(57)【要約】【課題】  細胞の形態学的パラメーター、例えば、細胞の位置及び／又は形状の変化を測定する方法。【解決手段】  検出不能な状態であるが、適切な第一の波長の光に対する露光によって検出可能に変換することができるマーカー物質で細胞の集団を標識する工程を含む。所定のパターンの適切な第一の波長の光に標識細胞の亜集団を露光して細胞の亜集団を規定することができ、この亜集団によってカバーされる領域が、用いる照明のパターンに適合する。次いで、マーカーの検出に適した選択された第二の波長の照射光を用いた細胞集団の少なくとも一部の検査によって、細胞形態学的パラメーターの変化の指標であるマーカー物質の分布のパターンが明らかになる。また、細胞の形態学的パラメーターに対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法も記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の形態学的パラメーターの変化を測定する方法であって、
ａ）第一の波長の光にマーカーを露光することによって実質的に検出不能な状態から検出可能な状態へ変換することができるマーカー物質で標識された細胞集団中の細胞の亜集団を第一の波長の光に露光する工程と、
ｂ）細胞集団の少なくとも一部を第二の波長の光に最初に露光してマーカー物質の分布の第一のパターンを検出する工程と、
ｃ）細胞集団の一部を第二の波長の光に二度目に露光してマーカー物質の分布の第二のパターンを検出する工程と
を含み、マーカー物質の分布の第一のパターンと第二のパターンの差異が細胞の形態学的パラメーターの変化の指標である、方法
【請求項２】
細胞サイズ、細胞位置及び／又は細胞形状を前記形態学的パラメーターとして選択する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞形状の変化が神経突起成長の指標である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
以下の工程ｃ）：細胞集団の一部をさらにＮ回（Ｎは１以上）第二の波長の光に露光し、マーカー物質の分布のパターンを検出し、マーカー物質の分布のパターンを細胞の形態学的パラメーターの変化の指標となるプロフィールの作製に用いる工程をさらに含む、請求項１乃至請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞の形態学的パラメーターに対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験薬の存在下及び非存在下で、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法を実施する工程と、
（ｂ）試験薬の有無によるマーカー物質の分布のパターンの差異を測定する工程と、
を含み、
試験薬の有無による分布のパターンの差異が細胞の形態学的パラメーターに対する試験薬の効果の指標である、方法。
【請求項６】
細胞の形態学的パラメーターに対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験薬の存在下で、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法を実施する工程と、
（ｂ）マーカー物質の分布のパターンと試験薬の非存在下で測定した分布の対照パターンとを比較する工程と
を含む方法。
【請求項７】
マーカーがケージド蛍光分子及びフォトクロミック化合物から選択される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ケージド蛍光分子が、Ｎ−（ＤＭＮＢ−ケージドフルオレセイン）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン及び５−カルボキシフルオレセイン−ｂｉｓ−（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）エーテル−アラニン−カルボキサミド、スクシンイミジルエステルから選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
フォトクロミック物質が、酸化銀ナノクラスター粒子、スピロベンゾピラン及びナフタセネキノンから選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の細胞の形態学的パラメーターの変化を測定する方法における、ケージド蛍光分子及びフォトクロミック化合物から選択されるマーカー物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の形態学的パラメーター、例えば、細胞の位置及び／又は形状の変化を測定するための新規な方法であって、スループットが改善されており、かつ自動化に適合している方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の運動性は、種々の正常及び異常な細胞プロセスにおいて本質的な要素である。多くの細胞タイプがその形態学、例えば、移動、神経軸索の伸長及び細胞分裂の間の形状の変化において劇的な変化を示す。創傷治癒、胚形成及び免疫系応答、例えば、走化性は全て、細胞の運動を起こすことによって外部刺激を認識しかつ応答するために専門的な細胞型を必要とする。細胞の動きを制御する機構の研究及び細胞の動きを調節し得る試験薬の開発は、新しい治療剤の開発において重要な関心事である。軸索成長及びこのプロセスに対する候補薬物の影響の測定は、脳卒中及び脊髄損傷を含む種々の障害のため、並びにパーキンソン病及びアルツハイマー病のような神経変性状態のための見込みのある処置を評価するために重要である。
【０００３】
