(57)【要約】本発明は、包括的には、分子および細胞の生体磁気的検定に関し、特に、光磁気バイオディスクで行われる分子および細胞の生体磁気的検定に関する。本発明はさらに、光磁気バイオディスクおよびＭＯドライブを含む光磁気バイオディスクシステムに関する。より詳細には、本発明は、磁気粒子またはビーズを用いた、細胞集団および細胞集団の溶液中の特定の標的細胞を検出して選択的に操作するための生体磁気的方法（免疫磁気的方法を含む）と、磁気的に誘導される神経突起成長および神経再生と、ＭＯＢＤＳを用いて磁気的に形成された神経網とに関するが、最良の実施の形態により本明細書中以下に記載される特定の実施の形態に限定されない。
2005530127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ磁気検定を行うための光磁気バイオディスクであって、
中心および外縁を有する基板と、
該基板に関連した光磁気スタック、および、
前記基板上に設けられた一つまたは複数の磁区であって、生体磁気粒子を結合または解放する磁区
を含む、
光磁気バイオディスク
【請求項２】
前記生体磁気粒子は常磁性ビーズであり、結合剤に付着している、請求項１に記載の光磁気バイオディスク。 
【請求項３】
前記結合剤は、抗原、抗体、リガンド、受容体、ビオチン、ストレプトアビジン、ＤＮＡ断片、およびＲＮＡ断片を含む群から選択される、
請求項２に記載の光磁気バイオディスク
【請求項４】
前記一つまたは複数の磁区は、光磁気ディスクドライブを用いて、前記基板の前記中心および外縁の間に選択的に形成される、
請求項１に記載の光磁気バイオディスク。
【請求項５】
前記一つまたは複数の磁区は、前記光磁気ディスクドライブを用いて、選択的に消去される、
請求項４に記載の光磁気バイオディスク。
【請求項６】
前記一つまたは複数の磁区は、形成および消去され、それにより前記磁気粒子は選択的に結合および放出される、
請求項４または５に記載の光磁気バイオディスク。
【請求項７】
前記光磁気ディスクは、前記磁区にある特徴物を読み出しおよび検出するのに用いられる、
請求項６記載の光磁気バイオディスク。
【請求項８】
前記基板に関連する流路層であって、該流路層は流体回路を形成する切り取り部位を有する、流路層をさらに含む、
請求項７に記載の光磁気バイオディスク。
【請求項９】
前記流路層と関連するキャップ部をさらに含む、
請求項８に記載の光磁気バイオディスク。
【請求項１０】
前記流体回路は、注入ポート、混合チャンバ、分離チャンバ、一つまたは複数の試験チャンバ、および排出ポートを含み、これらはすべてがお互いに流体連通する、
請求項９に記載の光磁気バイオディスク。
【請求項１１】
前記一つまたは複数の試験チャンバは、試験剤を含む試験溶液があらかじめロードされている、
請求項１０に記載の光磁気バイオディスク。
【請求項１２】
薬物感受性に関し、標的細胞を検出、定量、および試験する方法であって、  
細胞のサンプルを用意し、
前記サンプルを前記注入ポートから前記混合チャンバにロードし、
サンプル中の標的細胞の表面の表面マーカーに特異的な結合剤に結合した、生体磁気粒子を用意し、
前記生体磁気粒子を混合チャンバにロードし、
結合剤がサンプル中の標的細胞上の表面マーカーと結合し、標識細胞を形成するのに十分な時間、前記サンプルおよび生体磁気粒子を培養し、
前記光磁気バイオディスクを前記光磁気ディスクドライブにロードし、
前記分離チャンバ内のあらかじめ決められた位置に磁区を形成し、
前記光磁気バイオディスクを回転させ、前記サンプルおよび生体磁気粒子を前記分離チャンバに移動させ、
前記生体磁気粒子および標識細胞を、前記分離チャンバ内の前記磁気区に結合させ、そして
前記分離チャンバを電磁放射ビームで走査し、磁区は標識細胞を含むか決定する、
請求項１１に記載の光磁気バイオディスクを用いる方法
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
前記磁区に結合した標識細胞の数を定量し、
標識細胞が結合した前記磁区を選択的に消去し、選択的に該標識細胞を放出し、
前記一つまたは複数の試験チャンバにあらかじめ決められた数の標識細胞を移動するために前記磁区を続けて消去および形成し、前記標識細胞を前記一つまたは複数の試験チャンバに磁気的に導き、
前記標識細胞を前記試験剤と共に培養し、そして、
前記試験チャンバを電磁放射ビームで走査し、生細胞およびアポトーシス細胞の数を決定し、それにより前記試験剤に対する細胞の感受性を決定する
ステップをさらに含む、方法。
【請求項１４】
前記流体回路において、生物マトリックス中で神経回路網を形成するための、請求項９に記載の光磁気ディスクを用いる方法であって、
前記流体回路において前記生物マトリックスを形成し、
樹状突起および軸索を有する神経を前記生物マトリックスに用意し、前記神経は磁気粒子を組み込まれ、
前記光磁気バイオディスクを前記光磁気ディスクドライブにロードし、
前記流体回路において磁区を書き込みおよび消去し、前記神経の前記樹状突起および軸索をお互いに向かって成長させ、そして
前記樹状突起および軸索を介して前記神経の間で相互作用を可能にし、それにより前記磁区により磁気的に制御される前記神経回路網を形成する、
ステップを含む、用いる方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の光磁気バイオディスク。
【請求項１６】
光磁気バイオディスク検定に用いる光磁気バイオディスクシステムであって、
光磁気スタックを有する基板、および、
光磁気粒子を結合および放出するために採用され、前記基板に設けられた、一つまたは複数の磁区
を含む、光磁気バイオディスク、および
光をディスクに向ける光源であって、前記一つまたは複数の磁区を形成または消去するのにさらに用いられる前記光源、および
ディスクから反射した光またはディスクを通過した光を検出し、信号を発する、検出器  を含む、光磁気ディスクドライブ
を含む、システム。
【請求項１７】
前記一つまたは複数の磁区に結合したものを計数するのに前記信号を利用するプロセッサをさらに含む、請求項１６に記載の光磁気バイオディスクシステム。  
【請求項１８】
請求項１７に記載の光磁気バイオディスクシステム。
【請求項１９】
光磁気バイオディスクを製造する方法であって、
中心、外縁、および一つまたは複数の光磁気スタックを有する基板を用意し、
前記中心および外縁の間には、一つまたは複数の磁区を形成し、そして、
前記一つまたは複数の磁区と流体連通する分析チャンバを形成する
ステップ、を含む方法
【請求項２０】
混合チャンバと前記分析チャンバとの流体連通を形成するステップをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
生物マトリックスを前記分析チャンバに形成するステップをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記混合チャンバに複数のバイオ磁気粒子を堆積させ、前記バイオ磁気粒子の各々は結合剤を含む、
ステップをさらに含む、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記混合チャンバと関連する注入サイトを指定し、該注入サイトは、任意の標的細胞の存在を試験するための細胞のサンプルの受け入れを行う、
ステップをさらに含む、
請求項２２記載の方法
【請求項２４】
基板に関連した情報層に情報をコードし、このコードされた情報は、ディスクの回転を制御するのにディスクドライブアセンブリにより読み取り可能である、
ステップをさらに含む、請求項２１または２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記分析チャンバと流体連通する試験チャンバを形成するステップをさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記試験チャンバを試験剤で満たすステップをさらに含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記流体回路の生物マトリックスに神経網を形成するために、
前記生物マトリックスに樹状突起および軸索を有する神経を用意し、
磁気粒子を前記神経に取り込み、
前記光磁気バイオディスクを光磁気ディスクドライブにロードし、
前記神経の前記樹状細胞および軸索をお互いに向かって成長させるために、前記分析チャンバ内に一つまたは複数の磁区を消去および形成し、そして
前記樹状細胞および軸索を介して前記神経間で相互作用を可能にし、それにより前記磁区により磁気的に制御された前記神経回路網を形成する、  
ステップを含む、      
請求項２１記載の方法により製造された光磁気バイオディスクを用いる方法。
【請求項２８】
薬物感受性に関し、前記細胞のサンプル中の任意の標的細胞を検出、定量、および試験する方法であって、
前記サンプルを前記注入サイトから前記混合チャンバにロードし、
結合剤がサンプル中の標的細胞上の表面マーカーと結合し、標識細胞を形成するのに十分な時間、前記サンプルおよび生体磁気粒子を培養し、
前記光磁気バイオディスクを前記光磁気ディスクドライブにロードし、
前記分析チャンバ内のあらかじめ決められた位置に磁区を形成し、
前記光磁気バイオディスクを回転させ、前記サンプルおよび生体磁気粒子を前記分析チャンバに移動させ、
前記生体磁気粒子および標識細胞を、前記分析チャンバ内の前記磁気区に結合させ、そして、
前記分析チャンバを電磁放射ビームで走査し、磁区は標識細胞を含むか決定する、
ステップを含む、
請求項２６記載の方法により製造された光磁気バイオディスクを用いる方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法であって、
前記磁区が含む標識細胞の数を定量し、
標識細胞が結合した前記磁区を選択的に消去し、選択的に該標識細胞を放出し、
前記試験チャンバにあらかじめ決められた数の標識細胞を移動するために前記磁区を続けて消去および形成し、前記標識細胞を前記試験チャンバに磁気的に導き、
前記標識細胞を前記試験剤と培養し、そして、
前記試験チャンバを電磁放射ビームで走査し、生細胞およびアポトーシス細胞の数を決定し、それにより前記試験剤に対する細胞の薬物感性を決定する、
ステップをさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、包括的には、分子および細胞の生体磁気的検定（biomagnetic assays）に関し、特に、光バイオディスクで行われる分子および細胞の生体磁気的検定に関する。本発明はさらに、光磁気（ＭＯ）分析ディスクおよびＭＯドライブシステム（以下、光磁気バイオディスクシステム（ＭＯＢＤＳ）と呼ぶ）に関する。より詳細には、本発明は、磁気粒子またはビーズを用いた、細胞集団および細胞集団の溶液中の特定の標的細胞を検出して選択的に操作するための生体磁気的方法（免疫磁気的方法を含む）と、磁気的に誘導される神経突起成長および神経再生とに関するが、最良の実施の形態により本明細書中以下に記載される特定の実施の形態に限定されない。
【０００２】
［関連技術の相互参照］
本出願は、２０００年１１月２７日に出願された米国仮出願第６０／２５３，２８３号、２０００年１１月２８日に出願された米国仮出願第６０／２５３，９５８号、および２００１年３月１日に出願された米国仮出願第６０／２７２，５２５号の優先権の利益を主張する、２００１年１１月２７日に出願された米国出願第０９／９９７，７４１号の一部継続出願である、２００２年３月１４日に出願された米国出願第１０／０９９，２６６号の一部継続出願である。
【０００３】
また、本出願は、２００２年２月５日に出願された米国仮出願第６０／３５５，６４４号、２００２年２月１３日に出願された米国仮出願第６０／３５６，９８２号、２００２年２月１９日に出願された米国仮出願第６０／３５８，４７９号、２００２年４月１１日に出願された米国仮出願第６０／３７２，００７号、２００２年６月１２日に出願された米国仮出願第６０／３８８，１３２号、および２００２年９月４日に出願された米国仮出願第６０／４０８，２２７号の優先権の利益を主張する。
【０００４】
上記実用出願および仮出願はそれぞれ、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０００５】
２．関連技術の説明
あらゆる種類の診断検定および法医学検定をエンドユーザにとってより迅速でよりローカルなものにすることが大いに必要とされている。理想的には、臨床医、患者、検査官（investigators）、軍隊、他の医療機関職員、および消費者は、自分の身体に特定の因子または指標が存在するかどうか、および犯罪現場または戦場に特定の生体物質が存在するかどうかを自ら試験することができるべきである。現在のところ、核酸および／またはタンパク質が結び付いたいくつかのシリコンベースチップが市販されており、または開発中である。これらのチップは、エンドユーザが使用するためのものではなく、極めて専門的な知識および高価な設備を有さない人物や事業体が使用するためのものではない。
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、生体磁気学的検定および実験分析を行うことに関し、特に、磁性、常磁性、または超常磁性の粒子（以下、生体磁気または磁気粒子またはビーズと呼ぶ）を、限定はされないがＣＤ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ、ＤＶＤ−Ｒ、およびＭＯディスクを含む光バイオディスク上で用いることに関する。本発明の生体磁気的検定は、例えば、免疫磁気的検定、および非磁性および磁性プラットフォーム上で実施されるＤＮＡおよびＲＮＡを用いた検定などの分子磁気的（molecumagnetic）検定を含み得る。非磁性プラットフォームは、例
えば、マイクロタイタープレートおよび非光磁気バイオディスクシステムを含む。磁性プラットフォームは、例えば、光磁気バイオディスクシステム（ＭＯＢＤＳ）を含む。ＭＯＢＤＳを用いて行われる検定は、本明細書中ではＭＯ生体磁気的検定（ＭＯＢＭＡ）と呼び、非光磁気バイオディスクを用いる検定は、本明細書中では光ディスク生体磁気的検定（ＯＤＢＭＡ）と呼ぶ。ＯＤＢＭＡは、例えば、制御可能な電磁石が関連付けられた、改良された光ディスクドライブを用いて実行されてもよい。本発明は、検定を準備する方法と、検定を実行する方法と、実験または臨床分析を行う方法と、検定または分析を行うディスクと、関連する検出システムとを含む。
【０００７】
生体サンプルとしては、血液、血清、血漿、髄液、乳房吸引液（breast aspirate）、滑液、胸膜液、腹水、囲心腔液、尿、唾液、羊水、精液、粘液、体毛、糞便、生体微粒子懸濁液、一本鎖または二本鎖核酸分子、細胞、器官、組織、または組織抽出物、あるいは化学的または生物学的プロセスにより磁気粒子に結合し得る標的を含む任意の他のサンプルが挙げられる。種々の標的の選択および検出に関連する他の態様に関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００１年３月２６日に出願された「Dual Bead Assays for Detecting Medical Targets」と題する米国仮特許出願第６０，２７８，６９７号に開示されており、当該出願はその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０００８】
対象となる標的は、腫瘍細胞、細菌、ウイルス、または疾患に特徴的な核酸などの標的作用物質分子、またはある人物に特異的なヌクレオチド配列、あるいはある生物または細胞型（細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、植物、または動物であり得る）に特異的なヌクレオチド配列または抗原決定基を含むことができる。標的作用物質は、癌に関連する核酸分子または抗原決定基を含み得る。標的核酸分子は、ＨＥＲ２ｎｅｕ、ｐ５２、ｐ５３、ｐ２１、およびｂｃｌ−２からなる群から選択される遺伝子の少なくとも一部である核酸を含み得る。標的作用物質は、ＨＩＶ−１に感染した被験体にのみ存在する抗体、ウイルスタンパク質抗原、または被験体の疾患状態に特徴的なタンパク質であり得る。本発明の方法および装置は、被験体がウイルスに感染しているか否か、被験体から得られた核酸が対応する野生型核酸配列に関する単一ヌクレオチド変異（ＳＮＭ）を示しているか否か、または被験体が対象となるタンパク質（細菌タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質、ＨＩＶタンパク質、Ｃ型肝炎タンパク質、Ｂ型肝炎タンパク質、またはある疾患に特異的に関連することが知られているタンパク質など）を発現しているか否かを判断するために用いることができる。核酸標的を検出する二重ビーズ実験の一例を、以下の実施例１に提示する。
【０００９】
本発明の別の態様によると、複数の標的作用物質（例えば、数十、数百、さらには数千もの異なる標的作用物質）を１つの光分析ディスク上で識別することができる多重化法（multiplexing methods）が提供される。複数の捕捉剤が１つのチャンバの捕捉領域にまとめて、または別個の捕捉領域に別々に供給されてもよい。異なる波長で蛍光を発するビーズや異なるサイズのレポータービーズ（reporter beads）などの種々のレポータービーズを用いて、互いを区別可能にすることができる。多重化技法を用いて２つの異なる標的を識別するための実験を行った。そのような検定の１つの例を以下の実施例２で説明する。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、基板と、基板に関連する捕捉層と、捕捉層に結合した捕捉剤とを有し、捕捉剤が二重ビーズ複合体に結合するようになっている、光ディスクを含む。複数の異なる捕捉剤が、異なる型の二重ビーズ複合体に対して用いられる。ディスクは、適当なチャンバおよび流体構造でディスクに何らかの二重ビーズ処理を施すことを可能にするよう設計することができ、レポーターおよび捕捉ビーズがあらかじめロードされることにより、二重ビーズ複合体構造を形成するのに加える必要があるのはサンプルのみとすることができる。
【００１１】
ＯＤＢＭＡ細胞分析
本発明の一態様によると、ビーズまたはビーズ−細胞検定のためのディスクおよびディスクドライブシステムが提供される。ディスクドライブは、単離プロセスを行うための電磁石を含むことができ、適切な光源制御および用いられるレポータービーズの型の検出を含んでもよい。ディスクドライブは、光学式または光磁気式であり得る。
【００１２】
ディスクに施される処理のために、ドライブは電磁石を含むことが有利であり、ディスクは、混合チャンバ、廃液チャンバ、および捕捉区域を有することが好ましい。この実施の形態では、サンプルは混合チャンバにおいてビーズと混合され、混合チャンバ付近に磁界が印加され、磁石により保持されていないサンプルは廃液チャンバに導かれ、それにより、二重ビーズ複合体に結合しているか未結合であるかにかかわらず、全ての磁気ビーズが混合チャンバに残る。続いて、磁気ビーズは捕捉区域に導かれる。いくつかの異なる弁機構のうちの１つを用いて流れを制御してもよい。
【００１３】
光磁気バイオディスクシステム（ＭＯＢＤＳ）
本発明の別の態様では、ＭＯＢＭＡは、生体サンプルと共に用いるために作成され、かつディスク上の磁区すなわち磁性領域を選択的に形成することができるディスクドライブ（光磁気（ＭＯ）ディスクドライブなど）と共に用いられる、ＭＯディスクを用いて行われる。本発明のこのＭＯＢＭＡ態様では、磁区は、高度に制御可能かつ正確な方法でＭＯディスクに形成することができる。これらのドメインは、未結合磁気捕捉ビーズを含む磁気ビーズのような生体磁気粒子と、磁気捕捉ビーズとの二重ビーズ複合体を含む磁気複合体、磁気ビーズ−細胞複合体と、または少なくとも１つの磁気粒子または磁気特性が関連している任意の生物学的または化学的複合体とを結合し、これらの複合体を磁石または磁区を用いて結合できるようにすることができる。ＭＯディスクドライブは、ディスク上の選択された場所に書き込むことができ、続いて、光学式読み取り装置を用いてそれらのドメインすなわち領域にある特徴物を検出することができる。ドメインを選択的に消去することにより、個々のビーズおよび複合体を選択的に解放することができる。分析にＭＯＢＤＳを用いることに関する生物医学的用途を以下で説明する。
【００１４】
本発明のさらに別の態様では、光バイオディスクまたは医療用ＣＤの磁区すなわち磁性領域を形成することを含む、バイオディスクおよびドライブを用いる方法が提供される。この方法はさらに、ビーズが磁区において結合するようにディスクに磁気ビーズを供給することを含む。本発明は、好ましくは検出可能なレポータービーズを用いて、蛍光または光学的イベント検出などにより、磁気ビーズが生体サンプルに結合する場所において検出することを含むことが好ましい。本方法は、複数のチャンバを使用することにより、時間および場所に関して複数の段階で形成され得る。ドメインは、ＭＯバイオディスクの所定の場所に選択的に書き込まれ、磁気ビーズまたは磁気複合体を捕捉するために、サンプルを磁区にわたって移動させる。続いて、この領域を選択的に消去することができ、磁気ビーズまたは磁気複合体は個別に解放され、所望の場合は再配置される。この方法により、一度に多くの異なる試験を行うことができ、ユーザとディスクドライブとの間の対話性のレベルが、試験プロセス中にさらなる試験を作成できるようなものにすることができる。光磁気記録、光磁気ディスク上の磁性領域の正確な作成、および光磁気検出方法に関するさらなる詳細は、例えば、Maeda, et al.に付与された米国特許第６，２１２，１３６号、Ohmori et al.に付与された米国特許第５，３２９，５０３号、Saito et al.に付与された米国特許第４，９８５，８８１号、Fujiwara et al.に付与された米国特許第４，８４３，６０４号、およびNaito et al.に付与された米国特許第４，７８４，６０６号に開示されている。これら特許の全ては、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００１５】
ＭＯバイオディスクは、例えばＭＯバイオディスクの光磁気スタックの光学的特性の最適化を含む種々のタイプのＭＯＢＭＡ用途に合わせて最適化することができ、それにより、入射追跡および検出電磁放射ビームが反射層を部分的に通過し、ＭＯバイオディスクの作用層（operative layer）の別個の検出器および構成要素を用いて検出される透過ビームは、ＭＯバイオディスク上に生成された磁界および磁界の強度が、種々のタイプの磁気ビーズが結び付いている磁気複合体を捕捉してそれら磁気複合体間を区別するのに十分な大きさおよび強度となるように修正され得る。さらに、種々のタイプの電磁放射源を、限定はされないが、赤外線、赤色、青色、および蛍光型光源を含むＭＯＢＤＳと共に用いることができる。磁気ビーズおよび磁気複合体は、例えば図２８Ａ、図２８Ｂ、図２９Ａ、および図２９Ｂに関連して以下で説明するように、例えば反射および／または透過ビームの特徴の分析により、または蛍光検出器および蛍光標識標的分子または細胞に関連して蛍光型光源を用いる蛍光により、光学的に検出することができる。
【００１６】
本発明による生体磁気ビーズ検定は、本明細書中では分子磁気的検定と呼ぶ遺伝的検定において、磁気捕捉ビーズおよび蛍光レポータービーズと共に実施してもよい。これらの生体磁気ビーズまたは粒子は、捕捉プローブおよびレポータープローブそれぞれで被覆される。捕捉プローブおよびレポータープローブは、標的配列と相補的であるが、互いには相補的ではない。捕捉ビーズは、様々な量の標的ＤＮＡと混合される。未結合の標的は、磁気ビーズの磁気濃縮（magnetic concentration）により溶液から除去される。そのため、蛍光レポータービーズは、捕捉標的ＤＮＡに統合することができる。未結合レポータービーズは、磁気ビーズの磁気濃縮により除去される。したがって、標的配列の存在下でのみ、磁気捕捉ビーズは蛍光レポータービーズに結合し、二重ビーズ検定が行われる。
【００１７】
捕捉プローブ結合
ＥＤＣ結合（conjugation）を介して捕捉またはレポータープローブをカルボキシ化された捕捉ビーズおよびレポータービーズそれぞれに共有結合させることを含む、プローブをビーズに結合させるいくつかの異なる表面化学的性質（chemistries）および異なる方法が調査された。プローブをビーズに結び付けるＥＤＣ結合法を用いて観察された１つの結果は、プローブの非共有結合であった。この制限は、部分的二本鎖ＤＮＡプローブを用いてプローブを結び付ける方法を開発すること、および結合効率の高い適切なビーズタイプを選択することにより克服された。共役プロセスにおいて二本鎖プローブを用いることにより、ビーズへのプローブの非共有結合が著しく減少した。適切なビーズタイプおよび結合条件を用いることにより、共有結合効率が９５％もの高さになった。固体表面へのＤＮＡプローブ結合に関する詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された、２００２年２月２８日に出願された「Methods for Decreasing Non-Specific Binding of Beads in Dual Bead Assays Including Related Optical Bio-discs and Disc Drive Systems」と題する米国特許出願第１０／０８７，５４７号に開示されており、当該出願はその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００１８】
標的ＤＮＡの捕捉に磁気ビーズを用いることにより、洗浄ステップが迅速化され、結合したものと未結合のものとの分離ステップが極めて円滑になった。さらに、標的濃度が限られている場合、各標的分子は１つのレポータービーズとハイブリダイズすることができる。そのサイズにより、１つの標的分子はいかなる既存の技術によっても検出することができない。しかしながら、１μｍ以上のレポータービーズは様々な方法により容易に検出および定量することができる。したがって、ビーズ検定は、標的捕捉の感度を非常に高める。
【００１９】
バイオディスクドライブおよび関連する信号処理システム
さらに別の主な態様では、本発明は、分析ディスク、修正光ディスク、ＭＯＢＤＳ、またはバイオディスク上で上記の方法を実施することも含む。バイオディスクドライブアセ
ンブリを用いて、ディスクを回転させ、ディスクに記憶された任意の符号化情報を読み出して処理し、バイオディスクのフロー流路において試験サンプルを分析することができる。したがって、バイオディスクドライブには、バイオディスクを回転させるモータと、ディスクの回転速度を制御するコントローラと、ディスクからの帰還信号および／または透過信号を処理するプロセッサと、処理された信号を分析する分析装置とが設けられる。モータの回転速度は、ディスクの所望の回転を得るために制御される。バイオディスクドライブアセンブリを利用して、フロー流路および標的領域の試験物質をドライブの読み取りビームにより呼びかけて分析装置により分析する前またはその後に、バイオディスクに情報を書き込んでもよい。バイオディスクは、ディスクの回転速度を制御し、行うべき試験のタイプに特有の処理情報を提供し、バイオドライブに関連するモニタに結果を表示するための、符号化情報を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明の装置および方法の種々の実施の形態は、専門知識および高価な設備を用いずに、エンドユーザによって安価に用いられるように設計することができる。システムはポータブルにすることができるため、従来の診断設備が一般に利用可能ではない可能性がある遠隔の場所で用いることができる。この検定システムの構成要素および信号取得方法に適用可能な他の関連する態様は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年１月４日に出願された「Dual Bead Assays Including Covalent Linkages For Improved Specificity And Related Optical Analysis Discs」と題する米国特許出願第１０／０３８，２９７号、２００１年３月１日に出願された「Biological Assays Using Dual Bead Multiplexing Including Optical Bio-Disc and Related Methods」と題する米国仮出願第６０／２７２，５２５号、それぞれ２００１年３月１４日、２００１年８月２４日、および２００２年１月３０日に出願された、それぞれ「Surface Assembly for Immobilizing Capture Agents and Dual Bead Assays Including Optical Bio-Disc and Methods Relating Thereto」と題する米国仮出願第６０／２７５，６４３号、第６０／３１４，９０６号、および第６０／３５２，２７０号に開示されている。これら出願の全ては、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００２１】
他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および技術例から明らかとなるであろう。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、本発明に寄与するさらなる特徴および本発明から得られる利点と共に、以下の本発明の好ましい実施の形態の説明から明らかとなるであろう。本発明の好ましい実施の形態の説明は、全体を通して同様の参照符号が同様の構成要素を示す添付図面に示されている。
【００２３】
［好ましい実施の形態の詳細な説明］
本発明の以下の説明は、光分析ディスク、ディスクドライブシステム、光ディスクによる生体磁気的検定、ならびに検定化学物質（chemistries）および検定技法に関する。本発明はさらに、代替の光磁気ドライブシステム、ＭＯバイオディスク、ＭＯバイオディスクシステム、ＭＯ生体磁気的検定、および関連する処理方法に関する。
【００２４】
ディスクドライブシステムおよび関連する光分析ディスク
まず図１を参照して、光ディスクドライブ１１２において用いる光分析ディスク、光バイオディスク、または医療ＣＤ１１０の斜視図を示す。ドライブ１１２は、ドライブ内のソフトウェアと共に、または別個のコンピュータと関連して、ディスプレイモニタ１１４に画像、グラフ、または出力データを表示させることができる。以下に示すように、限定はされないが光磁気ディスクおよび光磁気ディスクドライブを含む、種々のタイプのディスクおよびドライブが用いられ得る。ディスクドライブは、制御コンピュータとは別個のユニット内にあってもよく、またはコンピュータ内のベイに設けられてもよい。デバイス
は、ラップトップコンピュータのようにポータブルなものにすることができるため、バッテリー電力を用いて、一般的に高度な診断設備が配備されていない遠隔の場所で使用可能である。ドライブは、最小限のハードウェア変更を行ったかまたはハードウェア変更のない従来のドライブであることが好ましいが、専用のバイオディスクまたは医療ＣＤドライブであってもよい。これらのタイプのドライブシステムおよび関連する信号処理方法に関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、１９９９年８月２３日に出願された「Methods and Apparatus for Analyzing Operational and Non-operational Data Acquired from Optical Discs」と題する米国特許出願第０９／３７８，８７８号、１９９９年８月２３日に出願された「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical Synchronization Markers」と題する米国仮特許出願第６０／１５０，２８８号、１９９９年１０月２６日に出願された「Trackable Optical Discs with Concurrently Readable Analyte Material」と題する米国特許出願第０９／４２１，８７０号、２０００年８月２１日に出願された「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical synchronization Markers」と題する米国仮出願第０９／６４３，１０６号、および２００２年１月１０日に出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題する米国特許出願第１０／０４３，６８８号に開示されている。これらの出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００２５】
本発明の実施の形態で用いる光バイオディスク１１０は、任意の適当な形状、直径、または厚さを有することができるが、コンパクトディスク（ＣＤ）、記録可能ＣＤ（ＣＤ−Ｒ）、ＣＤ−ＲＷ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、光磁気ディスクまたは他の標準的な光ディスクフォーマットのものと同様の直径および厚さを有する円形ディスクで実施されることが好ましい。ディスクは、好ましくは既知のフォーマットの、試験または検定を実施、制御、および後処理するための符号化情報（ディスクの回転速度および方向、回転調節（timing for rotation）、停止および開始、遅延期間、サンプルの場所、光源の位置、および光源のパワーを制御する情報など）を含むことができる。このような符号化情報は、ここでは包括的に動作情報と呼ぶ。
【００２６】
ディスクは、図３Ａ〜図３Ｃに示すような反射型ディスク、図４Ａ〜図４Ｃの透過型ディスク、または反射型および透過型の何らかの組み合わせであってよい。反射型ディスクでは、入射光ビームがディスク上に（通常は情報が符号化される反射表面に）合焦し、反射して、光学要素を通って光源と同じ側のディスク面にある検出器に戻る。透過型ディスクでは、光はディスク（またはその一部）を通過して、光源とは反対側のディスク面にある検出器に届く。ディスクの透過部分では、一部の光は反射されて反射光として検出される場合もある。
【００２７】
図２は、光ディスク読み取り装置システム１１６を示す。このシステムは、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ、ＭＯ、または他の既知の類似のフォーマット用の従来の読み取り装置、そのようなドライブの変更版、または全く異なる専用デバイスであってもよい。基本的な構成要素は、ディスクを回転させるモータと、光を供給する光システムと、光を検出する検出システムとである。
【００２８】
次に、図２〜図４Ｃの全体を参照して、光源１１８が光学構成要素１２０に光を供給して入射光ビーム１２２を生成する。図３Ａ〜図３Ｃの反射型ディスク１４４の場合、帰還ビーム１２４は図３Ｃおよび図４Ｃの反射表面１５６、１７４、または１８６から反射される。帰還ビーム１２４は、光学構成要素１２０に戻され、次に底部検出器１２６に供給される。このタイプのディスクでは、帰還ビームは、動作情報または他の符号化データ、ならびに調査中の検査特徴または試験サンプルに関する特徴情報を運ぶことができる。
【００２９】
図４Ａ〜図４Ｃの透過型ディスク１８０の場合、入射ビーム１２２からのエネルギーの一部は検査特徴または試験サンプルとの光／物質相互作用を受け、次に透過ビーム１２８としてディスクを通って進み、これが上部検出器１３０により検出される。作用層として半反射層１８６（図４Ｃ）を含む透過型ディスクの場合、入射ビーム１２２からのエネルギーの一部もまた、動作情報または記憶データを運ぶ帰還ビーム１２４として作用層から反射する。光学構成要素１２０は、レンズと、ビームスプリッタと、四分の一波長板とを含むことができ、四分の一波長板は、光ビームの偏光を変えて、ビームスプリッタがレンズを通る反射ビームを、反射ビームが検出器上に合焦するように導くようにする。円柱レンズなどの非点収差要素が、ビームスプリッタと検出器との間に設けられて、反射光ビームに非点収差を与える。光源は、ユーザにより導入されたかまたはディスクから読み取られたデータに応じた所望の範囲にわたる可変波長および電力レベルを提供するように制御可能であり得る。この制御性は、異なる波長で蛍光を発する複数の異なる構造を検出することが望ましい場合に特に有用である。
【００３０】
図２を引き続き参照して、検出器１２６および／または検出器１３０からのデータが、プロセッサ１３４および分析装置１３６を含むコンピュータ１３２に供給される。次に、画像または出力結果がモニタ１１４に提供される。コンピュータ１３２は、デスクトップコンピュータ、プログラム可能ロジック、または他の何らかの処理デバイスとすることができ、他の処理および／または記憶デバイスへの（インターネットを介するなどした）接続部を含んでもよい。ドライブモータ１４０およびコントローラ１４２は、ディスク１４４または１８０の回転速度および方向または回転を制御するために設けられる。コントローラ１４２およびプロセッサ１３４を含むコンピュータ１３２は、同じコンピュータと遠隔通信するか、または同じコンピュータ内で実施することができる。このようなディスクを読み取る方法およびシステムは、Gordonによる米国特許第５，８９２，５７７号にも示されており、この特許は参照により本明細書に援用される。
【００３１】
検出器は、その構造または外部フィルタを通して検出器に到達する全ての光、または特定の波長の光のみを検出するように設計されてもよい。検出器を検出可能な波長に関して制御可能にすることにより、異なる波長で蛍光を発するビーズまたは他の構造体を個別に検出することができる。
【００３２】
ハードウェアトリガセンサ１３８を、反射型ディスク１４４または透過型ディスク１８０と共に用いてもよい。トリガセンサ１３８は、入射ビーム１２２が標的領域または検査区域にある場合にのみプロセッサ１３４によるデータ収集を可能にする信号をコンピュータ１３２に（または他の何らかの電子回路に）に供給する。別法として、ディスクから読み取られたソフトウェアを用いて、ディスク上のいかなる物理的マークにも関係なくプロセッサ１３４によるデータ収集を制御することができる。このようなソフトウェアまたは論理トリガは、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年１月２８日に出願された「Logical Triggering Methods And Apparatus For Use With Optical Analysis Discs And Related Disc Drive Systems」と題する米国仮出願第６０／３５２，６２５号においてさらに詳細に説明されており、この出願はその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００３３】
光分析ディスクの基板層は、ディスクの最も内側の読み取り可能部分から開始して、ディスクの最も外側の読み取り可能部分に向かって螺旋状に出て行く螺旋状トラックが刻まれ得る。記録不可能なＣＤでは、このトラックは異なる長さを有する一連のエンボスピットから構成され、それぞれのエンボスピットは通常、ディスクを読み取るのに用いられる光の波長の約１／４の深さを有する。ピット間の異なる長さおよび間隔が、動作データを符号化する。記録可能ＣＤのようなディスクの螺旋溝は、ピットではなく検出可能な染料を含む。さらに、ＭＯディスクでは、データはＭＯディスク上に形成された磁区に記憶さ
れる。これは、回転速度などの動作情報が記録される場所である。試験、検定、または調査プロトコルに応じて、回転速度は、介在的または連続的な加速、定速、および減速期間を有して可変であってもよい。これらの期間は、例えば、薬剤、試薬、抗体、または他の物質との流体および懸濁液の混合、撹拌、または分離を行うように、回転速度および回転時間の双方に関して厳密に制御されることができる。本発明で利用され得る、または本発明に容易に適合され得る種々の光分析ディスク、医療ＣＤ、およびバイオディスクの設計は、例えば、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００１年１１月１５日に出願された「Optical Bio-discs with Reflective Layers」と題する米国特許出願第０９／９９９，２７４号、２００１年１２月７日に出願された「Optical Discs for Measuring Analytes」と題する米国特許出願第１０／００５，３１３号、２００１年１２月１０日に出願された「Methods for Detecting Analytes Using Optical Discs and Optical Disc Readers」と題する米国特許出願第１０／００６，３７１号、２００１年１２月１０日に出願された「Multiple Data Layer Optical Discs for Detecting Analytes」と題する米国特許出願第１０／００６，６２０号、および２００１年１２月１０日に出願された「Optical Disc Assemblies for Performing Assays」と題する米国特許出願第１０／００６，６１９号に開示されており、これらの全ては、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００３４】
光ピックアップおよび関連する電子回路の多くの設計および構成を、本発明の実施の形態の状況で用いることができる。コンパクトディスクおよび読み取り装置のさらなる詳細および代替の設計は、Compact Disc Technology, by Nakajima and Ogawa, IOS Press, Inc. (1992); The Compact Disc Handbook, Digital Audio and Compact Disc Technology, by Baert et al. (eds.), Books Britain (1995); および CD-Rom Professional’s CD-Recordable Handbook: The Complete Guide to Practical Desktop CD, Starrett et al. (eds.), ISBN:0910965188 (1996)に記載されており、これらの全ては、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００３５】
したがって、ディスクドライブアセンブリは、ディスクを回転させ、ディスクに記憶された任意の符号化動作情報を読み取って処理し、ディスクの検定領域において液体、化学的、生物学的、または生化学的検査特徴を分析するために用いられる。ディスクドライブアセンブリはさらに、検定領域にある物質がドライブの読み取りビームにより分析される前、その間、またはその後に、ディスクに情報を書き込むために用いられ得る。代替の実施の形態では、ディスクドライブアセンブリは、イーサネットを介してユーザへ、インターネットを介して遠隔のデータベースへ、またはこのような情報が有利に利用され得る任意の場所へなど、種々の可能なインタフェースを介して検定情報を送るように実施される。このタイプのディスクドライブインタフェース接続に関するさらなる詳細は、本出願の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００１年１１月７日に出願された「Interactive System For Analyzing Biological Samples And Processing Related Information And
The Use Thereof」と題する米国特許出願第０９／９８６，０７８号に開示されており、当該出願はその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００３６】
次に、図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃを特に参照して、反射型ディスク１４４を、キャップ１４６、流路層１４８、および基板１５０を有して示す。流路層１４８は、薄膜接着部材により形成されてもよい。キャップ１４６は、サンプルを受け取る注入ポート１５２と排出ポート１５４とを有する。キャップ１４６は、主にポリカーボネートから形成することができ、その底部がキャップ反射層１５６で被覆され得る。反射層１５６は、アルミニウムまたは金といった金属からなることが好ましい。
【００３７】
流路層１４８は、流路層１４８から所望の形状を切り抜くことにより、流体回路１５８を画定する。各流体回路１５８は、フロー流路１６０および帰還流路１６２を有すること
が好ましく、混合チャンバ１６４を有するものもある。混合チャンバ１６６はフロー流路１６０に対して対称に形成されることができるが、オフセット混合チャンバ１６８はフロー流路１６０の片側に形成される。流体回路１５８はかなり単純な構成であるが、流体回路は、調製領域または廃液領域などの他の流路およびチャンバを含んでもよく、これは例えば、「Laboratory in a Disc」と題する米国特許第６，０３０，５８１号に示されており、当該特許は参照により本明細書に援用される。これらの流体回路は、本明細書中で代替的に用いられ、図３３Ａ〜図３３Ｄ、図３４Ａ〜図３４Ｃ、図３５、および図３６Ａ〜図３６Ｃに関連してさらに詳細に説明するようなものなどの、弁および他の流体制御構造を含んでもよい。流路層１４８は基体および上部に結合するための接着剤を含んでもよい。
【００３８】
基板１５０は、プラスチック層１７２を有し、層１７２の上部に体積した基板反射層１７４の開口として形成される標的領域１７０を有する。この実施の形態では、図３Ｃに最もよく示される反射層１７４は、動作情報を符号化するために用いられる。反射層１７４は、単一の相に限定されず、例えばＭＯディスク上の光学スタックなどの基板１５０上の反射層のいくつかのスタックであってもよい。プラスチック層１７２は、ポリカーボネートから形成されることが好ましい。標的領域１７０は、任意の所望の形状に基板反射層１７４の一部を除去することにより、または基板反射層１７４を塗布する前に標的領域の区域をマスクすることにより形成することができる。基板反射層１７４は、アルミニウム、金、または磁気合金といった金属から形成されることが好ましく、例えばウォブル溝を通したかまたはピットの配列を通した入射光で読み取られる動作情報を符号化するように、基板の残りの部分と共に構成してもよい。したがって、基板１５０の下から入射する光は、標的領域１７０を除いて層１７４により反射され、標的領域１７０を通った光は層１５６により反射される。標的領域は、検査特徴が検出される場所である。標的領域が、抗体、ＤＮＡ鎖、または標的に結合し得る他の物質がある場所である場合、標的領域は捕捉領域と呼んでもよい。
【００３９】
次に、図３Ｃを特に参照すると、光ディスク１４４は、部分断面斜視図を示すために破断している。活性層１７６が、基板反射層１７４上に形成される。活性層１７６は通常、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリカーボネート、金、活性ガラス、変性ガラス（modified glass）、または例えばポリスチレン無水マレイン酸（polystyrene-co-maleic anhydride）などの変性ポリスチレンから形成され得る。この実施の形態では、流路層１４８は活性層１７４上に位置付けられる。
【００４０】
動作の際には、サンプルはキャップ１４６の注入ポート１５２から導入され得る。回転すると、サンプルは活性層１７６に沿って注入ポート１５２から外側に移動する。いくつかの生物学的または化学的な反応またはプロセスの１つにより、検査特徴と呼ばれる検出可能な特徴物が、標的領域に存在し得る。このようなプロセスの例は、援用される米国特許第６，０３０，５８１号に、また本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００１年１１月１６日に出願された「Methods And Apparatus For Detecting And Quantifying Lymphocytes With Optical Biodiscs」と題する米国特許出願第０９／９８８，７２８号、および２００１年１２月２１日に出願された「Surface Assembly For Immobilizing DNA Capture Probes And Bead-Based Assay Including Optical Bio-Discs And Methods Relating Thereto」と題する米国特許出願第１０／０３５，８３６号に示されており、これら出願の双方は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００４１】
捕捉剤を有する捕捉層により標的領域内で捕捉された検査特徴は、反射層１７４と同一平面上にある、通常は入射ビームが従来型の読み取り装置に合焦される焦点面に位置するように設計することができる。別法として、検査特徴は、焦点面から離間した平面に捕捉され得る。前者のような構成は「近位」型ディスクと呼ばれ、後者は「遠位」型ディスク
と呼ばれる。
【００４２】
図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃを参照して、透過型光ディスク１８０のある特定の実施の形態は、透明キャップ１８２と、流路層１４８と、基板１５０とを含むことが示されている。透明キャップ１８２は、注入ポート１５２および排出ポート１５４を含み、主にポリカーボネートから形成されることが好ましい。トリガマーク１８４は、キャップ１８２上に含まれ得る。流路層１４８は、図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃに関連して説明したものと同様の構造および用法を有し得る流体回路１５８を有する。基板１５０は、標的領域１７０を含んでいてもよく、ポリカーボネート層１７２を含むことが好ましい。基板１５０は、層１７２の上部に堆積された薄い半反射層１８６を有してもよいが、その必要はない。半反射層１８６は、反射型ディスク１４４（図３Ａ〜図３Ｃ）の基板１５０上の基板反射層１７４よりも大幅に薄いことが好ましい。半反射層１８６は、単一層に限定はされず、例えばＭＯディスク上の光学スタックなどの基板１５０上の半反射層のいくつかのスタックであってもよい。半反射層１８６は、アルミニウム、金、または磁気合金といった金属から形成されることが好ましいが、入射光ビームの一部が層１８６に貫通して層１８６を通過することができるほど十分に薄い一方、入射光の一部は反射し戻される。金薄膜層１８６は、たとえば、約７００Åを越える厚さでは９５％の反射性を有するが、金薄膜を通る光の透過は、約１００Åで約５０％の透過性を有する。
