(57)【要約】本発明は線維芽細胞、とりわけ関節軟骨細胞を培養するために有用な、定義された無血清培地を提供し、かかる培地は血清含有培地の使用に付随する問題を回避する。定義された培地は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、および化学的に定義された脂質、またはこれらの化合物の組み合わせを含む。別の側面において、本発明はまた、定義された無血清培地において軟骨細胞をインキュベートすることを含む、組織培養法を提供する。かかる方法は、低密度で播種された軟骨細胞の再分化能を維持しながら、それらの接着および増殖性増幅を促進する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基礎培地、ＰＤＧＦ、ならびにステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸からなる群から選択される１以上の脂質を含む培地により軟骨細胞をインキュベートする工程を含む、軟骨細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖の方法。
【請求項２】
軟骨細胞が２０，０００細胞／ｃｍ2未満で播かれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地がステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸からなる群から選択される、いずれか２種の脂質を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培地が表４に記載された化学的に定義された脂質混合物（ＣＤＬＭ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
培地が表２に記載されたＤＲＦを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
基礎培地が表３に記載されたｃＤＲＦを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＰＤＧＦの濃度が０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、１〜５ｎｇ／ｍｌ、５〜１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０〜１５ｎｇ／ｍｌ、１５〜５０ｎｇ／ｍｌ、および５０〜１００ｎｇ／ｍｌから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＰＤＧＦがＰＤＧＦ‐ＢＢ、ＰＤＧＦ‐ＡＢ、およびＰＤＧＦ‐ＡＡから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
培地中の脂質濃度が０．０５〜０．１％、０．１〜０．５％、０．５％、０．５〜１％、１〜２％、および２〜５％から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
培地がさらにＢＭＰ、ＴＧＦ‐β、ＩＧＦ、およびインスリンからなる群から選択される１以上の補足物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＢＭＰがＢＭＰ‐４またはＢＭＰ‐６である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
培地がステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸からなる群から選択される少なくとも４種の脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＤＧＦの濃度が１０ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
培地がＩＴＳ、ハイドロコーチゾン、フィブロネクチン、ｂＦＧＦ、およびアルブミンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
培地が表３に記載されたｃＤＲＦを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
培地がステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸からなる群から選択される少なくとも６種の脂質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ｃＤＲＦ、ＰＤＧＦ、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸を含む培地により軟骨細胞をインキュベートする工程を含む、かかる軟骨細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させる方法。
【請求項１８】
基礎培地、ＰＤＧＦ、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸を含む、無血清培地。
【請求項１９】
ＰＤＧＦの濃度が０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、１〜５ｎｇ／ｍｌ、５〜１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０〜１５ｎｇ／ｍｌ、１５〜５０ｎｇ／ｍｌ、および５０〜１００ｎｇ／ｍｌから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＤＧＦがＰＤＧＦ‐ＢＢ、ＰＤＧＦ‐ＡＢ、およびＰＤＧＦ‐ＡＡから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
表４に記載の化学的に定義された脂質混合物（ＣＤＬＭ）をさらに含む、請求項１８に記載の培地。
【請求項２２】
培地中のＣＤＬＭ濃度が０．０５〜０．１％、０．１〜０．５％、０．５％、０．５〜１％、１〜２％、および２〜５％から選択される、請求項１８に記載の培地。
【請求項２３】
ＩＴＳ、ハイドロコーチゾン、フィブロネクチン、ｂＦＧＦ、およびアルブミンをさらに含む、請求項１８に記載の培地。
【請求項２４】
基礎培地が表２に記載のＤＲＦを含む、請求項１８に記載の培地。
【請求項２５】
基礎培地が表３に記載のｃＤＲＦを含む、請求項１８に記載の培地。
【請求項２６】
ＢＭＰ、ＴＧＦ‐β、ＩＧＦ、およびインスリンからなる群から選択される１以上の補足物をさらに含む、請求項１８に記載の培地。
【請求項２７】
ＢＭＰがＢＭＰ‐４またはＢＭＰ‐６である、請求項１８に記載の培地。
【請求項２８】
表３に記載のｃＤＲＦ、表４に記載の０．５％  ＣＤＬＭ、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦを含む、請求項１８に記載の培地。
【請求項２９】
ＰＤＧＦがＰＤＧＦ‐ＢＢである、請求項２８に記載の培地。
【請求項３０】
軟骨細胞および培地を含む組成物であって，かかる培地が基礎培地、ＰＤＧＦ、ならびにステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸からなる群から選択される１以上の脂質を含む，前記組成物。
【請求項３１】
基礎培地がＤＲＦを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
基礎培地がｃＤＲＦを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸からなる群から選択されるいずれか２種の脂質を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
表４に記載のＣＤＬＭのいずれか４種の脂質を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
表４に記載の化学的に定義された脂質混合物（ＣＤＬＭ）を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３６】
