(57)【要約】  本発明は、約３〜１０日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ワクチンの有効量を単回投与することにより、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に起因する、動物における疾患または障害を治療または予防する方法に関するものである。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンは、細胞の全体または一部を不活化した調製物または修飾した生の調製物、サブユニットワクチン、あるいは核酸またはＤＮＡワクチンであることが可能である。本発明に従って投与されるマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンは、合成するか、または組換えにより産生することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染に起因する、動物における疾患または障害を治療または予防する方法であって、約３〜約１０日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンの有効量を単回投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチン処方物が、不活化された、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の全体または一部の調製物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンの単回投与が、用量あたり約１ｘ１０６〜約５ｘ１０１０変色単位（ｃｏｌｏｒ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）（ＣＣＵ）を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
投与される前記ワクチンの量が約０．５〜約３．０ｍｌである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞調製物がＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンがマイコプラズマ・ハイオニューモニエ以外のウイルス性または細菌性抗原をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルス性または細菌性抗原が、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、ブタ繁殖・呼吸疾患ウイルス（ＰＲＲＳまたはブタミステリー病）、離乳後下痢（ＰＷＤ）及びブタ増殖性腸炎（ＰＰＥ）から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マイコプラズマ・ハイオニューモニエ調製物が筋肉内投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ブタがワクチン接種２５週間後まで防御される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンがアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンがサブユニットワクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
サブユニットワクチンが一つ以上の免疫原性ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはこれらポリペプチドまたはタンパク質の免疫原性フラグメントを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドまたはタンパク質が：Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０及びＰ４４からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１４】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンが、一つ以上の免疫原性ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはこれらポリペプチドまたはタンパク質の免疫原性フラグメントをコードする、１つ以上の遺伝子または核酸を含み、そして該遺伝子または核酸がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子または核酸が：ｐ４６、ｐ６５、ｐ９７、ｐ１０２、ｐ７０、ｐ５０及びｐ４４からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、約３〜１０日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ワクチンの有効量を単回ワクチン投与することにより、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に起因する、動物における疾患または障害を治療または予防する方法に関するものである。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンは、細胞の全体もしくは一部を不活化した調製物または修飾した生の調製物、サブユニットワクチン、または核酸もしくはＤＮＡワクチンであることが可能である。本発明に従って投与されるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンは、合成または組換えにより産生可能である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
マイコプラズマ・ハイオニューモニエはブタにおける地方病性肺炎の原因となる細菌性病原体である。地方病性肺炎は慢性疾患で、劣った飼料転換、成育不全、および二次的な肺感染症に罹りやすい素因を生じる。マイコプラズマ・ハイオニューモニエは気道分泌物を介して、そして母子感染により容易に伝播し、そして養豚農場に非常に蔓延する。米国における養豚のおよそ９９パーセントが感染し、養豚産業には年間約３億ドルの負担となる。
【０００３】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する既知のワクチンのほとんどは、アジュバントを添加したマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞全体の不活化調製物を基とする。加えて、免疫原性ポリペプチドまたはタンパク質を基にするワクチンは、合成またはマイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子のクローニング及び組換え発現による調製も可能である。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてこれらのポリペプチドまたはタンパク質を発現可能なマイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子もまた、ワクチンとして使用することが可能である。
【０００４】
細胞全体を不活化したマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの例には、米国ファイザー社より入手可能なＲＥＳＰＩＳＵＲＥ及びＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥが含まれる。
