(57)【要約】  本明細書に含まれる方法は、骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）の発現または生物学的活性の阻害による、アテローム性動脈硬化症、ならびに、脈管形成術および／またはステント配置後の血栓症、再狭窄、およびバイパス手術後の静脈／移植片疾患のようなその他の脈管疾患の処置を記載する。ＭｙＤ８８を阻害する化合物で被覆され、それによって、このデバイスに改善された効力を与える、脈管内デバイスもまた含まれる。ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達は、アテローム性動脈硬化症およびその他の形態の脈管疾患の兆候、継続および／または悪化の少なくとも部分的な原因である。本発明は、ＭｙＤ８８の生物学的活性に影響することによってこのシグナル伝達経路を阻害する、いくつかの手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）の生物学的活性を阻害するためのシステムであって：
脈管内デバイス；および
該脈管内デバイス上に被覆された治療組成物であって、ＭｙＤ８８インヒビターを含む治療組成物
を含む、システム。
【請求項２】
前記脈管内デバイスが、カテーテルおよびステントからなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、
アンチセンスＭｙＤ８８ＲＮＡを発現する核酸、
可溶性ＭｙＤ８８タンパク質をコードする核酸、
ＭｙＤ８８ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸、
アンチセンスＭｙＤ８８オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する核酸であって、阻害されなければＭｙＤ８８の生成を引き起こすｍＲＮＡのコード機能を該ｄｓＲＮＡが阻害可能であるように該ｄｓＲＮＡがＭｙＤ８８遺伝子産物の一部と十分に相同である、核酸、
ＴＬＲ−４シグナル伝達事象の間にＴｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ−４）レセプターに結合するＭｙＤ８８分子の少なくとも一部分に対応するタンパク質配列、および
抗ＭｙＤ８８抗体
からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、アンチセンスＭｙＤ８８ＲＮＡを発現する核酸である、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、ＭｙＤ８８ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸である、請求項３に記載のシステム。
【請求項６】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、アンチセンスＭｙＤ８８オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項３に記載のシステム。
【請求項７】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、抗ＭｙＤ８８抗体である、請求項３に記載のシステム。
【請求項８】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、ベクター内に含まれる、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウイルスベクター、および非ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ベクターが、アデノウイルス血清型５ベースのベクターである、請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、
アンチセンスＭｙＤ８８ＲＮＡを発現する核酸、
可溶性ＭｙＤ８８タンパク質をコードする核酸、
ＭｙＤ８８ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸、
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する核酸であって、阻害されなければＭｙＤ８８の生成を引き起こすｍＲＮＡのコード機能を該ｄｓＲＮＡが阻害可能であるように該ｄｓＲＮＡがＭｙｄ８８遺伝子産物の一部と十分に相同である、核酸、
からなる群から選択される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
脈管疾患を阻害するに十分な量の治療組成物をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記脈管疾患が、動脈硬化症、移植アテローム性動脈硬化症、静脈移植片アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、ステント再狭窄、および脈管形成術再狭窄からなる群から選択される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、可溶性ＭｙＤ８８タンパク質をコードする核酸である、請求項３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記可溶性ＭｙＤ８８タンパク質が、正常なＭｙＤ８８シグナル伝達に関与不可能である、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記可溶性ＭｙＤ８８タンパク質が、正常ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインの実質的部分を欠いている、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記可溶性ＭｙＤ８８タンパク質が、非結合ＴＬＲ−４レセプターと競合する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、前記ｄｓＲＮＡを発現する核酸であり、そして該ｄｓＲＮＡが：
約２１ヌクレオチドをさらに含むセンス鎖；および
約２１ヌクレオチドをさらに含むアンチセンス鎖
をさらに含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項１９】
前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とが、約１９ヌクレオチドの二重鎖領域を保有するように対とされる、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、各々、３’末端に約２ヌクレオチド突出をさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記センス突出と、前記アンチセンス突出とが、対称的である、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記アンチセンス突出が、ＵＵ  ３’突出またはｄＴｄＴ  ３’突出を含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２３】
前記ＵＵ  ３’突出または前記ｄＴｄＴ  ３’突出が、前記ｍＲＮＡと相補的である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記センス突出および前記アンチセンス突出のうちの少なくとも一方が、デオキシチミジンをさらに含む、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２５】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、ＴＬＲ−４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ−４レセプターに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部分に対応するタンパク質配列である、請求項３に記載のシステム。
【請求項２６】
前記タンパク質配列が、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸を含む、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
脈管疾患を処置する方法であって：
骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）インヒビターを、哺乳動物に、ＭｙＤ８８の生物学的活性を少なくとも部分的に阻害するために有効な量で投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２８】
前記脈管疾患が、アテローム性動脈硬化症、移植アテローム性動脈硬化症、静脈移植片アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、ステント再狭窄、および脈管形成術再狭窄からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＭｙＤ８８インヒビターを投与する工程が、前記脈管疾患を阻害するために有効な量で該ＭｙＤ８８インヒビターを投与する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭｙＤ８８インヒビターを投与する工程が、該ＭｙＤ８８インヒビターを静脈内に投与することをさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭｙＤ８８インヒビターを投与する工程が、該ＭｙＤ８８インヒビターを筋肉内に投与することをさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭｙＤ８８インヒビターを投与する工程が、脈管内デバイスとともに該ＭｙＤ８８インヒビターを送達することをさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記脈管内デバイスが、カテーテルまたはステントである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記脈管内デバイスが、ＭｙＤ８８インヒビターで被覆されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、
アンチセンスＭｙＤ８８ＲＮＡを発現する核酸、
可溶性ＭｙＤ８８タンパク質をコードする核酸、
ＭｙＤ８８ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸、
アンチセンスＭｙＤ８８オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する核酸であって、阻害されなければＭｙＤ８８の生成を引き起こすｍＲＮＡのコード機能を該ｄｓＲＮＡが阻害可能であるように該ｄｓＲＮＡがＭｙＤ８８遺伝子産物の一部と十分に相同である、核酸、
ＴＬＲ−４シグナル伝達事象の間にＴｏｌｌ様レセプター−４（ＴＬＲ−４）レセプターに結合するＭｙＤ８８分子の少なくとも一部分に対応するタンパク質配列、および
抗ＭｙＤ８８抗体
からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、アンチセンスＭｙＤ８８ＲＮＡを発現する核酸である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、ＭｙＤ８８ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、アンチセンスＭｙＤ８８オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、抗ＭｙＤ８８抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、ベクター内に含まれる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウイルスベクター、および非ウイルスベクターからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ベクターが、アデノウイルス血清型５ベースのベクターである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、
