(57)【要約】本発明は、グリコシダーゼ酵素の阻害剤を疾病の治療用薬物の製造に用いる方法であって、該グリコシダーゼ酵素は患者の糖結合体を加水分解して病原性因子に対する中性多糖レセプターを露呈させ、露呈された中性多糖レセプターはオリゴ糖配列を含むものであることを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の糖含有阻害性物質を感染症の治療用薬物の製造に用いる方法であって、該糖含有阻害性物質はピラノース環構造またはそれを模倣した単糖を含み、該ピラノース環構造は、GlcNAcβ, GalNAcβ, Galβ, Galα, GalNAcα, Fucα, ManαおよびNeu5Acαからなる群より選ばれるものであり、
所望により、下記式（Ｉ）で表される少なくとも１種のオリゴ糖配列を該糖含有阻害性物質と共に用いることを特徴とする方法。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u      （Ｉ）
（式中、ｐ、ｒ、ｓおよびｕは各々独立に０または１の整数であり、ｙは３位または４位の結合位置を表し、ｚは３位または４位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
ｐが１であり、且つ、ｙが３である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、ｒは１であり；
ｐが１であり、且つ、ｙが４である場合には、HexはGlcβであり、ｒは１であり；そして
ｐが０であり、且つ、ｚが４である場合には、HexがGalβであり、且つ、ｒが１であるか、あるいはHexがGalαであり、且つｒが０である。）
【請求項２】
該薬物が、胃腸器系における細菌感染の治療用であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該薬物が、胃における感染症の治療用であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該薬物が、腸管における感染症の治療用であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該薬物が、口腔における感染症の治療用であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該薬物が、肺における細菌感染の治療用であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該糖含有阻害性物質をオリゴ価または多価の形態で用いることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該糖含有阻害性物質を一価の形態で用いることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種の糖含有阻害性物質を、式（Ｉ）で表される少なくとも１種のオリゴ糖配列と共に用いることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該オリゴ糖配列が、下記式からなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
Galβ4Glc, GalNAcβ4Galβ4Glc, Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glc,
Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc, Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc,
Galα4Galβ4GlcNAc, Galα4GalβGlc, Galβ3GlcNAc, Galβ4GlcNAc,
Galα3Galβ4Glc, Galα3Galβ4GlcNAc, GalNAcα/β3Galβ4GlcNAc,
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc, そして GlcNAcβ3Galβ4Glc。
【請求項１１】
該糖含有阻害性物質が、α−アノマー構造を有する糖含有阻害性物質またはその模倣物であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該糖含有阻害性物質が、NeuNAcαまたはその模倣物であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該糖含有阻害性物質が、Fucαまたはその模倣物であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ピラノース環構造またはその模倣物を含み、該ピラノース環構造がGlcNAcβ, GalNAcβ, GalβおよびGalαからなる群より選ばれるものであることを特徴とする糖含有阻害性物質の用途。
【請求項１５】
ピラノース環構造またはその模倣物を含み、該ピラノース環構造がGlcNAcβ, GalNAcβおよびGalβからなる群より選ばれるものであることを特徴とする糖含有阻害性物質の用途。
【請求項１６】
ピラノース環構造またはその模倣物を含み、該ピラノース環構造がGlcNAcβ, ManαおよびFucαからなる群より選ばれるものであることを特徴とする糖含有阻害性物質の用途。
【請求項１７】
以下の条件のいずれか一方を満足する糖含有阻害性物質とオリゴ糖配列の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
（１）少なくとも１種の糖含有阻害性物質および少なくとも１種のオリゴ糖配列が同じ末端単糖残基を有する、または
（２）糖含有阻害性物質が、オリゴ糖配列の末端単糖の模倣物である。
【請求項１８】
少なくとも二種の異なる糖含有阻害性物質を用いることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも三種の異なる糖含有阻害性物質を用いることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
該感染症が、Helicobacter pyloriまたは下痢発症性E. coliの存在によって生じる感染症であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
インフルエンザの治療用薬物、または細菌とインフルエンザウイルスとの共感染の治療用薬物の製造に、NeuNAcαまたはそれを模倣する単糖を該糖含有阻害性物質として用いることを特徴とする、請求項１および４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
該糖含有阻害性物質が、細菌とインフルエンザウイルスとの共感染の治療用であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該共感染が、肺炎または気管支炎の原因となることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
該感染症がインフルエンザに関連した二次細菌感染症であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
該感染症が、Streptococcus pneumoniae、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas auruginosa、Pseudomonas cepacia、Xanthomonas maltophilia、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzaeおよびStaphylococcus aureusからなる群より選ばれる細菌による感染症であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
該糖含有阻害性物質が、オセルタミビル、ザナミビルまたはRWJ-27020であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ピラノース環構造またはそれを模倣した単糖を含み、該ピラノース環構造がGlcNAcβ, GalNAcβ, Galβ, Galα, GalNAcα, Fucα, ManαおよびNeu5Acαからなる群より選ばれるものであることを特徴とする糖含有阻害性物質を含有してなる、グリコシダーゼ酵素、植物レクチンまたは細菌の毒素に対する阻害性物質。
【請求項２８】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む組成物であって、食物または飼料の質を向上させるための添加剤となる治療剤または栄養補助組成物を製造するための組成物。
【請求項２９】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている少なくとも二種の阻害性物質の精製物を含む組成物を、胃腸器系における感染症を予防または治療するための薬物の製造に用いる方法。
【請求項３０】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む、肺における疾患の予防または治療に用いるための組成物。
【請求項３１】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む、ヒトの治療に用いるための組成物。
【請求項３２】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む、動物の治療に用いるための組成物。
【請求項３３】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている少なくとも二種の阻害性物質の精製物を包含する、胃腸器系における感染症の予防または治療に用いるための栄養補助組成物または栄養補助剤。
【請求項３４】
プロバイオテック微生物またはプレバイオテック化合物を更に包含することを特徴とする、請求項３３に記載の栄養補助組成物または栄養補助剤。
【請求項３５】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む組成物をろ過材の一部として用い、液状の食物、飲料および水から病原体をろ過により除去する方法。
【請求項３６】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む組成物を用いる診断方法。
【請求項３７】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質であって、食物または飼料の質を向上させるための添加剤となる治療剤または栄養補助組成物を製造するための阻害性物質。
【請求項３８】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を少なくとも二種包含する乳児用ミルク。
【請求項３９】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を少なくとも二種包含する食品保存料。
【請求項４０】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む組成物を食品の表面に被覆することを特徴とする、食品の安全性を向上させるための方法。
