(57)【要約】本発明は、哺乳動物におけるインスリン耐性の緩和に有用な作用剤を同定する方法に関し、該方法は、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）とヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）が物理的に相互作用するという知見により可能となる。この複合体中のデアセチラーゼ活性を阻害することにより、インスリン感受性から回復させることができる。
2005535316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和する作用剤を同定する方法であって、
候補薬剤を哺乳動物ヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）ポリペプチドまたは哺乳動物ＨＤＡＣ２ポリヌクレオチドと接触させ；
ポリペプチドの生物学的活性またはポリヌクレオチドの発現の阻害剤として候補作用剤を同定し；次いで
候補作用剤が哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和するかどうかを決定する
ことを含む方法。
【請求項２】
候補作用剤がペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログである請求項１記載の方法。
【請求項３】
候補作用剤がヒドロキサム酸誘導体、環状テトラペプチド、ベンズアミド、またはブチレートである請求項１記載の方法。
【請求項４】
候補作用剤がＨＤＡＣ２のデアセチラーゼ活性を阻害するものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
候補作用剤が２型糖尿病の治療において有効かどうかを決定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和する作用剤を同定する方法であって、
哺乳動物ＨＤＡＣ２ポリペプチドの生物学的活性または哺乳動物ＨＤＡＣ２ポリヌクレオチドの発現を阻害する候補作用剤を用意し；次いで
候補作用剤が哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和するかどうかを決定する
ことを含む方法。
【請求項７】
候補作用剤がペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログである請求項６記載の方法。
【請求項８】
候補作用剤がヒドロキサム酸誘導体、環状テトラペプチド、ベンズアミド、またはブチレートである請求項６記載の方法。
【請求項９】
候補作用剤がＨＤＡＣ２のデアセチラーゼ活性を阻害するものである請求項６記載の方法。
【請求項１０】
候補作用剤が２型糖尿病の治療に有効かどうかを決定することを含む請求項６記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和する作用剤を同定する方法であって、
ＨＤＡＣ２ポリペプチドまたはインスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）ポリペプチドを候補作用剤と接触させ；
ＨＤＡＣ２ポリペプチドまたはＩＲＳ−１ポリペプチドへの候補作用剤の結合を検出し；次いで
候補作用剤が哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和するかどうかを決定する
ことを含む方法。
【請求項１２】
ＨＤＡＣ２ポリペプチドまたはＩＲＳ−１ポリペプチドが接触工程の間固定化されている請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
候補作用剤が接触工程の間固定化されている請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
候補作用剤がペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログである請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
インビトロ系を用いて接触工程が行われる請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
インビトロ系が無細胞系である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
候補作用剤が２型糖尿病の治療に有効であるかどうかを決定することをさらに含む請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
ＩＲＳ−１のアセチル化を増加させる作用剤を同定する方法であって、
候補作用剤を哺乳動物ＩＲＳ−１ポリペプチドと接触させ；次いで
候補作用剤がＩＲＳ−１ポリペプチドのアセチル化を増加させるかどうかを決定する
ことを含む方法。
