(57)【要約】本発明は、毒ヘビ毒腺、特にボスロプス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ）によって分泌されたペプチドの単離および精製；かく得られたペプチド、ならびに原核生物および真核生物系における遺伝子工学技術による生産方法；かく得られた遺伝子工学作成ペプチド；化学合成による該ペプチドの生産、ならびにこの化学的プロセッシングから得られるペプチドに関する。また、本発明は、バソペプチダーゼの阻害剤としてそれを作用させ、その結果、全身動脈血圧を低下させ、局所的な血管拡張作用を示させるために、区別される医薬組成物中での、異なる手法によって得られた、および種々の手段によって生物に導入された該ペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）１５００ないし２０００ｒｐｍにおける１５ないし２０分間の遠心によって、ボスロプス・ジャララカ毒液のプールから得られた合計８００ないし１５００ｍｇの毒液を７．０ないし１５ｍｌの脱イオン水に溶解させ；上清を濾過カラム、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（２５ないし８０μ，Ｓｉｇｍａ）、１．２×１０１ｃｍに通し；該カラムを室温にてｐＨ５．０ないしｐＨ６．０の３０ないし５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液で平衡化させ；
ｂ）試料を該カラムの頂部に載せ、成分を１．０ない し２．０ｍＬ／分の液速で溶出させ；
ｃ）２１４ｎｍにおいて各分取分につき吸光度プロフィールを得て、該プールの組成を規定し；
ｄ）増強活性を示すプールの成分を、０．２ないし０．５ｍＬ／分の液速にて、０．１ないし１．０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／水およびアセトニトリル／水（９：１）を溶媒として用い、溶媒Ｂの５％ないし６０％のグラジエントを用いる高速液体クロマトグラフィーによって部分的に精製し；
ｅ）ブラジキニン増強ペプチドの分子量および一次構造を質量分析（ＥＳＭＳ−ＭＳ）によって測定する；
ことを含む、血管拡張および抗高血圧作用を有し、毒ヘビ毒腺（ＢＰＰ）、特にボスロプス・ジャララカによって分泌されるか、または内因的に生産される（ＥＶＡＳＩＮＳ）、アンギオテンシン−変換酵素のカルボキシル部位につき特異性を示すバソペプチダーゼペプチド阻害剤を単離し精製する方法。
【請求項２】
上記工程（ｄ）において、２１４ｎｍに設定されたＵＶ−ｖｉｓ検出器および逆相カラムＣ−１８／Ｂｅｃｋｍａｎ（５μ，４．６×２５０ｍｍ）と共にＨＰＬＣ  Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ、モデルＬ−６２００Ａを用い、試料に従ってグラジエントを変化させることを特徴とする請求項１記載の血管拡張および抗高血圧作用を有し、毒ヘビ毒腺、特にボスロプス・ジャララカによって分泌される（ＢＰＰ）か、または内因的に生産される（ＥＶＡＳＩＮＳ）、アンギオテンシン−変換酵素のカルボキシル部位につき特異性を示すバソペプチダーゼペプチド阻害剤を単離し精製する方法。
【請求項３】
試料を０．１％のギ酸を含む５０％水／ＡＣＮに溶解させ、注入ポンプによって５μＬ／分の一定液速下で試料を注入することによって、質量分析によって実施され、４００および１６００の間の質量／電荷比率（ｍ／ｚ）を走査し、全分析プロセスの間に５秒の走査時間を用いて、データを第１の四重極（ＥＭ−ＭＳ）で獲得し、第１の四重極において特徴付けられるごとくプロトン化イオンを呈するペプチドを選択し、続いて３×１０−３アルゴンガス圧下で衝突誘導解離（ＣＩＤ）によって断片化し、次いで、第２の四重極（ＥＳＭＳ−ＭＳ）を走査することによりデータを獲得することによって配列決定を行うことを特徴とするＢＰＰのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項４】
それを、電子スプレイイオン源（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）にての正イオン化モードでマススペクトロメーターＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＩＩ（ＥＳ−ＭＳ−ＭＳ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で行い、データ獲得にソフトウエアＭａｓｓ  Ｌｙｎｘ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を用いることを特徴とする請求項３記載のＢＰＰのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項５】
特徴付けおよび配列決定が、質量分析システム（ＬＣ−ＥＳＭＳ−ＭＳ）にカップリングされたＨＰＬＣシステムによって行い、自動インジェクター、２１４ｎｍに設定されたＵＶ／ｖｉｓ検出器と、逆相カラムとして全毒液成分の精製のためのＣ−１８／分離グループ（５μＭ，４．６×２５０ｍｍ）とを備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＨＰＬＣ、モデル１１００を用いることを特徴とするＢＰＰのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項６】
以下の工程：
ａ）イソチオシアナイドグアニジン−フェノール−クロロホルム抽出方法により種々のボスロプス・ジャララカ組織から全ＲＮＡを単離し；各毒ヘビ組織の１．０ないし５．０マイクログラムの全ＲＮＡを変性アガロース電気泳動処理（１．０ないし２．５％ホルムアルデヒド）に付し、毛管現象によってナイロン膜に移し；真空オーブン中にてＲＮＡを８０℃にて１ないし２時間で該膜にブロットし；
ｂ）該膜を、クロスリンカー（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）（ＲＰＮ  ２５００モデル−アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））にて７００００Ｊ／ｃｍ２において該膜を３０ないし５０分間紫外光に暴露し；
ｃ）２．５ｍＭのＫ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５×デンハルトの溶液、５０μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、および１０％硫酸デキストランを含有する５０％ホルムアミド溶液中にて、プレ−ハイブリダイゼーションを４２℃にて一晩または１６時間行い；
ｄ）各々、ＥＶＡＳＩＮＳおよびＣＮＰのコーディング配列につき、制限酵素ＳｍａＩ、およびＳｍａＩ＋ＢａｍＨＩで、ＢＰＰおよびＣＮＰ前駆体、クローンＮＭ８７をコードするｃＤＮＡインサートを含むクローンを消化することによって、放射性プローブの合成用の鋳型ストランドとして用いるｃＤＮＡ断片を得；
ｅ）低融点アガロースを用いるゲル電気泳動によって該インサートを得；
ｆ）続いて、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、次いでエタノール沈殿を行い；
ｇ）ランダムヘキサヌクレオチドおよびポリメラーゼ（クレノウまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下、α［３２Ｐ］−ｄＣＴＰの取込に基づく反応において約５０ないし１００ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いて放射性プローブを調製し；
ｈ）スピン−カラムＳ−２００（ファルマシア）を用いて、取り込まれなかった放射性−標識ヌクレオチドからプローブを分離し；
ｉ）放射性標識ｃＤＮＡプローブを用いて、プレ−ハイブリダイゼーションを６５℃にて３０ないし４５分間行い；
ｊ）約１．５×１０６ｃｐｍ／ｍｌの濃度にて、放射性標識プローブをプレ−ハイブリダイゼーション培地に添加し；
ｋ）膜を高ストリンジェンシー条件で洗浄し（２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃において各々１５分間４回洗浄、および０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６５℃にて各々１０分間の３回洗浄）；
ｌ）膜の放射性シグナルの観察された強度に応じて、適当なカセット中のＸ−線フィルムに膜を必要な時間暴露し；
ｍ）上記フィルムを−８０℃に保持する；
ことを含む、特にボスロプス・ジャララカの、毒ヘビ組織で発現されたこれらの分子の前駆体のｃＤＮＡを用いて推定によりＥＶＡＳＩＮＳのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項７】
以下の工程：
ａ）グアニジンイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出方法を用いて、Ｂ．ジャララカの脳からの全ＲＮＡを単離し；
ｂ）全ＲＮＡ溶液を予め充填されたオリゴ−ｄＴセルロースカラム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）に２回通すことによってメッセンジャーＲＮＡを精製し；
ｃ）精製されたメッセンジャーＲＮＡの１つの分取分を変性アガロースゲル電気泳動（１．０ないし２．５％ホルムアルデヒド）に付し、臭化エチジウムで染色し；
ｄ）該ＲＮＡを毛管現象によってナイロン膜に移して、ＢＰＰをコードする領域に特異的なプローブでハイブリダイゼーションによるその一体性を確認し；
ｅ）カラム技術を用いて、ｃＤＮＡライブラリをλ  ＺＡＰファージ中に構築し；
ｆ）５μｇの脳メッセンジャーＲＮＡから得られた二本鎖ｃＤＮＡインサートをλ  ＺＡＰファージにクローン化し；
ｇ）これをイン・ビトロでパッケージし；力価を測定してクローニング効率を確認し；
ｈ）各々、クロロホルムおよびＤＭＳＯの存在下、ファージライブラリ−を増幅し、分取分を−２０℃および−８０℃に維持する；
ことを含む、特にボスロプス・ジャララカの、毒ヘビの脳組織で発現されたこれらの分子の前駆体のｃＤＮＡを用いて、推定によりＥＶＡＳＩＮＳのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項８】
以下の工程：
ａ）毒腺からのＢＰＰおよびＣＮＰの前駆体をコードするｃＤＮＡ配列に従って設計された特異的オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）増幅のために、脳ｃＤＮＡライブラリーの全ファージ溶解物（１０μｌ）を用い、インキュベーションを４２℃で１５分間行い、続いて４℃まで冷却し；
ｂ）酵素を供給された、１０ピコモルの各プライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（アマーシャム）、２００μＭのｄＮＴＰおよび１×ＰＣＲ緩衝液よりなる増幅反応に他の成分を添加し；
ｃ）各調製された反応混合物を、９４℃における４℃の変性サイクル、および引き続いて、９４℃における１分、６０℃における１分、及び７２℃における１分の３５サイクルに付し；
ｄ）アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を分析し、臭化エチジウムで染色するまで、反応混合物を４℃に維持し；
ｅ）通常の方法によってＰＣＲ産物をｐＣＲｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミドベクターにサブクローン化し、ベクターの多重クローニング部位に隣接する部位にアニールされるオリゴヌクレオチド（プライマーＴ３およびＴ７）を用いて配列決定する；
ことを含む、特にボスロプス・ジャララカの、毒ヘビの脳の組織で発現されたこれらの分子の前駆体のｃＤＮＡの推定によるＥＶＡＳＩＮＳのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項９】
以下の工程：
ａ）各々約５００００のファージプラークを含有するプレートから調製したニトロセルロース膜を、６×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、５０％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳおよび５×デンハルト中での放射性プローブを用いるハイブリダイゼーションに４２℃にて１６時間付し；
ｂ）膜を２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中にて３回、次いで０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中にて３回、各洗浄（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）につき１５分間、６５℃で洗浄し；
ｃ）オートラジオグラフィーの後、プローブによって同定されたファージプラークをＤＮＡインサートの分析のために単離し；
ｄ）該インサートを分析するために、「ヘルパーファージ」を用いて行った、ベクターλ  ＺＡＰからのファゲミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのイン・ビボ切出後に、その末端を配列決定する；
ことを含む、特にボスロプス・ジャララカの、毒ヘビ脳組織で発現されたこれらの分子の前駆体のｃＤＮＡの推定によるＢＰＰのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１０】
各々、ＳｍａＩまたはＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ、約４５０ｂｐおよび４３２ｂｐ、位置１６４ないし６１０および６１０ないし１０４４でクローンＮＭ８７の消化によって得られた断片を、ランダム−プライミング方法（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ｋｉｔ／アマーシャム）による放射性プローブ（α３２Ｐ）の合成で用いることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程：
ａ）イソチオシアナイドグアニジン−フェノール−クロロホルム抽出を用いてＢ．ジャララカ毒ヘビ単独の脳から全ＲＮＡを単離し、次いで、既に充填したオリゴｄＴセルロースカラムを１回通過させることによってメッセンジャーＲＮＡを精製し；
ｂ）該調製のメッセンジャーＲＮＡの一体化をアガロースゲル電気泳動によって確認し、続いて、ＢＰＰＳおよびＣＮＰ前駆体をコードするｃＤＮＡ配列に従って合成された放射性標識プローブでハイブリダイゼーションを行い；
ｃ）５μｇのこの調製を用いて、ｃＤＮＡライブラリを通常の技術によってλ  ＺＡＰファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に構築し；
