(57)【要約】ヒトの大腸または後腸の組織試料の中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムチャンネルを検出することを特徴とする癌の診断剤及び癌の検出方法を開示する。さらに、抗不整脈剤Ｅ−４０３１を用いた結腸・直腸癌の治療方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しないヒト組織又はリンパ節、あるいは体液を試料とし、該試料中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムチャンネルを検出することを特徴とする、癌を検出するための診断剤。
【請求項２】
健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しない組織又はリンパ節、あるいは体液を試料とし、該試料中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムカリウムチャンネルを検出することを特徴とする、癌の診断方法。
【請求項３】
ヒトの大腸又は後腸の組織又はリンパ節中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムチャンネルを検出することで、結腸・直腸癌の診断を行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＥＲＧカリウムチャンネルの存在によって確認した癌に対し、抗不整脈剤である式１で表される１−［２−（６−メチル−２−ピリジニル）エチル−４−ピペリジニル］カルボニル］メタンスルホンアリニド，２ＨＣｌ（Ｅ−４０３１）を用いることを特徴とする治療方法。
【化１】
2005531301.tif 000007
【請求項５】
抗不整脈剤である式１で表される１−［２−（６−メチル−２−ピリジニル）エチル−４−ピペリジニル］カルボニル］メタンスルホンアリニド，２ＨＣｌ（Ｅ−４０３１）を用いた、ＨＥＲＧカリウムチャンネルの存在によって確認した癌を治療するための薬剤の製造方法。
【請求項６】
抗不整脈剤である式１で表される１−［２−（６−メチル−２−ピリジンニル）エチル−４−ピペリジンニル］カルボニル］メタンスルホンアリニド，２ＨＣｌ（Ｅ−４０３１）を用いた、結腸・直腸癌の治療方法。
【化２】
2005531301.tif 000008
【請求項７】
抗不整脈剤である式１で表される抗不整脈剤１−［２−（６−メチル−２−ピリジンニル）エチル−４−ピペリジンニル］カルボニル］メタンスルホンアリニド，２ＨＣｌ（Ｅ−４０３１）を用いた、結腸・直腸癌を治療するための薬剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の診断剤、癌の検出方法、特にヒトの大腸または後腸組織に生ずる結腸・直腸癌（大腸癌）の検出方法、及び癌、特に結腸・直腸癌の治療手段に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
周知のように、癌はすべての国でますます問題となっている病気である。癌の治療と治療の成功は、特にその早期発見の方法にかかっている。したがって、信頼できる癌診断手段が強く求められている。特に、明らかな組織学上の所見がまだ得られていない場合や、組織学上の所見が陰性という結果になった場合でも、転移及び微小転移の検出を可能にする、信頼できる癌の診断手段が強く求められている。
【０００３】
結腸・直腸癌は癌による死亡例の中で２番目に多く、その罹病中は絶えず進行し、その手術後もしばしば再発する。結腸・直腸癌（悪性の大腸・後腸腫瘍）は先進国では増え続け、男性では２番目、女性では３番目に多い癌である。結腸・直腸癌は悪性腫瘍の１５％を占め、年に２０万人以上の新しい患者が発症し、そのうち１０万人以上が死亡する。結腸・直腸癌は癌による死亡原因では２番目である。
【０００４】
結腸・直腸癌は、de novoに、あるいは腺腫様ポリープからadenoma-carcinoma-sequence説（アデノーマがカルチノーマに変わるという説）に基づいて発生する。腺腫が悪性に変わる確率は１〜４０％である。この意味では、結腸・直腸ポリープを有する患者はリスクグループのひとつである。この理由から、腺腫であるうちに結腸・直腸癌を早期に発見すること、及び良性の結腸・直腸組織から癌化組織を確実に鑑別することは、特に予後診断と治療過程にとって決定的に重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この種の癌の診断及び予後診断は、初診時に存在する多くの特性の影響を受ける。これらの特性として、年齢、性別、症状期間、腸閉塞の状態、腫瘍の局在部位、輸血の必要性、外科的介入の質などが挙げられる。これまでは確かに、脈管・リンパ腺浸潤、従来の腫瘍マーカーに基づく鑑別度及び手術前滴定濃度など、多くの腫瘍特性が診断価値をもっていた。しかし、癌の初期段階（良性の結腸・直腸癌の前段階（腺腫）の変性）の発見のための適切なマーカーや、外科手術の後であっても癌の再発の原因となり得る、組織病理学的には検出困難な微小転移（微小残存病変）のための適切なマーカーは、これまで知られていない。これまでに使用されてきた腫瘍マーカーであるＣＥＡ、ＣＫ−１９およびＣＫ−２０は、現在では予後診断方法を決定するための指針にはなるものの、鑑別診断において信頼できるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明の課題は、任意に用いることができて信頼できる、癌の診断剤及び癌の検出方法、さらには、任意に用いることのできる癌を治療するための有効な手段を提供することである。下記の検出実験は結腸・直腸癌の場合を例にとって行ったが、それ以外の癌の診断と治療にも適用できる。
