(57)【要約】  デフィブロチドの生物学的活性を決定するための酵素による方法が記載される。上記方法は、プラスミンの酵素活性を高めるデフィブロチドの能力に基づき、ａ）デフィブロチド、プラスミンおよび、プラスミンとの反応によって測定可能な生成物を提供するところの、該プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、およびｂ）生成した生成物の量を継時的に測定する工程を含む。
2005512547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ）デフィブロチド、プラスミンおよび、プラスミンとの反応によって測定可能な生成物を提供するところの、該プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、および
ｂ）生成した生成物の量を継時的に測定する工程
を含む、デフィブロチドの生物学的活性を決定する方法。
【請求項２】
プラスミンが哺乳類プラスミン、好ましくはヒトプラスミンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プラスミンに特異的な基質が下記式の化合物：
【化１】
2005512547.tif 000004
［式中、Ａ1およびＡ2は非極性アミノ酸であり、Ａ3はリシンまたはアルギニンであり、Ｘは測定可能な生成物である。］である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
測定可能な生成物Ｘがパラ−ニトロアニリンおよび２−ナフチルアミンから選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
プラスミンのための基質がＨ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシン−ｐ−ニトロアニリンである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
プラスミンが０．００６４〜０．０５０Ｉ．Ｕ．／ｍｌの濃度を有し、プラスミンのための基質が２．５〜３．５ｍＭの濃度を有する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
プラスミンの濃度が０．０１２５Ｉ．Ｕ．／ｍｌであり、プラスミンのための基質の濃度が３ｍＭである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
測定可能な生成物Ｘが分光測光法によって測定される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
反応媒体が、７〜８のｐＨ、好ましくはｐＨ７．４に緩衝された水性溶液である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
系の温度が３５〜３９℃、好ましくは３７℃で維持される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
下記段階：
ａ）標品および試験用の両方のデフィブロチドのサンプルの各々に関して、酵素反応の間の測定可能な生成物Ｘの放出速度を決定する段階、
ｂ）上記放出速度を、対応するデフィブロチド濃度と、数学的におよび／またはグラフを用いて相関させる段階、および
ｃ）デフィブロチドの試験サンプルの生物学的活性を得る段階
を含む、請求項１に記載のデフィブロチドの生物学的活性を決定する方法。
【請求項１２】
ａ）測定された量の、プラスミンのための基質、および
ｂ）測定された量のプラスミン
を少なくとも含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載のデフィブロチドの生物学的活性を決定するためのキット。
【請求項１３】
プラスミンのための基質がＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡであり、プラスミンがヒトプラスミンである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
プラスミンに特異的な基質をプラスミン１単位当たり２０〜３０ｍｇ、好ましくは２５ｍｇ含む、請求項１２記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デフィブロチド（defibrotide）の生物学的活性を決定する方法に関し、特に、デフィブロチドの生物学的活性を決定するための間接的酵素法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デフィブロチド（メルクインデックス、１９９６、ｎｏ．２９１５）は、動物器官からの抽出によって得られ、かつ低分子量を有するポリデオキシリボヌクレオチドのナトリウム塩によって構成されるところの天然源の物質である。デフィブロチドは、多くの薬理学研究の主題になっており、治療において抗トロンビン剤として使用されることが示唆されている（米国特許第３，８２９，５６７号）。
