(57)【要約】  所望のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む非霊長類レンチウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法。アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができるＮＯＩを含むレンチウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法も記載される。第１核酸配列を含むウイルスベクターであって、前記第１核酸配列が（ａ）アプタザイムを含む第２核酸配列、及び（ｂ）ポリヌクレオチドを生成することができる第３核酸配列を含み、（ａ）及び（ｂ）は機能できる形で結合し、前記ポリヌクレオチドを生成するように第１核酸配列の転写物を切断するために、アプタザイムが活性化することができるウイルスベクターについても記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む非霊長類レンチウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項２】
前記ＮＯＩが、治療用タンパク質又はアプタザイムをコードし、且つ発現することができる、或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非霊長類レンチウイルス発現ベクターが、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、又はＭＶＶに由来する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＯＩ又はアプタザイムを含むレンチウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができるトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項５】
前記レンチウイルス発現ベクターが、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＭＶＶ、又はＨＩＶに由来する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発現ベクターを生体内（in vivo）又は生体外（ex vivo）で導入する請求項１から５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、子宮内細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、周産期細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、胚細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、胎児細胞である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、生殖細胞系列の変化を生じさせることができる請求項１から１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、生殖細胞である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、配偶子形成に関与する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、卵母細胞、卵管細胞、卵巣細胞、卵子、卵原細胞、接合体、ＥＳ細胞、胚盤細胞、精母細胞、精細胞、精子、又は精原細胞である請求項１１から１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
前記レンチウイルス発現ベクターを胚盤葉、臍帯、胎盤、羊水、子宮、又は生殖腺を介して、或いは腹腔内、筋肉内、脊髄内、頭蓋内、静脈内、呼吸器内、胃腸、又は肝内投与によって前記細胞に導入する請求項１から１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
前記レンチウイルス発現ベクターを胚盤葉、臍帯、胎盤、又は羊水を介して、或いは腹腔内、筋肉内、脊髄内、頭蓋内、静脈内、呼吸器内、胃腸、又は肝内投与によって子宮内細胞に導入する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＮＯＩを含むレンチウイルス発現ベクターを非分裂細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項１８】
前記レンチウイルス発現ベクターが、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＭＶＶ、又はＨＩＶに由来する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＯＩが、タンパク質又はアプタザイムをコードし、且つ発現することができる、或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができる請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、生殖細胞系列の変化を生じさせることができる請求項１７から１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、生殖細胞である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、配偶子形成に関与する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、卵母細胞である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、動物又は酵母に由来する請求項１から２３のいずれか記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、非ヒト生物に由来する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、哺乳動物細胞である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、マウス、ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、ウマ、鳥類、昆虫、爬虫類、又は魚類の細胞である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）又はキイロショウジョウバエに由来する請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記レンチウイルス発現ベクターが偽型である請求項１から２８のいずれか記載の方法。
【請求項３０】
前記レンチウイルス発現ベクターがいかなる機能性アクセサリー遺伝子も含まない請求項１から２９のいずれか記載の方法。
【請求項３１】
ＮＯＩが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は誘導性プロモーターに機能できる形で結合されている請求項１から３０のいずれか記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれか記載の方法によって作製したトランスジェニック細胞。
【請求項３３】
請求項３２に記載のトランスジェニック細胞から、又は請求項１から３１のいずれか一項で定義した方法から生成することによって生じる、又は得ることができるトランスジェニック生物。
【請求項３４】
前記ＮＯＩが、卵管細胞、生殖路細胞、（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、又はこれらのいずれかの前駆細胞を含む）造血細胞、分泌細胞、乳腺細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、間質細胞、星状膠細胞、又はグリア細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロン、線維芽細胞、肝細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、心臓細胞、又は肺細胞中に発現される請求項３３に記載のトランスジェニック生物。
【請求項３５】
前記生物が、鳥類である請求項３３又は３４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項３６】
前記生物が、ニワトリ、アヒル、又はガチョウなどの家禽である請求項３５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項３７】
請求項３３から３６のいずれか記載のトランスジェニック生物由来のトランスジェニック卵。
【請求項３８】
タンパク質をコードし、且つ発現することができる少なくとも１個のＮＯＩを含む請求項のいずれか記載のトランスジェニック生物又は卵。
【請求項３９】
さらに、アプタザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができる少なくとも１個のＮＯＩを含む請求項３８に記載のトランスジェニック生物又は卵。
【請求項４０】
第１核酸配列を含むベクターであって、前記第１核酸配列が
（ａ）アプタザイムをコードする第２核酸配列、及び
（ｂ）ポリヌクレオチドを生成することができる第３核酸配列を含み、
（ａ）及び（ｂ）は機能できる形で結合し、且つ前記ポリヌクレオチドが生じるように前記第１核酸配列の転写物を切断すべく前記アプタザイムを活性化することができるベクター。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドが、標的遺伝子の発現を調節することができるＲＮＡ分子である請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
前記ＲＮＡ分子が、アプタザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選択される請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
第１核酸配列を含むベクターであって、前記第１核酸配列が
（ａ）アプタザイムをコードする第２核酸配列、及び
（ｂ）ＮＯＩを含む第３核酸配列を含み、
（ａ）及び（ｂ）は機能できる形で結合し、且つ前記ＮＯＩの発現が阻害されるように第１核酸配列の転写物を切断すべく前記アプタザイムを活性化することができるベクター。
【請求項４４】
前記第３核酸配列の転写物内の位置で前記第１核酸配列の転写物を切断すべく前記アプタザイムを活性化することができる請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
ＮＯＩが、治療用タンパク質をコードする請求項４３又は４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記アプタザイムが、リガンドによって活性化される請求項４０から４５のいずれか記載のベクター。
【請求項４７】
前記アプタザイムが、リガンドによって不活化される請求項４０から４５のいずれか記載のベクター。
【請求項４８】
前記ベクターが、請求項４６又は４７のリガンドをコードする第４核酸配列を含む請求項４６又は４７に記載のベクター。
【請求項４９】
前記リガンドをコードする前記核酸配列がプロモーターに機能できる形で結合されている請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
前記リガンドが、ポリペプチド及びその断片、線状ペプチド、環状ペプチド、及びそれらをコードする核酸、低分子量の有機又は無機の化合物及び抗体を含む、合成及び天然化合物からなる群から選択される請求項４６から４９に記載のベクター。
【請求項５１】
前記リガンドが、ＦＭＮ、ドキシサイクリン及びＶＥＧＦ、テトラサイクリン及びグルコースからなる群から選択される請求項４６から４９に記載のベクター。
【請求項５２】
（ａ）及び（ｂ）が、プロモーターに機能できる形で結合されている請求項４０から５１のいずれか記載のベクター。
【請求項５３】
前記プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター及びＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターからなる群から選択される請求項５２に記載のベクター。
【請求項５４】
前記第１核酸配列の転写がテトラサイクリンモジュレータ及びテトラサイクリン又はその誘導体によって調節されるように、前記プロモーターが少なくとも１コピーのテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）に機能できる形で結合されている請求項５２に記載のベクター。
【請求項５５】
前記ベクターがテトラサイクリンモジュレータをコードする第５核酸配列を含む請求項５４に記載のベクター。
【請求項５６】
前記ウイルスＲＮＡゲノム内でヘアピンを形成して活性アプタザイムが形成されることを防止するために、前記アプタザイムの部分と塩基対を作りうる配列を前記プロモーターがその３’末端に含む請求項５２から５５のいずれか記載のベクター。
【請求項５７】
ウイルスベクターの形である請求項４０から５６のいずれか記載のベクター。
【請求項５８】
ウイルスＲＮＡゲノム内に活性アプタザイムが形成されることを防止するために、前記ベクターが分割イントロンベクターとして構成されている請求項５７に記載のベクター。
【請求項５９】
前記ベクター系が、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ベクター、ヘルペスベクター、ポックスウイルスベクター、パルボウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターに由来する請求項５７又は５８に記載のベクター。
【請求項６０】
請求項４０から５９のいずれか記載のベクターを使用するトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項６１】
請求項６０で定義したトランスジェニック細胞から生成することによって生じる、又は得ることができるトランスジェニック生物。
【請求項６２】
請求項４６から５９のいずれか記載のウイルスベクターを使用する請求項１から３１のいずれか記載の方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法によって作製したトランスジェニック細胞。
【請求項６４】
請求項６３に記載のトランスジェニック細胞から生成することによって生じる、又は得ることができるトランスジェニック生物。
【請求項６５】
ＮＯＩが、卵管細胞、生殖路細胞、アルブミン、（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、又はこれらのいずれかの前駆細胞を含む）造血細胞、分泌細胞、乳腺細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、間質細胞、又はグリア細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロン、線維芽細胞、肝細胞、星状膠細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、心臓細胞、又は肺細胞中に発現される請求項６４に記載のトランスジェニック生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック細胞の作製方法、及びトランスジェニック生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子及び／又は他のＤＮＡ配列を哺乳類などの生物の生殖細胞系列（germline）又は体細胞に導入することができることは、最近の生物学における最も偉大な技術進歩の１つである。そのような動物をトランスジェニック動物と言う。生殖細胞系列の変化が関与する場合、遺伝子操作の結果はその動物の子孫によって受け継がれ、これらの子孫の細胞は全て、その遺伝子構造の部分として導入遺伝子及び場合によっては欠失ＤＮＡを受け継ぐ。トランスジェニック哺乳類によって、胚形成及び分化中の遺伝子調節の研究、発癌遺伝子の作用の研究、及び免疫系細胞における細胞の複雑な相互作用の研究用の手段が提供されてきた。その動物全体は、複雑な生物学的プロセスを支配する遺伝子を操作するための究極のアッセイ系である。さらに、トランスジェニック動物によって、有用な組換えタンパク質の発現やヒト遺伝子異常の正確な動物モデルの生成に対し、興味深い可能性がもたらされる。
【０００３】
トランスジェニック動物の作製は、通常２つの方式：胚幹（ＥＳ）細胞における相同組換えによるＤＮＡの標的を定めた挿入による方式であって、労働集約的で時間のかかる工程であるもの、又は受精卵の前核の注射による方式であって、ＤＮＡの組込みが無作為であり大型で直列のＤＮＡ配列体の挿入をもたらし得る、不安定でその後の細胞分裂中に再配列及び欠失を起こしがちなもののいずれかで行われる。ＷＯ９９／５１７５５は、トランスジェニック動物作製用に、少なくとも１つのリボザイムをコードする核酸を含むレトロウイルス発現ベクターの使用について述べている。特定の実施例で使用したレトロウイルスの具体的な開示はない。アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルスの使用の可能性にも言及している。しかし、これらのウイルスの使用について、具体的実施例はない。
【０００４】
したがって、近年、遺伝子治療での使用にレトロウイルスが提案されてきた。本質的に、レトロウイルスは、溶解性ウイルスの生活環とは異なる生活環を有するＲＮＡウイルスである。この点で、レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムはＤＮＡ型に変換される。すなわち、レトロウイルスはＤＮＡ中間体を介して複製する感染実体である。レトロウイルス感染などについての詳細を後に示す。
【０００５】
多種のレトロウイルスがあり、例には以下が含まれる：マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄腫ウイルス−２９（ＭＣ２９）、及びトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）。
【０００６】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）やウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含むレンチウイルスと称する科もある。詳細を以下に示す。
【０００７】
レトロウイルス及びレンチウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ等、（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、１９９７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁）に見出すことができる。
【０００８】
幾つかのレトロウイルスのゲノム構造の詳細は当技術分野で見出すことができる。例として、ＨＩＶの詳細は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋから見出すことができる（すなわち、ゲノムアクセッション番号ＡＦ０３３８１９）。
【０００９】
上記したように、レトロウイルスの小さな下位グループであるレンチウイルスに基づくレトロウイルスベクター系の開発に相当の関心が持たれてきた。この関心は、第１にＨＩＶ感受性細胞に抗ＨＩＶ治療遺伝子を標的とさせるためにＨＩＶを基にしたベクターを使用する考えから、第２にその予測から生じる。というのは、レンチウイルスは非分裂細胞にも感染することができ（Ｌｅｗｉｓ  ＆  Ｅｍｅｒｍａｎ、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、５１０頁）、これらのウイルスに基づくベクター系は非分裂細胞に形質導入できるはずであるからである（たとえば、Ｖｉｌｅ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ、１９９５、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５１、１２頁）。ＨＩＶに基づくベクター系が作製され（Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ  ＆  Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６、２７３１頁）、それらを使用して予想通りに非分裂細胞であるＣＤ４＋細胞に形質導入を生じさせてきた（Ｎａｌｄｉｎｉ等、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２、２６３頁）。さらにレンチウイルスベクターは当該遺伝子の非常に安定した長期発現を可能にする。これは、形質導入したラット神経細胞では少なくとも３カ月であることが示されてきた。ＭＬＶに基づくベクターは６週間しか当該遺伝子を発現することができなかった。
【００１０】
今日までに作製されたＨＩＶに基づくベクターは、形質導入細胞中にその末端にＨＩＶ  ＬＴＲを有する組込みプロウイルスをもたらす。このことはこれらのベクターの使用を制限する。内部プロモーターが使用されない場合は、いかなる挿入遺伝子に対してもＬＴＲを発現シグナルとして使用しなければならないからである。内部プロモーターの使用には著しい短所がある。レトロウイルスＬＴＲ転写単位内に追加のプロモーターを置くことの予測不可能な結果は詳しく実証されている（Ｂｏｗｔｅｌｌ等、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、２４６４頁；Ｃｏｒｒｅｌｌ等、１９９４、Ｂｌｏｏｄ  ８４、１８１２頁；Ｅｍｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３９、４５９頁；Ｇｈａｔｔａｓ等、１９９１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１、５８４８頁；Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ等、１９８９、ＰＮＡＳ  ８６、３５１９頁；Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ等、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６６、８４１６頁；Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６３、１７７９８頁；Ｌｉ等、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３、３８１頁；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ等、１９９３、Ｖｉｒｏｌ．１９５、１頁；Ｏｖｅｒｅｌｌ等、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、１８０３頁；Ｓｃｈａｄｍａｎ等、１９９１、ＰＮＡＳ  ８８、４６２６頁；Ｖｉｌｅ等、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１、３０７頁；Ｘｕ等、１９８９、Ｖｉｒｏｌ．１７１、３３１頁；Ｙｅｅ等、１９８７、ＰＮＡＳ  ８４、５１９７頁）。関与する要因には、２つのプロモーターの相対的位置及び方位、プロモーターの性質及び発現される遺伝子、並びに採択され得るいかなる選択手順も含まれると思われる。内部プロモーターの存在は、パッケージング細胞系から得られる形質導入の力価、及び組込みベクターの安定性に影響を与え得る。
【特許文献１】ＷＯ９９／５１７５５
【特許文献２】ＷＯ９９／１５６８３
【特許文献３】ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９９／１５６８３
【特許文献４】ＷＯ９８／１７８１５
【特許文献５】ＷＯ０１／７９５１８
【特許文献６】ＷＯ９９／３２６４６
【特許文献７】ＷＯ９５／３００１８
【特許文献８】ＷＯ００／２９４２８
【特許文献９】ＷＯ９５／２１９２７
【特許文献１０】ＷＯ９８／１５２９４
【特許文献１１】ＷＯ９５／２１９２７
【特許文献１２】ＷＯ−Ａ−９２／１７５０５
【特許文献１３】ＷＯ−Ａ−９２／２１７６６
【特許文献１４】ＷＯ９８／０５６３５
【特許文献１５】ＷＯ９８／０７８５９
【特許文献１６】ＷＯ９１／１０７４１
【特許文献１７】ＷＯ９０／１３６２６
【特許文献１８】ＧＢ０２０２４０３．１
【特許文献１９】ＷＯ９６／３７６２３
【特許文献２０】ＷＯ９８／１７８１６
【特許文献２１】ＵＳ５、２５８、３０７
【特許文献２２】ＷＯ９０／１３６２６
【非特許文献１】Ｃｏｆｆｉｎ等、（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、１９９７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁）
【非特許文献２】Ｌｅｗｉｓ  ＆  Ｅｍｅｒｍａｎ、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、５１０頁
【非特許文献３】Ｖｉｌｅ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌ、１９９５、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．５１、１２頁
【非特許文献４】Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ  ＆  Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６、２７３１頁
【非特許文献５】Ｎａｌｄｉｎｉ等、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２、２６３頁
【非特許文献６】Ｂｏｗｔｅｌｌ等、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２、２４６４頁
【非特許文献７】Ｃｏｒｒｅｌｌ等、１９９４、Ｂｌｏｏｄ  ８４、１８１２頁
【非特許文献８】Ｅｍｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３９、４５９頁
【非特許文献９】Ｇｈａｔｔａｓ等、１９９１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１、５８４８頁
【非特許文献１０】Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ等、１９８９、ＰＮＡＳ  ８６、３５１９頁