ｄ）該ライブラリーを増幅し、最終力価を測定し、これは９×１０９ｐｆｕ／ｍｌ程度となるはずである；
ことを特徴とする、毒ヘビ脳組織、特にボスロプス・ジャララカ、で発現されたこれらの前駆体分子のｃＤＮＡから推定によりＢＰＰのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１２】
配列決定されたＤＮＡインサートを得ることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程：
ａ）ＢＰＰおよびＣＮＰ前駆体をコードするｃＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用い；
ｂ）約２５０塩基対の断片を、毒ヘビ脳ｃＤＮＡライブラリの全ファージ溶解物からクローン化し；
ｃ）このｃＤＮＡインサートの完全な配列を決定し；
ｄ）高いレベルの同様性が毒腺ライブラリーで同定されたｃＤＮＡ配列に対して見出され；
ｅ）プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋）の多重クローニング部位に隣接する領域にアニールするオリゴヌクレオチド（プライマー）（プライマーＴ３およびＴ７）を用い、ＤＮＡミニ−調整（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｓ）用のｃＤＮＡインサートを含有するプラスミドベクターのハイブリダイゼーションおよび同定、およびインサートの配列決定で用いられる放射性プローブの合成のための鋳型としてナトリウム利尿性ペプチドのコーディングセグメントを用い、約４×１０６の独立したクローンを分析する；
ことを特徴とする毒ヘビ特にボスロプス・ジャララカの、脳ｃＤＮＡライブラリ、からｃＤＮＡを増幅する方法。
【請求項１４】
Ｂ．ジャララカののｃＤＮＡライブラリのハイブリダイゼーションを介するクローンの選択が、これらの生物活性ペプチドの前駆体蛋白質内のＢＰＰ前駆体をコードするｃＤＮＡの単離を可能とすることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
Ｂ．ジャララカの毒液から単離されたＢＰＰとＥＶＡＳＩＮＳとの類似性によって、６つのペプチドの式が同定される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
６つのペプチドの式が：
式          配列
Ｉ        ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ｐ４ａａ５ａａ６ｐ７ｐ８
ＩＩ      ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４ｐ５ａａ６ａａ７Ｐ８Ｐ９
ＩＩＩ    ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４Ｐ６ａａ７ａａ８Ｐ９Ｐ１０
ＩＶ      ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４ａａ５ａａ６Ｐ７ａａ８ａａ９Ｐ１０Ｐ１１
Ｖ        ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４ａａ５ａａ６ａａ７Ｐ８ａａ９ａａ１０Ｐ１１Ｐ１２
ＶＩ      ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４ａａ５ａａ６ａａ７ａａ８Ｐ９ａａ１０ａａ１１Ｐ１２Ｐ１３
［式中、
Ｐは常にプロリンであり、残りは常にＬ−アミノ酸であって、一文字記号によって表され（後記参照）＊、
ｐｐ１はＮ−末端であり、ピログルタミル（＜Ｅ）または単純アミノ酸であってよく、これは通常塩基性ではなく；
ａａ１は非−塩基性アミノ酸であり、通常Ｗ、Ｓ、ＧまたはＮであり、
ａａ２は非−酸性アミノ酸であり、通常Ｐ、Ｇ、ＷまたはＲであり、
ａａ３は非−酸性アミノ酸であり、通常Ｐ、Ａ、ＲまたはＷであり、
ａａ４は式ＩについてはＰであり、残りのオリゴペプチドについてはアミノ酸であり、通常Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、ＷまたはＥであり、
ａａ５は式Ｉについては通常Ｑ、Ｎ、ＰまたはＧであり、
式ＩＩについてのａａ６、式ＩＩＩについてのａａ７、式ＩＶについてのａａ８、および式Ｖについてのａａ９は非−塩基性アミノ酸であり、通常Ｑ、Ｎ、Ｐ、またはＧであり、
式Ｉについてのａａ６、式ＩＩについてのａａ７、式ＩＩＩについてのａａ８、式ＩＶについてのａａ９、および式Ｖについてのａａ１０は常にＩまたはＡまたはＴであり、
＊
酸性アミノ酸  Ｄ、Ｅ
塩基性アミノ酸  Ｋ、Ｒ
芳香族アミノ酸  Ｆ、Ｗ、Ｙ
Ｇ  −  グリシン              Ｎ  −  アスパラギン
Ａ  −  アラニン              Ｑ  −  グルタミン
Ｐ  −  プロリン              Ｄ  −  アスパラギン酸
Ｖ  −  バリン                Ｅ  −  グルタミン酸
Ｉ  −  イソロイシン          Ｋ  −  リシン
Ｌ  −  ロイシン              Ｒ  −  アルギニン
Ｓ  −  セリン                Ｆ  −  フェニルアラニン
Ｔ  −  スレオニン            Ｈ  −  ヒスチジン
Ｗ  −  トリプトファン        Ｙ  −  チロシン
＜Ｅ  −  ピログルタミル］
であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程：
ａ）２％アニソールを含有する、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３０％ＴＦＡの存在下、樹脂に結合した第１のアミノ酸残基からＢｏｃ基を３０分間で除去し；
ｂ）続いて、１／２％アニソール、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄し、次のアミノ酸のカップリングのために；
ｃ）ＤＣＭ中の１０％ＴＥＡまたは５％ＤＩＰＥＡでの１０分間の処理によって、アミノ基を中和し；
ｄ）ペプチジル−樹脂をＤＣＭ、ＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびカップリングフェーズで用いられる溶媒で洗浄し；
ｅ）ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾリル）−１，１，３，３−テトラメチルウロンテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、および樹脂中のアミノ基（アミン成分、ＣＡ）の量と比較して３倍モル過剰のＢｏｃ−アミノ酸（カルボン酸成分、ＣＣ）およびカップリング剤に基づき、アシル化剤を用いる活性化によってアミノ酸をカップリングし；ニニドリン定量方法を用いてカップリング反応を２時間モニターし；
ｆ）今度の残基が反応に入るまで、アミノ酸を脱保護することによって以下のサイクルを開始し、所望の配列の伸長の最後まで、プロセスをサイクルにて継続し；
ｇ）ペプチドを樹脂から切断し、ＨＦ処理の間に放出されるカルボケーションによって誘導される副次的な反応に対するサプレッサーとして作用するｐ−クレゾールおよびジメチルスルフィド（ＤＭＳ）（各々の５％ｖ／ｖ）の存在下での０℃における６０ないし９０分間の無水ＨＦでの処理によってその側鎖を脱保護し；
ｈ）樹脂を酢酸エチルで洗浄し、ペプチドを水中の５％酢酸（ＡｃＯＨ）（ｖ／ｖ）で抽出し、続いて、凍結乾燥して、通常アモルファス状である白色粉末を得る；
ことを含む、血管拡張および抗−高血圧作用を呈するバソペプチダーゼペプチド阻害剤の固相合成方法。
【請求項１８】
（工程ｅ）において、ＤＩＣを用いる場合、試薬ＣＡ：ＣＣ：ＤＩＣの割合は１：３：３であって、ＴＢＴＵを用いる場合、ＣＡ：ＣＣ：ＴＢＴＵ：ＤＩＥＡの１：３：３：４であり、これらの試薬の最終濃度は０．０５および０．１Ｍの間にあることを特徴とする請求項１７記載の血管拡張および抗−高血圧作用を呈するバソペプチダーゼペプチド阻害剤についての固相合成方法。
【請求項１９】
工程（ｅ）において、ＡｓｎおよびＧｌｎのカップリングにおいて、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をアシル化化合物と一緒に用いて、これらのアミノ酸の二トリルの形成を防止し、ＣＡ：ＣＣ：ＴＢＴＵ：ＨＯＢｔ；ＤＩＥＡの最終割合は１：３：３：３：５であることを特徴とする請求項１７記載の血管拡張および抗−高血圧作用を呈するバソペプチダーゼペプチド阻害剤についての固相合成方法。
【請求項２０】
工程（ｇ）において、このアミノ酸の側鎖を保護するホルミル基の除去が、Ｔｒｐ残基を含む配列において切断と同時に起こるように、エタン−１，２−ジチオール（ＥＤＴ）を添加することを特徴とする請求項１７記載の血管拡張および抗−高血圧作用を呈するバソペプチダーゼペプチド阻害剤についての固相合成方法。
【請求項２１】
以下の工程：
ａ）約２０分間のＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液での処理によって、アミン保護基Ｆｍｏｃをアミノ酸から除去し、それにより、アミノ基を脱プロトン化し；
ｂ）樹脂におけるアミノ酸基の量を比較して３モル過剰のＢｏｃアミノ酸およびアシル化剤と共に、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾリル）−１，１，３，３−テトラメチルウロンテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）を含有するアシル化剤での活性化によって、アミノ酸をカップリングさせ；該カップリング反応は、ニニドリン定性方法を用いて２時間続き；
ｃ）８５ないし９５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を用い、ＨＦよりも弱い酸性である培地中で切断を行い、異なるサプレッサータイプの付随的反応の混合物を約２時間で添加し；
ｄ）樹脂と共に氷冷エチルエーテル中でペプチドを沈殿させ、８０００ｒｐｍにおいて５分間遠心処理し、上清を捨て；
ｅ）残渣をエチルエーテル中に再懸濁し、攪拌し、遠心処理し、該手法を５回反復し；洗浄および沈殿を続いて行い；
ｆ）樹脂およびペプチドの混合物を真空中で乾燥し、
ｇ）水中の５％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ）でペプチドを樹脂から抽出し、次いで、
ｈ）濾液を凍結乾燥してアモルファス状の白色粉末を得る；
ことを含む血管拡張および抗−高血圧作用を呈するバソペプチダーゼペプチド阻害剤についての固相合成方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）において、（通常、ｔｅｒｔ−ブチルタイプの）側鎖のプロテクターの結合、ならびに樹脂に対するペプチドの結合が、Ｂｏｃ化学観察されるものよりも弱いので、切断がＨＦよりも弱い酸性媒体中で行われることを特徴とする請求項２１記載の血管拡張および抗−高血圧作用を呈するバソペプチダーゼペプチド阻害剤の固相合成方法。
【請求項２３】
以下の式：
ＡＣＥのＣ部位に対する特異性を示さないグループ（ａ）：
＜ＥＫＷＡＰ
ＡＣＥのＣ部位に対する特異性を示すグループ（ｂ）：
Ｉ          ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３Ｐ４ａａ５ａａ６Ｐ７Ｐ８
ＩＩ        ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４Ｐ５ａａ６ａａ７Ｐ８Ｐ９
ＩＩＩ      ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４ａａ５Ｐ6ａａ７ａａ８Ｐ９Ｐ１０
ＩＶ        ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４ａａ５ａａ６Ｐ７ａａ８ａａ９Ｐ１０Ｐ１１
Ｖ          ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４ａａ５ａａ６ａａ７Ｐ８ａａ９ａａ１０Ｐ１１Ｐ１２
ＶＩ        ｐｐ１ａａ１ａａ２ａａ３ａａ４ａａ５ａａ６ａａ７ａａ８Ｐ９ａａ１０ａａ１１Ｐ１２Ｐ１３
［式中、
Ｐは常にプロリンであり、残りは常にＬ−アミノ酸であって、一文字記号によって表され（後記＊参照）、
ｐｐ１はＮ−末端であって、ピログルタミル（＜Ｅ）または単純アミノ酸であってよく、通常塩基性ではなく；
ａａ１は非−塩基性アミノ酸であり、通常Ｗ、Ｓ、ＧまたはＮであり、
ａａ２は非−酸性アミノ酸であり、通常Ｐ、Ｇ、ＷまたはＲであり、
ａａ３は非−酸性アミノ酸であり、通常Ｐ、Ａ、ＲまたはＷであり、
ａａ４は式ＩについてはＰであって、アミノ酸であり、残りのオリゴヌクレオチドについては通常Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、ＷまたはＥであり、
ａａ５は式Ｉについては通常Ｑ、Ｎ、ＰまたはＧであり、
式ＩＩについてのａａ６、式ＩＩＩについてのａａ７、式ＩＶについてのａａ８および式Ｖについてのａａ９は非−塩基性アミノ酸であり、通常Ｑ、Ｎ、ＰまたはＧであり、
式Ｉについてのａａ６，式ＩＩについてのａａ７、式ＩＩＩについてのａａ８、式ＩＶについてのａａ９、および式Ｖについてのａａ１０は常にＩまたはＡまたはＴであり、
Ｇ  −  グリシン            Ｎ  −  アスパラギン
Ａ  −  アラニン            Ｑ  −  グルタミン
Ｐ  −  プロリン            Ｄ  −  アスパラギン酸
Ｖ  −  バリン              Ｅ  −  グルタミン酸
Ｉ  −  イソロイシン        Ｋ  −  リシン
Ｌ  −  ロイシン            Ｒ  −  アルギニン
Ｓ  −  セリン              Ｆ  −  フェニルアラニン
Ｔ  −  スレオニン          Ｈ  −  ヒスチジン
Ｗ  −  トリプトファン      Ｙ  −  チロシン
＜Ｅ−ピログルタミル］
によって特徴付けられ、
ここに、
前記表に記載したペプチドはＡＣＥのＣ−部位に対するより高い選択性を有し、これは２ｎｍおよび１００μＭの間のＫｉ値によって特徴付けられ、他方、ＡＣＥのＮ−部位については５０μＭを超え；これらのペプチドはＮＥＰの阻害剤でもあり、５ないし１５０μＭの間のＫｉ値を示し；それらの全ては摘出されたモルモット回腸に対するブラジキニンの収縮作用を増強させ、５ないし３００ｎＭで変化する濃度で用いた場合、ブラジキニンの収縮効果は倍増され；１０および７００ｎＭの間の濃度で使用した場合、ブラジキニンの血圧降下効果もまた３０ないし８０％だけ増強され、ブラジキニン単独の効果の持続と比較した場合、５および１５倍の間の血圧降下の持続を増強させることを特徴とする抗−高血圧および血管拡張作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項２４】
