(57)【要約】本発明は、患者に血管内皮細胞増殖因子レセプター−３（ＶＥＧＦＲ−３）インヒビターを含む医薬組成物を有効量で投与して、患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞増殖因子レセプター−３（ＶＥＧＦＲ−３）インヒビターを含む医薬組成物を患者に有効量で投与して、患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することを含む、患者における角膜移植後の角膜移植片の生存を延長させる方法。
【請求項２】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターが優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターがキナーゼ不活性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターが可溶性である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターが優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターをコードする核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターがキナーゼ不活性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターが可溶性である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターがＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターがＶＥＧＦＲ−３触媒ドメインである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターがＡＴＰアナログである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターがＶＥＧＦＲ−３結合分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＶＥＧＦＲ−３結合分子がＶＥＧＦＲ−３細胞外ドメインに結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＶＥＧＦＲ−３結合分子が抗ＶＥＧＦＲ−３抗体物質である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＶＥＧＦＲ−３抗体物質がモノクローナルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターがＶＥＧＦＲ−３の発現をダウンレギュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターが配列特異的リボヌクレアーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列特異的リボヌクレオチドがリボザイムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターがＶＥＧＦＲ−３アンチセンス核酸分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターが抗ＶＥＧＦ−Ｃ中和抗体物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
抗ＶＥＧＦ−Ｃ中和抗体物質がモノクローナルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターがＶＥＧＦ−Ｃ発現をダウンレギュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターが配列特異的リボヌクレアーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列特異的リボヌクレアーゼがリボザイムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターがＶＥＧＦ−Ｃアンチセンス核酸分子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを分泌する細胞を含む医薬組成物を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
患者に抗血管新生薬剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
患者に免疫抑制剤を投与することをさらに含む、請求項１または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
医薬組成物を角膜移植前に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
医薬組成物を角膜移植後に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を、２または３回、有効量で患者に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１ヶ月間の反復投与を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも６ヶ月間の反復投与を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
（ａ）ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を角膜移植前に患者に投与すること、および
（ｂ）角膜移植に続いて、患者にＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を投与することにより、患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
医薬組成物の全身投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
医薬組成物の局在性の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
医薬組成物の局所性投与を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
医薬組成物の局所注射を含む、請求項３５に記載の方法
【請求項３８】
医薬組成物が眼内または眼周囲インプラントから放出される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、眼科、移植および分子医学の分野に関し、具体的には角膜同種移植片拒絶（反応）を阻害するために、リンパ管新生を調節（制御）する医薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
おそらく、角膜移植は、部分的には角膜の相対的な免疫学的寛容性に一部起因して、ヒトにおいて最もうまくいく組織移植である。角膜移植片の最初の一年の全体的な生存率は、慣用的なＨＬＡ分類および最小限の免疫抑制療法を行わない場合ですら９０％もの高さである。しかしながら、角膜移植の初期の成功は長期成功率により損なわれ、５年目までに約７４％まで低下し、１０年目までに約６２％まで低下する。さらに、角膜新血管形成または進行中の眼炎症を有する患者などの危険性の高い患者において、移植片１０年生存率は３５％未満である。免疫学的、外科的手順および内科的治療の発展にもかかわらず、角膜移植片の生存は最近１０年間の間は、改善されていない（Naackeら、Cornea 350-353 (2001)；WaldockおよびCook, Brit. J. Ophthal. 84:813-815 (2000)、およびFoulks, 「Clinical Aspects of Corneal Allograft Rejection」Krachmerら、Cornea  III巻、1687-1696頁(1997))。さらに、角膜移植は米国において比較的一般的であり、１年間に約４５，０００件の手術が行われているので、同種移植片拒絶は多数の個人に影響を与える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
角膜移植失敗の主な原因は同種移植片拒絶である。不幸なことに、同種移植片拒絶に関する現在の処置（主にコルチコステロイドのような免疫抑制剤）は、症例の約５０％にのみ有効である。さらに、レシピエントの角膜の血管新生が移植失敗に関与しているという証拠にもかかわらず、例えば、血小板活性化因子（ＰＡＦ）アンタゴニストを用いる同種移植片血管新生の阻害は、移植片生存の上昇においてうまくいっていない（Cohenら、Curr. Eye Res. 13:139-144 (1994))。従って、移植片生存を延長させるために角膜同種移植片拒絶を治療する新規な方法に関する必要性が存在している。本発明はこの必要性を満たし、関連する利点をも同様に提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、血管内皮細胞増殖因子レセプター−３(VEGFR-3)インヒビターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。
【０００５】
１つの態様において、本発明は、優性（ドミナント）ネガティブなＶＥＧＦＲ−３レセプターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することによる、患者における角膜移植の後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。このような優性ネガティブなＶＥＧＦＲ−３レセプターは、例えば、キナーゼ不活性化ＶＥＧＦＲ−３レセプターまたは可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターであってもよい。同様に、角膜移植片生存を延長させるために有用なＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、例えば、キナーゼ不活性化ＶＥＧＦＲ−３レセプターまたは可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターのような優性ネガティブなＶＥＧＦＲ−３レセプターをコードする核酸分子であり得る。
【０００６】
本発明はまた、ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長させる方法を提供する。１つの態様において、ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターはＶＥＧＦＲ−３触媒ドメインに結合し、別の態様において、ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターはＡＴＰアナログである。
【０００７】
さらに、本発明は、ＶＥＧＦＲ−３結合分子であるＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して、患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者における角膜移植の後の角膜移植片生存を延長させる方法を提供する。このようなＶＥＧＦＲ−３結合分子は、例えば、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインに結合しうる。本発明に有用なＶＥＧＦＲ−３結合分子はまた、抗ＶＥＧＦＲ−３抗体物質であり得、１つの態様においてモノクローナル抗体物質である。
【０００８】
本発明はまた、ＶＥＧＦＲ−３発現をダウンレギュレートするＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含有する医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜のリンパ管新生を抑制することによる、患者における角膜移植の後の角膜移植片生存を延長させる方法を提供する。このようなＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、例えば、配列特異的リボヌクレアーゼ（例えば、リボザイム）、または例えば、ＶＥＧＦＲ−３アンチセンス核酸分子であってもよい。
【０００９】
本発明はまた、抗ＶＥＧＦ−Ｃ中和抗体物質を含む医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜においてリンパ管新生が抑制されることによる、患者における角膜移植の後の角膜移植片生存を延長させる方法を提供する。本発明において有用な抗ＶＥＧＦ−Ｃ中和抗体物質は、例えば、モノクローナル抗体物質でありうる。
【００１０】
さらに、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｃの発現をダウンレギュレートするＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含有する医薬組成物を有効量で患者に投与して、リンパ管新生が患者の角膜内で抑制することによる、患者の角膜移植後の角膜移植片生存を延長させる方法を提供する。このようなＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、例えば、配列特異的リボヌクレアーゼ（例えば、リボザイム）、または、例えばＶＥＧＦ−Ｃアンチセンス核酸分子であってもよい。
【００１１】
本発明はまた、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを発現する細胞を含有する医薬組成物を有効量で患者に投与して、患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することによる患者の角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。
【００１２】
本発明の方法において、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物に加えて、抗血管形成薬剤を患者に投与しうる。同様に、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物に加えて、免疫抑制剤を患者に投与してもよく、必要に応じて、抗血管新生薬剤と共に投与してもよい。
【００１３】
本発明の方法において、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を、角膜移植の前、間、またはその後に投与することができる。さらに、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物の投与は、必要な場合、反復してもよい。１つの態様において、少なくとも１ヶ月の期間にわたり、投与を反復する。別の態様において、少なくとも６ヶ月の期間にわたり、投与を反復する。
【００１４】
