(57)【要約】リボソーム蛋白質、特にＰ０及びＬ５に結合する１以上の抗体の存在及び／又は量が、慢性の炎症性腸疾患にかかった患者又はそのような病気が疑われる患者の血清、血漿、組織試料及び／又は大便中で測定される、慢性の炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）の診断、早期診断、鑑別診断、病気の重さの評価、及び治療に伴うモニタリングと予後をする方法。適当な薬剤によって、そのような抗体をブロック又は除去すること、及び／又はリボソーム蛋白質、例えばＰ０及びＬ５と反応する抗原提示細胞又は特異的反応性のＴ細胞に影響を与えることは治療上利用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性の炎症性腸疾患にかかった患者又はそのような病気が疑われる患者の血清、血漿、組織試料及び／又は大便中の、リボソーム蛋白質に結合する１以上の抗体の存在及び／又は量を測定することを特徴とする、慢性の炎症性腸疾患の診断、早期診断、鑑別診断、病気の重さの評価、及び治療に伴うモニタリング及び予後をする方法。
【請求項２】
慢性の炎症性腸疾患がクローン病又は潰瘍性大腸炎又は不確定性大腸炎(colitis indeterminata)と命名されるそれらの混合形態から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リボソーム蛋白質Ｐ０又はリボソーム蛋白質Ｌ５に結合する抗体群から選択される少なくとも１種の抗体を測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該１以上の抗体又は該少なくとも１種の抗体をイムノアッセイを用いて測定し、該イムノアッセイ中で完全な形態のリボソーム蛋白質、又はアダクト、ホスホリル化生成物、部分ペプチド又は腸に特異的なスプライシングバリアントの形態のリボソーム蛋白質を、測定されるべき抗体に結合するための及び／又は測定されるべき抗体をマーキング（marking）するための抗原としてそれぞれ使用することを特徴とする請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
リボソーム蛋白質が濃縮された又は天然供給源から単離された又は遺伝子工学方法によって（組替えにより）造られたヒト又は動物の蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
クローン病及び／又は潰瘍性大腸炎の治療のための、リボソーム蛋白質Ｐ０に結合する抗体及び／又はリボソーム蛋白質Ｌ５に結合する抗体に対する結合又はブロックをする薬剤製造用の、完全な形態の又はアダクト、ホスホリル化生成物、部分ペプチド、ペプチド類似体又は腸に特異的なスプライシングバリアントの形態のリボソーム蛋白質Ｐ０及び／又はリボソーム蛋白質Ｌ５の用途。
【請求項７】
抗原提示細胞をブロックすることによって腸の炎症及びクローン病及び／又は潰瘍性大腸炎に関連する炎症を抑制するための又はＴ細胞アネルギーをつくりだすための薬剤製造用の、完全な形態の又はアダクト、ホスホリル化生成物、部分ペプチド、ペプチド類似体又は腸に特異的なスプライシングバリアントの形態のリボソーム蛋白質Ｐ０及び／又はリボソーム蛋白質Ｌ５の用途。
【請求項８】
リボソーム蛋白質Ｐ０に結合する抗体及び／又はリボソーム蛋白質Ｌ５に結合する抗体を患者の血液循環から体外的に除去するためのアフィニティ物質を製造する請求項６に記載のリボソーム蛋白質Ｐ０及び／又はリボソーム蛋白質Ｌ５の用途。
【請求項９】
抗原提示細胞をブロックする為の又はＴ細胞アネルギーをつくりだす為の注射用又は経口投与用薬剤を製造する請求項６又は７に記載のリボソーム蛋白質Ｐ０及び／又はリボソーム蛋白質Ｌ５の用途。
【請求項１０】
リボソーム蛋白質Ｐ０及び／又はＬ５に結合する抗体のリボソーム蛋白質Ｐ０及び／又はＬ５に対する結合を完全に又は部分的にブロックするように、該リボソーム蛋白質Ｐ０及び／又はＬ５に結合する抗体に結合する活性成分を製薬上受入れられる賦形剤の他に含有している、クローン病及び／又は潰瘍性大腸炎を治療する為の薬剤。
【請求項１１】
活性成分がリボソーム、リボソーム断片、リボソーム蛋白質及びそれらの部分配列及び／又は断片であることを特徴とする請求項１０に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性腸疾患の新規な診断方法に関する。特に本発明は、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＣＵ）、及び不確定性大腸炎(colitis indeterminata)と呼ばれているそれらの混合形等の慢性の炎症性腸疾患を、そのような病気にかかっている患者中の定義された抗体（自己抗体）の最初の証拠に基づいて診断する新規な方法、その診断方法から誘導される治療方法、及びそのような治療方法で使用することのできる試薬・薬剤に関している。
【背景技術】
【０００２】