【０００７】
上記課題の解決のために、本発明においては、組織から採った試料中のＨＥＲＧカリウムチャンネルの有無を調べる。
【０００８】
したがって、本発明の主題は、健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しないヒトの組織又は体液を試料とし、該試料中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムチャンネルを検出することを特徴とする、癌の検出のための診断剤である。また、本発明のもう一つの主題は、健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しない組織又は体液を試料とし、該試料中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムチャンネルを検出することを特徴とする、癌の診断方法である。
【０００９】
本発明の診断方法によるＨＥＲＧカリウムチャンネルの検出においては、健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しない組織またはリンパ節においてＨＥＲＧカリウムチャンネルが検出された場合、癌の存在の確かなしるしとなる。これは、健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが常に存在する心筋組織や脳組織には該当しない。しかし、たとえば、周知のごとく、健常者においてはＨＥＲＧカリウムチャンネルが決して存在しない大腸組織や後腸組織の試料からＨＥＲＧカリウムチャンネルが検出されれば、それは癌の存在を示す確実な証拠となる。
【００１０】
ＨＥＲＧカリウムチャンネルの発見を目標とする癌検出は、通常はカリウムチャンネルが決して検出されることのない血液、血漿、血清、尿、汗又は涙液のような体液、あるいは便においてＨＥＲＧカリウムチャンネルが検出される場合に、その信頼性が高い。
【００１１】
本発明の癌の検出及び診断の例としては、ヒト大腸の組織の試料に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムチャンネルを検出し、結腸・直腸癌を診断することが挙げられる。
【００１２】
診断のために、大腸または後腸の結腸組織試料を実験室で調べる。このとき結腸・直腸癌の細胞におけるＨＥＲＧカリウムチャンネルの存在を調べる。ＨＥＲＧカリウムチャンネルは、高感度なＲＴ−ＰＣＲ方法によっても、病院でよく使う免疫組織化学法によっても検出することができる。ＨＥＲＧカリウムチャンネルは結腸・直腸癌に対して高い選択性を有する機能性の腫瘍マーカーであるため、診断法、特に癌の初期段階での発見、検出困難な微小転移の検知、及び健康な結腸・直腸組織からの癌の鑑別に使用できる。これは意外且つ価値ある結果である。
【００１３】
Ether a go-go（ＥＡＧ）遺伝子のコードするカリウムチャンネルファミリーのサブユニット、特に、ヒトＥＲＧ（ＨＥＲＧ）カリウムチャンネルのようなエストロゲン（eag）依存性（eag-related-gene；ＥＲＧ）遺伝子産物は、診断に適していた。これらは組織発生の異なるいろいろな腫瘍細胞株に見出すことができ、細胞増殖と変異においてある役割を担うことが知られている。
【００１４】
逆転写酵素・ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）は、微小な腫瘍に関連したｍＲＮＡの転写を検出するために非常に有効で感度の高い方法である。免疫組織化学法は、病院でよく用いられる、広く普及した方法であり、簡単に日常業務に組入れることができる。
【００１５】
ＨＥＲＧ（human eag related gene）カリウムチャンネルは、電位差により活性化されるカリウムチャンネルのｅａｇ（ether a go-go）ファミリーに属する特殊な型のヒト カリウムチャンネルである。種々な組織より発生した腫瘍細胞において、ＨＥＲＧカリウムチャンネルは、調節メカニズムにおいて重要な病理生理学上の役割を演じていると考えられ、無制限な腫瘍増殖を引き起こす。
【００１６】
本発明では、結腸・直腸癌の細胞の治療に抗不整脈剤Ｅ−４０３１を用いることを提案する。これは、細胞増殖と癌成長に大きな役割を果たす機能性ＨＥＲＧカリウムチャンネルを選択的に抗不整脈剤Ｅ−４０３１によって阻害できるという価値ある認識に基づいている。これによって、癌治療の新しい試みが可能となる。
【００１７】
抗不整脈剤Ｅ−４０３１は、下記式１で表される１−［２−（６−メチル−２−ピリジニル）エチル−４−ピペリジニル］カルボニル］メタンスルホンアリニド，２ＨＣｌである。
【００１８】
【化１】
2005531301.tif 000002
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は以下の実験と測定に基づくものである。