【非特許文献１１】Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ等、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６６、８４１６頁
【非特許文献１２】Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６３、１７７９８頁
【非特許文献１３】Ｌｉ等、１９９２、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３、３８１頁
【非特許文献１４】ＭｃＬａｃｈｌｉｎ等、１９９３、Ｖｉｒｏｌ．１９５、１頁
【非特許文献１５】Ｏｖｅｒｅｌｌ等、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、１８０３頁
【非特許文献１６】Ｓｃｈａｄｍａｎ等、１９９１、ＰＮＡＳ  ８８、４６２６頁
【非特許文献１７】Ｖｉｌｅ等、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１、３０７頁
【非特許文献１８】Ｘｕ等、１９８９、Ｖｉｒｏｌ．１７１、３３１頁
【非特許文献１９】Ｙｅｅ等、１９８７、ＰＮＡＳ  ８４、５１９７頁
【非特許文献２０】Ｃｕｌｌｅｎ、１９９５、ＡＩＤＳ  ９、Ｓ１９
【非特許文献２１】Ｐｉｇａｎａｅｕ等、２０００
【非特許文献２２】Ｓｏｕｋｕｐ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ、１９９９
【非特許文献２３】Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）
【非特許文献２４】Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．
【非特許文献２５】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍｅｙｅｒｓ、Ｐｕｂ  ＶＣＨ、５５６〜５５８頁）
【非特許文献２６】Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ、１９９４、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６９：２７３〜２７９頁
【非特許文献２７】Ｃｏｆｆｉｎ等（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、１９９７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁）
【非特許文献２８】Ｌｅｗｉｓ等、ｌ９９２、ＥＭＢＯ．Ｊ．１１：３０５３〜３０５８頁
【非特許文献２９】Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｍａｎ、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５１０〜５１６頁
【非特許文献３０】Ｃｌａｂｏｕｇｈ、等、１９９１、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６５：６２４２〜５１頁
【非特許文献３１】Ｄｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｎｅｗｂｏｌｄ、ｌ９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９４：５３０〜６頁
【非特許文献３２】Ｍａｕｒｙ、等、１９９４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００：６３２〜４２頁
【非特許文献３３】Ｍａｒｔａｒａｎｏ等、１９９４、ＪＶｉｒｏｌ．６８：３１０２〜１１頁
【非特許文献３４】Ｙｕ等、１９８６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８３：３１９４〜３１９８頁
【非特許文献３５】Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ、１９８７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：１１９７〜１２０１頁
【非特許文献３６】Ｈａｗｌｅｙ等、１９８７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：２４０６〜２４１０頁
【非特許文献３７】Ｙｅｅ等、１９８７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：９５６４〜９５６８頁
【非特許文献３８】Ｊｏｌｌｙ等、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１：１８５５〜１８７２頁
【非特許文献３９】Ｅｍｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３９：４４９〜４６７頁
【非特許文献４０】Ｈｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｉｎ、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：８４５〜８４８頁
【非特許文献４１】Ｃｏｆｆｉｎ等、１９９７、「ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁
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【非特許文献４３】Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ、１９８３、Ｇｅｎｅ  ２５：２１〜２８頁
【非特許文献４４】Ｕｐｔｏｎ、等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６０：９２０頁（１９８６）
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【非特許文献４６】Ｗｅｉｒ、等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５３０頁（１９８３）
【非特許文献４７】Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３５：５６１頁（１９８４）
【非特許文献４８】Ｈｒｕｂｙ、等、ＰＮＡＳ  ８０：３４１１頁（１９８３）
【非特許文献４９】Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ、等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４３：３９９頁（１９８５）
【非特許文献５０】Ｂｉｎｎｓ、等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１２７５頁（１９８８）
【非特許文献５１】Ｂｏｙｌｅ、等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６：３５５頁（１９８７）
【非特許文献５２】Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎ、等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２０：３４１頁（１９８８）
【非特許文献５３】Ｌｙｔｖｙｎ、等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ７３：３２３５〜３２４０頁（１９９２）
【非特許文献５４】Ｍｏｓｓ、Ｂ．、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６６２〜７頁
【非特許文献５５】Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，ＪＶＫ、１９９１、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２８４：３８６〜３９１頁
【非特許文献５６】「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｅｄ．ＲＡ  Ｍｅｙｅｒｓ、１９９５、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．、８３１〜８３２０頁）
【非特許文献５７】「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（Ｅｄ．ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ等、１９９７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、６８３頁）
【非特許文献５８】Ｓｔａｒｋ等、１９９８
【非特許文献５９】Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１
【非特許文献６０】Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等、２００１
【非特許文献６１】Ｏｈｋａｗａ等、２０００
【非特許文献６２】Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ等、２００１
【非特許文献６３】Ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ等、２００１
【非特許文献６４】Ｒｏｕｌｅｕｘ等、１９９４、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２１４：１１３〜１１９頁
【非特許文献６５】Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、２ｎｄ  Ｅｄ．ｂｙＢ．Ｈｏｇａｎ、Ｒ．Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｅ．Ｌａｃｙ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４
【非特許文献６６】Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．Ｐｉｎｋｅｒｔ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９４
【非特許文献６７】Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５
【非特許文献６８】Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｍ．Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｒｏｂｌ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５
【非特許文献６９】ＭｏｕｓｅＧｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｂｙ  Ｌｅｅ  Ｍ．Ｓｉｌｖｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５
【非特許文献７０】Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、１９９７）
【非特許文献７１】Ｍｉｚｕａｒａｉ等、（２００１）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ；２８６：４５６〜４６３頁）
【非特許文献７２】Ｄｉｅｒｉｃｈ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８７  Ａｕｇ；６（８）：２３０５〜１２頁
【非特許文献７３】Ｍｕｒａｍａｔｓｕ等、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９８  Ａｕｇ；１８５（１−２）：２７〜３２頁）
【非特許文献７４】Ｂｏｎｉｆｅｒ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７  Ｏｃｔ  １７；２７２（４２）：２６０７５〜８頁、概説
【非特許文献７５】Ｄｉｅｒｉｃｈ等、（１９８７）
【非特許文献７６】Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ等、１９９９
【非特許文献７７】Ｓｔｅｔｏｒ等、１９９９
【非特許文献７８】Ｄｏｎｅｌｌｏ等、１９９８
【非特許文献７９】Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ等、１９９７
【非特許文献８０】Ｋｉｔａｄａ等、（１９９８）
【非特許文献８１】Ｓｈｉｍｕｒａ等、２００１
【非特許文献８２】Ｈａａｓｓ及びＫａｈｌｅ，２００１
【非特許文献８３】Ｎａｇａｎｏ等、２００１
【非特許文献８４】Ｅｐｓｔｅｉｎ等、２００１
【非特許文献８５】Ｂｒｕｉｃｋ及  ａｎｄ  ＭｃＫｎｉｇｈｔ，２００１
【非特許文献８６】Ｃｈａｎ等、１９９８；２００１
【非特許文献８７】Ｉｓｍａｉｌ等、２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＨＩＶ及び他のレンチウイルスのＬＴＲは、遺伝子発現に対してウイルス特異的要件を有する。例えば、ＨＩＶ  ＬＴＲはウイルスＴａｔタンパク質の不在下では活性でない（Ｃｕｌｌｅｎ、１９９５、ＡＩＤＳ  ９、Ｓ１９）。したがって、遺伝子発現の要件を変化させるようにＬＴＲを改変することが望ましい。特に、組織特異的遺伝子発現シグナルが、一部の遺伝子治療適用例に必要とされ得る。
【００１２】
ＨＩＶベクターには、ある種の疾患に対する治療適用を制限し得るいくつかの重大な欠点がある。ＨＩＶ−１は、潜在的に発癌性タンパク質及び配列を持つヒト病原体であるという欠点を有する。ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌを発現するパッケージング細胞中で産生されたベクター粒子の導入は、これらのタンパク質を患者中に導入し抗体陽転をもたらす危険性がある。こうした理由で、患者中にＨＩＶタンパク質を導入しないレンチウイルスに基づくベクターを開発する必要がある。
【００１３】
トランスジェニック動物の作製ではＭＬＶの使用も提案されてきた。しかし、この技術を使用しての発現レベルは期待はずれであった。
【００１４】
導入遺伝子が調節可能であり、効率よく生成させることができる疾患モデルを生成することが長い間必要と感じられている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の態様はこうした問題を克服する。
【００１６】
第一の本発明の態様によれば、所望のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む非霊長類レンチウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法が提供される。
【００１７】
本発明は、トランスジェニック動物を作製し、霊長類レンチウイルスの使用に伴ういかなる潜在的困難も克服する効率的な方式を提供する。
【００１８】
非霊長類レンチウイルス発現ベクターは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、又はＭＶＶに由来することが好ましく、ＥＩＡＶであることが特に好ましい。
【００１９】
本発明の１つの利点は、この発現ベクターは生体内（in vivo）又は生体外（exvivo）で導入することができることである。一実施形態では、この方法は試験管内で実施される。別の実施形態では、細胞は子宮内細胞である。
【００２０】
哺乳類の生殖細胞系列に外来ＤＮＡを導入するいくつかの方法が開発されてきた。その技術によって、ＥＳ細胞などの多能性細胞を発生中の胚に導入し、ＤＮＡをマイクロインジェクションし、レトロウイルスによって感染させて異なる胚由来の細胞を混合すること、すなわちキメラの作製が可能になる。多くのこうした技術は、受精した卵又は初期胚を取り出すこと、それらを試験管内で培養すること、次いでそれらをさらに胚形成が進行できる養母に戻すこと、という基本要件を有する。特に、ＥＳ細胞中での相同組換えによる標的としたＤＮＡの挿入によりトランスジェニック動物を作製することは、労働集約的で時間のかかる工程、例えば核注射から所要時間８〜９週間である。
【００２１】
本発明のこの実施形態の１つの主要な利点は、除去する、試験管内で培養する、次いで再移植する必要性を回避できることである。集約的で時間のかかる組換えＥＳ細胞の作製も回避される。
【００２２】
次に、実際、莫大な数の遺伝子の未知の機能を大規模遺伝子配列決定プログラムに続いて入手することができる。新規なゲノム標的から治療用産物を開発するために、生物学を遺伝子配列情報と相関させる必要がある。本発明は、標的の確認を援助するための効率的で有効な生体内方法を提供する。
【００２３】
本発明を使用して良好なレベルの発現を実現することができ、発現レベル、特にＥＩＡＶでの発現レベルはＭＬＶを使用して実現したものよりも良好であることも本発明者らは見出している。これは驚くべきことである。
【００２４】
本発明の別の利点はその効率である。必要に応じて１個のベクターでの形質導入によって調節可能なノックアウト疾患モデルを効率よく作製することができ、継代はほとんど必要でない。したがって、本発明は、その時点では解決策が明らかでなかった長い間必要と感じられてきたものに対処する。
【００２５】
本発明のこの態様の別の利点はその柔軟性であり、すなわちレンチウイルスベクターは生物の発生全体にわたって導入することができる。すなわち一実施形態では、細胞は周産期細胞であり、胚細胞でよいはずである。この実施形態の特定の態様では、胚細胞は子宮内細胞である。しかし、任意の体細胞など、いかなる細胞にも、また生殖細胞系列に変化を生じさせることができるいかなる細胞にもこの方法を適用することができる。このような細胞にはもちろん生殖細胞が含まれるが、本発明は直接的又は間接的に配偶子形成又は受精に関与する細胞にも適用することができる。本発明者らは、直接受精なしに、例えば細胞核交換技術によって生じた同等の細胞も含める。
【００２６】
細胞は、卵母細胞、卵管細胞、卵巣細胞、卵子、ＥＳ細胞、胚盤細胞、精母細胞、精細胞、精子、又は精原細胞であることが好ましい。
【００２７】
生殖細胞系列の変化を実現しようと試みる場合、形質導入が初期に行われるほど、生殖細胞を形質導入させる機会は増えるので良好であることは理解されよう。
【００２８】
レンチウイルスベクターの使用による特定の利点は、卵母細胞及び精子形成細胞などの非分裂又は緩徐分裂細胞に形質導入を生じさせることが可能なことである。
【００２９】
したがって、本発明の別の態様によれば、非分裂細胞にＮＯＩを含むレンチウイルス発現ベクターを導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法が提供される。レンチウイルス発現ベクターは、非霊長類レンチウイルスに由来するものでよいが、ＨＩＶなどの霊長類レンチウイルスに由来してもよい。
【００３０】
本発明のこの態様の重要な利点は、形質導入を実現するために細胞を受精させる必要がないことである。
【００３１】
本発明者らは、非分裂細胞によって分裂することができるが特定のときには非分裂性である細胞を含める。
【００３２】
方法は、特定の細胞型には限らないが、細胞は動物、好ましくは哺乳動物、又は酵母細胞などの真核細胞が好ましい。本発明を適用することができる細胞の例には、マウス、ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、ウマ、家禽特にニワトリなどの鳥類、昆虫類、爬虫類、又は魚類の細胞が含まれる。細胞は、例えば、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）又はキイロショウジョウバエに由来してよい。
【００３３】
一実施形態では、細胞は非ヒト生物に由来する。
【００３４】
レンチウイルス発現ベクターは、偽型であることが好ましい。
【００３５】
レンチウイルス発現ベクターは、いかなる機能性アクセサリー遺伝子も含まないことが好ましい。
【００３６】
ＮＯＩは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は誘導性プロモーターに機能できる形で結合することができる。
【００３７】
ＮＯＩは、治療用タンパク質をコードし発現することができ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードし、又はリボザイムをコードすることが好ましい。
【００３８】
好ましい実施形態では、ＮＯＩは標的遺伝子の転写後サイレンシングを行うことができるＲＮＡ分子を生成することができる。本発明のこの態様では、本発明者らは、標的遺伝子の転写後サイレンシングを行うことができるＲＮＡ分子を生成することができるＮＯＩを含むレンチウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法を提供する。
【００３９】
ＮＯＩは、短いＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成できることが好ましい。
【００４０】
一実施形態では、短いＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡの発現はＲＮＡポリメラーゼプロモーターのテトラサイクリン応答誘導体によって調節される。
【００４１】
一実施形態では、タンパク質、好ましくは治療用タンパク質を発現することができる少なくとも１個のＮＯＩ、及び標的遺伝子の転写後サイレンシングを行うことができるＲＮＡ分子を生成することができる少なくとも１個のＮＯＩを導入するステップを含む方法。タンパク質、好ましくは治療用タンパク質を発現することができる少なくとも１個のＮＯＩ、及び標的遺伝子の転写後サイレンシングを行うことができるＲＮＡ分子を生成することができる少なくとも１個のＮＯＩは、同じ又は別個のレンチウイルス発現ベクター内に組み込むことができる。
【００４２】
レンチウイルス発現ベクターは、臍帯、胎盤、又は羊水の細胞などの標的細胞に任意の好都合な到達経路を介した投与によって導入、或いは子宮、生殖腺、脳、腎臓、肝臓、心臓、骨髄、血液、中枢神経系、又は肺などの器官中に直接導入することができる。
【００４３】
疾患モデルを確立するためのトランスジェニック動物の作製に伴う１つの問題は、発現の消失すなわちノックアウトマウスが致死である場合に生じる。本発明の方法では、ＮＯＩを組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターに機能できる形で結合することができる。遺伝子発現の除去が特定の発生期で、又は特定の組織中で所望される場合これは特に有利である。
【００４４】
ＮＯＩは、トランスジェニック生物中で構成的、組織特異的、又は調節可能方式で発現することができる。ＮＯＩが発現することができる細胞の例には、前記生物の脳、腎臓、肝臓、心臓、骨髄、血液、中枢神経系、又は肺の細胞など、いかなる器官又は組織の細胞も含まれる。ＮＯＩは、生物の特定の発生期で発現することもできる。
【００４５】
上記したように、本発明の好ましい実施形態では、前記ＮＯＩは標的遺伝子の転写後サイレンシングを行うことができるＲＮＡ、例えば、短いＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、又はマイクロＲＮＡをコードする。
【００４６】
本発明は、このような細胞に由来するトランスジェニック動物にも関する。疾患モデルでのその使用と同様に、このようなトランスジェニック動物は治療用タンパク質、例えばインスリンのようなタンパク質の作製に使用できることは理解されよう。
【００４７】
本発明の特定の態様では、トランスジェニック鳥類由来の卵が提供される。すなわち本発明のこの態様によれば、鳥類の細胞にＮＯＩを含むレンチウイルス発現ベクターを導入するステップを含むトランスジェニック鳥類及び／又は卵の生成方法が提供される。ＮＯＩがタンパク質をコードする場合、タンパク質を発現するトランスジェニック卵から清浄に効率よくタンパク質を採取することができる。
【００４８】
しかし、そのサイズによって卵中に産生され得るタンパク質の量には限界があることを本発明者らは認識してきた。今回、卵中に自然に存在するタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子をサイレンシングすることによって、導入したＮＯＩによって発現するタンパク質の収量を増加させることが可能であることを本発明者らは見出してきた。本発明の方法によって、すなわち天然卵遺伝子の転写後サイレンシングを行うことができるＲＮＡ分子を生成することができる少なくとも１個のＮＯＩをコードするレンチウイルス発現ベクターを用いて、これらの天然タンパク質を下方調節することができる。タンパク質、好ましくは治療用タンパク質を発現することができる少なくとも１個のＮＯＩ、及び標的卵遺伝子の転写後サイレンシングを行うことができるＲＮＡ分子を生成することができる少なくとも１個のＮＯＩを同じ又は別個のレンチウイルス発現ベクター中に組み込むことができる。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、タンパク質を発現することができるＮＯＩはリゾチームプロモーターなど、卵に本来備わっているプロモーターの制御下に置かれる。
【００４９】
それによって、本発明は、タンパク質、好ましくは治療用タンパク質を発現することができる少なくとも１個のＮＯＩ、及び天然卵遺伝子の転写後サイレンシングを行うことができるＲＮＡ分子を生成することができる少なくとも１個のＮＯＩを含むトランスジェニック生物又は卵を提供する。上記したように、この第２ＮＯＩは、標的遺伝子の転写後サイレンシングを行うことができるＲＮＡ、例えば、短いＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ又はマイクロＲＮＡをコードすることができる。
【００５０】
２本鎖ｄｓＲＮＡによって媒介される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存的な細胞防御機構である。トランスポゾンやウイルスなどのエレメントの無作為な組込みは、相同の１本鎖ｍＲＮＡ又はウイルスゲノムのＲＮＡの配列特異的分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと思われる。サイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている。ＲＮＡｉの機構には、長いｄｓＲＮＡを２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡの２本鎖に加工することが関与する。これらの生成物は、小干渉又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称され、これはｍＲＮＡ分解の配列特異的媒介物質である。ｓｉＲＮＡの他に、短いＲＮＡの発現は、スプライシング（「エクソン−スキッピング」）又はポリアデニル化を再指示し、或いは翻訳を阻害するために作用することができる。