胃腸管の病気には腸壁及び／又は腸の粘膜が炎症を起こす炎症性腸疾患が含まれる。狭い意味の腸炎は小腸の腸壁の炎症として定義されるが、一方大腸炎は大腸の粘膜の炎症と定義される。炎症性の腸疾患には種々の原因があり、例えば感染性のもの又は毒性の結果起こり得るものであり得、そして急性又は慢性の病気として起こり得る。炎症性腸疾患の中でも、慢性の炎症性腸疾患は罹病率（病気にかかる割合）及び致死率（死亡の割合）が高いため、経済及び内科医療のために特に重要である。即ちこれらは、クローン病（crohn's disease,同義語：局所性回腸炎(regional enteritis)）、潰瘍性大腸炎（同義語：重症大腸炎(Colitis gravis)）、及びそれらの混合形の不確定性大腸炎(colitis indeterminata)と言う名前で知られた病気等である。特徴的な症状は腹痛、下痢及び小腸が影響を受けている場合にはおそらく吸収不良がある。腸の狭窄、内的及び外的な瘻、及び膿瘍がクローン病においては併発症として生じる一方、潰瘍性大腸炎の場合においては、ひどい血液の損失と大腸ガンの発生リスクの増加(２５年を越えて病気が存在する場合には約４０％）が起きる。クローン病における臨床的な特徴は、遠位の小腸の不連続的な攻撃及び大腸（結腸）への不連続的な攻撃がある一方、潰瘍性大腸炎の場合には、主として遠位の区域で、腸への連続的な攻撃がある。組織学的には、クローン病では類上皮細胞(epithelioid cell)の肉芽腫(granuloma)が特徴的に見いだされ、そして潰瘍性大腸炎では陰窩膿瘍(crypt abscess)の発見が特徴的である。慢性の炎症性腸疾患にかかっている５〜１０％の患者が両方の臨床像を示す（不確定性大腸炎）。
【０００３】
今日までの知識をもとにすれば慢性の炎症性腸疾患はある程度多数の要因によるものである。議論される要因には栄養的な習慣及び精神的な引き金が含まれる。ポリジェネティックな素因(polygenetic predisposition:素因が複数の遺伝子の制御によるもの)及び幾つかの外的な影響、特に腸内菌相（intestinal flora）からの影響が確認されている。
【非特許文献１】
段落番号００４７の引用文献のリストを参照
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
病気が慢性的に経過することに基づいて、そして種々の付随する現象に基づいて、上記の慢性炎症性腸疾患は自己免疫反応の可能性があるのではないかとの観点からも比較的長い期間にわたって議論されてきた。しかしながら、自己抗体が存在する場合には、診断目的に必要な、感受性（患者をもとにした特徴。１００％の最適な特異性のためには抗体が全ての患者に見出されること。）と特異性（健康な人をもとにした特徴。１００％の最適な特異性のためには抗体はどんな健康な患者中にも検出されないこと。）とを有しているものであるが、自己抗体というものは今日までよく解明されていない。今日まで慢性の炎症性腸疾患の治療では、いかなる形でも、慢性の炎症性腸疾患の病理学的なプロセスと密接に関連した抗体が解明されたことがないということも、それらの病気の性質を特に自己免疫病の可能性があるものと考えることを妨げてきた。
【０００５】
本発明は、純粋に実験的（経験的）であって特定の器官や組織に表れる調べようとする病気が自己免疫病かもしれないということ以外は仮説又は論理的推測を全くたてたり行ったりしない、免疫学的な蛋白質分析の特別に設計された分析方法手段によってなされる新規な発見に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この方法の使用によって次の様な結果に導かれる。臨床的な知見に基づきクローン病又は潰瘍性大腸炎と診断された患者中に、それ自体は知られていることがわかった特定のリボソーム蛋白質、即ちリボソーム蛋白質Ｐ０及び／又はＬ５、に結合する抗体が高い感受性及び特異性で見いだされるということである。クローン病又は潰瘍性大腸炎中に起きる自己免疫プロセスでそれらがどのように参加しているかは今日まで全く知られていなかった。
【０００７】
本明細書に記載される経験的な発見は、生物学的試料、特に血清、血漿、組織試料、及び／又は大便中に、高い診断の確度をもって対応する抗体が検出されることによって、はじめて、上記の慢性の炎症性腸疾患を診断することを可能にするものである。
【０００８】
更に、上記の病気に存在する抗体の性質についての新規な発見は、性質が自己免疫病である上記の病気の治療に対する新規な治療方法を開発することを可能にするものである。
【０００９】
第一の面に於いて、本発明は従って慢性の炎症性腸疾患、特にクローン病、潰瘍性大腸炎、及びそれらの混合形である不確定性大腸炎の新規な診断方法、特に診断、初期診断、鑑別診断(differential diagnosis)、病気の重さの評価、治療に伴うモニタリングと予後・予知(prognosis)を提供するものであって、その特徴はリボソーム蛋白質、特にリボソーム蛋白質Ｐ０及びＬ５に結合する１以上の抗体の存在及び／又は量が炎症性腸疾患にかかっている患者又はそのような病気が疑われる患者の血清、血漿、組織試料及び／又は大便中で測定されることである。
【００１０】
生物学的試料中の上記抗体の測定方法は、抗体を検出し測定するために使用される任意の公知の免疫診断法であり得る。好ましくは、抗体はイムノアッセイの助けによって測定され、そのイムノアッセイ中では、それぞれのリボソーム蛋白質（Ｐ０，Ｌ５）が、完全な形態で又はアダクト、ホスホリル化生成物、部分ペプチド、又は観測されるスプライシングバリアント（スプライシング変異物）、特に腸に特異的なスプライシングバリアントの形態で、捜そうとする抗体に結合するための抗原として使用される。次に生物学的試料からの特異的に結合した抗体をマーキングするために、それ自体は知られている方法でマーキングのされたある種の適当な抗ヒト抗体を、又は抗体結合のために使用される抗原を含有している別の抗原調製物を、又は類似の特異的な抗原を、マーキングされた形態で使用することが出来る。勿論、抗体測定に使用されるアッセイを、生じる抗体濃度の範囲内の要求感度のものに確実になるようにするのが好ましい。
【００１１】
測定方法はまた、チップ(chip)テクノロジーを用いて、又は緊急検査（rapid test）（ポイントオブケア検査（point-of-care test＝オーダー無し検査）)として実施されることも出来る。抗原として使用されるべきリボソーム蛋白質Ｐ０及び／又はＬ５は、濃縮されるか又は適当な天然（ヒト又は動物）供給源から単離されたヒト又は動物蛋白質のものであり得るか、又は遺伝子工学方法によって特別に（組替えによって）つくられたものであり得る。例えばリボソーム蛋白質Ｐ０は、種の境界線の数多くを越えて、同一の形態で又は免疫学的に非常に類似した形態で見いだされるものであるから、適当なアッセイ法を提供するのに、必要な抗原調製物を得るのに広い範囲の恐らく適当と思われる出発物質を利用できる。
