(57)【要約】本発明は、低分子量物質をデンプン由来修飾多糖類にカップリングする方法に関する。修飾多糖類と低分子量物質との間の結合相互作用は、末端アルデヒド基またはこのアルデヒド基の化学反応から生じた修飾多糖類分子の官能基と、このアルデヒド基または多糖類分子の生じた官能基と反応する低分子量物質の官能基とのカップリング反応の結果である、共有結合に基づく。カップリング反応から直接生じた結合は場合により、上述の共有結合へのさらなる反応によって修飾することができる。本発明はさらに、このカップリングプロセスで形成されたコンジュゲートを含む薬学的組成物ならびにヒトまたは動物の体の予防または治療のための前記コンジュゲートおよび組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシアルキルデンプンと低分子量物質のコンジュゲートであって、ヒドロキシアルキルデンプン分子と低分子量物質との結合相互作用が、（ｉ）ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基、またはこのアルデヒド基から化学反応によって誘導された官能基と、（ii）ヒドロキシアルキルデンプン分子のこのアルデヒド基またはそこから誘導された官能基と反応することができる、低分子量物質の官能基との間の、カップリング反応の結果である、共有結合に基づくことを特徴とするコンジュゲート。
【請求項２】
ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基から誘導された官能基が、末端アルデヒド基またはそこから誘導された官能基と反応した二官能性リンカー分子の官能基の１つであることを特徴とする、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
低分子量物質の反応性官能基が、低分子量物質にカップリングした二官能性リンカー分子の官能基の１つであることを特徴とする、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
共有結合が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基の選択的酸化により形成されたカルボキシル基または活性化カルボキシル基、および低分子量物質の第一級アミノ基またはチオール基との間のカップリング反応の結果であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５】
共有結合が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基の選択的酸化により形成されたラクトンと、低分子量物質の第一級アミノ基との間のカップリング反応の結果であるアミド結合であることを特徴とする、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
共有結合が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基と低分子量物質の第一級アミノ基との間のシッフ塩基を形成するためのカップリング反応、およびシッフ塩基のアミンへの還元反応の結果である、アミド結合であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項７】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が、約７０〜約１０００ｋＤの範囲の分子量を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項８】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が、約１３０ｋＤの分子量を有することを特徴とする、請求項７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が、約０．３〜約０．７の置換度を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が、８〜１２のＣ6に対するＣ2の置換比を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
ヒドロキシアルキルデンプン分子が、ヒドロキシエチルデンプン分子であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
低分子量物質が活性薬学的成分であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
活性薬学的成分が、抗生剤、抗鬱剤、抗糖尿病薬、抗利尿薬、抗コリン作用薬、不整脈治療剤、制吐薬、抗癲癇薬、抗ヒスタミン剤、抗真菌剤、抗交感神経緊張剤、抗血栓剤、アンドロゲン、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、抗骨粗鬆症薬、抗腫瘍剤、血管拡張薬、他の血圧降下剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、β−ブロッカー、免疫抑制剤およびビタミンより成る群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
カップリング反応に関与する活性薬学的成分の官能基が、アミノ基であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
活性薬学的成分が、アルブテロール、アレンドロネート、アミカジン、アミノペニシリン、アモキシシリン、アテノロール、アザチオプリン、セファクロール、セファドロキシル、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、シラスタチン、シメチジン、シプロフロキサシン、クロニジン、コリスチン、コシントロピン、サイクロセリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、デスモプレシン、ジヒドロエルゴタミン、ドブタミン、ドーパミン、エフェドリン、エピネフリン、ε−アミノカプロン酸、エルゴメトリン、エスモロール、ファモチジン、フレカイニド、葉酸、フルシトシン、フロセミド、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、グルカゴン、ヒドラザリン、イミペネム、イソプロテレノール、ケタミン、リオチロニン、ＬＨＲＨ、メルパトリシン、メタラミノール、メチルドーパ、メトクロプラミド、メトプロロール、メキシレチン、マイトマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ニモジピン、ナイスタチン、オクトレオチド、オキシトシン、パミドロネート、ペンタミジン、フェントラミン、フェニレフリン、プロカインアミド、プロカイン、プロプラノロール、リトドリン、ソタロール、テイコプラニン、テルブタリン、チアミン、チルドロネート、トラゾリン、トリメトプリム、トロメタミン、バンコマイシン、バソプレシンおよびビンブラスチンから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
カップリング反応に関与する活性薬学的成分の官能基が、カルボキシル基または活性化カルボキシル基であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
活性薬学的成分が、アセチルシステイン、アズロシリン、アズトレオナム、ベンジルペニシリン、カンプトセシン、セファマンドール、セファゾリン、セフェピム、セフォタキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアキソン、セファロチン、シラスタチン、シプロフロキサシン、クラブラン酸、ジクロキサシリン、ε−アミノカプロン酸、フロキサシリン、フォリン酸、フロセミド、フシジン酸、イミペネム、インドメタシン、ケトロラク、リオチロニン、メルファラン、メチルドーパ、ピペラシリン、プロスタサイクリン、プロスタグランジン、テイコプラニン、チカルシリンおよびバンコマイシンから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１６に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
カップリング反応に関与する活性薬学的成分の官能基が、脂肪族基またはアリール−ＯＨ基であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
