(57)【要約】本発明は、少なくとも１種の核酸、及び、性質の異なる少なくとも１種の他のリガンドからなる対象検体を含む可能性のある試料中でハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出する方法であって、以下の段階：（ｉ）反応バッファー中に希釈した既知容量の試料を、上記対象検体を捕獲するためのパートナーであらかじめ被覆した捕獲表面上に配置する段階であって、上記捕獲するためのパートナーは、少なくとも１種の核酸プローブ及び少なくとも１種の抗リガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）からなる段階、（ｉｉ）１５℃〜６０℃の温度で反応させる段階、並びに、（ｉｉｉ）起こったハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する段階：を含むことを特徴とする方法、並びに、伝染性疾患又は代謝由来疾患又はウイルス性疾患を検出するための、並びに、細菌の存在を工業的に診断するための、並びに、生物分子を同定及び／又は定量するための、この方法の使用に関する。また、本発明は、診断におけるこの方法の使用、及び、本発明の方法の実施に有用な、生物学的な、又は、診断用の試験キットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の核酸、及び、性質の異なる少なくとも１種の他のリガンドからなる対象検体を含む可能性のある試料中でハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出する方法であって、
以下の段階：
（ｉ）反応バッファー中に希釈した既知容量の試料を、前記対象検体を捕獲するためのパートナーであらかじめ被覆した捕獲表面上に配置する段階であって、
前記捕獲するためのパートナーは、少なくとも１種の核酸プローブ及び少なくとも１種の抗リガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）からなる段階、
（ｉｉ）１５℃〜６０℃の温度で反応させる段階、並びに、
（ｉｉｉ）起こったハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する段階：
を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
段階（ｉ）と段階（ｉｉ）の間に以下の段階（ｉ’）：
（ｉ’）前記対象検体に特異的な結合パートナーを添加する段階であって、前記パートナーはあらかじめ標識と結合させたものである段階：
を更に含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｉｉ）と段階（ｉｉｉ）の間に以下の２つの段階（ｉｉ’）及び段階（ｉｉ’’）：
（ｉｉ’）前記対象検体に特異的な結合パートナーを添加する段階であって、前記パートナーはあらかじめ標識と結合させたものである段階、及び、
（ｉｉ’’）１５℃〜６０℃の温度で反応させる段階：
を更に含む
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物試料中に含まれる標的核酸があらかじめ標識されていて、段階（ｉ’）又は段階（ｉｉ’）で添加する結合パートナーは、リガンドに特異的なパートナーをあらかじめ標識したもののみである
ことを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｉ’）及び段階（ｉｉ’）において、リガンドに特異的な結合パートナーの代わりに、生物試料中に含まれている可能性のあるリガンドをあらかじめ標識したものを添加する
ことを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
標識に特異的な基質を段階（ｉｉｉ）の前に添加して、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する
ことを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
捕獲表面を段階（ｉｉ）及び／又は段階（ｉｉ’’）の後に洗浄する
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
反応温度が３５〜４５℃である
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
反応温度が３７〜４１℃である
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
反応温度が３７℃又は４１℃である
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
反応バッファーは、イオン強度０．４〜１Ｍであり、ｐＨ７〜８であり、界面活性剤を含む
ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
核酸特異的結合パートナー、リガンド特異的結合パートナー、請求項４に記載の標的核酸、及び、請求項５に記載のリガンドを、同じ標識で標識する
ことを特徴とする請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
捕獲パートナーは同一の疾患に対するマーカーである
ことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
捕獲パートナーは異なる疾患に対するマーカーである
ことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
伝染性疾患又は代謝由来疾患を検出するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１６】
ウイルス性疾患を検出するための請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
細菌の存在の工業的な診断における請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１８】
生物分子を同定及び／又は定量するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１９】
細胞又は組織のトランスクリプトーム及びプロテオームを同時に検出するための請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２０】
捕獲表面；少なくとも１種の核酸プローブ、及び、性質の異なる少なくとも１種の他の抗リガンドからなる対象検体を捕獲するためのパートナー；並びに、反応バッファーを含む診断用キット。
【請求項２１】
標的リガンドに特異的な結合パートナーをあらかじめ標識したものを更に含む
ことを特徴とする請求項２０に記載の診断用キット。
【請求項２２】
試験する試料中に含まれている可能性のあるリガンドをあらかじめ標識したもの、及び、反応バッファーを更に含む
ことを特徴とする請求項２０に記載の診断用キット。
【請求項２３】
標的核酸に特異的な結合パートナーを更に含む
