(57)【要約】本発明は、陽の純電荷を有する少なくとも１種の有機陽イオン分子と会合したカンプトテシン剤又はその誘導体のカルボキシレート型から成る組成物、特に、コロイド状ナノ凝集体に関する。この組成物又はナノ凝集体は、エマルジョン、小滴、ミセル、リポソーム、ナノ粒子又はナノカプセルとして存在していてよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽の純電荷を有する少なくとも１種の有機陽イオン分子と会合したカンプトテシン剤のカルボキシレート型から成る組成物において、有機陽イオン分子対カルボキシレートのモル比は少なくとも約１：１であり、前記の組成物は本質的に前記のカンプトテシンのラクトン型を含有しない、カンプトテシン‐カルボキシレート配合物。
【請求項２】
前記の有機陽イオン分子は陽イオン両親媒体及び／又は陽イオンポリマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記の陽イオン両親媒体は、有利に三級アミノ又は四級アンモニウム基を有する脂質、リソ脂質又はポリエチレングリコール化脂質、例えば、N‐［１‐（２，３‐ジアシルオキシ）プロピル］‐N，N‐ジメチルアミン又はN‐［１‐（２，３‐ジアシルオキシ）プロピル］‐N，N，N‐トリメチルアンモニウムである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記の陽イオンポリマーは、分子量約５〜約５００kDaを有する高分子電解質、酸、例えば、ポリアリルアミン又はポリエチレンイミン、多糖類（polymeric sugar）又はポリアミンである、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
更に、少なくとも１種の陰イオン及び／又は中性両親媒体から成る、請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記の陰イオン及び／又は中性両親媒体は、負又は中性純電荷を有するステロール又は脂質、例えば、コレステロール、燐脂質、リソ脂質、リソ燐脂質、スフィンゴ脂質又はポリエチレングリコール化脂質から選択される、請求項１から５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
中性両親媒体は、ジアシルホスファチジルコリンである、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から７までのいずれか１項に記載の組成物から成るコロイド状ナノ凝集体。
【請求項９】
全体に陽電荷を有する、請求項８に記載のナノ凝集体。
【請求項１０】
更に、負及び／又は中性純電荷を有する少なくとも１種の両親媒体（陰イオン及び／又は中性両親媒体）から成る、請求項８又は９に記載のナノ凝集体。
【請求項１１】
前記の陰イオン及び／又は中性両親媒体は、負又は中性純電荷を有するステロール又は脂質、例えば、コレステロール、燐脂質、リソ脂質、リソ燐脂質、スフィンゴ脂質又はポリエチレングリコール化脂質から選択される、請求項８から１０までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１２】
中性両親媒体は、ジアシルホスファチジルコリンである、請求項８から１１までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１３】
分子外層中に、少なくとも約２０％、有利に少なくとも約３０％及び最も有利に少なくとも約４０％の過剰の陽電荷部分を有する、請求項８から１２までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１４】
エマルジョン、小滴、ミセル、リポソーム、ナノ粒子又はナノカプセルとして存在する、請求項８から１３までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１５】
カンプトテシン剤又はその誘導体約０．１〜約５０モル％から成る、請求項８から１４までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１６】
更に、糖又はアルコール又はその組合せ、例えば、トレハロース、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、デキストラン、マンニトール又はソルビトールから選択される凍結保護剤から成る、請求項８から１５までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１７】
製薬学的に認容性の担体、希釈剤及び／又は補助剤と共に、請求項１から７までのいずれか１項に記載の組成物又は請求項８から１６までのいずれか１項に記載のコロイド状ナノ凝集体の製薬学的有効量から成る製薬学的製剤。
【請求項１８】
請求項８から１６までのいずれか１項に記載のコロイド状ナノ凝集体を製造するために、次の段階：
a）有利に、塩としてのカンプトテシン剤を製造し、
ｂ）前記のカンプトテシン剤をそのカルボキシレート型で、陽の純電荷を有する陽イオン両親媒体及び任意に、陽、負及び／又は中性純電荷を有する少なくとももう１種の両親媒体と会合させ、かつ
ｃ）コロイド状ナノ凝集体を形成させる
から成る、コロイド状ナノ凝集体の製法。
【請求項１９】
段階ｂ）及びｃ）は、前記のナノ凝集体を均質化、脂質膜によって、又は溶剤注入法によって形成させることより成る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
高められた血管形成活性を特徴とする病気を治療及び／又は予防するための医薬剤を製造するための、請求項１７に記載の製薬学的製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽の純電荷を有する少なくとも１種の有機陽イオン分子と会合したカンプトテシン剤又はその誘導体のカルボキシレート型から成る組成物、特にコロイド状ナノ凝集体に関する。組成物又はナノ凝集体は、エマルジョン、小滴、ミセル、リポソーム、ナノ粒子又はナノカプセルとして存在することができる。
【０００２】
カンプトテシン（CPT）は、チャイニーズ・ツリー・カンプトテカ・アクミナタ（Chinese tree Camptotheca acuminata)から分離され得るキノリンをベースとするアルカロイドである(Wall, Wani et al. 1966)。これは最初に６０年代及び７０年代に抗癌剤として記載され、試験された。抗腫瘍活性は、動物モデル及び臨床研究で示された。しかし、患者は重い副作用、例えば、好中球減少症、血小板減少症、出血性膀胱炎を経験した（Wall and Wani 1996)。ヒトにおけるカンプトテシンの治療効果は疑問視された（Moertel, Schutt et al. 1972;Muggia, Creaven et al. 1972)。これは、抗癌剤の開発のための可能な候補薬として高く関心され続け、DNA切断及び細胞死を引き起こすトポイソメラーゼI-DNA複合体に結合する特別な作用モードを有することが判明した（トポイソメラーゼI阻害剤）（Hsiang and Liu 1988)。
【０００３】
CPTの基本的分子特性は、ラクトンとカルボキシレート型との間のそのｐH依存平衡である（図１）。ラクトン型は親油性であり、一方で、生理学的ｐH以上で支配するカルボキシレートは水溶性である。ラクトン型は、非常に親油性で、投与するのに困難であるので、最初は、CPTは水溶性のナトリウム塩に変換された（NCS 100880）。しかし、受け入れられない副作用のために、その化合物の開発はそれ以上追求されなかった（Moertel, Schutt et al. 1972 ; Muggia, Creaven et al. 1972）。
【０００４】
その後の研究で、ラクトン型とカルボキシレート型との間の平衡は、基本的に、抗癌治療内の細胞分裂抑制作用及び副作用の出現に見出された：CPT‐カルボキシレートは、観察された副作用について責任があると認められ、CPT‐ラクトンよりも著しく低い活性であると見なされた（Hertzberg, et al. 1989）。ラクトンの膜透過性に比べてカルボキシレート型の低い膜透過性、及び各々局所的生理的環境でのｐH値の関数としての分子平衡の移動が、これらの活性差をもたらすと見なされた（図２参照）。
【０００５】
CPT‐カルボキシレートのこれらの不利な特性のために、CPTをベースとする薬剤の開発への更なる努力は、ラクトン型を含有し、かつカルボキシレート型を含まない配合物の製造に集中された。このことは殊に重要であり、それというのも、生理学的条件下にカルボキシレートがCPTの主要分子型であり、かつラクトン型は短時間内（典型的には、数時間以下）で加水分解してカルボキシレートになるからである。従って、ＣＰＴ剤の開発の主要目的は、ラクトン型を安定させ、かつそれを困難なく投与するための方法を見つけることであった（Zunino et al. 2002）。
様々な方策が、ラクトン環を安定させ、更に容易な投与を得るための分子の可溶性を付随的に改善するために追及されてきた。特に、本来の分子から異なる型の誘導体への官能化、前薬剤の合成及び様々な投与法が追及されてきた（Kehrer, Soepenberg et al. 2001)。しかし、そのどれも、抗癌剤としてのカンプトテシンの前記した本来の困難さを解決するための所望の結果をもたらさなかった。
【０００６】
他の研究で、リポソームがCPT‐ラクトンを加水分解から保護するために使用された。このことは、ラクトンを加水分解及び血液と血清との相互作用から保護するために、酸性条件下にリポソーム中へのCPTのカプセル包入によって、又はリポソームの脂質二重層中へのCPTの埋込によって実現された。実際に、小嚢状脂質二重層の疎水性範囲中へのCPT‐ラクトンの埋込によって（US ５５５２１５６）、ラクトン型は水性環境に曝されず、かつ加水分解は著しく遅延された。しかし、極めて低い薬剤／脂質比が達成され得るだけで、臨床的使用に必要な投与量は実現され得なかった。
【０００７】
もう１つのリポソームをベースとする研究で、CPT‐ラクトンは、不飽和脂肪酸を含有する燐脂質より成るリポソームの脂質二重層中に埋込まれた（ＵＳ５８３４０１２）。それによって、安定化効果が報告された。後者は、ラクトン型のCPTと脂質の不飽和脂肪酸鎖との相互作用に依ることが示された。
しかし、他の研究と同様に、機能的ＣＰＴ剤組成物に向かっての基本的な進歩は、今日まで達成され得なかった。
従って、本発明の基礎にある問題は、副作用の軽減下に、必要とする対象への最も有効な投与のための、カンプトテシン剤及びその配合物から成る組成物を得ることであった。
【０００８】
前記の問題の解明は、本発明により、請求の範囲で特徴付けられた実施態様を備えることによって達成される。本発明は、陽電荷（陽イオン性）基、有利に陽イオン両親媒体を有する少なくとも１種の有機性分子（図３）と会合したカンプトテシン剤又はその誘導体のカルボキシレート型から成る組成物に関し、この際、前記の組成物は、有機陽イオン分子（CM）対カンプトテシンカルボキシレートのモル比少なくとも約１：１を有し、かつ前記の薬剤又はその誘導体のラクトン型を基本的に含有しない。
【０００９】
本発明に関して、”カンプトテシン剤”は、カンプトテシンそれ自体又はその誘導体に関する。カンプトテシン誘導体は、カンプトテシンの任意の化学的誘導体化によって得られる（構造参照）。可能なカンプトテシン剤の一覧表が下に挙げられているが、これに限定されるものではない：http:／／dtp.nci.nih.gov Aug. 19, 2002より。分子の概略図に、最も慣例的な誘導体化位置がＲ１〜Ｒ５として略述されている。
カンプトテシン剤の構造：
【００１０】
【化１】
2005535633.tif 000002
【００１１】
次の表に、異なる位置での誘導体化の典型的な例が挙げられている。カンプトテシンは塩酸塩として存在していてよい。ラクトン環（Ｅ‐環）は、６‐環員の代わりに７‐環員であってよい（ホモカンプトテシンス）。
【００１２】
【表１】
2005535633.tif 000003
【００１３】
誘導体化は、分子をより親水性又はより親油性にするためにCPTの特性に影響を与えることができ、又はラクトン‐カルボキシレート平衡が影響される。抗癌剤としてのCPTの適用に関して、誘導体化は、活性を保持又は増強させるために意図される。
【００１４】
本発明の組成物を製造するために、カルボキシレート型のカンプトテシン又は任意の好適なカンプトテシン誘導体が得られる。最も有効な製造のために、カンプトテシン剤はカンプトテシンカルボキシレート塩として得られる。得られるカンプトテシン誘導体の有機性対分子への結合効力は、カンプトテシンに関して、より高い又はより低くてよい。Ｒ１〜Ｒ５位置における好適な残基は、両親媒性対分子への結合に有利で有り得る。
【００１５】
続いて、本発明を実施例としてカンプトテシンを用いて詳細に説明するが、例証は任意のカンプトテシン誘導体にも関する。
【００１６】
本発明化合物は、少なくとも１種の有機陽イオン分子、有利に、陽の純電荷を有する両親媒体又はポリマー（陽イオン分子）と会合したカンプトテシン剤のカルボキシレート型から成る新規物質であり、ここで、物質中の電荷基のモル比は、有機陽イオン分子対カンプトテシン剤のカルボキシレート型約２：１まで、有利に約１．５：１まで、より有利には約１．１：１まで、及び最も有利には約１：１である。組成物は、カンプトテシン剤のラクトン型を本質的に含まない。本発明の組成物は、独特の物理‐化学的特性を有する新規の分子組成物を構成する新規の物質を含有する。
【００１７】
本発明の組成物中で使用される有機陽イオン分子は、陽の純電荷を有する両親媒体（陽イオン両親媒性物質）又は陽の純電荷を有するポリマー（陽イオンポリマー）であってよい。陽イオンポリマーは、任意の陽イオン高分子電解質、例えば、ポリアリルアミン又はポリエチレンイミン、同様にポリアミノ酸又は多糖類であってよい。分子量は、有利に約５〜５００ｋDaである。CPTは、簡単な混合によってポリマーに結合する。得られる組成物は、ナノ凝集体（ナノ粒子、ナノカプセル）の異なる型の自己集合のための成分として使用され得る。
【００１８】
