(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は修飾およびゲノム配列、ゲノムＤＮＡのシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー、ならびに結腸細胞増殖疾患の区別、診断、治療および／またはモニタリングに使用する遺伝子の遺伝的および／または後成的パラメーター、または結腸細胞増殖疾患への素因を確認する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た生物学的サンプル中の標的核酸を少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させることを含み、該試薬または一連の試薬が標的核酸内のメチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する、被験者のＭＤＲ１、ＡＰＯＣ２、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＥＧＲ４、ＡＲ、ＲＢ１、ＧＰＩｂベータ、ＭＹＯＤ１、ＷＴ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＥＬＫ１、ＡＰＣ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＹＡ４、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＮＣＡ９、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＰＡＸ６、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＢ、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＶＨＬ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＤＨ１３、ＤＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＤＮＭＴ１、ＣＥＡ、ＭＢ、ＰＣＮＡ、ＣＤＣ２、ＥＳＲ１、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳＳＦ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５を含む群から得た少なくとも１つの遺伝子および／またはその制御領域に関連する結腸細胞増殖疾患を検出および区別するための方法。
【請求項２】
前記方法は、正常結腸組織と結腸細胞増殖疾患組織を区別する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、ＡＰＣ、ＣＡＬＣＡ、ＣＡＶ１、ＣＤ４４、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ４、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＬＡ−Ｆ、ＩＧＦ−２、ＬＫＢ１、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＷＴ１およびＥＹＡ４を含む群から得た遺伝子のメチル化状態分析によって実施される、請求項２に記載の方法。 
【請求項４】
前記方法は結腸腺腫組織と正常結腸組織を区別する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＡＶ１、ＣＤ４４、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ４、ＥＳＲ１、ＧＰＩｂベータ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＬＡ−Ｆ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＣＮＡ、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＲＢ、ＲＡＳＳＦ１、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＷＴ１およびＥＹＡ４を含む群から得た遺伝子のメチル化状態分析によって実施される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記方法は、結腸癌腫組織と正常結腸組織を区別する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、ＡＰＣ、ＣＡＶ１、ＣＤ４４、ＣＤＨ１３、ＣＳＰＧ２、ＥＧＦＲ、ＧＳＴＰ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＩＧＦ２、Ｎ３３、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＴＰ７３、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）およびＥＹＡ４を含む群から得た遺伝子のメチル化状態分析によって実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、結腸腺腫組織と結腸癌腫組織を区別する、請求項１記載の方法の使用。
【請求項９】
前記方法はＣＰＩｂベータおよびＣＤＫＮ２ａを含む群から得た遺伝子のメチル化状態分析によって実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
下記工程；
−  ゲノムＤＮＡ含有生物学的サンプルを得て、
−  ゲノムＤＮＡを抽出し、
−  ５位でメチル化されていないゲノムＤＮＡサンプル中のシトシン塩基を処理によって、ウラシルまたは塩基対形成挙動においてシトシンに類似していない他の塩基に変換し、
−  前処理されたゲノムＤＮＡの断片を増幅し、そして
−  １つまたはそれ以上のシトシン位置のメチル化状態を同定すること
を含む、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
試薬は重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩または二亜硫酸塩の溶液であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
増幅はポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって実施されることを特徴とする、請求項１０および１１に記載される方法。
【請求項１３】
増幅は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって実施されることを特徴とする、請求項１０〜１２の１つに記載される方法。
【請求項１４】
長さ１００〜２０００塩基対を有する１０より多い異なった断片を増幅することを特徴とする、請求項１０〜１３の１つに記載される方法。
【請求項１５】
増幅工程は、配列番号３８９〜配列番号５１８を含むプライマーオリゴヌクレオチドのセットを使用して実施される、請求項１０〜１４の１つに記載される方法。
【請求項１６】
数種のＤＮＡセグメントの増幅は、１つの反応容器中で実施されることを特徴とする請求項１０〜１５の１つに記載される方法。
【請求項１７】
増幅工程は、バックグランドＤＮＡを対照として、結腸組織の特定ゲノムのメチル化状態に基づき、健康および／または病的結腸組織における特に問題となるＤＮＡを優先的に増幅することを特徴とする、請求項１０〜１６の１つに記載される方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーに各増幅産物をハイブリダイズさせて、ＭＤＲ１、ＡＰＯＣ２、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＥＧＲ４、ＡＲ、ＲＢ１、ＧＰＩｂベータ、ＭＹＯＤ１、ＷＴ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＥＬＫ１、ＡＰＣ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＹＡ４、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＮＣＡ９、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＰＡＸ６、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＢ、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＶＨＬ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＤＨ１３、ＤＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＤＮＭＴ１、ＣＥＡ、ＭＢ、ＰＣＮＡ、ＣＤＣ２、ＥＳＲ１、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳＳＦ１、ＭＳＨ４およびＭＳＨ５を含む群から得た少なくとも１つの遺伝子および／またはそれらの制御領域内のメチル化状態を検出することを特徴とする、請求項１０〜１７の１つに記載の方法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーは、配列番号５１９〜配列番号１０３０を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
増幅産物は標識化されていることを特徴とする、請求項１０〜１９に記載の方法。
【請求項２１】
増幅産物の標識は蛍光標識であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
増幅産物の標識は放射性核種であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
増幅産物の標識は質量分析計で検出される通常の質量を有する検出可能な分子断片であることを特徴とする、請求項２０に記載される方法。  
【請求項２４】
増幅産物または増幅産物断片は質量分析計で検出されることを特徴とする、請求項１０〜２３の１つに記載される方法。
【請求項２５】
産生した断片は１価の正または負の総電荷を有することを特徴とする、請求項２３および２４の１つに記載の方法。
【請求項２６】
検出はマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によるか、または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して実施され、かつ、可視化されることを特徴とする、請求項２３〜２５の１つに記載される方法。
【請求項２７】
下記工程：
ａ）ゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプルを得て、
ｂ）ゲノムＤＮＡを抽出し、
ｃ）遺伝子ＭＤＲ１、ＡＰＯＣ２、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＥＧＲ４、ＡＲ、ＲＢ１、ＧＰＩｂベータ、ＭＹＯＤ１、ＷＴ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＥＬＫ１、ＡＰＣ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＹＡ４、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＮＣＡ９、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＰＡＸ６、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＢ、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＶＨＬ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＤＨ１３、ＤＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＤＮＭＴ１、ＣＥＡ、ＭＢ、ＰＣＮＡ、ＣＤＣ２、ＥＳＲ１、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳＳＦ１、ＭＳＨ４およびＭＳＨ５の１つまたはそれ以上のＣｐＧを含むゲノムＤＮＡを、１つまたはそれ以上のメチル化感受性制限酵素で分解し、そして
