(57)【要約】流体試料において検体の混合物を分離する際に使用するための電気泳動装置が提供される。この装置は、検体が通り抜けて移動する第一次元分離媒体（１０２）を備え、分離媒体は可撓性シート（１０１）の一面に支えられ、この面の表面積は分離媒体と可撓性シートとの接触領域の表面積より大きい。この装置において、第一次元分離媒体は、少なくとも部分的に可撓性シートによって形成される第一の分離ゾーン内に配置される。この装置は、さらに、可撓性シート（１０１）によって第一次元分離ゾーンから分離される流体室（１０５）を備え、流体室において、流体は、分離媒体が支えられる面と反対側のシートの面との接触を維持することができる。この装置は、さらに、第二次元電気泳動分離を実施するために、第二の分離媒体が配置される第二の分離ゾーン（１０８）を備えることができる。
2005517953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体試料において検体の混合物を分離する際に使用するための電気泳動装置において、該装置は、前記検体が通り抜けて移動する第一次元分離媒体を備えており、前記分離媒体が可撓性シートの一面に支えられており、前記可撓性シートの前記面の表面積が前記分離媒体と前記シートとの間の接触領域の表面積より大きく、
該装置において、前記第一次元分離媒体が、前記可撓性シートによって少なくとも部分的に形成される第一の分離ゾーン内に配置されており、
該装置は、前記可撓性シートによって前記第一次元分離ゾーンから分離される流体室を更に備え、前記流体室において流体が、前記分離媒体が支えられる面と反対側の前記シートの面との接触を維持することができる、電気泳動装置。
【請求項２】
前記第一の分離ゾーンを可逆的に隔離するための手段を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第一の分離ゾーンを可逆的に隔離するための手段は、前記可撓性シートのある領域が変形されて密封要素と接触するときに、前記可撓性シートと一緒に前記第一の分離ゾーンを少なくとも部分的に形成する密封要素を備える、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記流体室は、制御液を収納する制御室であり、前記可撓性シートの変形が前記制御室における前記制御液の圧力を変動させることによって生じるような配置である、請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
さらに、前記シートの１つまたはそれ以上の領域に及び／または領域から熱を伝達するための手段を備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記流体室が前記可撓性シートへ及び／または前記可撓性シートから熱を伝達するための機能を果たす温度調整液を収納する、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記流体室が制御室でありかつ温度調整室である、請求項４から６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記第一の分離媒体が固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）成分を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記可撓性シートの前記第一の分離媒体を支える面の表面積が、前記分離媒体と前記シートとの間の接触領域の表面積の少なくとも１５倍である、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
第二の分離ゾーン内に配置される第二の分離媒体を更に備え、前記第二の分離ゾーンが少なくとも部分的に前記可撓性シートによって形成される、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
前記流体室は、流体が前記第一の分離媒体及び前記第二の分離媒体の両方に対応する領域において前記可撓性シートとの接触を維持できるようにする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記流体室は、前記可撓性シートを介して前記第一の分離ゾーン及び前記第二の分離ゾーンの両方に及び／または両方から熱を伝達する機能を果たす温度調整液を収納する、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記第一の分離媒体及び前記第二の分離媒体を横切って電場を個別に加えるための手段を備える、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
該装置が２つのプレートの間に配備される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
それにより１つまたはそれ以上の電気泳動分離を行うための設備であって、該設備は、請求項１から１４のいずれか一項に記載の電気泳動装置を少なくとも１台備える、設備。
【請求項１６】
該設備を構成する前記１台またはそれ以上の電気泳動装置を個別に自動的に作動させるための制御手段を備える、請求項１５に記載の設備。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体分離システム及びその使用法、特にゲル電気泳動システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゲル電気泳動は、検体の混合物を分離するための既知の技法である。ゲルに電場が加えられと、ゲルを介して、流体試料の形の混合物が移動することができる。電場の影響を受ける各検体の移動速度は、分子量または等電点など検体の様々な特性に応じて決まる。その結果、検体は加えられる電場の方向にゲルに沿って分離する。
