(57)【要約】本発明は、ＫＳＰの新規リガンド結合部位の特定、特性指摘及び三次元構造に係る。新規結合部位へのリガンドの結合は、前記タンパク質の三次元構造の立体配座変化及びＫＳＰの活性の変調をもたらす。この立体配座変化は、次に、本発明の新規結合部位を含む、ＫＳＰタンパク質内の新規結合ポケットの形成を生じさせる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＳＰのアミノ酸残基の相対構造座標が、表１に記載の数値±約２Å以下の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差である、ＫＳＰ及びそのリガンドの結晶複合体。
【請求項２】
前記アミノ酸残基の相対構造座標が、表１に記載の数値±約０．５Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差である、請求項１に記載の結晶複合体。
【請求項３】
前記リガンドが、ＫＳＰアミノ酸残基１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）を含むリガンド結合部位で前記ＫＳＰに結合する、請求項１に記載の結晶複合体。
【請求項４】
ＫＳＰのアミノ酸残基の相対構造座標が、表２に記載の数値±約２Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差である、ＫＳＰの結晶複合体及びそのリガンド。
【請求項５】
前記アミノ酸残基の相対構造座標が、表２に記載の数値±約０．５Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差である、請求項４に記載の結晶複合体。
【請求項６】
前記リガンドが、ＫＳＰアミノ酸残基１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）を含むリガンド結合部位で前記ＫＳＰに結合する、請求項４に記載の結晶複合体。
【請求項７】
ＫＳＰのアミノ酸残基の相対構造座標が、表３に記載の数値±約２Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差である、ＫＳＰ及びそのリガンドの結晶複合体。
【請求項８】
前記アミノ酸残基の相対構造座標が、表３に記載の数値±約０．５Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差である、請求項７に記載の結晶複合体。
【請求項９】
前記リガンドが、ＫＳＰアミノ酸残基１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）を含むリガンド結合部位で前記ＫＳＰに結合する、請求項７に記載の結晶複合体。
【請求項１０】
ＫＳＰのアミノ酸残基の相対構造座標が、表４に記載の数値±約２Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差である、ＫＳＰ及びそのリガンドの結晶複合体。
【請求項１１】
前記アミノ酸残基の相対構造座標が、表４に記載の数値±約０．５Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差である、請求項１０に記載の結晶複合体。
【請求項１２】
前記リガンドが、ＫＳＰアミノ酸残基１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）を含むリガンド結合部位で前記ＫＳＰに結合する、請求項１０に記載の結晶複合体。
【請求項１３】
表５に記載の相対構造座標±約２Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を含む、ＫＳＰタンパク質のリガンド結合部位。
【請求項１４】
表５に記載の相対構造座標±約０．５Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を含む、ＫＳＰタンパク質のリガンド結合部位。
【請求項１５】
表１、２、３及び４から成る群より選択される表に記載のＫＳＰアミノ酸残基１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）の相対構造座標±約２Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を含む、請求項１３に記載のＫＳＰタンパク質のリガンド結合部位。
【請求項１６】
ＫＳＰ機能の阻害因子である、請求項１３に記載のリガンド結合部位に結合する物質又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項１７】
（ａ）請求項１６に記載の物質及び（ｂ）医薬的に許容され得る担体を含有する組成物。
【請求項１８】
１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）から成る群より選択されるＫＳＰアミノ酸残基の５個以上に結合する薬剤であって、前記薬剤がＫＳＰ機能の阻害因子であるもの、又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項１９】
（ａ）表５に記載のＫＳＰ結合部位±約２．０Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差の三次元モデルからＫＳＰのリガンド結合部位を決定すること；及び
（ｂ）前記リガンド結合部位と相互作用する物質を特定するためにコンピュータフィッティング解析を実施すること
の工程を含む、ヒトＫＳＰのリガンド結合部位と相互作用する物質を特定するための方法。
【請求項２０】
（ａ）表１、２、３及び４の群より選択される表に記載のＫＳＰアミノ酸残基１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）の相対構造座標±約２．０Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を使用したＫＳＰの三次元モデルからＫＳＰのリガンド結合部位を決定すること；及び
（ｂ）コンピュータフィッティング解析を実施して前記リガンド結合部位と相互作用する物質を特定すること
の工程を含む、ヒトＫＳＰのリガンド結合部位と相互作用する物質を特定するための方法。
【請求項２１】
（ａ）表５に記載のリガンド結合部位±約２．０Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差の三次元モデルからのＫＳＰのリガンド結合部位の相対構造座標を含む、ＫＳＰ結合部位の三次元モデルを得ること；
（ｂ）前記三次元モデルを使用して潜在的阻害因子を設計する又は選択すること；及び
（ｃ）前記潜在的阻害因子を合成する又は入手すること
の工程を含む、ＫＳＰ機能の潜在的阻害因子を特定するための方法。
【請求項２２】
前記潜在的阻害因子を新規に設計する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｄ）前記潜在的阻害因子をＫＳＰ結合分子の存在下でＫＳＰと接触させること；及び
（ｅ）前記潜在的阻害因子がＫＳＰと前記ＫＳＰ結合分子の間の結合に及ぼす作用を測定すること
の工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）表１、２、３及び４から選択される表に記載の相対構造座標±約２．０Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を使用してＫＳＰの三次元モデルを作製すること；
（ｂ）前記三次元モデルを使用して潜在的阻害因子を設計する又は選択すること；及び
（ｃ）前記潜在的阻害因子を合成する又は入手すること
の工程を含む、ＫＳＰ機能の潜在的阻害因子を特定するための方法。
【請求項２５】
前記潜在的阻害因子を新規に設計する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｄ）前記潜在的阻害因子をＫＳＰ結合分子の存在下でＫＳＰと接触させること；及び
（ｅ）前記潜在的阻害因子がＫＳＰと前記ＫＳＰ結合分子の間の結合に及ぼす作用を測定すること
の工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記潜在的阻害因子をＫＳＰ結合分子の存在下でＫＳＰと接触させること、及び前記潜在的阻害因子がＫＳＰと前記ＫＳＰ結合分子の間の結合に及ぼす作用を測定することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記潜在的阻害因子を、ＡＴＰ及び微小管から選択される１個又は２個のＫＳＰ基質の存在下でＫＳＰと接触させること、及び前記潜在的阻害因子がＫＳＰのＡＴＰアーゼ活性に及ぼす作用を測定することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２１に記載の方法によって特定される潜在的阻害因子又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項３０】
（ａ）表１、２、３及び４から選択される表に記載のタンパク質座標±約２．０Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差から選択されるタンパク質座標を、（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌリガンド結合部位立体配座を定義するために適切なコンピュータプログラムに導入することであって、前記プログラムが前記（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌリガンド結合部位の三次元構造を表示するものであり；
（ｂ）前記コンピュータプログラムにおいて前記（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌリガンド結合部位の三次元画像を作成すること；
（ｃ）被験化合物の三次元画像を表示し、前記（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌリガンド結合部位の三次元画像に重ねること；
（ｄ）前記被験化合物が前記（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌリガンド結合部位に空間的に適合するかどうかを評価すること；
（ｅ）前記（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌリガンド結合部位に空間的に適合する前記被験化合物を製造すること；
（ｆ）ＫＳＰ機能に関する生物学的アッセイにおいて前記被験化合物を使用すること；及び
（ｇ）前記アッセイにおいて前記被験化合物がＫＳＰ機能を阻害するかどうかを判定すること
を含む、キネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）に結合することができる阻害因子化合物を特定する方法。
【請求項３１】
（ａ）少なくとも２個の潜在的リガンドの混合物の存在下で結晶化させたヒトキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）のＸ線回折図形を得ること；
（ｂ）前記ＫＳＰ結晶のＸ線回折図形から算定した電子密度地図を、表１、２、３及び４から選択される表に示すＸ線回折図形から算定した電子密度地図と比較することによってリガンド／ＫＳＰ複合体が形成されるかどうかを判定すること；及び
（ｃ）ＫＳＰに結合したとき前記リガンドが細胞増殖を阻止するように、前記リガンド／ＫＳＰ複合体からの前記リガンドが請求項１５に記載の前記ＫＳＰのリガンド結合部位に結合するかどうかを判定すること
の工程を含む、ヒトＫＳＰに結合すると細胞増殖を阻止する潜在的抗有糸分裂物質を特定するための方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法によって特定される抗有糸分裂物質又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項３３】
（ａ）請求項３２に従って特定される抗有糸分裂物質；及び（ｂ）医薬的に許容され得る担体を含有する組成物。
【請求項３４】
ＫＳＰアミノ酸残基１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）についての表１、２、３及び４から成る群より選択される表に記載の相対構造座標±約２．０Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を有するＫＳＰ結合部位の原子構造モデルを使用して、ＫＳＰリガンド結合部位に空間的に適合する被験化合物をモデリングすること；前記リガンド結合部位へのリガンドの結合を特徴とするアッセイにおいて前記被験化合物をスクリーニングすること；及びその結合部位において前記ＫＳＰへの前記リガンドの結合を調節する被験化合物を特定することを含む、ヒトＫＳＰのリガンド結合部位へのリガンドの結合を調節する化合物を特定する方法。
【請求項３５】
機器読取り可能データを使用するための指示でプログラムされた機器を使用するとき、ヒトＫＳＰのリガンド結合部位に結合した化合物の分子複合体の三次元グラフ画像を表示することができる、前記データでコード化されたデータ保存資料を含み、前記三次元画像が表１〜４から選択される表に示すＫＳＰ又は前記分子複合体のホモログの構造座標を含み、前記ホモログが約２．０Å以下の前記ＫＳＰの骨格原子からの二乗平均平方根偏差を有する結合部位を含む、機器読取り可能データ保存媒体。
【請求項３６】
（ａ）少なくとも２個の潜在的リガンドの混合物に暴露しながら結晶化させたＫＳＰの結晶を得ること；
（ｂ）前記結晶においてリガンド／ＫＳＰ複合体が形成されるかどうかを判定すること；及び
（ｃ）潜在的抗有糸分裂物質を、表５に示す相対構造座標±約２．０Å以下の二乗平均平方根偏差を有するリガンド結合部位において前記ＫＳＰに結合するものとして特定すること
の工程を含む、標的ヒトＫＳＰに結合すると細胞増殖を阻止する抗有糸分裂物質を特定するための方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法によって特定される抗有糸分裂物質又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項３８】
（ａ）請求項３７に記載の抗有糸分裂物質；及び（ｂ）医薬的に許容され得る担体を含有する組成物。
【請求項３９】
リガンド結合部位でＫＳＰに結合したリガンドを含む複合体の結晶に関するＸ線回折データを得ること；及び前記データを利用して前記複合体の三次元構造を定義することを含む、ＫＳＰとそのリガンドの複合体の三次元構造を決定するための方法。
【請求項４０】
（ａ）化学物質と表５に記載の相対構造座標±約２．０Å以下の二乗平均平方根偏差を有するＫＳＰのリガンド結合部位の間でフィッティング操作を実施するためのコンピュータ又は実験的手段を用いて、それによって前記化学物質とヒトＫＳＰのリガンド結合部位又は少なくともその部位の一部又はＫＳＰ結合部位を含む複合体との結合に関連するデータを得ること；及び
（ｂ）工程（ａ）で得たデータを解析して、前記化学物質と前記ＫＳＰ又は複合体の間の結合の特徴を決定すること
の工程を含む、前記化学物質がヒトＫＳＰのリガンド結合部位又は少なくともその部位の一部又はＫＳＰ結合部位を含む複合体と結合する能力を評価するための方法。
【請求項４１】
前記化学物質が、インビボ又はインビトロでＫＳＰのモーター活性に干渉することができる、請求項３７に記載の方法によって特定される化学物質又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項４２】
（ａ）請求項３８に従って特定される化学物質；及び（ｂ）医薬的に許容され得る担体を含有する組成物。
【請求項４３】
（ａ）表１、２、３及び４から成る群より選択される表に記載の原子座標±約２．０Å以下の二乗平均平方根偏差によって定義されるリガンド結合ＫＳＰの三次元構造を提供すること；
（ｂ）表１、２、３又は４に示す、ＫＳＰに結合したときの前記リガンドの三次元座標±約２．０Å以下の二乗平均平方根偏差を、化合物構造のデータベースにおける化合物の三次元座標と比較すること；及び
（ｃ）前記データベースから、前記ＫＳＰに結合したとき前記リガンドと構造的に類似する、前記ＫＳＰの潜在的阻害因子である少なくとも１つの化合物を選択すること
の工程を含む、ヒトキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）の潜在的阻害因子を特定するための方法。
【請求項４４】
前記構造類似性を、キネシンペプチド及びキネシン阻害因子の骨格原子における二乗平均平方根偏差に基づいて決定する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）表１〜４から選択される表に示す原子座標±約２．０Å以下の二乗平均平方根偏差によって定義されるＫＳＰの三次元構造を提供すること；
（ｂ）前記三次元構造を使用して潜在的阻害因子を設計する又は選択すること；  
（ｃ）前記潜在的阻害因子を合成すること；及び
（ｄ）前記潜在的阻害因子をＫＳＰと接触させて、前記潜在的阻害因子が有糸分裂を停止させる又は細胞増殖を阻止する能力を測定すること
の工程を含む、ヒトキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）の潜在的阻害因子を特定するための方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法によって特定される潜在的阻害因子又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項４７】
（ａ）請求項４６に従って特定される潜在的阻害因子；及び（ｂ）医薬的に許容され得る担体を含有する組成物。
【請求項４８】
ＫＳＰの１２７位のアミノ酸残基の蛍光の変化を測定することを含み、前記アミノ酸残基がトリプトファンである、請求項１３に記載のリガンド結合部位に結合するＫＳＰの阻害因子を特定する方法。
【請求項４９】
（ａ）ＫＳＰを被験化合物とヌクレオチドに接触させ、ＫＳＰ内のＷ１２７についてのピーク発光波長でその混合物の蛍光を測定すること；
（ｂ）ＫＳＰをヌクレオチドと接触させ、ＫＳＰ内のＷ１２７についてのピーク発光波長でその混合物の蛍光を測定すること；及び
（ｃ）ＫＳＰ、前記被験化合物及び前記ヌクレオチドの混合物の蛍光を、ＫＳＰとヌクレオチドだけの混合物の蛍光と比較すること
の工程を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
（ａ）表１、２、３又は４に従ったＫＳＰアミノ酸残基１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）の相対構造座標±約２．０Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差を含むリガンド結合部位で、標的ＫＳＰ又はその類似体に特異的に結合すること；及び
（ｂ）前記ＫＳＰ又はその類似体に結合すると、前記ＫＳＰ又は類似体の生物活性を特異的に阻害すること
を特徴とする抗有糸分裂物質。
【請求項５１】
表５に記載のＫＳＰリガンド結合部位±約２．０Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差に結合するリガンドにＫＳＰタンパク質を暴露することを含む、前記ＫＳＰタンパク質の構造立体配座の変化を生じさせる方法。
【請求項５２】
前記ＫＳＰタンパク質が付加的にヌクレオチドに結合している、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
表５に記載のＫＳＰリガンド結合部位±約２．０Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差に結合する化合物の治療有効量を哺乳類に投与することを含む、過剰増殖性疾患を治療又は予防する方法。
【請求項５４】
癌を治療する又は予防する方法である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
癌を治療する方法である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、単離され、実質的に純粋なポリペプチド又はそのフラグメント。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが、表５に記載のリガンド結合ポケット±約２．０Å以下の二乗平均平方根偏差の立体配座をとる、請求項５６に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５８】
パーセンテージ同一性を、デフォルトＧａｐ重を使用して、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン７．０におけるＧａｐ、ＢＡＳＥＦＩＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムで決定する、請求項５７に記載のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項５７に記載の単離ポリペプチドの変異体。
【請求項５９】
ヒトＫＳＰの活性部位の物理、化学及び／又は原子環境を表わす特徴のセットの三次元配向を指し、前記特徴が、１疎水性領域特徴、水素結合受容体特徴及び水素結合供与体特徴（図１４Ａにおける活性基モデル）、又は２疎水性領域特徴と水素結合受容体特徴（図１４Ｂにおける活性基モデル）のいずれかを含む、活性基モデルとして本明細書に記載のようにして設計する活性構造モチーフ。
【請求項６０】
請求項５９に記載の活性基モデルへの、スクリーニングした化合物の適合性を評価することによって潜在的ＫＳＰ阻害因子化合物をスクリーニングし、かつ特定するための方法。
【請求項６１】
適合性の評価を、コンピュータ及びコンピュータ読取り可能媒体の使用によって実施する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
図１４Ｂに例示するように配向されている、２疎水性領域特徴と水素結合受容体特徴を含む、有糸分裂キネシンＫＳＰを阻害する化合物又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項６３】
図１４Ｂに例示するように配向されている、２疎水性領域特徴と水素結合受容体特徴を含み、キネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）のリガンド結合部位に適合し、前記リガンド結合部位が、表５に記載の相対構造座標±約２Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を含む化合物又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項６４】
２疎水性領域特徴が、場合により置換された、アリール、ヘテロアリール及びＣ３−Ｃ７−シクロアルキルから独立して選択される、請求項６３に記載の化合物。
【請求項６５】
２疎水性領域特徴が、場合により置換されたフェニルから独立して選択される、請求項６３に記載の化合物。
【請求項６６】
前記化合物が、約０．１ｎＭから約１００ｎＭのＫＳＰに対する結合親和性を有する、請求項６３に記載の化合物。
【請求項６７】
１疎水性領域特徴、水素結合供与体特徴及び水素結合受容体特徴を含み、前記特徴が図１４Ａに例示するように配向され、かつ有糸分裂キネシンＫＳＰを阻害するものである化合物又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項６８】
図１４Ａに例示するように配向されている１疎水性領域特徴、水素結合供与体特徴及び水素結合受容体特徴を含み、及び表５に示す相対構造座標±約２Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を含むキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）のリガンド結合部位内に適合する化合物又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項６９】
前記疎水性領域特徴が、場合により置換された、アリール、ヘテロアリール及びＣ３−Ｃ７−シクロアルキルから選択される、請求項６８に記載の化合物。
【請求項７０】
前記疎水性領域特徴が、場合により置換されたフェニルから選択される、請求項６８に記載の化合物。
【請求項７１】
前記化合物が、約０．１ｎＭから約１００ｎＭのＫＳＰに対する結合親和性を有する、請求項６８に記載の化合物。
【請求項７２】
前記化合物が、２−チオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン成分、ジヒドロピリミジン成分又は５，６，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［１’，５’：１，６］−ピリド［３．４−ｂ］インドール−１，３（２Ｈ）−ジオン成分を含まない、請求項６８に記載の化合物。
【請求項７３】
３疎水性領域特徴と水素結合受容体特徴を含み、前記特徴が、図１６に例示するように空間的に配向されており及び特徴間に以下のような：
【表１】
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Å距離を有し、かつ有糸分裂キネシンＫＳＰを阻害する化合物又は医薬的に許容され得るその塩。
【請求項７４】
前記化合物がキナゾリノン、フェノチアジン、チエノピリミジノン、フラノピリミジノン、アゾロピリミジノン、チアゾロピリミジン、シクロアルキルピリミジノン又はトリフェニルメタン成分を含まない、請求項７３に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に分子生物学、タンパク質精製、タンパク質結晶化、Ｘ線回折解析、三次元構造決定、合理的薬剤設計及びモータータンパク質、特にキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）の分子モデリングの分野に関する。また、ここで特定する新規リガンド結合部位で前記タンパク質に結合したＫＳＰ阻害因子とのＫＳＰの組成物及び結晶も提供する。結晶ＫＳＰをＸ線回折手法によって物理的に解析する。生じるＸ線回折図形は、阻害因子結合ＫＳＰの三次元構造を決定するために有用な十分に高い分解能である。それらの原子座標は、関連タンパク質の分子モデリング、及びＫＳＰについてのミメティック及びリガンド及び関連タンパク質の合理的薬剤設計（ＲＤＤ）において有用である。ＫＳＰの生物学的機能、特にＫＳＰを含む分子相互作用によって仲介される生物学的機能を阻害する医薬組成物の設計のために、阻害因子との複合体におけるＫＳＰの構造座標を使用する方法も開示する。
【背景技術】
【０００２】
癌は依然として米国における死亡の主要原因の１つである。臨床的には、手術、放射線治療及び化学療法剤治療を含む極めて多様な医学的アプローチが、ヒトの癌の治療において現在使用されている（教本、ＣＡＮＣＥＲ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第６版、Ｄｅ  Ｖｉｔａら編集、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，２００１参照）。しかし、そのようなアプローチが、悪性形質転換と新生物増殖の厳密な細胞ベースについて明確な理解が基本的に欠如していることにより、今も制限されていることは認識されている。
【０００３】
細胞分裂の制御は多細胞生物の最も基本的な側面の１つである。分裂すべきでない時点で分裂する細胞を産生する、細胞増殖及び分裂の制御不全は、多くの癌の基礎である腫瘍と呼ばれる近接細胞塊を生じる。
【０００４】
癌治療の一般的戦略は、有糸分裂の間に細胞周期を中断する薬剤の開発である。短縮（解重合）又は伸長（重合）を混乱させる化合物は、染色体移動のために必要な正常微小管動力学の混乱によって有糸分裂における細胞周期の停止を生じさせる。（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｄ．Ａ．ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９１３−９１４）。これらの化合物に付随する公分母は、それらが紡錘体構築を阻害することによって有糸分裂における細胞を停止させるということである（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｄ．Ａ．ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：３１３−３１４）。ごく最近、ｍｏｎａｓｔｒｏｌなどの一部の物質が、有糸分裂タンパク質などの必須タンパク質の機能を遮断することによって有糸分裂を阻害することに関係付けられた。（Ｍａｙｅｒ，Ｔ．Ｕ．ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９７１−９７４）。
【０００５】
モータータンパク質、キネシンは、１９８５年にヤリイカの軸索原形質中で発見された。Ｒ．Ｄ．Ｖａｌｅら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆｏｒｃｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｋｉｎｅｓｉｎ，Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｂａｓｅｄ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ，Ｃｅｌｌ  ４２：３９−５０（１９８５）。この数年間に、キネシンはモータータンパク質の非常に大きなファミリーの単なる一成員であることが発見された。例えば、Ｓ．Ａ．Ｅｎｄｏｗ，Ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｋｉｎｅｓｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  Ｍｏｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１６  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２２１（１９９１）；Ｌ．Ｓ．Ｂ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｓｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：Ｔａｉｌｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ，１  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９３（１９９１）；Ｒ．Ｊ．Ｓｔｅｗａｒｄら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｘ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｓｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：８４７０（１９９１）。他のモータータンパク質は、ダイニン、例えばＭ．−Ｇ．Ｌｉら、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｄｙｎｅｉｎ，ａ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  Ｍｏｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｉｓ  Ａｓｙｍｍｅｔｉｒｉｃａｌｌｙ  Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｏｏｃｙｔｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２６：１４７５−１４９３（１９９４）及びミオシン、例えばＴ．Ｑ．Ｐ．Ｕｙｅｄａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１４：６９９−７１０（１９９０）を含む。
【０００６】
有糸分裂キネシンは紡錘体の構築と機能のために必須の酵素であるが、一般には、神経突起におけるように他の微小管構造の一部ではない。これらの重要な微小管依存性モータータンパク質は、微小管に沿って移動して細胞のあらゆる場所に達する。有糸分裂キネシンは有糸分裂のすべての期において重要な役割を果たす。これらのタンパク質は、化学エネルギーを力学的力と運動に変換する生物機構として概念化されうる。キネシンはＡＴＰ加水分解から生じるエネルギーを利用して、微小管に沿ったそれらの一方向運動を推進し、分子貨物を特定目的地へと輸送する。有糸分裂の間に、キネシンは微小管を紡錘体という二極性構造へと組織する。キネシンは、紡錘体微小管に沿った染色体の運動ならびに有糸分裂の特定期に関連する有糸分裂紡錘体の構造変化を仲介する。有糸分裂キネシン機能の実験的混乱は、有糸分裂紡錘体の奇形又は機能不全を引き起こし、しばしば細胞周期の停止と細胞死をもたらす。微小管モーターが有糸分裂における微小管の機能に決定的な役割を果たすことが急速に明らかになりつつある。
【０００７】
特定された有糸分裂キネシンの中にキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）がある。ＫＳＰは、基本的に、逆平行のホモ二量体から成る二極性ホモ四量体へと集合するプラス端指向微小管モーターの保存されたキネシンサブファミリーである、キネシンのＢｉｍＣファミリーに属する。ヒトＫＳＰ（ＨｓＥｇ５とも称される）は記述されており［Ｂｌａｎｇｙら、Ｃｅｌｌ，８３：１１５９−６９（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，３９：１６３５−４２（１９９６）；Ｇａｌｇｉｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３５：３３９−４１４（１９９６）；Ｂｌａｎｇｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１９４１８−２４（１９９７）；Ｂｌａｎｇｙら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ  Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，４０：１７４−８２（１９９８）；ＷｈｉｔｅｈｅａｄとＲａｔｔｎｅｒ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１１：２５５１−６１（１９９８）；Ｋａｉｓｅｒら、ＪＢＣ  ２７４：１８９２５−３１（１９９９）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ８５１３７、ＮＭ００４５２３及びＵ３７４２６］、及びＫＳＰ遺伝子のフラグメント（ＴＲＩＰ５）も記述されている［Ｌｅｅら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，９：２４３−５４（１９９５）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｌ４０３７２］。ツメガエルＫＳＰホモログ（Ｅｇ５）ならびにショウジョウバエＫ−ＬＰ６１Ｆ／ＫＲＰ１３０が報告されている。ＫＳＰは細胞における適切なＤＮＡ分裂のために必須の有糸分裂キネシンタンパク質である。
