(57)【要約】ヒトＧ−ＣＳＦの配列と比べて、少なくとも１つのリシン残基が導入され、少なくとも１つのリシン残基が除去されているポリペプチドを含むＧ−ＣＳＦ活性を有し、２−６ポリエチレングリコール部分と結合しているポリペプチド結合体。この結合体は低いインビトロ生物活性、長いインビボ半減期、減少したレセプターによるクリアランスを有し、非結合組み換えヒトＧ−ＣＳＦよりも白血球および好中球の産生をさらに迅速に刺激する。
2005506317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチド結合体であって、配列番号１に示されるｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列に関して、または配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関して対応する位置において、Ｋ１６Ｒ／Ｑ、Ｋ３４Ｒ／ＱおよびＫ４０Ｒ／Ｑからなる群から選択される少なくとも一つの置換およびＴ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋからなる群から選択される少なくとも一つの置換を含むポリペプチドを含み、当該ポリペプチドの結合基に結合した約１０００〜１００００Ｄａの分子量を有する２〜６個のポリエチレングリコール部分を有する結合体。
【請求項２】
３、４または５個の前記置換を含む請求項１記載のポリペプチド結合体。
【請求項３】
さらに置換Ｈ１７０Ｋ、Ｈ１７０ＱまたはＨ１７０Ｒを含む請求項１または２記載のポリペプチド結合体。
【請求項４】
Ｑ７０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、  Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０ＫおよびＱ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋからなる群から選択される置換を含む請求項１〜３記載のポリペプチド結合体。
【請求項５】
Ｋ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ、Ｋ２３Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０ＲおよびＫ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒからなる群から選択される置換を含む請求項１〜４記載のポリペプチド結合体。
【請求項６】
置換Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒを含み、２３位にリシン残基を含む請求項５記載のポリペプチド結合体。
【請求項７】
前記置換が、配列番号１と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関して対応する位置にある請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項８】
前記置換が、配列番号１と少なくとも約９５％、たとえば少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関して対応する位置にある請求項７記載のポリペプチド結合体。
【請求項９】
ポリエチレングリコール部分が少なくとも一つのリシン残基および所望によりＮ−末端アミノ基とも結合している請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項１０】
配列番号１に示されるｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列に関して置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋを含むポリペプチドを含み、かつ当該ポリペプチドの結合基に結合した分子量約１０００〜１００００Ｄａの２〜６個のポリエチレングリコール部分を有する、請求項１記載のポリペプチド結合体。
【請求項１１】
Ｔ１３３でグリコシル化されている請求項１〜１０のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項１２】
３〜５、４〜６、３〜４、４〜５または５〜６個の結合したＰＥＧ部分を有する請求項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項１３】
分子量約５０００〜６０００Ｄａの３〜６、たとえば４〜５個のポリエチレングリコール部分が結合している、請求項１２記載のポリペプチド結合体。
【請求項１４】
約５ｋＤａの４個のＰＥＧ部分が結合している請求項１３記載のポリペプチド結合体。
【請求項１５】
約５ｋＤａの５個のＰＥＧ部分が結合している請求項１３記載のポリペプチド結合体。
【請求項１６】
本明細書に記載するルシフェラーゼアッセイにより測定すると非結合ｈＧ−ＣＳＦの生物活性の約２〜３０％の範囲のインビトロ生物活性を有する請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチド結合体。
【請求項１７】
配列番号１に示されるｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列と少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、かつポリペプチドの結合基に結合した少なくとも一つの非ポリペプチド部分を有し、本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにより測定すると非結合ｈＧ−ＣＳＦの生物活性の約２〜３０％の範囲であるインビトロ生物活性を有する、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチド結合体。
【請求項１８】
アミノ酸位置１１〜４１（へリックスＡ）、７１〜９５（へリックスＢ）、１０２〜１２５（へリックスＣ）、および１４５〜１７０（へリックスＤ）から選択されるアミノ酸残基において、配列番号１と比較して、少なくとも一つのアミノ酸変更を含む請求項１７記載のポリペプチド結合体。
【請求項１９】
ポリペプチドの結合基に結合した約１０００〜１００００Ｄａの分子量の２〜６ポリエチレングリコール部分を含む請求項１７または１８記載のポリペプチド結合体。
【請求項２０】
減少したレセプター性クリアランスを有する、および／またはｈＧ−ＣＳＦと比較して好中球減少の期間を減少させるＧ−ＣＳＦ結合体を調製する方法であって、配列番号１に示すｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列と少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを調製し、かつ少なくとも一つの非ポリペプチド部分を前記ポリペプチドの結合基と結合させることを含み、その結果、本明細書に記載されるルシフェラーゼアッセイにより測定すると非結合ｈＧ−ＣＳＦの生物活性の約２〜３０％の範囲であるインビトロ生物活性を有する結合体が得られる調製法。
【請求項２１】
配列番号１のアミノ酸配列に関してアミノ酸位置１１〜４１（へリックスＡ）、７１〜９１（へリックスＢ）、１０２〜１２５（へリックスＣ）、および１４５〜１７０（へリックスＤ）から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基の変更、典型的には置換、および少なくとも一つの変更アミノ酸残基への少なくとも一つの非ポリペプチド部分の結合により所望のインビトロ生物活性が得られる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれかに記載のポリペプチド結合体および少なくとも一つの医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項２３】
不十分な好中球レベルに苦しむ哺乳動物を治療する方法であって、これを必要とする哺乳動物に治療上有効量の請求項１〜１９のいずれかに記載のポリペプチド結合体または請求項２２記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれかに記載のポリペプチド結合体の医薬としての使用。
【請求項２５】
不十分な好中球レベルを処置するための医薬組成物を調製するための、請求項１〜１９のいずれかに記載のポリペプチド結合体の使用。
【請求項２６】
医薬組成物が化学療法または放射線療法、あるいはＨＩＶまたは別のウイルス感染症による好中球減少症の予防および／または処置用である、請求項２５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は顆粒球コロニー形成促進因子（Ｇ−ＣＦＧ）活性を示す新規ポリペプチド、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドと非ポリペプチド部分間の結合体、かかるポリペプチドまたは結合体の調製法およびかかるポリペプチドまたは結合体の治療、特に好中球減少症または白血球減少症の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球が増殖し、分割し、分化して骨髄になるプロセスは造血と呼ばれる（Dexter and Spooncer, Ann. Rev. Cell. Biol., 3:423, 1987）。血液細胞のタイプのそれぞれは多能性幹細胞から生じる。インビボで生じる血液細胞には一般に３つの種類：赤血球、血小板および白血球があり、後者のほとんどは宿主免疫防御に関与する。造血前駆体細胞の増殖および分化は、Ｇ−ＣＳＦおよびインターロイキンなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）を含むサイトカインの１種により調節される（Arai et al., Ann. Rev. Biochem., 59:783-836, 1990）。インビボのＧ−ＣＳＦの主な生物学的効果は、好中顆粒球または好中球と呼ばれるある種の白血球の増殖および発生を刺激することである（Welte et al., PNAS-USA 82:1526-1530, 1985, Souza et al., Science, 232:61-65, 1986）。血流中に放出されると、好中顆粒球は細菌および他の感染症と戦う働きをする。
【０００３】
ヒトＧ−ＣＳＦ（ｈＧ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列は、Nagata et al. Nature 319:415-418, 1986により報告されている。ｈＧ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦ分子および２レセプターとの２：２複合体の形成によりＧ−ＣＳＦレセプターを二量化するモノマータンパク質である（Horan et al. (1996), Biochemistry 35(15): 4886-96）。Aritomi et al. Nature 401:713-717, 1999は、ｈＧ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦレセプターのＢＮ−ＢＣドメイン間の複合体のＸ線構造を記載している。次のｈＧ−ＣＳＦ残基がレセプター結合界面の一部として同定された：Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｌ１５、Ｋ１６、Ｅ１９、Ｑ２０、Ｌ１０８、Ｄ１０９、Ｄ１１２、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｑ１１９、Ｅ１２２、Ｅ１２３、およびＬ１２４。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および哺乳動物細胞におけるｒｈＧ−ＣＳＦの発現が報告されている(Souza et al., Science 232:61-65, 1986, Nagata et al., Nature 319: 415418, 1986, Robinson and Wittrup, Biotechnol. Prog. 11:171-177, 1985)。
【０００４】
白血球減少症（白血球の量が減少）および好中球減少症（好中球の量が減少）は、様々なタイプの感染症に対する感受性が増大する疾患である。好中球減少症は、たとえばＨＩＶに感染した患者において慢性であり、あるいはたとえば化学療法または放射線療法を受けている癌患者においては急性であり得る。化学療法の結果として、重度の好中球減少症にかかっている患者にとっては、比較的軽い感染症でさえも重大で、生命をおびやかす場合もあり得る。組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）は一般に様々な形態の白血球減少症／好中球減少症を治療するために用いられる。従って、ｒｈＧ−ＣＳＦの商業的製剤は、ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｇｒａｎ（登録商標）およびＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））、ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍ（Ｎｅｕｔｒｏｇｉｎ（登録商標）およびＧｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標））およびｎａｒｔｏｇｒａｓｔｉｍ（Ｎｅｕ−ｕｐ（登録商標））の名前で入手可能である。Ｇｒａｎ（登録商標）およびＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）はグリコシル化されておらず、組み換えイー・コリ細胞において産生される。Ｎｅｕｔｒｏｇｉｎ（登録商標）およびＧｒａｎｏｃｙｔｅはグリコシル化され、組み換えＣＨＯ細胞において産生され、Ｎｅｕ−ｕｐはグリコシル化されず、組み換えイー・コリ細胞において産生される無傷ｒｈＧ−ＣＳＦのＮ−末端領域で５のアミノ酸置換を有する。
【０００５】
ｈＧ−ＣＳＦの様々なタンパク質操作された変異体が報告されている（ＵＳ５，５８１，４７６、ＵＳ５，２１４，１３２、ＵＳ５，３６２，８５３、ＵＳ４，９０４，５８４およびRiedhaar-Olson et al. Biochemistry 35: 90349041, 1996）。本来のポリペプチドと比較して、少なくとも一つのさらなる炭水化物鎖を導入するためのｈＧ−ＣＳＦおよび他のポリペプチドの修飾が提案されている（ＵＳ５，２１８，０９２）。ポリペプチドのアミノ酸配列は、追加の炭水化物鎖の付加を行うためのアミノ酸置換、アミノ酸欠失またはアミノ酸挿入により修飾することができるといわれている。加えて、ＰＥＧ基の結合を包含する本来のｈＧ−ＣＳＦのポリマー修飾が報告されている（Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and Function 17:157-160, 1992、ＵＳ５，８２４，７７８、ＵＳ５，８２４，７８４、ＷＯ９６／１１９５３、ＷＯ９５／２１６２９、ＷＯ９４／２００６９、ＥＰ０６１２８４６  Ａ１、ＷＯ０１／０００１１）。
【０００６】
Bowen et al., Experimental Hematology 27 (1999), 425-432は、分子量とＰＥＧ結合Ｇ−ＣＳＦムテインの活性期間の間の関係の研究を開示している。タンパク質に結合したＰＥＧ部分の分子量とインビトロ活性の間の明らかな反比例の関係が示唆され、一方、インビボ活性は分子量が増大するにつれ増大した。レセプターによるエンドサイトーシスは造血成長因子のレベルを調節する重要なメカニズムであるので、結合体の低い親和力は、半減期を増大させる働きをすることが予想される。
【０００７】
商業的に入手可能なｒｈＧ−ＣＳＦは薬理学的効果が短期間であり、したがって白血球減少状態の期間中１日に１回投与しなければならない。さらに長い循環半減期を有する分子は、白血球減少症を緩和し、その結果としての感染症を予防するために必要な投与回数を減少させる。現在利用可能なｒＧ−ＣＳＦ製品についてのもう一つのより重大な問題は、患者がＧ−ＣＳＦの投与後であっても化学療法後に白血球減少症になることである。これらの患者にとって、重篤な感染症の危険性を最小限に抑えるために、できるだけ好中球減少の期間および程度を減少できることは重要である。さらなる問題は、用量依存性骨痛が起こることである。骨痛は、ｒＧ−ＣＳＦでの治療の重大な副作用として患者が経験するので、この効果を本質的に有さない製品または骨痛をおこさない程度の少量で有効である製品のいずれかにより、骨痛を引き起こさないｒＧ−ＣＳＦ製品を提供することが望ましい。
【０００８】
半減期に関して、タンパク質の循環半減期を増大させる一方法は、特に腎臓クリアランスおよびレセプター性クリアランスによりタンパク質のクリアランスを確実に減少させることである。これは、見かけの大きさを増大させることができ、これにより腎臓クリアランスを減少させ、インビボ半減期を増大させることができる化学部分とタンパク質を結合させることにより達成することができる。さらに、化学部分のタンパク質との結合は、タンパク分解酵素がタンパクと物理的接触するのを有効にブロックし、従って非特異的タンパク加水分解による分解を防止する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は治療的タンパク質製品の調製において用いられるこのような化学的部分の一つである。最近、１つのＮ−末端結合した２０ｋＤａＰＥＧ基をで修飾されたＧ−ＣＳＦ分子（Ｎｅｕｌａｓｔａ）がアメリカ合衆国において販売を承認された。このＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子は、非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦと比較して、増大した半減期を有することが証明され、従って現行のＧ−ＣＳＦ製品ほどしばしば投与しなくてよいが、非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦと比較して著しく白血球減少症の期間を減少させない。従って、実質的に公知Ｇ−ＣＳＦ分子の改良の余地がまだある。
【０００９】
従って、白血球減少症／好中球減少症の治療において有用であり、例えば増大した半減期および特に好中球減少症の期間の減少の点で改良されたＧ−ＣＳＦ活性を示す新規分子を提供する必要性がある。本発明はこのような分子に関する。
【００１０】
【特許文献１】
米国特許第５，５８１，４７６号
【特許文献２】
米国特許第５，２１４，１３２号
【特許文献３】
米国特許第５，３６２，８５３号
【特許文献４】
米国特許第４，９０４，５８４号
【特許文献５】
米国特許第５，２１８，０９２号
【特許文献６】
米国特許第５，８２４，７７８号
【特許文献７】
米国特許第５，８２４，７８４号
【特許文献８】
ＷＯ９６／１１９５３
【特許文献９】
ＷＯ９５／２１６２９
【特許文献１０】
ＷＯ９４／２００６９
【特許文献１１】
ＥＰ０６１２８４６  Ａ１、
【特許文献１２】
ＷＯ０１／０００１１
【非特許文献１】
Dexter and Spooncer, Ann. Rev. Cell. Biol., 3:423, 1987
【非特許文献２】
Arai et al., Ann. Rev. Biochem., 59:783-836, 1990
【非特許文献３】
Welte et al., PNAS-USA 82:1526-1530, 1985
【非特許文献４】
Souza et al., Science, 232:61-65, 1986
【非特許文献５】
Nagata et al. Nature 319:415-418, 1986
【非特許文献６】
Horan et al. (1996), Biochemistry 35(15): 4886-96
【非特許文献７】
Aritomi et al. Nature 401:713-717, 1999
【非特許文献８】
Robinson and Wittrup, Biotechnol. Prog. 11:171-177, 1985
【非特許文献９】
Riedhaar-Olson et al. Biochemistry 35: 90349041, 1996
【非特許文献１０】
Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and Function 17:157-160, 1992
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドおよび非ポリペプチド部分を含む特定の結合体、その調製法ならびにその医療および医薬の調製における使用に関する。従って、第一の態様において、本発明はＧ−ＣＳＦ活性を示し、配列番号１において示すようなヒトＧ−ＣＳＦの公知アミノ酸配列と非ポリペプチド部分の結合基を含む少なくとも一つの特定の変更されたアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、かつポリペプチドの結合基と結合した少なくとも一つの非ポリペプチド部分を有する、様々な特性の結合体に関する。これらの結合体は、インビボ半減期の増加に加えて、非複合ｈＧ−ＣＳＦと比べてインビトロ生物活性が実質的に減少し、この結果、驚くべきことにさらに迅速に好中球が回復されることが証明された。
【００１２】
さらにもう一つの態様において、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ活性を示し、本発明の結合体の一部を形成するポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、治療、診断または他の目的に有用であるが、本発明の結合体の調製用中間体製品として特に興味深い。
さらにもう一つの態様において、本発明はＧ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドを含むポリペプチド結合体に関し、これは、ｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列（配列番号１に示すアミノ酸配列を有する）と、非ポリペプチド部分の結合基を含む導入された、または除去されたアミノ酸から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列、および公知組み換えＧ−ＣＳＦ産物と比較して、増大した半減期および／またはさらに迅速な好中球回復を有する結合体を提供するために十分な数および種類の非ポリペプチド部分を含む。
【００１３】
特定の態様において、本発明は置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５Ｋ、およびＳ１５９Ｋ、および任意にＨ１７０の位置、たとえば、配列番号１に示すｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列に関してＲ、ＫまたはＱ、あるいは配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関して対応する位置に置換を有し、ポリペプチドの１以上の結合基に結合した約１０００〜１００００Ｄａの分子量を有する２〜６、典型的には３〜６個のポリエチレングリコールを有するポリペプチドを含む、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチド結合体に関する。これらの置換が配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列に関連する場合、配列同一性の程度は、典型的には少なくとも約９０％または９５％、例えば少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％である。
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列、かかるヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびかかるヌクレオチド配列または発現ベクターを含む宿主細胞を含む本発明の結合体の調製法に関する。
最後の態様において、本発明は、本発明の結合体またはポリペプチドを含む組成物、医薬組成物の調製法、本発明の結合体または組成物の医薬としての使用、およびかかる組成物で哺乳動物を治療する方法に関する。特に、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、ある種の放射線治療、化学療法、および骨髄移植を受けている癌患者において感染を予防するため、末梢血先祖細胞移植において採集のために先祖細胞を移動させるため、重い慢性または相対的白血球減少症（原因に関係なく）の治療のため、および急性骨髄性白血病の患者の治療をサポートするために用いることができる。加えて、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患ならびに細菌感染症の治療のために用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
定義
本出願および本発明に関して、次の定義を適用する：
「結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」なる用語は、１以上のポリペプチド、典型的には単一のポリペプチドの、１以上の非ポリペプチド部分、特にポリマー分子との共有結合により形成される異種分子を示す。加えて、結合体は、１以上の炭水化物部分と、特にＮ−またはＯ−グリコシル化により結合させることができる。共有結合なる用語は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分が、互いに直接共有結合するか、またはそうでなければ、ブリッジ、スペーサー、またはリンケージ部分などの介在する部分を介して互いに間接的に共有結合することを意味する。好ましくは、結合体は関連する濃度および条件で可溶性である。すなわち、血液などの生理学的液体中に可溶性である。「非結合ポリペプチド」なる用語は、結合体のポリペプチド部分について用いることができる。
「ポリペプチド」なる用語は、本発明においては「タンパク質」なる用語と交換可能に用いられる。
【００１５】
「ポリマー分子」とは、２以上のモノマーの共有結合により形成される分子であり、ここにおいて、ポリマーがヒトアルブミンまたは別の豊富な結晶タンパク質である場合を除いて、モノマーのいずれもアミノ酸残基ではない。「ポリマー」なる用語は、「ポリマー分子」なる用語と交換可能に用いることができる。この用語は、炭水化物分子を網羅することを意図されるが、通常、この用語はインビボＮ−またはＯ−グリコシル化（以下にさらに詳細に記載する）によりポリペプチドと結合する種類の炭水化物は、本発明においては「オリゴサッカライド部分」と呼ばれるので、このような分子は包含しない。ポリマー分子の数が明らかに表示されている場合を除いて、本発明のポリペプチドに含まれるか、または他の方法で本発明において用いられる「ポリマー」、「ポリマー分子」なる用語は、１以上のポリマー分子を意味する。
【００１６】
「結合基」なる用語は、関連する非ポリペプチド部分と結合できるポリペプチドのアミノ酸残基を示すことを意図する。例えば、特にＰＥＧとのポリマー結合について、しばしば用いられる結合基は、リシンのε−アミノ基またはＮ−末端アミノ基である。他のポリマー結合基は、遊離カルボン酸基（例えば、Ｃ−末端アミノ酸残基のもの、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のもの）、適当に活性化されたカルボニル基、酸化炭水化物部分およびメルカプト基を包含する。有用な結合基はおよびその適合する非ペプチド部分は以下の表から明らかである。
【００１７】
【表１】
2005506317.tif 000003
【００１８】
インビボＮ−グリコシル化について、「結合基」なる用語は、Ｎ−グリコシル化部位（配列Ｎ−Ｘ’−Ｓ／Ｔ／Ｃ−Ｘ”（ここにおいて、Ｘ’はプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｘ”はＸ’と同一であっても、なくてもよく、好ましくはプロリンと異なる任意のアミノ酸残基であり、Ｎはアスパラギンであり、Ｓ／Ｔ／Ｃは、セリン、スレオニンまたはシステインのいずれかであり、好ましくはセリンまたはスレオニンであり、最も好ましくはスレオニンである）を有する）を構成するアミノ酸残基を示すために通常でない方法で用いられる。Ｎ−グリコシル化部位のアスパラギン残基は、オリゴサッカライド部分がグリコシル化中に結合する場所であるが、このような結合は、Ｎ−グリコシル化部位の他のアミノ酸残基が存在しなければ達成できない。従って、非ペプチド部分がオリゴサッカライド部分であり、結合がＮ−グリコシル化により達成される場合、関心のあるポリペプチドのアミノ酸配列の変更に関連して用いられる「非ペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基」なる用語は、Ｎ−グリコシル化部位を構成する１以上のアミノ酸残基が、機能的Ｎ−グリコシル化部位がアミノ酸配列中に導入されるか、または前記配列から除去されるかのいずれかになるように変更されるという意味と理解される。
【００１９】
本出願において、アミノ酸名および原子名（例えば、ＣＡ、ＣＢ、ＮＺ、Ｎ、Ｏ、Ｃなど）は、ＩＵＰＡＣ命名法(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atom names etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984) together with their corrections in Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985))に基づくＰｒｏｔｅｉｎ  ＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）(www.pdb.org)により定義されているように使用される。「アミノ酸残基」なる用語は、天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸、特に２０の天然に存在するアミノ酸、すなわち、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ）残基からなる群に含まれるアミノ酸残基を意味する。
【００２０】
アミノ酸位置／置換の識別に用いられる用語を以下に示す：Ｆ１３は参照アミノ酸配列におけるフェニルアラニン残基により占有される位置番号１３を示す。Ｆ１３Ｋは１３位のフェニルアラニン残基がリシン残基で置換されていることを示す。特に明記しない限り、本明細書において行われるアミノ酸残基のナンバリングは、配列番号１に示すｈＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列に対して行われる。二者択一の置換は、「／」で示される。例えば、Ｑ６７Ｄ／Ｅは６７位のグルタミンがアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されているアミノ酸配列を意味する。複数の置換は、「＋」で示す。たとえば、Ｓ５３Ｎ＋Ｇ５５Ｓ／Ｔは、５３位のセリン残基がアスパラギン残基で置換され、５５位のグリシン残基がセリンまたはスレオニン残基で置換されているアミノ酸配列を意味する。
【００２１】
「ヌクレオチド配列」なる用語は、２以上のヌクレオチド分子の連続した鎖を示すことを意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成または合成起源、あるいはその組み合わせのものであってよい。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」なる用語は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたインビトロでの所望のヌクレオチド配列の増幅のための周知の方法を意味する。