【０００３】
たんぱく質検体の場合、この種の分離は、一般に等電点電気泳動によって行うことができる。等電点電気泳動においては、ｐＨ勾配が等電点（たんぱく質が正味電荷を持たないｐＨ）に応じてたんぱく質を分離する。「固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）」法に従って、例えば不活性基質に結合されるストリップ（帯状体）の形のゲルにｐＨ勾配を組み込み、このゲルにたんぱく質混合物を加えることができる。
【０００４】
この種の「ＩＰＧストリップ」は周知であり、例えば第ＵＳ-５，９９３，６２７号、ＵＳ-４，１３０，４７０号、ＵＳ-５，５３４，１２１号及びＥＰ-０  ３９３  ４７８号特許において説明されるものを含めて様々な技法をその調製に使用することができる。ＩＰＧストリップは、ＧｅｌｂｏｎｄTM（第ＵＳ-５，９９３，６２７号特許において示される通り）などのフィルム・バッキング（裏打ち）で支えることができる。この場合、バッキング層はストリップ自体の寸法と同じかほとんど同じ寸法を持つ傾向がある。分離システムにおいて使用する際、ストリップ及びバッキング層は、プレートまたはブロックなど別個の支持物に配置される。
【０００５】
ＩＰＧストリップは、一般に、予備調製され乾燥した状態で入手でき、次にこれを使用する前に、試料がゲルに引き入れられるように試料流体で再水和する。ストリップの処理には、多数の試料及び／または例えば緩衝液及び洗浄液を含めた試薬液の応用を含めることができる。
【０００６】
電気泳動分離を実施するためにＩＰＧストリップを使用するとき、これを環境汚染及び脱水から保護する必要がある。これは、一般に分離工程中ストリップをシリコン油に浸漬するか、少なくともストリップを不浸透性のプラスティック・フィルムの保護層で覆うことによって、実現される。この保護材は扱い難さを生じる可能性がある。
【０００７】
ＩＰＧストリップは、また、加えられた電場によって生じた温度上昇を相殺するために、分離工程中冷却する必要もある。このことも、往々にして工程を困難にする可能性がある。一般に、冷却は、ストリップを熱伝導性の材料で作られるブロックの中にはめ込んだ後、従来の手段によってブロックの1面またはそれ以上の面を冷却することによって実施する必要がある。しかし、電気泳動分離は、高い電場を加える必要があるので、ストリップと接する材料が導電性ではないことが不可欠であり、そのことが、支持ブロックの達成可能な熱伝導度を制限している。
【０００８】
電気泳動分離の分解は、2つの連続した分離を行うことによって改良することができる。まず、検体を第一の特性に従って分離し、このようにして分離された混合物を別のゲルに加えて、第二の異なる特性に従ってその成分を分離するために電場を加える。二次元ゲル電気泳動として知られるこの技法は、１９７５年に始めて報告された（Ｏ‘Ｆａｒｒｅｌｌ，ＰＨ［１９７５］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７-４０２１）。この技法は、たんぱく質など生物学的検体の混合物を分離するためによく使用される。
【０００９】
「第一次元」分離は、上記の通りにＩＰＧストリップを使用して実施することができる。「第二次元」分離は、一般に通常のスラブ・ゲル電気泳動法によって実施され、加えられる電場を通る検体（例えば、たんぱく質）の可動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）は分子量及び帯電の程度によって決まる。第一次元分離は、一般にはそこでは第一次元分離が行われたゲルを第二のゲルに接触させることによって、このようにして分離された検体が第二次元ゲルの中に移動して通ることができるようになる前に、完了しなければならない。この場合にも、例えば第ＵＳ-５，９９３，６２７号、ＵＳ-６，０１３，１６５号、ＥＰ-０  ３６６  ８９７号及びＥＰ-０  ８７７  ２４５号及び出願者の同時係属ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ/ＧＢ０２/０１７４９号において説明されるとおり、第一次元及び第二次元移動を実現する方法は多数知られている。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の第一の形態に従えば、流体試料において検体混合物を分離する際に使用するための電気泳動装置が提供される。この装置は、検体が通り抜けて移動する第一次元分離媒体を備えており、この分離媒体が可撓性シートの一面に支えられ、この面の表面積が分離媒体とシートとの間の接触領域の表面積より大きく、第一次元分離媒体が、可撓性シートによって少なくとも部分的に形成される第一の分離ゾーン内に配置される。
この装置は、可撓性シートによって第一次元分離ゾーンから分離される流体室を更に備え、流体室において流体は、分離媒体が支えられる面と反対側のシートの面との接触を維持することができる。
【００１１】
分離媒体は、ポリアクリルアミドなどゲル電気泳動法に従来使用されるタイプの適切な水性ゲルである。分離媒体は、これに電場が加えられるとき検体を等電点電気泳動できることが好ましい。分離媒体は、例えば、その次元の1つに沿ってｐＨ勾配を示す固定ｐＨ勾配（ＩＰＧ）要素の形をとることができる。
【００１２】
分離媒体は、ストリップまたはシリンダなど細長い要素の形を取ることが好ましい。このタイプのゲル・ストリップの典型的な寸法は、０．１から１．５ｍｍまでの間、好ましくは０．４から０．８ｍｍまでの間の厚み、５０から５００ｍｍまでの間、好ましくは１００から３５０ｍｍまでの間、より好ましくは１５０から３２０ｍｍまでの間、もっとも好ましくは約３００ｍｍの長さ（これは使用される検体の移動の方向である）であり、及び２から５ｍｍまでの間、好ましくは３．５ｍｍの幅である。