活性薬学的成分が、アルブテロール、アロプリノール、アポモルヒネ、セフトリアキソン、ドブタミン、ドーパミン、ドキシサイクリン、エドロホニウム、イソプロテレノール、リオチロニン、メタラミノール、メチルドーパ、ミノサイクリン、パクリタキセル、ペンタゾシン、フェニレフリン、フェントラミン、プロポフォール、リファマイシン、リトドリン、タキソール、テイコプラニン、テルブタリン、テトラサイクリンおよびバンコマイシンから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
有効量の請求項１２〜１９のいずれかに記載のコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体、および必要に応じて、さらなる賦形剤および活性成分を含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
ヒトまたは動物の治療的または予防的処置のための、請求項１２〜１９のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項２０に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプンコンジュゲートを調製する方法であって、カップリング反応が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基、またはこのアルデヒド基から化学反応によって誘導された官能基と、ヒドロキシアルキルデンプン分子のこのアルデヒド基またはそれから誘導された官能基と反応することが可能である低分子量物質の官能基との間で実施され、必要に応じて、カップリング反応から直接生じる結合がさらなる反応によって修飾されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基が選択的酸化によって相当するラクトン基に変換され、そしてこれが次に、低分子量物質の第一級アミノ基と反応させられ、ヒドロキシアルキルデンプン分子が低分子量物質にアミド結合によって結合されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アルデヒド基の選択的酸化が、塩基性水溶液中でヨウ素または金属イオンによって実施されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
カップリング反応が、カルボジイミド、好ましくは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下で実施される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
カップリング反応が、異種相で実施されることを特徴とする、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
カップリング反応が、ＤＭＳＯまたはＮ−メチルピロリドンまたはグリコールの同種相で実施されることを特徴とする、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
カップリング反応が、活性化剤の非存在下で、ＤＭＳＯまたはＮ−メチルピロリドンまたはグリコール中で実施されることを特徴とする、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２９】
ヒドロキシアルキルデンプンの末端アルデヒド基が低分子量物質の第一級アミノ基にカップリングされてシッフ塩基を形成し、形成されたシッフ塩基がアミンに還元され、ヒドロキシルエチルデンプン分子がアミン結合によって低分子量物質に結合されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
還元剤が、ホウ化水素ナトリウム、シアノホウ化水素ナトリウムまたは有機ホウ素錯体であることを特徴である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
末端アルデヒド基が選択的に酸化されたヒドロキシアルキルデンプンを調製する方法であって、ヒドロキシアルキルデンプンが塩基性水溶液中で、２：１〜２０：１のヨウ素対ＨＡＳのモル比で反応させられることを特徴とする方法。
【請求項３２】
ヨウ素対ＨＡＳのモル比が、約５：１〜６：１であることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）所定量のヒドロキシアルキルデンプンを温蒸留水に溶解させ、１モル当量より多少低いヨウ素水溶液を添加することと、
ｂ）ヨウ素溶液の濃度の約５〜１５倍であるモル濃度のＮａＯＨ水溶液を、添加後に溶液が再度透明になり始めるまで、数分間隔でゆっくり滴下して反応溶液に添加することと、
ｃ）１モル当量より多少低いヨウ素水溶液を再度、反応溶液に添加することと、
ｄ）ＮａＯＨ溶液の滴下による添加を再開することと、
ｅ）ヒドロキシアルキルデンプンに対してヨウ素溶液の約５．５〜６モル当量およびＮａＯＨ溶液の１１〜１２モル当量が添加されるまで、ステップｂ）〜ｄ）を反復することと、
ｆ）反応を停止させ、反応溶液を脱塩して、カチオン交換クロマトグラフィーにかけ、凍結乾燥によって反応生成物を得ることと、
を特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ヨウ素水溶液が、約０．０５〜０．５Ｎヨウ素溶液であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＮａＯＨ溶液のモル濃度が、ヨウ素溶液の濃度の約１０倍であることを特徴とする、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
末端アルデヒド基が選択的に酸化されたヒドロキシアルキルデンプンを調製する方法であって、ＨＡＳがアルカリ性水溶液中でＣｕ2+イオンおよびＡｇ+イオンから選択される過剰モルの安定化金属イオンによって酸化されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
商業的に興味深い、多数の低分子量物質、特に活性薬学的成分および作物保護剤があり、その使用は水性溶媒での不満足な溶解度特性および／または体内での短い滞留時間によって、制限または防止さえされている。従ってたとえば、小型の薬学的分子は、排除限度が約７０ｋＤである腎臓での糸球体濾過によって循環からまたあまりにも迅速に除去されることが頻繁であるため、費用が掛かり、患者にとって不都合である連続補充が、この薬剤に関しては、たとえば頻繁に反復される投与または輸液によって必要である。
【背景技術】
【０００２】
この不都合を回避するために、一部の場合では、わずかに溶解性である活性薬学的成分を油性巨丸剤として投与するが、これは注入部位で有痛性の沈殿を頻繁に形成する。加えてそのようなわずかに溶解性である薬剤の使用は、肝臓および／腎臓などの臓器でのその沈着のために、しばしば毒性副作用と関連付けられる。そのような望ましくない副作用は次に、活性成分のインビボで利用できる濃度範囲が大幅に制限されることを引き起こす。
【０００３】
上述の問題を除去するために最近用いられている手法は、そのような問題のある物質をただちに溶解する生体適合性ポリマー、たとえばポリエチレングリコールおよびデキストランなどにカップリングさせることより成る。一方ではカップリングを通じて、分子量を７０ｋＤの閾値以上に向上させることが可能であるため、より小型の分子の血漿滞留時間を大幅に延長することが可能であり、そして他方では親水性ポリマー部分によって、水性溶媒での溶解度を改善することができる。
【０００４】
今日までの大半の修飾は、ポリエチレングリコールまたはデキストランを用いて実施されており、より単純な生成物を産生するために一般にＰＥＧが好ましい。デキストランコンジュゲートはしばしば、高いアレルゲン性、低い代謝安定性、および多くの場合、低い収率のカップリング反応を示す。同様に、ＰＥＧコンジュゲートの使用時には、掻痒、過敏症反応および膵炎などの不快または危険な副作用の報告がある。加えて、活性成分の生物活性は、ＰＥＧカップリングの後に場合によって大幅に低下することがさらに多い。さらにＰＥＧコンジュゲートの分解生成物の代謝はいまだに実質的に未知であり、おそらく健康上の危険を呈する。
【０００５】
従って、デキストランまたはＰＥＧコンジュゲートに代わる、生理的に耐用性が良好な代替物への要求がなおあり、それによって溶解性の乏しい低分子量物質の溶解度を改善することが可能であり、および／または低分子量物質の血漿中での滞留時間を延長することが可能であり、活性分子の改善された薬力学特性を生じる。
【発明の開示】
【０００６】
したがって本発明の目的は、そのような代替物を提供すること、およびそのような代替コンジュゲートを調製するための簡単かつ効率的な方法を開発することである。
【０００７】