加えて、サブユニットワクチンとして有用な可能性のある、組換えにより産生されるいくつかのマイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原性ポリペプチド及びタンパク質について記載されている。国際特許公報ＷＯ  ９６／２８４７２では、分子量４６〜４８、５２〜５４、６０〜６４、７２〜７５、９０〜９４及び１１０〜１１４キロダルトンの６種類のマイコプラズマ・ハイオニューモニエタンパク質抗原について記載されており、そして５２〜５４、６０〜６４および７２〜７５キロダルトン抗原のタンパク質部分配列並びに４６〜４８キロダルトン抗原の全長ヌクレオチド及びアミノ酸配列が開示されている。
【０００５】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエタンパク質Ｐ４６をコードする遺伝子、すなわちｐ４６のクローニングについても、Ｆｕｔｏらにより記載された（１９９５；Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７：１９１５−１９１７）。同グループは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現した遺伝子産物が、他のマイコプラズマ種と交叉反応を示すことなくマイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に対する抗体応答を診断するのに有用であることを示した（Ｆｕｔｏら、１９９５，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３３：６８０−６８３）。Ｆｕｔｏらにより記載されたｐ４６遺伝子の配列及び診断上の使用は、欧州特許公報第０  ４７５  １８５  Ａ１号においてさらに開示されている。
【０００６】
ＷｉｓｅおよびＫｉｍ（１９８７，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １６９：５５４６−５５５５）は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエには、ｐ７０、ｐ６５（Ｐ６５、上記）、ｐ５０及びｐ４４と称する４種類の内在性膜タンパク質種があり、そして後者３つは共有結合した脂質付着物により修飾され、そして強い液性免疫応答を誘導することを報告している。免疫応答の保護効果については検討されなかった。Ｐ６５タンパク質をコードする遺伝子はクローニングされており、そして米国特許第５，７８８，９６２号にその配列、並びにワクチン及び診断法におけるその使用について記載されている。
【０００７】
国際特許公報ＷＯ  ９１／１５５９３では、みかけの分子量が１０５、９０、８５、７０及び４３キロダルトンの５つのマイコプラズマ・ハイオニューモニエタンパク質について記載されている。８５キロダルトンタンパク質（タンパク質Ｃ）をコードする遺伝子の全長配列が提供され、他の４つのタンパク質をコードするヌクレオチドの部分配列も提供された。
【０００８】
米国特許第５，２５２，３２８号では、Ｆａｕｌｄｓにより、分子量が３６、４１、４４、４８、６４、６８、７４．５、７９、８８．５、９６及び１２１キロダルトンの免疫応答性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  タンパク質のアミノ酸末端配列が開示されている。他にみかけの分子量２２．５、３４及び５２キロダルトンのタンパク質が電気泳動の移動度に基づいて同定されたが、タンパク質配列については開示されなかった。米国特許第５，２５２，３２８号ではこれらのタンパク質をワクチン処方物に使用することが提案されたが、ワクチンの臨床試験結果は報告されなかった。
【０００９】
国際特許公報ＷＯ  ９５／０９８７０では、宿主の上気道上皮の線毛への付着に関与するマイコプラズマの内在性膜タンパク質であるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ付着因子の生化学的精製法が開示されている。ＷＯ  ９５／０９８７０ではまた、例えばワクチン及び診断法における、これらタンパク質のアッセイ及び使用を提案している。
【００１０】
Ｋｉｎｇらによる研究論文（１９９７；  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：２５−３５）では、Ｐ９７の菌株バリアントである１２４キロダルトンの付着因子Ｍｈｐ１について開示された。
【００１１】
Ｐ９７の９４キロダルトンバリアントは、Ｗｉｌｔｏｎらによって同定された（１９９８，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：１９３１−１９４３）。さらに、ｐ９７遺伝子は、予想分子量およそ１０２キロダルトンの、Ｐ１０２と称する第二のタンパク質もコードするオペロンの一部であることが示された（Ｈｓｕら，  １９９８，  Ｇｅｎｅ  ２１４：１３−２３）。ＭｉｎｉｏｎおよびＨｓｕは、国際特許公報ＷＯ  ９９／２６６６４にてＰ１０２をワクチンに使用することを提案しているが、ワクチン臨床試験については報告していない。
【００１２】
既知のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンで、約３〜１０日齢のブタの単回投与治療において有効なものは記載されていない。このようなワクチンがあれば、複数回投与の必要性はなくなり、そしてその結果、世界的に大規模に行われている養豚へのワクチン接種にかかる費用及び労力は有意に減少するであろう。このように、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに起因する疾患または障害からの防御及び予防のため、約３〜約１０日齢のブタに単回ワクチン接種で投与可能な、有効なマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンが必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの感染に起因する、動物における疾患または障害を治療または予防する方法であって、約３〜約１０日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンの有効量を単回投与することを含む、前記方法を含む。
【００１４】
本発明の方法により、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する免疫を作るため及び／または維持するために追加投与を行う必要はなくなる。本方法の単回（一回）ワクチン接種により、血清陰性及び血清陽性のいずれのブタでも毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対して防御が得られる。本発明の方法は、例えばブタにおける肺病変の予防及び縮小といった、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に起因する症状の治療または予防に有効である。
【００１５】
本発明の方法は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンの有効量をブタに単回投与することを含み、ここでいうマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンは、バクテリンまたは修飾した生の調製物などの細胞全体または一部の調製物、一つ以上のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ由来ポリペプチドまたはタンパク質、これらポリペプチドまたはタンパク質の免疫原性フラグメントを含むサブユニットワクチンなどのサブユニットワクチン、あるいはこれらタンパク質、ポリペプチドまたは免疫原性フラグメントをコードする一つ以上のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子であって、その遺伝子または核酸がｉｎ  ｖｉｖｏにて発現可能であるものを含む。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンに提供されるマイコプラズマ・ハイオニューモニエのポリペプチド、タンパク質、その免疫原性フラグメント、及び遺伝子または核酸は、当該技術分野において公知の技術を用いて合成するか、または組換えにより産生することが可能である。