【００４３】
図４Ｃは、透過型ディスク１８０の破断斜視図である。層１８６の半反射性により、その表面全体が、ディスク上のトリガマークまたは符号化データパターンにより画定される仮想領域を含む標的領域に潜在的に利用可能となる。標的領域１７０は、図示の形状または任意の所望の形状に指定領域をマーキングすることにより形成することもできる。標的領域１７０を示すマーキングは、半反射層１８６上になされてもよく、または基板１５０の底部（ディスクの下）になされてもよい。標的領域１７０は、半反射層１８６上のシルクスクリーンインクにより作成することができる。
【００４４】
半反射層１８６上には活性層１７６が施される。活性層１７６は、層１７６（図３Ｃ）に関連して上述されたものと同じ材料から形成されてもよく、サンプルがディスク１８０の開口を通して供給され、ディスクが回転すると、ほぼ同じ目的を果たす。透過型ディスク１８０では、透明キャップ１８２上には、反射型ディスク１４４（図３Ｃ）の反射層１５６に相当する反射層はない。
【００４５】
次に図５Ａを参照して、本発明によるバイオディスク１１０（図１）の反射型ディスク実施の形態１４４（図３Ａ〜図３Ｃ）のトラックを横切った断面図が示されている。図示のように、この図は、ディスクの半径およびフロー流路に沿って長手方向に取られている。図５Ａは、プラスチック層１７２および基板反射層１７４からなる基板１５０を含む。この実施の形態では、基板１５０は一連の溝１８８を含む。溝１８８は、ディスクの中心付近から外縁に向かって延びる螺旋の形態である。溝１８８は、呼びかけまたは入射ビーム１２２がディスク上の螺旋溝１８８に沿って追従できるように実施される。このタイプの溝１８８は、「ウォブル溝」として知られている。溝１８８は、波状すなわち波形の側壁を有する底部により形成される。高くなった、すなわち立ち上がった部分は、隣接する溝１８８を螺旋状に分離する。この実施の形態で溝１８８上に施された反射層１７４は、図示するように、性質上等角である。また、図５Ａは、反射層１７４上に施された活性層１７６も示している。図５Ａに示すように、標的領域１７０は、所望の場所の反射層１７４の区域または一部を除去することによるか、あるいは、反射層１７４を施す前に所望の区域をマスクすることにより形成される。図５Ａにさらに示すように、プラスチック接着部材または流路層１４８が活性層１７６上に施される。また、図５Ａは、キャップ部１４６、および、当該キャップ部１４６に関連した反射面１５６も示している。したがって、キャップ部１４６が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１４８に貼付さ
れると、それによって、フロー流路１６０が形成される。
【００４６】
図５Ｂは、図５Ａで示したものと同様であり、本発明によるバイオディスク１１０（図１）透過型ディスク１８０（図４Ａ〜図４Ｃ）の実施の形態のトラックを横切った断面図である。この図は、ディスクの半径およびフロー流路に沿って縦方向に描かれている。図５Ｂは、薄い半反射層１８６を含む基板１５０を示す。この薄い半反射層１８６は、光源１１８（図２）からの入射または呼びかけビーム１２２がディスクを貫通して通過し、上部検出器１３０により検出されることを可能にする一方で、光の一部は帰還ビーム１２４の形態で反射し戻される。薄い半反射層１８６の厚さは、その追従能力を維持するためにディスク読み取り装置が必要とする反射光の最小量により確定される。この実施の形態の基板１５０は、図５Ａで説明したものと同様に、一連の溝１８８を含む。また、この実施の形態の溝１８８は、ディスクの中心付近から外縁に向かって延びる螺旋の形態であることが好ましい。溝１８８は、呼びかけビーム１２２を螺旋に沿って追従できるように実施される。図５Ｂは、薄い半反射層１８６上に施された活性層１７６も示している。図５Ｂにさらに示すように、活性層１７６上にはプラスチック接着部材または流路層１４８が施される。図５Ｂは、透明キャップ１８２も示す。したがって、透明キャップ１８２が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１４８に貼付されると、それによって、フロー流路１６０が形成され、入射ビーム１２２の一部が実質的に反射されずにそこを通過することができる。次に、通過する光の量が上部検出器１３０により検出され得る。
【００４７】
図６Ａは、図５Ａと同様ではあるが、フロー流路１６０を半径方向から観察した場合の、反射型ディスクとその初期屈折特性とを示す、ディスクの半径に垂直に取った図である。並列に比較して、図６Ｂは図５Ｂと同様ではあるが、フロー流路１６０を半径方向から観察した場合の、透過型ディスクとその初期屈折特性を表す、ディスクの半径に垂直に取った図である。溝１８８に沿って断面を切断してあるため、溝１８８は図５Ａおよび図５Ｂでは見えない。図６Ａおよび図６Ｂは、これらの実施の形態では、溝１８８に垂直に位置する狭いフロー流路１６０の存在を示す。図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａ、および図６Ｂは、反射型ディスクおよび透過型ディスクそれぞれの全厚を示す。これらの図では、入射ビーム１２２は、基板１５０と最初に相互作用するように示されており、この基板１５０は、図示のように入射ビームの経路を変化させる屈折特性を有し、反射層１７４または薄い半反射層１８６上にビーム１２２を合焦させるようになっている。
【００４８】
流体回路１５８は、等半径すなわち「ｅ−ｒａｄ」フォーマットに構成されてもよく、これは、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００２年１月２９日に出願された「Optical Discs Including Equi-Radial and/or Spiral Analysis Zones and Related Disc Drive Systems and Methods」と題する米国仮出願第６０／３５３，０１４号に開示されており、当該出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００４９】
検定化学物質および二重ビーズ形成
次に図７Ａ〜図１０Ａ、および図７Ｂ〜図１０Ｂを参照すると、捕捉ビーズ１９０と、レポータービーズ１９２と、二重ビーズ複合体１９４の形成とが示されている。捕捉ビーズ１９０は、免疫検定（図７Ｂ〜図１０Ｂ）などの生物学的検定、分子検定、およびより詳細には遺伝的検定（図７Ａ〜図１０Ａ）を含むさまざまな異なる検定と共に用いることができる。免疫検定の場合、抗体輸送プローブ１９６がビーズに結合する。抗体輸送プローブ１９６は、タンパク質標的を捕捉するように実施される抗原または抗体などのタンパク質を含む。分子検定の場合、オリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８がビーズに結合し得る。オリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８は、遺伝標的を捕捉するように実施されるＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸を含む。
【００５０】
図７Ａに示すように、試験サンプルから得られる標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２などの
標的剤を、オリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８で被覆された捕捉ビーズ１９０に添加する。この実施態様では、輸送プローブ１９８は、所望の核酸配列から形成される。この検定系の固相へのＤＮＡプローブの結合に関する態様は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００１年３月２６日に出願された「Use of Double Stranded DNA for Attachment to Solid Phase to Reduce Non-Covalent Binding」と題する米国仮出願第６０／２７８，６８５号においてさらに詳細に説明されている。この出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００５１】
図７Ｂに示すように、試験サンプルからの標的抗原２０４などの標的剤は、抗体輸送プローブ１９６で被覆された捕捉ビーズ１９０に添加される。この代替の実施態様では、輸送プローブ１９６は、抗体などのタンパク質から形成される。
【００５２】
捕捉ビーズ１９０は、捕捉ビーズ１９０を物質懸濁液または溶液から単離させる特性を有する。捕捉ビーズは、所望のサイズに基づいて選択することができ、捕捉ビーズを単離可能にするのに好ましい方法は、捕捉ビーズが磁性を有することである。
【００５３】
図８Ａは、本発明の遺伝的検定の実施態様における、捕捉ビーズ１９０上の相補的な輸送プローブ１９８への標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２の結合を示す。図８Ｂは、図８Ａの免疫検定バージョンを示し、輸送プローブ１９６は別法として、標的タンパク質２０４に結合するための抗体または抗原を含み得る。
【００５４】
図９Ａは、標的剤２０２（図８Ａを参照）と相補的なオリゴヌクレオチドシグナルプローブ２０６で被覆されたレポータービーズ１９２を示す。レポータービーズ１９２は、検出および報告のための所望のサイズおよび物質特性に基づいて選択される。ある特定の実施の形態では、２．１μｍのポリスチレンビーズが用いられる。シグナルプローブ２０６は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを捕捉するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり得る。
【００５５】
図９Ｂは、図８Ｂに示すように、標的剤２０４に結合する抗体シグナルプローブ２０８で被覆されたレポータービーズ１９２を示す。レポータービーズ１９２は、検出および報告のための所望のサイズおよび物質特性に基づいて選択される。これもまた、２．１μｍのポリスチレンビーズを含むことが好ましい場合がある。シグナルプローブ２０８は、タンパク質または糖タンパク質標的を捕捉するように実施される抗原または抗体であり得る。
【００５６】
図１０Ａは、プローブ１９８を有する捕捉ビーズ１９０、標的剤２０２、およびプローブ２０６を有するレポータービーズ１９２から形成することができる二重ビーズ複合体１９４のイラスト表現である。捕捉ビーズ１９０およびレポータービーズ１９２それぞれに結合したプローブ１９８および２０６は、標的剤２０２と相補的ではあるが互いに相補的ではない配列を有する。標的剤検出と、ビーズへの標的剤の非特異的結合を減らす方法とに関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００１年３月２３日に出願された「Dual Bead Assays Including Use of Restriction Enzymes to Reduce Non-Specific Binding」と題する米国仮出願第６０／２７８，１０６号、および同様に２００１年３月２３日に出願された「Dual Bead Assays Including Use of Chemical Methods to Reduce Non-Specific Binding」と題する米国仮出願第６０／２７８，１１０号において論考されており、これらの双方は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００５７】
図１０Ｂは、プローブ１９６を有する捕捉ビーズ１９０、標的剤２０４、およびプローブ２０８を有するレポータービーズ１９２から形成することができる二重ビーズ複合体１９４の免疫検定バージョンのイラスト表現である。捕捉ビーズ１９０およびレポータービ
ーズ１９２それぞれに結合したプローブ１９６および２０８は、標的剤２０２にのみ結合し、互いには結合しない。
【００５８】
本検定系の代替の実施の形態では、標的剤結合の効率および特異性は、レポータービーズ１９２と捕捉ビーズ１９０とを一時的に連結する切断可能スペーサまたは置換可能スペーサの使用により高めることができる。切断可能スペーサまたは置換可能スペーサにより形成される二重ビーズ複合体は、基本的に、輸送プローブとシグナルプローブとを互いに近接して配置するため、両プローブへのより効率的な標的結合が可能となる。標的剤がプローブに結合すると、次に、結合している標的剤が二重ビーズ構造を保持することを可能にしつつ、スペーサが切断され得る。切断可能スペーサの二重ビーズ検定系での使用は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００１年３月２６日に出願された「Dual Bead Assays Using Cleavable Spacers to Improve Specificity and Sensitivity」と題する米国仮出願第６０／２７８，６８８号に開示されており、当該出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。切断可能スペーサおよび置換可能スペーサの使用は、図４２Ａ〜図４２Ｄおよび図４３Ａ〜図４３Ｃに関連して以下でも説明する。
【００５９】
次に図１１Ａを参照して、本発明の一態様による、溶液中で二重ビーズ複合体構造を作成する「シングルステップハイブリダイゼーション」技法を用いて分子検定を準備する方法が示される。この方法は、ステップＩ、ステップＩＩ、ステップＩＩＩ、ステップＩＶ、およびステップＶとして連続的に示す５つの主なステップを含む。
【００６０】
この方法のステップＩでは、オリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８で被覆されたいくつかの捕捉ビーズ１９０を、緩衝溶液２１０を含む試験管２１２に入れる。この方法で用いられる捕捉ビーズ１９０の数は、例えば約１０Ｅ＋０７であり、それぞれの直径は約１μｍ以上であり得る。捕捉ビーズ１９０をハイブリダイゼーション溶液に懸濁し、ピペット２１４による注入により試験管２１２にロードする。好ましいハイブリダイゼーション溶液は、０．２ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物（Denhart’s mix）からなる。所望のハイブリダイゼーション温度は３７℃である。この実施の形態の予備的ステップでは、輸送プローブ１９８を、ＥＤＣ結合により３μｍの磁気捕捉ビーズ１９０に結合させる。結合法に関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡された、２００１年２月２７日に出願された「Methods for Attaching Capture DNA and Reporter DNA to Solid Phase Including Selection of Bead Types as Solid Phase」と題する米国仮出願第６０／２７１，９２２号、および２００１年３月２２日に出願された「Methods of Conjugation
for Attaching Capture DNA and Reporter DNA to Solid Phase」と題する米国仮出願第６０／２７７，８５４号に開示されており、これら出願の双方は、その全文が本明細書に援用される。
【００６１】
ステップＩＩに示すように、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２を溶液に添加する。オリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的剤２０２と相補的である。したがって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２は、図８Ａに示すように捕捉ビーズ１９０に結び付いた輸送プローブ１９８の相補配列に結合する。
【００６２】
次にステップＩＩＩを参照して、オリゴヌクレオチドシグナルプローブ２０６で被覆されたレポータービーズ１９２を溶液２１０に添加する。図９Ａおよび図１０Ａにも示すように、シグナルプローブ２０６は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２と相補的である。一実施の形態では、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２の一部と相補的なシグナルプローブ２０６は、２．１μｍの蛍光レポータービーズ１９２に接合する。シグナルプローブ２０６および輸送プローブ１９８はそれぞれ、標的ＤＮＡ２０２と相補的ではあるが互いに相補的ではない配列を有する。レポータービーズ１９２を加えた後、標的ＤＮＡ２０２が捕捉ビー
ズ１９０とレポータービーズ１９２とを連結するように、二重ビーズ複合体１９４が形成される。特定の完全な洗浄により、レポータービーズ１９２と捕捉ビーズ１９０との間の非特異的結合は最小限に抑えられるはずである。標的剤２０２およびシグナルプローブ２０６は、３７℃で３〜４時間ハイブリダイズされることが好ましい。
【００６３】
この実施の形態および他の実施の形態では、ハイブリダイゼーション中の断続的混合（すなわち、周期的混合とそれに続く停止）により、連続的混合よりも二重ビーズ複合体の収量が高まることが見出された。したがって、このステップをディスク上で行う場合、図２のディスクドライブモータ１４０およびコントローラ１４２を用いて、ディスクを周期的に回転させ、所望の断続的混合を行うことが有利であり得る。これは、回転および停止セッションの好ましいデューティサイクルを用いた規定の方法で、ディスクを一方向に回転させ、次にディスクを停止させ、その後ディスクを同じ方向に再び回転させるという、ディスクに符号化された混合プロトコルで実施され得る。別法として、符号化された混合プロトコルは、回転、停止、および逆回転セッションの好ましいデューティサイクルを用いて、第１の方向にディスクを回転させ、次にディスクを停止させ、その後ディスクを逆方向に再び回転させることができる。本発明のこれらの特徴は、図３３Ａおよび図３５に関連してさらに詳細に説明する。
【００６４】
次に、図１１ＡのステップＩＶに示すように、ハイブリダイゼーション後、二重ビーズ複合体１９４を溶液中の未結合レポータービーズから分離する。捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液を磁界に曝露して二重ビーズ複合体構造１９４を捕捉することができる。磁界は、内蔵磁石２１８を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、内蔵磁石２１８は、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中のいかなる未結合レポータービーズも除去するように、永久磁石であっても電磁石であってもよい。レポータービーズに結合していない捕捉ビーズも単離されることに留意されたい。別法として、この磁気による除去ステップは、図３３Ａ、図３５、および図３６Ａ〜図３６Ｃに示すようにオンディスクで行ってもよい。
【００６５】
ステップＩＶに示す精製プロセスは、浮遊粒子を含む上清の除去を含む。洗浄緩衝液を試験管に添加し、ビーズ溶液を十分に混合する。１ステップ検定に好ましい洗浄緩衝液は、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡからなる。未結合レポータービーズ１８２、浮遊ＤＮＡ、および非特異的結合粒子のほとんどは、攪拌されて、上清から除去される。二重ビーズ複合体は、捕捉ビーズ、標的配列、およびレポータービーズのマトリックスを形成することができ、ここで、重なり合った二重ビーズ粒子の格子構造に捕獲された浮遊粒子の抽出の際に、洗浄プロセスがさらに役立ち得る。捕捉ビーズへのレポータービーズの非特異的結合を低減する方法に関連する他の態様に関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された、２００１年２月２８日に出願された「Reduction of Non-Specific Binding in Dual Bead Assays by Selection of Bead Type and Bead Treatment」と題する米国仮出願第６０／２７２，１３４号、および２００１年３月１２日に出願された「Reduction of Non-Specific Binding in Dual Bead Assays by Selection of Buffer Conditions and Wash Conditions」と題する米国仮出願第６０／２７５，００６号に開示されている。これら出願の双方は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００６６】
図１１Ａに示す最後の主なステップはステップＶである。このステップでは、二重ビーズ複合体を洗浄緩衝溶液で約３〜５分間洗浄してから、検定混合物をディスクにロードして分析に備えることができる。
【００６７】
図１１Ｂは、図１１Ａの方法と同様の「シングルステップ抗原結合」法を用いて、溶液
中の二重ビーズ複合体構造を形成する免疫検定を示す。この方法も同様に、５つの主なステップを含む。これらのステップは、図１１ＡのステップＩ、ステップＩＩ、ステップＩＩＩ、ステップＩＶ、およびステップＶそれぞれを指す。
【００６８】
ステップＩに示すように、例えば、数が約１０Ｅ＋０７でそれぞれの直径が約１μｍ以上であり、抗体輸送プローブ１９６で被覆された捕捉ビーズ１９０を、緩衝溶液２１０に添加する。この溶液は、図１１Ａに示す方法で用いられるものと同じであってよく、または免疫化学的検定で用いるように特別に調製してもよい。抗体輸送プローブ１９６は、標的抗原２０４に対して特異的親和性を有する。輸送プローブ１９６は、図８Ｂにも示すように、標的抗原２０４内のエピトープに特異的に結合する。一実施の形態では、標的抗原の一部に対する親和性を有する抗体輸送プローブ１９６は、ＥＤＣ結合を介して３μｍの磁気捕捉ビーズ１９０に結合することができる。別法として、捕捉ビーズ１９０への輸送プローブ１９６の結合は、受動的な吸着により達成することができる。
【００６９】
次に図１１Ｂに示すステップＩＩを参照して、標的抗原２０４を溶液に添加する。標的抗原２０４は、図８Ｂにも示すように、捕捉ビーズ１９０に結び付いた抗体輸送プローブ１９６に結合する。
【００７０】
ステップＩＩＩに示すように、抗体シグナルプローブ２０８で被覆されたレポータービーズ１９２を溶液に添加する。抗体シグナルプローブ２０８は、図９Ｂおよび図１０Ｂにも提示するように、標的抗原２０４のエピトープに特異的に結合する。一実施の形態では、シグナルプローブ２０８は２．１μｍの蛍光レポータービーズ１９２に結合する。シグナルプローブ２０８および輸送プローブ１９６はそれぞれ、標的抗原の特異的エピトープに結合するが、互いには結合しない。レポータービーズ１９２を添加した後、標的抗原２０４が捕捉ビーズ１９０とレポータービーズ１９２とを連結するように、二重ビーズ複合体１９４が形成される。特定の完全な洗浄により、レポータービーズ１９２と捕捉ビーズ１９０との間の非特異的結合は最小限に抑えられるはずである。
【００７１】
ステップＩＶでは、ステップＩＩＩでの結合後に、二重ビーズ複合体１９４を溶液中の未結合レポータービーズから分離する。捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液に磁界を印加して二重ビーズ複合体構造１９４を捕捉することができる。磁界は、内蔵磁石２１８を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、内蔵磁石２１８は、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中のいかなる未結合レポータービーズも除去するように、永久磁石であっても電磁石であってもよい。レポータービーズに結合していない捕捉ビーズも単離されることに留意されたい。別法として、上記で示したように、この磁気による除去ステップは、図３３Ａ、図３５、および図３６Ａ〜図３６Ｃに示すようにオンディスクで行ってもよい。
【００７２】
ステップＩＶの精製プロセスは、浮遊粒子を含む上清の除去を含む。洗浄緩衝液を試験管に添加し、ビーズ溶液を十分に混合する。未結合レポータービーズ１８２、浮遊タンパク質サンプル、および非特異的結合粒子のほとんどは、攪拌されて、上清から除去される。二重ビーズ複合体は、捕捉ビーズ、標的抗原、およびレポータービーズのマトリックスを形成することができ、ここで、重なり合った二重ビーズ粒子の格子構造に捕獲された浮遊粒子の抽出の際に、洗浄プロセスがさらに役立ち得る。
【００７３】
図１１Ｂに示す最後の主なステップはステップＶである。このステップでは、二重ビーズ複合体を洗浄緩衝溶液で約３〜５分間洗浄してから、検定混合物をディスクにロードすることにより、分析される状態にする。
【００７４】
図１２Ａは、６つの主なステップを有する二重ビーズ複合体を作成する、本明細書では
「２ステップハイブリダイゼーション」と呼ぶ代替的な遺伝的検定法を示す。概して、捕捉ビーズを、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的剤と相補的なオリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８で被覆し、緩衝溶液中に入れる。この実施の形態では、標的剤の一部と相補的な輸送プローブは、ＥＤＣ結合を介して３μｍの磁気捕捉ビーズに結合する。固相へのオリゴヌクレオチド輸送プローブの他のタイプの結合を利用してもよい。これらは、例えば、ストレプトアビジン−ビオチンの受動的な吸着またはストレプトアビジン−ビオチン相互作用の使用を含む。本発明のこの方法によるこれら６つの主なステップは、連続して図１２ＡのステップＩ、ステップＩＩ、ステップＩＩＩ、ステップＩＶ、ステップＶ、およびステップＶＩを指す。
【００７５】
次に、図１２Ａに示すステップＩをより詳細に参照して、ハイブリダイゼーション溶液に懸濁された捕捉ビーズ１９０を、ピペット２１４から試験管２１２にロードする。好ましいハイブリダイゼーション溶液は、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物である。望ましいハイブリダイゼーション温度は３７℃である。
【００７６】
ステップＩＩでは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２が溶液に添加され、捕捉ビーズ１９０に結び付いた輸送プローブ１９８の相補配列に結合する。この方法の１つの特定の実施の形態では、標的剤２０２および輸送プローブ１９８を、３７℃で２〜３時間ハイブリダイズさせる。しかしながら、十分なハイブリダイゼーションは室温で３０分間以内で行うことができる。高温では、ハイブリダイゼーションはほぼ瞬時に行うことができる。
【００７７】
次にステップＩＩＩに示すように、捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液を磁界に曝露して結合している標的配列を単離することにより、捕捉ビーズに結合している標的剤２０２を溶液中の未結合種から分離する。磁界は、内蔵の永久磁石２１８または電磁石を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、永久磁石２１８または電磁石は、溶液のピペット抽出によって、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中に浮遊するいかなる未結合標的ＤＮＡ２０２も除去する。上記の方法に関して、この方法のオンディスクの方法では、この磁気による除去ステップは、図３３Ａ、図３５、図３６Ａ〜図３６Ｃに示すように行ってもよい。洗浄緩衝液を添加し、分離プロセスを繰り返すことができる。輸送プローブ１９８および標的ＤＮＡ２０２のハイブリダイズ後の好ましい洗浄緩衝液は、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、および０．０５％  Ｔｗｅｅｎからなる。ビーズへの標的剤の非特異的結合を低減するためのハイブリダイゼーション法および技法は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００１年３月２６日に出願された「Reduction of Non-Specific Binding of Dual Bead Assays by Use of Blocking
Agents」と題する米国仮出願第６０／２７８，６９１号にさらに開示されている。この出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００７８】
次に図１２Ａに示すステップＩＶを参照して、図１１Ａに示す方法に関連して説明したように、レポータービーズ１９２を溶液に添加する。レポータービーズ１９２は、標的剤２０２と相補的なシグナルプローブ２０６で被覆される。この方法の１つの特定の実施の形態では、標的剤２０２の一部と相補的なシグナルプローブ２０６は、２．１μｍの蛍光レポータービーズ１９２と結合する。シグナルプローブ２０６および輸送プローブ１９８はそれぞれ、標的剤２０２と相補的ではあるが互いに相補的ではない配列を有する。レポータービーズ１９２の添加後、二重ビーズ複合体構造１９０が形成される。当業者には容易に明らかとなるように、二重ビーズ複合体構造は、対象となる標的剤が存在する場合にのみ形成される。この形成では、標的剤２０２は、磁気捕捉ビーズ１９０とレポータービーズ１９２とを連結する。好ましい緩衝溶液を用いて、特定の完全な洗浄により、レポータービーズと捕捉ビーズとの間の非特異的結合は最小限に抑えられる。標的剤２０２およびシグナルプローブ２０６は、３７℃で２〜３時間ハイブリダイズされることが好ましい
。上述のステップＩＩのように、十分なハイブリダイゼーションは室温で３０分以内で行うことができる。より高温では、このステップにおけるハイブリダイゼーションはほぼ瞬時に行うこともできる。
【００７９】
次に図１２Ａに示すステップＶを参照して、ステップＩＶのハイブリダイゼーション後、二重ビーズ複合体１９４を溶液中の未結合種から分離する。捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液に再び磁界を印加して二重ビーズ複合体１９４を単離する。なお、ここでも同様に、単離物はレポータービーズに結合しない捕捉ビーズを含むであろう。この方法のオンディスクの方法での上記のステップＩＩＩのように、この磁気による分離ステップは、図３３Ａ、図３５、および図３６Ａ〜図３６Ｃに示すように行ってもよい。
【００８０】
浮遊粒子を含む上清を除去する精製プロセスは、緩衝液を試験管に添加すること、およびビーズ溶液を十分に混合することを含む。２ステップ検定に好ましい洗浄緩衝液は、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡからなる。未結合レポータービーズ、浮遊ＤＮＡ、および非特異的結合粒子のほとんどは、攪拌されて、上清から除去される。二重ビーズ複合体は、捕捉ビーズ、標的配列、およびレポータービーズのマトリックスを形成することができ、ここで、重なり合った二重ビーズ粒子の格子構造に捕獲された浮遊粒子の抽出の際に、洗浄プロセスがさらに役立ち得る。レポータービーズ、標的剤、および捕捉ビーズの間の非特異的な結合の低減を対象とする他の関連する態様は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された、２００１年２月２８日に出願された「Mixing
Methods to Reduce Non-Specific Binding in Dual Bead Assays」と題する米国仮出願第６０／２７２，２４３号、および２００１年３月１日に出願された「Dual Bead Assays
Including Linkers to Reduce Non-Specific Binding」と題する米国仮出願第６０／２７２／４８５号に開示されており、これらはその内容のすべてが本明細書に援用される。
【００８１】
図１２Ａに示す最後の主なステップはステップＶＩである。このステップでは、二重ビーズ複合体１９４を洗浄緩衝溶液で約３〜５回洗浄してから、検定混合物をディスクにロードして分析する。別法として、このステップの間、オリゴヌクレオチドシグナルおよび輸送プローブをライゲーションして、ディスク分析および信号検出プロセス中の二重ビーズ複合体の分解を防止することができる。プローブライゲーション法に関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡された、２００１年３月２６日に出願された「Improved Dual Bead Assays Using Ligation」と題する米国仮出願第６０／２７８，６９４号に開示されており、当該出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００８２】
本発明の別の態様によると、図１２Ｂは、図１１Ｂの免疫検定法に関連して説明し、図１２Ａの遺伝的検定のステップに従うものと同様の免疫検定法を示す。この方法は、ここでは免疫化学的検定の二重ビーズ複合体を作成する「２ステップ結合」とも呼ばれる。図１２Ａに示す方法のように、この方法は、６つの主なステップを含む。概して、標的抗原のエピトープに特異的に結合する抗体輸送プローブで被覆された捕捉ビーズを、緩衝溶液中に入れる。１つの特定な実施の形態では、抗体輸送プローブを、３μｍの磁気捕捉ビーズに結合させる。検定を行うために利用されるディスクドライブおよびディスクアセンブリのタイプに応じて、異なるサイズの磁気捕捉ビーズを用いることができる。本発明のこの代替法によるこれら６つの主なステップは、図１２ＢのステップＩ、ステップＩＩ、ステップＩＩＩ、ステップＩＶ、ステップＶ、およびステップＶＩそれぞれを指す。
【００８３】
次に図１２Ｂに示すステップＩを特に参照して、緩衝溶液２１０中に懸濁した捕捉ビーズ１９０を、ピペット２１４からの注入によって試験管２１２にロードする。
【００８４】
ステップＩＩでは、標的抗原２０４が溶液に添加され、捕捉ビーズ１９０に結び付いた
抗体輸送プローブ１９６に結合する。標的抗原２０４および輸送プローブ１９６は、３７℃で２〜３時間結合させることが好ましい。結合時間をさらに短くすることもできる。
【００８５】
ステップＩＩＩに示すように、捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液に磁界を印加して、結合している標的タンパク質または糖タンパク質を単離することにより、捕捉ビーズ１９０に結合した標的抗原２０４を溶液中の未結合種から分離する。磁界は、内蔵の永久磁石２１８または電磁石を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、永久磁石２１８または電磁石は、溶液のピペット抽出によって、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中に浮遊するいかなる未結合標的ＤＮＡ２０４も除去する。洗浄緩衝液を添加して、分離プロセスを繰り返すことができる。
【００８６】
次にステップＩＶに示すように、図１１Ｂに示す方法に関連して説明したように、レポータービーズ１９２を溶液に添加する。レポータービーズ１９２は、標的抗原２０４に対する親和性を有するシグナルプローブ２０８で被覆される。２ステップの免疫化学的検定の１つの特定の実施の形態では、標的剤２０４の一部に特異的に結合するシグナルプローブ２０８を、２．１μｍの蛍光レポータービーズ１９２に結合させる。シグナルプローブ２０８および輸送プローブ１９６はそれぞれ、標的剤２０４の特異的エピトープに結合するが、互いには結合しない。レポータービーズ１９２の添加後、二重ビーズ複合体構造１９０が形成される。当業者には容易に明らかとなるように、これらの二重ビーズ複合体構造は、対象となる標的抗原が存在する場合にのみ形成される。この形成では、標的抗原２０４は、磁気捕捉ビーズ１９０とレポータービーズ１９２とを連結する。好ましい緩衝溶液を用いて、特定の完全な洗浄により、レポータービーズと捕捉ビーズとの間の非特異的結合は最小限に抑えられる。標的抗原２０４およびシグナルプローブ２０８は、３７℃で２〜３時間ハイブリダイズされることが好ましい。上述のステップＩＩのように、十分な結合は室温で３０分以内で行うことができる。免疫検定の場合、３７℃を超える温度は、タンパク質が変性するため好ましくない。
【００８７】
次に図１２Ｂに示したステップＶに移り、ステップＩＶに示す結合後、二重ビーズ複合体１９４を溶液中の未結合種から分離する。これは、図示のように捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液を磁界に曝露し二重ビーズ複合体１９４を単離することにより行われる。単離物はレポータービーズに結合していない捕捉ビーズを含むことに、再び留意されたい。
【００８８】
浮遊粒子を含む上清を除去する精製プロセスは、洗浄緩衝液を試験管に添加すること、およびビーズ溶液を十分に混合することを含む。未結合レポータービーズ、浮遊タンパク質、および非特異的結合粒子のほとんどは、攪拌されて、上清から除去される。二重ビーズ複合体は、捕捉ビーズ、標的剤、およびレポータービーズのマトリックスを形成することができ、そこで、重なり合う二重ビーズ粒子の格子構造に捕獲された浮遊粒子の抽出の際に、洗浄プロセスがさらに役立ち得る。
【００８９】
図１２Ｂに示す最後の主なステップはステップＶＩである。このステップでは、二重ビーズ複合体１９４を洗浄緩衝溶液で約３〜５回洗浄してから、検定混合物をディスクにロードして分析する。
【００９０】
上述の他のいかなる方法とも同様に、図１２Ｂに示す方法の磁気による除去または分離ステップは、別法として、図３３Ａ〜図３３Ｄ、図３４Ａ〜図３４Ｃ、図３５、および図３６Ａ〜図３６Ｃに示すディスク、流体回路、および装置を用いて、オンディスクで行ってもよい。
【００９１】
次に図１３を参照して、混合またはロードチャンバ（loading chamber）１６４のディ
スク層を示す断面図（図６と同様）が示されている。ロードチャンバ１６４へのアクセスは、二重ビーズ検定調製液がディスクシステムにロードされる注入ポート１５２により得られる。
【００９２】
図１４は、ピペット２１４で二重ビーズ複合体１９４がディスクに注入されている、混合またはロードチャンバ１６４を示す図１３と同様の図である。この例では、複合体は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２により互いに連結されたレポータービーズ１９２および捕捉ビーズ１９０を含む。シグナルＤＮＡ２０６は、捕捉剤と相補的な一本鎖ＤＮＡとして示される。図１３および図１４に示すディスクは、上述の免疫検定および一般的な分子検定を含む他の検定に容易に適合させることができ、これらの検定は、代替的に、それぞれに応じて輸送プローブ、標的剤、およびシグナルプローブとして実施される抗原または抗体などのタンパク質を用いる。
【００９３】
図１５Ａは、二重ビーズ複合体１９４が捕捉剤２２０に固定された後の、フロー流路１６０および標的または捕捉領域１７０を示す。この実施の形態の捕捉剤２２０は、少量の捕捉剤溶液を活性層１７６に施して、標的領域１７０の区域内に捕捉剤のクラスタを形成することにより、活性層１７６に結び付ける。この実施の形態では、捕捉剤は、ビオチンまたはＢＳＡビオチンを含む。図１５Ａは、本発明で用いられる二重ビーズ複合体１９４の成分としてのレポータービーズ１９２および捕捉ビーズ１９０も示す。この実施の形態では、アンカー剤（anchor agent）２２２をレポータービーズ１９２に結び付ける。この実施の形態では、アンカー剤２２２は、ストレプトアビジンまたはニュートラビジン（Neutravidin）を含んでよい。したがって、レポータービーズ１９２が捕捉剤２２０に接近すると、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によってアンカープローブ２２２／２０６と捕捉剤２２０との間に結合が起こり、それにより、標的領域１７０内に二重ビーズ複合体１９４が保持される。この時点で、標的領域１７０内の二重ビーズ複合体１９４を検出するのに、標的領域１７０に送られる呼びかけビーム２２４を用いることができる。
【００９４】
図１５Ａおよび図１５Ｂに示す本発明の実施の形態は、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで代替的に実施してもよい。
【００９５】
図１５Ｂは、その後にディスク回転速度を変えた後の、標的領域１７０内のレポータービーズ１９２の取り込み（entrapment）を示す、図１５Ａと同様の断面図である。回転速度の変化により、捕捉ビーズ１９０が二重ビーズ複合体１９４から除去され、最終的に、標的領域１７０のレポータービーズ１９２を単離して、呼びかけまたは読み取りビーム２２４で検出する。
【００９６】
図１６Ａは、図１５Ａと同様の断面図であり、図１５Ａの代替の実施の形態を示し、レポータービーズ１９２上のシグナルプローブ２０６またはアンカー剤２２２が、捕捉剤２２０に直接ハイブリダイズする。図１６Ａは、捕捉剤２２０での二重ビーズ複合体１９４の固体後のフロー流路１６０および標的または捕捉領域１７０を示す。この実施の形態の捕捉剤２２０は、少量の捕捉剤溶液を活性層１７６に施して、標的領域１７０の区域内に捕捉剤のクラスタを形成することにより、活性層１７６に結び付ける。別法として、捕捉剤２２０を、活性層１７６に共有結合するアミノ基を用いて、活性層に付着させてもよい。この実施の形態では、捕捉剤はＤＮＡを含む。図１６Ａは、本発明で用いられるような二重ビーズ複合体１９４として、レポーター１９２および捕捉ビーズ１９０も示す。この実施の形態では、アンカー剤２２２は、レポータービーズ１９２に付着する。この実施の形態のアンカー剤２２２は、捕捉剤２２０またはオリゴヌクレオチドシグナルプローブ２０６自体と相補的な核酸の特異的配列であり得る。したがって、レポータービーズ１９２が捕捉剤２２０に接近すると、アンカー剤２２２と捕捉剤２２０とのハイブリダイゼーションが起こり、それにより、標的領域１７０内に二重ビーズ複合体１９４が保持される。
代替の実施の形態では、シグナルプローブ２０６が、アンカー剤２２２の機能を果たす。この時点で、標的領域１７０内の二重ビーズ複合体１９４を検出するのに、標的領域１７０に送られる呼びかけビーム２２４を用いることができる。
【００９７】
図１６Ｂは、その後にディスク回転速度を変えた後の、図１６Ａの実施の形態を示す。回転速度の変化により、捕捉ビーズ１９０が二重ビーズ複合体１９４から除去され、最終的に、標的領域１７０のレポータービーズ１９２および標的ＤＮＡ配列２０２を単離して、呼びかけビーム２２４で検出する。
【００９８】
図１６Ａおよび図６Ｂに示す本発明の実施の形態は、別法として、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで実施してもよい。
【００９９】
次に図１７を参照して、図１５Ａに示す実施の形態の代替例が示されている。この実施の形態では、アンカー剤２２２は、レポータービーズの代わりに捕捉ビーズ１９０に付着する。この実施の形態のアンカー剤２２２は、ストレプトアビジンまたはニュートラビジンを含んでよい。図１５Ａにおけるように、標的領域１７０は、捕捉剤２２０で被覆されている。捕捉剤は、ビオチンまたはＢＳＡビオチンを含んでよい。図１７は、本発明で用いられるような二重ビーズ複合体１９４の成分としてのレポータービーズ１９２および捕捉ビーズ１９０も示す。捕捉ビーズ１９０が捕捉剤２２０に接近すると、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によってアンカープローブ２２２と捕捉剤２２０との間に結合が起こり、それにより、標的領域１７０内に二重ビーズ複合体１９４が保持される。この時点で、標的領域１７０内の二重ビーズ複合体１９４を検出するのに、標的領域１７０に送られる呼びかけビーム２２４を用いることができる。図１７に示す本発明の実施の形態は、別法として、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで実施してもよい。
【０１００】
図１８は、図１６Ａに示す実施の形態の代替例である。この実施の形態では、アンカー剤２２２は、レポータービーズの代わりに捕捉ビーズ１９０に付着する。この実施の形態では、捕捉ビーズ１９０上の輸送プローブ１９８またはアンカー剤２２２は、捕捉剤２２０に直接ハイブリダイズする。この実施の形態では、捕捉剤２２０は核酸の特異的配列を含む。この実施の形態のアンカー剤２２２は、捕捉剤２２０またはオリゴヌクレオチドシグナル輸送プローブ１９８自体と相補的な核酸の特異的配列であり得る。したがって、捕捉ビーズ１９０が捕捉剤２２０に接近すると、アンカー剤２２２と捕捉剤２２０とのハイブリダイゼーションが起こり、それにより、標的領域１７０内に二重ビーズ複合体１９４が保持される。この時点で、標的領域１７０内の二重ビーズ複合体１９４を検出するのに、標的領域１７０に送られる呼びかけビーム２２４を用いることができる。図１８に示す本発明の実施の形態は、別法として、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで実施してもよい。
【０１０１】
図１９Ａ〜図１９Ｃは、本明細書で説明する遺伝的検定に関連して実施される本バイオディスク１１０の活性層１７６および基板１７４を示す詳細な部分断面図である。図１９Ａ〜図１９Ｃは、少量の捕捉剤溶液を活性層１７６に施して、標的領域の区域内に捕捉剤のクラスタを形成することにより、活性層１７６に結び付いた捕捉剤２２０を示す。捕捉剤２２０と活性層１７６との間の結合は、ディスクの回転時に捕捉剤２２０が標的領域内で活性層１７６に付着したままであるのに十分である。図１９Ａおよび図１９Ｂは、捕捉領域において捕捉剤２２０に結合している二重ビーズ複合体１９４からの捕捉ビーズ１９０も示している。これらの二重ビーズ複合体は、図１１Ａおよび図１２Ａで説明した方法などに従って調製される。捕捉剤２２０は、ビオチンおよびＢＳＡビオチンを含む。この実施の形態では、レポータービーズ１９２は、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用によって、標的領域に二重ビーズ複合体１９４を固定する。別法として、標的領域は、スト
レプトアビジンで被覆してもよく、ビオチン化レポータービーズと結合してもよい。図１９Ｃは、図１９Ａおよび図１９Ｂに関連して説明したものにさらなるステップを含む代替の実施の形態を示す。この好ましい実施の形態では、1分間あたりのディスク回転の分散（variance）により、ビーズのサイズおよび／または質量の差に基づいて、二重ビーズ複合体１９４から捕捉ビーズ１９０を切り離すのに十分な遠心力が生成される。ディスクの回転速度には変化があるが、レポータービーズ１９２は標的領域に固定されたままである。したがって、レポータービーズ１９２は、標的領域内に維持され、光バイオディスクまたは医療ＣＤ読み取り装置を用いて検出される。
【０１０２】
図１９Ａ〜図１９Ｃに関連して説明する本発明の実施の形態は、図３Ａ〜図３Ｃ、図５Ａ、および図６Ａに示す反射型ディスクで実施してもよく、または図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂおよび図６Ｂに示す透過型ディスクで実施してもよい。
【０１０３】
図２０Ａ、図２０Ｂ、および図２０Ｃは、図１９Ａ〜図１９Ｃで説明した実施の形態の代替の実施の形態を示す。図２０Ａ〜図２０Ｃは、免疫化学的検定に関連して実施される標的領域の詳細な部分断面図を示す。図２０Ａおよび図２０Ｂは、捕捉領域において捕捉剤２２０に結合している二重ビーズ複合体１９４からの捕捉ビーズ１９０も示している。捕捉剤２２０は、ビオチンおよびＢＳＡビオチンを含む。これらの二重ビーズ複合体は、図１１Ｂおよび図１２Ｂで説明した方法などに従って調製することができる。この実施の形態では、レポータービーズ１９２は、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用によって、標的領域に二重ビーズ複合体１９４を固定する。図２０Ａ〜図２０Ｃを参照して説明する本発明の実施の形態は、図３Ａ〜図３Ｃ、図５Ａ、および図６Ａに示す反射型ディスクで実施してもよく、または図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで実施してもよい。
【０１０４】
次に図２１Ａ、図２１Ｂ、および図２１Ｃを参照して、本明細書で説明する遺伝的検定に関連して実施される本バイオディスク１１０の活性層１７６および基板１７４を含む、標的領域の詳細な部分断面図が示されている。図２１Ａ〜図２１Ｃは、捕捉剤２２０の一体部分であるアミノ基２２６の使用によって活性層１７６に結び付いた捕捉剤２２０を示す。図示のように、捕捉剤２２０は標的領域内に位置する。アミノ基２２６と捕捉剤２２０との間の結合、およびアミノ基２２６と活性層１７６との間の結合は、ディスクの回転時に捕捉剤２２０が標的領域内で活性層１７６に付着したままであるのに十分である。好ましいアミノ基２２６はＮＨ２である。別法として、アミノ基２２６の代わりにチオール基を用いてもよい。本発明のこの実施の形態では、捕捉剤２２０は、レポータービーズ１９２と結び付いたアンカー剤２２２またはオリゴヌクレオチドシグナルプローブ２０６と相補的なアミノ酸の特異的配列を含む。
【０１０５】
図２１Ｂは、図１１Ａおよび図１２Ａで説明した方法などに従って調製された、標的領域において捕捉剤２２０に結合する二重ビーズ複合体１９４のレポータービーズ１９２を示す。二重ビーズ複合体１９４が捕捉剤２２０に向かって流れ、捕捉剤２２０に十分に近づくと、アンカー剤２２２またはオリゴヌクレオチドシグナルプローブ２０６と捕捉剤２２０との間でハイブリダイゼーションが起こる。したがって、レポータービーズ１９２は標的領域内に二重ビーズ複合体１９２を固定する。