ｄ）工程ｃ）の分解で生成したＤＮＡ断片を検出する
ことを含む、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ分解物は、工程ｄ）の前に増幅される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
増幅はポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって実施されることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
１つより多いＤＮＡ断片の増幅は１つの反応容器で実施されることを特徴とする、請求項２８および／または２９の１つに記載される方法。
【請求項３１】
ポリメラーゼは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項２８〜３０の１つに記載される方法。
【請求項３２】
配列番号１３３〜配列番号３８８を含む群から選択された配列およびそれらの相補的な配列のうちの１つである前処理されたゲノムＤＮＡの単離された核酸。
【請求項３３】
前記オリゴマーは、請求項３２に記載される配列番号１３３〜配列番号３８８の１つに記載の前処理されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするか、あるいは同一である少なくとも１０個のヌクレオチドの少なくとも１つの塩基配列を含む、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー。
【請求項３４】
塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
少なくとも１つのＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチドのシトシンは、オリゴマーのおよそ中３分の１に位置することを特徴とする、請求項３４に記載されるオリゴヌクレオチオド。
【請求項３６】
配列番号５１９〜配列番号１０３０を含む群から選択された配列の１つに記載のオリゴマー、特にオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー。
【請求項３７】
請求項３３〜３６のいずれかに記載の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３８】
配列番号８９５〜９８６に記載の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項３９】
配列番号６５から１１０に記載される群から選択された１つまたはそれ以上の単離された核酸。
【請求項４０】
配列番号８９５〜９０６、９０９〜９１８、９２１〜９２４、９３１、９３２、９４１、９４２、９７２および９８７〜９９０に記載の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項４１】
配列番号６５〜７０、７２〜７６、７８、７９、８３、８８、１０３、１１１および１１２に記載される群から選択された１つまたはそれ以上の単離された核酸。
【請求項４２】
配列番号８９５〜９５４、９５７〜９６２、９６５〜９７０、９７５〜９７８、９８１〜９８６および９９１〜１０２８に記載の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項４３】
配列番号６５〜９４、９６〜９８、１００〜１０２、１０５、１０６、１０８〜１１０および１１３〜１３１に記載される群から選択された１つまたはそれ以上の単離された核酸。 
【請求項４４】
配列番号１００５、１００６、１０２９および１０３０に記載の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項４５】
配列番号１２０および１３２に記載の群から選択された１つまたはそれ以上の単離された核酸。
【請求項４６】
配列番号１〜配列番号６４に記載される１つまたはそれ以上の配列およびそれらに相補的な配列内の全てのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を検出するためのオリゴマーを含む、請求項３７〜４５に記載されるオリゴマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーおよび／または単離された核酸のセット。
【請求項４７】
配列番号１〜 配列番号６４に記載の配列およびそれらに相補的な配列のシトシンメチル化状態および／または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を決定するためのプローブとして、請求項３３〜３８、４０、４２および４４のいずれかに記載されるオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーのセットの使用。
【請求項４８】
結腸腺腫組織または結腸癌腫組織と正常結腸組織を区別するための請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドのセットまたは請求項３９に記載の核酸の使用。
【請求項４９】
結腸癌腫組織と正常結腸組織を区別するための請求項４０に記載のオリゴヌクレオチドのセットまたは請求項４１に記載の核酸の使用。
【請求項５０】
結腸腺腫組織と正常結腸癌腫を区別するための請求項４２に記載のオリゴヌクレオチドのセットまたは請求項４３に記載の核酸の使用。
【請求項５１】
結腸癌腫組織と結腸腺腫組織を区別するための請求項４４に記載のオリゴヌクレオチドのセットまたは請求項４５に記載の核酸の使用。
【請求項５２】
請求項３２に記載の配列番号１３３〜配列番号３８８の１つおよび／またはそれらの相補的配列およびそれらのセグメントのＤＮＡ配列の増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチドとしての、請求項３３に記載される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーのセット。
【請求項５３】
対応ゲノムＤＮＡのメチル化状態の測定および／または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出のための請求項３２に記載の前処理されたゲノムＤＮＡの使用。
【請求項５４】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが固相に結合されていることを特徴とする、請求項３７、３８、４０、４２または４４に記載されるオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーのセット。
【請求項５５】
該セットの全員が固相に結合されていることを特徴とする、請求項３７、３８、４０、４２または４４に記載されるオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーのセット。
【請求項５６】
配列番号１〜配列番号６４の１つおよびそれらに相補的な配列内のＣｐＧジヌクレオチドの対応ゲノムメチル化状態と関連する疾患を分析するための異なったオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー（アレイ）の配列を製造する方法であって、請求項３７、３８、４０、４２または４４のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴマーは固相に結合されている方法。
【請求項５７】
請求項５４および５５により得られうる異なったオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー（アレイ）の配置。
【請求項５８】
四角形または六角形格子形態の平面固相上に配列されることを特徴とする、請求項５７に記載される異なったオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー配列のアレイ。
【請求項５９】
先の請求項の１つに記載される少なくとも１つの核酸を含む遺伝子のメチル化状態に関連した結腸細胞増殖疾患の分析のための核酸またはペプチド核酸アレイ。
【請求項６０】
固相表面はシリコーン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金から構成されることを特徴とする、請求項５７〜５９のいずれかに記載されるアレイ。
【請求項６１】
重亜硫酸塩（＝二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）試薬ならびに請求項３３〜４６の１つに記載されるオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマーを含むキット。
【請求項６２】
結腸細胞増殖疾患の素因の検出、サブクラスの区別、診断、予測、治療および／またはモニタリングのための配列番号６５〜配列番号１３２および配列番号５１９〜 配列番号１０３０の群に記載のオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用。
【請求項６３】
結腸細胞増殖疾患の素因の検出、サブクラスの区別、診断、予測、治療および／またはモニタリングのための前記核酸内のシトシンメチル化の分析に使用する配列番号１３３〜配列番号３８８を含む群から選択された配列およびそれらの相補的配列の１つに記載のＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分子生物学において近年の方法論的発展によって研究されてきた観察レベルは、遺伝子そのもの、これらの遺伝子のＲＮＡへの翻訳およびその生成タンパク質である。個体の発生過程のどの時点でどの遺伝子にスイッチが入るか、また、いかにして特定細胞および組織の特定遺伝子の活性化および阻害が制御されるかの問題は、遺伝子またはゲノムのメチル化の程度および特性に相互に関連しうる。この点で、病的状態は個々の遺伝子またはゲノムの変化したメチル化パターンにおいて、それ自身を明らかにするであろう。
【０００２】
結腸直腸癌は、頻度において男性では第３位に女性では第２位にランク付けされるが、男性および女性の癌死亡率の原因としては第４位にある。５年生存率はステージ全体にわたって６１％であり、早期発見がこの疾患の治癒的療法の必須条件である。全結腸直腸癌の９５％までは分化の程度が異なる腺癌である。
【０００３】
散発性結腸癌は、正常結腸上皮の病理的形質転換から始まり、浸潤癌に継続的に進行する腺腫に至る多段階プロセスで発生する。良性結腸腺種の進行速度は、その組織学的外観に強く依存する：管状型良性腺種は稀に悪性腫瘍に進行する傾向にあるが、絨毛性腺腫は特に直径が２ｃｍより大きいなら、有意な悪性である可能性を有する。
【０００４】
良性増殖性病変から悪性新生物への進行中に、いくつかの遺伝的および後成的変化が生じる。ＡＰＣ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸腺腫および癌腫の７５〜８０％である最も初期の事象の１つであると思われる。Ｋ−ＲＡＳの活性化は、悪性表現型への進行における臨界的段階であると考えられる。継続的に他の発癌遺伝子の変異ならびに腫瘍抑制遺伝子の不活性化となる変質が蓄積する。
【０００５】