【００１６】
本発明に従って投与されるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンは、アジュバントなどの添加物を含んでもよい。使用可能な種々のアジュバントには、本明細書に記載のもの及び当該技術分野において公知のものが含まれる。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に起因する、動物における疾患または障害を治療または予防する方法であって、約３〜約１０日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンの有効量を単回投与することを含む、前記方法を含む。
【００１８】
本発明の単回ワクチン接種法により、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する免疫を作るため及び／または維持するためにブタに追加投与を行う必要はなくなる。
明確に開示するため、そして限定を目的とせずに、本発明の詳細な説明を以下の小節に分割し、本発明のいくつかの特徴、実施態様または適用について記載または例証する。
【００１９】
いくつかの実施態様では、本発明の方法において用いられるワクチンは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の一部または全体の不活化調製物（バクテリン）または修飾生ワクチン及び薬学的に許容可能なキャリヤー、あるいはマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の一部または全体の不活化調製物（バクテリン）または修飾生ワクチン及びアジュバントを含む。
【００２０】
他の特定の実施態様では、本発明の方法において用いられるワクチンは、免疫原性タンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント及び薬学的に許容可能なキャリヤー、あるいは免疫原性タンパク質もしくはポリペプチドまたはそのフラグメント及びアジュバントを含む。
【００２１】
定義及び略語
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に関する「治療または予防」の語は、本明細書では、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌の複製を阻害するか、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの伝播を阻害するか、またはマイコプラズマ・ハイオニューモニエの宿主への定着を防止すること、並びに、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に起因する疾患または障害の症状を緩和することを意味する。細菌数の縮小、肺感染部の減少、並びに／あるいは飼料摂取及び／または発育の増加がみられる場合、治療は効果を奏しているとみなされる。本発明の方法は、例えば、肺病変を予防または縮小するのに有効である。
【００２２】
「マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチン」の語は、本明細書では、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に起因する障害または疾患を予防または治療するのに有用なワクチンを指す。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンには、ブタにおけるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染の治療または予防に効果的ないかなるワクチンも含めることが可能である。本発明において使用可能なマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンには、例えば、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の全体または一部の調製物、不活化または修飾生ワクチン、一つ以上のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ由来ポリペプチドもしくはタンパク質またはこれらタンパク質もしくはポリペプチドの免疫原性フラグメントを有するサブユニットワクチン、あるいは一つ以上のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ由来ポリペプチドもしくはタンパク質またはその免疫原性フラグメントをコードし、そしてブタにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで発現可能である、一つ以上のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子または核酸が含まれることが可能である。マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ポリペプチド、タンパク質、これらポリペプチド及びタンパク質の免疫原性フラグメント、またはマイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子もしくは核酸は、当該技術分野において公知の技術を用いて、合成するか、または組換えにより産生することが可能である。好ましくは、本発明の方法において用いられるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンは、バクテリンである。
【００２３】
「動物」の語は、本明細書では、哺乳動物を含む非ヒト動物すべてを指す。
「ブタ」の語は、本明細書では、子ブタ（ｐｉｇｌｅｔｓ）、養豚（ｓｗｉｎｅ）、ブタ（ｐｉｇｓ）、ブタの（ｐｏｒｃｉｎｅ）、雌ブタ（ｓｏｗｓ）、若齢雌ブタ（ｇｉｌｔｓ）、去勢雄ブタ（ｂａｒｒｏｗｓ）、去勢していない雄ブタ（ｂｏａｒｓ）及びイノシシ（Ｓｕｉｄａｅ）科の動物を指す。
【００２４】
好ましくは、本発明の方法は非ヒト哺乳動物である動物に適用され；最も好ましくはブタに適用される。
「バクテリン」の語は、本明細書では、ワクチンとしての使用に適したマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞の全体または一部の不活化調製物を指す。
【００２５】
「有効量」の語は、投与した被験者において免疫応答を引き出すのに十分なマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンの量を指す。免疫応答は、限定なしに、自然免疫、細胞性及び／または液性免疫の誘導を含むことが可能である。
【００２６】
不活化（細胞の一部または全体）及び修飾生ワクチン
本発明の方法に用いられる慣用的な不活化または修飾生ワクチンの調製法は、当該技術分野において知られている。
【００２７】
本単回ワクチン接種法に使用可能なマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリンは、種々の公的に入手可能な供給源より得ることが可能である。例えば、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリンはマイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株より調製可能である。多数のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株が当業者に知られており、そして例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９）から入手可能である。これらには、例えば：ＡＴＣＣ番号２５０９５、２５６１７、２５９３４、２７７１４及び２７７１５が含まれる。