【０００３】
さらに、デフィブロチドは、末梢動脈疾患、急性腎不全（米国特許第４，６９４，１３４号）または急性心筋虚血（米国特許第４，６９３，９９５号）の治療においても良好に使用されている。
【０００４】
抽出によって得られる他の生物学的物質と同様に、デフィブロチドも、天然の生物重合体の典型であるところの、組成の限られた変化を受けやすい。この状況にある古典的例は、鎖長、分子量、組成、硫酸化度などに関してバッチごとに変化することが周知であるところのヘパリンによって提供される。この結果、同じ量（重量）のデフィブロチドが、特異的生物学的活性の点からは実際は等価でない可能性がある。
【０００５】
抽出、単離および精製の方法自体は、生成物の完全な再現性を保証することができない。これは、厳密には、生成物の固有の生物重合体状性質故である。しかし、十分制御されるならば、この変化を低下させることが可能である。その目的のために、例えば米国特許第４，９８５、５５２号に記載されているような、器官からの抽出によってデフィブロチドを単離するための標準的な工業的方法が研究されている。
【０００６】
上記方法に従って得られる生成物は、いくつかの特異的な物理化学的パラメーター、例えば電気泳動度、消衰係数、旋光度および可逆的濃色化性などの測定によって解析される。しかし、それらのパラメーターは基本的にデフィブロチドの構造に依存し、その生物学的活性に関する情報を提供することができない。
【０００７】
本発明者らが知る限り、デフィブロチドの生物学的活性を評価するために今まで使用されることが報告されている唯一の方法は、フィブリンプレート試験および真性グロブリン溶菌時間のトロンボエラストグラフレコーディングである（Prino G., Mantovani M., Niada R., Coccheri S., Butti A., Indagini preliminari sullattivita fibrinolitica, nellanimale e nelluomo, di una nuova sostanza presente in diversi organi animali, Simposio Internazionale: La ricerca scientifica nellindustria farmaceutica in Italia, Rome, 2-4 October 1975  II Farmaco, Ed. Prat. (1969), 24, 552-561）。
【０００８】
しかし、上記方法は、相当の実験の複雑さ、不十分な再現性および精度、ならびにトロンボエラストグラフレコーディングの特定の場合における非常に限られた濃度範囲に限定される応答直線性によって特徴付けられる。
【０００９】
従って、今まで、デフィブロチドの生物学的活性を決定するための真に有効で厳密かつ再現性のある方法は知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、デフィブロチドの生物学的活性を決定するための簡単かつ信頼できる方法を開発した。該方法は、抽出によって得られるサンプルを制御することができ、従って、デフィブロチドに基づく医薬調製物を標準化することができる。
【００１１】
本発明が関するところの方法は、デフィブロチドの特異的生物学的活性を、高い精度、速度および再現性を伴って、参照基準と比較して決定することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明は、デフィブロチドのサンプルの特異的生物学的活性を決定するための方法に関し、該方法は、下記工程：
ａ）デフィブロチド、プラスミンおよび、プラスミンとの反応によって測定可能な生成物を提供するところの、該プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、および
ｂ）生成した生成物の量を継時的に測定する工程
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法は、デフィブロチドの活性を決定するための間接的インビトロ（in vitro）法であり、これは、デフィブロチドとプラスミンとの間の機能的相互作用に基づく。
【００１４】
プラスミンが、フィブリン、フィブリノゲンおよび他の血漿タンパク質を開裂することができる、凝固／フィブリン溶解のカスケードにおけるタンパク分解酵素であることは文献から公知である。
【００１５】