ＣｐＧアイランド内の異常なＤＮＡメチル化は、広範囲の遺伝子の抑止または過剰発現につながるヒト悪性腫瘍の最も初期および最も一般的な変質に含まれる。さらに、異常なメチル化はある種の腫瘍における遺伝子のイントロンおよびコード部分のＣｐＧリッチ制御要素に生じることが示されている。腫瘍抑制遺伝子の特異的高メチル化に対して、ＤＮＡの全体的な低メチル化が腫瘍細胞中に観察され得る。全体的メチル化のこの低下は、あからさまな腫瘍形成への発達よりずっと前に、早くから観察され得る。また、低メチル化と増加した遺伝子発現との相関性は、多くの発癌遺伝子において報告されている。結腸癌では、異常なＤＮＡメチル化は最も顕著な変質の１つを構成し、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＴＨＢＳ１、ＭＩＮＴ２およびＭＩＮＴ３１などの多くの腫瘍抑制遺伝子およびｈＭＬＨ１などのＤＮＡミスマッチ修復遺伝子を不活性化する。
【０００６】
結腸直腸癌の分子的進化では、ＤＮＡメチル化異常は２つの異なる役割を果たすと示唆されている。正常な結腸粘膜細胞では、メチル化異常はこれらの細胞の新生物形質転換への素因となる加齢的又は経時的事象の機能として蓄積する。例えば、数種の遺伝子座位の高メチル化は、腺腫、特に腺管絨毛および絨毛サブタイプにおいて既に存在することが示されている。その後の段階で、ＣｐＧアイランドの増大したＤＮＡメチル化は、いわゆるＣｐＧアイランドメチル化誘発表現型（ＣＩＭＰ）により影響される腫瘍のサブセットで重要な役割を果たす。全散発性結腸直腸癌の約１５％を構成するほとんどのＣＩＭＰ＋腫瘍は、ｈＭＬＨ１プロモーターおよび他のＤＮＡミスマッチ修復遺伝子の高メチル化によるミクロサテライト不安定性（ＭＩＮ）を特徴とする。反対に、ＣＩＭＰ−結腸癌は高率のｐ５３変異および染色体変化をともなう、より古典的な遺伝的不安定経路（ＣＩＮ）に沿って進化する。
【０００７】
しかしながら、分子サブタイプは分子変化に関する変動頻度を示すだけではない。ミクロサテライト不安定性または染色体異常のいずれかの存在によって、結腸癌は有意な臨床的差異を示す２つのクラスに下位分類され得る。ほとんど全てのＭＩＮ腫瘍は、近位結腸（上行性および横行性結腸）に始まるが、ＣＩＮ腫瘍の７０％は、遠位結腸および直腸に位置する。これは結腸の異なった部分での異なった発癌性物質の変動する有病率に起因している。近位結腸での一般的な発癌性物質を構成するメチル化発癌性物質は、ＭＩＮ癌の病理学である役割を果たすことが示唆されているが、一方、ＣＩＮ腫瘍は結腸および直腸の遠位部分でより頻繁に生じる付加物生成発癌性物質によってより頻繁に引き起こされると考えられている。さらに、ＭＩＮ腫瘍はＣＩＮ表現型を有する腫瘍よりもより良い予後を示し、補助的化学療法に対してより良く反応する。
結腸癌腫を区別ならびに早期検出するマーカーの同定は、現在の研究の大きな目標である。
【０００８】
５−メチルシトシンは、真核生物細胞のＤＮＡにおける最も頻度の高い共有塩基修飾である。これは例えば転写の制御、遺伝子インプリンティングおよび腫瘍形成においてある役割を果たす。したがって、遺伝子情報の１成分として、５−メチルシトシンの同定はかなり興味深いものである。しかしながら、５−メチルシトシンはシトシンとして同じ塩基対形成挙動を有するから、５−メチルシトシンの位置は配列決定によって同定することができない。さらに、５−メチルシトシンがもつ後成的情報は、ＰＣＲ増幅中に完全に失われる。
【０００９】
５−メチルシトシンのＤＮＡ分析のための、相対的に新しくかつ目下最も頻繁に使用される方法は、シトシンと重亜硫酸塩との特異的な反応に基づく。これはその後のアルカリ加水分解において、塩基対形成挙動でチミジンに対応するウラシルに変換される。しかしながら、５−メチルシトシンはこれらの条件下で未修飾のまま残存する。その結果、ハイブリダイゼーション挙動では元来シトシンと区別され得ないメチルシトシンが、「通常の」分子生物学的技術を使用して、例えば増幅およびハイブリダイゼーションまた配列決定によって、唯一、残存するシトシンとして検出され得るような方法で、元のＤＮＡを変換する。これらの技術の全ては、完全に活用され得る塩基対形成に基づく。感度からみて、先行技術はアガロースマトリックス中に分析されるＤＮＡを包埋する方法に限定され、すなわち、ＤＮＡの拡散および再生を阻止し（重亜硫酸塩は単一鎖ＤＮＡとの反応しかしない）、そして高速透析で全沈殿および精製工程を置換する方法に限定される（オレク(Olek)A、オズワルド（Oswald）J、ウォルター(Walter)J、「重亜硫酸塩系シトシンメチル化分析のための修正および改良方法」、Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6（非特許文献１））。この方法を使用すると、個々の細胞を分析することが可能となり、これがこの方法の潜在性を示す。しかしながら、目下、長さが約３０００塩基対以下の個々の領域のみが分析されるが、数千の可能性あるメチル化事象が起こりうる細胞の全体的な分析は可能ではない。しかもこの方法は少量のサンプル量から得た非常に小さな断片を確実に分析することはできない。これらは拡散保護にもかかわらずマトリックス中で失われる。
５−メチルシトシンを検出する別な公知方法に関する概要は、次の総説文献：レイン(Rein),T、デパムフィリス(DePamphilis),M.L、ゾルバス(Zorbas),H、Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255（非特許文献２）から集めてもよい。
【００１０】
現在まで、いくつかの例外（例えば、ツェシュニック(Zeschnigk)M、リッチ(Lich)C、ビュティング（Buiting）K、ドエルフラー(Doerfler)W、ホルステムケ(Horsthemke)B、「ＳＮＲＰＮ座のアレルメチル化相違に基づくアンジェルマンおよびプラダー・ウィリー症候群の診断のための単管ＰＣＲ試験」、Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94-8（非特許文献３））を除いて、重亜硫酸塩技術が唯一、研究において使用されている。しかしながら、常に、公知遺伝子の短い特定断片が重亜硫酸処理に続いて増幅され、完全に配列決定されるか（オレク(Olek)A、ウォルター(Walter)J、「Ｈ１９メチル化刷り込みの移植前個体発生」、Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6（非特許文献４））または個々のシトシン位置がプライマー伸長反応（ゴンザルゴ(Gonzalgo)ML、ジョーンズ(Jones)PA、「メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）を使用する特定部位でのメチル化相違の迅速定量」、Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12)）: 2529-31（非特許文献５）、ＷＯ９５／００６６９（特許文献１））または酵素分解（ション(Xiong)Z、レアード（Laird）PW、COBRA：「高感度および定量的ＤＮＡメチル化分析」、Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4（非特許文献６））によって検出される。さらに、ハイブリダイゼーションによる検出もまた、記述されている（オレク(Olek)ら、ＷＯ９９／２８４９８（特許文献２））。
【００１１】
個々の遺伝子のメチル化検出における重亜硫酸塩技術の使用を扱っている別な刊行物は、グリッグ(Grigg)G、クラーク(Clark)S、「ゲノムＤＮＡの５−メチルシトシン残基の配列決定」、Bioassays. 1994 Jun;16(6):431-6,431（非特許文献７）；ツエシュニク(Zeschnigk)M、シュミッツ(Schmitz)B、ディトリッチ(Dittrich)B、ビューティング(Buiting)K、ホルステムケ(Horsthemke)B、ドエルフラー(Doerfler)W、「ヒトゲノム中の刷り込みされたセグメント：ゲノム配列決定法により測定されたプラダー・ウィリー／アンジェルマン症候群領域中の異なったＤＮＡメチル化パターン」、Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3)387-95（非特許文献８）；フェイル(Feil)R、チャールトン(Charlton)J、バード(Bird)AP、ウォルター(Walter)J、レイク(Reik)W、「個々の染色体上のメチル化分析：重亜硫酸塩ゲノム配列決定の改良プロトコール」、Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6（非特許文献９）；マーチン(Martin)V、リビエラス(Ribieras)S、ソンーウォン(Song-Wang)X、リオ(Rio)MC、ダンテ(Dante)R、「ゲノム配列決定はｐＳ２遺伝子の５’領域中のＤＮＡ低メチル化とヒト乳癌セルラインでのその発現の相関性を示す」、Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4（非特許文献１０）:ＷＯ９７／４６７０５（特許文献３）およびＷＯ９５／１５３７３（特許文献４）がある。
オリゴマーアレイ製造における先行技術の概要は、１９９９年１月に発行されたNature Geneticsの特別版(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999（非特許文献１１）)およびそこに引用された文献から集めることができる。
【００１２】
蛍光標識されたプローブは、しばしば、固定化ＤＮＡアレイのスキャニングに使用される。特異的プローブの５’ＯＨへのＣｙ３およびＣｙ５色素の単純な結合は、蛍光標識に特に好適である。ハイブリダイズされたプローブの蛍光検出は、例えば、共焦点顕微鏡によって実施してもよい。とりわけ、Ｃｙ３およびＣｙ５色素は市販されている。
【００１３】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生物分子分析には非常に効率的な開発である（カラス(Karas)M、ヒレンカムプ（Hillenkamp）F、「１０，０００ダルトンを超える分子質量を有するタンパク質のレーザー脱離イオン化」、Anal Chem. 1988 Oct 15; 60(20): 2299-301（非特許文献１２））。分析物は光吸収性マトリックス中に包埋される。マトリックスを短いレーザーパルスで蒸発させ、非断片化方法で蒸気相中へ分析物分子を輸送する。分析物はマトリックス分子とともに衝突によってイオン化される。適用された電位がこのイオンをフィールドフリー飛行管中へ加速する。その種々の質量によって、イオンは種々の速度で加速される。小さなイオンは大きなものよりも早く検出器へ届く。
【００１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光測定は、ペプチドおよびタンパク質の分析に極めて適している。核酸の分析はいくぶんか困難である（グット(Gut)IG、ベック(Beck)S、「ＤＮＡおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分光分析」、Current Innovations and Future Trends 1995,1;147-57（非特許文献１３））。核酸の感度は、ペプチドよりも約１００倍も悪く、断片サイズが大きくなるにつれて反比例して減少する。多重に負に電荷されたバックボーンを有する核酸では、マトリックスによるイオン化方法は、かなり効率が低い。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光測定では、マトリックスの選択が著しく重要な役割を果たす。ペプチドの脱離には、非常に微細な結晶化を生じるいくつかの効率的なマトリックスが見出されている。ＤＮＡに対するいくつかの反応性マトリックスが今では存在するが、しかしながら、感度の相違はまだ減少していない。感度の相違は、ペプチドに、より類似するような方法にて、ＤＮＡを化学的に修飾することによって減少させることができる。バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩で置換されたホスホロチオエート核酸は、簡単なアルキル化化学を使用して電荷中性ＤＮＡに変換され得る（グット(Gut)IG、ベック(Beck)S、「選択的ＤＮＡアルキル化のための手法と質量分析による検出」、Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73（非特許文献１４））。この修飾ＤＮＡへの電荷タグの結合は、ペプチドにおいて見られた感度と同じ程度に感度が増加する。電荷タギングのさらなる利点は、未修飾基質の検出を著しく困難なものとする不純物に対して分析の安定性を増大させる。