また、本発明は角膜移植前にＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含有する医薬組成物を有効量で患者に投与すること、および角膜移植後にＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して、患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することによる、患者の角膜移植後の角膜移植片生存を延長させる方法を提供する。外科手術前または外科手術後用の医薬組成物は、同一であるかまたは異なっていてもよく、同一または異なる送達経路を用いて投与することができる。
【００１５】
種々の投与経路が本発明の方法において有用であり得る。１つの態様において、本発明の角膜移植片生存を延長させる方法は、医薬組成物の全身投与により実行される。別の実施態様において、本発明の方法は医薬組成物の局在性投与により実施される。さらなる態様において、医薬組成物は、局所投与するか、または局所注射により投与するか、または眼内インプラントまたは眼周囲インプラントから放出される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、血管内皮細胞増殖因子レセプター−３（ＶＥＧＦＲ−３）インヒビターを含有する医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することによる、患者の角膜移植後の角膜移植片生存を延長させる方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法は、患者の角膜移植後の角膜移植片生存を延長させるために有用である。本明細書中で用いる用語「角膜移植」は、同種または異種の角膜組織がレシピエント患者に同所的に（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ）移植される任意の方法を意味する。１つの態様において、同種角膜組織を角膜移植手順法で移植する。さらなる態様において、角膜移植手順は全層角膜の切片が移植される全層角膜移植である。また、本発明の方法は、角膜の前面半分にインタクトで残っている前房を移植する表層角膜移植、ドナー角膜物質を移植して視力を妨害するレシピエントの傷組織を取り替える視力補充角膜移植（ｏｐｔｉｃ  ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ）、ドナー角膜の切片を所望の湾曲に成形し、レシピエントの角膜の層の間、またはレシピエントの角膜上に挿入してレシピエントの角膜の湾曲を変更し、視覚的な問題を校正する屈曲矯正的角膜形成術（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ）、（例えば、外傷の後に）角膜物質を移植して欠損したレシピエント組織を移植する形成性角膜移植等のような角膜移植方法に適用される。
【００１８】
角膜内の上皮中のランゲルハンス細胞または実質内に存在する樹状細胞のいずれかの表面でのＭＨＣクラスＩＩ分子の常在性の発現は比較的低いが、ＨＬＡクラスＩ抗原は、角膜上皮、実質および内皮細胞で豊富に発現される（Ｔｒｅｓｅｌｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９８：７６３−７７２（１９８４）；ＭｃＣａｌｌｕｍら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３４：１７９３−１８０３（１９９３））。本発明の方法は、レシピエント患者と１種以上のＨＬＡ抗原で適合している角膜移植片の移植の後の角膜移植片の生存を延長するために有用であり得ることが理解される（ＷａｌｄｏｃｋおよびＣｏｏｋ、既出、２０００）。このような分子はメジャーな（ｍａｊｏｒ）またはクラスＩ抗原（ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ）またはマイナーな（ｍｉｎｏｒ）またはクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ−ＤＲ）でありうる。
【００１９】
それゆえ、本発明の方法は、例えば、少なくとも１種のＨＬＡクラスＩ抗原または少なくとも２種のクラスＩ抗原をレシピエント患者と共有するように選択されている角膜移植片の生存を延長するために実施されうる。同様に、本発明の方法は少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ抗原をレシピエント患者と共有するように選択されているか、または少なくとも１種のＨＬＡクラスＩ抗原および少なくとも１種のＨＬＡクラスＩＩ抗原をレシピエント患者と共有するように選択されている角膜移植片の生存を延長するために実施されうる。本発明の方法はまた、例えば、少なくとも１種のＨＬＡクラスＩ抗原を共有するように選択されているが、ＨＬＡクラスＩＩ抗原に関してはミスマッチである角膜移植片の生存を延長するために実施されうる。
【００２０】
本明細書中で用いる用語「患者」は、角膜移植方法におけるドナー角膜組織のレシピエントを意味する。患者は、例えば、哺乳動物（霊長類、ウサギまたは齧歯類等）でありうる。１つの実施態様において、患者はヒト患者である。
【００２１】
本発明の方法は、角膜移植の後の角膜移植片生存を延長するために実施される。本明細書中で用いる語句「角膜移植片（の）生存の延長」は、概して、不可逆的な移植片拒絶を遅延または予防することを意味する。それゆえ、ある集団における、不可逆的同種移植片拒絶が起こる前の月数が、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物で処置されていない対応する集団と比較して概して増加している場合、角膜移植片生存は「延長」されている。また、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物で処置されていない対応する集団と比較して、ある集団内における不可逆的移植片拒絶を有する個体の割合が概して減少している場合に、その集団内において角膜移植片生存は延長されている。
【００２２】
当業者は、不可逆的移植片拒絶が存在するかどうかを決定するための確立されている判断基準を用いる。通常、拒絶反応は移植した角膜に関連し、移植片の中心へと進行するが、レシピエントの角膜には生じない１つ以上の病理学的事象として顕れる。上皮拒絶反応は、上皮の隆起部として現れる上皮拒絶反応線により特徴付けられ、上皮下拒絶反応は、流行性角結膜炎で見られるのと似ている上皮下浸潤により特徴付けられる。さらに、実質拒絶は、移植片の中心へと進行する実質性浸潤により特徴付けされ、内皮拒絶反応は以下の少なくとも１つにより特徴付けられる。Ｋｈｏｄａｄｏｕｓｔ線、角膜裏面沈着物、実質浮腫または水疱性細胞（ａｑｕｅｏｕｓ  ｃｅｌｌｓ）。多くの場合において、拒絶反応は、局所デキサメタゾン、結膜下デキサメタゾン注射を伴う、および、必要であれば数日間の静脈内メチルプレドニゾンを伴う局所性デキサメタゾンのような処置を用いて改善することが可能であることを当業者は理解する。拒絶反応は、細隙灯検査を用いて観察される拒絶反応の徴候（拒絶反応線、上皮下浸潤、角膜裏面沈着物、実質浸潤、実質浮腫および水疱性細胞）が消失しなかった場合、または移植片の異常肥大または視力障害がある場合に、不可逆的であるとみなされる。
【００２３】
本発明の方法は血管内皮細胞増殖因子レセプター−３のインヒビターまたは別の抗リンパ管新生薬剤に依る。少なくとも３種の血管内皮細胞増殖因子レセプターであるＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３（もともとは、それぞれ、Ｆｌｔ１（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ）、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（キナーゼインサートドメイン含有レセプターまたは胎児肝臓キナーゼ）およびＦｌｔ４と命名されている）が存在する。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプターファミリーに類似するこれらのサブクラス−ＩＩＩレセプターチロシンキナーゼは、細胞外ドメイン内の７個のイムノグロブリンホモロジードメイン、およびキナーゼインサート配列により分割されているチロシンキナーゼ細胞内ドメインにより特徴付けされる（ＫｌａｇｓｂｒｕｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．７：２５９−２７０（１９９６））。
【００２４】
ヒトＶＥＧＦＲ−３は、細胞外ドメインにおいてＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２とおよそ３５％のアミノ酸同一性を示し、チロシンキナーゼドメインにおいて約８０％のアミノ酸同一性を示す。ヒトＶＥＧＦＲ−３を胎盤および赤白血病の細胞のｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた（Ａｐｒｅｌｉｋｏｖａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：７４６−７４８（１９９２
）；Ｇａｌｌａｎｄら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：４７５−４８７８（１９９２）；Ｇａｌｌａｎｄら、既出、１９９３；Ｐａｊｕｓｏｌａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：５７３８−５７４３（１９９２）；およびＰａｊｕｓｏｌａら、既出、１９９３およびマウスおよびウズラのホモログもまたクローニングされている（Ｆｉｎｎｅｒｔｙら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：２２９３−２２９８（１９９３）；Ｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ  １７４：３−８（１９９６））。ＶＥＧＦＲ−３ホモログは進化において良好に保存されており、ウズラホモログはヒトレセプターと約７０％のアミノ酸同一性を有し、類似のリガンド結合特性を有する。
【００２５】
メジャーなヒトＶＥＧＦＲ−３  ｍＲＮＡ転写物はサイズが約５．８ｋｂであり、別の３’ポリアデニル化シグナルはＣ末端での６５残基縮重を有するタンパク質をコードするマイナーな４．５ｋｂ転写物を生じる。組織中で検出されるメジャーな形態である、より長い形態のＶＥＧＦＲ−３は、１９５ｋＤａ前駆体として合成され、これはグリコシル化され、タンパク質分解によりＡｒｇ４７２の後で切断されてジスルフィド結合した２鎖形態を生じる。より長い形態のカルボキシ末端領域は、短い方の転写物中ではコードされていない３個のチロシン残基が存在する（Ｔｙｒ１３３３、Ｔｙｒ１３３７およびＴｙｒ１３６３）。
【００２６】
ＶＥＧＦＲ−３はアミノ末端細胞外ドメイン、小さい膜貫通領域およびカルボキシ末端細胞質ドメインを有する。ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインは７個のイムノグロブリン様Ｃ２型ドメインを有し、二量体化の際にタンパク質は５番目のイムノグロブリン様ドメイン内で結合してジスルフィドとなる。ＶＥＧＦＲ−３は、約２０残基の膜貫通領域を含むＩ型膜タンパク質であり、カルボキシ末端細胞質ドメインは２個のチロシンキナーゼドメインを含んでいる（図１参照）。図２Ｂに示されるように、長いイソ型（ｌｏｎｇ  ｉｓｏｆｏｒｍ）のヒトＶＥＧＦＲ−３（配列番号２）は１３６３残基のタンパク質であり、これは成熟タンパク質を構成する２４〜１３６３アミノ酸を有する。ヒトＶＥＧＦＲ−３（配列番号２）の残基２４〜７７５は、細胞外ドメインを構成し、残基７７６〜７９７（配列番号２）は膜貫通領域を構成し、残基７９８〜１３６３（配列番号２）は細胞質ドメインを構成する。７個のイムノグロブリン様ドメインは、以下のようにヒトＶＥＧＦＲ−３（配列番号２）の細胞外部分内に位置しうる。イムノグロブリン様ドメイン１（残基４４〜１１８）、イムノグロブリン様ドメイン２（残基１５１〜２１３）、イムノグロブリン様ドメイン３（残基２４５〜３１７）、イムノグロブリン様ドメイン４（残基３５１〜４０３）、イムノグロブリン様ドメイン５（残基４３８〜５４１）、イムノグロブリン様ドメイン６（残基５７１〜６６０）およびイムノグロブリン様ドメイン７（残基６９２〜７５８）。ＶＥＧＦＲのリガンド結合ドメインは最初の３つのイムノグロブリン様ドメインから構成される。
【００２７】
血管内皮細胞増殖因子であるＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、典型的な構造的特性を共有するが、ＶＥＧＦレセプター（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３）に対する異なる特異性に起因する異なる生物学的活性を示す。増殖因子のＶＥＧＦファミリーでは、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄが最も密接に関連しており、共通のＶＥＧＦ−ホモロジードメインに隣接する独特のアミノ−およびカルボキシ末端伸長部により特徴付けられるサブグループを形成する。ヒトＶＥＧＦ−Ｃは、推定分子量４６．９ｋＤａの４１９アミノ酸のタンパク質であり、マウスＶＥＧＦ−Ｃは４１５アミノ酸のタンパク質である。
【００２８】
中心コア（ＶＥＧＦホモロジードメイン）はＶＥＧＦと約３０％のアミノ酸同一性を示し、ＶＥＧＦファミリーの他のメンバーに関しては７個のエキソンの３番目および４番目にコードされている。ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦホモロジードメインは６０％アミノ酸同一性を共有する。カルボキシ末端ドメインは、昆虫ユスリカ（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｔｅｎｔａｎｓ）の幼虫唾液腺で産生される絹の構成成分である分泌タンパク質のバルビアニ環３タンパク質（Ｂａｌｂｉａｎｉ  ｒｉｎｇ  ３  ｐｒｏｔｅｉｎ）に存在するモチーフに類似するシステイン残基の反復パターン（Ｃｙｓ−Ｘ１０−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号５）を有する。
【００２９】
ＶＥＧＦ−Ｃは前駆体として合成され、次いでＰＤＧＦ−ＡおよびＢ鎖プロセシングに類似の様式でタンパク質分解により処理される。ＶＥＧＦ−Ｃは、Ｃ末端シルクドメインを含有するジスルフィド結合型ホモダイマーとして分泌される。分泌に続いて、カルボキシ末端シルクドメインが切断され、ジスルフィドはアミノ末端ドメインに結合して２９および３１ｋＤａポリペプチドから構成されるジスルフィド結合型テトラマーを生じる。アミノ末端プロペプチドのタンパク質分解プロセシングは、ＶＥＧＦホモロジードメインをコードする２個の２１ｋＤａポリペプチド鎖から構成される成熟形態を遊離する。
【００３０】