ＤおよびＥが酸性アミノ酸であり、ＫおよびＲが塩基性アミノ酸であって、Ｆ、ＷおよびＹが芳香族アミノ酸であることを特徴とする請求項２３記載の血管拡張および抗―高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項２５】
オリゴペプチドのカルボキシル−末端に配列モチーフを含む一般式：
ＰＸ１Ｘ２ＰＰ
［式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸でもあり得、Ｘ２は通常Ｉであって、Ｎ−末端アミノ酸は通常＜Ｅによってブロックされている］
によって表される８ないし１３個のアミノ酸のペプチドであることを特徴とする請求項２３記載の血管拡張および抗―高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤（グループｂ）。
【請求項２６】
ＡＣＥのＣ−部位に対する選択性を示し［グループ（ｂ）］、これは、２ｎＭおよび１００μＭの間のＫｉ値によって特徴づけられ、他方、ＡＣＥのＮ−部位についての値は５０μＭを超えることを特徴とする請求項２３および２５記載の血管拡張および抗―高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項２７】
ＮＥＰの阻害剤でもあり、５ないし１５０μＭの間のＫｉ値を示すことを特徴とする請求項２３および２５記載の血管拡張および抗−高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項２８】
５ないし３００ｎＭの間の濃度において、摘出されたモルモット回腸に対するブラジキニンの収縮作用を増強させ、ブラジキニンの収縮効果を倍増させることを特徴とする請求項２３および２５記載の血管拡張および抗−高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項２９】
１０ないし７００ｎＭの間の濃度においてブラジキニンの血圧降下効果を３０ないし８０％増強させ、ブラジキニン単独による降下の持続と比較した場合、この血圧降下効果の持続を５倍ないし１５倍増幅させることを特徴とする請求項２３および２５記載の血管拡張および抗−高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項３０】
非常に種々のリガンド：スルフォニル、カルボキシル、ホスホリルのような酸性基、またはチオールおよびオレフィン、ジチオ、アゾもしくはジアゾ化合物、アルデヒドなどのような他の基に対してコンジュゲートすることができることを特徴とする請求項２３および２５記載の血管拡張および抗―高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項３１】
微小循環が侵された標的である場合、一般的なまたは局在する全身心血管障害で用いられることを特徴とする請求項３０記載の血管拡張および抗―高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項３２】
ヒト高血圧障害およびその結果で用いられることを特徴とする請求項３１記載の血管拡張および抗―高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項３３】
血管病巣および過形成で用いられことを特徴とする請求項３２記載の血管拡張および抗−高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項３４】
リン酸―生理食塩水緩衝液、生理食塩水または他のより便宜な担体のような生理学的に許容される媒体中に希釈されたことを特徴とする医薬化合物を得るにおいて血管拡張および抗―高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤。
【請求項３５】
イン・ビトロおよびビン・ビボにおけるバソペプチダーゼペプチド阻害剤の使用。
【請求項３６】
組織微小循環における全身または局所作用についての経粘膜、非経口、または注入、特に静脈内を介するイン・ビボでのバソペプチダーゼペプチド阻害剤の使用。
【請求項３７】
約１μｇないし１０ｍｇの間で変化する、通常０．５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量におけるイン・ビボでのバソペプチダーゼペプチド阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗−高血圧および血管拡張作用を呈し、毒ヘビ毒腺によって分泌され（ＢＰＰ）、または内因的に生産された（ＥＶＡＳＩＮＳ（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＶＡＳｏｐｅｐｒｉｄａｓｅｓ  ＩｎｈｉｂｉｔｏｒＳ））、アンギオテンシン変換酵素のカルボキシル部位に特異的なバソペプチダーゼペプチド阻害剤の単離および精製方法に関する。また、本発明は、毒ヘビ毒腺によって分泌された（ＢＰＰ）、または内因的に生産されたペプチド阻害剤の単離方法、およびそのアミノ酸配列の決定方法に関する。また、本発明は、毒ヘビ組織、特に、ボスロプス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ、Ｂ．ジャララカ）で発現された分子の前駆体のｃＤＮＡの推定によるＢＰＰのアミノ酸配列決定方法；特にボスロプス・ジャララカからの脳のｃＤＮＡまたは膵臓ｃＤＮＡライブラリー（ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）からｃＤＮＡを増幅する方法；バソペプチダーゼペプチド阻害剤の固相合成方法；血管拡張および抗―高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤の使用に関する。さらに、本発明は、バソペプチダーゼに対する阻害効果の、および平滑筋、および微小循環および心血管系に対する生物学的活性の測定方法に関する。
【０００２】
すなわち、血管拡張および抗−高血圧作用を呈し、毒ヘビ毒腺（ＢＰＰ）、特にボスロプス・ジャララカによって分泌されるか、または内因的に生産された（ＥＶＡＳＩＮＳ）カルボキシル部位またはアンギオテンシン変換酵素に特異的なバソペプチダーゼペプチド阻害剤の単離および精製方法；毒ヘビ毒腺によって分泌された（ＢＰＰ）または内因的に生産されたアミノ酸配列決定方法；毒ヘビ組織、特にボスロプス・ジャジャラカで発現された分子の前駆体のｃＤＮＡの推定によるＢＰＰのアミノ酸配列決定方法；毒ヘビ組織、特にボスロプス・ジャララカで発現された分子の前駆体のｃＤＮＡの推定によるＥＶＡＳＩＮＳのアミノ酸配列決定方法；ボスロプス・ジャララカからの毒ヘビ脳および／または膵臓ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを増幅する方法；抗−高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤の、血管拡張および抗−高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチドの固相合成方法；医薬化合物を得るための血管拡張および抗―高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤の使用；バソペプチダーゼに対する阻害活性の、および平滑筋に対する、および微小循環および心血管系に対する生物学的活性の測定方法に関する。
【０００３】
さらに詳しくは、本発明は、毒ヘビ毒腺によって分泌された（ＢＰＰ）、または特にボスロプス・ジャララカの脳において内因的に見出されるペプチドの単離に関する。本発明者らは、かく得られたペプチド、ならびに原核生物および真核生物系において遺伝子工学方法によってそれらを生産する方法；かく得られた遺伝子工学作成ペプチド；化学合成による該ペプチドの生産、ならびに蛋白質分解加工から得られたペプチドに対して、内因的ペプチドについての一般的名称エバシンズ（ＥＶＡＳＩＮＳ）（内因的バソペプチダーゼ阻害剤）を提案する。本発明は、また、バソペプチダーゼに対する阻害作用を持ち、その結果、血圧を降下させる医薬化合物における前記方法によって得られたペプチドの使用、および血圧を降下させるための前記ペプチドの使用に関する。
【０００４】
このように、本発明は、毒ヘビ毒腺によって分泌された（ＢＰＰ）、またはボスロプス・ジャララカの他の組織で生産された（ＥＶＡＳＩＮＳ）、ブラジキニン増強ペプチドして知られた、心血管作用を持つペプチドに関する。
【背景技術】
【０００５】
毒ヘビ毒液は、生物学的に活性な蛋白質およびペプチドの複雑な混合物よりなる。公知の特徴付けられた生物学的に活性なペプチドの内、本発明者らは、とりわけ、ブラジキニン増強ペプチド（ＢＰＰ）、ナトリウム利尿因子（Ｃ−タイプのナトリウム利尿ペプチド、ＣＮＰ）、サラフォトキシン（ＳＲＴｘ）を挙げる。これらの生物活性ペプチド（ホルモン、神経ペプチド、トキシン（ｔｏｘｉｎｓ）など）は、分子当たり１以上の生物活性ペプチドを含有する、そして、これらのペプチドの蛋白質前駆体に対する酵素の加水分解作用によって生じる。ボソルプス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｋａ）のような種々の毒ヘビの毒腺によって分泌されるトキシン類は、その作用メカニズムがアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対するその阻害効果、アンギオテンシンＩからアンギオテンシンＩＩの変換のブロッキング（高血圧）、およびブラジキニンの保持（低血圧）に関する血圧降下作用を持つ非常に多数のペプチド（ＢＰＰ）を含む。
【０００６】
これらのペプチドの一次構造は、２つのファミリー、互いに高度の相同性を示す、７アミノ酸残基よりも小さなこれらのペプチドおよび７アミノ酸残基よりも大きなペプチド、へのその分類を可能とする。
【０００７】
この特別な分野における研究は、広く種々の適用が、トキシン、特に毒ヘビの毒液トキシンブラジキミン増強ペプチド（ＢＰＰ）のような分子のいくつかの修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）で見出すことができることを示し、そしてこのペプチドはヒトを含めた哺乳動物において抗−高血圧作用の特別な剤であり得る。
【０００８】
ＢＰＰのアミノ酸配列に対して高度な相同性を有する他のブラジキミン増強ペプチドのアミノ酸配列はヘビの毒液から得られなかった。事実、これらは、分子生物学技術を用い、脳、膵臓および脾臓組織のような他の毒ヘビ組織で見出されるその前駆体のヌクレオチド配列から導かれた。その合成形態において、ボスロポス・ジャララカの毒腺から分泌されたＢＰＰのような、これらの内因性ペプチドは、血管内皮のアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に作用し、アンギオテンシンＩＩの形成を防止し（高血圧）、およびブラジキニンの低血圧を防止する。
【０００９】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は、内皮細胞の細胞質膜に主として位置する、２つの触媒部位（カルボキシ−またはＣ−部位、およびアミノ酸−またはＮ−部位）を持つペプチダーゼである。Ｃ−末端活性部位は、アンギオテンシンＩおよびブラジキニンにより特異的である。ＢＰＰは、本発明に至るまではＡＣＥを阻害することによって作用し、Ｃ−またはＮ−部位の阻害の特異性は知られておらず、この阻害の結果は動脈血圧の低下である。
【００１０】
特異的な活性部位に選択的でないＡＣＥの阻害は、カプトプリルと呼ばれる部位−指向性阻害剤の開発に導いた。
【００１１】
Ｎ部位は、造血を調節する天然循環ペプチドホルモン（Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）を代謝する。該酵素のカルボキシルドメイン（Ｃ部位）は、アンギオテンシンＩのアンギオテンシンＩＩへの変換に対してより特異的であって、ブラジキニンを不活化させる。現在まで、記載されたＢＰＰの全てがＣ部位に対してなんらかの優先性を呈し、それをより特異的な抗高血圧剤とするかは知られていなかった。
【００１２】
抗−高血圧剤として作用する潜在能力を有し得る、ヘビの毒液からの多数の未知のトキシンが依然としてある。これらの分子は、ＡＣＥのＣ−部位を特異的に阻害できるのみならず、同時に、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）およびエンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）として血管内皮の他のペプチダーゼを阻害する。ＥＣＥは、ブラジキニン、ナトリウム利尿性ペプチド、血圧降下剤を不活化し、エンドセリン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｓ）を生成する（高血圧）。ＡＣＥ、ＮＥＰおよびＥＣＥはバソペプチダーゼとして知られており、動脈血圧制御のほとんどを担う。これらの二重および／または三重阻害剤はより特異的であるのみならず、より効果的である。なぜならば、それらは動脈血圧を調節する内因性分子の代謝に作用するからである。ＡＣＥの２つの触媒部位の間の差は、ダイブ，Ｖ．（Ｄｉｖｅ，Ｖ．）；コットン，Ｊ．（Ｃｏｔｔｏｎ  Ｊ．）；イオタキス，Ｍ．Ａ．（Ｙｉｏｔａｋｉｓ，Ｍ．Ａ．）；バシリオウ，Ｓ．（Ｖａｓｓｉｌｉｏｕ，Ｓ．）；ジラセック，Ｊ．（Ｊｉｒａｃｅｋ，Ｊ．）；バゾ・，Ｇ．（Ｖａｚｅａｕｘ，Ｇ．）；ショヴェ，Ｇ．（Ｃｈａｕｖｅｔ，Ｇ．）；クニアッセ，Ｐ．（Ｃｕｎｉａｓｓｅ，Ｐ．）；Ｃｏｒｖｏｌ；ＲＸＰ４０７でよく規定されており、ホスフィニックペプチドは、その２つの活性部位の間を区別することができるアンギオテンシンＩ変換酵素の優れた阻害剤である（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，１３，４３３０−４３３５（１９９９））。
【００１３】
血圧降下作用を呈するブラジルおよびアジア毒ヘビの毒液からのあるペプチドが既に単離され、配列決定されており（オンデッティ（Ｏｎｄｉｔｔｉ）およびクッシュマン（Ｃｕｓｈｍａｎ），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５１，２９３−３０８，１９８２）、それらのうちの１つの抗高血圧効果がヒトで示されている（グラバスら  （Ｇｒａｖａｓ  ｅｔ．ａｌ．））  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９１，８１７−８２１，１９７４）ことが科学文献から知られている。
【００１４】
いくつかのＢＰＰが、分子生物学技術を用いて、その前駆体のアミノ酸配列から導かれている（ムラヤマ等（Ｍｕｒａｙａｍａ  ｅｔ．ａｌ），  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１１８９−１１９３，１９９７）。
【００１５】