ゲノムＤＮＡは標準的方法によって細胞、組織または他の試験サンプルのＤＮＡから得られる。この標準的方法論は、サンブルック(Sambrook)、フリッシュ(Fritsch)およびマニアティス(Maniatis)編、Molecular Cloning：「研究室マニュアル」、1989（非特許文献１５）などの参考文献に見られる。
【特許文献１】ＷＯ９５／００６６９
【特許文献２】ＷＯ９９／２８４９８
【特許文献３】ＷＯ９７／４６７０５
【特許文献４】ＷＯ９５／１５３７３
【非特許文献１】Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064-6
【非特許文献２】Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255
【非特許文献３】Eur J Hum Genet. 1997Mar-Apr; 5(2): 94-8
【非特許文献４】Nat Genet. 1997 Nov; 17(3): 275-6
【非特許文献５】Nucleic Acids Res. 1997 Jun15; 25(12)）: 2529-31
【非特許文献６】Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2532-4
【非特許文献７】Bioassays. 1994 Jun; 16(6): 431-6,431
【非特許文献８】Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3)387-95
【非特許文献９】Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22(4): 695-6
【非特許文献１０】Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4（
【非特許文献１１】Nature Genetics Supplement, Volume21, January 1999
【非特許文献１２】Anal Chem. 1988 Oct 15; 60(20): 2299-301
【非特許文献１３】Current Innovations and Future Trends 1995, 1; 147-57
【非特許文献１４】Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25; 23(8): 1367-73
【非特許文献１５】Molecular Cloning：「研究室マニュアル」、1989
【発明の開示】
【００１５】
（発明の実施態様）
本発明は、ＭＤＲ１、ＡＰＯＣ２、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＥＧＲ４、ＡＲ、ＲＢ１、ＧＰＩｂベータ、ＭＹＯＤ１、ＷＴ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＥＬＫ１、ＡＰＣ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＹＡ４、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＮＣＡ９、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＰＡＸ６、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＢ、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＶＨＬ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＤＨ１３、ＤＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＤＮＭＴ１、ＣＥＡ、ＭＢ、ＰＣＮＡ、ＣＤＣ２、ＥＳＲ１、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳＳＦ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５を含む群の少なくとも１員である核酸を、問題のゲノム配列内のメチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別することができる試薬または一連の試薬に接触させることを特徴とする、結腸細胞増殖疾患の発達に関与する特徴について生物学的サンプルを分析する方法を提供する。
【００１６】
本発明は、ゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターを確認する方法を利用可能とする。この方法は、より具体的には、結腸細胞増殖疾患のサブクラスおよび該疾患の遺伝的素因の改良された同定および区別を可能とすることによる、結腸細胞増殖疾患の改良された診断、治療およびモニタリングにおける使用に関する。本発明は結腸癌腫の高特異的分類を可能にし、それによって改善され、かつ情報に基づく患者の治療を可能とする当該技術分野の現状を超えた改良をもたらす。
特に好ましい実施態様では、本発明は結腸癌腫、結腸腺腫および正常結腸組織を区別することができる方法および核酸を利用可能とする。
さらに、本方法はシトシンメチル化および単一ヌクレオチド多型を分析することを可能とする。
【００１７】
本発明の基礎を形成する遺伝子は、「遺伝子パネル」、すなわち本発明の特別な遺伝子配列および／またはそれぞれの情報となるメチル化部位を含むコレクションを形成するために使用することができる。遺伝子パネルの形成は、それらが関連する疾患の迅速かつ特異的な分析を可能とする。本発明の遺伝子パネルはここに記載するように、結腸細胞増殖疾患の診断、治療およびモニタリング、および分析において、驚くべき高効率でもって使用することができる。様々な遺伝子アレイから得た複数のＣｐＧ部位の使用は、単一遺伝子診断および検出用具に比べて、比較的高い感受性および特異性を可能とする。さらに、ここに記載するパネルは、結腸細胞増殖疾患の多くの態様の分析に使用するように適合させてもよい。
【００１８】
好ましい実施態様では、本方法は下記工程を含む：
本方法の第１工程で、ゲノムＤＮＡサンプルは組織または細胞原料から単離されなければならない。このような原料としては結腸組織サンプル、セルライン、組織学的スライド、体液、またはパラフィン包埋組織が挙げられる。抽出は、界面活性剤溶解液の使用、超音波処理およびガラスビーズによる渦流動を含む当業者にとって標準的な手段によってもよい。一度、核酸が抽出されると、ゲノム２本鎖ＤＮＡが分析に使用される。
【００１９】
好ましい実施態様では、ＤＮＡは本方法の次工程に先たって解裂されていてもよい。これは特に制限エンドヌクレアーゼを使用する当該技術分野で標準的な手段によってもよいが、これに限定されない。
【００２０】
本方法の第２工程では、ゲノムＤＮＡサンプルは５’位でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル、チミンまたはハイブリダイゼーション挙動においてシトシンと異なる他の塩基に変換するような方法にて処理される。これは以後、「前処理」として理解される。
【００２１】
ゲノムＤＮＡの上記した処理は、好ましくは重亜硫酸塩（亜硫酸塩、二亜硫酸塩）を使用し、続いて、非メチル化シトシン核酸塩基をウラシルまたは塩基対形成挙動においてシトシンと異なる他の塩基に変換するアルカリ加水分解を実施する。もしも亜硫酸塩溶液が反応に使用されるなら、そのとき、非メチル化シトシン塩基で付加が生じる。さらに、変性試薬または溶媒ならびにラジカル遮断剤が存在しなければならない。次いで、それに続くアルカリ加水分解では、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシルへの変換を生じる。化学的に変換されたＤＮＡは、次いでメチル化シトシンの検出に使用される。
【００２２】
前処理されたＤＮＡ断片は、配列番号３８９〜配列番号５１８に記載されるプライマーオリゴヌクレオチドのセットおよび好ましくは熱安定性ポリメラーゼを使用して、増幅される。統計的かつ実用的な理由から、好ましくは長さ１００〜２０００塩基対を有する１０個以上の異なった断片が増幅される。数種のＤＮＡセグメントの増幅は、１つの同じ反応容器内で同時に実施することができる。通常、増幅はポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって実施される。
【００２３】
本方法はまた、別なプライマーを使用しても可能であり、このようなプライマーの設計は当業者には自明である。これらは、その配列が添付書類（配列番号１３３〜配列番号３８８）に特定される塩基配列のうち、少なくとも長さ１８塩基対のセグメントにそれぞれ逆相補的であるか、または同一である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。該プライマーオリゴヌクレオチドは、それらがいかなるＣｐＧジヌクレオチドをも含まないことを特徴とすることが好ましい。本方法の特に好ましい実施態様では、該プライマーオリゴヌクレオチドの配列は、問題の結腸組織特異的ＤＮＡにのみ選択的にアニールし、かつ増幅するように設計され、それによって、バックグランドまたは非関連ＤＮＡの増幅を最小限とする。本発明では、バックグランドＤＮＡは関連組織特異的メチル化パターンを有していないゲノムＤＮＡを意味すると解釈される。この場合、関連組織とは健康および病的結腸の両方である。
【００２４】
本発明では、少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドは、増幅中に固相に結合されていることが好ましい。種々のオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー配列は、四角形または六角形格子の形態をもつ平面固相上に配列され得る。固相表面は好ましくはシリコーン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金から構成され、ニトロセルロースまたはプラスチックなどの他の材料も同様に使用され得る。
【００２５】
増幅によって得られた断片は、直接または間接に検出可能な標識を有することができる。蛍光標識、放射性核種、または質量分析計で検出できる通常の質量を有する分離可能な分子状断片の形態の標識が好ましく、産生される断片は質量分析計でのよりよい検出性のために１価の正または負の総電荷を有することが好ましい。検出はマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によるか、または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して実施し、かつ可視化してもよい。
【００２６】