【００５１】
ウイルスベクターは、生体内遺伝子送達の有効なツールであるが、転写後遺伝子サイレンシングに関与する短鎖ＲＮＡ分子は、従来の発現カセットを使用するこれらのＲＮＡの転写が困難であることを意味する。別の問題は、トランスジェニック体を生成させて重要な又は不可欠な機能を有する遺伝子産物を標的とする前述のＲＮＡ分子を送達するためのウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを使用することは、発生中にトランスジェニック動物に死をもたらし得ることである。アプタザイム（aptazyme）の使用によりポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡの転写を調節することができるベクターを提供することによって本発明の態様はこの問題を克服する。実際、本発明のこの態様は、レンチウイルスベクターが関与する方法だけには限らず本発明の別々の態様を構成する。
【００５２】
したがって、本発明の第２態様では、第１核酸配列を含むベクターであって、前記第１核酸配列が
（ａ）アプタザイムをコードする第２核酸配列、及び
（ｂ）ポリヌクレオチドを生成することができる第３核酸配列を含み、
（ａ）及び（ｂ）は機能できる形で結合し、且つ前記ポリヌクレオチドが生じるように第１核酸配列の転写物を切断すべくアプタザイムを活性化することができるベクターが提供される。
【００５３】
すなわち、前記核酸配列が
（ｃ）アプタザイムをコードする第１核酸配列、及び
（ｄ）ポリヌクレオチドを生成することができる第２核酸配列を含み、
（ａ）及び（ｂ）は機能できる形で結合し、前記ポリヌクレオチドが生じるように核酸配列の転写物を切断すべくアプタザイムを活性化することができる核酸配列を含むベクターの提供である。
【００５４】
ベクターはウイルスベクターが好ましい。
【００５５】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは標的遺伝子の発現を調節することができるＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子はｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイムからなる群から選択されることが好ましい。
【００５６】
アプタザイムは、アロステリックなリボザイムである。アプタマーは、タンパク質及び薬物分子を含むいくつかのリガンドに結合することができる構造を形成する核酸分子である。リボザイム、例えばハンマーヘッドリボザイムの１個のらせん体をアプタマーに置き換えることによって、リガンドの存在又は不在によって誘発される立体配置変化の結果として（それ自体でよい）基質を切断することができる触媒ＲＮＡを作り出すことが可能になっている。ドキシサイクリンによって阻害されるアプタザイムの記載（Ｐｉｇａｎａｅｕ等、２０００）と同様にフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）によって誘発又は阻害され得るアプタザイムも記載（Ｓｏｕｋｕｐ  ａｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ、１９９９）されている。
【００５７】
本発明のさらに別個の態様では、アプタザイムによって誘発された切断を使用して直接ＮＯＩの発現を調節することができる。
【００５８】
したがって、本発明の第３態様によれば、第１核酸配列を含むベクターであって、前記第１核酸配列が
（ａ）アプタザイムをコードする第２核酸配列、及び
（ｂ）ＮＯＩを含む第３核酸配列を含み、
（ａ）及び（ｂ）は機能できる形で結合し、且つ前記ＮＯＩの発現が阻害されるように第１核酸配列の転写物を切断すべくアプタザイムを活性化することができるベクターが提供される。
【００５９】
すなわち本発明は、核酸配列を含むベクターを提供し、その場合前記核酸配列は、
（ｃ）アプタザイムをコードする第１核酸配列、及び
（ｄ）ＮＯＩを含む第２核酸配列を含み、
（ａ）及び（ｂ）は機能できる形で結合し、且つ前記ＮＯＩの発現が阻害されるように核酸配列の転写物を切断すべくアプタザイムを活性化することができる。
【００６０】
ベクターはウイルスベクターであることが好ましい。
【００６１】
一実施形態では、第３核酸配列の転写物内の位置で第１核酸配列の転写物を切断すべく上記ベクターによってコードされているアプタザイムを活性化することができる。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明の第３態様によるベクターによってコードされているＮＯＩは治療用タンパク質をコードする。
【００６３】
本発明の第２及び第３態様の一実施形態では、リガンドをアプタザイムに結合することによってアプタザイムを活性化する。
【００６４】
本発明の第２及び第３態様の別の実施形態では、リガンドをアプタザイムに結合することによってアプタザイムを不活化する。
【００６５】
本発明の第２及び第３態様の好ましい実施形態では、ベクターは、さらにアプタザイムを結合することができるリガンドをコードする第４核酸配列を含む。前記リガンドをコードする核酸配列はプロモーターに機能できる形で結合されてもよい。
【００６６】
リガンドは、ポリペプチド及びその断片、線状ペプチド、環状ペプチド、及びそれらをコードする核酸、低分子量の有機又は無機の化合物及び抗体を含む、合成及び天然化合物からなる群から選択することができる。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明のこれらの態様で使用されるリガンドは、ＦＭＮ、ドキシサイクリン及びＶＥＧＦ、テトラサイクリン又はグルコースからなる群から選択される。
【００６８】
本発明の第２及び第３態様の別の実施形態では、（ａ）及び（ｂ）はプロモーターに機能できる形で結合されている。好ましいプロモーターは、Ｕ６プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｕ６）プロモーター、及び従来のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターからなる群から選択される。
【００６９】
第１核酸配列の転写がテトラサイクリンモジュレータ及びテトラサイクリン又はその誘導体によって調節されるように、プロモーターを少なくとも１個のテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）の複製、例えば、Ｔｅｔオペレータに機能できる形で結合させることができる。
【００７０】
一実施形態では、本発明の第２及び第３態様によるベクターはテトラサイクリンモジュレータをコードする第５核酸配列を含む。
【００７１】
アプタザイム活性を最小化、したがって自己切断によるベクターゲノムの不要な崩壊を最小化するはずである条件下でベクターの作製を実施するのが好ましいが、好ましい実施形態では、ベクターは分割イントロンベクターとして構成されている。これによってアプタザイムの全配列は、プロウイルスによってコードされている転写物中にしか存在せず、ベクター粒子中に存在するＲＮＡゲノムには存在しないことが確実になる。ウイルスＲＮＡゲノム内での潜在的に活性なアプタザイムの形成を防止する追加の手段は、ウイルスＲＮＡゲノム内での活性アプタザイムの形成を防ぐためにヘアピンを形成するように、一部のアプタザイムと塩基対を作ることができる配列をその３’末端に含むプロモーターを使用することである。分割イントロンベクターの詳細はＷＯ９９／１５６８３に記載されている。
【００７２】
本発明の第２及び第３態様によるベクターは、いかなる適当なウイルス、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ベクター、ヘルペスベクター、ポックスウイルスベクター、パルボウイルスベクター、バキュロウイルスベクターに由来してもよい。
【００７３】
本発明の第４態様では、本発明の第２又は第３態様のベクターを使用してトランスジェニック細胞の作製方法が提供される。
【００７４】
本発明の第５態様によれば、本発明の方法のいずれかにより作製したトランスジェニック細胞が提供される。
【００７５】
本発明の第６態様によれば、本発明のトランスジェニック細胞からの生成よって生成される、又は得ることができるトランスジェニック生物が提供される。
【００７６】
本発明の第７態様によれば、ＮＯＩが、（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、又はこれらのいずれかの前駆細胞を含む）造血細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、間質細胞、星状膠細胞、又はグリア細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロン、線維芽細胞、肝細胞、星状膠細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、心臓細胞、又は肺細胞中に発現される本発明のトランスジェニック生物が提供される。
【００７７】
本発明の別の態様では、ＮＯＩが、卵管細胞、生殖路細胞、アルブミン、（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、又はこれらのいずれかの前駆細胞を含む）造血細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、間質細胞、星状膠細胞、又はグリア細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロン、線維芽細胞、肝細胞、星状膠細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、心臓細胞、又は肺細胞中に発現される、本発明によるトランスジェニック生物が提供される。
【００７８】
次に、本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を非限定的な実施例として、及び添付図面を参照して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
一般に、本明細書に記載した技術は当技術分野でよく知られているが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．を参照することができる。
【００８０】
本発明の一態様は、非霊長類レンチウイルス発現ベクター、並びにトランスジェニック細胞から得ることができるトランスジェニック生物、又はトランスジェニック細胞が部分を形成するトランスジェニック生物を使用するトランスジェニック細胞の作製方法に関する。さらに詳しくは、本発明のこの態様は、遺伝子治療、及び疾患モデルの作製に有用なレンチウイルスベクターに関する。疾患モデル、例えば、トランスジェニック「ノックアウト」マウスの生成は、遺伝病の哺乳動物モデルの確立に特定の関連性を持ち、遺伝子機能の研究に顕著な利益をもたらしてきた。
【００８１】
遺伝子治療には、１つ又は複数の標的部位、例えば、標的細胞などで１つ又は複数の核酸配列に付加、交換、欠失、補充、操作のいずれか１つ又は複数を行うことなどが含まれる。標的部位が標的細胞である場合、細胞は組織又は器官の一部でよい。遺伝子治療の一般的な教示はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍｅｙｅｒｓ、Ｐｕｂ  ＶＣＨ、５５６〜５５８頁）などに見出すことができる。
【００８２】
他の例として、遺伝子治療は、以下のいずれか１つ又は複数による手段も提供する。欠陥遺伝子に置換又は補充するために遺伝子などの核酸配列を適用できること、病原性遺伝子又は遺伝子産物を除去できること、例えばより好ましい表現型を作り出すために新規な遺伝子を加えることができること、細胞を分子レベルで操作して癌（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｗｏｌｆ、１９９４、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６９：２７３〜２７９頁）又は免疫、心血管、神経系、炎症、又は感染の異常などの他の状態を治療できること、遺伝子ワクチン接種など、抗原を操作及び／又は導入して免疫反応誘発できること。
【００８３】
トランスジェニック生物は、その少なくとも１つの細胞に所望のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む生物である。一実施形態では細胞は生殖細胞である。別の実施形態では、細胞は体細胞である。さらに詳しくはＮＯＩは、例えば、ｃＤＮＡ技術を使用して実験的に導入されている。
【００８４】
通常、ＮＯＩは、「導入遺伝子」、すなわちその機能を確実にするように細胞中に挿入される遺伝子として称される。この遺伝子が生殖細胞遺伝子に挿入されると、機能し複製し正常な遺伝子として形質導入されるはずである。
【００８５】
本発明は、キメラ及びモザイクを包含する。
【００８６】
「キメラ」は、遺伝的に異なる細胞の混合物から構成される生物である。
【００８７】
「モザイク」は、第一細胞分裂後に導入遺伝子がゲノムに組み込まれた生物である。異なる細胞が異なる組込み部位を持つのでこの生物はモザイクとなる。
【００８８】
本発明のトランスジェニック生物は、動物や植物などの多細胞真核生物、真菌、又は酵母などの単細胞真核生物が好ましい。
【００８９】
次いで、生物は動物が好ましく、哺乳動物がより好ましい。
【００９０】
本発明の第１の態様は、非霊長類レンチウイルス発現ベクターを利用する。
【００９１】
当技術分野でよく知られているように、ベクターは１つの環境から別の環境へ実体の移動を可能にし、又は促進するツールである。本発明によれば、例として、ＤＮＡセグメントを含むベクターを複製する目的で、組換えＤＮＡ技術で使用されるベクターの幾つかによって、（異種ＤＮＡセグメントなど、異種ｃＤＮＡセグメントなどの）ＤＮＡセグメントなどの実体を宿主細胞に積み換えることが可能になる。組換えＤＮＡ技術に使用されるベクターの例には、それだけには限らないがプラスミド、染色体、人工染色体又はウイルスが含まれる。
【００９２】
「発現ベクター」の語は、生体内で、又は試験管内／生体外で発現することができる構築体を意味する。
【００９３】
本発明の態様で使用するレンチウイルスベクターは、標的非分裂細胞を形質導入することができる。この特徴の一利点は、新たに単離した卵母細胞は休止しているので、レトロウイルスベクターよりもレンチウイルスの使用によって形質導入速度を上げることができる。
【００９４】
本発明の方法で使用する典型的なベクターでは、複製に不可欠な１つ又は複数のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから取り除くことができる。これによりウイルスベクターは複製欠陥となる。標的非分裂宿主細胞を形質導入し、且つ／又はそのゲノムを宿主ゲノムに組み込むことができる、候補調節部分を含むベクターを生成するために、ウイルスゲノムの一部を、調節制御領域に機能できる形で連結されたライブラリコード候補調節部分及びベクターゲノム中のレポーター部分で置き換えることもできる。
【００９５】
標的とする非分裂細胞又は緩徐分裂細胞を形質導入することができるウイルスベクターはレンチウイルスベクターが好ましい。
【００９６】
レンチウイルスベクターは、大きな群のレトロウイルスベクターの一部である。レンチウイルスの詳細なリストはＣｏｆｆｉｎ等（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、１９９７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁）に見出すことができる。手短に言えば、レンチウイルスは霊長類群及び非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例には、それだけには限らないが以下のものが含まれる：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。非霊長類レンチウイルス群には、原型「緩徐ウイルス」のビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、関連するヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、並びにより最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
【００９７】
レンチウイルス科と他の型のレトロウイルスとの区別は、レンチウイルスが分裂細胞及び非分裂細胞に感染する能力を有していることである（Ｌｅｗｉｓ等、ｌ９９２、ＥＭＢＯ．Ｊ．１１：３０５３〜３０５８頁；Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｍａｎ、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５１０〜５１６頁）。それに反して、ＭＬＶなどの他のレトロウイルスは、例えば、筋肉、脳、肺、及び肝臓組織を作り上げている細胞など、非分裂細胞又は緩徐分裂細胞に感染することができない。
【００９８】
本明細書の本発明の幾つかの態様で使用した「非霊長類」ベクターは、主として霊長類、特にヒトに感染しないウイルスに由来するベクターをさす。すなわち、非霊長類ウイルスベクターには、イヌ、ヒツジやウマ、爬虫類、鳥類、昆虫類などの非霊長哺乳類に感染するベクターが含まれる。
【００９９】
本明細書で使用したレンチウイルス又はレンチウイルスベクターは、レンチウイルスに由来し得る少なくとも１個の成分を含むベクターである。その成分は、それによってベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現し、又は複製される生体機構に関与することが好ましい。「由来し得る」の語は、その配列は必ずしもレトロウイルスから入手されなくてもよいが、代わりにそれに由来できるはずであること意味するような通常の感覚で使用される。例として、配列は、合成して又は組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することができる。
【０１００】
非霊長類レンチウイルスは、霊長類には自然感染しないレンチウイルス科のいかなる構成要素でもよく、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含むことができる。レンチウイルスは、ＥＩＡＶが好ましい。ウマ伝染性貧血ウイルスは、全てのウマ科に感染し血漿ウイルス血症及び血小板減少症をもたらす（Ｃｌａｂｏｕｇｈ、等、１９９１、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６５：６２４２〜５１頁）。ウイルスの複製は、単球がマクロファージへ成熟する過程により制御されると考えられる。
【０１０１】
一実施形態ではウイルスベクターはＥＩＡＶに由来する。ＥＩＡＶは、最も単純なゲノム構造のレンチウイルスであり、本発明での使用に特に好ましい。ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖの他に、遺伝子ＥＩＡＶは３個の他の遺伝子：ｔａｔ、ｒｅｖ、及びＳ２をコードする。Ｔａｔは、ウイルスＬＴＲの転写アクチベーターとして作用し（Ｄｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｎｅｗｂｏｌｄ、ｌ９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９４：５３０〜６頁；Ｍａｕｒｙ、等、１９９４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００：６３２〜４２頁）、Ｒｅｖは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）によってウイルス遺伝子の発現を調節し統合する（Ｍａｒｔａｒａｎｏ等、１９９４、ＪＶｉｒｏｌ．６８：３１０２〜１１頁）。これら２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスにおける同様の機序に概ね類似すると考えられる（Ｍａｒｔａｎｏ等、前記文献）。Ｓ２の機能は不明である。さらに、膜貫通タンパク質の先頭でスプライスされてｅｎｖコード配列になるｔａｔ  の第１エクソンによってコードされるＥＩＡＶタンパク質Ｔｔｍが同定されている。
【０１０２】
プロテアーゼ、逆転写酵素、及びインテグラーゼの他に、非霊長類レンチウイルスはｄＵＴＰａｓｅをコードする第４ｐｏｌ遺伝子産物を含む。このことは、こうしたレンチウイルスがある種の非分裂細胞型に感染できる能力においてある役割を果たしている可能性がある。
【０１０３】
本発明のこの態様のウイルスＲＮＡはプロモーターから転写され、このプロモーターはウイルス起源又は非ウイルス起源でよいが、哺乳動物細胞などの真核細胞において発現を指示することができる。場合によっては、プロモーターの上流又は下流にエンハンサーを付加する。ＲＮＡ転写はポリアデニル化部位で停止し、この部位はレンチウイルス３’ＬＴＲ中に存在する部位、又は異なるポリアデニル化シグナルでよい。
【０１０４】
したがって、本発明は、プロモーター、及び場合によっては非霊長類レンチウイルスベクターゲノムの発現を指示することができるエンハンサーを含むＤＮＡ転写単位を利用する。
【０１０５】
本明細書に記載した通り、転写単位は転写され得る配列を有する核酸領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡをコードする配列がこの定義内に含まれる。その配列は、プロモーターに関してセンス又はアンチセンス方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）でよい。公知の技術に従いアンチセンス構築体を使用して細胞中の遺伝子の発現を阻害することができる。核酸は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、又はその類似体でよい。ｍＲＮＡをコードする配列は、場合によっては、５’  及び／又は３’の転写されているが翻訳されていず、翻訳されたコード配列に自然に又はその他の形で関連付けられるフランキング配列の一部又は全部を含む。それは、場合によってはさらに転写された配列、例えば、転写停止シグナル、ポリアデニル化部位、及び下流エンハンサーエレメントに通常関連付けられる関連転写調節配列を含む。核酸はｃＤＮＡ又は（イントロンを含み得る）ゲノムＤＮＡを含むことができる。
【０１０６】
レトロウイルスゲノムの基本構造は、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ、それらの間又は内部にはゲノムのパッケージングを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムへの組込みを可能にする組込み部位、並びにパッケージング成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子が位置し、これら遺伝子はウイルス粒子の形成に必要なポリペプチドである。より複雑なレトロウイルスは、ＨＩＶのｒｅｖ及びＲＲＥ配列などの追加の特徴を有し、これらの配列は組み込んだプロウイルスＲＮＡ転写物を核から感染した標的細胞の細胞質へ効率よく運び出すことができるようにする。
【０１０７】
プロウイルスでは、これらの遺伝子には末端反復配列（ＬＴＲ）と称する領域が両端に置かれる。ＬＴＲは、プロウイルスの組込み及び転写を担う。ＬＴＲは、エンハンサー−プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって生じる。
【０１０８】
ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５と称する３個のエレメントに分割することができる同一配列である。Ｕ３は、ＲＮＡ３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡ両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。３個のエレメントの大きさは、異なるレトロウイルスの中で大きく変化し得る。
【０１０９】
欠陥レトロウイルスベクターゲノムでは、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖが不在、又は機能していない。ＲＮＡ両端のＲ領域は反復配列である。Ｕ５及びＵ３はそれぞれ、ＲＮＡゲノムの５’末端及び３’末端で特異的配列を表す。
【０１１０】
本発明の一態様による使用に好ましいベクターは、組換え非霊長類レンチウイルスベクターである。
【０１１１】
「組換えレンチウイルスベクター」（ＲＬＶ）の語は、パッケージング成分の存在下で、標的細胞に感染することができるウイルス粒子中にＲＮＡゲノムをパッケージングすることを可能にする、十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターをさす。標的細胞の感染は、逆転写及び標的細胞ゲノムへの組込みを含む。ＲＬＶは、ベクターによって標的細胞へ送達される非ウイルスコード配列を有する。ＲＬＶは、非依存的に複製して最終標的細胞内に感染力のあるレトロウイルス粒子を産生することはできない。通常、ＲＬＶは、複製に不可欠な機能性ｇａｇ−ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子、並びに／或いは他の遺伝子を欠く。本発明のベクターを分裂イントロンベクターとして構成することもできる。分裂イントロンベクターはＰＣＴ特許出願第ＷＯ９９／１５６８３に記載されている。
【０１１２】
本発明のレンチウイルスベクターは最小のウイルスゲノムを有することが好ましい。
【０１１３】
本明細書では、「最小のウイルスゲノム」の語は、非必須成分を除去し、感染し形質導入し標的宿主細胞に当該核酸配列を送達するために必要とされる機能を得るために必須な成分を保持するようにウイルスベクターを操作することを意味する。この戦略のより詳しい説明は本出願人のＷＯ９８／１７８１５に見出すことができる。
【０１１４】
したがって、本発明で使用する最小のレンチウイルスゲノムは、（５’）Ｒ−Ｕ５−１つ又は複数の第１核酸配列−Ｕ３−Ｒ（３’）を含む。しかし、宿主細胞／パッケージング細胞内でレンチウイルスゲノムを生成するために使用するプラスミドベクターは、宿主細胞／パッケージング細胞中でゲノムの転写を指示するためにレンチウイルスゲノムに機能できる形で結合された転写調節制御配列も含む。これらの調節配列は、転写したレトロウイルス配列すなわち５’Ｕ３領域に関連付けられる天然配列でよく、又はこれらは別のウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターなどの異種プロモーターでよい。効率よくウイルス作製するためには、幾つかのレンチウイルスゲノムは追加の配列を必要とする。例えば、ＨＩＶの場合には、ｒｅｖ及びＲＲＥ配列を含めることが好ましい。しかし、コドンの最適化によってｒｅｖ及びＲＲＥの必要性を減少又は除去することができる。この戦略のさらに詳しい説明は本出願人のＷＯ０１／７９５１８に見出すことができる。
