(57)【要約】【課題】一時的な不死化【解決手段】本発明は、外部の不死化タンパク質を細胞内へ導入して細胞を一時的に不死化する方法、並びに器官に関する細胞に不死化タンパク質の外部供給により一時的に不死化し、増殖後に再致死化させる細胞を獲得する方法に関する。更に、本発明は前記の製造方法により製造された細胞、この細胞の増殖片の製造のための使用並びにこの方法において使用すべき不死化タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部から不死化タンパク質を細胞内へ導入する、細胞を一時的に不死化する方法。
【請求項２】
細胞の細胞周期停止を克服するために、不死化タンパク質として形質転換タンパク質を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
形質転換タンパク質として、ウイルス性癌遺伝子の発現産物、好ましくはＳＶ４０  ＴＡｇ、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、アデノウイルスＥ１Ａ、アデノウイルスＥ１Ｂ、および／または細胞性癌遺伝子の発現産物、好ましくはｒａｓ、ｍｙｃ、ｓｒｃ、特に好ましくはＳＶ４０  ＴＡｇを使用する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
増殖時にテロメアの損失を回避するために、不死化タンパク質としてテロメアタンパク質を使用する、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
テロメアタンパク質として、ヒトテロメラーゼの触媒サブユニット、好ましくはＴＲＴｐｌｕｓ（ＤＳＭ  １４５６９）を使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
不死化タンパク質はメッセンジャータンパク質と、好ましくはＶｏｙａｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ２２と、レセプターリガンドとまたは一本鎖抗体と融合されて、融合タンパク質になっている、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
不死化タンパク質を特異的な抗体と結合させ、この抗体は第２の特異性を介して細胞性レセプターと結合し、それによりこの不死化タンパク質のインターナリゼーションが引き起こされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
不死化タンパク質を、好ましくはナノ粒子を介して、ｉｎ  ｖｉｖｏで適用する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
融合タンパク質を組み換えにより製造し、精製し、次いで一時的に不死化すべき細胞に投与するか、もしくは生体内に適用する、請求項６〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
融合タンパク質をフィーダー細胞中で発現させ、この細胞から培地中へ放出させ、その培地内でフィーダー細胞を一時的に不死化すべき細胞と一緒に共培養する、請求項６〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
フィーダー細胞は空間的に、好ましくは半透膜を備えた室によって、一時的に不死化すべき細胞と隔てられ、その再致死化のためにこのフィーダー細胞を培地から除去する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
フィーダー細胞は少なくとも１種のプラスミドで安定にトランスフェクションされていて、このプラスミドは、ＶＰ２２−ＴＡｇ（ＤＳＭ  １４５７０）、ＴＡｇ−ＶＰ２２（ＤＳＭ  １４５６８）、ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ、Ｔｅｌｏ−ＶＰ２２からなる群から選択される融合タンパク質をコードし、その際、Ｔｅｌｏはヒトテロメラーゼの触媒サブユニットｈＴＲＴｐｌｕｓ（ＤＳＭ  １４５６９）を表す、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも２種のフィーダー細胞を使用し、この細胞の一方は形質転換タンパク質との融合タンパク質を分泌し、他方はテロメアタンパク質との融合タンパク質を分泌する、請求項１０〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
不死化タンパク質を、リポソームまたはナノ粒子を介して一時的に不死化すべき細胞内へ輸送する、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
不死化タンパク質を、エレクトロポレーションまたはマイクロインジョクションによって一時的に不死化すべき細胞内へ輸送する、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
器官に関係する細胞を準備し、不死化タンパク質を外部から供給することによりこの器官に関係する細胞を一時的に不死化し、この不死化細胞を増殖させ、不死化タンパク質の供給を停止することにより増殖した細胞を再致死化させる工程を有する、細胞を獲得する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５の何れか１項に記載の方法により一時的な不死化を行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
器官に関係する細胞として、多分化能幹細胞、好ましくは骨髄の間葉系ストローマ細胞を使用することを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
器官に関係する細胞として、分裂するまたは休止する、末端分化した、器官の出発細胞、好ましくは心筋細胞を使用することを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
この出発細胞は不死化との関係で形質転換されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
器官に関係する細胞として自己の細胞を使用することを特徴とする、請求項１６〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
器官に関係する細胞として同種の細胞を使用することを特徴とする、請求項１６〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１６〜２２の何れか１項に記載の方法により製造された、細胞。
【請求項２４】
器官の再生のための増殖片を製造するための、請求項２３に記載の細胞の使用。
【請求項２５】
慢性疾患の治療のための、請求項２３に記載の細胞の使用。
【請求項２６】
請求項２３に記載の細胞を含有する、増殖片。
【請求項２７】
器官の再生のための、請求項２３に記載の細胞の使用。
【請求項２８】
請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法において有利に使用するための、不死化タンパク質。
【請求項２９】
細胞の細胞周期停止を克服するための形質転換タンパク質である、請求項２８に記載の不死化タンパク質。
【請求項３０】
形質転換タンパク質が、ウイルス性癌遺伝子の発現産物、好ましくはＳＶ４０  ＴＡｇ、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、アデノウイルスＥ１Ａ、アデノウイルスＥ１Ｂ、および／または細胞性癌遺伝子の発現産物、好ましくはｒａｓ、ｍｙｃ、ｓｒｃ、特に好ましくはＳＶ４０  ＴＡｇを使用する、請求項２９に記載の不死化タンパク質。
【請求項３１】
増殖時にテロメア損失を回避するためのテロメアタンパク質である、請求項２８に記載の不死化タンパク質。
【請求項３２】
テロメアタンパク質が触媒サブユニット、好ましくはヒトテロメラーゼのＴＲＴｐｌｕｓ（ＤＳＭＺ３４５６）である、請求項３１に記載の不死化タンパク質。
【請求項３３】
メッセンジャータンパク質と、好ましくはＶｏｙａｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ２２と、レセプターリガンドとまたは単鎖抗体と融合させて、融合タンパク質になっている、請求項２８〜３２の何れか１項に記載の不死化タンパク質。
【請求項３４】
ブダペスト条約により２００１年１０月１７日付で寄託された、寄託番号ＤＳＭ  １４５６７０、ＤＳＭ  １４５６８、ＤＳＭ  １４５６９のプラスミドによりコードされる、不死化タンパク質。
【請求項３５】
ＶＰ２２および有用タンパク質、好ましくは不死化タンパク質からなる、融合タンパク質。
【請求項３６】
プラスミドＤＳＭ  １４５６９によりコードされる、ヒトテロメラーゼの触媒サブユニットｈＴＲＴｐｕｌｓ。
【請求項３７】
請求項２８〜３６の何れか１項に記載のタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項３８】
請求項３７に記載の核酸分子を有するプラスミドまたは発現ベクター。
【請求項３９】
プラスミドＤＳＭ  １４５６８。
【請求項４０】
プラスミドＤＳＭ  １４５６９。
【請求項４１】
プラスミドＤＳＭ  １４５７０。
【請求項４２】
請求項３８〜４１の何れか１項に記載のプラスミドで形質転換された、細胞、特にフィーダー細胞。
【請求項４３】
請求項２８〜３６の何れか１項に記載のタンパク質を分泌する、細胞、特にフィーダー細胞。
【請求項４４】
請求項２８〜３６の何れか１項に記載の少なくとも１種のタンパク質、および／または請求項３８〜４１の何れか１項に記載の少なくとも１種のプラスミドおよび／または請求項３７に記載の核酸分子を有する、キット。
【請求項４５】
