(57)【要約】本発明は、新規なStreptococcus salivarius、それを含む組成物、および抗菌剤としてのＳ.salivarius菌株の使用に関する。これらの菌株は、少なくともＳ.ｍutansおよび/またはＭＳに関しては細菌阻害剤であり、したがって、いくつかの治療用途がある。その用途には、虫歯を抑制、治療、または予防する際に使用するための治療用配合物の一部を形成することがあるが、それだけには限らない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サリバリシンＡ2産生菌株であり抗ＭＳ活性を示すが、ただしＳ.salivarius Ｋ12(Ｋ12)ではないStreptococcus salivarius菌株の、生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
サリバリシンＡ2産生菌株であり抗ＭＳ活性を示し、炭水化物の代謝に関して、Ｌ-アラビノース、イヌリン、グリコーゲン、キシリトール、およびβ-ゲンチオビオースの少なくとも１つの使用、またはβ-ガラクトシダーゼ産生に関して陽性であり；かつ/あるいはグリセロール、α-メチル-Ｄ-マンノシドの少なくとも１つの使用、またはアルカリホスファターゼ産生に関して陰性であるStreptococcus salivarius菌株の、生物学的に純粋な培養物。
【請求項３】
菌株がＬ-アラビノース、イヌリン、グリコーゲン、キシリトール、およびβ-ゲンチオビオースのそれぞれの使用、またはβ-ガラクトシダーゼ産生に関して陽性であり；かつ/あるいはグリセロール、α-メチル-Ｄ-マンノシドのそれぞれの使用、またはアルカリホスファターゼ産生に関して陰性である、請求項２に記載の生物学的に純粋な培養物。
【請求項４】
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Ｄ-38124, Braunschweig, Germany に受託番号ＤＳＭ 14685で寄託された、Streptococcus salivarius 菌株Ｍia の生物学的に純粋な培養物、またはその同定された特性を有する培養物。
【請求項５】
Ｓ.salivariusのサリバリシンＡ2産生菌株から得られる抽出物であって、抗ＭＳ活性を有する抽出物。
【請求項６】
抗Ｓ.ｍutans活性を有する、請求項５に記載の抽出物。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivariusから得られる、請求項５または６に記載の抽出物。
【請求項８】
Ｓ.salivarius Ｋ12から得られる、請求項５または６に記載の抽出物。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、または請求項５から８のいずれか一項に記載の抽出物を含む、抗菌性組成物。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、または請求項５から８のいずれか一項に記載の抽出物、および希釈剤、担体および/または賦形剤を含む、治療用配合物。
【請求項１１】
１つまたは複数の補助抗菌剤をさらに含む、請求項９または10に記載の組成物または配合物。
【請求項１２】
補助抗菌剤がナイシン、ＢＬＩＳおよびＢＬＩＳ産生微生物から選択される、請求項11に記載の組成物または配合物。
【請求項１３】
ＢＬＩＳがサリバリシンＡ、Ａ1、Ａ2およびＢから選択される１つまたは複数のＢＬＩＳである、請求項12に記載の組成物または配合物。
【請求項１４】
ＢＬＩＳ産生微生物がＫ12および/またはＫ30である、請求項12に記載の組成物または配合物。
【請求項１５】
１つまたは複数の補助抗う蝕剤をさらに含む、請求項９から14のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項１６】
補助抗う蝕剤がキシリトール、フッ化物、マヌカハニーおよびタンニンから選択される、請求項15に記載の組成物または配合物。
【請求項１７】
経口投与可能な組成物または配合物である、請求項９から16のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項１８】
組成物または配合物が食品または飲料中に含まれる、請求項９から17のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項１９】
前記食品または飲料が乳製品系の食品または飲料である、請求項18に記載の組成物または配合物。
【請求項２０】
前記食品または飲料がミルク粉末、ミルクビスケット、ミルク、フレーバーミルク、ヨーグルトまたはチーズである、請求項19に記載の組成物または配合物。
【請求項２１】
組成物または配合物が薬剤、薬用ドロップまたは菓子類の形態である、請求項９から17のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項２２】
薬用ドロップの形態である、請求項21に記載の組成物または配合物。
【請求項２３】
口内洗浄液、口内洗浄剤、歯磨き粉、うがい薬、シロップ、口内スプレー、カプセル、フロス、チューインガム、または錠剤中に存在する、請求項21に記載の組成物または配合物。
【請求項２４】
単位剤形である、請求項17から23のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項２５】
用量当たり約105〜1012、好ましくは109〜1010ＣＦＵのＳ.salivariusを含む、請求項24に記載の組成物または配合物。
【請求項２６】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivariusに対して感受性がある細菌の増殖を少なくとも阻害するための方法であって、阻害有効量の請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、請求項５から８のいずれか一項に記載の抽出物、または請求項９から25のいずれか一項に記載の組成物または配合物と、感受性がある細菌を接触させることを含む方法。
【請求項２７】
感受性がある細菌がＭＳである、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
感受性がある細菌がＳ.ｍutansである、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
ＭＳまたはＳ.ｍutans菌の増殖を少なくとも阻害するための方法であって、阻害有効量の
(i)請求項１から25のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、抽出物、組成物または配合物、または
(ii)Ｓ.salivarius Ｋ12、またはそれに由来する抗ＭＳまたは抗Ｓ.ｍutans活性抽出物、またはＫ12またはＫ12に由来する活性抽出物を含む組成物または配合物と、ＭＳまたはＳ.ｍutansを接触させることを含む方法。
【請求項３０】
治療処置の必要がある個体中においてＳ.ｍutansにより少なくとも部分的に引き起こされる虫歯を治療処置する方法であって、前記個体に、
(i)請求項１から25のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、抽出物、組成物または配合物、または
(ii)Ｓ.salivarius Ｋ12、またはそれに由来する抗Ｓ.ｍutans活性抽出物、またはＫ12またはＫ12に由来する活性抽出物を含む組成物または配合物を、
個体の口腔中のＳ.ｍutansの増殖を少なくとも阻害するのに有効な量、投与することを含む方法。
【請求項３１】
虫歯の発生率または重症度を抑制する方法であって、虫歯を抑制する量の請求項１から25のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、抽出物、組成物または配合物を、虫歯になりやすい個体の口腔に導入することを含む方法。
【請求項３２】
虫歯がＭＳによって引き起こされる、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
ＭＳによって引き起こされる虫歯の発生率または重症度を抑制する方法であって、虫歯を抑制する量のＳ.salivarius Ｋ12、それに由来する抗ＭＳ活性抽出物、またはこれらを含む組成物または配合物を、虫歯になりやすい個体の口腔に導入することを含む方法。
【請求項３４】
Ｓ.salivariusまたは抽出物を、食品、飲料または栄養素の一部として投与する、請求項26から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
Ｓ.salivariusまたは抽出物を、請求項９から25のいずれか一項に記載の組成物または配合物中に投与する、請求項26から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
個体を予備治療して、既に存在する通常のミクロフローラを少なくとも減少させる予備ステップを含む、請求項26から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
抗菌剤または抗生物質を使用して予備治療を行う、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
抗菌剤がクロロヘキシジンである、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
虫歯の重症度の発生率を抑制する方法であって、
(a)虫歯を引き起こす存在する生物を含む通常のミクロフローラを減少させるのに有効な量の抗菌剤または抗生物質を、前記患者に投与するステップ、および