ことを特徴とする請求項２１又は２２に記載の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出する新規の方法、並びに、治療的及び工業的診断における、並びに、生物分子の同定及び／又は定量におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
病状の診断又は監視には、非常に一般的には、ハイブリダイゼーション検出及び／又は免疫検出が必要である。従って、ＡＩＤＳを診断する際には、ｐ２４タンパク質、抗ウイルスエンベロープタンパク質抗体及びウイルスのＲＮＡの存在、又は、抗ｐ２４タンパク質抗体及びウイルスのＲＮＡの存在の両方を調べる必要がある可能性がある。
【０００３】
同一の操作条件下において、かつ、同一反応媒体中において、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出することにより、この２種の反応の検出を要する病状を容易に診断できるようになるであろう。
【０００４】
共通のパラメーターを使用して免疫反応及びハイブリダイゼーション反応を検出するという研究は、従来技術において既になされている。
【０００５】
例えば、特許文献１に、各検体に特異的なマーカーを使用して多数の検体を同時に検出することを目的とした方法が記載されている。しかしながら、この方法は、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応の両方を同時に検出することについては記載しておらず、また、視覚化するために、各検体に特異的な各マーカーによって異なる操作条件を使用している。
【０００６】
また、特許文献２には、検出マーカーとして半導体ナノ結晶を使用して、検体を同時に検出する方法も記載されている。ハイブリダイゼーション反応又は免疫反応は、読み取る波長の変化から分かる。しかしながら、この方法は、検体をそれぞれ異なる条件下で調べるために、分析試料を数個に分けなければならないという点が不利である。
【０００７】
従って、従来技術における方法には、同一操作条件下かつ同一反応媒体中におけるハイブリダイゼーション反応及び免疫反応の同時検出が、複雑で高価であるという理由から不可能である、という欠点がある。
【特許文献１】ＰＣＴ特許ＷＯ０１／８６２９６
【特許文献２】ＰＣＴ特許ＷＯ０１／６１０４０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本出願人は、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出する新規の方法を開発し、上記欠点を克服した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の目的は、
少なくとも１種の核酸、及び、性質の異なる少なくとも１種の他のリガンドからなる対象検体を含む可能性のある試料中でハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出する方法であって、
以下の段階：
（ｉ）反応バッファー中に希釈した既知容量の試料を、上記対象検体を捕獲するためのパートナーであらかじめ被覆した捕獲表面上に配置する段階であって、
上記捕獲するためのパートナーは、少なくとも１種の核酸プローブ及び少なくとも１種の抗リガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）からなる段階、
（ｉｉ）１５℃〜６０℃の温度で反応させる段階、並びに、
（ｉｉｉ）起こったハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する段階：
を含む
ことを特徴とする方法、並びに、
（例えばウイルス性等の）伝染性疾患及び代謝由来疾患を検出するための、並びに、細菌の存在を工業的に診断するための、並びに、生物分子を同定及び／又は定量するための、この方法の使用
である。
【００１０】
本発明の別の主題は、
本発明の方法の実施に有用な、生物学的な、又は、診断用の試験キット
である。
【００１１】
本発明の方法は、容易に実施できる方法であり、あらゆる期待に反して、試料中において、同一操作条件（すなわち反応媒体及び温度）下で、少なくとも１種の核酸及び性質の異なる少なくとも１種の他のリガンドからなる対象検体の存在を検出できるようにする方法である。上記対象検体の存在は、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化することによって実証される。
【００１２】
「ハイブリダイゼーション反応」という用語は、捕獲核酸と標的核酸との間の任意の反応を意味することを意図し、「免疫反応」という用語は、捕獲抗リガンドと、核酸以外の標的リガンドとの間の任意の反応を意味することを意図する。
【００１３】
「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸及びリボ核酸、並びに、それらの誘導体を意味することを意図する。
【００１４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、適切なハイブリダイゼーション条件下で少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズできる、天然の又は改変された少なくとも２つのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はその両方）の鎖を意味する。「改変されたヌクレオチド」という用語は、例えば、改変された塩基を含むヌクレオチド、並びに／又は、ヌクレオチド間の結合における改変及び／若しくはバックボーンにおける改変を含むヌクレオチドを意味することを意図する。改変された塩基の例としては、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン及びブロモ−５−デオキシウリジンを挙げることができる。
【００１５】
改変されたヌクレオチド間の結合の例としては、チオリン酸、Ｎ−アルキルリン酸アミド（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、アルキルホスホン酸エステル（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）及びアルキルホスホジエステル結合を挙げることができる。フランス特許ＦＲ−Ａ−２６０７５０７に記載されるもの等のα−オリゴヌクレオチド、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，第８巻，Ｉｓｓｕｅ  １６，１９９８年８月１８日，２２１９〜２２２２頁に記載されるチオリン酸−ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡ等のＬＮＡ、Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍらの文献（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２），１１４，１８９５−１８９７）の主題であるＰＮＡは、バックボーンが改変されたヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの例である。
【００１６】
