(57)【要約】本発明は、脂肪酸合成、特に飽和および不飽和の脂肪の比に関連する核酸分子および核酸構築体ならびに他の剤に指向される。さらに、本発明は、該植物が飽和および不飽和の脂肪の改変した比を示すかかる剤を組み込む植物に指向される。特に、本発明は、植物が改変したレベルの飽和および不飽和脂肪酸を示すような剤を組み込む植物に指向される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
作動可能に連結した成分として、
（Ａ）植物細胞中で機能して、ｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすプロモーター；ならびに
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を含む組換え核酸分子。
【請求項２】
該プロモーターが種子特異的なプロモーターである請求項１記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
該プロモーターが７Ｓプロモーターである請求項２記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
該核酸配列が該プロモーターに対してセンス配向である請求項１記載の組換え核酸分子。
【請求項５】
該核酸配列が該プロモーターに対してアンチセンス配向である請求項１記載の組換え核酸分子。
【請求項６】
該核酸配列がｄｓＲＮＡを発現できる請求項１記載の組換え核酸分子。
【請求項７】
該核酸分子が、さらに、１以上のさらなる核酸配列を含み、ここに、該さらなる核酸配列が、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択される酵素をコード化する請求項１記載の組換え核酸分子。
【請求項８】
該さらなる核酸配列が、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶをコード化する請求項７記載の組換え核酸分子。
【請求項９】
該さらなる核酸配列が、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素をコード化する請求項７記載の組換え核酸分子。
【請求項１０】
ａ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１のコード領域に少なくとも７０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１のコード領域に少なくとも８０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１のコード領域に少なくとも９０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１のコード領域に少なくとも９５％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列よりなる群から選択されるゲノムポリヌクレオチド配列から得られたイントロン。
【請求項１１】
ａ）配列番号：１０の全長にわたって配列番号：１０のコード領域に少なくとも７０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号：１０の全長にわたって配列番号：１０のコード領域に少なくとも８０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号：１０の全長にわたって配列番号：１０のコード領域に少なくとも９０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号：１０の全長にわたって配列番号：１０のコード領域に少なくとも９５％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列よりなる群から選択されるゲノムポリヌクレオチド配列から得られたイントロン。
【請求項１２】
作動可能に連結した成分として、（Ａ）植物細胞中で機能して、ｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすプロモーター；ならびに（Ｂ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を含む組換え核酸分子を含む形質転換された大豆植物。
【請求項１３】
該形質転換された植物が、同様の遺伝的背景を持つが組換え核酸分子を欠く植物に対して、低下したパルミチン酸レベルを示す請求項１２記載の形質転換された植物。
【請求項１４】
該形質転換された植物が、同様の遺伝的背景を持つが組換え核酸分子を欠く植物に対して、低下したパルミチン酸レベルを持つ種子を生成する請求項１２記載の形質転換された植物。
【請求項１５】
該形質転換された植物が、同様の遺伝的背景を持つが組換え核酸分子を欠く植物に対して、低下したステアリン酸レベルを示す請求項１２記載の形質転換された植物。
【請求項１６】
該形質転換された植物が、同様の遺伝的背景を持つが組換え核酸分子を欠く植物に対して、低下したステアリン酸レベルを持つ種子を生成する請求項１２記載の形質転換された植物。
【請求項１７】
該形質転換された植物が、同様の遺伝的背景を持つが組換え核酸分子を欠く植物に対して、低下した飽和脂肪酸レベルを持つ種子を生成する請求項１２記載の形質転換された植物。
【請求項１８】
該形質転換された植物が、同様の遺伝的背景を持つが組換え核酸分子を欠く植物に対して、増加したオレイン酸レベルを示す請求項１２記載の形質転換された植物。
【請求項１９】
該形質転換された植物が、同様の遺伝的背景を持つが組換え核酸分子を欠く植物に対して、増加したオレイン酸レベルを持つ種子を生成する請求項１２記載の形質転換された植物。
【請求項２０】
（ａ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体、およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を持つ第１の核酸分子に作動可能に連結した第１のプロモーター、および（ｂ）ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択される酵素をコードする第２の核酸配列を持つ第２の核酸分子を含む核酸分子を有する形質転換された大豆植物。
【請求項２１】
該第１のプロモーターが種子特異的なプロモーターである請求項２０記載の形質転換された大豆植物。
【請求項２２】
該第１のプロモーターが７Ｓプロモーターである請求項２０記載の形質転換された大豆植物。
【請求項２３】
該第１の核酸分子が転写され、内因性ＦＡＴＢ遺伝子によりコードされた転写体のレベルを少なくとも部分的に低下できる請求項２０記載の形質転換された大豆植物。
【請求項２４】
５’から３’方向への転写における作動可能に関連した成分として、該宿主細胞中で機能する転写開始領域、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体、およびそのいずれかの断片よりなる群から選択されるＤＮＡ配列、および転写終止配列を含むＤＮＡ構築体で宿主細胞を形質転換させ、次いで、該ＤＮＡ配列の転写が開始される条件下で該細胞を増殖させ、それによって、該脂質組成を改変することを含むことを特徴とする宿主細胞中の脂質組成を改変する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、脂肪酸合成に関与する核酸分子および核酸構築体ならびに他の剤に指向される。さらに、本発明は、植物が改変した比の飽和および不飽和脂肪酸を示すような剤を組み込む植物に指向される。
【０００２】
背景
植物油（plant oil）は種々の適用に用いられる。生合成または天然の植物源からの新規な植物油組成物および油組成を得るための改良されたアプローチが必要とされている。意図された油使用に依存して、種々の異なる脂肪酸組成物が望ましい。植物、特に、植物種子中で大量の油を合成する植物種は、食用および産業用途の双方のための油の重要な源である。
【０００３】
多量のラウリル酸塩（Ｃ１２：０）を含有するココナッツ内乳およびパーム核油を除いて、一般的な食用油の全てが基本的に、、パルミチン酸塩（１６：０）、ステアリン酸塩（１８：０）、オレイン酸塩（１８：１）、リノール酸塩（１８：２）およびリノレン酸塩（１８：３）よりなる。多数の油料種子種は、高度に上昇したレベルの飽和脂肪酸を有する。ココナッツ油は、９０％を超える飽和脂肪酸、主にラウリン酸塩（１２：０）およびＣ６〜Ｃ１６の範囲にある他の中鎖脂肪酸を含む。他の高度に飽和した油は、（アシル鎖の約６０％までの）高パルミチン酸塩（１６：０）およびステアリン酸塩（１８：０）レベルを持つ油を含む。これらの油は、カカオ脂（２５％パルミチン酸塩；３４％ステアリン酸塩）および油ヤシ中果皮（４５％パルミチン酸塩；１５％ステアリン酸塩）から得るものを含む。大豆油は、典型的には、約１６〜２０％飽和脂肪酸：１３〜１６％パルミチン酸塩および３〜４％ステアリン酸塩を含有する。Voelkerら、５２ Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. ３３５−６１（２００１）。
【０００４】
多数の油適用について、飽和脂肪酸レベルは、好ましくは、６重量％未満、より好ましくは約２〜３重量％である。飽和脂肪酸は、望ましくない高融点および低温での濁りを有する。低い飽和脂肪酸レベルを含む油から創製された製品は、それらがより健全であると理解され、および／またはＦＤＡガイドラインに従い「飽和した脂肪がない」または「トランス脂肪がない」と標識され得るために、消費者および食品産業により好まれる。
低飽和脂肪酸レベルを持つ油は、改善した低温フロー特性を有し、それはバイオディーゼル（biodiesel）および潤滑性適用に重要であり、低温にて濁らなく、それによって、サラダ油のごとき食品適用の油を防寒準備するための要求を低下または消失させる。
【０００５】
高等植物は、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）経路を介してプラスチド中で脂肪酸を合成する。油料種子の開発において、大部分の脂肪酸は、グリセロール骨格に結合して、エネルギー源としての貯蔵のためにトリグリセリドを形成する。
【０００６】
β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉはパルミトイル−ＡＣＰ（Ｃ１６：０）までの伸長を触媒し、一方、β−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＩはステアロイル−ＡＣＰ（Ｃ１８：０）まで最終の伸長を触媒する。貯蔵トリグリセリド中で見出されたオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸のごとき一般的な植物不飽和脂肪酸は、可溶性プラスチド  デルタ−９不飽和化酵素（しばしば、「ステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素」とも呼ばれる）により触媒された反応において、ステアロイル−ＡＣＰの脱飽和から始まり、オレオイル−ＡＣＰ（Ｃ１８:１）を形成する。さらなる脱飽和は、膜結合デルタ−１２不飽和化酵素およびデルタ−１５不飽和化酵素の作用により順次生じる。かくして、これらの「不飽和化酵素」は、多飽和脂肪酸を創製する。
【０００７】
特定のチオエステラーゼは、新規に生成されたアシル−ＡＣＰを遊離脂肪酸およびＡＣＰに加水分解することにより脂肪酸の鎖伸長を終止できる。引き続いて、その遊離脂肪酸はプラスチド・エンベロープにおいて脂肪アシル−ＣｏＡに変換され、細胞質に運び出され、それらは、リン脂質、トリグリセリドおよび他の中性脂質の形成を担う小胞体（ＥＲ）脂質生合成経路（Kennedy経路）に組み込まれ得る。植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂肪酸合成におけるそれらの役割および植物油種子の生物工学におけるそれらの利用のために生化学的に注目される。該チオエステラーゼは、植物における新規な脂肪酸生合成の間に鎖長を決定するのに重要な役割を有し、かくして、これらの酵素は、脂肪アシル組成物の種々の改変の供給において、特に、種子貯蔵油に存在する種々の脂肪アシル基の相対的割合に関して有用である。
【０００８】
植物チオエステラーゼは、配列相同性および基質選択（substrate preference）に基づいて２つの遺伝子ファミリーに分類できる。第１の遺伝子ファミリーのＦＡＴＡは、主にオレオイル−ＡＣＰ（１８：１−ＡＣＰ）上に活性を有する長鎖アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを含む。オレオイル−ＡＣＰは、ＥＲ脂質生合成経路により合成されたリン脂質およびトリグリセリド中で見出された大部分の脂肪酸の中間前駆体である。第２のクラスの植物チオエステラーゼのＦＡＴＢは、大部分の植物において、パルミトイル−ＡＣＰ（１６:０−ＡＣＰ）、ステアロイル（１８:０−ＡＣＰ）およびオレオイル−ＡＣＰ（１８：１−ＡＣＰ）を利用する酵素を含む。ＦＡＴＢ酵素は、カルフォルニアベイ（Umbellularia californica）（米国特許第５,９５５,３２９号；米国特許第５,７２３,７６１号）、ニレ（elm）（米国特許第５,７２３,７６１号）、Cuphea hookeriana（米国特許第５,７２３,７６１号）、Cuphea palustris（米国特許第５,９５５,３２９号）、Cuphea lanceolata、ニクズク（nutmeg）、Arabidopsis thaliana、マンゴー（米国特許第５,７２３,７６１号）、リーキ（米国特許第５,７２３,７６１号）、樟脳（Cinnamomum camphora）（米国特許第５,９５５,３２９号）、カノーラ油（米国特許第５,９５５,６５０号）およびトウモロコシ（米国特許第６,３３１,６６４号）から単離されている。
【０００９】
ＦＡＳにおける表現型結果を生成できる核酸配列を得るには、油を生成するためのグリセロール骨格への脂肪酸の脱飽和および／または組み込みは、限定されるものではないが、注目する代謝因子の同定、有用な速度特性を持つ酵素源の選定および特徴付け、注目する蛋白質のそのアミノ酸配列決定を可能とするレベルまでの精製、所望のＤＮＡ配列を検索するためにプローブとして用いることができる核酸配列を得るのに利用するアミノ酸配列データ、および得られる植物の遺伝子構築体の調製、形質転換および分析を含めた種々の障害に付される。
【００１０】
かくして、脂肪酸組成物を改変するためのさらなる核酸標的および方法が必要とされる。特に、種々の範囲の異なる脂肪酸組成物を生成するための構築体および方法が必要とされる。