【０００８】
有糸分裂の間にＫＳＰは有糸分裂紡錘体の微小管に結合する。ヒト細胞へのＫＳＰに対する抗体の微量注入は、前中期における紡錘体極の分離を妨げ、単極紡錘体を生じさせて、有糸分裂の停止とプログラムされた細胞死の誘導を引き起こす。有糸分裂におけるＫＳＰ機能の現在のモデルは、ＫＳＰ及び他の非ヒト生物における関連キネシンは、逆平行微小管を束ねて、それらを相互に対して滑らせ、それによって２つの紡錘体極を分離させると想定している。ＫＳＰはまた、後期Ｂ紡錘体伸長と紡錘体極への微小管の集中を仲介すると考えられる。有糸分裂紡錘体は多大の研究の対象となってきた。微小管などの有糸分裂紡錘体タンパク質の試験は、癌の化学療法において重要な適用を有する抗有糸分裂化合物を生成した。重要な医学及び農学適用において明らかにされたこれらの抗有糸分裂化合物の有効性は、抗有糸分裂化合物の開発候補物質を特定し、特徴付けることの必要性を示すものである。
【０００９】
ＫＳＰ機能の欠陥が細胞周期停止に関係付けられているので、このキネシンの活性を調節する物質及び／又は化合物は、癌などの過剰増殖性細胞疾患の治療に役立つ。
【００１０】
薬剤は一般に、そのそれぞれの標的との強力な相互作用を通して生物活性を発揮する。近年、タンパク質結晶学とコンピュータ化学における進歩は、薬剤開発の分野に、構造に基づく薬剤設計の新しい方法をもたらした。Ｘ線結晶解析（結晶学）は、結晶内で分子がどのようになっているかを三次元画像として最も良好に描写したものを提供してくれる、確立され、十分に検討された手法である。科学者達は、結晶解析を利用して多くの生物学的に重要な分子についての結晶構造を解き明かした。タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びウイルスを含むがこれらに限定されない多くのクラスの生体分子を結晶解析によって検討することができる。
【００１１】
結晶解析は、構造に基づく薬剤設計に向けてリガンド−タンパク質複合体を検討するために広汎に使用されてきた。そのような複合体を検討するために、通常は既知のリガンドを標的分子結晶内に浸漬し、その後複合体の結晶解析を実施する。時には、適切な結晶を得るためにリガンドを標的分子と共に共結晶化することが必要である。
【００１２】
標的生体分子又はリガンド−タンパク質複合体の「像」が得られると、科学者は、生物活性が起こりうるポケット又は受容体を探索することができる。その後、科学者は実験的に又はコンピュータを利用してタンパク質／受容体についての高親和性リガンド（又は薬剤）を設計することができる。コンピュータ法は、低分子の結合をスクリーニングするために選択的に使用されてきた。このアプローチはまた、新しい抗有糸分裂物質を開発するためにも有用である。
【００１３】
最近、独立した研究によって、有糸分裂の間の微小管形成の決定的メディエイターとしての有糸分裂キネシンの役割が確認された。モータータンパク質、例えばヒトＫＳＰの生物学的機能を遮断することは細胞周期の停止を導くと主張されている。ＡＤＰと複合したＫＳＰの二元構造が公表されているが（Ｔｕｒｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７６：２５４９６−２５５０２（２００１））、調節因子、例えば阻害因子と複合したＫＳＰの三元構造はこれまでのところ公表されていない。その結果として、様々なリガンド、阻害因子であるが、とヒトＫＳＰの構造座標を詳述する本発明までは、ここで詳述する新規結合部位の同一性と特性指摘はこれまで合理的薬剤設計のために使用可能ではなかった。それ自体で、ＫＳＰタンパク質に向けられてきた薬剤発見努力は、このタンパク質及びリガンド、例えばｍｏｎａｓｔｒｏｌとのその複合体についての構造情報の欠如によって妨げられてきた。そのような構造情報は抗有糸分裂物質の発見において貴重な情報を提供する。
【発明の開示】
【００１４】
本発明はここで、新規誘導適合結合部位を含む、リガンドと複合したＫＳＰの結晶を提供し、その三次元構造と決定した。この情報により、今や初めて、抗有糸分裂物質として機能しうるＫＳＰの阻害因子、例えば有糸分裂の間の紡錘体極の分離を阻害し、それによって細胞周期の停止を有効に誘導する化合物を合理的に設計することが可能となる。これまで誰も、ここで特定した結合部位の三次元構造を決定したことを報告していないと信じる。
【００１５】
有益な治療的実施態様は、それ故、ＫＳＰの機能的活性の１つ以上を有する、ここで特定するその新規結合部位を含むＫＳＰの三次元結晶構造に基づく又は三次元結晶構造から誘導される治療及び／又は診断薬を包含する。さらなる治療的実施態様は、ここで提供するＫＳＰ及びその結合部位の三次元結晶構造を用いたＢｉｍＣタンパク質ファミリーの他の成員の分子モデリングに基づく又はそれから誘導される治療及び／又は診断薬を包含する。
【００１６】
本発明によれば、ここで開示する新規結合部位は抗有糸分裂物質のための潜在的標的とみなされる。加えて、本発明は、ここで提供するＫＳＰの結合部位の構造座標を用いて、コンピュータによるリガンド候補物質構造の創造のための方法を提供する。さらに、ここで提供する情報は、既知の化合物を含む三次元構造データベースからリガンド構造を検索することを可能にする。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、ＫＳＰの新規リガンド結合部位の特定、特性指摘（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）及び三次元構造に係る。その新規結合部位へのリガンドの結合は、前記タンパク質の三次元構造における立体配座変化及びＫＳＰの活性の調節を生じさせる。この立体配座変化は、次に、本発明の新規結合部位を含む、ＫＳＰタンパク質内の新規結合ポケットの形成をもたらす。さらに、新規結合ポケットの形成は前記タンパク質への１個以上のヌクレオチド基質の同時結合によって促進されることが発見された。さらに、本発明は、本発明の方法によって特定されるＫＳＰの強力で選択的な阻害因子の合理的設計のための魅力的な標的、特に過剰増殖性及びＫＳＰ依存性疾患を治療する上で有用な新規先導化合物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
「保存的置換」は、類似の極性を有することによって、立体配置を有することによって、又は置換された残基と同じクラスに属することによって（例えば疎水性、酸性又は塩基性）、置換されたアミノ酸残基と機能的に対応するアミノ酸置換であり、及びＫＳＰ又はＫＳＰ複合体阻害因子の特定と設計のため、分子置換分析のため及び／又はホモロジーモデリングのためのＫＳＰの三次元構造の使用に関して、前記構造に重要でない（ｉｎｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）影響を及ぼす置換を包含する。
【００１９】
アミノ酸配列の「類似性」は、整列したアミノ酸配列が対応する位置に同一アミノ酸又は保存的アミノ酸置換を有する度合の測定単位（ｍｅａｓｕｒｅ）である。
【００２０】
ＫＳＰの「フラグメント」は、野生型又は標準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質の完全なアミノ酸配列の一部を含むタンパク質分子を指すものとする。
【００２１】
ここで使用するとき、ＫＳＰタンパク質の「変異体」は、本発明の受容体タンパク質の配列と比較して１個以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。一般に、相違は、標準（天然又は野生型ＫＳＰ）の配列と変異体の配列が全体として密接に類似しており、多くの領域で同一であるように限定される。そのような変異体は一般に生物活性であり、必ず対象ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する。
【００２２】
好ましくは、生物活性変異体ＫＳＰは、標準ＫＳＰと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する。アミノ酸置換は、好ましくは単一アミノ酸残基の置換である。好ましくは、そのようなポリペプチドはまた、天然ＫＳＰポリペプチドの特有の構造特徴と生物活性を備える。
【００２３】
例えば、ＫＳＰの変異体は、リガンド結合に関与する、鍵となる機能性残基を含むと特徴付けられる。これらのポリペプチドフラグメントは、次に、伝統的な薬剤開発と類似した方法によって誘導体化されてきた。本発明の好ましいポリペプチド及びポリヌクレオチドは、中でも特に、それらの相同ポリペプチド及びポリヌクレオチドに類似の生物学的機能／特性を有すると期待される。さらに、本発明の好ましいポリペプチド及びポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＧＰＲ２５活性を有する。
【００２４】
配列類似性又はパーセント類似性は、例えば、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０などの配列分析ソフトウエアを使用して配列情報を比較することによって決定できる。ＧＡＰプログラムは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）によって修正された、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）の整列方法を利用する。
【００２５】
ここで使用するとき、「結合部位」は、その形状及び電荷電位の結果として、様々な共有結合力及び／又は非共有結合力によってもう１つ別の物質（限定を伴わずに、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む核酸、分子、化合物、抗体又は薬剤を含む）と良好に相互作用する又は結合する分子又は分子複合体の領域を指す。
【００２６】
「リガンド結合部位」及び「結合部位」の語は交換可能に使用され、ＫＳＰとリガンドの複合体から生じるヒトＫＳＰの領域を指す。このリガンド結合部位は、その形状及び電荷電位の結果として、好ましくはＫＳＰ機能の阻害因子である、リガンド又は結合パートナーと良好に相互作用する又は結合すると考えられる。この結合部位へのリガンドの結合はＫＳＰタンパク質の全体的なコンフォメーション変化を誘導し、それによって潜在的に前記タンパク質の有糸分裂活性を変調させ、及びそれによって細胞分裂を阻害して、細胞周期の停止を促進する。本発明に従ったリガンド結合部位は、例えば、ＫＳＰと結合するここで開示する化合物のいずれかの実際の部位、ならびに好ましくはここで開示するリガンド結合部位への結合によってＫＳＰの活性を阻害する、化学的又は生物学的な、他の何らかの成分（ｍｏｉｅｔｙ）を含みうる。
【００２７】
ここで使用するとき、結合部位又はアミノ酸の基とリガンドの相互作用を表わすために使用するときの「結合する」及び「結合」の語は、結合部位又はアミノ酸の基がリガンドと共有又は非共有結合を形成できることを意味する。
【００２８】
好ましくは、リガンドと結合部位又はアミノ酸の間の結合は非共有結合である。そのような非共有結合は、水素結合、静電結合、ファンデルワールス結合等を包含する。結合部位へのリガンドの結合はまた、前記リガンドが本発明の新規結合ポケットにおいてＫＳＰと共結晶化する能力によっても特徴付けられる。本発明の新規結合部位とリガンドの相互作用を指すとき、「結合（ｂｉｎｄ又はｂｉｎｄｉｎｇ）」の語の使用は、前記結合部位を含むアミノ酸残基の全部又は一部とリガンドとの共有結合又は非共有結合相互作用を包含することがさらに了解される。
【００２９】
「ＫＳＰ複合体」は、分子／ここで開示する結合部位において共有結合又は非共有結合力によってリガンドと結合関係にあるＫＳＰを含む複合体の共複合体（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）を指す。ＫＳＰ複合体の非制限的例は、ＫＳＰ−（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌ又はここで列挙する化合物のいずれかに結合したＫＳＰを包含する。
【００３０】
本発明は、リガンド結合ＫＳＰ又はＫＳＰ類似体の三次元構造、より明細にはＸ線結晶解析及び様々なコンピュータモデリング手法を用いて決定されるＫＳＰの結合部位の構造に関する。表１〜４（モータードメイン全体に関する）に記載のＡＤＰ及びここで述べるリガンド化合物の１つに結合したＫＳＰの座標は、その新規結合部位を含むＫＳＰの三次元構造の特性指摘、ならびにＫＳＰリガンド結合部位の視覚化、特定及び特性指摘を含むがこれらに限定されない、多くの適用のために有用である。リガンド結合部位構造は、その後、ＫＳＰの阻害因子、ＫＳＰ類似体又はＫＳＰ複合体の設計又は選択された阻害因子の配向と結合親和性を予測するために使用しうる。一般に、ここで言及するＫＳＰ構造は、ＫＳＰのＫＳＰ−リガンド結合立体配座（コンフォメーション）である。一例として、本発明のＫＳＰに特異的な抗体に言及するときは、ここで開示するＫＳＰ−リガンド結合立体配座に親和性を有する抗体を意味する。
【００３１】
特に、本発明は、例えばリガンド、好ましくは阻害因子に結合したときの、リガンド結合ＫＳＰの三次元構造に係る。
【００３２】
ヒトＫＳＰのモータードメインのアミノ酸配列を配列番号１に示す。これらのアミノ酸は、前記天然タンパク質の残基１〜３６８に対応する。本発明のもう１つの側面は、配列番号１に示すアミノ酸配列の実質的に純粋な単離アミノ酸である。本発明のもう１つの側面は、その単離アミノ酸の変異体である。好ましくは配列番号１のアミノ酸の変異体は、本発明の新規結合ポケットを形成する１個以上のアミノ酸置換あるいは１個以上のアミノ酸の欠失を含む。より好ましくは、配列番号１のアミノ酸の変異体は、本発明の新規結合ポケットを形成するアミノ酸の１個のアミノ酸置換を含む。
【００３３】
本発明のもう１つの側面は、本発明の新規結合ポケットを形成するアミノ酸の、１個以上のアミノ酸置換あるいは１個以上のアミノ酸欠失を含む、ＫＳＰの単離変異体である。より好ましくは、ＫＳＰの変異体は、本発明の新規結合ポケットを形成するアミノ酸の１個のアミノ酸の置換を含む。
【００３４】
本発明のＫＳＰは、好ましくは図１０に記載のアミノ酸残基あるいは表１〜４に記載のアミノ酸残基の相対構造座標±約２．０Å以下（又はより好ましくは約１．０Å以下、最も好ましくは約０．５Å以下）の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差によって特徴付けられるリガンド結合部位を含む。前記に列挙するアミノ酸が、ＫＳＰと本発明のリガンドの複合体化時に形成される新規結合ポケットを規定する残基であることは了解される。列挙した残基の間の特異的結合相互作用が、リガンドの大きさ及びリガンドの構造に基づいて起こりうる又は起こりえないことはさらに了解される。また、許容されるファンデルワールス相互作用のコンピュータ上の長さも、アミノ酸残基がリガンドに結合するかどうかを決定するときの因子であることが了解される。それ故、本発明のリガンドの結合は、図１０に列挙する残基の間又はそのサブセットの間で起こりうることが了解される。
【００３５】
驚くべきことに、キネシン阻害因子としてこれまでに開示された化合物及びＫＳＰの最近特定された他の阻害因子が、ここで述べる新規結合部位においてＫＳＰタンパク質に結合することが発見された。特に、これまでにＫＳＰキネシン活性を阻害すると記述された化合物（Ｍａｙｅｒ，Ｔ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９７１（１９９９）参照）、（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌ（化合物５−２ｂ）が本発明の新規結合部位のリガンドであることが認められた。ＫＳＰの阻害因子はまた、係属中の米国特許仮出願第６０／３４４，４５３号（事件２０９９０ＰＶ）、同第６０／３３８，３８３号（事件２０９９５ＰＶ）、同第６０／３３８，３８０号（事件２０９９６ＰＶ）、同第６０／３３８．７７９号（事件２０９９７ＰＶ）、同第６０／３３８，３４４号（事件２０９９８ＰＶ）、同第６０／３３８，３７９号（事件２０９９９ＰＶ）、同第６０／３６２，９２２号（事件２１０４７ＰＶ）、同第６０／３８３，４４９号（事件２１０１８ＰＶ）、同第６０／３８３，４７８号（事件２１０６０ＰＶ）、同第６０／３８８，６２１号（事件２１１１４ＰＶ、２００２年６月１４日出願）及び同第６０／３８８，８２８号（事件２１１１９ＰＶ、２００２年６月１４日出願）にも開示されている。さらに、ＫＳＰキネシン活性の阻害因子は、ＰＣＴ出願の国際公開公報第ＷＯ０１／３０７６８号及び同第ＷＯ０１／９８２７８号に述べられている。
【００３６】
Ｍｇ＋＋−ＡＤＰ及び化合物５−２ｂに結合したＫＳＰの三次元構造を２．５Åの分解能で測定した。化合物５−２ｂは、前記酵素の触媒中心からほぼ１２Åの距離の誘導適合によってＫＳＰに結合し、化合物５−２ｂ（又はここで述べる他のリガンド）の不在下では存在しないこれまで未知の結合ポケットの創造を生じることが認められた。化合物５−２ｂの結合はまた、ヌクレオチド結合ポケットがＡＤＰ二元複合体で見られるものから実質的に変化しないという興味深い例外と共に、ＫＳＰモータータンパク質の他の領域において構造コンフォメーションに有意の変化を導入した。ＫＳＰのＡＤＰ二元及びＡＤＰ／５−２ｂ三元複合体における温度因子分布の解析は、５−２ｂの誘導適合結合ポケットを取り巻くタンパク質領域が５−２ｂの結合時に高度に剛性（ｒｉｇｉｄ）になることを明らかにした。
【００３７】
種入れ法（ｓｅｅｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、ＡＤＰ及び５−２ｂの存在下で調製したＫＳＰについての高品質の単結晶を得た。２．５Å分解能までの回折データセットを収集し、斜方晶系Ｐ２１２１２１空間群で処理した。Ｒｓｙｍは０．０８４であり、データの完全性は９９％であった。細胞寸法は６９．５Å、７９．５Å及び１５９．０Åであった。ＫＳＰ結晶の振動Ｘ線回折像を図１に示す。
【００３８】
分子置換、広汎な手動再構築及び動的高精度化の組合せから誘導した位相を使用して、Ｍｇ＋＋−ＡＤＰ及び５−２ｂに結合したＫＳＰの三次元三元構造を２．５Åの分解能で測定した。２個の同一タンパク質複合体が結晶の非対照単位として認められ、局所非結晶２倍軸によって関係付けられた。各々に関して、前記タンパク質の電子密度ならびにリガンド（ＡＤＰ、Ｍｇ＋＋及び５−２ｂ）の電子密度がすべて良好に定義された。５−２ｂはＳ偏光性（Ｓ  ｈａｎｄｅｄｎｅｓｓ）であることが認められた。残基２〜１７、２７２〜２８６及び３６３〜３６８は無秩序であり、電子密度を示さなかった（Ｎ末端のＭｅｔ１酸基を発現時に処理した）。
【００３９】
ＫＳＰ／ＡＤＰ／化合物５−２ｂ複合体の構造をリボン描写で示す（表２）。ＡＤＰと５−２ｂの結合コンフォメーションもそれらのそれぞれの電子密度と共に示している。５−２ｂの位置は、ヌクレオチド結合部位及び酵素の触媒中心からほぼ１２Å離れた、新規誘導適合部位に認められる。この領域の拡大図を、５−２ｂと共に図３に示す。
【００４０】
図３において、化合物５−２ｂは、α２らせんとα３らせん（の挿入ループ）の間（すべてのキネシンにおいて典型的に見られる「スイッチＩ」の直前）で結合することが認められる。また、Ａｒｇ１１９、Ｔｙｒ２１１及びＴｒｐ１２７の側鎖も示している。Ａｒｇ１１９とＴｙｒ２１１残基は上方及び外側へ移動し、前記阻害因子の結合に適合するための空隙を生じる。同時に、α２らせんの挿入ループは、〜８Åの下方移動を伴ってその主鎖を再配置する；その結果としてそのＴｒｐ１２７の側鎖は〜１０Å内側に振れて、Ａｒｇ１１９及びＴｙｒ２１１の側鎖と共に誘導適合腔の入口にキャップを形成する。新たに形成されたポケットを裏打ちし、前記阻害因子を取り巻くのは、図１０に列挙するアミノ酸残基である。二元複合体と三元複合体におけるこの領域の比較を図４に示す。
【００４１】
化合物５−２ｂの結合ポケットは新規であり、阻害因子が結合するまではこの結合部位が存在しないという意味でこれまで知られていない。それ故、このポケットは化合物５−２ｂなどのリガンドによる「誘導適合」である。前記モータータンパク質のヌクレオチド結合部位から離れて位置するこのアロステリック結合ポケットは、化合物５−２ｂに限定されず、ＫＳＰ活性の阻害因子である多様な化学構造の他の化合物とＫＳＰの複合体の結晶構造決定時にも認められる。これらの結果は、ＫＳＰの比活性部位指定阻害因子の設計に重要な影響を有する。
【００４２】
本発明のさらなる実施態様は、ＫＳＰを本発明の新規リガンド結合部位のリガンドに暴露することによってＫＳＰの構造にコンフォメーション変化を生じさせる方法である。ＡＤＰ−ＫＳＰ二元複合体への化合物５−２ｂの結合（及び他の化合物の結合）時にキネシン構造に認められるコンフォメーション変化は、前記阻害因子のすぐ近くに限定されない。タンパク質成分の再配列は、前記タンパク質のヌクレオチド結合部位ならびにそのβシート構造が基本的に不変のままであることを除いて、５−２ｂ結合時の前記酵素全体に及ぶ。誘導適合ポケットから離れた変化の中で、次の３つが注目すべきである：
１．図５において円で囲んだ及び拡大図における、ＫＳＰのスイッチＩ領域では、主鎖は、Ａｌａ２３０の両端でそのジオメトリを有意に再配向させる。スイッチＩ領域のらせん構造は不変であるが、α３らせんのＣ末端における勾配（ｐｉｔｃｈ）が、三元複合体では二元複合体におけるよりも上昇している。
【００４３】
２．図６において円で囲んだ及び拡大図における、５−２ｂ結合部位の反対側に位置するＫＳＰのスイッチＩＩ領域では、α４らせんのＣ末端が有意に再配置されている。Ａｒｇ３０５付近でこのらせんの先端が、三元複合体では二元複合体におけるその位置から〜６Å移動している。
【００４４】
３．前記タンパク質構築物のＣ末端部分である、ＫＳＰのネックリンカー領域では、Ｌｙｓ３５７から始まるＰｈｅ３６２までの残基が、三元複合体ではＡＤＰ二元複合体におけるその位置からほぼ１８０°振れている。残基３６３〜３６８は前記タンパク質内に存在するが、それらは結晶では乱れており、それ故電子密度を与えない。図７においてＫＳＰのネックリンカー領域を円で囲んでいる。拡大図を描いて、三元複合体におけるこの領域を二元複合体におけるものと比較している。
【００４５】
これらの変化に加えて、前記タンパク質の主鎖及び側鎖の他のより小さな限局性再配置が存在する。最も興味深いことに、ＡＴＰ加水分解が起こる、モータータンパク質のヌクレオチド結合部位は、５−２ｂ結合時に基本的に不変である。ＫＳＰの二元複合体と三元複合体におけるこの部位を比較した拡大図を図８に示す。実験誤差内で、前記タンパク質のこの領域では２つの複合体についての骨格と側鎖の大部分を重ね合わせることができる。
【００４６】
化合物５−２ｂによって誘導される全体的なコンフォメーション変化の影響は、温度因子の分布を比較することによっても検討することができる。
【００４７】
ＫＳＰの阻害因子である他の化合物についても、高品質単結晶を得た。それらの結晶に関して２．５Åで決定した三次元構造は、他の阻害因子化合物も化合物５−２ｂと同じように前記タンパク質に誘導適合することを明らかにした。
【００４８】
その結果、本発明の１つの実施態様は、ここで開示するリガンド結合部位に結合したリガンドと複合したＫＳＰのタンパク質結晶、及びＫＳＰ又はＫＳＰホモログを作製するための方法を提供する。それらの結晶は、前記結合部位を形成し、及び前記結合部位を通して分子、例えばＫＳＰに結合するリガンド又は結合パートナーと相互作用する特定アミノ酸及びそれらの原子の原子モデリング情報を得るための手段を提供する。
【００４９】
前記結晶はまた、タンパク質−リガンド相互作用ならびにそれに結合したリガンドの構造に関するモデリング情報を提供する。本発明に従ったＫＳＰ結晶又はＫＳＰホモログは、ここで開示するＫＳＰの結合部位に結合する物質又は化合物又は分子と共に結晶化することによって入手できる。本発明に従ったＫＳＰ結晶は、ＫＳＰ（ヒトＥｇ５）及びＫＳＰの特定結合部位に結合する物質を包含する。
【００５０】
本発明の好ましい結晶組成物は、Ｘ線を約３．５Åより良好な分解能、より好ましくは約２．６Å以上の分解能、さらに一層好ましくは約２．０Å以上の分解能に回折することができ、物質の三次元構造を決定するために有用である。（オングストロームの数が小さいほど、分解能がより良好である。）
ＫＳＰの結晶複合体及びここで述べるリガンド化合物に関してＸ線回折を得たときの、ＫＳＰモータードメインのアミノ酸残基の相対構造座標を表１〜４に示す。
【００５１】
もう１つの側面では、本発明は、ヒトＫＳＰの三次元構造ならびにその中の結合部位の特定と特性指摘を提供する。この部位の特定は、リガンド結合部位に結合して、ＫＳＰ関連活性を調節する化合物の設計及び特定を可能にする。前記化合物は、細胞増殖を特異的に阻止する阻害因子を包含する。
【００５２】
等しく重要であるのは、ＫＳＰの結合部位の三次元構造の知識は、前記タンパク質の作用機構を検討するための手段及びその機能の阻害因子を特定するためのツールを提供するという事実である。
【００５３】
ここで使用するとき、リガンド結合部位はまた、ここで開示する阻害因子のいずれか又は他の何らかのリガンドなどの、結合リガンドの存在下で観測可能なＮＭＲ変動を示すＫＳＰ又はＫＳＰ類似体残基を包含する。観測可能なＮＭＲ変動を示すそのような残基は必ずしもリガンド結合残基と直接接触又はごく近接していなくてもよいが、それらは合理的薬剤設計プロトコールのためのＫＳＰ残基にとって決定的であると考えられる。
【００５４】
例えば、リガンド結合部位の三次元構造の知識は、それによってＫＳＰとその天然リガンドの相互作用を阻害し、それによって細胞停止を誘導することができる分子を含む、それに結合することができる分子、好ましくは薬剤を設計することを可能にする。
【００５５】
アッセイを実施し、その結果を分析して、その物質が阻害因子であるか（すなわち前記物質がＫＳＰとその天然リガンド／結合パートナーの間の結合親和性を低下させうる又は妨げうる）、あるいはＫＳＰとその天然リガンドの間の相互作用に影響を及ぼさないかを判定しうる。前記方法を使用して特定される物質、好ましくはＫＳＰの阻害因子を、その後、過剰増殖性細胞疾患、及び癌などの、やはり過剰増殖細胞の存在によって特徴付けられる他の疾患の治療及び／又は予防における治療薬として試験しうる。
【００５６】
ひとたびＫＳＰ結合物質／阻害因子が上述したように最適に選択又は設計されれば、その選択性及び結合特性、すなわちここで開示するリガンド結合部位についてのその親和性を改良する又は調節するために、その原子又は側鎖基の一部に置換を施しうる。一般に、初期置換は保存的である、すなわち置換基はもとの基とおおよそ同じ大きさ、形状、疎水性及び電荷を有する。そのような置換化合物を、次に、前記で詳細に述べた同じコンピュータ法によってＫＳＰのリガンド結合部位の適合の効率に関して解析しうる。
【００５７】
様々な分子解析及び合理的薬剤設計手法は、さらに、その内容が参照してここに組み込まれる、米国特許第５，８３４，２２８号、同第５，９３９，５２８号及び同第５，８６５，１１６号ならびに国際公開公報第ＷＯ９９／０９１４８号として公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６８７９号に開示されている。
【００５８】
本発明のもう１つの側面では、ＫＳＰ、ＡＤＰ及びここで述べる化合物を含むＫＳＰ複合体の高品質単結晶を使用して、ＫＳＰに弱く結合する化合物又はＫＳＰに結合する化合物の１個以上の弱結合フラグメントを得ることができる。この方法は、結晶内リガンド交換と称することができる。そこで、例えば、この実施態様の範囲内に限定されることなく、ＫＳＰ−ＡＤＰ−化合物５−２ｂ複合体の高品質単結晶を、ＫＳＰに弱く結合する被験化合物１ｍＭをさらに含む、「実験材料及び方法」の中で述べる結晶化緩衝液に暴露する。前記被験化合物は結晶内に挿入され、結合部位で化合物５−２ｂに置き換わる。ＫＳＰに強く結合する化合物の１個以上の分子フラグメントも、この手法において使用しうる。
【００５９】
結晶内リガンド交換手法によって得た高品質単結晶から、Ｘ線回折データを収集しうる（「実験材料及び方法」の中で述べるように）。そのような弱結合化合物に結合したＫＳＰの三次元三元構造を利用して、前記化合物の構造修飾を導き、その結果として、ＫＳＰへの修飾化合物の結合を最適化することができる。分子フラグメントに結合したＫＳＰの三次元三元構造を利用して、ＫＳＰへの最適結合を有する化合物のための新しい鋳型の特定を導くことができる。
【００６０】
ひとたび物質が設計又は選択されれば、その物質のＫＳＰへの親和性を算定しうる。阻害因子が有効であるためには、リガンド結合部位に高い親和性、すなわち結合前と結合後に算定されるエネルギーの間に低いエネルギー差を有していなければならない。阻害因子の親和性は、ＫＳＰと阻害因子の複合体の解離定数を算定することによって測定しうる。解離定数は、好ましくは１００マイクロモル又はそれ以下である。阻害因子はまた、好ましくは結合後もＫＳＰとの結合を安定に保持する。このためには、阻害因子とＫＳＰの間で電荷−電荷相互作用、双極子−双極子及び電荷−双極子相互作用のような静電反発が起こらないか又は最小限でなければならない。静電相互作用の総計が中性であるか又は結合のエンタルピーの正の作用を与えるべきである。そのような親和性を算定するために設計されたプログラムの例は、次のものを含むが、これらに限定されない：Ｇａｕｓｓｉａｎ  ９２、修正Ｃ［Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．（著作権）１９９２］；ＡＭＢＥＲ、バージョン４．０［Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，（著作権）１９９４］；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（著作権）１９９４］；及びＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｓｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，（著作権）１９９４）。この方法によって選択した先導化合物を使用して、より強力な阻害因子を作製又は設計することができる。この工程を下記に述べる。
【００６１】
同様に、ここで開示する方法に従って選択又は設計される化合物又は抗有糸分裂物質（先導化合物）を変更又は修飾することができる。原子、置換基又は構造の一部を、ＫＳＰへの結合親和性を高めるように変化させうる。一般に、初期置換は保存的である、すなわち置換基はもとの基とおおよそ同じ大きさ、形状、疎水性及び電荷を有する。コンフォメーションを変化させることが当技術分野で知られている成分は避けるべきであることに留意する。その置換化合物を、次に、前記で述べた同じコンピュータ法によってＫＳＰとの適合に関して解析しうる。
【００６２】
上述したコンピュータによって設計した物質を調製し、ＫＳＰに結合させて結晶を生成した後、その複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶解析法を用いて十分に高い分解能（０．２８ｎｍ以上）で決定しうる。そこから得られた情報、例えばこれから得た阻害因子とＫＳＰの相互作用についての情報を使用して、前記阻害因子を修飾し、ＫＳＰのリガンド結合部位に対するその阻害因子の親和性を高めることができる。
【００６３】
そこで、例えば、ここで開示するリガンド結合部位への結合に関与するとみなされる原子を、リガンド結合部位内又は最終的に基礎となる細胞へのＫＳＰの機能を生じさせるＫＳＰのモータードメイン内のアミノ酸残基の１個以上を交換することによって突然変異させることができる。一例として、突然変異したＫＳＰによって細胞の過剰増殖状態に変化が生じなければ、その突然変異はおそらくＫＳＰの機能に影響を及ぼさないと推測しうる。代替的な仮定として、突然変異が疾患細胞の過剰増殖状態を低減する場合、その突然変異は、アミノ酸残基の置換によって、ＫＳＰがその意図される目的において機能する、例えばＡＴＰをＡＤＰへと加水分解する又は微小管に結合する等の能力に影響を及ぼしたと推測しうる。この方法を使用して、ここで開示するＫＳＰの結合部位へのリガンドの結合において重要な、もとのＫＳＰ内のアミノ酸残基を特定することができる。
【００６４】
ひとたびＫＳＰのリガンド結合部位内のアミノ酸残基がＫＳＰに付随する全体的機能に関与すると特定されれば、ＫＳＰの三次元構造に基づいてその結合部位の構造を特定することができる。結合部位の構造に基づいて、結合部位の三次元モデルに適合する、ペプチド又は他の化合物などの化合物をスクリーニングし、設計することができる。
【００６５】
また、ＫＳＰの三次元モデルがＸ線回折図形からの座標を用いて本発明によって提供されるのと同じように、これらを直接解析してその三次元構造を提供することができる（十分に高い分解能であれば）。あるいは、ここで提供するような、結晶化ＫＳＰについての原子座標を構造決定のために使用することができる。本発明の方法によって得られるＸ線回折図形は、コンピュータ読取り可能媒体上で提供することができ、電子密度地図を作成するために使用しうる。
【００６６】
ここで提供する、化合物５−２ｂと複合したＫＳＰのＸ線座標の解析によって得られる電子密度地図を、次に、適切なコンピュータアルゴリズムを用いて適合させて、ＫＳＰの二次、三次及び／又は四次構造及び／又はドメインを生成することができ、それらの構造及び／又はドメインは、その後、ＫＳＰの全体的三次元構造ならびに結合及び／又は活性部位を提供するために使用される。
【００６７】
ここで定義する結合部位を含む、ＫＳＰに関して得られる知識はまた、関連キネシンタンパク質、特にＢｉｍＣタンパク質ファミリーの成員の三元構造をモデリングするために使用できる。
【００６８】
一例として、誘導体化の出発点としてエンドチアペプシン（ｅｎｄｏｔｈｉａｐｅｐｓｉｎ）の三元構造を使用してレニンの構造をモデリングした。セルカリアエラスターゼ及びトフォゾイトシステインプロテアーゼのモデル構築は、各々、３５％未満の配列同一性を有する既知のセリン及びシステインプロテアーゼから実施した。生じたモデルを使用して、低いマイクロモル範囲内で阻害因子を設計した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９３，９０，３５８３）。さらに、ＮＭＲ手法などの、Ｘ線回折手法に頼らず、それ故タンパク質の結晶化を必要としない三元構造決定の代替的方法は、その代替的手法によって収集された付加的なデータを使用した洗練化のために構造のモデルが使用可能であれば、単純化される。それ故、ＫＳＰ結合部位の三元構造の知識は、他のキネシンファミリー成員の構造に重要なウインドウを提供する。そこで、本発明の１つの実施態様は、ＫＳＰタンパク質をモデリングするための、ＫＳＰタンパク質又はそのフラグメント、類似体又は変異体の原子座標の使用を想定する。
【００６９】
当業者は、もう１つ別の種のＫＳＰのリガンド結合部位を特定するために従来の分子モデリング法を使用しうる。明細には、本発明によって提供される座標を使用して、リガンド結合した又はリガンド結合していない、標的ＫＳＰ分子の三次元構造を特性付けることができる。重要な点として、そのような当業者は、そのような構造から、推定上の結合部位をコンピュータで視覚化し、ここで提供する座標に基づいて他の特徴を指摘しうる。そのような推定上のリガンド結合部位を、様々な及び異なるＫＳＰ複合体、例えば他の種からのＫＳＰ複合体の競合的及び非競合的阻害実験から作製したスペクトルの化学的シフト変動を用いて、及び／又はリガンド結合部位の決定的残基又は特徴を特定するためにＫＳＰ又はリガンドの突然変異体を作製し、特性付けることによって、さらに洗練しうる。