本明細書中に開示するように、角膜移植片生存はＶＥＧＦＲ−３インヒビターにより患者を処置することにより延長されうる。本明細書中で用いる用語「ＶＥＧＦＲ−３インヒビター」は、ＶＥＧＦＲ−３発現、活性または細胞内シグナル伝達を低下させる分子を意味する。このようなインヒビターは、例えば、低分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、リボザイム、核酸分子またはオリゴヌクレオチド、オリゴ糖、細胞、ファージまたはウィルス、またはそれらの組合せであり得る。さらに以下に記載するように、本発明において有用なＶＥＧＦＲ−３インヒビターとしては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。可溶性レセプターおよびキナーゼ不活性レセプターを含む優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプター、選択的ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターおよびＡＴＰアナログのようなＶＥＧＦＲ−３触媒ドメインと結合する分子を含むＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビター、ＶＥＧＦＲ−３細胞外ドメインに結合する分子を含む、およびＶＥＧＦＲ−３へのリガンド結合を阻害するまたは低下させる抗体、タンパク質、低分子およびオリゴヌクレオチドを含むＶＥＧＦＲ−３結合分子、抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体、ＶＥＧＦ−Ｃアンタゴニスト、ＶＥＧＦＲ−３リガンドがトキシンに連結されている結合体、ＶＥＧＦＲ−３発現を阻害または低下させるネガティブな調節性転写因子をコードするリボザイム、アンチセンス核酸分子および核酸分子ならびにこのようなリボザイムおよび核酸分子を含む細胞またはウィルス、ＶＥＧＦ−Ｃ発現を阻害または低下させるネガティブな調節性転写因子をコードするリボザイム、アンチセンス核酸分子および核酸分子ならびにこのようなリボザイムおよび核酸分子を含む細胞またはウィルス、例えば、優性ネガティブなＶＥＧＦＲ−３レセプター、転写因子および抗体およびそれらの抗原結合フラグメントをコードする核酸分子ならびにそのような核酸分子を含む細胞およびウィルス、ならびにＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達の選択的インヒビター。当業者であれば、これらおよび他のＶＥＧＦＲ−３インヒビターが、以下にさらに記載する本発明の方法に有用であり得ることを理解し得る。
【００３１】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、ＶＥＧＦＲ−３の発現、活性または細胞内シグナル伝達の特異的な、選択的または非選択的インヒビターであり得る。特定のＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、関連のないレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＦＧＦＲ１）のほとんどまたは全ての活性よりも、およびＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の活性よりも、ＶＥＧＦＲ−３の発現、活性または細胞内シグナル伝達を低下させる。選択的ＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、関連のないレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＦＧＦＲ１）のほとんどまたは全ての活性よりもＶＥＧＦＲ−３の発現、活性または細胞内シグナル伝達を低下させる。対照的に、非選択的ＶＥＧＦＲ−３インヒビターはＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２、または両方の発現、活性または細胞内シグナル伝達を、ＶＥＧＦＲ−３の場合と同程度まで低下させる。当業者であれば、特異的な選択的および非選択的ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターが本明細書中に開示される方法において有用であり得ることを認識する。
【００３２】
本明細書中に記載のように、種々のＶＥＧＦＲ−３インヒビターが本発明の角膜移植片生存の延長に有用である。１つの実施態様において、本発明は、優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して、患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。このような優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターは、例えば、キナーゼ−不活性ＶＥＧＦＲ−３レセプターまたは可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターでありうる。同様に、角膜移植片生存の延長に有用なＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、例えば、優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターをコードする核酸分子であるかもしれない。このような方法では、核酸分子は、例えば、キナーゼ−不活性ＶＥＧＦＲ−３レセプターまたは可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターをコードしうる。
【００３３】
本明細書中で用いる用語「優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプター」は、野生型ＶＥＧＦＲ−３レセプターの活性を低下させるように作用する野生型ＶＥＧＦＲ−３レセプターの変異体を意味する。優性ネガティブレセプターが種々のメカニズムを通じて機能しうることは認識されているが、ＶＥＧＦＲ−３優性ネガティブレセプターが機能し得る代表的なメカニズムとしては、遊離リガンドの枯渇および不活性な野生型／優性ネガティブレセプター二量体の形成が挙げられるがこれらに限定されない。従って、優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターは可溶性または膜結合型のＶＥＧＦＲ−３レセプターであるかもしれず、例えば、１つまたは数個の点変異、または野生型レセプター配列と比較して数百個のアミノ酸のかなりの欠失を含むかもしれない。代表的な優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターとしては、基本的には細胞質ドメイン（可溶性ＶＥＧＦＲ−３）または機能的なリガンド結合ドメインを含む別の可溶性レセプターから構成される変異ＶＥＧＦＲ−３レセプター、基本的には細胞質および膜貫通ドメインから構成される変異ＶＥＧＦＲ−３レセプター、例えば、チロシンキナーゼドメインのいくつかまたは全ての欠失またはチロシンキナーゼドメイン内に１ヶ所以上の点置換を有する、不活性なチロシンキナーゼドメインを有する変異ＶＥＧＦＲ−３レセプターが挙げられるが、これらに限定されない。また、優性ネガティブなＶＥＧＦＲ−３レセプターはＶＥＧＦＲ−３レセプター配列に加えて１以上の異種配列を含みうることが理解される。優性ネガティブ血管内皮細胞増殖因子レセプターの製造方法は当該分野において周知である。例えば、Ｍａｋｉｎｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：１９９−２０５（２００１）およびＭｉｌｌａｕｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６７：５７６−５７９（１９９４）を参照。
【００３４】
優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターまたはそれをコードする核酸は、角膜移植を受けた患者に存在する内因性ＶＥＧＦＲ−３レセプターの活性が低下するように作用する。患者がヒトである場合、優性ネガティブＶＥＧＦＲ−３レセプターまたはそれをコードする核酸分子は内因性ヒトＶＥＧＦＲ−３レセプターの活性を低下させるように作用する。図２Ｂに示すヒトＶＥＧＦＲ−３レセプター（長いイソ型）では、配列番号２の残基２４〜７７５が細胞外ドメインを構成し、配列番号２の残基７７６〜７９７が膜貫通ドメインを構成し、配列番号２の残基７９８〜１３６３が細胞質ドメインを構成し、チロシンキナーゼドメインがアミノ酸８４５〜１１７３に配置されている。短いイソ型は長いイソ型と類似するが、カルボキシ末端の６５残基を欠失している。代表的な優性ネガティブヒトＶＥＧＦＲ−３レセプターとしては、可溶性ヒトＶＥＧＦＲ−３レセプター変異体（例えば、配列番号２の残基２４〜３５０（イムノグロブリン様ドメイン１〜３を含むリガンド結合ドメイン）を有する変異体または残基２４〜７７５（完全な細胞外ドメイン）を有する変異体、またはこれらの変異体をコードする核酸分子、残基２４〜７９７（細胞外および膜貫通ドメイン）を有するヒトＶＥＧＦＲ−３レセプター変異体またはこの変異体をコードする核酸分子、残基２４〜８４４を有するヒトＶＥＧＦＲ−３レセプター変異体（チロシンキナーゼドメインを欠失している）またはこの変異体をコードする核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
１つの実施態様において、本発明は、可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターであるＶＥＧＦＲ−３インヒビターを投与することによる患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。このような可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターは機能的な膜貫通ドメインを欠いている。可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターはＶＥＧＦＲ−３変異体であり得、これはネイティブな膜貫通ドメインの欠失を有する。１つの実施態様において、可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターは細胞外ドメインまたはその一部からなる。このような可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターは、例えば、ＶＥＧＦＲ−３（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−３）の３、４、５、６または７個の細胞外Ｉｇ−ホモロジードメインを有するＶＥＧＦＲ−３変異体であり得る。この、および他の可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターは、慣用的な方法で製造されうる。例えば、Ｍａｋｉｎｅｎら、既出、２００１（これは、ＶＥＧＦＲ−３の３個のアミノ末端Ｉｇ−ホモロジードメインおよびＩｇＧ  Ｆｃドメインからなり、ＶＥＧＦＲ−３を発現する内皮細胞において全長細胞外ドメインと同じ効率でＶＥＧＦ−Ｃと結合し、ＶＥＧＦ−Ｃ−誘発性ＶＥＧＦＲ−３ホスホリル化および続いてのｐ４２／ｐ４４マイトジェン活性型タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）活性化を阻害する可溶性ＶＥＧＦＲ−３レセプターを記載する）を参照。
【００３６】
また、本発明は、ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターを含有する医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。ある態様では、ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターはＶＥＧＦＲ−３触媒ドメインに結合し、さらなる態様では、ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターはＡＴＰアナログである。
【００３７】
本明細書中で用いる用語「ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビター」は、選択的または非選択的にＶＥＧＦＲ−３レセプターのチロシンキナーゼ活性を低下させるレセプターチロシンキナーゼ活性のインヒビターを意味する。このようなインヒビターは、通常、ＶＥＧＦＲ−３の発現に顕著な影響は与えず、そして他のＶＥＧＦＲ−３活性（例えば、リガンド結合能力）に影響を与えずに、ＶＥＧＦＲ−３チロシンキナーゼ活性を低下させる。ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターは、ＶＥＧＦＲ−３触媒ドメインに直接結合する分子（例えば、ＡＴＰアナログ）であり得る。ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターは、ＡＴＰのアデニン部分をＶＥＧＦＲ−３に固定するのと同様に、１ヶ所以上の水素結合を介してＶＥＧＦＲ−３触媒ドメインに結合することができる（Ｅｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２６１５７−２６１６４（１９９６）；Ｔｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．４：３１１−３１６（１９９７）およびＷｉｌｓｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：４２３−４３１（１９９７））。また、ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターはアデニン結合部位に隣接した疎水性ポケットに結合し得る（Ｍｏｈａｍｅｄｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：５８９６−５９０４（１９９８）；Ｔｏｎｇら、既出、１９９７；およびＷｉｌｓｏｎら、既出、１９９７）。
【００３８】
本発明において有用なＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターとしては、特異的ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビター（例えば、ＶＥＧＦＲ−２と比較してＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ誘発性ＶＥＧＦＲ−３キナーゼ活性を特異的にブロックするインドリノン）が挙げられる。このような特異的ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビター（例えば、ＭＡＥ１０６およびＭＡＺ５１）は、Ｋｉｒｋｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：５５３０−５５４０（２００１）に記載されるように製造することができる。さらなるＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビター（特異的な、選択的および非選択的インヒビターを含む）は当該分野において公知であるか、またはレセプターチロシンキナーゼ阻害についての多数の周知のアッセイ方法のうちの１つを用いて同定することができる。
