(57)【要約】本発明は、p53ヌル細胞におけるヒトT細胞白血病ウイルスI型（HTLV-1）Tax活性を有するポリペプチドをコードする外因性核酸の発現に起因して、DNA損傷剤へのそれらの細胞の感作が起こるという発見に基づく。従って、本発明は、p53ヌル細胞において細胞死を誘導する方法、そのようなDNA損傷剤に対する感受性を強化する方法、およびp53ヌル細胞の選択的細胞致死方法に関する。レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターは、p53ヌル細胞においてHTLV-1 Taxタンパク質を一過的に発現させ、それによって前記細胞を感作させることを可能にする本発明に適する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトT細胞白血病ウイルスI型Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を標的細胞に導入する段階、有効量の該ポリペプチドをその標的細胞において発現させ、それによって、該ポリペプチドを発現している標的細胞のDNA損傷剤に対する感度を強化する段階、および該ポリペプチドを発現している標的細胞にDNA損傷剤を投与し、それによって該細胞の生存率を低下させる段階を含む、標的p53ヌル細胞の生存率を低下させる方法。
【請求項２】
標的p53ヌル細胞が癌細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
DNA損傷剤が化学療法薬である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
化学療法薬が、エトポシド、アドリアマイシン、アムサクリン、アクチノマイシンD、VP16、カンプトテシン、コルヒチン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
DNA損傷剤が放射線照射である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
放射線照射が、γ線、X線、放射線同位元素の定方向送達、マイクロ波、またはUV線に該細胞を暴露することによって送達される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
核酸を含有するレトロウイルスベクターと腫瘍細胞を接触させることによって、該核酸を該細胞に導入する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
Taxポリペプチドをコードする核酸を導入する前に、患者から標的細胞を単離する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
DNA損傷剤と接触させる前に、Taxポリペプチドを発現している標的細胞を患者に再び導入する工程をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
標的細胞が患者体内に存在する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
標的細胞が患者体内に存在する場合、Taxポリペプチドをコードする核酸が腫瘍部位に導入される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
ヒトT細胞白血病ウイルスI型Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を患者の標的p53ヌル細胞に導入する段階、有効量の該ポリペプチドを該標的細胞において発現させ、それによって、該ポリペプチドを発現している標的細胞のDNA損傷剤に対する感受性を強化する段階、および該患者にDNA損傷剤を投与する段階を含む、DNA損傷剤に対する患者の感受性を強化するための方法。
【請求項１４】
標的p53ヌル細胞が癌細胞である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
DNA損傷剤が、エトポシド、アドリアマイシン、アムサクリン、アクチノマイシンD、VP16、カンプトテシン、コルヒチン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートからなる群より選択される化学療法薬である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
DNA損傷剤が放射線照射である、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
放射線照射が、γ線、X線、放射線同位元素の定方向送達、マイクロ波、またはUV線に該細胞を暴露することによって送達される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
核酸を含有するレトロウイルスベクターと標的細胞を接触させることによって、核酸が腫瘍細胞に導入される、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
Taxポリペプチドをコードする核酸を標的細胞に導入する前に、患者から標的細胞を単離することをさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項２１】
DNA損傷剤の投与前に、Taxポリペプチドを発現している標的細胞を患者に再び導入する工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
標的細胞が患者体内に存在する場合、Taxポリペプチドをコードする核酸を患者の腫瘍部位に導入する、請求項13記載の方法。
【請求項２３】
ヒトT細胞白血病ウイルスI型Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を患者の腫瘍細胞に導入する段階、有効量の該ポリペプチドを該腫瘍細胞において発現させ、それによって、DNA損傷剤に対する腫瘍の感度を強化する段階、および該腫瘍を該DNA損傷剤と接触させ、それによって該腫瘍を不活性化する段階を含む、その必要がある患者体内の腫瘍を不活性化する方法。
【請求項２４】
DNA損傷剤が、エトポシド、アドリアマイシン、アムサクリン、アクチノマイシンD、VP16、カンプトテシン、コルヒチン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートからなる群より選択される化学療法薬である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
DNA損傷剤が放射線照射である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
放射線照射が、γ線、X線、放射線同位元素の定方向送達、マイクロ波、またはUV線に該細胞を暴露することによって送達される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
ヒトT細胞白血病ウイルスI型Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を標的p53ヌル細胞に導入する段階、有効量の該ポリペプチドを該標的p53ヌル細胞において発現させ、それによって、DNA損傷剤に対する該細胞の感度を強化する段階、および該細胞にDNA損傷剤を投与する段階を含む、患者体内の標的p53ヌル細胞の細胞死を誘導する方法。
【請求項２８】
DNA損傷剤が、エトポシド、アドリアマイシン、アムサクリン、アクチノマイシンD、VP16、カンプトテシン、コルヒチン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートからなる群より選択される化学療法薬である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
DNA損傷剤が放射線照射である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
放射線照射が、γ線、X線、放射線同位元素の定方向送達、マイクロ波、またはUV線に細胞を暴露することによって送達される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
ヒトT細胞白血病ウイルスI型Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を標的p53ヌル細胞に導入する段階、有効量の該ポリペプチドを該標的p53ヌル細胞において発現させ、該細胞のDNA損傷剤に対する感度を強化する段階、および該細胞にDNA損傷剤を投与し、それに際して該p53ヌル細胞を選択的に死滅させる段階を含む、p53ヌル細胞を選択的に死滅させるための方法。
【請求項３２】
DNA損傷剤が、エトポシド、アドリアマイシン、アムサクリン、アクチノマイシンD、VP16、カンプトテシン、コルヒチン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートからなる群より選択される化学療法薬である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
DNA損傷剤が放射線照射である、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
放射線照射が、γ線、X線、放射線同位元素の定方向送達、マイクロ波、またはUV線に細胞を暴露することによって送達される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
ヒトT細胞白血病ウイルスI型Taxタンパク質をコードする核酸を含むレトロウイルスベクターをp53ヌル癌細胞に形質導入する段階、有効量の該Taxタンパク質を発現させて、該形質導入細胞をDNA損傷剤に対して感作させる段階、および該形質導入細胞にDNA損傷剤を投与し、それによって該形質導入細胞の細胞死を誘導することを含む、p53ヌル癌細胞において細胞死を誘導するための方法。
【請求項３６】
DNA損傷剤が化学療法薬である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
