(57)【要約】本発明は、TSCシグナル伝達経路における異常を同定するための組成物および方法に関する。特に本発明は、TSC遺伝子における変異によって引き起こされる、結節性硬化症のような疾患を、診断および治療するための方法に関する。さらに本発明は、TSCシグナル伝達疾患によって仲介される癌を治療するための方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 対象から生体試料を提供する段階；および
b) 該生体試料からS6キナーゼ活性の上昇の有無を検出する段階、
を含む、対象においてS6キナーゼ活性の上昇を検出する方法。
【請求項２】
S6キナーゼ活性の上昇の有無の検出が、S6キナーゼホスファターゼアッセイ法を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
S6キナーゼホスファターゼアッセイ法が、S6キナーゼ基質に対してリン酸特異的抗体をハイブリダイズさせる段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
S6キナーゼ活性の上昇が、TSC1タンパク質およびTSC2からなる群より選択される、タンパク質の不活化を示す、請求項1記載の方法。
【請求項５】
タンパク質の不活化が、TSC1タンパク質またはTSC2タンパク質をコードする遺伝子における変異のためである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
S6キナーゼ活性の上昇の有無の検出に基づいて、対象に対して診断を提供する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
S6キナーゼ活性の上昇が存在する場合に、診断が、対象における結節性硬化症の陽性の診断である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
S6キナーゼ活性の上昇が存在しない場合に、診断が、対象における結節硬化症の陰性の診断である、請求項6記載の方法。
【請求項９】
変異が切断である、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
対象に結節性硬化症の治療を提供する段階をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
治療が、対象にS6キナーゼ阻害剤を投与する段階を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
S6キナーゼ阻害剤がラパマイシンを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
対象におけるS6キナーゼ活性の上昇を検出するための試薬を含む、結節硬化症の診断キット。
【請求項１４】
試薬が、S6キナーゼ基質に特異的なリン酸特異的抗体を含む、請求項13記載のキット。
【請求項１５】
対象における結節性硬化症の診断用の試薬を使用するための説明書をさらに含む、請求項13記載のキット。
【請求項１６】
説明書が、インビトロ診断用製品の使用のために米国食品医薬品局が要求する説明書を含む、請求項13記載のキット。
【請求項１７】
a) i) 結節性硬化症と診断された対象；および
ii) S6キナーゼの阻害剤
を提供する段階；ならびに
b) 該阻害剤を該対象に投与する段階、
を含む、対象において結節性硬化症を治療する方法。
【請求項１８】
投与の結果、対象の結節性硬化症の症状が軽減する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
S6キナーゼ阻害剤がラパマイシンである、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
S6キナーゼの阻害剤がラパマイシン誘導体である、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
a) i) S6キナーゼを発現する細胞；
ii) 1つまたは複数の被験化合物
を提供する段階；ならびに
b) 該被験化合物を、S6キナーゼのキナーゼ活性を阻害する能力についてスクリーニングする段階、
を含む、化合物のスクリーニング方法。
【請求項２２】
S6キナーゼ活性のキナーゼ活性を阻害する能力についての化合物のスクリーニングが、S6キナーゼホスファターゼアッセイ法を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
S6キナーゼホスファターゼアッセイ法が、S6キナーゼ基質に対してリン酸特異的抗体をハイブリダイズさせる段階を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
被験化合物が薬剤である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
被験化合物がラパマイシンである、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
被験化合物がラパマイシン誘導体である、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
細胞がインビトロにある、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
細胞がTSC2-/-細胞である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
細胞がインビボにある、請求項21記載の方法。
【請求項３０】
細胞が非ヒト動物である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
非ヒト動物が、ラットおよびマウスからなる群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
ラットがEkerラットである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
請求項21の方法によって同定される薬剤。
【請求項３４】
a) i) 欠損のあるTSC経路を含む欠損のある細胞を含む疾病に罹患した被験者；
ii) 細胞のATPレベルを低下させる物質、
を提供する段階；および
b) 該物質を該対象に投与する段階であって、該物質は該欠損のある細胞を標的とする段階
を含む、疾病の治療方法。
【請求項３５】
物質がヘキソキナーゼを阻害する、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
物質が2-デオキシ-グルコースである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
物質がミトコンドリアの脱共役剤FCCPである、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
物質がPKCを阻害する、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
物質がロットレリンである、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
物質が5-アミノイミダゾール-4-カルボキシアミドリボヌクレオチドである、請求項34記載の方法。
【請求項４１】
ラパマイシンの同時投与をさらに含む、請求項34記載の方法。
【請求項４２】
疾病が結節硬化症である、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
疾病が癌である、請求項34記載の方法。
【請求項４４】
疾病が心肥大である、請求項34記載の方法。
【請求項４５】
物質がラパマイシンである、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
欠損のあるTSC経路が、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、S6K、および4EBP-1からなる群より選択される、TSC経路の要素の欠損を含む、請求項34記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照として本明細書に組み入れられる2002年8月12日に出願された米国特許仮出願第60/402,718号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は国立衛生研究所により付与された助成金番号GM51586による政府の援助を受けた発明である。政府は本発明の特定の権利を持つ。
【０００３】
発明の技術分野
本発明はTSCシグナル伝達経路の異常を同定するための組成物および方法に関する。特に、本発明はTSC遺伝子の変異によって引き起こされる、結節性硬化症のような疾病の診断および治療の方法に関する。さらに本発明は、TSCシグナル伝達疾患によって仲介される癌の治療のための方法および組成物にも関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
結節性硬化症(TSC)は、約6000人に1人に起こる比較的一般的な遺伝性の遺伝子疾病で、様々な臓器に過誤腫が発生するという特徴を持つ（YoungおよびPovey,Mol. Med. Today 4, 313-319 (1998)）。一般的な臨床症状には、発作、精神遅滞、自閉症、腎不全、顔面血管線維腫、および心臓の横紋筋腫が含まれる（Gomez, Ann. NY Acad. Sci. 615, 1-7 (1991)）。さらに、多くの患者は特定の骨格領域、特に手指と足指の骨（指節骨）に嚢胞様の領域を持つ。特徴的な皮膚病変には、乳児期に発達すると考えられる、境界が明確に特定できる皮膚色素の低下した（低色素症）領域、ならびに頬および鼻に4歳頃から見られることがある比較的小さな赤みがかった結節が含まれる。これらの赤みがかった病変部は、最終的には拡大し、融合（合体）し、イボ様（脂腺腺腫）になる。扁平で皮膚色素の増加した「コーヒー色の」領域（カフェオレ斑）；爪の周辺または下から発生する良性の線維性結節（線維腫）；またはでこぼこで盛り上がった下背部の「こぶ状の」病変（粒起革様斑）を含め、さらなる皮膚病変も発生する可能性がある。
【０００５】
TSCは誕生時に存在する可能性があるが、この疾患の徴候はわずかで、完全な症状が発生するまでに時間がかかる場合がある。その結果、TSCはしばしば何年もの間、見過ごされ、誤診される。大部分の場合、TSCを認識する最初の手がかりは、発作の存在または発達遅延である。最初の徴候が皮膚の白斑（メラニン減少斑点）である場合もある。
【０００６】
この疾患の診断は、注意深い臨床的診察と、脳の結節を示すことがある脳のコンピューター断層撮影(CT)または磁気共鳴映像(MRI)、ならびに臓器の腫瘍を示すことがある心臓、肝臓、および腎臓の超音波診断との組み合わせに基づく。診断はまた、様々な皮膚の特徴に関する皮膚の、爪の線維腫に関する手指および足指の爪の、歯のくぼみおよび/または歯茎の線維腫に関する歯と歯茎の、ならびに瞳孔散大に関する眼の、注意深い診察を含む。メラニン減少斑点は、乳児および蒼白または色白の患者では見つけにくい場合もあるので、ウッド灯または紫外線を用いて探すこともできる。
【０００７】
小児が誕生時に心臓の横紋筋腫または発作（乳児痙攣）がある場合には、乳児性TSCが疑われることがある。皮膚および脳を注意深く診察することで、非常に幼い乳児でTSCを診断することも可能である。しかし、大部分の小児は後年になって、発作が始まり、顔面の血管線維腫のような他の症状が現れるまで、診断されない。
【０００８】
結節性硬化症には特異的な治療法がない。治療は対症療法であり、発作に対する抗痙攣療法、皮膚の症状発現に対する皮膚剥離およびレーザー除去技術、神経行動的問題に対する薬物療法、腎臓に問題があって起こる高血圧の治療、および成長する腫瘍を切除する手術が含まれる可能性がある。
【０００９】
結節性硬化症患者の予後は、症状の重症度に依存する。治癒することはない。軽度の症状の患者は、一般的に状態が良く、長く生産的な人生を送るが、より重症の患者は、重篤な障害を持つ場合がある。まれではあるが、発作、感染、または重要器官の腫瘍によって、腎臓および脳のような一部の器官に合併症が発生し、重度の問題や死に至ることさえある。
【００１０】
TSCの早期診断の改善は、早期治療を行うために必要である。さらなる治療法も必要とされている。好ましい治療法は、全身の症状を治療するものである。
【発明の開示】
【００１１】
概要
本発明はTSCシグナル伝達経路の異常を同定するための組成物および方法に関する。特に、本発明はTSC遺伝子の変異によって引き起こされる、結節性硬化症のような疾患の診断および治療の方法に関する。さらに本発明は、TSCシグナル伝達疾患によって仲介される癌の治療のための方法および組成物にも関する。
【００１２】
したがって、一部の態様では、本発明は対象におけるS6キナーゼ活性の上昇を検出する方法を提供し、これは対象から生体試料を提供する段階、およびその生体試料のS6キナーゼ活性の上昇を検出する段階を含む。いくつかの態様では、S6キナーゼ活性の上昇の検出には、S6キナーゼホスファターゼアッセイ法が含まれる。例えば、いくつかの態様では、S6キナーゼホスファターゼアッセイ法には、S6キナーゼ基質にリン酸特異的抗体をハイブリダイズさせる段階が含まれる。特定の態様では、S6キナーゼ活性の上昇は、TSC1タンパク質およびTSC2タンパク質からなる群より選択されるタンパク質の不活化を示す。一部の態様では、タンパク質の不活化は、TSC1タンパク質またはTSC2タンパク質をコードする遺伝子における変異（例、切断）によって発生する。いくつかの態様では、本発明はさらにS6キナーゼ活性の上昇の検出に基づいて、対象に診断を提供する段階も含む。いくつかの態様では、診断は対象の結節性硬化症の診断である。いくつかの態様では、本発明は、対象に結節性硬化症の治療法を提供する段階も含む。いくつかの態様では、治療法は対象へのS6キナーゼ阻害剤の投与を含む。本発明は特定のS6キナーゼ阻害剤に限定されない。ラパマイシンおよびラパマイシン誘導体を含む、任意の適当なS6キナーゼ阻害剤が意図される。
【００１３】
本発明は、対象においてS6キナーゼ活性の上昇を検出するための試薬を含む、結節性硬化症の診断キットも提供する。いくつかの態様では、試薬はS6キナーゼ基質に特異的なリン酸特異的抗体を含む。いくつかの態様では、キットはさらに対象の結節性硬化症の診断に試薬を使用するための説明書も含む。特定の態様では、説明書には、インビトロ診断用製品に使用するために米国食品医薬品局によって求められている説明書も含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明は、対象において結節性硬化症を治療する方法も提供し、これには、結節性硬化症と診断された対象を提供する段階；およびS6キナーゼ阻害剤を提供する段階；ならびに阻害剤を対象に投与する段階が含まれる。いくつかの好ましい態様では、投与によって、対象の結節性硬化症の症状が軽減する。本発明は特定のS6キナーゼ阻害剤に限定されない。ラパマイシンおよびラパマイシン誘導体を含むが、これらに限定されない、任意の適当なS6キナーゼ阻害剤が意図される。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明は化合物のスクリーニング方法を提供し、これには、S6キナーゼを発現する細胞、および1つまたは複数の被験化合物を提供する段階；ならびにS6キナーゼのキナーゼ活性を阻害する能力について被験化合物をスクリーニングする段階が含まれる。いくつかの態様では、S6キナーゼ活性のキナーゼ活性を阻害する能力についての化合物のスクリーニングには、S6キナーゼホスファターゼアッセイ法が含まれる。いくつかの態様では、S6キナーゼホスファターゼアッセイ法には、S6キナーゼ基質にリン酸特異的抗体をハイブリダイズさせる段階が含まれる。いくつかの態様では、細胞はインビトロにある。いくつかの態様では、細胞はTSC2-/-細胞である。他の態様では、細胞はインビボにある。いくつかの態様では、細胞は非ヒト動物（例、ラットまたはマウス）に存在する。いくつかの態様では、ラットはEkerラットである。いくつかの態様では、被験化合物は薬剤である。いくつかの態様では、被験化合物はラパマイシンである。別の態様では、被験化合物はラパマイシン誘導体である。本発明はさらに本方法によって同定された薬剤も提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は疾病を治療する方法を提供し、これには、疾病を持つ対象、および細胞のエネルギーレベルを低下させる能力のある物質を提供する段階、ならびにその物質を対象に投与する段階が含まれる。好ましい態様では、疾病には欠損のある細胞が含まれる。さらなる態様では、欠損のある細胞には、TSC経路の欠損が含まれる。なおさらなる態様では、この方法はラパマイシンを対象に同時に投与する段階がさらに含まれる。
【００１７】
好ましい態様では、TSC経路の欠損には、TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、S6K、および/または4EBP-1のような、TSC経路の要素の欠損が含まれる。
【００１８】
いくつかの好ましい態様では、物質は欠損のある細胞を標的とする。別の態様では、物質はヘキソキナーゼを阻害する。別の態様では、物質は2-デオキシグルコースである。別の態様では、物質はミトコンドリアの脱共役剤FCCPである。別の態様では、物質はPKCを阻害する。別の態様では、物質はロットレリンである。さらに別の態様では、物質は5-アミノイミダゾール-4-カルボキシアミドリボヌクレオチドである。
【００１９】
別の好ましい態様では、疾病は結節性硬化症である。別の態様では、疾病は癌である。
【００２０】
定義
本発明の理解を助けるために、いくつかの用語および表現を以下に定義する。
【００２１】
本明細書で使用される「S6K」および「S6キナーゼ」という用語は互換的に用いられ、S6Kキナーゼをさす（例、ヒトまたは非ヒトS6Kキナーゼ）。
【００２２】
本明細書で使用される「前記生体試料中でS6キナーゼ活性の上昇を検出する」とは、対照試料（例、S6キナーゼ活性の正常レベルを持つことが知られている個体から得られた対照試料）のキナーゼ活性のレベルと比較して、S6キナーゼのキナーゼ活性が上昇していることを、任意の適当な方法を用いて検出することをさす。いくつかの態様では、キナーゼ活性は、以下の実験の節に記述される免疫アッセイ法を用いてアッセイされる。しかし、対照と比較したキナーゼ活性の測定を提供できる任意のアッセイ法が使用できる。いくつかの態様では、S6キナーゼ活性が上昇していることは、不活性なTSC1またはTSC2タンパク質があることを示す。
【００２３】
本明細書で使用される「前記対象における結節性硬化症の陽性の診断」という用語は、対象が結節性硬化症であるという診断をさす。本明細書で使用される「対象における結節性硬化症の陰性の診断」という用語は、対象が結節性硬化症でないという診断をさす。
【００２４】
本明細書で使用される「TSC経路」または「結節性硬化症複合体経路」という用語は、一般的に、TSC-1遺伝子、TSC-1タンパク質、TSC-2遺伝子、および/またはTSC-2タンパク質の関与する生物学的（例、分子的、遺伝的、細胞性、生化学的、薬学的、環境的）事象（例、細胞経路、細胞機序、細胞カスケード）をさす。TSC経路の成分の例には、TSC-1、TSC-2、TSC-1/TSC-2、Rheb、mTOR、S6Kおよび4EBP-1が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用される「結節性硬化症を持つ対象」という用語は、一般的に、欠損のあるTSC経路を持つ対象をさす。欠損のあるTSC経路は、任意の認識された同定方法によって、（例えば、表現型、遺伝的、生化学的、および分子的に）同定できる。結節性硬化症を持つ対象を同定するための1つの方法では、欠損のあるTSC経路を検出するための、診断アッセイ法（例、本明細書に記述される診断アッセイ試験）の適用が含まれる。
【００２６】
本明細書で使用される「結節硬化症と診断された対象」という用語は、結節性硬化症を持つことが、医学的に決定された（例、治療を行う医師による）対象をさす。
【００２７】
本明細書で使用される「欠損のあるTSC経路」または「欠損のあるTSC経路を持つ試料」という用語は、TSC経路に調節異常（dysregulation）（例、細胞または組織上に有害な影響を引き起こす生物学的影響をもたらすような経路の調節）があることが（例えば、表現型、遺伝的、生化学的、および分子的に）示された試料をさす。欠損のあるTSC経路を同定する1つの方法では、欠損のあるTSC経路を検出するために、診断アッセイ法（例、本明細書に記述される診断アッセイ試験）を行う。
【００２８】
本明細書で使用される「細胞のエネルギーレベルを低下させる」または「細胞のエネルギーレベルの低下」という用語は、一般に、細胞のグルコースレベル、アミノ酸レベル、またはATPレベルの低下（reduction）（例、低くする（lowering）、低減させる（diminishing）、少なくする（lessing））をさす。
【００２９】
本明細書で使用される「前記物質は細胞のエネルギーレベルを低下させる」または「細胞のエネルギーレベルを低下させる方法」という用語は、一般に、細胞エネルギーのターゲッティングをさす。その例には、ATPおよびグルコースが含まれるが、これらに限定されない。また、この用語は一般に、細胞エネルギーを生成する助けとなる成分のターゲッティングもさす。その例には、ミトコンドリア、ATPの生成に使用される酵素（例、ヘキソキナーゼ）、エネルギー生成経路（例、クレブス回路）、およびATP代謝を調節する薬剤（例、2-デオキシグルコース）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用される「肥大」という用語は一般に、それを構成する細胞のサイズが大きくなったために、臓器または身体の部分が拡大または過剰成長することをさす。その例には、右心室肥大、肥大性心筋症、および良性前立腺肥大が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で使用される「S6キナーゼ阻害剤」という用語は、S6キナーゼのキナーゼ活性を阻害する化合物を指す。好ましい態様では、阻害剤は、キナーゼ活性を、対照試料中で見られるキナーゼ活性のレベルにまで阻害する。特に好ましい態様では、S6キナーゼ阻害剤は、S6キナーゼ活性の上昇によって引き起こされる疾病（例、結節性硬化症）の症状を低下させる。
【００３２】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、特定の抗体と接触する抗原の部分をさす。
【００３３】
