(57)【要約】本発明は、一般に、アレルギー過敏症患者から取り出した肥満細胞及び組織における遺伝子発現の変化に関する。本発明は、詳細には、遺伝子ＭＣ２１、ＭＣ２２、ＭＣ２５、ＭＣ３３、ＭＣ３６、及びＭＣ３９に関し、これは正常組織に比べて肥満細胞中において、又、活性化肥満細胞に比べて休止細胞において異なって発現される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子、（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸分子、（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸分子、（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を示すタンパク質をコードする単離核酸分子、及び（ｅ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５の相補体を含む単離核酸分子からなる群より選択される単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１のヌクレオチド７０〜１０４１を含む請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド７０〜１０３８からなる請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列をコードする請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項５】
ＭＣ２１の成熟タンパク質即ち配列番号２のアミノ酸残基３９〜３２３をコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
ＭＣ２１の細胞外ドメイン即ち配列番号２のアミノ酸残基３９〜２７８をコードする請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項７】
ＭＣ２１の膜貫通ドメインに近接したＭＣ２１の細胞外ドメイン即ち配列番号２のアミノ酸残基３９〜２７８をコードする請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項８】
１つ以上の発現制御エレメントと作動可能に連結している、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項９】
請求項１記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項１記載の核酸分子を含むように形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
原核宿主細胞及び真核宿主細胞からなる群より選択される請求項１１記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１記載の核酸分子で、前記核酸分子によってコードされるタンパク質が発現されるような条件下で形質転換された宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドの作製方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、原核宿主細胞及び真核宿主細胞からなる群より選択される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３記載の方法によって作製される単離ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１５記載のポリペプチドに結合する単離抗体。
【請求項１７】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の少なくとも６アミノ酸の断片を含む単離ポリペプチド、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の保存的アミノ酸置換体或いは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の天然に存在するアミノ酸配列変異体を含む単離ポリペプチド、及び、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を示す単離ポリペプチドからなる群より選択される単離ポリペプチド若しくはタンパク質。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、成熟ＭＣ２１タンパク質即ち配列番号２のアミノ酸残基３９〜３２３を含む単離ポリペプチド、配列番号２のＭＣ２１細胞外ドメインアミノ酸残基３９〜２７８を含む単離ポリペプチド、ＭＣ２１タンパク質の膜貫通ドメインに近接したＭＣ２１の細胞外ドメインを含む単離ポリペプチド、配列番号２の保存的アミノ酸置換体或いは配列番号２の天然に存在するアミノ酸配列変異体を含む単離ポリペプチド、及び、配列番号２と少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を示す単離ポリペプチドからなる群より選択された請求項１６記載の単離ポリペプチド若しくはタンパク質。
【請求項１９】
請求項１７記載のポリペプチドに結合する単離抗体。
【請求項２０】
モノクローナル又はポリクローナル抗体である請求項１９記載の抗体。
【請求項２１】
請求項１７記載のタンパク質をコードする核酸の発現を変調する作用剤を同定する方法であって、
前記核酸を発現する細胞を前記作用剤に曝露し、及び
前記作用剤が前記核酸の発現を変調するかどうかを判定し、それによって、前記タンパク質をコードする核酸の発現を変調する作用剤を同定する、
ことを含む上記方法。
【請求項２２】
請求項１７記載のタンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤を同定する方法であって、
前記タンパク質を発現する細胞を前記作用剤に曝露し、及び
前記作用剤が前記タンパク質の少なくとも１つの活性を変調するかどうかを判定し、それによって前記タンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤を同定する、
ことを含む上記方法。
【請求項２３】
前記作用剤が前記タンパク質の１つの活性を変調する請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
請求項１７記載のタンパク質の結合相手を同定する方法であって、
前記タンパク質を、可能性ある結合相手に曝露し、及び
前記可能性ある結合相手が前記タンパク質に結合するかどうかを判定し、それによってタンパク質の結合相手を同定する、
ことを含む上記方法。
【請求項２５】
請求項１７記載のタンパク質をコードする核酸の発現を変調する方法であって、前記タンパク質をコードする核酸の発現を変調する作用剤の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２６】
請求項１７記載のタンパク質の少なくとも１つの活性を変調する方法であって、前記タンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤の有効量を投与することを含む方法。
【請求項２７】
請求項１記載の核酸分子を含むように改変されている非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２８】
前記核酸分子が、コードされたタンパク質の発現を妨げる突然変異を含む請求項２７記載のトランスジェニック動物。
【請求項２９】
被験者における疾病状態を診断する方法であって、請求項１記載の核酸分子の発現レベルを決定することを含む方法。
【請求項３０】
前記疾病状態がアレルギー過敏症である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記疾病状態が季節的鼻炎である請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記疾病状態が喘息である請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
前記疾病状態が蕁麻疹又はアトピー性皮膚炎である請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
前記疾病状態が肥満細胞症である請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
請求項１記載の単離核酸分子と水性担体とを含む組成物。
【請求項３６】
被験者における疾病状態を診断する方法であって、請求項１７記載のタンパク質の発現レベルを決定することを含む方法。
【請求項３７】
前記疾病状態がアレルギー過敏症である請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記疾病状態が季節的鼻炎である請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記疾病状態が喘息である請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
前記疾病状態が蕁麻疹又はアトピー性皮膚炎である請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記疾病状態が肥満細胞症である請求項３７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：カール・ノッカ、スン・ル、クインタス・メドリー、ダニエル・トミス、及びジェシー・グ。
【０００２】
本発明は、一般に、アレルギー過敏症患者から取り出した肥満細胞及び組織における遺伝子発現での変化に関する。本発明は、詳細には、遺伝子ＭＣ２１、ＭＣ２２、ＭＣ２５、ＭＣ３３、ＭＣ３６、及びＭＣ３９に関する。これらは、正常組織に比べて肥満細胞において、又、活性化肥満細胞に比べて休止細胞において異なって発現される。
【背景技術】
【０００３】
アレルギー過敏症
アレルギー反応又は過敏症反応に特徴的な炎症応答は、花粉、埃、食物、及び環境中の化学物質などの外因性の抗原により誘発され得る。過敏症反応には主に４つのクラスがあり、これは関与する免疫細胞及び抗体のタイプ並びに生じる病理によって区別される。最も一般的なＩｇＥ依存的アレルギー反応では、炎症応答には、肥満細胞表面上のＩｇＥ分子とアレルゲンの相互作用によって引き起こされる肥満細胞の脱顆粒、即ち顆粒が空になることが関与する。肥満細胞は、上皮組織に多く存在するが、その表面上に高親和性のＩｇＥ受容体を有する。
【０００４】
吸入されたアレルゲンは、アレルギー性鼻炎、枯草熱、及び喘息などの呼吸器アレルギーを惹起するが、一方、摂取されたアレルゲンは食物アレルギーを引き起こすことがある。抗生物質や昆虫の毒液などの注入されたアレルゲンは、生命に危険を及ぼすアナフィラキシー反応を引き起こし得る。
【０００５】
成熟肥満細胞の細胞質顆粒は、ヒスタミン、ヘパリン、及びプロテアーゼなどのアレルギーメディエーターを含む。ロイコトリエンやプロスタグランジンなど新たに形成される脂質メディエーターも急速に合成され、活性化時に肥満細胞から遊離される。呼吸器系の粘膜表面上に遊離されたこれらのメディエーターは少量でも、アレルギー性鼻炎に関連した症状、例えば痒い涙眼、鼻水、及びくしゃみを引き起こす。喘息に関連した多くの症状が、肥満細胞から遊離されたメディエーターの作用に直接的に関連しているだけでなく、これらのメディエーターにより肺に補充される他の細胞を介して間接的にも関連している。大量のこれらのメディエーターが呼吸器平滑筋を収縮させ、呼吸を制限し、致命的となる可能性もあるアナフィラキシー反応を引き起こすことがある。皮膚におけるこれらのメディエーターの遊離は、浮腫、紅斑、及び膨疹形成、即ち蕁麻疹を引き起こす。
【０００６】
蕁麻疹は、中心が盛り上がり周辺領域が紅斑（発赤）している強い痒みを伴う膨疹又は丘斑の出現を特徴とする皮膚容態である。膨疹は、通常、身体の体幹及び四肢に分布するが、いずれかの上皮又は粘膜表面上にも生じ得る。蕁麻疹は、急性の場合もあり、６週間又はそれより短い期間続く場合もあり、或いは慢性の場合もある。類似しているが痒みのないびらんを有する関連した皮膚容態である血管性浮腫は、皮膚組織のより深いレベルに罹患している。人口の１０〜２０％、通常小児が、蕁麻疹又は血管性浮腫或いは両方に一度に同時に又は別々の時期に罹患していると推定されている（Ｆｒａｎｋ，Ｍ．Ｍ．、Ｃｅｃｉｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２０版、Ｂｅｎｎｅｔ及びＰｌｕｍ編、第１９章、ｐ．１４０８〜１４１２、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、フィラデルフィア、１９９６）。現在までに最も一般的で最も効果的な処置は、抗生物質又はグルココルチコイド、症例によってはエピネフリンの投与である。抗ヒスタミン剤が効果がない場合には、症状は数年間、又はさらには数十年間続く。蕁麻疹／血管性浮腫の症例の約７０％において、疾病の原因は判明していない。しかし、典型的な起源は、食物又は薬物（例えば非ステロイド抗炎症薬）に由来する摂取アレルゲン、或いは、抗甲状腺薬、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＥ自己抗体などの自己免疫型アレルゲンである。他の原因には、物理的因子、例えば熱、寒さ、気圧及び太陽が含まれる。
【０００７】
アレルギー及び喘息の処置
従来の治療化合物（例えば抗ヒスタミン剤（Ｈ１アンタゴニスト））は、ヒスタミンがＨ１受容体に結合するのを妨げる。抗ヒスタミン剤は、肥満細胞顆粒から遊離されたヒスタミンの作用を遮断するために投与し得るが、他の同時に遊離された血管作動性化合物の活性に対しては全く作用を及ぼさない。クロモリンナトリウム及びネドクロミルは、幾人かの患者において効果的であり、肥満細胞脱顆粒を遮断し得、それ故、肥満細胞からのヒスタミン並びに他のメディエーターの遊離を遮断し得る。リポキシゲナーゼ阻害剤又はロイコトリエンアンタゴニストは、特異的に、肥満細胞から遊離されたロイコトリエンの作用を遮断する。グルココルチコイド、テオフィリン、及びβ−アゴニストなど他の作用剤も、喘息の制御に重要な役割を果たしている。それらは全て、肥満細胞の発達又は活性化に対して阻害作用を及ぼすことが示された。モノクローナル抗体療法でＩｇＥを直接標的化する新しい手法が、鼻炎並びに喘息をもつ幾人かの患者において効果的であることが判明し、これらの疾病における肥満細胞に対するこのトリガーの重要性が実証された。
【０００８】
肥満細胞の機能及び活性化に関与する細胞事象及び分子事象
活性化肥満細胞内では、不活性化細胞に比べて、多くの遺伝子の発現レベルが変化していることが実証された。しかし、一般に、肥満細胞脱顆粒及び肥満細胞の再顆粒化に関連した細胞事象及び分子事象、或いは、機能的に成熟した肥満細胞に至る細胞成熟の事象及び段階については殆ど知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
