(57)【要約】本発明の様々な実施様態はヒトキナーゼおよびホスファターゼ(KPP)、およびKPPを同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の実施例はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。他の実施態様は、KPPの異常発現に関連する疾患を診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-52（配列番号１乃至52）からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO:2-4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16-17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:36-37、SEQ ID NO:41-44、およびSEQ ID NO:51から成る群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:28のアミノ酸配列に対して少なくとも91％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄ）SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:12から成る群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも92％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｅ）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列に対して少なくとも93％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｆ）SEQ ID NO：18-19からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも94％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｇ）SEQ ID NO:25のアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｈ）SEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:46からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも96％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｉ）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｊ）SEQ ID NO：22、SEQ ID NO:33およびSEQ ID NO:49からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも99％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｋ）SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13-14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26-27、SEQ ID NO:30-32、SEQ ID NO:34-35、SEQ ID NO:38-40、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47-48、SEQ ID NO:50、およびSEQ ID NO:52を有する群から選択したアミノ酸配列と少なくとも９０％が同一であるような天然のアミノ酸配列から本質的に構成されるポリペプチド、
（ｌ）SEQ ID NO：1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および
（ｍ）SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:53-104からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドへ機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを有する遺伝形質転換生物。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなる方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異結合するような単離された抗体。
【請求項１２】
以下からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:53-104からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:53-61、SEQ ID NO:63-84、SEQ ID NO:86-100およびSEQ ID NO:103-104からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）SEQ ID NO:62のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも91％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
（ｄ）SEQ ID NO:85のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９６％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
（ｅ）SEQ ID NO:101のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９２％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド
（ｆ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｇ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｈ）（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｉ）（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｊ）（ｅ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｋ）（ａ）〜（ｊ）のRNA等価物 
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドを持つ、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも20の連続したヌクレオチドを持つプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも60の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項1に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-52からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
機能的なKPPの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項17に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法で同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能性KPPの発現低下に関連する疾患又は病状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項21に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項1に記載のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項23に記載の方法で同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項２５】
機能性KPPの過剰発現に関連する疾患又は病状の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項24に記載の組成物を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項1に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項1に記載のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも1つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項1に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項1のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項1に記載のポリペプチドの活性をモジュレート（調節）する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項1に記載のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項1のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項1に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項1に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項1に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項5に記載の配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも20の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生体サンプル中のKPPの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルと請求項11に記載の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項11に記載の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F（ab'）2 断片
（ｅ）ヒト化抗体のいずれかである抗体。
【請求項３２】
請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを有する組成物。
【請求項３３】
被検者中のKPPの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項32に記載の組成物であり、さらに或る標識を有する。
【請求項３５】
被検者中のKPPの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項１１に記載の抗体の特異性を持つポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項36に記載の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項37に記載のポリクローナル抗体と好適なキャリアとを有する組成物。
【請求項３９】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO：1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項40に記載のモノクローナル抗体と適切なキャリアとを有する組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリのスクリーニングによって前記抗体を産出することを特徴とする、請求項11に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることにより産出される、請求項11に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-52を有する群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをサンプル中で検出する方法であって、
（ａ）請求項11に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と1サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-52 からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製ポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも1つのエレメントが請求項13に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチド群を有する或るサンプルの発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項46のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドとを接触させる過程と、
（ｃ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程を含む方法
【請求項４８】
固体基板上の固有の物理的位置に付着された種々のヌクレオチド分子を有するアレイであって、少なくとも1つの前記ヌクレオチド分子が、或る標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチド群と特異的にハイブリダイズ可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記の標的ポリヌクレオチドが請求項12に記載のポリヌクレオチドであることを特徴とするアレイ。
【請求項４９】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５０】
請求項48に記載のアレイで、前記の最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列が前記の標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５１】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列が前記の標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であることを特徴とするアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイで、マイクロアレイであることを特徴とするアレイ。
【請求項５３】
請求項48に記載のアレイで、前記のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの最初の配列を有するヌクレオチド分子にハイブリダイズした前記の標的ポリヌクレオチドを有することを特徴とするアレイ。
【請求項５４】
請求項48に記載のアレイで、或るリンカーが少なくとも１つの前記のヌクレオチド分子と前記の固体基板とを連結していることを特徴とするアレイ。
【請求項５５】
請求項48に記載のアレイで、該基板上の固有の物理的位置の各々が複数のヌクレオチド分子を含み、任意の単一の固有の物理的位置でのその複数のヌクレオチド分子は同一の配列を有し、該基板上の固有の物理的位置の各々は、該基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子群の配列とは異なる或る配列を有するヌクレオチド分子群を含むことを特徴とするアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
SEQ ID NO:42のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９８】
SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９９】
SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１００】
SEQ ID NO:45のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１０１】
SEQ ID NO:46のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
SEQ ID NO:47のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１０３】
SEQ ID NO:48のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
SEQ ID NO:49のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
SEQ ID NO:50のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１０６】
SEQ ID NO:51のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
SEQ ID NO:52のアミノ酸配列を有する請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
SEQ ID NO:53のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
SEQ ID NO:55のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
SEQ ID NO:56のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
SEQ ID NO:57のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
SEQ ID NO:58のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
SEQ ID NO:59のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
SEQ ID NO:60のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
SEQ ID NO:61のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
SEQ ID NO:62のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
SEQ ID NO:63のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
SEQ ID NO:64のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
SEQ ID NO:65のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
SEQ ID NO:66のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
SEQ ID NO:67のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
SEQ ID NO:68のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
SEQ ID NO:69のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
SEQ ID NO:70のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
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【請求項１２７】
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【請求項１２８】
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【請求項１２９】
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【請求項１３０】
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【請求項１３１】
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【請求項１３２】
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【請求項１３３】
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【請求項１３４】
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【請求項１３５】
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【請求項１３６】
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【請求項１３７】
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【請求項１３８】
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【請求項１３９】
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【請求項１４０】
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【請求項１４１】
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【請求項１４２】
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【請求項１４３】
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【請求項１４４】
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【請求項１４５】
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【請求項１４６】
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【請求項１４７】
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【請求項１４８】
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【請求項１４９】
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【請求項１５０】
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【請求項１５１】
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【請求項１５２】
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【請求項１５３】
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【請求項１５４】
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【請求項１５５】
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【請求項１５６】
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【請求項１５７】
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【請求項１５８】
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【請求項１５９】
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な核酸、これらの核酸によってコードされるキナーゼ及びホスファターゼに関する。またこれらの核酸およびタンパク質の、心血管疾患、免疫系疾患、神経疾患、成長および発達に影響を及ぼす疾患、脂質異常、細胞増殖異常、および癌の、診断、治療および予防における利用に関する。本発明は更に、核酸またキナーゼ及びホスファターゼの発現における、外因性化合物の効果についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
可逆的なタンパク質リン酸化は、真核細胞の細胞内での様々な現象を調節するために広く利用されている。一般的な哺乳動物細胞における活性なタンパク質の10％以上がリン酸化していると推定される。キナーゼは、高エネルギーのリン酸基の、アデノシン三リン酸(ATP)から標的タンパク質のヒドロキシアミノ酸残基であるセリン、トレオニン、またはチロシンへの転移を触媒する。これとは対照的に、ホスファターゼはこれらのリン酸基を除去する。ホルモン、神経伝達物質、および成長因子、および分化因子を含む細胞外シグナルは、キナーゼを活性化する。そのようなキナーゼは細胞表面受容体、または最終的なエフェクタータンパク質の活性体として存在する場合があり、さらにシグナル伝達経路上のどこかに存在する場合もある。キナーゼのカスケードが生じ、またセカンドメッセンジャー分子に対し感受性のあるキナーゼも存在する。このシステムによって、弱いシグナル（例えば、わずかにしか存在しない成長因子分子）の増幅や、多くの弱いシグナルの全か無かの応答への統合が行われる。次に、ホスファターゼは細胞におけるリン酸化の程度の決定に必須であり、キナーゼと共に代謝酵素活性、細胞増殖、細胞の成長および分化、細胞接着、および細胞周期の進行などの重要な細胞プロセスを調節する。
【０００３】
キナーゼ
キナーゼは最も大きな既知の酵素スーパーファミリーを構成し、標的分子が多種多様である。キナーゼは、高エネルギーリン酸基のリン酸供与体からリン酸受容体への移動を触媒する。ヌクレオチドは通常、これらの反応においてリン酸供与体として働き、ほとんどのキナーゼはアデノシン三リン酸（ATP）を利用する。リン酸受容体には様々な分子が可能であり、その中には、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、およびタンパク質が含まれる。タンパク質は、ヒドロキシアミノ酸においてリン酸化される。リン酸基が付加されると、受容体分子における局所電荷が変化し、それによって内部構造が変化し、分子間接触に影響し得る。可逆的なタンパク質のリン酸化は、真核細胞におけるタンパク質活性の調節の主な方法である。一般に、タンパク質は、ホルモン、神経伝達物質、成長因子、および分化因子などの細胞外シグナルに応答したリン酸化により活性化される。活性化されたタンパク質は、細胞内シグナル伝達経路、並びにタンパク質リン酸化を調節するサイクリックヌクレオチド、カルシウム−カルモジュリン、イノシトール、および様々な分裂促進因子などのセカンドメッセンジャー分子によって細胞の細胞応答を開始させる。
【０００４】
キナーゼは、解糖などの基本的な代謝プロセスから細胞周期の調節、分化、およびシグナル伝達カスケードによる細胞外環境との情報交換に至る細胞機能の全てに関与する。細胞内におけるタンパク質の不適切なリン酸化は、細胞周期の進行および細胞分化における変化に関連する。細胞周期における変化は、アポトーシスの誘発や癌の誘発に関連することが示されている。細胞分化における変化は、生殖系、免疫系、および骨格筋の、疾患や障害に関連することが示されている。
【０００５】
プロテインキナーゼには２つのクラスがある。一方のクラスのプロテインチロシンキナーゼ（PTK）はチロシン残基をリン酸化し、他方のクラスであるプロテインセリン／トレオニンキナーゼ（STK）はセリン残基およびトレオニン残基をリン酸化する。数種のPTKおよびSTKは、両方のファミリーの構造的な特徴を有し、チロシン残基およびセリン／トレオニン残基の両方に対して特異性（二重特異性）を有する。ほとんど全てのキナーゼは、キナーゼファミリー特有の特定の残基群および配列モチーフ群を含む保存された250〜300のアミノ酸からなる触媒ドメインを含むプロテインキナーゼ触媒ドメインは、更に１１のサブドメインに分類することができる。N末端サブドメインI-IVは、ATP供与体分子に結合して方向性を与える２葉構造（two lobed structure）に折り畳まれ、サブドメインVはその２葉にまたがる。C末端サブドメインVI-XIはタンパク質基質と結合し、γリン酸をATPからチロシン残基、セリン残基、またはトレオニン残基のヒドロキシル基に移動させる。１１のサブドメインのそれぞれは、サブドメインに特徴的なアミノ酸モチーフ或いは特定の触媒残基を含む。例えば、サブドメインIは、８個のアミノ酸からなるグリシンリッチなATP結合共通モチーフを１つ含み、サブドメインIIは、触媒活性の最大化に必要な重要なリシン残基を１つ含み、サブドメインVIからIXは高度に保存された触媒中心を含む。PTK類およびSTK類はまた、ヒドロキシアミノ酸特異性を付与し得るサブドメインVIおよびVIIIに固有の配列モチーフを含む。
【０００６】
更に、キナーゼは、キナーゼドメイン内に含まれるか或いは隣接する、通常は５〜１００の範囲の残基からなる追加のアミノ酸配列によって分類され得る。これらの追加のアミノ酸配列はキナーゼ活性を調節し、基質特異性を決定する(Hardie, G及びS. Hanks (1995) The Protein Kinase Facts Book, Vol I, 17-20ページ Academic Press, San Diego CA.を参照)。具体的には、２つのプロテインキナーゼシグネチャ配列が、キナーゼドメインで同定されている。 第１のプロテインキナーゼシグネチャ配列は、ATP結合に関与するリシン残基活性部位を含み、第２のプロテインキナーゼシグネチャ配列は触媒活性に重要なアスパラギン酸残基を含む。分析するタンパク質がこの２つのプロテインキナーゼシグネチャを含む場合、そのタンパク質がプロテインキナーゼである確率は100％に近い（PROSITE: PDOC00100, November 1995）。
【０００７】
プロテインチロシンキナーゼ
プロテインチロシンキナーゼ（PTK）は、膜貫通受容体PTKタンパク質または非膜貫通非受容体PTKタンパク質のいずれかに分類され得る。膜貫通チロシンキナーゼは、ほとんどの成長因子に対する受容体として機能する。成長因子が受容体チロシンキナーゼ（RTK）に結合し、それによって受容体が、自己をリン酸化し（自己リン酸化）、また特定の細胞内セカンドメッセンジャータンパク質をリン酸化する。受容体PTKに結合する成長因子（GF）は、上皮成長因子、血小板由来成長因子、繊維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、インスリン成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血管内皮成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子が含まれる。
【０００８】
非膜貫通型非受容体PTKは、膜貫通領域を含まない代わりに細胞膜受容体の細胞質ドメインとシグナル伝達複合体を形成する。非受容体PTKを介して機能する受容体には、サイトカイン受容体およびホルモン受容体（成長ホルモンおよびプロラクチン）や、Tリンパ球およびBリンパ球における抗原特異的受容体が含まれる。
【０００９】
多くのPTKは、PTK活性が正常な細胞制御を受けない癌細胞における腫瘍遺伝子産物として初めに同定された。実際に、約３分の１の腫瘍遺伝子がPTKをコードする。更に、細胞形質転換（発癌）はチロシンリン酸化活性の上昇を伴う場合が多い（Charbonneau, H.及びTonks, N. K. (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8:463-93）。従って、PTK活性の調節は、ある種の癌を制御するための重要な手段となり得る。
【００１０】
プロテインセリン／トレオニンキナーゼ
プロテインセリン／トレオニンキナーゼ（STK）は非膜貫通型タンパク質である。STK類のサブクラスは、ERK（extracellular signal regulated kinases：細胞外シグナル調節キナーゼ）またはMAP（mitogen-activated protein kinases：マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）として知られ、様々なホルモンや成長因子による細胞刺激によって活性化される。細胞刺激は、MEK（MAP／ERKキナーゼ）のリン酸化に導くシグナル伝達カスケードを誘導し、次にMEKが、セリンおよびトレオニンのリン酸化によりERKを活性化する。様々な数のタンパク質類が活性なERKに対する下流のエフェクターであることから、これらのタンパク質は細胞増殖および分化の調節や、細胞骨格の調節に関与すると思われる。ERKの活性化は通常一過性であり、細胞は、そのダウンレギュレーション(下方制御〕に関係する二重特異性ホスファターゼを有する。また様々な研究から、ERK活性の上昇がある種の癌に関連することが分かった。その他のSTKには、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）、カルシウム−カルモジュリン（CaM）依存性プロテインキナーゼ、およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAP）などのセカンドメッセンジャー依存性プロテインキナーゼや、サイクリン依存性プロテインキナーゼ、チェックポイントおよび細胞周期キナーゼ、Numb関連キナーゼ(Nak)、ヒト融合(hFu)、増殖関連キナーゼ、5'-AMP-活性化プロテインキナーゼ、およびアポトーシスに関与するキナーゼが含まれる。
【００１１】
MAPキナーゼのERKファミリーの１メンバ−であるERK7は、ERK1とERK2へのモチ−フ類似性を有する新規61-kDaタンパク質であるが、ERK1及びERK2のように細胞外刺激によって活性化されず、また共通活性剤であるc-Jun N-末端キナーゼ(JNK)及びp38キナーゼによっても活性化されない。ERK7は、その核局在化及び成長の阻害の調節を、他のMAPキナーゼでは典型的であるキナーゼドメインではなく、そのＣ末端テイルにより行う(Abe, M.K. (1999) Mol. Cell. Biol. 19:1301-1312)。
【００１２】
セカンドメッセンジャー依存性プロテインキナーゼは、サイクリックAMP（cAMP）、サイクリックGMP、イノシトール三リン酸、ホスファチジルイノシトール、3,4,5-三リン酸、サイクリックADPリボース、アラキドン酸、ジアシルクリセロールおよびカルシウム−カルモジュリンなどのセカンドメッセンジャーの効果を主に仲介する。PKA類はホルモン誘導性細胞応答の仲介に関与し、ホルモン刺激に応答して細胞内で生成されるcAMPによって活性化される。cAMPは、研究されている全ての動物細胞におけるホルモン作用の細胞内メディエーターである。ホルモン誘導性細胞応答には、甲状腺ホルモン分泌、コルチゾル分泌、プロゲステロン分泌、グリコーゲン分解、骨再吸収、心拍数の調節、および心筋収縮力の調節が含まれる。PKAは全ての動物細胞に見られ、これらほとんどの細胞におけるcAMPの効果に関係すると思われる。PKA発現の変容は、癌、甲状腺疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患など、種々の障害や疾患に関連すると考えられる（Isselbacher, K. J.他(1994) Harrison’s Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc. New York, NY,416-431, 1887ページ)。
【００１３】
カゼインキナーゼI（CKI）遺伝子ファミリーは、セリン／トレオニンプロテインキナーゼの別のサブファミリーである。この引き続き拡大するキナーゼ群は、細胞代謝、DNAの複製、およびDNAの修復を含む様々な細胞プロセスおよび核プロセスの調節に関与する。CKI酵素類は、真核細胞の膜、核、細胞質および細胞骨格や、哺乳動物細胞の紡錘体上に存在する（Fish, K. J.他(1995) J. Biol. Chem. 270:14875-14883)。
【００１４】
CKIファミリーメンバーの全ては、9〜76のアミノ酸からなる１つの短いアミノ末端ドメイン、284のアミノ酸からなる高度に保存された１つのキナーゼドメイン、および24〜200を超える範囲のアミノ酸からなる１つの可変カルボキシル末端ドメインを含む（Cegielska, A.他(1998) J. Biol. Chem. 273:1357-1364)。このCKIファミリーは高度に関連するタンパク質からなる。 これは、様々な試料からのカゼインキナーゼIのイソ型の同定によって確認されている。α、β、γ、δ、およびεの少なくとも５つの哺乳動物イソ型が存在する。Fish 他が、ヒト胎盤cDNAライブラリからCKIεを同定した。このCKIεは４１６のアミノ酸からなる塩基性タンパク質であり、CKIデルタに最も類似している。CKIεが既知のCKI基質群をリン酸化し、CKI特異的インヒビターであるCKI-7によって抑制されることが組み替え発現によって分かった。CKIεのヒト遺伝子は、酵母CKI遺伝子座であるHRR250の欠失によって起こる成長が遅い表現型（slow-growth phenotype）を有する酵母をレスキューすることができる(Fish 他 前出)。
【００１５】
哺乳動物の概日リズム突然変異であるtauが、シリアンハムスターにおける概日リズムの周期を著しく短くするCKIεの半優性染色体対立遺伝子であることが分かった。tau遺伝子座はカゼインキナーゼIεによってコードされ、ショウジョウバエ概日遺伝子double-timeの相同体でもある。野生型およびtau突然変異CKIε酵素の両方の研究から、突然変異酵素はその最大速度が著しく低下し、自己リン酸化状態であることが分かった。更に、in vitroにおけるCKIεは哺乳動物PERIODタンパク質と相互作用する能力を有するが、突然変異酵素はPERIODをリン酸化する能力に欠ける。Lowreyらが、CKIεが概日機構の中心をなす転写−翻訳系の自己調節ループ内の負のフィードバックシグナルを遅らせる重要な因子であると提案した。従って、CKIε酵素は、概日リズム、時差ぼけおよび睡眠、更に概日調節下のその他の生理的プロセスおよび代謝プロセスに影響を与える医薬組成物の理想的な標的である（Lowrey, P. L.他(2000) Science 288:483-491）。
【００１６】
ホメオドメイン相互作用プロテインキナーゼ類(HIPK)はセリン/スレオニンキナーゼであり、DYRKキナーゼサブファミリーの新しいメンバーである(Hofmann, T.G. 他 (2000) Biochimie 82:1123-7）。HIPK類はホメオプロテイン類と相互作用する或るドメインから別れた、或る保存されたプロテインキナーゼドメインを含む。HIPK類は核内キナーゼであり、またHIPK2は神経組織においてよく発現される(Kim, Y.H. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:25875-25879、Wang, Y.他(2001) Biochim. Biophys. Acta 1518: 168-172)。HIPK類はホメオドメイン転写因子のコリプレッサとして作用する。この補抑制体の活性は、細胞タンパク質機能の調節に重要なユビキチン結合やリン酸化のような翻訳後修飾において見られる (Kim, Y.H. 他 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12350-12355)。
【００１７】
ショウジョウバエいぼ腫瘍抑制因子遺伝子の相同体であるヒトｈ-wartsタンパク質は、染色体6q24-25.1にマッピングされる。それは１つのセリン/トレオニンキナーゼドメインを有しており、間期細胞の中心体に局在する。それは、有糸分裂に関与しており、分裂装置の成分として機能する(Nishiyama, Y. (1999) FEBS Lett. 459:159-165)。
【００１８】
Cdc42/Rac結合p21活性化キナーゼ(PAK)とRho結合キナーゼ(ROK)は、アクチン再組織化で機能するRho GTPaseの形態エフェクターとして作用する。190kDa筋緊張性ジストロフィーキナーゼ関連Cdc42結合キナーゼ(MRCK)は或る脳Cdc42結合セリン/トレオニンキナーゼであり、そのp21結合ドメインはPAKのそれと類似しているが、そのキナーゼドメインは筋緊張性ジストロフィーキナーゼ関連ROKのドメインと類似している。MRCKはセリン19で非筋肉ミオシン軽鎖をリン酸化するが、これはアクチン-ミオシン収縮性の活性化にとって重要である。MRCKは、HeLa細胞とPC12細胞においてそれぞれ周辺のアクチン形成と神経突起の伸長に関与する(Tan, I. 他. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:2767-2778、Tan, I. 他 (2001) J. Biol. Chem. 276:2120921216、Leung, T. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:130-140)。
【００１９】
EMK(ELKLモチーフキナーゼ)は、細胞極性の制御、微小管の安定性、および癌に関与するセリン/トレニオンプロテインキナーゼの小ファミリーである。EMK1(ELKLモチーフキナーゼ1、MARK2)には2つのイソ型があり、片方は1つの162bpの選択的エキソンを含み、もう片方は含まない。両型とも、試験された細胞株群と組織サンプル群で同時発現されている。ヒトのEMK1は遍在的に発現される。EMK1は最低限16の小エキソンを含む(Espinosa, L.およびNavarro, E. (1998) Cytogenet. Cell Genet. 81:278-282)。
【００２０】
カルシウム−カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ
カルシウム−カルモジュリン依存性（CaM）キナーゼは、平滑筋の収縮、グリコーゲン分解（ホスホリラーゼキナーゼ）、および神経伝達（CaMキナーゼIおよびCaMキナーゼII）の調節に関与する。CaM依存性プロテインキナーゼ類は、細胞内の遊離カルシウムの濃度に応答して細胞内カルシウム受容体であるカルモジュリンによって活性化される。多くのCaMキナーゼはまた、リン酸化によって活性化される。ある種のCaMキナーゼ類はまた、自己リン酸化またはその他の調節キナーゼ類によって活性化される。CaMキナーゼIは、神経伝達物質関連タンパク質であるシナプシンIおよびII、遺伝子転写調節因子であるCREB、および嚢胞性繊維コンダクタンス調節タンパク質であるCFTRを含む様々な物質をリン酸化する（Haribabu, B.他(1995) EMBO J. 14:3679-3686）。また、CaMキナーゼIIは、様々な部位においてシナプシンをリン酸化し、チロシンヒドロキシラーゼのリン酸化および活性化によって脳におけるカテコールアミンの合成を調節する。CaMキナーゼIIはまた、チロシンヒドロキシラーゼおよびトリプトファンヒドロキシラーゼのリン酸化／活性化によってカテコールアミンおよびセロトニンの合成を調節する（Fujisawa, H. (1990) BioEssays 12:27-29）。カルモジュリン結合プロテインキナーゼ様タンパク質をコードするmRNAが哺乳動物前頭葉で多量に見つかった。このタンパク質は軸索および樹状突起の双方における小胞に結合し、主に出生後に蓄積される。このタンパク質のアミノ酸配列はCaM依存性STKに類似しており、このタンパク質はカルシウムの存在下でカルモジュリンと結合する（Godbout, M. 他(1994) J. Neurosci. 14:1-13)。
【００２１】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAP）は、リン酸化カスケードによって細胞表面から核へのシグナル伝達を仲介するが、細胞内シグナル伝達経路を調節する別のSTKファミリーである。いくつかのサブグループが同定されており、それぞれが異なった基質特異性を有し、固有の細胞外刺激に応答する（Egan, S. E.およびWeinberg, R. A. (1993) Nature 365:781-783）。MAPキナーゼカスケードを構成する三つのキナーゼモジュールがあり、それらはMAPK(MAP)、MAPKキナーゼ(MAP2K、MAPKKまたはMKK)およびMKKキナーゼ(MAP3K、MAPKKKまたはMEKK)である(Wang,X.S. 他 (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 253:33-37)。細胞外信号制御キナーゼ(ERK)経路は、例えば、上皮細胞成長因子(EGF)、紫外線、高浸透圧性培養液、熱ショックまたは内毒素リポ多糖(LPS)のような成長因子やマイトジェン(分裂促進因子)によって活性化される。密接に関連しているが、異なった平行経路である、c-Jun N-末端キナーゼ (JNK)、即ちストレス応答キナーゼ(SAPK)経路、およびP38キナーゼ経路は、ストレスによる刺激および腫瘍壊死因子(TNF)やインターロイキン-1(IL-1)のような炎症誘発性サイトカインによって活性化される。MAPキナーゼ発現の変容は、癌、炎症、免疫疾患、および成長および発達に影響を及ぼす疾患を含む様々な疾患に関与する。MAPキナーゼシグナリング経路は哺乳類細胞および酵母に存在する。
【００２２】
サイクリン依存性プロテインキナーゼ
サイクリン依存性プロテインキナーゼ（CDK）は、細胞周期を介して細胞の進行を調節するSTKである。細胞は、サイクリンと呼ばれる活性化タンパク質ファミリーの合成および分解による調節により、有糸分裂に入ったり有糸分裂から出たりする。小さな調節タンパク質であるサイクリンはCDKに結合してそのCDKを活性化させる。 それによって、有糸分裂プロセスに関与する選択されたタンパク質がリン酸化され活性化される。CDKは、活性化するために多数の入力が必要であるという点でユニークである。サイクリンの結合に加えて、CDKの活性化には、CDKにおける特定のトレオニン残基のリン酸化および特定のチロシン残基の脱リン酸化が必要である。
【００２３】
NIMA（never in mitosis：有糸分裂に決して入らない）関連キナーゼ（Nek）は細胞周期に関連するSTKの別のファミリーである。CDKおよびNekの両方は、動物細胞における複製、成熟、微小管形成中心である中心体の分離に関与する（Fry, A. M.他，(1998) EMBO J. 17:470-481)。
【００２４】
チェックポイントおよび細胞周期キナーゼ
細胞分化のプロセスでは、細胞周期移行の順序およびタイミングは細胞周期チェックポイントの制御下にある。 この細胞周期チェックポイントは、DNA複製および染色体分離などの重要なプロセスが正確に実行されるようにする。例えば放射線などによってDNAが損傷を受けた場合、チェックポイント経路が活性化され、修復の時間を与えるべく細胞周期が停止される。損傷が大きい場合には、アポトーシスが誘導される。このようなチェックポイントが存在しないと、損傷したDNAが異常な細胞に受け継がれ、癌などの増殖異常が引き起こされ得る。プロテインキナーゼは、このプロセスにおいて重要な役割を果たす。例えば、特定のキナーゼすなわちチェックポイントキナーゼ1（Chk1）が酵母および哺乳動物で同定された。 このChk1は、酵母におけるDNA損傷によって活性化される。Chk1が活性化されると、G2／M移行において細胞が停止する（Sanchez, Y.他(1997) Science 277:1497-1501）。具体的には、Chk1が細胞分裂サイクルホスファターゼCDC25をリン酸化し、それによってサイクリン依存性キナーゼCdc2を脱リン酸化して活性化するCDC25の正常な機能が阻害される。Cdc2の活性化によって細胞が有糸分裂に入るのが調節される（Peng, C-Y 他(1997) Science 277:1501-1505）。従って、Chk1の活性化によって、損傷した細胞が有糸分裂に入るのが阻止される。Chk1のようなチェックポイントキナーゼにおける欠損によっても、G2/Mのような他のチェックポイントにおいてDNAが損傷した細胞を停止できないことにより癌が引き起こされ得る。