(b)結果として生じる細菌が減少した環境に、請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、またはそれを含む組成物または配合物を投与して、前記環境を再生させるステップを含む方法。
【請求項４０】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、または請求項５から８のいずれか一項に記載の抽出物の使用であって、請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivariusに対して感受性がある細菌の増殖を少なくとも阻害する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【請求項４１】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、または請求項５から８のいずれか一項に記載の抽出物、またはＫ12、またはＫ12に由来する活性抗Ｓ.ｍutans抽出物の使用であって、Ｓ.ｍutans菌の増殖を少なくとも阻害する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【請求項４２】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、または請求項５から８のいずれか一項に記載の抽出物、またはＫ12、またはＫ12に由来する活性抗Ｓ.ｍutans抽出物の使用であって、ＭＳ菌の増殖を少なくとも阻害する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【請求項４３】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、または請求項５から８のいずれか一項に記載の抽出物、またはＫ12、またはＫ12に由来する活性抗Ｓ.ｍutans抽出物の使用であって、Ｓ.ｍutansにより少なくとも部分的に引き起こされる虫歯を、予防的または療法的に治療する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【請求項４４】
虫歯がＭＳによって引き起こされる、請求項37に記載の使用。
【請求項４５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＳ.salivarius、または請求項５から８のいずれか一項に記載の抽出物の使用であって、虫歯の発生率および重症度を抑制する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なStreptococcus salivarius、それを含む組成物、および抗菌剤としてのＳ.salivarius菌株の使用、特に虫歯を予防または治療する際の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
虫歯は、歯の鉱質部分の溶解によって特徴付けられる疾患である。虫歯が進行すると、歯のエナメル質および象牙質の破壊、次に歯髄組織および根尖周囲組織の炎症が起こる。
【０００３】
ミュータンス連鎖球菌(ＭＳ)は、一群の酸産生性の、歯垢に生息する連鎖球菌種であり、これらはう蝕の主な原因物質であると考えられている。現在、７つの異なるＭＳ種(Ｓ  ｍutans、Ｓ.rattus、Ｓ.cricetus、Ｓ.sobrinus、Ｓ.ferus、Ｓ.ｍacacae、およびＳ.doｗneiとして知られている)が認められている。これら７種の中で、ヒトのう蝕に関して重要なのは、主にＳ.ｍutansとＳ.sobrinusである。
【０００４】
長年、虫歯の問題を予防または少なくとも軽減するための、様々な方法が開発され試されてきており、様々な結果が得られている。ペニシリンなどの抗生物質による治療が提案されてきており、これらは有効であるが、口内の有用な細菌と有害な細菌の両方を無差別に破壊して、細菌の不均衡をもたらす。
【０００５】
口内のミクロフローラへの害を最小限にするために、抗生物質を生産する微生物が、う蝕を阻害するその能力に関して調べられてきている。この点において能力を有するものとして同定された一群の生物は、バクテリオシン様阻害物質(ＢＬＩＳ)を生産する微生物である。Streptococcus、StaphylococcusおよびEnterococcus属のＢＬＩＳ産生菌が、虫歯を予防するための可能性のある用途に関してスクリーニングされてきている(Balakrishnan、Ｍ. 他、Ｃaries Ｒes. 2001；35:75〜80)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
考えられるのは、疾患を引き起こすＳ.ｍutansの非毒性類似体、すなわちいわゆるエフェクター菌株である。細菌感染の補充療法においてエフェクター菌株として働くために、微生物はそれ自体が非毒性であり、競合作用および/または抗菌作用によって、病原性微生物と首尾よく競合することができなければならない。Ｓ.ｍutans エフェクター菌株が同定されてきており(Hillman 他、J Dent Res. 1987；66:1092〜４；James and Tagg、N Z Dent J. 1991；87:80〜３)、これらは強力な抗Ｓ.ｍutans活性を示す。Ｓ.ｍutansエフェクター菌株を使用する欠点は、これらの菌株の、う蝕原性である。
【０００７】
Ｓ.salivariusは、この欠点を回避する代替的な連鎖球菌種である。ＷＯ 01/27143では、Ｓ.sobrinusにより少なくとも部分的に引き起こされる虫歯の治療において有用性がある、Ｓ.salivarius菌株が同定されている。一般にＭＳに対する、あるいは特にＳ.ｍutansに対する、活性は記録されなかった。同様に、Balakrishnan(上記)中では、Ｓ.salivarius Ｋ３は、トリプトソイブイヨン、酵母菌抽出物、炭酸カルシウム寒天培地上で増殖させると、Ｓ.sobrinusに対して活性があるとして同定されるが、Ｓ.ｍutansに対する影響はなかった。
【０００８】
Ｓ.salivarius ＴＯＶＥ-Ｒ(Ｔanzer、Ｊ.Ｍ. 他、Infect Immun., 1985、48:44〜50)は、アンタゴニスト菌株であり、これは虫歯の減少をもたらした。この菌株によるＢＬＩＳ産生の報告は存在していない。
【０００９】
本出願者は、Ｓ.ｍutansを含めた虫歯を引き起こすＭＳ微生物に対する広範囲の活性を有する、ＢＬＩＳ産生Ｓ.salivarius菌株を現在同定している。
【００１０】
本発明は概して、これらの新規なＳ.salivarius菌株、および虫歯の治療における抗ＭＳ Ｓ.salivarius菌株の使用を対象とするものであり、あるいは有用な選択を公衆に少なくとも提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
[発明の概要]
したがって、一態様では、本発明は、サリバリシンＡ2産生菌株であり抗ＭＳ活性を示すが、ただし菌株がＳ.salivarius Ｋ12(Ｋ12)ではない、Streptococcus salivarius菌株の生物学的に純粋な培養物からなると、広義には言うことができる。
【００１２】
他の態様では、本発明は、サリバリシンＡ2産生菌株であり抗ＭＳ活性を示し、炭水化物の代謝に関して、Ｌ-アラビノース、イヌリン、グリコーゲン、キシリトール、およびβ-ゲンチオビオースの少なくとも１つの使用、またはβ-ガラクトシダーゼ産生に関して陽性であり；かつ/あるいはグリセロール、α-メチル-Ｄ-マンノシドの少なくとも１つの使用、またはアルカリホスファターゼ産生に関して陰性であるStreptococcus salivarius 菌株の、生物学的に純粋な培養物を提供する。
【００１３】
好ましくは、菌株はＬ-アラビノース、イヌリン、グリコーゲン、キシリトール、およびβ-ゲンチオビオースのそれぞれの使用、またはβ-ガラクトシダーゼ産生に関して陽性であり；かつ/あるいはグリセロール、α-メチル-Ｄ-マンノシドのそれぞれの使用、またはアルカリホスファターゼ産生に関して陰性である。
【００１４】
本発明は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Ｄ-38124, Braunschweig, Germanyに受託番号ＤＳＭ 14685で寄託された、Streptococcus salivarius 菌株Ｍia の生物学的に純粋な培養物、またはその同定された特性を有する培養物をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、その抽出物が抗ＭＳ活性を有する、Ｓ.salivariusのサリバリシンＡ2産生菌株から入手可能な抽出物も提供する。詳細には、その抽出物は抗Ｓ.ｍutans活性を有する。好都合なことに、抽出物は、Ｓ.salivarius菌株ＭiaまたはＫ12から得られる。
【００１６】
他の態様では、本発明は、前に定義したＳ.salivariusまたは抽出物を含む、抗菌性組成物を提供する。
【００１７】
さらに他の態様では、本発明は、前に定義したＳ.salivariusまたは抽出物を、希釈剤、担体および/または賦形剤と共に含む、治療用配合物を提供する。
【００１８】
一実施形態では、本発明の組成物または配合物は、補助抗菌剤をさらに含む。
【００１９】
一実施形態では、治療用配合物は、食品または飲料、好ましくは乳製品系の食品または飲料の形態である。他の形態は薬剤、薬用ドロップおよび菓子類である。
【００２０】
本発明は、本発明のＳ.salivariusに対して感受性がある細菌の増殖を少なくとも阻害するための方法であって、阻害有効量のＳ.salivarius、本発明の抽出物または組成物または配合物と、感受性がある細菌を接触させることを含む方法をさらに提供する。
