(57)【要約】（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３の少なくとも１つの化合物、（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び場合により（ＩＩＩ）非還元性架橋剤〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕、を含むモノマーの重合化混合物を含む、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
2005505752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）場合により、非還元性架橋剤
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含むモノマーの重合化混合物を含む、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲル。
【請求項２】
アルキルがＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つがＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項４】
２％〜２０％Ｔを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項５】
２％〜１０％Ｔを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項６】
２％〜８％Ｔを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項７】
３％〜６％Ｔを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項８】
４％Ｔを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項９】
１％Ｃ〜８．５％Ｃを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１０】
２％Ｃ〜６％Ｃを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１１】
３％Ｃ〜５％Ｃを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１２】
４％Ｃを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１３】
４％Ｔ／２．５％Ｃを含む、請求項１に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１４】
非還元性架橋剤が存在しない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１５】
モノマーの混合物が、（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１６】
モル比が１：５〜５：１の（ＩＩ）：（ＩＩＩ）を含む、請求項１５に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１７】
モル比が１：４〜４：１の単位（ＩＩ）：単位（ＩＩＩ）を含む、請求項１５に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１８】
モル比が１：３〜３：１の単位（ＩＩ）：単位（ＩＩＩ）を含む、請求項１５に記載のＩＰＧゲル。
【請求項１９】
モル比が１：２〜２：１の単位（ＩＩ）：単位（ＩＩＩ）を含む、請求項１５に記載のＩＰＧゲル。
【請求項２０】
モル比が１：１の単位（ＩＩ）：単位（ＩＩＩ）を含む、請求項１５に記載のＩＰＧゲル。
【請求項２１】
単位（ＩＩＩ）がＰＤＡ（Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ２）又はＮ，Ｎメチレンビス−アクリルアミドである、請求項１５に記載のＩＰＧゲル。
【請求項２２】
電気泳動に用いるための固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルであって、アクリルアミド、ＢＡＣ及びＰＤＡの重合化モノマー単位の混合物を含むものであり、４％Ｔ／２．５％Ｃと、モル比が１：１のＢＡＣ：ＰＤＡを含む、上記ゲル。
【請求項２３】
サンプル中の少なくとも１種の高分子を分析又は分離するための、請求項１に記載のＩＰＧゲルの使用。
【請求項２４】
サンプル中の高分子を分離又は分析する方法であって、請求項１に記載のＩＰＧゲルを用いて、サンプルに対し等電点電気泳動を実施することを含む、上記方法。
【請求項２５】
サンプルを処理することにより、サンプル中に存在するすべてのタンパク質チオールをアルキル化するか、又はサンプル中の高分子を還元及びアルキル化することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＰＧゲルを第２ゲルにトランスファーし、ＩＰＧゲルを少なくとも部分的に可溶化することにより、高分子を第２ゲルに放出することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
第２ゲル上で電気泳動を実施することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第２ゲルがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
第２ゲルがＩＰＧゲルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＩＰＧゲルを染色することにより、そこに含まれる高分子を可視化することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＰＧゲルから、高分子を含む画分を切り出すことをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
切り出した画分を少なくとも部分的に可溶化することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
以下の（Ｉ）〜（ＩＶ）：
（Ｉ）置換又は非置換のアクリルアミド、アクリロイルアミノエトキシエタノール（ＡＡＥＥ）、アクリロイルアミノプロパノール（ＡＡＰ）、
（ＩＩ）ＢＡＣ（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２、及び
（ＩＩＩ）場合により、非還元性架橋剤、及び／又は
（ＩＶ）アガロース
の重合化混合物を含む電気泳動に使用するためのゲルであって、単一の％Ｔ、又はポリアクリルアミド勾配を含む、上記ゲル。
【請求項３４】
置換アクリルアミドがジメチルアクリルアミドである、請求項３３に記載のゲル。
【請求項３５】
２％Ｃ〜１０％Ｃを含む、請求項３３に記載のゲル。
【請求項３６】
０〜３０％Ｔのポリアクリルアミド勾配を含む、請求項３３に記載のゲル。
【請求項３７】
３〜２０％Ｔのポリアクリルアミド勾配を含む、請求項３３に記載のゲル。
【請求項３８】
４％Ｃ、及び０〜７．５％Ｔのアクリルアミド勾配を含む、請求項３３に記載のゲル。
【請求項３９】
０．１％〜１％アガロースの均一濃度を含む、請求項３３に記載のゲル。
【請求項４０】
０〜１％アガロースのアガロース勾配を含む、請求項３３に記載のゲル。
【請求項４１】
（Ｉ）アクリルアミド（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ２）、
（ＩＩ）ＢＡＣ（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２、及び
（ＩＩＩ）非還元性架橋剤
の重合化モノマー単位の混合物を含む、請求項３３に記載のゲル。
【請求項４２】
非還元性架橋剤（ＩＩＩ）がＰＤＡ（Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ２）である、請求項４１に記載のゲル。
【請求項４３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである、請求項３３に記載のゲル。
【請求項４４】
サンプル中の高分子を分離又は分析するための、請求項３３に記載のゲルの使用。
【請求項４５】
サンプル中の高分子を分離又は分析するための、請求項４３に記載のゲルの使用。
【請求項４６】
サンプル中の高分子を分離又は分析する方法であって、以下のｉ）及びｉｉ）の工程：
ｉ）サンプルを処理し、サンプル中に存在する遊離タンパク質チオールをアルキル化するか、又はサンプル中のタンパク質シスチン／システインを還元及びアルキル化する工程；
ｉｉ）請求項３３に記載のゲルを用いて、処理されたサンプルに対し電気泳動を実施する工程、
を含む、上記方法。
【請求項４７】
以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）非還元性架橋剤
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含む重合化混合物を含むポリマーゲルであって、ＢＡＣ誘導単位のジスルフィド結合が切断されたときにゲル構造を保持するようなものである、上記ポリマーゲル。
【請求項４８】
以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）ピペラジンジ−アクリルアミド（ＰＤＡ）
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含むモノマーの重合化混合物を含む、ポリマーゲル。
【請求項４９】
以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）非還元性架橋剤
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含むモノマーの重合化混合物を含むポリマーゲルであって、該重合化混合物のジスルフィド結合の少なくとも一部分が切断されたものである、上記ポリマーゲル。
【請求項５０】
実質的にすべてのジスルフィド結合が切断される、請求項４９に記載のポリマーゲル。