【００２０】
患者 
ＵＩＣＣ分類Ｉ〜ＩＶの結腸・直腸癌患者１８名（女性１２名と男性６名、年齢５１〜８６歳、平均年齢６７．７歳）から２４の組織試料を採取し、検査した。５例は結腸、４例はS字結腸、９例は直腸に癌が局在した。クロスコンタミネーションを避けるために、組織試料を周囲の組織から隔離する際には、各組織試料につき新しいメスを使用した。
【００２１】
結腸・直腸の腺腫癌の患者の臨床及び組織病理学上のＵＩＣＣ分類及びＤｕｋｅｓ分類は、以下の通りである：
ステージＩ      Ｄｕｋｅｓ  Ａ：３  （ｐＴ１＝１、ｐＴ２＝２）
ステージＩＩ      Ｄｕｋｅｓ  Ｂ：５  （ｐＴ３＝５、ｐＴ４＝０）
ステージＩＩＩ      Ｄｕｋｅｓ  Ｃ：７  （ｐＮ１＝４、ｐＮ２＝３）
ステージＩＶ      Ｄｕｋｅｓ  Ｄ：３  （ｐＭ１＝３）
【００２２】
患者７名（女性４名と男性３名、年齢６０〜６８歳、平均年齢６２．８歳）より得た、組織病理学的に陰性の結腸組織試料（このうち、３つの試料は結腸の腺管状腸絨毛腺腫であり、４つの試料はＳ字結腸憩室炎の組織である）を陰性の対照として用いた（表２）。
【００２３】
組織病理学的診断、ＵＩＣＣ分類、Ｄｕｋｅｓ分類及びＴＮＭ分類は、標準条件下で行い、組織試料は切除後直ちに液体窒素で凍結し、ＲＮＡ抽出まで−８０℃で貯蔵した。
【００２４】
細胞内全ＲＮＡの分離は、Qiagen Rneasy mini-kitを用いて製造元（ドイツ国、Hilden社）のマニュアルに従って凍結した組織試料を用いて行った。ＲＮＡの含有量と純度は、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長による分光光度法で測定した。
【００２５】
結腸・直腸の癌細胞株（Ｃｏｌｏ−２５０）は、この実験の感度を確認するための陽性の対照として用いた。
【００２６】
逆転写 
ｃＤＮＡは、全ＲＮＡ２μｇを含む反応混合物２０μｌで合成した。この反応混合物は、４μｌの５×反応緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ及び３ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ2）、５００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、１００ μｍｏｌ／Ｌのpoly-dT15-Primer溶液（ドイツ国、マンハイム、Roche Diagnostic社製）、及び４００ＵのSuperscript ＩＩ（米国、メリーランド州、ガイサースバーグ、Gibco BRL社製）を含む。反応混合物は、４２℃で６０分間インキュベートし、９０℃で２分間加熱し、それから氷上で冷却した。
【００２７】
ＲＴ−ＰＣＲ試験のプライマー配列 
続いて行うＲＴ−ＰＣＲ試験において、次のプライマー配列を用いた。
【００２８】
ＣＥＡのｍＲＮＡのプライマー配列としては、次のＡ、Ｂ及びＣを用いた：
Ａ：5'-TCTGGAACTTCTCCTGGTTCTCTCAGCTGG-3'（アウターセンスプライマー）；
Ｂ：5'-TGTAGCTGTTGCRNAATGCTTTAAGGAAGAA-3'（アンチセンスプライマー）；
Ｃ：5'-GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG-3'（インナーセンスプライマー）。
【００２９】
ＣＫ−１９のｍＲＮＡのプライマー配列としては、次のＡ、Ｂ及びＣを用いた：
Ａ：5'-GTGGAGGTGGATTCCGCTCC-3'（アウターセンスプライマー）；
Ｂ：5'-TGGCAATCTCCTGCTCCAG-3'（アウターアンチセンスプライマー）；
Ｃ：5'-ATGGCCGAGCAGAACCGGAA-3'（インナーセンスプライマー）；
Ｄ：5'-CCATGAGCCGCTGGTACTCC-3'（インナーアンチセンスプライマー）。
【００３０】
ＣＫ−２０のｍＲＮＡのプライマー配列としては、次のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを用いた：
Ａ：5'-GCGTTTATGGGGGTGCTGGAG-3'（アウターセンスプライマー）；
Ｂ：5'-AAGGCTCTGGGAGGTGCGTCTC-3'（インナーセンスプライマー）；
Ｃ：5'-CGGCGGGGACCTGTTTGT-3'（アウターアンチセンスプライマー）；
Ｄ：5'-CAGTGTTGCCCAGATGCTTGTG-3'（インナーアンチセンスプライマー）。
【００３１】
ＨＥＲＧのｍＲＮＡのプライマー配列としては、次のＡ及びＢを用いた：
Ａ：5'-AGCTGATCGGGCTGCTGAAGACTG -3'（アップ（up）プライマー）；
Ｂ：5'-AATGAGCATGACGCAGATGGAGAAG-3'（ダウン（down）プライマー）。
【００３２】
抽出したＲＮＡの純度を検査し、且つ、使用するＲＮＡが等モル量であることを確かめるために、抽出したＲＮＡについて、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（GAPDH）ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで定量した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのプライマー配列としては、5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'（センスプライマー）及び5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'（アンチセンスプライマー）を用いた。