陽イオン性両親媒体は、１価又は多価であってよい。これは、陽の純電荷を有する脂質、リソ脂質又はポリエチレングリコール化（pegylated）脂質から選択され得る。有用な陽イオン脂質は次のものを包含する：
DDAB、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；
N‐［１‐（２，３‐ジオレオイルオキシ）プロピル］‐N，N，N‐トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（DOTAP）；１，２‐ジアシルオキシ‐３‐トリメチルアンモニウムプロパン、（次のものを含むが、これに限定されるものではない：ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイル及びジステアロイル；同様に、２個の異なるアシル鎖は、グリセロール骨格に結合され得る）；Ｎ‐［１‐（２，３‐ジオレオイルオキシ）プロピル］‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミン（DODAP）；１，２‐ジアシルオキシ‐３‐ジメチルアンモニウムプロパン、（次のものを包含するが、これに限定されるものではない：ジオレオイル、ジミリストイル、ジラウロイル、ジパルミトイル及びジステアロイル；同様に２個の異なるアシル鎖は、グリセロール骨格に結合され得る）；N‐［１‐（２，３‐ジオレイルオキシ）プロピル］‐N，N，N‐トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）；１，２‐ジアルキルオキシ‐３‐ジメチルアンモニウムプロパン、（次のものを包含するが、これに限定されるものではない：ジオレイル、ジミリスチル、ジラウリル、ジパルミチル及びジステアリル；同様に２個の異なるアルキル鎖は、グリセロール骨格に結合され得る）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS）；
３β‐［N‐（N’，N’‐ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（DC‐Chol）；２，３‐ジオレオイルオキシ‐N‐（２‐スペルミンカルボキシアミド）‐エチル）‐N，N‐ジメチル‐１‐プロパナミニウムトリフルオロ‐アセテート（DOSPA）；β‐アラニルコレステロール；セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）；ジC１４‐アミジン；
N‐ｔ‐ブチル‐Ｎ’‐テトラデシル‐３‐テトラデシルアミノプロピオンアミジン；１４Dea２；N‐（アルファ‐トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル‐D‐グルタメートクロリド（TMAG）；O，O’‐ジテトラデカノイル‐N‐（トリメチルアンモニオアセチル）デエタノールアミンクロリド；１，３‐ジオレオイルオキシ‐２‐（６‐カルボキシ‐スペルミル）‐プロピルアミド（DOSPER）；Ｎ，N，N’，N’‐テトラメチル‐N，N’‐ビス（２‐ヒドロキシエチル）２，３‐ジオレオイルオキシ‐１，４‐ブタンジアンモニウムイオジド；
Solodin et al. (1995) Biochem. 43:13537-13544 によって記載されているような、１‐［２‐アシルオキシ）エチル］２‐アルキル（アルケニル）‐３‐（２‐ヒドロキシエチル）‐イミダゾリニウムクロリド誘導体、例えば、１‐［２‐（９（Z）‐オクタデセノイルオキシ）エチル］‐２‐（８（Z)‐ヘプタデセニル‐３‐（２‐ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（DOTIM）、１‐［２‐（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］‐２‐ペンタデシル‐３‐（２‐ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（DPTIM）、例えば、Felgner et al.［Felgner et al. J.Biol.Chem. 1994, 269, 2550-2561］によって記載されている、四級アミン上にヒドロキシアルキル部分を有する２，３‐ジアルキルオキシプロピル四級アンモニウム化合物誘導体、例えば、１，２‐ジオレオイル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORI）、１，２‐ジオレイルオキシプロピル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORIE）、１，２‐ジオレイルオキシプロピル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシプロピルアンモニウムブロミド（DORIE-HP）、１，２‐ジオレイルオキシプロピル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシブチルアンモニウムブロミド（DORIE-HB）、
１，２‐ジオレイルオキシプロピル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシペンチル‐アンモニウムブロミド（DORIE‐Hpe）、１，２‐ジミリスチルオキシプロピル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、１，２‐ジパルミチルオキシプロピル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DPRIE）、１，２‐ジステリルオキシプロピル‐３‐ジメチル‐ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DSRIE）；Santaniello et al.［US5498633］によって報告されたような、アシルカルニチンの陽イオンエステル；ホスパチジルコリンの陽イオントリエステル、例えば、１，２‐ジアシル‐sn‐グリセロール‐３‐エチルホスホコリン（ここで、アシル鎖は、鎖長Ｃ１２〜Ｃ２２を有する飽和又は不飽和及び分枝鎖又は非分枝鎖であってよく、２個のアシル鎖は必ずしも同一ではない）。
【００１９】
有利な実施態様で、陽イオン両親媒体は、四級アンモニウム化合物、例えば、Ｎ‐［１‐（２，３‐ジアシルオキシ）プロピル］‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムから選択され、これは、塩化物、臭化物、弗化物、沃化物、硝酸塩、硫酸塩、メチル硫酸塩、燐酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、グルタル酸塩又は乳酸塩から成る群から選択され得る、製薬学的に認容性の対陰イオンとの塩として得られてよい。
【００２０】
本発明の組成物は、カンプトテシン剤のカルボキシレート型が有機陽イオン分子と会合していることを特徴とする。この会合は、静電力及び任意に両親媒的相互作用によって行なわれる。有機対分子は陽イオン両親媒体又は陽電荷ポリマーであることが有利である。ここで、用語CM‐CPTは、カンプトテシン剤及び有機対分子から成る組成物を称するために使用される。この組成物は、任意の好適な方法で、対イオンにCPT‐カルボキシレートを付加する又はその逆によって得られ得る。本発明の組成物を製造するための詳細な方法は次の節で示される。
【００２１】
CM‐CPTの存在は、例えば、分光法によって、CPT‐カルボキシレート、CPT‐ラクトン及びCM‐CPTのスペクトルが明らかに異なるので、その場で示され得る（図４、図５）。図４で、有機溶剤中の遊離CPT及び水性環境中のリポソーム配合物としてのCM‐CPTの蛍光励起及び放射スペクトルが示される。図５で、リポソーム配合物としてのCM‐CPT、様々な条件下での水性環境中のCPT及び有機溶剤中のCPT‐ラクトンのUV‐visスペクトルが比較される。
【００２２】
陽イオン分子へのCPTの結合選択性は、図８で明白に示され、ここで、水性懸濁液中のDOPC（中性脂質）及びDOTAP（陽イオン脂質）へのCPTの結合が比較される。この際、CPT‐カルボキシレートの水溶液への脂質溶液のエタノール注入が行なわれ、残留する遊離CPT‐カルボキシレートを除去するために、生成したコロイド状懸濁液を大過剰量の緩衝液に対して透析させた（実験的詳細は次の節で示される）。時間関数としてのCPT‐カルボキシレートの放出は、UV‐vis分光法によって測定された。見てわかるように、DOPCについては、事実上全てのCPTが懸濁液から放出され、即ち、DOPCへの結合は測定され得なかった。これに反して、DOTAPで平衡が達成され、この際、CPTの大部分が脂質に結合して残留した。このことは、CPT‐カルボキシレートはDOTAPに結合するが、DOPCには結合しないことを示す。
【００２３】
この発明はCPTの蛍光異方性測定によって確証される。この実験で、蛍光異方性の増加は、蛍光団がリポソーム中に挿入され、従って、その可動性が減少される場合に期待される。図９で見てわかるように、DOPCで極めて少ない異方性が、水溶液中の１個の遊離CPT‐カルボキシレートに接近して測定され、一方で、DOTAPで、示された全配合物について、極めて高い異方性が観察された。これらの観察で、陽イオン両親媒体だけのCPT‐カルボキシレートの結合及び安定したコロイド状懸濁液の形成が生じることが判る。DOPCでは、そのような結合は認められなかった。DOTAP及びDOPCは両方とも不飽和脂肪酸鎖から成るが、DOTAPは陽に電荷され、一方でDOPCは中性である。従って、負電荷のCPT‐カルボキシレートの結合のための推進力は脂質の陽電荷であることが観察で判明する。陽イオン分子へのCPT‐カルボキシレートの結合を推進する静電気相互作用は、脂質の不飽和脂肪酸残基へのCPT‐ラクトンの結合を推進する疎水性相互作用よりも更に有効であり、これはUS５８３４０１２に記載されている。
【００２４】
有効な結合のために、電荷に加えて、脂肪酸鎖の相状態が重要である。このことは、図１０に示され、ここでは、室温及び４０℃で、DMTAP又はDOTAPでのCPT又は１０OH‐CPTの蛍光異方性測定からの結果が描かれている。DOTAPは、その主な相転移（Ｔｍ）を３７℃付近で有する（Lewis, Tristram-Nagle et al. 2001）。その温度以下で、脂肪酸鎖はゲル相であり（結晶様状態）、その温度以上では液晶（液体様）状態である。データは、高い異方性及び従って強い結合が４０℃で、即ち、（Ｔｍ）以上で、液体様状態で見出されることを示す。このことは、高い結合効力には、炭化水素鎖の好適な相状態が重要であることを強調している。脂肪酸がオレイン酸から成るか又はそうではないかには無関係で、好適な状態にある任意の脂質で、高い結合効力は実現され得る。従って、本発明の組成物は、有利に、液体‐様状態にあるアルキル鎖を有する陽イオン両親媒体を含有する。更に、このデータは、陽イオン分子へのＣＰＴ剤の結合が、CPT自体だけに限定されずに、任意の好適なCPT誘導体にも適用され、より高い結合効力さえも得ることができることを示す。
【００２５】
他の記載の無い限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び学術的用語は、本発明が属する公知技術水準の当業者に周知の意味と同じである。
【００２６】
量値に関する”約”は、指示値に対する最高＋／−２０％、有利に＋／−１０％の平均的偏差に関係する。例えば、陽イオン脂質約３０モル％の量は、総合的脂質／両親媒体モル濃度に関して、陽イオン脂質３０モル％＋／−６モル％、有利に３０モル％＋／−３モル％に関係する。
【００２７】
”両親媒体”は、水溶性（親水性）及び油溶性（親油性）部分から成る分子に関する。親油性部分は、少なくとも１０、有利に少なくとも１２個の炭素原子を有する少なくとも１個のアルキル鎖を有利に含有する。
【００２８】
負に電荷した化合物を陽イオン両親媒体へ”会合させること”は、前記の化合物を陽イオン有機分子に、静電気的及び／又は両極性（又は両親媒性）作用によって結合させることに関する。得られる組成物は、有利に、１：１に近い電荷比を特徴とするが、分子の特性に依って、１．５：１又は＞２：１の比を使用することもできる。
【００２９】
”カンプトテシン”は、２０（Ｓ）‐カンプトテシン（１H‐ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２‐ｂ］キノリン‐３，１４（４Ｈ，１２Ｈ）‐ジオン、４‐エチル‐４−ヒドロキシ‐、（Ｓ）‐）、ＣＡＳ７６８９‐０３‐4に関する。
【００３０】
”癌”は、比較的共通の型の癌、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮癌、頭部及び頚部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、非‐小‐細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌及び小児期癌、例えば、脳幹腫、小脳腫瘍、脳腫瘍、上衣細胞腫、ユーイング（Ewing's）肉腫／腫瘍系統、生殖細胞腫瘍、頭蓋、ホジキン病、白血病、急性リンパ芽球、白血病、急性骨髄性、肝臓癌、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、非‐ホジキンリンパ腫、骨肉腫／骨の悪性線維組織球腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、軟組織肉腫、天幕上原始神経外胚葉及び松果体腫瘍、異常小児期癌、視路及び視床下部膠腫、ウィルムス（Wilms')腫瘍及び他の小児期腎腫瘍に関し、かつ急性リンパ球白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非‐ホジキンリンパ腫、脳腫瘍、頚部癌、小児期癌、小児期肉腫、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄性白血病、食道癌、毛細胞白血病、腎臓癌、肝臓癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、膵臓癌、一次中枢神経系リンパ腫、皮膚癌、小‐細胞肺癌を含む、さほど共通ではない癌に関する。