「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養」は本明細書中、互換的に用いられ、かかる用語はある細胞の成長または培養の結果得られる子孫を包含すると理解される。「形質転換」および「トランスフェクション」は、互換的に用いられ、ＤＮＡを細胞中に導入するプロセスを意味する。
【００２２】
「作動可能に結合」とは、酵素結紮または他の方法による、配列の通常の機能を行うことができるような互いの配置での２以上のヌクレオチド配列の共有結合を意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーをエンコードするヌクレオチド配列は、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパクとして発現されるならば、ポリペプチドのヌクレオチド配列と作動可能に結合し：プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響するならば、コーディング配列と作動可能に結合しており；リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するような位置にあるならば、コーディング配列と作動可能に結合している。一般に、「作動可能に結合した」とは、結合しているヌクレオチド配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合には、隣接し且つ読み取り枠内にある。結合は都合の良い制限部位での結紮により達成される。もしそのような部位が存在しない場合、標準的組み換えＤＮＡ法に関連して、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００２３】
「導入する」なる用語は、非ポリペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基を、特に存在するアミノ酸残基の置換、あるいは追加のアミノ酸残基の挿入により導入することを意味する。「除去する」なる用語は、非ポリペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基を、特に除去されるアミノ酸残基をもう一つのアミノ酸残基で置換するか、あるいは除去されるアミノ酸残基の欠失（置換しないで）により除去することを意味する。
親ポリペプチドに関連して置換が行われる場合、これらは好ましくは「保存的置換」、言い換えれば、類似した特性を有するアミノ酸、たとえば小アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸および芳香族アミノ酸のグループ内で行われる置換である。
【００２４】
本発明において好ましい置換は、特に以下の表に列挙する保存的置換基から選択することができる。
保存的置換基：
【表２】
2005506317.tif 000004
【００２５】
本発明において所定の物質に関連して用いられる「免疫原性」なる用語は、免疫系から反応を誘発する該物質の能力を示すことを意図される。免疫反応は、細胞または抗体による反応である（例えば、免疫原性についてのさらなる定義に関しては、Roitt: Essential Immunology (8th Edition, Blackwell)参照）。通常、抗体反応性の低下は、免疫原性の低下を意味する。免疫原性の低下は、当該分野において公知の適当な方法を使用することにより、例えばインビボまたはインビトロで決定することができる。
【００２６】
「機能的インビボ半減期」なる用語は、その通常の意味において用いられ、すなわち、ポリペプチドまたは結合体の生物学的活性の５０％が体内／標的器官内に依然として存在する時間、またはポリペプチドまたは結合体の活性が初めの値の５０％である時間である。機能的インビボ半減期を決定するための別法として、「血清半減期」、すなわち、ポリペプチドまたは結合体分子の５０％が一掃される前に血漿または血流中に循環する時間を決定することができる。血清半減期の別の用語としては、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」が挙げられる。ポリペプチドまたは結合体は、１以上の細網内皮系（ＲＥＳ）、腎臓、脾臓または肝臓の作用によるか、レセプター性分解によるか、または特異的または非特異的タンパク質分解により、特にレセプター性クリアランスおよび腎臓クリアランスの作用により一掃される。通常、クリアランスは、タンパク質の細胞レセプターのサイズ（糸球体濾過のカットオフに対して）、電荷、結合する炭水化物鎖、および存在によって変わる。保持される機能性は、通常、増殖性またはレセプター結合活性から選択される。機能的インビボ半減期および血清半減期は、以下の物質および方法のセクションにおいてさらに議論するような当該分野において公知の適当な方法により決定することができる。
【００２７】
機能的インビボ半減期または血清半減期について用いられる場合、「増大した」なる用語は、結合体またはポリペプチドの関連する半減期が、類似の条件下で決定される参照分子、たとえば非結合ｈＧ−ＣＳＦ（例えば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）の半減期に対して統計的に有意に増大することを意味するために用いられる。例えば、関連する半減期は、少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約１００％、２００％、５００％または１０００％増大し得る。
【００２８】
「腎臓クリアランス」なる用語は、腎臓、例えば糸球体濾過、尿細管排出または尿細管放出により行われるクリアランスを意味するその通常の意味において用いられる。腎臓クリアランスは、大きさ（直径）、対称性、形状／堅さおよび電荷を包含する結合体の物理的特徴に依存する。低下した腎臓クリアランスは、任意の適当な分析法、例えば確立されたインビボアッセイにより確立することができる。典型的には、腎臓クリアランスは、標識された（例えば放射性または蛍光標識された）ポリペプチド結合体を患者に投与し、患者から集めた尿中の標識活性を測定することにより決定される。低下した腎臓クリアランスは、対応する参照ポリペプチド、例えば対応する非結合ポリペプチド、非結合の対応する野生型ポリペプチドまたは別の結合ポリペプチド（例えば、本発明によらない結合ポリペプチド）に対して類似の条件下で決定される。好ましくは、結合体の腎臓クリアランス速度は、関連する参照ポリペプチドと比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％減少する。
【００２９】
一般に、レセプターの活性化は、レセプターによるクリアランス（ＲＭＣ）とカップリングし、したがってポリペプチドのそのレセプターとの活性化を伴わない結合はＲＭＣに至らず、一方、レセプターの活性化は、ＲＭＣに至る。クリアランスは、その後にリソソーム分解を伴うレセプター結合ポリペプチドの内在化のためである。低下したＲＭＣは、最適のインビボ生物学的反応を得、かかる反応を得るために必要である以上のレセプターの活性化を回避するために十分な数のレセプターと結合し、活性化できるように結合体をデザインすることにより達成することができる。これは、インビトロ生物活性の低下および／またはオフ速度の増大に反映される。好ましい具体例において、本発明の結合体は、非結合ｈＧ−ＣＳＦと比べて実質的に減少したインビトロ生物活性を有する。
【００３０】
典型的には、減少したインビトロ生物活性は、減少した効力／有効性および／または減少した潜在性を反映し、これらの性質を決定するための任意の適当な方法により決定することができる。例えば、インビトロ生物活性は、ルシフェラーゼベースのアッセイ（「一次アッセイ２」、物質および方法参照）において決定することができる。インビトロ生物活性を決定するためのもう一つの方法は、物質および方法のセクションに記載されている細胞ベースのアッセイ（「二次アッセイ」）を用いて本発明の結合体の結合親和力を決定することである。
【００３１】
ｈＧ−ＣＳＦ（配列番号１）の活性と比較して比較的低いインビトロ生物活性は、血漿半減期が長いことおよび好中球の刺激の程度が高いという点において有利である。驚くべきことに、低いインビトロ生物活性を有する本発明のＧ−ＣＳＦ結合体を投与した結果、好中球の回復が速くなる。すなわち、好中球数の通常レベルへの回復が、ｈＧ−ＣＳＦの投与よりも速い。例えば化学療法または放射線療法のために好中球レベルが低下した患者において、好中球減少の期間をできるだけ減少させることができることが重要であるので、これは重要な発見である。従って、好ましい具体例において、本発明の結合体のインビトロ生物活性は、本明細書において記載されるルシフェラーゼアッセイにより、あるいは別法として細胞ベースのレセプター結合親和力アッセイ（「二次アッセイ」）を用いて測定すると、ｈＧ−ＣＳＦの生物活性の約２〜３０％、好ましくは約３〜２５％の範囲である（ここにおいて、参照ポリペプチドとして用いられるｈＧ−ＣＳＦは、所望によりＮ−末端メチオニン残基を有していてもよい配列番号１を有し；参照ｈＧ−ＣＳＦは特にＮｅｕｐｏｇｅｎ、すなわち、非グリコシル化Ｍｅｔ−ｈＧ−ＣＳＦである）。結合体のインビトロ生物活性は、従って、類似の条件で測定すると、ｈＧ−ＣＳＦのインビトロ生物活性と比べて、好ましくは少なくとも約７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％または８５％減少する。違った表現をすると、結合体は野生型ポリペプチドの約２％、典型的には少なくとも約３％、例えば少なくとも約４％または５％程度の低いインビトロ生物活性を有する。例えば、インビトロ生物活性は、類似の条件下で測定したｈＧ−ＣＳＦのインビトロ生物活性の約４〜２０％の範囲である。レセプターによるクリアランスを減少させるために減少したインビトロ生物活性が望ましい場合において、所望のレセプター活性化を得るために十分な生物活性をそれでも維持しなければならないことは明らかであり、このために生物活性はｈＧ−ＣＳＦの少なくとも約２％、好ましくは前記よりも若干高めであるべきである。
【００３２】
Ｇ−ＣＳＦのへリックス領域、すなわち、アミノ酸位置１１〜４１（へリックスＡ）、７１〜９５（へリックスＢ）、１０２〜１２５（へリックスＣ）、および１４５〜１７０（へリックスＤ）（配列番号１と比較）から選択されるアミノ酸における変更、特に置換の結果、レセプターによるクリアランスが減少し、したがって結果として得られるポリペプチドがポリエチレングリコールと結合する場合にインビボ半減期が増大する。半減期がさらに長いことに加えて、かかるポリペプチド結合体の投与は、白血球および好中球の産生を、商業的に入手可能なＧ−ＣＳＦ製品ＮｅｕｐｏｇｅｎおよびＮｅｕｌａｓｔａと同じ程度、またはさらに高い程度まで刺激することができる。インビトロ生物活性が減少したＧ−ＣＳＦ結合体は、従って、Ｇ−ＣＳＦのへリックス領域における１以上のアミノ酸残基を変更、典型的には置換し、結果として得られるポリペプチドを１以上の非ポリペプチド部分、例えばポリエチレングリコールと結合させることにより調製することができる。
【００３３】
好ましくは、ポリペプチド結合体とそのレセプター間のオフ速度は、レセプター−リガンド複合体の実質的な内在化が起こる前に、そのレセプターからのポリペプチド結合体が放出される程度に増大する。レセプター−ポリペプチド結合親和力は、本明細書の物質および方法のセクションにおいて記載されているように決定することができる。オフ速度は、物質および方法のセクションにおいて記載されているようなＢｉａｃｏｒｅ技術を用いて決定することができる。インビトロＲＭＣはポリペプチド結合体を標識し（例えば、放射性または蛍光標識）、ポリペプチドのレセプターを含む細胞を刺激し、細胞を洗浄し、標識活性を測定することにより決定することができる。別法として、関連するレセプターを発現する細胞に結合体を暴露することができる。適当なインキュベーション時間の後、上清を除去し、類似した細胞を含むウェルに移す。これらの細胞の上清に対する生物学的反応は非結合ポリペプチドまたは別の参照ペプチドに対して決定され、これは減少したＲＭＣはポリペプチド結合体の程度の尺度である。
【００３４】
通常、結合体の減少したインビトロ生物活性は、非ポリペプチド部分によるその修飾の結果として得られる。しかしながら、インビトロ生物活性をさらに減少させるために、あるいは他の理由から、結合体のポリペプチド部分をさらに修飾することは興味深い。例えば、一具体例において、ポリペプチドのレセプター結合部位またはその付近に位置する少なくとも一つのアミノ酸残基は、インビトロ生物活性を減少させるために、対応する野生型ポリペプチドと比較してもう一つ別のアミノ酸残基と置換することができる。置換により導入されるアミノ酸残基は、結合体のインビトロ生物活性を減少させることができる任意のアミノ酸残基である。都合の良いことには、導入されたアミノ酸残基は本明細書において定義される非ポリペプチド部分の結合基を含む。特に、非ポリペプチド部分がポリマー分子、例えばＰＥＧ分子である場合、導入されるアミノ酸残基はリシン残基である。
【００３５】
「Ｇ−ＣＳＦ活性を示す」なる用語は、ポリペプチドまたは結合体が、Ｇ−ＣＳＦレセプターと結合できることを含む本来のＧ−ＣＳＦ、特に配列番号１に示すアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦの１以上の機能を有することを意味する（Fukunaga et al., J. Bio. Chem, 265:14008, 1990）。Ｇ−ＣＳＦ活性は、後記の物質および方法のセクションに記載されている一次アッセイを用いて都合よく分析される。「Ｇ−ＣＳＦ活性を示す」ポリペプチドは、それが測定可能な機能、例えば測定可能な増殖活性またはレセプター結合活性、（例えば、物質および方法のセクションに記載されている一次アッセイにより測定される）を示す場合にかかる活性を有すると見なされる。Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドは実際にはＧ−ＣＳＦの変異体であるが、簡便のために「Ｇ−ＣＳＦ分子」とも呼ばれる。
【００３６】
「親Ｇ−ＣＳＦ」または「親ポリペプチド」なる用語は、本発明に従って修飾される分子を示すことを意図される。親Ｇ−ＣＳＦは通常ｈＧ−ＣＳＦまたはその変異体である。「変異体」は、親ポリペプチドと１以上のアミノ酸残基、通常１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基が異なるポリペプチドである。ｒｈＧ−ＣＳＦの例としては、ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（Ｇｒａｎ（登録商標）およびＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））、ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍ（Ｎｅｕｔｒｏｇｉｎ（登録商標）およびＧｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標））およびｎａｒｔｏｇｒａｓｔｉｍ（Ｎｅｕ−ｕｐ（登録商標））が挙げられる。
【００３７】
本発明の結合体
前記のように、第一の態様において、本発明はＧ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドを含む結合体であって、配列番号１のアミノ酸配列と、非ポリペプチド部分の結合基、および非ポリペプチドの結合基と結合した少なくとも一つの非ポリペプチド部分を含む特定の導入または除去されたアミノ酸残基から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列、およびポリペプチドの結合基に結合した少なくとも一つの非ポリペプチド部分を含むものに関する。導入および／または除去されるアミノ酸残基を次のセクションにおいてさらに詳細に記載する。結合体それ自身もＧ−ＣＳＦ活性を示すと理解される。
【００３８】
非ポリペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基を除去および／または導入することにより、ポリペプチドを特異的に適合させて、分子を適当な非ポリペプチド部分との結合をさらに受けやすくし、結合パターンを最適化し（例えば、Ｇ−ＣＳＦ分子の表面上の非ポリペプチド部分の最適の分散を確実にし、結合することを意図される結合基のみが分子中に存在することを確実にするため）、それにより、Ｇ−ＣＳＦ活性と、それに加えて現在入手可能なＧ−ＣＳＦ分子と比較して１以上の向上された性質を有する新規結合体分子を得ることが可能になる。
ポリペプチドは任意の起源、特に哺乳動物起源のものであってよいが、これは目下ヒト起源であるのが好ましく、特に配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド変異体である。
【００３９】
本発明の好ましい具体例において、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの１以上のアミノ酸残基は変更される。例えば、変更は、適当な非ポリペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基の除去ならびに導入を包含する。
非ポリペプチド部分の結合部位の除去および／または導入を目的とする本発明において開示されるアミノ酸変更に加えて、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、必要ならば、結合部位の導入または除去に関する必要がない他の変更、すなわち、他の置換、挿入または欠失を含んでもよいと理解される。これらは、例えば、Ｎ−および／またはＣ−末端の１以上のアミノ酸残基による切断、またはＮ−および／またはＣ−末端での１以上の余分な残基の添加、例えばＮ−末端でのメチオニン残基の添加を包含する。
【００４０】
本発明の結合体は、ｈＧ−ＣＳＦ、特にｒｈＧ−ＣＳＦ（例えば、ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ、ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍまたはｎａｒｔｏｇｒａｓｔｉｍ）または公知ｈＧ−ＣＳＦ変異体と比較して１以上の次の向上された性質を有する：増大した、好中球減少症の期間を減少させる能力、増大した機能的インビボ半減期、増大した血清半減期、減少した腎臓クリアランス、減少したレセプターによるクリアランス、減少した副作用、例えば骨痛、および減少した免疫原性。
【００４１】
非ポリペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基は、除去されるかまたは導入されるかにかかわらず、適当な非ポリペプチド部分の性質に基づいて選択され、ほとんどの場合、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分間の結合が達成されるような方法に基づいて選択される。例えば、ポリエチレングリコールとリシン残基の結合が達成される場合、適当な活性化された分子は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．から得られるｍＰＥＧ−ＳＰＡ、オキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミド−ＰＥＧ（ＵＳ５，１２２，６１４）、またはＰｏｌｙＭＡＳＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｐｌｃから入手可能なＰＥＧである。これらのうちの第一のものを以下にさらに説明する。
【００４２】
親ｈＧ−ＣＳＦ分子の構造および機能の過度の破壊を回避するために、例えば本明細書の次のセクションにおいて記載されるような（配列番号１に示すアミノ酸と比較して）本発明の従って変更されるアミノ酸残基の合計数は、典型的には１５を超えない。アミノ酸残基の正確な数および導入されるかまたは除去されるアミノ酸残基の性質は、特に結合の望ましい性質および程度（例えば、非ポリペプチド部分の同一性、結合が望ましいかまたは回避しなければならない場合、どれくらい多くの非ポリペプチド部分をポリペプチドと結合させることが望ましいかまたは可能であるかなど）に依存する。好ましくは、本発明の結合体のポリペプチド部分または本発明のポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列と、配列番号１のアミノ酸と１〜１５のアミノ酸残基、典型的には２から１０のアミノ酸残基、例えば、３〜８のアミノ酸残基、例えば４〜６のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む。従って、通常、本発明の結合体のポリペプチド部分またはポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
結合体のポリペプチド部分は典型的には配列番号１と少なくとも約８０％の同一性、好ましくは配列番号１と少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列相同性／同一性は、都合の良いことには、たとえばＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（１．８バージョン、１９９９年６月）を用いて、デフォルトのパラメータを用いて、整列させた配列から（Thompson et al., 1994, ClustalW: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22: 46734680）、あるいはＰＦＡＭファミリーデータベース４．０バージョンから（http://pfam.wustl.edu/) (Nucleic Acids Res. 1999 Jan 1; 27(1):260-2）、ＧＥＮＥＤＯＣ２．５バージョン(Nicholas, K.B., Nicholas H.B. Jr., and Deerfield, D.W. II. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW.NEWS 4:14; Nicholas, K.B. and Nicholas H.B. Jr. 1997 GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation)の使用により決定される。
【００４４】
好ましい具体例において、ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列間の違いの一つは、少なくとも１つで、多くの場合はそれ以上、例えば１〜１５の、非ポリペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基が、好ましくは置換によりアミノ酸配列に導入されていることである。これにより、ポリペプチド部分は適当な非ポリペプチド部分が結合する特定のアミノ酸残基の含量が変更され、これによりさらに有効で、特異的および／または広範囲におよぶ結合が達成される。例えば、適当な非ポリペプチドの結合基を含むアミノ酸残基の合計数が最適化されたレベルに変更される場合、結合体のクリアランスは、結合により変更される分子の形状、サイズおよび／または電荷のために典型的には著しく減少する。さらに、適当な非ポリペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基の合計数が増大する場合、さらに多くのポリペプチド分子が適当な非ポリペプチド部分により遮蔽され、免疫反応の低下につながる。
本出願において用いられる「一つの違い」なる用語は、さらに別の違いが存在する可能性があることが意図される。従って、特定のアミノ酸の違いに加えて、特定されたもの以外のアミノ酸残基を突然変異させることができる。
【００４５】
さらに好ましい具体例において、ポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号１に示すアミノ酸配列間の一つの違いは、少なくとも１つ、好ましくはさらに多く、例えば１〜１５の、非ポリペプチド部分の結合基を含むアミノ酸残基は、好ましくは置換により、アミノ酸配列から除去されていることである。適当な非ポリペプチド部分の結合基を含む１以上のアミノ酸残基を除去することにより、かかる結合が不利であるポリペプチドの部分、たとえばポリペプチドの機能的部位またはその付近に位置するアミノ酸残基において非ポリペプチド部分との結合を回避することが可能である（かかる部位での結合の結果、レセプター認識が損なわれるために結果として得られる結合体のＧ−ＣＳＦ活性が不活化または低下するため）。本発明において、「機能的部位」なる用語は、ｈＧ−ＣＳＦの機能または性能に本質的にまたは他の方法で関与する１以上のアミノ酸残基を意味する。かかるアミノ酸残基は機能的部位の一部である。機能的部位は当該分野において公知の方法により決定することができ、好ましくは関連するレセプター、たとえばｈＧ−ＣＳＦレセプターと複合体形成するポリペプチドの構造の分析により確認される（例えば、Aritomi et al. Nature 401:713-717, 1999参照）。
【００４６】
本発明の結合体は、一般に、ｈＧ−ＣＳＦ、たとえばｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ、ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍまたはｎａｒｔｏｇｒａｓｔｉｍと比較して、好ましくは一つのＮ−末端結合した２０ｋＤａのＰＥＧ部分を含むｒｈＧ−ＣＳＦと比較して好中球減少の期間を減少させる能力が増大した結合体を提供するために十分な数および種類の非ポリペプチド部分を含む。好中球減少の期間を減少させる能力の増大は、本明細書の物質および方法のセクションに記載するようにして決定することができる（「結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」）。
【００４７】
本発明の結合体は、少なくとも一つの結合していない、結合可能な非ポリペプチド部分の結合基を含むことができる。本発明において、「結合可能な結合基」なる用語は、結合に近づきやすいポリペプチドの位置にあり、特定の予防措置がなければ、結合に供されると関連する非ポリペプチド部分と結合する結合基を意味する。例えば、かかる結合基は、ポリペプチドがその活性を働かせるために関与するかまたは必須であるアミノ酸残基の一部である。他の方法で結合可能な結合基の結合を回避するための都合の良い方法は、例えば標題「機能的部位のブロッキング」のセクションにおいて記載するようなヘルパー分子により結合基を遮蔽することである。結合していない結合可能な結合基の数は、特定のＧ−ＳＣＦポリペプチドおよび結合可能な結合基の位置によって変わると理解される。例えば、ポリペプチド結合体は１または２の結合していない結合可能な結合基、および少なくとも１、好ましくは２以上の結合した結合基を含む。
【００４８】
Ｇ−ＣＳＦの４のへリックスはアミノ酸残基１１〜４１（へリックスＡ）、７１〜９５（へリックスＢ）、１０２〜１２５（へリックスＣ）、および１４５〜１７０（へリックスＤ）を含む（Zink et al. (1994) Biochemistry 33: 8453-8463）。驚くべきことに、タンパク質へリックスの修飾、たとえばＧ−ＣＳＦなどの４へリックス束状タンパク質のへリックス構造の修飾は一般的にタンパク質機能が妨害される危険性を伴うと考えられるが、非ポリペプチド部分がＧ−ＣＳＦの１以上のへリックス中に位置するアミノ酸残基と結合する場合に有利な結果が得られることが見いだされた。一具体例において、本発明のポリペプチド結合体は従って、４へリックスの１つ、特にＢ、ＣまたはＤへリックスの１以上に位置するアミノ酸残基の結合基に結合した少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含む。
【００４９】
非ポリペプチド部分がリシン残基と結合した本発明の結合体
一般に、ポリペプチド結合体は：
ｉ）配列番号１に示すアミノ酸配列と、Ｔ１Ｋ、Ｐ２Ｋ、Ｌ３Ｋ、Ｇ４Ｋ、Ｐ５Ｋ、Ａ６Ｋ、Ｓ７Ｋ、Ｓ８Ｋ、Ｌ９Ｋ、Ｐ１０Ｋ、Ｑ１１Ｋ、Ｓ１２Ｋ、Ｆ１３Ｋ、Ｌ１４Ｋ、Ｌ１５Ｋ、Ｅ１９Ｋ、Ｑ２０Ｋ、Ｖ２１Ｋ、Ｑ２５Ｋ、Ｇ２６Ｋ、Ｄ２７Ｋ、Ａ２９Ｋ、Ａ３０Ｋ、Ｅ３３Ｋ、Ａ３７Ｋ、Ｔ３８Ｋ、Ｙ３９Ｋ、Ｌ４１Ｋ、Ｈ４３Ｋ、Ｐ４４Ｋ、Ｅ４５Ｋ、Ｅ４６Ｋ、Ｖ４８Ｋ、Ｌ４９Ｋ、Ｌ５０Ｋ、Ｈ５２Ｋ、Ｓ５３Ｋ、Ｌ５４Ｋ、Ｉ５６Ｋ、Ｐ５７Ｋ、Ｐ６０Ｋ、Ｌ６１Ｋ、Ｓ６２Ｋ、Ｓ６３Ｋ、Ｐ６５Ｋ、Ｓ６６Ｋ、Ｑ６７Ｋ、Ａ６８Ｋ、Ｌ６９Ｋ、Ｑ７０Ｋ、Ｌ７１Ｋ、Ａ７２Ｋ、Ｇ７３Ｋ、Ｓ７６Ｋ、Ｑ７７Ｋ、Ｌ７８Ｋ、Ｓ８０Ｋ、Ｆ８３Ｋ、Ｑ８６Ｋ、Ｇ８７Ｋ、Ｑ９０Ｋ、Ｅ９３Ｋ、Ｇ９４Ｋ、Ｓ９６Ｋ、Ｐ９７Ｋ、Ｅ９８Ｋ、Ｌ９９Ｋ、Ｇ１００Ｋ、Ｐ１０１Ｋ、Ｔ１０２Ｋ、Ｄ１０４Ｋ、Ｔ１０５Ｋ、Ｑ１０７Ｋ、Ｌ１０８Ｋ、Ｄ１０９Ｋ、Ａ１１１Ｋ、Ｄ１１２Ｋ、Ｆ１１３Ｋ、Ｔ１１５Ｋ、Ｔ１１６Ｋ、Ｗ１１８Ｋ、Ｑ１１９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ、Ｍ１２１Ｋ、Ｅ１２２Ｋ、Ｅ１２３Ｋ、Ｌ１２４Ｋ、Ｍ１２６Ｋ、Ａ１２７Ｋ、Ｐ１２８Ｋ、Ａ１２９Ｋ、Ｌ１３０Ｋ、Ｑ１３１Ｋ、Ｐ１３２Ｋ、Ｔ１３３Ｋ、Ｑ１３４Ｋ、Ｇ１３５Ｋ、Ａ１３６Ｋ、Ｍ１３７Ｋ、Ｐ１３８Ｋ、Ａ１３９Ｋ、Ａ１４１Ｋ、Ｓ１４２Ｋ、Ａ１４３Ｋ、Ｆ１４４Ｋ、Ｑ１４５Ｋ、Ｓ１５５Ｋ、Ｈ１５６Ｋ、Ｑ１５８Ｋ、Ｓ１５９Ｋ、Ｌ１６１Ｋ、Ｅ１６２Ｋ、Ｖ１６３Ｋ、Ｓ１６４Ｋ、Ｙ１６５Ｋ、Ｖ１６７Ｋ、Ｌ１６８Ｋ、Ｈ１７０Ｋ、Ｌ１７１Ｋ、Ａ１７２Ｋ、Ｑ１７３ＫおよびＰ１７４Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの置換において異なるアミノ酸配列を含む、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチド、および
ｉｉ）ポリペプチドのリシン残基、および所望によりＮ−末端アミノ酸残基と結合した少なくとも１つの非ポリペプチド部分を含む。
【００５０】
ｈＧ−ＣＳＦは４のリシン残基を含み、そのうちＫ１６はレセプター結合ドメインに位置し、他はそれぞれ２３、３４および４０に位置し、全てはレセプター結合ドメインに比較的近い。これらのリシン残基の１以上との結合を回避するために（これは結果として得られる結合体の活性を不活化するかまたは非常に低下させるため）、少なくとも１つのリシン残基、たとえばこれらの残基のうちの２、３または全てを除去することが望ましい。従って、もうひとつ別のさらに好ましい態様において、本発明は、Ｋ１６、Ｋ２３、Ｋ３４およびＫ４０からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失またはもう一つ別のアミノ酸残基と置換されている前記定義のポリペプチド結合体に関する。好ましくは、少なくともＫ１６がもう一つのアミノ酸残基と置換されている。
【００５１】
好ましいアミノ酸置換の例としては、Ｑ７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ、Ｑ１２０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ、Ｓ１５９ＫおよびＨ１７０Ｋ／Ｑ／Ｒの１以上、たとえばこれらの置換の２、３、４または５、たとえば：Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ９０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ７０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１０５＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｑ１２０Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋ、Ｔ１０５Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０ＫまたはＱ１２０Ｋ＋Ｔ１３３Ｋ＋Ｓ１５９Ｋ＋Ｈ１７０Ｋが挙げられる。前記の変異体のいずれにおいても、置換Ｈ１７０ＫはＨ１７０ＱまたはＨ１７０Ｒであってもよい。
【００５２】