【請求項１９】
候補作用剤がインスリン耐性の緩和に有効であるかどうかを決定することをさらに含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
候補作用剤が２型糖尿病の治療に有効であるかどうかを決定することをさらに含む請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和する方法であって、インスリン耐性の緩和を必要とする哺乳動物に有効量のＨＤＡＣ２阻害剤を投与することを含む方法。
【請求項２２】
ＨＤＡＣ２阻害剤がトリコスタチンＡである請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＨＤＡＣ２阻害剤がヒドロキサム酸誘導体、環状テトラペプチド、ベンズアミド、またはブチレートである請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
ＨＤＡＣ２阻害剤がＨＤＡＣ２のデアセチラーゼ活性を阻害するものである請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物がヒトである請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
ヒトが２型糖尿病を有しているものである請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和する方法であって、インスリン耐性の緩和を必要とする哺乳動物に、ＩＲＳ−１のアセチル化を増加させる有効量の作用剤を投与することを含む方法。
【請求項２８】
哺乳動物がヒトである請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ヒトが２型糖尿病を有するものである請求項２８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、哺乳動物におけるインスリン耐性の緩和に有用な作用剤を同定する方法に関し、該方法は、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）とヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）が物理的に相互作用するという知見により可能となる。この複合体中のデアセチラーゼ活性を阻害することにより、インスリン感受性を回復させることができる。
【０００２】
背景
インスリン受容体基質蛋白は、インスリンおよびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）の小夜における重要な要素であり、細胞機能の多面的効果をトランスダクションし、代謝、増殖、細胞分化および生存のごときプロセスを調節している（１，２）。少なくとも４つのメンバー（ＩＲＳ１〜４）が同定されており、それらは組織分布、細胞内局在化、発達発現、インスリン受容体への結合、およびＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインとの相互作用に関して異なっている（下記参照）。それらはすべて、活性化されたインスリン／ＩＧＦ受容体へのカップリングに必要なＮ末端プレックストリン（pleckstrin）ホモロジーおよびホスホチロシン結合ドメイン、ならびに複数のチロシンリン酸化部位を有するＣ末端領域により構造的に特徴づけられる。かくしてＩＲＳ蛋白は、とりわけ、特異的なリン酸化チロシン残基に結合する多くのＳＨ−２含有蛋白の動員の際の分子アダプターとして作用する。このことは、異なる分子内カスケードの活性化を導き、カスケードの１つはインスリンの代謝効果の媒介に関与するＰＩ３−キナーゼシグナリングカスケードである（３）。
【０００３】
それらの異なる生理学的役割のいくつかを明らかにするためにマウスにおいてこれらの蛋白の標的化された欠失が開始された。ＩＲＳ−１が存在しないと、中程度のインスリン耐性を伴う重大な成長遅滞が生じるが（４）、（５）、対照的に、ＩＲＳ−２が存在しないと、末梢組織のインスリン耐性とβ−細胞の増殖障害が併発する（６）。ＩＲＳ−３が存在しないと明確な表現型が生じないし（７）、ＩＲＳ−４の不存在は中程度のインスリン耐性に関連している（８）。利用可能なデータは、グルコース産生（肝臓）、グルコース摂取（骨格筋および脂肪組織）、およびインスリン産生（膵臓β−細胞）に関与する組織において、ＩＲＳ−１およびＩＲＳ−２は機能的に入れ替わることができないという考えと矛盾しない。実際、ＩＲＳ−１は骨格筋において大きな役割を果たしていると思われ、ＩＲＳ−２は肝臓のインスリン作用ならびに膵臓β−細胞の発達および生存を調節していると思われる。
【０００４】
