(57)【要約】本発明はヒト一過性受容器電位６遺伝子（ＴＲＰＣ６）がコードするポリペプチドの活性を変調する物質のアッセイ法に関する。該アッセイ法は、候補物質と当該ポリペプチドとを組合せ、次いで、該候補物質が当該ポリペプチドに及ぼす作用を測定することからなる。かかる物質は炎症性疾患、特に白血球と関連する疾患の処置用医薬の製造に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト一過性受容器電位６遺伝子（ＴＲＰＣ６）がコードするポリペプチドの活性を変調する白血球関連炎症性疾患処置の使用に適する物質の同定法であって、候補物質と当該ポリペプチドとを組合せ、次いで該候補物質が当該ポリペプチドに及ぼす作用を測定することを特徴とする方法。
【請求項２】
該候補物質と、ＴＲＰＣ６により安定に形質導入を受け、機能的ＴＲＰＣ６チャンネルを発現する細胞とを組合せ、ＴＲＰＣ６−介在Ｎａ＋流入を示すいずれかの膜脱分極を測定することからなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
アゴニストの刺激によりＴＲＰＣ６チャンネルを活性化し得る内在性カルシウム−可動性Ｇタンパク質−カップル結合レセプターを該細胞により発現させ、ＴＲＰＣ６チャンネルを刺激するための候補物質に続いてレセプターアゴニストを添加し、阻害測定を可能とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ヒトＴＲＰＣ６イオンチャンネルを通過するカルシウムイオンの流入を阻害する化合物および医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物。
【請求項５】
該化合物が１−［ｂ−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］−４−メトキシフェネチル］−１Ｈ−イミダゾール・ＨＣｌである請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヒトＴＲＰＣ６遺伝子によりコードされるポリペプチドと免疫反応する抗体の使用、または当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリオヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であって、ヒト組織において白血球蓄積を阻害する医薬の製造に際しての使用。
【請求項７】
ヒトＴＲＰＣ６遺伝子によりコードされるポリペプチドと免疫反応する抗体の使用、または当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリオヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であって、白血球関連炎症性疾患処置用の医薬製造に際しての使用。
【請求項８】
該疾患が、慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、リウマチ様関節炎または炎症性腸疾患などの好中球関連疾患である請求項７記載の使用。
【請求項９】
該疾患が、喘息およびアレルギー性鼻炎などの好酸球関連疾患である請求項７記載の使用。
【請求項１０】
白血球関連炎症性疾患の処置用医薬の製造におけるＴＲＰＣ６インヒビターの使用。
【請求項１１】
肺高血圧症の処置用医薬の製造におけるＴＲＰＣ６インヒビターの使用。
【請求項１２】
本明細書において実質的に実施例と関連して記載される、ヒト一過性受容器電位６遺伝子がコードするポリペプチドの活性を変調する白血球関連炎症性疾患の処置使用に適する物質の同定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は一過性受容器電位６イオンチャンネル（ＴＲＰＣ６）の活性を変調する物質または作用因子の同定、およびかかる物質の炎症性疾患、特に呼吸器系炎症性疾患の処置においての使用に関する。
【０００２】
炎症に際しては様々な細胞が組織内に引き寄せられる。これら細胞には種々の白血球、とりわけ中性好性顆粒球、好酸性顆粒球および単球などの炎症性食細胞が含まれる。好中球は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、たとえば、慢性気管支炎およびその関連する肺気腫、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などの呼吸器疾患、クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患、およびリウマチ様関節炎における炎症と組織破壊に関わる。好酸球は喘息およびアレルギー性鼻炎などの呼吸器疾患と関わっている。
【０００３】