【００２５】
細胞増殖関連キナーゼ
細胞増殖関連キナーゼは、ヒト巨核球細胞における細胞周期および細胞増殖の調節に関与する血清／サイトカイン誘導性STKである（Li, B.他(1996) J. Biol. Chem. 271:19402-19408)。増殖関連キナーゼは、細胞分裂に関与するSTKのpolo（ショウジョウバエpolo遺伝子に由来する）ファミリーに関連する。増殖関連キナーゼは肺腫瘍組織においてダウンレギュレートされ、プロトオンコジーンである可能性がある。 プロトオンコジーンが正常な組織において制御を受けないで発現すると、正常な組織が癌化し得る。
【００２６】
5'-AMP-活性化プロテインキナーゼ
あるリガンド活性化STKプロテインキナーゼは、5'-AMP-活性化プロテインキナーゼ（AMPK）である（Gao, G.他(1996) J. Biol Chem.271:8675-8681)。哺乳動物AMPKは、酵素であるアセチル-CoAカルボキシラーゼおよびヒドロキシメチルグルタリル-CoAレダクターゼのリン酸化による脂肪酸およびステロールの合成の調節因子であって、熱ショックやグルコースおよびATPの枯渇などの細胞内ストレスに対するこれらの経路の応答を仲介する。AMPKは、触媒αサブユニットと、このαサブユニットの活性を調節すると考えられている２つの非触媒βサブユニットおよびγサブユニットからなるヘテロ三量体複合体である。AMPKのサブユニット群は、脳、心臓、脾臓、および肺などの非脂肪性組織において予想以上に広く分布している。この分布から脂質の代謝の調節以外にもある役割を果たしていると考えられる。
【００２７】
アポトーシスにおけるキナーゼ
アポトーシスは、細胞死を導く高度に制御されたシグナル伝達経路であって、組織の発達および恒常性に極めて重要な役割を果たしている。このプロセスの調節不全は、自己免疫疾患、神経変性疾患、および癌を含む様々な疾患の病原に関連する。様々なSTKがこのプロセスにおいて重要な役割を果たす。ZIPキナーゼは、N末端プロテインキナーゼドメインに加えてC末端ロイシンジッパードメインを含むSTKである。このC末端ドメインは、ホモ二量体化およびキナーゼの活性化、ならびに転写因子のサイクリックAMP応答性エレメント結合タンパク質（ATF/CREB）ファミリーのメンバーである活性化転写因子ATF4などの転写因子との相互作用を仲介する（Sanjo, H.他 (1998) J. Biol. Chem. 273:29066-29071)。DRAK1およびDRAK2は、死関連プロテインキナーゼ（DAPキナーゼ）と相同性を共有するSTKであって、インターフェロンγ誘導性アポトーシスにおいて機能することが知られている（Sanjo他 前出）。ZIPキナーゼと同様に、DAPキナーゼも、N末端キナーゼドメインに加えてアンキリンリピート型のC末端タンパク質−タンパク質相互作用ドメインを１つ含む。ZIP、DAP、およびDRAKキナーゼは、NIH3T3細胞に形質転換されると、アポトーシスに関連する形態変化を誘導する（Sanjo他，前出）。しかしながら、これらのタンパク質のN末端キナーゼ触媒ドメイン或いはC末端ドメインのいずれかが欠失すると、アポトーシス活性がなくなる。 このことから、キナーゼ活性に加えてC末端ドメインにおける活性も、アポトーシスに必要であり、調節因子または特定の基質と相互作用するドメインの可能性がある。
RICKは、死受容体CD95を含む特定のアポトーシス経路を仲介するとして近年同定された別のSTKである（Inohara, N.他(1998) J. Biol. Chem. 273:12296-12300)。CD95は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであって、免疫系の調節および恒常性において重要な役割を果たす（Nagata, S. (1997) Cell 88:355-365）。CD95受容体シグナル伝達経路は、様々な細胞内分子の受容体複合体への補充、およびそれに続くリガンド結合を伴う。このプロセスは、システインプロテアーゼカスパーゼ-8の補充を伴い、それによってカスパーゼカスケードが活性化され細胞死が起こる。RICKは、カスパーゼ様ドメインと相互作用するC末端「カスパーゼ動員」ドメインおよびN末端キナーゼ触媒ドメインとからなる。このことから、RICKがカスパーゼ-8の動員において或る役割を果たしていると思われる。 この解釈は、ヒト293T細胞におけるRICKの発現がカスパーゼ-8の活性化を促進し、CD95アポトーシス経路に関与する様々なタンパク質によるアポトーシスの誘導を増強するという事実によって補強される（Inohara 他，前出）。
【００２８】
ミトコンドリアプロテインキナーゼ
原核生物ヒスチジンプロテインキナーゼに対する配列によって関連する真核生物キナーゼの新規のクラスであるミトコンドリアプロテインキナーゼ（MPK）は、他の真核生物プロテインキナーゼとは配列類似性を有していないようである。これらのプロテインキナーゼは、ミトコンドリアマトリックス空間のみに存在し、原始的真核細胞によってエンドサイトーシスによって取り込まれた呼吸依存性細菌に存在した遺伝子が進化したものと思われる。MPK類は、分枝鎖αケト酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリン酸化および不活化に関係する（Harris, R. A.他 (1995) Adv. Enzyme Regul.34:147-162)。５つのMPKが同定されている。４つのメンバーはピルビン酸デヒドロゲナーゼイソ酵素に対応し、解糖とクエン酸回路との中間において重要な調節酵素であるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を調節する。５番目のメンバーは分岐鎖αケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼに対応し、分岐鎖アミノ酸の除去のための経路の調節に重要である(Harris, R.A. 他 (1997) Adv. Enzyme Regul.37:271-293)。飢餓状態および糖尿病状態において、ラットの肝臓、心臓および筋肉におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼの活性が著しく上昇することが知られている。この活性の上昇が、両方の病態におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリン酸化および不活化、並びに糖新生のためのピルビン酸および乳酸の保存に貢献する（Harris (1995) 前出）。
【００２９】
非タンパク質基質に対するキナーゼ
ヒトガラクトキナーゼであるGK2は予測長458アミノ酸であり、サッカロミセスカールスベルゲンシスのガラクトキナーゼに対して29%同一性を有する。GK1は染色体17q23-25にマッピングされたが、GK2は１５番染色体にマッピングされた(Lee, R.T. 他 (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89:1088710891)。
【００３０】
脂質キナーゼおよびイノシトールキナーゼ
脂質キナーゼは、脂質ヘッドグループのヒドロキシル残基をリン酸化する。ホスファチジルイノシトール（PI）のリン酸化に関与するキナーゼのファミリーが記載されており、それぞれのメンバーがイノシトール環の特定の炭素をリン酸化する（Leevers, S.他(1999) Curr. Opin. Cell. Biol. 11:219-225）。ホスファチジルイノシトールのリン酸化は、プロテインキナーゼCシグナル伝達経路の活性化に関与する。イノシトールホスホリピッド（ホスホイノシチド）細胞内シグナル伝達経路は、細胞膜においてシグナル伝達分子がGタンパク質結合受容体に結合することによって始まる。これによって、イノシトールキナーゼによる細胞膜の内側のホスファチジルイノシトール（PI）残基のリン酸化が起こり、それによってPI残基が二リン酸状態（PIP２）に変換される。次にPIP２がイノシトール三リン酸（IP３）およびジアシルグリセロールに切断される。これらの２つの生成物は、シグナル伝達経路を分けるためのメディエーターとして作用する。これらの経路によって仲介される細胞応答には、バソプレシンに応答する肝臓におけるグリコーゲン分解、アセチルコリンに応答する平滑筋の収縮、およびトロンビン誘導性血小板凝集がある。
【００３１】
PIおよびその誘導体のD3位をリン酸化するPI3-キナーゼ（PI3K）は、細胞増殖、分化、および代謝に関与する成長因子シグナルカスケードにおいて重要な役割を果たす。PI3Kは、１つのアダプターサブユニットおよび１つの触媒サブユニットからなるヘテロ二量体である。このアダプターサブユニットは足場タンパク質として作用し、特定のチロシン−リン酸化タンパク質、脂質成分、およびその他の細胞質因子と相互作用する。アダプターサブユニットがインスリン応答性基質（IRS）-1などのチロシンリン酸化標的と結合すると、触媒サブユニットが活性化され、PI (4, 5) 二リン酸 (PIP2)をPI (3, 4, 5) P3 (PIP3)に変換する。次にPIP３が、PKA、プロテインキナーゼB（PKB）、プロテインキナーゼC（PKC）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（GSK）-3、およびP70リボソームs6キナーゼを含むその他の幾つかのタンパク質を活性化する。PI3Kもまた、細胞骨格形成タンパク質であるRac、rho、およびcdc42と直接相互作用する（Shepherd, P. R.他，(1998) Biochem. J. 333:471-490)。obeseマウスおよびfatマウスなどの糖尿病動物モデルは、PI3kアダプターサブユニットのレベルが改変されている。アダプターサブユニットにおける特定の変異が、インスリン抵抗性のデンマーク人集団に見られることから、PI3Kが２型糖尿病においてある役割を果たしていると思われる（Shepherd、前出）。
【００３２】
脂質キナーゼリン酸化活性の例は、スフィンゴ脂質代謝産物であるスフィンゴシン-1-リン酸(SPP)へのD-エリスロ-スフィンゴシンのリン酸化である。SPPは、細胞外作用および細胞内作用の両方を持つ新規の脂質セカンドメッセンジャーであることが分かった（Kohama, T.他 (1998) J. Biol. Chem. 273:23722-23728)。細胞外では、SPPはGタンパク質共役受容体EDG-1（内皮由来Gタンパク質結合受容体）のリガンドである。細胞内では、SPPは、細胞の成長、生存、運動性、および細胞骨格の変化を調節する。D-エリトロ-スフィンゴシンを特異的にリン酸化してSPPにするスフィンゴシンキナーゼによってSPPのレベルは調節される。細胞シグナル伝達におけるスフィンゴシンキナーゼの重要性は、血小板由来成長因子（PDGF）、神経成長因子、およびプロテインキナーゼＣの活性化を含む様々な刺激が、スフィンゴシンキナーゼの活性化によってSPPの細胞内レベルを上昇させるという事実、および酵素の競合阻害剤がPDGFによって誘導された細胞増殖を選択的に阻害するという事実から証明された（Kohama 他，前出）。
【００３３】
プリンヌクレオチドキナーゼ
プリンヌクレオチドキナーゼであるアデニル酸キナーゼ（ATP：AMPホスホトランズフェラーゼ、もしくはAdK）およびグアニル酸キナーゼ（ATP：GMPホスホトランズフェラーゼ、もしくはGuK）が、ヌクレオチド代謝において重要な役割を果たし、ATPおよびGTPの合成および細胞内レベルの調節のそれぞれにおいて重要である。これらの２つの分子は、成長している細胞におけるDNA合成およびRNA合成の前駆物質であって、細胞における主な生化学エネルギーの主な供給源（ATP）であり、シグナル伝達経路（GTP）を提供する。これらの２つの分子の合成における様々なステップを妨げることが、癌および抗ウイルス治療のための多くの抗増殖剤の原理である（Pillwein, K. 他 (1990) Cancer Res. 50:1576-1579)。
【００３４】
AdKはほとんどの細胞型に見られ、高い速度でATPを合成する骨格筋などの細胞に特に多く存在する。これらの細胞において、AdKは、細胞レベル下構造であるミトコンドリアおよび筋原繊維と物理的に結合している。ミトコンドリアはエネルギーを生産し、筋原繊維はそのエネルギーを利用する。近年の研究により、ATPを生成する代謝プロセスからATPを消費する細胞成分への高エネルギーのホスホリルの転移においてAdKが重要な役割を果たしていることが実証された（Zeleznikar, R. J.他，(1995) J. Biol. Chem. 270:7311-7319)。従って、AdKは、細胞、特に癌細胞などの増殖や代謝速度が速い細胞におけるエネルギー生産の維持において中心的な役割を演じると考えられ、ある種の癌の治療においてその活性を抑制するための標的を提供し得る。別法では、AdK活性の低下が、心不全や呼吸器不全を引き起こす様々な代謝筋エネルギー疾患の原因と考えられ、AdKの活性を上昇させて治療できるであろう。
【００３５】
RNAおよびDNA合成のためのGTPの合成における重要なステップを提供するのに加えて、GuKはまた、GDPおよびGTPの調節によって細胞のシグナル伝達経路において重要な役割を果たす。具体的には、GTPが膜結合Gタンパク質に結合すると、細胞受容体の活性化を仲介し、アデニルシクラーゼが細胞内で活性化され、セカンドメッセンジャーであるサイクリックAMPが生産される。 GDPがGタンパク質に結合すると、これらのプロセスを阻害する。また、GDPおよびGTPのレベルによって、細胞増殖の調節および発癌に関与するとして知られるp21rasなどのある種の腫瘍タンパク質の活性が調節される（Bos, J. L. (1989) Cancer Res. 49:4682-4689）。GuKの抑制によって起こるGDPに対するGTPの比率が高いと、p21rasが活性化され発癌が促進される。GDPのレベルを上昇させ、GDPに対するGTPのレベルを低下させるためにGuKの活性を高めることが、発癌を抑制する治療となり得る。
【００３６】
GuKは、ヘルペスウイルス感染の治療に有用なある種の抗ウイルス剤のリン酸化および活性化における重要な酵素である。これらの薬剤には、グアニン相同体アシクロビルおよびbuciclovirが含まれる（Miller, W. H.およびMiller R. L. (1980) J. Biol. Chem. 255:7204-7207 ; Stenberg, K.他，(1986) J. Biol. Chem. 261:2134-2139)。感染細胞においてGuKの活性を高めることが、これらの薬剤の効果を促進させる治療方法となり得るため、薬剤の服用を減らすことが可能であろう。
【００３７】
ピリミジンキナーゼ
ピリミジンキナーゼは、デオキシチジンキナーゼ、およびチミジンキナーゼ１および２を含む。デオキシチジンキナーゼは核に存在し、チミジンキナーゼ１および２は細胞質に見られる（Johansson, M.他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11941-11945)。ピリミジンキナーゼによるデオキシリボヌクレオシドのリン酸化によって、DNA前駆物質のde novo合成のための代替の経路が提供される。リン酸化におけるピリミジンキナーゼの役割はプリンキナーゼと同様に、化学療法に重要な幾つかのヌクレオシド類似体の活性化に重要である（Arner E. S.およびEriksson, S. (1995) Pharmacol. Ther. 67:155-186）。
【００３８】
ホスファターゼ
一般的に、プロテインホスファターゼは、ホスホアミノ酸基質選択性に基づいて、セリン／トレオニン特異性またはチロシン特異性のいずれかによって特徴づけられる。しかしながら、或る種のホスファターゼ（DSP：二重特異性ホスファターゼ）は、リン酸化したチロシン、セリン、またはトレオニン残基に作用し得る。プロテインセリン／トレオニンホスファターゼ(PSP)は、細胞内での多くのcAMP仲介性ホルモン応答の重要な制御因子である。プロテインチロシンホスファターゼ(PTP)は、細胞周期および細胞シグナル伝達プロセスにおいて重要な役割を果たす。別のファミリーのホスファターゼは、酸性ホスファターゼ、またはヒスチジン酸性ホスファターゼ（HAP）ファミリーで、そのメンバーは酸性のｐH条件下でリン酸エステルを加水分解する。
PSPはサイトゾル、核、およびミトコンドリアに見られ、多くの組織、特に脳において細胞骨格および膜構造に結合している。或る種のPSPは、活性のためにCa2+またはMn2+などの２価の陽イオンを必要とする。PSPは、糖代謝、筋収縮、蛋白合成、T細胞機能、神経作用、卵母細胞成熟、および肝代謝において重要な役割を果たす（Cohen, P. (1989) Annu. Rev. Biochem. 58:453-508の概説を参照）。PSPは２つのクラスに分類することができる。PPPクラスには、PP1、PP2A、PP2B/カルシニュリン、PP4、PP5、PP6、およびPP7が含まれる。このクラスのメンバーは、高度に保存されたシグネチャ配列を有する相同な触媒サブユニットに、１つ以上の調節サブユニットが組み合わさって構成されている(PROSITE PDOC00115)。更に、足場分子および固着分子との相互作用によって、PSPの細胞内局在性および基質特異性が決定される。PPMクラスは、PP2Cに密接に関連した幾つかのアイソフォームから成り、PPPクラスにとは進化的な関連性が存在しない。
【００３９】
PP1は、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)によってリン酸化した多くのタンパク質を脱リン酸化し、細胞における多くのcAMP仲介性ホルモン応答の重要な制御因子である。幾つかのアイソフォームが同定されているが、α型およびβ型は同じ遺伝子の異なるスプライシングによって生成される。PP1に関して、遍在性の標的タンパク質および組織特異的標的タンパク質が同定された。脳において、ドーパミンおよび32kDaのアデノシン3'、5'一リン酸調節性ホスホプロテイン(DARPP-32)によるPP1活性化の阻害が、新線条体ニューロンにおける正常なドーパミン応答に必要である（Price, N. E.及びM. C. Mumby (1999) Curr. Op. Neurobiol. 9:336-342の概説を参照）。PP1およびPP2Aが微少血管内皮細胞の細胞運動を制限することが分かっており、脈管形成の阻害にPSPがある役割を果たしていると思われる（Gabel, S.他(1999) Otolaryngol. Head Neck Surg. 121:463-468）。
【００４０】
PP2Aは、主なセリン／トレオニンホスファターゼである。コアPP2A酵素は、別の調節サブユニット（B）を動員する役割を有する65 kDaの足場サブユニット（A）と結合した１つの36 kDaの触媒サブユニット（C）から成る。Bサブユニットをコードする３つの遺伝子ファミリー（PR55、PR61、およびPR72）が知られており、そのそれぞれが複数のアイソフォームを含み、別のファミリーが存在し得る（Millward, T. A.他(1999) Trends Biosci. 24:186-191）。これらの「B型」サブユニットは細胞型特異的および組織特異的であって、基質特異性、酵素活性、およびホロ酵素の細胞内局在性を決定する。PR55ファミリーは高度に保存されていて、保存されたモチーフを有する（PROSITE PDOC00785）。PR55によって、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)およびMAPKキナーゼ(MEK)に対するPP2A活性が上昇する。PP2Aは、MAPK活性化部位を脱リン酸化し、細胞の有糸分裂への移行を阻害する。CKIIキナーゼ触媒サブユニット、ポリオーマウイルスの中型Ｔ抗原および小型T抗原、およびSV40小型t抗原を含む幾つかのタンパク質が、PP2Aのコア酵素結合についてPR55と競合し得る。ウイルスはこのメカニズムを利用してPP2A活性を徴用し、細胞の細胞周期進行を刺激する（Pallas, D. C.他(1992) J. Virol. 66:886-893)。MAPキナーゼの発現の変容はまた、癌、炎症疾患、免疫系疾患、および成長および発達に影響を与える疾患を含む様々な症状に関与すると考えられている。実際、PP2Aはin vitroで30種以上のプロテインキナーゼを脱リン酸化してその活性を調節する。また、その他の研究結果から、PKB、PKC、カルモジュリン依存性キナーゼ、ERKファミリーMAPキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、およびIκBキナーゼなどのキナーゼについてもin vivoで同様の結果が得られることが示された（前出のMillward他に概説）。PP2A自体が、CK IキナーゼおよびCKIIキナーゼの基質であり、ポリカチオン高分子によって刺激され得る。PP2A様ホスファターゼは、哺乳動物サイクリンAおよびBのG1期破壊を維持するために必要である（Bastians, H.他(1999) Mol. Biol. Cell 10:3927-3941)。PP2Aは脳において主に作用し、神経フィラメントの安定性および正常な神経機能の調節、特に微少管結合タンパク質tauのリン酸化に関係すると考えられる。tauの過剰なリン酸化がアルツハイマー病に見られる神経変性を引き起こすと提案された（前出のPrice および Mumbyの概説を参照）。
【００４１】
PP2Bすなわちカルシニュリンは、Ca2+活性化二量体ホスファターゼであって、特に脳に多量に存在する。PP2Bは、触媒サブユニットおよび調節サブユニットから成り、カルシウム／カルモジュリン複合体の結合によって活性化される。カルシニュリンは、免疫抑制薬シクロスポリンおよびFK506の標的である。その他の細胞因子と共にこれらの薬剤は、カルシニュリンと相互作用してホスファターゼ活性を阻害する。T細胞では、この作用によって、転写因子のNF-ATファミリーのカルシウム依存性活性化が阻害され、免疫抑制が起こる。このファミリーは広く分布し、カルシニュリンがその他の組織においても遺伝子の発現を調節する可能性が高い。ニューロンでは、カルシニュリンは神経伝達物質放出の阻害から後シナプスNMDA受容体共役カルシウムチャネルの脱感作、および長期の記憶に至るまでの機能を調節する（PriceおよびMumby, 前出）。
【００４２】
PPPクラスのその他のメンバーが近年同定された（Cohen, P. T. (1997) Trends Biochem. Sci 22:245-25）。その１つであるPP5は、テトラトリコペプチド リピートを有する調節ドメインを含む。PP5は、in vitroで陰イオン性リン脂質および多価不飽和脂肪酸によって活性化され、心房性ナトリウム利尿ペプチドまたはステロイドホルモンによって調節されるシグナル伝達経路を含む幾つかのシグナル伝達経路に関与すると思われる（Andreeva, A. V.およびM. A. Kutuzov (1999) Cell Signal. 11:555-562の概説を参照）。
【００４３】
PP2Cは、広い基質特異性を有する最大42 kDaの単量体であって、その活性が二価の陽イオン（主にMn2+またはMg2+）に依存する。PP2Cタンパク質は、陽イオン結合に関係するアスパラギン酸残基を含む不変なDGHモチーフを有する保存されたN末端領域を共有する（PROSITE PDOC00792）。標的タンパク質とPP2Cの作用を調節するメカニズムは、同定されていない。PP2Cは、ストレス応答性p38およびJunキナーゼ(JNK)経路を阻害することが分かっている（Takekawa, M.他(1998) EMBO J. 17:4744-4752）。
【００４４】
ヒト骨格筋PP2Cγは、哺乳類のPP2Cよりもヨツヒメゾウリムシ(Paramecium tetraurelia)と分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のPP2Cにより似ている。PP2Cγは、特に精巣、骨格筋、心臓等で広範囲に発現される。活性のためにMg2+あるいはMn2+が必要とされ、54残基の75％がグルタミン酸またはアスパラギン酸であるような1つの高度な酸性ドメインを持つ(Travis, S.M.およびWelsh, M.J. (1997)FEBS Lett. 412:415-419)。PP2Cγはin vivoで核に局在化し、スプライシング反応を通じてin vitroでスプライセオソームと会合する。スプライセオソームのアセンブリの初期段階中のA複合体の効果的な形成のためにも必要とされる。研究は、PP2Cγによって触媒化された少なくとも一つの特異的な脱リン酸化事象がスプライセオソームの形成には不可欠であることを示した(Murry, M.V. 他(1999) Genes Dev. 13:8797)。
【００４５】
PSPとは対照的に、チロシン特異的ホスファターゼ(PTP)は、大きさおよび構造が様々であって（20 kDa〜100 kDa以上）一般に単量体のタンパク質であり、主に原形質膜を通過するシグナル伝達において機能する。PTPは、可溶性ホスファターゼか、或いは１つのホスファターゼドメインを含む膜貫通受容体タンパク質のいずれかに分類される。全てのPTPは、活性部位を含む約300のアミノ酸の保存された触媒ドメインを共有する。この活性部位のコンセンサス配列は、触媒作用中にリン酸部分に求核攻撃を加える１つのシステイン残基を含む（Neel, B.G.およびN.K. Tonks (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9:193-204）。受容体PTPは、１つの可変長のN末端細胞外ドメインと、１つの膜貫通領域と、通常は２つの触媒ドメインを有する１つの細胞質内領域とから成る。第一の触媒ドメインのみが酵素活性を有するように見えるが、第２の触媒ドメインは第１の触媒ドメインの基質特異性に影響を与えると思われる。幾つかの受容体PTPの細胞外ドメインは、フィブロネクチン様リピート、免疫グロブリン様ドメイン、MAMドメイン（接着機能を有する可能性が高い細胞外モチーフ）、または炭酸脱水素酵素様ドメインを含む（PROSITE PDOC 00323）。このような様々な構造モチーフによって、PTPの大きさおよび特異性が多様になっている。
【００４６】
PTPは、細胞接着、リンパ球活性化、および細胞増殖などの生体プロセスにおいて重要な役割を果たす。PTPμおよびPTPκは、細胞−細胞接触に関与し、カドヘリン／カテニン機能を調節するであろう。幾つかのPTPが細胞の伸展、接着斑、および細胞運動に影響を与えているが、そのほとんどがインテグリン／チロシンキナーゼシグナル伝達経路によって行なわれる（前出のNeelおよびTonksの概説を参照）。CD45ホスファターゼは、シグナル伝達およびリンパ球活性化を調節する（Ledbetter, J. A.他(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8628-8632)。Src-ホモロジー-2ドメインを有する可溶性PTP(SHP)が同定された。このことは、これらの分子が受容体チロシンキナーゼと相互作用することを示唆するものである。SHP-1は、造血細胞におけるJanusファミリーPTKの調節によって、およびT細胞受容体およびc-Kitによるシグナル伝達によって、サイトカイン受容体シグナル伝達を調節する（前出の NeelおよびTonksの概説を参照）。M期誘導ホスファターゼはPTK CDC2を脱リン酸化して活性化し、有糸分裂の誘導において重要な役割を果たし、細胞分裂を導く（Sadhu, K.他(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5139-5143)。加えて、少なくとも８種のPTPをコードする遺伝子が、リンパ腫、小細胞肺癌、白血病、腺癌、および神経芽腫を含む様々な腫瘍症状において転座或いは再構成された染色体領域にマッピングされている（Charbonneau, H.およびN. K. Tonks (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8:463-493の概説を参照）。PTP酵素の活性化部位は、MTM1遺伝子ファミリーのコンセンサス配列を含む。MTM1遺伝子は、X染色体に連関した劣性のミオチューブ様ミオパシーに関与している。この疾患は、Xq28に連関される先天的な筋疾患である(Kioschis, P. 他 (1998) Genomics 54:256-266)。多くのPTKが発癌遺伝子によってコードされ、発癌にチロシンリン酸化活性の上昇を伴う場合が多いことは良く知られている。従って、PTPは、細胞におけるチロシンリン酸化のレベルを調節して細胞形質転換および様々な癌の成長を防止或いは逆転し得る可能性がある。この考えは、PTPの過剰な発現により細胞の形質転換を抑制でき、PTPの特異的阻害により細胞形質転換を促進できるという研究結果によって支持される（Charbonneau および Tonks, 前出）。
【００４７】
TPTE(テンシン相同性を有する膜貫通ホスファターゼ)は、551アミノ酸の1つの予測ポリペプチドと少なくとも2つの膜貫通ドメイン、1つのチロシンホスファターゼモチーフをもつ新規のタンパク質である。TPTEは腫瘍抑制因子PTEN/MMAC1タンパク質と相同的である。TPTE遺伝子はヒトの動原体性配列の近くに位置する。男性半数体ヒトゲノムには最大7個のコピー、女性半数体ヒトゲノムには最大6個のコピーがある。TPTE遺伝子は、ヒト21番染色体の１つのコピー或いは複数のコピーに加えて、ヒト染色体13番、15番、22番、Y上に高度に相同なコピーを有する。そのｃDNAはニワトリのテンシン、ウシのauxilin、ラットのサイクリンG関連キナーゼ(GAK)と相同な配列を持つ。研究が示唆するところでは、TPTEの生物学的機能が内分泌系のシグナル伝達経路または精巣の精子形成機能に関与する(Chen, H. 他. (1999) Hum. Genet. 105:399-409)。
【００４８】
二重特異性ホスファターゼ(DSP)は、PSPよりもPTPに構造的に類似している。DSPは、追加の７個のアミノ酸残基を有する拡張されたPTP活性化部位モチーフを有する。DSPは、主に細胞増殖に関与しており、細胞周期調節因子であるcdc25A、cdc25B、およびcdc25Cが含まれる。ホスファターゼDUSP1およびDUSP2は、チロシン残基およびトレオニン残基の両方においてMAPKファミリーメンバーERK（細胞外シグナル調節キナーゼ）、JNK(c-Jun N-末端キナーゼ)、およびp38を不活化する（PROSITE PDOC 00323, 前出）。活性化された状態では、これらのキナーゼは、ニューロンの分化、増殖、癌への形質転換、血小板凝集、およびアポトーシスに関与すると考えられている。従って、DSPはこれらのプロセスの適切な調節に必要である（Muda, M.他(1996) J. Biol. Chem. 271:27205-27208)。腫瘍抑制因子PTENは、脂質ホスファターゼ活性も示すDSPである。PTENは、細胞外マトリックスとの相互作用を負に調節してアポトーシス感受性を維持すると思われる。PTENは、血管形成の防止に関係する（Giri, D.およびM. Ittmann (1999) Hum. Pathol. 30:419-424）。PTENの発現の異常は、様々な癌に関連する（Tamura, M.他(1999) J. Natl. Cancer Inst. 91:1820-1828の概説を参照）。
【００４９】
ヒスチジン酸ホスファターゼ（HAP、EXPASY EC 3.1.3.2）もまた、酸性ホスファターゼとして知られ、低いpH下で、アルキル基、アリール基、アシル基のオルトリン酸モノエステル、およびリン酸化されたタンパク質を含む広範囲な基質を加水分解する。HAPは、２つの領域で保存された配列を共有し、どちらも触媒作用に関与するヒスチジン残基のあたりに位置する。HAPファミリーのメンバーには、リソソーム酸性ホスファターゼ（LAP）と前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）が含まれ、両者ともL-酒石酸塩による抑制に感受性を示す(PROSITE PDOC00538)。
【００５０】
イノシトールリン酸ホスファターゼであるシナプトジャニンは、イノシトールリン酸をイノシトール環の3、4、5の位置で脱リン酸する。シナプトジャニンは神経末端でクラスリンで覆われたエンドソーム中間物に見つけられるシナプス前部の主要タンパク質であり、クラスリンコートに関与するタンパク質であるEPS15と結合する。この結合は、Asp−Pro−Pheのアミノ酸の3回繰り返しを有するシナプトジャニン−170のC末端領域で媒介される。更に、この3残基繰り返しは、EPS15のEHドメインの結合部位であることがわかっている（Haffner, C. 他 (1997) FEBS Lett.419:175-180)。加えて、シナプトジャニンはエンドソームタンパク質と原形質膜との相互作用を調節し、シナプス小胞のリサイクリングに関与している可能性もある（Brodin, L. 他 (2000) Curr. Opin. Neurobiol. 10:312-320)。シナプトジャニン１遺伝子（Synj1）の標的破壊を受けたマウスの研究は、野生型マウスに見られるより効果的にエンドソーム小胞のコートが形成されていることを支持しており、Synj1が膜とコートタンパク質の相互作用の負調整として機能していることを示唆する。これらの発見は、シナプス小胞リサイクリングでホスホイノシチド代謝が重要な役割を果たしている遺伝的証拠を提供する（Cremona, O. 他 (1999) Cell 99:179-188)。
【００５１】
発現プロファイル作成
マイクロアレイは、生物分析に用いる分析ツールである。マイクロアレイには複数の分子を有し、それらは或る固体支持体の表面で空間的に分布し、その表面と安定して結合している。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および/または抗体のマイクロアレイが開発され、その種々の用途には例えば遺伝子配列決定、遺伝子発現モニタリング、遺伝子マッピング、細菌同定、創薬、コンビナトリアルケミストリがある。
【００５２】
特にマイクロアレイを用いる領域は遺伝子発現分析である。アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【００５３】
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は特に、疾患の、診断、予後診断、および治療の向上に関わる。例えば、アルツハイマー病患者に由来の組織に発現されるレベルと配列との双方を、正常な脳組織に発現されるレベルおよび配列と比較し得る。アルツハイマー病は進行性神経変性障害であり、特徴は、アミロイドβペプチドを含有する、老人斑と神経原線維変化との形成である。これらの斑は脳の辺縁皮質と連合皮質とに見られる。これには海馬、側頭皮質、帯状皮質、扁桃、基底核、および青班核を含む。アルツハイマーの病理の早期には、生理変化が帯状皮質で見られる(Minoshima, S. 他(1997) Annals of Neurology 42:85-94)。海馬は辺縁系の一部であり、学習と記憶で重要な役割を果たす。アルツハイマー病の患者では、蓄積する斑が、辺縁領域の神経構造を損傷し、最終的に、記憶プロセスを不自由にする。
【００５４】
遺伝子発現プロファイル作成の潜在的応用は、治療の可能性のある化合物に対する毒性反応と治療薬剤の代謝反応の測定にも関連する。例えば、ステロイドで治療する疾患とステロイド治療への代謝反応によって引き起こされる病気には、腺腫症、胆汁鬱滞、肝硬変、血管腫、アレルギー性紫斑病、肝炎、肝細胞癌、転移性癌、特発性血小板減少性紫斑病、ポルフィリン症、サルコイドーシス、ウィルソン病が含まれる。治療の可能性のある化合物に対する毒性反応と治療薬剤の代謝反応の測定が望ましい。
【００５５】
ステロイドは、コレステロール、胆汁酸、ビタミンD、ホルモン等の脂溶性分子の１クラスであり、シクロペンタノペルヒドロフェナントレン（cyclopentanoperhydrophenanthrene）に基づく共通な4リング構造を共有し、広範な機能を果たす。副腎皮質、卵巣、精巣によって生成されるステロイドホルモンには、グルココルチコイド、鉱質コルチコイド、アンドロゲン、エストロゲンが含まれる。ステロイドホルモンは、避妊法、また怪我や関節炎、喘息、自己免疫障害等の疾患での抗炎症治療において広範囲に利用されている。天然のプロゲスチンであるプロゲステロンは、無月経、異常子宮出血を治療するために、または避妊薬として主に使用される。
【００５６】
6α-メチル-17-ヒドロキシプロゲステロンとしても知られるメドロキシプロゲステロン(MAH)は、プロゲステロンより約15倍も大きな薬理学的作用を有する合成プロゲスチンである。MAHは腎臓癌と子宮内膜癌、無月経、異常子宮出血および、ホルモン失調と関連する子宮内膜症の治療のために使用される。MAHは呼吸中枢刺激作用を有し、睡眠時無呼吸、慢性閉塞性肺疾患あるいは高炭酸血症によって生じる血液低酸素化の症例に使用されている。ベクロメタゾンは、ステロイド依存性喘息を治療、アレルギーまたは非アレルギー（血管運動性）鼻炎に付随する症状を緩和、あるいは外科的切除に続く再発性鼻ポリープを予防するために使用される合成グルココルチコイドである。ブデソニドは、アレルギー性鼻炎または喘息に付随する症状を制御するために使用されるコルチコステロイドである。デキサメタゾンは、抗炎症組成物または免疫抑制組成物において使用される合成グルココルチコイドである。プレドニゾンは肝臓で代謝されて、活性型であるプレドニゾロン（抗炎症特性を有するグルココルチコイド）になる。ベタメタゾンは抗炎症作用と免疫抑制作用を有する合成グルココルチコイドであり、乾癬と、水虫や白癬等の真菌感染症を治療するために使用される。ステロイドに対する組織反応については、ステロイド化合物に曝露したあるいは治療した患者の組織で発現したレベルおよび配列の両者を、正常な治療されていない組織のレベルおよび配列と比較することによって測定され得る。
【００５７】
骨肉腫は、悪性形成、類骨形成、骨形成、または軟骨形成の徴候を有する悪性結合組織間質から成る骨の悪性初代腫瘍である。古典的な骨肉腫は、主に青少年に影響を及ぼす低分化腫瘍であり、長骨で最頻発する。そして優勢な組織学的成分によって骨芽細胞型、軟骨芽細胞型、線維芽細胞型に分類される。
【００５８】
肺癌
肺癌は米国における癌死亡の主要原因であり、毎年10万人以上の男性および5万人以上の女性がこの影響を受けている。肺癌症例の大部分は喫煙に起因すると考えられており、第三世界におけるタバコ消費の増加から肺癌の蔓延が予想されている。肺癌と診断された患者の殆ど90%が喫煙者である。タバコの煙には暴露された気管支上皮において発癌物質代謝酵素および共有結合性DNA付加体形成を誘発する有害物質がたくさん含まれている。気管支上皮をタバコの煙に曝露すると組織形態が変化するようであり、それが癌の前兆であると考えられている。肺癌と診断された患者のほとんど80%においてすでに転移が生じている。大部分の肺癌は胸膜、脳、骨、心膜、および肝臓に移転する。手術、放射線療法、あるいは化学療法を行うかの決定は、腫瘍組織学、成長因子またはホルモン応答および阻害剤または薬物への感受性に基づいてなされる。現在の治療では大部分の患者が診断の一年以内に死亡する。肺癌の早期診断、および同定、病期および治療に対する系統的アプローチは患者への結果をポジティブなものにし得る。
【００５９】
肺癌は、過形成から侵襲性癌への一連の形態学的に固有の段階を通して進行する。悪性の肺癌は四つの組織病理学的なクラスからなる２つのグループに分かれる。非小細胞肺癌 (Non Small Cell Lung Carcinoma：NSCLC) 群は扁平上皮細胞癌、腺癌および大細胞癌を含み、すべての肺癌症例の約70%を占める。腺癌は通常、末梢気道に生じ、ムチン分泌腺を形成する。扁平上皮細胞癌は一般に、近位気道に発症する。扁平上皮細胞癌の組織形成は慢性炎症と、気管支上皮の損傷に関連し、扁平上皮化生につながる。肺小細胞癌（Small Cell Lung Carcinoma ：SCLC) 群は肺癌症例の約20%を占める。SCLCは一般的に近位の気道に発症し、副腎皮質刺激ホルモンおよび抗利尿ホルモンの不適切な産生などの多くの腫瘍随伴症候群を示す。
【００６０】
肺癌細胞は多くの遺伝的病変を蓄積し、その多くは、細胞学的に明らかな染色体異常を伴う。肺癌に関連する染色体欠失の頻度が高いことはこの疾患の病因において複数の癌抑制遺伝子座の関与を示し得る。３番染色体の短腕の欠失は症例の90%以上に見られ、肺癌につながる最も早期の遺伝子病変の一つを示す。染色体の９pおよび17pの短腕における欠失もまた一般的である。その他のしばしば見られる遺伝的病変にはテロメラーゼの過剰発現、Kras やcmycなどの発癌遺伝子の活性化、またRB、 p53 および CDKN2のような癌抑制遺伝子の不活性化がある。
【００６１】
肺癌において差次的に制御される遺伝子が種々の方法によって同定されている。mRNAディファレンシャルディスプレイ技術を用いて、Manda,.他 (1999; Genomics 51:5-14)は正常気管支上皮細胞に比べて肺癌細胞株に差次的に発現される５つの遺伝子を同定した。既知の遺伝子の内で、肺界面活性物質のアポプロテインAおよびアルファ２マクログロブリンは下方制御され、他方、nm23H1は上方制御される。Petersen, 他 (2000; Int J. Cancer, 86:512-517)はサプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーションを用いて、肺腫瘍由来細胞系に差次的に発現された552のクローンを同定した。その中の205は既知の遺伝子を示した。既知の遺伝子の間で、トロンボスポンジン1、フィブロネクチン、細胞間接着分子1およびサイトケラチン6と18は肺癌において差次的に発現されることが以前に観察されていた。Wang,. 他(2000; Oncogene 19:1519-1528)はマイクロアレイ解析とサブトラクティブハイブリダイゼーションを併用して正常肺上皮と比べて扁平細胞癌に差次的に過剰発現された17の遺伝子を同定した。彼らが同定した既知の遺伝子の中には、ケラチンアイソフォーム6、KOC、SPRC、IGFb2, コネキシン 26、 plakofillin 1 およびサイトケラチン 13があった。
【００６２】
乳癌
18万例を超える新規発症の乳癌が毎年診断されており、乳癌による死亡率は45〜54歳の女性の全死亡の10%に近い(K. Gish (1999) AWIS Magazine 28:7-10)。ただし、限局性乳癌の早期診断に基づく生存率は極めて高い(97％)。これに対して、病期が進行し腫瘍が乳房外に進展した場合は22％である。現在の臨床乳癌検診の手法は感度と特異性とを欠いており、乳癌の包括的な遺伝子発現プロファイルを開発する努力がなされている。このプロファイルを従来のスクリーニング法とともに用いれば、乳癌の診断と予後診断とを向上し得る（Perou, C.M. 他(2000) Nature 406:747-752)。
【００６３】
乳癌は遺伝子病であり、通常、乳房の上皮細胞での突然変異に起因する。2種の遺伝子、BRCA1とBRCA2との突然変異が女性乳癌の大きな素因となることが知られており、この変異は親から子へ受け渡されるようである(前出Gish)。しかし、このタイプの遺伝性乳癌はわずかに乳癌の約５％〜９％であり、大多数の乳癌の原因は乳房上皮細胞で生じる非遺伝性突然変異である。
【００６４】
既に多くの事が、乳癌に関わる特定遺伝子群の発現について既知である。例えば上皮成長因子(EGF)とその受容体であるEGFRとの発現と、ヒト乳癌との関係は、特に良く研究されている(Khazaie, K. 他(1993) Cancer and Metastasis Rev. 12:255-274とその中の参照文献に、この分野が概説されている）。EGFRの過剰発現、特にエストロゲン受容体の下方制御と結びついた発現は、乳癌患者の不良な予後のマーカーである。また、乳腺腫瘍転移におけるEGFR発現は、しばしば原発腫瘍に比して上昇するので、EGFRが腫瘍の進行と転移とに関わることを示唆している。これを支持する証拠が蓄積されている。それはEGFが、転移の潜在能に関する細胞機能に対する効果を持つという証拠である。この機能とは例えば、細胞運動性、走化性、分泌、および分化である。erbB受容体ファミリー（EGFRはその１つである）の他のメンバーの発現の変化も、乳癌に関わるとされている。erbB受容体（例えばHER-2/neu、HER-3、HER-4）およびそれらリガンドの乳癌における豊富さは乳癌の発生機序におけるそれらの機能的重要性を示しており、したがって乳癌治療の標的を提供しうる(Bacus, SS他(1994) Am. J. Clin. Pathol. 102:S13-S24)。別の既知の乳癌マーカーとしては、或るヒトの分泌型frizzledタンパク質のmRNA（乳腺腫瘍では下方調節される）、マトリクスG1aタンパク質(ヒト乳癌細胞で過剰発現)、Drg1すなわちRTP(この遺伝子の発現は結腸腫瘍、乳腺腫瘍、前立腺腫瘍で低下)、maspin（この腫瘍抑制遺伝子は浸潤性乳癌で下方調節）、およびCaN19（S100タンパク質ファミリーのメンバーであり、このファミリーは全て、乳癌細胞では正常乳腺上皮細胞に比して下方調節される）を含む(Zhou, Z. 他(1998) Int. J. Cancer 78:95-99; Chen, L. 他(1990) Oncogene 5:1391-1395、Ulrix W. 他 (1999) FEBS Lett. 455:23-26、Sager, R. 他. (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213:51-64、Lee, S.W. 他.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2504-2508)。
【００６５】
種々の病期のヒト乳癌の乳腺上皮細胞に由来する細胞株は、悪性転換と腫瘍進行とのプロセスを研究するのに有用なモデルを提供する。その理由は、これらの細胞株が、その親腫瘍の多くの特性を、長い培養期間にわたり保持することが示されているからである(Wistuba, I.I. 他(1998) Clin.Cancer Res.4:2931-2938)。こうしたモデルが特に有用なのは、ヒト乳腺上皮細胞の表現型と分子との特徴を、悪性転換の種々の病期で比較する場合である。
【００６６】
卵巣癌
卵巣癌は婦人科癌の死亡の主な原因となっている。卵巣癌の主なものは上皮細胞から由来しており、上皮卵巣癌の患者の70%は疾患の後期段階にある。その結果、この疾患に対する長期的生存率は極めて低い。卵巣癌の早期マーカーを同定できれば、生存率を大きく増加できるであろう。卵巣癌につながる分子的現象は十分理解されていない。わかっている異常のいくつかにはp53の突然変異とミクロサテライトの不安定性がある正常卵巣を卵巣腫瘍と比較すると遺伝子発現パターンが異なっていると考えられるため、これらの組織における遺伝子発現の試験によって卵巣癌のマーカーの可能性があるものを同定することは、この疾患の特に診断、予後、および治療の向上に関連する。
【００６７】
大腸癌
結腸直腸癌は米国の癌死亡で二番目に高い。結腸癌は、全症例の９０％が55才以上に発症しているため老化に関連している。広く受け入れられている仮説は、いくつかの起因する遺伝子突然変異が長年にわたる罹患により蓄積されることである。結腸直腸癌における遺伝子的変化の本質を理解するために、遺伝性疾患を重視した多くの研究がなされている。最初に知られた遺伝性疾患である、家族性大腸ポリポーシス(FAP)は腺腫性ポリープ症Coli遺伝子(APC)における突然変異によって生じ、そのタンパク質の切断形態または不活性形態を生じる。この癌抑制遺伝子は染色体５ｑにマップされている。二番目によく知られている遺伝性疾患は遺伝性非ポリープ症結腸直腸癌(HNPCC)で、これはミスマッチの修復遺伝子における突然変異によって生じる。
【００６８】
遺伝性大腸癌の発症率は低く、大部分の結腸直腸癌は散発的であるが、遺伝性疾患の研究から理解されることが一般に適用され得る。例えば、APCにおける体細胞の突然変異は無差別の結腸腫瘍の少なくとも80%に発生する。APCの変異は、疾患における開始事象であると見なされる。続いて他の変異が発生する。約50%の結腸直腸癌はras癌遺伝子における活性化突然変異を有するが、85％はp53における不活性化突然変異を有する。これらの遺伝子における変更は、結腸癌における遺伝子発現の変化につながる。これらの突然変異の下流の標的と、これらが癌の発症と進行において果たす役割についてはあまり理解されていない。
【００６９】
前脂肪細胞
脂肪組織の最重要の機能は、脂肪を摂食時に貯蔵し空腹時に放出する能力である。白色脂肪組織は過剰エネルギー使用時のための主なエネルギー備蓄部位である。その第一目的は、エネルギー欠乏時の動員性(mobilization)である。いかにして種々の分子が、脂肪過多症と、生理的および病態生理的な諸状況でのエネルギーバランスを調節するかを理解すれば、ヒト肥満症の新規の治療法を開発しうる。脂肪組織はまた、インスリンの重要な標的組織の１つである。II型糖尿病における脂肪生成とインスリン耐性とは連関しており、興味深い関係を示す。II型糖尿病の殆どの患者は肥満であり、肥満は次にインスリン耐性を生じる。
【００７０】