【００３９】
例えば、ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターは、例えば、Ｈｅｎｎｅｑｕｉｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：５３６９−５３８９（１９９９）およびＷｅｄｇｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：９７０−９７５（２０００）に記載のリン酸化チロシンの産生を分析するための周知のＥＬＩＳＡアッセイを用いて同定することができる。このようアッセイを用いて、ＶＥＧＦＲ−１のような他の血管内皮細胞増殖因子レセプターよりも、そして線維芽細胞増殖因子レセプター１（ＦＧＦＲ１）のような関係のないチロシンキナーゼよりもＶＥＧＦＲ−３を阻害する分子に関してスクリーニングすることができる。簡単に説明すると、スクリーニングする分子をポリ（Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｔｙｒ）６：３：１ランダムコポリマー支持体（ＳＩＧＭＡ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングした９６ウェルプレート中、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２および２μＭ  ＡＴＰを含むＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）緩衝化溶液中で、細胞質レセプタードメインと共に室温で２０分間インキュベートする。リン酸化チロシンは、マウスＩｇＧ抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型ヒツジ抗マウスイムノグロブリン抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）および２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）との連続インキュベーションにより検出することができる。このようなインビトロキナーゼアッセイでは、ＶＥＧＦＲ−３の供給源は、例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−３（配列番号２）の残基７９８〜１３６３をコードするような細胞質レセプタードメインを含む組換えバキュロウィルスで感染させた昆虫細胞から調製した溶解調製物であってよい。
【００４０】
本明細書中で用いる用語、ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターは、特異的な選択的および非選択的なＶＥＧＦＲ−３のインヒビターを含む。特異的ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターはＶＥＧＦＲ−３のチロシンキナーゼの活性を、ほとんどまたは全ての関係のないレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＦＧＦＲ１）の活性よりも、そして血管内皮細胞増殖因子レセプター（ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２）の活性よりも、低下させる。選択的ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターはＶＥＧＦＲ−３のチロシンキナーゼ活性を、ほとんどまたは全ての関係のないレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＦＧＦＲ１）よりも低下させる。このような選択的ＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、単離したＶＥＧＦＲ−３細胞質ドメインの阻害に関して、例えば、少なくともＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の両方のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍低いＩＣ５０を有しうる。特定の実施態様において、本発明は、単離したＶＥＧＦＲ−３細胞質ドメインの阻害に関して、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の両方のＩＣ５０に関して、少なくとも２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍または５００倍低いＩＣ５０を有する選択的ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターを提供する。反対に、非選択的ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターは、ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２または両方のチロシンキナーゼ活性を、ＶＥＧＦＲ−３の場合と同じ程度まで低下させる。特定の選択的および非選択的ＶＥＧＦＲ−３キナーゼインヒビターは、本発明の方法に従って角膜移植片生存を延長させるために有用でありうることが理解される。
【００４１】
また、本発明は、ＶＥＧＦＲ−３結合分子であるＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。このようなＶＥＧＦＲ−３結合分子は、例えば、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインまたはＶＥＧＦＲ−３のキナーゼドメインに結合しうる。本発明において有用なＶＥＧＦＲ−３結合分子はまた、１つの態様においてはモノクローナル抗体である抗ＶＥＧＦＲ−３抗体物質でありうる。
【００４２】
１つの実施態様において、抗ＶＥＧＦＲ−３抗体物質はＶＥＧＦＲ−３のリガンド結合部位に結合し、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄまたは両方のＶＥＧＦＲ−３への結合を阻害する。このような抗体物質はモノクローナルであっても良いし、ポリクローナルであっても良い。例えば、抗マウスＶＥＧＦＲ−３モノクローナル抗体ＡＦＬ４はＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦＲ−３への結合をブロックし、さらにレセプターシグナル伝達を阻害する（Ｋｕｂｏら、Ｂｌｏｏｄ  ９６：５４６−５５３（２０００））。本発明に有用な抗ＶＥＧＦＲ−３抗体物質は、例えば、ＶＥＧＦＲ−３へのＶＥＧＦ−Ｃ結合の阻害に関して５０μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ未満、０．００５μｇ／ｍｌ未満、または０．０００５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有しうる。特定の実施態様において、本発明の方法はヒトＶＥＧＦＲ−３へのＶＥＧＦ−Ｃ結合の阻害に関して５０μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ未満、０．００５μｇ／ｍｌ未満または０．０００５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０を有する抗ヒトＶＥＧＦＲ−３抗体物質を利用する。ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄまたは両方のＶＥＧＦＲ−３への結合を阻害する抗ＶＥＧＦＲ−３抗体物質はまた、例えば、ＶＥＧＦ−Ｃ誘発性のＶＥＧＦＲのチロシンリン酸化の減少により実証されるレセプターシグナル伝達を低下させ得る。
【００４３】
別の態様において、本発明は、抗ＶＥＧＦ−Ｃ中和抗体物質を含む医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。本発明に有用な抗ＶＥＧＦ−Ｃ中和抗体物質は、例えば、モノクローナル抗ＶＥＧＦ−Ｃ中和抗体物質であり得る。
【００４４】
本明細書中で用いる用語「抗体物質」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃに関して少なくとも約１×１０５Ｍ−１の結合活性を保持する抗体のポリペプチドフラグメントを含む、最も広い意味で使用する。抗ＶＥＧＦＲ−３抗体フラグメントおよび抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント）はＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃに対する結合活性を保持することができ、それゆえ、抗体物質の定義内に含まれることは、当業者であれば理解するであろう。さらに、本明細書中で用いる用語「抗体物質」は、天然には存在しない抗体およびフラグメント（最小で、１個のＶＨおよび１個のＶＬドメインを含む。）は、以下のものを含む。例えば、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃに特異的に結合するキメラ抗体、ヒト化抗体および単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）。このような天然には存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築し得るか、組換えにより産生し得るか、またはＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載の可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすること等により得ることができる。
【００４５】
ＶＥＧＦＲ−３に「特異的な」、すなわちＶＥＧＦＲ−３に「特異的に結合する」抗体物質は、ほとんどまたは全ての関連しないレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＦＧＦＲ１）および他の血管内皮細胞増殖因子レセプター（例えば、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２）よりも実質的に高い親和性でＶＥＧＦＲ−３に結合する。同様に、ＶＥＧＦ−Ｃに「特異的な抗体物質」、すなわちＶＥＧＦ−Ｃに「特異的に結合する」抗体物質は、他の血管内皮細胞増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ｂ）と比較した場合、ほとんどまたは全ての関連のない増殖因子レセプターよりも実質的に高い親和性でＶＥＧＦ−Ｃに結合する。
【００４６】
ＶＥＧＦＲ−３に「選択的な」抗体物質、すなわちＶＥＧＦＲ−３に「選択的に結合する」抗体物質は、ＦＧＦＲ１のようなほとんどまたは全ての関連のないレセプターチロシンキナーゼよりも実質的に高い親和性でＶＥＧＦＲ−３に結合する。同様に、ＶＥＧＦ−Ｃに「選択的な」抗体物質、すなわちＶＥＧＦ−Ｃに「選択的に結合する」抗体物質は、ほとんどまたは全ての関連のない増殖因子レセプターよりも実質的に高い親和性でＶＥＧＦ−Ｃに結合する。特異的および選択的な抗ＶＥＧＦＲ−３および抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体物質を本発明の方法に用い得ることが理解される。
【００４７】
抗ＶＥＧＦＲ−３抗体物質は、例えば、ＶＥＧＦＲ−３融合タンパク質またはＶＥＧＦＲ−３の一部（配列番号２など）をコードする合成ペプチドをイムノゲンとして用いて製造することができる。同様に、抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗体物質は、ＶＥＧＦ−Ｃ融合タンパク質またはＶＥＧＦ−Ｃの一部（配列番号４など）をコードする合成ペプチドをイムノゲンとして用いて製造することができる。組換えにより製造することができる精製ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃ、またはＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃのフラグメント（合成ペプチドのようなＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃのペプチドの一部を含む）をイムノゲンとして用いうることを当業者は理解するであろう。さらに、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃの非免疫原性フラグメントまたは合成ペプチドは、ハプテンをキャリア分子（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ：ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ））にカップリングさせることにより免疫原性にすることができる。さらに、種々の他のキャリア分子およびハプテンのキャリア分子へのカップリング方法が当該分野において周知であり、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）等に記載されている。
【００４８】
ＶＥＧＦＲ−３のリガンド結合部位に結合し、ＶＥＧＦＲ−３へのリガンド結合を阻害する抗ＶＥＧＦＲ−３抗体物質はまた、例えば、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインをイムノゲンとして（所望であればＦｃ融合タンパク質として）用いる慣用的な方法により製造することができる。ハイブリドーマまたは抗体ライブラリーは、例えば、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメイン（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＶＥＧＦＲ−２のような別のレセプターの細胞外ドメイン（同量）（コントロールとして）を用いてコーティングしたプレートを用いるＥＬＩＳＡにより、スクリーニングすることができる。続いて、マウス幹細胞因子およびｍｙｃエピトープタグのＮ−末端シグナル配列を含む成熟ＶＥＧＦ−Ｃを用いるＥＬＩＳＡアッセイ等を用いて、ポジティブハイブリドーマまたはライブラリークローンをＶＥＧＦ−Ｃ結合阻害に関してスクリーニングすることができる。ＶＥＧＦＲ−３／Ｆｃの細胞外ドメインを用いてコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、種々の抗体希釈物と共にインキュベートし、次いでｍｙｃタグ型ＶＥＧＦ−Ｃ遺伝子でトランスフェクトした細胞由来の順化培地と共にインキュベートしてもよい。ｍｙｃタグ型ＶＥＧＦ−Ｃとの結合は、例えば、抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて検出することができる。例えば、Ｋｕｂｏら、既出、２０００を参照のこと。