多くの個々の遺伝子の発現レベルの変化が同定されているが、ヒト肥満細胞における遺伝子発現の全体的な変化の調査は報告されていない。従って、遺伝子発現レベルの変化を調査する必要性、並びに、肥満細胞の成熟、活性化、脱顆粒及び再顆粒に関連した新しい分子マーカーを同定する必要性がある。さらに、介入により成功裏にアレルギー過敏症が予防又は低減できると期待される場合、肥満細胞成熟及び活性化の初期段階を実際に評価する手段を確立する必要がある。肥満細胞活性化に関与する初期細胞事象を実際に評価する１つの方法は、その過程に唯一関連しているマーカーを同定することである。同様に、ＩｇＥにより媒介されるアレルギー反応を予防又は停止する治療薬の開発は、肥満細胞の成熟、活性化並びに脱顆粒及び再顆粒化に関与する遺伝子の同定に依拠する。
【００１０】
本発明は、ＩｇＥ受容体を介して活性化される肥満細胞において異なって発現されている新しい遺伝子ファミリーの発見に基づく。これらは、非肥満細胞個体群又は全組織に比べて、休止肥満細胞において高レベルの発現を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列をコードする単離核酸分子、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の少なくとも６アミノ酸の断片をコードする単離核酸分子、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５を含む核酸分子の相補体にハイブリダイズする単離核酸分子、及び配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズする単離核酸分子からなる群より選択された単離核酸分子を含む。本発明の核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に対して少なくとも約３５％、４０％、５０％、６０％、又は６５％のアミノ酸配列同一性、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に対して好ましくは少なくとも約７０％又は７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードし得る。
【００１２】
本発明はさらに、単離核酸分子を含むベクターを含む、１つ以上の発現制御エレメントに作動可能に連結した核酸分子を含む。本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むように形質転換された宿主細胞、並びに、タンパク質が発現されるような条件下で本発明の核酸分子で形質転換された宿主細胞を培養することを含むタンパク質の作製方法を含む。
【００１３】
本発明はさらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の少なくとも６アミノ酸の機能的又は抗原性断片を含む単離ポリペプチド、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の保存的アミノ酸置換体を含む単離ポリペプチド、及び、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の天然に存在するアミノ酸変異体を含む単離ポリペプチドからなる群より選択された単離ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは又、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示した配列に対して少なくとも約３５％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、又は７５％のアミノ酸配列同一性；配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示した全長配列に対してより好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明はさらに、モノクローナル及びポリクローナル抗体を含む、本発明のポリペプチドに特異的に結合する単離抗体又は抗原結合断片を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、核酸を発現する細胞を作用剤に曝露すること、及び、作用剤が前記核酸の発現を変調するかどうかを判定し、それによって、前記タンパク質をコードする核酸の発現を変調する作用剤を同定することを含む、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現を変調する作用剤を同定する方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、前記タンパク質を発現する細胞を作用剤に曝露すること、及び、前記作用剤が前記タンパク質の少なくとも１つの活性を変調するかどうかを判定し、それによって、前記タンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤を同定することを含む、本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤を同定する方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、前記タンパク質を可能性ある結合相手に曝露すること、及び、可能性ある結合相手が前記タンパク質に結合するかどうかを判定し、それによって、タンパク質の結合相手を決定することを含む、本発明のタンパク質の結合相手を同定する方法を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、前記タンパク質をコードする核酸の発現を変調する作用剤の有効量を投与することを含む、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現を変調する方法を提供する。本発明は又、前記タンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤の有効量を投与することを含む、本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性を変調する方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、本発明のコードされたポリペプチドの発現が妨げられるように、本発明の核酸分子又は突然変異核酸分子を含むように改変された非ヒトのトランスジェニック動物を含む。
【００２０】
本発明はさらに、本発明の核酸分子又は本発明のポリペプチドの発現レベルを決定することを含む、ＩｇＥによって媒介される過敏症、蕁麻疹、又は肥満細胞症の状態を診断する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
Ｉ．一般的説明
本発明は、一部には、肥満細胞で高度に発現されているが、他の細胞型又は組織では発現が少ない、新しい遺伝子ファミリーの同定に基づく。この遺伝子ファミリーは、配列番号１のヒトｃＤＮＡに対応する。配列番号２のヒトタンパク質をコードする遺伝子は、他の動物種、特に哺乳動物種にも見出され得る。
【００２２】
ＭＣ２１は、最初は、配列番号２のアミノ酸残基１〜３８に及ぶシグナルペプチドを含んでコードされている。成熟ＭＣ２１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸残基３９〜３２３に及ぶ膜貫通タンパク質である。成熟ＭＣ２１の細胞外ドメインは、配列番号２のおよそアミノ酸残基４２〜１６１におけるＶセットＩｇドメイン（シアル酸に結合している場合がある）及びおよそアミノ酸１６２〜２５４におけるＣ２免疫グロブリンドメインを含む。ＭＣ２１の膜貫通ドメインは、配列番号２のおよそアミノ酸残基２７９〜３０１に見出され、ＭＣ２１は、配列番号２のおよそアミノ酸３０２〜３２３に短い細胞質尾部を有する。ＭＣ２１が、配列番号２のアミノ酸２９０位の膜貫通ドメイン内にリジン残基を有することは特筆すべきであり、これは膜貫通ドメイン内で別のタンパク質ドメインと会合しているタンパク質に共通した特徴である。ＭＣ２１オープンリーディングフレームの一部又は全てを含む、３つのｃＤＮＡ、ＢＡ４、ＢＤ９、及びＯＢ４が同定されている。ＯＢ４は、他の２つのｃＤＮＡクローンに比べて５’側が伸長されており、ＭＣ２１オープンリーディングフレーム全体を含む。
【００２３】
本発明はさらに、肥満細胞で高度に発現されるが、他の細胞型又は組織では発現が少ない、他の新しい遺伝子を含む。これらの遺伝子は、配列番号４のポリペプチドをコードする、ＭＣ２２．１（配列番号３）と称されるヒトｃＤＮＡ配列、配列番号６のポリペプチドをコードする、ＭＣ２２．２（配列番号５）、配列番号８のポリペプチドをコードするＭＣ２５（配列番号７）、配列番号１０のポリペプチドをコードするＭＣ３３（配列番号９）、配列番号１２のポリペプチドをコードするＭＣ３６（配列番号１１）、配列番号１４のポリペプチドをコードするＭＣ３９（最初のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、配列番号１３）、及び、配列番号１６のポリペプチドをコードするＭＣ３９（第二のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、配列番号１５）に対応する。前記のヒトタンパク質をコードする遺伝子は又、他の動物種、特に哺乳動物種にも見出され得る。
【００２４】
ＭＣ２２は、ここではＭＣ２２．１（配列番号３）及びＭＣ２２．２（配列番号５）と称される２つのスプライス変異体を有し、ラットタンパク質であるトモシン（ｔｏｍｏｓｙｎ）のヒト相同分子種であり、８９％の同一性を有する。トモシンは、神経伝達物質放出過程で複合体を形成するシンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）−１−結合タンパク質である（Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．ら（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ  ２０（５）：９０５−９１５）。
【００２５】
ＭＣ２１、ＭＣ２２、ＭＣ２５、ＭＣ３３、ＭＣ３６、及びＭＣ３９は、個別に、又は、群の少なくとも２つのメンバーの組合せでマーカーとして使用して、患者におけるアレルギー応答を検出、診断、又は同定し得る。ＭＣ２１、ＭＣ２２、ＭＣ２５、ＭＣ３３、ＭＣ３６、及びＭＣ３９は、個別に、又は、群の少なくとも２つのメンバーの組合せでマーカーとして使用して、肥満細胞活性化状態を検出、決定、又は同定、即ち、肥満細胞が活性化状態にあるのか、それとも休止状態にあるのかも決定し得る。前記タンパク質は又、遺伝子若しくはタンパク質の発現若しくは活性を変調する作用剤の標的として作用できる。例えば、蕁麻疹に至る肥満細胞脱顆粒を含む、肥満細胞機能に関連した生物学的過程を変調する作用剤を同定し得る。
【００２６】
ＩＩ．特定の実施形態
Ａ．肥満細胞再顆粒化及び／又は過敏症に関連するタンパク質
本発明は、単離タンパク質、前記タンパク質の対立遺伝子変異体、及び前記タンパク質の保存的アミノ酸置換体を含む。本明細書に使用したような「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、一部、配列番号２に示したヒトアミノ酸配列を有するタンパク質であるＭＣ２１又はその断片；スプライス変異体ＭＣ２２．１（配列番号４に示したヒトアミノ酸配列を有するタンパク質又はその断片）及びＭＣ２２．２（配列番号６に示したヒトアミノ酸配列を有するタンパク質又はその断片）を含む、ＭＣ２２；配列番号８に示したヒトアミノ酸配列を有するタンパク質であるＭＣ２５又はその断片；配列番号１０に示したヒトアミノ酸配列を有するタンパク質であるＭＣ３３又はその断片；配列番号１２に示したヒトアミノ酸配列を有するタンパク質であるＭＣ３６又はその断片；或いは、最初のオープンリーディングフレーム（配列番号１４に示したヒトアミノ酸配列を有するタンパク質又はその断片）及び第２のオープンリーディングフレーム（配列番号１６に示したヒトアミノ酸配列を有するタンパク質又はその断片）を含む、ＭＣ３９を意味する。この語は又、明確に前記に列挙したものとは僅かに異なるアミノ酸配列を有する、天然に存在する対立遺伝子変異体及びタンパク質を意味する。対立遺伝子変異体とは、前記に列挙したものとは僅かに異なるアミノ酸配列を有するが、これらのタンパク質に関連した同じ又は類似の生物学的機能を依然として有するものである。
【００２７】
本明細書においては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のヒトアミノ酸配列に関連したタンパク質ファミリーは、一部では、ヒトの他に、生物から単離しておいたタンパク質をも意味する。これらのタンパク質に関連するタンパク質ファミリーの他のメンバーを同定及び単離するのに使用される方法を下記に述べる。
【００２８】
本発明のタンパク質は、好ましくは、単離形である。本明細書においては、タンパク質は、物理的、機械的、又は化学的方法を使用して、通常タンパク質と会合している細胞構成成分からタンパク質を取り出した場合に、単離したと言う。当業者は、単離タンパク質を得るために、容易に標準的な精製法を使用できる。
【００２９】
本発明のタンパク質はさらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の挿入、欠失、保存的アミノ酸置換又はスプライス変異体を含む。本明細書においては、保存的変異体とは、前記タンパク質の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を意味する。置換、挿入又は欠失は、変化した配列がタンパク質に関連した生物学的機能を妨げる又は破壊する場合に、前記タンパク質に悪影響を及ぼすと言う。例えば、前記タンパク質の全体的荷電、構造、又は疎水性／親水性特性は、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく改変することができる。従って、アミノ酸配列を、前記タンパク質の生物活性に悪影響を及ぼすことなく変化させて、例えば、ペプチドをより疎水性又は親水性にすることができる。
【００３０】
