐々に死滅するが、なおいくらかの野生型ＨＩＶを産生し、一方で、ｃｒＨＩＶを選択的に産生するｃｒＨＩＶ発現細胞は生存する。残存する野生型ＨＩＶによるｃｒＨＩＶ含有細胞の感染は、ウイルス粒子を含むさらなるｃｒＨＩＶ産生を生じる。従って、ウイルスゲノムシフトは、ｃｒＨＩＶゲノムによるＣＤ４＋細胞の累積的感染と共に生じ得、それにより、病原性野生型ＨＩＶから非病原性ｃｒＨＩＶゲノムへと、宿主におけるウイルスバランスが変化する。このようなストラテジーは、野生型ＨＩＶのクリアランスを生じ得、一旦、ＨＩＶゲノムのバランスが、野生型ＨＩＶからｃｒＨＩＶに選択的にシフトする。ｃｒＨＩＶは、野生型ＨＩＶヘルパーゲノムの存在下でのみ複製し得るので、ウイルス複製は、実質的に消滅する。従って、このような相互限定条件下で、野生型ＨＩＶウイルス負荷を減少させるだけでなく、ＨＩＶ感染宿主からウイルスを浄化するｃｒＨＩＶベクターを操作することが可能であり得る。
【０１８８】
（作製手段）
このベクターは、ベクターおよびヘルパーゲノムの細胞株（好ましくは、周知の２９３Ｔ細胞株であるがこれに限定されない）への一過的なトランスフェクションの使用によるか；またはパッケージング細胞株を使用することによるかのいずれかによる補完プロセスにより作製され得る。好ましくは、細胞は、トランスフェクション試薬（好ましくは、リン酸カルシウム）、エレクトロポレーション、または脂質トランスフェクション試薬を用いて、高いトランスフェクション効率で一過的にトランスフェクションされる。一旦、トランスフェクションが起こると、ベクターは、上清（好ましくは、トランスフェクション後１２時間以上７日間以下の上清）から収集される。ベクターは、所望の場合、必要に応じて、沈殿または超遠心分離を用いずに、高速遠心分離により濃縮され得る。好ましい遠心分離条件は、約５０００〜１２，０００×ｇ、より好ましくは、約１０，０００×ｇである。より好ましい条件は、４℃で一晩の遠心分離である。
【０１８９】
（ベクター精製方法）
（方法１）
１．ウイルス上清の明澄化
２．限外濾過による濃縮
３．ダイアフィルトレーション（ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｚｅ）処理をしてもしなくてもよい）
４．イオン交換クロマトグラフィー
５．サイズ排除クロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーション
６．必要に応じて、限外濾過による濃縮
（方法２）
１．ウイルス上清の明澄化
２．イオン交換クロマトグラフィー
３．ダイアフィルトレーションまたはサイズ排除クロマトグラフィー
４．任意のベンゾナーゼ処理
５．サイズ排除クロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーション
６．必要に応じて、限外濾過による濃縮
上記の手順に異なる樹脂が使用され得る。これらとしては、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｏｒｏｓ  ５０ＨＱが挙げられる。中空の線維カートリッジが、限外濾過またはダイアフィルトレーションのために使用される。これらとしては、Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのカートリッジ（ＵＦＰ−７５０シリーズ）が挙げられる。
【０１９０】
（投与手段）
本発明に従って、ベクターは、以前に記載されたようなウイルス感染のために遺伝子治療を必要とする宿主細胞に導入される。導入手段は、ウイスルにより感染され得る宿主と、本発明に従うベクターとを接触させる工程を包含する。好ましくは、このような接触工程は、ベクターを宿主細胞に導入する任意の手段を含み；この方法は、任意の特定の導入手段に依存せず、そしてそのように解釈されるべきでない。導入手段は当業者に周知であり、また、本明細書中に例示されている。
【０１９１】
従って、導入は、例えば、インビトロ（例えば、遺伝子治療のエキソビボ型方法において）またはインビボのいずれかにおいてなされ得る。導入としては、エレクトロポレーション、形質転換、形質導入、結合体化または三親接合（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ）、トランスフェクション、感染、カチオン性脂質との膜融合、ＤＮＡコートされた微粒子による高速照射、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、単一細胞への直接マイクロインジェクションなどの使用が挙げられる。他の方法もまた利用可能であり、そして当業者に公知である。
【０１９２】
しかし、好ましくは、ベクターまたはリボザイムは、カチオン性脂質（例えば、リポソーム）の手段により導入される。このようなリポソームは、市販されている（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄにより供給される、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭなど）。さらに、インビボでの増大した移入収容能および／または減少した毒性を有するリポソーム（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／２１２５９において総説されるようなリポソーム）が、本発明において使用され得る。リポソームの投与のために、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／２３５６９において確認される推奨に、従い得る。一般的に、このような投与によって、処方物は、３７℃で８時間以内に大部分のリンパ球によって取り込まれ、５０％より高い注入用量が、静脈内投与１時間後の脾臓において検出される。同様に、他の送達ビヒクルとしては、ヒドロゲルおよび制御放出ポリマーが挙げられる。
【０１９３】
宿主細胞に導入されるベクターの形態は、そのベクターがインビトロで導入されているかインビボで導入されているかに一部依存して変化し得る。例えば、核酸は、そのベクターが、染色体外で（すなわち、自律複製ベクターとして）維持され得るか、プロウイルスまたはプロファージとして組み込まれ得るか、一過的にトランスフェクトされ得るか、複製欠損ウイルスまたは条件複製ウイルスの使用によるように一過的に感染され得るか、あるいは二回または一回の交差組換え事象を介して、宿主ゲノムに安定に導入され得るか否かに依存して、閉鎖された環状体、ニックを有する環状体、または直鎖状にされた環状体であり得る。
【０１９４】
宿主への導入の前に、本発明のベクターは、治療処置方法および予防処置方法における使用のために種々の組成物中に処方され得る。特に、ベクターは、適切な薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて薬学的組成物に作製され得、そしてヒトまたは獣医のいずれかへ適用に適するように処方され得る。
【０１９５】
従って、本発明の方法において使用するための組成物は、１つ以上の上記ベクターを、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含み得る。薬学的に受容可能なキャリアは当業者に周知であり、投与の適切な方法もまた同様である。キャリアの選択は、一部、特定のベクターにより、および組成物を投与するのに使用される特定の方法により、決定される。当業者はまた、組成物を投与する種々の経路が利用可能であり、そして１つより多い経路が投与のために使用され得るが、特定の経路が別の経路よりも迅速かつ効果的な反応を提供し得ることを認識している。従って、本発明の組成物の広範な種々の適切な処方物が存在する。
【０１９６】
本発明のベクター単独でか、または他の抗ウイルス化合物と組み合わせて本発明のベクターで構成される組成物は、非経口投与、好ましくは腹腔内投与に適した処方物に作製され得る。このような処方物としては、水性および非水性の等張滅菌注入溶液（抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、および意図するレシピエントの血液との等張性を処方物に与える溶質を含み得る）、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁物（懸濁剤、可溶化剤、濃厚剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る）が挙げられ得る。この処方物は、単一用量または複数用量の密封された容器（例えば、アンプルおよびバイアル）において提供され得、そして使用直前に、注入のために滅菌液体キャリア（例えば、水）の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存され得る。即時注入可能な溶液および懸濁物は、本明細書中に記載されるような、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【０１９７】
ベクターは、所望の場合、任意の適切な溶液、緩衝液、または凍結乾燥可能な形態で保存され得る。好ましい保存用緩衝液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝生理食塩水；１〜５０％のトレハロース水溶液（１：１）（好ましくは、１０％トレハロース水溶液（１：１））と混合されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝生理食塩水（その結果、最終濃度は５％トレハロースである）；１〜５０％グルコース水溶液（１：１）（好ましくは、１０％グルコース水溶液（１：１））と混合されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝生理食塩水（その結果、最終グルコース濃度は、５％である）；１〜５０％トレハロース水溶液（１：１）（好ましくは、１０％トレハロース水溶液（１：１））と混合された２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（その結果、最終トレハロース濃度は５％である）；または、１〜５０％マンニトール水溶液（１：１）（好ましくは５％マンニトール水溶液（１：１））と混合されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝生理食塩水（その結果、最終マンニトール濃度は２．５％である）である。
【０１９８】
経口投与に適した処方物は、液体溶液（例えば、希釈液（例えば、水、生理食塩水、またはフルーツジュース）に溶解された有効量の化合物）；カプセル、サチェ、または錠剤（各々、固体または顆粒として予め決定された量の活性成分を含む）；水性液体中の溶液または懸濁液；およびオイルインウォーターエマルジョンまたはウォーターインオイルエマルジョンからなり得る。錠剤形態は、１つ以上のラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロース（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、芳香剤、ならびに薬理学的に適合性のキャリアが挙げられ得る。
【０１９９】
吸入による投与に適したエアロゾル処方物もまた、作製され得る。エアロゾル処方物は、圧縮された受容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に加えられ得る。
【０２００】