【００１１】
発明の概要
本発明は、配列番号：２またはその相補体に少なくとも７０％の配列同一性を持つ核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子を提供する。また、本発明により提供されるのは、配列番号：３またはその相補体に少なくとも７０％の配列同一性を持つ核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子である。また、本発明により提供されるのは、配列番号：４またはその相補体に少なくとも７０％の配列同一性を持つ核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子である。また、本発明により提供されるのは、配列番号：５またはその相補体に少なくとも７０％の配列同一性を持つ核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子である。また、本発明により提供されるのは、配列番号：６またはその相補体に少なくとも７０％の配列同一性を持つ核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子である。また、本発明により提供されるのは、配列番号：７またはその相補体に少なくとも７０％の配列同一性を持つ核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子である。また、本発明により提供されるのは、配列番号：８またはその相補体に少なくとも７０％の配列同一性を持つ核酸配列を含む実質的に精製された核酸分子である。さらに、本発明により提供されるのは、配列番号：２の配列を有する核酸分子の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子；および配列番号：３の配列を有する核酸分子の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子；および配列番号：４の配列を有する核酸分子の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子；および配列番号：５の配列を有する核酸分子の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子；および配列番号：６の配列を有する核酸分子の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子；および配列番号：７の配列を有する核酸分子の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子；および配列番号：８の配列を有する核酸分子の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む核酸分子である。
【００１２】
また、本発明により提供されるのは、作動可能に連結した成分として、（Ａ）植物細胞中で機能して、ｍＲＮＡ分子の生成を引き起こすプロモーター；ならびに
（Ｂ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を含む組換え核酸分子である。
【００１３】
また、本発明により提供されるのは、ａ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１のコード領域に少なくとも７０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；ｂ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１のコード領域に少なくとも８０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；ｃ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１のコード領域に少なくとも９０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；およびｄ）配列番号：１の全長にわたって配列番号：１のコード領域に少なくとも９５％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列よりなる群から選択されるゲノムポリヌクレオチド配列から得られたイントロンである。
【００１４】
また、本発明により提供されるのは、ａ）配列番号：１０の全長にわたって配列番号：１０のコード領域に少なくとも７０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；ｂ）配列番号：１０の全長にわたって配列番号：１０のコード領域に少なくとも８０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；ｃ）配列番号：１０の全長にわたって配列番号：１０のコード領域に少なくとも９０％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列；およびｄ）配列番号：１０の全長にわたって配列番号：１０のコード領域に少なくとも９５％の同一性を有するゲノムポリヌクレオチド配列よりなる群から選択されるゲノムポリヌクレオチド配列から得られたイントロンである。
【００１５】
また、本発明により提供されるのは、作動可能に連結した成分として、（Ａ）植物細胞中で機能して、ｍＲＮＡ分子の生成を引き起こすプロモーター；ならびに（Ｂ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を含む組換え核酸分子を含む形質転換された植物細胞および植物である。
【００１６】
また、本発明は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一性を有する核酸配列に作動可能に連結したプロモーターを含む組換え核酸分子を有する形質転換された大豆植物を提供する。
【００１７】
さらに、本発明により提供されるのは、（ａ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体、およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を持つ第１の核酸分子に作動可能に連結した第１のプロモーター、および（ｂ）ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択される酵素をコードする第２の核酸配列を持つ第２の核酸分子を含む核酸分子を有する形質転換された大豆植物である。
【００１８】
また、本発明は、作動可能に連結した成分として、（Ａ）植物中で機能して、ｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすプロモーター；ならびに（Ｂ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を含む組換え核酸分子を含む形質転換された植物から由来する種子を提供する。
【００１９】
また、本発明は、作動可能に連結した成分として、（Ａ）植物中で機能して、ｍＲＮＡ分子の生成を引き起こすプロモーター；ならびに（Ｂ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一性を有する核酸配列を含む組換え核酸分子を含む形質転換された植物の種子から由来する油を提供し、ここに、該油は、同様の遺伝的背景を持つが組換え核酸分子を欠く植物の種子から由来する油に対して、低下した飽和脂肪酸含量を示す。
【００２０】
また、本発明は、（Ａ）植物を核酸分子で形質転換して、形質転換された植物を生成し、ここに、該核酸分子は、植物チオエステラーゼ遺伝子のイントロンに８５％以上の同一性を有する核酸分子を含み；次いで、（Ｂ）該形質転換された植物を成長させ、ここに、該植物は、同様の遺伝的背景を持つが該核酸分子を欠く植物に対して、低下した飽和脂肪酸含量を持つ種子を生成することを含むことを特徴とする低下した脂肪酸含量を持つ種子を有する形質転換された植物を生成する方法を提供する。
【００２１】
さらに、本発明により提供されるのは、低下したパルミチン酸およびステアリン酸レベルを持つ種子を有する植物を生成する方法であって、（ａ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体、およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を有する第１の核酸分子に作動可能に連結した第１のプロモーター、および（ｂ）ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択される酵素をコードする第２の核酸配列を有する第２の核酸分子を含む核酸分子で植物を形質転換させ；次いで、該植物を成長させ、ここに、該植物は、同様の遺伝的背景を持つが該核酸分子を欠く植物に対して、低下したパルミチン酸およびステアリン酸レベルを持つ種子を生成することを特徴とする該方法である。
【００２２】
また、本発明は、作動可能に連結した成分として、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体、およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列に８５％以上の同一性を有する第１の核酸配列を持つ第１のプロモーターおよび第１の核酸配列を含む核酸分子で植物を形質転換させ；次いで該植物を成長させることを特徴とする、改変した油組成を持つ種子を有する植物を生成する方法であって、ここに、該植物は、同様の遺伝的背景を持つが該核酸分子を欠く植物に対して改変した油組成を持つ種子を生成する該方法を提供する。
【００２３】
さらに、本発明は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体、およびそのいずれかの断片よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ構築体で植物細胞を形質転換させ、次いで、該ＤＮＡ配列の転写が開始される条件下で該細胞を増殖させ、脂質組成を改変することを特徴とする植物細胞中の脂質組成を改変させる方法を提供する。
【００２４】
また、本発明により提供されるのは、５’から３’方向への転写における作動可能に関連した成分として、宿主細胞中で機能する転写開始領域、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体、およびそのいずれかの断片よりなる群から選択されるＤＮＡ配列、および転写終止配列を含むＤＮＡ構築体で宿主細胞を形質転換させ、次いで、該ＤＮＡ配列の転写が開始される条件下で該細胞を増殖させ、該脂質組成物を改変することを含むことを特徴とする宿主細胞中の脂質組成を改変する方法である。
【００２５】
さらに、本発明により提供されるのは、（ａ）ＦＡＴＢ遺伝子の転写されたイントロンに少なくとも９０％の同一性を示す第１のＲＮＡを発現できる第１のＤＮＡ配列、および該第１のＲＮＡでｄｓＲＮＡを形成できる第２のＲＮＡを発現できる第２のＤＮＡ配列を植物細胞に導入し、次いで，（ｂ）該第１のＲＮＡおよび該第２のＲＮＡを種子中で発現させることを特徴とする種子中のＦＡＴＢ遺伝子の発現を改変する方法である。
【００２６】
また、本発明により提供されるのは、（ａ）ＦＡＴＢ遺伝子の転写されたイントロンに少なくとも９０％の同一性を示すＲＮＡを発現できる第１のＤＮＡ配列、および該ＦＡＴＢ遺伝子の転写されたイントロンに少なくとも９０％の同一性を示す第２のＲＮＡを発現できる第２のＤＮＡ配列を植物細胞に導入し、次いで，（ｂ）該第１のＲＮＡおよび該第２のＲＮＡを種子中で発現させることを特徴とする種子中のＦＡＴＢ遺伝子の発現を改変する方法である。
【００２７】
発明の詳細な記載
核酸配列の記載
配列番号：１は、大豆ＦＡＴＢゲノムクローンの核酸配列を示す。
配列番号：２は、大豆ＦＡＴＢイントロンＩの核酸配列を示す。
配列番号：３は、大豆ＦＡＴＢイントロンＩＩの核酸配列を示す。
配列番号：４は、大豆ＦＡＴＢイントロンＩＩＩの核酸配列を示す。
配列番号：５は、大豆ＦＡＴＢイントロンＩＶの核酸配列を示す。
配列番号：６は、大豆ＦＡＴＢイントロンＶの核酸配列を示す。
配列番号：７は、大豆ＦＡＴＢイントロンＶＩの核酸配列を示す。
配列番号：８は、大豆ＦＡＴＢイントロンＶＩＩの核酸配列を示す。
配列番号：９は、大豆ＦＡＴＢ酵素の核酸配列を示す。
配列番号：１０は、大豆ＦＡＴＢ部分ゲノムクローンの核酸配列を示す。
配列番号：１１〜１８は、オリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列を示す。
配列番号：１９は、大豆ＦＡＴＢイントロンＩＩを含むＰＣＲ産物の核酸配列を示す。
配列番号：２０は、大豆ＦＡＴＢ ｃＤＮＡの核酸配列を示す。
【００２８】
定義
本明細書に用いた「遺伝子」なる用語を用いて、遺伝子産物の発現と関連した５’プロモーター領域、いずれかのイントロンおよびエクソン領域、ならびに該遺伝子産物の発現と関連した３’非翻訳領域を含む核酸配列をいう。
【００２９】
本明細書に用いた「ＡＣＰ」なる用語を用いて、アシル担体蛋白質部位をいう。本明細書に用いた「脂肪酸」なる用語は、遊離脂肪酸およびアシル−脂肪酸群をいう。
【００３０】
本明細書に用いた「ＦＡＴＢ」または「パルミトイル−ＡＣＰ チオエステラーゼ」遺伝子は、その好ましい反応としてパルミトイル−ＡＣＰのパントテン（panthothene）補欠分子族における炭素−イオウチオエステル結合の加水分解性切断を触媒できる酵素（ＦＡＴＢ）をコードする遺伝子である。また、他の脂肪酸−ＡＣＰチオエステルの加水分解も、この酵素により触媒できる。
【００３１】
本明細書中の蛋白質および核酸を引用する場合、単なる大文字、例えば、「ＦＡＴＢ」の使用は、酵素、蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドに対する引用を示し、イタリック体の大文字、例えば、「ＦＡＴＢ」の使用は、限定されるものではないが、遺伝子、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡを含めた核酸を言及するために用いる。
【００３２】
本明細書に用いた「ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ」または「ＫＡＳ Ｉ」遺伝子は、パルミトイル−ＡＣＰ（Ｃ１６：０）までの脂肪アシル基の伸長を触媒できる酵素（ＫＡＳ Ｉ）をコードする遺伝子である。例示的ＫＡＳ Ｉ遺伝子および酵素は、米国特許第５,４７５,０９９号およびＰＣＴ公開ＷＯ ９４／１０１８９に記載されている。
【００３３】