ＩＲＳ−１は哺乳動物系において同定された最初のドッキング蛋白である（９）。そのｃＤＮＡから１３１ｋＤａの蛋白が推定されるが、セリン／スレオニンのリン酸化が多いので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは１６５〜１８０ｋＤａの位置に移動する。ＩＲＳ−１は２１個の推定チロシンリン酸化部位を含み、それらのうち数個は、ＰＩ３−キナーゼのｐ８５調節サブユニット、Ｇｒｂ−２Ｎｃｋ、ｃｒｋ、ｃ−ｆｙｎ、Ｃｓｋ、ホスホリパーゼＣガンマおよびＳＨＰ−２を包含するＳＨ−２ドメイン蛋白に結合するアミノ酸配列モチーフ中に存在する（３）。ＩＲＳ−１もまた、カゼインキナーゼＩＩ、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＢ／Ａｋｔ、およびマイトジェン−活性化蛋白（ＭＡＰ）キナーゼのごとき種々のキナーゼにより認識されるモチーフ中に３０個よりも多い潜在的なセリン／スレオニンリン酸化部位を有する（３）。ＩＲＳ−１のセリンリン酸化が増加すると、インスリン受容体によるそのチロシンリン酸化が減少し、それゆえインスリン耐性を導くことが、後になって多く議論されている（１０）。
【０００５】
遺伝子の転写においてクロマチン構造が重要な役割を果たしており、複数のシグナリング経路がヒストンに集まっていることが知られている（１１）。存在する共有結合によるヒストンＮＨ２尾部の修飾はアセチル化、リン酸化、およびメチル化である。これらの転写後修飾はクロマチンの濃縮状態に影響し、それゆえその下に存在するＤＮＡへのアクセスを調節する（１２）。この「ヒストンコード」は遺伝学的コードの情報能力をかなり伸ばしている（１３）。
【０００６】
複数のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴｓ）およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣｓ）はクロマチンのアセチル化状態を制御しており、それゆえクロマチンの構造および機能のモジュレーションにおいて役割を果たしている（１４，１５）。かくして、アセチルにより媒介されるシグナルは、ヒストン尾部のリジン残基を脱アセチル化することによりＨＡＴｓの効果に対抗するＨＤＡＣｓにより逆転される。高等真核生物において、ＨＤＡＣｓは、酵母の構成メンバーの配列に対する類似性に従ってクラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩとして知られる３つの異なるグループに分けられている（１６）。現在に至るまで、４つの酵素、ＨＤＡＣ１、２、３および８はクラスＩのデアセチラーゼとして知られている（１５）。ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２（GenBank受託番号XM 004370）は最もよく特徴づけられており、多蛋白転写抑制複合体Ｓｉｎ３／ＨＤＡＣおよびヌクレオソームリモデリングデアセチラーゼＮｕＲＤ／Ｍｉ２／ＮＲＤ複合体の主要構成成分である（１７）。クラスＩのＨＤＡＣを含む複合体は、直接的にあるいは核−ホルモンコレプレッサーＮＣＯＲおよびＳＭＲＴ（レチノイドおよび甲状腺ホルモンのサイレンシングメディエイタ）を介して間接的に多くの転写因子に結合する。クラスＩおよびＩＩのＨＤＡＣｓはヒストン尾部を脱アセチル化しうるが、他の細胞蛋白もまた異なるＨＤＡＣｓによって特異的に標的化されうると思われる（１８）。
【０００７】
種々の異なる非特異的ヒストンデアセチラーゼ阻害物質が当該分野において知られている（２４，２５）。これらは、ブチレート、ヒドロキサム酸、ベンズアミドおよび環状ペプチドを包含する４つの広いカテゴリーに属する（WO 02/06307, JP 01/348340, EP 1170008, WO 01/70675, WO 01/38322, WO 00/52033, WO 00/21979, JP 11302173, WO 99/11659, GB 2309696）。数種のものがヒトの臨床試験中である。特に、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）のごときトリコスタチンＡに関連したヒドロキサム酸は十分に耐えられるものであり、毒性がなく、生物学的活性を示す（２６）。
【０００８】
発明の開示
本発明は、インスリン受容体基質（ＩＲＳ−１）およびヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）が物理的に相互作用するという驚くべき知見に関する。インビボにおいてこの複合体のデアセチラーゼ活性を阻害することにより、異なったインスリン耐性状態において、インスリン受容体によるＩＲＳ−１のチロシンリン酸化の増加が見られることから、インスリン感受性が回復されうる。
【０００９】
特に、本発明者らは、ＩＲＳ−１およびＨＤＡＣ２が酵母細胞の細胞質コンパートメントにおいて相互作用することを見出した。「サイトトラップ」（Stratagene）酵母ツー−ハイブリッド系により、ＩＲＳ−１の新規相互作用パートナーが検出できた。上記相互作用は、インビトロで転写および翻訳されたＩＲＳ−１およびＨＤＡＣ２蛋白の同時免疫沈降により確認された。該相互作用はＩＲＳ−１分子のＣ末端領域（１９）およびＨＤＡＣ２のＣ末端部分にマッピングされた。