【０１１５】
本発明の一実施形態では、レンチウイルスベクターは自己不活化ベクターである。
【０１１６】
例として、自己不活化レトロウイルスベクターは、転写エンハンサー、又は３’ＬＴＲのＵ３領域中のエンハンサー及びプロモーターを欠失させることにより構築されている。一巡のベクターの逆転写及び組込み後、これらの変化を５’及び３’ＬＴＲに複製し、転写不活性プロウイルスを作製する（Ｙｕ等、１９８６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８３：３１９４〜３１９８頁；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ、１９８７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：１１９７〜１２０１頁；Ｈａｗｌｅｙ等、１９８７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：２４０６〜２４１０頁；Ｙｅｅ等、１９８７、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：９５６４〜９５６８頁）。しかし、このようなベクター中のＬＴＲ間にあるいかなる１つ又は複数のプロモーターも依然として転写活性を有する。この戦略は、内部にある遺伝子からの転写に対するウイルスＬＴＲ中のエンハンサー及びプロモーターの作用を除去するのに利用されてきた。このような作用は転写の増加（Ｊｏｌｌｙ等、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１：１８５５〜１８７２頁）、又は転写の抑制（Ｅｍｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｔｅｍｉｎ、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３９：４４９〜４６７頁）を含む。この戦略を使用して、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡまでの下流転写を除去することもできる（Ｈｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｉｎ、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：８４５〜８４８頁）。これは、ヒト遺伝子治療において特に関心が高く、内在性発癌遺伝子の偶発的な活性化を防止することが極めて重要となる。
【０１１７】
本出願人のＷＯ９９／３２６４６には、本発明に有利に適用することができる特徴が詳述されている。特に、非霊長類レンチウイルスゲノムは（１）ｇａｇ中の欠失がｇａｇコード配列の約３５０又は３５４ヌクレオチド下流で１つ又は複数のヌクレオチドを除去することである、欠失ｇａｇ遺伝子を含むのが好ましく、（２）非霊長類レンチウイルスゲノムに存在しない１つ又は複数の付属の遺伝子を含むのが好ましく、（３）ｔａｔ遺伝子を欠くが、５’ＬＴＲ末端とｇａｇのＡＴＧの間のリーダー配列を含むのが好ましく、且つ（４）（１）、（２）、及び（３）の組合せであることが理解されよう。特に好ましい実施形態では、レンチウイルスベクターは特徴（１）及び（２）及び（３）の全てを含む。
【０１１８】
非霊長類レンチウイルスベクターは標的ベクターでよい。「標的ベクター」の語は、細胞に感染／形質移入／形質導入をもたらす能力、又は宿主及び／又は標的細胞中で発現する能力が宿主生物内のある種の細胞型に制限されているベクターをさし、通常細胞は共通の又は類似の表現型を有する。
【０１１９】
レトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療用標的細胞には、それだけには限らないが、（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、又はこれらのいずれかの前駆細胞を含む）造血細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、間質細胞、星状膠細胞、又はグリア細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロン、線維芽細胞、肝細胞、星状膠細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、心臓細胞及び肺細胞が含まれる。
【０１２０】
ベクターはいかなる最適な分子の偽型でもよく、それだけには限らないがＶＳＶ−Ｇ、狂犬病、モコラ、ＭｕＬＶ、ＬＣＭＶ、仙台、エボラのエンベロープ糖蛋白（野生種、設計変種、又はキメラ）を含む。
【０１２１】
本発明の第１の態様は、特にレンチウイルスベクターを使用する方法を目的とするが、本発明の他の態様は、他のウイルス発現ベクターを利用することができる。こうした態様によるウイルスベクターには、それだけには限らないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、パルボウイルスベクター、又はバキュロウイルスベクターが含まれる。
【０１２２】
本発明の態様で利用されるレトロウイルスベクターは、いかなる適当なレトロウイルスに由来する、又は由来可能なものでよい。多数の異なるレトロウイルスが同定されている。例には以下のものが含まれる：マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄腫（ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ）ウイルス−２９（ＭＣ２９）、及びトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ等、１９９７、「ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ、７５８〜７６３頁に見出すことができる。
【０１２３】
レトロウイルスは広く２つの範疇：すなわち「単純」及び「複合体」に分けることができる。レトロウイルスは、さらになお７群に分けることができる。これらの群の５群は、発癌性を持つレトロウイルスを表す。残りの２群が、レンチウイルス及スプマウイルスである。これらのレトロウイルスの概説はＣｏｆｆｉｎ等、１９９７（前記文献）に提供されている。
【０１２４】
アデノウイルスは、ＲＮＡ中間体を経ない２本鎖、線状ＤＮＡウイルスである。遺伝子配列相同性に基づき６個の下位群に分けられるアデノウイルスには５０種を超える異なるヒト血清型がある。アデノウイルスの自然標的は呼吸器上皮及び胃腸管上皮であり、一般に軽度の症状しかもたらさない。（配列相同性９５％の）血清２型及び５型は、アデノウイルスベクター系で最も一般的使用され、若年者では通常上気道感染症を伴う。
【０１２５】
ウイルス遺伝子発現は、初期（Ｅ）相及び後期（Ｌ）相に分けることができる。後期相は、ウイルスＤＮＡの複製の開始によって決定される。一般に、アデノウイルスの構造タンパク質は後期相中に合成される。アデノウイルス感染に続き、宿主細胞ｍＲＮＡ及びタンパク質合成は、ほとんどの血清型に感染した細胞中で阻害される。アデノウイルス２及びアデノウイルス５のアデノウイルス溶解サイクルは非常に効率的で、感染細胞当たり約１０，０００ビリオンが、過剰なウイルスタンパク質の合成、及びビリオン中に組込まれないＤＮＡと共にもたらされる。アデノウイルスの初期転写は、複雑な相関する生化学的事象の連続であるが、ＤＮＡの複製開始前に基本的にウイルスＲＮＡの合成を伴う。
【０１２６】
アデノウイルスゲノムの構成は、研究されている各血清型ではアデノウイルス群すべてにおいて類似し、特異的官能基は通常同一場所に位置する。初期細胞質メッセンジャーＲＮＡは、ウイルスＤＮＡ上の４個の決定された非隣接領域に相補的である。これらの領域はＥ１〜Ｅ４と称される。初期転写物は、中間初期領域（Ｅ１ａ）、遅延初期領域（Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３及びＥ４）、及び中間領域の配列体に分類されている。
【０１２７】
初期遺伝子は、感染後約６〜８時間で発現し、遺伝子ブロックＥ１〜４中の７個のプロモーターから作動される。
【０１２８】
遺伝子運搬用ベクターとして使用するために、Ｅ１遺伝子を欠失させることによってアデノウイルスを転換することができ、この欠失がＥ２、Ｅ３及びＥ４プロモーターの誘導に重要である。Ｅ１複製欠陥ウイルスは、Ｅ１ポリペプチドを輸送する、ヒト胚腎臓細胞系２９３などの細胞系中で増殖させることができる。Ｅ１遺伝子の代わりに組換えによって１つ又は複数の治療遺伝子を挿入することができる。遺伝子の発現は、Ｅ１プロモーター又は異種プロモーターから作動される。
【０１２９】
Ｅ４オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の幾つか又はすべてを欠失させることにより、さらに多くの弱毒化アデノウイルスベクターが生成されてきた。しかし、たとえＤＮＡが維持されているように見えても、ある種の第２世代ベクターは長い期間の遺伝子発現を行わないように見える。したがって、１つ又は複数のＥ４ＯＲＦの機能は、ウイルスによって運ばれた、少なくともある種のウイルスプロモーターからの遺伝子発現を強化することができると思われる。
【０１３０】
より欠陥の多いウイルスを製造することのための代替手法は、ウイルスの複製に必要な末端反復だけを完全に維持してウイルスの「内部を抜き取る（ｇｕｔ）」ことであった。「内部を抜き取った」又は「内部のない」ウイルスは、２９３細胞系中で第１世代ヘルパーウイルスにより高い力価に増殖させることができるが、ヘルパーウイルスから「内部を抜き取った」ベクターを分離することは難しい。
【０１３１】
以下の理由により、アデノウイルスは候補調節部分を同定するベクターとして他の遺伝子治療ベクター系より優れた利点を提供する。
【０１３２】
アデノウイルスは、ヒト及び非ヒト起源の広範囲の細胞型を生体内及び試験管内で形質導入することができる、２本鎖ＤＮＡ非エンベロープ性ウイルスである。こうした細胞には、呼吸気道上皮細胞、幹細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、一次乳房上皮細胞、及びニューロンなど有糸分裂後末端分化した細胞が含まれる。
【０１３３】
アデノウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入することもできる。これは、嚢胞性線維症などの疾患に非常に重要であり、そこでは肺上皮中の罹患細胞の代謝回転速度は緩慢である。実際、アデノウイルスの媒介を利用して、嚢胞性線維症成人患者の肺中へ嚢胞性線維症トランスポータ（ＣＦＴＲ）を移送する、いくつかの試行が進行中である。
【０１３４】
アデノウイルスゲノムからのウイルス遺伝子又は外来遺伝子の発現は複製化細胞を必要としない。アデノウイルスベクターは、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞に侵入する。一度細胞内に入ると、アデノウイルスベクターが宿主染色体に組み込まることはほとんどない。その代わり、それは、宿主核中で線状ゲノムとして（宿主ゲノムから独立して）エピソーム的に機能する。したがって、組換えアデノウイルスの使用は、宿主ゲノムへの無作為な組込みに付随する問題を低減する。
【０１３５】
ポックスウイルスベクターを、本発明の態様にしたがって使用することができる。これは大きい断片のＤＮＡが容易にそのゲノム中にクローンされるからであり、組換え弱毒化ワクシニア変種は（Ｍｅｙｅｒ、等、１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１〜１０３８頁、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ、１９８３、Ｇｅｎｅ  ２５：２１〜２８頁）に記載されている。
【０１３６】
ポックスウイルスベクターの例には、それだけには限らないが、レポリポックス：Ｕｐｔｏｎ、等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６０：９２０頁（１９８６）（ショープ繊維腫ウイルス）；カプリポックスウイルス：Ｇｅｒｓｈｏｎ、等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５２５頁（１９８９）、（ケニアヒツジ−１）；オルソポックスウイルス：Ｗｅｉｒ、等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５３０頁（１９８３）（ワクシニアの）；Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３５：５６１頁（１９８４）（サル痘及び痘瘡ウイルス）；Ｈｒｕｂｙ、等、ＰＮＡＳ  ８０：３４１１頁（１９８３）（ワクシニアの）；Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ、等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４３：３９９頁（１９８５）（ヤバサル腫瘍ウイルス）；アビポックスウイルス：Ｂｉｎｎｓ、等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１２７５頁（１９８８）（鶏痘）；Ｂｏｙｌｅ、等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５６：３５５頁（１９８７）（鶏痘）；Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎ、等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２０：３４１頁（１９８８）（鶏痘、ウズラポックス）；昆虫ポックス（Ｌｙｔｖｙｎ、等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ７３：３２３５〜３２４０頁（１９９２）］が含まれる。
【０１３７】
真核細胞中での当該遺伝子の発現ビヒクルとしてポックスウイルスベクターが広範囲に使用されている。外来タンパク質の発現のため、且つワクチン抗原用送達ビヒクルとして、様々な宿主細胞中でのクローニング及び増殖のその簡便さが、特にポックスウイルスベクターの広範な使用をもたらしてきた（Ｍｏｓｓ  Ｂ．、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１６６２〜７頁）。
【０１３８】
本発明の態様にしたがって使用することができるポックスウイルスは、組換えポックスウイルスベクターだけには限らず、鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）、昆虫ポックスウイルス、ＮＹＶＡＣなどのワクシニアウイルス、カナリヤポックスウイルス、ＭＶＡ、例えばＷＯ９５／３００１８に記載されるものなど他の非複製ウイルスベクター系が含まれる。少なくとも１個の免疫回避遺伝子が欠失しているポックスウイルスベクターも記載されている（ＷＯ００／２９４２８を参照のこと）。
【０１３９】
上記したように、本発明の方法で使用する核酸配列は、宿主細胞によってコード配列の発現を提供することができる制御配列に機能できる形で結合するベクター中に挿入される。すなわちベクターは発現ベクターである。使用する配列及び／又はベクターに応じて、宿主組換え細胞によって作製されるＮＯＩは、分泌されても又は細胞内に含まれていてもよい。
【０１４０】
異種遺伝子、すなわちＮＯＩは、野生型遺伝子のいかなる対立遺伝子変異でも、又は変異遺伝子でもよい。「遺伝子」の語は、少なくとも転写され得る核酸配列を包含する。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡをコードする配列がこの定義内に含まれる。その配列は、プロモーターに関してセンス又はアンチセンス方向でよい。公知の技術に従いアンチセンス構築体を使用して細胞中の遺伝子の発現を阻害することができる。核酸は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はその類似体でよい。ｍＲＮＡをコードする配列は、場合によっては、５’  及び／又は３’の転写されているが翻訳されていず、翻訳されたコード配列に自然に又はその他の形で関連付けられるフランキング配列の一部又は全部を含む。それは、場合によってはさらに転写された配列、例えば、転写停止シグナル、ポリアデニル化部位、及び下流エンハンサーエレメントに通常関連付けられる関連転写調節配列を含む。核酸はｃＤＮＡ又は（イントロンを含み得る）ゲノムＤＮＡを含むことができる。しかし、一般にｃＤＮＡを使用するのが好ましい。というのは、イントロンの除去する必要がないのでそれはより効率よく発現されるからである。
【０１４１】
適当なＮＯＩコード配列は、それだけには限らないが、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、組換え免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫同時刺激（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子、免疫調節分子、アンチセンスＲＮＡ、標的タンパク質の変異優性阻害突然変種（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ）、毒素、条件的毒素（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔｏｘｉｎ）、抗原、腫瘍サプレッサータンパク質及び増殖因子、膜タンパク質、血管作動性タンパク質及びペプチド、抗ウイルスタンパク質及びリボザイム、及び（それに関連付けられるレポーター群など）それらの誘導体をコードする配列など、治療及び／又は診断に適用されるものが含まれる。そのようなコード配列は含まれると、通常、適当なプロモーターに作動可能に結合することができ、このプロモーターは１つ又は複数のリボザイムを発現させるプロモーター、又は１つまた複数の異なるプロモーターでよい。
【０１４２】
癌の治療又は予防において本発明での使用に適当なＮＯＩには、以下のタンパク質コードするＮＯＩが含まれる：標的細胞（例えばリボソーム毒素）を破壊するもの；（野生型ｐ５３などの）腫瘍サプレッサーとして；（サイトカイン、同時刺激分子、及び免疫グロブリンなどの）抗腫瘍免疫機構のアクチベーターとして；脈管形成阻害剤として働くもの；又は（プロドラッグ活性化酵素などの）薬物感受性を高めるもの；天然エフェクター細胞によって間接的に標的細胞の崩壊を刺激するもの（例えば、免疫系を刺激するための強力な抗原）、又は標的細胞を破壊する有毒物質に前駆体物質を変換するもの（例えば、プロドラッグ活性化酵素））。コードされたタンパク質は、（例えば分泌された抗腫瘍抗体−リボソーム毒素融合タンパク質を用いて）バイスタンダー腫瘍細胞を破壊し、バイスタンダー腫瘍細胞の崩壊を間接的に刺激（例えば免疫系又は凝血原タンパク質を刺激して局所血管閉塞を引き起こすサイトカイン）し、バイスタンダー腫瘍細胞を破壊する有毒物質又は前駆体物質をに変換（例えばプロドラッグを拡散性薬物に活性化する酵素）することも可能であろう。
【０１４３】
腫瘍を持続させるための細胞遺伝子の発現を妨害する（例えばバーキットリンパ腫中の異常なｍｙｃ転写物に対して、又は慢性骨髄性白血病中のｂｃｒ−ａｂｌ転写物に対して）、アンチセンス転写物又はリボザイムをコードする１つ又は複数のＮＯＩを使用することができる。このようなＮＯＩの組合せの使用も想定される。
【０１４４】
治療遺伝子の性質の詳しい情報はＷＯ９５／２１９２７及びＷＯ９８／１５２９４を参照のこと。
【０１４５】
虚血性心疾患の治療又は予防に使用するための適当なＮＯＩには、プラスミノゲンアクチベーターをコードするＮＯＩが含まれる。リウマチ性関節炎又は脳マラリアの治療又は予防に適当なＮＯＩには、抗炎症性タンパク質、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αを目標とする抗体、及び（接着分子に特異的な抗体分子又は受容体などの）抗接着分子をコードする遺伝子が含まれる。
【０１４６】
低酸素調節治療用ＮＯＩの例はＷＯ９５／２１９２７に見出すことができる。
【０１４７】
ＮＯＩコード配列は、融合タンパク質又はコード配列のセグメントをコードしてもよい。
【０１４８】
１つ又は複数のＮＯＩは標的組織中で選択的に発現される代わりに、或いはそれに加えて、１つ又は複数の酵素を活性化するプロドラッグをコードしてもよく、その１つ又は複数の酵素が作用する１つ又は複数のプロドラッグで個体を治療するまで、この酵素は著しい効果も有毒な作用も持たない。活性ＮＯＩの存在下で適したプロドラッグで個体を治療することは腫瘍の増殖又は残存を大きく低減する。
【０１４９】
癌の治療に対してプロドラッグ活性化酵素を腫瘍部位へ送達することができる。各々の場合に、適したプロドラッグ活性化酵素と組み合わせて適当なプロドラッグを患者の治療に使用する。適したプロドラッグをベクターと併せて投与する。プロドラッグの例には以下のものが含まれる：エトポシドリン酸塩（アルカリフォスファターゼと共に）、５−フルオロシトシン（シトシン脱アミノ酵素と共に）、ドキソルビシン−Ｎ−ｐ−ヒドロキシフェノキシアセトアミド（ペニシリン−Ｖ−アミダーゼと共に）、パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタマート（カルボキシペプチダーゼＧ２と共に）、セファロスポリンナイトロジェンマスタードカルバマート（β−ラクタマーゼと共に）、ＳＲ４２３３（Ｐ４５０還元酵素と共に）、ガンシクロビル（ＨＳＶチミジンキナーゼと共に）、ニトロ還元酵素及びシクロホスファミドと共にマスタードプロドラッグ（Ｐ４５０と共に）。
【０１５０】
本発明での使用に適当なプロドラッグ活性化酵素の例には、５−フルオロ−ウラシルプロドラッグカプセタビン及びフルツロンを活性化するチミジンホスホリラーゼ、ガンシクロビルを活性化する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ、シクロホスファミドなどのプロドラッグをＤＮＡ損傷剤へ活性化するシトクロムＰ４５０、及び５−フルオロシトシンを活性化するシトシン脱アミノ酵素が含まれる。ヒト起源の酵素を使用するのが好ましい。
【０１５１】
虚血性心疾患の治療又は予防に使用するための適当なＮＯＩには、プラスミノゲンアクチベーターをコードするＮＯＩが含まれる。リウマチ性関節炎又は脳マラリアの治療又は予防に適当なＮＯＩには、抗炎症性タンパク質、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αを目標とする抗体、及び（接着分子に特異的な抗体分子又は受容体などの）抗接着分子をコードする遺伝子が含まれる。
【０１５２】
ＮＯＩによってコードされた発現産物は細胞から分泌されるタンパク質であってよい。或いは、ＮＯＩ発現産物は分泌されず細胞内で活性である。いずれにせよ、ＮＯＩ発現産物がバイスタンダー効果又は遠隔バイスタンダー効果を示すことが好ましく、すなわちそれは１つの細胞中で発現産物を産生することであり、隣接する又は遠隔（例えば転移性）の、通常の表現型を有する追加の関係細胞を死に至らしめる。
【０１５３】
マクロファージ又は他の造血細胞を使用する場合、例えば、サイトカインをコードするＮＯＩを使用することができる。これらは、治療用ＮＯＩを含む造血幹（ｓｔｅｍｐ）細胞（ＨＳＣ）のその後の分化を支配する役割を担うはずである。適当なサイトカイン及び増殖因子には、それだけには限らないが以下のものが含まれる：ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルディオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エクソドゥス（Ｅｘｏｄｕｓ）−２、ＦＧＦ−酸性、ＦＧＦ−塩基性、線維芽細胞増殖因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−β１、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト増殖因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンフォタクチン、ミュラー管抑制物質、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄球系前駆細胞抑制因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、及びＨＣＣ１。
【０１５４】
幾つかの適用においては、幹細胞集団の維持及び拡大には、幾つかのこれらのサイトカインの組合せが好ましく、特にＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＳＣＦを含む組合せが好ましい。試験管内での分化には、マクロファージ、又はＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦの分化を誘発して好中球を得るために、ＧＭ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦなどの別のサイトカインを加えることができる。それらが由来する個体中に設計した細胞を再導入すると、身体自身の機構によって細胞又はその分化した子孫が患部、例えば、腫瘍中へ遊走することが可能になる。
【０１５５】
場合によっては、別のＮＯＩは自殺遺伝子でよく、外来性物質の存在下でのその発現は形質移入細胞又は形質導入細胞の崩壊をもたらす。自殺遺伝子の一例には、ガンシクロビルでの治療に続き感染細胞及びバイスタンダー細胞を殺すことができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶｔｋ）が含まれる。
【０１５６】
場合によっては、別のＮＯＩは、（幹細胞因子受容体の抗体などの）ターゲティングタンパク質でよい（ＷＯ−Ａ−９２／１７５０５；ＷＯ−Ａ−９２／２１７６６）。例えば、ＨＳＣ（例えばＣＤ３４又は幹細胞因子）上に存在する受容体に対する抗体（又は増殖因子又はペプチド）を示す組換え（エコトロピック）レトロウイルスを、分画していない骨髄をウイルスで培養することによって、又はウイルスの静脈内送達によって生体外でこれらの細胞に標的細胞送達するために使用することができるであろう。
【０１５７】
ＮＯＩは、標識遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ又は緑色蛍光タンパク質をコードする）、又はその産物が他の遺伝子の発現を調節する遺伝子を含むこともできる。さらに、ＮＯＩは、当該タンパク質をコードする配列と共に融合タンパク質パートナーをコードする配列を骨組みに含むことができる。融合タンパク質パートナーの例には、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合又は転写活性化領域、６ｘＨｉｓタグ、及びβ−ガラクトシダーゼが含まれる。ＮＯＩがコードするタンパク質を特定の細胞区画又は分泌経路に狙わせるために、ターゲティング配列を加えることも望ましい。そのようなターゲティング配列は、当技術分野で広範に特徴付けられている。