【００７０】
そのような推定上のリガンド結合部位の特定は、合理的薬剤設計において極めて重要である。
【００７１】
表１〜４においてここで述べる複合体ＫＳＰから作製した構造座標を利用するためには、関連座標を三次元形状又はグラフ描写として表示する、又はそれらに変換する、又はさもなければそれらを操作することが必要でありうる。一般に、構造座標のそのような三次元画像は、合理的薬剤設計、分子置換分析、ホモロジーモデリング及び突然変異分析に役立つ。これは、典型的には、構造座標のセットから分子又はその部分の三次元グラフ描写を作成することができる様々な市販のソフトウエアプログラムのいずれかを使用して実施される。当学術分野には、それらの全体が参照してここに組み込まれる、慣用ソフトウエアプログラムが十分に存在する。例えば、ＧＲＩＤ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）；Ｆｌｏ９９（Ｔｈｉｓｔｌｅｓｏｆｔ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔｏｗｎｓｈｉｐ，Ｎ．Ｊ．）等参照。
【００７２】
そのようなプログラムを保存する、移す及び使用するためには、ＫＳＰ結合部位の三次元画像を作成する、コンピュータなどの機器も考慮される。前記機器は、機器読取り可能データでコード化されたデータ保存資料を含む機器読取り可能データ保存媒体を含む。データ保存資料を含む機器読取り保存媒体は、従来のコンピュータハードドライブ、フロッピーディスク、ＤＡＴテープ、ＣＤ−ＲＯＭ及び他の磁気、磁気光学、光学、フロプティカル及びコンピュータでの使用に適合しうる他の媒体を包含する。前記機器は、機器読取り可能データを処理するための保存指示用のワーキングメモリー、ならびに機器読取り可能データを所望三次元画像に処理するためのワーキングメモリー及び機器読取り可能データ保存媒体に接続された中心処理装置（ＣＰＵ）をさらに含む。同様に、本発明の機器は、三次元画像がユーザーによって視覚化されうるようにＣＰＵに接続されたディスプレイをさらに含む。従って、前記データを使用するための指示でプログラムされた機器、例えば前記で特定した種類の１つ以上のプログラムを入力したコンピュータと共に使用するとき、ここで提供する機器は、ここで述べる及び表１〜４に記載のＫＳＰ複合体のグラフ三次元画像を表示することができる。
【００７３】
本発明の構造座標は、（ｉ）他の種又はＢｉｍＣファミリーのタンパク質の他の成員の三次元構造などの、関連分子、好ましくは分子複合体の三次元構造を解明すること；ならびに（ｉｉ）ＫＳＰ分子のリガンド結合部位に都合よく結合する又は相互作用することができる化学物質を設計する、選択する及び合成すること、但しその場合前記化学分子は、好ましくは、それに接触した細胞において有糸分裂停止を誘導することを含む、ＫＳＰ機能を阻害すること、のために、様々な分子設計及び分析手法を使用することを可能にする。
【００７４】
それ故、本発明は、例えば関連種から、構造が未知である分子複合体を得ること及び次に、それからＮＭＲデータを生成すること、の工程を含む、構造が未知である分子複合体の分子構造を決定するための方法を提供する。構造が未知である分子複合体からのＮＭＲデータを、その後、本発明のＫＳＰ複合体から得た構造データと比較することができる。次に、２Ｄ、３Ｄ及び４Ｄ同位体のフィルタリング、エディティング及び三重共鳴ＮＭＲ手法を使用して、表１〜４に開示するＫＳＰ複合体についてここで述べる３Ｄ構造を、未知の標的分子複合体からのＮＭＲデータに適合させることができる。あるいは、分子置換を使用して、本発明の３Ｄ構造を、未知の標的分子複合体の結晶からのＸ線回折データに適合させうる。
【００７５】
分子置換は、既知の構造を、未知の構造の結晶単位格子内に正しく配向し、位置づけることを含む。これは、検索したあらゆる配向及び位置についての既知構造を使用して理論的回折データのセットを演算すること及びそれを未知構造の観察された回折データと比較することを含む六次元（３つの位置及び３つの回転）検索工程によって実施される。最良の対合が、未知の単位格子における既知構造の正しい位置と配向を規定する。この対合は、その三次元構造の決定のために、未知構造のＸ線回折データと共に使用するための位相情報を提供する。
【００７６】
もう１つの側面では、本発明は、ＫＳＰ又はそのフラグメント、類似体又は変異体と結合することができる化合物を設計するための、ここで開示するＫＳＰタンパク質の原子座標の使用を考慮する。
【００７７】
例えば、化学物質がここで示すタンパク質又はタンパク質−リガンド複合体のいずれかと結合する能力を評価するための本発明の１つの方法は、ａ）化学物質と分子又は分子複合体の結合ポケット又は他の表面特徴との間の適合操作（ドッキング）を実施するために演算手段を用いること；及びｂ）化学物質と結合ポケットの間の結合を数量化するために前記適合操作の結果を解析すること、の工程を含む。
【００７８】
もう１つの側面では、本発明は、ここで定義する結合部位におけるリガンドのモデルを設計するための、ＫＳＰタンパク質の原子座標の使用を考慮する。
【００７９】
前記使用の好ましい実施態様は、ＫＳＰタンパク質が、図１０に示すアミノ酸残基によって特徴付けられる結合部位を含むものである。
【００８０】
一般的原則として、ここで開示するリガンド結合部位の様々な領域、例えば疎水性及び／又は親水性領域の地図の知識は、全体的なＫＳＰ構造は変化しないが、変化が生物活性（「生物活性」は、ここでは機能を表わすためにその最も広い意味で使用される）に影響及ぼすＫＳＰ類似体（突然変異体）を設計するために使用しうる。それ故、その結合リガンドにより大きな親和性を示すＫＳＰ類似体／突然変異体を有効に入手するためにアミノ酸配列に変更を加えることができる。同様に、生物活性を構造に相関させうる。構造が変化せず、突然変異が生物活性に影響を及ぼさない場合、その突然変異は生物学的機能を持たない。しかし、構造は変化せず、突然変異が生物活性に影響を及ぼす場合は、その残基（又は原子）は少なくとも１つの生物学的機能に必須である。
【００８１】
同様の分子モデリングはまた、ＫＳＰのミメティック及びリガンドの合理的薬剤設計（ＲＤＤ）のために本発明によって提供され、「リガンド」はその最も広い意味で使用され、ここで開示する結合部位でＫＳＰタンパク質に観察可能に結合することができる物質を指す。薬剤設計のパラダイムは、前記タンパク質上の部位と相互作用すると予想される潜在的ミメティック及びリガンドを決定するためにコンピュータモデリングプログラムを使用する。潜在的ミメティック又はリガンドを、次に、活性及び／又は結合に関してスクリーニングする。ＫＳＰ関連ミメティック又はリガンドに関して、スクリーニング方法は、ＫＳＰの少なくとも１つの生物活性、例えば抗有糸分裂活性についてのアッセイから選択することができる。そこで、本発明の１つの実施態様は、ＫＳＰに結合する既知のリガンドよりも密接に結合する、より特異的に結合する、より良好な生物活性を有する又はより良好な安全性プロフィールを有する新しい化学的又は生物学的成分を設計する上での、それから誘導される情報を含む、ここで認められるリガンド／タンパク質複合体からの構造情報の使用を考慮する。
【００８２】
ここで開示するコンピュータモデリング法はまた、親和性又は溶解度を改良するようにミメティック又はリガンドをリモデリングするため及び最適化薬剤を製造するために使用することができる。
【００８３】
その後、生じた最適化ミメティック又はリガンドを調製し、ＫＳＰについての阻害活性をインビトロ及びインビボで試験することができる。試験によって前記物質が実際にＫＳＰを阻害することが確認されれば、その物質又は誘導体は抗有糸分裂薬として使用できる。上述した方法を使用して、阻害活性を有すると特定された化合物を、その後、改良された阻害因子を得るための先導化合物として使用しうる。
【００８４】
コンピュータモデリング法によって予測した親和性を確認するために、複合体の解離定数を実験的に測定しうる。
【００８５】
生じるミメティック又はリガンドは、本発明の方法によって提供され、ヒトを含む動物においてＫＳＰ調節疾患を治療する、阻止する又は予防するために有用である。好ましくは、ここで提供する新規結合部位のリガンドは、過剰増殖性疾患、好ましくは癌の治療又は予防において有用である。好ましくは、ここで述べる方法によって特定されるリガンドは、癌の治療において有用である。
【００８６】
本発明の方法によって特定されるリガンドは、標準製薬慣例に従って、医薬組成物中、単独で又は、好ましくは医薬的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤と組み合わせて、哺乳類、好ましくはヒトに投与しうる。前記リガンドは、経口的又は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸及び局所投与経路を含む非経口的に投与することができる。
【００８７】
ここで使用するとき、「組成物」の語は、特定量の特定成分を含有する生成物、ならびに特定量の特定成分の組合せから直接又は間接的に生じる生成物を包含することが意図されている。
【００８８】
前記有効成分を含有する医薬組成物は、経口使用に適した形態、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒剤、乳剤、硬又は軟カプセル、あるいはシロップ又はエリキシルでありうる。本発明に従ったリガンドをヒト被験者に投与するとき、一日用量は、通常、処方医師によって決定され、一般に個々の患者の年齢、体重、性別及び応答、ならびに患者の症状の重症度によって異なる。
【００８９】
１つの例示的適用では、新規ＫＳＰリガンド結合部位のリガンドの適切な量を、癌のための治療を受けている哺乳類に投与する。投与は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約６０ｍｇ／ｋｇ体重／日まで、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約４０ｍｇ／ｋｇ体重／日までの量で実施する。
【００９０】
従って、本発明の１つの目的は、ホモロジーモデリング手法及び本発明の組成物についての構造座標を使用して、ここで開示するリガンド結合部位を含むタンパク質又は前記タンパク質とそのリガンドの複合体の三次元構造を決定するための方法を提供することである。ホモロジーモデリングは、１個以上の関連タンパク質、タンパク質ドメイン及び／又はサブドメインの構造座標を使用して構造未知のモデルを構築することを含む。ホモロジーモデリングは、その三次元構造を解明すべきタンパク質又はペプチドの共通又は相同部分を、相同な構造エレメントの三次元構造に適合させることによって実施しうる。ホモロジーモデリングは、アミノ酸（又は他の成分）を解明すべき関連構造のものによって置換して三次元構造の一部又は全部を再構築することを含みうる。
【００９１】
本発明の目的の１つは、ＫＳＰがその一員であるＢｉｍＣファミリーの成員と様々なリガンドとの新しい複合体、ならびに前記のいずれかのムテイン又は他の変異体に関する三次元構造情報を提供することである。そのために、本発明は、例えば分子置換によって、典型的にはここで開示する少なくとも１つのリガンド結合部位を有するタンパク質を含む、そのようなリガンド−タンパク質複合体の結晶形態の三次元構造を解明するための、本発明の結晶組成物又はその部分の構造座標の使用を提供する。その実施は、その三次元構造を決定しようとするタンパク質−リガンド複合体の結晶に関するＸ線回折データを得ることを含む。次に、過去の構造座標を参照しながら分子置換手法を使用してＸ線回折データを解析することにより、そのタンパク質又は複合体の三次元構造を決定する。例えば、米国特許第５，３５３，２３６号に述べられているように、分子置換は、未知の結晶試料の構造をモデリングするための出発点として既知構造を有する分子を使用する。
【００９２】
さらに、本発明はまた、ＢｉｍＣタンパク質ファミリーの他の成員の結合部位を特定するための組成物及び方法を包含する。その方法は、対象タンパク質、好ましくはキネシンの表面を検査して、結合部位への結合を促進する残基を特定することを含む。前記残基は、ここで述べるヒトＫＳＰのリガンド結合部位との相同性によって特定できる。ＫＳＰ結合部位又はリガンド結合部位を含むその部分の三次元モデルとの重ね合わせ（overlays and super-positioning）もこのために使用できる。
【００９３】
本発明の代替的方法は、ＢｉｍＣファミリータンパク質に結合することができる化合物を化学構造のデータベースから選択することを提供する。前記方法は、本発明の結晶組成物の構造座標、例えばＢｉｍＣファミリータンパク質又はその部分の三次元構造を規定する座標、例えばここで提供するヒトＫＳＰに関する座標から出発する。その三次元構造に関連する点を、１つ以上の官能基との良好な相互作用の度合に関して特徴づける。次に、これまでの特性指摘に基づいてタンパク質との良好な相互作用が予想される１つ以上の官能基を含む候補化合物に関して化学構造のデータベースを検索する。その後、三次元構造と良好に相互作用する点に最もよく適合する構造を有する化合物を特定する。
【００９４】
本発明の１つの例示的実施態様は、ここで提供するＫＳＰの原子モデルを使用して結合部位に結合する低分子を特定し、設計するための方法を提供する。その方法は、ＫＳＰ結合部位又はその部分を含む原子構造モデルを使用して対象結合部位に空間的に適合する被験化合物をモデリングすること、ＫＳＰへの被験化合物の結合によって特徴付けられる生物学的アッセイにおいてその被験化合物をスクリーニングすること、及びＫＳＰに結合する被験化合物を特定することを含む。
【００９５】
また、表５に記載の相対構造座標又は表１〜４に記載の図１０のアミノ酸の相対構造座標によって規定されるＫＳＰ結合部位の三次元構造を使用して、潜在的阻害因子を設計する又は選択すること、及び前記潜在的阻害因子を得ること又は合成すること、の工程を含む、ＫＳＰの潜在的阻害因子を特定するための方法を提供する。前記阻害因子は、適切なデータベースをスクリーニングすることによって選択しうるか、適切なソフトウエアプログラムと組み合わせて空きＫＳＰ結合部位の立体配置及び荷電電位を分析することによって新たに設計しうるか、又は「雑種」阻害因子を創造する既知の阻害因子の特徴を用いて設計しうる。次にその阻害因子をＫＳＰと接触させて、ＫＳＰ関連機能への前記阻害因子の作用を評価しうる。例えば、この方法によって特定される潜在的阻害因子を、ＡＴＰ及び微小管から選択される１個又は２個のＫＳＰ基質の存在下でＫＳＰと接触させて、その潜在的阻害因子がＫＳＰのＡＴＰアーゼ活性に及ぼす作用を測定しうる。また、ＫＳＰと結合することができる化学物質又はフラグメントを特定することによって潜在的阻害因子を設計又は選択すること；及び特定した化学物質又はフラグメントを単一分子に構築して、前記潜在的阻害因子の構造を提供することは、本発明の範囲内である。
【００９６】
前記をさらに進めて、表１〜４に記載の図１０のアミノ酸の相対原子構造座標±その約２．００Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差を含む原子座標をコンピュータ化モデリングシステムに提供すること；ＫＳＰ結合部位に空間的に適合する化合物をモデリングすること；及びＫＳＰ活性に関するアッセイにおいて、結合部位への結合を通してＫＳＰの活性を阻害する又は低下させる化合物を特定すること、を含む、抗有糸分裂物質を特定するための方法が提供される。
【００９７】
ひとたび物質が特定されれば、それをＫＳＰに接触させ、その後、前記物質がＫＳＰに及ぼす作用を評価しうる。さらに、前記物質をＫＳＰ結合分子の存在下でＫＳＰと接触させ、その後、前記物質がＫＳＰと前記ＫＳＰ結合分子の間の結合に及ぼす作用を評価しうる。
【００９８】
また、
ａ）ヒトＫＳＰを少なくとも２個の潜在的リガンドの混合物に暴露すること；
ｂ）前記混合物の存在下で前記ＫＳＰを結晶化させようとすること；
ｃ）もし結晶が得られれば、前記ＫＳＰ結晶のＸ線回折図形を得ること；及び
ｄ）少なくとも２個の潜在的リガンドの前記混合物に暴露したときの前記ＫＳＰ結晶のＸ線回折図形から算定した電子密度地図を、表１、２、３及び４から選択される表に記載のＸ線回折図形から算定した電子密度地図と比較することによってリガンド／ＫＳＰ複合体が形成されるかどうかを判定すること
の工程を含む、ヒトＫＳＰに結合したとき細胞増殖を阻止する潜在的抗有糸分裂物質を特定するための方法も開示する。
【００９９】
また、ＫＳＰアミノ酸残基１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）、１６０（Ｌ）２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）及び２３９（Ｆ）についての、表１、２、３及び４から成る群より選択される表に記載の相対構造座標±約２．０Å以下の前記アミノ酸の骨格原子からの二乗平均平方根偏差を有するＫＳＰ結合部位の原子構造モデルを使用して、ＫＳＰリガンド結合部位に空間的に適合する被験化合物をモデリングすること；リガンド結合部位へのリガンドの結合によって特徴付けられるアッセイにおいて前記被験化合物をスクリーニングすること；及びその結合部位においてＫＳＰへの前記リガンドの結合を調節する被験化合物を特定すること、を含む、ヒトＫＳＰのリガンド結合部位へのリガンドの結合を調節する化合物を特定する方法もここで提供する。
【０１００】
さらに、
（ｉ）表１、２、３及び４から選択される表に記載の原子座標によって規定されるリガンド結合ＫＳＰの三次元構造を提供すること；
（ｉｉ）表１、２、３又は４に記載の、ＫＳＰに結合したときの前記リガンドの三次元座標を、化合物構造のデータベースにおける化合物の三次元座標と比較すること；及び
（ｉｉｉ）前記ＫＳＰに結合したとき前記リガンドと構造的に類似する少なくとも１つの化合物を前記データベースから選択し、選択した化合物が前記ＫＳＰの潜在的阻害因子であること、
の工程を含む、ヒトキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）の潜在的阻害因子を特定するための方法を提供する。
【０１０１】
また、
ａ）標的ＫＳＰを少なくとも２個の潜在的リガンドの混合物に暴露すること；
ｂ）前記混合物の存在下で前記標的ＫＳＰを結晶化させようとすること；
ｃ）リガンド／ＫＳＰ複合体が形成されるかどうかを判定するために前記混合物に暴露した前記標的ＫＳＰの結晶を得ること；
ｄ）潜在的抗有糸分裂物質を、表５に記載の相対構造座標±約２．０Å以下の二乗平均平方根偏差を有するリガンド結合部位で前記ＫＳＰに結合するものとして特定すること
の工程を含む、標的ヒトＫＳＰに結合したとき細胞増殖を阻止する抗有糸分裂物質を特定するための方法も提供する。
【０１０２】
さらに、
（ａ）少なくとも２個の潜在的リガンドの混合物に暴露しながら結晶化させたＫＳＰの結晶を得ること；
（ｂ）前記結晶においてリガンド／ＫＳＰ複合体が形成されるかどうかを判定すること；及び
（ｃ）潜在的抗有糸分裂物質を、表５に記載の相対構造座標±約２．０Å以下の二乗平均平方根偏差を有するリガンド結合部位で前記ＫＳＰに結合するものとして特定すること
の工程を含む、標的ヒトＫＳＰに結合したとき細胞増殖を阻害する抗有糸分裂物質を特定するための方法を提供する。
【０１０３】
前記で述べる方法において、ＫＳＰの潜在的リガンドは、被験化合物及びＭｇ＋＋及びＡＤＰを包含する。
【０１０４】
また、ＫＳＰの活性を調節する、例えば阻害する方法も提供する。前記方法はインビトロ又はインビボでありうる。前記方法は、インビトロ又はインビボで、ここで開示する結合部位に結合する化合物の十分な量を投与することを含む。
【０１０５】
また、他のＫＳＰ又はキネシンと比較して１つの種類のＫＳＰの活性を、例えば別の種に比べて１つの種のＫＳＰの活性を、又はＫＳＰがその一員であるＢｉｍＣファミリーの他の成員に比べてＫＳＰの活性を選択的に阻害する化合物を特定する方法も提供する。それ故、前記方法は、同じファミリー、例えばＢｉｍＣ内でのＫＳＰ及びＫＳＰ様タンパク質の特定、又は他の種に比べて１つの種におけるＫＳＰの特定を可能にする。前記方法は、ＫＳＰリガンド結合部位の原子構造モデルを使用して対象ＫＳＰリガンド結合部位に空間的及び優先的に適合する被験化合物をモデリングすること、その部位に関してユニークなリガンド結合部位の１個以上の残基と相互作用する化合物を選択すること、及びリガンド結合アッセイにおいて、他のＫＳＰと比較して前記リガンド結合部位に選択的に結合する化合物を特定すること、によって例示される。受容体選択的リガンド結合に関わるユニークな特徴は、異なる受容体又は同じ種類の受容体のアイソフォームの原子モデルを比較することによって特定できる。
【０１０６】
本発明はまた、ＫＳＰ又は類似体の三次元構造の表示（視覚的ディスプレイなど）のためのコンピュータプログラム、及びさらに、ＫＳＰ分子の各々の成分の同一性及び全体構造内でのその成分の正確な位置を原子レベルまで表示するコンピュータプログラムを提供する。
【０１０７】
分子の三次元構造の表現のために現在使用可能な多くのコンピュータプログラムが存在する。一般に、これらのプログラムは、分子の三次元構造に関する座標（すなわち、例えばｘ、ｙ及びｚ軸に沿ったＫＳＰ分子の各々の原子についての数字指定又は表１〜４に記載の結合部位の各々の原子についての数字指定）を入力すること、そのような座標を表示するための手段（例えば視覚的ディスプレイなど）、そのような座標を変化させるための手段、及びそのような変化させた座標を有する分子の画像を表示するための手段を提供する。結晶学的情報、すなわち、ＫＳＰ分子の結晶解析から得た、三次元空間におけるＫＳＰ結合部位分子の原子の位置の座標をそのようなプログラムに入力して、ＫＳＰ三次元構造の表示（例えば視覚的ディスプレイなど）のためのコンピュータプログラムを作製しうる。
【０１０８】
前記をさらに進めて、本発明は、ＫＳＰ又はその部分の座標が、前記座標を機器に接続されたディスプレイ上で構造座標の三次元グラフ画像へと変換することができるプログラムと共にメモリーにプログラムされた、コンピュータなどの機器を提供する。
【０１０９】
同様に、新規ＫＳＰ結合部位の構造と共にＫＳＰの三次元構造を表示するためのコンピュータプログラムが提供される。表１〜４の入力情報に示す図１０のアミノ酸の座標と共に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓより入手可能なＱＵＡＮＴＡ２０００又はＢｉｏｓｙｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．より入手可能なＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ、バージョン４のコンピュータプログラムが好ましい。好ましい表示手段は当業者に周知である。あるいは、本発明のＫＳＰ結晶座標及び回折データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｐｔｏｎ，Ｎ．Ｙ．１１９７２３，ＵＳＡにも寄託されている。ＫＳＰ分子又はその類似体の三次元構造の表示のための異なるコンピュータプログラムを作製するときにこれらのデータを使用しうる。
【０１１０】
本発明の結晶組成物の構造座標は、三次元形状としてのディスプレイのため、あるいは構造座標又はそれらが規定する三次元構造のコンピュータ援用操作又はそれらに基づく演算を含む他の用途のために、機器読取り可能な保存媒体、例えばコンピュータハードドライブ、フロッピーディスク、ＤＡＴテープ等に機器読取り可能形態で保存しうる。例えば、ＫＳＰタンパク質又はそのようなタンパク質の部分又は構造的に類似するホモログの三次元構造を規定するデータを、機器読取り可能保存媒体に保存することができ、及び典型的には前記保存媒体からのデータを読み取ることができ、そのようなデータから画像を作成するための指示でプログラムされたコンピュータを使用して、前記タンパク質構造のグラフ三次元画像として表示しうる。
【０１１１】
本発明は、それ故、本発明の結晶組成物の構造座標、例えば表１〜４に記載の座標を表示するデータを、そのようなデータを操作するための付加的な任意のデータ及び指示と共に含むメモリーを有する、コンピュータなどの機器を包含する。そのようなデータは、他の関連構造の解明及び薬剤発見などの様々な目的のために使用しうる。例えば、そのようなデータを含むメモリーを有する機器は、ここで開示するＫＳＰと好都合に結合する特定化学物質の能力の評価を含む、ＫＳＰ結合又は活性の阻害因子の合理的設計又は選択、ならびに構造的又は配列相同性によってＫＳＰに関連する化合物、タンパク質、複合体等のモデリングを助ける。
【０１１２】
それ故、Ｘ線回折図形からの座標を使用して本発明によって提供されるＫＳＰの三次元モデリングは、分子モデリングのための１つ以上のコンピュータプログラムに入力することができる。そのような分子モデリングプログラムは、その全体的三次元構造に寄与するタンパク質の二次、三次及び／又は四次構造を反映した原子座標を作成し、タンパク質の結合及び／又は活性部位に関する情報を提供する。
【０１１３】
本発明はさらに、標的分子又は分子複合体の未知の三次元構造を決定するための、標準ホモロジーモデリング手法による本発明の構造座標の使用を考慮する。ホモロジーモデリングは、１個以上の関連タンパク質分子／分子複合体又はその部分（すなわちリガンド結合部位）の構造座標を用いて未知構造のモデルを構築することを含む。一般に、ホモロジーモデリングは、その三次元構造が解明すべきタンパク質の共通又は相同部分を、特に表１〜４に提供する関連（すなわち相同）構造座標を使用して、既知分子における相同な構造エレメントの三次元構造に適合させることを含む。ホモロジーは、アミノ酸配列同一性、相同な二次構造エレメント及び／又は相同な三次折りたたみを用いて決定しうる。ホモロジーモデリングは、アミノ酸（又は他の成分）を解明すべき関連構造のもので置換して三次元構造の一部又は全部を再構築することを含みうる。ホモロジーモデリングのためのプログラムの例は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ又はＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．２００２）、ＭＯＤＥＬＬＥＲ（版権（著作権）１９８９−２００２  Ａｎｄｒｅｊ  Ｓａｌｉ；Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ及びＣａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｂａｙ  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）その他を含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
前記に従って、表１〜４の本発明のＫＳＰ分子の三次元構造を利用して、未知分子／分子複合体についての三次元構造を作製し、当技術分野で周知のいくつかの手法を用いて洗練化し、その後本発明の構造座標と同じように、例えば分子置換分析、ホモロジーモデリング及び合理的薬剤設計を含む適用において使用しうる。
【０１１５】
他の側面の中で、表１〜４の座標はタンパク質、ヌクレオチド及びリガンドの間の相対的関係を規定する。そのような座標のセットは、使用する特定座標系に依存する。当業者は、これらの座標の回転移動、平行移動又は他の数学的操作がこれらの座標の特定値を変化させうるが、新しいセットはまだ、ここで開示する結晶構造の多くの成分の間の関係を規定することを認識する。
【０１１６】
ここで開示するＫＳＰのリガンド結合部位の三次元構造の決定は、そのような物質を特定するための唯一の方法が、標的化合物に所望阻害作用を及ぼす物質が特定されるまで数千の被験化合物をスクリーニングすることである、従来の薬剤アッセイ手法に比べて有利である。一般に、そのような従来のスクリーニング法は費用がかかり、多大の時間を要し、及び特定した物質が標的化合物に作用する方法を明らかにしない。対照的に、進んだＸ線分光・コンピュータモデリングテクノロジーは、研究者に、標的化合物の三次元構造（すなわちＫＳＰリガンド結合部位）を視覚化し、そのような三次元構造を利用して推定上の結合部位を特定し、次にこれらの結合部位と相互作用する物質を特定する又は設計することを可能にする。これらの物質を、その後、標的分子への阻害作用に関してスクリーニングすることができる。従って、本発明の１つの実施態様は、ＫＳＰの潜在的阻害因子を特定するための方法を詳述する。提示する方法は、ＫＳＰの三次元構造、及び表１〜４の相対構造座標及び表１〜４に記載の図１０のアミノ酸残基の相対構造座標によって規定される本発明の新規結合部位を使用して、ＫＳＰ活性の潜在的阻害因子を設計又は選択し、その後前記潜在的阻害因子を合成すること又は入手することを含む。前記阻害因子は、適切なデータベースをスクリーニングすることによって選択しうる。あるいは、適切なソフトウエアプログラムと共にリガンド結合ＫＳＰの立体配置及び電荷電位を分析することによって新たに設計しうる、又はＫＳＰの既知の阻害因子の特徴を利用して設計しうる。
【０１１７】
ＫＳＰのリガンド結合部位と相互作用する又は結合する実体／物質は、前記部位と相互作用する又は結合する物質を特定するためのコンピュータフィッティング解析を実施することによって特定しうる。コンピュータフィッティング解析は、（ａ）ホモロジーモデリング又は表１〜４の結合部位の原子構造座標を使用してリガンド結合部位の三次元モデルを作製すること、及び（ｂ）前記結合部位と特定した物質の間の結合の程度を判定することにより、前記結合部位と特定した物質の間の「適合」を評価する様々なコンピュータソフトウエアプログラムを利用する。結合の程度は、いくつかの市販のソフトウエアプログラムによってコンピュータで決定しうるか、又は標準結合アッセイを使用して実験的に決定しうる。
【０１１８】
好ましくは、本発明の方法は、表１〜４に記載の図１０に列挙するアミノ酸残基の相対構造座標±約２．０Å以下、好ましくは約１．０Å以下、最も好ましくは約０．５Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差を含む三次元構造によって特徴付けられるリガンド結合部位の使用を含む。本発明の方法が、上述した二乗平均平方根偏差内の表１〜４の対応する残基の同じ構造座標を生じる、前記アミノ酸の保存的置換を含む付加的な実施態様を包含することは了解される。
【０１１９】
コンピュータフィッティング解析によって特定した物質のヒトＫＳＰ活性への作用を、コンピュータによって、あるいは競合結合実験によって又は特定物質をＫＳＰに接触させて、標的生物活性へのその物質の作用を測定することによって実験的に、さらに評価しうる。標準酵素測定法を実施し、その結果を解析して、その物質がＫＳＰ活性の阻害因子であるかどうか（すなわち細胞周期の停止を誘導する又は微小管とのＫＳＰの結合ならびにキネシンに付随する他の既知の活性を阻害する）を判定しうる。他のＫＳＰタンパク質（他の種）又はＢｉｍＣタンパク質ファミリーの他の成員に関して、特定した物質のＫＳＰに対する選択性を評価するためにさらなる試験を実施しうる。
【０１２０】
好ましくは、ＫＳＰと相互作用するように設計又は選択した物質は、ＫＳＰと結合することができ、ＫＳＰの関連リガンド結合部位を補う三次元立体配置及び配向を担うことができる。
【０１２１】
その結果、これらの判定基準、ここで開示するＫＳＰ分子の構造座標、及び／又は分子置換又はホモロジーモデリングを用いてそれらから誘導される構造座標を使用して、例えば既知の阻害因子の構造を修飾することによって又はここで述べるＫＳＰの新規リガンド結合部位の三次元立体配置（表１〜４に記載の図１０に列挙するアミノ酸残基の相対構造座標及び表５に記載の相対構造座標）のコンピュータ検査を通して新しい物質を新規に設計することによって、既知の阻害因子に比べて高い効力及び／又は選択性を有する物質を設計しうる。
【０１２２】
それ自体で、本発明の１つの実施態様は、本発明の表１〜４の構造座標、あるいは前記で論じたような分子置換又はホモロジーモデリング手法を用いてそれらから誘導される構造座標を使用して、ＫＳＰ活性の潜在的阻害因子として働きうる物質に関してデータベースをスクリーニングすることを提示する。一例として、得られた本発明の構造座標をソフトウエアパッケージに読み取り、その三次元構造をグラフで解析しうる。例えばＳｙｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）等の、多くのコンピュータソフトウエアパッケージが構造座標の解析のために使用しうる。場合により付加的なソフトウエアプログラムを使用して、結合及び原子種別などの特徴に関して座標を検討しうる。必要に応じて、三次元構造を修飾し、その後、すべての構造パラメータがそれらの平衡／最適値になるまで適切なソフトウエアを用いてエネルギーを最小化しうる。次に、エネルギー最小化構造をもとの構造に重ね合わせて、最初の構造とエネルギー最小化構造の間に有意の偏差が存在しないことを確認できる。
【０１２３】
ひとたび、表１〜４に提供する情報のような、ＫＳＰと既知の阻害因子の間で特異的相互作用が確認されれば、種々の阻害因子に関するドッキング試験により、当業者はＫＳＰに結合する新しい阻害因子の初期モデルを作製することが可能となる。これらの新しいモデルの完全性は、ＫＳＰと結合阻害因子の両方に、最も良好な状態に達するまで又はタンパク質と結合物質の間に最も良好な状態が存在することが認められるまで異なる三次元コンフォメーション状態をとらせる、分子動力学的方法を用いた制約的コンフォメーション解析（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙａｓｉｓ）を含む、多くの方法で評価しうる。ひとたび、ＫＳＰに結合した最初の既知の物質のモデル（表１〜４）が得られ、及び同様にＫＳＰに結合した他の分子のコンピュータモデルが得られれば、阻害因子の活性を高めるため及び／又はそれらの選択性を増強するための阻害因子への修飾を設計するための戦略が提示され、決定されうる。
【０１２４】
例えば、ひとたび、上述したようにＫＳＰ結合物質が最適に選択又は設計されれば、ＫＳＰに対するその選択性と結合特性を改良する又は修飾するためにその原子又は側鎖基の一部において置換を実施しうる。一般に、初期置換は保存的である、すなわち置換基はもとの基とおおよそ同じ大きさ、形状、疎水性及び電荷を有する。そのような置換化合物を、次に、前記で詳細に述べた同じコンピュータ法によってＫＳＰへの適合の効率に関して解析しうる。さらなる分子解析及び合理的薬剤設計手法は、その内容全体が参照してここに組み込まれる、米国特許第５，８３４，２２８号及び同第５，９３９，５２８号に開示されている。
【０１２５】
そこで、本発明の例示的な実施態様は、
（ａ）コンピュータ読取り可能形式のＫＳＰタンパク質のＸ線回折測定から誘導される三次元原子座標を提供すること；
（ｂ）工程（ａ）からのデータを適切なソフトウエアプログラムを備えたコンピュータに入力すること；及び
（ｃ）視覚化及びさらなるコンピュータ操作に適したＫＳＰタンパク質の三次元構造画像を作製すること
の工程を含む、ＫＳＰタンパク質の三次元モデリングの方法を考慮する。
【０１２６】