アンチセンスＭｙＤ８８ＲＮＡを発現する核酸、
可溶性ＭｙＤ８８タンパク質をコードする核酸、
ＭｙＤ８８ｍＲＮＡを切断するハンマーヘッドリボザイムをコードする核酸、
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を発現する核酸であって、阻害されなければＭｙＤ８８の生成を引き起こすｍＲＮＡのコード機能を該ｄｓＲＮＡが阻害可能であるように該ｄｓＲＮＡがＭｙＤ８８遺伝子産物の一部と十分に相同である、核酸、
からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、可溶性ＭｙＤ８８タンパク質をコードする核酸である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記可溶性ＭｙＤ８８タンパク質が、正常なＭｙＤ８８シグナル伝達に関与不可能である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記可溶性ＭｙＤ８８タンパク質が、正常ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインの実質的部分を欠いている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記可溶性ＭｙＤ８８タンパク質が、非結合ＴＬＲ−４レセプターと競合する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、前記ｄｓＲＮＡを発現する核酸であり、そして該ｄｓＲＮＡが：
約２１ヌクレオチドをさらに含むセンス鎖；および
約２１ヌクレオチドをさらに含むアンチセンス鎖
をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とが、約１９ヌクレオチドの二重鎖領域を保有するように対とされる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、各々、３’末端に約２ヌクレオチド突出をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記センス突出と、前記アンチセンス突出とが、対称的である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記アンチセンス突出が、ＵＵ  ３’突出またはｄＴｄＴ  ３’突出を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＵＵ  ３’突出または前記ｄＴｄＴ  ３’突出が、前記ｍＲＮＡと相補的である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記センス突出および前記アンチセンス突出のうちの少なくとも一方が、デオキシチミジンをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＭｙＤ８８インヒビターが、ＴＬＲ−４シグナル伝達事象の間にＴＬＲ−４レセプターに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部分に対応するタンパク質配列である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
前記タンパク質配列が、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸を含む、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、骨髄分化因子８８（「ＭｙＤ８８」）の生物学的活性を阻害する方法に関し、そして特に、ＭｙＤ８８による発現またはシグナル伝達を阻害することにより脈管の疾患を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓疾患は、一年間合計の３０％近くを占める（すなわち、約１５００万の人々）、世界の主要な死亡原因であるままである。心臓疾患および脈管疾患は、毎年、より多くの個体を衰弱させている。多くのアテローム性動脈硬化の疾患は、一生のプロセスであり；それは、中年またはそれより後まで臨床的症状なくして、小児期に初期ステージを所有し得る。その発症は、不健康なライフスタイル（例えば、タバコの使用、バランスの悪い食事、および身体的な不活性）に繰り返し関連付けられている。心臓疾患および脈管疾患の種々の形態の検出および処置でかなりの進展がなされたが、予防処置および多様な処置養生法は、通常、基礎となる疾患状態を停止または治癒することはできない。
【０００３】
過去１０年に亘る実験的研究は、脈管壁の炎症を、アテローム症、再狭窄、およびプラーク破壊に関連付けた。炎症の正確な引き金は知られていないが、いくつかの引き金は、改変リポタンパク質および種々の局所感染または遠隔感染を含み得ると考えられている。アテローム性動脈硬化症の発症における感染の潜在的な役割が考慮されており；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（「Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」）のような特異的な感染性因子が、アテローム性動脈硬化症の進行および／または不安定化における役割を演じていると示唆されている。
【０００４】
最近の研究は、ｃｈｌａｍｙｄｉａのリポ多糖（「ｃＬＰＳ」）が、泡沫細胞形成を誘導し、その一方で、そのヒートショックタンパク質（「ｃＨＳＰ−６０」）が、低密度リポタンパク質（「ＬＤＬ」）の酸化的改変を誘導することを示唆している。Ｍ．Ｖ．ＫａｌａｙｏｇｌｕおよびＧ．Ｉ．Ｂｙｒｎｅ、「マクロファージ泡沫細胞形成を誘導するＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ成分は、ｃｈｌａｍｙｄｉａのリポ多糖である」Ｉｎｆｅｃ．＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６６：５０６７〜５０７２（１９９８）；Ｇ．Ｉ．ＢｙｎｅおよびＭ．Ｖ．Ｋａｌａｙｏｇｌｕ「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびアテローム性動脈硬化症；疾患プロセスへの関連」Ａｍｅｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３８：Ｓ４８８〜Ｓ４９０（１９９９）。ｃＨＳＰ−６０は、ヒトｃｈｌａｍｙｄｉａ感染における有害な免疫応答の誘導に関与しており、そしてアテローム損傷における浸潤マクロファージとともに同時局在化することが見出されている。Ａ．Ｇ．Ｋｏｌら、「Ｃｈｒａｍｙｄｉａヒートショックタンパク質６０は、ヒトアテローム中に局在化し、そしてマクロファージ腫瘍壊死因子αおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ発現を調節する」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：３００（１９９８）。集合的に、これらのデータは、アテローム性動脈硬化症の発症および進行におけるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの潜在的な役割を支持し、そしてこの微生物が、アテローム発症における活性な役割を実際に演じ得ることを示唆している。しかし、利用可能なデータは、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を本質的な免疫に関連付け、そして増加した免疫およびアテローム発生のためのシグナルを誘引する分子機構の理解の現在の欠如を強調している。このような理解がないと、これらデータに基づく脈管疾患を処置するための有用な機構を開発することは極めて困難である。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症における炎症の正確な引き金は完全に理解されていないけれども、高コレステロール血症、改変リポタンパク質，およびＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのような生物での感染およびその他が関与している。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染が、コレステロール摂取ウサギ、および遺伝子的に改変されたアテローム性動脈硬化症にかかりやすいマウスにおけるアテローム性動脈硬化症の進行を加速し、かつその誘導を促進し得るという証拠がある。しかし、このシステムを制御する機構の明瞭な理解なくしては、これらのデータは、アテローム性動脈硬化症の処置または治療にための基礎を提供しないかも知れない。Ｊ．Ｂ．Ｍｕｈｌｅｓｔｅｉｎら、「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでの感染は、アテローム性動脈硬化症の発症を加速し、そしてアジスロマイシンでの処置は、ウサギモデルでそれを予防する」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：６３３〜６３６（１９９８）；Ｔ．Ｃ．Ｍｏａｚｅｄら、「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染のマウスモデルおよびアテローム性動脈硬化症」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：８８３〜８９０（１９９７）；Ｔ．Ｃ．Ｍｏａｚｅｄら、「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染は、アポリポタンパク質Ｅ欠損マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の進行を加速する」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：２３８〜２４１（１９９９）；Ｌ．Ａ．ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＣ．Ｃ．Ｋｕｏ、「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染のマウスモデルおよびアテローム性動脈硬化症」Ａｍ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．１３８：Ｓ５１６〜Ｓ５１８（１９９９）；Ｋ．Ｌａｉｔｉｎｅｎら、「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染は、ウサギの大動脈における炎症性変化を誘導する」Ｉｎｆｅｃｔ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：４８３２〜４８３５（１９９７）。
【０００６】