【００２１】
好ましくは、感受性がある細菌はＭＳであり、Ｓ.ｍutansであることがさらに好ましい。
【００２２】
本発明は、他の態様では、ＭＳまたはＳ.ｍutansの増殖を少なくとも阻害するための方法であって、阻害有効量の
(i)本発明のＳ.salivarius抽出物の組成物または配合物、または
(ii)Ｓ.salivarius Ｋ12、またはそれに由来する抗ＭＳまたは抗Ｓ.ｍutans活性抽出物、またはＫ12またはＫ12に由来する活性抽出物を含む組成物または配合物と、ＭＳまたはＳ.ｍutansを接触させることを含む方法を提供する。
【００２３】
他の態様では本発明は、必要性のある個体中においてＳ.ｍutansにより少なくとも部分的に引き起こされる虫歯を予防または療法治療する方法であって、前記個体に、
(i)本発明のＳ.salivarius、抽出物、組成物または配合物、または
(ii)Ｓ.salivarius Ｋ12、またはそれに由来する抗Ｓ.ｍutans活性抽出物、またはＫ12またはＫ12に由来する活性抽出物を含む組成物または配合物を、
個体の口腔中のＳ.ｍutansの増殖を少なくとも阻害するのに有効な量、投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
他の態様では、本発明は、虫歯の発生率および重症度を抑制する方法であって、虫歯を抑制する量の本発明のＳ.salivarius、抽出物、組成物または配合物を、虫歯になりやすい個体の口腔に導入することを含む方法を提供する。
【００２５】
一実施形態では、虫歯がＭＳによって引き起こされる。この場合、Ｓ.salivarius Ｋ12または抗ＭＳ活性抽出物、またはこれらを含む組成物または配合物を使用することもできる。
【００２６】
Ｓ.salivariusは、食品、飲料または栄養素の一部として投与することが好ましい。
【００２７】
本発明の方法は、個体を予め治療して、既に存在する通常のミクロフローラを少なくとも減少させる予備ステップも含んでよい。
【００２８】
本発明は、前に論じた組成物および方法における、本発明のＳ.salivariusまたは抽出物の使用にも関する。
【００２９】
他の態様では本発明は、Ｓ.ｍutansによって、ＭＳによってさらに通常的に、少なくとも部分的に引き起こされる虫歯を、阻害、抑制、防止または治療するための前に論じた方法における、Ｓ.salivarius菌株(Ｋ12含む)および活性抽出物の使用にも関する。
【００３０】
本発明は前で広義に記載しているが、本発明は制限的なものではなく、以下の記載によって例を与える実施形態も含むことは、当業者により理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
[発明の詳細な説明]
前に記したように、本発明は、第１の態様において、サリバリシンＡ2を生産し抗ＭＳ活性を示す、Streptococcus salivarius 菌株を対象とする。TSBCaYE寒天上で増殖させると、Ｓ.salivarius菌株は望ましいことに、Ｓ.ｍutansを含めた広範囲のＭＳに対する活性を示す。サリバリシンＡ2およびＡ2産生Ｓ.salivarius菌株(菌株Ｋ12)は、例えば参照によって本明細書に組み込んだＷＯ 01/27143中に記載されている。
【００３２】
一実施形態では本発明は、Ｓ.salivarius菌株Ｍia、およびその同定された特性を有するＳ.salivarius菌株を対象とする。
【００３３】
菌株Ｍiaは、炭水化物の代謝の研究を可能にする、API 20 Strepキット(bioＭerieux)および API 50 CH(bioＭerieux)を使用して決定される、その生化学的特性が菌株Ｋ12と異なる。その違いを以下に要約する:
API 20 Strepキット
ＭＩＡ     Ｋ12
β-ガラクトシダーゼ           ＋        −
アルカリホスファターゼ        −        ＋
API 50 CH
グリセロール                  −        ＋嫌気性
Ｌ-アラビノース               ＋        −
α-メチル-Ｄ-マンノシド       −        ＋好気性
イヌリン                      ＋        −
グリコーゲン                  ＋        −
キシリトール                  ＋        −
β-ゲンチオビオース           ＋        −
好ましくは、本発明で使用する菌株は、菌株Ｍia の区別可能な生化学的特性の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも６つ、さらに好ましくはすべてを示す。
【００３４】
Ｍiaは、Ｋ12より強い抗ＭＳ、特にＫ12より強い抗Ｓ.ｍutans活性も示す。
【００３５】
Ｓ.salivarius菌株Ｍiaは、他の細菌、特に連鎖球菌、およびさらに詳細にはＳ.ｍutansを含めたＭＳに対する活性を有するＢＬＩＳ産生菌株である。Ｓ.salivarius 菌株Ｍiaは、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder, Weg 1b, Ｄ-38124, Braunschweig, Germany に、2001年12月12日に寄託され、受託番号ＤＳＭ 14685を割り当てられている。
【００３６】
前に記したようにＭＳは、虫歯の主な原因物質であると考えられており、Ｓ.ｍutansは非常に重要である。連鎖球菌に対して活性があるＳ.salivariusのＢＬＩＳ産生菌株が以前に報告されているが、ＭＳおよび詳細にはＳ.ｍutansに対して活性があるＢＬＩＳ産生Ｓ.salivariusが同定されたのは、これが初めてである。
【００３７】
本発明のＳ.salivarius菌株は、特にTSBCaYE寒天培地上で増殖させると、広範囲の抗菌活性を示す。したがってＳ.salivariusは、それ自体で抗菌剤として、および治療上有用である。この文脈において、「治療的」は予防的治療を含む。治療的使用は、微生物感染、特に連鎖球菌感染の、治療または予防を含む。本発明のsalivariusは、ＭＳおよびＳ.ｍutansに対して使用するのに非常に適している。本発明の菌株または抽出物を用いて治療を施しやすい状態には、虫歯、咽喉炎、および口臭がある。
【００３８】
本発明は、Ｓ.salivariusのサリバリシンＡ2産生菌株から、特に本発明の菌株から得られる抽出物にも関する。これらの活性抽出物は、治療用配合物および方法に同様に使用することができる。知られている当分野のプロトコルを使用して、細胞培養および遠心分離により好都合に、抽出物を得ることができる。
【００３９】
「治療用配合物」は、本発明のＳ.salivarius菌株または抽出物を、これらを必要とする個体、特に虫歯になりやすい個体に投与するのに適した配合物である。一般に、本発明の治療用配合物は、本発明のＳ.salivarius菌株または抽出物、および許容される担体、希釈剤および/または賦形剤から構成される。
【００４０】
「許容される担体、希釈剤および/または賦形剤」は、本発明のＳ.salivarius菌株または抽出物を、個体に送達するためのビヒクルを意味し、個体中でビヒクルは、細菌細胞の生存能力、または抽出物の活性と適合性がある。本発明の生存能力のあるＳ.salivarius菌株および抽出物の投与において、使用するのに適した許容される担体は、当業者にはよく知られている。適切な担体は一般に不活性であり、固体または液体のいずれかであってよい。
【００４１】
一実施形態では、担体は薬剤として許容される担体である。本明細書中のＳ.salivarius菌株と共に使用するのに適した、薬剤として許容される担体には、水、緩衝生理食塩水溶液(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)、薬剤として許容される培養培地(例えば、BACa、TSBCaYE寒天)、または細菌の生存能力を保つ他の溶液があるが、これらだけには限らない。さらに、このような薬剤として許容される担体は、水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液であってよい。生存能力のある細菌または凍結保存した細菌の経口投与に適した、様々な薬剤として許容される担体は当分野でよく知られている(例えば、参照によって本明細書に組み込んだ、Remington のPharmaceutical Sciences, 18th ed., Gennaro, ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa を参照のこと；および薬剤組成物LACTINEX(商標)、生存能力のある乳酸菌の経口投与用の市販の配合物)。当分野で知られている適切な固形担体には、例えば炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、タルク、糖類、例えばフルクトース、スクロース、マンニトール、ラクトースなど、澱粉、小麦粉、およびスキムミルク、および類似の食用粉末があるが、これらだけには限られない。抽出物の投与用の担体が、同様によく知られている。
【００４２】
典型的な希釈剤は、例えば澱粉、ラクトース、マンニトール、カオリン、リン酸カルシウムまたは硫酸カルシウム、塩化ナトリウムなどの無機塩、および粉末状の糖類またはセルロースである。
【００４３】
本発明の組成物は賦形剤、例えば錠剤化助剤、樹脂、充填剤、結合剤、潤滑剤、溶媒、グライダント、崩壊剤、防腐剤、緩衝剤、香料、着色剤、甘味剤、および適切な芳香剤なども含むことができる。錠剤の流動性および圧縮性に関して好ましい賦形剤は、ProSolv(商標)(Penwest, ＮＹ, ＵＳＡ)である。好ましい甘味剤は、イソマルトである。