【００１３】
分離媒体は、可撓性シートで支えられなければならず、永久的に可撓性シートに固定されることが好ましい。分離媒体は、その場で形成することによってまたは分離媒体の製造後の別個の接着工程によって、シートに付けることができる。その場で形成する1つの方法は、ゲル成分の混合をシートに配分するために可動ノズルを使用するものである。ノズルが分離媒体の所期の進路に沿って動くと、成分の構成は必要な固定化ｐＨ勾配を示すように変化する。その場で形成するための別の方法は、ベース・ゲル（例えば、ポリアクリルアミド）を配分し、その後固定可能両性電解質をゲルの中に噴霧して必要な勾配を作るものである。分離媒体は、分離工程において使用する前は脱水形態をとることができる。
【００１４】
シートはシートへの分離媒体の付着を促す材料で作られるかまたはこのような付着を促すコーティングが施されることが好ましい。例えば、シートは、ポリアクリルアミド・ゲルが共有結合できるコーティングが施される専売のＧｅｌｂｏｎｄTMとすることができる。
【００１５】
シートは、下に述べる冷却機能及び密封機能を果たすのに充分な可撓性を持つことが理想である。シートは、不活性の流体不浸透性材料から作らなければならず、ポリエステルなど合成プラスティック材が適当である。好ましいシートの厚みは、２０から５００μｍまでの範囲であり、より好ましくは２５から２００μｍまでの範囲であり、最も好ましくは５０から１５０μｍまでの範囲である。
【００１６】
関係するシート面の面積は、分離媒体とシートとの間の接触領域の面積の少なくとも１５倍であることが好ましく、より好ましくは２０から２００倍までの間、最も好ましくは３０から１００倍までの間である。また、下で説明する通り、第二次元分離媒体用のバッキング（裏打ち）として役立つのに充分な大きさを持つことが理想である。シートの適切な寸法は、１００×４０ｍｍから４００×６００ｍｍまでの間である。
【００１７】
ＩＰＧストリップなど第一次元分離媒体をより大きい可撓性シートで支えることにより、多数の利点が生じる。これによって分離媒体の扱いが容易になり、電気泳動装置内への配置が容易になる。さらに、シートは、下で説明する通り、分離媒体において行われる電気泳動分離中冷却システムの一部として使用することができる。
【００１８】
好ましくは比較的小さい圧力を加えることによって局部的に変形または変位する能力を与えるシートの可撓性は、下で説明する通り、電気泳動装置の1つまたはそれ以上の流体収納領域特に第一次元分離媒体の周りの領域を可逆的に隔離するために役立てることができる。
【００１９】
可撓性シートは、少なくとも部分的に本発明の装置内に第一の分離ゾーンを形成するのに役立つ。第一の分離ゾーンは第一次元分離媒体を収納する。シートは、この第一の分離ゾーンの領域においてはベースプレートまたは同様の支持手段によって支持されないことが好ましい。
【００２０】
これは、本発明の装置が、第一次元分離媒体に近接するシートの1つまたはそれ以上の領域が変形または変位するようにこの領域に圧力を加えるための手段を備えることによって、都合よく行うことができる。変形及び（または）変位は、装置内においてシートを密封要素に接触させるので、密封要素とシートは一緒に、少なくとも部分的に、第一次元分離媒体を収納しかつ（または）その少なくとも一部と接触する閉鎖形流体不浸透性（液密）第一分離室を形成する。シートの変形および（または）変位は、分離室を希望に応じて開閉できるように、可逆的であることが好ましい。
【００２１】
「流体不浸透性（液密）」という言葉は、この文脈においては、希望の時に分離室に流体を導き入れまたは分離室から流体を排出する際の経路となる1つまたはそれ以上の流体引き入れ管路及び排出管路を有する分離室を含む。
【００２２】
シートが接触する密封要素は、例えば、ガスケット、または圧力を加えてシートを接触させることによって流体不浸透性の接触を生じても良い装置のその他の領域であっても良い。
【００２３】
このようにして形成される第一の分離室は、例えば２００μｌから２ｍｌまでの間または水和後の分離媒体の体積の1倍から4倍までの間など、比較的小さい容積であることが好ましい。第一次元分離媒体は分離工程中必要な流体（例えば、試料流体、試薬液、洗浄液、緩衝液など、また染色剤など造影剤）と接触し、理想を言えばこれに浸漬されても良いので、このような閉鎖形低容積室内で第一次元分離を行うのが特に妥当である。分離媒体は、このようにして、オイル層またはその他の形態の保護バリアの必要なく保護される。
【００２４】
ただし、第一の分離室は、流体が分離媒体によって吸収されるように、閉じ込められた第一次元分離媒体の周りにおける流体の少なくともある程度の移動を可能にするのに適するサイズでなければならない。
【００２５】
その代わりにまたはこれに加えて、シートの変形及び（または）変位を使って、一次元分離媒体自体を装置内で密封要素と接触させても良く、分離媒体と密封要素は一緒に、上述のタイプの第一の分離室を少なくとも部分的に形成する。
【００２６】
流体室は、制御室として機能しても良く、加圧制御液を制御室に供給しても良い。制御室は、少なくとも部分的にシートによって形成されることが好ましい。シートの所望の変形/変位は、装置の形状に応じて制御室に正または負の差圧を加え、それによって制御液の圧力を変動させることによって得ても良い。この圧力は、分離媒体を支える面に反対側のシートの面に加えられる。
【００２７】