医薬産業は、非−ペプチドの性質の、内因性分子といずれの化学的類似性のない新しい抗高血圧薬物を開発した。それはオモパトリラット（ＯＭＯＰＡＴＲＩＬＡＴ）と呼ばれ、ＡＣＥおよびＮＥＰ双方に対して阻害特性を呈し、高濃度の循環レニンにてラットにおいて長期抗−高血圧効果を示す。加えて、この物質は心臓の性能を改良し、自然発生高血圧ラット（ＳＵＲ（ヒト本態性高血圧についてのモデル）の生存を延ばす。該オモパトリラットは、臨床試験の進んだ相において、２つの場所ペプチダーゼＡＣＥおよびＮＥＰに対する最初の部位−指向性阻害剤である。
【００１６】
オマパトリラットならびにＢＰＰおよびＥＶＡＳＩＮＳの間の主な差は以下の通りである：
１．ＢＰＰおよびＥＶＡＳＩＮＳはポリペプチドの性質であり；
２．それらは、外分泌腺（ｅｘｏｃｒｉｎｅ  ｇｌａｎｄｓ）によって分泌された、または脊椎動物において内因的に生産されたペプチドと同一または相同な合成分子であり；
３．ＡＣＥ阻害剤として、８ないし１３アミノ酸残基のＢＰＰおよびＥＶＡＳＩＮＳはＣ−部位に対して選択性を示し、また、ＮＥＰ  Ｘを阻害し；
４．それらは、主として体液および組織の蛋白質分解酵素によって分解される。
【００１７】
１９９６年７月２３日に公開された米国特許第５５３８９９９１号、および１９９６年９月２４日に公開された米国特許第５５５９１３５号は、毒ヘビ毒腺によって分泌された阻害剤、「ＰＣＡ−Ｗ−Ｐ−Ｒ−Ｐ−Ｅ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−  ＳＱ  ２０８８１」、ＡＣＥ阻害剤が記載され、これは、結果的に、動物において動脈血圧を低下させ、高血圧の個体において動脈血圧の効果的な低下を示した。しかしながら、これらの特許は、ＡＣＥの１つまたは２つの触媒部位に対するこの阻害剤の作用の特異性を記載しておらず、また明らかにしていない。該特許は、動脈血圧を調節できると云う他の酵素の重要性を示さず、従って、より高い作用特異性を持つＢＰＰに対して研究はなされてなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、バソペプチダーゼに対するＥＶＡＳＩＮＳの作用の特異性を示す点で前記特許とは異なり；また、本発明は、心血管系に対するその活性を持つ数ダースの分子の化学的構造の間の明瞭な関係を確立する。また、本発明は、１つの構造モチーフ（ｍｏｔｉｆ）およびここに提案するリーダー分子（ｌｅａｄｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の内因性起源、前記刊行物からでは予測されない特徴を確立する。
【００１９】
本発明は、前記同様の議論を用いて、１９７４年６月２５日に公開された米国特許第３８１９８３１号、１９７３年１月３０日に公開された米国特許第３７１４１４０号、１９７４年８月２７日に公開された米国特許第３８３２３３７号、１９７４年１１月１９日に公開された米国特許第３８４９２５２号、１９７６年３月３０日に公開された米国特許第３９４７５７５号、１９７６年８月３日に公開された米国特許第３９７３００６号、１９８８年３月１５日に公開された米国特許第４７３１４３９号、１９８８年９月２７日に公開された米国特許第４７７４３１８号、および１９９６年８月２７日に公開された米国特許第５５５０１２７号から区別することができる。
【００２０】
現存する技術的問題を解決することを目的に、抗−高血圧剤としての効果の点で優れた質の最終製品を得るために、本発明は、最初であってかつ新規な方法にて、（１）規定された構造モチーフ；（２）ＡＣＥのＣ−部位に対する特異性；および（３）ＮＥＰ  Ｘに対する高い阻害特異性を呈するＢＰＰおよびＥＶＡＳＩＮＳを提案する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
これらの新規な、バソペプチダーゼに対する阻害作用を呈する、ＡＣＥのＣ部位に対して特異的な抗−高血圧剤は、ブラジルの毒ヘビボスロポス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ）の毒液から単離し、配列決定されるか、またはこの毒ヘビの組織から得たもののクローニングおよびｃＤＮＡ配列決定によって同定された。化学合成によっても得ることができ、天然ペプチドと同一のアミノ酸配列を含むこれらのペプチドは、ラットにおいて長期抗−高血圧作用を示す。それ自体用いられ、または前記した特徴を維持するために化学的に修飾された、天然ペプチドと同一の配列を有するこれらの合成ペプチドの使用は、心血管障害の治療において、または局所的循環作用において、特にヒトでの高血圧障害および他の心血管障害において治療剤として有用であり得る。
【００２２】
毒液において、およびボスロポス・ジャララカの組織において見出された２２のＢＰＰを質量分析によって配列決定し、あるいはそれらの配列は、毒ヘビの組織で発現された分子の前駆体のｃＤＮＡ配列から推定された。対応する合成ペプチドを、組換えＡＣＥのＣ−部位の、およびＮＥＰの阻害剤として、および摘出された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）モルモット回腸に対するブラジキニン収縮活性の増強剤として、およびラットにおけるブラジキニンン血圧降下活性としての双方としてテストした。それらは、共に、（分泌された）ＢＰＰとして、およびＥＶＡＳＩＮＳ（内因性）として見出された。ＡＣＥのＣ部位に対する作用の特異性に従って、それらは２つの群に分けることができる：
【００２３】
ａ）非−特異的。ＡＣＥのＣ−部位に対してはっきりとした選択性を呈しないが、摘出された（ｉｓｏｌｔｅｄ）平滑筋の調製（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）について観察されたごとく、ならびにその血圧降下効果によって、ブラジキニンの高増強活性を呈する１つのペプチド、ペンタペプチド＜Ｅ  Ｋ  Ｗ  Ａ  Ｐ  （ピログルタミル（＜Ｅ）−リシン（Ｋ）−トリプトファン（Ｗ）−アラニン（Ａ）プロリン（Ｐ））。それは、（毒ヘビ毒腺から分泌された）ＢＰＰならびに（毒ヘビ脳組織からの、内因性の）ＥＶＡＳＩＮＳとして見出された。それは、ＡＣＥのＮおよびＣ部位双方につき、μＭ範囲のＫｉ値を呈する。また、それは、低い親和性をもって、５０ないし１５０μＭの範囲のＫｉ値にてＮＥＰを阻害する。それは、１５ないし３００ｎＭに変化する濃度にて、摘出されたモルモット回腸に対するブラジキニンの収縮作用を増強する。また、３００ｎＭの濃度において、ブラジキニンの血圧降下効果もまた６０％だけ増強され、ブラジキニン単独の効果の持続と比較して、血圧降下効果の持続の５倍増加を示す。
【００２４】
ｂ）特異的。これらのペプチドは、８ないし１３個のアミノ酸残基（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）を含み、１０００ないし１７００ドルトン（Ｄａｌｔｏｎｓ）の範囲の分子量を呈する。このグループにおいては、摘出モルモット回腸に対する、およびラット動脈血圧に対するブラジキニンの収縮作用の最も選択的かつ効果的な増強剤がＢＰＰまたはＥＶＡＳＩＮＳとして見出された。それらは科学的に修飾され、同様な薬理学的特性を持つ他のペプチドを生じる。
【００２５】
以下の表１は、本発明のグループｂ）に記載された阻害剤から誘導される合成オリゴヌクレオチドを示す。
【００２６】
【表１】
2005505245.tif 000002
【００２７】
グループ（ｂ）中特に注目されるのは、一般式：
構造式［Ｐ  Ｘ１  Ｘ２  ＰＰ  ］
［式中、Ｘ１はいずれのアミノ酸であってもよく、Ｘ２は一般にＩであり、Ｎ−末端アミノ酸はブロックされており（ｂｌｏｃｋｅｄ）、Ｎ−アミノ酸は一般に＜Ｅによってブロックされている］
のオリゴペプチドのカルボキシ−末端モチーフを示す８ないし１３個のアミノ酸のペプチドである。
【００２８】
前記表１に記載したペプチドは、２ｎＭないし１００μＭの範囲のＫｉ値によって特徴付けられるごとくＡＣＥのＣ−部位に対してより高い特異性を示し、他方、ＡＣＥのＮ部位に対しては、これらの値は５０μＭを超えていた。これらのペプチドは、５ないし１５０μＭの範囲のＫｉ値を持つＮＥＰの阻害剤でもある。これらの全ては、摘出モルモット回腸に対するブラジキニンの収縮活性を増強し、５ないし３００ｎＭの範囲の濃度において、ブラジキニンの収縮効果を倍増させる。また、ブラジキニンの血圧降下効果が、１０ないし７００ｎＭの範囲の濃度において３０ないし８０％だけ増強され、ブラジキニン単独と比較して、血圧降下効果の持続を５ないし１５倍に増加させる。
【００２９】
本発明は、以下の工程を含む、毒ヘビ毒腺（ｓｅｒｐｅｎｔ  ｖｅｎｏｍ  ｇｌａｎｄｓ）、特にボスロプス・ジャララカの毒腺によって分泌された、抗−高血圧作用を持つバソペプチダーゼペプチド阻害剤についての単離および精製方法を最初に提案する。
Ａ−  ボスロプス・ジャララカのヘビ毒からのＢＰＰの単離および精製：
−  ボスロプス・ジャララカの毒液プール（ｐｏｏｌ）から得られた合計８００ないし１５００ｍｇの毒液を７．０ないし１５ｍｌの脱イオン水に溶解させ、１５００ないし２０００ｒｐｍにて１５ないし３０分間遠心分離処理を行った（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇ）；上清を取り出し、１．２×１０１ｃｍのセファデックス（Ｓｅｐｈａｂｅｘ）  Ｇ−２５Ｍゲル濾過カラム（２５−８０μ，シグマ（Ｓｉｇｍａ））に適用した；カラムを室温にて酢酸アンモニウム緩衝液（３０ないし５０ｍＭ，ｐＨ５．０ないし６．０）で平衡化した。試料をカラムの頂部に加え、１．０ないし２．０ｍＬ／分の液速にて成分を溶出させた。モルモット回腸に対するブラジキニン増強活性に基づき、２１４ｎｍにおける各分取分（ａｌｉｑｕｏｔ）についての吸光度プロフィーによりプールの構成を規定した。
【００３０】
Ｂ−  ブラジキニン増強活性を示すプール成分の部分的単離：
−高速液体クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ
ブラジキニン増強活性を示す、工程Ａで得られたプールの成分を、２１４ｎｍに設定されたＵＶ−ｖｉｓ検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ（メルク−ヒタチ（Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ）モデルＬ−６２００Ａ）、および逆相カラムＣ−１８／ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）（５μ，４．６×２５０ｍｍ）によって部分的に単離した。溶媒Ａは水中０．５ないし１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）であり、溶媒Ｂは５％ないし６０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）のグラジエント（ｇｒａｄｉｅｎｔ）であり、液速は０．２ないし０．５ｍＬ／分であった。用いたグラジエントは試料に応じて変化させた。２１４ｎｍにおける吸光度ピークを手動で収集することによってペプチドを得た。
【００３１】
Ｃ−  質量分析によるブラジキニン増強ペプチドの分子量および一次構造の決定（ＥＳ−ＭＳ−ＭＳ）
本発明のもう１つの態様は、電子スプレイイオン源（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）、およびデータ獲得のために用いるマス・ライニクス（Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘ）ソフトフェア（マイクロマス）を備えた、正イオン化モードの、マイクロマス・クアットロ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ）  ＩＩ質量分析計（ＥＳＭＳ−ＭＳ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で行う質量分析によって、毒ヘビ毒液、より具体的にはボスロポス・ジャララカから精製されたＢＰＰのアミノ酸配列決定方法に関する。試料を０．１％ギ酸を含む５０％水／ＡＣＮに溶解させ、注入ポンプによって、５μＬ／分の一定液速で注入した。全分析プロセスの間、５秒の走査時間にて、４００および１６００の間の質量／電荷（ｍｚ）比を走査することによって、第１の四重極（ＥＳＭＳ）でデータを獲得した。配列決定は、第１の四重極で特徴付けしてプロトン化イオンを呈する選択されたペプチドについて行い、続いて、３×１０−３のアルゴン圧力にて誘導乖離衝突（ＩＤＣ（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ））によって断片化し、最後に、第２の四重極（ＥＳＭＳ−ＭＳ）で走査することによってデータを獲得した。ソフトウエア・マスリニックス（Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘ）（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）をデータ獲得に用いた。機械のパラメーターは、標準として合成ブラジキニンを用いて最適化した。
全毒液成分の単離のために、自動インジェクター、２１４ｎｍに設定されたＵＶ−ｖｉｓ検出器、および逆相カラムＣ−１８／ザ・セパレーションズ・グループ（Ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）（４．６×２５０ｍｍ／５μ）を備えたヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＰＬＣモデル１１００を用い、質量分析システムにカップリングさせたＨＰＬＣシステム（ＬＣ−ＥＳＭＳ−ＭＳ）で特徴付けおよび配列決定も行った。用いた溶媒は溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶媒Ｂ：１０％Ａ／ＡＣＮ溶媒であり、液速は０．６ｍＬ／分であった。用いたグラジエントは、
ｔ＝０ないし５分：０％Ｂ
ｔ＝５ないし６５分：０ないし６０％Ｂ
ｔ＝６５ないし７０分：６０ないし１００％Ｂ
ｔ＝７０ないし７５分：１００％Ｂ
ｔ＝７５ないし８０分：１００ないし０％Ｂ
であった。
【００３２】
ＨＰＬＣで用いた６００μＬ／分の流れのうち、２０μｌを質量分析計に自動注入し、残りの５８０μｌをＵＶ−ｖｉｓ検出器に供給した。
【００３３】
質量分析はイオン電子スプレイ源（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を備えた、正イオン化モードの、マイクロマス・クアットロ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ）  ＩＩ（ＥＳＭＳ−ＭＳ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）質量分析計で行った。特徴づけおよび配列決定のデータの獲得は、この目的で作ったソフトウエア、マス・リニックス（Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘ）ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）によって行った。