【００１０】
さらに、ＩＲＳ−１がアセチル化されること、そしてこの転写後修飾がトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）をＭＣＦ−７細胞に添加することにより促進されうることが見出された。ＴＳＡはクラスＩおよびＩＩのヒストンデアセチラーゼの阻害剤である（１８）。
【００１１】
インスリン耐性状態においてＩＲＳ−１とＨＤＡＣ２との間の相互作用がより顕著になるという仮説を検証するために動物モデルが用いられた。ｏｂ／ｏｂマウス（インスリン耐性）、ＰＴＰ１Ｂノックアウトマウス（インスリン感受性）および対応対照動物からの肝臓組織抽出物について、ＩＲＳ−１／ＨＤＡＣ２相互作用が調べられた。インスリン感受性動物の肝臓においては相互作用が見られなかったが、インスリン耐性マウスは肝臓における著しい相互作用を示した。
【００１２】
したがって、本発明の第１の態様において、哺乳動物におけるインスリン耐性の緩和に有用な作用剤を同定する方法が提供され、該方法は下記工程を含む：
（ｉ）候補薬剤を哺乳動物ＨＤＡＣ２ポリペプチドまたは哺乳動物ＨＤＡＣ２ポリヌクレオチドと接触させ、次いで、
（ｉｉ）該候補作用剤が該ポリペプチドの生物学的活性または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するかどうかを決定する。
【００１３】
１の例において、哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和する作用剤を同定する方法は下記工程を含む：（ｉ）候補薬剤を哺乳動物ＨＤＡＣ２ポリペプチドまたは哺乳動物ＨＤＡＣ２ポリヌクレオチドと接触させ、（ｉｉ）ポリペプチドの生物学的活性またはポリヌクレオチドの発現の阻害剤としての候補作用剤を同定し、次いで（ｉｉｉ）候補作用剤が哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和するかどうかを決定する。該方法は、候補作用剤が２型糖尿病の治療に有効かどうかを決定する工程を含んでいてもよい。
【００１４】
もう１つの例において、哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和する作用剤を同定する方法は下記工程を含む：（ｉ）哺乳動物ＨＤＡＣ２ポリペプチドの生物学的活性または哺乳動物ＨＤＡＣ２ポリヌクレオチドの発現を阻害する候補作用剤を用意し、次いで（ｉｉ）候補作用剤が哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和するかどうかを決定する。該方法は、候補作用剤が２型糖尿病の治療に有効かどうかを決定する工程を含んでいてもよい。
【００１５】
もう１つの態様において、本発明は、哺乳動物におけるインスリン耐性の緩和に有用な作用剤を同定する方法を提供し、該方法は下記工程を含む：
（ｉ）候補作用剤を哺乳動物ＩＲＳ−１ポリペプチドと接触させ、次いで
（ｉｉ）該候補作用剤が該ＩＲＳ−１ポリペプチドのアセチル化を増加させるかどうかを決定する。所望により、該方法は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴｓ）および／またはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣｓ）の作用によるクロマチンアセチル化またはＩＲＳ−１アセチル化の状態を決定するような、さらなる工程を含んでいてもよい。該方法は、候補作用剤がインスリン耐性の緩和に有効かどうかを決定する工程、あるいは候補作用剤が２型糖尿病の治療に有効かどうかを決定する工程を含んでいてもよい。
【００１６】
候補化合物は、例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または他の小型分子を包含する。インスリン耐性の緩和に有用な上記作用剤は既知のＨＤＡＣ阻害剤であり、例えば、トリコスタチンＡのごときヒドロキサム酸誘導体、ＣＨＡＰ−３１のごとき環状テトラペプチド、ＭＳ−２７−２７５のごときベンズアミドまたは酪酸フェニルのごときブチレートである。インスリン耐性の緩和に有用な上記作用剤は、特に、２型糖尿病、リポジストロフィー関連糖尿病および薬物療法により誘導される糖尿病の治療に有用である。
【００１７】
細胞をベースにした系、無細胞系、または細胞をベースにした系と無細胞系との組み合わせを用いて、本明細書に記載の方法をインビトロまたはインビボにおいて行うことができる。
【００１８】