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ誘導アテローム形成の概念は、ｃｈｌａｍｙｄｉａに対する抗体治療が、ウサギモデルにおけるアテローム性動脈硬化症の加速を防ぐという知見により増強される。ｃｈｌａｍｙｄｉａ誘導炎症性応答の引き金として、Ｉｎｇａｌｌｓらはリポ多糖（「ＬＰＳ」）を示唆し、そしてＫｏｌらはＨＳＰ−６０を示唆している。Ｒ．Ｒ．Ｉｎｇａｌｌｓら、「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染に応答する炎症性サイトカインは、エンドトキシン媒介される」Ｉｎｆｅｃｔ＆Ｉｍｍｕｎ．６３：３１２５〜３１３０（１９９５）；Ａ．Ｋｏｌら、「Ｃｈｌａｍｙｄｉａおよびヒトヒートショックタンパク質６０ｓは、ヒト脈管内皮、平滑筋細胞およびマクロファージを活性化する」Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０３：５７１−５７７（１９９９）；Ａ．Ｋｏｌら、「ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）６０は、本質的な免疫応答を活性化する」Ｔｈｅ  Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１３〜１７（２０００）。現在まで、しかし、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのような感染がアテローム性動脈硬化症の進行に寄与する正確な分子機構、ならびに脂質、微生物抗原、および本質的な免疫と炎症応答との間の関連は良く理解されていない。
【０００７】
しかし、１つの最近の研究は、ＨＳＰ−６０が、インビトロで平滑筋細胞増殖を誘導し；平滑筋細胞増殖が、アテローム性動脈硬化症に直接関連していることを示した。Ｓａｓｕら、「Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｈｌａｍｙｄｉａヒートショックタンパク質６０は、Ｔｏｌｌ様レセプター４およびｐ４４／ｐ４２マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化を経由して脈管平滑筋筋肉細胞の増殖を刺激する」Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８９：２４４〜２５０（２００１）。この研究は、平滑筋細胞増殖が、抗ＴＬＲ−４抗体によりブロックされたか、または激しく妨害されたことを示した。この知見は、ＨＳＰ−６０もまた、ＴＬＲ−４経路を経由して平滑筋細胞増殖を引き起こすことを示す。
【０００８】
アテローム性動脈硬化症を処置するための外科的および皮下動脈再脈管形成の導入は、疾患の臨床管理を大いに改変したが、また、予期されない問題および解答されない疑問をもたらした。外科的、そして特に皮下再脈管形成は、過大な治癒応答を惹起し得、これは、多くの局面で、デノボアテローム性動脈硬化損傷の進展に類似している。この「損傷に対する応答」は、デノボ損傷形成より本来増殖的であるが、それにも関わらず、再狭窄、またはより後期もしくは突然の脈管閉鎖に至り得、そして最終的には、失敗した再脈管形成試行を生じ得る。この理由およびさらなる理由のため、長期間の臨床研究は、患者選択された患者サブグループ（安定な狭心症を持つような）においてのみ、改善された結果を記載し、冠状介入は単に対症なままであり、そして基礎となる原因の疾患プロセスの進行または結果は改変しない。
【０００９】
バルーン冠状脈管形成術で、３０％〜４０％またそれより多い再狭窄率が記載され、そして特定の損傷部位および患者サブグループが、特に再狭窄を受けやすいことが見出されている。再狭窄の原因への集中的な研究努力は、相当の見識を生じたが、この問題をなくすためにあいまいでない処置は未だ同定されていない。再脈管形成装置および技法における技術的革新は、ある程度の成功を示したが、これでさえ、限られた効目である。特に、冠内ステントは、再狭窄の発生率を顕著に減少した。適正なステント配置技法により、再狭窄率は、ほぼ１５％〜３０％まで減少し、そうなので、冠内ステント配置は、選択の介入冠状処置として単独のバルーン脈管形成術の大部分に取って代わった。なお、迅速な増殖および冠内ステント配置の受容可能性が与えられたとしても、なお、１５％〜３０％の再狭窄率は、再脈管形成試行が不成功であり、そしてその他の処置戦略が十分に有効ではない非常に多数の患者を生じる。しばしば、同じ患者が、複数の別個の介入を必要とし得、そして最終的に、これらは成功しなくなり得る。
【００１０】
損傷に対する動脈応答は、本来、優勢的に分裂促進的かつ新増殖的であるので、冠内照射（または冠内多枝治療）が開発され、そして冠状介入後の再狭窄になる患者の数をさらに減少するための試行を展開している。しかし、冠内多枝治療（Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ）もまた、限られた成功と遭遇し、そして副作用として、２つの新たな疾患の兆候：幾何学的失敗および後期のステント内血栓、をもたらした。これらの２つの副作用は、再狭窄の最終的な処置として冠内多枝治療の効目を顕著に制限するようである。従って、冠状ステント配置後の再狭窄を制限またはなくすための有効な方法のための必要性が残っている。あるいは、冠内多枝治療が、ステント配置後の再狭窄をなくすことであいまいでない有効性を達成し得る場合、後期ステント内血栓および幾何学的失敗に対する解決が見出されなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
脈管疾患の従来の処置は、実質的な欠点を有している；多くは、部分的にのみ有効であり、そして関連する症状の真実の治療を提供するものはほとんどない。当該分野には、アテローム性動脈硬化症を含む脈管疾患を予防、処置および治癒する方法に対する明確な必要性が残っている。当該分野には、現在のステント技術に対する改良であって、それによって再狭窄の機会を最小にし得る改良に対するさらなる必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の目的は、骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）の生物学的活性を、例えば、その発現またはシグナル伝達を阻害することにより、阻害する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、ＭｙＤ８８を阻害することが有益な影響を有し得るような疾患を処置する方法を提供することである。このような疾患は、例えば、動脈硬化症および血栓症のような脈管疾患、脈管形成術および／またはステント配置後の再狭窄、およびパイパス手術後の静脈移植片疾患を含む。
【００１３】
ＭｙＤ８８は、例として、ＴＬＲ−４のようなｔｏｌｌ様レセプター、ならびにインターロイキン−１（「ＩＬ−１」）およびインターロイキン−１８（「ＩＬ−１８」）を含む種々の細胞レセプターに帰因する生化学的シグナル伝達に必要なアダプタータンパク質である。いかなる理論によっても拘束されることは望まないが、従って、ＭｙＤ８８の発現またはシグナル伝達を阻害することは、ＴＬＲ−４の発現またはシグナル伝達を阻害することから生じるのと同じ多くの生化学的効果を生じると考えられる。同じシグナル伝達経路が阻害され；この経路に沿って単に異なる点で阻害される。勿論、ＭｙＤ８８の発現またはシグナル伝達を阻害することは、ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達経路とは非関連のその他の影響を有し得る。なぜなら、ＭｙＤ８８は、上記のような種々のさらなる経路中に含まれているからである。しかし、ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達経路の、脈管疾患の調節および処置に対する影響は、ＴＬＲ−４またはＭｙＤ８８のいずれかの発現またはシグナル伝達を阻害することにより同様に連座され得る。
【００１４】
本発明の第１の実施形態は、哺乳動物に、アンチセンスＭｙＤ８８ＲＮＡを発現する遺伝子を送達する組換えウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはその他のウイルスベクター）を投与することによりＭｙＤ８８を阻害する方法に関し；そうすることにより、ＭｙＤ８８の発現を阻害し、それによってその生物学的活性を阻害する。ウイルス粒子の最適量、およびそれを投与するための有効かつ便利な経路（例えば、それを静脈内または筋肉内に投与することにより）は、微生物学の当業者によって容易に決定され得る。
【００１５】
本発明の第２の実施形態は、非結合ＴＬＲ−４レセプターと競合する高親和性の可溶性ＭｙＤ８８タンパク質のインビボ産生を誘導することにより、ＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害する方法に関する。このＭｙＤ８８タンパク質は、最も好ましくは、ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメイン、またはＭｙＤ８８タンパク質が、ＭｙＤ８８またはＴＬＲ−４シグナル伝達に参加し得ないように、少なくとも十分な量のＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインを欠いている。この方法は、非結合ＴＬＲ−４レセプターの量を減少するに十分である量の可溶性ＭｙＤ８８またはその誘導体を生成するためにウイルスベクターを送達する工程を包含し；それによってＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害する。
【００１６】
本発明の第３の実施形態は、体細胞遺伝子治療でＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害する方法に関する。この方法によれば、ＭｙＤ８８ｍＲＮＡに対するリボザイムウイルス（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはその他のウイルスベクター）ベクターが、哺乳動物に投与される。この方法は、ウイルス骨格中のハンマーヘッドリボザイム発現カセットを利用する。リボザイムは、配列特異的エンドヌクレアーゼ活性を有し、これは、それらを、ｍＲＮＡの配列特異的切断および遺伝子発現のさらなる阻害のために有用にする。リボザイム治療は、多くの医療障害を処置するための新規かつ可能性のある薬学的クラスの試薬として広く認められている。リボザイム−ウイルスベターの発現の所望の性質または長さは、それを投与する最も有効かつ便利な経路がそうであり得るように、過度の実験を要することなく容易に決定され得る。ＭｙＤ８８ｍＲＮＡに対するリボザイム−ウイルスベクターは、脈管生理学に対するＭｙＤ８８媒介細胞シグナル伝達の寄与を特有に評価すること、およびこのようなシグナル伝達原因の病理学において治療的に介入することを可能にする。
【００１７】
本発明の第４の実施形態は、ＭｙＤ８８の発現を阻害する非ウイルスベクター方法を提供することである。この方法は、ＭｙＤ８８ｍＲＮＡの一本鎖領域の特異的塩基対とにより、ＭｙＤ８８遺伝子産物の発現を阻害するオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」）を用いるアンチセンス治療を含む。この方法は、ＭｙＤ８８ｍＲＮＡの十分な部分に相補的なＯＤＮの合成を包含する。この方法は、哺乳動物においてＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するために有効な量のＯＤＮをさらに提供する。
【００１８】
本発明の第５の実施形態は、ＲＮＡ妨害（「ＲＮＡｉ」）によりＭｙＤ８８の発現を阻害するための方法を提供する。この方法は、ＭｙＤ８８遺伝子産物の一部分に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、分解されなければＭｙＤ８８の産生に影響し得るｍＲＮＡを分解するように十分に相同であるｄｓＲＮＡの使用を含む。小妨害性ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）と呼ばれる、良好に規定された２１塩基の二重鎖ＲＮＡが、種々の細胞成分と組み合わされて作動し得、配列相同性でＭｙＤ８８遺伝子産物を沈黙させる。