【００３１】
”担体”は、診断剤又は治療剤を投与するために好適である希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルに関する。この用語は、複合体を含有するか、又はその目標とする標的部位へのそのような薬剤の輸送を容易にする試薬と会合されている製薬学的に認容性の成分に関する。担体は、公知技術で公知のもの、例えば、リポソーム、ポリマー、脂質、複合体、血清アルブミン、抗体、シクロデキストリン及びデキストラン、キレート又は他の超分子集合体を包含する。
【００３２】
”陽イオン性”は、各々環境条件下に純陽電荷又は陽のゼータポテンシャルを有する試薬に関する。本発明では、ｐＨが３〜９、有利に５〜８の範囲にある環境に関係する。
【００３３】
”陽イオン両親媒体”又は”陽イオン脂質”は、陽電荷を有する任意の両親媒体又は脂質に関する。本発明では、ｐＨが３〜９、有利に５〜８の範囲にある環境に関係する。
【００３４】
”陽イオンリポソーム”は、陽に電荷されるリポソームに関する。本発明では、ｐＨが３〜９、有利に５〜８の範囲にある環境に関係する。陽イオンリポソームは、陽イオン脂質又は両親媒体それ自体から、又は他の両親媒体、殊に中性又は陰イオン脂質と混合して製造される。
【００３５】
”CM”は、陽イオン分子の略語として本明細書中で使用される。
【００３６】
”コロイド”又はコロイド状粒子は、媒体中に分散される粒子又は分子凝集体に関し、これらは媒体中で不溶性であり、約５nm〜５０００nmの大きさを有する。
【００３７】
ここで使用される”全体的に陽の電荷を有するコロイド状ナノ凝集体”は、任意に本発明の組成物から成り、かつ分子の外層に過剰に陽電荷された分子を有するコロイド状ナノ凝集体に関する。
【００３８】
”凍結保護剤”は、凍結作用から種を保護することを補助する物質に関する。
【００３９】
”誘導体”は、その全体的構造の特徴を維持しながら、どれか他の化合物から誘導される化合物に関する。誘導体は、例えば、化学的官能化又は誘導体化によって得られ得る。
【００４０】
”高められた血管形成活性によって特徴付けられる病気”は、例えば、組織炎症、関節炎、喘息、網膜変性、腫瘍増殖、及び糖尿病性網膜症のような経過に関する。
【００４１】
”薬剤”は、製薬学的認容性の薬物学的活性物質、生理学的活性物質及び／又は診断使用のための物質に関する。
【００４２】
”均質化”は、数種の成分の間で均一の分配を達成する物理的方法に関する。１例は、高圧均質化である。
【００４３】
”脂質”は、水に不溶性である、脂肪、脂質、原形質のアルコール‐エーテル可溶性成分を包含する一般用語としての慣用の意味に関する。脂質は、脂肪、脂肪油、精油、蝋、ステロイド、ステロール、燐脂質、糖脂質、硫脂質、アミノ脂質、クロモ脂質、及び脂肪酸から成る。この用語は、天然起源及び合成脂質の両方を包含する。本発明に関する有利な脂質は次のものである：ステロイド及びステロール、特にコレステロール、ホスファチジル及びホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを包含する燐脂質、及びスフィンゴミエリン。脂肪酸が存在する場合には、それらは６個までの二重結合を含有し、骨格に結合される１２〜２４個の炭素鎖長であってよく、この脂肪酸は異なっていてよく（不斉）、又は１個だけの脂肪酸鎖が存在していてよく、例えば、リソレシチンである。特に、非‐陽イオン脂質が、天然起源、例えば、卵黄、ウシの心臓、脳又は肝臓、又は大豆から精製されるレシチン（ホスファチジルコリン）から誘導される場合には、混合組成物も可能である。
【００４４】
”リポソーム”は、実験室で人工的に製造された顕微鏡的球状の膜‐包囲小嚢（直径約５０〜２０００nm）に関する。用語”リポソーム”は、脂質二重層によって包囲される任意の画分を含む。リポソームは、脂質小嚢としても言及される。リポソームを形成するために、脂質分子は、細長い無極性（疎水性）部分及び極性（親水性）部分から成る。分子の疎水性及び親水性部分は、有利に、細長い分子構造の２つの末端に置かれる。そのような脂質が水中に分散される場合には、それらは積層として言及される二重層膜を自発的に形成する。積層は、互いに向かい合うその無極性（疎水性）表面及び水性媒体に向かうその極性（親水性）表面を有する脂質分子の２枚の単層シートから成っている。脂質によって形成される膜は、細胞の内容物を包囲する細胞膜のそれと同様の方法で水相の一部分を包囲する。従って、リポソームの二重層は、細胞膜中に存在する蛋白質成分を含まない細胞膜に類似している。本発明に関して使用されるように、用語のリポソームは、多層リポソームを包含し、これは、一般に約１〜約１０μｍの範囲の直径を有し、かつどこでも水相の層と交互する同心の脂質二重層２〜１００から成り、かつ単一の脂質二重層から成る単層小嚢も包含する。後者は、多層リポソームを超音波に暴露することによって、一定の大きさの孔を有する膜を通して加圧下に押出すことによって、又は高圧均質化によって製造することができる。これらの方法のもう１つの結果は、しばしばリポソームの明確に限定された寸法分配が達成されることである。限定された孔径（典型的な値は１００、２００、４００又は８００nmである）の膜を通す押出しによって、膜孔の大きさに近似した寸法分配を有するリポソームが達成され得る。超音波及び高圧均質化法によって、限定された寸法分配が、実験的条件の関数としての分子自律形成によって得られる。
【００４５】
”リソ脂質”は、１個の脂肪酸エステルが分解して、１個の遊離ヒドロキシル基を有するグリセロール骨格になった脂質に関する。
【００４６】
”リソ燐脂質”は、１個の脂肪酸エステルが分解して、１個の遊離ヒドロキシル基を有するグリセロール骨格になった燐脂質に関する。
【００４７】
”ミセル”は、コロイド状懸濁液中の両親媒性分子の凝集体に関する。
【００４８】
”ナノ凝集体”は、物理的引力によって一緒に捕捉された小粒子から集められるナノメーター〜マイクロメーターの大きさの集合体に関する。
【００４９】
”ナノ粒子”は、ナノメーター〜マイクロメーターの大きさの実体に関する。
【００５０】
”負電荷脂質”は、負の純電荷を有する脂質に関する。本発明では、ｐＨが３〜９、有利に５〜８の範囲にある環境に言及される。例は、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（特異的糖に限定されるものではない）、脂肪酸、ステロールである。
【００５１】
”中性脂質”は、中性の純電荷を有する脂質、例えば、コレステロール、１，２‐ジアシル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミンに関し、ジオレオイル（DOPE）、１，２‐ジアシル‐グリセロ‐３‐ホスホコリン、スフィンゴミエリンを包含するが、これに限定されるものではない。本発明では、ｐＨが３〜９、有利に５〜８の範囲にある環境に言及される。
【００５２】
”粒径”は、粒子の大きさに関する。粒径を実験的に測定するために、Malvern Zetasizer 1000 又は3000 (Malvern, Herrenberg, Germany）を用いる、動的光散乱（DLS）測定を行なった。定量的データ分析（Ｚ（平均及びPI）の測定）のために、水相が凍結保護剤を一定の範囲まで含有したとしても、全ての例で、純水のパラメーター（屈折率、密度、粘度）は打ち込まれた。従って、絶対数のために、文献データに関する一定の系統的偏差が考慮されるべきである。
【００５３】
”ポリエチレングリコール化脂質”は、１個以上のポリエチレングリコール残渣を有する脂質に関する。
【００５４】
”製薬学的組成物”は、２種以上の異なる物質の、各成分によって保有されるよりも優れた製薬学的特性を有する組合せに関する。
【００５５】
”燐脂質”は、グリセロール骨格、ホスフェート基及びエステル結合によってグリセロール骨格に結合される１種以上の脂肪酸から成る脂質に関する。
【００５６】
”陽電荷脂質”は、陽イオン脂質の同意語に関する（定義については、”陽イオン脂質”の定義を参照）。本発明では、ｐＨが３〜９、有利に５〜８の範囲にある環境に言及される。
【００５７】
”ステロール”は、ステロイドアルコールに関する。ステロイドは、シクロペンタノペルヒドロフェナントレンという化合物から誘導される。周知のステロールの例は、コレステロール、ラノステロール及びフィトステロールを包含する。
【００５８】
”治療剤”は、癌のような病気の症状の程度を軽減する種に関する。そのような化合物は、例えば、一次腫瘍増殖及び有利に、癌の転移ポテンシャルを軽減することができる。選択的に、そのような化合物は、例えば、微小血管の大きさ又は数を減少させるか、又は血管密度比を減少させることによって、腫瘍血管を減少させることができる。
【００５９】
種の”実質的には無い”は、HPTLCによって検出されないことに関する。
【００６０】
”ゼータポテンシャル”は、特定の条件下に、レーザードップラー（Laser Doppler）微小‐電気泳動を用いるゼータザイザー（Zetasizer）3000のような装置で測定されるコロイド粒子のような粒子の表面ポテンシャルに関する。ゼータポテンシャルは、総合溶液と流体力学的剪断又は拡散層の範囲との間の境界でのポテンシャルを示す。本発明について、ゼータポテンシャル測定は、Malvern Zetasizer 3000 (Malvern, Herrenberg, Germany）を用いて行なわれた。
【００６１】
本発明は、過去３０年以内のＣＰＴ剤の開発に反する方法を追求し、それというのも、この方法は、ＣＰＴ剤のラクトン型の代わりにカルボキシレート型を使用することに基づいているからである。本発明の組成物は、CPT‐カルボキシレート及び両親媒性低分子量化合物又はポリマーであってよい陽イオン有機対分子から得られる（図３）。組成物のために、有機性対分子が低分子量両親媒体であるか又はポリマーであるかには無関係で、略語CM‐CPT（陽イオン分子‐CPT）が、使用される。
【００６２】
CM‐CPTは、構成分子のそれとは明らかに異なるその物理的‐化学的特性を特徴とする。これは、例えば、分光法測定によって、カルボキシレート及びラクトン型に対照して、独立分子型として見なすことができる（図４、図５）。親油性であるCPTのラクトン型又は親水性であるカルボキシレート型に反して、CM‐CPTの特性は、有機対分子によって決定され、即ち、これは両親媒性であってよく、構成される分子ナノ凝集体の集合のために使用され得る（図６）。意外にも、本発明組成物が製薬学的製剤を製造するために有用であることが判明し、それというのも、これは、CPTの細胞分裂抑制活性を高め、一方で、カルボキシレートの不利な点をラクトン型のそれと同様に克服するからである。
【００６３】
本発明の利点は次の通りである：
本発明のCPT‐脂質組成物を用いて、ＣＰＴ剤の不利な点までは保有しない活性組成物が得られる。ラクトン型の固有の難点（水性環境中の低可溶性及び安定性）及びカルボキシレート型の難点（低い膜透過性、低い活性及び副作用の誘発）が克服される。
【００６４】
CN‐CPTを用いて、CPT‐カルボキシレートによって引き起こされる副作用を示さない活性抗癌剤が得られる。
【００６５】
この組成物を、水性環境中に入れることができ、安定したコロイド状ナノ凝集体を形成することができる。高い薬剤／脂質率を有するリポソームを得ることができる（図６）。遊離CPT‐カルボキシレートの放出及びそれにより副作用が軽減される。
【００６６】
陽イオン対分子への効果的な結合及び脂質マトリックス（例えば、リポソーム二重層）中への埋込のために、CM‐CPTは、血液／血清相互作用に対して保護され、これらの相互作用によって引き起こされるCPTの非活性化が抑制される。
【００６７】
CM及び有機陽イオン分子のイオン対は両親媒性を有するので、その膜可溶性は上昇され、薬剤の細胞取込は容易／可能にされる（図７）。異なる取込メカニズムが可能である。いわゆる飲食作用の経路に加えて、リポソーム担体と細胞膜及び随伴物との融合、細胞質中への複合体の直接放出又は血漿膜を通じて細胞質への複合体の直接透過が起こり得る。
【００６８】
ここで挙げられる両親媒体と同様にポリマーも、水性環境中で、様々な型のコロイド状ナノ粒子系を形成することができることは周知である。これらは、ミセル、リポソーム、ナノカプセル、任意の他の型のナノ粒子の懸濁液、又は同様にエマルジョン及びゲルも包含する。前記の本発明組成物の物理的‐化学的特性は、構成する両親媒体又はポリマーによっても決定される。従って、安定したナノ凝集体の懸濁液は、構成する両親媒体及び／又はポリマーと同様の方法で、本発明組成物から製造することができる。
【００６９】
従って、本発明のもう１つの観点は、本発明組成物から成り、かつ全体に陽の電荷を有するコロイド状ナノ凝集体に関する。陽イオンコロイド状ナノ凝集体中のＣＰＴ剤の割合は、有利に約５０モル％よりも少ない（リポソームの場合には、水性画分はこの平衡で無視される）。若干の実施態様では、ナノ凝集体は、カンプトテシン剤を約０．１モル％〜約５０モル％まで、及び他の実施態様では、約１モル％から約３０モル％までの割合で含有する。他の実施態様では、カンプトテシン剤は、約３モル％〜約１０モル％で存在する。
【００７０】
コロイド状ナノ凝集体は、表面層中に、陽イオン脂質を、少なくとも約３０モル％〜多くとも約１００モル％以下、有利に４０モル％〜約９８モル％、より有利に約５０モル％〜約９８モル％の量で含有してよい。
【００７１】
更に、本発明のナノ凝集体は、負及び／又は中性の純電荷を有する両親媒体（陰イオン及び／又は中性両親媒体）を含有することができる。これらは、負又は中性の純電荷を有するステロール又は脂質、例えば、コレステロール、燐脂質、リソ脂質、リソ燐脂質、スフィンゴ脂質又はポリエチレングリコール化脂質から選択され得る。従って、有用な陰イオン及び中性脂質は次のものを包含する：ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（特異的糖に限定されるものではない）、脂肪酸、カルボン酸残基を含有するステロール、コレステロール、ジオレオイル（DOPE)を含むが、これに限定されるものではなく、１，２‐ジアシル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン、１，２‐ジアシル‐グリセロー３‐ホスホコリン、スフィンゴミエリン。グリセロール骨格に結合する脂肪酸は、二重結合の特異的長さ又は数に限定されるものではない。燐脂質は２種の異なる脂肪酸を有することもできる。