脂肪細胞の生物学の、これまでの研究の大半に、形質転換したマウス前脂肪細胞株が利用されている。マウス前脂肪細胞の分化を刺激する培養条件は、ヒトの初代前脂肪細胞の分化を誘発する条件とは異なる。また、初代細胞は二倍体であるため、in vivo条件を異数体細胞株以上に反映すると思われる。ヒトの脂肪生成期の遺伝子発現プロフィールを理解すれば、脂肪過多症調節の根本機序を理解できるであろう。更に、脂肪生成の遺伝子発現プロフィールを、正常体重ドナーと肥満ドナーとで比較すれば、非常に重要な遺伝子群、すなわち肥満とII型糖尿病との潜在的な薬物標的の同定が可能となる。
【００７１】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γアゴニスト
チアゾリジンジオン（thiazolidinediones)(TZD)は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）のアゴニストとして作用する。PPARγは、核ホルモン受容体スーパーファミリのメンバーである。TZDは、高血糖、高インスリン血、および高血圧の低減を、一部にはグルコース代謝を促進して、また糖新生を阻害して行う。PPARγとそのアゴニストとの役割は、広範な病態で実証されている。この病態には例えば糖尿病、肥満、高血圧、アテローム硬化、多嚢胞卵巣症候群、および癌（例えば、乳癌、前立腺癌、脂肪肉腫、および結腸癌）を含む。
【００７２】
TZDと他のPPARγアゴニストがインスリン感受性を増強する機序は充分に理解されていないが、PPARγが脂肪生成を促進する能力に関わると思われる。培養した前脂肪細胞で異所的に発現されたPPARγは、脂肪細胞分化の強力な誘発因子である。TZDをインスリン他の因子と併用するとまた、培地でのヒト前脂肪細胞の分化を増強できる(Adams 他(1997) J. Clin. Invest. 100:3149-3153)。種々のTZDが脂肪生成をin vitro で促進する相対的な効力は、それらのin vivoでのインスリン感作効果と、PPARγにin vitroで結合し活性化するそれらの能力との双方に比例する。興味深いことに、大網脂肪貯蔵(omental adipose depots)に由来する脂肪細胞は、TZDの効果に不応である。これが示唆するところでは、TZD類のインスリン感作効果は、それらが脂肪生成を皮下脂肪貯蔵において促進する能力の結果である(Adams 他、前出)。更に、PPARγ遺伝子の優性阻害突然変異（dominant negative mutations）の同定が、二名の非肥満例でなされている。彼らには重度のインスリン耐性、高血圧、および、顕性の非インスリン依存性糖尿病(NIDDM)がみられた(Barroso 他(1998) Nature 402:880-883)。
【００７３】
NIDDMは最も多い型の糖尿病であり、糖尿病は慢性代謝病であって世界に１．４３億人の患者がいる。NIDDMの特徴は異常なグルコースと脂質との代謝であり、その原因は、末梢インスリン耐性と、欠陥のあるインスリン分泌とが組み合わさっている。NIDDMは複雑な進行性の病因を持ち、高度の遺伝率をも持つ。多数の合併症が糖尿病に併発し(例えば心臓病、卒中、腎不全、網膜症、および末梢神経障害を含む)、高い罹患率と死亡率との一因となっている。
【００７４】
分子レベルでPPARγは、リガンド活性化転写因子として機能する。リガンドの存在下でPPARγはレチノイドX受容体(RXR)と共にヘテロ二量体を形成する。この二量体は標的遺伝子の転写を活性化する。この標的遺伝子は、或るPPARγ応答エレメント（PPRE）の１つ以上のコピーを持つ。脂質の貯蔵と代謝とに重要な多くの遺伝子がPPREをもち、PPARγ標的として同定されている。これには例えばPEPCK、aP2、LPL、ACS、およびFAT-Pを含む(Auwerx, J. (1999) Diabetologia 42:1033-1049)。多数のPPARγリガンドが同定されている。このリガンドとしては例えば種々の脂肪酸代謝産物や、合成薬物のうちのTZDクラス(例えばピオグリタゾン：Pioglitazone およびロシグリタゾン：Rosiglitazone (BRL49653))並びに、数種の非グリタゾン系チロシン類似体(例えばGI262570 および GW1929)を含む。プロスタグランジン誘導体である15dPGJ2は、PPARγの強力な内因性リガンドである。
【００７５】
PPARγの発現は脂肪内では非常に高いが、骨格筋では殆ど検出されない。骨格筋は体内における、インスリンに刺激されたグルコース処理の主要部位である。PPARγの中程度の発現はまた、大腸、腎臓、肝臓、血管平滑筋、造血細胞、およびマクロファージに見られる。脂肪でのPPARγの高発現が示唆するところでは、TZD類のインスリン感作効果は、脂肪組織における、１つ以上のPPARγ調節遺伝子(PPARγ regulated genes)の発現における変容の結果である。PPARγ標的遺伝子群を同定すれば、糖尿、肥満その他の症状の為のより良い薬物設計と、新規治療戦略の開発とに寄与するであろう。
【００７６】
PPARγ標的遺伝子を同定する体系的な試みが、肥満と糖尿との数種のげっ歯類モデルでなされている(Suzuki 他(2000) Jpn. J. Pharmacol. 84:113-123; Way 他(2001) Endocrinology 142:1269-1277)。しかし、深刻な欠点がげっ歯類遺伝子発現研究にはある。それは、ヒトとげっ歯類モデルでの、脂肪生成、糖尿、および肥満の、顕著な差異である(Taylor (1999) Cell 97:9-12; Gregoire 他(1998) Physiol.Reviews 78:783-809)。したがって、ヒト組織の初代培養におけるTZD調節遺伝子を同定するための、偏向のない手法が、PPARγ活性に関連する疾患の分子的原理を充分に解明するのに必要である。
【００７７】
タンジール病
タンジール病（ＴＤ）は、扁桃腺、リンパ節、ステルの蓄積によって特徴付けられるまれな遺伝病である。低レベルのHDLは早発性冠動脈疾患の明確な予測因子を示し、ホモ接合性ＴＤは対照と比較して4〜6倍の心疾患での増加と相関する。ＨＤＬの心臓を保護する活性の主要な部分は、コレステロールの逆輸送、組織マクロファージ等の周辺の細胞から血漿リポタンパク質を介する肝臓へのコレステロールの流れにおけるその役割に起因する。HDLタンパク質であるアポリポタンパク質A-Iは、余分なコレステロールとリン脂質を除去するよう細胞表面と相互作用して、この過程において主要な役割を果たす。最近の研究は、この経路がＴＤにおいて重大な障害があり、特有の遺伝子であるABC1輸送体にその欠陥はあることを示した。この遺伝子はATP結合カセット輸送体のファミリ−の1メンバ−であり、膜を横切って多様な基質を輸送するためにATP加水分解を利用する。
【００７８】
当分野には、心血管疾患、免疫系の疾患、神経疾患、成長および発達に影響を及ぼす疾患、脂質異常、細胞増殖異常及び癌の診断、予防、および治療のための、核酸とタンパク質とを含む新規組成の要望がある。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００７９】
本発明の種々の実施態様は、総称して「KPP」、個別にはそれぞれ「KPP-1」、「KPP-2」、「KPP-3」、「KPP-4」、「KPP-5」、「KPP-6」、「KPP-7」、「KPP-8」、「KPP-9」、「KPP-10」、「KPP-11」、「KPP-12」、「KPP-13」、「KPP-14」、「KPP-15」、「KPP-16」、「KPP-17」、「KPP-18」、「KPP-19」、「KPP-20」、「KPP-21」、「KPP-22」、「KPP-23」、「KPP-24」、「KPP-25」、「KPP-26」、「KPP-27」、「KPP-28」、「KPP-29」、「KPP-30」、「KPP-31」、「KPP-32」、「KPP-33」、「KPP-34」、「KPP-35」、「KPP-36」、「KPP-37」、「KPP-38」、「KPP-39」、「KPP-40」、「KPP-41」、「KPP-42」、「KPP-43」、「KPP-44」、「KPP-45」、「KPP-46」、「KPP-47」、「KPP-48」、「KPP-49」、「KPP-50」、「KPP-51」、および「KPP-52」と呼ぶ、キナーゼおよびホスファターゼである、精製されたポリペプチドを提供し、またこれらのタンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドを使って疾患および病状の検出、診断および治療を行う方法を提供する。いくつかの実施様態はまた、精製した薬物代謝酵素、並びに/またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて創薬過程を促進する方法、例えば効力、用量、毒性、および薬理の決定の方法を提供する。関連する幾つかの実施態様は、精製したキナーゼおよびホスファターゼ群、並びに/またはそれらをコードするポリヌクレオチドを用いて疾患と病状との病原を調査する方法を提供する。
【００８０】
或る実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択されたアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択されたアミノ酸配列と90％以上同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片と、（ｄ）SEQ ID NO:1-52とからなる群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、とで構成される群から選択された単離したポリペプチドを提供する。別の実施態様は、SEQ ID NO:1-52のアミノ酸配列を持つ単離したポリペプチドを提供する。
【００８１】
また別の実施態様は(ａ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリヌクレオチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:53-104からなる群から選択される。
【００８２】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を持つ組換えポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。更に別の実施態様は、この組換えポリヌクレオチドを持つ遺伝形質転換生物を提供する。
【００８３】
別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｂ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％以上の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチドと、(ｃ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片と、(ｄ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、とからなる群から選択したポリペプチドを製造する一方法を提供する。製造方法は、(ａ)或る細胞を該ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、この細胞を組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換する過程と、(ｂ)そのように発現したポリペプチドを回収する過程からなる。この組換えポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し機能的に連結したプロモーター配列を持つ。
【００８４】
更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【００８５】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施態様で該ポリヌクレオチドは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００８６】
また別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。或る関連した実施態様で本法は、該ハイブリダイゼーション複合体の量の検出を含みうる。また別の実施態様で該プローブは、少なくとも約20、30、40、60、80、または100の連続したヌクレオチド群からなる場合がある。
【００８７】
また更に別の実施態様は、サンプル中に標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって該標的ポリヌクレオチドが(ａ)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｂ)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ｃ)(ａ)に相補的なポリヌクレオチド、(ｄ)(ｂ)に相補的なポリヌクレオチド、および(ｅ)(ａ)〜(ｄ)のRNA等価物、からなる群から選択される方法を提供する。検出方法は、(ａ)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(ｂ)該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出する過程からなる。或る関連した実施態様で本法は、該増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の量の検出を含みうる。
【００８８】
別の実施態様は、或る有効量のポリペプチドと薬物として許容し得る或る賦形剤とからなる、或る組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(ａ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択される。一実施様態では、組成物はSEQ ID NO:1-52からなる群から選択されたアミノ酸配列を含み得る。他の実施様態は、機能的KPPの発現の低下または異常発現に関連する疾患や症状の治療方法を提供し、そのような治療の必要な患者にこの組成物を投与することを含む。
【００８９】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的KPPの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００９０】
また更に別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(ｂ)サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別の実施態様は、この方法で同定したアンタゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。また別の実施態様は、機能的KPPの過剰発現を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、該組成物の投与方法を提供する。
【００９１】
別の実施態様は、(a)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列に少なくとも90％同一であるあるいは少なくとも約90％同一である天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(ｄ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(a）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、(b)試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによって、該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【００９２】
また別の実施態様は、(ａ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｂ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を持つポリペプチド、(ｃ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および(ｄ)SEQ ID NO:1-52からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(ａ)該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、(ｂ)該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、(ｃ)この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００９３】
また更に別の実施態様は、SEQ ID NO:53-104からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果に関し、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、(ａ)この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、(ｂ)この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、(ｃ)可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００９４】
別の実施態様は、試験化合物の毒性の算定方法を提供する。この方法には、以下の過程がある。(ａ)核酸群を有する生体サンプルを試験化合物で処理する過程。(ｂ)処理済み生体サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程。この過程には、次のようなプローブを用いる。(i)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)に相補的な配列を持つポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択した或るポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなるプローブである。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生体サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間に特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で生じる。上記標的ポリヌクレオチドは、(i)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(ii)SEQ ID NO:53-104からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％または少なくとも約９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチド、(iii)(i)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(iv)(ii)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(v)(i)〜(iv)のRNA等価物、からなる群から選択する。あるいは標的ポリヌクレオチドは、上記(i)〜(v)からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を持つ場合がある。毒性の算定方法には更に、以下の過程がある。(ｃ)ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、(ｄ)処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程である。処理済み生体サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の量の差異が、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９５】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、核酸、および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明の実施態様が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００９６】
補足請求および明細書中で用いている単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意されたい。したがって、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には1個以上の抗体、および、当業者に公知の抗体の等価物などについても言及している。
【００９７】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明の種々の実施態様に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬およびベクターについて説明および開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００９８】
（定義）
用語「KPP」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などからの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得た、実質的に精製されたKPPのアミノ酸配列を指す。
【００９９】
用語「アゴニスト」は、KPPの生物学的活性を強化または模倣する分子を指す。アゴニストとしては、KPPと直接に相互作用、あるいはKPPが関与する生物学的経路の各成分に作用してKPPの活性をモジュレートする、タンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【０１００】
「対立遺伝子変異体／変異配列」は、KPPをコードする、別の形態の遺伝子である。対立遺伝子変異体群は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る。また、変容したmRNA群を生じ得る。また、この変異体が生じ得るポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換による。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【０１０１】
KPPをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換がありながら、KPPと同じポリペプチド、或いはKPPの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、KPPをコードするポリヌクレオチドにとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列群との不適当或いは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、KPPをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多型性をも含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なKPPとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にKPPの活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性、についての1つ以上の類似性に基づいて成され得る。例えば負の荷電アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正の荷電アミノ酸にはリジンおよびアルギニンがありうる。親水性値が近似した極性無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、アスパラギンとグルタミン、およびセリンとトレオニンを含みうる。親水性値が近似した無電荷側鎖を持つアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、およびフェニルアラニンとチロシンを含みうる。
【０１０２】
用語「アミノ酸」および「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、あるいはそれらのいずれかの断片を指し、天然分子または合成分子を指し得る。ここで「アミノ酸配列」は天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を指すものであり、「アミノ酸配列」及び類似の語は、アミノ酸配列を、列挙したタンパク質分子に関連する完全な本来のアミノ酸配列に限定しようとするものではない。
【０１０３】
「増幅」は、或る核酸配列の付加的複製物を作製する行為に関する。増幅には、当該分野で公知の、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術または他の核酸増幅技術を用いうる。
【０１０４】
用語「アンタゴニスト」は、KPPの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、KPPと直接相互作用すること、あるいはKPPが関与する生物学的経路の各成分に作用することによってKPPの活性をモジュレートする、抗体などタンパク質、anticalin、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【０１０５】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFab、F(ab')2 及びFv断片を指す。KPPポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、無傷のポリペプチド群を用いて、または、当該の小ペプチド群を持つ断片群を用いて作製可能である。マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、担体タンパク質に抱合し得る。通常用いられる担体であってペプチドと化学結合する担体の例は、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、および、スカシガイのヘモシアニン（KLH）などがある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【０１０６】
「抗原決定基」の語は、特定の抗体と接触する、分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、該タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、或る抗体への結合について、無傷の抗原（すなわち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１０７】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーはin vitroでの進化プロセスに由来する（例えば、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmentの略、試験管内選択法）、米国特許第5,270,163号に記述）。これは、大規模なコンビナトリアルライブラリ群から標的特異的アプタマー配列を選択するプロセスである。アプタマーの組成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーの各ヌクレオチド成分は修飾された糖基を持つことがあり（例えば、リボヌクレオチドの2'-OH基は2'-Fまたは2'-NH2によって置換され得る）、これは、ヌクレアーゼへの抵抗性または血中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。アプタマーを他の分子(例えば高分子量キャリア)と抱合させることにより、循環系からのこのアプタマーのクリアランスを遅らせ得る。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって各々の同族リガンドと特異的に架橋させうる（Brody, E.N.およびL. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13）。
【０１０８】
「intramer」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。
【０１０９】
「スピーゲルマー（spiegelmer）」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性ヌクレオチド群を持つアプタマー類は、右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素類による分解に耐性がある。
【０１１０】
用語「アンチセンス」は、或る特定の核酸配列を有するポリヌクレオチドの「センス」（コーディング）鎖との塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、修飾された主鎖結合たとえばホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸などを有するオリゴヌクレオチドや、修飾された糖基たとえば2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖などを有するオリゴヌクレオチドや、あるいは修飾された塩基たとえば5-メチルシトシン、2'-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシンなどを有するオリゴヌクレオチドがあり得る。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考DNA分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考DNA分子のセンス鎖を意味しうる。
【０１１１】
「生物学的に活性」の語は、天然分子の構造的機能、調節機能または生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然、組換え体、または合成のKPPまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１１２】
「相補(的)」または「相補性」の語は、塩基対形成によってアニーリングする2つの一本鎖核酸の間の関係を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配列「3'T-C-A5'」と対を形成する。
【０１１３】
「〜のポリヌクレオチドを含む（持つ）組成物」または「〜のポリペプチドを含む（持つ）組成物」は、所定のポリヌクレオチド配列若しくはポリペプチドを持つ、任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。KPPをコード、若しくはKPPの断片群をコードするポリヌクレオチド群を有する組成物類は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩(例えばNaCl)、界面活性剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS)および他の成分(例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNAなど)を有する水溶液中に、プローブを分散させ得る。
【０１１４】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems,Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片アセンブリシステム（Accelrys, Burlington MA）、あるいはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片アセンブリ用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上の重複するcDNAやEST、またはゲノムDNA断片からアセンブリされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【０１１５】
「保存的なアミノ酸置換」は、置換がなされた時に元のタンパク質の特性を殆ど損なわないと予測されるような置換、即ちタンパク質の構造と特に機能が保存され、そのような置換による大きな変化がない置換を指す。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換可能で、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
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【０１１６】
保存アミノ酸置換では通常、(a）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、(b)置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または(c)側鎖の大部分を保持する。
【０１１７】
「欠失」は、結果的に１個若しくは数個のアミノ酸残基またはヌクレオチドが失われてなくなるようなアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【０１１８】
「誘導体」の語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの化学修飾を指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。誘導体ポリヌクレオチドは、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、次のようなプロセスによって修飾されたポリペプチドである。すなわち、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、あるいは任意の同様なプロセスであって、誘導元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスである。
【０１１９】
「検出可能な標識」は、測定可能なシグナルを生成することができ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに共有結合または非共有結合するようなレポーター分子または酵素を指す。
【０１２０】
「差次的発現」は少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または遺伝子発現またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【０１２１】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。或るエキソンは、コードするタンパク質の１つの構造的または機能的ドメインを意味し得るため、安定した下部構造群の新たな組合せによって新規のタンパク質群をアセンブリすることが可能であり、新たなタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１２２】
用語「断片」は、KPPの又はKPPをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一であり得るが親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、最長で定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さを有し得る。例えば或る断片は、約5〜約1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の、連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、或るポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるような或るポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択した、或る長さの連続したアミノ酸を持ち得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【０１２３】
SEQ ID NO:53-104の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:53-104を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を持ちうる。SEQ ID NO:53-104の或る断片を本発明の方法の1つ以上の実施態様、例えばハイブリダイゼーションおよび増幅技術に、またはSEQ ID NO:53-104を関連ポリヌクレオチドから区別する類似の方法に用い得る。SEQ ID NO:53-104の断片の正確な長さ及び断片に対応するSEQ ID NO:53-104の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１２４】
SEQ ID NO:1-52の或る断片は、SEQ ID NO:53-104の或る断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-52の或る断片は、SEQ ID NO:1-52を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を持ち得る。例えばSEQ ID NO:1-52の或る断片を、SEQ ID NO:1-52を特異的に認識する抗体の開発における免疫原性ペプチドとして用い得る。SEQ ID NO:1-52の或る断片の正確な長さは、また、この断片が対応するSEQ ID NO:1-52の領域は、その断片に意図する目的に基づき、本明細書に記載する、または当分野で既知の1つ以上の分析法で判定し得る。
【０１２５】
「完全長」ポリヌクレオチドとは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続く１オープンリーディングフレームおよび翻訳終止コドンを有する配列である。或る「完全長」ポリヌクレオチド配列は、或る「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１２６】
「相同性」の語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、選択性、または配列同一性を意味する。
【０１２７】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する同一残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、2配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の2配列内にギャップ群を挿入し得るので、2つの配列をより有意に比較できる。
【０１２８】
ポリヌクレオチド配列間の一致率(同一性)を判定するには、当分野で既知の、または本明細書に記載の、１つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを用い得る。例えば一致率を判定するには、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムの、デフォルトのパラメータ群を用い得る。このプログラムは、LASERGENEソフトウェアパッケージ(一組の分子生物学的分析プログラム)(DNASTAR, Madison WI)の一部である。CLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp (1989; CABIOS 5:151-153)、並びにHiggins, D.G.他(1992; CABIOS 8:189-191)に記載がある。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。
【０１２９】
あるいは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)が、一般的に用いられ且つ入手自由な用い得る配列比較アルゴリズム一式を提供している(Altschul, S.F.他（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410）。BLASTアルゴリズムは幾つかの情報源から入手可能であり、メリーランド州ベセスダにあるNCBIおよびインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）からも入手可能である。BLASTソフトウェア一式には様々な配列分析プログラムが含まれており、既知のポリヌクレオチド配列を種々のデータベースから得た別のポリヌクレオチド配列とアラインメントする「blastn」もその１つである。その他にも、２つのヌクレオチド配列をペアワイズで直接比較するために用いる「BLAST 2 Sequences」と称されるツールも利用可能である。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn 及び blastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ(gap)などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行し得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１３０】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
【０１３１】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１３２】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝暗号の縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１３３】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する同じ残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷および疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（したがって機能も）保存する。ポリペプチド配列に用いられる用語「類似率」または「〜％類似」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の同じ残基の一致および保存的置換を含む残基の一致率を意味する。一方、保存的置換は、ポリペプチド配列間の一致率の計算には含まれない。
【０１３４】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いてポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。PAM250マトリクスが、デフォルトの残基重み付け表として選択される。
【０１３５】
あるいは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用い得る。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）のblastpをデフォルトパラメータに設定して用い得る。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１３６】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
【０１３７】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得た断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定しうる。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列表を含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１３８】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb（キロベース）〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である。
【０１３９】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【０１４０】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、2つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容されるアニーリング条件下で形成され、１回以上の「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（すなわち完全には一致しない核酸鎖対間の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングに関する許容条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニール条件はどのハイブリダイゼーション実験でも一定であり得るが、洗浄条件は、所望のストリンジェンシー、したがってハイブリダイゼーション特異性を得るように、実験ごとに変更し得る。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が６８℃で、約６×SSC、約１％（w/v）のSDS、並びに約１００μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【０１４１】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約５〜２０℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度およびpHの条件下で、完全一致プローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式および核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook , J.およびD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, 1-3巻, Cold Spring Harbor NY, 9章）を参照されたい。
【０１４２】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約０．２x SSC及び約0.1％のSDSの存在の下、約６８℃で１時間の洗浄過程を含む。別法では、約65℃、60℃、55℃、または42℃の温度で行う。SSC濃度は、約０.１％のSDS存在下で、約０.１〜２×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約１００〜２００μg/mlの、せん断した変性サケ精子DNAがある。特定条件下で、例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションでは、有機溶剤、例えば約３５〜５０％v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に、高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【０１４３】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合の形成によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る(C0tまたはR0t解析など)。あるいは、一方の核酸が溶解状態で存在し、もう一方の核酸が固体支持体(例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、あるいは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板)に固定されているような２つの核酸間に形成され得る。
【０１４４】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いはポリヌクレオチド配列の変化を指す。
【０１４５】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１４６】