【００３３】
逆転写酵素・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ） 
２段階のＲＴ−ＰＣＲを、ＣＥＡ、ＣＫ−１９およびＣＫ−２０及びＨＥＲＧのｃＤＮＡ増幅に用いた。
【００３４】
ＰＣＲは、以下のように実施した。ＰＣＲは５０μｌの反応系で、１つの試料につき合計２μｇのＲＮＡを使用して実施した。１回目のＰＣＲでは、２μｌに分けた各ｃＤＮＡ溶液を、ＰＣＲ反応混合液１０．５μｌと混合した。ただし、反応混合液は、１．２５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ ８．３）、５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ及び１．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ2）、２００μｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー及び２．５ＵのPlatinum Taq Polymerase（米国、メリーランド州、ガイサースバーグ、Gibco BRL社製）を含むものである。
【００３５】
ＰＣＲは、ＰＣＲサーモサイクラー（ドイツ国、ゲッチンゲン、Biometra社製）の中で継続した。ＣＥＡ、ＣＫ−１９及びＣＫ−２０の増幅には次の条件を適用した：Taq Polymeraseを９５℃で４分間活性化し、９５℃で４５秒間ＤＮＡテンプレートを変性させ、６０℃で４５秒間アニーリングを行い、７２℃で４５秒間伸張反応を行うサイクルを２０サイクル行った。ＨＥＲＧの増幅は、９５℃で４分、５５℃で１分、７２℃で１分、９５℃で１分のサイクルを３０サイクル行った。最初のＰＣＲ産物の内２μｌを第２のマイクロチューブに入れ、さらに増幅した（ＣＥＡ、ＣＫ−１９及びＣＫ−２０については９５℃で４分、９５℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で４５秒のサイクルを２０サイクル行い；ＨＥＲＧについては９５℃で４分、５５℃で１分、７２℃で１分、９５℃で１分のサイクルを３０サイクル行った）。分注操作は全て氷上、無菌条件下で行い、その後、マイクロチューブを上記のサーモサイクラーに入れた。マイクロチューブは増幅を始める前に変成温度に加熱した。
【００３６】
以下の増幅ＤＮＡ断片が得られた：ＣＥＡプライマーペアに対し１３２塩基対（ｂｐ）の断片、ＣＫ−１９プライマーペアに対し３２８ｂｐの断片、ＣＫ−２０プライマーペアに対し４８５ｂｐの断片、ＨＥＲＧのプライマーペアに対し３８６ｂｐの断片。各組織試料について少なくとも２回実験を行った。
【００３７】
ｃＤＮＡの純度を測定するために、各ｃＤＮＡ断片について、６０３ｂｐからなるＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅を２５サイクル行った（１サイクルは９５℃で４分、９５℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で４５秒である）。
【００３８】
ＰＣＲ産物は、２％のアガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
【００３９】
ＲＴ−ＰＣＲ法の感度 
結腸・直腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ−２０５）を陽性の対照として、上記実験の検出感度の検査に使用した。方法の感受性を求めるために、結腸・直腸癌細胞（Ｃｏｌｏ−２０５）の１０6から１０0までの希釈系列を作り、それらに健康なホスト由来のリンパ球を１０7加えた。全ＲＮＡを抽出した後、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＮＡの希釈系列を用いたことで、各プライマーが１０6個のリンパ球が存在する条件下でも、腫瘍細胞数に対応する量のｍＲＮＡを検出できることが示された。
【００４０】
免疫組織化学 
結腸・直腸癌の組織と健康な結腸・直腸組織とを、緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。各組織は、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片を用いて評価した。さらに組織切片は、免疫組織化学的検出に用いた。
【００４１】
抗ＨＥＲＧ抗体による免疫組織化学的所見には、ＡＢＣ（アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体）検出方法のプロトコルを用いた。
【００４２】
切片をスライドグラスに貼り付け、１晩３７℃で空気乾燥した後、キシレンを用いてパラフィンを除去し、アルコール濃度を段階的に下げながら復元した。切片を１９ｍｌのリン酸緩衝液、１ｍｌのメタノール、２００μｌの３０％Ｈ2Ｏ2からなる溶液に１０分間浸漬することにより、内因性ペルオキシダーゼを阻害した。続いて１０分間のＰＢＳ洗浄を６回行った。