細胞の動きの測定のために種々の方法が記載されている。それらの方法は２つの一般的なカテゴリーにおさまる。これらのカテゴリーの第一は、細胞が膜障壁の片側に位置しており、この障壁を通じた細胞の動きを測定する方法に関する（Ｈａｇｅｄｏｒｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９９５），１２６９（３），２２１〜２３２；Ｂｏｃｋ及びＭｒｏｗｉｅｔｚ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２００１），４８（３），２５７〜２６８）；Ｄｕｎｚｅｎｄｏｒｆｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，（２０００），７１（１），５〜１１）。第二は、細胞の移動を測定するために光学的方法を利用するが、この方法は代表的には、細胞の一連の微速度撮影画像を取得する工程と、その後にこの画像の解析を実施して細胞の動きを測定する工程とを含む（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，（１９８８），９，４１１〜４１７；Ｔｈｕｒｓｔｏｎら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９８６），１６５，３８０〜３９０）。
【０００４】
中枢神経系の研究における主な労力は、神経突起の成長に影響する化合物を同定することに集中している。神経成長を促進する試験薬は、脳卒中、脊髄損傷及び神経変性状態、例えばパーキンソン病及びアルツハイマー病を含む、広範な種々の疾患及び外傷において治療能力を有する。神経突起の成長を測定するための現在の方法は、個々の細胞の手技的な検査、又は複雑な画像解析の使用に拠って、細胞本体からの神経突起の成長の程度を決定する（Ｊｉａｎｇ，Ｚ．Ｇ．ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，（１９９５），８５（２），２１２〜９；Ｐａｔｒｉｃｋ，Ｃ．Ｗ．ら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９６），１３８（２），２７７〜８５）。神経突起成長を測定する方法は、ＷＯ０１／１１３４０に記載されているが、この方法は細胞の位置を報告する蛍光標識レポーター分子及び神経突起成長を報告する第二の蛍光標識レポーター分子を含む神経細胞の使用による。この細胞上又は細胞内の第一及び第二の蛍光標識レポーターの分布、環境又は活性の変化は、デジタル画像化によって決定される。この方法は、純粋に形態学的解析に基づいた画像解析方法を上回る改善であるが依然として、２つの蛍光レポーターの相対的な空間配置を決定するために複雑な解析手順が必要である。
【０００５】
現在まで、細胞の動きを測定する方法は一般に、設定することが労働集約的であり、一方で、使い捨て可能な構成要素及び化学的解析方法を用いて障壁膜を横切る細胞の数を決定する変法が考案されている（Ｆｒｅｖｅｒｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９９８），２１３（１），４１〜５２）が、それらの方法は高スループットの適用にはまだ適していない。画像化方法は、１つの画像から続いて次への個々の細胞の移動を可能にするためには十分な画像が蓄積されなければならないので、解析プロセスが極めて複雑となりかねない短所を有する。さらに、培養中の哺乳動物細胞は、最大１〜２μｍ／分までの運動のかなり大きい相対速度を達成し得る（Ｚｉｃｈａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，（１９９９），１１２，４４７〜４５４；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ及びＰａｌｉｃ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，（１９８７），７，３６１〜３６７）ので、１０〜２０μｍの大きさの単一の細胞をその以前の位置と一致しない位置に１０〜３０分で容易に動かすことができる。細胞遊走の測定は、長時間にわたって実施し得るので、全ての細胞を追跡して画像間での細胞の誤認を回避するために、微速度撮影のフィルム又はビデオ記録によって、十分な情報を収集しなければならない。さらに、画像が一旦得られれば、データを解析して集団中の各々の細胞の転位置を決定するために、集中的なマニュアル解析又は洗練されたソフトウェアが必要である（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら（１９８８），その引用文中に；Ｔｈｕｒｓｔｏｎら（１９８６），その引用文に）。
【０００６】
アッセイを簡略にするためにいくつかの企画を行なって、それらのアッセイを高いスループットにおける自動化にさらに適合させた。これらのアッセイには、標準的な培養又は膜障壁上での培養のいずれかにおける標識細胞の蛍光強度測定を用い（Ｃｒｏｕｃｈ  Ｍ．Ｆ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２０００），１０４（１），８７〜９１）、膜を通じて蛍光標識細胞からの神経突起成長を測定する。これらのアッセイによって、神経突起成長の定量を蛍光強度測定のみを用いて実施することが可能になる。しかし、標準的な培養で実施した強度測定は、蛍光標識された神経細胞本体と神経突起との間の正確な識別が不可能であって、そのせいで神経突起成長の測定が不正確になる。障壁方法は、細胞本体と神経突起との間の識別を可能にするが、障壁細胞遊走方法について以前記載されたのと同じ問題を、アッセイを設定するのにおいて被る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述の方法は、細胞の形態学の変化を決定するための物理的な障壁の使用及び／又は個々の細胞同定によって特徴付けられる。結果的に、それらの方法は、平行に実施される多数の解析を不要にする洗練された装置及びソフトウェアと組み合わされた、手動的な介入及び／又は解析的労力のための高度な要件を必要とする。従って、最小の設定手順しか要さず、かつ高スループットのスクリーニング及び自動化に適合している、細胞の形態学的変化を測定する方法が必要である。本発明は、細胞の形態学的特性の変化、詳細には、細胞位置及び／又は細胞形状の変化を測定する方法であって、物理的障壁についての要件を回避して細胞集団を識別し、さらに個々の細胞を追跡する必要を回避する方法を提供する。これによって、広範な種々の細胞型及び培養条件で用いることができる細胞解析法が提供されるが、その結果は、利用可能な装置を用いて解析できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明の第一の局面では、細胞の形態学的パラメーターの変化を測定する方法であって、