PＤＧＦの濃度が０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、１〜５ｎｇ／ｍｌ、５〜１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０〜１５ｎｇ／ｍｌ、１５〜５０ｎｇ／ｍｌ、および５０〜１００ｎｇ／ｍｌから選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３７】
ＰＤＧＦの濃度が１０ｎｇ／ｍｌである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３８】
ＰＤＧＦがＰＤＧＦ‐ＢＢ、ＰＤＧＦ‐ＡＢ、およびＰＤＧＦ‐ＡＡから選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３９】
ＰＤＧＦがＰＤＧＦ‐ＢＢである、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４０】
培地中の脂質の濃度が０．０５〜０．１％、０．１〜０．５％、０．５％、０．５〜１％、１〜２％、および２〜５％から選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４１】
ＣＤＬＭの濃度が０．５％である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４２】
ＩＴＳ、ハイドロコーチゾン、フィブロネクチン、ｂＦＧＦ、およびアルブミンをさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４３】
ＢＭＰ、ＴＧＦ‐β、ＩＧＦ、およびインスリンからなる群から選択される１以上の補足物をさらに含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４４】
軟骨細胞がヒトに由来する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４５】
軟骨細胞がヒト関節軟骨細胞である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４６】
軟骨細胞が初代である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４７】
軟骨細胞が継代される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４８】
軟骨細胞が間葉系幹細胞である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項４９】
ヒト軟骨細胞、表３に記載のｃＤＲＦ、表４に記載の０．５％  ＣＤＬＭ、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項５０】
培地が基礎培地、ＰＤＧＦ、ならびにステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸からなる群から選択される１以上の脂質を含む、軟骨細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖のための培地の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
[００１]  本発明は細胞および組織培養の分野に関する。より具体的には、本発明は軟骨欠損の治療または修復を意図した、軟骨組織を形成することができる細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
[００２]  関節軟骨は，軟骨細胞によって産生された複合細胞外マトリクス内に包まれた軟骨細胞からなる。このマトリクス特有の生化学的組成は、膝関節の関節表面の滑らかで、ほとんど摩擦のない動きを提供する。加齢にしたがって、ヒト関節軟骨の引っ張り特性は生化学的変化の結果として変化する。３０歳以降、関節軟骨の引っ張り強度は著しく低下する。外傷または疾患、たとえばリウマチ性および変形性関節炎により生じた軟骨の損傷は、重大な身体的衰弱を引き起こす可能性がある。
【０００３】
[００３]  軟骨がそれ自体で修復することが不可能なことが軟骨損傷に関連した臨床症状を緩和するためのいくつかの外科的方法の開発を導いてきた。米国だけで、年間に５００，０００以上の関節形成法および関節交換が行われる。自己軟骨細胞移植は関節軟骨欠損の治療に認可されている方法である。その方法は、大腿顆の非荷重部分に由来する軟骨片を採取すること、および単離した軟骨細胞をその後同じ患者に戻して移植するためにｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させることを含む（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３１：８８９−８９５）。
【０００４】
[００４]  関節軟骨細胞は関節軟骨‐特異的細胞外マトリクス成分を発現する。関節軟骨細胞はいったん採取され、酵素的消化により組織から分離されると、それらを増殖増幅のために単層培養することができる。しかし、組織培養中にこれらの細胞は表現型が不安定になり、線維芽細胞的な形態をとり、その上ヒアリン様関節軟骨に特徴的なII型コラーゲンおよびプロテオグリカン産生を中止する。そのような“脱分化”細胞は、速やかに増殖し、線維性組織に特徴的な１型コラーゲンを産生する。それにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの懸濁培養（Ａｕｌｔｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．＆Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５：６５９−６６８）のような適切な環境中、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの軟骨欠損（Ｓｈｏｒｔｋｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７：１４７−１５４）の環境中に置いた場合、細胞は再分化する、すなわち関節軟骨‐特異的マトリクス分子を再び発現する。脱分化可逆性は培養した自己軟骨細胞を使用した、関節軟骨の首尾よい修復の秘訣である。
【０００５】
[００５]  ヒト軟骨細胞は一般に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したダルベッコの調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養する（Ａｕｌｔｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．＆Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５：６５９−６６８；Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２１２：９７−１０４）。しかし、たとえ血清が哺乳動物細胞培養で広く使用されていても、その使用に関してはいくつかの問題がある（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ．Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，９１−９９）：１）血清には多くの未確認または非定量成分が含まれ、したがって“限定（defined）”されない；２）血清成分はロット毎に異なり、実験または他の細胞培養への使用のために標準化することを困難にする；３）血清成分の多くは細胞接着、増殖、および分化に影響を与え、これらのパラメータを制御することを困難にする；４）血清のいくつかの成分は特定の細胞型の増殖に抑制性であり、ある程度その増殖作用を妨害し、結果として最適以下の増殖となる；そして５）血清はウイルスおよび他の病原体を含むかもしれず、培養した細胞をヒトに移植しようとする場合、そのような血清は実験結果に影響を与えるか、または潜在的な健康被害を与えるかもしれない。