溶液アッセイにおいて、本発明の方法は、工程（ａ）ＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１ポリペプチドを１またはそれ以上の候補化合物と接触させること、次いで、工程（ｂ）ＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１ポリペプチドに結合する化合物を同定すること、を含む。ＨＤＡＣ２ポリペプチドに結合する化合物の同定を、ＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１ポリペプチド／結合パートナー複合体を単離し、次いで、ＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１ポリペプチドから結合パートナー化合物を分離することにより行うことができる。結合パートナー化合物の物理的、生物学的、および／または生化学的特性を調べる付加的な工程を含めてもよい。
【００１９】
１の例において、本発明は、哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和する作用剤を同定する方法を包含し、該方法は下記工程を含む：（ｉ）ＨＤＡＣ２ポリペプチドまたはＩＲＳ−１ポリペプチドを候補作用剤と接触させること；（ｉｉ）ＨＤＡＣ２ポリペプチドまたはＩＲＳ−１ポリペプチドに対する候補作用剤の結合を検出すること；次いで（ｉｉｉ）候補作用剤が哺乳動物におけるインスリン耐性を緩和するかどうかを決定する。該方法は、候補作用剤が２型糖尿病の治療において有効であるかどうかを決定する工程を含んでいてもよい。
【００２０】
インビトロアッセイの１のバリエーションにおいて、本発明は、工程（ａ）固定化されたＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１ポリペプチドを候補結合パートナー化合物と接触させること、次いで（ｂ）ＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１ポリペプチドに対する候補化合物の結合を検出すること、を含む。別の具体例において、候補結合パートナー化合物が固定化され、ＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１の結合が検出される。支持体への共有結合、ビーズ、またはクロマトグラフィー樹脂、ならびに抗体結合のごとき非共有結合相互作用、あるいは固定化される化合物がビオチン部分を有するストレレプトアビジン／ビオチン結合の使用を包含する、当該分野にてよく知られたいずれかの方法を用いて固定化を行う。（ｉ）固定化されていない化合物に対する放射性標識を用いて、（ｉｉ）固定化されていない化合物に対する蛍光標識を用いて、（ｉｉｉ）固定化されていない化合物に対して免疫特異的な抗体を用いて、（ｉｖ）固定化された化合物が結合している蛍光支持体を励起させる固定化されていない化合物に対する標識を用いて、そしてまた当業者によく知られた他の方法を用いて結合の検出を行うことができる。
【００２１】
本発明は、ＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１ポリペプチドの結合パートナー化合物を同定するための、細胞をベースにしたアッセイも提供する。１の具体例において、本発明は、細胞で発現されたＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１ポリペプチドを候補結合パートナー化合物と接触させ、次いで、ＨＤＡＣ２またはＩＲＳ−１ポリペプチドに対する候補結合パートナー化合物の結合を検出する工程を含む方法を提供する。
【００２２】
標的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドへの候補作用剤の結合を、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、ファージをベースにした発現クローニング、クロマトグラフィーにより同時分画、共沈、クロスリンキング、相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析、サザンウェスタン分析、ＥＬＩＳＡ等を包含する当該分野でよく知られた標準的方法により決定することができる。
【００２３】
トランスフェクションアッセイは、有効な作用剤を同定するための特に有用なスクリーニングアッセイでありうる。トランスフェクションアッセイにおいて、ＨＤＡＣ２プロモーター、ヒストンアセチルトランスフェラーゼプロモーター、ＩＲＳ−１プロモーター、またはそれらの活性フラグメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子のごとき遺伝子を含む核酸が所望細胞タイプ中にトランスフェクションされる。レポーター遺伝子の試験レベルを候補作用剤の存在下でアッセイして、発現の対照レベルと比較する。有効な作用剤は、作用剤不存在下における発現レベルであるレポーター遺伝子発現の対照レベルとは異なる発現の試験レベルを生じさせる作用剤として同定される。細胞のトランスフェクション法および種々の便利なレポーター遺伝子は当該分野においてよく知られている（例えば、Goeddel (ed.), Methods Enzymol., Vol. 185, San Diego: Academic Press, Inc. (1990)参照、上記Sambrookも参照）。