請求項２８〜３６の何れか１項に記載の、少なくとも１種の不死化タンパク質を含有する、一時的にｉｎ  ｖｉｖｏで不死化させるための治療用調製物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、例えば器官内に移植可能である細胞を得る方法に関する。一般に、本発明は定義された細胞集団の死滅が共通している変性疾患、並びに移植およびこの種の変性疾患を治療する医薬に関する。
【０００２】
工業国では、特に年齢ピラミッドが変化することにより、重度のまたは全く治療可能ではない慢性の変性疾患が存在する。
【０００３】
このような疾患には、特に心筋疾患、神経変性疾患、骨疾患および肝臓疾患が属し、これらの疾患は該当する細胞集団の損失を特徴とする。
【０００４】
最も重大な疾患のいくつかを挙げてみただけでも、心筋梗塞の場合に、例えば心筋細胞は不可逆に死滅し、インシュリン依存性糖尿病の場合には膵臓の島細胞が自己免疫疾患のために死滅し、パーキンソン病の場合には黒質中のドーパミン産生細胞が死滅する。
【０００５】
自然の再生プロセスは、機能的に重要な細胞を置き換えることはほとんどできない。従って、変性疾患の治療の場合の大きな進歩は、このような器官に関連する細胞を体外で培養し、相応して増殖した後に損傷した器官内へ移植することにある。生体固有の細胞である場合には、器官の持続的な再生は見込みがある、それというのも組織拒絶反応が生じないためである。
【０００６】
このように器官に関連する細胞は、今日は胚性幹細胞および成熟した幹細胞から得ることができる。従って、心筋細胞は骨髄の間葉系ストローマ細胞から得ることができる。しかしながらこれらの細胞は限定的に分裂できるにすぎず、器官に関連する細胞の十分な数を得るためには細胞分裂の数は十分ではない。従って、このような細胞を不死化して、この細胞を無制限な量で産生できるようにすることが試みられた。不死化は、少なくともヒトテロメラーゼ（ｈＴＲＴ）の触媒サブユニットについての遺伝子機能をプライマリー細胞中へ導入することにより可能である。多くの場合に、プライマリー細胞の細胞周期の抑制を克服するためにはなお他の遺伝子機能が必要であり、それによりこのプライマリー細胞は一般に初めて分裂し始める。この遺伝子機能は、たいていは形質転換性の特性もしくは発癌遺伝子の特性を有している。この遺伝子機能のプロトタイプは、ＳＶ４０の大型腫瘍抗体（Ｌａｒｇｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ）である。
【０００７】
以前から、プライマリー細胞培養は限定的な細胞分裂能力を有することは公知である。Ｗｉｓｔａｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔのＬｅｏｎａｒｄ  Ｈａｙｆｌｉｃｋは１９６１年に、新生児の繊維芽細胞が８０〜９０回の細胞分裂を行うことができるが、７０才の人の繊維芽細胞は２０〜３０回の分裂であることを発見した。この分裂回数の後でこの細胞は老化期に移行する。この複製能力は供与者の年齢により決まる。
【０００８】
今日では、この複製能力は染色体末端のテロメアの長さによって規定されることは公知である。通常細胞中では細胞分裂ごとにテロメアは短くなる。このテロメアは、哺乳類の場合にヘキサマー配列のＴＴＡＧＧＧの繰り返しからなり、新生児の場合に約１２ｋｂの長さである。この欠失はたいていの場合に体皮細胞中に見られる。生殖系列の細胞は、この複製による欠失を再び補償することができる酵素機能を有する。このいわゆるテロメラーゼは、まず最初に単細胞のテトラヒメナ繊毛虫において、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  ＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＣａｒｏｌ  Ｃｒｅｉｄｅｒによって発見された。これはリボ核タンパク質である。別個の遺伝子によりコードされるＲＮＡ−成分は、テロメラーゼ−反応に対する鋳型配列を含有する。この鋳型−ＲＮＡに対する遺伝子は、その間に、ヒトを含めた多くの生物からクローニングすることができた。その間に、多様な種からのテロメラーゼの他の因子もクローニングされた。このテロメラーゼは付加的になお、ＲＮＡ−鋳型と結合するＰ８０−タンパク質と、ポリメラーゼ機能を有するＰ９５−タンパク質とからなる。テロメラーゼは、結合したＲＮＡに基づき染色体末端にひとまとまりのＤＮＡを作成する特別な逆転写酵素である。
【０００９】
テロメア結合性タンパク質により、この場合に、染色体末端の延長が調節されて行われることが保証される。ヒトの細胞から、６０ｋＤａのサイズのテロメア−リピート因子ＴＲＦに対する遺伝子がクローニングされた。このタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを有し、このドメインはＭＹＢ−腫瘍性タンパク質と相同性を示し、かつ相同性の酵母−タンパク質ＲＡＰ１中にも再び見つけられている。ＴＲＦ並びに他のタンパク質とテロメアとの結合は、染色体末端の特別なパッケージングを引き起こす。これによりテロメラーゼは明らかに阻害される。テロメアが短くなればそれだけ、阻害が少なくなり、それによりテロメアホメオスタシスが保証される。このホメオスタシスは、しかしながら高い確率で他の重大な機能をも有している：この機能はテロメア調節を細胞周期制御系と関連づけている。このシステムは、ＤＮＡ−架橋もしくはネーキッドＤＮＡ−末端が存在する場合に、ｐ５３−依存性メカニズムを介して活性化される。その他に、テロメラーゼ−ネガティブな体皮細胞中で、テロメアが次第に浸食され、それにより、ＴＲＦおよび類縁のタンパク質の結合可能性が生じる。これについては、ｐ５３依存性チェックポイント−システムの最短長さを下回った場合に活性化され、その結果、細胞周期は移行期Ｇ１／Ｓで停止することが実験的手がかりである。この細胞は、いわゆるハイフリック（Hayflick）−老化−リミットに達している。
【００１０】
細胞が発癌ウイルスで感染されることにより、この点を乗り越えることができる。このようなウイルスは、例えばＳＶ４０である。このウイルスはいわゆる大型腫瘍抗原、ＴＡｇを発現し、この抗原は腫瘍サプレッサタンパク質ｐ５３およびｐＲＢと結合し、これらはこの結合により不活性化される。これは、チェックポイント−システムの欠損を生じる。従って、細胞に対しては、ハイフリック−リミット（Hayflick-Limit）を越えて分裂することが可能となる。これは寿命の延長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｌｉｆｅ  ｓｐａｎ）を示す。しかしながら、生じた細胞集団はなお不死ではなく、つまりなお不死化されていない、それというのもなお第２のコントロールポイントが存在するためである：これは危機と呼ばれ、テロメアの更なる消耗によって生じる。約２．５ｋｂのテロメア長さから染色体末端は不安定になる。細胞の組み換え機構もこれに関与している可能性もある。遺伝子的な不安定性は、大部分の細胞に対して致死である。１０００万分の１より少ない、最もまれなケースの場合には、細胞はこの危機を免れ、更に複製的な生存の段階に入る。このような細胞は不死化され、従って潜在的な癌細胞である。
【００１１】
不死化された細胞および腫瘍細胞は、９０％より多くの場合に、テロメラーゼの触媒サブユニットの発現を示す。これは、鋳型ＲＮＡおよびＴＰ１がたいていの細胞内で発現していると思われる間に限られる。たいていの体皮細胞は、それに対してテロメラーゼの触媒サブユニットに対してネガティブである。この原則の例外は、活性化されたＴ−リンパ球およびＢ−リンパ球、ＣＤ３４ポジティブ幹細胞、並びに分裂活性角化細胞である。しかしながら、これらの細胞中の測定可能なテロメラーゼ活性は、最もよい場合でも、テロメア損失が延長できるだけで、このテロメア損失を停止できないことが発見された。他方で、テロメラーゼ活性のないいくつかのヒトの腫瘍が発見された。この腫瘍は、しばしば特に長いテロマーを有するため、テロメア損失を補償する別の機構が存在することが予測された。
【００１２】
既に分裂している細胞（例えばプライマリー繊維芽細胞）を不死化するために、テロメラーゼの触媒活性の添加で十分である。休止細胞および末端分化した細胞（例えば成熟心筋細胞、ニューロン）は、細胞周期の抑制を克服するために付加的になお遺伝子機能を必要とする。このために、ウイルス性癌遺伝子、例えばＳＶ４０  ＴＡｇ、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７、アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１ｂを使用することができる。しかしながら細胞性癌遺伝子、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｓｒｃ等も、必要な成長シグナルを提供することができる。
【００１３】
しかしながら、それぞれの不死化の固有の問題は、このような細胞が突然変異の蓄積によって癌細胞へと発展しかねないことである。従って、この不死化は再び取り消すことができる必要がある。
【００１４】
公開前のドイツ連邦共和国特許出願第１００１９１９５号明細書には、この問題の解決のために、可逆的不死化が提案されていて、この可逆的不死化は器官に関係する細胞内への「Ｓｕｒｖｉｖｅ−遺伝子複合体」を導入することに基づいている。この遺伝子複合体は、特にヒトテロメアーゼの触媒サブユニットおよびＴＡｇを含有する。この複合体はＬｏｘ／Ｐ配列が末端に存在している。この細胞は、複合体の不死化特性によりｅｘ  ｖｉｖｏで任意の期間増殖される。患者へ移植する前に、Ｃｒｅ−レコンビナーゼを使用し、このレコンビナーゼはＬｏｘ／ｐ−配列間のＳｕｒｖｉｖｅ−複合体を切り出す。この技術は、ヒトに使用するために必要であり、それぞれの細胞から不死化機能を完全に除去されたことが保障される。
【００１５】
ドイツ連邦共和国特許出願第１００１９１９５号明細書によると、これはＨＳＶ−チミジンキナーゼ（ＴＫ）のネガティブな選択システムとＣｒｅ／Ｌｏｘ−システムとの組み合わせにより行われる。Ｓｕｒｖｉｖｅ−遺伝子複合体がなお機能している全ての細胞は、この細胞にプロドラッグのガンシクロビルを投与した場合に、ＴＫの活性化により死滅する。この技術の欠点は、Ｓｕｒｖｉｖｅ−遺伝子複合体が発現可能なＤＮＡ配列の形で投与され、これがゲノム内へランダムに組み込まれてしまいかねないことにある。従って、Ｃｒｅ−レコンビナーゼの必要な適用な後でさえも、ＬｏｘＰ−位置に対して遠位のＤＮＡ配列はゲノム内に残留することは排除できない。