驚くべきことに、本目的は、ヒドロキシアルキルデンプン分子と低分子量物質との結合相互作用が、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基、またはこのアルデヒド基から化学反応によって誘導された官能基と、ヒドロキシアルキルデンプン分子のこのアルデヒド基またはそこから誘導された官能基と反応することができる、低分子量物質の官能基との間のカップリング反応の結果である、共有結合に基づき、必要に応じて、カップリング反応から直接生じる結合を上述の共有結合を与えるさらなる反応によって修飾することができることを特徴とする、ヒドロキシアルキルデンプンコンジュゲートによって達成できることが見出されている。
【０００８】
本発明はさらに、これらのコンジュゲートを含む薬学的組成物、ならびにヒトまたは動物の体の予防的または治療的処置のためのこれらのコンジュゲートおよび組成物の使用、ならびにこれらのコンジュゲートおよび組成物を調製するための方法を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明により利用されるヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）は、既知の方法、たとえば、各種の所望の分子量範囲および置換度を有するアルキレンオキシドまたは２−クロロアルカノール、たとえば２−クロロエタノール（デンプンのヒドロキシエチル化については、たとえば米国特許第5,218,108号を参照）による、アンヒドログルコース単位のＣ2および／またはＣ6位置におけるデンプンのヒドロキシアルキル化によって調製できる。市販で入手可能な、どの調製物を利用することも可能である。本明細書で使用される「ヒドロキシアルキルデンプン」におけるアルキル基化の定義は、メチル、エチル、イソプロピル、およびｎ−プロピルを含み、特にエチルが好ましい。ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）の実質的な利点は、当局によって生体適合性血漿増量剤としてすでに承認され、臨床で大規模に利用されていることである。
【００１０】
ヒドロキシアルキルデンプンの平均分子量は、約３ｋＤ〜数百万ダルトン、好ましくは約１０ｋＤ〜約２００ｋＤの範囲、さらに好ましくは約７０ｋＤ〜約１０００ｋＤの範囲、特に好ましくは約１３０ｋＤでありうる。低分子量物質の生体での滞留時間を延長するためには、ヒドロキシアルキルデンプンの平均分子量は好ましくは、７０ｋＤの糸球体閾値がコンジュゲートによって超えられるように選択される。置換度（アンヒドログルコース単位全体の数に対する修飾アンヒドログルコース単位の数の比）は同様に変化し、頻繁に約０．２〜０．８、好ましくは約０．３〜０．７の範囲にあり、さらに好ましくは０．５である（注記：数は、０〜１である「置換度」に関連する）。Ｃ6に対するＣ2の置換の比は通例は４〜１６の範囲にあり、好ましくは８〜１２の範囲にある。
【００１１】
これらのパラメータは、既知の方法によって調整できる。血液代用物としてのヒドロキシエチルデンプンの使用経験により、血漿中でのＨＥＳの滞留時間が分子量および置換度および置換の種類（Ｃ2置換またはＣ6置換）に依存し、より大きい分子量、より高い置換度およびＣ2置換のより高い割合が滞留時間を延長することが示されている。
【００１２】
これらの関係は、ヒドロキシエチルデンプンおよび低分子量物質の本発明のコンジュゲートにも適用されるため、血漿中での特定のコンジュゲートの滞留時間は、多糖類の割合によって調整することができる。
【００１３】
上述したように、ヒドロキシアルキルデンプン分子のカップリング反応に関与する官能基は、末端アルデヒド基または化学反応によりそれから誘導された官能基である。
【００１４】
そのような化学反応の一例は、適切な酸化剤、たとえばヨウ素、臭素またはある金属イオンを用いた、あるいは電気化学酸化による、このアルデヒド基のカルボキシル基または活性化カルボキシル基、たとえばエステル、ラクトン、アミドへの選択的酸化であり、カルボキシル基は適切な場合には、第二の反応において活性化誘導体に変換される。このカルボキシル基または活性化カルボキシル基は次に、低分子量物質の第一級アミノまたはチオール基にカップリングされて、アミド結合またはチオエステル結合を形成する。さらなる可能性は、エステルを形成するための、低分子量物質のヒドロキシル官能基へのカップリングである。
【００１５】
しかしながら本発明のコンジュゲートは、所望の官能基を導入するために、低分子量物質を適切な生理的に耐用性の二官能性リンカー分子と反応させることによって得ることもできる。カップリングされたリンカー分子の残りの反応性基は同様に、本発明の目的のために、「低分子量物質の反応性官能基」と見なされる。
【００１６】
適切なリンカー分子は、一端には、低分子量物質の反応性官能基、たとえばアミノ、チオール、カルボキシルまたはヒドロキシ基との共有結合を始めることができる基を、反対端には、末端アルデヒド基または化学反応によってそれから誘導される官能基、たとえばカルボキシル基、活性化カルボキシル基、アミノまたはチオール基との共有結合を始めることができる基を同様に含む。
【００１７】
リンカー分子の２つの官能基の間には、適切な長さの生体適合性架橋分子、たとえばアルキレン、（オリゴ）アルキレングリコール基または別の適切なオリゴマー基より誘導された基がある。アミノ基と反応することができる好ましい基はたとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステルまたは他の活性化カルボキシル基である；チオール基と反応することができる好ましい基はたとえば、マレイミドおよびカルボキシル基である；アルデヒドまたはカルボキシル基と反応可能である基はたとえば、アミノまたはチオール基である。
【００１８】
ＳＨおよびＮＨ官能基を接続するためのリンカー分子の例は、
ＡＭＡＳ  （Ｎ−α（マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル）
ＢＭＰＳ  （Ｎ−β（マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル）
ＧＭＢＳ  （Ｎ−γ（マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）
ＥＭＣＳ  （Ｎ−ε（マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル）
ＭＢＳ  （ｍ−（マレイミドベンゾイル）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）
ＳＭＣＣ  （スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート）
ＳＭＰＢ  （スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）
ＳＰＤＰ  （スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）
スルホ−ＧＭＢＳ  （Ｎ−γ（マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）
スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε（マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル）
である。
【００１９】
ＳＨおよびＳＨ官能基を接続するためのリンカー分子の例は、
ＢＭＢ  （１．４−ビス−マレイミドブタン）
ＢＭＤＢ  （１．４−ビス−マレイミド−２．３−ジヒドロキシブタン）
ＢＭＨ  （ビス−マレイミドヘキサン）
ＢＭＯＥ  （ビス−マレイミドエタン）
ＤＴＭＥ  （ジチオ−ビス−マレイミドエタン）
ＨＢＶＳ  （１．６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホン）
ＢＭ（ＰＥＯ）3  （１．８−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）
ＢＭ（ＰＥＯ）4  （１．１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール）
である。
【００２０】
ＮＨおよびＮＨ官能基を接続するためのリンカー分子の例は、
ＢＳＯＣＯＥＳ  （ビス−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル）スルホン
ＢＳ3  （ビス−（スルホスクシンイミジル）スベラート）
ＤＦＤＮＢ  （１．５−ジフルオロ−２，４−ニトロベンゼン）
ＤＭＡ  （ジメチルアジプイミダートＨＣｌ）
ＤＳＧ  （ジスクシンイミジルグルタレート）
ＤＳＳ  （ジスクシンイミジルスベラート）
ＥＧＳ  （エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート）
である。
【００２１】
ＳＨおよびＣＨＯ官能基を接続するためのリンカー分子の例は、
