(57)【要約】本発明は、Ｒａｆ／Ｒａｓ媒介型シグナル伝達の阻害剤としてＧＩＬＺタンパク質関連化合物を用いて、Ｒａｓ／Ｒａｆ複合体によって活性化されるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を阻害する新規手段を提供する。そのような化合物を含む医薬組成物も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒａｆタンパク質と結合し、且つＭＡＰＫ経路を阻害することができる化合物であって、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド；
ｂ）配列番号３の少なくとも５個連続のアミノ酸を含んで成るＧＩＬＺのＮ末端ドメインのフラグメント；
ｃ）１又は複数のアミノ酸残基が付加され、欠失され、又は置換されている（ａ）又は（ｂ）の活性変異体；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）、及びＧＩＬＺ以外のタンパク質に属するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド又はペプチド、
から選択される化合物。
【請求項２】
ペプチドＧＩＬＺ（１−２０）、ＧＩＬＺ（２１−５０）、ＧＩＬＺ（１−５０）、ＧＩＬＺ（１０−３０）、ＧＩＬＺ（１０−４０）、ＧＩＬＺ（１６−２２）、ＧＩＬＺ（３０−３６）、ＧＩＬＺ（１０−５０）、ＧＩＬＺ（３０−５０）、ＧＩＬＺ（１６−５８）、又はＧＩＬＺ（１−３６）に相当する、請求項２に記載の化合物。
【請求項３】
４〜２５個のアミノ酸を含むペプチドに相当し、且つ配列番号３に対して少なくとも７０、８０又は９０％の配列同一性を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
活性画分、前駆体、塩、又は誘導体の形態の、請求項２〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
ペプチドミメティックの形態の、請求項２〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
請求項２〜６のいずれか１項に記載の化合物であって、それらの侵入を容易にし、又は細胞膜から細胞質へのそれらの透過性を増強する分子で修飾された化合物。
【請求項７】
Ｒａｆ／Ｒａｓ及びＧＩＬＺに関連する配列及び構造情報を利用するコンピューター支援設計方法によって単離され、同定され、そして／あるいは特徴付けられる化合物。
【請求項８】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のＧＩＬＺ由来ペプチド及びタンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含んで成る発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１１】
少なくとも１％の前記化合物を含む、請求項２〜７のいずれか１項に記載の化合物の精製した調製物。
【請求項１２】
Ｒａｆ及び／又はＲａｓと結合し、且つＭＡＰＫ経路を阻害する化合物をin vitro及びin vivoでスクリーニングする方法であって、前記化合物の作用と、請求項２〜８のいずれか１項に記載の化合物によって提供される作用とを比較することによってスクリーニングする方法。
【請求項１３】
Ｒａｆ及び／又はＲａｓと結合し、且つＭＡＰＫ経路を阻害する化合物をin vitro及びin vivoでスクリーニングするキットであって、前記化合物の作用と、請求項２〜８のいずれか１項に記載の化合物によって提供される作用とを比較することによってスクリーニングするキット。
【請求項１４】
動物、器官、組織、又は培養細胞におけるＭＡＰＫによって媒介される不所望の細胞増殖を阻害する方法であって、有効量の、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の化合物を投与することによって阻害する方法。
【請求項１５】
有効量の請求項２〜１０のいずれか１項に記載の化合物を投与することによって悪性腫瘍を処置する方法。
【請求項１６】
有効量の請求項２〜１０のいずれか１項に記載の化合物を投与することによって、炎症又は自己免疫疾患を処置する方法。
【請求項１７】
薬物としての請求項２〜１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１８】
活性成分として請求項２〜１０のいずれか１項に記載の化合物のうちの１つと、医薬として許容される担体、賦形剤、安定剤又は希釈剤とを含んで成る医薬組成物。
【請求項１９】
自己免疫疾患又は炎症性疾患又はガンの処置のための医薬組成物の製造のための、ＧＩＬＺ又は請求項２〜１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シグナル伝達の分野における、ＧＩＬＺタンパク質及びＧＩＬＺタンパク質由来化合物の活性に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの急性／慢性炎症及び自己免疫疾患のための治療剤としてのグルココルチコイド（ＧＣＨ）の有効性は、少なくとも部分的に、Ｔ細胞の発達及び機能に対するＧＣＨの作用に起因する。これらの細胞の特性は、活性及びクローン増殖に関与する多数の遺伝子、例えばインターロイキン−２／インターロイキン−２受容体、の協調発現に間接的又は直接的に影響をもたらす多数の刺激によって制御される。胸腺上皮細胞はＧＣＨを産生し、そして、これらの局所的に産生されたグルココルチコイドが、活性化誘導型遺伝子の転写を阻害することによって抗原特異的な胸腺の発達に関与することが提唱されている(Ashwell JD et al., 2000)。
【０００３】
ＧＣＨは、胸腺細胞及び活性型成熟Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導して、その結果、恐らく、腫瘍性リンパ球を含む、不適切に分化するリンパ球の発達の排除を助ける(Ramdas J and Harmon JM, 1998)。逆説的に言えば、ＧＣＨはまた、胸腺細胞の生存を促進することがあり(Vacchio MS et al., 1994)、そして周辺においては、それらは構成的に抗原によって刺激されたＴリンパ球によって誘導されるアポトーシス（活性化起因性細胞死、ＡＩＣＤ）を阻害する。この二重の作用、アポトーシスの誘導又は阻害は、２つの異なるシグナル伝達系の間の機能的なクロストークを暗示し、そして多数のシグナルの統合が、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）のシグナル伝達だけでなく、他の生物学的作用にとっても特に重要なものであることを示唆している(Jamieson C and Yamamoto KR, 2000)。転写因子がこの複雑な制御機構において基本的な役割を果たすのは、ＧＣＨの免疫抑制作用が主に、恐らくは核因子ｋＢ（ＮＦ−ｋＢ）又はＡＰ−１について示されているように(Jehn BM and Osborne BA, 1997)、、サイトカインの遺伝子発現の阻害によって生じ、その結果、ＧＲと転写因子との間に干渉するためである。
【０００４】
ＧＣＨがＴ細胞の発達のそのような重要な制御因子であるため、多くの研究者が、ＧＣＨによって厳密に発現が制御される遺伝子を同定しようと試みている。これらの研究者は、Ｔ細胞の分子機構を制御して、ＧＣＨの制限と不所望な作用を同時に克服し、例えば、実験モデルにおいて一般的に使用されている非常に安定で且つ強力なＧＣＨ類似体であるデキサメタゾン（ＤＥＸ）で処理した細胞における転写活性に対する作用を研究する代替手段を提供しなくてはならない(Feng et al., 1995)。
【０００５】
それらのＤＥＸによって誘導される遺伝子の中でも、グルココルチコイド誘導型ロイシンジッパー（ＧＩＬＺ）は、発現がＤＥＸによってアップレギュレートされ、そしてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）トリガリング(triggering)によってダウンレギュレートされるロイシンジッパーファミリーの新規メンバーとして同定されている(WO 98/49291; EP 884385 A1; D'Adamino F et al., 1997; Cannarile L et al., 2001)。
【０００６】
ＤＥＸ処理マウスと未処理マウスの胸腺細胞で発現しているｍＲＮＡ種を比較することによって最初にクローニングされた、マウスＧＩＬＺ（ｍＧＩＬＺ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセス番号Ｑ９Ｚ２Ｓ７）は、１９７２ヌクレオチドのｍＲＮＡによってコードされ、これは２０６位から開始するオープンリーディングフレームを有し、そして１３７アミノ酸を含む。ｍＧＩＬＺとの相同性によってクローニングされたヒトＧＩＬＺ（ｈＧＩＬＺ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴアクセス番号Ｑ９９５７６）は、１９４６ヌクレオチドのｍＲＮＡによってコードされ、これは２４１位から開始するオープンリーディングフレームを有し、そして１３４アミノ酸を含む。
【０００７】
ＧＩＬＺタンパク質配列は、他のロイシンジッパーファミリーのメンバー、特にＤＩＰ(Sillard R et al., 1993; Vogel P et al., 1996)、ＴＳＣ−２２(Jay P et al., 1996; Shibanuma M et al., 1992)及びｔｈｇ−１(Fiorenza MT et al., 2001)と相同性がある。これらのタンパク質は、機能が明確には規定されていない、ロイシンジッパーファミリーの特定のグループを構成する(Kester HA et al., 1999)。ＧＩＬＺ及びＧＩＬＺ様タンパク質は、どこかで開示されており、そして他の名前、例えばＨＴ２２Ｌタンパク質(WO 98/504225)又は配列番号３５(WO 00/77255)と記載されており、そして二量体化を可能にする、ロイシンジッパーを含む中心ドメインを提示し、これはＮ末端タンパク質ドメインをプロリンに富むＣ末端ドメインから分けている。
【０００８】
ＧＩＬＺは、胸腺、脾臓、及びリンパ節の正常なＴリンパ球、脾臓のＢ細胞、並びに腹膜のマクロファージで発現することが明らかとなっている。ＧＩＬＺ遺伝子の発現は、ＧＩＬＺ遺伝子の発現は、それら全ての細胞において、ＤＥＸ処理によって強力にアップレギュレートされる。特に、ＧＩＬＺはマウス及びヒトＴリンパ球において、ＤＥＸ処理によってアップレギュレートされ、そしてα−ＣＤ３抗体による処理（マウス細胞）又はフィトヘムアグルチニンによる処理（ヒト細胞）によってダウンレギュレートされる。これらの結果は、Ｔ細胞の活性化がＧＬＩＺ発現を低下させることを示唆し、そして２つの事象（ＧＬＩＺ発現及びＴ細胞の活性化）が相互に排他的でありうることを示している(Riccardi C et al, 2000)。
【０００９】
ノーザンブロット解析によって評価した場合、ほとんどＧＩＬＺを発現していない非リンパ組織も存在し、それらは脳、腎臓及び肝臓である。最近になって、様々な論文が、異なる細胞及び組織、例えば原発性骨肉腫細胞(Khanna C et al., 2001)又はせん断応力がかかっているヒト臍帯静脈内皮細胞(McCormick SM et al., 2001)におけるＧＩＬＺの変化した発現を記載した。
【００１０】
ＧＬＩＺを過剰発現している細胞は、このタンパク質が核内に移動することができ、ＴＣＲ活性型アポトーシスからＴ細胞を保護するが、他のアポトーシス性の刺激からは保護することができず、ＧＣＨ媒介型の免疫抑制及び抗炎症活性に関与していると説明されてきた機能的な無応答性及び他の作用に似ていることを示す。この抗アポトーシス性の作用は、活性化誘導型のＦａｓ／ＦａｓＬの阻害及びインターロイキン−２／インターロイキン−２のアップレギュレーションと関連しており、ＮＦ−ｋＢに結合し、その結果、Ｉ−ｋＢのリン酸化及び分解又はＩ−ｋＢ／ＮＦ−ｋＢ結合に影響を及ぼすことなく、核転座を阻害し、そしてＮＦ−ｋＢのサブユニットにＤＮＡ結合する、ＧＩＬＺの特性に関連していた(Ayroldi E et al., 2001)。
【００１１】
ＧＩＬＺの発現が、ＦａｓＬ、ＡＰ−１、ＮＦ−ＡＴ、又はＩＬ−２プロモーターによって駆動するレポーターコンストラクトの誘導を阻害することも報告されている(Mittelstadt PR and Ashwell JD, 2001)。ＧＩＬＺは、ＮＦＡＴ／ＡＰ−１が駆動する転写を阻害して、ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎと相互作用することができることが証明された。ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎは共に、ロイシンジッパーを欠くＧＩＬＺのＮ末端部分（残基１〜６０）によって効率的に保持され、一方ＧＩＬＺのＣ末端部分（残基６１〜１３７）は、他のロイシンジッパータンパク質とのヘテロ二量体化の可能性が排除されないにも関わらず、ホモ二量体化する能力を保持した。あるいは、幾つかの研究が、相同タンパク質ＴＳＣ−２２上で、細胞内局在及びその機能に対する作用を特徴付けるために、種々の欠失変異体を利用して実施されてきた(Hino S et al., 2000; Hino S et al., 2002)。しかしながら、ヒト及びマウスＧＩＬＺを最初に開示している特許出願を含む従来技術(WO 98/49291; EP 884385 A1)は、シグナル伝達の分野におけるＧＩＬＺの相互作用について、そして／あるいは主要なタンパク質ドメイン（Ｎ−末端ドメイン、中心のロイシンジッパー、プロリンに富むＣ末端ドメイン）より小さな特異的なＧＩＬＬＺのサブシークエンスについて、何ら構造−機能の相関関係を提供していない。
【００１２】