【請求項４１】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を少なくとも二種包含する口腔衛生製品。
【請求項４２】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を少なくとも二種包含する口腔衛生製品。
【請求項４３】
該製品が、練り歯磨、うがい薬、タブレットおよびチューインガムからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項４１または４２に記載の口腔衛生製品。
【請求項４４】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されているオリゴ糖配列を少なくとも一種包含する局所用製品、洗剤または化粧品。
【請求項４５】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている、異なる種類のオリゴ糖配列を少なくとも二種包含する、局所用製品、洗剤または化粧品。
【請求項４６】
練り歯磨、うがい薬、タブレットおよびチューインガムからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項４４または４５に記載の局所用製品、洗剤または化粧品。
【請求項４７】
請求項１、７〜１７および２７のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を、生体外における病原体の非診断的阻害または凝集に用いる方法。
【請求項４８】
該病原体がE. coliであることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
グリコシダーゼ酵素の阻害剤を疾病の治療用薬物の製造に用いる方法であって、該グリコシダーゼ酵素は患者の糖結合体を加水分解して病原性因子に対する中性多糖レセプターを露呈させ、露呈された中性多糖レセプターは下記式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列を含み、該病原性因子は真菌、ウイルス、毒素または細菌であることを特徴とする方法。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u      （Ｉ）
（式中、ｐ、ｒ、ｓおよびｕは各々独立に０または１の整数であり、ｙは３位または４位の結合位置を表し、ｚは３位または４位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
ｐが１であり、且つ、ｙが３である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、ｒは１であり；
ｐが１であり、且つ、ｙが４である場合には、HexはGlcβであり、ｒは１であり；そして
ｐが０であり、且つ、ｚが４である場合には、HexがGalβであり、且つ、ｒが１であるか、あるいはHexがGalαであり、且つ、ｒが０である。）
【請求項５０】
該グリコシダーゼ酵素の阻害剤が、α−シアリダーゼ、α−フコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、エンド−β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼからなる群より選ばれる一種または数種のグリコシダーゼを阻害することを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該露呈された中性多糖レセプターが、糖脂質または糖タンパク質の一部であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
該オリゴ糖配列が、下記式からなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
Galβ4Glc, GalNAcβ4Galβ4Glc, Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glc,
Galα4Galβ4GlcNAc/Glc, Galβ3GlcNAc, Galβ4GlcNAc,
Galα3Galβ4GlcNAc/Glc, GalNAcα/β3Galβ4GlcNAc, そして
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc/Glc。
【請求項５３】
該病原性因子がウイルスであることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
該ウイルスがヒトインフルエンザウイルスまたはロタウイルスであることを特徴とする、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該病原性因子が毒素であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
該毒素が、シガトキシン、シガ様トキシン、Escherichia coli由来の熱不安定毒素またはClostridium difficile由来のトキシンＡであることを特徴とする、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
該疾病が、尿路感染症、慢性表在性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、ヒトの胃における非ホジキンリンパ腫、胃腺癌、心臓病、皮膚病、肝臓病、膵臓病、乳幼児突然死症候群またはClostridium difficileに起因する下痢であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
該病原性因子が、Streptococcus pneumoniae、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas auruginosa、Pseudomonas cepacia、Xanthomonas maltophilia、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter pyloriおよびStaphylococcus aureusからなる群より選ばれる細菌であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
該グリコシダーゼ酵素の阻害剤が、オセルタミビル、ザナミビルまたはRWJ-270201であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
該疾病が、インフルエンザに関連した二次感染症であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
インフルエンザに関連した該二次感染症が肺炎であることを特徴とする、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
該疾病が、該患者の胃腸器系に存在するヘリコバクター ピロリに起因する疾病であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
医薬的効果を生じる量のグリコシダーゼ酵素阻害剤を患者に投与することを包含する、病態の治療方法であって、
該阻害剤は請求項２または１１で定義されている糖含有阻害性物質であり、
グリコシダーゼ酵素は患者の糖結合体を加水分解して病原性因子に対する中性多糖レセプターを露呈させ、露呈された中性多糖レセプターは下記式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列を含み、該病原性因子は真菌、ウイルス、毒素または細菌であることを特徴とする方法。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u      （Ｉ）
（式中、ｐ、ｒ、ｓおよびｕは各々独立に０または１の整数であり、ｙは３位または４位の結合位置を表し、ｚは３位または４位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
ｐが１であり、且つ、ｙが３である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、ｒは１であり；
ｐが１であり、且つ、ｙが４である場合には、HexはGlcβであり、ｒは１であり；そして
ｐが０であり、且つ、ｚが４である場合には、HexがGalβであり、且つ、ｒが１であるか、あるいはHexがGalαであり、且つ、ｒが０である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明においては、患者における糖結合体の分解によって病原性因子に対するレセプターが形成される病理生物学的過程について説明する。レセプターとは、糖タンパク質や糖脂質などの天然の糖結合体に提示された特定の中性オリゴ糖配列である。病原性因子としては、細菌、真菌、ウイルスまたは毒素が挙げられる。本発明は、上記病原過程によって生じる疾患および病態を治療するための組成物および薬剤を開示する。特に本発明は、ヘリコバクター ピロリに対する新規なオリゴ糖レセプターの形成を阻害するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全てでなくとも大部分の病原体は動物細胞表面の特定のオリゴ糖配列に結合する。動物細胞は、細胞表面に対する結合を阻害するために、細胞表面のグリコシル化、特に糖鎖の末端のグリコシル化の変化を試みる。本発明は、病原体は保護修飾を除去するために特定のグリコシダーゼ酵素を用いることを教示する。更に本発明は、動物細胞表面の糖結合体の分解を防止し、その結果、病原性因子の付着を防止するためのグリコシダーゼ酵素の阻害剤の使用に関する。
【０００３】
中性であり且つ比較的希少な数種のオリゴ糖配列が動物およびヒトの糖結合体に提示されている。アシアロ−ＧＭ１グリコスフィンゴ脂質（Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCer）およびアシアロ−ＧＭ２グリコスフィンゴ脂質（GalNAcβ4Galβ4GlcβCer）の糖配列は、多くの病原体、例えば、肺に存在する多くの病原性細菌や、ロタウイルスといったウイルス、に対する公知のレセプターである。
【０００４】
Krivanらの米国特許第5,386,027号（1995年1月）および第5,217,715号（1993年6月）は、アシアロ−ＧＭ１およびアシアロ−ＧＭ２をいくつかの病原性細菌の阻害に用いることを開示している。また、これらの特許出願は、インフルエンザウイルスによる脱シアリル化が未置換のレセプターであるGalNAcβ4Galを生成する病原メカニズムも示唆している。しかし、このような構造体においてGalNAcがシアリル化されることは知られておらず、Galがα３位でシアリル化された場合には、この構造は立体障害性によって大部分のシアリダーゼに対して耐性となる。他の構造体の脱シアリル化、例えば、ＧＭ１ｂ（NeuNAcα3Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCer）の末端Galの脱シアリル化の方が起こる可能性が高い。これらの糖配列もウイルス、例えばロタウイルス、に対するレセプターである(Delorme et al., 2001）。しかしながら、グリコシダーゼ酵素阻害剤の使用に関する記載はない。