【００４９】
実質的に精製した抗体物質を用いて本発明の医薬組成物を製造する場合、このような抗体物質は、通常は抗体が細胞中で会合しているポリペプチド、核酸および他の細胞性物質を実質的に有さない。また、このような実質的に精製した抗体物質は、関係のない特異性の抗体物質（すなわち、ＶＥＧＦＲ−３に特異的に結合しない、またはＶＥＧＦ−Ｃに特異的に結合しない）を実質的に有さない。抗体物質は、例えば、ポリクローナル抗ＶＥＧＦＲ−３抗血清のＶＥＧＦＲ−３アフィニティー精製により、ＶＥＧＦＲ−３ポリペプチド（配列番号２等）に対するファージディスプレイ型抗体をスクリーニングすることにより、またはハイブリドーマ上清から精製したモノクローナル抗体として、実質的に精製した形態で製造することができる。
【００５０】
また、本発明に有用なＶＥＧＦＲ−３インヒビターはＶＥＧＦＲ−３発現をダウンレギュレートする分子（例えば、リボザイムまたはＶＥＧＦＲ−３アンチセンス核酸分子のような配列特異的リボヌクレアーゼ）でありうる。従って、本発明はさらにＶＥＧＦＲ−３発現をダウンレギュレートするＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。
【００５１】
同様に、本発明に有用なＶＥＧＦＲ−３インヒビターはまた、ＶＥＧＦ−Ｃ発現をダウンレギュレートする分子（例えば、リボザイムのような配列特異的リボヌクレアーゼ）であってもよいし、またはＶＥＧＦ−Ｃアンチセンス核酸分子等であってもよい。それゆえ、１つの実施態様において、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｃ発現をダウンレギュレートするＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して、患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。
【００５２】
さらなる実施態様において、本発明の方法は、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃ発現をダウンレギュレートする配列特異的リボヌクレアーゼであるＶＥＧＦＲ−３インヒビターを用いて実施される。このような配列特異的リボヌクレアーゼは、例えば、ＶＥＧＦＲ−３  ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃの発現または活性をポジティブに調節する調節分子のｍＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる。１つの実施態様において、本発明の方法は、ＶＥＧＦＲ−３  ＲＮＡの切断によりＶＥＧＦＲ−３の発現をダウンレギュレートする配列特異的リボヌクレアーゼ（例えば、リボザイム）を用いて実施される。別の態様において、本発明の方法は、ＶＥＧＦ−Ｃ  ＲＮＡの切断によりＶＥＧＦ−Ｃの発現をダウンレギュレートする配列特異的リボヌクレアーゼ（例えば、リボザイム）を用いて実施される。
【００５３】
本明細書中で用いる用語「配列特異的リボヌクレアーゼ」は、規定のリボヌクレオチド配列でのＲＮＡの切断を触媒する分子を意味する。配列特異的リボヌクレアーゼは、例えば、リボザイムまたはＤＮＡ酵素であってもよい。本明細書中で用いる用語「リボザイム」は、規定のリボヌクレオチド配列でのＲＮＡの切断を触媒するＲＮＡ分子を意味する。
【００５４】
リボザイム（例えば、ハンマーヘッドおよびヘアピン）は、一般的な方法により設計および製造されうる。リボザイム（例えば、ハンマーヘッドおよびヘアピン）の標的切断部位（例えば、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡに存在する部位）に対する特異性は、リボザイムおよびおよびそのＲＮＡ標的の間の塩基対合により決定される。例えば、ハンマーヘッドリボザイムは、「ＵＸ」ジヌクレオチド（Ｘはグアノシンを除く任意のリボヌクレオチドであり、Ｘがシトシンである場合に切断の割合が高い）の後を切断する。通常、標的配列中には「ＮＵＸ」トリプレット（Ｎは任意のリボヌクレオチドであり、ＧＵＣ、ＣＵＣまたはＵＵＣトリプレットが標的ＲＮＡ中に頻繁に存在する）が存在する。次いで、６〜８ヌクレオチド長のアンチセンス配列の２個のストレッチ（これはその間に触媒性ハンマーヘッドを形成する２１ヌクレオチド配列に隣接する）を、トリプレットの第３のヌクレオチド（「Ｘ」）の周りの標的配列に基づいて設計する。このヌクレオチドはリボザイムと塩基対形成しない。ハンマーヘッドリボザイムの設計方法は、例えば、ＨａｕｓｗｉｒｔｈおよびＬｅｗｉｎ、Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１９：６８９−７１０（２０００）およびＬｅｗｉｎおよびＨａｕｓｗｉｒｔｈ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７：２２１−２２８（２００１）に記載されるように周知である。
【００５５】
また、ヘアピンリボザイムは当該分野において周知であり、本発明の方法に従って角膜移植片生存を延長させる際に有用であり得る。ヘアピンリボザイムは約３４ヌクレオチドの触媒性コアを有し、配列ＮＮＹＮＧＵＣＮＮＮＮＮＮ（配列番号６）（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｙはピリミジンである）を認識する。「ＮＧＵＣ」（配列番号７）配列は、リボザイムと塩基対形成しない。１つの実施態様において、本発明の方法は、例えば、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡ中に存在する「ＮＧＵＣ」（配列番号７）モチーフを認識するヘアピンリボザイムを用いて実施される。さらなる実施態様において、本発明の方法は、触媒コア中に３塩基ループよりもテトラループを有するか、または触媒コアの３９位にＵのＣへの置換を有するか、またはその両方を有するヘアピンリボザイムに依存する（ＨａｕｓｗｉｒｔｈおよびＬｅｗｉｎ、既出、２０００；およびＬｅｗｉｎおよびＨａｕｓｗｉｒｔｈ、既出、２００１）。
【００５６】
当業者であれば、通常、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡ等の中の標的配列は、リボザイムが標的部位に結合する能力を干渉しうる二次構造を避けるように選択されることを理解する。周知の構造推定アルゴリズムを用いることができる。さらに、望ましい場合には、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補配列とのハイブリダイゼーションへの容易性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）に関して、可能性のあるリボザイムを評価することができる。ヒトＶＥＧＦＲ−３およびヒトＶＥＧＦ−Ｃをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、本明細書中において配列番号１および配列番号３として開示される。種ホモログをコードする追加のヌクレオチド配列もまた、Ｆｉｎｎｅｒｔｙら、既出、１９９３；およびＥｉｃｈｍａｎｎら、既出、１９９６等に記載されるように、当該分野において周知である。
【００５７】
配列特異的リボヌクレアーゼ（リボザイムおよびＤＮＡ酵素を含む）を上記の通りに設計し、核酸分子の合成に関する標準的な方法により製造する。Ｋｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１２：１３９１−１３９６（１９９８）；Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３０：４５７−４７５（２００１）；ＨａｕｓｗｉｒｔｈおよびＬｅｗｉｎ、既出、２０００；およびＬｅｗｉｎおよびＨａｕｓｗｉｒｔｈ、既出、２００１をも参照。配列特異的リボザイムもまた、インビトロ選択によりランダム配列のプールから同定することができる。このような方法は、例えば、ＢａｒｔｅｌおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８（１９９３）、Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：３７１−３９０（１９９７）およびＳａｎｔｏｒｏおよびＪｏｙｃｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９４：４２６２−４２６６（１９９７）に記載されるように、非常に良く確立されている。
【００５８】
リボザイムが、ウィルスまたは他のベクターを用いずに患者に投与されるべきである場合、望ましい場合には安定性を上昇させるためにリボザイムを修飾してもよい。治療用リボザイムに有用な修飾としては、分子の３’末端のブロック、ピリミジンの２’位のブロックが挙げられるが、これらに限定されない。安定型リボザイムは数時間の半減期を有し得、例えば、静脈内または局所注射（ｔｏｐｉｃａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を用いて反復的に投与することができる。当業者であれば、リボザイムはまた、ウィルス遺伝子治療ベクター中での発現により投与されうることを理解する。リボザイムをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩまたはＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの下流にクローニングされ、望ましい場合にはｔＲＮＡｖａｌ、Ｕ６  ｓｎＲＮＡまたはアデノウィルスＶＡ１  ＲＮＡのような遺伝子の転写物内に組み込まれうる。
【００５９】
また、本発明の方法に有用なＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃの発現をダウンレギュレートするアンチセンス核酸分子であり得る。このようなアンチセンス核酸分子は、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−ＣのｍＲＮＡ、またはＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃの発現または活性をポジティブに調節する調節分子のｍＲＮＡの、ｍＲＮＡの翻訳を低下させるか、またはｍＲＮＡ分解を亢進させる。１つの実施態様において、本発明の方法は、ＶＥＧＦＲ−３アンチセンス核酸分子を含む医薬組成物を用いて実施される。別の態様において、本発明の方法は、ＶＥＧＦ−Ｃアンチセンス核酸分子を含む医薬組成物を用いて実施される。
【００６０】
本明細書中で用いる用語「アンチセンス核酸分子」は、メッセンジャーＲＮＡまたは別の特定のＲＮＡ転写物の分子の全てまたは一部に配列が相補的である核酸分子を意味する。従って、ＶＥＧＦＲ−３アンチセンス核酸分子は、ＶＥＧＦＲ−３  ｍＲＮＡ（ヒトＶＥＧＦＲ−３  ｍＲＮＡ等）のいくらか、または全てに相補的である。同様に、ＶＥＧＦ−Ｃアンチセンス核酸分子は、ＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡ（ヒトＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡ等）のいくらか、または全てに相補的である。アンチセンス核酸分子は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、これは天然に存在するヌクレオチドおよび合成ヌクレオチド、または他の天然には存在しない改変（安定性を改善するリン酸骨格への修飾など）を含んでいてもよい。ホスホロチオエートおよび他の修飾オリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書中で用いる用語アンチセンス核酸分子に含まれる。
【００６１】
以下の記載により制限されることなく、本発明に有用なアンチセンス核酸分子はｍＲＮＡ翻訳を低下させ、ｍＲＮＡ分解を亢進することにより、標的ｍＲＮＡ（例えば、ヒトＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡ）の発現を低下させることができる。アンチセンス核酸分子は、例えば、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡ（ヒトＶＥＧＦＲ−３  ｍＲＮＡまたはヒトＶＥＧＦ−Ｃ  ｍＲＮＡ等）中の標的核酸配列と完全に相補的であってもよいし、または内因性の親核酸配列に対して１ヶ所以上のミスマッチを含んでいてもよいことが理解される。アンチセンス方法を用いて発現を低下させるためのホモロジー要件は、経験則により決定することができる。通常、少なくとも約８０〜９０％の核酸配列同一性が本発明で有用なアンチセンス核酸分子中に存在するが、アンチセンスオリゴヌクレオチド中でより高い核酸配列同一性が用いられることが多く、患者の内因性転写物と完全に同一であってもよい。望ましい場合、標的配列は、アンチセンス分子により侵入されて鎖のうちの１本が置き換えられている二本鎖のらせん状に並べられた幹（ｓｔｅｍ）に加えて、核形成が生じる部位に小さい一本鎖領域を有するように選択し得る（ＭｉｒおよびＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：７８８−７９２（１９９９）。アンチセンス核酸分子を選択する方法および製造する方法は当該分野において周知であり、コンピューター内でのアプローチを含む（Ｐａｔｚｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：４３２８−４３３４（１９９９）；Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９３：８５０２−８５０７（１９９６）；ＬｅｂｅｄｅｖａおよびＳｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４１：４０３−４１９（２００１）；ＪｕｌｉａｎｏおよびＹｏｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：２９７−３０３（２０００）；およびＣｈｏ−Ｃｈｕｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８２：４３７−４４９（１９９９））。
【００６２】
