(57)【要約】本発明は、受容体のアロステリックエフェクターを、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクス、及び／又は、該アロステリックエフェクターの非存在下における該受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅の変動を決定することにより、単離する方法［該受容体及び該リガンドは、適当な生理学的条件における少なくとも一つの生物学的応答に関与しており、かつアロステリックエフェクターは応答のうちの少なくとも一つをモジュレーションすることができ、該受容体は、少なくとも一つの蛍光性タンパク質によりマーキングされており、該リガンドは、蛍光性タンパク質により放射される光を吸収し得る分子、又は蛍光性物質のいずれかからなるマーカーによりマーキングされており、解離のキネティクスの変動及び振幅の変動を決定する工程は、蛍光エネルギー転移により実施される］に関するものである。
2005530158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体のアロステリックエフェクターを、
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクス、
−  並びに／又は、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅：
の変動の決定（但し、前記振幅の変動が負である場合、前記キネティクスの変動の存在も検出される）により、検出する方法であって、
該受容体及び該リガンドが、適切な生理学的条件の下での少なくとも一つの生物学的応答に関与しており、かつアロステリックエフェクターが応答のうちの少なくとも一つをモジュレーションすることができ、
該受容体が、分子吸光係数がおよそ１４０００M-1.cm-1超であり蛍光量子効率がおよそ０．３８超である、刺胞動物の自家蛍光性タンパク質より得られた又は派生した蛍光性タンパク質より選択される蛍光性タンパク質によりマーキングされており、
該リガンドが、
−  蛍光性タンパク質により放射される光を吸収し得る分子、
−  又は、蛍光性物質のいずれか：
により構成されるマーカーによりマーキングされており、
解離及び／又は会合のキネティクスの変動並びに振幅の変動の該決定が、
・  前記蛍光性タンパク質と、前記蛍光性物質（蛍光性物質は、前記蛍光性タンパク質の放射波長において励起可能であるか、もしくは前記蛍光性タンパク質の励起波長において放射するようなものである）との間、又は
・  前記蛍光性タンパク質と、蛍光性タンパク質により放射される光を吸収し得る前記分子との間：
の蛍光エネルギー転移により実施される、方法。
【請求項２】
受容体のアロステリックエフェクターを、
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクス、
−  並びに／又は、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅：
の変動の決定（但し、前記振幅の変動が負である場合、前記キネティクスの変動の存在も検出される）により、検出する方法であって、
該受容体及び該リガンドが、適切な生理学的条件の下での少なくとも一つの生物学的応答に関与しており、かつアロステリックエフェクターが応答のうちの少なくとも一つをモジュレーションすることができ、
該受容体が、
−  緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰもしくはＥＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰもしくはＥＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰもしくはＥＹＦＰ）もしくはＧＦＰＵＶ、又は
−  １個以上のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によりＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰもしくはＧＦＰＵＶより派生したバリアント（但し、これらのバリアントは蛍光の特性を保持している）、
−  又は、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰもしくはＧＦＰＵＶの断片、もしくは前記バリアントの断片（但し、これらの断片は蛍光の特性を保持している）：
より選択される蛍光性タンパク質によりマーキングされており、
該リガンドが、
−  蛍光性タンパク質により放射された光を吸収し得る分子、
−  又は、蛍光性物質のいずれか：
により構成されるマーカーによりマーキングされており、
解離及び／又は会合のキネティクスの変動並びに振幅の変動の該決定が、
・  前記定義のような蛍光性タンパク質と、前記蛍光性物質（蛍光性物質は、蛍光性タンパク質の放射波長において励起可能であるか、もしくは蛍光性タンパク質の励起波長において放射するようなものである）との間、又は
・  前記定義のような蛍光性タンパク質と、蛍光性タンパク質により放射される光を吸収し得る前記分子との間：
の蛍光エネルギー転移により実施される、方法。
【請求項３】
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクス、
−  及び／又は、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における前記受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅：
の変動が決定されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスのみが決定されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅のみが決定されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
リガンドがアンタゴニストであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
リガンドがアゴニストであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅の変動、
−  及び、場合により、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスの変動：
の決定による、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅の変動が正である場合、該変動のみが決定されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅の変動が決定され、
かつ該変動が負である場合、
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスの変動の決定が必要とされることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
テストされた化合物がアロステリックエフェクターであることを意味する、該解離のキネティクスの変動が正又は負であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
テストされた化合物が競合物質であることを含意する、該解離のキネティクスの変動がゼロであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により検出されるような化合物である、以下の式：
【化１】
2005530158.tif 000026
2005530158.tif 000027
2005530158.tif 000028
のうちの一つに相当する物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、受容体のアロステリックエフェクターを検出する方法である。
【０００２】
多数の医薬品及び天然物質が、生物の多数の生理学的機能に関与している受容体と呼ばれる調節タンパク質と相互作用することにより効果を発揮しており、それらの機能の変化は、多数の病理の原因となる。
【０００３】
受容体と結合することにより作用する分子の中でも、特にアロステリックエフェクター又はモジュレーターと呼ばれるカテゴリは、受容体の表面に存在するが内因性リガンドの結合部位とは位相幾何学的に別個の部位に結合することにより、効果を発揮する。それらの受容体との相互作用は、内因性リガンドの相互作用と比して、非競合性である。エフェクターは、内因性リガンドの非存在下では、それらの調節部位に結合することにより、受容体の応答に対してほとんど又は全く効果を及ぼさない。他方、それらは、競合性内因性リガンドの結合特性を改変し、該リガンドにより引き起こされる生物学的応答を変化させる。
【０００４】
アロステリックエフェクターの作用は、「構成性」ではなく、内因性リガンドが受容体を刺激する際にのみ明らかとなるため、それらは治療領域において特に有用である。そのような分子が同定され、市場へ導入され得た場合、患者の安楽及び効果の選択性は、例えば、アゴニストの投与により観察される効果と比較して大きく改善されることが常に見出されている（Panら、2001）。
【０００５】
受容体の新たなアロステリックエフェクターを同定するため、いくつかの実験アプローチ、特に、リガンドのその受容体との結合の測定及び生理学的応答の機能的測定が、現在開発されている。
【０００６】
結合を測定するための方法としては、放射性リガンドの解離のキネティクスの研究がある。Kostenis及びMohr(1996）に記載されているように、アロステリックモジュレーションは、最も一般的には、放射性リガンドの解離のキネティクスに対するアロステリックエフェクターの効果により検出される。この方法は、アセチルコリンのムスカリン受容体Ｍ１〜Ｍ５（Tucek及びPoska、1995）、アデノシンのＡ１（Bruns & Ferguns、1990）、アドレナリンのアルファ２（Nunnariら、1987）又はドパミンのＤ２（Hoare & Strange、1995）を調節する分子の非競合的な（従って、アロステリックな）特質を証明するために実行されている。これらの種々の例において、著者らは、放射性リガンドのようなアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかを無差別に使用し、使用された放射性リガンドの解離速度を加速（正）又は減速（負）する能力によりモジュレーターの正又は負の特質を定義した。
【０００７】
アロステリックエフェクターの同定のための二番目に広範なアプローチは、放射性リガンドの飽和に至らない濃度において放射性リガンド／受容体複合体の量を測定することからなる。これらの条件の下で、第三の分子が放射性リガンド／受容体複合体の量を増加させるという事実は、アロステリック効果による結合の増強の観点から解釈される。前掲のBruns及びFergunsの研究は、アゴニスト放射性リガンドが使用される場合のこの点を例示しており、Jakubikら(1997）の論文は、放射性アンタゴニストを使用している。
【０００８】
第三の実験アプローチは、アロステリックエフェクターの存在下及び非存在下での放射性リガンドの飽和曲線を確立することからなる。これは、セロトニン受容体５ＨＴ１Ｂに関するMossotら(1996）の論文に例示されている、この例において、エフェクターである５ＨＴ−モジュリンは、使用された放射性リガンドについて決定された見かけの親和性に影響を与えることなく受容体部位の量を減少させた。
【０００９】
受容体リガンドにより引き起こされる生物学的応答の測定は、活性化（アゴニストによる）又は阻害（アンタゴニストによる）のいずれかを含む。これらの測定は、一般的に、応答の正のエフェクターにより増強されるか又は負のエフェクターにより阻害される応答の大きさの変動を推測し、
−  電気生理学的方法による（Krauseら、1997; Galziら、1996）又は特異的なイオンプローブを使用した光学的方法による（Birdsallら、1999）、イオン電流の記録、
−  ｃＡＭＰ（Bruns & Ferguns、1990）又はイノシトールリン酸（Waughら、1999）のような二次メッセンジャーの産生の測定、
−  ＧＴＰの、受容体と会合したＧタンパク質との結合（Birdsallら、1999; Lazareno & Birdsall、1995; Hoareら、2000）又は受容体と会合したＧタンパク質によるＧＴＰの加水分解（Birdsallら、1999）：を含む。
【００１０】
蛍光性にされた受容体及びその蛍光性リガンドのうちの一つの使用と組み合わせられた蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の技術は、国際出願ＷＯ９８／５５８７３に記載されているように、該受容体と該リガンドとの間の非共有結合性相互作用を測定することを可能にする。
【００１１】
受容体は、蛍光性タンパク質、例えば、対応する遺伝子が配列決定されクローニングされ（Prasherら、1992）、そして高等真核生物における良好な発現のため最適化されている（Cormackら、1996）エクオレアビクトリア（Aequorea victoria）クラゲに由来するタンパク質によって蛍光性にされ得る。それは、蛍光性受容体タンパク質の発現を可能にするため、別のタンパク質、特にＧタンパク質共役型受容体をコードする遺伝子と融合させることができる（Galzi & Alix、1997; Weillら、1999; Vollmerら、1999; Valenzuelaら、2001）。蛍光性受容体タンパク質とその蛍光性リガンドのうちの一つとの組み合わせにより、蛍光エネルギー転移（Galzi & Alix、1997; Vollmerら、1999; Valenzuelaら、2001）により検出される非共有結合性受容体−リガンド複合体の形成が可能になり、その形成及び解離のキネティクスを測定することができる（Palancheら、2001; Valenzuelaら、2001）。
【００１２】
本発明の目的の一つは、実行が簡便、迅速、高感度であり、受容体と内因性リガンド部位のリガンドマーカーとの間の相互作用の定量的な測定を実施することを可能にし、かつアロステリックエフェクターの存在の検出を可能にする方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、内因性リガンド部位のリガンドマーカーとその受容体との相互作用のリアルタイムの測定を可能にし、アロステリックエフェクターの存在の検出を可能にすることである。
【００１４】
本発明の別の目的は、内因性リガンド部位のマーカーである蛍光性リガンドの、その受容体との会合及び解離のキネティクスの時間分解型測定を可能にすること、並びにアロステリックエフェクターの存在を検出することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、放射性リガンドが使用された場合（ナノモーラー域）より相当広い内因性蛍光性リガンド濃度の範囲（ナノモーラー〜マイクロモーラー）で、蛍光エネルギー転移による受容体とその内因性リガンドとの相互作用の検出を可能にすることである。従って、本発明は、受容体のより多数のコンフォメーション状態をエネルギー転移により検出できるようにし、それは、推定モジュレーティング作用物質の効果の同定及び解釈を大いに促進する。
【００１６】
本発明の目的の一つは、アロステリックエフェクターの存在の検出を可能にすることにより、内因性リガンド部位のマーカーである蛍光性リガンドの、その受容体との会合及び解離の速度定数の実験的測定を提供することである。
【００１７】
多数の受容体タンパク質及びそれらのリガンドに一般的に適用され得る、受容体のアロステリックエフェクターを検出する方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１８】
受容体の精製もリガンドの精製も必要としない、受容体のアロステリックエフェクターを検出する自動化可能な方法を提供することも、本発明の目的である。
【００１９】
放射能を使用しないため非汚染性であり、可視光を使用し、既存の機器を用いて実行され得るため経済的である、受容体のアロステリックエフェクターを検出する方法を提供することも、本発明の目的である。
【００２０】
本発明は、受容体のアロステリックエフェクターを、
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクス、
−  並びに／又は、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅：
の変動の決定により、検出する方法［ここで、
該受容体及び該リガンドは、適切な生理学的条件の下での少なくとも一つの生物学的応答に関与しており、かつアロステリックエフェクターは応答のうちの少なくとも一つをモジュレーションすることができ、
該受容体は、分子吸光係数がおよそ１４０００M-1.cm-1超であり蛍光量子収率がおよそ０．３８超である刺胞動物の自家蛍光性タンパク質に由来する又はそれらより派生した蛍光性タンパク質より選択された蛍光性タンパク質によりマーキングされており、
該リガンドは、
−  蛍光性タンパク質により放射される光を吸収し得る分子、
−  又は、蛍光性物質のいずれか：により構成されたマーカーによりマーキングされており、
解離及び／又は会合のキネティクスの変動並びに振幅の変動の決定は、
・  前記蛍光性タンパク質と、前記蛍光性物質（蛍光性物質は、前記蛍光性タンパク質の放射波長において励起可能であるか、もしくは前記蛍光性タンパク質の励起波長において放射するようなものである）との間、又は
・  前記蛍光性タンパク質と、蛍光性タンパク質により放射される光を吸収し得る前記分子との間：の蛍光エネルギー転移により実施される］に関する。
【００２１】
本発明は、受容体のアロステリックエフェクターを、
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクス、
−  並びに／又は、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅：
の変動の決定（但し、前記振幅の変動が負である場合、前記キネティクスの変動の存在も検出される）により、検出する方法［ここで、
該受容体及び該リガンドは、適切な生理学的条件の下での少なくとも一つの生物学的応答に関与しており、かつアロステリックエフェクターは応答のうちの少なくとも一つをモジュレーションすることができ、
該受容体は、分子吸光係数がおよそ１４０００M-1.cm-1超であり蛍光量子収率がおよそ０．３８超である刺胞動物の自家蛍光性タンパク質より得られた又は派生した蛍光性タンパク質より選択された蛍光性タンパク質によりマーキングされており、
該リガンドは、
−  蛍光性タンパク質により放射される光を吸収し得る分子、
−  又は、蛍光性物質のいずれか：により構成されたマーカーによりマーキングされており、
解離及び／又は会合のキネティクスの変動並びに振幅の変動の決定は、
・  前記蛍光性タンパク質と、前記蛍光性物質（蛍光性物質は、前記蛍光性タンパク質の放射波長において励起可能であるか、もしくは前記蛍光性タンパク質の励起波長において放射するようなものである）との間、又は
・  前記蛍光性タンパク質と、蛍光性タンパク質により放射される光を吸収し得る前記分子との間：
の蛍光エネルギー転移により実施される］に関する。
【００２２】
本発明は、会合及び解離のキネティクスの測定により、受容体と、受容体のエフェクター又は受容体の内因性リガンドの競合物質として作用すると推定される薬理作用物質との間の相互作用の競合的又は非競合的な特質の決定により提起される技術的問題に応答する。簡単に述べると、受容体のアロステリックエフェクターは、受容体の会合又は解離のキネティクスを変化させるが、内因性リガンドと競合する作用物質は、これらのキネティクスに対する効果を有しない。
【００２３】