本発明はさらに、三次元構造内、好ましくはリガンド結合部位内又はリガンド結合部位に隣接する反応性アミノ酸を特定するため；水接触可能表面又はすべての原子の空間充填型ファンデルワールス表面を含む表面などの分子表面を作製し、視覚化するため；タンパク質又は複合体の表面特徴、例えばリガンド結合ポケットの大きさ及び形状を算定し、視覚化すること；三次元構造内、好ましくはリガンド結合部位内又はリガンド結合部位に隣接する潜在的水素結合供与体及び受容体を位置づけるため；三次元構造内、好ましくはリガンド結合部位内又はリガンド結合部位に隣接する疎水性及び親水性領域を算定するため；及び選択した対象官能基（例えばアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、メチレン、アルキル、アルケニル、芳香族炭素、芳香環、複素芳香環、置換及び非置換リン酸塩、置換及び非置換ホスホン酸塩、置換及び非置換フルオロ及びジフルオロホスホン酸塩等）に関して良好な相互作用エネルギーのタンパク質表面上の領域又は隣接する領域を算定し、視覚化するための、本発明の結晶組成物又はその部分の構造座標の使用を提供する。タンパク質及び潜在的リガンドの成分とのその相互作用を特性付けて、反応性アミノ酸（例えばシステイン）に特異的共有結合することができる化合物を設計又は選択するため及びタンパク質の表面特徴に相補的な特性（例えば大きさ、形状、電荷、疎水性／親水性、水素結合に関与する能力等）を持つ化合物を設計又は選択するために前記アプローチを使用することができ、そのセットはあらかじめ選択しうる。構造座標を使用して、複合体状態のタンパク質への所与のリガンドの配向、結合定数又は相対的親和性を予測する又は算定することもでき、またその情報を使用して改良された親和性を有する化合物を設計又は選択しうる。
【０１２７】
そのような場合、ＫＳＰタンパク質あるいはその部分又は複合体の構造座標を、所望操作を実施するための指示でプログラムされ、必要な付加的データ、例えば潜在的リガンド又はその成分の構造及び／又は機能特性を規定するデータ、様々なアミノ酸の分子特性を規定するデータ等を含む機器に、機器読取り可能形態で入力する。
【０１２８】
本発明はさらに、最初にその構造が未知である分子又は分子複合体の結晶を得ること、及び次に結晶分子又は分子複合体からＸ線回折データを作製すること及び／又は分子又は分子複合体の溶液からＮＭＲデータを作製すること、の工程を含む、その構造が未知である分子又は分子複合体の三次元構造を決定する方法を対象とする。分子又は分子複合体からの作製した回折又は分光データを、次に、分子置換分析、２Ｄ、３Ｄ及び４Ｄ同位体のフィルタリング、エディティング及び三重共鳴ＮＭＲ手法などの標準手法、及びコンピュータホモロジーモデリングを使用して、ここで開示するＫＳＰの溶液座標又は三次元構造、及びＫＳＰ構造に適合する未知分子又は分子複合体の三次元構造と比較することができる。あるいは、アミノ酸配列同一性、二次構造エレメント又は三次折りたたみのいずれか又は全部に基づき、ＫＳＰと未知分子の間で配列アラインメントを作製し、その後、コンピュータモデリングにより、ＫＳＰの三次元構造及びＫＳＰとの配列アラインメントを使用して前記分子についての三次元構造を作製することによって、未知分子の三次元モデルを作製しうる。
【０１２９】
前記方法の好ましい実施態様は、ＫＳＰタンパク質が、図１０に記載のアミノ酸残基によって特徴付けられる結合部位を含む方法である。
【０１３０】
本発明はまた、ＫＳＰタンパク質又はＫＳＰホモログに結合することができる化合物を設計するためのペプチドミメティック法を提供する。そのような方法の１つは、リガンドと複合したＫＳＰファミリータンパク質又はその部分の三次元構造を規定する座標に基づいて三次元画像をグラフで表示することを含む。次に、置換のための候補成分を特定するためにリガンドの部分と前記タンパク質の間の相互作用を分析する。前記タンパク質と相互作用するリガンドの１個以上の部分を、１個以上の候補置換成分の知識ベースから選択した置換成分で置換しうるか、及び／又は成分をリガンドに付加して前記タンパク質とさらに相互作用させうる。
【０１３１】
本発明のもう１つの側面では、本発明の結晶組成物又はその部分の構造座標を使用して、リガンド結合部位に結合する化合物の１つ以上の活性基（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）を特定しうる。そのような活性基は、原子、化学基、疑似原子又はベクトルのセットとして、及びこれらの活性基特徴の各々の空間での相対位置として記述される。単独で又はその相対位置と組み合わせた各々の特徴が活性基パラメータを形成する。それ故、活性基は、活性基特徴及び活性基を含む他のすべての記述子に対する各々の記述子の相対位置を包含する。
【０１３２】
活性基モデルを直接又は間接的に構築することができる。直接法では、活性基特徴の空間中心は、Ｘ線構造座標又は受容体−リガンド複合体のＮＭＲ構造を検討すること、続いて、通常はコンピュータとコンピュータ読取り可能媒体を用いて実施される、受容体結合部位の形状−相補性機能解析から推論される。間接法では、受容体の構造は未知であり、活性基特徴の空間中心は、活性化合物の三次元コンフォメーションを重ね合わせ、共通の重複する官能基を見出すことによって推論される。
【０１３３】
直接法と間接法の両方を結合することによって得られる、本発明の活性基モデルを、単なる例示として及び限定を意図せずに、図１４Ａ及びＢを参照してここで述べる。
【０１３４】
最初のモデル活性基（図１４Ａ）は、図に示す平面配向：アリール、ヘテロアリール又はシクロアルキル環（又は、一般に疎水基）の中心を指示する球、及びそれぞれ水素結合受容体と水素結合供与体のヘテロ中心を表わす２つの小さな箱（ＨＡ及びＨＤと表示）、を有する３つの活性基特徴によって表わされる。第二のモデル活性基（図１４Ｂ）は、３つの活性基特徴：２個のアリール、ヘテロアリール又はシクロアルキル環（又は、一般に疎水基）の中心を指示する２つの球、及び水素結合受容体（ＨＡ）のヘテロ原子中心を表わす小さな箱、によって表わされる。
【０１３５】
ここで使用するとき、「アリール」は、少なくとも１つの環が芳香環であり、各々の環に７原子までを有する安定な単環式又は二環式炭素環を意味することが意図されている。そのようなアリールエレメントの例は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル及びビフェニルを含む。アリール置換基が二環式であり、１個の環が非芳香環である場合、結合が芳香環を通してであることは了解される。
【０１３６】
ここで使用するとき、「ヘテロアリール」の語は、少なくとも１つの環が芳香環であり、Ｏ、Ｎ及びＳから成る群より選択される１から４個のヘテロ原子を含む、各々の環に７原子までを有する安定な単環式又は二環式炭素環を表わす。この定義の範囲内のヘテロアリール基は、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンを含むが、これらに限定されない。本発明の１つの実施態様では、ヘテロアリールはキナゾリノンを含まない。
【０１３７】
ここで使用するとき、「シクロアルキル」は、規定された数の炭素原子を有する単環式飽和脂肪族炭化水素基を包含することが意図されている。例えば、「シクロアルキル」は、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、２，２−ジメチルシクロブチル、２−エチルシクロペンチル、シクロヘキシル等を含む。本発明の１つの実施態様では、「シクロアルキル」の語は、前記で述べた基を含み、さらに単環式不飽和脂肪族炭化水素基を包含する。例えば、この実施態様で定義される「シクロアルキル」は、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、２，２−ジメチルシクロブチル、２−エチルシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、シクロブテニル等を含む。
【０１３８】
シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロアリール置換基は、特に異なる規定がない限り、置換されていてもよく又は置換されていなくてもよい。例えば、アリールは、ＯＨ、アルキル、ハロゲン、アルコキシ又はジアルキルアミノから選択される１個、２個又は３個の置換基で置換されうる。
【０１３９】
ここで本発明のモデル活性基と称する活性構造モチーフを使用して、あらかじめ規定された構造モチーフの存在に関して分子のライブラリーをスクリーニングすることができ、特に前記活性基によって課せられる制約に適合する分子を特定することができる。活性基特徴の空間中心は包括的に特異的生物活性に結びつく。評価される分子は、コンピュータ法によって新たに設計しうるか、あるいは骨格又は完全な化学物質（例えば化合物のライブラリーから選択される）でありうる。ここで開示するモデル活性基を使用して、当業者は、図１４Ａ及びＢに記載のこれら２つの活性基モデルのいずれかとのその適合性に基づいて化合物の阻害効力を予測しうる。
【０１４０】
１つの実施態様では、ここで述べる活性基モデルの使用によって特定される化合物は、約０．１ｎＭから約１００ｎＭのＫＳＰに対する結合親和性を有する。さらなる実施態様では、結合親和性の範囲は約１ｎＭから約２０ｎＭである。
【０１４１】
１つの実施態様では、図１４Ａの活性基モデルとのその適合性によって特定される化合物は、２−チオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン成分、ジヒドロピリミジン成分又は５，６，１１，１１ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［１’、５’：１，６］−ピリド［３．４−ｂ］インドール−１，３（２Ｈ）−ジオン成分を含まない。
【０１４２】
さらなる活性基モデルを図１６に例示する。図１６の活性基モデルは、４つの活性基特徴：アリール、ヘテロアリール又はシクロアルキル環（又は、一般に疎水基）の中心を指示する３つの球、及び水素結合受容体（ＨＡ）のヘテロ原子中心を表わす小さな箱、によって表わされる。図１６を参照して、活性基特徴の間のÅで表わした距離を下記の表に列記する：
【０１４３】
【表２】
2005537257.tif 000002
【０１４４】
１つの実施態様では、図１６の活性基モデルとの適合性によって特定される化合物は、キナゾリノン、フェノチアジン、チエノピリミジノン、フラノピリミジノン、アゾロピリミジノン、チアゾロピリミジン、シクロアルキルピリミジノン又はトリフェニルメタン成分を含まない。さらなる実施態様では、図１６の活性基モデルとの適合性によって特定される化合物は、キナゾリノン、フェノチアジン又はトリフェニルメタン成分を含まない。
【０１４５】
１つの実施態様では、図１４Ｂの活性基モデルとの適合性によって特定される化合物は、キナゾリノン、フェノチアジン、チエノピリミジノン、フラノピリミジノン、アゾロピリミジノン、チアゾロピリミジン、シクロアルキルピリミジノン又はトリフェニルメタン成分を含まない。さらなる実施態様では、図１４Ｂの活性基モデルとの適合性によって特定される化合物は、キナゾリノン、フェノチアジン又はトリフェニルメタン成分を含まない。
【０１４６】
特定化合物構造の活性基モデルへの適合性の度合は、コンピュータ法を使用して、前記化合物が活性基モデルの化学的特徴を有しているかどうか及びそれらの特徴が前記モデルに適合するために必要な三次元配置をとりうるかどうかを決定することによって算定される。モデリングプログラムは、特定化合物と適合性を有する活性基モデルにおけるそれらの特徴又は試験する化合物の化学的特徴を指示する。化合物と活性基又は結合部位に言及するとき「適合性」の語は、活性基又は結合部位の空間領域だけを占める化合物及びその化学的特徴又は分子の部分が活性基又は結合部位の空間領域を占める化合物の両方を包含する。
【０１４７】
リガンド結合部位容積への化合物のフィッティングは、当業者に周知のコンピュータ法を用いた様々な方法で実施できる。視覚検査及び誘導適合活性部位容積への化合物の手動ドッキングは、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４，１９８４）ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７−２１７，１９８３）又は当業者に既知の他のモデリングプログラムなどの分子モデリングソフトウエアを使用して実施できる。このモデリング工程に続いて、ＣＨＡＲＭＭ及びＡＭＢＥＲ、その他のような標準力場を用いてエネルギーを最小化しうる。より特殊なモデリングプログラムは、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ  ＆  Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９−３４，１９９１）、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９−８５７，１９８５）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ  ＆  Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５−２０２，１９９０）及びＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９−２８８，１９８２）を含む。さらに、阻害因子化合物は、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ  ＆  Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１−７８，１９９２）、ＡｕｔｏＬｕｄｉ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）その他のようなコンピュータプログラムを使用して、空き活性部位又は既知の阻害因子の何らかの部分を含む活性部位において新たに構築しうる。
【０１４８】
本発明のもう１つの側面は、表１〜４に従った三次元構造；又は医薬的に有効なその部分、特にリガンド結合領域に実質的に相補的な構造を有する相補的タンパク質に関する。相補的タンパク質とは、その相補的構造が表１〜４の構造又はその部分に結合して複合体を形成しうるように、その三次元構造が表１〜４の構造又はその部分に実質的に相補的なタンパク質である。阻害性相補的タンパク質の場合には前記複合体の寿命が長くなりうる。言うまでもなく、結合にはアミノ酸配列の適切な選択も必要である。そのような相補的タンパク質はＫＳＰの阻害因子として作用しうる。そのような阻害因子は、ＫＳＰの活性を改変するためにインビボ又はインビトロで使用しうる。
【０１４９】
製薬工業においては、新規又は既知の化合物が、様々な既知のインビトロ又はインビボスクリーニングを用いて新しい用途のために常套的にスクリーニングされる。しばしばそのようなスクリーニングは複雑な天然分子を含み、それに相応して実施に費用がかかり、またその結果は解釈が困難なことがある。本発明に従った三次元タンパク質構造の知識は、その領域の三次元構造及びスクリーニングされる分子の構造類似性に基づいて予備的スクリーニングを実施することを可能にする。これは通常、その領域のアミノ酸配列の知識と組み合わせて実施される。そのようなスクリーニングは、前記タンパク質又はその部分（又は相補的タンパク質又はその部分）の三次元構造とスクリーニングする分子の構造を適合させ、それによって潜在的阻害因子活性を予測することができるコンピュータモデリング手法を用いて好都合に実施できる。
【０１５０】
本発明の新規結合部位へのリガンドの結合及びその結果としての新規結合ポケットの形成はまた、アミノ酸１２７のトリプトファン残基の蛍光の変化を分光器で測定することによって間接的に評価することもできる。そこで、ＫＳＰを１個以上のヌクレオチドの存在下に上述した阻害因子の１つで処理したとき、Ｔｒｐ１２７の蛍光発光が変化することが発見された。
【０１５１】
本発明のさらなる実施態様は、ここで述べる新規ＫＳＰ結合部位への被験化合物の結合を測定するためのインビトロアッセイである。前記アッセイは、
１．ＫＳＰを被験化合物及びヌクレオチドと接触させ、ＫＳＰ中のＴｒｐ１２７に関するピーク発光波長で前記混合物の蛍光を測定すること；
２．ＫＳＰをヌクレオチドと接触させ、ＫＳＰ中のＴｒｐ１２７に関するピーク発光波長で前記混合物の蛍光を測定すること；及び
３．ＫＳＰ、被験化合物及びヌクレオチドの混合物の蛍光を、ＫＳＰとヌクレオチドだけの混合物の蛍光と比較すること
の工程を含む。
【０１５２】
インビトロ蛍光アッセイのもう１つの実施態様では、前記ヌクレオチドはＡＤＰ及びＡＭＰＰＮＰ（ＡＴＰの非加水分解性類似体、アデノシン５’−（β，γ−イミド）三リン酸四リチウム塩水和物）から選択される。
【０１５３】
インビトロ蛍光アッセイの１つの実施態様では、前記混合物はマグネシウムイオンのソースをさらに含む。好ましくは、前記マグネシウムイオンソースはＭｇＣｌ２である。
【０１５４】
インビトロ蛍光アッセイのもう１つの実施態様では、ＫＳＰ、被験化合物及びヌクレオチドの混合物の蛍光の測定を、被験化合物のいくつかの異なる濃度で実施する。
【０１５５】
ＫＳＰキネシンの三次元構造は本発明の新規結合ポケットの形成に独自に適するので、上述した蛍光アッセイのような、ここで述べる新規結合ポケットに結合する化合物の特定方法は、他の有糸分裂キネシンを阻害しないＫＳＰの選択的阻害因子を特定するために使用しうる。そのような選択的ＫＳＰ阻害因子の特定は、ＫＳＰのヌクレオチド基質の結合と競合する阻害因子又は微小管結合の部位に結合する阻害因子に比べて特別な利点を提供しうる。
【０１５６】
本発明のさらなる側面は、ＫＳＰタンパク質又は相補的タンパク質の検出又はその医薬活性の調節のための、ＫＳＰタンパク質又は相補的タンパク質に対する抗体（モノクローナル抗体を含む）に関し、前記抗体がＫＳＰリガンド、例えば阻害因子結合コンフォメーションに特異的であることは了解される。
【０１５７】
前記手段のいずれかによって選択又は設計される構造の化合物は、ＫＳＰタンパク質の結合する能力、その天然又は非天然リガンドへのＫＳＰタンパク質の結合を阻害する能力、及び／又はＫＳＰタンパク質又はＢｉｍＣファミリー成員によって仲介される生物学的機能を阻害する能力に関して試験しうる。
【０１５８】
最後に、本発明は、ここで開示する方法を用いて設計又は選択される作用物質又は阻害因子を提供する。そのような化合物は、下記の項で述べるように利用しうる。
【０１５９】
（有用性）
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物は様々な適用において使用しうる。当業者に認識されるように、有糸分裂は様々な方法で変化させうる；すなわち、有糸分裂経路における成分の活性を上昇させる又は低下させることによって有糸分裂に影響を及ぼすことができる。言い換えると、有糸分裂は、ある種の成分を阻害する又は活性化することによって平衡を乱すことにより、影響されうる（例えば分断されうる）。減数分裂を変化させるためにも同様のアプローチを使用しうる。
【０１６０】
好ましい実施態様では、本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物を使用して有糸分裂紡錘体形成を調節し、それによって有糸分裂における長期的な細胞周期の停止を生じさせる。ここで「調節する」とは、紡錘体形成を上昇させること及び低下させることを含む、有糸分裂紡錘体形成を変化させることを意味する。ここで「有糸分裂紡錘体形成」とは、有糸分裂キネシンによって微小管が二極性構造に組織されることを意味する。ここで「有糸分裂紡錘体機能不全」とは、有糸分裂の停止及び単極性紡錘体形成を意味する。
【０１６１】
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物は、有糸分裂キネシンに結合する及び／又は有糸分裂キネシンの活性を調節するために有用である。好ましい実施態様では、有糸分裂キネシンは、有糸分裂キネシンのｂｉｍＣサブファミリーの成員である（米国特許第６，２８４，４８０号、コラム５に述べられているように）。さらなる好ましい実施態様では、有糸分裂キネシンはヒトＫＳＰであるが、他の生物からの有糸分裂キネシンの活性も本発明の化合物によって調節されうる。これに関して、調節するとは、紡錘体極の分離を高める又は低下させること、紡錘体極の奇形、すなわち扇形化を生じさせること、又はさもなければ紡錘体の形態変化を引き起こすことのいずれかを意味する。また、ＫＳＰの変異体及び／又はフラグメントも、これらの目的のためのＫＳＰの定義に包含される。その全体が参照してここに組み込まれる、１９９９年１０月２７日出願のＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０１／３１３３５号：「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｅｓ」参照。さらに、他の有糸分裂キネシンが本発明の化合物によって阻害されうる。
【０１６２】
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物は、細胞増殖疾患を治療するために使用される。ここで提供する方法及び組成物によって治療することができる疾患状態は、癌（下記でさらに論じる）、自己免疫疾患、関節炎、移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、手術、血管形成術等を含むがこれらに限定されない医学的処置後に誘発される増殖を含むが、これらに限定されない。一部の場合には、細胞は過剰増殖状態又は増殖低下状態（異常な状態）ではないが、それでも尚治療を必要とする場合があることは認識される。例えば、創傷治癒の間、細胞は「正常に」増殖しうるが、増殖の増強が望ましいと考えられる。同様に、前記で論じたように、農業分野では、細胞は「正常」状態でありうるが、直接作物の生育を増強することによって又は作物に有害な影響を及ぼす植物又は生物の生育を阻害することによって作物を増加させるために、増殖調節が望ましい場合がある。そこで、１つの実施態様では、本発明はここで、これらの疾患又は状態のいずれかに罹患した又は罹患しそうな細胞又は個体への適用を包含する。
【０１６３】
ここで提供する化合物、組成物及び方法は、皮膚癌、乳癌、脳の癌、子宮頸癌、精巣癌等のような固形腫瘍を含む癌の治療のために特に有用と考えられる。より特定すると、本発明の化合物、組成物及び方法によって治療しうる癌は、心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫及び奇形腫；肺：気管支原生癌（扁平上皮癌、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（腺管癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、類癌腫、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、類癌腫、カポージ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱及び尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、胚芽細胞腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ）（骨軟骨性外骨腫症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、脳室上衣細胞腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性神経膠芽細胞腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科系：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸（子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、偽粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌］、顆粒膜細胞腫、セルトーリ−ライディヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、ファローピウス管（癌）；血液系：血液（骨髄性白血病［急性及び慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポージ肉腫、形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；及び副腎：神経芽細胞腫を含むが、これらに限定されない。それ故、ここで提示する「癌細胞」の語は、前記で特定した状態のいずれかに罹患した細胞を包含する。
【０１６４】
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物はまた、米国特許第６，２８４，４８０号に述べられているように、ｂｉｍＣキネシンサブグループの真菌成員の活性を調節することにより、抗真菌薬としても有用でありうる。
【０１６５】
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物は、標準製薬慣例に従って、医薬組成物中、単独で又は、好ましくは医薬的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤と組み合わせて、哺乳類、好ましくはヒトに投与しうる。前記化合物は、経口的又は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸及び局所投与経路を含む非経口的に投与することができる。
【０１６６】
ここで使用するとき、「組成物」の語は、特定量の特定成分を含有する生成物、ならびに特定量の特定成分の組合せから直接又は間接的に生じる生成物を包含することが意図されている。
【０１６７】
前記有効成分を含有する医薬組成物は、経口使用に適した形態、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒剤、乳剤、硬又は軟カプセル、あるいはシロップ又はエリキシルでありうる。経口使用のための組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野で既知の方法に従って製造することができ、そのような組成物は、製薬上上品で美味な製剤を提供するために甘味料、着香料、着色剤及び防腐剤から成る群より選択される１つ以上の物質を含みうる。錠剤は、錠剤の製造に適する非毒性の医薬的に許容され得る賦形剤と混合した有効成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；造粒剤及び崩壊剤、例えば微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、トウモロコシデンプン又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン又はアカシア、及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又は滑石でありうる。錠剤は被覆されていなくてもよく、あるいは薬剤の不快な味を隠すため又は胃腸管における崩壊と吸収を遅延させ、それによってより長期間にわたる持続的作用を提供するために既知の手法によって被覆されていてもよい。例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロースなどの味を隠す水溶性物質、あるいはエチルセルロース、酢酸酪酸セルロースなどの放出遅延化物質を使用しうる。
【０１６８】
経口使用のための製剤はまた、有効成分が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル、又は有効成分がポリエチレングリコール又は油性媒質、例えば落花生油、流動パラフィン又はオリーブ油などの水溶性担体と混合されている軟ゼラチンカプセルとして提供されうる。
【０１６９】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適する賦形剤と混合した有効成分を含有する。そのような賦形剤は、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムであり、分散剤又は湿潤剤は、天然に生じるホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪アルコールの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなどの、エチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルの縮合物、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分エステルの縮合物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンでありうる。水性懸濁液はまた、１つ以上の防腐剤、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ以上の着色剤、１つ以上の着香剤、及びスクロース、サッカリン又はアスパルテームなどの１つ以上の甘味料を含みうる。
【０１７０】
油性懸濁液は、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油又はヤシ油中に、又は流動パラフィンなどの鉱物油中に有効成分を懸濁することによって製剤しうる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコールを含みうる。美味な経口製剤を提供するために上述したような甘味料及び着香料を添加してもよい。これらの組成物は、ブチルヒドロキシアニソール又はα−トコフェロールなどの抗酸化剤の添加によって保存しうる。
【０１７１】
水を加えて水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１つ以上の防腐剤と混合した有効成分を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は既に前記で挙げたものに例示される。付加的な賦形剤、例えば甘味料、着香料及び着色剤も含有しうる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存しうる。
【０１７２】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型乳剤の形態をとりうる。油相は、植物油、例えばオリーブ油又は落花生油、又は鉱物油、例えば流動パラフィン、又はこれらの混合物でありうる。適切な乳化剤は、天然に生じるホスファチド、例えばダイズレシチン、及び脂肪酸と無水ヘキシトールから誘導されるエステル又は部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、及びエチレンオキシドと前記部分エステルの縮合物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンでありうる。乳剤はまた、甘味料、着香料、防腐剤及び抗酸化剤も含みうる。
【０１７３】
シロップ及びエリキシルは、甘味料、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又はスクロースと共に製剤しうる。そのような製剤はまた、粘滑剤、防腐剤、着香料及び着色剤及び抗酸化剤も含みうる。
【０１７４】
前記医薬組成物は、無菌注射用水溶液の形態をとりうる。使用しうる許容されるビヒクル及び溶媒の中には、水、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液がある。
【０１７５】
無菌注射用製剤はまた、有効成分が油相に溶解している無菌注射用水中油型マイクロエマルジョンでもよい。例えば、有効成分を最初にダイズ油とレシチンの混合物に溶解しうる。次にその油溶液を水とグリセロールの混合物に導入し、処理して、マイクロエマルジョンを形成しうる。
【０１７６】
注射用溶液又はマイクロエマルジョンは、局所ボーラス注射によって患者の血流中に導入しうる。あるいは、本発明の化合物の一定の循環濃度を維持するように前記溶液又はマイクロエマルジョンを投与することは好都合であると考えられる。そのような一定濃度を維持するために、持続的静脈内送達装置を使用しうる。そのような装置の一例は、Ｄｅｌｔｅｃ  ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（登録商標）５４００型静脈内ポンプである。
【０１７７】
前記医薬組成物は、筋肉内及び皮下投与用の無菌注射用水性又は油性懸濁液の形態をとりうる。この懸濁液は、上述した適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して既知の技術に従って製剤しうる。無菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液でありうる。加えて、無菌不揮発性油が溶媒又は懸濁媒質として好都合に使用される。このために、合成モノ又はジグリセリドを含むあらゆる非刺激性不揮発性油が使用できる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の製造において使用できる。
【０１７８】
ここで開示する方法を用いて設計又は選択される化合物はまた、薬剤の直腸投与のための坐剤の形態で投与しうる。これらの組成物は、通常温度では固体であるが直腸温度では液体であり、それ故直腸で溶けて薬剤を放出する、適切な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することによって製造できる。そのような物質は、ココアバター、グリセリンゼラチン、硬化植物油、様々な分子量のポリエチレングリコールの混合物及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルを包含する。
【０１７９】
局所使用については、前記化合物を含有するクリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁液等が使用される。（本出願のために、局所適用は含そう薬及び咽頭洗浄剤を包含するものとする。）
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物は、適切な鼻内ビヒクルと送達装置の局所使用によって鼻内形態で、又は当業者に周知の経皮パッチの形態を用いて経皮経路で投与することができる。経皮送達システムの形態で投与するためには、薬剤投与は、言うまでもなく、投与レジメン全体を通じて間欠的ではなく持続的である。本発明の化合物はまた、ココアバター、グリセリンゼラチン、硬化植物油、様々な分子量のポリエチレングリコールの混合物及びポリエチレングリコールの脂肪酸エステルなどの基剤を用いた坐剤として送達しうる。
【０１８０】
本発明に従った化合物をヒト被験者に投与するとき、１日用量は通常、一般に個々の患者の年齢、体重、性別及び応答、ならびに患者の症状の重症度に応じて異なる用量で処方する医師によって決定される。
【０１８１】
１つの例示的な適用では、癌のための治療を受けている哺乳類に適切な量の化合物を投与する。投与は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約６０ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇ体重／日から約４０ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で実施する。