通常、対立遺伝子変異体、保存的置換変異体、及びタンパク質ファミリーのメンバーは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に示された全長配列に対して少なくとも約３５％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、又は７５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９７％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。このような配列に関する同一性又は相同性は、本明細書では、配列をアラインし、必要な場合にはギャップを導入して、最大相同率を達成した後に、どの保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、既知のペプチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基の比率として定義する（関連するパラメータについてはＢ章を参照されたい）。融合タンパク質、或いはペプチド配列へのＮ−末端、Ｃ−末端若しくは内部伸長、欠失、又は挿入は、相同性に影響を及ぼすとは解釈しない。
【００３１】
従って、本発明のタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６に開示したアミノ酸配列を有する分子；好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の連続配列を有する、少なくとも約６若しくは１０、１５若しくは２０、又は２５若しくは３０のアミノ酸残基、より好ましくは３５若しくは４０のアミノ酸残基、さらに好ましくは４５若しくは５０のアミノ酸残基、さらに好ましくは５５若しくは６０、さらに好ましくは６５若しくは７０のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも７５以上のアミノ酸残基のその断片；１つ以上のアミノ酸残基が、開示コード配列のＮ末端若しくはＣ末端に、又はその内部に挿入されている、アミノ酸配列変異体；及び、少なくとも１つの残基で置換されている、開示配列のアミノ酸配列変異体、或いは上記で定義したようなそれらの断片を含む。このような断片は、ペプチド又はポリペプチドとも称され、抗原性領域、既知のタンパク質ドメインに対応するアミノ酸配列の領域として同定されたタンパク質の機能的領域、並びに、親水性の顕著な領域を含み得る。前記領域は、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（オックスフォードモレキュラー（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ））などの一般的に利用可能なタンパク質配列解析ソフトウェアを使用することにより全て容易に同定可能である。
【００３２】
本発明のタンパク質はさらに、シグナル配列を含まない成熟ＭＣ２１タンパク質を含む。例えば、本発明は、配列番号２のおよそアミノ酸残基３９〜３２３からなる又は含む、ポリペプチドを含む。本発明によって包含されるＭＣ２１タンパク質の断片は又、膜貫通ドメインに付着しているが、シグナルペプチド又は細胞質尾部は含まない、細胞外ドメインを含む。例えば、本発明は、配列番号２のおよそアミノ酸残基３９〜３０１からなる又は含む、ポリペプチドを含む。本発明は又、実質的に前記タンパク質の細胞外ドメインからなる、可溶形のＭＣ２１を含む。例えば、本発明は、配列番号２のおよそアミノ酸残基３９〜２７８からなる又は含む、ポリペプチドを含む。本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸欠失、付加、又は置換を有する、成熟ＭＣ２１タンパク質及びその断片の変異体、改変形又は突然変異形を含む。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、保存的置換のように、ＭＣ２１の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を変化させることなく、サイレントであることがある。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は又、ＭＣ２１の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を破壊又は除去することもある。さらに、前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、ＭＣ２１の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を増強又は消失させることもある。
【００３３】
本発明のタンパク質はさらに、ＭＣ２２．１ポリペプチドを含む。例えば、本発明は、配列番号４のおよそアミノ酸残基１〜１１５１からなる又は含むポリペプチドを含む。本発明はさらに、配列番号４のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、付加、又は置換を有する、ＭＣ２２．１タンパク質及びその断片の変異体、改変形、又は突然変異形を含む。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、保存的置換のように、ＭＣ２２．１の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を変化させることなく、サイレントであることがある。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は又、ＭＣ２２．１の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を破壊又は除去することもある。さらに、前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、ＭＣ２２．１の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を増強又は消失させることもある。
【００３４】
本発明のタンパク質はさらに、ＭＣ２２．２ポリペプチドを含む。例えば、本発明は、配列番号６のおよそアミノ酸残基１〜１１１５からなる又は含むポリペプチドを含む。本発明はさらに、配列番号６のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、付加、又は置換を有する、ＭＣ２２．２タンパク質及びその断片の変異体、改変形又は突然変異形を含む。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、保存的置換のように、ＭＣ２２．２の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を変化させることなく、サイレントであることがある。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は又、ＭＣ２２．２の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を破壊又は除去することもある。さらに、前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、ＭＣ２２．２の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を増強又は消失させることもある。
【００３５】
本発明のタンパク質はさらに、ＭＣ２５タンパク質を含む。例えば、本発明は、配列番号８のおよそアミノ酸残基１〜１２５９からなる又は含むポリペプチドを含む。本発明はさらに、配列番号８のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、付加、又は置換を有する、ＭＣ２５タンパク質及びその断片の変異体、改変形又は突然変異形を含む。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、保存的置換のように、ＭＣ２５の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を変化させることなく、サイレントであることがある。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は又、ＭＣ２５の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を破壊又は除去することもある。さらに、前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、ＭＣ２５の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を増強又は消失させることもある。
【００３６】
本発明のタンパク質はさらに、ＭＣ３３タンパク質を含む。例えば、本発明は、配列番号１０のおよそアミノ酸残基１〜３５０からなる又は含むポリペプチドを含む。本発明はさらに、配列番号１０のアミノ酸配列に対するアミノ酸の欠失、付加、又は置換を有する、ＭＣ３３タンパク質及びその断片の変異体、改変形又は突然変異形を含む。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、保存的置換のように、ＭＣ３３の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を変化させることなく、サイレントであることがある。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は又、ＭＣ３３の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を破壊又は除去することもある。さらに、前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、ＭＣ３３の生物学的及び／又は免疫学的機能もしくは特性を増強又は消失させることもある。
【００３７】
本発明のタンパク質はさらに、ＭＣ３６タンパク質を含む。例えば、本発明は、配列番号１２のおよそアミノ酸残基１〜３９８からなる又は含むポリペプチドを含む。本発明はさらに、配列番号１２のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、付加、又は置換を有する、ＭＣ３６タンパク質及びその断片の変異体、改変形又は突然変異形を含む。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、保存的置換のように、ＭＣ３６の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を変化させることなく、サイレントであることがある。前記のアミノ酸の置換、付加、又は置換は又、ＭＣ３６の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を破壊又は除去することもある。さらに、前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、ＭＣ３６の生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を増強又は消失させることもある。
【００３８】
本発明のタンパク質はさらに、ＭＣ３９の第一ＯＲＦポリペプチドによりコードされるポリペプチドを含む。例えば、本発明は、配列番号１４のおよそアミノ酸残基１〜１０７からなる又は含むポリペプチドを含む。本発明はさらに、配列番号１４のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、付加、又は置換を有する、ＭＣ３９の第一ＯＲＦポリペプチド及びその断片の変異体、改変形又は突然変異形を含む。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、保存的置換のように、ＭＣ３９の第一ＯＲＦポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を変化させることなく、サイレントであることがある。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は又、ＭＣ３９の第一のＯＲＦポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を破壊又は除去することもある。さらに、前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、ＭＣ３９の第一ＯＲＦポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を増強又は消失させることもある。
【００３９】
本発明のタンパク質はさらに、ＭＣ３９の第二ＯＲＦポリペプチドによりコードされるポリペプチドを含む。例えば、本発明は、配列番号１６のおよそアミノ酸残基１〜８３からなる又は含むポリペプチドを含む。本発明はさらに、配列番号１６のアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、付加、又は置換を有する、ＭＣ３９の第二ＯＲＦポリペプチド及びその断片の変異体、改変形、又は突然変異形を含む。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、保存的置換のように、ＭＣ３９の第二ＯＲＦポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を変化させることなく、サイレントであることがある。前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は又、ＭＣ３９の第二ＯＲＦポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を破壊又は除去することもある。さらに、前記のアミノ酸の欠失、付加、又は置換は、ＭＣ３９の第二ＯＲＦポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的機能若しくは特性を増強又は消失させることもある。
【００４０】
企図されている変異体はさらに、例えば相同的組換え、部位特異的又はＰＣＲ変異誘発による所定の突然変異を含むもの、並びに、ウサギ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ及び非ヒト霊長類種を含むがこれに限定されない他の動物種の対応するタンパク質、並びに、タンパク質ファミリーの対立遺伝子変異体又は他の天然に存在する変異体、並びに、タンパク質が、置換、化学的、酵素的に、又は天然アミノ酸以外の部分（例えば酵素又は放射性同位体などの検出可能な部分）を用いた他の適切な手段によって共有結合で修飾されている誘導体を含む。
【００４１】
下記に述べるように、このタンパク質ファミリーのメンバーは、（１）診断マーカーとして、（２）前記のタンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤を同定するために、（３）タンパク質の結合相手を同定するために、（４）ポリクローナル又はモノクローナル抗体を産生する抗体として、又（５）治療剤又は標的として使用できる。
【００４２】
Ｂ．核酸分子