【００２８】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株はまた、自然感染または実験的に感染させたブタの肺病変部より、公知の技術を用いて直接得ることが可能である。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株は種々の公知の方法を用いて不活化することが可能である。例として、米国特許第５，５６５，２０５号に記載されているように細菌分離株をバイナリー  エチレンイミン（ＢＥＩ）で処理して、あるいは、例えばホルマリン、熱、ＢＰＬ、放射線照射またはグルタルアルデヒドを用いて不活化する方法がある。
【００２９】
本発明の方法における使用に適したマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリンはまた、種々の商業的供給源から得ることも可能である。これらの供給源には、限定されるわけではないが：ＲＥＳＰＩＦＥＮＤ（フォートダッジ社、アメリカンホームプロダクト社）、ＨＹＯＲＥＳＰ（メリアル社）、Ｍ＋ＰＡＣ（シェリング・プラウ社）、ＰＲＯＳＹＳＴＥＭ  Ｍ（インターベット社）、ＩＮＧＬＥＶＡＣ  Ｍ（ベーリンガー社）、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（ファイザー社）及びＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ  ＭＹＣＯＰＬＡＳＭＡ（ファイザー社）が含まれる。
【００３０】
本発明の方法における使用に好ましいマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリン供給源は、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ及びＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ  ＭＹＣＯＰＬＡＳＭＡである。
【００３１】
本発明の方法における使用に特に好ましいマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリン供給源は、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１（ファイザー社）であり、これは米国パデュー大学より入手したＰ−５７２２−３（ＮＬ１０４２）株を含有する。
【００３２】
好ましくは、Ｐ−５７２２−３株をＢＥＩで不活化し、そして商業的に入手可能なアジュバント、好ましくはＡＭＰＨＩＧＥＮ（ハイドロニクス社、米国）をアジュバント添加する。好ましい用量は約２．０ｍｌである。慣用的に使用される保存剤にはマーシオレート／ＥＤＴＡが含まれる。キャリヤー、好ましくはＰＢＳを加えてもよい。培養継代による毒性株の弱毒化によるなどの修飾生ワクチンの調製は、当該技術において公知である。
【００３３】
サブユニットワクチン
本発明の方法は、精製したマイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原性タンパク質、ポリペプチド、並びにこれらタンパク質及びポリペプチドの免疫原性フラグメントを有するサブユニットワクチンを用いて実行することが可能である。これらのタンパク質及びポリペプチドは当該技術分野において公知の技術を用いて調製可能である。さらに、タンパク質の純度または均質性を測定するのに、試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動後、染色したゲル上で単一ポリペプチドバンドを可視化するといった、当業者に周知の方法を用いることが可能である。ＨＰＬＣもしくは当該技術分野において周知の他の類似の方法を用いて、より高い分解能で測定してもよい。
【００３４】
特定の実施態様において、本発明の方法において用いられるワクチンは、限定されるわけではないが、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０及びＰ４４といったマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  タンパク質を少なくとも一つ含む。
【００３５】
他の実施態様において、本発明の方法に用いられるワクチンは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリン（細胞の全体もしくは一部を不活化したものまたは修飾した生のもの）あるいはマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  タンパク質もしくはポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント、および少なくとも一つの他の免疫原（細胞の全体もしくは一部を不活化したものまたは修飾した生のもの）あるいは免疫原性または抗原性タンパク質、ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントを含み、そして好ましくは、ウイルス、細菌または寄生虫のポリペプチドである。このような他の病原体及びタンパク質、ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの例には、限定されるわけではないが、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、ブタ繁殖・呼吸疾患ウイルス（ＰＲＲＳまたはブタミステリー病）、離乳後下痢（ＰＷＤ）及びブタ増殖性腸炎（ＰＰＥ）が含まれる。こういった構成は混合ワクチンとして有益である。
【００３６】
さらなる特定の実施態様では、これらタンパク質またはポリペプチドの免疫原性フラグメントは、本発明の方法において用いられる免疫原性タンパク質及びポリペプチドにおける、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０または少なくとも１００の連続したアミノ酸を含む配列を有し、この免疫原性タンパク質及びポリペプチドには、限定されるわけではないが、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０およびＰ４４が含まれる。
【００３７】
さらに、ワクチンに使用するマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  タンパク質は実質的に純粋または均質である。本発明の方法では、これらのタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を発現している宿主細胞より典型的に精製されたタンパク質またはポリペプチドを用いる。このようなタンパク質精製は、当該分野において周知の種々の方法により遂行することが可能である。例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（１９９０年、アカデミックプレス社、サンディエゴ）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ」（１９８２年，  シュプリンガー・フェアラーク社、ニューヨーク）を参照されたい。
【００３８】
精製されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ポリペプチド及びタンパク質、並びにそれらの免疫原性フラグメントはまた、公知の合成法によっても調製が可能である。
ワクチン処方物