「内因性リガンド部位のマーカーであるリガンド」とは、内因性リガンド部位とは別個の部位に結合するアロステリックエフェクターと反対に、内因性リガンド部位に結合するリガンドを意味する。内因性リガンド部位のマーカーは、内因性リガンドと競合的に相互作用するが（相互に排他的な結合）、アロステリックエフェクターは、内因性リガンドと非競合的に相互作用する。
【００２４】
「アロステリックエフェクター」又は「アロステリックモジュレーター」とは、リガンドとの競合に参加することなく、該リガンドの結合特性のみならず受容体の機能的特性をもモジュレーションする分子又はリガンド又は生物学的に活性な物質を意味する。
【００２５】
定義により、リガンドとは、内因性リガンドと同じ部位に結合することにより非共有結合的に受容体に結合し得る任意の分子を意味すること、及び、リガンドは、結合することによって生物学的応答を誘発し得るアゴニスト又は生物学的応答を誘発せずアゴニストの効果を阻止し得るアンタゴニストであり得ることが想起される。
【００２６】
アロステリックエフェクターも受容体のリガンドであるが、これは別の結合部位で受容体に結合する。本明細書においては、「アロステリックエフェクター」又は「アロステリックモジュレーター」という用語が使用され、「リガンド」は使用されない。
【００２７】
アロステリックモジュレーションは、アロステリックエフェクター又はアロステリックモジュレーターと呼ばれる分子が、アゴニストにより活性化される受容体の応答を増加又は減少させるメカニズムである。アロステリックエフェクターは、競合性リガンドが受容体と結合する部位とは別個の結合部位のレベルで受容体と相互作用する。アロステリックモジュレーションが可能であるという事実は、以下にある。
【００２８】
１）受容体の異なるコンフォメーション又は状態の存在。各コンフォメーションは、別個の薬理学的及び機能的な特性を賦与されている。従って、生物学的に活性なコンフォメーションと不活性なコンフォメーションとが存在する。各コンフォメーションは、異なる親和性でそのリガンドと結合する。例えば、正のアロステリックエフェクターのようなアゴニストは、受容体の生物学的に活性なコンフォメーションに対してより大きな親和性を示すが、負のアロステリックエフェクターのようなアンタゴニストは、受容体の生物学的に不活性なコンフォメーションに対してより大きな親和性を有する。
【００２９】
コンフォメーションの薬理学的特性とは、明確な親和性でリガンド及びモジュレーターと結合する能力である。各コンフォメーションは、各リガンドに特異的な固有の親和性で異なるリガンドに結合する。特異的な親和性であるコンフォメーションに結合するリガンドは、全て、いわゆる薬理学的プロファイルを構成する。コンフォメーションの薬理学的特性は、その薬理学的プロファイルと類似している。
【００３０】
受容体のコンフォメーションの機能的特性は、生物学的応答を刺激する能力又はその能力の欠如に相当する。受容体のいくつかの機能的特性が区別される。
−  静止状態：定義によると、応答と共役していないため不活性であるが、活性化可能である、即ち活性コンフォメーションへと相互変換され得るか又は応答と共役し得る；
−  活性状態：生物学的応答を担う；いくつかの活性状態が存在する場合、応答特性のうちの少なくとも一つが異なる（例えば、カルシウム応答であるかｃＡＭＰであるかが異なる、又は応答は同じであるがアゴニストに対する感受性が異なる、又は応答の持続時間も異なる、等）；他方、各活性状態は、性質的に又は量的な観点から識別可能な１個以上の応答を与え得る；さらに、受容体は、異なる型の応答が関連するいくつかの活性状態に対応するいくつかのコンフォメーションをとり得る；
−  不活性かつ非−活性化可能である（１個以上の）脱感作状態。
【００３１】
２）タンパク質上における、いくつかの分子の単一の受容体との同時相互作用を可能にする複数の部位の存在；競合性リガンドは、共通の部位と（相互に排他的に）相互作用するが、その部位は、アロステリックエフェクター又はモジュレーターの相互作用部位から識別しうる。
【００３２】
３）受容体のコンフォメーション変化（conformation transition）は、受容体分子の全てをまき込むものであり、リガンドと結合する分子の領域に制限されない；それらは、タンパク質の全ての三次構造、又は四次構造にさえも影響を与え、そして不連続である；従って、受容体の静止状態から活性状態へのコンフォメーション変化中、全ての結合部位のみならず、全ての「生物学的活性」部位が、協奏的に構造変化を経る。
【００３３】
タンパク質の機能調節のこれらの異なる面は、図１に例示されている（Monodら、1965; Galziら、1996; Rubin及びChangeux、1966）。二つのコンフォメーション（静止状態及び活性状態）で存在し得る受容体の作動モードの記載は、ある受容体に関して、図３に例示されている。アデニル酸シクラーゼの活性化を担うＧｓタンパク質を活性化し得るＧタンパク質共役型受容体に関する、この概略図と同等のものは、Tucek及びProska（1995）並びにHall(2000）に記載されている。
【００３４】
これらの概略図において、タンパク質、特に受容体は、二つのコンフォメーションで存在し、それらは相互に自然な平衡な状態にする。この平衡は、定数Ｌ0により定義され、その値は、分画濃度比［Ｒ］／［Ａ］［ここで、Ｒは静止状態であり、かつＡは活性状態である］により与えられる。リガンドは、それぞれ、解離定数ＫＲ及びＫAにより定義される親和性をもつＲ状態及びＡ状態に結合する。比ｃ＝ＫＲ／ＫAが＜１である場合、即ち、リガンドのＡに対する親和性がＲに対する親和性より良好である場合、該リガンドは、その受容体のアゴニストとして挙動し、Ａ状態の受容体の分画濃度は、Ｌ0より小さい積Ｌ0ｃにより定義される。反対に、親和性比ｃが＞１である場合、リガンドはＲ状態に優先的に結合し、アンタゴニストとして挙動する傾向を有する。積Ｌ0ｃはＬ0より大きい。アロステリックエフェクターは、競合性リガンド部位とは別個の部位に結合することにより、Ｒ状態とＡ状態との間の平衡定数の値を改変するという点で、競合性リガンドと同様に挙動する。アロステリックエフェクターの効果の数学的形式は、Rubin及びChangeux(1966）に与えられている。アロステリックエフェクターの存在は、Ｌ’0＝Ｌ0［（１＋βｄ）／（１＋β）］n［ここで、β＝ＫA／ＫＲかつｄ＝Ｆ／ＫA、Ｆはアロステリックエフェクター濃度に相当する］に従い、定数Ｌ0の値をＬ’0へと改変する。そして、アゴニスト又はアンタゴニストの添加は、その状態の受容体の分画濃度をＬ’0ｃへと変化させる。
【００３５】
以下の定義が想起される。
【００３６】
「受容体」とは、薬理作用物質との非共有結合的相互作用に関与し得るタンパク質性の任意の分子を意味する。優先的には、本発明において、薬理学的リガンドとの相互作用の後、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定可能なシグナル伝達応答を生じることができる神経伝達物質、ホルモン、増殖因子等の受容体が使用される。
【００３７】
「競合的相互作用」とは、単一の部位のレベルで起こる、二つの分子とある受容体との相互作用を意味し、あるリガンドが別のリガンドの結合を立体的に妨害する場合、そのリガンドは「競合性」と呼ばれる。
【００３８】
並行に、「非競合的相互作用」とは、トポロジー的に別個の部位のレベルで起こる、二つの分子とある受容体との相互作用を意味し、あるリガンドが別のリガンドの結合を妨害する場合（二つのリガンドは、受容体のトポロジー的に別個の部位と相互作用する）、そのリガンドは「非競合性」と呼ばれる。
【００３９】
「複合体の会合」という表現における「会合」とは、リガンドが受容体タンパク質と結合する作用であることも想起される。
【００４０】
受容体タンパク質がいくつかのコンフォメーション又は状態をとり得る場合、会合のキネティクスの違いによって、あるリガンドの異なるコンフォメーションとの結合を識別することが可能である場合がある。
【００４１】
「会合のキネティクス」とは、会合反応の時間的経過を意味する。キネティクスは、単一指数関数的（monoexponential）又は多重指数関数的（multiexponential）のいずれかであり得る。それらは、多重指数関数的である場合、各々会合の速度及び振幅によって特徴付けられる単一指数関数的緩和（relaxation）の総和へと分解される。
【００４２】
「会合速度」は、形式ｙ＝λｅｘｐ（−ｋapp×Ｔ）［ここで、λは振幅であり、ｋappは見かけの反応速度定数であり、かつＴは時間である］の単一指数関数的表現を使用した実験的曲線の調整によって得られた会合反応の速度定数によって測定される。会合がいくつかの同時結合の事象を反映する場合には、型ｙ＝λ1ｅｘｐ（−ｋ１app×Ｔ）＋λ2ｅｘｐ（−ｋ２app×Ｔ）＋・・・の多重指数関数的表現が使用される。
【００４３】
見かけの速度定数（ｋapp）の数学的表現は、リガンドの濃度［Ｌ］によるｋappの変動の線形性又は非線形性に依存することが想起される。従って、ｋappが［Ｌ］により線形的に変動する場合、反応は、複合体の形成に関するｋ1及び解離に関するｋ-1によるＲ＋Ｌ←→ＲＬ型の二分子反応である。その場合、ｋappはｋ1×［Ｌ］＋ｋ-1に等しい。反応が非線形的である場合には、以下の反応式：Ｒ＋Ｌ←→ＲＬ←→Ｒ’Ｌ［ここで、ＫDは複合体ＲＬの解離定数であり、ｋ2はＲＬ→Ｒ’Ｌ相互変換速度であり、かつｋ-2は変換速度定数Ｒ’Ｌ→ＲＬである］が適用され、その場合、ｋappはｋ2×（［Ｌ］／（［Ｌ］＋ＫD））＋ｋ-2に等しい。
【００４４】
「複合体の解離」という表現における「解離」とは、リガンドが受容体部位から離脱する作用であることと想起もされる。解離は、少なくとも二つの方式：ａ）会合と比して解離に有利となるように受容体−リガンド混合物を高度に希釈すること、又は２）リガンドが解離したことによって空になった部位を有利に占有する大過剰の競合性リガンドを添加することにより達成することができる。
【００４５】
受容体タンパク質がいくつかのコンフォメーション又は状態をとり得る場合、異なるコンフォメーション間の解離のキネティクスの違いにより、あるリガンドと異なるコンフォメーションを有する受容体との間の解離を識別することが可能である場合がある。
【００４６】
解離のキネティクスとは、解離反応の時間的経過を意味する。キネティクスは、単一指数関数的又は多重指数関数的のいずれかであり得る。それらは、多重指数関数的である場合、解離速度及び振幅により特徴付けられる単一指数関数的緩和の総和へと分解される。
【００４７】
「解離速度」は、形式ｙ＝λｅｘｐ（−ｋ×Ｔ）［ここで、λは振幅であり、ｋは固有の反応速度定数であり（ｋ＝ｋ-1）、かつＴは時間である］の指数関数的表現を使用した実験的曲線の調整によって得られた解離反応の速度定数によって測定される。解離がいくつかの刺同時解離事象を反映する場合には、型ｙ＝λ1ｅｘｐ（−ｋ1×Ｔ）＋λ2ｅｘｐ（−ｋ2×Ｔ）＋・・・の多重指数関数的表現が使用される。
【００４８】
「結合振幅」という表現は、受容体部位のレベル占有に比例する、記録されたシグナルの振幅をさすことが想起される。リガンドの飽和濃度において、結合振幅は一定である。これ未満では、それは、非線形的に、質量作用の法則に従い、漸進的に変化する。それは、ヒル（Hill）の経験式：ＲＬ＝Ｒ0／（１＋ＫD／Ｌ）n［ここで、Ｒ0はテスト中に存在する受容体部位の全量であり、ＫDは解離定数であり、Ｌはリガンドの濃度であり、かつｎはヒル定数とも呼ばれる比例係数である］により記載され得る。
【００４９】
「生物学的応答」とは、細胞、組織又は生物の代謝の任意の変動を意味する。細胞の場合、とりわけ、例えば、ｐＨ、イオン濃度、ＧＴＰ又はｃＡＭＰのような代謝物の形成、遺伝子発現、細胞形態（変化した形態を有する細胞の百分率の測定）、細胞増殖の変動を決定することが可能である。例は後に与えられる。
【００５０】
「適切な生理学的条件」とは、完全生物において見られるものに可能な限り近い、ｐＨ、濃度及びイオン組成、栄養素補足の全ての条件を意味する。これらの条件は、実施される実験が、完全生物において測定を実施することにより達成され得るものに可能な限り近い条件の下で実行されるよう選択される。
【００５１】
「応答のうちの少なくとも一つをモジュレーションし得る」という表現は、受容体によって刺激され得る測定可能な応答のセットのうち、少なくとも一つが、エフェクターによって改変されなければならないことをさす。改変又はモジュレーションは、応答の確立の遅延、その頻度、振幅、持続時間、消滅速度のみならず、アゴニストに対する感受性にも影響を与えることができる。
【００５２】
Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達応答に関して、一般的なテストは、ＧＴＰの結合の測定によりＧタンパク質の活性化を決定することからなる（Befortら、1996）。その他のより特異的な測定は、考慮された受容体に特異的な共役の型に応じた、例えば、ｃＡＭＰ、イノシトールリン酸、カルシウムの細胞内濃度の決定、遺伝子転写又は発癌活性の活性化の測定を含む。
【００５３】
受容体−チャンネルに関して、最も直接的な測定は、イオン電流の決定である（Hille、1992）。その他の測定は、例えば、遺伝子転写又は酵素の活性化の決定を含む。
【００５４】
増殖因子受容体に関して、一般的なテストは、増殖、分化又は細胞生存のテストであり、ホスホアミノ酸の特異的抗体による各受容体及び位置の特異的基質のリン酸化テスト（Honnegerら、1988）もしばしば行われる。
【００５５】
核受容体に関しては、シグナル伝達テストは、レポーター遺伝子、例えば「発色性」のものを、検討される受容体の伝達経路の特異的プロモーターの制御下に置く、遺伝子転写のテストである（Ｋｏら、２００２）。
【００５６】
従って、ｃＡＭＰ蓄積応答に関しては、様々なプロトコル、特にPalancheら(2001）又はHausdorffら(1990）に記載されたような放射免疫学的測定が使用され得る。
【００５７】
ＧＴＰのＧタンパク質との結合は、例えば、Fawziら(2001）又はVuong及びChabre(1990）に記載されたようにして記録され得る。
【００５８】
細胞増殖は、例えば、Bursteinら(1997）に記載されたプロトコルに従い分析される。
【００５９】
遺伝子発現の制御は、例えば、Baulmannら(2000）に記載されたプロトコルに従い研究され得る。
【００６０】
プロテインキナーゼの活性化は、例えば、Vollmerら(1999）又はYuanら(2000）に記載されたようにして研究され得る。
【００６１】
ｐＨの変動が測定され得る（Nicoliniら、1995）。
【００６２】
「自家蛍光性タンパク質」とは、天然又は合成のタンパク質であって、このようなタンパク質では、補欠分子族（発色団）の添加を必要とすることなく、タンパク質のアミノ酸間の自己触媒反応により発色団が形成され、そして蛍光特性がモノマー固有である。
【００６３】
「蛍光エネルギー転移」という表現は、双極子−双極子相互作用により、励起された発色団ドナーから別の発色団アクセプターへと非放射線的にエネルギーが伝達される、距離に依存する物理学的過程に相当する（Forster、1951; Wu及びBrand、1994; Clegg、1995）。エネルギー転移は、ドナー放射の振幅の減少又はアクセプターの励起及び放射の振幅の増加のいずれかにより観察され得る。アクセプターが蛍光性でないが、ドナー放射スペクトルに少なくとも部分的に重複する励起スペクトルを有する場合には、ドナー放射の振幅の減少の形態でエネルギー転移が検出され得る。
【００６４】
非共有結合的相互作用における生物学的試料へのエネルギー転移の適用の場合、実験条件が、蛍光性リガンドと蛍光性受容体との間の相互作用を可能にしない場合、転移シグナルは持続し得ない。同様に、二つの相互作用パートナーのうちの一方が適切な発色団を保有していない場合、他方のパートナーについて観察される蛍光の変動を、エネルギー転移過程に帰することはできない。
【００６５】
エネルギー転移に関して定義された「変化」又は「蛍光の変動」という用語は、１）アクセプターの蛍光シグナルの振幅、２）励起スペクトルの振幅又は３）ドナー放射シグナルの振幅、の任意の改変をさす。蛍光の変動又は変化は、二つのパートナーのうちの一方が適切な発色団もしくは蛍光団を保有していない場合（下記参照）、又は蛍光性パートナー間の相互作用が、例えば過剰の競合物質によって阻害される場合、観察されないはずである。
【００６６】
より正確には、蛍光エネルギー転移反応は、蛍光性でなければならないドナーと呼ばれる基と、蛍光性又は色素のいずれかであるアクセプターと呼ばれる基との二つの基を必要とする。この反応は、
１）アクセプターの吸収スペクトルとドナーの放射スペクトルとが相互に少なくとも部分的に重複していなければならない；重複は、実験データ及びcm3M-1単位の値を与える式より計算される（Lakeyら、1991）；
２）ドナーとアクセプターとは、エネルギー転移が起こり得るよう、空間的に近接していなければならない（１０〜１００オングストローム）：
という二つの条件が満たされた場合に生じる。
【００６７】
第一の条件は、ドナーの励起が、ドナー放射の振幅の減少及びアクセプター放射シグナルの出現を同時にもたらすという事実を結果として有する。これは、ドナーとアクセプターとの間の相互作用を検出すること、及び／又はそれらの距離を測定することを可能にする。
【００６８】
「空間的に近接している」という表現は、ドナーとアクセプターとの間の距離が２Ｒｏ（Ｒｏはフェルスター半径（Forster's radius）（前掲）を表す）未満であることをさす（Lakeyら、1991）。
【００６９】
本発明の有利な実施態様によると、アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅の変動が負である場合、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクスの変動の存在が検出されるべきであり、有利には、競合物質からアロステリックエフェクターを区別するため、このキネティクスの変動が定量されるべきである。
【００７０】
本発明は、受容体のアロステリックエフェクターを、
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離及び／もしくは会合のキネティクス、
−  並びに／又は、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅：
の変動の決定により、検出する方法［ここで、
該受容体及び該リガンドは、適切な生理学的条件の下での少なくとも一つの生物学的応答に関与しており、かつアロステリックエフェクターは応答のうちの少なくとも一つをモジュレーションすることができ、
該受容体は、
−  緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰもしくはＥＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰもしくはＥＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰもしくはＥＹＦＰ）もしくはＧＦＰＵＶ、又は
−  １個以上のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によりＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰもしくはＧＦＰＵＶより派生したバリアント（但し、これらのバリアントは蛍光の特性を保持している）、
−  又は、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰもしくはＧＦＰＵＶの断片、もしくは前記バリアントの断片（但し、これらの断片は蛍光の特性を保持している）：より選択される蛍光性タンパク質によりマーキングされており、
該リガンドは、
−  蛍光性タンパク質により放射された光を吸収し得る分子、
−  又は、蛍光性物質のいずれか：
により構成されるマーカーによりマーキングされており、
解離及び／又は会合のキネティクスの変動並びに振幅の変動の決定は、