【００１２】
慢性の炎症性腸疾患であるクローン病及び潰瘍性大腸炎の新規な可能性ある治療法を提供するために、一方では自己免疫プロセス中に関与する抗体を不活性化（ブロック）又は除去することを狙い、他方では免疫耐性を造り出すことによって特異的な方法で病理学的なプロセスに影響を与えることを狙う治療方法に従うことが出来る。抗体をブロックするためには活性物質、例えばリボソーム、リボソームフラクション、リボソーム蛋白質、又はその断片又は誘導体類であって循環している抗体に結合し抗体を不活性化するもの、を使用することが可能である。上記の抗体に対するそのような特異的な結合物は、アフィニティー精製のための物質の調製のためにも使用することが出来、その手段によって病原性の抗体を血漿搬出法(plasmapheresis:溢血により得た血液を遠心分離し血漿を廃棄し血球のみを再洗浄した後再び静注するなど)によって体外的に除去することが出来る。
【００１３】
別の方法として、蛋白質Ｐ０及び／又はＬ５は完全な形態又はアダクト、ホスホリル化生成物、部分ペプチド、ペプチド類似体、又は腸に特異的なスプライシングバリアントの形態で、免疫耐性を導入するための治療剤として使用することが出来、又は抗原提示のブロック又は調整により、抗原提示細胞又はＴ細胞中のＴ細胞反応性のブロックを誘発するための治療剤として使用することが出来る。
【００１４】
上にまとめた結果は、次の一般に応用できる分析手順に従って得ることが出来た。
基本的に任意の病気での自己免疫プロセスの関与を立証するのに適しており、同時にそれぞれの病気で生じている自己抗体の結合パートナーについての正確な情報を提供する、純粋に実験的な分析方法が抗体（自己抗体）を同定するために開発された。
【００１５】
この手順は以下の通りである。
病気が自己免疫反応に基づくか又は自己免疫の成分を有していることが仮定され、そしてそれぞれの病気についての典型的な症状が特に強められる器官又は組織の組織構造に対し、自己免疫病に特徴的な自己抗体は攻撃をするものであるということが仮定された。次に、病理学的プロセスに典型的な自己抗体が関与しているかどうかという問題を試験するために、臨床的な知見に基づけば調べようとする病気にかかっているとされる患者からの非特異的なアフィニティー精製によってイムノグロブリンのフラクションを先ず得る。同時に健康なヒトから対応するイムノグロブリンのフラクションを得る。健康なヒトから得られたイムノグロブリンフラクション及び患者から得られたイムノグロブリンフラクションを次に別々にアフィニティークロマトグラフィーの為のキャリア物質に結合させるが、これを行うに、比較アフィニティークロマトグラフィーのために異なるイムノグロブリンによって特徴付けられる二つのカラムが得られるようにする。
【００１６】
次に両方のカラムに組織抽出物が負荷させられるが、組織抽出物は健康な組織から得られたもの及び病気の場合の攻撃された病理学的組織から得られたものでありうる。
【００１７】
一つの同じ組織抽出物を二つの異なるアフィニティーカラムに通すと、患者イムノグロブリンの負荷されたアフィニティーカラムに病気に典型的な自己抗体が更に結合しているときは、カラムに存在する自己抗体と特異的な結合反応を受ける成分は、加えた組織抽出物から（カラムへ）保持される。
【００１８】
その後、抗原抗体結合が破壊される条件下で、カラムの溶離が行われるとき、二つの異なる溶出物（蛋白質フラクション）が得られる。即ち、患者のイムノグロブリンを有しているアフィニティカラムからの溶出物であるが、その溶出物は、存在する病気に特異的な自己抗体に結合されていた追加的な成分を含有していることもあるものである。
【００１９】
その後この溶出物の成分を２次元のゲル電気泳動で調べると、組織試料中の以前は病気に特異的な抗体に結合されていた成分は、健康なヒトのイムノグロブリンは有するが自己抗体は有しないアフィニティーカラムによっては保持されなかった蛋白質の追加的なスポットとして検出可能である。
【００２０】
次に病気に典型的な蛋白質のスポットを単離し、そして蛋白質分析の近代的方法によって調べることが出来る。
【００２１】
健康な組織からの組織フラクションを使用するとき、追加的な蛋白質が見いだされたとしてもそれは必ずしも自己免疫反応を起こす原因として関与した自己抗原であるとはかぎらない。例えば、もし自己免疫反応が見つかった蛋白質の特定の病理学的形態（例えば特別に処理された蛋白質、器官特異的なスプライシングバリアント、外来の蛋白質であって例えば感染ルートによって腸に入ったもの）によってトリガーされた／起こされたとすると、これは試験中で用いられた「正常な」組織成分に対する単離された抗体の結合挙動に反映される必要はない。病原的（引き金をひく）自己抗原の正確な性質は免疫診断法に対しては重要性は二次的なものにすぎず、免疫診断法に於いては重要なことは病理学的なプロセスに対するバイオマーカーの役目を何にまかせると信頼できるかということである。しかしながら特定の自己抗体が病気に特異的に発生することの知識に鑑み、必要ならば見つかった種類の自己抗体を任意付加的に組み合わせた、患者の組織試料を使用した場合に、攻撃される組織中に実際に存在し病気の引き金を引く又は自己抗体との相互作用で患者中に生じる、機能的な変化のより正確な詳細を決定することも原理的にはもちろん可能である。従って、そのようなその後の発見は診断手順の更なる改良の為に使用されることもできる。
【００２２】