【発明の開示】
【００１６】
このバックグラウンドから、本発明の根底をなす課題は、再生組織を作成するための細胞の不死化並びにこの細胞の完全な再致死化を可能にする方法、並びにこの新規の方法において使用するための適当な手段を提供することである。
【００１７】
本発明により、前記課題は、外部不死化タンパク質を細胞内へ導入する、細胞を一時的に不死化する方法により解決される。
【００１８】
不死化タンパク質とは、本発明の範囲内で、一方では、例えばＳＶ４０のＴＡｇが引き起こすように、細胞中でのその発現の際に相当する細胞がさらに分裂するかもしくはハイフリック−リミットを越えてさらに分裂するようにする形質転換タンパク質であると解釈される。このような不死化タンパク質の適用は、末端分化した休止細胞を再び分裂させるため、器官の出発細胞からｅｘ  ｖｉｖｏで移植用の組織を産生することができる。
【００１９】
他方では、この不死化タンパク質は、本発明の範囲内で、例えばテロメアーゼの触媒サブユニットが引き起こすように、細胞中でのその発現の際に相当する細胞が、増殖の際にテロメア損失が回避されるために、無制限に複製可能な状態を維持するかまたは再び無制限に複製可能な状態になるようにするテロメアタンパク質であるとも解釈される。本出願人は、同様に本発明の対象であり、かつｈＴＲＴｐｌｕｓと名付けられたヒトテロメラーゼの触媒サブユニットをコードするプラスミドを、ブダペスト条約によりＤＳＭＺ（ＤＳＭ１４５６９）に２００１年１０月１７日に寄託し、このプラスミドはｐｃｒｓｃｒｉｐｔ−テロメラーゼと称され、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１中にトランスフェクションされている。このプラスミドから、不死化遺伝子のｈＴＲＴｐｌｕｓに対するＤＮＡ−配列が単離される。
【００２０】
この形質転換タンパク質およびテロメアタンパク質は、本発明の場合に、それ自体または組み合わせて、組織に関して所望の量が産生されるまで、増殖すべき細胞に投与される。
【００２１】
しかしながら、この形質転換タンパク質およびテロメアタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの一時的な細胞分裂を活発化させる目的で（一時的ｉｎ  ｖｉｖｏ不死化）、さらになお下記する方法でも並び記載された患者に適用するための他の実施態様でも使用される。
【００２２】
このバックグラウンドから、本発明は、少なくとも１種の本発明による不死化タンパク質を含有する治療用組成物にも関する。
【００２３】
この新規の方法の本質的な利点は、細胞内へＤＮＡ−配列を導入しない点にあり、その結果、細胞のゲノム内への組み込みは行われることはない。この「不死化」は、不死化タンパク質が継続して外部から適用されている間だけ持続されるにすぎない。不死化タンパク質の供給を取りやめた場合に不死化の転換が生じる、それというのもこの細胞中に存在する不死化タンパク質は細胞のプロテアーゼにより継続して分解されているためである。このプロセスは、本発明の範囲内で、一時的な不死化と称されている、それというのも、不死化タンパク質が外部から提供されている限りこの不死化は持続するにすぎないためである。このタンパク質は、このために例えばフィーダー細胞から分泌させることができるかまたは例えばバキュロウイルス系を用いたまたはＥ．ｃｏｌｉ中で組み換えて産生することができる。
【００２４】
不死化特性を有するこの遺伝子機能は、つまり、発現可能なＤＮＡ−配列としてではなく、タンパク質として直接的に不死化すべき細胞に作用する。このために、不死化すべき細胞を不死化タンパク質と混合し、この不死化タンパク質は生化学的、化学的または物理的適用を用いて細胞内へ導入される。
【００２５】
不死化タンパク質の生化学的適用の場合には、この不死化タンパク質をタンパク質形質導入−ドメイン、リガンド、例えばペプチド−リガンド、または一本鎖抗体と融合する。この不死化タンパク質は、このために、例えばバキュロウイルス−系中またはＥ．ｃｏｌｉ−系中で組み換えにより製造され、かつ適当な融合タンパク質として目標細胞へ直接、つまり器官に関連する細胞へ直接投与されるか、または不死化タンパク質を培地中へ放出するフィーダー細胞中で発現される。このフィーダー細胞は、目標細胞と一緒に共培養されるため、この不死化タンパク質がフィーダー細胞から培地内へ達し、器官に関連する細胞によって取り込まれる。このフィーダー細胞は、この場合に、多様な融合タンパク質を発現することができるが、その際、各種のそれぞれ１種だけの融合タンパク質を発現する多様なフィーダー細胞を使用することもできる。
【００２６】
不死化タンパク質の化学的適用は、例えばリポソームまたはインターナリゼーション可能なナノ粒子を介して行う。この不死化タンパク質は組み換えにより製造され、精製されかつこの化学的方法を用いて目標細胞内へ導入される。同様に、この不死化タンパク質は、非−ペプチドリガンドと化学的に結合させ、これを介して目的細胞内へ搬入することもできる。
【００２７】
不死化タンパク質の物理的適用は、粒子打ち込み、エレクトロポレーションまたはマイクロインジョクションによって行う。この不死化タンパク質は組み換えにより製造され、精製されかつこの物理的方法を用いて目標細胞内へ導入される。
【００２８】
生化学的適用のためには、この不死化タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端に、このタンパク質を培地から天然の輸送経路を介して取り込みを行うことができる付加的なアミノ酸を設置する。これは、不死化タンパク質とタンパク質形質導入ドメインとからの融合の作成により行うことができる。このようなドメインを有するタンパク質は、「メッセンジャー」タンパク質または「トランスロケーション」タンパク質と称される（概要は：Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００年，１２、４００〜４０６頁参照）
今日公知のメッセンジャータンパク質の多くはホメオタンパク質に所属する（例えばＥｎｇｒａｉｌｅｄ、Ｈｏｘａ−５、アンテナペディア）。ホメオタンパク質は転写因子であり、この因子は成長プロセスにおいて重要な役割があり、全ての後生動物並びに植物において存在する。この転写因子は６０個のアミノ酸のサイズのドメイン、ホメオドメインによってＤＮＡと結合する。このホメオドメインは３つのヘリックスを有する。ホメオタンパク質のアンテナペディアの場合には、３つのヘリックス中のアミノ酸４３〜５８が「細胞インポート配列」、ＣＩＳであることが発見された。この配列から、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ペプチドの種類が開発され（概要は：Ｄｅｒｏｓｓｉら著、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９８年、８：８４〜８７頁参照）、この場合Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−１がオリジナル配列である。
【００２９】
精製されたＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−１並びにＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ−１と異種タンパク質またはペプチドとの融合体は、エンドサイトーシス経路を含まない非典型的プロセスを介して、細胞外空間から細胞質または各内へ取り込まれる。正確なメカニズムは未だに解明されていない。Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ社（ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ））はＰｅｎｅｔｒａｔｉｎの適用の２つの可能性を提供している：
１．Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−１−ペプチドをインポートすべきタンパク質またはペプチドと結合させる；この融合タンパク質を次いで細胞に投与し、細胞に取り込ませる。
【００３０】
２．Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ社のＴｒａｎｓＶｅｃｔｏｒシステムを用いて、目標タンパク質のＤＮＡ配列をＰｅｎｔｅｒａｔｉｎの配列と融合させ、この融合タンパク質をＥ．ｃｏｌｉクテリア内へのベクターの形質転換により組み換えて製造し、ＨＩＳ−Ｔａｇを用いて精製することができる。この組み換えられた融合タンパク質を細胞に投与し、細胞に取り込ませる。
【００３１】
Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅ社（ハイデルベルグ）は、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−１は１００アミノ酸のサイズを上回るタンパク質と一緒に使用する必要があることを記載している。従って、テロメラーゼまたはＴ−Ａｇの輸送のためのタンパク質またはこのタンパク質から誘導されたペプチドの使用も本発明の対象である。
【００３２】
本発明の範囲内で予定される使用方法は、不死化タンパク質とＶｏｙａｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ２２との融合である。この３８ｋＤａのサイズのタンパク質は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）遺伝子ＵＬ４９の遺伝子産物およびＨＳ−ビリオンの主構成タンパク質である。これは細胞間輸送の特別な特性を示す、つまり、文献（Ｅｌｌｉｏｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ  １９９７年、８８：２２３〜２３３頁）に記載されているように、細胞内で合成され、その細胞から隣接する細胞の各領域内へ輸送される。