可撓性シートは、さらに、本発明の装置において温度制御システムの一部として機能しても良い。この装置は、シートの1つまたはそれ以上の領域へまたシートの1つまたはそれ以上の領域から（一般には、前記の領域から）熱を伝えるための手段を備えることが好ましい。この装置は、シートの1つまたはそれ以上の領域に、好ましくは第一次元分離媒体を支える面に反対の面に及び好ましくは分離媒体に近接するこの面の領域に、より好ましくは分離媒体のすぐ後の領域に温度調整液を供給するための手段を備えることが好ましい。シートは比較的薄く、分離媒体の面積より大きい面積を持つので、効率的な熱伝達媒体として、特に分離媒体と大きい体積の温度調整液との間の境界面として作用することができるので、分離媒体およびこれと接触する流体へのまたはこれらからの熱の伝達を非常に容易にする。
【００２８】
一般に、温度調整液は、分離工程中電場が加えられる間分離媒体及びその周りの流体を冷却するために使用される。適切な冷却流体は水である。
【００２９】
装置は、可撓性シートの適切な領域に隣接して、好ましくはこれと流体接触して配置される温度調整室を備え、温度調整室に温度調整液を供給できることが好ましい。
【００３０】
温度調整室は、このように少なくとも部分的に可撓性シートによって形成されることが好ましい。温度調整液とシートとの間の接触面積は、できる限り大きくなければならず、第一次元分離媒体のすぐ周りの領域を含まなければならない。このように、調整室は、分離媒体とシートとの間の接触面積の１００倍から２００倍までの間のシートの面積と接触することが理想である。温度調整室は、例えば０．２から１０ｍｍまでの間の比較的小さい深さであると都合がよく、温度調整液は可撓性シートの大きな面積上をこの狭い調整室を通って流れることが好ましい。
【００３１】
流体室は、温度調整室として適切に機能しても良い。流体室は、制御室並びに温度調整室として機能することが好ましく、この場合、温度調整液は、適切な圧力で与えられるとき制御液としても使用されても良い。
【００３２】
本発明の装置は、単一次元の電気泳動分離を行うために使用されても良く、この場合には、第一次元分離媒体及び例えばこれに電場を加えるための手段、これに流体を供給するための手段及び分離工程中その温度を調整するための手段などの関連手段だけを含めばよい。
【００３３】
ただし、第一次元分離媒体を本発明に従った装置の可撓性シートに配置すると、第二次元分離を容易にしても良い。シートは、少なくとも部分的に装置内において第二の分離ゾーンを形成するのに役立っても良く、第二次元電気泳動分離を行うために、第二の分離ゾーンに第二の分離媒体（一般にはポリアクリルアミド・ゲルなど水性ゲル）を配置しても良い。第二の分離ゾーンは、第一次元分離媒体を収納する第一の分離ゾーンから分離しているかまたはこれから分離可能であっても良い（例えば、出願者の同時係属ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ/ＧＢ０２/０１７４９号において説明されるような取り外し可能なバリアを使って、より好ましくは上に説明する通りシート自体の局部的変形/変位によって）。
【００３４】
第一及び第二の分離ゾーンを、例えばシートの局部的変形/変位によって相互に可逆的に隔離できることがより好ましい。次に第一次元分離媒体を第一の分離室に閉じ込めながら（すなわち、上述の通り第一次元分離媒体の領域において可撓性シートに圧力を加えて）第一次元分離を行っても良く、その後、第一の分離室を第二のゾーンと流体連絡させて（シート圧力の除去）第一の分離媒体から第二の分離ゾーンに収納される第二の分離媒体への検体の移動を可能にすることができる。
【００３５】
このような装置において、流体室は、流体が第一及び第二の分離媒体の両方に対応する領域において可撓性シートとの接触を維持していられるようにすることが好ましい。
【００３６】
使用の際、第一次元分離が完了したら、第二の分離媒体を第二の分離ゾーンに導き入れるだけでよい。第二の分離媒体は、例えば後に装置内における現場重合によって凝固してスラブ・ゲルになれる水性液の形で導き入れることができる。一般に、第二の分離媒体は０．５から２ｍｍまでの間の厚み、好ましくは０．８から１．８ｍｍまでの間の厚み、より好ましくは約１．５ｍｍの厚みのスラブ・ゲルの形をとる。従って、これが第二の分離ゾーンの好ましい深さでもある。
【００３７】
第二の分離媒体は、第一次元分離媒体と接触するようにまたはこれを取り囲むように導入されても良い。ただし、第一の分離媒体と第二の分離媒体との間に空洞を残すように導き入れられると、さらに好都合であり、検体が所期の時点で第二の分離媒体に移動できるようにするためにアガロース・ゲルなど適切な媒体をこの空洞に充填しても良い。どちらの場合にも、第二の分離ゾーンは第一の分離ゾーンと効果的に合体するか、少なくとも第一の分離ゾーンと流体連絡しても良い。
【００３８】
このような中間空洞が第一の分離媒体と第二の分離媒体との間に与えられる場合、検体が第二のゾーンに移動する間第一の分離ゾーンにおいて成された検体分離が保存されること明らかに好ましい。このために、空洞の設計及び空洞が使用される条件は、第一のゾーンにおいて成された検体分離のゆがみを最小限に抑えるように選択されなければならず、これは、特に第一のゾーンにおいて分離が行われた方向における検体の移動を最小限に抑えることを意味する。
【００３９】
許容できる検体の「浮動（ｄｒｉｆｔｉｎｇ）」の量は、使用される分離媒体において得られる分解の程度によって決まる。検体が空洞を横切るときの関連次元における検体の移動は、理想的には最良の可能分解度より小さい距離でなければならない。現在入手可能な典型的なゲルは、約０．５ｍｍ程度の有益な分解度を示す。この種のゲルが使用される場合、検体の移動は０．５ｍｍ未満が適切であり、０．３ｍｍ未満が理想的である。
【００４０】
