(57)【要約】本開示は、薬理学的有効量の免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントを含む、獣医学的ワクチンの免疫原性を高めるための組成物を記載する。さらに、本開示は、有効免疫化量の抗原、免疫モジュレーター、免疫アジュバント、および医薬上許容されるキャリアを含むワクチン組成物を開示する。組成物は、常套の二次アジュバントまたは保存剤を含んでよい。本開示は、弱い、免疫抑制性の、または安全性が限界にある抗原の免疫原性を、鳥類または哺乳動物種に薬理学的有効量の前記免疫原性増強組成物または有効免疫化量の前記ワクチン組成物を投与することにより高めるまたは増強するためのユニークな方法を、さらに開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬理学的有効量の免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントを含むことにより特徴づけられる、獣医学的ワクチンの免疫原性を増強するための組成物。
【請求項２】
免疫モジュレーターが、サイトカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、形質転換増殖因子、コロニー刺激ファクター、およびそれらの組み合わせから成る群から選択されることに特徴づけられる、請求項１記載の免疫原性増強組成物。
【請求項３】
免疫モジュレーターがサイトカインであることに特徴づけられる、請求項２記載の免疫原性増強組成物。
【請求項４】
免疫モジュレーターがインターロイキン-１２であることに特徴づけられる、請求項３記載の免疫原性増強組成物。
【請求項５】
免疫モジュレーターが、相同動物、組み換えヒト、または組み換えネズミインターロイキン-１２であることに特徴づけられる、請求項４記載の免疫原性増強組成物。
【請求項６】
免疫アジュバントが、代謝可能なオイル、ブロックコポリマー、エチレン／マレイン酸コポリマー、アクリル酸コポリマー、アクリル酸コポリマーエマルジョン、鉱油エマルジョン、およびそれらの混合物から成る群から選択されることに特徴づけられる、請求項５記載の免疫原性増強組成物。
【請求項７】
免疫アジュバントがサポニンであることに特徴づけられる、請求項６記載の免疫原性増強組成物。
【請求項８】
代謝可能なオイルがスクアレンまたはスクアランであることに特徴づけられる、請求項６記載の免疫原性増強組成物。
【請求項９】
代謝可能なオイルがスクアランであることに特徴づけられる、請求項８記載の免疫原性増強組成物。
【請求項１０】
ブロックコポリマーがポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマーであることに特徴づけられる、請求項６記載の免疫原性増強組成物。
【請求項１１】
エチレン／マレイン酸コポリマーが、およそ等量のエチレンと無水マレイン酸、および約７５、０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する鎖状エチレン／無水マレイン酸コポリマーであることに特徴づけられる、請求項６記載の免疫原性増強組成物。
【請求項１２】
アクリル酸コポリマーが、スクアレン、およびアクリル酸とメタクリル酸の非癒着性水性アクリル酸コポリマーの混合物であることに特徴づけられる、請求項６記載の免疫原性増強組成物。
【請求項１３】
混合物が乳化されていることに特徴づけられる、請求項１２記載の免疫原性増強組成物。
【請求項１４】
鉱油エマルジョンが、軽鉱油のオイル-イン-ウォーターであることに特徴づけられる、請求項６記載の免疫原性増強組成物。
【請求項１５】
免疫アジュバントが、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマーおよびスクアランの混合物であることに特徴づけられる、請求項６記載の免疫原性増強組成物。
【請求項１６】
免疫アジュバントが、およそ等量のエチレンおよび無水マレイン酸、および約７５、０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する鎖状エチレン／無水マレイン酸コポリマー；およびスチレンと、アクリル酸とメタクリル酸の非癒着性水性アクリル酸コポリマーの乳化混合物を含むアクリル酸コポリマーエマルジョンの混合物であることに特徴づけられる、請求項６記載の免疫原性増強組成物。
【請求項１７】
免疫アジュバントが、およそ等量のエチレンおよび無水マレイン酸、および約７５，０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する鎖状エチレン／無水マレイン酸コポリマー；スチレンと、アクリル酸とメタクリル酸の非癒着性水性アクリル酸コポリマーの乳化混合物を含んでいるアクリル酸コポリマーエマルジョン；および鉱油エマルジョンの混合物であることに特徴づけられる、請求項６記載の免疫原性増強組成物。
【請求項１８】
有効免疫化量の抗原、免疫モジュレーター、免疫アジュバント、および医薬上許容されるキャリアを含むことにより特徴づけられる、改良された獣医学的ワクチン組成物。
【請求項１９】
免疫モジュレーターが、サイトカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、形質転換増殖因子、コロニー刺激ファクター、およびそれらの組み合わせから成る群から選択されることに特徴づけられる、請求項１８記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
免疫モジュレーターがサイトカインであることに特徴づけられる、請求項１９記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
免疫モジュレーターがインターロイキン-１２であることに特徴づけられる、請求項２０記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
免疫モジュレーターが、相同動物、組み換えヒトまたは組み換えマウスインターロイキン-１２であることに特徴づけられる、請求項２１記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
免疫アジュバントが、サポニン、代謝可能なオイル、ブロックコポリマー、エチレン／マレイン酸コポリマー、アクリル酸コポリマー、アクリル酸コポリマーエマルジョン、鉱油、およびそれらの混合物から成る群から選択されることに特徴づけられる、請求項２２記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
免疫アジュバントがサポニンであることに特徴づけられる、請求項２３記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
代謝可能なオイルがスクアレンまたはスクアランであることに特徴づけられる、請求項２３記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
代謝可能なオイルがスクアランであることに特徴づけられる、請求項２５記載のワクチン組成物。
【請求項２７】
ブロックコポリマーが、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマーであることに特徴づけられる、請求項２３記載のワクチン組成物。
【請求項２８】
エチレン／マレイン酸コポリマーが、およそ等量のエチレンおよび無水マレイン酸、および約７５，０００〜１００，０００の推定平均分子量を有する鎖状エチレン／無水マレイン酸コポリマーであることに特徴づけられる、請求項２３記載のワクチン組成物。
【請求項２９】
アクリル酸コポリマーが、スチレン、およびアクリル酸とメタクリル酸の非癒着性水性アクリル酸コポリマーの混合物であることに特徴づけられる、請求項２３記載のワクチン組成物。
【請求項３０】
混合物が乳化されていることに特徴づけられる、請求項２９記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
鉱油エマルジョンが、軽鉱油のオイル-イン-ウォーターエマルジョンであることに特徴づけられる、請求項２３記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
免疫アジュバントが、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックコポリマーおよび代謝可能なオイルの混合物であることに特徴づけられる、請求項２７記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
代謝可能なオイルが、スクアランであることに特徴づけられる、請求項３２記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
免疫アジュバントが、エチレン／無水マレイン酸コポリマーおよびアクリル酸コポリマーエマルジョンの混合物であることに特徴づけられる、請求項２３記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
免疫アジュバントが、鉱油エマルジョンをさらに含むことに特徴づけられる、請求項３４記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
抗原が、ウシ呼吸シンシチウイルス、単純疱疹ウイルスタイプ１、ウシ下痢ウイルス、パラインフルエンザ−３ウイルス、イヌ パルボウイルス、イヌ パラインフルエンザ ウイルス、イヌ アデノウイルス タイプＩＩ、イヌ アデノウイルス、イヌ コロナウイルス、狂犬病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネココロナウイルス、ブタ生殖器および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、ニワトリヘルペスウイルス、クラミジア、エーリキア(Ehrlichia)、パスツレラ(Pasteurella)、ヘモフィラス(Haemophilus)、サルモネラ(Salmonella)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、ボレリア(Borrelia)、レプトスピラ(Leptospira)、コクシジア(Coccidia)、ヘモスポリジア(Hemosporidia)、アモエビダ(Amoebida)、トリパノソーマ(Trypanosoma)、リーシュマニア(Leishmania)、ギアルジア(Giardia)、ヒストモナス(Histomonas)、コクシジオイデス(Coccidioides)、ヒストプラズマ(Histoplasma)、ブラストマイセス(Blastomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、およびそれらの混合物から成る群から選択されることに特徴づけられる、請求項２３記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