プラスミンの酵素活性は、種々の標準的なインビトロ（in vitro）試験によって通常決定される。最も一般的に使用される方法の１つは、適する基質に関するプラスミンの作用によって遊離される色素産生または蛍光産生化合物の分光測光または蛍光測定による決定である（Haemostasis, (1978), 7, 138-145）。式Ａ1−Ａ2−Ａ3−Ｘを有するペプチド基質が一般に使用され、ここでＡ1およびＡ2は主として非極生であるアミノ酸であり、Ａ3はリシンまたはアルギニンであり、Ｘは測定可能な遊離化合物、例えばパラニトロアニリン（ｐＮａ）または２−ナフチルアミン（ＮＡ）を表す（Haemostasis, (1978), 7, 146-149）。上記のペプチド基質に加えて、他のより簡単な化合物、例えばｐ−ニトロベンジル−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンの使用によって成功している（Haemostasis, (1978), 7, 105-108）。
【００１６】
それらの試験では、化合物Ｘがインキュベーション媒体中に放出されるときの速度が、サンプル中に存在するプラスミンの活性（国際単位）に比例する。
【００１７】
上記したプラスミン評価試験において、デフィブロチドは、その濃度に比例して化合物Ｘの放出速度を増加させることが今発見され、そしてこれが、本発明が基づくところの原理である。本発明が関するところの方法は、先ず最初に、デフィブロチドのサンプル、プラスミンおよびプラスミンのための基質を互いに接触させる用意をする。
【００１８】
本発明に従う決定のために使用されるデフィブロチドサンプルは一般に、例えば既に言及された米国特許第４，９８５，５５２号に記載されているように、公知手法に従って器官から抽出することによって調製される。
【００１９】
通常の工業的に製造されたデフィブロチドのバッチが参照サンプル（標品）として選択され、本発明の方法に従って較正曲線を作るために使用された。
【００２０】
一般に、本発明方法は、汚染物質、例えばＲＮＡ、ヘパリン、分解されたデフィブロチド（プリンまたはピリミジンが除去されたデフィブロチド）またはエタノールが、一般には１０重量％未満の、系を損なわないような濃度であるならば、その存在下ですら、デフィブロチドの厳密かつ正確な測定値を提供する。
【００２１】
デフィブロチドの上記決定を可能にすることに加えて、本発明方法は、デフィブロチドから誘導される他の生物学的に等価な物質、例えば、脱アミン化されたデフィブロチドまたは、より簡単には、加熱によって変性されたデフィブロチド、の決定をも可能にする。
【００２２】
本発明方法は、０．１μｇ／ｍｌ以下のデフィブロチドの濃度（決定系における最終濃度）を検出するために十分感受性であり、一般に、１００μｇ／ｍｌ以上の最大濃度値まで良好な相関関係を表す。
【００２３】
使用されるプラスミンは、一般に、任意の哺乳類プラスミン、例えばウシ、ブタまたはヒトのプラスミンであり、ヒトプラスミンが好ましい。しかし、プラスミンは選択された酵素であり、他の等価な酵素系、例えばプラスミンの前駆体、例えばプラスミノーゲン、または化学的に関連しかつ類似の機能を有するプラスミン類似酵素、の使用は本発明の範囲内である。
【００２４】
本発明の方法では、プラスミンのための基質は、該方法の条件下で検出可能な加水分解生成物Ｘを遊離するところの、プラスミンに特異的な任意の基質であると理解され得る。検出可能な基Ｘの性質に依存して、当業者に公知の代替検出系が同様に採用され得る。分光測光または蛍光測定検出系が特に有利であり、特に分光測光系が有利である。
【００２５】
一般に使用される基質は、プラスミンに特異的な基質である。式Ａ1−Ａ2−Ａ3−Ｘのペプチドを使用することが好ましい。ここで、Ａ1およびＡ2は主として非極性のアミノ酸であり、Ａ3はリシンまたはアルギニンであり、Ｘは検出可能な基である。そのような基質の例は、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮａ、Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮａまたはピロＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮａであり、分光測光法によって検出可能な基Ｘはパラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）である。他の適する基質、例えばＶａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−２ＮＡ、は２−ナフチルアミンを含み、これは蛍光測定によって測定可能である。特に好ましい基質は、化合物Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシン−ｐ−ニトロアニリン（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ）である。
【００２６】
デフィブロチドの上記決定に使用されるプラスミンおよび特異的基質は一般に市販されている。
【００２７】