【０１８２】
ここで開示する方法を用いて設計又は選択される化合物（以下「本発明の化合物」と称する）はまた、既知の治療薬及び抗癌剤との組み合わせにおいても有用である。例えば、本発明の化合物は、既知の抗癌剤との組み合わせにおいて有用である。ここで開示する化合物と他の抗癌剤又は化学療法剤の組合せは本発明の範囲内である。そのような薬剤の例は、Ｖ．Ｔ．ＤｅｖｉｔａとＳ．Ｈｅｌｌｍａｎ（編集）によるＣａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第６版（２００１年２月１５日）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに見出される。当業者は、薬剤の個々の特性と関与する癌に基づいてどの薬剤の組合せが有用であるかを識別できる。そのような抗癌剤は下記のものを含むが、これらに限定されない：エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質、抗増殖性物質、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子及び他の血管新生阻害因子、細胞の増殖及び生存シグナル伝達の阻害因子、及び細胞周期チェックポイントに干渉する物質。本発明の化合物は、放射線治療と併用するとき特に有用である。
【０１８３】
１つの実施態様では、本発明の化合物はまた、次のものを含む既知の抗癌剤との組合せにおいても有用である：エストロゲン受容体モジュレーター、アンドロゲン受容体モジュレーター、レチノイド受容体モジュレーター、細胞傷害性物質、抗増殖性物質、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子、ＨＩＶプロテアーゼ阻害因子、逆転写酵素阻害因子及び他の血管新生阻害因子。
【０１８４】
「エストロゲン受容体モジュレーター」は、機構に関わりなく、エストロゲンの受容体への結合に干渉する又は結合を阻害する化合物を指す。エストロゲン受容体モジュレーターの例は、タモキシフェン、ラロキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラント、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル）−フェニル−２，２−ジメチルプロパノエート、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン及びＳＨ６４６を含むが、これらに限定されない。
【０１８５】
「アンドロゲン受容体モジュレーター」は、機構に関わりなく、アンドロゲンの受容体への結合に干渉する又は結合を阻害する化合物を指す。アンドロゲン受容体モジュレーターの例は、フィナステリド及び他の５α−レダクターゼ阻害因子、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、リアロゾール及び酢酸アビラテロンを含む。
【０１８６】
「レチノイド受容体モジュレーター」は、機構に関わりなく、レチノイドの受容体への結合に干渉する又は結合を阻害する化合物を指す。そのようなレチノイド受容体モジュレーターの例は、ベキサロテン、トレチノイン、１３−シスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、α−ジフルオロメチルオルニチン、ＩＬＸ２３−７５５３、トランス−Ｎ−（４’−ヒドロキシフェニル）レチンアミドを含む。
【０１８７】
「細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質」は、アルキル化剤、腫瘍壊死因子、インターカレーター、低酸素活性化化合物、微小管阻害因子／微小管安定化物質、有糸分裂キネシンの阻害因子、有糸分裂の進行に関与するキナーゼの阻害因子、代謝拮抗物質；生物学的応答修飾因子；ホルモン／抗ホルモン治療薬、造血成長因子、モノクローナル抗体標的治療薬、トポイソメラーゼ阻害因子、プロテオソーム阻害因子及びユビキチンリガーゼ阻害因子を含む、主として細胞の機能に直接干渉することによって細胞死を引き起こす又は細胞増殖を阻害する、あるいは細胞の減数分裂を阻害する又は減数分裂に干渉する化合物を指す。
【０１８８】
細胞傷害性物質の例は、セルテネフ、カシェクチン、イフォスファミド、タソネルミン、ロニダミン、カルボプラチン、アルトレタミン、プレドニムスチン、ジブロモダルシトール、ラニムスチン、フォテムスチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、テモゾロミド、ヘプタプラチン、エストラムスチン、トシル酸インプロスルファン、トロフォスファミド、ニムスチン、塩化ジブロスピジウム、プミテパ、ロバプラチン、サトラプラチン、プロフィロマイシン、シスプラチン、イロフルベン、デキシフォスファミド、シス−アミンジクロロ（２−メチルピリジン）白金、ベンジルグアニン、グルフォスファミド、ＧＰＸ１００、（トランス、トランス、トランス）−ビス−ｍｕ−（ヘキサン−１，６−ジアミン）−ｍｕ−［ジアミン−白金（ＩＩ）］ビス［ジアミン（クロロ）白金（ＩＩ）］テトラクロリド、ジアリジニルスペルミン、三酸化ヒ素、１−（１１−ドデシルアミノ−１０−ヒドロキシウンデシル）−３，７−ジメチルキサンチン、ゾルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ビサントレン、ミトキサントロン、ピラルビシン、ピナフィド、バルルビシン、アンルビシン、アンチネオプラストン、３’−デアミノ−３’−モルホリノ−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン、アナマイシン、ガラルビシン、エリナフィド、ＭＥＮ１０７５５、及び４−デメトキシ−３−デアミノ−３−アジリジニル−４−メチルスルフォニルダウノルビシンを含むが、これらに限定されない（国際公開公報第ＷＯ００／５００３２号参照）。
【０１８９】
低酸素活性化化合物の一例はチラパザミンである。
【０１９０】
プロテオソーム阻害因子の例は、ラクタシスチン及びＭＬＮ−３４１（Ｖｅｌｃａｄｅ）を含むが、これらに限定されない。
【０１９１】
微小管阻害因子／微小管安定化物質の例は、パクリタキセル、硫酸ビンデシン、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキセル、リゾキシン、ドラスタチン、イセチオン酸ミボブリン、オリスタチン、セマドチン、ＲＰＲ１０９８８１、ＢＭＳ１８４４７６、ビンフルニン、クリプトフィシン、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、アンヒドロビンブラスチン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、ＴＤＸ２５８、エポチロン類（例えば米国特許第６，２８４，７８１号及び同第６，２８８，２３７号参照）及びＢＭＳ１８８７９７を含む。１つの実施態様では、エポチロン類は微小管阻害因子／微小管安定化物質に包含されない。
【０１９２】
トポイソメラーゼ阻害因子の一部の例は、トポテカン、ヒカプタミン（ｈｙｃａｐｔａｍｉｎｅ）、イリノテカン、ルビテカン、６−エトキシプロピオニル−３’，４’−Ｏ−エキソ−ベンジリデンチャルトロイシン（ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｎ）、９−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−ニトロピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］アクリジン−２−（６Ｈ）プロパンアミン、１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：ｂ，７］−インドリジノ［１，２ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）ジオン、ルルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、７−［２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル］−（２０Ｓ）カンプトテシン、ＢＮＰ１３５０、ＢＮＰＩ１１００、ＢＮ８０９１５、ＢＮ８０９４２、リン酸エトポシド、テニポシド、ソブゾキサン、２’−ジメチルアミノ−２’−デオキシ−エトポシド、ＧＬ３３１、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−９−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−カルボキサミド、アスラクリン、（５ａ，５ａＢ，８ａａ，９ｂ）−９−［２−［Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］エチル］−５−［４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル］−５，５ａ，６，８，８ａ，９−ヘキソヒドロフロ（３’，４’：６，７）ナフト（２，３−ｄ）−１，３−ジオキソール−６−オン、２，３−（メチレンジオキシ）−５−メチル−７−ヒドロキシ−８−メトキシベンゾ［ｃ］フェナントリジウム、６，９−ビス［（２−アミノエチル）アミノ］ベンゾ［ｇ］イソギノリン−５，１０−ジオン、５−（３−アミノプロピルアミノ）−７，１０−ジヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチルアミノメチル）−６Ｈ−ピラゾロ［４，５，１−ｄｅ］アクリジン−６−オン、Ｎ−［１−［２（ジエチルアミノ）エチルアミノ］−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−チオキサンテン−４−イルメチル］ホルムアミド、Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）アクリジン−４−カルボキサミド、６−［［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オン、及びジメスナである。
【０１９３】
有糸分裂キネシン、特にヒト有糸分裂キネシンＫＳＰの阻害因子の例は、ＰＣＲ国際公開公報第ＷＯ０１／３０７６８号及び同第ＷＯ０１／９８２７８号、及び係属中の米国特許出願第６０／３３８，７７９号（２００１年１２月６日出願）、同第６０／３３８，３４４号（２００１年１２月６日出願）、同第６０／３３８，３８３号（２００１年１２月６日出願）、同第６０／３３８，３８０号（２００１年１２月６日出願）、同第６０／３３８，３７９号（２００１年１２月６日出願）及び同第６０／３４４，４５３号（２００１年１１月７日出願）に述べられている。１つの実施態様では、有糸分裂キネシンの阻害因子は、ＫＳＰの阻害因子、ＭＫＬＰ１の阻害因子、ＣＥＮＰ−Ｅの阻害因子、ＭＣＡＫの阻害因子及びＲａｂ６−ＫＩＦＬの阻害因子を含むが、これらに限定されない。
【０１９４】
「有糸分裂進行に関与するキナーゼの阻害因子」は、オーロラキナーゼの阻害因子、ポロ様キナーゼ（ＰＬＫ）の阻害因子（特にＰＬＫ−１の阻害因子）、ｂｕｂ−１の阻害因子及びｂｕｂ−Ｒ１の阻害因子を含むが、これらに限定されない。
【０１９５】
「抗増殖性物質」は、Ｇ３１３９、ＯＤＮ６９８、ＲＶＡＳＫＲＡＳ、ＧＥＭ２３１及びＩＮＸ３００１などのアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡオリゴヌクレオチド、及びエノシタビン、カルモフル、テガフル、ペントスタチン、ドキシフルリジン、トリメトレキサート、フルダラビン、カペシタビン、ガロシタビン、シタラビンオクフォスフェート、フォステアビンナトリウム水和物、ラルチトレキセド、パルチトレキシド、エミテフル、チアゾフリン、デシタビン、ノラトレキセド、ペメトレキセド、ネルザラビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン、２’−フルオロメチレン−２’−デオキシシチジン、Ｎ−［５−（２，３−ジヒドロベンゾフリル）スルホニル］−Ｎ’−（３，４−ジクロロフェニル）尿素、Ｎ６−［４−デオキシ−４−［Ｎ２−［２（Ｅ），４（Ｅ）−テトラデカジノイル］グリシルアミノ］−Ｌ−グリセロ−Ｂ−Ｌ−マンノヘプトピラノシル］アデニン、アプリジン、エクテイナシジン、トロキサシタビン、４−［２−アミノ−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−ピリミジノ［５，４−ｂ］［１，４］チアジン−６−イル−（Ｓ）−エチル］−２，５−チエノイル−Ｌ−グルタミン酸、アミノプテリン、５−フルオロウラシル、アラノシン、１１−アセチル−８−（カルバモイルオキシメチル）−４−ホルミル−６−メトキシ−１４−オキサ−１，１１−ジアザテトラシクロ（７．４．１．０．０）−テトラデカ−２，４，６−トリエン−９−イル酢酸エステル、スワインソニン、ロメトレキソール、デクスラゾキサン、メチオニナーゼ、２’−シアノ−２’−デオキシ−Ｎ４−パルミトイル−１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、３−アミノピリジン−２−カルボキサルデヒドチオセミカルバゾン及びトラスツズマブなどの代謝拮抗物質を含む。
【０１９６】
モノクローナル抗体標的治療薬の例は、細胞傷害性物質又は放射性同位体を癌細胞特異的又は標的細胞特異的モノクローナル抗体に結合させた治療薬を包含する。その例はＢｅｘｘａｒを含む。
【０１９７】
「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子」は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの阻害因子を指す。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対して阻害活性を有する化合物は、当技術分野で周知のアッセイを使用して容易に特定することができる。例えば、米国特許第４，２３１，９３８号、コラム６及び国際公開公報第ＷＯ８４／０２１３１号ｐ．３０−３３の中で述べられている又は引用されているアッセイ参照。「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子」及び「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの阻害因子」の語は、ここで使用するとき同じ意味を有する。
【０１９８】
使用しうるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子の例は、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）：米国特許第４，２３１，９３８号、同第４，２９４，９２６号及び同第４，３１９，０３９号参照）、シンバスタチン（ＺＯＣＯＲ（登録商標）；米国特許第４，４４４，７８４号、同第４，８２０，８５０号及び同第４，９１６，２３９号参照）、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）；米国特許第４，３４６，２２７号、同第４，５３７，８５９号、同第４，４，１０，６２９号、同第５，０３０，４４７号及び同第５，１８０，５８９号参照）、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標）；米国特許第５，３５４，７７２号、同第４，９１１，１６５号、同第４，９２９，４３７号、同第５，１８９，１６４号、同第５，１１８，８５３号、同第５，２９０，９４６号及び同第５，３５６，８９６号参照）、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）；米国特許第５，２７３，９９５号、同第４，６８１，８９３号、同第５，４８９，６９１号及び同第５，３４２，９５２号参照）及びセリバスタチン（リバスタチン及びＢＡＹＣＨＯＬ（登録商標）としても知られる）；米国特許第５，１７７，０８０号参照）を含むが、これらに限定されない。これら及び本発明の方法において使用しうる付加的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子の構造式は、Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ，「Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｏｗｅｒｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ」，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｐｐ．８５−８９（１９９６年２月５日）の８７ページ及び米国特許第４，７８２，０８４号及び同第４，８８５，３１４号に述べられている。ここで使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子の語は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害活性を有する化合物の医薬的に許容され得るすべてのラクトン及びオープンアシッド形態（すなわちラクトン環が遊離酸を形成するように開いている）ならびに塩及びエステル形態を包含し、それ故そのような塩、エステル、オープンアシッド及びラクトン形態の使用は本発明の範囲内に包含される。ラクトン部分及びその対応するオープンアシッド形態の例を構造Ｉ及びＩＩとして下記に示す。
【０１９９】
【化１】
2005537257.tif 000003
【０２００】
オープンアシッド形態が存在しうるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子においては、オープンアシッドから塩及びエステル形態が形成されることがあり、そのような形態はすべて、ここで使用する「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子」の語の意味に包含される。１つの実施態様では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子はロバスタチン及びシンバスタチンから選択され、さらなる実施態様では、シンバスタチンである。ここでは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子に関して「医薬的に許容され得る塩」の語は、一般に遊離酸を適切な有機又は無機塩基と反応させることによって製造される、本発明において使用される化合物の非毒性塩、特にナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛及びテトラメチルアンモニウムなどの陽イオンから形成されるもの、ならびにアンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、１−ｐ−クロロベンジル−２−ピロリジン−１’−イル−メチルベンズイミダゾール、ジエチルアミン、ピペラジン及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどのアミンから形成される塩を意味するものとする。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子の塩形態のさらなる例は、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシレート、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオネート、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ムケート（ｍｕｃａｔｅ）、ナプシル酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモイン酸塩、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド及び吉草酸塩を含みうるが、これらに限定されない。
【０２０１】
上述したＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子化合物のエステル誘導体は、温血動物の血流中に吸収されたとき、薬剤形態を放出するように開裂して、薬剤に改良された治療効果を与えることを可能にする、プロドラッグとして働きうる。
【０２０２】
「プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子」は、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴアーゼ）、ゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩ型（ＧＧＰＴアーゼＩ）及びゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩＩ型（ＧＧＰＴアーゼＩＩ、Ｒａｂ  ＧＧＰＴアーゼとも呼ばれる）を含む、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ酵素のいずれか又は何らかの組合せを阻害する化合物を指す。プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害性化合物の例は、（±）−６−［アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン、（−）−６−［アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン、（＋）−６−［アミノ（４−クロロフェニル）（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル］−４−（３−クロロフェニル）−１−メチル−２（１Ｈ）−キノリノン、５（Ｓ）−ｎ−ブチル−１−（２，３−ジメチルフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−５−イミダゾリルメチル］−２−ピペラジノン、（Ｓ）−１−（３−クロロフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−５−イミダゾリルメチル］−５−［２−（エタンスルホニル）メチル］−２−ピペラジノン、５（Ｓ）−ｎ−ブチル−１−（２−メチルフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−５−イミダゾリルメチル］−２−ピペラジノン、１−（３−クロロフェニル）−４−［１−（４−シアノベンジル）−２−メチル−５−イミダゾリルメチル］−２−ピペラジノン、１−（２，２−ジフェニルエチル）−３−［Ｎ−（１−（４−シアノベンジル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イルエチル）カルバモイル］ピペリジン、４−｛５−［４−ヒドロキシメチル−４−（４−クロロピリジン−２−イルメチル）−ピペリジン−１−イルメチル］−２−メチルイミダゾール−１−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛５−［４−ヒドロキシメチル−４−（３−クロロベンジル）−ピペリジン−１−イルメチル］−２−メチルイミダゾール−１−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛３−［４−（２−オキソ−２Ｈ−ピリジン−１−イル）ベンジル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛３−［４−（５−クロロ−２−オキソ−２Ｈ−［１，２’］ビピリジン−５’−イルメチル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−｛３−［４−（２−オキソ−２Ｈ−［１，２’］ビピリジン−５’−イルメチル］−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル｝ベンゾニトリル、４−［３−（２−オキソ−１−フェニル−１，２−ジヒドロピリジン−４−イルメチル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イルメチル］ベンゾニトリル、１８，１９−ジヒドロ−１９−オキソ−５Ｈ，１７Ｈ−６，１０：１２，１６−ジメテノ−１Ｈ−イミダゾ［４，３−ｃ］［１，１１，４］ジオキサアザシクロノナデシン−９−カルボニトリル、（±）−１９，２０−ジヒドロ−１９−オキソ−５Ｈ−１８，２１−エタノ−１２，１４−エテノ−６，１０−メテノ−２２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾ［４，３−ｋ］［１，６，９，１２］オキサトリアザシクロオクタデシン−９−カルボニトリル、１９，２０−ジヒドロ−１９−オキソ−５Ｈ，１７Ｈ−１８，２１−エタノ−６，１０：１２，１６−ジメテノ−２２Ｈ−イミダゾ［３，４−ｈ］［１，８，１１，１４］オキサトリアザシクロエイコシン−９−カルボニトリル、及び（±）−１９，２０−ジヒドロ−３−メチル−１９−オキソ−５Ｈ−１８，２１−エタノ−１２，１４−エテノ−６，１０−メテノ−２２Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾ［４，３−ｋ］［１，６，９，１２］オキサトリアザシクロオクタデシン−９−カルボニトリルを含む。
【０２０３】
プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子の他の例は、下記の公開公報及び特許に認められる：国際公開公報ＷＯ９６／３０３４３、ＷＯ９７／１８８１３、ＷＯ９７／２１７０１、ＷＯ９７／２３４７８、ＷＯ９７／３８６６５、ＷＯ９８／２８９８０、ＷＯ９８／２９１１９、ＷＯ９５／３２９８７、米国特許公報第５，４２０，２４５号、米国特許公報第５，５２３，４３０号、米国特許公報第５，５３２，３５９号、米国特許公報第５，５１０，５１０号、米国特許公報第５，５８９，４８５号、米国特許公報第５，６０２，０９８号、欧州特許公報第０６１８２２１号、欧州特許公報第０６７５１１２号、欧州特許公報第０６０４１８１号、欧州特許公報第０６９６５９３号、ＷＯ９４／１９３５７、ＷＯ９５／０８５４２、ＷＯ９５／１１９１７、ＷＯ９５／１２６１２、ＷＯ９５／１２５７２、ＷＯ９５／１０５１４、米国特許公報第５，６１１，１５２号、ＷＯ９５／１０５１５、ＷＯ９５／１０５１６、ＷＯ９５／２４６１２、ＷＯ９５／３４５３５、ＷＯ９５／２５０８６、ＷＯ９６／０５５２９、ＷＯ９６／０６１３８、ＷＯ９６／０６１９３、ＷＯ９６／１６４４３、ＷＯ９６／２１７０１、ＷＯ９６／２１４５６、ＷＯ９６／２２２７８、ＷＯ９６／２４６１１、ＷＯ９６／２４６１２、ＷＯ９６／０５１６８、ＷＯ９６／０５１６９、ＷＯ９６／００７３６、米国特許公報第５，５７１，７９２号、ＷＯ９６／１７８６１、ＷＯ９６／３３１５９、ＷＯ９６／３４８５０、ＷＯ９６／３４８５１、ＷＯ９６／３００１７、ＷＯ９６／３００１８、ＷＯ９６／３０３６２、ＷＯ９６／３０３６３、ＷＯ９６／３１１１１、ＷＯ９６／３１４７７、ＷＯ９６／３１４７８、ＷＯ９６／３１５０１、ＷＯ９７／００２５２、ＷＯ９７／０３０４７、ＷＯ９７／０３０５０、ＷＯ９７／０４７８５、ＷＯ９７／０２９２０、ＷＯ９７／１７０７０、ＷＯ９７／２３４７８、ＷＯ９７／２６２４６、ＷＯ９７／３００５３、ＷＯ９７／４４３５０、ＷＯ９８／０２４３６、及び米国特許公報第５，５３２，３５９号。
【０２０４】
血管新生に関するプレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子の役割の例については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，３５巻、第９号、ｐ．１３９４−１４０１（１９９９）参照。
【０２０５】
「血管新生阻害因子」は、機構に関わりなく、新しい血管の形成を阻害する化合物を指す。血管新生阻害因子の例は、チロシンキナーゼ受容体Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）及びＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の阻害因子などのチロシンキナーゼ阻害因子、表皮由来、線維芽細胞由来又は血小板由来増殖因子の阻害因子、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害因子、インテグリン遮断剤、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ポリ硫酸ペントサン、アスピリン及びイブプロフェンのような非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含むシクロオキシゲナーゼ阻害因子ならびにセレコキシブ及びロフェコキシブのような選択的シクロオキシゲナーゼ−２阻害因子（ＰＮＡＳ，８９巻、ｐ．７３８４（１９９２）；ＪＮＣＩ，６９巻、ｐ．４７５（１９８２）；Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．，１０８巻、ｐ．５７３（１９９０）；Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．，２３８巻、ｐ．６８（１９９４）；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３７２巻、ｐ．８３（１９９５）；Ｃｌｉｎ．，Ｏｒｈｔｏｐ．３１３巻、ｐ．７６（１９９５）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１６巻、ｐ．１０７（１９９６）；Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，７５巻、ｐ．１０５（１９９７）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７巻、ｐ。１６２５（１９９７）；Ｃｅｌｌ，９３巻、ｐ．７０５（１９９８）；Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２巻、ｐ．７１５（１９９８）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４巻、ｐ．９１１６（１９９９））、ステロイド系抗炎症薬（コルチコステロイド、鉱質コルチコイド、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレド、ベタメタゾンなど）、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチルカルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１、アンギオテンシンＩＩ拮抗物質（Ｆｅｒｎａｄｅｚら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０５：１４１−１４５（１９８５）参照）、及びＶＥＧＦに対する抗体（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７巻、ｐ．９６３−９６８（１９９９年１０月）；Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２、８４１−８４４（１９９３）；国際公開公報第ＷＯ００／４４７７７号；及び同第ＷＯ００／６１１８６号参照）を含むが、これらに限定されない。
【０２０６】
血管新生を調節又は阻害し、同時に本発明の化合物と組み合わせて使用しうる他の治療薬は、凝固及び線維素溶解系を調節又は阻害する物質を包含する（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａ．Ｍｅｄ．３８：６７９−６９２（２０００）の中の総説参照）。凝固及び線維素溶解経路を調節又は阻害するそのような物質の例は、ヘパリン（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８０：１０−２３（１９９８）参照）、低分子量ヘパリン、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗物質（チロフィバンなど）、ワルファリン、トロンビン阻害因子及びカルボキシペプチダーゼＵ阻害因子（活性トロンビン活性化線維素溶解阻害因子［ＴＡＦＩａ］の阻害因子としても知られる）（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．１０１：３２９−３５４（２００１）参照）を含むが、これらに限定されない。ＴＡＦＩａ阻害因子は、米国特許出願第６０／３１０，９２７号（２００１年８月８日出願）及び同第６０／３４９，９２５号（２００２年１月１８日出願）に述べられている。
【０２０７】
「細胞周期チェックポイントに干渉する物質」は、細胞周期チェックポイントシグナルを伝達し、それによって癌細胞をＤＮＡ損傷物質へと感作するプロテインキナーゼを阻害する化合物を指す。そのような物質は、ＡＴＲ、ＡＴＭ、Ｃｈｋ１及びＣｈｋ２キナーゼの阻害因子、及びｃｄｋ及びｃｄｃキナーゼ阻害因子を含み、特に７−ヒドロキシスタウロスポリン、フラボピリドール、ＣＹＣ２０２（Ｃｙｃｌａｃｅｌ）及びＢＭＳ−３８７０３２に例示される。
【０２０８】
「細胞の増殖及び生存シグナル伝達経路の阻害因子」は、細胞表面受容体の下流のシグナル伝達カスケードを阻害する化合物を指す。そのような物質は、セリン／トレオニンキナーゼの阻害因子（国際公開公報第ＷＯ０２／０８３０６４号、同第ＷＯ０２／０８３１３９号、同第ＷＯ０２／０８３１４０号及び同第０２／０８３１３８号に述べられているようなＡｋｔの阻害因子を含むがそれらに限定されない）、Ｒａｆキナーゼの阻害因子（例えばＢＡＹ−４３−９００６）、ＭＥＫの阻害因子（例えばＣＩ−１０４０及びＰＤ−０９８０５９）、ｍＴＯＲの阻害因子（例えばＷｙｅｔｈ  ＣＣＩ−７７９）、及びＰＩ３Ｋの阻害因子（例えばＬＹ２９４００２）を含む。
【０２０９】
ＮＳＡＩＤとの組合せは、強力なＣＯＸ−２阻害性物質であるＮＳＡＩＤの使用を対象とする。本明細書のために、細胞又はミクロソームアッセイによって測定したときＣＯＸ−２の阻害に関して１μＭ以下のＩＣ５０を有する場合、ＮＳＡＩＤは強力である。
【０２１０】
本発明はまた、選択的ＣＯＸ−２阻害因子であるＮＳＡＩＤとの組合せを包含する。本明細書のために、ＣＯＸ−２の選択的阻害因子であるＮＳＡＩＤは、細胞又はミクロソームアッセイで評価したＣＯＸ−２についてのＩＣ５０対ＣＯＸ−１についてのＩＣ５０の比率によって測定したとき、ＣＯＸ−１と比較してＣＯＸ−２を少なくとも１００倍阻害する特異性を有するものと定義される。そのような化合物は、そのすべてが参照してここに組み込まれる、１９９５年１２月１５日発行の米国特許第５，４７４，９９５号、１９９９年１月１９日発行の米国特許第５，８６１，４１９号、１９９９年１２月１４日発行の米国特許第６，００１，８４３号、２０００年２月１日発行の米国特許第６，０２０，３４３号、１９９５年４月２５日発行の米国特許第５，４０９，９４４号、１９９５年７月２５日発行の米国特許第５，４３６，２６５号、１９９６年７月１６日発行の５，５３６，７５２号、１９９６年８月２７日発行の米国特許第５，５５０，１４２号、１９９７年２月１８日発行の米国特許第５，６０４，２６０号、１９９７年１２月１６日発行の米国特許第５，６９８，５８４号、１９９８年１月２０日発行の米国特許第５，７１０，１４０号、１９９４年７月２１日公開の国際公開公報第ＷＯ９４／１５９３２号、１９９４年６月６日発行の米国特許第５，３４４，９９１号、１９９２年７月２８日発行の米国特許第５，１３４，１４２号、１９９５年１月１０日発行の米国特許第５，３８０，７３８号、１９９５年２月２０日発行の米国特許第５，３９３，７９０号、１９９５年１１月１４日発行の米国特許第５，４６６，８２３号、１９９７年５月２７日発行の米国特許第５，６３３，２７２号、及び１９９９年８月３日発行の米国特許第５，９３２，５９８号に開示されているものを含むが、これらに限定されない。