【０００６】
[００６]  したがって、記載された無血清培地の使用は軟骨欠損の治療のための軟骨細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖にとりわけ好都合である。しかし、そのような記載された無血清培地は低密度で播かれたヒト関節軟骨細胞の接着には充分であり、コンフルエントな培養物が得られるまで増殖を持続させ、そして関節軟骨表現型を再発現するための軟骨細胞の能力を維持するに違いない。
【０００７】
[００７]  細胞培養のための生化学的に定義された培地（biochemically defined media: ＤＭ）を開発する努力が続けられてきた。ＤＭは一般に栄養分、成長因子、ホルモン、接着因子、および脂質を含む。的確な組成は，培地が考案される具体的な細胞型に対して適応しなければならない。線維芽細胞、ケラチン細胞、および上皮細胞を含む、いくつかの細胞型の首尾よい増殖が各種ＤＭ中で達成されてきた（Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる総説、１９９４）。しかし、公知の培地中での細胞の接着および増殖はしばしば最適ではない。
【０００８】
[００８]  さらに、自己軟骨細胞移植に利用可能な出発細胞材料の量は一般に限定されている。したがって、最小のコンフルエント下密度で関節軟骨細胞を播くことが望ましい。ＤＭにおいてコンフルエント下密度で関節軟骨細胞を培養する試みは部分的にだけ成功している。低密度で播かれた軟骨細胞の増殖能力を持続させることができるＤＭは開発されているが、これらの培地の使用は播種後の組織培養容器への細胞の初期の接着のために依然として血清を必要とする（Ａｄｏｌｐｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１５５：５２７−５３６、および米国特許第６，１５０，１６３号）。
【０００９】
[００９]  医学的適用、とりわけヒトにおける使用のために再分化可能な軟骨細胞の接着、増殖、および維持のための条件を最適化し、標準化し、そして制御するための必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
[０１０]  関節軟骨細胞を培養するための安全で、効果的で、安価な培地組成物および方法を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
[０１１]  関節軟骨細胞を培養するための血清の使用を含まない方法を提供することが本発明の別の目的である。
[０１２]  単一の定義された細胞培養培地において関節軟骨細胞を培養するための簡単な方法を提供することが本発明のさらに別の目的である。
【００１２】
[０１３]  無血清条件下において関節軟骨細胞を培養するための方法を提供することが本発明のさらに別の目的であり、ここで軟骨細胞は低いコンフルエント下密度で播かれる。
【００１３】
[０１４]  本発明のさらに別の目的は、関節軟骨細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増幅のための方法を提供することであり、ここで細胞はそれらの再分化能力を保持する。
[０１５]  本発明はヒト関節軟骨細胞を培養するための方法および化学的に定義された培地の組成物を提供する。本発明のＤＭは、軟骨細胞培養のどのような段階においても血清の使用を避け、軟骨‐特異的表現型を再発現するための軟骨細胞の能力を維持しながら、無血清条件下で細胞接着および増殖を促進する。
【００１４】
[０１６]  本発明の一側面は、細胞の培養底質への初期接着に十分な，定義された細胞培地を提供し、それによって細胞培養の初期段階における血清含有培地の必要性を除去する。本発明の別の側面は、細胞培養中のどのような段階においても血清を使用せずに軟骨細胞の増殖を促進する定義された無血清細胞培養培地を提供する。本発明のさらに別の側面は、対象への移植前に軟骨細胞を準備するために使用することができるか、または軟骨欠損への移植を意図してマトリクスに埋め込まれた軟骨細胞に対する再分化‐維持培地として含むことができる細胞培養培地を提供する。
【００１５】
[０１７]  ある態様において、本発明のＤＭは基礎培地を含む。一態様において、基礎培地はＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ‐１６４０，およびＨａｍ′ｓＦ‐１２のような市販の培地を使用して調製する。一態様において、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ‐１６４０，およびＨａｍ′ｓＦ‐１２は１：１：１の比で混合し、増殖補足物と合わせ、表３に記載の基礎培地を作製する（今後ｃＤＲＦと表す）。基礎培地に加え、本発明のＤＭは以下のものからなる群から選択される少なくとも２種の補足物を含む：血小板‐由来成長因子（platelet-derived growth factor: ＰＤＧＦ）、ならびにステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸からなる群から選択される１以上の脂質成分。具体的な態様において、ＤＭはＰＤＧＦおよび表４に記載の少なくとも２、４、６、８、またはすべての脂質成分を含む。別の態様において、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ‐ＢＢである。ある態様において、ＰＤＧＦの濃度は０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、１〜５ｎｇ／ｍｌ、５〜１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０〜１５ｎｇ／ｍｌ、１５〜５０ｎｇ／ｍｌ、および５０〜１００ｎｇ／ｍｌから選択される。ある別の態様において、脂質成分の濃度（ｖ／ｖ）は０．０５〜０．１％、０．１〜０．５％、０．５％、０．５〜１％、１〜２％、および２〜５％から選択される。
【００１６】
[０１８]本発明の別の目的および好都合な点は以下の説明において部分的に示され、そして一部は説明から明らかであるか、または本発明の実施により知ることができる。本発明の目的および好都合な点は、添付の特許請求の範囲においてとりわけ指摘される要素および組み合わせにより認識され、そして達成されるであろう。
【００１７】
[０１９]  先のおおまかな説明および以下の詳細な説明は共に代表的で説明的なものだけであり、特許請求の範囲のように本発明を限定するものではないと理解すべきである。
[０２０]  本明細書に包含され、その一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの態様を例証し、上記の説明と共に本発明の原理の説明に役立つ。
【００１８】
発明の詳細な説明
[０２４]  本発明は、定義された無血清培地中で軟骨細胞を培養するための方法を提供し、以下に記載のｃＤＲＦと表される基礎培地が、ＰＤＧＦおよび表４に示す脂質の少なくとも１つを補足した場合、培養物中の再分化可能な軟骨細胞の接着、増殖および維持に十分であるという発見に少なくとも部分的に基づく。
【００１９】
基礎培地の作製（ｃＤＲＦ）
[０２５]  本発明の定義された血清培地（ＤＭ）の作製の第一段階は基礎培地を作製することである。具体的な態様において、表３に記載の基礎培地（ｃＤＲＦ）は以下に記載の市販の出発成分から作製する。ｃＤＲＦはＡｄｏｌｐｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，１５０，１６３号）によって開発されたＤＭの改変である。
【００２０】