【００２４】
また本発明は、哺乳動物におけるインスリン耐性の緩和方法を包含し、該方法は、ヒトを包含する哺乳動物に有効量のＨＤＡＣ２阻害剤および／またはＩＲＳ−１のアセチル化を促進する作用剤を投与することを含む。
【００２５】
本発明のもう１つの態様は、インスリン耐性の治療または予防に用いられる医薬処方であり、有効成分はＨＤＡＣ２および／またはＩＲＳ−１のアセチル化を促進する作用剤である。
【００２６】
本明細書において、用語「標準的方法」および「標準的方法（複数）」は、分子生物学的手法に関して用いられる場合には、Current Protocols in Molecular Biology, editors F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. 1994, または Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989のごとき通常の研究室用マニュアルに見出されるプロトコルおよび手順であると理解される。
【００２７】
特記しないかぎり、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する分野の当業者により通常に理解されているのと同じ意味を有する。適当な方法および材料を以下に説明するが、それらと類似および同等の方法および材料を本発明の実施および試験に使用してもよい。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、参照により本明細書に包含されるものとする。コンフリクトの場合、定義を包含する本明細書が支配的である。さらに、材料、方法、および実施例は単なる説明であり、限定的に解してはならない。
【００２８】
本発明の実施例を説明することにより本発明をさらに例示説明する。実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【００２９】
実施例
実施例１：CytotrapTM酵母ツーハイブリッド系におけるＩＲＳ−１／ＨＤＡＣ２蛋白−蛋白相互作用の検出
CytotrapTM酵母ツーハイブリッド系を用いて酵母細胞の細胞質における蛋白−蛋白相互作用を見出した。Ｒａｓ経路を活性化させるヒトＳｏｓ（ｈＳｏｓ）遺伝子産物の細胞膜への救援により相互作用を検出した。使用酵母株（ｃｄｃ２５Ｈ）は、ｈＳｏｓの酵母ホモログであるｃｄｃ２５遺伝子中に温度感受性変異を有する。そのことは、細胞が２５℃で増殖できるが、３７℃では蛋白−蛋白相互作用が救援されなければ増殖できないことを意味する。
【００３０】
ｐＭｙｒベクター（膜蛋白に指向され定着するミリスチル化シグナルを有する）中のヒト胎児脳プラスミドｃＤＮＡライブラリー（Stratagene）を「えじき（prey）」として用い、ｐＳｏｓベクター中のサブクローン化された全長ＩＲＳ−１遺伝子を「えさ（bait）」として用いた。えじきおよびえさ蛋白が相互作用する場合、ｈＳｏｓはＲａｓの近傍にあり、その結果、酵母は生き残り、３７℃での増殖により選択される。このようにしてＩＲＳ−１／ＨＤＡＣ２相互作用が３７℃において増殖を救援する。対応ｐＭｙｒ酵母プラスミドを単離し、ｐＳｏｓえさ構築物とともに同時形質転換されて偽陽性を得た。結果は、３７℃でのガラクトース培地での増殖はＩＲＳ−１／ＨＤＡＣ２相互作用に依存することを示すものであった。グルコース培地の場合、増殖は見られなかった（ｐＭｙｒのＧＡＬ１プロモーターは誘導されず、えさとLamin Cとの間に非特異的相互作用が生じなかった）。
【００３１】
実施例２：インビトロ転写され翻訳された蛋白のインビトロ同時免疫沈降によるツーハイブリッド蛋白−蛋白相互作用の確認
インビトロでのＩＲＳ−１／ＨＤＡＣ２相互作用を確認するために、カップリングされた転写／翻訳系（Promega）を用いた。これは、ウサギ網状赤血球溶解溶液をＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、塩類、リボヌクレオシド阻害剤、および［３５Ｓ］−メチオニンと組み合わせて翻訳蛋白を検出する方法である。えじきベクターｐＭｙｒはすでにＴ７プロモーターを含んでいるので、これを系に直接使用することができる。一方、えさベクターｐＳｏｓはＴ７プロモーターを欠くので、転写を可能にするにはＩＲＳ−１遺伝子がＴ７−含有ベクター（ｐＧＢＫＴ７）中にサブクローン化されなくてはならない。個々に転写され翻訳された蛋白を混合し、抗−ＩＲＳ−１抗体とともに同時沈降させ、その後ポリアクリルアミドゲル（４〜１２％）電気泳動を用いて分析する。ゲルを乾燥させ、取り込まれた［３５Ｓ］−メチオニンによりホスホルイメージャーでの分析が可能となった。両方の蛋白バンド（ＩＲＳ−１およびＨＤＡＣ２）は同じレーンに出現し、それゆえＩＲＳ−１抗体により一緒に検出された。ＨＤＡＣ２バンドは全長蛋白に対応していなかったが、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて見出されたＣ末端の末端切断部分に対応していた（約３１ｋＤａ）。