【００４４】
典型的な結合剤には、澱粉、ゼラチン、ラクトース、フルクトース、およびグルコースなどの糖類などがある。アカシア、アルギン酸塩(エステル)、メチルセルロース、ポリビニルピロリジントラガカントなどを含めた、天然および合成ゴムも好都合である。ポリエチレングリコール、エチルセルロース、およびワックスも、結合剤として働くことができる。現在好ましい結合剤は、Emdex(商標)(Penwest, ＮＹ, ＵＳＡ)である。
【００４５】
成形中のダイへの付着を妨げるための潤滑剤には、滑りやすい固形物質、例えばタルク、シリカ、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール、ステアリン酸および硬化植物油などがある。
【００４６】
崩壊剤は、濡れると膨張して、薬用ドロップを破壊し、Ｓ.salivariusまたは抽出物を放出させる物質である。崩壊剤には、澱粉、粘土、セルロース、アルギンおよびゴム、より詳細にはトウモロコシおよびジャガイモの澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、木質セルロース、陽イオン交換樹脂、アルギン酸、ガーゴム、柑橘類パルプ、カルボキシメチルセルロース、粉末状スポンジ、およびラウリル硫酸ナトリウムがある。
【００４７】
本発明のＳ.salivarius 菌株または抽出物を、経口投与に適した任意の様々な組成物中に配合することができる。例えば、Ｓ.salivarius 菌株を、Ｓ.salivarius 培養物から調製した凍結乾燥物または細胞ペーストとして投与するために配合することができ、あるいは口腔に直接投与することができる。菌株または抽出物を、口内洗浄液、口内洗浄剤、歯磨き粉、口内スプレー、うがい薬、カプセル、薬用ドロップ、シロップ、フロス、チューインガム、または咀嚼可能な錠剤の形態で投与することもできるが、形はこれらだけに限らない。
【００４８】
治療用配合物は、食品、菓子類または飲料を含むことができる。一実施形態では、食品または飲料は乳製品系の食品または飲料であり、例えばヨーグルト、チーズ、ミルク、ミルク粉末、ミルクビスケット、およびフレーバーミルクを含む。菓子類の場合、配合物は、ＷＯ 00/05972中に記載されたものと同様のチューインガムであってよい。１つの好ましい配合物は、ビフィズスミルク粉末の調製に関して以前に報告された方法(Nagawa他、(1988)；J.Dairy Sci. 71:1777〜1782)と類似の方法で、凍結乾燥させた本発明のＳ.salivariusをミルク粉末配合物中に使用する。
【００４９】
Ｓ.salivarius の１つの経口投与用配合物は、凍結乾燥させたＳ.salivarius 菌株とスキムミルク粉末などの混合物であり、これは味付けされて嗜好性が高められている。
【００５０】
本発明のＳ.salivarius または抽出物の、現在好まれている経口投与用配合物は、薬用ドロップ、咀嚼可能な錠剤、またはカプセルである。薬用ドロップが特に好ましい。本発明の吸引可能な薬用ドロップは、本発明のＳ.salivarius 菌株または抽出物、イソマルトおよびエムデックスを含む。薬用ドロップは、直接的な圧縮、湿潤顆粒化、または乾燥顆粒化によって、調製することができる。薬用ドロップは、よく知られている製薬の慣習に従ってコーティングすることができる。
【００５１】
本発明の治療用配合物は、配合物中の細菌の生存能力を維持するための栄養素を、さらに含むことができる。前に記したように配合物は、配合物の有効性を害さずに、組成物の嗜好性を高める、かつ/あるいは患者のコンプライアンスを高める、香料、着色剤、芳香剤、または他の化合物も含むことができる。経口投与用配合物を調製するための方法は、当分野でよく知られている(例えば、参照によって本明細書に組み込んだ、Remingtonの Pharmaceutical Sciences, 18th ed.、上記を参照のこと)。
【００５２】
一般的な抗菌的使用のために、局所投与可能な配合物だけには限らないがこれを含めた、他の投与法用の配合物を生成することもできる。
【００５３】
論じる組成物および配合物中に含まれる、前に論じたＫ12およびその活性抽出物を、前と同様に調製することができる。
【００５４】
本発明の配合物および組成物は、１つまたは複数の補助抗菌剤をさらに含むことができる。これらの補助物質は、例えば抗生物質、または他の抗菌剤または抗菌物質産生微生物であってよい。有用な抗菌剤には、例えばナイシン、および他のＢＬＩＳがある。補助抗菌剤は、ＢＬＩＳまたはＢＬＩＳ産生微生物であることが好ましい。ＢＬＩＳは、１つまたは複数のサリバリシンＡ、Ａ1、Ａ2およびＢであってよい。他の抗菌微生物には、Ｋ12およびＫ30などの知られているＳ.salivariusがある。
【００５５】
本発明のＳ.salivarius 菌株は、主に舌の表面上に見られる。ＴＯＶＥ-Ｒ(上記)などの、歯垢中で増殖するＳ.salivarius との組合せが、有用であると思われる。
【００５６】
本発明の配合物および組成物は、他の抗う蝕剤、例えばキシリトール、フッ化物、マヌカハニーおよびタンニンをさらに含むことができる。
【００５７】
虫歯の治療では、本発明のＳ.salivarius 菌株または抽出物を、任意の虫歯になりやすい個体、通常はＳ.ｍutans またはＭＳが口腔にコロニー形成し、その結果虫歯がＳ.ｍutans により、さらに一般的にはＭＳにより少なくとも部分的に引き起こされる、個体に投与することができる。
【００５８】
本明細書で使用する用語「個体」は、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギを含むが、これらだけには限らない。個体はヒトであることが好ましい。Ｓ.salivarius 菌株は、任意の年齢、例えば幼少期、青年期、または成人期の個体に投与することができる。
【００５９】
本発明のＳ.salivariusまたはＫ12は、様々な方法で経口投与することができる。例えば、前に論じた組成物または配合物の形態で、または懸濁液、徐放性配合物(例えば、Ｓ.salivarius菌株を含む口腔インプラント)または凍結乾燥物の粉末として。Ｓ.salivarius菌株は、凍結乾燥物、培養物、または細胞ペーストを個体の歯または舌に直接施すことによって、投与することもできる。治療用配合物を口腔に施用する限り、任意の投与形式が適切である。一実施形態では、Ｓ.salivariusまたは抽出物を、例えばブラッシングおよび/またはフロッシングによって、個体の歯に直接施用することにより投与する。
【００６０】
一般に、個体に投与されるＳ.salivariusの量は、宿主の口腔中の虫歯を引き起こすＭＳ菌株、または少なくともＳ.ｍutansを置換するのに有効な量であろう。「宿主の口腔中の虫歯を引き起こすＭＳ菌株、または少なくともＳ.ｍutansを置換するのに有効な量」は、Ｓ.salivarius菌株による口腔中のコロニー形成、および存在する虫歯を引き起こすＳ.ｍutansまたはＭＳ菌株の大幅な減少(例えば、栄養素に関する細菌間の競合、および/またはＳ.salivarius菌株によるＢＬＩＳの生成による)に有効な量を意味する。
【００６１】
用語「単位用量」は、本発明の治療用配合物に関して使用するとき、個体の単位用量として適切な物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、必要とされる希釈剤、担体、または賦形剤と共に所望の治療効果を生み出すように計算された、所定量の活性物質(生存能力のあるＳ.salivariusまたはその活性抽出物)を含む。
【００６２】
具体的な用量は、大きさ、体重、年齢、疾患の重症度(例えば、虫歯を引き起こす存在するＭＳの粘着性および/または数)、および治療に対する応答性(例えば、個体の口腔のコロニー形成のしやすさ)を含めた、様々な個体の変数に従って、大きく変わる可能性がある。適切な投与の経路および用量を決定するための方法は、適切であるとみなされる消費者によって、あるいはケースバイケースで、受け持ちの歯科医または他の臨床医によって決定することができる。このような決定は、当業者には通常のことである(例えば、Remington の Pharmaceutical Sciences, ８th ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990を参照のこと)。
【００６３】
一般に、個体に投与されるＳ.salivariusの数は、約102〜1015個の細菌、好ましくは約103〜1014個の細菌、より好ましくは約105〜1012個の細菌の範囲であり、通常は用量当たり約109〜1010コロニー形成単位(ＣＦＵ)であろう。１つの薬用ドロップ配合物は、3.8×109ＣＦＵ/ｍlを使用する。
【００６４】
多数の用量のＳ.salivarius菌株を投与して、個体の口腔のコロニー形成、および存在する虫歯を引き起こすＭＳ菌株、特にＳ.ｍutansの置換を達成することができる。Ｓ.salivariusまたは抽出物は、ただ１度あるいは繰り返し患者に投与する必要がある。繰り返しの治療は、１月に１度、１週間に１度、１日に１度、１日に２度、あるいは他に必要とされるようなものであってよい。好都合なことに、患者の日常的な歯のケアの一部として、例えば、薬用ドロップ、ガム、歯磨き粉、フロス、または口内洗浄液の要素として、投与を実施することができる。
【００６５】
コロニー形成を容易にするために、一実施形態では、本発明の治療法は、個体を予備治療して、虫歯を引き起こす生物を含めた、口腔中に既に存在する通常のミクロフローラを少なくとも減少させる予備ステップを含む。この予備治療は、クロロヘキシジン、ラクトペルオキシダーゼ、緑茶、またはパイナップルジュース(凍結乾燥したもの)などだけには限られないが、これらの抗菌剤を投与するステップを含み、あるいはペニシリン、エリスロマイシン、またはアモキシシリンなどの抗生物質を前記個体に投与する処方されたコースに従ってもよい。したがって本発明のＳ.salivariusまたはＳ.salivarius Ｋ12は、細菌が減少した環境に投与して、それを再生させる。