本発明はさらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６を有するタンパク質及び本明細書に記載した関連タンパク質をコードする、好ましくは単離形の核酸分子を含む。本明細書においては、「核酸」とは、前記に定義したようなタンパク質又はペプチドをコードするか、このようなペプチドをコードする核酸配列に相補的であるか、このような核酸にハイブリダイズして、適切なストリンジェントな条件下で安定にそれに結合したままであるか、或いは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の全長ペプチド配列に対して、少なくとも約３５％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、又は７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９７％、又は９９％以上の同一性を共有するポリペプチドをコードする、ＲＮＡ又はＤＮＡ又は関連分子として定義される。本発明の「核酸分子」はさらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５のヌクレオチド配列又は本明細書に定義したオープンリーディングフレームの全長に対して、少なくとも約７０％又は７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは９５％、９７％、９９％以上の同一性を共有する核酸分子を含む。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びアンチセンス分子、並びに、天然源に由来するものであれ合成されたものであれ、代替骨格に基づくか若しくは代替塩基を含む核酸が、特に企図されている。しかし、このような核酸はさらに、本発明に記載のタンパク質をコードするか、適切なストリンジェントな条件下で前記タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズするか、又は前記核酸に相補的であるものを含めて、あらゆる従来技術の核酸と比べて新規でありかつ自明でないものとして定義される。
【００４３】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列レベルにおける相同性又は同一性は、配列類似性探索のために作製された、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９−３４０２（１９９７）及びＫａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）、共に、参照によりその全体を組み込む）によって使用されるアルゴリズムを使用したＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（基本的局所アラインメント探索ツール））解析によって決定する。ＢＬＡＳＴプログラムで使用する手法は、最初に、ギャップを含めて及び含めずに、照会配列とデータベース配列の間で類似のセグメントを考慮し、次いで、同定された全てのマッチの統計学的有意性を評価し、最後に、予め選択した有意性閾値を満たすマッチのみを要約するものである。配列データベースの類似性探索における基本的問題の考察については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９４）（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６、１１９−１２９）を参照されたい。これを参照によりその全体を組み込む。ｈｉｓｔｏｇｒａｍ、ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ、ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ｅｘｐｅｃｔ（データベース配列に対するマッチを報告するための統計学的有意性閾値）ｃｕｔｏｆｆ、ｍａｔｒｉｘ及びｆｉｌｔｅｒ（複雑さの低い）の探索パラメータは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘで使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、長さが８５（ヌクレオチド塩基又はアミノ酸）を超える照会配列に推奨される、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９、１０９１５−１０９１９、参照によりその全体を組み込む）である。
【００４４】
ｂｌａｓｔｎでは、スコアリングマトリックスは、Ｍ（即ち１対のマッチング残基に対するリワードスコア）とＮ（即ちミスマッチ残基に対するペナルティースコア）の比によって設定され、Ｍ及びＮのデフォルト値はそれぞれ＋５及び−４である。４つのｂｌａｓｔｎパラメータを以下のように調整した：Ｑ＝１０（ギャップ生起ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（照会配列に沿って各ｗｉｎｋ位置毎にワードヒットを生成する）；ｇａｐｗ＝１６（その中でギャップを入れたアラインメントが生成される、ウィンドウ幅を設定する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメータ設定はＱ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；及びｇａｐｗ＝３２であった。Ａｃｃｅｌｒｙのウィスコンシンパッケージバージョン１０．２で利用可能な配列間のギャップ比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生起ペナルティ）及びＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用し、タンパク質比較における等価な設定はＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２である。
【００４５】
「ストリンジェントな条件」とは、（１）低いイオン強度及び高い温度、例えば０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ及び５０℃を洗浄に使用する、又は（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭのＮａＣｌと７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドを４２℃で使用する条件を含む。別の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波をかけたサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストラン中４２℃でのハイブリダイゼーションであり、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で４２℃で洗浄する。当業者は、明瞭で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得るに適したストリンジェントな条件を容易に決定及び変化させることができる。好ましい分子は、前記の条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５の相補体にハイブリダイズし、機能的タンパク質をコードする分子である。さらに好ましいハイブリダイズする分子は、前記条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５のオープンリーディングフレームの相補鎖にハイブリダイズする分子である。
【００４６】
本明細書においては、核酸分子は、それが、他のポリペプチドをコードする混入核酸分子とは実質的に分離されている場合に「単離」されていると言う。
【００４７】
本発明はさらに、核酸分子の断片を提供する。本明細書においては、コード核酸分子の断片とは、全タンパク質コード配列の小部分を意味する。断片のサイズは目的の用途によって決まる。例えば、断片を、タンパク質の活性部分がコードされるように選択する場合、前記断片は、前記タンパク質の機能的領域（群）をコードするに十分大きい必要がある。例えば、予測抗原性領域に対応するペプチドをコードする断片を調製し得る。断片を、核酸プローブ又はＰＣＲプライマーとして使用する場合、断片の長さは、プロービング／プライミング中に偽陽性が比較的少数となるように選択する（Ｈ章の考察を参照）。
【００４８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプローブ又は特異的プライマーとして使用する、又は本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するための本発明の核酸分子の断片（即ち合成オリゴヌクレオチド）は、化学的技術により、例えばＭａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３、３１８５−３１９１）のホスホトリエステル法により、又は自動合成法を使用して容易に合成できる。さらに、遺伝子の種々のモジュラーセグメントを規定するオリゴヌクレオチド群を合成し、その後、オリゴヌクレオチドをライゲートして、完全な改修遺伝子を構築するなどの公知の方法により、より大きなＤＮＡセグメントを容易に調製できる。
【００４９】
本発明の核酸分子は、診断及びプローブ目的で検出可能な標識を含むようにさらに修飾し得る。種々のこのような標識が当技術分野で既知であり、本明細書に記載されたコード分子と共に容易に使用することができる。適切な標識には、ビオチン、放射能標識ヌクレオチドなどが含まれるがこれに限定されない。当業者は、本発明の核酸分子の標識変異体を得るために、任意のこのような標識を容易に使用することができる。
【００５０】
ヌクレオチド配列の欠失、付加、又は改変による核酸分子の一次構造の改変は、コードされているタンパク質の活性を破壊することなく行うことができる。このような置換又は他の改変により、本発明の企図する範囲内に含まれるアミノ酸配列を有するタンパク質が得られる。
【００５１】
Ｃ．他の関連する核酸分子の単離
前記で述べたように、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５を有する核酸分子の同定及び特徴づけにより、当業者は、本明細書に記載した配列の他に、前記タンパク質ファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子を単離することが可能となる。
【００５２】
例えば、当業者は容易に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列を使用して、抗体プローブを作製し、適切な細胞から調製した発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。典型的には、（下記で述べるような）精製タンパク質で免疫化したウサギなどの哺乳動物由来のポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を使用して、哺乳動物ｃＤＮＡ又はゲノム発現ライブラリー（例えばラムダｇｔｌｌライブラリー）をプロービングして、前記タンパク質ファミリーの他のメンバーの適切なコード配列を得ることができる。クローニングされたｃＤＮＡ配列は、融合タンパク質として発現できるか、それ自体の制御配列を使用して直接発現でき、又は、酵素の発現に使用される特定の宿主に適した制御配列を使用した構築物によって発現できる。
【００５３】
別法として、本明細書に記載したコード配列の一部分を合成し、プローブとして使用して、任意の哺乳動物生物由来のタンパク質ファミリーのメンバーをコードするＤＮＡを取り出すことができる。約１８〜２０ヌクレオチド（約６〜７アミノ酸鎖長をコードする）を含むオリゴマーを調製し、これを使用して、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、ストリンジェントな条件下又は過大なレベルの偽陽性を排除するのに十分にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行う。
【００５４】
さらに、オリゴヌクレオチドプライマー対を調製して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用し、コード核酸分子を選択的にクローニングすることができる。このようなＰＣＲプライマーを使用する上でのＰＣＲ変性／アニール／伸長サイクルは当技術分野で公知であり、他のコード核酸分子の単離に使用できるように容易に適合させることができる。
【００５５】
このタンパク質ファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子は又、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）；ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｚｈａｎｇら（１９９８）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３９８６−３９９０）、３Ｄ−ＰＳＳＭ（Ｋｅｌｌｙら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９９（２）：４９９−５２０）；及び他のコンピューター解析法（Ｓｈｉら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６２（１）：１３２−８及びＭａｔｓｕｎａｍｉら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４（６７７８）：６０１−４を含むがこれに限定されない任意の利用可能なコンピューター法を使用して既存のゲノム又は他の配列情報中で同定し得る。
【００５６】
Ｄ．核酸分子を含むｒＤＮＡ
本発明はさらに、コード配列を含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を含む。本明細書においては、ｒＤＮＡ分子とは、ｉｎ  ｓｉｔｕで分子操作にかけておいたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子の作製法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「分子クローニング−実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。好ましいｒＤＮＡ分子では、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列及び／又はベクター配列に作動可能に連結している。
【００５７】
本発明の配列をコードするタンパク質ファミリーの１つが作動可能に連結しているベクター及び／又は発現制御配列の選択は、当技術分野では公知のように、望まれる機能的特性、例えばタンパク質発現、並びに、形質転換する宿主細胞に直接依存する。本発明で、企図しているベクターは、少なくとも、複製又は宿主染色体への挿入を指示でき、好ましくはｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の発現も指示できるものである。