「核酸以外の性質の異なるリガンド」という用語は、特異的な結合パートナーと結合できる、核酸とは異なる任意の分子を意味することを意図する。この結合パートナーは、捕獲パートナーからなる場合に、抗リガンドと称される。便宜上、「リガンド」及び「抗リガンド」という用語を、以下において、ハイブリダイゼーション反応ではなく、免疫反応できる任意の化合物を示すために使用することとする。
【００１７】
リガンドとしては、例えば、抗原、抗体、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、糖、酵素及びその基質を挙げることができる。
【００１８】
抗リガンドとしては、リガンドの例と同様のもの、及び、レクチン、細胞受容体及びアプタマーを挙げることができる。
【００１９】
「抗原」という用語は、免疫応答で合成が引き起こされるような抗体によって認識できる化合物を意味する。
【００２０】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、遺伝子組換えで得られる抗体、及び、抗体断片を含む。
【００２１】
ポリクローナル抗体の取得は、対象である標的抗原の少なくとも１種で動物を免疫し、続いて、上記動物の血清を採取して、（特に、上記抗体によって特異的に認識される抗原（特に、対象である標的抗原）を付着させたカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって）他の血清成分から上記抗体を分離し、所望の抗体を精製した状態で回収することによって実施できる。
【００２２】
モノクローナル抗体の取得はハイブリドーマ技術によって実施でき、その一般的な原理を以下に記載する。
【００２３】
まず動物を、一般的にはマウス（又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける免疫の場合は培養細胞）を、対象である標的抗原で免疫する。これにより、Ｂリンパ球が上記抗原に対する抗体を産生できる。次に、このような抗体産生リンパ球を「不死」骨髄腫細胞（例示におけるマウス細胞）と融合させ、ハイブリドーマを作成する。こうして得られた異種細胞混合物から、特定の抗体を産生でき、かつ、無限に増殖できる細胞を選択する。ハイブリドーマをそれぞれクローンの形態で複製し、それぞれにモノクローナル抗体を作成させ、所望の腫瘍抗原に対する認識特性を（例えば、ＥＬＩＳＡによって、一次元若しくは二次元免疫阻害によって、免疫蛍光法によって、又は、バイオセンサーの使用によって）試験してもよい。こうして選択したモノクローナル抗体をその後、（特に、上述のアフィニティークロマトグラフィー法によって）精製する。
【００２４】
抗体断片は、その結合パートナー又は捕獲パートナーと結合する機能を維持しているような断片である。
【００２５】
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸からなる鎖を意味することを意図する。「アミノ酸」という用語は、タンパク質をコードする主要なアミノ酸、酵素作用の後に得られる（ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン等の）アミノ酸、天然アミノ酸であるがタンパク質中には存在しない（ノルバリン（ｎｏｒｖａｌｉｎｅ）、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、スタリン（ｓｔａｌｉｎｅ）等の）アミノ酸（Ｈｕｎｔ  Ｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，Ｂａｒｅｔｔ  ＧＣ，ｅｄ．，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，ロンドン，１９８５年）、固体の支持体の合成又は液相中で使用できる、化学基で保護されたアミノ酸、及び、非天然アミノ酸を意味することを意図する。
【００２６】
「タンパク質」という用語は、核タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質及び糖タンパク質等の、繊維状及び球状のホロタンパク質及びヘテロタンパク質を含む。
【００２７】
「ハプテン」という用語は、免疫原でない化合物、すなわち、自力では抗体産生による免疫反応を促進できないが、既知条件下で動物を免疫して（特にハプテン−タンパク質コンジュゲートで免疫して）得られる抗体によって認識できる化合物を示す。これらの化合物は一般的に分子量が３０００Ｄａ未満であり、より一般的には２０００Ｄａ未満であり、例えば、グリコシル化ペプチド、代謝産物、ビタミン、ホルモン、プロスタグランジン、毒素又は様々な医薬品、ヌクレオシド及びヌクレオチドであってよい。
【００２８】
酵素及びその基質は当業者に公知である。捕獲抗リガンドとして酵素を使用すると、その酵素の基質類似体を試験試料中において探索できる。
【００２９】
レクチンは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版，Ｇ．Ｌ．Ｚｕｂａｙ，１９９８年，Ｔｈｅ  Ｍｃ  Ｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，米国，ボストン）に記載されるように、当業者に公知の機構によって糖を認識できる。
【００３０】
抗リガンドとして使用される受容体は、標的リガンドであるエンベロープタンパク質と結合できる表面タンパク質である。このような受容体の例としては、ＨＩＶ  ｇｐ１２０  エンベロープタンパク質に対するＣＸＣＲ４ケモカイン受容体が含まれる（Ｃｏｒａｎａｎｉｔｉ，Ｍ．Ｔ．，２００１年，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１２（２），６７−７０）。
【００３１】
アプタマーは捕獲パートナーであり、事実上、抗体として働くと共にタンパク質リガンドと結合する機能を有するタンパク質及び核酸である（Ｔｏｕｌｍｅ，Ｊ．Ｊ．及びＧｉｅｇｅ，Ｒ．，１９９８年，Ｍｅｄｅｃｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４（２），１５５−１６６）。
【００３２】
本発明の方法において試験した試料は、生物学的なものであっても、工業的なものであってもよい。
【００３３】
生物試料としては、血液、リンパ液、脳脊髄液、咽頭から採取した標本、膣スミア及び尿等の、対象検体を含有できる任意の生物学的流体を挙げることができる。
【００３４】
工業試料としては、生物学的分析が必要な、工業から出る任意の試料を挙げることができる。食品産業から出る試料（調理済み料理、処理水）は、工業試料の例の一部である。
【００３５】
試料を希釈する反応バッファーは、ハイブリダイゼーションバッファーと免疫反応で使用するバッファーとの中間の反応バッファーである。このバッファーは、当業者には明瞭である。
【００３６】
ある特定の実施形態によれば、反応バッファーは、イオン強度０．４〜１Ｍであり、ｐＨ７〜８であり、界面活性剤を含む。
【００３７】
反応バッファーとしては、リン酸塩、ナトリウム塩、リチウム塩及びＨＥＰＥＳに基づくバッファーを挙げることができ、界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｒｉｔｏｎを挙げることができる。