【００６６】
虫歯に関する現在好まれている治療プロトコルは、２〜５日間、好ましくは３日間、クロロヘキシジンゲルを用いて歯を磨くことによる予備治療を含む。薬用ドロップは、ゲルの１〜４時間、好ましくは２時間後に投与する。これに１日に、１〜４時間、好ましくは２時間毎の間隔で、さらに２〜５個、好ましくは３個の薬用ドロップの投与が続く。このプロトコルを２〜４日間続けて、コロニー形成を容易にする。維持の目的で、通常の歯磨き後に、１個、２個、または３個の薬用ドロップ、通常は１〜２個の薬用ドロップを毎日摂取する。このレジメンは、必要とされる限り長く続ける。
【００６７】
Ｓ.salivarius菌株による個体の口腔の首尾良いコロニー形成は、個体の口腔細菌を培養すること、および例えばＢＬＩＳ産生または細菌菌株の同定に関する当分野でよく知られている他の方法によって、Ｓ.salivarius菌株を同定することにより確立することができる。
【００６８】
本発明の方法および使用は、前に論じた１つまたは複数の補助抗菌剤、および/または抗う蝕剤の使用をさらに含むことができる。
【００６９】
用語 comprise、comprises、comprised または comprising を本明細書中で使用する場合、これらの用語は、示した特徴、整数、ステップ、または参照する要素の存在を特定するものとして解釈すべきであり、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、要素、またはこれらの群の存在または追加を排除するものとして解釈すべきではない。
【００７０】
本発明の様々な態様を、非制限的な方法で、以下の実験項を参照することによりここで例示する。
【実施例】
【００７１】
《実験》
[同定]
健常成人ヒト被験者の口腔から、菌株 Ｍia を単離した。菌株 Ｍia は、Mitis salivarius寒天上において37℃、５％ＣＯ2で増殖し、これはＳ.salivariusに典型的な以下の形態を有している:
コロニー形状および大きさ:円状、直径１〜２ｍｍ
端(縁有り):全体(滑らか)
隆起:凸状
色:青色
質感:粘液状
血液寒天培地[５％ヒト血液を含むColumbia Agar Base(GIBCO)]上において37℃、５％ＣＯ2では、菌株Ｍia は溶血性ではなく、以下の形態を示す:
コロニー形状および大きさ:円状、直径１ｍｍ未満
端(縁有り):全体(滑らか)
隆起:凸状
色:白色
質感:粘液状
血液寒天培地上、または0.1％炭酸カルシウムを補ったトリプトソイブイヨン(ＢＢＬ)＋Davis寒天培地1.5％上で培養すると、この細菌の増殖体は、大部分のＳ.salivariusに典型的な増殖体より、寒天表面に比較的固く付着するようである。この菌株に関する API 20 Strep 同定コードは5050451であり、これは Streptococcus salivarius に対応する(同一性98.4％)。
【００７２】
GENEBANKデータベースを参照しながらの、16s rＲＮＡの配列分析によって、この菌株が Streptococcus salivarius であることが確かになった(相同性99.9％)。
【００７３】
(生化学的特徴付け)
Ｓ.salivarius MIAの生化学的特徴付けを、炭水化物の代謝の研究を可能にする、API 20 Strep キット(bioＭerieux)および API 50 CH(bioＭerieux)を使用して行った。
【００７４】
API 20 Strepの結果は、以下の通りである:
アセトン産生                              陽性
加水分解                                  陰性
β-グルコシダーゼ                         陽性
ピロリドニルアリルアミダーゼ              陰性
α-ガラクトシダーゼ                       陰性
β-グルウロニダーゼ                       陰性
β-ガラクトシダーゼ                       陽性
アルカリホスファターゼ                    陰性
ロイシンアリルアミダーゼ                  陽性
アルギニンジヒドロラーゼ                  陰性
リボース                                  陰性
Ｌ-アラビノース                           陰性
マンニトール                              陰性
ソルビトール                              陰性
ラクトース                                陽性
トレハロース                              陽性
イヌリン                                  陰性
ラフィノース                              陽性
澱粉                                    弱陽性
グリコーゲン                              陰性
β-溶血性物質                             陰性
API 50 CH の結果は、以下の通りである:
グリセロール                              陰性
エリトリトール                            陰性
Ｄ-アラビノース                           陰性
Ｌ-アラビノース               陽性(嫌気性のみ)
リボース                                  陰性
Ｄ-キシローゼ                             陰性
アドニトール                              陰性
Ｂメチル-キシロシド                       陰性
ガラクトース                              陽性
Ｄ-グルコース                             陽性
Ｄ-フルクトース                           陽性
Ｄ-マンノース                             陽性
Ｌ-ソルボース                             陰性
ラムノース                                陰性
ダルシトール                              陰性
イノシトール                              陰性
マンニトール                              陰性
ソルビトール                              陰性
α-メチル-Ｄ-マンノシド                   陰性
α-メチル-Ｄ-グルコシド       陽性(嫌気性のみ)
Ｎ-アセチルグルコースアミン               陽性
アミグダリン                              陽性
アルブチン                                陽性
エスカリン                                陽性
サリシン                                  陽性
セロビオース                              陽性
マルトース                                陽性
ラクトース                                陽性
メリビオース                  陽性(好気性のみ)
サッカロース                              陽性
トレハロース                              陽性
イヌリン                      陽性(嫌気性のみ)
メレジトース                              陰性
Ｄ-ラフィノース                           陽性
アミドン                                  陽性
グリコーゲン                  陽性(嫌気性のみ)
キシリトール                  陽性(好気性のみ)
β-ゲンチオビオース                       陽性
Ｄ-ツラノース                             陰性
Ｄ-リクソース                             陰性
Ｄ-タガロース                 陽性(嫌気性のみ)
Ｄ-フコース                               陰性
Ｌ-フコース                               陰性
Ｄ-アラビトール                           陰性
Ｌ-アラビトール                           陰性
グルコネート                              陰性
２セト-グルコネート                       陰性
５セト-グルコネート                       陰性
Ｓ.salivarius MIAは、Ｃhristenens尿素寒天培地上で増殖させると、ウレアーゼ陽性である。