【００３３】
興味深いことに、ＶＰ２２の融合タンパク質、例えば融合タンパク質ＶＰ２２−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質；Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）もその特性を維持する。
【００３４】
本願明細書の発明から、ＶＰ２２とＳＶ４０の大型Ｔ  Ａｇとの融合が実施され、並びにこの融合タンパク質を産生しかつ分泌するセルラインが製造された。本発明者は、タンパク質とＶＰ２２の融合が目的タンパク質の輸送をセルライン中だけでなく、プライマリー細胞内へも行えることを初めて検出することができた。
【００３５】
このバックグラウンドから、本発明は、更に好ましくは有用なタンパク質のプライマリー細胞への輸送のための、ＶＰ２２と有用なタンパク質、例えば不死化タンパク質とからなる融合タンパク質にも関する。
【００３６】
本発明の範囲内に、ＶＰ２２とテロメアーゼとからなる融合タンパク質の製造および相応するフィーダーセルラインの製造も含まれる。このフィーダー細胞は、不死化すべき細胞と一緒に培養される。この不死化タンパク質が放出され、不死化すべき細胞に取り込まれる。このフィーダー細胞は半透膜を備えた室により目標細胞と空間的に隔てられている。細胞培養シャーレからこの室を取り出すことにより、不死化タンパク質の供給は中断され、目標細胞は再び致死化され、当初の状態に戻る。
【００３７】
ＶＰ２２およびＰｅｎｅｔｒａｔｉｎの他に、目標細胞中へ侵入する能力を有する一連の他のタンパク質もしくはペプチドが存在する（表１参照）。この不死化タンパク質は、本発明の範囲を超えることなく、このタンパク質もしくはこのタンパク質からの配列の１種または数種と融合させることができる。更に、表１に記載されていない並びに今日未だに公知ではないタンパク質形質導入配列も不死化タンパク質と融合することができる。
【表１】
2005506090.tif 000002
【００３８】
本発明の範囲内で、不死化タンパク質の適用の他の予定される可能性は、このタンパク質とレセプターリガンドまたはレセプターと結合できる組み換え一本鎖抗体との融合である。全般的に使用可能なリガンドのプロトタイプはＲＧＤ−モチーフであり、これは付着分子、例えばビトロネクチン、コラーゲンおよびラミニン中に存在し、並びに多くのウイルス、例えばコクサッキーウイルスＡ９およびアデノウイルスのキャプシドタンパク質中に存在する。このＲＧＤ−モチーフは、アミノ酸Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有し、かつインテグリンへの結合を媒介し、このインテグリンはヘテロダイマーの膜−糖タンパク質であり、これはほとんど全ての細胞タイプから発現される。ウイルスはこのメカニズムを介して細胞内へ侵入することができる。ＨａｒｔはＥｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９９年、２：１９３〜１９９頁に分子を細胞内へ輸送するためにＲＧＤ−リガンドを使用することを記載している。本発明の範囲内で、このＲＧＤ−モチーフを不死化タンパク質のテロメアーゼおよびＴＡｇに融合させる。この適用は、共培養したフィーダー細胞から融合タンパク質が分泌される領域内で引き起こされるか、またはバキュロウイルス−システムまたはシステム内で製造された組み換え融合タンパク質として不死化すべき細胞に直接投与される。本発明の範囲内を逸脱することなく、一本鎖抗体を含めた他のリガンドも不死化タンパク質と融合させるかまたは（化学的に）連結させることができると解釈される。ファージディスプレーを介したペプチド−リガンドの同定のために、この明細書中に実施例が存在する。
【００３９】
本発明の範囲内で予定される、不死化タンパク質の適用のためのストラテジーは、特異的な抗体の適用である。Ａｒｎｄｔら著（Ｂｌｏｏｄ  １９９９年、９４：２５６２〜２５６８頁）は、組み換えた特異的なモノクローナル抗体の利用を記載していて、この抗体は一方の側にナチュラルキラー細胞のＣＤ１６−抗原に結合し、かつ他方の側にヒトＨｏｄｋｉｎ腫瘍のＣＤ３０−抗体が認識される。この「二重特異性抗体Ｄｉａｂｏｄｙ」の適用は、ナチュラルキラー細胞による腫瘍細胞の溶解を引き起こす。ハイデルベルグのＡｆｆｉｍｅｄ  Ｔｈｅｒｐｅｕｔｉｃｓ  ＡＧ社はサービス−機能として特別な二重特異性抗体の開発を提供する。本発明の範囲内で、一方の側で予め組み換えにより製造された不死化タンパク質のテロメアーゼまたはＴＡｇと結合し、他方の側で細胞レセプターと結合し、かつそれにより不死化タンパク質のインターナリゼーションを生じさせるような二重特異性抗体を使用することができる。
【００４０】
化学的な適用は、核酸（プラスミド、ベクター、リボザイムなど）をリポソームの形成によって細胞内へ取り込ませるために、例えば、以前から使用されたカチオン性脂質を利用する。Ｚｅｌｐｈａｔｉら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１年、３７：３５１０３〜３５１１０）は、最初に、新規のトリフルオロアセチル化したリポポリアミンのＴＦＡ−ＤＯＤＡＰＬを、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＥと一緒に使用することを記載している。このカチオン性の調製物（この調製物は、９２１２１、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、テレシス・コート１０１９０のジーン・セラピー・システムズ社（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，１０１９０  Ｔｅｌｅｓｉｓ  Ｃｏｕｒｔ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１，ＵＳＡ）から商品名ＢｉｏＰｏｒｔｅｒで市販されている）を用いて、ペプチドおよびタンパク質を高い効率で細胞内へ取り込ませることが可能である。本発明の範囲内で、予め組み換えにより製造した不死化タンパク質のテロメアーゼおよびＳＶ４０  Ｔ−Ａｇを不死化すべきプライマリー細胞内へ取り込ませるために、このＢｉｏＰｏｒｔｅｒ−試薬を使用することができる。同様に、本発明の範囲を逸脱することなく、他の適当なリポソーム−試薬を使用することもできると解釈される。
【００４１】
この数年間に、治療物質の医学的適用のためにナノ粒子の使用が次第に進んできている。ナノ粒子は、リポソームと同様に治療物質のためのキャリアとして利用されるが、この物質をほぼ安定に封入するという利点がある。
【００４２】
Ｓｏｐｐｉｍａｔｈら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００１年、７０：１〜２０頁）はポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（シアノアクリレート）（ＰＣＡ）およびポリ（ｅ−カプロラクトン）（ＰＣＬ）からなる生分解可能なナノ粒子の製造および使用を記載している。ナノ粒子は、１０〜１０００ｎｍのサイズを有し、ＤＮＡ、ＲＮＡ並びにタンパク質／ペプチドを封入するために使用することができる。
【００４３】
本発明の範囲内で、細胞中で予め組み換えにより製造した不死化タンパク質のテロメラーゼおよびＴ−Ａｇを次第に放出する、インターナリゼーション可能なナノ粒子が使用される。特別な適用のために、ナノ粒子の表面が、インターナリゼーション可能なレセプターとの結合を達成するように修飾されていることが重要である。これは、例えばリガンドまたは組み換え一本鎖抗体（単一または二重特異性）とナノ粒子表面との共有結合または非共有結合により達成することができる。ナノ粒子と細胞との付着を改善し、細胞内への取り込みを改善する他の修飾も、本発明の範囲内を逸脱することなく可能である。細胞内へのナノ粒子の取り込みを改善するために、エレクトロポレーションを実施することもできる。
【００４４】
中に不死化タンパク質が封入されている生分解可能なナノ粒子は、特に、治療または予防の範囲内で、例えば心臓のｉｎ  ｖｉｖｏ再生を生じさせるために、患者にｉｎ  ｖｉｖｏで投与するためにも適している。
【００４５】
物理的適用は、例えばエレクトロポレーションが利用され、これは真核細胞および原核細胞において数年来極めて良好なトランスフェクション手段としてＤＮＡの取り込みのために使用されている。この細胞は、数ミリ秒間、数１００ボルトの電場にかけられ、細菌の場合には１００００ボルトまでである。それによりこの細胞膜は短時間穴のあいた状態になるため、著しく極性の巨大分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを効果的に細胞に取り込ませることができる。
【００４６】
Ｌａｍｂｅｒｔら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０年、４：７２９〜７３４頁）並びにＭｏｒｇａｎおよびＤａｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５年、４８：６３〜７１頁）は、エレクトロポレーションを用いて細胞内へタンパク質をも効果的に取り込ませることができるプロトコルを記載している。本発明の範囲内で、予め組み換えにより製造した不死化タンパク質をエレクトロポレーションによって不死化すべきプライマリー細胞内へ導入することができる。
【００４７】
巨大分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のマイクロインジョクションも同様に数年来使用されている。この場合、ステレオマイクロスコープおよびマイクロマニピュレーターを用いて、ガラス針を細胞に直接差し込む。ガラス針またはガラスカニューレを介して、輸送すべき分子を所望の細胞コンパートメント（細胞質または細胞核）内へ直接導入する。これは手動でまたはコンピューター制御で極めて有効に実施することができる。本発明の範囲内で、予め組み換えにより製造した不死化タンパク質をマイクロインジョクションによって不死化すべきプライマリー細胞内へ導入することができる。