【０００５】
ラクトシルセラミドも病原性細菌に対する一般的なレセプターであり、病原性酵母に提示されている細胞表面多糖に結合することが証明されている。ヒトインフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、ムンプスウイルスおよび狂犬病ウイルスなどの数種のウイルスは、ラクトシルセラミドであるGlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer、Galα3/4Galβ4Glcβ1CerおよびGalβ3/4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cerに対するセンダイウイルスの結合（Karlssonらの米国特許第4,859,769号, 1989年8月）に例示されるように、四糖までのオリゴ糖の配列を含む糖脂質に結合する。Jimenezらの米国特許第5,242,800号（1993年9月）は、ラクトシルセラミドが病原性真菌に対するレセプターであることを開示している。オリゴ糖配列であるGalα-、GalNAcα/β-およびGlcNAcβ-3Galβ4GlcNAcは、Clostridium difficile由来のトキシンＡに対するレセプターである（Teneberg et al., 1996）。糖鎖であるGlcNAcβ3Galβ、Galβ3GlcNAc、Galβ3/4GlcNAcβ3Galβ4GlcおよびGalβ4Glcβは、Streptococcus pneumoniaeに対する潜在的なレセプターとして知られている（Andersson et al., 1986）。本願と同じ出願人による他の特許出願（FI20010118）は、C. difficileに対するレセプターに類似した糖配列を有する、ヘリコバクター ピロリに対する新規な中性オリゴ糖レセプターを開示している。ヘリコバクター ピロリはラクトシルセラミド、アシアロ−ＧＭ１−ガングリオシドおよびアシアロ−ＧＭ２−ガングリオシドに結合することも知られている。しかし、上述の研究は、いずれもグリコシダーゼ酵素の阻害剤の使用とは何ら関連がない。
【０００６】
通常、天然の糖結合体はグリコシダーゼ酵素によって生分解される。動物およびヒトの単糖残基を開裂する特異的なグリコシダーゼが知られている。動物およびヒトの他にも、グリコシダーゼは酵母、植物、ウイルスおよび細菌にも存在する。病原体のグリコシダーゼは、病原体自身の代謝消費作用に用いる炭水化物を遊離させるために、ヒトまたは動物の糖結合体を開裂すると考えられている。グリコシダーゼ反応を阻害するための多くの阻害性分子が報告されており、その大部分は酵素または細胞を用いた生化学的実験における効果が確認されている。
【０００７】
ヘリコバクター ピロリは、慢性胃炎、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）関連胃疾患、十二指腸や胃の潰瘍、胃ＭＡＬＴ悪性リンパ腫および胃腺癌を含む、様々な胃腸器系やその他の臓器の疾患との関連が知られている（Axon, 1993; Blaser, 1992; DeCross と Marshall, 1993; Dooley, 1993; Dunn et al., 1997; Lin et al., 1993; Nomura と Stemmermann, 1993; Parsonnet et al. 1994; Sung et al., 2000; Wotherspoon et al., 1993）。全体的にまたは部分的に胃腸疾患ではない疾患としては、乳幼児突然死症候群（Kerr et al., 2000 および米国特許第6,083,756号）、自己免疫性胃炎や悪性貧血などの自己免疫疾患（Appelmelk et al., 1998; Chmiela et al, 1998; Clayes et al., 1998; Jassel et al., 1999; Steininger et al., 1998）、ある種の皮膚病（Rebora et al., 1995）、膵臓病（Correa et al., 1990）、腺癌を含む肝臓病（Nilsson et al., 2000; Avenaud et al., 2000）およびじゅく状硬化症などの心臓病（Farsak et al., 2000）が挙げられる。ヘリコバクター ピロリが原因であるかまたは関連する様々な疾患について検討されている（Pakodi et al., 2000）。細菌のコロニー形成および感染において最も興味深い事柄は、細菌が胃粘膜の上皮細胞表面に付着するメカニズムである。
【０００８】
糖脂質および糖タンパクを含む糖結合体、例えば、シアリル化糖結合体（Evans et al., 1988）、サルファチドおよびＧＭ３（Saitoh et al., 1991）、Ｌｅb決定基（Boren et al., 1993）、ポリグリコシルセラミド類（Miller-Podraza et al., 1996; 1997a）、ラクトシルセラミド（Angstrom et al., 1998）およびガングリオテトラオシルセラミド（Lingwood et al., 1992; Angstrom et al., 1998）などは、上記微生物を結合するレセプターとして機能することが報告されている。ヘリコバクター ピロリに対するその他の潜在的なレセプターには、多糖硫酸へパリン（Ascensio et al.., 1993）のみならず、リン脂質ホスファチジルエタノールアミン（Lingwood et al., 1992）も含まれる。
【０００９】
Zopfらの米国特許第5,883,079号（1999年3月）、第5,753,630号（1998年5月）および第5,514,660号（1996年5月）には、ヘリコバクター ピロリの結合を阻害する物質としてNeu5Acα3Gal-を含有する化合物が記載されている。シアリル−ラクトース分子はヒト胃腸器系細胞株に対するヘリコバクター ピロリの結合を阻害し（Simon et al., 1999）、アカゲザルの感染モデルにおいても効果を示した（Mysore et al., 2000）。この化合物は臨床試験中である。本願は付着阻害性オリゴ糖の用途とは何ら関連がない。
【００１０】
Krivanらの米国特許第5,446,681号（1995年11月）は、細菌のレセプターと抗生物質の結合体であって、アシアロガングリオシドとペニシリン系抗生物質との結合体を含むものを開示している。特にこの特許では、アモキシシリン−アシアロ−ＧＭ１結合体によるヘリコバクター ピロリの処置を請求している。しかしながら、上記特許発明は、グリコシダーゼ酵素阻害剤の用途を開示していない。
【００１１】
ヒトインフルエンザウイルスのシアリダーゼ（またはノイラミニダーゼ）酵素に対するいくつかの阻害剤、例えばGlaxo-Wellcome社のザナミビルおよびHoffmann-La Roche社のオセルタミビル（タミフル）がインフルエンザに対する薬剤として市販されており、新規な阻害剤であるRWJ-270201（Biocryst社）が後期臨床試験中である（Gubareva et al., 2000; Babu et al., 2000）。これらの阻害剤は、ウイルス粒子が感染細胞から離れるのを防止することで、ウイルス増殖を阻害すると報告されている。インフルエンザウイルスの他のタンパク質であるヘマグルチニンは、ターゲット細胞のシアリル化レセプターに結合することが知られており、脱シアリル化は、複製したウイルスが細胞を離れる際のレセプターの除去においてのみ必要であると考えられている。いくつかの中性ウイルスレセプターが開示されている（Karlssonらの米国特許第4,859,769号）。近年の研究には、脱シアリル化細胞の感染に関する報告もあり、これは脱シアリル化レセプターが細胞表面に提示されている可能性も示している。本発明は、シアリダーゼ阻害剤を用いたインフルエンザ関連二次細菌感染の予防について開示するが、シアリダーゼ阻害剤は、インフルエンザのシアリダーゼが細胞表面の糖結合体を脱シアリル化して病原性細菌に対する中性レセプターグリカンを形成するのを阻害する。
【００１２】
インフルエンザウイルスによる感染は屡々細菌感染と関連し、細菌（例えば肺炎発症性の肺病原体）はインフルエンザウイルスに感染したことのある細胞に特によく感染することが示されている（Davidson, et al., 1981; Plotkowski, et al., 1986）。シアリダーゼの役割は示唆されていたものの、露呈された潜在的なレセプターエピトープは特定されておらず、シアリダーゼ阻害剤の使用についても示唆されていない（Plotkowski, et al., 1986）。本発明においては、この相互病因論を少なくとも部分的に説明する。インフルエンザウイルスのシアリダーゼ酵素と細菌由来グリコシダーゼは、細胞表面の糖結合体を開裂して中性レセプターを露呈させる。インフルエンザに関連した死亡率の大部分は、実際は二次細菌感染症によるものであり、ナーシングホームにいる老人にとって特に危険である。複合感染に対する現行の治療は未だ十分に効果的ではなく、例えば、ワクチンによる防御（および屡々その供給）には限界がある。
【００１３】
グルコシダーゼ酵素阻害剤は、現在、英国、Oxford Glycosciences社によって糖脂質蓄積症に対する臨床試験が行われており、ゴルジ体でα−マンノシダーゼ酵素を阻害するスワンソニン類似体は、カナダ国、Glycodesign社によって癌治療薬物として研究されている。細胞内プロセスに関与するこれらのグリコシダーゼ阻害剤は、病原体付着阻害剤としては研究されていない。
【００１４】
発明の概要
本発明は、少なくとも１種の糖含有阻害性物質（glycoinhibitor substance）を感染症の治療用薬物の製造に用いる方法であって、該糖含有阻害性物質はピラノース環構造またはそれを模倣した単糖（monosaccharide mimetic）を含み、該ピラノース環構造は、GlcNAcβ, GalNAcβ, Galβ, Galα, GalNAcα, Fucα, ManαおよびNeu5Acαからなる群より選ばれるものであり、
所望により、下記式（Ｉ）で表される少なくとも１種のオリゴ糖配列を該糖含有阻害性物質と共に用いることを特徴とする方法に関する。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u      （Ｉ）
（式中、ｐ、ｒ、ｓおよびｕは各々独立に０または１の整数であり、ｙは３位または４位の結合位置を表し、ｚは３位または４位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
ｐが１であり、且つ、ｙが３である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、ｒは１であり；
ｐが１であり、且つ、ｙが４である場合には、HexはGlcβであり、ｒは１であり；そして
ｐが０であり、且つ、ｚが４である場合には、HexがGalβであり、且つ、ｒが１であるか、あるいはHexがGalαであり、且つｒが０である。）
【００１５】