【００５８】
作動可能に連結したタンパク質をコードする配列の発現を調節するのに使用される発現制御エレメントは、当技術分野で既知であり、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、及び他の調節エレメントを含むがこれに限定されない。好ましくは、誘導性プロモーターは、宿主の細胞培地中の栄養分に応答するなど、容易に制御される。
【００５９】
一実施形態において、コード核酸分子を含むベクターは、原核レプリコン、即ち形質転換された、細菌宿主細胞などの原核宿主細胞において、染色体外で組換えＤＮＡ分子の自律的複製及び維持を指示できる能力を有するＤＮＡ配列を含む。このようなレプリコンは当技術分野で公知である。さらに、原核レプリコンを含むベクターは又、その発現によって薬剤耐性などの検出マーカーが付与される遺伝子も含み得る。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【００６０】
原核レプリコンを含むベクターはさらに、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主細胞においてコード遺伝子配列の発現（転写及び翻訳）を指示できる原核又はバクテリオファージプロモーターを含むことができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能とし、転写を可能とするＤＮＡ配列によって形成される発現制御エレメントである。細菌宿主に適合性をもつプロモーター配列が、一般に、本発明のＤＮＡセグメントを挿入するための好都合な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。このようなベクタープラスミドの典型例は、バイオラッドラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州リッチモンド）から入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、及びｐＢＲ３２９、ファルマシア（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）から入手可能なｐＰＬ及びｐＫＫ２２３である。
【００６１】
真核細胞に適合性のある発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合性のある発現ベクターも又、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を形成するのに使用することができる。ウイルスベクターを含む、真核細胞発現ベクターは当技術分野で公知であり、いくつかの業者から入手できる。一般に、所望のＤＮＡセグメントを挿入するための好都合な制限部位を含むこのようなベクターが提供される。このようなベクターの典型例は、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０（ファルマシア、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（インターナショナルバイオテクノロジーズ社、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ番号３１２５５）、本明細書に記載のベクターｐＣＤＭ８、及び類似の真核発現ベクターである。
【００６２】
本発明のｒＤＮＡ分子の構築に使用する真核細胞発現ベクターはさらに、真核細胞で効果的な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含み得る。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現によりネオマイシン耐性が得られる遺伝子、即ちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である。（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１、３２７−３４１）。別法として、選択マーカーは別のプラスミド上に存在でき、宿主細胞の同時トランスフェクションにより２つのベクターが導入され、選択マーカーに適した薬物中で培養することにより選択される。
【００６３】
Ｅ．外来的に供給されたコード核酸分子を含む宿主細胞
本発明はさらに、本発明のタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を含む。宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。本発明のタンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞系が、細胞培養法と適合性があり、発現ベクターの増殖及び遺伝子産物の発現に適合性がある限り、限定されない。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、及び哺乳動物細胞、好ましくは、マウス、ラット、サル、又はヒト細胞系に由来するものなどの脊椎動物細胞が含まれるがこれに限定されない。好ましい真核宿主細胞としては、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、及び類似の真核組織培養細胞系が含まれる。
【００６４】
任意の原核宿主を使用して、本発明のタンパク質をコードするｒＤＮＡ分子を発現できる。好ましい原核宿主はＥ．ｃｏｌｉである。
【００６５】
適切な細胞宿主の本発明のｒＤＮＡ分子による形質転換は、一般に使用するベクターのタイプ及び使用する宿主系に依存する公知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、一般に電気穿孔法及び塩処理法が使用される。例えばＣｏｈｅｎら、（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９、２１１０；及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「分子クローニング−実験マニュアル」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレスを参照されたい。ｒＤＮＡを含むベクターを用いた脊椎動物細胞の形質転換に関しては、一般に電気穿孔法、カチオン脂質又は塩処理法が使用される。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌ．５２、４５６；Ｗｉｇｌｅｒら、（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６、１３７３−１３７６を参照されたい。
【００６６】
形質転換に成功した細胞、即ち、本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、選択マーカーによる選択を含めて公知の技術により同定できる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入によって得られた細胞をクローニングして、単一コロニーを生成できる。これらのコロニーに由来する細胞を収集し、溶解し、そのＤＮＡ含有物を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３、１９７５又はＢｅｒｅｎｔら、（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８に記載のような方法を使用してｒＤＮＡの有無について、又は、免疫学的方法によりアッセイした細胞から作製したタンパク質について調べた。
【００６７】
Ｆ．ｒＤＮＡ分子を使用した組換えタンパク質の産生
本発明はさらに、本明細書に記載した核酸分子を使用して本発明のタンパク質を産生させる方法を含む。一般的に、組換え形のタンパク質の産生は、以下のステップを含む：
【００６８】
最初に、本発明のタンパク質をコードする核酸分子、例えば、配列番号１を含む、実質的にそれからなる、若しくはそれからなる核酸分子、又は配列番号１のヌクレオチド７０〜１０３８（又は１０４１）で定義されるオープンリーディングフレーム；配列番号３を含む、実質的にそれからなる、若しくはそれからなる核酸分子、又は配列番号３のヌクレオチド１〜３４５３（又は３４５６）で定義されるオープンリーディングフレーム；配列番号５を含む、実質的にそれからなる、若しくはそれからなる核酸分子、又は配列番号５のヌクレオチド１〜３３４５（又は３３４８）で定義されるオープンリーディングフレーム；配列番号７を含む、実質的にそれからなる、若しくはそれからなる核酸分子、又は配列番号７のヌクレオチド３１７〜４０９３（又は４０９６）で定義されるオープンリーディングフレーム；配列番号９を含む、実質的にそれからなる、若しくはそれからなる核酸分子、又は配列番号９のヌクレオチド１〜１０５０（又は１０５３）で定義されるオープンリーディングフレーム；配列番号１１を含む、実質的にそれからなる、若しくはそれからなる核酸分子、又は配列番号１１のヌクレオチド１〜１１９４（又は１１９７）で定義されるオープンリーディングフレーム；配列番号１３を含む、実質的にそれからなる、若しくはそれからなる核酸分子、又は配列番号１３のヌクレオチド１〜３２１（又は３２４）で定義されるオープンリーディングフレーム；配列番号１５を含む、実質的にそれからなる、若しくはそれからなる核酸分子、又は配列番号１５のヌクレオチド９〜２５７（又は２６０）で定義されるオープンリーディングフレームを得る。コード配列が、これらのオープンリーディングフレームのようにイントロンによって中断されていない場合、任意の宿主で発現するのに直接適している。
【００６９】
その後、核酸分子を、前記で述べたように、適切な制御配列と作動可能に連結するように配置して、タンパク質オープンリーディングフレームを含む発現単位を形成する。この発現単位を使用して適切な宿主を形質転換し、形質転換された宿主を、組換えタンパク質の産生が可能となる条件下で培養する。場合によっては、組換えタンパク質を培地から又は細胞から単離する。若干の不純物が許容されるいくつかの場合にはタンパク質の回収及び精製は必要でないこともある。
【００７０】
前記の各ステップは、種々の方法で実施できる。例えば、所望のコード配列をゲノム断片から得て、適切な宿主で直接使用し得る。種々の宿主内で作動可能な発現ベクターの構築は、前記に示したような、適切なレプリコン及び制御配列を使用して達成される。制御配列、発現ベクター、及び形質転換法は、遺伝子の発現に使用する宿主細胞のタイプに依存し、先に詳細に論じた。適切な制限部位が普通に得られない場合は、コード配列の末端にそれを付加して、これらのベクターを挿入するための切断可能な遺伝子を提供できる。当業者は、組換えタンパク質を産生させるために本発明の核酸分子と共に使用できるように、当技術分野で既知の任意の宿主／発現系を容易に適合させることができる。
【００７１】
Ｇ．結合相手を同定する方法
本発明の別の実施形態は、本発明のタンパク質の結合相手を単離及び同定する方法を含む。「結合相手」の表現により、本発明は、ＭＣ２１、ＭＣ２２．１、ＭＣ２２．２、ＭＣ２５、ＭＣ３３、ＭＣ３６、又はＭＣ３９に特異的に結合するリガンド又は受容体を含む。さらに、結合相手は又、膜貫通ドメイン内で、配列番号２の２８２、２９２、２９３、２９４、２９６、２９８、又は３０１位の少なくとも１つのＬｙｓ残基を介して会合しているタンパク質ドメインを含む。
【００７２】
一般に、本発明のタンパク質を、可能性あるタンパク質結合相手と本発明のタンパク質の会合が可能な条件下で、可能性ある結合相手又は細胞の抽出物若しくは画分と混合する。混合後、本発明のタンパク質と会合するようになったペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は他の分子を混合物から分離する。その後、本発明のタンパク質に結合した結合相手を取り出し、さらに解析できる。
【００７３】
結合相手を同定及び単離するために、タンパク質全体、例えば配列番号２の全アミノ酸配列を含む、又は、シグナルペプチドを含まない成熟ＭＣ２１タンパク質の配列を含むタンパク質を使用できる。例えば、配列番号２のおよそアミノ酸残基３９〜３２３からなる又は含むタンパク質又はポリペプチドを使用できる。さらに、配列番号４のおよそアミノ酸残基１〜１１５１、配列番号６の１〜１１１５、配列番号８の１〜１２５９、配列番号１０の１〜３５０、配列番号１２の１〜３９８、配列番号１４の１〜１０７、又は配列番号４の１〜８３からなる又は含むタンパク質又はポリペプチドも使用できる。別法として、好ましくは少なくとも約２５又は３０アミノ酸残基の連続配列、より好ましくは少なくとも約３５又は４０アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも約４５又は５０アミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも約５５又は６０、さらに好ましくは少なくとも約６５又は７０アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも約７５以上のアミノ酸残基を有するタンパク質の断片を使用できる。さらに、ＭＣ２１の少なくとも細胞外ドメインを含む又はＭＣ２１の少なくとも細胞外及び膜貫通ドメインを含む、タンパク質の断片を使用して、結合相手を同定及び単離できる。例えば、配列番号２のおよそアミノ酸残基３９〜２７８又は３９〜３０１からなる又は含む断片を使用して、結合相手を同定及び単離できる。
【００７４】
本明細書においては、細胞抽出物とは、溶解又は破壊された細胞から作成された調製物又は画分を意味する。細胞抽出物の好ましい供給源は、ヒト皮膚組織若しくはヒト気道から得られた細胞、又は、アレルギー過敏症患者のヒト肺組織の生検試料から得られた細胞である。又は、細胞抽出物は、正常組織又は入手可能な細胞系、特に顆粒球細胞系から調製してもよい。
【００７５】
種々の方法を使用して細胞の抽出物を得ることができる。細胞は、物理的又は化学的破壊法を使用して破壊できる。物理的破壊法の例には、超音波及び機械的剪断が含まれるがこれに限定されない。化学的溶解法の例には、洗浄剤による溶解及び酵素による溶解が含まれるがこれに限定されない。当業者は、本発明の方法に使用するための抽出物が得られるように、細胞抽出物の調製法を容易に適合させることができる。
【００７６】
細胞の抽出物が調製されると、抽出物を、タンパク質と結合相手の会合が生じることができる条件下で、本発明のタンパク質と混合する。種々の条件が使用できるが、最も好ましい条件は、ヒト細胞の細胞質に見られる条件に近似した条件である。使用する細胞抽出物のモル浸透圧濃度、ｐＨ、温度、濃度などの特徴は、タンパク質と結合相手の会合が最適となるように変えることができる。
【００７７】