抗原がストレプトコッカス エキであり、および免疫アジュバントがサポニンであることに特徴づけられる、請求項３６記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
抗原がウシ呼吸シンシチウイルスであり、免疫アジュバントがブロックコポリマーおよび代謝可能なオイルの混合物であることに特徴づけられる、請求項３６記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
抗原がエーリキア カニスであり、および免疫アジュバントがエチレン/マレイン酸コポリマーとアクリル酸コポリマーエマルジョンの混合物であることに特徴づけられる、請求項３６記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
抗原が、イヌ パルボウイルス、イヌ パラインフルエンザ ウイルス、イヌ アデノウイルス タイプＩＩ、イヌ アデノウイルス、イヌ コロナウイルス、レプトスピラ イクテロヘモラジエ、レプトスピラ カニコラ、レプトスピラ グリッポチフォサ、レプトスピラ ポモナの組み合わせであり、免疫アジュバントがエチレン／マレイン酸コポリマーとアクリル酸コポリマーエマルジョンの混合物であることに特徴づけられる、請求項３６記載のワクチン組成物。
【請求項４１】
抗原が、ネコ免疫不全ウイルスおよびネコ白血病ウイルスの組み合わせであり、免疫アジュバントがエチレン/マレイン酸コポリマー、アクリル酸コポリマーエマルジョン、および鉱油エマルジョンの混合物であることに特徴づけられる、請求項３６記載のワクチン組成物。
【請求項４２】
さらに保存剤を含むことにより特徴づけられる、請求項１８記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
さらに二次アジュバントを含むことにより特徴づけられる、請求項１８記載のワクチン組成物。
【請求項４４】
二次アジュバントが、安定剤、乳化剤、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ｐＨ調整剤、界面活性剤、リポソーム、イスコム(iscom)アジュバント、合成グリコペプチド、増量剤、カルボキシポリメチレン、細菌細胞壁、細菌細胞壁の誘導体、ワクシニア、動物ポックスウイルスタンパク質、サブウイルス粒子アジュバント、コレラ毒、Ｎ、Ｎ-ジオクタデシル-Ｎ’，Ｎ’-ビス（２-ヒドロキシエチル）プロパンジアミン、モノホスホリル脂質Ａ、ジメチルジオクタデシル-アンモニウムブロマイド、およびそれらの混合物から成る群から選択されることにより特徴づけられる、請求項４３記載のワクチン組成物。
【請求項４５】
鳥類または哺乳動物種に薬理学的有効量の請求項１記載の免疫原性増強組成物を、弱い、免疫抑制性の、または安全性が限界にある抗原の投与前、投与と同時に、投与に続けて、または投与後に投与することにより特徴づけられる、弱い、免疫抑制性の、または安全性が限界にある抗原の免疫原性を強化、増進、または拡張するための方法。
【請求項４６】
鳥類または哺乳動物種に、有効免疫化量の請求項１８記載のワクチン組成物を投与することにより特徴づけられる、弱い、免疫抑制性の、または安全性が限界にある抗原の免疫原性を強化、増強、または拡張するための方法。
【請求項４７】
免疫原性増強またはワクチン組成物を、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、鼻内、口内、経皮、または経口にて投与することにより特徴づけられる、請求項４５または４６記載の方法。
【請求項４８】
サイトカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、形質転換増殖因子、コロニー刺激ファクター、およびそれらの混合物から成る群から選択される免疫モジュレーターを含む、免疫原性増強またはワクチン組成物を投与することにより特徴づけられる、請求項４５または４６記載の方法。
【請求項４９】
相同動物、組み換えヒト、または組み換えネズミインターロイキン-１２を含むサイトカインを含む免疫原性増強またはワクチン組成物を投与することにより特徴づけられる、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
サポニン、代謝可能なオイル、ブロックコポリマー、エチレン/マレイン酸コポリマー、アクリル酸コポリマー、アクリル酸コポリマーエマルジョン、鉱油エマルジョン、およびそれらの混合物から成る群から選択される免疫アジュバントを含む、免疫原性増強またはワクチン組成物を投与することにより特徴づけられる、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ウシ呼吸シンシチウイルス、単純疱疹ウイルスタイプ１、ウシ下痢ウイルス、パラインフルエンザ−３ウイルス、イヌ パルボウイルス、イヌ パラインフルエンザ ウイルス、イヌ アデノウイルス タイプＩＩ、イヌ アデノウイルス、イヌ コロナウイルス、狂犬病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネココロナウイルス、ブタ生殖器および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、ニワトリヘルペスウイルス、クラミジア、エーリキア、パスツレラ、ヘモフィラス、サルモネラ、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、マイコプラズマ、ボレリア、レプトスピラ、コクシジア、ヘモスポリジア、アモエビダ、トリパノソーマ、リーシュマニア、ギアルジア、ヒストモナス、コクシジオイデス、ヒストプラズマ、ブラストマイセス、アスペルギルス、クリプトコッカスおよびそれらの組み合わせから選択される抗原を含むワクチン組成物を投与することにより特徴づけられる、請求項５０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連する米国出願に対するクロスリファレンス
本出願は、2001年9月17日に出願された米国仮出願番号60/322,840号の35U.S.C.§119 (e)の下の利益を主張する。先行出願を本明細書中に出典明示によりその全容を組み込む。
【０００２】
政府によってスポンサーされた研究または開発に関する記載
適用なし
「配列表」に対する引用
適用なし
【０００３】
発明の背景
発明の分野
本発明は、免疫アジュバントと組み合わせて免疫モジュレーターを含む、抗原を含んでいる獣医学的ワクチンの免疫原性または生理学的有効性を増強する新規組み合わせ、およびワクチン組成物と同時にまたは混合して投与した場合に、抗原に対する動物の免疫学的反応を有意に改善するための該組み合わせの新規使用に関する。
【０００４】
関連分野の記載
本明細書中に記載する全特許文献および公開文献は、本明細書中、その全容を出典明示により組み込む。
多くの衰弱性または致命的疾患の病因が確立されている。例えば、ウシ呼吸シンシチウイルス（以下、「ＢＲＳＶ」と呼ぶ）が、ウシ呼吸疾患コンプレックスの重要なファクターとして認識されている。該疾患は、ウシにおける、迅速な呼吸、咳、食欲喪失、眼および鼻の分泌ならびに温度上昇により特徴づけられる。急性突発にて症状が発症してから後４８時間以内に死亡する可能性がある。ＢＲＳＶは、子牛の風土性肺炎における最も一般的なウイルス病原であると考えられ、さらに新たに離乳した子牛の肺気腫に関連している。
【０００５】
巨大動物の他の疾患、ストラングル(Strangles)も、ストレプトコッカス エキ(Streptococcus equi)の細菌感染により引き起こされる。ジステンパーまたはバーン熱としても知られるストラングルは、局所および散在性の膿瘍の存在により特徴づけられる、ウマの上気道の高度に感染性の疾患である。
種々の病原因子により小動物において、疾患が導かれることが公知である。例えばイヌにおける疾患は、エーリキア カニス(Ehrlichia canis)、イヌ パルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌ パラインフルエンザ ウイルス（ＣＰＩ）、イヌ アデノウイルス タイプＩＩ（ＣＡＶ−２）、イヌ アデノウイルス（ＣＤＶ）、イヌ コロナウイルス（ＣＣＶ）、レプトスピラ イクテロヘモラジエ(Leptospira icterohemorrhagiae)(ＬＩ）、レプトスピラ カニコラ(Leptospira canicola)（ＬＣ）、レプトスピラ グリッポチフォサ(Leptospira grippotyphosa)（ＬＧ）、レプトスピラ ポモナ(Leptospira pomona) (ＬＰ）などの存在が関連することが認められる。同様に、ネコにおける疾患は、ネコ免疫不全ウイルスなどの感染性ウイルス、およびとりわけネコ白血病ウイルス、ネコクラミジア シッタシ（Chlamydia psittaci）などの細菌により引き起こされる。
【０００６】
動物における高度に感染性の、衰弱性の、および致死性の疾患を生じるこれらのタイプの病原因子に対して有効な予防法が、真に必要とされている。しかし、獣医学的ワクチンは、所定の病原因子の弱い抗原活性のため、またはある動物種から他への生物学的変化のために、乏しい免疫学的反応しか可能としないことが多い。低下した生理学的効能も、動物における適当な体液性免疫反応を得るあらゆる試みにおいて問題となっている点である。相伴う細胞媒介性免疫による、疾患に対する真の保護を表す十分なレベルの血清抗体を産生することは、達成するのが困難である。さらに、抗原物質の各添加剤または添加剤の組み合わせとの物理的および化学的適合性を、センシティブな抗原が不活性化されるのを防ぐために、有意な試験により解決しなければならない。厄介な副作用または安全性の狭いマージンからの潜在的毒性より、有用な獣医学的ワクチン化プログラムの進行に対して他の課題がさらに提供される。保護免疫を確立することは、簡単なことではない。つまり、研究は、抗原と適合可能な、そして毒性の懸念を引き起こすことなく動物ワクチンの免疫原性および有効性を改良し得る、信頼できる、無毒のアジュバントを見出すことに焦点が当てられている。
【０００７】