ＡＰ−１は、Ｊｕｎ及びＦｏｓの転写レベル及び翻訳後修飾のレベルで制御される。両現象は、他の多くのもののように、Ｒａｆシグナル伝達カスケード経路の支配下にある(Weinstein-Oppenheimer CR et al., 2000)。Ｒａｆ−１（通常単純に「Ｒａｆ」として言及される）は、セリン−スレオニンキナーゼファミリーに属するプロトオンコジーンであり、Ａ−Ｒａｆ及びＢ−Ｒａｆもこれに属しており、異なる組織分布及び制御を有する。Ｒａｆキナーゼは、異なる有効性で、マイトジェン活性化／細胞外制御キナーゼ１及び２（ＭＥＫ−２）をリン酸化し、そして活性化し、続いて、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）及び細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化し、シグナルの伝播をもたらす。特定の刺激及び細胞の環境に依存して、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫカスケードは、多様な細胞の過程、例えば増殖、分化、及びアポトーシスを制御する。
【００１３】
Ｒａｆは、小さいＧＴＰ結合タンパク質で且つよく研究されたプロトオンコジーンである、Ｒａｓと可逆的に相互作用するタンパク質として最初に同定された。Ｒａｓの活性化は、高等真核生物に特有で、且つ成長及び分化シグナルを変換するためにＲａｆを必要とする受容体及び非受容体チロシンキナーゼによって開始される、シグナル伝達の複雑な事象の多くを開始させる。
【００１４】
Ｒａｆは、これまでに特徴付けられている最良のＲａｓの基質及びエフェクターであり、そしてこのキナーゼは、正常な細胞の増殖及び分化に関与するシグナル伝達経路における中心成分として考えられる。活性型Ｒａｓは、ＭＡＰＫ経路を介して、ＥＬＫ−１のリン酸化及び活性化を刺激し、続いてｃ−Ｆｏｓ及びＪｕｎＢ遺伝子の転写を誘導する。Ｒａｆ活性の制御は、これまでに同定されている多数のＲａｆの相互作用により、非常に複雑なようである。Ｒａｆが関連し、そして／あるいはＲａｆが影響を及ぼす分子に対する文献の調査により、複数の分子のカテゴリーが、恐らくＲａｆと相互作用しており、これらにはＧタンパク質、アダプター、シャペロン、ホスファターゼ、受容体、キナーゼ、リン脂質が含まれていることが明らかとなっている(Kolch W, 2000)。
【００１５】
Ｒａｆ及びＭＡＰＫ経路は、Ｔ細胞の増殖及び分化において基本的な役割を果たしているが(Rincon M, 2001)、多くの証拠が、それらの働きがＧＣＨの働きと協調していることを示唆している。グルココルチコイド受容体は、ＧＲをＤＮＡに結合させることなく、ＡＰ−１及びＮＦκＢに対するトランス活性化を抑制するが(De Bosscher K et al., 1997)、ＧＲ及びＲａｆは、同一のタンパク質複合体内で更に見つけることができる(Widen C et al., 2000)。従って、ＧＲ／Ｒａｆの相互作用は、ＭＡＰＫ経路の阻害にとって重要であると思われ、これはまた、低濃度のＤＥＸでも達成されうる(Rider LG et al., 1996)。
【００１６】
多くのヒトのガンにおいて、Ｒａｓは、変異の結果、そのＧＴＰ結合型で固定されており、これが構成的なシグナル伝達をもたらす。このように、Ｒａｓ経路は、もはや上流の増殖シグナルを必要とせず、そしてＲａｓの下流成分、例えばＲａｆ及びＥＲＫ−１／２は、構成的に活性化される。この過程は、細胞に表現型の変換をもたらし、例えば接触増殖阻害の喪失、半固体培地中での増殖、及び増殖率の増大、である。Ｒａｓ及びＲａｆの異常な発現及び／又は突然変異は、ＲａｓとＲａｆの相互作用によって引き起こされる、これらの表現型の変換を引き起こすことが示されてきた。Ｒａｆの活性及び相互作用を調節する手段は、ガンを処置し、又は転移を阻害するための、増殖又は分化を誘導する下流のシグナル伝達経路に対する制御を可能にし得る(Kloog Y and Cox AD, 2000)。
【００１７】
このように、Ｒａｓの相互作用、特にＲａｓとのものは、結合の決定因子及び機能的な結果を解明するために、集中的に研究されてきた。これらの研究目的は、ガンの治療に潜在的に有用な、Ｒａｓ又はＲａｆのいずれかに対象とする分子の開発を助けることにある。例えば、Ｒａｓ又はＲａｆに由来し、あるいはコンピューターを用いる方法及び構造的な方法から得られる、種々の変異体及びペプチドが、Ｒａｆ／Ｒａｓの相互作用及び／又はシグナル伝達活性の阻害剤として文献において開示されてきた(WO 97/34146 ; Barnard D et al., 1998 ;ZengJ et al., 2001 ; Williams JG et al., 2000 ; Maruta H et al., 2002 ; Ohnishi M et al., 1998 ;Winkler DG et al., 1998 ;Radziwill G et al., 1996 ; Block C et al., 1996).。
【００１８】
Ｒａｆ／Ｒａｓ活性化シグナル伝達経路は、細胞増殖及び発ガン性の変換の制御に深く関与しているので、Ｒａｆ／Ｒａｓと結合し、そしてこの活性化を阻害する生理活性分子を同定することは望ましいであろう。そのようなＲａｆ／Ｒａｓ相互作用因子は、増大又は延長したＲａｆ／Ｒａｓ媒介のシグナル伝達活性に関連する病状の予防及び治療のための、医薬として許容される形態で且つ治療的に有効な量で、ヒト又は獣医学的な患者に投与され得る。
【００１９】
本発明の要約
現在、ＧＩＬＺタンパク質がＲａｆ／Ｒａｓ複合体と直接的に相互作用して、そのような複合体によって制御されるシグナル伝達経路の活性化を阻害することが発見されている。更に具体的には、現時点で、ＧＩＬＺのＮ末端領域中の特定のセグメントがＲａｆと相互作用することが明らかとなっている。これらの証拠は、ＧＩＬＺ、そして更に特別にはＧＩＬＺのＮ末端領域、並びにＧＩＬＺのＮ末端ドメインの配列及び構造を基に設計されたペプチド及び他の分子を使用するために利用され得る。
【００２０】
本発明に従い調製される化合物は、Ｒａｆ／Ｒａｓの細胞内活性化を、このタンパク質を発現している細胞において阻害し、それによって、ガンのような、Ｒａｆ／Ｒａｓ関連のシグナル伝達の過剰又は構成的な活性化に関連する疾患の処置における使用に有用な治療用組成物を提供するために使用され得る。本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００２１】
本発明の詳細な説明
従来技術における上文で言及した証拠を考慮したところ、タンパク質間の相互作用が転写に直接関与するタンパク質のレベルで知られていたが、ＧＩＬＺ、又は任意な特定のＧＩＬＺペプチドが、シグナル伝達経路を制御するタンパク質と直接的に相互作用し、その結果として下流の細胞の活性化を調節しうるという示唆はされていなかった。
【００２２】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードによって駆動するＡＰ−１の活性化に重要な分子機構を研究することによって、現在、驚くべきことに、ＧＩＬＺがまたタンパク質間相互作用によってＲａｆ／Ｒａｓ複合体媒介型細胞内シグナル伝達カスケードに影響を及ぼし得ることが明らかとなっている。この相互作用は、少なくとも部分的に、ＧＩＬＺ誘導型のＴＣＲ無応答性にとって、且つＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ活性化経路の阻害を経由する、ＧＣＨによって媒介される免疫応答の制御にとって、重要であると思われる。
【００２３】
本発明の前に、この発見は知られておらず、又は予想可能ではなく、そして新規化合物、ＭＡＰＫ経路を阻害することが可能な新規組成物、スクリーニングアッセイ、及び疾患を処置するための治療方法、を提供する。
【００２４】
従って、本発明は、生物、器官、組織、又は培養細胞におけるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を阻害するためのＧＩＬＺタンパク質の使用を提供する。更に、Ｒａｆタンパク質に結合し、且つＭＡＰＫを阻害することができる新規化合物は：
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド；
ｂ）配列番号３の少なくとも５個連続したアミノ酸を含んで成るＧＩＬＺのＮ末端ドメインのフラグメント；
ｃ）１又は複数のアミノ酸残基が付加、欠失、又は置換されている、（ａ）又は（ｂ）の活性変異体；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）、及びＧＩＬＺ以外のタンパク質に属するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド又はペプチド；
から選択される。
【００２５】
配列番号３のアミノ酸配列は、マウスＧＩＬＺの残基１６〜３６に相当するものであり、これがＲａｆに結合して、ＧＩＬＺによって決定されるＭＡＰＫカスケードの阻害を媒介するＧＩＬＺの領域であることが、本出願の実施例において証明されている。
【００２６】
ヒト及びマウスＧＩＬＺ配列を最初に開示した従来技術(WO 98/49291; EP 884385 A1)、並びにｃ−Ｆｏｓとｃ−ＪｕｎとＧＩＬＺのＮ末端残基１〜６０との相互作用を開示している従来技術(Mittelstadt PR and Ashwell JD, 2001)は、Ｒａｆ／Ｒａｓ複合体とのＧＩＬＺの相互作用の可能性及び効果並びに主要なタンパク質ドメインより小さな特定のＧＩＬＺ領域の相互作用特性のいずれも証明することに失敗した。
【００２７】
好ましい態様において、配列番号３の少なくとも５個連続のアミノ酸を含んでん成るポリペプチド又はペプチドは、そのような領域の構造因子に相当するＧＩＬＺのＮ末端ドメインのフラグメント、更に部分的又は完全に、１又は複数のこれらの構造因子に属する配列を含むＧＩＬＺフラグメントである。これらのペプチドの例は、配列ＧＩＬＺ（１−２０）、ＧＩＬＺ（２１−５０）、ＧＩＬＺ（１−５０）、ＧＩＬＺ（１０−３０）、ＧＩＬＺ（１０−４０）、ＧＩＬＺ（１６−２２）、ＧＩＬＺ（３０−３６）、ＧＩＬＺ（１０−５０）、ＧＩＬＺ（３０−５０）、ＧＩＬＺ（１６−５８）、又はＧＩＬＺ（１−３６）に相当する。
【００２８】
そのようなフラグメントは、本質的にＧＩＬＺ「類似体」、すなわち、そのような類似体を以下の実施例において開示されているアッセイにかけることを含んで成る慣習的な実験によって決定した場合に、本発明において特徴付けられるＧＩＬＺの実質的に同一の新規生物活性を示すものである。これらの類似体は、既知の合成技術及び／又は部位指定突然変異誘発技術、あるいはそれらに適した任意な他の既知の技術によって調製される。
【００２９】
上文で規定したＧＩＬＺフラグメントにおける欠失、置換、又は付加は、そのようなフラグメントの活性変異体である新規分子を提供することができる。本発明において規定されるようなポリペプチド又はペプチドの活性変異体、又はそれらをコードする核酸は、過度の実験無しに、本実施例において提示する技術及び機能的特徴に基づいて、当業者によって慣習的に得ることができる置換ペプチド又はポリペプチドに実質的に相当する配列の有限集合を含む。それにも関わらず、それらは本発明において示すように、同一の生物活性（すなわち、Ｒａｆ／Ｒａｓ複合体媒介のシグナル伝達の阻害）、又は当業界で知られている任意な他の関連手段によってはそれに匹敵するレベル又はより高いレベルの活性を示すはずである。
【００３０】
本発明によると、これらの活性変異体における好ましい変化は、「保存的な」又は「安全な」置換として一般に知られている。保存的なアミノ酸置換は、分子の構造及び生物学的機能を保存するために、十分に類似している化学的特性を有するアミノ酸を持つものである。アミノ酸の挿入及び欠失も、特に当該挿入又は欠失が数個のアミノ酸に関与するのみであり、例えば３０個以下、好ましくは１０個以下であり、そして関連するＧＩＬＺフラグメントの機能的高次構造に必須のアミノ酸を除去又は置換しない場合、それらの機能を変化することなく、上文で規定した配列内で行われ得ることは明らかである。
【００３１】
前記文献は、保存的なアミノ酸置換の選択が天然タンパク質の配列及び／又は構造に対する統計的且つ物理化学的研究に基づいて実施され得る多数のモデルを提供する(Rogoc SI and Mekrasov AN, 2001)。タンパク質の設計実験は、アミノ酸の特定のサブセットの使用が、折りたたみ可能で且つ活性なタンパク質を産生することができ、タンパク質構造により容易に対応することができ、且つ機能的で構造的なホモログ及びパラログを検出するために使用され得るアミノ酸置換の分類を助けることを示してきた(Murphy et al., 2000)。好ましくは、同義アミノ酸群及び更に好ましい同義群は、表Ｉに規定するものである。
【００３２】
あるいは、特定の活性変異体は、Ｒａｆ／Ｒａｓ相互作用から独立しているある特性を改善するために設計されうる。例えば、活性変異体は、特にループ／ターン領域内の表面残基を、Ｈｉｓ−金属リガンド、例えばニッケルカチオンに結合することができるヒスチジンで置換することによって、機能を損なうことなくタンパク質の安定性を改善するために金属結合部位の導入から生じることがある(Bell AJ Jr et al., 2002)。
【００３３】
「同一性」は、本明細書で使用する場合、２つの重合体分子、例えば２つのペプチド間のサブユニット配列の類似性を言及する。当該２つの分子の両方のサブユニットの位置が同一の単量体単位によって占められる場合、例えば、２つのペプチドのそれぞれの位置がセリンによって占められる場合、それらはその位置で同一である。２つの配列間の同一性は、例えば同一である場合、マッチしている又は同一の位置の数の一次関数であり；９０％の位置、例えば１０個のうち９個がマッチしている場合、２つの配列は９０％の同一性を有する。
【００３４】
用語「ポリペプチド」は、天然又は組換えタンパク質、フラグメント、又はポリペプチド配列の類似体を言及するための一般的な用語として本明細書で使用する。このように、天然又は組換えタンパク質、フラグメント、及び類似体は、ポリペプチド群の一種である。
【００３５】
用語「ペプチド」は、４〜８０個又はそれ以上の連続アミノ酸、通常約４〜２０個の連続アミノ酸を含むポリペプチド鎖に通常適用される。そのようなペプチドは、タンパク質の部分的なタンパク質分解による開裂、フラグメントの化学合成、又は遺伝子操作を含む、当業者に知られている方法によって生成されうる。