適切な条件下で混合した後、結合した複合体を混合物から分離する。種々の技術を利用して混合物を分離することができる。例えば、本発明のタンパク質に特異的な抗体を使用して、結合相手複合体を免疫沈降できる。別法として、クロマトグラフィーや密度／沈降遠心分離などの標準的な化学分離技術を使用できる。
【００７８】
抽出物に見られる会合していない細胞構成成分を除去した後、結合相手を、通常の方法を使用して複合体から解離できる。例えば、解離は、混合物の塩濃度又はｐＨを変化させることにより達成できる。
【００７９】
会合した結合相手対を混合抽出物から分離する助けとして、本発明のタンパク質を固相支持体上に固定できる。例えば、前記タンパク質をニトロセルロースマトリックス又はアクリル酸ビーズに付着できる。タンパク質の固相支持体への付着は、ペプチド／結合相手対を、抽出物に見られる他の構成成分から分離する助けとなる。同定される結合相手は、単一のタンパク質、又は、２つ以上のタンパク質からなる複合体であり得る。又は、結合相手は、Ｔａｋａｙａｍａら（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：１７１−１８４又はＳａｕｄｅｒら、（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：９９１−９９６の手順に従ってＦａｒ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して同定し得、又は、エピトープでタグ標識したタンパク質又はＧＳＴ融合タンパク質の使用により同定し得る。
【００８０】
別法として、本発明の核酸分子は、酵母ツーハイブリッドシステムで使用できる。酵母ツーハイブリッドシステムは、他のタンパク質相手対を同定するのに使用され、本明細書に記載の核酸分子が使用できるように容易に適合させることができる。
【００８１】
Ｈ．肥満細胞脱顆粒又はアレルギー過敏症に関連する遺伝子をコードする核酸の発現を変調する作用剤を同定する方法
本発明の別の実施形態は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列を有するタンパク質などの本発明のタンパク質をコードする核酸の発現を変調する作用剤を同定する方法を含む。このようなアッセイは、本発明の核酸発現レベルの変化をモニタする任意の利用可能な手段を利用し得る。本明細書においては、作用剤は、細胞における核酸の発現をアップ又はダウンレギュレートできる場合に、本発明の核酸の発現を変調すると言う。
【００８２】
１つのアッセイ形式において、配列番号１のヌクレオチド７０〜１０４１で定義されるオープンリーディングフレーム、及び／又は５’及び／又は３’調節エレメントと任意のアッセイ可能な融合相手との間のリポーター遺伝子融合物を含む細胞系を調製し得る。別法として、同じ、又は別の、又は関連したアッセイ形式において、配列番号３のヌクレオチド１〜３４５３、配列番号５のヌクレオチド１〜３３４５、配列番号７のヌクレオチド３１７〜４０９３、配列番号９のヌクレオチド１〜１０５０、配列番号１１のヌクレオチド１〜１１９４、配列番号１３のヌクレオチド１〜３２１、又は配列番号１５のヌクレオチド９〜２５７で定義されるオープンリーディングフレーム、及び／又は５’及び／又は３’調節エレメントと、任意のアッセイ可能な融合相手との間のリポーター遺伝子融合物を含む細胞系を調製し得る。ホタルルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含めて（Ａｌａｍら（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８、２４５−２５４）、数多くのアッセイ可能な融合相手が既知であり、容易に入手可能である。その後、リポーター遺伝子融合物を含む細胞系を、適切な条件及び時間の下で、試験すべき作用剤に曝露する。作用剤に曝露した試料と対照試料の間のリポーター遺伝子の発現の差異により、本発明の核酸の発現を変調する作用剤が同定される。
【００８３】
他のアッセイ形式を使用して、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６を有するタンパク質など、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現を変調する作用剤の能力をモニタし得る。例えば、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸へのハイブリダイゼーションにより直接モニタし得る。細胞系を、適切な条件及び時間の下で試験すべき作用剤に曝露し、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）分子クローニング−実験マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレスに開示されているような標準的な手順により単離する。
【００８４】
作用剤に曝露した細胞と対照細胞の間のＲＮＡ発現レベルの差を検出するためのプローブは、本発明の核酸から調製し得る。高ストリンジェントな条件下で標的核酸のみにハイブリダイズするプローブを設計することが好ましいが、必ずしもそうする必要はない。高度に相補的な核酸ハイブリッドのみが、高ストリンジェントな条件下で形成される。従って、アッセイ条件の厳密さにより、ハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖の間に存在すべき相補性の量が決定される。厳密さは、プローブ：標的のハイブリッドと、プローブ：非標的ハイブリッドの間の安定性の差異が最大化となるように選択するべきである。
【００８５】
プローブは、当技術分野で既知の方法により、本発明の核酸から設計され得る。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含量及びプローブ長は、プローブのその標的配列に対する結合に影響を及ぼし得る。プローブ特異性を最適化するための方法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）分子クローニング−実験マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス又はＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）「分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．から得られる。
【００８６】
ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌらにより記載された方法などの既知の方法を使用して、各プローブの必要に応じて改変する。全細胞ＲＮＡ又はポリＡ  ＲＮＡを富化させたＲＮＡのハイブリダイゼーションは、任意の入手可能な形式で達成できる。例えば、全細胞ＲＮＡ又はポリＡ  ＲＮＡを富化させたＲＮＡを固相支持体に付着させ、固相支持体を、プローブが特異的にハイブリダイズする条件下で、本発明の配列の少なくとも１つ、若しくは１つの一部分を含む、少なくとも１つのプローブに曝露できる。別法として、本発明の配列の少なくとも１つ、若しくは１つの一部を含む核酸断片を、シリコンチップ又は多孔性ガラスウェハなどの固相支持体に付着させることができる。その後、ウェハを、付着させた配列が特異的にハイブリダイズする条件下で、試料由来の全細胞ＲＮＡ又はポリＡ  ＲＮＡに曝露できる。このような固相支持体及びハイブリダイゼーション法は幅広く利用可能であり、例えばＢｅａｔｔｉｅ、（１９９５）第ＷＯ９５／１１７５５号に開示されたものが挙げられる。特定のプローブが、非処理細胞個体群由来の及び作用剤に曝露した細胞固体群由来のＲＮＡ試料に特異的にハイブリダイズする能力について調べることにより、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６の配列を有するタンパク質をコードする核酸の発現をアップ又はダウンレギュレートする作用剤を同定する。
【００８７】
ｍＲＮＡの定性的及び定量的解析のためのハイブリダイゼーションは、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（即ちＲＰＡ、Ｍａら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０、２７３−２３８を参照）を使用することにより実施し得る。簡潔には、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡ及びファージ特異的ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）を含む発現ビヒクルを、ファージプロモーターの下流のｃＤＮＡ分子の３’末端において線形化し、ここでのこのような線形化分子を、続いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によるｃＤＮＡの標識アンチセンス転写物の合成の鋳型として使用する。その後、標識転写物を８０％ホルムアミド、４０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．４、０．４Ｍ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中、４５ＥＣで一晩インキュベートすることにより、単離ＲＮＡ（即ち全又は分画ｍＲＮＡ）の混合物にハイブリダイズする。その後、得られたハイブリッドを、４０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ及び２μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼを含む緩衝液中で消化する。外来性タンパク質を失活及び抽出した後、試料を、解析のために尿素／ポリアクリルアミドゲル上に載せる。
【００８８】
別のアッセイ形式において、まず、本発明の遺伝子産物を生理学的に発現する、細胞又は細胞系を同定する。このようにして同定した細胞及び／又は細胞系は、転写装置の変調の忠実度が、適切な表面形質導入機序及び／又は細胞質ゾルカスケードを有する作用剤の外来的接触に関しても維持されるような、必要な細胞機構を含むものと予想される。さらに、このような細胞又は細胞系を、この遺伝子産物に特有である、１つ以上の抗原性断片に融合したこの遺伝子産物をコードする構造遺伝子の作動可能な非翻訳５’プロモーター含有末端を含む、発現ビヒクル（例えばプラスミド又はウイルスベクター）構築物で形質導入又はトランスフェクトする。前記断片は、前記プロモーターの転写制御下にあり、分子量が天然ポリペプチドとは区別できるポリペプチドとして発現され、又は、免疫学的に特徴的なタグ又は他の検出マーカーをさらに含み得る。このようなプロセスは当技術分野で公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照）。
【００８９】
その後、前記に概略を示したように形質導入又はトランスフェクトした細胞又は細胞系を、適切な条件下で作用剤と接触させる。例えば、製薬上許容される賦形剤中の作用剤を、生理的ｐＨのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理的ｐＨのイーグルス平衡塩溶液（ＢＳＳ）、血清を含むＰＢＳ若しくはＢＳＳ、又はＰＢＳ若しくはＢＳＳを含むならし培地、及び／又は３７ＥＣでインキュベートした血清などの生理的緩衝水溶液中の細胞と接触させる。前記条件は、当業者が必要と考えるように変調し得る。細胞を作用剤に接触させた後、前記細胞を破壊し、溶解液のポリペプチドを、ポリペプチド画分がプールされるように分画し、抗体と接触させて、免疫学的アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、免疫沈降、又はウェスタンブロット）によりさらに処理する。「作用剤に接触させた」試料から単離したタンパク質のプールを、賦形剤のみを細胞と接触させた対照試料と比較し、対照と比較した「作用剤に接触させた」試料からの免疫学的に発生したシグナルの増加又は減少を使用して、作用剤の効力を識別する。
【００９０】
Ｉ．肥満細胞脱顆粒及び／又はアレルギー過敏症に関連したタンパク質のレベル又は前記タンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤を同定する方法
本発明の別の実施形態は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列を有するタンパク質などの、本発明のタンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤を同定する方法を含む。このような方法又はアッセイは、所望の活性をモニタ又は検出する任意の手段を利用し得る。
【００９１】
１つの形式において、曝露されていない対照細胞個体群と比較した、試験する作用剤に曝露しておいた細胞個体群の間の本発明のタンパク質の相対量をアッセイし得る。この形式において、特異的抗体などのプローブを使用して、異なる細胞個体群におけるタンパク質の異なる発現をモニタする。細胞系又は個体群を、適切な条件及び時間の下で、試験する作用剤に曝露する。細胞溶解液を、曝露した細胞系又は個体群、及び、対照の非曝露細胞系又は個体群から調製し得る。その後、細胞溶解液をプローブを用いて解析する。
【００９２】
本発明のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が十分な長さである場合、又は、免疫原性を増強することが所望されるか、若しくは必要とされる場合に、適切な担体に結合させた（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）、本発明のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を使用して、適切な免疫化プロトコルで、適切な哺乳動物宿主を免疫化することにより抗体プローブを調製する。ＢＳＡ、ＫＬＨ、又は他の担体タンパク質などの担体を用いて免疫原性コンジュゲートを調製する方法は当技術分野で公知である。状況によっては、例えばカルボジイミド試薬を使用した直接的コンジュゲートが効果的であることもあるが、他の場合では、ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード）から供給されるような連結試薬が、ハプテンを利用するために望ましいこともあり得る。ハプテンペプチドは、システイン残基を用いてアミノ末端又はカルボキシ末端において伸長でき、又は、例えば担体への連結を容易にするためにシステイン残基を散在させることもできる。免疫原の投与は、一般に、一般的に当技術分野で理解されているように、適切な期間にわたり適切なアジュバントを使用して注射により行われる。免疫化スケジュール中に、抗体力価を測定して、抗体形成が十分かどうか判定する。
【００９３】