【００１９】
本発明の第６の実施形態は、ペプチド模倣物によってＭｙＤ８８細胞シグナル伝達経路を阻害する方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ−４レセプターに結合する小ペプチド（すなわち、約１０〜２０アミノ酸のペプチド）の導入を含み、それによって、ＴＬＲ−４レセプターがＭｙＤ８８に結合することを妨げるか、そうでなければＭｙＤ８８を誘引する。このようにして、ＭｙＤ８８シグナル伝達はブロックされ得る。なぜなら、このＴＬＲ−４レセプターは、ＭｙＤ８８を適切に結合し得ないからである。
【００２０】
本発明の第７の実施形態は、抗ＭｙＤ８８抗体の導入を通じてＭｙＤ８８の発現を阻害する方法を提供する。このような抗体は、哺乳動物においてＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するために有効な量で任意の従来の機構を通じて哺乳動物に送達され得る。送達の機構およびＭｙＤ８８発現を阻害するために必要な抗体の量の両方は、過度の実験を要することなく容易に確定される。
【００２１】
本発明のその他の特徴および利点は、本発明の実施形態の種々の特徴を例示により示す添付の図面と組み合わせて考慮し、以下の詳細な説明から明確になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法は、ネイティブなＭｙＤ８８；ＴＬＲ−４、およびその他の細胞レセプターに帰因する生化学的シグナル伝達のために必要なアダプタータンパク質の産生または生物学的活性を妨害することにより、Ｔｏｌｌ様レセプター−４（「ＴＬＲ−４」）活性を阻害する。これらの方法は、ＴＬＲ−４および／またはＭｙＤ８８活性を阻害することが、患者に対して有益な影響（例えば、疾患の改善すること、その合併症の重篤度を軽減すること、それが顕在化することを防ぐこと、それが再発することを防ぐこと、単に悪化することを防ぐこと、または、たとえ、そのような治療努力が最終的には不成功であるとしても、前記の任意を行う治療努力）を有する任意の疾患を処置するために用いられ得る。ＴＬＲ−４および／またはＭｙＤ８８活性が、疾患を含む病的状態を開始し、悪化し、または維持することで役割を演じることが知られるか、または疑われる疾患が当該分野で公知である。アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症およびその他の脈管疾患が例である．本発明の方法は、これらの疾患の任意を処置するために用いられ得る。
【００２３】
本発明は、ＭｙＤ８８−／−動物が、それらの冠状循環において、ＭｙＤ８８＋／＋動物が行うより実質的により少ないアテローム硬化性プラークを発症するという驚くべき発見に基づいている。ＭｙＤ８８＋／−動物が、容量的に、ＭｙＤ８８＋／＋動物とＭｙＤ８８−／−動物との間にある量のアテローム硬化性プラークを発症するという事実は、ＭｙＤ８８細胞シグナル伝達経路が、アテローム性動脈硬化症の発症またはそれを発症するための性向において直接的役割を演じているという考えのさらなる支持に役立つ。これらの結果は、図４および５に明瞭に示され、これらは、ＭｙＤ８８＋／＋、ＭｙＤ８８＋／−、およびＭｙＤ８８−／−である動物冠状循環の部分におけるプラーク発症の比較の写真を提供している。
【００２４】
さらに、ＭｙＤ８８は、ＴＬＲ−４細胞シグナル伝達経路で作動するので、ＭｙＤ８８またはＴＬＲ−４のいずれかの阻害が、同様の結果を達成し得ると考えられる。いずれの理論により拘束されることは希望しないが、ＭｙＤ８８は、さらなる細胞シグナル伝達経路に関与しているので（すなわち、ＴＬＲ−４に加え、その他の細胞レセプターにより誘引される）、ＭｙＤ８８の阻害は、アテローム性動脈硬化症およびその形態の脈管疾患の処置により劇的な衝撃を有し得ると考えられる。
【００２５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、アテローム性動脈硬化症、移植アテローム性動脈硬化症、静脈移植片アテローム性動脈硬化症、ステント再狭窄、および脈管形成術再狭窄を阻害するために用いられ、そしてそれによって、アテローム性動脈硬化が引き起こす心臓脈管疾患（以後本明細書では「脈管疾患」）を処置する。これらの方法は、既に存在するアテローム性動脈硬化症を減少することから、なお形成されるアテローム性動脈硬化症を阻害することから、または現存するアテローム性動脈硬化症を減少すること、および新たなアテローム性動脈硬化症を阻害することの両方から利益を受ける任意の患者において用いられ得る。このような患者は、例えば、狭心症およびそのサブタイプ（例えば、不安定狭心症および異型狭心症）；脳、心臓、骨、および腸のような虚血に影響される器官、ならびに、発作、一過性虚血発作、心臓発作、骨壊死、大腸炎、乏しい腎臓機能、およびうっ血性心不全；四肢への乏しい血液循環および乏しい脈管循環の合併症、例えば、遅延創傷治癒、感染、および跛行；脈管形成術またはアテローム性硬化損傷のステント処理後の再狭窄を含む、アテローム性硬化症それ自身；バイパス手術後の静脈移植片アテローム性硬化症；移植アテローム性硬化症；およびアテローム性硬化症により引き起こされるその他の疾患またはそれにともなう疾患を患う患者を含む。
【００２６】
本発明は、ＭｙＤ８８の生物学的活性を阻害するために採用される種々のＭｙＤ８８インヒビターを企図する。これらのインヒビターは、種々の確実にする実施形態中で提示されるような、任意の適切な手段により哺乳動物に投与され得る。このようなインヒビターは、ＭｙＤ８８の生物学的活性の阻害を行う任意の化合物、医薬品、またはその他の組成物を含み得る。このような組成物は、哺乳動物に、有効量で、そして任意の適切な手段（経口的、局所的、静脈内、筋肉内、カテーテルのような外科的デハイスを経由して、またはステントのような移植可能な機構を経由して）により投与され得る。
【００２７】
本発明の第１の局面は、アンチセンスＲＮＡを発現するＭｙＤ８８遺伝子配列を含むウイルスベクターを利用する体細胞遺伝子移入を含む。アンチセンスＭｙＤ８８ＲＮＡを発現し得る適切なウイルスベクターは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスに基づく発現ベクターを含むが、非ウイルスベクターも同様に用いられる。哺乳動物中のアテローム性硬化症および脈管形成術／ステント誘導再狭窄に対する、ＭｙＤ８８アンチセンス遺伝子移入のための理想的ベクターは、以下の属性を有する：（１）インビトロ遺伝子移入の高い効率；（２）分裂細胞および非分裂細胞における組換え遺伝子発現（冠状動脈壁におけるベースライン細胞分裂速度は、進行した損傷においてさえ、＜１％）；（３）迅速および長寿命組換え遺伝子発現；（４）最小の、炎症性応答または免疫応答からの脈管細胞障害性；（５）大多数の集団のベクターに対するベースライン免疫の不存在；および（６）ウイスルベクターの病原性の欠如。これは、ベクターがこれら属性のすべてを有しなければならないということではない；実際、多くの有用なベクターはそうではない。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態では、アデノウイルス血清型５（「Ａｄ５」）を基礎にしたベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａから入手可能）を採用して、培養マクロファージおよび脈管平滑筋細胞中、およびアテローム性動脈硬化症傾向のマウスおよびブタ中でアンチセンスＲＮＡを発現する、ＭｙＤ８８遺伝子配列を送達および発現する。この組換えＡｄ５ベクターは、リポソームおよびレトロウイルスのようなその他のベクターより優れた利点を有している。レトロウイルスベクターとは異なり、標的細胞の増殖はアデノウイルスベクターによる感染には必要ではなく、そしてそれ故、Ａｄ５ベクターは、インビボで静止状態にある細胞を感染し得る。Ａｄ５ベクターは、形質導入効率が細胞タイプに従って変動し得るが、多くの異なる組織を感染し得る。しかし、インビボ遺伝子送達の手段としてのＡｄ５ベクターは、いくつかの欠点を有している：（１）このＡｄ５ベクターで形質導入された細胞からの遺伝子発現は、しばしば、宿主免疫システムによるＡｄ５−形質導入細胞の除去に起因してしばしば一時的である；（２）Ａｄ５ベクターは、嚢胞性線維症患者におけるヒト臨床試験で観察されたように、ヒトレシピエントにある程度の毒性を生成し得る；および（３）Ａｄ５ベクターの初期投与は、ベクターに対するブロック抗体を生成し、それ故、このアデノウイルスベクターの繰り返し投与は、有効でないかも知れない。これらの制限があってもなお、本発明の方法は、アンチセンスＲＮＡを発現するＭｙＤ８８配列のｒＡｄ５−媒介移入を利用する。ＲＴ−ＰＣＲを用い、ＭｙＤ８８の一部分が単離され、そしてヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）主要極初期プロモーター−エンハンサーの上流に、アンチセンスＭｙＤ８８ＲＮＡを生成する方向でクローン化される。組換えＡｄ５ベクターの使用は、アデノウイルス媒介遺伝子治療が冠状脈管形成術の付属物として特に良好に適合されるという原理の証明を提供する。なぜなら、平滑筋細胞増殖の一時的阻害でさえ、再狭窄損傷の形成を制限するために十分であり得るからである。
【００２９】
本発明の第２の局面は、高レベルの、ＴＬＲ−４レセプターと競合するが、ＭｙＤ８８シグナル伝達ドメインの少なくとも実質的部分を欠いているＭｙＤ８８の可溶性形態を生成する遺伝子治療方法を提供する。その他のタイプの疾患でのように、アテローム性動脈硬化疾患を処置するための治療戦略は、数ヶ月〜数年の範囲の時間である延長された期間の処置を必要とする。異種プロモーターからの延長された、かつ効率的な移入遺伝子転写は、遺伝子治療の主要な考慮である。本発明における可溶性ＭｙＤ８８の発現を駆動するためにＣＭＶプロモーターを含めることは、種々の遺伝子を発現するために一般に用いられている。しかし、大部分のプロモーターおよび移入遺伝子のように、それは、しばしば、後生的なサイレンシングを受ける。この問題を回避する試みにおいて、種々のプロモーター発現戦略が、本発明における可溶性ＭｙＤ８８のインビボ産生を最適化するために用いられ得る。
【００３０】
ウルルスベクター中の効率的な遺伝子発現は、種々の因子に依存する。これらは、プロモーターの強さ、メッセージの安定性および翻訳効率を含む。これら因子の各々は、独立に調査され、可溶性ＭｙＤ８８遺伝子の最適発現を達成する。インビトロおよびインビボにおける可溶性ＭｙＤ８８の発現を増加および最適化するためのその他のプロモーター／エンハンサー改変体の適用は、本発明の範囲内に含まれる。これらは、テトラサイクリン誘導性プロモーターのような誘導可能性を示す、ＣＭＶより強いプロモーターまたはエンハンサーを含む。例えば、脈管内皮組織または平滑筋組織を標的にする組織特異的機能を有し、しかも非結合ＴＬＲ−４レセプターの量を減少するために十分な時間および条件下で可溶性ＭｙＤ８８またはその誘導体を産生し、そしてそれによってＭｙＤ８８機能を阻害するプロモーター／エンハンサーもまた含められ得る。可溶性ＭｙＤ８８発現のレベルおよび持続性は、ＣＭＶプロモーターから得られたそれらと比較され得る。
【００３１】