【００３８】
従って、本発明の独創的な点は、この反応バッファー中において、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応の両方を検出できるという点である。
【００３９】
本発明の方法の反応温度は１５〜６０℃である。１５℃未満の温度では、ハイブリダイゼーション反応が相対的に特異的でなくなる危険性があり、特にオリゴヌクレオチドが８ｂｐを超える長さである場合には、温度が６０℃を超えるとリガンド及び抗リガンドの観点から問題が出てくる可能性がある。実際、このような温度では、変性するタンパク質があり、かつ、ハイブリダイゼーション反応は３０ｂｐより長い大きなオリゴヌクレオチドの場合にのみ可能となる。
【００４０】
ある実施形態によれば、反応温度は３５〜４５℃、好ましくは３７〜４１℃であり、３７〜４１℃の温度がより好ましい。
【００４１】
試験する試料を配置する捕獲表面は、核酸プローブ及び抗リガンドを付着させることができる任意の表面であってよい。捕獲表面としては、マイクロウェル、マイクロプレート、ポリマー表面、メンブレン、顕微鏡用スライドグラス、（シリカ、ガラス、マイカ又は石英等の）機能化又は非機能化無機担体、（金及び銀等の）金属表面、並びに、粒子及び微粒子（特に磁気粒子及び微粒子）を挙げることができる。
【００４２】
本発明の方法において、捕獲表面を、上記対象検体を捕獲するためのパートナー、すなわち核酸プローブ及び抗リガンドであらかじめ被覆する。
【００４３】
捕獲パートナーは、本出願人によるフランス特許出願ＦＲ００／１４６９１（フランス特許ＦＲ２８１６７１１）に記載される方法によって配置できる。この方法は、９６ウェルマイクロプレート形式に特に適切な、接触させずに配置する方法である。この方法は、機械的衝撃を与えて、較正した微小滴をノズルを通してマイクロプレートのウェルの底に放出する方法である。こうして、衝撃を与える毎に、ノズルの直径によって直径の異なる（約５０〜５００μｍの）滴が得られる。
【００４４】
上記のパートナーの配置は、内径約１００ミクロン程度のガラス製毛細管を使用して手作業で実施することもできる。この場合、配置を実施するために毛細管を配置表面と接触させなければならず、このために、配置表面とわずかに衝撃が発生する。
【００４５】
ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応の視覚化は、直接又は間接的な方法等の任意の検出方法によって実施できる。
【００４６】
直接検出する場合、すなわち標識を使用しない場合、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を、例えば、プラズモン共鳴、又は、導電性高分子を備えた電極におけるサイクリックボルタンメトリーによって観察する。
【００４７】
間接的に、すなわち標識で検出する場合、標識は、対象検体に対して直接、又は、上記対象検体に特異的な結合パートナーをあらかじめ標識したものを介して、実施できる。
【００４８】
「対象検体に特異的な結合パートナー」という表現は、対象検体と結合できる任意のパートナーを意味することを意図しており、例として、核酸、抗原、抗体、抗体断片、タンパク質、ハプテン、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、及び、酵素の基質が挙げられる。
【００４９】
上記対象検体に特異的な結合パートナーをあらかじめ標識したものを使用してハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する実施形態によれば、本発明の方法は、段階（ｉ）と段階（ｉｉ）の間に以下の段階（ｉ’）：
（ｉ’）上記対象検体に特異的な結合パートナーを添加する段階であって、上記パートナーはあらかじめ標識と結合させたものである段階：
を更に含む。
【００５０】
上記対象検体に特異的な結合パートナーをあらかじめ標識したものを使用してハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する別の実施形態によれば、本発明の方法は、段階（ｉｉ）と段階（ｉｉｉ）の間に以下の２つの段階（ｉｉ’）及び段階（ｉｉ’’）：
（ｉｉ’）上記対象検体に特異的な結合パートナーを添加する段階であって、上記パートナーはあらかじめ標識と結合させたものである段階、及び、
（ｉｉ’’）１５℃〜６０℃の温度で反応させる段階：
を更に含む。
【００５１】
従って、この場合、本発明の方法は、２つの反応段階、すなわち、対象検体を捕獲するためのパートナーと対象検体とを結合させる段階（段階（ｉｉ））、及び、捕獲パートナー／対象検体コンジュゲートと対象検体に特異的な結合パートナーとを結合させる段階（段階（ｉｉ’’））を含む。
【００５２】
更に別の実施形態によれば、ハイブリダイゼーション反応の視覚化は、核酸型の対象検体をあらかじめ標識することによって行い、また、免疫反応の視覚化は、上記対象検体に特異的なリガンド型の結合パートナーを標識することによって行う。その結果、この実施形態においては、標的核酸があらかじめ標識されているため、段階（ｉ’）又は段階（ｉｉ’）で添加する結合パートナーは、リガンドに特異的なパートナーをあらかじめ標識したもののみである。
【００５３】
また、免疫反応は「競合」法によっても検出できる。リガンドに特異的なパートナーの代わりに、生物試料中に含まれている可能性のあるリガンドをあらかじめ標識したものを、次に反応媒体に添加する（段階（ｉ’）及び段階（ｉｉ’））。これは、本発明の別の実施形態の一部である。この場合、検出シグナルは、検出対象リガンドが存在しない場合に最も大きく、非標識の検出対象リガンドの濃度が競合反応によって増加するにつれて徐々に減少する。
【００５４】
捕獲表面を、本発明の各実施形態における反応段階（段階（ｉｉ）及び／又は段階（ｉｉ’’））の後で洗浄して、特異的な相互作用をしていない、未反応の分子及び吸着の弱い分子を捕獲表面から除去してもよい。このようにして、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応の視覚化を改善する。これは、本発明の別の実施形態の一部である。
【００５５】
洗浄媒体としては、例えば、Ａ．Ｐｅｒｒｉｎらによる文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９年，２２４，７７−８７）に記載されるＰＢＳ−ｔｗｅｅｎを使用できる。
【００５６】
「標識」という用語は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に発することができる標識の付着を意味することを意図する。このような標識の例としては、
−例えば比色定量、蛍光又は発光によって検出可能なシグナルを発する、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、α−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素、
−発光又は染料の化合物等の発色団、
−３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性物質、