【００７２】
有利な実施態様では、中性両親媒体は、ジアシルホスファチジルコリンである。
【００７３】
本発明のナノ凝集体は、表面層中に、中性及び／又は陰イオン脂質を約０〜約７００モル％、有利に約２０モル％〜約５０モル％、最も有利に約３０モル％〜約４０モル％の量で含有してよい。
【００７４】
本発明に関して、全体陽イオン電荷は、コロイド状ナノ凝集体の分子表面層における過剰の陽電荷分子を意味する。従って、有利な実施態様では、本発明のナノ凝集体は、過剰の陽イオン脂質少なくとも２０モル％、有利に少なくとも３０モル％、最も有利に少なくとも４０モル％を含有する。例として、ナノ凝集体の表面が負電荷脂質又は負電荷ＣＰＴ剤１０モル％を含有する場合には、これらの電荷要求を満たすために、陽電荷脂質の量は、少なくとも３０％、有利に少なくとも４０モル％、最も有利に少なくとも５０モル％でなけれなばらない。ゼータポテンシャルの測定は、コロイド状ナノ凝集体の純電荷を試験するために使用され得る。ゼータポテンシャルは、組成物に応じて、有利に、２５mV〜１００mV、より有利に３５mV〜７０mVの範囲である（KCl溶液約０．０５M中で、約ｐH７．５で、室温で測定され、本発明に関して有用である。しかし、この条件下で測定された２５mVよりも低いゼータポテンシャル値は、例えば、ナノ凝集体の表面がポリエチレングリコール化脂質を含有する場合には、ポリマーグラフトコロイド状ナノ凝集体について決定され得る。
【００７５】
本発明のナノ凝集体は、異なる寸法範囲を有する、異なる型の超分子集合体として存在することができる。従って、他の有利な実施態様では、本発明のナノ凝集体は、エマルジョン、小滴、リポソーム、ミセル、ナノ粒子又はナノカプセルである。粒径は、約５nm〜約２０００nm、有利に５０nm〜１０００nm、より有利に１００〜５００nmの範囲にある。
【００７６】
本発明の有利なナノ凝集体は、陽に電荷された部分の純超過が、分子の全数に対して、少なくとも約２０％、有利に少なくとも約３０モル％、より有利に少なくとも約４０％、最も有利に少なくとも約５０％であるという量のDOTAP、DSTAP、DPTAP、DMTAP、DLTAP、DODAP、他の同族のDOTAP又はDODAPから成る陽イオンリポソーム又は任意の他の陽イオン脂質である。リポソームは、更に、DOPC、ポリエチレングリコール化脂質又は中性又は負の純電荷を有する任意の他の脂質を含有してよい。ポリエチレングリコール化脂質画分は、有利に、約１０％まで、より有利に約５％までである。リポソームがポリエチレングリコール化脂質を含有しない場合には、このリポソームのゼータポテンシャルは、有利に約３０mV以上、より有利に約４０mV以上、最も有利に約５０mV以上である。ポリエチレングリコール化脂質又は任意の他の脂質が存在する場合には、前記の条件下に測定される有利な組成物のゼータポテンシャルは、より低い、即ち、ゼロに近い範囲にあってよい。
【００７７】
本発明のもう１つの目的は、陽イオンコロイド状ナノ凝集体、例えば、フリーズ‐ドライ（凍結乾燥）され、長時間貯蔵され、次いで乾燥した凍結乾燥体に除去した量の水を加えることによって再構成され得るリポソームを得ることである。凍結乾燥体の再構成は、その成分の基本的割合を失うことなくそれらが使用され得るべき時と場所で、フリーズ‐ドライ法（凍結乾燥）、貯蔵及び再構成段階中に行なわれる。後者を達成するために、１種以上の保護剤、例えば、凍結保護剤が存在することができる。従って、有利に、本発明のナノ凝集体は、凍結保護剤を含有し、ここで、凍結保護剤は糖又はアルコール又はその組合せから選択される。凍結保護剤は、有利に、トレハロース、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、デキストラン、マンニトール又はソルビトールから選択される。凍結保護剤は、凍結乾燥体がそれから形成される水溶液（ｍ／ｖ）に対して、約１％〜約２０％、有利に、５％〜１５％、最も有利に６％〜１２％の量で存在することができる。相応する脂質／凍結保護剤のモル比は、リポソーム濃度に依存する。組成物３０mMについては、モル比は約１：１〜１：２０、有利に１：５〜１：１５、最も有利に１：６〜１：１２である。他のリポソーム濃度のモル比については、その数値は２つの濃度の間の関係によって得られる因子を乗じなければならない。
【００７８】
濃縮された脂質及びCM‐ＣＰＴ剤懸濁液又はゲルを得ることが本発明のもう１つの目的である。懸濁液又はゲルの濃度は、有利に、１００mMよりも高いが、２００mM、５００mM又はより高くてもよい。濃縮物はそのものとして貯蔵されてよく、又は凍結又は凍結乾燥が適用されてよい。１種以上の保護剤、例えば、凍結保護剤、緩衝液又は他の添加剤が存在することができる。濃縮物は、更に希釈されたリポソーム懸濁液を得るために緩衝液及び他の添加剤を含有することができる水相で再構成され得る。
【００７９】
本発明の他の観点に従って、製薬学的有効量の本発明組成物又は本発明のコロイド状ナノ凝集体を、製薬学的に認容性の担体、希釈剤及び／又は補助剤と一種に含有する製薬学的製剤が得られる。
【００８０】
本発明のもう１つの観点は、本発明のナノ凝集体を製造する方法に関する。コロイド状ナノ凝集体は、当業者に周知の様々な方法で形成され得る。音波処理、渦動処理、機械的攪拌、静的混合、均質化、注入、微細流動化、コロイドミル及び／又は圧力乳化機を、原料の様々な添加順序を包含する様々な型のナノ凝集体を製造するために使用することができる。本発明のナノ凝集体は、均質化、脂質膜、溶剤混合によって、又は溶剤注入法によって形成され得る。
【００８１】
本発明のナノ凝集体は、次の段階から成る方法によって製造され得る：
a）有利にカンプトテシンカルボキシレートとしてカンプトテシン剤を得ること、
ｂ）前記薬剤と、陽の純電荷を有する（陽イオン両親媒性）陽イオン両親媒体とを、前記薬剤がそのカルボキシレート型で前記の陽イオン両親媒体と会合する条件下で接触させること、
ｃ）段階ｂ）での負及び／又は中性の純電荷を有する（陰イオン及び／又は中性両親媒性）少なくとももう１種の両親媒体を任意に混合させること及び
ｄ）前記の全体陽イオン電荷を有するコロイド状ナノ凝集体を形成すること。
【００８２】
CPT‐カルボキシレートを製造するための有利な方法は次の通りである：
i）ラクトンを好適なアルカリ性環境中に溶かし、次いで、任意に、この溶液を所望のpHにし、又は
ii）ラクトンを好適なアルカリ性環境中に溶かし、乾燥したカルボキシレート塩を、乾燥、再結晶又は沈殿によって得るか、又は
iii）ラクトンを揮発性アルカリ溶剤（例えば、好適な濃度のアンモニア）中に溶かし、次いで、溶剤を蒸発させる。そうして、他の添加物を含まずに、純粋なCPT‐アンモニウム塩を得る。
【００８３】
各例で、標準無機又は有機塩基、例えば、NaOH、KOH、NH４OH、トリス（TRIS）等を使用することができる。溶液はH２O及び有機溶剤（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン）を任意の好適な割合で含有することができる。
【００８４】
溶剤注入法は次のように行なわれる：
a）少なくとも１種の陽イオン両親媒体及び任意に少なくとも１種の陰イオン及び／又は中性両親媒体から成る有機溶液を、カンプトテシン剤又はその誘導体のカルボキシレート型の水溶液に加え、又は
ｂ）少なくとも１種の陽イオン両親媒体及び任意に少なくとももう１種の陽イオン、陰イオン及び／又は中性両親媒体及びカンプトテシン剤又はその誘導体から成る有機溶液を、水溶液に加え、
ここで、前記の水溶液はpH値３〜９、有利に５〜８を有する。
【００８５】
溶剤混合法は、水溶液及び非‐水溶液を混合させて行ない、ここで、溶液は、陽イオン両親媒体、陰イオン両親媒体、中性両親媒体、ポリマー緩衝液、凍結保護剤及び他の添加剤を含有することができ、かつ少なくとも一部分の両親媒体を非‐水相中に溶かす。次いで、非‐水性溶剤及び他の不所望な成分を好適な方法、有利に蒸発又は透析によって除去する。脂質及びカンプトテシン剤を含有するリポソームのコロイド状懸濁液又は濃縮ゲルが得られる。ゲル又は懸濁液を貯蔵のために凍結又は凍結乾燥させることができる。これを好適な水相で再構成させて、所望のコロイド状ナノ凝集体を得ることができる。
【００８６】
選択的に、有利な実施態様で、脂質膜を異なる２つの方法で形成させることができる：
カンプトテシン剤は、直接、それを少なくとも１種の陽イオン両親媒体及び任意に少なくとも１種の陰イオン及び／又は中性両親媒体及びカンプトテシン剤から成る有機溶液中に溶かすことによって、又は先ず薬剤を含まない脂質膜を形成させることによって配合させることができる。次いで、脂質膜を、最初の場合には、薬剤を含まない水溶液に入れ、二番目の場合には、カンプトテシン剤を含有するそれに入れる。
【００８７】
もう１つの有利な実施態様では、有機溶液は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、エチレングリコール、テトラヒドロフラン、クロロホルム又はジエチルエーテル又はこれらの溶剤の混合物から選択される有機溶剤から成る。
【００８８】
更に、水溶液は凍結保護剤を含有し、これは、約２０％（ｍ／ｖ）までの範囲で、糖又はアルコール又はその組合せ、例えば、トレハロース、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、デキストラン、マンニトール又はソルビトールから選択される。安定化剤は、リポソーム分散液の全容量に対して、有利に、約１％（ｍ／ｖ）〜約２０％（ｍ／ｖ）の範囲で、最も有利には約５％（ｍ／ｖ）〜約１５％（ｍ／ｖ）の範囲で使用される。相応する脂質／凍結保護剤モル比は、リポソーム濃度に依存する。配合物３０mMについては、モル比は有利に１：１〜１：２０、最も有利に１：５〜１：１５である。他のリポソーム濃度についてのモル比は、２つの濃度の関係から得られる因子とのこれらの数値の乗数から得られる。
【００８９】
他の有利な１実施態様では、本発明方法は、更に、少なくとも１回の透析及び／又は少なくとも１回の均質化及び／又は任意に少なくとも１回の無菌濾過及び／又は任意に凍結乾燥及び／又は任意に再構成段階を包含することができる。透析は、溶液から遊離カンプトテシン剤を除去するために、又は非‐水性溶剤又は他の成分を除去するために必要である。前記の方法によって得られるナノ凝集体は、必ずしも所望の寸法分配を持たないので、次に、均質化段階を行なうことができる。均質化は、限定された孔径を有する膜を通す押出、高圧均質化、超音波処理、高速均質化、又は当業者に周知の任意の他の均質化によって行なうことができる。
【００９０】
本発明方法の他の実施態様では、カンプトテシン剤の水溶液を、活性化合物を含まない既製の陽イオンリポソームの懸濁液に加える。リポソーム懸濁液は、脂質５mM〜１００mMの範囲の濃度であってよく、又は脂質１００mM〜５００mM又はより高い（ゲル）濃度であってよい。
【００９１】
血管形成に関連した病気は、血液供給に依存している。血管系の局所的断絶は、細胞死なだれを生じさせる。血管内皮は血液と直接接触している。様々な病気は、前記の方法及び組成物で予防及び治療することができると考えられる。有利な実施態様では、本発明によって得られる組成物、コロイド状ナノ凝集体又は製薬学的配合物が、病気、例えば、癌、様々な炎症性の病気、糖尿病網膜症、リウマチ類似関節炎、炎症、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍、斑変性、造血性及び充実性腫瘍を予防及び／又は治療するために使用され得る。もう１つ有利な実施態様では、本発明の方法及び組成物は、充実性腫瘍及びその転移、例えば、膀胱、脳、乳房、頚部、結腸直腸、子宮内膜、頭部及び頚部又は腎臓癌、白血病、肝臓又は肺癌、リンパ腫、メラノーマ、非‐小‐細胞肺、卵巣、膵臓又は前立腺癌を予防及び／又は治療するための医薬剤を製造するために使用され得る。
【００９２】
本発明の組成物及びナノ凝集体は、特に内皮細胞を標的にすることに好適である。従って、本発明のもう１つの目的は、血管形成血管標的部位への抗分裂活性を有するカンプトテシン剤の選択的投与のための医薬剤を製造することであり、この際、投与は次の段階から成る：
a）本発明のカンプトテシン剤又はその誘導体、及び／又はコロイド状ナノ凝集体及び／又は製薬学的組成物の膜透過組成物を得ること、
ｂ）前記の組成物及び／又はコロイド状ナノ凝集体及び／又は製薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与すること、
ｃ）組成物及び／又はコロイド状ナノ凝集体及び／又は製薬学的組成物を標的部位と結合させること、及び
ｄ）前記のカンプトテシン剤又は前記の誘導体を標的部位で放出し、それによって活性化させること。
【００９３】
有利な実施態様では、段階a）で本発明組成物及び／又は本発明コロイド状ナノ凝集体及び／又はその製薬学的組成物を得る。
【００９４】
段階ｄ）は、有利に、飲食細胞運動及び／又は細胞膜との融合及び／又は細胞膜を横切る受動的又は能動的拡散から成り、この際、飲食細胞運動は、前記のカンプトテシンのリポソーム画分への放出を包含する。
【００９５】
図の説明
図１：ラクトン型のカンプトテシン（左）とカルボキシレート型のカンプトテシン（右）との間の平衡。この平衡はｐＨ依存性であり、かつ可逆性である。７．５に近い、及び７．５以上のｐＨ値で、カルボキシレート型は優勢である。
図２：CPT‐カルボキシレートの高められた細胞毒性についての理由は、負電荷によるその減少された膜透過性である。従って、標的部位への投与は抑制される。他方で、より酸性のpHが存在する器官では、CPTは再構成されてラクトン型となり、これは次いで更に容易に細胞膜を貫通して、毒性の副作用を引き起こす。
図３：CPT（CM‐CPT）のカルボキシレート型、ラクトン型及び陽イオン分子‐結合型の間の平衡。