【００４８】
このバックグラウンドから、本発明は、器官に関係する細胞を準備し、本発明により使用される不死化タンパク質を外部から供給することによりこの器官に関係する細胞を一時的に不死化し、この不死化細胞を増殖させ、不死化タンパク質の供給を停止することにより増殖した細胞を再致死化させる工程を有する、細胞を獲得する方法に関する。器官に関係する細胞として、この場合に、器官、好ましくは心筋の多分化能の幹細胞、好ましくは間葉系ストローマ細胞または末端分化した休止出発細胞を使用することができる。
【００４９】
本発明による一時的な不死化によって、こうして得られた細胞は臨床的に問題がない。この細胞は、さらに無制限な数で製造することができる。
【００５０】
多分化能の幹細胞を器官に関連する細胞として使用する場合に、幹細胞が器官特異的細胞へと分化することを促進する少なくとも１種の分化誘導物質の添加の後に初めて、一時的に不死化した幹細胞の増殖を行う。この分化した細胞は、次いで本発明による方法を用いて一時的に不死化される。
【００５１】
それに対して、末端分化した出発細胞を使用する場合には、一時的な形質転換との関連で、この細胞は有利に不死化されるため、この細胞はほとんど無制限に増殖することができる。
【００５２】
分化しているが、なお分裂能力のある細胞、例えば新生児の心筋細胞を使用する場合には、形質転換を行わずに、テロメアタンパク質を用いた不死化だけを行うことも想定される。
【００５３】
こうして製造された細胞を用いて、例えば心筋梗塞エリアへの移植を実施することができ、それにより、同時にうっ血性の心臓の拒絶の危険性並びに二次的な致死性の心筋梗塞の危険性が著しく抑制される。この方法は、再生した骨細胞および軟骨細胞を獲得するためにも適していて、この細胞は、骨および軟骨の損傷並びに慢性的な骨の変性（骨粗鬆症）の場合に使用することができる。この方法を用いて、肝臓再生のための肝臓実質細胞並びにパーキンソン病の治療のためのドーパミン作動性細胞を製造することも可能である。
【００５４】
本発明による方法は、組織を体外で製造するために、任意の量のプライマリー細胞を製造することができる。この新規の方法により製造された繊維芽細胞または平滑筋細胞は、心臓弁または静脈弁を作成するために、マトリックス上に、好ましくは例えばコラーゲンまたはフィブロネクチンからなるバイオマトリックス上に定着させることができる。
【００５５】
例えば筋肉細胞、好ましくは心筋細胞並びに骨細胞を製造する場合に、一時的に不死化した幹細胞の増殖の前に、分化誘導物質を添加する場合が有利であり、この分化誘導物質はデキサメタゾン、５’−アザシチジン、トリシスタチンＡ、オールトランス型レチン酸およびアンホテリシンＢから選択される。特に有利なのは、この場合、少なくとも２種の、好ましくは４種のこの分化誘導物質を一時的な不死化の前に使用する場合である。
【００５６】
幹細胞から心筋細胞への分化は５’−アザシチジンの添加により誘導されるが、少なくとも１種の他の分化誘導物質を添加することによりこの分化を改善することができる。この場合、５’−アザシチジンとトリシスタチンＡとの組み合わせが特に適していて、これは本願明細書の発明者の認識によると相乗作用する。この分化は全トランス型レチン酸およびアンホテリシンＢを更に添加することにより更に最適化することができる。
【００５７】
複数の分化誘導物質の組み合わせにおける相乗作用の他に、他の利点は、発明者の認識による５’−アザシチジンの突然変異誘発作用が著しく減少するかまたは全く生じない点である。
【００５８】
この方法により、幹細胞から得られた心筋細胞の臨床的に問題のない適用が可能である。
【００５９】
分化誘導物質のデキサメタゾンの添加により、一時的不死化の前に幹細胞は骨細胞および軟骨細胞に分化する。この場合でも、分化物質の５’−アザシチジン、トリシスタチンＡ、オールトランス型レチン酸およびアンホテリシンＢをさらに添加することにより相乗効果を達成することができる。
【００６０】
この分化誘導物質のデキサメタゾンについてはなお、ＣｏｎｇｅｔおよびＭｉｎｇｕｅｌｌ著「人骨骨髄間葉先駆細胞の表現型および機能型特性（Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells）」、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８１巻、６７〜７３頁が、骨形成細胞が間葉系ストローマ細胞からデキサメタゾン−処理により得られることを既に記載していることに言及する。
【００６１】
器官に関係する細胞として、この場合に自己細胞も同種細胞も使用することができる。
【００６２】
自己細胞の利点は免疫寛容にあるが、同種細胞は、ほぼいつでも無制限な数で供給できるという利点を有する。
【００６３】
従って、患者の治療のために、まず最初に同種細胞から製造した移植可能な細胞を使用し、その間に平行して患者の自己細胞から他の移植可能な細胞を製造することができる。次いで十分に移植可能な自己細胞が提供される場合に、この自己細胞をだけを移植するために、免疫寛容はもはや問題ない。
【００６４】
この新規の方法を用いておよび場合により新規の手段を使用して製造した細胞も、同様に本発明の対象である。この細胞は、本発明の場合に、器官を再生するための増殖片の製造のためまたは慢性疾患の治療のために使用することができる。
【００６５】
このバックグラウンドから、本発明は同様に、本発明により製造された細胞を含有する増殖片に関する。
【００６６】
さらに、本発明は器官の再生のためのこの細胞の使用に関する。
【００６７】
本発明は、同様に本発明により使用された不死化タンパク質並びに不死化タンパク質をコードする核酸分子および不死化タンパク質を発現するためのプラスミド、並びに不死化タンパク質の発現のために形質転換された細胞、特にフィーダー細胞にも関する。
【００６８】
特に、本発明は、ブダペスト条約により２００１年１０月１７日付でＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ在のＤＳＭＺに、寄託番号ＤＳＭ１４５７０および１４５６８として寄託した、ｐＣＭＶ−ＶＰ２２−ＴＡｇおよびｐｃＤＮＡ−ＴＡｇ−ＶＰ２２と称されるプラスミドにも関し、このプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１中にトランスフェクションされかつこのプラスミドを用いて融合タンパク質を製造することができる。
【００６９】
最後に、本発明は、本発明によるプラスミドおよび／または不死化タンパク質を有する、一時的に不死化するためのキットに関する。
【００７０】
この本発明によるキットは、本発明によるプラスミド、核酸分子および／または不死化タンパク質の他に、生化学的、化学的または物理的に適用するためにさらに必要な物質および材料を含むことができる。
【００７１】
このキットを用いて、同種のまたは自己の提供者細胞を一時的に不死化し、増殖させ、その後にこの細胞を器官再生のために移植することができる。
【００７２】
他の利点は発明の詳細な説明および添付の図面に記載されている。
【実施例】
【００７３】
前記した特徴および後記のなお詳説する特徴はそれぞれ記載された組み合わせだけではなく、本発明の範囲を逸脱することなしに他の組み合わせまたは単独で使用可能である。
【００７４】
本発明を、実施例および添付した図面を用いて詳説する。
【００７５】
例  １：ＳＶ４０−ＴＡｇとＶＰ２２とからなる融合タンパク質のクローニング
ＶＰ２２−Ｔ−抗原並びにＴ−抗原−ＶＰ２２、つまりＮ末端融合タンパク質並びにＴ末端融合タンパク質の発現を可能にする発現構築物を製造した。
【００７６】
ａ．突然変異形成
このために、最初に指定部位ＰＣＲ突然変異誘発を用いて、停止コドンを有していないＳＶ４０  Ｔ−抗原を有するプラスミドを製造した（プライマーは表２参照）。このプラスミドをｐＩＮＤ−ＴＡｇ（−Ｓｔｏｐ）と命名した。このＳＶ４０  ＴＡｇは、ハンブルク大学の実験ウイルス学および免疫学研究所（Institut fuer Experimentelle Virologie und Immunologie）のＰｒｏｆ．Ｗ．Ｄｅｐｐｅｒｔ，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｐｅｔｔｅから入手した。「指定部位」突然変異誘発の場合に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のキットを使用した。
【表２】
2005506090.tif 000003
【００７７】
ｂ．クローニング
プラスミドｐＩＮＤ−ＴＡｇ（−Ｓｔｏｐ）から、制限エンドヌクレアーゼのＥｃｏＲＩおよびＢｇＩＩＩを用いた二重消化により停止コドンフリーのＴ−抗原−フラグメントが得られた。
【００７８】
プラスミドｐＣＤＴＫ４９からＶＰ２２−フラグメントをＮｏｔｌおよびＢｇＩＩＩ消化によって製造し、ベクターとしてｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＮｏｔｌおよびＥｃｏＲＩ消化により製造した。融合タンパク質ＴＡｇ−ＶＰ２２用の、ＣＭＶ−プロモーターにより制御される発現カセットを有する発現構築物ｐｃＤＮＡ−ＴＡｇ−ＶＰ２２が得られた（図７および８のｐｃＤＮＡ−ＴＡｇ−ＶＰ２２のプラスミドカセットおよび配列を参照）。このプラスミドは、ブダペスト条約に従って２００１年１０月１７日付でＤＳＭＺに寄託番号ＤＳＭ１４５６８で寄託され、これはＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１中にトランスフェクションされている。
【００７９】