本発明の場合慢性の炎症性腸疾患についての知識を得ることが目的である本発明者の実験は、（健康な）狒（ひひ）の小腸から得られた組織抽出物を使用して実施された。霊長類（ヒヒ）の組織抽出物を選択したが、その理由は、それらが容易に入手できるから、そして経験により霊長類とヒトの蛋白質の間の非常に高い類似性があることが示されているからである。上記類似性は多くの治療的及び診断的なヒトの試薬との高い交差反応性から明らかである。
【００２３】
下により詳細に記載されるように、アフィニティカラムと組み合わせたヒヒの小腸からの組織抽出物で研究を実施することによって、即ち、アフィニティーカラムの一つには健康なヒトのアフィニティ精製されたイムノグロブリンフラクションが負荷され、一方、もう一つのアフィニティーカラムにはクローン病及び／又は潰瘍性大腸炎にかかった患者のイムノグロブリンフラクションを有しているものを用いて、患者のアフィニティカラムからの溶出物中に、患者イムノグロブリンを有しているアフィニティカラムからの溶出物中のみに生じ、ゲル電気泳動に基づいてそれぞれ約３６ｋＤ及び３８ｋＤの分子量を有している、二つの蛋白質スポットを見つけることが可能である。これらの蛋白質スポットは電気泳動ゲルから単離され、トリプシン消化によって断片に分解され、それ自体は知られた方法でマススぺエクトロメトリーによって分析され、既知のトリプシン処理蛋白質についてのデーターとの比較によって同定することができた。
【００２４】
見いだされた両方の蛋白質が既知のリボソーム蛋白質であって、一方はいわゆるリボソーム蛋白質Ｐ０であって、既知のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に従う配列を有し｛データベース スイス ＰＲＯＴ Ｅｎｔｒｙ ＲＬＡ０＿ＨＵＭＡＮ  ６０Ｓ 酸性  リボソーム蛋白質Ｐ０；Ｐ０５３８８；N.ファビエン等，（１５），リボソームＰ蛋白質に対する自己抗体はＰ０、Ｐ１及びＰ２蛋白質の共通のエピトープに対するものではない，J.Autoimmune(1999),13,103-110；及びそこに引用されている文献、特にウールＩ．Ｇ．等、Ｂｉｏｃｈｉｍｅ７３：８６１−８７０も参照｝、そして他方はリボソーム蛋白質Ｌ５であって、既知のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に従う配列を有している｛データーベース  スイス  ＰＲＯＴ Ｅｎｔｒｙ ＲＬ５＿ＨＵＭＡＮ  ６０Ｓ  リボソーム蛋白質Ｌ５；Ｐ４６７７７；  J.-M.フリゲリオ、J.-C.ダゴルン、J.L.イオヴァンナ，（２６），Ｌ５、Ｌ２１、Ｌ２７ａ、Ｌ２８、Ｓ５、Ｓ９、Ｓ１０、及びＳ２９、ヒトリボソーム蛋白質ｍＲＮＡｓのクローニング、配列決定及び発現，Biochim. Biophys. Acta 1262(1995)64-68も参照｝。
【００２５】
蛋白質も又はそれらに対する抗体も両方とも、自己免疫病に於いてはある役割を果たす事が知られていたのは事実である。特にいわゆる全身的紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）に於いてはそうである｛例えば次を参照：J.-C. ホンベルグ，M.リゼット及びデボラ ドニアック，（２），全身的な紅斑性狼瘡及び他の膠原症中で蛍光抗体法(immunofluorescence)によって検出されるリボソーム抗体，Clin. exp. Immunol.(1974)17,617-628；トーマス L. ，（１），Labor und Diagnose〔実験室と診断〕第５版，１９９８，８２４−８４２；A.ギウアリス等，（２２），抗−５Ｓ  ＲＮＡ／蛋白質（ＲＮＰ）抗体水準が全身的紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）腎炎を有している患者中の病気の活性と相関する，Clin.Exp.Immunol.1994,95,385-389｝。蛋白質Ｐ０に対する抗体はＳＬＥの診断中で臨床的に測定される。この目的に開発されたアッセイ法は(米国特許)ＵＳ−Ａ−４,８６５,９７０中に記載されている。類似のアッセイ法が更に１４２２８  ニューヨーク州  バッファロー  イムコディアグノスティック  インコーポレイテッドのイミュリサ（商標）抗リボソーマルＰキット，エリサ〔ImmuLisaTM Anti-Ribosomal P Kit, ELISA〕として販売されている。これらのアッセイでは、測定されるべき抗体に対する特異的なバインダー（結合体）として、蛋白質Ｐ０のカルボキシ末端から比較的短いペプチド配列、及び密接に関連するＰ１及びＰ２を用いて操作される。そのようなアッセイは本発明に従う診断法中でも使用できるが、上記タイプの部分ペプチドを用いると適切に関係している抗体の幾つかのみが見いだされるにすぎないから、好ましさは小さい方法である（エヌ．ファビエン等，（２２：但し１５の誤記），J. Autoimmun. (1999) 13, 103-110）。
【００２６】
上記の二つのリボソーム蛋白質Ｐ０及びＬ５に結合する自己抗体が、慢性の炎症性腸疾患であるクローン病（ＣＤ）と潰瘍性大腸炎（ＣＵ）の症例での、患者の血清中にも見いだされるという事実は、今日までまったく知られていなかった。
【００２７】
Ｐ０は、低級の生物例えば寄生生物からヒトに至る範囲の多数の生物中に、同じ形で存在しているリボソーム蛋白質であるか、又は非常に高い類似性を有するリボソーム蛋白質という形で存在しているものである。これはリボソームの大サブユニット中のペンタマー複合体として存在することが知られている。リボソーム蛋白質Ｐ０については広範な化学文献が存在し、これらの文献に対する参照は、本明細書中の添付引用リスト中の例を全体に参照することによって、また特に１〜１６番を参照することによってなされる。本願中の発見に鑑みて、腸の癌及び肝臓癌の場合にＰ０が過剰発現していること（７，８）、そして組織にもよるが細胞膜の表面でも発現されていること（５）が特に興味深く、このことはＣＤ及びＣＵの腸特異性に関して興味深い。更にＰ０が属しているリボソームＰ蛋白質に対する抗体は抗リンパ球抗体（３，４）の観点からも議論されることを更に述べるべきである。