化学療法薬が、エトポシド、アドリアマイシン、アムサクリン、アクチノマイシンD、VP16、カンプトテシン、コルヒチン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートからなる群より選択される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
DNA損傷剤が放射線照射である、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
放射線照射が、γ線、X線、放射線同位元素の定方向送達、マイクロ波、またはUV線に細胞を暴露することによって送達される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
Taxタンパク質をコードする核酸を導入する前に、患者からp53ヌル癌細胞を単離する段階をさらに含む、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
DNA損傷剤と接触させる前に、Taxタンパク質を発現している標的細胞を患者に再び導入する工程をさらに含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
標的細胞が患者体内に存在する、請求項35記載の方法。
【請求項４３】
p53ヌル癌細胞が患者体内に存在する場合、Taxタンパク質をコードする核酸を腫瘍部位に導入する、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦に帰属すべき権利についての記録
本発明は、合衆国国立衛生研究所による承認番号CA76595の下、政府の援助を受けてなされたものである。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、2002年5月17日出願の米国特許仮出願第60/380,853号の優先権を主張するものである。前記出願は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００３】
ヒトT細胞白血病ウイルスI型（HTLV-1）は、成人T細胞白血病（ATL）およびHTLV-1関連ミエロパシー/熱帯性痙攣性不全対麻痺（HAM/TSP）と関連している（Gessain,A.ら、Lancet 2:407-410（1985）；Osame,M.,ら、Lancet 1:1031-1032（1986）；Poiesz,B.J.ら、Proc Natl Acad Sci USA 77:7415-7419（1980）；Yoshida,M.,L.ら、Proc Natl Acad Sci USA 79:2031-2035（1982））。CD4＋T細胞は、HTLV-1による感染の主な標的であり、その細胞形質転換プロセスは、大部分がそのウイルストランスアクチベータTaxの発現の結果であると考えられている（Yoshida,M.,Anne.Rev.Immunol.19:475-496（2001））。Taxは、5'の長い末端反復配列（LTR）との相互作用により、ウイルス転写を相互活性化するように機能する（Chen,I.ら、Science 229:54-58（1985）；Felber,G.ら、Science 229:675-679（1985）；Seiki,M.ら、EMBO J.5:561-565（1986））。加えて、Taxは、細胞成長に対する潜在的な影響力をもって様々な細胞プロモーターを活性化および/または抑制することができる（Franklin,A.A.ら、J.Biomed.Sci.2:17-29（1995）；Neuveut,C.ら、Prog Cell Cycle Res.4157-62（2000））。以前、Taxの発現は細胞ゲノムの安定性を低下させることが証明されており（Majone,F.ら、Virology 193（1）:456-9（1993）；Semmes,O.ら、Virology 217（1）:373-9（1996））、これが、ゲノムの不安定性を誘導することによってHTLV-1媒介細胞形質転換を促進することができるという推測を思いつかせた。
【背景技術】
【０００４】
Taxが全細胞ゲノムの完全性に対してどのように影響するかを判定するために、幾つかの研究が試みられた。提供された一つの説明は、β-ポリメラーゼ（Jeang,K.T.ら、Science 247（4946）:1082-4（1990））および増殖性細胞核抗原（PCNA）（Ressler,S.ら、Journal of Virology 71（2）:1181-90（1997））などの修復遺伝子産物の転写に対するTaxの直接的な作用を含む。これらの場合では、Taxは、同源の細胞プロモーターの転写を、それぞれ抑制または刺激した。もう一つの実現可能なメカニズムは、ゲノムの完全性をモニター/調節する細胞タンパク質とTaxの直接的相互作用を含む（Jin,D.Y.ら、Cell 93（1）:81-91（1998）；Majone,F.ら、J Biol Chem.275（42）:32906-10（2000）；Suzuki,T.ら、Virology 270（2）:291-8（2000））。このモデルの例の代表は、Taxが、HsMAD 1に結合すること（Jin,D.Y.ら、Cell 93（1）:81-91（1998））、従って、おそらく分子キレート形成により、紡錐体の集合/解集合およびM期までの進行を阻害することの立証である。Taxは、細胞周期に対して正と負、両方の作用があり、それらの各々が、ゲノムの不安定性の一因となり得る。細胞周期に対する正の効果には、キナーゼの活性化および細胞周期阻害剤の抑制が挙げられる（Neuveut,C.ら、Mol Cell Biol.18（6）:3620-32（1998）；Lemoine,F.J.ら、J Biol Chem.276:31851-31857（2001）；Iwanaga,R.ら、Oncogene 20:2055-2067（2001）；Schmitt,I.,ら、J Virol.72（1）:633-40（1998）；Santiago,F.ら、J Virol.73（12）:9917-27（1999）；Suzuki,T.ら、Virology 259（2）:384-91（1999））。細胞周期移動に対する負の作用は、c-myc機能の抑制（Semmes,O.ら、J Biol Chem.271（16）:9730-8（1996））または細胞周期阻害剤の活性化（Yoshida,M.,Anne.Rev.Immunol.19:475-496（2001））から生じ得る。これらの活性の全てが、まだ定義を与えられていないような共通の機能目的をもって、Taxに基づくものとされている。ゲノムの完全性に対して影響を及ぼすこれらの様々な直接効果に加えて、Taxは、調節タンパク質p53に対し、その報告されている活性によって、より包括的な作用を誘発し得る。
【０００５】
p53は、細胞ゲノム安定性の重要な調節因子である（Lane,D.,Nature 358:15-16（1992））。DNA損傷後にp53を導入すると、修復の活性化、細胞周期停止、およびアポトーシスをもたらすことができる（Levin,A.J.,Cell 88:323-331（1997））。細胞ゲノムの完全性の保存におけるp53の中心的な役割に鑑みて、p53の喪失または不活性化が、腫瘍形成性形質転換と因果関係があることは、意外なことではない（Donehower,L.A.ら、Biochem Biophys Res Commun.1155:181-205（1993）；Donehower,L.A.,Biochem Biophys Acta.13:171-176（1996））。幾つかの最近の報告は、Taxの発現が幾つかの提案されたメカニズムによりp53の不活性化をもたらすことを論証している。例えば、p53の不活性化は、セリン15（このタンパク質の転写活性化ドメイン（TAD）に位置する残基）の過リン酸化に関連していることが証明された（Pise Masison,C.A.ら.,Mol Cell Biol.20（10）:3377-86（2000））。加えて、他の研究所は、p53機能の阻害が、HLTV-1 Taxタンパク質によるCREB結合タンパク質（CBP）の鎮圧(squelching)によって生じ得ると報告している（Suzuki,T.ら、Oncogene 18:4137-4143（1999）；Van Orden,K.ら.,J Biol Chem.274（37）:26321-8（1999））。いずれにせよ、DNA修復とクローンの生存の両方に影響を与えることが予想されるp53の不活性化は、HTLV-1感染細胞のクローン発現を導く主要な事象の一つであり得る。
【０００６】
上述の研究は、p53転写のTax発現のメカニズムの理解に集中していた。さらなる幾つかの研究は、下流のp53機能に対するTax発現の影響を示唆している。これらのデータを要約すると、外因性p53の追加によってTax誘導修復欠陥を補うことができ（Kao,S.Y.ら、Oncogene 19（18）:2240-8（2000））、Tax発現p53ヌル細胞は、外因性p53の追加後、G1期で停止しない（Mulloy,J.C.ら、J Virol.72（11）:8852-60（1998））。Tax発現細胞の細胞ゲノムの不安定性の増大は、P53の欠陥から生じるのか、p53依存性メカニズムによって生じるのかを判定することが、明らかに必要である。一部のp53依存性活性には有用なモデルであるが、外因性p53の追加は、内在性p53媒介応答が機能的に損なわれないことには対処しない。さらに、Taxを発現している安定な系統は、Tax発現を補うように選択される/補うことに適合した細胞の変化を示す可能性が高く、直接的なTax作用を示すことはないだろう。
【０００７】