多くの免疫アジュバントが試験されており、多くは、弱い免疫原性を欠点として持つ様々な抗原に対する細胞媒介性および体液性免疫反応を増強する有望な能力を持つ（R. Rabinovich「ワクチンテクノロジー：将来への展望」サイエンス265 : 1401-1404（１９９４年９月２日）およびF. Audibert「アジュバント；現状、臨床展望および将来の見通し」イムノロジー トゥデイ14 (6) : 281-284 (1993)）を参照されたい）。ジフテリア、破傷風、およびＢ型肝炎ワクチンに見出されるAlum (硫酸アルミニウムカリウム）により、体液性免疫反応は刺激されるが、細胞性免疫は刺激されない。結果として、該塩は、全免疫原に関して有効なわけではない。アルミニウム塩は、それ自体またはワクチンを凍結乾燥および冷凍させないという不都合も有する。アルミニウム塩の制限のために、研究は、サポニン、非−イオン性ブロックポリマー界面活性剤、モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルジペプチド（スクアレンオイル）またはトリペプチドおよびサイトカインなどの多くの代替する免疫アジュバントに変遷してきている。しかし、適当な免疫アジュバントシステムの選択は、簡単なことではなく、システムが、異なる免疫原に対して動物の特定種において細胞媒介性および体液性免疫反応を高めるかどうかを見出すための実質的な実験を必要とする。免疫原の安定性および有効性を維持することが、免疫アジュバントシステムが動物において所望のごとく機能するかどうかを見出す選択プロセスに影響を与え得る他の重要なファクターである。
【０００８】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の産生を増すことにより細胞媒介性免疫によるウシ血清アルブミンに対する二次抗体反応を増幅することに関して、アジュバントとして有用であることが見出された最初のサイトカインであった。これまでの研究により、組換えウシＩＬ−１βが、ウイルス感染に対するウシの免疫反応の免疫モジュレーターとして有用であることが示されている（Reddyら、「組換えウシインターロイキン−１βのアジュバント性：ウシヘルペスウイルス−１感染における免疫性、感染、および潜伏性における影響」リンフォカインRes. 9:295-300 (1990)を参照されたい）。これらの研究において、子牛のｒ−ＢｏＩＬ−１β−処置により、ウシヘルペスウイルス−１（ＢＨＶ−１）、ウシウイルス下痢（ＢＶＤ）およびパラインフルエンザ−３（ＰＩ−３）ウイルスに対する抗体産生が増し、ウイルス感染したＭＤＶＫ細胞に対する細胞毒性反応が高まり、攻撃後のＢＨＶ−１のウイルスシェディングが低下し、デキサメタソン注射後のＢＨＶ−１の再発が低下した。報告は、組換えウシインターロイキン−１βが、水溶液にて皮下に投与した場合に抗原の活性を強めることができるということを示唆する。
【０００９】
インターフェロンα（ＩＦＮ−α）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）などのサイトカインの、非反応性の対象においてＢ型肝炎ワクチンの免疫原性を改善する能力を評価するための臨床試験が行われている。
【００１０】
免疫学におけるその後の研究により、例えば、インターロイキン−１２などの他のサイトカインの重要性および活性が試験されている（例えば、Y.-W. Tangら、「免疫化中のインターロイキン−１２処置により、呼吸シンシチウイルスで攻撃したマウスにおいてＴヘルパー細胞タイプ１−様免疫反応が誘発され、ワクチンの免疫原性が改善される」J. Infectious Diseases 172:734-738 (1995); S. Morris et al、「インビボサイトカイン遺伝子発現およびＩｇイソタイプ選択におけるＩＬ−１２の効果」J. Immunology, pp. 1047-1056 (1994); J. Orange et al.、「実験的ウイルス感染に対する反応性および感受性におけるＩＬ−１２の効果」J. Immunology, pp. 1253-1264 (1994); G. Trinchieri,、「ＴＨ１細胞の産生におけるインターロイキン−１２およびその役割」Immunology Today 14(7):335-338 (1993); R. Gazzinelli et al、「インターロイキン−１２は、細胞内寄生虫によるインターフェロンγのＴ−リンパ球細胞−非依存性誘導に必要であり、Ｔ−細胞−欠損宿主における抵抗性を誘導する。」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6115-6119 (July 1993); R. Locksley、「注釈；微生物性病原因子に対する宿主の防御におけるインターロイキン−１２」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5879-5880 (July 1993); B. Graham et al.、「プライミング免疫化により、呼吸シンシチウイルスで攻撃したマウスの肺におけるＴヘルパーサイトカインｍＲＮＡ発現パターンが決定される。」J. Immunology 151:2032-2040 (August 15, 1993); J. Sypek et al.、「皮膚のリーシュマニア症の消散：インターロイキン１２は、保護Ｔヘルパータイプ１免疫反応を開始する」J. Exp. Med. 177:1797-1802 (June 1993); F. Heinzel et al.、「組換えインターロイキン１２は、リーシュマニア メジャーで感染したマウスを治療する」J. Exp. Med. 177:1505-1509 (May 1993); C. Tripp et al、「インターロイキン１２および腫瘍壊死因子αは、リステリア症を有する重篤な複合免疫不全マウスにおけるナチュラルキラー細胞によるインターフェロンγの産生の同時刺激因子であり、および、インターロイキン１０は、生理的なアンタゴニストである。」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3725-3729 (April 1993); R. Manetti et al、「ナチュラルキラー細胞刺激因子（インターロイキン１２［ＩＬ−１２]）は、Ｔヘルパータイプ１（Ｔｈ１）−特異的免疫反応を誘導し、Ｉｌ−４産生Ｔｈ細胞の分化を阻害する。」J. Exp. Med. 177:1199-1204 (April 1993); C.-S. Hsieh et al.「リステリア−誘導性マクロファージにより産生されるＩＬ−１２による、ＴＨ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化」Science 260:547-548 (April 23, 1993); P. Scott,、「ＩＬ−１２：細胞媒介性免疫のためのイニシエーションサイトカイン」Science 260:496-497 (April 23, 1993); M. Gately et al、「インターロイキン１２によるヒト細胞溶解性リンパ球細胞反応の調節」、Cellular Immunology 143:127-142 (1992); A. D'Andrea et al、「ナチュラルキラー細胞刺激因子（インターロイキン１２）の、末梢血単核細胞による産生」J. Exp. Med. 176:1387-1398 (November 1992); B. Naume et al「免疫磁気的に精製したＣＤ５６ＮＫ細胞におけるＩＬ−１２（細胞毒性リンパ球細胞成熟因子）、ＩＬ−２、およびＩＬ−７誘導性の効果の比較試験」J. Immunology 148:2429-2436 (April 15, 1992); S. Chan et al.「ナチュラルキラー細胞刺激因子によるインターフェロンγ産生の誘導：応答細胞および他のインデューサーとの共同作用の特定」J. Exp. Med. 173:869-879 (April 1991); およびM. Kobayashi et al、���ヒトリンパ球細胞において多数の生物学的効果を有するサイトカイン、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）の同定および精製」J. Exp. Med. 170:827-845 (September 1989)）。
【００１１】
インターロイキン−１２（以下、「ＩＬ−１２」と呼ぶ）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるリーシュマニア症に対する細胞媒介性免疫を導き出すアジュバント活性を示した（L. Afonso et al「リーシュマニアメジャーに対するワクチンにおけるインターロイキン−１２のアジュバント効果」、Science 263:235-237 (January 14, 1994)）。エル．メジャーに対する保護の授与は、ＩＬ−１２がリーシュマニア−特異的ＣＤ４＋ＴＨ１（Ｔヘルパー）細胞の分化を導く活性に基いていた。米国特許第5,571,515号（Scott et al)および関連する分割出願、米国特許第5,723,127号および5,976,539号は、原生動物寄生虫を含む抗原に対する細胞媒介性免疫反応を高めることによるリーシュマニア症に対するアジュバントとしての、ＩＬ−２の使用を記載する。リーシュマニア症のモデルにおけるアジュバントとしておよび癌ワクチンとのＩＬ−１２の使用の記載に基けば、米国特許第5,723,127号は、選択される抗原およびＩＬ−１２から成る抗原組成物、および選択される抗原に対する宿主の細胞媒介性免疫反応を高める組成物の能力を増すための方法を指向する。米国特許第5,976,539号は、癌細胞または選択された抗原でトランスフェクトされた癌細胞から選択された抗原およびＩＬ−１２の組成物、およびその使用法を開示する。本シリーズにおけるさらなる関連出願、米国特許第6,168,923B1号(Scott et al)は、病原性微生物からなる抗原およびＩＬ−１２を含む組成物であって、微生物に対する宿主の細胞媒介性免疫反応を誘発する組成物、およびワクチン化された宿主細胞媒介性免疫反応を誘発する免疫原性組成物の能力を増すためにＩＬ−１２を投与する方法を権利主張する。
【００１２】
米国特許第5,665,347号（Metzger et al）は、ＴＨ１（Ｔヘルパー）細胞の活性化に加えて、ＩＬ−１２がＢ１細胞活性の機能活性を阻害するが、Ｂ２細胞については阻害せず、Ｂ１細胞がＩＬ−１２レセプターを有することを開示する。特許権者は、慢性リンパ球細胞白血病、リンパ腫、および感染性単球増加症などのＢ１細胞疾患の治療において、ＩＬ−１２を使用し得ることを示唆する。
【００１３】