【０１０６】
図２１Ｃは、図２１Ａ〜図２１Ｂに関連して説明したもののさらなるステップを含む代替の実施の形態を示す。この好ましい実施の形態では、1分間あたりのディスク回転の分散により、ビーズのサイズおよび／または質量の差に基づいて、二重ビーズ複合体１９４から捕捉ビーズ１９０を切り離すのに十分な遠心力が生成される。ディスクの回転速度には変化があるが、標的ＤＮＡ配列２０２を有するレポータービーズ１９２は標的領域に固定されたままである。いずれの場合も、レポータービーズ１９２は所望のとおりに標的領
域内に維持される。
【０１０７】
図２１Ａ〜図２１Ｃを参照して説明する本発明の実施の形態は、図３Ａ〜図３Ｃ、図５Ａ、および図６Ａに示す反射型ディスクで実施してもよく、または図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで実施してもよい。
【０１０８】
図２２Ａ、図２２Ｂ、および図２２Ｃは、図２１Ａ〜図２１Ｃで説明した実施の形態の代替の実施の形態を示す。図２２Ａ〜図２２Ｃは、免疫化学的検定に関連して実施される標的領域の詳細な部分断面図を示す。図２２Ａおよび図２２Ｂは、図１１Ｂおよび図１２Ｂで説明した方法などに従って調製された、標的領域において捕捉剤２２０に結合する二重ビーズ複合体１９４からのレポータービーズ１９２を示す。この実施の形態では、捕捉剤２２０は、捕捉剤２２０の一体部分をなすアミノ基２２６の使用によって標的領域に結合された抗体を示す。別法として、捕捉剤２２０は、受動的な吸着および疎水性またはイオン性相互作用によって活性層１７６に結合してもよい。この実施の形態では、レポータービーズ１９２は、特異的抗体結合によって標的領域に二重ビーズ複合体１９４を固定する。図２１Ｃに示す実施の形態のように、図２２Ｃは、図２２Ａおよび図２２Ｂに関連して説明したもののさらなるステップを含む代替の実施の形態を示す。この代替の実施の形態では、1分間あたりのディスク回転の分散により、ビーズのサイズおよび／または質量の差に基づいて、二重ビーズ複合体１９４から捕捉ビーズ１９０を切り離すのに十分な遠心力が生成される。ディスクの回転速度には変化があるが、標的抗原２０４を有するレポータービーズ１９２は標的領域に固定されたままである。いずれの場合も、レポータービーズ１９２は所望のとおりに標的領域内に維持される。図２２Ａ〜図２２Ｃに関連して説明する本発明の実施の形態は、図３Ａ〜図３Ｃ、図５Ａ、および図６Ａに示す反射型ディスクで実施してもよく、または図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで実施してもよい。
【０１０９】
図２３Ａおよび図２３Ｂは、遺伝的検定に関連して実施される本バイオディスク１１０の活性層１７６および基板１７４を示す詳細な部分断面図である。図２３Ａおよび図２３Ｂは、上記の図１９Ａおよび図１９Ｂで説明したものの代替の実施の形態を示す。図１９Ａおよび図１９Ｂの実施の形態とは対照的に、本実施の形態では、アンカー剤２２２がレポータービーズ１９２の代わりに捕捉ビーズ１９０に結び付く。図２３Ｂは、二重ビーズ複合体１９４からの、捕捉領域において捕捉剤２２０に結合する捕捉ビーズ１９０を示す。捕捉剤２２０は、ビオチンおよびＢＳＡビオチンを含む。この実施の形態では、捕捉ビーズ１９０は、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用によって、標的領域に二重ビーズ複合体１９４を固定する。
【０１１０】
図２３Ａおよび図２３Ｂを参照して説明する本発明の実施の形態は、図３Ａ〜図３Ｃ、図５Ａ、および図６Ａに示す反射型ディスクで実施してもよく、または図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで実施してもよい。
【０１１１】
次に図２４Ａおよび図２４Ｂを参照して、遺伝的検定に関連して実施される本発明のバイオディスク１１０の活性層１７６および基板１７４を示す詳細な部分断面図が提示されている。図２３Ａおよび図２３Ｂは、上記の図２１Ａおよび図２２Ｂで説明したものの代替の実施の形態を示す。図２１Ａおよび図２１Ｂの実施の形態とは対照的に、本実施の形態では、アンカー剤２２２がレポータービーズ１９２の代わりに捕捉ビーズ１９０に結び付けられる。図２３Ｂは、二重ビーズ複合体１９４からの、捕捉領域において捕捉剤２２０に結合する捕捉ビーズ１９０を示す。捕捉剤２２０は、捕捉剤２２０の一体部分をなすアミノ基２２６の使用によって活性層１７６に結び付けられる。図示のように、捕捉剤２２０は標的領域内に位置する。アミノ基２２６と捕捉剤２２０との間の結合、およびアミノ基２２０と活性層１７６との間の結合は、ディスクの回転時に捕捉剤２２０が標的領域
内で活性層１７６に付着したままであるのに十分である。本発明のこの実施の形態では、捕捉剤２２０は、捕捉ビーズ１９０に結び付いたアンカー剤２２２またはオリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８と相補的なアミノ酸の特異的配列を含む。この実施の形態では、捕捉ビーズ１９０は、捕捉剤２２０とアンカー剤または輸送プローブ１９８との間のハイブリダイゼーションによって、標的領域に二重ビーズ複合体１９４を固定する。
【０１１２】
図２４Ａおよび図２４Ｂに示す本発明の実施の形態は、図３Ａ〜図３Ｃ、図５Ａ、および図６Ａに示す反射型ディスクで実施してもよく、または図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで実施してもよい。
【０１１３】
ディスク処理法
次に図２５Ａ〜図２５Ｄに移り、ディスクのコンテキストにおいて図２１Ａ〜図２１Ｃおよび図２４Ａ〜図２４Ｂに記載される標的領域１７０が示されており、これは図１１Ａおよび図１２Ａに示す方法などに従って作成される溶液を注入物（input）として用いる。
【０１１４】
図２５Ａは、注入ポート１５２を通してアクセス可能であり、かつフロー流路１６０につながっている混合／ロードチャンバ１６４を示す。フロー流路１６０には、クラスタ状に位置する捕捉剤２２０があらかじめロードされている。捕捉剤２２０のクラスタのそれぞれは、各標的領域１７０内に位置する。各標的領域１７０は、１つのタイプの捕捉剤または複数のタイプの捕捉剤を有することができ、個別の標的領域は、複数の捕捉フィールドに、全く同一のタイプの捕捉剤または複数の異なる捕捉剤を有することができる。本実施の形態では、捕捉剤は、レポータービーズ１９２または捕捉ビーズ１９０上のアンカー剤２２２と相補的な核酸の特異的配列を含み得る。
【０１１５】
図２５Ｂでは、二重ビーズ複合体１９４に封鎖されている（sequestered）ＤＮＡまたはＲＮＡの試験サンプルを、ピペット２１４にロードする。二重ビーズ複合体を、注入ポート１５２を通してフロー流路１６０に注入する。フロー流路１６０がピペット２１４からの二重ビーズ複合体でさらにロードされると、ディスクが回転するにつれて二重ビーズ複合体１９４はフロー流路１６０を進み始める。ロードチャンバ１６４は、切り離し保持壁（break-away retaining wall）２２８を含むため、複合体１９４はフロー流路を一度に進むことができる。
【０１１６】
この実施の形態では、図２５Ｃに示すように、レポータービーズ１９２に結び付いたアンカー剤２２２は、ハイブリダイゼーションにより捕捉剤２２０に結合する。このようにして、レポータービーズ１９２は標的領域１７０内に保持される。二重ビーズ複合体１９４がフロー流路をゆっくりと進む、すなわち転がる（tumble down）ことができるようにディスクを回転させることにより、結合をさらに促進することができる。遅い移動により、さらなるハイブリダイゼーションに十分な時間を得ることができる。ハイブリダイゼーション後、ディスクを同じ速度で、またはそれよりも速くさらに回転させて、図２５Ｄに示すように、いかなる未結合の二重ビーズ複合体１９４をも標的領域１７０から取り除くことができる。
【０１１７】
次に、図２５Ｄに示すように、呼びかけビーム２２４を標的領域１７０に送り、レポーター、捕捉ビーズ、および二重ビーズ複合体の存在を判定することができる。標的ＤＮＡまたはＲＮＡが試験サンプル中にない場合、標的領域１７０に結合している二重ビーズ複合体構造、レポーター、または捕捉ビーズはないが、少量の背景信号が、標的領域において非特異的結合から検出される可能性がある。この場合、呼びかけビーム２２４を標的領域１７０に送ると、ゼロまたは低い読みが生じ、それにより、標的ＤＮＡまたはＲＮＡがサンプル中に存在しなかったことが示される。
【０１１８】
回転速度、回転方向、および、ある期間にはある速度で、続く別の期間には別の速度でなどの回転の段階は、すべてディスク上の動作情報に符号化され得る。図２５Ａ〜図２５Ｄに関連して説明する方法は、上部検出器１３０を有するシステムを用いて、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで行ってもよい。
【０１１９】
図２６Ａ〜図２６Ｄは、図１９Ａ〜図１９Ｃおよび図２３Ａ〜図２３Ｂで説明した補足化学物質を含む標的領域１７０を示す。この方法は、図１１Ａおよび図１２Ａに示す方法に従って作成される溶液を注入物として用いる。図２６Ａ〜図２６Ｄは、図２５Ａ〜図２５Ｄで説明したものの代替の実施の形態を示し、以下でさらに詳細に説明する異なるビーズ捕捉法を示す。
【０１２０】
図２６Ａは、注入ポート１５２を通してアクセス可能であり、かつフロー流路１６０につながっている混合／ロードチャンバ１６４を示す。フロー流路１６０には、クラスタ状に位置する捕捉剤２２０があらかじめロードされている。捕捉剤２２０のクラスタのそれぞれは、各標的領域１７０内に位置する。各標的領域１７０は、１つのタイプの捕捉剤または複数のタイプの捕捉剤を有することができ、個別の標的領域は、複数の捕捉フィールドに、全く同一のタイプの捕捉剤または複数の異なる捕捉剤を有することができる。本実施の形態では、捕捉剤は、レポータービーズ１９２または捕捉ビーズ１９０上のアンカー剤２２２に対する親和性を有する特異的なビオチンおよびＢＳＡビオチンを含み得る。アンカー剤は、ストレプトアビジンおよびニュートラビジンを含んでいてもよい。
【０１２１】
図２６Ｂでは、二重ビーズ複合体１９４に封鎖されているＤＮＡまたはＲＮＡの試験サンプルを、ピペット２１４にロードする。二重ビーズ複合体を、注入ポート１５２を通してフロー流路１６０に注入する。フロー流路１６０がピペット２１４からの二重ビーズ複合体でさらにロードされると、ディスクが回転するにつれて二重ビーズ複合体１９４はフロー流路１６０を進み始める。ロードチャンバ１６４は、切り離し保持壁２２８を含むため、複合体１９４はフロー流路を一度に進むことができる。
【０１２２】
この実施の形態では、図２６Ｃに示すように、レポータービーズ１９２に結び付いたアンカー剤２２２は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用により捕捉剤２２０に結合する。このようにして、レポータービーズ１９２は標的領域１７０内に保持される。二重ビーズ複合体１９４がフロー流路をゆっくりと進む、すなわち転がることができるようにディスクを回転させることにより、結合をさらに促進することができる。遅い移動により、捕捉剤２２０とアンカー剤２２２との間のさらなる結合に十分な時間を得ることができる。結合後、ディスクを同じ速度で、またはそれよりも速くさらに回転させて、図２６Ｄに示すように、いかなる未結合の二重ビーズ複合体１９４をも標的領域１７０から取り除くことができる。
【０１２３】
次に、図２６Ｄに示すように、呼びかけビーム２２４を標的領域１７０に送り、レポーター、捕捉ビーズ、および二重ビーズ複合体の存在を判定することができる。標的ＤＮＡが試験サンプル中に存在しない場合、標的領域１７０に結合している二重ビーズ複合体構造はない。少量の背景シグナルが、標的領域において非特異的結合から検出される可能性がある。この場合、呼びかけビーム２２４を標的領域１７０に送ると、ゼロまたは低い読みが生じ、それにより、標的ＤＮＡまたはＲＮＡがサンプル中に存在しなかったことが示される。
【０１２４】
回転速度、回転方向、およびある期間にはある速度で、続く別の期間には別の速度でなどの回転の段階は、すべてディスク上の動作情報に符号化され得る。
【０１２５】
図２６Ａ〜図２６Ｄに関連して説明する方法は、図３Ａ〜図３Ｃ、図５Ａ、および図６Ａに示すディスクなどの反射型ディスクに関して説明された。この方法は、上部検出器１３０を有するシステムを用いて、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに示す透過型ディスクで行ってもよい。
【０１２６】
次に図２７Ａ〜図２７Ｄを参照して、本発明によるさらに別の代替の方法のステップを示す一連の側断面図が示されている。図２７Ａ〜図２７Ｄは、図２２Ａ〜図２２Ｃに関連して説明した捕捉機構を含む標的領域１７０を示す。この方法は、図１１Ｂおよび図１２Ｂに示す調製法に従って作成される溶液を注入物として用いる。図２７Ａ〜図２７Ｄは、免疫化学的検定および代替的なビーズ捕捉法を示す。
【０１２７】
図２７Ａは、注入ポート１５２を通してアクセス可能であり、かつフロー流路１６０につながっている混合／ロードチャンバ１６４を示す。フロー流路１６０には、クラスタ状に位置する捕捉剤２２０があらかじめロードされている。捕捉剤２２０のクラスタのそれぞれは、各標的領域１７０内に位置する。各標的領域１７０は、１つのタイプの捕捉剤または複数のタイプの捕捉剤を有することができ、個別の標的領域は、複数の捕捉フィールドに、全く同一のタイプの捕捉剤または複数の異なる捕捉剤を有することができる。本実施の形態では、捕捉剤は、レポータービーズ１９２または捕捉ビーズ１９０上のアンカー剤２２２のエピトープに特異的に結合する抗体を含み得る。別法として、捕捉剤は、二重ビーズ複合体１９４内の標的抗原２０４のエピトープに直接結合してもよい。アンカー剤２２２は、標的抗原、抗体輸送プローブ１９６、抗体シグナルプローブ２０８、またはレポータービーズ１９２または捕捉ビーズ１９０に結合しており、かつ捕捉剤２２０に特異的に結合し得るエピトープを有する任意の抗体を含むことができる。
【０１２８】
図２７Ｂでは、二重ビーズ複合体１９４に封鎖されている標的抗原の試験サンプルを、ピペット２１４にロードする。二重ビーズ複合体を、注入ポート１５２を通してフロー流路１６０に注入する。フロー流路１６０がピペット２１４からの二重ビーズ複合体でさらにロードされると、ディスクが回転するにつれて二重ビーズ複合体１９４はフロー流路１６０を進み始める。ロードチャンバ１６４は、切り離し保持壁２２８を含み得るため、複合体１９４はフロー流路を一度に進むことができる。
【０１２９】
この実施の形態では、図２７Ｃに示すように、レポータービーズ１９２に結び付いたアンカー剤２２２は、抗体−抗原相互作用により捕捉剤２２０に結合する。このようにして、レポータービーズ１９２は標的領域１７０内に保持される。二重ビーズ複合体１９４がフロー流路をゆっくりと進む、すなわち転がることができるようにディスクを回転させることにより、結合をさらに促進することができる。遅い移動により、捕捉剤２２０とアンカー剤２２２とのさらなる結合に十分な時間を得ることができる。結合後、ディスクを同じ速度で、またはそれよりも速くさらに回転させて、図２７Ｄに示すように、いかなる未結合の二重ビーズ複合体１９４をも標的領域１７０から取り除くことができる。
【０１３０】
次に、図２７Ｄに示すように、呼びかけビーム２２４を標的領域１７０に送り、レポーター、捕捉ビーズ、および二重ビーズ複合体の存在を判定することができる。標的抗原が試験サンプル中にない場合、標的領域１７０に結合している二重ビーズ複合体構造、レポーター、または捕捉ビーズはないが、少量の背景シグナルが、標的領域において非特異的結合から検出される可能性がある。この場合、呼びかけビーム２２４を標的領域１７０に送ると、ゼロまたは低い読みが生じ、それにより、標的がサンプル中に存在しなかったことが示される。
【０１３１】
回転速度、回転方向、およびある期間にはある速度で、続く別の期間には別の速度でなどの回転の段階は、すべてディスク上の動作情報に符号化され得る。
【０１３２】
図２５Ａ〜図２５Ｄ、図２６Ａ〜図２６Ｄ、および図２７Ａ〜図２７Ｄに記載した方法は、反射型ディスクシステム１４４を用いて実施される。上記のように、これらの方法および他のビーズまたは球体検出は、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ｂ、および図６Ｂに記載するように、透過型ディスクの実施の形態１８０を用いて実行してもよいことは理解するべきである。また、図１１Ａおよび図１１Ｂ、図１２Ａおよび図１２Ｂ、図２５Ａ〜図２５Ｄ、図２６Ａ〜図２６Ｄ、ならびに図２７Ａ〜図２７Ｄに記載した方法は、光バイオディスク外での二重ビーズ複合体の作成に限定されず、二重ビーズ複合体の「インディスク」または「オンディスク」での形成を用いる実施の形態を含むことができることも理解するべきである。これらのオンディスクの実施態様では、二重ビーズ複合体は、光バイオディスク１１０の流体回路内に形成される。例えば、二重ビーズの形成は、ロードまたは混合チャンバ１６４において実行することができる。一実施の形態では、ビーズおよびサンプルを、同時に、またはほぼ同時にディスクに添加する。別法として、サンプルだけを添加すればよいように、プローブを有するビーズを、サンプルと共に将来使用するためにディスクにあらかじめロードしておいてもよい。
【０１３３】
ビーズは通常、長期の保存寿命を有するが、プローブの保存寿命はそれよりも短い。プローブは、プローブがディスク内に残り得る期間を延長させるために、乾燥または凍結乾燥（フリーズドライ）され得る。プローブが乾燥している場合、サンプルは基本的にプローブを再構成し、次にビーズと混ざり合って二重ビーズ複合体構造が生成され得る。
【０１３４】
いずれの場合も、オンディスク処理の基本的なプロセスは、（１）サンプルを、プローブを有するビーズを含んだディスクに挿入すること、（２）ディスク上でサンプルとビーズとを混合させること、（３）磁界の印加などにより、二重ビーズ複合体を保持して未結合ビーズをここでは廃液チャンバと呼ぶ領域などに移動させるように単離すること、（４）二重ビーズ複合体（および廃液チャンバに移動しなかった任意の他の材料）を捕捉フィールドに導くこと、を含む。検出プロセスは、イベント検出または蛍光分析法などによる、上述のプロセスのうちの１つと同じであってよい。
【０１３５】
上記に加えて、図２５Ａ〜図２５Ｄ、図２６Ａ〜図２６Ｄ、および図２７Ａ〜図２７Ｄに示すディスク表面捕捉技法および二重ビーズ複合体を形成するための連結技法を、その代替の変形形態を作成するために交換可能であり得ることは、当業者には明らかであろう。例えば、本発明者らは、核酸の特異的配列を含むように実施される捕捉剤２２０を用いて、図１０Ａに示すＤＮＡハイブリダイゼーションまたは図１０Ｂに示す抗体−抗原相互作用により形成される二重ビーズ複合体を捕捉できることを意図している。同様に、抗体を含むように実施される捕捉剤２２０を用いて、図１０Ａに示すＤＮＡハイブリダイゼーション法または図１０Ｂに示す抗体−抗原相互作用により形成される二重ビーズ複合体を捕捉することができる。また、ビオチンまたはＢＳＡビオチンを含むように実施される捕捉剤２２０を同様に利用して、図１０Ａに示すＤＮＡハイブリダイゼーション技法または図１０Ｂに示す抗体−抗原相互作用により形成される二重ビーズ複合体を捕捉することができる。捕捉剤との結合機能を果たす異なるアンカー剤を含む他の組み合わせは、本開示から容易に明らかとなるため、本明細書に具体的に示す。
【０１３６】
検出および関連する信号処理法および装置
捕捉フィールドまたは領域に結合されているレポータービーズ、標的細胞、または粒子の数は、定性的に検出することができ、光ディスク読み取り装置により定量することもできる。
【０１３７】
上述の試験法のいずれかの試験結果は、モニタ１１４（図１）に即座に表示され得る。本発明によるディスクは、図２に示すようなコントローラ、プロセッサ、および分析装置
を制御するために読み取られる符号化ソフトウェアを含むことが好ましい。この対話型ソフトウェアは、本明細書で説明する方法および結果の表示を容易にするために実施される。
【０１３８】
図２８Ａは、本発明による光バイオディスクまたは医療ＣＤのトラックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥに対して位置付けられる、１つの２．１μｍのレポータービーズ１９２と３μｍの捕捉ビーズ１９０とのグラフィカル表現である。
【０１３９】
図２８Ｂは、本発明による光ドライブからの検出信号を利用して、図２８Ａのビーズから得られるトラックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥからの一連のシグネチャトレースである。これらのグラフは、例えば図５Ａおよび図６Ａに示す反射型ディスクの検出された帰還ビーム１２４、または図５Ｂおよび図６Ｂに示す透過型ディスクの透過ビーム１２８を表す。図示のように、２．１μｍのレポータービーズ１９０のシグネチャは、３μｍの捕捉ビーズ１９２のシグネチャとは十分に異なり、２つの異なるタイプのビーズを検出および区別することができる。この検出法は、ビーズまたはビーズ複合体に限定されず、細胞またはビーズ−細胞複合体などの他の物体を検出するために用いてもよい。当業者には明らかであるように、ＭＯバイオディスク内の１μｍの磁気ビーズからのシグネチャトレースと８μｍの細胞のシグネチャトレースとは、例えば、これらの粒子を互いに区別するのに十分に異なっている。ビーズを通過する際に検出される帰還ビームからのトレース信号の十分なゆがみは、イベントと呼ばれる。
【０１４０】
図２９Ａは、本発明による光バイオディスクまたは医療ＣＤのトラックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥに対して位置付けられる二重ビーズ複合体に共に連結された、２．１μｍのレポータービーズと３μｍの捕捉ビーズとのグラフィカル表現である。
【０１４１】
図２９Ｂは、本発明による光ドライブからの検出信号を利用して、図２９Ａのビーズから得られるトラックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥからの一連のシグネチャトレースである。これらのグラフは、検出された、反射型ディスク１４４の帰還ビーム１２４、または透過型ディスク１８０の透過ビーム１２８を表す。図示のように、２．１μｍのレポータービーズ１９０のシグネチャは、３μｍの捕捉ビーズ１９２のシグネチャとは十分に異なり、２つの異なるタイプのビーズを検出および区別することができる。検出される帰還ビームからのまたはビーズを通過する際に送出されるトレース信号の十分なゆがみは、イベントと呼ばれる。レポーターおよび捕捉ビーズからのイベントの相対的な近さは、二重ビーズ複合体の存非を示す。図示のように、レポーターおよび捕捉ビーズのトレースは、互いにすぐ隣にあり、これらビーズが接合して二重ビーズ複合体になっていることを示す。
【０１４２】
別法として、他の検出法を用いてもよい。例えば、レポータービーズは蛍光または燐光であってもよい。これらのレポーターの検出は、蛍光または燐光型の光ディスク読み取り装置で実行することができる。他の信号検出法は、例えば、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００１年１１月９日に出願された「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-Discs」と題する米国特許出願第１０／００８，１５６号（参照により明示的に援用される）、２００１年２月２０日に出願された米国仮出願第６０／２７０，０９５号および２００１年５月１８日に出願された米国仮出願第６０／２９２，１０８号、ならびに上記で参照された２００２年１月１０日に出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題する米国特許出願第１０／０４３、６８８号に記載されている。
【０１４３】
図３０Ａは、蛍光レポータービーズを用いた濃度依存標的検出を示す蛍光測定器を用いて生成されるデータの棒グラフである。このグラフは、標的ＤＮＡのモル濃度対検出されたビーズの数を示す。グラフに示される標的検出のダイナミックレンジは、１０Ｅ−１６
〜１０Ｅ−１０モル濃度（モル／リットル）である。図示の特定のグラフは蛍光測定器からのデータを用いて生成されたが、蛍光型光ディスクドライブを用いて結果を生成してもよい。
【０１４４】
図３０Ｂは、蛍光二重ビーズ検定における蛍光測定器の感度が約１０００ビーズであることを説明する、標準曲線を提示している。いかなる検定の感度も、検定自体および検出システムの感度に依存する。図３０Ａ〜図３０Ｃを参照して、種々の検出法、例えば、蛍光測定器および本発明によるバイオディスクまたは医療ＣＤ検出を用いた二重ビーズ検定の感度を検査するために、さまざまな研究を行った。
【０１４５】
上述し、かつ図３０Ｂに示すように、蛍光二重ビーズ検定における蛍光測定器の感度は約１０００ビーズである。対照的に、図３０Ａは、１０Ｅ−１６モル濃度（モル／リットル）でも、ゼロ濃度を越える十分な数のビーズを検出して、標的の存在を検知することができることを示す。１０Ｅ−１６モル濃度の感度では、二重ビーズ検定は非常に高感度のＤＮＡ検出法となり、これはＤＮＡ増幅（ＰＣＲなどによる）を必要とせず、これを用いて単一ビーズでさえも検出することができる。
【０１４６】
従来の検出法とは対照的に、ＣＤ読み取り装置または光バイオディスクドライブ（図１）に接続された医療ＣＤまたはバイオディスクの使用により、検出の感度が向上する。例えば、蛍光測定器での検出は、約１０００ビーズに制限されるが（図３０Ｂ）、図２９Ａ、図２９Ｂ、および図３０Ｃに示すように、ＣＤ読み取り装置に接続されたバイオディスクの使用により、ユーザは呼びかけビームによって１つのビーズを検出することができる。したがって、本明細書において提供する生物検定システムにより、二重ビーズ検定の感度が著しく向上する。
【０１４７】
光バイオディスクまたは医療ＣＤを用いた単一ビーズの検出は、図２８Ａおよび図２８Ｂに関連して詳細に説明されている。図２８Ｂは、医療ＣＤまたはバイオディスク読み取り装置により検出された各ビーズのシグナルトレースを示す。二重ビーズ複合体は、図２９Ａおよび図２９Ｂに示すように、二重ビーズ複合体の検出から収集された特有のシグネチャトレースを用いて、バイオディスク読み取り装置により識別されることができる。限定はされないが、それぞれ図３Ｃおよび図４Ｃに示す反射型ディスクフォーマットおよび透過型ディスクフォーマットを含む、種々の光バイオディスクプラットフォームを、ビーズの検出のための読み取りデバイスと共に用いることができる。
【０１４８】
図３０Ｃは、遺伝的検定において、標的の存在により共に連結される二重ビーズ複合体の形成を説明するイラスト表現である。上記の図１および図２に示すバイオＣＤ読み取り装置を用いて定量される本二重ビーズ検定では、１レポーター分子以内までの感度が可能である。同様に、二重ビーズ複合体の形成は、図７Ｂ、図８Ｂ、図９Ｂ、図１０Ｂ、図１１Ｂ、および図１２Ｂで上述したような免疫化学的検定フォーマットで実施してもよい。
【０１４９】
図３１は、２つの異なる標的の濃度依存検出を示す、蛍光測定器を用いて生成されるデータを示す。標的検出を、２つの異なる方法（一重（single）および二重（duplex）検定）を用いて実行した。一重検定では、捕捉ビーズは１つの標的に特異的な輸送プローブを含み、同じ標的に特異的なシグナルプローブで被覆されたレポータープローブが、溶液中でその標的と混合される。二重検定では、捕捉ビーズは２つの異なる標的に特異的な２つの異なる輸送プローブを含む。二重標的検出法の使用に関する実験的な詳細は、表２においてさらに詳細に説明する。２つの標的のうちの１つに特異的なシグナルプローブを含む異なるレポータービーズ（例えば、赤色および緑色蛍光またはシリカおよびポリスチレンビーズ）の混合により、２つの異なる標的を同時に検出できる。
【０１５０】
二重ビーズ二重検定の検出は、以下で説明する光磁気ディスクシステムを用いて実行してもよい。図３２および図３７は、光バイオディスクドライブ（図２）、光磁気ディスクシステム、蛍光ディスクシステム、または任意の同様のデバイスにより検出され得る光ディスク上での種々の二重ビーズ複合体の形成および結合を示す。光ディスク読み取り装置から収集された二重ビーズ複合体の特有のシグネチャトレースは、上記の図２９Ｂに示されている。図２９Ｂからのトレースは、光ディスク読み取り装置により異なるビーズタイプが検出され得ることをさらに示しているが、それは、異なるビーズは異なるシグネチャプロファイルを示すからである。
【０１５１】
多重化、光磁気、および磁気ディスクシステム
標的の捕捉における二重ビーズ検定の使用は、多重検定での使用も可能である。このタイプの多重化は、異なるサイズの磁気ビーズを異なるタイプおよびサイズのレポータービーズと組み合わせることにより行われる。したがって、異なる標的剤を同時に検出することができる。図３２に示すように、４つのサイズの磁気捕捉ビーズと４つのサイズの３つのタイプのレポータービーズとにより、最大４８の異なるタイプの二重ビーズ複合体がもたらされる。したがって、多重化検定では、異なる標的に特異的なプローブは、捕捉ビーズにこのように結合される。異なる波長の蛍光などの異なる物理的および／または光学的特性を有するレポータービーズは、同じ生体サンプルからの異なる標的剤の同時検出を可能にする。図２８Ａ、図２８Ｂ、図２９Ａ、および図２９Ｂに示すように、反射光または透過光を検出することにより、サイズのわずかな差を検出することができる。
【０１５２】
異なる標的剤を捕捉するための複数の二重ビーズ複合体構造は、ディスク上またはディス外で実行することができる。二重ビーズ懸濁液を、ディスクのポートにロードする。ポートをシールし、ディスクをディスク読み取り装置で回転させる。スピン中、遊離（未結合）レポータービーズはディスクの周縁に向かってスピン除去され、磁気捕捉ビーズおよび磁気ビーズ複合体または二重ビーズは、磁気フィールドに、例えばＭＯディスクの磁区に捕捉される。したがって、さまざまな標的剤を検出するレポータービーズは、捕捉領域に局在化される。このように、ディスク読み取り装置によって、特異的標的剤の存在を検出することができ、特異的標的剤の量を定量することができる。
【０１５３】
図３３Ａは、本発明の別の態様による光ディスクの概略的表現である。図３３Ａに示すディスク１１０を用いて、上記の図１１Ａおよび図１１Ｂのシングルステップ法、または図６５Ａおよび図６５Ｂ、ならびに図６６Ａおよび図６６Ｂに関連して以下で説明する関連のシングルステップ法にほぼ対応する方法を実施することができる。サンプルおよびビーズは、一度に、または順次にではあるが近い時間に添加され得る。別法として、ディスクの一部にビーズをあらかじめロードしてもよい。これらの物質は、混合チャンバ１６４内に溶液を保持する切り離し壁２２８（図２５Ａを参照）を有し得る混合チャンバ１６４に供給され得る。ディスク上でのサンプルとビーズとの混合は、壁が壊れない、または毛管力に打ち勝たない程度の速度での回転により行われることになる。
【０１５４】
ディスクは一方向に回転してもよく、または逆方向に交互に回転して、混合チャンバ内の物質を攪拌してもよい。混合チャンバは、循環および混合が可能なほど十分に大きいことが好ましい。混合は連続的であっても断続的であってもよい。
【０１５５】
図３３Ｂは、弁として可動構成要素を用いる回転・方向依存弁機構の一実施の形態を示す。混合チャンバは、ボール２４６などの可動構成要素を有する中間チャンバ２４４につながっている。非回転状態では、ボール２４６はわずかに凹んだ部分に保持されていてよく、またはチャンバ２４４は、周方向にテーパ状となった緩やかな（gradual）Ｖ字形を有して、回転していない時にボールを中心に保持してもよい。
【０１５６】
図３３Ａおよび図３３Ｂに加えて図３３Ｃおよび図３３Ｄを参照して、ディスクが時計回りに回転している場合（図３３Ｃ）、ボール２４６は第１の弁座２４８に移動して、検出チャンバ２３４への通路を遮断し、図３３Ａに示す廃液チャンバ２３２への流れを可能にする。ディスクが反時計回りに回転している場合（図３３Ｄ）、ボール２４６は第２の弁座２５０に移動して、廃液チャンバ２３２への通路を遮断し、検出チャンバ２３４への流れを可能にする。
【０１５７】
図３４Ａ〜図３４Ｃは、ディスクの加速に応じて一方向または他方向に移動するウェッジ２５２でボールが置き換えられた、上記実施の形態の変形形態を示す。ウェッジ２５２は、中間チャンバ２４４の形状に一致する円形の外形を有し得る。ウェッジは、張り付きを回避するために、チャンバ２４４に比して高密度の（heavy dense）材料からできていることが好ましい。チャンバに対するウェッジの滑動を促進するために、コーティングを用いてもよい。
【０１５８】
ディスクが最初に図３４に示すように時計回りに回転すると、角加速度により、ウェッジ２５２が検出チャンバ２３４への通路を遮断して廃液チャンバ２３２への流れを可能にするように移動する。ディスクが最初に反時計回りに回転すると（図３４Ｃ）、角加速度により、ウェッジ２５２が廃液チャンバ２３２への通路を遮断して検出チャンバ２３４への流れを可能にする。加速後の一定の回転中、ウェッジ２５２は適当な通路を遮断して所定位置に留まる。
【０１５９】
捕捉ビーズが磁性を有する本発明の別の実施の形態では、磁界発生器または界磁コイル２３０からの磁界を混合チャンバ１６４にわたって印加して、二重ビーズ複合体および未結合の磁気ビーズを所定位置に保持しつつ、磁気ビーズを有さない物質を廃液チャンバ２３２に流すことができる。この技法は、不要な物質が洗い流される前に流体回路または流路内の検定溶液の混合を補助するためにも用いることができる。この段階で、未結合の、または二重ビーズ複合体の一部としての磁気捕捉ビーズのみが残る。磁界が解かれると、磁気ビーズを有する二重ビーズ複合体が捕捉および検出チャンバ２３４に導かれる。
【０１６０】
非磁気ビーズを廃液チャンバ２３２に導き、続いて磁気ビーズを捕捉チャンバ２３４に導くプロセスは、マイクロ流体構成物（construction）および／または流体構成要素により達成することができる。流れ制御弁２３６または他の何らかの誘導機構を用いて、サンプルおよび非磁気ビーズを廃液チャンバ２３２へ、続いて捕捉チャンバ２３４へ導いてもよい。回転依存流に関するいくつかの実施の形態を用いることができる。流れ制御機構の使用に関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００１年１１月２７日に出願された「Dual Bead Assays Including Optical Biodiscs and Methods Relating Thereto」と題する米国仮出願第０９／９９７,７４１号に開示されており、この出願は、その内容すべてが参照により本明細書に援用される。
【０１６１】
図３５は、本発明による磁気ビーズおよび磁界発生器２３０と共に用いられる流体回路の一実施の形態を含むディスクの斜視図である。図３５は、混合チャンバ１６４、廃液チャンバ２３２、および捕捉チャンバ２３４も示している。磁界発生器２３０は、ディスク１１０の上方に位置付けられ、ディスク１１０の回転の際に磁界発生器２３０が混合チャンバ１６４の上方に留まるような半径を有し、チャンバ２３２および２３４から半径方向に離間している。上述した先の実施形態のように、磁界発生器２３０からの磁界を混合チャンバ１６４にわたって印加して、さらなる物質を混合チャンバ１６４に入れつつ二重ビーズ複合体および／または未結合磁気ビーズを所定位置に保持することができる。磁界発生器２３０を用いて磁気ビーズを所定位置に保持しながらディスクを回転させるこの方法を用いて、混合チャンバ１６４内に含まれる検定溶液が他の場所に導かれる前に、混合チャンバ１６４内の溶液を混合するのを補助することもできる。
【０１６２】
図３６Ａ〜図３６Ｃは、図３５に示す流体回路を用いた二重ビーズ検定のための分離および検出の方法を示す平面図である。図３６Ａは、二重ビーズ複合体１９４および種々の未結合レポータービーズ１９２を含むサンプルを保持する環状扇形（annular sector）の形状をした混合チャンバ１６４を有する回転していない光ディスクを示す。電磁石が作動され、ディスクが反時計回りに回転し（図３６Ｂ）、または１Ｘまたは３Ｘなどの低いｒｐｍで攪拌され得る。磁気捕捉ビーズを有する二重ビーズ複合体１９４は混合チャンバ１６４に残るが、液体サンプルおよび未結合レポータービーズ１９２は、角加速度に応じて混合チャンバ１６４の回転方向後端に移動する。ディスクは、毛管力に打ち勝つのに十分な速度で図３６Ｂに示す反時計方向に回転し、サンプル中の未結合レポータービーズを廃液流体回路２３８を通して廃液チャンバ２３２に移動させることができる。プロセスのこの時点で、図示のような流体回路の物理的な遠心分離のため、液体は捕捉流体回路２４０を進まないであろう。
【０１６３】
次に図３６Ｃに示すように、磁石が無効にされ、ディスクが時計回りに回転する。二重ビーズ複合体１９４は、角加速度に応じて混合チャンバ１６４の反対側の後端に移動し、次に捕捉流体回路２４０を通って捕捉チャンバ２３４に移動する。プロセスのこの後者の段階で、図示のような流体回路の物理的レイアウトにより、二重ビーズ溶液は廃液流体回路２３８を進まないであろう。このように、図３６Ａ〜図３６Ｃに示す実施の形態は、回転依存流および回転速度依存流を示す。
【０１６４】
この実施の形態および流体回路がディスクのある領域に形成される他の実施の形態では、複数の領域をディスクの周りに、例えば均衡を保つための通常の方法で形成し分布させることができる。さらに、上述のように、回転を制御する命令をディスクに供給してもよい。したがって、ディスクを読み取ることにより、ディスクドライブは特定の速度で特定の期間の間回転させ、ある期間の間停止させ、別の期間の間逆方向に回転させる命令を有してよい。さらに、符号化情報は、例えば光源の電力および波長に関するものなどの、制御命令を含んでよい。このようなシステムパラメータを制御することは、検出法として蛍光を用いる場合に特に関連がある。
【０１６５】
さらに別の実施の形態では、通路は、ディスクドライブのレーザの影響下で、またはディスクにあらかじめロードされた触媒または試験サンプル中に供給された触媒などによって、シールまたは溶解される物質または構成を有していてもよい。例えば、ゲルはある物質の存在下では時間を経て凝固し、この場合、閉じる時間は、廃液チャンバへの通路が閉じる前に未結合捕捉ビーズを廃液チャンバに流すのに十分な長さに設定することができる。別法として、廃液チャンバへの通路は、検出チャンバへの通路が閉じている間は開いていてもよい。未結合ビーズが廃液チャンバへ送られた後、検出チャンバへの通路がレーザから導入されたエネルギーにより開かれて、検出チャンバへの流れを可能にする。
【０１６６】
次に図３７を全体的に参照して、光磁気記録が、外部磁界の存在下で合焦されたビームにより薄膜を加熱することにより磁区すなわち磁性領域が薄膜に書き込まれる、光記憶技法であることが理解される。次に、これらの磁区の存在が、同じレーザにより、層の異なる磁区間の反射光の偏光（カー回転）の差から検出される。一定の高レーザーパワーの磁界の切り替え、または一定の磁界でのレーザーパワーの変調により、データパターンを層に書き込むことができる。コンピュータデータ記憶システムおよびオーディオシステム（最も顕著なものはＭｉｎｉＤｉｓｃ）を含む、多くの光磁気記憶システムが市場に導入されている。この分野の現状の説明は、「The Principles of Optical Disc Systems」、 Bouwhuis et. al. 1985 (ISBN 0-85274-785-3);「Optical Recording, A Technical Overview」 A.B. Marchant 1990 (ISBN 0-201-76247-1);および「The Physical Principles of
Magneto-Optical Recording」、M. Mansuripur 1995 (ISBN 0521461243)において見ることができる。これら文献のすべては、それぞれの内容がすべて、参照により本明細書に援用される。
【０１６７】
次に図３７を特に参照して、多重化二重ビーズ検定で用いるための光ディスク１１０のさらに別の実施の形態が示されている。この場合、光磁気ドライブと共に用いるディスクは、磁気ヘッドで選択的に書き込みおよび削除ができる磁区すなわち磁性領域２４２を有する。本明細書中以下では、このタイプのディスクを「光磁気バイオディスク」または「ＭＯバイオディスク」と総称する。例えば、光磁気ディスクドライブは、１平方マイクロメートルもの小さい磁区２４２を作成することができる。磁区２４２の接近断面では、隣接する領域に関する磁界の方向が示されている。
【０１６８】
制御性の高い方法で小さい区域に選択的に書き込んでその領域に磁性を与えることができることにより、所望の場所に捕捉区域を作成することができる。これらの磁気捕捉区域またはドメインは、１つの流体チャンバまたは複数の流体チャンバに任意の所望の構成で、または任意の所望の場所に形成することができる。これらの区域は、ディスクに施されると、磁気ビーズを捕捉して保持する。ドメインは、所望であれば選択的に消去することができるため、非磁性になってビーズを解放することができる。
【０１６９】
本発明のこの態様による磁気ビーズ検定の１つの構成では、例として、１組の半径方向に向いた３つの磁気捕捉領域２４３が示されており、図示ではこれらの列の磁気捕捉領域にはビーズが結び付いていない。引き続き図３７を参照して、磁気捕捉領域の磁性区域に個々の磁気ビーズが磁気的に結び付いている、セクションＡの１組の４つの列が示されている。セクションＢに配列された別の組の４つの列は、レポータービーズが結合して特定の磁区すなわち磁性区域に結び付いた二重ビーズ複合体を形成した後の様子が示され、異なる列が異なるタイプのレポータービーズを有している。セクションＢに示すように、利用されるレポータービーズのいくつかはサイズが異なっており、それにより、光磁気バイオディスクまたはＭＯ医療ディスクで実施される本発明の多重化態様を達成する。セクションＣでは、種々の二重ビーズ複合体の１つの列が、別個の磁性区域に個別に結び付いた種々のビーズサイズを用いた多重化検定の別の例として示されている。
【０１７０】
このような光磁気バイオディスクを用いる方法では、ＭＯドライブの書き込みヘッドを用いて磁区を作成し、次にサンプルをそのドメインにわたって導いて、サンプル中に供給された磁気ビーズを捕捉する。第１のサンプルセットの導入後、他の磁区も作成することもでき、検出のために、新たに作成された磁気捕捉領域に別のサンプルセットを供給することができる。したがって、複数のサンプルセットの検出を、１つのディスク上で異なる期間に行うことができる。光磁気ドライブは、磁区すなわち捕捉領域を消磁して、所望であれば磁気ビーズを解放および単離することもできる。このように、このシステムは、さまざまな異なる生化学的、化学的、または生物学的サンプルからの１つまたは複数の特異的標的分子の制御可能な捕捉、検出、単離、および解放を可能にする。
【０１７１】
上述のように、サンプルはディスクの流体チャンバに供給することができる。別法として、サンプルは、異なるビーズの組を有する複数のチャンバに供給することができる。さらに、サンプルが回転運動により１つのチャンバから次のチャンバに移動することができ、次に各チャンバで別個に試験を行うことができるように、一連のチャンバを作成してもよい。
【０１７２】
このようなＭＯバイオディスクでは、多数の試験を一度に行うことができ、かつ対話式に行うことができる。このように、試験が行われて結果が得られると、システムは、新たな組の磁性領域を二重ビーズ複合体の捕捉のために作成するよう指示される。領域は一度
に１つ、または多数の群で作成することができ、異なるビーズがあらかじめロードされた一連のチャンバで行うことができる。書き込み可能磁性領域を有するＭＯバイオディスクでは、他の処理上の利点を得ることができる。例えば、「捕捉剤」は基本的に、ディスク上の磁性領域により作成された磁界であるため、さらなる生物学的または化学的捕捉剤を加える必要がない。
【０１７３】
ＭＯバイオディスクで書き込まれるかまたは消去される磁性領域の場所を制御する命令、および回転速度、回転の段階、待機期間、光源の波長、および他のパラメータなどの他の情報を、ディスク自体に符号化して、その後ディスク自体から読み取ることができる。本明細書に記載される開示を読んだ当業者には容易に理解されるように、図３７に示すＭＯバイオディスクは、上述の反射型および透過型ディスクの流体回路、混合チャンバ、フロー流路、検出チャンバ、注入ポート、または排出ポートの任意のものを含むことができる。本発明のこの態様によるＭＯバイオディスクの使用の説明例は、以下の実施例５および６で提供する。
【０１７４】
したがって、要するに、本発明の光磁気態様の以下の実施の形態は、本発明者らが意図したものであり、本明細書で詳細に説明する。まず、光磁気バイオディスクに関連して遺伝的二重ビーズ検定を行う方法を提供する。この方法は、輸送プローブが共有結合した複数の磁気捕捉ビーズを提供するステップと、ＤＮＡの特異的配列が共有結合した複数のレポータービーズを提供するステップと、特異的ＤＮＡ配列と相補的なＤＮＡ配列に関して試験すべき標的ＤＮＡ分子を含むサンプルを調製するステップと、光磁気バイオディスクに設けられた注入ポートを介して、光磁気バイオディスクに捕捉ビーズをロードするステップと、を含む。光磁気バイオディスクは磁気捕捉層を有する。この方法はさらに、サンプルおよび複数のレポータービーズをバイオディスクにロードすること、バイオディスクを回転させることであって、それにより、サンプル中に存在する任意の標的ＤＮＡの、レポータービーズのＤＮＡの特異的配列との、および輸送プローブとのハイブリダイゼーションを促進して、二重ビーズ複合体を形成する、回転させること、放射エネルギー入射ビームにより、いくつかの磁気捕捉ビーズに呼びかけることであって、それにより、いくつかの磁気捕捉ビーズそれぞれが二重ビーズ複合体を形成したか否かを判定する、呼びかけること、磁気捕捉層の特定の領域を磁化することであって、それにより、複数の二重ビーズ複合体をそこに結合させる、磁化すること、および複数の二重ビーズ複合体を定量すること、を含む。
【０１７５】
本方法は、ディスクを回転させるさらなるステップであって、それによりいかなる未結合ビーズも廃液チャンバへ導き、次に磁気捕捉層の特定の領域を消磁して、それにより複数の二重ビーズ複合体のいくつかを解放する、回転させるさらなるステップを含んでもよい。その後、ディスクを回転させて、解放されたいくつかの二重ビーズ複合体をさらなる処理のために分析区域へ導き、それにより解放されたいくつかの二重ビーズ複合体が分析区域に封鎖されるようにすることができる。分析区域は、封鎖された二重ビーズ複合体と反応する薬剤を有する分析チャンバであってもよい。
【０１７６】
本発明の光磁気態様の第２の実施の形態によると、光磁気バイオディスクに関連して二重ビーズ検定を行う別の方法が提供される。この他の方法は、輸送プローブが結び付いた複数の磁気捕捉ビーズを提供するステップと、シグナルプローブが結び付いた複数のレポータービーズを提供するステップと、光磁気バイオディスクに設けられた注入ポートを介して、光磁気バイオディスクに捕捉ビーズをロードするステップと、を含む。光磁気バイオディスクは磁気捕捉層を有する。この第２の方法はさらに、標的を含むサンプルおよび複数のレポータービーズをバイオディスクにロードすること、バイオディスクを回転させることであって、それにより、標的ビーズおよびレポータービーズと磁気捕捉ビーズとの結合を促進して、二重ビーズ複合体を形成する、回転させること、放射エネルギー入射ビ
ームにより、いくつかの磁気捕捉ビーズに呼びかけることであって、それにより、いくつかの磁気捕捉ビーズそれぞれが二重ビーズ複合体を形成したか否かを判定する、呼びかけること、磁気捕捉層の特定の領域を磁化することであって、それにより、複数の二重ビーズ複合体をそこに結合させる、磁化すること、および複数の二重ビーズ複合体を定量すること、を含む。
【０１７７】
この方法は、ディスクを回転させるさらなるステップであって、それによりいかなる未結合ビーズも廃液チャンバへ導き、次に磁気捕捉層の特定の領域を消磁して、それにより複数の二重ビーズ複合体のいくつかを解放する、回転させるさらなるステップを同様に含んでもよい。その後、ディスクを回転させて、解放されたいくつかの二重ビーズ複合体をさらなる処理のために分析区域へ導き、それにより解放されたいくつかの二重ビーズ複合体が分析区域に封鎖されるようにすることも、この方法の一態様である。分析区域は、封鎖された二重ビーズ複合体と反応する薬剤を有する反応チャンバを含んでいてもよい。
【０１７８】
本発明の光磁気態様の第３の実施の形態によると、光磁気バイオディスクに関連して多重化された二重ビーズ検定を行う方法が提供される。この多重化方法は、（１）少なくとも２つの群の異なるサイズの磁気捕捉ビーズを提供するステップであって、各群は、同じサイズの磁気ビーズを有し、各群に関連する異なる特異的タイプの輸送プローブを有する、磁気捕捉ビーズを提供するステップと、（２）少なくとも２つの異なるタイプのシグナルプローブが結び付いた複数のレポータービーズを提供するステップと、（３）光磁気バイオディスクに設けられた注入ポートを介して、光磁気バイオディスクに捕捉ビーズをロードするステップと、を含む。上記のＭＯバイオディスク法におけるように、この光磁気バイオディスクは磁気捕捉層を有する。本方法は、（４）少なくとも１つの標的を含むサンプルおよび複数のレポータービーズをバイオディスクにロードすること、（５）バイオディスクを回転させることであって、それにより、標的およびレポータービーズと磁気捕捉ビーズとの結合を促進して、二重ビーズ複合体を形成する、回転させること、（６）放射エネルギー入射ビームにより、いくつかの磁気捕捉ビーズに呼びかけることであって、それにより、いくつかの磁気捕捉ビーズそれぞれが二重ビーズ複合体を形成したか否かを判定する、呼びかけること、および（７）二重ビーズ複合体の磁気ビーズのサイズを判定すること、も含む。この特定の方法は、（８）磁気捕捉層の特定の領域を磁化することであって、それにより、複数の二重ビーズ複合体をそこに結合させる、磁化すること、および（９）複数の二重ビーズ複合体を定量すること、で終了する。
【０１７９】