本方法の第２工程で得られた増幅産物は、続いてオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡプローブのアレイまたはセットにハイブリダイズされる。ここで、ハイブリダイゼーションは、好ましくは以下に記載されるようにして行われる。ハイブリダイゼーション中に使用されるプローブのセットは、好ましくは少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーから構成される。しかしながら、特許請求されるように、この方法はオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡプローブを一つだけ使用して実施され得ることが理解される。この方法では、増幅産物は既に固相に結合されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。特に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは配列番号５１９〜配列番号１０３０からなる群から選択される。さらに好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは配列番号８９５〜配列番号１０３０を含む群から選択される。非ハイブリダイズ断片は続いて除去される。該オリゴヌクレオチドは添付書類に特定される塩基配列のセグメント、少なくとも１つのＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチドを含むセグメントに逆相補的であるか同一である、長さ１０個のヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列を含む。さらに好ましい実施態様では、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシン、またはＴｐＧの場合にはチアミンが１０マー（10-mer）の５’末端から５番目〜９番目に存在する。ＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチドそれぞれのための１つのオリゴヌクレオチドが存在する。
【００２７】
本方法の第５工程で、非ハイブリダイズ増幅産物が除去される。
本方法の最終工程で、ハイブリダイズした増幅産物が検出される。ここで、増幅産物に結合した標識はオリゴヌクレオチド配列が存在する固相のそれぞれの位置で確認されうることが好ましい。
【００２８】
本発明では、増幅産物の標識は蛍光標識、放射性核種また質量分析計で検出され得る通常の質量を有する分離可能な分子断片であることが好ましい。質量分析計は増幅産物、増幅産物の断片または増幅産物と相補的であるプローブの断片の検出において好ましい。検出はマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によるか、または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して実施され、かつ可視化されることが可能である。産生した断片は質量分析計でより良く検出するために１価の正または負の総電荷を有していてもよい。
【００２９】
上述した方法は、好ましくはゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターを確認するために使用される。
【００３０】
本方法を可能にするために、さらに本発明は遺伝子ＭＤＲ１、ＡＰＯＣ２、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＥＧＲ４、ＡＲ、ＲＢ１、ＧＰＩｂベータ、ＭＹＯＤ１、ＷＴ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＥＬＫ１、ＡＰＣ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＹＡ４、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＮＣＡ９、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＰＡＸ６、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＢ、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＶＨＬ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＤＨ１３、ＤＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＤＮＭＴ１、ＣＥＡ、ＭＢ、ＰＣＮＡ、ＣＤＣ２、ＥＳＲ１、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳＳＦ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５ならびに該遺伝子内のシトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマーの修飾ＤＮＡを提供する。本発明は遺伝的および後成的パラメーター、特にゲノムＤＮＡのシトシンメチル化パターンが特に結腸細胞増殖疾患の改良された診断、治療およびモニタリングに適しているとの発見に基づく。さらに、本発明は結腸細胞増殖疾患の異なるサブクラスの区別または結腸細胞増殖疾患への素因の検出を可能とする。
【００３１】
本発明の核酸はゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターの分析において使用することができる。
【００３２】
この目的は、配列番号１３３〜配列番号３８８の１つに記載される前処理されたゲノムＤＮＡおよびそれらに相補的な配列のうち、長さ少なくとも１８塩基の配列を含む核酸を使用する本発明によって達成される。
修飾核酸は、これまで疾患関連遺伝的および後成的パラメーターの確認に関連がなかった。
【００３３】
本発明の目的は、ゲノムのシトシンメチル化状態を検出するための前処理したＤＮＡの分析用のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーによって達成される。該オリゴヌクレオチドは、配列番号１３３〜配列番号３８８に記載の前処理されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズする長さ少なくとも１０個のヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列を含む。本発明のオリゴマープローブは、結腸細胞増殖疾患の発達に関与した特徴について生物学的サンプルの分析中の特定遺伝的および後成的パラメーターを確認することが初めて可能となる重要でかつ効果的な手段を構成する。該オリゴヌクレオチドは結腸細胞増殖疾患の改良された診断、治療およびモニタリングおよび該疾患への素因の検出を可能とする。さらに、結腸細胞増殖疾患の異なったサブクラスの区別を可能とする。オリゴマーの塩基配列は、好ましくは少なくとも１つのＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチドを含む。プローブはまた、特に好ましい対形成特性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態で存在してもよい。ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが１３マー（13-mer）の５’末端から５番目〜９番目のヌクレオチドである本発明のオリゴヌクレオチドが、特に好ましい。ＰＮＡオリゴマーの場合、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは９マー（9-mer）の５’末端から４番目〜６番目のヌクレオチドであることが好ましい。
【００３４】
本発明のオリゴマーは、通常、配列番号１３３〜配列番号３８８内のＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれについて少なくとも１つのオリゴマーを含む、いわゆる「セット」で使用される。配列番号５１９〜配列番号１０３０から得たＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれについて少なくとも１つのオリゴマーを含むセットが好ましい。配列番号８９５〜配列番号１０３０を含むセットがさらに好ましい。
【００３５】
本発明によるオリゴヌクレオチドのセットの場合、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは固相に結合されることが好ましい。１セットのオリゴヌクレオチド全てが固相に結合していることがさらに好ましい。
本発明はさらに、ゲノムＤＮＡ（配列番号１３３〜配列番号３８８およびそれらに相補的な配列）の処理された種々のものを使用して、ゲノムＤＮＡのシトシンメチル化状態を検出するために使用される、好ましくは少なくとも１０ｎ（オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー）のセットに関する。しかしながら、特許請求されるように、本方法はオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーを一つだけ使用して実施され得る。これらのプローブは、結腸細胞増殖疾患の改良された診断、治療およびモニタリングを可能とする。特に、これらは結腸細胞増殖疾患の異なったサブクラスの区別および該疾患への素因の検出を可能とする。特に好ましい実施態様では、セットは配列番号５１９〜配列番号１０３０を含む。
オリゴマーのセットはまた、配列番号１３３〜配列番号３８８の１つに記載の前処理されたゲノムＤＮＡを使用して、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するために使用してもよい。
【００３６】
本発明では、本発明で入手可能となった種々のオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマーの配置（いわゆる「アレイ」）は、固相に結合されるようにして存在することが好ましい。異なったオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー配列のアレイは、四角形または六角形の格子形態の固相上に配置されることを特徴とする。固相表面は、好ましくはシリコーン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金から構成される。しかしながら、ペレットの形態でまたは樹脂マトリックスとして存在することができるニトロセルロースならびにナイロンなどのプラスチックは好適な代替品である。
【００３７】
したがって、本発明のさらなる主題は、結腸細胞増殖疾患の改良された診断、治療およびモニタリング、結腸細胞増殖疾患の異なったサブクラスの区別および／または結腸細胞増殖疾患への素因の検出のための、担体物質に固定化されたアレイを製造する方法である。該方法では、本発明の少なくとも１つのオリゴマーが固相に結合されている。このようなアレイの製造方法は、例えば米国特許第５，７４４，３０５号から固相化学および感光性保護基により公知である。
【００３８】
本発明のさらなる主題は、結腸細胞増殖疾患の改良された診断、治療およびモニタリング用のＤＮＡチップに関する。さらに、ＤＮＡチップは結腸細胞増殖疾患への素因の検出および結腸細胞増殖疾患の種々のサブクラスの区別を可能とする。ＤＮＡチップは本発明の少なくとも１つの核酸を含む。ＤＮＡチップは例えば、米国特許第５，８３７，８３２号から公知である。
【００３９】
さらに、本発明の主題は、例えば重亜硫酸塩含有試薬、それぞれの場合における配列が、添付書類に特定される塩基配列（配列番号１３３〜配列番号３８８）の１８塩基長のセグメントに対応するか相補的である、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット、オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマーならびに記述した方法を実施し、かつ評価するための指示書から構成されるキットである。しかしながら、本発明ではキットは前記構成要素の一部のみを含むこともできる。
【００４０】
本発明のオリゴマーまたはそのアレイならびに本発明のキットは、結腸細胞増殖疾患の改良された診断、治療およびモニタリングのために使用されることが意図される。さらに、本発明の使用は、結腸細胞増殖疾患の種々のサブクラスの区別および結腸細胞増殖疾患への素因の検出に広がる。本発明では、本方法は好ましくはゲノムＤＮＡ内の重要な遺伝的および／または後成的パラメーターの分析、特に結腸細胞増殖疾患の改良された診断、治療およびモニタリング、該疾患への素因の検出および該疾患のサブクラスの区別に使用される。
【００４１】