米国特許第5,817,673号（Weiner et al）は、遺伝物質を免疫化剤として２つの別個の接種物にて用いる医薬免疫化キットに関する。第３の接種物は、トランスフェクティング試薬、複製試薬、または炎症性試薬、例えば、レクチン、増殖因子、サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２など）およびリンホカインなどの他の反応増強試薬と組み合わせてよい、ブピバカインを含む。
【００１４】
米国特許第5,985,264号(Metzger et al)は、成体同様の保護反応に関する記憶を誘導するための、ＩＬ−１２および抗原の投与を含む、新生児宿主において病原に対する免疫反応を高める方法に関する。新生児宿主は、哺乳動物、例えば、ヒト、ネズミ、ネコ、イヌ、ウシ、またはブタであり、胎児ならびに誕生約２年後までの新生児を含む。抗原は、細菌（例えば、エス．ニューモニアエ(S. pneumoniae)、エヌ．メニンギジティス(N.meningiditis)、エイチ．インフルエンザ(H.influenza)）、ウイルス（例えば、肝炎、風疹、ポリオウイルス、ヒト免疫不全、インフルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸シンシチ）、寄生虫（例えば、リーシュマニア、シストソーム(Schistosomes)）、および真菌(例えば、カンジダ、アスペルギルス(Aspergillus)）などとして記載される。
【００１５】
米国特許第5,744,132号(Warne et al.)は、ＩＬ−１２タンパク質、ポリソルベート、凍結防止剤、膨張剤、および緩衝剤の凍結製剤、液体製剤、または凍結乾燥製剤中にＩＬ−１２の濃縮製剤を含めるための組成物および方法を開示する。米国特許第5,853,714号（Deetz et al.）は、ＩＬ−１２を宿主細胞タンパク質およびウイルスなどの混入物から分離するための、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂を用いるＩＬ−１２の精製のための方法を提供する。
【００１６】
前記先行技術に加えて、例えばパラミキソビリダエ(paramyxoviridae)ワクチンにおけるアジュバントとしての（米国特許第6,071,893号、Graham et al）、経口許容性を高めるおよび自己免疫疾患を治療するための（WO98/16248)、炎症を治療するための（米国特許第5,674,483号、Tu et al.）、ボルデテラ ペルタシス(Bordetella pertussis)ワクチンにおけるアジュバントとしての（WO 97/45139)、またはインフルエンザＡ、ＨＩＶ、破傷風毒などの抗原を含んでいるワクチンにおけるＩＬ−１３とのコ−アジュバントなどとして（WO 98/31384)の所定の抗原とのＩＬ−１２の使用を記載する様々な分野における種々の特許文献および公開文献が存在する。さらなる研究により、種々の動物サイトカイン、およびそれら、例えば、少しだけ列挙すると、ネコＩＬ−１２（C. Leutenegger et al.「ＦＩＶｇｐ１４０を単独またはネコインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＩＬ−１６、またはＣｐＧモチーフと共に発現している最小限の免疫原性が規定された遺伝子発現ベクターワクチンを用いることによる、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）感染に対するネコの免疫化」J. Virology 74 (22) : 10447-10457 (Nov. 2000) および WO01/04155 A2）、鳥のＩＬ−１５（WO 97/14433）、ヒツジのＩＬ−５またはＩＬ−１２（WO 97/00321）を産生するための方法が提供されている。
【００１７】
前記公開文献のいくつを含む他の研究は、特定のワクチン製剤およびそれらを作製する方法に焦点を当てている。米国特許第5,242,686号（Chuet al.）は例えば、クラミジア感染に対して有用なネコワクチン組成物を調製するための方法に関する。不活性化された哺乳動物クラミジア細胞または抗原を、免疫学的に安定なアジュバントおよび生理学的に許容されるキャリアと組み合わせてよい。該特許文献は、例えば、界面活性剤、ポリアニオン、ポリカチオン、ペプチド、タフトシン、オイルエマルジョン、免疫モジュレーター、インターロイキン−１、インターロイキン−２、およびインターフェロンなど、アクリル酸コポリマー、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、スチレンのアクリル酸とメタクリル酸の混合物とのコポリマーまたはその組み合わせなどのアジュバントを記載する。
【００１８】
米国特許第5,733,555(Chu)およびその継続出願、米国特許第5,958,423号は、ウシ呼吸シンシチウイルス（「ＢＲＳＶ」）により引き起こされる感染に対して動物を免疫化するためのワクチン組成物であって、変更された生ＢＲＳＶを単独またはウシ鼻気管炎ウイルスＩＶ、ウシウイルス性下痢ウイルス、およびパラインフルエンザ３ウイルス、アジュバントおよび医薬上許容されるキャリアと組み合わせて含む組成物に関する。組成物により、細胞媒介免疫、分泌性免疫グロブリンＡ免疫、およびその組み合わせによる単一投与後に、保護免疫化が顕在化する。アジュバントには、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤がさらに含まれてよい。該特許文献は、スクアラン、スクアレン、ブロックコポリマー、サポニン、洗浄剤、Quil A、鉱油、植物油、インターロイキン−１、インターロイキン−２、およびインターロイキン−１２などのインターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、サポニンおよび水酸化アルミニウムまたはQuil Aおよび水酸化アルミニウムなどの組み合わせ、リポソーム、イスコム(iscom)アジュバント、合成グルコペプチド、ムラミルジペプチドなど、デキストラン、カルボキシポリメチレン、ＥＭＡ（登録商標）、アクリル酸コポリマーエマルジョン、Neocryl(登録商標)A640など、またはそれらの混合物などの他のアジュバントを開示する。
【００１９】
しかし、ＩＬ−１２または他の免疫モジュレーターが、特に免疫アジュバントと同時投与した場合に、弱い免疫抑制剤または潜在的に毒性のある抗原の免疫原性を効果的および懸著に高めることができることは、先行文献においては記載も例示もされていない。
それゆえ、哺乳動物および鳥類において有意に改善された免疫原性を有する高度にユニークなワクチンであって、弱いかまたは免疫抑制性の抗原、または狭いマージンの安全性を有する抗原を、本発明の免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントを含む新規な組み合わせと共に含むワクチンを提供することが、本発明の重要な対象である。
【００２０】
さらなる対象は、免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントを含む組み合わせを用いる新規方法、またはＴ記憶細胞を含む細胞媒介性免疫において、より強い刺激を誘導することによりワクチンの免疫原性を実質上改良するための、および免疫のより長い持続を提供し、それにより必要とされる抗原の投与量を時間を通じて少量に、または少ない頻度とする、および副作用および毒性に関する潜在性を減らすための該組み合わせを含むワクチンを提供することである。
【００２１】
さらなる対象は、鳥類または哺乳動物種における抗原の免疫学的活性を強化、増進、または拡張する新規方法を提供することである。
本発明のさらなる目的および対象は、明細書の記載を読めば、明らかとなろう。
前記対象は、免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントの組み合わせ、および免疫モジュレーターが免疫アジュバントおよびウイルス、細菌、寄生虫または真菌抗原と同時処方されるワクチンを提供することにより達成される。本発明の製品により、これまでのワクチン、およびサイトカインそのものを含む他の組み合わせと比較して、抗原に対する高度に改良された免疫学的反応が得られる。本発明の背景およびその当該分野における技術水準を超える点を、さらに以下に記載する。
【００２２】
発明の簡単な概要
本発明は、有効免疫化量の抗原、免疫モジュレーター、および１つまたはそれ以上の免疫アジュバントを含む改良されたワクチン製剤であって、ワクチンの免疫原性または生理学的有効性が有意に高められたワクチン製剤に関する。本発明は、ワクチン化された宿主の抗原に対する免疫学的反応を顕著に改善する、免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントを含む新規組み合わせ組成物を含む。また、本発明は、鳥類または哺乳動物種に、薬理学的有効量の前記組み合わせ組成物または有効免疫化量の前記ワクチン組成物を投与することを含む、弱い、免疫抑制性の、または安全性が限界にある抗原の免疫原性を強化、増進、または拡張する新規方法に関する。
【００２３】
図面の簡単な記載
適用なし
発明の詳細な説明
本発明に従い、新規ワクチン組成物は、有効免疫化量の抗原、免疫モジュレーター、１つまたはそれ以上の免疫アジュバント、および医薬上許容されるキャリアを含む。驚くべきことに、ワクチンへの免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントの組込みにより、抗原性物質の免疫原性および生理学的有効性が有意に強化される。免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントのユニークな組み合わせは、多くの抗原の生物学的活性を増すのに有用な適用を有する。
【００２４】
抗原は、医薬または獣医学分野の当業者により意図される広範な種々の感染因子を含む。感染因子は、例えば、天然のウイルス、細菌、または真菌であってよい。他の感染因子には、制限されるものではないが、寄生虫、腫瘍抗原および他の病的疾患の抗原が含まれる。ワクチン組成物に用いられるべき特定の抗原または抗原の組み合わせは、ワクチン化される種および所望の結果に依存する。
【００２５】