−フルオレセイン、ローダミン、アレクサ（ａｌｅｘａ）又はフィコシアニン等の蛍光性物質、及び、
−金粒子若しくは磁気ラテックス粒子等の粒子、又は、リポソーム
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
また、例えば別のリガンド／抗リガンドの対を使用する機構等の間接的な機構も使用できる。リガンド／抗リガンドの対は当業者に公知であり、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン、及び、ポリヌクレオチド／このポリヌクレオチドに相補的な配列等の対が挙げられる。この場合、結合媒介物質を有するのはリガンドである。抗リガンドは、上述の標識によって直接検出できる可能性もあるし、又は、リガンド／抗リガンドによって検出できる可能性もある。
【００５８】
これらの間接的な検出機構においては、特定の条件下でシグナルを増幅することになる。このシグナルの増幅方法は当業者に公知であり、本出願人による先のフランス特許出願ＦＲ９８／１００８４又はＷＯ−Ａ−９５／０８０００、又は、文献Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（４５：４８１−４９１，１９９７年）を参照することができる。
【００５９】
ポリメラーゼを使用して標識を直接又は間接的に組み込むことによって、核酸型の対象検体をあらかじめ標識できる。
【００６０】
対象検体に特異的な結合パートナーの標識は、当業者に広く公知であり、例えばＧｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによる文献（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６年，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ，５２５Ｂ  Ｓｔｒｅｅｔ，サンディエゴ，カリフォルニア州９２１０１，米国）に記載されている。
【００６１】
例えば酵素を使用する等といった、使用するコンジュゲートの標識の型によって、当業者は標識を視覚化するために試薬を加えることができる。
【００６２】
従って、本発明の方法のある実施形態によれば、標識に特異的な基質を段階（ｉｉｉ）の前に添加して、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する。
【００６３】
上記試薬は、当業者に広く公知であり、特にＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｅｓｓａｙ（第２版，Ｃ．Ｐｒｉｃｅ編，Ｄ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７年，３４５  Ｐａｒｋ  Ａｖｅｎｕｅ  Ｓｏｕｔｈ，ニューヨーク）に記載されている。
【００６４】
本発明の方法のために標識する成分、すなわち核酸特異的結合パートナー、リガンド特異的結合パートナー、生物試料中に含まれる標的核酸、及び、生物試料中に含まれていてよいリガンドを、異なる標識で又は同じ標識で標識できる。後者の溶液が好ましい。
【００６５】
本発明の方法によって検出したハイブリダイゼーション反応及び免疫反応は、ある１種の疾患の存在を表している可能性がある。この場合、捕獲表面に投与する捕獲パートナーは、その疾患のマーカーであり、本発明の実施形態の一部である。
【００６６】
このように、例えば、ＡＩＤＳの初期診断において、抗ｐ２４タンパク質抗体及びウイルスのＲＮＡの両方の存在を探索できる。従って、捕獲表面に存在する捕獲パートナーは、ｐ２４タンパク質であってもよく、ウイルスのＲＮＡとハイブリダイゼーション反応できる核酸プローブであってもよい。
【００６７】
本発明の方法で検出したハイブリダイゼーション反応及び免疫反応によって、様々な疾患を表すことができる。この場合、結合パートナーは異なる疾患に対するマーカーであり、本発明の別の実施形態の一部である。従って、本発明の方法は、生物試料を１種だけ使用して同一操作条件下で同時に、核酸の検出又は性質の異なるリガンドの検出によっていくつかの異なる疾患を実証してスクリーニングするために使用できる。この方法は、例えば、（病原体が存在しないことの確認が望まれる）献血由来の血液を輸血前に分析する際に有用である可能性がある。
【００６８】
本発明の方法で検出できる疾患は、相互作用できる対象検体と捕獲パートナーとの対が少なくとも１対知られている全ての疾患である。
【００６９】
上記疾患は、ＡＩＤＳ若しくは肝炎性等の伝染性（すなわちウイルス又は細菌による）疾患等であってよく、又は、甲状腺亢進症若しくは糖尿病等の代謝性疾患であってよい。
【００７０】
従って、本発明の別の主題は、伝染性又は代謝由来の疾患を検出するための、本発明の方法の使用からなる。
【００７１】
本発明の更に別の主題は、細菌の存在の工業的診断における本発明の方法の使用からなる。実際には、工業における細菌の存在、特に食品産業におけるリステリア又はサルモネラ菌の存在は、ハイブリダイゼーション反応の検出（細菌のＤＮＡ又はＲＮＡの検出）及び免疫反応の検出（細菌タンパク質の検出）によって確認できる。
【００７２】
また、本発明の別の主題は、生物分子を同定及び／又は定量するための、本発明の方法の使用からなる。実際には、多数の異なる捕獲パートナーを使用して多数の異なる生物分子を確認する場合、本発明の方法によって、どの分子が試料中に存在するかを確認できる。同様にして、性質の異なるものを少し含む多数の捕獲パートナーを使用する場合、本発明の方法によって、試料中に存在する生物分子を定量することにより、病状又は環境条件の一般的な状態を明らかにできる。
【００７３】
本発明の別の主題は、細胞又は組織のトランスクリプトーム及びプロテオームを同時に検出するための、本発明の方法の使用からなる。このように、細胞又は組織の全てのＲＮＡ（トランスクリプトーム）及び全てのタンパク質（プロテオーム）を同時に検出することにより、ＲＮＡと比較してタンパク質の過剰発現の潜在的な障害があるか、又は、その逆であるかを実証できる。
【００７４】
本発明の方法を実施するために、少なくとも１種の以下の構成成分：
−捕獲表面、
−少なくとも１種の核酸プローブ、及び、性質の異なる少なくとも１種の他の抗リガンドからなる対象検体を捕獲するためのパートナー、
−反応バッファー、
−任意に、標的リガンドに特異的なパートナーをあらかじめ標識したもの、又は、試験する試料中に含まれている可能性のあるリガンドをあらかじめ標識したもの、並びに、
−任意に、標的核酸に特異的なパートナー：
からなるキットを使用できる。
【００７５】
上記キットは、試験する試料が工業的な物質である場合には生物学的試験キットと記載でき、試験する試料が生物学的な物質である場合には診断用試験キットと記載でき、本発明の別の実施形態の一部である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
本発明は、以下の実施例及び付随の図１及び図２からより完全に理解できるであろう。上記実施例は説明のために記載するだけであって、限定するものではない。
【００７７】
−図１は２つのグラフを示す。
１つめは、ヒト血清中の、ｐ２４タンパク質／ＶＥＭＡポリマー捕獲パートナーと抗ｐ２４タンパク質抗体との間の免疫反応を示す蛍光の放出を、血清の希釈度に対して示すグラフである（図１Ａ）。