「免疫原性断片」は、生物（例えば哺乳類）に導入すると免疫応答を引き起こし得る、KPPのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」はまた、本明細書で開示するまたは当分野で周知のあらゆる抗体生産方法に有用な、KPPの任意のポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも指す。
【０１４７】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物の構成を指す。
【０１４８】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の指定された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体またはその他の化合物を指す。
【０１４９】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、KPPの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、KPPのタンパク質活性の増減が、あるいは、結合特性またはその他の、生物学的特性、機能的特性あるいは免疫学的特性の変化が生じ得る。
【０１５０】
「核酸」および「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を意味し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸(PNA)や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１５１】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列群は非常に近接するか連続的に隣接することがあり、また、2つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は同一リーディングフレーム内にあり得る。
【０１５２】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドのバックボーンに結合した、少なくとも約５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止させる。ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１５３】
KPPの「翻訳後修飾」としては、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解切断、及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成的或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、KPPの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１５４】
「プローブ」とは、核酸の内、KPPやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードし、同一や対立遺伝子核酸、または関連する核酸の検出に用いる核酸を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、および酵素がある。「プライマー」は、短い核酸、通常はDNAオリゴヌクレオチドであり、相補的塩基対を形成することで標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素により、標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、核酸の増幅(および同定)に用い得る。
【０１５５】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるため、長めのプローブおよびプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または少なくとも１５０の連続したヌクレオチドからなるようなプローブおよびプライマーも用い得る。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列表を含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１５６】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J.およびD.W. Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY)、Ausubel, F.M. 他(1999; Short Protocols in Molecular Biology, 第4版, John Wiley & Sons, New York NY),およびInnis, M.他（1990; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego CA）などの参照文献に記載がある。PCRプライマー対を既知の配列から得るには、例えば、そのためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用い得る。
【０１５７】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、最大で各１００ヌクレオチドのPCRプライマー対の選択に有用であり、オリゴヌクレオチドおよび、最大５,０００までの大きめのポリヌクレオチドであって最大３２キロベースのインプットポリヌクレオチド配列から得た配列を分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム(テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能)は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「非プライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である(後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る)。PrimerGenプログラム（英国ケンブリッジ市の英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンターから一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域のいずれかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、独自のものであれ保存されたものであれ、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１５８】
本明細書における「組換え核酸」は天然の配列ではなく、2つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた核酸である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメントの人為的操作によって、例えばSambrookとRussellの文献(前出)に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えばある細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部と成し得る。
【０１５９】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳類に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳類内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１６０】
「調節因子」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節因子は、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１６１】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子およびその他の当分野で既知の成分がある。
【０１６２】
DNA分子に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA分子と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、全ての窒素性塩基のチミンがウラシルで置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１６３】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。KPPをコードする核酸若しくはその断片、またはKPP自体を含む疑いのあるサンプルは、体液や、細胞、染色体、細胞小器官または細胞から単離された膜からの抽出物や、細胞や、溶解しているか基板に結合しているゲノムDNA、RNAまたはcDNAや、組織や、組織プリント等から構成され得る。
【０１６４】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造(例えば抗原決定基すなわちエピトープ)であって結合分子が認識する構造の有無に依存する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、遊離した標識Ａ及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり遊離した、標識されていないＡ）を含むポリペプチドの存在が、抗体に結合する標識されたＡの量を低減させる。
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約６０％除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましくは約９０％以上除去されたものを指す。
【０１６５】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１６６】
用語「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔など、様々な表面形態を有することができ、基板表面にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１６７】
「転写イメージ(transcript image)」または「発現プロファイル（プロフィール）」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１６８】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、当該分野で公知の種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する、任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクションおよび微粒子銃を用いる方法がある。「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１６９】
ここで用いる「遺伝形質転換生物体(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック(transgenic)技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスでの感染によって行う。別の実施態様で核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他(2002) Science 295:868-872）。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種あるいは体外受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指す。本発明に基づいて企図される遺伝形質転換生物には、細菌、藍藻、真菌、および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook とRussell(前出)などの文献で提供されている。
【０１７０】
特定の核酸配列の「変異体」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも４０％の相同性を有する核酸配列であると定義する。 その際、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として記載し得る。スプライス変異体は参照分子との顕著な同一性を有し得るが、mRNAプロセシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチドである。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意のアミノ酸同一性を持つ。多型変異体は、或る種の個体間における、或る特定遺伝子のポリヌクレオチド配列内での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチドが異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の集団、病態または病態性向を示し得る。
【０１７１】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも40％の配列相同性または配列類似性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、そのポリペプチドの一方の所定の長さに対して、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性または配列類似性を示し得る。
【０１７２】
（発明）
本発明の様々な実施様態は、新規のキナーゼおよびホスファターゼ(KPP)、およびKPPをコードするポリヌクレオチド、及び心血管疾患、免疫系の疾患、神経の疾患、成長および発達に影響を及ぼす疾患、脂質異常、細胞増殖異常及び癌の診断・治療あるいは予防のためのこれらの組成物の使用を含む。
【０１７３】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド実施態様およびポリペプチド実施態様の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号(IncyteプロジェクトID)に相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO:）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。列６は、本発明のポリペプチド配列とポリヌクレオチド配列とに対応する物理的完全長クローン群のIncyte ID番号を示す。完全長クローンは、列３に示すポリペプチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を持つポリペプチドをコードする。
【０１７４】
表２は、GenBankタンパク質(genpept)データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド実施様態に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列3は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号(GenBank ID NO:)と、最も近いPROTEOMEデータベース相同体のPROTEOMEデータベース識別番号(PROTEOME ID NO:)とを示す。列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５はGenBankおよびPROTEOMEデータベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これらすべては特にこの参照により開示に含まれる。
【０１７５】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４は潜在的リン酸化部位を示し、列５は潜在的グリコシル化部位を示すが、これはGCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム(Accelrys, Burlington MA)によって決定された。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを持つアミノ酸残基を示す。列７はタンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に用いた検索可能なデータベースを示す。
【０１７６】
表２及び３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドがキナーゼおよびホスファターゼであることを確立している。例えば、SEQ ID NO:1は、ヒトのリンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ(GenBank ID g187034)に対してM1残基からG215残基まで96％、Y212残基からP458残基まで100％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは2.4e-248であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:1は原形質膜に位置し、キナーゼとトランスフェラーゼ活性を有し、またチロシンキナーゼであることが、PROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。SEQ ID NO:1はまた、SH2、SH3およびプロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、BLAST、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:1がプロテインチロシンキナーゼである、さらに補強証拠を提供する。別の例では、SEQ ID NO:4は、ヒトのプロテインチロシンホスファターゼ(GenBank ID g1871531)に対してM1残基からW38残基まで82％、K32残基からV353残基まで98％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.8e-186であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:4はホスファターゼ活性とヒドロラーゼ活性を有し、またチロシンホスファターゼであることが、PROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。SEQ ID NO:4はまた、１つのプロテインチロシンホスファターゼドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、BLAST、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:4がプロテインチロシンキナーゼである、さらに補強証拠を提供する。別の例でSEQ ID NO:14は、G19残基からK286残基まで、ヒトのプロテインホスファターゼ１(GenBank ID g14124968)と100％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは3.4e-157であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:14はホスファターゼ活性とヒドロラーゼ活性を有し、またプロテインホスファターゼであることが、PROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。SEQ ID NO:14はまた、１つのセリン／トレオニンホスファターゼドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、PROFILESCAN、MOTIFS、および付加的BLAST解析よりのデータによって、SEQ ID NO:14がセリン/トレオニンプロテインホスファターゼである、さらに補強証拠が提供される。別の例では、SEQ ID NO:16は、マウスのプロテインキナーゼ(GenBank ID g406058)に対してE592残基からT1634残基まで82％、C83残基からE592残基まで94％同���であることが、Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:16は細胞骨格に局在し、プロテインキナーゼ機能を持ち、微小管と相互作用するプロテインキナーゼであると、BLAST解析にPROTEOMEデータベースを用いて判定した。SEQ ID NO:16はまた、１つのPDZ（DHRまたはGLGFとしても知られる）ドメインと１つのプロテインキナーゼドメインを有するが、これは隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、他のBLAST、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:16がプロテインキナーゼである、さらに補強証拠を提供する。別の例でSEQ ID NO:27は、M1残基からL731残基まで、ヒトのセリン／トレオニンタンパク質キナーゼEMK1(GenBank ID g1749794)との９７％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:27は、細胞質に局在し、微小管の安定性に関与するプロテインキナーゼとして機能し、またヒトEMK1に対して強い類似性を有するセリン／トレオニンキナーゼであるタンパク質に相同的であり、ことが、PROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。SEQ ID NO:27はまた、1つのキナーゼ関連ドメイン、1つのUBA/TS-Nドメイン、また1つのプロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、PROFILESCANおよび他のBLAST解析よりのデータによって、SEQ ID NO:27 がセリン/トレオニンプロテインキナーゼである、さらに補強証拠が提供される。別の例でSEQ ID NO:43はヒトのタンパク質セリン／トレオニンキナーゼ(GenBank ID g348245)に対して、Y29残基からW216残基まで44％、R460残基からL526残基まで26％の同一性を有することがBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.2e-42であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:43もまた、細胞質に局在し、セリン／トレオニンキナーゼ活性を有し、細胞周期の制御に関与するタンパク質に対して相同性があることが、PROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。SEQ ID NO:43はまた、１つのプロテインキナーゼドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、BLAST、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:43がプロテインキナーゼである、さらに補強証拠を提供する。SEQ ID NO:2-3、SEQ ID NO:5-13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17-26、SEQ ID NO:28-42、およびSEQ ID NO:44-52については、同様の方法で分析し、注釈を付けた。SEQ ID NO:1-52の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０１７７】
表４に示すように、完全長ポリヌクレオチド実施態様は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード(エキソン)配列を用いて、あるいはこれら２種類の配列を任意に組合せてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対の各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、完全長ポリヌクレオチド実施態様のアセンブリに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の開始ヌクレオチド（5'）位置および終了ヌクレオチド（3'）位置、また、例えばSEQ ID NO:53-104を同定するため、或いはSEQ ID NO:53-104と関連するポリヌクレオチド群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチドの断片の開始ヌクレオチド（5'）位置および終了ヌクレオチド（3'）位置を示す。
【０１７８】
表４の列２に記載したポリヌクレオチド断片は、特に例えば組織特異的cDNAライブラリ群やプールしたcDNAライブラリ群に由来するIncyte cDNA群を指す場合もある。或いは列２に記載のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチドのアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、英国ケンブリッジ）データベースから由来した配列（即ち「ENST」命名を含む配列）を同定し得る。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列2のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方のアセンブリ体を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 と同定されるポリヌクレオチドは、アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された(stitched)」配列である(実施例５参照)。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチされた」配列である。XXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号であり、Nは特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別子（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別子（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０１７９】
あるいは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法に由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する（実施例４と５を参照）。
2005518191.tif 000003
【０１８０】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表４に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNA適用範囲が得られたが、該当するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１８１】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチドのための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリとはIncyte cDNAライブラリであり、これは、最も頻繁にはIncyte cDNA配列群によって代表されるが、これら配列は、上記ポリヌクレオチドをアセンブリおよび確認するために用いられた。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１８２】
本発明はまた、KPPの変異体も含む。KPPの変異体の様々な実施様態は、KPPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも一つを有することが可能で、かつKPPアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１８３】
種々の実施態様もまた、KPPをコードするポリヌクレオチドをも含む。特定の実施例において、本発明は、KPPをコードするSEQ ID NO:53104からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。配列表に示したSEQ ID NO:53-104のポリヌクレオチド配列は等価RNA配列を含むが、窒素塩基チミンの出現はウラシルに置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースから構成されている。
【０１８４】
本発明はまた、KPPをコードするポリヌクレオチドの変異体群を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチドは、KPPをコードするポリヌクレオチドとの、少なくとも約70％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約85％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る実施態様では、SEQ ID NO:53-104からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも約70％、或いは少なくとも約85％、または少なくとも約95％もの一致率を有するようなSEQ ID NO:53-104からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチドの変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、KPPの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するポリペプチドをコードし得る。
【０１８５】
更にあるいは別法では、本発明のポリヌクレオチドの変異体はKPPをコ−ドするポリヌクレオチドのスプライス変異体である。或るスプライス変異体はKPPをコードするポリヌクレオチドとの顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常、より多数またはより少数のヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異体には、約70％未満、または約60％未満、あるいは約50％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、KPPをコードするポリヌクレオチドとの間で全長に渡って見られるが、このスプライス変異体の幾つかの部分には、KPPをコードするポリヌクレオチドの各部との、少なくとも約70％、あるいは少なくとも約85％、または少なくとも約95％、なおまたは100％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えばSEQ ID NO:95の配列を持つポリヌクレオチドとSEQ ID NO:96の配列を持つポリヌクレオチドとは互いのスプライス変異体である。上記のスプライス変異体は何れも、KPPの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るポリペプチドをコードし得る。
【０１８６】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るKPPをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを企図する。これらの組み合わせは、天然のKPPのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全てのそのような変異が明確に開示されているとみなす。
【０１８７】
KPPとその変異体とをコードするポリヌクレオチドは一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然KPPをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有するKPP或いはその誘導体をコードするポリヌクレオチドを作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定コドンを利用する頻度に基づき、特定の真核宿主または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようコドンを選択し得る。コードされたアミノ酸配列を変えないで、KPP 及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、天然の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることにある。
【０１８８】
本発明はまた、KPP及びその誘導体をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成ポリヌクレオチドを、当分野で公知の試薬を用いて、多くの入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、KPPまたはその任意の断片をコードするポリヌクレオチドの中に突然変異を導入することも可能である。
【０１８９】
本発明の実施態様には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載のポリヌクレオチド、特に、SEQ ID NO:53-104に示す配列を持つポリヌクレオチド、及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド群が含まれる(Wahl, G.M.およびS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507-511）。アニーリングおよび洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載した。
【０１９０】
DNAシークエンシングの方法は当分野では周知であり、本発明のいずれの実施態様にも、DNAシークエンシング方法を用い得る。DNAシークエンシング方法には酵素を用い得る。例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham Biosciences, Piscataway NJ）を用い得る。あるいは、例えばELONGASE増幅システム（Invitrogen, Carlsbad CA）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼとを併用し得る。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）およびABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel 他, 前出, 7章、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ）。
【０１９１】
当分野で周知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、KPPをコードする核酸を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマー及びネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する方法である（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322）。別の方法にインバースPCR法があり、これは多岐の方向に伸長するプライマー群を用いて、環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る(Triglia, T.他(1988) Nucleic Acids Res.16:8186）。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これにはヒトおよび酵母人工染色体DNAの既知の配列群に隣接するDNA断片群をPCR増幅する方法を含む(Lagerstrom, M.他(1991) PCR Methods Applic.1:111119）。この方法では、PCRを行う前に、複数の制限酵素の消化およびライゲーション反応を用い、未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入し得る。未知の配列群を検索するために用い得る、他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他(1991) Nucleic Acids Res.19:30553060）。更に、PCR、ネステッドプライマー類、およびPROMOTERFINDERライブラリ類（Clontech, Palo Alto CA）を用いて、ゲノムDNAをウォーキングし得る。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上で、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０１９２】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更にランダムプライマーのライブラリは遺伝子群の5'領域を有する配列群をしばしば含んでおり、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、5'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１９３】
市販のキャピラリー電気泳動システム群を用いて、シークエンシングまたはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認し得る。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチド特異的な、レーザーで刺激される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１９４】
本発明の別の実施態様では、適切な宿主細胞内で、KPP、その断片または機能的等価物を発現させる組換えDNA分子群に、KPPをコードするポリヌクレオチド群またはその断片群をクローニングし得る。遺伝暗号に固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のポリヌクレオチドをコードする別のポリヌクレオチドが作られ、これらの配列をKPPの発現に利用可能である。
【０１９５】
種々の目的で、KPPをコードする配列群を改変するために、当分野で一般的に既知の複数の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドを組換えることができる。この組換えの多様な目的には、遺伝子産物のクローン化の、あるいはプロセッシングおよび／または発現のモディフィケーションが含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドとの、ランダムな断片化およびPCR再アセンブリによるDNAシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組換え得る。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異導入を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン選択性の変更、スプライス変異体の生成などを起こす突然変異を導入し得る。
【０１９６】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING（Maxygen Inc., Santa Clara CA, 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.他(1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797; Christians, F.C. 他(1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264; Crameri, A. 他(1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャッフリング技術の対象となり得る。これにより、生物活性または酵素活性、あるいは他の分子や化合物と結合する能力など、KPPの生物学的特性を改変あるいは改良し得る。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。従って、「人工的な」育種及び急速な分子の進化によって遺伝的多様性が生み出される。例えば、ランダムな点突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。あるいは、所定の遺伝子の断片群を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組換えて、自然に生じる複数遺伝子の遺伝的多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化できる。
【０１９７】
別の実施態様では、KPPをコードするポリヌクレオチドは、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である(例えば、Caruthers. M.H.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223; Horn, T.他(1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232)。あるいは、KPP自体またはその断片を当分野で既知の化学的方法を用いて合成し得る。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（Creighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY55-60ページ; Roberge, J.Y.他(1995) Science 269:202-204）。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にKPPのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更を用いた他のタンパク質の配列または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０１９８】
ペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製可能である（Chiez, R.M.及び F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のCreighton, 28-53ページ）。
【０１９９】
生物学的に活性なKPPを発現させるために、KPPをコードするポリヌクレオチドまたはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含む。必要なエレメントとしては、ベクター内およびKPPをコードするポリヌクレオチドにおける調節配列（例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５'および３'の非翻訳領域など）が含まれる。必要なエレメント群は、強度および特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、KPPをコードするポリヌクレオチドのより効果的な翻訳を達成することが可能である。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。KPPをコードするポリヌクレオチド配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要でないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入される場合は、インフレームATG開始コドンなど外来性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である(Scharf, D.他(1994) Results Probl.Cell Differ. 20:125-162)。
【０２００】
当業者に周知の方法を用いて、KPPをコードするポリヌクレオチド群と、好適な転写及び翻訳制御エレメント群とを持つ発現ベクター群を作製できる。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(SambrookおよびRussell, 前出, 1-4、8章、Ausubel 他, 前出1、3、15章)。
【０２０１】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、KPPをコードするポリヌクレオチド群の保持及び発現ができる。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌などの微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス：CaMVまたはタバコモザイクウイルス：TMV）または細菌発現ベクター（例えばTiまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、動物細胞系等がある(SambrookおよびRussell,前出、Ausubel 他、前出、Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:55035509、Engelhard, E.K. 他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他(1996) Hum.Gene Ther.7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill, New York NY, 191-196ページ、Logan, J.およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチドを標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる(Di Nicola, M.他(1998) Cancer Gen. Ther. 5:350-356; Yu, M.他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344; Buller, R.M.他(1985) Nature 317:813-815; McGregor, D.P.他(1994) Mol. Immunol. 31:219-226; Verma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242)。本発明は使用する宿主細胞によって限定されない。
【０２０２】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、KPPをコードするポリヌクレオチド群の使用目的に応じて選択できる。例えばKPPをコードするポリヌクレオチドの慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Invitrogen)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。KPP をコードするポリヌクレオチドをこのベクターのマルチクローニング部位にライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を持つ形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう（Van Heeke, G. および S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509）。例えば抗体類の産生などに多量のKPPが必要な場合は、KPPの発現をハイレベルで指示するベクター類が使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを持つベクターが使用できる。
【０２０３】