抗原は、種々の量の免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントと共に組み込まれ、通常約０．０００１〜約１．０重量％の範囲である。典型的なウイルス抗原の例には、制限されるものではないが、ウシ呼吸シンシチウイルス、単純疱疹ウイルスタイプ１（ＨＳＶ）、ウシ下痢ウイルス（ＢＶＤ）、パラインフルエンザ−３ウイルス（ＰＩ）、イヌ パルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌ パラインフルエンザ ウイルス（ＣＰＩ）、イヌ アデノウイルス タイプＩＩ（ＣＡＶ−２）、イヌ アデノウイルス（ＣＤＶ）、イヌ コロナウイルス（ＣＣＶ）、狂犬病ウイルス（特に、制限するものではなく、イヌ狂犬病ウイルス）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネココロナウイルス（ネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）の病原因子）、ブタ生殖器および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、ニワトリヘルペスウイルス（マレック病の病原因子）などが含まれる。典型的な細菌抗原には、制限されるものではないが、クラミジア、エーリキア(Ehrlichia)、パスツレラ(Pasteurella)、ヘモフィラス(Haemophilus)、サルモネラ(Salmonella)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ボレリア(Borrelia)、マイコプラズマ(Mycoplasma)（例えば、マイコプラズマ肺炎(Mycoplasma hyopneumoniae)のブタの疾患）などが含まれる。典型的な寄生虫抗原には、制限されるものではないが、レプトスピラ(Leptospira)、コクシジア(Coccidia)、ヘモスポリジア(Hemosporidia)、アモエビダ(Amoebida)、トリパノソーマ(Trypanosoma)、リーシュマニア(Leishmania)、ギアルジア(Giardia)、ヒストモナス(Histomonas)などが含まれる。典型的な真菌抗原には、制限されるものではないが、コクシジオイデス(Coccidioides)、ヒストプラズマ(Histoplasma)、ブラストマイセス(Blastomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、クリプトコッカス(Cryptococcus)などが含まれる。
【００２６】
免疫モジュレーターは、改良された本発明のワクチン中種々の量で存在し、通常約０．００００１から約０．０１重量％の範囲である。適当な免疫モジュレーターの例には、制限されるものではないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２などのサイトカイン、α−インターフェロンまたはγ−インターフェロンなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子、形質転換増殖因子、コロニー刺激因子など、またはそれらの組み合わせが含まれる。望ましくは、免疫モジュレーターはサイトカインを含む。好ましい具体例では、免疫モジュレーターはインターロイキン−１２であり、および最も好ましくは、相同の動物インターロイキン−１２、例えばイヌのＩＬ−１２をイヌワクチンに用いる。ネコＩＬ−１２をネコワクチンに用いる。ウマＩＬ−１２をウマワクチンに用いる。以下同様。免疫強化効果はいくつかの動物ワクチンにおいて相同動物ＩＬ−１２ほど大きくない可能性があるが、組換えヒトＩＬ−１２（Genetics Institute, Inc., Cambridge, MAから市場入手可能である）または組換えネズミＩＬ−１２（種々の供給者、例えばResearch Diagnostics, Inc., Flanders, NJ およびCambridge Bioscience, Cambridge, Englandから市場入手可能である；また、D. Schoenhaut et al., 「ネズミＩＬ−１２のクローニングおよび発現」 J. Immunology 248(1): ３４３３−３４４０（June 1, 1992)を参照されたい）などを、種々の動物に適当に用いてよい。
【００２７】
１つまたはそれ以上の免疫アジュバントが改良された本発明のワクチンに種々の量で存在し、通常約０．０５〜約５０重量％の範囲である。適当な免疫アジュバントの例には、制限されるものではないが、スクアレン（2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル−2,6,10,14,16,18,22-テトラコサヘキサエン）または好ましくはスクアラン(2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-テトラコサン）などの植物または動物起源の代謝可能なオイル；ブロックコポリマー、例えば、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、プルロニック（登録商標）（BASFコーポレーション、Mount Olive, NJより市場入手可能）；Quil A(Quillaja サポナリアの精製形態の市販名称、Iscotec AB, Sweden and Superfos BIosector a/s, Vedbeak, Denmarkより入手可能である）；エチレン／マレイン酸コポリマー、EMA-31(登録商標）など（約75,000〜100,000の推定平均分子量を有する、およそ等量のエチレンおよび無水マレイン酸を有する鎖状エチレン／無水マレイン酸コポリマー；Monsanto Co., St Louis, MOより市場入手可能である）；アクリル酸コポリマー；アクリル酸コポリマーエマルジョン、Neocryl(登録商標）など（スチレンと混合されるアクリル酸およびメタクリル酸の非癒着性水性アクリル酸コポリマー、Polyvinyl Chemicals, Inc., Wilmington, MAより市場入手可能である）；鉱物オイルエマルジョン、ＭＶＰ（登録商標）など（軽鉱物油のオイル−イン−ウォーターエマルジョン、Modern Veterinary Products, Omaha, NEより市場入手可能である）またはその混合物が含まれる。
【００２８】
本発明の好ましいポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーには、種々の量のポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンが含まれる。望ましくは、ブロックコポリマーには、トータル分子量の約１０−２０％の量のポリオキシエチレン、および約３２５０〜４０００の平均分子量のポリオキシプロピレンが含まれる。
本発明のエチレン／マレイン酸コポリマーは、典型的には、以下の特性を有する、水溶性、白色の流動性の粉末である：約１．５４ｇ/ｍＬの真の密度、約１７０℃の軟化点、約２３５℃の融点、約２７４℃の分解温度、約２０ｌｂｓ／ｆｔ３の容積密度、および約２．３のｐＨ（１％溶液）。
【００２９】
本発明の好ましいアクリル酸コポリマーエマルジョンは、７．５のｐＨ、１００ｅｐｓの粘度（Brookfield, ２５℃）、４０重量％の固体を含んで供給された場合に、ガロン当たり８．６ポンドの重量、３８体積％の固体、および４８の酸の数を有する水性アクリル酸コポリマーを含むNeocryl(登録商標)A640である。詳細には、Necryl(登録商標)A640は、スチレンと混合したアクリル酸とメタクリル酸の非癒着性水性アクリル酸コポリマーのラテックスエマルジョンである。他の有用な製品には、制限されるものではないが、Neocryl(登録商標)A520およびA625などが含まれる。
【００３０】
免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントの好ましい組み合わせは、相同動物ＩＬ−１２、スクアラン、およびポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーの混合物；相同動物ＩＬ−１２およびサポニンの混合物；および相同動物ＩＬ−１２、ＥＭＡ−３１（登録商標）およびNeocryl(登録商標)A640の混合物、必要に応じて鉱油エマルジョンを含む。部分的な免疫保護効果しか顕在化されない可能性があるが、組換えヒトまたはネズミＩＬ−１２を相同動物ＩＬ−１２に置き換えてもよい。これらの所定の条件下で、効力または効能は、通常の試験により容易に決定することができ、活性成分の投与量は、必要に応じて患者または動物において適当に滴定することができる。
【００３１】
医薬上許容されるキャリアが、種々の量で本発明のワクチン組成物に存在していてもよい。無毒の、不活性キャリアの量は当然、他の活性成分に関して選択される量、活性抗原性物質の所望の濃度、バイアル、注射器、または他の常套のビヒクルのサイズの選択などに依存する。キャリアはいずれかの簡便な時点でワクチンに添加することができる。凍結乾燥ワクチンの場合、キャリアは、例えば投与直前に添加することができる。別法として、最終生成物をキャリアを用いて作製することができる。適当なキャリアの例には、制限されるものではないが、滅菌水、塩水、バッファー、リン酸緩衝塩水、緩衝化塩化ナトリウム、植物油、最少必須培地(MEM)、ＨＥＰＥＳバッファーを含むＭＥＭなどが含まれる。
【００３２】
任意に、組成物は、アジュバントおよび所望の結果によって、種々の量の常套の、二次アジュバントを含んでよい。通常の量は、他の成分および所望の効果によって、約０．０２重量％〜約２０重量％の範囲であり、約１μｇ〜約５０μｇを提供する。適当な二次アジュバントの例には、制限されるものではないが、安定剤；乳化剤；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；水酸化ナトリウム、塩酸などのｐＨ調整剤；トウィーン（登録商標）８０（Sigma Chemical Col., St. Louis, MOより市場入手可能なポリソルベート８０）などの界面活性剤；リポソーム;イスコム(iscom)アジュバント;ムラミルジペプチドなどの合成グリコペプチド;デキストラン、またはデキストランの、例えばリン酸アルミニウムとの組み合わせなどの増量剤；カルボキシポリメチレン；マイコバクテリア細胞壁抽出物などの細菌細胞壁；コリネバクテリウム パルバム(Corynebacterium parvum)などのその誘導体;プロピオニバクテリウム アクネ(Propionibacterium acne);例えばウシカルメード ゲルン(Bovine Calmede Guern)(ＢＣＧ）などのマイコバクテリウム ボビス(Mycobacterium bovis)；ワクシニア、または動物ポックスウイルスタンパク質;オルビウイルスなどのサブウイルス粒子アジュバント;コレラ毒;Ｎ−Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン（アブリジン）;モノホスホリル脂質Ａ;ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡ、Kodak, Rochester, NYより市場入手可能）;合成物およびその混合物が含まれる。望ましくは、水酸化アルミニウムを他の二次アジュバントまたは免疫アジュバント、Quil Aなどと混合する。適当な安定剤には、制限するものではないが、スクロース、ゼラチン、ペプトン、消化されたタンパク質抽出物、ＮＺ−アミンまたはＮＺ−アミンＡＳなどが含まれる。乳化剤の例には、制限するものではないが、注射可能なまたは鼻腔内ワクチンに有用な、鉱油、植物油、ピーナッツオイルおよび他の標準的な、代謝可能な、無毒のオイルが含まれる。