図４：クロロホルム／メタノール中に溶かしたカンプトテシン（遊離CPT）及びpH７．５での水性環境中のリポソーム配合物としてのCM‐CPT（リポソームCPT）の励起及び蛍光スペクトル。
図５：異なる条件下でのCPTのUV‐visスペクトル。リポソームCPTのスペクトル（トップ曲線）は全ての他の条件下でのそれとは明らかに異なっている。特有の形は、リポソームCPT、CPT‐カルボキシレート（上から第二及び第三曲線）及びCPTのラクトン型（上から第四及び第五曲線）について描き出され得る。ラクトンのスペクトルは、溶剤環境への強い依存性も示す。明確にするために、スペクトルを垂直に移動させる。
図６：ラクトン型（左）及び陽イオン両親媒体と会合させたカルボキシレート型（右）のCPTのリポソーム構成。限定された量のラクトンだけがリポソームの疎水性画分中に埋め込まれ得る。CM‐CPTはその両親媒性のために、膜の不可欠部分として作用し、非常に高い薬剤／脂質比を得ることができる。
図７：血漿膜を経る細胞取込。CPTと両親媒体との会合は親油特性を高める。従って、結合及び／又は融合、及び膜を横切る透過後の血漿膜への挿入の過程が容易に行なわれ得る。飲食細胞運動へのpH移動は、ラクトン型のCPTの放出に有利である。
図８：溶液中に存在するCPT‐カルボキシレートと一緒の脂質懸濁液の透析。溶液は脂質中１０mM、CPT‐カルボキシレート１mM、pH７．５であった。DOPCで事実上全てのCPTは透析物中に放出され、一方で、DOTAPで基本的滞留効果が測定される。
図９：異なる方法によって製造されるDOTAP及びDOPCからの脂質懸濁液中でのCPTの蛍光異方性測定。測定は、トリス‐緩衝液１０mM、pH７．５及び水相中に存在するトレハロース１０％を用いて行なわれた。DOPCについては、標準膜法が使用された（第二欄）。第三欄は、膜法によるDOTAP及びラクトン型のCPTからのリポソーム形成についての結果を示し、第三欄はCPT‐カルボキシレートをラクトンの代わりに使用した場合の結果を示す。第五欄は、CPT‐カルボキシレートの水溶液へのエタノール注入を示す。DOTAPを用いる場合だけ、本質的異方性が検出された。エタノール注入法で、値は最高であり、この場合、結合効力も最高であった。
図１０：CPT及び１０‐OH‐CPTを用いたDOTAP測定とDMTAP測定との蛍光異方性測定の比較が示される。DMTAPについては、測定は室温（RT)及び４０℃で行なわれた。飽和脂肪酸鎖を有するDMTAPは、４０℃では液様状態で存在し、室温では固体様状態で存在している。DOTAPは室温で既に液様状態である。液様状態のDMTAPでは、DOTAPと同様に、異方性は、高く、より高い。１０‐OH‐CPTでは、CPTと同様に、異方性は一層高い。
図１１：カンプトテシン配合物RM541、542、543、544によるEa. Hy 926 細胞増殖の阻害。詳細は明細書参照。
図１２：ヌードマウスのA-375メラノーマにおけるLipo Camの治療効力。詳細は明細書参照。
図１３：ヌードマウスのA-375メラノーマにおけるLipo Cam IV及びVIの治療効力。詳細は明細書参照。
図１４：ヌードマウスのA-375メラノーマにおけるLipo Cam IV及びPEG-Lipo Cam IVの治療効力。詳細は明細書参照。
【００９６】
次の実施例につき本発明の範囲を説明するが、これに限定されるものではない。他の一般的及び特異的立体配置は当業者に周知である。
【００９７】
例
１．CPT‐カルボキシレート塩製造
ＣＰＴ剤のカルボキシレート塩は、有利にpH９以上のアルカリ性環境にＣＰＴ剤を置くことによって得られる。明確には、次の段階から成る２つの方法が適用された：
a）ＣＰＴ剤をNaOH中に溶かし、即ち、NaOH／CPTモル比は、≧１でなければならない。CPTを溶かすために、モル比１：１が既に好適であるが、更に高い過剰量のアルカリ性化合物を使用することもできる。過剰量は１．０５と同様に少なくてよく、即ち、薬剤濃度１００mMを有するCPT‐カルボキシレート溶液１００ｍｌについては、CPT１０ミリモルをNaOH（１．０５mM）１００ｍｌ中に溶かす。２０mMと同様に高い濃度を得ることができる。溶液は他の添加剤、例えば、イオン又は凍結保護剤を含有してもよい。次いで、必要とする場合には、緩衝液又は酸（ビス、トリス、HEPES、HCl）によって、所望によって溶液をより低い又はより高いpHにすることができる。溶液を希釈し、濃縮させ（例えば、溶剤蒸発によって）、かつ他の成分（イオン、緩衝液）を加えることができる。所望の場合には、Na‐CPT塩を沈殿させ、乾燥純粋化合物として得ることができる。乾燥CPTカルボキシレートを製造するための他の好適な方法は、凍結乾燥である。この方法については、任意の他の塩基又は好適なアルカリ性化合物を適用することもできる（KOH、NH４OH、トリス等）。
ｂ）薬剤を過剰量の揮発性塩基中に溶かし、次いで、塩基を蒸発させ、純粋なCPTカルボキシレート塩を得る。例えば、ＣＰＴ剤２ｍｇ／ｍｌを２５％NH４OH中に溶かすことができる。その後に、溶剤を蒸発させる。この方法で、純粋なＣＰＴ剤‐カルボキシレートのアンモニウム塩が得られる。他の処理については、これを所望のpH及び選択された環境条件（緩衝液、凍結保護剤）の水相中に入れることができる。選択的に、これを好適な有機相中に入れることができる。
【００９８】
２．CM‐CPT組成物の合成
陽イオン両親媒体の溶液をカルボキシレート塩に添加することによって、CPT‐カルボキシレート塩からCM‐CPTが得られる（陽イオン分子及びカンプトテシンの組成物）。所望の場合には、次いで、溶剤を蒸発させる。溶剤は、エタノール、クロロホルム、クロロホルム／メタノール、又は任意の他の有機溶剤又は溶剤混合物であってよい。選択的に、陽イオン両親媒体の溶液をCPT‐カルボキシレートの水溶液に加えることができる。対分子として、陽電荷ポリマーの場合には、後者は水相中に存在していてもよい。他の処理について、CM‐CPT溶液又は懸濁液は、製造されたそのものを使用することができ、又は純粋な組成物を得るために、溶剤を除去することができる。その後に、それを所望の媒体中に入れることができる。例えば、約１：１のモル比を有するCPT‐DOTAP１mMを得るために、CPT１ミリモルをNH４OH中に溶かし、次いで、溶剤を方法１ｂ）に従って蒸発させる。塩を残留させるために（その場合には、フラスコの内壁に薄膜として存在する）、EtOH中のDOTAPの溶液（１mM）１０００ｍｌを加える。他の場合において、これが他の配合物に好適である場合には、より低いCM／CPTモル比、例えば、１０／９０、５／９５、１／９９又は０．５／９９．５が実現され得る。
【００９９】
３．リポソーム配合物
配合法は次の段階から成ってよい：
１．CPTカルボキシレート製造
２．（任意に）CM‐CPT製造
３．好適な方法による脂質及び薬剤成分からのコロイド状懸濁液の生成
４．（任意に）均一の大きさの単層リポソームを得るために膜を通過させる押出
５．（任意に）非‐カプセル包入薬剤及び／又は成分又は溶剤の分離のための透析又は類似方法
６．（任意に）高濃縮リポソームゲルを得るための濃縮段階
７．（任意に）凍結乾燥
８．（任意に）凍結
９．（任意に）好適な環境条件下に再構成。
【０１００】
コロイド状リポソーム懸濁液の生成のために、異なる方法論を適用することができる。次に、最も適切な方法を簡単に説明する。
【０１０１】
膜法
リポソームを、例えば、文献に記載されている周知の膜法によって形成することができる。簡単には、脂質又は脂質プラス薬剤の有機溶液から、溶剤を除去し、脂質（又は脂質プラス薬剤）の薄膜をフラスコの内壁で形成させる。分子薄膜を、例えば、緩衝液、イオン、凍結保護剤等の他の成分を含有することができる水相中で再懸濁させる。この方法を用いて、リポソーム懸濁液を自己集合法で形成させる。標準配合物は、クロロホルム／メタノール１０／１中の溶液から、DOTAP９０マイクロモル及びカンプトテシン１０マイクロモルの膜を形成することによって得られる。次いで、全リポソーム濃度（脂質＋薬剤）が１０mMである懸濁液を得るために、膜を水相１０ｍｌで再構成させる。
【０１０２】
水溶液は、再構成後に所望のpHを得るために、凍結保護剤、例えば、葡萄糖又はトレハロース及び／又は緩衝液（トリス）を含有することができる。典型的なpHは、７〜８の範囲にある。しかし、脂質に依っては、より高い（pH９まで上がる）又はより低い（pH５まで下がる）値を選択することができる。凍結保護剤については、典型的な条件は、水溶液中に存在するトレハロース５〜１０％に相応する。リポソーム配合物のpHは、形成後に更なる処理のために変更することができる。
【０１０３】
そうして、薬剤／脂質比１：９及び全（脂質＋薬剤）濃度１０mMを有するリポソーム配合物が得られる。他の典型的なモル濃度は、１５mM、２０mM、２５mM又は３０mMである。必要な場合には、５０mMまで又はより高いモル比濃度を配合させることができる。その場合には、１０mMについて前記した方法と同じ配合法を適用し、その際、薬剤、脂質及び溶剤の全量を所望の濃度に採用する。薬剤：脂質比は、通例は、１：９９〜２０：８０の範囲にあるように選択される。他のしばしば使用されるモル比は５／９５である。これらの配合物は、所望の最終配合物に採用される成分のモル量を用いて、前記の方法によって実現され得る。
【０１０４】
例えば、５／９５のモル組成を有する配合物（２５ｍＭ）１０ｍｌのために、DOTAP２３．７５マイクロモル及びカンプトテシン１２．５マイクロモルの膜を、緩衝液１０ｍｌで再構成させる。脂質相は、陽イオン脂質、例えば、DMTAP、DOTAP、DPTAP、DSTAP、DOTMA又はDDABだけで成り立つか、又は電荷及び非‐電荷の補脂質（colipids）６０％までを含有することができる。最も頻繁に本発明によって使用された標準配合物は、CPT／DOTAP／DPOC＝５：４７．５：４７．５、又は５：５５：４５又は１０：４５：４５又は１０：６０：３０から成る。
【０１０５】
表１に、そのようなリポソーム配合物の物理‐化学的特性付けからの結果を示す。表に挙げた配合物は、効力調査の場合と同様に試験された（図１２）。前記の方法によって、他の陽イオン脂質、例えば、DMTAP、DSTAP、DDAB、DOTMA等を含有する配合物を得ることができる。
【０１０６】
表１：頻繁に使用されるリポソーム配合物の物理的‐化学的特性付けからの結果
【０１０７】
【表２】
2005535633.tif 000004
【０１０８】
方法１a）の選択的実施態様で、カンプトテシンを、配合物のためのカルボキシレート又はカルボキシレート塩に変換させる。そうして、薬剤を陽イオン脂質に更に容易に会合させるために、CPTを’活性化’させるのであるが、相するに、カルボキシレートは後者に会合する分子型であるからである。CPTをNH３中に溶かし、薬剤の必要量（例えば、１aで記載した例中では１０μM）を含有する容量をフラスコに加える。溶剤の蒸発後に、CPT−カルボキシレートのアンモニウム塩の薄膜が形成される。次いで、脂質の有機溶液を加え、溶剤を蒸発させる。そうして、カンプトテシン及び脂質から成る薄膜が得られ、ここで、カンプトテシンは更に容易に陽イオン脂質に結合する。特に、低いpH値については、高い薬剤／脂質値を有するリポソームを得ることが更に容易である。その後の方法は、前記の１法と同様である。
【０１０９】
もう１つの実施態様で、CPT-カルボキシレートは、純粋な脂質膜の再構成のための水溶液の一部であってよい。その場合には、分離段階（下記したような）又は濃縮段階（下記のような）は配合後に行なわれ得る。
【０１１０】
有機溶液注入
リポソーム懸濁液は、脂質、又は脂質＋薬剤の溶液を水溶液中に注入することによって達成され得る。脂質又は脂質＋薬剤相のための典型的な溶剤は、エタノールである（’エタノール注入’）。この場合には、カンプトテシン‐カルボキシレートの水溶液中へのエタノール注入を行なうという意味において、新規の方法が使用される。薬剤及び陽イオン脂質の間の引力的相互作用によって、カンプトテシン‐含有リポソームは自己集合法で形成される。CPT／DOTAP１：９の懸濁液（１０mM）１０ｍｌを得るために、任意に前節で説明した他の添加剤を含有するCPT‐カルボキシレート溶液１０μMを製造する。他の典型的なモル濃度は、全脂質＋薬剤濃度の１５mM、２０mM、２５mM又は３０mMである。CPT／DOTAP５：９５の懸濁液２５mM（１０ｍｌ）を得るために、任意に前節で説明した他の添加剤を含有するCPT‐カルボキシレート溶液１２．５μMが製造される。カルボキシレートの溶液は、好適な量の塩基中にCPT‐ラクトンを溶かすことによって直接製造することができ、又は乾燥塩から製造することができる。有利に、CPT‐カルボキシレートのアンモニウム塩溶液又はNa‐塩溶液を使用する。
【０１１１】
水相は、実験の必要に応じて、pH５〜９を有することができる。ここで示される例において（表２）、pH７．５が選択される。エタノール性脂質溶液は濃度２００〜４００mMを有する。エタノール中の脂質溶液の好適な容量を、強力な攪拌下に注入する。前欄に記載された全組成物及び濃縮物はこの方法によって得られ得る。１：９懸濁液１０mMの場合には、エタノール中DOTAP溶液４００mM約０．２３ｍｌを使用することができ、５：９５懸濁液２５mMの場合には、エタノール中DOTAP溶液４００mM約０．５９ｍｌを使用することができる。エタノールについての選択として、他の好適な溶剤又はその混合物も使用することができる。それらは、典型的には、アルコール、エーテル、クロロホルム、炭化水素等である。超臨界状態にある溶剤、例えば、炭化水素、二酸化炭素、過弗化化合物等を適用することもできる。前記の配合法に続いて、押出（２）、透析（３）、濃縮段階（４）又は凍結乾燥を行なうことができる。
【０１１２】
純粋な脂質溶液の注入について選択的に、脂質及びCM‐CPT剤を両方とも注入溶液中に溶かすことができる。他の全ての段階は同じである。前記の配合法で、より良好に認知するために、DOTAP及びCPTを代表として使用したが、この方法は、挙げた他の脂質及びＣＰＴ剤にも適用可能である。陽イオン脂質としてDMTAP、DSTAP及びDDAPを用いて前記の方法で行なわれた配合物の例は、表４（添付）に示されている。数種の補脂質及びポリエチレングリコール化脂質（DOPC、コレステロール、PEG‐DOPE）を用いる配合物も挙げられている。使用される陽イオン脂質に依って、補脂質の画分は１〜７０モル％であってよい。ポリエチレングリコール化脂質は、有利に１〜１５モル％の範囲で使用される。