・  前記定義のような蛍光性タンパク質と、前記蛍光性物質（蛍光性物質は、蛍光性タンパク質の放射波長において励起可能であるか、もしくは蛍光性タンパク質の励起波長において放射するようなものである）との間、又は
・  前記定義のような蛍光性タンパク質と、蛍光性タンパク質により放射される光を吸収し得る前記分子との間：
の蛍光エネルギー転移により実施される］に関する。
【００７１】
本発明の好ましい実施態様によると、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅の変動が負である場合、前記キネティクスの変動の存在も検出される。
【００７２】
受容体は、
−  緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Wardら、1980; Chalfie、1995）もしくはＥＧＦＰ（Heim & Tsien、1996; Miyawakiら、1997）、
−  シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰもしくはＥＣＦＰ）（Heim & Tsien、1996; Miyawakiら、1997）、
−  黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰもしくはＥＹＦＰ）（Cormackら、1995; Heim、Cubitt及びTsien、1995; Ehrigら、1995）（Miyawakiら、1997）、
−  ＧＦＰＵＶ（Crameriら、1996; Ehrigら、1995）、
又は、ヒト、細菌もしくは植物細胞における発現のためコドンが最適化されたそれらの突然変異体、
又は、前記定義のタンパク質に関連したものより高いかもしくは低い励起もしくは放射の波長を有するそれらの突然変異体（ただし、それらの分子吸光係数はおよそ１４０００M-1cm-1より大きく、それらの蛍光量子収率はおよそ０．３８より大きい）：
より選択される蛍光性タンパク質により遺伝学的経路によりマーキングされる。
【００７３】
「最適化されたコドン」という表現は、暗号が変化せず、従ってタンパク質配列が変化しない、宿主生物の好ましいホモログによる野生型タンパク質のコドンの置換を示す。
【００７４】
３９５／４７０〜５０９の励起及び放射の波長を有する野生型（ＷＴ）ＧＦＰは、Wardら(1980)及びChalfie(1995）に記載されている。
【００７５】
それぞれ３９５〜５１０の励起及び放射の波長を有する、突然変異Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａを有するＵＶ  ＧＦＰは、Crameriら(1996）に記載されており、又は突然変異Ｔ２０３Ｉ並びにそれぞれ４００〜５１２の励起及び放射の波長を有するＵＶ  ＧＦＰは、Ehrigら(1995）に記載されている。
【００７６】
ＥＧＦＰは、以下の突然変異を有する。
Ｆ４６Ｌ  Ｓ６５Ｔ  Ｈ２３１Ｌ
【００７７】
ＥＹＦＰは、以下の突然変異を有する。
Ｓ６５Ｇ  Ｖ６８Ｌ  Ｓ７２Ａ  Ｔ２０３Ｙ
【００７８】
ＥＣＦＰは、以下の突然変異を有する。
Ｆ６４Ｌ  Ｓ６５Ｔ  Ｙ６６Ｗ  Ｎ１４６Ｉ  Ｍ１５３Ｔ  Ｖ１６３Ａ  Ｎ２１２Ｋ
【００７９】
ＧＦＰの種々の突然変異体は、以下の細胞における発現のため、さらに最適化され得る（それぞれの種に特異的なコドンの使用を最適化するサイレント突然変異の導入による）。
−  ヒト（Haasら、1996; Yanら、1996; Zolotukhinら、1996）
−  細菌（Escherichia coli（エスケリキアコリ）に関するCrameriら、1996; Cormackら; 1996）
−  植物（Reichelら、1996）
【００８０】
ＧＦＰという用語は、細胞内で発現されると、蛍光を放射するタンパク質を示す。ＧＦＰの蛍光特性又は発現レベルのいずれかに影響するアミノ酸の置換、付加又は欠失を有するＧＦＰは、ＧＦＰ突然変異体と呼ばれる。
【００８１】
本発明の方法において有利に使用される蛍光性タンパク質の主な特徴が、以下に与えられる。
【００８２】
【表１】
2005530158.tif 000003
【００８３】
自家蛍光性タンパク質ＢＦＰは、刺胞動物の自家蛍光性タンパク質に関してここで定義された条件、即ち、１４０００M-1cm-1より大きい分子吸光係数及び０．３８より大きい蛍光量子収率に相当しないため、好ましくは除外される。
【００８４】
本発明の有利な実施態様によると、受容体は、蛍光性タンパク質（Ｎｏ．１）によりマーキングされ、リガンドは、
＊  蛍光性基質によりマーキングされるか［マーキングは、
−  化学的経路により実施されるか（この場合、蛍光性物質は化学的化合物である）、
−  又は、組換え経路により実施される（この場合、蛍光性物質はペプチド又は蛍光性タンパク質（Ｎｏ．２）であり、特に、分子吸光係数がおよそ１４０００M-1cm-1より大きく、蛍光量子収率がおよそ０．３８より大きい刺胞動物の自家蛍光性タンパク質より得られた又は派生した蛍光性タンパク質より選択され得、特に、
−  緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、又は
−  １個以上のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によりＧＦＰより派生したバリアント（但し、これらのバリアントは、蛍光の特性を保持している）、
−  又は、ＧＦＰの断片もしくは前記バリアントの断片（但し、これらの断片は、蛍光の特性を保持している）：
より選択される］、
＊  又は、アシッドバイオレット［アシッドバイオレット５、ＣＡＳ１０１３０−４８−０；アシッドバイオレット７、ＣＡＳ４３２１−６９−１；アシッドバイオレット１７、ＣＡＳ４１２９−８４−４］、アシッドレッド［アシッドレッド１、ＣＡＳ３７３４−６７−６；アシッドレッド８、ＣＡＳ４７８７−９３−３；アシッドレッド３７、ＣＡＳ６３６０−０７−２；アシッドレッド４０、ＣＡＳ１２１６７−４５−２；アシッドレッド１０６、ＣＡＳ６８４４−７４−２；アシッドレッド１１４、ＣＡＳ６４５９−９４−５］、アリザリン、アルミノン、アゾカルミンＢ［ＣＡＳ２５３６０−７２−９］、ベイシックフスチン（basic fuschine）［ベイシックレッド９、ＣＡＳ５６９−６１−９］、ボルドー（Bordeaux）Ｒ［アシッドレッド１７、ＣＡＳ５８５８−３３−３］、カーミン［ＣＡＳ１３９０−６５−４］の群に属する非蛍光性物質によりマーキングされる。
【００８５】
「ＣＡＳ」は、ケミカルアブストラクツ（Chemical Abstracts）に相当する。
【００８６】
受容体又はリガンドのマーキングとは、
−  受容体に関しては、その遺伝子もしくはｃＤＮＡ又は遺伝子もしくはｃＤＮＡの一部の、ＧＦＰの遺伝子もしくはｃＤＮＡ又は遺伝子もしくはｃＤＮＡの一部との融合；
−  リガンドに関しては、リガンドと蛍光基との間の化学的カップリング、又はその遺伝子もしくはｃＤＮＡ又は遺伝子もしくはｃＤＮＡの一部の、ＧＦＰの遺伝子もしくはｃＤＮＡ又は遺伝子もしくはｃＤＮＡの一部との融合：を意味する。
【００８７】
本発明は、本発明に係る蛍光性タンパク質の使用に関するものであり、ここで受容体及びリガンドは、遺伝学的経路によりマーキングされ［蛍光性タンパク質及び蛍光性物質は、以下の化合物対
ＧＦＰＵＶ−ＥＹＦＰ
ＥＹＦＰ−ＧＦＰＵＶ
ＥＣＦＰ−ＥＹＦＰ
ＥＹＦＰ−ＥＣＦＰ
ＥＣＦＰ−ＥＧＦＰ
ＥＧＦＰ−ＥＣＦＰ
ＥＧＦＰ−ＥＹＦＰ
ＥＹＦＰ−ＥＧＦＰ
よりそれぞれ選択される］、特に、受容体がタンパク質ＥＹＦＰもしくはＥＧＦＰによりマーキングされ、かつリガンドがタンパク質ＥＣＦＰによりマーキングされるか、又は受容体がタンパク質ＥＣＦＰによりマーキングされ、かつリガンドがタンパク質ＥＹＦＰもしくはＥＧＦＰによりマーキングされるものである。
【００８８】
本発明の有利な実施態様によると、蛍光性タンパク質はＥＧＦＰであり、かつ
−  ＥＧＦＰが蛍光エネルギーのドナーであり、ＥＧＦＰにより放射された光を吸収するマーカーが蛍光性又は非蛍光性の物質であり、マーカーがＥＧＦＰの放射スペクトルとオーバーラップする励起スペクトルを有する物質より選択され、
かつ、マーカーが蛍光性物質である場合、それは、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（Bodipy）、エオシン、リサミン（lissamine）、エリスロシン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド（Texas Red）なる名称でMolecular Probeより販売されているスルホローダミン１０１、及び一方ではグラフティングを可能にし、他方ではＥＧＦＰの放射スペクトルと重複する励起スペクトルを有するそれらの誘導体より選択され、
かつ、マーカーが蛍光性物質でない場合、それは、アシッドバイオレット［アシッドバイオレット５、ＣＡＳ１０１３０−４８−０；アシッドバイオレット７、ＣＡＳ４３２１−６９−１；アシッドバイオレット１７、ＣＡＳ４１２９−８４−４］、アシッドレッド［アシッドレッド１、ＣＡＳ３７３４−６７−６；アシッドレッド８、ＣＡＳ４７８７−９３−３；アシッドレッド３７、ＣＡＳ６３６０−０７−２；アシッドレッド４０、ＣＡＳ１２１６７−４５−２；アシッドレッド１０６、ＣＡＳ６８４４−７４−２；アシッドレッド１１４、ＣＡＳ６４５９−９４−５］、アリザリン、アルミノン、アゾカルミンＢ［ＣＡＳ２５３６０−７２−９］、ベイシックフスチン（basic fuschine）［ベイシックレッド９、ＣＡＳ５６９−６１−９］、ボルドー（Bordeaux）Ｒ［アシッドレッド１７、ＣＡＳ５８５８−３３−３］、カーミン［ＣＡＳ１３９０−６５−４］の群より選択されるか、
−  又は、ＥＧＦＰは蛍光エネルギーのアクセプターであり、蛍光性物質は蛍光エネルギーのドナーであり、かつＥＧＦＰの励起スペクトルとオーバーラップする放射スペクトルを有する物質、特に、クマリン、フルオレスカミン、６−（Ｎ−メチルアニリノ）ナフタレン、（マンシル（mansyl））から選択されるとともに、一方ではグラフティングを可能にし、他方ではＥＧＦＰの励起スペクトルと重複する放射スペクトルを有するそれらの誘導体より選択される。
【００８９】
本発明の有利な実施態様によると、蛍光性タンパク質がＥＣＦＰであり、かつ
−  ＥＣＦＰが蛍光エネルギーのドナーであり、かつ蛍光性物質がエネルギーのアクセプターであり、かつフルオレセイン及び７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールより選択されるか、
−  又は、ＥＣＦＰが蛍光エネルギーのアクセプターであり、かつ蛍光性物質がエネルギーのドナーであり、かつピレンもしくはクマリン、又は一方ではグラフティングを可能にし、他方ではＥＣＦＰの励起スペクトルとオーバーラップする放射スペクトルを有するそれらの誘導体より選択される。
【００９０】
受容体に関して、それは、
−  Ｇタンパク質共役型膜受容体、特に、Supplement Trends in Pharmaceutical Sciences、1997年(Receptor and ion Channel Nomenclature）並びにデータベースensembl.org及びＧＰＣＲｄｂの中のもの、
−  増殖因子受容体、特に、インスリン受容体（Yarden,Y.及びUllrich,A.、1988)もしくはγインターフェロン受容体（Briscoら、1996; Ihle、1995）と構造的に関連したもの、並びにデータベースensembl.org及びＧＰＣＲｄｂに記載されたもの、
−  受容体チャンネル、特に、Supplement Trends in Pharmaceutical Sciences、1997年(Receptor and ion Channel Nomenclature）の中のもの、並びにデータベースensembl.org及びＧＰＣＲｄｂに記載されたもの、
−  細胞内核受容体、特に、ステロイド受容体（Mangelsdorfら、1995; Wurtzら、1996）と構造的に関連したもの、並びにデータベースensembl.org及びＧＰＣＲｄｂに記載されたもの：より選択される。
【００９１】
有利な実施態様によると、受容体は、Ｇタンパク質共役型膜受容体より選択される。
【００９２】
上記定義のように、「受容体」とは、薬理学的リガンドとの相互作用の後、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定可能なシグナル伝達応答を生じることができる、薬理学的作用物質との非共有結合的相互作用に参加することができるタンパク質性の任意の分子、優先的には神経伝達物質、ホルモン、増殖因子等の受容体を意味することが想起される。
【００９３】
シグナル伝達応答とは、受容体とその特異的薬理学的作用物質との相互作用に起因し、かつ二次メッセンジャー、酵素又はイオン電流に対する効果により細胞代謝の活性化又は阻害をもたらす、ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定可能な任意の応答又は応答阻害を意味する。
【００９４】
Ｇタンパク質共役型膜受容体の例としては、プリン及びヌクレオチド、生体アミン、ペプチド及びタンパク質、エイコサノイド、脂質及び誘導体、興奮性アミノ酸及びイオン、嗅覚分子の受容体、並びにオーファン受容体が挙げられる（以後、かなり網羅的なリスト）。
【００９５】
増殖因子受容体の例としては、サイトカイン、上皮増殖因子、インスリン、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子が挙げられる。
【００９６】
受容体チャンネルとしては、特に、ＡＴＰ、セロトニン、ＧＡＢＡ、グリシン、アセチルコリン、グルタミン酸の受容体が挙げられる。
【００９７】
核受容体の例としては、特に、甲状腺ホルモン、エストロゲン、グルココルチコイド、レチノイドの受容体が挙げられる。
【００９８】
Ｇタンパク質共役型受容体のリガンドとしては、以下のものが挙げられる。
●  プリン及びヌクレオチド
・  アデノシン
・  ｃＡＭＰ
・  ＡＴＰ
・  ＵＴＰ
・  ＡＤＰ
●  生体アミン（及び関連天然リガンド）
・  ５−ヒドロキシトリプタミン
・  アセチルコリン
・  ドーパミン
・  アドレナリン
・  ヒスタミン
・  メラトニン
・  ノルアドレナリン
・  チラミン／オクトパミン
・  その他の関連化合物
●  ペプチド
・  副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）
・  メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）
・  メラノコルチン
・  ニューロテンシン（ＮＴ）
・  ボンベシン及び隣接ペプチド
・  エンドセリン
・  コレシストキニン
・  ガストリン
・  ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）
・  タキキニンの受容体
・  サブスタンスＫ（ＮＫＡ）
・  サブスタンスＰ（ＳＰ）
・  ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）
・  甲状腺刺激ホルモン放出因子
・  ノシセプチイン
・  ブラジキニン
・  アンジオテンシンＩＩ
・  ベータ−エンドルフィン
・  Ｃ５ａアナファラトキシン
・  カルシトニン
・  ケモカイン（インタークリンとも呼ばれる）
・  副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）
・  ダイノルフィン
・  エンドルフィン
・  ホルミル化ペプチド（formylated peptides）
・  フォリトロピン（ＦＳＨ）
・  真菌成熟フェロモン
・  ガラニン
・  ガストリックインヒビトリーポリペプチド（gastric inhibitory polypeptide）（ＧＩＰ）受容体
・  グルカゴンペプチドアナログ（ＧＬＰ）
・  グルカゴン
・  性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｍＲＨ）
・  成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＭ）
・  昆虫利尿ホルモン
・  インターロイキン
・  ロイトロピン（Leutropin）（ＬＨ／ＨＣＧ）
・  ＭＥＴ−エンケファリン
・  オピオイドペプチド
・  オキシトシン
・  副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）及び（ＰＴＨｒＰ）
・  下垂体アデニルシクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）
・  セクレチン
・  ソマトスタチン
・  トロンビン
・  チロトロフィン（ＴＳＨ）
・  バソアクティブインテスティナルペプチド（vasoactive intestinal peptide）（ＶＩＰ）
・  バソプレッシン
・  バソトシン
●  エイコサノイド
・  ＩＰ−プロスタサイクリン
・  ＰＧ−プロスタグランジン
・  ＴＸ−トロンボキサン
●  レチナールに基づく化合物
・  脊椎動物の１１−ｃｉｓレチナール
・  無脊椎動物の１１−ｃｉｓレチナール
●  脂質及び脂質に基づく化合物
・  カンナビノイド
・  アナンダミド
・  リゾホスファチジン酸
・  血小板活性化因子
・  ロイコトリエン
●  興奮性アミノ酸及びイオン
・  カルシウムイオン
・  グルタミン酸
●  オーファン受容体
【００９９】
本発明は、
−  アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクス、
−  及び／又は、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における前記受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅：
の変動が決定されることを特徴とする、前記定義のような方法に関する。
【０１００】
本発明は、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスのみが決定されることを特徴とする、前記定義のような方法に関する。
【０１０１】
いずれの場合にも、キネティクスの変動の測定は、アロステリックエフェクターを検出するのに十分である。
【０１０２】
解離のキネティクスのみを観察することの有用性は、蛍光性リガンドの高い（飽和）濃度においては、全ての結合部位が飽和しているため、振幅の変動が検出できない可能性があるという事実にある。
【０１０３】
本発明は、アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における前記受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅のみが決定されることを特徴とする、前記定義のような方法に関する。
【０１０４】
振幅の測定のみがアロステリックエフェクターを検出するのに十分である場合もあるし、キネティクスの変動の測定と併用しなければならない場合もある。
【０１０５】
本発明の有利な実施態様によると、前記定義のような方法は、リガンドがアンタゴニストであることを特徴とする。
【０１０６】
前記定義のように、「アンタゴニスト」とは、アゴニストと同じ受容体に結合することにより、アゴニストの効果を阻害する任意の分子を意味することが想起される。
【０１０７】
本発明の有利な実施態様によると、前記定義のような方法は、リガンドがアゴニストであることを特徴とする。
【０１０８】
前記定義のように、「アゴニスト」とは、天然の内因性リガンド部位に結合し、生物学的応答を活性化することができる任意の分子を意味することが想起される。
【０１０９】