ａ）第一の波長の光にマーカーを露光することによって実質的に検出不能な状態から検出可能な状態へ変換することができるマーカー物質で標識された細胞集団中の細胞の亜集団を第一の波長の光に露光する工程と、
ｂ）細胞集団の少なくとも一部を第二の波長の光に最初に露光してマーカー物質の分布の第一のパターンを検出する工程と、
ｃ）細胞集団の一部を第二の波長の光に二度目に露光してマーカー物質の分布の第二のパターンを検出する工程と
を含み、マーカー物質の分布の第一のパターンと第二のパターンの差異が細胞の形態学的パラメーターの変化の指標である、方法を提供する。
【０００９】
好ましくは、この細胞の形態学的パラメーターは、細胞サイズ、細胞位置及び／又は細胞形状であるように選択され、上記亜集団における上記マーカー物質の分布のパターンの変化は、細胞のサイズ及び／又は位置及び／又は細胞の形状の変化の指標である。特に好ましい実施形態では、細胞形状の変化は、神経突起の成長の指標である。
【００１０】
従って、本発明の方法に従って、細胞の形態学的パラメーターの測定は、検出不能な状態であるが適切な第一の波長の光に対する露光によって検出可能になり得るマーカー物質を用いて細胞の集団を標識することによって達成される。所定のパターンの適切な第一の波長の光に、標識細胞の亜集団を露光することによって、細胞のこの亜集団を規定することが可能で、ここでは、この亜集団によってカバーされる領域が、用いられる照明のパターンに適合する。マーカーの検出のために適切であるように選択された第二の波長の照射光を用いる、この細胞集団の少なくとも一部の引き続く検査によって、このマーカーがこの第一の波長の光に露光された細胞のみが明らかになる。
【００１１】
工程ｂ）及びｃ）に従って第二の波長の光で検査される細胞集団の一部は、
ｉ）全ての細胞が第二の波長の光に露光され、マーカー物質の分布のパターンが、細胞全部にまたがって記録される細胞集団全体であって、このような検査は第一の波長の光を用いた照明を達成するように用いられる光パターン化の手段を排除することによって達成される、細胞集団全体であっても；又は
ｉｉ）第一の波長の光に露光される細胞の同じ亜集団が第二の波長の光に露光され、マーカー物質の分布のパターンが記録される細胞の亜集団であって、このような検査は第一の波長の光を用いた照明を達成するように用いられる光パターン化の手段の空間的な位置を保持すること、及び第二の波長の光を用いて照明を達成するためにこの手段を用いることによって達成される、細胞の亜集団であっても；又は
ｉｉｉ）第一の波長の光に露光される細胞の異なる亜集団が第二の波長の光に露光され、マーカー物質の分布のパターンが記録される細胞の亜集団であって、このような検査は第一の波長の光を用いた照明を達成するように用いられる光パターン化の手段の空間的な位置を変更すること、及び第二の波長の光を用いて照明を達成するためにこの手段を用いることによって達成される、細胞の亜集団であってもよい。
【００１２】
本発明による方法は、標準的な組織培養方法によって培養可能である任意の接着細胞型で用いることができる。このような細胞型としては、種（例えば、ヒト、げっ歯類、類人猿）、組織供給源（例えば、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓  皮膚、筋肉）及び細胞型（例えば、上皮、内皮）に関して任意の認識供給源に由来する全ての正常な細胞及び形質転換細胞が挙げられる。さらに、組み換え遺伝子で形質転換されている細胞も、本発明の方法において培養及び利用することができる。多様な細胞型の培養に利用可能なプロトコールが確立されている。（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第二版，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．１９８７を参照のこと）。このようなプロトコールは、細胞増殖及び専門的な細胞の細胞形態学的パラメーターの発現を可能にするために専門的なコーティング及び選択的な培地の使用を必要とするかもしれない。
【００１３】
適切には、生存している細胞の形態学的パラメーターの変化は、
ｉ）例えば、培養中の細胞が増殖及び分裂する場合、細胞がサイズ、形状又は位置の変化を示すが、この細胞の少なくとも一部が同じ空間を占める、一過性の形態学的変化；
ｉｉ）細胞全体が以前に占められた位置と重複しない空間を占めるように細胞位置が変化する、無作為の様式での細胞の移動（細胞運動性）、又は化学的もしくは物理的刺激に向かうかもしくはそれから離れる細胞の移動（細胞遊走）に関与する細胞位置の変化；並びに
ｉｉｉ）細胞サイズ及び形状の永続的な形態学的変化であって、代表的には細胞分化の結果として生じ、細胞の量及び面積の有意な増大を生じ得る、形態学的変化、
として分類することができる。
【００１４】