【００３６】
本明細書で使用する用語「フラグメント」は、親配列（すなわち、ＧＩＬＺのＮ末端領域）と比較した場合に、Ｎ末端及び／又はＣ末端に欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、例えば全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然配列の相当の位置と同一ポリペプチドであるポリペプチドを言及する。フラグメントは、典型的に少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸又はそれ以上を含む。
【００３７】
用語「活性」は、そのような代替の化合物が、本発明に従い、ＧＩＬＺ及び特定のフラグメント、ＧＩＬＺ（１８−３６）について特徴付けられている機能的特徴を維持するはずであり、そして更に医薬として許容される、すなわち、それらを含む医薬組成物に対して毒性を賦与しないはずであることを意味する。
【００３８】
他の好ましい態様において、本発明のポリペプチド又はペプチドは、上文で規定したＧＩＬＺフラグメント又はそれらの活性変異体、及びＧＩＬＺ；）以外のタンパク質に属するアミノ酸配列を含んで成る。更に好ましい態様において、ペプチドは４〜２５個のアミノ酸を含み、そして配列番号３に対して少なくとも７０、８０、又は９０％の配列同一性を有する。
【００３９】
先の態様は、本発明の化合物の中でも、異なる生物によって発現されるＴＳＣ−２２／ＤＩＰファミリーに属する他のタンパク質のアミノ酸配列を含む。例えば、ヒトＧＩＬＺは、２２位の１つの残基のみがＧＩＬＺと異なる（イソロイシンの代わりにスレオニン；図１２）。
【００４０】
本発明の化合物の現在の定義は、相当の「融合タンパク質」、すなわち、配列番号３のアミノ酸配列、又はそのフラグメント及び活性変異体、及びあらゆるＧＩＬＺ様タンパク質以外のタンパク質に属するアミノ酸配列、を含んで成るポリペプチドも含んで成る。この後者の配列は、機能的結合及び阻害活性を大幅に害することなく追加の特性を提供し得る。
【００４１】
そのような追加の特性の例は、より容易な精製手順、体液中でより長く持続する半減期、追加の結合部分、エンドプロテアーゼ消化による成熟、又は細胞内局在化である。この後者の特徴は、上文の規定に含まれる融合又はキメラタンパク質の特定の群を規定するのに特に重要であり、何故なら、それが本願のＲａｓ／Ｒａｆ複合体媒介型のシグナル伝達の阻害剤として規定される分子を、それがＲａｓ／Ｒａｆと相互作用するはずである空間に局在化させるためである。前記部分、リガンド、及びリンカーの設計、更に融合タンパク質の構築、精製、検出及び使用のための方法及び戦略は、文献において広く論じられている(NilssonJ et al., 1997 ; "Applications of chimeric genes and hybridproteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000 ; WO01/77137)。本発明のＧＩＬＺ由来配列と融合される、１又は複数のこれらの追加の配列の選択は、特定の使用及び／又は調製方法に対して機能的である。
【００４２】
本発明のポリペプチド及びペプチドは、所望の使用及び／又は産生方法に従い好ましいとされうる他の代替形態で、例えば活性画分、前駆体、塩、又は誘導体として提供され得る。
【００４３】
用語「画分」は、化合物自体のポリペプチド鎖の任意なフラグメントのみ、あるいは関連分子若しくはそれと結合した残基、例えば糖又はリン酸残基、又は最初のポリペプチド若しくはペプチドの凝集体と組み合わせたもの、を言及する。そのような分子は、通常一次配列を変化させない他の修飾、例えばin vivo又はin vitroでのペプチドの化学的誘導体化（アセチル化又はカルボキシル化）、合成及び処理の間の、又は追加の処理工程における、ペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって（グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳類のグリコシル化又は脱グリコシル化酵素にペプチドを曝露することによって）及びリン酸化パターンを修飾することによって（ホスホチロシン、ホスホセリン、又はホスホスレオニン残基導入）作られるもの、からも生じることがある。特に、タンパク質のグリコシル化の性質、効果及び分布は、文献において概説されている(Thanka Christlet TH and Veluraja K, 2001; Imperiali B and O'Counnor SE, 1999)。
【００４４】
「前駆体」は、細胞又は身体への投与前又は後の代謝的且つ酵素的処理によって、本発明の化合物へと変換され得る化合物である。
【００４５】
用語「塩」は、本明細書では、本発明のペプチド、ポリペプチド、又はそれらの類似体の、カルボキシル基の塩もアミノ基の酸付加塩も意味する。カルボキシル基の塩は、当業界で知られている方法によって形成されることがあり、そして無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛の塩等、並びに、アミン、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカイン等により形成されるもののような、有機塩基との塩を含む。酸付加塩には、例えば鉱酸、例えば塩酸又は硫酸との塩、及び無機酸、例えば酢酸又はシュウ酸との塩が含まれる。当然ながら、任意のそのような塩は、本発明のペプチド、ポリペプチド、又はその類似体と実質的に類似の活性を持たなければならない。
【００４６】
用語「誘導体」は、本明細書で使用する場合、既知の方法により、アミノ酸部分の側鎖上Ｎ又はＣ末端基上に存在する官能基から調製されうる誘導体を言及する。そのような誘導体は、例えば、カルボキシル基のエステル又は脂肪族アミド及び遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体又は遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含み、そして例えばアルカノイル−又はアロイル基のようなアシル基によって形成される。あるいは、本発明のアンタゴニストの有用な接合体又は複合体は、他のタンパク質との相互作用の検出（放射性又は蛍光ラベル、ビオチン）、治療の有効性（細胞毒性物質、同位体）、又は薬物送達の有効性を改善するために当業界で知られている分子及び方法、例えばポリエチレングリコール及び他の天然又は合成ポリマーを用いて、誘導体として生成されうる(Pillai O and Panchagnula R, 2001)。後者の場合、アンタゴニストは、天然配列に存在する、あるいは天然の配列を突然変異させることによって導入された、内部又は末端の部位にある適切な残基の部位指定の修飾により生成されうる。同様の修飾は、小ポリペプチド、例えばケモカインについて既に開示されている(WO 02/04499; WO 02/04015; Vita C et al., 2002)。
【００４７】
任意の残基が結合に使用され得るが、但し、それはポリマー結合しやすい側鎖（ずなわち、官能基を持つアミノ酸、例えばリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジン等の側鎖）を有する。あるいは、これらの部位にある残基は、ポリマー結合しやすい側鎖を有する、異なるアミノ酸で置換され得る。また、遺伝子でコードされるアミノ酸の側鎖は、ポリマー結合のために科学的に修飾されることがあり、あるいは適切な側鎖の官能基を有する非天然アミノ酸が用いられることもある。ポリマー結合は、アンタゴニストの特定の位置に天然に存在するアミノ酸の側鎖又はアンタゴニストの特定の位置に天然に存在するアミノ酸を置換する天然若しくは非天然アミノ酸の側鎖に対してだけではなく、標的の位置にあるアミノ酸の側鎖に結合している炭水化物又は他の部分に対するものであることもある。
【００４８】
これらの目的に適したポリマーは生体適合性があり、すなわち、それらは生物系に毒性がなく、そして多くのそのようなポリマーが知られている。そのようなポリマーは、疎水性又は親水性の性質、生分解性、非生分解性、又はそれらの組み合わせであってもよい。これらのポリマーには、天然ポリマー（例えばコラーゲン、ゼラチン、セルロース、ヒアルロン酸）、並びに合成ポリマー（例えばポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物）が含まれる。疎水性の非分解性ポリマーの例には、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、及びポリメチルメタエリレート(methaerylate)が含まれる。親水性非分解性ポリマーの例には、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、及びそれらのコポリマーが含まれる。好ましいポリマーは、連続的な反復単位として、エチレンオキシド、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ）を含んで成る。
【００４９】
好ましい結合方法は、ペプチド合成と化学的なライゲーションの組み合わせを用いる。有利には、水溶性ポリマーの結合は、生分解性リンカーを介して、特にタンパク質のアミノ末端領域でなされる。そのような修飾は、リンカーの分解により、ポリマー修飾無しにタンパク質を放出する、「プロドラッグ」型のタンパク質を提供するために働く。
【００５０】
上述の代替的な化合物の用語は、特にＲａｆ／Ｒａｓに結合し、そしてＭＡＰＫ経路を阻害する能力に関する限り、本願において開示されている基本的特徴に影響を及ぼさないＧＩＬＺタンパク質の配列に変化した分子を包含することが意図される。類似の変化は、ＧＩＬＺの１つに本質的に相当する活性を有する化合物を提供すると一般的に考えられており、そして、コード化されているＤＮＡの常用の突然変異誘発技術、コード化されているＤＮＡ／タンパク質配列のレベルでのコンビナトリアル技術（例えばＤＮＡシャッフリング、ファージディスプレー／選択）、又はコンピューター支援設計研究から、その後の、以下の実施例に記載のような所望の活性についてのスクリーニングによって、生じることがある。
【００５１】
特に、本発明は、ペプチドミメティック(peptide mimetics)（ペプチドミメティック(peptidomimetics)とも称される）の形態で生成するＧＩＬＺ由来ペプチド、すなわちペプチド又はポリペプチドの性質が、アミノ酸のキラリティー、及び／又はペプチド主鎖のアミノ酸側鎖のレベルで化学的に修飾されているＧＩＬＺ類似体、に基づく代替分子を含む。これらの変換は、類似の、又は改善した治療特性及び／又は薬物動態特性を有するＧＩＬＺアゴニスト化合物を提供することを意図する。
【００５２】
例えば、ペプチドが、問題の対象者への注射の後、ペプチダーゼによって開裂を受けやすい場合、非開裂性のペプチドミメティックと結合した特に感受性のあるペプチドの置換は、より安定で且つ、その結果治療に更に有用なペプチドを提供することができる。同様に、Ｌ−アミノ酸残基の置換は、タンパク質分解に対してあまり感受性のない、そして最終的には、ペプチド以外の有機化合物に更に類似しているペプチドを与える標準的な方法である。更に、有用なものとして、アミノ末端のブロッキング基があり、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、チエニル、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、及び２，４−ジニトロフェニルである。
【００５３】
増大した能力、延長された活性、精製の容易さ、及び／又は増大した半減期を提供する、多くの他の修飾は、文献に記載されている(WO 02/10195 ;Villain M et al., 2001)。特に、ペプチドの荷電したＮ及びＣ末端のブロッキングは、疎水性の細胞膜を介し、そして細胞内へのペプチドの通過を増強するという追加の利益を有するであろう。ペプチドミメティックに含まれるアミノ酸にとって好ましい代替の基は、表ＩＩにおいて規定されているものである。
【００５４】
ペプチドミメティック及び他の非ペプチドミメティックの合成及び開発のための技術は、当業界で周知である(Hruby VJ and Balse PM, 2000 ;Golebiowski A et al., 2001 ; Kim HO and Kahn M, 2000)。例えば、タンパク質間相互作用を破壊し、そしてタンパク質複合体の形成を阻害することができるミニタンパク質及び合成模倣物が説明されている(Cochran AG, 2001)。タンパク質の構造及び機能を証明し、そして／あるいは改善するために、in vitro及びin vivoの両方での翻訳系を用いて、タンパク質内に非天然アミノ酸を組み込むための種々の方法論も文献において開示されている(Dougherty DA, 2000)。
【００５５】
タンパク質のコンピューターによる安定化及び／又は最適化に従い、足場(scaffold)由来の一連のペプチドのペプチド構造を最適化するための方法は、細胞／ペプチドベースのマイクロアレイ，他の実験的なスクリーニング技術を用いて開発されうる(WO 02/90985 ; Wu RZ et al., 2002 ;Filikov AV et al., 2002 ; Hayes RJ et al., 2002)。
【００５６】