【請求項５１】
ポリマー混合物に還元剤を添加することにより、ジスルフィド結合が切断されたものである、請求項４９に記載のポリマーゲル。
【請求項５２】
還元剤がチオール還元剤である、請求項５１に記載のポリマーゲル。
【請求項５３】
電気泳動ゲルの形態である、請求項４８に記載のポリマーゲル。
【請求項５４】
ゲルを用いた電気泳動に付すサンプルに含まれる還元剤により、ジスルフィド結合が切断される、請求項５３に記載のポリマーゲル。
【請求項５５】
以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）非還元性架橋剤
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含むモノマーの重合化混合物を含むポリマーゲルの多孔度を制御する方法であって、該ポリマーゲルを処理することにより、ＢＡＣのジスルフィド結合の少なくとも一部分を切断することを含む、上記方法。
【請求項５６】
実質的にすべてのジスルフィド結合が切断される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ポリマーゲルが電気泳動ゲルである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
上記ゲルを用いてサンプルに対し電気泳動を実施する前に、ジスルフィド結合を切断する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ゲルでの電気泳動に付すサンプルに還元剤を含有させることにより、ジスルフィド結合を切断する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
還元剤がチオールである、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動用の改善されたゲル、ならびに、サンプル中の少なくとも１種の高分子の分離及び／又は分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子を分析する分野では、一次元及び二次元ゲル電気泳動が、高分子を分離及び可視化するための標準的手段となっている。
【０００３】
一次元ゲル電気泳動は、変性条件下のポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動を行うことにより、タンパク質のような高分子の混合物を質量差に応じて、個々の成分に分離するために用いられる。
【０００４】
二次元ゲル電気泳動は、電気泳動により、酸性及び塩基性残基の相対含量に基づいてタンパク質を分離する、等電点電気泳動を含む。印加された電場の影響下で、高度荷電タンパク質は、サイズ又は形状は同程度であるがこれより低荷電のタンパク質より速く移動する。タンパク質をサンプルゾーンから非対流媒質（典型的には、ポリアクリルアミドのようなゲル）を介して移動させると、電気泳動による分離が起こる。タンパク質の実効電荷がゼロであるｐＨ値（等電点、ｐｌ）を有する領域にそのタンパク質が入ると、媒質に対して移動を停止する。さらに、この移動が、陽極から単調に増大するｐＨ勾配によって起こる場合には、タンパク質は、その等電点に「泳動（集束；focus）」する。従って、異なる比率の荷電又は滴定アミノ酸を有する２つのタンパク質は、それらの異なる等電点によって分離することができる。
【０００５】
等電点電気泳動ゲルの一実施形態は、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルであり、このゲルにおいてｐＨ勾配の形成を引き起こす緩衝基はアクリルアミド誘導体であり、これは、アクリルアミドと架橋剤によりゲルに共重合化されている。これらの誘導体は、製造者であるファルマシア（Pharmacia）により「イモビリン（immobiline）」と称される。これらの「イモビリン」基の勾配は、ポリアクリルアミドと架橋する。市販のＩＰＧのポリアクリルアミドは、ビス−アクリルアミド又はピペラジン−ジ−アクリルアミド（ＰＤＡ）により架橋される。
【０００６】
ビス−アクリルアミドにより架橋されたポリアクリルアミドを含むポリアクリルアミドゲルは、主に、タンパク質分析に適した媒質である。重要なことは、プロテオーム研究が、目的とする系に含まれる全種のタンパク質を扱わなければならないことである。残念ながら、現在利用可能なゲルは、非溶解性であり、第２の次元へのトランスファー後も、ＩＰＧストリップ内にタンパク質（例えば、膜タンパク質）の残存が繰り返し認められている。その上、いったん第２の次元で分離しても、直前操作でさらなる残存及び喪失が起こり、問題を一層大きくしている。伝統的方法、すなわち、機械的、電子−溶離、及び拡散方法を用いて、８０〜９０％の回収率が得られるが、完全な回収が達成されるのことはほとんどない。さらに、ゲルマトリックスの化学的破壊は、往々にしてタンパク質の天然の特徴を変え、タンパク質を改変してしまうため、後の同定にも悪い影響を及ぼす。ウエスタンブロッティングのような日常的手順でさえ、アレイからのタンパク質の喪失を引き起こすことが多い。２Ｄ方法の各ステップで、現在利用可能なゲルが、マトリックス内のタンパク質残存により、情報喪失を起こすのは避けられない。
【０００７】
１９７６年、J. N. Hansenは、架橋剤として、ビス−アクリルアミドの代わりにビス−アクリロイル−シスタミン（ＢＡＣ）を用いることにより、溶解性ゲルマトリックスを開発した。ＢＡＣは、ビスアクリルアミドと類似した構造を有するが、例えば、β−メルカプトエタノール又はジチオトレイトールのような還元剤により、穏やかな還元条件下で、容易に破壊することができるジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合の切断により、ゲルは再可溶化し、マトリックス内のあらゆるタンパク質を放出する。架橋剤しか破壊されないため、長いアクリルアミドポリマー鎖（ＢＡＣの還元部分を含む）はその後も存在しており、これは、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー、又は超遠心分離のような方法により除去することができる。
【０００８】
ＢＡＣを含むゲルマトリックスを用いた作業のほとんどは、主に分子分野での用途に集中している。ジスルフィド結合の性質のために、この分離方法は、高度塩基性染色体タンパク質を分離及び分析するために用いられている。ＢＡＣを含むゲルマトリックスは、現在、ヒストン精製、ＤＮＡ及びＲＮＡ単離、ミオシン重鎖及び免疫沈降抗原に用いられている。ゲルマトリックスとしては、単純なＳＤＳ−ＰＡＧＥから、酸性尿素及びアガロース−アクリルアミド（ＢＡＣ）複合ゲルまで多様にある。
【０００９】
ＢＡＣを含むゲルは、ＢＡＣマトリックスと相互作用するため、現在、還元タンパク質調製物（例えば、チオール含有タンパク質）を分離及び分析するために有用ではないと考えられている。さらに、サンプルの事前還元を必要とする分析及び分離方法は、還元剤に対するＢＡＣの感受性のために、上記ゲルで用いるのに適していない。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、その様々な実施形態において、電気泳動に使用できるゲル、及び電気泳動方法を提供する。好ましくは、これらのゲルは、以下に示す特徴のうち１以上を含む、改善された特徴を有する：
ａ）複合混合物からの高分子の前分画の改善及び／又は精製若しくは濃縮の改善、
ｂ）高分子量成分を含む高分子のエントリーの増大、
ｃ）次元間の高分子トランスファーの改善、
ｄ）ブロッティング中の高分子トランスファーの効率改善、
ｅ）タンパク質スポットのトリプシンによる消化の効率向上、及び／又は
ｆ）トリプシンによる消化タンパク質からのペプチド回収の向上。
【００１１】
本発明者らは、電気泳動用の改良ＩＰＧゲルが、ポリアクリルアミドと、ビス−アクリロイルシスタミン（ＢＡＣ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−）２のような還元性架橋剤とのハイブリッドマトリックスを形成することにより、得られることをみいだした。本明細書で用いる「ＢＡＣ」とは、置換又は非置換のＢＡＣを意味することは理解されよう。好ましくは、ハイブリッドゲルは、タンパク質が残存しないという改善を示し、しかも溶解性である。
【００１２】
さらに、本発明のゲルは、サンプル内の高分子量成分をエントリー及び泳動可能なように設計できることも見出された。
【００１３】
様々なｐＨ勾配のＩＰＧゲルは、非還元性架橋剤、並びに、還元性架橋剤、例えば、ＰＤＡ及びＢＡＣの組合せを含んでもよい。非還元性及び還元性架橋剤の組合せの使用により、還元剤と接触させた後、ゲルの物理的構造を制御することが可能になる。例えば、非還元性架橋剤と還元性架橋剤の比を適切に選択することにより、ゲルの可溶性を完全可溶性（その場合、全ゲル構造が失われる）から、部分的可溶性（その場合、ゲル構造の一部又は実質的に全部が維持される）まで変動させることも可能である。ゲル構造の一部を残す利点は、可溶化タンパク質の著しい分散／拡散が避けられることである。
【００１４】
非還元性架橋剤を含有させた場合には、ＢＡＣ誘導単位のジスルフィド結合の全部又は一部を切断することにより、ゲルの孔サイズを制御することも可能になる。
【００１５】
例えば、ＩＰＧゲルは、再水和中に部分的に可溶化させることにより、高分子量分子（例えば、糖タンパク質及びムチン）をエントリー及び泳動させたり、あるいは、電気泳動中若しくは電気泳動後に可溶化させることにより、高分子（例えば、タンパク質、ペプチド、タンパク質複合体若しくはムチン）の放出及び／又はトランスファーを改善することができる。
【００１６】
別の態様では、本発明は、単一パーセントＴ又はポリアクリルアミド勾配を含む、還元性架橋ゲルに関する。好ましくは、この還元性架橋剤はＢＡＣである。一実施形態では、このゲルはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。一実施形態では、このゲルはアガロースを含む。好ましくは、このゲルは、ウエスタンブロッティング時の膜に対するトランスファー効率を増大させる。ＢＡＣ架橋ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルはまた、質量分光学分析を目的とする、トリプシン消化後のペプチド回収の改善を示しうる。一実施形態では、ゲルスポットを、トリプシンによる消化前又は後に溶解させる。これは、好ましくは１００％ＢＡＣ架橋ゲルを用いて実施する。