本発明において用いられるワクチンの適当な調製物には、溶液または懸濁液としての注射剤があり；注射前に液体に溶解または懸濁して用いるのに適した固体型もまた調製可能である。調製物はまた乳化されたものでもよい。免疫原性を有する活性成分は、薬学的に許容可能で、そして活性成分との適合性を有するアジュバントと混合されることが多い。
【００３９】
ポリペプチドは、中性または塩の形でワクチンへ処方されてもよい。薬学的に許容可能な塩には酸付加塩（ペプチドの未結合（ｆｒｅｅ）アミノ基で形成）が含まれ、そして例えば塩酸またはリン酸といった無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸で形成される。未結合カルボキシル基で形成される塩もまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄といった無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来することが可能である。
【００４０】
本発明において用いられるワクチン処方物は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原の有効免疫量及び薬学的に許容可能なキャリヤーを含む。ワクチン調製物は、一つ以上の抗原の有効免疫量および薬学的に許容可能なキャリヤーを含む。薬学的に許容可能なキャリヤーは当該技術分野において周知であり、そして限定されるわけではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張水性緩衝液、及びこれらの組み合わせが含まれる。これらの許容可能なキャリヤーの一例として、安定化され、加水分解されたタンパク質、ラクトースなどの安定化剤を一つ以上含有する生理的な平衡化培養培地がある。好ましくは、キャリヤーは無菌である。処方物は投与様式に適したものを用いるべきである。
【００４１】
標準法に基づき、精製抗原をワクチン調製物として使用することも可能である。例えば、精製タンパク質（類）を適度な濃度に調整して、適当なワクチンアジュバントとともに処方し、そして使用のため包装する。適当なアジュバントには、限定されるわけではないが：水酸化アルミニウムなどの鉱質ゲル；リゾレシチンなどの表面活性物質；サポニン及びＱｕｉｌ  ＡもしくはＧＰＩ−０１００といったサポニン由来物などのグリコシド；ＤＤＡ（第四級炭化水素アンモニウムハロゲン化物）、プルロニックポリオールなどの陽イオン性界面活性剤；ポリアニオン及び多原子イオン；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｂ．Ａ．Ｓ．Ｆ．社、米国）などのポリアクリル酸、非イオン性ブロックポリマー；Ａｖｒｉｄｉｎｅ及びＲａｎｔｉｄｉｎｅ；ペプチド；白血球毒素（ｒｍＬＴ）またはコレラ毒素（ＣＴ）などの不安定な毒素の組換え突然変異体；化学結合または近接した分子輸送体；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５０（セピック社、フランス・パリ）、カーボポール、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（ハイドロニクス社、米国）、米国・ネブラスカ州オマハ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（スーパーフォス・バイオセクター社、デンマーク・フレデリクスン）などの鉱油；ＢａｙｏｌＦ／Ａｒｌａｃｅｌ  Ａおよび水などの鉱油系エマルジョン、または、植物油、水およびレシチンなどの乳化剤のエマルジョンといった油エマルジョン；ミョウバン、ＭＤＰ、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン；コレステロール  サイトカイン、並びに複数のアジュバントの組み合わせが含まれる。多原子イオンはまた分散剤、粘度付与剤、および固結防止剤としても機能し、長期間固着（ｓｅｔｔｌｉｎｇ）した後ワクチンが単分散懸濁液として再懸濁されることを可能にする。アジュバントを組み合わせたものは、水性、カプセル（放出制御または徐放性）、またはマイクロカプセルの剤型で提示可能である。
【００４２】
ワクチン処方物として使用する目的で、免疫原をリポソームに封入するか、または多糖及び／または他のポリマーとコンジュゲート化させることも可能である。組換え抗原がハプテン、すなわち同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）抗体と選択的に反応可能である点では抗原性を有するが、免疫応答を誘発不能である点では免疫原性を持たない分子である場合、ハプテンをキャリヤーまたは免疫原性分子に共有結合させてもよく；例えば、ハプテンに血清アルブミンのような大きなタンパク質をカップリングさせると、免疫原性が付与されるであろう。ハプテン−キャリヤー結合体は、ワクチンとして使用する目的で処方することが可能である。
【００４３】
遺伝子及び核酸ワクチン
本発明の方法は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原性タンパク質、ポリペプチド、並びにこれらタンパク質及びポリペプチドの免疫原性フラグメントをコードする遺伝子または核酸を用いて実施することが可能である。このような遺伝子及び核酸はｉｎ  ｖｉｖｏにて発現させることが可能であり、そして当該技術分野において公知の技術を用いて調製可能である。
【００４４】
特定の実施態様では、本発明において用いられるワクチンは、限定されるわけではないが、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０およびＰ４４などのマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  タンパク質をコードする少なくとも一つの遺伝子または核酸を含む。
【００４５】
別の特定の実施態様では、本発明の方法において用いられる遺伝子または核酸は、本発明の方法において用いられる免疫原性タンパク質及びポリペプチドにおける、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０または少なくとも１００の連続したアミノ酸を含む配列を有するマイコプラズマ・ハイオニューモニエタンパク質またはポリペプチドの免疫原性フラグメントをコードし、この免疫原性タンパク質及びポリペプチドには、限定されるわけではないが、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０およびＰ４４が含まれる。
【００４６】
本発明の方法の他の実施態様では、用いられる遺伝子または核酸は、例えば遺伝子銃を用いるなどの公知の方法により投与される。
本発明の方法の別の他の実施態様では、用いられる遺伝子または核酸はＤＮＡワクチンである。さらに、核酸または遺伝子は、当該技術分野において公知のように、リポソームまたは他のトランスフェクション促進剤と会合した形で存在することが可能である。
【００４７】
ＤＮＡワクチンの調製および搬送の方法は、当該技術分野において公知である。例として、Ｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｂ．  Ｒ，  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ”，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）を参照されたい。
【００４８】
発現系