このように作製されたポリクローナル抗血清はいくつかの適用において満足のいくものであることもあるが、医薬組成物にはモノクローナル調製物の使用が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞系は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的な方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）  ２５６：４９５−４９７）又は一般的に知られているように、リンパ球若しくは脾臓細胞の不死化をもたらす改変を使用して調製し得る。所望の抗体を分泌する不死化細胞系を、抗原がペプチドハプテン、ポリペプチド又はタンパク質である免疫アッセイによりスクリーニングする。所望の抗体を分泌している適切な不死化細胞培養液を同定した場合、細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は腹水液中での産生により培養できる。
【００９４】
その後、所望のモノクローナル抗体を、培養上清から又は腹水上清から回収する。免疫学的に重要な部分を含むモノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清の断片を、アンタゴニスト並びに無傷抗体として使用できる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２断片などの免疫学的に反応性の抗体断片の使用が、特に治療の点で好ましいことが多い。なぜなら、これらの断片は、一般に、免疫グロブリン全体よりも免疫原性が低いからである。
【００９５】
抗体又は断片は又、現在の技術を使用して、組換え手段により作製し得る。タンパク質の所望の領域に特異的に結合する抗体領域は又、ヒト化抗体などの、複数の種に由来するキメラの状況で産生できる。抗体は、本明細書に記載の任意の方法で使用し得、診断剤として使用しても、治療剤として使用し得る。
【００９６】
前記の方法でアッセイされる作用剤は、無作為に選択でき、又は理論的に選択若しくは設計できる。本明細書においては、作用剤は、本発明のタンパク質のみ、又はその会合する基質、結合相手などとの会合に関与する特定の配列を考慮することなく無作為に選択した場合、無作為に選択したと言う。無作為に選択した作用剤の例は、化学ライブラリー又はペプチドコンビナトリアルライブラリー、又は生物の増殖ブロスの使用である。
【００９７】
本明細書においては、作用剤は、その作用剤を、標的部位の配列及び／又は作用剤の作用に関連したそのコンフォメーションを考慮に入れて無作為でなく選択した場合に、合理的に選択又は設計したと言う。作用剤は、これらの部位を構成するペプチド配列を利用することにより、合理的に選択又は合理的に設計できる。例えば、合理的に選択したペプチド剤は、アミノ酸配列が任意の機能的コンセンサス部位と同一であるか、又はその誘導体であるペプチドであり得る。
【００９８】
本発明の作用剤は、例えば、ペプチド、小分子、ビタミン誘導体、並びに炭水化物であり得る。優性阻害の（ドミナントネガティブな）タンパク質、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ、これらのタンパク質に対する抗体、これらのタンパク質のペプチド断片、又はこれらのタンパク質の模倣体を、細胞に導入して、機能に影響を及ぼし得る。本明細書においては、「模倣体」とは、親ペプチドとは化学的に異なるが、親ペプチドに組織分布上及び機能的に類似している構造を与える、ペプチド分子の一領域又は数個の領域の改変を意味する（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ：Ｍｅｙｅｒｓ（編）「分子生物学及びバイオテクノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（ニューヨーク、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）ｐ．６５９−６６４を参照）。当業者は、本発明の作用剤の構造的性質に関して制限はないことを容易に認識できる。
【００９９】
本発明のペプチド剤は、当技術分野で既知のように、標準的な固相（又は液相）ペプチド合成法を使用して調製できる。さらに、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、商業的に入手可能なオリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成し得、標準的な組換え産生システムを使用して組換え産生し得る。固相ペプチド合成を使用した作製は、遺伝子をコードしていないアミノ酸を含める場合に必要である。
【０１００】
本発明の別のクラスの作用剤は、本発明のタンパク質のクリティカルな位置と免疫反応性のある抗体である。抗体剤は、適切な哺乳動物被験者を、抗原性領域として、前記のような抗体によって標的化される予定のタンパク質部分を含む、ペプチドで免疫化することにより得られる。
【０１０１】
Ｊ．タンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤の使用
実施例に提供するように、本発明のタンパク質及び核酸、例えば配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のアミノ酸配列を有するタンパク質は、肥満細胞脱顆粒及び／又はアレルギー過敏疾患状態中に異なって発現される。タンパク質の少なくとも１つの活性のアゴニスト又はアンタゴニストなど、タンパク質又は作用剤の発現を変調又はアップ若しくはダウンレギュレートする作用剤を使用して、タンパク質の機能及び活性に関連した生物学的及び病理的過程を変調し得る。
【０１０２】
本明細書においては、被験者は、哺乳動物が、本発明のタンパク質によって媒介される病理的又は生物学的過程の変調を必要とする限り、任意の哺乳動物であり得る。哺乳動物なる語は、哺乳綱に属する個体と定義される。本発明は特に、ヒト被験者の処置に有用である。
【０１０３】
病的過程は、有害な作用を生じる生物学的過程の一カテゴリーを意味する。例えば、本発明のタンパク質の発現は、アレルギー過敏症に関連し得る。本明細書においては、作用剤は、前記作用剤が過程の程度又は重度を低減する場合に、病的過程を変調すると言う。例えば、何らかの方法で本発明のタンパク質の発現を又は前記タンパク質の少なくとも１つの活性をアップ若しくはダウンレギュレート又は変調する作用剤の投与により、アレルギー過敏症を予防し得、又は疾病進行を変調し得る。
【０１０４】
本発明の作用剤は、単独で、又は、特定の病的過程を変調する他の作用剤と組み合わせて提供できる。例えば、本発明の作用剤は、他の既知の薬物と組み合わせて投与できる。本明細書においては、２種の作用剤は、その２種の作用剤を同時に投与、又は、それらの作用剤が同時に作用するような様式で独立的に投与した場合に、組み合わせて投与したと言う。
【０１０５】
本発明の作用剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、又は頬側経路により投与できる。その代わりに、又はそれと併せて、投与は経口経路であり得る。投与する用量は、レシピエントの年齢、健康、及び体重、併用処置を行う場合はその種類、処置頻度、及び所望の作用の性質に依存する。
【０１０６】
本発明はさらに、本発明のタンパク質の発現又は前記タンパク質の少なくとも１つの活性を変調する作用剤を１種以上含む組成物を提供する。個体の必要性は変化するが、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当業者の技量の範囲内である。典型的な用量は、０．１〜１００μｇ／ｋｇ（体重）である。好ましい用量は、０．１〜１０μｇ／ｋｇ（体重）である。最も好ましい用量は、０．１〜１μｇ／ｋｇ（体重）である。
【０１０７】
薬理的に活性な作用剤の他に、本発明の組成物は、活性化合物を、作用部位に送達するために製薬上使用できる調製物へと加工するのを容易にする、賦形剤及び補助剤を含む、適切な製薬上許容される担体を含み得る。非経口投与に適切な製剤としては、水溶形の活性化合物の水溶液、例えば水溶性塩が含まれる。さらに、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与し得る。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドが含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、及び／又はデキストランを含み得る。場合によっては、懸濁液は安定剤を含み得る。リポソームも、細胞に送達するための作用剤を封入するのに使用できる。
【０１０８】
本発明に記載の全身投与用の医薬製剤は、経腸、非経口、又は局所投与用に製剤し得る。実際に、３種全てのタイプの製剤を同時に使用して、活性成分の全身投与を達成し得る。
【０１０９】
経口投与に適した製剤には、硬若しくは軟ゼラチンカプセル、丸剤、錠剤（コーティング錠を含む）、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、又は吸入剤、及びその放出制御形が含まれる。
【０１１０】
本発明の方法を実施するに際して、本発明の化合物を、単独で又は組み合わせて、或いは、他の治療剤若しくは診断剤と組み合わせて使用し得る。いくつかの好ましい態様において、本発明の化合物は、抗ヒスタミン剤など一般的に受け入れられている医学的慣行に従ってこれらの容態に一般に処方される他の化合物と共に同時投与し得る。本発明の化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、通常はヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、及びマウスなどの哺乳動物で、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用できる。
【０１１１】
Ｋ．トランスジェニック動物
好ましくは少なくとも約２５又は３０アミノ酸残基、より好ましくは３５又は４０アミノ酸残基、さらに好ましくは４５又は５０アミノ酸残基、さらに好ましくは５５又は６０、さらに好ましくは６５又は７０アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも７５以上のアミノ酸残基の連続配列を有する、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５のｃＤＮＡ配列、或いは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６のポリペプチド配列若しくはその断片をコードするオープンリーディングフレームに対応する突然変異、ノックアウト、又は改変遺伝子を含む、トランスジェニック動物も本発明に含まれる。トランスジェニック動物は、組換え、外来性、又はクローン化された遺伝子材料が実験的に導入されている、遺伝子的に改変された動物である。このような遺伝子材料は、しばしば「導入遺伝子」と呼ばれる。導入遺伝子の核酸配列、この場合、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５の形式を、その特定の核酸配列が普通ならその導入遺伝子の通常の遺伝子座には見出されない、ゲノムの遺伝子座に組み込み得る。導入遺伝子は、標的動物の種と同じ種の、又はその種とは異なる種のゲノムから得られた核酸配列からなり得る。
【０１１２】
「生殖細胞系トランスジェニック動物」なる語は、遺伝的改変又は遺伝子情報が生殖細胞系列に導入され、それによって、トランスジェニック動物が遺伝子情報を子孫に伝達する能力が付与された、トランスジェニック動物を意味する。このような子孫が、実際に、その改変又は遺伝子情報の一部又は全部を保有している場合、それらもトランスジェニック動物である。
【０１１３】
この改変又は遺伝子情報は、レシピエントが属する動物種にとって外来的であり、特定の個々のレシピエントにとってのみ外来的であり得、又は、レシピエントがすでに保有している遺伝子情報であり得る。最後の場合、改変された又は導入された遺伝子は、天然遺伝子とは異なって発現され得る。
【０１１４】
トランスジェニック動物は、トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、胚幹細胞における遺伝子標的化、組換えウイルス及びレトロウイルス感染を含む、多種多様な異なる方法により作製できる（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；米国特許第５，６０２，３０７号；Ｍｕｌｌｉｎｓら、（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２２、６３０−６３３；Ｂｒｅｎｉｎら（１９９７）Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６、９９−１１０；Ｔｕａｎ（１９９７）「組換え遺伝子発現プロトコル、分子生物学の方法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【０１１５】
数多くの組換え又はトランスジェニックマウスが作製されており、これには、活性化発癌遺伝子配列を発現するもの（米国特許第４，７３６，８６６号）；  サルＳＶ４０Ｔ抗原を発現するもの（米国特許第５，７２８，９１５号）；インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）の発現が欠失したもの（米国特許第５，７３１，４９０号）；ドーパミン作動性機能不全を示すもの（米国特許第５，７２３，７１９号）；血圧コントロールに関与する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するもの（米国特許第５，７３１，４８９号）；自然に存在するアルツハイマー病に存在する容態に対して極めて類似性を示すもの（米国特許第５，７２０，９３６号）；細胞接着を媒介する能力の減少したもの（米国特許第５，６０２，３０７号）；ウシ成長ホルモン遺伝子を有するもの（Ｃｌｕｔｔｅｒら、（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４３、１７５３−１７６０）；又は、完全なヒト抗体応答を生じることのできるもの（ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９７）Ｌａｎｃｅｔ  ３４９、４０５）が含まれる。
【０１１６】
マウス及びラットが依然として、大半のトランスジェニック実験において選択される動物であるが、場合によっては、代わりの動物種を使用することが好ましい又は必要でさえある。トランスジェニック手順は、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、雌ウシ、及びモルモットを含む、多種多様な非ネズミ動物において成功裏に利用されている（例えばＫｉｍら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６、５１５−５２６；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（１９９５）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．３５、６０９−６１７；Ｐｅｔｔｅｒｓ（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６、６４３−６４５；Ｓｃｈｎｉｅｋｅら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８、２１３０−２１３３；及びＡｍｏａｈ（１９９７）Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７５、５７８−５８５を参照）。