炎症症状において白血球が作用する重要な段階は、これらの細胞の組織への移行、たとえば、呼吸器炎症における気道への移行またはリウマチ様関節炎における関節への移行、細胞活性化とある範囲の炎症性メディエーター、ロイコトリエン、酸素ラジカル、プロテアーゼの放出などである。白血球の移行と活性化が必要であるというシグナルは、多くの場合、細胞質基質カルシウムレベルの増加に応答して、レセプターを介して伝達される。Ｉｎｓ（１,４,５）Ｐ３レセプターは細胞内貯蔵庫からカルシウムイオンを放出させることが知られているが、それらのイオンが通過する血漿膜のチャンネルについては余り知られていない。
【０００４】
ショウジョウバエ（Drosophila）の一過性受容器電位または“ｔｒｐ”遺伝子は、Ｃａ＋＋選択性貯蔵作用Ｃａ＋＋取込み（ＳＯＣ）をコードすることが知られているが、これはヒトの相同体（ＴＲＰＣ）および関連の遺伝子を見出すために使用されていた。このことが、イオンチャンネル、すなわち、ＴＲＰＣ１−６として機能するタンパク質ファミリーの発見につながった。
【０００５】
ブーレイ（Boulay）らはマウスのＴＲＰＣ６をクローン化し、配列決定して、「ＧｑクラスのＧタンパク質にカップル結合したレセプターの活性化に対し、二次的にカルシウム取り込みに関与するショウジョウバエの一過性受容器電位（trp）の新規哺乳動物相同体のクローニングと発現」として報告した（J. Biol. Chem. Vol.272, 29672-29680 （1997））。マウスＴＲＰＣ６はジェンバンク（GenBank）から寄託番号ＮＰ_０３８８６６として入手し得る。
【０００６】
古典的ＴＲＰ６またはＴＲＰＣ６としても知られるヒトＴＲＰＣ６は寄託番号ＮＰ＿００４６１２としてジェンバンクから入手し得る。
【０００７】
デスポジト（D'Esposito）らは、ヒトＴＲＰＣ６遺伝子の配列について、「染色体１１ｑ２１-->ｑ２２に対するヒト一過性受容器電位チャンネル６遺伝子ＴＲＰＣ６の同定と帰属（Identification and assignment of the human transient receptor potential channel 6 gene TRPC6 to chromosome 11q21-->q22）」として報告した（Cytogenet. Cell Cenet. 83 （1-2）, 46-47 （1998））。
【０００８】
ホフマン（Hofmann）らは、「ジアシルグリセロールによるヒトＴＲＰＣ６およびＴＲＰＣ３チャンネルの直接活性化（Direct activation of human TRPC6 and TRPC3 channels by diacylglycerol）」（Nature Vol.397, 21 January 1999）において、もしＣＨＯ−Ｋ１細胞が異種として機能的ＴＲＰＣ６チャンネルを発現するなら（電気生理学的には証明されている）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞においてはヒスタミンが大きなＣａ＋＋流入を刺激することを示している。彼らはまたＴＲＰＣ６チャンネル活性がＮａ＋流入同様に測定し得ることも証明している。
【０００９】
ＴＲＰＣ６は、炎症に際して組織に引き寄せられた細胞中に存在することが判明している。ＴＲＰＣ６ｍＲＮＡは分離した一次ヒト好中球に存在し、また喫煙者とＣＯＰＤ患者から気管支肺胞洗浄により分離したヒト肺マクロファージにも存在することが示されている。ＴＲＰＣ６ｍＲＮＡの発現はまた培養したヒトの気道平滑筋細胞および十分に分化したヒト気管支上皮細胞にも見出されている。ＴＲＰＣ６タンパク質はヒトＴ−リンパ球、培養したヒトの気道平滑筋細胞、十分に分化したヒト気管支上皮細胞、気管支気道平滑筋、気道上皮の上皮細胞、粘膜下腺および組織の白血球、すなわち、好中球、マクロファージおよびリンパ球において発現されることが示されている。
【００１０】
かかる細胞へのカルシウムイオンの流入を阻害することにより、好中球または好酸球などの白血球の活性化を減弱させる物質が、喘息および慢性閉塞性肺疾患などの呼吸器疾患の処置に有用であることを本発明により提案する。したがって、本発明はかかる疾患の治療標的としてのＴＲＰＣ６を提供し、またヒトＴＲＰＣ６の遺伝子産物により形成されるチャンネル活性を刺激または阻害するモジュレーター、すなわち、ペプチド、ペプチド擬似物質、小分子またはその他の薬物などの候補化合物または作用因子を同定する“スクリーニングアッセイ”法を提供する。
【００１１】
したがって、第一の側面において、本発明は、ヒト一過性受容器電位６遺伝子（ＴＲＰＣ６）がコードするポリペプチドの活性を変調する白血球関連炎症性疾患処置の使用に適する物質の同定法であって、候補物質と当該ポリペプチドとを組合せ、次いで該候補物質が当該ポリペプチドに及ぼす作用を測定することを特徴とする方法に関する。
【００１２】