同様に、経口投与に適した処方物として、ロセンジ形態が挙げられ得る。ロセンジ形態は、香味剤（通常は、スクロースおよびアカシアまたはトラガカント）に活性成分；不活性基材（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）中に活性成分を含む香錠；ならびに適切な液体キャリアに活性成分を含むうがい薬；ならびにクリーム、エマルジョン、ゲル、および活性成分に加えて当該分野で公知のキャリアを含む類似物を含み得る。
【０２０１】
局所投与に適した処方物は、クリーム、軟膏、またはローションの形態であり得る。
【０２０２】
直腸投与のための処方物は、例えば、ココアバターまたはサリチレートを含む適切な基材を有する坐薬として提供され得る。膣投与に適した処方物は、活性成分に加えて、当該分野で公知の適切なキャリアを含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体、またはスプレー処方物として提供され得る。同様に、活性成分は、潤滑剤（例えば、コンドーム上のコーティング）と組み合わせられ得る。
【０２０３】
本発明の関係で、動物（特にヒト）に投与される用量は、合理的な時間にわたって感染個体において治療効果をもたらすのに十分であるべきである。この用量は、処置に用いられる特定のベクターの効力、疾患状態の重篤度、ならびに感染個体の体重および年齢により決定される。用量のサイズはまた、用いられる特定のベクターの使用に付随し得る任意の副作用の存在により決定される。可能な場合ならば常に副作用を最小限に維持することが常に望ましい。
【０２０４】
投薬量は、単一投薬形態（例えば、錠剤またはカプセル）であり得る。用語「単一投薬形態」は、本明細書中で使用する場合、ヒトおよび動物被験体のための単一の投薬量として適切な、物理的に分離された単位（各々の単位は、予め決定された量のベクターを単独でかまたは他の抗ウイルス剤と組み合わせて含み、予め決定された量は、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、またはビヒクルと組み合わせて所望の効果を生じるのに十分な量で算出される）をいう。本発明の単一投薬形態についての詳細は、用いられる特定の化合物および達成される効果、ならびに宿主における各化合物に関連する薬理動態学に依存する。投与される投薬量は、個々の患者における「抗ウイルス有効量」または「有効レベル」を達成するのに必要な量であるべきである。
【０２０５】
「有効レベル」は、投薬の好ましい目的として使用されるので、実際の投薬およびスケジュールは、薬理動態学、薬物分散、および代謝における個体間の差異に依存して変化し得る。「有効レベル」は、例えば、患者において所望される血液レベルおよび組織レベル（化学化合物の臨床的抗ウイルス活性の指標となるアッセイにおいてウイルス（例えば、ＨＩＶ）を阻害する、本発明に従う１つ以上のベクターの濃度に対応する）として規定され得る。本発明の化合物についての「有効レベル」はまた、本発明の組成物が、ジドブジンまたは他の公知の抗ウイルス化合物あるいはそれらの組み合わせと組み合わせて使用される場合に変化し得る。
【０２０６】
当業者は、使用される組成物の正確な処方のための適切な投薬量、スケジュール、および投与方法を容易に決定し得、個々の患者において所望の「有効レベル」を達成し得る。当業者はまた、適切な患者サンプル（例えば、血液および／または組織）の直接的分析（例えば、解剖学的化学分析）または間接的分析（例えば、ウイルス感染の代理の指標（例えば、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患の処置についてはｐ２４または逆転写酵素）を用いて）により、本発明の化合物の「有効レベル」の適切な指標を容易に決定および使用し得る。
【０２０７】
さらに、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ様疾患の処置のための、患者における有効レベルの決定に関して、特に、適切な動物モデルが利用可能であり、そして種々の遺伝子治療プロトコルのＨＩＶに対するインビボでの効果を評価するために、広く実施されている（Ｓａｒｖｅｒら（１９９３ｂ）、前出）。これらのモデルとして、マウス、サル、およびネコが挙げられる。これらの動物が、ＨＩＶ疾患に対して天然では感受性でない場合でさえも、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ節、胎児肝臓／胸腺、または他の組織と再構成されたキメラマウスモデル（例えば、ＳＣＩＤ、ｂｇ／ｎｕ／ｘｉｄ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ−ｈｕ、免疫適合性ＳＣＩＤ−ｈｕ、骨髄切除ＢＡＬＢ／ｃ）が、ベクターまたはＨＩＶで感染され得、そしてＨＩＶ病理および遺伝子治療のモデルとして使用され得る。同様に、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）／サルモデルが使用され得、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）／ネコモデルもまた同様であり得る。
【０２０８】
これらのモデルはまた、臨床試験のためのベクター系の確認の目的で、ベクターの安全を決定するために使用され得る。重要な適用は、生物分布研究についてのこれらの動物モデルの使用である。ベクターを含む形質導入された細胞（好ましくは、ヒト細胞であるがこれらに限定されない）は、非ヒト動物モデルに注入され、そしてベクターの安全性が、動物組織におけるベクターの遺伝子物質の非存在により決定される。動物組織におけるベクターの遺伝子物質の非存在は、このベクターが、ヘルパーウイルスまたは野生型ウイルスの存在がなければ自律的に複製せず、従って、ヒトにおける臨床的使用について安全であるとみなされることを意味する。ヘルパーベクターまたはヘルパーウイルスの非存在下でのベクターの存在は、このベクターが、自律的に複製することが期待されない場合、安全面の危険を有するとみなされ得る。しかし、ベクターが自律的に複製することが期待される例において、安全についての他の基準（例えば、特定の組織における複製の欠如または動物における複製レベル）が確立されることが必要である。このベクターの存在または非存在は、試験ベクターがマーカー遺伝子を発現する場合、ＰＣＲまたはＦＡＣＳ分析により決定され得、そしてこのマーカー遺伝子は、ＦＡＣＳによって可視化され得るが、このような検出手段に限定されない。
【０２０９】
一般的に、一日あたり約５μｇ／ｋｇ体重〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重の投与されるリボザイム（またはベクター）の組織濃度が達成されるのに十分な量のベクターが好ましく、特に、一日あたり約１０μｇ／ｋｇ体重〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重が好ましい。特定の適用（例えば、経口適用、眼内適用、または膣内適用）において、複数の一日投薬量が好ましい。さらに、投薬量の数は、送達手段および投与される特定のベクターに依存して変化する。
【０２１０】
数人のウイルス感染個体の処置において、大投薬量のベクターが投与され、時間は化合物が作用することを可能にし、次いで適切な試薬が個体に投与されて、活性化合物が不活性化される、「巨大投薬量」レジメンを使用することが望ましくあり得る。本発明の方法において、処置（すなわち、処置されるウイルスと競合するベクターの複製）は、必ずしも制限されない。言い換えると、例えば、ＨＩＶ疾患のレベルと共に、ビリオンの生成についてＨＩＶに依存的なベクターのレベルもまた減少する。
【０２１１】
薬学的組成物は、ＡＩＤＳを治療的に処置するために使用される場合、本発明に従うベクターと組み合わせて、他の薬剤を含み得る。これらの他の薬剤は、それらの従来の様式で（すなわち、ＨＩＶ感染を処置するための薬剤として）、より詳細にはインビボでｃｒＨＩＶウイルスを選択する方法において使用され得る。本明細書中に記載されるような選択は、条件的に複製するＨＩＶの拡散を促進し、そして条件的に複製するＨＩＶが、野生型ＨＩＶとより効果的に競合することを可能にし、このことは、野生型ＨＩＶの病原性を必然的に制限する。特に、抗レトロウイルス剤（例えば、好ましくは、ジドブジン）が用いられ得ることが企図される。以前に記載された薬剤に加えて使用され得るこれらのさらなる薬剤のさらなる代表的な例として、抗ウイルス化合物、免疫調節物質、免疫刺激物質、抗生物質、ならびにＡＩＤＳを処置するのに使用され得る他の薬剤および処置レジメン（代替の医薬として認識されるものを含む）が挙げられる。抗ウイルス化合物として、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ガンシルクロビル、フッ化ジデオキシヌクレオチド、非ヌクレオシドアナログ化合物（例えば、ネビラピン（Ｓｈｉｈら、（ＰＮＡＳ、８８、９８７８−９８８２（１９９１））、ＴＩＢＯ誘導体（例えば、Ｒ８２９１３）（Ｗｈｉｔｅら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６、２５７−２６６（１９９１））、およびＢＩ−ＲＪ−７０（Ｓｈｉｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、９０（補遺４Ａ）、８Ｓ−１７Ｓ（１９９１））が挙げられるがこれらに限定されない。免疫調節物質および免疫刺激物質として、種々のインターロイキン、ＣＤ４、サイトカイン、抗体調製物、血液注入剤（ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）、および細胞注入剤（ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）が挙げられるがこれらに限定されない。抗生物質として、抗真菌剤、抗細菌剤、および抗Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ剤が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１２】
他の抗レトロウイルス剤および特に、公知のＲＴインヒビター（例えば、ｄｄＣ，ジドブジン、ｄｄＩ、ｄｄＡ、または他のＨＩＶタンパク質に対して作用する他のインヒビター（例えば、抗ＴＡＴ剤））と合わせてのウイルス阻害化合物の投与は、一般的に、ウイルスの生活サイクルのほとんどまたは全ての複製段階を阻害する。ＡＩＤＳまたはＡＲＣ患者において使用されるｄｄＣおよびジドブジンの投薬が公開されている。ｄｄＣのウイルス抑制範囲は、一般的に、０．０５μＭ〜１．０μＭの間である。約０．００５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲が、ほとんどの患者においてウイルス抑制的である。経口投与のための投薬量の範囲は、いくらか広く、例えば、２、４、６、８、および１２時間の間隔等で１つ以上の投薬量で与えられる０．００１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重のｄｄＣが、８時間毎に与えられる。併用治療において与えられる場合、他の抗ウイルス化合物は、例えば、本発明に従うベクターと同時に与えられ得るか、または投薬は、所望のようにずらされ得る。ベクターもまた、組成物と組み合わされ得る。各々の投薬量は、いずれかが単独で使用される場合よりも、組み合わせて使用される場合の方が少なくあり得る。