【００１７】
好ましくは、ＢＡＣ−アガロース複合ゲルは、ムチン、タンパク質、糖タンパク質及びその他の高分子のプロテオーム研究で使用するのに適している。
【００１８】
従って、第１の態様では、本発明は、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）式ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３の少なくとも１つの化合物、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）場合により、少なくとも１つの非還元性架橋剤
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含むモノマーの重合化混合物を含む、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルを提供する。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、Ｈである。
【００１９】
本発明の第１態様の一実施形態では、ＢＡＣが唯一の架橋剤である、すなわち、非還元性架橋剤は用いない。既に記載したように、このようなゲルは、ＢＡＣのジスルフィド結合の切断により完全に可溶化することができる。
【００２０】
好ましくは、ＢＡＣの原液は、ホルムアミドのような実質的に有機性の溶剤を用いて調製する。好ましくは、ＢＡＣは、水性溶液と比較して、ホルムアミド溶液中における保存安定性の改善を呈示する。さらに、好ましくはホルムアミドの使用により、還元によって溶解しやすく、しかも、重合ステップで必要とするＴＥＭＥＤがより少ないＢＡＣ架橋ゲルが得られる。一実施形態では、ホルムアミドの使用によるＴＥＭＥＤの最小限化は、過剰のＴＥＭＥＤを除去するためにゲルを前泳動させる必要がなくなるため、８％以上の％Ｔを含むゲルにとって重要である。別の実施形態では、ホルムアミドに完全又は部分的に代わるものとして、例えば、ジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドのような有機溶剤を用いる。
【００２１】
一実施形態では、アクリルアミド及びその架橋剤の溶剤としてホルムアミドを用いて、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子を分析する。
【００２２】
一実施形態では、例えば、ホルムアミドを含むアクリルアミドバッファーの調製により、ＢＡＣと架橋したアルカリ性ｐＨのＩＰＧ勾配が形成される。好ましくは、ホルムアミドのような有機溶剤を用いて、全アクリルアミドバッファーを調製することにより、ＢＡＣ架橋ＩＰＧゲルが得られ、これは、これまでより安定し、かつ、本明細書に記載するように、ｐＨ範囲全体を通じて、穏やかな還元条件下で完全に可溶性である。
【００２３】
好ましい実施形態では、ＩＰＧゲルは、アクリルアミドとＢＡＣの混合物を含む。
【００２４】
一実施形態では、ＩＰＧゲルは、約１％〜約３０％Ｔ、好ましくは、約２％〜２０％Ｔを含む。上記ゲルは、好ましくは約２％〜約１５％Ｔ、さらに好ましくは約２％〜約１０％Ｔ、好ましくは約３％〜約６％Ｔ、最も好ましくは約４％Ｔを含む。
【００２５】
一実施形態では、ＩＰＧゲルは、約１％Ｃ〜約８．５％Ｃを含む。上記ゲルは、好ましくは約２％Ｃ〜約６％Ｃ、さらに好ましくは約３％Ｃ〜約５％Ｃ、最も好ましくは約４％Ｃを有する。
【００２６】
本発明の第１態様の好ましい実施形態では、ＩＰＧゲルは、４％Ｔ／４％Ｃを含む。
【００２７】
好ましくは、２０％Ｔ／４％Ｃアクリルアミド−ＢＡＣ原液を用いて、ＩＰＧゲルを作製する。
【００２８】
別の実施形態では、ＩＰＧゲルを、還元性架橋剤（ＩＩ）、及び非還元性架橋剤（ＩＩＩ）を含むモノマー混合物（Ｉ）を重合することにより形成する。
【００２９】
本明細書で用いる用語「非還元性架橋剤」とは、ＢＡＣ誘導単位のジスルフィド結合が切断される穏やかな還元条件下で、上記ゲルにおける架橋結合を実質的に保持する架橋剤を意味する。好ましくは、非還元性架橋剤は、ジスルフィド結合を含まないため、還元条件により切断することができない。
【００３０】
好ましくは、モノマー混合物に化合物（ＩＩＩ）を含有させることにより、穏やかな還元条件下で、ＢＡＣ誘導単位のジスルフィド結合が切断された後、ＩＰＧゲルが維持するその構造の度合いを制御する能力が付与される。従って、架橋剤（還元性（ＢＡＣ）及び非還元性架橋剤（ＩＩＩ））の組合せのパーセント比を変動させることにより、非還元性架橋剤により付与されるゲル構造の一部を保持しながら、ゲルマトリックスの少なくとも部分的可溶化が可能となる。好ましくは、上記ゲル構造は、ＰＤＡ又はビスアクリルアミドにより部分的に維持されるため、可溶化タンパク質の著しい分散／拡散が防止される。
【００３１】
単位（ＩＩ）：単位（ＩＩＩ）のモル比は、好ましくは約１：５〜約５：１であり、さらに好ましくは約１：４〜約４：１、さらに好ましくは約１：３〜約３：１、またさらに好ましくは約１：２〜約２：１、最も好ましくは上記モル比は約１：１である。
【００３２】
非還元性架橋剤（ＩＩＩ）の非制限的例としては、ビスアクリルアミド、ＰＤＡ及びＮ，Ｎ’−ジアリルタルタルジアミド（ＤＡＴＤ）、又はその組合せが挙げられる。
【００３３】
好ましい実施形態では、上記ゲルは、アクリルアミド、ＢＡＣ及びＰＤＡの混合物を含む。
【００３４】
好ましくは、ＩＰＧゲルは、４０％Ｔ／２．５％Ｃアクリルアミド−ＰＤＡ原液と混合した４０％Ｔ／２．５％Ｃアクリルアミド−ＢＡＣ原液を用いて、４％Ｔ／２．５％Ｃを含む。
【００３５】
本発明の第１態様のＩＰＧゲルは、ストリップ又はスラブの形態としうる。好ましくは、上記スラブは、多区画型電気泳動（ＭＣＥ）装置に用いるのに適している。
【００３６】
第２の態様では、本発明は、サンプル中の高分子を分離又は分析する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載されている本発明のＩＰＧゲルを用いて、サンプルの等電点電気泳動を実施することを含む。
【００３７】
高分子は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、又はムチンのようなタンパク質性分子でよい。このムチンは、高分子量ムチンとしうる。
【００３８】
上記サンプルは、組織サンプル、腺の分泌物、細胞サンプル、微生物サンプル、及び培養物サンプルからなる群より選択することができる。サンプルの好ましい例としては、大腸菌、血漿及び唾液サンプルが挙げられる。
【００３９】
好ましくは、上記方法はさらに、サンプルを処理することを含む。
【００４０】
好ましくは、サンプルの処理は、サンプル中に存在するタンパク質チオールをアルキル化する、又は、サンプル中の高分子のシステイン残基を還元及びアルキル化することを含む。
【００４１】
このような処理を実施することにより、サンプル内のタンパク質を含むシスチン／システインに関して、ＢＡＣマトリックスとの相互作用を阻止することができる。好ましくは、サンプル還元が完了した後、存在するあらゆる過剰チオールをアルキル化により中和する。
【００４２】
このアルキル化は、カルボキシメチル化、カロボキサミドメチル化、ピリジルエチル化、アミドプロピオニル化、ジメチルアミドプロピオニル化、Ｎ−イソプロピルカルボキシアミドメチル化からなる群より選択することができる。好ましくは、タンパク質還元剤は、ジチオトレイトールやメルカプトエタノールのようなチオール還元剤、並びに、トリブチルホスフィンのようなホスフィン還元剤からなる群より選択される。
【００４３】
本発明の第２態様の方法は、ＩＰＧゲルを可溶化又は部分的に可溶化するさらなるステップと、次に、高分子を分離又は回収するさらなるステップを含んでもよい。
【００４４】
第２態様の方法は、さらに、ＩＰＧゲルを第２の次元のゲルにトランスファーし、ＩＰＧゲルを少なくとも部分的に可溶化させ、高分子を第２ゲルに放出させることを含んでもよい。好ましくは、上記方法はさらに、第２ゲル上で電気泳動を実施することを含む。
【００４５】
一実施形態では、「トランスファー」という用語は、ＩＰＧゲルを第２の次元のゲルの上に載せることを意味する。好ましくは、第２の次元のゲル上での電気泳動は、ＩＰＧゲルに用いたものに対して垂直の方向で行なう。
【００４６】
別の実施形態では、ＩＰＧゲルを、ふるいではなく（non-sieving）孔サイズの大きいスタッキングゲルの上に載せ、これをふるいの第２の次元のゲルの上に固定する。
【００４７】
第２ゲルは、変性（すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）若しくは天然ゲルであってもよいし、又はＩＰＧゲルであってもよい。
【００４８】
別の実施形態では、上記方法はさらに、ＩＰＧゲルから高分子を含む画分を切り出すことを含む。
【００４９】
上記ＩＰＧゲルを染色することにより、そこに含まれる高分子を可視化することができる。
【００５０】
好ましくは、切り出した画分を可溶化することにより、そこに含まれる高分子を放出する。一実施形態では、切り出した画分は、ＤＴＴを含むサンプルバッファー中に可溶化させる。好ましくは、切り出し及び可溶化させた画分を第２ゲル上に再泳動させ、好ましくはその後第３ゲルにおいて分離させる。
【００５１】
好ましい実施形態では、第２及び第３ゲルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び／又はＩＰＧゲルである。
【００５２】
さらに別の実施形態形態では、限定するものではないが、チオール還元剤（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ））のような還元剤を、電気泳動しようとするサンプル溶液中に含有させる。電気泳動中に、ＤＴＴは、ＩＰＧマトリックスを部分的に溶解するため、さらに孔の大きなゲルマトリックスが形成され、これによって、高分子量、例えば、約２００ｋＤａ以上の高分子の吸収及び泳動が可能になる。
【００５３】