第二の側面において、本発明は、ヒトＴＲＰＣ６イオンチャンネルを通過するカルシウムイオンの流入を阻害する化合物および医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物に関する。
【００１３】
第三の側面において、本発明は、ヒトＴＲＰＣ６遺伝子がコードするポリペプチドの使用、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリオヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、または当該ポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドプローブと免疫反応する抗体の使用であって、ヒト組織において白血球蓄積を阻害する医薬の製造に際しての使用に関する。
【００１４】
第四の側面において、本発明は、ヒトＴＲＰＣ６遺伝子がコードするポリペプチドの使用、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリオヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、または当該ポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドプローブと免疫反応する抗体の使用であって、白血球関連炎症性疾患の処置用医薬の製造における使用に関する。
【００１５】
第五の側面において、本発明は、白血球関連炎症性疾患の処置用医薬の製造におけるＴＲＰＣ６インヒビターの使用に関する。
【００１６】
上記のように、第一の側面において、本発明は、ヒト一過性受容器電位６遺伝子がコードするポリペプチドの活性を変調する白血球関連炎症性疾患処置の使用に適する物質の本発明同定法に関する。広い意味で、本方法、またはアッセイ法は、候補物質と一過性受容器電位チャンネル６遺伝子がコードするポリペプチドとを組合せ、次いで該候補物質が当該ポリペプチドに及ぼす作用を測定することからなる。
【００１７】
白血球関連炎症性疾患の処置使用に適した物質とは、その活性のエンハンサー（本明細書では“ヒトＴＲＰＣ６アゴニスト”）またはインヒビター（本明細書では“ヒトＴＲＰＣ６アンタゴニスト”）として役立つ。
【００１８】
ＴＲＰＣ６遺伝子産物、すなわち、ＴＲＰＣ６イオンチャンネルを形成するポリペプチドは、たとえば、ヒトＴＲＰＣ６チャンネルの活性に刺激的または阻害的作用を示す化合物を同定する細胞にもとづく方法またはスクリーニングアッセイ法により、あるいは適切なレポーター遺伝子アッセイ法により測定し得る。
【００１９】
上記のスクリーニング法は、たとえば、その表面にＴＲＰＣ６ポリペプチドを発現する細胞、たとえば、昆虫、哺乳動物もしくは酵母の細胞を調製し、次いで得られる細胞を候補物質とインキュベートして、ＴＲＰＣ６ポリペプチドの機能的活性が上昇しているか、阻害されているかを測定することにより実施し得る。
【００２０】
ＴＲＰＣ６チャンネル活性化の適切な試験では、候補物質を、ＴＲＰＣ６の形質移入を安定に受け、機能的ＴＲＰＣ６チャンネルを発現する細胞と組合せ、膜脱分極を測定してＴＲＰＣ６−介在のＮａ＋流入を示す。
【００２１】
ＴＲＰＣ６チャンネル阻害の適切な試験では、内在性Ｇタンパク質カップル結合カルシウム可動性レセプター、たとえば、ＴＲＰＣ６チャンネルを活性化し得るムスカリン様アセチルコリンレセプターを発現する細胞を用い、レセプターアゴニスト、たとえば、ムスカリン様アセチルコリンレセプターアゴニストを加えてＴＲＰＣ６チャンネルを刺激する。該細胞はレセプターアゴニストの添加前に、候補物質で処理する。この処理は蛍光増大を生ずるはずであるが、その増大度は該候補化合物がＴＲＰＣ６チャンネルを阻害する場合、減少する。蛍光の何らかの変化は適切な装置、たとえば、蛍光画像プレートリーダーにより測定し得る。
【００２２】
かかる方法を使用し、１−［ｂ−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］−４−メトキシフェネチル］−１Ｈ−イミダゾール・ＨＣｌがヒトＴＲＰＣ６イオンチャンネルの活性を阻害することを見出した。
【００２３】
１−［ｂ−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］−４−メトキシフェネチル］−１Ｈ−イミダゾール・ＨＣｌは、レセプター介在カルシウム取込み（ＲＭＣＥ）を阻害することが開示されている（Merritt et al in Biochem. J. （1990） 271: 515-522）。また、井上らもマウスのＴＲＰＣ６イオンチャンネルを遮断することを開示している（Inoue et al in Circ. Res. （2001） 88: 325-332）。
【００２４】