また、本発明は、グリコシダーゼ酵素の阻害剤を疾病の治療用薬物の製造に用いる方法であって、該グリコシダーゼ酵素は患者の糖結合体を加水分解して病原性因子に対する中性多糖レセプターを露呈させ、露呈された中性多糖レセプターは下記式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列を含み、該病原性因子は真菌、ウイルス、毒素または細菌であることを特徴とする方法に関する。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u      （Ｉ）
（式中、ｐ、ｒ、ｓおよびｕは各々独立に０または１の整数であり、ｙは３位または４位の結合位置を表し、ｚは３位または４位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
ｐが１であり、且つ、ｙが３である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、ｒは１であり；
ｐが１であり、且つ、ｙが４である場合には、HexはGlcβであり、ｒは１であり；そして
ｐが０であり、且つ、ｚが４である場合には、HexがGalβであり、且つ、ｒが１であるか、あるいはHexがGalαであり、且つ、ｒが０である。）
【００１６】
発明の詳細の説明
本発明は、多くの細菌およびウイルスに対するレセプターとして機能する、動物及びヒトの細胞の中性非シアリル化オリゴ糖配列に関する。全てでなくとも大部分の病原体は動物細胞表面の特定のオリゴ糖配列に結合する。病原体の付着による進化的な圧力は、そのような付着を防止するために、動物細胞にその細胞表面のグリコシル化構造、特に末端構造、を変化させる。本発明は、保護修飾を除去し、より一般的なオリゴ糖レセプターグリカンエピトープを作製するために病原性因子は、特定のグリコシダーゼ酵素を使用しうることを教示する。本発明は、特に可溶性タンパク質型の病原性因子の阻害に関する。可溶性タンパク質型の病原性因子は、病原体に対するレセプターを形成するためにヒト上皮炭化水素を分解しうるグリコシダーゼ酵素であることが好ましい。他の一つの好ましい態様においては、可溶性病原性因子は、ヒト組織に結合し、毒性を含む有害な影響を及ぼす植物レクチンであり、植物レクチンは具体的には毒性植物レクチンである。三番目の好ましい態様においては、可溶性タンパク質型病原性因子は非植物体由来の毒性レクチン、好ましくは細菌由来の毒性レクチンまたはタンパク質毒素、あるいは動物由来の毒性レクチンである。病原性因子は真菌、ウイルスまたは細菌であってもよく、これらの微生物病原性因子の阻害は、グリコシダーゼ酵素阻害剤または本発明の特定の糖含有阻害性物質の阻害作用、または病原体の付着の直接阻害によって達成される。本発明はin vivo および ex vivo における特定の用途に関する。本発明は、病原性因子に対する中性グリカンレセプターの形成を妨げることで、病理学過程によってもたらされる疾患および病態を治療するためのグリコシダーゼ酵素阻害剤の使用について説明する。
【００１７】
病原性因子に対するレセプター：  病原性因子に対するレセプターの一般的な特徴は、レセプターが中性であり、グリコシダーゼによるヒトまたは動物の糖結合体の分解によって形成されることである。この中性レセプターは、グリコスフィンゴ脂質のコア領域または一般的なポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの主鎖に存在するか、血液型のＡ型抗原またはＢ型抗原の脱フコシル化体として存在する。病原体がグリコシル化反応における保存領域をその結合のターゲットとすることは有益であると考えられる。多くの糖結合体は、シアル酸による酸性の修飾を含むか、フコシル化されており、おそらく病原体による進化的な圧力のために、これらの修飾はより最終的なものであり且つ多様である。このような酸性糖配列またはフコシル化配列、およびこれらの配列に対する病原体の特異的な結合メカニズムは、本発明の特定の態様には含まれない。上述のフコースやシアル酸からなるおとりは、コアとなる中性グリカンエピトープを病原性因子の結合から保護することを進化において意図されたものであると考えられ、病原性因子と共にグリコシダーゼが存在することはこの保護を壊すと考えられる。レセプターに共通の構造的特徴は、主要な結合エピトープとしてラクトース（Galβ1-4Glc）および／または２型Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）が存在することであり、これら２つの配列は、必要とされる厳密な結合特異性に基づいて、ガラクトース残基の３位または４位に単糖またはオリゴ糖を修飾することができる。レセプターの異型には、主要な結合構造として、構造的に類似する１型Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-3GlcNAc）を有するものもある。
【００１８】
ラクトシルセラミドも病原性細菌およびウイルスに対して共通のレセプターである。グリカンに結合する病原体に関する綿密な初期の研究は、ラクトシル配列への結合は多くの（主として病原性）細菌（Bacteroides、Clostridium、Shigella、FusobacteriumおよびYersinia属のいくつか、ならびにSalmonella typhimurium、E. coli、Campylobacter jejuni、Haemophilus influenzae、Pseudomonas aeruginosa、Vibrio choleraeおよびNeisseria gonorrheae）およびある種の毒素に共通することを示す。置換ラクトース残基を有する長い結合エピトープ（以下に詳細に説明する）は、病原性因子の特異性により許容されるラクトシル（Galβ4Glcβ）に特異的な修飾であると考えられる（Karlsson, 1989）。Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ4GlcNAcβ）配列に対して見出されたより新しい特異性は、グリカンの真の主鎖配列に対する結合の異型として認められる。
【００１９】
ラクトシルセラミドは、病原性酵母に提示される細胞表面多糖に結合することも示されている（米国、alfa-beta tech. inc.）。Jimenezらの米国特許第5,242,800号（1993年9月）はラクトシルセラミドが病原性真菌に対するレセプターであることを開示している。
【００２０】
糖配列であるGalα4Galβ4Glcβは、Shigella dysenteriaeのシガトキシン、Escherichia coliのシガ様トキシン（ベロ毒素）および尿路病原性E. coliに対するレセプターである。これらの毒素は出血を伴った下痢を生じ、この糖はＨＵＳ（溶血性尿毒症症候群）に対する第三相臨床試験が最近始まった（カナダ国、Synsorb inc.）。一方、尿路病原性E. coliは尿路感染症を生じる。
【００２１】
中性であり且つ比較的希少な数種のオリゴ糖配列が動物およびヒトの糖結合体に提示されている。アシアロＧＭ１グリコスフィンゴ脂質（Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCer）およびアシアロＧＭ２グリコスフィンゴ脂質（GalNAcβ4Galβ4GlcβCer）の糖配列は、多くの病原性因子、例えば、肺に存在する多くの病原性細菌や、ロタウイルスといったウイルス、に対する公知のレセプターである。Krivanらの米国特許第5,386,027号（1995年1月）および第5,217,715号（1993年6月）は、いくつかの病原性細菌を阻害するためのアシアロＧＭ１およびアシアロＧＭ２の用途について開示する。
【００２２】
ヒトインフルエンザウイルス、ロタウイルス、レオウイルス、ムンプスウイルスおよび狂犬病ウイルスなどの数種のウイルスは、ラクトシルセラミドであるGlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer、Galα3/4Galβ4Glcβ1CerおよびGalβ3/4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cerに対するセンダイウイルスの結合（Karlssonらの米国特許第4,859,769号, 1989年8月）に例示されるように、四糖までのオリゴ糖の配列を含む糖脂質に結合する。オリゴ糖配列であるGalα-、GalNAcα-またはβ-およびGlcNAcβ-3Galβ4GlcNAcは、Clostridium difficile由来のトキシンＡに対するレセプターである（Teneberg et al., 1996）。糖鎖であるGlcNAcβ3Galβ、Galβ3GlcNAc、Galβ3/4GlcNAcβ3Galβ4GlcおよびGalβ4Glcβは、Streptococcus pneumoniaeに対する潜在的なレセプターとして知られている（Andersson et al., 1986）。本願と同じ出願人による他の特許出願（FI20010118）は、C. difficileに対するレセプターに類似した糖配列を有する、ヘリコバクター ピロリに対する新規な中性オリゴ糖レセプターを開示している。
【００２３】
本発明は、ヘリコバクター ピロリに結合する特定の新規なオリゴ糖配列のファミリーにも関する。これらの新規な中性オリゴ糖レセプター、その類似体およびそれらの用途については同じ出願人によって出願中の特許出願「ヘリコバクター ピロリに対する新規受容体およびその用途」（FI20010118）に記載されている。そこに記載されているレセプターのうち、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galβ4GlcNAc、GalNAcα3Galβ4GlcNAc、Galβ3Galβ4GlcNAcおよびGalα3Galβ4GlcNAcを含む天然のレセプターは、長いオリゴ糖構造が分解されて作製されたレセプターであり、特に本発明で注目しているものである。
【００２４】
レセプターは次の配列を有する糖脂質として特徴付けられている：
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerおよびGalα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer。しかし、類似の配列も糖タンパク質に提示されている。結合エピトープは、活性を有する五糖からなる糖脂質の末端三糖エレメントを含むことが示され、少なくとも大きな繰り返しＮ−アセチルラクトサミンにおいては、結合エピトープは糖鎖の中央に存在してもよい。本発明者らは、結合エピトープが多様な形で天然のまたは生合成された糖結合体やオリゴ糖（例えば、糖タンパク質においてＯ−結合またはＮ−結合を有するグリカン中のオリゴ糖）あるいはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンオリゴ糖に提示されうることを見出した。エピトープの類似性は糖脂質の分子モデリングによって判明した。
【００２５】