【０２１１】
本発明の治療方法において特に有用なＣＯＸ−２の阻害因子は：
３−フェニル−４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−２−（５Ｈ）−フラノン；及び
【０２１２】
【化２】
2005537257.tif 000004
【０２１３】
５−クロロ−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−（２−メチル−５−ピリジニル）ピリジン；
【０２１４】
【化３】
2005537257.tif 000005
又は医薬的に許容され得るその塩である。
【０２１５】
上述したＣＯＸ−２阻害因子化合物の製造のための一般的及び特異的合成手順は、そのすべてが参照してここに組み込まれる、１９９５年１２月１２日発行の米国特許第５，４７４，９９５号、１９９９年１月１９日発行の米国特許第５，８６１，４１９号、及び１９９９年１２月１４日発行の米国特許第６，００１，８４３号に認められる。
【０２１６】
ＣＯＸ−２の特異的阻害因子として記述されており、それ故本発明において有用である化合物は、
【０２１７】
【化４】
2005537257.tif 000006
又は医薬的に許容され得るその塩を含むが、これらに限定されない。
【０２１８】
ＣＯＸ−２の特異的阻害因子と述べられており、それ故本発明において有用である化合物、及びそれらの合成方法は、参照してここに組み込まれる、下記の特許、係属中の特許出願及び特許公開の中に認められる：１９９４年７月２１日公開の国際公開公報第ＷＯ９４／１５９３２号、１９９４年６月６日発行の米国特許第５，３４４，９９１号、１９９２年７月２８日発行の米国特許第５，１３４，１４２号、１９９５年１月１０日発行の米国特許第５，３８０，７３８号、１９９５年２月２０日発行の米国特許第５，３９３，７９０号、１９９５年１１月１４日発行の米国特許第５，４６６，８２３号、１９９７年５月２７日発行の米国特許第５，６３３，２７２号、及び１９９９年８月３日発行の米国特許第５，９３２，５９８号。
【０２１９】
ＣＯＸ−２の特異的阻害因子であり、それ故本発明において有用な化合物、及びそれらの合成方法は、参照してここに組み込まれる、下記の特許、係属中の特許出願及び特許公開の中に認められる：１９９５年１２月１２日発行の米国特許第５，４７４，９９５号、１９９９年１月１９日発行の米国特許第５，８６１，４１９号、１９９９年１２月１４日発行の米国特許第６，００１，８４３号、２０００年２月１日発行の米国特許第６，０２０，３４３号、１９９５年４月２５日発行の米国特許第５，４０９，９４４号、１９９５年７月２５日発行の米国特許第５，４３６，２６５号、１９９６年７月１６日発行の米国特許第５，５３６，７５２号、１９９６年８月２７日発行の米国特許第５，５５０，１４２号、１９９７年２月１８日発行の米国特許第５，６０４，２６０号、１９９７年１２月１６日発行の米国特許第５，６９８，５８４号、及び１９９８年１月２０日発行の米国特許第５，７１０，１４０号。
【０２２０】
血管新生阻害因子の他の例は、エンドスタチン、ウクライン、ランピルナーゼ（ｒａｎｐｉｒｎａｓｅ）、ＩＭ８６２、５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２，５］オクト−６−イル（クロロアセチル）カルバメート、アセチルジナナリン、５−アミノ−１−［［３，５−ジクロロ−４−（４−クロロベンゾイル）フェニル］メチル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボキサミド、ＣＭ１０１、スクアラミン、コンブレタスタチン、ＲＰＩ４６１０、ＮＸ３１８３８、硫酸化マンノペンタオースリン酸塩、７，７−（カルボニル−ビス［イミノ−Ｎ−メチル−４，２−ピロロカルボニルイミノ［Ｎ−メチル−４，２−ピロール］−カルボニルイミノ］−ビス−（１，３−ナフタレンジスルホネート）、及び３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）を含むが、これらに限定されない。
【０２２１】
前記で使用したように、「インテグリン遮断剤」は、αｖβ３インテグリンへの生理的リガンドの結合に選択的に拮抗する、結合を阻害する又は中和する化合物、αｖβ５インテグリンへの生理的リガンドの結合に選択的に拮抗する、結合を阻害する又は中和する化合物、αｖβ３インテグリン及びαｖβ５インテグリンへの生理的リガンドの結合に選択的に拮抗する、結合を阻害する又は中和する化合物、及び毛管内皮細胞上に発現される特定インテグリンの活性に拮抗する、活性を阻害する又は中和する化合物を指す。この語はまた、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４インテグリンの拮抗物質も指す。この語はまた、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、α１β１、α２β１、α５β１、α６β１及びα６β４インテグリンの何らかの組合せの拮抗物質も意味する。
【０２２２】
チロシンキナーゼ阻害因子の一部の特定例は、Ｎ−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソキサゾール−４−カルボキサミド、３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］インドリン−２−オン、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシル］キナゾリン、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン、ＢＩＢＸ１３８２、２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−（ヒドロキシメチル）−１０−ヒドロキシ−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロール［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン、ＳＨ２６８、ゲニステイン、ＳＴＩ５７１、ＣＥＰ２５６３、４−（３−クロロフェニルアミノ）−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンメタンスルホネート、４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、４−（４’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、ＳＵ６６６８、ＳＴＩ５７１Ａ、Ｎ−４−クロロフェニル−４−（４−ピリジルメチル）−１−フタラジンアミン、及びＥＭＤ１２１９７４を含む。
【０２２３】
抗癌化合物以外の化合物との組合せも本発明の方法に包含される。例えば、本発明において特許請求する化合物とＰＰＡＲ−γ（すなわちＰＰＡＲ−ガンマ）アゴニスト及びＰＰＡＲ−δ（すなわちＰＰＡＲ−デルタ）アゴニストの組合せは、ある種の悪性疾患の治療において有用である。ＰＰＡＲ−γ及びＰＰＡＲ−δは、核内ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ及びδである。内皮細胞でのＰＰＡＲ−γの発現及び血管新生へのその関与が文献において報告されている（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；３１：９０９−９１３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：９１１６−９１２１；Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２０００；４１：２３０９−２３１７）。最近になって、ＰＰＡＲ−γアゴニストはインビトロでＶＥＧＦに対する血管新生応答を阻害することが示された；トログリタゾン及びマレイン酸ロシグリタゾンの両方が、マウスにおいて網膜の新生血管形成の発現を阻害する。（Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００１；１１９：７０９−７１７）。ＰＰＡＲ−γアゴニスト及びＰＰＡＲ−γ／αアゴニストの例は、チアゾリジンジオン（ＤＲＦ２７２５、ＣＳ−０１１、トログリタゾン、ロシグリタゾン及びピオグリタゾンなど）、フェノフィブレート、ゲンフィブロジル、クロフィブレート、ＧＷ２５７０、ＳＢ２１９９９４、ＡＲ−Ｈ０３９２４２、ＪＴＴ−５０１、ＭＣＣ−５５５、ＧＷ２３３１、ＧＷ４０９５４４、ＮＮ２３４４、ＫＲＰ２９７、ＮＰ０１１０、ＤＲＦ４１５８、ＮＮ６２２、ＧＩ２６２５７０、ＰＮＵ１８２７１６、ＤＲＦ５５２９２６、２−［（５，７−ジプロピル−３−トリフルオロメチル−１，２−ベンズイソキサゾール−６−イル）オキシ］−２−メチルプロピオン酸（米国特許出願第０９／７８２，８５６号に開示されている）、及び２（Ｒ）−７−（３−（２−クロロ−４−（４−フルオロフェノキシ）フェノキシ）プロポキシ）−２−エチルクロマン−２−カルボン酸（米国特許出願第６０／２３５，７０８号及び同第６０／２４４，６９７号に開示されている）を含むが、これらに限定されない。
【０２２４】
本発明のもう１つの実施態様は、癌の治療のための遺伝子療法と組み合わせた、ここで開示する化合物の使用である。癌を治療するための遺伝的戦略の概要については、Ｈａｌｌら（Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６１：７８５−７８９，１９９７）及びＫｕｆｅら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第５版、ｐｐ．８７６−８８９、ＢＣ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ２０００）参照。遺伝子治療は、何らかの腫瘍抑制遺伝子を供給送達するために使用できる。そのような遺伝子の例は、組換えウイルスを介した遺伝子導入によって送達できるｐ５３（例えば米国特許第６，０６９，１３４号）、ｕＰＡ／ｕＰＡＲ拮抗物質（「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｕＰＡ／ｕＰＡＲ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，」Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９５年８月；５（８）：１１０５−１３）、及びインターフェロンγ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；１６４：２１７−２２２）を含むが、これらに限定されない。
【０２２５】
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物はまた、固有の多剤耐性（ＭＤＲ）、特に輸送タンパク質の高レベル発現に関連するＭＤＲの阻害因子と組み合わせて投与しうる。そのようなＭＤＲ阻害因子は、ＬＹ３３５９７９、ＸＲ９５７６、ＯＣ１４４−０９３、Ｒ１０１９２２、ＶＸ８５３及びＰＳＣ８３３（バルスポダール）などの、ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の阻害因子を含む。
【０２２６】
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物は、単独で又は放射線治療と組み合わせた本発明の化合物の使用から生じうる、急性、遅発性、後期及び予測される嘔吐を含む、吐気又は嘔吐を治療するための鎮吐薬と共に使用しうる。嘔吐の予防又は治療のために、本発明の化合物を他の鎮吐薬、特にニューロキニン−１受容タンパク質拮抗物質、オンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロン及びザチセトロンなどの５ＨＴ３受容体拮抗物質、バクロフェンなどのＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト、Ｄｅｃａｄｒｏｎ（デキサメタゾン）、Ｋｅｎａｌｏｇ、Ａｒｉｓｔｏｃｏｒｔ、Ｎａｓａｌｉｄｅ、Ｐｒｅｆｅｒｉｄ、Ｂｅｎｅｃｏｒｔｅｎ又は米国特許第２，７８９，１１８号、同第２，９９０，４０１号、同第３，０４８，５８１号、同第３，１２６，３７５号、同第３，９２９，７６８号、同第３，９９６，３５９号、同第３，９２８，３２６号及び同第３，７４９，７１２号に開示されているその他のものなどのコルチコステロイド、フェノチアジン（例えばプロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジン及びメソリダジン）、メトクロプラミド又はドロナビノールなどの抗ドパミン作動薬と組み合わせて使用しうる。本発明の化合物の投与時に生じうる嘔吐の治療又は予防のためには、ニューロキニン−１受容体拮抗物質、５ＨＴ３受容体拮抗物質及びコルチコステロイドから選択される鎮吐薬との併用治療が好ましい。
【０２２７】
本発明の化合物と組み合わせて使用するニューロキニン−１受容体拮抗物質は、例えば、米国特許公報第５，１６２，３３９号、第５，２３２，９２９号、第５，２４２，９３０号、第５，３７３，００３号、第５，３８７，５９５号、第５，４５９，２７０号、第５，４９４，９２６号、第５，４９６，８３３号、第５，６３７，６９９号、第５，７１９，１４７号；欧州特許公報第０３６０３９０号、第０３９４９８９号、第０４２８４３４号、第０４２９３６６号、第０４３０７７１号、第０４３６３３４号、第０４４３１３２号、第０４８２５３９号、第０４９８０６９号、第０４９９３１３号、第０５１２９０１号、第０５１２９０２号、第０５１４２７３号、第０５１４２７４号、第０５１４２７５号、第０５１４２７６号、第０５１５６８１号、第０５１７５８９号、第０５２０５５５号、第０５２２８０８号、第０５２８４９５号、第０５３２４５６号、第０５３３２８０号、第０５３６８１７号、第０５４５４７８号、第０５５８１５６号、第０５７７３９４号、第０５８５９１３号、第０５９０１５２号、第０５９９５３８号、第０６１０７９３号、第０６３４４０２号、第０６８６６２９号、第０６９３４８９号、第０６９４５３５号、第０６９９６５５号、第０６９９６７４号、第０７０７００６号、第０７０８１０１号、第０７０９３７５号、第０７０９３７６号、第０７１４８９１号、第０７２３９５９号、第０７３３６３２及び第０７７６８９３号；ＰＣＴ国際特許公報ＷＯ９０／０５５２５、ＷＯ９０／０５７２９、ＷＯ９１／０９８４４、ＷＯ９１／１８８９９、ＷＯ９２／０１６８８、ＷＯ９２／０６０７９、ＷＯ９２／１２１５１、ＷＯ９２／１５５８５、ＷＯ９２／１７４４９、ＷＯ９２／２０６６１、ＷＯ９２／２０６７６、ＷＯ９２／２１６７７、ＷＯ９２／２２５６９、ＷＯ９３／００３３０、ＷＯ９３／００３３１、ＷＯ９３／０１１５９、ＷＯ９３／０１１６５、ＷＯ９３／０１１６９、ＷＯ９３／０１１７０、ＷＯ９３／０６０９９、ＷＯ９３／０９１１６、ＷＯ９３／１００７３、ＷＯ９３／１４０８４、ＷＯ９３／１４１１３、ＷＯ９３／１８０２３、ＷＯ９３／１９０６４、ＷＯ９３／２１１５５、ＷＯ９３／２１１８１、ＷＯ９３／２３３８０、ＷＯ９３／２４４６５、ＷＯ９４／００４４０、ＷＯ９４／０１４０２、ＷＯ９４／０２４６１、ＷＯ９４／０２５９５、ＷＯ９４／０３４２９、ＷＯ９４／０３４４５、ＷＯ９４／０４４９４、ＷＯ９４／０４４９６、ＷＯ９４／０５６２５、ＷＯ９４／０７８４３、ＷＯ９４／０８９９７、ＷＯ９４／１０１６５、ＷＯ９４／１０１６７、ＷＯ９４／１０１６８、ＷＯ９４／１０１７０、ＷＯ９４／１１３６８、ＷＯ９４／１３６３９、ＷＯ９４／１３６６３、ＷＯ９４／１４７６７、ＷＯ９４／１５９０３、ＷＯ９４／１９３２０、ＷＯ９４／１９３２３、ＷＯ９４／２０５００、ＷＯ９４／２６７３５、ＷＯ９４／２６７４０、ＷＯ９４／２９３０９、ＷＯ９５／０２５９５、ＷＯ９５／０４０４０、ＷＯ９５／０４０４２、ＷＯ９５／０６６４５、ＷＯ９５／０７８８６、ＷＯ９５／０７９０８、ＷＯ９５／０８５４９、ＷＯ９５／１１８８０、ＷＯ９５／１４０１７、ＷＯ９５／１５３１１、ＷＯ９５／１６６７９、ＷＯ９５／１７３８２、ＷＯ９５／１８１２４、ＷＯ９５／１８１２９、ＷＯ９５／１９３４４、ＷＯ９５／２０５７５、ＷＯ９５／２１８１９、ＷＯ９５／２２５２５、ＷＯ９５／２３７９８、ＷＯ９５／２６３３８、ＷＯ９５／２８４１８、ＷＯ９５／３０６７４、ＷＯ９５／３０６８７、ＷＯ９５／３３７４４、ＷＯ９６／０５１８１、ＷＯ９６／０５１９３、ＷＯ９６／０５２０３、ＷＯ９６／０６０９４、ＷＯ９６／０７６４９、ＷＯ９６／１０５６２、ＷＯ９６／１６９３９、ＷＯ９６／１８６４３、ＷＯ９６／２０１９７、ＷＯ９６／２１６６１、ＷＯ９６／２９３０４、ＷＯ９６／２９３１７、ＷＯ９６／２９３２６、ＷＯ９６／２９３２８、ＷＯ９６／３１２１４、ＷＯ９６／３２３８５、ＷＯ９６／３７４８９、ＷＯ９７／０１５５３、ＷＯ９７／０１５５４、ＷＯ９７／０３０６６、ＷＯ９７／０８１４４、ＷＯ９７／１４６７１、ＷＯ９７／１７３６２、ＷＯ９７／１８２０６、ＷＯ９７／１９０８４、ＷＯ９７／１９９４２及びＷＯ９７／２１７０２；及び英国特許公報第２２６６５２９号、第２２６８９３１号、第２２６９１７０号、第２２６９５９０号、第２２７１７７４号、第２２９２１４４号、第２２９３１６８号、第２２９３１６９号、及び第２３０２６８９号の中で詳細に述べられている。そのような化合物の製造は、参照してここに組み込まれる、前記特許及び特許公開の中で詳述されている。
【０２２８】
１つの実施態様では、本発明の化合物と組み合わせて使用するためのニューロキニン−１受容体拮抗物質は、米国特許第５，７１９，１４７号に述べられている、２−（Ｒ）−（１−（Ｒ）−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）エトキシ）−３−（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−４−（３−（５−オキソ−１Ｈ，４Ｈ−１，２，４−トリアゾロ）メチル）モルホリン、又は医薬的に許容され得るその塩から選択される。
【０２２９】
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物はまた、貧血の治療において有用な薬剤と共に投与しうる。そのような貧血治療薬は、例えば、持続的赤血球形成受容体活性化因子（エポエチンアルファなど）である。
【０２３０】
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物はまた、好中球減少症治療において有用な薬剤と共に投与しうる。そのような好中球減少症治療薬は、例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの好中球の産生と機能を調節する造血細胞増殖因子である。Ｇ−ＣＳＦの例はフィルグラスチムを含む。
【０２３１】
本発明の方法を用いて設計又は選択される化合物はまた、レバミゾール、イソプリノシン及びＺａｄａｘｉｎなどの免疫増強薬と共に投与しうる。
【０２３２】
それ故、本発明の範囲は、
１）エストロゲン受容体モジュレーター、
２）アンドロゲン受容体モジュレーター、
３）レチノイド受容体モジュレーター、
４）細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）／細胞増殖抑制性（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ）物質、
５）抗増殖性物質、
６）プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、
７）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子
８）ＨＩＶプロテアーゼ阻害因子、
９）逆転写酵素阻害因子、
１０）血管新生阻害因子、
１１）ＰＰＡＲ−γアゴニスト、
１２）ＰＰＡＲ−δアゴニスト、
１３）固有の多剤耐性阻害因子、
１４）鎮吐薬、
１５）貧血の治療において有用な薬剤、
１６）好中球減少症の治療において有用な薬剤、
１７）免疫増強薬、
１８）細胞の増殖及び生存シグナル伝達の阻害因子、及び
１９）細胞周期チェックポイントに干渉する物質
から選択される第二の化合物と組み合わせた、ここで開示する方法を用いて設計又は選択される化合物の使用を包含する。
【０２３３】
本発明の化合物に関して「投与」の語及びその変異形（例えば、化合物を「投与すること」）は、前記化合物又は前記化合物のプロドラッグを、治療を必要とする動物の系に導入することを意味する。本発明の化合物又はそのプロドラッグを１つ以上の他の活性物質（例えば細胞傷害性物質等）と組み合わせて提供するとき、「投与」及びその変異形は各々、前記化合物又はそのプロドラッグと他の薬剤の同時及び連続導入を包含すると理解される。
【０２３４】
ここで使用するとき、「組成物」の語は、規定量の規定成分を含有する生成物、ならびに規定量の規定成分の組合せから直接又は間接的に生じる生成物を包含することが意図されている。
【０２３５】
ここで使用するとき、「治療有効量」の語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床家が求める、組織、系、動物又はヒトにおける生物学的又は医学的応答を誘導する活性化合物又は薬剤の量を意味する。
【０２３６】
「癌を治療すること」又は「癌の治療」の語は、癌状態に罹患した哺乳類への投与を指し、及び癌細胞を死滅させることによって癌状態を緩和する作用を指し、同時に癌の増殖及び／又は転移の阻害をもたらす作用も意味する。
【０２３７】
１つの実施態様では、第二化合物として使用する血管新生阻害因子は、チロシンキナーゼ阻害因子、表皮由来増殖因子の阻害因子、線維芽細胞由来増殖因子の阻害因子、血小板由来増殖因子の阻害因子、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）阻害因子、インテグリン遮断剤、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ポリ硫酸ペントサン、シクロオキシゲナーゼ阻害因子、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチルカルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンギオスタチン、トロポニン−１、又はＶＥＧＦに対する抗体から選択される。１つの実施態様では、エストロゲン受容体モジュレーターはタモキシフェン又はラロキシフェンである。
【０２３８】
放射線治療と組み合わせて及び／又は：
１）エストロゲン受容体モジュレーター、
２）アンドロゲン受容体モジュレーター、
３）レチノイド受容体モジュレーター、
４）細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質、
５）抗増殖性物質、
６）プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、
７）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子
８）ＨＩＶプロテアーゼ阻害因子、
９）逆転写酵素阻害因子、
１０）血管新生阻害因子、
１１）ＰＰＡＲ−γアゴニスト、
１２）ＰＰＡＲ−δアゴニスト、
１３）固有の多剤耐性阻害因子、
１４）鎮吐薬、
１５）貧血の治療において有用な薬剤、
１６）好中球減少症の治療において有用な薬剤、
１７）免疫増強薬、
１８）細胞の増殖及び生存シグナル伝達の阻害因子、及び
１９）細胞周期チェックポイントに干渉する物質
から選択される化合物と組み合わせて、ここで開示する方法を用いて設計又は選択される化合物の治療有効量を投与することを含む、癌を治療する方法も、本発明の特許請求の範囲に包含される。
【０２３９】
本発明のさらにもう１つの実施態様は、パクリタキセル又はトラスツズマブと組み合わせて、ここで開示する方法を用いて設計又は選択される化合物の治療有効量を投与することを含む、癌を治療する方法である。
【０２４０】
本発明はさらに、ＣＯＸ−２阻害因子と組み合わせて、ここで開示する方法を用いて設計又は選択される化合物の治療有効量を投与することを含む、癌を治療する又は予防する方法を包含する。
【０２４１】
本発明はまた、ここで開示する方法を用いて設計又は選択される化合物の治療有効量及び
１）エストロゲン受容体モジュレーター、
２）アンドロゲン受容体モジュレーター、
３）レチノイド受容体モジュレーター、
４）細胞傷害性／細胞増殖抑制性物質、
５）抗増殖性物質、
６）プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害因子、
７）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子
８）ＨＩＶプロテアーゼ阻害因子、
９）逆転写酵素阻害因子、
１０）血管新生阻害因子、
１１）ＰＰＡＲ−γアゴニスト、
１２）ＰＰＡＲ−δアゴニスト、
１３）細胞の増殖及び生存シグナル伝達の阻害因子、及び
１４）細胞周期チェックポイントに干渉する物質
から選択される化合物を含有する、癌を治療する又は予防するために有用な医薬組成物を包含する。
【０２４２】
ＫＳＰの原子座標の前記使用の各々において、表１〜４に記載の座標が好ましい。
【０２４３】
本発明のさらなる目的は下記の説明から明らかになる。
【０２４４】
ここで使用するとき、下記の語及び語句は次に述べる意味を有するものとする：
別段の断りがない限り、「ＫＳＰ」は、天然及び野生型キネシン紡錘体タンパク質、ならびに実質的に配列番号１に示すリガンド結合部位を含むタンパク質又はペプチドとしてここで定義される、「ＫＳＰ類似体」を包含する。そのようなＫＳＰ類似体は、表１〜４に記載するような図１０に示すアミノ酸残基の相対構造座標±３．００５Å以下、より好ましくは約２．０Å以下、最も好ましくは約０．５Å以下の前記アミノ酸の保存された骨格原子からの二乗平均平方根偏差を含む三次元構造によって特徴付けられるリガンド結合部位を含むが、それに限定されない。
【０２４５】
特に異なる指示がない限り、「タンパク質」又は「分子」は、タンパク質、タンパク質ドメイン、ポリペプチド又はペプチドを包含するものとする。
【０２４６】
「構造座標」は、分子内又は分子複合体内の原子の他の原子に対する空間関係に対応するカーテシアン座標である。構造座標は、Ｘ線結晶解析手法又はＮＭＲ手法を用いて入手しうるか、又は分子置換分析又はホモロジーモデリングを用いて誘導しうる。様々なソフトウエアプログラムが、分子又は分子複合体の三次元画像を得るための構造座標のセットのグラフ表示を可能にする。本発明の構造座標は、反転（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）又は整数加算又は減算などの数学的操作によって表１〜４に記載の最初のセットから改変されうる。それ自体で、本発明の構造座標は相対的であり、特に、いかなる意味においても表１〜４の実際のｘ、ｙ、ｚ座標によって限定されないことは認識される。
【０２４７】
「物質」、「リガンド」又は「結合パートナー」は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む核酸、分子、化合物又は薬剤を包含するものとする。
【０２４８】
「二乗平均平方根偏差」は、平均値からの偏差の二乗の算術平均の平方根であり、ここで述べる構造座標からの偏差又は変異を表わす手段である。本発明は、言明される二乗平均平方根偏差内の同じ構造座標を生じる、対象アミノ酸残基の保存的置換を含むすべての実施態様を包含する。
【０２４９】
（実験材料及び方法）
提示する実験材料及び方法は、本発明のさらなる理解を助けることを意図するものであり、その妥当な範囲を限定することを意図しない。
【０２５０】
ヒトＫＳＰのモータードメイン、アミノ酸１〜３６８
【０２５１】
【化５】
2005537257.tif 000007
【０２５２】
ヒトＫＳＰの結合ポケット
新たに形成されるポケットを裏打ちし、リガンドを取り巻くのは、アミノ酸残基：
１１５（Ｍ）、１１６（Ｅ）、１１７（Ｇ）、１１８（Ｅ）、１１９（Ｒ）、１２７（Ｗ）、１３０（Ｄ）、１３２（Ｌ）、１３３（Ａ）、１３４（Ｇ）、１３６（Ｉ）、１３７（Ｐ）（α２らせん及びその挿入ループより；残基１１６はα２らせんの最初の部分の末端であり、及び残基１３４はα２らせんの第二部分の開始点であり、それ故挿入ループは残基１１６から始まって残基１３４で終わる）；
１６０（Ｌ）（βストレイン（ｂｅｔａ  ｓｔｒａｉｎ）−β４より）；
２１１（Ｙ）、２１４（Ｌ）、２１５（Ｅ）、２１７（Ｇ）、２１８（Ａ）、２２１（Ｒ）（α３らせんより）；及び
２３９（Ｆ）（βストレイン−β６より）
である。
【０２５３】
ＫＳＰ発現
ＫＳＰ（３６８残基）ベクターを内包する大腸菌細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＬＢ培地中３７℃で増殖させた。０．５ｍＭイソプロピル−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシドを加えて２５℃でＫＳＰ発現を誘導し、細胞を２５℃でさらに４時間増殖させた後、採集した。
【０２５４】
１０リットルからの細胞を溶解緩衝液７５ｍｌ（５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、プロテアーゼ阻害因子錠剤（緩衝液５０ｍｌにつき１錠）に懸濁し、均質化した。均質化懸濁液をマイクロフルイダイザー（１１０−Ｓ型）に３回通して細胞を破壊した。細胞溶解産物を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、その上清を、ＳＰセファロース緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ）中であらかじめ平衡させたＤＥ−５２樹脂（１００ｍｌ）と混合した。１０００ｒｐｍで１０分間遠心した後上清を除去した。樹脂を、１樹脂容量（１００ｍｌ）の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、１ｍＭ  ＥＧＴＡで２回洗った。その上清をプールし、ＳＰセファロースカラム（５０ｍｌ、直径２．６ｃｍカラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に注入した。〜９５％純度のキネシンを、０から３０％勾配を使用して０．１５から０．２Ｍ  ＫＣｌで溶出した。ＫＳＰを含む分画（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって）をプールし、ＳＰセファロース緩衝液Ａで５０ｍＭの最終ＫＣｌ濃度まで希釈した。そのプールを、ＳＰセファロース緩衝液Ｂ中で平衡させた高速Ｑセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１０ｍｌと混合した。１０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を採集した。樹脂を２樹脂容量で４回洗った。洗浄液と上清をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０で１５から１７ｍｇ／ｍｌに濃縮し、小量のアリコートとして−７０℃で保存した。そのタンパク質を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ４７０Ａ型気相シーケンサーでエドマン分解によるＮ末端配列分析によって特徴付けた。Ｂｅｃｋｍａｎ  ６３００分析器でポストカラムニンヒドリン誘導体化法を用いることによる定量的アミノ酸分析でタンパク質濃度を決定した。分子量はＤｅｃａ−ＬＣＱ（Ｆｉｎｎｅｇａｎ）質量分析計で決定した。モル質量及びサイズ分布は、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  ＨＰＬＣのサイズ排除カラムに接続した多角度光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＤＡＷＮ  ＥＯＳ）によって測定した。
【０２５５】
結晶化
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＴＥＣＰ、１ｍＭ  ＡＴＰ、８４ｍＭ  ＫＣｌ及び１ｍＭ  ＥＧＴＡの存在下にｐＨ６．８の５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中約１５ｍｇ／ｍｌの濃縮キネシン（ＡＤＰ、Ｍｇ＋＋）タンパク質を１ｍＭ阻害因子化合物５−２ｂ（（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌ）と共にインキュベートした。小さな単結晶種を、２０％ＰＥＧ３３５０、０．１５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４及びｐＨ７．０の０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を含むウエル溶液（ｗｅｌｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）による懸滴法によって約４日間後に得た。Ｘ線データ収集に適する結晶を、１４％ＰＥＧ３３５０、０．２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４及びｐＨ６．８の０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を含むウエル溶液による懸滴中への肉眼的種入れ（ｍａｃｒｏｓｅｅｄｉｎｇ）によって約２週間後に入手した。懸滴は等容量のタンパク質とウエル溶液によって形成した。
【０２５６】
Ｘ線データの収集及び処理
２．５Å分解能でのＸ線回折データを、Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおけるｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅのシンクロトロンビームライン１７−ＩＤ、１００Ｋで収集した。データ収集の前に、結晶を、２０％ＰＥＧ３３５０、０．１５Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４、２０％ＰＥＧ２００及びｐＨ６．８の０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を含む凍結保護物質溶液に２０分間浸した。次に結晶を液体窒素中で凍結させた。Ｘ線波長を１Åに設定した。フレーム当り０．２°振動で合計１０００フレーム、及び検出器から結晶の距離２５０ｍｍでフレーム当り１秒間の暴露でデータを収集した。ＨＫＬ２０００パッケージを使用してデータを処理し、評価した。結晶は、Ｐ２１２１２１の斜方晶系空間群に属し、細胞寸法はａ＝６９．５Å、ｂ＝７９．５Å及びｃ＝１５９．０Åである。データセットの完全性は９９％であった。Ｒｓｙｍは０．０８４であった。