中間空洞内における検体の移動の度合いは、空洞内にある媒体の粘度、空洞の長さ（試料の移動の方向の）、加えられる電場、加えられる圧力の勾配及び検体自体の性質及び可動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）など、多数の要因によって決まる。これらの要因、特に圧力勾配は、さらに温度、重力、装置の移動及び接続装置における流体の移動など外的影響によって影響を受ける。
【００４１】
中間空洞内で使用するのに適する媒体は、溶融アガロース（例えば５０から７０℃までの温度の時）など比較的粘性の高い流体である。適切な流体粘度は、２から１０００ｍＰａ.ｓまでの間（室温及び室内圧力で測定して）、好ましくは５から５００ｍＰａ.ｓまでの間、より好ましくは約１０ｍＰａ.ｓなど５から20ｍＰａ.ｓまでの間である。ゲル電気泳動分離に一般に使用されるような緩衝液も使用されても良い。
【００４２】
一般的に言って、検体の移動は、中間空洞内における流体の移動の可能性を減少することによって減少することができる。これは、例えば、下記のことによって制御することができる：
１）例えばポリアクリルアミドまたはアガロースなどゲル化剤を組み込むこと等によって、より粘性の高い流体を空洞に充填する；
２）空洞の長さ（空洞内での検体の移動の方向の）を小さくし、好ましくはこれを最小限にする−適切な長さは、例えば０．５から５ｍｍまでの間、好ましくは１から３ｍｍまでの間、より好ましくは約２ｍｍである；
３）例えば外部の影響によって生じるかもしれない流体の移動を制御するために空洞の付近に流体流量制御弁を含める；かつ／または
４）使用中の流体の移動を最小限に抑えるために、装置をしっかりした支持物に据え付ける。
【００４３】
第二の分離媒体の導入を容易にするために、及び中間空洞に媒体が使用される場合に、1つまたはそれ以上の液位センサを本発明の装置に組み込むことができる。都合のよい形態はオプティカル・レベル・センサ、例えば適切な形状の光導体を通じて関連ゾーンに光を導き入れて、光導体の内面から反射される光を検出するセンサである。反射の程度及び性質は光導体が入り込む領域に存在する流体によって決まる。
【００４４】
流体室は、第一の分離ゾーンに関して上に述べたのと同様に第二の分離ゾーンを可逆的に隔離するように作用する制御室として機能しても良い。
【００４５】
第二の分離ゾーン内の温度も、第一次元分離に関連して上で述べたのと同様に、すなわち第二の分離ゾーン内で可撓性シートの少なくとも1つの領域を温度調整液と接触させることによって適切に制御されても良い。この装置の温度調整室は、理想的には関連シート面の面積のほとんど（例えば９０％以上）と流体接触させることによって、第一及び第二の分離ゾーンの両方に共通としても良い。
【００４６】
従って、本発明の装置においては、可撓性シートは、スラブ・ゲルなど第二次元分離媒体のバッキングとなるのに充分な表面積を持つことが好ましく、これは第二次元分離媒体が冷却される際の大きな表面積ともなる。
【００４７】
第一及び第二の分離ゾーン、及び理想的にはその関連する温度調整室及び（または）制御室は、２つのプレートの間に好都合に配備されても良い。プレートは、縁が密封されるガラスまたはパースペクスまたはポリカーボネートなど同様の材料で作られても良い。
【００４８】
本発明に従った典型的な装置においては、第二の分離媒体は５０から５００ｍｍまで、好ましくは１００から３５０ｍｍまでの間、より好ましくは１５０から３２０ｍｍまでの間、最も好ましくは約３００ｍｍの長さ（使用中の検体の移動の方向）である。第二の分離ゾーンは、一般に５０から６００ｍｍまでであり、好ましくは５０から４００ｍｍまでの間、より好ましくは６０から３５０ｍｍまでの間、最も好ましくは約３００ｍｍの長さ（検体の流れの方向）である。
【００４９】
本発明に従った分離装置の別の特徴、例えば分離ゾーンへの流体の供給のため及び分離ゾーンを横切る電場を加えるための配置は、既知の一次元または二次元ゲル電気泳動装置と同様でよい。
【００５０】
この装置は、例えばマイクロプロセッサなどプログラム可能な制御手段の制御の下で、少なくとも部分的に自動的に作動可能であっても良い。この種の制御手段は、特に、第一次元分離ゾーンとの流体連絡を可能にするためまたはこれを防止するために適切な時点で可撓性シートの変形/変位を制御するために使用されても良い。
【００５１】
本発明に従った装置は、たんぱく質、ペプチド、荷電多糖類、合成重合体または電気泳動分離することができるその他の化学的または生物学的検体等の検体混合物、特にたんぱく質を分離するために使用されても良い。混合物を含有する試料は、流体の形、より好ましくは水性液または懸濁液など液体の形をとらなければならない。装置を使用する前の試料の準備は従来どおりでよい。
【００５２】
本発明のこれとは別の形態は、1つのまたは望ましくは複数の電気泳動分離を行うための設備を提供する。このアセンブリは、本発明の第一の形態に従った電気泳動装置を少なくとも１台、好ましくは２台以上、より好ましくは４台または６台または8台または１６台またはそれ以上備える。
【００５３】
本発明に従った設備は、複数の一次元または二次元電気泳動分離を同時に実行できるようにする。設備を構成する装置の各々の動作は自動化されても良いので、この設備は特に自動化に役立つ。この設備は、（好ましくは個別に）装置を作動するため及び流体、電力などの供給を調整するためにマイクロプロセッサなど制御手段を備えることが好ましい。
【００５４】
本発明について、次に例としてのみ、下記の添付図面を参照して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