本発明の第３の局面は、上記で述べた状態を治療するために、哺乳動物、そして特にヒトおいて、ＭｙＤ８８ｍＲＮＡに対し、リボザイム−ウイルス（アデノ、アデノ随伴またはレンチウイルス）ベクターまたは非ウイルスベクターを投与することによる、体細胞遺伝子治療方法を企図する。この方法は、ＭｙＤ８８ｍＲＮＡの配列を標的にするハンマーヘッドリボザイム発現の開発を含む。リボザイムは、特異的ＲＮＡ配列を、触媒的に切断する配列特異的エンドリボヌクレアーゼであり、標的ｍＲＮＡの不可逆的不活性化を生じ、それによって遺伝子発現を阻害する。Ｔ．Ｃｅｃｈ、「ＲＮＡによる生物学的触媒（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ＲＮＡ）」Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：５９９〜６２９（１９８６）；Ｊ．Ｊ．Ｒｏｓｓｉ、「治療的リボザイム：原理および適用（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」Ｂｉｏ  Ｄｒｕｇｓ  ９：１〜１０（１９９８）。リボザイムは、アンチセンスＯＤＮを超える利点を提供する。例えば、リボザイムは、ＯＤＮより高い触媒的活性を所有し；それ故、比較的より少ない量のリボザイム含有活性剤を遺伝子発現の阻害に必要とする。リボザイムは、外因的に送達され得るか、またはウイルスベクター中の適切なプロモーターの使用で内因的に発現され得る。本発明の方法は、ヒトＭｙＤ８８ｍＲＮＡに向けられるハンマーヘッドリボザイムを利用する。リボザイム−ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの発現の所望の量または長さは、大部分の効率的および／または便利な投与の経路がそうであるように、慣用的な実験により容易に決定され得る。
【００３２】
本発明の第４の局面では、ＭｙＤ８８の発現を阻害するための非ウイルス方法が提供される。この方法は、ヒトＭｙＤ８８ｍＲＮＡのセンス配列およびアンチセンス配列に対応するペンタデカマー（「１５マー」）ＯＤＮの合成を含む。ペンタデカマーＯＤＮは、標的ｍＲＮＡの一本鎖領域に強く結合することが知られている。Ｄ．Ｊａｓｋｕｓｋｉら、「ＰＣＮＡサイクリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞増殖の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｏ  ＰＣＮＡ  ｃｙｃｌｉｎ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１５４４〜１５４８（１９８８）。このような強い結合は、相応して、ｍＲＮＡの翻訳の強力な阻害を生じ得る。
【００３３】
本発明の好ましい方法では、ＯＤＮは、ＥＸＰＩＤＩＴＥ核酸合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手可能）のような核酸合成機上で合成され、そして標準的なプロトコールを用いて精製される。
【００３４】
本発明の第５の局面では、ＲＮＡｉによるＭｙＤ８８の発現を阻害するための方法が提供される。対応するＲＮＡ配列を分解することによって遺伝子産物をサイレンシングするこの新規なアプローチは、アンチセンスおよびリボザイムを基礎にした戦略を含む代替の遺伝子サイレンシング方法より効率的であると報告されている。この方法は、ＭｙＤ８８遺伝子産物の一部分に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、分解されなければＭｙＤ８８の産生に影響し得るｍＲＮＡを分解するに十分相同であるｄｓＲＮＡの使用を含む。良好に規定された２１塩基の二重鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯから得た）は、種々の細胞成分と組み合わされて作動し、配列相同性でＭｙＤ８８遺伝子産物をサイレンシングする。ＲＮＡｉは、Ｈａｍｍｏｎｄら、「二本鎖ＲＮＡによる転写後遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ−Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）」Ｎａｔｕｒｅ  １１０〜１１９（２００１）；Ｓｈａｒｐ、Ｐ．Ａ．、「ＲＮＡ妨害−２００１（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−２００２）」Ｇｅｎｅ  Ｃｅｖ．１５：４８５〜４９０（２００１）；およびＥｌｂａｓｈｉｒら、「２１−および２２−ヌクレオチドＲＮＡにより媒介されるＲＮＡ妨害」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８〜２００、これらの各々は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【００３５】
効率的な遺伝子サイレンシングは、各々が約２１ヌクレオチドを含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、そしてさらに、それらが約１９ヌクレオチドの二重鎖領域および各３’末端における約２ヌクレオチドの突出を所有するように対となるｓｉＲＮＡ二重鎖を採用することにより達成され得る。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、「２１−ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖は、培養哺乳動物細胞中のＲＮＡ妨害を媒介する（Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ）」Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４〜４９８（２００１）。互い違いのサイズのセンス鎖またはアンチセンス鎖および／または二重鎖のサイズおよびそれらを含む突出領域に関する改変が、本発明の方法との使用に適切であり得、そしてその範囲内にあるとして考えられることは、ＲＮＡｉの技術分野の当業者によって認識され得る。このような適切な互い違いのサイズは、当業者によって過度の実験を要することなく容易に確認され得る。
【００３６】
さらに、対称の３’末端突出を含めることは、ほぼ等しい比のセンスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ切断ｓｉＲＮＰをもつ、特異的エンドヌクレアーゼ複合体（「ｓｉＲＮＰ」）の形成を補助し得る。アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は、標的ＲＮＡ認識を担当し、その一方、センス鎖中の３’−突出はこの機能に関与していないと考えられる。従って、好ましい実施形態では、アンチセンス配列のＵＵまたはｄＴｄＴ３’−突出は、標的ｍＲＮＡに相補的であり、しかし、センスｓｉＲＮＡオリゴの対称のＵＵまたはｄＴｄＴ３’−突出は、ｍＲＮＡ対応している必要はない。デオキシチミジンは、３’−突出のいずれか、または両方に含まれ得；これは、ヌクレアーゼ抵抗性を増加し得る。しかし、ＵＵまたはｄＴｄＴ突出のいずれかを含むｓｉＲＮＡ二重鎖は、ヌクレアーゼに等しく抵抗性であり得る。
【００３７】
本発明に従って用いられるｓｉＲＮＡ二重鎖は、適切なウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを経由して細胞に導入され得る。このようなベクターは、本発明の体細胞遺伝子細胞移入実施形態に関して上記に記載のようなベクターを含む。
【００３８】
本発明の第６の局面では、ペプチド模倣物によってＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害する方法が提供される。この方法は、ＴＬＲ−４レセプターに結合する小ペプチド（すなわち、約１０〜２０アミノ酸のペプチド）の導入を含み、それによって、これらのレセプターがＭｙＤ８８に結合することを防ぐ。ＭｙＤ８８の短い、重複するセグメント（例えば、長さが約１０〜２０のアミノ酸）は、どの個々のセグメントが、ＴＬＲ−４レセプターに結合することにより、ＭｙＤ８８細胞シグナル伝達に影響するかを試験するために分離され得る。分離後、このセグメントを複製し、そしてこのセグメントが、ＴＬＲ−４レセプターに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部分を含むか否かを決定するために試験する。本発明の方法に従う使用のための適切なセグメントは、ＴＬＲ−４レセプターに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部分を、十分な量のこのセグメントの個々のコピーの投与が、ＭｙＤ８８シグナル伝達を妨げるように含む。一旦投与されると、セグメントは、好ましくは、ＴＬＲ−４レセプターのＭｙＤ８８結合部位に結合し、それによって、ＴＬＲ−４レセプターが、ＭｙＤ８８の対応する部位に結合することを妨げる。これは、ＭｙＤ８８細胞シグナル伝達を有意に妨害し得る。
【００３９】
本発明の方法によれば、実際、ＴＬＲ−４レセプターに結合するＭｙＤ８８の少なくとも一部分を含むセグメントは、患者に投与され得る。投与は、カプセル、錠剤、溶液、または懸濁液のような経口形態による；静脈内形態；注射可能な形態；ステント被覆、持続放出機構、または生分解性ポリマー単位のような移植可能形態；または活性または治療薬剤が患者に送達され得る任意のその他の適切な機構を含む、任意の適切な手段によって実施され得る。この投薬量は、大部分の投与の適切な手段がそうであるように、投与の選択された形態に従って同様に決定され得、そのレベルは、過度の実験なくして容易に確認され得る。
【００４０】
本発明の第７の局面では、抗−ＭｙＤ８８抗体の導入によりＭｙＤ８８発現を阻害する方法が提供される。任意の適切な抗−ＭｙＤ８８抗体が、本発明のこの局面と組み合わせて用いられ得、抗−ＭｙＤ８８抗体、および任意の適切なその誘導体、その等価物、または、（天然に存在するか、または合成物であるにかかわらず）抗−ＭｙＤ８８抗体と類似の様式で機能する活性部位をもつ化合物（以後本明細書で含まれるすべては、用語「抗−ＭｙＤ８８抗体」内に含められる）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４１】
本発明の方法を行うために必要な抗−ＭｙＤ８８抗体の適切な量、およびこれを哺乳動物に送達する最も都合の良い経路は、過度の実験を要することなく、当業者によって決定され得る。さらに、抗−ＭｙＤ８８抗体が種々の薬学的組成物中に処方され得、その任意の１つが本発明の方法に従う使用に適切であり得ることは、このような当業者によって容易に認識され得る。
【００４２】
このような抗体は、哺乳動物に、任意の従来の機構により、哺乳動物においてＭｙＤ８８シグナル伝達を阻害するために有効な量で送達され得；送達の機構およびＭｙＤ８８発現を阻害するために必要な抗体の量の両方は、過度の実験を要することなく容易に確認され得る。
【００４３】
本発明の種々の実施形態のいずれかに従って構成されるＭｙＤ８８阻害組成物の脈管送達は、広範な範囲の局所送達デバイスおよび方法のいずれかにより達成され得る。Ｋ．Ｌ．Ｍａｒｃｈ、「脈管組織への局所遺伝子送達の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｌｏｃａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ」Ｓｅｍｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１：２１５〜２２３（１９９６）。局所送達が好ましい。なぜなら、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含むこれらの組成物については、部位特異的送達が、最小の全身的副作用で最大の治療効力を生じ得るからである。これらの局所送達デバイスは、代表的には、脈管内アプローチまたは「インサイドアウト」アプローチを引き起こし、それによって、治療剤は、脈管内カテーテルまたはデバイスを経由して標的部位に送達される。各デバイスについて遺伝子移入が示されているけれども、カテーテルを基礎にした遺伝子移入の大部分の研究は、低い効率、注入物質の迅速な再分配、および注入物の全身循環中への逃避を示している。
【００４４】