複雑な生物学的系は、観察された現象を述べるのに十分な多数の変形（reduced）状態を含む部分的モデルにより記載され得る。アロステリックモジュレーター又はエフェクターの場合、受容体の静止状態（Ｒ）及び活性状態（Ａ）という二つの状態を含む部分的モデルが使用される。
【０１１０】
従って、Ｒ←→Ａ平衡が存在する。
【０１１１】
このモデルにおいて、リガンドは、Ｒ状態及びＡ状態に対して別個の親和性を有する。定性的には、ｃ＝ＫA／ＫＲとして、以下のように、それぞれＲ及びＡに対する相対親和性ＫＲ及びＫAを記載することが可能である。
静止状態  活性状態  ｃ
アゴニストに対する親和性            不良      良        ｃ＜１
競合性アンタゴニストに対する親和性  良        不良      ｃ≧１
【０１１２】
この記載において、アゴニストは、Ｒに対する親和性よりＡに対する親和性の方が良好であるため、Ｒ←→Ａ平衡をＡに有利にシフトさせる。反対に、競合性アンタゴニストは、平衡をＲの方へとシフトさせる。Ｒ状態とＡ状態との間の親和性の違いは、リガンドによって、１倍（ｃ＝１）（親和性の違いなし）から１００倍超（ｃ≧１００又はｃ≦０．０１）まで変動する。従って、標的のリガンドの一つのセットについて、可変の有効性を有するアゴニスト分子（ｃ＜１）又はアンタゴニスト分子（ｃ＞１）の範囲が得られる。
【０１１３】
実際、リガンドの受容体部位との会合は、生物学的媒体におけるこのリガンドの拡散によって調整されている。所定のリガンド及び所定の部位に対する親和性の違いは、それがとり得る各コンフォメーションにおける部位に対する該リガンドの異なる解離速度に起因する。同じことがアゴニスト、競合性アンタゴニスト及びアロステリックエフェクターにも当てはまる。この結果として、アロステリックエフェクターは、例えばアゴニストに対して高親和性のコンフォメーションを安定化することにより、高親和性コンフォメーションの受容体の割合を増加させ、従ってその部位と結合したアゴニストの解離速度を減少させるであろう。実験的な解離速度測定において、解離曲線は時間の関数として得られ、その一般的速度は、エフェクターが蛍光性リガンドに対して高親和性の状態を安定化する場合、より遅い。これらの曲線は、解離速度がエフェクターの存在下と非存在下とで同一であるが、振幅が異なる（従って、様々なコンフォメーション状態の分画濃度が異なる）、多重指数関数的モデルによって、正確に分析される。従って、アゴニスト単独が存在する場合と、アゴニスト及びアロステリックエフェクターの両方が存在する場合とで、異なる［静止］／［活性］濃度比が得られる。同様に、実験は、アンタゴニストを用いて実施され得；この場合、アロステリックエフェクターの効果は、アゴニストに関して観察されるものと反対の兆候を有する。
【０１１４】
平衡時、会合の後に解離が起こる場合、このＲとＡとの間の親和性の違いは、単一指数関数的時間的経過（０．０１≦Ｌoｃ≦１００）又はＬoｃ＞１００もしくはＬoｃ＜０．０１に関しては二指数関数的（biexponential）時間的経過を有する解離のキネティクスにより明らかとなり得る。キネティクスが二指数関数的である場合、それらは、二つの速度定数及び二つの振幅を使用して記載され、二つの振幅の比は各状態の分画濃度に相当する。解離のキネティクスが二指数関数的である場合、各コンフォメーション状態の解離事象の総和が記録される。
【０１１５】
前記と同様に、エフェクターの場合、それぞれＲ及びＡについての相対親和性ＫＲ及びＫAは、ｃ＝ＫA／ＫＲにより、以下のように記載され得る。
静止状態  活性状態  ｃ
正のエフェクターに対する親和性    不良      良        ｃ＜１
負のエフェクターに対する親和性    良        不良      ｃ≧１
【０１１６】
この記載において、正のエフェクターは、Ｒに対する親和性よりＡに対する親和性の方が良好であるため、Ｒ←→Ａ平衡をＡに有利にシフトさせる。反対に、負のエフェクターは、平衡をＲの方へとシフトさせる。
【０１１７】
従って、二つの状態、即ち、活性状態及び静止状態が存在する場合、本発明は、該アロステリックエフェクターの存在下での該受容体とそのリガンド（アゴニスト）のうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスが、該アロステリックエフェクターの非存在下での該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスより遅いこと（アロステリックエフェクターが正のエフェクターであることを意味する）を特徴とする、前記定義のような方法に関する。本発明の好ましい実施態様において、リガンドはアゴニストであり；従って、Ｒ←→Ａ平衡を、より高い親和性を有し、従ってより遅い解離速度を有するＡ（受容体の活性状態）の方へとシフトさせるが、アロステリックエフェクターもＡの方へと平衡をシフトさせ、それは、遅い解離の振幅を増加させ、速い解離の振幅を減少させるという効果を有する。
【０１１８】
二つの状態、即ち、活性状態及び静止状態が存在する場合、本発明は、該アロステリックエフェクターの存在下での該受容体とそのリガンド（アゴニスト）のうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスが、該アロステリックエフェクターの非存在下での該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスより速いこと（アロステリックエフェクターが負のエフェクターであることを意味する）を特徴とする、前記定義のような方法に関する。本発明の好ましい実施態様において、リガンドはアゴニストであり；従って、Ｒ←→Ａ平衡を、より高い親和性を有し、従ってより遅い解離速度を有するＡ（受容体の活性状態）の方へとシフトさせるが、アロステリックエフェクターもＲの方へと平衡をシフトさせ、それは、遅い解離の振幅を減少させ、速い解離の振幅を増加させるという効果を有する。
【０１１９】
二つの状態、即ち、活性状態及び静止状態が存在する場合、本発明は、該アロステリックエフェクターの存在下での該受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスが、該アロステリックエフェクターの非存在下での該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスより遅いこと（アロステリックエフェクターが負のエフェクターであることを意味する）を特徴とする、前記定義のような方法に関する。本発明の好ましい実施態様において、リガンドはアンタゴニストであり；従って、Ｒ←→Ａ平衡を、より高い親和性を有し、従ってより遅い解離速度を有するＲ（受容体の静止状態）の方へとシフトさせるが、アロステリックエフェクターも静止状態を安定化し、それは、遅い解離の振幅を増加させ、速い解離の振幅を減少させるという効果を有する。
【０１２０】
二つの状態、即ち、活性状態及び静止状態が存在する場合、本発明は、該アロステリックエフェクターの存在下での該受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスが、該アロステリックエフェクターの非存在下での該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスより速いこと（アロステリックエフェクターが正のエフェクターであることを意味する）を特徴とする、前記定義のような方法に関する。この本発明の好ましい実施態様において、リガンドはアンタゴニストであり；従って、Ｒ←→Ａ平衡を、より高い親和性を有し、従ってより遅い解離速度を有するＲ（受容体の静止状態）の方へとシフトさせるが、アロステリックエフェクターも活性状態を安定化し、それは、遅い解離の振幅を減少させ、速い解離の振幅を増加させるという効果を有する。
【０１２１】
受容体が２個超の多数のコンフォメーションをとり得る場合には、推定アロステリック剤の効果が関係しているコンフォメーション平衡を決定するため、蛍光性リガンドによって占有されたコンフォメーションを同定すべきである。
【０１２２】
従って、３個のコンフォメーション状態Ｒ（休止）、Ａ（活性）及びＤ（脱感作）が存在する場合、アゴニストはＡ状態及びＤ状態を占有することができ、アンタゴニストはＲ状態又はＤ状態に優先的に結合するであろう。これは、結合測定実験において蛍光性アゴニストが使用されるか又は蛍光性アンタゴニストが使用されるかに依って、アロステリック剤とは異なる性質の効果をもたらすであろう。（Ａを安定化する）正のエフェクターは、アゴニストのＤ状態への結合を減少させる。一般的にＡ状態より大きい親和性でアゴニストに結合するＤ状態にある受容体の画分の消失による、解離速度の増加が存在する。
【０１２３】
同様に、二つの活性状態Ａ１及びＡ２が存在する場合、Ａ１を安定化するエフェクターは、Ａ２との結合を減少させるという効果を有し（そして、それに関連した応答を減少させ）、Ａ１との結合を増加させる（そして、それに関連した応答を強化する）であろう。この場合、蛍光性アゴニストの解離速度の増加が観察される。
【０１２４】
リガンドの会合のキネティクスの分析はより複雑である。それは、実際、分析される実験系に依存する。ある種の受容体については、そしてある種の実験条件の下では、多重指数関数的な会合のキネティクスを観察することが可能である。これらの場合、最も速いキネティクスは、リガンド（アゴニスト又はアンタゴニスト）と受容体との二分子相互作用を反映し、より遅いキネティクスは、より遅く起こるコンフォメーション相互変換を反映し得る。これが実験的に観察される場合には、遅いキネティクスの振幅を分析し、アロステリックエフェクターの存在下でのこれらの振幅の変動を分析することが可能である。これらの変動は、アロステリックエフェクターによる様々なコンフォメーション状態のディファレンシャルな安定化を反映するであろう。他の不利な例においては、コンフォメーション相互変換が、リガンドの受容体との二分子会合のキネティクスより速いために、キネティクス的に不可視である。その場合、会合速度に対するアロステリックエフェクターの効果は、実験的に検出され得ない。
【０１２５】
応答の分析は、受容体の活性状態をモニタリングする手段である。実際、活性状態とは、生物学的応答を生じる能力を賦与されたコンフォメーション状態と定義される。応答の分析は、いくつかのパラメータに関係していなければならない。
【０１２６】
評価すべき、より単純なパラメータのうちの一つは、応答の振幅である。振幅は、正のアロステリックエフェクターの存在下ではより大きく、アロステリックエフェクターが負である場合にはより低い。
【０１２７】
第二のパラメータは遅延のそれである：対照の応答と比較して、増強された応答についてはより短い確立の遅延を、そして反対に阻害された応答についてはより長い遅延を検出することが可能である場合がある。これは、実際、受容体が応答を担う二次エフェクターを活性化する場合に観察され得る。Ｇタンパク質共役型受容体に当てはまるこの例において、増強が存在する場合には、活性化されたリレータンパク質（Ｇタンパク質）又は二次メッセンジャー（イノシトール三リン酸、ｃＡＭＰ等）の一過性の蓄積、応答の出現が、より短い遅延で起こり得る。
【０１２８】
最後に、いくつかの応答が受容体によって誘発され得る場合、様々な応答の振幅（及び／又は遅延）の比較分析は、モジュレーティング効果の性質の指示を提供し得る。
【０１２９】
本発明は、
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅の変動、
−  及び、場合により、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスの変動：
の決定による、前記定義のような方法にも関する。
【０１３０】
本発明は、該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅の変動が正である場合、該変動のみが決定されることを特徴とする、前記定義のような方法に関する。
【０１３１】
本発明は、
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された結合の振幅と比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された結合の振幅の変動が決定され、かつ該変動が負である場合、
−  該アロステリックエフェクターの非存在下における前記受容体とそのリガンドのうちの一つとの間で形成された複合体の解離のキネティクスと比した、該アロステリックエフェクターの存在下における該受容体と該リガンドとの間で形成された複合体の解離のキネティクスの変動の決定が必要とされることを特徴とする、前記定義のような方法に関する。
【０１３２】
従って、この実施態様は、アロステリックエフェクターを競合物質から区別することを可能にする。
【０１３３】
本発明の有利な実施態様によると、本発明の方法は、解離のキネティクスの変動が正又は負であること（テストされた化合物がアロステリックエフェクターであることを意味する）を特徴とする。
【０１３４】
本発明の有利な実施態様によると、本発明は方法は、解離のキネティクスの変動がゼロであること（テストされた化合物が競合物質であることを意味する）を特徴とする。
【０１３５】
Ｇタンパク質共役型受容体の場合、受容体にいくつかの活性状態が存在するため、複雑な例が識別される（Palanchaeら、2001; Lefkowitz、1998）。この場合、別個の機能的特性を有する異なる活性状態が提供される、即ち、それらは、相互に異なっているかもしれない応答を調節する。その場合、アロステリックエフェクターは、活性状態を弁別する挙動を有する。従って、エフェクターは、いくつかの中からとられたある活性状態の安定化を有利にすることにより、所定の応答の正のモジュレーターとして挙動しつつ、その他の活性状態に関連した応答の負のモジュレーターとして挙動することができる。この場合、正及び／又は負の特質は、所定の生物学的応答に比して定義される。
【０１３６】
エフェクターは受容体の未知の応答をモジュレーションするかもしれない。従って、既知の応答に対する効果が観察されない場合、本発明は、受容体の他の応答を研究することを可能にする。
【０１３７】
本発明は、既に示された方法によって検出されるような化合物である、以下の式のうちの一つに対応する物にも関する。
【０１３８】
【化２】
2005530158.tif 000004
2005530158.tif 000005
2005530158.tif 000006
2005530158.tif 000007
【０１３９】
式Ａ１１、Ｇ１１、Ｈ１０、Ｈ６、Ｈ３、Ｆ３、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、ＣＶ１−８０、ＣＶ１−８１、ＣＶ１−８４、ＣＶ１−８５、ＣＶ１−９３、ＣＶ１−９７、ＣＶ１−１２２、ＣＶ１−１２３、ＣＶ１−１３１及びＣＶ１−１３５は、自体新規である。
【０１４０】
以下の表１及び２は、分子Ｇ６、Ａ１１、Ｇ１１、Ｆ３、Ｈ６、Ｆ９、Ｈ３、Ｆ７、Ｈ１０、ＮＰ２３４（又は８０１）、ＮＰ２４６（又は８０３）、８０４、８０５、８０６、８０８、８０７、８０９、ＣＶ１−８０、ＣＶ１−８１、ＣＶ１−８４、ＣＶ１−８５、ＣＶ１−９３、ＣＶ１−９７、ＣＶ１−１２２、ＣＶ１−１２３及びＣＶ１−１３５について取得された実験データ全てを要約したものである（それらの構造がカラムに示されている）。
【０１４１】
表１中、「コード」カラムは使用された名称に相当し：「ＥＣ５０」カラムは、速い解離速度の振幅の百分率における５０％（最大値と比した）の増加を引き起こす化合物の濃度に相当し：「％ａｌ（ｍａｘ）」カラムは、速い解離速度の振幅の増加について観察された最大値に相当し；「ＩＣ５０」カラムは、２０nMのＮＫＡ−ＢｏのＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ受容体との結合の５０％の減少が観察される化合物の濃度に相当し；「Ｒｅｐ  Ｃａ」カラムは、ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ受容体を発現していない細胞におけるカルシウム応答を誘起する各化合物の能力に相当し、かつ「ｉｎｈｉｂ  ｃＡＭＰ」カラムは、ＮＫＡにより引き起こされるｃＡＭＰの生成の応答を阻害する各化合物の能力を示す。
【０１４２】
表２中、「コード」カラムは使用された名称に相当し：「ＥＣ５０」カラムは、速い解離速度の振幅の百分率における５０％（最大値と比した）の増加を引き起こす化合物の濃度に相当し：「％ａｌ（１０μMにおける）」カラムは、化合物が１０μMでのみテストされ、８０５について決定された値と比較されたことを意味し（Ｔ＝２２±１は、エフェクターの非存在下での速い解離の振幅を表す）；「結合復帰（reversion）％（１０μMにおける）」は、化合物が１０μMでのみテストされ、８０５について決定された値と比較されたことを意味する。
【０１４３】
全ての化合物のうち、８０５が、野生型ヒトＮＫ２Ｒ受容体、野生型ヒトＮＫ１Ｒ受容体又はＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ受容体に対するＮＫＡ又は短縮型ＮＫＡにより引き起こされるカルシウム応答の増強の研究の対象であった。
【０１４４】
【表２】
2005530158.tif 000008
2005530158.tif 000009
【０１４５】
【表３】
2005530158.tif 000010
【０１４６】
前記化合物は、ファミリーＩ及びファミリーＩＩという二つの大きなファミリーに分類される。
【０１４７】
ファミリーＩは、化合物Ａ１１、Ｇ１１、Ｈ１０、８０１、８０３、８０４、８０５、８０６、８０８、８０７、ＣＶ１−８０、ＣＶ１−８１、ＣＶ１−８４、ＣＶ１−８５、ＣＶ１−９３、ＣＶ１−９７、ＣＶ１−１２２、ＣＶ１−１２３及びＣＶ１−１３５を含む。
【０１４８】
これらの化合物は、以下の一般式：
【化３】
2005530158.tif 000011
【０１４９】
［ここで、ｎは０又は１に等しく、Ａｒ1及びＡｒ2は単環式又は二環式の置換された芳香族基を表し、かつＲはＣＮ、ＣＯＯＭｅもしくはＣＯＮＲ1Ｒ2のような電子吸引基又はアルケン基もしくはアルキン基のような不飽和基を表す］に相当する。
【０１５０】
【表４】
2005530158.tif 000012
【０１５１】
化合物Ｈ６及びＨ３は、前記ファミリーＩの化合物を得ることを可能にする合成中間体である。
【０１５２】
ファミリーＩＩは、化合物Ｆ３、Ｆ７及び８０９を含む。
【０１５３】
これらの化合物は、以下の一般式：
【化４】
2005530158.tif 000013
【０１５４】
［ここで、Ａｒ1及びＡｒ2は芳香族基を表し、かつＲは水素原子又は−ＣＨ2ＣＮ基のいずれかを表し、かつＲ1は水素原子又はＣＨ2ＣＯΦ基である］に相当する。
【０１５５】
化合物Ｆ７及びＦ９は、既知であり、Moutouら(1994）による文献に記載されている。
【０１５６】
さらに、表１の化合物Ｇ６は、既知であり、国際出願ＷＯ０２／２４１９２に記載されている。
【０１５７】
前記化合物の調製の方法：
Ｉ−ファミリーＩの化合物の調製の方法：
Ａ）第一段階：第二級アミンの調製：
第一級アミン（１eq）（下記表参照）を、適切な芳香族アルデヒド（１eq）のメタノール溶液に添加する。その反応媒体を、６０℃で２時間加熱し、次いで０℃へと急速に冷却する。次いで、ＮａＢＨ4（２eq）を添加し、その反応媒体を数分間攪拌し、次いで１時間かけて室温へと戻す。溶液の蒸発後、水で洗浄し、次いで飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄することにより、ＡｃＯＥｔによる抽出を実施し、続いてＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、フリットで濾過し、乾燥するまで蒸発させる。最も一般的には油状物質の形態である、このようにして単離された第二級アミンを、精製することなくそのまま使用する。
【０１５８】
このようにして得られた第二級アミンは、以下の式：
【化５】
2005530158.tif 000014
［ここで、Ａｒ1及びＡｒ2は前記と同義である］に相当する。
【０１５９】