本発明の決定法は、試薬およびデフィブロチドサンプルを、特定のｐＨおよびモル濃度で水性溶液中に入れることによって行われる。特に、プラスミンの濃度は、０．００１６〜０．２０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、好ましくは０．００６４〜０．０５０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、さらにより好ましくは約０．０１２５Ｉ．Ｕ．／ｍｌであり得る。しかし、プラスミンの基質に関しては、色素産生性基質の場合、０．３〜４ｍＭ、好ましくは２．５〜３．５ｍＭ、有利には３ｍＭの濃度が一般に使用され、一方、蛍光産生性基質の場合、０．０５〜０．１５ｍＭの濃度が使用される。
【００２８】
本発明の決定法は、他の酵素的方法と同様に、媒体のｐＨに対して感受性である。事実、酵素系が不活性化されるであろうところの極端なｐＨでは一般に適用され得ない。また、測定が行われている間の任意の時に媒体のｐＨが変動を受けないことが好ましく、従って、溶液は一般に、プラスミン測定試験において一般に使用されるものから選択される緩衝剤系によって処理される。適する緩衝剤系は、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミンメタン塩酸塩（ＴＲＩＳ）緩衝液であり得る。操作は好ましくは、ＴＲＩＳの存在下で行われる。本発明方法では、媒体のｐＨを約７〜８の範囲、より好ましくは約７．４で維持することが通常好ましい。さらに、緩衝剤系の濃度を１０〜２００ｍＭの範囲、好ましくは約５０ｍＭで維持することが好ましい。
【００２９】
デフィブロチドの上記決定のための本発明の方法は、プラスミン、プラスミンのための基質およびデフィブロチドが混合されることを提供する。特に、本発明方法によって提供される測定を正確に行うことを可能にするために、測定段階の開始前に、プラスミンまたは特異的基質、またはその両方を、デフィブロチドサンプルを含む緩衝された溶液に添加することが好ましい。プラスミンのための基質は好ましくは最後に添加される。
【００３０】
本発明の決定法における重要なパラメーターは温度である。測定の全時間にわたっておよび決定されるサンプルの全てに関して、同じ温度が維持されることが好ましく、これは、共に参照曲線の構築および測定段階中に関する。そのために、温度制御される装置を使用することが好ましく、また、必要ならば、系が最大限の熱均一性を有することを確実にするために、サンプルの位置を適切に変えながら数組の測定を続けることも可能である。一般に、この測定法は、例えば２５〜４０℃、好ましくは３５〜３９℃、さらにより好ましくは３７℃の温度範囲において適用される。
【００３１】
本発明によれば、試薬の全てが添加されたときに、プラスミンの作用によって媒体中に遊離される化合物Ｘの濃度の測定が開始し、そして、所定の時間および所定の回数で、Ｘの化学的性質および検出系の関数として続く。
【００３２】
他の生物学的決定法と同様に、本発明の方法も較正段階および測定段階を提供し、これらは、実験上の変数の発生をできるだけ少なくするために好ましくは並行して行われる。
【００３３】
較正段階は、既知の増加する濃度のデフィブロチドのサンプル（標品）に関する吸光度データの取得、それらのデータの統計的再処理および、本発明の酵素反応の速度における増加と媒体中に存在するデフィブロチドの濃度との間の相関関係を表す較正曲線の外挿を含む。測定段階では、較正段階で得られた相関関係に基づき、同じ条件下で測定され処理された吸光度値に基づいてデフィブロチドのサンプルの未知の生物学的活性を決定することができる。
【００３４】
より詳細には、実験プロトコルは一般に、デフィブロチドの種々の既知濃度でのいくつかのサンプル（標品および未知の両方）の調製を提供する。デフィブロチドサンプルは、母液を所定の希釈度に従って漸進的に希釈することにより調製される。本発明方法では、少なくとも５つの濃度の標品および５つの濃度の試験されるべきサンプルを、標品の各濃度に関して５個、またはより好ましくは１０個調製し、試験サンプルの各濃度、一般的には母液の連続する１：２希釈度、に関しても同様に調製することが好ましい。
【００３５】
デフィブロチドの標品および試験サンプルの濃度は共に、一般に０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．３〜５０μｇ／ｍｌ、より有利には０．５〜８μｇ／ｍｌである。試験サンプルの濃度は好ましくは、標品の濃度と同じオーダーの大きさである。
【００３６】
上記説明によれば、各濃度に関する測定は好ましくは、２つのマイクロプレート上で行われ、ここで、対応する濃度の各サンプル（標品および試験サンプル）の位置は好ましくは一方のプレートと他方のプレートとで逆にされる。サンプルの配置のこの計画（実験の部でより詳細に説明する）によれば、標品および試験サンプルの両方のデフィブロチドの各濃度に関して、少なくとも５または好ましくは１０の吸光度値が各時間に測定される。
【００３７】