タンパク質またはタンパク質断片が宿主動物の免疫に使用されると、そのタンパク質内の数多くの領域が、そのタンパク質の所定の領域または3次元構造に特異的に結合する抗体の生産を誘導する。これらの領域または構造は、「抗原決定基」と呼ばれる。抗原決定基は、完全な抗原（すなわち、免疫応答を誘発するために使用する「免疫原」）と競合して、抗体に結合する可能性がある。
【００３４】
「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語が、抗体とタンパク質またはペプチドとの相互作用に関して使用されるときは、その相互作用がタンパク質上の特定の構造（すなわち抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する；言い換えれば、抗体は、一般的なタンパク質ではなく、特異的なタンパク質構造を認識し、結合している。例えば、抗体が、エピトープ「A」に特異的ならば、標識された「A」と抗体とを含む反応液中に、エピトープA（または遊離の、非標識A）を含むタンパク質が存在すると、抗体に結合する標識されたAの量が低下する。
【００３５】
本明細書で使用される「非特異的結合」および「バックグラウンドの結合」という用語が抗体とタンパク質またはペプチドとの相互作用に関して使用される時は、特定の構造の存在に依存しない相互作用をさす（すなわち、抗体はエピトープのような特定の構造ではなく、一般的なタンパク質に結合している）。
【００３６】
本明細書で使用される「対象」という用語は、特定の治療を受ける、ヒト、非ヒト霊長類、および齧歯類等を含むがこれらに限定されない任意の動物（例、哺乳動物）をさす。通常、ヒトの対象に関しては、「対象」および「患者」という用語は本明細書では互換的に使用される。
【００３７】
本明細書で使用される「リン酸特異的抗体」という用語は、ポリペプチド（例、S6K）のリン酸化型には特異的に結合するが、ポリペプチドの非リン酸化型には特異的に結合しない抗体をさす。いくつかの態様では、リン酸特異的抗体は、特定の位置でリン酸化されたポリペプチドに特異的に結合する。
【００３８】
本明細書で使用される「前記対象において結節性硬化症を検出するための前記キットを用いるための説明書」という用語は、対象から得られた生体試料中で、結節性硬化症の検出および/または特徴付けを行うためのキットに含まれる試薬の使用説明書を含む。いくつかの態様では、説明書はさらに、分析物特異的試薬(ASR)またはインビトロ診断用製品のラベル表示に米国食品医薬品局(FDA)が要求している、意図される用途の陳述を含む可能性がある。FDAはインビトロ診断用物質（diagnosis）を医療用具と位置づけており、510(k)手順によって承認されるよう求めている。510(k)の申請に必要な情報には以下のものを含む：1)商品名または商標名、一般または通常の名称、および用具の分類名を含めた、診断用製品の名称；2)製品の意図される用途；3)該当する場合は510(k)申請を行う所有者または運営者の施設登録番号；既知の場合は、インビトロ診断用製品がFD&C法の第513条で分類されるクラス、その適当なパネル、または所有者もしくは運営者がそのような条文のもとにその用具が分類されていないと判断する場合は、その判断の記載およびそのインビトロ診断用製品が分類されていないという判断の根拠；4)インビトロ診断用製品、その意図される用途、および使用用途を記述するために十分な、提案されるラベル、ラベル表示、および広告。該当する場合には、写真または設計図面を提供する；5)用具が米国で市販されている類似のタイプの他のインビトロ診断用製品と類似している、および/または異なっていることを示すその陳述を支持するデータを添付した陳述書；6)実質的同等性の決定の根拠となる安全性および有効性のデータの510(k)概要；またはFDAの実質的同等性の所見を支持する510(k)安全性および有効性情報は書面での請求後30日以内に誰にでも提供される旨を記載した陳述書；7)申請者が知る範囲では、販売前届出中に提出した全てのデータおよび情報は真実および正確であり、割愛した重要事実はないと信ずるという陳述書；8) FDAが実質的同等性の判断を行うために必要な、インビトロ診断用製品に関する求められた任意の追加情報、が含まれる。さらなる情報は、米国FDAのインターネットのウェブページに掲載されている。
【００３９】
本明細書で使用される「コンピュータのメモリー」および「コンピュータの記憶装置」という用語は、コンピュータプロセッサが読める任意の記憶媒体をさす。コンピュータのメモリーの例には、RAM、ROM、コンピュータチップ、デジタルビデオディスク(DVD)、コンパクトディスク(CD)、ハードディスクドライブ(HDD)、および磁気テープが含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書で使用される「S6キナーゼ活性上昇の前記検出に基づいて、前記対象に診断を提供する」という用語は、対象における上昇したS6キナーゼ活性の存在に基づいて、医学的診断（例、結節性硬化症の）を提供することをさす。
【００４１】
本明細書で使用される「コンピュータが読める媒体」とは、情報（例、データおよび指示）を保存し、コンピュータプロセッサに提供する任意の装置またはシステムをさす。コンピュータが読める媒体の例には、DVD、CD、ハードディスクドライブ、磁気テープ、およびネットワークを通したストリーミングメディアのためのサーバが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で使用される「プロセッサ」および「中央演算処理装置」または「CPU」という用語は互換的に用いられ、コンピュータメモリー（例、ROMまたは他のコンピュータメモリー）からプログラムを読み、そのプログラムにしたがった一連の段階を実行することのできる装置をさす。
【００４３】
本明細書で使用される「非ヒト動物」という用語は、齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ等のような脊椎動物を含むがこれらに限定されない全ての非ヒト動物をさす。
【００４４】
本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、DNAまたはRNAを含むがこれらに限定されない、任意の核酸含有分子をさす。この用語は、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン（pseudoisocytosine）、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルシュードウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキオシン（queosine）、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトクソシン、シュードウラシル、キオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、シュードウラシル、キオシン、2-チオシトシン、および2,6-ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない、DNAおよびRNAの任意の既知の塩基類似体を含む配列を含む。
【００４５】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体、またはRNA（例、rRNA、tRNA）の生産に必要なコード配列を含む、核酸（例、DNA）配列をさす。ポリペプチドは、全長または断片の所望の活性または機能的性質（例、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等）が維持されている限り、全長コード配列またはコード配列の任意の部分によって、コードされている可能性がある。この用語は、構造遺伝子のコード領域、ならびにコード領域の5'および3'の両端に約1 kbまたはそれ以上の距離で隣接して存在する配列を含み、それにより遺伝子は全長mRNAの長さに対応する。コード領域の5'に位置し、mRNAに存在する配列は、5'非翻訳配列を呼ばれる。コード領域の3'または下流に位置し、mRNAに存在する配列は、3'非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、cDNAと遺伝子のゲノム型の両方を含む。ゲノム型または遺伝子クローンには、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって介在されるコード領域が含まれる。イントロンは核RNA（hnRNA）へと転写される遺伝子の一部である；イントロンにはエンハンサーのような調節要素が含まれる場合がある。イントロンは、核または一次転写物から除去または「スプライスアウト」される；したがって、イントロンはメッセンジャーRNA（mRNA）転写物には含まれない。mRNAは、翻訳時に役割を果たし、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を指定する。
【００４６】
本明細書で使用される「異種遺伝子」という用語は、天然の環境にない遺伝子をさす。例えば、異種遺伝子は、1つの種から得られ別の種に導入された遺伝子を含む。異種遺伝子は、何らかの方法で変更を加えられた（例、変異、複数のコピーを添加、非天然の調節配列に連結等）、生物体にもともと存在する遺伝子も含む。異種遺伝子は、通常、天然では染色体中の遺伝子配列には結合していないDNA配列に結合しているか、天然では見られない染色体部分に結合しているという点で（例、遺伝子が通常発現されるのではない遺伝子座で発現される）、異種遺伝子は内因性遺伝子とは区別される。
【００４７】
本明細書で使用される「遺伝子発現」という用語は、遺伝子にコードされる遺伝情報を、遺伝子の「転写」を通してRNA（例、mRNA、rRNA、tRNA、またはsnRNA）へ（RNAポリメラーゼの酵素活性を介する）、そしてタンパク質をコードする遺伝子では、mRNAの「翻訳」を通してタンパク質へと転換する過程をさす。遺伝子発現は、この過程の多くの段階で調節され得る。「アップレギュレーション」または「活性化」とは、遺伝子発現産物（すなわちRNAまたはタンパク質）の生産を増加させる調節を指し、「ダウンレギュレーション」または「抑制」とは、生産を減少させる調節をさす。アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに関与する分子（例、転写因子）は、しばしばそれぞれ「活性化剤」および「リプレッサー」と呼ばれる。
【００４８】
遺伝子のゲノム型は、イントロンを含むことに加え、RNA転写物上に存在する配列の5'および3'末端の両方に存在する配列を含む可能性がある。これらの配列は、「隣接」配列または領域と呼ばれる（これらの隣接配列は、mRNA転写物上の非翻訳配列の5'または3'に存在する）。5'隣接領域は、遺伝子の転写を制御またはこれに影響するプロモーターおよびエンハンサーのような調節配列を含む可能性がある。3'隣接領域は、転写の終結、転写後切断、およびポリアデニル化を指揮する配列を含む可能性がある。
【００４９】
「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団中で最も頻繁に観察される遺伝子であり、そのため遺伝子の「正常」または「野生型」と恣意的に呼ばれている。反対に、「修飾された」または「変異体」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較すると、配列または機能的性質に改変（変化した性質）を示す遺伝子または遺伝子産物をさす。ただし、天然に存在する変異体が単離される可能性もある；これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した時に、性質が変化している（核酸配列の変化を含む）という事実によって同定される。
【００５０】
本明細書で使用される「をコードする核酸分子」「をコードするDNA配列」および「をコードするDNA」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列をさす。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。したがって、DNA配列はアミノ酸配列をコードする。
【００５１】
本明細書で使用される「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を持つオリゴヌクレオチド」および「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、または言い換えると、遺伝子産物をコードする核酸配列をさす。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAの形で存在する可能性がある。DNA型で存在する場合には、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖（センス鎖）または二本鎖である可能性がある。必要ならば、遺伝子のコード領域に近接して、エンハンサー/プロモーター、スプライス結合部ポリアデニル化シグナル等のような適当な調節要素を置き、適切な転写開始、および/または一次RNA転写物の正しいプロセッシングを行うようにしても良い。または、本発明の発現ベクターに利用されるコード領域は、内因性のエンハンサー/プロモーター、スプライス結合部、介在配列、ポリアデニル化シグナル等を含むか、内因性と外因性の調節要素の組み合わせを含む場合もある。
【００５２】
本明細書で使用される「相補的な」または「相補性」という用語は、塩基対形成の法則によって関係するポリヌクレオチド（ヌクレオチドの配列）に関して用いられる。例えば、配列「A-G-T」は、配列「T-C-A」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対形成の法則に従って適合する「部分的」相補性の場合がある。または核酸の間に「完全な」または「全体の」相補性がある場合もある。核酸鎖の間の相補性の度合いは、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に、強い影響を持つ。これは、増幅反応、および核酸の間の結合に依存する検出方法において特に重要になる。
【００５３】
「相同性」という用語は、相補性の度合いをさす。部分的相同性または完全な相同性（すなわち同一性）があり得る。部分的に相同な配列は、完全に相補的な核酸分子が標的核酸にハイブリダイズするのを、少なくとも部分的に阻害する「実質的に相同」である分子である。完全に相補的な配列の標的配列に対するハイブリダイゼーションの阻害は低ストリンジェンシー条件で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて調べられる。実質的に相同な配列またはプローブは、完全に相同な核酸分子が低ストリンジェンシー条件下で標的に結合（ハイブリダイゼーション）するのに競合し、これを阻害する。だからといって、低ストリンジェンシー条件では非特異的結合が許されるわけではない；低ストリンジェンシー条件でも、2つの配列の互いの結合は、特異的な（選択的な）相互作用であることが必要である。非特異的結合がないことは、実質的に非相補的な（例、約30％未満の同一性）第2の標的を用いて、検定できる；非特異的結合がなければ、プローブは第2の非相補的標的にはハイブリダイズしない。
【００５４】
cDNAまたはゲノムクローンのような二本鎖核酸配列に関して使用した場合、「実質的に相同」という用語は、上述のような低ストリンジェンシー条件下で、二本鎖核酸配列の片方または両方の鎖にハイブリダイズできる任意のプローブをさす。
【００５５】
遺伝子は、一次RNA転写物の異なるスプライシングによって生成する複数のRNA種を生産する場合がある。同一の遺伝子のスプライス変種であるcDNAは、配列の同一性または完全な相同性の領域（両方のcDNA上の同一のエクソンまたは同一のエクソンの一部の存在を示す）、および完全な非同一性の領域（例えば、cDNA1にはエクソン「A」が存在し、cDNA2はそのかわりにエクソン「Ｂ」を含むことを示す）を含むはずである。2つのcDNAが配列の同一性の領域を含むため、両方のcDNAに見られる配列を含む遺伝子全体またはその一部に由来するプローブに、両方ともハイブリダイズするはずである；したがって、2つのスプライス変種は、そのようなプローブ、および互いに実質的に相同である。
【００５６】
一本鎖核酸配列に関して使用された場合、「実質的に相同」という用語は、上述のような低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列にハイブリダイズできる（すなわち、それに相補的である）任意のプローブをさす。
【００５７】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の塩基対形成に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸の間の会合の強度）は、核酸の間の相補性の度合い、用いられる条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのTm、および核酸のG:C比のような因子に影響を受ける。その構造内で相補的な核酸の塩基対形成を含む単一分子は、「自己ハイブリダイズした」といわれる。
【００５８】
本明細書で使用される「Tm」という用語は、「融解温度」に関して用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子の群が、半分、一本鎖に解離する温度である。核酸のTmを計算する公式は、当技術分野で周知である。標準的な参考文献に示されるように、核酸が1 M NaClの水溶液中に存在する時のTm値の簡単な見積もりは、Tm = 81.5 + 0.41(%G+C)という公式で計算される（例、AndersonおよびYoung, 「核酸ハイブリダイゼーション(Nucleic Acid Hybridization)」[1985]中、Quantitative Filter Hybridizationを参照されたい）。他の参考文献は、構造および配列の特性をTmの計算に考慮した、より洗練された計算を含む。
【００５９】
本明細書で使用される「ストリンジェンシー」とは、核酸のハイブリダイゼーションを行う時の、温度、イオン強度、および有機溶媒のような他の化合物の存在の条件に関して用いられる。「低ストリンジェンシー条件」下では、関心のある核酸配列は、完全な相補体、単一塩基のミスマッチを持つ配列、密接に関連した配列（例、90％またはそれ以上の相補性）、および部分的相補性のみ持つ配列（例、50％〜90％の相補性を持つ配列）とハイブリダイズする。「中程度のストリンジェンシー条件」下では、関心のある核酸配列は、完全な相補体、単一塩基のミスマッチを持つ配列、および密接に関連した配列（例、90％またはそれ以上の相補性）とハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」下では、関心のある核酸配列は、完全な相補体、および単一塩基のミスマッチを持つ配列（温度のような条件による）とのみハイブリダイズする。言い換えると、高ストリンジェンシー条件下では、温度を上げて単一塩基のミスマッチを持つ配列へのハイブリダイゼーションを排除することができる。
【００６０】
核酸のハイブリダイゼーションに関して使用される「高ストリンジェンシー条件」とは、約500ヌクレオチド長のプローブが用いられた時に、5X SSPE (43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4 H2Oおよび1.85 g/l EDTA、pHをNaOHで7.4に調節)、0.5％ SDS、5X デンハルト試薬、および100μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中で、42℃で結合またはハイブリダイゼーション後に、42℃で0.1X SSPE、0.1% SDSを含む溶液中で洗浄する条件に相当する条件を含む。
【００６１】
核酸のハイブリダイゼーションに関して使用される「中程度のストリンジェンシー条件」とは、約500ヌクレオチド長のプローブが用いられた時に、5X SSPE (43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4 H2Oおよび1.85 g/l EDTA、pHをNaOHで7.4に調節)、0.5％ SDS、5X デンハルト試薬、および100μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中で、42℃で結合またはハイブリダイゼーション後に、42℃で1.0X SSPE、1.0% SDSを含む溶液中で洗浄する条件に相当する条件を含む。
【００６２】
核酸のハイブリダイゼーションに関して使用される「低ストリンジェンシー条件」とは、約500ヌクレオチド長のプローブが用いられた時に、5X SSPE (43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4 H2Oおよび1.85 g/l EDTA、pHをNaOHで7.4に調節)、0.1％ SDS、5X デンハルト試薬［50Xデンハルト試薬は、500 mlあたり、5g フィコール（タイプ400、Pharmacia）、5 g BSA（フラクションV、Sigma）を含む］、および100μg/ml変性サケ精子DNAを含む溶液中で、42℃で結合またはハイブリダイゼーション後に、42℃で5X SSPE、0.1% SDSを含む溶液中で洗浄する条件に相当する条件を含む。
【００６３】
低ストリンジェンシー条件を構成するためには、数多くの同等の条件が利用できることが、当技術分野では周知である。プローブの長さおよび性質（DNA、RNA、塩基組成）、および標的の性質（DNA、RNA、塩基組成、溶液中か固定されているか等）、ならびに塩および他の成分（例、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの存在の有無）の濃度を考慮して、ハイブリダイゼーション溶液を変化させ、上述の条件とは異なるが、それと同等の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を作り出すことができる。また、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを促進する条件も、当技術分野で周知である（例、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄段階の温度を上げる、ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを使用する等）（上記「ストリンジェンシー」の定義を参照されたい）。
【００６４】