KPPの産生には、酵母発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを有する多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来ポリヌクレオチド配列群を組み込むことを可能にする(Ausubel他、前出; Bitter, G.A.他(1987) Methods Enzymol.153:516-544; Scorer, C.A.他(1994) Bio/Technology 12:181-184)。
【０２０４】
植物系を使用してKPPを発現することも可能である。KPPをコードするポリヌクレオチドの転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。あるいは、RUBISCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る(Coruzzi, G.他(1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R.他(1984) Science 224:838-843; Winter, J.他(1991) Results Probl.Cell Differ. 17:85-105)。これらの構成物は、直接DNA形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ）。
【０２０５】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とからなるアデノウイルス転写／翻訳複合体に、KPP をコードするポリヌクレオチド群をライゲーションし得る。アデノウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域への挿入を用いれば、宿主細胞内でKPPを発現する感染ウイルスを得ることができる(Logan, J.およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳類宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２０６】
また、ヒト人工染色体（HAC）類を用いて、或るプラスミドに含まれ得る断片やプラスミドから発現し得る断片より大きなDNA断片群を送達し得る。治療のために約６kb〜１０MbのHACsが作製され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:157-355)。
【０２０７】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるKPPの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、KPPをコードするポリヌクレオチドを株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素及び／または内因性の発現要素や、同じベクター上に或いは別のベクター上に選択マーカー遺伝子を含み得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列の発現に成功するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖できる。
【０２０８】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M.他(1977) Cell 11:223-232; Lowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドであるネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(Wigler, M. 他(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; Colbere-Garapin, F.他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)。更なる選択可能な遺伝子、例えばtrpBとhisDとが記載され、これらは代謝物についての細胞要求を変容させる（Hartman, S.C.およびR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051）。可視マーカー類、例えばアントシアニンや、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼおよびその基質であるβグルクロニド、またはルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンを用い得る。これらのマーカーを用いて、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因しうる一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することも可能である（Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131）。
【０２０９】
マーカー遺伝子発現の有無によって当該の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、KPPをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、KPPをコードするポリヌクレオチド群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定できる。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がKPP をコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０２１０】
一般に、KPPをコードするポリヌクレオチドを持ち、KPPを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定できる。これらの方法には、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーションや、PCR法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２１１】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるKPPの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。このような技法の例には、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取(フローサイトメーター)（FACS）などがある。KPP 上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当分野で周知である(Hampton, R.他(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect.IV; Coligan, J.E.他(1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience, New York NY; Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ)。
【０２１２】
多岐にわたる標識方法および抱合技術が当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの技術を用い得る。KPPをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。或いはKPPをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングしうる。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えばAmersham Biosciences、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどの種々の市販キットを用いて実行できる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体などがある。
【０２１３】
KPPをコードするポリヌクレオチド群で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。KPPをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過してのKPPの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２１４】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入したポリヌクレオチドの発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞機構および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38など）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【０２１５】
本発明の別の実施例では、KPP をコードする天然のポリヌクレオチド、修飾されたポリヌクレオチド、または組換えのポリヌクレオチドを上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に連結させ得る。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラKPPタンパク質が、KPP活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。異種タンパク質部分および異種ペプチド部分はまた、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープタグを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、融合タンパク質が、KPPをコードする配列と異種タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を持つように遺伝子操作すると、精製後にKPPが異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel他(前出、10および16章)に記載がある。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０２１６】
別の実施様態では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したKPPの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターに機能的に連結したタンパク質コード配列群の、転写と翻訳とを共役させる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２１７】
KPP或いはその断片またはその変異体を用いて、KPPに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。KPPに対する特異的結合について、一つ以上の試験化合物をスクリーンすることができる。種々の実施様態において、KPPに対する特異結合について、1、2、3、4、5、10、20、50、100または200の試験化合物をスクリーンすることができる。試験化合物の例として、抗体、アンティカリン(anticalins)、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えばリガンドや受容体）、または小分子が挙げられる。
【０２１８】
関連する実施様態において、KPP、KPPの変異体、あるいはKPPおよび／または１つ以上のKPP変異体とのある組み合わせへの試験化合物（抗体等）の結合/をスクリーニングするために、KPP変異体を用いることができる。ある実施様態においては、SEQ ID NO:1-52の配列の正確な配列を有するKPPではなく、KPPの変異体に結合する化合物のスクリーニングにKPPの変異体を用いることができる。このようなスクリーニングを行うために使うKPP変異体はKPPに約50%から約99%の範囲で配列同一性を有し得る。また、種々の実施様態で60%、70%、75%、80%、85%、90%,および95%の配列同一性を有することができる。
【０２１９】
或る実施態様でKPPへの特異結合スクリーニングで同定された化合物は、KPPの天然リガンドに密接に関連する場合があり、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである(Coligan, J.E.他(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):5章)。別の実施様態では、こうして同定した化合物は、受容体KPPの天然リガンドであり得る(Howard, A.D. 他.(2001) Trends Pharmacol.Sci.22:132-140、 Wise, A. 他(2002) Drug Discovery Today 7:235-246)。
【０２２０】
別の実施態様でKPPへの特異結合スクリーニングで同定した化合物は、KPPが結合する天然受容体に、或いは少なくとも該受容体の或る断片に、または例えばリガンド結合部位や結合ポケットの全体または一部を含む該受容体の或る断片に、密接に関連し得る。例えば該化合物は、シグナルを伝播可能なKPP受容体の場合や、シグナルを伝播できないKPPおとり受容体の場合がある(Ashkenazi, A.およびV.M. Divit (1999) Curr. Opin. Cell Biol.11:255-260、Mantovani, A. 他(2001) Trends Immunol. 22:328-336)。該化合物は既知の技術を用いて合理的に設計できる。こうした技術の例としては、化合物エタネルセプト（etanercept）(ENBREL; Amgen Inc., Thousand Oaks CA)作製に用いた技術を含む。エタネルセプトは、ヒトのリウマチ様関節炎の治療に有効である。エタネルセプトは遺伝子操作されたp75腫瘍壊死因子(TNF)受容体ダイマーであり、ヒトIgG1 のFc部分に連結されている(Taylor, P.C. 他(2001) Curr. Opin. Immunol. 13:611-616)。
【０２２１】
ある実施態様においては、類似した、あるいは異なる特異性を持つ2つ以上の抗体を、KPP、KPPの断片またはKPPの変異体への結合についてスクリーニングすることができる。こうしてスクリーニングした抗体の結合特異性を選択し、KPPの特定の断片または変異体を同定できる。１つの実施態様で、KPPの特定の断片または変異体を優先的に同定できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。別の実施態様で、KPP産生の増加、低下、或いは異常を有する特定の疾患または病状を優先的に診断できる結合特異性を持つ抗体を選択できる。
【０２２２】
１つの実施態様で、anticalinを、KPPまたはその断片あるいは変異体への特異結合につきスクリーニングできる。anticalinはリポカリン足場に基づいて作成されたリガンド結合タンパク質である(Weiss, G.A. 及び H.B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184、Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。リポカリン類のタンパク構造には８本鎖逆平行βストランドを持つ或るβバレルを含むことがあり、このバレルはその開放端で4つのループを支持する。これらのループはリポカリンの天然リガンド結合部位を形成し、この部位はin vitro でアミノ酸置換によって再度人工操作して、新規な結合特異性を与えることができる。このアミノ酸置換は当分野で既知の方法または本明細書に記載の方法を用いて行うことができる。また、保存的置換(例えば、結合特異性を変えないような置換)、あるいは、結合特異性を少し、中等度、または大きく変えるような置換を行うこともできる。
【０２２３】
一実施態様では、KPPに特異的に結合、刺激、あるいは阻害する化合物のスクリーニングには、分泌タンパク質として、あるいは細胞膜上でKPPを発現する、好適な細胞群の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞が含まれる。次に、KPP を発現する細胞、またはKPP を含有する細胞膜断片を試験化合物と接触させて、結合や、KPP または該化合物の何れかの結合、刺激または活性の阻害を分析する。
【０２２４】
或るアッセイでは単に試験化合物がポリペプチドに結合するのを試験でき、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体または他の検出可能な標識により検出する。例えば、このアッセイは、少なくとも1つの試験化合物を、溶液中のあるいは固体支持物に固定されたKPPと混合させるステップと、KPPとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法で該アッセイは、標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出または測定を行うことができる。更にこのアッセイは、無細胞再構成標本、化学ライブラリ、または、天然物の混合物を用いて実施でき、試験化合物（群）は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定する。
【０２２５】
アッセイを用いて、或る化合物が、その天然リガンドに結合する能力、および/または、その天然リガンドの、その天然受容体への結合を阻害する能力を評価しうる。こうしたアッセイの例としては、米国特許第5,914,236号および第6,372,724号に記載されたような放射ラベルアッセイを含む。関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(受容体など)に導入され、その天然リガンドに結合する能力を向上または改変しうる(Matthews, D.J. および J.A. Wells. (1994) Chem. Biol. 1:25-30)。別の関連した実施態様では、1つ以上のアミノ酸置換が或るポリペプチド化合物(リガンドなど)に導入され、その天然受容体に結合する能力を向上または改変しうる(Cunningham, B.C.およびJ.A. Wells (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3407-3411; Lowman, H.B.他(1991) J. Biol. Chem. 266:10982-10988)。
【０２２６】
KPPまたはその断片、あるいはKPPの変異体を用いて、KPPの活性を変調する化合物をスクリーニングすることができる。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。ある実施態様では、KPP活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をKPPと混合し、試験化合物の存在下でのKPPの活性を試験化合物不在下でのKPPの活性と比較する。試験化合物の存在下でのKPPの活性の変化は、KPPの活性を調整する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物をKPPの活性に適した条件下でKPPを含むin vitroすなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、KPPの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２２７】
別の実施態様では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組み換えを用いて動物モデル系内で、KPPまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である(例えば米国特許第5,175,383号および第5,767,337号を参照)。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo: Capecchi, M.R.(1989)Science 244:1288-1292)などのマーカー遺伝子で破壊した、当該の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする(Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002、Wagner, K.U.他(1997) Nucleic Acids Res.25:4323-4330）。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的移植し、得られるキメラ子孫の遺伝子型を決定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒物で検査されうる。
【０２２８】
KPPをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他(1998) Science 282:1145-1147）。
【０２２９】
KPPをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、KPPをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばKPPを乳汁内に分泌するなどKPPを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２３０】
（治療）
KPPのある領域とキナーゼおよびホスファターゼの領域との間に、例えば配列およびモチーフの内容における化学的および構造的類似性が存在する。さらに、KPPを発現する組織の例が、表６および実施例11に見つけられる。したがって、KPPは心臓血管系疾患、免疫系疾患、神経疾患、成長および発達に影響する疾患、脂質障害、細胞の異常増殖および癌に関与すると考えられる。KPPの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、KPPの発現または活性を低下させることが望ましい。また、KPPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、KPPの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０２３１】
従って、一実施例において、KPPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にKPPまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患には心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、冠動脈バイパス移植、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱及びリウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血および肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎およびマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞タンパク症、肺腫瘍、炎症性および非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、および肺移植の合併症などが含まれる。免疫系疾患の中には、後天性免疫不全症候群（AIDS）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、神経障害として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静��炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病およびゲルストマン‐シュトロイスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、精神遅滞、ダウン症候群を含むその他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害および統合失調症（精神分裂病）を含む精神障害と、季節性感情障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症、家族性前頭側頭痴呆が含まれ、成長および発達に影響を及ぼす疾患の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、脂質異常の中には、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、GM２ガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、リポイドネフローゼ、微小変化型ネフローゼ症候群、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、肥満症があり、また細胞増殖異常として、日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症があり、また癌として腺癌及び白血病、リン��腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌等の癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌、多発性骨髄腫などの白血病、ホジキン病などのリンパ腫が含まれる。
【０２３２】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むKPPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、KPPまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０２３３】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、KPPの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたKPPを有する組成物を、好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与し得る。
【０２３４】
更に別の実施例では、KPPの活性を調節するアゴニストを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むKPPの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２３５】
更なる実施例では、KPPの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にKPPのアンタゴニストを投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した心血管系疾患、免疫系疾患、神経疾患、発生または発達障害、脂質障害、細胞増殖異常および癌が含まれる。一実施態様では、KPPと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはKPPを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的化機構、或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０２３６】
別の実施例では、KPPをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むKPPの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２３７】
別の実施態様では、任意のタンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、相補配列、またはベクター実施態様を、別の適切な治療薬と組合せて投与できる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組合せることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で治療効力を得ることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２３８】
KPPのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造し得る。詳しくは、精製されたKPPを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてKPPと特異的に結合する薬の同定が可能である。KPPの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。一実施態様では、中和抗体(すなわち、二量体形成を阻害する抗体)は治療的に使用され得る。一本鎖抗体（例えばラクダまたはラマに由来する）は強力な酵素インヒビターであり得る。またペプチド擬態物質の設計及び免疫吸着剤とバイオセンサーの開発に用途を有し得る(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２３９】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、KPPまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)およびコリネバクテリウム‐パルバム(Corynebacterium parvum)が特に好ましい。
【０２４０】
KPPに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約5個のアミノ酸からなる、一般的には約10個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが好ましい。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片はまた、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と実質的に同一であることが望ましい。KPPアミノ酸類の短いストレッチ群は、KLHなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０２４１】
KPPに対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある(Kohler, G.他(1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D.他(1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R.J.他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030;  Cole, S.P.他(1984) Mol.Cell Biol. 62:109-120)。
【０２４２】
更に、「キメラ抗体」作製のために開発された技術、例えば、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るために用いられる(Morrison, S.L. 他(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855、Neuberger, M.S. 他 (1984) Nature 312:604-608; Takeda, S.他(1985) Nature 314:452-454)。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、KPP特異性一本鎖抗体を生成する。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137）。
【０２４３】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る(Orlandi, R. 他(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837; Winter, G.他(1991) Nature 349:293-299)。
【０２４４】
KPPのための特異結合部位を有する抗体断片を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF（ab'）2 断片と、F（ab'）2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる(Huse, W.D.他(1989) Science 246:1275-1281）。
【０２４５】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このような免疫測定法には、KPPとその特異抗体との間の複合体の計測が含まれる。二つの非干渉性KPPエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２４６】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、KPPに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表す。Kaの定義は、平衡状態下の、KPP抗体複合体のモル濃度を、遊離抗体と遊離抗原とのモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なKPPエピトープに対して親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したＫａは、KPPに対する抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のKPP エピトープに単一特異的なモノクローナル抗体試薬のKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が10９〜10１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、KPP抗体複合体が過酷な処理に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が１０６〜１０７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体医薬は、KPPが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２４７】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような製剤の品質および適合性を決定することができる。例えば、少なくとも1〜2ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは5〜10ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を持つポリクローナル抗体試薬は一般に、KPP抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、および結合力の評価手順、並びに、様々な適用例における抗体の品質と使用に対する指針については、一般に入手可能である(Catty, 前出; Coligan他、前出)。
【０２４８】
本発明の別の実施様態では、KPPをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施態様では、KPPをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、KPPをコードする配列の制御領域、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である（Agrawal, S., 編集 (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ 等を参照）。
【０２４９】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る(Slater, J.E.他(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102:469-475、Scanlon, K.J.他(1995) 9:1288-1296)。アンチセンス配列はまた、細胞内に、ウイルスベクター例えばレトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスのベクターを用いて導入しうる(Miller, A.D. (1990) Blood 76:271; Ausubel他、前出; Uckert, W.およびW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63:323-347)。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Boado, R.J.他(1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C.他(1997) Nucleic Acids Res. 25:2730-2736)。
【０２５０】
本発明の別の実施態様では、KPPをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療により、（i）遺伝子欠損症を治療し（例えばＸ染色体連鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M.他(2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫不全(SCID)-X1病の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫不全症候群（Blaese, R.M. 他(1995) Science 270:475-480; Bordignon, C.他(1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J.他(1993) Cell 75:207-216; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:643-666; Crystal, R.G.他(1995) Hum.Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症や、第８因子若しくは第９因子欠損に起因する血友病（Crystal, R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. および N. Somia (1997) Nature 389:239-242）、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば無秩序な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生体、例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poeschla, E.他(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicansおよびParacoccidioides brasiliensis等の寄生真菌、並びに熱帯熱マラリア原虫およびクルーズトリパノソーマ等の寄生原虫に対する保護作用を与えるタンパク質を発現できる。KPPの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からKPPを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２５１】
本発明の更なる実施例では、KPPの欠損による疾患や異常症を、KPPをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってKPP欠損細胞に導入することによって治療する。in vivoあるいはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、(i)個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、(ii)遺伝子銃、(iii)リポソームを介した形質移入、(iv)受容体を介した遺伝子導入、および(v)DNAトランスポゾンの使用がある(Morgan, R.A.およびW.F. Anderson(1993)Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z.(1997)Cell 91:501-510、Boulay, J-L.およびH. Recipon(1998)Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450)。
【０２５２】
KPPの発現に有効であり得る発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV(Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。KPPを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M.及びH. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551、Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769、Rossi, F.M.V.及びH.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V及びH.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するKPPをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２５３】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者は実験の各パラメータを最適化する努力をさほど要さず、ポリヌクレオチド群を、培養中の標的細胞群に送達し得る。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L. および A.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, E. 他(1982) EMBO J. 1:841845)を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、これら標準化された哺乳類形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０２５４】
本発明の別の実施例では、KPPの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でKPPをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性エレメント（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFBおよびPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他（1995）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737）に基づく。上記データは参照により開示に含まれる。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖される。VPCLは、各標的細胞上の受容体への向性を持つエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他(1987) J. Virol. 61:1647-1650; Bender, M.A.他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646; Adam, M.A. および A.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806; Dull, T.他(1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferey, R.他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の繁殖や、細胞集団（例えばCD4+Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ranga, U.他(1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G.他 (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U.他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290)。
【０２５５】
或る実施様態では、アデノウイルス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、KPPの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞群に、KPPをコードするポリヌクレオチド群を送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他(1995) Transplantation 27:263-268)。使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクター類については、Antinozzi, P.A. 他(1999; Annu. Rev. Nutr. 19:511-544)並びにVerma, I.M.およびN. Somia (1997; Nature 18:389:239-242)を参照されたい。
【０２５６】
別の実施様態では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、KPPの発現に関して１以上の遺伝子異常を持つ標的細胞に、KPPをコードするポリヌクレオチド類を送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターの利用は、HSVが親和向性を持つ中枢神経細胞にKPPを導入する際に特に有用たり得る。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）１型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他(1999) Exp.Eye Res.169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus strains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92の使用についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクター類については、Goins, W.F. 他(1999; J. Virol. 73:519-532)および Xu, H.他(1994; Dev. Biol. 163:152-161)。クローン化したヘルペスウイルス配列群の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを持つ複数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長および増殖、並びに細胞群へのヘルペスウイルスの感染は、当業者に公知の技術である。
【０２５７】
別の実施様態では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてKPPをコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（Semliki Forest Virus, SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクター類はSFVゲノムに基づく（Garoff, H. 及び K.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが産生される。このサブゲノムRNAは完全長ゲノムRNAよりも高レベルに複製するので、酵素活性（例えばプロテアーゼおよびポリメラーゼ）を持つウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質群が過剰産生される。同様に、KPPのコード配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することによって、ベクター導入細胞において多数のKPPをコードするRNAが産生され、高レベルでKPPが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他(1997) Virology 228:74-83)。αウイルスの宿主域は広いので、様々なタイプの細胞にKPPを導入できることとなる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの操作方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２５８】