【００２８】
リボソーム蛋白質Ｌ５についても広範な化学文献が存在する。この関係でも引用リストの例の全体を参照するが、特に１８〜２７番を参照されたい。本願の発見と関連して、Ｌ５が数多くの蛋白質、例えば酵素機能を有しているもの（例えば蛋白質フォスファターゼ−１（１９）又はカルモジュリンキナーゼ−２（２７））と相互作用すること、及びＬ５が更にＲＮＡとの複合体で存在し（１９−２３）、この複合体形で抗原として作用できることは特に興味深い。更に本願の発見は、研究への新たな強いはずみをつけるものであろうと期待される。
【００２９】
ＣＤ又はＣＵ患者中で検出可能な抗体のみに結合する蛋白質の発見と同定を、添付の配列リストも参照して、以下により詳細に記載する。
【００３０】
図面は以下のものを示している。
図１は健康なヒトの血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムの溶出物のスポットパターン（Ａ）をＣＤ又はＣＵ患者の血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムのもの（Ｂ）と比較することを可能とする２次元の電気泳動ゲルの図（写真）を示している。縁取りした領域は患者のアフィニティカラムのみから溶出できる第１の蛋白質の位置を示している。
図２は健康なヒトの血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムの溶出物のスポットパターン（Ａ）をＣＤ又はＣＵ患者の血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムのもの（Ｂ）と比較することを可能とする２次元の電気泳動ゲルの図（写真）を示している。縁取りした領域は患者のアフィニティカラムのみから溶出できる第２の蛋白質の位置を示している。
図３は図１（Ｂ）に従う二次元電気泳動のゲルから単離されたトリプシン消化生成物のマススペクトルを示している。
図４は図２（Ｂ）に従う二次元電気泳動のゲルから単離したトリプシン消化生成物のマススペクトルを示している。
【実施例１】
【００３１】
１．ヒヒ小腸から抽出物の調製
成長したヒヒ（２〜３才，２５〜３５ｋｇ，オスとメス）をドレサール（dolethal） （１０ｍｌ）の静脈内投与によって殺した。小腸を１５分以内に取り出し、水で洗浄し、およそ１０ｇ片に分割し、そして液体窒素で即時凍結させた。
【００３２】
更なる処理に於いて個々のディープ凍結した小腸組織の試料をポーセレン（磁器）の乳鉢中で砕き窒素で冷却しながら粉末を得た（ジェイ．クローゼ，「２次元電気泳動用のマウスとヒトからの全組織蛋白質の分別抽出法」，Methods in Molecular Biology, １１２巻，二次元プロテオーム分析プロットコル，ヒューマンプレスインコーポレイテッド，ニュージャージー州  トトアを参照）。全てのその後の段階はプラス４℃で実施された。粉末を１００ｍｌの緩衝液に入れた（５０mM HEPES(ヘペス)，５０mM NaCl, pH8）。そして９００rpmで５回の上下運動で６０ｍｌのポッター（ブラウンメルスンゲン製(のホモジナイザー)）によってホモジナイズした。その後100,000ｇで１時間遠心分離し、得られた上澄み（組織抽出物）を回収し更なる調査の為に使用した。
【００３３】
２．イムノグロブリン調製物とアフィニティカラムの準備
一方はクローン病又は潰瘍性大腸炎の患者の血清から、他方は（対照血清として）健康な患者から、イムノグロブリンをプロテインＧアガロース（Protein G agarose）を通過する非特異的アフィニティ精製によって単離した。この目的の為に各々０．２ｍｌの血清を０．２ｍｌのＰＢＳと混合し、次に０．５ｍｌのプロテインＧアガロース（パックゲル）を加えた。混合物を３０分間穏やかに振盪させながら培養し、次に下端が閉鎖され細かいフリットを有しているガラスカラム（直径０．５ｃｍ）中に導入した。このカラムをまずＰＢＳ（５ｍｌ）で洗浄し、そして結合したイムノグロブリンを次に２０mMクエン酸（pHおよそ２．５）で溶離した（流速およそ１ｍｌ／分）。イムノグロブリン溶出物をトリス−ＨCl，１Ｍ，ｐＨ８．０を加えることによって中和した。
【００３４】
次に精製されたイムノグロブリンフラクションを過ヨウ素酸ナトリウムを添加することによって２０分間酸化させた（最終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）。次に過ヨウ素酸ナトリウムを製造元の方法に従うＮＡＰ−５カラム（ファルマシア）による脱塩によって除去した。ここでＰＢＳをカラム中で使用しそして溶離緩衝液としても用いた。
【００３５】
脱塩された酸化されたイムノグロブリンフラクションをカルボリンク材料と混合した（０．５ｍｌのパックされたゲル，ＰＢＳで洗浄，ピアース製）。穏やかに振盪させながら１２時間培養した後、得られたそしてそれぞれのイムノグロブリンフラクションでコートされたアフィニティ材料を細かいフリットを有しているガラスカラム（０．５ｃｍ径）中に導入しそして１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。
【００３６】
３．アフィニティ精製による腸抽出物のワークアップ（仕上げ）
各々５ｍｌの上記１に従うヒヒの腸抽出物を、連続的にそして繰り返し０．５ｍｌ／分の流速で１時間にわたり各々上記２に従うイムノグロブリンフラクションが負荷されているアフィニティカラムに加えた。次にカラムを５ミリリットルのＰＢＳで洗浄した。流出を連続的に２８０nmの吸収についてモニターした。
【００３７】
アフィニティカラムに結合した蛋白質を次に２０ｍＭクエン酸（ｐＨおよそ２．５）で溶離した。得られた溶出物を次に二次元ゲル電気泳動によって分析した。