【００７５】
[阻害活性]
(ＢＬＩＳ活性に関する遅延性拮抗作用の試験)
血液寒天系培地、Columbia agar Base(GIBCO)＋0.1％ＣaＣＯ3＋５％ヒト血液(BACa)上で、TaggおよびBannisterの遅延性拮抗作用の試験に従って、バクテリオシン様阻害物質(ＢＬＩＳ)生成に関して試験すると、Ｐ型指定の菌株 Ｍia は677である。
【００７６】
(Ｐ型のＳ.salivarius MIA)
産生菌タイピング(Ｐ型)は、一組の標準的指標に対する細菌の抗菌活性を記載するものである。この手順は、Tagg および Bannister により最初に記載された(J. Med. Microbiol. 1979;12:397〜411)。
【００７７】
Ｐタイピング用に、Ｓ.salivarius MIAを、血液寒天＋0.1％炭酸カルシウムプレートまたはトリプトソイ-酵母菌抽出物-炭酸カルシウム寒天(トリプトソイブイヨン、30；酵母菌抽出物、20g；炭酸カルシウム、2.5g；寒天、15g；蒸留水、1000ｍl)上で直径画線培養物として増殖させ、37℃、５％ＣＯ2で18時間インキュベートした。次いで増殖体を除去し、プレートの表面をクロロホルムで滅菌した。次いで９つの指標菌株を交互に接種した。37℃、５％ＣＯ2で18時間インキュベートした後、増殖の阻害を記録した。阻害パターンは、この９つの指標を３つのトリプレット(例えば、I1、I2、I3、I4、I5、I6；I7、I8、I9)としてみなすことによって、コード形式で記録した。それぞれの指標に対する陽性反応は、指標がそれぞれトリプレットの第１、第２または第３のメンバーであるかに応じて、４、２または１という値を与えた。阻害なしはゼロとして記録した。したがって、それぞれのトリプレットの合計値は、３つの指標に対する反応を独自に指定した。完全なＰ型コードは３つの数の配列として書き、３つのトリプレット中の反応を連続的に定義する。
【００７８】
Ｓ.salivarius MIA は、血液寒天＋炭酸カルシウム上では677Ｐ型を有し、トリプトソイ-酵母菌抽出物-炭酸カルシウム寒天上では777Ｐ型を有する。
【００７９】
これは、指標３を除く９つの指標菌株のパネル中の、９つの細菌すべての阻害に対応する。このパターンは、菌株20Ｐ３などのサリバリシンＡ生成Ｓ.salivariusによって与えられるパターンの典型的なものである(Ross他、Appl. Envir. Microbiol. 1993；59；2014)。しかしながら、トリプトソイブイヨン(ＢＢＬ)＋Davis Agar(1.5％)＋0.25％炭酸カルシウム＋酵母菌抽出物(２％)[TSBCaYE]上で試験すると、Ｐ型は777である(すなわち、９つの指標すべてが阻害される)。指標３に対するこの高い活性と共に、指標として試験すると、様々な他の細菌に対する他の活性も存在する(表１)。
【００８０】
【表１】
2005517439.tif 000002
【００８１】
[抗Ｓ.ｍutans活性の遅延性拮抗作用の試験]
サリバリシンＡ2産生菌株の阻害活性の抗Ｓ.ｍutansスペクトルを、本質的にＴaggおよびBannister[J. Med. Microbiol. 1979；12:397]によって記載されたように、遅延性拮抗作用の試験を使用することによって確立した。簡潔に言うと、それぞれの産生菌株の１cｍ幅の直径画線培養物を、酵母菌抽出物(ＹＥ)の補充有りまたはなしで、TSBCaおよびBACa培地に接種した。嫌気性雰囲気中で24時間37℃でインキュベートした後、肉眼で見える細胞増殖体をガラススライドで除去し、寒天表面上の残りの細胞を、クロロホルム蒸気に30分間曝すことによって殺傷した。次いで寒天表面を30分間空気に曝し、指標菌株を、綿棒を使用し元の画線培養物の線に沿って、18時間Todd Hewitt Broth(ＴＨＢ)培養物から接種した。37℃において５％(v/v)ＣＯ2中で18時間インキュベートした後、それぞれの指標菌株の阻害の程度を記録した。
【００８２】
TSBCaYE培地(500ｍl当たり)
トリプトソイブイヨン(ＢＢＬ)       15g
Davis Agar                        7.5g
酵母菌抽出物(Difco)                10g
ＣaＣＯ3                         1.25g
BACaYE培地(500ｍl当たり) 
Columbia Blood Agar base(Difco)    22g
ＣaＣＯ3                          0.5g
酵母菌抽出物(Difco)                10
これらの結果は表２に示す。
【００８３】
【表２】
2005517439.tif 000003
【００８４】
[菌株Ｍiaによる唾液中の阻害活性の生成]
以下のように唾液を調製した:
刺激を与えた唾液を回収し、60℃で0.5時間加熱し、次いで12000×gで10分間遠心分離にかけた。上清に0.5％マルトース、0.5％ＣaＣＯ3および0.25μg/ｍlのシステインを補った(最終濃度)。
【００８５】
この補充した上清を、37℃における菌株Ｍiaの増殖用の、基礎液体培地として使用した。接種原は、上清２ｍl当たり100μlの割合で、18時間ＴＳＢＹＥＣa培養物からのものであった。異なる等分試料を、示したように補った。
【００８６】
嫌気性雰囲気中で24時間インキュベートした後、唾液培養物のサンプルを、非希釈状態または回転蒸発機による10倍濃縮後に、指標ＯＭＺ175、ＭutII、およびI１に対する阻害活性に関して試験した。マルトース、システインおよびＣaＣＯ3を補った唾液中で増殖させた培養物からの10倍濃縮した上清は、以下の表に示すように、Ｓ.ｍutans菌株ＯＭＺ175に対する阻害活性を有していた。したがってＳ.salivarius Ｍiaは、唾液中で増殖させると抗Ｓ.ｍutans活性を生み出す。
【００８７】
(阻害活性のアッセイ)
阻害活性を、表面滴下法を使用する終点滴定によって決定し、その中では、生理食塩水中の試験調製物の２倍連続希釈液の20μl滴を、血液寒天培地の表面上に滴下した。寒天中の滴が乾燥したとき、培地の表面をクロロホルム蒸気に30分間曝すことによって滅菌し、空気に曝し、次いで指標菌株の18時間ＴＨＢ培養物から、均一に塗抹することによって接種を行った。インキュベートした後、１ｍＬ当たりの任意単位(ＡＵ)中の阻害活性の滴定値を、最高希釈の相互的なものとして解釈して、明確な阻害活性を示した。これらの結果を表３に示す。
【００８８】
【表３】
2005517439.tif 000004
【００８９】
[ＭＳに対するＳ.salivarius MIA のin vivoでの活性]
１人の被験者は、第１日目に２分間２％クロロヘキシジンゲルで歯を磨き、次いでクロロヘキシジン処置の２時間後にＳ.salivarius MIAの3.8×109コロニー形成単位を含む錠剤を吸引し、次いで３個の錠剤を２時間間隔でさらに吸引した。第２日目は、被験者は第１日目と同じ手順を繰り返した。試験の残りの25日間、被験者は、朝と晩の市販の歯磨き粉を用いた歯磨き後に、１個の錠剤を吸引した。
【００９０】
対照被験者は、２％クロロヘキシジンゲルで３日間、１日１回歯を清掃し、残りの期間は市販の歯磨き粉を用いてその歯を磨いた。
【００９１】
唾液サンプルは、試験開始前、および試験中一定間隔で被験者すべてから回収して、ＭＳの数(唾液１ｍl当たりのコロニー形成単位(cfu))を決定した。唾液サンプルは滅菌生理食塩水に希釈し、Ｍutans選択寒天培地上にらせん状にまき、そのプレートを嫌気性条件下において、37℃で２日間インキュベートした。唾液サンプル中のＳ.salivarius MIAの数も、錠剤を摂取した被験者に関して決定した。希釈した唾液サンプルを、Ｍitis-salivarius寒天上にらせん状にまき、プレートを37℃、５％ＣＯ2で18〜24時間インキュベートした。次いでＳ.salivariusコロニーの数を数えた。Ｓ.salivarius MIAとのコロニー形成の割合を決定するために、以下のプロトコルを使用する。Micrococcus luteusおよびＳ.ｍutans ＯＭＺ175の新鮮なＴＨＢ培養物を、血液寒天/カルシウムプレートの上部に別々に広げる。次いでＳ.salivariusのコロニーを、両方のプレート中に採取する。これらのプレートを37℃、５％ＣＯ2で18〜24時間インキュベートする。Ｓ.salivarius MIAのコロニーによって、両方のプレート上の穿刺培養物周囲に阻害域が生じる。コロニー形成の割合は、採取したコロニーの合計数で割った陽性コロニーの数として決定する。
【００９２】
２％クロロヘキシジンゲルで歯を磨くことによって、対照(表４)とコロニー形成被験者(表５)の両方で、ＭＳ数の1.7〜2.4 logの減少がもたらされた。対照被験者のＭＳ細胞の数は、ゲルを用いた歯磨き後の１〜６日の間に対照被験者中で、予備治療レベルまで増大した。試験被験者は、ゲルを用いた予備治療後、100％コロニー形成し、残りの試験期間中、十分にコロニー形成する状態が続いた(表５)。ＭＳの数は、第27日目に予備治療レベルより、依然として1.7 log少なかった。これは、Ｓ.salivarius MIAとのコロニー形成によって、高レベルのＭＳの再確立を妨ぐことができることを示す。
【００９３】
【表４】
2005517439.tif 000005
【００９４】
【表５】
2005517439.tif 000006
【００９５】
[抗ＭＳ活性抽出物の調製]