本発明の抗原性タンパク質配列を発現させるために、種々の宿主−発現ベクター系を利用してもよい。このような宿主−発現系は、目的とするコード配列を産生し、そして続いて精製されてもよいビヒクルに相当するが、また、適切なヌクレオチドコード配列を形質転換またはトランスフェクションすることによってｉｎ  ｓｉｔｕにて本発明の方法で使用されるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子産物を提示可能な細胞にも相当する。これらには、限定されるわけではないが、ｍｈｐ３をコードする配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した細菌（例として、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；マイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子産物をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母（例として、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属）；マイコプラズマ・ハイオニューモニエをコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例として、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；マイコプラズマ・ハイオニューモニエをコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例として、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、または、同配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例として、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞ゲノム由来のプロモーター（例として、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例として、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を宿する哺乳動物細胞系（例として、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含まれる。好ましい実施態様において、発現系は細菌系である。
【００４９】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ポリペプチド及びタンパク質並びにその免疫原性フラグメントはまた、アデノウイルスまたはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などの生きた組換えウイルスベクター及び細菌ベクターを用いて発現し、そして搬送することが可能である。実際のベクターもまた公知であり、そして当該技術分野においてすぐに利用可能であるか、または周知の方法論を用いて当業者により構築することが可能である。
【００５０】
投与量及び投与形態
本発明にしたがって、約３〜１０日齢のブタに対してマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンの有効量を単回投与することにより、その後のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対する有効な免疫が付与される。好ましくは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンを約６〜約８日齢時に投与する。最も好ましくは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンを約７日齢時に投与する。
【００５１】
単回投与にて有効なマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリンワクチンの量は、用量あたり約１ｘ１０６〜５ｘ１０１０変色単位（ｃｏｌｏｒ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）（ＣＣＵ）を含有する。好ましくは、単回投与にて有効な免疫を付与するマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリンワクチンは、約１ｘ１０８〜５ｘ１０１０ＣＣＵ／用量を含有し、そしてより好ましくは約５ｘ１０８〜５ｘ１０１０ＣＣＵ／用量を含有する。
【００５２】
本発明にしたがって、好ましいバクテリン製品であるＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１を投与する場合、単回投与用のＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１の量は約０．５〜約３ｍｌであり、好ましくは、約１．５〜約２．５ｍｌであり、そしてより好ましくは２ｍｌである。
【００５３】
一つ以上のタンパク質またはポリペプチド、あるいはこれらタンパク質またはポリペプチドの免疫原性フラグメントを含むサブユニットワクチンであるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンの本発明の方法における有効量は、約０．０１μｇ〜約２００μｇである。
【００５４】
免疫原性タンパク質またはポリペプチド、あるいはこれらタンパク質またはポリペプチドの免疫原性フラグメントをコードする一つ以上のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ遺伝子または核酸（好ましくはＤＮＡ）を含むワクチンであるマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  ワクチンの本発明の方法における有効量は、約０．１μｇ〜約２００ｍｇである。
【００５５】
本発明の方法にしたがって、公知の経路で投与を行うことが可能であり、これには経口、経鼻、粘膜  局所、経皮、および非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）が含まれる。無針式の搬送用デバイスを用いて投与を行うこともまた可能である。例えば、初回投与を非経口経路で、そしてその次の投与を経粘膜で行うなど、経路を組み合わせて投与を行うことが可能である。好ましい投与経路は筋肉内投与である。
【００５６】
本発明のワクチンの有効用量（免疫量）はまた、モデル実験系より得られる用量−反応曲線から外挿可能である。
本ワクチン接種法は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対して血清陽性の子ブタ及び血清陰性の子ブタのいずれにも防御免疫を付与する。血清陽性の子ブタとは、血清中に抗マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗体を有する子ブタを指す。血清陰性の子ブタとは、検出可能なレベルの抗マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗体を血清中に持たない子ブタを指す。
【００５７】
本発明は以下の実施例にさらに例示されるが、該実施例によって限定されない。
【実施例】
【００５８】
（実施例１）
マイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンの調製
バイナリー  エチレンイミン（ＢＥＩ）を用いてマイコプラズマ・ハイオニューモニエＮＬ１０４２株を不活化する。
【００５９】
増殖期の終了時に培養液のｐＨを７．８±０．２に上げ、そしてｐＨを少なくとも一時間この範囲内に維持した。このとき、ろ過滅菌した２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（ＢＥＡ）水溶液を加えて最終濃度が約４．０ｍＭとなるようにした。ｐＨを上げた状態では、ＢＥＡはＢＥＩに化学的に変化する。培養液を常にかき混ぜながら、３７±２℃で少なくとも２４時間インキュベートした。
【００６０】
２４時間のインキュベート後、ろ過滅菌したチオ硫酸ナトリウム水溶液を最終濃度が約４ｍＭとなるように加え、過剰のＢＥＩを中和した。培養液を常に撹拌しながらさらに２４時間、３７±２℃でインキュベートした。