上記測定の組が所定の時間に行われる。すなわち、最初に時間ｔ0、すなわち成分の全てが添加され本発明の酵素反応が開始する前に行われ、続いて厳密な間隔でかつ必要なデータを得るために十分な時間の間に行われる。好ましくは、吸光度の測定は最大９０分まで続けられ、１〜１０分ごとに読み取りが行われる。より有利には、読み取りが時間ｔ0で行われ、続いて２０分後〜５０分後に５分ごとに行われる。測光による吸光度の読み取りは、酵素的加水分解反応の間に遊離される検出可能な基Ｘの性質に依存する波長で行われる。Ｘがｐ−ＮＡである特定の場合には、吸光度が４０５ｎｍで測定される。
【００３８】
生データとして知られる標品および未知のデフィブロチドサンプルの吸光度の読み取りは一般に、読み取り操作を提供する同じ装置から直接生じる。データは、吸光度が各時間およびウェルに関して表されるようなやり方で表にされる。次いで、生データは、例えばSpread Sheet-Microsoft Excelを使用して処理される。この最初の処理操作は、各時間でのおよび各組の読み取りに関して、平均吸光度および付随する標準偏差の計算を導く。各組は、標品および試験サンプルの両方のデフィブロチドの各濃度に関して少なくとも５および好ましくは１０の実験を含む。
【００３９】
データの更なる統計処理が、Sigma Plot Computer Program型（SPSS、米国シカゴ）のプログラムを用いて行われる。これは、デフィブロチド濃度の各組に関して、サンプルの吸光度値と時間との間に存在する数学的関係をみつけて直線を得るものであり、その傾きはデフィブロチドの濃度に比例する。より厳密には、上記プログラムは、応答直線性があるところの間、好ましくは２０分後〜５０分後、でかつ同じ濃度の５または好ましくは１０の実験の各々に関して、線形回帰係数「ｂ」、決定係数「ｒ2」および切片「ａ」によって特徴付けられる回帰直線を計算する。本発明の手法に従って得られる直線は一般に、ｒ2の高い値、一般には０．９７以上であり、好ましくはｒ2≧０．９９によって表される良好な相関関係を有する。
【００４０】
上記プログラムによって得られたデータは、各組の濃度に関して、表にされたデジタルデータとして再生され得、またはグラフで表され得る。
【００４１】
図１に示すように、横軸に時間を、縦軸に吸光度をとることにより直線が得られ、その傾き「ｂ」は、酵素反応の速度に比例する。デフィブロチドの濃度が増加すると、加水分解の速度および、比例して「ｂ」の値が増加する。最後に、標品デフィブロチドおよび試験サンプルデフィブロチドの各組の実験に関して上記したように計算される傾きの値は、それが関係するところのデフィブロチド濃度の常用対数と相関される。
【００４２】
グラフを用いると、その相関関係は、標品のためのＳ字状および試験サンプルのためのＳ字状を生じる（図２）。Ｓ字状の中心部分は２つの直線を有し、それらは一般に平行であり、その間の距離は、試験サンプルと標品との間の生物学的活性における相違の関数である。直線性であるこの間隔において、標品と比較された未知のデフィブロチドサンプルの活性が、Finney DJ, Statistical Medhod in Biological Assay, 第２版、Ch. Griffin, Londonに記載された平行線生物学的決定法にしたがって決定される。その方法は、本発明におけるように、生物学的応答が、決定されるべき物質の濃度の対数の直線関数であるとき、および標品に伴う直線と未知濃度に伴う直線との間に平行性および直線性があるときに適用され得る。
【００４３】
好ましくは、データの統計的処理、活性比の計算および従ってデフィブロチドの未知活性の決定が、上記方法に基づいて構築された専用のソフトウェアを使用して行われる。
【００４４】
しかし、一般的に化学分析においておよび特に本発明において誤差および実験上の変数を最小にすることを可能にする統計的データ処理は、本発明の方法を拘束するものではなく、当業者に周知でありかつ慣用であるところの、結果を評価する方法を単に表すものである。
【００４５】
本発明はまた、本発明の方法に従ってデフィブロチドの生物学的活性を決定するためのキットにも関し、該キットは少なくとも下記：
ａ）測定された量の上記で定義された、プラスミンのための基質、および
ｂ）測定された量のプラスミン
を含む。
【００４６】
好ましいキットは、プラスミン１単位につき２０〜３０ｍｇ、さらにより好ましくは２５ｍｇのプラスミン特異的基質を含む。
【００４７】
本発明によれば、プラスミンおよびヒトプラスミンに特異的な基質としてＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡを含むキットが特に有利である。
【００４８】