少なくとも１つのリシン残基が導入され、１つのリシン残基が除去されているポリペプチドは、好ましくは少なくとも１、たとえば１、２、３または４の、Ｋ１６Ｒ、Ｋ１６Ｑ、Ｋ２３Ｒ、Ｋ２３Ｑ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｋ４０ＲおよびＫ４０Ｑからなる群から選択される置換、好ましくは、Ｋ１６Ｒ置換を含み、これによりこの残基の結合が回避できる。好ましくは、ポリペプチドは、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ、Ｋ２３Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒ、Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０ＲおよびＫ１６Ｒ＋Ｋ２３Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒからなる群から選択される少なくとも一つの置換を含む。好ましい一具体例において、ポリペプチドは置換Ｋ１６Ｒ＋Ｋ３４Ｒ＋Ｋ４０Ｒを含むが、位置２３のリシンは変更されないままで残る。前記のように、リシン残基の除去についてこの項に記載した個々の置換または組み合わせは、リシン残基の導入について本発明において開示した他の置換、特に前項において記載した置換のいずれかと共に適当に用いることができる。
一具体例において、ポリペプチドは置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋを含み、２〜６、典型的には３〜６個の分子量約１０００〜１００００Ｄａのポリエチレングリコール部分と結合する。
【００５３】
一具体例において、本発明の結合体は、Ｔ１３３においてグリコシル化を有する。すなわち、この位置は野生型ｈＧ−ＣＳＦから変更されていない。これは天然のグリコシル化部位である。別法として、結合体はグリコシル化されなくてもよいが、グリコシル化された結合体が好ましい。
特に、結合体は２〜６、典型的には３〜６個の分子量約５０００〜６０００Ｄａのポリエチレングリコール部分、たとえば分子量約５ｋＤａのｍＰＥＧが結合している。好ましくは、結合体は４〜５個の、分子量約５０００〜６０００のポリエチレングリコール部分、たとえば５ｋＤａｍＰＥＧが結合している。
もう一つの具体例において、単一の数のＰＥＧ部分のみ、たとえばポリペプチドあたり２、３、４、５または６個のいずれかのＰＥＧ部分が結合しているように、あるいは異なる数のＰＥＧ部分が結合したポリペプチド結合体の所望の混合物、たとえば２−５、２−４、３−５、３−４、４−６、４−５または５−６個の結合したＰＥＧ部分を有する混合物を有する結合体を産生することができる。前記のように、好ましい結合体混合物の一例は、約５ｋＤａの４−５ＰＥＧ部分を有するものである。
【００５４】
特定の数の結合したＰＥＧ部分を有する結合体、または所定の範囲の数の結合したＰＥＧ部分を有する結合体の混合物は、適当なＰＥＧ化条件を選択し、任意にその後精製して、所望の数のＰＥＧ部分を有する結合体を分離することにより得ることができる。異なる数のＰＥＧ部分が結合しているＧ−ＣＳＦ分子を分離する方法の例を以下に記載する。結合したＰＥＧ部分の数の決定は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行うことができる。本発明の目的に関して、ポリペプチド結合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での分離が所定の数のＰＥＧ部分に対応するバンド以外にバンドを全くまたはわずかしか示さないならば、所定の数の結合したＰＥＧ部分を有すると見なすことができる。例えば、ポリペプチド結合体のサンプルは、該サンプルがかけられたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルがそれぞれ４および５のＰＥＧ基に対応するバンドを示し、３または６ＰＥＧ基に対応するバンドをわずかしか、好ましくは全く示さないならば、４−５の結合したＰＥＧ基を有すると考えられる。
【００５５】
前記のように、非ポリペプチド部分は、好ましくは、直鎖状または分岐鎖状ポリエチレングリコールまたは別のポリアルキレンオキシドからなる群から選択されるポリマー分子であるのが好ましい。好ましいポリマー分子は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．から得られるｍＰＥＧ−ＳＰＡ（特に、ＳＰＡ―ｍＰＥＧ５０００）またはオキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミドＰＥＧ（ＵＳ５，１２２，６１４）である。
このセクションにおいて規定したアミノ酸変化、特に置換は、特定のアミノ酸修飾、特にグリコシル化部位の導入および／または除去を開示する本明細書の他のセクションにおいて規定された任意のアミノ酸変化、好ましくは置換と組み合わせることができる。
【００５６】
本発明のグリコシル化結合体
前記のような導入および除去されたリシンを有することに加えて、本発明の結合体は、ｈＧ−ＣＳＦ（Ｔ１３３）の天然のグリコシル化部位および／または導入されたグリコシル化部位でグリコシル化される、グリコシル化宿主細胞において発現されるポリペプチドの結果として１以上の炭水化物部分を含むことができる。結合体はしたがって、配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも１つの天然に存在しないグリコシル化部位がアミノ酸配列中に、Ｌ３Ｎ＋Ｐ５Ｓ／Ｔ、Ｐ５Ｎ、Ａ６Ｎ、Ｓ８Ｎ＋Ｐ１０Ｓ／Ｔ、Ｐ１０Ｎ、Ｑ１１Ｎ＋Ｆ１３Ｓ／Ｔ、Ｓ１２Ｎ＋Ｌ１４Ｓ／Ｔ、Ｆ１３Ｎ＋Ｌ１５Ｓ／Ｔ、Ｌ１４Ｎ＋Ｋ１６Ｓ／Ｔ、Ｋ１６Ｎ＋Ｌ１８Ｓ／Ｔ、Ｅ１９Ｎ＋Ｖ２１Ｓ／Ｔ、Ｑ２０Ｎ＋Ｒ２２Ｓ／Ｔ、Ｖ２１Ｎ＋Ｋ２３Ｓ／Ｔ、Ｒ２２Ｎ＋Ｉ２４Ｓ／Ｔ、Ｋ２３Ｎ＋Ｑ２５Ｓ／Ｔ、Ｑ２５Ｎ＋Ｄ２７Ｓ／Ｔ、Ｇ２６Ｎ＋Ｇ２８Ｓ／Ｔ、Ｄ２７Ｎ＋Ａ２９Ｓ／Ｔ、Ａ２９Ｎ＋Ｌ３１Ｓ／Ｔ、Ａ３０Ｎ＋Ｑ３２Ｓ／Ｔ、Ｅ３３Ｎ＋Ｌ３５Ｓ／Ｔ、Ａ３７Ｎ＋Ｙ３９Ｓ／Ｔ、Ｔ３８Ｎ＋Ｋ４０Ｓ／Ｔ、Ｙ３９Ｎ＋Ｌ４１Ｓ／Ｔ、Ｐ４４Ｎ＋Ｅ４６Ｓ／Ｔ、Ｅ４５Ｎ＋Ｌ４７Ｓ／Ｔ、Ｅ４６Ｎ＋Ｖ４８Ｓ／Ｔ、Ｖ４８Ｎ＋Ｌ５０Ｓ／Ｔ、Ｌ４９Ｎ＋Ｇ５１Ｓ／Ｔ、Ｌ５０Ｎ＋Ｈ５２Ｓ／Ｔ、Ｈ５２Ｎ＋Ｌ５４Ｓ／Ｔ、Ｓ５３Ｎ＋Ｇ５５Ｓ／Ｔ、Ｐ６０Ｎ、Ｌ６１Ｎ、Ｓ６３Ｎ＋Ｐ６５Ｓ／Ｔ、Ｐ６５Ｎ＋Ｑ６７Ｓ／Ｔ、Ｓ６６Ｎ＋Ａ６８Ｓ／Ｔ、Ｑ６７Ｎ＋Ｌ６９Ｓ／Ｔ、Ａ６８Ｎ＋Ｑ７０Ｓ／Ｔ、Ｌ６９Ｎ＋  Ｌ７１Ｓ／Ｔ、Ｑ７０Ｎ＋Ａ７２Ｓ／Ｔ、Ｌ７１Ｎ＋Ｇ７３Ｓ／Ｔ、Ｇ７３Ｎ＋Ｌ７５Ｓ／Ｔ、Ｓ７６Ｎ＋Ｌ７８Ｓ／Ｔ、Ｑ７７Ｎ＋Ｈ７９Ｓ／Ｔ、Ｌ７８Ｎ、Ｓ８０Ｎ＋Ｌ８２Ｓ／Ｔ、Ｆ８３Ｎ＋Ｙ８５Ｓ／Ｔ、Ｑ８６Ｎ＋Ｌ８８Ｓ／Ｔ、Ｇ８７Ｎ＋Ｌ８９Ｓ／Ｔ、Ｑ９０Ｎ＋Ｌ９２Ｓ／Ｔ、Ｅ９３Ｎ＋Ｉ９５Ｓ／Ｔ、Ｐ９７Ｎ＋Ｌ９９Ｓ／Ｔ、Ｌ９９Ｎ＋Ｐ１０１Ｓ／Ｔ、Ｐ１０１Ｎ＋Ｌ１０３Ｓ／Ｔ、Ｔ１０２Ｎ＋Ｄ１０４Ｓ／Ｔ、Ｄ１０４Ｎ＋Ｌ１０６Ｓ／Ｔ、Ｔ１０５Ｎ＋Ｑ１０７Ｓ／Ｔ、Ｑ１０７Ｎ＋Ｄ１０９Ｓ／Ｔ、Ｌ１０８Ｎ＋Ｖ１１０Ｓ／Ｔ、Ｄ１０９Ｎ＋Ａ１１１Ｓ／Ｔ、Ａ１１１Ｎ＋Ｆ１１３Ｓ／Ｔ、Ｄ１１２Ｎ＋Ａ１１４Ｓ／Ｔ、Ｆ１１３Ｎ、Ｔ１１５Ｎ＋Ｉ１１７Ｓ／Ｔ、Ｔ１１６Ｎ＋Ｗ１１８Ｓ／Ｔ、Ｗ１１８Ｎ＋Ｑ１２０Ｓ／Ｔ、Ｑ１１９Ｎ＋Ｍ１２１Ｓ／Ｔ、  Ｑ１２０Ｎ＋Ｅ１２２Ｓ／Ｔ、Ｍ１２１Ｎ＋Ｅ１２３Ｓ／Ｔ、Ｅ１２２Ｎ＋Ｌ１２４Ｓ／Ｔ、Ｅ１２３Ｎ＋Ｇ１２５Ｓ／Ｔ、  Ｌ１２４Ｎ＋Ｍ１２６Ｓ／Ｔ、Ｍ１２６Ｎ＋Ｐ１２８Ｓ／Ｔ、Ｐ１２８Ｎ＋Ｌ１３０Ｓ／Ｔ、Ｌ１３０Ｎ＋Ｐ１３２Ｓ／Ｔ、Ｐ１３２Ｎ＋Ｑ１３４Ｓ／Ｔ、Ｔ１３３Ｎ＋Ｇ１３５Ｓ／Ｔ、Ｑ１３４Ｎ＋Ａ１３６Ｓ／Ｔ、Ａ１３６Ｎ＋Ｐ１３８Ｓ／Ｔ、Ｐ１３８Ｎ＋Ｆ１４０Ｓ／Ｔ、Ａ１３９Ｎ＋Ａ１４１Ｓ／Ｔ、Ａ１４１Ｎ＋Ａ１４３Ｓ／Ｔ、Ｓ１４２Ｎ＋Ｆ１４４Ｓ／Ｔ、Ａ１４３Ｎ＋Ｑ１４５Ｓ／Ｔ、Ｆ１４４Ｎ＋Ｒ１４６Ｓ／Ｔ、Ｑ１４５Ｎ＋Ｒ１４７Ｓ／Ｔ、Ｒ１４６Ｎ＋Ａ１４８Ｓ／Ｔ、Ｒ１４７Ｎ＋Ｇ１４９Ｓ／Ｔ、Ｓ１５５Ｎ＋Ｌ１５７Ｓ／Ｔ、Ｈ１５６Ｎ＋Ｑ１５８Ｓ／Ｔ、Ｓ１５９Ｎ＋Ｌ１６１Ｓ／Ｔ、Ｌ１６１Ｎ＋Ｖ１６３Ｓ／Ｔ、Ｅ１６２Ｎ、Ｖ１６３Ｎ＋Ｙ１６５Ｓ／Ｔ、Ｓ１６４Ｎ＋Ｒ１６６Ｓ／Ｔ、Ｙ１６５Ｎ＋Ｖ１６７Ｓ／Ｔ、Ｒ１６６Ｎ＋Ｌ１６８Ｓ／Ｔ、Ｖ１６７Ｎ＋Ｒ１６９Ｓ／Ｔ、Ｌ１６８Ｎ＋Ｈ１７０Ｓ／Ｔ、Ｒ１６９Ｎ＋Ｌ１７１Ｓ／ＴおよびＨ１７０Ｎ＋Ａ１７２Ｓ／Ｔ（ここにおいて、Ｓ／ＴはＳまたはＴ残基、好ましくはＴ残基を示す）からなる群から選択される少なくとも１つの置換により導入されている点で異なるアミノ酸配列を含む、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すグリコシル化されたポリペプチドであってもよい。
【００５７】
この態様の結合体を調製するために、ポリペプチドは、グリコシル化部位でオリゴサッカライド部分を結合できるグリコシル化宿主細胞において発現されるか、あるいはインビトログリコシル化に付さなければならない。グリコシル化宿主細胞の例は、以下の標題「オリゴサッカライド部分とのカップリング」のセクションにおいてさらに記載する。
別法として、この態様の結合体は、配列番号１に示すアミノ酸配列と、Ｐ５Ｎ、Ａ６Ｎ、Ｐ１０Ｎ、Ｐ６０Ｎ、Ｌ６１Ｎ、Ｌ７８Ｎ、Ｆ１１３ＮおよびＥ１６２Ｎ、特に、Ｐ５Ｎ、Ａ６Ｎ、Ｐ１０Ｎ、Ｐ６０Ｎ、Ｌ６１Ｎ、Ｆ１１３ＮおよびＥ１６２Ｎ、たとえばＰ６０Ｎ、Ｌ６１Ｎ、Ｆ１１３ＮおよびＥ１６２Ｎからなる群から選択される少なくとも１つの置換において異なるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドを含む。
別法として、この態様の結合体は、配列番号１に示すアミノ酸配列と、Ｄ２７Ｎ＋Ａ２９Ｓ、Ｄ２７Ｎ＋Ａ２９Ｔ、Ｄ１０４Ｎ＋Ｌ１０６Ｓ、Ｄ１０４Ｎ＋Ｌ１０６Ｔ、Ｄ１０９Ｎ＋Ａ１１１Ｓ、Ｄ１０９Ｎ＋Ａ１１１Ｔ、Ｄ１１２Ｎ＋Ａ１１４ＳおよびＤ１１２Ｎ＋Ａ１１４Ｔ、さらに好ましくは、Ｄ２７Ｎ＋Ａ２９Ｓ、Ｄ２７Ｎ＋Ａ２９Ｔ、Ｄ１０４Ｎ＋Ｌ１０６Ｓ、Ｄ１０４Ｎ＋Ｌ１０６Ｔ、Ｄ１１２Ｎ＋Ａ１１４ＳおよびＤ１１２Ｎ＋Ａ１１４Ｔ、たとえばＤ２７Ｎ＋Ａ２９Ｓ、Ｄ２７Ｎ＋Ａ２９Ｔ、Ｄ１０４Ｎ＋Ｌ１０６ＳおよびＤ１０４Ｎ＋Ｌ１０６Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの置換において異なるアミノ酸配列を含む、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドを含む。
【００５８】
本発明の結合体を調製する方法
次のセクション、「ポリマー分子との結合」および「オリゴサッカライド部分との結合」において、特定の種類の非ポリペプチド部分との結合を記載する。一般に、本発明のポリペプチド結合体は、ポリペプチドを発現すを行うための条件下で適当な宿主細胞を培養し、ポリペプチドを回収し、その後、ポリペプチドをインビトロで非ポリペプチド部分と結合させることにより生成させることができる。少なくとも１つのＮ−またはＯ−グリコシル化部位を含むグリコシル化されたポリペプチドの場合、グリコシル化は好ましくは、インビボグリコシル化ができる真核宿主細胞の使用により得られる。
ポリマー分子との結合
ポリペプチドとカップリングされるポリマー分子は、任意の適当なポリマー分子、例えば天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマーで、典型的には約３００〜１０００００Ｄａの範囲、例えば約５００〜２００００Ｄａ、さらに好ましくは約１０００〜１５０００Ｄａの範囲、さらに一層好ましくは約２０００〜１２０００Ｄａの範囲、たとえば約３０００〜１００００の範囲の分子量を有する。本明細書においてポリマー分子について使用される場合、「約」なる語は、およその平均分子量を示し、所定のポリマー調製においてはある分子量分布が通常存在するという事実を反映する。
ホモポリマーの例としては、ポリオール（すなわち、ｐｏｌｙ−ＯＨ）、ポリアミン（すなわち、ｐｏｌｙ−ＮＨ２）およびポリカルボン酸（すなわち、ｐｏｌｙ−ＣＯＯＨ）が挙げられる。ヘテロポリマーは、異なるカップリング基、たとえばヒドロキシル基とアミン基を含むポリマーである。
【００５９】
適当なポリマー分子の例としては、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）（ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、たとえば直鎖または分岐鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコールを含む）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリ−（ビニルピロリドン）、ポリエチレンコマレイン酸アンヒドリド、ポリスチレンコマレイン酸アンヒドリド、デキストラン（カルボキシメチル−デキストランを含む）、または免疫原性の減少および／または機能的インビボ半減期および／または血清半減期の増大に適当な他のバイオポリマーからなる群から選択されるポリマー分子が挙げられる。ポリマー分子の別の例は、ヒトアルブミンまたは別の大量の血清タンパク質である。一般に、ポリアルキレングリコール誘導化ポリマーは、生体適合性、非毒性、非抗原性、非免疫原性であり、様々な水溶性を有し、生きている生物から容易に抽出される。
【００６０】
ＰＥＧはデキストランなどの多糖類と比べて架橋できる反応性基をごくわずかしか有さないので、好ましいポリマー分子である。特に、単官能ＰＥＧ、例えば、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）は、そのカップリング化学反応が比較的単純であるので興味深い（ポリペプチド上の結合基との結合について１つの反応性基しか利用可能でない）。従って、架橋の危険性が排除され、結果として得られるポリペプチド結合体はさらに均質であり、ポリマー分子のポリペプチドとの反応はさらに制御しやすい。
ポリマー分子のポリペプチドとの共有結合を行うために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基を活性化された形態において、すなわち、反応性官能基を有する形態において提供する。適当な活性化ポリマー分子は、たとえばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）から、またはｐｏｌｙＭＡＳＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｐｌｃ、ＵＫから商業的に入手可能である。別法として、ポリマー分子は当該分野において慣例の方法により、たとえば、ＷＯ９０／１３５４０に開示されているようして活性化することができる。本発明において使用される活性化直鎖または分岐鎖ポリマー分子の例は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．１９９７年および２０００年カタログに記載されている（Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives、出典明示により本発明の一部とする）。活性化ＰＥＧポリマーの特定の例は、次の直鎖ＰＥＧ：ＮＨＳ−ＰＥＧ（例えば、ＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＳＰＡ−ＰＥＧ、ＳＢＡ−ＰＥＧ、ＳＳ−ＰＥＧ、ＳＳＡ−ＰＥＧ、ＳＣ−ＰＥＧ、ＳＧ−ＰＥＧおよびＳＣＭ−ＰＥＧ）、およびＮＯＲ−ＰＥＧ）、ＢＴＣ−ＰＥＧ、ＥＰＯＸ−ＰＥＧ、ＮＣＯ−ＰＥＧ、ＮＰＣ−ＰＥＧ、ＣＤＩ−ＰＥＧ、ＡＬＤ−ＰＥＧ、ＴＲＥＳ−ＰＥＧ、ＶＳ−ＰＥＧ、ＩＯＤＯ−ＰＥＧ、およびＭＡＬ−ＰＥＧ、並びに分岐鎖ＰＥＧ、たとえば、ＰＥＧ２−ＮＨＳおよびＵＳ５，９３２，４６２およびＵＳ５，６４３，５７５に開示されているもの（両方とも出典明示により本発明の一部として参照される）を包含する。さらに、出典明示により本発明の一部として参照される次の刊行物は、有用なポリマー分子および／またはＰＥＧ化反応を開示している：ＵＳ５，８２４，７７８、ＵＳ５，４７６，６５３、ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９，１０８、ＥＰ４０２，３７８、ＵＳ４，９０２，５０２、ＵＳ５，２８１，６９８、ＵＳ５，１２２，６１４、ＵＳ５，２１９，５６４、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１、ＵＳ５，７３６，６２５、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９９９６、ＵＳ５，６２９，３８４、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、ＵＳ５，４７３，０３４、ＵＳ５，５１６，６７３、ＥＰ６０５９６３、ＵＳ５，３８２，６５７、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３およびＥＰ１５４３１６。
【００６１】
ポリペプチドおよび活性化ポリマー分子の結合は、例えば以下の刊行物（ポリマー分子を活性化するための適当な方法も記載する）に記載されているような任意の慣例法を使用することにより行われる：R.F. Taylor, (1991), ”Protein immobilisation. Fundamental and applications”, Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), ”Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”, CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), ”Immobilized Affinity Ligand Techniques”, Academic Press, N.Y.)。当業者らは、使用される活性化法および／または結合化学は、ポリペプチドの結合基（その例はすでに記載）、ならびにポリマーの官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンまたはハロアセテート）によって変わることを認識するであろう。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上の全ての利用可能な結合基（すなわち、ポリペプチドの表面に露出しているかかる結合基）との結合に導くか、または１以上の特定の結合基、例えばＮ−末端アミノ基（ＵＳ５，９８５，２６５）に導かれる。さらに、結合は、一段または段階的方法において達成することができる（例えば、ＷＯ９９／５５３７７に記載）。
【００６２】
ＰＥＧ化は、結合したＰＥＧ分子の数、かかる分子の大きさおよび形態（例えば、直鎖であるかまたは分岐鎖であるか）、およびポリペプチドにおいてかかる分子が結合している場所に関して最適の分子を生成するように設計される。使用されるポリマーの分子量は、達成される所望の効果を考慮して選択される。例えば、結合の第一の目的が、高い分子量を有し、さらに大きなサイズの（例えば腎臓クリアランスを減少させるために）結合体を達成することである場合、所望の効果を得るために、１または数個の高分子量ポリマー分子または分子量が小さい多くのポリマー分子のいずれかを選択することができる。しかしながら、好ましくは分子量の低い数個のポリマー分子が使用される。これは高度のエピトープシールディングが望ましい場合でもある。かかる場合において、例えば約５０００Ｄａの分子量を有する２−８分子、たとえば３−６のかかるポリマーを例えば使用することができる。以下に示す例として、高分子量を有する少数のポリマー分子（例えば、ＭＷ１２０００−２００００を有するものを１−３）と比べて、低い分子量を有する多数のポリマー分子（例えば、ＭＷ５０００を有するもの４−６）を有するのが、ポリペプチド結合体の機能的インビボ半減期を向上させる点において、２つの場合における結合したポリマー分子の合計分子量が同じかまたは類似している場合でさえも有利である。小さなポリマー分子が多数存在することは、例えば１個のさらに大きなポリマー分子よりも大きな直径または見掛けのサイズを有するポリペプチドを、少なくともポリマー分子がポリペプチド表面上に比較的均一に分布している場合に提供する。
【００６３】
本発明の結合体の少なくとも大部分の見かけのサイズ（「見かけの分子量」または「見掛けの質量」ともいう）が少なくとも約５０ｋＤａ、好ましくは少なくとも約５５ｋＤａ、さらに好ましくは少なくとも約６０ｋＤａ、例えば少なくとも約６６ｋＤａである場合に、有利な結果が得られることがさらに見いだされた。これは、腎臓クリアランスが十分に大きな見掛けのサイズを有する結合体について実質的に排除されるという事実によると考えられる。本発明において、Ｇ−ＣＳＦ結合体またはポリペプチドの「見掛けのサイズ」は、以下の実施例のセクションにおいて記載されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により決定される。
【００６４】
「大部分」なる用語の使用は、本発明のポリペプチド結合体が典型的には様々な数の非ポリペプチド部分が結合した個々の結合体を含むという事実に関する。たとえば、所定のＰＥＧ化条件下でＰＥＧ化に供される所定のポリペプチドは、個々のポリペプチド結合体のほとんどがたとえば３から５の間のＰＥＧ基が結合している組成物を生じる（大部分の結合体は４ＰＥＧ基が結合している）。これらの個々の結合体分子の見かけの分子量は変化するであろうことは明らかであろう。この例において、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドが５ｋＤａの分子量のＰＥＧ基と結合すると仮定すると、３ＰＥＧ基のみが結合している結合体がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に約５０ｋＤａ未満の見かけの分子量を有する可能性のあるバンドとして見られ、一方、４または５のＰＥＧ基が結合した結合体は、おそらくすべてが約５０ｋＤａより大きな段々に大きくなる見かけの分子量を有するバンドを生じる。従って、この例において、それぞれ３、４または５の結合したＰＥＧ基に対応する３つの主要なバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にある。本明細書および請求の範囲に関連して「主要な部分」なる用語は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のこれらの主要なバンドの少なくとも一つが表示された最小の見かけの分子量に対応するという事実を意味することを意図される。
【００６５】
好ましくは、個々の結合体分子の少なくとも５０％は前記の最小の見かけのサイズを有する。さらに好ましくは、個々の結合体分子の少なくとも６０％、さらにより好ましくは７０％、７５％、８０％または８５％はかかる最小の見かけのサイズを有する。最も好ましくは、個々の結合体分子の少なくとも９０％は前記のような最小の見かけのサイズ、すなわち、少なくとも５０ｋＤａ、好ましくはそれ以上、たとえば少なくとも５５ｋＤａまたは６０ｋＤａを有する。
【００６６】
結合体またはポリペプチドの見かけのサイズ（ｋＤａ）は結合体またはポリペプチドの実際の分子量と同じである必要はない。むしろ、見かけのサイズは、実際の分子量と全体のかさ高さの両方を反映する。ほとんどの場合において、１以上のＰＥＧ基または他の非ポリペプチド部分の結合の結果、かかる部分が結合しているポリペプチドのかさ高さは比較的大きく増大し、本発明のポリペプチド結合体は通常、結合体の実際の分子量を超える見かけのサイズを有する。従って、腎臓クリアランスに関連して、本発明の結合体は、たとえば６６ｋＤａ（見かけのサイズに対応）より高い分子量を有するポリペプチドに特徴的な性質を容易に示すことができるが、実際の分子量は６６ｋＤａよりもかなり低い。この見かけのサイズに対する影響は、たとえば、それぞれが５ｋＤａの分子量を有する４のＰＥＧ基の結合は、１つの２０ｋＤａＰＥＧ基が結合した対応するポリペプチドよりも優れた結果を提供するという観察結果によると考えられる。
【００６７】
一つのポリマー分子のみがタンパク質上の一つの結合基と結合するのが好ましいが、一つのポリマー分子のみが結合する場合において、一般に、ポリマー分子は直鎖であっても、分岐鎖であっても、比較的高い分子量、たとえば約２０ｋＤａを有するのが有利である。
さらに好ましい具体例において、本発明の結合体は１）少なくとも大部分が少なくとも約５０ｋＤａの見かけの分子量を有し、２）前記のようにｈＧ−ＣＳＦと比べて減少したインビトロ生物活性（減少したレセプター結合親和力）を有する。かかる結合体は、大きな見かけのサイズの結果としての低い腎臓クリアランスおよび低いインビトロ生物活性（低いレセプター結合親和力）の結果としての低いレセプター性クリアランスの両方を有することが見いだされた。全体の結果は、好中球の有効な刺激の点において、著しく増大したインビボ半減期、従って重要な臨床的利点をもたらす長期間の作用とあわせて優れた性能である。
【００６８】
通常、ポリマー結合はできるだけ多くの利用可能なポリマー結合基をポリマー分子と反応させることを目的とする条件下で行われる。これは、ポリペプチドに関して（結合部位の数）適当なモル過剰のポリマーにより達成される。活性化されたポリマー分子とポリペプチド結合部位の典型的なモル比は、約１０００−１まで、たとえば約２００−１まで、または約１００−１までである。しかしながら、たとえば、ポリマー結合の程度が低いのが望ましいならば、たとえば約５０−１、１０−１または５−１までなど、この比が幾分低い場合もあり得る。
【００６９】
本発明に従って、ポリマー分子をポリペプチドとリンカーを介してカップリングさせることも考えられる。適当なリンカーは、当業者には周知である。好ましい例は、塩化シアヌル酸である（Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 35783581; US 4,179,337; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375378）。
結合の後、残存する活性化ポリマー分子を当該分野において公知の方法、たとえば第一アミンを反応混合物に添加することによりブロックし、結果として得られる不活化ポリマー分子を適当な方法により除去する（たとえば、物質および方法参照）。
好ましい具体例において、本発明のポリペプチド結合体は、ＰＥＧ化に利用可能なポリペプチドにおけるいくつか、大部分または好ましくは実質的にすべてのリシン残基と結合したＰＥＧ分子、特に直鎖または分岐鎖ＰＥＧ分子、たとえば約１−１５ｋＤａ、典型的には約２−１２ｋＤａ、たとえば約３−１０ｋＤａ、たとえば約５または６ｋＤａの分子量を有するものを含む。
【００７０】
たとえばポリペプチドのアミノ酸配列、使用される活性化ＰＥＧ化合物の性質および特定のＰＥＧ化条件（ＰＥＧとポリペプチドのモル比を含む）などの状況に応じて、様々な程度のＰＥＧ化が得られ、ＰＥＧとポリペプチドの比が高いほど、高い程度のＰＥＧ化が一般に得られる。しかしながら、所定のＰＥＧ化プロセスから得られるＰＥＧ化されたポリペプチドは、通常若干程度が異なるＰＥＧ化を有するポリペプチド結合体の確率分布を含む。望ましいならば、異なる数のＰＥＧ部分が結合したこのようなポリペプチド種の混合物を、たとえば以下の実施例に記載する方法を用いて精製して、さらに均一な程度のＰＥＧ化を有する生成物を得ることができる。
さらにもう一つの具体例において、本発明のポリペプチド結合体は、ＰＥＧ化に利用可能なポリペプチドにおいてリシン残基に結合したＰＥＧ分子をポリペプチドのＮ−末端アミノ酸残基に加えて含むことができる。
【００７１】
オリゴサッカライド部分とのカップリング
オリゴサッカライド部分との結合は、インビボまたはインビトロ、好ましくはインビボで行われる。１以上のグリコシル化部位を有するＧ−ＣＳＦ分子のインビボグリコシル化を達成するために、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列をグリコシル化真核発現宿主中に挿入しなければならない。発現宿主細胞は、真菌（糸状菌または酵母）、昆虫または動物細胞あるいはトランスジェニック植物細胞から選択することができる。一具体例において、宿主細胞は哺乳動物、たとえばＣＨＯ細胞、ＢＨＫまたはＨＥＫ、たとえばＨＥＫ２９３細胞、または昆虫細胞、たとえばＳＦ９細胞、または酵母細胞、たとえば、エス・セレビシエ（S. cerevisiae）またはピチア・パストリス（Pichia pastoris）、あるいは後述の宿主細胞のいずれかである。たとえば、ＷＯ８７／０５３３０およびAplin et al., CRC Crit Rev. Biochem., pp. 259-306, 1981に記載されているように、グリコシド（たとえばデキストラン）のポリペプチドのアミノ酸残基とのインビトロ共有カップリングも用いることができる。
【００７２】
オリゴサッカライド部分またはＰＥＧのタンパク質−およびペプチド−結合Ｇｌｎ残基とのインビトロカップリングはトランスグルタミナーゼ（ＴＧ’ａｓｅ）により行うことができる。トランスグルタミナーゼは、いわゆる架橋反応において、ドナーアミン基のタンパク質−およびペプチド−結合Ｇｌｎ残基への移動を触媒する。ドナーアミン基は、たとえばＬｙｓ残基におけるε−アミノ基としてタンパク質−またはペプチド−結合することができるか、または小または大有機分子の一部であってもよい。ＴＧ’ａｓｅにより触媒される架橋においてアミノドナーとしての働きをする小有機分子の例はプトレシン（１，４−ジアミノブタン）である。ＴＧ’ａｓｅにより触媒される架橋においてアミノドナーとしての働きをする大有機分子の例はアミン含有ＰＥＧである（Sato et al., Biochemistry 35, 13072-13080）。
ＴＧ’ａｓｅは一般に非常に特異的な酵素であり、タンパク質の表面上に露出しているすべてのＧｌｎ残基が、アミノ含有物質とのＴＧ’ａｓｅにより触媒される架橋に利用可能であるわけではない。反対に、ごくわずかのＧｌｎ残基がＴＧ’ａｓｅ基質として本来機能するが、どのＧｌｎ残基が良好なＴＧ’ａｓｅ基質であるかを支配する正確なパラメータはわかっていない。従って、タンパク質をＴＧ’ａｓｅにより触媒される架橋反応を受けやすくするために、都合の良い位置でＴＧ’ａｓｅ基質として非常によく機能することが知られているアミノ酸配列を添加することがあらかじめ必要である場合が多い。いくつかのアミノ酸配列が優れた天然のＴＧ’ａｓｅ基質、たとえばサブスタンスＰ、エラフィン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、α２−プラスミン阻害物質、α−カゼイン、およびβ−カゼインであるか、またはこれを含むことが知られている。
【００７３】
機能的部位のブロッキング
過剰のポリマー結合は、ポリマーが結合しているポリペプチドの活性の損失につながる可能性があることが報告されている。この問題は、たとえば機能的部位に位置する結合基の除去または機能的部位が結合中にブロックされるように結合前に機能的部位をブロックすることにより排除することができる。後者の方法は、本発明のさらに別の態様を構成する（第一の方法はすでに例示し、たとえば機能的部位の近くに位置するリシン残基の除去による）。さらに詳細には、第二の方法に従って、ポリペプチドと非ポリペプチド部分間の結合は、ポリペプチドの機能的部位が、ポリペプチドの機能的部位と結合できるヘルパー分子によりブロックされる条件下で行われる。
【００７４】
好ましくは、ヘルパー分子は、レセプター、特にＧ−ＣＳＦレセプターまたはＧ−ＣＳＦレセプターの一部などのポリペプチドの機能的部位を特異的に認識するものである。別法として、ヘルパー分子は、抗体、特にＧ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドを認識するモノクローナル抗体である。特に、ヘルパー分子は、中和モノクローナル抗体であってもよい。
結合を行う前にポリペプチドをヘルパー分子と相互作用させる。これにより、ポリペプチドの機能的部位がシールドまたは保護され、その結果、ポリマーなどの非ポリペプチド部分による誘導化に利用できなくなる。ヘルパー分子から溶出した後、非ポリペプチド部分とポリペプチド間の結合は少なくとも部分的に保存された機能的部位で回復できる。
【００７５】