【００３８】
４．アフィニティカラムの溶出物を用いるプロテオーム分析
最初の分析用２次元ゲル電気泳動（analytical 2D gel electrophoresis）に於いて、個々の溶出物を、Ｊ．クローゼ等「蛋白質の２次元ゲル電気泳動：ゲノムの機能分析の為のアップデートされたプロトコルとその意味（implications）」，Electrophoresis  １９９５，１６，１０３４−１０５９に記載されるように、分析用２次元ゲル電気泳動で分離した。２次元電気泳動ゲル中の蛋白質の可視化を銀染色によって実施した（以下を参照：J. ホイケショーベン等，「Phast-System Development Unit Ｉ中のファスト（fast）染色の為の改良された銀染色手順。ナトリウムドデシルゲルの染色。」，Electrophoresis  １９８８，９，２８−３２）。染色されたゲルをバイオラッド５８３ゲルドライヤーを用いて乾燥した。
【００３９】
評価の為に、健康なヒトのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムからの溶出物の蛋白質スポットパターンを、ＣＤ又はＣＵ患者のイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムからの対応する溶出物から生じた蛋白質スポットパターンと比較した。健康なヒトでは生じることがなく、患者の試料の場合には常に追加的に存在する蛋白質スポットを、更なる分析試験の為に選択した。図１と図２は、健康なヒトの血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムの溶出物のスポットパターン（Ａ）を、ＣＤ又はＣＵ患者の血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムからのもの（Ｂ）と比較することを可能とする、２次元電気泳動ゲルの写真を示している。縁取りした領域は、患者のアフィニティカラムのみから溶出されることができる蛋白質の位置を示している。
【００４０】
驚くべきことに、患者のカラムからの溶出物中に二つの新規な蛋白質スポット又は蛋白質バンドが発見された。即ち、約３８ｋＤの分子量で、ｐＩが約５．５の一つのスポットと、分子量約３６ｋＤにあるがｐＩ方向に細長いストライプ状のスポットとして見える鋭いバンドとである。これらの二つの新規な蛋白質スポットは、患者のカラムからの全ての溶出物中に存在するが、健康な人のイムノグロブリンを含有しているカラムからの溶出物中には見ることが出来なかった。
【００４１】
次に分析用２次元ゲル電気泳動（analytical 2D gel electrophoresis）の蛋白質スポットパターン中で同定された新規な特異的な蛋白質を、分離(分取)用２次元ゲル電気泳動（preparative 2D gel electrophoresis）によって製造した。（クローゼ，上記引用文中を参照）。染色はクマシーブリリアントブルーＧ２５０によって行った。（V.ノイホフ等、Electrophoresis 1988, 9, 255-262；及びElectrophoresis 1990, 11, 101-117を参照）。
【００４２】
更に分析するための予め選択された蛋白質スポットを、コウルチェスネ PL等、Methods in Molecular Biology, Vol. 112:487-513中に記載された方法を使用してゲルから切り取り、トリプシン消化し、コウルチェスネ PL（上記引用文）中に同様に記載され議論されるように質量分析法の試験を用いて質量分析装置により分析した。次に二つの新規なスポットの質量分析装置（MALDI-MS）で得られたフラグメントパターン（図３及び図４）をデータベースから入手できる既知の蛋白質のフラグメントパターンと比較した。この目的には種々のインターネットソフトウェアプログラムを使用した。先ず、MALDI-MSによって測定されたペプチドの質量を全ての既知の哺乳類蛋白質の論理的ペプチドの質量とマッチさせた。蛋白質の検索の為には（検索プログラムのプロテインプロスペクター(Protein Prspector)を使用してOwl.７．２．２００１データベース中で実施）、１００ｐｐｍ（Ｐ０）又は２００ｐｍ（Ｌ５）の質量トレランス(mass torelance)を有しているモノアイソトピック質量が許された。図１Ｂ（Ｐ０）の蛋白質の場合には、検索プログラムのプロファウンド（ProFound）を使用してＮＣＢｉｎｒ．データベースで、そして図２Ｂの蛋白質の場合には検索プログラムのプロファウンド（種：哺乳類）及び質量トレランス２００ｐｐｍを使用するデータベースＮＣＢＩ（２００１／０７／２０）を使用して更に検索を実施した。
【００４３】
病気に典型的な二つの蛋白質は、SEQ ID NO:1に従うアミノ酸配列を有しているリボソーム蛋白質Ｐ０、そしてアミノ酸配列SEQ ID NO:2を有しているリボソーム蛋白質Ｌ５として疑いなく同定され、これらの蛋白質はそらら自体は知られているものである。
【００４４】
５．  対照と病理学的試料の間の定性的比較
次の表に示される結果は、各々、健康なヒト（対照）の１０個の血清、ＣＤ患者の１０個の血清、及びＣＵ患者の１０個の血清を用い、上記のカラムを上記の腸の抽出物で処理することによって、上記の手順に従う個々のアフィニティカラムを準備することによって得られた。
【００４５】
【表１】
2005504321.tif 000002
【００４６】
表から両方の種類の抗体がほとんどのＣＤ及びＣＵ患者中で同時に見いだされ、そして少なくとも１種の抗体は全てのＣＤ又はＣＵ患者中に見いだされる事が明らかである。一方そのような抗体は健康な対照のヒトのどんな血清中にも見いだされない。従って、調査された比較的限られた試験ヒト群に於いて、選択性は１００％である。両方の抗体が測定され、そしてある抗体種の証拠が診断的に有意義に見えるとき、感受性も１００％であった。