ヌクレオチド配列に関して「一部」という用語が本明細書で使用されるときは（「特定のヌクレオチド配列の一部」というように）、その配列の断片をさす。断片は、4ヌクレオチドから、ヌクレオチド配列全体より1ヌクレオチド少ない長さ（10ヌクレオチド、20ヌクレオチド、30ヌクレオチド、40ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、200ヌクレオチド等）までの範囲である。
【００６５】
「単離オリゴヌクレオチド」または「単離ポリヌクレオチド」というように、核酸に関して「単離された」という用語が使われるときは、同定され、かつその天然の供給源では通常結合している少なくとも1つの成分または混入物から分離された核酸配列をさす。単離された核酸とは、天然に存在するときに見られるものとは異なる形または状況で存在するものである。反対に、非単離核酸とは、天然で存在する状態で見られるDNAおよびRNAのような核酸である。例えば、特定のDNA配列（例、遺伝子）は、宿主細胞の染色体上で、隣接する遺伝子の近くに見られる；特定のタンパク質をコードするmRNA配列のようなRNA配列は、複数のタンパク質をコードする数多くの他のmRNAとの混合物として細胞中に見られる。しかし、特定のタンパク質をコードする単離核酸には、例えば、その特定のタンパク質を通常発現する細胞中で、天然の細胞での位置とは異なる染色体位置に存在する核酸、または、天然で見られる核酸配列とは異なる核酸配列が隣接している核酸が含まれる。単離核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形で存在し得る。単離核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドがタンパク質の発現に用いられる時は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは最低、センス鎖またはコード鎖を含むが（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖である可能性がある）、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む可能性もある（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖である可能性がある）。
【００６６】
本明細書で使用される「精製された」または「精製する」という用語は、試料中から成分（例、混入物）を除去することをさす。例えば、抗体は混入している非免疫グロブリンタンパク質を除去することによって精製される；また、標的分子に結合しない免疫グロブリンを除去することでも精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および/または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去により、試料中の標的に反応する免疫グロブリンの割合が上昇する。別の例では、組み換えポリペプチドが細菌宿主細胞中で発現され、ポリペプチドは宿主細胞タンパク質を除去することで精製される；これによって試料中の組み換えポリペプチドの割合が上昇する。
【００６７】
「アミノ酸配列」および「ポリペプチド」または「タンパク質」というような用語は、アミノ酸配列を、説明されたタンパク質分子に伴う完全な、天然のアミノ酸配列に限定するものではない。
【００６８】
本明細書で使用される「天然のタンパク質」という用語は、タンパク質が、ベクター配列によってコードされるアミノ酸残基を含まないことを示す；すなわち、天然のタンパク質は、天然に存在するタンパク質に見られるアミノ酸のみを含んでいる。天然のタンパク質は、組み換え手法によって生産するか、天然に存在する供給源から単離することができる。
【００６９】
タンパク質に関して「一部」という用語が本明細書で使用されるときは（「特定のタンパク質の一部」のように）、そのタンパク質の断片をさす。断片は、4アミノ酸残基から、全体のアミノ酸配列より1アミノ酸少ない長さまでの範囲である。
【００７０】
「サザンブロット」という用語は、アガロースまたはアクリルアミドゲル上でサイズによってDNAを分画し、その後、ゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜ような固体支持体にDNAを移動させる、DNAの解析をさす。固定されたDNAは、標識されたプローブを用いて調べ、使用したプローブに相補的なDNA種を検出する。DNAは電気泳動の前に制限酵素で切断できる。電気泳動後、固体支持体への移動の前または移動時に、DNAを脱プリンまたは変性することがある。サザンブロットは、分子生物学者の標準的なツールである（J.Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Press, NY, pp9.31-9.58 [1989]）。
【００７１】
本明細書で使用される「ノーザンブロット」という用語は、サイズによってRNAを分画するためにアガロースゲル上でRNAの電気泳動をした後、ゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜のような固体支持体へRNAを移動させることによる、RNAの解析をさす。その後、固定されたRNAは、標識されたプローブを用いて調べ、使用したプローブに相補的なRNA種を検出する。ノーザンブロットは、分子生物学者の標準的なツールである（J.Sambrookら、上記、pp7.39-7.52 [1989]）。
【００７２】
「ウェスタンブロット」という用語は、ニトロセルロースまたは膜のような支持体に固定されたタンパク質（またはポリペプチド）の解析をさす。タンパク質はアクリルアミドゲル上で分離し、その後、ニトロセルロースまたはナイロン膜のような固体支持体へゲルからタンパク質を移動させる。その後、固定されたタンパク質を、関心のある抗原に対して反応する抗体に暴露する。抗体の結合は、放射性標識した抗体の使用を含む様々な方法によって検出できる。
【００７３】
本明細書で使用される「細胞培養」という用語は、細胞のインビトロ培養をさす。本用語には、細胞株の連続培養（例、不死の表現型を持つ）、初代細胞培養、形質転換株、有限の細胞株（例、非形質転換細胞）、およびインビトロで維持される任意の他の細胞群が含まれる。
【００７４】
本明細書で使用される「真核生物」という用語は、「原核生物」から区別され得る生物体をさす。本用語は、中に染色体が存在する核膜に囲まれた真核の存在、膜に結合したオルガネラ、および真核生物に通常観察される他の特徴のような、真核生物の通常の特徴を示す細胞を持つ全ての生物体を含む。したがって、本用語は、真菌、原生動物、および動物（例、ヒト）をのような生物体を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書で使用される「インビトロ」という用語は、人工的な環境、および人工的な環境内で起こる過程または反応をさす。インビトロの環境は、試験官および細胞培養を含む可能性があるが、これらに限定されない。「インビボ」という用語は、天然の環境（例、動物または細胞）および天然の環境内で起こる過程または反応をさす。
【００７６】
「被験化合物」および「候補化合物」という用語は、疾病、病気、疾患、または身体の機能の異常（例、結節性硬化症）を治療または予防するために使用する候補である、任意の化学物質、医薬品、薬剤等をさす。被験化合物は、既知および潜在的な治療化合物の両方を含む。被験化合物は、本発明のスクリーニング方法を用いたスクリーニングによって、治療剤であると決定できる。本発明のいくつかの態様では、被験化合物にはアンチセンス化合物が含まれる。
【００７７】
本明細書で使用される「試料」という用語は、最も広い意味で使用される。1つの意味では、任意の供給源から得られた検体または培養、ならびに生体試料および環境試料を含む。生体試料は、動物（ヒトを含む）から得ることができ、液体（例、血液または尿）、固体、組織、および気体を含む。生体試料は、血漿、血清等のような血液産物を含む。環境試料は、表面物質、土壌、水、結晶、および産業試料のような環境材料を含む。しかし、このような例は、本発明に適用される資料のタイプを限定するものと解釈してはならない。
【００７８】
発明の詳細な説明
本発明はTSCシグナル伝達経路の異常を同定するための組成物および方法に関する。特に、本発明はTSC遺伝子の変異によって引き起こされる、結節性硬化症のような疾病の診断および治療の方法に関する。例えば、いくつかの態様では、本発明はTSC1またはTSC2遺伝子中の変異によって引き起こされるS6Kキナーゼ活性の上昇を診断することによる、結節性硬化症の診断方法を提供する。別の態様では、本発明はS6Kキナーゼ活性を阻害する化合物（例、ラパマイシン）を投与することによる、結節性硬化症の治療方法を提供する。さらに本発明は、TSCシグナル伝達疾患によって仲介される癌の治療のための方法および組成物にも関する。
【００７９】
I. TSC1およびTSC2
TSC1（ハマルチンとしても知られる）は、コイルドコイルドメインを含むが、明確な触媒ドメインは持たない、相対的分子量（Mr）130,000 (130K)のタンパク質をコードする。TSC2（ツベリンとしても知られる）は、コイルドコイルドメインおよびRap GTPase活性化タンパク質（GAP）3と相同性のあるC末端領域を含む200Kのタンパク質をコードする。TSC2は、RapおよびRab5に対して弱いGAP活性を持つ。マウスでは、TSC1またはTSC2のいずれかの不活化の同型接合は胎児期に致死的であり、異型接合動物は、腫瘍を発生しやすい（Ondaら、J. Clin. Invest. 104, 687-695 (1999); Auら、Am.J. Hum. Genet. 62, 286-294 (1998); Kobayashi, T.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8762-8767 (2001)；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）。キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）では、dTsc1またはdTSC2のいずれかの不活化は、細胞のサイズと増殖を増加させるが、dTsc1およびdTSC2の両方の過剰発現では、細胞のサイズが減少するが、片方では減少しないため、Tsc1およびTsc2が細胞の増殖を調節する機能的複合体を形成することが示される（GaoおよびPan, Genes Dev. 15, 1383-1392 (2001); Itoら、Cell 96, 529-539 (1999); Potterら、Cell 105, 357-368 (2001); Taponら、Cell 105, 345-355 (2001)；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、遺伝子解析では、dTsc1およびdTsc2は、細胞増殖の制御において、インスリン/インスリン様成長因子(IGF)受容体の下流で機能することが示された（GaoおよびPan、上記；Potterら、上記、Taponら、上記）。インスリン経路の成分が細胞の増殖に重要であることは、十分に確立されている（Kozmaら、Bioessays 24, 65-71 (2002); StockerおよびHafen, Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 529-535 (2000)；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）。この経路のメンバーには、正の調節因子：インスリン受容体(IR)、インスリン受容体基質（IRS）、ホスファチジルイノシトール-3-OHキナーゼ（PI(3)K）、PDK-1、Akt、TOR、S6KおよびeIF4E（真核生物開始因子4E）が含まれる。これらの正の調節因子の過剰発現は、細胞のサイズおよび/または数を増加させ、正の調節因子の低次形態変異またはヌル変異は、ショウジョウバエにおいて細胞の数およびサイズを減少させる（WeinkoveおよびLeevers, Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 75-80 (2000)；参照として本明細書に組み入れられる）。マウスでは、心臓で構成的に活性なPI(3)KまたはAktは、肥大を引き起こす（Shioi, T.ら、EMBO J. 19, 2537-2548 (2000); Shioi, Tら、Mol. Cell. Biol. 22, 2799-2809 (2002)；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）。IGFまたはその受容体（DeChiaraら、Nature 345, 78-80 (1990); Liuら、Cell 75, 59-72 (1993)）、IRSs20、またはS6Kをコードする遺伝子を削除すると、マウスにおいて矮性が誘導され（Shimaら、EMBO J. 17, 6649-6659 (1998)；参照として本明細書に組み入れられる）、これらの遺伝子が細胞の増殖の調節に機能的に重要であることを示している。TSC1およびTSC2腫瘍抑制タンパク質が増殖および細胞サイズの調節に関与していることが示されているが、インスリンシグナル伝達経路におけるTSC1-TSC2複合体の詳しい機能は明らかになっておらず、これが腫瘍抑制剤として働く分子機序も明らかになっていない。
【００８０】
ヒトの腫瘍においてPI(3)Kのシグナル伝達を上昇させるような遺伝的および後成的変化は数多くある（Vogt, Trends Mol. Med. 7, 482-484 (2001)。ヒトでは、インスリン/IGFシグナル伝達経路における細胞増殖の負の調節因子であるPTENの変異は、Akt、mTOR、S6KおよびeIF-4Eの過剰な活性化を誘導し、過誤腫を含むいくつかの種類の腫瘍を引き起こす（YoungおよびPovey、上記；Neshatら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10314-10319 (2001)；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）。インスリンシグナル伝達の正の成分の中で、mTORはS6Kおよび4E-BP1による翻訳の調節を通した細胞の成長および増殖の制御に、必須である（SchmelzleおよびHall, Cell 103, 253-262 (2000)；参照として本明細書に組み入れられる）。S6Kおよび4E-BP1のリン酸化は、マイトジェンと栄養のシグナルの伝達を仲介し、翻訳を刺激する。多くのリボゾームタンパク質および翻訳因子をコードするmRNAは、5'末端のオリゴピリミジントラクト(TOP)を含む。TOP配列は、マイトジェン刺激に応答した、選択的な翻訳誘導を与える。top mRNAの翻訳は、S6Kによる40SリボゾームS6タンパク質のリン酸化と相関している（Shahら、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 279, E715-E729 (2000)；参照として本明細書に組み入れられる）。低リン酸化4E-BP1はCAP含有mRNAに結合し、e1F4E依存性翻訳を阻害する（Shahら、上記）。これらのe1F4Eに調節されるメッセージは、c-MycおよびサイクリンD1のような、増殖に関与するタンパク質をしばしばコードしている（SonenbergおよびGingras, Curr. Opin. Cell Biol. 10, 268-275 (1998)；参照として本明細書に組み入れられる）。S6Kのリン酸化の活性化および4E-BP1のリン酸化の不活化は、PI(3)Kに誘導される腫瘍発生に相関している（Neshatら、PNAS 98, 10314 (2001)；参照として本明細書に組み入れられる）。腫瘍発生におけるmTORの重要性は、ラパマイシンが腫瘍の成長を阻害するという事実により支持される（Podsypaninaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10320-10325 (2001)；参照として本明細書に組み入れられる）。
【００８１】
本発明の開発の過程で行われた実験では、TSC1-TSC2がS6Kおよび4E-BP1のリン酸化を阻害することが示された（実験の項を参照されたい）。データは、TSC1-TSC2がmTORを介して効果を発揮し、S6Kおよび4E-BP1の活性を調節することを示している。別の実験では、TSC1-TSC2の機能が、インスリン処理に応答したAkt依存性リン酸化によって負の調節を受け、TSC2がS6Kを阻害する能力が腫瘍抑制機能と相関することが示された。
【００８２】
哺乳動物細胞を用いた以前の研究では、AktがS6Kの活性化を促進することが示されている（Aokiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 136-141 (2001); Burgeringら、Nature 376, 599-602 (1995)；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）。インスリンによるAktの活性化または構成的に活性なAkt変異体の発現により、S6Kのリン酸化およびキナーゼ活性が上昇する。AktによるS6Kの活性化は、間接的な過程で、mTORが仲介する可能性がある（Scottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7772-7777 (1998); Sekulic, A.ら、Cancer Res. 60, 3504-3513 (2000)；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）。本発明は特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は本発明の実施に不要である。しかしながら、本発明の開発の過程で行われた実験は、AktによるS6Kの調節の想定される機序を提供すると考えられる。このモデルでは、哺乳動物細胞で、TSC1-TSC2はAktの下流かつmTORの上流で機能し、S6Kおよび4E-BP1を制御する（図7f）。さらに、TSC1-TSC2の生理的機能の1つは、翻訳と細胞の増殖の鍵となる調節因子である、S6Kおよび4E-BP1のリン酸化を阻害することであると考えられる（DufnerおよびThomas, Exp. Cell Res. 253, 100-109 (1999)；参照として本明細書に組み入れられる）。TSC1-TSC2のこの活性は、疾病に関連するTSC2変異では損なわれているので、その生理的な機能に重要である（図2c）。これと一致して、S6Kリン酸化の増加がTSC1ヌル細胞で観察されている（Kwiatkowskiら、Hum. Mol. Genet. 11, 525-534；参照として本明細書に組み入れられる）。TSC1-TSC2の機能アッセイは現在不可能であるが、いくつかの態様では、本発明はS6Kおよび4E-BP1リン酸化の阻害および促進のアッセイを提供し、これはTSC1-TSC2の単純で適切な機能アッセイを提供することになる。
【００８３】
ショウジョウバエにおける遺伝的研究で、細胞増殖の調節におけるTSC1-TSC2の機能が調べられた。本発明は特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は本発明の実施に不要である。しかしながら、TSC1-TSC2は細胞のサイズおよび細胞の増殖の制御に関与していると考えられ、TSC1-TSC2のシグナル伝達経路は細胞増殖の阻害の標的（例、癌において）を提供すると考えられる。
【００８４】
本発明の開発の過程で行われた研究では、AktがmTORを刺激し、したがって、TSC1-TSC2の阻害の緩和によってS6K活性を刺激することが示された（図7f）。ショウジョウバエにおけるdS6Kの活性化には、dPDK1が必要であるが、dPI(3)KおよびdAkt46は必要ではない。しかし、トランスジェニックマウスモデルでは、S6Kの活性化および細胞のサイズの制御にAktが正の役割を持つことが示されている（Tuttleら、Nature Med. 7, 1133-1137 (2001)；参照として本明細書に組み入れられる）。本発明の開発の過程で行われた実験では、AktがS6Kの活性化を促進することが示された。AktによるTSC2のリン酸化は、少なくとも2つの機序によって、その機能に影響を与える：第1に、リン酸化でTSC2の活性が低下する；第2に、リン酸化でTSC2タンパク質が不安定化する。この不安定化は、TSC1とTSC2との間の複合体の形成を破壊し、遊離TSC2のユビキチン結合を誘導することで行われる。TSC1-TSC2を介したmTOR阻害の脱抑制は、インスリン経路によるS6K活性化の想定される機序である。本発明の開発の過程で行われた実験は、TSC1-TSC2がどのようにして腫瘍抑制剤として作用し、細胞増殖を抑制するかの分子的基礎を示し、インスリンシグナル伝達におけるこれらの役割を規定するものである。TSC1-TSC2の重要な生理的機能は、mTOR、S6Kおよび4E-BP1活性の阻害である。
【００８５】
インスリンシグナル伝達におけるAktおよびmTORの役割は複雑である。mTORのSer 2448は、Akt40の直接のリン酸化標的であることが示されている。Ser 2448のリン酸化は、インスリンによって刺激され（Scottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7772-7777（1998）；参照として本明細書に組み入れられる）、mTORの活性と相関するが、アラニンでSer 2448を置換してもmTORがS6K42を活性化する能力には影響がなく、これはmTORの活性化におけるAktの役割が、より複雑であることを示している。しかし、この変異体は、ラパマイシン耐性のmTOR変異体（S2035I変異を含む）で作製されており、これは4E-BP1に対する活性が低い（Reynoldsら、J. Biol. Chem. 277, 17657-17662 (2002)；参照として本明細書に組み入れられる）。したがって、そのような結果は、mTOR機能におけるSer 2448のリン酸化の重要性を排除するには適切ではない。実際、最近の研究では、mTORの活性化におけるSer 2448のリン酸化の正の役割がさらに確認されている（Raynoldsら、上記）。mTORにおけるSer 2448のリン酸化は、アミノ酸の補給によって促進され、これはmTORの活性化におけるSer 2448のリン酸化の役割を支持するものである（Raynoldsら、上記；Naveら、Biochem J. 344, 427-431 (1999)；参照として本明細書に組み入れられる）。本発明の開発の過程で行われた実験では、mTORにおけるSer 2448のリン酸化が、栄養の枯渇で低下し、栄養刺激によって上昇することが分かった。ラパマイシンによるS6Kの阻害は、タンパク質ホスファターゼPP2A49によって仲介される。ラパマイシン処理またはアミノ酸枯渇で、S6Kに対するPP2A様の活性が活性化し、PP2AとS6Kの間の弱い結合が検出された（Petersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4438-4442 (1999)；参照として本明細書に組み入れられる）。S6Kの活性化におけるmTORの正の機能は、確立されている。本発明の開発の過程で行われた実験では、TSC1-TSC2がmTORキナーゼ活性およびのリン酸化を阻害することが示された。