一実施形態では、上記方法は、さらに、複合混合物内の高分子の特定のサブセクションの前分画（ｐｌに応じて）と、それに続く濃縮を含む。
【００５４】
一実施形態では、第２の態様の方法は、さらに、第２ゲルにＩＰＧゲルをトランスファーした後、ＩＰＧゲルを少なくとも部分的に可溶化することにより、高分子を第２ゲルに放出させることを含む。好ましくは、この方法はさらに、第２ゲル上で電気泳動を実施することを含む。
【００５５】
別の実施形態では、上記方法はさらに、ＩＰＧゲルから、高分子を含む画分を切り出すことを含む。好ましくは、切り出した画分を可溶化することにより、そこに含まれる高分子を放出させる。
【００５６】
第３の態様では、本発明は、サンプル中の高分子を分離及び分析するための、本明細書に記載した本発明のＩＰＧゲルの使用を提供する。
【００５７】
本発明の第４の態様では、本発明は、電気泳動に使用するためのゲルに関し、該ゲルは、置換又は非置換のアクリルアミド、アクリロイルアミノエトキシエタノール（ＡＡＥＥ）、若しくはアクリロイルアミノプロパノール（ＡＡＰ）；（ＩＩ）ＢＡＣ（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ）２；及び場合により（ＩＩＩ）非還元性架橋剤；及び／又は（ＩＶ）アガロース、の重合化混合物を含み、単一の％Ｔ、又はポリアクリルアミド勾配を含むものである。
【００５８】
さらに好ましい実施形態では、上記ゲルは、ＰＤＡ又はＮ，Ｎメチレンビス−アクリルアミドのような非還元性架橋剤を含む。
【００５９】
上記ゲルは、好ましくは約２％〜約１０％Ｃ、さらに好ましくは約３％〜約６％Ｃ、さらに好ましくは約４％〜約５％Ｃ、最も好ましくは約４％Ｃを含む。
【００６０】
上記ゲルは、好ましくは約０〜約３０％Ｔ、さらに好ましくは約０〜約２５％Ｔ、さらに好ましくは約０〜約２０％Ｔ、好ましくは約０〜約１５％Ｔ、好ましくは約０〜約１０％Ｔ、好ましくは約０〜約７．５％Ｔのポリアクリルアミド勾配を含む。これに代わり、上記ゲルは、約２〜約１４％Ｔ、さらに好ましくは約３〜約１０％Ｔ、さらに好ましくは約３〜約８％Ｔ、又は、約４〜約１２％Ｔ、あるいは、約５〜約１５％Ｔ、さらに好ましくは約７〜約１５％Ｔのポリアクリルアミド勾配を含む。
【００６１】
好ましい一実施形態では、上記ゲルは、４％Ｃと、０〜１２％Ｔのアクリルアミド勾配を含む。
【００６２】
一実施形態では、上記ゲルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【００６３】
一実施形態では、上記ゲルは、（Ｉ）アクリルアミド（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ２）、及び（ＩＩ）ＢＡＣ（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２、（ＩＶ）アガロース、及び場合により（ＩＩＩ）非還元性架橋剤、の混合物を含む。
【００６４】
上記ゲルは、約０．１％〜約１％の均一濃度のアガロースを含んでいてよい。
【００６５】
別の実施形態では、上記ゲルは、約０〜約１％アガロースのアガロース勾配を含む。好ましくは、上記ゲルは、約０〜約０．５％、約０．５％〜約１％、約１〜約０．５％、又は約０．５％〜約０％アガロースのアガロース勾配を含む。
【００６６】
好ましくは、上記ゲルは、アガロースと組み合わせて用いる場合、約０〜約８％Ｔを含む。
【００６７】
別の実施形態では、上記ゲルは、（Ｉ）アクリルアミド（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ２）、（ＩＩ）ＢＡＣ（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ）２、及び（ＩＩＩ）非還元性架橋剤、の重合化モノマー単位の混合物を含む。好ましくは、単位（ＩＩＩ）は、ＰＤＡ（Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ２）である。
【００６８】
第５の態様では、本発明は、サンプル中の高分子を分離又は分析するための、本発明のゲルの使用を提供する。
【００６９】
好ましくは、上記高分子は、約１５ｋＤａ〜約７５０ｋＤａの分子量を有する。
【００７０】
第６の態様では、本発明は、サンプル中の高分子を分離又は分析する方法を提供し、該方法は、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）サンプルを処理して、サンプル中に存在する遊離タンパク質チオールをアルキル化するか、又はサンプル中のタンパク質シスチン／システインを還元及びアルキル化する工程；
（ｉｉ）本発明の第４の態様のゲルを用いて、処理されたサンプルに対し電気泳動を実施する工程
を含む。
【００７１】
本発明の第６態様の一実施形態では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを可溶化若しくは部分的に可溶化し、高分子を回収するか、又は更なる分離ステップに付す。
【００７２】
高分子を含むサンプルは、組織サンプル、腺分泌物、血漿サンプル、細胞サンプル、微生物、又は培養物サンプルからなる群より選択することができる。好ましいサンプルの例として、限定するものではないが、大腸菌、血漿及び唾液が挙げられる。
【００７３】
好ましい実施形態では、本発明の方法はさらに、ステップ（ｉｉ）から得たゲルを第２ゲルにトランスファーすることを含む。好ましくは、上記方法は、さらに、ステップ（ｉｉ）からのゲルを少なくとも部分的に可溶化して、第２ゲルに高分子を放出させることを含む。好ましくは、上記方法は、第２ゲル上で電気泳動を実施することを含む。
【００７４】
第２ゲルは、ＩＰＧゲル、ポリアクリルアミドゲル又はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとしうる。
【００７５】
本発明の第６態様の方法を２回以上繰り返すことにより、分離を改善することができる。
【００７６】
一実施形態では、上記方法は、トリプシンを用いた消化の前又は後のいずれかに、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析のための抽出前に、限定するものではないが、ＤＴＴ及びβ−メルカプト−エタノールのようなチオール還元剤などの還元剤を用いて、ゲルを溶解させることを含む。
【００７７】
別の実施形態では、上記方法は、ウエスタンブロット法を実施中、膜支持体へのトランスファー時に、ゲルマトリックスを溶解させることを含む。
【００７８】
さらに別の実施形態では、（ｉ）サンプル中の高分子を分離手順に付す工程の前に、好ましくは、複合混合物内の高分子の特定のサブセクションの前分画（ｐｌに応じて）と、それに続く濃縮を含む。
【００７９】
さらに好ましい実施形態では、上記ゲルは部分的に、ＰＤＡ又はＮ，Ｎメチレンビス−アクリルアミドのような非還元性架橋剤を含むと共に、該ゲルを部分的に可溶化する。
【００８０】
第７の態様では、本発明は、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）非還元性架橋剤
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含む重合化混合物を含むポリマーゲルを提供し、このゲルは、ＢＡＣ誘導単位のジスルフィド結合が切断されるときに、ゲル構造を保持するようなゲルである。
【００８１】
さらに別の態様では、本発明は、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）ピペラジンジ−アクリルアミド（ＰＤＡ）
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含むモノマーの重合化混合物を含むポリマーゲルを提供する。
【００８２】
また別の態様では、本発明は、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）非還元性架橋剤
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含むモノマーの重合化混合物を含むポリマーゲルを提供し、該重合化混合物のジスルフィド結合の少なくとも一部分が切断されたものである。好ましくは、ジスルフィド結合は切断されている。好ましくは、ポリマー混合物に還元剤を添加することにより、ジスルフィド結合が切断されている。好ましくは、還元剤は、チオール還元剤である。
【００８３】
一実施形態では、上記ポリマーゲルは、電気泳動ゲルの形態をしている。好ましくは、ジスルフィド結合は、ゲルによる電気泳動に付すサンプルに含まれる還元剤によって切断される。
【００８４】
別の態様では、本発明は、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）：
（Ｉ）ＣＨ２＝ＣＲ１−ＣＯ−ＮＲ２Ｒ３、
（ＩＩ）（ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−）２（ＢＡＣ）、及び
（ＩＩＩ）非還元性架橋剤
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なるものであり、水素又は場合により置換されていてもよいアルキル若しくはシクロアルキルである〕
を含むモノマーの重合化混合物を含むポリマーゲルの多孔度を制御する方法を提供し、該方法は、該ポリマーゲルを処理することにより、ＢＡＣのジスルフィド結合の少なくとも一部分を切断することを含む。好ましくは、すべてのジスルフィド結合を切断する。好ましくは、上記ポリマーゲルは電気泳動ゲルである。一実施形態では、ゲルを用いて、サンプルに対し電気泳動を実施する前に、ジスルフィド結合を切断する。好ましくは、ゲルでの電気泳動に付そうとするサンプルに還元剤を含有させることにより、ジスルフィド結合を切断する。一実施形態では、還元剤はチオールである。
【００８５】
本明細書に記載する方法を通常の分離方法と組み合わせて、分離及び分析の改善を達成できることは理解すべきである。一実施形態では、第６の態様に記載の方法をウエスタンブロット法に用いることにより、この方法を実施中にゲルを可溶化させ、ゲルマトリックスからの全タンパク質を支持体膜に結合させることができる。好ましくは、ウエスタンブロット法の実施中、ゲルを可溶化すれば、ゲルマトリックスからのタンパク質が、好適な支持体膜により効率的にトランスファーされるため、情報力が増加した２Ｄアレイブロットが得られる。