【０１１３】
更に、表には、他のＣＰＴ剤を用いる配合物例が示されている。他のCPT誘導体を用いる配合物は、同様の方法で形成される。結果を最適にするために、ＣＰＴ剤及び陽イオン脂質の分子特性に従って、明確な配合法を採用する。本明細書中、（i）より親水性である、（ii）より疎水性である、又は（iii）CPTと同様の特性を有するＣＰＴ剤を区別することができる。より親水性であるＣＰＴ剤については、有利に、前記のように、薬剤の水様液へのエタノール注入が行なわれる。そのような分子の例は、トポテカン及びイリノテカンであり、これらの化合物を用いる配合物例は表４に挙げられている。CPTよりももっと疎水性であるＣＰＴ剤については、有利に、膜法又は薬剤及び脂質の両方ともエタノール溶液中に存在するエタノール注入が行なわれる。より疎水性の誘導体の例はCPT‐オレエートであり、これは文献（Lundberg 1998）に記載されているような１０‐OH‐CPTから得ることができる。膜法でのCPT‐オレエートを用いる配合物例は、表４中に示されている。本明細書で、CPTと同様の分子特性を有する化合物の例は、１０‐OH‐CPT及びSN３８である。従って、CPTと同様に、前記の方法のいずれかを適用することができる。表４に、エタノール注入を用いる１０‐OH‐CPT及びSN３８での配合物例が示されている。
【０１１４】
押出
前記の方法によって得られるリポソーム懸濁液は、必ずしも所望の寸法分配を有するとは限らない。従って、その後に、限定された孔径の膜を通る押出を行なうことができる。本実験では、孔径２００nmの膜（Osmonics Inc., Poretics, ポリカルボネート０．２ミクロン）を通る押出を通例通り行なった。他の典型的な押出膜は、孔径１００nm又は４００nmであった。寸法分配は、準弾性光散乱（Malvern, Herrenberg, Germany）によって調整された。押出後のリポソーム寸法の例は、表１及び２に示されている。
【０１１５】
低分子化合物の分離
リポソーム懸濁液から低分子成分を分離するために、透析技術を使用した。これは特にエタノール注入での実験の場合であり、この際、非‐リポソームカンプトテシン画分に加えて、一定量のエタノールが懸濁液中に存在した。MWCO８０００〜１００００を有する再生セルロース製の透析管（Roth, Karsruhe Germany）を使用した。選択的に、ポリエーテルスルホン膜、MWCO５００００を有する、いわゆる”クロス‐フロー（cross-flow）”技術（Vivascience, Sartorius Group, Goettingen, Germany）を使用した。遊離CPTの放出を、UV‐vis分光によって測定した。放出されるCPT‐カルボキシレートの量は、脂質及び薬剤濃度、薬剤／脂質比、pH及び他のパラメーターに依存する。例を表８に示し、ここに、リポソーム懸濁液DOTAP／CPT及びDOPC／CPT９０／１０（１０mM）の透析からの結果を示す。希釈因子２０で、CPTの６０％以上がDOTAPリポソームによって保有され、一方で、DOPCリポソームでは、１０％以下が保有され、即ち、実質的に全てのCPTが放出された。
【０１１６】
凍結及び凍結乾燥
リポソーム配合物の凍結乾燥は、標準装置を用いて行い、プロトコールを選択した（例えば：Epsilon 2-12D, Control Unit LMC-2, Christ, Osterode, Germany）。懸濁液の組成及び物理的状態を再構成後に下記のように特徴付けた。準‐弾性光散乱測定によって証明されるように、リポソームの凝集状態を強烈に影響することなく、前記の懸濁液を凍結し、室温に戻すことができた。
【０１１７】
凍結乾燥／凍結前及び後の寸法測定からの結果を表２に示す。
【０１１８】
凍結乾燥は、液体配合物で不安定である配合物を得ることができる。例えば、熱力学的準安定状態は’凍結’であり、再構成後に、そのような配合物は、合理的な使用中（in-use）の安定を伴って得られ得る。液体状態で数時間又は数日の安定だけを有する配合物を凍結させ、使用直前に再構成させることができる。従って、凍結乾燥は、数日又は数時間だけの安定性を有する配合物に適用することができる。本発明では、凍結乾燥によって、液体配合物で可能である広いpH範囲で配合物を得ることができる。CPT及びDOTAPを有する液体配合物における有利なpH範囲は、６．５〜８である。それ以下で、CPT‐ラクトン形成が有利とされ、それ以上で、脂質加水分解が起こり得る。凍結乾燥物については、より低い（４まで下がる）及びより高い（８〜９まで上がる）pH値で配合物を実現得ることができる。
【０１１９】
更に、揮発性酸又は塩基を使用することによって、配合中及び凍結乾燥後の有利なpH状態を達成することができ、これらの状態は、配合中、即ち、凍結乾燥前の状態、及び凍結乾燥後、即ち、再構成された凍結乾燥物とは異なって選択され得る。配合中にHClを添加することによって、pHを、その製造状態中低下させることができる。HClは凍結乾燥で失われるので、再構成後の懸濁液のpHは再び上昇する。これは、ＣＰＴ剤及び陽イオン分子からの配合物の使用中（in-use）の安定を増加させることができ、この際、ＣＰＴ剤のラクトン‐カルボキシレート平衡はラクトンに向かって移動され、陽イオン分子への結合定数は低い。配合中にNH４OHを使用することによって、カンプトテシン剤は、凍結乾燥前の陽イオン分子への有効な結合のために’活性化’され得る（より高いpHがカルボキシレート形成に有利である）。凍結乾燥後に過剰のNH４OHは失われ、そうして得られるより低いpHは脂質安定に有利であり得る。
【０１２０】
表２：CPTを含有するDOTAPの選択されたリポソーム懸濁液の寸法測定からの結果。押出後（孔径２００nm）、透析後（遊離CPT‐カルボキシレートの除去のため）及び凍結乾燥、貯蔵及び本来の濃度への再構成後の測定を示す。結果は、好適な条件下に、リポソームの物理的状態に著しく影響しないで、懸濁液を貯蔵のために凍結乾燥させかつ再構成させ得ることを示す。
【０１２１】
【表３】
2005535633.tif 000005
【０１２２】
４．濃縮リポソーム懸濁液及びゲル
予備‐形成させたリポソーム懸濁液を、標準技術、例えば、ポリマー溶液に対する透析、’クロス‐フロー’又は溶剤の蒸発によって濃縮させる。本来の寸法分配を本質的に変化させずに、濃縮懸濁液を前に戻すことができ、又は任意の他の濃度にすることができる。
【０１２３】
濃縮リポソーム懸濁液及びゲルを直接製造するために、１種以上の成分を含有する（任意に）水相及び他の成分を含有する有機相を混合させる。例えば、CPTカルボキシレート２mM、０．５％トレハロース及び１％トリス／HCl緩衝液の水溶液をエタノール中のDOTAPの溶液６mMと混合させ、その最終CPT‐カルボキシレート／DOTAP比は１０／９０である。均質混合物が得られる。次いで、溶剤を減圧下室温で、所望の濃度が得られるまで蒸発させる。エタノールだけ（水の共融画分と共に）、又は高真空で水も蒸発させることができる。更なる蒸発のために、半‐濃縮懸濁液にエタノールを添加することが可能である。この方法で、例えば、１００mM、２００mM及び５００mMの濃度を有する懸濁液を得ることができる。より低い濃度に水又は緩衝液で再構成させた後に、寸法分配が先の最高濃度の関数であるリポソーム懸濁液が得られる。例を表３に挙げる。
【０１２４】
この概念のもう１つの実現で、純粋な脂質の濃縮ゲルを貯蔵のために製造する。適用の前に、ゲルをＣＰＴ剤の水溶液で希釈する。この方法で、CPT‐CM化合物のリポソーム配合物を得ることができる。各成分を最適条件下に個別に貯蔵し得るので、配合物の貯蔵問題は回避される。
【０１２５】
表３：濃縮配合物及びゲルの例
【０１２６】
【表４】
2005535633.tif 000006
【０１２７】
５．使用直前の純脂質リポソーム及び薬剤溶液の混合
CPT含有リポソームを、CPTカルボキシレートの水溶液と純脂質からの陽イオンリポソームの懸濁液との混合によって製造することができる。更に、純脂質からの陽イオンリポソーム懸濁液の凍結乾燥物を、CPTカルボキシレートの水溶液で再構成させて、CM‐CTのリポソーム配合物を使用するために準備形成させることができる。このことは、リポソーム懸濁液及びCPT‐カルボキシレート溶液を別々に製造し、かつ貯蔵し得るという利点を有する。リポソーム懸濁液をそのままで貯蔵し、又は凍結乾燥させることができる。CPT‐カルボキシレートを、溶液として、乾燥塩として又は凍結乾燥物として貯蔵し得る。例えば、トレハロース１０％中のDOTAP１００％からのリポソームの懸濁液３０mMを凍結乾燥させる。その後に、凍結乾燥物を、CPTカルボキシレートの溶液（１．５mM）２．０８８ｍｌで再構成させた。更に、トリス／HCl緩衝液（１００mM）２５０μｌ、pH７．５を加えた。挿入物の効力の物理的‐化学的測定は、前記の方法によって製造された配合物と同様のリポソームCPT画分を示した。リポソームの寸法分配は、著しくは影響されなかった。
【０１２８】
６．陽イオンポリマー結合CPT
陽イオンポリマーに結合するCPTは、CPT‐カルボキシレートの溶液及びポリマーの混合によって得られる。溶液は、実験的必要性及びポリマーの型に依存して、水溶液及び／又は有機溶剤溶液であってよい。
【０１２９】
ポリマーの典型的な型は、高分子電解質、例えば、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン又は多糖類（キトサン）である。成分を、任意に緩衝液、イオン及び凍結保護剤を含有する水相中に供給する。高分子電解質を、物理的収着（physisorption）によって、対電荷表面及びナノ粒子上に沈殿させる。陽及び負電荷ポリマー（例えば、ポリアリルアミン又はポリアリルアミン／CPT及びポリスチレンスルホネート）の反復沈殿によって、組織化された積層構造が得られる。沈殿法については、標準プロトコールが適用される（Radtchenko et al. 2000）。この技術で、CPT／高分子電解質から成るナノ粒子が制御法で集められる。
【０１３０】
７．物理的‐化学的特徴付け
a．陽イオン脂質とのCPT相互作用の基本的見地
本発明では、CPTと陽イオン有機分子との間の相互作用が基本である。従って、脂質へのCPT‐カルボキシレートの結合を、様々な方法によって特徴付けた。特に、他の初期の研究に対する本発明の利点を強調するために、DOTAP及びDOPCへの結合特性を比較した。
【０１３１】
リポソーム懸濁液を、CPT‐カルボキシレートの水溶液中への脂質溶液のエタノール注入によって製造し、遊離の非‐リポソームCPTを除去するために、懸濁液を透析した。リポソーム及び放出CPTの量をUV‐vis分光法によって測定した。図８に、同一条件下でDOTAP及びDOPCを用いた結果を示す。リポソーム懸濁液中に残留したCPTの濃度を透析時間の関数として描く。見てわかるように、DOPC懸濁液から実質的に全てのCPTが短時間で放出され、一方で、DOTAPリポソームについては、CPTの６０％以上がリポソーム懸濁液と共に残留している。このことは、DOPCではなく、DOTAPを用いてのみ、引力的相互作用及びリポソーム安定化効果を、CPT‐カルボキシレートについて測定することができることを示す。
【０１３２】
独立した方法から、CPT‐脂質相互作用についての更なる情報を得るために、蛍光異方性測定を行なった。異なる分子形のCPTと一緒にDOTAP及びDOPCからコロイド状懸濁液を製造した。蛍光異方性を、リポソームへのCPTの結合力についての測定として採用した。図９に、様々な測定結果を示す。予期したように、脂質を含まないCPT‐カルボキシレート溶液については、異方性はゼロであり、DOPCリポソームでも、異方性はむしろ小さかった。これに反して、DOTAPでの全３回の実験では、異方性は極めて高いリポソームへのCPT‐カルボキシレート結合を示した。製造様式に依存して、異方性は配合直後には異なっているが、数時間後には全ての場合に同じ平衡値が達成された。最高の異方性は、リポソームをCPTの水溶液中へのエタノール注入によって製造した実験で見出され、一方で、リポソームを膜法によりCPT‐ラクトンで製造した場合には、著しく低かった。このことは、実際には、CPTのカルボキシレート型が、陽イオン脂質への有効な結合及びCM‐CPT含有リポソームの形成に必要であることを示す。
【０１３３】
この推測は、図１０に描かれたデータによって明らかに支持される。２種の異なる陽イオン脂質、DOTAP及びDMTAP、及び２種の異なるＣＰＴ剤（CPT及び１０‐OH‐CPT）を用いたリポソームからの蛍光異方性測定が比較される。DMTAPを用いて、測定は室温及び４０℃で、即ち、DMTAPの液晶／ゲル相転移以下及び以上で行なわれた。低温で、DMTAPの疎水性鎖は固体様状態（ゲル相）であり、一方で、４０°では液様（液晶）相である。DOTAPは室温で既に液‐様状態である。見て判るように、４０℃でのDOTAP及びDMTAPの異方性は同じであり、一方で、RTでのDOTAPでは著しく低い。このことは、炭化水素鎖が二重結合を含有する又は含有しないに関係なく、炭化水素鎖が液様状態である場合が、リポソームへの有効な結合には有利であることを示す。CPTと１０‐OH‐CPTとの間の比較は、これらの推測が、CPTについてばかりでなく、CPT誘導体についても正しいことを示す。本例では、１０‐OH‐CPTの分子特性によっても、高い結合効力が認められる。
【０１３４】
要約すると、これらのデータは、終始一貫して、脂質へのCPTの最高結合効力については、カルボキシレート型でCPTを得ること、及び対分子として陽電荷脂質を使用することが必要であることを示す。得られるCM‐CPTは、その物理的‐化学的特性によって明らかに区別され、特徴付けられる。これに反して、そのようなCM‐CPT凝集体は、陰イオン又は中性脂質では形成されない。このことは、後者が不飽和脂肪酸を含有する場合も当てはまる。
ｂ．リポソーム配合物の特徴付け