本発明の方法は、例えば結腸細胞増殖疾患進行の改良された診断、治療およびモニタリング、該疾患への素因の検出および該疾患のサブクラスの区別に使用される。本発明のさらなる実施態様は前処理の必要がないゲノムＤＮＡのメチル化状態の分析方法である。本方法の第１工程では、ゲノムＤＮＡサンプルは組織または細胞原料から単離されなければならない。このような原料はセルライン、組織学的スライド、体液またはパラフィン包埋組織を含む。抽出は当業者にとって標準的である手段による。これらは界面活性剤溶解液の使用、超音波処理およびガラスビーズによる渦流動を含む。一度、核酸が抽出されると、ゲノム二本鎖ＤＮＡが分析に使用される。
【００４２】
好ましい実施態様では、ＤＮＡは処理の前に解裂されていてもよく、これは当該技術分野の標準的な手段であり、特に制限酵素による。次いで、第２工程ではＤＮＡは１つまたはそれ以上のメチル化感受性制限酵素により分解される。分解は制限酵素部位でのＤＮＡの加水分解が特定ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の情報となるようにして実施される。
【００４３】
第３工程で、制限酵素断片を増幅する。好ましい実施態様では、これはポリメラーゼチェインリアクションを使用して実施される。
最終工程で、増幅産物を検出する。検出は当該技術分野で標準的な手段、例えばゲル電気泳動分析、ハイブリダイゼーション分析、ＰＣＲ生成物内への検出可能なタグの挿入、ＤＮＡアレイ分析、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ分析によるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明はさらに患者または個人にとって不利なまたは関連する事象の診断および／または予測に関する。ゲノムＤＮＡ内の重要な遺伝的および／または後成的パラメーターであって、本発明によって得られた前記パラメーターは、他のセットの遺伝的および／または後成的パラメーターと比べてもよく、その差異は患者または個人にとって不利なまたは関連する事象の診断および／または予測の基礎としてはたらく。
【００４５】
本発明では、「ハイブリダイゼーション」との用語は、サンプルＤＮＡ中でワトソン−クリック塩基対形成に従って、オリゴヌクレオチドが完全に相補的な配列に結合して二重鎖構造を形成することとして理解される。
【００４６】
本発明では、「遺伝的パラメーター」はゲノムＤＮＡの変異および多型、それらの制御にさらに必要な配列である。変異として示されるものは、特に挿入、欠失、点変異、反転および多型、および特に好ましくはＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）である。
【００４７】
本発明では、「メチル化状態分析」とはそれらがメチル化されているか否かを確認するための核酸内のシトシン分析を意味すると解釈される。本発明では、「後成的パラメーター」とは特にシトシンメチル化およびさらにゲノムＤＮＡのＤＮＡ塩基の修飾およびそれらの制御にさらに必要である配列である。さらに、後成的パラメーターは、例えば、上述した方法を使用して直接に分析することができないが、次にＤＮＡメチル化に関連する、ヒストンのアセチル化を含む。
【００４８】
以下に、本発明は配列および実施例をもとに、より詳細に説明されるであろうが、これらに限定されない。
配列番号１〜配列番号６４は、遺伝子ＭＤＲ１、ＡＰＯＣ２、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＥＧＲ４、ＡＲ、ＲＢ１、ＧＰＩｂベータ、ＭＹＯＤ１、ＷＴ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＥＬＫ１、ＡＰＣ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＹＡ４、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＮＣＡ９、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＰＡＸ６、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＢ、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＶＨＬ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＤＨ１３、ＤＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＤＮＭＴ１、ＣＥＡ、ＭＢ、ＰＣＮＡ、ＣＤＣ２、ＥＳＲ１、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳＳＦ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５のゲノムＤＮＡの５’および／または制御領域を示す。これらの配列はアンサンブルデータベース（データ01.10.2001）（http//www.ensembl.org）から得られ、目下、予期されない配列物質の全ての僅少変異、例えば、これらに限定されないが、僅かな欠失およびＳＮＰを含むと考えられるであろう。
【００４９】
配列番号１３３〜３８８は、遺伝子ＭＤＲ１、ＡＰＯＣ２、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＥＧＲ４、ＡＲ、ＲＢ１、ＧＰＩｂベータ、ＭＹＯＤ１、ＷＴ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＥＬＫ１、ＡＰＣ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７ Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＹＡ４、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＮＣＡ９、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＰＡＸ６、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＢ、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＶＨＬ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＤＨ１３、ＤＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＤＮＭＴ１、ＣＥＡ、ＭＢ、ＰＣＮＡ、ＣＤＣ２、ＥＳＲ１、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳＳＦ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５から誘導されるＤＮＡの前処理された配列を示す。これらの配列は目下、予期されない配列物質の全ての僅少変異、例えば、これらに限定されないが、僅かな欠失およびＳＮＰを含むと考えられるであろう。
【００５０】
配列番号３８９〜配列番号５１８は、配列番号１３３〜配列番号３８８の前処理されたＤＮＡの増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号６５〜配列番号１３２は、配列番号１〜配列番号６４のゲノムＤＮＡ内のＣｐＧ位置の分析に有用であるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号５１９〜配列番号１０３０は、重亜硫酸塩によるゲノムＤＮＡ処理後の配列番号１〜配列番号６４のゲノムＤＮＡ内のＣｐＧ位置のメチル化状態の分析のために有用であるオリゴマーの配列を示す。
配列番号８９５〜配列番号１０３０は、重亜硫酸塩による処理後の配列番号１〜配列番号６４のゲノムＤＮＡ内のＣｐＧ位置の分析のために特に有用であり、本発明の好ましい実施態様に供するオリゴマーの配列を示す。
【００５１】
（図面の説明）
図１：実施例２の健康な結腸組織と癌腫または腺腫結腸組織との区別を示す。プロットの左側のラベルは遺伝子およびＣｐＧの名称であり、これらは表３および表７を使用して相互に参照することができる。図の右側のラベルは、２つのグループの平均値間の差異の有意性（ｐ−値、Ｔ−検定）を示す。各列は１つのＣｐＧに対応し、各カラムは１つのサンプルにおけるメチル化程度に対応する。ＣｐＧは２つの組織型（Ａ＝健康、Ｂ＝非健康）間の区別への寄与により順序づけられ、上部から下部へ寄与が大きくなる。黒色は所与のＣｐＧ位置での全メチル化を示し、白色は特定の位置での非メチル化を示す。メチル化の程度は明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示す。
【００５２】
図２：実施例２の健康な結腸組織と癌腫結腸組織との区別を示す。プロットの左側のラベルは遺伝子およびＣｐＧの名称であり、これらは表４および表７を使用して相互に参照することができる。図の右側のラベルは２つのグループの平均値間の差異の有意性（ｐ−値、Ｔ−検定）を示す。各列は１つのＣｐＧに対応し、各カラムは１つのサンプルにおけるメチル化程度に対応する。ＣｐＧは２つの組織型（Ａ＝健康、Ｂ＝癌腫）間の区別への寄与により順序づけられ、上部から下部へ寄与が大きくなる。黒色は所与のＣｐＧ位置での全メチル化を示し、白色は特定の位置での非メチル化を示す。メチル化の程度は明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示す。
【００５３】
図３：実施例２の健康な結腸組織と腺腫結腸組織との区別を示す。プロットの左側のラベルは遺伝子およびＣｐＧの名称であり、これらは表５および表７を使用して相互に参照することができる。右側のラベルは２つのグループの平均値間の差異の有意性（ｐ−値、Ｔ−検定）を示す。各列は１つのＣｐＧに対応し、各カラムは１つのサンプルにおけるメチル化程度に対応する。ＣｐＧは２つの組織型（Ａ＝健康、Ｂ＝腺腫）間の鑑別診断の区別への寄与により順序づけられ、上部から下部へ寄与が大きくなる。黒色は所与のＣｐＧ位置での全メチル化を示し、白色は特定の位置での非メチル化を示す。メチル化の程度は明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示す。頁の構成上、この図には４０個のＣｐＧだけが示される。
【００５４】
図４：実施例２の癌腫結腸組織と腺腫結腸組織との区別を示す。プロットの左側のラベルは遺伝子およびＣｐＧの名称であり、これらは表６および表７を使用して相互に参照することができる。右側のラベルは２つのグループの平均値間の差異の有意性（ｐ−値、Ｔ−検定）を示す。各列は１つのＣｐＧに対応し、各カラムは１つのサンプルにおけるメチル化程度に対応する。ＣｐＧは２つの組織型（Ａ＝腺腫、Ｂ＝癌腫）間の鑑別診断の区別への寄与により順序づけられ、上部から下部へ寄与が大きくなる。黒色は所与のＣｐＧ位置での全メチル化を示し、白色は特定の位置での非メチル化を示す。メチル化の程度は明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示す。
【実施例】
【００５５】
実施例１および２：デジタル表現型
下記実施例で、結腸腺腫または結腸癌腫から得た組織サンプルについて多重ＰＣＲを実施した。多重ＰＣＲは健康結腸組織についても実施した。ＣｐＧ位置のメチル化状態を推論するために、実施例１では以下に説明される方法で各サンプルを処理し、各サンプルのＣｐＧメチル化情報をまとめ、次いで実施例２に詳述されるように分析に使用した。ＣｐＧメチル状態の分析における別な方法は、実施例３に記載される。
【００５６】
実施例１
第１工程で、プロメガ(Promega)製ビザード(Wizzard)キットを使用して細胞サンプルからゲノムＤＮＡを単離した。
サンプルから得た単離ゲノムＤＮＡは、重亜硫酸塩溶液（亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩）で処理する。この処理はサンプル内の非メチル化シトシン全てがチアミジンに変換し、逆にサンプル内の５−メチル化シトシンは未修飾のまま残存するものである。
【００５７】