ブロックされた機能的部位を有するポリペプチドとポリマー、オリゴサッカライド部分、または任意の他の化合物とのその後の結合は、通常の方法、たとえば前記のようにして行われる。
ポリペプチドの機能的部位を結合からシールドするために用いられるヘルパー分子の性質とは無関係に、ヘルパー分子は、かかる基との結合がヘルパー分子からの結合したポリペプチドの脱着を阻害する分子の一部において適当な非ポリペプチド部分の結合基を含まないか、またはごくわずかしか含まないのが望ましい。この結果、ポリペプチドのシールドされていない部分に存在する結合基との選択的結合を得ることができ、ヘルパー分子を結合の繰り返されるサイクルに再使用することができる。たとえば、非ポリペプチド部分が、結合基としてリシンのイプシロンアミノ基またはＮ−末端アミノ酸残基を有するＰＥＧなどのポリマー分子である場合、ヘルパー分子は結合可能なイプシロンアミノ基が実質的にないのが望ましく、イプシロンアミノ基がないのが好ましい。従って、好ましい具体例において、ヘルパー分子は、ポリペプチドの機能的部位と結合できるタンパク質またはペプチドであり、該タンパク質またはペプチドは、適当な非ポリペプチド部分の結合可能な結合基がない。
【００７６】
ポリペプチド結合体が関心のあるポリペプチドをエンコードするヌクレオチドの多様な集団から調製される本発明の具体例に関連して特に興味深いことに、官能基のブロッキングが結合の前に、例えば発現されたポリペプチド変異体を、レセプター、抗体などの固定化ブロッキング基を含むマイクロタイタープレートにおいてプレートすることにより、マイクロタイタープレートにおいて行われる。
さらにもう一つの具体例において、ヘルパー分子はまず、たとえばセファデクスまたはアガロースビーズなどのカラム充填物質などの固相、あるいは反応容器などの表面と共有結合する。次に、ヘルパー分子を有するカラム物質上にポリペプチドをかけ、当該分野において公知の方法に従って、たとえば前記のようにして結合を行う。この手順により、ポリペプチド結合体が溶出によりヘルパー分子から分離される。ポリペプチド結合体は、ポリペプチド結合体の本質的な分解に至らない物理化学的条件下で慣用の技術により溶出される。ポリペプチド結合体を含有する液相を、ヘルパー分子が共有結合したままである液相から分離する。分離は、他の方法で行うことができる：たとえば、ヘルパー分子を特異的バインダー（たとえば、ストレプトアビジン）により認識できる第二の分子（たとえば、ビオチン）で誘導化させることができる。特異的バインダーを固相と結合させることができ、これにより、その後の溶出に際し、ヘルパー分子−第二分子複合体を保持するが、ポリペプチド結合体を保持しない第二のヘルパー−固相カラム上に通すことにより、ポリペプチド結合体をヘルパー分子−第二分子複合体から分離することができる。ポリペプチド結合体は、任意の適当な方法でヘルパー分子から放出させることができる。脱保護は、ヘルパー分子が結合しているＧ−ＣＳＦの機能的部位からこれが解離する条件を提供することにより達成できる。たとえば、ポリマーが結合する抗体と抗イディオタイプ抗体間の複合体は、ｐＨを酸性またはアルカリ性ｐＨに調節することにより解離させることができる。
【００７７】
標識されたポリペプチドの結合
もう一つ別の具体例において、ポリペプチドは標識、すなわち、典型的には１−３０、たとえば１−２０アミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはペプチド鎖を有する融合タンパク質として発現される。迅速で簡単な精製を可能にすることに加えて、標識は、標識されたポリペプチドと非ポリペプチド部分間の結合を達成するための都合の良い手段である。特に、標識はマイクロタイタープレートまたは標識されたポリペプチドが標識により固定化される他の担体、たとえば常磁性体ビーズにおける結合を達成するために用いることができる。標識されたポリペプチドの、たとえばマイクロタイタープレートにおける結合は、標識されたポリペプチドをマイクロタイタープレートにおいて培養ブロスから直接（原則として精製しない）固定化し、結合に付すことができる利点を有する。これにより、プロセス工程の合計数（発現から結合まで）を減少させることができる。さらに、標識はスペーサー分子として機能することができ、結合される固定化されたポリペプチドの向上された利用可能性を確実にする。標識されたポリペプチドを使用した結合は、本発明において開示された任意の非ポリペプチド部分、たとえばＰＥＧなどのポリマー分子に対するものであってよい。
【００７８】
用いられる特定の標識の同一性は、この標識がポリペプチドで発現でき、適当な表面または担体物質上に固定できる限り重要ではない。多くの適当な標識は、たとえばＵｎｉｚｙｍｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｍｍａｒｋから商業的に入手可能である。たとえば、標識は次の配列の任意のものからなる：
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ（配列番号５）
Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号９）
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１０）
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号１１）
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ（配列番号１２）
または次のうちの任意のものである：
ＥＱＫＬＩ  ＳＥＥＤＬ（配列番号１３）（Mol. Cell. Biol. 5:3610-16, 1985に記載されているＣ−末端標識）
ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）（Ｃ−またはＮ−末端標識）
ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１５）。
前記標識に対する抗体は、たとえばＡＤＩ、Ａｖｅｓ  Ｌａｂ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓから商業的に入手可能である。
ＰＥＧ化のために標識されたポリペプチドを使用する都合の良い方法を以下の物質および方法のセクションに記載する。その後の標識のポリペプチドからの開裂は、商業的に入手可能な酵素の使用により達成することができる。
【００７９】
本発明のポリペプチドまたは本発明の結合体のポリペプチド部分の調製法
本発明のポリペプチドまたは本発明の結合体のポリペプチド部分（所望によりグリコシル化形態であってよい）は、当該分野において公知の任意の適当な方法により産生することができる。かかる方法は、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を構築し、該配列を適当な形質転換またはトランスフェクトされた宿主において発現することを含む。しかしながら、本発明のポリペプチドは、あまり効率的ではないが、化学合成または化学合成の組み合わせまたは化学合成と組み換えＤＮＡ技術の組み合わせにより産生することができる。
【００８０】
本発明のポリペプチドまたは結合体のポリペプチド部分をエンコードするヌクレオチド配列は、親Ｇ−ＣＤＧ、たとえば配列番号１に示すアミノ酸配列を有するｈＧ−ＣＳＦをエンコードするヌクレオチド配列を単離または合成し、次いでヌクレオチド配列を、関連するアミノ酸残基の導入（すなわち、挿入または置換）または欠失（すなわち、除去または置換）が行われるように変更することにより構築することができる。
ヌクレオチド配列は、都合の良い方法にしたがって、部位特異的突然変異誘発により都合良く修飾される。別法として、ヌクレオチド配列は、化学合成、たとえばオリゴヌクレオチドが所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチド合成器を使用し、好ましくは組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞において有利なコドンを選択することにより調製される。たとえば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ、結紮または結紮連鎖反応（ＬＣＲ）により合成し、組み立てることができる(Barany, PNAS 88:189-193, 1991)。個々のオリゴヌクレオチドは典型的には相補アセンブリの５’または３’オーバーハングを含む。
【００８１】
別のヌクレオチド配列修飾法、たとえばＵＳ５，０９３，２５７に開示されているようなホモローガスなクロスオーバーを含む方法、および遺伝子シャッフリング、すなわち２以上のホモローガスなヌクレオチド配列間の組み換えの結果、出発ヌクレオチド配列と比べた場合に多くのヌクレオチド変更を有する新規ヌクレオチド配列が得られる方法が、高スループットスクリーニングのためのポリペプチド変異体を産生するために利用可能である。遺伝子シャッフリング（ＤＮＡシャッフリングともいう）は、ヌクレオチド配列のランダムな断片化および再組み立ての１以上のサイクルを含み、それに続いて所望の性質を有するポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を選択するためのスクリーニングを行う。相同性ベースの核酸シャッフリングを行うために、ヌクレオチド配列の関連する部分は好ましくは少なくとも５０％同一、たとえば少なくとも６０％同一であり、さらに好ましくは少なくとも７０％同一であり、たとえば少なくとも８０％同一である。組み換えは、インビトロまたはインビボで行うことができる。
【００８２】
適当なインビトロ遺伝子シャッフリング法の例は、Stemmer et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA; vol. 91, pp. 10747-10751; Stemmer (1994), Nature, vol. 370, pp. 389-391; Smith (1994), Nature vol. 370, pp. 324-325; Zhao et al., Nat. Biotechnol. 1998, Mar; 16(3): 258-61; Zhao H. and Arnold, FB, Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25. No. 6 pp. 1307-1308; Shao et al., Nucleic Acids Research 1998, Jan 15; 26(2): pp. 681-83;およびWO 95/17413により開示されている。適当なインビボシャッフリング法の例は、ＷＯ９７／０７２０５に開示されている。核酸配列のインビトロまたはインビボ組み換えによる突然変異のための他の技術は、ＷＯ９７／２００７８およびＵＳ５，８３７，４５８に開示されている。特定のシャッフリング技術の例は、「ファミリーシャッフリング」、「合成シャッフリング」および「インシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）シャッフリング」を包含する。ファミリーシャッフリングは、異なる種から得られるホモローガスな遺伝子のファミリーを、シャッフリングとその後のスクリーニングまたは選択の１以上のサイクルに付すことを含む。ファミリーシャッフリング技術は、たとえば、Crameri et al. (1998), Nature, vol. 391, pp. 288-291; Christians et al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 259-264; Chang et al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, pp. 793-797;およびNess et al. (1999), Nature Biotechnology, vol. 17, 893-896により開示されている。合成シャッフリングは、たとえば関心のあるホモローガスな遺伝子の配列に基づいてオーバーラップする合成オリゴヌクレオチドのライブラリーを提供することを含む。合成により生成するオリゴヌクレオチドを組み換え、結果として得られる組み換え核酸配列をスクリーンし、望ましいならばさらにシャッフリングサイクルに用いる。合成シャッフリング技術はＷＯ００／４２５６１に開示されている。インシリコシャッフリングは、コンピューターシステムを用いて行うかまたはモデル化され、これにより核酸の物理的操作が部分的または全体的に回避されるＤＮＡシャッフリング法を意味する。インシリコシャッフリングの技術は、ＷＯ００／４２５６０に開示されている。
【００８３】
（合成、部位特異的突然変異誘発または別の方法により）いったん組み立てられると、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列が組み換えベクター中に挿入され、所望の形質転換された宿主細胞においてＧ−ＣＳＦの発現に必要な調節配列と作動可能に結合される。
もちろん、本明細書に記載されるポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を発現するために十分等しくすべてのベクターおよび発現調節配列が機能するわけではないことは理解される。また、すべての宿主が同じ発現系について等しく機能するわけではない。しかしながら、これらのベクター、発現調節配列および宿主間で実験を行わずに選択を行うことができる。たとえば、ベクターの選択において、ベクターはその中で複製するかまたは染色体中に統合できなければならないので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数は、コピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどのベクターによりエンコードされる任意の他のタンパク質の発現も考慮すべきである。発現調節配列の選択において、様々な因子を考慮しなければならない。これらは、たとえば配列の相対的強度、その調節可能性、およびそのポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列との適合性、特に潜在的二次構造を含む。宿主は、その選択されたベクターとの適合性、ヌクレオチド配列によりコードされた生成物の毒性、その分泌特性、そのポリペプチドを正確に折り畳む能力、その発酵または培養要件、およびヌクレオチド配列によりコードされる生成物の精製の容易性を考慮することにより選択すべきである。
【００８４】
組み換えベクターは、自発的に複製するベクター、すなわち染色体外物質として存在するベクターであり、その複製が染色体複製と独立しているもの、たとえばプラスミドである。あるいは、ベクターは宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、その中に組み入れられた染色体と一緒に複製されるものである。
ベクターは好ましくは、本発明のポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の転写に必要なさらなるセグメントと作動可能に結合した発現ベクターである。ベクターは典型的にはプラスミドまたはウイルスＤＮＡから誘導される。本明細書において記載される宿主細胞における発現に適当な多くの発現ベクターは、商業的に入手可能であるか、または文献に記載されている。真核宿主の有用な発現ベクターは、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの発現調節配列を含むベクターを包含する。具体的なベクターは、例えば、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）／Ｈｙｇ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)およびｐＣＩ−ｎｅｏ(Stratagene, La Jolla, CA, USA)である。酵母細胞の有用な発現ベクターは、２μプラスミドおよびその誘導体、ＰＯＴ１ベクター（ＵＳ４，９３１，３７３）、Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996に記載されているｐＪＳＯ３７ベクター、およびｐＰＩＣＺ、Ａ、ＢまたはＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を包含する。昆虫細胞の有用なベクターは、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Cate et al., ”Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells”, Cell, 45, pp. 685-98 (1986)）、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５およびｐＭｅｌｂａｃ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を包含する。細菌宿主の有用な発現ベクターは、公知細菌プラスミド、例えばイー・コリから得られるプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１２ａ（両方ともＮｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡから得られる）を含む）、さらに広範囲の宿主プラスミド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばファージラムダの多くの誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のＤＮＡファージ、たとえばＭ１３および糸状一本鎖ＤＮＡファージを包含する。
【００８５】
本発明において用いられる他のベクターは、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチドがコピー数において増幅されるのを許容するものを包含する。かかる増幅可能なベクターは当該分野において周知である。これらは、例えばＤＨＦＲ増幅（例えば、Kaufman, U.S. Pat. No. 4,470,461, Kaufman and Sharp, ”Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression”, Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)参照）およびグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）増幅（例えば、ＵＳ５，１２２，４６４およびＥＰ３３８，８４１参照）により増幅することができるベクターを包含する。
組み換えベクターはさらに、問題の宿主細胞においてベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を含んでもよい。かかる配列の例（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）は、複製のＳＶ４０起源である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターの複製を可能にする適当な配列は酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３および複製起源である。
ベクターは選択可能なマーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠点を補完する遺伝子、たとえばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子またはシゾサッカロミセス・ポンベＴＰＩ遺伝子（P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130により記載）、またはアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬剤の耐性を賦与するものを含む。サッカロミセス・セレビシエに関して、選択可能なマーカーは、ｕｒａ３およびｌｅｕ２を包含する。糸状菌に関して、選択可能なマーカーはａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤおよびｓＣを包含する。
【００８６】
「調節配列」なる用語は、本発明において、本発明のポリペプチドの発現に必要または有利な全ての成分を包含すると定義される。各調節配列は、ポリペプチドをエンコードする核酸配列に対して自生または外来である。かかる調節配列は、これらに限定されないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを包含する。最低でも、調節配列はプロモーターを含む。
【００８７】
さまざまな発現調節配列を本発明において用いることができる。このような有用な発現調節配列は、外来発現ベクターの構造遺伝子と結合した発現調節配列ならびに原核または真核細胞またはそのウイルス、およびその様々な組み合わせの遺伝子の発現を調節することが知られている任意の配列を含む。
哺乳動物において転写を行うための適当な調節配列の例は、ＳＶ４０およびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、たとえばアデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト延長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ショウジョウバエ最小熱ショックタンパク質７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチン（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、ＳＶ４０またはアデノウイルスＥｌｂ領域ポリアデニル化シグナルおよびコザックのコンセンサス配列(Kozak, M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947-50)を含む。
【００８８】
哺乳動物細胞における発現を向上させるために、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列の５’未翻訳領域中に合成イントロンを挿入することができる。合成イントロンの例は、プラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ（Promega Corporation, WI, USAから入手可能）からの合成イントロンである。
昆虫細胞における転写を行うための適当な調節配列の例は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核体症ウイルス塩基性タンパク質プロモーター、バクロウイルス最初期遺伝子１プロモーター、バクロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーター、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。酵母宿主細胞において使用するために適当な調節配列の例は、酵母α−接合型システムのプロモーター、酵母トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解糖遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのプロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター、および誘導ＧＡＬプロモーターを包含する。糸状菌宿主細胞において使用するために適当な調節配列の例は、ＡＤＨ３プロモーターおよびターミネーター、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）ＴＡＫＡアミラーゼトリオースホスフェートイソメラーゼまたはアルカリプロテアーゼ、エイ・ニガー（A. niger）α−アミラーゼ、エイ・ニガーまたはエイ・ニデュランス（A. nidulans）グルコアミラーゼ、エイ・ニデュランスアセトアミダーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼまたはリパーゼをエンコードする遺伝子から誘導されるプロモーター、ＴＰ１１ターミネーターおよびＡＤＨ３ターミネーターを包含する。細菌宿主細胞における使用に適当な調節配列の例は、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステムのプロモーター、およびファージラムダの主要プロモーター領域を包含する。
【００８９】
シグナルペプチドの存在または不在は、発現されるポリペプチド（これが細胞内または細胞外ポリペプチドであるかどうかに関わらず）の産生に用いられる発現宿主細胞によって、また分泌を得るために望ましいかどうかによって変わる。糸状菌における使用に関して、シグナルペプチドは、アスペルギルス種アミラーゼまたはグルコアミラーゼをエンコードする遺伝子、リゾムコール・ミエヘイリパーゼまたはプロテアーゼまたはフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼをエンコードする遺伝子から都合よく誘導することができる。シグナルペプチドは、好ましくは、エイ・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、エイ・ニガー中性α−アミラーゼ、エイ・ニガー酸安定性アミラーゼ、またはエイ・ニガーグルコアミラーゼをエンコードする遺伝子から誘導される。昆虫細胞における使用に関しては、シグナルペプチドは、昆虫遺伝子（ＷＯ９０／０５７８３参照）、例えば、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ  ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ脂質動員ホルモン前駆体（ＵＳ５，０２３，３２８参照）、ミツバチメリチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、エクジステロイドＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ｅｇｔ）(Murphy et al., Protein Expression and Purification 4, 349-357 (1993))またはヒト膵臓リパーゼ（ｈｐｌ）（Methods in Enzymology 284, pp. 262-272, 1997）から都合よく誘導することができる。哺乳動物細胞における使用に好ましいシグナルペプチドは、ｈＧ−ＣＳＦまたはネズミＩｇカッパ軽鎖シグナルペプチド（Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152:89-104）を有するものである。酵母細胞における使用に関して、適当なシグナルペプチドは、エス・セレビシエからのα−ファクターシグナルペプチド（ＵＳ４，８７０，００８参照）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897参照）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０参照）、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137参照）、および合成リーダー配列ＴＡ５７（ＷＯ９８／３２８６７）であることが判明している。イー・コリ細胞における使用に関して、適当なシグナルペプチドは、シグナルペプチドｏｍｐＡであることが判明している。
【００９０】
Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドをエンコードする本発明のヌクレオチド配列は、部位特異的突然変異誘発、合成、ＰＣＲまたは他の方法により調製されるかどうかにかかわらず、所望によりシグナルペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。ポリペプチドが発現される細胞から分泌される場合、シグナルペプチドが存在する。このようなシグナルペプチドは、もし存在するなら、ポリペプチドの発現のために選択される細胞により認識されるものである。シグナルペプチドは、ポリペプチドに対してホモローガス（例えば、通常ｈＧ−ＣＳＦと関連する）またはヘテロローガス（すなわち、ｈＧ−ＣＳＦ以外の起源から生じる）であるか、または宿主細胞に対してホモローガスまたはヘテロローガスである、すなわち、宿主細胞から通常発現されるシグナルペプチドまたは宿主細胞から通常発現されないものである。従って、シグナルペプチドは、たとえばイー・コリ（E. coli）などの細菌から誘導される原核生物、あるいは哺乳動物、昆虫または酵母細胞などから誘導される真核細胞である。
【００９１】
本発明の結合体のポリペプチドまたはポリペプチド部分を産生するために、細菌、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物、または他の適当な動物細胞または細胞系、ならびにトランスジェニック動物または植物を包含する任意の適当な宿主を用いることができる。細菌宿主細胞の例は、グラム陽性菌、たとえばバチルス（Bacillus）の菌株、たとえばビー・ブレビス（B. brevis）またはビー・サチリス（B. subtilis）、またはストレプトミセス（Streptomyces）、あるいはグラム陰性菌、たとえばイー・コリまたはシュードモナス（Pseudomonas）の菌株を包含する。ベクターの細菌宿主細胞への導入は、たとえば、原形質体形質転換（例えば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115参照）により、コンピテント細胞（たとえば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221参照）、エレクトロポレーション（例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751参照）、または結合（例えば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278参照）を用いて行うことができる。適当な糸状真菌宿主細胞の例は、アスペルギルスの菌株、例えばエイ・オリザエ、エイ・ニガー、エイ・ニデュランス、フサリウムまたはトリコデルマ（Trichoderma）を包含する。真菌細胞は、それ自体公知の方法で原形質体形成、原形質体の形質転換、および細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換することができる。アスペルギルス宿主細胞を形質転換するための適当な手順は、ＥＰ２３８０２３およびＵＳ５，６７９，５４３に記載されている。フサリウム種を形質転換するための適当な方法は、Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156およびＷＯ  ９６／００７８７に記載されている。適当な酵母細胞の例は、サッカロミセスの菌株、例えば、エス・セレビシエ、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、クリベロミセス（Klyveromyces）、ピチア（Pichia）、たとえばピー・パストリス（P. pastoris）またはピー・メタノリカ（P. methanolica）、ハンセヌラ（Hansenula）、たとえばエイチ・ポリモルファ（H. polymorpha）またはヤロウィア（Yarrowia）を包含する。酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920:により記載されている方法を用いて、Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, USA (in the product protocol for the YeastmakerTM Yeast Transformation System Kit)により開示されているようにして形質転換することができる。適当な昆虫宿主細胞の例は、鱗翅類細胞系、たとえばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９またはＳｆ２１）またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｏａ  ｎｉ細胞（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）（ＵＳ５，０７７，２１４）を包含する。昆虫細胞の形質転換およびヘテロローガスなポリペプチドの産生は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより記載されているようにして行うことができる。適当な哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）、ミドリザル細胞系（ＣＯＳ）（例えば、ＣＯＳ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ７（ＡＴＣＣ  ��ＲＬ−１６５１））；マウス細胞（例えば、ＮＳ／Ｏ）、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞系（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２またはＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、およびヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３））、ならびに組織培養における植物細胞を包含する。さらなる適当な細胞系は当該分野において公知であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）などの一般の受託所から入手可能である。外因性ＤＮＡを哺乳動物宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポソームによるトランスフェクション、ウイルスベクターおよびLife Technologies Ltd, Paisley, UK using Lipofectamin 2000により記載されているトランスフェクション法を包含する。これらの方法は当該分野において周知であり、例えば、Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USAにより記載されている。哺乳動物細胞の培養は、確立された方法にしたがって、たとえば(Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jersey, USA and Harrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997)に開示されているようにして行われる。