本明細書に用いた「ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶ」または「ＫＡＳ ＩＶ」遺伝子は、中鎖アシル−ＡＣＰの縮合を触媒できる酵素（ＫＡＳ ＩＶ）をコードする遺伝子である。例示的ＫＡＳ ＩＶ遺伝子および酵素は、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６７７６に記載されている。
【００３４】
本明細書に用いた「デルタ−９不飽和化酵素」または「ステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素」または「オメガ−９不飽和化酵素」遺伝子は、カルボキシル末端から数えて９番目の位置にて、脂肪酸アシル基への二重結合の挿入を触媒できる酵素をコードする遺伝子である。例示的デルタ−９不飽和化酵素の遺伝子および酵素は、米国特許第５,７２３,５９５号に記載されている。
【００３５】
本明細書に用いた「中オレイン酸大豆種子」は、該種子の油組成物中に存在する５０％および７５％のオレイン酸を有する種子である。
【００３６】
本明細書に用いた「高オレイン酸大豆種子」は、該種子の油組成物中に存在する７５％を超えるオレイン酸を有する油を持つ種子である。
【００３７】
本明細書に用いた「低飽和」油組成物は、３.４および７パーセントの間の飽和脂肪酸を含有する。
【００３８】
本明細書に用いた「ゼロ飽和」油組成物は、３.４パーセント未満の飽和脂肪酸を含有する。
【００３９】
本明細書に用いた細胞または生物体は、特定の酵素をコードする１を超える遺伝子のファミリーを有することができ、例えば、植物は１を超えるＦＡＴＢ遺伝子（すなわち、該植物の遺伝子内の異なる位置に存在する特定の活性を持つ酵素をコードする遺伝子）を有することができる。本明細書に用いた「ＦＡＴＢ遺伝子ファミリーメンバー」は、該植物の遺伝物質内に見出されたいずれかのＦＡＴＢ遺伝子である。１つの具体例において、遺伝子ファミリーは、さらに、核酸配列の類似性により分類できる。この具体例の好ましい態様において、遺伝子ファミリーメンバーは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の核酸配列同一性を該遺伝子のコード配列部分において示す。
【００４０】
「非コード」なる用語は、部分的または全ての発現蛋白質をコードしない核酸分子の配列をいう。非コード配列は、限定されるものではないが、イントロン、プロモーター領域、３’非翻訳領域および５’非翻訳領域を含む。
【００４１】
本明細書に用いた「イントロン」なる用語は、部分的または全ての発現蛋白質をコ―ドせず、内因性条件において、ＲＮＡ分子に転写されるが、該ＲＮＡが蛋白質に翻訳される前に内因性ＲＮＡ外にスプライシングされる核酸分子、通常、ＤＮＡのセグメントを意味する用語の通常の意味をいう。
【００４２】
本明細書に用いた「エクソン」なる用語は、部分的または全ての発現蛋白質をコ―ドする核酸分子、通常、ＤＮＡのセグメントを意味する用語の通常の意味をいう。
【００４３】
本明細書に用いた１以上の核酸配列に「作動可能に連結した」プロモーターは、多シストロン性配置に配置した複数のコードまたは非コード核酸配列を含めた１以上の核酸配列の発現を駆動できる。
【００４４】
「多シストロン性遺伝子」または「多シストロン性ｍＲＮＡ」は、発現について標的化された１を超える遺伝子の核酸配列に対応する翻訳された核酸配列を含むいずれかの遺伝子またはｍＲＮＡである。かかる多シストロン性の遺伝子またはｍＲＮＡは、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはその組合せに対応する配列を含むことができ、および組換え多シストロン性遺伝子またはｍＲＮＡは、例えば、限定なくして、一つの遺伝子からの１以上のＵＴＲおよび第２の遺伝子からの１以上のイントロンに対応する配列を含むことと理解される。
【００４５】
本明細書に用いた核酸配列の相補体なる用語は、その全長に沿った配列の相補体をいう。
【００４６】
本明細書に用いた前記のいずれの範囲も、特記しない限りは、その範囲の終点を含める。
【００４７】
剤
本発明の剤は、もう一つの核酸分子にハイブリダイズする核酸分子の能力、または抗体により結合する（またはかかる結合についてもう一つの分子と競合する）蛋白質の能力のごときいずれかの構造的特性に関して、好ましくは「生物学的に活性」であろう。あるいは、かかる特性は触媒でき、かくして、化学反応または応答を媒介する剤の能力を含む。該剤は、好ましくは「実質的に精製された」ものである。本明細書に用いた「実質的に精製された」なる用語は、その天然の環境条件においてそれと通常関連する実質的に全ての他の分子から分離された分子をいう。より好ましくは、実質的に精製された分子は、調製物中に存在した主な種である。実質的に精製された分子は、天然混合物中に存在する他の分子（溶剤を除く）が６０％を超えてなく、７５％を超えてなく、好ましくは９０％を超えてなく、最も好ましくは９５％を超えてないものであろう。
【００４８】
また、本発明の剤は、組換えできる。本明細書に用いた「組換え」なる用語は、核酸分子のヒトの操作からもの、またはその結果であるが間接的であるいずれかの剤（例えば、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ペプチドを含む）を意味する。
【００４９】
本発明の剤は、該剤の検出を促す試薬（例えば、蛍光標識、Proberら、Science ２３８：３３６−３４０（１９８７）；Albarellaら、ＥＰ １４４９１４；化学標識、Sheldonら、米国特許第４,５８２,７８９号；Albarellaら、米国特許第４,５６３,４１７号；修飾塩基、Miyoshietら、ＥＰ １１９４４８）で標識できると理解される。
【００５０】
核酸分子
本発明の剤は、核酸分子を含む。本発明のある態様において、該核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを選択的に低下できる核酸配列を含む。
【００５１】
本発明の好ましい態様において、該核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを選択的に低下させる結果、脂肪酸生合成経路を改変し、引き続いて該細胞または生物体における飽和脂肪酸レベルを減少させるＦＡＴＢ遺伝子のイントロン配列または他の非コード配列である。また、ＦＡＴＢ遺伝子の非コード配列は、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素のごとき酵素をコードする核酸配列と組み合せて用い、さらに、細胞または生物体中の脂肪酸生合成経路を改変し、さらに、飽和脂肪酸レベルを減少させることができる。また、ＦＡＴＢ遺伝子の非コード配列は、他の酵素を下方調節する核酸配列、例えば、デルタ−１２不飽和化酵素遺伝子のセンス抑制できるｃＤＮＡと組み合わせて用いて、さらに、細胞または生物体中の脂肪酸生合成経路を改変し、さらに、飽和脂肪酸レベルを減少させることができる。
【００５２】
好ましい態様において、蛋白質および／または転写体のレベルを選択的に低下させる核酸分子の能力は、ｍＲＮＡ転写体のレベルの比較により行われる。本発明のもう一つの好ましい態様において、本発明の核酸分子は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列を含む。
【００５３】
本発明の一つの態様において、本発明の核酸は、導入核酸分子と呼ばれるものである。核酸分子は、如何に間接的であろうとヒト操作の結果として細胞または生物体に挿入されるならば「導入された」と言われる。導入核酸分子の例は、限定されるものではないが、形質転換、トランスフェクション、注入および投影を介して細胞に導入された核酸、および限定されるものではないが、コンジュゲーション、エンドサイトーシスおよび食作用を含めた方法を介して生物体に導入されたものを含む。細胞または生物体は、限定なくして、植物、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌または細菌細胞であるか、またはそれらから由来し得る。
【００５４】
蛋白質、脂肪酸またはｍＲＮＡのごとき剤の本明細書に用いた「選択的低下」は、該剤を選択的に低下できる核酸分子を欠く細胞または生物体に関する。好ましい態様において、該剤のレベルは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％または９５％だけ選択的に低下する。
【００５５】
蛋白質、脂肪酸またはｍＲＮＡのごとき剤の本明細書に用いた「部分的低下」は、該レベルを、該剤を低下できる核酸分子を欠く細胞または生物体に対して、少なくとも２５％低下させることを意味する。
【００５６】
蛋白質、脂肪酸またはｍＲＮＡのごとき剤の本明細書に用いた「実質的な低下」は、該レベルを、該剤を低下できる核酸分子を欠く細胞または生物体に対して、少なくとも７５％低下させることを意味する。
【００５７】
蛋白質、脂肪酸またはｍＲＮＡのごとき剤の本明細書に用いた「有効な消失」は、該剤のレベルを低下できる核酸分子を欠く細胞または生物体に対して、少なくとも９５％低下させることを意味する。
【００５８】
剤のレベルを比較する場合、かかる比較は、同様の遺伝背景を持つ生物体間で好ましくは行われる。好ましい態様において、同様の遺伝背景は、比較されるべき生物体が５０％以上のそれらの核遺伝物質を共有する場合の背景である。より好ましい態様において、同様の遺伝背景は、比較されるべき生物体が７５％以上、さらにより好ましくは９０％以上のそれらの核遺伝物質を共有する場合の背景である。もう一つのさらにより好ましい態様において、同様の遺伝背景は、比較されるべき生物体が植物であって、該植物が植物形質転換技術を用いて本来導入されるいずれかの遺伝物質を除いて同遺伝子型である。
【００５９】
本発明の具体例において、核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、蛋白質、脂肪酸および／または転写体のレベルを選択的に低下できる。好ましい態様において、蛋白質、脂肪酸および／または転写体のレベルを選択的に低下する核酸分子の能力は、蛋白質、脂肪酸および／または転写体を選択的に低下できる核酸分子を欠く細胞または生物体に対して決定される。本明細書に用いたｍＲＮＡ転写体は、プロセッシングされたおよびプロセシングされていないｍＲＮＡを含み、「ＦＡＴＢ転写体」とは、ＦＡＴＢ遺伝子によりコード化されたいずれかの転写体をいう。
【００６０】
もう一つの具体例において、核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを少なくとも部分的に低下できる。異なる具体例において、核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを少なくとも実質的に低下できる。さらなる具体例において、核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを有効に消失できる。
【００６１】
異なる具体例において、核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、異なる蛋白質および／または転写体のレベルを過剰発現しつつ、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを選択的に低下できる。好ましくは、異なる蛋白質は、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択され、該異なる転写体は、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択される酵素をコードする。
【００６２】
さらなる具体例において、核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、異なる蛋白質および／または転写体のレベルを過剰発現しつつ、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを少なくとも部分的に低下できる。好ましくは、異なる蛋白質は、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択され、該異なる転写体は、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択される酵素をコードする。異なる具体例において、核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、異なる蛋白質および／または転写体のレベルを過剰発現しつつ、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを少なくとも実質的に低下できる。さらなる具体例において、核酸分子は、細胞または生物体に導入される場合に、異なる蛋白質および／または転写体のレベルを過剰発現しつつ、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを有効に消失できる。
【００６３】
さらに、本発明の好ましい具体例は、本発明の核酸分子に対してそれらの全長にわたって少なくとも５０％、６０％または７０％同一性である核酸分子、およびかかる核酸分子に相補的である核酸分子である。より好ましくは、本発明の核酸分子に対してそれらの全長にわたって少なくとも８０％または８５％同一性である領域を含む核酸分子、およびそれに相補的である核酸分子である。これに関して、それらの全長にわたって少なくとも９０％同一性の核酸分子が特に好ましく、少なくとも９５％同一性のものが特に好ましい。さらに、少なくとも９７％同一性を持つものが高度に好ましく、少なくとも９８および９９％同一性を持つものが特に高度に好ましく、少なくとも９９％のものが最も高度に好ましい。
【００６４】
また、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下の配列表に記載の核酸分子配列について完全な遺伝子を含む適当なライブラリーを該核酸分子配列またはその断片の配列を有するプローブでスクリーニングし；次いで、該核酸分子配列を単離することにより得ることができる核酸分子配列を含む核酸分子を提供する。かかる核酸分子を得るのに有用な断片は、例えば、本明細書に記載されたプローブおよびプライマーを含む。
【００６５】
本発明の核酸分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、全長のｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離でき、また、配列表に記載された核酸分子に高度に類似する配列を有する他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離できる。