[０２６]  ｃＤＲＦの３種の出発成分はＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ‐１６４０、およびＨａｍ′ｓＦ１２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）である。これらの出発成分のそれぞれの正確な組成は表１に示す。出発成分は１：１：１の比で合わせる。得られた培地（表２に記載し、ＤＲＦと表す）は次にＩＴＳ（１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５．５μｇ／ｍｌ  トランスフェリン、７ｎｇ／ｍｌ  セレン、および場合により２．０μｇ／ｍｌ  エタノールアミン）、ヒトフィブロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、リノール酸、ヒト塩基性胎児成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、ゲンタマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、およびハイドロコーチゾン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補足し、ｃＤＲＦを作製する。新たに作製した不完全なｃＤＲＦ（ｂＦＧＦ、フィブロネクチン、リノール酸、およびＨＳＡを含まないｃＤＲＦ）は暗所で２週間まで、２〜８℃で保存することができる。ｂＦＧＦ、フィブロネクチン、およびＨＳＡはリノール酸を補足して、細胞培養に使用する当日に培地で希釈し，ｃＤＲＦを作製する。本発明の培地中で使用するＨＳＡはヒト血漿（Ｇｒｉｆｏｌｓ（登録商標）ＨＳＡ，ＳｅｒａＣａｒｅ，Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ，ＣＡ）から精製するか、または組換え体（Ｎｅｗ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）のいずれかである。すべての材料は取り扱い説明書に従って溶かし、希釈し、そして保存する。
【００２１】
[０２７]  “基礎培地”という用語は“定義された基礎培地”と互換性があり、表３に記載のｃＤＲＦのすべての必須成分を含むどのような培地も表す。表３に記載の成分または成分のサブセットの濃度を下げるか、または成分を除去した場合に軟骨細胞の接着、増殖、および再分化に関連する培地の特性が実質的に同じならば、かかる成分または成分のサブセットは必須ではない。個々の成分について定められた濃度は具体的な細胞培養条件に合わせて調整することができる。当業者は定法を使用してそのような調整を容易に行うことができる。また，付加的な成分が望ましく、軟骨細胞の接着、増殖、および再分化に悪い影響を与えない場合は、そのような成分を培地に添加することができると理解すべきであろう。そのような成分には、成長因子、脂質、血清蛋白質、ビタミン、ミネラル、炭水化物が挙げられる。たとえば、米国特許第６，１５０，１６３号に記載の、ＴＧＦ‐β（ＴＧＦ‐β１、‐β２、‐β３）、ＩＧＦ，およびインスリンのような軟骨細胞再分化を促進する成長因子またはホルモンを培地に補足することが好都合であってもよい。そのような成長因子またはホルモンは市販されている．補足物の別の例としては骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）が挙げられ、それらには少なくとも１５の構造および機能の関連する蛋白質が存在するが、それらに限定されない。ＢＭＰは各種細胞型の成長、分化、走化性、およびアポトーシスに関与することが示されている。組換えＢＭＰ‐４およびＢＭＰ‐６はたとえば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；それぞれカタログ番号３１４−ＢＰおよび５０７−ＢＰ）から購入することができる。本発明のＤＭ中の各種補足物の濃度は過度な実験をせずに決定することができる。本発明のＤＭ中のＢＭＰの濃度は、０．０１〜０．１ｎｇ／ｍｌ、０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、１〜１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、および０．１〜１μｇ／ｍｌから選択される。
【００２２】
[０２８]  当業者は本発明のＤＭが血清の使用を避けることのほかに好都合な点を有することを認識するであろう。したがって、記載されていない成分の使用が許容可能な適用において、本発明のＤＭを使用することが望ましいこともある。結果として、本発明のＤＭは血清、たとえばウシ胎仔血清、または他の化学的に不明確な成分、たとえば動物もしくは植物組織抽出物を補足することができる。ある態様において、本発明のＤＭは１０％または８％、６％、４％、２％、もしくは１％未満の血清を補足してもよい。
【００２３】
[０２９]当業者はまた、ｃＤＲＦの等価物がさまざまな公知の培地、たとえばイーグルの基礎培地（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２：５０１，１９５５）、最少必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８：３９６，１９５９）、Ｈａｍ′ｓ培地（Ｈａｍ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２９：５１５，１９６３）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｖｉｔｚ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｙｇ．，７８：１７３，１９６３）、ＭｃＣｏｙ  ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１００：１１５，１９５９）、ＰＲＭＩ培地（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．，１９９：５１９，１９６７）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ′培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，６９，１０６−１１２，１９７１）ＮＣＴＣ  １３５培地（Ｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，３６：４３９，１９６８）、Ｗａｙｍｏｕｔｈ′ｓ培地  ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，２２：１００３，１９５９）などから作製することができると認識すべきである。これらの培地は単独または適切な割合の混合物として使用して、ｃＤＲＦに等価な基礎培地を作製することができる。あるいは、ｃＤＲＦまたはその等価物は個々の化合物または他の培地および増殖補足物から作製することができる。本発明はいずれか具体的な粘度の培地に限定されず、液体から半固体までの範囲の培地の使用を包含し、溶解に適した固化培地および固体組成物を含む。
【００２４】
【表１】
2005515777.tif 000002
【００２５】
【表２】
2005515777.tif 000003
【００２６】
【表３】
2005515777.tif 000004
【００２７】
【表４】
2005515777.tif 000005
【００２８】
【表５】
2005515777.tif 000006
【００２９】
基礎培地の補足物
血小板‐由来成長因子（ＰＤＧＦ）
[０３０]  ＰＤＧＦは血清には存在するが、血漿には存在しない主要な分裂促進因子である。ＰＤＧＦはＡおよびＢと表される２種の構造の関連した鎖からなる二量体分子である。二量体イソ型のＰＤＧＦ‐ＡＡ、ＡＢおよびＢＢは各種細胞型において異なって発現される。一般に、すべてのＰＤＧＦイソ型は、皮膚線維芽細胞、グリア細胞、動脈平滑筋細胞、ならびにいくつかの上皮および内皮細胞を含む、結合組織細胞に対する強力な分裂促進因子である。
【００３０】