ＢＭＰＨ  （Ｎ−（β−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジドＴＦＡ）
ＥＭＣＡ  （Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド）
ＫＭＵＨ  （Ｎ−（κ−マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド）
Ｍ2Ｃ2Ｈ  （４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジドＨＣｌ）
ＭＰＢＨ  （４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジドＨＣｌ）
ＰＤＰＨ  （３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）
である。
【００２２】
ＳＨおよびＯＨ官能基を接続するためのリンカー分子の例は、
ＰＭＰＩ  （Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート）
である。
【００２３】
ＳＨ官能基をＣＯＯＨ官能基に変換するためのリンカー分子の例は、
ＢＭＰＡ  （Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸）
ＥＭＣＨ  （Ｎ−β−マレイミドカプロン酸）
ＫＭＵＡ  （Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸）
である。
【００２４】
ＮＨ官能基をＣＯＯＨ官能基に変換するためのリンカー分子の例は、ＭＳＡ（メチル−Ｎ−スクシンイミジルアジペート）またはその長鎖相同体またはエチレングリコールの相当する誘導体である。
【００２５】
ＮＨ官能基をＣＯＯＨ官能基に変換するためのリンカー分子の例は、ＤＡＢ（１．４−ジアミノブタン）またはその長鎖相同体またはエチレングリコールの相当する誘導体である。
【００２６】
分子のアミノ基と反応し、立体障害を避けるために本分子からより大きな距離に保護アミノ基を提供するリンカー分子の例は、ＴＦＣＳ（Ｎ−ε（トリフルオロ−アセチルカプロイルオキシ）スクシンイミドエステルである。
【００２７】
さらに適切なリンカー分子は当業者に既知であり、市販されているか、または必要に応じて、ＨＡＳ中に存在し、所望される官能基およびカップリングされる低分子量物質に合わせて設計され、そして既知の方法によって調製することができる。
【００２８】
特に好ましい調製方法において、ＨＡＳの末端アルデヒド基は、モル過剰のヨウ素を用いて、好ましくは塩基性水溶液中、２：１〜２０：１、特に好ましくは約５：１〜６：１のヨウ素対ＨＡＳのモル比で選択的に酸化される。実施例１で述べる最適化された方法において、最初に所定量のヒドロキシアルキルデンプンを蒸留した温水に溶解させ、１モル当量より多少低いヨウ素水溶液を好ましくは約０．０５〜０．５Ｎ、特に好ましくは約０．１Ｎの濃度で添加する。この後、ヨウ素溶液の濃度の約５〜１５倍、好ましくは約１０倍であるモル濃度のＮａＯＨ水溶液を反応溶液に、添加後に溶液が再度透明になり始めるまで、数分間隔で滴下してゆっくり添加する。１モル当量より多少低いヨウ素水溶液を再度、反応溶液に添加し、ＮａＯＨ溶液の滴下添加を再開し、ヒドロキシアルキルデンプンに対してヨウ素溶液約５．５〜６モル当量およびＮａＯＨ溶液１１〜１２モル当量が添加されるまで、ヨウ素およびＮａＯＨの添加を反復する。次に反応を停止させ、たとえば、透析または限外濾過によって反応溶液を脱塩して、カチオン交換クロマトグラフィーにかけ、凍結乾燥によって反応生成物を得る。この方法では、ＨＡＳの分子量とは無関係に、実質的に定量的な収量が達成される。
【００２９】
さらに特に好ましい実施形態において、選択的酸化は金属イオン、たとえばＣｕ++またはＡｇ+のアルカリ安定化溶液を用いて、同様にほぼ定量的収率で行われる（実施例２）。この場合、酸化剤の約３〜１０倍のモル過剰を利用することが好ましい。
【００３０】
形成された選択的酸化ヒドロキシアルキルデンプンは次に、適切な有機溶媒中で所望の低分子量物質の第一級アミノ基と反応して、アミド結合を形成する。好ましい溶媒は、極性非プロトン性溶媒から選択され、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が特に好ましく使用されている。同様のカップリング反応について文献で述べられた従来の方法とは対照的に、この場合では驚くべきことに、カルボジイミドおよびトリアゾールなどの別の必須活性化剤は不要であることが見出されている。選択的酸化ヒドロキシエチルデンプン（ｏｘ−ＨＥＳ）の各種モデル化合物（実施例を参照）へのカップリングは、活性化剤の非存在下ですらスムーズに進行する。
【００３１】
しかしながらカップリング反応は、好ましくはカルボジイミドの存在下で、さらに好ましくはＤＣＣ（ジシクロヘキシルジカルボジイミド）の存在下で、最も好ましくはＥＤＣ（１−（３−ジメチル−アミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド）の存在下で行われる。
【００３２】
ヒドロキシアルキルデンプン分子の反応性基は、末端アルデヒド基の化学反応によって生成されるアミンまたはチオール基でもよい。たとえばアルデヒド基の還元的アミノ化は、水素および触媒の存在下で、またはシアノホウ化水素ナトリウムの存在下で、アンモニアとの反応によって実施することができる。生じるアミンまたはチオール基は次に、低分子量物質の遊離カルボキシル基またはアルデヒド基と反応することができる。このような場合の最初の結果は、アミドまたはチオエステル結合またはシッフ塩基であり、それは適切な場合にさらなる反応によって修飾することができる。
【００３３】
さらなる可能性は、ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基または化学反応によってそれから誘導された官能基も、適切な生理的に耐用性の二官能性リンカー分子と反応することである。この場合、カップリング反応のための「ヒドロキシアルキルデンプン分子の末端アルデヒド基から化学反応によって誘導された官能基」は、末端アルデヒド基またはそれから誘導された官能基が反応した二官能性リンカー分子の、残りの反応性官能基である。このようにして同様に、末端アルデヒド基を所望の官能基に変換することができる。
【００３４】
適切なリンカー分子は、一端には、末端アルデヒド基または化学反応によりそれから誘導された官能基、たとえばカルボキシル基、活性化カルボキシル基、アミノまたはチオール基との共有結合を始めることができる基を、反対端には、低分子量物質の反応性官能基、たとえばアミノ、チオール、カルボキシルまたはＯＨ基、好ましくはアリール−ＯＨ基との共有結合を始めることができる基を含む。リンカー分子の２つの官能基の間には、適切な長さの生体適合性架橋分子、たとえばアルキレン、（オリゴ）アルキレングリコール基または別の適切なオリゴマー基より誘導された基がある。アミノ基と反応することができる好ましい基はたとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステルまたは他の活性化カルボキシル基である；チオール基と反応することができる好ましい基はたとえば、マレイミドおよびカルボキシル基である；アルデヒドまたはカルボキシル基と反応可能である好ましい基はたとえば、アミノまたはチオール基である。
【００３５】
適切なリンカー分子の多数の具体的で非制限的な例は、リンカー分子の低分子量物質への共役に関して、上ですでに示されている。
【００３６】
本発明の別の発明カップリング方法において、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）末端アルデヒド基は、低分子量物質の、またはこの物質にカップリングされたリンカー分子の第一級アミノ基と直接反応して、シッフ塩基を形成する。形成されたシッフ塩基は、それに続いてまたは平行して、適切な還元剤との反応によってアミンに還元され、低分子量物質とＨＡＳとの間に水性溶媒中で安定である結合形成を生じる。
【００３７】
好ましい還元剤は、ホウ化水素ナトリウム、シアノホウ化水素ナトリウム、有機ホウ素錯体、たとえば４−（ジメチルアミノ）ピリジン−ホウ素錯体、Ｎ−エチル−ジイソプロピルアミン−ホウ素錯体、Ｎ−エチルモルホリン−ホウ素錯体、Ｎ−メチルモルホリン−ホウ素錯体、Ｎ−フェニル−モルホリン−ホウ素錯体、ルチジン−ホウ素錯体、トリエチルアミン−ホウ素錯体、トリメチルアミン−ホウ素錯体である；適切な立体選択性還元剤はたとえば、ホウ化水素三酢酸ナトリウム、トリエチルホウ化水素ナトリウム、トリメトキシホウ化水素ナトリウム、トリ−ｓｅｃ−ブチルホウ化水素カリウム(K-Selectride)、トリ−ｓｅｃ−ブチルホウ化水素ナトリウム(N-Selectride)、トリ−ｓｅｃ−ブチルホウ化水素リチウム(L-Selectride)、トリアミルホウ化水素カリウム(KS-Selectride)、およびトリアミルホウ化水素リチウム(LS-selectride)である。