本発明によると、p53は、DNA損傷にさらされた細胞の一次減衰またはスイサイドを確実なものにすることを含む細胞の過成長を調節する種類の遺伝子産物であり、p53は、細胞成長、分化およびストレス応答の多くの局面を調節する多面発現機能を有することが観察された。それ故、癌の全症例のうちのほぼ半数は、p53遺伝子の欠失または後成的発現を伴う。さらに、p53機能の欠失は、宿主癌細胞の選択的破壊の点で治療をさらに著しく困難にする。これは、化学療法および放射線療法において用いられるようなアポトーシス誘発性ストレスシグナルに対する耐性の増加に主として起因する。非常に多くの治療アプローチが、p53機能の回復、p53非依存性アポトーシスの誘導および免疫活性化を中心に据えている。しかし、p53非依存性細胞方法論において過成長細胞の細胞死を達成するためのアプローチの開発が、必要とされ続けている。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、標的p53ヌル細胞の生存率を低下させる、または細胞死を誘導する方法に関する。本方法は、ヒトT細胞白血病ウイルスI型（HTLV-1）Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を標的細胞に導入することを含む。HTLV-1活性を有するポリペプチドは、標的細胞において有効量で発現させると、それによってDNA損傷剤に対するその標的細胞の感度を強化することができる。この要領で感作させたら、その標的細胞をDNA損傷剤(DNA damaging agent)と接触させるか、DNA損傷剤に暴露し、それによってその細胞の生存度を低下させるか、その死を誘導する。好ましくは、前記標的p53ヌル細胞は、癌細胞である。
【０００９】
本発明によると、DNA損傷剤は、エトポシド、アドリアマイシン、アムサクリン、アクチノマイシンD、VP16、カンプトテシン、コルヒチン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートなどの化学療法薬であり得る。または、DNA損傷剤は、放射線照射への暴露であり得る。そのような場合、放射線照射は、γ線、X線、放射線同位元素の定方向送達、マイクロ波、またはUV線に前記細胞を暴露することによって送達され得る。
【００１０】
この要領で処理した細胞は、HTLV-1 Taxポリペプチドをコードする核酸を導入する前に患者から単離してもよいし、しなくともよい。核酸を導入する前に細胞を単離する場合、細胞は、HTLV-1 Taxポリペプチドの発現に基づきDNA損傷剤に対して感受性になった後、患者に再び導入することができる。または、HTLV-1 Taxポリペプチドをコードする核酸を、標的p53ヌル細胞がある患者の部位に直接導入してもよい。
【００１１】
HTLV-1 Taxポリペプチドをコードする核酸を標的細胞に導入するための方法は、既知のあらゆる法式で行うことができ、好ましくは、その核酸を含有するレトロウイルスベクターによって導入される。さらに好ましくは、前記レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００１２】
本発明は、HTLV-1 Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を患者の標的p53ヌル細胞に導入すること、有効量の前記ポリペプチドをその標的細胞において発現させ、それによって、DNA損傷剤に対する前記ポリペプチドを発現している標的細胞の感受性を強化すること、およびその患者にDNA損傷剤を投与することを含む、DNA損傷剤に対する患者の感受性を強化するための方法にさらに関する。
【００１３】
加えて、その必要がある患者体内の腫瘍を不活性化する方法を提供する。この方法は、HTLV-1 Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を患者の腫瘍細胞に導入すること、有効量の前記ポリペプチドを前記腫瘍細胞において発現させ、それによって、DNA損傷剤に対する前記腫瘍の感度を強化すること、および前記腫瘍をDNA損傷剤と接触させ、それに際してその腫瘍を不活性化することを含む。
【００１４】
本発明は、p53ヌル細胞を選択的に致死させる方法をさらに提供する。この方法は、HTLV-1 Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を標的p53ヌル細胞に導入すること、有効量の前記ポリペプチドをそれらの標的p53ヌル細胞において発現させ、それによって、DNA損傷剤に対するそれらの細胞の感度を強化すること、およびそれらの細胞にDNA損傷剤を投与し、それに際してそれらのp53ヌル細胞を選択的に致死させることを含む。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、標的細胞において生存度を低下させる、または細胞死を誘導する方法に関する。本方法は、HTLV-1 Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸を標的細胞に導入することにより、標的細胞をDNA損傷剤に対して敏感にすることを含む。本発明によると、Taxだけで、標的細胞、特にp53ヌル細胞をゲノム不安定状態にさせて、適切な細胞周期チェックポイントヌクレオチド修復システムのバイパス形成により、tax発現細胞が正常な細胞損傷修復応答をできないようにすることが判明した。その後、そのような細胞をDNA損傷剤に暴露すると、細胞死が誘導される。好ましくは、前記標的細胞は、p53ヌル細胞である。
【００１６】
本明細書中で用いられる場合、本発明の「標的細胞」とは、細胞死を誘導するために選ばれた、不適切な細胞増殖を特徴とする細胞である。あらゆる細胞または細胞タイプを用いることができるが、好ましくは、前記細胞または細胞タイプは、腺癌、扁平上皮癌、胸部、膀胱、結腸、頭部、頚部などを含む器官の癌腫などの癌腫のような癌；軟骨肉腫、黒色肉腫などを含む肉腫；ならびに急性リンパ腫性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫などを含む白血病およびリンパ腫；ならびに自己免疫疾患を含む変性疾患に随伴するものである。好ましくは、前記標的細胞には、宿主癌細胞または腫瘍細胞が含まれ、T細胞を含むリンパ球、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、およびケラチノサイトを挙げることができる。好ましくは、標的細胞は、p53ヌル細胞である。本明細書中で用いられる場合、「p53ヌル細胞」は、p53を発現していないか、p53活性を欠く細胞を指す。例えば、幾つかの既知のヒト癌p53ヌル細胞として、HT1080線維肉腫（Andersonら、Genes,Chromosomes ＆ Cancer 9:266-281（1994）,Saos2 osteosarcoma（Subler and Martin,J.of Virology 68:103-110（1994））、NCI-H23非小細胞肺癌（Takahashiら、Cancer Research 52:2340-2343（1992））、およびRD横紋筋肉腫（Felixら、Cancer Research 52:2243-2247（1992））が挙げられる。しかし、本発明によるtax核酸の挿入のために単離される、または挿入の標的となる細胞におけるp53活性または発現は、既知の方法に従ってアッセイすることができる。それらの標的細胞は、哺乳動物、好ましくはヒト、ラットまたはマウスから単離される。
【００１７】
標的細胞は、形質転換細胞によるTaxのデノボ発現およびその後のDNA損傷剤への暴露により、細胞死が増大する（生存度が低下する）ことがさらに判明した。Taxの「デノボ発現」とは、形質転換前には標的細胞にTax発現がないことをいう。例えば、天然細胞、またはゲノムが安定な挿入などにより遺伝子修飾されいるか、別様に形質転換されている供給源から単離した初代細胞集団（Taxタンパク質を発現していないもの）を、本発明に従って用いることができる。従って、Taxのデノボ発現が、Tax発現に対する初期細胞応答を反映するに対し、長期的または安定的Tax発現系において発生する事象は、Tax発現に対する細胞の順応性を表すことができ、長期的なTaxの作用を反映し得ることが判明した。
【００１８】
同様に、形質転換標的細胞におけるTaxの発現は、時間に限りがある、すなわち、一過性であり得る。「一過性発現」とは、挿入された核酸がコードする遺伝子産物を、形質転換細胞が短期間、すなわち、細胞の増殖および伸長の間だけ発現することを示す。
【００１９】
標的細胞は、HTLV-1 Tax活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターで形質転換される。Taxは、既知のタンパク質であり、Taxをコードする核酸分子は、以前に開示されている（Seikiら、Science 228:1532-1534（1985））。例えば、Majorら、J.Gen.Virol.74（Pt 11）,2531-2537（1993）に記載されているようなTaxのアミノ酸配列（アクセッション番号S67443）およびTaxをコードするヌクレオチド配列（アクセッション番号GI45570）は、GenBankにおいて公的に入手可能である。しかし、本明細書での本発明は、Majorらの文献に開示されているTaxタンパク質および核酸に限定されない。当業者は、本発明で使用するために、Taxをコードする適する核酸を選択することができるだろう。本明細書中で用いられる場合、「核酸」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、1本鎖もしくは二本鎖DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド、またはヌクレオチドポリマーを指す。本発明によって提供されるTaxタンパク質をコードする核酸をcDNAフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てて、合成遺伝子を生じることができ、それは、組換え発現ベクターに挿入することができ、組換え転写単位において発現させることができる。
【００２０】
本発明によると、「HTLV-1 Tax活性を有するポリペプチド」は、HTLV-1 Taxを有するポリペプチドを発現している標的細胞をDNA損傷剤に対して敏感にさせる、HTLV-1 Taxの能力を有するポリペプチドを指す。好ましくは、コードされるポリペプチドは、HTLV-1 Taxタンパク質である。しかし、本発明は、p53ヌル細胞において発現された時にそのp53ヌル細胞をDNA損傷剤に対して感作させるHTLV-1 Tax由来のポリペプチドをコードする核酸の導入を提供することに注目される。特に、標的細胞のこの感作は、p53ヌル細胞に対して非常に選択的である。
【００２１】