【００９２】
本発明の産生法において、当該分野において公知の方法を用いてポリペプチドの産生に適当な栄養培地において細胞を培養する。例えば、細胞をフラスコ振盪培養、適当な培地中、ポリペプチドの発現および／または単離を可能にする条件下で行われる実験室または工業的発酵槽中での小規模または大規模発酵（連続、バッチ、供給−バッチ、または固相発行を包含する）により、培養することができる。培養は、炭素および窒素供給源および無機塩を含む適当な栄養培地中で、当該分野において公知の方法を用いて行われる。適当な培地は、商業的供給者から入手可能であるか、または公開された組成物（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ）にしたがって調製することができる。ポリペプチドが栄養培地中に分泌されるならば、ポリペプチドは培地から直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されないならば、細胞溶解物から回収することができる。
【００９３】
結果として得られるポリペプチドは、当該分野において公知の方法により回収することができる。例えば、ポリペプチドは、これらに限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿を包含する慣例の方法により栄養培地から回収することができる。
ポリペプチドは、これらに限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、調製的等電点フォーカシング）、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989参照）を包含する当該分野において公知の様々な方法により精製することができる。Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドを精製するための特定の方法は、D. Metcalf and N. A. Nicola in The hemopoietic colony-stimulating factors, p. 5051, Cambridge University Press (1995), by C. S. Bae et al., Appl. Microbiol. Biotechnol, 52:338-344 (1999)およびＵＳ４，８１０，６４３に記載されている。
【００９４】
本発明の医薬組成物およびその使用
さらにもう一つの態様において、本発明は、本明細書に記載するポリペプチドまたは結合体および少なくとも一つの医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を含む。
本発明のポリペプチド、結合体または医薬組成物は、疾患の治療、特に化学療法、放射線療法および骨髄移植を受けている癌患者における感染症の予防、末梢血先祖細胞移植における採集のための先祖細胞の起動、重い慢性または相対的白血球減少症の治療、急性骨髄性白血病の患者の治療、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患の治療、および抗真菌療法、特に全身性または侵襲性カンジダ症の治療用医薬を製造するために用いることができる。
【００９５】
もう一つの態様において、本発明のポリペプチド、結合体または医薬組成物は、放射線療法または化学療法から起こるものを包含する一般的な造血障害、特に好中球減少症または白血球減少症、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患の哺乳動物を治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物にかかるポリペプチド、結合体または医薬組成物を投与することを含む方法において用いられる。特に、この方法は、例えば化学療法、放射線療法、あるいはＨＩＶまたは他のウイルス感染症による不十分な好中球レベルの患者において好中球のレベルを増大させることを目的とする。
【００９６】
本発明のポリペプチドおよび結合体は「治療的に有効な」用量、すなわち、投与された状態に関して所望の効果を生じるために十分な用量で患者に投与される。正確な用量は、治療される障害によって変わり、公知技術を用いて当業者により確認できる。本発明のポリペプチドまたは結合体は、例えば、ＮｅｕｐｏｇｅｎなどのｒｈＧ−ＣＳＦを用いた療法において用いられるのと類似した用量で投与することができる。本発明の結合体の適当な用量は、体重１ｋｇあたり約５−３００マイクログラム（結合体のタンパク質部分の重量に基づく）、例えば１０−２００マイクログラム／ｋｇ、たとえば２５−１００マイクログラム／ｋｇの範囲である。本発明のポリペプチド、結合体または組成物の有効量は、とりわけ、疾患、用量、投与スケジュール、ポリペプチドまたは結合体または組成物が単独で投与されるかまたは他の治療薬と組み合わせて投与されるかどうか、組成物の血清半減期、患者の身体全体の健康状態、および投与の頻度によって変わる。好ましくは、本発明のポリペプチド、結合体、製剤または組成物は、有効な用量、特に白血球、特に好中球の数を標準化するために十分な用量で問題の患者に投与される。白血球の数の標準化は、確立された慣例法にしたがって、規則正しい間隔で白血球の数を単にカウントすることにより決定することができる。
【００９７】
本発明のポリペプチドまたは結合体は、好ましくは、１以上の医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物において投与される。ポリペプチドまたは結合体は、当該分野においてそれ自体公知の方法で医薬組成物中に処方することができ、その結果、十分貯蔵安定性で、ヒトまたは動物への投与に適したポリペプチド医薬が得られる。医薬組成物は、液体またはゲル、または凍結乾燥、または任意の他の適当な形態を包含する様々な形態に処方することができる。好ましい形態は、治療される特定の適応症に依存し、当業者には明らかである。
【００９８】
従って、本発明は様々な形態の白血球減少症または好中球減少症を治療するための組成物および方法を提供する。特に、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、ある種の放射線療法、化学療法および骨髄移植を受けている癌患者における感染症を予防するため、末梢血先祖細胞移植において採集のために先祖細胞を移動させるため、重い慢性または相対的白血球減少症の治療のため、および急性骨髄性白血病の患者の治療をサポートするために用いることができる。加えて、本発明のポリペプチド、結合体または組成物は、ＡＩＤＳまたは他の免疫不全疾患の治療および抗真菌療、特に全身性または侵襲性カンジダ症の治療、および細菌感染症の治療に用いることができる。
【００９９】
本発明のポリペプチド結合体は、長いインビボ半減期を有し、毎日投与しなければならないｈＧ−ＣＳＦと対照的に１回の投与により好中球減少および白血球減少の期間を減少させることが判明しているので、本発明の結合体は、例えば好中球減少症の予防および／治療のための週単位での投与に非常に適している。一具体例において、本発明のポリペプチド結合体および医薬組成物は、化学療法による好中球減少症の予防および／または治療用である。例えば静脈内注射あるいは皮下または筋肉内注射などの他の種類の注射により週単位で、間隔をおいて投与される化学療法の場合において、本発明の結合体を化学療法あたり１回の投与、すなわち化学療法の前、後または同時に投与することで通常十分である。化学療法が違う方法で投与される他の場合、たとえば毎日経口投与されるかまたは注入ポンプにより長期間にわたって投与される場合において、本発明の結合体は、類似した方法で、たとえば１週間に１回、または１週間に１回より少ない頻度で行われる化学療法セッションの場合においては、１セッションあたり１回で投与することができる。
【０１００】
剤形
本発明のポリペプチドまたは結合体は、「そのまま」および／またはその塩形態において用いることができる。適当な塩としては、これらに限定されないが、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、たとえばナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムとの塩、ならびに亜鉛塩が挙げられる。これらの塩または複合体は、結晶および／またはアモルファスな構造として存在し得る。
【０１０１】
賦形剤
「医薬的に許容される」とは、採用された用量および濃度で、それが投与される患者において都合の悪い効果を引き起こさない担体または賦形剤を意味する。このような医薬的に許容される担体および賦形剤は当該分野において周知である（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000] ;およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]参照）。
【０１０２】
薬剤の混合物
本発明の医薬組成物は、単独または他の治療薬と組み合わせて投与することができる。これらの薬剤は、同じ医薬組成物の一部として組み入れてもよいし、あるいは別の治療スケジュールと同時にまたはこれと一致して、本発明のポリペプチドまたは結合体と別に投与してもよい。加えて、本発明のポリペプチド、結合体または医薬組成物は、他の治療のアジュバントとして用いることができる。
【０１０３】
患者
本発明の目的についての「患者」は、ヒトおよび他の哺乳動物の両方を包含する。従って、該方法はヒトの治療および獣医学的用途の両方に適用可能である。
投与経路
本発明の処方の投与は、これらに限定されないが、経口、皮下、静脈内、大脳内、鼻内、経皮、腹膜組織内、筋肉内、肺臓内、経膣、経直腸、眼内を含む様々な方法、または任意の他の許容される方法で行うことができる。処方は、注入により連続して投与できるが、当該分野において周知の技術を用いたボーラス注射が許容される。典型的には、処方はたとえば皮下経路による非経口投与用に設計される。
【０１０４】
非経口薬
医薬組成物の一例は、非経口投与用に設計された溶液である。多くの場合において医薬溶液処方は、即座に使用するのに適した液体形態で提供されるが、このような非経口処方は、凍結または凍結乾燥された形態においても提供できる。前者の場合において、組成物は使用前に解凍しなければならない。凍結乾燥製剤は一般に液体の対応するものよりも安定であることが当業者により認識されているので、後者の形態は、様々な貯蔵条件下で組成物中に含まれる活性化合物の安定性を向上させるためにしばしば用いられる。このような凍結乾燥製剤は、１以上の適当な医薬的に許容される希釈剤、例えば注射用滅菌水または滅菌生理食塩水を添加することにより使用前に復元される。
【０１０５】
非経口製剤の場合において、これらは凍結乾燥されたは処方として、または適当ならば所望の程度の純度を有するポリペプチドを当該分野において典型的に用いられる１以上の医薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤（これら全てを「賦形剤」と称する）、例えば緩衝剤、安定剤、保存料、等張化剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤および／または他の添加剤と混合することにより水性溶液として貯蔵するために調製される。
【０１０６】
緩衝剤は、生理学的状態に近い範囲のｐＨを維持するのを助ける。これらは典型的には約２ｍＭから約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明に関して使用するのに適当な緩衝剤は、有機および無機酸およびその塩、たとえばクエン酸塩緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸塩緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸塩緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸塩緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸塩緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸塩緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸塩緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）を包含する。さらに可能性のあるものは、リン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩、たとえばＴｒｉｓである。
【０１０７】
微生物の成長を遅らせるために保存料を添加し、典型的には約０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の量で添加する。本発明に関する使用に適当な保存料は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハライド（例えば、ベンザルコニウムクロリド、ブロミドまたはヨージド）、ヘキサメトニウムクロリド、アルキルパラベン、たとえばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロへキサノールおよび３−ペンタノールを包含する。
【０１０８】
等張化剤は、液体組成物の等張性を確実にするために添加され、多価糖アルコール、好ましくは三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールを包含する。多価アルコールは、他の成分の相対的量を考慮して、０．１重量％から２５重量％、典型的には１％から５％の間の量において存在し得る。
【０１０９】
安定剤は、増量剤から、治療薬を可溶化させるかあるいは変性または容器壁への付着を防止するのを助ける添加剤まで、機能が様々な広範囲に及ぶ賦形剤を意味する。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（前記の通り）；アミノ酸、例えばアルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オミチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなど（イノシトールなどのシクリトールを包含する）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（すなわち＜１０残基）；タンパク質、たとえばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；モノサッカライド、例えばキシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコース；ジサッカライド、例えばラクトース、マルトースおよびシュークロース；トリサッカライド、たとえばラフィノース、およびポリサッカライド、たとえばデキストランである。安定剤は、典型的には活性タンパク質に基づいて０．１から１００００重量部の範囲で存在する。
【０１１０】
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」ともいう）は、治療剤の可溶化を助けるため、ならびに撹拌により誘発される凝集に対して治療ポリペプチドを保護するために提供され、これはさらにポリペプチドの変性を引き起こすことなく剪断表面応力に処方をさらさせる。適当な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８等）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０など）を包含する。
さらに他のミセル性賦形剤は、増量剤またはフィラー（例えばデンプン）、キレート化剤（例えばＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および補助溶剤を包含する。
活性成分は、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ（メチルメタクリレート）ミクロカプセルなどの、例えばｃｏａｓｃｅｒｖａｔｉｏｎ技術または界面重合により調製されるミクロカプセル中、コロイド状ドラッグデリバリーシステム中（たとえばリポソーム、アルブミン微小球、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中に封入することができる。このような技術は、前出のRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
インビボ投与に用いられる非経口処方は無菌でなければならない。これは、たとえば滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１１１】
持続性放出製剤
持続性放出製剤の適当な例は、ポリペプチドまたは結合体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、フィルムまたはミクロカプセルなどの適当な形態を有するマトリックスを包含する。持続性放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸およびエチルＬ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＰｒｏＬｅａｓｅテクノロジーまたはＬｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびレオプロリドアセテートからなる注射可能な微小球）、およびポリ−Ｄ−（−）−ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日までまたはそれ以上などの長期間の分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルはさらに短い期間タンパク質を放出する。封入されたポリペプチドが長時間体内に残存する場合、これらは３７℃で湿度にさらされる結果、変性または凝集し、その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与するメカニズムに応じて安定化のために合理的な方法を考案することができる。例えば、凝集のメカニズムがチオジスルフィド交換による細胞間Ｓ−Ｓ結合形成であることが見いだされるならば、安定化はスルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿分を調節し、適当な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
本明細書に記載される全ての文献はあらゆる目的に関して出典明示により全体として本発明の一部として参照される。
本発明を以下の非制限的実施例においてさらに説明する。
【０１１２】
物質および方法
修飾されるアミノ酸を決定するために用いられる方法
利用可能な表面積（ＡＳＡ）
ＮＭＲ分光分析（Zink et al. (1994) Biochemistry 33: 8453-8463）により決定された３Ｄアンサンブルの１０の構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から入手可能である(www.rcsb.org/pdb/)。この情報は、コンピュータープログラムアクセス（B. Lee and F.M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971)）バージョン２（(著作権） 1983 Yale University）に入力することができ、構造中の各原子の利用可能な表面積（ＡＳＡ）を計算するために用いることができる。この方法は典型的には１．４Åのプローブサイズを使用し、利用可能な表面積（ＡＳＷＡ）をプローブの中心により形成される面積と定義する。この計算の前に、タンパク質に直接関連しない他の原子同様、全ての水分子および全ての水素原子を同格の組から除去しなければならない。
【０１１３】
側鎖のＡＳＡ率
側鎖における原子のＡＳＡの合計を、延長されたＡＬＡ−ｘ−ＡＬＡトリペプチドにおける残基タイプの側鎖原子のＡＳＡを表す値で割ることにより、側鎖原子のＡＳＡ率を計算する。Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J.Mol.Biol.220, 507-530参照。この例に関して、ＣＡ原子はグリシン残基の側鎖の一部と見なされるが、残りの残基についてはみなされない。次の表の値は、側鎖の標準１００％ＡＳＡとして使用される：
【表３】
2005506317.tif 000005
構造において検出されない残基は、柔軟な領域にあると考えられるので、１００％露出面を有すると定義される。
【０１１４】
原子間の距離の決定
原子間の距離は、分子グラフィクスソフトウェア、たとえばＩｎｓｉｇｈｔＩＩ  ｖ。９８．９、ＭＳＩ  ＩＮＣ．を用いて最も容易に決定される。
修飾されるアミノ酸残基に関する一般的問題
すでに説明したように、本発明にしたがって修飾されるアミノ酸は、好ましくはその側鎖の表面が露出しているもの、特に側鎖の約２５％が分子の表面で露出しているもの、さらに好ましくは、側鎖の５０％以上が露出しているものである。別の問題は、レセプター界面に位置する残基は、好ましくはレセプター結合または活性化との干渉の可能性を回避するか、または少なくとも最小限に抑えるために好ましくは排除されることである。さらなる問題は、最も近いＬｙｓ（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）ＣＢ−ＣＢ（ＧｌｙについてＣＡ）から１０Å未満である残基も排除すべきことである。最後に、修飾の好ましい位置は、特に親水性および／または荷電残基、すなわち、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＳｅｒおよびＴｈｒを有するものであり、アルギニン残基を有する位置が特に好ましい。
【０１１５】
修飾のためのＧ−ＣＳＦアミノ酸残基の同定
以下の情報は、本発明に従って修飾されるアミノ酸残基を同定する場合に一般に考慮すべき因子を説明する。
Ｘ線結晶学（(Hill et al. (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 51675171）およびＮＭＲ分光学（Zink et al. (1994) Biochemistry 33: 8453-8463）により、ヒトＧ−ＣＳＦについて三次元構造が報告されている。前記のように、Aritomiら(Nature 401:713-717, 1999)は、次のｈＧ−ＣＳＦ残基をレセプター結合界面の一部であると同定した：Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｌ１５、Ｋ１６、Ｅ１９、Ｑ２０、Ｌ１０８、Ｄ１０９、Ｄ１１２、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｑ１１９、Ｅ１２２、Ｅ１２３、およびＬ１２４。従って、これらの残基を修飾することが可能であるが、これらの残基は修飾から除外するのが好ましい。
【０１１６】
入力構造としてZinkら(1994)により同定されたＧ−ＣＳＦの１０ＮＭＲ構造を用い、続いて側鎖の平均ＡＳＡを計算して、次の残基が２５％以上のＡＳＡを有すると確認された：Ｍ０、Ｔ１、Ｐ２、Ｌ３、Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｆ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｋ１６、Ｃ１７、Ｅ１９、Ｑ２０、Ｖ２１、Ｒ２２、Ｋ２３、Ｑ２５、Ｇ２６、Ｄ２７、Ａ２９、Ａ３０、Ｅ３３、Ｋ３４、Ｃ３６、Ａ３７、Ｔ３８、Ｙ３９、Ｋ４０、Ｌ４１、Ｈ４３、Ｐ４４、Ｅ４５、Ｅ４６、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｌ５０、Ｈ５２、Ｓ５３、Ｌ５４、Ｉ５６、Ｐ５７、Ｐ６０、Ｌ６１、Ｓ６２、Ｓ６３、Ｐ６５、Ｓ６６、Ｑ６７、Ａ６８、Ｌ６９、Ｑ７０、Ｌ７１、Ａ７２、Ｇ７３、Ｃ７４、Ｓ７６、Ｑ７７、Ｌ７８、Ｓ８０、Ｆ８３、Ｑ８６、Ｇ８７、Ｑ９０、Ｅ９３、Ｇ９４、Ｓ９６、Ｐ９７、Ｅ９８、Ｌ９９、Ｇ１００、Ｐ１０１、Ｔ１０２、Ｄ１０４、Ｔ１０５、Ｑ１０７、Ｌ１０８、Ｄ１０９、Ａ１１１、Ｄ１１２、Ｆ１１３、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｗ１１８、Ｑ１１９、Ｑ１２０、Ｍ１２１、Ｅ１２２、Ｅ１２３、Ｌ１２４、Ｍ１２６、Ａ１２７、Ｐ１２８、Ａ１２９、Ｌ１３０、Ｑ１３１、Ｐ１３２、Ｔ１３３、Ｑ１３４、Ｇ１３５、Ａ１３６、Ｍ１３７、Ｐ１３８、Ａ１３９、Ａ１４１、Ｓ１４２、Ａ１４３、Ｆ１４４、Ｑ１４５、Ｒ１４６、Ｒ１４７、Ｓ１５５、Ｈ１５６、Ｑ１５８、Ｓ１５９、Ｌ１６１、Ｅ１６２、Ｖ１６３、Ｓ１６４、Ｙ１６５、Ｒ１６６、Ｖ１６７、Ｌ１６８、Ｒ１６９、Ｈ１７０、Ｌ１７１、Ａ１７２、Ｑ１７３、Ｐ１７４。
【０１１７】
同様に、次の残基は５０％以上のＡＳＡを有する：Ｍ０、Ｔ１、Ｐ２、Ｌ３、Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｆ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｋ１６、Ｃ１７、Ｅ１９、Ｑ２０、Ｒ２２、Ｋ２３、Ｇ２６、Ｄ２７、Ａ３０、Ｅ３３、Ｋ３４、Ｔ３８、Ｋ４０、Ｌ４１、Ｈ４３、Ｐ４４、Ｅ４５、Ｅ４６、Ｌ４９、Ｌ５０、Ｓ５３、Ｐ５７、Ｐ６０、Ｌ６１、Ｓ６２、Ｓ６３、Ｐ６５、Ｓ６６、Ｑ６７、Ａ６８、Ｌ６９、Ｑ７０、Ｌ７１、Ａ７２、Ｇ７３、Ｓ８０、Ｆ８３、Ｑ９０、Ｇ９４、Ｐ９７、Ｅ９８、Ｐ１０１、Ｄ１０４、Ｔ１０５、Ｌ１０８、Ｄ１１２、Ｆ１１３、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｑ１１９、Ｑ１２０、Ｅ１２２、Ｅ１２３、Ｌ１２４、Ｍ１２６、Ｐ１２８、Ａ１２９、Ｌ１３０、Ｑ１３１、Ｐ１３２、Ｔ１３３、Ｑ１３４、Ｇ１３５、Ａ１３６、Ａ１３９、Ａ１４１、Ｓ１４２、Ａ１４３、Ｆ１４４、Ｒ１４７、Ｓ１５５、Ｓ１５９、Ｅ１６２、Ｒ１６６、Ｖ１６７、Ｒ１６９、Ｈ１７０、Ｌ１７１、Ａ１７２、Ｑ１７３、Ｐ１７４。
【０１１８】
リシンのＮＺ原子およびＮ−末端残基Ｔ１のＮ原子と定義される、最も近いアミン基から１５Å以上の距離でそのＣＢ原子（グリシンの場合においてはＣＡ）を有する残基を決定するために、分子グラフィクスプログラムＩｎｓｉｇｈｔＩＩ  ｖ．９．８を使用した。次のリストは、１０のＮＭＲ構造のうちの少なくとも一つにおいてこの基準を満たす残基を含む。Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１８、Ｖ２１、Ｒ２２、Ｑ２５、Ｇ２６、Ｄ２７、Ｇ２８、Ａ２９、Ｑ３２、Ｌ３５、Ｃ３６、Ｔ３８、Ｙ３９、Ｃ４２、Ｈ４３、Ｐ４４、Ｅ４５、Ｅ４６、Ｌ４７、Ｖ４８、Ｌ４９、Ｌ５０、Ｇ５１、Ｈ５２、Ｓ５３、Ｌ５４、Ｇ５５、Ｉ５６、Ｐ５７、Ｗ５８、Ａ５９、Ｐ６０、Ｌ６１、Ｓ６２、Ｓ６３、Ｃ６４、Ｐ６５、Ｓ６６、Ｑ６７、Ａ６８、Ｌ６９、Ｑ７０、Ｌ７１、Ａ７２、Ｇ７３、Ｃ７４、Ｌ７５、Ｓ７６、Ｑ７７、Ｌ７８、Ｈ７９、Ｓ８０、Ｇ８１、Ｌ８２、Ｆ８３、Ｌ８４、Ｙ８５、Ｑ８６、Ｇ８７、Ｌ８８、Ｌ８９、Ｑ９０、Ａ９１、Ｌ９２、Ｅ９３、Ｇ９４、Ｉ９５、Ｓ９６、Ｐ９７、Ｅ９８、Ｌ９９、Ｇ１００、Ｐ１０１、Ｔ１０２、Ｌ１０３、Ｄ１０４、Ｔ１０５、Ｌ１０６、Ｑ１０７、Ｌ１０８、Ｄ１０９、Ｖ１１０、Ａ１１１、Ｄ１１２、Ｆ１１３、Ａ１１４、Ｔ１１５、Ｔ１１６、Ｉ１１７、Ｗ１１８、Ｑ１１９、Ｑ１２０、Ｍ１２１、Ｅ１２２、Ｅ１２３、Ｌ１２４、Ｇ１２５、Ｍ１２６、Ａ１２７、Ｐ１２８、Ａ１２９、Ｌ１３０、Ｑ１３１、Ｐ１３２、Ｔ１３３、Ｑ１３４、Ｇ１３５、Ａ１３６、Ｍ１３７、Ｐ１３８、Ａ１３９、Ｆ１４０、Ａ１４１、Ｓ１４２、Ａ１４３、Ｆ１４４、Ｑ１４５、Ｒ１４６、Ｒ１４７、Ａ１４８、Ｇ１４９、Ｇ１５０、Ｖ１５１、Ｌ１５２、Ｖ１５３、Ａ１５４、Ｓ１５５、Ｈ１５６、Ｌ１５７、Ｑ１５８、Ｓ１５９、Ｆ１６０、Ｌ１６１、Ｅ１６２、Ｖ１６３、Ｓ１６４、Ｙ１６５、Ｒ１６６、Ｖ１６７、Ｌ１６８、Ｒ１６９、Ｈ１７０、Ｌ１７１、Ａ１７２、Ｑ１７３、Ｐ１７４。
【０１１９】
アスパラギン酸のＣＧ原子、グルタミン酸のＣＤ原子およびＣ−末端残基Ｐ１７４のＣ原子と定義される、最も近い酸性基から１０Å以上の距離でそのＣＢ原子（グリシンの場合においてはＣＡ原子）を有する残基を決定するために、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ  ｖ．９．８プログラムを同様に使用した。次のリストは、１０ＮＭＲ構造のうち少なくとも一つにおいてこの基準を満たす残基を包含する。Ｍ０、Ｔ１、Ｐ２、Ｌ３、Ｇ４、Ｐ５、Ａ６、Ｓ７、Ｓ８、Ｌ９、Ｐ１０、Ｑ１１、Ｓ１２、Ｆ１３、Ｌ１４、Ｔ３８、Ｙ３９、Ｋ４０、Ｌ４１、Ｃ４２、Ｌ５０、Ｇ５１、Ｈ５２、Ｓ５３、Ｌ５４、Ｇ５５、Ｉ５６、Ｐ５７、Ｗ５８、Ａ５９、Ｐ６０、Ｌ６１、Ｓ６２、Ｓ６３、Ｃ６４、Ｐ６５、Ｓ６６、Ｑ６７、Ａ６８、Ｌ６９、Ｑ７０、Ｌ７１、Ａ７２、Ｇ７３、Ｃ７４、Ｌ７５、Ｓ７６、Ｑ７７、Ｌ７８、Ｈ７９、Ｓ８０、Ｇ８１、Ｌ８２、Ｆ８３、Ｌ８４、Ｙ８５、Ｑ８６、Ｇ８７、Ｌ８８、Ｉ１１７、Ｍ１２６、Ａ１２７、Ｐ１２８、Ａ１２９、Ｌ１３０、Ｑ１３１、Ｐ１３２、Ｔ１３３、Ｑ１３４、Ｇ１３５、Ａ１３６、Ｍ１３７、Ｐ１３８、Ａ１３９、Ｆ１４０、Ａ１４１、Ｓ１４２、Ａ１４３、Ｆ１４４、Ｑ１４５、Ｒ１４６、Ｒ１４７、Ａ１４８、Ｇ１４９、Ｇ１５０、Ｖ１５１、Ｌ１５２、Ｖ１５３、Ａ１５４、Ｓ１５５、Ｈ１５６、Ｌ１５７、Ｖ１６７、Ｌ１６８、Ｒ１６９、Ｈ１７０、Ｌ１７１。