【００８６】
別の実施形態では、トリプシン消化前又は後に、ゲルマトリックスを溶解させるＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析と、本明細書に記載の方法を組み合わせることにより、ペプチド回収を向上させる。好ましくは、７〜１５％Ｔの範囲にあるポリアクリルアミドのゲルでは、市販の調製された４〜１２％Ｔビス架橋対応物と同様の分離度を達成する。本発明に係るゲルをＭＡＬＤｉ−ＭＳにより分析したところ、本明細書に概要を示したゲル系は、市販の対応物と同様のシグナル強度を生成することがわかり、示差的に放出されるペプチド断片の存在を示すプロフィールが得られた。
【００８７】
当業者であれば理解されるように、本発明は、「オールインワン」タイプの２Ｄ分離系の生産を可能にする。例えば、少なくとも一方が溶解可能なゲルである２つのゲルは、面を接触させることができる。このようなゲルの構成は、２Ｄ分離技法において明らかに有利であろう。
【００８８】
略語：
１０％ＡＰＳ：１０％ｗ／ｖ過硫酸アンモニウム
２０％Ｔ／４％Ｃ：２０％全モノマー（そのうち４％は架橋モノマーのもの）を含むポリアクリルアミド溶液
アガロース：アガロースは、基本反復単位アガロビオース（ガラクトースと３，６−アンヒドロガラクトースの単位を交互に含む）から構成される直鎖状多糖（平均分子量は約１２，０００）である
ＡＳＢ−１４：アミドスルホベタイン
ＢＡＣ：Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）−シスタミン
ビス−アクリルアミド：Ｎ，Ｎ−メチレン  ビス−アクリルアミド
β−ＭＥ：ベータ−メルカプトエタノール
ＤＴＴ：ジチオトレイトール
ＦＡ：ギ酸
ゲルバッファー：３７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．８）
ＩＡＡ：ヨードアセトアミド
ＩＥＦ：等電点電気泳動
ＩＰＧ：固定化ｐＨ勾配
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＭｉｌｌｉＱ：１８．２メガオームでのＭｉｌｌｉＱ水
ＭＯＰＳ泳動バッファー：５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び３．５ｍＭ  ＳＤＳ
ＭＯＰＳ：３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
ＰＡＳ染色：炭水化物のための過ヨウ素酸／シッフ試薬染色
ＰＤＡ：ピペラジンジアクリルアミド
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
シグマキット（Sigma Kit）Ｃ溶液３：７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１％ＡＳＢ−１４
ＴＢＰ：トリ−ブチルホスフィン
ＴＥＭＥＤ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルエチレンジアミン
ＴＦＡ：トリ−フルオロ酢酸
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ：塩酸を用いて必要なｐＨに調節されたＴｒｉｓ塩基性溶液
2005505752.tif 000003
【実施例】
【００８９】
本発明の特性がさらに明確に理解されるように、その好ましい形態を以下の非制限的実施例を参照にして説明する。
【００９０】
材料：
アクリルアミド（非安定化）（ＢＤＨ）生産番号４４２９９４０
アクリルアミドバッファー粉末（Fluka）
ｐＫ３．１  カタログ番号０１７１３
ｐＫ３．６  カタログ番号０１７１５
ｐＫ４．６  カタログ番号０１７１７
ｐＫ６．２  カタログ番号０１７１９
ｐＫ７．０  カタログ番号０１７２７
ｐＫ８．５  カタログ番号０１７３５（これは、０．１％ヒドロキノンで安定化させた１ｇとして供給され、液体である）
ｐＫ９．３  カタログ番号０１７３８（イソプロパノール中の２００ｍＭ溶液としてのみ供給）
ｐＫ１０．３  カタログ番号０１７３９（これは、０．１％ヒドロキノンで安定化させた１ｇとして供給され、液体である）
アミノ−ｎ−カプロン酸（Sigma）カタログ番号Ａ−２５０４
ＡＰＳ（Biorad）カタログ番号１６１−０７００
ＡＳＢ−１４  シドニー有機合成ユニット（Sydney Organic Synthesis Unit）
β−ＭＥ（Sigma）カタログ番号Ｍ−６２５０
ダイレクトブルー７１（Aldrich）カタログ番号２１，２４０−７
大腸菌（Ｋ−１２株）（Sigma）カタログ番号ＥＣ−１
ホルムアミド（Sigma）カタログ番号Ｆ−５７８６
ゲルボンド（GelBond）ＰＡＧフィルム（Amersham）カタログ番号８０−１１２９−３７
イモビリロン（Immobiline）−ＰＳＱ（Millipore）カタログ番号ＩＳＥＱ０００１０
ＭＯＰＳ（Sigma）カタログ番号Ｍ−１２５４
Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）−シスタミン（Sigma）カタログ番号Ａ−５９１２
Ｎ，Ｎメチレンビスアクリルアミド（Biorad）カタログ番号１６１−０２００
６〜１５％線形勾配ゲルチップ（GelChip）（Proteome Systems Ltd.）
ゲルチップ泳動バッファー（Ｔｒｉｓ／トリシン／ＳＤＳ）（Proteome Systems Ltd.）
プロテオプレップ（ProteoPrep）キット（Proteome Systems Ltd.）カタログ番号ＰｒｏｔＴｏｔ
ＰＤＡ（Biorad）カタログ番号１６１−０２０２
ＳＤＳ（Sigma）カタログ番号Ｌ−３７７１
ＴＥＭＥＤ（Sigma）カタログ番号Ｔ−９２８１
Ｔｒｉｓ（ＢＤＨ）生産番号１０３１５７Ｐ
【００９１】
設備：
バイオラド電源（Biorad）
プロテオームシステムズ５７０−９０電源
プロテオームシステムズ：第２の次元の泳動タンク
イモビリンドライストリップキット（Immobiline Drystrip Kit）（Pharmacia）
ブランソンデジタルソニフィアー（Branson Digital Sonifier）モデル４５０
トランスソニックＴ７００／Ｈ超音波水浴（John Morris Scientific）
【００９２】
コンピュータープログラム：
Ｄｒ  ｐＨ（著作権１９９３、Hoefer Scientific Instruments）
【００９３】
実施例１
アクリルアミド／ＢＡＣ溶液（４０％Ｔ／２．５％Ｃ）
３９ｇアクリルアミド
１ｇＢＡＣ
８０ｍｌホルムアミドに粉末を添加し、６０℃に加熱することにより、ＢＡＣの溶解を促進した。溶解させた後、ホルムアミドを用いて量を１００ｍｌに調節した後、溶液を室温まで冷却させた。得られた４０％Ｔ／２．５％Ｃ溶液をホイルで被覆したびんに入れて室温で保存した。
【００９４】
アクリルアミドバッファー原液（ホルムアミド中２００ｍＭ）：
１００％ホルムアミドを用いて、適切なアクリルアミドバッファー粉末を溶解することにより、全てのアクリルアミドバッファーの２００ｍＭ原液を調製した。全てのアクリルアミドバッファーの分子量は異なるため、各々５ｍｌの溶液を調製することにより、最終濃度を２００ｍＭとした。
【００９５】
５ｍｌを生成するのに用いた重量：
ｐＫ３．１ＭＷｔ＝５ｍｌ中に溶解した重量１６３Ｄａ＝１６３ｍｇ
ｐＫ３．６ＭＷｔ＝５ｍｌ中に溶解した重量１２９Ｄａ＝１２９ｍｇ
ｐＫ４．６ＭＷｔ＝５ｍｌ中に溶解した重量１５７Ｄａ＝１５７ｍｇ
ｐＫ６．２ＭＷｔ＝５ｍｌ中に溶解した重量１９０Ｄａ＝１９０ｍｇ
ｐＫ７．０ＭＷｔ＝５ｍｌ中に溶解した重量２００Ｄａ＝２００ｍｇ
ｐＫ８．５ＭＷｔ＝５ｍｌ中に希釈した量１４２Ｄａ＝１４２μｌ
ｐＫ１０．３ＭＷｔ＝５ｍｌ中に希釈した量１８４Ｄａ＝１８４μｌ
【００９６】
ｐＫ９．３アクリルアミドバッファーは、イソプロパノール中の２００ｍＭ溶液としてしか得ることができないため、溶剤としてホルムアミドを用いて、２００ｍＭ原液を調製するためには、高速真空（speedy vac）を用いて、少量の残留液が残るまで、イソプロパノールを蒸発させる。次に、この溶液を、１００％ホルムアミドで元の量まで再希釈する。一般に、３ｍｌの溶液を乾燥させた（約５０〜１００μｌの残留液が残る）後、前記のように再懸濁して３ｍｌに戻す。
【００９７】
実施例２
ＢＡＣ−ＩＰＧ
Ｄｒ  ＰＨプログラム（用いた勾配及びそれらのミックスについては付録Ｂを参照のこと）を用いて、目的のｐＨ範囲を獲得するのに必要なイモビリンミックスを計算した後、４％ＴのＢＡＣ−ＩＰＧスラブゲル（０．５ｍｍ、長さ１１ｃｍ）（そこから、個別のストリップを切り出した）を流し込んだ。アクリルアミドバッファーの水中ｐＫをＤｒ  ｐＨプログラムに入れて、勾配構成を計算した。これに代わり、アクリルアミドバッファーの各々について、尿素中のｐＫも用いることができるが、この場合、同じｐＨ勾配を形成するのに必要なアクリルアミドバッファーの各々の量に変化が生じる。最も標準的に用いられているｐＨ４〜７勾配の構成を以下に示す：
【００９８】
酸性溶液（ｐＨ４．０）
イモビリンｐＨ３．１      ２５７．２μｌ
イモビリンｐＨ４．６      ２５４．２μｌ
イモビリンｐＨ６．２      ２８８．５μｌ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ              ６２．９μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ      ８００μｌ
５０％グリセロール            ０μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水          ６３３７μｌ
塩基性溶液（ｐＨ７．０）
イモビリンｐＨ４．６      ２７１．６μｌ
イモビリンｐＨ６．２      ２４４．１μｌ
イモビリンｐＨ７．０      １０２．２μｌ
イモビリンｐＨ８．５      １８２．１μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ      ８００μｌ