最近、心筋または脈管系のいずれかの間質性組織中に直接注入し得る、改変されたニードルを備えたいくつかのデバイスが記載されている。局所薬物送達への１つのこのようなアプローチは、任意の適切なカテーテルが用いられ得るけれども、ＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）（ＩｎｔｅｒＶｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）のような、ニップルバルーンカテーテルを経由する。本発明の方法は、小容量の高力価ｒＡｄ５の壁内送達のために、ＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）を利用し、ここでは、このようなベクターが適切である。このＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）カテーテルは、ベクター粒子を脈管壁に直接およびその中に深く配置することにより、改善された局所遺伝子送達を提供する。このＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）カテーテルは、媒体および内外膜中への機械的接近により、薬剤の直接壁内送達を提供するように設計され、これは、バルーン表面上にマウントされた鋭いエッジの注入オリフィスを用いて達成される。Ｐ．Ｂａｒａｔｈら、「ニップルバルーンカテーテル（Ｎｉｐｐｌｅ  ｂａｌｌｏｎ  ｃａｔｈｅｔｅｒ）」Ｓｅｍｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１：４３（１９９６）。このカテーテルは、臨床的に使用されている。Ｇ．Ｓ．Ｐａｖｌｉｄｅｓら、「動脈壁内の直接注入による壁内薬物送達：新規冠状内送達−侵入機システムでの最初の臨床経験（Ｉｎｔｒａｍｕｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｗａｌｌ：ｆｉｒｓｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）」Ｃａｔｈｅｔ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｉａｇｎ、４１：２８７〜２９２（１９９７）。さらに、ＩＮＦＩＬＴＲＡＴＯＲ（登録商標）は、管腔内送達により達成され得る局所形質導入効率と比較して、アデノウイルスベクターによる改善された局所形質導入効率を生じることが示されている。Ｔ．Ａｓａｈａｒａら、「脈管内皮成長因子の局所送達は、再内皮化を促進し、そしてバルーン損傷ラット頚動脈における初期過形成を減衰する」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、９１：２７９３〜２８０１（１９９５）。
【００４５】
本発明の方法はまた、ＴＬＲ−４に関して、以下の実施例１０で記載のような、マウス中の外膜周囲頚動脈損傷において適用された手順を改変することにより、脈管壁中の薬物送達の脈管周囲アプローチまたは「裏返し（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎ）」アプローチを利用する。Ｏｇｕｃｈｉ  Ｓら、「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｔｉｍａｌ  ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ：ｆｉｎｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（補遣）Ｉ−５４８：３０６６（１９９７）；Ｐ．Ｄｉｍａｙｕｇａら、「Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ＨＤＬ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１  ｒｅｄｕｃｅｓ  ＶＣＡＭ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｏｉｎｔｉｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｅｒｉａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ  ｃｕｆｆ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃａｒｏｔｉｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ａｐｏＥ  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２６４：４６５〜４６８（１９９９）。
【００４６】
遺伝子治療アプローチを経由して関与する遺伝子を直接標的にすることにより、本発明の方法は、ステント配置後の再狭窄、および冠内近接照射療法後の幾何形状損失および後期ステント内血栓をなくすか、または実質的に減少するステント被覆で用いられ得る。本発明の方法は、ＭｙＤ８８阻害性組成物で被覆されたステントを企図する。これら遺伝子治療薬剤は、既に存在するステント上の被覆として用いられ得るので、それらは、増加した手順時間なくして配置され得、そして有意なさらなる装置、経験、入院または出費を必要としない。成功する場合、この戦略は、繰り返しの入院およびさらなる介入手順の必要性をなくすので、それは、長期間の実行におけるコスト有効性が証明されるはずである。結果はまた、この戦略が、ステント配置後の再狭窄、および冠内近接照射療法後の幾何形状損失および後期ステント内血栓にともなう臨床事象を最小にすることで有効である程度まで、有利である。被覆されたステントは、最終的には、ステントのための候補であるすべての患者中に移植され得る。なぜなら、現在のところ、この手順の前には、どの患者が、冠内介入後、動脈損傷をともなう再狭窄またはその他の合併症になるかを決定することは可能ではないからである。
【００４７】
ＴＬＲ−２およびＴＬＲ−４は、生来の免疫および炎症応答で重要な役割を演じているので、本発明者らは、これらレセプターの発現を調査し、そしてＴＬＲ−４が、脂質豊富かつマクロファージ浸潤マウス大動脈およびヒト冠状アテローム性硬化プラークにおいて優先的発現を示すことを見出した。以下に記載される、本発明者らのインビトロ研究は、酸化ＬＤＬ（「ｏｘ−ＬＤＬ」）によって上方制御された、マクロファージによるＴＬＲ−４の基礎発現を示した。いかなる理論に拘束されることも希望しないが、これらの知見は、アテローム性動脈硬化症における脂質媒介炎症促進シグナル伝達におけるＴＬＲ−４の潜在的な役割を示唆する。さらに、ＴＬＲ−４は、ｃＬＰＳおよびｃＨＳＰ−６０のようなｃｈｌａｍｙｄｉａ抗原、エンドトキシン、およびＴＬＲ−４レセプターと作動可能に相互作用するよう分子的に構成されているその他のリガンドを認識するレセプターであるので、慢性感染、炎症、およびアテローム性動脈硬化症間の分子的リンクを提供し得る。
【００４８】
この炎症促進シグナル伝達レセプターＴＬＲ−４は、マウスおよびヒトの脂質豊富なマクロファージ浸潤アテローム性動脈硬化症損傷中で発現される。さらに、培養マクロファージ中のＴＬＲ−４ｍＲＮＡは、ｏｘ−ＬＤＬによって上方調節されるが、ネイティブなＬＤＬ（「Ｎ−ＬＤＬ」）ではされない。ともに、これらの知見は、増加したＴＬＲ−４発現が、アテローム性動脈硬化症中の炎症において役割を演じ得ることを示唆している。
【００４９】
マクロファージのような、生来の免疫系の細胞は、パターン認識レセプターにより、微生物起源の共通および保存された構造成分を認識する能力を有している。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｌａ  ＴｏｌｌのヒトホモログであるＴＬＲ−４は、ＮＦ−κＢを活性化し、そして微生物病原体に応答して種々の炎症性遺伝子を上方制御するパターン認識レセプターである。Ｔｏｌｌ様レセプターは、生来の免疫応答および病原体認識の活性化において基礎的役割を演じている。さらに、ＮＦ−κＢの活性化は、アテローム性動脈硬化症に重要な細胞の炎症応答および増殖応答に関与する種々の遺伝子の調節に必須である。ＮＦ−κＢおよびＮＦ−κＢの両方により調節される遺伝子はともに、アテローム性硬化損傷において発現される。ＮＦ−κＢ活性化は、アテローム性血栓症に関与する多くの炎症促進遺伝子の転写に至るので、それは、感染性因子およびＬＰＳおよび／またはＨＳＰ−６０のようなｃｌａｍｙｄｉａｌ抗原が、ｏｘ−ＬＤＬにより上方調節されているＴＬＲ−４レセプターを通じるシグナル伝達により、増加した、かつ慢性の炎症に寄与するということであり得る。
【００５０】
本発明者らの、ｏｘ−ＬＤＬによって誘導されるＴＬＲ−４の増加した発現の知見は、実験モデルで観察されたアテローム性動脈硬化症の加速、およびヒトの疫学的観察における、高コレステロール血症および感染の相乗効果のための潜在的な機構を示唆している。これは、脂質、感染／炎症およびアテローム性動脈硬化症間のリンクへの新たな見識を提供する。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
（マウス組織の調製）
５匹のアポリポタンパク質Ｅ欠損（「ＡｐｏＥ−／−」）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、５週齡、１８〜２０グラム；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥから得た）を、４２％（ｗｔ／ｗｔ）脂肪および０．１５％コレステロールを含む、高脂肪、高コレステロール（すなわち、粥腫発生）餌を、６週齡から実験の持続期間を通じて与えた。ＥＴＨＲＡＮＥ（Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬから入手可能）で麻酔した後、マウスを２６週齡で屠殺し、そしてそれらの心臓および基部大動脈（上行大動脈、大動脈弓および下行大動脈の一部を含む）を切除し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）中で洗浄し、血液を除去した。心臓の基礎部分および基部大動脈を、ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ  ＶＩＰ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ、Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡから入手可能）を用いてＯＣＴ化合物中に包埋し、ドライアイス上で凍結し、そして次に、切片にするまで−７０℃で貯蔵した。連続する１０μｍ厚さの凍結切片（心室の下部分から大動脈弁の出現までの５番目毎の切片、大動脈洞の領域中のあらゆる他の切片、および大動脈弁の消失から大動脈弓までの５番目毎の切片）を、ポリ−Ｄ−リジン被覆されたスライド（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）上に収集した。アテローム性損傷、動脈壁カルシウム沈着、および軟骨性化生の識別のために、切片を、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏおよびヘマトキシリンで染色し、そしてＦａｓｔ  Ｇｒｅｅｎで対比染色した（すべて、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、「Ｓｉｇｍａ」から入手可能）。カルシウム沈着物の存在は、代表的な切片を用い、アリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａから入手可能）およびｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ技法により確認した。
【００５２】