【００３４】
−  本発明のもう１つの態様は、以下の工程を経る、毒ヘビ組織、特にボスロポス・ジャララカで発現された分子の前駆体のｃＤＮＡ配列の推定によるＢＰＰのアミノ酸配列の決定である。
−  単一のＢ．ジャララカ種の脳からの全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出方法によって単離し、予め充填したオリゴ−ｄＴセルロースカラムに全ＲＮＡ溶液を二回通すことによってメッセンジャー（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）ＲＮＡを精製した。精製されたｍＲＮＡの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を、アガロースゲル電気泳動、続いて、ノーゼンブロットアッセイ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙｓ）によって以前に同定されたＢＰＰおよびＣＮＰの前駆体をコードする配列よりなる放射性プローブでのハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によってチェックした。λ  ＺＡＰファージ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））におけるｃＤＮＡライブラリーの調製は、慣用的かつ通常の方法によって、製造業者の指示に従い、５μｇのこの試料を用いて行った。組換えファージの最初のパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）により、１％未満の非−組換えクローンと共に約２×１０５ｐｆｕ／ｍＬの力価を生じた。このライブラリーを直ちに増幅し、最終力価は約９×１０９ｐｆｕ／ｍＬであった。
【００３５】
Ｆ−ＰＣＲ増幅（ポリメラーゼ鎖反応）：
−最初のアプローチの目標は、ＢＰＰおよびＣＮＰの前駆体をコードするｃＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲによって、Ｂ．ジャララカ脳ｃＤＮＡライブラリーから注目するｃＤＮＡを増幅することであった。反応は本明細書中に記載する材料および方法で行い、毒ヘビ脳ｃＤＮＡライブラリーからの全ファージ溶解物から約２５０塩基対１断片をクローンできるに過ぎなかった（毒ヘビ脳ライブラリーからのいずれの他の断片の増幅もなかった）。このｃＤＮＡインサートの完全な配列決定は、毒腺ライブラリーから同定されたｃＤＮＡ配列に対して、ナトリウム利尿性ペプチドに先行するセグメントにおける数個のヌクレオチド（１２塩基）といくつかの点突然変異（置換された４つの残基）の挿入を除き、非常に高度な同様性を示した。そして、これら置換された４つの残基の３つがサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）であり（同一アミノ酸残基をコードする）、４つめは「保存的」（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）（同一化学的特徴を持つアミノ酸についての置換）であった。用いた反応条件、および／またはポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドを変化させる多数の増幅試みにもかかわらず、調べたライブラリーのいずれからも他の断片をクローン化させることができなかった。
【００３６】
−  １３陽性クローンを同定するのを可能としたハイブリダイゼーション実験で用いる放射性プローブの合成のための鋳型としてのナトリウム利尿性ペプチドをコードするセグメントを用い、約５×１０６クローンを独立して分析した。ｃＤＮＡインサートを含むプラスミドベクターをＤＮＡのミニ−調製（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）によって回収（ｒｅｃｏｖｅｒ）し、次いで、プラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋）の多重クローニング部位（市販のプライマーＴ３およびＴ７）に隣接する配列にアニール（ａｎｎｅａｌ）するオリゴヌクレオチドを用いて配列決定した。
【００３７】
−  Ｂ．ジャララカ（ｊａｒａｒａｃａ）の脳からのｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションによるクローン選択は、ＢＰＰおよびＣＮＰに対する前駆体をコードするｃＤＮＡの単離を可能とした（図１）。ボスロポス・ジャララカの毒液から単離されたＢＰＰに対する類似性によって、７つのペプチドが同定され、その配列は表１にリストする。これらの配列に基づく、毒液ペプチドと同一の薬理学的特性、ならびにＥＣＡおよびＮＥＰの阻害を対するペプチドを合成した。
【００３８】
図１は、対応するｃＤＮＡ配列から推定された、ボスロポス・ジャララカ脳からのＥＶＡＳＩＮＳ前駆体の一次配列を示す。ヌクレオチドについての略語は以下の通りである：Ａ  −  アデノシン；Ｃ  −  シチジン；Ｇ  −  グアノシン；Ｔ  −  チミジン。ＣＮＰ  −  タイプＣのナトリウム利尿性ペプチド。ボスロポス・ジャララカ脳からのｃＤＮＡライブラリーから単離されたＥＶＡＳＩＮＳおよびＣＮＰの前駆体蛋白質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列、および推定アミノ酸配列。ＥＶＡＳＩＮＳのアミノ酸配列に下線を施し、ＣＮＰの配列は太文字で示す（なお、図１の配列は配列１、推定アミノ酸配列は配列２とした）。
【００３９】
本発明のもう１つの態様は、２つの特別な方法を用いる、固相でのペプチドの合成方法である。
Ａ−  アミノ基用の一時的保護基としてのｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）およびアミノ酸反応性側鎖のほとんどの保護のためのベンジル誘導体（Ｂｚｌ）の使用。
−  この合成方法における最初の工程は、樹脂に結合した第１のアミノ酸残基からＢｏｃ基を除去することである。
【００４０】
Ｂｏｃ基の除去は、２％アニソールを含有するジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３０％ＴＦＡ中、３０分間で起こる。次いで、樹脂を、順次、０．５％アニソールを含有するイソプロパノール、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄する。次のアミノ酸カップリングのために、アミノ基をＤＣＭ中のＴＥＡ１０％またはＤＩＰＥＡ５％での１０分間の処理によって脱プロトン化する。次いで、ペプチジル−樹脂をＤＣＭ、ＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびカップリングのために用いる溶媒で洗浄する。
【００４１】
アミノ酸のカップリングは活性化相で出発し、通常、カップリング剤：ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾリル）−１，１，３，３−テトラメチルリロンテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ、２−  （１Ｈ−  ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｌｕｒｏｎｅ  ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｂｏｒａｔｅ）で達成される。通常、Ｂｏｃ−アミノ酸（カルボキシル成分、ＣＣ）およびカップリング剤を、樹脂中のアミノ基（アミン成分、ＣＡ）の量と比較して、３倍モル過剰で用いる。
【００４２】
−  ＤＩＣを用いる場合、試薬ＣＡ：ＣＣ：ＤＩＣの割合は１：３：３である。ＴＢＴＵを用いる場合、試薬ＣＡ：ＣＣ：ＴＢＴＵ：ＤＩＥＡの割合は１：３：３：４である。これらの試薬の最終濃度は０．０５および０．１Ｍの間である。
【００４３】
−Ａｓｎ（アスパラギン）またはＧｌｎ（グルタミン）をカップリングさせる場合、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をカップリング剤とともに用いて、これらのアミノ酸からの二トリルの形成を妨げる。これらのカップリングでは、試薬ＣＡ：ＣＣ：ＴＢＴＵ：ＨＯＢｔ：ＤＩＥＡの最終割合は１：３：３：３：５である。通常２時間を要するカップリング反応はニニドリン定性方法（ｎｉｎｉｄｒｉｎ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いてモニターし、ここに、ペプチジル−樹脂の青色染色は不完全なカップリングを示す。この場合、一般には、再度カップリングを行い、以前のカップリング反応で用いた溶媒および／またはカップリング剤それ自体を変更する。カップリングフェーズが終了すれば、次の残基がカップリングされるまで、次のサイクルをアミノ基の脱保護で開始させる。所望の配列の延長の最後まで、プロセスをサイクル的に継続させる。
【００４４】
合成方法の最後に、ペプチドを樹脂から切断し、ＨＦ処理の間に放出されたカルボケーションによって誘導された付随的反応についてのサプレッサー（抑制剤：ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ）として作用するｐ−クレゾールおよびジメチルスルフィド（ＤＭＳ）（各々５％、ｖ／ｖ）の存在下にて、０℃での６０ないし９０分間の無水ＨＦでの処理によって、単一工程でその側鎖を脱保護する。ペプチド配列がＴｒｐ残基を含む場合、エタノール−１，２−ジチオール（ＥＤＴ）を添加して、切断と同時にこのアミノ酸の側鎖を保護するホルミル基を除去する。ＥＤＴを他のサプレッサーとして（各々５％，ｖ／ｖ）同一割合で用いる。切断の後、樹脂を酢酸エチルで洗浄し、水中の５％（ｖ／ｖ）酢酸で樹脂を洗浄することによってペプチドを溶出させ、凍結乾燥する。一般的にアモルファス状の白色粉末が得られる。
【００４５】
Ｂ−  塩基−不安定保護基９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｔｅｒｔ−ブチル誘導体（ｔＢｕ）の使用
−  前述の方法とは異なり、この場合、アミノ基保護基Ｆｍｏｃを用い、ＤＭＦ中での約２０分間の２０％ピペリジン溶液での処理によってアミノ酸から除去する。この処理により、次のカップリング工程のためにアミノ基が脱プロトン化される。カップリング方法はＢｏｃ化学（ｔｈｅ  Ｂｏｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’ｓ）と同一であり、最終切断は弱酸溶液を用いて行われる。なぜならば、双方の保護基が（一般に、ｔｅｒｔ−ブチルタイプの）側鎖に結合し、樹脂に結合したペプチドはＢｏｃ化学におけるよりも不安定だからである。通常、８５ないし９５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）の付随的反応の異なるサプレッサーの混合物で樹脂を約２時間処理する。この処理の後、ペプチドを氷冷エチルエーテル中にて樹脂とともに沈殿させ、２，５００ｇのスピードにて５分間遠心処理する。上清を捨て、ペレットをエチルエーテルに再懸濁させ、攪拌し、遠心処理する。該手法を５回繰り返し、樹脂／ペプチド混合物を真空下で乾燥する。最後に、ペプチドを水中５％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ）で樹脂から取り出し、濾過する。濾過した溶液を、アモルファス状白色粉末が得られるまで凍結乾燥する。
【００４６】
双方の方法ＡおよびＢは以下の文献に基づく：
１−  バラニー，Ｇ．（Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．）およびメリフィールド，Ｒ．Ｂ．（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．）、（グロス，Ｅ．（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．）およびメインホーファー，Ｊ．（Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．）編）（１９８０），  「ペプチド類」（Ｔｈｅ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ＩＩ巻，  １，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，
２−  スチュワート，Ｊ．Ｍ（Ｓｔｕｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ）およびヤング，Ｊ．Ｄ．（Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．）（１９８４），「固相でのペプチド類の合成」（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，
３−  フィールズ，Ｇ．Ｂ．（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；  ３−アセルトン，Ｅ．（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．）およびシェパードＲ．Ｃ．（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．）（１９８９），  「固相でのペプチドの合成」（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｉ．Ｌ．Ｒ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，
４−  フィールズ，Ｇ．Ｂ．（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．）およびノーブル，Ｒ．Ｌ．（Ｎｏｂｌｅ，Ｒ．Ｌ．）（１９９０）  Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．  ３５，１６１。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明に記載した方法に従い、ブラジキニンによって引き起こされた平滑筋に対するその収縮活性によってテストし、実施例５に示したごとく摘出されたモルモット回腸の調製を用いて測定して、ブラジキニン増強活性を呈する単離されたペプチドのプールが得られる。
【００４８】
ブラジキニン増強活性を測定するために、摘出モルモット回腸に対するブラジキニンの効果のｌｏｇ−用量応答曲線をプロットした。
【００４９】
ブラジキニン増強活性の血圧降下効果は、エチルエーテルで麻酔した正常血圧および高血圧（ＳＨＲ）オスおよびメスのウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットでテストした。