２％の酵母菌抽出物および0.25％の炭酸カルシウムを含む、溶融状態のトリプトソイ寒天100ｍlを、１Ｌのショットボトル中に注いだ。空気中に５％ＣＯ2で37℃においてTodd Hewittブイヨン中で増殖させた、１ｍlの一晩培養したＳ.salivarius MIAを、このボトルに加えた。37℃で18〜24時間、培養物を嫌気的にインキュベートした。２％の酵母菌抽出物および0.25％の炭酸カルシウムを含む、トリプトソイブイヨン100ｍlをボトルに加え、それを嫌気的条件下でプレインキュベートした。次いで培養物を、37℃において嫌気的に、さらに24時間インキュベートした。ブイヨンを遠心分離にかけて細菌細胞を除去し、次いで硫酸アンモニウムを50％(w/v)まで加え、４℃で18時間インキュベートした。次いでサンプルを遠心分離にかけ、１ｍlのｍilli-Ｑ水にペレットを再懸濁させた。次いでサンプルの抗ＭＳ活性を、血液寒天プレートにおいてウエル拡散アッセイを使用して試験した。50μlのサンプルを、それぞれのウエルに加え空気乾燥させた。次いでプレートを、クロロホルム処理した。一晩培養した指標菌株をプレートの上部に広げ、18〜24時間空気中に５％ＣＯ2で37℃においてインキュベートした。
【００９６】
阻害域(ウエルの端部から細胞増殖が阻害された端部までの距離)を、すべての指標菌株に対して記録した(表６)。
【００９７】
【表６】
2005517439.tif 000007
【００９８】
[剤形の例]
薬用ドロップ
成分                      薬用ドロップ945ｍg当たり
Ｓ.salivarius            3.8×109コロニーＣＦＵ(凍結乾燥)
イソマルト                600ｍg
Emdex(商標)               150ｍg
ProSoly  ＨＤ(商標)        50ｍg
ステアリン酸マグネシウム   15ｍg
香料                       10ｍg
これらの成分を混合し、乾燥圧縮を使用して錠剤を生成する。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
前の結果は、広範囲の微生物、特に連鎖球菌に対する、Ｓ.salivarius菌株、特に菌株Ｍiaの抗菌効果を実証するものである。これらの菌株は、ＭＳ、より詳細にはＳ.ｍutansに対する活性を有する、同定された最初のＢＬＩＳ産生Ｓ.salivariusである。したがって、本明細書中の菌株、および関連活性抽出物は、特に口腔中の連鎖球菌感染の有害な影響に対して、個体を療法的に治療する方法において用途がある。これらの方法は、ＭＳまたはＳ.ｍutansが主な原因物質である、虫歯の治療を含む。本発明のＳ.salivariusの抽出物および組成物は、口臭および咽喉炎の治療においても用途がある。
【０１００】
前述の記載事項は例によってのみ与えられ、当業者に知られている、使用する物質および技術の変更形態が企図されることは、理解されるであろう。
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月24日(2003.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Ｄ-38124, Braunschweig, Germany に受託番号ＤＳＭ 14685で寄託された、Streptococcus salivarius 菌株Ｍia の生物学的に純粋な培養物、またはその同定された特性を有する培養物。
【請求項２】
サリバリシンＡ2産生菌株であり抗ＭＳ活性を示し、炭水化物の代謝に関して、Ｌ-アラビノース、イヌリン、グリコーゲン、キシリトール、およびβ-ゲンチオビオースの少なくとも１つの使用、またはβ-ガラクトシダーゼ産生に関して陽性であり；かつ/あるいはグリセロール、α-メチル-Ｄ-マンノシドの少なくとも１つの使用、またはアルカリホスファターゼ産生に関して陰性である、請求項１に記載の培養物。
【請求項３】
菌株がＬ-アラビノース、イヌリン、グリコーゲン、キシリトール、およびβ-ゲンチオビオースのそれぞれの使用、またはβ-ガラクトシダーゼ産生に関して陽性であり；かつ/あるいはグリセロール、α-メチル-Ｄ-マンノシドのそれぞれの使用、またはアルカリホスファターゼ産生に関して陰性である、請求項２に記載の培養物。
【請求項４】
請求項１で定義されるＳ.salivarius 菌株Ｍiaから得られる抽出物であって、抗ＭＳ活性を有する抽出物。
【請求項５】
抗Ｓ.ｍutans活性を有する、請求項４に記載の抽出物。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、あるいは請求項４または５に記載の抽出物を含む、抗菌性組成物。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、あるいは請求項４または５に記載の抽出物、および希釈剤、担体および/または賦形剤を含む、治療用配合物。
【請求項８】
１つまたは複数の補助抗菌剤をさらに含む、請求項６または７に記載の組成物または配合物。
【請求項９】
補助抗菌剤がナイシン、ＢＬＩＳおよびＢＬＩＳ産生微生物から選択される、請求項８に記載の組成物または配合物。
【請求項１０】
ＢＬＩＳがサリバリシンＡ、Ａ1、Ａ2およびＢから選択される１つまたは複数のＢＬＩＳである、請求項９に記載の組成物または配合物。
【請求項１１】
ＢＬＩＳ産生微生物がＫ12および/またはＫ30である、請求項９に記載の組成物または配合物。
【請求項１２】
１つまたは複数の補助抗う蝕剤をさらに含む、請求項６から11のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項１３】
補助抗う蝕剤がキシリトール、フッ化物、マヌカハニーおよびタンニンから選択される、請求項12に記載の組成物または配合物。
【請求項１４】
経口投与可能な組成物または配合物である、請求項６から13のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項１５】
組成物または配合物が食品または飲料中に含まれる、請求項６から14のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項１６】
前記食品または飲料が乳製品系の食品または飲料である、請求項15に記載の組成物または配合物。
【請求項１７】
前記食品または飲料がミルク粉末、ミルクビスケット、ミルク、フレーバーミルク、ヨーグルトまたはチーズである、請求項16に記載の組成物または配合物。
【請求項１８】
組成物または配合物が薬剤、薬用ドロップまたは菓子類の形態である、請求項６から14のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項１９】
薬用ドロップの形態である、請求項18に記載の組成物または配合物。
【請求項２０】
口内洗浄液、口内洗浄剤、歯磨き粉、うがい薬、シロップ、口内スプレー、カプセル、フロス、チューインガム、または錠剤中に存在する、請求項18に記載の組成物または配合物。
【請求項２１】
単位剤形である、請求項14から20のいずれか一項に記載の組成物または配合物。
【請求項２２】
用量当たり約105〜1012、好ましくは109〜1010ＣＦＵのＳ.salivarius 菌株Ｍiaを含む、請求項21に記載の組成物または配合物。
【請求項２３】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍiaに対して感受性がある細菌の増殖を少なくとも阻害するための方法であって、阻害有効量の請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、請求項４または５に記載の抽出物、または請求項６から22のいずれか一項に記載の組成物または配合物と、感受性がある細菌を接触させることを含む方法。
【請求項２４】
感受性がある細菌がＭＳである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
感受性がある細菌がＳ.ｍutansである、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＳまたはＳ.ｍutans菌の増殖を少なくとも阻害するための方法であって、阻害有効量の請求項１から22のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、抽出物、組成物または配合物と、ＭＳまたはＳ.ｍutansを接触させることを含む方法。
【請求項２７】
治療処置の必要がある個体中においてＳ.ｍutansにより少なくとも部分的に引き起こされる虫歯を治療処置する方法であって、前記個体に、請求項１から22のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、抽出物、組成物または配合物を、個体の口腔中のＳ.ｍutansの増殖を少なくとも阻害するのに有効な量、投与することを含む方法。
【請求項２８】
虫歯の発生率または重症度を抑制する方法であって、虫歯を抑制する量の請求項１から22のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、抽出物、組成物または配合物を、虫歯になりやすい個体の口腔に導入することを含む方法。
【請求項２９】
虫歯がＭＳによって引き起こされる、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
Ｓ.salivarius 菌株Ｍiaまたは抽出物を、食品、飲料または栄養素の一部として投与する、請求項23から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
Ｓ.salivariusまたは抽出物を、請求項６から22のいずれか一項に記載の組成物または配合物中に投与する、請求項23から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