（実施例２）
（ヒト組織およびヒト単球由来マクロファージの調製）
９例の検死解剖事例からのヒト冠状動脈標本を、死亡の２４時間以内に収集し、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａから入手可能）で一晩固定し、そしてパラフィンに包埋した。９つの冠状動脈標本のうちの５つに、繊維状キャップによって被覆され良好に規定された脂質コアを含む脂質豊富なプラークが含まれ、そして９つの標本のうちのその他の４つには、繊維状プラークが含まれ、これは、脂質コアなしの最も細胞外のマトリックスを含んだ。正常な哺乳動物動脈標本をまた、４つのさらなる検死解剖事例から得た。５μｍ厚さの切片を、切断し、そしてヘマトキシリン−エオシンおよび免疫組織化学的染色の両方のためにスライド上に付与した。末梢血単球を、正常ヒト被験体の全血から、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ密度勾配遠心分離（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能）で単離した。単球由来のマクロファージを、１０％ウシ胎仔血清（「ＦＣＳ」）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含む、ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａから入手可能）中で５日間培養し、そして次にＦＣＳなしであるが、０．１％低エンドトキシンウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）（Ｓｉｇｍａから得た）を含む培養培地中で飢餓状態にした。
【００５３】
（実施例３）
（免疫組織化学）
ＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈根の凍結切片を、アセトンで５分間室温で固定し、そして次に、ＤＡＫＯ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、「ＤＡＫＯ」）から入手可能な免疫染色キット上の指示書に従い、ウサギ抗ｈＴＬＲ−４免疫血清（１：１００；Ｒｕｓｌａｎ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ、Ａｓｓｔ．Ｐｒｏｆ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴから得た）で免疫染色した。ラット抗マウスｍａｃｒｏｓ  Ａｂ（１：５００、Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｕ．Ｋ．から入手可能）を、マクロファージマーカーとして用いた。発色は、ＤＡＫＯ  ＡＥＳ基質システムを用いて行った。平滑筋細胞は、アルカリホスファターゼを結合したマウス抗−アクチンＡｂ（１：５０、Ｓｉｇｍａから入手可能）によって染色した。発色は、ＶＥＣＴＯＲ  Ｒｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  Ｉ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡから得た）を用いて行った。ウサギＩｇＧまたはウサギ血清をネガティブコントロールとして用いた。
【００５４】
ヒトアテローム硬化プラークについては、段階的アルコール中で脱パラフィンした後、切片を、ＴＬＲ−４およびＴＬＲ−２の細胞外ペプチドドメインに対して惹起されたウサギ抗ヒトＴＬＲ−４およびＴＬＲ−２抗血清（１：１００）（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡから入手可能）を用いて免疫染色した。免疫ペルオキシダーゼ染色の後、代表的視野を、写真撮影した。細胞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解し、そして１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」）で分離した。次いで、タンパク質をポリビニリデンジフルオライドメンブレン上に移し、そしてこのメンブレンを、抗ＴＬＲ−２、抗ＴＬＲ−４抗体でプロープし、そして各抗体（１：２，０００）に対応して洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡから入手可能）とのインキュベーションの後、このメンブレンを、増強化学発光ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  Ｌｔｄ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄから入手可能）で発色した。抗ＴＬＲ−４血清の、ＴＬＲ−４ペプチド（Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ）とプレインキュベーションを、この系統の特異性を示すために用い、そして一次抗体に代わるウサギＩｇＧまたはウサギ血清を、ネガティプコントロールとして用いた。
【００５５】
（実施例４）
（二重免疫組織化学）
ヒトアテローム硬化性プラークの二重免疫染色を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯから入手可能）を用いて実施した。ＴＬＲ−４免疫染色の後、３，３’−ジアミノベンザジン（Ｓｉｇｍａから得た）を、ペルオキシダーゼ色原体基質として用いた。マクロファージについてマウスモノクローナル抗ヒトＣＤ６８抗体（３６０μｇ／ｍｌ、１：２０希釈；ＤＡＫＯから入手可能）、および平滑筋細胞についてマウスモノクローナル抗−ヒトα−アクチン抗体（１００μｇ／ｍｌ、１：１００希釈；ＤＡＫＯから入手可能）を、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａから入手可能）とともに、アルカリホスファターゼ色原体基質として用いた。
【００５６】
（実施例５）
（リポタンパク質の調製および改変）
ヒトＮ−ＬＤＬ（Ｓｉｇｍａから得た）を、１０，０００分子量カットオフＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＺＥＲ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから得た）を用いることにより、等張のリン酸生理食塩水緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し、エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）を除去した。Ｏｘ−ＬＤＬを、０．１ｍｇのＬＤＬタンパク質／ｍｌを５μＭの硫酸銅（ＣｕＳＯ４）と３７℃で２４時間インキュベートし、そしてブチル化ヒドロキシトルエン（２，６−ジ−ｔ−ブチル−ｐ−クレゾール）（Ｓｉｇｍａから入手可能）を添加することにより停止し、最終濃度０．１ｍＭにすることにより調製した。Ｏｘ−ＬＤＬを、ＣｕＳＯ４から分離し、そしてＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）上、細胞培養培地中に平衡化した。すべての試薬は、エンドトキシンフリーであった。ＬＤＬ調製物中のＬＰＳレベルは、発色Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイで確認し、そして０．３ｐｇＬＰＳ／μｇＬＤＬタンパク質より少なく含有していた。
【００５７】
リポタンパク質調製物の酸化の程度は、チオバルビツール酸反応基質（「ＴＢＡＲＳ」）アッセイにより決定した。濃縮したトリクロロ酢酸を、１．５ｍｇのタンパク質を含むリポタンパク質サンプルのアリコートに添加し、最終濃度５％にした。等容量の１％チオバルビツール酸を、次いで添加し、そしてこの混合物を、１００℃の水浴中２０分間加熱した。この溶液を清澄にするために遠心分離した後、緩衝液ブランクに対し５８２ｎｍのピーク吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＢ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡから入手可能）上で読み取った。チオバルビツール酸反応性基質の量を、標準としてマロンアルデヒドビス（ジメチルアセタール）（Ｓｉｇｍａから入手可能）を用い、標準曲線から算出した。このｏｘ−ＬＤＬは、２０〜２５ｎＭ  ＴＢＡＲＳ／ｍｇコレステロールを有していた。
【００５８】
（実施例６）
（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））
総ＲＮＡを、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ６０単離試薬（Ｔｅｌ−ｔｅｓｔ「Ｂ」、Ｉｎｃ．、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸから得た）を、製造業者の指示書に従って用い、休止している、Ｎ−ＬＤＬ、ｏｘ−ＬＤＬ刺激されたヒト単球由来マクロファージ細胞から単離し、そしてＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅＩで処理した。ＲＴ反応には、ＳＵＰＥＲＣＲＩＰＴ  ＭＭＬＶ予備増幅システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから得た）を適用した。ＰＣＲ増幅は、ＴＡＱ  ＧＯＬＤポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから得た）を用い、９５℃４５秒、５４℃４５秒、および７２℃６０秒の３２サイクルで実施した（ＴＬＲ−２およびＴＬＲ−４について）。ＴＬＲ−２のＲＴ−ＰＣＲのために用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、［ｇｃｃａａａｇｔｃｔ  ｔｇａｔｔｇａｔｔｇ  ｇ］および［ｔｔｇａａｇｔｔｃｔ  ｃｃａｇｃｔｃｔｇ］、そしてＴＬＲ−４には、［ｔｇｇａｔａｃｇｔｔ  ｔｃｃｔｔａｔａａｇ］および［ｇａａａｔｇｇａｇｇ  ｃａｃｃｃｃｔｔｃ］であった。グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（「ＧＡＰＤＨ」）プライマーは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から得た。
【００５９】
ＴＬＲ−２およびＲＴ−４  ＲＴ−ＰＣＲフラグメントを、精製し、そして配列決定してフラグメントの同一性を確認した。リアルタイム定量ＰＣＲを、ｉＣｙｃｌｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡから得た）上で、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから得た）および上記のＴＬＲプライマーを用いて実施した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を、細胞を１５ｄ−ＰＧＪ２（２０μＭ）、プロテアソームインヒビターＩ（１００μＭ）（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯから入手可能）、またはシクロヘキシミド（１０μｍ／ｍｌ）で１時間前処理して繰り返した。内皮細胞を、ＬＰＳ刺激（５０ｎｇ／ｍｌ）前に３回、ＮＦ−κＢ  ｐ６５アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチド（３０μＭ）で２４〜４８時間前処理した。デンシトメトリー分析には、バンドの強度は、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹから得た）により測定し、そしてＧＡＰＤＨ強度で補正した。