【００６１】
不活化後、チオ硫酸ナトリウムで中和する前に、代表試料を得て、そして不活化が完了したかどうかを検査する。０．００２６％フェノールレッドを含有する新鮮な培地に、５〜２０％接種原を接種し、そして３７±２℃で少なくとも１週間インキュベート後、色の変化を検査する。色の変化は、不活化の失敗の指標となる。バルク試料の無菌性について、３７±２℃にてチオグリコレート  ブロス、並びに、室温にてトリプチケース  ソイ  ブロスを用いて検査した。不活化した培養液は無菌の保管容器に移し、そして混合するまで２〜８℃で保管してもよい。
【００６２】
力価をｉｎ  ｖｉｔｒｏ血清学的アッセイにより決定し、最終容器中の抗原を定量した。効力試験に用いるワクチンの力価より、使用期限時にワクチンが有するべき最低力価が決定される。
【００６３】
完成品のバルクまたは最終容器試料の各シリアルまたはサブシリアルの初番について、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに関する検査を以下のように行った。
バクテリンを１００ｍｌバイアル中に−５０℃で保管した。バイアルを解凍し、そして１５ｍｌに分注したものを、使用するまで５±２℃で保管する。
【００６４】
混合シリアルの力価を測定するために、シリアルの試料を標準品と比較し、そしてシリアルのＲＰ単位を求める。シリアルまたはサブシリアルは、好ましくは、製造日に少なくとも６．３３ＲＰを、及び使用期限内を通して少なくとも５．０６ＲＰを含む。
【００６５】
ＲＰは相対力価を指す。ＲＰは、ワクチン標準品と比較した場合の相対的な抗原定量によって求めることが可能である。この場合、標準品のＲＰを１．０と定義する。本発明の単回投与品は、好ましくは、ＲＰが６．３３、すなわち標準品の６．３３倍である。
【００６６】
保存剤として、マーシオレートを最終濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）を超えないように加える。
保存剤として、１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、二ナトリウムまたは四ナトリウム塩）溶液を最終濃度およそ０．０７％（ｗ／ｖ）で加える。
【００６７】
（実施例２）
動物
約１週齢のブタをワクチン接種用に選定した。ＥＬＩＳＡアッセイにてマイコプラズマ・ハイオニューモニエに対する血清学的状態を評価した。ＥＬＩＳＡ値が０．５０以下のブタをマイコプラズマ・ハイオニューモニエ陰性と判断した。ＥＬＩＳＡ値が０．５０より大きいブタは血清学的にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ陽性であると判断した。
【００６８】
ワクチン
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ    バクテリンであるＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１（ファイザー社）をブタへのワクチン接種に用いた。使用する前に、マイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリン標準品と比較した相対的な抗原定量によって、ワクチンの力価を求めた。ワクチン標準品（ＲＰ＝１．０）は用量あたり約８０００単位の抗原（不活化前に採取した生細胞約１〜２ｘ１０８ＣＣＵ）を含有し、これはワクチン中のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原量を測定する固相イムノアッセイにより求められた。
【００６９】
ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１を処方するのに用いられるのと同じ液体アジュバント（ＡＭＰＨＩＧＥＮ）をプラセボ（すなわち、細菌細胞を含まない）として用いた。
曝露用接種原
曝露用接種原には、１０ｍｌに分注した肺ホモジネートを−７０℃にて凍結したものを用意し、そしてこれはマイコプラズマ・ハイオニューモニエ１１（Ｌ１  ３６）株由来と同定された。接種原を解凍して、そしてその後、Ｆｒｉｉｓマイコプラズマ  ブロス中に１：２５の希釈度となるよう希釈し、そして投与するまで氷上に保管した。以下の各実施例において特定した日に、１：２５懸濁物５ｍｌを各ブタに経鼻接種（各鼻孔に２．５ｍｌ）した。各曝露日に、肺接種原のアリコットを培養し、細菌が混入していないことを確認した。別のアリコットを３日間の各日に逆滴定し、接種原が約１０６〜１０７変色単位（ＣＣＵ）／ｍｌのマイコプラズマ・ハイオニューモニエを含有するとの結果が示された。
【００７０】
実験法
ブタは、母ブタといるうちに（第（−１）日）イヤータグで区別した。ブタを一般化乱塊法に従って豚舎及び治療群に割り当てた。ブタは同腹児及び離乳後の豚舎に基づいてブロック化した。
【００７１】
第０日に、２ｍｌの筋肉内用量のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリンＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１（ファイザー社）、または２ｍｌの筋肉内用量のプラセボいずれかを、ブタにワクチン接種した。以下の各実施例において特定した日に、１：２５懸濁物の曝露用接種原５ｍｌを各ブタに経鼻接種した。すべてのブタを毎日観察し、そして臨床疾患の徴候について検査した。
【００７２】
曝露初日後の特定した時間に、すべてのブタを屠殺し、そして剖検した。肺を摘出し、そして評価を行った。死後検査には、マイコプラズマ呼吸器疾患に関連する病理の程度の評価が含まれた。各肺葉を検査し、そして病変部をスケッチして各葉の病変部の割合を概算した。存在した肉眼病変の程度を記録した。
【００７３】
データ解析
有効性を、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染に典型的な肺病変の割合に基づき評価した。治療群（ワクチン接種）のブタでは、プラセボ群のブタに比べ、肺病変部の総割合が有意に少ないと決定された（Ｐ≦０．０５）。
【００７４】
肺病変部の総割合
肺全体に対する各肺葉の割合（左上（ｌｅｆｔ  ｃｒａｎｉａｌ）１０％、左中１０％、左下（ｌｅｆｔ  ｃａｕｄａｌ）２５％、右上１０％、右中１０％、右下２５％および副１０％）を用いて、各肺葉における肉眼病変の割合に加重値を与えた。次に、肺葉全体で肺葉の加重値を合計して、肺病変部の総割合を算出した（Ｐｏｉｎｔｏｎら，  １９９２）。
【００７５】
（実施例３）
マイコプラズマ・ハイオニューモニエバクテリンＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１（ファイザー社）を３〜８日齢のブタに単回投与し、毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対する防御作用を、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対して血清陽性のブタにおいて評価した。
【００７６】
ワクチン接種時またはその前後に、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１に対する力価アッセイを５度反復して実施した。ワクチン標準品と比較した場合の相対的な抗原定量により、相対力価（ＲＰ）を求めた。ワクチン標準品は、ＲＰ＝１．０であり、約８０００単位のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原を含有した。これらの５度のアッセイより得られたＲＰは、それぞれ５．４２、３．９６、４．７１、５．４９、および４．３６であった。
【００７７】