【００３３】
本発明の目的に関して、これらのアジュバントは、本明細書中、前記免疫アジュバント（これは抗原性物質に対する哺乳動物または鳥類の体液性免疫反応を有意に増すための免疫モジュレーターと組み合わせて、その効果に関してワクチン中の必須成分である）と対照させるためにのみ「二次」として、本明細書中に指定される。二次アジュバントは、所定のアジュバントはある程度まで免疫学的増強特性を有し、そして二重の目的を有するが、ワクチン製剤中、プロセシング補助として主に含まれる。
【００３４】
必要に応じて、常套の保存剤を約０．０００１重量％〜約０．１重量％の範囲の有効量でワクチンに添加することができる。製剤に用いられる保存剤によって、この範囲未満またはこれを超える量を用いてよい。典型的な保存剤には、例えば、カリウムソルベート、ナトリウムメタビスルファイト、フェノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、チメロサールなどが含まれる。
【００３５】
不活性化された、変更された、または他のタイプのワクチンの選択、および本発明の改良されたワクチン製剤の調製法は、当該分野の専門家により公知であるか、または容易に決定される。不活性化ワクチンの調製のための説明として、例えば、免疫モジュレーター、好ましくは相同動物ＩＬ−１２を１種またはそれ以上の抗原、１種またはそれ以上の免疫アジュバント、および任意に１種またはそれ以上の二次アジュバントと混合する。抗原は、不活性化されたＦＩＶ、ＦｅＬＶ、イー．カニス(E. canis)、ＣＣＶ、レプトスピラ種(Leptospira species)などであってよい。さらなる説明として、免疫モジュレーター、好ましくは相同動物ＩＬ−１２を抗原と、免疫アジュバントまたは二次アジュバントの存在または不在下に混合して、変更ワクチンを調製する。この場合の抗原は、ＢＲＳＶ、エス．エキ(S.equi)、ＣＰＶ、ＣＡＶ−２、ＣＤＶ、ＣＰＩなどであってよい。しかし、本発明のワクチンは、処方分野における当業者に周知の様々な標準的方法により作製し得、本明細書中に記載する説明によっては制限されない。
【００３６】
免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントを含む組み合わせは、別個の製品として調製および投与してよい。この免疫原性増強組成物の薬理学的に有効な量を、例えば、非経口、経口その他にて哺乳動物または鳥類に、抗原の免疫原性を強化、増強、または拡張するために、弱い、免疫抑制性の、またはわずかに安全な抗原の投与前、投与と同時に、または投与に続いて、または投与直後に投与してよい。典型的には、免疫原性増強組成物は、ワクチン化工程の開始前２４時間以内に、および好ましくはワクチン化前４時間以内、またはワクチン化と同時に投与する。ワクチン化が１以上の投与量の抗原性物質を必要とする場合、免疫原性増強組成物は、ワクチンの投与と連続様式で投与してよい。有効性は少ないが、免疫原性増強組成物をワクチン後に投与して、抗原に対する免疫性をブーストしてよいが、２４時間はめったに越えない。
【００３７】
ワクチンとは別個に与えられる場合、組み合わせは、医薬上許容されるキャリア、および任意に本明細書中に記載する二次アジュバントをさらに含んでよい。免疫モジュレーターおよび免疫アジュバントの両方が様々な量で、典型的には単位投与容器中に存在していてよい。組み合わせの投与量は、抗原、種、ワクチン化された、またはワクチン化されるべき宿主の体重などの依存し、免疫モジュレーターの薬理学的有効量の投与量は、通常、投与量当たり約０．１μｇ〜約１００μｇ、好ましくは投与量当たり約５μｇから約５０μｇの範囲である。免疫アジュバントは、典型的には、投与量当たり約１μｇから約２５μｇの範囲である。組み合わせ中の特定の免疫アジュバントの存在および量は、免疫反応を改善するのに必要な免疫モジュレーターの量に影響するが、特定の環境に適合させるための常套の試験により、主治医が、免疫モジュレーターの有効投与量を容易に調整することが期待される。
【００３８】
相同動物ＩＬ−１２を用いる場合、ワクチン中の免疫モジュレーターの量は、その効能のために有意に低下し得る。イヌ、ネコ、などの小動物のためには、投与量当たり約０．０２μｇ〜約２μｇの範囲の相同動物ＩＬ−１２が典型的に用いられ、投与量当たり約０．１μｇ〜約１μｇの範囲の動物ＩＬ−１２が好ましくは用いられ、および投与量当たり約０．５μｇがより好ましく、本発明の組み合わせ組成物に用いられる。ウマ、ウシ、ブタなどの巨大動物のためには、投与量当たり約０．１μｇ〜約５μｇの範囲の動物ＩＬ−１２が典型的に用いられ、投与量当たり約０．５μｇ〜約２．５μｇが好ましくは用いられる。これらの所定の範囲未満およびこれを超す量が、より小さな鳥類および極端に大きな動物においてそれぞれ用いられてよい。生物学的活性を保持するために、動物ＩＬ−１２をワクチンまたは単位投与製剤に、使用直前に添加することも推奨される。
【００３９】
無制限の例として、適当なイヌワクチンは、イー．カニスのエボニー株を１×１０５ＴＣＩＤ５０の濃度にて、ビー．バーグドロフェリ(B. burgdorferi) ＩＰＳを５×Ｅ７の濃度／投与量にて、ビー．バークドロフェリＢ−３１を５×Ｅ８の濃度／投与量にて、５％ｖ／ｖのエマルジゲンＳＡ、１％ｖ／ｖのＥＭＡ−３１（登録商標）、３％ｖ／ｖのNeocryl(登録商標)A640、１：２０，０００濃度のチメロサール（５％）、適量の１×ＭＥＭ希釈剤、および約０．５μｇの投与量当たりの濃度のイヌＩＬ−１２、または投与量当たり約１０μｇの濃度のヒトＩＬ−１２を含んでよい。
【００４０】
本発明はさらに、弱い、免疫抑制性の、または安全性が限界の抗原の免疫原性を強化、増強、または拡張するための新規方法であって、鳥類または哺乳動物種に、薬理学的有効量の免疫原性増強組成物または有効ワクチン化量もしくは免疫化量の本明細書中に記載するワクチン製剤を投与することを含む方法をさらに包含する。弱い、免疫抑制性の、または安全性が限界にある抗原の免疫原性を強化することには、抗原の効能を改善することが含まれる。免疫原性を増強することは、活性の発生を加速することを意味する。免疫原性を拡張することは、活性の持続を延長することを意味する。
【００４１】
一般的な習慣として、本発明のワクチンは、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、または腹腔内）、口内、鼻内、経皮、または経口にて簡便に投与する。本発明により意図される投与の経路は、抗原性物質および同時処方物に依存する。例えば、ワクチンがサポニンを含む場合、経口または鼻内にて無毒であっても、サポゲニングリコシドは強い溶血物質として機能するので、それらが血流に入らないように注意しなければならない。さらに、多くの抗原は経口にて摂取する場合、有効でない。好ましくは、ワクチンは皮下、粘膜内、またはエス．エキその他の場合、鼻内に投与する。
【００４２】
ワクチンの投与量は、選択される抗原、投与経路、種、体重、および他の標準的なファクターに依存する。当該分野の専門家が、各抗原に関する免疫原性反応に適した投与量を簡単かつ容易に滴定して、有効な免疫化量および投与法を達成することができることが予想される。
【００４３】
都合よくは、抗原および免疫モジュレーター、サイトカイン、好ましくは相同動物ＩＬ−１２を、ワクチン製剤において免疫アジュバントと組み合わせて用いることにより、改良されたワクチンは高度に免疫原性となり、従来達成されているものよりも、より強いＴ記憶細胞の刺激が誘発される。本発明の製剤でのワクチン化後の抗原性物質に対する血清抗体力価は、免疫モジュレーターの不在下での同じ製剤により誘導される力価よりももっと高い。例えば、これまでの研究により、スクアランおよびポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーの混合物を添加したＢＲＳＶでのワクチン化後１４日でのＢＲＳＶに対する血清抗体力価は、約１：１２５であった。驚くべきことに、スクアラン、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーおよび組換えヒトＩＬ−１２と混合したＢＲＳＶでのワクチン化後１４日でのＢＲＳＶに対する血清抗体力価は、約１：３９５にて明らかにより高く、２８日後では約１：３６６にてさらに顕著により高い。驚くべく高められた免疫原性、活性の加速した発生、および免疫性の持続の延長が、高められた血清抗体力価（即ち、体液性免疫反応）およびＴ記憶細胞のより強い刺激により示される。この選択的発明のワクチンの効率における実質上の改良は、当該分野の水準から十分な進歩性を有する。
【００４４】
本明細書中に用いられる、「ＣＦＵ」は、コロニー形成ユニットを表す。ＢＲＳＶの「感染ユニット」は、例えば、ＴＣＩＤ５０として規定される。「ＴＣＩＤ５０」または５０％組織培養感染投与量は、組織培養物の５０％を感染する投与量として規定される。例えば、抗原を含んでいる溶液が１：１００に希釈される場合、１感染ユニットは、組織培養物の５０％に影響を及ぼす量に等しい。ＢＲＳＶの場合、ＴＣＩＤ５０は、組織培養細胞の５０％を感染させるのにまたは死滅されるのに必要とされるウイルスの量である。「細胞媒介性免疫化」なる用語には、Ｔ−ヘルパー細胞、Ｔ−キラー細胞、およびＴ−遅延型過敏性細胞の刺激、ならびにマクロファージ、単球、および他のリンホカインおよびインターフェロン産生の刺激が含まれる。細胞媒介性免疫の存在は、常套のインビボおよびインビトロアッセイにより決定することができる。分泌性ＩｇＡなどの局所免疫は、１〜２またはそれ以上の血清中和抗体力価を示す常套のＥＬＩＳＡまたはＩＦＡアッセイにより決定することができる。本発明に従い誘発される細胞媒介性または局所免疫性は、抗原に特異的であり、または抗原に直接関連する。「哺乳動物」なる用語は、ヒト、畜牛、乳牛、ヒツジ、シカ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコなどを意味する。「鳥類」なる用語は、チキンまたは七面鳥などの家禽、他のタイプの家畜化された鳥類または野鳥を意味する。動物における種々の使用が好ましいが、本明細書中に記載する免疫原性増強およびワクチン組成物は、医薬上の使用に有益に用いられてよいことが予想される。