【００３２】
実施例３：哺乳動物細胞におけるＩＲＳ−１およびＨＤＡＣ２の同時免疫沈降
ＩＲＳ−ＨＤＡＣ２相互作用をさらに確認するために、数種の哺乳動物細胞系を用いた。ＭＣＦ−７はヒト胸部アデノカルシノーマ細胞系であり、ＨｅｐＧ２は肝細胞カルシノーマ細胞系であり、Ｌ６はラット骨格筋細胞系である。内在性ＩＲＳ−１産生能が高いので、ＭＣＦ−７細胞系を選択した。細胞を集密になるまで増殖させ、ＩＧＦ−１またはＰＭＡ（ホルボールミリスチン酸）で異なる時間処理し、次いで、高張細胞溶解バッファー（20mM Hepes, pH 7.6, 20% グリセロール, 10 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.1% NP40, 25 mM NaF, 25 mM β-グリセロホスフェート, 1 mM DTT, 1 mM オルトバナジン酸ナトリウム、およびプロテアーゼ阻害剤を含有）中に集めた。すべてのプレクリアされた（precleared）フラグメントの蛋白含量を一致させ、その後、抗−ＩＲＳ−１［抗体とともに免疫沈降させた。沈降物をポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ，４〜１２％）電気泳動により分離し、膜にブロッティングし、次いで、抗−ＨＤＡＣ２抗体プラス適当なＨＲＰ−縫合二次抗体でプローブした（蛋白バンドはＥＣＬ−検出により明らかとなった）。結果は、相互作用がＰＭＡにより駆動されることを示すものであった（ＰＭＡは、細胞をインスリン耐性にすることが知られているプロテインキナーゼＣを活性化させる）。類似の実験を行い、ＨＤＡＣ２を細胞抽出物から免疫沈降させ、その後、膜を抗−ＩＲＳ−１抗体でプローブした。結果は矛盾しないものであり、相互作用がＰＭＡにより駆動されることが示された。Ｌ６およびＨｅｐＧ２細胞の使用において、ＩＲＳ−１とＨＤＡＣ２との間の相互作用がインスリンでの刺激により影響されないことが確認された。
【００３３】
実施例４：ＩＲＳ−１上へのＨＤＡＣ２の相互作用部位のマッピング
ＲＡＣＥ ｃＤＮＡおよび遺伝子特異的プライマーを用いて、ヒト心臓組織からＨＤＡＣ２の全長をクローン化した。ＩＲＳ−１上へのＨＤＡＣ２の相互作用部位のマッピングを目的として、Matchmaker-3TM酵母ツーハイブリッド系（Clontech）を用いた。これは、ＧＡＬ４をベースにしたツーハイブリッド系であり、酵母における特異的な蛋白−蛋白相互作用を検出するための転写アッセイを提供するものである。２種の栄養マーカーおよび１つの酵素レポーター遺伝子を用いて相互作用を検出する。
【００３４】
ＩＲＳ−１の異なるドメイン（ＰＣＲにより得た）を「えさ」ベクター（ｐＧＢＫＴ７）中にサブクローン化し、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合させた。全長のＨＤＡＣ２を「えじき」ベクター（ｐＧＡＤＴ７）中にサブクローン化し、ＧＡＬ４の活性化ドメインに融合させた。えさおよびえじきが相互作用するならば、レポーター遺伝子がオンになり、酵母細胞は２種の栄養マーカーを欠く培地で増殖できる。結果（図１）は、元のクローンから判断すると、ＩＲＳ−１のプレＣ末端領域とＨＤＡＣ２のＣ末端部分との間で相互作用が生じたことを示すものであった。
【００３５】
実施例５：ＩＲＳ−１は翻訳後にアセチル化される
ＩＲＳ−１とＨＤＡＣ２との間の相互作用は、ＩＲＳ−１がアセチル化されうること、修飾がＨＤＡＣ２により調節されうることを示唆するものであった。抗−アセチル−リジン抗体を用いるウエスタンブロッティングにより、これを試験した。集密に至るまで増殖したＭＣＦ−７細胞をＩＧＦ−１、ＰＭＡまたはＴＳＡで異なる時間処理した。実施例３で説明したように細胞を集めた。蛋白決定、抗−ＩＲＳ−１抗体との免疫沈降および抗−アセチル−リジン抗体を用いるウエスタンブロッティングの後に、ＩＲＳ−１の基底アセチル化が見られ、それはＴＳＡ（ＨＤＡＣ阻害剤）で処理したフラクションにおいて明らかであった（図２）。それゆえ、ＩＲＳ−１に結合するデアセチラーゼの阻害の結果、ＩＲＳ−１が著しくアセチル化されることになる。
【００３６】
実施例６：ＨＤＡＣ阻害によるインスリン耐性の逆転