２つめは、適切であれば、核酸プローブ捕獲パートナーＣ＋（ＨＩＶウィルスＤＮＡターゲットと反応できる）及びＣ−（ＨＩＶウィルスＤＮＡターゲットと反応できない）及びＨＩＶウィルスＤＮＡターゲットの間のハイブリダイゼーション反応を示す、又は、この反応が存在しないことを示す蛍光の放出を、ＰＣＲ産物の希釈度に対して示すグラフである（図１Ｂ）。
【００７８】
−図２は、ウェル数１７の多重投与用検出チップを使用する際の配置図を示す。各捕獲パートナーは、ウェル２つずつの中に配置する：
・ウェル１、９及び１７中；ＨＩＶウィルスに対する核酸捕獲パートナー（ＣＨＩＶ）、
・ウェル３及び１１中；Ｂ型肝炎ウィルスＨＢＶに対する核酸捕獲パートナー（ＣＨＢＶ）、
・ウェル７及び１５中；Ｃ型肝炎ウィルスＨＣＶに対する核酸捕獲パートナー（ＣＨＣＶ）、
・ウェル５及び１３中；ＨＩＶウィルスに対するタンパク質捕獲パートナー（ｇｐ１６０エンベロープタンパク質）、
・ウェル４及び１２中；ＨＣＶウィルスに対するタンパク質捕獲パートナー（コアタンパク質）、
・ウェル８及び１６中；ＨＢＶウィルスに対するタンパク質捕獲パートナー（１ウェル当たり異なる２種のＨＢＡｇ表面抗原）、及び、
・ウェル２、６、１０及び１４中；この研究に対して特異的でないタンパク質捕獲パートナー、すなわち抗ＴＳＨ抗体（ＮＳＰ１、ウェル２及び１０）、及び、抗ＨＣＧ抗体（ＮＳＰ２、ウェル６及び１４）。
【実施例１】
【００７９】
＜患者において、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を検出してＨＩＶウィルスの存在を示すための捕獲表面の調製＞
１．１．抗ｐ２４タンパク質抗体を認識できる捕獲パートナーの調製
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）／水の９０／１０（Ｖ／Ｖ）混合物中に１ｇ／Ｌで溶解した無水マレイン酸ビニルエーテルポリマーＭＡＶＥ−６７（６７０００ｇ／ｍｏｌ）の溶液を、フラスコ中で調製した。この混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。その後、組み換えｐ２４タンパク質３６μｇ（ｐｍＲ  Ｋ２４Ｈ、ビオメリュー社、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）を、ポリマー溶液１００μＬと混合した。この混合物を３７℃で３時間インキュベートした。
【００８０】
１．２．ＨＩＶウィルスのＲＮＡから増幅したＤＮＡターゲットを認識できる捕獲パートナーの調製
次のオリゴヌクレオチド２種（ＤＮＡターゲットとハイブリダイズできるＣ＋、及び、ハイブリダイズできないＣ−、）をそれぞれ、濃度１０μＭになるように３×ＰＢＳバッファー（０．４５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８）−ＥＤＴＡ１０ｍＭ中に希釈した。
Ｃ＋：ＮＨ２−ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＧＡＣ  ＧＴＧ  ＧＧＧ
Ｃ−：ＮＨ２−ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＣ
【００８１】
１．３．捕獲表面の調製
上記フランス特許出願ＦＲ００／１４６９１中に記載される方法に従って、微量滴定用プレート（Ｎｕｎｃ社、Ｍａｘｉｓｏｒｂ）の各ウェル中にスポット４つを接触させずに配置した。スポット２つはｐ２４タンパク質−ＭＡＶＥポリマーコンジュゲートからなり、スポットの一方はＣ＋プローブ、他方はＣ−プローブからなる。スポットを配置した後、プレートをすぐに４℃のチャンバー中に移して２時間静置し、その後、６０℃で３０分間インキュベートした。
【実施例２】
【００８２】
＜対象検体の調製、及び、その特異的な捕獲＞
２．１．対象検体の調製
ＤＮＡターゲット（２００ｂｐ）を、細胞培養物から抽出したウイルス遺伝子の一部からＲＴ−ＰＣＲによって作成した。これらを、５’位をビオチンで標識した下記プライマーＡ及びＢを使用してビオチン化した：
プライマーＡ：ＣＡＴ  ｇＴｇ  ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  Ｃｇｇ
プライマーＢ：ＣＴｇ  ｇＴＡ  ｇＴＴ  ｇＴｇ  ＴＣＴ  ｇＣＡ  ＣＡＡ
【００８３】
これらのターゲットを導入直前に、等量の０．２Ｎ水酸化ナトリウムと共に大気温において５分間インキュベートし、変性させた。様々なヒト血清について、抗ｐ２４タンパク質抗体が存在するか存在しないかを従来の方法であらかじめ試験し、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．６５％ｔｗｅｅｎ２０、０．０１４％サケＤＮＡ及び２％ＰＥＧ４０００からなるｐＨ７の反応バッファーＡ中に５００倍希釈した。
【００８４】
２．２．対象検体の特異的な捕獲
希釈した患者の血清３０μＬ、反応バッファーＡ３０μＬ、及び、変性させたＤＮＡターゲット３μＬを混合し、この混合物を各ウェル中に注入した。これを３７℃で１時間反応させた。その後、０．１５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ）でウェルを洗浄した。
【実施例３】
【００８５】
＜ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応の検出＞
混合物（反応バッファーＡ３０μＬ、ペルオキシダーゼ結合抗ヒト抗体（ヤギ）１０ｎｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、ターゲットＤＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド０．０７ｐｍｏｌ）を各ウェル中に注入することにより、プレート底に固定した捕獲プローブと検出プローブとの間に上記ターゲットを挟むことができた。このオリゴヌクレオチドの５’位をペルオキシダーゼであらかじめ標識した。３７℃で１時間反応させた後、ウェルをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで洗浄した。
【００８６】
次に、ペルオキシダーゼに対する比色定量沈殿用基質（ＴＭＢ、ｂｉｏＦＸ社）３０μＬを各ウェル中に添加した。２０分間かけて視覚化した後、基質をピペットで除去し、画像処理ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ＋、Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ社）を備えた顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社、Ａｘｉｏｐｌａｎ２）にＣＣＤカメラ（Ｓｐｏｔ社）を接続し、これを用いて各スポットの吸光度を測定した。このソフトを使用すると、各スポットのシグナル強度を、０（黒、シグナルなし）〜２５５（白、シグナルが飽和）のデジタル値に変換できる。
【００８７】
比較として、ハイブリダイゼーションの特異性を試験するためにＤＮＡターゲットを省略するか、又は、ウィルス（ＨＩＶ−）を含まない血清を使用する以外は、上記操作を繰り返して行った。得られた結果を下記表１中に示す。