この特定の方法の一態様によると、定量するステップは、磁気捕捉ビーズのサイズに従って複数の二重ビーズ複合体を定量することを含むことが有利であり得る。本方法は、ディスクを回転させるさらなるステップであって、それによりいかなる未結合ビーズも廃液チャンバへ導き、次に磁気捕捉層の特定の領域を消磁して、それにより、同じサイズの磁気捕捉ビーズを含む複数の二重ビーズ複合体のいくつかを解放する、回転させるさらなるステップを含んでもよい。本方法はさらに、ディスクを回転させることであって、それにより、解放されたいくつかの同じサイズの二重ビーズ複合体をさらなる処理のために分析区域へ導き、それにより解放されたいくつかの同じサイズの二重ビーズ複合体が分析区域に封鎖されるようにする、回転させることを含んでもよい。分析区域は、封鎖された同じサイズの二重ビーズ複合体と反応する薬剤を有する反応チャンバを含んでいてもよい。本発明の特定の実施の形態では、シグナルプローブはＤＮＡの特異的配列である。
【０１８０】
さらに本発明の光磁気態様の第４の実施の形態によると、光磁気バイオディスクに関連して多重化された二重ビーズ検定を行う別の主な方法が提供される。このさらなる二重ビーズ多重化方法は、（１）少なくとも２つの群の異なるタイプのレポータービーズを提供するステップであって、各群は、同じタイプのレポータービーズを有し、各群に関連する異なる特異的タイプのシグナルプローブを有する、レポータービーズを提供するステップ
と、（２）異なるタイプの輸送プローブが結び付いた複数の磁気捕捉ビーズを提供するステップと、（３）光磁気バイオディスクに設けられた注入ポートを介して、光磁気バイオディスクに捕捉ビーズをロードするステップと、を含む。上記のＭＯバイオディスク法におけるように、この特定の光磁気バイオディスクは磁気捕捉層を有する。本方法は、（４）少なくとも１つの標的および複数のレポータービーズに関して試験すべきサンプルをバイオディスクにロードするさらなるステップと、（５）バイオディスクを回転させるさらなるステップであって、それにより、サンプル中に存在する任意の標的のレポータービーズへの、および磁気捕捉ビーズへの結合を促進して、二重ビーズ複合体を形成する、回転させるさらなるステップと、（６）放射エネルギー入射ビームにより、いくつかのレポータービーズに呼びかけるさらなるステップであって、それにより、いくつかのレポータービーズそれぞれが二重ビーズ複合体を形成したか否かを判定する、呼びかけるさらなるステップと、を含む。次に、本方法のこの特定の実施の形態は、（７）二重ビーズ複合体中のレポータービーズのタイプを判定すること、（８）磁気捕捉層の特定の領域を磁化することであって、それにより、複数の二重ビーズ複合体をそこに結合させる、磁化すること、および（９）複数の二重ビーズ複合体を定量すること、で終了する。
【０１８１】
本発明の光磁気態様の１つの特定の実施の形態では、定量するステップは、レポータービーズのタイプに従って複数の二重ビーズ複合体を定量することを含む。本方法はさらに、ディスクを回転させるさらなるステップであって、それによりいかなる未結合ビーズも廃液チャンバへ導き、所望であれば次に磁気捕捉層の特定の領域を消磁して、それにより、同じタイプのレポータービーズを含む複数の二重ビーズ複合体のいくつかを解放する、回転させるさらなるステップを含んでもよい。ディスクを回転させるさらなるステップであって、それにより、同じタイプの二重ビーズ複合体をさらなる処理のために分析区域へ導き、それにより解放されたいくつかの同じタイプの二重ビーズ複合体が分析区域に封鎖されるようにする、回転させるさらなるステップを行ってもよい。
【０１８２】
上記の方法のように、分析区域は、封鎖された同じタイプの二重ビーズ複合体と反応する薬剤を有する反応チャンバを含んでいてもよい。本発明はさらに、上記の方法のいずれかを行うために用いられる光バイオディスクと、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、図１２Ｂに関連して上述した方法、または図６５Ａおよび図６５Ｂ、図６６Ａおよび図６６Ｂ、図６７Ａおよび図６７Ｂ、ならびに図６８Ａおよび図６８Ｂに関連して以下で詳細に説明する方法に従って調製される任意の二重ビーズ複合体を分析するために用いられる光バイオディスクとを意図している。さらに、ＭＯバイオディスクは、以下で説明するＭＯバイオディスクを用いた細胞捕捉および分析法などの、免疫磁気的および分子磁気的検定を含む他の生体磁気的検定で実施してもよい。
【０１８３】
検定感度を高めるためにライゲーションを用いる遺伝的検定
図３８を参照して、捕捉ビーズ１９０およびレポータービーズ１９２それぞれに共有結合した輸送プローブ１９８およびシグナルプローブ２０６を介して標的ＤＮＡ２０２により結合された（held together）二重ビーズ複合体１９４が示されている。この図に示すように、シグナルプローブ２０６の５’末端は、輸送プローブ１９８の３’末端のすぐ隣に保持される。この構成により、リガーゼを加えるとプローブの３’および５’末端がライゲーションされる。両プローブのライゲーションは、標的の存在下でのみ起こり、レポータービーズと捕捉ビーズとの間の結合強度を増加させることにより検定の感度を高め、二重ビーズ複合体の解離を防止する。
【０１８４】
次に図３９を参照して、酵素検定により検出される遺伝試験からの結果を示す棒グラフがある。輸送プローブに結合した３μｍの捕捉ビーズを用いて、この試験で標的を捕捉した。標的が捕捉されると、ビオチン化レポータープローブを導入して、標的に結合させた。次に、捕捉ビーズを洗浄して、未結合レポータープローブを除去した。次に、溶液にリ
ガーゼを添加して、図３８に示すように、レポータープローブの末端と輸送プローブの末端とをライゲーションする。一連の洗浄ステップ後、ストレプトアビジン化アルカリホスファターゼをビーズ溶液に添加し、レポータープローブ上でビオチンと結合させる。ビーズを再び洗浄し、色原体（chromagen）としてアルカリホスファターゼ基質をビーズ溶液に添加する。次に、アルカリホスファターゼおよび基質反応により形成される色の強度を、分光光度計を用いて定量する。この定量の結果を図３９に示す。この図に提示するデータは、プローブがライゲーションされた場合にシグナルが約５０％増加することを示す。このように、この実験のライゲーションステップにより、検定感度は著しく高まる。実施例３および４では、同様の実験を実行する際に従う手順を詳細に説明する。
【０１８５】
図４０は、酵素検定の代わりに二重ビーズ検定で実施するライゲーションステップを用いた遺伝試験からの棒グラフを示す。図３９で説明した酵素検定を用いて、非二重ビーズフォーマットでのリガーゼの活性を確認し、これは二重ビーズ実験の対照としての役割を果たす。酵素検定のように、輸送プローブに結合した同じ３μｍの捕捉ビーズを二重ビーズ検定で用いた。二重ビーズ検定で用いるレポータービーズは２．１μｍの蛍光ビーズであった。二重ビーズは、図１１Ａまたは図１２Ａで説明したように形成した。ライゲーションステップは、図１１ＡのステップＶまたは図１２ＡのステップＶＩで実施し、ここで、リガーゼを二重ビーズ複合体溶液に添加し、輸送プローブをシグナルプローブにライゲーションさせた。図４０に示すデータは、ライゲーションが、セット１では非ライゲーション対照処理に比して検定の信号および感度を著しく高めるが、セット２ではそうではないことを示す。
【０１８６】
同様に、図４１は、図４０で説明したものと同じライゲーションステップを用いて、３９量体ブリッジを用いて二重ビーズ複合体に結合したレポータービーズの数を示す棒グラフである。図４０におけるように、図４１のデータは、ライゲーションがステップ１およびステップ２の双方で二重ビーズ検定の感度を著しく高めることを示す。このデータは、３９量体ブリッジの使用がライゲーションプロセスに役立ち、したがって二重ビーズ検定で実施される両セットからのシグナルを高めることを説明している。
【０１８７】
切断可能スペーサまたは置換プローブを用いた二重ビーズ検定
二重ビーズ検定における切断可能スペーサの使用は、検定の特異性を高める。実際、標的ＤＮＡと相補的な配列に加えて、捕捉プローブおよびレポータープローブは、互いに相補的な配列を含む。この付加的な要件により、標的捕捉に対する特異性が高まる。さらに、捕捉プローブとレポータープローブとの水素結合を介した捕捉ビーズとレポータービーズとのさらなる結合は、二重ビーズ間の相互作用を強化する。
【０１８８】
本発明のこの実施の形態では、標的の非存在下で、捕捉プローブはレポータープローブとハイブリダイズし、それにより図４２Ｂおよび図４３Ａに示すような二重ビーズ複合体が形成される。図４２Ｂおよび図４２Ｃに示すように、二重ビーズ複合体は、標的捕捉後に選択的な制限酵素消化に付される。配列特異的な消化は、図４２Ｄに示すような捕捉プローブとレポータープローブとの水素結合を選択的に切断するであろう。標的の非存在下では、捕捉プローブおよびレポータープローブを保持する水素結合の切断により、二重ビーズは互いに解離する。標的の存在下では、捕捉ビーズおよびレポータービーズは、標的媒介水素結合を介して結合されたままである（図４２Ｄ）。したがって、捕捉された標的の量は、酵素消化後に残っている二重ビーズの数と相関する。
【０１８９】
別法として、制限酵素消化の代わりに、捕捉プローブおよびレポータープローブを保持する結合は、置換可能なリンカーの使用により解くことができる。リンカーは置換プローブを用いて分離される。この場合、レポータープローブは、捕捉プローブと部分的に相補配列を含み、図４３Ａに示すようなミスマッチ突起（mismatch overhang）が生じる。捕
捉プローブとレポータープローブを互いに解離するために、複合体は、捕捉プローブからのレポータープローブの溶解を開始させる熱処理に付され、続いて過剰な置換プローブが加えられる。高濃度の置換プローブおよび置換プローブとミスマッチ突起との間の密接な相互作用により、図４３Ｂおよび図４３Ｃに示すように、捕捉プローブからレポータープローブが解かれる。これにより、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズからのレポータービーズの解離が生じるであろう。
【０１９０】
より詳細には、本発明による二重ビーズ検定は、３μｍの磁気捕捉ビーズおよび２．１μｍの蛍光レポータービーズを用いて実施され得る。これらのビーズは、輸送プローブおよびシグナルプローブそれぞれで被覆される。輸送プローブおよびシグナルプローブは、標的配列、例えばｐＵＣ１９と相補的であることに加えて、図４２Ａ、図４２Ｂ、図４２Ｃ、および図４３Ｄに示すように、互いに相補的な配列を含む。輸送プローブとシグナルプローブを結合する配列は、Ｎｏｔ１を含む非常に稀な制限酵素の切断を受けやすいように設計される。稀な制限酵素および制限部位の使用は、標的ＤＮＡの偶発的な切断を防止する。捕捉ビーズおよびレポータービーズは、さまざまな量の標的ＤＮＡと混合される。標的捕捉後、ＤＮＡ複合体は、Ｎｏｔ１を含む稀な制限酵素による制限消化を受ける。この酵素による制限消化により、レポータービーズを捕捉ビーズに接続しているＤＮＡ配列が切断される。標的ＤＮＡの非存在下では、レポータービーズは捕捉ビーズから解離され、磁気ビーズの磁気濃縮により除去される。したがって、標的配列の存在下でのみ、磁気捕捉ビーズは蛍光レポータービーズに結合し、二重ビーズ検定が行われる。捕捉プローブおよびレポータープローブへの切断可能スペーサの導入により、二重ビーズの特異性および感度が著しく向上する。
【０１９１】
本発明の別の実施の形態では、置換可能リンカーの形成をもたらす、レポータービーズおよび捕捉ビーズのプローブ（プローブ１およびプローブ２Ｂ）の相補配列間の短い重複およびミスマッチ突起が、図４３Ａおよび図４３Ｂに示す置換プローブに関連して用いられる。プローブ２Ｂのミスマッチ突起は、図４２Ｂに示す置換プローブが最初に結合する部位である。置換プローブが突起に結合すると、置換プローブは、プローブ１とプローブ２Ｂとの重複配列の置換を進める。これを図４３Ｃに示す。標的ＤＮＡの非存在下では、レポータービーズは、置換プローブの作用により捕捉ビーズから解離され、結果として磁気ビーズの磁気濃縮により除去される。したがって、標的配列の存在下でのみ、磁気捕捉ビーズは蛍光レポータービーズに結合し、二重ビーズ複合体の非解離が生じる。
【０１９２】
本発明による切断可能スペーサの一般的な動作は、図４４、図４５、図４６Ａ〜図４６Ｃ、図４７、図４８Ａ、図４８Ｂ、および図４９Ａ〜図４９Ｃを参照することにより、より詳細に理解することができ、これらの図は、本発明の２つの実施の形態を図式化したものである。図４４を参照して、捕捉ビーズに、複数の切断可能スペーサ分子２５６が結び付いた誘導体化表面が設けられる。各スペーサ２５６は、切断部位２５８、シグナルプローブ２０６、および輸送プローブ１９８を含む。図４４に示すように、輸送プローブは、図４５に関連して説明するように、金属元素と共有結合を形成するように反応するチオール基を含む。捕捉ビーズは、多孔質であっても中実であってもよく、プラスチック、ガラス、マイカ、シリコンなどのようなさまざまな材料から選択することができる。
【０１９３】
捕捉ビーズ１９０またはレポータービーズ１９２の表面は、切断可能スペーサ分子２５６を含むプローブそれぞれに共有結合を提供するように誘導体化されることが好都合であり得る。次に図４５を参照して、標的の存在を検出するための便利な反射型シグナル発生手段を提供する金属レポータービーズが示されている。金属ビーズの作成に用いられる通常の材料は、金、銀、ニッケル、クロム、白金、銅などであり、ここでは金が好ましいが、それは金が、例えば切断可能スペーサのシグナル応答性末端における遊離ＳＨ基の配位結合を介して、容易かつ緊密に結合することができるからである。金属ビーズは、金属固
体であってもよく、あるいは金属コーティングが施されたプラスチックまたはガラスビーズなどから形成されてもよい。また、金属の代わりの他の反射材料を用いてもよい。ここで好ましい金球体は、シグナルプローブ２０６のチオ基に直接結合する。
【０１９４】
図４４および図４５に示すように、輸送プローブ１９８は、アミド結合を介してアミノ末端に共有結合する。切断可能スペーサ分子は、その切断部位の性質に応じて化学的または酵素的手段、熱、光などにより、検定手順中に切断されやすい切断部位２５８を含む。化学的手段は、シロキサン切断基（cleavage group）、および例示的にそれぞれ、化学的切断部位および化学的切断剤のフッ化ナトリウムおよびフッ化アンモニウム溶液を用いることがここでは好ましい。また、エステル基やジチオ基のような切断されやすい他の基も用いられ得る。金球体がスペーサの切断後に加えられる場合、ジチオ基が特に有利である。別法として、切断部位は、制限酵素を用いた切断の制限部位であってもよい。制限切断は、遺伝的または免疫化学的検定を行う場合に好ましい方法である。スペーサは、全スペーサの完全な切断を最適化するために、２つ以上の切断部位を含み得る。
【０１９５】
切断可能スペーサを用いた核酸検定
本発明の一態様では、輸送プローブおよびシグナルプローブは、試験サンプル中に存在し得る核酸の相補鎖と結合するようになっている。相補的なオリゴヌクレオチドは、特異的結合対の成員を含み、すなわち、１つのオリゴヌクレオチドが、第２の相補的オリゴヌクレオチドに結合する。
【０１９６】
本発明の一実施の形態を図式化した図４６Ａ〜図４６Ｃにより詳細に示すように、輸送プローブ１９８およびシグナルプローブ２０６を含む切断可能スペーサ分子２５６は、捕捉ビーズ１９０およびレポータービーズ１９２の表面上の異なる部位に位置付けられる。図４６Ａに示すように、オリゴヌクレオチド標的剤２０２は、輸送プローブ１９８およびシグナルプローブ２０６に近接して位置付けられる。これらの標的剤が両プローブと相補的である場合、標的剤２０２、輸送プローブ１９８、およびレポータープローブ２０６の間にハイブリダイゼーションが起こり、図４６Ｂに示すように二重螺旋が形成される。標的剤２０２とプローブとの間に相補性がない場合、図４６Ｂにさらに示すようにこれらの基の間には結合がなく、この場合、二重螺旋は形成されない。
【０１９７】
切断部位２５８が切断され、二重螺旋結合オリゴヌクレオチドによる結合がない場合、レポータービーズ１９２は捕捉ビーズ１９０から解放されて解離する。これは、図４６Ｃにより詳細に示される。次に、入射光、特に入射レーザ光によって二重ビーズ複合体１９４の存非を検出することができる。
【０１９８】
切断可能スペーサおよびライゲーションを用いた核酸検定
次に図４７Ａを参照すると、架橋剤２６０を用いる代替の実施の形態の概略表現が示されている。架橋剤２６０は、標的が輸送プローブ１９８およびシグナルプローブ２０６に結合すると、架橋剤２６０が輸送プローブ１９８およびシグナルプローブ２０６の末端間のブリッジとして働くように標的の一部に結合するための、比較的短いオリゴヌクレオチド配列を含み得る。これにより、図４７Ｂに示すような２つの切断箇所（breaks）を有する二重螺旋が形成される。
【０１９９】
図４７Ｃに示す次のステップに移り、本発明の核酸検出の実施の形態のさらなる実施の形態における、切断可能スペーサに関連したＤＮＡリガーゼの使用の概略表現が示されている。ライゲーション手順により、二重螺旋の切断箇所が共有結合される。この共有結合は、検体特異的な結合が二重ビーズ複合体を接着させる強度を高め、それにより、この実施の形態では検定の特異性を高めつつ高いストリンジェンシーの洗浄が可能となる。
【０２００】
本発明の切断可能な反射シグナル要素が、規定サイズの増幅核酸、特に、種々の形態のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた増幅法などを用いて増幅された核酸を検出することに特に適していることは、核酸の検出に熟練した者により理解されるであろう。
【０２０１】
切断可能スペーサを用いた免疫検定
図４８Ａ〜図４８Ｃに示す本発明のさらなる実施の形態では、切断可能スペーサ２５８は、免疫検定を可能にするように修飾された抗体を含む。修飾抗体は、抗体に共有結合されたオリゴヌクレオチドにより媒介される切断可能スペーサ２５８に非共有結合され得る。超分子構造の非共有的な組み合わせ構築を達成するための相補的核酸分子の使用は、共有特許であり同時係属中の、１９９４年１０月３１日に出願された米国特許出願第０８／３３２，５１４号、１９９５年４月１９日に出願された第０８／４２４,８７４号、および１９９６年３月２９日に出願された第０８／６２７，６９５号にさらに詳細に記載されており、これらは参照により本明細書に援用される。別の実施の形態では、抗体は、従来のクロスリンク剤を用いて、直接またはリンカーを介して切断可能スペーサに共有結合することができる。
【０２０２】
抗体プローブは、捕捉ビーズ１９０に結合した抗体輸送プローブ１９６と、レポータービーズ１９２に結合した抗体シグナルプローブ２０８とを含む。ビーズおよびプローブはいずれも、切断可能スペーサ２５８により結合される。抗体輸送プローブ１９６および抗体シグナルプローブ２０８は、対象となる抗原の異なるエピトープ部位に対する親和性を有する。
【０２０３】
図４８Ａ〜図４８Ｃに図式化される免疫検定をさらに参照して、図４８Ａに示すように、標的抗原２０４または非特異的標的剤２００を含む試験溶液を二重ビーズ複合体１９４のコレクションに加えると、標的抗原２０４は、図４８Ｂに示すように、抗体輸送プローブ１９６および抗体シグナルプローブ２０８に結合する。この結合は、切断部位２５８が例えば化学切断剤との接触などにより切断された場合の二重ビーズ複合体１９４のデカップリングを防止する。対照的に、標的剤２００に対する抗体の結合親和性の欠如により、非特異的標的剤２００により結合されていない第２の切断可能シグナル要素は、図４８Ｃに示すように、二重ビーズ複合体を解離させる。
【０２０４】
次に、二重ビーズ複合体１９４の存非を、入射光、特に入射レーザ光の反射率または反射率の非存在として検出することができる。
【０２０５】
明らかであるように、図示のような抗体のカップリングは、本発明の二重ビーズ検定における切断可能スペーサとの使用のための、標準的な免疫検定化学特性（chemistries）および免疫検定幾何学特性（geometries）の適合を可能にする。これらの従来の免疫検定幾何学特性のいくつかは、１９９２年１２月１日に発行された米国特許第５，１６８，０５７号にさらに記載されており当該特許は参照により本明細書に援用される。本発明に効果的に適合され得る他の免疫検定幾何学特性および技法は、Diamandis et al. (eds.), Immunoassay , AACC Press (July 1997); Gosling et al. (eds.), Immunoassay: Laboratory Analysis and Clinical Applications, Butterworth-Heinemann (June 1994); and Law (ed.), Immunoassay: A Practical Guide, Taylor & Francis (October 1996)に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に援用される。したがって、図４８Ａ〜図４８Ｃに図式化されている検体の直接検出は、本発明の切断可能スペーサ型二重ビーズ検定および検定デバイスに適合可能な免疫検定幾何学特性の１つにすぎない。
【０２０６】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびヒトヘルペスウイルスをスクリーニングする免疫検定において特に有益で
あることがわかる。
【０２０７】
抗体は特異的結合対の広い概念を例示するものであり得、抗体は特異的結合対の第１の成員であり得、それが結合する抗原は特異的結合対の第２の成員であるとみなすことができることが、さらに理解されるであろう。概して、特異的結合対は、２つの分子として規定することができ、その相互親和性は、本発明の実施を可能にするのに十分な結合力および特異性を有する。したがって、本発明の切断可能スペーサは、副次的成員（side members）として他の特異的結合対成員を含み得る。このような実施の形態では、切断可能シグナル要素の第１の副次的成員は第１の特異的結合対の第１の成員を含み、切断可能スペーサの第２の副次的成員は第２の特異的結合対の第１の成員を含み、上記第１の特異的結合対の上記第２の成員および上記第２の特異的結合対の上記第２の成員は、互いに接続可能に結び付いており、以下の一般式の連結ループ（tethering loop）の形成を可能にする：第１の特異的結合対の第１の第１の成員−第１の特異的結合対の第２の成員−第２の特異的結合対の第２の成員−第２の特異的結合対の第１の成員。
【０２０８】
当該技術分野において既知の特異的結合対としては、生物的受容体およびその天然のアンタゴニストおよびアンタゴニストリガンド、タンパク質および補助因子、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、αスペクトリンおよびβスペクトリンモノマー、および抗体のＦｃタンパク質およびＦｃ受容体が挙げられる。
【０２０９】
固相へのＤＮＡ結合の方法
ビーズまたはバイオディスクなどの固相へのプローブの結合の成功は、本発明の二重ビーズ検定の重要なステップである。本発明のいくつかの実施の形態では、プローブはビーズに共有結合する。共有結合の効率は、利用するビーズのタイプおよび用いられる特定の共役法に依存する。
【０２１０】
図４９に示すように、プローブ結合のための固相の使用を評価する体系的方法が提示される。この方法は、二重ビーズ検定の特異性を改善する共有結合を特定する。この手法を用いて、固相の処理（すなわち、ビーズの表面またはバイオディスクの表面などの固相の被覆）を評価し、その処理が固相結合効率を改善するか否かを調べ得る。第１のステップとして、その後に結合したプローブを検出してその量を測定するために、プローブに適当な分子でタグを付ける。非限定的な例として、ビオチン部分（Ｂ）を、ＤＮＡプローブの３’末端に結合させることができる。次に、クロスリンク剤、例えばＥＤＣ（１−エチル３−３ジメチルアミノプロピルカルボジイミド−ＨＣｌ）の存在下または非存在下で、プローブを結合させる。クロスリンク剤の存在下では、プローブは共有結合および非共有結合する。あるいは、クロスリンク剤の非存在下では、プローブはビーズに非共有的に吸収される。適当な洗浄ステップがなされた後、プローブであらかじめ標識されたビオチン分子の特異的結合に検出剤が加えられる。例えば、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｓ−ＡＰ）をプローブ結合ビーズに添加すると、Ｓ−ＡＰはビオチン化プローブに特異的に結合する。次に、アルカリホスファターゼ基質をサンプルに添加する。この基質はリン酸基を失うと発色し、色の強度はビーズに結合したプローブの量に相関する。適当な培養期間後、溶液が単離され、適当な波長の溶液の光学濃度を、分光光度計またはマイクロタイタープレート読み取り装置で測定する。
【０２１１】
図５０を参照して、カルボキシル化ビーズ上へのオリゴヌクレオチドプローブの結合が示されている。プローブの結合は、共有的または非共有的に実行され得る。図５１Ａ、図５１Ｂ、図５３Ａ、および図５３Ｂに関連してさらに詳細に説明するように、二重ビーズ検定では、プローブの共有結合が非共有結合よりも好ましい。この共役プロセスは、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、および図１２Ｂに提示するように、二重ビーズ検定のステップＩの前に行われる。固体表面に共有結合したプローブの量は、固相に共有結合または非
共有結合する、すなわちクロスリンク剤（例えばＥＤＣ）の存在下または非存在下で非特異的に結合する、プローブの量を判定することにより評価することができる。非共有結合プローブの割合は、式１００％＊Ｎ／Ｔに従って求めることができ、共有結合プローブの割合は、式１００％＊（Ｔ−Ｎ）／Ｔにより求めることができ、ここで、「Ｔ」は、クロスリンク剤の存在下で得られるシグナルの総量（すなわち、共有結合および非共有結合したプローブの総量）を表し、「Ｎ」は、クロスリンク剤を使用しない場合に得られるシグナルの総量を表す。別法として、共有結合したプローブの量は、すべての非共有結合プローブがＳ−ＡＰの添加前に除去される場合に直接得ることができる。これは、Ｓ−ＡＰを添加するステップの前に７０℃までビーズを過熱することにより好都合に行うことができる。非共有結合ビーズの割合が２０％未満である場合、試験されているビーズは共有結合のための固相として用いることができる。この方法を適用した結果を、図５１Ａ、図５１Ｂ、および図５５に提示する（詳細は実施例７を参照）。
【０２１２】
図５１Ａおよび図５１Ｂに示すように、１．８μｍ、２．１μｍ、および３μｍのビーズは、少なくとも７５％の結合効率を有し、プローブ共有結合に適した固相を提供する。しかしながら、１〜２μｍのビーズは、２１％未満という低い共有結合効率のため、プローブの共有結合には適していない可能性がある。
【０２１３】
本発明の種々の実施の形態は、核酸分子をプローブとして利用する。図５２Ａは、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの構造差を示すことにより、一本鎖ＤＮＡの方がより容易に固相に非共有結合する仕組みを示す。一本鎖ＤＮＡは、容易に固相に非共有的に吸収され得る疎水性塩基側鎖を有する。対照的に、二本鎖ＤＮＡでは、固相との疎水性塩基相互作用は通常は起こらず、非共有すなわち非特異的結合は一本鎖ＤＮＡ分子と比較して制限される。したがって、本発明の種々の実施の形態では、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡの代わりに利用することにより、共有結合によるＤＮＡの固相への結合を促進することができる（図５２Ｂ）。二本鎖ＤＮＡプローブの鎖の１つが固相に共有結合した後、非共有結合している鎖は、適当な緩衝液中で７０℃でサンプルを加熱することにより除去することができる。これらの条件下で、二本鎖ＤＮＡは分離され、ビーズに共有結合している一本鎖ＤＮＡプローブのみが残って標的の捕捉に用いられる。プローブ共有結合のための二本鎖ＤＮＡの使用に関する実験の詳細は、以下の実施例８でさらに詳細に説明する。
【０２１４】
本発明の種々の実施の形態では、熱処理を用いて、非共有結合プローブ（複数可）を固相から選択的に除去することができる。この方法は、例えば、固相のタイプ、固相の処理、および二本鎖ＤＮＡの使用をすべて最適化したにもかかわらず、固相への非共有結合が依然として問題である場合に、有用である。熱処理の条件は最適化されている。最適な緩衝液は、２％ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２である。高温では磁気ビーズがその磁性を失う可能性があるため、処理は約７０℃以下の温度で行われる。
【０２１５】
本発明の他の実施の形態では、二重ビーズ検定の特異性を高める共有結合を得るために最適な条件を決定する、本明細書に提示する方法は、固相として用いられるディスク表面に適用してもよい。同様に、本発明は、タンパク質結合のための固体表面を評価するための本明細書中で上述した実施の形態に類似の、他の実施の形態を提供する。例えば、このような用途は、利用するプローブが抗原または抗体である場合に有用であろう。
【０２１６】
次に図５３Ａを参照して、二重ビーズ検定で用いるための２つの異なる捕捉ビーズ上のプローブに結合された標的を検出する酵素検定から収集した結果の棒グラフが示されている。図５１Ａで上述したように、１〜２μｍのビーズは最高２０％の共有結合効率を有し、残りのプローブは非共有結合し、３μｍのビーズの共有結合効率は７５〜８５％である。図５３Ａに示すデータは、試験されたビーズの双方が、プローブが共有結合しているか
非共有結合しているかに関係なく、同様の量の標的と結合することを示す。これは、共有結合が酵素検定フォーマットに必要ではないことを示す。
【０２１７】
図５３Ａとは対照的に、図５３Ｂは、図５３Ａで用いた同じ捕捉ビーズにより捕捉されたレポータービーズの数を調べるように設計された二重ビーズ検定の結果を提示している。図５３Ｂに示す結果は、検定の感度を高めるために、捕捉ビーズへのプローブの共有結合が必要であることを示す。本発明のこの特定の実施の形態では、上述のように、３μｍの捕捉ビーズは、１〜２μｍのビーズよりも多くの共有結合を含む。これは、捕捉ビーズ上の共有的に連結されたプローブが非共有結合プローブよりも高い結合強度を有するため、二重ビーズ複合体におけるレポータービーズの保持を可能にする。
【０２１８】
上記の本発明の概要で述べたように、ビーズの表面すなわち固相は平坦ではなく、これが溶液中の標的へのプローブの可触性を制限する。図５２Ａを参照して説明したように、プローブリンカーを用いてプローブの長さを延長し、プローブの標的への可触性を高めることができる。
【０２１９】
次に図５４を参照して、ＰＥＧをリンカーとして用いて改善された標的結合を示す、二重ビーズ検定から収集した結果のデータが提示されている。リンカーは、検定感度を約５０％以上高めることができる。リンカーの使用により、捕捉ビーズへのレポータービーズの非特異的結合も低減する。本発明のこの実施の形態では、プローブは、リンカー分子により固相に結合される。リンカー分子の使用により、プローブの長さおよび剛性が増す。これらの２つの特性は、プローブ（複数可）の可触性を高め、したがって、標的捕捉の効率および二重ビーズ検定の感度を最大にする。当業者には既知であるように、本明細書に記載する基準を満たすさまざまなリンカー分子を用いることができる。非限定的な例として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をリンカー分子として用いることができる。本発明のいくつかの実施の形態では、リンカーは、ＤＮＡプローブの５’末端に共有結合する一連の３〜１０ＰＥＧ分子であり得る。リンカー分子としてのＰＥＧの使用に関する詳細は、以下の実施例９で説明する。
【０２２０】
次に図５５を参照して、３μｍのSpherotech製ビーズに関する共有的なプローブ濃度の割合の測定を示す棒グラフが示されている。これらのグラフは、ビオチン化プローブおよびストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ酵素反応を用いた酵素検定から生成されるシグナルを表す。図５０を参照して説明したように、共有結合効率は、非熱処理ビーズに結合したプローブの総量を測定することにより計算することができる。次に、ビーズの別個のアリコートを加熱して、非共有結合プローブを除去し、次に、共有結合プローブの量を、以下の実施例７で説明するように酵素検定を用いて測定する。次に、これらのデータにより、プローブの共有結合の割合を、以下の式：Ｈ／Ｔ＊１００を用いて求めることができる。ここで、Ｈは熱処理ビーズからのシグナルを表し、Ｔは非熱処理ビーズからの全シグナルを表す。
【０２２１】
図５６は、界面活性剤を含む種々の遮断剤でのビーズの前処理を説明する棒グラフ表現である。検定感度は、捕捉ビーズへのレポータービーズの非特異的結合であるベースラインシグナルと逆相関するため、ビーズの非特異的結合を低減させることは二重ビーズ検定において重要である。したがって、ベースラインが低いほど、検定の感度はより高まる。図示のように、サケ精子ＤＮＡの使用は、この実験で試験された他の遮断剤に比して、非特異的結合を低減するのに最も効果があった。サケ精子ＤＮＡによる遮断は、非特異的結合を約１０分の１に低減した。したがって、サケ精子ＤＮＡは、本発明の一態様ではビーズの非特異的結合を遮断する好ましい方法である。ＢＳＡ、デンハルト溶液、およびスクロースを含む他の遮断材を用いてもよい。好ましくは、ビーズは、図５０に示すような結合および熱処理の後に、または上記の図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、および図１２Ｂの
ステップＩの前に、適当な遮断剤により遮断して、二重ビーズ検定の感度を高めるべきである。
【０２２２】
ビーズの非特異的結合を低減する方法
上述のように、図５６は、ビーズの非特異的結合を低減するための、界面活性剤を含む種々の遮断剤でのビーズの前処理を説明する棒グラフ表示である。検定感度は、捕捉ビーズへのレポータービーズの非特異的結合であるベースラインシグナルと逆相関するため、ビーズの非特異的結合を低減させることは二重ビーズ検定において重要である。したがって、ベースラインが低いほど、検定の感度はより高まる。図示のように、サケ精子ＤＮＡの使用は、この実験で試験された他の遮断剤に比して、非特異的結合を低減するのに最も効果があった。サケ精子ＤＮＡによる遮断は、非特異的結合を約１０倍低減した。したがって、サケ精子ＤＮＡは、本発明の一態様ではビーズの非特異的結合を遮断する好ましい方法である。ＢＳＡ、デンハルト溶液、およびスクロースを含む他の遮断材を用いてもよい。好ましくは、ビーズは、上記の図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、および図１２ＢのステップＩの前に、適当な遮断剤により遮断して、二重ビーズ検定の感度を高めるべきである。
【０２２３】
図５７は、二重ビーズ検定において蛍光レポータービーズを用いた濃度依存標的検出を示す、蛍光測定器を用いて生成されたデータの棒グラフである。このグラフは、標的ＤＮＡのピコモル濃度対二重ビーズ複合体に結合したビーズの数を示す。このグラフに示す標的検出のダイナミックレンジは、０．２５ｐＭ〜２５００ｐＭ（ピコモル／リットル）である。この特定のグラフは、蛍光測定器からのデータを用いて生成したが、蛍光型光ディスクドライブを用いて結果を生成してもよい。標的濃度の範囲の検出に関する実験からの実験の詳細は、実施例１０で詳細に説明する。
【０２２４】
次に図５８、図５９、図６０、図６１Ａ、および図６１Ｂを参照して、ハイブリダイゼーション緩衝液または検定緩衝液中の種々の塩の最適濃度またはイオン強度を判定するために行われる実験からのデータが示されている。検定緩衝液中の塩濃度は、ハイブリダイゼーション効率または結合効率を高め、かつ捕捉ビーズとレポータービーズとのビーズの非特異的結合を低減して、それにより検定の感度を高める信号対雑音比の低下をもたらすように最適化する必要がある。概して、これらの図に提示されているデータは、４０ｍＭ
ＥＤＴＡ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２が、二重ビーズ検定の一実施の形態での使用に最適な塩濃度であることを示す。
【０２２５】
図５８を特に参照して、ビーズ緩衝液中の種々のＮａＣｌ濃度と、緩衝液のイオン強度の変化の結果としての関連する非特異的結合とを用いた実験から収集したデータを示す棒グラフ表現がある。図５８に提示される結果に基づいて、二重ビーズ検定で用いるのに最適なビーズ緩衝液の塩化ナトリウム濃度は０．２Ｍであり、これはビーズの非特異的結合がこのＮａＣｌ濃度で最小になるからである。
【０２２６】
次に図５９を参照して、種々の標的濃度を用いた二重ビーズ検定感度に対するＥＤＴＡ濃度上昇の影響を示す棒グラフが示されている。図５９は、検定緩衝液中のＥＤＴＡの濃度の影響を受けた、関連する非特異的結合も示す。提示されているデータに基づいて、ハイブリダイゼーション緩衝液で用いるのに最適なＥＤＴＡ緩衝液濃度は４０ｍＭであり、これは二重ビーズ検定から生成されるシグナルがこの濃度で最高になるからである。
【０２２７】
同様に、図６０は、種々の標的濃度を用いた二重ビーズ検定感度に対するＮａＣｌ濃度上昇の影響を示す棒グラフ表示を提示している。緩衝液のＮａＣｌ濃度の最適化に関するビーズの非特異的結合データは、図５８に提示されている。図６０に示すように、二重ビーズ検定で実施されるハイブリダイゼーションに最適なＮａＣｌ濃度は０．３Ｍ  ＮａＣ
ｌである。このデータを生成するために用いられた実験手順の詳細な説明は、以下の実施例１１で説明する。
【０２２８】
次に図６１Ａおよび図６１Ｂに移り、二重ビーズ検定感度および酵素検定感度それぞれに対する、検定緩衝液中のＭｇＣｌ２濃度上昇の影響を示す棒グラフ表現が示されている。これらの図からのデータは、ハイブリダイゼーション緩衝液中の３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２の濃度が、生成されるシグナルを増加させ、かつ検定感度を高めるのに最適であることを示す。図６１Ａおよび図６１Ｂに示すデータによると、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２処理では、酵素検定の方が二重ビーズ検定よりも高感度であると思われる。この結論は、種々の標的濃度からの処理群内のシグナルの差に基づく。したがって、図示のように、図６１Ｂの酵素検定の３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２群の濃度曲線の傾きは、図６１Ａの対応する曲線よりも急である。実施例１２では、図６１Ａに関する実験を実行する手順を詳細に説明する。
【０２２９】
次に図６２に移り、ビーズ検定の感度を高めるためのプローブ遮断剤の使用のイラスト表現が示されている。この特定の実施例で用いられるプローブ遮断剤は、ビーズのプローブと相補的なビオチン化ＤＮＡである。ビーズの過剰なプローブを遮断するために用いられるプローブ遮断剤の量は、プローブの所定部分が遮断剤により遮断されるような量である。二重ビーズ検定でのプローブ遮断剤の使用は、二重ビーズ検定での１つの捕捉およびレポータービーズへの標的結合の確率を高めるという点で、検定の感度を高める。これにより、二重ビーズ複合体ごとに１つの標的まで、二重ビーズ検定の感度を高めることができる。ビオチン化プローブ遮断剤の使用は、検定の最適化のためのプローブ遮断剤の遮断効率の定量を可能にする。ビーズに結合したビオチン化プローブの量は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓ−ＡＰ）を含むストレプトアビジン化またはニュートラビジン化（neutravidinated）酵素およびその適切な基質を用いた酵素検定により定量することができる。この試験に用いる酵素および基質の選択は、所望のタイプの検出により決まる。一般的に、酵素−基質反応により分光光度計で定量される色を生成する比色試験を実施する。別法として、蛍光測定器またはＦｌｕｏｒｉｍａｇｅｒを用いて定量され得るストレプトアビジン化またはニュートラビジン化蛍光タグを用いてもよい。比色定量および蛍光定量はいずれも、図１および図２に示す適当な光ディスク読み取り装置を用いて実行してもよい。
【０２３０】
図６３は、二重ビーズ検定でのハイブリダイゼーション反応中に種々の標的濃度を用いた、生成されるシグナルおよび検定感度に対する培養時間の影響を示すデータの棒グラフ表示を示す。データは、二重ビーズ検定で最高のシグナルおよび感度を得るのに必要な最短培養時間が２時間であり、４時間または一晩のハイブリダイゼーションは必要ないことを示す。
【０２３１】
同様に、図６４は、二重ビーズ検定で実施されるハイブリダイゼーション反応において種々の標的濃度を用いた、ハイブリダイゼーション効率および検定感度に対する培養時間および混合の影響を示す、収集されたデータの棒グラフを示す。図６３におけるように、図６４もまた、２時間がハイブリダイゼーションの最適時間であり、ハイブリダイゼーション時間の延長によりシグナル生成が増加しないことを示す。さらに、混合により、対照に比して、２時間のハイブリダイゼーション後のハイブリダイゼーション効率が著しく高まった。以下に提示する実施例１４では、図６３および図６４に示すデータを生成するために行われる実験に関する詳細を説明する。
【０２３２】
非特異的結合複合体の除去を含む二重ビーズ調製法
以下の調製法は、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、および図１２Ｂに関連して上述した対応する方法のより具体的な代替の実施の形態である。
【０２３３】
次に図６５Ａおよび図６５Ｂを参照して、本発明の一態様による溶液中の二重ビーズ複合体構造を作成する「シングルステップハイブリダイゼーション」技法を用いた分子検定の準備法が示されている。この方法は、図１１Ａに関連して上述した方法と同様である。本方法は、ステップＩ、ステップＩＩ、ステップＩＩＩ、ステップＶＩ、ステップＶ、ステップＶＩ、ステップＶＩＩ、およびステップＶＩＩＩとして連続的に示す８つの主なステップを含む。
【０２３４】
この方法のステップＩでは、オリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８で被覆されたいくつかの捕捉ビーズ１９０を、緩衝溶液２１０を含む試験管２１２に入れる。この方法で用いる捕捉ビーズ１９０の数は、例えば約１０Ｅ＋０７であり、それぞれの直径は約１μｍ以上であり得る。捕捉ビーズ１９０をハイブリダイゼーション溶液に懸濁し、ピペット２１４による注入により試験管２１２にロードする。好ましいハイブリダイゼーション溶液は、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物からなる。所望のハイブリダイゼーション温度は３７℃である。この実施の形態の予備的ステップでは、輸送プローブ１９８を、ＥＤＣ結合により３μｍの磁気捕捉ビーズ１９０に結合させる。結合法に関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡された、２００１年２月２７日に出願された「Methods for Attaching Capture DNA and Reporter DNA to Solid Phase Including Selection of Bead Types as Solid Phase」と題する米国仮出願第６０／２７１，９２２号、および２００１年３月２２日に出願された「Methods of Conjugation for Attaching Capture
DNA and Reporter DNA to Solid Phase」と題する米国仮出願第６０／２７７，８５４号に開示されており、これら出願の双方は、その内容がすべて参照により本明細書に援用される。
【０２３５】
ステップＩＩに示すように、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２を溶液に添加する。オリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的剤２０２と相補的である。したがって、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２は、図８Ａに示すように捕捉ビーズ１９０に結び付いた輸送プローブ１９８の相補配列に結合する。
【０２３６】
次にステップＩＩＩを参照して、オリゴヌクレオチドシグナルプローブ２０６で被覆されたレポータービーズ１９２を溶液２１０に添加する。図９Ａおよび図１０Ａにも示すように、シグナルプローブ２０６は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２と相補的である。一実施の形態では、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２の一部と相補的なシグナルプローブ２０６は、２．１μｍの蛍光レポータービーズ１９２に結合する。シグナルプローブ２０６および輸送プローブ１９８はそれぞれ、標的ＤＮＡ２０２と相補的ではあるが互いに相補的ではない配列を有する。レポータービーズ１９２を加えた後、標的ＤＮＡ２０２が捕捉ビーズ１９０とレポータービーズ１９２とを連結するように、二重ビーズ複合体１９４が形成される。特定の完全な洗浄により、レポータービーズ１９２と捕捉ビーズ１９０との間の非特異的結合は最小限に抑えられるはずである。標的剤２０２およびシグナルプローブ２０６は、３７℃で３〜４時間ハイブリダイズされることが好ましい。
【０２３７】
この実施の形態および他の実施の形態では、ハイブリダイゼーション中の断続的混合（すなわち、周期的混合とそれに続く停止）により、連続的混合よりも二重ビーズ複合体の収量が高まることが見出された。したがって、このステップをディスク上で行う場合、図２のディスクドライブモータ１４０およびコントローラ１４２を用いて、ディスクを周期的に回転させ、所望の断続的混合を行うことが有利であり得る。これは、回転および停止セッションの好ましいデューティサイクルを用いた規定の方法で、ディスクを一方向に回転させ、次にディスクを停止させ、その後ディスクを同じ方向に再び回転させるという、ディスクに符号化された混合プロトコルで実施され得る。別法として、符号化された混合プロトコルは、回転、停止、および逆回転セッションの好ましいデューティサイクルを用
いて、第１の方向にディスクを回転させ、次にディスクを停止させ、その後ディスクを逆方向に再び回転させることができる。本発明のこれらの特徴は、図３３Ａおよび図３５に関連してさらに詳細に説明されている。
【０２３８】
次に、図６５ＡのステップＩＶに示すように、ハイブリダイゼーション後、二重ビーズ複合体１９４を溶液中の未結合レポータービーズから分離する。捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液に磁界を印加して二重ビーズ複合体構造１９４を捕捉することができる。磁界は、内蔵磁石２１８を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、内蔵磁石２１８は、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中のいかなる未結合レポータービーズも除去するように、永久磁石であっても電磁石であってもよい。レポータービーズに結合していない捕捉ビーズも単離されることに留意されたい。別法として、この磁気による除去ステップは、図３３Ａ、図３５、および図３６Ａ〜図３６Ｃに示すようにオンディスクで行ってもよい。
【０２３９】
ステップＩＶに示す精製プロセスは、浮遊粒子を含む上清の除去を含む。洗浄緩衝液を試験管に添加し、ビーズ溶液を十分に混合する。１ステップ検定に好ましい洗浄緩衝液は、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡからなる。未結合レポータービーズ１８２、浮遊ＤＮＡ、および非特異的結合粒子のほとんどは、攪拌されて、上清から除去される。二重ビーズ複合体は、捕捉ビーズ、標的配列、およびレポータービーズのマトリックスを形成することができ、ここで、重なり合った二重ビーズ粒子の格子構造に捕獲された浮遊粒子の抽出の際に、洗浄プロセスがさらに役立ち得る。捕捉ビーズへのレポータービーズの非特異的結合を低減する方法に関連する他の態様に関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された、２００１年２月２８日に出願された「Reduction of Non-Specific Binding in Dual Bead Assays by Selection of Bead Type and Bead Treatment」と題する米国仮出願第６０／２７２，１３４号、および２００１年３月１２日に出願された「Reduction of Non-Specific Binding in Dual Bead Assays by Selection of Buffer Conditions and Wash Conditions」と題する米国仮出願第６０／２７５，００６号に開示されており、これら出願の双方は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０２４０】
図６５Ａにおける次のステップはステップＶである。このステップでは、図示のように、二重ビーズ複合体を洗浄緩衝溶液で約３〜５分間洗浄してから、制限酵素、尿素、酸（好ましくは強酸）、または塩基（好ましくは強塩基）を二重ビーズ溶液に添加することができる。このようにして、二重ビーズ複合体は、これらの解離剤の作用により解離され、それにより、６５ＢのステップＶＩに示すように、捕捉ビーズ１９０からレポータービーズ１９２を解放する。
【０２４１】