【００３８】
ＨＡＳまたは酸化ＨＡＳの低分子量物質へのカップリング反応は、水中での物質の溶解度が不十分であることが予想され、水性溶媒でのラクトンの安定性が低いため、好ましくは有機溶媒中で、さらに好ましくは、ＨＡＳおよび好ましくは低分子量物質も溶解する極性の非プロトン性溶媒中で実施される。ＨＡＳに適した溶媒の例は、ＤＭＳＯ、グリコール、ジグリコール、トリグリコールおよびＮ−メチルピロリドンである。低分子量物質がＤＭＳＯまたはＨＡＳに好ましい別の溶媒に不溶である場合は、ＤＭＳＯと他の溶媒との混合物を利用することも可能である。しかしながら反応は場合により、異種相(heterogeneous phase)で好都合に行うこともできる。
【００３９】
カップリング反応におけるＨＡＳの低分子量物質に対するモル比は、通常約２０：１〜１：１、好ましくは約５：１〜１：１である。
【００４０】
低分子量物質に基づくカップリング収率は通常、４０％超、頻繁には６０％超、そしてまれには８０％超である（実施例を参照）。
【００４１】
カップリングされる低分子量物質は好ましくは、水性溶媒中での溶解度および／または体内での生物学的利用能、安定性および滞留時間が向上される活性薬学的成分である。「低分子量物質」という用語は、約５０までのアミノ酸のペプチドも含むものとする。活性薬学成分は好ましくは、抗生剤、抗鬱剤、抗糖尿病薬、抗利尿薬、抗コリン作用薬、不整脈治療剤、制吐薬、鎮咳薬、抗癲癇薬、抗ヒスタミン剤、抗真菌剤、抗交感神経緊張剤、抗血栓剤、アンドロゲン、抗アンドロゲン、エストロゲン、抗エストロゲン、抗骨粗鬆症薬、抗腫瘍剤、血管拡張薬、他の血圧降下剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、β−ブロッカー、免疫抑制剤およびビタミンより成る群から選択される。
【００４２】
ＨＡＳとのカップリング反応におけるパートナーとしてＮＨ2基を有する活性薬学的成分の、ある非制限的な例は、アルブテロール、アレンドロネート、アミカジン、アンピシリン、アモキシシリン、アンフォテリシンＢ、アテノロール、アザチオプリン、セファクロール、セファドロキシル、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、シラスタチン、シメチジン、シプロフロキサシン、クロニジン、コリスチン、コシントロピン、サイクロセリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、デスモプレシン、ジヒドロエルゴタミン、ドブタミン、ドーパミン、エフェドリン、エピネフリン、ε−アミノカプロン酸、エルゴメトリン、エスモロール、ファモチジン、フレカイニド、葉酸、フルシトシン、フロセミド、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、グルカゴン、ヒドラザリン、イミペネム、イソプロテレノール、ケタミン、リオチロニン、ＬＨＲＨ、メルパトリシン、メタラミノール、メチルドーパ、メトクロプラミド、メトプロロール、メキシレチン、マイトマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ニモジピン、ナイスタチン、オクトレオチド、オキシトシン、パミドロネート、ペンタミジン、フェントラミン、フェニレフリン、プロカインアミド、プロカイン、プロプラノロール、リトドリン、ソタロール、テイコプラニン、テルブタリン、チアミン、チルドロネート、トラゾリン、トリメトプリム、トロメタミン、バンコマイシン、バソプレシンおよびビンブラスチンである。
【００４３】
ＨＡＳとのカップリング反応におけるパートナーとしてＮＨ2基を有する活性薬学的成分の好ましい例は、６−アミノペニシリン酸、７−アミノ−セファロスポリン、７−アミノセファロスポラニン酸および７−アミノペニシリン酸である。
【００４４】
ＨＡＳとのカップリング反応におけるパートナーとしてＣＯＯＨ基を有するこれらの活性成分の具体的な例は、アセチルシステイン、アズロシリン、アズトレオナム、ベンジルペニシリン、カンプトセシン、セファマンドール、セファゾリン、セフェピム、セフォタキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフタジジム、セフトリアキソン、セファロチン、シラスタチン、シプロフロキサシン、クラブラン酸、ジクロキサシリン、ε−アミノカプロン酸、フロキサシリン、フォリン酸、フロセミド、フシジン酸、イミペネム、インドメタシン、ケトロラク、リオチロニン、メルファラン、メチルドーパ、ピペラシリン、プロスタサイクリン、プロスタグランジン、テイコプラニン、チカルシリンおよびバンコマイシンである。
【００４５】
ＨＡＳとのカップリング反応におけるパートナーとしてアリール−ＯＨ基を有するこれらの活性成分の具体的な例は、アルブテロール、アロプリノール、アポモルヒネ、セフトリアキソン、ドブタミン、ドーパミン、ドキシサイクリン、エドロホニウム、イソプロテレノール、リオチロニン、メタラミノール、メチルドーパ、ミノサイクリン、ペンタゾシン、フェニレフリン、フェントラミン、プロポフォール、リファマイシン、リトドリン、テイコプラニン、テルブタリン、テトラサイクリンおよびバンコマイシンである。
【００４６】
ＨＡＳとのカップリング反応におけるパートナーとして脂肪族ＯＨ基を有するこれらの活性成分の具体的な例は、タクソールおよびパクリタキセル (palcitaxel)である。
【００４７】
上述の化学カップリングの反応生成物は、既知の方法で調査することが可能であり、カップリング効率を確立することができる。たとえば比較的低い分子量の物質のＵＶ較正プロットを構成して、カップリング生成物中の低分子量物質のサンプルまたは含有率を決定するために使用することができる。低分子量物質がＵＶ吸収を示さない場合、適切な熱量測定または電気化学検知方法を既知の方法と同様に開発することができる。コンジュゲート中の多糖類含有率は、たとえば分画された反応生成物のグリカン特異性染色によって検知することができる。グリカンの定量も可能である。第一級アミンを含有する反応物のカップリング収率は、フルオレサミンによる未反応アミンの誘導体化および蛍光の測定によっても確立することができる。
【００４８】
水中の改善された溶解度は、わずかに溶解性である開始物質の場合は、溶解試験によって容易に確認できる。部分的に水溶性の活性薬学的成分とのカップリングの場合は、ｌｏｇＰ値を測定するＯＥＣＤ法によって、向上した親水性を判定することができる。このことは、ＲＰ−ＨＰＬＣでの物質の保持時間を、ｎ−オクタノール／水混合物中での分配係数に関連付ける。この方法によって調査した本発明のすべてのＨＥＳコンジュゲートは、Ｃ１８カラムのホールドアップ体積中で溶出し、従ってＣ１８物質との相互作用を示さなかった。
【００４９】
本発明のコンジュゲートは、適切な場合はそのように、あるいはヒトまたは動物体の予防または治療的処置のための薬学的組成物の形で利用することができる。
【００５０】
この種の組成物は、活性成分として本発明のコンジュゲートの薬学的有効量、および薬学的に適切な担体、および適切な場合には、他の治療用または薬学的成分または賦形剤を含む。賦形剤はたとえば、希釈剤、緩衝剤、着香料、バインダ、表面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存料（抗酸化剤を含む）および対象とするレシピエントの血液と調合物とを等張性にするために役立つ物質を含んでもよい。薬学的有効量は、病状を緩和または治療または防止するために１回または複数回の投与で、処置中に所望の有益な効果を示すのに十分な量である。薬学的に許容される担体は、活性薬学的成分および患者の体の両方に適合性である担体である。
【００５１】
組成物の形式は、所望のまたは適切な投与経路によって変化するであろう。適切な投与経路はたとえば、経口、非経口、たとえば皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、くも膜下腔内、硬膜外注射または、適切な場合には、輸液、鼻腔内、気管内、直腸または局所投与でもよい。薬学的組成物は有益には、投薬単位の形で供給され、薬学分野で周知のどの方法によっても生成することができる。
【００５２】
本発明のＨＡＳコンジュゲートは、他のポリマーコンジュゲート、たとえばＰＥＧコンジュゲートが使用されている他のすべての分野でも利用できる。ある具体的な、非制限的な例は、異種相における反応のための固定化反応体としての、またはアフィニティークロマトグラフィーのカラム材料としてのＨＡＳコンジュゲートの使用である。さらに考えられる使用は、本発明のＨＡＳコンジュゲートの本明細書で開示された特性の知識を備えた当業者には、完全に明白となるであろう。
【実施例】