段階Ｉに相当する反応の一例（ここでは、化合物Ｈ３を入手）は：
【化６】
2005530158.tif 000015
である。
【０１６０】
出発生成物を要約した表：
【表５】
2005530158.tif 000016
【０１６１】
Ｂ）第二段階：第三級アミンの調製：
前段階で得られた第二級アミン（１．１eq）をジメチルホルムアミドに溶解させ、ハロゲン化アルキル（クロロアセトニトリル、塩化プロパルギル等）（下記参照）を添加する。その溶液を１２時間加熱還流させ、次いで室温に戻し、続いてエーテル（ＤＭＦより１０倍多い容量）で抽出し、水で洗浄し、次いで飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄する。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、次いでそれを乾燥するまで蒸発させる。その粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（ＡｃＯＥｔ  １／Ｈｅｘ  ９）により精製する。ＡｃＯＥｔに気体ＨＣｌを通すことにより、その塩酸塩を調製する。
【０１６２】
次いで、以下に定義されるような式：
【化７】
2005530158.tif 000017
の塩酸塩の形態の前記化合物を得る。
【０１６３】
より正確には、この第二段階は、以下の反応式に相当する。
【化８】
2005530158.tif 000018
【０１６４】
従って、第二級アミンは、異なる市販のハロゲン化物と反応させられる。
【０１６５】
化合物Ａ１１、Ｇ１１、８０１、８０３、８０４、８０５、ＣＶ１−８０、ＣＶ１−８１、ＣＶ１−８４、ＣＶ１−８５、ＣＶ１−９３、ＣＶ１−１２２、ＣＶ１−１２３及びＣＶ１−１３５については、クロロアセトニトリルが使用される。
【０１６６】
化合物８０６及びＣＶ１−９７については、ブロモ酢酸エチルもしくはブロモ酢酸メチル、又はクロロ酢酸エチルもしくはクロロ酢酸メチルが使用される。
【０１６７】
化合物Ｈ４、Ｈ１０及び８０７については、ブロモアセトアミド又はクロロアセトアミドが使用される。
【０１６８】
化合物８０８については、臭化プロパルギル又は塩化プロパルギルが使用される。
【０１６９】
化合物ＣＶ１−１３５に関して、それは、下記のような特定の操作法に従い入手される。
【０１７０】
式：
【化９】
2005530158.tif 000019
の４−ブロモベンゾニトリル、並びに触媒ＰｄＣｌ2（ＰＰｈ3）2、ヨウ化銅ＣｕＩ、塩基ＮＥｔ3及びフェニルアセチレンを、アセトニトリルに溶解させる。その反応媒体を５０〜６０℃で一夜加熱し、続いて、反応の終了時に蒸発させ、シリカカラムでのクロマトグラフィにより精製する。
【０１７１】
この操作法は、以下の反応式に相当する。
【化１０】
2005530158.tif 000020
【０１７２】
ＩＩ−ファミリーＩＩの化合物の調製の方法
ベンズアルデヒドとの縮合、それに続く水素化により、５−フェニル−２−アミノチアゾールを出発原料として５−フェニル２−ベンジルアミノチアゾールを得る。次いで、得られた化合物をクロロアセトニトリルによりアルキル化する（操作法Ｉ参照）。
【０１７３】
化合物Ｆ３は、以下の反応式に従い得られる。
【化１１】
2005530158.tif 000021
【０１７４】
ＮａＨ（１．３eq）を、０℃に冷却された５−フェニル−２−アミノベンジルチアゾール（１eq）のＤＭＦ溶液に添加する。その反応媒体を１５分間攪拌し、次いでクロロアセトニトリル（１eq）を滴下にて添加する。攪拌を室温で８時間続行し、次いで溶液を水で希釈する。酢酸エチルでの抽出の後、有機相を硫酸ナトリウム無水物で乾燥させ蒸発させる。その粗反応生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（ＡｃＯＥｔ  １／ヘキサン  ２）により精製する。
【０１７５】
従って、以下の反応式に従い、例えば、化合物８０９：（（５−フェニル−チアゾール−２−イル）−Ｎ−ベンジル）アセトニトリルＣ18Ｈ15Ｎ3Ｓ（３０５．４０g.mol-1）が、ベージュ色の粉末の形態で得られる。
【０１７６】
【化１２】
2005530158.tif 000022
【０１７７】
発明の詳細な説明
好ましい実施態様において、本発明の開発は、クラゲであるエクオレアビクトリア（Aequorea victoria）の緑色蛍光タンパク質（Prasherら、1992）、優先的には、好ましい宿主生物、哺乳動物細胞における発現のため最適化されたこのタンパク質の突然変異体ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ及びＥＣＦＰをコードするｃＤＮＡを使用する。
【０１７８】
ｃＤＮＡは、受容体をコードする遺伝子とのＮ又はＣ末端での融合を可能にするため、１個以上のアミノ酸が置換、挿入又は欠失されたバリアントをコードするよう改変され得る。
【０１７９】
受容体は、
１）とりわけ、毎年更新されＧＰＣＲｄｂ（http: //www.gcrdb.uthscsa.edu又はhttp: //www.gpcr.org）及びEnsemblデータベース（http: //www.ensembl.org）で発表されるリストに提示されたようなアドレナリン作動性受容体及び代謝共役型グルタミン酸受容体に構造的に連結したＧタンパク質共役型の神経伝達物質の受容体、
２）とりわけ、毎年更新されＧＰＣＲｄｂ（http: //www.gcrdb.uthscsa.edu又はhttp: //www.gpcr.org）及びEnsemblデータベース（http: //www.ensembl.org）で発表されるリストに提示されたようなニコチン受容体、グルタミン酸受容体及びＡＴＰ受容体と構造的に連結した受容体−チャンネル、
３）ステロイド受容体と構造的に連結したＤＮＡ相互作用ドメインを所有している核受容体（Mangelsdorfら、1995; Wurtzら、1996）、
４）インスリン受容体と構造的に連結したチロシンキナーゼ活性を有する原形質膜の受容体（Yarden,Y.及びUllrich,A.、1988）、
５）γインターフェロン受容体（Briscoら、1996; Ihle、1995）と構造的に連結したプロテインチロシンキナーゼ（ＳＴＡＴ、ＴＹＫ２、Ｊａｋ）と共役した膜受容体、より選択され得る。
【０１８０】
ＥＧＦＰとＧタンパク質共役型受容体との間で融合が実施される場合（グループ１）、融合は、特に、
１）受容体のＮ末端側で、従ってＥＧＦＰのＣ末端側で、
２）受容体のＣ末端側で、従ってＥＧＦＰのＮ末端側で、
３）受容体の配列内、特に、第一又は第三の細胞内ループ内で、場合によっては、１コピー以上のスペーサー配列、特に−ＧＧＧＧＳ−を導入することにより、実施され得る。
【０１８１】
ＥＧＦＰと受容体−チャンネルとの間で融合が実施される場合（グループ２）、融合は、特に、
１）シビレエイ（Torpedo）ニコチン受容体のαサブユニット（残基６７〜７６）の「主要免疫原性領域」と相同な領域で、場合によっては、１コピー以上のスペーサー配列、特に−ＧＧＧＧＳ−を導入することにより、実施され得る。
【０１８２】
ＥＧＦＰと核受容体との間で融合が実施される場合（グループ３）、融合は、特に、
１）受容体のＮ末端側で、従ってＥＧＦＰのＣ末端側で、
２）ＤＮＡ結合ドメインの上流のＮ末端部分が短縮された受容体のＮ末端側で、従ってＥＧＦＰのＣ末端側で、実施され得る。
【０１８３】
ＥＧＦＰとチロシンキナーゼ活性を有するか又はチロシンキナーゼと共役した受容体との間で融合が実施される場合（グループ４及び５）、融合は、特に、
１）受容体のＮ末端側で、従ってＥＧＦＰのＣ末端側で、実施され得る。
【０１８４】
蛍光性タンパク質、特に、受容体と共役し、かつＧＦＰ又は類似タンパク質を発現している生物に由来するＧＦＰをコードするあらゆる遺伝子が、本発明において使用され得る。
【０１８５】
ＧＦＰ及び標的タンパク質、特に受容体をコードするＤＮＡ配列は、ゲノム起源のものであってもよいし又はｃＤＮＡであってもよく、例えば、標準的な技術（Current Protocols in Molecular Biology（前掲））により、遺伝子バンク又はｃＤＮＡバンクを調製し、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによってコーディング配列を同定するためにこれらのバンクをスクリーニングすることによって、任意の真核もしくは原核の動物種又は植物種のＤＮＡより入手され得る。
【０１８６】
ＧＦＰ及び標的タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、標準的な方法、特にホスホラミダイト法（Beaucage及びCaruthers、1981）及び自動化ＤＮＡ合成装置の使用による全合成によっても入手され得、次いで、得られたポリヌクレオチドは精製され、ライゲートさせられ、適切なベクターへとクローニングされ得る。大部分の適用について、ＧＦＰ及び標的タンパク質をコードする遺伝子は、優先的には、バンクをスクリーニングすることにより入手され、スペーサーアーム及び突然変異誘発に必要とされるオリゴヌクレオチドは、優先的には、合成により入手される。
【０１８７】
ＤＮＡ構築物は、標準的な手順（Current Protocols in Molecular Biology（前掲））による、合成断片をゲノムＤＮＡ由来エレメントとライゲーションさせたことによる、合成性及びゲノム性が混合されたものであってもよい。
【０１８８】
ＤＮＡ構築物は、例えば、PCR protocol 1990、Academic press、San Diego、California、USAに記載されたような特異的プライマーを使用することにより、ＰＣＲ（「ポリペプチド連鎖反応」）によって入手されてもよい。
【０１８９】
最後に、ＤＮＡ構築物は、いずれかのタンパク質、特に、ＧＦＰ及び標的タンパク質の特性を改変し得る、例えば、化学反応、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によるランダム又は特異的な突然変異誘発を含むその他の方法により改変されてもよい。
【０１９０】
ＤＮＡ構築は、組換えベクターへとクローニングされ得る。このベクターは、組換えベクターと共に使用され得る手順のための任意の適切なベクターであり得る。ベクターの選択は、しばしば、ＤＮＡ構築物が導入される宿主細胞の機能で実施され得る。従って、ベクターは、自律的に、即ち、染色体外で、染色体複製とは独立に複製することができるベクター、例えば、プラスミドであり得る。又は、ベクターは、それが含有しているＤＮＡの全部又は一部を宿主細胞のゲノムへと組み込むために開発され得、それが組み込まれた染色体と同時に複製されるであろう。
【０１９１】
ベクターは、優先的には、受容体と融合したＧＦＰ又はリガンドと融合したＧＦＰが、転写に必要とされる他のＤＮＡセグメントの制御下にある発現ベクターである。一般的に、プラスミド又はウイルスのＤＮＡに由来する発現ベクターは、いずれかのエレメントを含有し得る。
【０１９２】
「の制御下にある」という用語は、所望の目的を果たすために協調的に機能するよう、例えば、転写が、プロモーター内で開始され、ＧＦＰと融合した受容体又はＧＦＰと融合したリガンドをコードする配列全体にまで継続されるよう、ＤＮＡセグメントがベクター上に配置されていることを示す。
【０１９３】
プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を促進することができる任意のＤＮＡ配列であり得、宿主細胞と同種又は異種の遺伝子に由来し得る。
【０１９４】
哺乳動物細胞におけるＧＦＰと融合した受容体又はＧＦＰと融合したリガンドの発現に適したプロモーターの例は、サルウイルスＳＶ４０プロモーター（Subramaniら、1981）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター又はアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）である。
【０１９５】
昆虫細胞のためのプロモーターの例：
ポリヘドリンプロモーター（米国特許第４，７４５，０５１号；Vasuvedanら、1992）Ｐ１０プロモーター（Vlackら、1988）、バキュロウイルスの初期１遺伝子のプロモーター（米国特許第５，１５５，０３７号；米国特許第５，１６２，２２２号）。
【０１９６】
酵母のためのプロモーターの例：
解糖遺伝子（Hitzemanら、1980; Alber及びKawasaki、1982）、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Youngら、1982）のプロモーター。
【０１９７】
細菌のためのプロモーターの例：
細菌における発現のためのプロモーターの例は、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターのような構成的プロモーター又は例えばファージラムダのｐＬプロモーターのような誘導可能プロモーターであり得る（Current Protocols in Molecular Biology（前掲））。
【０１９８】
糸状菌のためのプロモーターの例：
使用され得るプロモーターは、例えば、ＡＤＨ３プロモーター（McKnightら、1985）又はｔｐｉＡプロモーターである。その他の有用なプロモーターは、リゾムコールミエヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）の中性アルファ−アミラーゼ、アスペルギルスニデュランス（Aspergillus nidulans）のアセトアミダーゼ、アスペルギルスオリザ（Aspergillus oryzae）のＴＡＫＡアミラーゼ又はアスペルギルスアワモリ（Aspergillus awamori）のグルコアミラーゼプロモーターをコードする遺伝子に由来し得る。
【０１９９】
ベクターは、さらに、
−  例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルスのＥｌｂ５領域のもののようなポリアデニル化配列、
−  転写活性化（エンハンサー）配列（ＳＶ４０アクチベーター）、
−  哺乳動物細胞のための、例えば、ＳＶ４０もしくはエプスタインバー（Epstein Barr）ウイルスの複製配列のような複製配列、又は酵母のための、２μプラスミドの開始点遺伝子及び複製遺伝子ＲＥＰ１−３、
−  選択マーカー、即ち、抗生物質（ネオマイシン、ゼオシン、ハイグロマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等）に対する耐性を賦与するか又は欠陥に対する代償を可能にする遺伝子（メトトレキサートに対する耐性を可能にするジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子、又はRussel(1985）により記載されたＳ．ポンベ（pombe）のＴＰＩ遺伝子、を含有し得る。
【０２００】
宿主細胞は、適切なベクターへと挿入されたＤＮＡ構築物を発現することができる任意の細胞であり得る。
【０２０１】
細胞は、特に、細菌、酵母、真菌及び例えば哺乳動物細胞のような高等真核細胞であり得る。
【０２０２】
ＤＮＡ構築物を発現することができる細菌細胞の例は：
−  Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンツス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. strearothermophilus）、Ｂ．チューリギエンシス（B. thurigiensis）のようなバチルス（Bacillus）株又はＳ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．ムリヌス（S. murinus）のようなストレプトミセス（Streptomyces）株のようなグラム陽性菌、
−  エシェリシアコリ（Escherichia coli）のようなグラム陰性菌、である。
【０２０３】
細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換又はコンピテント細菌の形質転換によって実施され得る（Current Protocols in Molecular Biology（前掲））。
【０２０４】
真核細胞の例：
ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ細胞系、初代培養物、ＣＯＳ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６３２）ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）。
【０２０５】
ＤＮＡをこれらの細胞へ導入するための方法（トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔等）は、Current Protocols in Molecular Biology（前掲）に記載されている。
【０２０６】
Current Protocols in Molecular Biology（前掲）に記載されたプロトコルに従い、異種ＤＮＡの導入により形質転換される酵母細胞の例：
サッカロミセス（Saccharomyces）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．クルイベリ（S. kluyveri）、
クルイベロミセス（Kluiveromyces）、Ｋ．ラクチス（K. lactis）、
ハンセヌラ（Hansenula）、Ｈ．ポリモルファ（H. polymorpha）、
ピキア（Pichia）、Ｐ．パストリス（P. pastoris）。
【０２０７】
形質転換された細胞は、耐性マーカー、一般的には薬物に対する耐性マーカーによって決定される表現型、又は特定の栄養素の非存在下での増殖能により選択される。
【０２０８】
糸状菌の例：
アスペルギルス（Aspergillus）株（Ａ．オリゼ（A. oryzae）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、Ａ．ニガー（A. niger））、ノイロスポラ（Neurospora）、フサリウム（Fusarium）、トリコデルマ（Trichoderma）。タンパク質の発現のためのアスペルギルス（Aspergillus）の使用は、欧州特許第２７２２７７号、欧州特許第２３００２３号又は欧州特許第１８４４３８号に記載されている。
【０２０９】
昆虫細胞の例：
レピドプテラ（Lepidoptera）、例えば、スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９）又はトリコプルシアニ（Trichoplusia ni）（Ｔｎｉ）の系が挙げられる。形質転換法（特に、感染）は、Current Protocols in Molecular Biology（前掲）に記載されている。
【０２１０】
リガンド
受容体と相互作用するリガンドは、任意の起源（天然、合成、半合成、組換え）及び任意の構造（化合物、ペプチド性、タンパク質性）のものであり得る。それらは、天然に蛍光性（もしくは発色団のキャリア）であってもよいし、又は蛍光性基（もしくは蛍光性基前駆体）もしくは発色団のグラフティングを可能にする化学反応、もしくはリガンドをＧＦＰと融合させ、それにより蛍光性にされたリガンドの発現を可能にすることができるＤＮＡ構築物を必要としてもよい。
【０２１１】
化学反応の例は、
−  塩基の存在下の有機溶媒又は水性媒体における、アミン又はチオールの、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、酸ハロゲン化物型、イソチオシアネート基、マレイミド基、エポキシドの試薬とのカップリング、
−  酸の、スクシンイミドのような基により活性化されたアミンとのカップリング、である。
【０２１２】