【００６６】
本発明の核酸分子は、植物種または他の適当な生物体から得られたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするために、本明細書に記載された核酸分子またはその断片を用いることにより容易に得ることができる。これらの方法は当業者に知られ、かかるライブラリーを形成する方法である。１つの具体例において、かかる配列は、本発明の核酸分子とゲノムライブラリーのメンバーとをインキュベートし、次いで、そのかかる核酸分子にハイブリダイズするクローンを回収することにより得られる。第２の具体例において、染色体歩行または反転ＰＣＲの方法を用いて、かかる配列を得ることができる。第３の具体例において、本発明の核酸分子の配列は、当該技術分野において知られた生物情報技術を用いてライブラリーまたはデータベースをスクリーニングするために用いることができる。例えば、Bioinformatics、Baxevanis & Ouellette、eds., Wiley−Interscience（１９９８）参照。
【００６７】
種々の方法のいずれかを用いて、１以上の本発明の核酸分子を得ることができる。自動化核酸シンセサイザーをこの目的に使用して、細胞または生物体においても見出される配列を有する核酸分子を作成できる。かかる合成に代えて、開示された核酸分子を用いて、いずれかの所望の核酸分子または断片を増幅し得るためにポリメラーゼ連鎖反応で用いることができる一対のプライマーを規定できる。
【００６８】
当該技術分野において良好に理解されている「同一性」なる用語は、配列を比較することにより決定された２以上のポリペプチド配列または２以上の核酸分子配列間の関連性である。また、当該技術分野において、「同一性」は、かかる配列の連鎖（string）間の対合により決定されたポリペプチドまたは核酸分子配列間の配列関連性の度合を意味する。「同一性」は、限定されるものではないが、Computational Molecular Biology、Lesk、A. M. 、ed. 、Oxford University Press、New York（１９８８）；Biocomputing：Informatics and Genome Projects、Smith、D. W.,ed.、Academic Press、New York（１９９３）；Computer Analysis of Sequence Data, Part I、Griffin、A. M.およびGriffin、H. G. 、eds. 、Humana Press、New Jersey（１９９４）；Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje、G. 、Academic Press（１９８７）；Sequence Analysis Primer、Gribskov、M.およびDevereux、J. 、eds. 、Stockton Press、New York（１９９１）；ならびにCarillo、H. およびLipman、D.、SIAM J. Applied Math、４８：１０７３（１９８８）に記載されたものを含めた公知の方法により容易に算出できる。同一性を決定する方法は、テストされた配列間の最大の対合を与えるように設計される。
【００６９】
さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手可能なプログラムにおいて暗号化されている。２つの配列間の同一性を決定するのに用いることができるコンピュータープログラムは、限定されるものではないが、ＧＣＧ（Devereux、J.ら.、Nucleic Acids Research １２（１）：３８７（１９８４）；一組の５つのBLASTプログラム、ヌクレオチド配列問合せ用に設計された３つ（BLASTN、BLASTXおよびTBLASTX）および蛋白質配列問合せ用に設計された２つ（BLASTPおよびTBLASTN）（Coulson、Trends in Biotechnology、１２：７６−８０（１９９４）；Birrenら、Genome Analysis,１：５４３−５５９（１９９７））を含む。該BLASTXプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の源（BLAST Manual、Altschul、S. ら、NCBI NLM NIH、Bethesda、MD ２０８９４；Altschul、S.、ら、J. Mol.Biol.、２１５：４０３−４１０（１９９０））から公的に入手可能である。また、よく知られたSmith Watermanアルゴリズムを用いて、同一性を決定できる。
【００７０】
ポリペプチド配列比較用のパラメーターは、以下のものを含む：
アリゴリズム：NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.、４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス： HentikoffおよびHentikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのBLOSSUM６２ギャップペナルティ：１２ 
ギャップ長ペナルティー（Gap Length Penalty）：４。
【００７１】
これらのパラメーターで用いることができるプログラムは、Genetics Computer Group、Madison、Wisconsinからの「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。エンドギャップにペナルティーがない前記のパラメーターは、ペプチド比較用の不履行（default）パラメーターである。 
【００７２】
核酸分子配列比較用のパラメーターは、以下を含む：
アリゴリズム：NeedlemanおよびWunsch、J. Mol.Bio.、４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：対合−+１０ ；不対合＝０ 
ギャップペナルティ：５０ 
ギャップ長ペナルティ：３。
【００７３】
本明細書に用いた「％同一性」は、核酸分子配列比較用の不履行パラメーターとしての前記パラメーターおよびＧＣＧ、バージョン１０.２からの「ギャップ」プログラムを用いて決定される。
【００７４】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子に関する。特に、本発明は、前記核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子に関する。本明細書に用いた「ストリンジェントな条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％同一性が存在するならばハイブリダイゼーションが一般的に引き起こされることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５×デンハート溶液、１０％デキストラン硫酸および２０ミリグラム／ミリリットルの変性の剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩インキュベートするのに続いて、約６５℃の０.１×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション支持体を洗浄する。他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor、NY（１９８９）、特に第１１章に例示されている。
【００７５】
発現した場合にＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体のレベルを選択的に低下できる核酸配列の具体例において、好ましい核酸配列は、（１）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列と、該核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を持つ核酸配列；（２）大豆ＦＡＴＢ遺伝子イントロンにも見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と該核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を持つ配列を示す核酸分子よりなる群から選択される。
【００７６】
本発明の核酸分子の一つのサブセットは、断片核酸分子を含む。断片核酸分子は、具体的に開示されたごとき本発明の核酸分子のかなりの（複数の）部分または本発明の核酸分子の実際上大部分よりなり得る。あるいは、該断片は、（約１５〜約４００個の連続するヌクレオチド残基、より好ましくは約１５〜約３０個の連続するヌクレオチド残基、または約５０〜約１００個の連続するヌクレオチド残基、または約１００〜約２００個の連続するヌクレオチド残基、または約２００〜約４００個の連続するヌクレオチド残基、または約２７５〜約３５０個の連続するヌクレオチド残基を有する）類似するオリゴヌクレオチドを含み得る。より好ましくは、該断片は、約１５〜約４５個の連続するヌクレオチド残基、約２０〜約４５個の連続するヌクレオチド残基、約２０〜約４５個の連続するヌクレオチド残基、約１５〜約３０個の連続するヌクレオチド残基、約２１〜約３０個の連続するヌクレオチド残基、約２１〜約２５個の連続するヌクレオチド残基、約２１〜約２５個の連続するヌクレオチド残基、約１９〜約２５個の連続するヌクレオチド残基、または約２１個の連続するヌクレオチドを有する小さなオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００７７】
もう一つの態様において、断片核酸分子は、本発明の核酸分子の少なくとも１５、２５、５０または１００個の連続するヌクレオチドである核酸配列を有する。より好ましい具体例において、該核酸分子は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８およびその相補体よりなる群から選択される核酸配列を有する核酸分子の少なくとも１５、２５、５０または１００個の連続するヌクレオチドである核酸配列を有する。
【００７８】
本発明の１以上の核酸分子の断片は、プローブ、特にＰＣＲプローブであり得る。ＰＣＲプローブは、もう一つの核酸分子と二本鎖構造にある間にポリメラーゼ活性を開始できる核酸分子である。ＰＣＲプローブの構造を決定する種々の方法およびＰＣＲ技術は、当該技術分野において存在する。例えば、Primer３（www−genome. wi. mit. edu／cgi−bin／primer／primer３. cgi）、STSPipeline（www−genome. wi. mit. edu／cgi−bin／www−STS~Pipeline）またはGeneUp（Pesoleら、BioTechniques２５：１１２−１２３（１９９８））のごときプログラムを用いたコンピューター生成調査を用いて、潜在的なＰＣＲプライマーを同定できる。
【００７９】
本発明の核酸分子またはその断片は、ある種の環境下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズできる。本発明の核酸分子は、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列を有する核酸分子に特異的にハイブリダイズするものを含む。本明細書に用いた２つの核酸分子とは、該２つの分子が抗−並列の二本鎖核酸構造を形成できるならば、もう一つに特異的にハイブリダイズできることをいう。
【００８０】
また、本発明の核酸分子は、ホモログ核酸分子をコードできる。本明細書に用いたホモログ核酸分子またはその断片は、第２の種における対応体核酸分子である（例えば、トウモロコシＦＡＴＢイントロンＩ核酸分子は、ArabidopsisＦＡＴＢイントロンＩ核酸分子のホモログである）。また、ホモログは、分子進化またはＤＮＡ混合技術（DNA shuffling technique）より生成でき、該分子は、元来のポリペプチドの少なくとも１つの機能的または構造的特徴を保持する（例えば、米国特許第５,８１１,２３８号参照）。
【００８１】
もう一つの具体例において、該ホモログは、アルファルファ、Arabidopsis、大麦、Brassica campestris、アブラナ、ブロッコリー、キャベツ、カノーラ、シトリス、綿花、ニンニク、オート麦、Allium、麻、観賞植物、ホホバ、トウモロコシ、落花生、胡椒、ジャガイモ、菜種、糠、ライ麦、サトウモロコシ、イチゴ、甘蔗、甜菜、トマト、小麦、ポプラ、松根、モミ、ユーカリ、リンゴ、レタス、レンティル、ブドウ、バナナ、茶、芝草、ヒマワリ、Phaseolus、ハマナ、カラシナ、トウゴマの実、ゴマ、綿実、アマニ、紅花および油ヤシよりなる群から選択される選択された植物から得られる。より詳細には、好ましいホモログは、カノーラ、トウモロコシ、Brassica campestris、アブラナ、大豆、ハマナ、カラシナ、トウゴマの実、落花生、ゴマ、綿実、アマニ、菜種、紅花、油ヤシ、麻およびヒマワリよりなる群から選択された植物から得られる。さらにより好ましい具体例において、ホモログは、カノーラ、菜種、トウモロコシ、Brassica campestris、アブラナ、大豆、ヒマワリ、紅花、油ヤシおよび落花生よりなる群から選択される植物から得られる。
【００８２】
さらなる具体例において、さらなるＦＡＴＢイントロンは、さらなるイントロンが同定できるいずれかの方法により得ることができる。好ましい具体例において、さらなる大豆ＦＡＴＢイントロンは、大豆ＦＡＴＢの公知のエクソンまたはイントロン配列のいずかのプローブで大豆ゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。次いで、該大豆ＦＡＴＢ遺伝子をクローニングできる。もう一つの好ましい具体例において、さらなる大豆ＦＡＴＢイントロンを大豆ゲノム配列およびさらなるイントロンの同定を可能とする大豆ｃＤＮＡ配列間の比較により得ることができる。より好ましい具体例において、さらなる大豆ＦＡＴＢイントロンを大豆ＦＡＴＢの公知のエクソンまたはイントロン配列のいずかのプローブで大豆ゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。次いで、該大豆ＦＡＴＢ遺伝子をクローニングし、確認し、次いで、いずれかのさらなるイントロンを大豆ゲノム配列および大豆ｃＤＮＡ配列間の比較により同定できる。さらなるイントロンは、例えば、限定なくして、ＰＣＲにより増幅し本発明の具体例において用いることができる。
【００８３】