【実施例】
【０２１３】
本発明の化合物および方法は、以下の実施例の関係でさらに記載される。これらの実施例は、本発明をさらに例示するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０２１４】
（実施例１）
この実施例は、本発明に従う条件的に複製コンピテントなベクターの構築を記載する。特に、この実施例は、ＨＩＶ（すなわち、ｃｒＨＩＶベクター）に基づく条件的に複製するベクターの構築を記載する。
【０２１５】
ＨＩＶ−１の病原性の最も突出した局面の１つは、このウイルスの遺伝子改変体の生成である。インビボでのＨＩＶ改変体の迅速な生成は、このウイルスが、Ｄａｒｗｉｎｉａｎ遺伝子モデリングの枠組み内にあるとみなされ得る（例えば、Ｃｏｆｆｉｎ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７６、１４３−１６４（１９９２）；およびＣｏｆｆｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７、４８３−４８９（１９９５）を参照のこと）。これらの改変体は、ＨＩＶ−１逆転写酵素分子の不誠実性の結果であり、これによって、ウイルスゲノムＲＮＡから新規に転写されたプロウイルスにおいて変異が生成される。従って、有意なボトルネックを有さないインビボ条件および多くの複製サイクル下で、相当な程度の遺伝子改変が、多くのウイルス改変体の生成を伴い生じる。しかし、野生型ＨＩＶはなお優勢である。なぜならば、このような非制限条件下では、野生型ＨＩＶが最も高い選択的利点を有するからである。しかし、インヒビター（例えば、ジドブジン）の存在下においては、野生型株よりも高い選択的利点を与えられるウイルス改変体が選択され、結果として優勢となる（Ｃｏｆｆｉｎ（１９９２）および（１９９５）、前出）。このことに基づき、本発明は、病原性の野生型ＨＩＶ−１を超える選択的利点を有する非病原性ＨＩＶ−１ゲノムを提供する、条件的に複製するウイルスベクターのストラテジーを提供する。
【０２１６】
これらの非病原性の、条件的に複製するＨＩＶ（ｃｒＨＩＶ）ベクターは、野生型ＨＩＶに感染した細胞でのみ複製およびパッケージングを起こす欠損性ＨＩＶである。ｃｒＨＩＶゲノムは、病原性野生型ＨＩＶウイルス負荷と競合し、これを減少させる。感染宿主において野生型ＨＩＶウイルス負荷を減少させる効果は、増加した余命を導くはずである。ｃｒＨＩＶゲノムはまた、野生型ＨＩＶを非感染個体に伝染させる感染宿主の能力を減少させるはずである。ｃｒＨＩＶと野生型ＨＩＶ−１との競合の成功のために、以下の２つの因子が重要であるようである：（１）野生型ＨＩＶゲノムを上回るｃｒＨＩＶゲノムの選択的利点、および（２）野生型ＨＩＶを発現する細胞を上回るｃｒＨＩＶ発現細胞の選択的利点（すなわち、野生型ＨＩＶを発現する細胞を上回るｃｒＨＩＶ発現細胞からのｃｒＨＩＶビリオンの産生についての選択的利点）。
【０２１７】
ｃｒＨＩＶベクターは、これらがＲＮＡ発現、重合化、およびパッケージングに必要とされる配列を含むが、機能的な（すなわち、野生型の）ＨＩＶ−１タンパク質を発現しないという事実に起因して、条件的に複製する。選択的利点は、野生型ＨＩＶゲノムのＵ５領域を切断するがｃｒＨＩＶ  Ｕ５  ＲＮＡを切断しないリボザイムカセットを挿入することにより、ｃｒＨＩＶベクターに与えられる。
【０２１８】
ベクター中に存在するリボザイムは、ｃｒＨＩＶ  ＲＮＡを切断しない。なぜならば、ｃｒＨＩＶ  ＲＮＡのＵ５領域は、保存的な塩基置換（他のＨＩＶ株に存在する塩基置換）により改変されて、リボザイムがこれらの部位に効果的に結合し、そして切断するのを防止しているからである。さらに、ｃｒＨＩＶは、ＣＤ４＋の細胞死を担うと考えられるタンパク質をコードしないので、非病原性である。ＨＩＶ感染細胞（ｃｒＨＩＶベクターでトランスフェクトされた）が活性化状態になる場合、この細胞は、ｃｒＨＩＶゲノムの欠損を補完し得、ｃｒＨＩＶの子孫ビリオンを産生する。
【０２１９】
一般的に、ｃｒＨＩＶゲノムを、全長の感染性ＨＩＶクローンｐＮＬ４−３から構築した（Ａｄａｃｈｉら（１９８６）、前出）。全てのクローニング反応ならびにＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質操作は、当業者に周知であり、当該分野で記載されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ（１９８２）））方法を用いて実施した。これらの反応において使用する酵素および試薬を、業者（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ；およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）から入手し、そして販売元の推奨に従って使用した。さらに、ベクターの維持および増殖を、一般的に知られており、そして以前に記載された（例えば、Ｄｒｏｐｕｌｉｃ’ら（１９９２）、前出；およびＤｒｏｐｕｌｉｃ’ら（１９９３）、前出）技術を用いて行った。
【０２２０】
ｐＮＬ４−３を、酵素ＰｓｔＩ（ｇａｇにおいて、転写の開始からおよそ＋１０００位で切断する）およびＸｈｏＩ（ｎｅｆにおいて、転写の開始からおよそ＋８４００位で切断する）を用いて切断し、そして便利な制限部位を含むポリリンカーを挿入した。ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む０．８６ｋｂのＢｇｌ  ＩＩ〜Ｂａｍ  ＨＩフラグメントを、このポリリンカーに存在するＢａｍ  ＨＩ部位にクローニングした。これらの操作により、ＨＩＶ野生型ゲノムのｇａｇコード領域からＵ３コード領域を欠損させた（すなわち、このようにして、ｎｅｆ遺伝子もまた欠損させた）。ベクターは、短縮型ｇａｇ転写物を生成し得るが、全長の機能的なＧａｇタンパク質は、このベクターによって生成されない。しかし、野生型Ｇａｇ機能が本発明に従って非必須であるので、ｇａｇ配列はＧａｇタンパク質が翻訳されるのを防ぐために変異され得る。
【０２２１】
本明細書中に記載される単一のリボザイムまたは複数のリボザイムのいずれかを含むリボザイムカセットは、Ｂａｍ  ＨＩ部位から下流のＳａｌ  Ｉ部位に挿入される。このことを達成するために、リボザイム配列をコードする相補的なデオキシオリゴヌクレオチドを合成し、アニールし、次いでＳａｌ  Ｉ部位にクローニングした。ｃｒＨＩＶベクターの構築のために使用したリボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムであった。これらのリボザイムは、２２塩基対で構成される触媒ドメイン、および各々９塩基対で構成される２つのハイブリダイゼーションドメインを含んだ。このリボザイムを、Ｕ５  ＲＮＡ配列の＋１１５部位または＋１３３部位（すなわち、転写の開始から下流の塩基対の数に対応する）のいずれかに標的化させた。＋１１５部位および＋１３３部位に標的化された、このリボザイムのハイブリダイゼーションドメインおよび触媒ドメイン（下線）は、以下の通りである。
【０２２２】
【化１】
2005520482.tif 000002
リボザイムカセットは、タンデムに配置された単一リボザイム、２つのリボザイム、または３つのリボザイムのいずれかで構成された。単一または３つのリボザイムのいずれかを含むベクターは、容易に構築され得、そしてＵ５  ＨＩＶ  ＲＮＡの同一部位（＋１１５部位）に標的化され得る。２つのリボザイムを含むベクターは、容易に構築され得、そしてＵ５  ＨＩＶ  ＲＮＡの＋１１５の同一部位かまたは＋１１５部位および＋１３３の異なる部位のいずれかに標的化され得る。
【０２２３】
ベクターの構築を完了するために、ｃｒＨＩＶゲノムのＵ５領域内に存在するハンマーヘッドリボザイムにより認識される部位を変異させることによって、ｃｒＨＩＶベクターに、（ＲＮＡとしての発現における）リボザイム切断に対する耐性を与えた。このことを達成するために、図２、配列番号２に示される塩基置換を含む二本鎖オリゴヌクレオチド（すなわち、
【０２２４】
【化２】
2005520482.tif 000003
）を使用して、ベクターに改変部位を導入した。詳細には、塩基置換を、塩基対１１５および１３３のリボザイムハイブリダイゼーション部位および切断部位を操作した。特に、図２に示されるように、変異を、塩基対１１３、１１４、１３２、１３４、および１４２に導入した。これらの部位は、任意の変異（すなわち、
【０２２５】
【化３】
2005520482.tif 000004
ここで、Ｎは任意の変異ヌクレオチド（配列番号１４）であり得る）を含むよう改変され得る。しかし、好ましくは、この配列は、例えば、＋１１３位にてＧからＡへの置換が存在するように（すなわち、配列が
【０２２６】
【化４】
2005520482.tif 000005
を含むように）、＋１１４位（配列番号５）でのＵ（すなわち、ＤＮＡ配列の観点では、Ｔ）からＣへの置換、＋１３２位（配列番号６）でのＵ（すなわち、ＤＮＡ配列の観点では、Ｔ）からＣへの置換、＋１３４位（すなわち、この配列が、
【０２２７】
【化５】
2005520482.tif 000006
を含むＡからＧへの置換、および＋１４２位でのＵ（すなわち、ＤＮＡ配列の観点では、Ｔ）からＡへの置換が存在するように変異される。この変異は、単独または組み合わせてのいずれかでなされ得る。特に、他のＵ５変異の非存在下で、ｃｒＨＩＶ  ＵＳ  ＲＮＡにおける＋１１４位（配列番号５）および／または＋１３２位（配列番号６）でのＵ（すなわち、ＤＮＡ配列の観点では、Ｔ）からＣへの置換は、リボザイムによるその切断を防止する（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７）、前出）。この挿入された塩基置換は、種々の他の株のＨＩＶにおいて存在し（Ｍｙｅｒｓら、ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｌｅｓ  Ｎａｔ．Ｌａｂ（１９９４））、これは、これらの置換がＨＩＶゲノムの複製能力を減少させないことを示す。
【０２２８】
本明細書中に記載される方法は、例えば、異なるウイルスゲノム（例えば、異なるＲＮＡウイルス）で構成されるか、または異なる遺伝子的抗ウイルス剤で構成される、他の条件的に複製するベクターを構築するために使用され得る。さらに、条件的に複製するベクターは、ベクターが導入される宿主細胞に、野生型ウイルスを含む宿主細胞を上回る選択的利点を与えるようさらに改変され得る。例えば、このようなベクターは、多剤耐性または変異したプロテアーゼもしくは逆転写酵素をさらにコードするよう改変され得る。
【０２２９】
これらの方法はまた、当然、本明細書中に記載される種々のヘルパーベクター構築物を構築するために用いられ得る。
【０２３０】
（実施例２）
この実施例は、条件付き（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ）複製ベクターのリボザイム切断、そして詳細には、ｃｒＨＩＶベクターのリボザイム切断に対する耐性を記載する。
【０２３１】