【０１５８】
一実施形態では、本発明によって細菌性ＨＲＥに機能できる形で結合されている少なくとも１つのＮＯＩは、ＦＮＲなどの酸素応答細菌性転写調節タンパク質をコードする。低酸素の存在下では、ＨＲＥ構築体からの細菌性転写調節タンパク質の発現は増加し、ＨＲＥ構築体、及び存在する他のＨＲＥ構築体からの転写をさらに増加する働きをするので、そのような構築体は自動調節系を提供する。
【０１５９】
好ましい一実施形態では、ＮＯＩはリボザイムをコードする。リボザイムは、タンパク質の強制的な関与なしに細胞内で特異的化学反応に触媒作用を及ぼすように機能することができるＲＮＡ分子である。例えば、グループＩリボザイムは、自己スプライシング前駆体ＲＮＡからそれ自体の切断を媒介することができるイントロンの形を取る。他のリボザイムは、ウイルスＲＮＡ分子の複製に不可欠な自己切断ＲＮＡ構造体に由来する。タンパク質酵素のようにリボザイムは、基質、及び金属イオンなどの因子に特異的な結合部位を提供する二次及び三次構造に折り畳まれていてよい。そのような構造体の例には、ハンマーヘッド、ヘアピン又はステムループ、シュードノット、及び肝炎δ型抗ゲノム性リボザイム（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）が含まれることが記載されている。
【０１６０】
各々別個のリボザイムは、標的ＲＮＡ中の認識部位を認識し結合するモチーフを持っている。このモチーフは１本又は複数の「結合手」、一般に２本の結合手の形を取る。ハンマーヘッドリボザイム中の結合手は、ＨｅｌｉｘＩＩの両側に置かれるフランキング配列ＨｅｌｉｘＩ及びＨｅｌｉｘＩＩＩである。これらは長さが様々であり、通常各６〜１０ヌクレオチドであるが短くても長くてもよい。フランキング配列の長さは切断速度に作用する。例えば、フランキング配列中の全ヌクレオチド数を２０から１２に減少させると、ＨＩＶ配列を切断するリボザイムの処理速度は１０倍に増加できることが判明している（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、ＪＶＫ、１９９１、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２８４：３８６〜３９１頁）。ハンマーヘッドリボザイム中のリボザイムＨｅｌｉｘＩＩ中の触媒モチーフは、切断部位と称する部位で標的ＲＮＡを切断する。リボザイムがいかなる所与のＲＮＡを切断するか否かは、適当な切断部位を含むリボザイムの認識部位の存在又は不在によって決定される。
【０１６１】
各型のリボザイムはそれ自体の切断部位を認識する。ハンマーヘッドリボザイムの切断部位は、直ぐ上流にヌクレオチド塩基三つ組ＧＵＸを有し、そこではＧはグアニン、Ｕはウラシル、及びＸは任意のヌクレオチド塩基である。ヘアピンリボザイムは、切断部位ＢＣＵＧＮＹＲを有し、そこではＢはアデニン以外の任意のヌクレオチド塩基、Ｎは任意のヌクレオチド、Ｙはシトシン又はチミン、及びＲはグアニン又はアデニンである。ヘアピンリボザイムによる切断は、切断部位中のＧとＮの間で行われる。
【０１６２】
リボザイムについてのより詳しい詳細は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｅｄ．ＲＡ  Ｍｅｙｅｒｓ、１９９５、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．、８３１〜８３２０頁）及び「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（Ｅｄ．ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ等、１９９７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、６８３頁）に見出すことができる。
【０１６３】
リボザイムの発現は、細胞全てで誘発され得るが、効果を発揮するのは標的遺伝子転写物が存在する細胞だけである。
【０１６４】
あるいは、成分の関連性を直接妨害する代わりに、この物質は生物学的に入手可能な本発明のポリペプチドの量を抑制することができる。これは成分の発現を阻害すること、例えば転写レベル、転写安定性、翻訳、又は翻訳後安定性によることでよい。そのような物質の一例は、アンチセンスＲＮＡ、又はｍＲＮ生合成量を抑制する２本鎖干渉ＲＮＡ配列のはずである。
【０１６５】
別の好ましい実施形態では、ＮＯＩはｓｉＲＮＡを含む。２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存的な細胞防御機構である。トランスポゾンやウイルスなどのエレメントの無作為な組込みは、相同の１本鎖ｍＲＮＡ又はウイルスゲノムのＲＮＡの配列特異的分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと思われる。このサイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている。ＲＮＡｉの機構には、長いｄｓＲＮＡを２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡの２本鎖に加工することが伴う。これらの産物は、小干渉又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称され、これはｍＲＮＡ分解の配列特異的媒介物質である。分化した哺乳動物細胞では、３０ｂｐより大きいｄｓＲＮＡが、インターフェロン応答を活性化しタンパク質合成及び非特異的ｍＲＮＡ分解を停止させることが判明している（Ｓｔａｒｋ等、１９９８）。しかし、この応答は２１ｎｔのｓｉＲＮＡ２本鎖を使用することによって迂回することができ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ等、２００１、Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ等、２００１）、培養した哺乳動物細胞での遺伝子機能の分析を可能にする。
【０１６６】
一実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、その活性がテトラサイクリンの存在によって調節されるＵ６を使用して、ｓｉＲＮＡの発現を調節することができる（Ｏｈｋａｗａ等、２０００）。
【０１６７】
別の実施形態では、ＮＯＩはマイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは、生物中で自然に生成される小さなＲＮＡの非常に大きなグループであり、少なくとも幾つかのマイクロＲＮＡは標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリーの基礎となる構成要素はｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４である。ｌｅｔ−７遺伝子は、らせん（ｗｏｒｍ）生成中の内因性タンパク質コード遺伝子の発現を調節する小さな高度に保存性のＲＮＡ種をコードする。活性ＲＮＡ種は、７０ｎｔの前駆体として最初に転写され、この前駆体は転写後処理されて２１ｎｔの成熟体になる。ｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４は、酵素ダイサーによって処理されてその成熟体になるヘアピンＲＮＡ前駆体として転写される（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ等、２００１）。
【０１６８】
別の実施形態では、ＮＯＩはヘアピンの形で２本鎖干渉ＲＮＡを含む。短いヘアピンは単一プロモーター、例えば、Ｕ６から発現され得る。別の実施形態では、効率的なＲＮＡｉは、一方がセンス領域を発現し、他方が標的と同じ配列のリバース相補鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を発現する２つのプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターを組み込むことによって媒介することができる。これは、実施例９に記載される。別の実施形態では、効率的又は２本鎖干渉ＲＮＡは、２つの対向するプロモーターを使用して前及び発現カセットの相補鎖から標的のセンス及びアンチセンス領域を転写することによって媒介することができる。これらの実施形態は実施例９に詳述されている。
【０１６９】
別の実施形態では、スプライシング（「エクソン読み飛ばし」）又はポリアデニル化を再指示し、又は翻訳を阻害する働きをすることができる短いＲＮＡをＮＯＩはコードすることができる。筋ジストロフィフレームシフト突然変異の場合には、ジストロフィン遺伝子は、翻訳オープンリーディングフレームを撹乱していない（ベッカー型筋ジストロフィ）表原型よりも重篤なデュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）表現型をもたらす。エクソン４６の読み飛ばしを誘発することを標的とするアンチセンス配列が、ＤＭＤ患者由来筋細胞中の内因性遺伝子からのジストロフィンの発現を修復することに有効であることが判明している（Ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ等、２００１）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的とすることによるポリアデニル化を、Ｅ−セレクチンの３’最端のポリアデニル化部位へ向け直すことは、ポリアデニル化を隠れた上流部位に向け直すことと考えられ、不安定配列が少ない転写物をもたらし、それによってｍＲＮＡの安定性を増大させタンパク質の発現を変化させている（Ｖｉｃｋｅｒｓ等、２００１）。このように、アンチセンスの使用を適用してメッセージの量を増大させることができる。翻訳開始に重要な部位を標的とすることも可能であり、この場合ｍＲＮＡの量は増加するがタンパク質濃度は減少する。
【０１７０】
ＮＯＩは発現調節エレメント、通常プロモーター、或いはプロモーター及びエンハンサーの発現制御下にあってよい。腫瘍、関節炎、又は他の虚血部位の環境中など、特定の当該組織中でＮＯＩが優先的に発現されるように、エンハンサー及び／又はプロモーターは、低酸素、虚血性、又は低糖環境において優先的に活性であってよい。したがって、治療対象となる個体に対するＮＯＩのいかなる著しい生物学的作用、又は有毒な作用も低減又は除去することができる。調節発現をもたらすエンハンサーエレメント、又は他のエレメントが多数の複製中に存在してもよい。同様に、又は加えて、いずれか１つ又は複数のマクロファージ、内皮細胞、又はそれらの組合わせなど、１つ又は複数の特異的細胞型中でエンハンサー及び／又はプロモーターは優先的に活性であってよい。別の例には、呼吸気道上皮細胞、幹細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、一次乳房上皮細胞、並びにマクロファージ及びニューロンなどの有糸分裂後に最終分化した非複製細胞が含まれる。
【０１７１】
「機能できる形で結合」の語は、記載した成分が、その所期の方式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。核酸レポーター配列の発現が制御配列に適合する条件下で実現するように、レポーター配列に「機能できる形で結合」する調節配列を含むライブラリはライゲートされている。
【０１７２】
「プロモーター」の語は、当技術分野の通常の意味で使用され、例えば遺伝子発現のジャコブ＝モノー説でのＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０１７３】
「エンハンサー」の語は、転写開始複合体の他のタンパク質成分に結合するＤＮＡ配列を含み、それによってその関連プロモーターによって指示された転写の開始を促進する。
【０１７４】
二次送達系をコードする転写単位のプロモーター及びエンハンサーは、二次送達系の生成条件下、一次標的細胞中で強活性、又は強力に誘発され得ることが好ましい。プロモーター及び／又はエンハンサーは構成的に効率的あり、又は組織でよく、又はその活性が一時的に制限されていてよい。一時的に制限されたプロモーター／エンハンサーの例は、低酸素応答エレメントなど、虚血及び／又は低酸素に応答的であるもの、又はｇｒｐ７８又はｇｒｐ９４遺伝子プロモーター／エンハンサーである。１つの好ましいプロモーター−エンハンサーの組合せは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要最初期（ＭＩＥ）プロモーター／エンハンサー組合せである。
【０１７５】
１つの好ましい実施形態では、ＣＭＶなどの強力な構成的プロモーター、又はＰＧＫなどのハウスキーピングプロモーター、及びＴｅｔ調節系を組み合わせた使用を遺伝子発現の制御に使用することができる。Ｔｅｔ系の他に、他の誘導系には、メタロチオネイン、ｈｓｐ６８、ｌａｃＺ、及びＳＶ４０Ｔ抗原系が含まれる。
【０１７６】
トランス転写活性促進因子は、２つのトランスジェニック系統、すなわちプロモーター「ａ」下でＮＯＩを発現する第１系統、及びプロモーター「ａ」のトランス転写活性促進の因子「ｂ」を発現する第２系統の使用を通して利用することもできる。
【０１７７】
別の実施形態では、酵母ＦＬＰリコンビナーゼによって媒介される組換え事象で、不活性な導入遺伝子を活性体に変換するＦＬＰリコンビナーゼ系を使用することができる。バクテリオファージＰ１Ｃｒｅリコンビナーゼ系を使用することもでき、これにより特定の細胞型又は組織型で、生物生成の特定の回数で遺伝子をサイレンス（抑制）することが可能になる。
【０１７８】
ベータ−アクチン、マウスメタロチオネイン、ＨＭＧＣＲ、及びヒストンＨ４などのハウスキーピング遺伝子に由来するプロモーターを使用して遍在的発現を実現することができる。
【０１７９】
本発明の好ましいプロモーターは組織特異的である。すなわち、それらは、他の組織型では概ね「サイレント」なまま、一組織中でＮＯＩの転写を作動することができる。
【０１８０】
「組織特異的」の語は、活性が単一組織型に制限されないとはいえ、それは１グループの組織には活性であり、別のグループには低活性又はサイレントであり得るという点で選択性を示すプロモーターを意味する。
【０１８１】
特定のプロモーターの制御下でのＮＯＩの発現レベルは、プロモーター領域を操作することによって調節することができる。例えば、プロモーター領域内の異なる区域は、異なる遺伝子調節活性を保持している。通常は、こうした異なる領域の役割は、特定の領域を欠失させた異なる変種のプロモーターを有するベクター構築体を使用し評価する（すなわち欠失分析）。例えば、組織特異性をもたらすことができる最小領域を同定するために、この手法を使用することができる。
【０１８２】
上記の幾つかの組織特異的プロモーターは本発明の実施に特に有利であり得る。たいていの場合には、これらのプロモーターは、選択したベクター中でのクローニングに適当で好都合な制限消化断片として単離することができる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用しプロモーター断片を単離することができる。増殖した断片のクローニングは、プライマーの５’末端の制限部位に組み込むことによって促進することができる。
【０１８３】
心臓特異的発現に適当なプロモーターには、マウス心臓α−ミオシンＨ鎖（ＭＨＣ）遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。適当な血管内皮特異的プロモーターには、Ｅｔ−１プロモーター、及びフォン・ウィルブランド因子プロモーターが含まれる。
【０１８４】
前立腺特異的プロモーターには、ヒト腺性カリクレイン−ｌ（ｈＫＬＫ２）遺伝子、及び前立腺特異的抗原（ｈＫＬＫ３）の５’フランキング領域が含まれる。
【０１８５】
細胞特異的であるプロモーター／エンハンサーの例には、ＣＳＦ−１プロモーター−エンハンサーなどのマクロファージ特異的プロモーター又はエンハンサー、或いはマンノース受容体遺伝子プロモーター−エンハンサー由来のエレメントが含まれる（Ｒｏｕｌｅｕｘ等、１９９４、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２１４：１１３〜１１９頁）。あるいは、好中球中で優先的に活性なプロモーター又はエンハンサーエレメント、或いはＩＬ−２遺伝子エンハンサーなどのリンパ球特異的エンハンサーを使用することができる。
【０１８６】
さらに、発生調節（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）発現を付与する１つ又は複数の配列の制御下にＮＯＩを置くことができる。これによりトランスジェニック生物又はその子孫の生成における所与の段階でＮＯＩの活性化をもたらす。
【０１８７】
アプタザイムの使用によってＮＯＩの転写を調節することができる。転写物からのＮＯＩの放出に続いてＮＯＩを発現できるように、転写物を切断するためにＮＯＩに機能できる形で結合されているアプタザイムを活性化させることができる。好ましい実施形態では、ＮＯＩはｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡからなる群から選択される。例えば、短いヘアピンによってコードされているアプタザイムｓｉＲＮＡの５’を付加することによって、転写物の自己切断の調節した誘導（又は阻害）が可能となり、アプタザイム構造物からのヘアピンの分離、したがってサイレンシングをを活性化させることができる。アプタマーに特異的なリガンドを外来的に供給し、内因的に又は同じベクターから発現させる。例えば、その発現が低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）によって制御されているタンパク質リガンドは低酸素条件下でのみ合成されるはずである。これが、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的に短いヘアピンを放出するアプタザイムの切断を活性化するのであるならば、ＶＥＧＦは低酸素中で特異的に下方調節されるはずであり、このことは増殖性糖尿病性網膜症を含む幾つかの疾患に治療上有益なはずである。あるいは、アプタマーのリガンドはＶＥＧＦ自体でもよいはずである。
【０１８８】
本発明の別の態様では、アプタザイムによって誘発された切断は直接ＮＯＩの発現を調節することができる。本発明によって、この方式でアプタザイムの使用はＮＯＩの転写後調節を包含する。ＮＯＩ発現が阻害されるように転写物の切断を誘発する適当なリガンドの付加／除去によってアプタザイムを活性化（又は阻害）することができる。アプタザイムは、転写物を、例えば、イニシエーターであるメチオニンのコドン、又はＵＴＲで切断することができ、翻訳に先立ち、続いて分解されるキャップ及び／又はポリ−アデノシンテールを欠く転写物をもたらす。
【０１８９】
これによって、濃度が高過ぎる場合、ＮＯＩ、例えば、因子ＩＸなどの治療用遺伝子の合成を停止する手段が提供される。このようにして、導入遺伝子の発現を自己調節的であるように設計することができる。例えば、血糖値が高いときにだけ高レベルのインスリンの発現が生じるように、その活性をグルコース結合によって調節するアプタザイムを設計することが可能であろう。糖濃度が閾値レベル未満に下がった場合、アプタザイムは活性化され、インスリン導入遺伝子転写物は破壊される。ドキシサイクリンによって調節されるアプタザイムを使用して、ドキシサイクリンの投与により試験管内で及び生体内でＮＯＩの発現を調節することができる。
【０１９０】
Ｔｅｔ調節系を使用してアプタザイムの発現を制御して別の制御レベルを提供することもできる。ドキシサイクリンが除去され、それによって新規な転写が防止されるとき、プロモーターの下流に挿入されたＴｅｔオペレータ配列がＴｅｔリプレッサタンパク質の存在下で転写を抑制することができる。ドキシサイクリンの不在下ではアプタザイムは活性なのでいかなる既存の転写物も切断され分解される。
【０１９１】
トランスジェニック「ノックアウト」マウス技術の発達は、遺伝病の哺乳動物モデルの確立における特定の関連性を有する遺伝子機能研究に多大な恩恵をもたらしてきた。しかし、現在の技術は特定の場合には制限的である。例えば、多くの遺伝子、しばしば医療的に重要な遺伝子は実行可能性に不可欠である。そのような場合、胚発達中又は出生後まもなく子動物は死ぬ。本発明は、当該タンパク質の作製を所望の発達段階で停止させ、成体哺乳類での疾患モデルの生成を促進することができるように、調節可能な遺伝子を除去するための有効なトランスジェニック法を提供する。次いで、トランスジェニック生物を１つ又は複数の任意の表現型スクリーニングにかけることができる。適当な全体的及び表現型を目標にしたスクリーニングには、基底部写真の使用、血圧、行動分析、Ｘ線蛍光透視、二重エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＥＸＡ）、ＣＡＴスキャン、総血球数（ＣＢＣ）、検尿、血液化学、インスリン濃度、糖耐性、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、組織病理学、発現データ、生成生物学が含まれる。本発明の方法は、一時的な遺伝子調節が利点であるはずの多くの分野、及びゲノム科学プログラムで同定されている推定薬物標的の実証において広範な適用を有する。
【０１９２】
本発明を使用してヒト疾患に伴う遺伝子発現を調節することができる。非網羅的な遺伝子のリストを以下に示す（遺伝子同等物を含む）：
癌に関係する遺伝子には、それだけには限らないが、Ｃｄｈ３、Ｎｃａｍ、Ａｋｐ２、Ａｓｇｒ２、Ｂａｘ、Ｂｍｐ４、Ｃｃｎｄ１、Ｃｄ３８、Ｃｄｃ３７、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｄｋｎ１ｂ、Ｃｄｋｎ１ｃ、Ｃｓｋ、Ｅｐａｓ１、Ｆｇｆ２、Ｇｒｐｒ、ＨＢＶ、Ｉｇｆ１、Ｉｎｈｂｂ、Ｉｎｐｐ５ｄ、ＩＲＳ１、Ｉｔｇａ５、Ｋｃｎａ１、ｌａｃＺ、Ｍａｐ２ｋ４、Ｍｄｍ２、Ｎｆｋｂｉａ、Ｎｇｆｂ、Ｏｘｔ、Ｐｅｍｔ、Ｐｌｐ、Ｓｈｈ、Ｓｒｃ、Ｓｔａｔ５ａ、Ｔｃｆａｐ２ａ、Ｔｒｐ５３、Ｂｌｍｈ、Ｃｄ１５２、Ｃｍｋａｒ２、Ｃｍｋｂｒ５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ３、Ｅｇｆｒ、Ｇｚｍｂ、Ｉｆｎｇ、Ｉｆｎｇｒ、ＩＧＦＢＰ３、Ｉｌ１ｒ１、Ｉｌ１ｒａｐ、Ｉｌ２、Ｉｌ２ｒａ、１ｌ２ｒｂ、Ｉｌ２ｒｇ、Ｉｌ４、Ｉｌ４ｒａ、Ｉｌ５、Ｉｌ６、Ｉｌ７ｒ、Ｉｌ１０、Ｉｌ１２ａ、Ｉｌ１２ｂ、Ｉｌ１２ｒｂ１、Ｉｌ１２ｒｂ２、ＩＲＳｌ、Ｋｄｒ、Ｌｉｆｒ、Ｌｔａ、Ｎｃａｍ、Ｎｔｆ３、Ｎｔｆ５、Ｎｔｒｋ１、Ｎｔｒｋ２、Ｎｔｒｋ３、Ｐｈ、ｐｒｌｒ、Ｓｃｙａ３、Ｓｍｓｔ、Ｔｇｆａ、Ｔｇｆｂ１、Ｔｇｆｂ２、Ｔｇｆｂ３、Ｔｎｆ、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ、Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ、Ｔｎｆｒｓｆ５、Ａｐｃ、Ｐｒｋｄｃ、ＴＡｇ、Ａｍｈ、Ｋｉｔ、Ｋｉｔｌ、Ｔｅｒ、Ｆｅｃｈ、ｈｒ、Ａｔｍ、Ｅ２ｆ１、Ｈｏｘｌ１、Ａｐｃ、Ｃｄｈ３、Ｅｒｂｂ２、Ｈｒａｓ、Ｍｅｔ、Ｎｏｔｃｈ４、ＰＩＰ、ＰｙＶＴ、Ｔａｇ、Ｗｎｔ１、Ｍａｄｈ３、Ｎｆ１、Ｐｔｃｈ、Ｒｂ１、Ｏｄｃ、Ｂｃｌ３、Ｆｏｓ、Ｆｙｎ、Ｊｕｎ、Ｋｒａｓ２、ｌｕｃ、Ｍｏｓ、Ｍｙｃ、Ｒａｂ３ａ、Ｒｅｌａ、Ｙｅｓ、Ｃｄ４４、Ｍｇｍｔ、Ｐｌｇ、Ａｈｒ、Ｐｇｙ２、Ｒａｇ１、Ｂｔｋ、Ｉｇｈ−６、．Ｊａｋ３、Ｔｃｒａ、Ｔｃｒｂ、Ｔｃｒｄ、Ｔｔｐ５３、Ｔｔｐａ、Ｖｈｌｈ、及びＷｔ１が含まれる。
【０１９３】
糖尿病及び肥満に関係する遺伝子には、それだけには限らないが、Ｉｎｓ２、Ｉｎｓ１、Ｈ２−Ｅａ、Ｈ２−Ａｂ１、Ｉｆｎｇ、Ｐｒｋｄｃ、Ｂ２ｍ、Ｒａｇ１、Ｌｅｐ、Ｌｅｐｒ、Ｃｐｅ、Ｇｃｋ、Ｉｒｓ１、Ｉｒｓ２、Ｉｒｓ３、Ｉｒｓ４、Ｓｌｃ２ａ１、Ｃｒｅ、Ｄｇａｔ、ｔｕｂ、Ｐｃｓｋ２、Ｉｎｓｒ、Ｎｏｓ１、Ｎｏｓ３、Ｔｎｆ、Ｂ２ｍ、Ｔｈｙ１、Ｐｏｍｃ、Ｐｐａｒａ、及びＣｓｆ２が含まれる。
【０１９４】
心血管系疾患に関係する遺伝子には、それだけには限らないが、Ａｃａｃｔ、Ａｌｏｘ１５、Ａｐｏａ２、Ａｐｏｂ、Ａｐｏｅ、Ａｔｈｌｒ、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｙｐ７ａ１、Ｅｐａｓ１、Ｌｃａｔ、Ｌｄｌｒ、Ｐｅｍｔ、Ｓｏａｔ１、ｆｌｄ、ｈｒ、Ａｃｅ、Ａｄｒａｌｂ、Ａｄｒｂ２、Ａｄｒｂｋｌ、Ａｎｘ６、Ａｔｐ７ａ、Ｃｄｈ２、Ｅｖｉｌ、Ｆｎ１、Ｇｊａ１、Ｉｔｇａ４、Ｊｕｐ、Ｋｉｆ３ａ、Ｎｆ１、Ｎｏｓ３、Ｎｐｐａ、Ｔｈｒａ、Ｖｃａｍ１、Ｗｔ１、Ａｇｔ、Ｂｄｋｒｂ２、Ｂｍｐ４、Ｄｒｄ３、Ｋｃｎａｌ、Ｎｐｒ３、Ｒｅｎ、Ａｐｏｃ１、Ａｐｏｃ２、Ａｐｏｃ３、Ａｐｏａ１、Ｃｅｔｐ、Ｈｐｌ、Ｌｉｐｃ、Ｓｒｂ１、Ａｄｒａ２ａ、Ａｇｔｒ１ａ、Ｆｇｆ２、Ｔｎｆ、Ａｓｇｒ２、Ｌｒｐａｐ１、Ｖｌｄｌｒ、Ｃｏｌ３ａ１、及びＰｌｇが含まれる。
【０１９５】
内分泌系疾患に関係する遺伝子には、それだけには限らないが、Ａ、Ｃｐｅ、ｆｌｄ、Ｉｎｓｒ、Ｌｅｐ、Ｌｅｐｒ、ｔｕｂ、Ａｃａｃｔ、ａｃｄ、Ｃａｃｎｂ４、Ｃｒｈ、Ｆｏｘｎ１、ｇｌ、Ｂｍｐ４、Ｃｓｆ１、ｄｗｇ、ｆｓｎ、Ｈｃｐｈ、Ｋｉｔ、Ｋｉｔｌ、Ｍｉｔｆ、ｏｃ、Ｐｈｅｘ、Ｐｒｌｒ、Ｓｐａｒｃ、Ｇｒｐｒ、Ａｍｈ、Ａｒ、Ｃｇａ、Ｆｓｈｂ、ｊｓｄ、Ｇｈｒｈｒ、Ｈｍｇｉｃ、Ｍｙｏ５ａ、Ｎｒ５ａｌ、Ｏｘｔ、ｐ、Ｐｉｔ１、Ｐｒｏｐ１、Ｓｍｓｔ、Ａｇｔ、Ｉｇｆ１、Ｇｃｋ、Ｐｃｓｋ２、Ｅｇｆｒ、Ｆｏｘｎ１、Ｍｃｌｒ、Ｔｇｆａ、Ｔｈｒｂ、Ｔｓｈｒ、及びＴｔｒが含まれる。
【０１９６】
アポトーシスに関係する遺伝子には、それだけには限らないが、Ｆａｓ、Ｎｇｆｒ、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ、Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、Ｅ２ｆ１、Ｍｄｍ２、Ｐｃｃ、Ｒｂ１、Ｔｒｐ５３、Ｂｄｎｆ、Ｆａｓｌ、Ｇｚｍｂ、Ｎｔｆ３、Ｎｔｆ５、Ｐｆｐ、Ｔａｇ、及びＴｎｆが含まれる。
【０１９７】