以下の説明は、第一次元分離がＩＰＧストリップによって行われ、第二次元分離（適用可能な場合には）スラブ・ゲル上で行われ、その際第一の分離ゾーン及び第二の分離ゾーンに直交する電場が加えられる、電気泳動分離に関するものである。
【００５６】
図１に示される電気泳動装置は、単一次元分離を実施するために使用されても良く、あるいは二次元分離を実施するために使用することがより好ましい。
【００５７】
装置は、８０μｍの厚みの可撓性ポリエステル・シート１０１を備え、この上にゲルＩＰＧストリップ（帯状体）１０２が形成されている。シートはそれぞれ参照番号１０３、１０４で示される前面支持プレート及び裏面支持プレートの間の所定位置に固定される。シート１０１と裏面プレート１０４との間の狭い背面室１０５は、シートの背面への冷却液の供給を可能にし、冷却液（例えば、水）は、引き入れ口１０６を通じて導き入れられ、排出口１０７を通じて排出される。
【００５８】
シート１０１の他方の面は、部分的に前面室１０８を形成するのに役立ち、そこの流体は管路１０９、１１０を通じて前面室の中に導かれ、これから排出される。ＩＰＧストリップ１０２の領域においては、前面プレート１０３に密封ガスケット１１１が配備される。
【００５９】
背面室１０５の圧力が比較的低いとき、図２Ａに示される通り、ＩＰＧストリップはガスケット１１１に接触しない。背面室１０５に正の流体圧力を加えることによって、シート１０１をガスケット１１１と強制的に接触させ、これによってＩＰＧストリップの周りに低容量の閉鎖室を形成することができる（図２Ｂを参照のこと）。管路１０９を通じてこの閉鎖室に試料及び（または）試薬液（例えば、染色液など造影剤を含めて）を導き入れて、脱水されたＩＰＧストリップを膨らませることができる（図２Ｃ）。保護され制御された微環境においてＩＰＧストリップで電気泳動分離を行うことができる。分離中、ストリップの効率の良い冷却は、背面室１０５を通じて簡単に行うことができる。
【００６０】
第一次元分離を実施するために、ＩＰＧストリップの長さに沿って電場を加える必要がある。これは、従来どおり、両端の電極を使ってその間に高電圧を加えることによって行われる。図１の装置において、参照番号１１２、１１３で示されるのはこの種の電極線であり、ＩＰＧストリップの縦軸に平行に装置を横断して伸びる。管路１１４、１１５は、従来の方法で２つの電極に緩衝液を供給できるようにするが、リザーバ（図には示されていない）から連続的に補給されることが望ましい。
【００６１】
金属イオンによる汚染を避けるために、通常、電極にはプラチナ線が使用される。電圧が加えられると、水和ストリップの一部の成分は電極に達する。これがストリップの残りの成分に干渉しないようにするために、電極とストリップとの間に湿った吸収芯を含めることは既知である。同じ機能を得る方法が図３に示されており、図３において、図１及び２に示されるのと同様の部分には同じ参照番号が与えられている。
【００６２】
プレート１０３のＩＰＧストリップ１０２の両端に該当する位置に、円筒形の空洞１２０（典型的な横断面直径２．５ｍｍ）が設けられる。これらの空洞の各々には、できれば紙で作られる多孔プラグ１２１が組み込まれる。プラグの下には、例えばプラチナの電極線１２２、及び電極緩衝液の入口及び出口用の２つのポート１２３、１２４がある。緩衝液は、リザーバからポンプによって真空で吸引されることが好ましい。これは、過剰な緩衝液によってストリップが水浸しになるのを防ぐのに役立つ。
【００６３】
緩衝液は、空洞１２０の残り部分を満たして、ＩＰＧストリップに滲み込む。こうすることによって、電極１２２から多孔プラグ１２１まで、さらにプラグと接しているＩＰＧゲルまでの電気の経路を作る。緩衝液は、電気接触を生じるだけでなく、ストリップの端のｐＨを維持するのに役立つ。ストリップの酸性端の電極は、０．００１から０．５Ｍ、好ましくは０．００５から０．０２Ｍまでの燐酸を使用することができる。塩基性端の電極は、同様のモル濃度の水酸化ナトリウムを使用することができる。
【００６４】
緩衝液は、電気泳動の進行に合わせてゆっくり流れるよう作られるのが好ましい。このように流れることによって、電極で発生する気泡を除去するのに役立ち、電極に移動した種を洗い流す。緩衝液の流量は、０．１から１０ｍｌ/分までが好ましい。
【００６５】
電極配列の代替形態が図４に示されている。この場合にも、図１、２及び３に示されるのと同様の部分には同じ参照番号が与えられている。
【００６６】
図４の配列においては、電極線は、１つまたはそれ以上の小さい金属管と一体化している。１つの金属管１３０は、緩衝液の入口として作用して、その流れを多孔プラグに向かわせ、第二の金属管１３１は過剰な液を空洞１２０から排出する。矢印は、使用中の緩衝液の流れの方向を示している。管の一方または両方は金属製とすることができ、電極として作用することができる。同様に、管に接合する本体１３２も金属にすることができる。
【００６７】
第一次元分離の後に第二次元分離が実施される場合、背面室１０５の圧力を下げて、ガスケット１１１からシート１０１を引き離すことができる（図２Ａを参照のこと）。このとき、ＩＰＧストリップは、もはや前面室１０８の他の部分から隔離されていない。ポリアクリルアミド・ゲルを作るための試薬は、下部引き入れ管路１１０を通じて液体の形で適切な液位まで前面室に導き入れることができる。この液位は、ＩＰＧストリップと接触する程度またはこれを浸漬する程度とすることができる。ただし、第二次元ゲルは、ＩＰＧストリップから多少間隔を置いて、中間空洞を残すことが好ましく、この空洞は、後に第二の分離ゾーンへの検体の移動が望まれるときに、例えば溶融アガロースによって充填することができる。アガロースは、前面室１０８に（ＩＰＧストリップ１０２のすぐ下が便利である）配備される引き入れ口を通じてＩＰＧストリップと接触するまたはより好ましくはこれを浸漬する液位まで導き入れられても良い。