このｃｒＨＩＶベクターのリボザイム切断に対する耐性を確認するために、インビトロ転写を実施した。これを実行するために、このリボザイム配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）のＸｈｏＩ部位にクローニングした。変異したｃｒＨＩＶ  Ｕ５領域を含む０．２１キロ塩基対（ｋｂ）のＢｇｌＩＩフラグメントを、同様にｃｒＨＩＶベクターから切り出し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＩＩのＢａｍ  ＨＩ部位に挿入した。その結果生じた改変ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳＩＩベクターを、インビトロ転写前に、Ｂｓｓ  ＨＩＩを用いて直線化した。野生型ＨＩＶ  Ｕ５  ＲＮＡ（Ｍｙｅｒｓら、（１９９４）、前出に記載される）を発現する類似プラスミドを、コントロールとして使用した。このプラスミドを、インビトロ転写前にＥｃｏ  ＲＩを用いて直線化した。
【０２３２】
放射性標識したＵ５  ＨＩＶ  ＲＮＡおよびリボザイム  ＲＮＡを、以前に記載されたのように（Ｄｒｏｐｕｌｉｃ’ら、（１９９２）、前出）、ベクターのインビトロ転写により産生した。これらの放射性標識した転写物を、（標的対リボザイムのモル比を１：２で）一緒に、１×転写緩衝液（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのスペルミジン、および１０ｍＭのＮａＣｌを含む）中でインキュベートした。このサンプルを、６５℃まで加熱し、次いで停止緩衝溶液（９５％のホルムアミド、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のブロモフェノールブルー、および０．０５％のキシレンシアノールＦＦを含む）を加える前に５分間、３７℃まで冷却した。次いでこの産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離し、そしてオートラジオグラフィによって検出した。
【０２３３】
野生型Ｕ５−ＨＩＶ  ＲＮＡを＋１１５部位に指向された単一のリボザイムを含む転写物と一緒にインキュベートした場合、切断を直ちに観察した。このような切断は、産物Ｐ１およびＰ２を生じる。切断はまた、野生型ＨＩＶ  ＲＮＡを、同じ部位または異なる部位のいずれかに対する二重リボザイムを含むＲＮＡと一緒にインキュベートした場合に見られ得る。２つの異なる部位に指向されたリボザイム含有転写物を野生型ＨＩＶ  ＲＮＡと一緒にインキュベートした場合、産物Ｐ１、Ｐ２およびＰ３を生じる。Ｐ３は、＋１３３部位の切断の結果生じる。
【０２３４】
相対的に、改変したＵ５含有ｃｒＨＩＶ  ＲＮＡを、＋１１５部位に指向された単一のリボザイムまたは＋１１５部位もしくは＋１３３部位のいずれかに指向された二重リボザイムのいずれかと一緒にインキュベートした場合、切断産物は検出されなかった。従って、これらの結果は、ｃｒＨＩＶ  Ｕ５  ＲＮＡがリボザイム切断に対して耐性である一方、野生型ＨＩＶ−Ｕ５  ＲＮＡは、抗ＵＳ  リボザイムによって切断されることを確認する。さらにこの結果は、野生型株のウイルスと比較した場合、本発明のアプローチが、宿主細胞中に導入された場合に、複製に対する選択的利点を条件付き複製ベクター（ｃｒＨＩＶベクター以外のベクターを含む）に加えるために使用され得ることを確認した。
【０２３５】
（実施例３）
この実施例は、本発明のヘルパーベクター構築物の産生における重要なステップを手短に述べる。特に断りのない限り、種々のレトロウイルスエレメントをコードする核酸配列を、公に利用可能な供給源から得た。記載されるステップ全てが、必要な場合、間違いおよび直接的補正を検出するために、タンパク質全てについて全コード領域の配列決定を必要とした。
【０２３６】
ｔａｔ配列を変性し、そして抗ｔａｔリボザイムによってその標的化を可能にするために、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットを用いて、抗ｔａｔリボザイムカセットに対する標的部位を含むように、プラスミドｐＴＡＴを変異誘発した。続いて、この変異誘発したｔａｔ配列をＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎからのｐＭＧプラスミドに基づく発現ベクター中にクローニングした。このｔａｔ配列を、ＮｃｏＩ部位を用いて、第１のＡＴＧでＩＲＥＳと融合した。このベクターをさらに、アンピシリン耐性遺伝子およびＳＶ４０の複製起点を含むように改変した。
【０２３７】
ＨＩＶ−１  ｒｅｖエレメントおよびＲＲＥエレメントを含む配列を、ｒｅｖの第３エキソンをＲＲＥと一緒にｐＮＬ４−３から切り出すことにより入手し、そしてｐＬＩＴＭＵＳ３８プラスミドにクローニングした。ヌクレオチド２０８までのＲｅｖ配列（第２エキソンおよびＢａｍＨＩ部位までの第３エキソンの一部を含む）を、ＥＴＲおよびＰＣＲを使用して３つの合成ヌクレオチドから構築した。このＰＣＲ産物をｐＵＣ  １８にクローニングし、次いでｐＬＩＴ／ＲＲＥｒｅｖ３にサブクローニングした。この２つのｒｅｖ片を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットを用いて融合した。ＨＩＶ−２由来のＲＲＥをＨＩＶ−１  ＲＲＥの代わりに使用し、両構築物をｇａｇ／ｐｏｌ／Ｒｚベクターにクローニングした。変性したｒｅｖ配列をまた、ｐＶＩＲＰａｃ−２のようなベクターに対するパッケージング構築物中に直接サブクローニングするために使用した。
【０２３８】
パッケージングに必要とされ、そしてベクタープラスミドの一部分に存在しなければならないｇａｇの最初の４２ヌクレオチドを変性するために、ｐＮＬ４−３由来のＢｓｓＨＩＩ／ＳｐｅＩフラグメントをｐＬＩＴＭＵＳ３８にサブクローニングした。このｇａｇ配列を、パッケージングシグナルの成分全てが除去され、そしてＨＩＶの主要なスプライスドナーが、ｇａｇの第１のＡＴＧコドンの前に再挿入されるように、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットを用いて変性した。連続するｇａｇ配列を形成するために、５’ＬＴＲの代わりに、この変性したｇａｇを、ｐＮｇｐプラスミド（Ｄｒ．Ｃｏｎｄｅからの無料提供による）にサブクローニングした。この結果生じた構築物は、ｖｉｆタンパク質を発現するために使用されるスプライスアクセプター（ＳＡ）配列およびスプライスドナー（ＳＤ）配列をなおも含む。このスプライシングは、スプライシングされたｍＲＮＡ中にリボザイムカセットを生じ得る。これは、スプライシングされたレトロウイルス（条件付きで複製する）ベクターＲＮＡの切断の可能性およびその結果、パッケージングされた形質導入ベクターの力価の減少を生じるため、望ましくない。重複（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲを用いて、ＳＡ配列およびＳＤ配列を変異させた。このＰＣＲ産物をｇａｇ／ｐｏｌ構築物中に挿入してクローニングし、続いて抗Ｕ５リボザイムカセット、そしてｒｅｖエレメントおよびＲＲＥエレメントを挿入した。
【０２３９】
水疱性口内炎タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）のｅｎｖタンパク質を、ｐＭＧ−ｔａｔベクターの第１のＭＣＳにクローニングして、エンベロープ発現カセットを生成した。クローニング工程をさらに簡略化するために、ＶＳＶ−ＧをＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで埋めたＢｇｌ  ＩＩ部位に平滑末端フラグメントとしてクローニングした。ＳＶ４０複製起点（ｏｒｉ）を有する構築物を生成した。ヘルパーベクターとしてのパッケージングプラスミドを完成させるために、ｒｅｖ配列を、第２のＭＣＳにサブクローニングした。この結果生じたプラスミドをｐＶＩＲＰＡＣ−２と呼んだ（図６を参照のこと）。
【０２４０】
いくつかのパッケージングプラスミドからヘルパーベクターを作成するために、ｇａｇ／ｐｏｌ／Ｒｚ／ＲＲＥ／ｒｅｖカセットを、ｐＭＧ−ｔａｔ−Ｇプラスミド（ＳＶ４０  ｏｒｉを含まない）にサブクローニングした。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のいずれか由来のＲＲＥを有する構築物を作製した（図６のｐＶＩＲＰａｃ−１．１およびｐＶＩＲＰａｃ−１．２Ｒｚ）。リボザイム機能を試験するためのコントロールとして、このリボザイムカセットを最終的なＨＩＶ−２  ＲＲＥ含有構築物において欠失させ、ｐＶＩＲＰａｃ−１．２を生成した。最後に、スプライシング機構にｇａｇ／ｐｏｌ  ＲＮＡを向けることがレトロウイルスの（条件付きで複製する）ベクターゲノムＲＮＡの切断を防止し得るという仮説を試験するために、β−グロビン由来のイントロンをＳＶ４０ポリＡシグナルの前に挿入した（ｐＶＩＲＰａｃ−１．２ＲｚＩｎ）。言うまでもなく、本発明の他の実施形態において、この挿入されたイントロンは、ＨＩＶ由来であり、好ましくは、細胞スプライシング機構（例えば、スプライセオソーム）内にＲＮＡを誘導することが確認された完全なＨＩＶのイントロンである。
【０２４１】
（実施例４）
この実施例は、ウイルスヘルパーベクター構築物の効率を述べる。一過性トランスフェクションによるレトロウイルスベクター生成についての標準化したプロトコルを、これらの実験で使用した。公知の技術を使用して、プラスミドＤＮＡのメガプレップを生成した。ウイルスを産生するために、２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウム法により、レトロウイルスベクターおよびヘルパーベクタープラスミドによりコトランスフェクトした。トランスフェクションの約４０時間後に細胞懸濁物を回収し、０．４５μｍのシリンジフィルターに通して濾過し、そしてＨＴ１０８０細胞に対して滴定した。感染の約７２時間後にフローサイトメトリにより測定した形質導入効率に基づき、ベクター力価を算出した。力価算出のために用いた任意の式は、Ｎ＊４００，０００＊であった。ここで、Ｎは形質導入細胞のフラクションであり；４００，０００は、感染時のおよその細胞数であり；そしてＦは、希釈係数である。
【０２４２】
ＨＩＶ−１ベースのレトロウイルスベクターとの組換えの際にＲＣＶを生成する可能性を減少させることによりヘルパーベクターの安全性を増大させるため、抗Ｕ５リボザイムカセットを特定のヘルパーベクター構築物内に挿入した。このリボザイムをビリオン内に同時にパッケージングした場合、このリボザイムは、レトロウイルスベクターＲＮＡを切断しそして破壊する。しかし、このリボザイムはまた、産生細胞内部でベクターＲＮＡを切断し、従って、ウイルス産生を妨害する可能性がある。安全性をさらに増加させるために、このヘルパー構築物は、ヘルパーおよびベクターがウイルス粒子中に同時にパッケージングされる可能性をさらに減少させるようなＲＲＥ−２エレメントを含んだ。これらのヘルパーを使用して、ｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰベクターをパッケージングした。
【０２４３】
図７に示すように、ヘルパー構築物上でのリボザイムの存在は、ベクターの力価に対してほとんど影響を有しない。重要なことに、ベクターＲＮＡから離れてヘルパーＲＮＡの細胞輸送（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）に影響するイントロンを含むヘルパー構築物（ｐＶｉｒＰａｃ１．２ＲｚＩｎ）はまた、ベクター力価に対して有意な影響を有さない。この２−プラスミド系を用いて得られたこのベクター力価は、従来の３−プラスミドトランスフェクション系を用いて得られた力価に相当する。ＲＲＥ−１含有ヘルパー構築物（ｐＶｉｒＰａｃ１．１）を用いた同様の実験は、約５倍低いパッケージング効率を示した。従って、ヘルパーベクター構築物内へのＲＲＥ−２の取り込みは、相同組換えの可能性を減少させることによりその安全性を増加するだけでなく、予想外に、パッケージング効率を増大した。