グリコシダーゼ：  本願において、「グリコシダーゼ」という用語は、（非還元末端から）単糖を切り離すことができる酵素（即ち、エキソグリコシダーゼ）、あるいはオリゴ糖鎖および／または糖結合体からオリゴ糖を切り離すことができる酵素（即ち、エンドグリコシダーゼ）を意味し、放出された糖は、例えば二重結合によって、修飾することができる。患者の糖結合体から切り離される単糖は、シアル酸（ノイラミン酸）であることが好ましく、D-Neu5Ac、D-Neu5Gc、L-Fuc、D-Gal、D-GlcNAcおよびD-GalNAcであることがより好ましく、α-D-Neu5Ac、α-L-Fuc、β-D-Galおよびβ-D-GlcNAcであることがさらに好ましく、Neu5Acが隣接している単糖残基にα3-、α8-またはα6-結合していること（Neu5Acα(2-3)- など）が最も好ましい。Fucはα2-、α3-またはα4-結合しており、Galはβ3-またはβ4-結合しており、GlcNAcはβ3-またはβ6-結合している。エキソグリコシダーゼ酵素は好ましくは、上記の結合を１個以上有する単糖を切り離すことが可能なシアリダーゼ；Ｎ−アセチルノイラミニダーゼ、α−フコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ；あるいはβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである。エンドグリコシダーゼ酵素、例えばエンド−β−ガラクトシダーゼまたはエンド−β−アセチルグルコサミニダーゼは、好ましくはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンを切り離す。中性レセプターエピトープは、スルファターゼ酵素によって硫酸化糖結合体からも切り離すことができ、このような過程はスルファターゼ酵素に対する阻害剤によって阻害することができる。
【００２６】
グリコシダーゼ酵素阻害剤：  エキソグリコシダーゼに対するグリコシダーゼ酵素阻害剤は、通常、エキソグリコシダーゼ酵素によって切り離される末端単糖の類似体である。このような類似体は、グリコシダーゼ反応の遷移状態を模倣することで酵素と強固な結合を示しうる。例えば、ノジリマイシンや単糖のラクトン類似体が挙げられる。グリコシダーゼ酵素によって切り離された遊離の単糖や、それと同じアノマー構造を有する単糖を末端に含んだオリゴ糖やその誘導体（α−またはβ−アノマー構造を有する遊離の還元単糖は、通常、どちらも水溶液中に存在する）までもを競争阻害剤として用いることもできるが、１ミリモルから数百ミリモルといった高濃度が必要になる。オリゴ糖は単糖よりも効果が高い。本発明に従って単糖またはオリゴ糖を用いる場合には、レクチンまたはレクチン様レセプターをブロックするための抗付着性化合物として用いるのではなく、病原性因子に対する中性オリゴ糖レセプターをグリコシダーゼ酵素が形成するのを阻害するための阻害剤として用いる。また、阻害剤は、グリコシダーゼによって開裂することのできないグリコシド結合を有する単糖誘導体、例えばグリコシド結合中の酸素原子が硫黄原子で置換されているか（チオグリコシド結合）、炭素原子で置換されている（Ｃ−グリコシド結合）類似体が挙げられる。このようなグリコシド結合の類似体を有するオリゴ糖もまたグリコシダーゼ酵素阻害剤である。エンドグリコシダーゼ阻害剤は、オリゴ糖がエンドグリコシダーゼによって開裂される中央部分に、上記のような加水分解できない結合を導入することで作製することができ、例えばGalβ4GlcNAcβ3Galβ-S-4Glc（-S-はＯ−グリコシド結合の代わりのチオグリコシド結合である）はエンド−β−ガラクトシダーゼ型酵素に対する潜在的な阻害剤である。
【００２７】
グリコシダーゼ酵素阻害剤としては、2,3-無水-2-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac2en、DANA）（Kopitz et al., 1997）、パラ-アミノフェニル-β-D-チオガラクトピラノース（McGee と Murray, 1986）、N-(n-ブチル)-デオキシガラクトノジリマイシン（Platt et al., 1994）、デオキシガラクトノジリマイシンおよびデオキシフコノジリマイシン（1,5-ジデオキシ-1,5-イミノ-L-フシトール）（Winchester et al., 1990）が挙げられ、これらは、例えば米国、ラ ホーヤ、Calbiochem社より入手できる。また、2-アセタミド-1,2-ジデオキシノジリノマイシン（Woynarowska et al., 1992）および2-アセタミド-2-デオキシ-D-グルコノ-1,5-ラクトン（Sasaki et al., 1997）は、カナダ国、アルバータ州、ノースヨーク、Toronto Research Chemicals社より入手できる。更に、D-ガラクトン酸 ガンマ-ラクトン（D-ガラクトノ-1,4-ラクトン）（Huber と Brockbank, 1987）（実際の活性型はおそらくD-ガラクトノ-1,5-ラクトン）は米国、セントルイス、Sigma社より入手できる。その他のグリコシダーゼ酵素阻害剤とその合成方法については、C.-H. Wongの米国特許第5,461,143号に記載されている。種々のグリコシダーゼ酵素阻害剤とその用途についても、例えば、次の論文およびその参考文献に記載されている：Huber と Brockbank, 1987; Kumar et al., 1981; Nohle et al., 1985; Schreiner et al., 1985。シアリダーゼ阻害剤を新規な抗インフルエンザ薬とする医薬用途は検討されている（Gubareva et al., 2000; Babu et al., 2000）。
【００２８】
ターゲット細胞：  ヘリコバクター ピロリが結合するターゲット細胞は主としてターゲット組織（特に胃腸器系）の上皮細胞であり、潜在的なターゲット組織としては、例えば、肝臓や膵臓が挙げられる。ターゲット組織のグリコシル化は病原体による感染によって変化すると考えられる。ターゲット細胞はターゲット組織の悪性細胞、形質転換細胞または癌化／腫瘍細胞でもよい。形質転換細胞または組織は異なる形のグリコシル化反応を発現し、細菌に対するレセプターを提供する場合がある。レクチンまたは糖類が糖タンパクまたは糖脂質からなるレセプターの糖質と結合すること（炭水化物−炭水化物間相互作用）によって細胞が活性化され、癌化／悪性細胞の場合には、これは癌の増殖または転移につながる。本願に記載のオリゴ糖エピトープのいくつか、例えば、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc（Hu, J. et al., 1994）、Galα3Galβ4GlcNAc（Castronovo et al., 1989）ならびに悪性細胞由来の中性シアリル化ポリラクトサミン（Stroud et al., 1996）は、癌関連抗原または癌抗原として報告されている。ヘリコバクター ピロリは胃リンパ腫とも関連する。本願で開示する物質はヘリコバクター ピロリの前癌状態または悪性の細胞に対する結合および癌の増殖および転移を防止するために用いることができる。結合阻害は胃がん、特にリンパ腫を治療する可能性がある。
【００２９】
ターゲット細胞には血液細胞、特に白血球が含まれる。消化性潰瘍と関連するヘリコバクター ピロリ株、例えば、本発明で主として用いた株は、オプソニン作用を受けていないにもかかわらず、顆粒球による炎症反応を刺激した（Rautelin et al., 1994a,b)。細菌の食作用において最初に起こる事柄は特定のレクチン様相互作用を含み、その結果、顆粒球の凝集が生じる（OfekとSharon, 1988)。食作用に続いて酸化的バースト反応が生じるが、これはヘリコバクター ピロリ関連疾患の病因を導くものとも考えられる（Babior, 1978)。
【００３０】
微生物の病原性株の特異的制御：  本発明の具体的な目的は、ウイルス、毒素、細菌または真菌の集団中の、病原関連中性オリゴ糖レセプターに結合する副次集団を阻害または抑制することである。このような副次集団は具体的には病原性因子である。しかし、同種のウイルス、毒素、細菌または真菌であっても、別の種類のものは中性レセプターに結合せず、一般的には、正常状態においてはレセプターが置換残基で保護されている主要な正常集団に対しては、少なくとも低い病原性または非病原性の因子である。抗体を用いた現行の治療では、無害または有益な種も含む、複数の微生物種および微生物株を完全に除去してしまう。いわゆる正常な細菌叢を形成する微生物の大部分はヒト（または動物）に必要な共生生物であり、食物消化を促進し、重要な補因子およびビタミンを産生し、重症病原体の付着または増殖を阻害する。有益な細菌の全集団が破壊されてしまうことが、一般的な抗生物質または非特異的な予防接種を用いた現行の化学療法の主要な欠点である。したがって、本発明は、微生物の病原性株の制御を目的とする。
【００３１】
ヘリコバクター ピロリは種々のオリゴ糖配列に結合することが知られている。特定の株による特異性はより共生的な相互作用であり、癌や重度の病態に進行することはない。癌型糖エピトープへの結合に関する本願のデータは、本願で開示する物質が病原性の相互作用も防止することが可能であり、その際、他のレセプター構造に結合した病原性の低いヘリコバクター ピロリ株の中には影響を受けないものもあることを示した。従って、細菌の完全な除去はヘリコバクター ピロリ関連疾患の予防には必ずしも必要ない。病原性の低い細菌は、消化管に存在する病原性ヘリコバクター ピロリ株の定着を防止することができるので、プロバイオティックな効果を発揮することも考えられる。
【００３２】
本発明によると、本願で開示する物質を、所望により担体と共に医薬組成物に導入することができる。このような医薬組成物は、ヘリコバクター ピロリが患者の胃腸器系に存在することによって生じる病態の治療に有用であり、また、本願で開示する物質を用いたこのような病態の治療方法に用いることもできる。本発明によって治療することのできる病態の具体例としては、慢性表在性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、ヒトの胃における非ホジキン悪性リンパ腫、胃腺癌、ならびにある種の膵臓病、皮膚病、肝臓病、心臓病、乳幼児突然死症候群、自己免疫疾患（自己免疫性胃炎および悪性貧血を含む）ならびに非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）関連胃疾患などの、ヘリコバクター ピロリ感染によって生じる病態である。
【００３３】
本発明は、ヘリコバクター ピロリ感染によって生じる自己免疫疾患、例えば胃炎および悪性貧血、の予防を特に目的とする。自己免疫過程においては、壁細胞と呼ばれる特定の胃上皮細胞が破壊される。この現象がヘリコバクター ピロリ感染と関連することが分子擬態法によって示唆されていたが、この発表は、近年、著者自らによって否定されている。本願においては、壁細胞がフコースおよび／またはシアル酸を開裂するグリコシダーゼ酵素などの加水分解因子と接触すると、本発明者らが開示した新規なポリラクトサミンレセプターが、ヒト壁細胞のシアリル化および／またはフコシル化オリゴ糖ポリラクトサミン（ならびに他の種が壁細胞上に特異的に発現するポリラクトサミン）から形成されうることを見出した。ヘリコバクター ピロリとの直接的な結合は、ヘリコバクター ピロリの酵素による壁細胞膜タンパク質、特にプロトンポンプ、の修飾およびタンパク質分解を可能にし、その結果、潜在的な自己抗原エピトープを生成する。自己抗原性エピトープは、ヘリコバクター ピロリタンパク質の一部に類似するペプチドを含む。本発明は、胃壁細胞に提示されるレセプターの形成を阻害することにより疾患を特異的に予防する方法を示す。自己免疫状態は、胃上皮の病的変化および癌の形成をも導くと考えられる。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、他の物質、例えば不活性なベヒクルまたは医薬的に許容される担体や保存剤などの公知の物質を包含してもよい。