【００６８】
第二の分離媒体の導入を容易にするために、更にゾーン間空洞用の媒体が使用される場合には、１つまたはそれ以上の液位センサを装置に組み込まれても良い。便利な形態はオプティカル・レベル・センサであり、例えば適切な形状の光導体を通じて関連する流体室に光を導きいれて、光導体の内面から反射される光を検出するセンサである。反射の程度及び性質は、流体室の光導体が入り込む領域に存在する流体によって決まる。
【００６９】
第二次元液体ゲルが凝固したら、アガロースなどの媒体がゾーン間空洞に導き入れられて固化できるようになっている場合、第二次元分離を実施することができ、ＩＰＧストリップ上で分離された検体は、加えられる電場の影響の下で自由に第二次元ゲルの中に移動することができる。
【００７０】
この場合にも、第二次元分離中、ゲル温度は、背面室１０５に冷却液を流すことによって制御することができる。
【００７１】
第二次元における均等な電気泳動分離のためには、ゲルの厚みは前面室１０８において形成されるスラブの面積全体を通じて均等である必要がある。シート１０１がしっかりと支えられていない場合、前面室１０８の厚みが変動する可能性がある。シートを支持する１つの方法は、シートが背面支持プレート１０４の面にしっかり引き付けられるまで負の差圧（前面室１０８に対して相対的な）を加えることである。背面支持プレートは正確に平らに作ることができるが、そうすると、冷却液がシートの全面に流れる機会を小さくする。従って、プレート１０４の内面に狭い溝を設けて、冷却液が溝を流れられるようにすることが好ましくても良い。溝は、シート１０１の溝と溝の間のエリアと冷却液との間で適切に熱結合するのに充分な小ささの間隔で作られる。
【００７２】
プレート１０４は、アルミニウムなど熱伝導性材料から作られることが好ましい。これによって、シートから冷却液への熱の流れが改良される。プレート１０４の伝導率は、液体の冷却を必要としないほどの高さにすることができる。すなわち、熱はプレートの厚みを通って反対面のフィンまたはその他の熱交換装置の助けによって反対面の環境に放出される。プレート１０４の溝は、シートが支えられないところで実質的に変形しないように狭いことが重要である。一般には、溝は０．５から３ｍｍまでの幅である。
【００７３】
シート１０１及びＩＰＧストリップ１０２は、一般に使い捨て品であり、装置の残り部分と別個にあるいはこれと組み合わせて供給される。シート及びストリップは、上述の残りの部品を含む再利用可能な処理カセットにはめ込める単一の品目として供給されることが好ましい。
【００７４】
ＩＰＧストリップは、第一次元分離中必ずしも（シート１０１及びガスケット１１１によって）閉鎖されなくても良いことに留意すること。ストリップは、電気泳動分離システムに配置される前に試料を含有する液体内に浸漬することができる。これとは別に、試料液によるストリップの再水和を装置内で、ただし境界形成シール１１１を使用せずに行っても良い。このように使用するのに適する装置の部分が図５及び６に示されている。
【００７５】
この配置においては、制御圧力がシート１０１に加えられると、ＩＰＧストリップ１０２は前面ブロック１０３の内面に接触する。接触エリア内に、溝１４０がプレート１０３の面に設けられる。流体は、１４１、１４２など１つまたはそれ以上のポートを通じてこの溝へまたは溝から通しても良い。このようにして試料液または試薬をストリップ１０２の面の少なくとも一部と接触させて、この中に滲み込ませても良い。ストリップは一般に浸透性なので、液体はストリップの全ての部分に移動しても良い。ストリップの面とプレート１０３との間の空隙が小さい（例えば、０．３ｍｍ未満）場合、液体は表面張力の作用によって数時間損失なしにストリップとの接触を維持しても良い。
【００７６】
上述のような装置においては、プレート１０３は、装置を解体する必要なく電気泳動の進行及び最終分離を観察できるように透明であることが好ましい。ただし、ゲルに発生する熱が両面の間の温度差を生じる場合、問題が生じる可能性がある。これは、最終分離パターンにおいて種の線状化として現れる電気泳動分離の差速を引き起こす。第二次元ゲルの冷却は、この効果を抑えるために対称的であることが好ましい。プレート１０３が透明のままでなければならない場合、図７に示される装置のように冷却筒を付加しても良い。この装置においては、温度調整室１５０が前面プレート１０３の隣に配備される。冷却液は引き入れ口１５１を通じて導き入れられ、排出口１５２を通じて排出される。
【００７７】
これとは別に、ゲルを観察することが不可欠でなければ、前面プレート１０３は、背面プレート１０４の冷却に関連して上で説明した通り、溝付きアルミニウムまたはこれと同様のもので作っても良い。この後者の方法が使用されるが、小さい透明の窓が冷却プレートに含まれて、狭いストリップを観察できるようにするのが、さらなる変形形態である。これは、分離の進行につれて種の移動が移動方向に対して直交するストリップに沿って光学的に検出され（例えば、付けられた色素の蛍光によって）記録される場合に特に効果的であっても良い。この種の記録から、分離期間後種がどのように見えるかを示す複合エリア画像を数学的に合成することができるだろう。これは、複数のストリップから画像化することによってさらに改良することができ、ストリップからの記録は、時間依存的に相関させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、本発明に従った電気泳動装置の図式的縦断面図である。
【図２】図２において、図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、図１の装置の一部のより詳細な図式的断面図であり、その動作の様々な段階を示している。