二重ビーズ構造の解離後、ステップＶＩＩに示すように、溶液中の、未結合となったレポータービーズ１９２から捕捉ビーズ１９０を分離する。溶液に磁界を印加して、磁気捕捉ビーズ１９０を捕捉することができる。磁界は、内蔵磁石２１８を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、内蔵磁石２１８は、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中のいかなる未結合レポータービーズも除去するように、永久磁石であっても電磁石であってもよい。ステップＶＩの間に分離されなかった非解離二重ビーズ複合体も溶液から除去されることに留意されたい。ステップＶＩＩの間、解放されたレポータービーズを含む上清を、ピペット２１４を用いて回収する。次に、検定混合物を、ディスク１４４または１８０にロードして、ステップＶＩＩＩに示すように、光バイオディスクまたは医療ＣＤ読み取り装置を用いて分析することができる。レポータービーズの分析には、透過型バイオディスク１８０を用いてもよく、または反射型バイオディスク１４４を用いてもよい。反射型および透過型光バイオディスクに関する詳細は、それぞれ図３Ａ〜図３Ｃおよび図
４Ａ〜図４Ｃに関連して上述されている。光バイオディスクを分析するために用いることができる光バイオディスク読み取り装置および他の代替のディスク読み取り装置は、図１および図２に関連して詳細に上述されている。レポータービーズが蛍光である場合、ステップＶＩＩで単離されたレポータービーズもまた、蛍光測定器または蛍光光ディスク読み取り装置を含む任意の同様の蛍光型分析装置を用いて定量することができる。
【０２４２】
図６６Ａおよび図６６Ｂは合わせて、図６５Ａおよび図６５Ｂの方法と同様に、溶液中で二重ビーズ複合体構造を作成する「シングルステップ抗原結合」法を用いた免疫検定を示す。この方法も同様に、８つの主なステップを含み、図１１Ｂに関連して上述した方法に関する。この方法の８つのステップは、図６６Ａおよび図６６Ｂにおいて、それぞれステップＩ、ステップＩＩ、ステップＩＩＩ、ステップＩＶ、ステップＶ、ステップＶＩ、ステップＶＩＩ、およびスステップＶＩＩＩとして示す。
【０２４３】
図６６ＡのステップＩに示すように、例えば、数が約１０Ｅ＋０７でそれぞれの直径が約１μｍ以上であり、抗体輸送プローブ１９６で被覆された捕捉ビーズ１９０を、緩衝溶液２１０に添加する。この溶液は、図６５Ａおよび図６５Ｂに示す方法で用いられるものと同じであってよく、または免疫化学的検定で用いるように特別に調製してもよい。抗体輸送プローブ１９６は、標的抗原２０４に対して特異的親和性を有する。輸送プローブ１９６は、図８Ｂにも示すように、標的抗原２０４内のエピトープに特異的に結合する。一実施の形態では、標的抗原の一部に対する親和性を有する抗体輸送プローブ１９６は、ＥＤＣ結合を介して３μｍの磁気捕捉ビーズ１９０に結合することができる。別法として、捕捉ビーズ１９０への輸送プローブ１９６の結合は、受動的な吸着により達成することができる。
【０２４４】
次に図６６Ａに示すステップＩＩを参照して、標的抗原２０４を溶液に添加する。標的抗原２０４は、図８Ｂにも示すように、捕捉ビーズ１９０に結び付いた抗体輸送プローブ１９６に結合する。
【０２４５】
ステップＩＩＩに示すように、抗体シグナルプローブ２０８で被覆されたレポータービーズ１９２を溶液に添加する。抗体シグナルプローブ２０８は、図９Ａおよび図１０Ｂにも提示するように、標的抗原２０４のエピトープに特異的に結合する。一実施の形態では、シグナルプローブ２０８は２．１μｍの蛍光レポータービーズ１９２に結合する。シグナルプローブ２０８および輸送プローブ１９６はそれぞれ、標的抗原の特異的エピトープに結合するが、互いには結合しない。レポータービーズ１９２を添加した後、標的抗原２０４が捕捉ビーズ１９０とレポータービーズ１９２とを連結するように、二重ビーズ複合体１９４が形成される。特定の完全な洗浄により、レポータービーズ１９２と捕捉ビーズ１９０との間の非特異的結合は最小限に抑えられるはずである。
【０２４６】
ステップＩＶでは、ステップＩＩＩでの結合後に、二重ビーズ複合体１９４を溶液中の未結合レポータービーズから分離する。捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液に磁界を印加して二重ビーズ複合体構造１９４を捕捉することができる。磁界は、内蔵磁石２１８を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、内蔵磁石２１８は、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中のいかなる未結合レポータービーズも除去するように、永久磁石であっても電磁石であってもよい。レポータービーズに結合していない捕捉ビーズも単離されることに留意されたい。別法として、上記で示したように、この磁気による除去ステップは、図３３Ａ、図３５、および図３６Ａ〜図３６Ｃに示すようにオンディスクで行ってもよい。
【０２４７】
ステップＩＶの精製プロセスは、浮遊粒子を含む上清の除去を含む。洗浄緩衝液を試験管に添加し、ビーズ溶液を十分に混合する。未結合レポータービーズ１８２、浮遊タンパ
ク質サンプル、および非特異的結合分子のほとんどは、攪拌されて、上清から除去される。二重ビーズ複合体は、捕捉ビーズ、標的抗原、およびレポータービーズのマトリックスを形成することができ、ここで、重なり合った二重ビーズ粒子の格子構造に捕獲された浮遊粒子の抽出の際に、洗浄プロセスがさらに役立ち得る。
【０２４８】
図６６Ａにおける次のステップはステップＶである。このステップでは、図示のように、二重ビーズ複合体を洗浄緩衝溶液で約３〜５回洗浄してから、尿素、酸、または塩基を解離剤として、図示のようにピペット２１４を用いて二重ビーズ溶液に添加することができる。本明細書で用いられる酸または塩基は、それぞれ強酸または強塩基であることが好ましい。このようにして、二重ビーズ複合体は、これらの解離剤の作用により解離され、それにより、６６ＢのステップＶＩに示すように、捕捉ビーズ１９０からレポータービーズ１９２を解放する。
【０２４９】
二重ビーズ構造の解離後、ステップＶＩＩに示すように、溶液中の、未結合となったレポータービーズ１９２から捕捉ビーズ１９０を分離する。オンディスクまたはオフディスクで溶液に磁界を印加して、磁気捕捉ビーズ１９０を捕捉することができる。ここで示す予備的なオフディスク方法では、磁界は、内蔵磁石２１８を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、内蔵磁石２１８は、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中のいかなる未結合レポータービーズも除去するように、永久磁石であっても電磁石であってもよい。ステップＶＩの間に分離されなかった非解離二重ビーズ複合体も溶液から除去されることに留意されたい。ステップＶＩＩでは、解放されたレポータービーズを含む上清を、ピペット２１４を用いて回収する。次に、検定混合物を、ディスクに直接ロードして、ステップＶＩＩＩに示すように、光バイオディスク読み取り装置を用いて分析することができる。レポータービーズの分析には、透過型バイオディスク１８０を用いてもよく、または反射型バイオディスク１４４を用いてもよい。反射型および透過型光バイオディスクに関する詳細は、それぞれ図３Ａ〜図３Ｃおよび図４Ａ〜図４Ｃに関連して詳細に説明されている。光バイオディスクを分析するために用いることができる光バイオディスク読み取り装置および他の代替のディスク読み取り装置は、図１および図２を参照して詳細に上述されている。レポータービーズが蛍光である場合、ステップＶＩＩで単離されたレポータービーズもまた、蛍光測定器または蛍光光ディスク読み取り装置を含む任意の同様の蛍光型分析装置を用いて定量することができる。
【０２５０】
図６７Ａおよび図６７Ｂは合わせて、ここでは「２ステップハイブリダイゼーション」と呼ばれる代替の遺伝的検定法を示す。この方法は、図１２Ａに関連して上述した方法を変更した実施の形態である。本方法は、二重ビーズ複合体を作成することを対象とする９つの主なステップを有する。概して、捕捉ビーズを、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的剤と相補的なオリゴヌクレオチド輸送プローブ１９８で被覆し、緩衝溶液に入れる。この実施の形態では、標的剤の一部と相補的な輸送プローブを、ＥＤＣ結合によって３μｍの磁気捕捉ビーズに結合させる。固相へのオリゴヌクレオチド輸送プローブの他のタイプの結合を利用してもよい。これらは、例えば、受動的な吸着またはストレプトアビジン−ビオチン相互作用の使用を含む。本発明のこの方法による９つの主なステップは、図６７ＡにおけるステップＩ、ステップＩＩ、ステップＩＩＩ、ステップＩＶ、ステップＶ、およびステップＶＩとして、また図６７ＢにおけるステップＶＩＩ、ステップＶＩＩＩ、およびステップＩＸとして連続的に示される。
【０２５１】
次に図６７Ａに示すステップＩをより詳細に参照して、ハイブリダイゼーション溶液に懸濁した捕捉ビーズ１９０を、ピペット２１４から試験管２１２にロードする。好ましいハイブリダイゼーション溶液は、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物である。望ましいハイブリダイゼーション温度は３７℃である。
【０２５２】
ステップＩＩでは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ２０２が溶液に添加され、捕捉ビーズ１９０に結び付いた輸送プローブ１９８の相補配列に結合する。この方法の１つの特定の実施の形態では、標的剤２０２および輸送プローブ１９８を、３７℃で２〜３時間ハイブリダイズさせる。しかしながら、十分なハイブリダイゼーションは室温で３０分間以内で行うことができる。高温では、ハイブリダイゼーションはほぼ瞬時に行うことができる。
【０２５３】
次にステップＩＩＩに示すように、捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液に磁界を印加して結合している標的配列を単離することにより、捕捉ビーズに結合している標的剤２０２を溶液中の未結合種から分離する。磁界は、内蔵の永久磁石２１８または電磁石を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、永久磁石２１８または電磁石は、磁気ビーズを引き出して、溶液のピペット抽出によって懸濁液中に浮遊するいかなる未結合標的ＤＮＡ２０２も除去する。上記の方法に関して、この方法のオンディスクの方法では、この磁気による除去ステップは、図３３Ａ、図３５、図３６Ａ〜図３６Ｃに示すように行ってもよい。洗浄緩衝液を添加し、分離プロセスを繰り返すことができる。輸送プローブ１９８および標的ＤＮＡ２０２のハイブリダイズ後の好ましい洗浄緩衝液は、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、および０．０５％  Ｔｗｅｅｎからなる。ビーズへの標的剤の非特異的結合を低減するためのハイブリダイゼーション法および技法は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００１年３月２６日に出願された「Reduction of Non-Specific Binding of Dual Bead Assays by Use of Blocking Agents」と題する米国仮出願第６０／２７８，６９１号にさらに開示されている。この出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０２５４】
次に図６７Ａに示すステップＩＶを参照して、図６５Ａに示す方法に関連して説明したように、レポータービーズ１９２を溶液に添加する。レポータービーズ１９２は、標的剤２０２と相補的なシグナルプローブ２０６で被覆される。この方法の１つの特定の実施の形態では、標的剤２０２の一部と相補的なシグナルプローブ２０６は、２．１μｍの蛍光レポータービーズ１９２に結合する。シグナルプローブ２０６および輸送プローブ１９８はそれぞれ、標的剤２０２と相補的ではあるが互いに相補的ではない配列を有する。レポータービーズ１９２の添加後、二重ビーズ複合体構造１９０が形成される。当業者には容易に明らかとなるように、二重ビーズ複合体構造は、対象となる標的剤が存在する場合にのみ形成される。この形成では、標的剤２０２は、磁気捕捉ビーズ１９０とレポータービーズ１９２とを連結する。好ましい緩衝溶液を用いて、特定の完全な洗浄により、レポータービーズと捕捉ビーズとの間の非特異的結合は最小限に抑えられる。標的剤２０２およびシグナルプローブ２０６は、３７℃で２〜３時間ハイブリダイズされることが好ましい。上述のステップＩＩのように、十分なハイブリダイゼーションは室温で３０分以内で行うことができる。より高温では、このステップにおけるハイブリダイゼーションはほぼ瞬時に行うこともできる。
【０２５５】
次に図６７Ａに示すステップＶを参照して、ステップＩＶのハイブリダイゼーション後、二重ビーズ複合体１９４を溶液中の未結合種から分離する。捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液に再び磁界を印加して二重ビーズ複合体１９４を単離する。また、単離物がレポータービーズに結合していない捕捉ビーズを含むことに留意されたい。この方法のオンディスクの方法での上記のステップＩＩＩのように、この磁気による分離ステップは、図３３Ａ、図３５、および図３６Ａ〜図３６Ｃに示すように行ってもよい。
【０２５６】
浮遊粒子を含む上清を除去する精製プロセスは、洗浄緩衝液を試験管に添加すること、およびビーズ溶液を十分に混合することを含む。２ステップ検定に好ましい洗浄緩衝液は、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡからなる。未結合
レポータービーズ、浮遊ＤＮＡ、および非特異的結合粒子のほとんどは、攪拌されて、上清から除去される。二重ビーズ複合体は、捕捉ビーズ、標的剤、およびレポータービーズのマトリックスを形成することができ、ここで、重なり合った二重ビーズ粒子の格子構造に捕獲された浮遊粒子の抽出の際に、洗浄プロセスがさらに役立ち得る。レポータービーズ、標的剤、および捕捉ビーズの間の非特異的な結合の低減を対象とする他の関連する態様は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された、２００１年２月２８日に出願された「Mixing Methods to Reduce Non-Specific Binding in Dual Bead Assays」と題する米国仮出願第６０／２７２，２４３号、および２００１年３月１日に出願された「Dual Bead Assays Including Linkers to Reduce Non-Specific Binding」と題する米国仮出願第６０／２７２，４８５号に開示されており、これらはその内容のすべてが本明細書に援用される。
【０２５７】
図６７Ａに示す次のステップはステップＶＩである。このステップでは、二重ビーズ複合体１９４を洗浄緩衝溶液で約３〜５回洗浄してから、検定混合物をディスクにロードして分析する。別法として、このステップの間、オリゴヌクレオチドシグナルおよび輸送プローブをライゲーションして、ディスク分析およびシグナル検出プロセス中の二重ビーズ複合体の分解を防止することができる。プローブライゲーション法に関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００１年３月２６日に出願された「Improved Dual Bead Assays Using Ligation」と題する米国仮出願第６０／２７８，６９４号に開示されており、当該出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。本発明のさらに別の実施の形態では、図６７ＡのステップＶＩに示すように、制限酵素、尿素、酸、または塩基を、ピペット２１４を用いて二重ビーズ溶液に添加してもよい。二重ビーズ複合体は、図６７ＢのステップＶＩに示すように、これらの解離材の作用により解離され、それにより、捕捉ビーズ１９０からレポータービーズ１９２を解放する。本明細書で用いられる酸または塩基は、それぞれ強酸または強塩基であることが好ましい。
【０２５８】
二重ビーズ構造の解離後、ステップＶＩＩＩに示すように、溶液中の、未結合となったレポータービーズ１９２から捕捉ビーズ１９０を分離する。溶液に磁界を印加して、磁気捕捉ビーズ１９０を捕捉することができる。磁界は、内蔵磁石２１８を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、内蔵磁石２１８は、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中のいかなる未結合レポータービーズも除去するように、永久磁石であっても電磁石であってもよい。ステップＶＩＩＩの間に分離されなかった非解離二重ビーズ複合体も溶液から除去されることに留意されたい。ステップＶＩＩＩの間、解放されたレポータービーズを含む上清を、ピペット２１４を用いて回収する。次に、検定混合物を、ディスクにロードして、ステップＩＸに示すように、光バイオディスク読み取り装置を用いて分析することができる。レポータービーズの分析には、透過型バイオディスク１８０を用いてもよく、または反射型バイオディスク１４４を用いてもよい。反射型および透過型光バイオディスクに関する詳細は、それぞれ図３Ａ〜図３Ｃおよび図４Ａ〜図４Ｃに関連して詳述されている。光バイオディスクを分析するために用いることができる光バイオディスク読み取り装置および他の代替のディスク読み取り装置は、図１および図２に関連して詳細に上述されている。レポータービーズが蛍光である場合、ステップＶＩＩＩで単離されたレポータービーズもまた、蛍光測定器または蛍光光ディスク読み取り装置を含む任意の同様の蛍光型分析装置を用いて定量することができる。二重ビーズ複合体からレポータービーズを解放するために解離剤を用いて行われる実験は、以下の実施例１５および１６で詳細に説明する。
【０２５９】
この発明の別の態様によると、図６８Ａおよび図６８Ｂは合わせて、図６６Ａおよび図６６Ｂに関連して説明し、かつ図６７Ａおよび図６７Ｂの遺伝的検定の技法に従ったものと同様の免疫検定法を示す。この方法は、ここでは免疫化学的検定の二重ビーズ複合体を作成する「２ステップ結合」とも呼ばれる。この方法は、図１２Ｂで上述した方法に関連
するより具体的な実施の形態である。図６７Ａおよび図６７Ｂに示す方法のように、この方法は９つの主なステップを含む。概して、標的抗原のエピトープに特異的に結合する抗体輸送プローブで被覆された捕捉ビーズを、緩衝溶液に入れる。１つの特定の実施の形態では、抗体輸送プローブを３μｍの磁気捕捉ビーズに結合させる。検定を行うために利用されるディスクドライブおよびディスクアセンブリのタイプに応じて、異なるサイズの磁気捕捉ビーズを用いてもよい。本発明のこの代替の方法による９つの主なステップは、それぞれ図６８ＡのステップＩ、ステップＩＩ、ステップＩＩＩ、ステップＩＶ、ステップＶ、およびステップＶＩ、ならびに図６８ＢのステップＶＩＩ、ステップＶＩＩＩ、およびステップＩＸとして示される。
【０２６０】
次に図６８Ａに示すステップＩを特に参照して、緩衝溶液２１０に懸濁した捕捉ビーズ１９０を、ピペット２１４からの注入によって試験管２１２にロードする。
【０２６１】
ステップＩＩでは、標的抗原２０４を溶液に添加して、捕捉ビーズ１９０に結び付いた抗体輸送プローブ１９６に結合させる。標的抗原２０４および輸送プローブ１９６は、３７℃で２〜３時間結合させることが好ましい。より短い結合時間も可能である。
【０２６２】
ステップＩＩＩに示すように、捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液に磁界を印加して結合している標的タンパク質または糖タンパク質を単離することにより、捕捉ビーズ１９０に結合している標的抗原２０４を溶液中の未結合種から分離する。磁界は、内蔵の永久磁石２１８または電磁石を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、永久磁石２１８または電磁石は、磁気ビーズを引き出して、溶液のピペット抽出によって懸濁液中に浮遊するいかなる未結合標的抗原２０４も除去する。洗浄緩衝液を添加して、分離プロセスを繰り返すことができる。
【０２６３】
次にステップＩＶに示すように、図６６Ａに示す方法に関連して説明したように、レポータービーズ１９２を溶液に添加する。レポータービーズ１９２は、標的抗原２０４に親和性のあるシグナルプローブ２０８で被覆される。この２ステップ免疫化学的検定の１つの特定の実施の形態では、標的抗原２０４の一部に特異的に結合するシグナルプローブ２０８は、２．１μｍの蛍光レポータービーズ１９２に結合する。シグナルプローブ２０８および輸送プローブ１９８はそれぞれ、標的抗原２０４のエピトープに特異的に結合するが、互いには結合しない。レポータービーズ１９２の添加後、二重ビーズ複合体構造１９０が形成される。当業者には容易に明らかとなるように、これらの二重ビーズ複合体構造は、対象となる標的抗原が存在する場合にのみ形成される。この形成では、標的抗原２０４は、磁気捕捉ビーズ１９０とレポータービーズ１９２とを連結する。好ましい緩衝溶液を用いて、特定の完全な洗浄により、レポータービーズと捕捉ビーズとの間の非特異的結合は最小限に抑えられる。標的抗原２０４およびシグナルプローブ２０８は、３７℃で２〜３時間ハイブリダイズされることが好ましい。上述のステップＩＩのように、十分な結合は室温で３０分以内で行うことができる。免疫検定の場合、３７℃を超える温度は、タンパク質が変性するため好ましくない。
【０２６４】
次に図６８Ａに示すステップＶに移り、ステップＩＶに示す結合後に、二重ビーズ複合体１９４を溶液中の未結合種から分離する。これは、図示のように捕捉ビーズ１９０の磁気特性を用いて、溶液に磁界を印加して二重ビーズ複合体１９４を単離することにより行われる。単離物はレポータービーズに結合していない捕捉ビーズを含むことに、再び留意されたい。
【０２６５】
浮遊粒子を含む上清を除去する精製プロセスは、洗浄緩衝液を試験管に添加すること、およびビーズ溶液を十分に混合することを含む。未結合レポータービーズ、浮遊タンパク質、および非特異的結合粒子のほとんどは、攪拌されて、上清から除去される。二重ビー
ズ複合体は、捕捉ビーズ、標的剤、およびレポータービーズのマトリックスを形成することができ、ここで、重なり合った二重ビーズ粒子の格子構造に捕獲された浮遊粒子の抽出の際に、洗浄プロセスがさらに役立ち得る。
【０２６６】
図６８Ａにおける最後のステップはステップＶＩである。このステップでは、図６８ＡのステップＶＩに示すように、二重ビーズ複合体１９４を洗浄緩衝溶液で約３〜５回洗浄してから、ピペット２１４を用いて尿素、酸（好ましくは強酸）、または塩基（好ましくは強塩基）を二重ビーズ溶液に添加することができる。二重ビーズ複合体は、これらの解離剤の作用により解離され、それにより、次に図６８ＢのステップＶＩＩに示すように、捕捉ビーズ１９０からレポータービーズ１９２を解放する。
【０２６７】
二重ビーズ構造の解離後、図６８ＢのステップＶＩＩＩに示すように、溶液中の、未結合となったレポータービーズ１９２から捕捉ビーズ１９０を分離する。溶液に磁界を印加して、磁気捕捉ビーズ１９０を捕捉することができる。磁界は、内蔵磁石２１８を有する磁気試験管ラック２１６に封入することができ、内蔵磁石２１８は、磁気ビーズを引き出して、懸濁液中のいかなる未結合レポータービーズも除去するように、永久磁石であっても電磁石であってもよい。ステップＶＩＩの間に分離されなかった非解離二重ビーズ複合体も溶液から除去されることに留意されたい。この方法のステップＶＩＩＩの間、解放されたレポータービーズ１９２を含む上清を、ピペット２１４を用いて回収する。次に、検定混合物を、ディスクにロードして、ステップＩＸに示すように、光バイオディスク読み取り装置を用いて分析することができる。レポータービーズの分析には、透過型バイオディスク１８０を用いてもよく、または反射型バイオディスク１４４を用いてもよい。反射型および透過型光バイオディスクに関する詳細は、それぞれ図３Ａ〜図３Ｃおよび図４Ａ〜図４Ｃを参照して詳細に説明されている。光バイオディスクまたは医療ＣＤを分析するために用いることができる光バイオディスク読み取り装置および他の代替のディスク読み取り装置は、図１および図２に関連して詳細に上述されている。ステップＶＩＩＩで単離されたレポータービーズもまた、蛍光測定器または蛍光光ディスク読み取り装置を含む任意の同様の蛍光型分析装置を用いて定量することができる。
【０２６８】
上記の別の方法のいずれについても、図６８Ａおよび図６８Ｂに示す方法における磁気的な除去または分離ステップは、別法として図３３Ａ〜図３３Ｄ、図３４Ａ〜図３４Ｃ、図３５、図３６Ａ〜図３６Ｃ、および図３７に示されるディスク、流体回路、および装置を用いてオンディスクで行ってもよい。
【０２６９】
検定感度を高め、かつビーズの非特異的結合を低減するための解離剤の使用
次に図６９に進み、レポータービーズの非存在下でのＤＮＡｓｅＩ消化効率を説明する棒グラフ表示が示されている。この実験では、図８Ａで上述したように、ビオチン化標的ＤＮＡ２０２を磁気捕捉ビーズ１９０の輸送プローブ１９８とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン化アルカリホスファターゼ（Ｓ−ＡＰ）を検定混合物に添加し、標的ＤＮＡのビオチンと結合させた。一連の洗浄ステップ後、Ｓ−ＡＰ色原体基質を検定溶液のアリコートに添加し、結合した標的の量を分光光度計を用いて比色定量した。同時に、上記で取ったものと等量のアリコートを、ＤＮＡｓｅＩを含む緩衝液中で培養した。培養後、検定混合物を洗浄し、Ｓ−ＡＰを溶液に添加し、ＤＮアーゼにより消化されなかった標的残渣に結合させた。観察により、対照とＤＮＡｓｅ消化処理群とのシグナルの差に顕著に現れる高いＤＮＡｓｅ消化活性が示された。ここで説明したものと同様の実験に関する詳細は、以下の実施例１５で詳細に説明する。
【０２７０】
次に図７０を参照して、図６９で説明したものと同様の実験から収集したデータの棒グラフ図が示されている。この実験では、図６９で説明したような磁気捕捉ビーズ単独の代わりに二重ビーズ複合体を用いた。この場合、標的２０２を、図１０Ａで上述したように
、捕捉ビーズ１９０とレポータービーズ１９２との間に位置付ける。図６５ＡのステップＩ〜ステップＶで説明した二重ビーズ複合体の形成後に、ステップＩＶ（図６５Ａ）で回収した上清中のレポータービーズの量と、ステップＶ（図６５Ａ）に示す検定混合物中の捕捉ビーズに結合したレポータービーズの量とを、蛍光測定器を用いて定量した。次に、ＤＮＡｓｅＩを検定混合物に添加し、図６５ＢのステップＶＩに提示したように、二重ビーズ複合体のプローブに結合した標的を切断させ、それにより磁気捕捉ビーズからレポータービーズを解放した。次のステップは、図６５ＢのステップＶＩに示すような、捕捉ビーズの単離および新たに解放された蛍光レポータービーズを含む上清の回収を伴う。上清中のレポータービーズからのシグナルを、蛍光測定器を用いて定量した。非解離レポータービーズも、蛍光測定器を用いて定量した。この実験から収集したデータは、ＤＮＡｓｅＩ酵素消化が、二重ビーズ複合体では図６９で説明した単一ビーズ設定でのＤＮＡｓｅＩ酵素消化ほど効率的ではなかったことを示す。ＤＮＡｓｅ消化活性の低下は、標的へのＤＮＡアーゼのアクセスを妨げる二重ビーズ複合体のビーズからの立体障害による可能性がある。二重ビーズ検定で実施される制限酵素消化の使用に関する実験の詳細は、以下の実施例１５でさらに詳細に説明する。この検定で回収された蛍光レポータービーズは、蛍光型光ディスク読み取り装置または上述の任意の同様のデバイスと共に光バイオディスクまたは医療ＣＤを用いて定量してもよい。
【０２７１】
いかなる検定の感度も、雑音に対する信号の比に依存する。二重ビーズ検定の感度は、捕捉ビーズとレポータービーズとの非特異的結合の最小化に依拠する。標的の非存在下での二重ビーズ間の非特異的相互作用は安定しているため、ストリンジェントな条件下での洗浄によってなくすことはできない。しかしながら、非特異的二重ビーズの寄与は、標的媒介二重ビーズのみの検出および定量によりなくすことができる。図７１に示すように、二重ビーズ複合体は、酵素消化（ＤＮＡｓｅ、制限酵素）により、または化学的および物理的処理（熱処理、尿素処理、塩基処理、または酸処理）により分離することができる。さらに、過剰な未結合捕捉ビーズの存在下でのレポータービーズの定量は、検出検定の感度を低下させる可能性がある。したがって、捕捉ビーズからレポータービーズを分離することにより、バイオディスク読み取り装置によるレポータービーズの定量が容易になり、したがって検定の感度が高まる。
【０２７２】
次に図７１をより詳細に参照して、酵素消化および物理的または化学的処理による、二重ビーズ複合体の捕捉ビーズからのレポータービーズの分離の概略表現がある。図７１は、図６５Ａ、図６５Ｂ、図６７Ａ、および図６７Ｂに関連して説明した種々の解離剤を用いた二重ビーズ形成および解離の概要を示す。解放されたレポータービーズを回収した後、蛍光測定器、フルオルイメージャ（fluorimager：蛍光イメージアナライザ）、蛍光型光ディスク読み取りシステム、ＣＤ−Ｒ型光ディスクシステム、あるいは微小球または蛍光を検出することができる任意のデバイスを含む、いくつかの方法のうちの任意の１つによって、ビーズを定量する。目下好ましい検出の方法は、図１、図２、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃに関連して詳細に説明したような光バイオディスクまたは医療ＣＤシステムの使用である。
【０２７３】
次に図７２を参照して、図７０で説明したものと同様の種々の標的濃度での高ｐＨ洗浄を用いた、捕捉ビーズからのレポータービーズの分離を示す棒グラフ表現がある。二重ビーズ複合体は、図６７ＡのステップＩ〜ステップＶＩで説明したように形成される。二重ビーズが形成されて単離されると、ステップＶＩ（図６７Ａ）に示すように、強酸を二重ビーズ溶液に添加する。短時間の培養後、標的とプローブとの水素結合を妨害する塩基の作用により二重ビーズが解離し、それにより、ステップＶＩＩ（図６７Ｂ）に示すように、二重ビーズ複合体から蛍光レポータービーズおよび磁気捕捉ビーズが解放される。次のステップは、図６７ＢのステップＶＩＩＩで説明したような捕捉ビーズの単離である。単離された捕捉ビーズは、非解離二重ビーズ複合体も含む。この単離物を、この特定の実施
の形態において蛍光測定器により定量した。図７２に示すデータは、１×１０−１６Ｍ〜１×１０−１４Ｍの標的濃度で二重ビーズ複合体の解離が１００％であることを示す。塩基を解離剤として用いて行われる実験の詳細は、以下の実施例１６で詳細に説明する。レポータービーズは、フルオルイメージャ、蛍光型光ディスク読み取りシステム、ＣＤ−Ｒ型光ディスクシステム、あるいは微小球または蛍光を検出することができる任意のデバイスを含む、いくつかの方法のうちの任意の１つによって定量することもできる。好ましい検出の方法は、図１、図２、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃに関連して詳細に説明したような光バイオディスクまたは医療ＣＤシステムの使用である。
【０２７４】
次に図７３Ａを参照して、尿素を変性剤または解離剤として用いた実験から収集されたデータの棒グラフ図がある。この実験の詳細は、図６９に関連して説明したものと同様である。図６９におけるように、図８で上述したように、ビオチン化標的ＤＮＡ２０２を磁気捕捉ビーズ１９０の輸送プローブ１９８とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン化アルカリホスファターゼ（Ｓ−ＡＰ）を検定混合物に添加し、標的ＤＮＡ２０２のビオチンと結合させた。一連の洗浄ステップ後、Ｓ−ＡＰ色原体基質を検定溶液のアリコートに添加し、結合した標的の量を分光光度計を用いて比色定量した。同時に、上記で取ったものと等量のアリコートを、７Ｍ  尿素を含む緩衝液中で培養した。培養後、検定混合物を洗浄し、Ｓ−ＡＰを溶液に添加し、７Ｍ  尿素により変性されなかった、捕捉ビーズの輸送プローブに結合したままの標的残渣に結合させた。この結果は、対照と７Ｍ  尿素処理群とのシグナルの差により明らかであるように、比較的効率のよい変性活性を示した。ここで説明したものと同様の実験に関する詳細は、以下の実施例１６で詳細に説明する。
【０２７５】
次に図７３Ｂを参照して、二重ビーズ検定において尿素を解離剤として用いた実験から収集したデータを示す棒ぐグラフがある。この実験の詳細は、図７０に関連して説明したものと同様である。図７０におけるように、図７３Ａで説明したような磁気捕捉ビーズ単独の代わりに二重ビーズ複合体を用いた。この場合、標的を、図１０Ａで上述したように、捕捉ビーズとレポータービーズとの間に位置付ける。図６７ＡのステップＩ〜ステップＶＩで説明した二重ビーズ複合体の形成後に、ステップＶ（図６７Ａ）で回収した上清中のレポータービーズ１９２の量と、ステップＶＩ（図６７Ａ）に示す検定混合物中の捕捉ビーズ１９０に結合したレポータービーズ１９２の量とを、蛍光測定器を用いて定量した。次に、所定量の尿素を検添加し、検定溶液の最終尿素濃度を７Ｍにした。これにより、図６７ＢのステップＶＩＩに提示したように、二重ビーズ複合体のプローブに結合した標的の変性が生じ、それにより磁気捕捉ビーズからレポータービーズが解放された。次のステップは、図６７ＢのステップＶＩＩＩに示すような、捕捉ビーズ１９０の単離および新たに解放された蛍光レポータービーズ１９２を含む上清の回収を伴う。上清中のレポータービーズからのシグナルを、蛍光測定器を用いて定量した。非解離レポータービーズも、蛍光測定器を用いて定量した。この実験から収集したデータは、二重ビーズ複合体検定において、図７０で説明したようにＤＮＡｓｅＩを解離剤として使用した場合よりも７Ｍ  尿素変性の方が効率的であったことを示す。解離の増加は、二重ビーズ複合体のビーズからの立体障害がないためである可能性があり、これは尿素がＤＮＡｓｅよりも著しく小さい分子であるからである。二重ビーズ検定で実施される７Ｍ  尿素変性の使用に関する実験の詳細は、以下の実施例１６でさらに詳細に説明する。この検定で回収された蛍光レポータービーズは、蛍光型光ディスク読み取り装置または上述の任意の同様のデバイスと共に光バイオディスクまたは医療ＣＤを用いて定量してもよい。
【０２７６】
ＤＮＡ標的検出の向上のためのＤＮＡ変性剤の使用
医学的標的を検出するために二重ビーズ検定をさらに変更することが、本発明の主な態様である。実際のサンプルでは、ＤＮＡ標的は二本鎖であり、非常に長い。二重ビーズ検定、および任意の他のＤＮＡ診断検定の、全ゲノム内の臨床上の対象となる配列を検出す
る能力は、第１に、対象となる配列に対するプローブの特異性に、第２に、ＤＮＡ標的を変性された一本鎖の形態に保って捕捉するための非常に強い界面活性剤の使用に依存する。
【０２７７】
臨床上の対象となる配列を検出する際の二重ビーズ検定の成功は、プローブの設計に主に依存する。ヒトゲノムの複雑性および退化（degeneracy）を考慮すれば、臨床上の対象となる配列を検出するように設計されたプローブは、診断される配列に特有のものであり、かつ配列の変異体を認識するのに十分なほど一般的なものでなければならない。コンピュータソフトウェアを用いたプローブの設計により、配列をＢｌａｓｔ検索などのデータバンクにおける既存の配列と比較することができる。対象となる配列に特異的なプローブが設計されると、二重ビーズ検定に導入される主な変更は、ハイブリダイゼーション緩衝液中の変性剤を用いて、標的ＤＮＡの相補配列の再アニーリングを防止することを含む。これにより、標的とプローブとのハイブリダイゼーションが可能になる。
【０２７８】
本発明は、分析ディスク、改良型光ディスク、医療ＣＤ、またはバイオディスクに対して上記の方法を実施することにも向けられ得る。図１および図２を参照して上述したものなどのバイオディスクまたは医療ＣＤドライブアセンブリを用いて、ディスクを回転させ、ディスクに記憶されたいかなる符号化情報をも読み取って処理し、バイオディスクまたは医療ＣＤのフロー流路においてＤＮＡサンプルを分析することができる。したがって、バイオディスクドライブには、バイオディスクを回転させるモータと、ディスクの回転速度を制御するコントローラと、ディスクからの帰還信号を処理するプロセッサと、処理された信号を分析する分析装置とが設けられる。モータの回転速度は、ディスクの所望の回転を得るために制御される。バイオディスクドライブアセンブリを利用して、フロー流路および標的領域にある医療試験物質にドライブの読み取りビームによって呼びかけて、分析装置によって医学的に診断する前、その間、またはその後に、バイオディスクに情報を書き込むこともできる。本発明のこの実施の形態では、分析装置は、専用の診断ソフトウェアを含むことにより、医療エキスパートシステムを提供することが有利であり得る。バイオディスクも同様に、ディスクの回転速度を制御し、行うべきＤＮＡ試験のタイプに特定の処理情報を提供し、かつバイオドライブに関連するモニタに結果を表示するための、対応する医療エキスパートシステムソフトウェアおよび符号化情報を含むことができる。
【０２７９】
この発明の好ましい実施の形態では、グアニジンイソチオシアネートを典型的な変性剤として用いる。１．５Ｍ  グアニジンイソチオシアネートを変性剤として用いた実験から収集したデータを図７４に示す。この実験で従う実験手順は、以下の実施例１７で詳細に説明する。図７４はさらに、適切な量の変性剤をハイブリダイゼーション実験で用いた場合に検定感度が著しく高まることを示す。この特定の検定では、図８Ａにおいて上述したように磁気捕捉ビーズ１９０上で、ビオチン化標的ＤＮＡ２０２を、１．５Ｍ  グアニジンイソチオシアネートの存在下で輸送プローブ１９８にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン化アルカリホスファターゼ（Ｓ−ＡＰ）を検定混合物に添加し、標的ＤＮＡ２０２のビオチンと結合させた。一連の洗浄ステップ後、Ｓ−ＡＰ色原体基質を検定溶液に添加し、発色に十分な時間を与えて、結合した標的の量を分光光度計を用いて比色定量した。
【０２８０】
標的とプローブとのハイブリダイゼーションを可能にしつつ、標的ＤＮＡの相補配列の再アニーリングを防止するには、適切な量のグアニジンイソチオシアネートが必要である。しかしながら、高濃度では、グアニジンイソチオシアネートはいかなるハイブリダイゼーションも防止する。二重ビーズ検定で用いるためのグアニジンイソチオシアネートの適切な緩衝液濃度を決定するために、グアニジンイソチオシアネートの滴定を行った。この滴定実験からのデータを図７５に示す。図７５に示すように、グアニジンイソチオシアネートの最適なハイブリダイゼーション緩衝液濃度は、１．５Ｍであり、これは、１．５Ｍ
グアニジンイソチオシアネートを添加した場合に、０．０Ｍの標的濃度と１．０×１．０−１０Ｍの標的濃度とのシグナル差が最も大きいことが示されたからである。
【０２８１】
ＭＯバイオディスクシステム（ＭＯＢＤＳ）を用いた特異的細胞集団の選択、検出、および操作のためのＭＯ生体磁気検定（ＭＯＢＭＡ）
本発明のさらなる態様は、磁気粒子またはビーズを用いて細胞集団および細胞集団の溶液中の特定の標的細胞を検出する、上述のＭＯＢＭＡと呼ばれる磁気的方法に関する。本発明のＭＯＢＭＡ態様の一実施の形態では、磁気ビーズは、１つまたは複数の結合剤または捕捉プローブで被覆され、それにより生体磁気粒子またはビーズが形成される。磁気粒子を含む固体支持体への結合剤の結合に関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の、２００２年７月１２日に出願された「Multi-Purpose Optical Analysis Disc For Conducting Assays and Various Reporting Agents for use Therewith」と題する米国特許出願第１０／１９４，３９６号に開示されており、当該出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。結合剤は、例えば、細胞膜の特定の抗原決定基を対象とする標的細胞関連抗体のＦｃ部分を認識する抗体を含んでもよい。標的細胞の捕捉、検出、操作、および定量は、本発明のＭＯＢＤＳを用いて実行される。捕捉された細胞は、細胞試験を容易にするために、磁気的に操作して、ＭＯバイオディスクのある分析、分離、または試験チャンバから別のチャンバに移動させることもできる。例えば、捕捉された標的癌細胞を等しい細胞数で磁気的に分取して癌治療剤を含む異なる分析チャンバに入れ、細胞レベルに対するこれら薬剤の影響を判定することができる。この方法の用途の具体的な例は以下で説明する。
【０２８２】
マイルドな界面活性剤および／または第２の組の抗体または抗体断片（蛍光剤、金属コロイド（metallocolloids）、生体磁気粒子、放射性同位元素、ビオチン複合体または可視化を可能にする特定の酵素であらかじめ標識されているかまたはされていない）を用いた細胞懸濁液の培養により、上記方法の特異性および感度を劇的に高めることができる。本方法はさらに、ＭＯバイオディスクの磁気捕捉領域で磁気的に捕捉された標的細胞を、動的に単離、精製、操作、および定量するために用いてもよい。特殊なまたは混合された細胞集団および混合細胞集団を含む溶液中の特定の標的細胞を検出する方法に関するさらなる詳細は、例えば、Fodstad and Kvalheimに付与された米国特許第６，１８４，０４３号に開示されており、当該特許は、その内容がすべて参照により本明細書に援用される。
【０２８３】
結合剤は、１つまたは複数の化学的／生化学的エンティティを親和性によって結合することができる。親和性結合では、例えば連結されるべき物質に結び付いている一対の結合相手が、接触させられると互いに結合する。細胞表面の分子は、このような連結の結合相手の一方を表し得る。例えば、細胞上の抗原−抗体相互作用、酵素−受容体相互作用、リガンド−受容体相互作用、ビオチン−アビジン結合、ハプテン／抗ハプテン結合対、およびオリゴヌクレオチド相補配列結合などのいくつかのそのような結合相手システムが既知であり、その中でも抗原−抗体結合が最も頻繁に用いられる。
【０２８４】
結合相手の一方が磁気粒子またはビーズなどの不溶性支持体に結び付けられる方法、および混合細胞集団中の標的細胞の単離がネガティブセレクションによる単離（negative isolation）またはポジティブセレクションによる単離（positive isolation）として行われる方法が既知である。ネガティブセレクションによる単離の手順では、不要な細胞に特異的な抗体で被覆された磁気ビーズ（生体磁気ビーズまたは粒子）と共に細胞を培養することにより、不要な細胞を細胞調製物から除去することができる。培養後、得られる細胞ビーズ複合体を、磁気的に除去すなわち単離し、必要な標的細胞を残すことができる。一方、ポジティブセレクションによる単離の手順では、対象となる細胞に対する抗体で被覆された磁気ビーズ（生体磁気ビーズ）を用いて、必要な標的細胞を混合細胞集団から除去する。
【０２８５】
本発明のＭＯＢＭＡ態様の目的は、診断のために特定の標的細胞を検出および研究することである。試験サンプルは、血液、骨髄、腹水、および種々の組織または腫瘍からの細胞を含み得る。本発明は、ＭＯＢＤＳを用いて多数の細胞を容易にスクリーニングでき、手順が迅速かつ簡単である、さまざまな細胞型を検出する高感度の検出システムおよび方法を提示する。さらに、本ＭＯＢＤＳは、生化学的、生物学的、および免疫学的検査のための、およびヌクレオチドまたはタンパク質レベルでの特定の遺伝子の研究のための、細胞の単離に用いることができる。さらに、単離または捕捉された細胞−ビーズ複合体は、細胞−ビーズ複合体の切断を必要とせずに、関連するＭＯドライブおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞傷害性研究のために培養または使用される細胞を用いて、対象となる細胞が配置されるＭＯバイオディスクの磁気捕捉領域内の磁界を遮断または除去することにより、解放することができる。
【０２８６】
本発明のＭＯＢＭＡ態様の別の実施の形態は、混合細胞集団または生理溶液中の健常または病原性の標的細胞の免疫磁気的なポジティブセレクションによる単離を含む。本発明のこの実施の形態では、特定の標的細胞と磁気ビーズまたは粒子などの不溶性支持体との間に結合が生じる。粒子は、標的細胞の膜の特定の抗原決定基に対する抗細胞抗体で被覆されるか、または粒子は、標的細胞の膜の抗原決定基に対する特異的な抗細胞抗体（一次抗体）のＦｃ部分に結合することができるポリクローナル抗マウスまたは抗ヒト抗体で被覆される。粒子の被覆にポリクローナル抗マウス／抗ヒト抗体を用いる代わりに、モノクローナルラット抗マウス／抗ヒト抗体を用いてもよい。モノクローナル抗体の使用により、溶液中の非標的細胞との起こり得る交差反応の危険性を低減することができる。さらに、マイルドな界面活性剤および／または第２の組の抗体または抗体断片（蛍光剤、磁気粒子、金属コロイド、生体磁気粒子、放射性同位元素、ビオチン複合体または可視化を可能にする特定の酵素であらかじめ標識されている、混合細胞捕捉物内の捕捉細胞のうちの１つまたは複数の細胞型の特定の決定基に結合する）を用いた細胞懸濁液の培養により、この実施の形態の方法の特異性を劇的に高めることができる。
【０２８７】
上述の免疫磁気的なポジティブセレクションによる単離の実施の形態の詳細な用途は、検出および単離される標的細胞として癌細胞を用いて以下で提示される。しかしながら、この実施の形態は癌細胞に限定されず、本開示は、方法をこの特定の使用分野に限定するものではない。それは、この方法が、例えば免疫系の細胞（ナチュラルキラー細胞、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋を含むその亜型など）、細菌細胞（Chandler, et al., Int. J. of Food Micr., 70:143-154, 2001, and Yu, J. of Immuno. Mthds., 218: 108, 1998）、およびペルオキシソーム（Luers, et al., Electrophoresis,
19: 1205-1210, 1998）を対象とした検定を含む細胞学的応用範囲で用いるのに適しているからである。
【０２８８】
癌患者の管理において、疾患が局所的か他の組織への転移が起きているかに関する疾患のステージングは、患者個人の治療レジメンの選択に最も重要である。悪性細胞は、周囲組織への直接的な侵襲により、またはリンパ管から、あるいは血液中の腫瘍細胞が骨髄、中枢神経系、および髄液を含む遠隔の器官に分布することにより広がる。転移性腫瘍細胞の検出は、最近まで、生検した腫瘍試料、骨髄および抹消血の塗布標本、および種々の体液の細胞遠心分離後に調製したスライドに対する光および電子顕微鏡法を用いる形態学的方法に依存してきた。抗原を認識するモノクローナル抗体の出現は、種々の型の悪性細胞の表面に主に発現するため、転移性細胞の同定は、免疫細胞化学および免疫蛍光にもかなり関係している。したがって、生検した腫瘍または細胞遠心分離から調製されたスライドは、モノクローナル抗体で処理され、腫瘍細胞へのこれらの結合が比色法または蛍光により可視化される。後者の方法は、蛍光顕微鏡の使用、別法として細胞懸濁液の調製およびフローサイトメータの使用を必要とする。
【０２８９】
上記の方法は、感度および／または特異性が制限され、通常は面倒で時間がかかり、また高度の専門知識を必要とする。フローサイトメトリ検査も高価な機器を必要とする。
【０２９０】
血液および骨髄中の腫瘍細胞の検出の形態学的方法は、免疫細胞化学および免疫蛍光を伴う方法よりもはるかに感度が低い（Beiske, et al., Am. J. Pathology 141 (3), September 1992）。しかしながら、後者の方法はまた、腫瘍細胞が試験サンプル中の細胞の総数の１％未満しかない場合には不適切である。フローサイトメトリは、顕微鏡の使用を伴う方法よりも高い感度を提供することができるが、多数の細胞が利用可能であることが必要であり、またいくつかの技術的困難も伴う。さらに、細胞の凝集がフローサイトメトリに関する問題を引き起こす可能性があり、この方法では、標識された腫瘍細胞と非特異的に蛍光を発している正常細胞とを区別できる可能性がない。
【０２９１】
本発明は、多数の細胞を即座にスクリーニングすることができ、細胞−ビーズ複合体をＭＯＢＤＳにより容易に検出および定量することができるため、例えば転移性腫瘍細胞の非常に高感度な検出を可能にする。本発明の標的細胞の検出に用いられるモノクローナル抗体は、これらの抗体が、例えば腫瘍細胞に対して十分な特異性を有して結合し、混合細胞懸濁液または試験サンプル中に存在する非標的細胞には結合しないように選択される。試験サンプルは、ビーズが結び付いている全細胞が標的細胞を表すような、例えば、血液、骨髄、および腫瘍が発現している他の溶液を含むことができる。次に、標的細胞を、光磁気（ＭＯ）バイオディスクの特定の磁化区域すなわち磁区で捕捉し、関連する光磁気ドライブおよびソフトウェアを用いて定量する。さらに、手順は迅速かつ簡単であり、フローサイトメータなどの高価で複雑な機器を必要とせずに、調査者により行われることができる。ＭＯＢＤＳに関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡された同時係属中の、２００２年３月１４日に出願された「Dual Bead Assays Using Cleavable Spacers and/or Ligation to Improve Specificity and Sensitivity Including Related Methods and Apparatus」と題する米国特許出願第１０／０９９，２５６号、および２００２年３月１４日に出願された「Use of Restriction Enzymes and Other Chemical Methods to Decrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and Related Bio-Discs, Methods, and System Apparatus for Detecting Medical Targets」と題する上記で参照された米国特許出願第１０／０９９，２６６号に開示されている。光磁気記録、光磁気ディスクの磁性領域の正確な作成、および光磁気検出法に関する詳細は、図３７に関連して上述されており、また例えば、Tsunashima, Magneto Optical Recording, J. Phys. D: Appl.