アンチセンス核酸分子は、例えば、配列番号１に示すヒトＶＥＧＦＲ−３配列または別のＶＥＧＦＲ−３をコードする配列またはコントロール配列または５’または３’非翻訳配列に相補的な少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含みうる。また、アンチセンス核酸分子は、例えば、配列１または別のＶＥＧＦＲ−３コード配列またはコントロール配列または５’または３’非翻訳配列に相補的な、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００、５００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含み得る。望ましい場合、アンチセンス核酸分子は標的メッセンジャー（ｍｅｓｓａｇｅ）の全長に相補的であり得る。同様に、本発明に有用なアンチセンス核酸分子は、例えば、配列番号３に示すヒトＶＥＧＦ−Ｃ配列または別のＶＥＧＦ−Ｃコード配列またはコントロール配列または５’または３’非翻訳配列に相補的な少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、３００またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含み得る。ホスホロチオエートおよび他のオリゴヌクレオチド（そうでなければ修飾骨格）を含む本発明に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦ−Ｃに相補的な（例えば、配列番号１に示すヒトＶＥＧＦＲ−３配列または配列番号３に示すヒトＶＥＧＦ−Ｃ配列に相補的な）、例えば、１２〜１００ヌクレオチド、例えば、１２〜５０または１２〜３０のヌクレオチド、または１５〜１００、１５〜５０または１５〜３０ヌクレオチド、または２０〜１００、２０〜５０または２０〜３０ヌクレオチドを有しうる。本発明に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１に示すヒトＶＥＧＦＲ−３配列または配列番号３に示すヒトＶＥＧＦ−Ｃ配列に相補的な、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドを有しうる。
【００６３】
１つの実施態様において、アンチセンス核酸分子はホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのような修飾骨格を有するヌクレアーゼ耐性核酸分子である（各リンにおいて非架橋酸素の代わりに硫黄分子が置き換えられている）。さらに、本発明に有用なアンチセンス核酸分子は、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−ｍｅＲＮＡ）またはメチルホスホネートオリゴデオキシヌクレオチド（ｍｅ−ＰＤＮＡ）（これらはヌクレアーゼに対してより耐性であり、対応するホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドよりも安定な二本鎖をＲＮＡと形成する）のセグメントを含むホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのような混合型骨格オリゴヌクレオチドを含む。（Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ、既出、１９９９）。また、本発明に有用なアンチセンス核酸分子としては、いくつかの連続したオリゴデオキシ含有塩基の「中央コア」、および残りの塩基に組み込まれている２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（メチルまたはメトキシエトキシ）修飾を含み、骨格が全体的にホスホロチオエート連結から構成されているキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる（「ｇａｐ−ｍｅｒ」と記載する）。例えば、６〜８オリゴデオキシリボヌクレオチドの中央コアは、５’および３’末端で６〜８個の２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（ａｌｋｙｌｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）が隣接し得る。
【００６４】
以下の記載に拘束されることは意図しないが、アンチセンス活性は、ハイブリダイゼーション部位でＲＮａｓｅ  ＨによるｍＲＮＡ鎖の切断から生じうる。それゆえ、１つの実施態様において、アンチセンス核酸分子はＲＮａｓｅ  Ｈコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）である骨格部分を含む。このようなコンピテント骨格は、ホスホジエステル連結またはホスホロチオエート連結、およびデオキシリボース糖部分を有する。荷電していない骨格（例えば、メチルホスホネートまたはペプチド核酸結合）または２’位での２’−Ｏ−メチルリボースまたは別の置換は、ＲＮａｓｅ  Ｈによる切断に対してコンピテントではない。
【００６５】
また、本発明に有用なＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、ＶＥＧＦＲ−３刺激の際に生じる細胞内シグナル伝達のインヒビターであるかもしれない。ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達は、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−３の第２のイムノグロブリンホモロジードメインへの結合で始まり、レセプター二量体化およびトランスリン酸化が続く。ＶＥＧＦＲ−３長形イソ型は、短形イソ型よりも高い割合で自己リン酸化され、また、２個のイソ型はシグナル伝達特性という点で異なる。長形イソ型はソフトアガー上での細胞増殖およびヌードマウスの腫瘍形成を媒介し得る（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１：９２１−９３１（１９９５）；Ｐａｊｕｓｏｌａら、既出、１９９３；ＫａｒｋｋａｉｎｅｎおよびＰｅｔｒｏｖａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：５５９８−５６０５（２０００）；およびＰｅｔｒｏｖａら、Ｅｘｐｅｒ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５３：１１７−１３０（１９９９））。
【００６６】
また、ＶＥＧＦＲ−３リガンドでの刺激は、Ｓｈｃタンパク質の迅速なチロシンリン酸化を誘発する。Ｓｈｃリン酸化レベルはＶＥＧＦＲ−３の長形イソ型を発現する細胞においてより高く、唯一長形イソ型で存在するＴｙｒ１３７７のフェニルアラニンへの変異がＳｈｃリン酸化を低下させ、ＶＥＧＦＲ−３による腫瘍形成細胞形質転換を阻害する。Ｓｈｃリン酸化部位の変異はＶＥＧＦＲ−３の形質転換活性の上昇を導くので、Ｓｈｃは、おそらくＶＥＧＦＲ−３活性のネガティブレギュレーターとして働く（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、１８：５０７−５１４（１９９９））。さらに、両方のＶＥＧＦＲ−３イソ型はリガンド依存性の様式でＧｒｂ２およびＰＬＣγのＳＨ２ドメインに結合するが、ＰＩ３−ＫのＳＨ２ドメインには結合しない（Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、既出、１９９５；Ｐａｊｕｓｏｌａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：３５４５−３５５５（１９９４）；およびＦｏｕｎｉｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２９５６−１２９６３（１９９６））。
【００６７】
ＶＥＧＦＲ−３を高レベルで発現するヒト赤白血病細胞株で得られた結果は、ＶＥＧＦ−Ｃ刺激が細胞増殖およびシグナル伝達分子であるＳｈｃ、Ｇｒｂ２およびヒト７なしの息子（ｈＳＯＳ、ｓｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）の活性型ＶＥＧＦＲ−３への補充を誘発する（Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３５０７−３５１５（１９９７））。さらに、ＶＥＧＦ−Ｃ刺激は、細胞骨格タンパク質であるパキシリンのチロシンリン酸化を誘発し、パキシリンの関連接着焦点チロシンキナーゼ（ＲＡＦＴＫ、ｒｅａｌａｔｅｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｆｏｃａｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）との会合の上昇を生じる。ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）もまた、ＶＥＧＦ−Ｃ刺激に続いて活性化されうる（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１７９８−１８０４（１９９７））。さらに、Ｓｈｃのチロシンリン酸化は、マイトジェン活性型タンパク質キナーゼであるＥＲＫ１およびＥＲＫ２の活性化を導く（図１を参照）。
【００６８】
従って、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、ｈＳＯＳまたはＰＬＣγの補充、発現または活性等を調節することにより作用するＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達のインヒビターでありうる。また、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターは、例えば、パキシリンのＲＡＦＴＫとの会合を調節することにより、またはパキシリンまたはＲＡＦＴＫの発現または活性化を調節することにより、ＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達に影響を与えるかもしれない。同様に、ＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達のインヒビターは、ＪＮＫの補充、発現または活性、またはＥＲＫ１またはＥＲＫ２の補充、発現または活性を調節しうる。本明細書中で用いる用語「ＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達のインヒビター」は、ＶＥＧＦＲ−３の発現または活性に直接影響を与えることなく、ＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦＲ−３への結合に対する、ＶＥＧＦＲ−３の下流にある１つ以上の細胞反応を低下させるように作用する分子を意味する。ＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達のインヒビターはＶＥＧＦＲ−３細胞内経路の構成成分に対して正または負に作用し得、このようなインヒビターは小分子、ＡＴＰアナログ、タンパク質または核酸分子（優性ネガティブタンパク質、キナーゼインヒビター、リボザイムまたはアンチセンス分子を含む）であり得る（しかし、これらに限定されない）ことが理解される。例えば、ＳｈｃはＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達の負のレギュレーターであるので、ＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達のインヒビターは、Ｓｃｈの補充、発現または活性を上昇させる分子であるかもしれない。
【００６９】
ＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達のインヒビターは、特異的な、選択的または非選択的インヒビターであり得る。このような選択的インヒビターは、ＦＧＦＲ１のような無関係のレセプターチロシンキナーゼのほとんどまたは全てにより誘発されるシグナル伝達よりも、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達を低下させる。ＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達の特異的なインヒビターは、ＦＧＦＲ１のような無関係のレセプターチロシンキナーゼのほとんどまたは全てのシグナル伝達よりも、および血管内皮細胞増殖因子レセプターであるＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２よりも、ＶＥＧＦＲ−３シグナル伝達を低下させる。ＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達の非選択的インヒビターは、他のチロシンキナーゼレセプターおよび１種以上の他の血管内皮細胞増殖因子レセプターのシグナル伝達を、ＶＥＧＦＲ−３により誘発されるシグナル伝達と同程度まで低下させる。当業者であれば、ＶＥＧＦＲ−３細胞内シグナル伝達の、特異的な、選択的および非選択的インヒビターが本明細書中に開示される方法に従う角膜移植片生存の延長に有用であり得ることを理解する。
【００７０】
また、本発明は、抗リンパ管新生薬剤を患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより患者における角膜移植後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。本明細書中で用いる用語「抗リンパ管新生薬剤」は、既存のリンパ管からの新規な管の発生または形成を減少させるまたは阻害する分子を意味する。このような抗リンパ管新生薬剤は、例えば、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたはリンパ管新生を現実に促進する様に機能する別の分子のインヒビターであってもよい。ＶＥＧＦＲ−３インヒビターに関して上に記載したように、このような分子は、優性ネガティブインヒビター、配列特異的リボヌクレアーゼ、アンチセンス分子、抗体、小分子インヒビターまたは通常はリンパ管新生薬剤により活性化される細胞内経路のインヒビターであり得るが、これらに限定されない。
【００７１】
１つの実施態様において、角膜移植片生存はまた、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物に加えて、抗血管新生薬剤を患者に投与することにより、延長される。別の態様において、免疫抑制薬剤はＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物に加えて、望ましい場合には、抗血管新生薬剤の投与と併せて患者に投与される。
【００７２】
本明細書中で用いる用語「抗血管新生薬剤」は、血管新生を低下させる、または阻害する分子を意味する。抗血管新生薬剤およびＶＥＧＦＲ−３インヒビター、または他の抗リンパ管新生薬剤は、同一または異なる医薬組成物中で独立して、または同時に、同一または異なる投与経路により投与されうることが理解される。１つの実施態様において、本発明は、抗リンパ管新生および抗血管新生の活性の両方を有する二機能性分子を投与することにより実施される。さらなる実施態様において、本発明はＶＥＧＦＲ−３インヒビターおよび抗血管新生薬剤を含む二機能性分子を投与することにより実施される。
【００７３】