【０２５７】
構造決定及び洗練化
広汎なモデル再構築と動的洗練化を組み合わせた分子置換法を使用して構造を決定した。ＡＤＰ（Ｍｇ＋＋）と結合したキネシンの二元複合体結晶構造におけるキネシンタンパク質座標を検索モデルとして使用した。分子置換溶液は、４．０Åから１５Å分解能範囲でＡｍｏＲｅプログラムを使用して入手し、Ｒ因子０．４８及び相関係数０．６０を得た。初期タンパク質モデルを再構築し、２．５Å分解能で逐語的に洗練化し、これは動的洗練化、エネルギーの最小化及び温度因子洗練化を含んだ。４回目の再構築と洗練化サイクルで化合物５−２ｂの密度が明らかになった。最後に、４４１水分子をモデルに加え、Ｒ因子は０．２１、フリーＲ因子は０．２６で、良好なジオメトリであった（ＲＭＳＤ結合＝０．００７Å、ＲＭＳＤ角度＝１．３２°）。現在のタンパク質モデルは、１個のＡＤＰ、１個のＭｇ＋＋イオン及び１個の化合物５−２ｂと結合する。残基Ａｎｓ１８で始まり、Ｌｙｓ３６２までに電子密度の欠如による残基Ａｓｎ２７１〜Ａｎｓ２８７のギャップ（Ｉｌｅ２７２〜Ｇｌｙ２８６までの喪失ループ１１）を有する。非対称単位中に２個の複合体が存在する。
【０２５８】
ＫＳＰ／ＡＤＰ／化合物５−２ｂの三元構造
Ｍｇ＋＋−ＡＤＰ及び化合物５−２ｂ（（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌに結合したＫＳＰの三次元三元構造を、分子置換、広汎な手動操作再構築及び動的洗練化の組合せから誘導される位相を使用して２．５Å分解能で決定した。２個の同一タンパク質複合体を結晶の非対称単位内に認め、局所非結晶２倍軸によって関係付けた。各々について、タンパク質の電子密度ならびにリガンド（ＡＤＰ、Ｍｇ＋＋及び化合物５−２ｂ）の電子密度がすべて良好に定義された。化合物５−２ｂはＳ偏光性であることが認められた。残基２〜１７、２７２〜２８６及び３６３〜３６８は無秩序であり、電子密度を示さなかった（Ｎ末端のＭｅｔ１残基を発現時に処理した）。図１〜８参照。
【０２５９】
ＫＳＰ（３６８）−ＡＤＰ−／＋阻害因子のＴｒｐ１２７の蛍光
実験材料
−２Ｘキネシン緩衝液：１６０ｍＭ  Ｋ−Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ（毎日新鮮添加）及び１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ６．８。
−ヌクレオチド：ヌクレオチドを５０ｍＭ  Ｋ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ６．８）中に２００ｍＭまで再懸濁する。
−ヌクレオチドを２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２で１：１のヌクレオチド：ＭｇＣｌ２  １００ｍＭの原液濃度に希釈する。
−キュベット容量＝３００μｌ
実験方法
１）１Ｘキネシン緩衝液、±ヌクレオチド及びＨ２Ｏ  ２８１μｌ（ヌクレオチド＝なし、１ｍＭ  ＡＭＰＰＮＰ又は１ｍＭ  ＡＤＰ（最終濃度））を加える。
【０２６０】
２）４μＭの原液ヌクレオチド不含ＫＳＰ（３６７Ｈ）１８．７５μｌを加える。
【０２６１】
３）ＤＭＳＯ原液から連続的に化合物を加える（すべての添加物のすべての容量≦０．６μｌ）。
【０２６２】
４）各々の添加後の蛍光を測定する（緩衝液単独から出発する）。
【０２６３】
５）化合物８−１とＫＳＰ（３６７Ｈ）ＡＤＰについての例示的滴定：１Ｘキネシン緩衝液２８１μｌ＋１ｍＭ  ＡＤＰ：
２５０ｎＭ  ＫＳＰを加える（４μＭヌクレオチド不含原液１８．７５μｌ）
１ｎＭ  化合物８−１（１ｎＭｆ）を加える（０．００１ｍＭ原液０．３μｌの添加）
２ｎＭ  化合物８−１（３ｎＭｆ）を加える（０．００１ｍＭ原液０．６μｌの添加）
４ｎＭ  化合物８−１（７ｎＭｆ）を加える（０．０１ｍＭ原液０．１２μｌの添加）
３ｎＭ  化合物８−１（１０ｎＭｆ）を加える（０．０１ｍＭ原液０．０９μｌの添加）
２０ｎＭ  化合物８−１（３０ｎＭｆ）を加える（０．０１ｍＭ原液０．６μｌの添加）
４０ｎＭ  化合物８−１（７０ｎＭｆ）を加える（０．１ｍＭ原液０．１２μｌの添加）
３０ｎＭ  化合物８−１（１００ｎＭｆ）を加える（０．１ｍＭ原液０．０９μｌの添加）
２００ｎＭ  化合物８−１（３００ｎＭｆ）を加える（０．１ｍＭ原液０．６μｌの添加）
４００ｎＭ  化合物８−１（７００ｎＭｆ）を加える（１ｍＭ原液０．１２μｌの添加）
３００ｎＭ  化合物８−１（１０００ｎＭｆ）を加える（１ｍＭ原液０．０９μｌの添加）
２０００ｎＭ  化合物８−１（３０００ｎＭｆ）を加える（１ｍＭ原液０．６μｌの添加）。
【０２６４】
６）各々の添加後、次の条件下で定常状態の蛍光を測定する：
λｅｘ＝３８８ｎｍ、λｅｍ＝３４２〜３４６ｎｍ、バンド幅＝３ｎｍ  ｅｘ／３ｎｍ  ｅｍ、波長増分＝０．５ｎｍ、積算時間＝２秒。
【０２６５】
７）同じ滴定シリーズを反復する：
ＫＳＰの不在下（化合物に関連するバックグラウンドを測定するため）、及び
ＫＳＰの不在下であるが、１μＭ  Ｌ−トリプトファンの存在下（アミノ酸自体への化合物関連の作用を測定するため）。
【０２６６】
算定
ＫＳＰ（３６７Ｈ）内のＷ１２７についてのピーク発光波長（＝３４４ｎｍ）で、キネシン緩衝液中の化合物の発光を［化合物］の関数として測定する；Ｌ−トリプトファンの蛍光を［化合物］の関数として測定する；ＫＳＰ（３６７Ｈ）の蛍光を［化合物］の関数として測定する；ＫＳＰ（３６７Ｈ）の蛍光を、その経時的な低下に関して補正する（キュベットへのタンパク質の損失のため）；Ｌ−トリプトファンの発光から化合物の発光を差し引く；ＫＳＰ（３６７Ｈ）の発光から化合物の発光を差し引く。Ｌ−トリプトファン対［化合物］の蛍光の分画を算定する：（所与の［化合物］でのＬ−ｔｒｐ蛍光（３４４ｎｍ））／０ｃｐｄでのＬ−ｔｒｐ蛍光（３４４ｎｍ））：ＫＳＰ（３６７Ｈ）対［化合物］の蛍光の分画を算定する：（所与の［化合物］でのＫＳＰ蛍光（３４４ｎｍ））／０ｃｐｄでのＫＳＰ蛍光（３４４ｎｍ））；次に基準化する：ＫＳＰ（ｆｒｃｎ  ｆｌ）／Ｌ−ｔｒｐ（ｆｒｃｎ  ｆｌ）及び［化合物］に対してプロットする。
【０２６７】
このアッセイの結果を図１１−１３に示す。
【０２６８】
ここで開示する新規ＫＳＰ結合部位の特定と試験において使用した化合物は、下記に述べる方法によって製造しうる：
【０２６９】
【化６】
2005537257.tif 000008
【０２７０】
ステップ１：３−［３−（ベンジルオキシ）フェニル］−１−（２−クロロフェニル）プロパ−２−エン−１−オン（１−４）
−７８℃のＴＨＦ４０ｍｌ中の２’−クロロアセトフェノン（１−１）（１．２６ｍＬ、９．７０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ中の１Ｍ  ＬｉＨＭＤＳ溶液１０．７ｍＬ（１０．７ｍｍｏｌ）を緩やかに加えた。−７８℃で１時間攪拌した後、ＴＨＦ８ｍＬ中の３−（ベンジルオキシベンズアルデヒド（１−２）２．０５ｇ（９．７０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、その温度でさらに１時間攪拌を続けた。次のその混合物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液１００ｍＬが入った別の漏斗に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃ１００ｍＬで２回抽出した。その有機相を併合し、ブライン１００ｍＬで洗って、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。乾燥物をろ別した後、回転蒸発器で溶媒を除去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２５０ｍＬに溶解した。−７８℃に冷却した後、トリエチルアミン４ｍＬと無水トリフルオロ酢酸２ｍＬを連続的に加え、その混合物を放置して室温に温め、１２時間攪拌した。次にその反応物を、１Ｍ  ＨＣｌ１００ｍＬが入った別の漏斗に注ぎ入れ、層を分離して、水相を再びＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を併合し、再び１Ｍ  ＨＣｌで洗い、水で洗って、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、粗物質を４５分間にわたってヘキサン中０から４０％ＥｔＯＡｃの勾配のシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製し、１−４を粘性黄色油として得た。１−４に関するデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５−７．０（ｍ，１５Ｈ）５．１（ｓ，２Ｈ）ｐｐｍ。
【０２７１】
ステップ２：１−（２−クロロフェニル）−３−（ヒドロキシフェニル）プロパ−２−エン−１−オン（１−５）
−７８℃のＣＨ２Ｃｌ２１５ｍＬ中の１−４  ７４０ｍｇ（２．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２中のＢＢｒ３の１Ｍ溶液２．７５ｍＬ（２．７５ｍｍｏｌ）を滴下した。その温度で３０分間攪拌した後、ＭｅＯＨ１ｍＬを加え、その混合物を水に注ぎいれて、ＣＨ２Ｃｌ２５０ｍＬで２回抽出し、再び水で洗って、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濃縮後、残渣を３０分間にわたってヘキサン中２から７０％ＥｔＯＡｃの勾配のシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製し、１−５をベージュ色固体として得た。１−５に関するデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５−７．３（ｍ，５Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），７．２−７．０（ｍ，３Ｈ），６．９（ｍ，１Ｈ），５．１（ｂｓ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２７２】
ステップ３：３−［１−アセチル−３−（２−クロロフェニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−５−イル］フェノール（１−７）
酢酸４ｍＬ中のカルコン１−５  １２０ｍｇ（０．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン水和物５０μＬ（０．９３ｍｍｏｌ）を加えた。次のその反応物を２４時間、１１０℃の油浴に入れた。室温に冷却した後、回転蒸発器で溶媒を除去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２５０ｍＬに溶解し、ＮａＨＣＯ３水溶液で２回洗って、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。次のその残渣を３０分間にわたってヘキサン中５から７５％ＥｔＯＡｃの勾配のシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製し、１−７を綿状白色固体として得た。１−７に関するデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７５（ｍ，１Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），７．４−７．３（ｍ，２Ｈ），７．２（ｍ，１Ｈ），６．８（ｄ，１Ｈ），６．７（ｍ，２Ｈ），５．５（ｍ，１Ｈ），３．９（ｍ，１Ｈ），３．３（ｍ，１Ｈ），２．４（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＨＲＭＳ（ＥＳ）Ｃ１７Ｈ１５ＣｌＮ２Ｏ２に対する計算値Ｍ＋Ｈ：３１５．０８９５。実測値：３１５．０９０４。
【０２７３】
【化７】
2005537257.tif 000009
【０２７４】
ステップ１：テトラフルオロホウ酸２，５−ジフルオロベンゼンジアゾニウム（２−１）
テトラフルオロホウ酸ニトロソニウム（９０５ｍｇ、７．７５ｍｍｏｌ、１．００当量）を、０℃のアセトニトリル（５０ｍＬ）中の２，５−ジフルオロアニリン（０．７８０ｍＬ、７．７５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加えた。生じた混合物を１時間攪拌し、次にエチルエーテル（１５０ｍＬ）で希釈した。その沈殿物をろ過し、空気乾燥して、テトラフルオロホウ酸２，５−ジフルオロベンゼンジアゾニウム（２−１）を黄褐色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．５４（ｍ，１Ｈ），８．２４（ｍ，１Ｈ），７．９５（ｍ，１Ｈ）。
【０２７５】
ステップ２：ｔｅｒｔ−ブチル３−（２，５−ジフルオロフェニル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（２−２）
酢酸パラジウム（ＩＩ）（６７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、０．０２０当量）を、２３℃の水及び四塩化炭素（１：１、１５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（２．５９ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ、１当量）とテトラフルオロホウ酸２，５−ジフルオロベンゼンジアゾニウム（２−１、３．４２ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、１．００当量）の強く攪拌して脱酸素化した混合物に加え、生じた混合物を２０時間攪拌した。その反応混合物を濃縮し、残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７５ｍＬ）に分配した。有機層をブラインで洗い、硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。残渣をトルエン（２００ｍＬ）に溶解し、残留水の共沸除去を容易にするために、生じた溶液を真空中で濃縮した。次に２，６−ルチジン（３．５０ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ、２．００当量）及び無水トリフルオロ酢酸（１．４８ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ、０．７００当量）を、−１０℃のトルエン（１００ｍＬ）中の残渣の溶液に連続的に加えた。生じた混合物を１６時間放置して１０℃に温め、次に１時間、還流で加熱した。反応混合物を２３℃に冷却し、その後濃縮した。残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１５０ｍＬ）に分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（最初にヘキサン、ヘキサン中２０％ＥｔＯＡｃへの勾配）によって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル３−（２，５−ジフルオロフェニル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（２−２）を赤色油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）主回転異性体：δ７．０３−６．８４（ｍ，３Ｈ），６．７０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．０１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），４．４２（ｍ，１Ｈ），４．１３（ｍ，１Ｈ），３．６０（ｍ，１Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）。
【０２７６】
ステップ３：ｔｅｒｔ−ブチル４−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（２−４）
トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（５９ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、０．０２０当量）を、２３℃のアセトニトリル（７０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル３−（２，５−ジフルオロフェニル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（２−２、９００ｍｇ、３．２０ｍｍｏｌ、１当量）、テトラフルオロホウ酸ベンゼンジアゾニウム（１−３、２−３について上述した方法によって調製、６１４ｍｇ、３．２０ｍｍｏｌ、１．００当量）及び酢酸ナトリウム三水和物（１．３２ｇ、９．６０ｍｍｏｌ、３．００当量）の脱酸素化混合物に加えた。その反応混合物を１６時間攪拌し、次に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチル（２×７０ｍＬ）に分配した。併合した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（最初にヘキサン、ＥｔＯＡｃ中４０％ヘキサンへの勾配）によって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（２−４）を橙色油として得た。ＬＲＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ−ＣＨ３）実測値３４３．０、要求値３４３．１。
【０２７７】
ステップ４：４−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール（２−５）
トリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を、２３℃のジクロロメタン（５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル４−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（２−４、７００ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加えて、生じた混合物を３０分間攪拌し、その後濃縮して、４−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール（２−５）をＴＦＡ塩（褐色油）として得た。ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）２５８．１  実測値，２５８．１  要求値。
【０２７８】
ステップ５：４−（２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキサミド（２−６）
トリエチルアミン（１．３７ｍＬ、９．７９ｍｍｏｌ、５．００当量）及び塩化ジメチルカルバモイル（０．１８０ｍＬ、１．９６ｍｍｏｌ、１．００当量）を、２３℃のジクロロメタン（５０ｍＬ）中の４−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール（２−５、１．９６ｍｍｏｌ）の溶液に加え、生じた混合物を２時間攪拌して、その後濃縮した。残渣を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（７５ｍｌ）と酢酸エチル（１００ｍＬ）に分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。その残渣を逆相ＬＣ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配ｗ／０．１％ＴＦＡ存在）によって精製して、４−（２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキサミド（２−６）をオフホワイト色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３５−７．２９（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），７．０５（ｍ，１Ｈ），７．００（ｍ，１Ｈ），６．９６（ｍ，１Ｈ），６．４０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．１３（ｍ，１Ｈ），４．８８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．７，５．６，２．０Ｈｚ），４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ），２．８８（ｓ，６Ｈ）。
【０２７９】
ＬＲＭＳｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）３２９．１  実測値，３２９．１  要求値。
【０２８０】
ステップ６：４−（２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキサミドの鏡像異性体（２−７及び２−８）
キラル順相ＨＰＬＣ（Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤカラム：ヘキサン中４０％エタノール中０．１％ジエチルアミン）による４−（２，５−ジフルオロフェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキサミド（２−６）の鏡像異性体の分割により、２−７（−）及び２−８（＋）をこの溶出順序で得た。
【０２８１】
【化８】
2005537257.tif 000010
【０２８２】
ステップ１：（２Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−ヒドロキシ−２−フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（３−２）
攪拌棒を備える、火炎乾燥したフラスコに、ｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，４Ｓ）−４−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−２−フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（３−１、Ｍａｅｄａら、Ｓｙｎｌｅｔｔ  ２００１、１８０８−１８１０、７．８ｇ、２０．７ｍｍｏｌの方法によって（Ｓ）−（−）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリルから調製）及び無水アセトニトリル（２０．０ｍＬ）を加えた。生じた溶液を、Ｎ２下で攪拌しながら三フッ化水素酸トリエチルアミン（１０．１ｍＬ、６２．０ｍｍｏｌ）で処理した。反応物を４０℃で１２時間攪拌した。次にその反応物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、５％ＮａＨＣＯ３水溶液に注ぎ入れた。ガス生成の停止後、有機層を５％ＮａＨＣＯ３水溶液でさらに３回洗った。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過して、濃縮し、粗生成物を得た。ＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶化させて、（２Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−ヒドロキシ−２−フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（３−２）を白色結晶性固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）回転異性体δ７．３８−７．１８（ｍ，５Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．４２（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｄｄ，Ｊ＝１１．５，４．０Ｈｚ，１Ｈ），２．６０（ｍ，１Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ），１．５０及び１．２０（ｂｒ  ｓ，９Ｈ）；ＭＳ２０８．０  実測値，２０８．１（Ｍ−Ｃ（ＣＨ３）３）  要求値。
【０２８３】
ステップ２：（２Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−オキソ−２−フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（３−３）
攪拌棒を備える、火炎乾燥したフラスコに、−７８℃に冷却した無水ジクロロメタン１５０ｍＬを加えた。塩化オキサリル（３．８ｍＬ、４４ｍｍｏｌ）及びＤＭＳＯ（４．８ｍＬ、６１ｍｍｏｌ）を連続的に加え、その反応物を１０分間攪拌した。無水ジクロロメタン１０ｍＬ中の（２Ｓ，４Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−ヒドロキシ−２−フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（３−２、２．２８ｇ、８．７３ｍｍｏｌ）を滴下し、−７８℃で１時間攪拌した。トリエチルアミン（１２ｍＬ、８７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を１時間かけて０℃に温めた。完了後、反応物を５％ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗い、ＭｇＳＯ４で乾燥した。有機層を濃縮して、粗（２Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−オキソ−２−フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（３−３）を得た。ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで再結晶化させた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３５（ｍ，３Ｈ），７．１７（ｍ，２Ｈ），５．３８（ｍ，１Ｈ），４．０８（ｄ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｄ，Ｊ＝１９．３Ｈｚ，１Ｈ），３．１３（ｄｄ，Ｊ＝１８．８，９．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５８（ｄｄ，Ｊ＝１８．６，２．４Ｈｚ，１Ｈ），１．４０（ｂｒ  ｓ，９Ｈ）；ＭＳ２０６．０  実測値，２０６．１（Ｍ−Ｃ（ＣＨ３）３）要求値。
【０２８４】
ステップ３：（２Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−フェニル−４−｛［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ｝−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（３−４）
攪拌棒を備える、火炎乾燥したフラスコに、ケトン（２Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−オキソ−２−フェニルピロリジン−１−カルボキシレート（３−３、０．１６ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）及び無水ＴＨＦ（２ｍＬ）を加えた。生じた溶液を−７８℃に冷却し、リチウムヘキサメチルジシリルアミド（ＬＨＭＤＳ、０．６８ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ、０．６８ｍｍｏｌ）を滴下して処理した。反応物を−７８℃で１時間攪拌し、Ｎ−（５−クロロピリジン−２−イル）−１，１，１−トリフルオロ−Ｎ−［（トリフルオロメチル）トリメチルスルホニル］−メタンスルホンアミド（０．２７ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）をそのまま１回で添加した。その反応物を放置して０℃に温め、合計４時間攪拌した。反応物をＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）及びブライン（１０ｍＬ）で連続的に洗った。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過して、濃縮した。その粗残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（０〜２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配、１５分）によって精製して、（２Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−フェニル−４−｛［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ｝−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（３−４）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）主回転異性体δ７．３０（ｍ，５Ｈ），５．７２（ｍ，１Ｈ），５．４８（ｍ，１Ｈ），４．４２（ｍ，２Ｈ），１．１８（ｓ，９Ｈ）；ＭＳ３７９．０  実測値  ３７９．１（Ｍ−ＣＨ３）要求値。
【０２８５】
ステップ４：（２Ｓ）−４−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−フェニル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキサミド（３−５）
攪拌棒を備える、火炎乾燥したフラスコに、（２Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−フェニル−４−｛［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ｝−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（３−４、０．２５０ｇ、０．６３６ｍｍｏｌ）、２，５−ジフルオロフェニルボロン酸（０．２５１ｇ、１．５９ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（０．２０２ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）及びＬｉＣｌ（０．０８１ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）を加えた。その固体を４：１のＤＭＥ／Ｈ２Ｏ  ２０ｍＬに溶解し、窒素で脱気した。Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．０３７ｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を窒素下で密封し、９０℃に２時間加熱した。完了後、反応物を５％ＮａＨＣＯ３水溶液とＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）に分配し、併合した有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した。ろ過した後、有機層を濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、０から２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配）によって精製して、（２Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（２，５−ジフルオロフェニル）−２−フェニル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−カルボキシレート（３−５）を得た。スキーム１で述べたものに従ったさらなる変換により、本発明の化合物２−６を得た。
【０２８６】
【化９】
2005537257.tif 000011
【０２８７】
トランス−１Ｈ−イミダゾ［１’，５’：１，６］ピリド［３，４−ｂ］インドール−１，３（２Ｈ）−ジオン，５，６，１１，１１ａ−テトラヒドロ−２−メチル−５−（３−ヒドロキシフェニル）（４−２ａ）
ＥｔＯＨ（３ｍＬ）中のＤＬ−トリプトファン（１．５ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシベンズアルデヒド（０．９０ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）の混合物に、Ｈ２ＳＯ４水溶液（０．５Ｍ溶液１４．９ｍＬ）を加えた。反応物を１２時間５０℃に加熱した。その反応混合物を部分的に濃縮してＥｔＯＨを除去し、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）に再懸濁した。沈殿物をろ過によって収集し、真空中で乾燥した。この固体残渣の一部（０．１４ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）をアセトン（３ｍＬ）に溶解し、イソシアン酸メチルで処理した。その反応混合物をマイクロ波反応器において１５０℃で１５分間、密封容器中で加熱した。反応物を室温に冷却し、濃縮した。残渣をシリカゲルに吸収させ、３０分間にわたり２０ｍＬ／分でヘキサン中０から１００％ＥｔＯＡｃで溶出する、Ｂｉｏｔａｇｅフラッシュ４０（ｓ）カートリッジを貼付したＩＳＣＯ自動化システムで精製し、４−２ａ／４−２ｂの混合物を得た。この混合物をジエチルエーテルで粉砕して、純粋な４−２ａを得た。４−２ａに関するデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．５２（ｄ，Ｊ＝８ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝８ｈｚ，１Ｈ），７．１８（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｍ，１Ｈ），７．０７（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｍ，１Ｈ），６．７４（ｍ，２Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），４．４４（ｍ，１Ｈ），３．４３（ｍ，１Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），２．８８（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ。ＨＲＭＳ  計算値（Ｍ＋１）３４８．１２７０；実測値３４８．１３４３。