５０％グリセロール      １６００μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水          ２３６４μｌ
【００９９】
触媒：ＴＥＭＥＤ      １６μｌ／８ｍｌゲル溶液（０．１％最終）
２０％ＡＰＳ    ４０μｌ／８ｍｌゲル溶液（０．２％最終）
【０１００】
触媒をゲル溶液に添加した後、溶液を勾配形成装置内に導入し、バルブを開ける。６０ｍｌ／分のポンプ速度を用いて、ＩＰＧを流し込んだ後、ゲルに水飽和イソブタノールを重層して、５０℃で６０分かけて重合させた。
【０１０１】
ブタノールを洗い流した後、合わせガラス板を取り外し、ゲルを下記の洗浄液で洗浄した：
２×１０％  メタノール      各１５分
２×２０％  メタノール      各１５分
（最後の２０％メタノール洗浄液は、５％グリセロールを含む）。
【０１０２】
次に、ＩＰＧをガラス板支持体に固定してから、化学物質の蒸気の乾燥器中で一晩乾燥させた。完全に脱水したら、ＩＰＧをグラドラップ（Glad Wrap）で被覆し、−２０℃で保存した。
【０１０３】
実施例３（図５を参照）
改良３単位ｐＨ  ＩＰＧ勾配
ｐＨ３〜６
酸性溶液（ｐＨ３．０）
イモビリンｐＨ３．６            １８７．５μｌ
イモビリンｐＨ４．６            １９６μｌ
イモビリンｐＨ６．２                ５μｌ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ                    ７５μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ（ＢＡＣ）  ８００μｌ
５０％グリセロール                  ０μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水                ６７３６μｌ
塩基性溶液（ｐＨ６．０）
イモビリンｐＨ３．６              ３３μｌ
イモビリンｐＨ４．６            ３２２μｌ
イモビリンｐＨ６．２            ３０９μｌ
イモビリンｐＨ９．３            １３７μｌ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ                      １μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ（ＢＡＣ）  ８００μｌ
５０％グリセロール            １６００μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水                ６３３７μｌ
【０１０４】
ｐＨ５〜８
酸性溶液（ｐＨ５．０）
イモビリンｐＨ３．１            １６３μｌ
イモビリンｐＨ４．６            ２６２μｌ
イモビリンｐＨ６．２            ３４４μｌ
イモビリンｐＨ７．０              ３１μｌ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ                  １６２μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ            ８００μｌ
５０％グリセロール                  ０μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水                ６２３８μｌ
塩基性溶液（ｐＨ８．０）
イモビリンｐＨ４．６            ２２０μｌ
イモビリンｐＨ６．２              ４６μｌ
イモビリンｐＨ７．０            ３０３μｌ
イモビリンｐＨ８．５            １９５μｌ
イモビリンｐＨ９．３              ３６μｌ
１Ｍ酢酸                          ６６μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ            ８００μｌ
５０％グリセロール            １６００μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水                ４７３３μｌ
【０１０５】
ｐＨ７〜１０
酸性溶液（ｐＨ７．０）
イモビリンｐＨ４．６            ３１５μｌ
イモビリンｐＨ６．２            ３６６μｌ
イモビリンｐＨ７．０            １１９μｌ
１Ｍ酢酸                          ３１μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ            ８００μｌ
５０％グリセロール                  ０μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水                ６３６９μｌ
塩基性溶液（ｐＨ１０．０）
イモビリンｐＨ４．６              ３８μｌ
イモビリンｐＨ７．０            ３３３μｌ
イモビリンｐＨ８．５            ２３５μｌ
イモビリンｐＨ９．３            １９４μｌ
１Ｍ酢酸                        １４２μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ            ８００μｌ
５０％グリセロール            １６００μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水                ４６３８μｌ
【０１０６】
ＩＰＧゲルはすべて、下記量の２種の触媒を用いて重合化した：
ＴＥＭＥＤ      １６μｌ／８ｍｌゲル溶液（０．１％最終）
２０％ＡＰＳ    ４０μｌ／８ｍｌゲル溶液（０．２％最終）
【０１０７】
実施例４
ＩＥＦのサンプル調製物：
９０ｍｇの大腸菌Ｋ−１２株（乾燥凍結）（Sigma、EC-1）を１５ｍｌのプロテオプレップ（Proteoprep）キット（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、及び１％Ｃ７）中に再懸濁させ、最終濃度を６ｍｇ／ｍｌとした。７０％振幅で懸濁液を６×１０秒間音波破砕するが、その際、破砕と破砕の間の１〜２分間を氷上で冷却することにより、タンパク質のカルバミル化を最小限に抑えた。
【０１０８】
５ｍＭ  ＴＢＰを用いて、溶解物を室温で１時間還元した後、室温の暗所にて、１５ｍＭ  ＩＡＡを用いて１時間かけてサンプルを完全にアルキル化した。２１，０００ｇでのマイクロ遠心分離により、可溶化タンパク質から細胞残屑を分離した後、アリコートに分け、−２０℃で保存した。
【０１０９】
ＢＡＣ−ＩＰＧ系で用いるために、プロテオプレップ（Proteoprep）キットを用いて、６ｍｇ／ｍｌ大腸菌溶解物をさらに３ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した後、微量の１％オレンジＧを追跡色素として添加した。一般に、２２０μｌを用いて、１１ｃｍＩＰＧスラブから３ｍｍ幅のストリップを再水和させ、又は、２〜３ｃｍ幅のスラブについての比例量についても試験した。再水和は、室温にて６〜８時間で完了した。
【０１１０】
血漿
一般に規定された方法を用いて、全血を回収及び処理することにより、血漿サンプルを取得し、これを−２０℃で保存した。２Ｄ電気泳動に使用するための血漿サンプルにその後実施した追加処理について以下に概説する。
【０１１１】
アセトン沈降を実施することにより、生物学的液体からのタンパク質の沈降により、サンプルの脱塩を効果的に行なう。基本的には、ＣＨＡＰＳを最終濃度０．５％まで１ｍｌの血漿に添加する。次に、−２０℃まで前冷却したアセトンで、血漿／ＣＨＡＰＳを１０ｍｌまで希釈し、沈降を−２０℃で３０分かけて実施した。５，０００×ｇ及び４℃での遠心分離により沈降物を回収した後、７０％振幅で３×１５秒のプローブ音波破砕により、１０ｍｌの７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び２％ＣＨＡＰＳ中に再懸濁させるが、その際、音波破砕と音波破砕の間に氷上で冷却した。
【０１１２】
血漿タンパク質の脱塩後、サンプルを還元及びアルキル化した。５ｍＭ  ＴＢＰを用いて、室温で１時間標準的還元を実施した後、室温の暗所にて、１５ｍＭ  ＩＡＡでサンプルを１時間アルキル化した。次に、サンプルをアリコートに分け、−２０℃で保存した。
【０１１３】
血漿サンプルを１００％濃度で用いるか、必要であれば、サンプル溶液だけを用いて希釈することによりレベルを低下させた。
【０１１４】
唾液
唾液（１０ｍｌ）を氷上で回収した後、１０ｍＭ  ＤＴＴを添加し、２０分静置してから、２ｍｌアリコートにおいて、２１，０００ｘｇで１０分マイクロ遠心分離した。次に、ペレット化材料及び表面上で分離した脂質を避けるために、得られた上清の中心部から１ｍｌを採取した。
【０１１５】
こうして、遠心した唾液の５ｍｌを用いて、以下に概説するサンプル溶液の成分を可溶化した。
【０１１６】
唾液サンプル（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び１％ＣＨＡＰＳ中の唾液）
２．１ｇ      尿素
７６１ｍｇ    チオ尿素
２４．２ｍｇ  Ｔｒｉｓ
５０ｍｇ    ＣＨＡＰＳ
【０１１７】
遠心した唾液で５ｍｌまでサンプルを調製する。振とう器（rocker）に載せて溶解させる。尚、唾液中に存在するムチンなどの完全性を維持するため、いずれの段階でもサンプルは音波破砕してはならないことに注意すべきである。
【０１１８】
次に、室温の暗所にて、１５ｍＭ  ＩＡＡで唾液サンプルを１時間アルキル化した。それから、唾液サンプルをアリコートに分け、−２０℃で保存した。
【０１１９】