Phys. 34, R87-R102, 2001、およびCoombs, Differential Phase Contrast and Magneto-optic Edge Detection, Applied Optics, 34(29), 6723-6729, 1995に記載されており、これら双方は、その全体が繰り返されるのと同様にその内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０２９２】
上述のように、本発明のＭＯＢＭＡ態様の免疫磁気的な実施の形態は、腫瘍細胞に存在する抗原を特異的に認識するが正常細胞の抗原は認識しない、または他の目的で正常細胞の指定された亜集団の抗原を特異的に認識する、例えばマウスまたはヒト由来のモノクローナル抗体を含む捕捉抗体を、磁気粒子またはビーズに結合させて、それにより生体磁気粒子を形成することに関する。捕捉抗体は、標的細胞の抗原、または腫瘍細胞に結合する一次抗体または細胞結合抗体のＦｃ部分に直接結合することができる。細胞結合抗体は、ＩｇＧ型またはＩｇＭ型、あるいはＩｇＧまたはＩｇＭ抗体の断片であってよい。捕捉または一次抗体は、例えば、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）抗原（ＣＣ４９抗体）（Barjer et al., Gynec. Onco. 82: 57-63, 2001）、ＣＤ５６／ＮＣＡＭ抗原（ＭＯＣ−１抗体）（Speirs et al., J. Histochem. Cytochem., 41 (9):1303-10, 1993）、上皮細胞表面抗原（ＢＥＲ−ＥＰ４抗体）（Borgen et al., J. Hematother., 6(2):103-114, 1997, and Ziggeuner et al. J. Urol., 164: 1834-1837, 2000）、クラスタ２上皮抗
原（ＭＯＣ−３１抗体）（Rye et al., Am J. Patho., 150(1): 99-106, 1997, and Ree et al., Int. J. Cancer, 97: 28-33, 2002）、クラスタ２（ＭＷ４０ｋＤ）抗原（ＮｒＬｕ１０抗体）（Myklebust et al., Br. J. Cancer Suppl. 14: 49-53, 1991）、ＨＭＷメラノーマ関連抗原（２２５．２８Ｓ抗体）（Dell'Erba et al., Anticancer Res., 21(2A):925-930, 2001)、８０ｋＤ、肉腫関連抗原（ＴＰ−１およびＴＰ−３抗体）（Bruland, et al., Cancer Res., 48:5302-5309, 1988）、サイトケラチン抗原（全抗ＣＫ抗体（pan-anti-CK antibody））（Bilkenroth et al., Int. J. Cancer, 92:577-582, 2001）、ムチン抗原ＴＡＧ１２（２Ｅ１１）（Diel et al., J. Natl. Cancer Inst., 88(22): 1652-8, 1996）、およびＥＧＦ受容体抗原（４２５．３抗体）（Merck）を含む抗原決定基の群に対する抗体であり得る。４２５．３抗体は、正常細胞および腫瘍細胞の双方の抗原に対するものである。捕捉抗体はさらに、正常細胞および悪性細胞の膜に発現する、および悪性細胞のみに発現する発癌産物、例えばＮｅｕ／ｅｒｂ  Ｂ２／ＨＥＲ２に加えて、正常細胞および異常細胞の双方の成長因子受容体、例えばＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ（ＡおよびＢ）受容体、インスリン受容体、インスリン様受容体、トランスフェリン受容体、ＮＧＦおよびＦＧＦ受容体、インテグリンの群、および他の接着膜分子およびＭＤＲタンパク質、ならびに正常細胞の亜集団に存在する抗原に対するものであってもよい。悪性細胞に関しては、これらは、乳癌細胞、卵巣癌細胞、および肺癌細胞、消化管および細網内皮系のメラノーマ癌細胞、肉腫癌細胞、神経膠芽細胞腫癌細胞であってよく、または標的細胞は、心臓血管障害、神経障害、肺障害、自己免疫障害、消化管障害、尿生殖器障害、細網内皮障害、および他の障害などの非腫瘍性疾患に関連し得る。さらに、悪性細胞集団は、骨髄、抹消血にあってもよく、胸水および腹水、ならびに他の体液区画（尿、髄液、精液、リンパ液など）からのものであってもよく、正常組織および器官の固形腫瘍、例えば、肝臓、リンパ節、脾臓、肺、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜からのものであってもよい。改良された本発明に関連して用いることができる抗原決定基および対応する抗体または抗体断片の部分的なリストは、以下の表１に提示する。
【０２９３】
標的細胞の密度が低い場合、例えば、悪性細胞すなわち標的細胞が細胞の総数のうちの非常に低い割合を占める（１％以下）場合、ＭＯＢＤＳでの分析前に、磁石を用いて、標的細胞を非標的細胞から確実に分離して予備濃縮することができる。次に、単離した標的細胞を、ＭＯＢＤＳを用いて計数することができ、最初の細胞懸濁液の細胞の総数に対する標的細胞の割合を計算することができる。
【０２９４】
ＭＯＢＤＳでの薬物感受性検定
上述のように、ＭＯＢＤＳを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで標的細胞の単離、操作、および研究を行うことができる。標的細胞に対して行うことができる１つの検定は、薬物への曝露に続く薬物誘導性細胞死を測定するための細胞傷害性、化学的感受性、薬物感受性、または薬物耐性検定である。この方法では、標的細胞は、例えば、悪性腫瘍生検材料、細菌、植物、ウイルス、および単細胞生物から回収されてもよい。標的細胞は、上述のようにＭＯバイオディスクの１つまたは複数のチャンバにおいて免疫磁気的に単離され、それにより単離物を構成する。標的細胞が単離されると、単離物からの所定数の細胞を、試験チャンバを含むＭＯバイオディスク内の種々のチャンバに向けて磁気的に移動または操作する。これらのチャンバは、限定はされないが、化学療法剤、抗生物質、または抗ウイルス剤を個別にまたは組み合わせて含む薬物を、種々の所定の投与量で含み得る。化学療法剤は、例えば、乳癌、肺癌、脳腫瘍、肝臓癌、および卵巣癌の制癌剤を含むことができ、これらとしては、シスプラチン、トポテカン、タキソール、ゲムシタビン（１）、マイトマイシン−Ｃ、ナベルビン、ナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、エトポシド、トリメトレキセート、および限定はされないが、シスプラチンおよびトポテカン、シスプラチンおよびタキソール、シスプラチンおよびゲムシタビン（１）、シスプラチンおよびナイトロジェンマスタード、ならびにシスプラチンおよび５−フルオロウラシルを含むそれらの種々の組み合わせなどが挙げられる。次に、単離細胞を所
定の条件で、種々の濃度および薬物の組み合わせで培養する。培養後、生細胞の数を、ＭＯＢＤＳを用いて計数し、全薬物からのＩＣ５０（薬物または薬物の組み合わせへの曝露の結果として細胞の５０％が死滅する薬物濃度）を計算し、患者にとって最良の治療レジメンを決定する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性であると判明した薬物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで不活性であると判明した薬物に比して約１０倍も臨床的に効果的である可能性が高いため、この試験は非常に重要である。ｉｎ  ｖｉｖｏの薬物感受性検定は、当該技術分野において既知である。（Bosanquet et al., Leukemia 16(6): 1035-44, 2002; Nagourney et al., J. Clin. Onco. 18:11, 2245-49, 2000; Bosanquet et al., Br. J. Haem., 106:71-77, 1999; and Cortazar et al., J. Clin. Onco., 17:5, 1625-31, 1999）。従来技術の検定は、ほとんどがマイクロタイタープレートを用いて行われており、細胞の計数および分析は、生細胞または死細胞の選択染色によって、顕微鏡を用いて、またはマイクロタイタープレート読み取り装置を用いて比色法により行われて、生細胞の数が判定される。本発明は、顕微鏡またはマイクロタイタープレート読み取り装置などの別個の分析デバイスを必要とせずに、細胞の選択、操作、培養、分析、およびＩＣ５０の判定がＭＯＢＤＳを用いて行われるプロセスを自動化する。自動プロセスは、これらの薬物感受性検定の効率および精度を高める。
【０２９５】
サンプル調製
上述した本発明の免疫磁気的な実施の形態を行うステップは、検査される組織のタイプに応じて異なる。例えば、
ａ）固形組織または腫瘍針生検材料からの細胞を、機械的に、またはマイルドな酵素処理により分離して単独細胞の懸濁液を生成し、これに特異的な一次抗体または抗体断片を、直接添加するか、またはウシ胎児血清、ウシ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヤギ血清、またはヒト血清などを含むかまたは含まないリン酸緩衝生理食塩水または培養培地で細胞懸濁液を洗浄した後に添加する。
ｂ）胸水または腹水、髄液、尿、リンパ液、または種々の形態の関節炎に罹患している患者の関節の浸出液などの体液中の細胞、特異的な捕捉抗体または抗体断片を、サンプルに直接添加するか、または洗浄したかまたはせずに遠心分離の後に添加するか、サンプル中の細胞を遠心沈降させて懸濁液中に戻す前またはその後に添加する。
ｃ）血液または骨髄吸引液からの単核細胞を勾配遠心分離により単離し、洗浄および再懸濁時またはその前に、捕捉抗体を単離した単核細胞に加える。
【０２９６】
［表１］
関連抗原および関連抗原結合抗体の例のリスト
抗原                                          モノクローナル抗体
接着分子
フィブロネクチン受容体                      Ｐｉｅｒｃｅ  ３６１１４、
（α５βインテグリン）                        ＢＴＣ  ２１／２２
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ３４１６４９
インテグリンα３β  １                      Ｍ−Ｋｉｏｌ  ２
ビトロネクチン受容体
（αγβ３インテグリン）                      ＴＰ３６．１、  ＢＴＣ  ４１／４２
インテグリンα２                            Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０７２７７
インテグリンα３                            Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０７２７８
インテグリンα４                            Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０７２７９
インテグリンα５                            Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０７２８０
インテグリンαＶ                            Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０７２８１
インテグリンβ２                            Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０７２８３
インテグリンβ４                            Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４０７２８４
ＧｐＩＩβＩＩＩα                          ８２２１
ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）                    Ｃ５７−６０、ＣＬ２０３．４、
ＲＲ１／１
ＶＣＡＭ−１                                Ｇｅｎｚｙｍｅ  ２１３７−０１
ＥＬＡＭ−１                                Ｇｅｎｚｙｍｅ  ２１３８−０１
Ｅ−セレクチン                              ＢＢＡ  ８
Ｐ−セレクチン／ＧＭＰ−１４０              ＢＴＣ  ７１／７２
ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）                      ＴＳ  ２／９
ＣＤ４４                                    ＢＭ  １４４１  ２７２、２５．３２
ＣＤ４４変異体                              １１．２４、１１．３１、１１．１０
Ｎ−ＣＡＭ（ＣＤ５６）                      ＭＯＣ−１
Ｈ−ＣＡＭ                                  ＢＣＡ９
Ｌ−ＣＡＭ                                  ＢＭ  １４４１  ８９２
Ｎ−ＣＡＭ                                ＴＵＲＡ−２７
ＭＡＣＡＭ−１                            ＮＲＩ−Ｍ９
Ｅ−カドヘリン                            ＢＴＣ  １１１、ＨＥＣＤ−１、６Ｆ９
Ｐ−カドヘリン                            ＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９
テネイシン                                ＢＭ  １４５２  １９３、
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ５８０６６４
トロンボスポンジン受容体（ＣＤ３６）      ＢＭ  １４４１  ２６４
ＶＬＡ−２                                Ａ１．４３
ラミニン受容体
ＨＮＫ−１エピトープ                      ＨＮＫ−１
炭水化物抗原
Ｔ−抗原                                  ＨＨ８、ＨＴ−８
Ｔｎ−抗原                                ＴＫＨ６、ＢａＧｓ２
シアリルＴｎ                              ＴＫＨ−２
消化器癌関連抗原（ＭＷ２００ｋＤ）        ＣＡ１９−９
癌腫関連抗原                              Ｃ−５０
Ｌｅｙ                                    ＭＬｕＣ１、ＢＲ９６、ＢＲ６４
ジ−ＬｅＺ、トリ−Ｌｅ１                  Ｂ３
ダイメリックＬｅ１エピトープ              ＮＣＣ−ＳＴ−４２１
Ｈ−２型                                  Ｂ１
ＣＡ１５−３エピトープ                    ＣＡ１５−３
ＣＥＡ                                    Ｉ−９、Ｉ−１４、Ｉ−２７、
ＩＩ−１０、Ｉ−４６、
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ２５０７２９
Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮａｃ
（ｎＬ４，６，８）                          １Ｂ２
Ｈ−ＩＩ                                  ＢＥ２
Ａ−３型                                  ＨＨ８
ラクト−Ｎ−フコペンタノースＩＩＩ
（ＣＤ１５）                                ＰＭ−８１
糖脂質
ＧＤ３                                    ＭＥ  ３６．１、Ｒ２４
ＧＤ２                                    ＭＥ  ３６．１、３Ｆ８、１４．１８
Ｇｂ３                                    ３８−１３
ＧＭ３                                    Ｍ２５９０
ＧＭ２                                    ＭＫＩ−８、ＭＫＩ−１６
ＦｕｃＧＭ１                              １Ｄ７、Ｆ１２
成長因子受容体
ＥＧＦ受容体                              ４２５．３、２．Ｅ９、２２５
ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２）              ＢＭ  １３７８  ９８８、８００  Ｅ６
ＰＤＧＦα受容体                          Ｇｅｎｚｙｍｅ１２６４−００
ＰＤＧＦβ受容体                          Ｓｉｇｍａ  Ｐ  ７６７９
トランスフェリン受容体                    ＯＫＴ  ９、Ｄ６５．３０
ＮＧＦ受容体                              ＢＭ  １１９８  ６３７
ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）                ＢＭ  １２９５  ８０２、
ＢＭ  １３６１  ９３７
ｃ−キット                                ＢＭ  ４２８  ６１６、１４  Ａ３、
ＩＤ９．３Ｄ６
ＴＮＦ受容体                              ＧＥｎｚｙｍｅ１９９５−０１、
ＰＡＬ−Ｍ１
ＮＧＦ受容体
メラノーマ抗原
高分子量抗原（ＨＭＷ２５０．０００）      ９．２．２７、ＮｒＭＬ５、
２２５．２８、７６３．７４、
ＴＰ４１．２，ＩＮＤ１
ＭＷ１０５メラノーマ関連糖タンパク質      ＭＥ２０
１００ｋＤａ抗原（メラノーマ／癌腫）      ３７６．９６
ｇｐ１１３                                ＭＵＣ１８
ｐ９５−１００                            ＰＡＬ−Ｍ２
Ｓｐ７５                                  １５．７５
ｇｒ１００−１０７                        ＮＫＩ−ｂｅｒｅｂ
ＭＡＡ                                    Ｋ９．２
ＭＱ１２５ｋＤ（ｇｐ１２５）              Ｍａｂ４３６
肉腫抗原
ＴＰ−１およびＴＰ−３エピトープ        ＴＰ−１、ＴＰ−３
ＭＷ２００ｋＤ                          ２９−１３、２９．２
ＭＷ１６０ｋＤ                          ３５−１６、３０−４０
癌腫マーカー
ＭＯＣ−３１エピトープ
（クラスタ２上皮抗原）                    ＭＯＣ−３１、ＮｒＬｕ１０
ＭＵＣ−１抗原
（ＤＦ３エピトープ（ｇｐ２９０ｋＤ）など）ＭＵＣ−１、ＤＦ３、
ＢＣＰ−７〜−１０
ＭＵＣ−２およびＭＵＣ０３              ＰＭＨ１
ＬＵＢＣＲＵ−Ｇ７エピトープ
（ｇｐ２３０ｋＤ）                        ＬＵＢＣＲＵ−Ｇ７
前立腺特異的抗原                        ＢＭ  １２７６  ９７２
前立腺癌抗原                            Ｅ４−ＳＦ
前立腺高分子抗原ＭＷ＞４００ｋＤ        ＰＤ４１
多形性上皮性ムチン                      ＢＭ−２、ＢＭ−７、１２−Ｈ−１２
前立腺特異的膜抗原（Ｃｙｔ−３５６）    ７Ｅ１１−Ｃ５
ヒト乳脂グロブリン                      Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ  ＨＭＦＧ−１、
２７．１
４２ｋＤ乳癌エピトープ                  Ｂ／９１８９
ＭＷ＞１０６ムチン                      ＴＡＧ−７２、ＣＣ−４９、ＣＣ−８３
卵巣がんＯＣ１２５エピトープ
（ＭＷ７５０ｋＤ）                        ＯＣ１２５
膵臓ＨＭＷ糖タンパク質                  ＤＵ−ＰＡＮ−２
結腸抗原Ｃｏ１７−１Ａ（ＭＷ３７０００）  １７−１Ａ
Ｇ９エピトープ（結腸癌）                  Ｇ９
ヒト結腸スルホムチン                      ９１．９Ｈ
ＭＷ３００ｋＤ膵臓抗原                    ＭＵＳＥ１１
ＧＡ７３３．２                            ＧＡ７３３、ＫＳ１．４
ＴＡＧ７２                                Ｂ７２．３、ＣＣ４９、ＣＣ８３
未定義                                    Ｏａｔ１、ＳＭ１
膵臓癌関連                                ＭＵＳＥ１１
全癌（Pancarcinoma）                      ＣＣ４９
前立腺癌抗原                              ＰＤ４１
ＭＷ１５０−１３０ｋＤ肺腺癌              ＡＦ−１０
ｇｐ１６０肺癌抗原
（Cancer Res. 48, 2768, 1988）              抗ｇｐ１６０
ＭＷ９２ｋＤ膀胱癌抗原                    ３Ｇ２−Ｃ６
ＭＷ６００ｋＤ膀胱癌抗原                  Ｃ３
膀胱癌抗原（Cancer Res. 49, 6720, 1989）  ＡＮ４３、ＢＢ３６９
ＣＡＲ−３エピトープＭＷ＞４００ｋＤ      ＡＲ−３
ＭＡＭ−６エピトープ（Ｃ１５．３）        １１５Ｄ８
高分子卵巣癌抗原                          ＯＶＸ１、ＯＶＸ２
ムチンエピトープｌａ３                    ｌａ３
肝細胞癌抗原ＭＷ９００ｋＤ                ＫＭ−２
Ｈｅｐｅｒｎａｌエピトープ（ｇｐ４３）
肝細胞癌ａｇ                              Ｈｅｐｅｍａ−１
Ｏ結合ムチン含有
Ｎ−グリコリルノイラミン酸                ３Ｅ１．２
ＭＷ４８ｋＤ結腸直腸癌抗原                Ｄ６１２
ＭＷ７１ｋＤ乳癌抗原                      ＢＣＡ２２７
１６．８８エピトープ（結腸直腸癌抗原）    １６．８８
ＣＡＫ１（卵巣癌）                        Ｋ１
結腸特異的抗原ｐ                          Ｍｕ−１、Ｍｕ−２
肺癌抗原ＭＷ３５０−４２０ｋＤ            ＤＦ−Ｌ１、ＤＦ−Ｌ２
ｇｐ５４膀胱癌抗原                        Ｔ１６
ｇｐ８５膀胱癌抗原                        Ｔ４３
ｇｐ２５膀胱癌抗原                        Ｔ１３８
神経芽細胞腫抗原
神経芽細胞腫関連
（ＵＪ１３Ａエピトープなど）                ＵＪ１３Ａ
膠腫抗原
Ｍｅｌ−１４エピトープ                    Ｍｅｌ−１４
頭頚部癌抗原
ＭＷ１８−２２ｋＤ抗原                    Ｅ４８
ＨＬＡ抗原
ＨＬＡクラス１                            ＴＰ２５．９９
ＨＬＡ−Ａ                                ＶＦ１９ＬＬ６７
ＨＬＡ−Ｂ                                Ｈ２−１４９＿１
ＨＬＡ−Ａ２                              ＫＳ１
ＨＬＡ−ＡＢＣ                            Ｗ６．３２
ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＤＰ                  Ｑ５／１３、Ｂ８．１１．２
β２−ミクログロブリン                    ＮＡＭＢ−
アポトーシス受容体
Ａｐｏ−１エピトープ                      Ａｐｏ  １
その他
プラスミノゲンアクチベータ抗原および
受容体                                    ウサギポリクローナル
ｐ−糖タンパク質                          Ｃ２１９、ＭＲＫ１６、ＪＳＢ−１、
２６５／Ｆ４
カテプシンＤ                              ＣＩＳ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｉ
（Italy）
胆管上皮抗原                              ＨＥＡ１２５
神経腺抗原（ＣＤ６３）                    ＭＥ４９１、ＮＫＩ−Ｃ３、ＬＳ６２
ＣＤ９                                    ＴＡＰＡ−１、Ｒ２、ＳＭ２３
全ヒト細胞抗原                            ｐａｎ−Ｈ
【０２９７】
本発明のＭＯＢＤＳ態様の別の実施の形態では、標的細胞は、二次元または二重パラメータ免疫磁気的細胞分離法により分離することができ、この方法は、例えば、Partington, et al., A Novel Method of Cell Separation Based on Dual Parameter Immunomagnetic Cell Selection, J. of Immuno. Mthds., 223: 195-205, 1999に記載されており、当該文献は、その内容がすべて参照により本明細書に援用される。この実施の形態では、生体磁気粒子を用いた標的細胞のタグ付けおよび分離を、ＭＯバイオディスクの流体回路内で行うことができる。この手法は、市販の免疫磁気ビーズおよび／または粒子間のサイズの差と、種々の強度の磁界への吸引に関するそれらの異なる特性とを利用する。例えば、分離の第１のステップは、５０ｎｍのビーズを利用した細胞のポジティブセレクションであり得る。次に、第１のステップで単離され、５０ｎｍのビーズでロゼット化されたままの細胞を、前もってビーズを除去する必要なく、より大きいビーズ、例えばＭ２８０またはＭ４５０のダイナビーズ（Dynabeads）を用いてさらにポジティブセレクションまたはネガティブセレクションに付すことができる。第２の分離ステップの間の磁界の強度は、ＭＯディスクの磁区に発生した磁力がより大きいダイナビーズのみを吸引するには十分であるが５０ｎｍのビーズは吸引しない程度であるように変調される。したがって、この二重パラメータの実施の形態は、対象となる細胞を単離および精製するよりよい方法を提供する。
【０２９８】
本発明のＭＯＢＤＳ態様のさらに別の実施の形態では、標的細胞は、弾動移入（ballistic transfer）により磁気粒子で標識またはタグ付けすることができる。弾動移入技術は、機械力により物質を細胞内に運ぶ微粒子を加速させるために冷ガス衝撃波を用いる。本発明のこの実施の形態は、感磁性にされたことにより強磁界でそれらを保持することで分離され得る標的細胞の分離を可能にする方法に関する。次に、タグ付けされた細胞を、ＭＯＢＤＳを用いて捕捉、分析、操作、および定量することができる。磁気粒子での細胞の弾動的タグ付けに関するさらなる詳細は、例えばWittigに付与された米国特許第６，３４８，３３８号に開示されており、当該特許は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０２９９】
本発明のさらなる実施の形態は、上述のように、ＭＯＢＤＳを用いて、免疫磁気的な細胞選択により細胞の分析、操作、および定量を行うこと、およびＭＯバイオディスクのトラック上の細胞の整列など、ＭＯバイオディスク上に標的細胞を種々の所定の構成に整列させることである。この実施の形態では、細胞をＭＯバイオディスク上で磁気的に選別して整列させ、ＭＯディスクドライブおよび関連のソフトウェアを用いて分析する。関連する免疫磁気的細胞分析の方法およびシステムは、例えば、Tibbe et al., Cytometry, 43:31-37, 2001、およびTibbe et al., Cytometry, 47:163-172, 2002に記載されており、これらはいずれも、その内容がすべて参照により本明細書に援用される。従来技術のこれらの方法は、蛍光検出を含む専用デバイスおよびシステムを必要とする。本発明は、標準的
なＭＯディスクドライブを用いて上述の免疫磁気的な細胞の選択、操作、検出、定量、および分析を行うことができるという点で、これらの専用デバイスの必要を回避する。
【０３００】
ＭＯＢＤＳ生体磁気的検定の分子の応用
単離された標的細胞は、特定の生化学的および生物学的特徴の存在に関して特徴付けられ得る。特に重要なのは、分子生物学の研究のためのこのような細胞の使用である。従来技術の上記の方法とは対照的に、本方法は、磁気粒子−標的細胞結合の切断を行う必要なく、標的細胞の研究および成長を可能にする。いくつかの目的のために、血液、骨髄、および他の体液（例えば、尿、髄液、精液、リンパ液）に存在する、またはそれ以外の正常組織および器官（例えば、肝臓、リンパ節、脾臓、肺、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚および粘膜）からの腫瘍生検材料および腫瘍細胞との両方で、また細胞学的検定の他の区域で、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質レベルで、純粋な標的細胞集団における特定の遺伝子を検査することが重要である場合がある。
【０３０１】
従来技術の方法では、サザンブロット、ノーザンブロット、およびウェスタンブロットで得られたシグナルは、生検材料中の正常細胞および腫瘍細胞を表す。１つの細胞懸濁液を最初に腫瘍材料から調製し、次に本発明のＭＯＢＤＳを用いて腫瘍細胞をポジティブセレクションにより免疫磁気的に検出および分離すると、この材料に対して行われたいかなる遺伝子研究も、標的細胞のみを表す。これは、例えば、骨髄、抹消血、胸水および腹水、ならびに他の体液（例えば、尿、髄液、精液、およびリンパ液）を含む哺乳類組織に存在する悪性細胞にも関連する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびマイクロアレイ法を伴う研究もまた、本発明の方法および装置を用いて得られる純粋な標的細胞集団に対して行った場合、特異性および信頼性の向上を得ることができる。
【０３０２】
ＭＯバイオディスクシステム（ＭＯＢＤＳ）での神経生物学的検定
本発明のＭＯＢＤＳ態様のさらに別の実施の形態では、ＭＯバイオディスクにおいて、ニューロンを単離して刺激し、生物マトリックスまたは溶液中で成長および再生させることができる。生物マトリックスは、細胞の固体支持体を提供しつつ、細胞の生存を可能にするように必須栄養素および気体を通す、ゲルまたは任意の生体適合性材料から形成することができる。生物マトリックスは、マトリックス内での細胞およびその構成要素の成長および移動（軸索突起および樹状突起の移動など）も可能にする。軸索突起および樹状突起、および細胞の成長の方向および速度は、ＭＯドライブにより生成されるＭＯバイオディスクの磁界により制御することができる。この実施の形態では、神経突起（neurites）には、例えば、ニューロンおよびその軸索突起に吸収されるかまたは積極的に組み込まれる磁気ナノ粒子またはビーズが設けられ得る。次に、これらのニューロンのアレイは、ＭＯバイオディスク上の生物マトリックス内の所定の場所に整列される。次に、整列したニューロンまたは神経突起に、所望の軸に沿って磁気粒子負荷（magnetic-particle-loaded）ニューロンおよびその軸索突起を移動させてアレイのニューロン間の１つまたは複数のギャップを埋めるように変位された磁界が印加される。ＭＯディスクに発生した磁性領域は比較的小さく、厳密に制御できるため、本発明の磁気誘導性神経突起成長の実施の形態の使用により、従来技術の方法に比して神経突起成長のより厳密な制御が可能になる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの磁気誘導性神経突起成長およびｉｎ  ｖｉｖｏでの神経再生は、当該技術分野では既知である（Moorman et al., Brain Res. Bulletin, 35(5-6):419-422, 1994, Dubey et al., Exp. Neuro., 158:333-350, 1999, Macias et al., Bioelectromagnetics, 21:272-286, 2000, Shah et al., Bioelectromagnetics, 22:267-271, 2001、およびHalpernに付与された米国特許第６，１３２，３６０号（これらはすべて、その内容がすべて参照により本明細書に援用される））。本発明のこの実施の形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの神経突起成長の厳密な磁気的制御の研究のためのＭＯＢＤＳの使用、およびｉｎ
ｖｉｔｒｏでの神経回路網の作成を対象としている。
【０３０３】
次に図７６を参照して、注入ポート１５２、混合チャンバ１６４、分離または分析チャンバ３００、および試験チャンバ３０２を含む流体回路を有する光磁気バイオディスクの一部の平面図が示されている。光磁気バイオディスクは、図３Ａ〜図３Ｃ、図４Ａ〜図４Ｃ、図３３Ａ〜図３３Ｃ、図３５、図３６Ａ〜図３６Ｃ、および図３７に関連して上述したバイオディスクの１つまたは複数の構成要素を含み得る。
【０３０４】
次に図７７Ａ〜図７７Ｅを参照して、図７６に示す流体回路での細胞の分離および試験の方法を示す平面図が示されている。本発明のこの特定の方法では、試験細胞３０６を、ピペット２１４を用いて注入ポート１５２を通して混合チャンバ１６４にロードする（図７７Ａ）。次に、生体磁気粒子３０８を、ピペット２１４を用いて混合チャンバ１６４にロードする。生体磁気粒子は、サンプル中の対象となる細胞の表面マーカーに特異的な結合剤で被覆される。結合剤は、例えば、表１に上記した抗体を含むことができる。次に、細胞３０６および生体磁気粒子３０８を、結合剤と細胞表面マーカーとの結合により、対象となる細胞に生体磁気粒子３０８を結合させるのに十分な時間の間培養する。培養後、対象となる細胞すなわち標的細胞はそれにより生体磁気粒子で標識され、標識細胞３１０となる。これにより、標識細胞３１０が磁気操作を受けやすくなる。磁区すなわち磁性領域２４６は、培養前または培養後に光磁気ドライブを用いて分離チャンバ３００に形成することもできる。光磁気バイオディスクの磁区２４６の形成に関する詳細は、図３７に関連して上述されている。培養が終了すると、光磁気ドライブを用いてディスクを所定の速度で所定の持続時間の間回転させ、非標識細胞３０６、生体磁気粒子３０８、および標識細胞３１０を含む懸濁液を、分離チャンバ３００に移動させる（図７７Ｂ）。懸濁液が分離チャンバ内を移動すると、標識細胞３１０および自由なすなわち未結合の生体磁気粒子３０８が、分離チャンバ３００内の磁区２４３に磁気的に結合する。次に、ディスクを別の所定の速度で別の所定の時間の間回転させ、懸濁液中の未結合および非標識細胞３０６を分離チャンバ３００の底部に移動させる（図７７Ｃ）。次に、磁区２４６を順次消去および形成し、磁気的に結合した標識細胞３１０を選択的に解放する（図７７Ｄ）。次に、磁区２４６を順次消去および形成することにより、標識細胞３１０を１つまたは複数の試験チャンバ３０２に磁気的に導く（図７７Ｅ）。試験チャンバ３０２には、限定はされないが、化学療法剤、抗生物質、および抗ウイルス薬を含む試験剤を含む試験溶液があらかじめロードされていてもよい。次に、標識細胞３１０を試験剤と共に培養することができる。次に、電磁放射ビームを試験チャンバ３０２にわたって走査させて、生細胞およびアポトーシス細胞を定量し、それにより、試験剤に曝露した場合の細胞の感受性を判定することができる。アポトーシス細胞は、膜泡、細胞収縮、タンパク質断片化、クロマチン凝縮、およびＤＮＡ分解を特徴とし、これらすべては細胞の光学的特性を変化させ、光ディスク読み取り装置を用いて非アポトーシス細胞から区別することを可能にする。
【０３０５】
本発明の他の実施態様
この発明またはその種々の態様は、以下の本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中の特許出願に開示されているディスク、検定、およびシステムの多くで容易に実施することができるか、または適合させることができる。１９９９年８月２３日に出願された「Methods and Apparatus for Analyzing Operational and Non-operational Data Acquired from
Optical Discs」と題する米国特許出願第０９／３７８，８７８号、１９９９年８月２３日に出願された「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical Synchronization Markers」と題する米国仮特許出願第６０／１５０，２８８号、１９９９年１０月２６日に出願された「Trackable Optical Discs with Concurrently Readable Analyte Material」と題する米国特許出願第０９／４２１，８７０号、２０００年８月２１日に出願された「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical Synchronization Markers」と題する米国特許出願第０９／６４３，１０６号、２００１年１１月１５日に出願された「Optical Bio-discs with Reflective Layers」と題する米国特許出願第０９／９９９，２７４号、２００１年１１月２０日に出願
された「Methods And Apparatus For Detecting And Quantifying Lymphocytes With Optical Biodiscs」と題する米国特許出願第０９／９８８，７２８号、２００１年１１月１９日に出願された「Methods and Apparatus for Blood Typing with Optical Bio-discs」と題する米国特許出願第０９／９８８，８５０号、２００１年１１月２０日に出願された「Apparatus and Methods for Separating Agglutinants and Disperse Particles」と題する米国特許出願第０９／９８９，６８４号、２００１年１１月２７日に出願された「Dual Bead Assays Including Optical Biodiscs and Methods Relating Thereto」と題する米国特許出願第０９／９９７，７４１号、２００１年１１月３０日に出願された「Apparatus and Methods for Separating Components of Particulate Suspension」と題する米国特許出願第０９／９９７，８９５号、２００１年１２月７日に出願された「Optical Discs for Measuring Analytes」と題する米国特許出願第１０／００５，３１３号、２００１年１２月１０日に出願された「Methods for Detecting Analytes Using Optical Discs and Optical Disc Readers」と題する米国特許出願第１０／００６，３７１号、２００１年１２月１０日に出願された「Multiple Data Layer Optical Discs for Detecting Analytes」と題する米国特許出願第１０／００６，６２０号、２００１年１２月１０日に出願された「Optical Disc Assemblies for Performing Assays」と題する米国特許出願第１０／００６，６１９号、２００１年１２月１４日に出願された「Detection System For Disc-Based Laboratory And Improved Optical Bio-Disc Including Same」と題する米国特許出願第１０／０２０，１４０号、２００１年１２月２１日に出願された「Surface Assembly For Immobilizing DNA Capture Probes And Bead-Based Assay Including Optical Bio-Discs And Methods Relating Thereto」と題する米国特許出願第１０／０３５，８３６号、２００２年１月４日に出願された「Dual Bead Assays Including Covalent Linkages For Improved Specificity And Related Optical Analysis Discs」と題する米国特許出願第１０／０３８，２９７号、２００２年１月１０日に出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題する米国特許出願第１０／０４３，６８８号、２００２年１月１４日に出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Signal Processing Methods and Software」と題する米国仮出願第６０／３４８，７６７号、２００２年２月２６日に出願された「Methods For DNA Conjugation Onto Solid Phase Including Related Optical Biodiscs and Disc Drive Systems」と題する米国特許出願第１０／０８６，９４１号、２００２年３月１２日に出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３６３，９４９号、２００２年５月２４日に出願された「Methods and Apparatus for Use in Detection and Quantitation of Cell Populations and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３８２，９４４号、２００２年５月３０日に出願された「Optical Disc Systems For Determining The Concentration
Of Cells Or Particles In A Sample And Methods Relating thereto」と題する米国仮出願第６０／３８４，２０５号。これらの出願はすべて、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。したがって、これらの出願は、その全体が本明細書において繰り返されるのと同様に、本明細書を支持するものとして背景および関連の開示を提供する。
【０３０６】
実験の詳細
本発明を図面を参照して詳細に説明してきたが、本発明の一定の例およびさらなる例示を以下に提供する。
【実施例１】
【０３０７】
図１２Ａで説明した２ステップハイブリダイゼーション法を、この実施例の二重ビーズ検定を行う際に用いた。
【０３０８】
Ａ．二重ビーズ検定
この実施例では、男性に存在するが女性には存在しない遺伝子配列ＤＹＳを検出するために二重検定を実行した。検定物は、共有結合した捕捉プローブで被覆された３μの磁気捕捉ビーズ、共有結合したＤＹＳ遺伝子に特異的な配列で被覆された２．１μの蛍光レポータービーズ、およびＤＹＳ配列を含む標的ＤＮＡ分子から構成する。標的ＤＮＡは、合成の８０オリゴヌクレオチド配列である。捕捉プローブおよびレポータープローブは、４０ヌクレオチド長であり、ＤＹＳ配列と相補的であるが互いには相補的ではない。
【０３０９】
検定物の調製に用いられる特定の方法は、１００マイクログラム／ミリリットルのサケ精子ＤＮＡ中で１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを室温で１時間処理することを含む。この前処理により、図３８に示すように、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非共有結合が低減する。捕捉ビーズを、上清を除去して磁気的に濃縮した。１００マイクロリットル容量のハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０マイクログラム／ミリリットルの変性サケ精子ＤＮＡ）を捕捉ビーズに添加し、ビーズを再懸濁した。１、１０、１００、１０００フェムトモルの範囲の種々の濃度の標的ＤＮＡを、３７℃で２時間混合しながら添加した。ビーズを磁気的に濃縮し、標的ＤＮＡを含む上清を除去した。１００マイクロリットル容量の洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３１０】
次に、１００マイクロリットルのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０マイクログラム／ミリリットルの変性サケ精子ＤＮＡ）中２×１０７の量のレポータービーズを添加して、捕捉ビーズを洗浄した。ビーズを再懸濁し、３７℃でさらに２時間混合しながら培養した。培養後、捕捉ビーズを磁気的に濃縮し、未結合レポータービーズを含む上清を除去した。１００マイクロリットル容量の洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３１１】
最後の洗浄後、２０マイクロリットルの結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  ＢＳＡ）中にビーズを再懸濁した。この実施例の以下のパートＢで説明するように調製したディスクに、１０マイクロリットル容量をロードした。
【０３１２】
Ｂ．ディスクの調製
金ディスクを無水マレイン酸ポリスチレン（maleic anhydride polystyrene）で被覆した。レポータープローブ（または捕捉剤）と相補的なアミンＤＮＡ配列を、ディスクの個別の反応領域に固定した。サンプル注入の前に、流路を遮断緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  ＢＳＡ、１％スクロース）で遮断して、ディスク表面への二重ビーズ複合体の非共有結合を防止した。本発明で用いられる捕捉剤２２０、捕捉領域１７０、および流体回路を示すディスクアセンブリの斜視図は、図２５Ａ〜図２５Ｄに詳細に示されている。別法として、レポータービーズをストレプトアビジンで被覆する場合、捕捉ゾーンは、受動吸着によりディスク（ポリスチレンで前処理されている）に固定され得るＢＳＡビオチンなどの捕捉剤で作成してもよい。ビオチン捕捉剤の使用を示すディスクアセンブリの斜視図は、図２６Ａ〜図２６Ｄに提示されている。ディスクへのビーズのこのタイプの固定で用いる種
々の方法も、図１５Ａおよび図１５Ｂ、図１７、図１９Ａ〜図１９Ｃ、および図２３Ａおよび図２３Ｂに示されている。
【０３１３】
Ｃ．ディスク上の二重ビーズ複合体構造の捕捉
上記のパートＡで説明したように調製した１０マイクロリットル容量の二重ビーズ混合物をディスクチャンバにロードし、注入ポートを密閉した。レポータービーズのレポータープローブと捕捉剤とのハイブリダイゼーションを促進させるために、ディスクを低速（８００ｒｐｍ未満）で１５分まで遠心分離した。ディスクを、速度４倍速（約１６００ｒｐｍ）で５分間、ＣＤ読み取り装置で読み取った。これらの条件下で、未結合磁気捕捉ビーズを遠心分離して捕捉領域から除去した。二重ビーズ複合体にある磁気捕捉ビーズは、捕捉領域のレポータービーズに結合したままであった。ディスクを用いて二重ビーズ複合体を捕捉および分析することに関するステップは、図２５Ａ〜図２５Ｄ、図２６Ａ〜図２６Ｄ、および図２７Ａ〜図２７Ｄに詳細に提示されている。
【０３１４】
Ｄ．二重ビーズ複合体構造の定量
捕捉された標的ＤＮＡの量は、捕捉磁気ビーズの数およびレポータービーズの数を定量することにより確定（enumerate）することができる。これは、各タイプのビーズが別個のシグネチャを有するからである。
【実施例２】
【０３１５】
以下の実施例は、例えば図３２を参照して上述されたような二重ビーズ多重化および関連する検定を対象とする。
【０３１６】
Ａ．二重ビーズ検定多重化
この実施例では、２つのＤＮＡ標的を同時に検出するために二重ビーズ検定を実行した。検定物は、３μｍの磁気捕捉ビーズから構成される。磁気捕捉ビーズの１つの集団をＤＮＡ標的１と相補的な捕捉プローブ１で被覆し、磁気捕捉ビーズの別の集団をＤＮＡ標的２と相補的な捕捉プローブ２で被覆する。別法として、２つの異なるタイプの磁気捕捉ビーズを用いてもよい。検定では２つの別個のタイプのレポータービーズがある。これら２つのタイプは、化学組成物（例えばシリカおよびポリスチレン）および／またはサイズが異なる。多重二重ビーズ検定フォーマットで用いることができるビーズの種々の組み合わせは、図３２に示されている。１つのタイプのレポータービーズを、ＤＮＡ標的１と相補的なレポータープローブ１で被覆する。他のレポータービーズは、ＤＮＡ標的２と相補的なレポータープローブ２で被覆する。この場合も、捕捉プローブおよびレポータープローブは、各標的とは相補的であるが、互いには相補的ではない。
【０３１７】