[０３１]  組換えＰＤＧＦは各種供与源から市販されている。以下の実施例で使用されるヒト組換えＰＤＧＦ‐ＢＢ（ｈｒＰＤＧＦ‐ＢＢ）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；カタログ番号２２０−ＢＢ）から購入し、溶かし、取り扱い説明書に従って使用した。ｈｒＰＤＧＦ‐ＢＢの大腸菌による発現および１０９アミノ酸残基の成熟ヒトＰＤＧＦ‐Ｂ鎖蛋白質をコードするＤＮＡ配列（前駆体配列においてトレオニン残基１９０を有する末端からＣ末端へプロセッシングされる）はＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．３：９２１，１９８４）により記載される。ジスルフィド結合したホモダイマーのｒｈＰＤＧＦ‐ＢＢは，２つのアミノ酸残基Ｂ鎖からなり、約２５ｋＤａの分子量を有する。ＰＤＧＦの活性は、Ｒａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０９：７４９−７７３，１９８５）に記載のように、静止ＮＲ６Ｒ‐３Ｔ３線維芽細胞の3Ｈ−チミジン取込を刺激する能力により測定する。このアッセイにおけるＰＤＧＦのＥＤ50は一般に１．０〜３ｎｇ／ｍｌである。
【００３１】
[０３２]  ある態様において、本発明のＤＭは、ＰＤＧＦおよびＢＭＰまたはステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸からなる群から選択される１以上の脂質により補足されたｃＤＲＦである。ＰＤＧＦの濃度は０．１〜１ｎｇ／ｍｌ、１〜５ｎｇ／ｍｌ、５〜１０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１０〜１５ｎｇ／ｍｌ、１５〜５０ｎｇ／ｍｌ、および５０〜１００ｎｇ／ｍｌから選択される。ある態様において、ｃＤＲＦは１〜２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５〜１５ｎｇ／ｍｌ、そしてもっとも好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを補足される。あるいは、ＰＤＧＦは別の型、たとえばＰＤＧＦ‐ＡＢ、ＰＤＧＦ‐ＢＢ、またはいずれかのＰＤＧＦ型の混合物であってもよい。関連した態様において、本発明のＤＭは以下に記載の付加的な補足物をさらに含む。
【００３２】
脂質
[０３３]  脂質は生細胞において潜在的なエネルギー源であるだけでなく、構造成分としても重要である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、多くの細胞は培地に存在するグルコースおよびアミノ酸から脂質を合成することができる。しかし、細胞外脂質が利用可能な場合，脂質生合成は阻害され、細胞は培地中の遊離脂肪酸、脂質エステル、およびコレステロールを利用する。血清は脂質に富み、培養細胞にとっての細胞外脂質の主要な供与源となってきた。いくつかの系では、無血清培地における細胞の増殖の促進に、魚油に基づいた化学的に不明確な脂質調製物が有効であることが見出されている（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２６：３０Ａ；Ｇｏｒｆｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２６：３７Ａ；Ｆｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２６：５４Ａ）。したがって、通常は血清により供給される各種脂質の代わりに、そのような脂質を無血清培地に補足することが好ましくてもよい。
【００３３】
[０３４]  本発明のＤＭに使用するために適切な脂質には、ステアリン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸、リノレン酸、コレステロール、およびアルファ‐トコフェロール酢酸が挙げられる。一態様において、基礎培地は、表４に示す化学的に定義された脂質混合物（ＣＤＬＭ）を補足される。Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬが供給するように、ＣＤＬＭは脂質成分の他にエタノール（１００ｇ／Ｌ）および乳化剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（登録商標）（１００ｇ／Ｌ）およびＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標）（２．２ｇ／Ｌ）を含む。
【００３４】
[０３５]  本発明の方法を実施する場合、表４に示すＣＤＬＭの個々の脂質成分の濃度は、具体的な培養条件に対して調整することができる。当業者は定法を使用して、そのような調整を容易に行うことができる。さらに、ＣＤＬＭのすべての成分が必須でなくてもよい。成分または成分のサブセットの濃度を下げるか、または成分を除去した場合に軟骨細胞の接着、増殖、および再分化に関連する培地の性質が実質的に同じのままならば、かかる成分または成分のサブセットは必須ではない。
【００３５】
[０３６]  ある態様において、本発明のＤＭは少なくとも１、２、４、６、８、またはすべてのＣＤＬＭの脂質成分を含む。一態様において、ＤＭは表４に記載のＰＤＧＦおよびＣＤＬＭを含む。他の限定的でない説明的な態様において、ＤＭはＰＤＧＦおよび表５に示す脂質の組み合わせを含む。
【００３６】
【表６】
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【００３７】
[０３７]  ある態様において、培地の脂質濃度（ｖ／ｖ）は０．０５〜０．１％、０．１〜０．５％、０．５％、０．５〜１％、１〜２％、および２〜５％から選択される。ある別の態様において、ＤＭは付加的に１〜２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５〜１５ｎｇ／ｍｌ、そしてもっとも好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦを補足される。具体的な態様において、ＤＭは約０．５％（ｖ／ｖ）ＣＤＬＭ、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦを含む。
【００３８】
[０３８]  本発明の培地を使用して、血清を使用せずに培養物中で再分化可能な軟骨細胞を播き、増殖させ、そして維持することができる。記載されたＰＤＧＦおよび脂質の濃度範囲は具体的な細胞培養条件に対して調整する必要があってもよい。当業者は定法を使用して、そのような調整を容易に行うことができる。
【００３９】
【表７】
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【００４０】
【表８】
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【００４１】
軟骨細胞および他の適切な細胞
[０３９]  本発明は通例軟骨性組織を産生することができる細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖に適している。軟骨細胞は種々の軟骨型、たとえばヒアリン軟骨、弾性軟骨、および線維軟骨に見出される細胞である。軟骨細胞は、それらが産生する細胞外マトリクスに主に基づいた特徴的な表現型を有する間葉系細胞である。前駆体細胞はＩ型コラーゲンを産生するが、軟骨細胞系譜にコミットされる場合、それらはＩ型コラーゲン産生を停止し、細胞外マトリクスの実質的な部分を構成するＩＩ型コラーゲン産生を始める。さらにコミット軟骨細胞は、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンを有する、アグレカンと呼ばれるプロテオグリカン凝集体を産生する。
【００４２】
[０４０]  軟骨細胞はヒト、オランウータン、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、マウス、ウマ、ウシ、ブタ、ゾウなどを含むが、それらに限定されないどんな動物からも単離することができる。
【００４３】