【００５０】
本発明においては、特に注目するペプチドは天然抗−高血圧ペプチドである。これらは、結局は、それ自体、または他の物質と組み合わせて用いるであろう。これらの合成分子はスルホニル、カルボキシルおよびホスホリルのような酸性基、またはチオール、オレフィン、ジチオ、アゾもしくはジアゾ化合物、アルデヒドおよび同様の化合物のような他の基のような種々のリガンド（ｌｉｇａｎｄ）にコンジュゲート（ｃｏｊｕｇａｔｅ）させることができる。
【００５１】
特異的リガンド（ペプチドアプタマー（ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｐｔａｍｅｒｓ））に結合したＢＰＰを用いて、酵素および受容体のごとき標的蛋白質を同定することができる。例えば、特異的細胞は、これらの修飾されたＢＰＰによって認識または影響され得る標的蛋白質を表すことができる。かくして、ＢＰＰにコンジュゲートした特異的リガンドの使用は、これらの分子を、選択的に、特異的標的蛋白質を保有する細胞へと駆動（ｄｒｉｖｅ）させることができる。これらのリガンドは、例えば、メチレンブルー、クリスタルバイオレット、アスピリン、サッカリン等であり得る。
【００５２】
これらに加えて、ステロイド、低密度リポ蛋白質、成長因子、ウイルス蛋白質等のごときいくつかの他の化合物をリガンドとして用いることができる。そのようなリガンドを含有する化合物は、それがどこに位置しようとも、それらを抗原として認識する免疫グロブリンまたはその断片によって選択的に同定され得る。注目する免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧのサブタイプのいくつかである。免疫グロブリンは、いずれかの源（ｓｏｕｒｃｅ）から、特にマウスおよびヒトから誘導することができる。免疫グロブリンは形質転換リンパ球（transformed lymphocytes）のようなハイブリドーマーから誘導することができるか、または組換えＤＮＡ法によって誘導することができる。
【００５３】
特に、マウス免疫グロブリンの可変部分をヒト免疫グロブリンに連結させて、低い免疫原性を持つキメラ免疫グロブリンを形成することができる。Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＶ部位等の使用のみが必要であろう。
【００５４】
リガンドを問題のトキシンにカップリングさせて、それを、細胞に進入させ、内部の標的蛋白質（ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓ））を同定するのを助けることができる。ジスルフィド結合を用いて、それが細胞内部で減少するにつれリガンドからトキシンを放出させることができる。
【００５５】
問題の化合物はイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）およびイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で用いることができる。イン・ビボの使用では、化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は経粘膜、非経口、または注入により、特に静脈内投与することができる。用量は、恐らく、約１μｇないし１０ｍｇ程度で変化させ、通常０．５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００５６】
投与の手段、天然由来のトキシンまたはその修飾形態と同一のアミノ酸配列を呈する使用合成トキシンに応じ、化合物は、結局は、非常に低い用量で用いることができる。化合物は、結局は、リン酸−生理食塩水緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｓａｌｉｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、生理食塩水溶液または他のより利用しやすい溶液のような生理学的に許容される媒体中に希釈することができる。
【００５７】
これらの化合物は、結局は、慢性または急性心血管障害の場合に用いることができ、ここに、微小循環が治療の標的であろう。特に、これらの化合物は、結局は、ヒト高血圧障害および血管病巣、過形成等を引き起こすもののようなその結果で用いることができる。可能な推奨される使用は、急性肺浮腫の場合であろう。それらは、結局は、修飾されてもまたは未修飾のままでもよく、これらのトキシンの同定、または標的蛋白質（酵素、受容体等）とこれらのトキシンとの相互作用が有用であり得る病理生理学診断のために未修飾形態で用いることができる。
【００５８】
本発明におけるＢＰＰおよびＥＶＡＳＩＮＳは心血管病理学で用いられる。
【００５９】
本発明で提示される革新は、一般に、２０未満の既知のＢＰＰに、天然ＢＰＰおよびＥＶＡＳＩＮＳと同一のアミノ酸配列を持つ数ダースの他の合成ペプチド、またはここに規定する構造的モチーフを呈するその化学的修飾されたホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）を添加すること、ならびにアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のカルボキシル部位に対する、およびＮＥＰおよびＥＣＥに対するそれらの阻害活性を介してそれらの生物学的作用を特徴付けることよりなる。
【００６０】
これらの特徴を持つペプチドは、総括的に、ＢＰＰ（ブラジキニン増強ペプチド）およびＥＶＡＳＩＮＳ（内因性バソペプチダーゼ阻害剤）として命名されるであろう。本発明からのＢＰＰおよびＥＶＡＳＩＮＳは、毒腺によって分泌されるペプチド、およびボスロポス・ジャララカの内因性組織で生産されたペプチドに対応する。
【００６１】
ＢＰＰの配列は質量分析によって測定し；ＥＶＡＳＩＮＳの配列は、毒ヘビ、特にボスロポス・ジャララカで発現された分子の前駆体をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の推定によって決定した。
【実施例１】
【００６２】
−  ブラジキニン増強活性を示すプール成分の部分的単離
−  高速液体クロマトグラフィー  −  ＨＰＬＣ
ブラジキニン増強活性を呈するペプチドプールの成分を、０．２ないし０．５ｍＬ／分の液速にて、水中の０．５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、および５％ないし６０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）のグラジエントにおいて、逆相カラム：Ｃ−１８／ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）（４．６×２５０ｍｍ／５μ樹脂）を備えた、高速液体クロマトグラフィー  −  ＨＰＬＣ  メルク−ヒタチ（Ｍｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ）モデルＬ−６２００Ａ、２１４ｎｍに設定したＵＶ−ｖｉｓディテクターによって部分的に単離した。用いたグラジエントは試料に従って変化させた。ペプチドは、２１４ｎｍにおける吸光度ピークの形状に従って溶出物を手動で分画することによって得た。
【００６３】
ブラジル毒ヘビボスロポス・ジャララカの毒液からの抗−高血圧ペプチドの精製
ブタンタン研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｂｕｔａｎｔａｎ）の毒液部門（Ｖｅｎｏｍ  Ｓｅｃｔｉｏｎ）によって供給されたボスロポス・ジャララカの毒液プールから得られた全毒液（１２００ｍｇ）を１０ｍＬの脱イオン水に溶解させ、８００ｇにて３０分間遠心処理した。上清を収集し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（２５−８０μ，シグマ（Ｓｉｇｍａ））ゲル濾過カラム（１．２×１０１ｃｍ）に負荷（ｌｏａｄ）した。カラムを、室温にて、３０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化した。試料をカラムの頂部に負荷し、１．２ｍＬ／分の液速にて成分を溶出させた。２１４ｎｍにおける各分取分の吸光度プロフィールはプールの構成を規定した。
【００６４】
高速液体クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ
用いたＨＰＬＣ装置は、０．５ｍＬ／分の液速での、０．５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、および５％および６０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）のグラジエントにおける、ブラジキニン増強活性を持つプールの部分的単離のための、逆相カラム：Ｃ−１８／ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ（４．６×２５０ｍｍ／５μ樹脂）を備えた、メルク−ヒタチ（Ｍｅｒｃｋ―Ｈｉｔａｃｈｉ）モデルＬ−６２００Ａ  ＵＶ  ｖｉｓ検出器であった。
【実施例２】
【００６５】
質量分析によるブラジキニン増強ペプチドの分子量および一次構造の決定
質量分析実験は、電子スプレイイオン源（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を備えた正イオン化モードのマイクロマス−クアットロ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ）ＩＩ質量分析計（ＥＳＭＳ−ＭＳ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で行った。データ獲得のためにマス・リンクス（Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘ）ソフトウエアを用いた。
【００６６】
質量分析計のパラメーターは標準として合成ブラジキニンを用いて最適化した。
【００６７】
試料を５０％ＡＣＮ／水および０．１％ギ酸に溶解させ、注入ポンプによって、０．５μＬ／分の一定液速にて注入した。データは、全分析手法の間、５秒の走査時間を用い、４００および１６００の間の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を走査することによって、第１の四重極（ＥＳＭＳ）で獲得した。
【００６８】
第１の四重極で特徴付けしたプロトン化イオンにてペプチドを配列決定し、３×１０−３のアルゴンガス圧力で誘導解離の衝突（ＣＩＤ：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によって断片化し、最後に、第２の四重極（ＥＳＭＳ−ＭＳ）で走査することによってデータを獲得した。
【００６９】
質量分析計にカップリングさせたＨＰＬＣシステム（ＬＣ−ＥＳＭＳ−ＭＳ）
用いたＨＰＬＣシステムは、全毒液からの成分を単離するための、自動インジェクター、２１４ｎｍに設定されたＵＶ−ｖｉｓ検出器と、逆相カラム：Ｃ−１８／ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）（４．６×２５０ｍｍ／５μ樹脂）とを備えたヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）モデル１１００であった。
−  溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水
−  溶媒Ｂ：０．６ｍＬ／分の液速での１０％溶媒Ａ／ＡＣＮ
【００７０】
用いたグラジエントは：
ｔ＝０ないし５分：０％  Ｂ
ｔ＝５ないし６５分：０％ないし６０％  Ｂ
ｔ＝６５ないし７０分：６０％ないし１００％  Ｂ
ｔ＝７０ないし７５分：１００％  Ｂ
ｔ＝７５ないし８０分：１００％ないし０％  Ｂ
であった。
【００７１】
ＨＰＬＣ液速は６００μｌ／分であり、そのうち２０μｌは質量分析計に自動注入し、他方、残りの５８０μｌはＵＶ−ｖｉｓディテクターに送った。
【００７２】
質量分析は、マイクロマス・クアットロ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ）質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で行った。配列決定および特徴付けのデータは、特にこの目的のために開発されたソフトウェアを用いて獲得した。
【実施例３】
【００７３】
固相におけるペプチドの合成
ペプチド合成では２つの方法（ｓｔｒａｔｅｇｙ）を用いた。
【００７４】
より伝統的な方法である第１のものは、アミノ酸のほとんどの反応性側鎖の保護のために、アミノ基およびベンジル誘導体（Ｂｚｌ）用の一時的保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）を用いる。
【００７５】
第２の、最も最近の方法は、塩基不安定な保護基９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｔｅｒｔ−ブチル誘導体（ｔＢｕ）との間を交互に行う（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）。
【００７６】
ａ）Ｂｏｃ／Ｂｚｌ方法  −  この方法における最初の工程は、樹脂に結合した第１のアミノ酸残基からのＢｏｃ基の除去である。
【００７７】
Ｂｏｃ基の除去は、２％アニソールを含有するジクロロメタン（ＤＣＭ）中の３０％ＴＦＡ中にて３０分間で起こる。樹脂を、０．５％アニソール、ＤＣＭおよびＭｅＯＨを含有するイソプロパノールで洗浄する。次のアミノ酸のカップリングのために、アミノ基をＤＣＭ中の１０％ＴＥＡまたは５％ＤＩＰＥＡで１０分間脱プロトン化（中和）する。次いで、ペプチジル−樹脂をＤＣＭ、ＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびカップリングフェーズ（ｐｈａｓｅ）で用いるべき溶媒で洗浄する。
【００７８】
アミノ酸のカップリングは活性化相で、通常、カップリング剤、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾイル）−１，１，３，３−テトラメチルルロンテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、を伴い、開始する。通常、ＢＯＣ−アミノ酸（カルボキシル成分、ＣＣ）およびカップリング剤を、樹脂中のアミノ基（アミン成分、ＣＡ）の量と比較して、３倍モル過剰で用いる。
【００７９】
ＤＩＣを用いる場合、試薬ＣＡ：ＣＣ：ＤＩＣの割合は１：３：３である。ＴＢＴＵを用いる場合、試薬ＣＡ：ＣＣ：ＴＢＴＵ：ＤＩＥＡの割合は１：３：３：４である。
【００８０】
これらの試薬の最終濃度は０．０５および０．１Ｍの間である。Ａｓｎ（アスパラギン）またはＧｌｎ（グルタミン）をカップリングさせる場合、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）をカップリング剤と共に用いて、これらのアミノ酸からの二トリルの形成を妨げる。