培養された全ての細胞が、ｉ）のカテゴリーによる形態学的変化を示すが、特定の専門的な生物学的プロセスは、ｉｉ）及びｉｉｉ）のカテゴリーの一方又は両方に関与し得る。例えば、サイトカインで刺激された線維芽細胞は、化学誘引物質の勾配に向けられた指向性の走化性を示す（Ｓａｓａｋｉら、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ．，（２０００），９（３〜４），１５５〜６０）。この場合、細胞挙動は、上記のｉｉ）のカテゴリーに相当する。ＰＣ１２細胞においては、ＮＧＦ誘導性分化によって細胞は運動性を失って神経突起の成長を生じるが（Ｇｒｅｅｎ及びＲｅｉｄ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７），２６８，３４９）、神経突起は細胞の本体の直径の２倍よりも大きい長さの細胞成長として分類される。この場合、細胞挙動はｉｉｉ）のカテゴリーに相当する。個々の筋細胞が筋線維を形成するプロセスである筋管の形成において、個々の細胞は、高密度の細胞を有する領域に向かって優先的に遊走して、引き続き他の細胞と融合して直線的な線維を形成する（Ｃｈａｚａｕｄら、Ｊ．Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．，（１９９８），１９（８），９３１〜６）。この場合、細胞は、ｉｉ）及びｉｉｉ）の両方のカテゴリーの挙動を示す。
【００１５】
第一の局面による１つの実施形態において、本発明は、マークした細胞の亜集団の少なくとも１回のさらなる検査によって、細胞の形態学的パラメーターにおける経時的な変化を測定する方法を提供する。このような変化は、検出可能なマーカーのパターンの経時的な拡大及び／又は拡散から生じ得る。これは、個々の細胞を特定又は追跡する必要なしに達成できる。この実施形態において、この方法は、以下の工程ｃ）：上記第二の波長の光に対して上記細胞集団の上記一部をさらにＮ回露光する工程であって、Ｎは１以上である工程と、上記マーカー物質の分布のパターンを検出する工程であって、このマーカー物質の分布のこのパターンが上記細胞の形態学的パラメーターの変化の指標であるプロフィールを作製するために用いられる工程とを含む。
【００１６】
第一の局面による特定の実施形態において、細胞形態学的パラメーターに対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、以下の工程：（ａ）この試験薬の存在下及び非存在下で、この第一の局面による方法を実施する工程と、（ｂ）この試験薬の有無による上記マーカー物質の分布のパターンの差異を測定する工程とを含み；この試験薬の有無による分布のパターンの差異が、細胞の形態学的パラメーターに対するこの試験薬の効果の指標である。或いは、この測定は、試験薬の存在下でこの方法を実施する工程、及びこのマーカー物質の分布のパターンとこの試験薬の非存在下で測定した分布の対照パターンとを比較する工程によって行なうことができる。このコントロールパターンは、データベース又は他の電気的な形式で電気的に便利に記憶し得る。
【００１７】
適切には、本発明による細胞を標識するためのマーカー物質は、適切な波長の光に対するマーカーの露光によって、検出できないか又は実質的に検出できない状態から検出可能な状態に変換できるマーカーである。適切なマーカー物質は、その特性及び使用の方法によって２つのカテゴリーに分類できる。
【００１８】
第一のカテゴリーでは、マーカー（本明細書においては直接マーカーとして定義される）は、光によって直接作用されてこのマーカーは検出可能な状態に変換される。直接マーカーは、集団中の全ての細胞及び規定の形状の光に対する露光によって引き続いてマークされた細胞の亜集団にロードされても、結合されてもよい。直接マーカーとしての使用に適切な物質としては、ケージド蛍光分子、フォトクロミック分子及びフォトクロミックタンパク質が挙げられる。直接マーカーはまた、レポーター分子の生物物理学的な特性又は蛍光特性に影響し得る第二の部分を含んでもよい。このような場合、レポーターは、細胞外培地の中では非蛍光性であり、細胞内で、又は細胞に結合された場合には、光に対する露光後に蛍光性である。このカテゴリーにおける直接マーカーとしての使用のための適切な物質としては、酵素基質−フォトクロミック蛍光色素、膜感受性−フォトクロミック色素及びｐＨ感受性−フォトクロミック色素が挙げられる。
【００１９】
本明細書において直接マーカーとして規定される、第二のカテゴリーによるマーカーは、光に露光された場合でもその検出特性を変更しないが、他の光活性化可能な物質と組み合わせて用いることができる。間接マーカーは、規定の形状の光への露光によって総集団内の細胞の亜集団にロードされても結合されてもよい。間接マーカーとしての使用のために適切な物質としては、光活性化可能なリポソーム及び光反応性の標識内において高濃度で含まれる自己消光蛍光が挙げられる。
【００２０】
本発明による使用のために好ましいマーカー物質は、以下：
ａ）それらは、水性培地及び緩衝液中に自由に溶解可能でなければならない；
ｂ）それらは、細胞膜を横切って又は細胞膜内に自由に浸透可能でなければならないが、細胞の内側に又は細胞と会合して残留しなければならない；
ｃ）それらは、活性化に適切な波長の光の非存在下では、自由溶液内及び細胞内で、検出不能であるか又は実質的に検出不能でなければならない、
として記載されるような、多数の所望される特性を有する
本発明による使用のための特に好ましいマーカー物質は、
ａ）活性化に適切な波長の光に対する露光の後には、自由溶液内で、検出不能であるか又は実質的に検出不能；
ｂ）活性化に適切な波長の光に対する露光の後には、細胞の内側で検出可能、
という多数のさらなる特性を有する。
【００２１】
これらの特徴を有するレポーター分子は、検出不能であるか又は実質的に検出不能なマーカー物質の溶液に対して細胞の集団を露光させることを可能にするために、全ての細胞にマーカーをロードすることを可能にするために、解析を邪魔する自由溶液中の大部分のマーカーの変換なしに、細胞の亜集団内の検出可能なマーカーへの変換を可能にするために所望される。
【００２２】