【０１２０】
前記リストを組み合わせ、比較することにより、修飾のために個々のアミノ酸残基を選択し、その結果、所定のＧ−ＣＳＦポリペプチドにおけるその修飾が所望の性質を有する可能性のある限定された数のアミノ酸残基を含むリストを得る。
【０１２１】
ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のＰＥＧ化法
ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の溶液中でのＰＥＧ化
ヒトＧ−ＣＳＦおよびその変異体を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５中で２５０μｇ／ｍｌの濃度でＰＥＧ化する。ＰＥＧのモル過剰は、タンパク質上のＰＥＧ化部位に関して５〜１００倍である。反応混合物をサーモミキサー中３７℃、１２００ｒｍｐで３０分間入れる。３０分後、１モル過剰のグリシンを添加することにより、反応を停止させる。
カチオン交換クロマトグラフィーを適用して、反応混合物から過剰のＰＥＧ、グリシンおよび他の副生成物を除去する。ＰＥＧ化反応混合物を２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ２．５でイオン強度が７ｍＳ／ｃｍより低くなるまで希釈する。５Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨを２．５に調節する。２０ｍＭ  クエン酸ナトリウムｐＨ２．５で平衡化したＳＰ−セファロースＦＦカラムに混合物をかける。４カラム体積の平衡緩衝液を用いて未結合物質をカラムから洗い流す。２０ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭ  塩化ナトリウムを添加することにより、ＰＥＧ化タンパク質は３カラム体積において溶出される。純粋なＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを濃縮し、ＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮装置、分子量カットオフ（ｍｗｃｏ）：１０ｋＤａを用いて緩衝液交換を行う。
【０１２２】
Ｇ−ＣＳＦ活性を有する標識されたポリペプチドのマイクロタイタープレート中でのＰＥＧ化
Ｇ−ＣＳＦ活性を示すポリペプチドを適当な標識、例えば前記の一般的説明において説明した標識のいずれかを用いて発現し、標識されたポリペプチドを固定化できるマイクロタイタープレートの１以上のウェルに培養ブロスを移す。標識がＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎである場合、ＱＵＩＡＧＥＮから商業的に入手可能なニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）ＨｉｓＳｏｒｂマイクロタイタープレートを使用できる。
標識されたポリペプチドをマイクロタイタープレートに固定した後、結合およびその後のＰＥＧ化に適当な緩衝液中でウェルを洗浄し、続いてウェルを適当な活性化ＰＥＧと共にインキュベートする。一例として、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．から得られるＭ−ＳＰＡ−５００を使用する。活性化ＰＥＧとポリペプチドのモル比を最適化するべきであるが、典型的には１０：１以上、例えば約１００：１またはそれ以上までである。周囲温度で適当な反応時間後、典型的には約１時間後、活性化ＰＥＧ溶液を除去することにより反応を停止させる。適当な緩衝液と共にインキュベーションすることにより、結合したタンパク質をプレートから溶出させる。適当な溶出緩衝液は、イミダゾール、過剰のＮＴＡまたは別のキレート化化合物を含有し得る。結合したタンパク質を必要に応じて生物学的活性および免疫原性について分析する。標識は所望により当該分野において公知の方法を用いて開裂させてもよい。例えばジアミノペプチダーゼを用いて、位置１のＧｌｎをＧＣＴ（グルタミルシクロトランスフェラーゼ）でピログルタミルに変換し、最後にＰＧＡＰ（ピログルタミルアミノペプチダーゼ）で開裂させて、未標識タンパク質を得ることができる。このプロセスは、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーのいくつかの工程を含む。別法として、標識されたポリペプチドを結合させることができる。
【０１２３】
ｈＧ−ＣＳＦ活性を示し、ブロックされたレセプター結合部位を有するポリペプチドのＰＥＧ化
レセプター認識に関与するリシンのＰＥＧ化を排除する方法でｈＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化を最適化するために、次の方法が開発された：
精製されたｈＧ−ＣＳＦを実施例４に記載するようにして得る。２：２の化学量論比のｈＧ−ＣＳＦポリペプチドおよびＧ−ＣＳＦレセプターの可溶性ドメインからなるホモダイマー複合体をリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）緩衝液ｐＨ７中で形成する。ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドの濃度は約２μｇ／ｍｌまたは１μＭであり、レセプターは等モル濃度で存在する。
Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．から得られるＭ−ＳＰＡ−５００を、ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドにおける結合部位の数に対して１０、２５および５０モル過剰に対応する３つの異なる濃度で添加する。３０分の反応期間の後、反応混合物のｐＨをｐＨ２．０に調節し、反応混合物をＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラムにかけ、本質的に記載されているようにしてアセトニトリル勾配で溶出する（Utsumi et al., J. Biochem., Vol. 101, 11991208, (1987)）。別法として、イソプロパノール勾配を用いることができる。
本明細書に記載する一次スクリーニングアッセイを用いてフラクションを分析し、この方法により得られる活性ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦポリペプチドを−８０℃でＰＢＳ（ｐＨ７、１ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する）で保存する。
【０１２４】
結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体を特徴づけるために用いられる方法
ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の分子サイズの決定
結合または非結合ｈＧ−ＣＳＦまたはその変異体の分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、マトリックス支援レーザー脱着質量分析または平衡遠心分離のいずれかにより決定する。前記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは「見かけの分子量」に関する情報を提供する。実際の分子量は、質量分析を用いて有利に決定できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られるＮｕＰＡＧＥキット（Ｎｏｖｅｘ高性能プレキャストゲル）を用いて行われる。１５μｌのサンプルをＮｕＰＡＧＥ４０１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｃａｔ．Ｎｒ．ＮＰＯ３２１）上にかけ、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｒ．ＮＰＯ００２−０２）で３５分間２００Ｖおよび１２０ｍＡで溶出する。
【０１２５】
ポリペプチド濃度の決定
ポリペプチドの濃度は、２８０ｎｍでの光学密度測定、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または当該分野において周知の他のかかる免疫検出技術を用いて測定できる。さらに、サンプル中のポリペプチド濃度は、ポリペプチドについて特異的な抗体でコートされたＢｉａｃｏｒｅチップを用いてＢｉａｃｏｒｅ装置で測定できる。
かかる抗体は、様々な化学反応によりＢｉａｃｏｒｅチップと共有結合できる。別法として、抗体を、例えば、抗ポリペプチド抗体のＦｃ部分について特異的な抗体により非共有結合させることができる。Ｆｃ特異的抗体をまずチップと共有結合させる。抗ポリペプチド抗体を次いでチップ上に流し、方向性のある方法で第一の抗体により結合させる。さらに、ストレプトアビジンでコートされた表面（例えば、Biacore Sensor Chip SA(登録商標)) (Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions, Nagata and Handa (Eds.), 2000, Springer Verlag, Tokyo; Biacore 2000 Instrument Handbook, 1999, Biacore AB)を用いてビオチニル化抗体を固定化できる。
サンプルをチップ上に流す場合、ポリペプチドはコートされた抗体と結合し、質量における増加を測定できる。既知の濃度においてポリペプチドの調製物を使用することにより、標準曲線を作成でき、その後サンプル中のポリペプチドの濃度を決定できる。サンプルの各注射後、センサーチップを、結合分析物を除去する適当な溶離剤（例えば低ｐＨ緩衝液）により再生する。
一般に、適用された抗体は野生型ポリペプチドに対して生じさせたモノクローナル抗体である。突然変異の導入または野生型ポリペプチドの他の操作（特別のグリコシル化またはポリマー結合）はかかる抗体による認識を変更させることができる。さらに、ポリペプチドの分子量の増大を引き起こすかかる操作の結果、プラズモン共鳴シグナルが増大する。結果として、試験される確聞しについての標準曲線を作成する必要がある。
【０１２６】
結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のインビトロおよびインビボ活性を決定するために用いられる方法
一次アッセイ１−インビトロＧ−ＣＳＦ活性アッセイ
ネズミ細胞系ＮＦＳ−６０（J. Ihle博士（St. Jude Children's Research Hospital, Tennessee, USA）から入手）の増殖は、成長培地中の活性Ｇ−ＳＣＦの存在に依存する。従って、ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のインビトロ生物学的活性は、成長培地にＧ−ＣＳＦ活性サンプルを添加し、続いて一定期間インキュベーションした後ＮＦＳ−６０細胞が分割する数を測定することにより決定できる。
ＮＦＳ−６０細胞を、１０％ｗ／ｗＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１％ｗ／ｗＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０μｇ／リットルのｈＧ−ＣＳＦおよび２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＩｓｃｏｖｅｓ  ＤＭＥ培地中で維持する。サンプルを添加する前に、細胞をｈＧ−ＣＳＦを含まない成長培地で２回洗浄し、１ミリリットルあたり２．２×１０５細胞の濃度に希釈する。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに添加する。
結合または非結合Ｇ−ＣＳＦまたはその変異体を含有するサンプルを成長培地中１．１×１０−６Ｍから１．１×１０−１３Ｍの間の濃度に希釈する。１０μｌの各サンプルをＮＦＳ−６０細胞を含有する３ウェルに添加する。１０μｌの哺乳動物成長培地からなる対照を各マイクロタイタープレート上の８ウェルに添加する。細胞を４８時間インキュベートし（３７℃、５％ＣＯ２）、ＷＳＴ−１細胞増殖剤（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いて、各ウェル中に分割された細胞の数を定量化する。０．０１ｍｌのＷＳＴ−１をウェルに添加し、続いて１５０分間３７℃で、５％ＣＯ２空気中でインキュベーションする。生存可能な細胞におけるテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによる開裂の結果、ホルマザンが形成され、これは４５０ｎｍでの吸収を測定することにより定量化される。これによって、各ウェル中の生存細胞の数が定量化される。
これらの測定に基づいて、各結合および非結合Ｇ−ＣＳＦ分子またはその変異体の用量依存曲線を計算し、その後、各分子についてＥＣ５０値を決定できる。この値は、非結合ヒトＧ−ＣＳＦの活性の最大増殖の５０％を得るために必要な活性Ｇ−ＣＳＦタンパク質の量に等しい。従って、ＥＣ５０値は、所定のタンパク質のインビトロ活性の直接測定値であり、低いＥＣ５０値は活性が高いことを示す。
【０１２７】
一次アッセイ２−インビトロＧ−ＣＳＦ活性アッセイ
ネズミ造血細胞系ＢａＦ３を、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターおよび転写レギュレーターのプロモーターをルシフェラーゼレポーター遺伝子の前に有するプラスミドでトランスフェクトする。かかる細胞系をＧ−ＣＳＦサンプルで刺激すると、多くの細胞内反応の結果、ｆｏｓ発現の刺激に至り、結果としてルシフェラーゼが発現される。この刺激をＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２５１０）によりモニターし、これによりＧ−ＣＳＦサンプルのインビトロ活性を定量化できる。
ＢａＦ３／ｈＧＣＳＦ−Ｒ／ｐｆｏｓ−ｌｕｘを３７℃で加湿した５％ＣＯ２雰囲気中、完全培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０／ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２２４００）、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、特徴化）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２２４００）、１×Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０−０８１）、１０％ＷＨＥＩ−３順化培地（ｍｕＩＬ−３の供給源）中に維持し、５×１０５細胞／ｍＬ（コンフルエント）の密度まで増殖させる。細胞を約２×１０４細胞／ｍＬで２〜３日ごと再播種する。
【０１２８】
アッセイの１日前に、対数期の細胞を２×１０５細胞／ｍＬでスタービング培地（ＤＭＥＭ・Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２）、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３６７５）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２）、１×Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０−０８１）、０．１％ＷＥＨＩ−３順化培地）中に再懸濁し、２０時間枯渇させる。細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、トライパンブルー生存性染色を用いて生存性について試験する。細胞をアッセイ培地（ＲＰＭＩ−１６４０（フェノールレッド無し、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１８３５）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ３６７５）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２）、１×Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２５０３０−０８１）中に４×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、５０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェル中に等分する。結合または非結合Ｇ−ＣＳＦまたはその変異体を含有するサンプルをアッセイ培地中１．１×１０−７Ｍから１．１×１０−１２Ｍの濃度に希釈する。５０μｌの各サンプルをＢａＦ３／ｈＧＣＳＦ−Ｒ／ｐｆｏｓ−ｌｕｘ細胞を含有する３ウェルに添加する。５０μｌの培地からなる負の対照を各マイクロタイタープレート上の８ウェルに添加する。プレートを優しく混合し、２時間３７℃でインキュベートする。ルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ  Ｓｔａｄｙ−Ｇｌｏプロトコル（Promega Steady-GloTM Luciferase Assay System, Cat. No. E2510）にしたがうことにより測定する。１００μＬの基質をウェルごとに添加し、続いて優しく混合する。発光をＴｏｐＣｏｕｎｔ照度計（Ｐａｃｋａｒｄ）でＳＰＣ（単光子計数）モードにおいて測定する。
これらの測定に基づいて、各結合および非結合Ｇ−ＣＳＦ分子またはその変異体についての用量依存性曲線を研鑽し、その後、各分子についてのＥＣ５０値を決定できる。
【０１２９】
二次アッセイ−ｈＧ−ＣＳＦレセプターに対するＧ−ＣＳＦまたはその変異体の結合親和力
ｒｈＧ−ＣＳＦまたはその変異体のｈＧ−ＣＳＦレセプターに対する結合を、標準的結合分析を用いて研究する。レセプターは生成された細胞外レセプタードメイン、精製された細胞原形質膜に結合したレセプター、または全細胞であり、細胞の供給源は、Ｇ−ＣＳＦレセプター（例えばＮＦＳ−６０）を本質的に発現する細胞系またはレセプターをエンコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のいずれかである。ｒｈＧ−ＣＳＦまたはその変異体の天然Ｇ−ＣＳＦと結合部位を競争する能力を、標識されたＧ−ＣＳＦ類似体、たとえばビオチニル化ｈＧ−ＣＳＦまたは放射性ヨウ素標識ｈＧ−ＣＳＦと共にインキュベートすることにより分析する。かかる分析の一例は、Yamasakiら(Drugs. Exptl. Clin. Res. 24:191-196 (1998))により記載されている。
ｈＧ−ＣＳＦレセプターの細胞外ドメインは、所望によりＦｃと結合させ、９６ウェルプレート中に固定化することができる。ｒｈＧ−ＣＳＦまたはその変異体を次に添加し、特異的抗ｈＧ−ＣＳＦ抗体またはビオチニル化または放射線ヨウ素標識ｈＧ−ＣＳＦのいずれかを用いてこれらの結合を検出する。
【０１３０】
結合または非結合ｒｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のインビボ半減期の測定
本発明の重要な態様は、ポリペプチドをポリマー部分と結合させるかにかかわらず、ｈＧ−ＣＳＦの構築により得られる延長された生物学的半減期である。ｈＧ−ＣＳＦ血清濃度の急速な減少は、結合または非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体での治療に対する生物学的反応を評価することが重要になる。好ましくは、本発明の結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体は、静脈内投与後にも延長された血清半減期を有し、例えばＥＬＩＳＡ法または一次スクリーニングアッセイにより測定することを可能にする。インビボ生物学的半減期の測定は、以下に記載するようにして行った。
オススプレーグ・ドーリーラット（７週令）を使用した。投与当日に、動物の体重を測定した（動物あたり２８０〜３１０グラム）。体重１ｋｇあたり１００μｇの非結合および結合ｈＧ−ＣＳＦサンプルをそれぞれに３匹のラットの尾静脈中に静脈内注射した。注射の１分、３０分、１、２、４、６、および２４時間後、ＣＯ２麻酔下で５００μｌの血液を各ラットの眼から抜き取った。血液サンプルを室温で１時間半保存し、続いて遠心分離（４℃、１８００×ｇで５分間）により血清を単離した。血清サンプルを−８０℃で分析の日まで保存した。活性Ｇ−ＣＳＦの血清サンプル中の量をＧ−ＣＳＦインビトロ活性アッセイ（一次アッセイ２参照）によりサンプルを氷上で解凍した後に定量化した。
Ｇ−ＣＳＦまたはその変異体のインビボ半減期を測定するためのアッセイのもう一つの例は、ＵＳ５，８２４，７７８に記載され、その内容は本発明の一部として参照される。
【０１３１】
結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の健康なラットのけるインビボ生物学的活性の測定
ＳＰＦスプレーグ・ドーリーラット（Ｍ＆Ｂ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから購入）におけるｈＧ−ＣＳＦのインビボ生物学的影響の測定を用いて、結合および非結合Ｇ−ＣＳＦおよびその変異体の生物学的有効性を評価する。
到着した日にラットをランダムに６のグループに分配する。動物を７日間順化させ、健康状態が不良であるかまたは体重が極端である動物を除外する。順化期間の最初でのラットの体重の範囲は２５０〜２７０ｇである。
投与当日、ラットを１６時間絶食させ、続いて体重１ｋｇあたり１００μｇのｈＧ−ＣＳＦまたはその変異体を皮下注射する。各ｈＧ−ＣＳＦサンプルを６匹のランダム化したラットの１グループに注射する。投与の６、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０および１４４時間後に、３００μｌのＥＤＴＡ安定化血液の血液サンプルをラットの尾静脈から抜き取る。血液サンプルを次の血液学的パラメータに関して分析する：ヘモグロビン、赤血球数、ヘマトクリット、平均細胞体積、平均細胞ヘモグロビン濃度、平均細胞ヘモグロビン、白血球数、白血球数の差（好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、単球）。これらの測定に基づいて、結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の生物学的有効性を評価する。ｈＧ−ＣＳＦまたはその変異体のインビボ生物学的活性の測定についての分析のさらなる例は、ＵＳ５，６８１，７２０、ＵＳ５，７９５，９６８、ＵＳ５，８２４，７７８、ＵＳ５，９８５，２６５およびBowen et al., Experimental Hematology 27:425-432 (1999)により記載されている。
【０１３２】
結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性の測定
ＳＰＦスプレーグ・ドーリーラットをＭ＆Ｂ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋから購入した。到着日にラットをランダムに６のグループに分配する。動物を７日間順化させ、健康状態が不良であるかまたは体重が極端である動物を除外する。順化期間の最初でのラットの体重の範囲は２５０〜２７０ｇである。
ｈＧ−ＣＳＦサンプル投与の２４時間前に、ラットに体重１ｋｇあたり５０または９０ｍｇのシクロホスファミド（ＣＰＡ）を腹膜組織内注射する。ＰＥＧ化ｈＧ−ＣＳＦ変異体を１回の用量として０日に皮下注射し、一方非結合ｈＧ−ＳＦを１回の用量として０日または毎日のいずれかで皮下注射する。０日に１回の用量で投与されたｈＧ−ＣＳＦまたは変異体について、用量は体重１ｋｇあたり１００μｇｆである。毎日投与された非結合ｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｏｐｏｇｅｎ）について、投与量は変化し、以下の実施例に記載する。各ｈＧ−ＣＳＦサンプルを６匹のランダム化したラットの１グループに注射する。３００μｌのＥＤＴＡ安定化血液の血液サンプルを、投与前および投与後６、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０、１４４および１６８時間に、ラットを１６時間絶食させ、続いて体重１ｋｇあたり１００μｇのｈＧ−ＣＳＦまたはその変異体を皮下注射する。各ｈＧ−ＣＳＦサンプルを６匹のランダム化したラットの１グループに注射する。投与の６、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０および１４４時間後にラットの尾静脈から３００μｌのＥＤＴＡ安定化血液の血液サンプルを抜き取る、血液サンプルを次の血液学的パラメータに関して分析する：ヘモグロビン、赤血球数、ヘマトクリット、平均細胞体積、平均細胞ヘモグロビン濃度、平均細胞ヘモグロビン、白血球数、白血球数の差（好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、単球）。これらの測定に基づいて、結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の生物学的有効性を評価する。
【０１３３】
ポリペプチドレセプター結合親和力（オンおよびオフ速度）の決定
レセプターとリガンド間の結合の強度は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または当該分野において周知の他のかかる免疫検出技術を用いて測定できる。リガンド−レセプター結合相互作用は、プラズモン共鳴検出を利用するＢｉａｃｏｒｅ装置で測定することもできる（Zhou et al., Biochemistry, 1993, 32, 8193-98; Faegerstram and O'Shannessy, 1993, In Handbook of Affinity Chromatography, 229-52, Marcel Dekker, Inc., NY）。
６８１，７２０、ＵＳ５，７９５，９６８、ＵＳ５，８２４，７７８、ＵＳ５，９８５，  Ｂｉａｃｏｒｅ技術により、レセプターを金表面と結合させ、リガンドをその上に流すことが可能になる。プラズモン共鳴検出は、実時間で表面に結合する質量を直接定量化する。この技術により、オン速度およびオフ速度定数の両方を得、従ってリガンド−レセプター解離定数および親和定数を直接決定できる。
【０１３４】
ｈＧ−ＣＳＦ結合体のインビトロ免疫原性試験
本発明の結合体の減少した免疫原性は、参照分子または製剤に対する結合体の免疫反応性を測定するＥＬＩＳＡ法の使用により決定できる。参照分子または製剤は通常組み換えヒトＧ−ＣＳＦ製剤、たとえばＮｅｕｐｏｇｅｎまたは別の組み換えヒトＧ−ＣＳＦ製剤、たとえばＵＳ５，８２４，７８４に記載されているようなＮ−末端ＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ分子である。ＥＬＩＳＡ法は、これらの組み換えＧ−ＣＳＦ製剤の１つで治療された患者から得られる固体に基づく。免疫原性は、本発明の結合体が、参照分子または製剤よりも分析において統計的に有意に低い反応を有する場合に、減少すると見なされる。
【０１３５】
Ｇ−ＣＳＦバイオアッセイにおける活性の中和
抗Ｇ−ＣＳＦ血清によるｈＧ−ＣＳＦ結合体の中和を、前記のＧ−ＣＳＦバイオアッセイを用いて分析する。
Ｇ−ＣＳＦ参照分子で治療された患者または免疫化された動物から得られた血清を使用する。血清を、一定濃度（希釈度１：２０〜１：５００（患者血清）または２０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（動物血清））または１：２０（患者血清）または１０００ｎｇ／ｍｌ（動物血清）で出発した血清の５倍連続希釈のいずれかで添加する。ｈＧ−ＣＳＦ結合体を」、１０ｎＭから出発する７倍希釈または一定濃度（１−１００ｐＭ）のいずれかで、合計体積８０μｌＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＣＳで添加する。血清を１時間３７度でｈＧ−ＣＳＦ結合体と共にインキュベートする。
サンプル（０．０１ｍｌ）を次に、０．１ｍｌ  ＤＭＥＭ培地中ＮＦＳ−６０細胞を含有する９６ウェル組織培養プレートに移す。培養物を４８時間３７℃で５％ＣＯ２雰囲気中でインキュベートする。生存可能な細胞におけるミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の開裂の結果、ホルマゾンが形成され、これは４５０ｎｍでの吸収を測定することにより定量化される。
ｈＧ−ＣＳＦ結合体サンプルを一定量の血清の存在下で滴定する場合、中和効果は、ＥＣ５０（血清あり）／ＥＣ５０（血清無し）として定量化されるフォールド阻害（ＦＩ）として定義される。Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質の抗体中和の減少は、次のように定義される：
2005506317.tif 000006
【実施例１】
【０１３６】
ｈＧ−ＣＳＦをエンコードする合成遺伝子の構築およびクローニング
Stemmer et al. (1995), Gene 164, pp. 49-53により記載されている一般的手順にしたがって、次のＤＮＡフラグメントを合成した。
ＢａｍＨＩ消化部位、ＹＡＰ３シグナルペプチドをエンコードする配列（ＷＯ９８／３２８６７）、ＴＡ５７リーダー配列をエンコードする配列（ＷＯ９８／３２８６７）、ＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位（ＡＡＡＡＧＡ）をエンコードする配列、そのコドン使用がイー・コリ（配列番号２）における発現に最適化されたｈＧ−ＳＦをエンコードする配列およびＸｂａＩ消化部位からなるフラグメント１。
ＢａｍＨＩ消化部位、ＹＡＰ３シグナルペプチドをエンコードする配列（ＷＯ９８／３２８６７）、ＴＡ５７リーダー配列をエンコードする配列（ＷＯ９８／３２８６７）、ヒスチジン標識（配列番号５）をエンコードする配列、ＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位（ＡＡＡＡＧＡ）をエンコードする配列、そのコドン使用がイー・コリ（配列番号２）における発現に最適化されたｈＧ−ＳＦをエンコードする配列およびＸｂａＩ消化部位からなるフラグメント２。
ＮｄｅＩ消化部位、ＯｍｐＡシグナルペプチドをエンコードする配列（配列番号３）、そのコドンの使用がイー・コリにおける発現に最適化されたｈＧ−ＣＳＦをエンコードする配列およびＢａｍＨＩ消化部位からなるフラグメント３。
ＢａｍＨＩ消化部位、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（Kozak, M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947-50）、ｈＧ−ＣＳＦシグナルペプチドをエンコードする配列（配列番号７）およびその使用がＣＨＯ細胞における発現に最適化されたｈＧ−ＣＳＦ（配列番号８）およびＸｂａＩ消化部位からなるフラグメント４。
ＤＮＡフラグメント１および２を、標準的ＤＮＡ技術を用いて、プラスミドｐＪＳＯ３７におけるＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ消化部位中に挿入した（Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782:202-207, 1996）。この結果、プラスミドｐＧ＝ＣＳＦセレビシエおよびｐＨＩＳＧ−ＣＳＦセレビシエが得られた。