[０４１]  本発明で使用する軟骨細胞はいずれか適切な方法により単離することができる。軟骨細胞単離のための各種出発物質および方法は当該技術分野で公知である（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２版，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ１３７−１６８；Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８：５６０−５６４）．例としては、関節軟骨はヒトドナーの大腿顆から採取することができ、軟骨細胞は０．１％  コラゲナーゼ／ＤＭＥＭ中で一晩消化することにより軟骨から剥離することができる。剥離された細胞は、本発明のＤＭまたは１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭのような適切な培地中で初代細胞として増幅する。細胞は０．０５％  トリプシン‐ＥＤＴＡを使用して８０〜９０％コンフルエントに継代し、継代培養のために希釈し、２回目およびそれに続く継代のために再播種し、さらに増幅を行う。いずれの時点でも、トリプシン処理した細胞は１０％  ＤＭＳＯおよび４０％  ＨＳＡを含むＤＭＥＭ中、または米国特許第６，３６５，４０５号に記載のような当該技術分野で公知の他の組成物中で凍結することができる。
【００４４】
[０４２]  ある状況においては、すでに軟骨細胞に分化している、軟骨生検由来の細胞より、むしろ間葉系幹細胞のような軟骨細胞前駆幹細胞を使用することが望ましくてもよい。そのような幹細胞を単離することができる組織の例としては、胎盤、さい帯、骨髄、皮膚、筋肉、骨膜、または軟骨膜が挙げられる。軟骨細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのそのような細胞の軟骨細胞への分化を誘導することによって得ることができる。
【００４５】
[０４３]  本明細書で使用する“軟骨細胞”という用語は間葉系幹細胞だけでなく、軟骨細胞に分化転換することができる細胞、たとえば脂肪細胞、骨細胞、線維芽細胞、および筋細胞も表す。また、“軟骨細胞”という用語は継代されるか、脱分化した軟骨細胞を表す。
【００４６】
[０４４]  “低密度”という用語は２０，０００細胞／ｃｍ2未満の播種密度を表す。
[０４５]  本発明の方法は、単層、多層、固体支持体上、懸濁液中、および３Ｄ培養物中を含むがそれらに限定されない、各種条件下の培養物中で増殖する細胞に適切である。
【００４７】
[０４６]  本発明の別の態様は、本明細書を考慮し、明細書に開示された発明を実施することにより当業者には明らかであろう。明細書および実施例は代表的なものだけであると見なし、本発明の真の範囲および意図は以下の特許請求の範囲に示されることを意図する。
【実施例】
【００４８】
実施例
[０４７]  本発明の各種側面は以下に提示された実施例においてさらに詳しく表現され、説明される。
【００４９】
実施例１
[０４８]  年齢１６〜５１歳のドナー由来のヒト関節軟骨生検試料は、異物を取り除き、細分し、バシラス  サーモプロポリピクス（Ｂａｓｃｉｌｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｏｌｉｐｙｃｕｓ）由来のプロテアーゼ０．２５％を使用して酵素消化し、その後０．１％  コラゲナーゼ／ＤＭＥＭ中、３７℃で一晩消化した。単離した関節軟骨細胞は１０％  ヒト血清アルブミンを含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／１０％  ＨＳＡ）中で２回洗浄した。単離した初代ヒト関節軟骨細胞（ＨＡＣ）は、以下の異なる培地条件を使用して、Ｔ７５フラスコ中に５，０００〜６，０００細胞／ｃｍ2で播種した：
１）ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ（１０％  ウシ胎仔血清および１００μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを補足したＤＭＥＭ）；
２）ｃＤＲＦ（表３に記載）；
３）ｃＤＲＦ／Ｐ（１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦを補足したｃＤＲＦ）；
４）ｃＤＲＦ／Ｌ（５μｌ／ｍｌ  ＣＤＬＭ（表４に記載）を補足したｃＤＲＦ）；および
５）ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ（１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦおよび５μｌ／ｍｌ  ＣＤＬＭを補足したｃＤＲＦ）
[０４９]  それぞれの条件毎に２つのフラスコを使用した。それぞれの継代の最後に、コンフルエントに近い細胞をトリプシン処理により採取し、計数し、ＤＭＥＭ／１０％ＨＳＡで洗浄し、対応する培地に５，０００〜６，０００細胞／ｃｍ2で再播種した。細胞収率はそれぞれの条件に対して重複した試料の平均値として計算した。先に定義した培地条件下で増殖させた軟骨細胞のそれぞれの継代の最後における細胞収率の比較を表６に示す。この実験結果により、継代の回数に関わらず、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌで継代した軟骨細胞の細胞収率はＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳあるいはｃＤＲＦよりも高いことが示された。この効果は継代回数が多くなるほど顕著であった。
【００５０】
【表９】
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【００５１】
実施例２
[０５０]  複数のドナーから集めたヒアリン軟骨生検試料を使用して、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中または本発明に従って完全に限定された無血清培地中で培養した軟骨細胞の継代番号の関数として細胞収率を比較した。試料は実施例１に記載のように集め、処理した。単離した軟骨細胞は１０％  ヒト血清アルブミンを含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／１０％  ＨＳＡ）中で２回洗浄した。単離した初代ヒト関節軟骨細胞（ＨＡＣ）は、以下の培地条件を使用して、Ｔ７５フラスコ中に６，０００細胞／ｃｍ2で播種した：
１）ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ（１０％  ウシ胎仔血清および１００μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシンを補足したＤＭＥＭ）；および
２）ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ（１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦおよび５μｌ／ｍｌ  ＣＤＬＭを補足したｃＤＲＦ）
[０５１]  それぞれの継代の最後に、コンフルエントに近い細胞をトリプシン処理により採取し、計数し、ＤＭＥＭ／１０％ＨＳＡで洗浄し、それぞれの培地に６，０００細胞／ｃｍ2で再播種した。ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳまたはｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌで増殖させた軟骨細胞のそれぞれの継代の最後における細胞収率の比較を表７に示す。ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌにおける細胞収率は、１〜３回目の継代細胞ではＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳでの収率てより高く、４回目の継代細胞では著しく（ｐ＝０．０５）高かった。
【００５２】
【表１０】