ＩＲＳ−１とＨＤＡＣ２との間の相互作用がＩＲＳ−１のチロシンリン酸化状態に影響するかどうかという問題に答えるために、一連の細胞実験を行った。集密にまで増殖したＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−２２）をホルボールミリスチン酸（ＰＭＡ）（４時間）、ＴＳＡ（４時間）次いでインスリン（１０分）で処理した。実施例３で説明したように細胞を集めた。異なるフラクションが蛋白含量に関して合致させ、その後、抗−ＩＲＳ−１抗体とともに免疫沈降させた。沈降物を電気泳動させ、抗−ホスホ−チロシン抗体を用いてウエスタンブロットした。結果は、ＰＭＡが細胞をインスリン耐性にすることを明確に示した（図３において、レーン１よりもレーン３のチロシンリン酸化の程度が低い）。結果は、細胞がＴＳＡとともに同時に処理された場合、インスリン耐性が大幅に低減されることも示された。かくして、ＨＤＡＣ２の阻害は、ＩＲＳ−１のアセチル化レベルを高め、ＩＲＳ−１分子のチロシンリン酸化を有意に容易化させる。
【００３７】
実施例７：ＩＲＳ−１／ＨＤＡＣ２相互作用はインスリン耐性の動物モデルにおいて見られるが、インスリン感受性のモデルでは見られない
動物組織においてもＩＲＳ−１／ＨＤＡＣ２相互作用が正当なものであることを確認するために、異なるマウス株を調べた。レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスモデルは病的肥満により特徴づけられる（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝学的バックグラウンド；（２１））。これらのマウスはインスリン耐性であり、かくして糖尿病のモデルとして役立つ。他の極端なマウスモデルはＰＴＰ１Ｂノックアウトマウスであり（ｂａｌｂ／ｃＪＪ遺伝学的バックグラウンド；（２２））、筋肉および肝臓組織のインスリン受容体の増加したリン酸化のためにインスリン感受性が高まっている。
【００３８】
ｏｂ／ｏｂマウス、ＰＴＰ１Ｂノックアウトマウスおよび対応対照からの肝臓組織を、乳鉢と乳棒（あらかじめ−８０℃に冷却）を用いて粉末化させ、次いで、Polytronを用いて４℃でホモジナイズした。１グラムの組織あたり３ｍｌのホモジネーションバッファー（4.0 mM EDTA, 50.0 mM NaF pH 8.0, 1.0 mM オルトバナジン酸ナトリウム, 1.0 μM オカダ酸, 0.1% 2-メルカプトエタノールおよびプロテイナーゼ阻害剤カクテルを含有;（２３））を用いた。ホモジナイズ物を４℃、１３０００ｘｇで１０分間遠心分離し、その後、上清を即座に使用するか、あるいは即座に液体窒素中で凍結させた。４種の異なるマウス株からの肝臓抽出物の蛋白含量を一致させ、抗−ＩＲＳ−１抗体を用いて免疫沈降させた。抗−ＨＤＡＣ２抗体を用いて実施例３にて説明したようにウエスタンブロットを行って、ＩＲＳ−１とＨＤＡＣ２との間の相互作用のレベルを検出した。結果（図４）は、ｂａｌｂ／ｃ遺伝学的バックグラウンドにおいて、ＩＲＳ−１とＨＤＡＣ２が相互作用するが、この相互作用はインスリン感受性動物（ＰＴＰ１Ｂ ＫＯ）においては出現しないことを示した。対照的に、インスリン耐性動物（ｏｂ／ｏｂ）において相互作用が見られ、明確であるが、個々の対照動物においては同時免疫沈降が見られない。このことは、ＩＲＳ−１／ＨＤＡＣ２相互作用が、ＩＲＳ−１のセリンリン酸化の増加に関連している可能性のある低下したインスリン耐性と相関関係があるとの結論を導く。
【００３９】
文献
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【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１はＭａｔｃｈｍａｋｅｒ３酵母ツーハイブリッド系におけるＩＲＳ−１／ＨＤＡＣ２相互作用部位のマッピングを示す図である。
【図２】図２はＩＲＳ−１の免疫沈降および抗−アセチル−リジンの検出を示す図である。  ＭＣＦ−７細胞を次のように処理した：レーン１：ＩＧＦ−１で１０分；レーン２：ＩＧＦ−１で３０分；レーン３：ＩＧＦ−１で１時間；レーン４：ＩＧＦ−１で６時間；レーン５：ＩＧＦ−１で２４時間；レーン６：ＰＭＡで６時間；レーン７：ＰＭＡで６時間次いで、ＩＧＦ−１で１０分;レーン８：ＰＭＡで２４時間；レーン９：ＰＭＡおよびＴＳＡで６時間;レーン１０：ＴＳＡで６時間；レーン１１：対照(ビヒクル)。
【図３】図３はＩＲＳの免疫沈降および抗−ホスホチロシンの検出を示す図である。ＭＣＦ−７細胞を次のように処理した：レーン１：インスリンで１０分；レーン２：ＰＭＡおよびＴＳＡで４時間、次いで、インスリンで１０分；レーン３：ＰＭＡで４時間、次いで、インスリンで１０分；レーン４：ＰＭＡおよびＴＳＡで４時間；レーン５：ＰＭＡで４時間；レーン６：対照（ビヒクル）。
【図４】図４はマウス肝臓組織におけるＩＲＳ−１およびＨＤＡＣ２の同時免疫沈降を示す図である。レーン１：ｏｂ／ｏｂ；レーン２：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ；レーン３：ＰＴＰ１Ｂ ＫＯ；レーン４：ｂａｌｂ／ｃＪＪ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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