【００５３】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に、しかしながらそれを制限することなく説明するものである。特に、ヒドロキシメチルデンプンとヒドロキシプロピルデンプンについて類似反応も実施することができ、同様の結果を得ることができる。
【００５４】
［実施例１］
〔ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）のヨウ素による選択的酸化〕
ＨＥＳ−１３０ｋＤ  １０ｇを丸底フラスコ中で加熱することによって、脱イオン水１２ｍｌに溶解させた。Ｉ2溶液（０．１Ｎ）２ｍｌをこの溶液に添加した。１．０Ｎ  ＮａＯＨ  ２ｍｌを含むピペットを２方向コネクタを介してフラスコに接続して、ＮａＯＨ溶液を４分ごとに約１滴で滴下して添加した。ＮａＯＨ溶液約０．２ｍｌの添加後、溶液は退色し、この時点で０．１Ｎヨウ素溶液２ｍｌの第二の部分を加えた。ヨウ素溶液１４ｍｌおよびＮａＯＨ溶液２．８ｍｌ全部の添加後に、反応が完了した。反応混合物は次に、脱イオン水で透析した。
【００５５】
ラクトン化：
アルドナート基をアルドン酸基に変換するために、部分的脱塩溶液をカチオン交換カラム（Amberlite IR-120、Ｈ+形）を用いてクロマトグラフィーにかけた。次に凍結乾燥によって水を除去し、従ってラクトン形を得た。
【００５６】
酸化度の決定：
アルカリ性銅試薬（Ｎａ2ＰＯ4  ３．５ｇ、Ｈ2Ｏ  ５０ｍｌ中のＫ  Ｎａタトラート４．０ｇ、加えて１Ｎ  ＮａＯＨ  １０ｍｌ、１０％強度（重量／体積）ＣｕＳＯ4溶液８．０ｍｌおよびＨ2Ｏ  １０ｍｌ中のＫヨーダート０．０８９ｇ、Ｎａサルフェート１８ｇの添加後に、１００ｍｌとする）１ｍｌを、いずれの場合もＮ2雰囲気下でサンプル溶液１ｍｌ中にピペットで加える。混合物を１００℃にて４５分間加熱する。冷却後、２．５％強度ＫＩ溶液０．２ｍｌおよび２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4  ０．１５ｍｌを添加する。５分後、フェノールレッド指示薬溶液（１％重量／体積）１滴を加え、５ｍＭ  Ｎａ2Ｓ2Ｏ3溶液を用いて色が消えるまで滴定を行う。未反応アルデヒド基の濃度は、滴定液の消費量から計算できる。
【００５７】
ほぼ定量的な収率を得た（＞９８％）。この手順によって、より高い分子量（たとえば１３０ｋＤ、２５０ｋＤ、４００ｋＤ）を有するヒドロキシエチルデンプンを、より低い分子量（たとえば１０ｋＤ、２５ｋＤ、４０ｋＤ）を有するヒドロキシエチルデンプンのように、同様の高い収率で酸化することが可能である。
【００５８】
［実施例２］
〔ＨＥＳのＣｕ2+イオンによる選択的酸化〕
ＨＥＳ−１３０ｋＤ  ０．２４ｍｍｏｌの溶液を脱イオン水１０ｍｌ中で加熱により調製した。この溶液を１００ｍｌ丸底フラスコ中で７０〜８０℃の温度に加熱し、安定化Ｃｕ2+（たとえば安定剤としてのロッシェル塩または他の安定剤）１．１７ｍｍｏｌおよび希ＮａＯＨ水溶液を添加した（最終濃度０．１Ｎ  ＮａＯＨ）。次に温度を１００℃まで上昇させて、赤みがかった色が現れるまで反応を進行させた。反応を停止させ、反応混合物を４℃まで冷却した。赤みがかった沈殿を濾過により除去した。濾液を脱イオン水で透析して、次に実施例１と同様にラクトンに変換した。酸化は定量的に起こった（収率＞９９％）。この方法によっても、低分子量のＨＥＳ（たとえばＨＥＳ−１０ｋＤ、ＨＥＳ−２５ｋＤ、ＨＥＳ−４０ｋＤ）および高分子量ＨＥＳ種（たとえば１３０ｋＤ、２５０ｋＤ、４００ｋＤ）を酸化することが可能であった。
【００５９】
［実施例３］
〔選択的に酸化されたヒドロキシエチルデンプン（ｏｘ−ＨＥＳ）のアレンドロネートへのカップリング〕
アレンドロネート（ビスホスホネート）５ｍｇおよび３〜５倍のモル過剰のｏｘ−ＨＥＳラクトン（実施例１または２で述べたように調製）を１００ｍｌ丸底フラスコ内で、ＤＭＳＯ  ４〜５ｍｌに溶解させた。懸濁物を７０℃に加熱し、適度に攪拌しながら（磁気スターラー）によって２４〜３６時間放置した。次に反応を停止させ、反応混合物を室温まで冷却した。水２０〜３０ｍｌを添加し、この溶液を蒸留水で透析した。透析の代わりに、膜の適切な排除限界を用いた限外濾過を利用することも可能である。これにより溶媒を交換することだけでなく、溶媒を濃縮することも可能となり、溶液は次に凍結乾燥させる。カップリングの成功は、標準分析方法、たとえばゲル透過クロマトグラフィーおよび遊離アミノ基についてのニンヒドリン試験によって証明される。カップリング生成物の収率は、ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤを用いたカップリングでは約８５％、ｏｘ−ＨＥＳ−１０ｋＤラクトンを用いたカップリングでは約８０％であった。
【００６０】
［実施例４］
〔選択的に酸化されたヒドロキシエチルデンプン（ｏｘ−ＨＥＳ）のアンフォテリシンＢへのカップリング〕
無水ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤラクトン１２．０ｇを無水ＤＭＳＯ  ３０ｍｌ中にＮ2雰囲気下で溶解させた。溶液を７０℃に加熱し、アンフォテリシンＢ  ５２ｍｇを添加した。反応は光を遮断して、これらの条件下で２４時間放置した。成功したカップリングは、３８５ｎｍ（アンフォテリシンのλmax）を用いてゲル透過クロマトグラフィーによって証明した。反応の完了後、蒸留水８０ｍｌを添加することによって停止させ、水で激しく透析した。凍結乾燥は、淡黄色カップリング生成物を与えた（収率約８７％）。
【００６１】
比較条件下では、ｏｘ−ＨＥＳ−１０ｋＤラクトンとアンフォテリシンＢとのカップリングにおいて、約７５％の収率が達成された。
【００６２】
［実施例５］
〔ｏｘ−ＨＥＳのアンピシリンへのカップリング〕
無水ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤラクトン１．３ｇを１００ｍｌ丸底フラスコ内で、無水ＤＭＳＯ  ５ｍｌに溶解させた。この溶液を４５℃に加熱し、アンピシリン１１．０ｍｇ（Aldrich #27.186-1）を添加した。反応は適度に攪拌して２０時間行い、この時間の後に蒸留水２５ｍｌを添加することによって停止させた。反応混合物を蒸留水で透析して、次に凍結乾燥させた。カップリングの成功は、生成物をＧＰＣで分析することおよびニンヒドリンを用いてアンピシリンの遊離アミノ基を決定することによって証明した。
【００６３】
［実施例６］
〔ｏｘ−ＨＥＳのネオマイシンへのカップリング〕
ｏｘ−ＨＥＳ−２５ｋＤラクトン３×１０-5ｍｏｌを５０ｍｌ反応容器内で６０℃にて磁気スターラーで攪拌しながら、Ｎ−メチルピロリドン５ｍｌに溶解させた。無水ＤＭＳＯ  ２ｍｌ中のネオマイシン１０ｍｌの添加に続いて、約１０時間、還流下で沸騰させた。室温に冷却した後、さらに水３５ｍｌを添加することにより反応を停止させた。溶媒の大半を透析によって除去し、そして次にカップリング生成物を凍結乾燥させた。ＵＶ検出を用いたＧＰＣによって、収率約８２％のカップリング生成物を証明することが可能であった。
【００６４】
［実施例７］
〔ｏｘ−ＨＥＳのメパルトリシンへのカップリング〕
ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤラクトン２．５ｇおよびメパルトリシン（イタリア、ミラノのSocieta Prodotti Antibioticiより入手可能）２２ｍｇを加熱しながら完全に溶解するためには、エチレングリコール１０ｍｌが必要であった。溶媒はあらかじめ脱気および乾燥させてあった。反応溶液は、光を遮断して不活性ガス雰囲気下で３６時間攪拌し、反応は氷冷水４０ｍｌを導入することによって最終的に停止させた。エチレングリコールは限外濾過（１０ｋＤ膜）によって除去し、続いての凍結乾燥は薄黄色がかった粉末２．１ｇを与えた。さらなる精製は、ＵＶ／ＶＩＳ検出による、Ｃ１８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって行った。
【００６５】
［実施例８］
〔ｏｘ−ＨＥＳのナイスタチンへのカップリング〕
無水ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤラクトン２．５ｇを１００ｍｌ丸底フラスコ内で、無水ＤＭＳＯ  １０ｍｌに溶解させた。ナイスタチン９．５ｍｇの添加に続いて、６０℃に加熱し、暗所にて不活性ガス雰囲気下で攪拌した。反応は適度に攪拌しながら４８時間行い、この時間の後に蒸留水５０ｍｌを添加することによって停止させた。反応混合物を蒸留水で透析し、次に凍結乾燥させた。成功したカップリングは、ＲＰ−ＨＬＰＣ（Ｃ１８カラム）および３２５ｎｍでの検出によって証明した。生成物ピークの吸収から概算した収率は、約６７％であった。
【００６６】
［実施例９］
〔ｏｘ−ＨＥＳのマイトマイシンＣへのカップリング〕
ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤラクトン２．５ｇおよびマイトマイシン（Fluka #69824）２０ｇを９：１  ＤＭＳＯ：ＭｅＯＨ混合物１０ｍｌに６０℃にて溶解させた。反応溶液を還流下で２４時間維持し、次に水４０ｍｌを添加して反応を停止させた。この溶液を脱イオン水で一晩透析し、次に凍結乾燥させた。カップリングは、ＲＰ−ＨＰＬＣおよび３２０ｎｍでの検出によって証明した。予想カップリング生成物は、収率８２％となった。
【００６７】
［実施例１０］
〔ｏｘ−ＨＥＳのダウノルビシンへのカップリング〕
ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤラクトン１．３ｇを７０℃にて攪拌しながら、Ｎ−メチルピロリドン１０ｍｌに溶解させた。ＤＭＦ  ３ｍｌに溶解させたダウノルビシン（Fluka #30450）１７ｍｇをそこに滴下して添加した。反応混合物をこれらの条件下で２０時間攪拌して、室温まで冷却し、最後に蒸留水４０ｍｌとともに振とうした。溶媒の大半は水による透析によって除去し、続いて凍結乾燥させた。カップリングしたダウノルビシンは、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＵＶ−ＶＩＳ検出によって証明した。
【００６８】
［実施例１１］
〔ｏｘ−ＨＥＳの７−アミノセファロスポリンへのカップリング〕
ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤラクトン３．０ｇおよび７−アミノセファロスポリン（Fluka #07300）２０ｍｇを１００ｍｌの丸底フラスコ内で磁気スターラーによって攪拌しながら、無水ＤＭＳＯ  ５ｍｌに溶解させた。温度を５０℃に上昇させ、１５時間維持した。この時間の後、反応混合物を２５℃に冷却し、蒸留水５ｍｌを添加することによって希釈した。ＤＭＳＯおよび未反応の７−アミノセファロスポリンは、蒸留水による透析で除去した。次に溶液を凍結乾燥させて、生成物をＴＬＣおよびＧＰＣによって分析した。
【００６９】
［実施例１２］
〔ｏｘ−ＨＥＳの６−アミノペニシリン酸へのカップリング〕
７−アミノセファロスポリンの代わりに６−アミノペニシリン酸を同じ条件下で用いて、実施例１１で述べた反応を同様に実施し、反応生成物を完成させて、同じ条件下で分析した。
【００７０】
［実施例１３］
〔ｏｘ−ＨＥＳのＬＨＲＨへのカップリング〕
無水ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤラクトン１．０ｇを無水ＤＭＳＯ  １０ｍｌ中で、ＬＨＲＨ（黄体形成ホルモン放出ホルモン）（Bachem、スイス）５ｍｇによってインキュベートした。反応は４５℃にて１５時間攪拌しながら進行させ、水４０ｍｌを添加して停止させた。ヘシル化ＬＨＲＨは、大半のＤＭＳＯおよび未反応ペプチドを除去するために水によって激しく透析した後に、乾燥凍結によって得た。生じた生成物は、ＧＰＣ（Superose 12、Amersham-Pharmacia、スウェーデン）および２８０ｎｍでのＵＶ検出によって分析した。カップリング生成物の約１：１の化学両論は、Ｔｒｐ吸収に基づくペプチドの定量化およびフェノール／硫酸着色による多糖類含有量の定量化からわかった。
【００７１】
［実施例１４］
〔ｏｘ−ＨＥＳのカンプトセシンへのカップリング〕
カンプトセシン２０ｍｇを丸底フラスコ内で５０℃にて、無水ＤＭＳＯ  ５ｍｌに溶解させた。無水ＤＭＳＯ  ２ｍｌ中の１．４−ジアミノブタン３６ｍｇをこの溶液に滴下して添加した。反応混合物を放置して、これらの条件下で２４時間静かに攪拌した。共役生成物はフラッシュクロマトグラフィーで精製した。収率は約８３％であった。
【００７２】
修飾カンプトセシンのｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤによるカップリング反応のために、精製後の完成した反応混合物を多糖類ラクトン３．６ｇとともに、無水ＤＭＳＯ  ８ｍｌ中に攪拌および５０℃での加熱によって溶解させた。反応の進行は、反応混合物からのサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣによって追跡した。５０℃での２０時間後、さらなる生成物形成は観測できず、反応は蒸留水５０ｍｌを添加することによって停止させた。水による透析の後、カップリング生成物を凍結乾燥させた。分析は、ＧＰＣおよび修飾された未反応カンプトセシン中の遊離アミノ基のＴＬＣプレート上でのニンヒドリンによる染色によって行った。
【００７３】
［実施例１５］
〔ｏｘ−ＨＥＳのプロスタサイクリンへのカップリング〕
ａ）アミノ官能基化
プロスタサイクリン（Sigma-Aldrich）３５２ｍｇを０℃にて、２％塩化メチレン（Ｖ／Ｖ）とともに無水ＤＭＦ  ５ｍｌ中に溶解させた。無水ＤＭＦ  ５ｍｌ中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）１．３ｇをそれに添加した。静かに３０分間攪拌しながら反応を行わせた。次に１．５−ジアミノエチルエーテルの５倍モル過剰（プロスタサイクリンに基づいて）を添加し、溶液をゆっくりと室温まで加温した。アミノ官能基化カップリング生成物は、シリカ相でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００７４】
ｂ）ヘシル化
ａ）の精製カップリング生成物２２０ｍｇを室温にてグリコール８ｍｌに溶解させた。グリコール１０ｍｌに溶解させたｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤラクトン４．０ｇを攪拌しながら混合し、４５℃に加熱した。８時間の反応時間の後、混合物を氷浴で冷却し、水によって激しく透析した。透明溶液は、Ｃ１８カラムを用いてＲＰ−ＨＰＬＣによって調べた。カラムのホールドアップ体積（カップリング生成物）および初期物質の面積の比から、カップリング効率を計算することが可能であった。収率は５３％であった。
【００７５】
［実施例１６］
〔ＨＥＳのアレンドロネートへのカップリング〕
ＨＥＳ−２５ｋＤの１０倍のモル過剰を１００ｍｌ丸底フラスコ内で、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５）４ｍｌ中のアレンドロネート２．２５ｍｇの溶液に添加した。多糖類を完全に溶解させるために反応混合物を振とうして、次に３０倍のモル過剰のＮａＢＨ3ＣＮを添加した。反応は室温で４８時間進行させ、カップリング生成物の精製は、一定分量中でのフルオレサミンとの反応によって検出され、それは遊離アミノ基との蛍光生成物を生じた。
【００７６】
［実施例１７］
〔ＨＥＳのアモキシリンへのカップリング〕
０．１Ｎ  Ｎａリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）４．０ｍｌを二口フラスコに導入し、そこにＨＥＳ−４０ｋＤ  １．５ｇを６０℃に加熱しながら溶解させた。２５℃に冷却した後、アモキシリン（Fluka #10039）７．０ｍｇを磁気スターラーで攪拌しながら添加した。別の容器で、３０倍モル過剰に相当するＮａＢＨ3ＣＮの溶液を同じＮａリン酸緩衝液２ｍｌ中で調製した。シアノホウ化水素溶液を滴下漏斗によって、ゆっくりと滴下して第一の溶液に３０分間にわたって添加した。反応混合物をさらに２４〜３６時間攪拌し、次に反応を停止させるために、０．１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４に調整した。溶液を透析によって脱塩し、凍結乾燥させた。カップリング生成物の証明は、ＧＰＣおよびＵＶ光度計によって行った。
【００７７】
［実施例１８］
〔ＨＥＳのセファクロールへのカップリング〕
０．１Ｎ  Ｎａリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌを用いて、１００ｍｌの丸底フラスコ内でＮａＢＨ3ＣＮ  １１０ｍｇを溶解させた。ＨＥＳ−１３０ｋＤ  ６．０×１０-5ｍｏｌおよびセファクロール（Fluka #22125）２．０×１０-5ｍｏｌを攪拌しながら添加した。反応温度は２５℃に維持し、反応混合物を２４時間適度に攪拌した。溶液を次にｐＨ４．０に酸性化し、さらに３０分間攪拌した。脱塩および濃縮を限外濾過（１０ｋＤ膜）によって実施した。カップリング生成物は、ＨＰ−ＧＰＣにより２６５ｎｍにて証明した。
【００７８】
［実施例１９］
〔ＨＥＳのドキソルビシンへのカップリング〕