こうして得られた唾液サンプルをこれ以上希釈せずに、直接用いて、ＩＰＧストリップを再水和した。いくつかの事例では、粉末状の０．１Ｍ以下のＤＴＴをサンプルに添加することにより、水和段階で、マトリックス内のＢＡＣ架橋を溶解させる。本発明者らは、これにより、高分子量成分がサンプル内に入りやすくなると推定する。また、この過程を促進するために、能動的（active）再水和を実施してもよい。
【０１２０】
実施例５
ＢＡＣ−ＩＰＧ
第１の次元では、ＢＡＣ−ＩＰＧストリップ、及び、対照として、ファルマシア（Pharmacia）ｐＨ４〜７イモビリンドライストリップ（Immobiline Drystrip）１１ｃｍ  ＩＰＧストリップを用いた：
泳動パラメーター
下記の勾配での泳動：（５０μＡ／ストリップ限界）
３００Ｖ急傾斜（４時間）
１０，０００Ｖ線形傾斜（６時間）
１０，０００Ｖ急傾斜（６〜１０時間）
【０１２１】
次に、泳動した（focused）ストリップを、バンド抽出に用いるか、あるいは、平衡させて第２の次元のゲル上で泳動させるか、あるいは、気密容器内に密封し、−２０℃で保存した。
【０１２２】
実施例６
バンド抽出
大腸菌の泳動ＢＡＣ−ＩＰＧ及びＰＤＡ−ＢＡＣ−ＩＰＧスラブをクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０（０．１％Ｇ−２５０、１７％硫酸アンモニウム、３４％メタノール、及び、３％オルト−リン酸）で６時間からＯ／Ｎまで染色した後、１％酢酸で脱染しておいたものをバンド抽出実験に用いた。
【０１２３】
照明ボックスを用いてバンドの可視化を促進し、バンドを選択してから、まず、清浄な小刀の刃でバンドの両側に沿って切断することにより、切り出した。改変されたイエローチップ（付録Ａを参照）を用いて、バンドを回収した後、５０μｌβ−ＭＥを含む５００μｌプロテオプレップキットの入ったエッペンドルフ管に移した。このバンドを音波水浴中で、１０分以下又はバンドの完全な溶解が達成するまで、音波破砕した（カルバミル化を最小限に抑えるため、溶液を加熱しないよう注意しなければならない）。
【０１２４】
溶解したバンドは、第２ラウンドの等電点電気泳動のために、新しいＩＰＧストリップを直接再水和するのに用いるか、あるいは、後の使用のために−２０℃で保存することができる。
【０１２５】
バンド抽出前の大腸菌タンパク質のＢＡＣ−ＩＰＧ及びＰＤＡ−ＢＡＣ−ＩＰＧ染色スラブの例を図３に示す。図３に示したＢＡＣ−ＩＰＧ及びＰＤＡ−ＢＡＣ−ＩＰＧスラブからの２Ｄアレイの一例を図１に示す。
【０１２６】
図４は、ＢＡＣ−ＩＰＧ及びＰＤＡ−ＢＡＣ−ＩＰＧスラブの各々からの３ｍｍＩＰＧストリップの１×再充填時に、再泳動した抽出バンド（パネルＡ＋Ｂ）及び抽出ゾーン（パネルＣ＋Ｄ）から発生した２Ｄアレイを示す。
【０１２７】
実施例７
第２の次元のゲルへのタンパク質のトランスファー増大
ｐＨ３〜１０の勾配を有するＩＰＧゲルを生成するための配合を概説する。この態様に加えた主な構造的改変は、還元性及び非還元性架橋剤を組み合わせて、保持力の低いＩＰＧマトリックスを取得することである。この例は、ＰＤＡ−ＢＡＣハイブリッドゲルである。
【０１２８】
酸性溶液（ｐＨ３．０）
イモビリンｐＨ３．１              ６６．２μｌ
イモビリンｐＨ４．６            ３６４．４μｌ
１Ｍ  Ｔｒｉｓ                    ８４．６μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ（ＰＤＡ）  ４００μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ（ＢＡＣ）  ４００μｌ
５０％グリセロール                  ０μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水                ６６８４．８μｌ
塩基性溶液（ｐＨ１０．０）
イモビリンｐＨ４．６              １９．２μｌ
イモビリンｐＨ６．２            ４４３．０μｌ
イモビリンｐＨ７．０            １４４．６μｌ
イモビリンｐＨ８．５              ７４．６μｌ
イモビリンｐＨ９．３            １１８．５μｌ
１Ｍ酢酸                        １２２．１μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ（ＰＤＡ）  ４００μｌ
４０％Ｔ／２．５％Ｃ（ＢＡＣ）  ４００μｌ
５０％グリセロール            １６００μｌ
ＭｉｌｌｉＱ水                ６３３７μｌ
【０１２９】
触媒：ＴＥＭＥＤ      １６μｌ／８ｍｌゲル溶液（０．１％最終）
２０％ＡＰＳ    ４０μｌ／８ｍｌゲル溶液（０．２％最終）
【０１３０】
勾配形成装置を用いて、ゲルを流し込み、５０〜６０ｍｌ／分の速度で供給し、５０℃で２時間かけて重合してから、上に概説したように脱水した後、使用するまで−２０℃で保存した。
【０１３１】
サンプルを泳動した後は、ストリップを平衡させて、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、１１２ｍＭ  Ｔｒｉｓ／酢酸ｐＨ７．０ゲルバッファーの溶液中にＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づくゲル系において、室温で一定に揺動しながら２０分使用した。
【０１３２】
実施例８
再水和中にマトリックスを溶解した場合のタンパク質エントリーの増大
前記実施例６に記載したように、ゲルを流し込んだ。
【０１３３】
再水和の際、ＤＴＴ又はβ−ＭＥをサンプル溶液に添加する。これにより、マトリックス内のすべてのＢＡＣ架橋を効果的に溶解することができ、多孔度がさらに高いゲルマトリックスを獲得することができる。本発明者らは、この態様によって、事前にサイズ排除した材料の泳動（集束）が可能となるに違いないと推定する。
【０１３４】
還元剤で再水和した後、ＰＤＡ−ＢＡＣ−ＩＰＧストリップを前記のように泳動させてから、平衡させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ第２の次元のゲル上で泳動させた。
【０１３５】
実施例９
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＢＡＣゲル
用いたゲルは、３〜８％、４〜１２％及び６〜１５％のいずれかのアクリルアミド勾配を有するか、又は全体を通じて１０％Ｔ及び１５％Ｔのような均一％Ｔであった。染色中に、取扱いを容易にし、かつ、ゲルサイズを維持しやすくするために、ゲルを含むＢＡＣをゲルボンド（GelBond）支持シート上に形成したが、これはゲルの形成には必須というわけではない。すべてのゲルを流し込む手順は同じであるが、各％Ｔゲルに用いられる水の量に対するアクリルアミド／ＢＡＣ原液の量が変動する。
【０１３６】
４〜１２％Ｔ
各ゲルチップ（GelChip）サイズゲル（８ｃｍ×１３．５ｃｍ×１ｍｍ）につき、１２ｍｌの溶液を要する。従って、勾配ゲルを得るには、６ｍｌの各溶液が必要である。
【０１３７】
2005505752.tif 000004
【０１３８】
触媒：ＴＥＭＥＤ      １２μｌ／６ｍｌ（０．１％）
２０％ＡＰＳ    ３０μｌ／６ｍｌ（０．２％）
【０１３９】
１０％均質ゲルについては下記の通りである：
2005505752.tif 000005
【０１４０】
触媒：ＴＥＭＥＤ      ２４μｌ／６ｍｌ（０．１％）
２０％ＡＰＳ    ６０μｌ／６ｍｌ（０．２％）
【０１４１】
１．０ｍｍスペーサーを用いて、室温及び６０ｍｌ／分の供給速度でゲルを流し込んでから、ブタノールを重層した後、５０℃で１時間かけて重合した。
【０１４２】
ブタノールをＭｉｌｌｉＱですすいだ後、１１２ｍＭ  Ｔｒｉｓ／酢酸ｐＨ７バッファーでゲルを覆った後、使用まで、ジップロック式プラスチック製袋に密封して−４℃で保存した。
【０１４３】
実施例１０
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル調製
大腸菌溶解物（３ｍｇ／ｍｌ）の分子量標準物又は泳動したｐＨ４〜７のＩＰＧのいずれかをサンプルとして用いて、各種％Ｔゲルを試験することにより、１５〜２５０＋ｋＤａ程度の分離範囲を提供するゲルを取得した。
【０１４４】
６〜１５％ゲルチップ第２の次元のゲルを比較対照ゲルとして用いた。
【０１４５】
５ｍＭ  ＴＢＰを用いて、分子量標準物を１時間還元し、１５ｍＭ  ＩＡＡで１時間暗所にてアルキル化した後、ＢＡＣに基づくゲルを用いることにより、標準物を含むシステインがゲルマトリックス内でＢＡＣ成分と相互作用するのを阻止した。用いた分子量標準物は、Ｂｉｏｒａｄのブロードレンジ（Broad Range）ミックス又はカレイドスコープ（Kaleidoscope）前染色マーカーのいずれかであった。
【０１４６】
泳動したＩＰＧストリップを用いようとする場合には、６Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／酢酸ｐＨ７．２％、ＳＤＳ、並びに、追跡色素として微量のブロモ−フェノールブルーを含む溶液中で、ストリップをまず平衡させた後、ゲルチップ対照又はアクリルアミド／ＢＡＣゲルの上に載せた。
【０１４７】
実施例１１
１×ゲルチップ泳動バッファー：
ＭｉｌｌｉＱを用いて、泳動バッファーパック（Proteome Systems Ltd.）を溶解することにより、Ｔｒｉｓ／トリシン／ＳＤＳバッファーの１０×原液を調製する。次に、これをＭｉｌｌｉＱで適宜希釈することにより、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／５０ｍＭトリシン／２％ＳＤＳの最終１×溶液を取得する。
【０１４８】
実施例１２
泳動パラメーター：
ゲルチップ及びゲルを含むＢＡＣの泳動条件は、５０ｍＡ／ゲルの定電流であった。
【０１４９】
泳動は、ブロモ−フェノールブルー前端がゲルの底部から泳動し始めた直後に停止した。それから、ゲルサンドイッチを取り外し、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０で一晩染色した後、１％酢酸で脱染した。図１は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＢＡＣゲル上で分離した大腸菌（３ｍｇ／ｍｌ）の２Ｄマップを示す。