もう一つの好ましい具体例においいて、例えば、大豆イントロンのごときイントロンを例えば、Arabidopsisのごとき他の生物体からのイントロンに対する整列によりクローニングできる。この具体例において、例えば、Arabidopsisアミノ酸配列におけるイントロンの位置を同定できる。次いで、Arabidopsisアミノ酸配列は、例えば、大豆アミノ酸配列と共に例えば、整列でき、例えば、さらなる大豆ＦＡＴＢイントロンの位置についての予測を提供できる。プライマーは、例えば、該大豆ＦＡＴＢ ｃＤＮＡを用いて合成できる。予測イントロンは、例えば、かかるプライマーを用いるＰＣＲにより合成できる。かかるイントロンは、本発明の具体例において用いることができる。
【００８４】
植物構築体および植物形質変換体
本発明の１以上の核酸分子を植物の形質転換またはトランスフェクションに用いることができる。外来性遺伝物質は、植物細胞に移入することができ、該植物細胞は、全ての増殖性または繁殖不能の植物または植物部分に再生できる。外来性遺伝物質は、天然に発生するか、そうでなければ、いずれかの生物体に挿入できるいずれかの源からのいずれかの遺伝物質である。
【００８５】
本発明の具体例において、一つのＦＡＴＢ遺伝子ファミリーメンバーの蛋白質または転写体の発現レベルは、第２のＦＡＴＢ遺伝子ファミリーメンバーの蛋白質または転写体のレベルに部分的に影響せずに選択的に低下される。本発明の好ましい具体例において、一つのＦＡＴＢ遺伝子ファミリーメンバーにおける蛋白質または転写体の発現レベルは、第２のＦＡＴＢ遺伝子ファミリーメンバーの蛋白質または転写体のレベルに実質的に影響せずに選択的に低下される。本発明の高度に好ましい具体例において、一つのＦＡＴＢ遺伝子ファミリーメンバーにおける蛋白質または転写体の発現レベルは、第２のＦＡＴＢ遺伝子ファミリーメンバーの蛋白質または転写体のレベルに本質的に影響せずに選択的に低下される。
【００８６】
本明細書に用いた「部分的に影響せず」は、部分的に影響されない剤のレベルが、もう一つの剤を選択的に低下できる核酸分子を欠く細胞または生物体において見出されたレベルの８０％以内、より好ましくは６０％以内、さらにより好ましくは５０％以内である蛋白質またはｍＲＮＡ転写体のごとき剤のレベルをいう。
【００８７】
本明細書に用いた「実質的に影響せず」は、実質的に影響されない剤のレベルが、もう一つの剤を選択的に低下できる核酸分子を欠く細胞または生物体において見出されたレベルの４９％以内、より好ましくは３５％以内、さらにより好ましくは２４％以内である蛋白質またはｍＲＮＡ転写体のごとき剤のレベルをいう。
【００８８】
本明細書に用いた「本質的に影響せず」は、特定の事象により改変されないか、またはその剤の生理学的機能に影響しない範囲にまでだけ改変でされる蛋白質またはｍＲＮＡ転写体のごとき剤のレベルをいう。好ましい態様において、本質的に影響されない剤のレベルは、もう一つの剤を選択的に低下できる核酸分子を欠く細胞または生物体において見出されたレベルの２０％以内、より好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内である。
【００８９】
特により好ましい具体例において、本発明の大豆植物は、発現する場合、異なる蛋白質および／または転写体のレベルを過剰発現しつつ、ＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体の発現レベルを選択的に低下できる核酸配列を含む。好ましくは、該蛋白質は、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択され、該異なる転写体は、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素Ｉ、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰ合成酵素ＩＶおよびデルタ−９不飽和化酵素よりなる群から選択される酵素をコードする。
【００９０】
形質転換された植物において発現する場合にＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体の発現レベルを選択的に低下できる核酸配列の具体例において、好ましい核酸配列は、（１）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列と、核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ核酸配列；（２）大豆ＦＡＴＢ遺伝子イントロンにおいても見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と、核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を持つ配列を示す核酸分子よりなる群から選択される。
【００９１】
好ましい具体例において、本発明の大豆種子は、５０％以上のオレイン酸および１５％以下の（パルミチン酸およびステアリン酸を含めた）飽和脂肪酸である油組成を有する。より好ましい具体例において、本発明の大豆種子は、１０％以下の飽和脂肪酸である油組成を有する。本明細書に用いた、種子のごとき植物または植物部分の油の全ての％組成は、重量により決定される。
【００９２】
特に好ましい具体例において、本発明の大豆種子は、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３.６％以下、３.５％以下、３.４％以下の飽和脂肪酸である油組成を有する。より好ましい具体例において、本発明の大豆種子は、低い飽和組成である油組成を有し、さらにより好ましい具体例において、本発明の大豆種子は、ゼロの飽和組成である油組成を有する。
【００９３】
もう一つの好ましい具体例において、本発明の大豆種子は、５０％以上のオレイン酸および１０〜１５％の間の飽和脂肪酸である油組成を有する。
【００９４】
より好ましい具体例において、本発明の大豆種子は、７〜１０％の間の飽和脂肪酸、５〜８％の間の飽和脂肪酸、３.４〜７％の間の飽和脂肪酸、３.５〜７％の間の飽和脂肪酸、３.６〜７％の間の飽和脂肪酸、２〜４％の間の飽和脂肪酸、または３.４未満の飽和脂肪酸である油組成を有する。
【００９５】
本発明のもう一つの好ましい具体例において、本発明の大豆種子は、パルミチン酸のレベルが少なくとも部分的に低下し、少なくとも実質的に低下し、または有効に消失する油組成を有する。もう一つの具体例において、本発明の大豆種子は、ステアリン酸のレベルが少なくとも部分的に低下し、少なくとも実質的に低下し、または有効に消失する油組成を有する。
【００９６】
本発明の大豆種子が５０％以上のオレイン酸も含有する低飽和またはゼロ飽和の油組成を有するように、発現する場合にＦＡＴＢ蛋白質および／またはＦＡＴＢ転写体の発現レベルを選択的に低下できる核酸配列の具体例において、核酸配列は、（１）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列と、核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ核酸配列；（２）大豆ＦＡＴＢイントロンにおいても見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と、核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を持つ配列を示す核酸分子よりなる群から選択される。
【００９７】
また、遺伝子物質は、限定されるものではないが、カノーラ、トウモロコシ、大豆、Arabidopsis、Phaseolus、落花生、アルファルファ、小麦、糠、オート麦、サトウモロコシ、菜種、ライ麦、大麦、ミッレト、ウシノケグサ（fescue）、多年生ライ麦草、甘蔗、クランベリー、パパイヤ、バナナ、紅花、油ヤシ、麻、マスクメロン、リンゴ、キュウリ、デンドロビウム、グラジオラス、キク、ユリ（liliacea）、綿花、ユーカリ、ヒマワリ、Brassica campestris、アブラナ、芝草、甜菜、コーヒーおよびディオスコレア（dioscorea）（Christou、INO：Particle Bombardment for Genetic Engineering of Plants、Biotechnology Intelligence Unit. Academic Press、San Diego、California（１９９６））、好ましくは、カノーラ、トウモロコシ、Brassica campestris、アブラナ、菜種、大豆、ハマナ、カラシナ、トウゴマの実、落花生、ゴマ、綿実、アマニ、紅花、油ヤシ、麻およびヒマワリ、より好ましくは、カノーラ、菜種、トウモロコシ、Brassica campestris、アブラナ、大豆、ヒマワリ、紅花、油ヤシおよび落花生を含めた他の種、例えば、単子葉植物または双子葉植物から得られる。より好ましい具体例において、カノーラ遺伝物質は、カノーラに移される。もう一つのより好ましい具体例において、アブラナ遺伝物質は、アブラナに移される。もう一つの特に好ましい具体例において、大豆遺伝物質は大豆に移される。
【００９８】
転写体または蛋白質のごとき産物のレベルは、植物のごとき生物体を通して増加または減少できるか、該生物体の１以上の特定の器官もしくは組織中で局在化できる。例えば、産物のレベルは、限定されるものではないが、根、塊茎、幹、葉、茎、果実、液果、ナッツ（nut）、樹皮、鞘、種子および花を含めた植物の１以上の組織および器官において増加または減少できる。好ましい器官は種子である。
【００９９】
外来性遺伝物質は、かかる目的のために設計されたＤＮＡベクターまたは構築体の使用により宿主細胞に移入することができる。かかるベクターの設計は、一般的に、当業者の技量内にある（例えば、Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual、Clark（ed. ）、Springer、New York（１９９７）参照）。
【０１００】
構築体またはベクターは、選定された核酸分子を発現するための植物プロモーターを含み得る。好ましい具体例において、本明細書に記載されたいずれの核酸分子も、ｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすために植物細胞において機能するプロモーター領域に作動可能に連結できる。例えば、本明細書に記載されたそれらのプロモーターのごときｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすために植物細胞において機能するいずれのプロモーターも、限定することなくして用いることができる。好ましい具体例において、該プロモーターは、植物プロモーターである。
【０１０１】
植物細胞中で活性である多数のプロモーターは、文献に記載されている。これらは、限定されるものではないが、ノパリン合成酵素（NOS）プロモーター（Ebertら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U. S. A.）８４：５７４５−５７４９（１９８７））、オクト松根合成酵素（OCS）プロモーター（Agrobacterium tumefaciensの腫瘍誘発プラスミドを維持する）、カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）１９Ｓプロモーター（Lawtonら、Plant Mol. Biol.９：３１５−３２４（１９８７））およびCaMV ３５Ｓプロモーター（Odellら、Nature３１３：８１０−８１２（１９８５））のごときカリモウイルスプロモーター、ゴマノハグサ（figwort）モザイクウイルス３５Ｓ−プロモーター（米国特許第５,３７８,６１９号）、リブロース−１,５−ビス−ホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ssRUBISCO）からの光誘導可能なプロモーター、Adhプロモーター（Walkerら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U. S. A.）８４：６６２４−６６２８（１９８７））、スクロース合成酵素プロモーター（Yangetら、Proc. Natl. Acad. Sci.（U. S. A.）８７：４１４４−４１４８（１９９０））、Ｒ遺伝子複合プロモーター（Chandlerら、The Plant Cell １：１１７５−１１８３（１９８９））およびクロロフィルa／b 結合蛋白遺伝子プロモーターを含む。これらのプロモーターを用いて、植物中で発現したＤＮＡ構築体を創製した；例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ８４／０２９１３参照。CaMV ３５Ｓプロモーターは、植物における使用に好ましい。植物細胞中でＤＮＡの転写を引き起こすことが知られたか、または判明したプロモーターは、本発明に用いることができる。
【０１０２】
また、特に好ましいプロモーターを用いて、種子または果実において本発明の核酸分子を発現できる。事実、好ましい具体例において、用いたプロモーターは種子特異的なプロモーターである。かかるプロモーターの例は、ナピン（napin）（Kridlら、Seed Sci. Res. １：２０９−２１９（１９９１））、ファゼオリン（Bustosら、Plant Cell、１（９）：８３９−８５３（１９８９））、大豆トリプシン阻害剤（Riggsら、Plant Cell １（６）：６０９−６２１（１９８９））、ＡＣＰ（Baersonら、Plant Mol. Biol.、２２（２）：２５５−２６７（１９９３））、ステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素（Slocombeら、Plant Physiol. １０４（４）：１６７−１７６（１９９４））、b−コングリシニンの大豆 a'サブユニット（大豆７ｓ、（Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci.、８３：８５６０−８５６４（１９８６）））およびオレオシン（例えば、Hongら、Plant Mol.Biol.、３４（３）：５４９−５５５（１９９７）参照）のごときかかる遺伝子からの５’調節領域を含む。さらなる例は、β−コングリシニン用のプロモーター（Chenら、Dev. Genet. １０：１１２−１２２（１９８９））および FAE用のプロモーター（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１１０６１）を含む。該種子中の発現のための好ましいプロモーターは、７Ｓおよびナピンプロモーターである。
【０１０３】