好ましくは、tax核酸は、適する発現ベクター内に存在する。用語「発現ベクター」は、tax核酸の挿入または組み込みによって操作されたプラスミド、ウイルスまたは当技術分野において既知の他の溶剤を指す。Taxをコードするポリヌクレオチド配列は、機能するように発現制御配列に結合されていなけれはならない。「機能するように結合されている」とは、そのように記載された成分が、所期の方式で機能することができる関係にある近位を指す。機能するようにコード配列に結合されている発現制御配列は、そのコード配列の発現が、その発現制御配列と共存可能な条件下で達成されるようにライゲートされている。本明細書中で用いられる場合、用語「発現制御配列」は、機能できるように結合されている核酸配列の発現を調節する核酸配列を指す。発現制御配列は、その発現制御配列が、核酸配列の転写および適する場合には翻訳を制御および調節する時、機能するようにその核酸配列に結合されている。従って、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ATG）、イントロンのためのスプライシングシグナル、mRNAの適切な翻訳を可能ならしめる遺伝子の正しい読取り枠の維持、および停止コドンを含むことができる。用語「制御配列」は、その存在が発現に影響を及ぼし得る成分を最低限含み、且つ、その存在が都合がよい追加成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができると解釈される。発現制御配列は、プロモーターも含むことができる。
【００２２】
「プロモーター」とは、転写を命じるために充分な最小限の配列を意味する。プロモーター依存性遺伝子発現を、細胞タイプ特異的、組織特異的に制御できるようにするため、または外部のシグナルもしくは薬剤によって誘発できるようにするために充分なプロモーター要素も本発明に包含され、そのような要素は、その遺伝子の5'または3'領域に位置し得る。構成的プロモーターと被誘導性プロモーターの両方が、本発明に包含される（例えば、Bitterら、Methods in Enzymology 153:516-544（1987）参照）。哺乳動物の細胞系におけるクローニングの際、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインもしくは延長因子1αプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター；サイトメガロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター；モロニー肉腫ウイルスプロモーター）を用いることができる。組換えDNA法または合成手法によって生産されたプロモーターも、本発明の核酸配列の転写を生じるために用いることができる。
【００２３】
それに加えて、有用な発現ベクターは、所期の核酸配列の組み込み成功を確認するために用いることができる選択可能マーカーをさらに含むことができる。適する選択可能マーカーには、緑色蛍光タンパク質、抗生物質耐性体（アンピリシンおよびテトラサイクリン耐性体など）、ネオマイシン、ゾシン、ヒグロマイシン、ならびに劣性マーカー（チミジンキナーゼ（TK）、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）およびドロキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼなど）が挙げられ、従って、形質転換細胞を特定する簡単な手段となる。
【００２４】
前記ベクターは、好ましくは、導入された配列の一過性発現を達成するように構成される。例えば、tax核酸は、自発的複製ができない線状分子または共有結合性閉環状分子のいずれかであり得る非複製性DNA（またはRNA）分子として標的細胞に導入するために、プロモーターに機能するように結合させることができる。そのような場合、前記細胞によるTaxタンパク質の一過性発現が発生し得る。
【００２５】
好ましい態様では、本発明において用いられるパッケージング構成体は、vpuおよびenν産物を除く全てのウイルスタンパク質の発現を推進する、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターでLTRが置換されているHIV系プラスミドである。この構成体では、パッケージングシグナルは、この構成体のRNAがパーケージされないように除去される。遺伝子伝達ベクターは、RNAのパッケージングおよび逆転写に必要な全ての配列を含む。図8は、形質導入プラスミドベクターを示す図である。伝達ベクターは、revおよびtat依存性であり得る。第三プラスミドは、CMVプロモーターの制御下で発現された偽型VSV-Gを供給する。さらに、TaxおよびGFPを共発現できるように内在性リボソーム認識部位（IRES）配列が導入され、それ故、図8Dに示されているような生きているTax発現細胞を迅速に選択することができる。加えて、図8Eは、3つの異なる遺伝子産物を発現することができる二重IRESベクターを含む、本発明の範囲内のさらにもう一つの構成体を表す図である。この遺伝子送達系は、非常に高い割合の感染細胞を生じ、非増殖性細胞を感染させ得る。好ましくは、構成体pHRTaxiGFPは、生産されたパッケージング可能なRNAを含み、そのRNAを用いてリン酸カルシウム法により哺乳動物細胞を同時にトランスフェクト(cotransfect)して、複製欠陥ウイルス粒子を生じることができる。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、細胞は、tax核酸で形質転換されており、これは、その核酸を標的細胞に導入または挿入することによってなされる。核酸の「導入」は、細胞への外因性核酸分子のあらゆる挿入法を包含し、形質導入、トランスフェクション、微量注入、および標的宿主細胞のウイルス感染が挙げられるが、それらに限定されない。理想的には、遺伝子送達系の選択は、細胞特異的な方式での適切なレベルの遺伝子発現を伴い、有害反応は一切伴わない効率的な遺伝子伝達という目標に留意して、当業者によってなされる。例えば、HTLV-1 Taxタンパク質をコードするDNAでの哺乳動物細胞の形質転換は、そのTax DNA構成体を宿主細胞染色体DNAに挿入することが望ましいか否か、またはそれを染色体外形で存在させることが望ましいか否かによって、多数の異なるベクター系を用いて達成することができる。
【００２７】
ヌクレオチド配列をコードするHTLV-I Tax（およびそれらと機能的に同等なもの、および/またはそれらのハイブリッド、および/または突然変異体）を導入するための好ましい方法は、ウイルスベクターの使用によるものである。遺伝子伝達に適するウイルスベクターには、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）ベクターを含むレトロウイルスベクター（Millerら、Methods Enzymol.217:581-599（1993））、アデノウイルス誘導体ベクター（Erzurumら、Nucleic Acids Res.21:1607-12（1993）；Zabnerら、Nat.Genet.6:75-83（1994）；Davidsonら、Nat.Genet.3:219-223（1993））、アデノ関連ウイルス（AAV）ベクター（Flotteら、Proc.Natl.Acad.Sci.90:10613-7（1993））、およびヘルペスウイルスベクター（Andersonら、Cell Mol.Neurobiol.13:503-15（1993））が挙げられる。当業者には、他の適するウイルスを容易に選択し、利用することができる。他のDNA送達法には、リポソーム媒介遺伝子伝達が挙げられる（Altonら、Nat.Genet.5:135-42（1993）；Nabelら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:11307-11（1993））。哺乳動物細胞に遺伝子を導入するためのウイルスベクターの使用は、例えば、Varmus,Science 240（4858）:1427（1988）；Eglitisら、BioTechniques 6,7:608（1988）；Jaenisch,Science 240（4858）:1468（1988）；およびBernsteinら、Genet.Eng.（N.Y.）7:235（1985）にも総括されている。
【００２８】
ウイルス感染プロセスを活用することにより、レトロウイルスベクターを用いて遺伝子を効率的に標的細胞に伝達することができる。レトロウイルスゲノムに挿入されたまたはクローニングされた外来もしくは異種遺伝子は、レトロウイルスによる感染に対して感受性である標的宿主細胞に、効率的に送達することができる。周知の遺伝子操作により、レトロウイルスゲノムの複製能を破壊することができる。生じた複製欠陥ベクターを用いて、tax核酸を標的細胞に導入することができるが、それらのウイルスは、複製不能であろう。加えて、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系統を用いて、細胞からベクター粒子を組み立て、出現させることができる。「ベクター粒子」または「レトロウイルス粒子」は、ウイルス様メカニズムによって細胞に核酸を導入することができるウイルス様粒子を指す。本発明によると、標的宿主細胞に核酸を挿入することができるあらゆるレトロウイルスベクターを本発明で使用することができる。例えば、両栄養性モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、小水疱性口内炎ウイルスG-糖タンパク（VSV-G）偽型複製欠陥レンチウイルス（Naldini,L.ら、Science 272:263-267（1996））、または遺伝子送達用の他のあらゆる選択的もしくは非選択的ウイルスベクター。好ましくは、レンチウイルス形質導入系が使用される。
【００２９】
taxヌクレオチド配列が標的細胞に導入され、そこで発現されると、そのTaxタンパク質の発現によって、形質転換細胞がDNA損傷剤に対して過敏性になる。DNA損傷剤は、当技術分野において周知であり、例えば、化学療法薬および放射線照射が挙げられる。化学療法薬は、腫瘍細胞に選択的に作用する、化学療法で使用される化学薬品または薬物であり、エトポシド、アドリアマイシン、アムサクリン、アクチノマイシンD、VP16、カンプトテシン、コルヒチン、タキソール、シスプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートが挙げられる。加えて、放射線照射は、γ線、X線、放射線同位元素の定方向送達、マイクロ波、またはUV線を含む光子、電子、中性子または他のイオン化放射線に細胞、組織または器官を暴露することを意味する。感作細胞は、当技術分野において周知のように、それらの細胞に直接もしくは細胞付近に化学療法薬を送達することによって、またはそれらの感作細胞を放射線照射に暴露することによってDNA損傷剤に「接触させる」または「暴露する」。細胞致死を達成するために、DNA損傷剤は、標的細胞を選択的に致死させるために充分な量で送達される。