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【００５３】
実施例３
[０５２]  この実験では、年齢が１６歳、２２歳および５５歳の３人のドナー由来のヒト関節軟骨細胞を単離し、実施例１に記載のように処理した。軟骨細胞はＴ７５フラスコ中に６，０００細胞／ｃｍ2で播種し、コンフルエント近くまでＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中で増殖させた。その後細胞をトリプシン処理により採取し、播種培地で洗浄し、１０％  ＤＭＳＯ／４０％  ＨＳＡ／５０％  ＤＭＥＭ中で速やかに凍結した。２回目の継代のために、凍結細胞のアンプルを解凍し、ＤＭＥＭ／１０％  ＨＳＡですすぎ、以下の培地中に３，０００〜４，０００細胞／ｃｍ2で再播種した：１）ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ；２）ｃＤＲＦ；３）ｃＤＲＦ／Ｐ；および４）ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ（培地の説明は実施例１を参照されたい）。それぞれの培地条件のセット毎に２つのフラスコを使用した。それぞれの継代の最後に、コンフルエントに近い細胞をトリプシン処理により採取し、ＤＭＥＭ／１０％  ＨＳＡで洗浄し、対応する培地に再播種した。３回目の継代時に、細胞を採取し、計数した。７日間の最後に１日ごとの倍加数として表された増殖指数は、３人のドナー試料に対する平均値として計算し、それぞれの試料は各ドナー由来の重複物の平均として表した。ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中および完全に定義された無血清培地中で増殖させた軟骨細胞の増殖指数の比較を図１に示す。ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中で増殖させた軟骨細胞とｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ中で増殖させた軟骨細胞の増殖指数は類似するが、ｃＤＲＦ／ＰまたはｃＤＲＦ中で増殖させた細胞はわずかに低い増殖指数を示した。ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳで増殖した軟骨細胞と比較した場合、本発明のＤＭ中で単層として増殖した軟骨細胞は典型的な線維芽細胞の形態ではないが、明瞭な境界を有する非常にはっきりした細胞の形態であった。
【００５４】
実施例４
[０５３]  この実験では、播種密度に関する依存性を調査した。ヒトヒアリン関節軟骨細胞は同じドナーから得て、それぞれの試料を３つに分割して６，０００；４，０００および２，０００細胞／ｃｍ2で播種すること以外は、実施例３に記載のように処理した。それぞれの継代の最後に、そのセットの初めの播種密度で細胞を再播種した。３回目の継代の終わりに細胞を採取し、計数し、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中または本発明のＤＭ中で増殖させた軟骨細胞の細胞収率を計算した。実験の結果は図２に示す。ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌで培養した軟骨細胞は、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳまたはｃＤＲＦ／Ｐ中で増殖させた細胞に少なくとも匹敵するか、またはより高い収率を示すが、ｃＤＲＦ中で増殖させた細胞は、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳに比較してわずかに低い収率を示した。差は、播種密度６，０００細胞／ｃｍ2で継代した細胞で、より顕著であった。さらに、ｃＤＲＦまたはｃＤＲＦ／Ｐ中で増殖させた細胞はさらに高い播種密度において、より高い収率を示した。
【００５５】
実施例５
[０５４]  本発明のＤＭでの単層培養で増幅した後の軟骨細胞の再分化能を評価するために、軟骨組織を形成する軟骨細胞の能力を調べた。軟骨細胞は実施例２に記載のように単離し、処理した。２回目の継代の最後に、軟骨細胞はトリプシン処理し、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳですすぎ、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＣＭ（登録商標）フィルター挿入物（直径１２ｍｍ、ポアサイズ０．４μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に以下に記載のように播種した。フィルターはＩＩ型コラーゲン（０．５ｍｇ／ｍｌ  ０．０１２Ｎ  ＨＣｌ）［Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］でプレコートした。軟骨細胞はＤＭＥＭ／２０％  ＦＢＳ中、またはＤＭＥＭを基礎にした分化培地（２ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ、５μｇ／ｍｌ  リノール酸、２％  ＩＴＳを補足したＤＭＥＭ）中で、フィルター上に２ｘ１０6細胞／ｃｍ2で播種した。培養物は５％  ＣＯ2を補足した加湿空気中、３７℃で維持した。培養３日目に、１００μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ‐β２および１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ‐ＢＢを培地に添加した。培地は、２日ごとに交換した。１週間後、フィルター挿入物上の軟骨細胞培養物を選択した間隔で採取し、１０％  ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、５μｍの切片に切断し、その後トルイジンブルーまたはサフラニン‐Ｏで染色した。これらの試薬はプロテオグリカンを染色する。硫酸化グリコサミノグリカンは、Ｆａｒｎｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．により記載された手順に従って改変したジメチルメチレンブルーアッセイを使用して定量した（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｃａ  Ａｃｔａ  ８８３：１７３−１７７，１９８６）。
【００５６】
[０５５]  パラフィン‐包埋切片に対して免疫組織化学的分析を行い、II型コラーゲンの発現を分析した。II型コラーゲンの一次抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ，ＭＥ）を１：５０に希釈して使用した。反応は加湿空気中、３７℃で１時間行った。次に組織切片をりん酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、一次抗体に記載されたものと同じ条件下で、二次抗体としてのＰＢＳ中のローダミン‐抱合ヤギ抗‐ウサギＩｇＧを１：２００に希釈したものと一緒にインキュベートした。いくつかの実験では、核染色のためにＨｏｅｃｈｓｔ染料  １μｇ／ｍｌを二次抗体と共に加えた。切片はＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡で調べた。
【００５７】
[０５６]  培養物の組織検査は、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ中で継代培養した軟骨細胞がプロテオグリカンおよびコラーゲンを含む細胞外マトリクスを蓄積し、連続した軟骨組織層を形成することを示した。これらの軟骨細胞は、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中で増殖させた軟骨細胞と比較した場合、産生された組織量およびマトリクスのプロテオグリカン染色の増加を示した。ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳに比較して、ｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ中で増殖させた細胞は単層から小腔性の軟骨細胞形成性の形態を有する円形細胞への分化をたやすく行い、より多くII型コラーゲンを発現した。この実験の結果は、本発明のＤＭ中で増殖させた軟骨細胞はそれらの軟骨細胞表現型を再発現することができる、すなわちそれらは再分化能を保持していることを示す。結果はまた、単離し、本発明のＤＭ中で増幅した培養軟骨細胞から予め形成された軟骨移植片を産生することの実現可能性を示す。