ＤＮＡフラグメント３を、標準的ＤＮＡ技術を用いてプラスミドｐＥＴ１２ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ消化部位中に挿入した。この結果、ｐＧ−ＣＳＦコリが得られた。
ＤＮＡフラグメント４を、標準的ＤＮＡ技術を用いてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ消化部位中に挿入した。この結果、プラスミドｐＧ−ＣＳＦＣＨＯが得られた。
【実施例２】
【０１３７】
エス・セレビシエおよびイー・コリにおけるｈＧ−ＣＳＦの発現
サッカロミセス・セレビシエＹＮＧ３１８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＶＡ，ＵＳＡからＡＴＣＣ２０８９７３として入手可能）のプラスミドｐＧ−ＣＳＦセレビシエまたはｐＨＩＳＧ−ＣＳＦセレビシエのいずれかでの形質転換、２つのプラスミドのいずれかを含有する形質転換体の単離、およびＨＩＳ標識の有無にかかわらずｈＧ−ＣＳＦの細胞外発現は、それぞれ、文献に記載されている標準的技術を用いて行った。イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６９３８７−３）のｐＧ−ＣＳＦコリでの形質転換、プラスミドを含有する形質転換体の単離およびその後の上清中および細胞の外質におけるｈＧ−ＣＳＦの発現は、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ（第８版）に記載されているようにして行った。
エス・セレビシエおよびイー・コリによるｈＧ−ＣＳＦの発現を、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＡＢＣウサギＩｇＧ染色キット（Ｐｉｅｒｃｅ）およびｈＧ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ．）を用いて、ウェスタンブロット分析により実証した。タンパク質が正しい大きさを有することが観察された。
ｈＧ−ＣＳＦ（Ｎ−末端ヒスチジン標識の有無によらない）のエス・セレビシエおよびイー・コリにおける発現レベルを、商業的に入手可能なＧ−ＣＳＦ特異的ＥＬＩＳＡキット（Quantikine Human G-CSF Immunoassay, R&D Systems Cat. No. DCS50）を用いて定量化した。測定値を以下に記載する。
【表４】
2005506317.tif 000007
【実施例３】
【０１３８】
安定なＣＨＯ−Ｋ１  Ｇ−ＣＳＦプロデューサーの生成
トランスフェクションの前日、ＣＨＯ  Ｋ１細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＣ１−６１）を、１０％ｗ／ｗＦＢＳＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンで補足された５ｍｌ ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｇｉｂｃｏ＃３１３３０−０３８）中でＴ−２５フラスコ中に播種する。次の日（ほぼ１００％コンフルエンシー）、トランスフェクションを調製する：９０μｌの補足無しのＤＭＥＭ培地を１４ｍｌのポリプロピレン試験管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に等分する。１０μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を培地中に直接添加し、５分間室温でインキュベートする。その間に、５μｇのプラスミドｐＧ−ＣＳＦＣＨＯをもう一つの１４ｍｌポリプロピレン試験管中に等分する。インキュベーション後、Ｆｕｇｎｅｎｅ６ミックスをＤＮＡ溶液に直接添加し、１５分間室温でインキュベートする。インキュベーション後、全体積を細胞培地に滴下する。
翌日、培地を、３６０μｇ／ｍｌのヒグロマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する新鮮な培地と交換する。その後毎日、一次トランスフェクションプールが１００％コンフルエンシーコンフルエンシーに達するまで選択培地を更新する。一次トランスフェクションプールを制限希釈によりサブクローンする（３００細胞を５つの９６ウェルプレート中に播種する）。
【実施例４】
【０１３９】
エス／セレビシエ培養上清からのｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の精製
ｈＧ−ＣＳＦの精製を次のようにして行った：
細胞を遠心分離により除去する。細胞減少上清を次に０．２２μｍフィルターを通して濾過滅菌する。濾過滅菌された上清を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中で５倍に希釈する。５リットルの希釈された上清につき１０ｍｌの濃酢酸を添加することにより、ｐＨを調節する。イオン強度はカチオン交換樹脂に適用する前に８ｍＳ／ｃｍより低くなければならない。
カラムからの流出液が安定なＵＶおよび伝導性ベースラインに達するまで、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５で平衡化されたＳＰ−セファロースＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に希釈された上清を９０ｃｍ／時の直線的流速でかける。未結合物質を除去するために、カラムからの流出液がＵＶ吸収および導電性に関して安定なレベルに達するまで、平衡緩衝液を用いてカラムを洗浄する。直線的勾配；３０カラム体積；０−８０％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４，５、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を４５ｃｍ／時の流速で用いて、結合Ｇ−ＣＳＦタンパク質をカラムから溶出させる。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づいて、Ｇ−ＣＳＦを含有するフラクションをためる。溶液のイオン強度が８０ｍＳ／ｃｍ以上になるまで塩化ナトリウムを添加する。
タンパク質溶液を、５０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．５、７５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化させたＰｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏ  Ｐｅａｒｌ６５０Ｓカラム上にかける。平衡緩衝液を用いて未結合物質をカラムから洗い流す。Ｇ−ＣＳＦを含有するフラクションをためる。この２段階下流プロセッシング法を用いることにより、９０％以上の純粋なＧ−ＣＳＦを得ることができる。精製されたタンパク質を次に、２８０ｎｍでの分光光度測定値の使用および／またはアミノ酸分析により定量化する。
Ｇ−ＣＳＦを含有するフラクションをためる。ＶｉｖａＳｐｉｎ濃縮器（ｍｗｃｏ：５ｋＤａ）を用いて緩衝液交換および濃縮を行う。
【実施例５】
【０１４０】
非結合および結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の同定および定量化
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
精製され、濃縮されたＧ−ＣＳＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。約１７ｋＤａの見かけの分子量を有する１つのバンドが優性であった。
吸収
Ｇ−ＣＳＦ濃度の評価を分光光度法により得られる。２８０ｎｍでの吸収を測定し、０．８３の理論的吸光係数を用いることにより、タンパク質濃度を計算できる。
アミノ酸分析
さらに精密なタンパク質測定は、アミノ酸分析により得ることができる。精製されたＧ−ＣＳＦに関して行われるアミノ酸分析により、実験的に決定されたアミノ酸組成は、ＤＮＡ配列に基づいて予想されるアミノ酸措定と一致することが明らかになった。
【実施例６】
【０１４１】
ＰＥＧ化ｗｔＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ変異体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ＰＥＧ化ｗｔＧ−ＣＳＦおよび選択されたＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体に結合したＰＥＧ−基の数を評価するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用した。
ｗｔＧ−ＣＳＦは、ＳＰＡ−ＰＥＧの予想される結合部位である５の第一アミンを含有する（Ｋ１６、Ｋ２３、Ｋ３４およびＫ４０上のＮ−末端アミノ基およびε−アミノ基）。ｗｔＧ−ＣＳＦのＳＰＡ−ＰＥＧ５０００でのＰＥＧ化の後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、主に４、５および６ＰＥＧ基が結合したｗｔＧ−ＣＳＦの種の存在が示された。加えて、７ＰＥＧ基を有するｗｔＧ−ＣＳＦは少量ながら明らかに見られた。
置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｑ７０Ｋ、Ｑ９０Ｋ、およびＱ１２０Ｋを有するＧ−ＣＳＦ変異体はさらに、５の第一アミン（Ｋ２３、Ｋ７０、Ｋ９０およびＫ１２０上のＮ−末端アミノ基およびε−アミノ基）も含有する。このＧ−ＣＳＦ変異体のＳＰＡ−ＰＥＧ５０００でのＰＥＧ化の後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、主に４、５および６ＰＥＧ基が結合したＧ−ＣＳＦ種の存在が示された。加えて、７ＰＥＧ基が結合したＧ−ＣＳＦ変異体は、少量ながら明らかに見られた。
置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、およびＫ４０Ｒを有するＧ−ＣＳＦ変異体は、２の第一アミン（Ｋ２３上のＮ−末端アミノ基およびε−アミノ基）を含有する。このＧ−ＣＳＦ変異体のＳＰＡ−ＰＥＧ１２０００でのＰＥＧ化の後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により、主に２および３ＰＥＧ基が結合したＧ−ＣＳＦ種の存在が示された。加えて、４ＰＥＧ基が結合したＧ−ＣＳＦ変異体は、少量ながら明らかに見られた。
Ｉ消化部位からなるフラグメント１ＹＡＰ３シグナルペプチド
【０１４２】
これらの観察から、アミン基を含有するアミノ酸残基に加えて、他のアミノ酸残基が時々使用されるＰＥＧ化条件下でＰＥＧ化されることが明らかされる。アミン基が導入される場合がＰＥＧ化について多少重要であることも示される。これは、ｗｔＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いても観察される。
実施例１２に記載するように、ＳＰＡ−ＰＡＧ化学反応が使用される場合にヒスチジン１７は完全にＰＥＧ化されることが示された。さらに、Ｋ２３およびＳ１５９は部分的にＰＥＧ化される。これは、ｈＧ−ＣＳＦおよび生成された変異体における第一アミンの他に１〜２の余分なＰＥＧ化部位の存在を証明する。
【実施例７】
【０１４３】
Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ変異体上のＳＰＡ−ＰＥＧの追加の結合部位をマップするために次の方法を使用した。
予想されるＰＥＧ化部位の数を最小に減少させるために少数のアミン基を有するＧ−ＣＳＦ変異体を選択した。選択されたＧ−ＣＳＦ変異体は、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０ＲおよびＨ１７０Ｑを有する。従来のデータから大部分がＰＥＧ化されていないことが証明されているＫ２３上のε−アミノ基を除いて、この変異体はＮ−末端で１つの第一アミンを含有するだけである。従って、アミン基上のバックグラウンドＰＥＧ化はこのＧ−ＣＳＦ変異体において著しく減少する。ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００を用いてＧ−ＣＳＦ変異体をＰＥＧ化した。ＰＥＧ化後、Ｇ−ＣＳＦ変異体を変性させ、ジスルフィド結合を還元し、結果として得られるチオール基をアルキル化し、アルキル化され、ＰＥＧ化されたタンパク質をグルタミン酸特異的プロテアーゼで分解した。最後に、結果として得られるペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分離した。
これと対応して、参照ＨＰＬＣクロマトグラムを得るために、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、およびＫ４０Ｒを有するＧ−ＣＳＦの非ＰＥＧ化されたバージョンを同じように処理した。
ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体および非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の分解のＨＰＬＣクロマトグラムの比較により、どのペプチドがＰＥＧ化により消失したかが明らかになる。非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体から得られるペプチドのＮ−末端アミノ酸配列化によるこれらのペプチドの同定から、ＰＥＧ化された位置が間接的に示される。
原則として、全ての置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０ＲおよびＨ１７０Ｑを有するＧ−ＣＳＦ変異体の使用が好ましいが、全ての実用的な目的に関して、これは重要ではない。
より詳細には、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０ＲおよびＨ１７０Ｑを有する約１ｍｇのＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体および置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、およびＫ４０ＲおよびＨ１７０Ｑを有する約５００μｇの非ＰＥＧ化バージョンを使用かＧ−ＣＳＦ変異体をＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器中で乾燥した。２つのサンプルをそれぞれ４００μｌの６Ｍグアニジニウム、０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３中に溶解させ、一夜３７℃で変性させた。変性後、５０μｌの６Ｍ愚兄時有無中０．１Ｍ  ＤＴＴ、０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３を添加することによりタンパク質におけるジスルフィド結合を還元した。２時間周囲温度でインキュベーションした後、５０μｌの６Ｍグアニジニウム中０．６Ｍヨードアセトアミド、０．３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３を添加することにより、存在するチオール基をアルキル化した。アルキル化が３０分間周囲温度で起こった後、ＮＡＰ５カラムを用いて、還元され、アルキル化されたタンパク質を５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中に緩衝液交換した。ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器中でサンプルの体積を約２００μｌに減少させた後、それぞれ２０μｇおよび１０μｇのグルタミン酸特異性プロテアーゼを添加した。グルタミン酸特異性プロテアーゼでの分解を１６時間３７℃で行った。結果として得られるペプチドを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（０．２×５ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより、０．１％水性ＴＦＡ中アセトニトリルの直線的勾配で溶出して分離した。集められたフラクションをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析し、その後、選択されたペプチドをＮ−末端アミノ酸配列分析に付した。
【０１４４】
ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ変異体および非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体の分解のＨＰＬＣクロマトグラムの比較により、２つのフラクションのみがＰＥＧ化により消失したことが明らかになった。非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体からの２つのフラクションのＮ−末端アミノ酸配列分析から、ペプチドはどちらもＧ−ＣＳＦ変異体のＮ−末端から誘導化されることが示された。１つのペプチドは、Ｇｌｎ１１後の予想されなかった開裂により生成したアミノ酸残基１−１１からなっていた。他のペプチドは、Ｇｌｕ１９予想された開裂により生成したアミノ酸残基１−１９からなっていた。
Ｎ−末端アミノ基は容易にＰＥＧ化されるので、Ｇ−ＣＳＦのＮ−末端ペプチドは、この方法を用いて同定されることが予想された。しかしながら、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００の追加の結合のいずれもこの方法を用いて同定されなかった。
ＰＥＧ５０００結合部位の間接的確認の代替法は、ＰＥＧ化ペプチドにおける結合部位の直接的確認である。しかしながら、分解ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体のＨＰＬＣ分離におけるＰＥＧ化ペプチドを含有するフラクションは、互いに、また非ＰＥＧ化ペプチドを含有するいくつかのフラクションから十分に分離されない。従って、これらのフラクションのＮ−末端アミノ酸分析の結果、Ｋ２３が部分的にＰＥＧ化できるということがカニンされることを除いては有用なデータが得られなかった。
これらの問題を克服するために、ＰＥＧ化ペプチドの２つのプールを、第一のＨＰＬＣ分子殻のフラクションから生成した。これらの２つのプールをＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器中で乾燥し、２００μｌの新たに調製された５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中に溶解させ、さらに１μｇのキモトリプシンで分解した。結果として得られるペプチドを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（０．２×５ｃｍ）を使用し、０．１％水性ＴＦＡ中アセトニトリルの直線的勾配で溶出して、逆相ＨＰＬＣにより分離した。集められたフラクションをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析し、続いて選択されたペプチドをＮ−末端アミノ酸配列分析に付した。
Ｎ−末端アミノ酸配列決定から、Ｋ２３ならびにＳ１５９は部分的にＰＥＧ化されることが確認できた。これらの２つの位置でのＰＥＧ化の正確な程度は確認できなかったが、Ｋ２３およびＳ１５９が未修飾であるペプチドが確認され、初期ＨＰＬＣから配列決定されたので、ＰＥＧ化は部分的である。
【実施例８】
【０１４５】
ｗｔＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ変異体のグリコシル化
生成されたｗｔＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ変異体をＭＡＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析する場合の一貫した観察は、分析されたＧ−ＣＳＦ分子の質量よりも約３２４Ｄａ大きい質量を有するさらなる成分の存在である。最低の質量を有す売る成分は一様にＧ−ＣＳＦ分子の質量を有し、Ｇ−ＣＳＦ分子は正しいＮ−末端アミノ酸配列を有するので、さらなる成分は、２つのヘキソース残基を有する修飾されたＢ−ＣＳＦ分子であると結論づけられた。多くの場合において、未修飾Ｇ−ＣＳＦ分子は最も強いシグナルを生じるが、いくつかの場合においては修飾されたＧ−ＣＳＦ分子の強度が最も強い。
さらなるＰＥＧ化部位を同定することを目的として生成したペプチドの分析中、グリコシル化の部位を同定するための関心のある２つのペプチドを各分気合いにおいて同定した。
両ＨＰＬＣ分離において、２つのペプチドは互いの次に溶出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は２つのペプチドの差が約３２４Ｄａであることを示した。質量分析データは、ペプチドが１２４−１６２のアミノ酸残基を包含することを示す。４ペプチド全てのＮ−末端アミノ酸配列分析は、この指定が正しく、Ｔｈｒ１３３が唯一の修飾の部位であることを示す。未修飾ペプチドの分子量を有するペプチドにおいて、Ｔｈｒ１３３は明らかに配列において見られるが、さらなる３２４Ｄａの分子量を有するペプチドにおいて位置１３３にアミノ酸残基をわりあてることができない。他のアミノ酸残基はすべて配列において割り当てられるので、Ｔｈｒ１３３が唯一の修飾の部位であると結論づけられた。このグリコシル化部位はＣＨＯ細胞において発現された組み換えＧ−ＣＳＦにおいて用いられることがすでに報告されているが、グリカンは酵母により結合される物とは異なる。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により示されるフラクションはｗｔＧ−ＣＳＦ７ＰＥＧ基を有の非グリコシル化形態を含むだけなので、０．１％ＴＦＡ中５１％アセトニトリルで定組成溶離されたＶｙｄａｃ  Ｃ１８カラム（０．２１×５ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣを用いて、非グリコシル化ｗｔＧ−ＤＳＦはグリコシル化ｗｔＧ−ＣＳＦから分離された。
【実施例９】
【０１４６】
共有結合したＰＥＧ分子の数が異なるＧ−ＣＳＦの分離
４、５または６ＰＥＧ基に共有結合したＧ−ＣＳＦ分子の分離は次のようにして得られた。２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ２．５中ＰＥＧ化タンパク質を、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウムｐＨ２．５で平衡化したＳＰセファロースＦＦカラムにかけた。未結合物質をカラムから洗い流した。ｐＨ勾配を用いて溶出を行った。ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦは約ｐＨ３．８でカラムから溶出し始め、ｐＨ３．８から４．５を包含するフラクションにおいて溶出を続けた。
フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析に付した。これらの分析は、最も高い程度のＰＥＧ化を有するＧ−ＣＳＦは「低いｐＨフラクション」中にあることを示す。最低のＰＥＧ化を有するＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦは、「高いｐＨフラクション」中で溶出される。
ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦについて行われたアミノ酸分析は、理論的および実験的に決定された発酵係数間に良好な一致を示した。
【実施例１０】
【０１４７】
ｈＧ−ＣＳＦ変異体の構築
ｈｊＧ−ＣＳＦに存在するアミノ酸の他のアミノ酸残基に対する特定の置換、たとえば一般的説明においてすでに記載した特定の置換は、当該分野において公知の標準的ＤＮＡ技術を用いて導入された。新規Ｇ−ＣＳＦ変異体変異体は、ＰＣＲ反応におけるＤＮＡテンプレートとしてＨＩＳ標識無しのｈＧ−ＣＳＦをエンコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＧ−ＣＳＦセレビシエを用いて調製された。変異体は、エス・セレビシエにおいて発現され、実施例４において記載されたように精製された。構築されたＧ−ＣＳＦ変異体のいくつかを以下に記載する（実施例１２および１３参照）。
【実施例１１】
【０１４８】
ｈＧ−ＣＳＦまたはその変異体に対するＳＰＡ−ＰＥＧの共有結合
ヒトＧ−ＣＳＦ活性およびその変異体は、前記のように（「溶液中のｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のＰＥＧ化」）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００、ＳＰＡ−ＰＥＧ１２０００およびＳＰＡ−ＰＥＧ２００００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）に共有結合した。結合体のインビトロ活性を実施例１３に記載する。
【実施例１２】
【０１４９】
部位特異的突然変異誘発におけるＳＰＡ−ＰＥＧ結合の同定とそれに続く精製された変異体のＰＥＧ化
ＳＰＡ−ＰＥＧはＧ−ＣＳＦにおけるリシン以外のアミノ酸残基と結合することができる。ＳＰＡ−ＰＥＧがヒスチジン、セリン、スレオニンおよびアルギニンと結合するかどうかを決定するために、これらのアミノ酸がリシン、アラニンまたはグルタミンに置換された変異体を調製した。変異体をエス・セレビシエにおいて発現し、精製し、ＰＥＧ化の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で結合したＳＰＡ−ＰＥＧ分子の数の分析を行った。この分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの目視検査により行い、すべて３つの主要なバンドを含んでいた。バンドの相対的なサイズに基づいて各バンドについてＰＥＧ化の程度はほぼ５％と評価された。所定のアミノ酸のグルタミンまたはアラニンでの置換後、結合したＳＰＡ−ＰＥＧ分子の数における減少は、このアミノ酸がＳＰＡ−ＰＥＧによりＰＥＧ化されたことを示し、この観察は、アミノ酸がリシンに置換された後にＰＥＧ化の程度が変化しないことによりさらに裏付けられる。分析された変異体を以下に記載する。
【表５】
2005506317.tif 000008
データは、Ｎ−末端、Ｋ１６、Ｋ３４およびＫ４０に加えて、ＳＰＡ−ＰＥＧもＨ１７０に共有結合することを示す。さらに、データは利用可能なＫ２３アミノ酸残基の１０％しかＰＥＧ化されず、Ｓ１５０の約１０％がＰＥＧ化されたことを示す。
【実施例１３】
【０１５０】
非結合および結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のインビトロ生物学的活性
結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のインビトロ生物学的活性を「一次アッセイ２−インビトロｈＧ−ＣＳＦ活性アッセイ」においてすでに記載したようにして測定した。利用可能なＰＥＧ化部位に対するＳＰＡ−ＰＥＧ５０００の結合の有無にかかわらず各変異体について測定されたＥＧ５０値により表されるインビトロ生物活性を以下に記載する。この値は、非結合ｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）のＥＣ５０値に関して標準化されている。すなわち、表の値は非結合ｈＧ−ＣＳＦの活性に対する活性（％）を表す。値は、同じ分析条件下で各回で変異体と同時に測定した。記載された分析においてｈＧ−ＣＳＦのＥＣ５０値は３０ｐＭであった。
【表６−１】
2005506317.tif 000009
【表６−２】
2005506317.tif 000010
【表６−３】
2005506317.tif 000011
データは、Ｋ２３のアルギニンへの置換は結合したタンパク質の活性を増大させないことを示す。これは、わずか１０％のＫ２３しかＰＥＧ化されないという事実により、これにより結合したＫ２３Ｒ変異体は、ｈＧ−ＣＳＦと同数のこれに結合したＰＥＧ基を有し、ＰＥＧ化部位の位置が同じである。ポジションＫ１６、Ｋ３４およびＫ３４の残存するリシンの除去の結果、ＰＥＧ化後に著しい活性を有するＧ−ＣＳＦＮ−末端ヒスチジン標識変異体が得られた。ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００のこの変異体に対する結合は、非結合変異体と比べて活性を著しく減少させない。従って、Ｎ−末端およびＨ１７０のＳＰＡ−ＰＥＧ５０００でのＰＥＧ化（実施例１２参照）は、ｈＧ−ＣＳＦの活性を減少させない。残基Ｌ３およびＨ１５９間の２４の新規ＰＥＧ基の数Ｇ−ＣＳＦか部位をこの主鎖中に導入した。これらの残基は、Ｇ−ＣＳＦレセプターと相互作用しないｈＧ−ＣＳＦの部分にわたって分布する。ポジションＬ３、Ｑ７０、Ｓ７６、Ｑ９０、Ｔ１０５、Ｑ１２０、Ｔ１３３およびＳ１４２、Ｑ７０、Ｓ７６、Ｑ９０、Ｔ１０５の新規ＰＥＧ基の数Ｇ−ＣＳＦか部位の導入の結果、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００によるＰＥＧ化後に有意な量の活性を保持するｈＧ−ＣＳＦ変異体が得られた。従って、これらの新規ＰＥＧ化部位のいくつかは、２または３の新規ＰＥＧ化部位を有するｈＧ−ＣＳＦ変異体において組み合わされた。
さらに、ＳＰＡ−ＰＥＧの共有結合１２０００およびＳＰＡ−ＰＥＧ２００００を選択されたｈＧ−ＣＳＦ変態の基に結合させた。インビトロ活性を以下に記載する（Ｎｅｕｐｏｇｅｎの％）。
【表７】
2005506317.tif 000012
【実施例１４】
【０１５１】
非結合および結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のインビボ半減期
非結合ｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦＫ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋのインビボ半減期を前記のようにして測定した（「結合および非結合ｒｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のインビボ半減期の測定」）。結果を図１および２に示す。Ｎｅｏｐｏｇｅｎのインビボ半減期はそれぞれ２．１０時間および１．４０時間であると測定された。以前の同様の実験において（ＵＳ５，８２４，７７８）、ｈＧ−ＣＳＦのインビボ半減期は１．７９時間であると決定された。本発明に記載された実験の結果は、従って、該実験と直接比較できる。ＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  ａｎｄ  ＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋのインビボ半減期はそれぞれ１２．１５時間および１６．１０時間であると測定された。ｈＧ−ＣＳＦ中に新規ＰＥＧ化部位を導入し、これらとＳＰＡ−ＰＥＧを結合させると、インビボ半減期が著しく増大した。
すでに記載した以前の実験において（ＵＳ５，８２４，７７８）、大きなＮ−末端結合ＰＥＧ分子（１０ｋＤａ）と結合したｈＧ−ＣＳＦのインビボ半減期は７．０５時間であると測定された。したがって、ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋは、Ｎｅｕｐｏｇｅｎおよび１０ｋＤａのＮ−末端結合ＰＥＧ分子を有するｈＧ−ＣＳＦの両方よりも著しく長い半減期を有する。ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  ａｎｄ  ＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋは両方とも３つの除去された内因性ＰＥＧ化部位および３つの新しい導入されたＰＥＧ化部位を有し、従って大きさが同じである。２つの化合物間の唯一の差は、インビトロ活性であり、それぞれＮｅｕｐｏｇｅｎの１２％および５％である。この違いの結果、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋと比較して、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋのインビボ半減期は長くなる。インビボ活性は化合物のレセプター結合親和力と相関するので、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋのレセプターによるクリアランスは、ＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋよりも遅いと結露運づけることができる。従って、Ｇ−ＣＳＦの大きさが増大し、インビトロ活性が減少する組み合わせの結果、すでに記載された化合物よりも著しく長いインビボ半減期を有するＧ−ＣＳＦ化合物が得られる。