【０１１７】
核酸断片を組換えに適格な哺乳動物細胞に導入する方法は、複数の核酸分子の同時形質転換に有利な任意の方法であり得る。トランスジェニック動物を作製する詳細な手順は、米国特許第５，４８９，７４３号及び米国特許第５，６０２，３０７号の開示を含めて、当業者には容易に入手可能である。
【０１１８】
Ｌ．診断法及び診断剤
本発明の遺伝子及びタンパク質を使用して、アレルギー過敏症、季節的鼻炎、喘息、アトピー性皮膚炎、及び肥満細胞症を診断又はモニタし得、又は、疾病の進行を追跡し得る。本発明の核酸分子又はタンパク質を使用してアレルギー過敏症を診断する１つの手段は、生存している被験者由来の皮膚、肺、又は気管組織から細胞を得るものである。可能なら、粘膜分泌物、尿、血液、又は末梢リンパ球試料を、アッセイの組織試料として使用し得る。
【０１１９】
分子生物学的ツールの使用は、法医学技術において日常的になりつつある。例えば、核酸プローブを使用して、法医学／病理標本における、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、又は１５の配列全部又は少なくとも一部を含む核酸分子の発現を決定し得る。さらに、核酸アッセイを、転写プロファイリング解析を実施する任意の手段により実施し得る。核酸解析の他に、本発明の法医学的方法は、遺伝子のアップ又はダウンレギュレーションを決定するために、本発明のタンパク質、特に配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、又は１６を含むタンパク質を標的とし得る（Ｓｈｉｖｅｒｉｃｋら（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ３９３、１２４−１３３）。
【０１２０】
本発明の方法は、組織を細胞溶解させるための、コラゲナーゼ又は他のプロテアーゼによる組織の処理を含み得る（Ｓｅｍｅｎｏｖら、（１９８７）Ｂｉｕｌｌ  Ｅｋｓｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  １０４、１１３−１１６）。さらに、解析のために、皮膚、気管、又は肺の種々の領域から生検試料を得ることが可能である。
【０１２１】
本発明の核酸又はタンパク質分子を検出するためのアッセイは、任意の利用可能な形式であり得る。核酸分子についての典型的なアッセイには、ハイブリダイゼーション又はＰＣＲに基づいた形式が含まれる。本発明のタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの検出のための典型的なアッセイには、ｉｎ  ｓｉｔｕ結合アッセイなど、任意の利用可能な形式における抗体プローブの使用が含まれる。Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、（１９８８）「抗体−実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレスを参照されたい。好ましい実施形態において、アッセイは、適切な対照を用いて実施する。
【０１２２】
前記の方法は又、他の組織又は臓器における、例えば遺伝子発現が検出される組織における疾病状態を検出するためのプロトコル及び方法を含む、他の診断プロトコルにも使用し得る。
【０１２３】
さらに説明を行わずとも、当業者は、前記の説明及び以下の例示的実施例を使用して、本発明の化合物を作製及び利用でき、特許請求の範囲に記載の方法を実践できると考えられる。それ故、以下の作業実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであり、残りの開示をいかなる形でも限定するものとは理解すべきではない。
【実施例１】
【０１２４】
肥満細胞における異なって発現されるＭＣ２１ｍＲＮＡの同定
肥満細胞において異なって発現又は調節される遺伝子を同定するために、ｍＲＮＡを、培養ヒト肥満細胞、単離造血細胞、及び正常なヒト組織から単離し、電気的ノザンアッセイで使用して、ヒトゲノム由来の一連の標的配列をプロービングした。ＡＦ１５０１４３（ＭＣ２１；配列番号１）の発現強度を、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ９５Ｋチップセットを使用して、組織及び細胞培養のパネルで測定した。平均発現強度を図１に示す。各平均値に含まれるデータ点の数を、組織名の右に括弧内に示す。肥満細胞試料を６週間培養し、その後、指定したように収集又は処理した。Ｒｅｓｔ＝非処理。Ａｃｔ＝ＩｇＥ及び抗原により活性化して３時間後。Ｄｅｘ＝１０−７Ｍのデキサメタゾンによる処理の２４時間後。Ｉｌ−４＝１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４による処理の５日後。Ｔ細胞ｓｔｉｍ＝ＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体による刺激。
【実施例２】
【０１２５】
異なって発現されるｍＲＮＡ種に対応する全長ヒトｃＤＮＡのクローニング
配列番号１を有する全長ｃＤＮＡを、溶液ハイブリダイゼーション法により得た。簡潔に述べると、遺伝子特異的オリゴを、実施例１に同定したＥＳＴ断片の配列に基づいて設計した。このオリゴをビオチンで標識し、これを使用して、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手したＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）キットの手順に従って、ヒト休止肥満細胞ライブラリー由来の単鎖プラスミドＤＮＡ（ｃＤＮＡ組換え体）５μｇとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたｃＤＮＡを、ストレプトアビジンとコンジュゲートさせたビーズにより分離し、ＴＥ緩衝液により溶出した。溶出したｃＤＮＡを二本鎖プラスミドＤＮＡに変換し、これを使用してＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＤＨα５）を形質転換した。
【０１２６】
前記で検出された異なって調節されるｍＲＮＡに対応する全長ヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号１に示す。このｃＤＮＡは１５９６塩基対を含み、ヌクレオチド７０〜１０３８（ＴＡＡ終止コドンを含むヌクレオチド７０〜１０４１）にあるオープンリーディングフレームが、３２３アミノ酸のタンパク質をコードする。このコードされたタンパク質に対応するアミノ酸配列を配列番号２に示す。図２は、プローブとしてＭＣ２１ｃＤＮＡクローンＢＤ９を使用したノザンブロットを示す。ここで、配列番号１に対応する１．７９ｋｂのｍＲＮＡ種の発現レベルを、ヒト培養肥満細胞又は組織において測定した。レーン１）活性化肥満細胞、レーン２）休止肥満細胞、レーン３）腎臓、レーン４）胎児肝臓、レーン５）心臓、レーン６）胎盤。配列番号１に基づくプローブ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＰＲＩＭＥ−ＩＴ  ＩＩキットを使用して無作為に標識されている）を、高感度のハイブリダイゼーション条件（Ｃｈｕｒｃｈ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液、室温で２９時間）を使用して、ヒトｍＲＮＡブロット（ＣｌｏｎＴｅｃｈのｍＲＮＡブロット−Ｈ４）に曝露した。１．７９Ｋｂ種の有意な発現が、休止肥満細胞試料中で見られ、より低いレベルが活性化肥満細胞中で見られた。
【実施例３】
【０１２７】
患者におけるアレルギー過敏症の検出
本発明の核酸又はタンパク質の発現レベルを、アレルギー過敏症が疑われる患者に由来する試料において、抗原である可能性のあるものに曝露する前及び／又は後に決定した。試料は、皮膚、気道、又は肺細胞試料などの上皮組織に由来するものであり得、或いは、尿又は血液試料であり得る。試料は又、肺胞洗浄液であり得る。アレルギー過敏症を示すことが知られる患者、及び健常な被験者に由来する、組織又は単離肥満細胞試料を、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用し得る。対照又は正常組織の発現レベルと比較した、本発明の核酸又はタンパク質の発現レベルの変化は、アレルギー過敏症の指標となり得る。
【実施例４】
【０１２８】
ＭＣ２１の疎水性及び抗原性
ｃＤＮＡクローンＯＢ４のオープンリーディングフレーム、即ちＭＣ２１（配列番号２）の予測全長タンパク質配列に対応する、配列番号２の残基７０〜１０３８の翻訳を、タンパク質内の疎水性領域について、Ｋｉｌｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法により解析した（図３）。この配列を、特定の抗原性領域又はエピトープの有無について、Ｐａｒｋｅｒ法を使用してさらに解析した（図４）。
【実施例５】
【０１２９】
肥満細胞における、異なって発現される他のｍＲＮＡの同定
他のヒト細胞型及び組織に対して肥満細胞中で異なって発現される、数個の他の遺伝子を同定した。電気的ノザンアッセイにおいて、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ９５Ｋチップセットを、培養ヒト肥満細胞、単離造血細胞、及び正常ヒト組織に由来するｍＲＮＡ試料を使用してプロービングした。ｃＤＮＡを、複数の方法により得た。ＭＣ２５及びＭＣ３９のＣＤＮＡは、実施例２のように溶液ハイブリダイゼーションにより得た。ＭＣ２２、ＭＣ３３、及びＭＣ３６のｃＤＮＡは、ｅｓｔ配列から５’ＲＡＣＥにより得て、５’末端を決定した。この配列並びにヒトゲノム配列情報を使用して、肥満細胞ＲＮＡからｃＤＮＡをＰＣＲするためのプライマーを設計した。
【０１３０】
図５は、ＭＣ２２の発現強度を示す。配列番号３及び５は、配列番号３のヌクレオチド２１４７〜２２５４における挿入により互いに異なる、検出された異なって発現されるｍＲＮＡに対応する、全長ヒトｃＤＮＡのスプライス変異体を示す。図６はＭＣ２５（配列番号７）の発現強度を示し、図７はＭＣ３３（配列番号９）の発現強度を示し、図８はＭＣ３６（配列番号１１）の発現強度を示す。図９は、配列番号１３及び１５の変異体が示す、ＭＣ３９の発現強度を示す。
【０１３１】
各図で、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ９５Ｋチップセットを使用して測定した平均発現強度を示す。各平均値に含まれるデータ点の数を、組織名の右に括弧内に示す。肥満細胞試料を６週間培養し、その後、指定したように収集又は処理した。Ｒｅｓｔ＝非処理。Ａｃｔ＝ＩｇＥ及び抗原による活性化の３時間後。Ｄｅｘ＝１０−７Ｍのデキサメタゾンによる処理の２４時間後。Ｉｌ−４＝１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４による処理の５日後。Ｔ細胞ｓｔｉｍ＝ＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体による刺激。
【０１３２】
ヒト肥満細胞において異なって発現及び／又は調節されているものとしてここで同定された遺伝子の要約を、表に提示する。
【表１】
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【０１３３】
本発明を前記の実施例に関して詳細に説明してきたが、本発明の精神から逸脱することなく種々の改変を行えることが理解される。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。引用した全ての特許、特許出願、及び、本出願において言及した刊行物をすべて、参照によって本明細書にその全体を組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】培養ヒト肥満細胞、単離ヒト造血細胞、及び種々の正常なヒト組織に由来する試料における、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ９５Ｋチップセットを使用した、ＡＦ１５０１４３（ＭＣ２１）の相対発現を示す。
【図２】配列番号１に対応する１．７９ｋｂのｍＲＮＡ種の発現レベル（クローンＢＤ（ＭＣ２１））を、ヒト培養肥満細胞又は組織において測定した、ノザンブロットを示す。レーン１）活性化肥満細胞、レーン２）休止肥満細胞、レーン３）腎臓、レーン４）胎児肝、レーン５）心臓、レーン６）胎盤。
【図３】コードＭＣ２１タンパク質のアミノ酸配列のＫｉｌｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性親水性指標プロットを示す。
【図４】コードＭＣ２１タンパク質のアミノ酸配列のＰａｒｋｅｒ抗原性プロットを示す。
【図５】培養ヒト肥満細胞、単離ヒト造血細胞、及び種々の正常ヒト組織に由来する試料における、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ９５Ｋチップセットを使用した、ＭＣ２２の相対発現を示す。
【図６】培養ヒト肥満細胞、単離ヒト造血細胞、及び種々の正常ヒト組織に由来する試料における、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ９５Ｋチップセットを使用した、ＭＣ２５の相対発現を示す図である。
【図７】培養ヒト肥満細胞、単離ヒト造血細胞、及び種々の正常ヒト組織に由来する試料における、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ９５Ｋチップセットを使用した、ＭＣ３３の相対発現を示す。
【図８】培養ヒト肥満細胞、単離ヒト造血細胞、及び種々の正常ヒト組織に由来する試料における、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ９５Ｋチップセットを使用した、ＭＣ３６の相対発現を示す。
【図９】培養ヒト肥満細胞、単離ヒト造血細胞、及び種々の正常ヒト組織に由来する試料における、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＧｅｎｅＣｈｉｐ９５Ｋチップセットを使用した、ＭＣ３９の相対発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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