本発明の方法によると、形質転換された細胞の蛍光は、懸濁又は接着している細胞のスペクトル特性を、励起及び放射のスペクトルの取得により決定することができる、分光蛍光光度計において測定され得る。次いで、蛍光性リガンドとの相互作用が、エネルギーのドナー及びアクセプターの励起及び／又は放射のスペクトルの変化によって検出され、蛍光性受容体と蛍光性リガンドとの間の相互作用を防止する過剰の非蛍光性リガンドの添加によって、受容体との相互作用が阻害される場合、そのリガンドは、薬理学的に重要であると定義される。
【０２１３】
結合測定
会合及び／又は解離のキネティクスの測定は、会合及び解離のキネティクスパラメータ、即ち（１個以上の）速度定数、並びに各会合及び／又は解離のキネティクスの段階に関連する相対振幅が決定されるよう、マーキングされたリガンドとマーキングされた受容体との間の複合体の形成又は解離を連続的又は不連続的に記録することを可能にする全ての手段によって実施される。
【０２１４】
好ましい実施態様において、見かけの速度定数が０．１s-1超であるキネティクスは、励起及び蛍光の検出装置と接続された急速混合装置を使用して記録される（図１）。混合される試料は、混合シリンジ（又はその他の容器）に配置され、次いで急速に混合される。これに関して、「急速に」とは、例えば、Palancheら(2001）に記載されたように、１００μl観察チャンバーの場合、シリンジの内容物が４ml/秒以上の速度で推し進められることを意味する。
【０２１５】
見かけの速度定数が０．１s-1未満である場合には、急速混合装置の使用は不可欠ではない。この場合には、磁気攪拌サンプル装置、温度調節及び経時的な記録機能を備えた標準的な分光蛍光光度計においてドナー及び／又はアクセプターの蛍光の変動を記録することが可能である。次いで、試料が、攪拌子を備えたキュベットに配置され、所望の成分又は溶液の手動での添加によって混合物が得られる。受容体を含有しているサンプルは、細胞又は細胞の断片のいずれかであり得る。優先的には、それらがまずキュベットに配置され、モジュレーティング作用物質及びマーキングされたリガンドがこの溶液に添加される。従って、これらの添加の効果が記録され得、そしてエネルギー転移過程に関与しているか否か及び求められる薬理学的特異性の基準に対応しているか否かを決定するため、物理学的又は薬理学的なレベルで、蛍光の任意の変動が特徴決定され得る。その好ましい実施態様において、解離の測定は、過剰の競合性リガンドを添加することによって得られる。これは、
−  少量（最終容量の≦５％）の競合性リガンドの濃縮溶液（最終溶液におけるそのＫｄのおよそ５００〜１０００倍、Ｋｄは部位の５０％が占有される濃度に相当）を、蛍光性リガンド、蛍光性受容体及び場合によりアロステリックエフェクターを含有しているキュベットに添加することにより、又は
−  蛍光性リガンド、蛍光性受容体及び場合によりアロステリックエフェクターを含有しているシリンジの内容物の、所望の濃度の競合性リガンド、及び、混合操作中に希釈されるのを回避するため（容量対容量混合物について）他方のシリンジの濃度と等しい濃度のアロステリックエフェクターを含有しているシリンジの内容物との急速混合により、得ることができる。
【０２１６】
方法の好ましい実施態様において、会合の測定は、エネルギー転移による蛍光の変動をモニタリングしながら、蛍光性リガンドを、蛍光性受容体を含有している細胞、膜又は抽出物と混合することによって実施される。エフェクターの効果は、事前に受容体と混合した後、又は蛍光性リガンドとの同時混合のプロトコルにおいて、研究され得る。混合は、急速混合装置により、又は分光蛍光光度計キュベット内での手動での混合により、実施され得る。
【０２１７】
応答測定
受容体の多様性及びそれらがとり得るコンフォメーション状態の数も様々であるため、アロステリックエフェクターの正又は負の特質を定義することを可能にするのは、応答のモジュレーションの測定である。
【０２１８】
この関連において、アロステリックエフェクターの正又は負の特質は、検討した受容体に特異的な生理学的応答を増強（正のエフェクター）又は抑制（負のエフェクター）する能力により定義されることが想起される。正のアロステリックエフェクターは、蛍光マーカーリガンドがアゴニストであっても又はアンタゴニストであっても、その会合及び／又は解離のキネティクスに対する効果（加速又は減速）が何であっても、そのように考慮される。
【０２１９】
応答を測定するために使用される様々なテストは、既に記載されている。
【０２２０】
応答のパラメータは、全て、正のアロステリックエフェクターによって影響を受け得る。これらのパラメータは、とりわけ、応答の確立の速度、その振幅、その持続時間、その頻度、そのアゴニストに対する感受性及び応答の基底レベルを含む。
【０２２１】
好ましい実施態様において、方法は、Ｇタンパク質共役型受容体の研究のためのものである。これらの受容体について、それらは複数のシグナル伝達経路と共役しているため、研究の対象となり得る応答は様々である。例えば、ＧＴＰのＧタンパク質との結合、ｃＡＭＰ、イノシトールリン酸、アラキドン酸の産生、タンパク質のリン酸化、細胞内カルシウムの放出、細胞ｐＨの改変、細胞増殖速度の改変、細胞形態の変化、アクチンの重合が挙げられ、又はイオンチャンネルもしくは遺伝子発現の調節も挙げられる。
【０２２２】
これらの応答は、各々、記録され得、エフェクターの効果が決定され得る。
【０２２３】
最も広範な例において、第一の焦点は、カルシウム応答及びｃＡＭＰの産生に当てられる。
【０２２４】
カルシウム応答については、カルシウムに対して感受性の光プローブ（optical pbe）又は電流の調節の電気生理学的記録を使用することが可能である。カルシウムプローブの使用は、応答の確立の遅延、応答の持続時間、その強度又はそのアゴニストに対する感受性を決定することを可能にする。電気生理学的記録は、さらに、チャンネルの開口の頻度の分析を可能にする（Mulleら、1992）。正のアロステリックエフェクターは、応答の確立の遅延を減少させ、その他のパラメータ（振幅、持続時間、感受性等）を増加させ得る。負のアロステリックエフェクターは、反対の効果を有するであろう。
【０２２５】
図１は、迅速なキネティクスの測定を実施することを可能にする急速混合装置の概略図を示す。装置は、２個のシリンジ、即ち混合チャンバー及び観察チャンバーにより構成されている。シリンジピストンの前進によって、シリンジの内容物の混合物が混合チャンバーに入る。不感時間の後、混合物は、励起及び蛍光の検出装置を備えた観察チャンバーに到達する。ピストンの移動の停止又はストッピングシリンジの停止位置への到達は、混合段階を中止させ、その完了時に混合物の展開が記録される。
【０２２６】
図２（Monod、Wyman及びChangeux、1965より引用）は、二つのコンフォメーション状態又は二つのオリゴマー化状態で存在するタンパク質の調節の概略図を表す。このモデルにおいて、タンパク質は、三次構造及び四次構造が相互に異なる熱力学的に安定な状態に相当する、有限のいくつかの別個の状態で存在することができる。各状態間の相互変換は、自発的に作動することができ、異性化パラメータによって記載される。
【０２２７】
コンフォメーションは、薬理学的特性に関して異なる。従って、リガンドは、最も高い親和性を示すコンフォメーションを安定化する。コンフォメーションは、機能的特性に関して異なる。従って、アゴニストは、活性状態を優先的に安定化するが、アンタゴニストは不活性状態を優先的に安定化する。
【０２２８】
この概略図において、緩和状態（relaxed state）は、タンパク質の「活性」コンフォメーション状態に相当する。このコンフォメーションは、高い親和性で、受容体であればアゴニスト（Ａ）に、又は酵素であれば基質（Ａ）に結合することができる。緊張状態（constrained state）及び／又はモノマー状態は、最も高活性である緩和状態と比較して低活性（又は不活性である）。緊張状態は、阻害剤又はアンタゴニストと高親和性で結合する。モノマー状態は、アゴニスト又は基質と中程度の親和性で結合する。
【０２２９】
図３Ａ及び３Ｂは、コンフォメーション状態間の比及びリガンドとの相互作用の数量化された概略図を示す。
【０２３０】
図３Ａにおいて、タンパク質は静止状態（生物学的レベルにおいて不活性）及び活性状態に相当する二つのコンフォメーションで存在する。Ｒ状態とＡ状態との間の自然な異性化は、各状態の相対濃度の比に等しい異性化定数Ｌ0（Ｌ0＝［Ｒ］／［Ａ］）によって記載される。タンパク質のリガンドはＫＲに等しい解離定数でＲ状態と結合し、ＫAに等しい解離定数でＡ状態と結合する。比ｃ＝ＫA／ＫＲは、コンフォメーション間の所定のリガンドに対する親和性比を記載する。ｃが１未満である場合、リガンドはアゴニストである（Ａの分画濃度を増加させる）。ｃが１以下である場合、リガンドはアンタゴニストである（Ｒの分画濃度を増加させる）。リガンドと結合したＲコンフォメーションとＡコンフォメーションとの間の平衡（ＲＦ←→ＡＦ）は、Ｌ0とｃとの積によって記載される。
【０２３１】
アロステリックエフェクターの存在下（図３Ａ参照）においては、異性化定数Ｌ0は、Ｌ0’＝Ｌ［（１＋βｄ）／（１＋β）］n［ここで、β（ｃのホモログ）は二つのコンフォメーションに対するエフェクターの親和性比を記載し（β＝ＫA／ＫＲ）、かつｄはＡ状態に対する親和性に対して規準化されたエフェクターの濃度である（ｄ＝［エフェクター］／ＫA）］に従い、Ｌ0’へと改変される。β＞１であるエフェクターは阻害剤であり、β＜１であるものは増強剤である。
【０２３２】
図４は、ＮＫＡ−Ｂｏ（BodipyによりマーキングされたＮＫＡ）の受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ（ＧＦＰによりマーキングされたＮＫ２Ｒ）との会合（Ａ）及び解離（Ｂ）のキネティクスのリアルタイムの記録を表す。会合のキネティクスの記録は、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞の急速混合の後に実施された。解離のキネティクスは、受容体を発現している細胞を、ＮＫＡ−ｂｏ（１５分間のプレインキュベーション、１００ナノモーラー）と、次いで競合性アンタゴニストＳＲ４８９６（最終１０μM）と手動で混合した後に記録される。
【０２３３】
ｘ軸は時間（秒）を表し、ｙ軸は５１０nmにおける蛍光（自由単位）を表す。値λｎ及びκｎは、それぞれ、二つの指数関数を用いた最小二乗法により調整して決定された振幅及び速度定数に相当する。
【０２３４】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄは、受容体部位において蛍光性リガンドと競合的に相互作用するリガンドの同定の手順を示す。
【０２３５】
受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２ＲとＮＫＡ−Ｂｏとの間で形成された複合体は、増加する濃度の分子Ｇ６（表１参照）、次いで非蛍光性ＮＫＡによって復帰させられる。
【０２３６】
図５Ａは、受容体−リガンド複合体の一部が、分子Ｇ６（１０又は２０μM）の各添加及び飽和濃度のＮＫＡ（１０μM）の添加の間に復帰させられることを示す。この図において、ｘ軸は時間（秒）に相当し、ｙ軸は５１０nmにおいて測定された蛍光に相当する。
【０２３７】
図５Ｂは、飽和濃度のＮＫＡの添加の後に決定されたＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスが、分子Ｇ６の存在によって改変されないことを示す。
【０２３８】
二つの実験的追跡は、振幅（速が６６％、遅が３３％）が５０μモルの分子Ｇ６の存在によって影響を受けない二つの速い指数関数（０．０４s-1）及び遅い（０．０１４s-1）指数関数を使用して調整される。
【０２３９】
この図において、ｘ軸は時間（秒）に相当し、ｙ軸は５１０nmにおいて測定された蛍光に相当する。
【０２４０】
図５Ｃは、既知の競合性アンタゴニストＳＲ４８９６８の存在下におけるＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスの定量的研究を表す。ＮＫＡ−Ｂｏの解離は、０．２、１及び５nMのＳＲ４８９６８の存在下で記録される。三つの実験条件下で、解離速度は、速度が０．０４sec-1及び０．００８sec-1であり、相対振幅がＳＲ４８９６８の異なる用量において一定（速い解離（０．０４s-1）が４５％、遅い解離（０．００８s-1）が５５％）のままである二つの指数関数の総和として記載され得る。
【０２４１】
この図において、ｘ軸は時間（秒）に相当し、ｙ軸は５１０nmにおいて測定された蛍光に相当する。
【０２４２】
図５Ｄは、ＳＲ４８９６８存在下でのＮＫＡ−Ｂｏの速い解離（四角）及び遅い解離（上向き三角）の振幅、並びにＮＫＡ−Ｂｏの結合の全振幅（下向き三角）の値を表す。
【０２４３】
この図において、ｘ軸はＳＲ４８９６８濃度の対数に相当し、ｙ軸は規準化された蛍光の振幅に相当する。
【０２４４】
図５Ｄの上部は、解離の全振幅（全Ａ）に対する遅い解離の振幅（Ａ２）の比を表す（菱形付きの曲線）。この比が一定であることが認められた。このグラフにおいて、ｘ軸はＳＲ４８９６８濃度の対数に相当し、ｙ軸は蛍光の振幅の百分率に相当する。
【０２４５】
図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、受容体部位において蛍光性リガンドと非競合的に相互作用するリガンドの同定の手順を示す。
【０２４６】
図６Ａは、５１０nmにおいて測定された蛍光を時間（秒）の関数で示す。
【０２４７】
受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２ＲとＮＫＡ−Ｂｏとの間で形成された複合体は、増加する濃度の分子Ａ１１、次いで非蛍光性ＮＫＡによって復帰させられる。図６Ａは、受容体−リガンド複合体の極一部が、分子Ａ１１の各添加の間に復帰させられるが、ＮＫＡ（１０μM）は複合体の大多数を復帰させることを示す。ＮＫＡによる解離のキネティクスは、対照と同じ型ではない。
【０２４８】
図６Ｂは、時間（秒）の関数としての５１０nmにおいて測定された蛍光を示す。図６Ｂは、分子Ａ１１の存在下における解離のキネティクスの改変を例示す。受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２ＲからのＮＫＡ−Ｂｏの解離の記録が、分子Ａ１１の存在下及び非存在下で実施される。解離は、最終濃度２０μMの非蛍光性ＮＫＡの添加によって開始させられた。解離のキネティクスの分析は、速度定数（ｋ１及びｋ２）は分子Ａ１１の存在下及び非存在下で同一であるが、相対振幅は遅い解離が対照においては全シグナルの５９％、分子Ａ１１の存在下では全シグナルの２２％を表すよう変化する、二つの単一指数関数的緩和を示した。
【０２４９】
図６Ｃは、時間（秒）の関数としてのＮＫＡ−Ｂｏ（２０ナノモーラー）の受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒとの会合を示す。図６Ｃは、分子Ａ１１の非存在下及び存在下での、ＮＫＡ−Ｂｏの受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒとの時間分解的結合（会合）の記録を示す。結合キネティクスの分析は、速度定数（ｋ１及びｋ２）は分子Ａ１１の存在下で変化しないが、振幅は、細胞が分子Ａ１１と共にインキュベーションされたか否かによって可変であることを特徴とする、二つの単一指数関数的緩和を示した。
【０２５０】
図７Ａ〜７Ｉは、蛍光性受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと結合したＮＫＡ−Ｂｏの解離に対する様々な分子の効果の分析を例示する。
【０２５１】
図７Ａは、様々な濃度（１、１０及び５０μM）の８０５分子（表１参照）の存在下でのＮＫＡ−Ｂｏの解離の記録を表す。５１０nmにおいて測定された蛍光が、時間（秒）の関数として表される。解離のキネティクスの定量的分析は、相対振幅（速／遅）が、８０５の濃度が増加するにつれ３０／７０から８０／２０へと変動する、二つの速い指数関数（０．０４sec-1）及び遅い指数関数（０．０１４sec-1）を使用して得られた。
【０２５２】
図７Ｂ〜７Ｉは、テストされた化合物の濃度の対数の関数としての速い解離の振幅の百分率を示す。これらの図は、８０５分子（図７Ｂ）、ＮＰ２４６分子（図７Ｃ）、Ａ１１分子（図７Ｄ）、Ｈ１０分子（図７Ｅ）、Ｇ１１分子（図７Ｆ）、Ｆ７分子（図７Ｇ）、Ｆ３分子（図７Ｈ）及びＮＰ２３４分子（図７Ｉ）の存在下でのＮＫＡ−Ｂｏの解離の定量的分析の結果を与える。ＮＫＡ−Ｂｏの解離は、ｘ軸に示された濃度の各分子の存在下で決定された。解離速度の増加の効果は、速い解離の振幅（％λ１）の相対増加により表される。
【０２５３】
図８Ａ及び８Ｂは、ＮＫＡ分子及び８０５分子による、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと結合した［3Ｈ］ＳＲ４８９６８のシフトの定量を示す。
【０２５４】
これらの図は、１ナノモーラーの［3Ｈ］ＳＲ４８９６８（Amersham, Life Sciences）の結合を、ＮＫＡ濃度の対数の関数として（図８Ａ）又は８０５濃度の関数として（図８Ｂ）、示す。
【０２５５】
ＮＫＡ（競合性リガンド）は［3Ｈ］ＳＲ４８９６８の結合の１００％を復帰させるが、８０５（非競合性リガンド）はＳＲ４８９６８の結合のおよそ３５％のみを復帰させることが、認められた。
【０２５６】
図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃは、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるＮＫＡによるｃＡＭＰの産生の刺激の結果を示す。
【０２５７】
図９Ａは、競合性アンタゴニスト（Ｈ８５６５）及びアロステリックエフェクター（８０５）の存在の効果を表す。この図は、ＮＫＡ濃度の対数の関数としての、細胞内ｃＡＭＰ（pmole／ウェル）の蓄積を示す。黒四角付きの曲線はブランクに相当し；黒三角付きの曲線は濃度１μMのアンタゴニストＨ８５６５に相当し；灰色四角付きの曲線は濃度１０μMのリガンド８０５に相当し、灰色三角付きの曲線は濃度５０μMのリガンド８０５に相当する。
【０２５８】
細胞内ｃＡＭＰの蓄積を、異なるＮＫＡ濃度で決定した。アンタゴニストＨ８５６５は、最大応答の強度に影響を与えることなく、ＮＫＡ濃度−応答曲線をより高い値へとシフトさせた（黒三角）。リガンド８０５（灰色の四角及び三角）は、応答に対するＮＫＡのＥＣ50（５０％有効濃度）に影響を与えることなく最大応答の強度を減少させた。
【０２５９】
図９Ｂは、ＮＫＡに対する環状ＡＭＰの最大応答の５０％有効濃度を表す。このＥＣ50は、競合性アンタゴニストの存在下では増加するが、１０及び５０μMの８０５の存在下では有意に改変されなかった。
【０２６０】
図９Ｃは、増加する濃度の８０５の存在下での、ＮＫＡにより誘導されるｃＡＭＰの最大応答の阻害を表す。ｘ軸は８０５濃度の対数を表し、ｙ軸は環状ＡＭＰの産生の最大値を表す。阻害定数ＫＩは、ほぼ６μMである。
【０２６１】
図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ及び１０Ｅは、ＨＥＫ２９３細胞における受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと関連したカルシウム応答に対する８０５の効果を例示する。
【０２６２】
図１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃは、時間（秒）の関数としての４００nmにおけるＩＮＤＯ−１の蛍光を示す。
【０２６３】
応答は、カルシウム感受性蛍光プローブＩＮＤＯ−１を使用して記録される。アゴニストＮＫＡの各濃度（１nM、５nM及び１μM）について、対照応答（白丸）及び５０μMの８０５の存在下での応答（黒丸）を測定した（図１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃ）。いずれの場合にも、８０５の存在下では、振幅又は応答の確立のキネティクスに対する有意な効果はなしに、カルシウム応答の持続時間の増加が認められた。