本発明はまたヒトＴＲＰＣ６イオンチャンネルを通過するカルシウムイオンの流入を阻害する化合物、たとえば、１−［ｂ−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］−４−メトキシフェネチル］−１Ｈ−イミダゾール・ＨＣｌ、および医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物に関する。
【００２５】
ヒト組織において白血球の蓄積を阻害する医薬を製造するために、ヒトＴＲＰＣ６遺伝子がコードするポリペプチドと免疫反応する抗体（本明細書では“ヒトＴＲＰＣ６抗体”という）、または当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリオヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含んでなるアンチセンスオリゴヌクレオチド（本明細書では“ヒトＴＲＰＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチド”という）を使用することができる。
【００２６】
上記のヒトＴＲＰＣ６抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、白血球関連炎症性疾患を処置するために使用することができる。
【００２７】
ヒトＴＲＰＣ６アゴニスト、ヒトＴＲＰＣ６アンタゴニスト、ヒトＴＲＰＣ６抗体およびヒトＴＲＰＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書において“本発明の作用因子”として相互に集合的に引用する。
【００２８】
本発明を適用し得る好中球関連炎症性疾患は、好中球関連の炎症または閉塞性気道疾患、とりわけ慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、たとえば、慢性気管支炎および肺気腫、および成人（または急性）呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、リウマチ様関節炎、およびクローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患である。また本発明を適用し得る好酸球関連炎症性疾患は、好酸球関連の炎症または閉塞性気道疾患、とりわけ喘息およびアレルギー性鼻炎である。
【００２９】
末梢組織の中で、肺は胎盤とともに最高のレベルでＴＲＰＣ６を発現する。ＴＲＰＣ６は肺の多くの常在性細胞、たとえば、上皮細胞および気道平滑筋細胞に存在するが、肺動脈の平滑筋にも存在する。ＴＲＰＣ６は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）により刺激を受けた場合、これらの平滑筋細胞で上方制御される。ＰＤＧＦの増大は肺高血圧症および動脈平滑筋細胞の増殖と関連する。ＴＲＰＣ６の発現を、たとえば、アンチセンスにより阻害すると、ＰＤＧＦ−刺激を受けた動脈平滑筋細胞の増殖が抑制される。したがって、肺動脈の平滑筋ＴＲＰＣ６を阻害する医薬は肺高血圧症の処置に有用である。
【００３０】
ヒトＴＲＰＣ６ポリペプチドは適当な常套法により単離することができる。ヒトＴＲＰＣ６遺伝子の配列は既知であるため、特異的プライマーを簡便な選択肢として使用してもよい。たとえば、前進プライマーとしての（ＳＥＱ０１）５’−ｇｃａａａｔｇａａａｇｃｔｔｔｇｇａｃｃ−３’および逆進プライマーとしての（ＳＥＱ０２）５’−ａｔｃｇｔａａｃａｔｔａｔａｇａｃｔｃｃａｔ−３’は、３００塩基対のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物を生成する。
【００３１】
ヒトＴＲＰＣ６ポリヌクレオチドはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡであり、適当な常套法により取得し得る。たとえば、それを構成するヌクレオチドから化学合成により、たとえば、既知の手法と装置を用いる自動化固相合成により調製し得る。
【００３２】
ヒトＴＲＰＣ６抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。かかる抗体は常套の手法により調製し得る。精製抗原に対するポリクローナル抗体の産生方法は十分に確立されている（参考：Cooper and Paterson in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. Eds., John Wiley and Sons Inc., Chapter 11）。ヒトＴＲＰＣ６抗体はヒトＴＲＰＣ６ポリペプチドの検出または発現レベルの定量に、あるいはヒトＴＲＰＣ６ポリペプチドのリガンド／抗リガンド結合活性の阻害に使用し得る。
【００３３】