免疫及び炎症に関係する遺伝子には、それだけには限らないが、Ｃｄ１、Ｃｄ３ｅ、Ｃｄ３ｚ、Ｃｄ４、Ｃｄ４４、Ｃｄ５、Ｃｄ８ａ、Ｃｄ８ｂ、Ｃｄ１４、Ｃｄ１５２、Ｃｄ２８、Ｃｄ３８、Ｆｃｅｒ１ｇ、Ｆｃｇｒ２ａ、Ｆｃｇｒ２ｂ、Ｆｃｇｒ３、Ｇｐｉ１、Ｈ２−Ａａ、Ｈ２−ＤＭａ、Ｈ２−Ｅｂ１、Ｈ２−Ｅｂ２、Ｈ２、Ｈｃ、Ｉｃａｍ１、Ｉｇｈ−１、Ｉｇｈ−５、Ｉｇｈ、Ｉｇｋ−Ｃ、Ｉｇｌ−１、Ｉｇｌ−５、Ｉｔｇａ４、Ｉｔｇａ５、Ｉｔｇｂ２、Ｉｔｇｐ、Ｌｙｓｔ、Ｍａｒ１、Ｎｃａｍ、ＰＣＣ、Ｐｅｐ３、Ｐｔｐｒｃ、Ｐｔｐｒｃａｐ、ＰＶＲ、Ｓｅｌｅ、Ｓｅｌｌ、Ｓｅｌｐ、Ｓｐｎ、Ｔａｐｂｈ、Ｔｃｒａ、Ｔｃｒｂ、Ｔｃｒｄ、Ｔｈｙ１、Ｔｌｘ１、Ｔｎｆｒｓｆ５、Ｔｎｆｒｓｆ６、Ｔｎｆｓｆ５、Ｂｍｐ４、Ｃｍｋａｒ２、Ｃｍｋｂｒ５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ３、Ｅｇｆｒ、Ｇｚｍｂ、Ｉｆｎｇ、Ｉｆｎｇｒ、Ｉｌ１ｒ１、Ｉｌ１ｒａｐ、Ｉｌ２、Ｉｌ２ｒａ、Ｉｌ２ｒｂ、Ｉｌ２ｒｇ、Ｉｌ４、Ｉｌ４ｒａ、Ｉｌ５、Ｉｌ６、Ｉｌ７ｒ、Ｉｌ１０、Ｉｌ１２ａ、Ｉｌ１２ｂ、Ｉｌ１２ｒｂ１、Ｉｌ１２ｒｂ２、Ｉｌ１５ｒａ、Ｉｒｓ１、Ｉｔｇｂ７、Ｋｄｒ、Ｋｉｔｌ、Ｌｉｆｒ、Ｌｔａ、Ｍａｐ２ｋ４、Ｎｔｆ３、Ｎｔｆ５、Ｎｔｒｋ１、Ｎｔｒｋ３、Ｐｈ、Ｓｃｙａ３、Ｓｍｓｔ、Ｔｇｆａ、Ｔｇｆｂ１、Ｔｇｆｂ２、Ｔｇｆｂ３、Ｔｎｆ、Ｔｎｆｒｓｆ１ａ、Ｔｎｆｒｓｆ１ｂ、Ａ、Ａｔｍ、Ｃ３、Ｃ４、Ｃａｃｎｂ４、Ｃｄ８０、Ｃｄ８６、Ｄｈ、Ｄｓｇ３、Ｅｅｆ１ａ２、ｇｌ、ｈｒ、Ｌａｍａ２、Ｌｂｐ、Ｌｅｐ、Ｌｅｐｒ、Ｍｉｔｆ、Ｐｉｔ１、Ｐｒｏｐ１、Ｓｃｎ８ａ、Ａｂｃｂ２、Ａｄａ、Ｂ２ｍ、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ３、Ｂｔｋ、Ｃ２ｔａ、Ｆｏｘｎｌ、Ｈ２−Ａｂ１、Ｈｃｐｈ、Ｉｇｈ−６、Ｉｇｈ−Ｊ、Ｉｉ、Ｊａｋ３、キット、Ｌｃｋ、Ｌｔｂ、Ｌｙｎ、Ｎｆｋｂ１、Ｎｆｋｂｉａ、Ｐｆｐ、Ｐｎｌｌｉｐｒｐ２、Ｐｒｋｄｃ、Ｐｔｐｒｃａｐ、Ｒａｇ１、Ｒｅｌｂ、Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ６、Ｔｌｒ４、Ａｌｏｘ５、Ａｌｏｘ５ａｐ、Ａｌｏｘ１５、Ｂｄｋｒｂ２、Ｂｌｍｈ、Ｂｍｐ６、Ｃｍｏ、Ｃｒｈ、Ｎｏｓ２、Ｐｔｇｓ２、Ｖｒ１、Ｂａｘ、Ｅ２ｆ１、Ｉｎｐｐ５ｄ、Ｒｂ１、Ｓｔａｔ５ａ、Ｔｒｐ５３、Ｆｙｎ、及びＩｒｆｌが含まれる。
【０１９８】
神経生物学に関係する遺伝子には、それだけには限らないが、Ａｐｏｅ、Ａｔｍ、Ｂｄｎｆ、Ｃｄｋ５、Ｃｈｒｎａ７、Ｃｍｋａｒ４、Ｃｓｔｂ、Ｇａｄ２、Ｇｆａｐ、Ｇｒｉａ２、Ｇｒｉｋ２、ＨＤ、Ｈｄｈ、Ｎｏｓ１、Ｎｔｆ３、Ｐｅｎｋ−ｒｓ、Ｐｒｋｃｃ、Ｐｓｅｎ１、Ｓｎｃａ、Ｔｎｆ、及びＶｒ１が含まれる。
【０１９９】
１つ又は複数の治療用遺伝子、記載した並びに発現調節要素の他に、送達系は効率的又は調節した１つ又は複数の遺伝子の発現に追加の遺伝子エレメントを含むことができ、そのエレメントにはプロモーター／エンハンサー、翻訳開始シグナル、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、スプライシング及びポリアデニル化シグナルが含まれる。発現レベルはＷＰＲＥなどの組み込みエレメントによって改良することができる。
【０２００】
本発明による送達系によって１つ又は複数の治療用遺伝子の送達を単独で或いは他の治療又は治療成分と組み合わせて使用することができる。本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、１つ又は複数の所望のヌクレオチド（ＮＯＩ）をクローニング部位でベクターに導入する。そのような治療用遺伝子をレトロウイルスＬＴＲ中に置いたプロモーターから発現させることができ、又はクローニング部位で導入した内部プロモーターから発現させることができる。
【０２０１】
例えば、本発明の送達系を使用してＷＯ９８／０５６３５に掲載される疾患の治療に有用な１つ又は複数のＮＯＩを送達することができる。参照を容易にするために、次にそのリストの一部を提供する：癌、炎症又は炎症性疾患、皮膚の異常、発熱、心血管作用、出血、凝固及び急性期応答、悪液質、摂食障害、急性感染、ＨＩＶ感染、ショック状態、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、再灌流障害、髄膜炎、偏頭痛及びアスピリン依存性抗血栓症；腫瘍増殖、浸潤及び伝播、脈管形成、転移、悪性、腹水及び悪性胸水滲出；脳虚血、虚血性心疾患、骨関節炎、リウマチ性関節炎、骨粗鬆症、喘息、多発性硬化症、神経変性疾患、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、脳梗塞、血管炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎；歯周病、歯肉炎；乾癬、アトピー性皮膚炎、慢性潰瘍、表皮水泡症；角膜潰瘍形成、網膜症及び外科創傷治癒；鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アナフィラキシ；再狭窄、鬱血性心不全、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症、又は内部硬化症（ｅｎｄｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）。
【０２０２】
さらに、又は代替で、本発明の送達系を使用してＷＯ９８／０７８５９に掲載される疾患の治療に有用な１つ又は複数のＮＯＩを送達することができる。参照を容易にするために、次にそのリストの一部を提供する：サイトカイン及び細胞増殖／分化活性；免疫抑制又は免疫賦活活性（例えばヒト免疫不全ウイルス感染を含む免疫不全症の治療；リンパ球増殖の調節；癌及び多くの自己免疫疾患の治療、移植片拒絶の防止又は腫瘍免疫の誘発のために）；造血調節、例えば骨髄疾患又はリンパ疾患の治療；骨、軟骨、腱、靭帯、及び神経組織の増殖促進、例えば創傷治癒、熱傷、潰瘍、歯周病、神経変性疾患の治療；卵胞刺激ホルモンの阻害又は活性化（妊性調節）；走化性／化学運動性活性（例えば特異的細胞型を損傷又は感染部位まで動員するために）；止血性活性及び血栓溶解性活性（例えば血友病及び脳梗塞の治療）；抗炎症性活性（例えば敗血症性ショック又はクローン病の治療のため）；抗菌剤；調節剤例えば代謝又は行動の調節剤；鎮痛薬として；特異的欠損異常の治療；治療例えば乾癬、ヒト又は動物用薬。
【０２０３】
さらに、又は代替で、本発明の送達系を使用してＷＯ９８／０９９８５に掲載される疾患の治療に有用な１つ又は複数のＮＯＩを送達することができる。参照を容易にするために、次にそのリストの一部を提供する：マクロファージ阻害活性及び／又はＴ細胞阻害活性、すなわち抗炎症活性；抗免疫活性、すなわち炎症を伴わない応答を含む、細胞性及び／又は体液性免疫反応に対する阻害作用；マクロファージ及びＴ細胞が細胞外マトリックス成分及びフィブロネクチンへ付着する能力を阻害、Ｔ細胞中で上方調節されたｆａｓ受容体発現；リウマチ性関節炎を含む関節炎を含む不要な免疫反応及び炎症の阻害、過感受性、アレルギー性反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患、及び他の自己免疫疾患に伴う炎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、アテローム性硬化症型心疾患、再灌流障害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性異常、呼吸困難症候群、又は他の心肺疾患に伴う炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎及び他の消化管疾患、肝臓線維症、肝硬変、又は他の肝臓疾患に伴う炎症、甲状腺炎又は他の腺性疾患、糸球体腎炎又は他の腎臓及び泌尿器疾患、耳炎又は他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎又は他の皮膚疾患、歯周病又は他の歯科疾患、精巣炎又は精巣上体−精巣炎、不妊症、睾丸外傷又は他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症及び他の免疫及び／又は炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、例えば網膜炎又は嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性眼底疾患の免疫及び炎症成分、眼外傷の炎症成分、感染原因眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経障害、過剰瘢痕、例えば緑内障ろ過手術後、眼内インプラントに対する免疫及び／又は炎症性反応、及び他の免疫及び炎症関連眼科疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）又はその他の器官で免疫抑制及び／又は炎症抑制が有効であるはずの自己免疫疾患、状態、又は異常に伴う炎症、パーキンソン病、パーキンソン病治療に由来する合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆複合）ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病及び他の退行性疾患、ＣＮＳの状態又は異常、ストークスの炎症成分、ポリオ後症候群、精神異常の免疫及び炎症成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギラン−バレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、偽腫瘍大脳、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫の炎症成分、ＣＮＳ外傷、又はＣＮＳ感染症、筋萎縮及び筋ジストロフィの炎症成分、及び免疫及び炎症関連疾患、中枢及び末梢神経系状態又は異常、外傷後炎症、敗血症性ショック、伝染病、外科の炎症合併症又は副作用、骨髄移植又は他の移植合併症及び／又は副作用、遺伝子治療の炎症及び／又は免疫合併症及び副作用、例えばウイルス担体による感染、又はＡＩＤＳに伴う炎症、体液性及び／又は細胞性免疫反応を抑制又阻害するために、単球又は白血球増殖疾患例えば白血病、を治療又は改善するために、単球又はリンパ球の量を減少させることによる、角膜、骨髄、分裂後、レンズ、ペースメーカー、天然又は人工皮膚組織などの天然細胞又は人工の細胞、組織及び器官の移植の場合の移植片拒絶の予防及び／又は治療のために。
【０２０４】
本発明の方法によって治療する対象は動物対象でもよい。対象は哺乳動物対象が好ましく、ヒト対象がより好ましい。
【０２０５】
本発明は、遺伝子治療によって個体を治療するための薬剤組成物も提供し、その場合組成物は治療有効量の本発明の送達系を含み、場合によっては１つ又は複数の送達可能な治療及び／又は診断のＮＯＩを含む。送達系はウイルス送達系なので、組成物は、追加で又は代替で、同じものにから作製、又は入手されるウイルス粒子を含む。薬剤組成物は、ヒト又は動物用使用であってよい。通常は、内科医が個体対象に最も適当な実用量を決定し、それは年齢、体重、及び特定の個体の応答によって異なる。
【０２０６】
場合によっては、組成物は、薬剤として許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はアジュバント含むことができる。製薬用担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は所期の投与経路及び標準の製剤上の慣行に関して選択することができる。薬剤組成物は、担体、賦形剤、又は希釈剤として又は追加で適当ないかなる結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤、及び標的部位中へのウイルス侵入を助ける又は増大することができる他の担体剤（例えば脂質送達系などの）を含むこともできる。
【０２０７】
適宜、薬剤組成物は、１種又は複数の吸入によって、座薬又は腟坐薬の形で、局所的にローション、溶液、クリーム、軟膏、又はまぶし粉の形で、皮膚パッチの使用によって、経口的にデンプン又はラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形で、単独で又は賦形剤と混合してカプセル剤又は種子剤（ｏｖｕｌｅ）で、矯味剤又は着色剤を含むエリキシル剤、溶液、又は懸濁液の形で投与することができ、或いはそれらは非経口的に、例えば、腔内に（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｓａｌｌｙ）、静脈内に、筋肉内又は皮下に注入することができる。非経口投与には組成物は他の物質、例えば、十分な塩又は単糖類を含んで血液と等張の溶液にできる滅菌水溶液の形で最良に使用することができる。頬腔又は舌下投与には組成物は従来の方式で調剤できる錠剤又はドロップの形で投与することができる。
【０２０８】
本発明による送達系による１つ又は複数の治療用遺伝子の送達は、単独で、或いは他の治療、又は治療成分と組み合わせて使用することができる。
【０２０９】
本発明の非霊長類レンチウイルスベクター粒子は、通常、適当な産生細胞中で生成される。産生細胞は、一般に哺乳動物細胞であるが例えば昆虫細胞でもよい。産生細胞は、ウイルス構造遺伝子を含むパッケージング細胞でよく、通常そのゲノム中に組み込まれる。次いで、感染性、複製欠損ベクター粒子を作製するため、パッケージング細胞にベクターゲノムをコードする核酸を形質移入する。あるいは、産生細胞は、ベクターゲノム及びその構造成分をコードする核酸配列で、及び／又はプラスミド、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどの１つ又は複数の発現ベクター上に存在する核酸配列で、或いは機能性ＤＮＡを標的細胞に送達することが知られているいかなる方法でも同時形質移入することができる。
【０２１０】
本発明のベクター、例えば、本発明の第１の態様のレンチウイルスベクターを使用してＮＯＩをいかなる胎児期細胞に送達することもできる。「胎児期」の語は出生前の生成又存在を意味する。一実施形態では、その方法は胚形成期の細胞に適用される。胚の語は、生成初期から出生（又は孵化）までの動物を含む。本明細書では「胚」の語は「前期胚子」、すなわち卵子の受精後に形成され胚組織の分化前までの構造体を含み、接合体及び胚盤細胞を含む。この語は、胎児細胞、すなわち生成後期の胚細胞も含む。本発明は、周産期細胞への送達も包含する。「周産期」の語は出生約３カ月前から出生後約ひと月の期間をさし、新生児期間を含む。「新生児」の語は出生に続く初めの数週間をさす。
【０２１１】
一般には、本発明のベクター、例えば、本発明の第１の態様のレンチウイルスベクター使用して始原生殖細胞、又は生殖細胞に変化を生じさせることができる細胞を含むいかなる生殖細胞にもＮＯＩを送達することができる。「生殖細胞」の語は、減数分裂によって分割されて配偶子を形成する、多細胞生物の生殖器官中の細胞の総称である。「配偶子」の語は、半数体生殖細胞、事実上、卵子及び精子をさす。しかし、上記したように、本発明は配偶子形成に関与する細胞、及び卵巣など、そこで配偶子形成が行われる構造体からの細胞にも適用可能である。
【０２１２】
次に、配偶子形成を哺乳類に関して例のみによって記載する。レンチウイルスベクターなどのベクターを使用して以下に記載した構造の細胞のいずれかにＮＯＩを送達することができる。非哺乳動物における同等の方法も本発明に含まれることは理解されよう。手短に言えば、配偶子形成は生殖細胞の二倍体細胞から配偶子（定義により半数体ｎ）を形成する過程である。精子形成は、生殖腺（オスではこれらを精巣と称する）として知られる分化した器官中で減数分裂（動物において、植物では有糸分裂による）によって精子細胞を形成する過程である。分裂後、細胞は分化を経て精子細胞になる。卵形成は（動物において、植物では配偶体において有糸分裂による）卵巣として知られる分化した生殖腺中で減数分裂により卵子を形成する過程である。
【０２１３】
精子形成では、雄性生殖細胞である、精巣中の精細管の内壁に並ぶ精原細胞から精子が形成される。単一精原細胞は、有糸分裂で分割されて一次精母細胞を形成し、その個々は減数分裂の第一分裂を経て２個の二次精母細胞を形成する。次いで、これらの個々は第２減数分裂を経て２個の精細胞を形成し、これが精子に成熟する。精巣は多数の精細管から構成され、その壁内で精子形成が行われる。精細管の外へ向って列を作る始原生殖細胞は胚上皮中で形成され、細胞分裂が進行するにつれて精娘細胞は精細管の管腔へ向かって移動する。これらの細胞全ては隣接するセルトリ細胞によって栄養補給され補助される。
【０２１４】
卵形成では、一次卵母細胞が卵原細胞の分化によって形成され、次いで減数分裂の第一分裂を経て極体及び二次卵母細胞を形成する。卵子の受精に続き、二次卵母細胞は第２減数分裂を経て成熟卵及び第二極体を形成する。卵巣は、濾胞細胞の外層に囲まれた発達中の卵から構成される多くの濾胞を含む。排卵後、卵子は卵管を下って子宮に移動する。
【０２１５】
ベクターは一箇所に投与されるだろうが、その生物の別の細胞でＮＯＩが発現し又はその影響を感じる、すなわち投与部位は標的細胞と異なってよいことが理解されよう。その中へ非霊長類レンチウイルスベクター投与することができる細胞は上掲の標的細胞の例を含む。
【０２１６】
細胞は胚形成期がより好ましく、例えば子宮内にレンチウイルスベクターを臍帯、胎盤、又は羊水を経て、或いは腹腔内経路又は肝内経路によって投与することができる。レンチウイルスベクターの導入は超音波の使用によって補助される。
【０２１７】
ＥＳ細胞、そうでない場合は他の方法を使用するトランスジェニック動物の作製は当技術分野で公知であり、例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、２ｎｄ  Ｅｄ．ｂｙＢ．Ｈｏｇａｎ、Ｒ．Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ  ａｎｄ  Ｅ．Ｌａｃｙ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．Ｐｉｎｋｅｒｔ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９９４；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５；Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｍ．Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｒｏｂｌ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５；及びＭｏｕｓｅＧｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｂｙ  Ｌｅｅ  Ｍ．Ｓｉｌｖｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５に記載されている。この主題についての有用な一般的教科書はＨｏｕｄｅｂｉｎｅ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、１９９７）−魚類からマウス及ウシまでのトランスジェニック動物を作製するために使用する技術の広範な概説である。
【０２１８】
したがって、例えば、レンチウイルス感染によって異種ＤＮＡを、例えば、受精した哺乳動物卵子に導入することが本発明によって可能になる。一実施形態では、受精した卵子を１細胞期でドナー母から採取し、形質導入細胞を養母に移す。１細胞期で生じた組込みは、真のトランスジェニック、すなわち生殖細胞を含む、全体にわたってトランスジェニックである生物を作製する。組込みが後期に生じる場合、モザイクが作製される。特に好ましい方法では、発達中の胚を所望のＤＮＡを含むレンチウイルスに感染させ、感染胚からトランスジェニック動物を作製する。従来のトランスジェニック法は、胚細胞を生体外で形質転換し、次いでその子宮へ再移植することが必要とされてきた。本発明に伴う著しい利点は、子宮内でＮＯＩを導入できることである。トランスジェニック動物を作製するために使用することができる別の方法は、レンチウイルス感染によって核酸を前核期卵子に導入することを含む。次いで、注入した卵を培養した後、偽妊娠受容体の卵管中に移す。
【０２１９】
ウシなどトランスジェニック哺乳類の構築のための具体的な例として、本発明の方法を使用し治療用タンパク質をコードする配列を含むヌクレオチド構築体を、その哺乳動物から取り除いたばかりの卵巣から入手した卵母細胞中へ導入する。卵母細胞を濾胞から吸引し、解凍しヘパリンで受精能を獲得させパーコール勾配によって事前分画して運動性画分を単離した精子で受精させた後定着させる。
【０２２０】
受精した卵母細胞を遠心分離機に、例えば、８分間１５，０００ｇかけ注入用前核を可視化し、次いで卵管組織−培養上清中で接合体期から桑実胚又は胚盤胞期まで培養する。この培地は、卵管からかき取り培地で希釈した管腔組織を使用することによって調製する。マイクロインジェクションから２時間以内に培地中に接合体を置かなければいけない。
【０２２１】
次いで、コプロスタノールを投与することによってウシなどの所期の受容体哺乳類中で発情を同時生成させる。発情は２日以内に生じ、胚を発情後５〜７日目に受容体に移す。成功した移転はサザンブロットによって子孫で評価することができる。
【０２２２】
あるいは、所望の構築体を胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入することができ、その細胞を培養して導入遺伝子による改変を確実にする。次いで、改変細胞を胞胚期に注入し、胞胚を偽妊娠宿主と取り替える。ＥＳ細胞及び宿主細胞に関して得られた子孫はキメラであり、排他的にＥＳ子孫を含む非キメラ株は従来の交雑育種法を使用し得ることができる。この技術は例えばＷＯ９１／１０７４１に記載されている。
【０２２３】
トランスジェニック配列を含んでいる可能性のある動物の分析は、標準的方法に続いてＰＣＲ分析又はサザンブロット分析によって通常実施されるはずである。必要に応じて、その生物をホモ接合に繁殖させることができる。
【０２２４】
遺伝子治療及び疾患モデルの作製で使用するトランスジェニック生物を作製するために本発明を使用することは先に記載している。特に、疾患モデルによって遺伝子機能の実験的究明が可能となる。一般には、新規な遺伝子、又は異種プロモーターを有する遺伝子を発現するトランスジェニック生物は機能獲得型突然変異を表す。機能喪失型突然変異は、いわゆる「ノックアウト」生物を作り出すための遺伝子ターゲティングによって創生することができる。トランスジェニック生物は、制御領域及び発現パターンの究明にも使用可能である。トランスジェニック生物を使用して、挿入突然変異、遺伝子トラップ及びプロモータートラップなどの技術を使用し新規な遺伝子を同定することもできる。トランスジェニック動物は農業にも、例えば、乳収量、体重、乳組成、耐病性などを遺伝子改良するために適用される。トランスジェニック動物は、トランスジェニック家畜をバイオリアクターとして治療用タンパク質の作製に使用する、いわゆる薬剤ファーミングでも使用可能である。
【０２２５】
例として、（そのホモ接合性の欠失が生前死亡をもたらす）ＳＭＮの調節した除去は、遺伝子治療研究用の有用な脊髄筋萎縮症モデルを提供するはずである。ＣＦＴＲ欠損モデルも貴重な適用例である。他の推定上候補にはプレセニリン−１、ＲＡＲａ、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、及びＥＧＦＲが含まれる。
【０２２６】
得られた表現型の分析は、組織分析、及びマイクロアレイ遺伝子発現プロファイリングなどの標準的な技術を使用し行うことができる。
【０２２７】
本発明の好ましい特徴によれば、レンチウイルスベクター、好ましくはＥＩＡＶベクターを使用して、治療用又は診断用タンパク質をその卵で生成するトランスジェニックニワトリを作製する。
【０２２８】
トランスジェニック鳥類を作製するためのレンチウイルスベクターの使用によって、一部のレトロウイルスベクターで観察される外来遺伝子のサイレンシングもなく、著しい数の世代にわたって遺伝子の発現が可能となる。例えば、Ｍｉｚｕａｒａｉ等、（２００１）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ；２８６：４５６〜４６３頁）は、トランスジェニックウズラにおいてＬＴＲが作動するＭＬＶに基づくベクターからの発現は観察できなかったが、内部ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからの発現がＧ０、Ｇ１及びＧ２鳥中に存在することを観察した。
【０２２９】
治療用タンパク質又は診断用途のタンパク質、例えば、抗体又は抗体の断片をコードするレンチウイルスベクターを使用してトランスジェニックニワトリを作製することができる。抗体は１種を超える動物種由来の領域を含む、又は異なる標的分子に結合する領域を含むように設計することができる。標的遺伝子のヌクレオチドコード配列を変更して、得られたタンパク質のアミノ酸配列を変更することなくＲＮＡの安定性又はＲＮＡの転写レベルを増大させることができる。
【０２３０】
治療用／診断用遺伝子の発現は、構成的プロモーターから、又は組織特異的発現を付与するプロモーターから行うことができる。例えば、標的タンパク質が卵中に存在するような方式で標的タンパク質の発現を生殖用構造物（卵管又は生殖管（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒａｃｔ）を含む）に制限することができる。卵白アルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、及びオボムコイドなど、卵白中に見出されるタンパク質の遺伝子プロモーターに由来するプロモーター又はエレメントを使用することができる。こうした遺伝子の発現はステロイドホルモンによって調節されるが、卵白アルブミン及びコンアルブミンプロモーターには他の細胞特異的転写因子も関与するという証拠がある（Ｄｉｅｒｉｃｈ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８７  Ａｕｇ；６（８）：２３０５〜１２頁）。卵白アルブミン遺伝子プロモーターは、組織特異的サイレンシングエレメントを転写物部位より−３２００から−２８００ｂｐの間に有することが示されているＭｕｒａｍａｔｓｕ等、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９８  Ａｕｇ；１８５（１−２）：２７〜３２頁）。それに反して、サイレンシングエレメントはリゾチーム遺伝子の転写物部位から−２４００ｂｐに存在する（Ｂｏｎｉｆｅｒ等、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７  Ｏｃｔ  １７；２７２（４２）：２６０７５〜８頁、概説）。しかしＤｉｅｒｉｃｈ等、（１９８７）は、−１３４８から−１までに渡る切断卵白アルブミン中にある程度の細胞特異性を得た。初代培養したニワトリ卵管の管状腺細胞中の−４２５から−１までに渡る切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）卵白アルブミンに、ある程度のステロイド調節が観察された（Ｄｉｅｒｉｃｈ等、１９８７）。
【０２３１】
治療用／診断用タンパク質をコードするレンチウイルスベクターを使用して注入によって産みたて卵中の胚盤葉期の胚中の細胞に形質導入を生じさせる。あるいは、レンチウイルスベクターを使用して、ＷＯ９０／１３６２６に記載されている技術、又は同様の公にされた技術などの技術を使用し初期の胚に形質導入を生じさせ、その胚を正常に発達させることができる。
【０２３２】
手短に言えば、子宮の胚を手動で、又は成熟前に産卵を誘発することによって雌鶏から取り出す。その胚をレンチウイルスベクターで形質導入を生じさせ、次いで培養して充実（ｆｒｕｉｔｉｏｎ）させる。これにより胚細胞は形質導入され得るが、存在する細胞数は比較的に少なく、その中に導入された遺伝子が生殖細胞中に存在し受け継がれる鳥の作製数は増加する。
【０２３３】