利用できるさらなるプロモーターは、例えば、米国特許第５,３７８,６１９号；同第５,３９１,７２５号；同第５,４２８,１４７号；同第５,４４７,８５８号；同第５,６０８,１４４号；同第５,６０８,１４４号；同第５,６１４,３９９号；同第５,６３３,４４１号；同第５,６３３,４３５号；および同第４,６３３,４３６号に記載されている。加えて、組織特異的なエンハンサーを用いることができる（Frommら、The Plant Cell １：９７７−９８４（１９８９））。
【０１０４】
また、構築体またはベクターは、注目する領域を持つ、その領域の転写を終止するために全てまたは部分的に作用する核酸配列を含み得る。多数のかかる配列は、Tr７ ３'配列およびNOS ３'配列（Ingelbrechtら、The Plant Cell １：６７１−６８０（１９８９）；Bevanら、Nucleic Acids Res. １１：３６９−３８５（１９８３））を含めて単離された。調節転写体終止領域は、同様に本発明の植物発現構築体において提供できる。転写体終止領域は、注目する遺伝子をコードするＤＮＡ配列または異なる遺伝子源から由来する簡便な転写終止領域、例えば、転写開始領域と天然で関連する転写終止領域により提供できる。当業者は、植物細胞中で転写を停止できるいずれの簡便な転写体終止領域も本発明の構築体に使用できると認識するであろう。
【０１０５】
また、ベクターまたは構築体は、調節エレメントを含み得る。かかるものの例は、Adh イントロン１（Callisら、GenesおよびDevelop. １：１１８３−１２００（１９８７））、スクロース合成酵素イントロン（Vasilら、Plant Physiol. ９１：１５７５−１５７９（１９８９））およびTMVオメガエレメント（Gallieら、The Plant Cell １：３０１−３１１（１９８９））を含む。これらのおよび他の調節エレメントは、適当な場合に含み得る。
【０１０６】
また、ベクターまたは構築体は、選択マーカーを含み得る。また、選択マーカーは、外来性遺伝物質を含む植物または植物細胞について選択するために用いることができる。かかるものの例は、限定されるものではないが、カナマイシン耐性をコードし、かつカナマイシン、ＲｐｔＩＩ、Ｇ４１８、ｈｐｔを用いて選択できるｎｅｏ遺伝子（Potrykusら、Mol. Gen. Genet.１９９：１８３−１８８（１９８５））；ビアラホス耐性をコードするbar遺伝子；変異体EPSP合成酵素遺伝子（Hincheeら, BiolTechnology ６：９１５−９２２（１９８８）；Reynaertsら、Selectable and Screenable Markers. GelvinおよびSchilperoort. Plant Molecular Biology Manual、Kluwer、Dordrecht（１９８８）；Reynaertsら、Selectable and Screenable Markers. GelvinおよびSchilperoort. Plant Molecular Biology Manual、Kluwer、Dordrecht（１９８８））、グリフォセート耐性をコードするaadA（Jonesら、Mol. Gen. Genet.（１９８７））；ブロモキシニルに対する耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子（Stalkerら, J. BIOL. CHEM. ２６３：６３１０−６３１４（１９８８））；イミダゾリノンまたはスルフォニル尿素耐性を与える変異体アセトラクテート合成遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許出願第１５４,２０４号（Sept. １１,１９８５））、ＡＬＳ（D'Halluinら, Bio/Technology １０: ３０９−３１４（１９９２））、およびメトトレキサート耐性DHFR遺伝子（Thilletら, J. Biol. Chem. ２６３：１２５００−１２５０８（１９８８））を含む。
【０１０７】
また、ベクターまたは構築体は、スクリーニング・マーカーを含み得る。スクリーニング・マーカーを用いて、発現をモニターできる。例示的なスクリーニング・マーカーは、その種々の色素産生性物質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはuidA遺伝子（GUS）（Jefferson, Plant Mol. Biol, REP. ５：３８７−４０５（１９８７）；Jeffersonら, EMBO J ６：３９０１−３９０７（１９８７））；植物組織中でアントシアニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするR−LOCUS遺伝子,（Dellaportaら, Stadler Symposium １１：２６３−２８２（１９８８））；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffeら, PROC. NATL. ACAD. SCI（U. S. A.）７５：３７３７−３７４１（１９７８））、その種々の色素産生性物質が知られている酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、色素産生性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Owら, Science ２３４：８５６−８５９（１９８６））；色素産生性カテコールを変換できるカテコールをコードするxylE遺伝子（Zukowskyら, Proc. Natl. ACAD. Sci.（U. S. A.）８０：１１０１−１１０５（１９８３））；α−アミラーゼ遺伝子（Ikatuら, Bio/Technol. ８：２４１−２４２（１９９０））；ＤＯＰＡおよびドパキノンにチロシンを酸化し、次いで、今度はメラニンに縮合できる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katzら, J. Gen. Microbiol. １２９：２７０３−２７１４（１９８３））；色素産生性α−ガラクトース基質を変化させるα−ガラクトシダーゼを含む。
【０１０８】
また、「選択またはスクリーニング・マーカー遺伝子」なる用語に含まれるのは、形質転換細胞を同定または選択する手段としてその分泌を検出できる分泌・マーカーをコードする遺伝子である。その例は、抗体相互作用により同定できる分泌可能抗原、またはさらに、触媒的に検出できる分泌酵素をコードするマーカーを含む。分泌蛋白質は、（例えば、ＥＬＩＳＡにより）検出可能である小さな拡散性蛋白質、細胞外溶液中で検出可能である小さな活性酵素（例えば、α−アミラーゼ、α−ラクタマーゼ、フォスフィノスリシン転移酵素）、または（伸長の発現単位またはタバコＰＲ−３において判明したごとき）細胞壁中で挿入または捕捉される蛋白質を含む。他の可能な選択および／またはスクリーニング・マーカー遺伝子は、当業者に明らかであろう。
【０１０９】
本発明の２以上の核酸分子は、単一構築体を用いて植物へ導入でき、構築体は１を超えるプロモーターを含むことができると理解される。該構築体が２つの核酸分子を発現するように設計された具体例において、２つのプロモーターは、（ｉ）２つの構成プロモーター、（ｉｉ）２つの種子特異的なプロモーター、または（ｉｉｉ）１つの構成プロモーターおよび１つの種子特異的なプロモーターであることが好ましい。好ましい種子特異的および構成プロモーターは、各々、ナピンおよび７Ｓプロモーターである。例示的な組合せを実施例５に記載する。２以上の該核酸分子は単一プロモーター、好ましくは、種子特異的または構成プロモーターを利用して物理的に連結させ、発現できる。
【０１１０】
さらに、本発明の２以上の核酸は、２以上の異なる構築体を用いて植物に導入できると理解される。あるいは、本発明の２以上の核酸を２つの異なる植物に導入でき、植物を２以上の核酸を発現する単一植物を生成するために交配できる。ＲＮＡｉ具体例において、そのセンスおよびアンチセンス鎖は、１つの構築体または２つの構築体上で同一植物に導入できると理解される。あるいは、センスおよびアンチセンス鎖を２つの異なる植物に導入でき、植物を交配して、センスおよびアンチセンス鎖の双方を発現する単一植物を生成できる。
【０１１１】
本発明の該核酸分子および構築体のいずれも、永久または一時的に植物または植物細胞に導入できる。本発明の好ましい該核酸分子および構築体は、その詳細な記載および実施例に前記されている。本発明のもう一つの具体例は、一般的に適当な細胞を選択し、組換えベクターで該植物または植物細胞を形質転換させ、次いで、形質転換された宿主細胞を得る工程を含むトランスジェニック植物を生成する方法に指向される。
【０１１２】
好ましい具体例において、該植物または細胞は、食用および産業使用のための植物油の製造に関連する植物またはその植物であるか、あるいはそれらから由来する。具体例に好ましいのは、熱帯油料種子植物作物である。注目する植物は、限定されるものではないが、菜種（カノーラおよび高エルカ酸の品種）、トウモロコシ、大豆、ハマナ、カラシナ、トウゴマの実、落花生、ゴマ、綿花、アマニ、紅花、油ヤシ、麻、ヒマワリおよびヤシを含む。本発明は、単子葉植物または双子葉植物種等に適用でき、新しいおよび／または改良された形質転換および調節技術に容易に適用できるであろう。
【０１１３】
植物細胞へのＤＮＡの導入についての方法および技術は、当業者によく知られており、実質的には、核酸分子が細胞に導入できるいずれの方法も本発明の使用に適当である。適当な方法の非限定の例は、化学的方法；微量注入法、電気穿孔法、遺伝子銃、微粒子銃、真空浸透のごとき物理的方法；ウイルスベクター；および受容体媒介機序を含む。また、細胞形質転換の他の方法を用いることができ、それは、限定されるものではないが、花粉への直接的なＤＮＡ移入による、植物の再生器官へのＤＮＡの直接的注入による、または未成熟胚の細胞へのＤＮＡの直接的注入後の乾燥胚の再水和による植物へのＤＮＡの導入を含む。
【０１１４】
Agrobacterium媒介移入は、植物細胞への遺伝子を導入するために広範囲に適用可能な系である。Fraleyら, Bio/Technology ３：６２９−６３５（１９８５）；Rogersら, Melhods Enzymol. １５３：２５３−２７７（１９８７）参照。移入されるＤＮＡの領域は、広範囲の配列により規定され、介在性ＤＮＡは、通常、植物ゲノムに挿入される。Spielmannら、Mol. Gen. Genet. ２０５：３４（１９８６）。近年のAgrobacterium形質転換ベクターは、E. coliならびにAgrobacterium中で複製でき、簡便な操作を可能とする。Kleeら、In：Plant DNA Infectious Agents、HohnおよびSchell（eds. ）、Springer−Verlag、New York、pp. １７９−２０３（１９８５）。
【０１１５】
単一植物プロトプラスト形質転換体から、または種々の形質転換された外植片からの植物の再生、発育および栽培は、当該技術分野においてよく知られている。一般的に、Maligaら、Methods in Plant Molecular Biology、Cold Spring Harbor Press（１９９５）；WeissbachおよびWeissbach、In：Methods for Plant Molecular Biology、Academic Press、San Diego、CA（１９８８）参照。本発明の植物は、育種プログラムの一部であり、それから生成でき、また、無配偶生殖を用いて再生できる。無配偶生殖植物の増殖は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許第５,８１１,６３６号参照。
【０１１６】
共抑制は、通常、内因性遺伝子の転写と同一の鎖の数のｍＲＮＡを転写できる相同性のセンス構築体の発現による特定の内因性遺伝子または遺伝子ファミリーの発現レベルにおける、通常、ＲＮＡレベルでの低下である（Napoliら、Plant Cell ２：２７９−２８９（１９９０）；van der Krolら、Plant Cell ２：２９１−２９９（１９９０））。共抑制は、細胞で判明した核酸配列に相同性である単一コピーの核酸分子（ProllsおよびMeyer、PlantJ. ２. ４６５−４７５（１９９２））、または細胞で判明した核酸配列に相同性である複数コピーの核酸分子（Mittlestenら、Mol. Gen. Genet.２４４. ３２５−３３０（１９９４））での安定な形質転換に起因する。相同的なプロモーターにたとえ異なって連結した遺伝子も、連結した遺伝子の共抑制を生じ得る（Vaucheret、C. R. Acad. Sci. III ３１６. １４７１−１４８３（１９９３）；Flavell、Proc. Natl.Acad. Sci.（U. S. A.）９１：３４９０−３４９６（１９９４））；van Bloklandら、Plant J. ６：８６１−８７７（１９９４）；Jorgensen, Trends Biotechnol. ８：３４０−３４４（１９９０）；MeinsおよびKunz、In：Gene Inactivation and Homologous Recombination in Plants、Paszkowski（ed. ）、pp. ３３５−３４８、Kluwer Academic、Netherlands（１９９４））（Kinney、Induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement、Proceedings of a Symposium １９−２３ June １９９５（ＩＡＥＡおよびＦＡの共催））、pages １０１−１１３（IAEA−SM ３４０−４９）。
【０１１７】
本発明の１以上の核酸は、適当なプロモーターを用いて植物細胞に導入し、転写でき、かかる転写の結果、内因性蛋白質の共抑制を生じる。
【０１１８】
アンチセンスアプローチは、遺伝物質を標的とすることにより遺伝子機能を防止または低下させる方法である（Molら、FEBS Lett. ２６８：４２７−４３０（１９９０））。アンチセンスアプローチの目的は、その発現をブロックし、変異体細胞系または生物体を創製するような標的遺伝子に相補的な配列を用いることであり、ここに、単一の選定された蛋白質のレベルは、選択的に低下または撤廃される。アンチセンス技術は、他の「逆遺伝学的」アプローチを超えるいくつかの有利さを有する。不活性化部位およびその発生効果は、アンチセンス遺伝子用のプロモーターの選定により、または外部適用または微量注入法のタイミングにより操作できる。アンチセンスは、標的遺伝子のユニークな領域または他の関連遺伝子に相同性を共有する領域のいずれかを選択することによりその特異性を操作できる（Hiattら、In：Genetic Engineering、Setlow（ed.）、Vol.１１、New York：Plenum ４９−６３（１９８９））。