【００５８】
実施例６
[０５７]  正常な成人関節軟骨細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて単層における増幅の結果として脱分化する。本発明のＤＭ中で培養された軟骨細胞が再分化する能力を保持していることを確かめるために、軟骨‐特異的マーカーの遺伝子発現のＴａｑＭａｎ分析を行った。遺伝子発現の解析は、ｅｘ  ｖｉｖｏで形成された軟骨様組織および正常関節軟骨由来の充実した全ＲＮＡの単離から始める。
【００５９】
[０５８]  初めに、軟骨細胞を単離、処理し、実施例２に記載のＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳまたはｃＤＲＦ／Ｐ／Ｌ中で増幅した。これらの培養物はフィルター挿入物上に播種してから１、２、３および４週間後に採取した。その後、軟骨細胞は実施例５に記載のＭｉｌｌｉｃｅｌｌ‐ＣＭ（登録商標）フィルター挿入物上で増殖した。遺伝子発現は以下の蛋白質に関して分析した：アグレカン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、およびベルシカン。
【００６０】
[０５９]  全ＲＮＡは公開されたプロトコール（Ｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１０８２−１０８６）の改変を使用して単離した。初めの全ＲＮＡは、小型の組織ホモジナイザーを使用した機械的ホモジナイズの他に、ＴＲＩｚｏｌ試薬（カタログ番号１５５９６−０２６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して組織から単離する。単離したＲＮＡは１０μｌのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、取り扱い説明書に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｓｐｉｎカラム（カタログ番号７４１０４，ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）上で精製した。混在するゲノムＤＮＡはＤＮＡ‐ｆｒｅｅキット（カタログ番号１９０６，Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して除去する。等しい量の全ＲＮＡをそれぞれの試料から採り、オリゴ‐ｄＴプライマー（カタログ番号２７−９２６４−０１，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＯＲ）の付いたビーズを使用して、逆転写（ＲＴ）した。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイ（カタログ番号Ｐ−７５８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を行い、ＲＴ反応の効率を測定した。次にＴａｑＭａｎ分析を行い、それぞれの試料由来の出発物質２５ｎｇを使用したそれぞれの遺伝子の絶対コピー数を定量した。遺伝子コピー数は、市販のプラスミド標準物により作成した標準曲線を使用して、それぞれの遺伝子に対して測定した。最終結果は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイの結果に従って調整した。
【００６１】
[０６０]  ２つの対象に由来する試料のＴａｑＭａｎ分析の結果は、図３Ａおよび３Ｂに示す。これらの結果は、ＤＭＥＭ／Ｐ／Ｌ中で増幅した細胞における、関節軟骨の主要マーカーであるII型コラーゲン遺伝子の持続的（２〜４週間）に上昇した発現を示す。この実験の結果は、本発明のＤＭ中で増殖した軟骨細胞が軟骨細胞表現型を再発現する能力を保持していることを確証する。また、この結果は単離し、本発明のＤＭ中で増幅した増殖軟骨細胞から、予め形成された軟骨移植片を産生することの実現可能性を示す。
【００６２】
[０６１]  本明細書は、明細書内に引用された参考文献の教示の観点において、もっともよく理解され、そのような参考文献のすべてはそのまま参照として本明細書に援用する。本明細書内の態様は本発明の態様の説明を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００６３】
[０６２]  特記しない限り、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される成分、細胞培養条件などの量を表すすべての数は、“約”という用語によりすべての場合において改変されていると理解すべきである。したがって、特に異なって記載されない限り、数で示されるパラメータは近似値であり、本発明で得ることを求められた所望する特性に依存して変化してよい。当業者は、多くの他の態様が主張された発明に包含されること、ならびに本明細書および実施例は代表的なものだけであり、本発明の真の範囲および意図は以下の特許請求の範囲に示されるとみなされることを意図することを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
[０２１]
【図１】ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ、またはｃＤＲＦ（表３に記載）、１０ｎｇ／ｍｌＰＤＧＦを補足したｃＤＲＦ、ならびに１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦおよび表４に示した化学的に定義された脂質混合物（ＣＤＬＭ）５μｌ／ｍｌを補足したｃＤＲＦ中において、ｅｘ  ｖｉｖｏで４回継代して増殖させたヒト関節軟骨細胞の増殖指数を表す。
【００６５】
[０２２]
【図２】ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳまたは以下のような無血清培地：ｃＤＲＦ；１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦを補足したｃＤＲＦ；ならびに１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦおよび５μｌ／ｍｌ  ＣＤＬＭを補足したｃＤＲＦ中において、各種播種密度で培養し、ｅｘ  ｖｉｖｏで４回継代して増殖させたヒト関節軟骨細胞の細胞収率を表す。
【００６６】
[０２３]
【図３−Ａ】図３Ａは、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ、または１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦおよび５μｌ／ｍｌ  ＣＤＬＭを補足したｃＤＲＦ中で増幅した軟骨細胞によって発現された遺伝子のＴａｑＭａｎ解析の結果を表す。
【図３−Ｂ】図３Ｂは、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ、または１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦおよび５μｌ／ｍｌ  ＣＤＬＭを補足したｃＤＲＦ中で増幅した軟骨細胞によって発現された遺伝子のＴａｑＭａｎ解析の結果を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【国際調査報告】
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