【００８６】
本発明は特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は本発明の実施に不要である。しかしながら、ラパマイシン誘導体および他のS6K阻害剤は、TSCおよび他の細胞増殖疾患（例、癌）の治療薬として使用できると考えられる。
【００８７】
以前の研究では、mTORによるS6Kおよび4EBP1のリン酸化が、翻訳の調節に重要な役割を果たすことが示されている（Brownら、Nature 377:441-446 (1995); Haraら、J. Biol. Chem. 273:14484-94 (1998); Shahら、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 279:E715-729 (2000)）。TSC1またはTSC2変異細胞では、S6Kと4EBP1の両方のリン酸化が上昇している（Goncharovaら、J. Biol. Chem. 277:30958-30967 (2002); Kenersonら、Cancer Res. 62:5645-5650 (2002); Kwiatkowskiら、Hum. Mol. Gen. 11:525-534 (2002); Ondaら、Mol. Cell Neurosci. 21:561-574 (2002)）。反対に、TSC1およびTSC2の過剰発現は、S6Kおよび4EBP1のリン酸化を阻害する（Goncharovaら、2002; Inokiら、Nat. Cell Bio. 4:648-657 (2002); Teeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13571-13576 (2002)）。本発明は特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は本発明の実施に不要である。しかしながら、TSC1/TSC2の主要な細胞機能の1つは、S6Kおよび4EBP1のリン酸化を阻害することによる、翻訳の阻害であると考えられる。
【００８８】
翻訳の速度は、栄養素の利用可能性、増殖因子、細胞内ATPレベル、および環境ストレスを含めた、複数のシグナル伝達経路によって調節されている（BrowneおよびProud, Eur. J. Biochem. 269:5360-5368 (2002); Proud, Eur. J. Biochem. 269:5338-5349 (2002)）。ATP枯渇はS6Kおよび4EBP1のリン酸化を低下させ、翻訳を阻害する。以前の研究では、mTORはATPに対して、生理的ATPレベルに相当するミリモルレベルのKmを持つので、mTORがATP枯渇シグナルを仲介することが示唆された（Dennisら、Genes Dev. 16:1472-1487 (2001)）。しかし、正常な細胞のATPレベルは、生理的なエネルギー枯渇条件では、大きく変化しない。そのかわり、細胞のATP濃度はAMP濃度よりもはるかに高いので、ATPレベルが比較的わずかに低下しても、AMPレベルは比較的大きく上昇し、これが5'AMP-活性化タンパク質キナーゼ（AMPK）により感知され、これを刺激する（Hardieら、Ann. Rev. Biochem. 67:821-855 (1998)）。D-グルコース類似体である2-デオキシグルコース（2-DG）および5-アミノイミダゾール-4-カルボキシアミドリボヌクレオチド（AICAR）はAMPKを活性化する（Cortonら、Eur. J. Biochem. 229:558-565 (1995)）。2-DGおよびAICARは真核生物の伸長因子2 (eEF2)のリン酸化を上昇させることが示されており、これは、AMPKが翻訳に負の役割を果たすことを示している（Hormanら、Curr. Bio. 12:1419-1423 (2002)）。また2-DGおよびAICARがS6K活性を阻害することも報告されている（Kimuraら、Genes Cells 8:65-79 (2003); Krauseら、Eur. J. Biochem. 269:3751-3759 (2002)）。AMPKによるS6Kの阻害機序は、mTOR経路を介すると思われる（Kimuraら、2003）。
【００８９】
本発明の開発の過程で行われた研究は、TSC2が細胞のエネルギーレベルによって調節されることを示している。エネルギー枯渇によるAMPKの活性化により、TSC2のT1227およびS1345の直接のリン酸化が起こる（図12）。RNA干渉によりTSC2タンパク質をノックダウンすると、ATP枯渇に誘導されるS6Kの脱リン酸化がなくなる（図10）。さらに、エネルギー枯渇に応答して、TSC2-/-細胞は、S6K脱リン酸化の異常な応答を示す（図10）。さらに、TSC2-/-細胞において、エネルギー枯渇に誘導されるS6Kの脱リン酸化は、野生型TSC2の発現によって回復するが、AMPKリン酸化変異体では起こらない。これは、細胞のエネルギー枯渇による翻訳の調節において、AMPKによるTSC2のリン酸化が重要な機能を持つことを示している（図13）。
【００９０】
本発明は特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は本発明の実施に不要である。しかしながら、TSC2は、グルコース枯渇に誘導されるアポトーシスから細胞を守るために、必須の役割を果たしていると考えられる。野生型TSC2の発現はグルコース枯渇によって誘導されるアポトーシスを予防できるが、TSC2-/-細胞におけるAMPKリン酸化変異体の場合は予防できないため、TSC2のAMPK依存性リン酸化は、細胞のエネルギー応答におけるTSC2の機能に重要である（図13）。本発明は特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は本発明の実施に不要である。しかしながら、細胞のエネルギー応答において、TSC2およびAMPKのリン酸化は必須の役割を持つと考えられる。
【００９１】
II. 診断用途
いくつかの態様では、本発明はTSCを診断する方法を提供する。TSCを早期に診断できれば、早期の介入が可能になる。例えば、障害を引き起こす前に腫瘍を同定し、除去し、薬物治療（例、本発明の医薬品による）を早期に開始することができる。
【００９２】
いくつかの態様では、本発明はTSC1またはTSC2の変異体を直接診断する方法を提供する。別の態様では、本発明はTSC1またはTSC2の変異体を間接的に診断する方法を提供する（例、S6K活性の上昇の診断を通して）。以下の説明は、早期の診断スクリーニング方法の例を提供する。当業者は、別の診断方法も利用できることを認識する。
【００９３】
A. 直接の検出
いくつかの態様では、本発明はTSC1またはTSC2の変異体を直接に診断する方法を提供する。TSC1およびTSC2の変異は、一般に無作為的である。大部分の変異では、フレームシフトまたは早期の終止コドンが誘導される。したがって、いくつかの態様では、変異TSC1またはTSC2遺伝子は切断されている。
【００９４】
1. 直接の検出
いくつかの態様では、変異はTSC1またはTSC2遺伝子のDNA配列決定によって、検出される。いくつかの態様では、当技術分野で周知の自動配列決定法が利用される。DNA配列決定は、変化したTSC1またはTSC2核酸配列（例、フレームシフトまたは早期の終止コドンを含む）を検出するために使用され、これによりTSCが診断される。
【００９５】
2. 切断されたTSC1またはTSC2タンパク質の検出
別の態様では、切断されたTSC1またはTSC2タンパク質が検出される。切断されたTSC1またはTSC2タンパク質を検出するためには、任意の適当な方法が使用できる。例えば、いくつかの態様では、Ambergen, Inc.（マサチューセッツ州ボストン）の無細胞翻訳法が使用される。Ambergen, Inc.は、放射性アミノ酸または他の放射性標識を使用せずに、無細胞または細胞翻訳系で、新生タンパク質を標識、検出、定量、解析、および単離する方法を開発した。マーカーは、tRNA分子にアミノアシル化される。潜在的マーカーには、天然のアミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸の類似体もしくは誘導体、または化学的部分が含まれる。これらのマーカーは、翻訳過程で、結果として得られたミスアミノアシル化された（misaminoacylated）tRNAから新生タンパク質に導入される。
【００９６】
Ambergenのタンパク質標識技術の1つの用途は、ゲルフリー切断試験(GFTT)アッセイである（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,303,377号を参照されたい）。いくつかの態様では、このアッセイを使って、TSC1またはTSC2タンパク質の切断変異がスクリーニングされる。GFTTアッセイでは、タンパク質のN末端付近の翻訳時に、マーカー（例、蛍光体）が新生タンパク質に導入される。タンパク質のC末端付近では、第2の別のマーカー（例、異なる発光波長をもつ蛍光体）が新生タンパク質に導入される。その後、タンパク質は翻訳系から分離され、マーカーのシグナルが測定される。N末端とC末端のシグナルの測定を比較すると、C末端の切断がある分子の割合が分かる（すなわち、C末端マーカーからの標準化したシグナルが、N末端のマーカーのシグナルの50％ならば、分子の50％がC末端の切断を持つ）。
【００９７】
別の態様では、切断されたタンパク質は抗体結合により検出される。例えば、いくつかの態様では、2つの抗体が使用される。第1の抗体は、TSC1またはTSC2のC末端を認識するように設計されており（例、以下の抗体の作製の説明を参照されたい）、第2の抗体は、TSC1またはTSC2のN末端を認識するように設計されている。N末端の抗体によって認識されるが、C末端の抗体では認識されないタンパク質は切断されている。いくつかの態様では、定量的免疫アッセイを用いて、C末端とN末端の抗体結合の比率が決定される。
【００９８】
抗体の結合は、当技術分野で周知の技術で検出される（例、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射線測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュー免疫アッセイ（例、例えば、金コロイド、酵素、または放射性同位体標識を使用する）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集反応アッセイ（例、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ等）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等）。
【００９９】
1つの態様では、抗体の結合は一次抗体上の標識を検出することで、検出される。別の態様では、一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することで、検出される。さらに別の態様では、二次抗体は標識されている。免疫アッセイで結合を検出するための多くの方法が当技術分野で周知であり、これらは本発明の範囲内である。
【０１００】
いくつかの態様では、自動検出アッセイが利用される。免疫アッセイの自動化の方法には、米国特許第5,885,530号、4,981,785号、6,159,750号、および5,358,691号に記述されたものが含まれ、この各々は参照として本明細書に組み入れられる。いくつかの態様では、結果の解析および標示も自動化される。例えば、いくつかの態様では、免疫アッセイの結果に基づいた予後診断を作製するソフトウェアが使用される。
【０１０１】
別の態様では、免疫アッセイは米国特許第5,599,677号、および5,672,480号に記述されており、この各々は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１０２】
B. 間接的検出
別の態様では、TSC1またはTSC2の変異は、間接的に検出される。本発明の開発の過程で行われた実験では、TSC1およびTSC2がS6Kキナーゼ活性を阻害することが示された（実験の項を参照されたい）。TSC1またはTSC2に変異があると、S6Kキナーゼ活性が上昇する。いくつかの態様では、S6Kキナーゼ活性の上昇は、リン酸化S6K特異的抗体を用いて測定される（図1および2ならびに以下の実験の項を参照されたい）。本発明は、S6Kキナーゼ活性を検出するための特定の方法に限定されない。当技術分野で周知の方法を含め、任意の適当な方法が使用できる。
【０１０３】
III. 抗体
本発明は単離された抗体または抗体断片（例、FAB断片）を提供する。好ましい態様では、本発明は、本発明に開示されるタンパク質（例、TSC1、TSC2、S6K、mTORおよびAkt）の少なくとも5つのアミノ酸残基を含む単離されたポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナル抗体または断片を提供する。これらの抗体は、本明細書に記述される診断および薬剤スクリーニング法に使用できる。
【０１０４】
本発明のタンパク質に対する抗体は、タンパク質を認識する限り、任意のモノクローナル、ポリクローナル、または組み換え（例、キメラ、ヒト化等）抗体であり得る。抗体は通常の抗体または抗血清の調製過程に従って、本発明のタンパク質を抗原として用いて生産できる。
【０１０５】
本発明は、モノクローナル、組み換え、およびポリクローナル抗体またはその断片を使用することを意図する。本明細書に開示される方法を含めるがこれに限定されない、任意の適当な方法を用いて、本発明に使用される抗体および本発明の組成物を作製できる。例えば、モノクローナル抗体、タンパク質の調製物自体を、または適当なキャリアまたは希釈剤と共に、抗体が生産されるような条件下で動物（例、哺乳動物）に投与する。抗体生産能力を増大するために、フロイントの完全または不完全アジュバントも投与できる。通常は、タンパク質は2週間から6週間ごとに1回、合計で約2回から約10回投与される。そのような方法に適した動物には、霊長類、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
モノクローナル抗体を産生する細胞の調製には、抗体の力価が確認されている個々の動物（例、マウス）を選択し、最後の免疫の2日から5日後に、その脾臓またはリンパ節を採取し、その中の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製する。抗血清中の抗体の力価の測定は、例えば、以下に説明するように標識されたタンパク質と抗血清とを反応させ、その後、抗体に結合した標識物質の活性を測定することにより実行できる。細胞融合は、例えば、KoehlerおよびMilsteinによって記述された方法（Nature 256:495 [1975]；参照として本明細書に組み入れられる）のような、周知の方法に従って行うことができる。融合の促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)またはセンダイウイルス(HVJ)、好ましくはPEGが使用される。
【０１０７】
骨髄腫細胞の例には、NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等が含まれる。抗体産生細胞（脾臓細胞）の数と骨髄腫細胞の数との比率は、好ましくは約1:1から20:1である。PEG（好ましくはPEG 1000〜PEG 6000）は、好ましくは約10％から約80％の濃度で添加される。細胞融合は、両方の細胞の混合物を、約20℃から約40℃、好ましくは約30℃から約37℃で、約1分から10分インキュベートすることによって、効率的に実施できる。
【０１０８】
抗体（例、本発明のタンパク質に対する）を産生するハイブリドーマのスクリーニングには、様々な方法が使用できる。例えば、抗体が直接またはキャリアと共に吸着している固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマの上清を添加し、その後、放射性物質または酵素で標識された抗免疫グロブリン抗体（マウス細胞が細胞融合に使用される場合は、抗マウス免疫グロブリン抗体が使用される）またはプロテインAを添加して、固相に結合したタンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。または、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAが吸着した固相にハイブリドーマの上清を添加し、その後、放射性物質または酵素で標識されたタンパク質を添加し、固相に結合したタンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。
【０１０９】
モノクローナル抗体の選択は、任意の周知の方法またはその変法にしたがって、実施できる。通常は、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）が添加された、動物細胞用培地が利用される。ハイブリドーマが成長できる限り、任意の選択および増殖培地が利用できる。例えば、1％から20％、好ましくは10％から20％のウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地、1％から10％のウシ胎児血清を含むGIT培地、ハイブリドーマの培養用の無血清培地（SFM-101、Nissui Seiyaku）、および類似の培地が使用される。通常は、培養は20℃から40℃、好ましくは37℃で、約5日から3週間、好ましくは1週間から2週間、5％CO2ガスの存在下で行われる。培養ハイブリドーマの上清の抗体の力価は、抗血清中の抗タンパク質の抗体力価に関して、上記に説明したのと同じ方法で、測定できる。
【０１１０】
モノクローナル抗体（例、本発明のポリペプチドに対する）の分離および精製は、免疫グロブリンの分離および精製のような通常のポリクローナル抗体の分離と精製と同様にして実行でき、例えば、塩析、アルコール沈殿、等電沈殿、電気泳動、イオン交換体への吸着と脱離（例、DEAE）、超遠心、ゲル濾過、または、抗原の結合した固相、プロテインA、またはプロテインGのような活性吸着剤で抗体のみが収集され、結合を解離して抗体が得られる、特異的な精製方法が用いられる。
【０１１１】
他の態様では、本発明は本発明のタンパク質に対する組み換え抗体またはその断片が考慮される。組み換え抗体には、ヒト化およびキメラ抗体が含まれるが、これらに限定されない。組み換え抗体の作製方法は、当技術分野で周知である（例、米国特許第6,180,370号および6,277,969号、ならびに「モノクローナル抗体(Monoclonal Antibodies)」H. Zola, BIOS Scientific Publishers Limited 2000. Springer-Verlay New York, Inc., New Yorkを参照されたい；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１１２】
ポリクローナル抗体は、患者から抗体を採取することを含め、任意の周知の方法またはこれらの方法の変法により、調製できる。例えば、免疫原（タンパク質に対する抗原）とキャリアタンパク質との複合体を調製し、上記にモノクローナル抗体の調製に関して説明したのと同じ方法に従って、この複合体によって動物を免疫する。免疫動物から抗体を含む材料を回収し、抗体を分離および精製する。
【０１１３】
動物の免疫に使用する免疫原とキャリアタンパク質の複合体については、キャリアに架橋され免疫原として使用されるハプテンに対する抗体が効率良く生産される限り、任意のキャリアタンパク質が、任意のキャリアとハプテンの混合比率で、使用できる。例えば、ウシ血清アルブミン、ウシシクログロブリン、スカシガイのヘモシアニン等を、重量比で、ハプテン1に対して約0.1から20、好ましくは約1から約5の割合で、ハプテンに結合できる。
【０１１４】
また、ハプテンとキャリアのカップリングには、様々な縮合剤が使用できる。例えば、本発明にはグルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性化エステル、チオール基またはジチオピリジル基を含む活性化エステル試薬等が使用できる。縮合産物をそれ自体で、または適当なキャリアもしくは希釈剤と共に、抗体産生の可能な動物の部位に投与する。抗体産生能力を増強するために、フロイントの完全または不完全アジュバントを投与できる。通常は、タンパク質は2週間から6週間ごとに1回、合計で約3回から約10回投与される。
【０１１５】
ポリクローナル抗体は、上述の方法で免疫された動物の血液、腹水等から回収される。抗血清中の抗体の力価は、培養ハイブリドーマの上清に関して上記に説明したのと同様にして、測定することができる。抗体の分離と精製は、上記にモノクローナル抗体に関して説明したのと同じ免疫グロブリンの分離および精製方法を用いて、実施できる。
【０１１６】
本明細書で免疫原として使用するタンパク質は、特定のタイプの免疫原に限定されない。例えば、本発明のポリペプチド（さらにヌクレオチド配列が部分的に改変された遺伝子を含む）は、免疫原として使用できる。また、タンパク質の断片も使用できる。断片は、遺伝子断片の発現、タンパク質の酵素処理、化学合成等を含むがこれらに限定されない任意の方法によって得られる。
【０１１７】
IV. 薬剤スクリーニング
いくつかの態様では、本発明は薬剤のスクリーニングアッセイを提供する（例、S6Kのキナーゼ活性を阻害する薬剤のスクリーニング）。本発明はインビトロ（例、細胞培養中）およびインビボ（例、TSCの動物モデル中）の両方で、任意の数の治療用化合物の候補のスクリーニングを提供する。
【０１１８】
A. 候補化合物