【０２４４】
（実施例５）
この実施例は、ＨＩＶ−ＬＴＲのスプライシングされたｍＲＮＡ由来のＭＧＭＴ遺伝子の発現が、ＢＧおよびＢＣＮＵを用いてＭＧＭＴを形質導入した細胞の効率的な選択に十分であるかどうかを試験する。図１０Ａは、使用したベクターを示す。図１０Ｂは、細胞破壊濃度のＢＧ／ＢＣＮＵの存在下で、効果的な細胞生存およびおよび効果的な細胞増大を示す。記号は、以下の通りである：Ｍ，ＭＧＭＴ；Ｉ，ＩＲＥＳ；Ｇ，ＧＦＰ；Ｗ，マーモットの転写後エレメント；およびＣ，ＣＭＶプロモーター。スプライスアクセプター部位が遺伝子挿入部位にまさに近接して位置するため、ＲＲＥエレメントに対しすぐ３’側の任意の遺伝子が、スプライシングされたｍＲＮＡから発現されるように、ｐＮ１ベクターのＲＲＥエレメントの下流に、上記エレメントの全てをクローニングした。この図は、レンチウイルスベクターにより形質導入したコントロール細胞（「ＣＧＦＰ」）は、増殖も生存もしなかったが、ＭＧＭＴを発現するベクター全てが、生存し増殖することを実証する。
【０２４５】
ｐＮ１ＣＭＩＧにより形質導入した細胞は、１４週間後には死滅したが、ｐＮ１ＭＣＧにより形質導入した細胞は、２１週間後に死滅した。重要なことに、ｐＮ１ＭＩＧおよびｐＮ１ＭＩＧ−Ｗにより形質導入した細胞は、２９週間後に生存していた。このことは、内在性プロモーターを挿入していないベクターにより形質導入した細胞の長期生存を示す。
【０２４６】
驚いたことに、ＨＩＶ−ＬＴＲスプライシングｍＲＮＡ由来のＭＧＭＴを発現するベクターは、非常に効率的に選択された。ＭＧＭＴの発現は、ＭＧＭＴ遺伝子または選択遺伝子のいずれかへの運搬遺伝子の範囲を制限しない。これらの結果は、任意の遺伝子をＴ細胞においてＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターから発現し得ることを示す。非Ｔ細胞において同様のデータを得た。このデータは、ＨＩＶ−ＬＴＲのスプライシングされたｍＲＮＡ由来の遺伝子発現を、多くの細胞型における遺伝子発現に適用し得ることを実証した。
【０２４７】
さらに、「ＭＩＧ」構築物のバイシストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）特性は、複数の遺伝子がＩＲＥＳにより連結される場合、発現し得ることを実証する。上記以外の例としては、ＭＧＭＴ、あるいはケモカイン、インターフェロン、または他の遺伝的抗ウイルス因子を用いた他の選択遺伝子が挙げられる。
【０２４８】
（実施例６）
ＢＧおよびＢＣＮＵに対する感受性について、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を試験した。ＣＤ１４を枯渇した（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＣＤ４＋細胞を、サイトカイン動員を有する末梢血またはサイトカイン動員を有しない末梢血から精製した。この細胞を、ＢＧおよびＢＣＮＵの処理の４〜７日間前に、３μｇ／ｍｌのＰＨＡおよび５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２中で培養した。ＢＦＧおよびＢＣＮＵの存在しない適切な条件下で、ＣＤ４＋細胞を１０日間にわたる培養で１００倍まで増殖し得た。試験した用量は、０、０．２、０．５、２、５、１０、２０、３０、および４０μＭのＢＧおよび０、２、５、１０、２０、３０、および４０μＭのＢＣＮＵであった。一連の３つの実験を実施した。
【０２４９】
図１１は、上記からの代表的な結果を示す。増殖を１０μＭのＢＧおよびμＭのＢＣＮＵ後に２０分の１まで減少させ、そして２０μＭまたはそれ以上のＢＣＮＵ後に約１０分の１以下まで減少させた。ＣＤ４＋細胞のＢＣＮＵによる処置は、増殖の遅延を生じなかった。従って、上記の実施例で使用したＳｕｐＴ１細胞とは異なり、ＣＤ４＋細胞は、低用量のＢＣＮＵ単独に対して感受性でない。このことは、より多くのＭＧＭＴ発現初期ＣＤ４＋細胞を示唆するが、ＭＧＭＴ発現における変化が、Ｔ細胞ドナー間の変化に基づき予測される。
【０２５０】
ＢＧおよびＢＣＮＵの両方の存在は、それぞれ１０μＭまたはそれ以上で、ＣＤ４＋細胞の感作に最適であるが、０．５μＭでのＢＧおよび１５μＭまたはそれ以上のＢＣＮＵは、同様に、この細胞を感作した。ＢＧ用量の増加は、細胞死を増加しないが、ＣＤ４細胞に対する毒性は、ＢＣＮＵ用量に伴い増加した。
【０２５１】
図１１に示されるように、一般的に、選択レベルは、ベースラインの２０％から１００％に５倍に増加した。１つの実施形態において、選択は、３％〜＞９０％であった。１０〜１００倍の増殖が選択後および一週間後に見られ、そして；２０〜４００倍（平均８０倍で）の増殖が、２．５倍において見られた。
【０２５２】
（実施例７）
先の研究は、骨髄自己移植片のパージングと自己移植後の改善された、疾患のない生存との間の相関を示唆する。また、同種移植片由来の正常Ｔ細胞のパージングは、対宿主性移植片病の危険性を減少させるために使用されている。図１３Ａは、ｐＮ１（ｃＰＴ）ＡＳｅｎｖＧＦＰを用いた１ラウンドの形質導入による形質導入腫瘍細胞の効力を立証する。図１３Ｂは、腫瘍細胞が、選択的かつ効率的にＣＤ３４＋幹細胞により殺傷され得ることを確認する。なぜなら、後者は、１ラウンドの形質導入後に有意な形質導入を示さないからである。
【０２５３】
自己骨髄移植片由来の腫瘍細胞のパージングへの上記の適用は、骨髄を収集するか、または末梢血幹細胞を回収することにより始める。ＣＤ３４＋細胞を、ＣＤ３４抗体カラムを介して精製し、次いで条件付複製ベクターを用いて、ＭＯＩ  ２〜４００で２〜１６時間形質導入した。この細胞を、形質導入を補助するか、または細胞を維持するかのいずれかのために、１つ異常の細胞活性化因子（例えば、サイトカイン）の存在下で、必要に応じてインキュベートする。次いで、この細胞を処置されるべき被験体内に移す。
【０２５４】
同種移植片中のＴ細胞を同様に標的化する能力は、代理人登録番号３９７２７２０００４００として２０００年８月３１日に出願した同時係属の米国特許出願（今は譲渡されている）におけるプロトコルと同様に、Ｔ細胞を選択的に形質導入するように、高効率の安定な形質導入プロトコルと組み合わせて、複製ベクターを条件付きで使用する。
【０２５５】
（実施例８）
図１４のパネルＢは、種々のエンベロープタンパク質を有する本発明のＨＩＶ−１ベクターの効果的な仮分類を示す。
【０２５６】
ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質で仮分類されたレンチウイルスベクターと同様の初期力価は、高速遠心分離またはダイアフィルトレーションのいずれかを用いた精製により増大され得る。ベクターｐＮ１（ｃＰＴ２）ＡＳｅｎｖＧＦＰをｐＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ２とパッケージングした。以下の表は、（ａ）サンプル中の総タンパク質、（ｂ）そのサンプル中のベクター力価、および（ｃ）サンプル中の外来性物質由来の精製倍率（ｆｏｌｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を示す。
【０２５７】
【表１】
2005520482.tif 000007
表から分かるように、細胞片遠心後のベクター上清サンプル中の総タンパク質は３０２７ｍｇである一方、この段階でのそのベクター力価は、５．９×１０６である。ついで、このサンプルを、限外濾過により、サンプル中の総タンパク質が７２２ｍｇであり、そしてそのベクター力価が８．２×１０７まで、６１．７倍精製に増加するまで濃縮する。限外濾過による濃縮後、このサンプルを、サンプル中の総タンパク質がさらに２２４ｍｇまで減少するが、そのベクター力価は、１ｍｌにつき６．８×１０８まで、１６５０倍精製に増加するまでダイアフィルトレーションする。このことは、ベクターではない外来性タンパク質が除去され得、そしてＶＳＶ−Ｇにより仮分類したレンチウイルスベクターを、上記プロトコルを用いて精製し得ることを実証する。
【０２５８】
上記はまた、図１６に示されるように、約１０１０の力価を生じる、Ｈｅｌａ−ｔａｔ細胞株で産生されたベクターと組み合わせて使用され得る。
【０２５９】
（実施例９）
条件付き複製ベクターを仮分類するための代替のヘルパー構築物を、Ｒｅｖ−依存性コントロール下でＶＳＶ−Ｇ発現を配置することにより、開発した。ＲＲＥ含有ｍＲＮＡは、Ｒｅｖの非存在下では発現されないので、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子内に存在するシス抑制配列（ｃｉｓ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ＣＲＳ）の存在に帰因して欠損すると仮定される。このＣＲＳは、核内でｍＲＮＡを捕捉するか、ｍＲＮＡを不安定化するか、またはリボソームに関連するｍＲＮＡを妨げることが報告されている。従って、イントランスで供給されるＣＲＳおよびＲｅｖの存在は、スプライシングと組み合わせて遺伝子発現を調節するように産生するために使用され得る。
【０２６０】
Ｒｅｖ／ＲＲＥ／ＣＲＳ系を用いて、Ｒｅｖ依存性様式においてＶＳＶ−Ｇ発現を調節した。このアプローチのためのヘルパー構築物は、以下を含む：５’スプライスドナー部位；ＨＩＶ−２  ＲＲＥ部位および３’スプライスアクセプター部位（好ましくはｔａｔ／ｒｅｖについて）；ＨＩＶ−１ベースのベクターとの組換えの可能性を減少させるためのＨＩＶ−２  ｐｏｌ領域由来のＣＲＳフラグメント；および必要に応じて、任意の誘導性のプロモーターの代わりに、非誘導性のプロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）（ＩＥ）プロモーター）。ＲＮＡをコードするＶＳＶ−Ｇは、誘導されることなく産生されるが、スプライシングされていないＲＮＡのみが搬出され、そしてＲｅｖなしで細胞質中で発現され得るため、Ｒｅｖの存在によってなお調節される。ＶＳＶ−Ｇ発現は、Ｒｅｖに媒介されるままである。なぜなら、Ｒｅｖは、ｍＲＮＡスプライシングおよびＣＲＳによって調節される転写物の核保持を妨害するからである。
【０２６１】
好ましくは、このスプライスドナー部位は、合成５’β−グロビンスプライスドナー部位ではなく、ネイティブＨＩＶまたはＨＩＶアナログのスプライスドナー部位である。そのＨＩＶ−２  ＲＲＥは、Ｔａｔ／Ｒｅｖに対するＨＩＶ−２  ＲＲＥおよびそのスプライスアクセプター部位の両方を含む２８０ｂｐフラグメントであり；そしてそのＣＲＳは、ＨＩＶ−２  ｐｏｌ配列由来の５５０ｂｐの内因性フラグメントである。ＨＩＶ−２由来のＣＲＳエレメントおよびＲＲＥエレメントは、ＰＣＲによって調製され得る。このようなヘルパー構築物の非限定的な例としては、ｐＣＧＣＲＳＲＲＥ、ｐＣＧＣＲＳＲｚＲＲＥ、および図１５Ａ〜１５Ｅに示される他の構築物が挙げられる。この最終プラスミド構築物を、複数の制限酵素消化により確認した。ｐＥＨ−ＧＰおよびｐＣＭＶ−ＧＰは、ｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質を構成的に発現する構築物であるが、所望される場合、レンチウイルスプロモーターまたはＨＩＶプロモーターを含む他のプロモーターを使用し得る。