第０日に、治療群Ｔ０２（下の表１を参照されたい）のブタにマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリン  ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１（ファイザー社）を２ｍｌ筋肉内用量でワクチン接種した。治療群Ｔ０１のブタには、プラセボ２ｍｌを筋肉内接種した。第１７８、１７９及び１８０日に、各ブタに１：２５懸濁物の曝露用接種原５ｍｌを経鼻接種した。この３日間の各日に、曝露物質のアリコットを培養して細菌が混入していないことを確認した。別のアリコットを逆滴定し、曝露用ストックが約１０７ＣＣＵ／ｍｌのマイコプラズマ・ハイオニューモニエを含有することを確認した。すべてのブタを毎日観察し、そして臨床疾患の徴候について検査した。
【００７８】
曝露初日から３０日後に、すべてのブタを屠殺し、そして剖検した。肺を摘出し、そして評価を行った。死後検査には、マイコプラズマ呼吸器疾患に関連する病理の程度の評価が含まれた。各肺葉を検査し、そして病変部をスケッチして各葉の病変部の割合を概算した。存在した肉眼病変の程度を記録した。
【００７９】
【表１】
2005515162.tif 000002
肺病変の結果を表２に要約する。その結果、ワクチン接種されたブタ（Ｔ０２）では肺炎性肺病変の割合の最小自乗平均値がプラセボブタ（Ｔ０１）よりも有意に低い（２．０％  ｖｓ．４．５％、Ｐ＝０．０３８５）ことが示された。
【００８０】
【表２】
2005515162.tif 000003
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリン  ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１を約１週齢のブタに単回接種したことにより、それに続く毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対して防御作用が誘導されたことが、結果より示される。
（実施例４）
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリン  ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１を３〜８日齢のブタに単回投与し、毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対する防御作用を、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対して血清陰性のブタにおいて評価した。
【００８１】
ワクチン接種時またはその前後に、該ワクチンに対する力価アッセイを５度反復して実施した。ワクチン標準品と比較した場合の相対的な抗原定量により、ＲＰを求めた。ワクチン標準品は、ＲＰ＝１．０であり、約８０００単位のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原を含有した。これらの５度のアッセイより得られたＲＰは、それぞれ５．４２、３．９６、４．７１、５．４９および４．３６であった。
【００８２】
第０日に、治療群Ｔ０２のブタにマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリン  ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１を２ｍｌ筋肉内用量でワクチン接種した。治療群Ｔ０１のブタには、プラセボ２ｍｌを筋肉内接種した。第１７３、１７４及び１７５日に、各ブタに１：２５懸濁物の曝露用接種原５ｍｌを経鼻接種した。この３日間の各日に、曝露物質のアリコットを接種のときに培養して細菌が混入していないことを確認した。別のアリコットを逆滴定し、曝露用ストックが約１０６ＣＣＵ／ｍｌのマイコプラズマ・ハイオニューモニエを含有することを確認した。すべてのブタを毎日観察し、そして臨床疾患の徴候について検査した。
【００８３】
曝露初日から２９日後に、すべてのブタを屠殺し、そして剖検した。肺を摘出し、そして評価を行った。死後検査には、マイコプラズマ・ハイオニューモニエが誘導する呼吸器疾患に関連する病理の程度の評価が含まれた。各肺葉を検査し、そして病変部をスケッチして各葉の硬化（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）の割合を概算した。存在した肉眼病変の程度を記録した。
【００８４】
表３に実験計画を要約する。
【００８５】
【表３】
2005515162.tif 000004
肺病変の結果を表４に要約する。ワクチン接種されたブタ（Ｔ０２）では肺炎性肺病変の割合の最小自乗平均値がプラセボブタ（Ｔ０１）よりも有意に低い（０．３％  ｖｓ．５．９％、Ｐ＝０．０００１）ことが全体的分析より示された。
【００８６】
【表４】
2005515162.tif 000005
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリン  ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１をブタに単回接種したことにより、それに続く毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエの実験的曝露に対して防御作用が誘導されたことが、この研究結果より示される。
（実施例５）
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリン  ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ−１を３〜８日齢のブタに単回投与し、毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエの曝露に対する防御作用を、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに対して血清陰性のブタにおいて評価した。
【００８７】
ワクチン接種時またはその前後に、該バクテリンに対する力価アッセイを５度反復して実施した。ワクチン標準品と比較した場合の相対的な抗原定量により、ＲＰを求めた。ワクチン標準品は、ＲＰ＝１．０であり、約８０００単位のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原を含有した。これらの５度のアッセイより得られたＲＰは、それぞれ５．４２、３．９６、４．７１、５．４９および４．３６であった。
【００８８】
第０日に、治療群Ｔ０２のブタにマイコプラズマ・ハイオニューモニエ  バクテリンを２ｍｌ筋肉内用量でワクチン接種した。治療群Ｔ０１のブタには、プラセボ２ｍｌを筋肉内接種した。第７６、７７及び７８日に、各ブタに１：２５懸濁物の曝露用接種原５ｍｌ（各鼻孔に２．５ｍｌ）を経鼻接種した。この３日間の各日に、曝露物質のアリコットを接種のときに培養して細菌が混入していないことを確認した。別のアリコットを逆滴定し、曝露用ストックが約１０６ＣＣＵ／ｍｌのマイコプラズマ・ハイオニューモニエを含有することを確認した。すべてのブタを毎日観察し、そして臨床疾患の徴候について検査した。
【００８９】
曝露初日から２９日後に、すべてのブタを屠殺し、そして剖検した。肺を摘出し、そして評価を行った。死後検査には、マイコプラズマ・ハイオニューモニエが誘導する呼吸器疾患に関連する病理の程度の評価が含まれた。各肺葉を検査し、そして病変部をスケッチして各葉の病変部の割合を概算した。存在した硬化の程度を記録した。
【００９０】
表５に実験計画を要約する。
【００９１】
【表５】
2005515162.tif 000006
肺病変の結果を表６に要約する。ワクチン接種されたブタ（Ｔ０２）では肺炎性肺病変の割合の最小自乗平均値がプラセボブタ（Ｔ０１）よりも有意に低い（０．５％  ｖｓ．９．９％、Ｐ＝０．０００１）ことが全体的分析より示された。
【００９２】
【表６】
2005515162.tif 000007
【国際調査報告】
2005515162.tif 000008