本発明に有用な種々の抗血管新生薬剤が当該分野において公知であり、慣用的な方法により製造されうる。例えば、ＨａｇｅｄｏｒｎおよびＢｉｋｆａｌｖｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４：８９−１１０（２０００）およびＫｉｒｓｃｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．５０：１４９−１６３（２０００）を参照。抗血管新生薬剤としては、小分子、タンパク質（例えば、血管新生因子およびレセプター、転写因子および抗体およびその抗原結合フラグメント）、ペプチドおよびペプチド模倣物、および核酸分子（リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および優性ネガティブな血管新生因子およびレセプター、転写因子、および抗体およびその抗原結合フラグメント等をコードする核酸分子を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
抗血管新生薬剤は、例えば、正常な状態または病理学的状態における血管新生の主要誘導物質であり、初期の血管新生に必須である血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のような血管新生因子の発現またはシグナル伝達を低下させるインヒビターまたは中和抗体でありうる。ＶＥＧＦの生物学的効果としては、内皮細胞増殖、生存、移動および管形成の刺激、および血管透過性の調節が挙げられる。また、抗血管形成薬剤は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー（例えば、ＦＧＦ−１（酸性）、ＦＧＦ−２（塩基性）、ＦＧＦ−４またはＦＧＦ−５（Ｓｌａｖｉｎら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．１９：４３１−４４４（１９９５）；ＦｏｌｋｍａｎおよびＳｈｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２））の１つのメンバー等の別の血管新生因子または内皮細胞特異的Ｔｉｅ２レセプターチロシンキナーゼ（Ｄａｖｉｓら、Ｃｅｌｌ  ８７：１１６１−１１６９（１９９６）；およびＳｕｒｉら、Ｃｅｌｌ  ８７：１１７１−１１８０（１９９６））を介してシグナル伝達を行う因子であるアンジオポエチン−１、またはこれらの血管新生因子のうちの１つのレセプターを、阻害し得る。種々のメカニズムは血管新生因子の活性を阻害するように作用しうること（レセプター結合の直接阻害、血管新生因子の細胞外空間への分泌の減少による間接阻害または血管新生因子のシグナル伝達、発現または機能の阻害を含むが、これらに限定されない）が理解される。
【００７５】
種々の他の分子もまた、本発明に有用な抗血管形成薬剤として機能しうる（アンジオスタチン、エンドスタチン、フィブロネクチンのヘパリン結合フラグメント、抗トロンビンの修飾型、コラゲナーゼインヒビター、基底膜ターンオーバーインヒビター、アンジオスタチンステロイド、血小板因子４およびそのフラグメントおよびペプチド、トロンボスポンジンおよびそのフラグメントおよびペプチド、およびドキソルビシン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−３２８（１９９４））；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−２８５（１９９７）；Ｈｏｍａｎｄｂｅｒｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１２０：３２７−３３２（１９８５）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８７４：６１−７１（１９８６）；およびＯ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１９２６−１９２８（１９９９））が含まれるが、これらに限定されない）。
【００７６】
本発明に有用な代表的な抗血管形成薬剤としては、アンジオスタチン、エンドスタチン、メタスタチンおよび２ＭＥ２（ＥｎｔｒｅＭｅｄ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ））；およびＶＥＧＦＲ−２インヒビター（例えば、ＳＵ５４１６）、ＶＥＧＦＲ−２の小分子インヒビター（ＳＵＧＥＮ；Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）およびＳＵ６６６８（ＳＵＧＥＮ）、ＶＥＧＦＲ−２の小分子インヒビター、血小板由来増殖因子および線維芽細胞増殖因子Ｉレセプターが挙げられるが、これらに限定されない。当該分野において周知であるか、または慣用的な方法により製造することができるこれらおよび他の抗血管新生薬剤は、用語「抗血管新生薬剤」の範囲内にあり、本発明の方法に従って角膜移植片生存を延長するために使用し得ことが理解される。
【００７７】
また、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤に加えて、免疫抑制剤を角膜移植患者に投与することができる。このような免疫抑制剤は、例えば、同種移植片拒絶の危険性が高い角膜移植患者または同種移植片拒絶と一致する１種以上の症状を示す患者を治療するために有用であるかもしれない。本発明の方法で有用な免疫抑制薬剤には、コルチコステロイドのようなステロイド、ステロイドである酢酸プレドニゾロン、シクロスポリンおよびタクロリムス（ＦＫ５０６）および抗Ｔリンパ球、抗ＣＤ４＋細胞、抗−ＩＣＡＭ−１および抗−ＩＬ−２抗体のような治療用モノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
コルチコステロイド免疫抑制剤は、例えば、局所的に、眼周囲に、全身的にまたは複数の投与経路を用いて投与することができる。例えば、酢酸プレドニゾロンは１％製剤として局所的に投与することができる。局所用酢酸プレドニゾロンを、静脈内メチルプレドニゾロンパルス療法（３〜５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶプッシュ）と併用した緩和な反応用に１時間毎に塗布し、続いて強い反応用に５日間、経口用プレドニゾン（１ｍｇ／ｋｇ／日）を投与してもよい。局所用治療と組み合わせた場合、望ましい場合、毎日の経口プレドニゾン（６０〜８０ｍｇ）を静脈内メチルプレドニゾロンの単回投与（５００ｍｇ）で置き換えることができる。当業者であれば、これらおよび他のコルチコステロイド免疫抑制剤が本発明の方法に有用であり得ることを理解する。
【００７９】
免疫抑制剤であるシクロスポリンもまた本発明の方法に有用であり、例えば、数ヶ月または数年の期間にわたり全身投与され得るか、または例えば２％シクロスポリン製剤として局所投与されうる。治療用モノクローナル抗体もまた、本発明の方法において有用であり得、例えば、抗Ｔリンパ球または他の免疫抑制モノクローナル抗体を眼房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌｌｙ）投与することができる。望ましい場合、抗ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物と併用して、本発明の方法に従って、これらおよび他の免疫抑制剤を投与し得ることが理解される。
【００８０】
本発明の方法において、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物は角膜移植の前、間またはその後に投与することができる。望ましい場合、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物の投与が、必要とされる場合に反復的に投与されうる。１つの実施態様において、少なくとも１ヶ月の期間にわたり、投与が繰り返される。別の実施態様において、少なくとも６ヶ月の期間にわたり、投与が繰り返される。
【００８１】
さらなる態様において、本発明は、角膜移植前にＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与し、および角膜移植後にＶＥＧＦＲ−３インヒビターを含む医薬組成物を有効量で患者に投与して患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制することにより、患者内における角膜移植の後の角膜移植片生存を延長する方法を提供する。手術前および手術後用の医薬組成物は同一でも、異なっていてもよく、そして同一または異なる送達経路を用いて投与されうる。
【００８２】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を含む医薬組成物は、角膜移植の前、角膜移植の間、または角膜移植に続いて、またはこれらの時点を組み合わせて、投与されうることが理解される。さらに、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を含む医薬組成物は、全ての患者に対する慣用的な予防として、手術の前、間またはその後に同種移植片拒絶の症状の発症前に投与することができ、または危険性の高い患者（例えば、移植片拒絶の病歴を有する患者）に選択的に投与できることが理解される。投与は、例えば、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年または２年の期間にわたって、抗リンパ管新生薬剤の有利な効果を維持するために必要な頻度で反復されうる。当業者であれば、投与頻度がＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤の正確な性質および投与される濃度、および必要であれば、用いる持続放出製剤に依存することを認識する。本発明の方法に有用な眼科用組成物は、例えば、１日１回または２回、または１日３回または４回投与され得る。重要な期間（例えば、手術直後、または同種移植片拒絶の１つ以上の症状の発生時）に、眼科用組成物（例えば、局所用眼科用組成物）は、例えば、一時間毎を基本として、より頻繁に投与し得ることが理解される。
【００８３】
本発明の方法では、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤は医薬組成物中で投与される。本発明に有用な医薬組成物は、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を、例えば、約０．０００１重量％／体積〜約０．１重量％／体積の濃度範囲で含む。本発明の方法に有用な医薬組成物はさらに、医薬組成物（例えば、眼科用組成物）の製造のために、当該分野において周知の賦形剤を含みうる。
【００８４】
本発明に従い、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤はインヒビターまたは薬剤を眼に有効な量で送達するような十分な濃度で投与する。通常、眼用溶液は、例えば、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を約０．０００１％〜約０．１％（重量／体積）の濃度範囲で、例えば、約０．０００５％〜約０．１％（重量／体積）で含有する。
【００８５】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤は、望ましい場合は、眼科用に許容されるキャリア（これは、投与する眼に対して有害な影響を長期間又は永続的に実質的に有さない任意のキャリアである）を含む眼科用組成物中で投与することができる。眼科用に許容されるキャリアの例としては、水（例えば、蒸留水または脱イオン水）、生理食塩水、および他の水性媒体が挙げられるが、これらに限定しない。１つの実施態様において、眼科用組成物は可溶性抗リンパ管新生薬剤（例えば、可溶性ＶＥＧＦＲ−３インヒビター）を含む眼用溶液である。別の実施態様において、眼科用組成物はＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を適切なキャリア中の懸濁物として含有する。
【００８６】
局所用眼科用組成物は、角膜移植片生存の延長に関して本発明の方法で有用であり得、これには点眼剤、眼軟膏、眼用ゲルおよび眼用クリームが挙げられるこれらに限定されない。このような眼科用組成物は塗布しやすく、活性成分を有効に送達し、全身性の副作用の可能性を避ける。
【００８７】
代表的な局所用（ｔｏｐｉｃａｌ）組成物の組成を以下の表１に示す。
【表１】
2005525352.tif 000002
【００８８】
望ましい場合、本発明に有用な眼科用組成物（例えば、表１に示す局所用組成物）中に保存剤を含みうる。このような保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀および硝酸フェニル水銀が挙げられるが、これらに限定されない。局所用眼科用組成物に有用なビヒクルとしては、ポリビニルアルコール、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよび精製水が挙げられ、これらに限定しない。
【００８９】
望ましい場合、張力調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｄｊｕｓｔｏｒ）は、本発明の方法に従って角膜移植片生存を延長するために投与される眼科用組成物中に含有することができる。このような張力調節剤は、例えば、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールまたはグリセリン）または、別の製薬上許容される、または眼科用に許容される張力調節剤であってもよい。
【００９０】
得られた製剤は眼科用に許容されるならば、種々の緩衝剤およびｐＨを調節するための方法を用いて、本発明に有用な眼科用組成物を製造することができる。このような緩衝剤としては、酢酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤およびホウ酸塩緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されないことが理解される。酸または塩基を用いて必要とされる組成物のｐＨを調節することができる。眼科用組成物の製造に有用な、眼科用に許容される抗酸化剤としては、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル型ヒドロキシアニソールおよびブチル型ヒドロキシトルエンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤は、部分的には投与する薬剤のタイプおよび薬歴、危険因子および患者の症状に応じて種々の方法により患者に投与することができる。本発明の方法に適した投与経路としては、全身投与および局在性投与の両方が挙げられる。従って、１つの実施態様において、角膜移植片生存を延長するための本発明の方法は、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を含む医薬組成物の全身投与により実施される。別の実施態様において、本発明の方法は、抗リンパ管新生薬剤（例えば、ＶＥＧＦＲ−３インヒビター）を含有する医薬組成物の局在性投与により実施される。さらなる実施態様において、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を含む医薬組成物を局所的に、すなわち局所注射により投与するか、または眼内または眼周囲インプラントから放出させる。