【００４３】
非特異的な抗体結合を減らすために、切片をヤギの標準血清で予めインキュベートした。
【００４４】
その後、５００倍に希釈したウサギ抗ＥＲＧ１一次抗体ＥＲＧ１（ＨＥＲＧ）（ＡＢ５２２２−２００ＵＬ；米国、カリフォルニア州、テメクラ、Chemicon社製）を用いて４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、切片を２００倍に希釈したビオチン化抗ウサギ抗体（Vector Laboratories社製）を用いて２５℃で１時間インキュベートした。続いてＰＢＳで３回洗浄した。その後ＡＢＣ複合体（Vector Laboratories社製）を用いて２５℃で１時間インキュベートした。数回洗浄した後、１次抗体を視覚化するために、切片を３，３’−ジアミノベンチジン四塩酸塩（ＤＡＢ）（Sigma社製）を用い、標準プロトコルに従い（０．１Ｍリン酸緩衝液の０．３％Ｈ2Ｏ2溶液に０．０５％のＤＡＢを添加したものを用い）２５℃で３分間処理した。
【００４５】
切片の色調を顕微鏡で観察した。染色反応はＰＢＳで洗浄して停止した。
【００４６】
抗体反応が陽性であるときは、該当する組織域は均一に褐色に染まる。
【００４７】
免疫組織化学的処理の後、切片は１晩乾燥し、次いで脱水し、カバーグラスをかけた。
【００４８】
陰性対照：１次抗体を用いる以外は上記と同様のプロセスを実施した。
陽性対照：抗ＥＲＧ１（Ｈｅｒｇ）抗体を用いる実験を、ヒト心臓の切片で行った。
【００４９】
Ｅ−４０３１を含む結腸・直腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０５の増殖試験 
増殖試験は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）試験で行った。結腸・直腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０５の細胞は０．０５％のＥＤＴＡで調製し、続いてその数を正確に数えた。次に細胞を９６穴プレートの中に、細胞数がウエル当たり１０4個となるように蒔き、２４時間放置して固着させた。２４時間後、Ｅ−４０３１を１μＭ、５μＭ、１０μＭ含む溶液で培地交換を行った。各ウエルの終濃度を２００μＭとした。０〜７日間インキュベートした後、２００μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。それから溶液を取り除き、１００μｌのジメチルスルホキシド（ドイツ国、Sigma社製）を１０分かけて各ウエルに加えた。
【００５０】
９６穴マイクロプレートリーダー（ドイツ国、Comtek社製）で評価した。ＭＴＴ試験は５７０ｎｍオングストロームの波長でＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーで読取った。平均濃度は５ウエルを一まとめにして測定した。
【００５１】
未処理の対照ウエルの吸光度を１００％と仮定して、ＩＣ50を算出した。
【００５２】
統計的評価 
Ｐ＜０．０５の差異を有意差とした。
【００５３】
ＲＴ−ＰＣＲの結果 
ＣＥＡ、ＣＫ−１９、ＣＫ−２０について、癌組織及び対照組織、並びに結腸・直腸細胞株Ｃｏｌｏ−２０５で試験した。ＨＥＲＧの発現は１００％ではなく、癌組織とＣｏｌｏ−２０５細胞に限られた。図１及び表１に示したように、組織病理学試験において明らかに結腸・直腸癌を示す組織試料は、すべてのマーカー（ＣＥＡ、ＣＫ−１９、ＣＫ−２０及びＨＥＲＧ）を発現していた。悪性病巣のない患者の結腸・直腸組織はＣＥＡ、ＣＫ−１９及び／又はＣＫ−２０を発現していたが、ＨＥＲＧは検出できなかった（表２）。逆転写酵素を使わずにＲＴ−ＰＣＲを行った時には、細胞株Ｃｏｌｏ−２０５にバンドパターンは検出できなかった。これはＤＮＡが存在しないことを示すものであり、それ故ＲＴ−ＰＣＲの条件は非常によく調整されていることを意味する。
【００５４】
図１においては、レーン１とレーン１５に１００ｂｐのバンドを含む対照パターンを示した。レーン２には、すべての試料で陽性である対照のＧＡＰＤＨを示した。レーン３〜６は、Ｓ字結腸憩室炎を有する１人の患者（表２の患者Ｎｏ．６）の組織試料に関する結果、レーン７〜１０は、腺管絨毛結腸腺腫を有する１人の患者（表２の患者Ｎｏ．１）の組織試料に関する結果である。レーン１１〜１４に見られるバンドパターンは、結腸・直腸癌を有する１人の患者（表１の患者Ｎｏ．３）の組織試料に関する結果である。ＤＮＡ断片は２％アガロースゲルで泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
【００５５】
表１にまとめたように、検査した１８人の患者の結腸・直腸癌から得た２４の試料のうち、ＣＥＡは２２の試料（９１．７％）、ＣＫ−１９は１９の試料（７９．２％）、ＣＫ−２０は２３の試料（９５．８％）で検出され、ＨＥＲＧは全ての試料（１００％）で検出することができた。
【００５６】
患者Ｎｏ．２におけるＣＫ−１９及びＣＫ−２０の発現以外は、同一の患者（患者Ｎｏ．４、６、７、８と９）から得た異なる組織試料のすべてにおいて、ｍＲＮＡの発現結果に違いは見られなかった（表１）。
【００５７】
【表１】
2005531301.tif 000003