ＭＡＰＫカスケード阻害特性を有し、且つ更に幾つかの親油性の特徴を有する本発明の化合物は、実際には、医薬として使用されるそのような化合物が、細胞膜を通過する能力を有するはずであるという事実の観点から、最も有用でありうる。あるいは、そのような化合物は、細胞膜を天然に通過して、それらの侵入を容易にし、又は細胞膜を経由して細胞質へのそれらの透過性を増強する分子で化学的に修飾され得る（すなわち、誘導体化、接合、又は複合体化）。これらの膜配合(blending)因子の例は、膜融合性ポリペプチド、イオンチャンネル形成ポリペプチド、他の膜ポリペプチド、及び長鎖脂肪酸、例えばミリスチン酸、パルミチン酸である(US 5149782)。これらの膜配合因子は、分子接合体を細胞膜の脂質二重層内に挿入し、そして細胞質へのそれらの侵入を容易にする。分子の膜貫通輸送のための外の有用な方法は、レセプター媒介型のエンドサイト−シス活性の機構を活用する。これらの受容体系は、ガラクトース、マンノース、マンノース６−ホスフェート、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、トランスコバラミン（ビタミンＢ１２）、インスリン及び他のペプチド増殖因子、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、を認識するものを含む。栄養素受容体、例えばビオチン及び葉酸の受容体も、多くの細胞の膜表面上にあるビオチン及び葉酸受容体の位置及び多重度並びに関連する受容体媒介型の膜貫通輸送過程により、細胞膜を通過する輸送を増強するために有利に使用され得る(US 5108921)。このように、細胞質内に輸送される化合物と、リガンド、例えばビオチン又は葉酸との間に形成される複合体は、受容体媒介型の膜貫通輸送機構を開始し、そしてそれによって、細胞内への所望の化合物の侵入を可能にするために、ビオチン又は葉酸受容体を持つ細胞膜と接触されうる。Ｒａｆ／Ｒａｓ相互作用ペプチドの細胞内輸送のための具体例は文献において示されている(Maruta H et al., 2002)。
【００５７】
血液脳関門の貫通を改善するための本発明の化合物の修飾も有用であろう。ペプチドは、親油性を増大させるために（例えば、かさ高い親油性部分、例えばコレステリルに対するエステル化による）、又は当該関門の脳側上での保持を増強する開裂可能な「ターゲッター」部分を供給するために、変化させられることがある(Bodor et al., 1992)。あるいは、当該ペプチドは、トランスフェリン受容体に特異的な抗体と連結され、鉄の血液脳関門の通過におけるその受容体の役割が利用されることがある(Friden et al., Science 1993, 259: 373-377)。経血管薬(transvascular drug)送達の分野における生物模倣型の輸送及び合理的な薬物送達の他の方法は、当業界で知られている(Ranney DF, Biochem Pharmacol 2000, 59: 373-377)。
【００５８】
本発明の化合物は、当業界で周知の任意な手順、例えば組換えＤＮＡ関連技術又は化学合成技術によって調製されうる。本発明のペプチド及びポリペプチドの発現は、真核細胞又は原核細胞において、前記細胞内で構成的に活性であるか、又は誘導可能である転写開始／終結制御配列の支配下にある所望のポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、細胞のゲノムに組み込まれるか、又はエピソームとして維持される発現ベクターを導入することによって達成されうる。あるいは、関連のコード配列が細胞のゲノムＤＮＡ内に既に存在していることもあり、そしてその発現は、従来技術において説明されているように(EP505500)、外来の制御配列を導入することによって達成されうる。
【００５９】
本発明のＧＩＬＺ由来ペプチド及びタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、相当のヒト又はマウスゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列、あるいは、遺伝コードの縮重の結果、所定のアミノ酸配列もコードする任意な他の核酸配列から単離されうる。上記ＤＮＡと、任意の適切な転写及び翻訳停止／開始因子並びに任意な他の追加配列（例えば、融合タンパク質内に含まれる異種配列）とを含んで成る発現ベクターは、発現したタンパク質を回収し、そして更に処理する前に、適切な培養液中で培養され得る宿主細胞を形質転換するために使用され得る。
【００６０】
本明細書で言及したような本発明の組換えタンパク質のいずれかの発現は、真核細胞（例えば、酵母、昆虫又は哺乳類細胞）又は原核細胞において、適切な発現ベクターを用いて達成されうる。当業界で知られている任意な方法が利用され得る。コード配列は、その結果、特定の宿主細胞、例えばＥ．コリ(E. coli)に従う発現に最適なコドン使用頻度を有するように、選択されうる(Kane JF et al., 1995)。所望のグリコシル化パターンを有する組換えタンパク質は、適切な哺乳類宿主細胞を選択することによって得ることができる(Grabenhorst E et al, 1999)。
【００６１】
特に、哺乳類細胞、例えばヒト、サル，マウス、そして特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が好ましく、これは、それらがタンパク質分子に対する翻訳後修飾、例えば正確な折りたたみ又は正確な位置でのグリコシル化を提供するためである。また、酵母細胞は、グリコシル化を含む、翻訳後のペプチド修飾を実施し得る。多数の組換えＤＮＡ戦略が存在しており、これらは強力なプロモーター配列及び酵母内での所望のタンパク質の産生に利用され得る、高コピー数のプラスミド、を利用する。酵母は、クローン化された哺乳類遺伝子産物上のリーダー配列を認識し、そしてリーダー配列（すなわち、プレペプチド，シグナル配列）を有するペプチド配列を分泌する。
【００６２】
特定のプラスミド又はウイルスベクターを選択するのに重要な因子には、ベクターを含むレシピエント細胞が認識でき、そしてベクターを含まないレシピエント細胞から選択することができること；特定の宿主において所望されるベクターのコピー数；及び異なる種の宿主細胞間をベクターが「往復」することができることが望ましいか否か、が含まれる。
【００６３】
ベクターは原核又は真核宿主細胞における本発明のアンタゴニストを含む、単離されたタンパク質又は融合タンパク質の発現であって、前記細胞において構成的に活性であるか、又は誘導可能であるように選択される転写開始／終結制御配列の支配下での発現を可能にするはずである。ベクターの誘導後、宿主細胞は、ベクターを含む細胞の生育について選択する選択培地中で生育する。続いて、実質的に前記細胞に富む細胞系が安定な細胞系を提供するために単離されうる。
【００６４】
原核細胞（例えば、酵母、昆虫又は哺乳類細胞）の場合、異なる転写及び翻訳制御配列が、宿主の性質に依存して利用され得る。それらは、ウイルス源、例えばアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルス等に由来することがあり、ここでは、制御シグナルが高レベル発現する特定の遺伝子と関連している。例えば、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母gal4遺伝子プロモーター等である。遺伝子の発現が調節されうるように、抑制及び活性化が可能な転写開始制御シグナルが選択され得る。導入遺伝子によって安定して形質転換された細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１又は複数のマーカーを導入することによっても選択され得る。当該マーカーはまた、栄養要求性の宿主に対する光合成栄養、殺生物耐性、例えば抗生物質、又は重金属、例えば銅等を提供することもある。選択マーカー遺伝子は、発現するＤＮＡ遺伝子配列と直接的に連結されるか、又は同時トランスフェクションによって同一細胞内に導入されることがある。
【００６５】
本発明のこれらの目的は、ＧＩＬＺペプチドに対して本願によって提供される開示と、一般的な分子生物学的技術の知識とを組み合わせることによって達成され得る。多数の本及び概説が、どのようにクローニングし、そしてベクター及び原核又は真核宿主細胞を用いて組換えタンパク質を産生するかについての技術を提供し、例として、Oxford University Pressによって出版されている"A Practical Approach"シリーズの幾つかの表題がある("DNA Cloning 2 : Expression Systems", 1995;"DNA Cloning 4 : Mammalian Systems", 1996 ;"Protein Expression",1999 ;"Protein Purification Techniques",2001)。
【００６６】
本発明のＧＩＬＺ由来ペプチド及びタンパク質は、当業界で周知の任意な他の方法によって、特に、短い長さを示すこれらの分子に効率的に適用され得る化学合成手順によって調製されうる。追加の化学基も含む完全に合成のタンパク質でさえも、文献に開示されている(Brown A et al., 1996 ; Vita C et al.,2002)。
【００６７】
化学合成技術の例は、固相合成及び液相合成である。固相合成として、例えば、合成されるペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸が、有機溶媒中で不溶な支持体と結合し、そして、アミノ基を有するアミノ酸と適切な保護基で保護された側鎖の官能基とが、Ｃ末端からＮ末端へと順番に１つずつ縮合されるものと、樹脂と結合したアミノ酸又はペプチドのアミノ基の保護基が離されるものとの交互の反応の繰り返しによって、ペプチド鎖がこのようにして伸長する。固相合成法は、使用する保護基の型に依存して、ｔＢｏｃ法及びＦｍｏｃ法に大きく分類される。典型的に使用される保護基には、アミノ基の場合、ｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）及びＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）が含まれ；グアニジノ基の場合、ＮＯ２（ニトロ）及びＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）が含まれ；そしてヒドロキシル基の場合、ｔＢｕ（ｔ−ブチル）が含まれる。所望のペプチドの合成後、それは脱保護反応にかけられ、そして固体の支持体から切り離される。そのようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法の場合フッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて、そしてＦｍｏｃ法の場合ＴＦＡを用いて実施されうる。
【００６８】
合成又は組換えタンパク質の精製は、この目的のために知られている方法のいずれか１つ、すなわち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動等を包含する任意な常用の手順によって実施され得る。例えば、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）が使用され得る。溶出は、タンパク質精製に一般的に使用される水−アセトニトリルベースの溶媒を用いて実施され得る。本発明のペプチド又はタンパク質を精製するために好みで使用され得る追加の精製手順は、モノクローナル抗体、ヘパリン、又は高効率で標的タンパク質と結合することができ、且つカラム内に含まれるゲルマトリックス上に固定化することができる任意な他の適当なリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーである。当該タンパク質を含む不純な調製物は、当該カラムを通過する。タンパク質はこのリガンドによってカラムに結合するが、不純物は通過する。戦場後、タンパク質は、ｐＨ又はイオン強度の変化によってゲルから溶出される。
【００６９】
本発明は、本発明の化合物の精製した調製物を含む。精製した調製物とは、本明細書で使用する場合、乾燥重量当たり本発明の化合物を少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％含む調製物を意味する。
【００７０】
本発明のＧＩＬＺ由来ペプチド及びタンパク質はまた、本願の実施例に示すように、恐らくＲａｆ／Ｒａｓに結合し、そしてＭＡＰＫ経路を阻害する化合物を、そのような化合物の作用と本発明のＧＩＬＺ由来ペプチド及びタンパク質によって示される作用とを比較することによって、in vitro及びin vivoでスクリーニングする方法及びキットにおいて使用され得る。当業界で知られている方法を用いて、このスクリーニングアッセイの成分は、固定化され（プラスチック製のマイクロタイタープレート上への吸着又は親和性基を含むポリマービーズに対する融合タンパク質の特異的な結合による）、共沈されることがあり（抗体による）、そして／あるいは標識されることがある（放射性同位体、酵素標識、蛍光剤、化学発光剤を用いる）。
【００７１】
従って、本発明はまた、上記in vivo又はin vitroでのアッセイのいずれかによって単離され、同定され、そして／あるいは特徴付けられ、そして本願において例示される化合物を提供し、更にはＲａｆ／Ｒａｓ及びＧＩＬＺに関連する配列及び構造の情報、特にＭＡＰＫ経路の阻害剤として合成され、そしてin vitro及びin vivoで試験されるペプチド又は他の有機化合物を誘導するために、各結合表面を利用するコンピューター支援の薬物デザインの方法によって同定される任意な他の化合物を提供する。
【００７２】
構造が導く生化学的解析とタンパク質間相互作用の生物学的機能とを関連付けた定量的な構造−活性研究は、Ｒａｓ及びＲａｆの三次元構造に基づいて実施されてきた(Block C et al., 1996)。ＧＩＬＺ様タンパク質フラグメントの三次元構造は知られているので(Seidel G et al., 1997)、それは、結合に必須の残基の構造上の関連情報を抽出し、そして、その結果Ｒａｆ／ＲａｓとのＧＩＬＺの相互作用部位を模倣し得る化学構造を導くために使用され得る。そのようなコンピューターを用いるタンパク質の設計及び構造に基づく薬物の設計の技術は、折りたたみ、シグナルを送り、又は高次構造の状態をより素早く且つより効率よく採用するタンパク質及び他の型の分子を同定し、そして操作することを可能にし、バイオテクノロジー及び生物化学に重大な影響を与える(Kraemer-Pecore CM etal., 2001 ; Sawyer TK, "Peptidomimetic and Nonpeptide Drug Discovery : impact of Structure-Based Drug Design" in "Structure Based Drug Design", 編者VeerapandianP, Marcel Dekker Inc., 1997,pg. 557-663)。