【００８８】
【表１】
2005535305.tif 000002
【００８９】
上記の結果から、反応の特異性は十分であることが分かる。ＤＮＡターゲットが存在しても、Ｐ２４抗原と抗Ｐ２４抗体との間の免疫反応の認識は損なわれない。一方、核酸プローブスポット上へのＤＮＡターゲットのハイブリダイゼーションは、媒体中に抗体が存在する場合に可能である。検体がどちらか一方存在しても、望ましくないバックグラウンドノイズは発生しない。ＨＩＶ−血清に対する場合と同様に、Ｃ−スポットは全く検出されない。
【実施例４】
【００９０】
＜本発明の方法による検出の定量及び定性＞
ＤＮＡターゲットの濃度及びＨＩＶ＋血清の希釈度を変える以外は実施例１及び２に記載の操作を繰り返して行った。その後、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を以下のように検出した。
【００９１】
混合物（反応バッファーＡ３０μＬ、アルカリフォスファターゼ結合抗ヒト抗体（ヤギ）１０ｎｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（シグマ社）２５ｎｇ）を各ウェル中に注入した。この混合物を３７℃で１時間反応させた後、ウェルをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎで洗浄した。
【００９２】
その後、アルカリフォスファターゼの蛍光性基質（ＥＣＦ、アマシャム社、調製済）３０μＬを各ウェル中に添加した。視覚化を５分間かけて行った後、ピペットで基質を除去し、上記実施例３中に示すように各スポットの蛍光強度を測定した。
【００９３】
血清又はＰＣＲ産物の希釈度に対して蛍光量を表す結果を、図１Ａ及び図１Ｂ中に示す。分かりやすくするため、ｐ２４タンパク質−ＭＡＶＥポリマーコンジュゲートスポットについて測定したシグナルを図１Ａ中に、Ｃ＋スポット（菱形）及びＣ−スポット（四角形）について同一ウェル中で測定したシグナルを図１Ｂ中に示す。
【００９４】
図１Ａにおいて、ウェル中の血清濃度が増加するにつれて蛍光シグナルが直線的に増加し、プラトーに達することが、希釈度１／１０００未満の場合に観察された。従って、本発明を使用すれば定量が可能である。検出限界は、統計学的手法に従って、０．００００１と推定される。この値は、血清の希釈度１／１０００００と一致する。このように高感度であるため、ＨＩＶ感染後の血清の変化を早期に検出できる。
【００９５】
図１Ｂにおいて、血清を順次希釈して観察された状態と同様の状態が見られる。蛍光シグナルは、特異的なスポットＣ＋上のＤＮＡターゲットの濃度に対して増加する（菱形）。一方、ターゲットとハイブリダイズできないＣ−スポット上のシグナルは安定していて、ターゲットがない状態における測定値と類似している（四角形）。検出限界は０．００００７、すなわちＰＣＲ産物の希釈度１／１４０００と推定される。
【実施例５】
【００９６】
＜反応温度及びバッファーを変えることによる影響＞
１６０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５Ｍ塩化リチウム及び０．０５％ｔｗｅｅｎ２０からなるｐＨ７．５の反応バッファーＢを更に使用し、かつ、温度を４１℃とする以外は実施例４の操作を繰り返して行った。この実験において、血清はウィルス（ＨＩＶ＋）を含み、ウイルスのＤＮＡを認識しないターゲット（Ｃ−）は含まない。結果を下記表２中に示す。
【００９７】
【表２】
2005535305.tif 000003
【実施例６】
【００９８】
＜ＨＩＶ、ＨＢＶ及びＨＣＶウィルスによって引き起こされたウィルス感染の検出チップ中における同時検出＞
６．１．結合した核酸及びタンパク質パラメーターを調べるための生物学的ツール
６．１．１．ハイブリダイゼーション反応
Ａｍｂｉｏｎ社（オースティン、テキサス、アメリカ）から入手したＨＩＶ  ＲＮＡターゲットを使用した。ビオチン化プライマー（ＳＫ４３１  ＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴ、及び、ＳＫ４６２  ＡＧＴＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴ）、及び、ＰＣＲ産物を捕獲するためのアミノ化した捕獲プローブ（ＣＨＩＶ：ＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧＡＴ）をＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社（スラン、ベルギー）において合成した。
【００９９】
ＨＣＶウィルスのＲＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡウィルスキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社、Ｈｏｅｒｄｔ、フランス）を使用して慢性患者の血清から抽出し、ビオチン化プライマー（ＲＣ２１：ＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣ、及び、ＲＣ１：ＧＴＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡ）（Ｒｏｑｕｅ  Ａｆｏｎｓｏ  Ａ．Ｍ．，２０００年，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８６，５５−６０）を使用してＲＴ−ＰＣＲで増幅した。アミノ化したＨＣＶ捕獲プローブの配列は、ＣＨＣＶ（ＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴ）である。ＨＩＶ及びＨＣＶのＲＮＡを、プロメガ社（マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ）のＡｃｃｅｓｓキットを使用して、下記条件下においてＲＴ−ＰＣＲで増幅した：１×ＡＭＶ／Ｔｆｌ反応バッファー、１．８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１μＭのプライマー、１ＵＳＩのＡＭＶ逆転写酵素、及び、５ＵＳＩのＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＴサイクル（４８℃、４５分間）；３５ＰＣＲサイクル（９４℃、３０秒間；６０℃、１分間；６８℃、２分間）；最終伸張（６８℃、７分間）。
【０１００】
アガロース＋臭化エチジウムのゲル上でアンプリコンを調べた。増幅産物の濃度を、ｍａｓｓ  ｌａｄｄｅｒ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）（ＨＩＶアンプリコンについて４６ｎＭ、ＨＣＶアンプリコンについて２３ｎＭ）を使用して調べた。
【０１０１】