転写開始部位（transcription initiation site）由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。この位置は、例えばスタート部位(start site)から数えて約−１０と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または制御分子と結合できるように十分に開こうとする、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重鎖DNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある(Gee, J.E.他(1994) in Huber, B.E. および B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページ）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を妨害するように設計することができる。
【０２５９】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用の機序は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後に起こるヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、KPPをコードするRNA分子の内ヌクレオチド鎖分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２６０】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を持つ標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いRNA配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへの到達性をテストすることによって行い得る。
【０２６１】
相補リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子合成のための当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、RNA分子は、KPPをコードするDNA分子のin vitro及びin vivo転写によって産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。あるいは、相補的RNAを構成的あるいは誘導的に合成するこれらのcDNA構築物を、細胞株、細胞または組織内に導入できる。
【０２６２】
細胞内の安定性を高め半減期を延ばすためRNA分子を修飾し得る。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2' O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、本来はPNA群の産出におけるものであるが、これら全ての分子に拡張できる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−および同様の修飾型や、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を含める。
【０２６３】
本発明の別の実施様態では、本発明の１つ以上の選択されたポリヌクレオチドの発現を、当分野で知られているRNA干渉(RNAi)または転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)方法を用いて変更、阻害、低下、または抑制し得る。RNAiは、遺伝子サイレンシングの転写後モードであり、標的細胞に導入された二本鎖ＲＮＡ(dsRNA)が相同遺伝子（例えば、dsRNAに相補的な配列を有する遺伝子）の発現を特異的に抑制する。これは効果的に標的遺伝子の発現をノックアウトするか、実質的に低下させる。PTGSはまた、DNAあるいはDNA断片の使用によっても達成され得る。RNAiの方法はFire, A. 他.(1998; Nature 391:806-811)およびGura, T. (2000; Nature 404:804-808)によって記述されている。PTGSを開始するにはまた、選択した組織にDNAの相補セグメントを導入して行うことができ、これには本願記載の、または当該分野で既知の、遺伝子送達および/またはウイルスベクター送達法を用いる。
【０２６４】
RNAiを哺乳類細胞内で誘導するには、低分子干渉(small interfering)RNA、略称siRNAの利用で可能となる。siRNAはdsRNAの短いセグメント(通常、約21〜23ヌクレオチド長)であり、in vivo で、導入したdsRNAが内因性リボヌクレアーゼの作用で切断されて生じる。siRNAは、哺乳類でのRNAi効果のメディエータであると思われる。最も有効なsiRNAは、21ヌクレオチドdsRNAで2ヌクレオチドの3'オーバーハングを持つRNAのようである。哺乳動物細胞へのRNAiの導入のためのsiRNAの利用は、Elbashir, S.M. 他. (2001; Nature 411:494-498)に記述されている。
【０２６５】
siRNAを産生するには、間接的ににdsRNAを標的細胞に導入するか、直接的に、本願記載または当該分野で既知の哺乳類トランスフェクション法および媒介物(例えば、リポソームを介したトランスフェクション、ウイルスベクター法、または他のポリヌクレオチド送達/導入法)で可能である。好適なsiRNAを選ぶには、AUG開始コドンから下流のヌクレオチド配列群について標的ポリヌクレオチドの転写物(例えばmRNA)を検討し、各ヌクレオチドと3'側の隣接する19〜23ヌクレオチドの出現を潜在的siRNA標的部位として記録して可能であり、21ヌクレオチド長を持つ配列が好ましい。標的siRNA部位として避けるべき領域としては、5'と3'の非翻訳領域(UTR)、および開始コドンに近い領域(75塩基以内)があり、理由は、これらは調節タンパク質結合部位が、より豊富なためである。UTR結合タンパクおよび/または翻訳開始複合体は、siRNPエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉しうる。siRNAのために選択した標的部位は次に、適切なゲノムデータベース(例えばヒト等のもの)と比較でき、これにはBLASTまたは他の、当該分野で既知の配列比較アルゴリズムを用いる。標的配列の内、他のコード配列への有意な相同性を持つ配列は、考慮から除外できる。選択したsiRNAを産生するには、当該分野で既知の化学合成法で、またはin vitro転写に市販の方法とキット、例えばSILENCER siRNA作製キット(Ambion, Austin TX)を用いて可能である。
【０２６６】
別の実施態様で、長期の遺伝子サイレンシングおよび/またはRNAi効果を、選択した組織で誘導でき、これにはsiRNAを持続的に発現する発現ベクターを用いる。これは、当分野で既知の方法を用いてヘアピンRNA(shRNA)を発現するよう遺伝子操作された発現ベクターを用いて達成される(Brummelkamp, T.R. 他. (2002) Science 296:550-553、Paddison, P.J. 他. (2002) Genes Dev. 2(10):1296306)。これら及び関連の実施態様でshRNAを標的細胞に送達するには、当該分野で既知の発現ベクターを用い得る。siRNAの送達に好適な発現ベクターの一例はPSILENCER1.0-U6 (circular)プラスミド(Ambion)である。標的組織に送達されると、shRNAはin vivo でプロセスされてsiRNA様分子となり、これは遺伝子特異的サイレンシングを行える。
【０２６７】
種々の実施態様で、RNAiまたはPTGS法が標的にする遺伝子の発現レベルの判定は、mRNAおよび/またはタンパク質解析用のアッセイで行える。或る標的遺伝子のmRNAの発現レベル判定は、ノーザン解析法に例えばNORTHERNMAX-GLYキット(Ambion)を用いて、またマイクロアレイ法で、PCR法で、リアルタイムPCR法で、また他の、当該分野で既知または本願記載のRNA/ポリヌクレオチドアッセイで行える。標的遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの判定は、ウェスタン解析に当該分野で既知の標準技術を用いて行える。
【０２６８】
本発明の更なる実施例は、KPPをコードするポリヌクレオチドの発現の変化に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効であり得る化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチドや、転写因子などのポリペプチド転写制御因子、および、特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学物質がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはプロモーターのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、KPPの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、KPPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、KPPの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、KPPをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２６９】
種々の実施態様で、或る特定ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性について、１つ以上の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物を得るには、当分野で公知の任意の方法を用い得る。取得方法としては、以下の場合に有効な既知化合物の化学修飾がある。ポリヌクレオチドの発現を改変する場合と、既存の、市販のまたは私的な、天然または非天然の化学物質のライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的および／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化学物質のライブラリから選択する場合とである。KPPをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルは例えば、無傷細胞、透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。KPPをコードするポリヌクレオチドの発現における変化は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常、KPPをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量することにより、１つ以上の試験化合物に曝露される、または曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較のための基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示す。或る特定ポリヌクレオチドの改変発現に有効な化合物のためのスクリーニングを実行でき、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他(1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他(2000) Nucleic Acids Res.28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞株（Clarke, M.L. 他(2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いて行い得る。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）のコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他(1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W.他(2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２７０】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリポソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（Goldman, C.K.他(1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466）。
【０２７１】
上記の治療方法はどれも例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含め、そうした治療が必要な任意の被験体に適用できる。
【０２７２】
本発明の或る更なる実施態様は、薬剤的に許容される或る賦形剤と共に処方される或る活性成分を一般に有する、或る組成物の投与に関する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、KPP、KPPの抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはKPPのインヒビターなどからなる。
【０２７３】
種々の実施態様で、本願に記載の組成物たとえば医薬組成物は、任意の数の経路によって投与でき、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸法がある。
【０２７４】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチドおよびタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近発達したことにより、インスリンなどの薬物を実用的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号などを参照）。肺送達は、針注射なしに投与でき、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２７５】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２７６】
KPPまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な形態に組成物が調製されるのが好ましい。例えば、細胞不透過性高分子を有するリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、KPPまたはその断片をHIV Tat-1タンパク質からの短い陽イオン性N末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他(1999) Science 285:1569-1572）。
【０２７７】
任意の化合物に対して、先ず細胞培養アッセイ例えば新生物細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは動物モデル例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、治療有効用量を推定できる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２７８】
治療有効量は、症状や容態を回復させる活性成分の量、たとえばKPPまたはその断片、KPPの抗体、KPPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの量を指す。治療有効性及び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の５０％の治療有効量）またはLD50（集団の５０％の致死量）の統計を計算するなどして決定することができる。毒性効果の、治療効果に対する用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイと動物実験とから得られたデータは、ヒトに用いる投与量の範囲の策定に用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性および投与の経路によってこの範囲内で変わる。
【０２７９】
正確な投与量は、治療が必要な被検者に関する要素を考慮して、実務医が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被検者に関する要素としては、病態の重症度、被検者の全身健康状態、患者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮しうる。長時間作用性の組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度によって３〜４日毎に１度、毎週、或いは隔週の間隔で投与し得る。
【０２８０】
通常の投与量は、投与経路にもよるが約0.1〜100,000μgで、合計で約1gまでとする。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、当該分野の実務医は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２８１】
（診断）
別の実施例では、KPPに特異的に結合する抗体が、KPPの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはKPPやKPPのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で作成される。KPPの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからKPPを検出する方法が含まれる。この抗体は、修飾して、または修飾せずに使用される。また、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２８２】
KPPを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が本技術分野において知られており、KPP発現の修正レベル或いは異常レベルを診断する基準を提供する。正常或いは標準的なKPPの発現の値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞とKPPに対する抗体とを混合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験体、対照、および、生検組織からの疾患サンプルでの、KPP発現の量を標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２８３】
本発明の別の実施態様では、KPPをコードするポリヌクレオチドを、診断目的で用い得る。用い得るポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド、相補的RNAおよびDNA分子、そしてPNAが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、KPPの発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、KPPの存在の有無、更には過剰な発現を判定し、治療時のKPPレベルの調節を監視し得る。
【０２８４】
一実施形態では、例えばKPPをコードまたは近縁の分子群をコードするゲノム配列群など、ポリヌクレオチドを検出できるPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いて、KPPをコードする核酸配列群を同定できる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いは特異性のやや低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性、およびハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーによって、そのプローブが、KPP、対立遺伝子、または関連配列をコードする自然界の配列のみを同定するかどうかが決まるであろう。
【０２８５】
プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はKPPをコードする任意の配列と少なくとも50％の相同性を有し得る。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:53104の配列、或いはKPP遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２８６】
KPPをコードするポリヌクレオチドに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを作製する方法には、KPPまたはKPP誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を、mRNAプローブを作製するためのベクターにクローニングする方法が含まれる。ｍＲＮＡプローブ作製のためのベクターは当該分野で既知であり、市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼ及び適切な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター基によって標識され得る。レポーター基の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２８７】
KPPをコードするポリヌクレオチドは、KPPの発現に関係する疾患の診断の為に用い得る。限定するものではないが、このような疾患には心血管障害も含まれ、その中には動静脈瘻、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脈管炎、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、静脈瘤、血栓静脈炎および静脈血栓、血管系腫瘍、血栓溶解の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、冠動脈バイパス移植、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性２尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱及びリウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性紅斑性狼瘡の心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、心臓移植の合併症、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血および肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎およびマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏性肺炎、肺好酸球増加、閉塞性細気管支炎―器質化肺炎（bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、膠原血管病併発性肺疾患、肺胞タンパク症、肺腫瘍、炎症性および非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、および肺移植の合併症などが含まれる。免疫系疾患の中には、後天性免疫不全症候群（AIDS）及びアジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ性外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、胎児赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、神経障害として、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病その他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化その他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症その他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー、クロ��ツフェルト‐ヤコブ病およびゲルストマン‐シュトロイスラー‐シャインカー症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系の栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜性血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、精神遅滞、ダウン症候群を含むその他の中枢神経系発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィーその他の神経筋疾患、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分障害、不安障害および統合失調症（精神分裂病）を含む精神障害と、季節性感情障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、皮質基底核変性症、家族性前頭側頭痴呆が含まれ、成長および発達に影響を及ぼす疾患の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群(Smith- Magenis syndrome)、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病(Syndenham's chorea)及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失が含まれ、脂質異常の中には、脂肪肝、胆汁うっ滞、原発性胆汁性肝硬変、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ欠乏症、ミオアデニレートデミナーゼ欠乏症、高トリグリセリド血症、ファブリー病などの脂質貯蔵病、ゴーシェ病、ニーマン‐ピック病、変染色性白質ジストロフィー、副腎性白質ジストロフィー、GM２ガングリオシドーシス、セロイドリポフスチン症、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、リポ蛋白過剰血症、糖尿病、脂肪異栄養症、脂肪腫症、急性皮下脂肪組織炎、播種性脂肪組織壊死症、有痛脂肪症、リポイド副腎過形成、リポイドネフローゼ、微小変化型ネフローゼ症候群、脂肪腫、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症を伴った高コレステロール血症、原発性低αリポ蛋白血症、甲状腺症機能低下症、腎臟病、肝疾患、レシチン-コレステロールアシルトランスフェラーゼ欠乏症、脳腱黄色腫症、シトステロール血症、低コレステロール血症、テイ‐サックス病、サンドホフ病、高脂血症、脂肪過剰血症、脂質筋障害、肥満症があり、また細胞増殖異常として、日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症があり、また癌として腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌等の癌、具体的には、副腎、膀胱、��、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌、多発性骨髄腫などの白血病、ホジキン病などのリンパ腫が含まれる。KPPをコードするポリヌクレオチドは、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、および、変容したKPP発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２８８】
或る特定の実施態様では、KPPをコードするポリヌクレオチド群を、関連する障害、特に上記した障害を検出するアッセイ類に用い得る。KPPをコードする配列に相補的なポリヌクレオチドを、標準的な方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が対照サンプルに比較して著しく変化している場合は、そのサンプル内のKPPをコードするポリヌクレオチド群のレベル変化の存在により、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２８９】
KPPの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロファイルが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、KPPをコードする配列或いはその断片とを混合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被検体から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２９０】
障害の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。経時的なアッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２９１】
癌に関しては、個体からの生検組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防処置または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２９２】
KPPをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの、更なる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはKPPをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはKPPをコードするポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適化された条件下で特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNAあるいはRNA配列の検出、定量、あるいはその両方のため用いることが可能である。
【０２９３】
或る特定態様で、KPPをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用い一塩基多型(SNP)を検出し得る。SNPは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定はされないがSNPの検出法は、SSCP（single-stranded conformation polymorphism:一本鎖高次構造多型）と蛍光SSCP（fSSCP）がある。SSCPでは、KPPをコードするポリヌクレオチド群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類とポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）を用いDNAを増幅する。このDNAは例えば、患部組織または正常組織、生検サンプル、体液などに由来し得る。ＤＮＡ内のＳＮＰは、一本鎖形状のＰＣＲ生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSSCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってＤＮＡシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、共通のコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片群の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、または統計モデルとDNA配列クロマトグラムの自動分析とを用いたシークエンシングのエラーに起因する配列変異を、フィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２９４】
SNPを利用して、ヒト疾患の遺伝的基礎を研究しうる。例えば少なくとも16種の一般的SNPが、インスリン非依存型糖尿病と関連している。SNPはまた、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、慢性肉芽腫症等の単一遺伝子病の転帰の違いを研究するために有用である。例えば、マンノース結合レクチンであるMBL2における変異体群は、嚢胞性線維症における有害な肺の転帰との相関が示されている。SNPはまた、薬理ゲノム学においても有用性を持つ。薬理ゲノム学は、患者の薬物への応答（例えば命を脅かす毒性）に影響する遺伝的変異体の同定を行う。例えばNアセチル転移酵素における或る変異は、抗結核薬であるイソニアジドに応答しての末梢ニューロパシーの高い発症率と関連する。一方、ALOX5遺伝子のコアプロモータにおける或る変異の結果、5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする或る抗喘息薬での治療に対する臨床応答が低下する。異なる集団群におけるSNPの分布の分析は、遺伝的浮動、突然変異、遺伝子組換え、遺伝子選択の調査に有用であり、集団の起源とその移動との追跡にも有用である(Taylor, J.G.他(2001) Trends Mol. Med. 7:507-512、Kwok, P.-Y.およびZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543、Nowotny, P. 他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０２９５】
KPPの発現を定量するために用い得る別の方法の例としては、ヌクレオチド群の放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および、標準曲線から得た結果の補間もある(Melby, P.C 他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235-244、Duplaa, C.他(1993) Anal. Biochem. 212:229-236)。当該のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈度で存在し、分光応答または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数サンプルの定量速度を加速できる。
【０２９６】
更に別の実施態様では、本願に記載した任意のポリヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の相対発現レベルを同時にモニターする転写イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／退行をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロファイルを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロファイルに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用の最も少ない治療薬を選択することができる。
【０２９７】
別の実施態様では、KPP、KPPの断片または、KPPに特異的な抗体類を、或るマイクロアレイ上のエレメントとして用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質間相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定できる。
【０２９８】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる、遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号 「Comparative Gene Transcript Analysis」は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを持つような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供するであろう。
【０２９９】
転写イメージは、組織、細胞株、生検、または他の生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０３００】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロファイルを作製する転写イメージはまた、in vitroモデル系および医薬品の前臨床評価に、あるいは工業的または天然の環境化合物の毒性試験に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他(1999) Mol. Carcinog. 24:153-159; Steiner, S.およびN.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471)。試験化合物が、既知の毒性を有する化合物のシグネチャと同様のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ精緻である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子も重要である。ノーマライズ手順は、種々の化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。或る毒性シグネチャのエレメント群に遺伝子機能を割り当てることは毒性機序の解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャ群の統計的マッチングには、遺伝子機能の知識は必要でない(例えばNational Institute of Environmental Health SciencesのPress Release 00-02、2000年2月29日, http://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htm参照)。したがって、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは、重要且つ望ましい。
【０３０１】
或る実施態様では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定しうる。処理した生体サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ以上のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生体サンプル中の転写レベルを、無処理生体サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０３０２】
別の実施態様は、本発明で開示するポリペプチド群を用いた、或る組織または細胞タイプのプロテオームの分析に関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析にかけることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析する。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施態様では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により、分離が達成される（前出SteinerおよびAnderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生体サンプルからの、同等に位置したタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、当該のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
プロテオームのプロファイルは、KPPに特異的な抗体を用いてKPP発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111、Mendoze, L.G.他(1999) Biotechniques 27:778-788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３０３】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。いくつかの組織のいくつかのタンパク質については、転写物の存在量とタンパク質の存在量との相関が乏しいので（Anderson, N.L. および J. Seilhamer（1997）Electrophoresis 18:533-537）、転写イメージにはそれ程影響しないがプロテオームのプロファイルを改変するような化合物の分析において、プロテオーム毒性シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼でき、情報価値があり得る。
【０３０４】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３０５】
別の実施態様では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、未処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質の量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を標示する。
【０３０６】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法で調製、使用し、分析し得る（Brennan, T.M. 他（1995）米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他（1995）PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他（1995）PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155; Heller, M.J.他(1997) 米国特許第5,605,662号）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、Schena, M 編集(1999; DNA Microarrays:A Practical Approach, Oxford University Press, London)。
【０３０７】
本発明の別の実施態様ではまた、KPPをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列より非コード配列の方が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。核酸配列は、特定の染色体、染色体の特定領域または人工染色体構成、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1構成、或いは単一染色体cDNAライブラリに対してマッピングされる(Harrington, J.J.他(1997) Nat. Genet. 15:345-355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149-154)。一度マッピングすると、核酸配列群を用いて、例えば或る病状の遺伝を特定染色体領域の遺伝とまたは制限酵素断片長多型(RFLP)と相関させるような遺伝子連鎖地図を開発し得る(Lander, E.S.およびD. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357)。
【０３０８】
蛍光切片上ハイブリッド形成(FISH)は、他の物理地図および遺伝地図データと相関し得る(Heinz-Ulrich他(1995) in Meyers前出965-968ページ）。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見られる。物理的な染色体地図上のKPPをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、ポジショナルクローニングの作業を促進し得る。
【０３０９】
確定した染色体マーカー類を用いた連鎖解析などの物理的マッピング技術、および染色体標本の切片上ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳類の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、ポジショナルクローニングなどの遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探る研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域へ遺伝連鎖によって大まかに限局されると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは制御遺伝子を提示している可能性がある(Gatti, R.A.他(1988) Nature 336:577-580)。転座、反転などに起因する、健常者、保因者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
本発明の別の実施例では、KPP、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。薬物スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持体に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。KPPと、検査される薬剤との結合による複合体の形成を測定しうる。
【０３１０】
別の薬物スクリーニング技術は、当該のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen他（1984）PCT出願WO84/03564）。この方法においては、多数の様々な低分子の試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、KPP、或いはその断片と反応してから洗浄される。次に、本技術分野でよく知られている方法で、結合したKPPを検出する。精製したKPPはまた、上記した薬剤のスクリーニング技術において用いるプレート上で直接コーティングすることもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持体に固定することもできる。
【０３１１】
別の実施例では、KPPと結合可能な中和抗体がKPPと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。このようにして、KPPと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在をも、抗体を使って検出できる。
【０３１２】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にKPPをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０３１３】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３１４】
本明細書において開示した全ての特許、特許出願及び刊行物、特に米国特許第60/345,474号、第60/343,910号、第60/333,098号、第60/332,424号及び第60/334,288号は、言及することをもって本明細書の一部となす。
【実施例】