本発明に従うキットは、緩衝された水性溶液、好ましくはＴＲＩＳ−ＨＣｌ５０ｍＭ、ｐＨ７．４で緩衝された溶液をも含み得る。所望により、本発明のキットは、対照の測定を可能にするために、測定された量のデフィブロチド（標品）をも含む。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、標品溶液および決定されるべきデフィブロチドのサンプルの溶液がマイクロプレートの夫々のウェルに入れられる。プラスミン溶液は、使用時に調製され、デフィブロチドを含むウェルに分配され、最後にプラスミンのための基質を含む溶液が添加される。次いで、マイクロプレートがサーモスタット付きリーダーに置かれ、急速に撹拌された後、系の吸光度の読み取りが、所定の間隔でかつ所定の時間にわたって行われる。得られた生データは次いで処理され、こうして、デフィブロチドサンプルの未知の活性を決定する。
【００５０】
本発明の上記および他の局面を、以下の実施例においてさらに説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００５１】
下記材料が以下の実施例において使用された。
装置
９６ウェルを有するマイクロプレートのための検出器ＭＲＸ  ＴＣII（Dynex Technologies, Chantilly, 米国バージニア州）、サーモスタット付きで酵素反応動力学プログラム装備；
平らな底を有する９６ウェルを有するマイクロプレート（Greiner L., Kremunster, Austria, cat. 655101）；
連続的体積調節装置Pipetman P200（３０〜２００μｌ）および保証された品質の８ｘ２００（２０〜２００μｌ）および２００μｌ先端を有するピペット（Gilson, イタリア国ミラノ）；
ｐＨメーターＰＨＭ８５ Radiometer（Analitica De Mori, イタリア国ミラノ）；
【００５２】
プログラム
Microsoft Excel（登録商標）（Microsoft Corporation, 米国ワシントン州レドモント）；
Sigma Plot Computer Program（登録商標）（SPSS, 米国シカゴ）
【００５３】
物質
デフィブロチド（Gentium）；
ヒトプラスミン、１単位、Ｐ−４８９５（Sigma Aldrich, イタリア国ミラノ）；
色素産生性物質Ｓ−２２５１、８２０３３２−３９（Chormogenix Instrumentation Laboratory S.p.A., イタリア国ミラノ）；
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、２５５２８５−９（Sigma-Aldrich, イタリア国ミラノ）；
１Ｎ  ＨＣｌ  1090571000 (Merck)；
１Ｎ  ＮａＯＨ  1091411000 (Merck)；
【００５４】
溶液
ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液
２．４２ｇのＴＲＩＳを蒸留水に溶解し、希釈して１００ｍｌの体積にした。１６ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌをその溶液に添加し、次いでさらに蒸留水を添加して４００ｍｌの最終体積にした。この最後の溶液のｐＨは７．４０である。値が異なるならば、１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨの添加によって所望の値になるようにｐＨを調整する。
【００５５】
プラスミン溶液
１単位（１Ｉ．Ｕ．）のヒトプラスミンを０℃で４ｍｌのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液に溶解する。操作は常に氷中であり、次いで、その溶液を２００μｌのアリコートに分割し、これらを１０ｍｌのプラスチック試験管中に−２０℃で貯蔵した。
【００５６】
色素産生性物質Ｓ−２２５１の溶液
２５ｍｇのＳ−２２５１を１５．１５ｍｌの蒸留水に溶解し、＋４／＋８℃で貯蔵した。
【００５７】
標準デフィブロチド溶液
標準溶液の調製
０．１〜１００μｇ／ｍｌの（最終）濃度
６０ｍｇのデフィブロチドを３ｍｌのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液で１：１５に希釈した。得られた溶液は１．３３３ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、これを順次１：２に希釈して、６６６μｇ／ｍｌ、３３３μｇ／ｍｌおよび１６６μｇ／ｍｌの濃度を有するデフィブロチド溶液を得る。この最後の溶液は母液として使用され、これをさらに希釈して、８３．３３μｇ／ｍｌ、４１．６７μｇ／ｍｌ、３３．３３μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１６．６６μｇ／ｍｌ、８．３３μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．６６μｇ／ｍｌ、０．８３μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、および最後に０．１６μｇ／ｍｌの濃度を有する溶液を得る。
【００５８】
０．５〜８μｇ／ｍｌの（最終）濃度