組成の全段階を、HPLC分析（脂質＋薬剤）によって、かつUV‐vis及び蛍光分光法によって監視する。HPLC分析で、押出後に原料の僅かな損失を認めることができる。UV‐vis及び蛍光分光法は、配合物効力を調整するための定性手段として用いられる。
【０１３５】
CPTスペクトルは、分子状態及び局所的環境に強く依存することは周知である。従って、
定性的に、ラクトン型、カルボキシレート及びリポソームCPTのスペクトルは、スペクトルの形から区別することができる（図４、図５）。図４に、有機溶剤（クロロホルム／メタノール）中の脂質‐結合CPT及び遊離薬剤の励起及び放射スペクトルを示す。蛍光スペクトルにおいて、脂質への結合は、著しい赤方偏移及びピーク高の変化を引き起こす。吸収スペクトルの変化は、図５で最も明らかに見られる。上部曲線は脂質‐結合CPTのスペクトルを示し、その後に、異なる条件下で遊離CPTのスペクトルが示される。第二及び第三曲線は分子のラクトン型に相応し、第四及び第五曲線は分子のラクトン型に相応する。
【０１３６】
準‐弾性光散乱（Zetasizer 1000及びZetasizer 3000, Malvern Instrumennts, Herrenberg, Germany）を、リポソームの寸法分配を決めるために測定する。ゼータポテンシャルをZetasizer 3000(Malvern Instrumennts）によって決定する。表１に、模範的な若干の組成物の特徴付けからの結果を示す。
【０１３７】
８．Lipo Camの細胞分裂抑制効力の試験管内測定
細胞分裂抑制剤の効力を、試験管内で、薬剤濃度に相関する細胞生育の減少を分析することによって測定する。細胞生育が５０％に阻害される薬剤濃度（”IC５０”）を、各薬剤の阻害ポテンシャルの指数として使用する。細胞分裂抑制ポテンシャルが高ければ高いほど、IC５０値は低くなる。高阻害ポテンシャルを有する薬剤は、nM範囲のIC５０値を有する。ここで、リポソームカプセル包入カンプトテシンカルボキシレートの３種の配合物（RM544＝Lipocam I、RM541＝Lipocam II、RM542＝Lipocam III）を、遊離カルボキシレート（RM543）と比較した。
【０１３８】
原則：
好適な細胞系（例えば、内皮又は腫瘍細胞系）を、不変密度で、２４個の窪みを有する４枚のプレート中で生育させる。１又は２日後に、１１種の連続する薬剤希釈物を、最終薬剤濃度０〜５０００nM範囲に渡って加える。各個別濃度を、分析の精密性を高めるために、２個の窪みにおいて無関係で測定する。薬剤を含まない２個の窪みを対照として使用する。細胞を最適生長条件（CO２  ５〜５．５％、３７℃、湿度〜９０％）で培養する。７２時間後に、各窪み中の細胞生育を、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を測定することによって決定する（MTT分析）。生細胞において、MTT基質を、青色の細胞不透過色素（ホルマザン）に変える。約１時間後に培地を除去し、細胞を、イソプロパノール／０．０４％HClで溶かし、青色ホルマザンの量を、ELISA リーダー中５５０nmで定量する（ブランクとして溶菌緩衝液に対して測定する）。実験を、各薬剤濃度に対して、Sigma Plot 分析ソフトウエアを用いて（同じ薬剤濃度を含有する2個の窪みの）平均OD５５０ｎｍ値を描くことによって評価する。IC５０濃度を半‐最高OD５５０ｎｍ値で採用する。高阻害ポテンシャルは低いIC５０値となる。
【０１３９】
実験：
Ea. Hy926細胞（形質転換されたヒト内皮細胞系）２×１０４／ｃｍ２を２４個の窪みを有する４枚のプレート中に入れ、１晩培養する。１日目に、細胞培養培地中の各カンプトテシン配合物の１１種連続した５倍（×）濃縮マスター希釈液を製造する（２５０００、１００００、５０００、２５００、１２５０、５００、２５０、５０、２５、１２．５、５nM）。全希釈液を製造して、培地を細胞から除去し、新たな培地４００μｌ＋各マスター薬剤濃縮物１００μｌを加える（各濃縮物を２個の窪みに）。この結果、マスター連続の１：５希釈となる（最終薬剤濃度１nm〜５０００nM）。２個の窪みには薬剤を加えない（対照）。プレートを更に７２時間培養する。この培養終了後に、培地を、MTT基質含有の新たな培地に代え、１時間培養する。培地を除去し、細胞をイソプロパノール／０．０４％HCl中に溶かし、ODを５５０nmで測定する。
【０１４０】
結果：
図１１で説明するように、全３種のLipo Cam配合物（RM541、RM542、RM544）は、遊離カンプトテシンカルボキシレートに比較可能な又はそれよりも良好な生長阻害を示す。IC５０値は約２５〜３０nMである。従って、リポソームカプセル包入カンプトテシンカルボキシレートは、試験管内で、高い細胞阻害効力を有する。
【０１４１】
９．ヌードマウスのA‐375メラノーマにおけるLipo Camの治療的効力
NMRI‐ヌードマウスをElevage Janvierから購入し、任意補給の餌及び水を備えた保護環境条件下に（SPF設備、２２℃、湿度３０〜７０％、１２時間の明／暗サイクル）隔離した換気装置付檻に入れた。実験計画は、地方自治体によって検査され、承認された。
【０１４２】
腫瘍細胞（Ａ‐375ヒトメラノーマ細胞系、ATCC Nr.:CRL-1619）を、ATCCによって供給されたデータシートに記載されたように生長させた。腫瘍細胞（PBS中５×１０６）を０日で５０μｌの容量でマウスの右背側脇腹に接種した（s.c.）。
【０１４３】
マウスを実験群に割り当て（１檻毎に８匹の動物）、檻に入れ、腫瘍接種前少なくとも5日間（‐６〜０日間）処理した（体重増加の監視を含む）。治療は腫瘍が約１００ｍｍ３の体積に達した後に開始する。薬剤を、iv注射によって、１週間に３回（月、水、金）、等毒性（equitoxic）用量で３週間続けて投与した。薬剤を当初記載したように製造した。化合物の等毒性用量を別の実験で決定し、その際、毒性を血液学的パラメーター、体重及び動物臨床観察に基づいて評価した（表３参照）。溶液を〜１０μｌ／体重ｇの容量で徐々に投与した。
【０１４４】
動物を全実験中臨床的に監視し、腫瘍の大きさの監視は１週間に３回行なった。腫瘍の寸法をカリパスによって測定し、腫瘍の大きさを次の式によって計算した：Ｖ＝πＬＷ２／６（Ｌ＝最長、Ｗ＝垂直軸の幅）。各個の動物の体重を処理期間中少なくとも２回、腫瘍接種後及び治療開始後に監視した。血液学のために全治療群４匹の動物から、EDTA血液を延髄後部叢から異なる３時点で集めた：処理中、腫瘍期及び治療の中間。赤血球及び白血球及び血小板の数を、自動細胞計測器（Abbott Cell Dyn 3500）により測定した。
【０１４５】
対照群での腫瘍は急速かつ進行性の腫瘍生長を示したが、全ての薬剤配合物（等毒性用量で投与した）は、抗‐腫瘍効果を示した（図１２）。最も有効な配合物は、Lipo Cam IIIであり、殆どの動物で全腫瘍退行を伴った。Lipo Cam I 及びLipo Cam IIも同様に、治療期間の後半で開始する腫瘍の徐々の反‐生長を伴う部分的腫瘍退行を示した。CPT‐Na‐カルボキシレートは、対照群に比較して減速を示すだけであった。
【０１４６】
１０．ヒト治療的処置プロトコール
この例は、解明された配合物を使用するヒト治療プロトコールに関する。治療は、高められた血管形成活性と関連した様々な人間の病気及び不全の診断、予防及び／又は治療に使用される。抗‐腫瘍治療、例えば、充実性腫瘍及び血液学的悪性腫瘍又は慢性の炎症性疾病、例えば、乾癬で特に有用であると考慮される。
【０１４７】
本発明の特徴は、数種類の病気及び／又は異常が、異常になった組織を直接治療するのではなく、例えば、何らかの方法で腫瘍細胞を直接治療するのではなく、血管形成の阻害によって腫瘍への血液供給を切断し、腫瘍を殺すことによって治療することである。
【０１４８】
脂質：薬剤複合体を用いるそのような患者の治療法は、既に明らかにされている（例えば、参照によって本明細書中に記入された文書参照）。そのような方法は、ここに記載された方法との併用に率直に適合され得ると考えられる。前記で解明したように、他の治療剤を同時に又は異なる時間で投与することができる。従って、治療剤の予備混合された薬物学的組成物又は”カクテル”を使用するか、又は選択的に、別々の容器から薬剤を異なる割分で使用することができる。
【０１４９】
本発明に鑑みて、臨床試験を行なって、患者治療を含み、かつ監視する様々な要素は、当業者に周知である。
【０１５０】
規定的な承認目的のための研究に選ばれた患者は、慣例的治療の少なくとも１つの経過への適応に失敗し、身体検査、実験室的技術、又は放射線撮影法によって決定されるような、対象的に測定可能な病気を有すると考えられる。そのような患者は、心臓又は腎臓病歴も持たず、かつどんな化学療法もこの研究に入る少なくとも２週間前は中止されなければならない。
【０１５１】
使用に先立って、配合物が凍結乾燥された場合には、配合物を水溶液中で再構成させることができる。必要な使用容量は、再度、患者の体重及び用量スケジュールから計算される。
【０１５２】
解明された配合物を短時間注入で投与することができる。任意の用量レベルで与えられる注入は、それぞれの後に達成される毒性に依存すべきである。従って、任意の単一注入後に、又は不変率注入の特別な期間で、毒性II段階が達した場合には、毒性が改善されなければ、更なる用量を制するか、又は不変率注入を止めるべきである。患者の約６０％がどんなカテゴリーにおいても容認できない毒性III又はIVを示すまで、患者群に増加用量を投与すべきである。その用量は、安全用量として限定される値の２／３である。
【０１５３】
身体検査、腫瘍測定及び検査室試験は、当然、治療前及び約３〜４週間後の期間で行なわれるべきである。検査室試験は、完全血球計算値、血清クレアチニン、クレアチンキナーゼ、電解質、尿素、窒素、SGOT、ビリルビン、アルブミン、及び全血清蛋白質を含むべきである。
【０１５４】
臨床的応答は、検査値、例えば、腫瘍マーカーにおける認容可能な測定又は変化によって限定され得る。例えば、完全応答は、少なくとも１ヶ月の全ての測定可能な病気の消失によって限定され得る。ところが、部分的応答は、５０％以上の減少によって限定される。
【０１５５】
本明細書で解明され、特許請求された全組成物及び方法は、本発明に鑑みて、不適当な実験を行なわずに、製造され、遂行され得る。本発明の組成物及び方法を有利な実施態様によって記載したが、本発明の概念、精神及び範囲から外れることなく、ここに記載した方法の組成物、方法に、かつ段階又は連続段階で、変法が適用され得ることは、当業者に明らかである。更に詳細には、同じ又は類似の結果が達成されるので、化学的にも物理学的にも関係される一定の試薬を、ここに記載された試薬に代え得ることは明らかである。当業者に明らかな、全てのこのような類似代用剤及び変法は、従属請求によって定義された本発明の精神、範囲及び概念内にあると認められる。
【０１５６】
用量における若干の変法は、必然的に、治療される対象の症状に依存して起きる。投与に反応する患者は、どんな結果においても、個々の対象に好適な用量を決定する。更に、ヒトへの投与のための製剤は、FDA Office of Biologics standardsによって要求される不妊症、発熱性、一般的安全性及び純度標準を満たすべきである。
【０１５７】
投与及び服用
本発明は、それを必要とする対象の血管標的部位に、カンプトテシン剤の本発明配合物の製薬学的有効量を投与する方法を包含する。従って、”それを必要とする対象”は、哺乳動物、例えば、人間に関する。
【０１５８】
投与経路は、腹膜内、腸管外又は局所投与を包含し、配合物は様々な用量形で、例えば、注射可能な溶液、薬剤放出カプセル等で容易に投与される。
【０１５９】
本発明での使用のために、それを必要とする対象（これは、血管形成を受ける内皮細胞を有する循環系を有する任意の動物であってよい）に投与される化合物の”薬物学的有効量”は、広い範囲のファクターに依存して変化する。例えば、小動物へよりも本質的に多い用量を人間へ与えることが必要である。化合物の量は、患者の大きさ、年齢、性別、体重及び症状にも、投与される物質の効力にも依存する。配量によって著しい変動性があると示された場合には、当業者は、本発明によって、先ず、非常に少量を投与し、かつ所望の結果が得られるまで用量を増加させることによって、好適な用量を容易に決定することができると考えられる。用量は前記のような因子に基づいて非常に変化するが、一般に、本発明は、周囲の組織を標的にする配達系に比べて、本質的にもっと少ない量の任意の物質を、例えば、腫瘍細胞それ自体を標的にして投与することを可能とする。
【０１６０】
ここで解明した製薬学的に有効な量の治療剤は、試薬の種類及び作用型に依存する。ここで挙げる例として、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ（ヒト）の範囲内である。カンプトテシン剤について、典型的には、約５ｍｇ／ｋｇの用量を適用する。
【０１６１】
９．Lipo Cam配合物の製造
Lipo Cam配合物の製法
a）DOTAP／CPT（モル比９５／５）３０mM
ｂ）DOTAP／CPT（モル比９７．５／２．５）３０mM
ｃ）DOTAP／PEG−DOPE／CPT（モル比９０／５／５）３０mM
を記載する。全配合物は、連続した一定の配合段階から成る同じプロトコールによって得られる。異なる配合物を得るために、成分量を変化させる。最終懸濁液の典型的容量は１０〜１００ｍｌであった。
【０１６２】
CPT‐カルボキシレート溶液
ＣＰＴ剤のカルボキシレート塩は、ＣＰＴ剤をpH９以上のアルカリ性環境に曝すことによって得られる。ＣＰＴ剤２ｍｇ／ｍｌを２５％NH４OH中に溶かす。次いで、溶剤を蒸発させる。この方法で、純粋なＣＰＴ剤‐カルボキシレートのアンモニウム塩が得られる。この塩を水中に溶かし（約２〜３mM）、好適な量を、トレハロース  トリス／HCl、pH７．５、ストック溶液に加え、１０％トレハロース（ｗ／ｖ）、トリス１０mM及びCPT ×mMの最終濃縮物を得る（ここで、×は、例a）及びｃ）については１．５であり、例ｂ）については０．７５である）。
【０１６３】
エタノール注入
脂質及び脂質混合物のエタノール溶液４００mMを、強力な攪拌下に、CPT‐カルボキシレート溶液中に注入する。この溶液は、例a）及びｂ）についてはDOTAPだけを含有し、例ｃ）についてはDOTAP／PEG‐DOPEをモル比９５／５で含有する。こうして、自己集合法によって、多分散性多層小嚢を形成する。