【０１１９】
アンチセンスＲＮＡ技術は、細胞への標的ｍＲＮＡに相補的であるＲＮＡの導入を含み、その結果、特異的なＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖は、アンチセンス基質および標的ｍＲＮＡ間の塩基対形成により形成される（Greenら、Annu. Rev. Biochem. ５５：５６９−５９７（１９８６））。一つの具体例のもと、そのプロセスは、アンチセンス遺伝子配列の導入および発現を含む。かかる配列は、部分的または全ての通常の遺伝子配列を逆配向のプロモーター下に配置し、「誤った」または相補的な鎖を標的ｍＲＮＡとハイブリダイズし、その発現を干渉する非コードのアンチセンスＲＮＡに転写するものである（TakayamaおよびInouye、Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. ２５：１５５−１８４（１９９０））。アンチセンスベクターは、標準的な手順により構築され、限定されるものではないが、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法および感染を含めた方法により細胞へ導入される。形質転換のタイプおよびベクターの選定は、発現が一時的かまたは安定であるを決定するであろう。アンチセンス遺伝子に用いたプロモーターは、アンチセンス阻害のレベル、タイミング、組織、特異性または誘導能に影響し得る。
【０１２０】
また、細胞への二本鎖ＲＮＡの導入を用いて、内因性遺伝子の機能を崩壊できることが報告されている（Fireら、Nature ３９１：８０６−８１１（１９９８））。かかる崩壊は、例えば、Caenorhabditis elegansで示され、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉとしばしばといわれる（Fireら、Nature ３９１：８０６−８１１（１９９８））。C. elegans中の二本鎖ＲＮＡによる遺伝子発現の崩壊は、転写後機序により抑制を誘導すると報告されている。（Montgomeryら、Proc. Natl. Acad. Sci. ９５：１５５０２−１５５０７（１９９８））。また、二本鎖ＲＮＡによりサイレンシングする遺伝子の証拠は、植物についても報告されている。（Waterhouseら、Proc. Natl. Acad. Sci. ９５：１３９５９−１３９６４（１９９８））。また、Plasterk、Science ２９６：１２６３−１２６５（２００２）；Zamore、Science ２９６：１２６５−１２６９（２００２）参照。
【０１２１】
また、イントロンをスプライシングしたヘアピン構造を用いて、転写後の遺伝子抑制をもたらすことができる。（Smithら、Nature ４０７：３１９−３２０（２０００））。報告は、転写後の遺伝子スプライシングが、ヘアピン構造を持つイントロンスプライジングされたＲＮＡの使用によりほぼ１００％の効率で誘導できることを示す。（Smithら、Nature ４０７：３１９−３２０（２０００））。ＲＮＡスプライジングをもたらす代表的な方法は、本願と同時に出願された、発明者をJoAnne Fillattiとする「Intron Double Stranded RNA Constructs And Uses Thereof」と題する米国出願、アトニー整理番号１６５１８.０６９に記載されている。
【０１２２】
本発明の１以上の核酸は、転写後の遺伝子抑制のＲＮＡｉまたはもう一つの様式を達成するために改変できると理解される。
【０１２３】
また、本発明は、植物の器官、特に、再生または貯蔵器官を提供する。植物器官は、限定なくして、種子、内胚乳、胚珠（ovule）、花粉、根、塊茎、茎葉、茎、果実、液果、ナッツ（nut）、樹皮、鞘、種子および花を含む。本発明の特に好ましい具体例において、その植物器官は種子である。
【０１２４】
また、本発明は、１０％、より好ましくは２５％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは７５％または９０％を超える種子が本発明の植物から由来する種子である１０,０００、より好ましくは２０,０００、さらにより好ましくは４０,０００を超える種子の容器を提供する。
【０１２５】
また、本発明は、１０％、より好ましくは２５％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは７５％または９０％を超える種子が本発明の植物から由来する種子である１０ｋｇ、より好ましくは２５ｋｇ、さらにより好ましくは５０ｋｇを超える種子の容器を提供する。
【０１２６】
本発明のいずれの植物またはその器官も加工して、飼料、食事、蛋白質または油調製物を製造できる。この目的のための特に好ましい植物器官は、種子である。好ましい具体例において、該飼料、食事、蛋白質または油調製物は家畜動物またはヒト、または双方のために設計される。飼料、食事、蛋白質および油調製物の製法は、当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第４,９５７,７４８号、同第５,１００,６７９号、同第５,２１９,５９６号、同第５,９３６,０６９号、同第６,００５,０７６号、同第６,１４６、６６９号および同第６,１５６,２２７号参照。好ましい具体例において、該蛋白質調製物は、高蛋白質調製物である。かかる高蛋白質調製物は、好ましくは、５％ ｗ／ｖ、より好ましくは、１０％ ｗ／ｖ、さらにより好ましくは、１５％ ｗ／ｖを超える蛋白質含量を有する。好ましい油調製物において、該油調製物は、５％ ｗ／ｖ、より好ましくは、１０％ ｗ／ｖ、さらにより好ましくは、１５％ ｗ／ｖを超える本発明の植物またはその器官から由来する油含量を持つ高油調製物である。好ましい具体例において、該油調製物は、液体であり、１、５、１０または５０リットルを超える容量のものである。本発明は、本発明の植物から生成されるか、または本発明の方法により生成された油を提供する。かかる油は、酸化安定性の増強を示し得る。また、かかる油は、いずれかの得られた生成物の微量または主要な成分であり得る。さらに、かかる油は、他の油と混合できる。好ましい具体例において、本発明の植物から生成されたか、または本発明の方法により生成された油は、いずれかの生成物の容量または重量当たり０.５％、１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％または９０％を超える油成分を構成する。もう一つの具体例において、該油調製物は混合でき、容量当たり１０％、２５％、３５％、５０％または７５％を超える混合物を構成できる。本発明の植物から生成された油は、１以上の有機溶媒または石油蒸留物と混合できる。
【０１２７】
一つの具体例において、本発明の油は、５０％以上のオレイン酸および１５％以下の飽和脂肪酸である油組成を有する。もう一つの具体例において、本発明の油は、１０％以下の飽和脂肪酸である油組成を有する。もう一つの具体例において、本発明の油は、９％以下の飽和脂肪酸、８％以下の飽和脂肪酸、７％以下の飽和脂肪酸、６％以下の飽和脂肪酸、５％以下の飽和脂肪酸、４％以下の飽和脂肪酸、３.６％以下の飽和脂肪酸、３.５％以下の飽和脂肪酸または３.４％以下の飽和脂肪酸である油組成を有する。より好ましくい具体例において、本発明の油は、低飽和油組成を有し、もう一つの好ましい具体例において、本発明の油は、ゼロの飽和油組成を有する。
【０１２８】
もう一つの好ましい具体例において、本発明の油は、５０％以上のオレイン酸および１０〜１５％の間の飽和脂肪酸である油組成を有する。より好ましい具体例において、本発明の油は、７〜１０％の間の飽和脂肪酸、５〜８％の間の飽和脂肪酸、３.４〜７％の間の飽和脂肪酸、３.５〜７％の間の飽和脂肪酸、３.６〜７％の間の飽和脂肪酸、２〜４％の間の飽和脂肪酸、または３.４未満の飽和脂肪酸である油組成を有する。
【０１２９】
本発明のもう一つの好ましい具体例において、本発明の油は、パルミチン酸のレベルが少なくとも部分的に低下し、少なくとも実質的に低下し、または有効に消失する油組成を有する。もう一つの具体例において、本発明の油は、ステアリン酸のレベルが少なくとも部分的に低下し、少なくとも実質的に低下し、または有効に消失する油組成を有する。
【０１３０】
本発明の油が５０％以上のオレイン酸および１０％以下の飽和脂肪酸、好ましくは ５％以下の飽和脂肪酸、好ましくは３.６％以下の飽和脂肪酸、好ましくは３.５％以下の飽和脂肪酸、より好ましくは、３.４％以下の飽和脂肪酸である油を有するように、発現する場合にＦＡＴＢ遺伝子によりコード化された蛋白質および／または転写体の発現レベルを選択的に低下できる核酸配列の具体例において、核酸配列は、（１）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、その相補体およびそのいずれかの断片よりなる群から選択される核酸配列と、核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を持つ核酸配列；（２）大豆ＦＡＴＢイントロンにおいても見出される配列を含む核酸分子；および（３）（２）の核酸分子と、核酸分子の全長にわたって少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を持つ配列を示す核酸分子よりなる群から選択される。
【０１３１】
コンピューター可読媒体
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８に供されたヌクレオチド配列、その相補体およびそのいずれかの断片、または配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８に供されたヌクレオチド配列、その相補体およびそのいずれかの断片に、少なくとも５０％、６０％または７０％同一性、好ましくは、少なくとも８０％、８５％同一性、または特に好ましくは９０％または９５％同一性、または特に高度に好ましくは、９７％、９８％または９９％同一性のヌクレオチド配列は、使用を促すために種々の媒体において「提供する」ことができる。また、かかる媒体は、当業者が配列を調べるのを可能とする形態でそのサブセットを提供できる。
【０１３２】
この具体例の一つの適用において、本発明のヌクレオチド配列は、コンピューター可読媒体に記録できる。本明細書に用いた「コンピューター可読媒体」とは、コンピューターにより直接的に読込まれ、アクセスできるいずれかの媒体をいう。また、かかる媒体は、限定されるものではないが、フロッピーディスク、ハードディスク、記憶媒体および磁気テープのごとき磁気記憶媒体；ＣＤ−ＲＯＭのごとき光学記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのごとき電気記憶媒体；および磁気／光学記憶媒体のごときこれらのカテゴリーの混成物を含む。当業者は、現在知られたコンピューター可読媒体のいずれを用いても、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録したコンピューター可読媒体を含む製造物を創製できると容易に理解するであろう。
【０１３３】
本明細書に用いた「記録された」とは、コンピューター可読媒体上に情報を記憶するプロセスをいう。当業者は、コンピューター可読媒体上に情報を記録するための現在知られているいずれの方法も容易に採用して、本発明のヌクレオチド配列を含む媒体を生成できる。種々のデータ記憶構造を、当業者が本発明のヌクレオチド配列をその上に記録したコンピューター可読媒体を創製するために利用できる。データ記憶構造の選定は、記憶された情報にアクセスするための選定された手段に一般的に基づくであろう。加えて、種々のデータ処理プログラムおよび様式を用いて、コンピューター可読媒体上に本発明のヌクレオチド配列情報を記憶できる。該配列情報は、Word PerfectおよびMicorosoft Wordのごとき商業的に入手可能なソフトウエアにおいてフォーマットされた文書処理テキストファイル中で表すか、またはＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅ等のごときデータベースアプリケージョン中で保存されたＡＳＣＩＩファイルの様式で表すことができる。当業者は、容易に、本発明のヌクレオチド配列情報をその上に記録したコンピューター可読媒体を得るためにかなり多数のデータ処理構造様式（例えば、テキストファイルまたはデータベース）を適合できる。
【０１３４】
本発明の１以上のヌクレオチド配列を提供すると、当業者は、種々の目的のために配列情報に日常的にアクセスできる。コンピューターソフトウエアは、公的に入手でき、それは当業者がコンピューター可読媒体中で提供された配列情報にアクセスするのを可能とする。Sybaseシステム上でBLAST（Altschulら.、J Mol. Biol. ２１５：４０３−４１０（１９９０））およびBLAZE（Brutlagら.、Comp. Chem. １７：２０３−２０７（１９９３））検索アルゴリズムを実行するソフトウエアは、他の生物体からの非コード領域に対する相同性を含むゲノム内で本発明の非コード領域および他の核酸分子を同定するために用いることができる。かかる非コード領域を利用して、アミノ酸生合成、代謝、転写、翻訳、ＲＮＡプロセンシング、核酸および蛋白質の分解、蛋白質修飾およびＤＮＡ複製、制限、修飾、組換えおよび修復に用いる酵素のごとき商業的に重要な蛋白質の発現に影響できる。
【０１３５】
さらに、本発明は、本明細書に記載された配列情報を含むシステム、特に、コンピューターベースのシステムを提供する。かかるシステムは、本発明の核酸分子の商業的に重要な断片を同定するように設計される。本明細書に用いた「コンピューターベースのシステム」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するためのハードウエア手段、ソフトウエア手段、およびデータ記憶手段をいう。本発明のコンピューターベースのシステムの最小のハードウエア手段は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段およびデータ記憶手段を含む。当業者は、容易に、現在入手可能なコンピューター−ベースのシステムのいずれか１つが本発明の使用に適することを理解できる。
【０１３６】