【００４７】
引用文献のリスト
１．トーマス L., Labor und Diagnose(レーバーウントディアグノーゼ)第５版１９９８，８２４−８４２。
２．J.-C. ホムベルグ，M.リゼット及びデボラ  ドニアック，全身的な紅斑及び他の膠原症で蛍光抗体法(immunofluorescence)によって検出されるリボソーム抗体，Clin. exp. Immunol.(1974)17,617-628。
３．J.B.ウィンフィールド，抗リボソームＰ蛋白質抗体は抗リンパ球抗体のタイプか？  Clin.Exp.Immunol.1997,109,1-3。
４．サフォード HA, チェン AE，アンダーソンCJ等，抗リボソーム及び「P-ペプチド」特異抗体はＴリンパ球に結合する， Clin. Exp. Immunol. 1997;109,12-19 。
５．H.-H.サン、W.-T.リン、S.-Y.タン、C.-Y.サイ、S.-C.サイ、S.C. シェー、T.-H.ウー、S.-H.ハン，抗ダブルストランデッドＤＮＡ抗体に対する標的分子である自己免疫及び正常なマウス中の異なる組織の表面膜上の酸性のリボソームリンタンパク質の発現，Immunology 1996,87,362-371。
６．デイヴィット T.グラボウスキー、ウォルター A.ドイッチェ、デニス デルダ及びマーク R. ケリー，ショウジョウバエ（Drosophila）AP3、即ち推定ＤＮＡリペア蛋白質がヒトのリボソーム関連蛋白質Ｐ０とホモロガスである，Nucleic Acids Research, １９巻４２９７、１９９１。
７．ノブオ  コンドー、トール  ワタツキ、アキヒデ  リョウ、アキユキ  ハダ、ツカサ  アイハラ、サンキチ  ホリウチ、ナリヒデ  ゴセキ、オサム  マツバラ、ケンジ  タケナカ、ミズエ  シチタ、ケンジ  タナカ、マサヒロ  シューダ、及びミキオ  ヤマモト，ヒト肝細胞発癌性と関連する遺伝子の同定と解析，Cancer Res.59,4990-4996,1999。
８．M.A. ロドリゲス−ガブリエル、M.レマチャ及びJ.P.G.バレスタ，リボソーム蛋白質Ｐ０のホスホリル化は、リボソーム機能に必須ではないが翻訳に影響し得る，Biochemistry 1998,37,16620-16626。
９．G.F.バーナード、R.J.スタニウナス、シデング  バオ、ケンイチ  マフネ、G.D.スティール Jr.、J.L.ゴラン及びラン ボ チェン，肝細胞癌及び結腸癌中のヒトリボソームリンタンパク質Ｐ０メッセンジャーＲＮＡの増加した発現，Cancer Res.52, 3067-3072,1992。
１０．  K.-H.サン、W.-T.リュウ、C.-Y.サイ、S.-J.タン、S.-H.ハン、C.-L.ユー、糸球体脈管膜細胞の表面上で発現されたリボソームＰ蛋白質と抗−dsＤＮＡ抗体が交差反応し細胞分裂抑制効果を発揮する，Immunology 1995,85,262-269。
１１．  I. フェラーリ、M.J.レビン、G.ワルカット、R.エリース、D.レベスグエ、P.キアーレ、M.エリザリ、M.ローゼンバウム、及びJ.ホエベケ，クルーズトリパノソーマの強免疫原性の(immunodominant)リボソーム蛋白質Ｐ０とヒトβ１−アドレナリン作働性レセプター上の機能エピトープの間の分子擬態（分子模倣），J.Exp.Med., Vol.182,1995,59-65。
１２．  S.シャテルジー、S.シング、R.ソホニ、V.カティゲ、Ch.デシパンデ、Sh.チプルンカー、N.クマール、Sh.シャルマ，熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウムファルシパルム）のホスホリボタンバク質Ｐ０のドメインの解析，Mol.Biochem.Parasitol.107(2000)143-154。
１３．  S.シャッテルジェー、S.シング、R.ソホニ、N.J.シング、A.ヴァイドヤ、C.ロング及びSh.シャルマ，熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウムファルシパルム）のリボソームリンタンパク質Ｐ０に対する抗体がプラスモジウムヨエリー(yoelli)による挑戦に対しマウスを保護する，Infect. Immun. Vol.68,2000,4312-4318。
１４．  A.ゴスワニ、S.シング、V.D.レドカー及びSh.シャルマ，熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウムファルシパルム）のリボソームリンタンパク質であるＰ０の解析，J.Biol.Chem.Vol.272,12138-12143,1997。
１５．  N.ファビエン等，リボソームＰ蛋白質に対する自己抗体はＰ０、Ｐ１及びＰ２蛋白質の共通のエピトープに対するものではない，J.Autoimmune(1999),13,103-110。
１６．  B.リリエンシーク等，発現が腫瘍細胞とホストの免疫状態に影響される内皮細胞中の４つの遺伝子の同定、体外(Ex vivo)単離内皮細胞中試験，Blood Vol.92(9),1998,3394-3404。
１７．  R.スジスズカ、G.ボウ、J.P.G.バレスタ，サッカロマイセスセレビシエ(Sacharomyces cerevisiae)からの酸性Ｐプロテインをホスホリル化する新規な酵素であるRAPキナーゼ，Biochim．Biophys．Acta 1293,(1996),213-221。
１８．  O.ロソリウス等，ヒトリボソーム蛋白質Ｌ５は定義された核の局在化及びエキスポートシグナルを含有する，J.Biol.Chem.Vol.275,12061-12068,2000。
１９．  K.ヒラノ等，リボソーム蛋白質Ｌ５の蛋白質ホスホターゼタイプ１との相互作用，J.Biol．Chem.Vol.270,19786-19790,1995。