本発明の薬剤スクリーニング方法では、TSCの治療に有用な任意の数の候補化合物が使用される。いくつかの態様では、候補化合物はラパマイシンまたはラパマイシン誘導体である。ラパマイシンはストレプトミセス、例、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）から抽出可能な抗真菌抗生剤である。ラパマイシンの調製方法は、各々が参照として本明細書に組み入れられるSehgalら、米国特許第3,929,992号および3,993,749号に開示されている。また、ラパマイシンのモノアシルおよびジアシル誘導体ならびにその調整方法は、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,316,885号に開示されている。米国特許第4,650,803号（参照として本明細書に組み入れられる）は、ラパマイシンの水溶性プロドラッグ、すなわち、以下のラパマイシンプロドラッグを含むラパマイシン誘導体を開示している：グリシン酸プロドラッグ、プロピオン酸プロドラッグ、およびピロリジノ酪酸プロドラッグ。米国特許第5,118,678号（参照として本明細書に組み入れられる）は、ラパマイシンのカルバメートを開示している。米国特許第5,100,883号（参照として本明細書に組み入れられる）は、ラパマイシンのフッ素化エステルを開示している。米国特許第5,118,677号（参照として本明細書に組み入れられる）は、ラパマイシンのアミドエステルを開示している。米国特許第5,130,307号（参照として本明細書に組み入れられる）は、ラパマイシンのアミノエステルを開示している。米国特許第5,117,203号（参照として本明細書に組み入れられる）は、ラパマイシンのスルホン酸塩およびスフラミン酸塩を開示している。米国特許第5,194,447号（参照として本明細書に組み入れられる）は、ラパマイシンのスルホニルカルバメートを開示している。
【０１１９】
本発明の薬剤スクリーニング方法は、ラパマイシンに限定されない。任意の数の候補化合物が利用できる。いくつかの態様では、市販または既知の候補化合物ライブラリーがスクリーニングされる。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。そのようなコンビナトリアルケミカルライブラリーには、ペプチドライブラリー（例、各々が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991)、およびHoughtonら、Nature 354:84-88 (1991)を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されないある可能性がある。化学的に多様なライブラリーを作製するための他の化学反応も使用できる。そのような化学反応には、ペプトイド（国際公開公報第91/19735号；参照として本明細書に組み入れられる）、コードされたペプチド（国際公開公報第93/20242号；参照として本明細書に組み入れられる）、ランダムバイオオリゴマー（国際公開公報第92/00091号；参照として本明細書に組み入れられる）、ベンゾジアゼピン（米国特許第5,288,514号；参照として本明細書に組み入れられる）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドのようなダイバーソマー（diversomer）（Hobbsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）、ビニロガスポリペプチド（Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)；参照として本明細書に組み入れられる）、β-D-グルコース骨格を持つ非ペプチダルペプチド模倣物（Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)；参照として本明細書に組み入れられる）、低分子化合物ライブラリーの類似有機合成（Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)；参照として本明細書に組み入れられる）、オリゴカルバメート（Choら、Science 261:1303 (1993)；参照として本明細書に組み入れられる）、および/またはペプチジルホスホネート（Campbellら、J. Org. Chem. 59:658 (1994)；参照として本明細書に組み入れられる）、核酸ライブラリー（Ausubel, Berger、およびSambrook、すべて上記、を参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリー（例、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,539,083号を参照されたい）、抗体ライブラリー（例、各々が参照として本明細書に組み入れられる、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996)およびPCT/US96/10287を参照されたい）、炭化水素ライブラリー（例、各々が参照として本明細書に組み入れられる、Liangら、Science, 274:1520-1522 (1996)、および米国特許第5,593,853号を参照されたい）、有機低分子ライブラリー（例、各々が参照として本明細書に組み入れられる、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN、1月18日、33ページ（1993）；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号等を参照されたい）、が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
他の態様では、化合物ライブラリーは空間的に指定可能な平行した固相または溶液相ライブラリー；デコンボルーションが必要な合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法である。ペプチドライブラリーには、生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーの手法が好ましく、他の4つの手法は、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリーに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145；参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１２１】
分子ライブラリーの合成法の例は、当技術分野で見られる。例えば：DeWittら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909 [1993]; Erbら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422 [1994]; Zuckermannら、J. Med. Chem. 37:2678 [1994]; Choら、Science 261:1303 [1993]; Carrellら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]; Carellら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994];およびGallopら、J. Med. Chem. 37:1233 [1994]；この各々は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２２】
化合物のライブラリーは、溶液（例、Houghten, Biotechniques 13:412-421 [1992]；参照として本明細書に組み入れられる）、またはビーズ（Lam, Nature 354:82-84 [1991]）、チップ（Fodor, Nature 364:555-556 [1993]；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）、細菌または胞子（米国特許第5,223,409号；参照として本明細書に組み入れられる）、プラスミド（Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:18651869 [1992]；参照として本明細書に組み入れられる）、またはファージ上（ScottおよびSmith, Science 249:386-390 [1990] Devlin Science 249:404-406 [1990]; Cwirlaら、Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382 [1990]; Felici, J. Mol. Biol. 222:301 [1991]；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）で提示される可能性がある。
【０１２３】
B. インビトロの薬剤スクリーニング
いくつかの態様では、本発明はインビトロの薬剤スクリーニングアッセイを提供する。いくつかの態様では、インビトロの薬剤スクリーニングアッセイは、細胞培養アッセイである。1つの態様では、アッセイは、変異TSC1またはTSC2を発現する細胞に被験化合物を接触させ、被験化合物がS6K活性を調節する能力を決定する、細胞ベースのアッセイである。被験化合物がS6K活性を調節する能力は、本明細書に開示されるものを含むがそれらに限定されない任意の適当な方法によって、決定できる。細胞は、例えば哺乳動物に由来することがある。
【０１２４】
他の態様では、S6KまたはmTORタンパク質またはその生物活性のある部分に、被験化合物を接触させ、被験化合物がS6Kキナーゼ活性またはmTOR活性を変化させる能力を評価する、無細胞アッセイが提供される。無細胞アッセイでは、標的遺伝子タンパク質と被験化合物の反応液を調製するが、これはこの2つの成分が相互作用をして結合できる条件下で、十分な時間行い、それにより除去および/または検出できる複合体を形成させる。
【０１２５】
さらに別の態様では、細胞株（例、TSC2-/-細胞株（例、LexF2細胞）のような齧歯類またはヒトの細胞株）を候補化合物で処理し、その細胞株がヌードマウスで腫瘍を誘導する能力を評価する（例、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,235,873号を参照されたい）。例えば、いくつかの態様では、候補化合物で処理された細胞株が腫瘍を誘導する能力を、候補化合物で処理されていない対照細胞株の能力と比較する。
【０１２６】
C. インビボの薬剤スクリーニング
他の態様では、インビボの薬剤スクリーニング法が使用される。いくつかの態様では、TSCの動物モデルであるEckerラットが利用される（例、Fox Chase Cancer Center、ペンシルバニア州フィラデルフィア、から市販されている）。別の態様では、TSCのマウスモデル（例、参照として本明細書に組み入れられる、Kwiatkowskiら、Hum Mol Genet 2002 Mar 1; 11(5):525-34を参照されたい）が利用される。動物モデルに候補化合物を投与し、候補化合物がTSCの症状にもたらす影響を観察する。好ましい化合物は、TSCの症状を低下または除去するが、動物に他の有害効果を引き起こさないものである。動物モデル（本明細書に記述されたようなもの）は、そのような物質による治療の有効性、毒性、副作用、または作用機序を決定するためにもさらに利用される。さらに、上述のスクリーニングアッセイで同定された新規の物質は、例えば、本明細書に記述されるように治療に使用できる。
【０１２７】
V. 治療法
いくつかの態様では、本発明はTSCの治療のための治療法を提供する。別の態様では、本発明は癌の治療のための治療法を提供する。
【０１２８】
A. TSCの治療法
いくつかの態様では、本発明はTSCを治療するための方法を提供する。いくつかの態様では、方法はS6KまたはmTORの阻害剤（例、上述の薬剤スクリーニングアッセイで同定された化合物）の投与を含む。いくつかの態様では、治療は、ラパマイシンもしくはラパマイシン誘導体、または上述の薬剤スクリーニング法を用いて同定された他の治療用化合物の投与を含む。さらに別の態様では、TSCの治療法は、遺伝的治療法（例、遺伝子療法）を含む。さらに別の態様では、治療法は抗体療法（例、ヒト化抗体療法）を含む。
【０１２９】
1. 薬物療法
いくつかの態様では、上述の薬剤スクリーニング法を用いて同定された低分子治療薬は、TSCの治療薬として利用される。化合物は、好ましくは薬学的化合物（例、以下に説明されるとおり）として調合される。例えば、以下に説明される方法を用いて、用量が決定される。本発明の治療薬をどのように調合、用量決定、および投与するかは、当業者には周知である。
【０１３０】
2. 遺伝的治療法
本発明はTSC1およびTSC2の発現を調節する際に、任意の遺伝子操作を使用することを意図している。例えば、いくつかの態様では、遺伝的治療法は、対象にTSC1またはTSC2の野生型を投与することを含む。インビトロまたはインビボでの核酸構築物の送達は、任意の適当な方法を使用して実施できる。適当な方法とは、所望の事象が起こるように（例、野生型TSC1またはTSC2の発現）、核酸構築物を細胞に導入する方法である。
【０１３１】
遺伝情報を運ぶ分子の細胞への導入は、裸のDNA構築物の直接の注入、該構築物を乗せた金粒子の照射、および例えば、リポソーム、バイオポリマー等を用いた巨大分子を介した遺伝子移入を含むがこれらに限定されない、様々な方法のうちの任意のものによって実行できる。好ましい方法では、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルスを含むがこれらに限定されない、ウイルスに由来する遺伝子送達ベクターを用いる。インビボで宿主細胞に核酸分子を運搬するためには、レトロウイルスよりも効率が良いので、アデノウイルスに由来するベクターが好ましい。アデノウイルスベクターは、動物モデルの様々な固形癌、および免疫不全マウスにおけるヒトの固形癌異種移植へ、インビボで非常に効率良く遺伝子移入をすることが示されている。アデノウイルスベクターおよび遺伝子移入の方法の例は、各々がその全体が参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第00/12738号および00/09675号、ならびに米国特許出願第6,033,908号、6,019,978号、6,001,557号、5,994,132号、5,994,128号、5,994,106号、5,981,225号、5,885,808号、5,872,154号、5,830,730号、および5,824,544号に記述されている。
【０１３２】
ベクターは、様々な方法で対象に投与できる。例えば、本発明のいくつかの態様では、ベクターは、直接の注入を用いて、腫瘍または腫瘍関連組織に投与される。別の態様では、投与は血液またはリンパ循環を通して行われる（例、全体が参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第99/02685号を参照されたい）。アデノウイルスベクターの典型的な用量では、潅流液に添加するベクター粒子数が好ましくは108から1011である。
【０１３３】
3. 抗体療法
いくつかの態様では、本発明は抗体療法を用いてS6KまたはmTORを阻害する方法を提供する。好ましい抗体は、TSCの症状を低下させるものである（例、S6KまたはmTORのシグナル伝達機能を阻害することによる）。S6Kに対する好ましい抗体は、S6Kのキナーゼ活性を阻害する抗体である。本明細書で開示される治療法には、任意の適当な抗体（例、モノクローナル、ポリクローナル、または合成）が利用できる。好ましい態様では、癌療法に使用される抗体は、ヒト化抗体である。抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である（例、上記の説明、およびその各々が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,180,370号、5,585,089号、6,054,297号、および5,565,332号を参照されたい）。好ましい態様では、抗体に基づく治療薬は、以下に説明するような薬学的組成物である。
【０１３４】
B. 癌の治療法
本発明は、TSCの治療に限定されない。上述のように、ラパマイシンおよびラパマイシン誘導体（例、上述のもの）は、様々な癌の治療に使用できる。ラパマイシンおよび誘導体は、任意の適当なスクリーニング方法を用いて（例、上述のもの）、腫瘍の増殖を低下させる能力について、スクリーニングできる。例えば、いくつかの態様では、癌の動物モデルをラパマイシンで治療する。別の態様では、薬剤のスクリーニングに腫瘍を持つヌードマウスまたは癌細胞株を使用する。本発明は、癌の治療薬として、ラパマイシンを使用することに限定されない。上述のように、mTORおよびS6Kのシグナル伝達を阻害する化合物は、癌治療薬として使用できると考えられる。
【０１３５】
C. 薬学的組成物
本発明はまた、薬学的組成物も提供する（例、上記の薬学的化合物を含むもの）。本発明の薬学的組成物は、局所治療か全身治療のどちらが望まれるか、および治療部位に依存して、いくつもの方法で投与できる。投与は、局所（眼科、および膣および直腸送達を含む粘膜を含む）、肺（例、ネブライザーによるものを含む粉末またはエアゾルの吸入または通気；気管内、鼻腔内、表皮内、経皮的）、経口、または非経口である可能性がある。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内注射もしくは注入；または頭蓋内、例、クモ膜下もしくは脳室内の投与が含まれる。
【０１３６】
局所投与用の薬学的組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末が含まれ得る。通常の薬学的キャリア、水性、粉末、または油性の基剤、増粘剤等も、必要または望ましい場合がある。
【０１３７】
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、小袋、または錠剤が含まれる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散剤、または結合剤も望ましい場合がある。
【０１３８】
非経口、気管内、または脳室内投与のための組成物および製剤には、緩衝液、希釈剤、および、浸透増強剤、キャリア化合物、および他の薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含むがこれらに限定されない他の適当な添加剤も含む可能性のある、無菌的な水溶液が含まれる可能性がある。
【０１３９】
本発明の薬学的組成物には、溶液、乳濁液、およびリポソーム含有製剤が含まれるがこれらに限定されない。これらの組成物は、既製の液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含むがこれらに限定されない様々な成分から作製される可能性がある。
【０１４０】
本発明の薬学的製剤は、単位用量ごとに都合よく提示される場合があるが、製薬業界で周知の通常の技術を用いて、調製できる。そのような技術には、活性成分と、薬学的キャリアまたは賦形剤を会合させる段階が含まれる。一般に、製剤は、活性成分と液体キャリアまたは細かく分割した固体キャリア、またはその両方を均一かつ密接に会合させ、必要ならば、製品の成形をすることによって、調製される。
【０１４１】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、座薬、および浣腸剤を含むがこれらに限定されない、多くの可能な剤形のうちの任意のものに調合できる。本発明の組成物は、水性、非水性、または混合媒体中の懸濁液としても調合できる。水性懸濁液はさらに、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を高める物質を含む可能性がある。懸濁液は、安定化剤も含む可能性がある。
【０１４２】
本発明の1つの態様では、薬学的組成物は、泡沫として調合され、使用される場合がある。薬学的泡沫には、乳濁液、マイクロエマルジョン、クリーム、ジェリー、およびリポソームのような製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの製剤は、基本的には類似した性質を持つものの、最終産物の成分および硬度が異なっている。
【０１４３】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込みを促進させる物質も、本発明の薬学的および他の組成物に添加できる。例えば、リポフェクチン（米国特許第5,705,188号）のような陽イオン脂質、陽イオングリセロール誘導体、およびポリリジン（国際公開公報第97/30731号）のようなポリカチオン分子も、細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みを促進させる。 
【０１４４】
本発明の組成物は、さらに薬学的組成物に通常見られる他の補助剤も含む可能性がある。したがって、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤のような、適合性のある薬学的に活性な物質をさらに含む可能性があり、または、色素、香料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、濃化剤、および安定化剤のような、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合するために役立つ更なる物質を含む可能性がある。しかし、そのような物質は、添加されても、本発明の組成物の成分の生物学的活性に不当に干渉してはならない。製剤は、滅菌し、必要ならば、例えば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝液、着色剤、香料、および/または芳香物質等のような、製剤の核酸と有害な相互作用をしない補助剤と混合することができる。
【０１４５】
本発明の特定の態様では、(a) 本発明の1つまたは複数の化合物、および (b) 1つまたは複数の他の化学療法剤を含む、薬学的組成物が提供される。そのような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェン・マスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロフォスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン(CA)、5-フルオロウラシル（5-FU）、フロクスウリジン（5-FUdR）、メトトレキセート(MTX)、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール(DES)のような抗癌剤が含まれるがこれらに限定されない。非ステロイド系抗炎症薬およびコルチコステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症剤、ならびに、リビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを含むがこれらに限定されない抗ウイルス剤も、本発明の組成物と組み合わせることができる。他の化学療法剤も、本発明の範囲内である。2つまたはそれ以上の組み合わせた化合物は、一緒にまたは順次使用できる。