前記のごとき本発明のコンピューター−ベースのシステムは、その中に検索手段を支持し、実行するために、本発明のヌクレオチド配列ならびに必要なハードウエア手段およびソフトウエア手段を保存したデータ記憶手段を含む。本明細書に用いた「データ記憶手段」は、本発明のヌクレオチド配列情報を保存でいるメモリー、またはその上に本発明のヌクレオチド配列情報を記録した製造物にアクセスできるメモリーアクセス手段をいう。本明細書に用いた「検索手段」とは、標的核酸または標的構造モチーフとデータ記憶手段内に保存された配列情報とを比較するためにコンピューター−ベースのシステム上で実行される１以上のプログラムをいう。検索手段を用いて、特定の標的配列または標的モチーフを対合させて本発明の配列の断片または領域を同定する。種々の公知のアリゴリズムは公的に開示され、検索手段を実施する種々の商業的に入手可能なソフトウエアが利用可能であり、本発明のコンピューター−ベースのシステムに用いることができる。かかるソフトウエアの例は、限定されるものではないが、MacPattern（EMBL）、BLASTINおよび BLASTIX（NCBIA）を含む。相同性検索を実施するための利用可能なアルゴリズムまたは実施化ソフトウエアパッケージの一つは、本コンピューター−ベースのシステムにおける使用に適合できる。
【０１３７】
標的配列の最も好ましい配列の長さは、約１０〜１００個のアミノ酸または約３０〜３００個のヌクレオチド残基である。しかしながら、遺伝子発現および蛋白質プロセシングに関与する配列断片のごとき本発明の核酸分子の商業的に重要な断片についての検索中に、標的配列はより短長であり得る。
【０１３８】
本明細書に用いた「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」とは、配列が標的モチーフの折りたたみに際して形成される３次元配置に基づいて選定されたいずれかの合理的に選択された配列または配列の組合せをいう。当該技術分野において知られた種々の標的モチーフが存在する。蛋白質標的モチーフは、限定されるものではないが、酵素活性部位およびシグナル配列を含む。核酸標的モチーフは、限定されるものではないが、プロモーター配列、ｃｉｓエレメント、ヘアピン構造および誘発性発現エレメント（蛋白質結合配列）を含む。
【０１３９】
かくして、本発明は、さらに、標的配列を受入れる入力手段、前記の検索手段を用いて同定された本発明配列の標的配列を保存するデータ記憶手段、およびその同定された相同性配列を出力するための出力手段を提供する。入力および出力手段用の種々の構造様式を用いて、本発明のコンピューター−ベースのシステムにおいて情報を入出力できる。出力手段についての好ましい様式は、標的配列または標的モチーフに対する相同性の程度を変更することにより本発明の配列の断片を評価できる。かかる提示は当業者に、種々の量の標的配列または標的モチーフを含み、同定された断片に含まれた相同性の程度を同定する配列のランキングを提供する。
【０１４０】
種々の比較手段を用いて、標的配列または標的モチーフと、データ記憶手段とを比較して、本発明の配列断片配列を同定できる。例えば、BLASTおよびBLAZEアルゴリズムを実行する実行ソフトウエア（Altschulら、J. Mol. Biol. ２１５：４０３−４１０（１９９０））を用いて、本発明の核酸分子内の非コード領域を同定できる。当業者ならば、公的に利用可能な相同性検索プログラムは、本発明のコンピューター−ベースのシステムのための検索手段として用いることができると容易に認識できる。
【０１４１】
以下の実施例は例示であり、何ら限定を意図するものではない。
【０１４２】
実施例
実施例１  ＦＡＴＢチオエステラーゼゲノム配列のクローニング
葉組織をAsgrow大豆品種Ａ３２４４から得、液体窒素中ですり砕き、使用まで−８０℃にて貯蔵する。６ｍｌのＳＤＳ抽出緩衝液（６５ｍｌの無菌ｄｄＨ２Ｏ、１００ｍｌ  １Ｍトリス−Ｃｌ ｐＨ８、１００ｍｌ ０.２５Ｍ  ＥＤＴＡ、５０ｍｌ ２０％ ＳＤＳ、１００ｍｌ ５Ｍ ＮａＣｌ、４μｌ ベータ−メルカプトエタノール）を２ｍｌの凍結／粉砕した葉組織に添加し、その混合物を６５℃にて４５分間インキュベートする。この試料を１５分毎に振盪し、２ｍｌの氷冷した５Ｍ酢酸カリウムを試料に添加し、試料を振盪し、次いで、氷上で２０分間インキュベートする。３ｍｌのＣＨＣｌ３を試料に添加し、試料を１０分間振盪する。
【０１４３】
試料を１０,０００ｒｐｍにて２０分間遠心し、上清を採取する。２ｍｌのイソプロパノールをその上清に添加し、混合する。次いで、試料を１０,０００ｒｐｍにて２０分間遠心し、上清を排出する。ペレットを２００μｌのＲＮＡ分解酵素中で再懸濁させ、６５℃にて２０分間インキュベートする。３００μｌの酢酸アンモニウム／イソプロパノール（１：７）を添加し、混合する。次いで、試料を１０,０００ｒｐｍにて１５分間遠心し、上清を捨てる。そのペレットを５００μｌの８０％エタノールですすぎ、空気乾燥させる。次いで、ゲノムＤＮＡのペレットを２００μｌ  Ｔ１０Ｅ１（１０ｍＭトリス：１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁する。
【０１４４】
第１の方法において、大豆ＦＡＴＢ ｃＤＮＡ配列を用いて、該遺伝子にわたる６種のオリゴヌクレオチド：Ｆ１（配列番号：１１）、Ｆ２（配列番号：１２）、Ｆ３（配列番号：１３）、Ｒ１（配列番号：１４）、Ｒ２（配列番号：１５）およびＲ３（配列番号：１６）を設計する。該オリゴヌクレオチドを単離した大豆ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅用のペア：ペア１（Ｆ１＋Ｒ１）、ペア２（Ｆ１＋Ｒ２）、ペア３（Ｆ１＋Ｒ３）、ペア４（Ｆ２＋Ｒ１）、ペア５（Ｆ２＋Ｒ２）、ペア６（Ｆ２＋Ｒ３）、ペア７（Ｆ３＋Ｒ１）およびペア８（Ｆ３＋Ｒ２）において用いる。ＰＣＲ増幅は、以下のごとく実施する：９５℃にて１０分間、１サイクル；９５℃にて１分間、５８℃にて３０秒間、７２℃にて５５秒間、４０サイクル；７２℃にて７分間、１サイクル。特にプライマーペア３、６および７からの３つのポジティブな断片を得る。各断片をベクターｐＣＲ２.１（Invitrogen）にクローニングする。クローニングは、ゲノム断片＃３にだけ成功し、それは確認および配列決定する（配列番号：１０）。
【０１４５】
３種のイントロンは、該ｃＤＮＡ配列：ゲノム配列（配列番号：１０）の塩基１０６〜塩基２１４にわたり、１０９ｂｐの長さのイントロンＩ（配列番号：２）；ゲノム配列（配列番号：１０）の塩基２８９〜塩基１１２５にわたり、８３７ｂｐの長さのイントロンＩＩ（配列番号：３）；およびゲノム配列（配列番号：１０）の塩基１６３５〜塩基１８０３にわたり、１６９ｂｐの長さのイントロンＩＩＩ（配列番号：４）に対するゲノム配列の比較により該大豆ＦＡＴＢ遺伝子において同定する。
【０１４６】
第２の方法において、Arabidopsis thaliana ＦＡＴＢ ｃＤＮＡおよびA. thalianaＦＡＴＢゲノム配列を大豆ＦＡＴＢ ｃＤＮＡと整列させ、大豆ＦＡＴＢイントロンの潜在的な位置を決定する。オリゴヌクレオチドを推定上の大豆イントロンに隣接して挟まれる配列について合成し、ゲノムＤＮＡを適当なプライマー対を用いて増幅する。さらに、４つのイントロンを、該ｃＤＮＡ配列に対する増幅したゲノム配列の比較により該大豆ＦＡＴＢ遺伝子中で同定する。これらの４種の大豆イントロン配列を、該ＦＡＴＢ遺伝子（配列番号：１）のゲノム配列を生成するために、大豆ｃＤＮＡ配列および３種の従前に単離された大豆イントロン配列と合わせる。単離された４つの新たなイントロンは次の通りである：ゲノム配列（配列番号：１）の塩基１９３９〜塩基２４６３にわたり、５２５ｂｐの長さのイントロンＩＶ（配列番号：５）を得るプライマーＦ１およびＲ１；ゲノム配列（配列番号：１）の塩基２５７８〜塩基２９６６にわたり、３８９ｂｐの長さのイントロンＶ（配列番号：６）を得るプライマーＦ２およびＲ２；ゲノム配列（配列番号：１）の塩基３１４０〜塩基３２４５にわたり、１０６ｂｐの長さのイントロンＶＩ（配列番号：７）を得るプライマーＦ３およびＲ４；ゲノム配列（配列番号：１）の塩基３３１４〜塩基３３９５にわたり、８２ｂｐの長さのイントロンＶＩＩ（配列番号：８）。
【０１４７】
実施例２  植物発現構築体
大豆ＦＡＴＢイントロンＩＩ配列（配列番号：３）をテンプレートとして部分的ＦＡＴＢクローン化ゲノムＤＮＡ配列（配列番号：１０）ならびにプライマー１８１３３（配列番号：１７）および１８１３４（配列番号：１８）を用いるＰＣＲを介して増幅する。ＰＣＲ増幅は、以下の通り実施する：９５℃にて１０分間、１サイクル；９５℃にて３０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間、２５サイクル；７２℃にて７分間、１サイクル。
【０１４８】
ＰＣＲ増幅の結果、８５４ｂｐの長さである産物（配列番号：１９）を得る。該ｐＣＲ産物を該ＰＣＲプライマーの５’末端に設計されたXhoI部位の方法によりセンス配向にて発現カセットｐＣＧＮ３８９２へ直接的にクローニングし、ｐＭＯＮ７０６７４（図２）を形成する。ベクターｐＣＧＮ３８９２は、大豆７ＳプロモーターおよびエンドウマメRBCS ３'を含む。次いで、ｐＭＯＮ７０６７４をNotIで切断し、FMVプロモーターにより調節されたCP４遺伝子を含むベクターのｐＭＯＮ４１１６４に連結させる（図３）。得られた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ７０６７８（図４）を本明細書に記載されたAgrobacterium方法を用いて大豆の形質転換に用いる。
【０１４９】
大豆ＦＡＴＢイントロンＩＩ配列（配列番号：３）を含む２つの他の発現構築体を創製する。ｐＭＯＮ７０６７４をNotIで切断し、ＦＭＶプロモーターにより調節されるＣＰ４遺伝子およびナピンプロモーターにより調節されるＫＡＳ  ＩＶ遺伝子を含むｐＭＯＮ７０６７５（図５）に連結する。得られた発現構築体ｐＭＯＮ７０６８０（図６）を本明細書に記載されたAgrobacterium方法を用いて大豆の形質転換に用いる。次いで、発現ベクターをSnaBIで切断し、７Ｓプロモーターにより調節されたセンス配向にてホホバ デルタ−９不飽和化酵素遺伝子の遺伝子融合で連結する（ｐＭＯＮ７０６５６；図７）。得られた遺伝子発現構築体ｐＭＯＮ７０６８１（図８）を本明細書に記載されたAgrobacterium方法を用いて大豆の形質転換に用いる。
【０１５０】
配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８のごとき他の大豆ＦＡＴＢイントロン配列を同様にクローニングする。適当なプライマーを所望のイントロン配列に基づいて設計する。これらのプライマー対を用いて、該ＦＡＴＢゲノム配列からイントロンを増幅する。増幅したイントロンを所望の発現ベクターに連結し、構築体を大豆に形質転換する。
【０１５１】
実施例３  植物の形質転換および分析
該大豆ＦＡＴＢイントロンの発現構築体を含む直線ＤＮＡ断片を、Martinellら、米国特許第６,３８４,３０１号の方法により大豆（Asgroｗ／品種Ａ３２４４）に安定に導入する。形質転換大豆植物は、グリフォセートを含む培地上での選択により同定する。
【０１５２】
脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーを用いて該イントロン発現構築体で形質転換された大豆系の種子から分析する。ｐＭＯＮ７０６７８を宿す植物のＲ１単一種子油組成は、該飽和および不飽和脂肪酸組成物が、トランスジェニック大豆系から種子の油において、形質転換されていない大豆からの種子のものと比較して、改変することを示す（表１）。特に、１６：０はトランスジェニック種子において低下する。選択は、所望の相対的な脂肪酸組成に依存してかかる系から作成できる。加えて、各イントロンが各脂肪酸のレベルを改変して、程度を変更できるので、イントロンの組合せは、所望の組成に依存して用いることができる。
【０１５３】
【表１−１】
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【０１５４】
【表１−２】
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【０１５５】
実施例４
ＲＮＡを、２つのＦＡＴＢイントロン抑制系からのホモ接合性Ｒ２および陰性対照（野生型種子および各イントロン抑制事象からの無分離個体からの種子）から単離する。これらのＲＮＡ試料を含むノーザンゲルを該ＦＡＴＢ ｃＤＮＡでプローブする。ＦＡＴＢ転写体レベルは、陰性対照に対し、イントロン抑制系においてかなり低下する。
【０１５６】
実施例５  ＦＡＴＢイントロン構築体
センスまたはアンチセンス配向にて１以上のＦＡＴＢイントロンを含む植物発現構築体を作成する。所望の脂肪酸効果を達成するために、２以上のＦＡＴＢイントロンを転写ユニットに合わせる。別法のアプローチにおいて、各ＦＡＴＢイントロンをそれ自身のプロモーター（単子葉）のコントロール下で発現させる。ＦＡＴＢイントロンが１つの転写ユニット（逆方向反復）、または１つがセンスイントロンを含み、かつ他方がアンチセンスを含む２つの発現カセットを用いてのいずれかにてdsRNAを生成できる場合に他の構築体を作成する。
【０１５７】
これらの構築体は、先に記載された方法により大豆（例えば、Asgrow／品種Ａ３２４４）に安定的に導入される。形質転換した大豆植物をグリフォセートを含有する培地上での選択により同定される。ガスクロマトグラフィーを用いて、該構築体で形質転換された大豆系からの種子の脂肪酸組成を決定する。加えて、いずれの構築体も、限定なくして、ＫＡＳ Ｉ、ＫＡＳ ＩＶおよび／またはデルタ−９不飽和化酵素を過剰発現するための配列を含めた他の注目する配列、ならびに異なる組合せのプロモーターを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１は、構築体ｐＣＧＮ３８９２の模式図である。
【図２】図２は、構築体ｐＭＯＮ７０６７４の模式図である。
【図３】図３は、構築体ｐＭＯＮ４１１６４の模式図である。
【図４】図４は、構築体ｐＭＯＮ７０６７８の模式図である。
【図５】図５は、構築体ｐＭＯＮ７０６７５の模式図である。
【図６】図６は、構築体ｐＭＯＮ７０６８０の模式図である。
【図７】図７は、構築体ｐＭＯＮ７０６５６の模式図である。
【図８】図８は、構築体ｐＭＯＮ７０６８１の模式図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005530506.tif 000020
【図７】
2005530506.tif 000021
【図８】
2005530506.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月15日(2005.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005530506000001.app
【国際調査報告】
2005530506.tif 000023
2005530506.tif 000024
2005530506.tif 000025