２０．  W.M.マイケル及びG.ドレイファス，リボソーム蛋白質Ｌ５の区別されるドメインが５ Ｓ rRNA結合と核の局在化を媒介するJ.Biol．Chem.Vol.271,11571-11574,1996。
２１．  M.クラウセン、F.ルッド及びT.ピーラー，リボ核タンパク質複合体形成と核-細胞質間輸送(nucleocytoplasmic transport)の為のリボソーム蛋白質Ｌ５中の機能モジュール，J.Biol．Chem.Vol.274,33951-33958,1999。
２２．  A.ギウアリス等，抗−５Ｓ  ＲＮＡ／蛋白質（ＲＮＰ）抗体水準が全身的紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）腎炎を有している患者中の病気の活性と関連する，Clin.Exp.Immunol.1994,95,385-389。
２３．  V.マレカル等，リボソームＬ５蛋白質はmdm-2及びmdm-2-p53複合体と関連している，Mol.Cell.Biol.Vol.14,7414-7420,1994。
２４．  O.スピリナ等，ヒトミトコンドリアリボソーム蛋白質の心臓特異的スプライスバリアント（ｍＲＮＡプロセッシング；組織特異的スプライシング），Gene 261(2000)229-234。
２５．  J.-M.キム等，カゼインキナーゼIIのβサブユニットのリボソーム蛋白質Ｌ５との相互作用，BBRC 226,180-186(1996)。
２６．  J.-M.フリゲリオ、J.-C.ダゴルン、J.L.イオヴァンナ，Ｌ５、Ｌ２１、Ｌ２７ａ、Ｌ２８、Ｓ５、Ｓ９、Ｓ１０、及びＳ２９、ヒトリボソーム蛋白質ｍＲＮＡのクローニング、配列決定、及び発現，Biochim. Biophys. Acta 1262(1995)64-68。
２７．  B.グエラ、O.-G.イッシンガー，ｐ５３及びリボソーム蛋白質Ｌ５は血清刺激とシスプラチン処理の後に於けるネズミの奇形癌細胞ラインＦ９中のプロテインキナーゼＣＫ２との高分子量複合体形成に参加する，FEBS Letters  434(1998)115-120。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は健康なヒトの血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムの溶出物のスポットパターン（Ａ）をＣＤ又はＣＵ患者の血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムのもの（Ｂ）と比較することを可能とする２次元の電気泳動ゲルの写真を示している。縁取りした領域は患者のアフィニティカラムのみから溶出できる第１の蛋白質の位置を示している。
【図２】図２は健康なヒトの血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムの溶出物のスポットパターン（Ａ）をＣＤ又はＣＵ患者の血清からのイムノグロブリンを含有しているアフィニティカラムのもの（Ｂ）と比較することを可能とする２次元の電気泳動ゲルの写真を示している。縁取りした領域は患者のアフィニティカラムのみから溶出できる第２の蛋白質の位置を示している。
【図３】図３は図１（Ｂ）に従う二次元電気泳動のゲルから単離されたトリプシン消化生成物のマススペクトルを示している。
【図４】図４は図２（Ｂ）に従う二次元電気泳動のゲルから単離したトリプシン消化生成物のマススペクトルを示している。
【図１】
2005504321.tif 000003
【図２】
2005504321.tif 000004
【図３】
2005504321.tif 000005
【図４】
2005504321.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2005504321.tif 000007
2005504321.tif 000008
2005504321.tif 000009
2005504321.tif 000010
2005504321.tif 000011
2005504321.tif 000012
2005504321.tif 000013
2005504321.tif 000014
2005504321.tif 000015
2005504321.tif 000016
2005504321.tif 000017
2005504321.tif 000018
2005504321.tif 000019
2005504321.tif 000020
2005504321.tif 000021
2005504321.tif 000022
2005504321.tif 000023
2005504321.tif 000024
2005504321.tif 000025
2005504321.tif 000026
2005504321.tif 000027
2005504321.tif 000028
2005504321.tif 000029
2005504321.tif 000030
2005504321.tif 000031
2005504321.tif 000032
2005504321.tif 000033
2005504321.tif 000034
2005504321.tif 000035
2005504321.tif 000036
2005504321.tif 000037
2005504321.tif 000038
2005504321.tif 000039
2005504321.tif 000040
【国際調査報告】
2005504321.tif 000041
2005504321.tif 000042
2005504321.tif 000043
2005504321.tif 000044
2005504321.tif 000045
2005504321.tif 000046