ＨＢＶ遺伝子由来の一本鎖合成ターゲット（７４ｂｐ）（ＣＣＣＡＧＴＡＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＧＡＧＴＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＡＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴＣＣＣＧＡＧＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＧＡ）、アミノ化した捕獲プローブ（ＣＨＢＶ：ＡＴＣＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＡＴＧＴＴＡＧ）及びビオチン化検出プローブ（ＤＨＢＶ：ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＣＡＴＡＡＧＧＴＧ）（両プローブともＨＢＶターゲットに相補的である）を、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社において合成した。
【０１０２】
６．１．２．免疫反応
ＨＣＶコアタンパク質（ＨＣＶコア）及びＨＩＶエンベロープタンパク質（ｇｐ１６０）は、本出願人が作成した。２種の異なるＨＢＶ表面抗原（ＨＢＡｇｓ）、すなわち、サブタイプＡｙ抗原（Ｈｙｔｅｓｔ社、トゥルク、フィンランド）及びＣｌｉｎｉｑａ社製血漿サブタイプＡｄ抗原（Ｆａｌｌｂｒｏｏｋ、カリフォルニア州、アメリカ）を使用した。
【０１０３】
この研究において非特異的なマウス抗体２種、すなわち抗ＴＳＨ抗体（ＮＳＰ１）及び抗ＨＣＧ抗体（ＮＳＰ２）を使用して、アッセイの特異性を確認した。ＨＩＶ、ＨＢＶ及びＨＣＶヒト血清は、リヨンの病院から入手した。
【０１０４】
アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧコンジュゲート（ヤギ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ペンシルベニア州、アメリカ）から入手し、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンはシグマ社（Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ、フランス）から入手した。
【０１０５】
６．２．検出チップの調製、及び、生物学的アッセイプロトコール
６．２．１．捕獲パートナーの配置
オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド吸着用反応バッファー（１５０ｍＭリン酸塩、４５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）中に１０μＭに希釈した。非特異的なＩｇＧを、ｐＨ９．３の５０ｍＭ炭酸塩バッファー中に５０μｇ／ｍＬに希釈した。ｇｐ１６０、ＨＢＡｇ及びＨＣＶコアタンパク質を、ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍＬに希釈した。
【０１０６】
バイオチップ配列装置（パーキンエルマー社、ボストン、アメリカ）を使用して配置した。スポット１６＋１個を、スポットとして、円形に、白色微量滴定用プレート（グライナー社、ロングウッド、アメリカ）中に、同じものを２つずつ配置した（図２）。配置して、温度（１０℃）及び湿度（５０％）を制御した条件下でインキュベートした後、プレートを洗浄し（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ０．０５％）、乾燥させて４℃で保存した。
【０１０７】
６．２．２．核酸ターゲット及び抗体の捕獲
検体を、下記のように様々に組み合わせて使用した。
Ｉ：ＨＢＶターゲット
ＩＩ：ＨＩＶターゲット
ＩＩＩ：ＨＢＶ血清
ＩＶ：ＨＩＶ血清
Ｖ：ＨＢＶ＋ＨＩＶターゲット
ＶＩ：ＨＢＶ＋ＨＩＶ＋ＨＣＶターゲット
ＶＩＩ：ＨＢＶ＋ＨＩＶ＋ＨＣＶターゲット＋ＨＢＶ血清
ＶＩＩＩ：ＨＢＶ＋ＨＩＶ＋ＨＣＶターゲット＋ＨＢＶ血清＋ＨＩＶ血清
【０１０８】
これを実施するために、下記のものを各ウェル中に注入した：０．２Ｎ水酸化ナトリウム１．５μＬであらかじめ変性したＨＩＶ又はＨＣＶ増幅産物１．５μＬ；１０ｎＭの合成ＨＢＶ  ＤＮＡを３μＬ；１０倍希釈したヒト血清１μＬ。反応バッファー（０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４；０．５ＭのＮａＣｌ；０．６５％のｔｗｅｅｎ２０；２％のＰＥＧ４０００；ｐＨ７）で容量３０μＬまで希釈し、この溶液を３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ０．０５％混合物で洗浄した
【０１０９】
６．２．３．検出
プレートを０．２μＭのＤＨＢＶ溶液と共に３７℃で３０分間インキュベートした後（ＨＢＶ検出）、洗浄した。その後、これを、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（０．５μｇ／ｍＬ）及びアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト抗体（ヤギ）（μｇ／ｍＬ）の溶液の存在下でインキュベートした。続いてプレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄し、アルカリフォスファターゼに対する沈殿性基質を各ウェル中に添加した（ＢＭ  ｐｕｒｐｌｅ、ロシェ社、バーゼル、スイス）。画像処理ソフトに連結したＣＣＤカメラを使用してプレートを撮影することによって、各スポットに結合している灰色部分の平均値を測定できた。結果を下記表３中に示す。
【０１１０】
【表３】
2005535305.tif 000004
【０１１１】
インキュベートした検体の性質に関連してスポットが発生した。このことから、捕獲パートナーが異なる疾患に対するマーカーである場合においてさえ、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応は同一の操作条件下で、特に同一バッファー中で同一温度において起こることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１Ａは、ヒト血清中の、ｐ２４タンパク質／ＶＥＭＡポリマー捕獲パートナーと抗ｐ２４タンパク質抗体との間の免疫反応を示す蛍光の放出を、血清の希釈度に対して示すグラフである。図１Ｂは、適切であれば、核酸プローブ捕獲パートナーＣ＋（ＨＩＶウィルスＤＮＡターゲットと反応できる）及びＣ−（ＨＩＶウィルスＤＮＡターゲットと反応できない）及びＨＩＶウィルスＤＮＡターゲットの間のハイブリダイゼーション反応を示す、又は、この反応が存在しないことを示す蛍光の放出を、ＰＣＲ産物の希釈度に対して示すグラフである
【図２】多重投与用検出チップを使用する際の配置図を示す。
【図１】
2005535305.tif 000005
【図２】
2005535305.tif 000006
【配列表】
2005535305000001.app
【国際調査報告】
2005535305.tif 000007
2005535305.tif 000008
2005535305.tif 000009
2005535305.tif 000010
2005535305.tif 000011
2005535305.tif 000012
2005535305.tif 000013
2005535305.tif 000014