ヒトＴＲＰＣ６アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＤＮＡのホスホロチオエートもしくはメチルホスホネート類似体などのＤＮＡ類似体、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似体、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）でもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば、自動化固相法を用いる常套の方法で合成し得る。これは、それが望ましい場合、ヒトＴＲＰＣ６遺伝子の発現を阻害するために使用し得る。あるいは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を標的遺伝子ノックダウンの特異的手段として使用することができる。ＲＮＡ干渉は遺伝子の発現を阻害し、したがって遺伝子機能の探求に使用し得る。この技法についてはエルバシアーらが記載している（S.M. Elbashir et al in Methods 26 （2002） 199-213）。
【００３４】
ヒトＴＲＰＣ６ポリヌクレオチドプローブは上記ポリヌクレオチドまたはその相補体の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドからなる。該プローブはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡであり、常套の方法で合成することができる。通常、それは１５ないし５０個のヌクレオチドからなる合成オリゴヌクレオチドであり、たとえば、発蛍光基で標識して検出可能なシグナルを生じさせることも可能である。ヒトＴＲＰＣ６の最初の５０個程度のアミノ酸をコードするヌクレオチドは、この目的に使用し得る。ヒトＴＲＰＣ６ポリヌクレオチドプローブはヒトＴＲＰＣ６遺伝子の有無の検出、すなわち、遺伝的異常の検出に使用することができる。
【００３５】
白血球関連炎症性疾患を阻害または逆転させる際の本発明作用因子の有効性は、該疾患のモデル、たとえば、ラットまたはマウスのリポ多糖誘発肺炎症モデル、または文献（Durie et al., Clin. Immunol. Immunopathol. （1994） 73: 11-18; and Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1992） 89: 9784-9788）記載のモデルにて証明し得る。
【００３６】
本発明の作用因子は適切な経路により、たとえば、経口により、たとえば、錠剤またはカプセル剤の形状で；非経口的に、たとえば、静脈内に；局所的に、たとえば、軟膏またはクリームとして；経皮的に、たとえば、パッチとして；吸入により；または経鼻的に投与し得る。
【００３７】
本発明作用因子を含有する医薬組成物は、通常の希釈剤または添加剤ならびに製剤技術上既知の技法を用い、製造し得る。したがって、経口投与用剤は錠剤およびカプセル剤であり、吸引用の組成物はエーロゾルまたは他の噴霧可能製剤または乾燥粉末製剤を含み得る。
【００３８】
該組成物がエーロゾル製剤からなる場合、該製剤は、好ましくは、たとえば、ヒドロ−フルオロ−アルカン（ＨＦＡ）噴射剤、たとえば、ＨＦＡ１３４ａまたはＨＦＡ２２７またはその混合物、技術上既知の１種以上の補助溶媒、たとえば、エタノール（２０重量％まで）、１種以上の界面活性剤、たとえば、オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン、および１種以上の充填剤、たとえば、ラクトースを含む。
【００３９】
該組成物が乾燥粉末製剤からなる場合、該有効成分は、好ましくは、粒径が１０ミクロンまでのものであり、該製剤は希釈剤または担体、たとえば、ラクトース、および湿気による製品の性能劣化を防止する助剤となる化合物を含む。
【００４０】
該組成物が噴霧製剤からなる場合、該製剤は、好ましくは、たとえば、溶解もしくは懸濁状態の有効成分を、水、補助溶媒としてのエタノールまたはプロピレングリコールおよび界面活性剤でもある安定剤を含む媒体を含有する。本発明は、（ｉ）吸入可能な形状、たとえば、エーロゾルまたは他の噴霧可能な組成物または吸入可能な微粒子、たとえば、微小化形状の本発明作用因子；（ii）吸入可能な形状の本発明作用因子を含有してなる吸入可能な医薬；（iii）吸入装置と組み合わせた吸入可能形状のかかる本発明作用因子を含有してなる医薬製品；および（iv）吸入可能な形状の本発明作用因子を含有する吸入装置；を包含する。
【００４１】
本発明を実施するに際し採用する本発明作用因子の投与量は、勿論、たとえば、処置すべき特定の症状、所望の効果、および投与形態によって変動し得る。一般に、吸入投与の場合の適切な日用量は１μｇないし１０ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、経口投与の場合の適切な日用量は０.１ｍｇないし１０００ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【００４２】