【００３０】
標的細胞の「選択的致死」は、tax核酸で形質転換されたp53ヌル細胞が、p53＋細胞または正常細胞を基準にして優先的にDNA損傷剤に感作されるという予想外の発見をいう。本発明によると、化学療法薬または放射線照射に暴露された形質転換p53ヌル細胞は、少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、さらに好ましくは少なくとも約70％、および最も好ましくは少なくとも約80〜100％の細胞死率を示す。特に、対照細胞（p53＋細胞）は、約2〜10％の量での化学療法薬または放射線照射への暴露により細胞死率を示した。従って、p53ヌル細胞におけるTax発現は、対照細胞と比較してこれらの細胞における細胞死率が高いという驚くべき結果をもたらすことがわかる。
【００３１】
通常の当業者は、細胞死の量を確認することができるであろう。例えば、細胞生存度を評価するための用量応答アッセイまたは細胞死の特徴であるDNAの断片化を判定するためのDNA抽出物のアガロースゲル電気泳動を利用して、細胞死の量を定量してもよい。加えて、クロマチンアッセイ、薬物耐性アッセイ（Loweら、Cell 74:957-967（1993））などの他のアッセイを利用して、感作する形質転換標的細胞に対するTaxの影響ならびにTaxおよび化学療法薬または放射線照射に対するそれらの応答を判定することもできる。
【００３２】
標的細胞へのtax核酸の導入により、患者を本発明に従って治療することができ、この場合、最初にその患者から標的細胞が単離してもよい。このように、標的細胞集団を当技術分野において既知の方法に従って単離し、tax核酸をその標的細胞に導入する。前記標的細胞は、Taxタンパク質をデノボ発現し、それによってTax発現細胞が細胞死に対して敏感になる。これらの細胞をトランスフェクトして患者に戻し、その後、その患者を化学療法または放射線照射に付して、細胞死を誘導する。
【００３３】
さらにもう一つの方法では、tax核酸を腫瘍部位に直接導入することができ、それが、その後、標的細胞に組み込まれることとなる。その後、その形質転換された細胞は、投与に基づき化学療法または放射線照射に次第に敏感になるだろう。従って、本発明は、化学療法または放射線照射に対する応答を強化するための方法にさらに関する。
【００３４】
さらに、本発明は、p53媒介機能が細胞、組織または器官の状態（不適切な細胞増殖または不適切な細胞存続が挙げられるが、これらに限定されない）に関連する細胞、組織または器官を治療するための方法を包含する。
【００３５】
上述の組成物および方法を説明する特定の実施例を参照することとする。それらの実施例は、好ましい態様を説明するために提供するものであり、それによって本発明の範囲を制限するためのものではないことは理解されるべきである。
【００３６】
実施例1
方法
レトロウイルス形質導入に使用したプラスミドは、Naldini,L.ら、Science 272:263-267（1996）および米国特許第6,428,953号および同第6,555,342号（これらは、参照として本明細書に組み入れられる）に以前記載されたとおり作成した。水疱性口内炎ウイルスのエンベロープタンパク質Gの生産には、pMD.Gを使用した。PCMV（Δ）8.2が、パッケージング構成体であり、それをヒト免疫不全ウイルスgag、pol、およびenν領域の生産に使用した。送達構成体pHRTaxは、tax ORF（GenBank番号S67443；アクセッション番号GI455730）をpHRCMVのXho IおよびBgl II部位に挿入することによって作成し、「パッケージ可能な」ウイルスRNAを生産した。pHRTaxiGFPおよびpHRGFPは、Tax-GFPおよびGFPパッケージ可能RNAの両方を生産した。pRSV-CATは、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーターの制御下でcat（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）レポーター遺伝子を含有するものであり、pMSV-Lucは、MSV（モロニー肉腫ウイルス）プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するものであった。REF52（ラット胚線維芽細胞）細胞系統は、Thomas Parson（University of Virginia）からプレゼントとして提供されたものであり、p53-/-細胞系統は、Bert Vogelstein（Johns Hopkins University）からのプレゼントであり、XP-A（色素性乾皮症相補性群A）細胞系統GM04429は、Coriell Cell Repositories（NIGMS）から入手した。それらの細胞を、10％ウシ胎仔血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するIscoveのダルベッコ変性培地（GibcoBRL）中、37℃で維持した。アミノ酸104から120のTaxタンパク質（GI455730に対応する；アクセッション番号AAP14011）に対して抗Taxウサギポリクローナル抗体を生じさせ、同ペプチドを用いてアフィニティ精製した。p53（DO-1）およびp21（F-5）に対する抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。抗BrdU（BU-3）は、Sigmaから購入した。
【００３７】
免疫ブロット分析
約2×106の細胞を回収し、タンパク質を200μLのM-Per Mammalian Protein Extraction Reagent（Pierce）で抽出した。50μLの4×Laemmli緩衝液をその溶解産物に添加した。その溶解産物30μLを10％SDSポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけた。タンパク質を、Immobolin-P membrane（Millipore）に電気ブロットし、示した一次抗体と適切な二次アルカリホスファターゼ接合抗体でプローブした。Western Star化学発光タンパク質検出（Tropix）によって免疫反応性を検出した。
【００３８】
宿主細胞回復アッセイ法
UVチャンバ-GS Gene Linker（Bio-Rad）を使用し、1000j/m2のUV-C線に暴露することによって、pSV2-CATレポータープラスミドをエキソビボで損傷させた。4μgのUV被照射または未照射pSV2-CATプラスミドと共に非損傷レポータープラスミド（pMSV-Luc）を用い、且つ、Taxプラスミドを用いてまたは用いずに、REF52およびXP-A細胞をトランスフェクトした。リン酸カルシウムトランスフェクションの四十八時間後、細胞をペレットにし、250mMのTris（pH8.0）250μLに浮遊させた。ルシフェラーゼアッセイのために、その全細胞抽出物の25μLを50μLのルシフェラーゼ基質に添加した。照度計でルシフェラーゼ活性を定量した。記載されている（Semmes,O.ら、J Virol.66（12）:7183-92（1992））とおり、同細胞で並行してCatアッセイを行った。Cat活性を同抽出物のルシフェラーゼ活性に対して正規化した。未照射pSV2-CATで同時にトランスフェクトした細胞からのcat活性を100％に正規化するように設定することにより、修復活性を計算した。被照射pSV2-CATで同時にトランスフェクトした複製細胞(duplicate cell)の修復活性を、その活性のパーセンテージとして報告した。
【００３９】
包括的ヌクレオチド除去修復アッセイ法
REF52細胞をカバーガラスに接種し、形質導入して、Taxを集密度25％で発現させた。やや集密なTax発現REF52細胞を、0.5％血清中で48時間培養して、G0で同調させた(sychronize)後、放射線照射した。完全培地の添加によって、細胞をG0から解放した。開放の4時間後、UVチャンバ-GS Gene Linker（Bio-Rad）を使用し、細胞にUV線（20j/m2）を照射し、10μM BrdU含有培地と共に30分間インキュベートした。その後、それらの細胞をPBSで4回洗浄し、4％のp-ホルムアルデヒド中で固定した。それらの細胞を100％メタノール中で2分間インキュベートすることによって透過性にし、PBSで4回洗浄した。準備した細胞を、その後、PBS（2％BSA含有）中で抗Taxと抗BrdUの両方と反応させた。PBS中1％のTween 20（PBS-Tween）で4回洗浄することによって、一次抗体を除去した。二次接合抗体を1時間、室温（RT）で反応させた。その後、それらの細胞をPBS-Tweenで洗浄し、それらのカバーガラスを、Vecta Shield（Vector Laboratories,CA）でスライドガラスに反転させた。G1の細胞核へのBrdUの組み込みは、不定期修復合成に相当するものであった。
【００４０】
ウイスル形質導入
Naldiniらが記載した（Naldini,L.ら、Science 272:263-267（1996））ようなレンチウイルス形質導入系を使用した。三つのプラスミド（pHRTaxiGFPまたはpHRGFP生産パッケージ可能RNA；pCMVΔ8.2生産gag、polおよび副遺伝子産物；ならびにpMD.G生産VSV G蛋白）をリン酸カルシウム法によって293/T17に同時にトランスフェクトして、複製欠陥ウイルス粒子を生じた。対照緑色蛍光タンパク質（GFP）生産ウイルス株を基準として、ウイルス力価を決定した。GFPの発現を緑色蛍光細胞のパーセントとして評価した。発現効率の上昇に対応付けられたp24の値の標準曲線を潜在感染単位の推定値として使用した。p24の値は、ウイルス上清の各バッチから導出した。
【００４１】