ケージド蛍光分子は、その蛍光特性が、不活性（非蛍光）型から活性（蛍光）型への光分解性の変換によって制御し得る分子である。種々のケージング基が利用可能であり、それらのいくつかは、ＵＶ光を用いた照射による「アンケージド（ｕｎ−ｃａｇｅｄ）」まで蛍光性でない、ケージド発蛍光団を生成するために用いられている（Ａｄａｍｓ及びＴｓｉｅｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，（１９９３），５５，７５５〜７８４；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。
【００２３】
本発明による方法における使用のためのケージド蛍光分子の適切な例としては、Ｎ−（ＤＭＮＢ−ケージドフルオレセイン）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン及び５−カルボキシフルオレセイン−ｂｉｓ−（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）エーテル−アラニン−カルボキサミド、スクシンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。これらのケージド蛍光は、３００〜３６０ｎｍの波長のＵＶ光に対する短時間の露光によって「アンケージド」になり得る。原則的に、生存細胞に結合し得るか又は組み込まれ得る任意のケージド蛍光分子は、本発明の方法において用いられ得る。
【００２４】
別の方法では、マーカーは、切り換え可能な蛍光を示すフォトクロミック物質であってもよい。適切なフォトクロミック物質としては、酸化銀ナノクラスター粒子（Ｐｅｙｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００１），２９１  １０３〜１０６）が挙げられる。この粒子は４８８ｎｍの光による照射によって活性化されて、その結果５２０〜５５０ｎｍの光での引き続く照射がこの粒子を蛍光性にするが、４８８ｎｍの照射に以前に露光されていない粒子は、５２０〜５５０ｎｍで励起されても蛍光を発しない。他の蛍光に基づくフォトクロミック切り換えが記載されている。例えば、フルギド（ｆｕｌｇｉｄｅ）誘導体（Ｉｎａｄａ，Ｔら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，（１９９７），３２１；Ｉｎａｄａ，Ｔ．，ら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，（１９９７），９６１；Ｗａｌｚ，Ｊら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ（１９９３），２１３，３２１〜３２４；及びジヒドロアズレン誘導体（Ｄａｕｂ，Ｊら，Ｍｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｌｉｑ．Ｃｒｙｓｔ．，（１９９２），２１７，１７７〜１８５）。
【００２５】
本発明による方法における使用のための別のフォトクロミック物質としては、米国特許第５２６８８６２号及び米国特許第５８４７１４１号に記載されるスピロベンゾピラン（ｓｐｉｒｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ）及びナフタセネキノン（ｎａｐｈｔｈａｃｅｎｅｑｕｉｎｏｎｅ）のようなフォトクロミック分子が挙げられる。このような物質は、基底状態の間にＵＶ、可視又は赤外線の照射で照射された場合、色が変わる。次いでこの分子は、準安定な状態への光化学的な変換を受け、ここではこの不安定な状態が、基底状態まで異なる波長で光を吸収する。
【００２６】
フォトクロミックタンパク質は、異なる励起又は発光スペクトルを有する２以上の安定な状態を有する蛍光タンパク質であり、ここではこのフォトクロミックタンパク質は、適切な波長の光を有する照射によって状態の間を切り換えられる。米国特許第６０４６９２５号は、フォトクロミック蛍光タンパク質を含む光学記憶デバイスを記載する。１つの実施形態では、フォトクロミックタンパク質は、Ａｅｑｕｏｒｅａの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の改変体であり、これにはＴ２０３のアミノ酸置換、例えば、Ｔ２０３Ｆ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｓ、Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｆ、Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ、またＴ２０３Ｓ／Ｓ２０５Ｔが挙げられる。さらなるＧＦＰ改変体が、記載されており（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｈ．及びＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００２），２９７，１８７３〜７）、これは４１３ナノメートルの光での強力な照射後、４８８ナノメートルの光によって励起された場合、蛍光を１００倍に増大して、好気的な条件下で数日間安定なままである。ＧＦＰの発現は、生存細胞における蛍光プローブ及びマーカーとして広範に用いられる（Ｍｉｓｔｅｌｉ，Ｔ及びＳｐｅｃｔｏｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（１９９７），１５（１０），９６１〜４）。当業者に周知である方法を用いて生存細胞中での構成的発現のために操作されたＧＦＰのフォトクロミック改変体又は他のフォトクロミック蛍光タンパク質（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照のこと）は、本発明の方法によって細胞をマーキングするさらなる手段を提供する。
【００２７】