ベクターｐＶＰ２２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用下で発現プラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ２２−ＴＡｇを製造した。このためにｐＩＮＤ−ＴＡｇからＫｐｎｌおよびＥｃｏＲＩを用いた二重消化によりＴ−抗原−フラグメントが得られ、これを同様にＫｐｎｌおよびＥｃｏＲＩを用いて開放したベクターｐＶＰ２２中に挿入した（図５および６中のｐｃＣＭＶ−ＶＰ２２−ＴＡｇのプラスミドマップおよび配列を参照）。このプラスミドは、ブダペスト条約に従って２００１年１０月１７日付でＤＳＭＺに寄託番号ＤＳＭ１４５７０で寄託され、これはＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１中にトランスフェクションされている。
【００８０】
この融合タンパク質は、ＶＰ２２−タンパク質の大型Ｔ−抗原のＮ末端への融合を表し、この発現は同様にＣＭＶ−プロモーターによって制御される。
【００８１】
例  ２：ＳＶ４０  ＴＡｇとＶＰ２２とからなる融合タンパク質の検出
クローニングにより実際にＶＰ２２とＳＶ４０大型Ｔ抗原とからなる融合タンパク質が生じていることの検証は、引き続くウェスタン−ブロット分析を用いたトランスフェクション試験で行われる（図１および２）。
【００８２】
まず最初に新規の発現構築物を一時的トランスフェクションによりＴ抗原ネガティブ細胞中へ導入する。引き続き、これからタンパク質抽出液を得て、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、モノクローナルアンチ−ＳＶ４０Ｔ抗原抗体並びにポリクローナルアンチ−ＶＰ２２抗血清を用いて分析した。
【００８３】
融合タンパク質でトランスフェクションした細胞はタンパク質を発現し、このタンパク質は期待すべき融合タンパク質のサイズを示し、かつ２つの種類の抗体によっても認識されたことが判明した。
【００８４】
例  ３：フィーダーセルラインの作成
「融合タンパク質生産者」として機能することができるセルラインを作成するために、１０ＳＷ−細胞（ヒト、アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂで形質転換された網膜細胞）を、融合タンパク質−発現プラスミドでトランスフェクションし、引き続きＣ４１８で選択した、それというのもこの発現構築物はネオマイシン耐性も媒介しているためである。
【００８５】
数週間選択した後、Ｃ４１８耐性の細胞の混合集団が生じた。免疫組織化学的調査は、期待されていたように、細胞の全てが融合タンパク質を発現しないことを示した（図３参照）。ｉｎ  ｓｉｔｕ局在化技術（免疫蛍光法、二重染色）を用いてこの系の機能性を検出することができた。フィーダーセルラインのたいていの細胞は融合タンパク質を産生し、この融合タンパク質は隣接する細胞へ拡散した。このことは産生しかつ発現する細胞が細胞質中だけでなく細胞核にも融合タンパク質を含有し、インポートされる細胞は融合タンパク質を細胞核だけに含有することが認識できる（図３、ＣおよびＦ）。この細胞は、終点希釈によりサブクローニングすることで、次にフィーダーセルラインが存在し、これは、均質に、つまり各細胞中で不死化タンパク質を発現する。このフィーダー細胞を用いて、ＴＡｇ−ＶＰ２２融合タンパク質のプライマリー細胞中への輸送は、共培養試験を用いて調査することができ、同様にＴＡｇの機能性はＮＩＨ３Ｔ３−形質転換アッセイで調査することができた。更に、共免疫沈降によりＴＡｇのｐ５３およびｐＲＢとの結合を試験することができた。
【００８６】
フィーダー細胞として致死化細胞並びに不死化細胞を使用することができる。
【００８７】
例  ４：プライマリー細胞中へのＶＰ２２−融合タンパク質のインポート
発明者は、次のように、ＶＰ２２−タンパク質がそれと共に融合したタンパク質をプライマリー細胞中へ輸送することを証明した。これは今まで腫瘍セルラインにとって公知であった。ＶＰ２２−融合タンパク質−インポートがヒト繊維芽細胞、ヒト平滑筋細胞およびヒト心筋細胞中へも行われるかどうかを試験した。
【００８８】
このため、ＣＯ６０−細胞（ＳＶ４０により形質転換されたハムスターセルライン）を、組み換えアデノウイルスで感染し、このアデノウイルスはＣＭＶ−プロモーターの制御下でのＶＰ２２とＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とからなる融合遺伝子を含有する。このアデノウイルスで感染された細胞を、上記のプライマリー細胞のそれぞれの種類と一緒に滅菌カバーグラス上に播種した。約４８時間インキュベーションした後に、このカバーグラスをホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学的に調査した。このために、マウス−アンチ−ＳＶ４０−Ｔ−抗原とウサギ−アンチ−ＶＰ２２との抗体コンビネーションを使用した。
【００８９】
当初に感染されたＣＯ６０−細胞は、つまりＳＶ４０−Ｔ−抗原に対して陽性でかつＶＰ２２−ＧＦＰ−融合タンパク質に対して陽性であることにより同定することができた。ＶＰ２２−ＧＦＰを細胞間輸送プロセスによって得られたプライマリー細胞は、ＶＰ２２については陽性であるが、ＳＶ４０−Ｔ−抗体については陽性でない。
【００９０】
ＶＰ２２−融合タンパク質の輸送は不死化されたプライマリーヒト心筋細胞だけでなく、試験したプライマリーヒト心筋細胞中へも可能であることが明らかである。ＶＰ２２と融合したタンパク質、つまりＧＦＰもしくは不死化遺伝子の機能はプライマリー細胞中に維持された。
【００９１】
例  ５：ヒトテロメラーゼの触媒サブユニットのクローニング
不死化のために最も重要な遺伝子、ヒトテロメラーゼの触媒サブユニットは、ヒト細胞からクローニングした（このテロメラーゼ−フラグメントｈＴＲＴｐｌｕｓのＤＮＡ−配列およびヒトテロメラーゼの触媒サブユニットを有するプラスミド−マップを図９および１０に示す）。このテロメラーゼのｃＤＮＡは極めて高いＧ／Ｃ割合を有し、かつクローニングするのが極端に困難である。従って、固有のテロメラーゼ−ｃＤＮＡを供給するグループは世界中でも極めてわずかに存在するだけである。図９および１０からのテロメラーゼは公知のおよび公開されたテロメラーゼとは異なり１０９ｂｐのイントロンを有する。イントロンは転写安定化作用を有する。このテロメラーゼは公知のテロメラーゼと区別するためにｈＴＲＴｐｌｕｓと命名される。
【００９２】
このテロメラーゼは次の工程でクローニングした：
１．ヒトＪｕｒｋａｔ−細胞（Ｔ−リンパ腫−セルライン）からｍＲＮＡを得た。
【００９３】
２．これを、特異的ＲＴ−プライマー（表３参照）を用いて逆転写においてｃＤＮＡ−分子に書き換えた。（ＭＭＬＶの逆転写酵素）。
【００９４】
３．こうして得られたｃＤＮＡ−プールから、個々のＰＣＲ−反応（表４参照）で、ヒトテロメラーゼ遺伝子のコードする領域のそれぞれ約５００〜１０００ｂｐを含むフラグメントを得た。この場合、それぞれこのｃＤＮＡに対して唯一の制限切断部位を含有するようなテロメラーゼ−ｃＤＮＡの領域において重複するフラグメントが生じるように、プライマーを選択した。
【００９５】
４．最も遠くの５’にあるフラグメントは、テロメラーゼ−ｍＲＮＡの逆転写によって作成されず、Ｈｅｌａ−細胞（ヒト子宮頚癌−セルライン）からゲノムＤＮＡのＰＣＲによって直接得た。この場合、高Ｇ／Ｃの配列に対する特別なＰＣＲ−技術を使用した。
【００９６】
５．得られたフラグメント（表５）をプラスミドベクター中へクローニングし（表６）、細菌中で増幅させた。全てのフラグメントを配列決定法によって調査した。テロメラーゼｃＤＮＡの位置９９３での塩基交換が見られた。ここでは当初から存在するＣはＡに交換されている。しかしながらこれは沈黙突然変異であり、つまり塩基交換はアミノ酸配列に影響しない。
【００９７】
多様な３成分−リゲーションにおいて、ここのフラグメントは、ヒトテロメラーゼの完全コード領域を含む変異体に組み立てられた。生じたプラスミドは、ｐｃｒｓｃｒｉｐｔ−テロメラーゼ（プラスミドカセットおよびｈＴＲＴ９の配列、図９および１０参照）と呼ばれ、ブダペスト条約により２００１年１０月１７日付でＤＳＭＺに寄託番号ＤＳＭ１４５６９でき託され、これはＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ  １０１中にトランスフェクションされている。
【表３】
2005506090.tif 000004
【表４】
2005506090.tif 000005
【表５】
2005506090.tif 000006
【表６】
2005506090.tif 000007
【００９８】
例  ６：ＶＰ２２とテロメラーゼの触媒サブユニットとからなる融合タンパク質を哺乳類細胞中で発現するためのベクターのクローニング
ＶＰ２２−配列がテロメラーゼ−配列の５’側にある、ＶＰ２２とテロメラーゼの触媒サブユニットとからなる融合タンパク質を哺乳類細胞中で発現することができるベクターを構築した。
【００９９】
ａ．構築物のｐｃｒｓｃｒｉｐｔ−テロメラーゼの突然変異誘発
発現ベクターのクローニングのために、この構築物のｐｃｒｓｃｒｉｐｔ−テロメラーゼ中にまず最初に、テロメラーゼ−配列中の開始コドンの前にある停止コドンを、「指定部位ＰＣＲ突然変異誘発」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のキット）によって除去し、この代わりにＫｐｎ  Ｉ−切断部位を挿入した。このために、表７に記載されたプライマー＃１を使用した。相応する「リバース」プライマーを用いたＰＣＲの後で、これから得られたプラスミドを第２の「指定部位ＰＣＲ突然変異誘発」のために使用した。このプライマー＃２を用いて実施した突然変異誘発は、テロメラーゼ−配列の３’末端にある停止コドンの除去と、それと同時のＡｇｅｌ−切断部位の挿入とのために利用し、それにより、ベクターｐＶＰ２２／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に存在する「Ｈｉｓ−ｔａｇ」との「ｉｎ  ｆｒａｍｅ」融合が可能である。
【０１００】
ｂ．構築物ｐＣＭＶ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−Ｈｉｓのクローニング