標的細胞を、無血清培地中、1mLあたり細胞数2〜3×105でプレーティングした。レンチウイルスベクター粒子を含有する上清を、1mLあたり感染単位数1×106に相当する濃度で添加した。それらの細胞を24時間インキュベートして、その後、洗浄し、48時間、インビトロで培養して、最大導入遺伝子発現を確保した。標的細胞におけるGFP発現を蛍光顕微鏡検査法によって分析した。
【００４２】
アポトーシス検査
Tax発現細胞を異なるUV線量（0、20および50j/m2）で処理し、形質導入後の異なる時点（4、8、12および24時間）で評価した。三源(triple source)蛍光標識、Vybrant Apoptosis Assay kit（Molecular Probes）をその製造業者の推奨に従って用いて、細胞を生きている集団、壊死集団またはアポトーシス集団に分けた。
【００４３】
細胞質分裂ブロック細胞周期進行アッセイ法
非同調細胞培養物をカバーガラスに接種して、UV線照射に暴露し、1時間放置して回復させた。サイトカラシンBを添加し、それらの培養物を36時間インキュベートした。それらのカバーガラスをp-ホルムアルデヒド/メタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで染色した。スライドガラスを準備し、細胞核を顕微鏡で検査した。二核細胞は、分裂と見なした。
【００４４】
フローサイトメトリー
細胞周期分析のために、細胞を迅速にEDTAですすいだ後、穏やかに掻き落とすことによって回収し、低速遠心分離によって濃縮して、PBSで1回洗浄し、冷70％エタノールで固定した。細胞をPI溶液（PBS 1X、RNアーゼ A［10μg/mL］、およびヨウ化プロピジウム［50μg/mL］）で染色し、その後、細胞選別分析を行った。得られたFACSデータをCellQuestソフトウエアで分析した。
【００４５】
ウイルス形質導入に起因して生じるTaxの効率的なデノボ発現
Taxのデノボ発現についてのウイルス形質導入効率を検査するために、REF52細胞を形質導入して、TaxとGFPまたはGFPのみを発現させた。TaxとGFPを発現する2シストロンのメッセージの送達に用いたpHRTaxiGFPベクター、およびGFPのみを発現する対応する対照ベクターを図1Aに示す。この系の形質導入効率は、結果として生じた被送達遺伝子発現の測定値として決定した。Tax発現REF52細胞を、TaxとGFP両方の2シストロン発現によって特定した。GFPを発現している細胞を50％生ずるレベルまでのウイスル上清の滴定によって、形質導入力価の終点測定値を得た。この定義により、典型的なウイルス力価は、上清を濃縮せずに1mLあたりの感染単位数1×106であった。標的細胞におけるTaxの発現を、ウエスタンブロッティングによって検証した。図1Bは、抗Tax抗体を使用したpHRTaxiGFP cDNAの形質導入後のTaxの発現を示すものである。このようにしてTaxとGFPの効率的な生産を達成した。それを、記載したウイルス媒介形質導入法を用いて定量することができる。
【００４６】
HTLV-1 Tax発現細胞が示すヌクレオチド除去修復欠陥
UV誘発DNA損傷に対するTax発現細胞の生物学的応答の検査において、効率的なヌクレオチド除去修復（NER）能力を試験した。宿主細胞回復アッセイ（HCRA）をTax発現REF52細胞のNER能力測定法として用いた。対照として、色素性乾皮症相補性群-A（XP-A）細胞系統GM04429および同系統の非XP細胞GM00010Bの示差修復能力を検査した。HCRAにおいてNER能力を検査した時、XP-A細胞系統は、非XPA細胞GM00010Bと比較して有意に低い修復能力を示した（図2A）。Tax発現REF52細胞を、対照GFP発現REF52と比較すると、Tax発現細胞はNER能力が有意に低かった（図2B）。このように、HCRAによって測定したところ、Taxの発現に起因してNER能力の低下が生じた。
【００４７】
HTLV-1 Tax発現細胞における細胞周期停止およびアポトーシス誘導
修復に加え、少なくとも二つの重要な事象が、UV誘発細胞DNA損傷応答において発生した。これらは、細胞周期停止の開始およびアポトーシスの誘導である。細胞周期停止およびアポトーシスを被るTax発現REF52細胞の能力を評価した。Tax発現細胞および対照細胞をUV照射に供し、アポトーシス事象および細胞周期プロフィールについて検査した。UVに暴露する前に、非アポトーシス細胞、アポトーシス細胞および壊死細胞の割合を検査した。Vybrantアッセイを用いてこれら三集団を特定した。UVが不在の場合、Tax発現細胞は、対照REF52およびXP-A細胞と同様、低い割合のアポトーシス細胞を示した（図3；-UV）。UV暴露後、REF52とTax発現REF52の両方が、適度のアポトーシス増加によって示されるようなDNA損傷に対する正常なアポトーシス応答を示した。GM00010Bを含む幾つかのTax発現細胞を用いて同じ結果が見られた（データは示さない）。しかし、NER修復欠陥XP-A細胞は、予想通り有意なアポトーシス応答の増加を示した（図3；＋UV）。このように、Tax発現細胞は、NER欠陥細胞から予想されるより非常に保存的である正常なアポトーシス反応を示した。
【００４８】
次に、Tax発現細胞の細胞周期応答を測定した。REF52細胞およびREF＋Tax細胞を、前記細胞質分裂ブロック細胞周期停止アッセイに供して、損傷誘導チェックポイントが損なわれていないことを判定した。このアッセイでは、非同調細胞をUVに暴露し、1時間後、サイトカラシンBと共にインキュベートした。36時間後にその細胞集団を検査し、分裂事象を評価した。停止できなかった細胞は、二核細胞として現われたが、Mの前に停止するものは、単核細胞として現れるあろう。予想通り、UV線に暴露しなかった細胞は、分割し続け、98％より多い二核細胞を生じた。対照的に、UV線に暴露したREF52細胞は、細胞周期停止を開始し、優勢に（＞90％）単核細胞集団を生じた。しかし、UVに暴露したTax発現REF52細胞は、ほぼ75％の集団を二核細胞として生じた。これは、UV誘発DNA損傷に応答して細胞周期を停止できなかったことを示す。データ点ごとに1000の細胞を分析した。UVに暴露していないTax発現細胞は、二核細胞を示すTax不在の場合と同じプロフィールを示した。全体として、これらの結果は、Tax発現細胞、初期アポトーシス応答は損なわれていないが、細胞周期を停止できないことを示唆している。
【００４９】
Tax発現細胞の包括的ヌクレオチド除去修復は、G1同調細胞では正常
損傷により誘導された細胞周期停止の失敗によって、修復効率の低下が生じることとなり、また、Tax関連NER欠陥を説明することができた。これは、Tax発現細胞における実際のNER経路が損なわれていないことを意味し、これによって、コンピテント細胞周期停止の回復がNER能力を回復させることが予測できた。この仮説を検証するために、G1同調細胞において包括的NERを検査した。REF52と混合したTax発現REF52細胞を、72時間の血清飢餓によりG0に蓄積させた。その後、それらの細胞をG0から解放し、4時間放置してG1に進めた。その後、それらの細胞をUVに暴露し、BrdU-dUTPと共にインキュベートした。BrdUの組み込みは、G1の間に不定期なDNA合成を受ける細胞に限られる。その後、細胞を固定し、抗Taxウサギポリクローナル抗体および抗BrdUマウスモノクローナル抗体で免疫染色した。二次抗体は、それぞれ、抗ウサギテキサスレッドおよび抗マウスFITC接合抗体であった。不定期DNA合成は、UV暴露細胞ではNER媒介修復合成に直接関連していた。これらの条件下でのTax発現細胞におけるUV誘発不定期DNA合成は、対照細胞と見分けがつかなかった。REF52およびREF＋Taxは、両方とも、UV照射後、不定期DNA合成を積極的に受けた。UVに暴露されていない細胞は、BrdUを組み込まず、S期以外での同調化の成功を示した。REF52およびREF＋Taxについては、いずれも、UV不在の状態では不定期DNA合成が観察されなかった。形質導入効率は、REF52およびREF＋Tax細胞を隣接して見らることができるように、25％にした。合計25の隣接事象を検査した。このように、G1同調性Tax発現細胞におけるNERは、損なわれておらず、G1停止細胞におけるTax発現細胞の除去修復は、正常である。
【００５０】
Tax発現細胞におけるUV暴露に応答したp53の安定化およびp21の導入
細胞周期停止のUV修復応答および活性化の開始において重要な役割を果たすのが、p53である。UV線に暴露された細胞の核へのp53の蓄積が、p53の活性化のしるしである。Tax発現細胞が、この初期p53応答を示すか否かを検査するために、REF52細胞に最適以下のウイルス力価を形質導入して、推定50％の形質導入効率を生じた。それらの細胞をUVに暴露し、p53の核発現について検査した。Tax発現REF52細胞は、Taxを発現していない、UV処理した同じREF52細胞と比較した時、UV損傷に応答して強いp53核蓄積を示した（図4A）。UVに暴露していないREF52細胞は、p53の核蓄積を示さなかった（データは示さない）。これらの結果は、p53活性化の初期段階の一つ、核蓄積が、Tax発現細胞では損なわれていないことを証明している。
【００５１】
Tax発現細胞におけるp53応答をさらに分析するために、Tax発現細胞と対照REF52細胞の両方を、定常状態のp53の安定化およびp21の一過性誘導について検査した。p21の誘導は、p53媒介細胞周期停止における重要な事象であるので、Tax発現細胞におけるp21レベルの分析によって、このシグナルの完全性を判定することができた。Tax発現細胞および対照細胞をUVに暴露し、ウエスタン分析のために、暴露前、暴露後8時間および24時間の時点で回収した。UV誘発DNA損傷に応答して、両方の細胞群が、p53の定常状態タンパク質レベルの安定化を示した（図4B）。同細胞のp21発現についての検査は、Tax発現細胞と対照細胞の間で類似したp53誘導一過性p21誘導を示した（図4C）。従って、細胞周期停止に関する一つのp53依存性シグナル、p21の一過性誘導は、損なわれていなかった。
【００５２】
p53-/-Tax発現細胞におけるG1チェックポイントのアテニュエーション