フォトクロミック物質と組み合わせて用いられ得る直接マーカーの他の例としては、細胞内成分と反応するまで非蛍光性である物質、例えば、ビマン誘導体、例えばモノブロモビマンが挙げられる。細胞への受動的拡散、並びに細胞内のグルタチオン含有及びチオール含有タンパク質との反応の際、青色蛍光付加物が形成される。
【００２８】
本発明によるマーカー物質を用いる細胞の標識は、マーカー物質の設計に適切な方法論の使用によって達成できる。例えば、この方法は、研究中の細胞の細胞質を標識するために利用可能であり、或いはこのマーカーを用いて細胞表面を標識することができる。標識方法の選択は、当業者に使用されかつ明白であるマーカー物質のタイプに依存する。例えば、細胞表面標識によって、本発明の方法におけるフォトクロミック物質の使用が可能になる。或いは、マーカー物質は、マイクロインジェクションによって細胞にロードされてもよく、又は確立されたバルク充填法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓによって供給される、Ｉｎｆｌｕｘ（商標）によってロードされてもよい。
【００２９】
本発明における使用に適切な検出可能な形態への検出不能なマーカーの活性化を提供するさらなる方法は、この標識を検出不能である形態に区切ることである。蛍光分子を検出不能にさせることは、例えば、自己消光によるか、又はそれが非蛍光性であるｐＨの環境でｐＨ感受性蛍光部分をカプセル化することにより、高濃度の標識が蛍光を失う小胞に蛍光部分を分離することによって達成し得る。カプセル化蛍光部分の導入及びパターン化された照明に対する露光による引き続く遊離によって、蛍光分子の検出不能型から検出可能型への空間的に制御された変換が可能になる。ＵＶ光分解による光感受性リポソーム由来の化合物の生存細胞への光活性化遊離は、薬物送達適用について記載されている（Ｂｉｓｂｙ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，（２０００），７２（１），５７〜６１；Ｍｏｒｇａｎ，Ｃ．Ｇ．ら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．，（１９９５），６２（１），２４〜９）。（１，２−（４’−ｎ−ブチルフェニル）アゾ−４’−（γ−フェニルブチロイル））−グリセロ−３−ホスホコリンのようなフォトクロミック脂質を含むリポソーム中への適切な蛍光標識のカプセル化（Ｍｏｒｇａｎ  Ｃ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，（１９８７），９０３（３），５０４〜９）は、溶質に対する膜透過性の変化及び結果的に細胞膜との光指向性融合を生じる近ＵＶ光に対する露光の際、異性体化するが、これによって、細胞に対する蛍光標識の送達手段で、本発明によって細胞をマーキングすることが可能になる。
【００３０】
この標識方法における使用のために適切な蛍光分子としては、高い局所濃度で区分された場合、自己消光に起因して非蛍光性である（Ｓｈｉ，Ｌ．Ｂ．及びＶｅｒｋｍａｎ，Ａ．Ｓ．Ｊ．ＧｅｎＰｈｙｓｉｏｌ．，（１９８９），９４（６），１１０１〜１５）が、例えば、細胞膜とのリポソームの光指向性融合によって細胞中に遊離される場合、希釈されるときに蛍光性になる、フルオレセインのような蛍光分子が挙げられる。或いは、ｐＨ感受性である、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（ａｎｄ−６）−カルボキシフルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のような蛍光分子が用いられてもよい。例えば、ｐＨ感受性蛍光は、酸性のｐＨの溶液中の光感受性リポソームにカプセル化されてもよく、この条件下ではこの分子は、低い蛍光を示すが、リポソームの光分解によって細胞中に遊離されて、さらに高いｐＨに曝された場合、この分子は蛍光を増大する。本発明における使用のためのさらなるｐＨ感受性蛍光分子は、ＷＯ００／７５２３７に記載されるようなｐＨ感受性シアニン色素である。
【００３１】
本発明の方法における使用に適切な標識のさらなる群は、光反応性の標識又は光親和性の標識であり、この標識は適切な波長の光に対する露光によって活性化され、結果として隣接する部分との共有結合を形成する、反応性基に連結された蛍光又は他の検出可能部分を含む。光反応性標識の例としては、モノアジ化エチジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、アジ化アリール（Ｂｒｏｎｋ，Ｋ．Ｓ．及びＷａｌｔ，Ｄ．Ｒ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９４），６６（２０），３５１９〜２０），アジド−ローダミン（Ｄａｏｕｄ，Ｒ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２０００），３９（５０），１５３４４〜５２）及びカルボシアニンニトロフェニラジド（Ｈａｈｎ，Ｋ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，（１９９３），４１（４），６３１〜４）が挙げられる。本発明の方法におけるこのような標識の使用は、活性化及び標識を生じるのに適切な波長のパターン化された照射の存在下における光反応性分子に対する細胞の露光と、それに続く洗浄による未結合の光反応性分子の除去によって達成されて、標識細胞のパターンを得ることができる。
【００３２】