【００３５】
本願で開示する物質または医薬組成物は、適当な方法で投与すればよく、経口投与が好ましい。
【００３６】
本願において「治療」とは、疾患または病態を治癒または改善するための治療と、疾患または病態の発症を予防するための治療の両方を意味する。治療は急性的または慢性的に行うことができる。グリコシダーゼ酵素阻害剤を他の薬物、例えば病原性因子となる細菌、ウイルスまたは真菌に対して使用されている公知の抗生物質、と共に投与することができる。胃のｐＨを制御する薬物には、特定のプロトンポンプ阻害剤であるオメプラゾール、エソメプラゾール、ランソプラゾールおよび他のｐＨ調節剤（例えば、ラニチジンなど）が含まれる。
【００３７】
グリコシダーゼ酵素阻害剤を、レセプターオリゴ糖あるいはその類似体または誘導体と共に用いることが好ましい。グリコシダーゼ酵素阻害剤を、上記の中性オリゴ糖レセプターおよび／またはその誘導体か類似体と共に用いることがより好ましい。このように用いることによって、ターゲット細胞上の活性オリゴ糖レセプターの形成を妨げ、レセプター活性配列を有する残存糖質体に対する結合を妨げる。
本明細書で説明する病原メカニズムおよび治療は、家畜およびペットを含む動物、より好ましくは哺乳類にも適用できる点に注目すべきである。しかしながら、ヒトと比べて動物の組織特異的グリコシル化、感染病原性株および種には屡々違いがある。本願において「患者」とは、本発明による治療を必要とするヒトまたはヒト以外の哺乳類である。
【００３８】
インフルエンザウイルスによる感染は屡々細菌感染と関連し、細菌（例えば肺炎発症性の肺病原体）はインフルエンザウイルスに感染したことのある細胞に特によく感染することが示されている（Davidson, et al., 1981; Plotkowski, et al., 1986）。シアリダーゼの役割は示唆されていたものの、露呈された潜在的なレセプターエピトープは特定されておらず、シアリダーゼ阻害剤の使用についても示唆されていない（Plotkowski, et al., 1986）。本発明においては、インフルエンザウイルスと肺病原体のこの相互病因論を少なくとも部分的に説明する。インフルエンザウイルスのシアリダーゼ酵素は、細胞表面の糖結合体を開裂して、他の病原性因子に対する中性レセプターを露呈させる。類似のメカニズムは、アシアロＧＭ１およびアシアロＧＭ２を病原性細菌の阻害に用いることを開示しているKrivanらの米国特許第5,386,027号および第5,217,715号において示唆されている。また、これらの特許出願は、インフルエンザウイルスによる脱シアリル化が未置換のレセプターであるGalNAcβ4Galを生成する病原メカニズムも示唆している。しかし、このような構造体においてGalNAcがシアリル化されることは知られておらず、Galがα３位でシアリル化された場合には、この構造は立体障害性によって大部分のシアリダーゼに対して耐性となる。他の構造体の脱シアリル化、例えば、ＧＭ１ｂの末端Galの脱シアリル化の方が起こる可能性が高い。本発明で開示するシアリダーゼ阻害剤の用途は、インフルエンザウイルス感染によって生じる細菌性肺炎の抑制、予防または治療に有用である。好ましい態様においては、ヒトインフルエンザウイルスに特異的なシアリダーゼ阻害剤、例えばザナミビルおよびタミフルならびにGubareva et al., (2000)で検討された類似の化合物を用いる。
【００３９】
また、本願で開示する物質を栄養補助組成物、例えば食品や飲料組成物、の一部として用いることができる。本願で開示する物質を機能性食品または機能化食品の一部として用いることが好ましい。機能性食品は、ヘリコバクター ピロリがターゲット細胞または組織に結合するのを阻害するか防止することでヒトまたは動物の健康に対して好ましい効果を示す。本願で開示する物質は既に知られている食品や機能性食品組成物の一部として用いてもよい。機能性食品は、専門機関、例えば米国ＦＤＡ、によって許可されている他の許容される食品材料を包含してもよい。本願で開示する物質は食品添加剤、好ましくは機能性食品を製造するための食品添加剤として用いることができる。胃腸器系に存在するグリコシダーゼの起源は食品、例えばアーモンドであり、多くの豆類はエキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼを含んでいる。グリコシダーゼ酵素阻害剤、好ましくは食品中のグリコシダーゼに特異的なグリコシダーゼ酵素阻害剤、をこのような食品に加えると、病原体に対するレセプターを産生する機能を低下させ、食品の質が向上する。天然型のグリコシダーゼ酵素阻害剤、例えばガラクトノラクトン、を用いるのが好ましい。
【００４０】
本願で開示する物質を乳幼児用の食品の一部、好ましくは乳児用ミルクの一部として用いることは特に有用である。多くの乳児は、ヒトの天然乳の代わりとして特別な処方のミルクを与えられている。ヘリコバクター ピロリは特に乳児および幼児に高い感染性を示し、この疾患を鑑みると、この段階で感染を予防することは妥当である。ヘリコバクター ピロリは乳幼児突然死症候群の原因となることが知られているが、バクテリアを一掃するための強い抗生物質を用いることは、特に幼児や乳児には不適切である。
【００４１】
また、本発明は、病原性因子、グリコシダーゼ、そして特にヘリコバクター ピロリや下痢発症性E. coliなどの細菌を阻害するための、本発明のオリゴ糖配列を用いた食品安全性向上製品にも関する。また、本発明は、病原体、有害なレクチンおよびグリコシダーゼを阻害するための、食品の安全性を向上させるための方法にも関する。
【００４２】
糖含有阻害性物質
本発明は、「糖含有阻害性物質」と命名した物質に関する。糖含有阻害性物質には、本願に記載した従来のグリコシダーゼ酵素阻害剤が含まれる。糖含有阻害性物質は、特に、ヒトまたは動物の胃腸器系に存在するグリコシダーゼ酵素の阻害を目的とする。特に標的となるグリコシダーゼは、以下の酵素群から選ばれるエキソグリコシダーゼである：β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-キシロシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、α-フコシダーゼ、α-マンノシダーゼおよびα-N-アセチルノイラミニダーゼ。糖含有阻害性物質型のグリコシダーゼ酵素阻害剤は、本願に記載したような多価の形態で用いることを目的としたものが好ましい。糖含有阻害性物質は、特に細菌による発病を予防するためのグリコシダーゼ酵素阻害剤を目的としており、病原体に対するレセプターを露呈させるグリコシダーゼの阻害によって予防を達成するものである。糖含有阻害性物質は、特に動物およびヒトの治療を目的としている。
【００４３】
他の態様においては、糖含有阻害性物質は、食物中の有害なレクチンの阻害を目的としている。更に他の一つの態様においては、本発明は、食物から炭水化物を遊離させる食物グリコシダーゼの阻害を目的としている。食物から炭水化物が遊離するのを妨ぐ糖含有阻害性物質は、食品のカロリー量を低下させるためのものである。本願に記載した全てのグリコシダーゼは、それらに対応する炭水化物構造を動物性食品やある種の植物性食品のみならず、酵母性食品においても分解することができる。このようにカロリー量を低下させるという用途においては、食品中の澱粉および／またはグリコーゲンの分解を妨げることのできる、アミラーゼ型酵素およびα−グルコースを切り離す他の酵素の阻害剤が好ましい。また、本発明は、特に、フルクトースおよび／またはフルクトースを遊離する酵素（例えば、ショ糖を分解するスクラーゼ型酵素）の阻害を目的とする。本願における糖含有阻害性物質は、糖含有阻害性物質が標的とする病原体の細胞付着に対する阻害剤としての付加的活性を有することが好ましい。糖含有阻害性物質は、細胞表面のグリコシダーゼ酵素が仲介する細胞付着を阻害するだけでなく、さらには、細胞付着性レクチンや付着因子に結合した、病原性細菌または他の病原因子の結合を阻害する場合もある。好ましい態様においては、糖含有阻害性物質は多価の結合体である。好ましい態様における多価の結合体は、糖含有阻害性物質の可溶性多価結合体である。本願における可溶性多価結合体は細胞表面のグリコシダーゼまたは病原性因子（好ましくは細菌）に提示されるレクチン／付着因子に結合することができ、病原性因子の他の結合相互作用を立体的に遮蔽する。
【００４４】
非還元ピラノース型単糖残基およびそれを模倣した単糖の用途
糖含有阻害性物質は単糖残基であることが好ましく、以下の群から選ばれる非還元ピラノース型単糖残基またはそれを模倣した単糖（単糖模倣物）であることがより好ましい：GlcNAcβ、GalNAcβ、Galβ、Galα、GalNAcα、Fucα、Manα、XylβおよびNeu5Acα。単糖は、グリコシダーゼ酵素の競争阻害剤および／またはレクチンまたは付着因子の阻害剤として機能する。
【００４５】
単糖模倣物
本願で開示する単糖模倣物（monosaccharide mimetics）には、グリコシダーゼ阻害剤として用いられる従来の単糖類似体が含まれる。模倣物は、一般的に、単糖残基よりもグリコシダーゼに対して高い親和性を有する。類似体を作製するための構造原理が当業界では多数知られている。単糖模倣物は、植物または細菌のグリコシダーゼ酵素によって認識されうる構造を含んでいる。単糖模倣物は、修飾アノマー炭素構造を有することが好ましい。修飾アノマー炭素構造は、Neu5Ac-2en（Ｃ２位およびＣ３位に二重結合が存在するN-アセチルノイラミン酸類似体）またはＣ１位がカルボン酸型のラクトンに見られるような２重結合構造を有することが好ましい。二重結合構造の存在は、遷移状態のグリコシダーゼの類似体である阻害剤の作製を意図している。好ましい態様においては、このような類似体は、デオキシノジリマイシン型阻害剤（例えば、デオキシ−マンノノジリマイシン、デオキシガラクトノジリマイシンおよびデオキシグルコノジリマイシン）に見られるような１−デオキシ構造を含む。修飾した単糖模倣物の好ましい第三の態様は、単糖類似体であって、通常のグリコシド結合中の酸素原子の代わりに、炭素原子（Ｃ−グリコシド結合）、窒素原子（Ｎ−グリコシド結合）または硫黄原子（Ｓ−グリコシド結合）を有するものに関する。グリコシド結合がＣ−グリコシド結合またはＮ−グリコシド結合で置換されていることが好ましく、Ｎ−グリコシド結合で置換されていることがより好ましい。
単糖間には類似性があるため、類似体として使用する安価な単糖としては、Glcα、Glcβ、Xylα、FruβおよびFruαが好ましく、多くの認識反応においてManα-構造を模倣するGlcαおよびGlcNAcβ-構造を模倣するGlcβがより好ましく、軸配座ジヒドロキシル基を認識する反応においてはFruαも好ましい。フルクトースおよびグルコースの放出を阻害する糖含有阻害性物質は、特に食物からのエネルギー放出を阻害するのにも好ましい。
【００４６】
単糖からなる糖含有阻害性物質