上の実験の結果は、Tax発現細胞の修復能力の欠如が、細胞周期チェックポイントの欠陥に起因すること、およびこの欠陥が、p53シグナリングに依存しないことを示唆していた。この仮説を検証するために、Tax発現細胞および対照p53-/-細胞において細胞周期停止応答を検査した。Tax発現細胞群および対照ヒーラ細胞群を上で説明したような細胞質分裂ブロック細胞周期進行アッセイに供した。各細胞群をUVに暴露し、1時間後にサイトカラシンBと共にインキュベートした。36時間後、それらの細胞を二核分裂細胞の存在について検査した。各細胞群をUVに暴露し、1時間後にサイトカラシンBと共にインキュベートした。36時間後、それらの細胞を二核分裂細胞の存在について検査した。ヒーラ細胞は、形質導入して、効率25％でTaxを発現させた。抗Taxマウスモノクローナル抗体およびFITC接合抗マウス二次抗体を使用して、免疫蛍光法により、Tax発現ヒーラ細胞を特定した。核は、ヨウ化プロピジウムで染色した。ヒーラおよびTax発現ヒーラは、二核を形成し、正常な分裂を示した。UVに暴露すると、ヒーラ細胞は、単核細胞として停止したのに対し、Tax発現細胞は、分裂し続け、二核細胞を形成した。同様の結果が、p53欠失細胞系統で得られた。細胞集団に形質導入して、効率100％でTaxを発現させた。Tax発現p53d細胞は、UVに応答して停止ができず、二核細胞を形成した。Taxの部分形質導入を用いる実験において、100対の隣接Tax発現および非発現細胞を検査した。形質導入100％のTaxを用いる実験では、1000の細胞事象をカウントした。二核対照細胞の割合は、15％未満であり、二核Tax発現細胞の割合は、72％より大きく、前記2つのアプローチの間には有意な差がなかった。
【００５３】
それらの結果は、p53-/-バックグラウンドにおけるTax発現細胞が、DNA損傷細胞周期停止応答を生じることができないことを示していた。これは、Taxを発現しているp53「機能抑制」またはp53「欠失」細胞系統にあてはまった。Taxを発現していないp53抑制およびp53欠失細胞系統は両方とも、他の場所で報告したように効率的な細胞周期停止を示した。従って、細胞周期停止の失敗は、p53の存在には依存せず、p53非依存性DNA損傷応答の欠陥の証拠である。
【００５４】
細胞周期停止の失敗が、G1チェックポイントの欠陥に依存するか否かを判定するために、血清飢餓により細胞をG0で同調させた。その後、それらの細胞を、UV処理後に20％血清中で培養して、細胞周期への復帰を刺激した。上で説明したとおりの全DNA含量により、細胞周期を判定した。Tax発現細胞は、G1を離れる細胞の割合の一貫した、有意な増加を示した（図5）。これは、野生型または欠失p53バックグラウンドにあてはまった。従って、細胞周期停止の失敗は、少なくとも一部はG1停止の失敗に起因する。
【００５５】
Tax発現p53細胞はUV処理に過敏
Tax発現細胞が、p53に依存しない方式で損傷応答欠陥を示す場合、p53を欠失した細胞とTaxを発現している細胞の両方が、UVに応答してアポトーシス細胞死をより受けやすくなると推論された。この仮説を検証するために、Tax発現細胞と対照p53-/-細胞の両方のアポトーシス応答を検査した。Tax発現細胞および対照細胞を亜致死量のUVに暴露し、処理の24時間後、生存細胞の割合を検査した。p53＋/＋またはp53突然変異体バックグラウンドにおけるTax発現は、生存細胞の割合が適切な対照細胞より低くないことを示した。しかし、p53-/-バックグラウンドにおけるTax発現は、UV暴露に応答して有意な細胞死を生じた（図6）。
【００５６】
Tax発現p53-/-細胞の初期アポトーシス応答も観察された。この系列の実験では、細胞群を0J/m2、20J/m2および50J/m2に暴露し、12時間および24時間の時点でアポトーシスを測定した（図7）。Tax発現細胞では、対照p53-/-細胞においてアポトーシスの誘発をわずかしか生じなかった線量のUVに応答して、有意なアポトーシスが各時点で見られた。このレベルのUV誘発アポトーシスは、NERに欠陥がある細胞で見られるものと同等である（図3）。
【００５７】
考察
HTLV-1媒介細胞形質転換を説明する最も人を納得させる仮説の一つは、Tax発現がゲノム不安定を誘導するというものである。そのようなモデルでは、ウイルス誘導性ゲノム不安定が、白血病誘発を支持するために必要な個々の遺伝子変化を獲得する可能性を増大させる。Tax誘導性ゲノム不安定に関する初期の報告は、細胞ゲノムの完全性が損なわれると、染色体異常誘発性および異数体誘発性、両方の遺伝子損傷の蓄積が生じることを示唆した（Majone,F.ら、Virology 193（1）:456-9（1993）；Semmes,O.ら、Virology 217（1）:373-9（1996））。標的細胞においてゲノムが不安定な状態をTaxが単独で誘導するという説得力のある証拠があるが、このプロセスの正確なメカニズムは、わかっていない。
【００５８】
Tax発現が損傷したDNA（染色体異常誘発性損傷）のレベルを上昇させる方法についてのメカニズムのモデルは、DNA損傷の蓄積を導くこととなる修復応答の欠陥を中心としたものであった。分子レベルでは、これは、β-ポリメラーゼなどの修復酵素の直接的な転写の欠陥によって（Jeang,K.T.ら、Science 247（4946）:1082-4（1990））、またはPCNA転写の刺激として（Ressler,S.ら、J.Virol.71（2）:1181-90（1997））発生し、それぞれ、塩基除去修復（BER）とヌクレオチド除去修復（NER）の両方における欠陥に関連すると考えられている。Tax発現細胞におけるBER機能は、十分に検査されてきたが、Taxによる発現に対するPCNAの影響は、宿主細胞回復アッセイ（HCRA）で測定して、NER活性の低下に関連付けられた（Kao,S.Y.ら、J Virol.73（5）:4299-304（1999））。
【００５９】
様々な腫瘍抑制遺伝子の抑制が、Tax形質転換を媒介することも提案されており（Yoshida,M.,Annu.Rev.Immunol 19:475-496（2001））、実際、腫瘍抑制遺伝子の突然変異は、ATL細胞では一般的である（Hatta,Y.ら、Blood 85（10）:2699-704（1995）；Hatta,Y.ら、Br J Haematol.99（3）:665-7（1997）；Nishimura,S.ら、Leukemia 9（4）:598-604（1995）；Sakashita,A.ら、Blood 79（2）:477-80（1992））。この考察の中心は、p53転写機能の欠陥をTax媒介形質転換プロセスに関連付ける幾つかの最近の報告である（Pise Masison,C.A.ら、Mol Cell Biol.20（10）:3377-86（2000）；Van Orden,K.ら、J Biol Chem.274（37）:26321-8（1999））。ある研究では、外因性p53の過発現が、Tax発現細胞のNER能力の欠陥を回復させた（Kao,S.Y.ら、Oncogene 19（18）:2240-8（2000））。これらの研究は、p53機能の損失が、非効率的な修復プロセスを導くことが関係している。しかし、p53ノックアウトの試験は、修復能力が低下した場合に期待されるような、突然変異率の上昇を示さなかった（Griffiths,S.D.ら、Oncogene 14:523-531 1997））。一般に、p53の初期喪失は、突然変異事象後の改善されたクローン生存に関連していた。興味深いことに、p53 ATLLを検査しても、より高い突然変異誘発率の証拠はなかった（Takemoto,S.ら、Blood 95:3939-3944（2000））。しかし、デノボTax発現は、酵母菌におけるcan耐性によって測定されるような（Semmesら、HTLV-1 Tax and loss of genetic integrity.Molecular Pathogenesis of HTLV-1:a current perspective,ed.O.Semmes and M.Hammarskjold.1999,Arlington:ABI Professional Publishing.205）、また、哺乳動物細胞におけるhrpt耐性で証明されるような（Miyake,H.ら、Virology 253（2）:155-61（1999））突然変異率の上昇をもたらした。従って、突然変異頻度の増加に随伴する「初期」Tax誘導性ゲノム不安定は、新に生じたクローンのクローン生存に寄与するp53機能の喪失によって表される「後」期に先立つものであり得る。実際、これら二つの期は、相互依存性である可能性が高い。
【００６０】
本発明に従って以前の観察を確認し（Kao,S.Y.ら、J Virol.73（5）:4299-304（1999））、HCRAによって測定して、デノボTax発現が細胞NER能力の低下を生じることを今般証明した。UVによって誘発されるTax発現細胞修復応答を検査した。p53核蓄積およびアポトーシス誘導などの幾つかの重要な初期損傷誘導細胞事象は、損なわれていなかった。興味深いことに、UV処理を行っていないTax発現細胞ではp53とp21の両方の定常状態レベルの上昇が観察された。これは、この経路のTax誘導安定性と矛盾しない結果である。しかし、UVが媒介する損傷によって誘導される著しいp53蓄積およびp21の一時的な安定化は、まだ明らかであった。このように、Tax発現細胞では、NER能力が低下しても、内因性p53媒介損傷応答事象は、正常であった。
【００６１】