【００４５】
本発明のさらなる理解は、以下の無制限の例から得ることができる。しかし、例は、本発明の所定の態様の説明のためにのみ記載し、それに関する制限としては解釈されるべきでない。実施例は、疾患および本発明の範囲に関して、完全に規定するものではないことが理解されるべきである。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間など）を与えた場合、特定した範囲を超すおよびそれ未満両方の条件を、一般には簡便さを欠くけれども、用いることもできる。以下の実験研究は、Wyeth, Madison, NJの完全な子会社、Genetics, Institute, Inc., Cambridge, MAから得られる組換えヒトＩＬ−１２を用いる。他が示されない限り、実施例は室温（約２３℃〜約２８℃）にて、および大気圧にて行い、本明細書中に記載する全部およびパーセントは、重量によるものであり、全温度は摂氏度にて示す。
【００４６】
実施例１
ウマワクチンの免疫原性におけるアジュバントの効果
ストレプトコッカス エキの不活性化ワクチンの免疫原性における所定のアジュバントの効果を決定するための試験を行う。アジュバントを調製するために、組換えヒトＩＬ−１２（４．４５ｍｇ／ｍＬ）、サポニン、変更された生きたワクチンに関する安定剤（ＳＧＧＫ−３、２５％ｖ／ｖ）および細菌増殖培地（Modified Todd Hewitt Broth, MTHB）のストック溶液を用いる。３つのアジュバントブレンドを、投与量当たり約１０μｇのＩＬ−１２、投与量当たり５０μｇのＩＬ−１２、および投与量当たり１０μｇのＩＬ−１２＋５ｍｇのサポニンに関して作製する。
【００４７】
投与量当たり約１０μｇのＩＬ−１２を含むアジュバントブレンドを調製するために、再水和希釈液を、約０．０５６ｍＬのＩＬ−１２を、トータル５０ｍＬまで約４９．７１９ｍＬの十分量の水に添加することにより作製する。調整希釈液を次いで、約０．０５６ｍＬのＩＬ−１２を、３７．４４４ｍＬのＭＴＨＢと混合した約１２．５ｍＬのＳＧＧＫ−３（２５％ ｖ／ｖ）に添加することにより作製する。
【００４８】
投与量当たり約５０μｇのＩＬ−１２を含むアジュバントブレンドを調製するために、再水和希釈液を、約０．２８１ｍＬのＩＬ−１２を、トータル５０ｍＬまで約４９．７１９ｍＬの十分量の水に添加することにより作製する。調整希釈液を次いで、約０．２８１ｍＬのＩＬ−１２を、３７．２１９ｍＬのＭＴＨＢと混合した約１２．５ｍＬのＳＧＧＫ−３（２５％ ｖ／ｖ）に添加することにより作製する。
【００４９】
投与量当たり約１０μｇのＩＬ−１２＋５ｍｇのサポニンを含むアジュバントブレンドを調製するために、再水和希釈液を、約０．０５６ｍＬのＩＬ−１２を約０．６２５ｍＬのサポニンへと、および該混合物をトータル５０ｍＬまで、約４９．３１９ｍＬの十分量の水に添加することにより作製する。調整希釈液を次いで、約０．０５６ｍＬのＩＬ−１２を約０．６２５ｍＬのサポニンへと添加し、次いで該混合物を３７．８１９ｍＬのＭＴＨＢと混合した約１２．５ｍＬのＳＧＧＫ−３（２５％ ｖ／ｖ）に添加することにより作製する。
【００５０】
各ワクチンの調製に関して、１バイアルのピナクル（登録商標）Ｉ．Ｎ．（Wyeth, Madison, NJの獣医学部門、Fort Dodge Animal Health, Inc.,より市場入手可能な鼻腔内ウマストラングルワクチン）を、約２．５ｍＬの再水和希釈剤で再水和する。１０投与量のワクチンを各群に関して調製する（約２０ｍＬのワクチン）。ワクチンを再水和した後、約０．４６７ｍＬの再水和ワクチンを約１９．５３３ｍＬの調整希釈剤に添加し、投与量当たり約１×１０７ＣＦＵの量を得る。
【００５１】
試験ワクチンに供する全ウマを２回、３週間間隔でワクチン化する。ワクチンを、約５．５インチの長さのカテーテルへ連結した注射器で鼻腔内投与する。最初のワクチン化を左の鼻孔へと投与し、第二の投与は右の鼻孔へと投与する。対照群のウマの全てを市場入手可能なストレプトコッカス エキワクチン（Stepguard（登録商標）とHavlogen(登録商標）、Bayer Corporationの農業部門であるBayer Animal Health, Inc.により製造された、カルボキシポリメチレンから成るアジュバント）でワクチン化し、３週間間隔で２回のワクチン化を受ける。市場入手可能なワクチンを、製造業者の指示に従い筋肉内投与する。
【００５２】
５頭のウマはワクチン化せず、そしてその代わりに、１ｍＬ（約５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）のエス.エキＣＦ−３２株を各鼻孔へと接触攻撃の５日前に接種する。約５．５インチの長さのカテーテルを備えた注射器を用いてウマを接種する。５頭のウマを、臨床徴候および直腸温度に関して、攻撃２日前から攻撃５日後まで毎日観察する。鼻から採取した分泌物を攻撃後に毎日回収し、エス.エキのシェディングをモニターする。二次ワクチン化の２１日後、全てのワクチン化されたウマを５頭の直接攻撃したウマと混ぜる。攻撃後日数（ＤＰＣ）−２日から０日まで毎日観察してベースラインを確立し、ＤＰＣ１〜２８日まで、種々の臨床徴候に関して観察する。動物をさらに、３０、３３、および３６ＤＰＣに観察する。
【００５３】
以下の表１は、アジュバントＩＬ−１２（約５０μｇＩＬ−１２／投与量）およびＩＬ−１のサポニンとの組み合わせが、平均的な臨床スコア、局所リンパ節の膿瘍、エス.エキのシェディング、および散在性の膿瘍の発生により立証されるように、本試験に用いられるアジュバントの残りと比較して相対的に良好な免疫モジュレーターであることを示す。これらの２群におけるウマは、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２とサポニンの組み合わせを含まない市販のワクチンを受けた群と比較して、散在膿瘍の発症に関して約３５％〜約４０％の低下を示し、平均臨床スコアに関して約２３％〜約４０％の低下を示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
実施例２
ウシワクチンの免疫原性におけるアジュバントの効果
ＢＲＳＶ（ウシ呼吸シンシチウイルス）の変更生ワクチンの免疫原性における所定のアジュバントの効果を決定する。アジュバントを調製するために、ＳＰオイルアジュバント（５％ｖ／ｖ）および組換えヒトＩＬ−１２（ｍＬ当たり約１,２６０μｇ）のストック溶液を用いる。
【００５６】
ＳＰオイルは、２０ｍＬのPluronic(登録商標)L121(BASF Corporation, Mount Olive, NJより市場入手可能なポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー）、４０ｍＬのスクアラン、３．２ｍＬのポリソルベート８０、および９３６．８ｍＬの緩衝化塩溶液を混合し、次いで安定な塊またはエマルジョンが形成されるまで混合物をホモジェナイズすることにより調製する。ホモジェネーションの前に、成分または混合物はオートクレーブする。エマルジョンをさらに濾過により滅菌する。ホルマリンおよびチメロサールを０．２％の最終濃度および１：１０,０００の希釈へとそれぞれ添加する。
【００５７】
投与当たり約５％ｖ／ｖのＳＰオイル＋約１０μｇのＩＬ−１２を含むアジュバントブレンドを、約０．２７８ｍＬのＩＬ−１２を約６９．７２２ｍＬの５％ｖ／ｖＳＰオイルへと添加することにより作製し、約７０ｍＬの、約５％ｖ／ｖＳＰオイル＋約１０μｇ／ＩＬ−１２アジュバント投与量を作製する。
【００５８】
ワクチンの調製に関して、ＢＲＳＶをＭＤＢＫ細胞（Madin-Darbyウシ腎臓細胞；ＭＤＢＫ細胞株は、正常な成人去勢ウシの腎臓由来である）にて増殖させ、次いで接種の６日後に回収する。ワクチンの塊を投与当たり約１０５．７ＴＣＩＤ５０のＢＲＳＶタイターにてＭＥＭとブレンドし、次いで凍結乾燥する。凍結乾燥したワクチン塊を次いで、前記のＩＬ−１２含有アジュバント希釈液で再水和し、最終ワクチン調製物を作製する。
【００５９】
約６月齢の９頭のウシをＢＲＳＶワクチンにて皮下にワクチン化し、７頭のウシを対照群とした。血清抗体反応をＢＲＳＶに対する特異的抗体を検出することにより測定する。ワクチンの効能は、ワクチン群および対照群を、毒性のＢＲＳＶにてワクチン化の２８日後に攻撃することにより立証する。
【００６０】
ＳＰオイル＋ＩＬ−１２を添加した変更生ＢＲＳＶワクチンにより、ＢＲＳＶに対する非常に高力価の抗体反応（ワクチン化２８日後にて約１：３６６）が誘導された。毒性ＢＲＳＶ攻撃後、疾患の重篤度は対照群と比較してワクチン化群にて低下する（約５３％の低下）。これにより、本試験に用いたＳＰオイル＋ＩＬ−１２アジュバントが、ＢＲＳＶ変更ウイルスワクチンと適合性があり、ＢＲＳＶ変更ウイルスワクチンの効能を有意に高めることができることを示す。
【００６１】
以下の表２は、変更生ＢＲＳＶおよびＩＬ−１２含有アジュバントでワクチン化したウシの、ＢＲＳＶに対する抗体反応を示す。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
以下の表３は、毒性ＢＲＳＶ攻撃後にアジュバントを含んでいる変更生ＢＲＳＶおよびＩＬ−１２でワクチン化したウシの疾患の減少を示す。
【００６４】
【表３】
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【００６５】
実施例３
イヌのワクチンの効能におけるアジュバントの効果
エーリキア カニスの単価ワクチン、死滅細菌ワクチンの免疫原性における所定のアジュバントの効果を決定するための試験を行う。アジュバントを調製するために、組換えヒトＩＬ−１２（４．４５ｍｇ/ｍＬ）、ＥＭＡ-３１（登録商標）（およそ等量のエチレンおよび無水マレイン酸を有する、約７５,０００〜１００,０００の推定平均分子量を有する、Monsanto Co., St. Louis, MOから市場入手可能な、１％ｖ／ｖの鎖状エチレン/無水マレイン酸コポリマー）およびNeocryl(登録商標)A640(３％ｖ／ｖ、７．５のｐＨ、１００ｅｐｓの粘度（Brookfield, 25℃）、４０重量％の固体を含んで供給された場合に８.６パウンドのガロン当たりの重量、３８体積％の固体、および４８の酸の数を有する、Polyvinyl Chemicals, Inc., Wilmington, MAから市場入手可能な、スチレンと混合したアクリル酸およびマレイン酸の非癒着性水性アクリル酸コポリマーのラテックスエマルジョン）を用いる。ＩＬ−１２のワーキング溶液を、マグネシウムおよびカルシウムを含まないリン酸緩衝塩水を含む希釈バッファーに調製する。４５μＬのＩＬ−１２ストック溶液を９．９５５μＬの希釈バッファーに添加する。希釈したＩＬ−１２ワーキング溶液の最終濃度は、２０μｇ／ｍＬである。