【００８１】
これらのカップリングでは、試薬ＣＡ：ＣＣ：ＴＢＴＵ：ＨＯＢｔ：ＤＩＥＡの最終割合が１：３：３：３：５である。通常２時間を要するカップリング反応はニニドリン定性方法を用いてモニターされ、ペプチジル−樹脂の青色染色は不完全なカップリングを示す。この場合、一般に、以前のカップリングで用いた溶媒および／またはカップリング剤を変更し、再度カップリングを行う。
【００８２】
カップリングフェーズが終了すれば、次の残基がカップリングされるまで、アミノ基を脱保護して次のサイクルを開始する。所望の配列の延長の最後まで、該プロセスをサイクル的に行う。
【００８３】
−  合成手法の最後に、ペプチドを樹脂から切断し、ＨＦ処理の間に放出されるカルボケーションによって誘導される付随的反応用のサプレッサーとして作用するｐ−クレゾールおよびジメチルスルフィド（ＤＭＳ）（各々５％、ｖ／ｖ）の存在下にて、０℃における６０ないし９０分間の無水ＨＦでの処理によって、単一工程でその側鎖を脱保護する。
【００８４】
ペプチド配列がＴｒｐ残基を含む場合、エタノール−１，２−ジチオール（ＥＤＴ）を添加して、切断と同時にこのアミノ酸の側鎖を保護するホルミル基を除去する。ＥＤＴは他のサプレッサーと同一の割合で用いる（各々５％ｖ／ｖ）。切断の後、樹脂を酢酸エチルで洗浄し、樹脂を水中の５％（ｖ／ｖ）酢酸で洗浄することによってペプチドを溶出させ、凍結乾燥する。一般にアモルファス状の白色粉末が得られる。
【００８５】
ｂ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ方法
−  以前の方法とは異なり、アミノ基保護基のＦｍｏｃを用い、これは、約２０分間のＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液での処理によってアミノ酸から除去される。この処理により、次のカップリング工程のために、アミノ基が脱プロトン化される。カップリング方法はＢｏｃ化学と同一であり、最終切断は弱酸溶液を用いて行われる。なぜならば、（一般に、ｔｅｒｔ−ブチルタイプの）側鎖に結合した保護基および樹脂に結合したペプチドの双方はＢｏｃ化学よりも不安定だからである。通常、樹脂を８５ないし９５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）および付随反応の異なるサプレッサーの混合物で約２時間処理する。この処理の後、ペプチドを氷冷エチルエーテル中にて樹脂で沈殿させ、２，５００ｇにて５分間遠心処理する。上清を捨て、ペレットを再度エチルエーテルに懸濁させ、攪拌し、遠心処理する。該手法を５回繰り返し、樹脂およびペプチド混合物を真空下で乾燥する。最後に、ペプチドを水中の５％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ）で樹脂から放出させ、濾過する。濾過した溶液を、アモルファス状白色粉末が得られるまで凍結乾燥する。
【００８６】
１  −  アセルトン，Ｅ．（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．）およびシェパード，Ｒ．Ｃ．（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．）（１９８９），  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｉ．Ｌ．Ｒ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ
２  −  フィールズ，Ｇ．Ｂ．（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．）およびノーブル，Ｒ．Ｌ．（Ｎｏｂｌｅ，Ｒ．Ｌ．）（１９９０）  Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３５，１６１
【実施例４】
【００８７】
ＢＰＰの前駆体をコードするｃＤＮＡから推定されるペプチド配列
ノーザンブロットアッセイ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙｓ）
グアニジンイソチオシアネート−フェノール−クロロホルムでの抽出方法を用い、ボスロプス・ジャララカのいくつかの組織からの全ＲＮＡを単離した。この毒ヘビの組織の各々からの１０マイクログラムの全ＲＮＡを、変性アガロースゲル電気泳動（１．７％ホルムアルデヒド）によって分離し、毛管現象によってナイロン膜に移した。真空−オーブン中、８０℃にて１時間でＲＮＡを膜にブロット（ｂｌｏｔ）し、続いて、７００００μＪ／ｃｍ２においてクロスリンカー（Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）モデルＲＰＮ２５００−アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））中で５分間のＵＶ処理を行った。
【００８８】
５０％ホルムアミド、２．５ｍＭ  Ｋ２ＰＯ４、５×デンハルトの溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５０μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡおよび１０％デキストラン硫酸（ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含有する緩衝液中、膜を４２℃にて一晩（約１６時間）プレ−ハイブリダイズ（ｐｒｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）させた。
【００８９】
放射性プローブの合成用の鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）として用いるｃＤＮＡ断片は、適当な制限酵素（各々、ＢＰＰおよびＣＮＰをコードする配列では、ＳｍａＩまたはＳｍａＩ＋ＢａｍＨＩ）を用いる、ＢＰＰおよびＣＮＰをコードするｃＤＮＡインサートを含むクローン（クローンＮＭ８７，  ムラヤマら（Ｍｕｒａｙａｍａ  ｅｔ．ａｌ），  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９４，１１８９−１１９３，１９９７）の応用（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって得られた。
【００９０】
切り出したインサートを低融点アガロースゲル電気泳動によって分離し、フェノール／クロロホルム抽出、続いてのエタノール沈殿（ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によってＤＮＡを回収した。
【００９１】
ランダムヘキサヌクレオチドおよびポリメラーゼ（クレノウまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下でのα［３２Ｐ］−ｄＣＴＰの取込に基づき、レディプライムキット（ＲｅｄｉＰｒｉｍｅ  ｋｉｔ）（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の製造業者の指示に従い、各反応につき、前記したごとく得られた約２５ｎｇの鋳型ＤＮＡを用い、放射性プローブを調製した。逆モレキュラーシールカラム（「スピンカラム（スピン  カラムズ：ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ）Ｓ−２００」，ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））にて、取り込まれなかった放射性ヌクレオチドをプローブから分離した。
【００９２】
約１．５×１０６ｃｐｍ／ｍＬの濃度にて放射性プローブをプレ−ハイブリダイゼーション溶液に添加した後、放射性プローブとのハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を４２℃にて１６時間行った。
【００９３】
最後に、膜を厳しい条件（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）で洗浄した。すなわち、２×ＳＳＣ：０．１％ＳＤＳ溶液で６５℃にて各々１５分間４回洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ溶液中にて６５℃にて３回洗浄した。各膜で観察された放射性シグナルの強度に基づき、適当なカセット中、膜を適当な時間Ｘ−線フィルム（ＬＳ−コダック（Ｋｏｄａｋ））に暴露した。より弱いシグナルの良好な検出のために、カセットはスクリーン、フィルムおよび膜の対を含み、−８０℃に維持された。
【００９４】
メッセンジャーＲＮＡの精製およびＢ．ジャララカの脳からのｃＤＮＡライブラリーの調製
Ｂ．ジャララカの脳からの全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出方法を用いて単離した。
【００９５】
予め充填したオリゴ−ｄＴセルロースカラム（ジブコ・ビィ・エル）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））に全ＲＮＡ溶液を２回通すことによって、メッセンジャーＲＮＡを精製した。精製されたメッセンジャーＲＮＡの１つの分取分を変性アガロースゲル電気泳動（１．７％ホルムアルデヒド含有）に付し、続いて、臭化エチジウムで染色した。ＲＮＡを毛管現象によってナイロン膜に移して、ＢＰＰをコードする配列に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションを介して試料の完全性を確認した。λ  ＺＡＰファージにおけるｃＤＮＡライブラリーの調製は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ラ・ジョラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ），  ＣＡ）からのｃＤＮＡ調製キットを用いて行った。５μｇの脳メッセンジャーＲＮＡから得られた二本鎖ｃＤＮＡインサートのλ  ＺＡＰファージへのクローニングの後、これらをイン・ビトロでパッケージし、力価を測定して、クローニング効率を確認した。このファージライブラリーを増幅し、各々、クロロホルムおよびＤＭＳＯの存在下にて、ファージを−２０℃および−８０℃で貯蔵した。
【００９６】
全ファージ溶解物からのｃＤＮＡの増幅
脳ｃＤＮＡライブラリーで得られた１０μｌの全ファージ溶解物を用い、ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）増幅を、毒腺からのＢＰＰおよびＣＮＰの前駆体をコードするｃＤＮＡの配列に由来する特異的オリゴヌクレオチドを用いて行った。ファージ溶解物をまず１００℃にて５分間インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）し、次いで、４℃まで冷却し、最後に、該酵素を補給した、１０ピコモルの各プライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））、２００μＭ  ｄＮＴＰおよび１×ＰＣＲ緩衝液よりなる増幅反応の他の成分に添加した。かく調製された反応を、次いで、４分間の９４℃における変性サイクルに、次いで、９４℃における１分、６０℃における１分、７２℃における１分の３５のさらなるサイクルに付した。引き続いて、臭化エチジウムでの染色の後、ＰＣＲ産物がアガロースゲル電気泳動によって分析されるまで、反応を４℃に維持した。毒腺からのｃＤＮＡ配列に基づき、予測されるサイズのＰＣＲ産物を、製造業者の指示に従い、（通常の方法による）、プラスミドベクターｐＣＲｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にサブクローン化し、ベクターの多重クローニング部位の隣接領域にアニールするオリゴヌクレオチド（プライマーＴ３およびＴ７）を用いて配列決定した。
【００９７】
ＢＰＰの前駆体をコードするクローンの選択および同定
ＳｍａＩまたはＳｍａＩおよびＢａｍＨＩでのクローンＮＭ８７の消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）（各々、約４５０ｂｐおよび４３２ｂｐ、位置１６４ないし６１０および６１０ないし１０４４）によって得られた断片を、ランダムプライマー方法（レディプライムキット（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ｋｉｔ）／アマーシャム）を用いる放射性プローブ（α３２Ｐ）の合成用の鋳型として用いた。
【００９８】
各々約５００００のファージプラーク（ｐｈａｇｅ  ｐｌａｑｕｅｓ）を含むプレート（ｐｌａｔｅｓ）から調製されたニトロセルロース膜（シュライヘル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ））を、４２℃における１６時間の、６×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  １５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，  ｐＨ７，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、５０％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳおよび５×デンハルト（Ｄｅｎａｒｄｔ）中での放射性プローブとのハイブリダイゼーションに付した。次いで、膜を各々６５℃にて１５分間、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で３回洗浄した（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  １５ｍＭクエン酸ナトリウム，  ｐＨ７）。陽性ファージプラークをオートラジオグラフィーによって同定し、ＤＮＡインサートの分析のために単離した。製造業者の指示に従い、ベクターλ  ＺＡＰからのファゲミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのイン・ビボ切出を「ヘルパーファージ」（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を用いて行い、インサートの末端を配列決定した。
【００９９】
ＤＮＡインサートの配列決定
製造業者の指示に従い、キット・ビッグダイ（Ｋｉｔ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ）（パーキン・エルマー）を用いるジデオキシ−ヌクレオチドでの鎖停止方法、続いて、ＡＢＩ３１０自動シーケンサーでの、その製造者の説明に従って行った分析に従い、配列決定反応を行った。
【０１００】