６０ｍｇのデフィブロチドを３ｍｌのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液で１：１５００に希釈した。得られた溶液は１３．３３μｇ／ｍｌの濃度を有し、これを順次１：２に希釈して、夫々６．６６μｇ／ｍｌ、３．３３μｇ／ｍｌ、１．６６μｇ／ｍｌおよび０．８３μｇ／ｍｌの濃度を有するデフィブロチド溶液を得る。
【００５９】
手順
上記した標準デフィブロチド溶液の各１５０μｌを取り、マイクロプレートのウェルに入れる。次いで、０．２ｍｌのヒトプラスミン溶液を含む試験管に３．８ｍｌのＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液を０℃で添加することによってプラスミン溶液を迅速に調製する。溶解が生じるまで全体を静かに撹拌し、５０μｌを採取し、マイクロプレートのウェルに入れ、次いで各ウェルに５０μｌのＳ２２５１を入れる。
マイクロプレートを、３７℃に設定されたＭＲＸ ＴＣIIリーダーに置き、約１０秒間撹拌する。吸光度の読み取りを４０５ｎｍで、初期時間ｔ0に、および次いで１０分後〜２０分後の間において２分毎に、酵素反応動力学プログラムに従って行う。
【００６０】
０．１〜１００μｇ／ｍｌのデフィブロチド濃度に関して測定された実験データを次いで処理し（Excel and Sigma Plot プログラム）、一例として図１および２に示すようにグラフ（回帰直線）で表す。デフィブロチドの標品および試験サンプルに対応する直線の角係数ｂ（傾き）の値（図１）をデフィブロチド濃度（対数目盛）に関してプロットする（図２）。グラフから分かるように、直線が確認されることを可能にする直線応答が曲線の中央部分に得られる。直線性であるその間隔において、未知のデフィブロチドサンプルの活性が、すでに言及されかつFinney DJ, Statistical Method in Biological Assay, 第２版、Ch. Griffin, Londonに記載されている平行線生物学的決定法に従って、標品と比較して決定される。この方法を適用可能にするために、直線性に加えて、標品に関する直線と試験されるべきデフィブロチドに関する直線との間に平行性があることが重要である。
未知のデフィブロチドサンプルの生物学的活性を標品デフィブロチドと比較して決定するための試験は、好ましくは、上記で決定されたＳ字状部分の直線部分を生じさせる濃度を使用して行われる。特に、標品および未知のデフィブロチドの濃度が０．５〜８μｇ／ｍｌの範囲にあるのが好ましい。
標品および試験中のサンプルのための種々のデフィブロチド濃度の反復実験（replicate）の、プレートのウェルにおける配置を以下に示す。
【００６１】
【表１】
2005512547.tif 000003
【００６２】
標準デフィブロチド溶液をカラム２〜６に、一方、決定されるべきデフィブロチドのサンプルをカラム７〜１１に、示した濃度で入れる。第２のプレートでは、サンプルの位置を好ましくは逆にする。マイクロプレートのより外側のカラムおよびラインは決定プロセスのためには使用されないが、系のすべてにおいて最大限の温度均一性を確実にするために、水で満たされる。
【００６３】
マイクロプレートを、３７℃に設定されたＭＲＸ ＴＣIIリーダーに置き、約１０秒間撹拌する。吸光度の読み取りを４０５ｎｍで、初期時間ｔ0に、および次いで２０分後〜５０分後の間において５分毎に、酵素反応動力学プログラムに従って行う。測定された吸光度の値を次いで処理し（Excel and Sigma Plot プログラム）、表にし、そしてグラフに表す（回帰直線）。次いで、上記したものと同じ計算システムを使用して、活性比を計算し、デフィブロチドの未知サンプルの活性を標品と比較して決定することができる。
【００６４】
一例として、０．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌおよび８．０μｇ／ｍｌの濃度で夫々試験されたデフィブロチドサンプルに関する表（１、２および３）およびグラフを図３、４および５に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】基質Ｓ−２２５１からのｐＮＡの放出の動力学を示すグラフである。
【図２】デフィブロチド濃度（対数目盛）と図１の直線の傾きとの関係を示すグラフである。
【図３】濃度０．５μｇ／ｍｌのデフィブロチドの存在下での基質Ｓ−２２５１からのｐＮＡの放出の動力学を示すグラフである。
【図４】濃度２．０μｇ／ｍｌのデフィブロチドの存在下での基質Ｓ−２２５１からのｐＮＡの放出の動力学を示すグラフである。
【図５】濃度８．０μｇ／ｍｌのデフィブロチドの存在下での基質Ｓ−２２５１からのｐＮＡの放出の動力学を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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