発現構築物のｐＣＭＶ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−Ｈｉｓのクローニングのために、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ  ＩおよびＡｇｅ  Ｉを用いてフラグメントを突然変異したプラスミドから切り出し、このフラグメントは５’末端にある開始コドンを有するが、３’末端には停止コドンを有していないテロメラーゼ配列を有する。このフラグメントを引き続き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＫｐｎ  ＩおよびＡｇｅ  Ｉで開放したベクターｐＶＰ２２／ｍｙｃ−Ｈｉｓ中に方向性を維持してクローニングし、その結果、Ｎ末端のＶＰ２２、テロメラーゼおよびＣ末端の「Ｈｉｓ−ｔａｇ」とからなる融合遺伝子がＣＭＶ−プロモーターの制御下に存在する。
【表７】
2005506090.tif 000008
【０１０１】
例  ７：ＶＰ２２テロメラーゼ用のフィーダーセルラインの作成
ＶＰ２２−テロメラーゼを発現するフィーダーセルラインの製造を、ＴＡｇ−ＶＰ２２フィーダーセルラインと同様に実施し、その際、構築物ｐＣＭＶ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−Ｈｉｓを１０ＳＷ−細胞中へ安定にトランスフェクションした。この構築物はネオマイシン耐性遺伝子を有するため、Ｇ４１８の投与下でＶＰ２２−テロメラーゼ−タンパク質を安定して発現する細胞を選択することができた。
【０１０２】
例  ８：プライマー細胞とフィーダー細胞との共培養
ウィースバーデン（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）のＮｕｎｃ  ＧｍｂＨ社は、フィーダー細胞と不死化すべきプライマリー細胞との共培養を行うことができる特別な細胞培養および組織培養器具を供給している。
【０１０３】
この器具の膜は、付着細胞の付着および増殖のために用いられる。一方のセルタイプ（例えばフィーダー細胞）を膜上で培養することができ、他方のセルタイプ（例えばプライマリー細胞）は適合するマルチシャーレのウェル付き底部中に保持され、双方の培養は相互に直接接触しない。イオン、タンパク質および他の物質はそれに対して膜の孔を通して自由に拡散できる。多様な孔サイズの選択により、更に通り抜ける物質の大きさを決めることができる。
【０１０４】
本発明の範囲内で、前記の実施例中に記載されたフィーダー細胞はこのような膜器具上に播種した。工業的規模のために、細胞培養室のサイズおよびこれに適合する膜器具を相応して適合させる。
【０１０５】
本発明の範囲内で、フィーダー細胞並びにプライマリー細胞の大量培養用にバイオリアクターを使用することも可能である。フィーダー細胞およびプライマリー細胞は、バイオリアクターの中の２つの別個の室中に播種される。これらの室は半透膜で仕切られているため、プライマリー細胞への不死化タンパク質の拡散は可能である。
【０１０６】
このフィーダー細胞は、プライマリー細胞との混合培養で存在することもできる。この場合、懸濁細胞をフィーダー細胞として使用しかつ単層細胞をプライマリー細胞として使用するか、またはその逆で使用するのが有利である。それにより、不死化を行った後に、フィーダー細胞をプライマリー細胞から機械的に分離することもできる。このフィーダー細胞は、細胞毒遺伝子（例えば発現可能なＨＳＶ−チミジンキナーゼ）の安定なトランスフェクションにより、相応するプロドラッグ（この場合ガンシクロビル（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ））の投与により選択的に殺すことも可能である。
【０１０７】
フィーダー細胞とプライマリー細胞とを分離する他の技術も可能である（例えば、蛍光標識式細胞分取器：Fluorescence Activated Cell Sorter［ＦＡＣＳ］または磁気標識式細胞分取器：Magnetic Activated Cell Sorter［ＭＡＣＳ］を用いる表面分子上での選別）。
【０１０８】
例  ９：ＶＰ２２とテロメラーゼ触媒サブユニットとからなる精製した組み換え融合タンパク質の獲得のためのバキュロウイルス構築物のクローニング
ＶＰ２２−テロメラーゼ−融合タンパク質の獲得は、バキュロウイルス−発現系中で行い、この発現系は一方でタンパク質を細胞から排出することができ、従って天然のフォールディングおよびモディフィケーションが可能であり、他方でこのタンパク質のアフィニティクロマトグラフィーによる生成が可能である。
【０１０９】
ａ．プラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−ＨｉｓおよびｐＭｅｌＢａｃ（Ａ）の突然変異誘発
このクローニングの出発構造体として、プラスミド「ｐＣＭＶ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−Ｈｉｓ」およびバキュロウイルス発現ベクターｐＭｅｌＢａｃ（Ａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、この中にそれぞれ「指定部位ＰＣＲ突然変異誘発」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のキット）を用いて付加的なＨｉｎｄ  ＩＩＩ−制限切断部位を挿入した。プラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−Ｈｉｓの場合には、このために表８に記載したプライマー＃１を使用し、それによりＣＭＶ−プロモーターとＶＰ２２−配列との間にあるＨｉｎｄ  ＩＩＩ−切断部位の他に、付加的にＨｉｎｄ  ＩＩＩ−切断部位を「Ｈｉｓ−ｔａｇ」の３’側にインサートした。ｐＭｅｌＢａｃ−ベクターの場合には、プライマー＃２（表８）を用いた突然変異誘発を用いて付加的なＨｉｎｄ  ＩＩＩ−切断部位を、分泌シグナルの直後にマルチクローニング部位中へ挿入した。
【表８】
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【０１１０】
ｂ．構築物ｐＭｅｌＢａｃ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−Ｈｉｓのクローニング
分泌型バキュロウイルス−発現ベクターのクローニングのために、突然変異誘発した構築物ｐＣＭＶ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−Ｈｉｓから、テロメラーゼ含有のフラグメントをＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いた制限消化により切り出し、単離し、同様にＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断した突然変異誘発したベクターのｐＭｅｌＢａｃ（Ａ）中へクローニングした。ｐＭｅｌＢａｃ中に含まれるミツバチ−メリチン−分泌シグナルがＶＰ２２−テロメラーゼ−Ｈｉｓ−フラグメントのＮ末端に「ｉｎ  ｆｒａｍｅ」で存在するクローン（ｐＭｅｌＢａｃ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−Ｈｉｓ）を、制限切断および配列決定により同定しかつ分析した。
【０１１１】
例１０：ＶＰ２２およびＳＶ４０  Ｔ−抗原からなる精製した組み換え融合タンパク質の獲得のためのバキュロウイルス構築物のクローニング
組み換えＶＰ２２−Ｔａｇ−融合タンパク質の獲得を、ＶＰ２２−テロメラーゼ−融合タンパク質についてと同様に分泌型バキュロウイルス−発現系中で行った。バキュロウイルス−発現ベクターのクローニング用の出発構築物として、プラスミドｐＣＭＶ−ＶＰ２２−ＴＡｇおよびバキュロウイルス発現ベクターｐＭｅｌＢａｃ（Ａ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。
【０１１２】
ａ．構築物ｐＣＭＶ−ＶＰ２２−ＴＡｇの突然変異誘発
まず最初に、構築物ｐＣＭＶ−ＶＰ２２−ＴＡｇ中に、「指定部位ＰＣＲ突然変異誘発」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のキット）を用いてプライマー＃１（表９）によって付加的なＡｇｅ  Ｉ−切断部位をＳＶ４０  Ｔ−抗原の配列の後方に挿入し、同時にその部位に存在する停止コドンを除去した。引き続き、第２の「指定部位ＰＣＲ突然変異誘発」を用いてプライマー＃２（表９）によって付加的なＢｇｌ  ＩＩ−切断部位をＣＭＶ−プロモーターの配列とＶＰ２２−タンパク質の配列との間にインサートし、その際、その部位に存在するＨｉｎｄ  ＩＩＩ−切断部位を除去した。
【表９】
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【０１１３】
ｂ．ベクターｐＭｅｌＢａｃ（Ａ）のモディフィケーション
ベクターｐＭｅｌＢａｃ（Ａ）中で、ミツバチ−メリチン−分泌配列の３’側に２つの制限切断部位Ｂｇｌ  ＩＩおよびＰｍｅ  Ｉをインサートし、その際に、このベクターをＢａｍ  ＨＩで開放し、２つの制限切断部位を含有する二本鎖折り後ヌクレオチドをクローニングする。ｐＭｅｌＢａｃ−ベクター中へインサートする前に相互にハイブリダイゼーションしたこのオリゴヌクレオチドの双方の相補的一本鎖の配列を表１０に記載する。
【表１０】
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【０１１４】
ｃ．バキュロウイルス−発現ベクターｐＭｅｌＢａｃ−ＶＰ２２−Ｔａｇ−Ｈｉｓのクローニング
Ａｇｅ  Ｉ−フラグメントを突然変異したｐＣＭＶ−ＶＰ２２−Ｔａｇ−構築物から切り出し、引き続き再ライゲーションすることにより、まず最初にＳＶ４０−Ｔ−抗原の配列を構築物中に存在する「Ｈｉｓ−ｔａｇ」の直近にもたらし、その結果、発現すべきＶＰ２２−Ｔａｇ−融合タンパク質のＣ末端に「Ｈｉｓ−ｔａｇ」が設けられる。引き続き、このｐＣＭＶ−ＶＰ２２−Ｔａｇ−Ｈｉｓと称される構築物から、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ  ＩＩおよびＰｍｅ  Ｉを用いてフラグメントを切り出し、これをモディフィケーションしかつ同じ制限酵素で切断したベクターｐＭｅｌＢａｃ中に方向性を維持してクローニングし、それによりベクターｐＭｅｌＢａｃ−Ｖ２２−Ｔａｇ−Ｈｉｓが生じる。