【０１５０】
実施例１３
２Ｄアレイのウエスタンブロット：
ＰＤＡ、ＰＤＡ−ＢＡＣ、又はＢＡＣ架橋を用いた１０％均質ゲルを用いて、ｐＨ４〜７の大腸菌アレイを作製した後、β−ＭＥの存在又は非存在下で、これらをイモビロン（Immobilon）−ＰＳＱ膜にトランスファーした。
【０１５１】
トランスファーのために、上部２枚のブロッティング紙を溶液１（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／４０ｍＭアミノ−ｎ−カプロン酸／０．０１％ＳＤＳ／１０％メタノール）に浸漬した後、ＭｉｌｌｉＱで２分すすいでから、溶液１に５分浸漬して、積層（stack）を構築した。次に、これを膜の上に載せ、次の一枚のブロッティング紙を溶液２（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／２０％メタノール）に浸漬した。この積層を、溶液３（３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ）に浸漬したブロッティング紙のイオントラップの上に載せた。ゲルを２０ｍＡで２０分、次に４００ｍＡで３０分、膜にトランスファーした後、ダイレクトブルー７１（Direct Blue 71）で１０分染色し、４０％メタノール／１０％酢酸で洗浄してから、空気乾燥させた。
【０１５２】
このようにしてダイレクトブルー７１で染色したブロットを図６に示すが、同図から、ホルムアミド及びＢＡＣを含むゲルが、依然としてゲルマトリックスから効果的にトランスファーすることができることがわかる。図６に示すＰＤＡの唯一の対照ブロットもβ−ＭＥで処理してある。
【０１５３】
実施例１４
アキシマ（Axima）質量分析計（Ｍ００６）分析
図４、５及び６に記載したゲルから、ＭＳ分析のために、ゲルからタンパク質スポットを選択し切り出した（図４及び６の矢印で示す）。選択したスポットを次の２つの特性に基づいて選んだ：
染色度（ペプチド、及び放出されたあらゆる示差的ペプチドの抽出効率を試験するため）、及び
分子量（分離された％Ｔ範囲の可溶性を評価するため）。
【０１５４】
７〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＢＡＣゲルからの２セットの切り出したタンパク質スポットをノベックス（Novex）４〜１２％Ｂ／Ｔズーム（Zoom）ゲルからの同じスポットと比較した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＢＡＣスポットの一方のセットはノベックス切り出しスポットと同様に処理したが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＢＡＣスポットのもう一方のセットは、５０％振幅で２×１秒の超音波プローブを用いた音波破砕により、２０μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ（トリプシン消化後）中に溶解させた。
【０１５５】
用いられるＭＡＬＤＩ−ＭＡ分析の一般的方法は下記の通りである：
【０１５６】
洗浄
１５０μＬの洗浄液（５０％ｖ／ｖアセトニトリル（ＭｅＣＮ）、２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を各ゲル片に添加した。このプレートを被覆し、振とう器に１時間載せることにより、脱染させた。（洗浄液は、一切のゲル片も失わないように、注意深く取り除いた）。
【０１５７】
シールテープをプレートに貼り、ゲル片を含むすべてのウェル上に孔を配置した。ゲル片を真空下で約１５分乾燥させた。
【０１５８】
消化
１ゲル片ずつ含む各ウェルに、１０μＬのトリプシン（２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中０．０２μｇ／μＬトリプシン）を添加し、被覆して、３０℃で一晩消化させた。
【０１５９】
抽出
抽出液：５０％ｖ／ｖ  ＭｅＣＮ
０．５％  ｖ／ｖ  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（噴煙フードを使用）
１０μＬの抽出液を各ウェルに添加した後、超音波浴中で１０分音波破砕した。１０μＬのＭＱを各ウェルに添加し、蓋を外してから、インキュベーター内に１０分置いた。これは、アセトニトリルの一部を蒸発させるためである。
【０１６０】
次に、ジップチップ（ZipTip）を用いて、サンプルを浄化した後、ＭＡＬＤＩプレート上にスポットした。
【０１６１】
実施例１５
ジップチップサンプルの浄化及び充填
必要な溶液：
９０％ｖ／ｖ  ＭｅＣＮ、５％ｖ／ｖＦＡ（２つの１ｍＬエピ（eppi））
７０％ｖ／ｖ  ＭｅＣＮ、５％ｖ／ｖＦＡ（マトリックス（４００μＬ）用）
５％ｖ／ｖ  ＦＡ（１エピ当たり１００μＬ、１スポット当たり１エピ）
マトリックス：
４００μＬの７０％ｖ／ｖ  ＭｅＣＮ、５％ｖ／ｖＦＡ中４μｇのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸
【０１６２】
新規のジップチップ／ゲル片を用いて１×９０％ｖ／ｖ  ＭｅＣＮを引き上げて（draw up）カラムを湿潤／洗浄した後、２×５％ｖ／ｖ  ＦＡを引き上げてカラムを平衡させた。サンプルをカラムに３回通過させることにより、サンプルをカラムに結合させた。
【０１６３】
３×０．１％ｖ／ｖ  ＴＦＡを用いて、サンプルを洗浄した後、１μｌのマトリックスをジップチップ中に引き上げ、ＭＡｌＤＩプレート上にペプチドを溶離させた。
【０１６４】
次に、アキシマ（Axima）−ＣＦＲ質量分析計（Kratos analytical）を用いて、スポットしたサンプルを分析した。
【０１６５】
参照文献
2005505752.tif 000006
当業者であれば、広範に説明してきた本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、具体的な実施形態に示した本発明に様々な変更及び／又は改変を加えることができることは理解されよう。従って、本発明の実施形態は、あらゆる点で例示的であり、制限的であると考えるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】４〜７のｐＨ勾配を有する、１００％ＢＡＣ及び５０％ＢＡＣ（５０％ＰＤＡ）架橋ＩＰＧ（４％Ｔ）を用いた、プロテオプレップ（ProteoPrep）キット中の３ｍｇ／ｍｌ大腸菌を１３０ｋＶｈで泳動した２Ｄアレイの写真のコピーである。次に、これらを６〜１５％ゲルチップの第２の次元のゲルにトランスファーしてから、クーマシーＧ−２５０で染色した。
【図２Ａ】図２Ａ及びＢは、３ｍｇ／ｍｌ血漿を用いて泳動を行った５０％ＢＡＣ（ｐＨ４〜７）の写真のコピーである。パネルＡ及びＢは、ＤＴＴのような還元剤の非存在下で泳動させた場合に得られる２Ｄアレイを示す。
【図２Ｂ】これに対し、パネルＣ＋Ｄは、還元剤で処理した場合のＩＰＧからのタンパク質のトランスファーの増大を示している。
【図３Ａ】抽出前（パネルＡ）、及びバンドを除去した後（パネルＢ）の、ｐＨ４〜７のＢＡＣ−ＩＰＧ（ｉ）及びＰＤＡ−ＢＡＣ−ＩＰＧ（ｉｉ）を用いたスラブゲルの写真のコピーである。用いたサンプルは、２ｍｇ／ｍｌ大腸菌であり、泳動したスラブをクーマシーＧ−２５０で染色することにより、タンパク質を可視化した。抽出したバンドに隣接するゾーンも抽出のため取り出した。
【図３Ｂ】抽出前（パネルＡ）、及びバンドを除去した後（パネルＢ）の、ｐＨ４〜７のＢＡＣ−ＩＰＧ（ｉ）及びＰＤＡ−ＢＡＣ−ＩＰＧ（ｉｉ）を用いたスラブゲルの写真のコピーである。用いたサンプルは、２ｍｇ／ｍｌ大腸菌であり、泳動したスラブをクーマシーＧ−２５０で染色することにより、タンパク質を可視化した。抽出したバンドに隣接するゾーンも抽出のため取り出した。
【図４Ａ】図４Ａ及びＢは、ｐＨ４〜７の市販のＩＰＧゲル上で再泳動させた後の図３のＢＡＣ−ＩＰＧ及びＰＤＡ−ＢＡＣ−ＩＰＧから抽出したタンパク質バンド／ゾーンの２Ｄアレイの写真のコピーである。パネルＡ＋Ｂは、スラブからのバンド２の再泳動を示す。
【図４Ｂ】これに対し、パネルＣ＋Ｄは、再泳動したゾーン１を示す。
【図５Ａ】図５Ａ及びＢは、１００％ＢＡＣ架橋を用いて形成された、改良３ｐＨ単位勾配の写真のコピーである。パネルＡは、血漿のｐＨ３〜５．５ＭＣＥ画分を用いたｐＨ３〜６のＩＰＧを示し、パネルＢは、ｐＨ５〜８のＢＡＣ−ＩＰＧにおける血漿のｐＨ５．５〜６．５画分を示す。
【図５Ｂ】パネルＣは、血漿のｐＨ７〜１０ＭＣＥ画分を用いたｐＨ７〜１０のＢＡＣ−ＩＰＧを示す。
【図６】架橋剤としてＰＤＡ（パネルＡ）又はＢＡＣ（パネルＢ）のいずれかを用いた１０％均質ゲル上で泳動させた際の大腸菌２Ｄアレイの写真のコピーである。いずれの場合も４０％Ｔ／２．５％Ｃ原液がホルムアミド基剤を有することに留意されたい。ゲルの低分子量領域でスポットがやや不鮮明であるのは、ホルムアミドの分解によるものと考えられる。このような作用は、ゲルのプレ泳動により容易に排除することができると予想される。
【図７Ａ】図７Ａ及びＢは、図６に示したような２Ｄアレイをトランスファーする際に生成されたブロットの写真のコピーである。パネルＡ＋Ｂは、β−ＭＥの非存在（Ａ）及び存在（Ｂ）下での５０％ＢＡＣ架橋１０％均質ゲルを示す。
【図７Ｂ】対照として、パネルＣは、β−ＭＥの存在下でゲルと架橋したＰＤＡだけを示す。
【図１】
2005505752.tif 000007
【図２Ａ】
2005505752.tif 000008
【図２Ｂ】
2005505752.tif 000009
【図３Ａ】
2005505752.tif 000010
【図３Ｂ】
2005505752.tif 000011
【図４Ａ】
2005505752.tif 000012
【図４Ｂ】
2005505752.tif 000013
【図５Ａ】
2005505752.tif 000014
【図５Ｂ】
2005505752.tif 000015
【図６】
2005505752.tif 000016
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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