【０１６４】
押出
均一の大きさの単層小嚢を得るために、リポソーム懸濁液を、孔径２００nmの膜を通して５回押出す（Osmonics Inc., Poretics、ポリカルボネート、０．２ミクロン）。動物試験の場合での付加的な任意の段階は、無菌濾過であった（Millipak 2000, ０．２２μｍ）。
【０１６５】
配合物を、組成についてHPLCによって検査した。寸法分配を、準‐弾性光散乱（Malvern, Herrenberg, Germany）によって調整した。
【０１６６】
【表５】
2005535633.tif 000007
【０１６７】
HPLC及びPCS分析からの結果
１０．ヌードマウスのＡ‐375メラノーマでのLipo Cam IV及びVIの治療的効力
NMRI‐ヌードマウスをElevage Janvierから購入し、任意補給の餌及び水を備えた保護環境条件下に（SPF設備、２２℃、湿度３０〜７０％、１２時間の明／暗サイクル）隔離した換気装置付檻に入れた。実験計画は、地方自治体によって検査され、承認された。
【０１６８】
腫瘍細胞（Ａ‐375ヒトメラノーマ細胞系、ATCC Nr.:CRL-1619）を、ATCCによって供給されたデータシートに記載されたように生長させた。腫瘍細胞（PBS中５×１０６）を０日で５０μｌの容量でマウスの右背側脇腹に接種した(s.c.)。
【０１６９】
マウスを実験群に割り当て（１檻毎に８匹の動物）、檻に入れ、腫瘍接種前少なくとも5日間（‐６〜０日間）処理した（体重増加の監視を含む）。治療は腫瘍が約８０ｍｍ３の体積に達した後に開始する。薬剤を、iv注射によって、１週間に３回（月、水、金）、３週間続けて投与した。薬剤を当初記載したように製造した（例９参照）。毒性を血液学的パラメーター、体重及び動物臨床観察に基づいて評価した。溶液を〜５μｌ／体重ｇの容量で徐々に投与した。
【０１７０】
動物を全実験中臨床的に監視し、腫瘍の大きさの監視は１週間に３回行なった。腫瘍の寸法をカリパスによって測定し、腫瘍の大きさを次の式によって計算した：Ｖ＝πＬＷ２／６（Ｌ＝最長、Ｗ＝垂直軸の幅）。各個の動物の体重を処理期間中少なくとも２回、腫瘍接種後及び処置開始後に監視した。血液学のために全治療群４匹の動物から、EDTA血液を延髄後部叢から異なる３時点で集めた：処理中、腫瘍期及び治療の中間。赤血球及び白血球及び血小板の数を、自動細胞計測器（Abbott Cell Dyn 3500）により測定した。
【０１７１】
図１３で示すように、Lipo Cam IV（２ｍｇ／ｋｇ）及びLipo Cam VI（１ｍｇ／ｋｇ）での治療は、各用量の遊離薬剤CPT‐カルボキシレートに比較してはるかにずっと有効であった。明白には、２つの用量でのLipo Camでの治療は、最初の使用後ですら腫瘍退行の開始となった。Lipo Cam配合物及び遊離薬剤の治療的効力は、用量‐依存性であった。配合物の抗腫瘍効力は、Lipo Cam IV（２ｍｇ／ｋｇ）＞Lipo Cam VI（１ｍｇ／ｋｇ）＞CPT‐カルボキシレート（２ｍｇ／ｋｇ）＞CPT‐カルボキシレート（１ｍｇ／ｋｇ）の順序である。比較すると、対照群における腫瘍は急速な進行性の腫瘍増殖を示し、腫瘍細胞培養３０日間後に、平均腫瘍容積＞１０００ｍｍ３に達した。
【０１７２】
１１．ヌードマウスのＡ‐375メラノーマでのLipo Cam IV及びPEG‐Lipo Cam IVの治療的効力
NMRI‐ヌードマウスを、Elevage Janvierから購入し、任意補給の餌及び水を備えた保護環境条件下に（SPF設備、２２℃、湿度３０〜７０％、１２時間の明／暗サイクル）隔離した換気装置付檻に入れた。実験計画は、地方自治体によって検査され、承認された。
【０１７３】
腫瘍細胞（Ａ‐375ヒトメラノーマ細胞系、ATCC Nr.:CRL-1619）を、ATCCによって供給されたデータシートに記載されたように生長させた。腫瘍細胞（PBS中５×１０６）を０日で５０μｌの容量でマウスの右背側脇腹に接種した(s.c.)。
【０１７４】
マウスを実験群に割り当て（１檻毎に８匹の動物）、檻に入れ、腫瘍接種前少なくとも5日間（‐６〜０日間）処理した（体重増加の監視を含む）。処置は腫瘍が約３００ｍｍ３の体積に達した後に開始する。薬剤を、iv注射によって、１週間に３回（月、水、金）、３週間続けて投与した。薬剤を当初記載したように製造した（例９参照）。毒性を血液学的パラメーター、体重及び動物臨床観察に基づいて評価した。溶液を〜５μｌ／体重ｇの容量で徐々に投与した。
【０１７５】
動物を全実験中臨床的に監視し、腫瘍の大きさの監視は１週間に３回行なった。腫瘍の寸法をカリパスによって測定し、腫瘍の大きさを次の式によって計算した：Ｖ＝πＬＷ２／６（Ｌ＝最長、Ｗ＝垂直軸の幅）。各個の動物の体重を処理期間中少なくとも２回、腫瘍接種後及び処置開始後に監視した。血液学のために全治療群の４匹の動物から、EDTA血液を延髄後部叢から異なる３時点で集めた：処理中、腫瘍期及び治療の中間。赤血球及び白血球及び血小板の数を、自動細胞計測器（Abbott Cell Dyn 3500）により測定した。
【０１７６】
図１４で示すように、Lipo Cam IV（２ｍｇ／ｋｇ）及びPEG‐Lipo Cam IV（２ｍｇ／ｋｇ）での治療効力を比較した。２つの配合物は、腫瘍増殖率を強力に減少させ、非‐ポリエチレングリコール化配合物に有利な抗腫瘍効果を伴った。比較すると、対照群における腫瘍は急速な進行性の腫瘍増殖を示し、腫瘍細胞培養３５日間後に、平均腫瘍容積〜３０００ｍｍ３に達した。
【０１７７】
参考文献
【０１７８】
【表６】
2005535633.tif 000008
【０１７９】
【表７】
2005535633.tif 000009
【０１８０】
【表８】
2005535633.tif 000010
【０１８１】
【表９】
2005535633.tif 000011
【０１８２】
【表１０】
2005535633.tif 000012
【０１８３】
【表１１】
2005535633.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】ラクトン型のカンプトテシン（左）とカルボキシレート型のカンプトテシン（右）との間の平衡を示した説明図である。
【図２】CPT‐カルボキシレートの高められた細胞毒性を示した説明図である。
【図３】CPT（CM‐CPT）のカルボキシレート型、ラクトン型及び陽イオン分子‐結合型の間の平衡を示した説明図である。
【図４】遊離CPT及びリポソームCPTの励起及び蛍光スペクトルを示すグラフである。
【図５】異なる条件下でのCPTのUV‐visスペクトルを示すグラフである。
【図６】ラクトン型（左）及び陽イオン両親媒体と会合させたカルボキシレート型（右）のCPTのリポソーム構成を示す説明図である。
【図７】血漿膜を経る細胞取込を示す説明図である。
【図８】溶液中に存在するCPT‐カルボキシレートと一緒の脂質懸濁液の透析を示すグラフである。
【図９】異なる方法によって製造されるDOTAP及びDOPCからの脂質懸濁液中でのCPTの蛍光異方性測定を示すグラフである。
【図１０】CPT及び１０‐OH‐CPTを用いたDOTAP測定とDMTAP測定との蛍光異方性測定の比較を示すグラフである。
【図１１】カンプトテシン配合物RM541、542、543、544によるEa. Hy 926 細胞増殖の阻害を示すグラフである。
【図１２】ヌードマウスのA-375メラノーマにおけるLipo Camの治療効力を示すグラフである。
【図１３】ヌードマウスのA-375メラノーマにおけるLipo Cam IV及びVIの治療効力を示すグラフである。
【図１４】ヌードマウスのA-375メラノーマにおけるLipo Cam IV及びPEG-Lipo Cam IVの治療効力を示すグラフである。
【図１】
2005535633.tif 000014
【図２】
2005535633.tif 000015
【図３】
2005535633.tif 000016
【図４】
2005535633.tif 000017
【図５】
2005535633.tif 000018
【図６】
2005535633.tif 000019
【図７】
2005535633.tif 000020
【図８】
2005535633.tif 000021
【図９】
2005535633.tif 000022
【図１０】
2005535633.tif 000023
【図１１】
2005535633.tif 000024
【図１２】
2005535633.tif 000025
【図１３】
2005535633.tif 000026
【図１４】
2005535633.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月5日(2004.5.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正の純電荷を有する少なくとも１種の陽イオン両親媒体及び／又は陽イオンポリマーと会合したカンプトテシン剤のカルボキシレート型から成る組成物であって、有機陽イオン分子対カルボキシレートのモル比は少なくとも約１：１であり、前記の組成物は本質的に前記のカンプトテシンのラクトン型を含有しない配合物。
【請求項２】
前記の陽イオン両親媒体は、有利に三級アミノ又は四級アンモニウム基を有する脂質、リソ脂質又はポリエチレングリコール化脂質、例えば、N‐［１‐（２，３‐ジアシルオキシ）プロピル］‐N，N‐ジメチルアミン又はN‐［１‐（２，３‐ジアシルオキシ）プロピル］‐N，N，N‐トリメチルアンモニウムである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記の陽イオンポリマーは、分子量約５〜約５００kDaを有する高分子電解質、酸、例えば、ポリアリルアミン又はポリエチレンイミン、多糖類又はポリアミンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
更に、少なくとも１種の陰イオン及び／又は中性両親媒体から成る、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記の陰イオン及び／又は中性両親媒体は、負又は中性純電荷を有するステロール又は脂質、例えば、コレステロール、燐脂質、リソ脂質、リソ燐脂質、スフィンゴ脂質又はポリエチレングリコール化脂質から選択される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
中性両親媒体は、ジアシルホスファチジルコリンである、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の組成物から成るコロイド状ナノ凝集体。
【請求項８】
全体に正電荷を有する、請求項７に記載のナノ凝集体。
【請求項９】
更に、負及び／又は中性純電荷を有する少なくとも１種の両親媒体（陰イオン及び／又は中性両親媒体）から成る、請求項７又は８に記載のナノ凝集体。
【請求項１０】
前記の陰イオン及び／又は中性両親媒体は、負又は中性純電荷を有するステロール又は脂質、例えば、コレステロール、燐脂質、リソ脂質、リソ燐脂質、スフィンゴ脂質又はポリエチレングリコール化脂質から選択される、請求項７から９までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１１】
中性両親媒体は、ジアシルホスファチジルコリンである、請求項７から１０までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１２】
分子外層中に、少なくとも約２０％、有利に少なくとも約３０％及び最も有利に少なくとも約４０％の過剰の正電荷部分を有する、請求項７から１１までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１３】
エマルジョン小滴、ミセル、リポソーム、ナノ粒子又はナノカプセルとして存在する、請求項７から１２までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１４】
カンプトテシン剤又はその誘導体約０．１〜約５０モル％から成る、請求項７から１３までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１５】
更に、糖又はアルコール又はその組合せ、例えば、トレハロース、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖、デキストラン、マンニトール又はソルビトールから選択される凍結保護剤から成る、請求項７から１４までのいずれか１項に記載のナノ凝集体。
【請求項１６】
製薬学的に認容性の担体、希釈剤及び／又は補助剤と共に、正の純電荷を有する少なくとも１種の有機陽イオン分子と会合したカンプトテシン剤のカルボキシレート型から成る組成物（ここで、有機陽イオン分子対カルボキシレートのモル比は少なくとも約１：１であり、前記の組成物は本質的に前記のカンプトテシンのラクトン型を含有しない）又はそのコロイド状ナノ凝集体の製薬学的有効量から成る製薬学的製剤。
【請求項１７】
請求項７から１５までのいずれか１項に記載のコロイド状ナノ凝集体を製造するために、次の段階：
a）有利に、塩としてのカンプトテシン剤を製造し、
ｂ）前記のカンプトテシン剤をそのカルボキシレート型で、正の純電荷を有する陽イオン両親媒体及び任意に、正、負及び／又は中性純電荷を有する少なくとももう１種の両親媒体と会合させ、かつ
ｃ）コロイド状ナノ凝集体を形成させる
から成る、コロイド状ナノ凝集体の製法。
【請求項１８】
段階ｂ）及びｃ）は、前記のナノ凝集体を均質化、脂質膜によって、又は溶剤注入法によって形成させることより成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
高められた血管形成活性を特徴とする病気を治療及び／又は予防するための医薬剤を製造するための、請求項１６に記載の製薬学的製剤の使用。
【国際調査報告】
2005535633.tif 000028
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