【００５８】
結腸・直腸癌のグレード（組織病理学上の識別度）は、患者Ｎｏ．１（Ｇ２〜３）、患者Ｎｏ．４（Ｇ３）、患者Ｎｏ．９（Ｇ２〜３）の組織試料を除く全ての組織試料でＧ２であった。
【００５９】
結腸の腺管絨毛腺腫を有する患者３名とＳ字結腸憩室炎を有する患者４名の組織試料を陰性対照として使用したが、その組織病理学的に陰性な結腸・直腸組織試料のいずれにも（０％）、ＨＥＲＧのｍＲＮＡは検出されなかった（図１と表２）。
【００６０】
腫瘍マーカーＣＥＡ、ＣＫ−１９及びＣＫ−２０のｍＲＮＡは、結腸腺腫を罹患しているすべての患者（１００％）で陽性であった。Ｓ字結腸憩室炎を罹患している患者の組織試料では、腫瘍マーカーＣＥＡ、ＣＫ−１９及びＣＫ−２０のｍＲＮＡは２人の患者（５０％）で陽性であった。
【００６１】
【表２】
2005531301.tif 000004
【００６２】
免疫組織化学的検出の結果 
抗ＥＲＧ１（ＨＥＲＧ）抗体による免疫組織化学的検出の結果、結腸・直腸癌のすべての試料において、当該の悪性に変性した組織（腺）部分の染色で示される免疫組織化学的に陽性の反応が顕著になった（表３）。
【００６３】
免疫反応性は、上皮細胞の細胞質の塩基性の部分に限られた（図３と４）。上皮細胞の他に粘膜と血管（血液細胞）に汎発性反応が見られた。さらに、筋肉層には孤立した、詳細な特徴が不明な細胞も存在する。
【００６４】
同じ腫瘍患者より得られる、部分切除後の組織病理学的に陰性な残存腸部分は、大抵の組織試料で免疫組織化学的にも陰性であった。しかし、免疫組織化学的に陽性な組織試料においては、部分切除後の組織病理学的に陰性な残存腸部分の腺基質の塩基性上皮細胞に弱いけれども明らかな陽性な免疫反応が見られた（図６）。患者のいくつかの代表例においては、結腸・直腸癌の切除後２年以内に癌の局所的再発が認められた（表３の患者Ｎｏ．１９〜２５）。
【００６５】
組織病理学的には癌の確認が困難な組織においても、高感度で確実にＨＥＲＧを検出し、更に微小転移も証明できるので、ＨＥＲＧは信頼性の高い腫瘍マーカーである。
【００６６】
組織病理学的に陰性である良性の腸腫瘍（Ｓ字結腸憩室炎、結腸・直腸腺腫）の結腸・直腸組織試料及び健康な結腸・直腸組織試料（健康な腸粘膜）は、どのような場合でも変色することはなかった。したがって、いずれも免疫組織化学的に陰性反応を示した（表４と図５）。
【００６７】
【表３】
2005531301.tif 000005
【００６８】
【表４】
2005531301.tif 000006
【００６９】
増殖試験の結果 
図２は、ＨＥＲＧカリウムチャンネルの選択的阻害剤であるＥ−４０３１による結腸・直腸癌細胞株の増殖阻害を示す。
【００７０】
Ｅ−４０３１を３つの異なる濃度（１、５、１０μＭ）で細胞に与え、その後５日に渡る結腸・直腸癌細胞の増殖を測定した。癌細胞の増殖はいずれの濃度のＥ−４０３１の場合も、癌の増殖にとって重要なカリウムチャンネルの阻害によって抑制され、細胞は壊死した。
【００７１】
本発明により、発癌性（悪性）組織を非発癌性（良性）の組織から確実に区別し、その結果、発癌性組織を検出することが可能な腫瘍マーカーを見出すことができた。さらに、この腫瘍マーカーは組織病理学的には癌の検出ができない組織においても発癌性の腫瘍細胞を検出することができる。これは、結腸・直腸腺腫における癌細胞の確実な早期発見、組織及びリンパ腺における組織病理学的には検出できない微小転移の確実な認知、治療経過及び予後診断にとって大きな意味をもつ。
【００７２】
ＣＥＡは上述のようなマーカーには適していない。というのは、ＣＥＡのｍＲＮＡは、ステージＩの結腸・直腸癌では検出されないが、腺管絨毛・結腸腺腫の全ての組織試料及び陰性の対照として用いるＳ字結腸憩室炎の２つの試料で検出されたからである。上記の結果と同様に、Bhatnagar et al.は、定量的な酵素免疫測定法と免疫細胞化学とを用いて、正常組織又は正常組織と極めて区別困難な結腸・直腸腫瘍にはＣＥＡは全く存在しないことを示した。Boucher et al.は、ＣＥＡは結腸の腺癌のみならず、結腸の腺癌に隣接する健康な粘膜組織にも存在することを示した。
【００７３】
ＣＫ−１９とＣＫ−２０は、血清のみならず結腸・直腸組織においても確実な腫瘍マーカーではない。ＣＫ−１９とＣＫ−２０は、ステージＩＩＩまで進行した癌では検出されないが、一部の対照組織で検出される。これは、ＣＫ−１９とＣＫ−２０は健康な腸粘膜にも見つかるが、いくつかの腫瘍では見つからないというかつての観察結果を実証するものである。区別の容易な腫瘍細胞と細胞増殖能の低い軽度の異形成におけるＣＫ−１９の大量発現、区別の困難な腫瘍組織と細胞増殖能の高い重度の異形成におけるＣＫ−１９の少量発現、及び健康な結腸組織と比べて比結腸直腸癌におけるＣＫ−２０の発現が少量であることから、ステージＩＩＩの陰性腫瘍試料は高い増殖状態にあると推測される。さらに、患者Ｎｏ．２（表１）の組織試料間の矛盾する結果は、マーカーが腫瘍に均一に分布していないことを示す。
【００７４】
ＣＥＡ、ＣＫ−１９及びＣＫ−２０の結果に反して、ＨＥＲＧの発現は、腫瘍のステージに関係なく、すべての結腸・直腸癌に選択的に存在し、各対照組織で陰性であった。この結果は、ＰＣＲ法によるＨＥＲＧのＲＮＡの検出によって分子生物学的に証明され、また、結腸・直腸癌細胞に対して選択的なＨＥＲＧタンパク質の検出によって免疫組織化学的にも証明された。