【０２６２】
図１７は、ＶＳＶ−ＧのＲｅｖ依存性発現について、多数の異なるスプライスドナーの組み合わせを使用した結果を示す。示すように、テトラサイクリンの除去は、Ｒｅｖ依存性発現を生じた。
【０２６３】
スプライスドナー部位の組み合わせおよびコンセンサス配列のさらなる例を、以下に提供する。全てを使用し得るが、ＨＩＶ主要、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ、ＨＩＶ−２主要、およびアナログのスプライスドナーの組み合わせが好ましい。
【０２６４】
コンセンサス  スプライスドナー：        ＮＮＮＮＡＧＧＴＡＡＧＴＮＮＮ
β−グロビン  スプライスドナー：        ＮＧＧＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴ
ＨＩＶ  主要スプライスドナー：          ＮＮＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＮ
ＨＩＶ−１  ＥＮＶスプライスドナー：    ＡＡＡＧＣＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴ
ＨＩＶ−２  ＥＮＶスプライスドナー：    ＡＧＡＣＡＡＧＴＧＡＧＴＡＡＧ
ＨＩＶ−２  主要スプライスドナー：      ＮＮＧＡＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＮ
アナログ  スプライスドナー：            ＣＴＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＮＮ
（実施例１０）
使用前にベクターを保存するための適切な条件を同定するため、種々の保存緩衝液および条件を試験した。その結果を図１８に示す。ベクターの回復を著しく低下せずに、−２０℃でかつ薬学的に受容可能な緩衝液中でベクターを保存する能力は、使用前のベクターを維持する非常にすばらしい利点である。言うまでもなく、他の薬学的に受容可能な組成物中での約−８０℃、約−２０℃、および約４℃でのベクターの保存もまた、容易に実施し得る。
【０２６５】
（実施例１１）
この実施例は、本発明の実施における使用のために、キメラＨＩＶ  ＣＴＬエピトープのアミノ酸配列を記載する。この配列は、翻訳を開始するための最初のメチオニン（Ｍ）、続いて、それぞれ、ｐ１７，ｐ２４，ｐ１５，Ｐｏｌ，Ｒｅｖ，ｇｐ１２０ｅｎｖ，ｇｐ４１ｅｎｖおよびｎｅｆに対応する、種々の部分配列を含む。
【０２６６】
【数１】
2005520482.tif 000008
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（実施例１２）
初期ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｗｔ−ＨＩＶ  ＤＮＡ形成の用量依存性阻害を、ＨＩＶベースのベクターの初期誘導後に観察した（図１９参照のこと）。初期ＣＤ４＋Ｔ細胞をベクターを用いて形質導入し、そしてｗｔ−ＨＩＶ感染によりチャレンジする前に刺激性条件下で５日間培養した。１または１０の感染効率（ｃＰＴ２−１またはｃＰＴ２−１０として図に示す）でこのＨＩＶベースのベクター（ｃＰＴ２）を用いた。次いで、この形質導入した細胞を、変化する感染効率（０．２，０．０１および０．００１）でｗｔ−ＨＩＶ（ＮＬ４−３株）でチャレンジした。図１９の最後の２つのレーンは、ｗｔ−ＨＩＶ  ＤＮＡ増幅を示すｐＮＬ４−３プラスミドスパイク（ｓｐｉｋｅｄ）ＤＮＡポジティブコントロールである。この細胞を感染後８日目に溶解し、そして確立した方法を用いてＤＮＡを抽出した。ｗｔ−ＨＩＶおよびベクター配列に特異的なプライマーを用いて、ＤＮＡ  ＰＣＲを、この抽出した細胞のＤＮＡサンプルに対して実施して、統合したｗｔ−ＨＩＶとベクターＤＮＡとの間を識別した。このｗｔ−ＨＩＶ特異的プライマーは、使用したベクター中に存在しないｎｅｆ遺伝子配列に指向する。このデータは、ベクター形質導入ＭＯＩ  １（ｃＰＴ２−１）で、細胞は、ＤＮＡサンプルにおけるｗｔ−ＨＩＶ  ＤＮＡの可視シグナルによって示されるように、ｗｔ−ＨＩＶ  ＤＮＡ形成を可能にするが、ベクターＭＯＩ  １０（ｃＰＴ−２−１０）では、ｗｔ−ＨＩＶ  ＤＮＡ形成は見られなかった。このことは、このベクターが、ｗｔ−ＨＩＶ  ＤＮＡの産生を阻害し得、そして形質導入した宿主細胞内での組み込みを防止し得ることを示す。このデータはまた、この阻害レベルが用量依存的であることを示す。
【０２６７】
（実施例１３）
この実施例は、上記のような本発明の実施形態の要旨を提供する。本発明は、発現されるべき遺伝子（または他の核酸）および１以上の第１ヌクレオチド配列を含む、条件付きで複製するウイルスベクターを含み、ここでこのベクターが、（ａ）ウイルスの野生型株、ヘルパーウイルス、またはヘルパーベクター（これら各々が上記１以上の第１ヌクレオチド配列の存在に対して感受性である）と相補性である場合にのみ宿主細胞において複製し；（ｂ）上記１以上の第１ヌクレオチド配列の存在に対して耐性であり；そして（ｃ）複製可能ベクターを生成する可能性を減少させる１以上の置換、挿入、または欠失を含む。
【０２６８】
複製可能ベクターを生成する可能性を減少させるために、本発明は、ヘルパー構築物、宿主細胞の核酸成分、または他の核酸の１以上の配列に関与する、変性した配列を含むベクターを提供する。さらに、ヘルパーは、それらをパッケージングするためのこのようなベクターとの組み合わせにおいて使用するために構築される。このようなヘルパー構築物はまた、このベクター、宿主細胞の核酸成分、または他の核酸の１以上の配列に関与する、変性した配列を含み得る。
【０２６９】
本発明のベクターはまた、ヘルパー構築物を標的とする１以上の配列を含み得る。このような配列は、遺伝子的抗ウイルス因子を含み、そして好ましくは、リボザイムまたはアンチセンス核酸である（かまたはこれらをコードする）。好ましいリボザイムおよびアンチセンス配列は、標準のＡ−Ｔ、Ａ−Ｕ、およびＧ−Ｃ塩基対に加え、Ｇ−Ｕ塩基対を介してそれらの別個の標的との塩基対形成の相補性を生じ得る。同様に、本発明のヘルパー構築物はまた、ベクターを標的化するために、同じ型の配列を含み得る。
【０２７０】
本発明のヘルパーベクターはまた、ベクターと比較して、ヘルパーによってヘルパーから発現されたＲＮＡの局在、すなわち細胞性輸送に影響する、１以上の配列を含み得る。例えば、このヘルパーベクターはイントロン、ベクターと比較して非相同性のＲＲＥ、またはベクターと比較して非相同性のｇａｇ配列を含み得る。このヘルパーベクターはまた、ヘルパーＲＮＡおよびベクターＲＮＡが、同時に局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅ）しないように、このベクターと組み合わせて、変性したｇａｇ配列および／またはｐｏｌ配列を含み得る。このヘルパーベクターはまた、それらとベクターＲＮＡとの同時局在を防止するために、パッケージングシグナルおよびＲＲＥシグナル（配列）をＲＮＡから除くように、スプライスドナー部位を含み得る。このようなスプライスドナー部位はまた、ヘルパーベクターまたは野生型ウイルスと比較して、ベクターの差示的輸送を生じるように、ヘルパーベクター中に存在し得る。
【０２７１】
本発明のヘルパーベクターはまた、本発明のベクターを仮分類し得る。例示的な例としては、ＶＳＶ−Ｇ、ＲＤ１１４、狂犬病ウイルス、ＧＡＬＶ、およびキメラエンベロープタンパク質が挙げられる。本発明のヘルパーベクターはまた、好ましくは、ベクターに関して、異種ウイルス由来する。一例は、ＨＩＶ−２由来のヘルパーベクターである。本発明の方法は、本発明のベクターを複製するために、このようなヘルパーベクターの使用を含む。
【０２７２】
本発明の例示的ベクターとしては、図１Ａ〜１Ｋに示される、特に、ＧＦＰ配列の除去または置換を有する、ｐＮ１およびｐＮ２シリーズのベクターが挙げられる。好ましくは、これらのベクターは、少なくとも、アンチセンス配列およびｃＰＴ含有配列を保持する。本発明の例示的なヘルパー構築物としては、リボザイムを有するか、または有しない、図６Ａ〜６Ｇに示されるようなｐＶｉｒＰａｃシリーズが挙げられる。
【０２７３】
本発明のベクターおよびヘルパーの全てを、必要に応じて、上記のように、またはこの構成の他の部分で、変性し得る。好ましい変性は、ヒト細胞において優先的に使用されるコドンに対する。このベクターおよびヘルパーはまた、別個の、天然に存在する核酸ならびに合成核酸由来であるように、本質的にキメラであり得る。好ましいキメラ構築物は、ＨＩＶ−１配列およびＨＩＶ−２配列の両方を含む。しかし、特に好ましいベクターは、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質由来かまたはＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質をコードするＨＩＶ−１である。あるいは、このベクターは、ヘルパーベクター、野生型ウイルス、または宿主細胞によって供給されるＴａｔタンパク質をコードしない。
【０２７４】
本発明のベクターはまた、好ましくは、ウイルス補助タンパク質（ｖｉｒａｌ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードしないか、または発現しない。このベクターはまた、宿主細胞中に存在するか、または毒薬に対する耐性を上記細胞に与える場合、ウイルス感染を減少させるか、最小化するか、または予防する核酸を含み得る。このような核酸の例としては、細胞表面タンパク質または短縮されたＣＣＲ５タンパク質、好ましくは、ＣＣＲ５Δ３２Ｔタンパク質が挙げられる。他の例としては、薬物またはＤＮＡ損傷薬剤に対する耐性、好ましくは多剤耐性またはＭＧＭＴ改変体（特にＧ１５６Ａ改変体）に対する耐性をコードする核酸が挙げられる。さらなる例としては、トランス優性の表現型をコードする核酸が挙げられる。例示的な例は、トランス優性のＨＩＶ−１  ｇａｇ配列である。
【０２７５】
本発明のベクターはまた、非相同配列の発現を補助するような配列を含み得る。例示的例は、絶縁（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）配列である。このベクターはまた、細胞内へのこのベクターの形質導入を改善する配列を含み得る。例示的な例は、本明細書中に記載されるｃＰＴを含む５４５塩基対配列であるが、ｃＰＴを含む、より小さなフラグメントまたはより大きなフラグメントもまた使用され得る。このベクターはまた、その中に配置される転写結合部位で改変されたＬＴＲを含む遺伝子ならびに核酸を発現するＬＴＲを含み得る。好ましくは、このように改変されたＬＴＲがレンチウイルスベクター中に含まれる。本発明の方法は、このようなベクターの使用を含む。
【０２７６】
本発明のベクターはまた、適切に配置されたスプライス部位またはＩＲＥＳエレメントを用いて少なくとも２つの遺伝子を発現する。このベクターはまた、形質導入のための標的または宿主細胞を刺激する１つ以上のキメラエンベロープタンパク質を有するウイルス粒子内にパッケージングされ得る。さらに、このベクターは、ヘルパーがタンパク質であるか、またはヘルパーが遺伝子発現を調節するためのＲｅｖ／ＲＲＥ／ＣＲＳ系を含む場合、細胞内にパッケージングされ得る。本発明の方法は、このようなベクターの使用も含む。