【０１４６】
投与は、治療する病態の重症度および反応性に依存し、治療のコースは数日から数ヶ月または治癒が達成されるか、病態の低減が達成されるまで、継続する。最適な投与スケジュールは、患者の体内での薬剤の蓄積を測定して、計算できる。投与する医師は、至適用量、投与方法、および反復頻度を容易に決定できる。至適用量は一般に、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存し、インビトロおよびインビボの動物モデルにおいて有効なEC50に基づくか、本明細書に記述される実施例に基づいて、見積もることができる。一般に、用量は体重1 kgあたり0.01μgから100 gであり、1日1回またはそれ以上、毎週、毎月、または毎年、投与することができる。治療担当医師は、体液または組織中の薬剤の、測定した残留時間および濃度に基づいて、投与の反復頻度を見積もることができる。治療の成功後は、病態の再発を予防するために、対象は維持療法を受けることが望ましい場合があり、維持療法では、投与されるオリゴヌクレオチドの用量は、体重1 kgあたり0.01μgから100 gで、1日1回またはそれ以上から、20年に1回の投与となる。
【０１４７】
VI. 考察
タンパク質合成は、分裂促進増殖因子、アミノ酸濃度、および細胞のエネルギーレベルのような、様々な細胞内および細胞外の条件によって調節される、主要な細胞過程である（Schmidt, Oncogene 18:2988-2996 (1999)）。翻訳の主要な制御は、mTORによるS6Kおよび4EBP1のリン酸化によって仲介される（Proud, 2002）。本発明の開発の過程で行われた実験では、細胞のエネルギーレベルに応答して、TSC2が主要な生理学的役割を果たすことが示された（図7G）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、AktによるTSC2のリン酸化は、増殖因子のシグナルを伝達し、TSC2がS6Kおよび4EBP1のリン酸化を阻害する能力を抑制すると考えられる。反対に、細胞の低いエネルギーレベルによって開始するAMPKによるTSC2のリン酸化は、TSC2の活性を刺激する。これらの結果は、ATP枯渇に誘導されるS6Kの脱リン酸化には、AMPK依存性のTSC2のリン酸化が必要であることを示す。
【０１４８】
タンパク質合成は、細胞の全エネルギーの約25〜30％を利用し、細胞のエネルギー状態と密接に調和していなくてはならない。翻訳の阻害は、エネルギーが限定された細胞において、主要な生理学的応答となっている可能性がある。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、機序は図7Gに示されている。図7Gに提示されたモデルに基づくと、mTORは、TSC1/TSC2の下流のエネルギー感知経路にある。しかし、AMPKはおそらく細胞のエネルギーセンサーであり、TSC1/TSC2の上流で機能している。AMPKは、少なくとも2つの機序により、翻訳を阻害できる。1つは真核細胞の伸長因子2 (eEF2)のリン酸化により（Hormanら、2002）、もう1つはTSC2のリン酸化による。しかし、AMPKによるeEF2のリン酸化は、TSC-mTOR経路に依存しない。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、AMPKの活性化は、エネルギー枯渇および低い代謝状態に応答して、S6K、4EBP1、およびeEF2を含めた複数の翻訳調節因子の機能を抑制することにより、タンパク質合成の阻害に主要な役割を果たすと考えられる。TSC2はAMPKの鍵となる下流の標的である。
【０１４９】
グルコース枯渇は、TSC2-/-LEF細胞で、大量のアポトーシスを誘導する。野生型TSC2の発現は、アポトーシスを完全にブロックするが、TSC2-3A変異体の発現では、アポトーシスから細胞は守られない。さらに、TSC2は、グルコース枯渇からのみ保護し、DNA傷害に誘導されるアポトーシスからは保護しない。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、TSC2は細胞のエネルギー応答において、必須で特異的な役割を果たしていると考えられる。細胞のエネルギー応答におけるTSC2の機能は、グルコース枯渇または2-DG処理によるエネルギー制限でも、細胞のサイズが減少するという事実によってさらに支持される。さらに。TSC2発現も細胞のサイズを減少させる。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、エネルギー制限とTSC2は、培養された哺乳動物細胞のサイズを同様に調節すると考えられる。この研究では、細胞のエネルギー制限に対する生理的応答における、AMPKによるTSC2のリン酸化の重要性も確立された。AMPK依存性のリン酸化によるTSC2の活性化により、タンパク質合成の低下と、細胞エネルギーの保存が誘導されると考えられる（図7G）。このモデルと一致して、ラパマイシンは、グルコース枯渇に誘導されるアポトーシスからLEF細胞を著しく保護する（未発表データ）。TSC2-/-細胞は、エネルギー枯渇状態でも翻訳を抑制することができないので、有害な効果があり、アポトーシスの引き金となる可能性がある。本発明は、細胞の増殖および細胞の生存における、TSC2の重要な生理学的機能を明らかにする。いくつかの態様では、細胞のエネルギーレベルを低下させる任意の方法が（例、グルコースまたはアミノ酸供給の低下、ATP代謝を調節する薬剤等）、本発明の治療方法に使用できると考えられる。
【０１５０】
AMPKの変異が、家族性肥大型心筋症に関与しているとされていることは興味深い（HardieおよびHawley, 2001）。さらに、ラパマイシンによるmTORの阻害は、心肥大の抑制において、十分に実証されている（Shioiら、Circulation 107:1664-1670 (2003)）。TSC2は、ショウジョウバエにおいて（PotterおよびXu, Curr. Opin. Genet. Dev. 11:279-286 (2001)）、およびこの研究では哺乳動物細胞において、細胞サイズの制御に関する、顕著な負の調節因子である。これらの所見は全て、TSC2がAMPKの下流で作用し、mTORを阻害するという、限定しないモデルと矛盾がない。これは、心肥大でのAMPKの機能の仲介において、TSC2の使用を提供する。
【０１５１】
結論として、腫瘍抑制因子TSC2は、複数の経路のシグナルを統合し、翻訳、細胞のサイズ、およびアポトーシスを調節する。TSC2は、代謝状態およびエネルギーレベルに対する細胞の応答に関与している。AMPK依存性のリン酸化によるTSC2の活性化は、不利な増殖環境に備えて細胞の準備をし、細胞死から保護することになる。TSC1/ TSC2腫瘍抑制複合体の不活化は、結節性硬化症を引き起こすことに加え、腫瘍発生経路および細胞の肥大においても役割を果たしている。本発明は、TSC1またはTSC2陰性の癌細胞を選択的に殺す、細胞エネルギーレベルの枯渇のための方法を提供し、したがって、癌および他の状態の治療法を提供する。
【０１５２】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を示し、さらに説明するために提供されるもので、その範囲を限定すると解釈してはならない。
【０１５３】
以下の実施例の開示では、以下の略語が用いられる：N（正常）；M（モル）；mM（ミリモル）；μM（マイクロモル）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；pmol（ピコモル）；g（グラム）；mg（ミリグラム）：μg（マイクログラム）；ng（ナノグラム）；lまたはL（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；および℃（摂氏の温度）。
【０１５４】
A. 方法
抗体、プラスミド、および試薬
抗S6K、抗リン酸化S6K、抗mTOR、抗リン酸化mTOR、抗AKt、抗リン酸化Akt、抗リン酸化4EBP1、および抗リン酸化ERK抗体は、Cell Signalling Inc.から入手した。抗TSC2および抗Myc抗体は、Santa Cruz Biotechnology（カリフォルニア州サンタクルーズ）から入手した。抗HAおよび抗Flag抗体は、それぞれCovance（ニュージャージー州プリンストン）およびSigma（ミズーリ州セントルイス）から入手した。HAタグS6K1（αII）およびGST-S6構築物は、J. Blenis（ニューヨーク州ニューヨーク、コロンビア大学）から入手した。FlagタグmTORおよびキナーゼ不活化mTORは、S. Schreiber（マサチューセッツ州ケンブリッジ、ハーバード大学）から入手した。H-RasV12、PTEN、PTEN-CS、Akt、Akt-KM、Flagユビキチン、およびFlag-4E-BP1を含め、その他のDNA構築物は全て、研究室のストックであった。TSC2の変異構築物は全て、PCR変異導入によって作製され、DNA配列決定によって確認された。LY294002は、Calbiochem（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した；ホスファターゼはNew England Biolabs（マサチューセッツ州ビバリー）から入手した。MG132はPeptide Instituteから入手した。シクロヘキシミドおよびワートマニンは、Sigmaから入手した。D-PBSはGibcoから入手した。ラパマイシンはCell Signallingから入手した。
【０１５５】
細胞培養、トランスフェクション、および免疫沈降
HEK293細胞は、10％ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)中に播種し、維持した。トランスフェクションは、製造元の説明書に従って、リポフェクタミン試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いた無血清条件で行った。簡単に述べると、トランスフェクションの4時間後に、10％FBSを含むDMEM中で細胞を16時間回収し、そして16〜24時間飢餓状態にした。その後、細胞を溶解緩衝液（10mM Tris-HCl、pH7.5、100 mM塩化ナトリウム、1% NP-40、1% Triton X-100、50 mMフッ化ナトリウム、2mM EDTA、1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物、10μg/mlロイペプチン、および10μg/mlアプロチニン）中で溶解し、標示された抗体およびプロテインGセファロースビーズを用いて免疫沈降させた。免疫複合体は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって解析した。
【０１５６】
キナーゼアッセイ
S6Kアッセイでは、6ウェルプレートで増殖させたHEK293細胞に、図に記載されるように、種々のプラスミドと共に、またはなしで、10〜20 ng HA-S6K構築物をトランスフェクトした。HA-S6Kは抗HA抗体を用いて、血清枯渇細胞から免疫沈降させ、基質として精製GST-S6を用いてインビトロキナーゼアッセイによって解析した（Pearsonら、EMBO J. 14, 5279-5287 (1995)）。
【０１５７】
Aktキナーゼアッセイには、10μgのGST-AktまたはGST-Akt-KM（キナーゼ不活性）DNAを、2μg RasV12の存在下で、10 cmプレート中のHEK293細胞にトランスフェクトした。GST-Aktを精製し、インビトロで5μgの精製GST-TSC2断片1（アミノ酸910位〜1112位）または断片2（アミノ酸1357位〜1765位）のリン酸化に使用した。mTORキナーゼアッセイは、以前に記述されたようにして行なった（Dennisら、Science 294, 1102-1105 (2001)）。簡単に述べると、HEK293細胞に、TSC1-TSC2と共に、またはなしでFlag-mTORを一過性にトランスフェクトした。細胞を溶解し、抗Flag抗体で免疫沈降させ、基質として精製GST-S6Kを用いてインビトロキナーゼアッセイにより解析した。mTORキナーゼ緩衝液は2 mM ATPを含んでいた。GST-S6Kのリン酸化は、抗リン酸化Thr 389 S6K抗体を用いて免疫ブロット解析を行うことにより決定した。
【０１５８】
RNA干渉
RNAi-NおよびRNAi-Cは、TSC2のアミノ酸残基164位〜170位（RNAi-N）および1518位〜1524位（RNAi-C）に対応する、二本鎖RNAオリゴヌクレオチドを表す（Elbashirら、Nature 411, 494-498 (2001)）。HEK293細胞に、上述のようにリポフェクタミン試薬を用いて、指示されたプラスミドと共に、またはなしで、200〜1000 ng RNAiをトランスフェクトした。内因性TSC2のレベルは、抗TSC2抗体を用いた免疫ブロットによって決定した。
【０１５９】
代謝ラベルおよび2次元リン酸化ペプチドマッピング
HEK293細胞は、HAタグTSC2、MycタグTSC1、および記載されたプラスミドを同時トランスフェクションさせた。細胞は、4時間、リン酸および血清を枯渇させてから、0.25 mCi/ml 32P-正リン酸塩（ICN）と4時間インキュベートした。
【０１６０】
細胞は、氷冷したPBSで1回洗浄し、溶解した。HAタグTSC2を免疫沈降させ、SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写させた。リン酸化TSC2はオートラジオグラフィーで可視化し、その後、リン酸化ペプチドマッピングを行なった。簡単に述べると、リン酸化TSC2のバンドを切り出し、メタノール中で固定し、100 mM酢酸中に溶解した0.5％ポリビニルピロリドン40溶液500μl中で、37℃で30分間インキュベートした。その後、5％アセトニトリルを含むpH 8.0の75 mM重炭酸アンモニウム緩衝液中で、37℃で、TPCK処理されたトリプシン（Sigma）20μgを用いて、試料を消化した。消化後、試料を真空下で乾燥させ、10μlの水に懸濁した。試料をセルロースプレート上にスポットし、pH 8.9の1％重炭酸アンモニウム緩衝液を用いて、1次元電気泳動を行なった。プレートは、クロマトグラフィー緩衝液（n-ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝20:24:6:30）中で、2次元クロマトグラフィーによって分離した。プレートを乾燥させ、オートラジオグラフィーによってリン酸化ペプチドを可視化した。
【０１６１】
B. 結果
S6K活性に対するTSC1-TSC2の影響
細胞増殖の制御におけるTSC1-TSC2機能の機序を解明するために、哺乳動物細胞において、S6K活性に対するTSC1-TSC2の影響を調べた。TSC1とTSC2の同時発現で、インスリンおよびRasに刺激されるS6Kキナーゼ活性に加え、基礎S6Kキナーゼ活性も阻害される（図1a）。TSC1-TSC2のこの阻害活性は、細胞増殖制御においてこれが負の役割を果たしていることと一致する。S6K活性は、Thr 389、Thr 421およびSer 424を含む、いくつかの残基のリン酸化によって活性化される（DufnerおよびThomas, Exp. Cell Res. 253, 100-109 (1999)）。これらの残基のリン酸化は、インスリン、Aktおよび活性化されたRasによって刺激される（図1b）。さらに、TSC1-TSC2が同時発現すると、3つの条件全てにおいて、Thr 389のリン酸化が阻害された（図1b）。Thr 389は、S6K29の活性化と相互に相関する、ラパマイシン感受性リン酸化部位であることが知られている。TSC1-TSC2が共に発現しても、S6Kのラパマイシン非感受性部位であるThr 421またはSer 424（Dufnerら、上記）のリン酸化には、ほとんど影響がなかった（図1b）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの結果は、TSC1-TSC2がmTORを通してその効果を発揮する可能性を示すものだと考えられる。
【０１６２】
S6Kの活性化におけるTSC1-TSC2の特異性を調べるために、やはりRasによって活性化されるERKに対するTSC1-TSC2の効果を調べた。結果は、TSC1-TSC2の過剰発現はRas誘導性ERKのリン酸化に影響はないが、一方で同じ実験において、S6Kのリン酸化は阻害されたことを示した（図1c）。これらの所見は、TSC1-TSC2がS6Kのリン酸化と活性化を特異的に阻害することを示す。
【０１６３】
インスリン経路におけるTSC1-TSC2の位置を決定するために、mTORおよびS6Kの上流にあるAktの、インスリン誘導性リン酸化に対する、TSC1-TSC2の過剰発現の効果を調べた。結果からは、TSC1-TSC2はインスリン誘導性Aktのリン酸化を阻害することはできないが、S6Kのリン酸化を用量依存的に阻害することが示された（図1d）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、TSC1-TSC2はAktの下流、またはこれと平行して機能すると考えられる。
【０１６４】
RNA干渉
内因性TSC2のS6Kに対する効果を調べるために、RNA干渉（RNAi）が用いられた。TSC2のアミノ末端（RNAi-N）またはC末端（RNAi-C）領域のいずれかに対応する、2つの二重鎖RNAを用いて、内因性TSC2の発現を抑制した（図2a）。RNAi-CまたはRNAi-Nのトランスフェクションによって、HEK293細胞の内因性TSC2タンパク質レベルが大きく低下したが、TSC2 RNAiはMEK2の発現レベルには影響を示さなかった。データは、TSC2 RNAiによる内因性TSC2タンパク質レベルの低下が、トランスフェクトされたS6Kの、基礎リン酸化およびインスリン刺激によるリン酸化の両方を上昇させることを示す（図2a）。無関係のRNAオリゴヌクレオチドを用いた対照実験では、S6Kのリン酸化には影響がなかった。内因性Akt、S6KおよびS6のリン酸化に対するTSC2 RNAiの効果も調べられた。TSC2 RNAiのトランスフェクションによって、内因性S6KおよびS6両方のリン酸化においては、わずかながら再現性のある上昇が誘導されたが、Aktには見られなかった（図2b）。S6リン酸化の上昇は、TSC2 RNAiがS6K活性を上昇させたことを意味する。共にトランスフェクトされた赤血球凝集素(HA)タグS6Kと比較すると、内因性S6Kのリン酸化の上昇は、それほど劇的ではない。これは、トランスフェクションの効率が100％ではないためである。トランスフェクトされなかった細胞の内因性S6Kが、トランスフェクトされた細胞のRNAiの効果を希釈している。したがって、TSC2 RNAiがトランスフェクトされた細胞における内因性S6Kの真の上昇は、図2bに示されるデータよりも、劇的なはずである。上記の所見は、TSC1-TSC2の1つの生理学的機能は、S6Kキナーゼのリン酸化および活性化を阻害することであることを示す。
【０１６５】
キナーゼ活性に対するTSCの変異の効果
患者において、TSC1およびTSC2の変異が以前から多く同定されている（Deboraら、Am. J. Hum. Genet. 68, 64-80 (2001); Jonesら、Am. J. Hum. Genet. 64, 1305-1315 (1999)；参照として本明細書に組み入れられる）。次に、TSC2がS6K活性を阻害する能力に対して、これらの疾病に由来する変異が、どのような効果を持つかが調べられた。具体的には、表面残基の変異の方が、TSC2の3次元構造に影響を与える可能性が少ないので、親水性または荷電した残基における点突然変異が調べられた。解析した疾病関連変異11例の全てにおいて、野生型対照と比較して、S6Kリン酸化を阻害する能力の低下がみられた（図2c）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらのデータは、TSC1-TSC2によるS6K活性の阻害は、生理的に関連するものであることを示すと考えられる。
【０１６６】
AktによるTSC2のリン酸化
ショウジョウバエの遺伝研究では、dTsc1-dTsc2が、細胞の増殖制御においてIRの機能に拮抗することが確立しているが、この経路におけるdTsc1-dTsc2の詳しい機能は明らかではない。遺伝的証拠は、dTsc1-dTsc2がAktの下流またはこれに平行して作用する可能性があることも示している（GaoおよびPan, Genes Dev. 15, 1383-1392 (2001); Potterら、Cell 105, 357-368 (2001)）。これらの2つの可能性を区別するために、TSC1およびTSC2に対するAktの効果が調べられた。Aktとの共発現では、遅い移動度の型のTSC2が蓄積するが、キナーゼ不活化変異体Akt-KMとの発現では蓄積せず、AktがTSC2のリン酸化を促進することが示された（図3a）。反対に、AktはTSC1に対して影響を示さない。また、Aktの内因性の活性化を阻止するPI(3)K阻害剤LY294002で処理すると、TSC2の移動度が増大した。さらに、PTENまたはその触媒的に不活性な変異体PTEN-CSを用いた実験でも、AktがTSC2のリン酸化を担っているという考えが支持された。PTENの発現ではTSC2の移動度が増大したが、PTEN-CSで上昇しなかった（図3a）。ホスファターゼ処理により、移動度の変化はリン酸化の結果であることが確認された（図3a）。
【０１６７】
AktによるTSC2のリン酸化を特徴付けるために、インビボの32P標識および2次元リン酸化ペプチドマッピングが行われた。結果は、インビボではTSC2の複数の部位がリン酸化されることを示した（図3b）。AktまたはPTENとの共発現では、リン酸化ペプチドのサブセットが影響を受けた（図3b、パネルVおよびVI）。Aktはこれらのリン酸化ペプチドの強度を上昇させたが、PTENは強度を減少させた。これらの結果は、模式的にも示されている（図3b、パネルIV）。影をつけた部分は、AktまたはPTENとの共発現によりその強度が変化するリン酸化ペプチドを示す。インスリン刺激は、Aktによって促進されるものと同じリン酸化ペプチドのリン酸化をわずかに増加させた（図3c、パネルII）。Aktを間接的に阻害するLY294002によって処理しても、同じリン酸化ペプチドのサブセットのリン酸化が低下した（図3c、パネルIII）。反対に、ラパマイシンによってmTORを阻害しても、TSC2のリン酸化に対する影響はなかった（図3c、パネルIV）。これらの結果は、インスリン-Akt経路はTSC2のリン酸化を担うが、mTORまたはS6Kは関与していないことを示す。