【００７５】
腫瘍患者の、部分切除後の組織病理学的に陰性の残存腸部分において、ＨＥＲＧの免疫組織化学的に陽性反応が認められた。これらの患者には、癌の切除後２年の間に、結腸・直腸癌の局所的な再発がみられた。これは、組織病理学的には確認が困難な結腸・直腸組織における微小転移を示すものである。
【００７６】
通常の方法ではあるが、互いに関連性のない、検出感度の高い２つの方法を組み合わせてＨＥＲＧを検出することより、検出の質と確実性を高めることができる。
【００７７】
したがって、ＨＥＲＧカリウムチャンネルは、結腸・直腸組織に対して高い選択性を示す腫瘍マーカーである。
【００７８】
ＨＥＲＧカリウムチャンネルは、子宮粘膜癌にも存在するので、他の上皮性癌に対する貴重なマーカーでもある。上記のデータは、最近のin vitro の研究に基づいて推測された、ＨＥＲＧカリウムチャンネルを含むＥＡＧカリウムチャンネルが癌発生に大きく係るという知見を裏付けるものである。このカリウムチャンネルはいくつかの腫瘍細胞系において見出されたが、そのような腫瘍細胞系は、哺乳動物由来の癌化細胞に特徴的な癌細胞の表現型を表し、免疫を抑制したマウスにおける腫瘍増殖を促進するものである。カリウムチャンネルは腫瘍の成長及び／又は腫瘍の残存に非常に重要であるため、増殖試験においては、Ｅ−４０３１がＨＥＲＧカリウムチャンネルを選択的に阻害することによって腫瘍細胞は壊死に至ることが証明された。したがって、ＨＥＲＧカリウムチャンネルは、結腸・直腸癌の機能的腫瘍マーカーとして、選択的腫瘍マーカーであるだけでなく、Ｅ−４０３１による選択的抑制により癌治療のための新しい試みを可能にするものである。
【００７９】
本発明の意外且つ価値のある知見は次のようにまとめられる。結腸・直腸癌細胞の確実な診断は２つの互いに無関係な試験方法（免疫組織学とＰＣＲ）によって選択的にＨＥＲＧ遺伝子を検出することによって可能となる。この方法においては、ＨＥＲＧカリウムチャンネルを新規な高度に選択的なマーカーとして検出し、また、腫瘍細胞の増殖は抗不整脈剤Ｅ−４０３１によって抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】健康な結腸組織、腺管絨毛結腸腺腫及び結腸・直腸癌における、ＣＥＡ、ＣＫ−１９、ＣＫ−２０及びＨＥＲＧのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲで検出した結果である。
【図２】ＨＥＲＧ抑止剤Ｅ−４０３１の存在下における、Ｃｏｌｏ−２０５細胞の増殖を示したものである。
【図３】抗ＥＲＧ１（ＨＥＲＧ）抗体による免疫組織化学的に陽性な反応を示す結腸・直腸癌の１例を示したものである。
【図４】抗ＥＲＧ１（ＨＥＲＧ）抗体による免疫組織化学的に陽性な反応を示す結腸・直腸癌の他の１例を示したものである。
【図５】免疫組織化学的に陰性な反応を示す健康な組織を示したものである。
【図６】後に局所的な癌の再発を患う腫瘍患者の部分切除後の腸の残存部分であって、組織病理学的には確認困難であるが、免疫組織化学的には陽性反応を示す組織を示したものである。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１    合成配列に関する記載：  ＣＥＡ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号２    合成配列に関する記載：  ＣＥＡ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号３    合成配列に関する記載：  ＣＥＡ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号４    合成配列に関する記載：  ＣＫ−１９ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号５    合成配列に関する記載：  ＣＫ−１９ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号６    合成配列に関する記載：  ＣＫ−１９ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号７    合成配列に関する記載：  ＣＫ−１９ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号８    合成配列に関する記載：  ＣＫ−２０ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号９    合成配列に関する記載：  ＣＫ−２０ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号１０    合成配列に関する記載：  ＣＫ−２０ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号１１    合成配列に関する記載：  ＣＫ−２０ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号１２    合成配列に関する記載：  ＨＥＲＧ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号１３    合成配列に関する記載：  ＨＥＲＧ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号１４    合成配列に関する記載：  ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのプライマー配列