二重ビーズ検定多重化の調製に用いられる特定の方法は、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを室温で１時間処理することを含む。この前処理により、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非共有結合が低減する。捕捉ビーズを、上清を除去して磁気的に濃縮した。１００マイクロリットル容量のハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０マイクログラム／ミリリットルの変性サケ精子ＤＮＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。１、１０、１００、１０００フェムトモルの範囲の種々の濃度の標的ＤＮＡを、捕捉ビーズ懸濁液に添加した。懸濁液を３７℃で２時間混合しながら培養した。ビーズを磁気的に濃縮し、標的ＤＮＡを含む上清を除去した。１００マイクロリットル容量の洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３１８】
次に、１００マイクロリットルのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０マイクログラム／ミリリットルの変性サケ精子ＤＮＡ）中２×１０７の量のレポータービーズを添加して、捕捉ビーズを洗浄した。ビーズを再懸濁し、３７℃でさらに２時間混合しながら培養した。培養後、捕捉ビーズを磁気的に濃縮し、未結合レポータービーズを含む上清を除去した。１００マイクロリットル容量の洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３１９】
最後の洗浄後、２０マイクロリットルの結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  ＢＳＡ）中にビーズを再懸濁した。この実施例の以下のパートＢで説明するように調製したディスクに、１０マイクロリットル容量のこの溶液をロードした。
【０３２０】
Ｂ．ディスク調製
金ディスクを無水マレイン酸ポリスチレンで上記のように被覆した。２つのタイプのレポータービーズ用に個別の反応領域を作成した。各反応領域は、各レポータープローブ（または捕捉剤）と相補的なアミンＤＮＡ配列からなる。サンプル注入の前に、流路を遮断緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１％  ＢＳＡ、１％スクロース）で遮断して、ディスク表面への二重ビーズ複合体の非共有結合を防止した。別法として、多重化二重ビーズ検定フォーマットで用いられる磁気ビーズは、光磁気ディスクおよびドライブを用いて検出してもよい。磁気ディスクフォーマットの化学反応領域は、図３７に関連して説明したような明確に離間した磁気捕捉領域で置き換えられる。以下の実施例５および６を参照されたい。
【０３２１】
Ｃ．ディスク上の二重ビーズ複合体構造の捕捉
上記のこの実施例のパートＡで説明したように調製した１０マイクロリットル容量の二重ビーズ混合物をディスクチャンバにロードし、注入ポートを密閉した。レポータービーズのレポータープローブと捕捉剤とのハイブリダイゼーションを促進させるために、ディスクを低速（８００ｒｐｍ未満）で１５分まで遠心分離した。ディスクを、速度４倍速（約１６００ｒｐｍ）で５分間、ＣＤ読み取り装置で読み取った。これらの条件下で、未結合磁気捕捉ビーズを遠心分離して流路から除去した。レポータービーズは、レポータープローブとその相補的な薬剤とのハイブリダイゼーションにより、捕捉領域に結合した。
【０３２２】
Ｄ．二重ビーズ複合体構造の定量
捕捉された標的ＤＮＡ１および２の量は、各反応領域における各レポータービーズの数を定量することにより確定することができる。
【実施例３】
【０３２３】
二重ビーズ検定の感度は、二重ビーズをつなぎ合わせる標的媒介結合の強度に依存する。二重ビーズは水素結合によりつなぎ合わせられる。結合の強度は、二重ビーズをつなぎ合わせる結合が共有結合である場合に著しく高まる。このために、標的の捕捉後に、ライゲーション反応を実行して、図３８で上述したような捕捉プローブとレポータープローブとの共有結合を形成する。レポータープローブの５’末端は、ライゲーション反応で必要とされるリン酸基を保持する。
【０３２４】
ライゲーション実験：検定物は、共有結合した捕捉プローブで被覆された３μｍの磁気
捕捉ビーズ（Spherotech, Libertyville, IL）、共有結合したＤＹＳ遺伝子に特異的な配列で被覆された２．１μｍの蛍光レポータービーズ（Molecular Probes, Eugene, OR）、およびＤＹＳ配列を含む標的ＤＮＡ分子から構成される。標的ＤＮＡは、合成８０オリゴヌクレオチド長である。捕捉プローブおよびレポータープローブは、４０ヌクレオチド長であり、ＤＹＳ配列と相補的であるが互いには相補的ではない。
【０３２５】
検定物の調製に用いられる特定の方法は、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを室温で１時間処理することを含む。この前処理により、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非特異的結合が低減する。捕捉ビーズを、上清を除去して磁気的に濃縮した。次に、１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。１、１０、１００、１０００フェムトモルの範囲の種々の濃度の標的ＤＮＡを、捕捉ビーズ懸濁液に添加した。ビーズ懸濁液を、３７℃で２時間混合しながら培養した。ビーズを磁気的に濃縮し、未結合標的ＤＮＡを含む上清を除去した。１００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３２６】
次に、１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５および５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）中２×１０７の量のレポータービーズを添加して、捕捉ビーズを洗浄した。ビーズを再懸濁し、３７℃でさらに２時間混合しながら培養した。培養後、捕捉ビーズを磁気的に濃縮し、未結合レポータービーズを含む上清を除去した。１００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３２７】
最後の洗浄後、２０μｌの結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｔ−２０、１％  ＢＳＡ）中にビーズを再懸濁した。次に、実施例２のパートＢで説明するように調製したバイオディスクに、１０μｌをロードした。
【０３２８】
Ａ．捕捉ビーズの調製
上記検定物の調製に用いられる特定の方法は、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを室温で１時間処理することを含む。この前処理により、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非特異的結合が低減する。捕捉ビーズを、上清を除去して磁気的に濃縮した。次に、１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。１、１０、１００、１０００フェムトモルの範囲の種々の濃度の標的ＤＮＡを、捕捉ビーズ懸濁液に添加した。ビーズ懸濁液を、３７℃で２時間混合しながら培養した。ビーズを磁気的に濃縮し、未結合標的ＤＮＡを含む上清を除去した。１００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を
２回繰り返した。
【０３２９】
Ｂ．標的ＤＮＡまたは架橋配列（Bridging Sequence）へのハイブリダイゼーション
０モル、１Ｅ−１４モル、１Ｅ−１３モル、１Ｅ−１２モル、および１Ｅ−１１モルという濃度での種々の濃度の標的ＤＮＡを、捕捉ビーズ懸濁液に添加した。ビーズ懸濁液を、３７℃で２時間混合しながら培養した。ビーズを磁気的に濃縮し、未結合標的ＤＮＡを含む上清を除去した。１００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を２回繰り返した。捕捉ビーズを、５０μＬの４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液に再懸濁した。
【０３３０】
Ｃ．レポータープローブまたはレポータービーズへのハイブリダイゼーション
次に、１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）中２×１０７の量のレポータービーズまたは１００ｐモルのレポータープローブを添加して、捕捉ビーズを洗浄した。ビーズを再懸濁し、３７℃でさらに２時間混合しながら培養した。培養後、捕捉ビーズを磁気的に濃縮し、未結合レポータービーズまたは未結合レポータープローブを含む上清を除去した。１００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３３１】
Ｄ．ライゲーション反応
１０μＬ容量の１０×ライゲーション緩衝液（最終濃度６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、６６μＭ  ＡＴＰ）および４ユニットのリガーゼ（濃度１０ユニット／μＬ）を、ビーズ懸濁液に添加した。ライゲーション反応を室温で２時間実行した。ビーズ懸濁液を、洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．２％ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．２５％ＮＦＤＭ）で３回洗浄した。対照用試験管にはリガーゼを添加しなかった。
【０３３２】
Ｅ．酵素検定
レポータープローブの量を、捕捉された標的ＤＮＡの量と直接相関させた。したがって、捕捉された標的を定量する１つの方法は、レポータープローブの量を定量することである。この検定の原理は、レポータープローブがビオチン化されたことである。したがって、レポータープローブの濃度は、酵素であるストレプトアビジンアルカリホスファターゼがビオチン部分に結合する酵素検定により求めることができる。アルカリホスファターゼの色原体基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸をレポーターとして用いた。この無色基質は、アルカリホスファターゼにより加水分解され、４０５ｎｍの吸光度を有する黄色の生成物となる。ビーズを１００μｌのＣＤＢ（２％  ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３）で洗浄し、２５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンホスファターゼ１００μｌと共に３７℃で１時間培養した。ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５．０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、未結合Ｓ−ＡＰを除去した。ビーズを１００μｌのＳ−ＡＰ基質であるｐ−ニトロリン酸塩と共に、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中３．７ｍｇ／ｍｌで、室温で５〜１５分間培養した。上清の発色を４０５ｎｍで監視した。色の強度は、ビオチン化レポータープローブの量、したがって捕捉された標的の量と直接相関する。
【０３３３】
Ｆ．二重ビーズ検定
レポータービーズの量は、捕捉された標的の量と直接相関した。したがって、捕捉された標的を定量する１つの方法は、レポータービーズの量を定量することであった。ハイブリダイゼーションおよびライゲーション後、ビーズを２００μＬのＰＢＳに再懸濁し、レポータービーズの量を、蛍光測定器Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−２によって、Ｅｘ＝５００ｎｍ、スリット＝２．０、Ｅｍ＝５３０ｎｍ、スリット＝２．０で定量した。別法として、上述のように、蛍光レポータービーズの数をバイオＣＤ読み取り装置により定量してもよい。
【実施例４】
【０３３４】
二重ビーズ検定での切断可能スペーサの使用により、検定の感度が高まる。以下の実施例は、切断可能スペーサを用いた二重ビーズ検定を対象とする。
【０３３５】
Ａ．捕捉プローブおよびレポータープローブの設計
捕捉プローブおよびレポータープローブの設計は、切断可能スペーサを用いた二重ビーズ検定の成功に重要である。捕捉プローブおよびレポータープローブは、図で上述されるような３つの枝を含む。レポータープローブまたは捕捉プローブの１つの枝は、標的捕捉に関与する。いくつかのリンカー（ＰＥＧ基）を、捕捉プローブまたはレポータープローブに導入して、プローブの螺旋化を最小にし、標的捕捉効率を高める。捕捉プローブまたはレポータープローブの第２の枝は、末端にビオチンが続く３つのリンカーを含む。カルボキシルまたはアミンなどの他の官能基を用いることもできる。ビオチンは、固相への捕捉プローブまたはレポータープローブの結合に関与する。捕捉プローブの第３の枝は、レポータープローブとハイブリダイズする。
【０３３６】
制限酵素消化が捕捉プローブまたはレポータープローブの切断を選択する方法である場合、制限部位をプローブの配列に導入する。制限部位の選択は、捕捉プローブおよびレポータープローブを保持する（そして標的ＤＮＡを保持しない）配列のみを切断するように特有である（共通ではない）必要があるという点で重要である。標的の存在下での捕捉プローブおよびレポータープローブの形成は、上記の図４２Ｃに示されている。
【０３３７】
レポータープローブの置換が捕捉プローブおよびレポータープローブの切断を選択する方法である場合、捕捉プローブとのハイブリダイゼーションに関与するレポータープローブの配列は比較的短い（約１０ヌクレオチド）。残りの配列は捕捉プローブと相補的ではないため、置換プローブがハイブリダイズするのに利用可能である。これは、レポータープローブ（プローブ２Ｂ）への捕捉プローブ（プローブ１）のハイブリダイゼーションを示すために、図４３Ａおよび図４３Ｂに包括的に上述されている。この実施例では、用いられるプローブはBiosource（Camarillo, CA）で合成された。
【０３３８】
Ｂ．ストレプトアビジンビーズへの捕捉プローブの固定
１．捕捉ビーズの調製：この検定の第１のステップは、固相への捕捉プローブの結合である。この実施例では、Dynal製のストレプトアビジンで被覆された２．８μｍの磁気ビーズを固相として用いた。通常、６．７×１０７のＤｙｎａｌビーズを結合ごとに用いた。ビーズを２００μｌの結合および洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ）に再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を除去した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３３９】
２．捕捉ビーズへの捕捉プローブの結合：磁気ビーズを、４００μｌの結合および洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ）に再懸濁し、最終濃度を５μｇビーズ／μｌにした。次に、水中６００ピコモルの捕捉プローブをビーズ懸濁液に添加した。混合物の最終塩濃度は１Ｍ  ＮａＣｌである。効率
的な結合には高塩濃度が必要であることに留意すべきである。混合物を３７℃で２〜４時間、時々混合しながら培養した。次に、ビーズを磁気的に濃縮し、上清を除去した。ビーズを結合および洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。
【０３４０】
３．結合効率の決定：結合前および結合後の上清の光強度を、２６０ｎｍで測定し、結合された捕捉プローブの量を定量した。通常、５０％を超える捕捉プローブがストレプトアビジンビーズに結合した。プローブの密度は、０．５×１０６〜１×１０６プローブ／ビーズであった。以下の表２では、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズへのビオチン化プローブの結合効率の決定の例のリストを提示している。
【０３４１】
４．ビーズ上の残りのストレプトアビジン部位の遮断：ビーズを、２ｍｇ／ｍｌのビオチンを含む４００μｌのＰＢＳ中で、回転混合機において１時間培養し、Ｄｙｎａｌ磁気ビーズの残りのストレプトアビジン部位すべてを遮断した。磁気ビーズを、結合および洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄し、１０００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）に再懸濁した。
【０３４２】
【表２】
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【０３４３】
Ｃ．レポータープローブへの捕捉プローブのハイブリダイゼーション
１．ハイブリダイゼーション：１０００μｌのビーズ懸濁液のうち、４００μｌを１ナノモルのレポータープローブ２Ａを含む４００μｌのＴＥ緩衝液と混合し、４００μｌを１ナノモルのレポータープローブ２Ｂを含む４００μｌのＴＥ緩衝液と混合し、２００μｌを陰性対照として２００μｌのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）と混合した。ハイブリダイゼーションを３７℃で２時間実行した。
【０３４４】
２．洗浄：ハイブリダイゼーションに続き、磁気ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。
【０３４５】
３．ハイブリダイゼーション効率の決定：ここで、８００μｌのうちの５０μｌをハイブリダイゼーション効率について検定した。この検定の原理は、レポータープローブ２Ａおよび２Ｂがビオチン化されたことである。したがって、これらのプローブの濃度は、酵素であるストレプトアビジンアルカリホスファターゼがビオチン部分に結合する酵素検定により求めることができる。アルカリホスファターゼの色原体基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸をレポーターとして用いた。この無色基質は、アルカリホスファターゼにより加水分解され、４０５ｎｍの吸光度を有する黄色の生成物となった。ビーズを１００μｌのＣＤＢ（２％  ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４５ｍＭ  Ｎａ
Ｃｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３）で洗浄し、２５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンホスファターゼ１００μｌと共に３７℃で１時間培養した。ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、未結合Ｓ−ＡＰを除去した。ビーズを１００μｌのＳ−ＡＰ基質であるｐ−ニトロリン酸塩と共に、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中３．７ｍｇ／ｍｌで、室温で５〜１５分間培養した。上清の発色を４０５ｎｍで監視した。色の強度は、ハイブリダイズしたビオチン化レポータープローブ２Ａまたは２Ｂの量と直接相関する。
【０３４６】
この時点で、レポータープローブはそのビオチン部分を介して別の固相に結び付くことができる。この代替の二重ビーズ検定の場合、異なるタイプのストレプトアビジン被覆ビーズ、すなわちポリスチレンまたは蛍光を、ビーズ懸濁液に添加し、二重ビーズ複合体を形成させる。固相がバイオディスクの表面である場合、捕捉ビーズおよびレポータービーズの混合物は、ストレプトアビジン被覆ディスク表面上で培養する。
【０３４７】
Ｄ．標的ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーション
１．ハイブリダイゼーション：この実施例では、標的ＤＮＡは一本鎖の８０量体オリゴヌクレオチドであった。０、１、および１０００ピコモルの範囲の種々の濃度の標的ＤＮＡを、ビーズ懸濁液に添加した。ビーズ懸濁液を、３７℃で２時間混合しながら培養した。
【０３４８】
２．洗浄：ビーズを磁気的に濃縮し、未結合標的ＤＮＡを含む上清を除去した。１００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。洗浄手順を２回繰り返した。
【０３４９】
Ｅ．制限酵素消化またはプローブ置換による標的媒介捕捉の識別
１．制限酵素消化：捕捉プローブおよびレポータープローブに導入した制限酵素部位はＮＯＴ１であった。この制限酵素部位は稀であり、このモデル系では他のどの部位にも見られない。ビーズを４００μｌのＣＤＢ（２％  ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３）に再懸濁した。ビーズ懸濁液を、７つの試験管、すなわち１つの対照用試験管および６つの消化用試験管に分取した。酵素ＮＯＴ１を、製造業者の取扱説明書に従って調製した。次に、５ユニットの酵素を各消化用試験間に１００μｌの総容量で添加した。対照用試験管には水を添加した。消化を３７℃で３〜４時間実行した。
【０３５０】
２．置換プローブによるレポータープローブの置換：ビーズを４００μｌのＣＤＢ（２％  ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３）に再懸濁した。ビーズ懸濁液を、２つの試験管、すなわち１つの対照用試験管および１つの置換用試験管に分取した。ビーズを、２００μｌの６×ＳＳＣ、１ｍＭ  ＥＤＴＡで５５℃で５分間加熱した。熱処理を用いて、捕捉プローブからのレポータープローブ２Ｂの溶解を誘導した。この時点で、１０倍過剰な置換プローブをビーズ懸濁液に添加し、混合物を３７℃で数時間培養した。対照用試験管には水を添加した。
【０３５１】
Ｆ．酵素検定による捕捉された標的の定量
制限酵素消化またはプローブ置換後の残っているレポータープローブの量は、捕捉された標的ＤＮＡの量と直接相関した。したがって、捕捉された標的を定量する１つの方法は、残りのレポータープローブの量を定量することであった。この検定の原理は、レポータ
ープローブ２Ａおよび２Ｂがビオチン化されたことである。したがって、これらのプローブの濃度は、酵素であるストレプトアビジンアルカリホスファターゼがビオチン部分に結合する酵素検定により求めることができる。
【０３５２】
アルカリホスファターゼの色原体基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸をレポーターとして用いた。この無色基質は、アルカリホスファターゼにより加水分解され、４０５ｎｍの吸光度を有する黄色の生成物となった。ビーズを１００μｌのＣＤＢ（２％  ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３）で洗浄し、２５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンホスファターゼ１００μｌと共に３７℃で１時間培養した。ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５．０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、未結合Ｓ−ＡＰを除去した。ビーズを１００μｌのＳ−ＡＰ基質であるｐ−ニトロリン酸塩と共に、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中３．７ｍｇ／ｍｌで、室温で５〜１５分間培養した。上清の発色を４０５ｎｍで監視した。色の強度は、ハイブリダイズしたビオチン化レポータープローブ２Ａまたは２Ｂの量と直接相関する。
【０３５３】
Ｇ．二重ビーズ検定による捕捉された標的の定量
レポータープローブを蛍光またはポリスチレンストレプトアビジン被覆ビーズなどの別の固相に固定する場合、捕捉される標的の量は、二重ビーズ検定により定量することができる。制限酵素消化またはプローブ置換後に残っているレポータービーズの数は、蛍光測定器（蛍光ビーズの場合）またはバイオＣＤ読み取り装置により計数することができる。これは、各タイプのビーズが別個のシグネチャを有するからである。
【実施例５】
【０３５４】
以下の実施例は、図３７に関連して説明した光磁気バイオディスク１１０などの磁気的に書き込み可能かつ消去可能な分析ディスクで実行される二重ビーズ検定を説明する。
【０３５５】
この実施例では、男性に存在するが女性には存在しない遺伝子配列ＤＹＳを検出するために二重ビーズ検定を実行した。検定物は、共有結合した輸送プローブで被覆された３μｍの磁気捕捉ビーズ（Spherotech, Libertyville, IL）、共有結合したＤＹＳ遺伝子に特異的な配列で被覆された２．１μｍの蛍光レポータービーズ（Molecular Probes, Eugene, OR）、およびＤＹＳ配列を含む標的ＤＮＡ分子から構成される。標的ＤＮＡは、合成の８０オリゴヌクレオチド長である。輸送プローブおよびレポータープローブは、４０ヌクレオチド長であり、ＤＹＳ配列と相補的であるが互いには相補的ではない。
【０３５６】
検定物の調製に用いられる特定の方法は、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを室温で１時間処理することを伴った。この前処理により、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非特異的結合が低減する。
【０３５７】
サケ精子ＤＮＡでの前処理後、捕捉ビーズを、注入ポートを介してＭＯバイオディスク内にロードした。ＭＯバイオディスクは、光磁気ドライブにより生成された磁性領域を含む。これにより、捕捉ビーズはＭＯバイオディスクの特定の磁性領域内に保持される。
【０３５８】
次に、２００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）中の標的ＤＮＡおよびレポータービーズを含むサンプルを、注入ポートを介してＭＯバイオディスクに添加する。次に注入ポートを密閉する。磁界を解放する。ディスクをドライブにおいて非常に低速（８０
０ｒｐｍ未満）で回転させて、捕捉ビーズへの標的ＤＮＡおよびレポータービーズのハイブリダイゼーションを促進させる。ドライブの温度は常に３３℃に保つ。２時間のハイブリダイゼーション後、光磁気ドライブにより磁界を生成する。この段階で、未結合であるかまたは二重ビーズ複合体の一部としての磁気捕捉ビーズのみがＭＯバイオディスクに残る。未結合の標的およびレポータービーズを、上述の機構のいずれかにより廃液チャンバに導く。次に、２００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、Ｐｈ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加する。磁界を解放し、ディスクを低速（８００ｒｐｍ未満）で５分間回転させて、捕捉ビーズとレポータービーズとのいかなる非特異的結合も除去する。次に磁界を再印加する。洗浄緩衝液を、上述の機構のいずれかにより廃液チャンバに導く。この洗浄手順を２回繰り返す。
【０３５９】
この段階で、未結合であるかまたは二重ビーズ複合体の一部としての磁気捕捉ビーズのみが残る。磁界を解放し、二重ビーズ複合体を検出チャンバに導く。次に、捕捉された標的ＤＮＡの量を、捕捉磁気ビーズの数およびレポータービーズの数を定量することにより確定する。これは、図２８Ａ、図２８Ｂ、図２９Ａ、および図２９Ｂで上述したように、各タイプのビーズが別個のシグネチャを有するからである。
【実施例６】
【０３６０】
この実施例では、図３２および図３７に関連して上述した多重化技法を用いた二重ビーズ検定を、図３７を参照して説明したＭＯバイオディスク１１０などの磁気的に書き込み可能かつ消去可能な分析ディスクで実行する。
【０３６１】
２つ以上のＤＮＡ標的を同時に検出するために二重ビーズ検定を実行する。検定物は、３μｍの磁気捕捉ビーズ（Spherotech, Libertyville, IL）から構成される。磁気捕捉ビーズの１つの集団をＤＮＡ標的１と相補的な輸送プローブ１で被覆する。磁気捕捉ビーズの別の集団をＤＮＡ標的２と相補的な輸送プローブ２で被覆する。別法として、２つ以上の異なるタイプの磁気捕捉ビーズを用いてもよい。検定では２つ以上の別個のタイプのレポータービーズがある。これらのレポータービーズは、化学組成物（例えばシリカおよびポリスチレン）および／またはサイズが異なる。１つのタイプのレポータービーズを、ＤＮＡ標的１と相補的なレポータープローブ１で被覆する。他のレポータービーズは、ＤＮＡ標的２と相補的なレポータープローブ２で被覆する。この場合も、輸送プローブおよびレポータープローブは、各標的とは相補的であるが、互いには相補的ではない。
【０３６２】
二重ビーズ検定多重化の調製に用いられる特定の方法は、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを室温で１時間処理することを伴った。この前処理により、図３８に示すように、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非特異的結合が低減する。
【０３６３】
サケ精子ＤＮＡでの前処理後、捕捉ビーズをＭＯバイオディスクにロードする。特定の捕捉ビーズに対して異なる磁気領域を生成するために磁界を印加する。捕捉ビーズは、１０μｍ２あたり１つの捕捉ビーズの密度で、ＭＯバイオディスク上に保持することができる。ＭＯバイオディスクにビーズが堆積するのに使用可能な表面積は、約３×１０９μｍ２である。所与の密度の３μｍのビーズに対するＭＯバイオディスクの容量は、約３×１０８ビーズである。
【０３６４】
対象となる標的ＤＮＡを含むサンプルを、２００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）中で種々のタイプのレポータービーズと混合し、注入ポートを介してＭＯバイオデ
ィスクに添加する。次に注入ポートを密閉する。磁界を解放する。ディスクをドライブにおいて非常に低速（８００ｒｐｍ未満）で回転させて、種々のタイプの捕捉ビーズへの標的ＤＮＡおよびレポータービーズのハイブリダイゼーションを促進させる。ドライブの温度は常に３３℃に保つ。２〜３時間のハイブリダイゼーション後、光磁気ドライブにより磁界を再生成する。この段階で、未結合であるかまたは二重ビーズ複合体の一部としての磁気捕捉ビーズのみがＭＯバイオディスクに残る。未結合の標的およびレポータービーズを、上述の機構のいずれかにより廃液チャンバに導く。次に、２００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、Ｐｈ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加する。磁界を解放し、ディスクを低速（８００ｒｐｍ未満）で５分間回転させて、捕捉ビーズとレポータービーズとのいかなる非特異的結合も除去する。次に磁界を再印加する。洗浄緩衝液を、上述の機構のいずれかにより廃液チャンバに導く。この洗浄手順を２回繰り返す。
【０３６５】
この段階で、磁界を解放し、二重ビーズ複合体を検出チャンバに導く。種々のタイプの標的ＤＮＡの量は、対応する捕捉磁気ビーズおよびレポータービーズの数を定量することにより確定することができる。これは、上記の図２８Ａ、図２８Ｂ、図２９Ａ、および図２９Ｂに示したように、各タイプのビーズが別個のシグネチャを有するからである。
【実施例７】
【０３６６】
この実験は、種々のビーズ上の共有結合プローブの量を求めて、どのビーズタイプがプローブの共有結合に最適であるかを決定するために行った。
【０３６７】
Ａ．共役
Polysciences製の磁気ビーズ（１〜２μｍ）、Spherotech製の磁気ビーズ（３μｍ）、Polysciences製の蛍光ビーズ（１．８μｍ）、およびMolecular Probes製の蛍光ビーズ（２．１μｍ）を、この実施例で評価した。約５×１０８のビーズを共役反応ごとに用いた。ビーズを洗浄し、０．０５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（２−Ｎ−モルホレノ（morpholeno）−エタンスルホン酸）、ｐＨ６．０に再懸濁し、０．１Ｍ  ＥＤＣ（１−エチル−３−３ジメチルアミノプロピルカルボジイミド−ＨＣｌ）の添加により１５分間活性化した。活性化後、ビーズ溶液のｐＨをＮａＯＨを用いておよそ７．５に調節した。次に、０．５ナノモルのビオチン化プローブを溶液に添加した。プローブを、回転混合機において室温で２〜３時間結合させた。次に、ビーズを磁気的に濃縮し、上清を回収した。ビーズに結合しているビオチン化プローブの量を推定するために、結合前および結合後に上清の光学濃度（２６０ｎｍ）を測定した。
【０３６８】
Ｂ．共有結合効率の決定
上述のようにビオチン化プローブと結合した、通常は１〜５×１０７のビーズを、プローブの共有結合効率の決定に用いた。これらのビーズを、洗浄緩衝液で３回洗浄し、２００μｌのＣＤＢ（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２％  ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ２）に再懸濁した。次に、ビーズを磁気的に濃縮し、上清を除去した。ビーズを、５５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｓ−ＡＰ）を含む１００μｌのＣＤＢに再懸濁し、３７℃で１時間培養して、ストレプトアビジンがプローブのビオチンに結合するのに十分な時間を与えた。Ｓ−ＡＰとの培養後、ビーズを磁気的に濃縮し、未結合のＳ−ＡＰを含む上清を除去した。ビーズを洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、アルカリホスファターゼの基質として１００μｌのｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を、０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ１０中３．７ｍｇ／ｍｌの濃度で一定の時間間隔でビーズに添加し、培養時間の差による変動を最小にした。基質との培養時間は、４０５ｎｍの信頼性の高いＯＤを得るために必要とされるように（２分〜３０分）変化させた。これは、発色
の時間がプローブの濃度に応じて変わるからである。４０５ｎｍ波長で分光光度計から得られた光学濃度は、ビーズに結合したプローブの量に比例した。
【０３６９】
実験の結果を図５１Ａおよび図５１Ｂに示す。図示のように、３μｍのSpherotech製ビーズの非共有結合プローブが１５％であるのと比較して、Polysciences製の１〜２μｍの磁気ビーズに結合したプローブの８７％が非共有結合であった。
【０３７０】
図５３Ａおよび図５３Ｂを参照して、共有結合効率と二重ビーズ検定の感度との相関を示すデータが提示されている。これらの結果は、共有結合効率が高いほど、二重ビーズ検定の感度および特異性が高いことを示す。共有結合プローブの量は、以下のパートＣのステップを行った後に、このパートＢのステップを繰り返すことにより計算できる。共有結合の量の計算は図５５に提示されている。
【０３７１】
Ｃ．非共有結合プローブの除去における熱処理
どのビーズタイプが所望の共有結合効率を有するかを判定した後、非ビオチン化プローブおよび二重ビーズ検定で用いるのに適したビーズタイプを用いて、上記のパートＡおよびパートＢのステップを繰り返すことができる。
【０３７２】
結合後、非共有結合プローブを、ビーズの熱処理により選択的に除去することができる。このために、最高３×１０７のビーズを、７０℃で１０分間加熱した１００μｌのＣＤＢ溶液に再懸濁した。次に、ビーズを即座に磁気的に濃縮し、上清を除去した。ビーズを、洗浄緩衝液で２回、ＣＤＢで１回洗浄し、１００μｌのＣＤＢに再懸濁した。この時点で、ビーズは二重ビーズ試験で使用される準備が整っている。
【実施例８】
【０３７３】
固相上のＤＮＡプローブの共有結合効率を高めるためのプローブ結合の間の二本鎖ＤＮＡの使用を評価するためにも、実験を行った。
【０３７４】
Ａ．二本鎖ＤＮＡの形成
利用された捕捉プローブは、４０ヌクレオチド長であり、５’末端にアミノ基（ＮＨ２）と、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）リンカーのいくつかの鎖とを含んでいた。この実験で用いられるアミノ化プローブと相補的な鎖は、４０ヌクレオチド長であり、５’末端にビオチン基を含んでいた。ハイブリダイゼーション反応を、３７℃のストリンジェントな条件下で、過剰な相補的プローブを用いて実行した。
【０３７５】
Ｂ．ビーズ上の二本鎖ＤＮＡプローブの結合
Polysciences製の磁気ビーズ（１〜２μｍ）、Spherotech製の磁気ビーズ（３μｍ）、Polysciences製の蛍光ビーズ（１．８μｍ）、およびMolecular Probes製の蛍光ビーズ（２．１μｍ）を、この実施例で評価した。約５×１０８を共役反応ごとに用いた。ビーズを洗浄し、１ｍｌの０．０５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（２−Ｎ−モルホレノ−エタンスルホン酸）、Ｐｈ６．０に再懸濁し、０．１Ｍ  ＥＤＣ（１−エチル−３−３ジメチルアミノプロピルカルボジイミド−ＨＣｌ）の添加により１５分間活性化した。活性化後、ｐＨをＮａＯＨを用いておよそ７．５に調節した。次に、０．５ナノモルの容量のプローブを溶液に添加した。プローブ結合を、回転混合機において室温で２〜３時間実行した。次に、ビーズを磁気的に濃縮し、上清を回収した。ビーズに結合しているプローブの量を推定するために、結合前および結合後に上清の光学濃度（２６０ｎｍ）を測定した。
【０３７６】
結合後、ビーズ上のすべての未反応カルボキシル基を、１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で、混合機において室温で１時間遮断した。次に、いかなる非特異的タンパク質結合部位も遮断するように、ビーズを、ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ１ｍｌ
中で、混合機において室温で３０分間遮断した。遮断後、ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、保存緩衝液（１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５％  グリセロール、０．１％  アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）に再懸濁した。
【０３７７】
Ｃ．共有結合効率の決定
２×１０８の磁気ビーズのアリコートを上記の結合ビーズから取り出し、０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡで室温で１時間前処理した。次に、ビーズを洗浄緩衝液で３回洗浄し、２００μｌのＣＤＢに再懸濁した。次に、２００ピコモルの遮断プローブおよび１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液をビーズ溶液に添加した。遮断プローブを、３７℃で２時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ビーズを磁気的に濃縮し、上清を除去した。次に、ビーズを、磁気濃縮を用いて洗浄緩衝液で３回洗浄した。ビーズを５５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｓ−ＡＰ）を含む１００μｌの緩衝液を用いて再懸濁し、３７℃で１時間培養した。Ｓ−ＡＢとの培養後、ビーズを磁気的に濃縮し、未結合Ｓ−ＡＰを含む上清を除去した。ビーズを洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、アルカリホスファターゼの基質として、３．７ｍｇ／ｍｌの濃度の１００μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を一定の時間間隔でビーズに添加し、培養時間の差による変動を最小にした。発色の時間は、プローブの濃度に応じて変わる。基質との培養時間は、４０５ｎｍの信頼性の高いＯＤを得るために必要とされるように、２分〜３０分で変化させた。４０５ｎｍの光学濃度は、ビーズに結合したプローブの量に比例した。これらの二本鎖結合実験の１つからの結果は、上記の図５２Ａおよび図５２Ｂに提示されている。
【０３７８】
Ｄ．捕捉プローブから相補鎖を分離するための熱処理の使用
１００μｌのビーズのアリコートを７０℃で１０分間加熱した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を即座に取り出した。高温の洗浄緩衝液で１回、ＣＢＤで１回洗浄した。次にＣＢＤに再懸濁した。
【実施例９】
【０３７９】
結合の効率と固相に結び付いたプローブの接触性および剛性とを高めるためのより長いスペーサのリンカーの使用を試験するためにも、実験を行った。これらの実験では、捕捉プローブおよびレポータープローブは４０ヌクレオチド長であった。これらの合成ヌクレオチド配列は、対象となる検体に特異的であった。この実施例では、捕捉プローブの５’末端およびレポータープローブの３’末端は、共役する３つのポリエチレングリコール部分を含んでいた。これらの共有結合リンカーを、プローブ合成の間にプローブに導入した。これらの実験の１つから収集したデータは、上記の図５４で示されている。図５４に示すように、リンカーの使用により、二重ビーズ検定の感度が著しく高まる。
【０３８０】
この特定の検定で用いられたビーズは、Spherotech製の３μｍの磁気ビーズおよびMolecular Probes製の２．１μｍのレポータービーズであった。プローブを上述のようにビーズに共役結合させた。検定ごとに２×１０７のプローブ結合捕捉ビーズおよび６×１０７のレポータービーズのアリコートを、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ビーズを１００μｇ／ｍｌの水中サケ精子ＤＮＡで、室温で１時間前処理した。ビーズを洗浄緩衝液（０．１４５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で１回洗浄し、１００μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび５×デンハルト混合物を含むハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
【０３８１】
図１２Ａに提示するような２ステップハイブリダイゼーション法を、この実施例の二重ビーズ検定を行う際に用いた。１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡおよび５×デンハルト
溶液を含むハイブリダイゼーション緩衝液で希釈した、対照（０フェムトモル）、１０フェムトモル、１フェムトモル、０．１フェムトモル、０．０１フェムトモル、０．００１フェムトモル、０．０００１フェムトモルを含む種々の濃度の１つの標的を用いた。次に、種々の標的溶液を捕捉ビーズと混合し、３７℃で２時間培養して、ビーズの捕捉プローブへの標的のハイブリダイゼーションに十分な時間を与えた。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズした捕捉ビーズを洗浄緩衝液で３回、ハイブリダイゼーション緩衝液で１回洗浄し、１００μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび５×デンハルト混合物を含む１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。次に、ハイブリダイズした標的を含む捕捉ビーズ溶液を、１００μｌのレポータービーズと混合し、混合を続けながら３７℃で２時間培養した。次に、新しい洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％  ＮＦＤＭ）で６回、ＰＢＳで１回洗浄した。次に、二重ビーズ複合体を含む洗浄溶液を、２５０μｌのＰＢＳを用いて再懸濁した。次に、レポータービーズからのからの蛍光シグナルを、蛍光測定器を用いて定量した。
【０３８２】
結果は、３つのＰＥＧリンカーを捕捉プローブに導入した場合、二重ビーズ検定におけるバックグラウンドが低下し、リンカーのないプローブと比較して検定感度が著しく向上したことを示した。
【実施例１０】
【０３８３】
この研究は、遺伝的二重ビーズ検定の検定感度および検出の範囲を明らかにするために行った。結果を図５７に示す。
【０３８４】
Ａ．捕捉ビーズおよびレポータービーズの調製
この実験で用いたビーズは、磁気捕捉ビーズ（３μｍのSpherotech製）および黄色蛍光レポータービーズ（１μｍのPolysciences製）であり、それぞれ、ＤＮＡ輸送プローブおよびＤＮＡシグナルプローブそれぞれと共有結合している。約１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズをこの実験に用いた。これらのビーズをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｇ／ｍｌの消化サケ精子ＤＮＡを含む１ｍｌの水に再懸濁した。次に、サケ精子ＤＮＡ混合物中のビーズ溶液を室温で１時間培養した。培養後、ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で１回洗浄した。次に、ビーズをハイブリダイゼーション緩衝液（１００μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む）に再懸濁した。
【０３８５】
Ｂ．二重ビーズ検定
１００フェムトモル、１０フェムトモル、１フェムトモル、０．１フェムトモル、０．０１フェムトモル、および０フェムトモル（陰性対照）を含むＤＮＡ標的剤の連続希釈液を調製した。次に、等量の捕捉ビーズを種々の標的溶液と混合し、３７℃で２時間培養して、標的をビーズの５’捕捉プローブとハイブリダイズさせた。培養後、ビーズ溶液を洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で１回洗浄し、次に、ハイブリダイゼーション緩衝液（１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む）に再懸濁した。
【０３８６】
レポータービーズを捕捉ビーズ溶液と混合し、回転混合機において３７℃で２時間培養した。培養後、ビーズ溶液を０．５ｍｌの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％  ＮＦＤＭ）で６回洗浄し、２５０μｌの水に再懸濁した。次に、結合したレポータービーズ
の数を、励起＝５００ｎｍ、発光＝５３０ｎｍ、スリット＝励起−２、発光−２、および０．１秒の積分時間で、蛍光測定器により定量した。
【実施例１１】
【０３８７】
この研究は、遺伝的二重ビーズ型検定で用いるハイブリダイゼーション緩衝液の最適な塩濃度を求めるために行った。
【０３８８】
Ａ．捕捉ビーズおよびレポータービーズの調製
この実験で用いたビーズは、磁気捕捉ビーズ（３μｍのSpherotech製）および黄色蛍光レポータービーズ（２．１μｍのMolecular Probes製）であり、それぞれ、ＤＮＡ輸送プローブおよびＤＮＡシグナルプローブそれぞれと共有結合している。ビーズをハイブリダイゼーション緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で１回洗浄した。ビーズを、０．１％のＣＨＡＰＳおよびサケ精子ＤＮＡで、室温で1時間前処理した。次に、ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ）で３回、各ハイブリダイゼーション緩衝液（１４５ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で１回洗浄した。洗浄後、ビーズをハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
【０３８９】
Ｂ．二重ビーズ検定
セクションＡで調製した磁気捕捉ビーズを、２４個の１０μｌアリコートに分割した。６組のアリコートを、種々の濃度のＮａＣｌ（０ｍＭ、１４５ｍＭ、３００ｍＭ、および４００ｍＭ）を含むハイブリダイゼーション溶液で希釈した。標的ＤＮＡ混合物を、以下の濃度：１００ｆモル、１０ｆモル、１ｆモル、０．１ｆモル、０．０１ｆモル、０フェムトモル（陰性対照）のさまざまな塩濃度のハイブリダイゼーション緩衝液中で作成した。次に、種々の標的溶液を、ハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度に従ってそれぞれのビーズ溶液と混合し、３７℃で２時間培養して、標的を捕捉ビーズの５’輸送プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、検定溶液を、各処理群に必要な適切な量のＮａＣｌ（０ｍＭ、０．１４５ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭのＮａＣｌ）を含む洗浄緩衝液で３回、適切なハイブリダイゼーション緩衝液で1回洗浄した。次に、ビーズを、適切な量のＮａＣｌを含む各ハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
【０３９０】