【０２７７】
本明細書中に引用される特許、特許出願、および刊行物を含む引例の全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される。本明細書中で使用される場合、単数形態で示される用語全ては、単数形態および複数形態の両方を含むことを意図される。
【０２７８】
本発明は、好ましい実施形態により強調して記載されているが、好ましい実施形態における改変がなされて実施され得、そして本発明が、本明細書中に詳細に記載される以外の別な方法で行われ得ることは、当業者に明らかである。本発明は、このような変化および代替の実施を含むことを意図する。従って、本発明は、上記の請求項の範囲によって定義されるように、本発明の精神および範囲内に含まれる改変の全てを含む。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ１（ｃＰＴ）の模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性（ｃｅｎｔｒａｌ）ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ１（ｃＰＴｃ）ＡＳｅｎｖＧＦＰ（４６４）の模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ１（ｃＰＴ）ＡＳｅｎｖＧＦＰ（４５２）の模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ１（ｃＰＴ２）ＡＳｅｎｖＧＦＰの模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ１（ｃＰＴ）ｃＧＦＰの模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｆ】図１Ｆは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ１ＧＦＰ（ｃＰＴ）Ｔの模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｇ】図１Ｇは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰＴＡＲの模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｈ】図１Ｈは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ１ＧＦＰ（ｃＰＴ）ＶＴの模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質に対するコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｉ】図１Ｉは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ２ＧＦＰの模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｊ】図１Ｊは、本発明によって包含される特異的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ２ＡＳｅｎｖＧＦＰ（４１８）の模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図１Ｋ】図１Ｋは、本発明によって包含される本質的に改良された、条件付複製ベクターｐＮ２（ｓｐｅ）ＡＳｅｎｖＧＦＰの模式図である。当然、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するマーカー遺伝子を、本明細書中に記載される適用において、ベクターの使用の前に除去し得る。記号：Ｎ１、ｇａｇ／ｐｏｌ配列をもたないが、ｇａｇ’またはｇａｇ’’として示されるｇａｇ由来のパーッケージ化配列およびこのｇａｇ配列のＡＴＧから約４０塩基対に位置する終止コドンを有する最小のＨＩＶ−１由来ベクター；Ｎ２、ｇａｇ／ｐｏｌ配列を発現し得るＨＩＶ−１由来ベクター；ＡＳ、アンチセンス；ＡＳｅｎｖ、アンチセンス方向に存在するｅｎｖ配列；ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、それぞれウイルス核、逆転写酵素、およびエンベロープを形成するタンパク質についてのコード配列；ｔａｔ、ｒｅｖ、ｒｒｅ、およびｎｅｆ、付加的なウイルス性遺伝子；ｃＰＴｃ、最小の中心性ポリピリミジントラクト配列；ｃＰＴ、約５４８塩基対の大きな挿入物を含む中心性ポリピリミジントラクト；ｃＰＴ２、約４３８塩基対の配列を含む中心性ポリピリミジントラクト（ｃＰＴほどｇａｇ配列を含まない）；ｓｐｅ、翻訳されないｇａｇ／ｐｏｌ配列；ＧＦＰ、コードされた緑色蛍光タンパク質。
【図２】図２は、野生型ＨＩＶ  Ｕ５  ＲＮＡ配列番号１（Ａ）および改変ｃｒＨＩＶ  Ｕ５  ＲＮＡ配列番号２（Ｂ）のＤＮＡ配列を示す。番号は、転写開始から下流の塩基番号について言及する。
【図３Ａ】図３Ａは、産生された条件付きで複製する（ｃｒ）ベクターの力価に対する、ヘルパーベクター  対  ｃｒベクターの比率の影響を図示する。図３Ａは、ｐＮ１（ｃＰＴｃ）ＧＦＰについて最高の力価を生じる１：０．５のモル比を示す。アンチセンスｅｎｖ配列を欠損するｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰ、およびＧＦＰを発現するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを挿入されたｐＮ１ｃＧＦＰおよびｐＮ２ｃＧＦＰを除くベクターは、図１に示される。この図は、１ｍｌあたり少なくとも１．５×１０７形質導入単位の力価を生成する条件が、２つのプラスミド系を用いて達成されたことを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、産生された条件付きで複製する（ｃｒ）ベクターの力価に対する、ヘルパーベクター  対  ｃｒベクターの比率の影響を図示する。図３Ｂは、ｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰについて最高の力価を提供する１：０．７５のモル比を示す。アンチセンスｅｎｖ配列を欠損するｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰ、およびＧＦＰを発現するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを挿入されたｐＮ１ｃＧＦＰおよびｐＮ２ｃＧＦＰを除くベクターは、図１に示される。この図は、１ｍｌあたり少なくとも１．５×１０７形質導入単位の力価を生成する条件が、２つのプラスミド系を用いて達成されたことを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、産生された条件付きで複製する（ｃｒ）ベクターの力価に対する、ヘルパーベクター  対  ｃｒベクターの比率の影響を図示する。図３Ｃは、ｐＮ１（ｃＰＴ２）ＡＳｅｎｖＧＦＰについて最高の力価を提供する１：０．７５のモル比を示す。アンチセンスｅｎｖ配列を欠損するｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰ、およびＧＦＰを発現するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを挿入されたｐＮ１ｃＧＦＰおよびｐＮ２ｃＧＦＰを除くベクターは、図１に示される。この図は、１ｍｌあたり少なくとも１．５×１０７形質導入単位の力価を生成する条件が、２つのプラスミド系を用いて達成されたことを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、産生された条件付きで複製する（ｃｒ）ベクターの力価に対する、ヘルパーベクター  対  ｃｒベクターの比率の影響を図示する。図３Ｄは、ｐＮ１ｃＧＦＰについて最高の力価を提供する１：１．５のモル比を示す。アンチセンスｅｎｖ配列を欠損するｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰ、およびＧＦＰを発現するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを挿入されたｐＮ１ｃＧＦＰおよびｐＮ２ｃＧＦＰを除くベクターは、図１に示される。この図は、１ｍｌあたり少なくとも１．５×１０７形質導入単位の力価を生成する条件が、２つのプラスミド系を用いて達成されたことを示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、産生された条件付きで複製する（ｃｒ）ベクターの力価に対する、ヘルパーベクター  対  ｃｒベクターの比率の影響を図示する。図３Ｅは、ｐＮ２ｃＧＦＰについて最高の力価を提供する１：１．５のモル比を示す。アンチセンスｅｎｖ配列を欠損するｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰ、およびＧＦＰを発現するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを挿入されたｐＮ１ｃＧＦＰおよびｐＮ２ｃＧＦＰを除くベクターは、図１に示される。この図は、１ｍｌあたり少なくとも１．５×１０７形質導入単位の力価を生成する条件が、２つのプラスミド系を用いて達成されたことを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、１つのＨＩＶ−２ベースの条件付複製ベクターｐＳ１ｃＧＦＰのマップを示す。記号ｐＳ１は、ｐＮ１について上記されるようにｇａｇ／ｐｏｌ配列の非存在または存在をいう。記号ｃは、ＧＦＰの発現を指示するＣＭＶプロモーターの存在を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、１つのＨＩＶ−２ベースの条件付複製ベクターｐＳ２ｃＧＦＰのマップを示す。記号ｐＳ２は、ｐＮ２について上記されるようにｇａｇ／ｐｏｌ配列の非存在または存在をいう。記号ｃは、ＧＦＰの発現を指示するＣＭＶプロモーターの存在を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ｐＳ１ｃＧＦＰのパッケージ化に関する異なるヘルパーベクター構築物の効果を図示する。ヘルパーベクターと条件付複製ベクターとの間の異なるモル比の効果を、ヘルパーベクターに対する異なるＲＲＥの効果とともに試験した。示されるように、ヘルパーベクター  対  条件付複製ベクターの比１：１の使用が、試験した他の比率よりも機能性ベクター粒子の産生に、より効果的であった。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｐＳ２ｃＧＦＰのパッケージ化に関する異なるヘルパーベクター構築物の効果を図示する。ヘルパーベクターと条件付複製ベクターとの間の異なるモル比の効果を、ヘルパーベクターに対する異なるＲＲＥの効果とともに試験した。示されるように、ヘルパーベクター  対  条件付複製ベクターの比１：１の使用が、試験した他の比率よりも機能性ベクター粒子の産生に、より効果的であった。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明によって包含されるヘルパーベクター構築物ｐＶＩＲＰＡＣ−１の構造を示す。Ｒｚは、アンチ−Ｕ５リボザイムの存在をいい、一方、１．１および１．２は、それぞれ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に由来するＲＲＥを有するヘルパーをいう。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明によって包含されるヘルパーベクター構築物ｐＶＩＲＰＡＣ−２の構造を示す。Ｒｚは、アンチ−Ｕ５リボザイムの存在をいい、一方、１．１および１．２は、それぞれ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に由来するＲＲＥを有するヘルパーをいう。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明によって包含されるヘルパーベクター構築物ｐＶＩＲＰＡＣ−１．１Ｒｚの構造を示す。Ｒｚは、アンチ−Ｕ５リボザイムの存在をいい、一方、１．１および１．２は、それぞれ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に由来するＲＲＥを有するヘルパーをいう。