【０２６４】
図１０Ｄは、固定されたアゴニストの濃度（５nMのＮＫＡ）及び８０５の可変の濃度（１０及び５０μM）について得られたカルシウム応答の変動を示す。規準化されたカルシウム濃度が、時間（秒）の関数として表される。白丸付きの曲線は、５nMのＮＫＡの存在下かつ８０５の非存在下で実施された測定に相当し；黒丸付きの曲線は、５nMのＮＫＡ及び１０μMの８０５の存在下で実施された測定に相当し；黒四角付きの曲線は、５nMのＮＫＡ及び５０μMの８０５の存在下で実施された測定に相当する。
【０２６５】
いずれの場合にも、８０５の存在下で、カルシウム応答の持続時間の増加が認められた。
【０２６６】
図１０Ｅは、０、１０及び５０μMの８０５の存在下で記録されたカルシウム応答の初期値におけるハーフリターン（half-return）時間（カルシウム濃度が最大値の半分となるのに必要とされる時間）の定量を示す。
【０２６７】
図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅ、１１Ｆ及び１１Ｇは、テキサスレッド蛍光性基でマーキングされた蛍光性短縮型ニューロキニン（ＮＫＡ４−１０ＴＲ７）の結合及びそれに関連したカルシウム応答に対する８０５の効果を例示する。
【０２６８】
図１１Ａ〜１１Ｄにおいて、１０６nM（図１１Ａ）、５０．３nM（図１１Ｂ）、２６．５nM（図１１Ｃ）及び１０．６nM（図１１Ｄ）のＮＫＡ４−１０ＴＲ７（テキサスレッドにより７位においてマーキングされたＮＫＡ４−１０）に対するカルシウム応答を、２０μMの８０５の非存在下（白丸付き曲線）及び存在下（黒丸付き曲線）で、デュプリケートで記録した。規準化されたカルシウム濃度を、時間（秒）の関数として表す。８０５が、カルシウム応答の振幅の増加及びシグナルの持続を引き起こすことが、認められる。
【０２６９】
図１１Ｅは、カルシウム応答の振幅とアゴニストの濃度との間の関係を表す。細胞外カルシウム濃度に対して規準化されたカルシウムピークの振幅を、ＮＫＡ４−１０ＴＲ７の濃度の関数として表す。黒四角付き曲線は、対照となる測定（８０５なし）に相当し、三角付き曲線は、２０μMの８０５の存在下で実施された測定に相当する。
【０２７０】
図１１Ｆは、ＮＫＡ４−１０ＴＲ７結合の解離を表す。ｘ軸は時間（秒）を表し、ｙ軸は蛍光を表す。受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２ＲとＮＫＡ４−１０ＴＲ７（１０６nM）との間で形成された複合体は、１０μMの８０５の非存在下及び存在下で、非蛍光性ＮＫＡ（２０μM）により復帰した（１０℃において）。解離のキネティクスの分析は、速度定数（０．０５sec-1及び０．０１３sec-1）は８０５の存在下及び非存在下で同一であるが、相対振幅は、遅い解離が対照においては全シグナルの４２％、８０５の存在下では全シグナルの１２％を表すよう変化する、二つの単一指数関数的緩和を示した。
【０２７１】
図１１Ｇは、８０５濃度の対数の関数としての、ＮＫＡ４−１０ＴＲ７の速い解離の振幅の百分率を示す。ＮＫＡ４−１０ＴＲ７の速い解離の振幅を、様々な濃度の８０５の存在下で測定した。速い解離は、８０５の非存在下では全解離のおよそ４０％、１００μMにおいては解離の振幅の９０％にもなった。振幅の変動についての見かけの親和性は、ほぼ２０μMであった。
【０２７２】
図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ及び１２Ｄは、８０５の存在下及び非存在下での、ヒト受容体ＮＫ１に対してサブスタンスＰ（内因性リガンド）により誘起されたカルシウム応答（図１２Ａ及び１２Ｂ）並びにヒト受容体ＮＫ２に対してニューロキニンＡにより誘起されたカルシウム応答（図１２Ｃ及び１２Ｄ）を表す。
【０２７３】
図１２Ａ及び１２Ｂにおいては、野生型ヒト受容体ＮＫ１受容体を発現しており、ｉｎｄｏ−１（３μM）を負荷されたＨＥＫ２９３細胞の懸濁液（１×１０6個／ml）が、８０５分子（２０μM）の存在下（黒丸）及び非存在下（白丸）で、０．１nM（図１２Ａ）又は１０nM（図１２Ｂ）のサブスタンスＰ（ＳＰ）により刺激された。
【０２７４】
図１２Ｃ及び１２Ｄにおいては、野生型ヒトＮＫ２受容体を発現しており、ｉｎｄｏ−１（３μM）を負荷されたＨＥＫ２９３細胞の懸濁液（１×１０6個／ml）が、８０５分子（２０μM）の存在下（黒丸）及び非存在下（白丸）で、１０nM（図１２Ｃ）又は１００nM（図１２Ｄ）のニューロキニンＡ（ＮＫＡ）により刺激された。
【０２７５】
いずれの場合にも、８０５分子が、各アゴニストにより引き起こされるカルシウム応答の振幅及び持続時間の増加を引き起こすことが認められた。
【０２７６】
実施例
実施例１：蛍光エネルギー転移による、蛍光団BodipyによりマーキングされたニューロキニンＡの、ＥＧＦＰによりマーキングされたタキキニンの受容体ＮＫ２との会合及び解離の速度の測定
会合（図４Ａ）：受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ（ＧＦＰでマーキングされたＮＫ２Ｒ）を発現しているＨＥＫ２９３細胞を、Hepes生理学的バッファー（１３７．５mM  ＮａＣｌ；１．２５mM  ＭｇＣｌ2；１．２５mM  ＣａＣｌ2；６mM  ＫＣｌ；５．６mMグルコース；１０mM Hepes；０．４mM  ＮａＨ2ＰＯ4；１％ＢＳＡ(w/v)；ｐＨ７．４）に２，０００，０００個／mlの濃度で懸濁させ、急速混合装置のリザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ）のうちの一つに配置した。同バッファー中のＮＫＡ−Ｂｏ（BodipyによりマーキングされたニューロキニンＡ）（２００nM）の溶液を、急速混合装置の他方のリザーバーに配置した。観察チャンバーを、ＳＰＥＸ  ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ３分光蛍光光度計に配置した。シリンジのリザーバー並びに混合チャンバー及び観察チャンバーの温度は、２１℃に固定した。観察チャンバーの励起波長は４７０nmに固定し、蛍光放射波長は５１０nmに固定した。実験ポイントのサンプリング頻度は５０Hz（２０msec毎に１ポイント）に固定した。リザーバーの内容物を、４ml/secの流速を可能にする含気装置を使用して混合チャンバー及び観察チャンバーの方へ推し進め、リザーバーのピストンの移動の停止の瞬間から連続的に混合物の展開を記録した。ＮＫＡ−Ｂｏと受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒとの会合の反応は、受容体ＮＫ２Ｒが保持するＧＦＰの蛍光の強度の減少の形態で検出された。実験的追跡は、型ｙ＝λ1ｅｘｐ（−ｋ１app×Ｔ）＋λ2ｅｘｐ（−ｋ２app×Ｔ）＋「straight」［ここで、λ1及びλ2は速い緩和及び遅い緩和の振幅であり、ｋ１app及びｋ２appは速い会合及び遅い会合の見かけの速度定数であり、Ｔは時間であり、かつ「straight」はシグナルドリフトの数学的補正である］により調整された。ＮＫＡ−ＢＯの最終濃度が１００nMである場合のλ1、λ2、ｋ１app、ｋ２appの値は、それぞれ、６７％；３２％；０．６sec-1；及び０．０３sec-1である。実験曲線の調整の相関係数は、Ｒ＝０．９８９であった。
【０２７７】
解離（図４Ｂ）：受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞を、Hepes生理学的バッファー（１３７．５mM  ＮａＣｌ；１．２５mM  ＭｇＣｌ2；１．２５mM  ＣａＣｌ２；６mM  ＫＣｌ；５．６mMグルコース；１０mM Hepes；０．４mM  ＮａＨ2ＰＯ4；１％ＢＳＡ(w/v)；ｐＨ７．４）に１，０００，０００個／mlの濃度で懸濁させ、SPEX fluorolog ３分光蛍光光度計のキュベットホルダー上のマグネティックスターラーを備えた１mlキュベットに配置した。２０nM（最終濃度）のＮＫＡ−Ｂｏを添加し、その組み合わせを平衡に達するよう１０分間放置した。ＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスの測定を、１０μM（最終濃度）の競合性アンタゴニストＳＲ４８９６８の手動での添加により開始させ、１００msec毎に１ポイントの速度で、５１０nm（励起：４７０nm）において記録した。実験的曲線の調整は、それぞれ速度定数ｋ1＝０．０５２sec-1及びｋ2＝０．０１１sec-1並びに振幅λ1＝４０％及びλ2＝５８％を有する二つの指数関数の総和を使用して得られた。
【０２７８】
実施例２：ＮＫＡ−Ｂｏと受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒとの間の蛍光エネルギー転移による、競合性リガンドとして挙動するＧ６分子の同定
受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞１０6個を、２０nMのＮＫＡ−Ｂｏと共に、１ミリリットルのHepesバッファー中で１５分間インキュベーションした。次いで、その混合物を、分光蛍光光度計キュベットに置き、増加する濃度のＧ６分子（表１参照）の添加の後、ＥＧＦＰ−ＮＫ２ＲとＮＫＡ−Ｂｏとの間の相互作用の復帰を評価した（図５Ａ）。次いで、飽和量のＮＫＡ（１０μM）の添加の後、復帰した複合体の画分の定量を実施したところ、結合の復帰の値は１００％に達した。
【０２７９】
Ｇ６分子（５０μM）の存在下及び非存在下におけるＮＫＡによるＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスの比較は、Ｇ６分子が、ＮＫＡ−Ｂｏの解離速度を改変させないことを示した（図５Ｂ）。二つの実験的曲線は、速い速度定数ｋ1＝０．０４sec-1及び遅い速度定数ｋ2＝０．０１sec-1を有する二つの指数関数を使用して正確に調整された。
【０２８０】
図５Ｃに示された対照実験は、ＮＫＡ−Ｂｏのその部位との相互作用に関して競合性である既知の分子ＳＲ４８９６８が、ＮＫＡ−ＢｏがＮＫＡにより排除された場合に記録されたものと同一のキネティクスで、ＮＫＡ−Ｂｏの解離を引き起こすことを示した。ＳＲ４８９６８の異なるテストされた濃度において、ＮＫＡ−Ｂｏの解離は、速い解離（ｋ1＝０．０４sec-1）及び遅い解離（ｋ2＝０．００８sec-1）の段階を含む二相性の過程により起こることが認められた。各段階の相対振幅は、４５／５５に近い速／遅振幅の比により立証されるように、ＳＲ４８９６８の各濃度で一定のままであった。
【０２８１】
ある範囲の増加する濃度のＳＲ４８９６８の存在下でのＮＫＡ−Ｂｏの解離の定量的分析は、ＳＲ４８９６８の各濃度で、解離が二つの速度定数を有する二相性の過程によって生じるのみならず（図５Ｃ参照）、さらに、速い解離と遅い解離との振幅の比が一定のままであることを明らかにした（図５Ｄ）。遅い解離は、常に、「速い解離＋遅い解離」シグナルのおよそ４３％を占める。
【０２８２】
実施例３：タキキニンのＮＫ２受容体のアロステリックエフェクターとして挙動する分子の同定
受容体ＥＧＦＰ−ＮＫＲ２を発現しているＨＥＫ２９３細胞１０6個を、２０nMのＮＫＡ−Ｂｏと共に、１ミリリットルのHepesバッファー中で１５分間インキュベートした。次いで、その混合物を、分光蛍光光度計キュベットに置き、増加する濃度のＡ１１分子の添加の後、ＥＧＦＰ−ＮＫ２ＲとＮＫＡ−Ｂｏとの間の相互作用の復帰を評価した（図６Ａ）。次いで、飽和量のＮＫＡ（１０μM）の添加の後、復帰した複合体の画分の推測を測定した。Ａ１１分子は、その部位と結合したＮＫＡ−Ｂｏの極少ない画分（２９％）のみを排除することが見られた。反対に、非蛍光性ＮＫＡによるＮＫＡ−Ｂｏの解離中、Ａ１１の存在は、ＮＫＡ−Ｂｏの解離速度を加速する効果を有していた。この現象は、ＮＫＡによるＮＫＡ−ＢＯの解離のキネティクスが、Ａ１１分子の存在下及び非存在下で測定された図６Ｂに例示される。二つの解離のキネティクスは、速度がそれぞれ速い段階についてはｋ1＝０．０５２sec-1であり、遅い段階についてはｋ2＝０．０１１sec-1である二つの指数関数的緩和の総和によって、より良好に記載された。ＮＫＡ−Ｂｏのその受容体との会合速度（ｋoｎ＝５×１０6M-1sec-1）より、ＮＫＡ−Ｂｏは、解離定数（ＫD＝ｋoｆｆ／ｋoｎ）がそれぞれ１０nM（速い解離−０．０１１s-1）及び２nM（遅い解離−０．０５２s-1）である二つの部位集団とリンクしていると推量された。次いで、各緩和の振幅が、実験的追跡の調整によって与えられた。対照の解離（Ａ１１なし）に関して、速い緩和は４１％を表し、遅い緩和は５９％を表した。Ａ１１（５０μM）の添加の後、速い緩和はシグナルの７８％を表し、遅い緩和は２２％を表した。従って、Ａ１１分子は、ＮＫＡ−Ｂｏ単独が安定化するよりも低い親和性の状態の受容体の画分を安定化する効果を有する。Ａ１１分子自体は、ＮＫＡ−Ｂｏに対してより穏和な親和性を有する受容体のコンフォメーションと優先的に結合する。ＮＫＡ−Ｂｏの結合はＡ１１によって阻害されない。それは、受容体の同じコンフォメーション状態で生じるが、これらの二つのコンフォメーション状態の割合はＡ１１の存在によって改変される。結果として、ＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスは、Ａ１１の非存在下より存在下の方が速い。ＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスの加速は、ＮＫＡ−Ｂｏに対するコンフォメーションの固有の親和性の変化ではなく、高親和性状態と低親和性状態との相対割合の改変に起因する。
【０２８３】
ＮＫＡ−Ｂｏの会合のキネティクスに対するＡ１１分子の効果の分析（図６Ｃ）は、穏和であるが検出可能な加速を明らかにした。急速混合装置を使用して２０nMの濃度で記録されたＮＫＡ−Ｂｏの速い結合は、速度（ｋapp）が１０倍異なる二つの指数関数の総和へと分解された。ＮＫＡ−Ｂｏの速い結合（ｋapp＝０．０９５sec-1）は、Ａ１１（５０μM）の非存在下では全結合シグナルの４４％を占め、Ａ１１の存在下では全シグナルの５２％を占めた。遅い結合は、いずれの場合にも０．００９５sec-1に等しい見かけの速度（ｋapp）で、そしてＡ１１の非存在下では６６％、Ａ１１の存在下では４８％に等しい振幅で実施された。これらの結果は、以下の項目においてPalancheら(2001）に記載されたモデルに従い解釈される。
−  速い結合は、遅い結合と同様に、媒体中のＮＫＡ−Ｂｏの拡散によって調節される様式で実施される。
−  速い結合の見かけの速度は、ＮＫＡ−Ｂｏの濃度と共に線形的に増加する。従って、それは、拡散によって排他的に調節される結合である。
−  遅い結合の見かけの速度は、ＮＫＡ−Ｂｏの濃度と共に非線形的に増加し、ほぼ５００nMのリガンド濃度で飽和する。この遅いキネティクスは、ＮＫＡ−ＢＯに対して低親和性のコンフォメーション状態の、占有が検出されるより高親和性の状態への相互変換を反映している。
【０２８４】
従って、受容体は、アゴニストの添加の前に存在するコンフォメーションと、アゴニストの存在下で次第に徐々に出現するコンフォメーションとの、少なくとも二つのコンフォメーション状態で存在する。
【０２８５】
Ａ１１分子は、受容体の低親和性状態を安定化することにより、より高親和性状態の定化を反映する遅い結合を減少させ、（低親和性の）速い結合の割合を増加させる。
【０２８６】
実施例４：タキキニンの受容体ＮＫ２Ｒのアロステリックエフェクターとして挙動する他の分子の、ＮＫＡ−Ｂｏの結合の分析による同定
タキキニンの受容体ＮＫ２Ｒの他のアロステリックエフェクターの同定を、受容体と結合したＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスを分析することにより実施した。
【０２８７】
受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞１０6個を、Hepesバッファー（前記参照）に懸濁させ、ＮＫＡ−Ｂｏ（２０nM）及び以下の化合物：８０５、ＮＰ２４６、Ａ１１、Ｈ１０、Ｇ１１、Ｆ７、Ｆ３及びＮＰ２３４のうちの一つと共にインキュベーションした。Ａ１１分子及び既知の競合性アンタゴニストＳＲ４８９６８を陽性対照として実験に導入した。結合したＮＫＡ−Ｂｏを排斥するため１０μMの非蛍光性ＮＫＡを添加した後、ＮＫＡ−Ｂｏの解離を、磁気攪拌子を備えた分光蛍光光度計キュベット内で７００秒間記録した。ＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスを、増加する濃度の前記の各分子の存在下で記録した。
【０２８８】
図７Ａは、増加する濃度の８０５分子の存在下でのＮＫＡ−Ｂｏの解離速度の測定のための典型的な実験を示す。これらの決定は、いくつかの実験パラメータを測定することを可能にした。ｉ）次いで指数関数的緩和の総和へと分解されるＮＫＡ−Ｂｏの解離速度及びｉｉ）実験において検出された各コンフォメーション状態の分画濃度の測定を生じるであろう各指数関数的緩和の相対振幅。従って、ＮＫＡ−Ｂｏの解離は、速度定数ｋ1＝０．０４sec-1及びｋ2＝０．００８sec-1並びに可変のλ１／λ２振幅：λ１／λ２＝３０／７０（８０５なし）；λ１／λ２＝３５／６５（１μM  ８０５）；λ１／λ２＝９／３１（１０μM  ８０５）及びλ１／λ２＝８０／２０（５０μM  ８０５）を特徴とする二段階で起こることが決定された。
【０２８９】
図７Ｂ〜７Ｉは、テストされた各分子について、ＮＫＡ−Ｂｏの結合の振幅の変動及び速い解離の振幅の変動を示している。これらの図は、示された分子全てが、ＮＫＡ−Ｂｏの速い解離の振幅の増加を引き起こすため、アロステリックエフェクターと同様に挙動することを示している。
【０２９０】
速い解離の振幅の増加は、低親和性状態の受容体のより大きな画分を安定化する分子の能力を反映している。従って、低親和性状態の受容体の初期画分は、エフェクターの非存在下ではおよそ２５％から、８０５、ＮＰ２３４、Ａ１１、Ｇ１１、Ｆ７、Ｆ３及びＨ１０分子（１００μMのエフェクター）の存在下では６０〜７５％、Ａ１１及びＮＰ２４６の存在下ではほとんど１００％にもなる。
【０２９１】
実施例５：アゴニストＮＫＡ及びアロステリックエフェクター８０５による放射性競合性アンタゴニストＳＲ４８９６８の結合の阻害の研究
受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現している細胞２５，０００個を、１nＭの［3Ｈ］ＳＲ４８９６８及び様々な濃度のＮＫＡ又は８０５の存在下で、最終容量５００μlのHepesバッファー中で４℃で３時間インキュベーションした。インキュベーションの完了後、反応混合物を、１％（Ｗ／Ｖ）の粉末半脱脂乳が補足されたHepesバッファー中で予めインキュベーションされたＧＦ／Ｃ（Ｗｈａｔｍａｎ）ガラスファイバーフィルターで濾過し、４℃のHepesバッファー５mlで３回濯いだ。次いで、フィルターをシンチレーティングカクテル３mlが添加されたシンチレーションカウンターバイアルに配置した。１６時間後、放射能カウンターで放射能を測定した。図８Ａは、アゴニストＮＫＡが、見かけの親和性Ｋｉ＝２２nMでＳＲ４８９６８の結合を定量的に排除することを示している。他方、８０５エフェクターは、濃度がほぼミリモーラーである場合ですら、結合したＳＲ４８９６８を完全に排除することができなかった。それは、見かけの親和性Ｋｉ＝５μMで、放射性リガンドの結合の２７〜３３％のみを復帰させた。ＳＲ４８９６８の結合に対する８０５の効果は、競合性を反映してはおらず、非競合性の相互作用である。
【０２９２】
実施例６：受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰの蓄積応答に対する８０５分子の効果の定量
３０mm６穴細胞培養ディッシュをコラーゲンで処理し、次いで受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現している細胞５０，０００個を播種した。２〜３日間の培養の後、培地をホスホジエステラーゼＩＢＭＸ（イソブチル−メチル−キサンチン）阻害剤を含有しているHepesバッファーに交換し、ｉ）競合性阻害剤Ｈ８５６５（１μM）又はｉｉ）エフェクター８０５（１０又は５０μM）の存在下又は非存在下で、増加する濃度のＮＫＡと共に３０分間インキュベーションした。産生されたｃＡＭＰの量（pmole／ウェルで表す）を、Gicquiauxら(2002）に記載された放射免疫学的方法に従い決定した。これは、ＮＫＡの濃度−効果曲線の測定をもたらした（図９Ａ）。