【０１６８】
TSC2の変異解析
TSC2の配列解析では、TSC2には8つの推定AKtコンセンサスリン酸化部位が含まれており（Dattaら、Genes Dev. 13, 2905-2927 (1999)）、そのうち2つがdTsc2で保存されていることが示された（図4a）。2つの推定Akt部位が内部で欠失しているラットTSC2 cDNAが得られた。この短い型のTSC2は、発現配列タグ(EST)データベースでもいくつかのクローンにおいて同定されているが、これがこの試験で使用された。TSC2のリン酸化をさらに調べるために、6つの推定Aktリン酸化部位（図4a）に、個々に（A1-A5）または組み合わせて（6A）（図4b）、変異を導入した。Ser 939（A1；パネルI）、Ser 1086/Ser 1088（A2；パネルII）、Thr 1422（A4；パネルIV）の変異はTSC2のリン酸化ペプチドのパターンに影響を与えたが、Ser 1378（A3；パネルIII）およびSer 1756（A5；パネルV）の変異は影響を与えなかった（図4b）。6A変異体（パネルVI）で消失したリン酸化ペプチドは、パネルVIIIで影をつけたスポットとして示されている。これらのリン酸化ペプチドのパターンは、AktまたはPTENの同時発現（図3b、パネルVIと図4b、パネルVIIIを比較されたい）、またはLY294002処理（図3c、パネルIII）により変化するものと正確に一致した。これらのデータは、Ser 939、Ser 1086/1088およびThr1422がTSC2のインビボでの正確なリン酸化に必要であることを示している。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの部位はAkt依存性のリン酸化部位だと考えられる。
【０１６９】
TSC2の上記のように同定された残基をAktがリン酸化することを示すために、精製された組み換えタンパク質を用いて、AktがインビトロでTSC2をリン酸化するかどうかが調べられた。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）-Aktは、トランスフェクトされたHEK293細胞から精製され、一方で、TSC2断片1および2が大腸菌で発現され、精製された。野生型AktはインビトロでTSC2の断片1および断片2を効率良くリン酸化したが、キナーゼ不活性のAkt-KM変異体については、リン酸化しなかった（図4a、c）。さらに、断片1中のSer 939、Ser 1086およびSer1088の変異、ならびに断片2中のThr 1422の変異により、インビトロでのAkt依存性リン酸化はなくなった（図4c）。このデータは、インビトロとインビボの両方で、AktがTSC2の複数の部位を直接リン酸化することを示す。
【０１７０】
ショウジョウバエでは、細胞増殖の制御においてAktとTSC2が反対の機能を持つがそれに基づくと、Aktによるリン酸化がTSC2の機能を阻害することは、もっともなことである。Aktリン酸化部位がアラニンに変異すると、TSC2がS6Kを阻害する能力が高まるが、リン酸様酸性残基への変異は、TSC2の阻害活性を低下させた（図5a）。Aktシグナル伝達経路のもう1つの下流の標的は、4E-BP1であり、これはPI(3)K/Akt誘導性細胞増殖の調節に関与している（Mironら、Nature Cell Biol. 3, 596-601 (2001)）。これと一致して、リン酸様TSC2変異体は、4E-BP1のリン酸化を阻害するという点で、アラニン変異体よりも効率が悪かった（図5b）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらのデータは、Akt依存性のリン酸化がTSC2の機能を阻害することを示すと考えられる。
【０１７１】
TSC1とTSC2の間の複合体の形成は、その生物学的機能に重要である。TSC2の疾病関連変異は、TSC1との相互作用を弱めるが（図2c）、これはTSC1-TSC2複合体の形成が機能的に重要であることをさらに支持している。また、免疫共沈降実験で決定されたように、TSC2中のAkt部位のリン酸様変異がTSC1との相互作用を弱めることも分かった（図5c）。遊離のTSC2は、ユビキチン依存性の分解に感受性なため、不安定であるが、TSC1-TSC2複合体が形成されると、TSC2が安定化する（Benvenutoら、Oncogene 19, 6306-6316 (2000)）。同じ量のDNAがトランスフェクションで用いられた時に、リン酸様TSC2変異体は、野生型またはTSC2アラニン変異体よりも一貫して低いレベルで発現された。疾病由来のTSC2R611Q変異体と同様に、TSC2のリン酸様変異体は、野生型TSC2またはアラニン変異体よりも不安定だった（図5d）。TSC2変異体のユビキチン化は、プロテオソーム依存性タンパク質分解の阻害剤である、10μM MG132の存在下で、調べられた。予想した通り、リン酸様変異体はユビキチン化されたが、野生型TSC2およびアラニン置換変異体のユビキチン化の程度はこれよりも低かった（図5e）。同様に、疾病由来のTSC2R611Q変異体も、高度にユビキチン化された。したがって、Akt依存性リン酸化は、TSC2のTSC1との会合を不安定化し、これによりユビキチンを介した分解を促進することによって、TSC2の機能を阻害する。
【０１７２】
栄養素刺激
栄養素の刺激はS6Kを活性化し、4E-BP1を不活化する（Shahら、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 279, E715-E729 (2000)）。栄養素に誘導されるS6Kおよび4E-BP1のリン酸化は、ラパマイシンによって阻止され、栄養素のシグナル伝達にmTORが主要な役割を果たすことを示している。反対に、栄養素の刺激はAkt35の活性化には影響しない。栄養素に刺激されるS6Kのリン酸化およびキナーゼ活性は、TSC1-TSC2によって阻害され（図6a）、TSC1-TSC2が栄養素の反応にも関与していることが示される。S6K活性の阻害は、S6Kと比較してはるかに少ないTSC1-TSC2タンパク質が発現している条件で観察される。S6KとTSC1-TSC2の間の直接の相互作用は検出されず、TSC1-TSC2は、S6Kのラパマイシン感受性部位であるThr 389のリン酸化を選択的に阻害する（図1b）。4E-BP1のリン酸化は、ラパマイシンによる阻害に感受性であり、mTORは4E-BP1を直接リン酸化することが示されている（Gingrasら、Genes Dev. 13, 1422-1437 (1999)）。TSC1-TSC2が共に発現すると、栄養素による刺激に応答した4E-BP1のリン酸化も阻害された（図5b）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの所見を合わせると、TSC1-TSC2がmTORを通してS6Kおよび4E-BP1のリン酸化を調節する可能性があると考えられる。
【０１７３】
TSC1-TSC2の機能におけるmTORの役割を調べるために、ラパマイシン耐性変異体S6K-dC104およびS6KdNCが解析された（Dennisら、Science 294, 1102-1105 (2001); Wengら、Mol. Cell. Biol. 15, 2333-2340 (1995)；この各々は参照として本明細書に組み入れられる）。S6K-dC104はC末端の欠失を含み、S6K-dC104のThr 389のリン酸化はLY249002によって阻害されるが、ラパマイシンでは阻害されない（Dennisら、上記）。反対に、S6K-dC104のキナーゼ活性はラパマイシンによって阻害される（Wengら、上記；Schalmら、Curr. Biol. 12, 632-639 (2002)）。報告された所見と一致して、S6K-dC104のThr 389のリン酸化は、ワートマニンまたはLY294002によって阻害されるが、ラパマイシンによっては阻害されない（図7a）。TSC1-TSC2はS6K-dC104のThr 389の基礎またはインスリン刺激性リン酸化のいずれも阻害しない（図7b）。S6K-dC104のキナーゼ活性はTSC1-TSC2によって阻害される（図7c）。これらの結果は、TSC1-TSC2の効果は、ラパマイシンの効果と類似していることを示す。S6KのN末端領域には、TORシグナル伝達(TOS)モチーフが含まれている（Schalmら、上記）。TOSモチーフを削除すると、キナーゼ活性が著しく低下し、mTORによる刺激が除去される。しかし、C末端をさらに削除すると、N末端の欠失のキナーゼ活性を部分的に回復させ、S6K-dNCはラパマイシンに完全に耐性になる（Schlamら、上記）。S6K-dNCのキナーゼ活性も、TSC1-TSC2による阻害に耐性である（図7c）。S6K変異体に対するTSC1-TSC2の効果は、ラパマイシンの効果と厳密に相関しており、したがって、TSC1-TSC2とmTORとが同一の経路で機能するというモデルを支持する。
【０１７４】
mTORに対するTSC1-TSC2の影響を決定するために、免疫沈降したmTORのインビトロキナーゼアッセイが行われた。TSC1-TSC2の共トランスフェクションでは、mTORがS6KのThr 389をリン酸化する能力が阻害され（図7d）、mTOR活性がTSC1-TSC2によって阻害されることが示された。さらにmTOR活性に対するTSC1-TSC2の効果を調べるために、mTORの活性化に関与しているとされているmTORのSer 2448のリン酸化が調べられた（Naveら、Biochem J. 344, 427-431 (1999)）。結果は、TSC1-TSC2の過剰発現が、用量依存的に、mTORのSer 2448のリン酸化を阻害することを示した（図7e）。さらに、RNAiによって内因性TSC2を減少させると、mTORのSer 2448のリン酸化が上昇し（図7e）、mTORの調節における内因性TSC1-TSC2の負の役割が支持された。AktはmTORのSer 2448をリン酸化することが示唆されている（Naveら、上記；Scottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 7772-7777 (1998); Sekulicら、Cancer Res. 60, 3504-3513 (2000)）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、Aktの活性化はTSC1-TSC2によって阻害されないので、TSC1-TSC2を介する、mTORのSer 2448のリン酸化の阻害は、共通のキナーゼであるAktの競合の結果であると考えられる。また、TSC1-TSC2が、mTORのAktへの到達（accessibility）を阻止する、および/またはmTORの脱リン酸化を促進するという可能性もある。
【０１７５】
TSC2のリン酸化を誘導するATPの枯渇
タンパク質合成は、細胞のエネルギーレベルを含む複数の細胞条件によって調節されている。グルコース類似体である2-デオキシ-グルコース（2-DG、ヘキソキナーゼを間接的に阻害することによって、細胞のグルコース利用を阻止する）、ミトコンドリアの脱共役因子FCCP、およびPKC阻害剤ロットレリンにより（Soltoff, J. Biol. Chem. 276:37986-37992 (2001)）、細胞のATPが枯渇すると、S6Kおよび4EBP1の脱リン酸化が起きることが観察された（図8A）。また、D-PBS中で細胞を培養することによる栄養素の枯渇は、S6Kおよび4EBP1のリン酸化を阻害した（Haraら、1998）。ATPおよび栄養素が枯渇すると、5％のSDS-PAGEゲルで分離した場合、TSC2の移動度が著しく上方に移動し（図8B）、これらの細胞条件によって、TSC2のリン酸化が促進された可能性が示される。
【０１７６】
20〜100 mMの間の濃度で用いた2-DG処理により、細胞内ATPレベルは20〜50％低下し、S6Kおよび4EBP1のリン酸化が阻害されることが、以前に報告されている（Dennisら、2001）。2-DGによるS6Kおよび4EBP1のリン酸化の阻害は、ATPに対するKmが約1 mMであるmTORによって、ATPレベルの低下が感知された直接の結果であると結論された（Dennisら、2001）。本発明の開発の過程で行われた実験では、オスモライトであるマンニトールも100 mMで S6Kのリン酸化を著しく阻害し（図8C）、高濃度の2-DGの効果は、細胞のATPレベルの枯渇と、これのオスモライトとしての作用との混合型の応答によることが示された。さらに、2-DGが25 mMのような低濃度になると、S6KのT389におけるリン酸化が効率的に阻害されるが、同様な濃度のマンニトールでは、あまり効果がないことが観察された（図8C）。S6および4EBP1のリン酸化についても、同様な所見が観察された（図8C）。mTOR活性と相関する、mTOR S2448のリン酸化も（Naveら、1999; Scottら、Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7772-7777 (1998); Sekulicら、2000）、25 mM 2-DGによって阻害された（図8C）。反対に、25 mM 2-DGはAktのリン酸化にはほとんど影響しなかった（図8C）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの結果は、2-DGがS6K、4EBP1およびmTORのリン酸化を特異的に阻害するが、Aktを介したシグナル伝達の阻害は行なわないことを示すと考えられる。
【０１７７】
AMPKは、AMP/ATPの比率によって活性化するので、細胞のエネルギー状態の変化に対して、mTORよりも感受性が高い。AMPKのT172リン酸化の劇的な上昇で示されるように（図8D）、25 mM 2-DGはAMPKを活性化した。25 mMの2-DGは、AMPKの迅速な活性化を誘導し、同時に処理時間に応じて、S6Kの脱リン酸化も誘導した（図8E）。これらのデータは、AMPKの活性化がS6Kおよび4EBP1の阻害と密接に相関しているという最近の報告と一致している（Hormanら、2002; Kimuraら、2003; Krauseら、2002）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらのデータは、AMPKの活性化はATP枯渇に誘導されるS6Kおよび4EBP1の脱リン酸化を担っている可能性があることを示すと考えられる。25 mM 2-DGで処理された細胞中では、ATPレベルの統計的に有意な低下と、細胞内のAMP/ATP比の上昇が、観察された（図8F、G）。しかし、以前に発表されたデータに基づくと、ATP濃度の低下は、mTORキナーゼ活性にはあまり影響しない（Dennisら、2001）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、中程度のエネルギー枯渇に対しては、AMPKが、主なエネルギーセンサーであると考えられる。グルコースの制限によりS6Kリン酸化が低下し、AMPKリン酸化が上昇し、TSC2の移動度の変化（shift）を誘導した（図8H）。
【０１７８】
内因性AMPKとTSC2との間の相互作用を刺激する2-DG
AMPKがTSC2のリン酸化を担うかどうかを決定するため、AMPKとTSC2の相互作用の存在が調べられた。AMPKの免疫沈降は、TSC1およびTSC2の両方が、AMPKと弱く免疫共沈殿することを示した（図9A）。TSC2およびTSC1は2-DGの刺激の後、選択的にAMPKと相互作用することが分かった。AMPKの活性型を認識する抗リン酸化AMPK抗体（pAMPK）を用いた免疫共沈殿も行われた。この抗体は、対照および2?DG処理細胞溶解物の両方から、AMPKの活性型を特異的に沈殿させた（図9A）。しかし、抗pAMPK免疫沈降では、TSC2もTSC1も回収されなかった。AMPKのT172は、活性化ループに存在しているので、この所見は、驚くべきことではない（Scottら、J. Mol. Bio. 317:309-323 (2002); Steinら、Biochem. J. 345(part3):437-443 (2000)。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの結果は、活性化ループに対するAMPKの結合は、既知のキナーゼ構造に基づいた、基質の結合を阻止する可能性があることを示すと考えられる。
【０１７９】
活性AMPKがTSC2と結合するかどうかを決定するために、抗TSC2抗体を用いた相互免疫共沈殿後に、抗AMPKおよび抗pAMPK抗体を用いたウェスタンブロッティングを行なった。内因性AMPKとTSC2との間の相互作用は、2-DGによって増強することが観察された（図9B）。この相互作用は、競合するペプチドとともにTSC2抗体を前もってインキュベートすることにより、効率良く競合され、免疫共沈殿の特異性が示された（図9B）。図9Cは、溶解物中のタンパク質レベルが、類似していることを示す。上記の所見は、2-DG処理が内因性TSC2とAMPKとの間の相互作用を刺激することを示す。
【０１８０】
2-DGがTSC2とAMPKとの間の相互作用を増強することを確認するための、内因性AMPKと過剰発現したTSC2との間の共沈殿試験も行われた（図9D）。欠失解析では、TSC2のC末端ドメインがAMPKとの相互作用を担っており、N末端ドメインは不要であることが示された。
【０１８１】
細胞のエネルギー応答を仲介するために必要なTSC2
2-DGによるS6Kの不活化におけるTSC2の役割を決定するために、HEK293細胞をTSC2 RNAiオリゴで処理した。TSC2 RNAiは内因性TSC2タンパク質レベルを著しく低下させたが、無関係のタンパク質MEK2には影響しなかった（図10A）。2-DGの誘導するS6Kの脱リン酸化は、TSC2ノックダウン細胞では阻止されたが、対照細胞では阻止されなかった。反対に、TSC2ノックダウンは、2-DGに応答したAMPKリン酸化には有意に影響しなかった。ラパマイシンによるmTORの阻害は、TSC2発現がノックダウンされていても、S6Kリン酸化を阻止し、mTORがTSC2の下流であることが示された（図10B）。
【０１８２】
S6K調節におけるAMPKの機能がさらに調べられた。活性AMPKのαIまたはαII触媒サブユニットを共に発現すると、S6Kリン酸化が低下する（図10C）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、AMPKはS6Kリン酸化の負の調節を行なうと考えられる。RNAiによってTSC2をノックダウンすると、AMPK発現の阻害効果が阻止され、TSC2がAMPKの下流で作用することが示された。TSC2 RNAiとラパマイシンのいずれも、AMPKの2つの基質であるアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)および真核生物伸長因子2 (eEF2)のリン酸化に影響を与えず（図10D、E）、S6Kの調節に関してTSC2がAMPKを仲介する特別な役割を持つということを支持する。
【０１８３】
ATP枯渇によるS6Kの阻害を、TSC2が仲介するという役割を持つなら、線維芽細胞EEF8 (TSC2 -/-)およびEEF4(TSC2 +/+)は、様々なATP枯渇試薬に異なる反応を示すはずだという仮説が立てられた。予想通り、EEF8細胞では、S6Kリン酸化のレベルが、はるかに高かった（図10F）。EEF4細胞とEEF8細胞の結果を比較するために、S6Kリン酸化の免疫ブロット（短時間および長時間露光の両方）を図10Fに示す。ロットレリン、FCCP、および程度は低いながらもアジ化合物、オリゴマイシン、およびロテノンが、EEF4細胞でS6Kリン酸化を低下させることが観察された。S6Kリン酸化に対するこれらの試薬の効果は、EEF8 細胞では、はるかに弱かった（図10F）。4EBP1のリン酸化についても、同様の結果が観察された。しかし、AMPKの活性化には、EEF4細胞とEEF8細胞との間で、違いはなかった（図10F）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、S6Kおよび4EBP1のリン酸化に対するATP枯渇の効果を仲介する上で、TSC2が重要な役割を果たすと考えられる。2-DGおよびD-PBS処理を用いて、同様な実験が行なわれた。EEF8 (TSC2 -/-)細胞では、2-DGおよびD-PBSは4EBP1のリン酸化に対して、ほとんど影響しなかった。これは、EEF4 (TSC2 +/+)細胞における、4EBP1のリン酸化の阻害と対照的である（図10G）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらのデータは、栄養素枯渇によって誘導されるS6Kの脱リン酸化が、TSC2-/-細胞では損なわれているという、以前に発表された所見と一致している（Gaoら、Nat. Cell. Biol. 4:699-704 (2002)）。
【０１８４】
AMPKによるTSC2のリン酸化
λホスファターゼで処理すると、TSC2は、より速い移動性のバンドに変換され（図11A）、2-DGによって誘導される移動度の変化が、リン酸化のためであることが示された。TSC1もリン酸化タンパク質で、λホスファターゼ処理によって下方に変化する（図11A）。しかし、2-DG処理ではTSC1の移動度は変化しなかった。活性AMPKαIを共にトランスフェクトした場合も、TSC2の移動度の上方変化が引き起こされたが、TSC1は変化せず、AMPKがTSC2のリン酸化を調節していることが示された（図11B）。AMPK阻害剤（化合物C）を用いて、内因性AMPKがTSC2のリン酸化に関与しているかどうかが調べられた（Zhouら、J. Clin. Invest. 108:1167-1174 (2001)）。HEK293細胞を10μMのAMPK阻害剤とインキュベートすると、TSC2の移動度が増大し、内因性AMPKがTSC2のリン酸化に役割を果たしていることが支持された（図11C）。
【０１８５】
AMPKと2-DGに誘導されるS6Kの脱リン酸化との間の機能的関係が、ドミナントネガティブなAMPKを発現することで、調べられた。AMPKのキナーゼ不活性触媒サブユニットαII（AMPK-DN）の用量依存的発現により、2-DG処理によるS6K阻害が部分的に阻止された（図11D）。さらに、HEK293細胞をAMPK阻害剤とインキュベートすると、S6Kリン酸化に対する2-DGの阻害効果が、著しく逆行した（図11E）。逆に、AMPK阻害剤による処理は、Aktリン酸化には影響を与えなかった。AMPK阻害剤はまた、グルコース枯渇により誘導されるS6Kの脱リン酸化を著しく阻止した（図11F）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらのデータは、エネルギー枯渇に応答した、TSC2のリン酸化およびS6Kの阻害に、AMPKの活性化が重要な役割を果たすことを示すと考えられる。