処理された核酸は、次いでＣｙ５蛍光標識プライマーで１反応当たり８断片を増幅する多重ＰＣＲを使用して増幅される。使用されたＰＣＲプライマーは、表１に記載される。ＰＣＲ条件は以下の通りである。
反応溶液：
１０ｎｇ  重亜硫酸塩処理ＤＮＡ  
３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
４００μＭ  ｄＮＴＰ
２ｐｍｏｌ  各プライマー
１単位  ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（キアゲン（Quiagen））
次のサイクルを４０回実施した。９５℃で１５分間、変性、続いて５５℃で４５秒間、アニーリング、６５℃で２分間、プライマー伸長。６５℃の最終伸長を１０分間、実施した。
【００５８】
各個人サンプルから得た全ＰＣＲ生成物を各ＣｐＧ位置における１対の固定化オリゴヌクレオチドを有するガラススライドにハイブリダイズさせて分析した。これらの検出オリゴヌクレオチドのそれぞれは、元々は非メチル化（ＴＧ）またはメチル化（ＣＧ）のいずれかであった１つのＣｐＧ部位のまわりの重亜硫酸塩変換配列にハイブリダイズするように設計された。使用した全てのハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド（情報になるものおよび情報にならないものの両者）のさらなる詳細は、表２を参照。ハイブリダイゼーション条件は、ＴＧ変異体とＣＧ変異体間の１つのヌクレオチドの差異を検出可能とするように選択した。
各多重ＰＣＲ生成物５μｌ容量を１０×Ｓｓａｒｃ緩衝液（１０×Ｓｓａｒｃ：２３０ｍｌ  ２０×ＳＳＣ、２０％ラウロイルサルコシンナトリウム溶液１８０ｍｌ、ｄＨ２Ｏで１０００ｍｌに希釈）中で希釈した。次いで、反応混合物を以下のようにして、検出オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。９５℃で変性、１０℃に冷却、４２℃で一夜、ハイブリダイゼーション、続いて４２℃で１０×ＳｓａｒｃおよびｄＨ２Ｏにより洗浄した。
【００５９】
各ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドからの蛍光シグナルは、ジェネピックススキャナーおよびソフトウェアを使用して検出した。２つのシグナル（各ＣｐＧ位置の分析に使用されるＣＧオリゴヌクレオチドおよびＴＧオリゴヌクレオチドに由来）の割合は蛍光シグナル強度の比較をもとに計算した。
【００６０】
実施例２
実施例１で得たデータは、次いで、２つのクラスの組織間のＣｐＧメチル化差異により（図１〜４に示されるように）ランク付けされたマトリックス中へアルゴリズムを使用して区分けされた。最も有意なＣｐＧ位置は、上部へ向かって減少する有意性をもつマトリックスの下部にある。黒色は所与のＣｐＧ位置での全メチル化を示し、白色は特定の位置での非メチル化を示す。メチル化の程度は明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示す。各列は遺伝子内の１つの特定ＣｐＧ位置を示し、各カラムは１つのサンプルにおける異なったＣｐＧのメチル化プロフィールを示す。ＣｐＧと遺伝子名は左側に示され、これは問題の遺伝子と使用した検出オリゴマーを確認するために添付する表（表１および７）を相互に参照してもよい。個々のＣｐＧ位置におけるｐ値は右側に示される。ｐ値は、観察された分布がデータセット中で偶然に生じた可能性を示す。
【００６１】
選択された識別のために、我々は学習アルゴリズム（サポートベクターマシン、ＳＶＭ）を訓練した。ＳＶＭ（F.モデル(Model), P.アドルジャン(Adorjan)、オレク(Olek) C.ピーペンブロック(Piepenbrock)、「ＤＮＡメチル化に基づく癌の分類のための特徴選択」、Bioinformatics, 2001, June; 17 Suppl 1:S157-64にて議論される）は、２つのクラスの所与の訓練サンプル間の最適判別式を実施する。この場合、各サンプルは検査したＣｐＧ部位のメチル化パターン（ＣＧ／ＴＧ比率）でもって記載される。ＳＶＭは各クラスのサンプルのサブセット上で訓練され、添付の診断をそれに与える。もしも診断が訓練ラウンド中に作り出された予測変数に基づいて正しく予測され得るなら、それよりも前にＳＶＭに示されていなかった独立試験サンプルを評価に供した。この方法はサンプルの異なった区分を使用して、数回、繰り返す、いわゆる交差検定と呼ばれる方法である。全てのラウンドはそれより前の回で得た知識を使用しないで達成されたことに注目されたい。正しい分類数は全ての回を平均したものであり、これは我々の試験の精度を正しく評価するものである（全ラウンドの正しく分類されたサンプルのパーセント）。
【００６２】
非健康な結腸組織（結腸癌腫と結腸腺腫）と比べた健康な結腸組織（図１）
図１は非健康な標本は結腸腺腫または結腸癌腫組織から得られた非健康な組織と健康な組織の区別を示す。評価は２７個の遺伝子から得た情報となるＣｐＧ位置を使用して実施する。情報となるＣｐＧ位置をさらに表３に記載する。
【００６３】
結腸癌腫組織と比べた健康な結腸組織（図２）
図２は１５個の遺伝子から得た情報となるＣｐＧ位置を使用した癌腫組織と健康な組織の区別を示す。情報となるＣｐＧ位置をさらに表４に記載する。
【００６４】
結腸腺腫組織と比べた健康な結腸組織（図３）
図３は４０個の遺伝子から得た情報となるＣｐＧ位置を使用した腺腫組織と健康な組織の区別を示す。情報となるＣｐＧ位置をさらに表５に記載する。
【００６５】
結腸腺腫組織と比べた結腸癌腫組織（図４）
図４は２個の遺伝子から得た情報となるＣｐＧ位置を使用した腺腫組織と癌腫組織の区別を示す。情報となるＣｐＧ位置をさらに表６に記載する。
【００６６】
実施例３：遺伝子ＣＤ４４内のＣｐＧ部位のメチル化状態の確認
遺伝子ＣＤ４４（配列番号２０）の重亜硫酸塩処理ＤＮＡの断片を、プライマー：GAAAGGAGAGGTTAAAGGTTG (配列番号４２９)およびAACTCACTTAACTCCAATCCC (配列番号４３０)を使用して、ＰＣＲ増幅した。得られた断片（長さ６９６ｂｐ）は２３５位に情報となるＣｐＧを含んでいた。増幅産物ＤＮＡを認識部位GGGCCである制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩで分解した。該エンドヌクレアーゼによる加水分解は、増幅産物の２３５位のＣｐＧのメチル化によりブロックされる。分解物をコントロールとして使用した。
【００６７】
ゲノムＤＮＡはＤＮＡウィザードＤＮＡ単離キット（Promea）を使用してサンプルから単離した。各サンプルは製造者（New England Biolabs）の推奨によりＡｐａＩを使用して分解した。
次いで、各ゲノム分解物１０ｎｇをＰＣＲプライマー：GAAAGGAGAGGTTAAAGGTTGおよびAACTCACTTAACTCCAATCCCを使用して増幅した。ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマー６ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰ２００μＭ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ（Quaigen AG.）１単位を使用するサーモサイクラー（Eppendorf GmbH）を使用して実施した。他の条件はＴａｑポリメラーゼ製造者が推奨するものであった。上記プライマーを使用し、９６℃で１４分の第１変性工程、続いて（工程２：９６℃で６０秒、工程３：５２℃で４５秒、工程４：７２℃で７５秒を）３０〜４０回および７２℃で１０分の最終伸長を実施して遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ生成物の存在はアガロース電気泳動にて分析した。
【００６８】
ＰＣＲ生成物は、サイクルプログラムの工程２〜工程４が３４、３７、３９、４２および４５回繰り返されたとき、問題のＣｐＧ位置がアップメチル化されたＤＮＡから単離されたＡｐａＩ加水分解ＤＮＡを使用して検出可能であった。反対に、ＰＣＲ生成物は、サイクルプログラムの工程２〜工程４が４２および４５回繰り返されたとき、ダウンメチル化ＤＮＡ（およびコントロールＤＮＡ）から単離されたＡｐａＩ加水分解ＤＮＡでのみ検出可能であった。これらの結果は実施例２に記載されたようにＣｐＧメチル化マトリックス分析に導入した。
【表１】
2005518220.tif 000002
2005518220.tif 000003
2005518220.tif 000004
2005518220.tif 000005
【００６９】
【表２】
2005518220.tif 000006
2005518220.tif 000007
2005518220.tif 000008
2005518220.tif 000009
2005518220.tif 000010
2005518220.tif 000011
2005518220.tif 000012
2005518220.tif 000013
2005518220.tif 000014
2005518220.tif 000015
2005518220.tif 000016
2005518220.tif 000017
2005518220.tif 000018
2005518220.tif 000019
【００７０】
【表３】
2005518220.tif 000020
2005518220.tif 000021
2005518220.tif 000022
【００７１】
【表４】
2005518220.tif 000023
【００７２】
【表５】
2005518220.tif 000024
2005518220.tif 000025
2005518220.tif 000026
【００７３】
【表６】
2005518220.tif 000027
【００７４】
【表７】
2005518220.tif 000028
2005518220.tif 000029
2005518220.tif 000030
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】実施例２の健康な結腸組織と癌腫または腺腫結腸組織の区別を示す。
【図２】実施例２の健康な結腸組織と癌腫結腸組織の区別を示す。
【図３】実施例２の健康な結腸組織と腺腫結腸組織との区別を示す。
【図４】実施例２の癌腫結腸組織と腺腫結腸組織の区別を示す。
【図１】
2005518220.tif 000031
【図２】
2005518220.tif 000032
【図３】
2005518220.tif 000033
【図４】
2005518220.tif 000034
【配列表】
2005518220000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月23日(2004.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＲ１、ＡＰＯＣ２、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＥＧＲ４、ＡＲ、ＲＢ１、ＧＰＩｂベータ、ＭＹＯＤ１、ＷＴ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＥＬＫ１、ＡＰＣ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＤＨ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤ４４、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＹＡ４、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＮＣＡ９、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＰＡＸ６、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＲＡＲＢ、ＳＦＮ、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＶＨＬ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＡＶ１、ＣＤＨ１３、ＤＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＴＨＢＳ１、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＤＮＭＴ１、ＣＥＡ、ＭＢ、ＰＣＮＡ、ＣＤＣ２、ＥＳＲ１、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳＳＦ１、ＭＳＨ４、ＭＳＨ５を含む遺伝子および／またはそれらの制御領域の群から得た少なくとも１つの標的核酸を含み、少なくとも１つの標的核酸が遺伝子ＣＤ４４またはＧＰＩｂベータおよび／またはそれらの制御領域から選択される遺伝子パネル。