糖含有阻害性物質が単糖よりも大きい場合、非還元ピラノース型単糖残基は、阻害することを目的とした物質の認識に関与する潜在的な天然レセプターに含まれる単糖の近傍に存在し、該単糖を模倣した構造体であるアグリコンに結合していることが好ましい。アグリコンの存在は、糖含有阻害性物質が天然のＯ−グリコシド結合を介して他の単糖に結合していないことを意味する。具体的な態様においては、アグリコンは糖含有阻害性物質を担体、好ましくは多糖またはオリゴ糖からなる担体、に結合させている非単糖スペーサーである。単糖残基は、そのＣ１位に結合していることが好ましく、他の結合位置も（特に多価の結合体の場合には）用いることができ、へキソピラノースのＣ６位に結合している構造体のような１級ヒドロキシル基を酸化して、例えばアルデヒドを誘導し、更なる誘導に備えることができる。アセタミド基を単糖を含むＮ−アセチル官能基を有するスペーサーアミド基に修飾するには、ある種の模倣物を形成すればよい。さらに好ましくは、アグリコン構造は、対応するオリゴ糖配列の隣に位置する単糖を部分的に模倣する多水酸基化合物である。好ましい態様において、多水酸基化合物は非炭水化物化合物であり、最も好ましい多水酸基化合物は、本明細書の式（ＩＩ）で表される可とう性の親水性リンカーである。糖含有阻害性物質には、本願に記載した部分オリゴ糖配列からなる多価の結合体および可溶性多価結合体が含まれる。単糖模倣物は、単糖残基のＣ１位に結合させることができ、他の結合位置も（特に多価の結合体の場合には）用いることができ、ヘキソピラノース類似構造中のＣ６位に結合している構造体のような１級ヒドロキシル基は酸化して、例えばアルデヒドを誘導し、更なる誘導に備えることができる。アセタミド基を単糖模倣物を含むＮ−アセチル官能基を有するスペーサーアミド基へ修飾することができる。
【００４７】
本発明の好ましい態様においては、糖含有阻害性物質は、GlcNAcβ、Galβ、Galα、FucαおよびManαからなる群より選ばれ、対応するオリゴ糖配列の隣に位置する単糖を部分的に模倣する多水酸基化合物に結合していることがより好ましい。さらに好ましい態様においては、糖含有阻害性物質は、GlcNAcβ、Galβ、FucαおよびManαからなる群より選ばれ、他の一つの好ましい態様においては、糖含有阻害性物質は、GlcNAcβ、FucαおよびManαからなる群より選ばれる。オリゴ糖の部分配列は低コストのオリゴ糖配列と共に用いることが好ましい。ピラノース型の糖含有阻害性物質は、少なくとも一種の本明細書で開示するオリゴ糖配列と共に用いることが好ましく、より好ましくは二種、最も好ましくは三種のオリゴ糖配列と共に用いる。他の一つの態様において、少なくとも二種の糖含有阻害性物質配列を少なくとも一種の本発明で開示するオリゴ糖配列と共に用いる。糖含有阻害性物質は、本発明に基づく治療方法、特に飼料および食物に関連した用途に用いることが好ましい。
【００４８】
本発明で使用するオリゴ糖または二糖
具体的な態様においては、本発明は、オリゴ糖を用いたグリコシダーゼまたはレクチンの阻害に関する。具体的には、本発明は天然または有効な合成法によって大量入手可能な低コストオリゴ糖に関する。一般的に、その値段ゆえに低コストオリゴ糖は、現行の食品分野において商業的に使用されている。本発明は、上記で単糖に関して説明したような、オリゴ糖の結合体にも関する。好ましい態様においては、オリゴ糖は多価の結合体として用いる。オリゴ糖からなる糖含有阻害性物質を用いる場合は、非還元性の糖含有阻害性物質であることが好ましい。末端単糖残基が還元されている場合には、結合活性炭水化物エピトープの外に位置するアグリコンまたはスペーサーとして用いる。このようなアプローチにおいては、少なくとも二糖からなるオリゴ糖を用いることが必要であり、そうすることによって非還元末端の単糖環構造がそこなわれずにすむと考えられる。
【００４９】
好ましい低コストオリゴ糖
本発明に用いる低コストオリゴ糖は、低コストの天然または人工の多糖であって、本発明で開示する末端単糖を含むものから製造されることが好ましい。好ましい態様においては、低コスト多糖は、主に一種の単糖残基からなるホモ多糖であり、他の一つの態様においては、低コスト多糖は、数種類の単糖残基からなるヘテロ多糖である。多くの植物由来多糖（例えば、植物樹脂やヘミセルロース材料）または細菌由来多糖は、キサンタンガム、アラビアガムまたはイナゴマメガム由来のオリゴ糖の原料として好ましい。末端ガラクトース残基を有する好ましい低コストオリゴ糖としては、還元ペクチンオリゴ糖、ラクトース、人工ガラクトースオリゴ糖、ヘミセルロース（好ましくは木材）由来のガラクトース配列、植物材料由来天然β−ガラクトン（例えば、Galβ4Gal-ポリマー）、アガロースやカラゲニンなどの材料から製造される、Galα3Galβ4Galα3Galβ4繰り返し単位からなる配列およびケラタン硫酸が挙げられる。
【００５０】
末端GlcNAcを有する好ましい低コストオリゴ糖としては、キチンオリゴ糖（GlcNAcβ4GlcNAcβ4GlcNAc-ポリマー）、人工GlcNAcβ-および／またはGlcNAcα-ポリマー、ケラタン／ケラタン硫酸オリゴ糖、ヒアルロン酸オリゴ糖、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヘパロサン／N-アセチルヘパランオリゴ糖（細菌のGlcNAcα4GlcAβ3-ポリマー）が挙げられる。
【００５１】
末端Manを有する好ましいオリゴ糖としては、植物マンナンオリゴ糖（例えば、Manβ4Manで表され、側鎖を有する可能性のある、ココヤシの実由来のマンナンが好ましい）、α-マンナン（例えば、酵母マンナン由来のものおよびリン酸マンナン（Manα2/3/6 Man））および人工マンノースオリゴマーが挙げられる。
【００５２】
シアリルオリゴ糖の好ましい原料としては、細菌により産生されたポリシアル酸が挙げられる。シアリルオリゴ糖の原料は、ポリマー状の配列であるNeu5Ac[α8Neu5Ac]n、Neu5Ac[α9Neu5Ac]n、またはα9-結合とα8-結合を交互に有し、人工シアル酸オリゴマーを有するNeu5Acが挙げられる。
【００５３】
フコシルオリゴ糖の好ましい原料としては、海草由来フコイダン、Fucα2Galを含む植物ヘミセルロースオリゴ糖および人工フコースオリゴマーが挙げられる。
【００５４】
好ましいGalNAc-オリゴ糖としては、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン、デルマタン硫酸が挙げられ、哺乳類（例えば、ウシ軟骨）の他にも、サメのような海洋動物材料も用いることができる。硫酸化されていない細菌のコンドロイチンで、付加的な単糖残基で分枝しているものや、人工GalNAcβ-および／またはGalNAcα-ポリマーも好ましい。
【００５５】
大部分、たぶん全てのオリゴ糖は、細菌原料から製造することが可能であるが、その全てが同定されたわけではない。細菌によるオリゴ糖の合成は、組換え遺伝子技術によっても達成できる。
【００５６】
末端Xylを有するオリゴ糖は、天然キシラン多糖（ヘミセルロースXylβ4Xyl-多糖）から製造するか、人工的に合成することができる。
【００５７】
好ましいフルクトースオリゴ糖類としては、イヌリン由来オリゴ糖または人工フルクトースオリゴ糖が挙げられる。
【００５８】
好ましいグルコースオリゴ糖としては、細菌、酵母または植物（例えばオート麦）由来のβ−結合グルカン類（Glcβ3/6Glc）および澱粉またはデキストランのオリゴ糖が挙げられる。
【００５９】
オリゴ糖は硫酸化またはリン酸化エステルを含んでいてもよく、これらは、グリコシダーゼ酵素と同様に本発明において標的となる、細菌表面に提示されているある種のレクチンおよび硫酸化またはリン酸化酵素に対するオリゴ糖の親和性を高める。さらに、硫酸化およびリン酸化エステルは、細菌表面に提示されている多くの付着因子およびレクチンに対する活性を高める。
【００６０】
人工オリゴ糖類は、有機化学的方法またはトランスグリコシル化グリコシダーゼ酵素によって製造できる。例えば、ガラクトースオリゴ糖は、ガラクトシダーゼによってラクトースから製造する。合成オリゴ糖のほとんどがホモオリゴ糖であり、これはオリゴ糖が実質的に一種類の単糖残基からなることを意味する。本発明の具体的な態様においては、ホモオリゴ糖は、α型またはβ型のいずれかの単糖残基を含み、他の一つの態様においては、ホモオリゴ糖は、（還元末端構造が変化する可能性を除いては）一種類のアノマー構造のみをからなるものである。
【００６１】
還元カルボン酸基を有するペクチンオリゴ糖の配列は、完全な還元型の場合にはGal[α4Gal]n（式中、ｎは１〜約１０の整数である）であるが、還元が部分的で、オリゴ糖がいくつかのガラクツロン酸残基を含んでいてもよい。より大きなオリゴ糖も用いることができるが、一般的にあまり効果的ではないことに注目すべきである。エステル型のペクチン(例えば、天然のメタノールエステル）を還元する方法やカルボジイミドによってペクチンを還元する方法が報告されている。大きなペクチン多糖は、例えば、化学的加水分解やペクチナーゼによる酵素的分解によってオリゴ糖に分解することができる。天然原料（例えば、植物のオクラ）由来のGalα4Galオリゴ糖配列、その類似体、または部分オリゴ糖配列が、本発明に開示の用途には好ましい。低コストの天然材料には、細菌によって産生されたポリシアル酸も含まれる。これらは、ポリマー状の配列であるNeu5Ac[α8Neu5Ac]n、Neu5Ac[α9Neu5Ac]nまたはα9-結合とα8-結合を交互に有するNeu5Acを有する。ポリシアル酸には鎖中結合性（intrachain binding）を有するものがあるので、特定の態様においては、ポリシアル酸を重合阻害剤として用いることを目的とする。多糖は、公知の方法でオリゴ糖または低分子量多糖に分解することができる。低コスト天然原料の中でも、酵母マンナンおよび／またはリン酸マンナンあるいはそれらから誘導したオリゴ糖が本発明に用いるのに好ましい。低コスト天然オリゴ糖配列は、特に食品および飼料の栄養補助に用いるのが好ましい。
【００６２】
一価の糖含有阻害性物質による病原性因子の阻害
糖含有阻害性物質を用いたアプローチは、合成にかかる費用を抑えることができる。通常その効果は、長いオリゴ糖配列を認識するレクチンまたは付着因子を阻害するために高い濃度で使用する際に発揮される。単糖は、一般的にオリゴ糖よりもずっと安価なので、本発明は、特にグリコシダーゼ酵素が仲介する細胞付着によって病原細胞が患者の組織に結合する際の細胞付着の阻害に関する。
【００６３】
本発明において「一価の糖含有阻害性物質」とは、例えば、グリコシド結合を有する単糖からなる一価の結合体であり、例えば、グリコシルアミン、グリコシルアミド、メチルグリコシドあるいはＮ−グリコシド、Ｃ−グリコシドまたはＳ−グリコシドを含む他のグリコシドが挙げられ、Ｃ−グリコシドまたはＮ−グリコシドがより好ましく、Ｎ−グリコシドが最も好ましい。
【００６４】
多価の担体および結合体
好ましい態様においては、本発明の糖含有阻害性物質は多価の担体に結合しており、より好ましくは、少なくとも二種の糖含有阻害性物質配列が結合している。特定の態様においては、少なくとも二種の異なる糖含有阻害性物質を同じ多価担体に結合する。多価担体は、好ましくは炭水化物担体（例えば多糖またはオリゴ糖）であり、好ましい態様においては、炭水化物担体は可溶性炭水化物担体である。好ましい態様においては、炭水化物担体は細菌由来の多糖である。
【００６５】