【００７３】
タンパク質構造のホモロジー／スレディングモデリング、最小化、及びドッキングを可能にする方法及びソフトウェアは、当業界で周知であり、例えばInsight II (MSI)、3D-PSSM(Kelley LA et al.,2000)、及びFTDOCK(Gabb HA et al.,1997)である。これらのシミュレーションの結果は、後にＧＩＬＺ由来及びＲａｓ／Ｒａｓペプチド由来複合体の構造が核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学又はＸ線結晶学によって実際に解決されたときに挑戦されうる。そのような阻害ペプチドはまた、相互作用するペプチドの局所的環境に関するデータをもたらす物理的及び化学的技術（例えば、円二色性、蛍光、電子スピン共鳴）によっても特徴付けられる。合成化学技術は、各ペプチドの阻害構造を模倣する化合物を生成するために、上述のように使用され得る。
【００７４】
ＧＩＬＺのＮ末端配列由来の小ペプチド（例えば、４〜２５個のアミノ酸を有する）に対する、in vitroでの及び／又はコンピューター支援のスクリーニングは、更に安定なペプチド又はペプチドミメティック型の薬物を単離し、そして開発するために有利である。一旦これらの化合物がスクリーニングされ、そしてＲａｆ／Ｒａｓに結合することができることが明らかとなると、ＭＰＡＫ阻害特性が、それらの予想される有用性を証明するために評価される。
【００７５】
本発明の別の側面は、有効量の本発明のＧＩＬＺ由来化合物を投与することによって、動物、器官、組織、又は培養細胞における、ＭＡＰＫによって媒介される不所望な細胞増殖を阻害するための方法である。これらの分子は、核における転写機構に対する細胞膜及び細胞質由来のシグナル伝達に必須の役割を果たす、Ｒａｆ及びＥｒｋ−１／−２のリン酸化によって引き起こされる細胞の機構を阻害し得る。ＧＩＬＺの相互作用は、Ｒａｆ／Ｒａｓ媒介型の細胞内シグナル伝達の阻害を提供する。そのような阻害は、通常は不所望な細胞増殖、特にガン、の処置において望ましい。
【００７６】
多数の発見が、ＲａｆがＲａｓの機能の直接的且つ主要なエフェクターであることを示している。Ｒａｓのエフェクターシグナル伝達のためのＲａｆ活性の要求は、本発明の化合物に腫瘍細胞における発ガンの活性化のＲａｓタンパク質経路を中断させる(Kloog Y and Cox AD, 2000; Weinstein-Oppenheimer CR et al., 2000)。本発明は、ＭＡＰキナーゼ経路を標的にし、そして分化及び増殖の異常パターンを制御する抗ガン薬の開発のための新規の機会を提供する(Sebolt-Leopold JS, 2000)。
【００７７】
Ｒａｆ／Ｒａｓ制御型ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードの中断は、ヒトの腫瘍（ガン、リンパ系／骨髄系の造血器腫瘍、間葉性起源の腫瘍、黒色腫）の少なくとも一部において抗腫瘍活性を有することが予想される。従って、本発明はまた、前記化合物及び医薬組成物を製造する方法、並びに、Ｒａｆ／Ｒａｓ複合体媒介型の活性化によって引き起こされる、自己免疫疾患又は炎症疾患あるいはガン（例えば、リンパ腫又はリンパ性白血病）を処置する方法、に関する。これらの化合物、並びにＧＩＬＺは、自己免疫疾患又は炎症性疾患あるいはガンの処置のための医薬組成物の製造のために使用され得る。そのような処置において、時に、ガン細胞に対して、より高い正確さ及び特異性で本発明の化合物を標的化することが有利であることがある。そのような標的化は、ガンの処置の業界において周知であり、そして適当な製剤の調製及びその方法は普通の実験しか要しない。
【００７８】
Ｒａｆ／Ｒａｓの活性化の阻止が免疫細胞の受容体媒介型の活性化を妨害するので、この方法も、炎症又は自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病、脈管炎、自己免疫慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎(cholitiss)、クローン病、アレルギー性疾患、腎炎症候群、サルコイドーシス、及び関節リウマチを有する患者の免疫応答をダウンレギュレートするのに有用でありうる。この方法を用いる免疫応答の抑制も、移植器官の拒絶を防ぐために、同種移植片又は異種移植片の受容者の処置において有用でありうる。
【００７９】
細胞内へのペプチドの治療的な投与はまた、遺伝子治療を用いて達成することができ、ここで、異種ポリペプチド又はペプチドをコードする配列と作用可能に連結したプロモーターを含む核酸が既述の核酸をトランスフェクションした細胞内での高レベルの発現を生み出すために使用される。本発明のＧＩＬＺ由来ペプチド又はタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ又は単離された核酸は、標準的なベクター及び／又は遺伝子送達系によって、患者の細胞内に導入され得る。適当な遺伝子送達系には、中でも、リポソーム、受容体媒介型の送達系、裸のＤＮＡ、及びウイルスベクター、例えばヘルペスウイルス、レトロウイルス、及びアデノウイルスが含まれ得る。
【００８０】
上述の本発明の化合物（タンパク質、ペプチド、有機化合物等）は、このように薬物として、特に、通常不所望の細胞増殖、特にガンの処置のための医薬組成物中の活性成分として、使用され得る。そのような処置は、前記化合物を動物に投与することによるin vivo、又は前記化合物を、身体から抽出され、そして体内に再び移植される前に特定の治療的処置を提供するために短期間体外で保持される器官、組織、又は培養細胞に投与するex vivo、そのいずれかで実施され得る。
【００８１】
本発明はまた、活性成分として、本発明の化合物のうちの１つと、医薬として許容される担体、賦形剤、安定剤又は希釈剤とを含んで成る医薬組成物を提供する。本発明の化合物又は単離された化合物は、単独で、又は、共同的若しくは協調的に作用することによって追加の有益な効果を提供する別の組成物若しくは化合物と一緒に投与され得る。
【００８２】
本発明のＭＡＰＫ阻害化合物を含んで成る医薬組成物は、前記化合物が治療的に有効な量、すなわち、疾患の経過及び重症度に影響を及ぼし、そのような病状の低減若しくは緩和をもたらす量で含まれる、全ての組成物を含む。有効量は、投与経路及び患者の症状に依存する。
【００８３】
医薬組成物は、適当な医薬として許容される担体、生物学的に適合性のある媒体であって、動物に対する投与に適し（例えば、生理食塩水）、且つ医薬として使用され得る調製物に活性化合物を処理するのを容易にする助剤（例えば、賦形剤(excipient)、安定剤又は希釈剤）を含んで成るもの、を含んでもよい。
【００８４】
医薬組成物は、投与形態の要求を満たす、任意の許容される方法で調製されうる。薬物送達のための生体材料及び他のポリマーの使用、更に特定の投与形態を立証するための異なる技術及びモデルは、文献において開示されている(Luo B and Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al., 2001)。
【００８５】
任意の許容される投与形態は、当業者によって使用され、そして決定され得る。例えば、投与は、種々の非経口経路、例えば皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、経口、又は頬側から行われ得る。非経口投与は、ボーラス注入、又は時間をかけた漸進的な灌流によってなされ得る。非経口投与のための調製物は、当業界で知られている助剤又は賦形剤を含むことがある、滅菌した水溶性又は非水溶性の溶液、懸濁液、及び乳濁液を含み、そして慣習的な方法により調製され得る。尚、適切な油性の注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液も投与されうる。適当な親油性溶媒又は媒体には、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリドが含まれる。懸濁液の粘度を増大させる物質を含み得る水性注射懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含む。任意に、懸濁液はまた安定剤を含んでもよい。医薬組成物は、注射による投与に適した溶液を含み、且つ約０．０１〜９９％、好ましくは約２０〜７５％の活性化合物と賦形剤とを含む。直腸から投与されうる組成物には、座薬が含まれる。
【００８６】
投与される投与量は、受容者の年齢、性別、健康、及び体重、併用療法の種類、もしあるとしたら、処置の頻度、及び所望の効果の性質、に依存すると解される。投与量は、当業者に理解され、且つ決定可能なように、個々の対象者に合わせられる。各処置に必要な総量は、複数回投与又は単回投与によって投与されうる。本発明の医薬組成物は、単独で、又は、前記症状を対象とする、若しくは前記症状の他の症候を対象とする他の治療と一緒に投与されうる。
【００８７】
本発明の化合物は、医薬として許容される担体、例えば生理食塩水において、静脈内から患者に投与されうる。ペプチドの細胞内送達のための標準的な方法が使用されることがあり、例えばリポソームを介する送達である。そのような方法は当業者には周知である。本発明の製剤は、非経口投与、例えば静脈内、皮下、筋肉内、及び腹腔内投与に有用である。
【００８８】
医療業界で周知なように、いずれの患者の投与量も、患者の大きさ、身体の表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全般的な健康状態、及び並行して投与される他の薬物、を含む、多数の要因に依存する。通常、活性成分の一日量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜１００ｍｇでありうる。任意に、分割量で、又は徐放形態で与えられる、１〜４０ｍｇ／ｋｇ／日は、所望の結果を得るために有効である。第二又はその後の投与が、個体に投与された最初又はその前の量と同一の、それ未満の、又はそれより多い投与量で実施され得る。
【００８９】
本発明は、特定の態様を参照して記載しているが、当該記載の内容は、特許請求の範囲の意味及び目的を逸脱することなく当業者によってもたらされる全ての修飾及び置換を含んで成る。本明細書で引用した全ての文献は、引用文献中に提示されている全てのデータ、表、図、及び文章を含むその全てが引用によって、本明細書に組み入れられる。更に、本明細書で引用されている文献内に引用されている文献の全内容も、引用によってその全体が組み入れられる。既知の方法の段階、常用の方法の段階、既知の方法又は常用の方法への言及は、決して、関連技術において、本発明のあらゆる側面、記載又は態様を開示し、教示し、又は示唆することを是認するものではない。特に断らない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の者が一般的に理解するものと同一の意味を有する。一旦本願で開示される方法及び産物の特徴が理解されると、追加の段階の必要性及び種類は、従来技術、並びに、本発明の基本的な詳細及び幾つかの応用を説明する、限定的でない以下の図面及び実施例を再検討することによって容易に推測されうる。
【００９０】
実施例
実施例１：Ｒａｆ制御型のＭＡＰＫ伝達経路に対するＧＩＬＺの作用
方法
細胞培養
３ＤＯと称される卵細胞特異的Ｔ細胞系及びマウス胸腺細胞の自然発生的に分割するＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２＋、ＣＤ４４＋サブタイプを入手し、特徴づけ、そして前述のようにＤＥＸ処理した(Ayroldi E et al., 1997; D'Adamio F et al., 1997)。後者の細胞型の場合、脾臓及びリンパ節の細胞が飽和濃度のＦＩＴＣ複合型抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen）で染色され、続いてα−ＦＩＴＣ複合型磁気ビーズ(PerSeptive Diagnostic)と一緒に３０分間インキュベートされた。生じた抗体複合体の磁気的分離は、９８％以上の収率でＴ細胞の生成をもたらした。ＣＯＳ−７細胞は、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地中での培養で維持された。
【００９１】
トランスフェクションしたクローンは、既述のように調製した(Nocentini G et al., 1997)。要約すると、マウスＧＩＬＺのｃＤＮＡのコード配列（４１４塩基対；GenBank acc.n . AF024519)が、３ＤＯ細胞における発現のためにｐｃＤＮＡ３プラスミド(Invitrogen)内にクローニングされた。細胞は、１５μｇの直鎖化したｐｃＤＮＡ３ベクター（コントロールクローン）又は１５μｇの直鎖化した、マウスＧＩＬＺをコードするｃＤＮＡを発現するｐｃＤＮＡ３ベクター（ｐｃＤＮＡ３−ＧＩＬＺ）を用いる、エレクトロポレーション（３００ｍＡ、９６０μＦ）によってトランスフェクションした。３６時間後、細胞は、Ｇ４１８を０．８ｍｇ／ｍｌ含む培地(Gibco)中で培養され、そして細胞の懸濁液は、９６穴プレート内にプレーティングされた（各トランスフェクションにつき４個）。１５〜２０日後、わずかに１５％の穴が、生存し、且つ増殖する細胞を示した。これらの細胞（ｐｃＤＮＡ３−ＧＩＬＺ−３ＤＯ）が、外因性ＧＩＬＺの正確な発現のためにリボヌクレアーゼプロテクションにおいて解析した後にクローンであるとみなされる。クローンＧＩＲＬ−１９が主に使用されたが、更なる証拠のための実験も、他のクローンにおいて繰り返された。
【００９２】
Ｍｙｃタグ付きＧＩＬＺを発現するプラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター(Invitrogen)であり、これは、ＰＣＲ増幅され、そしてＢａｍＨＩ部位とＸｂａＩ部位との間でクローニングされた完全長のマウスＧＩＬＺのコード配列を含む。