【請求項２】
標的核酸は、ＡＰＣ、ＣＡＬＣＡ、ＣＡＶ１、ＣＤ４４、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ４、ＥＳＲ１、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＬＡ−Ｆ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＬＨ１、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＷＴ１およびＥＹＡ４を含む遺伝子および／またはそれらの制御領域の群から選択され、少なくとも１つの標的核酸は遺伝子ＣＤ４４および／またはその制御領域から選択される、請求項１に記載の遺伝子パネル。
【請求項３】
標的核酸は、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＣＬ２、ＣＡＬＣＡ、ＣＡＶ１、ＣＤ４４、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＣＤＫＮ２ａ、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ２、ＤＡＰＫ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ４、ＥＳＲ１、ＧＰＩｂベータ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＢＰ／ＭＳＨ６、ＨＩＣ−１、ＨＬＡ−Ｆ、ＩＧＦ２、ＬＫＢ１、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ３、ＭＹＣ、ＭＹＯＤ１、Ｎ３３、ＰＣＮＡ、ＰＧＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＲＡＲＢ、ＲＡＳＳＦ１、Ｓ１００Ａ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＰ７３、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）、ＷＴ１およびＥＹＡ４を含む遺伝子および／またはそれらの制御領域の群から選択され、少なくとも１つの標的核酸は、遺伝子ＣＤ４４および／またはその制御領域から選択される、請求項１に記載の遺伝子パネル。
【請求項４】
標的核酸は、ＡＰＣ、ＣＡＶ１、ＣＤ４４、ＣＤＨ１３、ＣＳＰＧ２、ＥＧＦＲ、ＧＳＴＰ１、ＨＬＡ−Ｆ、ＩＧＦ２、Ｎ３３、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＴＰ７３、ＴＰＥＦ（＝ＴＭＥＦＦ２；＝ＨＰＰ１）およびＥＹＡ４を含む遺伝子および／またはそれらの制御領域の群から選択され、少なくとも１つの標的核酸は、遺伝子ＣＤ４４および／またはその制御領域である、請求項１に記載の遺伝子パネル。
【請求項５】
前記標的核酸は、ＧＰＩｂベータおよびＣＤＫＮ２ａからなる遺伝子および／または制御領域の群から選択される、請求項１に記載の遺伝子パネル。
【請求項６】
前記標的核酸は、配列番号１３３〜配列番号３８８およびそれらの相補的配列からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子パネル。
【請求項７】
前記パネルは前記標的核酸のメチル化状態に関連した結腸細胞増殖疾患の分析のための核酸またはペプチド核酸アレイの形態で存在する、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子パネル。
【請求項８】
前記アレイの固相表面はシリコーン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金から構成されることを特徴とする、請求項７に記載のアレイ。
【請求項９】
前記アレイは、少なくとも１つのオリゴマー、特にオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーを含み、該オリゴマーは、配列番号１３３〜配列番号３８８の１つに記載される前処理されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするか同一である少なくとも１０ヌクレオチドの少なくとも１つの塩基配列を含み、かつ少なくとも１つの標的核酸は、遺伝子ＣＤ４４またはＧＰＩｂベータおよび／またはそれらの制御領域の前処理されたゲノムＤＮＡから選択されることを特徴とするオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＣｐＧまたはＴｐＧジヌクレオチドのシトシンは、オリゴマーの中３分の１に位置する、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号５１９〜配列番号１０３０の群から選択される、請求項９〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項１３】
配列番号９８６〜８９５に記載される少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、配列番号８９５〜９０６、９０９〜９１８、９２１〜９２４、９３１、９３２、９４１、９４２、９７１、９７２および９８７〜９９０に記載される少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、配列番号８９５〜９５４、９５７〜９６２、９６５〜９７０、９７５〜９７８、９８１〜９８６および９９１〜１０２８に記載される少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、および配列番号１００５、１００６、１０２９および１０３０に記載される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドの群から選択されたオリゴヌクレオチドのセットを含む、請求項９〜１２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドアレイ。 
【請求項１４】
下記工程；
ａ）ゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプルを用意し、
ｂ）前記ゲノムＤＮＡを抽出し、
ｃ）処理によって、５位でメチル化されていないゲノムＤＮＡサンプル中のシトシン塩基をウラシルまたは塩基対形成挙動の点からシトシンに類似していない他の塩基に変換し、
ｄ）請求項１〜１３のいずれかに記載されるパネルまたはアレイを用意し、そして、
ｅ）該アレイ上で１つまたはそれ以上のシトシン位置のメチル化状態を確認すること
を含む、結腸細胞増殖疾患を検出および区別するための方法。
【請求項１５】
試薬は重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩または二亜硫酸塩の溶液であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記前処理されたゲノムＤＮＡの断片は、工程（ｄ）の前に、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって増幅されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
長さ１００〜２０００塩基対を有する１０より多い異なった断片が増幅されることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
増幅工程は、配列番号３８９〜配列番号５１８を含むプライマーオリゴヌクレオチドのセットを使用して実施されることを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
増幅工程は、バックグランドＤＮＡを対照として、結腸組織の特定ゲノムメチル化状態に基づき、健康および／または病的結腸組織における特に問題となるＤＮＡを優先的に増幅することを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記アレイ上で１つまたはそれ以上のシトシン位置のメチル化状態を確認することは、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーへの各増幅産物のハイブリダイゼーションを含むことを特徴とする、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
増幅産物は標識化されていることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、増幅産物または増幅産物断片を質量分析法により検出することを含む請求項２１に記載される方法。
【請求項２３】
下記工程；
ａ）ゲノムＤＮＡを含む生物学的サンプルを用意し、
ｂ）該ゲノムＤＮＡを抽出し、
ｃ）請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子パネルを用意し、
ｄ）該遺伝子パネルのゲノムＤＮＡを１つまたはそれ以上のメチル化感受性制限酵素で分解し、そして
ｅ）工程ｄ）の分解において生じたＤＮＡ断片の検出
を含む結腸細胞増殖疾患を検出および区別するための方法。
【請求項２４】
ＤＮＡ分解物は工程ｅ）の前に増幅される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
増幅はポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
１つより多いＤＮＡ断片の増幅は１つの反応容器中で実施される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法は、正常結腸組織と結腸細胞増殖疾患組織を区別し、結腸腺腫組織と正常結腸組織を区別し、結腸癌腫組織と正常結腸組織を区別し、または結腸腺腫組織と結腸癌腫組織を区別する、請求項１４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
重亜硫酸塩（＝二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）試薬ならびに配列番号１３３〜配列番号３８８の１つに記載される前処理されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするか、あるいは同一である少なくとも１０ヌクレオチドの少なくとも１つの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマーを含み、少なくとも１つの塩基配列は、遺伝子ＣＤ４４またはＧＰＩｂベータおよび／またはそれらの制御領域の前処理されたゲノムＤＮＡから選択されるキット。
【請求項２９】
結腸細胞増殖疾患の素因の検出、サブクラスの区別、診断、予測、治療および／またはモニタリングのための請求項１〜６のいずれかに記載される遺伝子パネルまたは請求項７〜１３のいずれかに記載されるアレイの使用。
【国際調査報告】
2005518220.tif 000035
2005518220.tif 000036
2005518220.tif 000037
2005518220.tif 000038
2005518220.tif 000039