【００６０】
（実施例７）
（ＴＬＲ−４は、ＡｐｏＥ−／−マウスのアテローム硬化性損傷中で発現される）
図１に示されるように、５匹のすべてのＡｐｏＥ−／−マウスは、大動脈根のアテーム硬化性損傷におけるＴＬＲ−４免疫反応性を示し、これは、マクロファージ免疫反応性と同時局在化していた。ＴＬＲ−４染色は、コントロールＣ５６ＢＬ／６Ｊマウスから得た正常脈管中にはなかった（図１ｅ）。マウスＩｇＧ染色は、ネガティブであり、そして特異的ペプチド（これに対して抗ＴＬＲ−４抗血清が生成された）との組織切片のプレインキュベーションは、ＡｐｏＥ−／−脈管におけるＴＬＲ−４染色を完全にブロックし、ＴＬＲ−４免疫染色の特異的性質を示した。正常またはアテーム硬化性損傷中では、ＴＬＲ−２免疫反応性は観察されなかった（示さず）。
【００６１】
（実施例８）
（ＴＬＲ−４は、ヒト冠状プラーク中で発現される）
ヒト冠状アテーム硬化性プラークは、繊維状キャップにより被覆される良好に規定された脂質コアを含む脂質豊富なプラークに分類され（ｎ＝５）、そして繊維状プラークは、大部分が脂質コアの無い細胞外マトリックス含んでいた（ｎ＝４）。図２に示されるように、強いＴＬＲ−４発現（褐色染色）が、脂質豊富なプラークの肩で脂質コアの周りに観察され、そこでは、それは、マクロファージ免疫反応性と同時局在化していた。一次抗体を生成するために用いたペプチドとの抗血清のインキュベーションは、ＴＬＲ−４免疫反応性をブロックし、抗ＴＬＲ−４抗血清の特異性を確認した。二重染色は、ＴＬＲ−４発現のマクロファージ免疫反応性との緊密な空間的同時局在化を示した。繊維状プラークには、ＴＬＲ−４免疫反応性もマクロファージ免疫反応性もなく、これは、強い平滑筋α−アクチン免疫反応性を示した。正常な哺乳動物動脈は、ほんの最小限のＴＬＲ−４発現を示したか、またはＴＬＲ−４発現は示さなかった。ＴＬＲ−２免疫反応性は、すべてのプラークになく、その一方、コントロール染色は、ＴＨＰ−１細胞でポジティブであった（示さず）。
【００６２】
（実施例９）
（Ｏｘ−ＬＤＬによるＴＬＲ−４ｍＲＮＡ調節）
培養ヒト単球由来マクロファージを、Ｎ−ＬＤＬまたはｏｘ−ＬＤＬで５時間刺激した。ＲＴ−ＰＣＲをＴＬＲ−２およびＴＬＲ−４について実施し、そして相対強度を、Ｆａｕｒｅら，２０１８〜２０２４で記載されるように、デンシトメトリーにより算出した。図３に示されるように、ＲＴ−ＰＣＲは、マクロファージによる基礎ＴＬＲ−２およびＴＬＲ−４のｍＲＮＡ発現を示した。このＴＬＲ−４  ｍＲＮＡは、ｏｘ−ＬＤＬによって、用量依存的様式で、かつ３倍まで上方調節され、その一方、Ｎ−ＬＤＬは影響をもたなかった。ＴＬＲ−２  ｍＲＮＡは、ｏｘ−ＬＤＬにより上方調節されなかった。
【００６３】
（実施例１０）
（薬物送達への脈管周囲または「裏返し（ｏｕｔｓｉｄｅ  ｉｎ）」アプローチ）
ＡｐｏＥ−／−マウス（２０週齢、６匹／群）を麻酔し、そして頸動脈を、首の側面中に小切開を作製することにより剥きだした。動脈のセクションを、ＴＹＧＯＮチューブ（３．０ｍｍ長さ、０．５ｍｍ内径；Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ、Ｗａｙｎｅ、ＮＪから得た）から作製されたカフに緩く収めた。ポリ乳酸とポリグルコール酸とのコポリマーである、生分解性の生体適合性ポリマー材料ＡＴＲＩＧＥＬ（Ａｔｒｉｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｔ．Ｃｏｉｉｎｓ、ＣＯから得た）を、ウイルス粒子の局所送達のために用いた。１×１０８ｐｆｕのｒＡｄ５（右頸動脈）またはｒＡｄ５なし（左頸動脈）のＰＢＳ中の１８％（ｗ／ｗ）ポリマーゲルを、カフと脈管との間に、シリンジおよび平滑末端カニューレを用いて付与した。この研究に用いたゲル化合物は、体温未満で自由に流動する液体であった。体温またはそれを超える水性環境に配置されるとき、粘度が増加し、そしてゲルは粘性の塊に固化する。一旦、インビボで動脈に付与されると、このポリマーは、接触直後にゲルになり、そしてこのゲルは，約１４〜２１日でゆっくりと吸収され、それによって、薬物デポーとしての可能な使用を提供する。
【００６４】
（実施例１１）
（ＭｙＤ８８発現の影響の試験のためのマウス組織の調製）
ＭｙＤ８８＋／＋、ＭｙＤ８８＋／−またはＭｙＤ８８−／−であった、ＡｐｏＥ−／−マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、５週齢、１８〜２０グラム；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥから得た）に、実験期間を通じて、６週齢から、４２％（ｗｔ／ｗｔ）脂肪および０．１５％コレステロールを含む高脂肪、高コレステロール（すなわち、粥腫発生）餌を与えた。ＥＴＨＲＡＮＥで麻酔した後、マウスを２６週齢で屠殺し、そしてそれらの心臓および基部大動脈（上行大動脈、大動脈弓および下行大動脈の一部を含む）を切除し、そしてＰＢＳで洗浄し血液を除去した。心臓の基礎部分および基部大動脈を、ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ  ＶＩＰを用いてＯＣＴ化合物中に包埋し、ドライアイス上で凍結し、そして次に切片にするまで−７０℃で保存した。
【００６５】
連続的な１０μｍ厚さの凍結切片（心室の下部分から大動脈弁の出現までの５番目毎の切片、大動脈洞の領域中のあらゆる他の切片、および大動脈弁の消失から大動脈弓までの５番目毎の切片）を、ポリ−Ｄ−リジン被覆されたスライド上に収集した。切片を、マクロファージ活性の同定のためにＭＯＭＡ−２で染色した。大動脈をスライスしてその長さに沿って開放し、そしてプラーク検出のために染色した。
【００６６】
（実施例１２）
（マウス組織中のアテローム硬化プラーク発症に対するＭｙＤ８８発現の影響）
図４に示されるように、アテローム硬化プラークは、ＭｙＤ８８＋／＋マウスで最も厚く（示さず）、そしてＭｙＤ８８−／−マウスで最も薄かった。ＭｙＤ８８＋／−マウス中のアテローム硬化プラークは、ＭｙＤ８８＋／＋マウス中で観察された厚さとＭｙＤ８８−／−マウス中で観察された厚さとの間の厚さを有していた。これは、アテローム性動脈硬化症とＭｙＤ８８発現レベルとの間の直接相関を示唆し；ＭｙＤ８８の発現を阻害することが、アテローム性動脈硬化症および／または哺乳動物におけるその他の形態の脈管疾患を最小にするか、またはなくするという提案に対する支持の役に立つ。
【００６７】
図５に示されるように、ＭｙＤ８８＋／＋マウスは、最大量の大動脈プラーク沈着物を示し、その一方、ＭｙＤ８８−／−マウスは、最小量の大動脈プラーク沈着物を示した。ＭｙＤ８８＋／−マウス中の大動脈プラーク沈着物は、ＭｙＤ８８＋／＋中で観察された容量とＭｙＤ８８−／−マウス中で観察された容量との間の容量のほぼ中ほどの量で存在していた。これは、同様に、ＭｙＤ８８発現とアテローム性動脈硬化症プラーク発生との間の直接相関を示唆し；ＭｙＤ８８の発現を阻害することが、アテローム性動脈硬化症および／または哺乳動物におけるその他の形態の脈管疾患を最小にするか、またはなくするという提案に対するさらなる支持の役に立つ。
【００６８】
上記の説明は、本発明の特定の実施形態について言及しているが、多くの改変が本発明の思想から逸脱することなくなされ得ることを理解すべきである。添付の特許請求の範囲は、このような改変を、本発明の真実の範囲および思想内に入るように含むことが意図される。現在開示されている実施形態は、従って、すべての局面で例示であって制限ではないと考えられ、本発明の範囲は、先行する説明よりもむしろ添付の特許請求の範囲により示され、そして特許請求の範囲の意味および等価な範囲内に入るすべての変更は、従って、その中に包囲されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
この特許のファイルは、少なくとも１つのカラーで描かれた図面を含む。カラーの図面（単数または複数）をもつこの特許のコピーは、必要な料金の要求および支払いに際し、特許商標庁により提供される。
【図１】図１はカラーである。図１ａは、アポリポタンパク質Ｅ欠損（「ＡｐｏＥ−／−」）マウスの大動脈洞中のアテローム性動脈硬化症プラークの脂質コア内のＴＬＲ−４免疫反応性（褐色）の病理組織写真である。図１ｂおよび１ｃは、同じ大動脈洞の連続セクション中の、それぞれ、マクロファージ免疫反応性（褐色）および平滑筋細胞（赤）免疫反応性の病理組織を示す。図１ｄは、ネガティブコントロールのためのウサギＩｇＧ染色を示す。図１ｅは、非アテローム性動脈硬化症マウス大動脈洞におけるＴＬＲ−４免疫反応性の欠如を示す。
【図２】図２はカラーであり、そしてヒトアテローム性動脈硬化症脂質リッチなプラークにおけるＴＬＲ−４発現、および繊維状プラークにおけるこのような発現の欠如を示す一連の写真である。図２ａは、抗ヒトＴＬＲ−４抗血清で褐色に染色されたアテローム性動脈硬化症プラークを示す。図２ｂは、一次抗体がウサギＩｇＧにより置換されたネガティブコントロールを示す。図２ｃは、ＴＬＲ−４免疫反応性を示す（褐色）。図２ｄは、ＴＬＲ−４（褐色）とマクロファージ（赤）の同時局在化を示す、二重免疫染色を示す。図２ｅは、より高い倍率下のマクロファージ免疫染色（赤）を示す。図２ｆは、より高い倍率下のＴＬＲ−４免疫染色（褐色）を示す。図２ｇは、より高い倍率下のマクロファージ（赤）免疫反応性をＴＬＲ−４（褐色）免疫反応性とともに示す。図２ｈは、繊維状ブプラークにおけるＴＬＲ−４の免疫反応性の欠如を示す。図２ｉは、二重染色に際し、ＴＬＲ−４免疫反応性（褐色）なしの平滑筋細胞αアクチン免疫反応性（赤）を示す。図２ｊは、繊維状プラークにおけるマクロファージの免疫反応性の欠如を示す。図２ｋは、ペプチドとの抗血清の予備吸収を用いるネガティブコントロールを示す。図２ｌは、内皮境界に沿ったＴＬＲ−４の最小の免疫反応性のみをともなう正常哺乳動物動脈を示す。
【図３】図３はカラーではなく、そして逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）により分析されたとき、ＴＬＲ−４発現の示された投薬レベルでの、ネイティブまたは酸化ＬＤＬで５時間刺激された培養ヒト単球由来マクロファージ中でのＧＡＰＤＨ発現に対する、各バンドの相対強度を示す。
【図４】図４はカラーであり、そしてＭｙＤ８８欠損であるＡｐｏＥ−／−マウス（図４ａ：「ＭｙＤ８８−／−」）、およびＭｙＤ８８を部分的に発現するＡｐｏＥ−／−マウス（図４ｂ：「ＭｙＤ８８＋／−」）のＡｐｏＥ−／−マウスの心臓のＭＯＭＯ−２染色された切片の比較分析を示す。マウスは、すべて高コレステロール餌を供給され、そして６ヶ月で屠殺された。アテローム硬化プラークは、ＭｙＤ８８−／−マウスで最も厚かった。ＭｙＤ８８＋／−マウス中のアテローム硬化プラークは、ＭｙＤ８８−／−マウス中で観察された厚さより大きな厚さを有していた。
【図５】図５はカラーであり、そしてＭｙＤ８８−／−であるＡｐｏＥ−／−マウス（雌：図５ａ；雄：図５ｄ）；ＭｙＤ８８＋／−であるＡｐｏＥ−／−マウス（雌：図５ｂ；雄：図５ｅ）；またはＭｙＤ８８を発現するＡｐｏＥ−／−マウス（雌：図５ｃ；雄：図５ｆ「ＭｙＤ＋／＋」）から採取された大動脈プラーク沈着物の比較分析を示す。マウスは、すべて高コレステロール餌を供給され、そして６ヶ月で屠殺された。雄および雌の両方のＭｙＤ８８＋／＋マウスは、最大量の大動脈プラーク沈着物を示し、その一方、雄および雌の両方のＭｙＤ８８−／−マウスは、最小量の大動脈プラーク沈着物を示した。雄および雌の両方のＭｙＤ８８＋／−マウス中の大動脈プラーク沈着物は、ＭｙＤ８８＋／＋およびＭｙＤ８８−／−マウス中で観察された容量の間の約半分の量で存在していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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