【００９３】
ＴＣＲ媒介型のアポトーシスアッセイ
ハムスターモノクローナルα−マウスＣＤ３ε抗体（クローン１４５−２Ｃ１１；Pharmingen）は、１μｇ／ｍｌでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に希釈され、そして平底の高結合性の９６穴プレート(Coster)中に、各穴につき１００μｌを載せて分配された。当該抗体は、４℃で２０時間接着され、そして、ＰＢＳで洗浄した後、コーティングされた穴は、トランスフェクションされたクローン（１×１０5細胞／穴）をプレーティングするために使用され、そして３７℃でインキュベートされた。
【００９４】
細胞抽出物
核の細胞抽出物は、２×１０7個の氷冷したＰＢＳ洗浄細胞を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０（ＮＰ−４０）、０．１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、２０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む１ｍｌの低浸透圧性緩衝液中で懸濁することによって調製した。細胞質タンパク質を含む上清は、氷上での１０分のインキュベーション後、遠心によって核のペレットから分離された。核のペレットは、続いて、ＮＰ−４０を含まない低浸透圧性緩衝液で洗浄され、そして１０ｍｌの溶解緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、２０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦ）中で再懸濁された。氷上での１５分のインキュベーション後に得られたライセートは、１０倍量の希釈緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２０％のグリセロール、０．１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、２０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦ）で希釈され、そしてあらかじめ冷却された遠心機内で、１４０００ＲＰＭで、３０分間清澄にされた。
【００９５】
細胞全体の抽出物は、２×１０7個の氷冷したＰＢＳ洗浄細胞を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＩｇｅｐａｌＣＡ−６３０、１０ｍＭのＭｇＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２％のグリセロール、０．１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、２０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦ、２５ｍＭのフッ化ナトリウム、及び１ｍＭのオルト−バナジン酸ナトリウムを含む１ｍｌの緩衝液中で再懸濁することによって調製した。抽出物は、氷上での１５分間のインキュベーション後、あらかじめ冷却された遠心機内で、１４０００ＲＰＭで、３０分間清澄にされた。
【００９６】
ウェスタンブロット解析
ニトロセルロース膜を準備し、そして既述の通りウェスタンブロットで解析した(Ayroldi E et al., 1997; D'Adamio F et al., 1997)。ＧＩＬＺの一次抗体は、１：５０００で希釈したウサギポリクローナル抗血清、又は抗原としてＧＳＴ−ヒトＧＩＬＺでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫することによって調製したモノクローナルマウスα−ヒトＧＩＬＺ抗体であった。当該抗血清は、前記抗原を用いるＥＬＩＳＡによって最初にスクリーニングされ、そして陽性脾臓細胞（１：８００超のカットオフ希釈）は、支持細胞の存在下で骨髄腫細胞と融合された。ハイブリドーマの上清はＥＬＩＳＡでスクリーニングされ、そして陽性細胞は限界希釈によってクローニングされた。それらの幾つかは、マウスを腹腔内から接種し、そしてモノクローナル抗体に富む腹水を得るために使用された。腹水は、加熱により不活性化され、力価を決定され、そして保存された。
【００９７】
他の一次抗体、モノクローナルマウスα−ヒトｃ−Ｆｏｓ(Santa Cruz Biotechnology)、ポリクローナルウサギα−トリｃ−Ｊｕｎ(Santa Cruz Biotechnology)、ポリクローナルウサギα−マウスホスホ−ＥＲＫ−１／−２(Cell Signaling Technology)、ポリクローナルウサギα−マウスＥＲＫ−１／−２(Cell Signaling Technology)、ポリクローナルウサギα−ヒトＭＥＫ−１(Cell Signaling Technology)、ポリクローナルウサギα−ヒトホスホ−ＭＥＫ−１(Cell Signaling Technology)、モノクローナルラットα−マウスホスホ−Ｒａｆ(Upstate Biotechnology)、ポリクローナルウサギα−マウスＲａｆ(Santa Cruz Biotechnology)、α−ベータチューブリン(Calbiochem)は、取扱説明書に従い希釈した。二次抗体は、SuperSignalケミルミネセンスキット(Pierce)によって提供されたセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識α−ウサギ、α−ラット、又はα−マウス抗体（一次抗体に依存する）であり、取扱説明書に従い使用した。リン酸化されてないタンパク質変異体に対する抗体は、タンパク質発現の調節が起こらなかったことを立証するために使用され、一方、α−ベータチューブリン抗体は、等量のタンパク質が各レーン中に添加されたことを調べるために使用された。
【００９８】
異なる一次抗体で膜を再プローブする再調査することが必要であった場合、これまでに使用した一次抗体及び二次抗体は、取扱説明書に従いRestore Western Blot Stripping Buffer (Pierce)を用いて「ストリッピング」された。
【００９９】
ＤＥＸ／抗ＣＤ３アッセイ
マウス胸腺は、ＤＥＸを用いて６時間、そして次に抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いて異なる時間（３０分〜３時間）刺激され、その結果同様の結果が得られた。細胞の抽出物をウェスタンブロットによって試験した。
【０１００】
ＡＰ−１ルシフェラーゼアッセイ
３ＤＯ細胞は、ｐｃＤＮＡ３（コントロール、空のベクター）と共に、Ｒａｆの活性型のｃＤＮＡと一緒に又はそれ無しで、ＡＰ−１ルシフェラーゼレポーター遺伝子をトランスフェクションされた。ｐＵＳＥａｍｐベクター(Upstate Biotechnology)内にクローニングした。各トランスフェクションは、三回一組で（５μｇの各プラスミド）、上述のようにエレクトロポレーションによって実施された。トランスフェクションの有効性は、緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドを同時にトランスフェクションすることによって評価した。細胞の溶解及びルシフェラーゼ定量は、市販の試薬(Roche Diagnostics)を用いて実施した。
【０１０１】
細胞増殖アッセイにおける、異なる細胞周期の段階にある細胞の比率は、ヨウ化プロピジウム溶液及びフローサイトメトリーによって評価された。要約すると、細胞を遠心し、そしてペレットを１．５ｍＬの低浸透圧性ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液中で懸濁した。チューブを暗所において４℃で保持した。個々の核のＰＩ−蛍光は、標準的なＦＡＣＳｃａｎ装置(Becton Dickinson)を用いるフローサイトメトリーによって測定した。細胞周期は、Cell Fitプログラムによって解析した。トランスフェクションしたクローンは、エレクトロポレーションによって（３ＤＯ細胞）又はリポフェクタミンを用いて（Ｈ35ラット肝細胞腫細胞）、取扱説明書に従い(Gibco BRL)、既述の通りに調製し、そして２日後に解析した。放射性標識したチミジン取り込みアッセイは、段階的な濃度（１×１０5〜０．１７５×１０5／穴）で２４時間細胞を培養することによって実施した。２．５μＣｉ[3Ｈ]−チミジン／穴をファイバーグラスフィルター(Whittaker Co.)上で多重の吸引ろ過装置(Mash II)を用いて採集する１５時間前に添加し、そしてβカウンター(Packard)において計数した。
【０１０２】
結果
ＧＩＬＺの過剰発現はｃ−Ｆｏｓの転写を阻害する。
組換えＧＩＬＺが、in vitroでｃ−Ｆｏｓと、そしてin vitroでｃ−Ｊｕｎと特異的に相互作用し、活性ＡＰ−１がその標的ＤＮＡと結合するのを阻害することが証明されている(Mittellstadt PL et Ashwell JD, 2001)。今回、ＧＩＬＺがまた、上流のＡＰ−１活性化経路、例えばＭＡＰＫ活性化及びｃ−Ｆｏｓとｃ−Ｊｕｎの転写を妨害し得る可能性について取り組んだ。
【０１０３】
この目的のために、ウェスタンブロットによって、モノクローナルα−ＣＤ３抗体による刺激によりＧＩＬＺを過剰発現する３ＤＯクローンにおけるｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｆｏｓの発現を最初に評価した。ＴＣＲトリガリングは、空ベクターをトランスフェクションしたクローンにおけるｃ−Ｆｏｓ転写のアップレギュレーションを誘導したが（図１Ａ、レーン２）、ＧＩＬＺを過剰発現するクローンにおいてｃ−Ｆｏｓをアップレギュレートするのには失敗した（図１Ａ、レーン４）。しかしながら、ｃ−Ｊｕｎの転写の調節は、コントロール及びＧＩＬＺを過剰発現するクローンのいずれにおいても観察されず（図１Ｂ）、これは、この実験モデルにおいてｃ−Ｊｕｎ転写に重要な機構の活性な構成的コントロールの存在を示している。同じ結果が、２０分から６時間に及ぶ、試験した全ての動力学的時間で得られた。
【０１０４】
ＧＩＬＺの過剰発現は、ＥＲＫ−１／−２及びＲａｆを阻害するが、ＪＮＫのリン酸化は阻害しない。
ｃ−Ｆｏｓタンパク質の障害性の誘導は、部分的に、多量体化ＡＰ−１のトランス活性化（この（ｃ−Ｆｏｓ転写及びｃ−Ｊｕｎリン酸化を経由する）トランス活性化はＲａｓ／ＭＡＰＫ経路の支配下にある）の低下を説明することができる(Whitehurst CE and Geppert TD, 1996)。
【０１０５】
従って、ＧＩＬＺが、ＭＡＰＫのＥＲＫ−１／−２の活性化を妨害し得る可能性を試験した。コントロールの３ＤＯクローン及びＧＩＬＺを過剰発現している３ＤＯクローン由来の細胞は、モノクローナルα−ＣＤ−３抗体で５分間及び６０分間刺激された。予想されるように、コントロールのクローンは、活性化によるＥＲＫ−１／−２リン酸化レベルの増大を示した。対照的に、ＧＩＬＺを過剰発現するクローンは、α−ＣＤ３トリガリングに対し応答しなかった（図２Ａ）。Ｒａｆのリン酸化は、同一の挙動を示した（図２Ｂ）。これらの結果は、ＧＩＬＺを過剰発現している異なる３ＤＯクローンを用いて再現された。
【０１０６】
ＧＩＬＺの作用はＤＥＸによって誘導可能であり、そしてマウス胸腺細胞における抗ＣＤ３誘導型のシグナル伝達の阻害、特に、Ｒａｆ並びに下流タンパク質であるＭＥＫ及びＥＲＫ−１／−２のリン酸化と相関関係にあり、これは協調的に低下した（図３）。これらの結果は、ｍｙｃ−ＧＩＬＺ融合タンパク質を過剰発現しているＣＯＳ−７細胞においても再現され、そしてホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）で刺激され、ここで、ＭＥＫのリン酸化の阻害は、ウェスタンブロット解析及び抗−ｐＭＥＫ−１／−２抗体を用いて証明した。
【０１０７】
ｃ−Ｊｕｎのリン酸化及び転写を調節し、そして活性化がストレス活性型のＭＡＰＫ経路の支配下にあるＪＮＫは、刺激されていない３ＤＯクローン（空のクローン及びＧＩＬＺをトランスフェクションしたクローンの両方）において既にリン酸化されていた。α−ＣＤ３モノクローナル抗体による刺激はＪＮＫのリン酸化を増大させなかったが、反対に時間によって低下した（図４）。ＪＮＫ活性化の調節の欠如は、図１に示した実験において観察されたｃ−Ｊｕｎ転写の調節の欠如と対応していた。
【０１０８】
ＡＰ−１によって媒介される転写活性に対するＧＩＬＺ又はＲａｆの過剰発現の作用
ＡＰ−１転写活性に対するＧＩＬＺの作用は、活性型Ｒａｆの不在下又は存在下で、ＡＰ−１制御型プロモーターの支配下にあるルシフェラーゼ発現プラスミドによる３ＤＯ細胞の一過性トランスフェクションを用いて試験された。このベクターは、空のベクター又はＧＩＬＺを発現するベクターによりトランスフェクションされ、抗ＣＤ３活性化のもとＡＰ−１媒介型の転写に対するＧＩＬＺの阻害活性を示した(図５Ａ）。しかしながら、活性化が、Ｒａｆの活性型を発現するプラスミドを同時にトランスフェクションした細胞内で実施される場合には、ＡＰ−１媒介型の転写が最初のレベルで再確立される（図５Ｂ）。同一の細胞抽出物は、以前のようにウェスタンブロットで試験した場合（図３）、ＥＲＫ−１／−２及びＭＥＫの正常なリン酸化レベルの再確立を再び示す。従って、Ｒａｆの過剰発現は、ＧＩＬＺの阻害作用を克服し、ＧＩＬＺ特性の特異性を示す。
【０１０９】
これらのデータは、ＧＩＬＺがＲａｆ、ＭＥＫ、及びＥＲＫ−１／−２のリン酸化、そしてその後のｃ−Ｆｏｓ／ＡＰ−１媒介型の転写を阻害することを示しており、Ｆｏｓタンパク質を合成できなかったことが、ＡＰ−１ヘテロ二量体の複合体の形成の機能障害に重要であり、そしてその結果としてＡＰ−１トランス活性化の機能障害に重要であることを強く示唆している。
【０１１０】
ＧＩＬＺの過剰発現及び細胞増殖