本発明を以下の実施例により説明する。
【実施例１】
【００４３】
大量処理スクリーニングに適したアッセイ
候補化合物またはテスト化合物をスクリーニングするアッセイは、ＴＲＰＣ６を安定に形質導入した、機能的ＴＲＰＣ６チャンネルを発現する細胞、たとえば、哺乳動物細胞株ＨＥＫ２９３（ＴＲＰＣ６チャンネルを活性化し得る内在性ムスカリン様アセチルコリンレセプターを発現する）を用いて実施する。該アッセイは９６穴ＦＬＩＰＲ（登録商標）（Fluorescence Imaging Plate Reader；蛍光画像プレートリーダー）（モレキュラー・ディバイス・コーポレーション）上、モレキュラー・ディバイス専売ＦＬＩＰＲ（登録商標）膜電位アッセイキット（カタログ＃Ｒ８０３４）を用いて実施し、ＴＲＰＣ６−介在Ｎａ＋流入からの膜脱分極を測定する。このＴＲＰＣ６−介在応答の特異性は、Ｎａ＋が細胞外バッファーにおいて不透過性一価カチオンＮＭＤＧ＋と置換わっているならば、ＴＲＰＣ６発現細胞にはそれが観察されないこと、またＮａ＋流入依存性膜の脱分極がＴＲＰＣ６を形質移入していない対照の細胞で観察されないことを証明することにより示し得る。ＴＲＰＣ６発現細胞を９６穴黒色壁平底マイクロプレートに塗布容量１００μｌで播種し、アッセイにとって周密となるまで増殖させる。アッセイ用細胞を調製するために、細胞培地を除き、ローディングバッファー１００μｌを各ウエルに添加する。ローディングバッファーは、ｐＨ７.４で、１４０ｍＭ−ＮａＣｌ、０.１５ｍＭ−ＣａＣｌ２、３.３ｍＭ−ＫＨ２ＰＯ４、１.２ｍＭ−ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ−Ｄ−グルコースおよび２０ｍＭ−ＨＥＰＥＳからなり、０.０３ｍＭ−ＢＡＰＴＡ−ＡＭを含むバッファー中、必要なアッセイ濃度まで希釈したＦＬＩＰＲ（登録商標）膜電位色素からなる。プレートはアッセイを開始する前に３７℃で２０分間インキュベートする。ＴＲＰＣ６のインヒビターを検出するために、ムスカリン様アセチルコリンレセプターアゴニスト・カルバコール（ＴＲＰＣ６チャンネルを活性化する）で刺激する前または後に、各ウエルにテスト作用因子を加える。インヒビターの期待した効果は、カルバコール刺激による蛍光増大の減少となるはずである。ＴＲＰＣ６の活性化剤はテスト作用因子をカルバコールに置き換えることにより検出し得るが、この場合、活性化剤は蛍光増大を刺激する。
【実施例２】
【００４４】
１−［ｂ−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］−４−メトキシフェネチル］−１Ｈ−イミダゾール・ＨＣｌの検出
１−［ｂ−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］−４−メトキシフェネチル］−１Ｈ−イミダゾール・ＨＣｌで１０分間あらかじめ処理したＴＲＰＣ６クローン１４細胞を、実施例１に記載のアッセイ法にしたがってカルバコール（１０μＭ）で刺激する。カルバコールを添加する前に（最小の応答、すなわち、Ｍｉｎ）、また、カルバコール刺激による蛍光増大が最大に達したときに（最大応答、すなわち、Ｍａｘ）、蛍光を測定する。下記表１に認められるように、減少した蛍光応答が、化合物の存在しない対照応答に比べて、化合物処理細胞にて観察される。
【００４５】
【表１】
2005534311.tif 000002
【００４６】
データは（Ｍａｘ−Ｍｉｎ）／Ｍｉｎ応答として計算する。１−［ｂ−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］−４−メトキシフェネチル］−１Ｈ−イミダゾール・ＨＣｌの各濃度は、ｎ＝１０ウエルの平均±ＳＥＭ（平均値の標準誤差）である。ｎ＝４の実験から計算された平均ＩＣ５０値は４.９±０.８μＭ（平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）である。
【００４７】
この結果は実施例１に記載のアッセイ法が、１−［ｂ−［３−（４−メトキシフェニル）プロポキシ］−４−メトキシフェネチル］−１Ｈ−イミダゾール・ＨＣｌを検出していることを示している。
【配列表】
2005534311.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月27日(2005.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005534311000001.app
【国際調査報告】
2005534311.tif 000004
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