個体を予備治療して、既に存在する通常のミクロフローラを少なくとも減少させる予備ステップを含む、請求項23から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
抗菌剤または抗生物質を使用して予備治療を行う、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
抗菌剤がクロロヘキシジンである、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
虫歯の重症度の発生率を抑制する方法であって、
(a)虫歯を引き起こす存在する生物を含む通常のミクロフローラを減少させるのに有効な量の抗菌剤または抗生物質を、前記患者に投与するステップ、および
(b)結果として生じる細菌が減少した環境に、請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、またはそれを含む組成物または配合物を投与して、前記環境を再生させるステップを含む方法。
【請求項３６】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、あるいは請求項４または５に記載の抽出物の使用であって、請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍiaに対して感受性がある細菌の増殖を少なくとも阻害する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【請求項３７】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、あるいは請求項４または５に記載の抽出物の使用であって、Ｓ.ｍutans菌の増殖を少なくとも阻害する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【請求項３８】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、あるいは請求項４または５に記載の抽出物の使用であって、ＭＳ菌の増殖を少なくとも阻害する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【請求項３９】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、あるいは請求項４または５に記載の抽出物の使用であって、Ｓ.ｍutansにより少なくとも部分的に引き起こされる虫歯を、予防的または療法的に治療する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【請求項４０】
虫歯がＭＳによって引き起こされる、請求項33に記載の使用。
【請求項４１】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＳ.salivarius 菌株Ｍia、あるいは請求項４または５に記載の抽出物の使用であって、虫歯の発生率および重症度を抑制する際に使用するための組成物または配合物の調製における使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、新規なStreptococcus salivarius 菌株Ｍia、それを含む組成物、および抗菌剤としてのＳ.salivarius 菌株Ｍiaの使用、特に虫歯を予防または治療する際の使用に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
[発明の概要]
したがって、一態様では、本発明は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, Ｄ-38124, Braunschweig, Germanyに受託番号ＤＳＭ 14685で寄託された、Streptococcus salivarius 菌株Ｍia の生物学的に純粋な培養物からなると、広義には言うことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明は、その抽出物が抗ＭＳ活性を有する、Ｓ.salivarius 菌株Ｍia から入手可能な抽出物も提供する。詳細には、その抽出物は抗Ｓ.ｍutans活性を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
他の態様では、本発明は、前に定義したＳ.salivariusまたは抽出物を含む、抗菌性組成物を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
さらに他の態様では、本発明は、前に定義したＳ.salivarius 菌株Ｍia または抽出物を、希釈剤、担体および/または賦形剤と共に含む、治療用配合物を提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
一実施形態では、本発明の組成物または配合物は、補助抗菌剤をさらに含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
一実施形態では、治療用配合物は、食品または飲料、好ましくは乳製品系の食品または飲料の形態である。他の形態は薬剤、薬用ドロップおよび菓子類である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明は、本発明のＳ.salivariusに対して感受性がある細菌の増殖を少なくとも阻害するための方法であって、阻害有効量のＳ.salivarius 菌株Ｍia、本発明の抽出物または組成物または配合物と、感受性がある細菌を接触させることを含む方法をさらに提供する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
好ましくは、感受性がある細菌はＭＳであり、Ｓ.ｍutansであることがさらに好ましい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明は、他の態様では、ＭＳまたはＳ.ｍutansの増殖を少なくとも阻害するための方法であって、阻害有効量の本発明のＳ.salivarius 菌株Ｍia抽出物の組成物または配合物と、ＭＳまたはＳ.ｍutansを接触させることを含む方法を提供する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
他の態様では本発明は、必要性のある個体中においてＳ.ｍutansにより少なくとも部分的に引き起こされる虫歯を予防または療法治療する方法であって、前記個体に、本発明のＳ.salivarius 菌株Ｍia、抽出物、組成物または配合物を、
個体の口腔中のＳ.ｍutansの増殖を少なくとも阻害するのに有効な量、投与することを含む方法を提供する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
他の態様では、本発明は、虫歯の発生率および重症度を抑制する方法であって、虫歯を抑制する量の本発明のＳ.salivarius、抽出物、組成物または配合物を、虫歯になりやすい個体の口腔に導入することを含む方法を提供する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
一実施形態では、虫歯がＭＳによって引き起こされる。この場合、Ｓ.salivarius Ｋ12または抗ＭＳ活性抽出物、またはこれらを含む組成物または配合物を使用することもできる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
Ｓ.salivariusは、食品、飲料または栄養素の一部として投与することが好ましい。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明の方法は、個体を予め治療して、既に存在する通常のミクロフローラを少なくとも減少させる予備ステップも含んでよい。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明は、前に論じた組成物および方法における、本発明のＳ.salivarius 菌株Ｍiaまたは抽出物の使用にも関する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
他の態様では本発明は、Ｓ.ｍutansによって、ＭＳによってさらに通常的に、少なくとも部分的に引き起こされる虫歯を、阻害、抑制、防止または治療するための前に論じた方法における、Ｓ.salivarius 菌株Ｍiaおよび活性抽出物の使用にも関する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
また、Ｓ.ｍutansによって、ＭＳによってさらに通常的に、少なくとも部分的に引き起こされる虫歯を、阻害、抑制、防止または治療するための前に論じた方法における、Ｓ.salivarius Ｋ12、またはそれに由来する抗ＭＳまたは抗Ｓ.ｍutans活性抽出物、またはそれらを含む組成物の使用についても開示されている。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
[発明の詳細な説明]
前に記したように、本発明は、第１の態様において、サリバリシンＡ2を生産し抗ＭＳ活性を示す、Streptococcus salivarius 菌株Ｍiaを対象とする。TSBCaYE寒天上で増殖させると、Ｓ.salivarius菌株は望ましいことに、Ｓ.ｍutansを含めた広範囲のＭＳに対する活性を示す。サリバリシンＡ2およびＡ2産生Ｓ.salivarius菌株(菌株Ｋ12)は、例えば参照によって本明細書に組み込んだＷＯ 01/27143中に記載されている。


【国際調査報告】
2005517439.tif 000008
2005517439.tif 000009
2005517439.tif 000010