本発明の原理及び機能を明確にするため、添付の図及び図面について以下に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の以下の局面は、図１及び図２に関して記載される。表面上で成長している細胞（図１Ａの黒い四角によって提示される）は、検出不能なマーカー物質で標識される。細胞の亜集団は、本明細書において以降ではλ１と名付けられる第一の波長の光によって引き続いて照射されるが、このλ１は、検出不能な状態から検出可能な状態へこの標識を変換させることによって、この標識の活性化のために適切な波長であるように選択され、この細胞の亜集団は、規定されたパターンで照射の領域（図１Ａにおいて灰色のバーで提示される）に結合される。波長λ２の光を用いた細胞の同じ領域の引き続く照射（図１Ｂにおいて黒い四角で提示される）によって（λ２はλ１よりも長い波長である）、λ１でのパターン化された照射によって生じる検出可能な標識のパターン（図１Ｂにおける白色のバー）が明らかになる。引き続いて、波長λ２の光を用いて、同じ領域の細胞の照射によって（図１Ｃにおいて黒い四角で提示される）、１以上の又は所定の時間間隔で細胞を再度試験してもよい。これによって、細胞位置の変化が生じる場合、検出可能な標識の異なるパターンが生じる（図１Ｃにおいて、さらに広い影つきのバーで提示されるように）。従って、波長λ１の光に最初に露光された細胞は、波長λ１の光を用いて細胞の亜集団の最初の照射によって作製されたパターンと比較して、拡散されるかさもなければ変更されたパターンの検出可能な標識によって証明される場合、そのもとの位置から動いたことが示される。照射光の波長であるλ２を、マーカー物質の検出に適切であるように選択して、マーカー物質が第一の波長λ１の光に照射された細胞のみを明らかにする。
【００３４】
細胞の動き及び／又は細胞の形状の変化の程度は、標識の分布の適切な特徴に比べることにより検出可能な標識を担持する細胞の分布パターンを比較することによって、容易に決定できる。例えば、図２に例示されるように、細胞遊走アッセイの開始の際、照射されたパターンを横断する線（図１Ｂの線Ｘ−Ｙによって提示される）に沿った標識の分布を決定すること、及び後の時点で（図１Ｃの線Ｘ２−Ｙ２によって提示される）この測定を繰り返すことは、図２に示されるようにパターンプロフィールにおける明白な差異を生じ、ここでは細胞の動きによって、照射されたパターンの強度プロフィールの拡散及び広域化が生じる。
【００３５】
原則的に、波長λ１の光を用いる照射工程について、任意のパターン又は多数のパターン要素を用いることができる。１次元又は二次元で照射ポイントの連続的又は間欠的な側方への動きによって、スポット、線又は他の幾何学的形状を達成することができる。表面にまたがる照射の集中したポイントをスキャンニングすることによって、標本に対して照射ポイントを動かすかもしくはその逆にすることによって、又は動きの組み合わせによって、照射のパターン化を達成することができる。
【００３６】
走査型共焦点顕微鏡、例えば、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ４００は、標本を横切る光の小さい集中したポイントをスキャンする。照射ポイントの動きを制御することによって、又は照射ポイントの動きを制限して、標本資料台を動かすことによって、照射ポイントが規定のパターンを照射するようにすることができる。或いは、非走査型蛍光顕微鏡、例えば、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ（これは、固定照射源を用いる）を用いて、高倍率の対物レンズ及び部分的に閉鎖された照射絞りの組み合わせを用いて標本の上へ光の小スポットを投射することによって、標本上に照射のパターンを作成してもよい。次いで、１次元又は２次元の標本資料台の動きを用いて、垂直の任意の所望のパターンの照射を作成することができる。この方法によるＨｅＬａ細胞におけるケージド蛍光色素標識の活性化を図３に図示する。
【００３７】
本発明による各々の実施例において、複数の又は反復するパターン要素は、標本及び／又は照射のポイントを動かしながら、照射光をブロックするか又は切り換えて、非連続的な領域の照射を可能にすることによって達成されてもよい。
【００３８】
他の形態の走査型顕微鏡装置、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍは、規定の波長の光の線でこの標本を照射する。このような線の走査システムを本発明の方法において用いて、標本を横切る光の断続的に変調された線をスキャンすることによって、この標本上に平行な線のパターンを作成してもよい。
【００３９】
或いは、マスクパターンが標本上に集中されるように、部分的に不透明のパターン化されたマスクを通過した光を用いたこの標本の照射によって、所定のパターンの照射を達成してもよい。このようなマスクは通常、例えば、半導体デバイスの製造において、表面上の有機物質又は無機物質をパターン化するための写真平板術で利用される。米国特許第５７４４３０５号は、写真平板及び光指向性空間的アドレス可能な平行的な化学合成のためのこのようなマスクの製造及び使用を記載する。
【００４０】
本発明のさらなる局面において、時間依存性プロセスを研究するために、フォトクロミック物質を用いて培養細胞の別個のパターンをマークすることができる。このプロセスは、１つの別個の位置から他方への細胞の遊走に依存しない、検出可能な標識の分布の変化をもたらすが、細胞の形態学的変化の結果であって、細胞によってもともと占められた領域の外側への細胞の一部の伸長又は遊走をもたらす。
【００４１】
神経突起成長アッセイに対して本発明の方法を適用することによって、培養ニューロン細胞、例えば、ＰＣ−１２細胞（Ｋｏｉｋｅ，Ｔ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅａ．，（１９８３），２８９（１〜２），２９３〜３０３）を、適切なフォトクロミックマーカー物質で標識し、引き続いて適切な波長の光に露光して、このマーカー物質を細胞の亜集団にまたがって規定されたパターンで検出可能にさせる。マーカー物質の検出に適切な波長の光を用いて細胞を照射することによる異なる時間間隔での標本の引き続く再検査によって、パターン化された照射に供されない標本の領域における検出可能な標識の出現（このような出現は、細胞本体からの神経突起の成長によって生じる）を検出することにより、神経突起の成長の有無が明らかになる。
【実施例１】
【００４２】