【図６Ｄ】図６Ｄは、本発明によって包含されるヘルパーベクター構築物ｐＶＩＲＰＡＣ−１．２の構造を示す。Ｒｚは、アンチ−Ｕ５リボザイムの存在をいい、一方、１．１および１．２は、それぞれ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に由来するＲＲＥを有するヘルパーをいう。
【図６Ｅ】図６Ｅは、本発明によって包含されるヘルパーベクター構築物ＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚの構造を示す。Ｒｚは、アンチ−Ｕ５リボザイムの存在をいい、一方、１．１および１．２は、それぞれ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に由来するＲＲＥを有するヘルパーをいう。
【図６Ｆ】図６Ｆは、本発明によって包含されるヘルパーベクター構築物ｐＶＩＲＰＡＣ−１．２Ｒｚ２の構造を示す。Ｒｚは、アンチ−Ｕ５リボザイムの存在をいい、一方、１．１および１．２は、それぞれ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に由来するＲＲＥを有するヘルパーをいう。
【図６Ｇ】図６Ｇは、本発明によって包含されるヘルパーベクター構築物ｐＶＩＲＰＡＣ１．２ＲｚＩｎの構造を示す。Ｒｚは、アンチ−Ｕ５リボザイムの存在をいい、一方、１．１および１．２は、それぞれ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に由来するＲＲＥを有するヘルパーをいう。
【図７】図７は、ウイルスベクターの力価に対する１つ以上のリボザイムの影響を図示する。ｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰを、ｐＶｉｒＰａｃ１．２（リボザイムを含まない）、ｐＶｉｒＰａｃ１．２ＲｚＩｎ（１つのリボザイムおよびイントロンを含む）、ｐＶＰ１．２Ｒｚ（１つのリボザイムを含む）またはｐＶＰ１．２Ｒｚ２（２つのリボザイムを含む）の存在下で、ＨｅＬａ−ｔａｔ細胞にパッケージ化した。グラフに示されるように、１つのリボザイム（ｐＶｉｒＰａｃ１．２Ｒｚ）またはリボザイムおよびヘルパーＲＮＡ（ｐＶｉｒＰａｃ１．２ＲｚＩｎ）の細胞性輸送に作用するように設計されたイントロンの存在は、ベクター力価に有意な効果を有さなかった。同時パッケージ化（ｃｏ−ｐａｃａｋａｇｅ）ヘルパー構築物に関する力価サンプルのＰＣＲ分析は、リボザイムの非存在下の高い同時パッケージ化に対して、リボザイムの存在下で低い同時パッケージ化を示した。指標「ＶｉｒＰａｃ」はまた、「ＶＩＲＰＡＣ」または「ＶＰ」を意味し得る。
【図８】図８は、Ｔ細胞における野生型ＨＩＶの複製に関するｐＮ１シリーズおよびｐＮ２シリーズ由来のベクターの阻害性効果を図示する。Ｔ細胞を、最初ベクターで形質導入し、次いで１００％形質導入された細胞を用いて、０．１の感染多重度で、野生型ウイルスでチャレンジした。ウイルスの複製を、ｐ２４  ＥＬＩＳＡ抗原捕捉アッセイによってアッセイした。ｐＮ２ＡＳｅｎｖＧＦＰは、野生型ウイルス複製の大きな阻害を示した。
【図９Ａ】図９Ａは、ｐＮ１ベースのベクターおよびｐＮ２ベースのベクターによる野生型ＨＩＶの複製の強力な阻害を示す。図９Ａは、野生型ＨＩＶによる感染の際、コントロールの腫瘍細胞と比較した、ｐＮ１ＧＦＰ（ｃＰＴ）ＶＴおよびｐＮ２ＡＳｅｎｖＧＦＰによる、ヒトＴ細胞における野生型ＨＩＶの強力な阻害を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ｐＮ１ベースのベクターおよびｐＮ２ベースのベクターによる野生型ＨＩＶの複製の強力な阻害を示す。図９Ｂは、ｐＮ１（ｃＰＴ）ＡＳｅｎｖＧＦＰおよびｐＮ２ＡＳｅｎｖＧＦＰを用いた、Ｔ細胞における同様な結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ベクターおよび形質導入された細胞を選択するためのそれらの使用を示す。図１０Ａは、使用したベクターの構成を示し、ここで、ｐＮ１ＣＭＩＧおよびｐＮ１ＭＣＧは、内在性ＣＭＶプロモーターを有するが、ｐＮ１ＭＩＧおよびｐＮ１ＭＩＧ−Ｗは、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターを介してＭＧＭＴ遺伝子を発現する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ベクターおよび形質導入された細胞を選択するためのそれらの使用を示す。図１０Ｂは、上記ベクターで形質導入され、そして以下の実施例５に記載されるようにＢＧおよびＢＣＮＵで選択された、ＳｕｐＴ１細胞の増殖のグラフを示す。
【図１１】図１１において、パネルＡ〜Ｆは、ＢＧおよびＢＣＮＵで形質導入した初期ＣＤ４＋細胞の選択を示す。ｐＮ２ＭＩＧで形質導入したＣＤ４＋細胞を、示された濃度のＢＣＮＵとともに０μＭ、０．５μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、および１０μＭのＢＧ（それぞれパネルＡ〜Ｆに示される）中で培養した。パネルＦは、さらに、形質導入した細胞を１：５に希釈した後、１０μＭ  ＢＧおよび示されたＢＣＮＵ濃度で処理した結果を示す。パネルＦにおける３％  ＧＦＰ＋細胞の開始レベルは、インビトロでこれまで観察されていないレベルである、少なくとも３２倍（９７％）まで増加した。
【図１２】図１２は、ベクター調製物中へのヘルパーＲＮＡの同時パッケージ化を妨げるリボザイムの効果を示す。ウイルスを含む上清を、「ブーム（ｂｏｏｍ）抽出」によって抽出し、そしてＤＮａｓｅ  Ｉ消化した後、ヘルパー構築物中に見出されるＨＩＶ−１  ｇａｇ−ｐｏｌ領域の定量的逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）検出に供した。示されるように、使用したヘルパー構築物（ｐＶＰ１．２ＲｚまたはｐＶＰ１．２Ｒｚ２）における１つまたは２つのリボザイムの存在は、リボザイムを含まない（ｍｉｎｕｓ）ヘルパー（ｐＶＰ１．２）を越えて、同時パッケージ化ヘルパーベクターの量を有意に減少させた。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＣＤ３４＋幹細胞由来の腫瘍細胞をパージする能力を示す。図１３Ａは、ＭＯＩ  １０で、ｐＮ１（ｃＰＴ）ＡＳｅｎｖＧＦＰが、１ラウンドの形質導入後、９８．５２％のＳｕｐＴ１腫瘍細胞に形質導入されたことを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＣＤ３４＋幹細胞由来の腫瘍細胞をパージする能力を示す。図１３Ｂは、ＣＤ３４＋細胞の形質導入において、１ラウンドの形質導入後に有意な形質導入が観察されなかったことを示す。３ラウンド以降のみ、有意な形質導入が観察された。記号：１／２／Ａは、例えば、１ラウンドの２のＭＯＩの形質導入、および形質導入されたベクターに関するウイルス補助タンパク質の存在をいい、一方、３／５０は、例えば、３ラウンドの形質導入および５０のＭＯＩをいう。
【図１４Ａ】図１４Ａは、示される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインを有する、ＶＳＶ−Ｇ野生型エンベロープタンパク質、ＲＤ１１４野生型エンベロープタンパク質、およびキメラエンベロープタンパク質の構造を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、異なるエンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ野生型、狂犬病ウイルスＧ、ＲＤ１１４野生型、およびＲＤ１１４Ｅ、ＶＳＶ−ＧおよびＲＤ１１４のキメラ構築物）を有するＨＴ１０８０における、偽型ＨＩＶ−１ベクターの力価を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、本発明によって包含される特定のパッケージ化株構築物ｐ（ＣＧＣＲＳＲＲＥ）の模式図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、本発明によって包含される特定のパッケージ化株構築物ｐ（ＴＲＥｔＴＡｐｕｒｏ）の模式図である。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、本発明によって包含される特定のパッケージ化株構築物ｐ（ＢＩ−ＲｅｖＴａｔ）の模式図である。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、本発明によって包含される特定のパッケージ化株構築物ｐ（ＥＨ−ＧＰ）の模式図である。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、本発明によって包含される特定のパッケージ化株構築物ｐ（ＣＭＶ−ＧＰ）の模式図である。
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、ｒｅｖ依存性ＶＳＶ−Ｇ構築物の構成を示す。
【図１６】図１６は、ＨｅＬａ−ｔａｔ細胞における濃縮前後の細胞工場（ｆａｃｔｏｒｙ）あたりのｐＮ１（ｃＰＴ）ＧＦＰベクターの収量を示す。示されるように、この収量は、いずれの条件設定でも約１０１０のままである。
【図１７】図１７は、コントロールＶＳＶ−Ｇ発現に対してＲｅｖ／ＲＲＥ／ＣＲＳ系を使用した結果を示す。
【図１８】図１８は、異なる温度で３〜５週間貯蔵後のベクター回復における貯蔵緩衝液の影響を示す。示されるように、Ｄ−ＰＢＳまたはＨＢＳのいずれかにおいて、１０％トレハロースまたは１０％グルコースの存在は、−２０℃または−８０℃のいずれかで貯蔵後のベクターのよい回復を提供した。
【図１９】図１９は、本発明のベクターを含む細胞における野生型ＨＩＶ−１  ＤＮＡの阻害を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月23日(2005.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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