【０２８８】
【化１０】
2005537257.tif 000012
【０２８９】
（−）−４−（３−ヒドロキシフェニル）−６−メチル−２−チオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−４Ｈ−ピリミジン−５−カルボン酸エチルエステル（５−２ａ）及び（＋）−４−（３−ヒドロキシフェニル）−６−メチル−２−チオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−４Ｈ−ピリミジン−５−カルボン酸エチルエステル（５−２ｂ）
ラセミｍｏｎａｓｔｒｏｌ（５０ｍｇ、Ｔｏｃｒｉｓ）をキラルＨＰＬＣ（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤカラム５×５０ｃｍ；２０％ＥｔＯＨ／８０％（ヘキサン＋０．１％ジエチルアミン）；流速＝６０ｍＬ／分）によって分割して、（−）−鏡像異性体１−２Ａ（ＲＴ＝５７．０分）及び（＋）−鏡像異性体５−２Ｂ（ＲＴ＝７１．２分）を得た。鏡像異性体５−２Ｂをヘキサンから結晶化して、黄色固体を得た。
【０２９０】
【化１１】
2005537257.tif 000013
2005537257.tif 000014
2005537257.tif 000015
【０２９１】
ｔｅｒｔ−ブチル３−［（ベンジルアミノ）カルボニル］チエン−２−イルカルバメート（６−２）
ペンタン中のｔｅｒｔ−ブチルリチウムの溶液（１．７Ｍ、４２．５ｍＬ、７２．３ｍｍｏｌ、２．４０当量）を、−７８℃のＴＨＦ（３００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチルチエン−２−イルカルバメート（６−１、６．００ｇ、３０．１ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加えた。その反応混合物を４５分間攪拌し、次に固体ＣＯ２（約２０ｇ）を加えて、生じた混合物を０℃に温め、３０分間攪拌した。反応混合物を１Ｎ塩酸水溶液と酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）に分配した。併合した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（最初にヘキサン、１００％酢酸エチルへの勾配）によって精製し、極性分画を濃縮した。その残渣の溶液、ベンジルアミン（６．６１ｇ、６１．７ｍｍｏｌ、２．０５当量）、塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（５．９１ｇ、３０．８ｍｍｏｌ、１．０２当量）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（４．１９ｇ、３０．８ｍｍｏｌ、１．０２当量）及びＤＭＦ（１００ｍＬ）中のトリエチルアミン（８．５９ｍＬ，６１．７ｍｍｏｌ、２．０５当量）を５５℃で２４時間攪拌した。その反応混合物を濃縮し、残渣を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチル（３×１００ｍＬ）に分配した。併合した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラッシュカラム（最初にヘキサン、１００％酢酸エチルへの勾配）によって精製し、ｔｅｒｔ−ブチル３−［（ベンジルアミノ）カルボニル］チエン−２−イルカルバメート（６−２）を無色の油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３７（ｍ，５Ｈ），６．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），６．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），６．１３（ｓ，１Ｈ），４．６１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），１．５２（ｓ，９Ｈ）。
【０２９２】
Ｎ−ベンジル−２−（ブチリルアミノ）チオフェン−３−カルボキサミド（６−３）
ｔｅｒｔ−ブチル３−［（ベンジルアミノ）カルボニル］チエン−２−イルカルバメート（６−２、５００ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、０℃でＨＣｌガスによって飽和させ、生じた溶液を０℃で１時間攪拌させ、放置して２３℃に温め、１時間攪拌した。その反応混合物を濃縮し、残渣をピリジン（１０ｍＬ）に溶解した。生じた溶液を０℃に冷却し、塩化ブチリル（４２０μＬ、４．０４ｍｍｏｌ、２．６９当量）を３回の等量に分けて１時間かけて加えた。その反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチル（５０ｍＬ）に分配した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラッシュカラム（最初にヘキサン、１００％酢酸エチルへの勾配）によって精製し、Ｎ−ベンジル−２−（ブチリルアミノ）チオフェン−３−カルボキサミド（６−３）をオフホワイト色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３６（ｍ，５Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），６．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），６．２３（ｓ，１Ｈ），４．６２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），２．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．８０（ｓｅｘｔｅｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．０１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。
【０２９３】
３−ベンジル−２−プロピルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−４）
エチレングリコール（５ｍＬ）中のＮ−ベンジル−２−（ブチリルアミノ）チオフェン−３−カルボキサミド（６−３、２３０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ、１当量）と水酸化ナトリウム（３ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、０．１当量）の混合物を１３０℃で５時間加熱した。その反応混合物を放置して冷却し、半飽和塩化ナトリウム水溶液と酢酸エチル（２×７５ｍＬ）に分配した。併合した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣をフラッシュカラム（最初にヘキサン、１００％酢酸エチルへの勾配）によって精製して、３−ベンジル−２−プロピルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−４）を無色の油として得、それを放置して凝固させた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），７．３１（ｍ，３Ｈ），７．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），７．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），５．４２（ｓ，２Ｈ），２．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．７８（ｓｅｘｔｅｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），０．９７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。
【０２９４】
３−ベンジル−５，６−ジブロモ−２−（１−ブロモプロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−５）及び３−ベンジル−６−ブロモ−２−（１−ブロモプロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−６）
酢酸（２ｍＬ）中の３−ベンジル−２−プロピルチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−４、１００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、１当量）、酢酸カリウム（２０７ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、６当量）及び臭素（３３８ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、６当量）の溶液を１００℃で３時間加熱した。その反応物を濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。３０％ヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出して、３−ベンジル−５，６−ジブロモ−２−（１−ブロモプロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−５）を無色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３０（ｍ，１Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），６．１９（ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ，１Ｈ），４．８７（ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ，１Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），２．３５（ｍ，１Ｈ），２．１８（ｍ，Ｊ＝１Ｈ），０．７２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）。同じ溶離液でさらに溶出して、３−ベンジル−６−ブロモ−２−（１−ブロモプロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（２−６）を無色のゴムとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５３（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｍ，２Ｈ），７．２９（ｍ，１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），６．２１（ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ，１Ｈ），４．８８（ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ，１Ｈ），４．６２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｍ，１Ｈ），２．１８（ｍ，１Ｈ），０．７２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）。
【０２９５】
３−ベンジル−５，６−ジブロモ−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−７）
エタノール（５ｍＬ）中の３−ベンジル−５，６−ジブロモ−２−（１−ブロモプロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−５、３５ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ、１当量）及びＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（１７ｍｇ、０．１９８ｍｍｏｌ、３当量）の溶液を還流で１８時間加熱した。その反応混合物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃとブラインに分配した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、３−ベンジル−５，６−ジブロモ−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−７）を黄色のゴムとして得た。ＭＳ（Ｍ＋１）＝５２６．８。
【０２９６】
３−ベンジル−６−ブロモ−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−８）
エタノール（５ｍＬ）中の３−ベンジル−６−ブロモ−２−（１−ブロモプロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−６、３５ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ、１当量）及びＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（２１ｍｇ、０．２３７ｍｍｏｌ、３当量）の溶液を還流で１８時間加熱した。その反応混合物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃとブラインに分配した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、３−ベンジル−６−ブロモ−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−８）を黄色のゴムとして得た。ＭＳ（Ｍ＋１）＝４４９．９。
【０２９７】
Ｎ−［１−（３−ベンジル−５，６−ジブロモ−４−オキソ−３，４−ジヒドロチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）プロピル］−４−ブロモ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド（６−９）
ジクロロメタン（１ｍＬ）中の塩化４−ブロモベンゾイル（１９ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の３−ベンジル−５，６−ジブロモ−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−８、４５ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ、１当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加え、生じた反応混合物を環境条件下で１時間攪拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、次にブラインで洗い、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。その残渣を逆相ＬＣ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配ｗ／０．１％ＴＦＡ存在）によって精製して、Ｎ−［１−（３−ベンジル−５，６−ジブロモ−４−オキソ−３，４−ジヒドロチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）プロピル］−４−ブロモ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド（６−９）を無色の泡として得た。ＭＳ（Ｍ＋１）＝７０８．９。
【０２９８】
Ｎ−［１−（３−ベンジル−６−ブロモ−４−オキソ−３，４−ジヒドロチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）プロピル］−４−ブロモ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド（６−１０）
ジクロロメタン（１ｍＬ）中の塩化４−ブロモベンゾイル（１９ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の３−ベンジル−６−ブロモ−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−９、３８ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ、１当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加え、生じた反応混合物を環境条件下で１時間攪拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、次にブラインで洗い、乾燥して（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。その残渣を逆相ＬＣ（Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ勾配ｗ／０．１％ＴＦＡ存在）によって精製して、Ｎ−［１−（３−ベンジル−６−ブロモ−４−オキソ−３，４−ジヒドロチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）プロピル］−４−ブロモ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド（６−１０）を無色の泡として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５５（ｍ，３Ｈ），７．３１（ｍ，５Ｈ），７．１４（ｍ，２Ｈ），６．０４（ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９２（ｍ，１Ｈ），５．１２（ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．３７（ｍ，２Ｈ），２．０５（ｍ，４Ｈ），１．８３（ｍ，６Ｈ），０．６５（ｍ，３Ｈ）。
【０２９９】
【化１２】
2005537257.tif 000016
【０３００】
３−ベンジル−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（７−１）
酢酸エチル（５ｍＬ）中の３−ベンジル−６−ブロモ−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６−８、１７ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１当量）及び１０％Ｐｄ／Ｃの混合物を１気圧で３時間水素化した。その混合物をろ過し、ろ液を濃縮して、３−ベンジル−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（７−１）を淡黄色のゴムとして得た。ＭＳ（Ｍ＋１）＝３７１．１。
【０３０１】
Ｎ−［１−（３−ベンジル−４−オキソ−３，４−ジヒドロチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）プロピル］−４−ブロモ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド（７−２）
ジクロロメタン（１ｍＬ）中の塩化４−ブロモベンゾイル（８ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、ジクロロメタン（１ｍＬ）中の３−ベンジル−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（７−１、１３ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、１当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に加え、生じた反応混合物を環境条件下で１時間攪拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及びブラインで洗い、乾燥して（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。その残渣をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ＣＨ２Ｃｌ２から５％ＮＨ３−ＥｔＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出して、Ｎ−［１−（３−ベンジル−４−オキソ−３，４−ジヒドロチエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）プロピル］−４−ブロモ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］ベンズアミド（７−２）をオフホワイト色の泡として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３１（ｍ，５Ｈ），７．１４（ｍ，２Ｈ），６．０９（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｍ，１Ｈ），５．１０（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｍ，１Ｈ），２．０３（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｍ，１Ｈ），１．７９（ｓ，６Ｈ），０．６６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）。
【０３０２】
【化１３】
2005537257.tif 000017
【０３０３】
３−ベンジル−２−（１−｛（４−ブロモベンジル）［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（８−１）
メタノール（２０ｍＬ）中の３−ベンジル−２−（１−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（７−１、１７５ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ、１当量）及び４−ブロモベンズアルデヒド（１７４ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ、２当量）の溶液を、テトラヒドロフラン中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの溶液（１Ｍ、０．９４ｍＬ、０．９４ｍｍｏｌ、２当量）で処理した。酢酸を加えて６〜７のｐＨを得、その反応物を６０℃で１８時間温めた。酢酸でｐＨを６〜７に維持しながら、１８、４２及び６６時間後にさらなる２当量の４−ブロモベンズアルデヒド及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。６０℃で９０時間温めた後、反応物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃと飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に分配した。有機層をブラインで洗い、乾燥して（ＭｇＳＯ４）、濃縮した。その残渣をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ＥｔＯＡｃから５％ＮＨ３−ＥｔＯＨ／ＥｔＯＡｃで溶出して、３−ベンジル−２−（１−｛（４−ブロモベンジル）［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝プロピル）チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（８−１）を淡黄色のゴムとして得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４５（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），７．２１（ｍ，４Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｄｄ，Ｊ＝１１，３Ｈｚ，１Ｈ），３．５０（ｄ，Ｊ＝１４Ｈｚ，１Ｈ），２．９２（ｍ，１Ｈ），２．６１（ｍ，１Ｈ），２．２８（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｍ，１Ｈ），２．０７（ｓ，６Ｈ），１．７４（ｍ，１Ｈ），０．６４（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）。
【０３０４】
ＫＳＰモータードメイン／化合物５−２ｂのＸ線座標。
【０３０５】
【表３】
2005537257.tif 000018
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【０３０６】
ＫＳＰモータードメイン／化合物１−７のＸ線座標。
【０３０７】
【表４】
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【０３０８】
ＫＳＰモータードメイン／化合物２−７のＸ線座標。
【０３０９】
【表５】
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【０３１０】
ＫＳＰモータードメイン／化合物４−２ａのＸ線座標。
【０３１１】
【表６】
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【０３１２】
新規ＫＳＰリガンド結合部位／化合物５−２ｂのＸ線座標。
【０３１３】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【０３１４】
【図１】（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌ及びＡＤＰとの複合体（化合物５−２ｂ）中のＫＳＰの結晶からのＸ線振動回折像。
【図２】リボン描写で示したＫＳＰ−ＡＤＰ−（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌ複合体。ＫＳＰ−ＡＤＰ−（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌ（化合物５−２ｂ）複合体の構造をリボン描写で示している。ＡＤＰと化合物５−２ｂの結合コンフォメーションも、それらのそれぞれの電子密度と共に提示している。ｍｏｎａｓｔｒｏｌの活性異性体である化合物５−２ｂの位置は、前記酵素のヌクレオチド結合部位及び触媒中心からほぼ１２Å離れた、新規誘導適合部位に認められる。
【図３】α２らせんとα３らせんの間の（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌ結合。（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌ（化合物５−２ｂ）は、α２らせんとα３らせん（の挿入ループ）の間（すべてのキネシンにおいて典型的に見られる「スイッチＩ」の直前）で結合することが認められる。また、Ａｒｇ１１９、Ｔｙｒ２１１及びＴｒｐ１２７の側鎖も示している。Ａｒｇ１１９とＴｙｒ２１１残基は上方及び外側へ移動し、前記阻害因子の結合に適合するための空隙を生じる。同時に、α２らせんの挿入ループは、〜８Åの下方移動を伴ってその主鎖を再配置する；その結果として、そのＴｒｐ１２７の側鎖は〜１０Å内側に振れて、Ａｒｇ１１９及びＴｙｒ２１１の側鎖と共に誘導適合腔の入口にキャップを形成する。新たに形成されたポケットを裏打ちし、前記阻害因子を取り巻くのは、残基１１５〜１１９、１２７、１３０、１３２〜１３４、１３６、１３７、１６０、２１１、２１４、２１５、２１７、２１８、２２１及び２３９である。
【図４】リボン描写で示した二元構造と三元構造の間の比較。化合物５−２ｂのＡＤＰ−二元複合体への結合時にキネシン構造に関して認められるコンフォメーション変化は、前記阻害因子の直近に限定されない。タンパク質成分の再配列は、基本的に不変のままである前記タンパク質のヌクレオチド結合部位ならびにそのβシート構造を除いて、スイッチＩ、スイッチＩＩ及びネックリンカー領域を含む、（＋）−ｍｏｎａｓｔｒｏｌ結合時の前記酵素全体に及ぶ。
【図５】リボン描写で示したリガンド結合時のＫＳＰ構造のコンフォメーション変化。円で囲んだＫＳＰのスイッチＩ領域において、主鎖は、Ａｌａ２３０の両端でその幾何形状を有意に再適応させる。スイッチＩ領域のらせん構造は不変であるが、α３らせんのＣ末端における勾配が、三元複合体では二元複合体におけるよりも上昇している。
【図６】リボン描写で示したリガンド結合時のＫＳＰ構造のコンフォメーション変化。円で囲んだ、結合部位の反対側に位置するＫＳＰのスイッチＩＩ領域では、α４らせんのＣ末端が有意に再配置されている。ＫＳＰのスイッチＩＩ領域では、Ａｒｇ３０５付近でらせんの先端が、三元複合体では二元複合体におけるその位置から〜６Å移動している。
【図７】リボン描写で示したリガンド結合時のＫＳＰ構造のコンフォメーション変化。前記タンパク質構築物のＣ末端部分である、ＫＳＰのネックリンカー領域では、Ｌｙｓ３５７から始まるＰｈｅ３６２までの残基が、三元複合体ではＡＤＰ二元複合体におけるその位置からほぼ１８０°振れている。残基３６３−３６８は前記タンパク質内に存在するが、それらは結晶では乱れており、それ故電子密度を提供しない。ＫＳＰのネックリンカー領域を円で囲んでいる。拡大図を描いて、三元複合体におけるネックリンカー領域を二元複合体におけるものと比較している。
【図８】リガンド結合時のＫＳＰ構造のコンフォメーション変化。ＫＳＰの二元複合体と三元複合体におけるヌクレオチド結合部位を比較した拡大図。実験誤差内で、前記タンパク質のこの領域では２つの複合体についての骨格と側鎖の大部分を重ね合わせることができる。
【図９】ヒトＫＳＰのモータードメイン、アミノ酸１−３６８。
【図１０】ヒトＫＳＰの結合ポケット。
【図１１Ａ】ＫＳＰ／化合物５−２ｂの蛍光データ。化合物５−２ｂは、ＡＤＰ又はＡＭＰＰＮＰの存在下でＴｒｐ１２７の蛍光に関して用量依存的低下を示す。これらのデータは、この蛍光アッセイが潜在的ＫＳＰ阻害因子を測定するために有用であることを指示する。ヌクレオチド不在下では、５−２ｂはＴｒｐ１２７蛍光の低下を生じさせず、５−２ｂがヌクレオチド不在下ではＫＳＰに結合できないことを示唆する。
【図１１Ｂ】ＫＳＰ／化合物５−２ｂの蛍光データ。化合物５−２ｂは、ＡＤＰ又はＡＭＰＰＮＰの存在下でＴｒｐ１２７の蛍光に関して用量依存的低下を示す。これらのデータは、この蛍光アッセイが潜在的ＫＳＰ阻害因子を測定するために有用であることを指示する。ヌクレオチド不在下では、５−２ｂはＴｒｐ１２７蛍光の低下を生じさせず、５−２ｂがヌクレオチド不在下ではＫＳＰに結合できないことを示唆する。
【図１１Ｃ】ＫＳＰ／化合物５−２ｂの蛍光データ。化合物５−２ｂは、ＡＤＰ又はＡＭＰＰＮＰの存在下でＴｒｐ１２７の蛍光に関して用量依存的低下を示す。これらのデータは、この蛍光アッセイが潜在的ＫＳＰ阻害因子を測定するために有用であることを指示する。ヌクレオチド不在下では、５−２ｂはＴｒｐ１２７蛍光の低下を生じさせず、５−２ｂがヌクレオチド不在下ではＫＳＰに結合できないことを示唆する。
【図１２Ａ】ＫＳＰ／化合物８−１蛍光データ。化合物８−１は、ＡＤＰ又はＡＭＰＰＮＰの存在下でＴｒｐ１２７の蛍光に関して用量依存的低下を示す。これらのデータは、この蛍光アッセイが潜在的ＫＳＰ阻害因子を測定するために有用であることを指示する。ヌクレオチド不在下では、８−１はＴｒｐ１２７蛍光の低下を生じさせず、８−１がヌクレオチド不在下ではＫＳＰに結合できないことを示唆する。
【図１２Ｂ】ＫＳＰ／化合物８−１蛍光データ。化合物８−１は、ＡＤＰ又はＡＭＰＰＮＰの存在下でＴｒｐ１２７の蛍光に関して用量依存的低下を示す。これらのデータは、この蛍光アッセイが潜在的ＫＳＰ阻害因子を測定するために有用であることを指示する。ヌクレオチド不在下では、８−１はＴｒｐ１２７蛍光の低下を生じさせず、８−１がヌクレオチド不在下ではＫＳＰに結合できないことを示唆する。
【図１２Ｃ】ＫＳＰ／化合物８−１蛍光データ。化合物８−１は、ＡＤＰ又はＡＭＰＰＮＰの存在下でＴｒｐ１２７の蛍光に関して用量依存的低下を示す。これらのデータは、この蛍光アッセイが潜在的ＫＳＰ阻害因子を測定するために有用であることを指示する。ヌクレオチド不在下では、８−１はＴｒｐ１２７蛍光の低下を生じさせず、８−１がヌクレオチド不在下ではＫＳＰに結合できないことを示唆する。
【図１３Ａ】ＫＳＰ／化合物１−７蛍光データ。化合物１−７は、ＡＤＰ又はＡＭＰＰＮＰの存在下でＴｒｐ１２７の蛍光に関して用量依存的低下を示す。これらのデータは、この蛍光アッセイが潜在的ＫＳＰ阻害因子を測定するために有用であることを指示する。ヌクレオチド不在下では、１−７はＴｒｐ１２７蛍光の低下を生じさせず、１−７がヌクレオチド不在下ではＫＳＰに結合できないことを示唆する。
【図１３Ｂ】ＫＳＰ／化合物１−７蛍光データ。化合物１−７は、ＡＤＰ又はＡＭＰＰＮＰの存在下でＴｒｐ１２７の蛍光に関して用量依存的低下を示す。これらのデータは、この蛍光アッセイが潜在的ＫＳＰ阻害因子を測定するために有用であることを指示する。ヌクレオチド不在下では、１−７はＴｒｐ１２７蛍光の低下を生じさせず、１−７がヌクレオチド不在下ではＫＳＰに結合できないことを示唆する。
【図１３Ｃ】ＫＳＰ／化合物１−７蛍光データ。化合物１−７は、ＡＤＰ又はＡＭＰＰＮＰの存在下でＴｒｐ１２７の蛍光に関して用量依存的低下を示す。これらのデータは、この蛍光アッセイが潜在的ＫＳＰ阻害因子を測定するために有用であることを指示する。ヌクレオチド不在下では、１−７はＴｒｐ１２７蛍光の低下を生じさせず、１−７がヌクレオチド不在下ではＫＳＰに結合できないことを示唆する。
【図１４Ａ】ＫＳＰ阻害因子活性基モデル。結晶複合体の解析とさらなるコンピュータ処理から誘導した２つの活性基モデルを例示する。球は疎水基の中心を表わし、箱は水素結合受容体（ＨＡ）又は水素結合供与体（ＨＤ）のいずれかを表わす。距離はすべてÅである。
【図１４Ｂ】ＫＳＰ阻害因子活性基モデル。結晶複合体の解析とさらなるコンピュータ処理から誘導した２つの活性基モデルを例示する。球は疎水基の中心を表わし、箱は水素結合受容体（ＨＡ）又は水素結合供与体（ＨＤ）のいずれかを表わす。距離はすべてÅである。
【図１５】ＫＳＰ結合部位におけるＫＳＰ阻害因子活性基モデル。重ね合わせて、一部には図１０のアミノ酸によって規定されるＫＳＰのリガンド結合部位の地図上に示した２つの活性基モデルの概要図。関連ＫＳＰタンパク質残基だけを示している。
【図１６】ＫＳＰ阻害因子活性基モデル。結晶複合体の解析とさらなるコンピュータ処理から誘導した活性基モデルを例示する。球は疎水基の中心を表わし、箱は水素結合受容体（ＨＡ）を表わす。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2005537257.tif 000189
【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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