本発明は、トランスジェニック鳥類からのタンパク質収量を高めるためのＲＮＡｉの使用にも関する。
【０２３４】
卵中の所望するタンパク質の発現を最大化するために、下記実施例８の通りに、ＲＮＡｉを使用して、卵白アルブミン、リゾチーム、コンアルブミン、及びオボムコイドなどの卵白中に通常存在する豊富なタンパク質の比率を減少させることができる。これらのタンパク質の作製を下方調節すると、卵中の所望のタンパク質の割合を同時に上昇させることができ収量の改善がもたらされる。
【０２３５】
ＥＩＡＶベクターから必要とするｍＲＮＡを標的に、ｓｉＲＮＡ、又は短いヘアピン前駆体を発現させることによって、これは実現することができる。ベクターは、ｍＲＮＡ内の１つ又は複数の部位で１つ又は複数のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを含むことができる。
【０２３６】
卵白アルブミンなどのタンパク質の効率的なターゲティングによって、繁殖目的では成長できない卵を得ることができる。したがって、トランスジェニック雄鶏を同定し当該導入遺伝子を含むベクター用トランスジェニック雌鳥に掛け合せて、両形質を有する雌の子孫を得ることができ、この子孫はタンパク質産生のバイオリアクターとして使用されるはずである。（実施例１０に記載した通り）ｓｉＲＮＡの調節はこの代替法のはずであり、すなわち卵が繁殖用ではなくタンパク質産生に必要とされるとき産卵雌鳥にサイレンシングを誘発することができる。これにより生物全体の内で、標的遺伝子の下方調節発現のいかなる起こり得る有毒な影響も克服されるはずである。
【０２３７】
次に、以下の非限定的な実施例に関してさらなる例によって本発明を説明する。
【実施例１】
【０２３８】
周産期動物のＥＩＡＶ形質導入
ベクターの調製
先に述べた通り、２９３Ｔヒト胚腎細胞の一過性同時形質移入によってベクターを調製した（Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ等、１９９９）。ＥＩＡＶベクターゲノムＳＭＡＲＴ２Ｚは、内部ＣＭＶプロモーターからβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現する。それはＥＩＡＶのセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（Ｓｔｅｔｏｒ等、１９９９）及びウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（Ｄｏｎｅｌｌｏ等、１９９８）を含む。
【０２３９】
ベクターの投与
以下のように胎仔血管内に注射することによってベクターを投与した。イソフルラン麻酔下で最深（ｆｕｌｌ  ｄｅｐｔｈ）正中開腹を実施して妊娠１６日目の妊娠マウスの子宮を露出させた。各胎仔に２×１０７Ｔ．Ｕ．（形質転換単位）のベクターを総容量２０μｌで３４ゲージ針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用して末梢卵黄嚢血管中に投与した。母１頭につき５頭までの胎仔に注入した。層と層を縫合することによって開腹を閉じ、保温ケージ中にマウス放置して回復させた。
【０２４０】
トランスジェニックの検出
受胎後１８〜１９日目に仔が生まれた。イソフルラン麻酔で安楽死させることによってマウスを様々な生成段階（注射後３、７、１４、２８、及び７９日目）で屠殺し、組織像のための試料を調製した。臓器を１００％エタノール溶液中に２時間置いた後、ベクターによって発現したβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子をＸ−ｇａｌ溶液で（ｌｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むジメチルスルホキシド液、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、２ｍＭの塩化マグネシウム）で染色した。染色した組織を１０％ホルムアルデヒド中で２時間固定し、パラフィン包埋し、切片を作り、ニュートラルレッドで対比染色した。染色によって肝臓、肺、心臓、筋肉、腎臓、骨格筋、及び脳を含む幾つかの臓器の形質導入が示された。結果を図１〜１１に示す。
【０２４１】
研究期間を通して発現レベルは減少せず、形質導入細胞のクローン増殖が観察された。
【０２４２】
卵黄嚢血管又は臍静脈への注射の他に、循環血液、ＣＳＦ、又は他の組織中への直接注射も実施することができ、又は羊水中に実施することができる。肺又は皮膚組織の形質導入を所望する場合、後者は特に適しているだろう。
【実施例２】
【０２４３】
血友病
この実施例は、実施例１の方法に続いて実施する。血友病は、不可欠な凝固因子が部分的には又は完全に失われている血液状態である。Ｘ連鎖性劣性障害である。血友病には２つの型があり、最も一般的なものは因子ＶＩＩＩを欠く血友病Ａである。血友病Ｂでは、因子ＩＸが欠けている。ＥＩＡＶを使用して、ＥＩＡＶによって因子ＶＩＩＩ又はＩＸを血友病胎仔の臍静脈、又は周産期胎仔の肝臓門脈に送達する。
【０２４４】
ベクターの調製
本出願人同時係属ＧＢ０２０２４０３．１に記載されているものなどのベクター。より詳しくは：
ｐＯＮＹ８．４シリーズのベクターは、力価に有害な作用を及ぼすことなく、アクセサリータンパク質に全く依存しない一過性又は安定したベクター系の一部としてこれを機能させることを可能にする幾つかの修飾を受けている。従来、レンチウイルスベクターゲノムは、適切な力価を得るために（一過性又は安定）産生細胞中にウイルスタンパク質ｒｅｖの存在を必要としてきた。これには、現在のＨＩＶベクター系及び初期ＥＩＡＶベクターが含まれる。
【０２４５】
ｐＯＮＹ８．１シリーズのベクターゲノムと比較したとき３つの修飾があり、これらは：
ａ）ｇａｇに由来しパッケージングシグナルの一部を形成するＡＴＧモチーフ全てをＡＴＴＧを読み取るために修飾した。これによりＬＴＲ中のプロモーターによって作動され得るオープンリーディングフレームの挿入が可能となる。
【０２４６】
ｂ）ゲノム長、すなわちＲ領域間の距離は、ｗｔウイルス（７．９ｋｂ）中に見られる距離より近い。
【０２４７】
ｃ）３’のＵ３領域を修飾して、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）Ｕ３領域由来の配列を含めると、これは形質導入時に内部カセットの他に第２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を作動することができる。この実施例では本発明者らはＭＬＶを有するが、これはいかなるプロモーターでもよいはずである。
【０２４８】
ＬＴＲを修飾することの詳しい詳細は、本出願人のＷＯ９６／３７６２３及びＷＯ９８／１７８１６に見出すことができる。
【０２４９】
図１２は、ＥＩＡＶゲノムの模式図である。これらを本発明の方法にしたがって形質移入に使用することができる。形質移入すると、３’ＬＴＲは５’ＬＴＲまで複製される。図１３は、ｐＯＮＹ８．１Ｇの全プラスミド配列を示す。図１４は、ｐＯＮＹ８．４ＺＣＧの全プラスミド配列を示す。図１５は、ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺの全プラスミド配列を示す。図１６は、ハイブリッドＵ３領域の模式図である。図１７は、ハイブリッドＬＴＲの配列を示す。
【０２５０】
ＥＩＡＶ／ＭＬＶハイブリッドＬＴＲベクターの構築
以下のようにＰＣＲを実施した：
産物Ａ＝プライマーＫＭ００１＋ＫＭ００３、標的としてｐＯＮＹ８．１Ｚと共に。
【０２５１】
産物Ｂ＝プライマーＫＭ００４＋ＫＭ００５、標的としてｐＨＩＴｌ１１と共に。
【０２５２】
産物Ｃ＝プライマーＫＭ００６＋ＫＭ００２、標的としてｐＯＮＹ８．１Ｚと共に。
【０２５３】
ＰＣＲ産物（Ａ、Ｂ、及びＣ）をゲル精製した。（プライマーＫＭ００１及びＫＭ００５と共に）産物Ａ及びＢを使用しＰＣＲ反応を準備して産物Ｄを得た。（プライマーＫＭ００４及びＫＭ００２と共に）産物Ｂ及びＣを使用しＰＣＲ反応を準備して産物Ｅを得た。産物Ｄ及びＥをゲル精製し、プライマーＫＭ００１及びＫＭ００２と共に標的としてＰＣＲ反応に使用して、産物Ｆを得た。ＰＣＲ産物Ｆをゲル精製した（約１ｋｂ）。次いで、これをＳａｐＩで切断し、ＳａｐＩで切断したｐＯＮＹ８．１Ｚ中へサブクローン化した。これにより図１８及び１９に示すベクターｐＯＮＹ８．１Ｚｈｙｂがもたらされた。さて、ＥＩＡＶの３’ＬＴＲが、ＥＩＡＶ／ＭＬＶハイブリッドＬＴＲに交換された。ＥＩＡＶ  Ｕ３は、ＭＬＶ  Ｕ３領域にほぼ交換された。これらは、組込みに必要とされる配列であるａｔｔ部位を含むので３’ＬＴＲのＥＩＡＶ５’Ｕ３配列が保持された。
【０２５４】
プライマー配列を以下に示す。
【０２５５】
ＥＩＡＶ／ＭＬＶハイブリッドＵ３
【表１】
2005512598.tif 000003
【０２５６】
最終ＰＣＲ産物の配列。
【表２】
2005512598.tif 000004
【０２５７】
血友病Ａ
因子ＶＩＩＩ（野生種完全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又は野生種ＯＲＦで欠失させた切断Ｂ領域、又はコドン最適化ＯＲＦ、又はコドン最適化ＯＲＦで欠失させた切断Ｂ領域）を発現する（上記のものなどの）ＥＩＡＶウイルスベクターを実施例１の方法に続き、静脈内、肝臓内、又は筋肉内送達を含めて投与した。ＣＭＶなどの適当なプロモーター、又はＰＧＫなどのヒトプロモーター／エンハンサーを使用して遺伝子を発現させる。さらに、Ｔｅｔ系などの誘導性プロモーターを発現を調節するために使用することができる。代替法として組織特異的プロモーター／エンハンサーを細胞型に合わせて発現を制限するために使用することができる。
【０２５８】
血友病Ｂ
因子ＩＸ（野生種ＯＲＦ又はコドン最適化ＯＲＦ、）を発現する（上記のものなどの）ＥＩＡＶウイルスベクターを実施例１の方法に続き、静脈内、肝臓内、又は筋肉内送達を含めて投与した。ＣＭＶなどの適当なプロモーター、又はＰＧＫなどのヒトプロモーター／エンハンサーを使用して遺伝子を発現させる。さらに、Ｔｅｔ系などの誘導性プロモーターを発現を調節するために使用することができる。代替法として組織特異的プロモーター／エンハンサーを細胞型に合わせて発現を制限するために使用することができる。
【実施例３】
【０２５９】
嚢胞性線維症
この実施例を実施例１の方法に続き実施する。嚢胞性線維症は、イオン輸送、粘液流体力学、炎症、及び細菌付着に役割を有すると考えられているタンパク質である嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の突然変異が原因の劣性遺伝障害である。ＥＩＡＶを使用して肺の形質導入のためにＣＦＴＲを羊水へ送達する。
【０２６０】
ＣＦＴＲ（野生種ＯＲＦ又はコドン最適化ＯＲＦ）を発現する（上記のものなどの）ＥＩＡＶウイルスベクターを実施例１の方法に続き、胃腸内送達肺内又は羊水内を含み投与する。ＣＭＶなどの適当なプロモーター、又はＰＧＫなどのヒトプロモーター／エンハンサーを使用して遺伝子を発現させる。さらに、Ｔｅｔ系などの誘導性プロモーターを発現を調節するために使用することができる。代替法として組織特異的プロモーター／エンハンサーを細胞型に合わせて発現を制限するために使用することができる。
【実施例４】
【０２６１】
筋ジストロフィ
この実施例を実施例１の方法に続き実施する。デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）は、致死性Ｘ連鎖性劣性障害である。ＤＭＤは、横紋筋系中のタンパク質ジストロフィンの濃度及び／又は活性の遺伝的欠損から生じる。ＥＩＡＶを使用して（軽度のベッカー型筋ジストロフィ（ＢＭＤ）の表現型に対応する）ミニジストロフィンｃＤＮＡを周産期胎仔の臍静脈に、及び／又は直接胎仔骨格筋に送達する。
【０２６２】
ジストロフィン（野生種完全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、切断野生種ＯＲＦ、コドン最適化ＯＲＦ、又は切断コドン最適化ＯＲＦ）を発現する（上記のものなどの）ＥＩＡＶウイルスベクターを実施例１の方法に続き、筋肉群全ての中への送達を含み投与する。ＣＭＶなどの適当なプロモーター、又はＰＧＫなどのヒトプロモーター／エンハンサーを使用して遺伝子を発現させる。さらに、Ｔｅｔ系などの誘導性プロモーターを発現を調節するために使用することができる。代替法として組織特異的プロモーター／エンハンサーを細胞型に合わせて発現を制限するために使用することができる。
【実施例５】
【０２６３】
リボザイム
この実施例を実施例１の方法に続き実施する。メラニンを生成する生合成経路上の遺伝子を標的にするリボザイムをＥＩＡＶを使用して送達する。この手法によってトランスジェニック体の同定が容易になる。
【実施例６】
【０２６４】
パーキンソン病のトランスジェニックモデルのためのＥＩＡＶの使用
パーキンソン病（ＰＤ）は、６５歳を超える人口の約２％が罹患している最も一般的な神経変性疾患の１つである。この疾患は、その症状が強剛性、安静時振戦、及び運動緩慢（動作の開始、実行が緩慢）である運動障害パーキンソン病の症状を特徴とする。これは、神経伝達物質ドーパミンを生成する黒質中のニューロンの消失から生じる。この疾患が受け継がれる数種の稀有なファミリーがあるが、ＰＤの原因は大部分不明である。常染色体優性ＰＤを有するファミリーにおいて、２つの異なるミスセンスの突然変異が、α−シヌクレイン中にマップされているが（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ等、１９９７；Ｋｒｕｇｅｒ等、１９９８）、このα−シヌクレインはシナプス小胞の輸送に関与すると考えられる小さいリンタンパク質である。青年期に発症する常染色体劣性若年性パーキンソン病（ＡＲ−ＪＰ）では、Ｋｉｔａｄａら（１９９８）がパーキン（ｐａｒｋｉｎ）を担う遺伝子、Ｅ３ユビキチンリガーゼを示した。このリガーゼは最近α−シヌクレインのユビキチン化に触媒作用を及ぼすことが提案された（Ｓｈｉｍｕｒａ等、２００１）。したがって、α−シヌクレインを分解できるかどうかが、ＡＲ−ＪＰ及びおそらく散発性ＰＤ（Ｈａａｓｓ及びＫａｈｌｅ，２００１）を招くことが示唆されてきた。
【０２６５】
ＥＩＡＶベクター系を使用して以下の１つ又は複数をマウス精原細胞幹細胞に送達する（Ｎａｇａｎｏ等、２００１）。
【０２６６】
１．リボザイムをパーキンへ
２．突然変種α−シヌクレイン対立遺伝子
３．リボザイムをチロシンヒドロキシラーゼへ（ドーパミン合成に必要な酵素）
【実施例７】
【０２６７】
脈管形成
低酸素誘導因子（ＨＩＦ）は、酸素の恒常性において中心的役割を担う転写複合体である。ＨＩＦ中のヒドロキシル化プロリン残基を認識するフォンヒッペルリンドウユビキチン化複合体によって、標準条件下でＨＩＦのαサブユニットは分解を標的としている。結果として安定状態のタンパク質濃度は低く、転写複合体は生じることができない。その酵素活性が低酸素、鉄キレート化、及びコバルトイオンによって調節されるプロリル−４−ヒドロキシラーゼのファミリーが最近記載されており、ＨＩＦを調節する酸素センサであるための要件を満たしている（Ｅｐｓｔｅｉｎ等、２００１）。キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の細胞培養物中でＲＮＡ干渉によってプロリル−４−ヒドロキシラーゼが抑制されると、標準条件下で低酸素誘導遺伝子の高い発現がもたらされた（Ｂｒｕｉｃｋ  ａｎｄ  ＭｃＫｎｉｇｈｔ，２００１）。
【０２６８】
ＥＩＡＶベクター系を使用して
１．リボザイムをプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（又はＶＨＬ）へ。これは、ＨＩＦ−ｌαサブユニットの構成的上方調節、ＨＩＦ複合体の活性化、及びＨＩＦ標的遺伝子の過剰発現をもたらすことができる。
【０２６９】
２．構成的に活性なＨＩＦ−１（標準でのＨＩＦの上方調節）又はＰＨＤ３（低酸素でのＨＩＦの下方調節）。
【０２７０】
を注射によってマウス卵母細胞の囲卵腔に送達する。（Ｃｈａｎ等、１９９８；２００１）。
【０２７１】
健康関連研究におけるトランスジェニックマウスモデルの作製及び適用例は多く記載されている。提案した研究は、現在既存の「ノックアウト」法によってはその作製が叶えられない広範囲のヒト疾患モデルの作製を可能にする。
【０２７２】
既存の技術に勝る利点には以下が含まれる。
【０２７３】
１）注入したＤＮＡの非相同組換えと比べて、レンチウイルス形質導入による導入遺伝子送達効率の上昇。前核注射は、不安定で再配列及び欠失を起こしがちな大型の直列のＤＮＡ配列体の挿入をもたらす。一般に、レンチウイルス形質導入は、染色体ＤＮＡ中の別個のカセットとして分布する限られたの数ベクターの複製の安定した組込みをもたらす。
【０２７４】
２）現在の「ノックアウト」に比べて所要時間の減少。ホモ接合遺伝子欠失マウスの作製は、設計した遺伝子欠失が「生殖細胞系列を経る」モザイクヘテロ接合体の交雑育種法を必要とする、他と比べて労働集約的で時間のかかる工程である。それに反して、受精に先立ち卵母細胞に形質導入することにより、あらゆる細胞が除去カセットを含む。交雑育種法の必要性が回避され、短い所要時間及び必要とされる総動物数の実質的な減少がもたらされる。
【０２７５】
３）遺伝子産物ノックダウンの柔軟性。記載したように、この技術は当該遺伝子の欠失が致死的である疾患モデルの確立に一定の価値がある。これは、遺伝子発現の除去が、特定の生成段階で所望される、又は特異的組織に制限される研究全てに有利である。
【０２７６】
４）ＨＩＶベクターには、その治療適用を一定の疾患に限定し得る幾つかの著しい短所がある。ＨＩＶ−１は、潜在的発癌性タンパク質及び配列を持つヒト病原体であるという欠点を有する。ＨＩＶのｇａｇ−ｐｏｌを発現するパッケージング細胞中で生成されたベクター粒子の導入は、これらのタンパク質を個体に導入し抗体陽転をもたらす危険がある。本発明の実施形態で使用した本発明の非霊長類レンチウイルスに基づくベクターはＨＩＶタンパク質を個体に導入しない。
【実施例８】
【０２７７】
タンパク質生成のバイオリアクターとしてトランスジェニック鳥の作製。
【０２７８】
細菌性ガラクトシダーゼをコードするＥＩＡＶベクターを、初めに１０マイクロリットルのｐＯＮＹ８Ｚ５’ｃｐｐｔでＵＳ５，２５８，３０７に記載されるものなど公にされた技術を使用し産みたて卵中の胚盤葉期未満の胚に、又はＷＯ９０／１３６２６に記載されるものなどの技術を使用し初期胚に直接に注入する。不活性染料を胚盤葉期に注入してベクターの正確な送達を確実にする。抱卵中及び孵化後の異なる生成段階で胚を採取することによって形質導入効率を分析する。次いで、胚をを切片化しβ−ガラクトシダーゼ活性を染色して、どの臓器が形質導入されるか、及び胚生殖腺中の生殖細胞が形質導入されたかどうかを同定する。血液及びＣＡＭなどの組織試料を胚から取り出し、形質導入された細胞の割合を定量ＰＣＲを使用して評価する。幾つかの雄胚を性成熟まで成長させ、精液試料を採取する。そのような鳥が導入遺伝子をいかなる子孫にでも受け渡す可能性を定量ＰＣＲを使用して評価する。次いで、精液を使用して雌鳥を授精させ、胚を採取し、定量ＰＣＲによって評価してトランスジェニック子孫の割合を定量する。さらに、Ｇ１集団中のベクターからのβ−ガラクトシダーゼ発現のレベルをＸ−Ｇａｌを使用し染色することによって評価する。
【実施例９】
【０２７９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）で使用するベクター
図２０は、幾つかのＲＮＡｉ用発現カセットを例示し、このカセットをレンチウイルス、例えば、ＥＩＡＶ中に使用してトランスジェニック細胞及び動物中でｓｉＲＮＡを発現させることができる。これらの個々の実施例では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｕ６）が使用されている。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは、小さい５ＳリボソームＲＮＡ及び転移ＲＮＡを含む様々の非常に小さく安定したＲＮＡを生成する。効率的なＲＮＡｉは、単一Ｕ６プロモーター（図２０Ａ）由来の短いヘアピンの発現、又は一方がセンス領域を発現し、他方が標的と同じ配列の相補鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を発現する２つのＵ６プロモーターに組み込む（図２０Ｂ）ことによって媒介される。図２０Ｃに示す実施形態では、２つの対向するプロモーターを使用して前及び発現カセットの相補鎖から標的のセンス及びアンチセンス領域を転写する。
【実施例１０】
【０２８０】
短いＲＮＡの生成調節用アプタザイム
トランスジェニック動物を作製するためにウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを使用して、重要な又は不可欠な機能を有する遺伝子産物を標的とするｓｉＲＮＡを送達することは、作製中にトランスジェニック動物に死をもたらし得る。ｓｉＲＮＡの転写を調節し、それによってサイレンシング効果を調節可能にする能力は大変望まれているはずである。この実施例では、本発明者らは、機能性ｓｉＲＮＡの生成調節にアプタマー／リボザイムハイブリッド（「アプタザイム」）の使用を述べる。
【０２８１】
アプタマーは、タンパク質及び薬物分子を含む幾つかのリガンドを結合できる構造を形成する核酸分子である。ハンマーヘッドリボザイムの１個のらせん体をアプタマーに置き換えることによって、リガンドの存在又は不在によって誘発される立体配置変化の結果として（それ自体であり得る）基質を切断することができる触媒ＲＮＡを作り出すことが可能になる。図２１Ａは、本発明のベクター及び本発明の方法に使用することができる発現カセットの設計を例示する。このカセットでは、アプタザイムは短いヘアピンによってコードされるｓｉＲＮＡの５’に加えられる。これにより転写物の自己切断の調節した誘導（又は阻害）が可能となり、アプタザイム構造からヘアピンを分離し、したがってサイレンシングが活性化される。図２１Ｂに例示したように、リガンドの付加／除去は触媒活性を誘発し、転写物を切断し、短いヘアピンを放出して標的配列のサイレンシングの誘発を可能にする。
【実施例１１】
【０２８２】
ｓｉＲＮＡにより低酸素的に誘発したＶＥＧＦのサイレンシング
この実施例では、本発明者らは、機能性ｓｉＲＮＡの生成を調節するための「アプタザイム」の使用について説明し、そこではアプタマーに特異的なタンパク質リガンドが同じベクターから発現する。ベクターを図２２に例示したように構築する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ  Ｕ６ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモーターを使用して、ＶＥＧＦに対してアプタザイムに結合した短いヘアピンの発現を作動する。低酸素条件下で低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）からの発現が誘発され、アプタマーのリガンドであるタンパク質Ｘをコードする遺伝子Ｘを転写する。アプタザイムへのリガンドの結合は、触媒作用、短いヘアピン放出、結果として血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の遺伝子サイレンシングを誘発する。
【０２８３】
したがって、低酸素中でＶＥＧＦが特異的に下方調節される、このことは増殖性糖尿病性網膜症を含む幾つかの疾患で治療上有益である。
【０２８４】
別の実施形態において、アプタマーのリガンドはＶＥＧＦ自体でよい。
【実施例１２】
【０２８５】
ｓｉＲＮＡ前駆体を転写するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの使用
この実施例では、本発明者らは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下でのｓｉＲＮＡ前駆体の転写について説明する。これは、短いヘアピン（図２３Ａ）、又はｓｉＲＮＡ配列（図２３Ｂ）の両脇にアプタザイムなどの触媒ＲＮＡをコードする、又はその標的である配列を置くことによって達成される。フランキング配列の切断によって前駆体からｓｉＲＮＡ又は短いヘアピンが放出される。
【０２８６】
図２３Ａに示す発現カセットでは、短いヘアピンの発現はＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＣＭＶの制御下にある。下流の２つのＴｅｔオペレータの複製は追加の調節レベルを提供する。別々に発現、又は同じベクターから発現され得るＴｅｔリプレッサタンパク質の存在下で（ドキシサイクリンがない場合）転写は阻害される。標的の遺伝子サイレンシングを惹起することができるような具合に、活性化して設計した部位で切断する短いヘアピンを放出することができるアプタザイムが転写物の両脇には置かれる。この特定の実施形態では、リボザイムがレンチウイルスゲノムの自己切断をもたらすはずなのでリボザイムよりもアプタザイムの使用が必要とされる。
【０２８７】
図２３Ｂに示す発現カセットでは、アンチセンスｓｉＲＮＡの発現だけがアプタザイム調節の制御下にある。再度、標的配列は両脇に、Ｕ６プロモーターから構成的に発現するセンスＲＮＡと二重鎖を形成するための適当なＲＮＡ配列を放出する部位を切断するアプタザイムを置く。したがって、アプタザイムリガンドの存在／不在に応じて標的の遺伝子サイレンシングをオン又はオフに切り替えることができる。
【実施例１３】
【０２８８】
組み換え遺伝子の発現を調節するためのアプタザイム配列を含むベクターの使用
遺伝子を含むいかなる核酸配列の転写後調節にもアプタザイムを使用することができる。転写物の一部、例えばイニシエーターであるメチオニンのコドンを除去して、又はＵＴＲがキャッピング及び／又は転写物のポリアデニル化を防止して、転写物の切断を誘発する適当なリガンド付加／除去によりアプタザイムは活性化（又は阻害）される。これは、濃度が高過ぎる場合、遺伝子産物、例えば、因子ＩＸなどの治療用遺伝子の合成を停止する手段を提供する。このようにして導入遺伝子の発現を自己調節的であるように設計することもできる。
【０２８９】
図２４Ａは、インスリンの発現調節で使用するための構築体を例示する。血糖値が高いときにだけインスリンの高レベルの発現が生じるように、その活性がグルコース結合によって調節されるアプタザイムを設計する。グルコースが閾値レベル未満に下がった場合、アプタザイムは活性であり、インスリン導入遺伝子転写物は破壊される。
【０２９０】
図２４Ｂは、因子ＩＸの発現の調節で使用するための構築体を例示する。この構築体では、ドキシサイクリンによって調節されるアプタザイムを使用して、ドキシサイクリンの投与により試験管内で及び生体内で組み換え遺伝子／短いＲＮＡの発現を調節する。この構築体では、Ｔｅｔオペレータ配列はプロモーターの下流に挿入される。ドキシサイクリンが除去され、それによって新規な転写が防止されるとき、（同じベクター発現され得る）Ｔｅｔリプレッサタンパク質の存在下で転写が抑制される。ドキシサイクリンの不在下ではアプタザイムは活性なのでいかなる既存の転写物も切断され分解される。
【０２９１】
追加の制御レベルを加えるための戦略では、Ｔ−ＲｅｘＴＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）系を場合によっては組み込むことも可能であろう。