ＧＩＬＺの過剰発現を可能にするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＧＩＬＺ）は、ＧｉＬＺが、細胞増殖を制御するシグナル伝達経路に対する作用を示すこれまでの実験を考慮して、この細胞機能に対する作用を有するか否かを証明するために、種々の細胞型においてトランスフェクションされた。幾つかの細胞系（安定的又は一過的にトランスフェクションしたもの）で観察されたデータは、細胞周期のＧ0Ｇ1期にある細胞の蓄積を進める（表ＩＩＩ）、ＧＩＬＺの抗増殖活性を確認した。ＧＩＬＺによって媒介される細胞増殖の制御に対するこれらの証拠は、放射性標識したチミジンの取り込みを測定することによっても証明された。
【０１１１】
実施例２：Ｒａｆ制御型のＭＡＰＫ伝達経路のＧＩＬＺを媒介する阻害機構
方法
免疫沈降
免疫沈降は、１ｍＭのＰＭＳＦを添加したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％のデオキシコール酸、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び５ｍＭのＥＤＴＡ）中で実施した。
【０１１２】
マウス細胞（脾臓、リンパ節、胸腺細胞及び３ＤＯ細胞）の細胞全体の抽出物を用いる免疫沈降の場合、α−Ｒａｆ、α−ＮＦ−ＡＴ及びα−Ｒａｓ抗体(Upstate Technology)は、タンパク質抽出物各１ｍｇにつき８μｇの濃度で使用した。抗原−抗体複合体は、プロテインＡ−セファロースビーズ(Pharmacia)で沈降し、そしてローディングバッファー中で煮沸することによってＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にビーズから分離された。
【０１１３】
ＣＯＳ−７細胞の細胞全体の抽出物を用いる免疫沈降の場合、細胞は、既述の通り(Luo ZJ et al., 1995)、２μｇの各プラスミドを用いて、ＤＥＡＥ−デキストラン法によってトランスフェクションされた。ヒトＲａｆを発現するプラスミドはｐＵＳＥａｍｐであった(Upstate Biotechnology)。ＣＯＳ−７ライセート（５００μｇ）は、ＲＩＰＡ緩衝液中で、α−Ｍｙｃ抗体（４μｇ／ｍｇタンパク質、Invitrogen）を用いて免疫沈降し、そしてα−Ｍｙｃ抗体（１μｇ／ｍｌ、Invitrogen）又はα−Ｒａｆ抗体(Upstate Biotechnology)を用いて実施された。ウェスタンブロットは上述のように実施した。
【０１１４】
ＧＳＴ融合タンパク質
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＧＩＬＺ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＧＩＬＺ）は、既述の通り調製した(Ayroldi E et al., 2001)。ヒトＲａｆのＲａｓ結合ドメイン（Ｒａｆ−ＲＢＤ，残基１−１４９；De Rooji J and Bos JL, 1997）を含んで成るＧＳＴ融合タンパク質、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤは、同一の発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ２プラスミド(Pharmacia)内でクローニングされ、そして同一の方法で得られた。
【０１１５】
ＧＳＴプルダウン実験
抽出物は、指定の細胞から調製し、既述の通り(Ayroldi E et al., 2001)、ＤＥＸ（１０μＭ）で処理し、又は処理しなかった。セファロースビーズ上に載せられたＧＳＴ又はＧＳＴ融合タンパク質は、結合バッファー（２５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で細胞抽出物と混合し、４２℃で５分間加熱し、４℃で２時間インキュベートし、結合バッファーで余計に洗浄し、ローディングバッファー中で再懸濁し、そして既述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットで解析した。マウス胸腺細胞抽出物の場合、ビーズとのインキュベーションは、４℃で一晩行った。α−ＭＥＫ及びα−ＥＲＫ抗体(Upstate Biotechnology)は、取扱説明書に従い使用した。
【０１１６】
結果
ＧＩＬＺはＲａｆ及びＲａｓと相互作用する。
抗原誘導型の活性化は、Ｒａｓのその活性型への変換並びにキナーゼＲａｆの活性化をもたらす。また、肥満細胞のＤＥＸによる処理が、Ｒａｓの活性化に影響を及ぼすことなくＲａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ−２のリン酸化を阻止したことが証明されている(Cissel DS and Beaven MA, 2000)。タンパク質間相互作用はタンパク質のリン酸化、活性化及び輸送に重要な影響をもたらし得るので、ＤＥＸ誘導型タンパク質、例えばＧＩＬＺが、最終的にＭＡＰＫカスケードに属するタンパク質に結合することができ、そしてそれらの活性化を阻害するか否かが証明されなければならない。
【０１１７】
最初に、全マウスＧＩＬＺを含むＧＳＴ−ＧＩＬＺは、ビーズ上に固定され、そして、コントロールとしてＧＳＴを負荷したビーズを用いる、ＤＥＸで刺激されていない又は刺激された３ＤＯ細胞から得られたタンパク質抽出物によるプルダウン実験において使用した。ビーズと相互作用するタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離され、そして膜上に移され、すぐにα−ＧＩＬＺ抗体でプローブされた。α−Ｒａｆ抗体と免疫反応性のあるバンドは、ＧＳＴ−ＧＩＬＺがプルダウン実験において使用された場合にのみ明りょうに検出可能である（図６Ａ）。これらの結果は、α−Ｒａｓ抗体によっても再現性があり（図６Ｂ）、これは胸腺並びに脾臓及びリンパ節において単離された精製Ｔ細胞から得られたタンパク質抽出物でも、未処理細胞とＤＥＸ処理細胞との間の結合における有為差無しに同様であった。
【０１１８】
最初の仮説は、ＤＥＸの刺激によりＧＩＬＺの発現をアップレギュレートすることが知られている、マウス胸腺細胞を用いることによって更に試験された。マウス胸腺細胞は、６時間ＤＥＸで処理し、そして細胞全体のライセートを、Ｒａｆ又はＮＦ−ＡＴのいずれかを認識する抗体により免疫沈降した。免疫沈降した材料は、ＧＩＬＺ又はＲａｆのいずれかを認識する抗体を用いるウェスタンブロットによって解析した。ＧＩＬＺに対する抗体は、α−Ｒａｆ抗体で免疫沈降し、そしてα−ＮＦ−ＡＴ抗体で免疫沈降しなかったライセート中でのみ免疫反応性のタンパク質を検出する。更に、より大量のＧＩＬＺが、ＤＥＸで刺激した細胞から一緒に免疫沈降し、これはそのような細胞におけるＧＩＬＺの発現の増大から予想した通りである（図７Ａ）。α−Ｒａｆ抗体により生成したウェスタンブロットにおいて示されるように、マウス胸腺細胞におけるＲａｆの発現は、ＤＥＸ処理によって影響を受けていないようであり（図７Ｂ）、それ故に、免疫沈降したＧＩＬＺの増量がＤＥＸインキュベーションによって直接生じる。同様の結果が、Ｒａｓに対する抗体を用いて、免疫沈降及びウェスタンブロットにおいて得られた。
【０１１９】
Ｒａｓ／ＲａｆとのＧＩＬＺの相互作用はまた、異なる細胞アッセイによって証明された。細胞系（ＣＯＳ−７）は、ＧＩＬＺの独立した検出を助けるエピトープであるＭｙｃと融合したＧＩＬＺを発現するプラスミドと一緒に又はそれ無しに、Ｒａｆを発現するプラスミドをトランスフェクションされた。トランスフェクションした細胞から得た抽出物は、Ｍｙｃ特異的抗体を利用した免疫沈降実験において使用した。Ｒａｆがライセート全体の全てで検出可能である、α−Ｍｙｃ抗体は、Ｍｙｃ−ＧＩＬＺを発現するプラスミドが一緒にトランスフェクションされた場合にのみ、ｍｙｃ−ＧＩＬＺを発現するプラスミドをトランスフェクションした細胞全体のライセート中のＲａｆを免疫沈降する。予想した通り、α−Ｍｙｃ抗体は、ｍｙｃ−ＧＩＬＺ及びＲａｆをトランスフェクションした細胞の全ライセート中、並びにα−Ｒａｆ抗体で一緒に免疫沈降した材料中でｍｙｃ−ＧＩＬＺタンパク質を検出するが、Ｒａｆ発現プラスミドのみをトランスフェクションした細胞から得られた細胞抽出物中のものは検出しない（図８）。これまでのように、同様の結果が、Ｒａｆに対する抗体を用いて、免疫沈降及びウェスタンブロットにおいて得られた。
【０１２０】
比較試験のために、ＲａｆのＮ末端（残基１〜１４９）もＧＳＴとの融合タンパク質として発現させた。このＲａｆセグメントは、ＲａｆのＲａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ、残基５１−１３１、Winkler DG et al., 1998）を含み、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤと称した。
【０１２１】
最初のアッセイにおいて、Ｒａｓを過剰発現するＣＯＳ−７細胞系由来の細胞抽出物は、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ及び増大する量のＥ．コリが発現したマウスＧＩＬＺと一緒にインキュベートした。洗浄後、複合体はウェスタンブロットによって解析し、その結果、ＧＩＬＺによる、量依存性の、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤからのＲａｓの転移作用を示した。第二のＧＳＴプルダウン実験も、ＧＩＬＺはＧＳＴタンパク質単独では検出可能でないが、ＧＩＺに対する抗体によって認識されるタンパク質は、細胞全体のライセート中の固定化されているＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤによって保持された材料中で検出されうることを示す（図９Ｂ）。Ｒａｆに対する抗体によるこれまでの免疫沈降実験において示したように（図７Ａ）、大量のＧＩＬＺがＤＥＸ処理した胸腺細胞由来の抽出物において検出される。
【０１２２】
これらの実験は、ＧＩＬＺが、Ｒａｓの認識にも関与するＲａｆドメインと、おそらくＲａｓと競合することによって相互作用することを示す。しかしながら、この干渉作用はまた、三量体複合体ＧＩＬＺ／Ｒａｆ／Ｒａｓにおいても発揮され得る。
【０１２３】
最後に、同一経路の他の成分の代わりの、ＲａｆについてのＧＩＬＺの結合特異性も、刺激していない又は刺激したマウス胸腺細胞から得たライセートによる前述のプルダウンアッセイを用いて、そしてウェスタンブロットの場合にはα−ＭＥＫ−１／−２抗体を用いて試験した。この場合、前記抗体は、ＧＩＬＺをプルダウンした材料中にこれらのキナーゼの有意な存在性を明らかにせず、但し、ＧＩＬＺとこれらのタンパク質との直接的な相互作用を除く（図１０）。
【０１２４】
これらの証拠は、ＧＩＬＺに関与するタンパク質間相互作用が、ＤＮＡ結合に直接関与するタンパク質のレベルにおいてだけでなく、転写因子の上流の制御因子のレベルにおいても、特にＲａｆのリン酸化、結果としてＭＡＰＫの下流のリン酸化を抑制することによって、転写パターンの変化にとって重要であるという仮説を裏付ける。
【０１２５】
実施例３：ＧＩＬＺ／Ｒａｆ相互作用の構造−機能研究
方法
ＧＩＬＺフラグメント含有ＧＳＴ融合タンパク質及びＧＳＴプルダウン実験
ＧＩＬＺの異なるセグメントを含むグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、そのようなＧＩＬＺフラグメントをコードするセグメントを、ＧＳＴ−ＧＩＬＺの発現について最初に説明したプラスミド内にクローニングすることによって調製した(Ayroldi E et al., 2001)。必要な場合（すなわち、最初のＧＩＬＺのメチオニンが含まれなかった場合はいつでも）、Ｍｅｔコドンが、正常な遺伝学により配列の５’側に追加された。ＧＳＴプルダウン実験は、３ＤＯ細胞によるこれまでの実験に記載したように実施した。
【０１２６】
放射性標識ＧＩＬＺタンパク質
完全、欠失及び変異マウスＧＩＬＺ（図１１）は、ＰＣＲによって得られ、そしてｐＣＲ３．１(Invitrogen)内にクローニングされた。ΔＣ−ＧＩＬＺは、マウスＧＩＬＺの最初の９７アミノ酸を含む。ＤＮ−ＧＩＬＺは、残基７３−１３７と融合したｍＧＩＬＺの最初の８アミノ酸を含む。[３５S]−メチオニンによるin vitro翻訳は、市販のウサギ網状赤血球転写−翻訳系(TNT, Promega)を用いて実施した。
【０１２７】
結果
ＧＩＬＺ／Ｒａｆ相互作用の特異性
ＥＲＫ−１／−２リン酸化に対するＧＩＬＺ過剰発現の阻害作用の結果及びＧＩＬＺとＲａｆとの物理的相互作用を考慮すると、結合に重要なＧＩＬＺ及びＲａｆタンパク質のドメインを同定することは重要である。タンパク質間相互作用を研究するために一般的に使用される複数のアプローチの中でも、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いて融合されるＧＩＬＺ及びＲａｆタンパク質を利用するプルダウン実験が実施された。
【０１２８】
in vitroでの構造−活性実験は、前述のようなプルダウン実験において細胞のライセートをアッセイすることによって、一連のＧＩＬＺ及びＲａｆの切断型又は一部位突然変異体、並びにin vitro３５S標識ＧＩＬＺ変異体により、更に正確に相互作用に関与するこれらのタンパク質のドメインをマッピングするために行われた(図１１）。
【０１２９】
ＧＳＴプルダウン実験はまた、組換えＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ融合タンパク質を用いて実施した（図１２）。ＧＳＴ単独ではなく、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ融合タンパク質は、ＧＩＬＺ完全長タンパク質並びにＣ末端領域を欠いているＧＩＬＺの切断型（ΔＣ−ＧＩＬＺ）に結合する。反対に、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ融合タンパク質を負荷したビーズは、Ｎ末端領域を欠いてい得るＧＩＬＺ型（ΔＮ−ＧＩＬＺ）を保持しない。
【０１３０】