ドキソルビシン（Fluka #45584）６．０ｍｇを３倍のモル過剰のＨＥＳ−１３０ｋＤの存在下、室温にて０．１Ｎ  Ｎａリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）４ｍｌ中に懸濁させた。反応混合物を３０分間激しく攪拌し、０．８Ｍ  ＮａＢＨ3ＣＮ溶液３ｍｌをゆっくり添加した。反応を室温にて４８時間攪拌しながら維持した。次に、塩および未反応ドキソルビシンを除去するために、１０ｋＤ膜をダイアフィルトレーションに使用した。ダイアフィルトレートした溶液を凍結乾燥させ、カップリング生成物をＧＰＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣによって調査した。
【００７９】
［実施例２０］
〔ＨＥＳのバソプレシンへのカップリング〕
ＨＥＳ−１３０ｋＤ  １．２５ｇを、滴下漏斗を装備した丸底フラスコ内で、ｐＨ８．０の０．１Ｍ  Ｎａリン酸緩衝液５ｍｌに加熱および静かに攪拌しながら溶解させた。バソプレシン（Bachem、スイス）５ｍｇをこの溶液に添加した。ＮａＢＨ3ＣＮ  ３０ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌに溶解させ、滴下漏斗を通じて反応混合物にゆっくりと滴下して添加した。反応を２５℃にて約２４時間静置した。反応を終了させるために、０．１Ｎ  ＨＣｌを添加することによってｐＨを４．０に低下させた。水による激しい透析の後、ヘシル化生成物を凍結乾燥させた。分析は上述のＧＰＣおよび２２０ｎｍでのＵＶ検出によって行った。
【００８０】
［実施例２１］
〔ｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤのネオマイシンへのカップリング〕
ネオマイシン（硫酸塩）１．０１ｍｇおよびｏｘＨＥＳ  ７０ｋＤ  １２６．２１ｍｇをアルゴン雰囲気下の二口フラスコ内でＤＭＳＯ  ２ｍｌ中に溶解させ、ＤＭＡＰ  ０．８１ｍｇの添加後、７０℃にて２４時間加熱した。次にアセトンを添加することによって反応を停止させ、そこでカップリング生成物が沈殿した。固体を水に溶解させ、水による４８時間にわたる透析によって精製した。凍結乾燥は、白色のカップリング生成物８０ｍｇ（６３％）を生じた。
【００８１】
［実施例２２］
〔ｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤのネオマイシンへのカップリングの別の方法〕
ｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤのネオマイシンへのカップリングは同様に、活性化剤としてＥＤＣの添加によりＤＭＳＯ中で、室温にてうまく実施することができる。このためにネオマイシン（硫酸塩）１６．９７ｍｇ、ｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤ  ３４８ｍｇおよびＤＭＡＰ  ２．２８ｍｇをＤＭＳＯ  １ｍｌに溶解させた。ＤＣＣ（１当量）３．８３ｍｇの添加後、溶液を２時間攪拌し、ＤＣＣ  １当量の添加を反復した。このプロセスは、ＤＣＣ  １０当量が反応溶液に添加されるまで反復した。反応時間は合計２４時間であった。アセトン２０ｍｌを溶液に添加した後、カップリング生成物は沈殿した。固体を水に溶解させ、水によって４８時間透析して精製した。凍結乾燥は、白色カップリング生成物２８０ｍｇ（８０％）を生じた。
【００８２】
［実施例２３］
〔ｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤのダウノルビシンへのカップリング〕
塩酸ダウノルビシン０．５ｍｇ、ｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤ  ８２９．２ｍｇおよびＤＭＡＰ  ０．１０８ｍｇをアルゴン雰囲気下の二口フラスコ内で、ＤＭＳＯ  ２ｍｌに溶解させ、７０℃で２４時間加熱した。次にアセトン（２０ｍｌ）をそれに添加し、そこでカップリング生成物が沈殿した。溶液を遠心分離し、沈殿物をアセトンで洗浄し、数回遠心分離した。薄ピンク色の固体が得られ、水に溶解させて、水によって透析した。凍結乾燥は薄ピンク色固体６５６ｍｇ（８０％）を生じた。カップリングしたダウノルビシンの純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣで確認した。
【００８３】
［実施例２４］
〔ｏｘ−ＨＥＳ  １３０ｋＤの７−アミノセファロスポラニン酸へのカップリング〕
ｏｘ−ＨＥＳ−１３０ｋＤ３８３ｍｇおよび７−アミノセファロスポラニン酸（Fluka #07300）１．２２ｍｇを１００ｍｌ丸底フラスコ内で磁気スターラーによって攪拌しながら、無水ＤＭＳＯ  ２ｍｌに溶解させた。温度を７０℃に上昇させ、２４時間維持した。この時間の後、混合物を２５℃に冷却し、アセトン２０ｍｌを添加することによって反応生成物を沈殿させた。固体をアセトン２０ｍｌで洗浄し、蒸留水２０ｍｌに溶解させた。カップリング生成物のさらなる精製は、蒸留水による透析によって行った。次に溶液を凍結乾燥させ、生成物をＴＬＣおよびＧＰＣで分析した。カップリング生成物２７０ｍｇ（７０％）を白色固体の形で得た。
【００８４】
［実施例２５］
〔ｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤの６−アミノペニシラン酸へのカップリング〕
７−アミノセファロスポラニン酸の代わりの６−アミノペニシラン酸１．５７ｍｇおよびｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤ  １３５．５４ｍｇを同じ条件下で用いて、実施例ｄで述べた反応を同様に実施した。反応生成物を完成させて、同じ条件下で分析した。精製後、カップリング生成物（６５％）８８ｍｇを白色固体として得た。
【００８５】
［実施例２６］
〔ＨＥＳ  ４０ｋＤのアモキシシリンへのカップリング〕
０．１Ｎ  Ｎａリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）４．０ｍｌを二口フラスコに導入し、そこにＨＥＳ−４０ｋＤ  １．５を６０℃に加熱しながら溶解させた。２５℃に冷却した後、アモキシリン（Fluka #10039）７．０ｍｇを磁気スターラーで攪拌しながら添加した。別の容器で、３０倍モル過剰に相当するＮａＢＨ3ＣＮの溶液を同じＮａリン酸緩衝液２ｍｌ中で調製した。シアノホウ化水素溶液を滴下漏斗によって、ゆっくりと滴下して第一の溶液に３０分間にわたって添加した。反応混合物をさらに２４〜３６時間攪拌し、次に反応を停止させるために、０．１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨを４に調整した。溶液を透析によって脱塩し、凍結乾燥させた。カップリング生成物の証明は、ＧＰＣおよびＵＶ光度計によって行った。
【００８６】
［実施例２７］
〔ＨＥＳ  ７０ｋＤのアモキシシリンへのカップリング〕
ｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤ  １７３ｍｇおよびアモキシリン０．８５ｇを１００ｍｌ丸底フラスコ内でＤＭＳＯ  ２ｍｌ中に磁気スターラーで攪拌しながら溶解させた。温度を７０℃に上昇させ、２４時間維持した。この時間の後、混合物を２５℃に冷却し、アセトン２０ｍｌを添加することによって反応生成物を沈殿させた。固体をアセトン２０ｍｌで洗浄し、蒸留水２０ｍｌに溶解させた。カップリング生成物のさらなる精製は、蒸留水による透析によって行った。次に溶液を凍結乾燥させ、生成物をＴＬＣおよびＧＰＣによって分析した。カップリング生成物１５１ｍｇ（８７％）を白色固体の形で得た。
【００８７】
［実施例２８］
〔ＨＥＳ  ７０ｋＤのセファドロキシルへのカップリング〕
ｏｘ−ＨＥＳ  ７０ｋＤ  ６１０ｍｇおよびセファドロキシル２．９６５ｇを１００ｍｌの丸底フラスコ内でＤＭＳＯ  ２ｍｌ中に磁気スターラーで攪拌しながら溶解させた。温度を７０℃に上昇させ、２４時間維持した。この時間の後、混合物を２５℃に冷却し、アセトン２０ｍｌを添加することによって反応生成物を沈殿させた。固体をアセトン２０ｍｌで洗浄し、蒸留水２０ｍｌに溶解させた。カップリング生成物のさらなる精製は、蒸留水による透析によって行った。次に溶液を凍結乾燥させ、生成物をＴＬＣおよびＧＰＣによって分析した。カップリング生成物４９０ｍｇ（８７％）を白色固体の形で得た。
【００８８】
［実施例２９］
〔ＨＥＳ  ７０ｋＤのグルカゴンへのカップリング〕
グルカゴン（６６×１０-9ｍｏｌ、０．２３ｍｇ）、ｏｘＨＥＳ  ７０ｋＤ（６．６×１０-6ｍｏｌ、１２３ｍｇ）を丸底フラスコ内でＤＭＳＯ  １ｍｌ中に溶解させる。１時間の間隔で、ＤＤＣを８回に分けて１時間の間隔で、総量２３．０８ｍｇが反応溶液に添加されるまで添加する。２４時間の反応時間の後、水１５ｍｌを添加することによって反応を停止させる。カップリング生成物は水による透析によって精製する。凍結乾燥は白色カップリング生成物７９ｍｇ（６５％）を生じた。
【国際調査報告】
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