【０１８６】
TSC2の主要なAMPKリン酸化部位であるT1227およびS1345
AMPKによるTSC2制御の機序を解明するために、TSC2のインビボ標識および2次元リン酸化ペプチドマッピングが行われた。2-DG (25 mMおよび40 mM)による刺激により、いくつかのペプチドのリン酸化が増加した（図12Aのパネルa、bおよびcを比較されたい）。興味深いことに、活性AMPKαIサブユニットが共に発現しても、2-DGによって刺激されるのと同じペプチドのリン酸化が増加した（図12Aのパネルaとdを比較されたい）。パネルeの影をつけたスポットは、2-DGまたはAMPKによって誘導されるリン酸化ペプチドを示す。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの結果は、2-DG処理がTSC2のリン酸化を刺激し、TSC2のリン酸化においてはAMPKが重要な役割を果たすことを明らかに示すと考えられる。
【０１８７】
以前に、AMPK認識のコンセンサス部位がTSC2配列で検索され（Hardieら、1998）ラットのTSC2には8つの推定AMPK部位があることが分かった。全ての推定AMPK部位は、個々に変異を導入し、それぞれ個別の変異体を用いた2次元リン酸化ペプチドマッピングを行なった。これらのデータは、T1227AおよびS1345Aを除く全ての変異体が、野生型TSC2と類似したリン酸化ペプチドマップを持つことを示す。T1345A変異体では、2-DGおよびAMPKに誘導されるリン酸化ペプチドの大部分が影響を受けていた（図12Aのパネルfのスポット1、2、3、5、6、7、8）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの結果は、インビボにおいてS1345が、AMPKによるリン酸化部位である可能性が高いことを示す。さらに、S1345のリン酸化は、AMPK部位であるS1345の近傍にある、S1337およびS1341のような他の残基のリン酸化に影響を与える（図12B）。
【０１８８】
S1345がインビトロでAMPKによって直接リン酸化され得るかどうかを確認するために、S1345を含むTSC2断片を発現し、大腸菌から精製した（図12C）。TSC2断片は、免疫沈降したAMPKによってリン酸化されたが、キナーゼ不活性AMPK変異体ではされなかった（図12C、上パネル）。S1345がアラニン（S1345A）またはアスパラギン（S1345D）に変異すると、AMPKによるTSC2のインビトロでのリン酸化が完全に消失し、これはS1345が直接のAMPKリン酸化部位であることを示す。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらのデータは、S1337およびS1341のリン酸化は2-DGおよびAMPKによって増加するものの（図12A、B）、これらの残基は直接のAMPKリン酸化部位ではないことを示すと考えられる（図12C）。インビトロでのAMPKリン酸化部位が、インビボのTSC2でもリン酸化されることを確認するために、インビトロでAMPKによりリン酸化されたTSC2の2次元リン酸化ペプチドマップを、インビボで標識されたTSC2のマップと比較した（図12D）。インビトロでリン酸化されたTSC2断片を、インビボでリン酸化されたTSC2-S1345A変異体と混合した。これによりスポット3および6が直接のAMPKリン酸化によることが示された（図12D）。
【０１８９】
TSC2-T1227A変異体では、スポット4が消失し、スポット9が低下していることが観察された（図12E、パネルaおよびbを比較されたい）。精製されたTSC2-F2断片の、免疫沈降したAMPKによるインビトロのリン酸化は、AMPKがTSC2のT1227を特異的にリン酸化することを示す（図12F）。2次元リン酸化ペプチドマッピングでは、T1227が2Dマップ上のスポット4に対応することが確認された（図12E）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、AMPKはTSC2のT1227をリン酸化すると考えられる。
【０１９０】
S1345の変異は、AMPKコンセンサスではないにもかかわらず、S1337および1341を含め、多くのリン酸化部位に影響を与える（図12A、B）。TSC2-S1337/1341/1345A (TSC2-3A)トリプル変異体が作製され、2-DGにより誘導される移動度の変化が調べられた。トリプル変異体では、2-DG依存性の上方変化は、大きく減少しており（図12G）、これらの残基が、エネルギー枯渇に誘導される主要なリン酸化部位であることが示された。
【０１９１】
TSC2機能を増強するAMPKのリン酸化
TSC2リン酸化変異体を用いて、AMPKのリン酸化の機能的な意義が評価された。TSC2-3AがトランスフェクトされたHEK293細胞は、この変異体が2DG処理に応答してS6Kを阻害する能力が低下していることを示した（図13A）。この結果は、AMPKによるリン酸化により、TSC2がS6Kを阻害する能力が高まるという考え方と一致する。TSC2-3AがTSC1と相互作用する能力も調べられたが、この変異TSC2はTSC1と正常に複合体を形成することができることが分かった（図13B）。
【０１９２】
AMPKによるTSC2のリン酸化が、2-DG処理に応答したS6Kと4EBP1の脱リン酸化に役割を果たしているかどうかを調べるために、線維芽細胞EEF8 (TSC2-/-)に、野生型またはT1227A/S1345A変異体のいずれかを発現するレトロウイルスを、一過性に感染させた。TSC2が発現すると、S6Kおよび4EBP1の基礎リン酸化が低下した（図13C）。2-DG処理では、ベクターの感染した細胞においては、S6Kおよび4EBP1のリン酸化はほとんど低下しなかった。反対に、2-DGは、野生型のTSC2発現細胞において、S6Kおよび4EBP1のリン酸化を大きく低下させた（図13C）。TSC2 T1227A/S1345A変異体を発現する細胞は、野生型TSC2を発現する細胞よりも2-DG処理に対する反応が少なかった（図13C）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらのデータは、TSC2のT1227およびS1345のAMPK依存性リン酸化が、2-DG処理に対する細胞応答に重要な役割を果たすことを示すと考えられる。
【０１９３】
細胞エネルギーの変化に応答したTSC2およびAMPKリン酸化の機能的な重要性をさらに確立するために、上皮由来のTSC2-/- LEF細胞から得られたTSC2を安定的に発現する細胞株が樹立された。野生型と3A変異体の両方は同様なレベルで発現していたにもかかわらず、TSC2の発現はS6Kのリン酸化を低下させたが、TSC2-3Aの発現は、S6Kに対してはるかに弱い効果しか持たなかった（図13D）。16時間グルコースを枯渇させると、AMPK活性化には影響がないにもかかわらず、野生型のTSC2を発現する細胞でS6Kのリン酸化が低下し、ベクターまたはTSC2-3A発現細胞では、はるかに小さな影響しかなかった（図13E）。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの結果は、グルコース枯渇によるS6Kの不活化に、TSC2が必要であることを示すと考えられる。さらに、TSC2のリン酸化は、エネルギー制限に対する細胞応答に必要である。レトロウイルスの感染したLEF細胞におけるTSC2の発現レベルは、HEK293細胞におけるTSC2の内因性発現のレベルより、わずかに低かった。したがって、TSC2は、この実験に使用された安定細胞中で過剰発現しているわけではない。
【０１９４】
グルコース枯渇に誘導されるアポトーシスからのTSC2による細胞の保護
ベクター感染したLEF細胞は、無グルコース条件に移行してから72時間で、大量に細胞死した（図14A）。反対に、TSC2を発現するLEF細胞では、細胞死の増加はほとんどなかった。同様に、グルコースの枯渇はEEF8 (TSC2-/-)細胞では細胞死を誘導したが、対照のEEF4 (TSC2+/+)細胞では誘導しないことが観察された。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの結果は、エネルギー枯渇に誘導される細胞死から細胞を保護する上で、TSC2が必須の役割を果たすことを説得力を持って確立したと考えられる。
【０１９５】
TSC2機能におけるAMPKリン酸化の意義を決定するために、TSC2-3A発現LEF細胞も調べられた。TSC2-3Aは、グルコース枯渇に誘導される細胞死から、LEF細胞を保護しない（図14A）。反対に、DNA損傷によるアポトーシスを誘導するエトポシドは、ベクター発現細胞と野生型TSC2発現細胞の両方で、細胞死を引き起こし、これはTSC2がエネルギー応答には特異的に関与しているが、DNA傷害応答には関与していないことを示す。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらのデータは、AMPKによるTSC2のリン酸化が、グルコース枯渇に誘導される細胞死から細胞を保護するために、重要な役割を果たすことを示すと考えられる。
【０１９６】
グルコース枯渇に誘導されるアポトーシスをさらに調べるための実験も行なわれた。蛍光に基づくDNA断片化のアッセイでは、グルコースの枯渇が、ベクターとTSC2-3A発現LEF細胞ではアポトーシスを誘導したが、TSC2発現LEF細胞では誘導しなかったことが示された（図14B）。アポトーシスマーカーのウェスタンブロットでは、グルコース枯渇に誘導される細胞死の際に、カスパーゼ3とPARPの両方が切断されることが示され、細胞が実際にアポトーシスを起こしていることが確認された（図14C）。
【０１９７】
ATP枯渇およびTSC2による細胞サイズの調節
TSC2は、ショウジョウバエでは細胞サイズの制御に重要な役割を果たすことが示されている。RNAiによりTSC2をノックダウンすると、HEK293細胞のサイズが再現的に増大することが観察された（図14D）。細胞サイズに対するRNAiの効果が小さいのは、RNAiによるTSC2の排除が不完全なためである可能性がある。2-DG処理により細胞のサイズが大きく減少することが分かった（図14D）。RNAiによるTSC2のノックダウンは、2-DGにより誘導される細胞サイズの効果を、部分的にブロックした。これらの処理は、G1細胞とG2細胞の両方に同様に影響するので、TSC2と2-DGの細胞サイズの効果は、細胞周期に依存しない。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの結果は、2-DGに誘導される細胞サイズの減少に、TSC2が重要な役割を果たすことを示していると考えられる。
【０１９８】
細胞のサイズに対するグルコース枯渇の影響も、調べられた。2.8 mMグルコース（通常の培地は25 mMグルコースを含む）で72時間培養されたHEK293細胞は、細胞サイズが大きく減少していた（図14E）。以前に報告されたように、ラパマイシンによる処理でも、細胞のサイズは減少した（Fingarら、Gens Dev. 16:1472-1487 (2002)）。これらのデータは、TSC2がエネルギー制限シグナルを仲介して、細胞のサイズを調節するということと一致する。
【０１９９】
TSC2発現LEF細胞が、ベクターまたはTSC2-3A発現細胞よりも、かなり小さいことも、観察された（図14A）。FACS解析で、TSC2が発現すると、LEF TSC2-/-細胞のサイズがかなり減少することが確認された（図14F）。興味深いことに、TSC2-3Aは、野生型TSC2と比較して、LEF TSC2-/-細胞中において、細胞のサイズを減少させる能力が低下していた。ラパマイシン処理は、対照として含められた。本発明は、特定の機序に限定されない。実際、機序の理解は、本発明の実施には不要である。しかしながら、これらの所見は、以前の生物学的所見と一致し、哺乳動物細胞において、TSC2が細胞のサイズの負の調節を行なうという説得力のある実験的証拠を、初めて提供すると考えられる。さらに、これらのデータは、AMPK依存性のリン酸化が、TSC2の生理的機能に必須の役割を果たすことを示す。
【０２００】
上記明細書に引用されたすべての論文および特許は、参照として本明細書に組み入れられる。本発明を特定の好ましい態様に関して説明してきたが、請求された発明は、そのような特定の態様に不当に限定されてはならない。実際、当業者に明らかである、本発明を実施するための、記述された様式の種々の改変は、添付の特許請求の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】TSC1-TSC2によるS6Kの阻害を示す。図1aはTSC1-TSC2がS6Kキナーゼ活性を阻害することを示す。HA-S6Kは、記載のように、TSC1-TSC2の存在下および非存在下でHEK293細胞にトランスフェクトされた。図1bは、TSC1-TSC2がS6KのThr 389のリン酸化は選択的に阻害するが、Thr 421/Ser 424のリン酸化は阻害しないことを示す。図1cは、TSC1-TSC2が、Rasに誘導されるERK活性化を阻害しないことを示す。図1dはS6KのThr 389のリン酸化が用量依存的に阻害されることを示す（左）。TSC1-TSC2はAktの基礎またはインスリン刺激によるリン酸化のいずれにも影響を与えない（右）。
【図２】内因性TSC2および疾病に誘導される変異の、S6Kのリン酸化に対する影響を示す。図2aは、TSC2 RNA干渉によって、S6Kの基礎および刺激されたリン酸化が促進することを示す。図2bは、TSC2 RNA干渉によって、内因性S6KおよびS6のリン酸化が増加することを示す。図2cは、疾病に誘導されるTSC2変異体では、S6Kを阻害する能力が損なわれていることを示す。
【図３】AktによるTSC2のリン酸化を示す。図3aは、Aktに依存したTSC2の移動度変化を示す。図3bはインビボ32P標識TSC2の2次元リン酸ペプチドマッピングを示す。図3cは、インスリン（400 nM）、LY294002 (50μM)またはラパマイシン(20 nM)の存在下における、HA-TSC2の2次元リン酸ペプチドマッピングを示す。
【図４】TSC2におけるAkt依存性リン酸化部位の決定を示す。図4aは、TSC2の推定Aktリン酸化部位を表す模式図である。ショウジョウバエdTsc2において保存されている部位を四角で囲んでいる。インビトロAktリン酸化アッセイに使用されたTSC2断片1および断片2領域が示されている。図4bは、Aktリン酸化部位の変異解析を示す。変異体は、各パネルの下に示されている。パネルVIIIは四角で囲まれた領域の模式図であり、対応するアラニン置換によって変化する特異的なリン酸化部位を示している。各変異体で欠如しているリン酸化ペプチドは、パネルI、II、IVおよびVIにおいて白丸で示されている。図4cは、精製されたAktによる組み換えTSC2断片のリン酸化を示す。インビトロでリン酸化されたTSC2断片の2次元リン酸化ペプチドマッピングも示されている（下段）。
【図５】Aktリン酸化部位の変異が、TSC2活性を変化させることを示す。図5aは、リン酸化部位のアラニンによる置換では、TSC2活性を上昇させるが、酸性残基による置換では活性が低下することを示す。図5bは、TSC2変異による4E-BP1リン酸化の阻害を示す。図5cは、酸性残基による置換が、TSC1-TSC2複合体の形成を妨げることを示す。図5dは、TSC2のリン酸様変異体が不安定であることを示す。TSC2の安定性は、シクロヘシキミドの存在下で決定された（300μM、0〜6時間）。図5eは、TSC2のリン酸様変異体が、高度にユビキチン結合していることを示す。
【図７】TSC1-TSC2が、mTORを介してS6Kを阻害することを示す。図7aは、S6K-dC104変異体のThr 389のリン酸化が、ラパマイシンで阻害されないことを示す。図7bは、TSC1-TSC2がS6K-dC104変異体のThr 389リン酸化を阻害しないことを示す。図7cは、TSC1-TSC2が、インスリンに誘導されるS6K-dNCキナーゼ活性を阻害しないことを示す。図7dは、TSC1-TSC2がmTORキナーゼ活性を阻害することを示す。図7eは、TSC1-TSC2がmTORのリン酸化を阻害することを示す。TSC1-TSC2の同時トランスフェクションは、抗リン酸化mTOR抗体の免疫ブロッティングで検出される、mTOR上のSer 2448のリン酸化を阻害する（左）。RNAi-Cによる内因性TSC2の低下により、mTORのリン酸化が上昇した（右）。図7fは、細胞増殖の調節における、TSC1-TSC2機能の提案されるモデルを示す。
【図８】2-DGによるS6K、S6、4EBP1、mTOR、Akt、AMPKおよびTSC2のリン酸化に対する、エネルギー枯渇の効果を示す。図8Aは、ATP枯渇によるS6Kおよび4EBP1の脱リン酸化を示す。図8BはTSC2の移動度の変化を示す。図8Cは、2-DGが内因性S6K、S6、4EBP1、mTORの脱リン酸化を誘導するが、AKTの脱リン酸化は誘導しないことを示す。図8D、2-DGがAMPKのリン酸化を誘導することを示す。図8Eは2-DG処理の時間経過を示す。図8Fは2-DGが細胞内のATPレベルを低下させることを示す。図8Gは2-DGがAMP/ATP比を上昇させることを示す。図8Hはグルコースレベルの低下がS6Kを阻害することを示す。
【図９】2-DGが内因性AMPKとTSC2との相互作用を刺激することを示す。図9Aは2-DGが内因性TSC2とAMPKとの間の免疫共沈降を刺激することを示す。図9Bは内因性TSC2とAMPKとの相互免疫沈降を示す。図9Cは、HEK293細胞における内因性TSC1、TSC2、pAMPKおよびAMPKの発現レベルを示す。図9DはTSC2のC末端断片が内因性AMPKと相互作用することを示す。
【図１０】2-DGに誘導されるS6Kの脱リン酸化にTSC2が必要なことを示す。図10AはRNA干渉によるTSC2のノックダウンが、2-DG応答を阻止することを示す。図10Bは、RNA干渉によるTSC2のノックダウンが、ラパマイシンに誘導されるS6Kの脱リン酸化を阻止しないことを示す。図10CはAMPK過剰発現によるS6Kの阻害が、TSC2 RNAiによって阻止されることを示す。図10DはTSC2のノックダウンが、2-DGに誘導されるACCおよびeEF2のリン酸化にほとんど影響を与えないことを示す。図10Eは、ラパマイシンが、2-DGに誘導されるACCおよびeEF2のリン酸化にほとんど影響を与えないことを示す。図10Fは、ATP枯渇に誘導されるS6Kおよび4EBP1の脱リン酸化が、TSC2 -/-細胞では損なわれていることを示す。図10Gは、2-DGに誘導される4EBP1の脱リン酸化が、TSC2 -/-細胞では損なわれていることを示す。
【図１１】ATP枯渇およびAMPKが、TSC2のリン酸化を誘導することを示す。図11Aは2-DGに誘導されるTSC2の移動度変化が、リン酸化のためであることを示す。図11BはAMPK発現が移動性の遅い型のTSC2を誘導することを示す。HA-TSC1およびMyc-TSC2は、記載のように活性AMPKαIサブユニットありまたはなしで同時トランスフェクトされ、それぞれ抗HAおよび抗Myc抗体によりブロッティングされた。図11Cは、AMPK阻害剤が、2-DGに誘導されるTSC2の移動度変化を阻止することを示す。AMPK阻害剤（化合物C、10μM）は、記載のように2-DG処理の30分前に添加された。図11Dは、キナーゼ不活性のAMPK変異体が、2-DGに誘導されるS6Kの脱リン酸化を阻止することを示す。HEK293細胞は、徐々に量を増やしたキナーゼ不活性のAMPK変異体（AMPKDN）でトランスフェクトされた。図11EはAMPK阻害剤が、2-DGに誘導されるS6Kの脱リン酸化を阻止することを示す。図11Fは、AMPK阻害剤が、グルコース枯渇によって誘導されるS6Kの脱リン酸化を部分的に阻止することを示す。
【図１２】AMPKがTSC2のS1227およびS1345をリン酸化することを示す。図12Aは、インビボで2-DGおよびAMPKが、複数箇所でTSC2のリン酸化を誘導することを示す。図12BはS1337およびS1341が、2-DG処理によりリン酸化されるAMPK依存性部位であることを示す。図12Cは、インビトロではAMPKがTSC2のS1345を直接リン酸化するが、S1337または1341をリン酸化しないことを示す。図12Dは、インビボではTSC2のSer1345がリン酸化されることを示す。図12Eは、インビボではTSC2のT1227がリン酸化されることを示す。図12Fは、インビトロではAMPKがTSC2のT1227をリン酸化することを示す。図12Gは、2-DGに応答して野生型TSC2は移動度変化を示すが、S1337A/S1341A/S1345A変異体は変化を示さないことを示す。
【図１３】エネルギー制限に応答したS6Kリン酸化の調節におけるTSC2の機能にとって、AMPKのリン酸化が重要であることを示す。図13Aは、TSC2におけるAMPK依存性部位の変異が、TSC2活性を低下させることを示す。図13Bは、変異体TSC2がTSC1と複合体を形成できることを示す。図13Cは、AMPKリン酸化変異体TSC2（T1227A/S1345A）を発現する細胞は、2-DG処理に対する応答が低下していることを示す。図13Dは、TSC2-3A変異体はS6Kを阻害する活性が低下していることを示す。LEF (TSC2-/-上皮)細胞にTSC2レトロウイルスを感染させ、ネオマイシン耐性を安定に発現する細胞を選択した。図13Eは、TSC2のAMPKに依存するリン酸化が、グルコース枯渇に誘導されるS6Kの脱リン酸化に重要であることを示す。
【図１４】グルコース枯渇に誘導されるアポトーシスから細胞を保護する際に、および細胞サイズの調節に、TSC2が必須の役割を果たすことを示す。図14Aは、TSC2はグルコース枯渇に誘導される細胞死からLEF細胞を保護するが、TSC2-3Aは保護しないことを示す。図14Bは、グルコース枯渇がベクターおよびTSC2-3A発現LEF細胞ではDNA断片化を誘導するが、TSC2を発現するLEF細胞では誘導しないことを示す。図14Cはグルコースの枯渇が、ベクターおよびTSC2-3A発現LEF細胞ではカスパーゼ-3およびPARPの切断を誘導するが、TSC2発現LEF細胞では誘導しないことを示す。図14Dは2-DGがHEK293細胞の細胞サイズを減少させることを示す。HEK293細胞は、12.5 mM 2-DG、TSC2 RNAi、または20 nMラパマイシンの存在下で72時間培養された。図14Eは少ないグルコース（2.8 mM）が、HEK293細胞で細胞サイズを減少させることを示す。図14FはTSC2-3Aが細胞サイズの調節を欠くことを示す。図14Gは細胞のエネルギーシグナル伝達経路における、TSC2の提案されたモデルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【国際調査報告】
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