細胞損傷応答において観察された唯一の機能的欠陥は、細胞周期チェックポイントを順応させる能力がないことであった。Taxの発現は外因性p53によって誘導されるG1停止を廃止することが、報告されており（Mulloy,J.C.ら、J Virol.72（11）:8852-60（1998））、その後、この結果は、Taxによるp53機能の修飾の証拠であるという結論が下されている。しかし、外因性p53によるG1停止の誘導は、内因性p53の状態に依存する。これは、おそらくp53の喪失への細胞の順応を表す。特に、p53ヌル系統のみが、外因性p53に応答して効率的なG1停止をを示す（Cascallo,M.ら、Cancer Gene Therapy 6:428-436（1999）；Kagawa,S.ら、Oncogene 15:1903-1909（1997）；Morretti,F.ら、J Clinical Endocrinol Metabolism 85:302-308（2000）；St John,L.S.ら、Cancer Gene Therapy 7:749-756（2000））。これは、損傷誘導内因性G1チェックポイントと外因性p53誘導G1停止の間に生物学的な差がないことを意味する。損傷誘導G1停止が、p53非依存性経路によって発生する可能性があり、実際、本発明者らは、Taxによるp53ヌル細胞における損傷誘発G1チェックポイントの修飾を本明細書にて報告していることにご留意いただきたい。従って、これらの結果は、Taxが、p53には依存しない方式で細胞周期チェックポイントを直接修飾するメカニズムのモデルを支持している。Tax発現細胞をG1に同調させることによって、正常な細胞と異ならないNERの能力が生じた。従って、チェックポイントの欠陥だけでは、NER能力の欠陥を説明できなかった。この結果は、p53の外因的追加が、Tax発現細胞のNER活性を回復させるという以前の研究とは異なる解釈を可能にした。外因的に追加されたp53は、G1停止を誘導し得るので、外因性p53によるNERの救援は、強化されたG1停止の結果であり、p53機能回復の結果ではないだろう。興味深いことに、p53の状態にかかわらず、コンピテントp21の誘導が存在する状態は、細胞にて細胞周期停止の失敗が観察された。p53-/-細胞における細胞周期チェックポイントの喪失は、Taxの作用が、p53に依存しないことを意味し、Taxが、下流のシグナルに影響を及ぼすか、p53に依存しない可能性があることを示唆していた。
【００６２】
Tax媒介作用が、p53非依存性経路に基づく場合、Tax発現p53-/-細胞は、p53媒介修復応答とp53非依存性修復応答の両方を欠くと推測された。Tax発現p53-/-細胞ではUV線への暴露に応答して細胞死の劇的な増加が観察された。Tax発現p53-/-細胞におけるUVに対する感度は、NER不全XP-A細胞で見られるものに匹敵した。Tax発現p53＋/＋細胞とは全く対照的である。この結果は、Tax発現細胞の生存およびその結果としてのTax発現細胞に対する突然変異のプレッシャーが、p53の状態には依存しないことを示唆しており、Taxとp53の相互作用の枠組みを提供し得るものである。このように、TaxによるUV媒介細胞周期停止の修飾は、p53に対する直接的な作用から生じるようには見えないが、p53の状態は、Tax発現細胞に対して絶大な影響力を有する。さらに、これらの結果は、Taxのデノボ発現後に観察されたので、特定の処理を受けていないTax発現細胞では、それらに対してp53の喪失が選択されるという結論を下した。デノボTax発現細胞におけるp53の喪失に起因する過敏性は、HTLV-1感染と細胞の形質転換の間の長い期間を説明する助けとなり得る。実際、Kaoら（Kao,S.Y.ら、Virology 291:292-298（2001））は、安定なTax発現p53ヌル細胞が、適度なアポトーシス応答を示すことを証明しており、これは、Tax発現細胞が、p53喪失にもかからわらず生存するようにすることができることを示唆している。HTLV-1形質転換細胞の表現型をしばしば随伴する腫瘍抑制因子p53の喪失に対する選択によって、HTLV-1感染細胞の形質転換前の状態が延長されるだろう。これによって、Taxが、細胞p53経路と相互作用するメカニズムを発生させた理由、およびALT患者の50％近くがp53の突然変異を呈する理由を説明することができた。
【００６３】
本発明のレトロウイルス導入系によって、Taxのデノボ発現の検査が可能となり、その結果、Tax発現に対する初期細胞応答が反映された。長期または安定なTax発現系において発生する事象は、Tax発現に対する細胞の順応を表し、長期Tax作用を反映し得る。従って、これらの研究に基づき、適切な細胞周期チェックポイントのバイパス形成により細胞損傷修復応答の欠陥が、Tax誘導性細胞ゲノム不安定へのメカニズム上の経路であることを提案した。さらに、p53機能の喪失が、Tax発現細胞の生存に対して重大な影響を及ぼすことを証明した。その結果によって、Tax活性とp53機能との相互依存性が説明される。
【００６４】
本明細書中で引用した全ての参考文献は、当技術分野において技術水準を示すものであり、それら全文、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ウイルス形質導入効率を示す図である。（A）は、pHRTaxiGFP形質導入ベクター構成体と対照pHRGFPベクターを図示するものである。（B）は、pHRGFP単独または2シストロンのpHRTaxiGFPのいずれかによって形質導入されたREF52細胞を示すものである。細胞抽出物を、pHRGFP（レーン1）、pHRTaxiGFP（レーン2）にローディングし、抗Taxを用いて検出した。
【図２】Tax発現細胞細胞におけるヌクレオチド除去修復欠陥を示す図である。宿主細胞回復アッセイ（HCR）を行って、細胞のDNA修復活性を判定した。（A）は、示されているような異なるUV線量にcatレポータープラスミドを暴露したことを図示するものである。DNA修復活性は、CAT活性の相対的回復を反映しており、クロラムフェニコールの転化率によって表される。正常細胞（正常）を、修復不全色素性乾皮症-A細胞（XP）と比較している。（B）は、非発現対照細胞に正規化したTax発現細胞の修復能力を図示するものである。Tax発現細胞における修復の回復を対照に対するパーセントとして示す。結果は、三回繰り返したものの平均である。
【図３】Tax発現細胞におけるUV誘発アポトーシスを示す図である。Tax発現細胞（REF＋Tax）および対照細胞（REF52およびXPA）をUV照射に供し、アポトーシス事象について検査した。UVに暴露する前に、非アポトーシス細胞、アポトーシス細胞および壊死細胞を検査した。UV不在の状態では、Tax発現細胞は、REF52細胞およびXP-A細胞と同様、低いアポトーシス細胞のパーセンテージを示した（-UV）。UV暴露後、REF52とREF＋Taxの両方が、アポトーシスの穏やかな増加を示した。これに対し、XP-A細胞は、有意に増加したアポトーシス応答を示した（＋UV）。これらの実験は、三重で行った。
【図４】Tax発現細胞におけるUV照射に応答した核内蓄積、p53の安定化およびp21の導入を表す図である。（A）は、効率25％までpHRTaxiGFPを形質導入し、カバーガラスに載せたREF52細胞を示すものである。48時間後、それらの細胞にUV（20j/m2）を照射し、固定して、マウスモノクローナル抗p53抗体ならびにウサギポリクローナル抗Tax抗体で免疫染色した。二次抗体は、それぞれ、抗マウスFITC抱合抗体および抗ウサギTRITC抱合抗体である。二つの細胞を取巻く同じ視野の異なる画像を示している。矢印は、各細胞の核を指している。REF52細胞とREF＋Tax細胞の両方が、等価のp53核内蓄積を示した（左側のパネル）。（B）は、pHRGFPまたはpHRTaxiGFPのいずれかを形質導入し、その後、20j/m2のUV（＋）に暴露して回収し、ウエスタンブロット分析に供したREF52細胞を示すものである。抗P53抗体でプローブした時、両方の細胞群がp53の安定化を示し、結果として定常状態タンパク質レベルが上昇した。（C）は、0、8および24時間で回収した後の（B）からの同じ細胞を示すものである。上に記載したように免疫ブロットを作成した。それらのブロットを抗p21抗体でプローブした。pHRGFP（-）形質導入細胞とpHRTAXiGFP（＋）形質導入細胞、両方からの抽出物を示すものである。
【図５】p53が不在の状態では、Tax発現細胞がG1期で停止できないこと表す図である。REF52細胞、REF＋Tax細胞、p53d細胞およびp53d＋Tax細胞を、血清飢餓によってG0で同調させた。それらの細胞をG0から開放して、20j/m2のUVに暴露し、記載されているようなヨウ化プロピジウムを使用するDNA含量についてのFACS分析に供した。ModFitソフトウエアを使用して、細胞のG0/G1、SおよびG2/M占有率を計算した。UV暴露後12時間での細胞の相対分布を示している。
【図６】p53欠失細胞におけるUV照射に応答して増加した細胞致死を示す図である。Tax発現細胞および対照細胞を亜致死量のUVに暴露し、処理から24時間後に細胞生存率を検査した。p53＋/＋（REF/Tax）またはp53突然変異体バックグラウンド（HeLa＋Tax）におけるTax発現は、適切な対照細胞より低下した細胞生存率を示さなかった。しかし、p53-/-バックグラウンド（p53d＋Tax）におけるTax発現は、UV暴露に応答して有意な細胞死をもたらした。
【図７】p53欠失細胞におけるUV誘発アポトーシスを示す図である。p53dおよびp53d＋Taxを同調培養に付した。それらの細胞に漸増UV線量でUV照射し、アポトーシスを呼び起こした。照射後0、12および24時間で判定したアポトーシスを受けていない細胞のパーセントを示すものである。検査した線量は、0j/m2（A）、20j/m2（B）および50j/m2（C）であった。これらの実験は、三重で行った。
【図８】実施例1で説明した、Naldini,Science 272:263-267（1996）に記載されているような構成体を生じるために使用したプラスミドを表す図である。これは、HIPプロウイルスおよび三プラスミド発現系を用いて、一過性トランスフェクションにより偽型HIV系ベクターを生じる略図である。HIVプロウイルスについては、ウイルス蛋白のコドン領域を示す。スプライス供与部位（SD）およびパッケージングシグナル（φ）を指摘する。そのパッケージング構成体におけるEnvおよびVpuの読取り枠をブロックする（X）。そのenvコードディングプラスミドにおいて、4070a両栄養性MLVエンベロープのコドン領域は、MLV LTRおよびSV40ポリ（A）部位に隣接している。VSV Gコドン領域は、CMVプロモータおよびポリ（A）部位に隣接している。伝達ベクター、pHR'では、gag遺伝子は、トランケートされ、枠（X）外にあり、内在性プロモータCMVが、β-ガラクトシダーゼ（lacZ）またはルシフェラーゼcDNA、いずれかの発現の誘導に用いられる。Rev反応性要素（RRE）およびスプライス受容体部位（SA）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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