【実施例１５】
【０１５２】
非結合および結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の健康なラットにおけるインビボ生物学的活性
非結合ｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ、ＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  Ｔ１３３ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  Ｔ１３３Ｋのインビボ生物学的活性を前記尿にして測定した（「結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の健康なラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」。結果を図３および４に示す。
ｔ＝０時に体重１ｋｇあたり１００μｇの注射をした後４８時間でＮｅｕｐｏｇｅｎの活性は検出できなかった。ＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ、ＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  Ｔ１３３ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  Ｔ１３３Ｋの活性は、初回注射後７２時間まで検出できたが、ＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋは初回注射後９６時間までインビボで活性であった。従って、これらの結合変異体はすべてＮｅｕｐｏｇｅｎよりも長いインビボ生物学的活性を有し、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０ＫはＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の２倍長くインビボで活性であった。ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  Ｔ１３３ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  Ｔ１３３Ｋは、両方ともＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の２％のインビトロ活性を有するが（実施例１３）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ１２０ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ５０００  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋの投与後観察されるのと同じレベルの白血球形成を投与後の初めの１２時間に誘発しなかった。従って、Ｎｅｕｐｏｇｅｎと比べて２％以下のインビトロ活性を有する化合物は、投与直後に白血球の完全な形成を刺激できなかった。
【０１５３】
さらに、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、ＳＰＡ−ＰＥＧ１２０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒおよび異なる用量のＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋのインビボ生物学的活性を前記のようにして測定した（「結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の健康なラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」）。結果を図５に示す。すでに観察されたように、体重１ｋｇあたり１００μｇの初回注射後４８時間でＮｅｕｐｏｇｅｎの活性は検出できなかった。体重１ｋｇあたり５μｇのＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋを投与した結果、Ｎｅｕｐｏｇｅｎよりもインビボ生物学的活性が若干長くなり、一方、体重１ｋが足り２５μｇおよび１００μｇのこの化合物を投与すると、初回注射後、それぞれ７２時間および９６時間までｈＧ−ＣＳＦ活性であった。従って、ＳＰＡ−ＰＥＧ結合ｈＧ−ＣＳＦ化合物の作用の期間は、標準的投与計画を増大または減少させることにより調節できる。実施例６に記載したように、ＳＰＡ−ＰＥＧ１２０００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒは、２または３の結合したＳＰＡ−ＰＥＧ１２０００基を有しているが、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋは５または６の結合したＳＰＡ−ＰＥＧ５０００基を有している。従って、２つの化合物の分子量は、それぞれ４２−５４ｋＤａおよび４３−４８ｋＤａである。２つの化合物のインビボ活性は、それぞれＮｅｕｐｏｇｅｎの３０％および１２％である。本質的に同じ分子量を有するＳＰＡ−ＰＥＧ１２０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒと比較してＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋの長い生物学的活性は、Ｇ−ＣＳＦ化合物のサイズＰＥＧ基の数Ｇ−ＣＳＦ化によりある分子量を超えて増大する場合、作用の期間は、Ｇ−ＣＳＦ化合物の特定の活性およびレセプターによるクリアランスを減少させることによって増大できることを示唆する（実施例１４参照）。
【０１５４】
さらに、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋのインビボ生物学的活性を前記のようにして測定した（「結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の健康なラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」）。結果を図６に示す。
すでに観察されたように、結合ｈＧ−ＣＳＦ変異体はＮｅｕｐｏｇｅｎよりも著しく長い作用の期間を有していた。これら３つの結合ｈＧ−ＣＳＦ変異体のそれぞれを投与した結果、投与後の初めの１２時間にＮｅｕｐｏｇｅｎの投与後に観察されるのと同じ速度で、同じレベルまで白血球が形成された。ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ２００００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋのインビトロ活性は、それぞれＮｅｕｐｏｇｅｎの１２％、５％、および５％であり、したがって、インビトロでＮｅｕｐｏｇｅｎ活性の５％を有するｈＧ−ＣＳＦ化合物は投与後に完全な白血球形成を誘発できる。
Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９ＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の見かけのサイズはそれぞれ、１８ｋＤａ、６０ｋＤａ、６０ｋＤａおよび＞１００ｋＤａである。ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋはほとんど同じインビボでの作用期間を有し、作用期間は、結合ｈＧ−ＣＳＦ変異体はＮｅｕｐｏｇｅｎよりも化合物の分子サイズを約６０ｋＤａの見かけのサイズを超えて増大させることによって増大されないことを示す。そのかわりに、結合ｈＧ−ＣＳＦ化合物の見かけのサイズが約６０ｋＤａより大きい場合、インビトロ活性を減少させることにより作用の期間、従って化合物のレセプター結合親和力を増大させることができる。このさらなる例（前記参照）は、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  ３４Ｒ  ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋのインビボの作用期間を比較することにより観察できる。２つの化合物や両方とも６０ｋＤａの見かけのサイズを有し、インビトロ活性は、それぞれ１２％および５％である。この差は、２つの化合物のインビボの作用期間（それぞれ９６時間および１４４時間）に反映される。
【実施例１６】
【０１５５】
非結合および結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性
非結合ｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋの化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性を、体重１ｋｇあたり５０ｍｇのＣＰＡおよび１回量（体重１ｋｇあたり１００μｇ）のＧ−ＣＳＦを用いて前記のようにして測定した（「非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」）。結果を図７に示す。３つの化合物は同じ速度で白血球の初期形成を誘発した。従って、結合ｈＧ−ＣＳＦ化合物が投与直後にインビボで白血球形成を十分に刺激するためには、Ｎｅｕｐｏｇｅｎの４％のインビトロ活性で十分である。３６時間後、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ処置されたラットにおける白血球数（ＷＢＣ）は、未処置群において観察されるレベルまで降下した（＜３×１０９細胞／リットル）。この時点で、ラットは好中球減少状態であった。両群におけるＷＢＣのレベルは１４４時間後に正常なレベル（９×１０９細胞／リットル）に達した。
ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋで処置された２群におけるＷＢＣのレベルは、４８時間後に最低の４ｘ１０９細胞／リットルまで減少し、次いで直ちに増大しはじめた。両群におけるＷＢＣレベルは９６時間後に正常に戻った。従って、２つの結合ｈＧ−ＣＳＦ化合物は好中球減少症の程度を軽減し、かつＷＢＣレベルが正常に戻るまでの時間（好中球減少の期間）をＮｅｕｐｏｇｅｎ処置群における１１２時間からＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋのいずれかで処置された群における４８時間まで著しく減少させることができる。
ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋは、ＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋとくらべてさらに有効に好中球減少の期間を短縮した。両分子の見かけのサイズは６０ｋＤａより大きい（それぞれ６０ｋＤａおよび８０ｋＤａ）ので、これはＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋの腎臓クリアランスがＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋよりも低いことにより説明できない。ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋのインビトロ活性はそれぞれＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の４％および７％である。このことは、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋの結合親和力、従ってレセプターによるクリアランスが、ＳＰＡ−ＰＥＧ２０００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋよりも、白血球レベルが増大する投与後の最初の４８時間において低いことを意味する。したがって、ラットが４８時間後に好中球減少症になる場合、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋのインビボ濃度は、ＳＰＡ−ＰＥＧ  ２００００結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋよりも高い。好中球先祖細胞に関するＧ−ＣＳＦレセプターの完全な活性化を得るためにはＮｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の４〜５％の比較的低いインビトロＧ−ＣＳＦ活性で十分であるので（前記参照）、４８時間後のこの高いＧ−ＣＳＦ濃度は、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ−処置群においてＷＢＣレベルが速く増大することを証明する。従って、化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおいて、見かけのサイズが少なくとも約６０ｋＤａであり、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）の４％のインビトロ活性を有する本発明の結合Ｇ−ＣＳＦ化合物は、さらに高いインビトロ活性を有する類似したサイズの化合物よりも優れている。
【実施例１７】
【０１５６】
エス・セレビシエ培養上清からのＧ−ＣＳＦの精製
この実施例は、ｈＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ変異体を精製するための実施例４の方法の代替法を提供する。
細胞を、５０００ｒｐｍで１０分間４℃での遠心分離により除去し、清澄化された上清を０．２２μｍフィルターを通して濾過する。清澄化し、濾過された上清を濃縮し、１０ｋＤａ膜を用いたＴａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎにより、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中に透析するか。
結果として得られる限外濾液を、少なくとも５カラムｔ哀惜の５０ｍＭ酢酸ナトリウムで平衡化したＳＰ−セファロースカラム（２００ｍｌ充填床）上にかける。サンプルを流速約２０ｍｌ／分でかける。平衡化緩衝液を用いて、２８０ｎｍでの吸収により測定して安定な流出液が得られるまでカラムを洗浄する。段階的な緩衝液勾配を用いて（例えば、１０％、２０ａ％、３０％および３５％の緩衝液）、Ｇ−ＣＳＦを３５％緩衝液で周囲流速で溶出する（ここに、緩衝液は５０ｍＭ酢酸ナトリウム中７５０ｍＭ  ＮａＣｌである）。
この一段法により、＞９５％の純度のＧ−ＣＳＦを得る（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）。
【実施例１８】
【０１５７】
Ｇ−ＣＳＦの多ＰＥＧ化種の分離
前記実施例９は、異なる数のＰＥＧ基が結合したＧ−ＣＳＦ分子の分離法を記載する。この実施例は、結合したＰＥＧ基の数の点で所望の均一度を有するＧ−ＣＳＦ生成物を得るためにこのような多ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ種を分離するための代替法を提供する。
例えば前記（「溶液中のｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体のＰＥＧ化」）のＳＰＡ−ＰＥＧ５０００（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）と共有結合したＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦの混合物を、２０ｍＭクエン酸塩緩衝液、ｐＨ２．５で希釈する。導電性は＜３．５ｍＳ／ｃｍである。必要に応じて希ＨＣｌを用いてｐＨｗｏ２．５に調節する。次の緩衝液を分離に用いる：
緩衝液Ａ：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５（平衡化および洗浄緩衝液）。
緩衝液Ｂ：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５；７５０ｍＭ塩化ナトリウム（溶出緩衝液）。
分離されるサンプルを、平衡化されたＳＰ−セファロースＨＰカラム（７ｍｌ）に２ｍｌ／分の流速でかける。Ａ２８０によりモニターして安定なベースラインが得られるまで、カラムを緩衝液Ａで洗浄する。
０〜５０％＜例えば少なくともやく緩衝液Ｂの直線的勾配を１８０分間４ｍｌ／分の流速でかけ、２ｍｌのフラクションを集めることにより、多ＰＥＧ化種を分離する。集められたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、所望の数の結合したＰＥＧ基を有するフラクションをプールする。これにより、はじめに、たとえば３〜６の結合したＰＥＧ器を有する種を含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ混合物を精製して、例えば４または５ＰＥＧ基の数Ｇ−ＣＳＦ基が結合した生成物、または単数の結合したＰＥＧ基を有する生成物を得ることが可能になる。
【実施例１９】
【０１５８】
ペプチドマッピング
実施例７においてすでに記載したのと類似しているが、トリプシンでの分解に基づく手順を用いて、本発明のＧ−ＣＳＦ結合体のＰＥＧ化パターンをペプチドマッピングにより決定した。この場合において、ポリペプチドはＣＨＯ細胞（実施例３参照）において産生され、本来のヒトＧ−ＣＳＦの配列に関して、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５Ｋ  ａｎｄ  Ｓ１５９Ｋを有していた。これを前記のようにして５ｋＤａＳＰＡ−ＰＥＧでＰＥＧ化して、主に３、４または５のＰＥＧ部分とわずかに６ＰＥＧ部分を有する修飾タンパク質を得た。６の可能なＰＥＧ結合部位のうち５が既知であり、これらはＮ−末端アミノ基、Ｌｙｓ２３、Ｌｙｓ１０５、Ｌｙｓ１５９およびＨｉｓ１７０である。
このペプチドマッピング分析により、結合タンパク質が、Ｎ−末端およびＬｙｓ１０５およびＬｙｓ１５９で本質的に完全にＰＥＧ化され、一方、Ｌｙｓ２３は部分的にＰＥＧ化されたことがわかった。Ｈｉｓ１７０は先の実験において部分的にＰＥＧ化されることが示されたが、このことは驚くべきことにこの実験においては見いだされなかった。この観察についての一つの可能な説明は、ＰＥＧ基の数Ｇ−ＣＳＦとＨｉｓ１７０残基間の結合は、ペプチドマッピングの前に行われるサンプル調製中は不安定であるということである。この場合のような考えられる不安定なＰＥＧ化は、ヒスチジン残基を別の残基、特にさらに安定なＰＥＧ化が望ましいならばリシン残基で、あるいはＰＥＧ化を回避すべきならばグルタミンまたはアルギニン残基で置換することにより回避できる。
【実施例２０】
【０１５９】
化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性
本発明の２つＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ変異体のインビボ生物学的活性を化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおいて試験した。変異体は、配列番号１に関して、それぞれ、置換Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋ（以下、「１０５／１５９」と称する）およびＫ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｑ９０Ｋ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９Ｋ（「９０／１０５／１５９」と称する）を有する。両変異体は、酵母（エス・セレビシエ）において産生され、前記のようにＳＰＡ−ＰＥＧ５０００と結合される。１回量の２つの変異体のインビボ生物学的活性を、１日量の非結合ｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）および対象（ビヒクル）の活性に対して試験した。
Ｇ−ＣＳＦサンプル投与の２４時間前に、ラットに体重１ｋｇあたり５０ｍｇのＣＰＡを与えた。本発明のＰＥＧ化変異体を体重１ｋｇあたり１００μｇの１回量で時間０に投与し、一方、Ｎｅｕｐｏｇｅｎを体重１ｋｇあたり３０μｇの１日量で５日間投与した（０時間から９６時間）。
インビボ生物学的活性を前記のようにして測定した（「結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」）。結果を図８（白血球数、ＷＢＣ）および図９（絶対好中球数、ＡＮＣ）に示す。
図８に示すように、１０５／１５９、９０／１０５／１５９およびＮｅｕｐｏｇｅｎの投与は全て初めの１２時間で白血球レベルをまず増大させ、その後、白血球レベルは化学療法の結果として減少し、約４８時間後に最小値に達する。４８時間後、白血球の数は３処置群全てにおいて増大するが、増大速度は、Ｎｅｕｐｏｇｅｎで処置した群よりも、本発明の２つのＰＥＧ化変異体で処置した群において明らかに大きかった。ＰＥＧ化変異体１０５／１５９および９０／１０５／１５９での処置の結果、９６時間後に白血球の正常なレベル（１０×１０９／ｌ以上）になるが、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ処置群は１２０時間後で白血球レベルが依然として１０×１０９／ｌより低かった。５回毎日のＮｅｕｐｏｇｅｎでの処置の最後は９６時間に投与したので、この段階における白血球レベルは１２０時間後に再び減少した。対照的に、１回量の本発明のＰＥＧ化変異体で処置された２群における白血球レベルは９６時間から実験期間中２１６時間まで１０×１０９／ｌを少し上回って比較的安定であった。
好中球数について同様のパターンを図９に示し、これはＰＥＧ化変異体１０５／１５９で処置された群についての好中球レベルは、Ｎｅｕｐｏｇｅｎで処置された群よりも著しく速く増大したことを示す（９０／１０５／１５９群についてはＡＮＣは測定しなかった）。
【実施例２１】
【０１６０】
化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性
化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおいて、非結合ｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）および１つのＮ−末端結合した２０ｋＤａＰＥＧ基を有するｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）を本発明の２つのＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異体と比較した。それぞれ酵母（エス・セレビシエ）およびＣＨＯ細胞において産生された、これらの２つの変異体、すなわち、Ｋ１６Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｋ４０Ｒ、Ｔ１０５ＫおよびＳ１５９ＫをＳＰＡ−ＰＥＧ５０００の配列と結合させた。当初３〜６ＰＥＧ基が結合した多ＰＥＧ化種からなる本発明のＰＥＧ化変異体を分離して、４〜５のＰＥＧ基が結合したさらに均一な生成物を得る。これらの変異体を以下、「Ｇ２０」（酵母において産生）および「Ｇ２１」（ＣＨＯ細胞において産生）と称する。
Ｇ−ＣＳＦサンプルをＣＰＡ（体重１ｋｇあたり９０ｍｇ）の投与後２４時間に投与した。ＰＥＧ化変異体、すなわちＮｅｕｌａｓｔａ、Ｇ２０およびＧ２１を、体重１ｋｇあたり１００μｇの１回量として投与し、一方、Ｎｅｕｐｏｇｅｎを体重１ｋｇあたり１０μｇの一日量で７日間投与した。
インビボ生物学的活性を前記のようにして測定した（「結合および非結合ｈＧ−ＣＳＦおよびその変異体の化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性の測定」）。結果を図１０（白血球数、ＷＢＣ）および図１１（絶対好中球数、ＡＮＣ）に示す。
図１０および図１１は、Ｇ−ＣＳＦ化合物はすべて、初めの１２時間にほぼ同じ速度で白血球および好中球の初期形成を誘発し、その後白血球および好中球のレベルは化学療法の結果減少することを示す。９６時間後、白血球および好中球数は再び全ての場合において増大するが、その増加率は、Ｇ２０またはＧ２１で処置されたラットに関しｔｈｅ、ＮｅｕｐｏｇｅｎまたはＮｅｕｌａｓｔａのいずれかで処置されたラットよりも著しく高かった。図１０は、Ｇ２０またはＧ２１で処置されたラットの白血球レベルは１４４時間後に約１０９／ｌの正常なレベルに達するが、ＮｅｕｐｏｇｅｎまたはＮｅｕｌａｓｔａで処置されたラットは１６８時間後までこのレベルに達しなかったことを示す。図１１に示すように、同じパターンが、好中球数を見た場合にも見られる。すなわち、Ｇ２０またはＧ２１で処置されたラットの好中球数は、ＮｅｕｐｏｇｅｎまたはＮｅｕｌａｓｔａで処置されたラットが同じレベルに達する前約２４時間で正常なレベルに達する。本発明のこれらのＰＥＧ基の数Ｇ−ＣＳＦ化Ｇ−ＣＳＦ変異体は、現在入手可能なＧ−ＣＳＦ製品ＮｅｕｐｏｇｅｎおよびＮｅｕｌａｓｔａでの処置と比べてラットにおける化学療法により誘発される好中球減少の期間を約２４時間減少させることができると結論できる。
【０１６１】
配列表
添付の配列表配下の配列を含む：
配列番号１：ヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列。
配列番号２：コドンの使用がイー・コリにおける発現に最適化されたヒトＧ−ＣＳＦをエンコードする合成ＤＮＡ配列
配列番号３：ＯｍｐＡシグナル配列のアミノ酸配列
配列番号４：ＯｍｐＡシグナル配列をエンコードする合成ＤＮＡ配列
配列番号５：合成ヒスチジン標識
配列番号６：配列番号５のヒスチジン標識をエンコードする合成ＤＮＡ
配列番号７：ヒトＧ−ＣＳＦシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号８：配列番号７のシグナルペプチドを含み、コドンの使用がＣＨＯ細胞における発現に最適化された、ヒトＧ−ＣＳＦをエンコードする合成ＤＮＡ配列
配列番号９〜１５：様々な合成標識
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）およびＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈｇ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋのインビボ半減期。
【図２】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）およびＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈｇ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ１０５Ｋ  Ｑ１５９Ｋのインビボ半減期。
【図３】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ１２０ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００−結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋの健康なラットにおけるインビボ生物学的活性。
【図４】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  Ｔ１３３ＫおよびＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００−結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ  Ｔ１３３Ｋの健康なラットにおけるインビボ生物学的活性。
【図５】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ＳＰＡ−ＰＥＧ１２０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋの健康なラットにおけるインビボ生物学的活性。
【図６】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｑ１２０Ｋ、ＳＰＡ−ＰＥＧ  ５０００−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋ  ａｎｄ  ＳＰＡ−ＰＥＧ  ２００００−結合ｈＧＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋの健康なラットにおけるインビボ生物学的活性。
【図７】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ７０Ｋ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ、ＳＰＡ−ＰＥＧ  ２００００−結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋの化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性。
【図８】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｑ９０Ｋ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋの化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性（白血球数）。
【図９】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋの化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性（絶対好中球数）。
【図１０】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、２０ｋＤａＮ−末端ＰＥＧ基を有するｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）、および酵母およびＣＨＯ細胞において産生されたＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋの化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性（白血球数）。
【図１１】ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、２０ｋＤａＮ−末端ＰＥＧ基を有するｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）、および酵母およびＣＨＯ細胞において産生されたＳＰＡ−ＰＥＧ５０００結合ｈＧ−ＣＳＦ  Ｋ１６Ｒ  Ｋ３４Ｒ  Ｋ４０Ｒ  Ｔ１０５Ｋ  Ｓ１５９Ｋの化学療法により誘発される好中球減少症のラットにおけるインビボ生物学的活性（白血球数）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005506317.tif 000131
2005506317.tif 000132
2005506317.tif 000133
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