【図３】図３は、本発明に従った装置の一部の図式的断面図であり、代替電極配置を示している。
【図４】図４は、本発明に従った別の装置の一部の図式的断面図であり、代替電極配置を示している。
【図５】図５は、本発明に従った代替電気泳動装置の一部の図式的断面図である。
【図６】図６は、図５の線VI-VIに沿って見た図式的部分断面図である。
【図７】図７は、本発明に従った別の装置の一部の図式的断面図である。
【図１】
2005517953.tif 000003
【図２ａ】
2005517953.tif 000004
【図２ｂ】
2005517953.tif 000005
【図２ｃ】
2005517953.tif 000006
【図３】
2005517953.tif 000007
【図４】
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【図５】
2005517953.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月31日(2003.12.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体試料において検体の混合物を分離する際に使用するための電気泳動装置において、該装置は、前記検体が通り抜けて移動する第一次元分離媒体を備えており、前記分離媒体が可撓性シートの一面に支えられており、前記可撓性シートの前記面の表面積が前記分離媒体と前記シートとの間の接触領域の表面積より大きく、
該装置において、前記第一次元分離媒体が、前記可撓性シートによって少なくとも部分的に形成される第一の分離ゾーン内に配置されており、
該装置は、前記可撓性シートによって前記第一次元分離ゾーンから分離される流体室を更に備え、前記流体室において流体が、前記分離媒体が支えられる面と反対側の前記シートの面との接触を維持することができる、電気泳動装置。
【請求項２】
前記第一の分離ゾーンを可逆的に隔離して流体含有ゾーンを形成するための手段を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第一の分離ゾーンを可逆的に隔離するための手段は、前記可撓性シートのある領域が変形されて密封要素と接触するときに、前記可撓性シートと一緒に前記第一の分離ゾーンを少なくとも部分的に形成する密封要素を備える、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記流体室は、制御液を収納する制御室であり、前記可撓性シートの変形が前記制御室における前記制御液の圧力を変動させることによって生じるような配置である、請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
さらに、前記シートの１つまたはそれ以上の領域に及び／または領域から熱を伝達するための手段を備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記流体室が前記可撓性シートへ及び／または前記可撓性シートから熱を伝達するための機能を果たす温度調整液を収納する、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記流体室が制御室でありかつ温度調整室である、請求項４から６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記第一の分離媒体が固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）成分を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記可撓性シートの前記第一の分離媒体を支える面の表面積が、前記分離媒体と前記シートとの間の接触領域の表面積の少なくとも１５倍である、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
第二の分離ゾーン内に配置される第二の分離媒体を更に備え、前記第二の分離ゾーンが少なくとも部分的に前記可撓性シートによって形成される、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
前記流体室は、流体が前記第一の分離媒体及び前記第二の分離媒体の両方に対応する領域において前記可撓性シートとの接触を維持できるようにする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記流体室は、前記可撓性シートを介して前記第一の分離ゾーン及び前記第二の分離ゾーンの両方に及び／または両方から熱を伝達する機能を果たす温度調整液を収納する、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記第一の分離媒体及び前記第二の分離媒体を横切って電場を個別に加えるための手段を備える、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
該装置が２つのプレートの間に配備される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
それにより１つまたはそれ以上の電気泳動分離を行うための設備であって、該設備は、請求項１から１４のいずれか一項に記載の電気泳動装置を少なくとも１台備える、設備。
【請求項１６】
該設備を構成する前記１台またはそれ以上の電気泳動装置を個別に自動的に作動させるための制御手段を備える、請求項１５に記載の設備。
【国際調査報告】
2005517953.tif 000012
2005517953.tif 000013
2005517953.tif 000014