【００９２】
本明細書中で用いる用語「全身投与」は、基本的に患者の全身への医薬組成物の送達を生じる投与態様を意味する。全身投与の代表的な態様としては、静脈内注射および経口投与が挙げられるが、これらに制限されない。本明細書中で用いる用語「局所投与」は、医薬組成物が目から離れた領域よりも眼に、そして眼の回りにより著しく送達されることを生じる投与態様を意味する。
【００９３】
本発明の方法に有用な全身および局在性の投与経路としては、経口胃管栄養法、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、経皮拡散およびエレクトロフォレーシス（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、局部点眼および軟膏、眼周囲および眼内注射（結膜下注射を含む）、長期放出送達デバイス（局在性インプラント型長期放出デバイス）および眼内および眼周囲インプラント（生分解性およびリザーバーベースのインプラントを含む）が挙げられるが、これらに限定しない。
【００９４】
１つの実施態様において、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を含む眼科用組成物は局所的に眼に投与される。眼科用組成物は、例えば、眼用溶液（点眼）であり得る。別の実施態様において、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を含む眼科用組成物は、眼に直接注射される。さらなる態様において、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を含む眼科用組成物は、眼内または眼周囲インプラント（例えば、生分解性またはリザーバーベースのインプラント）から放出される。
【００９５】
１つの実施態様において、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を含む眼科用組成物は、長期放出製剤中で局在性投与される。例えば、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤を含む眼科用組成物を眼内または眼周囲インプラント（例えば、生分解性またはリザーバーベースであり得る）を介して投与することができる。本明細書中で用いる用語「インプラント」は、インプラント後に挿入部位から顕著には移動しない任意の物質を意味する。インプラントは、生分解性物質、非生分解性物質であってもよく、または生分解性物質および非生分解性物質の両方から構成されてもよい。望ましい場合、非生分解性インプラントは詰め替え可能なリザーバーを備えてもよい。本発明の方法に有用なインプラントとしては、例えば、パッチ、粒子、シート、プラーク（ｐｌａｑｕｅ）、マイクロカプセル等が挙げられ、選択した挿入部位（後眼房、前房、脈絡膜上または結膜下でありうるが、これらに限定しない）と適合した任意の形状およびサイズのものであり得る。本発明に有用なインプラントは、通常、長期間にわたり患者の角膜に有効な用量でインプラントした医薬組成物を放出することが理解される。種々の眼用インプラントおよび眼放出に適した長期放出製剤は、例えば、米国特許第５，８６９，０７９号および同第５，４４３，５０５号に記載されるように当該分野において周知である。
【００９６】
ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤が核酸分子である場合、核酸分子を含む医薬組成物の投与は遺伝子治療の分野で周知の多数の方法のうちの１つを用いて実施されうる。このような方法としては、さらに以下に記載する弾道銃（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｇｕｎ）送達、レンチウィルス形質転換、アデノウィルス形質転換、サイトメガロウィルス形質転換、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定しない。
【００９７】
例えば、弾道銃送達は角膜移植片生存の延長に関して本発明の方法に有用であるかもしれないし、Ｔａｎｅｌｉａｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２３：４８４−４８８（１９９７）に記載されるように実施して、焦点送達および角膜上皮でのプラスミドの高効率での発現を達成しうる。この方法では、０．２〜０．５ｍｇの金粒子をプラスミドＤＮＡでコーティングし、次いで弾道銃を用いて角膜に送達する。プラスミドＤＮＡの送達深度は、銃の圧力の関数であり、これによりプラスミドＤＮＡの所望の深度までの送達を容易にする。
【００９８】
レンチウィルスはまた、本発明の方法に従って核酸分子を含む医薬組成物を投与するために使用されうる。例えば、Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１９６−２００（２０００）に記載されるように、レンチウィルスをインビトロまたはインサイチュで用いて細胞に導入することができる。ヒト角膜における角膜内皮細胞、上皮細胞および角膜実質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｙｔｅｓ）をＶＥＧＦＲ−３インヒビターのような抗リンパ管新生薬剤である核酸分子を含むレンチウィルスに曝してもよい。暴露した細胞は、導入後少なくとも６０日間、コードするタンパク質を発現し続けることができる。
【００９９】
また、アデノウィルスは、角膜から表面上皮細胞を外科的に除去した後にインビボで核酸分子を角膜へと投与するために使用されうる。例えば、アデノウィルスは前眼房に投与されうる。例えば、米国特許第５，８２７，７０２号に記載されるように、アデノウィルスを投与する方法は当該分野において周知である。
【０１００】
また、マイクロインジェクションおよび電気パルスは、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤である核酸分子を含む医薬組成物を投与するために使用されうる。マイクロインジェクションおよび電気パルスを、例えば、サイトメガロウィルスまたはプラスミド発現ベクターを角膜に導入するために用いることができる（Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：２５５１−２５５７（１９９９）およびＯｓｈｉｍａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：１３４７−１３５４（１９９８））。ウィルスまたはプラスミドの角膜輪部の前房への注入、続いて電気パルスにより、角膜内皮細胞の導入を生じる。望ましい場合に、これらおよび他の方法を用いて、ＶＥＧＦＲ−３インヒビターまたは他の抗リンパ管新生薬剤が核酸分子である医薬組成物を投与できることが理解される。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は本発明を例示することを意図するが、限定することは意図しない。
【０１０２】
実施例Ｉ
リンパ管新生のインヒビターを用いて処置した動物での角膜移植片生存の上昇
Ｌｅｗｉｓ系統ラット由来の角膜のＷｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈレシピエントへの移植での、よく特徴付けをされている角膜移植のラットモデルに従って、移植片を製造し、移した。（Ｃａｌｌａｎａｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４５：４３７−４４３（１９８８））。ビヒクルまたは試験薬剤を投与した各処置群は９〜１４匹のラットを含む。移植片を、Ｃａｌｌａｎａｎら、既出、１９８８の判断基準に従って拒絶の徴候に関して１週間当たり３回、臨床的に観察し、スコア付けする。外科手術６０日目に、Ｌｅｗｉｓ／Ｗｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈの組合せにおいて角膜移植物に関して期待平均生存時間に２倍の延長が示され、それゆえ、処置停止の有利な時点として選択する。６０日目に拒絶されていない移植片を有するラットをさらに１４日間観察して、宿主の免疫系が許容されたかどうかを決定する。この時点で、移植した眼の８０％を低温切片法のために簡単に凍結させ、眼の残りの２０％をＨ＆Ｅ染色のためにホルマリン中で固定する。
【０１０３】
３−（２，４−ジヒドロキシベンジリデン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン（ＭＡＥ８７）、３−（３−フルオロ−４−メトキシベンジリデン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン（ＭＡＥ１０６）および３−（４−ジメチルアミノナフタレン−１−イルメチレン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン（ＭＡＺ５１）を、基本的には以下の通りにして製造した。インドリン−２−オン（１０ｍｍｏｌ）を、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（ＭＡＥ８７）、３−フルオロ−４−メトキシベンズアルデヒド（ＭＡＥ１０６）または４−ジメチルアミノナフタレン−１−カルバルデヒド（ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＭＡＺ５１）のいずれか１０ｍｌと混合する。反応系を、エタノール（４０ｍＬ）中ピペリジン３滴とともに５時間還流する（Ｋｉｒｋｉｎら、既出、２００１）。生成物をろ過し、エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥させる。構造を以下の表２に示す。ＭＡＥ８７の融点は２５０℃である。ＭＡＥ１０６の融点は２２０℃である。ＭＡＺ５１の融点は２５０℃より高い。
【０１０４】
【表２】
2005525352.tif 000003
【０１０５】
ＶＥＧＦＲ−３チロシンキナーゼインヒビターであるＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６またはＭＡＺ５１を種々の濃度（０．５〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲）で全身投与する。他の動物で、化合物を種々の濃度（０．０５％〜５．０％）で、種々の頻度（１日１回、１日２回および１日３回）で、点眼液として投与する。
【０１０６】
ビヒクルのみを投与した動物は、平均して３０日目に移植片拒絶の徴候を示す。反対に、ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６またはＭＡＺ５１を投与した動物では、移植片拒絶の証拠の顕著な遅延により実証されるように、平均移植片生存の増加が示される。
【０１０７】
これらの結果は、ＶＥＧＦＲ−３チロシンキナーゼ活性のインヒビターがよく受け入れられているラット角膜移植モデルで平均角膜移植片生存期間を上昇させるように作用することを示す。
【０１０８】
上記の括弧内に記載した、または他の方法で記載した全ての雑誌文献、参考文献および特許引用を、本明細書中に参照して組み込む。
【０１０９】
本発明は上記の実施例に関して記載したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更が行われうることが理解されるべきである。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、内皮細胞レセプターチロシンキナーゼおよび脈管形成、血管形成およびリンパ管新生に関連する増殖因子の構造を示す。構造的に異なるＴｉｅおよび血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプターファミリーを、レセプターに対するリガンド結合の特異性（矢印で示す）と共に示す。ＶＥＧＦレセプターファミリーは３個の膜貫通レセプターであるＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３を含む。可溶性形態のＶＥＧＦＲ−１（ｓＶＥＧＦＲ−１）もまた、特徴付けを行った。ＶＥＧＦレセプターの細胞外領域は、対合したシステイン残基間のジスルフィド結合（ＳＳ）により安定化されている７個のイムノグロブリンドメインを含み、ＶＥＧＦＲ−３中では５番目のドメインは２個のジスルフィド結合型ポリペプチドへとタンパク質分解により処理される。ＶＥＧＦレセプターの細胞内領域では、チロシンキナーゼドメインは、通常、キナーゼ挿入物と称するアミノ酸の小さいストレッチにより中断されている。また、レセプターにより媒介される生物学的プロセスもいくつか示す。
【図２】図２は、ヒト血管内皮細胞増殖因子レセプター−３（ＶＥＧＦＲ−３）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．ヒトＶＥＧＦＲ−３のヌクレオチド配列（配列番号１）。Ｂ．ヒトＶＥＧＦＲ−３のアミノ酸配列（配列番号２）。開始コドンに下線を付す。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６９８７８およびＳ６６４０７。また、Ｇａｌｌａｎｄら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１２３３−１２４０（１９９３）およびＰａｊｕｓｏｌａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：２９３１−２９３７（１９９３）を参照。
【図３】図３は、ヒト血管内皮細胞増殖因子−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。Ａ．ヒトＶＥＧＦ−Ｃのヌクレオチド配列（配列番号３）。Ｂ．ヒトＶＥＧＦ−Ｃのアミノ酸配列（配列番号４）。開始コドンに下線を付す。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５４２９。
【配列表】
2005525352.tif 000004
2005525352.tif 000005
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【図１】
2005525352.tif 000019
【図２Ａ】
2005525352.tif 000020
【図２Ａ】
2005525352.tif 000021
【図２Ｂ】
2005525352.tif 000022
【図３Ａ】
2005525352.tif 000023
【図３Ｂ】
2005525352.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月25日(2004.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005525352000001.app
【国際調査報告】
2005525352.tif 000025
2005525352.tif 000026
2005525352.tif 000027