【０２９３】
ＮＫＡ単独は、１００nMに近いＥＣ50で、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現している細胞におけるｃＡＭＰの産生を刺激することができた。
【０２９４】
固定された濃度の競合性アンタゴニストＨ８５６５の存在下では、反応の最大レベルは影響を受けることなく（最大応答＝１００％）、ＮＫＡの見かけの親和性（ＥＣ50＝３００nM）の減少が認められた。
【０２９５】
１０又は５０μMのエフェクター８０５の存在下では、ＮＫＡのＥＣ50の変動は検出されなかったが（ＥＣ50＝１００nM）、最大応答は決して対照の値（［８０５］＝１０μMでＲｍａｘ＝０．７、［８０５］＝５０μMでＲｍａｘ＝０．３）に達しなかった。ｃＡＭＰの最大応答が５０％減少する８０５の濃度の値は、ほぼ６μMであった（図９Ｃ）。従って、競合性アンタゴニストの存在下では、応答についての見かけの親和性は減少するが、最大振幅は減少せず、負のアロステリックエフェクターによって、応答の最大振幅は減少するが、見かけの親和性は減少しない。
【０２９６】
実施例７：受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるＮＫＡ−Ｂｏにより引き起こされるカルシウム蓄積応答に対する８０５分子の効果の定量
Vollmerら(1999）に記載されたプロトコルに従い、カルシウム感受性蛍光性プローブ：ｉｎｄｏ−１を細胞に負荷した後、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現している細胞におけるアゴニストＮＫＡ−Ｂｏにより引き起こされるカルシウム応答を記録した。細胞を、Hepesバッファーに５００，０００個／mlの率で懸濁させ、分光蛍光光度計キュベットに配置した。励起波長は３３８nmに固定し、放射は４００及び４７０nmで記録した。追跡された応答は、４００nm／４７０nmシグナル比であった。図１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃは、化合物８０５（５０μM）が、１、５及び１０００nMのＮＫＡにより引き起こされるカルシウム応答の持続時間を増加させることを示している。同様に、化合物８０５は、１０μM及び５０μMの濃度で、５nMのＮＫＡにより引き起こされるカルシウム応答の持続時間を増加させる（図１０Ｄ）。
【０２９７】
従って、化合物８０５は、応答の持続時間を増加させるアゴニストＮＫＡ−Ｂｏにより引き起こされるカルシウム応答の正のアロステリックエフェクターとして挙動する。これは、最大応答の５０％に戻るために必要な時間が、８０５の非存在下での９１秒から、８０５の濃度が１０、次いで５０μMになったとき１０５、次いで１１５になることが分かる図１０Ｅに示されている。
【０２９８】
実施例８：受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるＮＫＡ４−１０ＴＲ７により引き起こされるカルシウム蓄積応答に対する８０５分子の効果の定量
Vollmerら(1999）に記載されたプロトコルに従い、カルシウム感受性蛍光性プローブ：ｉｎｄｏ−１を細胞に負荷した後、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現している細胞における短縮型アゴニストＮＫＡ４−１０ＴＲ７により引き起こされるカルシウム蓄積応答を記録した。細胞を、Hepesバッファーに５００，０００個／mlの率で懸濁させ、分光蛍光光度計キュベットに配置した。励起波長は３５５nmに固定し、放射は３７５及び４０５nmで記録した。追跡された応答は、３７５nm／４０５nmシグナルの比であった。図１１Ａ〜１１Ｄは、化合物８０５（２０μM）が、ＮＫＡ４−１０ＴＲ７（１０６、５０．３、２６．５及び１０．６nM）により引き起こされる応答の振幅を増加させることを示している。８０５による振幅の変動は、５、１０、２５、５０及び１０６nMのＮＫＡ４−１０ＴＲ７の濃度について、図１１のパネルＢに例示されている。化合物８０５は、ＮＫＡ４−１０ＴＲ７により引き起こされるカルシウム応答の正のアロステリックエフェクターであり、５０％有効用量をおよそ２０nMからおよそ１５nMへと減少させることが判明した。
【０２９９】
実施例９：受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２ＲからのＮＫＡ４−１０ＴＲ７の解離に対する８０５分子の効果の定量
ＮＫＡ４−１０は、中腸の腫瘍の液体中に見出されるＮＫＡの短縮型に相当する。蛍光性ＮＫＡ４−１０を、システインを導入するため７位で改変し、次いで、そのシステインをテキサスレッド蛍光性基によりマーキングした。蛍光性ＮＫＡ４−１０は、蛍光性ＮＫＡと同様に、ｃＡＭＰ蓄積応答を引き起こすことができない程度の、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒのアゴニストである（Palancheら、2001）。
【０３００】
蛍光性ＮＫＡ４−１０の結合は、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒを発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるカルシウム応答の発生に関連している単一指数関数的過程によって起こる（Palancheら、2001）。
【０３０１】
１０℃において、ペプチドの７位に導入されたテキサスレッド基を使用して蛍光性にされたＮＫＡ４−１０（ＮＫＡ４−１０ＴＲ７）の解離は、ｋ1＝０．５sec-1及びｋ2＝０．０１５sec-1に等しい速い速度定数及び遅い速度定数、並びに速い解離についての５８％という振幅及び遅い解離についての４２％という振幅を特徴とする二相性の過程によって起こる（図１１Ｆ）。１０μMの８０５の存在下では、速い解離段階（８８％）及び遅い解離段階（１２％）の振幅の改変を特徴とする、解離の加速が観察された。ＮＫＡ４−１０ＴＲ７の解離速度の増加と８０５の濃度との間には関係が認められた（図１１Ｇ）。ＮＫＡ４−１０ＴＲ７の速い解離の振幅の５０％の増加を引き起こす８０５の濃度は、ほぼ２０μMであった。
【０３０２】
実施例１０：８０５分子による野生型ヒト受容体ＮＫ１及びＮＫ２のカルシウム応答の増強
Vollmerら(1999）に記載されたプロトコルに従い、カルシウム感受性蛍光性プローブ：ｉｎｄｏ−１（３μM）を細胞にチャージした後、野生型ヒト受容体ＮＫ１又は野生型ヒト受容体ＮＫ２を発現している細胞における以下のアゴニスト：サブスタンスＰ（ＳＰ）及びニューロキニンＡ（ＮＫＡ）により引き起こされるカルシウム応答を記録した。細胞を、Hepesバッファー（前掲）に１，０００，０００個／mlの率で懸濁させ、分光蛍光光度計キュベットに配置した。励起波長は３３８nmに固定し、放射は４００nmで記録した。追跡された応答は、４００nmで記録されたシグナルであった。図１２Ａ及び１２Ｂは、化合物８０５（２０μM）が、サブスタンスＰ（０．１又は１０nM）により引き起こされる応答の振幅を増加させることを示している。図１２Ｃ及び１２Ｄは、化合物８０５（２０μM）が、ニューロキニンＡ（１０又は１００nM）により引き起こされる応答の振幅を増加させることを示している。
【０３０３】
化合物８０５は、野生型ヒト受容体ＮＫ２においてニューロキニンＡにより引き起こされるカルシウム応答及び野生型ヒト受容体ＮＫ１においてサブスタンスＰにより引き起こされる応答の正のアロステリックエフェクターであることが判明した。
【０３０４】
実施例１１：アセチルコリンのムスカリン受容体Ｍ１のアロステリックエフェクターの同定
蛍光性ムスカリン受容体Ｍ１を、Ilienら(2003）に記載されたようにして、そのｃＤＮＡのＥＧＦＰ又はＹＰＦＰのｃＤＮＡとの融合により入手し、ＨＥＫ２９３細胞において安定に発現させた。細胞を、Hepes生理学的バッファー（１３７．５mM  ＮａＣｌ；１．２５mM  ＭｇＣｌ2；１．２５mM  ＣａＣｌ2；６mM  ＫＣｌ；５．６mMグルコース；１０mMHepes；０．４mM  ＮａＨ2ＰＯ4；１％ＢＳＡ(w/v)；ｐＨ７．４）に１，０００，０００個／mlの濃度で懸濁させ、分光蛍光光度計のシェーカーラックに置かれた１ml蛍光キュベットに配置した。細胞懸濁液を４７０nmで励起し、蛍光放射を５１０nm（ＥＧＦＰ）又は５３０nm（ＥＹＦＰ）で記録した。７０nMのBodipy（５５８−５６８）−ピレンゼピンの添加は、リガンドと受容体とか会合段階であることを反映している、受容体が保持する蛍光性タンパク質の蛍光放射の減少を引き起こした。この段階の時間的経過を、５１０又は５３０nmにおける放射を記録することによりモニタリングした。別法として、受容体とBodipy−ピレンゼピンとの間の複合体を分光蛍光光度計に置かれた蛍光キュベットにおいて形成させた後、受容体−リガンド複合体の解離段階を開始させるため、過剰（５μM）のアトロピンを添加した。この解離段階の時間的経過を、５１０又は５３０nmにおいて記録した。アセチルコリンのムスカリン受容体Ｍ１のアロステリックエフェクターを同定するため、細胞を１個以上の既知又は未知の分子と共にプレインキュベーションし、会合段階及び／又は解離段階の時間的経過を記録した。次いで、記録されたキネティクスを、型ｙ＝λ1ｅｘｐ（−ｋ１app×Ｔ）＋λ2ｅｘｐ（−ｋ２app×Ｔ）＋「straight」［ここで、λ1及びλ2は速い緩和及び遅い緩和の振幅であり、ｋ１app及びｋ２appは速い会合及び遅い会合の見かけの速度定数であり、Ｔは時間であり、かつ「straight」はシグナルドリフトの数学的補正である］の多重指数関数曲線により調整した。アロステリックエフェクターは、会合段階もしくは解離段階のいずれか又はその両方の時間的経過を加速又は減速する。これは、対照実験条件（エフェクターなし）と比較した、速い及び遅い会合（又は解離）の振幅の相対的な変動をもたらす。
【０３０５】
実施例１２：ケモカインの受容体ＣＸＣＲ４のアロステリックエフェクターの同定
蛍光性受容体ＣＸＣＲ４を、Valenzuelaら(2001)及びPalancheら(2001）に記載されたようにして、そのｃＤＮＡのＥＧＦＰのｃＤＮＡとの融合により入手し、ＨＥＫ２９３細胞において安定的に発現させた。細胞を、Hepes生理学的バッファー（１３７．５mM  ＮａＣｌ；１．２５mM  ＭｇＣｌ2；１．２５mM  ＣａＣｌ2；６mM  ＫＣｌ；５．６mMグルコース；１０mMHepes；０．４mM  ＮａＨ2ＰＯ4；１％ＢＳＡ(w/v)；ｐＨ７．４）に１，０００，０００個／mlの濃度で懸濁させ、分光蛍光光度計のシェーカーラックに置かれた１ml蛍光キュベットに配置した。細胞の懸濁液を４７０nmで励起し、蛍光放射を５１０nmで記録した。５０nMのテキサスレッド−ＳＤＦ１αの添加は、リガンドと受容体との会合段階を反映している、受容体が保持する蛍光性タンパク質の蛍光放射の減少を引き起こした。この段階の時間的経過を、５１０nmにおける放射を記録することによりモニタリングした。別法として、受容体とテキサスレッド−ＳＤＦ１αとの間の複合体を分光蛍光光度計に置かれた蛍光キュベットにおいて形成させた後、受容体−リガンド複合体の解離段階を開始させるため、過剰（５００nM）のＳＤＦ１αを添加した。この解離段階の時間的経過を、５１０nmにおいて登録した。受容体ＣＸＣＲ４のアロステリックエフェクターを同定するため、細胞を１個以上の既知又は未知の分子と共にプレインキュベーションし、会合段階及び／又は解離段階の時間的経過を記録した。次いで、記録されたキネティクスを、型ｙ＝λ1ｅｘｐ（−ｋ１app×Ｔ）＋λ2ｅｘｐ（−ｋ２app×Ｔ）＋「straight」［ここで、λ1及びλ2は速い緩和及び遅い緩和の振幅であり、ｋ１app及びｋ２appは速い会合及び遅い会合の見かけの速度定数であり、Ｔは時間であり、かつ「straight」はシグナルドリフトの数学的補正である］の多重指数関数曲線により調整した。アロステリックエフェクターは、会合段階もしくは解離段階のいずれか又はその両方の時間的経過を加速又は減速する。これは、対照実験条件（エフェクターなし）と比較した、速い及び遅い会合（又は解離）の振幅の相対的な変動をもたらす。
【表６】
2005530158.tif 000023
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【図面の簡単な説明】
【０３０６】
【図１】迅速なキネティクスの測定を実施することを可能にする急速混合装置の概略図を示す。
【図２】二つのコンフォメーション状態又は二つのオリゴマー化状態で存在するタンパク質の調節の概略図を表す。
【図３Ａ】コンフォメーション状態間の比及びリガンドとの相互作用の数量化された概略図を示す。
【図３Ｂ】コンフォメーション状態間の比及びリガンドとの相互作用の数量化された概略図を示す。
【図４Ａ】ＮＫＡ−Ｂｏ（BodipyによりマーキングされたＮＫＡ）の受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ（ＧＦＰによりマーキングされたＮＫ２Ｒ）との会合のキネティクスのリアルタイムの記録を表す。
【図４Ｂ】ＮＫＡ−Ｂｏ（BodipyによりマーキングされたＮＫＡ）の受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ（ＧＦＰによりマーキングされたＮＫ２Ｒ）との解離のキネティクスのリアルタイムの記録を表す。
【図５Ａ】受容体−リガンド複合体の一部が、分子Ｇ６（１０又は２０μM）の各添加及び飽和濃度のＮＫＡ（１０μM）の添加の間に復帰させられることを示す。
【図５Ｂ】飽和濃度のＮＫＡの添加の後に決定されたＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスが、分子Ｇ６の存在によって改変されないことを示す。
【図５Ｃ】既知の競合性アンタゴニストＳＲ４８９６８の存在下におけるＮＫＡ−Ｂｏの解離のキネティクスの定量的研究を表す。
【図５Ｄ】ＳＲ４８９６８の存在下でのＮＫＡ−Ｂｏの速い解離（四角）及び遅い解離（上向き三角）の振幅、並びにＮＫＡ−Ｂｏの結合の全振幅（下向き三角）の値を表す。
【図６Ａ】受容体部位における蛍光性リガンドと非競合的に相互作用するリガンドの同定において、５１０nmにおいて測定された蛍光を時間（秒）の関数で示す。
【図６Ｂ】受容体部位における蛍光性リガンドと非競合的に相互作用するリガンドの同定において、時間（秒）の関数としての５１０nmにおいて測定された蛍光を示す。
【図６Ｃ】受容体部位における蛍光性リガンドと非競合的に相互作用するリガンドの同定において、時間（秒）の関数としてのＮＫＡ−Ｂｏ（２０ナノモーラー）の受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒとの会合を示す。
【図７Ａ】様々な濃度（１、１０及び５０μM）の８０５分子（表１参照）の存在下でのＮＫＡ−Ｂｏの解離の記録を表す。
【図７Ｂ】８０５分子の濃度の対数の関数としての速い解離の振幅の百分率を示す。
【図７Ｃ】ＮＰ２４６分子の濃度の対数の関数としての速い解離の振幅の百分率を示す。
【図７Ｄ】Ａ１１分子の濃度の対数の関数としての速い解離の振幅の百分率を示す。
【図７Ｅ】Ｈ１０分子の濃度の対数の関数としての速い解離の振幅の百分率を示す。
【図７Ｆ】Ｇ１１分子の濃度の対数の関数としての速い解離の振幅の百分率を示す。
【図７Ｇ】Ｆ７分子の濃度の対数の関数としての速い解離の振幅の百分率を示す。
【図７Ｈ】Ｆ３分子の濃度の対数の関数としての速い解離の振幅の百分率を示す。
【図７Ｉ】ＮＰ２３４分子の濃度の対数の関数としての速い解離の振幅の百分率を示す。
【図８Ａ】ＮＫＡ分子による、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと結合した［3Ｈ］ＳＲ４８９６８のシフトの定量を示す。
【図８Ｂ】８０５分子による、受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと結合した［3Ｈ］ＳＲ４８９６８のシフトの定量を示す。
【図９Ａ】ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ発現ＨＥＫ２９３細胞のＮＫＡによるｃＡＭＰ産生の刺激における、競合性アンタゴニスト（Ｈ８５６５）及びアロステリックエフェクター（８０５）の存在の効果を表す。
【図９Ｂ】ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ発現ＨＥＫ２９３細胞のＮＫＡによるｃＡＭＰ産生の刺激における、ＮＫＡに対する環状ＡＭＰの最大応答の５０％有効濃度を表す。
【図９Ｃ】ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒ発現ＨＥＫ２９３細胞のＮＫＡによるｃＡＭＰ産生の刺激における、増加する濃度の８０５の存在下での、ＮＫＡにより誘導されるｃＡＭＰの最大応答の阻害を表す。
【図１０Ａ】ＨＥＫ２９３細胞における受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと関連したカルシウム応答に対する８０５の効果を例示する。
【図１０Ｂ】ＨＥＫ２９３細胞における受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと関連したカルシウム応答に対する８０５の効果を例示する。
【図１０Ｃ】ＨＥＫ２９３細胞における受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと関連したカルシウム応答に対する８０５の効果を例示する。
【図１０Ｄ】ＨＥＫ２９３細胞における受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと関連したカルシウム応答に対する８０５の効果を例示する。
【図１０Ｅ】ＨＥＫ２９３細胞における受容体ＥＧＦＰ−ＮＫ２Ｒと関連したカルシウム応答に対する８０５の効果を例示する。
【図１１】テキサスレッド蛍光性基でマーキングされた蛍光性短縮型ニューロキニン（ＮＫＡ４−１０ＴＲ７）の結合及びそれに関連したカルシウム応答に対する８０５の効果を例示する図である。
【図１１Ｅ】カルシウム応答の振幅とアゴニストの濃度との間の関係を表す。
【図１１Ｆ】ＮＫＡ４−１０ＴＲ７結合の解離を表す。
【図１１Ｇ】８０５濃度の対数の関数としての、ＮＫＡ４−１０ＴＲ７の速い解離の振幅の百分率を示す。
【図１２−１】野生型ヒト受容体ＮＫ１受容体におけるサブスタンスＰに対するカルシウム応答の８０５分子による刺激を示す図である。
【図１２−２】野生型ヒトＮＫ２受容体におけるサブスタンスＰに対するカルシウム応答の８０５分子による刺激を示す図である。
【図１】
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【図２】
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2005530158.tif 000031
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｉ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
2005530158.tif 000058
【図１１Ｇ】
2005530158.tif 000059
【図１２−１】
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【図１２−２】
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【国際調査報告】
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