【０１１５】
例１１：ＶＰ２２−テロメラーゼ−ＨｉｓもしくはＶＰ２２−Ｔａｇ−Ｈｉｓ−融合タンパク質の獲得および精製
タンパク質発現および精製をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の使用説明書に従って実施し、その際に新規に構築したベクターｐＭｅｌＢａｃ−ＶＰ２２−Ｔａｇ−ＨｉｓもしくはｐＭｅｌＢａｃ−ＶＰ２２−Ｔｅｌｏ−Ｈｉｓを使用した。
【０１１６】
例１２：不死化タンパク質を心筋細胞内へ輸送するためのペプチド−リガンドもしくは抗体−リガンドの同定
不死化すべき心筋細胞と相互作用しかつインターナリゼーションさせるペプチド−リガンドの同定を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社のランダムペプチドファージディスプレーライブラリーを用いて行った。これは７ｍｅｒまたは１２ｍｅｒペプチドをフィラメント状のファージのＰ３−タンパク質と融合した形態で含有する。このファージは細胞と一緒にクロロキンの存在でインキュベーションし、その際にクロロキンの投与は、リソソーム内へインターナリゼーションしたファージがデグラデーションすることを抑制する。結合しないファージを洗い流し、表面に会合したファージをｐＨ変化により細胞から取り外した後に、インターナリゼーションしたファージを細胞の溶解により放出させた。このアフィニティ選択を数回繰り返した（’Ｐａｎｎｉｎｇ’）。引き続き、ファージ−ＤＮＡの該当部分を配列決定し、対応するペプチド−モチーフを競合ＥＬＩＳＡで相応して標識した合成ペプチドを用いて結合アフィニティおよびインターナリゼーション率を調査した。
【０１１７】
前記したタンパク質の輸送のために同じく使用した「一本鎖」−抗体の同定のために、ランダムペプチドファージディスプレーライブラリーの代わりに、一本鎖ファージミド−ライブラリーをアフィニティ選択のために使用した。
【０１１８】
例１３：器官に関連する細胞の準備
器官に関連する細胞として、一時的な不死化および増殖の前になお器官特異的細胞へ分化させなければならない多分化能の幹細胞、または既にそれぞれの器官の分化した出発細胞を使用した。
【０１１９】
更に、それぞれの患者の自己細胞または提供者の同種細胞の間で区別しなければならない。
【０１２０】
幹細胞として、骨髄の間葉系ストローマ細胞を使用する。これは、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞並びに他のセルタイプに分化することができる。臨床において、骨髄は同種の骨髄移植のためのＯＰ条件下で通常操作で得られる。しかしながら、その際には造血幹細胞が必要なだけであり、他方でここで重要となる間葉系幹細胞は副産物として生じる。
【０１２１】
他方で、間葉系幹細胞は末梢血液から得ることもできる。
【０１２２】
こうして採取した幹細胞を常用の細胞培養シャーレ中に播種し、ＦＫＳ１０％、並びに抗生物質、例えばペニシリン、ストレプトマイシンまたはアンホテリシンＢを有するアルファ−ＭＥＭまたはＩＤＥＭ−培地中で培養する。
【０１２３】
肝臓の肝実質細胞をプライマリー培養として直接使用する。ドーパミン作動性出発細胞を、臓器提供者の範囲内で取り出す。心筋細胞を、骨髄からの幹細胞として、並びに心筋−バイオプシーの範囲内での出発細胞として不死化のために得ることができる。
【０１２４】
例１４：増殖および分化
既に末端で分化している出発細胞は、常用の培地中で不死化タンパク質の投与下でまたはフィーダー細胞との共培養において、他の手段を必要とせずに増殖する。
【０１２５】
不死化すべき細胞はしかしながら複製可能な細胞であり、例えば骨髄からの間葉系幹細胞であり、まず最初に分化誘導物質の添加により器官特異的細胞へ分化させる必要があり、その後で一時的な不死化を行うことができる。
【０１２６】
５’−アザシチジンを用いた処理により、間葉系幹細胞を、例えば心筋細胞へ分化させることができる；Ｍａｋｉｎｏら著、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９年、１０３：６９７〜７０５頁。心筋細胞の発生能力を有する幹細胞の５’−アザシチジン処理は、脱メチルにより分化プロセスが引き起こされる。この場合に、未知の必須の心筋−分化遺伝子のプロモーターが活性化されることはほぼ間違いない。
【０１２７】
発明者の認識によると５’−アザシチジンはしかしながら突然変異誘発能力を有する。従って、幹細胞の心筋細胞への分化は、本発明の場合に、少なくとも１種の他の分化誘導物質の添加により改善される。このために物質のトリシスタチンＡ（Ｔｒｉｃｈｓｔａｔｉｎ  Ａ；  ＴＳＡ）が使用される。ＴＳＡはヒストン−脱アセチルの阻害を引き起こす。このヒストン−脱アセチルは、ＣｐＧ−メチル化の転写抑制と関連している。
【０１２８】
ＣｐＧ−アイランド、つまり多くのＣｐＧ−ジヌクレオチドを有する領域が、プロモーター中に主に存在する。メチル化により、ＣｐＧ濃度の高いプロモーターの活性を著しく阻害することができる。このことは、例えば５’−アザシチジンがＤＮＡを複製する細胞内へ導入された場合、５位にあるアザ基によりそこでは細胞プロセスによるメチル化を行えないことが起こる。
【０１２９】
５’−アザシチジンおよびＴＳＡの組み合わせは、腫瘍細胞中で既に示されたように、従って相乗作用を示すことができる；Ｃａｍｅｒｏｎら著、「癌の休眠中の遺伝子の再発現における脱メチル反応およびヒストン脱アセチル化抑制の相乗作用（Synergy of demethylation and histonedeacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer）」、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１巻、１０３〜１０７頁参照。
【０１３０】
この相乗作用は、本発明の場合には幹細胞の分化により心筋細胞へ伝達される。全トランス型レチン酸およびアンホテリシンＢを更に添加することによりこの分化は更に最適化される。レチン酸は分化誘導物質であり、これは筋芽細胞−セルラインＨ９Ｃ２中で骨格筋表現型に対して心筋表現型体を優先する；Ｍｅｎａｒｄら著、「Ｈ９Ｃ２心臓細胞のレチノイン酸誘導分化の間のＬ型カルシウムチャネル発現の調節作用（Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４巻、２９０６３〜２９０７０巻参照。
【０１３１】
アンホテリシンＢも、心筋細胞の方向への分化に有利な影響を及ぼす；Ｐｈｉｎｎｅｙら著「近親交配のマウスの一般的に使用される菌株の骨髄からのプラスチック付着性間質細胞：収率、成長、および分化における変化（Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice:variations in yield,growth,and differentiation）」、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２巻、５７０〜５８５頁参照。
【０１３２】
複数の分化誘導物質からなる組み合わせを使用する利点は、５’−アザシチジンの突然変異作用を著しく減少または全く停止させる相乗効果が達成されることにある。これは、幹細胞から得られた心筋細胞の後の臨床的適用のために決定的に重要である。
【０１３３】
分化誘導物質のデキサメタソン（Ｃｏｎｇｅｔら、上述の文献箇所）単独または上記した４種の分化誘導物質との組み合わせた場合に、幹細胞を骨細胞および軟骨細胞へ分化させることができる。
【０１３４】
こうして分化した細胞を、次いで更に増殖させるために一時的に不死化する。
【０１３５】
例１５：移植
再致死化を行いかつ相応して品質制御した後で、細胞を通常の技術で損傷した器官内へ移植する、例えば器官内への注射により注入する。これは繰り返し行うことができる、それというのもこの不死化に基づき材料をそれぞれ所望の量で提供できるためである。
【０１３６】
不死化なしでは、１個の幹細胞から約５×１０８〜１×１０９個、高年齢の提供者の場合には場合により１×１０６個の細胞が生じるにすぎない。これは再生のためには恐らく少なすぎる。自己移植の場合に、患者は、細胞が必要な細胞数にまで増殖するまで長期間待たなければならない。同種移植の場合には、それに対して常に所望の細胞数を準備することができる。
【０１３７】
特に緊急の場合に、最初に同種移植を実施し、後に自己移植に切り換えることが有利である。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】融合タンパク質中のＴＡｇのウェスタン−ブロット検出を表す。
【図２】融合タンパク質中のＶＰ２２のウェスタン−ブロット検出を表す。
【図３】ＶＰ２２−ＴＡｇ発現するセルラインの作成を示す、細胞染色を表す。
【図４】プライマリーヒト心筋細胞中へのＶＰ２２−インポートを示す、細胞染色を表す。
【図５】ｐＣＭＶ−ＶＰ２２−ＴＡｇのプラスミドマップを表す。
【図６】図５からの融合タンパク質ＶＰ２２−ＴＡｇの配列を表す。
【図７】ｐｃＤＮＡ−ＴＡｇ−ＶＰ２２のプラスミドマップを表す。
【図８】図７からの融合タンパク質ＴＡｇ−ＶＰ２２の配列を表す。
【図９】ｐｃｒｓｃｒｉｐｔ−テロメラーゼのプラスミドマップを表す。
【図１０】図９からのテロメラーゼ遺伝子ｈＴＲＴｐｌｕｓの配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506090.tif 000081
【国際調査報告】
2005506090.tif 000082
2005506090.tif 000083
2005506090.tif 000084
2005506090.tif 000085
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