種々のＮａＣｌ濃度（０ｍＭ、０．１４５ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭのＮａＣｌ）を含むハイブリダイゼーション緩衝液中の１００μｌ容量のレポータービーズを、適当な検定溶液に添加し、同じ濃度のＮａＣｌが異なる処理群内で維持されるようにした。次に、これらの検定溶液を、回転混合機において３７℃で２時間培養した。培養後、種々の溶液を、適切な量のＮａＣｌを含む０．５ｍｌの洗浄緩衝液で６回、同様に各ハイブリダイゼーション緩衝液と等しい濃度のＮａＣｌ（０ｍＭ、０．１４５ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭのＮａＣｌ）を含む水で1回洗浄した。次に、種々の二重ビーズ溶液を２５０μｌの水に再懸濁した。次に、結合したレポータービーズの数を、励起＝５００ｎｍ、発光＝５３０ｎｍ、スリット＝励起−２、発光−２、および０．１秒の積分時間で、蛍光測定器を用いて定量した。この検定からの結果は上記の図６０に示されている。二重ビーズ複合体の検出は、図２に関連して説明したような光ディスクシステム、光磁気ディスクシステム、蛍光ディスクシステム、または任意の同様のデバイスを用いて実行することができる。光ディスク読み取り装置から収集される二重ビーズ複合体の特有のシグネチャトレースは、上記の図２９Ｂに示されている。
【実施例１２】
【０３９１】
この場合、Spherotech製の磁気捕捉ビーズ（３μｍ）およびMolecular Probes製の黄色
蛍光（２．１μｍ）レポータービーズを評価した。この研究は、遺伝的二重ビーズ型検定で用いられるハイブリダイゼーション緩衝液中の最適なＭｇＣｌ２濃度を求めるために行った。
【０３９２】
Ａ．捕捉ビーズおよびレポータービーズの調製
磁気捕捉ビーズおよび黄色蛍光レポータービーズそれぞれを、ＤＮＡ輸送プローブおよびＤＮＡシグナルプローブそれぞれと共有結合させた。結合後、ビーズをハイブリダイゼーション緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で1回洗浄した。ビーズを、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡで室温で1時間前処理した。次に、ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ）で３回、ハイブリダイゼーション緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で1回洗浄した。洗浄後、ビーズをハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
【０３９３】
Ｂ．二重ビーズ検定
パートＡで調製した磁気捕捉ビーズを、２４個の１０μｌアリコートに分割した。６組のアリコートを、種々の濃度のＭｇＣｌ２（０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、および３０ｍＭ）を含むハイブリダイゼーション溶液で希釈した。標的ＤＮＡ混合物を、以下の濃度：１００ｆモル、１０ｆモル、１ｆモル、０．１ｆモル、０．０１ｆモル、０ｆモル（陰性対照）のさまざまな量のＭｇＣｌ２を含むハイブリダイゼーション緩衝液中で作成した。次に、種々の標的溶液を、ハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度に従ってそれぞれのビーズ溶液と混合し、３７℃で２時間培養して、標的を捕捉ビーズの５’輸送プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、検定溶液を、各処理群に必要な適切な量のＭｇＣｌ２（０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２）を含む洗浄緩衝液で３回、適切なハイブリダイゼーション緩衝液で1回洗浄した。次に、ビーズを、適切な量のＭｇＣｌ２を含む各ハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
【０３９４】
種々のＭｇＣｌ２濃度（０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２）を含むハイブリダイゼーション緩衝液中の１００μｌ容量のレポータービーズを、適当な検定溶液に添加し、同じ濃度のＭｇＣｌ２が異なる処理群内で維持されるようにした。次に、これらの検定溶液を、回転混合機において３７℃で２時間培養した。培養後、種々の溶液を、適切な量のＮａＣｌを含む０．５ｍｌの洗浄緩衝液で６回、同様に各ハイブリダイゼーション緩衝液と等しい濃度のＭｇＣｌ２を含む水で1回洗浄した。次に、種々の二重ビーズ溶液を２５０μｌの水に再懸濁した。次に、結合したレポータービーズの数を、励起＝５００ｎｍ、発光＝５３０ｎｍ、スリット＝励起−２、発光−２、および０．１秒の積分時間で、蛍光測定器により定量した。この検定からの結果は上記の図６１Ａに示されている。二重ビーズ複合体は、図１および図２に示すような光ディスク読み取り装置を用いて定量することもできる。
【実施例１３】
【０３９５】
以下の実験は、二重ビーズ検定の感度に対する、ビーズのプローブの密度を低減するためのプローブ遮断剤の使用の影響を判定するために行った。
【０３９６】
Ａ．捕捉ビーズおよびレポータービーズの調製
磁気捕捉ビーズ（３μｍのSpherotech製）および黄色蛍光レポータービーズ（２．１μｍのPolysciences製）それぞれを、ＤＮＡ輸送プローブおよびＤＮＡシグナルプローブそれぞれと共有結合させた。結合後、ビーズをハイブリダイゼーション緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５
）で1回洗浄した。ビーズを、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡで室温で1時間前処理した。次に、ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ）で３回、ハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で1回洗浄した。洗浄後、ビーズをハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
【０３９７】
Ｂ．プローブ遮断
ビオチン化輸送遮断プローブを、以下の最終濃度：５００ｐモル、５０ｐモル、３５ｐモル、３０ｐモルに希釈した。１３μｌ（２×１０７）容量の磁気ビーズを各試験管（合計５本の試験管）に用いた。上記で調製した５μｌの量の遮断プローブおよび３２μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を、各試験管に添加した。次に、遮断プローブおよび輸送プローブを３７℃で２時間培養した。ハイブリダイゼーション後、ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｎＭ  ＮａＣｌ、５０ｎＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、１００μｌのＣＤＢ（２％  ＢＳＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．０５％  ＮａＮ３）に再懸濁した。レポータービーズを、ビオチン化レポーター遮断プローブを用いて同様に調製した。
【０３９８】
Ｃ．遮断剤処理後のビーズのプローブ密度判定
パートＢで調製した各組のビーズ溶液のアリコートを、１００μｌのＳ−ＡＰ（１４２０ｎｇ／ｍｌ）で３７℃で１時間培養し、次に洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ１０中３．７ｍｇ／ｍｌの濃度の、１００μｌ容量のＳ−ＡＰ基質としてのｐ−ニトロフェニルリン酸を、ビーズ溶液に添加した。発色に十分な時間を与えた後、分光光度計（４０５ｎｍのＯＤ）を用いて溶液を分析した。ビーズの遮断プローブの量を、４０５ｎｍにおける吸光度から計算した。
【０３９９】
Ｄ．二重ビーズ検定
パートＢで調製したビーズを洗浄し、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡおよび５×デンハルト溶液を含むハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。溶液標的ＤＮＡ混合物を、以下の濃度：０ｆモルの対照、１０ｆモル、１ｆモル、０．１ｆモル、０．０１ｆモル、０．００１ｆモル、０．０００１ｆモルのハイブリダイゼーション緩衝液中で調製した。次に、標的溶液を等量の捕捉ビーズおよびレポータービーズと混合し、３７℃で２時間培養した。捕捉ビーズおよびレポータービーズは、各組の検定混合物につき同量のプローブ遮断剤で遮断されている。すなわち、１０μｌの１０ｆモル標的を、それぞれ５０ｐモルの遮断プローブで遮断された１００μｌのレポーターおよび捕捉ビーズ溶液に添加する。ハイブリダイゼーション後、検定溶液を洗浄緩衝液で３回、ハイブリダイゼーション緩衝液で１回洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝液（１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡおよび５×デンハルト溶液を含む）に再懸濁した。検定溶液を濃縮し、２５０μｌの水に再懸濁した。次に、結合したレポータービーズの数を、励起＝５００ｎｍ、発光＝５３０ｎｍ、スリット＝励起−２、発光−２、および０．１秒の積分時間で、蛍光測定器により定量した。
【実施例１４】
【０４００】
以下の実験は、遺伝的二重ビーズ検定の最適なハイブリダイゼーション培養時間を求めるために実施した。この実験からの結果は、上記の図６３および図６４に示されている。
【０４０１】
Ａ．捕捉ビーズおよびレポータービーズの調製
この実験で用いたビーズは、共有結合により結び付いた５’輸送プローブを伴った２５μｌの捕捉ビーズ（１．５×１０７ビーズ／μｌの濃度の３μｍのカルボキシ化磁気粒子
）と、４００μｌのレポータービーズ（６．６×１０６ビーズ／μｌの濃度の２μｍのＹＦビーズ）であった。これらのビーズをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡおよび０．１％  ＣＨＡＰＳで室温で１時間前処理した。次に、ビーズを洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ）で３回、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１回洗浄した。次に、捕捉ビーズを２５０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁し、レポータービーズを４００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
【０４０２】
Ｂ．二重ビーズ検定
１組の標的ＤＮＡ溶液を、以下の濃度：０ピコモル、１ピコモル、１０ピコモル、１００ピコモルの標的を含むハイブリダイゼーション溶液中で作成した。１０μｌの捕捉ビーズ、１５μｌのレポータービーズ、１μｌのサケ精子ＤＮＡ、および７４μｌの標的溶液を全てハイブリダイゼーション緩衝液に含む試験サンプルを調製した。この試験サンプルのアリコートを、種々の培養時間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、および一晩で分析した。１つの組を混合せずに３７℃で培養し、他の組を回転混合機において混合した。
【０４０３】
サンプルのアリコートを、０．５ｍｌの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％  ＮＦＤＭ）で６回洗浄し、次に２０２μｌのＰＢＳに再懸濁した。次に、結合したレポータービーズの数を、励起＝４５０ｎｍ、発光＝４８０ｎｍ、スリット＝励起−１．３６５、発光−１．０５、および０．１秒の積分時間で、蛍光測定器により定量した。
【実施例１５】
【０４０４】
図６７Ａに関連して説明したように二重ビーズ複合体を形成した後、レポータービーズを、ＤＮＡ依存手順で捕捉ビーズから分離することができる。二重ビーズ複合体を、ＤＮＡｓｅ（ＤＮＡを特異的に切断する酵素）に付す。この処理により、レポータービーズおよび捕捉ビーズを結合しているＤＮＡを切断することによって、レポータービーズを捕捉ビーズから分離する。これにより、非標的媒介二重ビーズは影響を受けない。ＤＮＡｓｅ処理後に解放されるレポータービーズは、サンプル中に存在する標的ＤＮＡの量を示す。この実験では、二重ビーズ検定におけるＤＮＡｓｅＩの影響を評価した。この実験からの結果は、図６９および図７０に示されている。
【０４０５】
Ａ．二重ビーズ検定
実施例１のパートＡで上述したように、二重ビーズ検定を実行した。簡潔に言えば、検定物は、共有結合した輸送プローブで被覆された３μｍの磁気捕捉ビーズ（Spherotech, Libertyville, IL）、共有結合したレポータープローブで被覆された２．１μｍの蛍光レポータービーズ（Molecular Probes, Eugene, OR）、および対象となる標的ＤＮＡ分子から構成される。この実施例では、標的ＤＮＡは、合成の８０オリゴヌクレオチド長である。輸送プローブおよびレポータープローブは、４０ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡと相補的であるが互いには相補的ではない。
【０４０６】
検定物の調製に用いられる特定の方法は、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを室温で１時間処理することを含む。この前処理により、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非特異的結合が低減する。捕捉ビーズを、上清を除去して磁気的に濃縮した。１００μｌ容量のハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。１、１０、１
００、１０００フェムトモルの範囲の種々の濃度の標的ＤＮＡを、捕捉ビーズ懸濁液に添加した。ビーズ懸濁液を、３７℃で２時間混合しながら培養した。ビーズを磁気的に濃縮し、未結合標的ＤＮＡを含む上清を除去した。１００マイクロリットル容量の洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。この洗浄手順を２回繰り返した。
【０４０７】
次に、１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）中２×１０７の量のレポータービーズを添加して、捕捉ビーズを洗浄した。ビーズを再懸濁し、３７℃でさらに２時間混合しながら培養した。培養後、捕捉ビーズを磁気的に濃縮し、未結合レポータービーズを含む上清を除去した。１００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。この洗浄手順を２回繰り返した。
【０４０８】
Ｂ．ＤＮＡｓｅＩ検定
ＤＮＡｓｅＩは配列特異的でないため、ＤＮＡｓｅＩをこの目的に選択した。洗浄後、二重ビーズ複合体を８７．５μＬの水に再懸濁した。１０ユニットのＤＮＡｓｅＩ（２．５μｌ）および１０μＬのＤＮＡｓｅＩ反応緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）を、再懸濁したビーズに添加した。消化反応を３７℃で１時間実行した。消化後、捕捉ビーズを磁気的に濃縮し、レポータービーズを含む上清を除去した。磁気捕捉ビーズを１００μｌの水で２回洗浄した。洗浄した水を上清と合わせた。レポータービーズの数を、励起５００ｎｍ、発光５３０ｎｍ、およびスリットサイズ２．０で、蛍光測定器Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−２により定量した。この実験からの結果については図６９および図７０を参照されたい。別法として、蛍光レポータービーズの数は、上述のようなバイオディスク読み取り装置により定量することができる。
【実施例１６】
【０４０９】
この実施例では、二重ビーズ複合体を、物理的または化学的な処理により分離する。二重ビーズ検定を、実施例１５で上述したように実行した。洗浄後、ビーズ生成物を洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で５回洗浄し、４つの組に分割した。
１．対照：未処理、ビーズを２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄した。
２．酸洗浄：ビーズを０．１Ｍ  酢酸（ｐＨ４）を含む２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄した。
３．塩基洗浄：ビーズを０．１Ｍ  重炭酸ナトリウム（ｐＨ９）を含む２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄した。
４．尿素：ビーズを７Ｍ  尿素を含む２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄した。
【０４１０】
物理的または化学的処理の後、捕捉ビーズを磁気的に濃縮し、解放されたレポータービーズを含む上清を保存した。ビーズを洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄物を保存した。磁気捕捉ビーズを４００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。捕捉ビーズの上清中および溶液中のレポータービーズの量を、励起＝５００ｎｍ、スリット２．０、発光＝５３０ｎｍ、スリット＝２．０で、蛍光測定器Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−２により定量した。別法として、蛍光レポータービーズの数を、上述のようなバイオディスク読み取り装置により定量することができる。
【０４１１】
この実施例から明らかであるように、高ｐＨでの洗浄により、低い標的濃度でレポータービーズを捕捉ビーズから解離することができる。図７２の実験結果により示されるように、塩基洗浄は、低い標的濃度でレポータービーズを捕捉ビーズから完全に解離した。
【０４１２】
この実験の結果は、７Ｍの尿素での処理が、感度を著しく低下させることなく、レポータービーズを捕捉ビーズから効率的に解離することも証明する。図７３Ａおよび図７３Ｂの棒グラフに提示する実験結果により示されるように、尿素処理は、レポータービーズを捕捉ビーズから効率的に解離する。
【実施例１７】
【０４１３】
上述の実施例１５および１６では、標的ＤＮＡは一本鎖であった。臨床的サンプルを用いる場合、ＤＮＡは二本鎖であるため、ハイブリダイゼーション緩衝液はグアニジンイソチオシアネートなどの変性試薬を必要とする。検定に用いられる変性試薬の濃度は、二重ビーズ検定の特異性および感度に主に寄与する。この実施例では、ＨＳＶを検出するための二重ビーズ検定を、１．５Ｍのグアニジンイソチオシアネートの存在下で行った。
【０４１４】
Ａ．捕捉ビーズの調製
二重ビーズ検定物は、共有結合した５’ＨＳＶ輸送プローブで被覆された３μｍの磁気捕捉ビーズ（Spherotech, Libertyville, IL）、および３’ＨＳＶレポータープローブに結合したMolecular Probes（Eugene, OR）製の２．１μｍ蛍光レポータービーズ、および対象となる標的ＤＮＡ分子から構成される。この実施例では、標的は、３０サイクル増幅してＱｉａｇｅｎカラムで精製した、ＨＳＶ遺伝子配列を含む二本鎖ＰＣＲ産物であった。輸送プローブおよびレポータープローブは、４０ヌクレオチド長であり、標的ＤＮＡと相補的であるが互いには相補的ではない。
【０４１５】
検定物の調製に用いた特定の方法は、１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で室温で１時間処理することを伴った。この前処理により、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非特異的結合が低減される。捕捉ビーズを、上清を除去して磁気的に濃縮した。捕捉ビーズを、５×デンハルト混合物および１０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む６００μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（１．５ＧｕＳＣＮ、８ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）に再懸濁した。
【０４１６】
Ｂ．標的ＤＮＡの調製
標的は、３０サイクル増幅してＱｉａｇｅｎカラムで精製した二本鎖ＰＣＲ産物であった。標的を適切な濃度に希釈し、９５℃で５分間過熱して、二本鎖を変性し、氷上で急速に冷却した。
【０４１７】
Ｃ．標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション
合計１２．５μＬの冷却した標的を、１００μＬの前処理した捕捉ビーズに添加した。０、１０−１６、１０−１５、１０−１４、１０−１３、および１０−１２モルの種々の濃度の標的ＤＮＡを、捕捉ビーズ懸濁液に添加した。ビーズ懸濁液を、３７℃で２時間混合しながら培養した。ビーズを磁気的に濃縮して、未結合標的ＤＮＡを含む上清を除去した。１００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。この洗浄手順を２回繰り返した。
【０４１８】
Ｄ．二重ビーズ検定
５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（１．５  ＧｕＳＣＮ、８ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）中２×１０７の量のレポータービーズを添加して、捕捉ビーズを洗浄した。ビーズを再懸濁し、３７℃でさらに３時間混合しながら培養した。培養後、捕捉ビーズを磁気的に濃縮し、未結合レポータービーズを含む上清を除去した。１００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、ビーズを再懸濁した。ビーズを磁気的に濃縮し、上清を再び除去した。この洗浄手順を２回繰り返した。
【０４１９】
Ｅ．標的ＤＮＡの定量
二重ビーズ複合体を２５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、標的の量を、励起＝５００ｎｍ、スリット２．０、発光＝５３０ｎｍ、スリット＝２．０で、蛍光測定器Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−２により定量した。別法として、蛍光レポータービーズの数を、上述のような光バイオディスク読み取り装置により定量することができる。
【実施例１８】
【０４２０】
以下の実施例は、図３７に関連して説明した光磁気バイオディスク１１０などの磁気的に書き込み可能かつ消去可能な分析ディスクで実行される二重ビーズ検定を説明する。
【０４２１】
この実施例では、男性に存在するが女性には存在しない遺伝子配列ＤＹＳを検出するために二重ビーズ検定を実行した。検定物は、共有結合した輸送プローブで被覆された３μｍの磁気捕捉ビーズ（Spherotech, Libertyville, IL）、共有結合したＤＹＳ遺伝子に特異的な配列で被覆された２．１μｍの蛍光レポータービーズ（Molecular Probes, Eugene, OR）、およびＤＹＳ配列を含む標的ＤＮＡ分子から構成される。標的ＤＮＡは、合成の８０オリゴヌクレオチド長である。輸送プローブおよびレポータープローブは、４０ヌクレオチド長であり、ＤＹＳ配列と相補的であるが互いには相補的ではない。
【０４２２】
検定物の調製に用いられる特定の方法は、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを室温で１時間処理することを伴った。この前処理により、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非特異的結合が低減する。
【０４２３】
サケ精子ＤＮＡでの前処理後、捕捉ビーズを、注入ポートを介してＭＯバイオディスク内にロードした。ＭＯバイオディスクは、光磁気ドライブにより形成された磁性領域を含む。これにより、捕捉ビーズはＭＯバイオディスクの特定の磁性領域内に保持される。
【０４２４】
次に、２００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）中の標的ＤＮＡおよびレポータービーズを含むサンプルを、注入ポートを介してＭＯバイオディスクに添加する。次に注入ポートを密閉する。磁界を解放する。ディスクをドライブにおいて非常に低速（８００ｒｐｍ未満）で回転させて、捕捉ビーズへの標的ＤＮＡおよびレポータービーズのハイブリダイゼーションを促進させる。ドライブの温度は常に３３℃に保つ。２時間のハイブリダイゼーション後、光磁気ドライブにより磁界を生成する。この段階で、未結合であるかまたは二重ビーズ複合体の一部としての磁気捕捉ビーズのみがＭＯバイオディスクに残る。未結合の標的およびレポータービーズを、上述の機構のいずれかにより廃液チャンバに導く。次に、２００マイクロリットルの洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加する。磁界を解放し、ディスクを低速
（８００ｒｐｍ未満）で５分間回転させて、捕捉ビーズとレポータービーズとのいかなる非特異的結合も除去する。次に磁界を再印加する。洗浄緩衝液を、上述の機構のいずれかにより廃液チャンバに導く。この洗浄手順を２回繰り返す。
【０４２５】
この段階で、未結合であるかまたは二重ビーズ複合体の一部としての磁気捕捉ビーズのみが残る。磁界を解放し、二重ビーズ複合体を検出チャンバに導く。次に、捕捉された標的ＤＮＡの量を、捕捉磁気ビーズの数およびレポータービーズの数を定量することにより確定する。これは、図２８Ａ、図２８Ｂ、図２９Ａ、および図２９Ｂで上述したように、各タイプのビーズが別個のシグネチャを有するからである。
【実施例１９】
【０４２６】
この実施例では、図３２および図３７に関連して上述した多重化技法を用いた二重ビーズ検定を、図３７を参照して説明したＭＯバイオディスク１１０などの磁気的に書き込み可能かつ消去可能な分析ディスクで実行する。
【０４２７】
２つ以上のＤＮＡ標的を同時に検出するために二重ビーズ検定を実行する。検定物は、３μｍの磁気捕捉ビーズ（Spherotech, Libertyville, IL）から構成される。磁気捕捉ビーズの１つの集団をＤＮＡ標的１と相補的な輸送プローブ１で被覆する。磁気捕捉ビーズの別の集団をＤＮＡ標的２と相補的な輸送プローブ２で被覆する。別法として、２つ以上の異なるタイプの磁気捕捉ビーズを用いてもよい。検定では２つ以上の別個のタイプのレポータービーズがある。これらのレポータービーズは、化学組成物（例えばシリカおよびポリスチレン）および／またはサイズが異なっていてもよい。１つのタイプのレポータービーズを、ＤＮＡ標的１と相補的なレポータープローブ１で被覆する。他のレポータービーズは、ＤＮＡ標的２と相補的なレポータープローブ２で被覆する。この場合も、輸送プローブおよびレポータープローブは、各標的とは相補的であるが、互いには相補的ではない。
【０４２８】
二重ビーズ検定多重化の調製に用いられる特定の方法は、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中で１×１０７の捕捉ビーズおよび２×１０７のレポータービーズを室温で１時間処理することを伴った。この前処理により、標的ＤＮＡの非存在下での捕捉ビーズとレポータービーズとの非特異的結合が低減する。
【０４２９】
サケ精子ＤＮＡでの前処理後、捕捉ビーズをＭＯバイオディスクにロードする。特定の捕捉ビーズに対して異なる磁気領域を形成するために磁界を印加する。捕捉ビーズは、１０μｍ２あたり１つの捕捉ビーズの密度で、ＭＯバイオディスク上に保持することができる。ＭＯバイオディスクにビーズが堆積するのに使用可能な表面積は、約３×１０９μｍ２である。所与の密度の３μｍのビーズに対するＭＯバイオディスクの容量は、約３×１０８ビーズである。
【０４３０】
対象となる標的ＤＮＡを含むサンプルを、２００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および５×デンハルト混合物、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ）中で種々のタイプのレポータービーズと混合し、注入ポートを介してＭＯバイオディスクに添加する。次に注入ポートを密閉する。磁界を解放する。ディスクをドライブにおいて非常に低速（８００ｒｐｍ未満）で回転させて、種々のタイプの捕捉ビーズへの標的ＤＮＡおよびレポータービーズのハイブリダイゼーションを促進させる。ドライブの温度は常に３３℃に保つ。２〜３時間のハイブリダイゼーション後、光磁気ドライブにより磁界を再生成する。この段階で、未結合であるかまたは二重ビーズ複合体の一部としての磁気捕捉ビーズのみがＭＯバイオディスクに残る。未結合の標的およびレポータービーズを、上述の機構のいずれかにより廃液チャンバに導く。次に、２００マイクロリットルの
洗浄緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、Ｐｈ７．５、０．１％  ＳＤＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ、０．２５％  ＮＦＤＭ（脱脂粉乳）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加する。磁界を解放し、ディスクを低速（８００ｒｐｍ未満）で５分間回転させて、捕捉ビーズとレポータービーズとのいかなる非特異的結合も除去する。次に磁界を再印加する。洗浄緩衝液を、上述の機構のいずれかにより廃液チャンバに導く。この洗浄手順を２回繰り返す。
【０４３１】
この段階で、磁界を解放し、二重ビーズ複合体を検出チャンバに導く。種々のタイプの標的ＤＮＡの量は、対応する捕捉磁気ビーズおよびレポータービーズの数を定量することにより確定することができる。これは、上記の図２８Ａ、図２８Ｂ、図２９Ａ、および図２９Ｂに示したように、各タイプのビーズが別個のシグネチャを有するからである。
【実施例２０】
【０４３２】
Ａ．常磁性ビーズに結び付いたモノクローナルＣＤ４抗体を用いた、ＡＩＤＳ患者におけるＴヘルパー細胞の分離
サンプル（全血または単核細胞）を、混合／ロードチャンバに注入し、このチャンバで、抗ＣＤ４被覆常磁性ビーズ（生体磁気粒子）と混合する。１５分間の培養後、常磁性ビーズをＣＤ４＋細胞に結合させるために、ＭＯドライブのレーザを用いて、流路または分析チャンバ内に磁区を形成する。次に、標的ＣＤ４＋細胞をこれらの磁区に結合させ、ディスクが所定の速度および時間で回転すると、タグ付けされていない細胞および細胞成分がフロー流路を進んで廃液チャンバに移動するようにする。次に、磁区に結合したＣＤ４＋細胞の数をＭＯ読み取り装置により定量する。このようにして求められたＣＤ４＋細胞の数は、患者の健康状態を示す。
【０４３３】
Ｂ．選択されたＴヘルパー細胞の操作
ＣＤ４＋細胞が他の細胞成分から分離された後、次に磁区を消去する。次に、ディスクを所定の速度および方向に回転させて、新たに解放されたＣＤ４＋細胞がフロー流路を通って異なる試験チャンバに移動するようにし、ここで細胞が、そのＨＩＶ分解に対する感受性を低減し得る種々の薬物治療に付される。流体回路の設計およびディスクの回転速度および方向は、日常的な実験のみによって当業者により決定されることができる。
【図面の簡単な説明】
【０４３４】
【図１】本発明による光ディスクシステムの斜視図である。
【図２】本発明の実施の形態による光学式読み取りシステムのブロックイラスト図である。
【図３Ａ】本発明の実施の形態による反射型ディスクの分解図である。
【図３Ｂ】本発明の実施の形態による反射型ディスクの上面図である。
【図３Ｃ】本発明の実施の形態による反射型ディスクの斜視図である。
【図４Ａ】本発明の実施の形態による透過型ディスクの分解図である。
【図４Ｂ】本発明の実施の形態による透過型ディスクの上面図である。
【図４Ｃ】本発明の実施の形態による透過型ディスクの斜視図である。
【図５】Ａは、内部に形成されたウォブル溝を示す、図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃに示す反射型光ディスクの長手方向部分断面図である。      Ｂは、内部に形成されたウォブル溝を示す、図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃに示す透過型光バイオディスクの長手方向部分断面図である。
【図６】Ａは、図５Ａに示すディスクの半径方向部分断面図である。      Ｂは、図５Ｂに示すディスクの半径方向部分断面図である。
【図７】Ａは、遺伝的検定に関連して利用される捕捉ビーズの概略表現である。      Ｂは、免疫化学的検定に関連して用いられる捕捉ビーズの概略表現である。
【図８】Ａは、遺伝的検定に関連して利用される捕捉ビーズの概略表現である。      Ｂは、免疫化学的検定に関連して用いられる捕捉ビーズの概略表現である。
【図９】Ａは、遺伝的検定に関連して利用されるレポータービーズの概略表現である。      Ｂは、免疫化学的検定に関連して用いられるレポータービーズの概略表現である。
【図１０】Ａは、遺伝的検定に関連して利用される二重ビーズ複合体の概略表現である。      Ｂは、免疫化学的検定に関連して用いられる二重ビーズ複合体の概略表現である。
【図１１Ａ】遺伝的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法の一実施の形態のイラスト表現である。
【図１１Ｂ】免疫化学的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法の一実施の形態のイラスト表現である。
【図１２Ａ】遺伝的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法の別の実施の形態のイラスト表現である。
【図１２Ｂ】免疫化学的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法の別の実施の形態のイラスト表現である。
【図１３】混合またはロードチャンバと組み合わせたディスク層を示す長手方向断面図である。
【図１４】二重ビーズ複合体溶液がロードされた混合チャンバを示す図１３と同様の図である。
【図１５】遺伝的検定において薬剤を捕捉するためのレポータービーズの結合の一実施の形態を示す、ディスクおよび標的領域の半径方向断面図である。
【図１６】遺伝的検定において薬剤を捕捉するためのレポータービーズの結合の別の実施の形態を示す、ディスクおよび標的領域の半径方向断面図である。
【図１７】遺伝的検定において薬剤を捕捉するための捕捉ビーズの結合の一実施の形態を示す、ディスクおよび標的領域の半径方向断面図である。
【図１８】遺伝的検定において薬剤を捕捉するための捕捉ビーズの結合の別の実施の形態を示す、ディスクおよび標的領域の半径方向断面図である。
【図１９】遺伝的検定において二重ビーズ複合体のレポータービーズを捕捉層に結合させる本発明による方法の一実施の形態を示す部分断面図を示す。
【図２０】免疫化学的検定において二重ビーズ複合体のレポータービーズを捕捉層に結合させる本発明による方法の一実施の形態を示す部分断面図を示す。
【図２１】遺伝的検定において二重ビーズ複合体のレポータービーズを捕捉層に結合させる本発明による方法の別の実施の形態を示す部分断面図を示す。
【図２２】免疫化学的検定において二重ビーズ複合体のレポータービーズを捕捉層に結合させる本発明による方法の別の実施の形態を表す部分断面図を示す。
【図２３】遺伝的検定において二重ビーズ複合体の捕捉ビーズを捕捉層に結合させる本発明による方法の一実施の形態を示す部分断面図を示す。
【図２４】Ａは、遺伝的検定において二重ビーズ複合体の捕捉ビーズを捕捉層に結合させる本発明による方法の別の実施の形態を示す部分断面図を示す。      Ｂは、遺伝的検定において二重ビーズ複合体のレポータービーズを捕捉層に結合させる本発明による方法の別の実施の形態を示す部分断面図を示す。
【図２５】光バイオディスクを利用して遺伝サンプル中の標的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を検出する本発明による方法を示す。
【図２６】光バイオディスクを利用して遺伝サンプル中の標的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を検出する本発明による別の方法を示す。
【図２７】光バイオディスクを利用して生体試験サンプル中の標的抗原の存在を検出する本発明による方法を示す。
【図２８】Ａは、本発明による光バイオディスクのトラックに対して位置付けられた個別の２．１μｍレポータービーズおよび３μｍ捕捉ビーズのグラフィカル表現である。      Ｂは、本発明による光ドライブからの検出信号を利用して図２８Ａのビーズから得られる一連のシグネチャトレースである。
【図２９】Ａは、本発明による光バイオディスクのトラックに対して位置付けられた、共に連結して二重ビーズ複合体になった２．１μｍレポータービーズおよび３μｍ捕捉ビーズのグラフィカル表現である。      Ｂは、本発明による光ドライブからの検出信号を利用して図２９Ａの二重ビーズ複合体から得られる一連のシグネチャトレースである。
【図３０Ａ】本発明による二重ビーズ検定からの結果を示す棒グラフである。
【図３０Ｂ】蛍光測定器を用いて検出された蛍光ビーズの検出限界を示す標準曲線を示すグラフである。
【図３０Ｃ】二重ビーズ複合体の形成を説明するイラスト表現である。
【図３１】二重ビーズ複合体を用いるディスクドライブ検出の感度を示す棒グラフである。
【図３２】本発明の実施の形態による二重ビーズ検定多重化のためのビーズの結合の概略表現である。
【図３３−１】磁気ビーズの移動を制御する磁界発生器に関連して利用される、本発明による流体回路の概略表現である。
【図３３−２】本発明の流体輸送態様の一実施の形態による、図３３Ａの弁構造を実施する第１の流体回路の概略図である。
【図３４】本発明の流体輸送態様の別の実施の形態による、図３３Ａの弁構造を実施する第２の流体回路の概略図である。
【図３５】磁界発生器と、本発明による磁気ビーズに関連して用いられる流体回路の一実施の形態を含むディスクとの斜視図である。
【図３６】図３５に示す流体回路を用いた二重ビーズ検定のための分離および検出の方法を示す平面図である。
【図３７】本発明の別の態様による、磁区すなわち磁性領域、磁気的に結合した捕捉ビーズ、および二重ビーズ複合体の形成を示す光磁気バイオディスクの斜視図である。
【図３８】捕捉ビーズとレポータープローブとの間に共有結合を形成するライゲーションの使用を示す。
【図３９】ライゲーション実験において酵素検定により検出された遺伝試験からの結果を示す棒グラフである。
【図４０】ライゲーションを行った場合および行っていない場合の２．１μｍレポータービーズを用いて結合したビーズの数を標的濃度に応じて比較した棒グラフである。
【図４１】ライゲーションを行った場合および行っていない場合の３９量体ブリッジを用いて結合したビーズの数を標的濃度に応じて比較した棒グラフである。
【図４２Ａ】本発明による切断可能または置換可能なスペーサを用いて二重ビーズ複合体で用いられるＤＮＡ配列を含む種々のプローブ構造の概略表現である。
【図４２Ｂ】標的の結合前に二重ビーズ複合体を接続する切断可能スペーサを示すイラストによる概略表現である。
【図４２Ｃ】標的の結合後に二重ビーズ複合体を接続するＮｏｔｌを含む切断可能スペーサを示す、図４２Ｂと同様の図である。
【図４２Ｄ】標的の結合後およびＮｏｔｌによる切断後の二重ビーズ複合体を示す、図４２Ｃと同様の図である。
【図４３Ａ】標的の結合前に二重ビーズ複合体を接続する置換可能スペーサを示すイラストによる概略表現である。
【図４３Ｂ】標的の結合後に二重ビーズ複合体を接続する置換可能スペーサへの置換プローブの最初の結合を示す、図４３Ａと同様の図である。
【図４３Ｃ】標的媒介結合の存在下で二重ビーズ複合体を接続する置換プローブの完全な置換を示す、図４３Ｂと同様の図である。
【図４４】本発明による捕捉ビーズに共有結合する切断可能スペーサのイラスト表現である。
【図４５】金属レポータービーズに共有結合する切断可能スペーサに結び付いたチオール基を示す、図４４と同様の図である。
【図４６−１】Ａは、標的の結合前に切断可能スペーサにより共に結合された一対の二重ビーズ複合体のイラスト表現である。
【図４６−２】Ｂは、標的の結合後および標的の結合がない場合の切断可能スペーサにより共に結合された二重ビーズ複合体を示す、図４６Ａと同様の図である。      Ｃは、酵素切断後に解離した二重ビーズ複合体のうちの一方と、標的の存在により結合された他方とを示す、図４６Ｂと同様の図である。
【図４７−１】Ａは、一対の切断可能スペーサにより形成された二重ビーズ複合体と、標的に結合したブリッジの使用とのイラスト表示である。
【図４７−２】Ｂは、２つの切断箇所を含む二重螺旋となる、ブリッジを含む標的結合後の図４７Ａと同様の図である。      Ｃは、切断可能スペーサの制限消化および二重螺旋の切断箇所のライゲーションの後の、図４７Ｂと同様の図である。
【図４８Ａ】標的抗原結合の前に免疫化学的検定において実施される、一対の切断可能スペーサによりそれぞれが共に接合された２つの二重ビーズ複合体のイラスト表現である。
【図４８Ｂ】標的結合がある場合およびない場合の切断可能スペーサにより共に結合された二重ビーズ複合体を示す、図４８Ａと同様の図である。
【図４８Ｃ】酵素消化後に解離した二重ビーズ複合体のうちの一方と、標的の存在により共に結合された他方とを示す、図４８Ｂと同様の図である。
【図４９】プローブの共有結合のために固相を評価する方法を提示する概略図である。
【図５０】固体基板に共有結合したプローブおよび非共有結合したプローブの定量の種々のステップを詳細に示す概略図である。
【図５１】Ａは、プローブの共有結合のための磁気ビーズ担体の種々の試験の実験結果のグラフ表示である。      Ｂは、プローブの共有結合のための蛍光ビーズ担体の種々の試験の実験結果のグラフ表示である。
【図５２Ａ】プローブとしてのその使用に関連する一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの構造的相違を示すイラスト表現である。
【図５２Ｂ】固相への一本鎖および二本鎖ＤＮＡの結合特性を評価するように計画された実験の結果のグラフ表示である。
【図５３】Ａは、二重ビーズ検定で用いる２つの異なる捕捉ビーズのスクリーンの酵素検定結果であって、プローブが共有結合しているか非共有結合しているかにかかわらず、試験したビーズの両方が同様の量の標的に結合することを示す結果のグラフ表示である。      Ｂは、２つの異なる捕捉ビーズにより捕捉されたレポータービーズの数を調べるように設計された二重ビーズ検定の結果であって、捕捉ビーズへのプローブの共有結合により検定感度が大幅に向上することを示す結果のグラフ表示である。
【図５４】プローブへのＰＥＧリンカーの導入により標的媒介結合が著しく向上することを説明するグラフ表示である。
【図５５】３μｍビーズを用いたプローブ密度測定を示す棒グラフ表示である。
【図５６】非特異的結合を１０分の１に低減した、サケ精子ＤＮＡを含む種々の界面活性剤でのビーズの前処理を示す棒グラフ表示である。
【図５７】二重ビーズ検定の検出範囲を示す棒グラフ表示である。
【図５８】様々な濃度のＮａＣｌの使用および関連する非特異的結合を示す棒グラフである。
【図５９】ＥＤＴＡ濃度の上昇および関連する非特異的結合を示す棒グラフ表示である。
【図６０】ＮａＣｌ濃度の上昇および関連する非特異的結合を示す棒グラフ表示である。
【図６１】ＭｇＣｌ２の濃度の上昇および関連する非特異的結合を示す棒グラフ表示である。
【図６２】ビーズ検定の感度を高めるためのプローブ遮断剤の使用を示すイラストによる概略表現である。
【図６３】ハイブリダイゼーション反応中の培養時間の影響を示す棒グラフ表示である。
【図６４】二重ビーズ結合の効率を高めることを目的とした混合方法を示す棒グラフ表示である。
【図６５Ａ】図６５Ｂと合わせて、図１１Ａに関連して説明した方法に関する遺伝的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法の別の実施の形態のイラスト表現を構成する。
【図６５Ｂ】図６５Ａと合わせて、図１１Ａに関連して説明した方法に関する遺伝的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法の別の実施の形態のイラスト表現を構成する。
【図６６Ａ】図６６Ｂと合わせて、図１１Ｂに示すものと同様の免疫化学的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法の別の実施の形態のイラスト表現を形成する。
【図６６Ｂ】図６６Ａと合わせて、図１１Ｂに示すものと同様の免疫化学的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法の別の実施の形態のイラスト表現を形成する。
【図６７Ａ】図６７Ｂと合わせて、図１２Ａに示す方法に関する遺伝的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法のさらに別の実施の形態のイラスト表現を示す。
【図６７Ｂ】図６７Ａと合わせて、図１２Ａに示す方法に関する遺伝的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法のさらに別の実施の形態のイラスト表現を示す。
【図６８Ａ】図６８Ｂと合わせて、図１２Ｂに示すものと同様である免疫化学的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法のさらに別の実施の形態のイラスト表現を示す。
【図６８Ｂ】図６８Ａと合わせて、図１２Ｂに示すものと同様である免疫化学的二重ビーズ複合体溶液を生成する方法のさらに別の実施の形態のイラスト表現を示す。
【図６９】レポータービーズの非存在下でのＤＮＡｓｅＩ消化の効果を説明する棒グラフ表示である。
【図７０】ＤＮＡｓｅＩ酵素消化の効果による二重ビーズ検定の効率を示す棒グラフ表示である。
【図７１】酵素消化および物理的または化学的処理による捕捉ビーズからのレポータービーズの分離の概略表現である。
【図７２】塩基性溶液中での洗浄前および洗浄後の二重ビーズ複合体を示す棒グラフ表示である。
【図７３Ａ】７Ｍの尿素溶液中での洗浄前および洗浄後の二重ビーズ複合体を示す棒グラフ表示である。
【図７３Ｂ】尿素での洗浄後の解離レポータービーズの検出を含む、７Ｍの尿素溶液での洗浄前および洗浄後の二重ビーズ複合体を表す棒グラフ表示である。
【図７４】二重ビーズ検定中の変性剤としての１．５Ｍのグアニジンイソチオシアネートの使用を示す棒グラフ表示である。
【図７５】二重ビーズ検定中に変性剤として用いられる様々な濃度のグアニジンイソチオシアネートを示す棒グラフ表示である。
【図７６】流体回路を有する光磁気バイオディスクの一部の平面図である。
【図７７Ａ】図７６に示す流体回路を用いて細胞を分離および試験する方法を示す平面図である。
【図７７Ｂ】図７６に示す流体回路を用いて細胞を分離および試験する方法を示す平面図である。
【図７７Ｃ】図７６に示す流体回路を用いて細胞を分離および試験する方法を示す平面図である。
【図７７Ｄ】図７６に示す流体回路を用いて細胞を分離および試験する方法を示す平面図である。
【図７７Ｅ】図７６に示す流体回路を用いて細胞を分離および試験する方法を示す平面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６８Ａ】
2005530127.tif 000093
【図６８Ｂ】
2005530127.tif 000094
【図６９】
2005530127.tif 000095
【図７０】
2005530127.tif 000096
【図７１】
2005530127.tif 000097
【図７２】
2005530127.tif 000098
【図７３Ａ】
2005530127.tif 000099
【図７３Ｂ】
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【図７４】
2005530127.tif 000101
【図７５】
2005530127.tif 000102
【図７６】
2005530127.tif 000103
【図７７Ａ】
2005530127.tif 000104
【図７７Ｂ】
2005530127.tif 000105
【図７７Ｃ】
2005530127.tif 000106
【図７７Ｄ】
2005530127.tif 000107
【図７７Ｅ】
2005530127.tif 000108
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月13日(2005.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４２Ａ】
2005530127.tif 000109
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４２Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４２Ｂ】
2005530127.tif 000110
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４２Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４２Ｃ】
2005530127.tif 000111
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４２Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４２Ｄ】
2005530127.tif 000112
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３Ａ】
2005530127.tif 000113
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３Ｂ】
2005530127.tif 000114
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３Ｃ】
2005530127.tif 000115