【００６６】
ワクチンの調製のために、約１×１０４または１×１０５ＴＣＩＤ５０のイー.カニスの不活性化したエボニー株を、１％ｖ／ｖのＥＭＡ−３１（登録商標）および３％ｖ／ｖのNeocryl(登録商標)とブレンドする。２パーセントのチメロサールをワクチンへ、約１：２０,０００のレベルにて保存剤として添加する。投与量当たり５００μＬの量の希釈したＩＬ−１２ワーキング溶液を、注射の前にワクチンと混合する。以下の表４に示す群４のためのワクチンは、１００μｇ／投与量のウシ カルメード ゲルン(Bovine Calmede Guern)（ＢＣＧ）細菌ワクチンとブレンドする。
【００６７】
３５匹のイヌを、４つのワクチン化群および２つの対照群を含む６つの群へ無作為に分ける。ワクチン化群は、２つの抗原レベルにて、イー.カニスワクチンの単価エボニー株でワクチン化する。以下の表４に示すように、群２は、約１×１０４ＴＣＩＤ５０の抗原レベルでワクチン化し、残りは約１×１０５ＴＣＩＤ５０の抗原レベルでワクチン化する。群２、３、および５は、投与量当たり１０μｇのＩＬ−１２とブレンドしたワクチンでワクチン化する。群４は、アジュバントとしてＢＣＧを含んでいるワクチンでワクチン化する。２投与の各ワクチンを２０週齢および２３週齢にてそれぞれ投与する。交差保護の可能性を立証するために、群５および６は、イー.カニスのブロードフォード株で異種攻撃し、他は、イー.カニスのエボニー株で同種攻撃する。
【００６８】
以下の表４に示すように、群３における５匹のイヌのうちの２匹（４０％）および群４の６匹のイヌのうちの２匹（３３％）は、ワクチンをイー.カニスのエボニー株と同種攻撃する場合に、血小板減少を示さない。対照の１００パーセント（群１）および低投与量のワクチンでワクチン化したイヌ（群２）は、試験が終わるまでに重篤な血小板減少を示す。死亡に関して、６匹の対照のうちの５匹（８３％）が、観察期間中に死亡または安楽死する。低投与量ワクチンを添加したＩＬ−１２でワクチン化したイヌ（群２）およびＢＣＧを添加したワクチンでワクチン化したイヌ（群４）は、３３％の死亡率を有する。罹患率および死亡率のデータに基き、ＩＬ−１２を添加したイー.カニスワクチンは、同種イー.カニス攻撃に対して有意に高まった保護免疫性を有する。
【００６９】
対照と比較して、ＩＬ−１２のＥＭＡ−３１（登録商標）およびNeocryl(登録商標)との組み合わせの添加により、イー.カニス単価ワクチンの効能が大いに増し、死亡率が有意に低下する。群２および３に示すように、ＩＬ−１２の組み合わせにより誘導される保護は、抗原投与量依存性である。さらに、ＢＣＧと比較して、ＩＬ−１２の組み合わせにより誘導されるアジュバント反応は、ワクチン化されたイヌのイー.カニスの致命的な攻撃からの減少に重要な役割を果たす。
以下の表４は、組換えヒトＩＬ−１２を添加した単価イー.カニスワクチンの前免疫原性試験の結果を示す。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
実施例４
イヌワクチンに対する体液性免疫反応の評価
カニン ドゥラム(Canine Duramune)(登録商標)１０ワクチンの変更生ウイルスおよび死滅ウイルスおよび死滅細菌ワクチン（凍結乾燥した生きた弱毒化されたイヌのパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌのパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）、イヌのアデノウイルスタイプＩＩ（ＣＡＶ−２）、イヌのアデノウイルス（ＣＤＶ）、およびイヌのコロナウイルス（ＣＣＶ）、レプトスピラ イクテロヘモラジエ(Leptospira icterohemorrhagiae)（ＬＩ）、レプトスピラ カニコラ（ＬＣ）、レプトスピラ グリッポチフォサ(Leptospira grippotyphosa)(ＬＧ）およびレプトスピラ パモナ（ＬＰ）、死滅ウイルスおよび細菌ワクチンフラクションを含んでいる希釈物から成る、Wyeth, Madison, NJの獣医学部門、Fort Dodge Animal Health, Inc.から市場入手可能な）の免疫原性における所定のアジュバントの効果を決定するための試験を行う。アジュバントを調製するために、組換えヒトＩＬ−１２（４．４５ｍｇ／ｍＬ）、Duramune(登録商標)10免疫原性ワクチン、ＥＭＡ−３１（登録商標）、Neocryl(登録商標)A640およびチメロサールv/v)のストック溶液を用いる。
【００７２】
試験ワクチンの調製のために、最初のアジュバントを、Neocryl(登録商標)およびEMA-31(登録商標)を、それぞれ約３％および約１％の最終濃度へとブレンドすることにより調製する。チメロサールは、保存剤として約１：２０,０００の濃度にて添加する。
【００７３】
ＩＬ−１２添加希釈液を調製するために、Duramune(登録商標)10ワクチンの希釈部分をまず前記初期アジュバントと、約１：１０の割合でまずブレンドし、Duramune(登録商標)10希釈物の１部およびNeocryl(登録商標)およびEMA-31(登録商標)から成る初期アジュバントの９部とブレンドする。組換えヒトＩＬ−１２を次いで、投与当たり約１０μｇまたは４０μｇの最終濃度にて添加する。
【００７４】
使用前に、１部のDuramune(登録商標)10ワクチンの凍結乾燥部分を９部のＩＬ−１２アジュバント希釈液に再水和する。それゆえ、この試験に用いるDuramune(登録商標)10ワクチンのフラクションは、常套の免疫原性ワクチンよりも約１０倍少ない。言いかえれば、本試験で試験したワクチンは、市場での販売のために設計された正規のワクチンと比較して不十分な量の抗原（通常の効力より弱い）を含む。
【００７５】
トータル１５匹のイヌを、それぞれ５匹のイヌの３つの群に無作為に分け、次いで２回、１０週齢および１３週齢にて皮下にワクチン化する。第一群を約１０μｇのＩＬ−１２を含んでいるワクチンでワクチン化する。第二群を約４０μｇのＩＬ−１２を含んでいるワクチンでワクチン化する。第三群は、ＩＬ−１２を含まない１：１０基釈されたDuramune(登録商標)10プラシーボでワクチン化する。
【００７６】
イヌを血清に関してワクチン化後０日（０ＤＰＶ１）にておよびワクチン化２後０日（０ＤＰＶ２）、７、１４、２１、および２８ＤＰＶ２にて採血する。レプトスピラ菌に関する抗体力価を、微細凝集試験(MAT)により決定する。
【００７７】
結果を、以下の表５−８に詳細に示す。主な群とプラシーボの間の有意差が、ＬＰおよびＬＧフラクションに認められる。表５に示すＬＰフラクションに関しては、有意差が０ ＤＰＶ２（約１０μｇのＩＬ−１２でワクチン化した群）および２１ ＤＰＶ２（同群）にて観察される。表６に示すＬＧのフラクションに関しては、有意差は０ＤＰＶ２（約４０μｇのＩＬ−１２でワクチン化した群）、７、１４、および２１ＤＰＶ２（両１０および４０μｇ群）にて認められる。他の２つのフラクションにおいては有意差は全く認められない（表７および８）。それゆえ、ＥＭＡ−３１（登録商標）およびNeocryl(登録商標)の混合物へのＩＬ−１２の添加は、２つのレプトスピラ菌、ＬＰおよびＬＧに対する体液性免疫反応を高めることが示される。
【００７８】
【表５】
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【００７９】
【表６】
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【００８０】
【表７】
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【００８１】
【表８】
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【００８２】
実施例５
ネコワクチンの免疫原性におけるアジュバントの効果
組換えヒトＩＬ−１２がＦＩＶ−ＦｅＬ Ｖワクチンの免疫原性を高めることができるかどうかを決定するために、ＩＬ−１２を不活性化ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）と、投与量当たり５μｇにてEMA-31(登録商標)、Neocryl(登録商標)A 640およびMVP(登録商標）（Modern Veterinary Products, Omaha, NEより市場入手可能な軽鉱油のオイル−イン−ウォーターエマルジョン）をワクチンに添加した後にブレンドする。ワクチンの投与の攻撃経路は、腹腔内である。８週齢の２０匹のネコの１群を２回、ＦＩＶ−ＦｅＬＶワクチンにてワクチン化し、２０匹の年齢を一致させたネコの他の群を、ＩＬ−１２を追加した同じワクチンでワクチン化する。ワクチン化完了の３週後に、全ワクチン群を９匹の年齢を一致させた対照と共に、毒性ＦｅＬＶで攻撃する。攻撃したネコを１５週間、ウイルス血症に関して毎週モニターする。ＦｅＬＶウイルス血症に関して攻撃したネコをモニターするために、血清サンプルを毎週、ＦｅＬＶｐ２７抗原の存在に関して、IDEXX FeL V抗原試験キットを用いて試験する。攻撃暴露後３週〜１２週の間の３回の連続サンプリング時点でＦｅＬＶ ｐ２７を検出する場合、ネコはＦｅＬＶで持続的に感染したと考える。全９匹の対照が、ＦｅＬＶで持続的に感染していることが認められる。ＦＩＶ−ＦｅＬＶワクチンを受ける２０匹のワクチン化群の５匹が、ＦｅＬＶで持続的に感染することが認められるが、ＩＬ−１２を追加したＦＩＶ−ＦｅＬＶワクチンを受ける２０匹のワクチン化群の１匹しかＦｅＬＶで持続的に感染していないことが認められる。この結果により、ＥＭＡ−３１（登録商標）、Neocryl(登録商標)およびＭＶＰ（登録商標）と組み合わせてＩＬ−１２を用いて、ＦｅＬＶワクチンの免疫原性を高め得ることが示唆される。
【００８３】
前記において、制限するためでなく説明のために、本発明の特定の具体例の詳細な記載を示す。本開示に基き当業者に明らかな全ての他の変更、派生物、および均等物は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲内に含まれるものとする。
【国際調査報告】
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