配列番号１５    合成配列に関する記載：  ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのプライマー配列
【図１】
2005531301.tif 000009
【図２】
2005531301.tif 000010
【図３】
2005531301.tif 000011
【図４】
2005531301.tif 000012
【図５】
2005531301.tif 000013
【図６】
2005531301.tif 000014
【配列表】
2005531301000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月30日(2004.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しないヒトの大腸又は後腸の組織又はリンパ節、あるいは体液を試料とし、該試料中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムチャンネルを検出することを特徴とする、結腸・直腸癌を検出するための診断剤。
【請求項２】
健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しないヒトの大腸又は後腸の組織又はリンパ節、あるいは体液を試料とし、該試料中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムカリウムチャンネルを検出することを特徴とする、結腸・直腸癌の診断方法。
【請求項３】
抗不整脈剤である式１で表される１−［２−（６−メチル−２−ピリジンニル）エチル−４−ピペリジンニル］カルボニル］メタンスルホンアリニド，２ＨＣｌ（Ｅ−４０３１）を用いた、結腸・直腸癌の治療方法。
【化１】
2005531301.tif 000015
【請求項４】
抗不整脈剤である式１で表される抗不整脈剤１−［２−（６−メチル−２−ピリジンニル）エチル−４−ピペリジンニル］カルボニル］メタンスルホンアリニド，２ＨＣｌ（Ｅ−４０３１）を用いた、結腸・直腸癌を治療するための薬剤の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
したがって、本発明の課題は、任意に用いることができて信頼できる、結腸・直腸癌の診断剤及び結腸・直腸癌の検出方法、さらには、任意に用いることのできる結腸・直腸癌を治療するための有効な手段を提供することである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
上記課題の解決のために、本発明においては、ヒトの大腸又は後腸の組織から採った試料中のＨＥＲＧカリウムチャンネルの有無を調べる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
したがって、本発明の主題は、健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しないヒトの大腸又は後腸の組織又は体液を試料とし、該試料中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムチャンネルを検出することを特徴とする、結腸・直腸癌の検出のための診断剤である。また、本発明のもう一つの主題は、健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しないヒトの大腸又は後腸の組織又はリンパ節、あるいは体液を試料とし、該試料中に少なくとも１つのＨＥＲＧカリウムチャンネルを検出することを特徴とする、結腸・直腸癌の診断方法である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の診断方法によるＨＥＲＧカリウムチャンネルの検出においては、健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが存在しないヒトの大腸又は後腸の組織又はリンパ節、あるいは体液においてＨＥＲＧカリウムチャンネルが検出された場合、結腸・直腸癌の存在の確かなしるしとなる。これは、健常者ではＨＥＲＧカリウムチャンネルが常に存在する心筋組織や脳組織には該当しない。しかし、たとえば、周知のごとく、健常者においてはＨＥＲＧカリウムチャンネルが決して存在しない大腸組織や後腸組織の試料からＨＥＲＧカリウムチャンネルが検出されれば、それは癌の存在を示す確実な証拠となる。
【国際調査報告】
2005531301.tif 000016
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2005531301.tif 000018
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2005531301.tif 000024
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