ＤＭＥＭ＋１０％血清を含む１２ウェルマルチウェルディッシュ中でＨｅＬａ細胞を成長させた。細胞をＰＢＳ中で洗浄して、細胞表面タンパク質を、ＣＭＮＢケージドカルボキシ−フルオレセインスクシンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を０．０２５ｍｇ／ｍｌを用いて室温で１時間標識した。ＰＢＳを用いて細胞を３回洗浄し、続いて最大程度に近い照射絞りを備えるＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ  ３００顕微鏡上で２０×対物レンズを用いて水銀灯からの３３０〜３８０ｎｍの光に露光した。顕微鏡の資料台の側方移動を用いて、細胞培養を横切る線におけるカルボキシ−フルオレセインをアンケージした。４５０〜４９０ｎｍの励起波長の引き続く変化及び照射絞りの開口によって、マークされた細胞の線が明らかになったが、ここではケージド標識が、内因性の細胞蛍光のバックグラウンドに対して明るい蛍光細胞として明確に可視である検出可能型に変換されていた（図３）。
【実施例２】
【００４３】
ＤＭＥＭ＋１０％血清を含む１２ウェルマルチウェルディッシュ中でＨｅＬａ細胞を成長させた。供給業者の指示に従って、Ｉｎｆｌｕｘ  Ｐｉｎｏｃｙｔｉｃ細胞ローディング試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＮＢケージドフルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて細胞をロードした。最大程度に近い照射絞りを備えるＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ  ３００顕微鏡上で１０×対物レンズを用いて水銀灯からの３３０〜３８０ｎｍの光に細胞を露光させて、環状の領域を照射した（図４Ａ、環状の位相差画像）。４５０〜４９０ｎｍの励起波長の引き続く変化及び照射絞りの開口によって、マークされた細胞の群が明らかになったが、ここではケージド標識が、明るい蛍光細胞として明確に可視である検出可能型に変換されていた（図４Ｂ、蛍光画像）。
【実施例３】
【００４４】
ＤＭＥＭ＋１０％血清を含む２４ウェルプレート中でＨｅＬａ細胞を成長させた。供給業者の指示に従って、Ｉｎｆｌｕｘ  Ｐｉｎｏｃｙｔｉｃ細胞ローディング試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、１ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＮＢケージドフルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて細胞をロードして、低蛍光Ｈａｍｓ  Ｆ−１２培地に移した。部分的に閉じられた照射絞りを備えるＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ  ３００顕微鏡上で１０×対物レンズを用いて水銀灯からの３３０〜３８０ｎｍの光に細胞を露光させて、環状の領域を照射した。４５０〜４９０ｎｍの励起波長の引き続く変化及び照射絞りの開口によって、マークされた細胞の群が明らかになったが、ここではケージド標識が、検出可能型に変換されており、これは１０×対物レンズを用いて明るい蛍光細胞として（図５Ｂ）、及び４×対物レンズを用いて低倍率で蛍光細胞の島として（図５Ｃ）明確に可視であり、細胞の総集団から明確に識別可能であり、位相差検査によってのみ可視であった（図５Ａ）。
【実施例４】
【００４５】
Ｈａｍｓ  Ｆ−１２＋１０％血清を含むＷｅｌｌｃｏガラス底ディッシュ中でＨｅＬａ細胞を成長させた。供給業者の指示に従って、Ｉｎｆｌｕｘ  Ｐｉｎｏｃｙｔｉｃ細胞ローディング試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、１ｍｇ／ｍｌ  ＣＭＮＢケージドフルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて細胞をロードした。部分的に閉じられた照射絞りを備えるＮｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ  ３００顕微鏡上で２０×対物レンズを用いて水銀灯からの３３０〜３８０ｎｍの光に細胞を露光させて、環状の領域を照射した。１つの画像（図６Ａ）を直ちに記録して、培養ディッシュの同じ領域のさらなる画像を３７℃で２４時間のインキュベーション後に得た（図６Ｂ）。この領域を横切る蛍光強度を線Ｘ−Ｙに沿って決定して、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトウェアを用いて決定したが（図６Ｃ）、これは、画像を分離する２４時間中のランダムな細胞遊走に起因してマークされた領域から離れる細胞の移動に一致して、明確なピーク強度の低下及び一般的蛍光の上昇を示した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】細胞の光活性化されたパターン化の模式図及び細胞分布の引き続く解析である。
【図２】細胞遊走の後の細胞分布の解析を示すダイアグラムである。
【図３】ケージド蛍光標識で標識されＵＶ光を用いてパターン化されたＨｅＬａ細胞を示すエレクトロニックイメージである。
【図４】ケージド蛍光をロードされ、ＵＶ光を用いてパターン化されたＨｅＬａ細胞を示すエレクトロニックイメージである。
【図５】ケージド蛍光をロードされ、ＵＶ光を用いてパターン化されたＨｅＬａ細胞を示す。
【図６】ケージド蛍光をロードされ、ＵＶ光を用いてパターン化されたＨｅＬａ細胞、並びに０時間及び２４時間で解析された蛍光分布を示す。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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