【実施例１４】
【０２９２】
組み換え遺伝子発現を調節するためのアプタザイム配列を含むベクターの使用−ベクターゲノムＲＮＡの自己切断を防止するための手段
アプタザイム活性を最小化、したがって自己切断によるベクターゲノムの不要な崩壊を最小にするはずの条件下で本発明のウイルスベクターの作製を実施すべきであるが、好ましい手段はベクターを分割イントロンベクターとして構成することによりアプタザイム（又はリボザイム）を物理的に分離することである（Ｉｓｍａｉｌ等、２０００）。これによってリボザイムの全配列が、プロウイルスによってコードされている転写物中にしか存在せず、ベクター粒子中に存在するＲＮＡゲノムには存在しないことを確実になる。
【０２９３】
図２５Ａは分割イントロン戦略を例示し、図２８Ｂは本発明のこの態様の適したベクターを例示する。逆転写の過程中、転写されたプロウイルスのスプライシングの後にのみリボザイムが生成されるように、スプライスドナー、及び一部のリボザイムの５’配列はウイルスのＬＴＲの５’まで複製される。図２５Ａに示す具体的な実施例を使用して、アプタザイムをコードする配列は、青で示す領域（ＡＧＡＵＣＡＵ）が黒で示す配列（ＧＡＵＧＣＵ）の上流に存在することのないように、ウイルス産生細胞によってパッケージされたゲノム中で分割されるはずである。その代わりそれは３’ＬＴＲ、及びスプライスドナー（下線）を含む追加の配列中に存在する。次に、それが残りのアプタザイム配列に隣接するスプライスアクセプタの上流にあるような具合に、逆転写と同時にこれは５’ＬＴＲまで複製される。転写と同時に下線のイントロン配列は
【表３】
2005512598.tif 000005
【０２９４】
スプライスされ、それによって完全なアプタザイムを形成する。したがって、アプタザイムは、形質導入細胞中にのみ存在し、力価の損失を招くはずである、いかなる事前のベクターゲノムの切断も防止する。
【０２９５】
図２５Ｂは、本発明のこの態様に使用できる分割イントロンベクターを例示する。ベクターはＥＩＡＶ／ＭＬＶのハイブリッドＬＴＲを有する。このベクターは、転写開始の下流及びＥＩＡＶ反復の上流に挿入されたスプライスドナーを有し、アプタザイムの５’部分の配列も含む。逆転写中、修飾３’ＬＴＲは５’ＬＴＲまで複製される。転写及びスプライシングに続いて機能性アプタザイムが作り出される。アプタザイムの活性化によって転写物が切断されその分解がもたらされる。
【０２９６】
ウイルスＲＮＡゲノム内に潜在的活性アプタザイムが形成することを防止する追加の手段は、プロモーターの３’末端にアプタザイムの部分と塩基対を作ることができる配列を含め、それが正しい立体配置を使用する可能性を減少させることである。これを図２６に例示する。示すように、らせん体Ｉの５’領域と塩基対を組み、アプタザイムが触媒活性に必要な立体配置を採用することを防止するヘアピンを形成する配列を組み込むために、Ｕ６プロモーターの３’末端は修飾されている。これはＲＮＡゲノム中でのみ生じ転写物中では生じない。転写の開始がプロモーター中の修飾配列の下流にあるからである。これは、プロモーター配列は存在しないはずなので、転写されたプロウイルスの三次構造を妨害しないはずである。
【０２９７】
記載した本発明の方法及び系の、本発明の範囲及び精神から逸脱することのない様々な変更形態及び変形形態は当業者には明らかであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求された本発明はそのような特定の実施形態のみに不当に限定されるべきでないことは理解されるものとする。実際、化学、生物学、又は関連分野の当業者には明らかである、本発明を実施するために記載された形態の様々な変更形態は本発明によって包含されるものとする。上記明細書に記載した刊行物全ては参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０２９８】
【図１】ＥＩＡＶレンチウイルス子宮内注射後の肝臓及び組織組織像を示し、胎仔静脈内注射後３、７、１４、２８、７９日目及び６カ月目にβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス肝臓の断面を示す図である。
【図２】ＥＩＡＶレンチウイルス子宮内注射後の組織及び組織像を示し、胎仔静脈内注射後様々に３、７、１４、及び７９日目にβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス肝臓、心臓、骨格筋、肺、脳、及び腎臓の断面を示す図である。
【図３】核局所性ＬａｃＺを発現しているＥＩＡＶウイルスベクターの胎仔脊髄内注射後７日目にβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス後根神経節を示す図である。
【図４】核局所性ＬａｃＺを発現しているＥＩＡＶウイルスベクターの胎仔脊髄内注射後にβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス後根神経節の断面を示す図である。
【図５】核局所性ＬａｃＺを発現しているＥＩＡＶウイルスベクターの胎仔静脈内注射後７日目にβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス肝臓の断面を示す図である。
【図６】核局所性ＬａｃＺを発現しているＥＩＡＶウイルスベクターの胎仔静脈内注射後７日目にβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス腎糸球体及びその断面を示す図である。
【図７】核局所性ＬａｃＺを発現しているＥＩＡＶウイルスベクターの胎仔静脈内注射後７日目にβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス膵臓及びその断面を示す図である。
【図８】核局所性ＬａｃＺ発現しているＥＩＡＶウイルスベクターの胎仔筋肉内注射後７日目のβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス骨格筋を示す図である。
【図９】ＥＩＡＶウイルスベクターＬａｃＺ発現の胎仔腹腔内注射後２週間目β−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス横隔膜並びにその平面断面及び横行断面を示す図である。
【図１０】核局所性ＬａｃＺ発現しているＥＩＡＶウイルスベクター胎仔筋肉内注射後２週間目にβ−ガラクトシダーゼ標識遺伝子で染色したマウス脚、並びにその平面及び横行断面を示す図である。
【図１１】ＥＩＡＶウイルスベクターの胸腔内及び腹腔内注射後９６時間目のβ−ガラクトシダーゼのＸ−Ｇａｌ可視化を示す図である。図１１Ａは内臓を取り除いた矢状断面を示す図である。図１１Ｂは横隔膜を切除し、前側から見た図である。
【図１２】様々な大きさのＥＩＡＶゲノムを示す略図である。本発明では形質移入にこれらを使用することができる。形質移入と同時に３’ＬＴＲは５’ＬＴＲへ複製される。
【図１３】ｐＯＮＹ８．１Ｇの核酸配列を示す図である。
【図１４】ｐＯＮＹ８．４ＺＣＧの核酸配列を示す図である。
【図１５】ｐＯＮＹ８．４ＧＣＺの核酸配列を示す図である。
【図１６】本発明で使用したベクターのハイブリッドＵ３領域を示す模式図である。
【図１７】このハイブリッドＬＴＲの核酸配列を示す図である。
【図１８】ｐＯＮＹ８．１ＺＨｙｂの核酸配列を示す図である。
【図１９】ｐＯＮＹ８．１ＺＨｙｂの模式図を示す図である。
【図２０（ａ）−（ｃ）】ＲＮＡｉの適用例で使用した発現カセットを示す図である。
【図２１（ａ）】アプタザイムで調節したｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングの媒介に使用した発現カセットを示す図である。
【図２１（ｂ）】図２４ａの発現カセットの転写物の構造を示す図である。
【図２２】ｓｉＲＮＡにより低酸素で誘発したＶＥＧＦのサイレンシングに使用した発現カセットを示す図である。
【図２３（ａ）】アプタザイムで調節した短いヘアピンを発現するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む発現カセットを示す図である。
【図２３（ｂ）】アプタザイムで調節したアンチセンスｓｉＲＮＡを発現するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む発現カセットを示す図である。
【図２４（ａ）】アプタザイムで調節したインスリン発現の媒介に使用される発現カセットを示す図である。
【図２４（ｂ）】アプタザイムで調節した因子ＩＸ発現の媒介に使用される発現カセットを示す図である。
【図２５（ａ）】ＲＮＡゲノムの自己切断を回避するための分割イントロン戦略を示す略図である。
【図２５（ｂ）】分割イントロン戦略で使用される発現カセットを示す図である。
【図２６】ＲＮＡゲノムの自己切断を回避するための２重ヘアピン戦略を示す略図である。
【表４】
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2005512598.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005512598.tif 000012
【図６】
2005512598.tif 000013
【図７】
2005512598.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2005512598.tif 000017
【図１１】
2005512598.tif 000018
【図１２】
2005512598.tif 000019
【図１３】
2005512598.tif 000020
【図１４】
2005512598.tif 000021
【図１５】
2005512598.tif 000022
【図１６】
2005512598.tif 000023
【図１７】
2005512598.tif 000024
【図１８】
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【図１９】
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【図２０（ａ）−（ｃ）】
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【図２１（ａ）】
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【図２１（ｂ）】
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【図２２】
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【図２３（ａ）】
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【図２３（ｂ）】
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【図２４（ａ）】
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【図２４（ｂ）】
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【図２５（ａ）】
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【図２５（ｂ）】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月10日(2003.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のヌクレオチド（ＮＯＩ）を含む非霊長類レンチウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項２】
前記ＮＯＩが、治療用タンパク質又はアプタザイムをコードし、且つ発現することができる、或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非霊長類レンチウイルス発現ベクターが、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、又はＭＶＶに由来する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＯＩ又はアプタザイムを含むレンチウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含み、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができるトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項５】
前記レンチウイルス発現ベクターが、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＭＶＶ、又はＨＩＶに由来する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発現ベクターを生体内（in vivo）又は生体外（ex vivo）で導入する請求項１から５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、子宮内細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、周産期細胞である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、胚細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、胎児細胞である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、生殖細胞系列の変化を生じさせることができる請求項１から１０のいずれか記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、生殖細胞である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、配偶子形成に関与する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、卵母細胞、卵管細胞、卵巣細胞、卵子、卵原細胞、接合体、ＥＳ細胞、胚盤細胞、精母細胞、精細胞、精子、又は精原細胞である請求項１１から１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
前記レンチウイルス発現ベクターを胚盤葉、臍帯、胎盤、羊水、子宮、又は生殖腺を介して、或いは腹腔内、筋肉内、脊髄内、頭蓋内、静脈内、呼吸器内、胃腸、又は肝内投与によって前記細胞に導入する請求項１から１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
前記レンチウイルス発現ベクターを胚盤葉、臍帯、胎盤、又は羊水を介して、或いは腹腔内、筋肉内、脊髄内、頭蓋内、静脈内、呼吸器内、胃腸、又は肝内投与によって子宮内細胞に導入する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＮＯＩを含むレンチウイルス発現ベクターを非分裂細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項１８】
前記レンチウイルス発現ベクターが、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＭＶＶ、又はＨＩＶに由来する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＮＯＩが、タンパク質又はアプタザイムをコードし、且つ発現することができる、或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができる請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、生殖細胞系列の変化を生じさせることができる請求項１７から１９のいずれか記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、生殖細胞である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、配偶子形成に関与する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、卵母細胞である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、動物又は酵母に由来する請求項１から２３のいずれか記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、非ヒト生物に由来する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、哺乳動物細胞である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、マウス、ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、ウマ、鳥類、昆虫、爬虫類、又は魚類の細胞である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）又はキイロショウジョウバエに由来する請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記レンチウイルス発現ベクターが偽型である請求項１から２８のいずれか記載の方法。
【請求項３０】
前記レンチウイルス発現ベクターがいかなる機能性アクセサリー遺伝子も含まない請求項１から２９のいずれか記載の方法。
【請求項３１】
ＮＯＩが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は誘導性プロモーターに機能できる形で結合されている請求項１から３０のいずれか記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれか記載の方法によって作製したトランスジェニック細胞。
【請求項３３】
請求項３２に記載のトランスジェニック細胞から、又は請求項１から３１のいずれか一項で定義した方法から生成することによって生じる、又は得ることができるトランスジェニック生物。
【請求項３４】
前記ＮＯＩが、卵管細胞、生殖路細胞、（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、又はこれらのいずれかの前駆細胞を含む）造血細胞、分泌細胞、乳腺細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、間質細胞、星状膠細胞、又はグリア細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロン、線維芽細胞、肝細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、心臓細胞、又は肺細胞中に発現される請求項３３に記載のトランスジェニック生物。
【請求項３５】
前記生物が、鳥類である請求項３３又は３４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項３６】
前記生物が、ニワトリ、アヒル、又はガチョウなどの家禽である請求項３５に記載のトランスジェニック生物。
【請求項３７】
請求項３３から３６のいずれか記載のトランスジェニック生物由来のトランスジェニック卵。
【請求項３８】
タンパク質をコードし、且つ発現することができる少なくとも１個のＮＯＩを含む請求項のいずれか記載のトランスジェニック生物又は卵。
【請求項３９】
さらに、アプタザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができる少なくとも１個のＮＯＩを含む請求項３８に記載のトランスジェニック生物又は卵。
【請求項４０】
第１核酸配列を含むベクターであって、前記第１核酸配列が  （ａ）アプタザイムをコードする第２核酸配列、及び  （ｂ）ポリヌクレオチドを生成することができる第３核酸配列を含み、  （ａ）及び（ｂ）は機能できる形で結合し、且つ前記ポリヌクレオチドが生じるように前記第１核酸配列の転写物を切断すべく前記アプタザイムを活性化することができるベクター。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドが、標的遺伝子の発現を調節することができるＲＮＡ分子である請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
前記ＲＮＡ分子が、アプタザイム、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選択される請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
第１核酸配列を含むベクターであって、前記第１核酸配列が  （ａ）アプタザイムをコードする第２核酸配列、及び  （ｂ）ＮＯＩを含む第３核酸配列を含み、  （ａ）及び（ｂ）は機能できる形で結合し、且つ前記ＮＯＩの発現が阻害されるように第１核酸配列の転写物を切断すべく前記アプタザイムを活性化することができるベクター。
【請求項４４】
前記第３核酸配列の転写物内の位置で前記第１核酸配列の転写物を切断すべく前記アプタザイムを活性化することができる請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
ＮＯＩが、治療用タンパク質をコードする請求項４３又は４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記アプタザイムが、リガンドによって活性化される請求項４０から４５のいずれか記載のベクター。
【請求項４７】
前記アプタザイムが、リガンドによって不活化される請求項４０から４５のいずれか記載のベクター。
【請求項４８】
前記ベクターが、請求項４６又は４７のリガンドをコードする第４核酸配列を含む請求項４６又は４７に記載のベクター。
【請求項４９】
前記リガンドをコードする前記核酸配列がプロモーターに機能できる形で結合されている請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
前記リガンドが、ポリペプチド及びその断片、線状ペプチド、環状ペプチド、及びそれらをコードする核酸、低分子量の有機又は無機の化合物及び抗体を含む、合成及び天然化合物からなる群から選択される請求項４６から４９に記載のベクター。
【請求項５１】
前記リガンドが、ＦＭＮ、ドキシサイクリン及びＶＥＧＦ、テトラサイクリン及びグルコースからなる群から選択される請求項４６から４９に記載のベクター。
【請求項５２】
（ａ）及び（ｂ）が、プロモーターに機能できる形で結合されている請求項４０から５１のいずれか記載のベクター。
【請求項５３】
前記プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター及びＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターからなる群から選択される請求項５２に記載のベクター。
【請求項５４】
前記第１核酸配列の転写がテトラサイクリンモジュレータ及びテトラサイクリン又はその誘導体によって調節されるように、前記プロモーターが少なくとも１コピーのテトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）に機能できる形で結合されている請求項５２に記載のベクター。
【請求項５５】
前記ベクターがテトラサイクリンモジュレータをコードする第５核酸配列を含む請求項５４に記載のベクター。
【請求項５６】
前記ウイルスＲＮＡゲノム内でヘアピンを形成して活性アプタザイムが形成されることを防止するために、前記アプタザイムの部分と塩基対を作りうる配列を前記プロモーターがその３’末端に含む請求項５２から５５のいずれか記載のベクター。
【請求項５７】
ウイルスベクターの形である請求項４０から５６のいずれか記載のベクター。
【請求項５８】
ウイルスＲＮＡゲノム内に活性アプタザイムが形成されることを防止するために、前記ベクターが分割イントロンベクターとして構成されている請求項５７に記載のベクター。
【請求項５９】
前記ベクター系が、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ベクター、ヘルペスベクター、ポックスウイルスベクター、パルボウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターに由来する請求項５７又は５８に記載のベクター。
【請求項６０】
請求項４０から５９のいずれか記載のベクターを使用するトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項６１】
請求項６０で定義したトランスジェニック細胞から生成することによって生じる、又は得ることができるトランスジェニック生物。
【請求項６２】
請求項４６から５９のいずれか記載のウイルスベクターを使用する請求項１から３１のいずれか記載の方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法によって作製したトランスジェニック細胞。
【請求項６４】
請求項６３に記載のトランスジェニック細胞から生成することによって生じる、又は得ることができるトランスジェニック生物。
【請求項６５】
ＮＯＩが、卵管細胞、生殖路細胞、アルブミン、（単球、マクロファージ、リンパ球、顆粒球、又はこれらのいずれかの前駆細胞を含む）造血細胞、分泌細胞、乳腺細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、間質細胞、又はグリア細胞、筋細胞、上皮細胞、ニューロン、線維芽細胞、肝細胞、星状膠細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、心臓細胞、又は肺細胞中に発現される請求項６４に記載のトランスジェニック生物。
【請求項６６】
治療用タンパク質をコードし、且つ発現することができる当該ヌクレオチド（ＮＯＩ）を含むウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項６７】
ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はグループＩイントロンを生成することができるアプタザイムを含むウイルス発現ベクターを細胞に導入するステップを含むトランスジェニック細胞の作製方法。
【請求項６８】
請求項６６又は６７に記載の方法によって作製したトランスジェニック細胞。
【請求項６９】
請求項６８に記載のトランスジェニック細胞、又は請求項６６若しくは６７で定義した方法から生成することによって生じる、又は得ることができるトランスジェニック生物。
【請求項７０】
請求項６９に記載のトランスジェニック生物由来のトランスジェニック卵。
【国際調査報告】
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