単一のＢ．ジャジャラカ種の脳からの全ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出方法によって単離し、予め充填したオリゴ−ｄＴセルロースカラムに全ＲＮＡ溶液を一回通すことによってメッセンジャーＲＮＡを精製した。試料の精製されたｍＲＮＡの完全性をアガロースゲル電気泳動、続いての（ノーザンブロットアッセイによって同定された）ＢＰＰおよびＣＮＰの前駆体をコードするｃＤＮＡから合成された放射性試料とのハイブリダイゼーションによってチェックした。
【０１０１】
λ  ＺＡＰファージ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））におけるｃＤＮＡライブラリーの調製は、製造業者の支持に従い、５μｇのこの試料を用いる慣用的かつ通常の方法によって行った。
【０１０２】
得られた組換えファージの最初のパッケージングにより、約２×１０５ｐｆｕ／ｍＬの力価が生じ、非−組換えクローンは１％未満であった。このライブラリーを直ちに増幅し、最終力価は約９×１０９ｐｆｕ／ｍＬであった。
【０１０３】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）増幅
用いた最初のアプローチの目標は、ＢＰＰおよびＣＮＰの前駆体をコードするｃＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによりＢ．ジャララカ脳ｃＤＮＡライブラリーから注目するｃＤＮＡを増幅させることであった。反応は本明細書中に記載した材料および方法で行った。約２５０塩基対の１つの断片のみが、脳ｃＤＮＡライブラリーを含む全ファージ溶解物からクローン化された（毒ヘビ脳または膵臓ライブラリーからのいずれの他の断片の増幅もなかった）。このｃＤＮＡインサートの完全な配列決定は、ナトリウム利尿性ペプチド、およびその内３つがサイレントであり（同一のアミノ酸酸残基をコードする）、４番目が「保存されている」（同一の化学的特徴を持つアミノ酸についての置換）いくつかの点突然変異（４残基置換）に先行するセグメントにおける数個のヌクレオチド（１２塩基）の挿入を除き、毒腺ライブラリーで同定されたｃＤＮＡ配列との非常に高度な同様性を示した。用いた反応条件および／またはポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドを変化させる多数の増幅の試みにも拘わらず、調べたライブラリーのいずれからも他の断片をクローン化することができなかった。
【０１０４】
１３の陽性クローンを同定するのを可能としたハイブリダイゼーション実験で用いた放射性プローブの合成のための鋳型としてナトリウム利尿性ペプチドをコードするセグメントを用い、約５×１０６クローンを独立して分析した。ｃＤＮＡインサートを含むプラスミドベクターをＤＮＡのミニ−調製によって回収し、プラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋）多重クローニング部位の隣接領域にアニールするオリゴヌクレオチド（市販のプライマーＴ３およびＴ７）を用いて配列決定した。
【０１０５】
Ｂ．ジャララカの脳からのｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションによるクローンのスクリーニングは、これらのペプチドについての前駆体蛋白質の一部としてのＢＰＰをコードするｃＤＮＡの単離を可能とした（図１）。ボスロプス・ジャララカの毒液から単離されたＢＰＰとの類似性によって、７つのペプチド（表１中のものの中にリストされた配列）を同定した。これらの配列に基づき、毒液ペプチドと同一の薬理学的特性、ならびにＥＣＡおよびＮＥＰの阻害を呈するペプチドを合成した。
【実施例５】
【０１０６】
ＢＰＰおよびＥＶＡＳＩＮＳのブラジキニン増強活性のテスト
モルモット回腸に対する生物学的アッセイ（ａｓｓａｙ）
単離されたペプチドのプールの増強活性を、平滑筋に対するブラジキニンの収縮活性につきテストし、摘出されたモルモット回腸の調製を用いて測定した。体重が１６０および１８０ｇの間であるメスのモルモットを用いた。アッセイを開始する前、回腸をタイロード（ＴＹＲＯＤＥ）溶液中に３７℃にて３０分間保持した。１．５ないし２．０ｃｍと測定される提出回腸セグメントの端部の１つを、毛管現象を介する一定の酸素バブリング下３７℃のタイロード（ＴＹＲＯＤＥ）生理学的溶液を含有する５ｍＬの容量を持つガラス容器の底部に位置するセミ−リング（ｓｅｍｉ−ｒｉｎｇ）に結んだ。回腸セグメントの他の末端は、以前にキャリブレートされた登録アーム（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ｒｅｇｉｓｔｅｒｉｎｇ  ａｒｍ）に結んだ。アームに対する張力は１ｇであり、回腸の収縮はＲＥＣ１０１レコーダー（ファルマシア・バイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））によって記録した。
【０１０７】
試料は使用時に脱イオン水中で調製し、生物学的調整で用いる容量は０．２ｍＬを超えなかった。
【０１０８】
試料のブラジキニン増強効果を決定するために、回腸に対するブラジキニンの効果のｌｏｇ−用量曲線をプロットした。摘出モルモット回腸の収縮を測定することによってブラジキニン活性を決定し、増強活性は、標準用量のブラジキニンに対する組織応答の増加の関数として表した。
【０１０９】
単一用量のブラジキンンの添加の前に、プールおよび画分を個々にアッセイし、３０秒間添加した。ｌｏｇ用量−効果曲線の直線部分に測定された応答を内挿し、標準用量のブラジキニンに対する組織応答の上昇の関数として増強活性が与えられた。タイロード溶液：２０ｍＬのストック溶液Ｉ、４０ｍＬの溶液ＩＩ、１ｍＬのジフェニドラミン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）、１ｍＬのアトロピン溶液（１ｍｇ／ｍＬ）、５．６０ｍＭ  Ｄ−グルコースおよび１Ｌまでの水。
【０１１０】
この実験で用いた全ての試薬は分析グレードであった。
【実施例６】
【０１１１】
全身血液循環および微小循環に対する効果
ブラジキニンの血圧降下増強活性効果を、エチルエーテルで麻酔した正常血圧および高血圧オスおよびメスのウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットでテストした；カニューレを薬物投与のために大腿静脈に導入し、血圧記録のために大腿動脈に導入した。グルド（Ｇｏｕｌｄ）ポリグラフを、スタサム・グルド（Ｓｔａｔｈａｍ  Ｇｏｕｌｄ）生理学的トランスジューサーにカップリングさせて用いた。圧力ベースラインによって境界が定まる領域を積分し、それらを対照実験で得られた値と比較することによって、動脈圧変動値を得た。トキシン効果のテストは、腸間膜循環を用いる生存中顕微鏡観察によって正常血圧および高血圧ラットで行った。動物を麻酔し、その体温を加熱したプレートによって維持し、他方、腸間膜をそれを横断して照射し、テレビカメラに結合したレンズを介して観察した。これらの動物の脈管（ｖａｓｅ）直径をマイクロメーターのネジで測定した。テストした物質は、一定液速のペリスタポンプによって投与するか、またはボーラス注射（ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｂｏｌｕｓ）した。
【実施例７】
【０１１２】
ＢＰＰによるＡＣＥ阻害の測定のための酵素アッセイ
ただ１つの機能的活性部位を含む野生型ヒト・アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）および２つの突然変異体を、チャイニーズハムスター卵巣細胞のＡＣＥコードｃＤＮＡでの安定なトランスフェクションを介して得た。２つのＡＣＥ突然変異体は、リシン残基による亜鉛結合ヒスチジン残基の置換によって不活化された、触媒部位、Ｎ−またはＣ−末端の１つを呈する全長蛋白質として発現された。
【０１１３】
２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０μＭ  ＺｎＣｌ２を含有する５０ｍＭのｐH6.８のＨｅｐｅｓ緩衝液中にて、酵素アッセイを基質Ｍｃａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＤｐａＯＨを用いて２５℃で行った。フルオリメーター・フルオロライト（Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ）１００００（ダイナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ））にて、３９０ｎｍ発光波長における蛍光の上昇、およびＡＣＥによる基質の切断（Ｓ＝Ｋｍ，  ４０μＭ）によって引き起こされた３４０ｎｍにおける励起を測定することによって、反応を継続的にモニターした。基質の添加９０分前に、ブラジキニン増強ペプチド（ＢＰＰ）（阻害剤）を酵素と共にプレ−インキュベートした。
【実施例８】
【０１１４】
イン・ビボにおけるＢＰＰの効果―動脈血圧および微小循環の特徴付け
加熱されたプレートによって３６．５℃および３７℃の間に体温を維持しつつ、体重が１８０および２２０ｇの間のウィスターオス・ラットをペントバルビタールナトリウム（ハイプノール（Ｈｙｐｎｏｌ）（登録商標）クリスタリア（Ｃｒｉｓｔａｌｉａ），  ５０ｍｇ／ｋｇ体重，  腹腔内）で麻酔した。気管切開の後、動物の通気を、標準的な条件下にて、以下のごとく、機械的ベンティレーター（ハーバード（Ｈａｒｖａｒｄ）げっ歯類ベンティレーター，  モデル６８３，  ハーバード・アパレータス（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ），  サウス・ナティック（Ｓｏｕｔｈ  Ｎａｔｉｃｋ，  マサチューセッツ州  米国）によって制御した：頻度：５７ないし６５吸息／分；通過容量：２ないし２．５ｍＬ；吸息された酸素分率：０．２５ないし０．４０。各々、動脈血圧の連続的モニタリングのために（ティエスイー・システム・テクニカル・アンド・シーエイチエム・サイエンティフィック・イクイップメント・ゲーエムベーハー（ＴＳＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ＆  ＣＨＭ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  ＧＭＢＨ））、および液体の投与のために、カニューレを右頚動脈および頚静脈に導入した（ＰＥ−５０カテーテル，  ５８ｍｍ  ＩＤ，  ポルテックス（Ｐｏｒｔｅｘ），  ハイセ（Ｈｙｔｈｅ），  ＵＫ）。腸間膜床（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ  ｂｅｄ）を露出させた。腹部領域の三分割の後、皮膚を切り（rupture）、白質線の切開を介して腸間膜に到達した。温度が制御されたプレートの透明領域で腸間膜を露出させ、これを顕微鏡のステージ（ｃｈａｒｒｉｏｔ）上に置いた。プレートの温度は３７℃に維持した。露出した組織を湿潤に維持し、３７℃の１％ゼラチンを含有するリンガー−ロック（Ｒｉｎｇｅｒ−Ｌｏｃｋｅ）溶液（ｐＨ７．２ないし７．４）（１５４ｍＭ  ＮａＣｌ；５．６ｍＭ  ＫＣｌ；２ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；５ｍＭグルコース）での灌流によって加熱した。
【０１１５】
顕微鏡で得られた像をコンピューターおよび／またはＴＶモニターに同時または同時でなく伝達する着色像投影カメラ（ＪＶＣ−ＴＫＣ  ６０００）に連結させた光学顕微鏡（アキオスコープ−カール・ツアイス（Ａｋｉｏｓｋｏｐ−Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，ドイツ国）を用い、その部位（ｉｎ  ｓｉｔｅ）での腸間膜微小循環の実験を行った。像解析ソフトウエア、ＭＳウィンドウズコンパチブル（コントロン・カーエス（Ｋｏｎｔｒｏｎ  ＫＳ）３００，  コントロン・ビルド・アナリーゼ−ゲーエムベーハ（Ｋｏｎｔｒｏｎ  Ｂｉｌｄ  Ａｎａｌｙｓｅ−ＧＭＢＨ），ドイツ国）をコンピュータにインストールし、固定された時間間隔におけるストアされた像の定量的測定を可能とした。実験の全コースを記録できるビデオテープレコーダーをＴＶモニターに連結する。
【０１１６】
かくして、実験の間に可視化された像を、コンピューターモニター上の固定像を介して定量的に評価することができ、同時に、ＴＶモニター上で観察された実験のコースは、後の解析のためにビデオテープレコーダーによってストアすることができる。
【０１１７】
光学顕微鏡は、レンズおよび投影カメラの間に位置する増幅レンズ（オプトバール（Ｏｐｔｏｖａｒ））のシステムを有する。モニターに伝達された像はレンズ、増幅レンズおよび投影レンズによって決定される倍率に由来する。本明細書中に記載する実験において、コンピューターモニターにおける倍率は８６０倍であり、ＴＶモニターでは１５３０倍であった。
【０１１８】
微小循環血管（直径１５および３０μｍの間）における赤血球細胞速度の決定は、ボーダーズ・アンド・グランジャー（Ｂｏｒｄｅｒｓ  ＆  Ｇｒａｎｇｅｒ）（１９８４）によって記載され、デービス（Ｄａｖｉｓ）（１９８７）によって考えられた測光方法によって行った。光学顕微鏡のアイピースおよび生存中顕微鏡観察器具の像投影カメラの間にインストールされた光学ドップラー速度計（マイクロサーキュレーション・リサーチ・インスティテュート（Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ），（テキサス・エイ・アンド・エム・カレッジ・オブ・メディスン（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ））を介して、血流をその場でコンピューターモニターで測定した。該器具は２つのセンサー（平面フォトダイオードおよび低キャパシタンス）よりなり、これは、コンピューターモニターでの観察下で血管の像の中心に置く。それらの間の確立された既知の距離におけるセンサーは、赤血球細胞の通過によって生じた光強度の変化を検出することができ、変化を電圧シグナルに変換し、これは、それらの細胞の速度に比例する。
【０１１９】
該センサーは、血管の直径、および血流の中心における赤血球細胞の速度を測定する。
【０１２０】
実験プロトコル
外科的手法
−微小循環網目および血圧の安定化のための１０分間
―ＢＰＰまたは等容量の滅菌生理食塩水（１０分間で５ｍＬ）の投与。ＢＰＰまたは生理食塩水の投与直後に、ブラジキニンのボーラス注射（３μｇ／３００μｌ）。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】対応するｃＤＮＡ配列から推定された、ボスロポス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ）脳からのＥＶＡＳＩＮＳ前駆体の一次配列を示す図である。
【国際公開パンフレット】
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