ＧＩＬＺのこれら２つの切断型は、共に、ＧＩＬＺの二量体化に関与することが知られているロイシンジッパーを含む、残基７６−９７を含んで成るように設計された。特定の突然変異が、ホモ二量体化及びＲａｆ相互作用のＧＩＬＺの特性が、同一のタンパク質配列又は異なるドメインによって提供されるか否かを確かめるために、このセグメント内に導入された。アスパラギン（Ｎ８７Ａ−ＧＩＬＺ）又は３つのロイシン（３ＬＡ−ＧＩＬＺ）のいずれかがアラニンに突然変異している組換え完全長ＧＩＬＺタンパク質は、ビーズ上に固定されているＧＳＴ−ＧＩＬＺによって保持されず、ＧＩＬＺのホモ二量体化におけるこれらの残基の重要性が確認された。しかしながら、これらの突然変異体は、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤが固定化されているビーズに保持される（図１３）。これらの実験は、二量体化及びＲａｆの結合が、異なるタンパク質ドメインに起因するＧＩＬＺの特性であることを示唆している。
【０１３１】
最後に、ＧＩＬＺのＮ−末端の様々なセグメントを含むＧＳＴ融合タンパク質は、既述のように、３ＤＯにおいて試験した（図６Ａを参照のこと）。残基１６と３６の間に含まれる領域（配列番号３）を少なくとも含むＧＩＬＺは、Ｒａｆと効率的に結合するようである（図１４）。
【０１３２】
ＧＩＬＲ配列に基づく構造−活性の予測
既に論じられているように、ＴＳＣタンパク質ファミリーは、進化的に保存されている二量体ドメインを共有するロイシンジッパータンパク質（ＧＩＬＺ、ＴＳＣ−２２、ＴＨＧ−１、ＤＩＰ）を含んで成り、これらはほとんど保存されていないＮ末端とＣ末端ドメインの間に含まれる。これらの後者のものは、恐らくＴＳＣタンパク質の機能を特徴付ける領域であり、一方、保存されたものは、ホモ二量体化を可能にし、そしておそらくはこれらのタンパク質のヘテロ二量体化を可能にする。
【０１３３】
構造が解明されている唯一のＴＳＣ関連タンパク質は、ブタＤＩＰであり(Seidel G et al., 1997)、これはヒトＧＩＬＺのセグメント５８−１３４と高度に相同性のある７７残基長のタンパク質であって、ＧＩＬＺ及びＴＳＣ−２２の中心／Ｃ末端部分に相当する。従って、ＧＩＬＺのＲａｆ結合ドメインとしてこれまでの実験によって区切られた領域の多くについての構造データは利用可能でない。
【０１３４】
タンパク質の二次構造を予測するための複数の方法が利用可能であり、そしてそれらの幾つかはｍＧＩＬＺ（１−９７）及びｈＧＩＬＺ（１−９７）に適用されてきた。当該予測に基づき、このＮ末端領域は、ランダムコイル領域の内側にあるヘリックス領域（残基１−２０）、伸長された鎖が強力に予測される領域（残基２１−５０）、及びロイシンジッパー内に４つの重要なロイシン残基（７６、８３、９０及び９７位）及びアスパラギン残基（８７位）を含む長いヘリックス構造を含んで成り、これらは前記ファミリーの規範的なロイシンジッパー構造に適合する（図１５）。ＰＲＯＳＩＴＥデータベース(Bairoch A et al., Nucl. Acids Res 1997, 25: 217-221; URL: http://www.expasy.ch/prosite)によると、この後者のセグメントは、ＴＳＣタンパク質ファミリーの痕跡の始まり（メチオニン５８）及びロイシンジッパーパターン（ロイシン７６から開始）を含む。
【０１３５】
Ｒａｆの結合を可能にするＧＩＬＺ配列は、図１４に示すように、ＧＩＬＺ（１６−３６）に含まれる。特に、ＧＩＬＺの結合決定因子の構造的特徴がこのフラグメントの多くのＮ末端及びＣ末端配列に存在し得るのは、中心領域が高度に疎水性であるためである（２１〜２９の間の配列ＳＴＳＦＦＳＳＬＬを参照のこと）。アポトーシス又は変換を制御する他のタンパク質複合体について従来技術において示された例、例えばＭＤＭ２／ｐ５３及びＢｃｌＸＬ／Ｂａｋは、ヘリックスコイルドコイルペプチドが単離された分子として使用されることがあり、タンパク質間相互作用を破壊する化合物を開発するために修飾され得ることを示している(Cochran AG 2001; Chin JW and Schepartz, A, 2001)。
【０１３６】
配列番号３の少なくとも５個連続したアミノ酸を含んで成るポリペプチド又はペプチドは、そのような領域の構造因子に相当するＧＩＬＺのＮ末端ドメインのフラグメントであると推測され得る。これらのペプチドの例は、配列ＧＩＬＺ（１−２０）、ＧＩＬＺ（２１−５０）、ＧＩＬＺ（１−５０）、ＧＩＬＺ（１０−３０）、ＧＩＬＺ（１０−４０）、ＧＩＬＺ（１６−２２）、ＧＩＬＺ（３０−３６）、ＧＩＬＺ（１０−５０）、ＧＩＬＺ（３０−５０）、ＧＩＬＺ（１６−５８）、又はＧＩＬＺ（１−３６）に相当する。
【０１３７】
従って、１又は複数のこれらの構造因子に属する配列を部分的又は完全に含むＧＩＬＺフラグメントは、有用に試験されうる。そのようなフラグメントは、本発明で開示されているアッセイに類似のものにかけることを含んで成る慣習的な実験によって決定した場合、本発明において特徴付けられるＧＩＬＺの同一の新規な生物活性を示すはずである。
【０１３８】
ＧＩＬＺ突然変異体を用いて得られた結果は、ＧＩＬＺのＮ末端ドメインが、ＲａｆのＲａｓ結合ドメインと相互作用することを示している。更に、二量体化しないＧＩＬＺ突然変異体を用いて得られた結果も、ＧＩＬＺ／ＮＦ−κＢ相互作用と異なり、ＧＩＬＺ／Ｒａｆ相互作用がＧＩＬＺの二量体化を必要とせず、そしてそれが１：１のタンパク質：タンパク質の相互作用モデルに適合することを示している。ＧＩＬＺとＮＦ−κＢとの相互作用についての証拠と比較して、異なる分子部分がＮＦ−κＢ及びＲａｆとの相互作用に重要であり、そしておそらく、ＧＩＬＺがその二量体及び／又は単量体の配置の比率に依存して、優先的にＮＦ−κＢ又はＲａｆと結合し得ることが示唆され得る。得られた結果はまた、ＧＩＬＺが、細胞の状態（刺激されたもの／刺激されたもの、形質転換してないもの／形質転換したもの）及び／又は細胞型（末梢リンパ／中枢リンパ球、又は他の組織）に依存して、単独で、又は他のＲａｆ相互作用タンパク質（例えば、Ｒａｓ。実施例２に示した通り）と一緒に、Ｒａｆと結合しうることを排除することができない。
【０１３９】
上文の結果は、ＧＩＬＺが、ＭＡＰＫ媒介型の作用の主な媒介因子として、ＧＣＨ誘導型のＭＡＰＫ経路の阻害に直接関与し、細胞増殖／炎症／細胞の免疫抑制活性、そして恐らくはサイトカイン産生を調節することを明確に示している。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】ｃ−Ｆｏｓ（Ａ）及びｃ−Ｊｕｎ（Ｂ）の発現に対するＧＩＬＺの過剰発現作用を示すウェスタンブロット解析。核の細胞ライセートは、ｐｃＤＮＡ３−３ＤＯ細胞（空のベクターをトランスフェクションしたクローンＰＶ６、レーン１−２）及びＧＩＬＺ−ｐｃＤＮＡ３−３ＤＯ細胞（クローンＧＩＲＬ−１９、レーン３−４）から、刺激せず（レーン１及び３）、又は固定化α−ＣＤ３抗体で２時間刺激した後（レーン２及び４）に調製した。
【図２】Ｒａｆ及びＥＲＫ−１／−２のリン酸化に対するＧＩＬＺ過剰発現の作用を示すウェスタンブロット解析。細胞全体のライセートは、ｐｃＤＮＡ３−３ＤＯ細胞（空のベクターをトランスフェクションしたクローンＰＶ６、レーン１−３）及びＧＩＬＺ−ｐｃＤＮＡ３−３ＤＯ細胞（クローンＧＩＲＬ−１９、レーン４−６）から、刺激せず（レーン１及び４）、又はプラスチックに結合したモノクローナルα−ＣＤ３抗体で２０分間（レーン２及び５）及び６０分間（レーン３及び６）刺激した後（レーン２及び４）に調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した細胞全体のライセートを移した膜は、リン酸化ＥＲＫ−１／−２に特異的な抗体で最初にプローブされ、続いて、ストリッピングの後、それはα−ＥＲＫ抗体（Ａ）で再びプローブされた。あるいは、当該膜は、リン酸化Ｒａｆに特異的な抗体で最初にプローブされ、続いて、ストリッピングの後にα−Ｒａｆ抗体（Ｂ）で再びプローブされた。当該膜はまた、等量のタンパク質が各レーンに負荷されたことを証明するために、β−チューブリンに特異的な抗体で再びプローブされた。
【図３】Ｒａｆ、ＭＥＫ、及びＥＲＫ−１／−２のリン酸化に対するＤＥＸ誘導型のＧＩＬＺ過剰発現作用を示すウェスタンブロット解析。膜はストリッピングされ、そして図２に示すように再びプローブされた。
【図４】ＳＡＰＫ／ＪＮＫのリン酸化パターンに対するＧＩＬＺ過剰発現作用を示すウェスタンブロット解析。ｐｃＤＮＡ３（クローンＰＶ６）又はＧＩＬＺ−ｐｃＤＮＡ３（クローンＧＩＲＬ−１９）をトランスフェクションした３ＤＯクローンは、指定時間、プラスチックに結合したモノクローナルα−ＣＤ３抗体で刺激された。細胞全体のライセートは、ＪＮＫのリン酸化型の両方（ホスホ−ｐ５４、ホスホ−ｐ４６）を認識する抗体でプローブされた。
【図５】異なるプラスミドの存在下で、抗ＣＤ３抗体で刺激せず、又は刺激した、ＡＰ−１制御型ルシフェラーゼ遺伝子で一過的にトランスフェクションした３ＤＯを用いるルシフェラーゼアッセイ。刺激は、（Ｂ）においては１時間行った。
【図６】内因性Ｒａｆ／ＲａｓとＧＳＴ−ＧＩＬＺとのタンパク質間相互作用を証明するウェスタンブロット解析。ＧＳＴプルダウンアッセイは、ＤＥＸ（１００ｎＭ）で処理し、又は処理しなかった３ＤＯの細胞全体の抽出物（５００μｇ）の存在下で実施した。ウェスタンブロットは、指定の一次抗体を用いて実施した。
【図７】マウス胸腺細胞は、ＤＥＸで６時間処理した。細胞全体のライセートを、α−Ｒａｆ又はα−ＮＦ−ＡＴ（コントロールとして使用）で免疫沈降（ＩＰ）した。膜はα−ＧＩＬＺ抗血清（Ａ）でプローブし、ストリッピングし、そしてα−Ｒａｆ抗体（Ｂ）で再びプローブした。免疫グロブリンの重鎖の位置をＨＣで示した。
【図８】トランスフェクションした細胞中でのＧＩＬＺとＲａｆの相互作用を証明するウェスタンブロット解析。ＣＯＳ−７細胞は、ｐＵＳＥａｍｐ−Ｒａｆのみ（Ｒａｆを有する発現ベクター、レーン１及び３）又はｐＵＳＥａｍｐ−Ｒａｆ及びｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＧＩＬＺ（Ｍｙｃタグ付きＧＩＬＺを有する発現ベクター、レーン２及び４）のいずれかで同時にトランスフェクションした。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をそれぞれＨＣ及びＬＣで示す。
【図９】ＲａｆとＧＩＬＺの相互作用が、Ｒａｓ結合ドメインを含んで成るＲａｆ領域によって媒介されることを示すウェスタンブロット解析。ＧＳＴプルダウンアッセイは、ヒトＲａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）を含んで成る融合タンパク質であるＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ又はＧＳＴのみを用いて実施した。細胞全体のライセートは、Ｒａｓを過剰発現しているＣＯＳ−７細胞から得られ、これは続いてＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ及び異なる量のＧＩＬＺに曝露され（Ａ）、あるいは前記ライセートは、ＤＥＸ処理していない／処理した休戦細胞から得られた（Ｂ）。
【図１０】ＧＩＬＺとＲａｆの相互作用の特異性を示すウェスタンブロット。ＧＳＴプルダウン実験は、細胞全体のライセートの存在下でインキュベートした、ＧＩＬＺ完全長タンパク質を含むＧＳＴ−ＧＩＬＺ融合タンパク質又はＧＳＴのみを用いて実施した。ウェスタンブロットは、α−ＭＥＫ又はα−ＥＲＫ抗体を用いて実施した。
【図１１】プルダウン実験において使用したＧＩＬＺ突然変異体の略図。
【図１２】ＲａｆのＲａｓ結合ドメインとＧＩＬＺの間の相互作用が、ＧＩＬＺのＮ末端領域に位置するドメインによって媒介されることを示すウェスタンブロット解析。グルタチオンセファロースビーズに付着したＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ融合タンパク質は、in vitroで、３５S標識した完全長のＧＩＬＺ（３５S−ＧＩＬＺ）、又はＣ末端領域を欠失しているＧＩＬＺ（３５S−ΔＣ−ＧＩＬＺ）若しくはＮ末端領域を欠失しているＧＩＬＺ（３５S−ΔＮ−ＧＩＬＺ）と一緒に一晩インキュベートした。レーン１：放射性標識したタンパク質試料。レーン２：ＧＳＴビーズ上に固定化された放射性標識タンパク質。レーン３：ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤビーズ上に固定化された放射性標識タンパク質。
【図１３】ＲａｆのＲａｓ結合ドメインとＧＩＬＺとの間の相互作用が、ＧＩＬＺの二量体化ドメインと異なるＧＩＬＺドメインによって媒介されることを示すウェスタンブロット解析。グルタチオンセファロースビーズ上に固定化されたＧＳＴ−ＧＩＬＺ又はＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ融合タンパク質は、in vitroで、３５S標識した完全長のＧＩＬＺ又はＧＩＬＺ突然変異体と一緒に一晩インキュベートした。レーンＣ：放射性標識タンパク質試料。
【図１４】異なるＧＩＬＺフラグメントが、３ＤＯ細胞を用いるＧＳＴプルダウンアッセイにおいて、細胞抽出物中のＲａｆと結合することを示すウェスタンブロット（図６を参照のこと）。
【図１５】それぞれ配列番号１及び配列番号２に相当する、マウスＧＩＬＺ（ｍＧＩＬＺ）及びヒトＧＩＬＺ（ｈＧＩＬＺ）のＮ末端領域の二次構造の予測。マウスとヒトのＧＩＬＺで同一の残基を−で示す。当該予測は、以下の方法：ＰＲＥＤＡＴＯＲ（ＰＲＥＤ；Frishman D and Argos P, Protein Eng 1996, 9(2):133-142）、ＧＩＢＲＡＴ(Gibrat, JF et al., J Mol Biol 1987, 198: 425-443)、ＳＯＰＭＡ(Geourjon C and Deleage G, Cabios 1995 11: 681-684)を用いることによって得た。これらの方法は、異なるインターフェースを介して、例えばＮＰＳ＠サイト(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_server.html)において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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