【０３１５】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネートに溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Invitrogen）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの一相溶液である。結果として得た溶解物は、塩化セシウムのクッション液の上に重層して遠心分離するか、クロロフォルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、あるいは別の慣例的方法で、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０３１６】
RNAの純度を高めるため、フェノールによるRNAの抽出および沈殿を、必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd（T）連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ（A）+RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY（A）PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて、組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３１７】
場合によってはStratagene社にRNAを提供し、同社が、対応するcDNAライブラリ群を作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Invitrogen）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出Ausubel他、5章）。逆転写は、オリゴd（T）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結し、好適な制限酵素または酵素群でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対しcDNAのサイズ選択（300〜1000bp）には、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィ（Amersham Biosciences）、あるいは分取用アガロースゲル電気泳動法を用いた。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの、適合する制限酵素部位にライゲーションした。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1プラスミド（Invitrogen）PCDNA2.1プラスミド（Invitrogen）、PBK-CMVプラスミド（Stratagene）、PCR2−TOPOTAプラスミド（Invitrogen）、PCMV-ICISプラスミド（Stratagene）、pIGEN（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、pRARE(Incyte Genomics)、またはplNCY（Incyte Genomics）、またはこれらの誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、あるいはInvitrogen社のDH5α、DH10BまたはElectroMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３１８】
2cDNAクローンの単離
実施例１のようにして得たプラスミドの、宿主細胞からの回収は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０３１９】
別法ではハイスループットフォーマットで直接結合PCRを用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した(Rao, V.B.(1994)Anal. Biochem. 216:1-14)。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルをプロセスして384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）およびFLUOROSKAN II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３２０】
3  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミド中に回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。シークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）を、HYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Biosciences社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離と、標識したポリヌクレオチドの検出とには、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Amersham Biosciences）か、標準ABIプロトコルとベースコーリングソフトウェアとを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、あるいはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出Ausubel他、7章）を用いて同定した。いくつかのcDNA配列を選択し、実施例８に開示する技術で配列を伸長させた。
【０３２１】
Incyte cDNAに由来のポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカーおよびポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクして検証した。その際、BLASTと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド分析(dinucleotide nearest neighbor analysis)とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。次に、Incyte cDNA配列またはそれらの翻訳の問い合わせを、以下のデータベース群に対して行った。すなわち、選抜した公共のデータベース群(例えばGenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM)と、ヒト、ラット、マウス、線虫(Caenorhabditis elegans)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)およびCandida albicansからの配列群を持つPROTEOMEデータベース群(Incyte Genomics, Palo Alto CA)、および、隠れマルコフモデル(HMM)ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、例えばPFAM、INCY、およびTIGRFAM (Haft, D.H. 他(2001) Nucleic Acids Res.29:41-43)、並びにHMMベースのタンパク質ドメインデータベースたとえばSMART(Schultz. J.他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他(2002) Nucleic Acids Res.30:242-244)である（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS、およびHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列をアセンブリし、完全長のポリヌクレオチド配列を産出した。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体群を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAのアセンブリ体を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を得た。あるいは、或るポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（MiraiBio, Alameda CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチドとポリペプチドとの配列アラインメントは、MEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組込まれたCLUSTALアルゴリズムが指定する、デフォルトパラメータを用いて作製する。これは、アラインメントした配列間の一致率も計算する。
【０３２２】
表７は、Incyte cDNAと完全長配列との分析とアセンブリとに用いたツールとプログラムとアルゴリズムとの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表７の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は好適な参照文献であり、全ての文献の全体が、この参照により開示に含まれる。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、または確率値が低いほど、２配列間の相同性が高くなる）。
【０３２３】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアセンブリ及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:53-104のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。 ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約２０〜約４０００ヌクレオチドの断片を表４の列2に示した。
【０３２４】
4  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上のキナーゼおよびホスファターゼは、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは汎用遺伝子同定プログラムであり、様々な生物からのゲノムDNA配列を分析する（Burge, C. および S. Karlin（1997）J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C. および S. Karlin（1998）Curr. Opin. Struct. Biol. 8:346-354）。このプログラムは予測されたエキソン群を連結し、メチオニンから終止コドンに及ぶ、アセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、３０kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列がキナーゼおよびホスファターゼをコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいてキナーゼおよびホスファターゼについて問合せて分析した。潜在的なキナーゼおよびホスファターゼも、キナーゼおよびホスファターゼとして注釈が付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定された。これら選択したGenscan予測配列を、次にBLAST分析により、公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNA適用範囲の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載のアセンブリプロセスを用い、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。あるいは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集後または非編集のGenscan予測コード配列に、完全に由来する。
【０３２５】
5  ｃDNA配列データを使ったゲノム配列データのアセンブリ
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列群を伸長させるため、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムが予測したエキソン群を用いた。実施例３に記載したようにアセンブリした部分cDNA群を、ゲノムDNAにマッピングし、また、関連するcDNA群と、１つ以上のゲノム配列からGenscan予測されたエキソン群とを有するクラスター群に分解した。cDNAとゲノムとの情報を統合すべく、グラフ理論および動的プログラミングに基づく或るアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、潜在的スプライス変異体群を生成した。配列群を続いて確認、編集または伸長し、完全長配列を創出した。区間の全長が、２つ以上の配列に在るような配列区間群をクラスター内で同定し、そのように同定された区間群は、推移性により、等しいと考えた。例えば、或る区間が、１つのcDNAと２つのゲノム配列とに在る場合、３つの区間は全て等しいと考えた。このプロセスにより、無関係だが連続したゲノム配列群を、cDNA配列で結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われる順にステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って続く区間間の連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）より優先した。結果として得たスティッチ配列群を翻訳し、BLAST分析で公共データベースgenpeptおよびgbpriと比較した。Genscanが予測した不正確なエキソン群は、genpeptからのトップBLASTヒットとの比較により補正した。必要な場合、追加cDNA配列群を用いるかゲノムDNAの検査により、配列群を更に伸長させた。
【０３２６】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列群を、BLAST分析に基づく１アルゴリズムで完全長まで伸長した。先ず、BLASTプログラムを用い、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物および真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載のようにアセンブリした部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。得られた高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラ蛋白質を産出し、翻訳した配列をGenBank蛋白質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体に対し、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を、相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を有するか否かを判定した。
【０３２７】
６  KPPをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:53-104をアセンブリするために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:53-104 と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続及びオーバーラップした配列のクラスターにアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethonなどの公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッドおよび遺伝地図データを用いて、いずれかのクラスター化された配列が既にマッピングされているかを判定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０３２８】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体の短腕（p-arm）の末端に対して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒトDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポットおよびコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap/）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子群が、上記した区間内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３２９】
7  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン解析は遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合している或る膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(SambrookおよびRussell 、前出、7章、Ausubel他、前出、4章)。
【０３３０】
類似の、BLASTを応用したコンピュータ技術を用いて、GenBankやLIFESEQ（Incyte Genomics）などのデータベースにおいて、同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正できる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義する。
【０３３１】
【数１】
2005518191.tif 000004
【０３３２】
積スコアは、2つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。BLASTスコアを計算するには、或る高スコアリングセグメント対（HSP）内の一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基に−４を割り当てる。２つの配列は、２以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。２以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア１００は、比較した２つの配列の短い方の長さ全体にわたって１００％一致する場合のみ得られる。積スコア７０は、一端が１００％一致し、７０％オーバーラップしているか、他端が８８％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア５０は、一端が１００％一致し、５０％オーバーラップしているか、７９％一致し、１００％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３３３】
或いは、KPPをコードするポリヌクレオチドを、由来する組織に対して分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリする(実施例３を参照)。各cDNA配列は、ヒト組織から作製されたcDNAライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎児構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー、すなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、KPPをコードするcDNAの組織特異的および疾患特異的な発現を反映する。cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０３３４】
８  ポリヌクレオチドをコードするKPPの伸長
完全長ポリヌクレオチドを、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマー群を用いて該断片を伸長させ産生する。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーは、長さが約２２〜３０ヌクレオチド、GC含有率が約５０％以上となり、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの区間は全て回避した。
【０３３５】
選択したヒトcDNAライブラリ群を用い、配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３３６】
高忠実度の増幅を当業者に周知の方法でのPCRで得た。PCRはPTC-200サーマルサイクラー(MJ Research, Inc.)での96穴プレートで行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と(NH4)2SO4と2−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)、ELONGASE酵素(Invitrogen)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：60℃で1分間、ステップ4：68℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す、ステップ6：68℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。別法では、プライマー対であるT7とSK+とに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：57℃で1分間、ステップ4：68℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す、ステップ6：68℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。
【０３３７】
各ウェルのDNA濃度は、１×TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan  II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット５〜１０μlを１％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０３３８】
伸長したヌクレオチドは、脱塩および濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化して音波処理またはせん断し、pUC 18ベクター（Amersham Biosciences）への再連結を行った。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Biosciences）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位オーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を抗生物質含有培地上で選択し、個々のコロニーを選択してLB/2x carb液体培地の３８４穴プレート内において３７℃で一晩培養した。
【０３３９】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Biosciences)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：60℃で1分間、ステップ4：72℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を29回繰り返す、ステップ6：72℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNA回収率が低いサンプルは、上記同一条件で再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（１：２,v/v）で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、およびDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Biosciences）またはABI PRISM BIGDYEターミネーターサイクルシークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンスした。
【０３４０】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチドを検証した。あるいは、完全長ポリヌクレオチドを用い、上記手順で、そのような伸長のために設計したオリゴヌクレオチド類と、或る適切なゲノムライブラリとを用いて５'調節配列を得た。
【０３４１】
９  KPPをコードするポリヌクレオチドの一塩基多型の同定
１塩基多型（SNP）として知られる一般的なDNA配列変異体が、SEQ ID NO:53-104において、LIFESEQデータベース（Incyte Genomics）を用いて同定された。同じ遺伝子からの配列群は共にクラスター化され、実施例３に述べたようにアセンブリされて、その遺伝子における全ての配列変異体の同定を可能にした。一連のフィルタからなるアルゴリズムを使って、SNPを他の配列変異体から区別した。前段フィルターは、最小限Phredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アライメントエラーや、ベクター配列、キメラおよびスプライス変異体の不適当なトリミングにより生じるエラーを取り除いた。染色体の高度解析の自動化手順により、推定SNPの近傍におけるオリジナルのクロマトグラムファイルが解析された。クローンエラーフィルタは統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼ、または体細胞突然変異によって引き起こされるエラーのような、実験処理時に導入されるエラーを識別した。クラスターエラーフィルターは、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体または偽遺伝子のクラスター化に起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションにより生じたエラーを同定した。最後のフィルター群によって、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に存在する重複(duplicates)とSNPが除去された。
【０３４２】
幾つかのSNPは、更なる特徴付けの為に選択された。選択は高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc.）を用いた質量分析によって行い、４群の異なるヒト集団におけるSNP部位での対立遺伝子頻度を分析した。白人集団は92個体（46名の男子、46名の女子）からなり、83名はユタ出身、4名はフランス人、3名はベネズエラ人、2名はアーミッシュの人々である。アフリカ集団は194個体（97名の男子、97名の女子）からなり、全員がアフリカ系アメリカ人である。ヒスパニック集団は324個体（162名の男子、162名の女子）からなり、全員がメキシコのヒスパニックである。アジア集団は126個体（64名の男子、62名の女子）からなり、報告された親の内訳は43％が中国人、31％が日本人、13％がコリアン、5％がベトナム人、8％が他のアジア人である。対立遺伝子頻度の分析は先ず白人集団においてなされ、幾つかの場合、SNPの内、対立遺伝子変異をこの集団において示さなかったSNPは、更に他の３集団においてテストされることは無かった。
【０３４３】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:53-104から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドは、OLIGO 4.06ソフトウェア(National Biosciences)等の最新ソフトウェアを用いて設計し、各オリゴマー５０pmolと、[γ-32P]アデノシン３リン酸(Amersham Biosciences)２５０μCiと、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN, Boston MA)とを化合させることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビーズカラム（Amersham Biosciences）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba IまたはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを有するアリコットを用いる。
【０３４４】
各消化物から得たDNAは、０.７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、40℃で16時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば0.1×クエン酸ナトリウム食塩水および0.5％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３４５】
11  マイクロアレイ
或るマイクロアレイ上でのアレイエレメント群の連接または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler他などを参照）、機械的マイクロスポッティング技術およびこれらから派生した技術を用いて達成し得る。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである(Schena, M., 編集 (1999) DNA Microarrays:A Practical Approach, Oxford University Press, London)。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップおよびシリコンウェハがある。あるいは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用し、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置および結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(Schena, M. 他(1995) Science 270:467-470; Shalon, D.他(1996) Genome Res.6:639-645; Marshall, A. および J. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31)。
【０３４６】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。一実施態様におけるマイクロアレイの調製および使用について、以下に詳述する。
【０３４７】
組織または細胞サンプルの調製
総RNAを組織サンプルから単離するためグアニジニウムチオシアネート法を用い、ポリ(A)+RNA精製にオリゴ(dT)セルロース法を用いる。各ポリ（A）+RNAサンプルを逆転写するため、MMLV逆転写酵素を用い、また、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、1×第一鎖バッファ、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Biosciences）を用いる。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte Genomics）を用い、200ngのポリ（A）+RNAを含有する体積25ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル（1つはCy3、もう1つはCy5標識）は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプル精製には、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（Clontech, Palo Alto CA）を用いる。混合後、２つの反応サンプルをエタノール沈殿させるため、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、60mlの酢酸ナトリウム、及び300mlの100％エタノールを用いる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて乾燥して仕上げ、１４μl ５×SSC／０.２％ SDS中で再懸濁する。
【０３４８】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサート群と、ベクター群とを含有する細菌細胞群から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートに隣接するベクター配列群に相補的なプライマー類を用いる。３０サイクルのＰＣＲによって、１〜２ngの初期量から５μgを超える最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Biosciences）を用いて精製する。
【０３４９】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、0.1％のSDSおよびアセトン中で超音波洗浄し、処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。スライドグラスは、４％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation（VWR）, West Chester PA）中でエッチングし、充分に蒸留水中で洗浄し、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドは、110℃のオーブンで硬化させる。
【０３５０】
米国特許第5,807,522号に記載されている手順を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメント群を付加する。この特許は、引用を以って本明細書の一部とする。平均濃度１００ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを、高速ロボット装置（robotic apparatus）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。該装置はここで、スライド毎に約５nlのアレイエレメントサンプルを置く。
【０３５１】
マイクロアレイに、STRATALINKER UVクロスリンク機（Stratagene）を用いてUV架橋する。マイクロアレイは、室温において０.２％SDSで１度洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。非特異結合部位をブロックするため、マイクロアレイのインキュベートをリン酸緩衝食塩水（PBS）（Tropix, Inc., Bedford MA）中に０.２％カゼイン、６０℃で３０分間行った後、前記のように０.２％SDSおよび蒸留水で洗浄する。
【０３５２】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる９μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各０.２μgを、５×SSC,０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、65℃まで５分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して1.8cm2のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チャンバーに移す。チェンバーのコーナーに140μlの5×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100％に保持する。アレイを入れたチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC,0.1％SDS）において45℃で10分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（0.1×SSC）において45℃で10分間ずつ３回洗浄して乾燥させる。
【０３５３】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体を検出するには、Ｃｙ3の励起のために４８８nm、Ｃｙ5の励起のために６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova70混合ガス10Ｗレーザー（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡を用いる。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、２０×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを有するスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる１.８cm×１.８cmのアレイは、解像度２０μmでスキャンする。
【０３５４】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は波長に基づき分割され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザー源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３５５】
通常、各スキャンの感度を較正するため、cDNA対照種を或る既知濃度でサンプル混合体に添加し、対照種が発生するシグナル強度を用いる。アレイ上の或る特定の位置には或る相補DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度をハイブリダイゼーション種の重量比1：100,000と相関させる。異なる源泉（例えば代表的な試験細胞および対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、異なる発現をする遺伝子群を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、較正するcDNAのサンプルを２種のフルオロフォアで標識し、ハイブリダイゼーション混合液に各々等量を加えることによって較正を行う。
【０３５６】
光電子増倍管の出力をディジタル化するため、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールした12ビットRTI-835Hアナログディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いる。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起および測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正される。
【０３５７】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルが次に統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte Genomics）である。発現の変化が少なくともほぼ２倍、シグナルとバックグラウンドの割合が少なくとも2.5、および少なくとも40%のエレメントのスポットサイズを示すアレイエレメントは、差次的発現を示すとされる。
【０３５８】
発現
SEQ ID NO:57はまた、プロゲステロンとベクロメタゾンのホルモンで処理した肝臓腫瘍に由来する細胞で差次的発現を示すことがマイクロアレイ分析で明らかになった。C3A細胞株は、肝臓腫瘍を患う15歳の男子から単離したHepG2肝臓癌細胞株のクローン誘導体である。C3A細胞は、インシュリン受容体とインシュリン様成長因子II受容体を発現する。プロゲステロンは天然プロゲスチンであり、肝臓で代謝される。ベクロメタゾンは、ステロイド性喘息の治療に用いられる合成グルココルチコイドである。グルココルチコイドは天然ホルモンであり、薬理量で投与すると、炎症および免疫応答を防止または抑制する。コンフルエント前期のC3A細胞は、1、3、6時間の間、100μMのプロゲステロンまたは10μMのベクロメタゾンで処理され、未処理のC3A細胞と比較された。SEQ ID NO:57の発現は、両処理の全時点で少なくとも2倍増加した。これらの実験は、SEQ ID NO:57は、キナーゼ及びホスファターゼが関係している疾患の診断アッセイ、またキナーゼ及びホスファターゼが関係している疾患の治療の潜在的な生物学的マーカーおよび治療薬として、また肝臓でグリココルチコイドの効果をモニタリングに有用であることを示唆する。
【０３５９】
SEQ ID NO:65はまた差次的発現をアルツハイマー病(AD)において示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。重度ADの79歳女性からの前海馬組織を正常な61歳女性からの前海馬組織と比べると、SEQ ID NO:65の発現は少なくとも2分の１に低下した。したがってSEQ ID NO:65は、ADの診断アッセイに、またAD治療での潜在的生体マーカーおよび治療薬として有用である。
【０３６０】
SEQ ID NO:67は、マイクロアレイ解析の判定で差次的発現を肝臓C3A細胞で示したが、この細胞群は以下のステロイドの1つで処理した。ベクロメタゾン、デキサメタゾン、プロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、ブデソニド、プレドニゾン、およびベタメタゾンである。ヒトC3A細胞株はHepG2/C3のクローン誘導体であり、成熟したヒト肝臓のin vitro モデルとして確立されている(Mickelson 他(1995) Hepatology 22:866-875、Nagendra 他(1997) Am J Physiol 272:G408-G416)。SEQ ID NO:67は、1、3、または6時間の間プロゲステロン、ベクロメタゾン、メドロキシプロゲステロン、ブデソニド、プレドニゾン、デキサメサゾン、またはベタメタゾンで処理されたコンフルエント前期のC3A細胞での発現は少なくとも2分の１に低下したことを示した。これらの実験は、SEQ ID NO:67は、肝臓疾患の診断アッセイまた肝臓疾患と障害の治療の潜在的な生物学的マーカーおよび治療薬として有用であることを示唆する。
【０３６１】
SEQ ID NO:67はまた、マイクロアレイ分析が実証するように、正常な前立腺上皮細胞に比較して前立腺癌細胞株において差次的発現を示した。前立腺癌細胞株DU 145は、広領域に転移を有する前立腺癌の69才男性の脳の転移部位から単離された。DU 145には検出可能なホルモン感受性がなく、半固形培地でコロニーを形成する。そして酸性ホスファターゼに対してほんの弱陽性であり、細胞は前立腺特異抗原(PSA)に対して陰性である正常上皮細胞株であるPrECは初代前立腺上皮細胞株であり、或る正常ドナーから単離された。マイクロアレイ実験が示したところでは、SEQ ID NO:67の発現が、正常前立腺上皮細胞株であるPrECからの細胞と比較して前立腺癌細胞株DU 145で少なくとも2倍増加していた。したがってSEQ ID NO:67は、或る種の前立腺癌の診断マーカーとして、または潜在的治療標的として有用である。
【０３６２】
別例でSEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72は差次的発現を腫瘍性組織で非腫瘍性組織に対して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。幾人かの提供者からの肺、卵巣、結腸腫瘍組織に由来するcDNAの発現を同じ提供者からの正常な肺、卵巣、結腸組織とそれぞれ比較した。
【０３６３】
SEQ ID NO:68の発現はまた、同じ提供者の正常な組織とマッチした時、肺扁平細胞癌において少なくとも2.8倍に上昇した。この腫瘍性肺組織は、肺扁平細胞癌を患う或る68才女性の肺から取得した。正常な肺組織は、同じ提供者の肺の、肉眼で見る限り腫瘍を伴わない組織から単離された。したがって、SEQ ID NO:68は肺腺癌の診断アッセイにおいて有用である。
【０３６４】
SEQ ID NO:70の発現はまた、同じ提供者の正常な組織とマッチした時、卵巣腺癌において少なくとも2.3分の１に減少した。この腫瘍性卵巣組織は79才女性の卵巣腺癌から取得した。正常な卵巣組織は、同じ提供者の卵巣から取得した。したがって、SEQ ID NO:70は卵巣腺癌の診断アッセイにおいて有用である。
【０３６５】
SEQ ID NO:72の発現は、２人の提供者の正常な組織をそれぞれ同じ提供者からのヒトの結腸腺癌組織とマッチした時、少なくとも2分の１に減少した。結腸腺癌組織は、結腸腺癌を患う85才の女性または結腸腺癌を患う85才の男性から単離した。正常な結腸組織は、それぞれ肉眼で見る限り腫瘍を伴わないプールされた正常結腸組織または同じ提供者の肉眼で見る限り腫瘍を伴わない結腸組織から単離された。SEQ ID NO:72の発現はまた、ヒトの正常な直腸組織を同じ提供者の直腸腫瘍組織とマッチした時に少なくとも3.5分の１に減少した。直腸腫瘍組織は、直腸癌の或る男性（年齢不詳）得られた。正常な直腸組織は、同じ提供者からの肉眼で見る限り腫瘍を伴わない直腸組織から得られた。  さらにSEQ ID NO:72の発現は、ヒトS状結腸腫瘍組織を同じ提供者の正常組織とマッチさせた時少なくとも8分の1に減少した。Ｓ状結腸組織は転移性胃肉腫(間質腫瘍)から起始するＳ状結腸腫瘍を持つ或る48才女性から取得した。正常なＳ状結腸組織は、同じ提供者からの肉眼で見る限り腫瘍を伴わないＳ状結腸組織から得られた。したがって、SEQ ID NO:72は結腸癌、直腸癌、Ｓ状結腸癌の診断アッセイにおいて有用である。
【０３６６】
マッチした正常結腸および発癌性結腸、正常卵巣および発癌性卵巣の組織サンプルがHuntsman Cancer Institute, (Salt Lake City, UT)によって提供された。マッチさせた正常肺組織および腫瘍形成性肺組織サンプルは、Roy Castle International Centre for Lung Cancer Research (Liverpool, UK)によって提供される。
【０３６７】
別の実施例では、SEQ ID NO:79の発現は、ヒト癌性結腸組織を同じ提供者の正常組織とマッチさせると、少なくとも2分の1に減少した。結腸腺癌組織を、結腸の腺管絨毛腺腫過形成性ポリープを持つ或る59才男性から取得し、これを同じ提供者からの肉眼で見る限り腫瘍を伴わないプールされた結腸組織から得られた正常な結腸組織とマッチさせた。したがって、SEQ ID NO:79 は結腸癌の診断アッセイにおいて有用である。  マッチさせた正常大腸組織および腫瘍形成性大腸組織サンプルは、Huntsman Cancer Institute, (ハンツマン癌研究所、Salt Lake City, UT)によって提供される。
【０３６８】
別の実施例では、SEQ ID NO:82の発現を、乳房腫瘍進行の種々の病期を示す数種の腫瘍細胞株と非悪性乳腺上皮細胞株MCF-10Aで比較した。例えば、5種の腫瘍細胞株(BT20、MCF7、MDA-mb-231、Sk-BR-3およびT-47D)からのSEQ ID NO:82の発現は、増殖を供給者の推奨培地または限定無血清H14培地で70-80%のコンフルエンスまで行ったMCF-10A細胞における発現と比較された。MCF10Aは乳腺(腔管の特徴：luminal ductal characteristics)細胞株であり、乳腺症(fibrocystic breast disease)の36才の女性から単離された。MCF-10A は、細胞質ケラチン類、上皮性シアロムチン類、および乳脂肪小球（milkfat globule）抗原類を発現する。この細胞株はまたコラーゲン中で3次元成長を示し、またコンフルエントな培養でドームを形成する。MCF7は或る69才の女性の胸水から単離された非悪性乳腺癌細胞株である。MCF7 は、乳腺上皮の特徴、例えば細胞質エストロゲン受容体を介してエストラジオールをプロセスする能力、および、培養でドームを形成する能力などを保持している。T-47D乳癌細胞株は、浸潤性乳管癌を持つ或る54才の女性から得た胸水から単離された。Sk-BR-3は、43才の女性の悪性胸水から単離された乳腺癌細胞株である。これはヌードマウスに注入すると、低分化腺癌を形成する。BT-20乳癌細胞株は、或る74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片から遊出した細胞群からin vitroで得られた。MDA-mb-231は、51才の女性の胸水から単離された乳癌細胞株である。これはヌードマウスおよびALS処理BLAB/ｃマウスにおいて低分化腺癌を形成する。これはまた、Wnt3癌遺伝子、EGF、およびTGF-αを発現する。MDA-mb-435Sは紡錘状の株であり親株(435)から進化した株で、これは1976年にR. Cailleauが、転移性乳管腺癌を患う31歳女性の胸水から単離した。SEQ ID NO:82は少なくとも2倍に上昇した発現を、MCF-10A細胞をBT-20、MCF7、およびSk-BR-3細胞と比較した時に示した。これらの実験はテストされた乳房腫瘍細胞株でSEQ ID NO:82の発現が有意に低下していることを示し、SEQ ID NO:82が診断マーカーとして有用なこと、あるいは乳癌の治療上の標的として使える可能性があることをさらに確立している。
【０３６９】
さらに、SEQ ID NO:82の発現は、肥満の提供者の未処理の含脂肪細胞を同じ提供者からの処理されたヒトの含脂肪細胞と比べると少なくとも2倍の増加があった。この肥満ヒト初代皮下前脂肪細胞は、肥満度指数(BMI)が32.47の健常な女性(40才)の脂肪組織から単離した。前脂肪細胞を培養して、それらを活性成分PPAR-γアゴニストとヒトインスリンを含む分化培養液中で培養することによって脂肪細胞に分化するように誘導した。ヒトの前脂肪細胞はヒトのインシュリンとPPAR-γアゴニストで３日間処理された。次いで分析のために細胞が回収される前までインシュリンだけを含む培地に24時間、48時間、4日間、8日間、または15日間の間移された。分化した脂肪細胞が誘発剤の入っていない培養液中にある未処理の前脂肪細胞と比較された。前脂肪細胞の80%から90%が最終的に脂肪細胞に分化したことを位相差顕微鏡下で観察した。よってSEQ ID NO:82は真性糖尿病や肥満症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、多嚢胞性卵巣症候群、そして乳癌、前立腺癌、結腸癌を含む癌等の他の疾患の診断、予後、または治療において有用である。
【０３７０】
SEQ ID NO:83の発現はまた癌性肺組織において、同じ提供者の正常組織と比べて少なくとも2分の1に減少した。右肺由来の中分化腺癌組織を或る60才の提供者から取得し、これを同じ提供者からの肉眼的に正常な組織に由来する正常な右肺組織とマッチさせた。したがってSEQ ID NO:83は、肺癌の診断アッセイに有用である。さらに、SEQ ID NO:83の発現はまた癌性卵巣組織において、同じ提供者の正常組織と比べて少なくとも2.4分の1に減少した。卵巣腺癌は或る79才女性から取得し、これを同じ提供者から得た正常な卵巣組織とマッチさせた。したがって、SEQ ID NO:83は卵巣癌の診断アッセイにおいて有用である。マッチした正常および発癌性の肺および卵巣組織サンプルがHuntsman Cancer Institute, (Salt Lake City, UT)によって提供された。
【０３７１】
SEQ ID NO:84の発現は、正常な繊維芽細胞と比較してタンジール病に由来する繊維芽細胞において少なくとも2倍に上昇した。さらに、両タイプの細胞がコレステロールの存在下で培養され、コレステロールの不存在下で培養された同じ細胞タイプと比較された。正常な被験者およびホモ接合型のタンジール病を患う２人の患者の両者から皮膚外植体から、ヒトの繊維芽細胞が得られた。細胞株群は、ヒトの乳頭腫ウイルス16遺伝子E6およびE7そしてネオマイシン耐性選択マーカーの形質移入によって不死化された。TD由来細胞は、アポA-Iが仲介するトリチウム化されたコレステロールの流出のアッセイで欠陥（deficient）である。したがって、SEQ ID NO:84はタンジール病の診断アッセイにおいて有用である。
【０３７２】
SEQ ID NO:86の発現を、乳房腫瘍進行の種々の病期を示す数種の腫瘍細胞株と非悪性乳腺上皮細胞株HMECおよびMCF-10Aで比較された。例えば、6種の細胞株(BT20、MCF7、MDA-mb-231、Sk-BR-3、MDA-mb-435SおよびT-47D)からのSEQ ID NO:86の発現は、増殖を供給者の推奨培地で70-80%のコンフルエンスまで行ったHMECまたはMCF-10A細胞における発現と比較された。SEQ ID NO:86は、HMEC細胞と比較した時6種のうち5種の細胞株(MCF7、MDA-mb-231、Sk-BR-3、MDA-mb-435SおよびT-47D)、またMCF-10A細胞と比較した時6種のうち2種の細胞株（MDA-mb-231およびT-47D）で少なくとも2分の1に減少した。これらの実験はテストされた乳房腫瘍細胞株でSEQ ID NO:86の発現が有意に低下したことを示し、SEQ ID NO:86が診断マーカーとして有用なこと、あるいは乳癌の治療標的として使える可能性があることを確立している。
【０３７３】
別の例でSEQ ID NO:98は差次的発現を乳癌に関して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。非悪性乳腺上皮細胞株の遺伝子発現プロファイルが、腫瘍進行の様々な段階を示す種々の乳癌細胞株の遺伝子発現プロファイルと比較された。比較した細胞株は次のとおりである。a)BT-20、乳癌細胞株で74才の女性から単離した腫瘍塊の薄切片から遊出した細胞にin vitroで由来、b)BT-474、乳管癌細胞株で60才女性から得た充実性浸潤性乳管癌から単離、c)BT-483、乳管癌細胞株で乳癌の家族歴を持つ23才正常で月経のある経産女性から得た乳頭浸潤型乳管腫瘍から単離、d)Hs 578T、乳管癌細胞株で乳癌の74才女性から単離、e)MCF7、非悪性乳腺癌細胞株で69才女性の胸水から単離、f)MCF-10A、乳腺(管腔腺管の特徴を持つ)細胞株で36才の線維嚢胞性乳房疾患の女性から単離、g)HMEC、初代乳房上皮細胞株で正常な提供者から単離、である。SEQ ID NO:98の発現は、すべての乳癌細胞株においてHMEC細胞株と比較して少なくとも２分の１の発現の低下を示した。したがって、SEQ ID NO:98は、乳癌を含む細胞増殖性障害の診断アッセイおよび疾患段階決定アッセイに有用である。
【０３７４】
別の例でSEQ ID NO:100は差次的発現を骨肉腫に関して示し、これはマイクロアレイ解析で判定した。正常なヒト骨芽細胞（初代培養、NHOst 5488)由来のメッセンジャーRNAは、生検標本および骨肉腫組織からのmRNAと比較された。SEQ ID NO:100の発現は、正常な骨芽細胞と比較して骨肉腫を患う患者の大腿骨腫瘍組織において少なくとも2倍上昇した。したがってSEQ ID NO:100は、骨肉腫の治療のモニタリングおよび診断アッセイにおいて有用である。
【０３７５】
別の実施例で、SEQ ID NO:101は肺癌と関連する差次的発現を示した。SEQ ID NO:101の発現を、肺腫瘍を患う10人（3人は腺癌、5人は扁平細胞癌）の患者から得られた正常および癌性組織サンプルについて比較した。SEQ ID NO:101の発現は、扁平細胞癌を患う5人中3人の患者の肺組織において同じ提供者のマッチした微視的に正常な組織と比較して少なくとも2倍増加していることがマイクロアレイ解析で明らかになった。さらに、SEQ ID NO:101はアルツハイマー病と関連する差次的発現を示した。SEQ ID NO:101の発現は、アルツハイマー病を患う被験者の脳の細胞または組織において正常な脳組織と比較して少なくとも2分の１に減少していることを示した。したがってSEQ ID NO:101は、肺癌、特に扁平細胞癌、またアルツハイマー病等の神経障害の疾病段階決定と診断アッセイに有用である。
【０３７６】
１２  相補的ポリヌクレオチド
KPPをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的配列は、天然のKPPの発現を検出し、低下させ、または阻害するために用いられる。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）と、KPPのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な5'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコード配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、KPPをコードする転写物にリボソームが結合するのを防ぐ。
【０３７７】
１３  KPPの発現
KPPの発現及び精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でKPP を発現させるには、抗生物質耐性遺伝子と、cDNAの転写レベルを高める誘導性プロモーターとを持つ、好適なベクターに、cDNAをサブクローニングする。このようなプロモーターとしては、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター、およびtrp-lac（tac）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌は、イソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導されるとKPP を発現する。真核細胞でのKPP の発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須の多角体遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、KPP をコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高レベルのcDNA転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合は夜蛾の１種Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いるが、ヒト肝細胞への感染に用いることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスへの更なる遺伝的修飾が必要になる(Engelhard, E.K 他、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他 (1996) Hum.Gene Ther. 7:1937-1945)。
殆どの発現系では、KPPが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)と、または、FLAGや6-Hisなどペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの、組換え融合タンパク質の、親和性ベースの精製を迅速に１ステップで行い得る。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Biosciences）。精製後、GST部分を、特異的に操作した諸部位において、KPP からタンパク分解的に切断できる。FLAGは8アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナルおよびポリクローナル抗FLAG抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。6ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、Ausubel他(前出、10および16章)に記載がある。これらの方法で得られた精製KPP を直接用いて以下の実施例１７、１８、19、20および21のアッセイを行うことができる。
【０３７８】
１４  機能的アッセイ
KPP機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのKPPをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターとしては、PCMV SPORTプラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）およびPCR 3.1プラスミド（Invitrogen）があり、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを持つ。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、組換えベクターからのcDNA発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP;Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、それらの細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変容、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変容とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G. (1994; Flow Cytometry, Oxford, New York NY)に記述がある。
【０３７９】
遺伝子発現におけるKPPの影響は、KPPをコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存された複数の領域に結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。 mRNAは、当分野で周知の方法で細胞から精製することができる。KPP及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３８０】
１５  KPPに特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488-495等を参照）または他の精製技術を用いて実質上精製されたKPPを用いて、標準プロトコルでウサギ、マウス等の動物を免疫化して抗体を産出する。182:488-495を参照）または他の精製技術で行い、これを用いて標準的なプロトコルで動物（例えばウサギ、マウスなど）を免疫化して抗体を作り出す。
【０３８１】
或いは、レーザGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてKPPアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。そして対応するオリゴペプチドを合成し、このオリゴペプチドを用いて当業者によく知られている方法で抗体を生成する。例えばＣ末端付近或いは隣接する親水性領域等の、適切なエピトープの選択については、当分野で公知である（前出のAusubel 他、11章）。
【０３８２】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、FMOCケミストリを用いるABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）との反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出Ausubel他）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗KPP 活性を検査するには、ペプチドまたはKPP を基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３８３】
１６  特異的抗体を用いる天然KPPの精製
天然または組換えKPPを、KPP特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Biosciences）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗KPP抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３８４】
KPPを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、KPPを優先的に吸着する条件下（例えば洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液）でカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とKPPとの結合を切るような条件で（例えば、或るpH２〜３のバッファー、あるいは高濃度の、例えば尿素またはチオシアン酸イオンなどのカオトロープで）溶出させ、KPPを回収する。
【０３８５】
１７  KPPと相互作用する分子の同定
KPPまたはその生物活性断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する（Bolton A.E.及びW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529）。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したKPPと共にインキュベートし、洗浄して、標識したKPP複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なKPP濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したKPPの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３８６】
別法では、KPPと相互作用する分子を、Fields, S.及びO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステムやMATCHMAKERシステム(Clontech)などの２−ハイブリッドシステムに基づいた市販のキットを用いて分析する。
【０３８７】
KPPはまた、ハイスループットな方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリにコードされる遺伝子間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。(2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３８８】
１８  KPP活性の実証
通常、プロテインキナーゼ活性は、[γ-32P]ATPの存在で、KPPによりタンパク質基質のリン酸化を定量化することで測定される。KPPを、タンパク質基質、32P-ATP、および或る適切なキナーゼバッファと共にインキュベートする。基質に組み込まれた32Pは、電気泳動法で遊離32P-ATPより分離され、組み込まれた32Pをラジオアイソトープカウンターでカウントする。組み込まれた32Pの量は、KPPの活性に比例する。リン酸化した特異的アミノ酸残基の判定を、加水分解したタンパク質のホスホアミノ酸解析で行う。
【０３８９】
或る実施態様では、プロテインキナーゼ活性はガンマリン酸塩がアデノシン三リン酸（ATP）からタンパク質基質中のセリン、トレオニン、またはチロシン残基に転移する量を定量化することによって測定される。反応はビオチン標識されたペプチド基質を有するプロテインキナーゼサンプルとガンマ32P-ATPとの間で起こる。反応に続き、溶液中のアビジンがビオチン標識された32Pペプチド生成物に結合させる目的で添加される。結合試料は、次に生成物アビジン複合体を保持し、遊離のγ32P-ATPの透過させる膜を用いて、遠心限外濾過プロセスを行う。残余として32Pペプチド生成物を含む遠心分離されたユニットのリザーバーは、次にシンチレーションカウンタでカウントされる。この方法は、選択されたペプチド基質及びキナーゼ反応バッファによってあらゆるタイプのプロテインキナーゼのアッセイを可能とする。このアッセイは、キット形態(ASUA, Affinity Ultrafiltration Separation Assay, Transbio Corporation, Baltimore MD,米国特許番号 5, 869, 275)で提供される。限定されてはいないが、示唆された基質及びその各々の酵素は、ヒストンH1(シグマ)及びp34cdc2キナーゼ、アネキシンI、アンギオテンシン(シグマ)及びEGF受容体キナーゼ、アネキシンII及びsrcキナーゼ、ERK1及びERK2基質及びMEK、ミエリン塩基性蛋白質及びERKである(Pearson, J. D.他(1991) Methods Enzymol. 200 : 62-81)。ヒストンH1(シグマ)及びp34cdc2キナーゼ、アネキシンI、アンギオテンシン(シグマ)及びEGF受容体キナーゼ、アネキシンII及びsrcキナーゼ、ERK1及びERK2基質及びMEK、ミエリン塩基性タンパク質及びERKである(Pearson, J. D.他(1991) Methods Enzymol. 200:62-81)。
【０３９０】
別の実施態様では、KPPのプロテインキナーゼ活性は、KPP、50μlのキナーゼバッファー、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）若しくは合成ペプチド基質のような基質1μg、1mMのDTT、10μgのATP、及び0,5. 5μCiの[γ-32P]ATPを含むアッセイに於いて証明される。反応液を３０℃で３０分間インキュベートし、ピペットでP81ペーパーに移して反応を停止させる。組み込まれていない[γ-32P]ATPは、洗浄によって取り除かれ、組み込まれた放射活性はシンチレーションカウンタを用いて測定される。別法では、SDSローディングバッファーの存在下で１００℃に加熱して反応を停止し、オートラジオグラフにより12％SDSポリアクリルアミドゲル上で分離させる。組み込まれた32Pの量は、KPPの活性に比例する。
【０３９１】
さらに別の実施例では、KPPのアデニル酸キナーゼ若しくはグアニル酸キナーゼ活性が、ガンマラジオアイソトープカウンターを用いて、[γ-32P]ATPからの32PのADP若しくはGDPへの取り込みによって測定でき得る。キナーゼバッファー中のKPPを、適切なヌクレオチドモノリン酸基質（AMP若しくはGMP）及びリン酸ドナーとしての32p標識ATPと共にインキュベートする。反応は37℃でインキュベートされ、トリクロロ酢酸の添加によって終了される。酸抽出物は、中和され、ゲル電気泳動にかけられて、一リン酸、二リン酸、三リン酸のヌクレオチド画分に分離する。二リン酸ヌクレオチド画分が取り除かれ、カウントされる。回収した放射性活性はKPPの活性に比例する。
さらに別の実施例では、KPPのための別のアッセイは、シンチレーション近接アッセイ（SPA）、シンチレーションプレート技術、及びフィルタ結合アッセイを含む。有用な基質はグルタチオントランスフェラーゼで標識された組換えタンパク質を含み、ビオチンで標識された合成ペプチド基質を含む。小さい有機分子、タンパク質またはペプチドのようなKPP活性の阻害物質はこのようなアッセイによって同定され得る。
【０３９２】
別の実施例では、KPPのホスファターゼ活性は、P-ニトロフェニルリン酸(PNPP)の加水分解によって測定する。KPPを、0.1％のβメルカプトエタノールの存在下で、ｐH7.5のHEPESバッファー中にPNPPと共に37℃で60分インキュベートする。この反応は６mlの10N NaOHを加えて停止する（Diamond, R.H.他(1994) Mol. Cell. Biol. 14:3752-62)。或るいは、KPPの酸性ホスファターゼ活性は、ｐH4.5の0.1Mクエン酸ナトリウム、及び50μlの40ｍM塩化ナトリウム中にKPPを含む抽出液と100μlの10ｍM PNPPを37℃で20分インキュベートして実証する。この反応は0.5 mlの0.4M グリシン／NaOH（ｐH10.4）を加えて止める（Saftig, P. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:18628-18635)。PNPPの加水分解によって起こる410nmでの光吸収の増加を分光光度計で測定する。このアッセイでは、光吸収の増加がKPP の活性に比例する。
【０３９３】
別法では、KPP活性は、リン酸化したタンパク質基質から除去されたリン酸の量を測定して決定する。反応は、60mM Tris（pH7.6）、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％のβ-メルカプトエタノールおよび10μM 基質、適量の32P標識したセリン／トレオニン／またはチロシンを含む最終容量30μlの２nM或いは4nMのKPPにおいて行なう。反応は基質で開始し、30℃で10〜15分間インキュベートする。0.6 M HC1、90mM Na4P2O7、および2mM NaH2PO4中の4％(w/v)活性化木炭450μlで停止させ、次に12,000×gで5分間遠心分離する。酸可溶性32Piを液体シンチレーションカウンターで定量する（Sinclair, C. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:23666-23672)。
【０３９４】
19  キナーゼ結合アッセイ
KPPのFLAG-CD44cyt融合タンパク質への結合は、KPPを抗KPP抱合免疫親和性ビーズとインキュベートした後、ビーズ（10〜20ngのタンパク質を有する）の一部を、125I-標識化 FLAG-CD44cyt融合タンパク質(5,000 cpm/ng のタンパク)の存在下で、0.5mlの結合バッファ (20 mM Tris-HCL (pH 7.4)、150 mMの NaCl、0.1% ウシ血清アルブミンおよび0.05% Triton X-100)で4℃で、５時間インキュベートすることによって測定できる。結合させた後、ビーズは結合バッファー中でよく洗浄し、ビーズ結合放射活性をシンチレーションカウンタで測定する(Bourguignon, L.Y.W. 他 (2001) J. Biol. Chem. 276:7327-7336)。取り込まれた32Pの量は、結合したKPPの量に比例する。   ２０  KPP阻害剤の同定
実施例１7のアッセイで説明したように、検査されるべき化合物を、好適なバッファーおよび基質と共に様々な濃度で384穴プレートのウェルに注入する。KPP 活性はそれぞれのウェルについて測定し、KPP 活性を阻害するそれぞれの化合物の能力および容量反応動態（dose-response kinetics）を決定することができる。KPP活性を増強する分子の同定にも、このアッセイを用いることができる。
【０３９５】
２１  ＫＰＰ基質の同定
KPPの「基質トラッピング（substrate-trapping）」アッセイは、タンパク質チロシンホスファターゼのPTPシグネチャ配列におけるある突然変異によって付与され得る基質親和性の上昇を利用する。このような突然変異を有するKPPは、それらの基質と安定した複合体を形成し、このような複合体を生化学的に単離し得る。KPPの触媒ドメインをコードするクローンのPTPシグネチャ配列における不変な残基の特定部位の突然変異誘発を、当分野で周知の方法或いはBIO-RADが販売するMUTA-GENEキットなどの市販のキットを用いて行うことができる。大腸菌におけるKPP突然変異を誘発する場合は、突然変異を含むDNA断片を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)-KPP融合タンパク質或いはKPPをコードする配列を有する発現ベクターの対応する野生型配列と交換する。KPP突然変異体が大腸菌で発現され、それを生化学的に精製する。
【０３９６】
発現ベクターを、10cmのシャーレ１枚に付き20μgのCsCl-精製DNA、6cmのシャーレ１枚に付き8μgのCsCl-精製DNAを用いたリン酸カルシウム仲介性トランスフェクションによってCOS1または293細胞に形質転換する。トランスフェクションから48時間経過した後に、細胞を100ng/mlの上皮成長因子で刺激すると、チロシンキナーゼEGFRがCOS細胞に多量に存在するため、細胞におけるチロシンのリン酸化が増大する。細胞を、50mM Tris HCl（pH7.5）／5mM EDTA／150mM NaCl／1％ Triton X-100／5 mMヨード酢酸／10mM リン酸ナトリウム／10mM NaF／5μg/mlロイペプチン／5μg/mlアプロチニン／1mM benzamidineで溶解する（10cmのシャーレ１枚に付き1ml、6cmのシャーレ１枚に付き0.5ml）。KPPを、好適な抗体で溶解物から免疫沈降させる。GST-KPP融合タンパク質を、細胞溶解物1mgにつきそれぞれ、グルタチオン−セファロース、4μgのmAbまたは10μlのビーズで沈降させる。複合体をポリアクリルアミド電気泳動（PAGE）で視覚化することができるが、更に精製して基質分子を同定することもできる(Flint, A. J.他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1680-1685)。
【０３９７】
22  KPP分泌アッセイ
或る高処理アッセイを用いて、真核細胞内に分泌されるポリペプチドを同定しうる。このようなアッセイの1例では、ポリペプチド発現ライブラリを作製するため、5'に偏向したcDNAを、或るリーダーのないβラクタマーゼ遺伝子の5'末端に融合する。βラクタマーゼは便利な遺伝子レポーターである。理由は、この酵素が高い信号／ノイズ比と、低い内因性バックグラウンド活性とを示し、他のタンパク質に融合しても活性を保持するからである。或る2重プロモーター系によって、βラクタマーゼ融合ポリペプチドの発現を、細菌又は真核細胞でなしうる。これにはlacまたはCMVプロモーターを各々用いる。
【０３９８】
ライブラリは先ず細菌(大腸菌など)に形質転換され、真核生物系で分泌されうる融合ポリペプチドをコードするライブラリメンバーが同定される。哺乳類シグナル配列は、βラクタマーゼ融合ポリペプチドが細菌のペリプラズムへ移動するよう指示する。ペリプラズムでこれはカルベニシリンへの抗生物質耐性を授ける。カルベニシリン選択された細菌の単離を固体培地で行い、個々のクローンを液体培地で成長させ、生じた培養物を用いてライブラリメンバープラスミドDNAを単離する。
【０３９９】
哺乳類細胞(293細胞など)の播種を96ウェル組織培養プレート上に、約40,000細胞／ウェルの密度で、100 μlフェノールレッドを含まないDMEに10%ウシ胎児血清(FBS) ( Life Technologies, Rockville, MD)を加えて行う。次の日に、精製プラスミドDNA(カルベニシリン耐性細菌から単離)を、15 μlのOPTI-MEM I培養液(Life Technologies)で、形質移入すべき細胞の各ウェルに25 μlの容量まで希釈する。別のプレートで、1μlのLF2000 Reagent (Life Technologies)の希釈を25μl/ウェルOPTI-MEM I中に行う。25μl希釈LF2000 Reagentを次に25μl希釈DNAと混合し、短時間攪拌し、インキュベートを20分間、室温で行う。生じたDNA-LF2000試薬複合体を次に、直接、293細胞の各ウェルに加える。細胞の形質移入はまた、適切な対照プラスミド(野生型βラクタマーゼ、リーダーのないβラクタマーゼ、又は例えばCD4融合したリーダーのないβラクタマーゼのいずれかを発現するプラスミド)で行う。形質移入の24時間後、約90μlの細胞培地のアッセイを37oCで、100 μMのNitrocefin(ニトロセフィン、Calbiochem, San Diego CA)及び0.5 mMのオレイン酸（Sigma Corp., St. Louis, MO)を用い、10 mMリン酸バッファー(pH 7.0)中でおこなう。ニトロセフィンはβラクタマーゼの基質であり、加水分解すると黄色から赤へ顕著に変色する。βラクタマーゼ活性のモニターを、20分間、マイクロタイタープレートリーダーにおいて486nmで行う。486nmでの色吸収の増加が、形質移入した細胞培地でのβラクタマーゼ融合ポリペプチドの分泌に一致する。これは、融合ポリペプチドにおける真核生物シグナル配列の存在の結果である。対応するライブラリメンバープラスミドDNAのポリヌクレオチド配列分析を次に用いて、シグナル配列をコードするcDNAを同定する(記載は米国特許出願09/803,317号、ファイル日は2001年3月9日)。
【０４００】
例えば、このアッセイを用いてSEQ ID NO:12 は分泌タンパク質であることが示された。
【０４０１】
当業者には、本発明の範囲および趣旨から逸脱しない限りの、記載した本発明の、組成物、方法およびシステムの、種々の修正および変更については自明であろう。本発明が、新規かつ有用なタンパク質群およびそれらをコードするポリヌクレオチド群を提供し、これらを創薬過程に利用しうること、また本発明が、これらの組成を用いた、疾患と病態との検出、診断、および治療の方法を提供することは理解されよう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施態様に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施態様に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。このような実施態様の記載は完全であると考慮されるべきでなく、また本発明を開示したとおりの形態に限定するものでもない。更に、1つの実施態様の要素は、他の1つ以上の実施態様の要素と容易に組み換え得る。このような組み合わせにより、本発明の範囲にある多数の実施態様を形成し得る。本発明の範囲は、添付した請求の範囲およびそれらの等価物によって規定されるよう意図される。
【０４０２】
(表の簡単な説明)
表１は、本発明の完全長のポリヌクレオチド実施態様およびポリペプチド実施態様の命名の概略である。
【０４０３】
表２は、本発明のポリペプチド実施態様のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈(annotation)と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。また、各ポリペプチドとその相同体（１つ以上）が一致する確率スコアも併せて示す。
【０４０４】
表３は、予測されるモチーフおよびドメインなど、ポリペプチド実施態様の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いた方法、アルゴリズムおよび検索可能なデータベースと共に示す。
【０４０５】
表４は、ポリヌクレオチド実施態様をアセンブリするために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、該ポリヌクレオチドの選択された断片と共に示す。
【０４０６】
表５は、ポリヌクレオチド実施態様の代表的cDNAライブラリを示す。
【０４０７】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織およびベクターを説明する付表である。
【０４０８】
表７は、ポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献および閾値パラメータと共に示す。
【０４０９】
【表１−１】
2005518191.tif 000005
【０４１０】
【表１−２】
2005518191.tif 000006
【０４１１】
【表１−３】
2005518191.tif 000007
【０４１２】
【表２−１】
2005518191.tif 000008
【０４１３】
【表２−２】
2005518191.tif 000009
【０４１４】
【表２−３】
2005518191.tif 000010
【０４１５】
【表２−４】
2005518191.tif 000011
【０４１６】
【表２−５】
2005518191.tif 000012
【０４１７】
【表２−６】
2005518191.tif 000013
【０４１８】
【表２−７】
2005518191.tif 000014
【０４１９】
【表２−８】
2005518191.tif 000015
【０４２０】
【表２−９】
2005518191.tif 000016
【０４２１】
【表２−１０】
2005518191.tif 000017
【０４２２】
【表２−１１】
2005518191.tif 000018
【０４２３】
【表２−１２】
2005518191.tif 000019
【０４２４】
【表２−１３】
2005518191.tif 000020
【０４２５】
【表２−１４】
2005518191.tif 000021
【０４２６】
【表２−１５】
2005518191.tif 000022
【０４２７】
【表２−１６】
2005518191.tif 000023
【０４２８】
【表２−１７】
2005518191.tif 000024
【０４２９】
【表２−１８】
2005518191.tif 000025
【０４３０】
【表２−１９】
2005518191.tif 000026
【０４３１】
【表２−２０】
2005518191.tif 000027
【０４３２】
【表２−２１】
2005518191.tif 000028
【０４３３】
【表２−２２】
2005518191.tif 000029
【０４３４】
【表２−２３】
2005518191.tif 000030
【０４３５】
【表２−２４】
2005518191.tif 000031
【０４３６】
【表２−２５】
2005518191.tif 000032
【０４３７】
【表２−２６】
2005518191.tif 000033
【０４３８】
【表２−２７】
2005518191.tif 000034
【０４３９】
【表２−２８】
2005518191.tif 000035
【０４４０】
【表２−２９】
2005518191.tif 000036
【０４４１】
【表２−３０】
2005518191.tif 000037
【０４４２】
【表２−３１】
2005518191.tif 000038
【０４４３】
【表２−３２】
2005518191.tif 000039
【０４４４】
【表２−３３】
2005518191.tif 000040
【０４４５】
【表２−３４】
2005518191.tif 000041
【０４４６】
【表３−１】
2005518191.tif 000042
【０４４７】
【表３−２】
2005518191.tif 000043
【０４４８】
【表３−３】
2005518191.tif 000044
【０４４９】
【表３−４】
2005518191.tif 000045
【０４５０】
【表３−５】
2005518191.tif 000046
【０４５１】
【表３−６】
2005518191.tif 000047
【０４５２】
【表３−７】
2005518191.tif 000048
【０４５３】
【表３−８】
2005518191.tif 000049
【０４５４】
【表３−９】
2005518191.tif 000050
【０４５５】
【表３−１０】
2005518191.tif 000051
【０４５６】
【表３−１１】
2005518191.tif 000052
【０４５７】
【表３−１２】
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【０４５８】
【表３−１３】
2005518191.tif 000054
【０４５９】
【表３−１４】
2005518191.tif 000055
【０４６０】
【表３−１５】
2005518191.tif 000056
【０４６１】
【表３−１６】
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【０４６２】
【表３−１７】
2005518191.tif 000058
【０４６３】
【表３−１８】
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【０４６４】
【表３−１９】
2005518191.tif 000060
【０４６５】
【表３−２０】
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【０４６６】
【表３−２１】
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【０４６７】
【表３−２２】
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【０４６８】
【表３−２３】
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【０４６９】
【表３−２４】
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【０４７０】
【表３−２５】
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【０４７１】
【表３−２６】
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【０４７２】
【表３−２７】
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【０４７３】
【表３−２８】
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【０４７４】
【表３−２９】
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【０４７５】
【表３−３０】
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【０４７６】
【表３−３１】
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【０４７７】
【表３−３２】
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【０４７８】
【表３−３３】
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【０４７９】
【表３−３４】
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【０４８０】
【表３−３５】
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【０４８１】
【表３−３６】
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【０４８２】
【表３−３７】
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【０４８３】
【表３−３８】
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【０４８４】
【表３−３９】
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【０４８５】
【表３−４０】
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【０４８６】
【表３−４１】
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【０４８７】
【表３−４２】
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【０４８８】
【表３−４３】
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【０４８９】
【表３−４４】
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【０４９０】
【表３−４５】
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【０４９１】
【表３−４６】
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【０４９２】
【表３−４７】
2005518191.tif 000088
【０４９３】
【表３−４８】
2005518191.tif 000089
【０４９４】
【表３−４９】
2005518191.tif 000090
【０４９５】
【表３−５０】
2005518191.tif 000091
【０４９６】
【表３−５１】
2005518191.tif 000092
【０４９７】
【表４−１】
2005518191.tif 000093
【０４９８】
【表４−２】
2005518191.tif 000094
【０４９９】
【表４−３】
2005518191.tif 000095
【０５００】
【表４−４】
2005518191.tif 000096
【０５０１】
【表４−５】
2005518191.tif 000097
【０５０２】
【表４−６】
2005518191.tif 000098
【０５０３】
【表４−７】
2005518191.tif 000099
【０５０４】
【表４−８】
2005518191.tif 000100
【０５０５】
【表４−９】
2005518191.tif 000101
【０５０６】
【表４−１０】
2005518191.tif 000102
【０５０７】
【表４−１１】
2005518191.tif 000103
【０５０８】
【表４−１２】
2005518191.tif 000104
【０５０９】
【表４−１３】
2005518191.tif 000105
【０５１０】
【表４−１４】
2005518191.tif 000106
【０５１１】
【表４−１５】
2005518191.tif 000107
【０５１２】
【表４−１６】
2005518191.tif 000108
【０５１３】
【表４−１７】
2005518191.tif 000109
【０５１４】
【表４−１８】
2005518191.tif 000110
【０５１５】
【表４−１９】
2005518191.tif 000111
【０５１６】
【表４−２０】
2005518191.tif 000112
【０５１７】
【表４−２１】
2005518191.tif 000113
【０５１８】
【表４−２２】
2005518191.tif 000114
【０５１９】
【表４−２３】
2005518191.tif 000115
【０５２０】
【表４−２４】
2005518191.tif 000116
【０５２１】
【表４−２５】
2005518191.tif 000117
【０５２２】
【表４−２６】
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【０５２３】
【表４−２７】
2005518191.tif 000119
【０５２４】
【表４−２８】
2005518191.tif 000120
【０５２５】
【表４−２９】
2005518191.tif 000121
【０５２６】
【表４−３０】
2005518191.tif 000122
【０５２７】
【表４−３１】
2005518191.tif 000123
【０５２８】
【表４−３２】
2005518191.tif 000124
【０５２９】
【表４−３３】
2005518191.tif 000125
【０５３０】
【表４−３４】
2005518191.tif 000126
【０５３１】
【表４−３５】
2005518191.tif 000127
【０５３２】
【表４−３６】
2005518191.tif 000128
【０５３３】
【表４−３７】
2005518191.tif 000129
【０５３４】
【表４−３８】
2005518191.tif 000130
【０５３５】
【表４−３９】
2005518191.tif 000131
【０５３６】
【表５−１】
2005518191.tif 000132
【０５３７】
【表５−２】
2005518191.tif 000133
【０５３８】
【表６−１】
2005518191.tif 000134
【０５３９】
【表６−２】
2005518191.tif 000135
【０５４０】
【表６−３】
2005518191.tif 000136
【０５４１】
【表６−４】
2005518191.tif 000137
【０５４２】
【表６−５】
2005518191.tif 000138
【０５４３】
【表６−６】
2005518191.tif 000139
【０５４４】
【表６−７】
2005518191.tif 000140
【０５４５】
【表６−８】
2005518191.tif 000141
【０５４６】
【表６−９】
2005518191.tif 000142
【０５４７】
【表６−１０】
2005518191.tif 000143
【０５４８】
【表６−１１】
2005518191.tif 000144
【０５４９】
【表７−１】
2005518191.tif 000145
【０５５０】
【表７−２】
2005518191.tif 000146
【０５５１】
【表７−３】
2005518191.tif 000147
【配列表】
2005518191000001.app
【国際調査報告】
2005518191.tif 000148
2005518191.tif 000149
2005518191.tif 000150
2005518191.tif 000151