他の一つの態様においては、病原体阻害性の糖含有阻害性物質は粒状担体上に発現されている。粒状担体としては、炭水化物粒子、合成重合体粒子または細胞が好ましい。細胞は、細菌または酵母の細胞であることが好ましい。好ましい粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍの範囲内である。
【００６６】
多価結合体は、非抗原性および非免疫原性となるように設計されているものが好ましく、こうすることで結合体による免疫反応をわずかにするか、完全に抑える。多糖の他の好ましい特性には、多糖および／またはその分解産物の低毒性が含まれる。
【００６７】
細菌の阻害を目的とする多価結合体は、上皮に対する炭水化物結合特異性が表れないように設計する。炭水化物結合特異性を有すると、結合体は上皮に付着し、組織に対する病原体の病理的結合が増加する。
【００６８】
細菌の細胞外多糖（exopolysaccharide）または細菌の夾膜多糖が好ましく、特に非病原性細菌、例えば乳酸菌、の多糖が好ましい。本発明で開示する糖含有阻害性物質のいくつかは、細菌の多糖から見出されている。本発明は、糖含有阻害性物質を得るために、細菌の多糖、特に非病原性細菌（例えば乳酸菌）の多糖の工学的な改変にも関する。工学的な改変は、遺伝学的または化学的な多糖の修飾によって行うことが可能であり、例えば特異的加水分解やグリコシル基転移反応が挙げられる。本発明によると、本発明の糖含有阻害性物質を少なくとも二種含有する、細菌性多糖または細菌性多糖の混合物を用いることができる。より好ましくは、本発明の糖含有阻害性物質を少なくとも三種含有する、細菌性多糖または細菌性多糖の混合物を用い、他の態様においては、本発明の糖含有阻害性物質を少なくとも四種含有するものが好ましい。
【００６９】
好ましい態様においては、本発明は、化学合成した多価糖含有阻害性物質であって、糖含有阻害性物質構造が（好ましくはスペーサーまたは非酸素原子を介して）担体（好ましくは多糖）に多価またはオリゴ価となるように結合している。好ましい態様においては、糖含有阻害性物質は、本願に記載した非還元ピラノース型単糖残基である糖含有阻害性物質と結合したピラノースである。他の一つの態様は、本発明は、糖含有阻害性物質構造が（好ましくはスペーサーまたは非酸素原子を介して）単体（好ましくは多糖）に多価またはオリゴ価で結合している、多価のホモオリゴ糖含有阻害性物質に関する。
【００７０】
病原体を被覆し凝集させる可溶性多価結合体
好ましい多価結合体には、可溶性のまたはゲル形成性の多価結合体が含まれる。さらに好ましくは、多価結合体は可溶性であり、有害なタンパク質や細菌などの病原性因子の表面を被覆することができる。一種のタンパク質をターゲットにする場合には、細菌をターゲットとする場合よりも小さな結合体であることが好ましい。細菌を被覆する可溶性多価結合体の分子量は少なくとも５，０００ダルトンであることが好ましく、さらに好ましくは少なくとも１０，０００ダルトンであり、別の態様においては、少なくとも約２０，０００ダルトンである。いくつかの用途においては、結合体が胃粘膜で効果的に拡散するために、高分子量の結合体の使用は制限すべきである。多価結合体の分子量の上限は、３００，０００ダルトンが好ましく、１５０，０００ダルトンがより好ましく、５０，０００ダルトンが最も好ましい。さらに好ましい分子量範囲は約５，０００〜約５０，０００ダルトンであり、約１０，０００〜５０，０００ダルトンがより好ましく、約２０，０００〜約１００，０００ダルトンが最も好ましい。好ましい分子量は主鎖の構造にも依存する。分子量の限定においては、少なくとも約７０％の分子が所望の範囲にあることが好ましく、少なくとも８０％が所望の範囲にあることがさらに好ましい。グリコシダーゼが細胞表面に多価で提示されるか、低重合体である場合には、多価結合体は効果的なグリコシダーゼ酵素阻害剤でもある。
【００７１】
いくつかの種類の結合を阻害しなければならない場合、病原性因子の表面に拡散し、それを被覆する多価結合体は、特に病原性因子の阻害に効果的である。少なくとも一種の多価結合体が、現存する病原性因子の少なくとも一種が有する最も一般的な結合活性に対応する炭水化物を含んでいる。多価結合体による表面の被覆は、少なくとも一種の病原性因子の表面上の他の少なくとも一種の炭水化物結合レセプターを立体的に遮蔽する。立体阻害には適当な分子量が必要であり、一般的に、効果的な阻害には分子量が十分に高くなければならず、一方、いくつかの用途においては、可溶性炭水化物を効果的に拡散させるために、分子量は十分に低くなければならない。少なくとも二種の病原体を被覆する多糖を用いることが好ましい。より好ましくは、二種の異なるレセプターオリゴ糖配列が同じポリマーに結合している。
【００７２】
被覆性可溶性多価炭水化物は、一度にいくつかの病原性因子に結合して凝集体を形成し、この凝集体は、例えば肺または腸上皮で粘膜分泌と共に除去される。いくつかの病原体には、異なる種または株の病原性因子、あるいは同じ種、株または型の複数の細胞やタンパク質からなる病原性因子が含まれる。
【００７３】
最も好ましくは、可溶性多価結合体は多糖主鎖を有する。可溶性多価結合体の好ましい主鎖はキトサンである。本発明は、特に人工の糖含有阻害性物質に関し、糖含有阻害性物質は、キトサンに結合して多価またはオリゴ価の結合体を形成し、さらに好ましい態様においては、糖含有阻害性物質は以下のものを含んでいる。
１．本願に記載した少なくとも一種の非還元ピラノース型単糖残基またはその模倣物；および／または
２．少なくとも一種の本発明のホモオリゴ糖含有阻害性物質；および／または
３．少なくとも一種のヘテロオリゴ糖含有阻害性物質。
さらに好ましいキトサン結合体は、単糖残基またはその模倣物および／またはキトサンに結合したホモオリゴ糖を含む。好ましい態様においては、キトサン結合性糖含有阻害性物質は、本願で開示したスペーサーを介してキトサンに結合しており、別の態様においては、非酸素グリコシド結合を介しており、最も好ましくはＮ−グリコシド結合を介して結合している。好ましい態様においては、単糖およびオリゴ糖の少なくとも一種または両方を結合する。
【００７４】
本発明のex vivo における用途
本発明は、ex vivoにおける病原性因子の阻害に用いることができ、病原性因子には、グリコシダーゼ、レクチンおよび病原体（特にH. pyloriまたは下痢発症性E. coli）が含まれる。また、このような方法は、消毒および保存のために用いることもできる。このような態様においては、好ましくは単一物質の部分または単一物質そのものである本発明の糖含有阻害性物質、さらに好ましくは、少なくとも二種の本発明の糖含有阻害性物質を包含する組成物を、病原性毒素、レクチンまたはグリコシダーゼのみならず、細菌（好ましくは下痢発症性E. coli）までもを含む病原性因子を阻害するためにex vivoで用いる。本発明の多価結合体、特に病原性因子（好ましくは毒性レクチンまたは下痢発症性E. coli）を凝集することができる可溶性多価結合体が、ex vivoでの使用には好ましい。下痢発症性E. coliを標的としたさらに具体的な糖含有阻害性物質は、別の出願で開示している。
【００７５】
口腔における感染症および口腔衛生製品
本発明が標的とする感染症は経口、おそらく鼻から口腔への経路へも広がることが判明した。本発明は、ヒトの口に存在している感染症の阻害に関する。本発明は、少なくとも二種の異なる糖含有阻害性物質による口腔における感染症の治療に関し、糖含有阻害性物質は、病原体（好ましくは経口的に感染する細菌であり、さらに好ましくは下痢発症性細菌）の少なくとも二種の特異的結合を阻害するものである。口腔または鼻腔における感染症の予防のために、単一物質の部分または単一物質そのものとして本発明の糖含有阻害性物質を二種用いるか、本発明の糖含有阻害性物質を少なくとも二種包含する組成物として用いることが好ましい。本発明によると、本発明で開示したような糖含有阻害性物質は、組成物または個別の物質として、ヒトの口の中の病原体を阻害する製品（ここでは「口腔衛生製品」と称する）に用いる。
【００７６】
ヒトの口には、ヒトの腸と同様のレセプターが存在することが知られており、特にタンパク質上には、少なくともネオラクト−レセプター、マンノースレセプターおよび本発明の糖含有阻害性物質に類似した、フコースを有するオリゴ糖レセプターが存在することが知られている。別の態様においては、本発明の物質および組成物は、カリエスを発症する病原体を阻害するのにも有用である。具体的な態様においては、本発明は、経口的に広がる他の感染症、例えば、中耳炎を発症する感染症やインフルエンザ、気管支炎または肺炎を含む肺における感染症を治療するための本発明の組成物にも関する。本発明の口腔衛生製品は、カリエス、中耳炎、気管支炎および肺炎の治療を目的とすることもできる。
【００７７】
特に本発明は、病原体を阻害する糖含有阻害性物質、特に本発明で好ましい糖含有阻害性物質、を含む物質または組成物を包含する口腔衛生製品に関する。口腔衛生製品は、練り歯磨、うがい薬、口腔用タブレット、チュアブル錠およびチューインガムからなる群より選ばれることが好ましい。一価型の糖含有阻害性物質または多価型の糖含有阻害性物質のいずれかを用いることが好ましい。他の一つの態様においては、口腔衛生製品は、本発明の多価糖含有阻害性物質を包含する。ヒトの口のサイズおよび口腔表面に存在する唾液の容量を考慮すると、口腔において病原阻害性レセプターの飽和濃度に達するのに比較的少量の糖含有阻害性物質で十分である。レセプター活性一価エピトープの典型的な量は、レセプター活性糖含有阻害性物質として約１〜１，０００μｍｏｌの範囲内で変動する。別の態様においては、本発明の治療用組成物は、病原体を阻害するスプレー式点鼻薬にも関する。スプレー式点鼻薬は、中耳炎または肺における感染症の治療を目的としたものである。
【００７８】
局所用製品、洗剤および化粧品
一般的な病原体は、ヒトの肌、性器上皮、髪、日用品の表面およびヒトの環境中に存在する他の表面に広がりうることが知られている。本発明のオリゴ糖配列は、このように環境中に存在する病原体の阻害にも有用である。したがって、局所用製品または化粧品（例えば、クリーム、ローションまたはジェル）に、単一物質の部分または単一物質そのものとして本発明のオリゴ糖配列を用いるか、本発明の異なる種類の糖含有阻害性物質を少なくとも二種包含する組成物を用いることも好ましい。また、本発明の物質または組成物を、ヒトの肌、髪または性器上皮を洗浄するための製品（個人用衛生製品とも言う）や、日用品の表面、皿または衣服を洗浄するための製品に用いることも好ましい。従来の抗生物質は、日用品用の洗浄液に用いることを目的としているが、本発明の物質とは違って耐性の問題があるため有用ではない。好ましい態様においては、多価糖含有阻害性物質を洗浄液に用い、他の一つの好ましい態様においては、一価糖含有阻害性物質を洗浄液に用いる。洗浄液は家庭用または病院内と病院環境用であるか、食品の包装を洗浄するためのものであることが好ましい。別の態様においては、洗浄液は、病院環境にある医療器具、表面、繊維製品または患者の消毒用である。
【００７９】
食品または飼料、飲料、酒類および水に用いる食品安全性向上製品
ヒトまたは動物の治療方法の他に、本発明は、本発明で開示するレセプターおよび組成物を用いた感染の予防方法、即ち、本発明を用いて食品製品の内部または表面上の病原体や細菌を中和する方法に関する。例えば、病原性因子が広がるのを阻害するために、食肉生産の際に本発明の糖含有阻害性物質を食肉製品、動物の体または部分の表面に塗布することができる。細菌を被覆し凝集させるために可溶性結合体および他の多価結合体を用いることが好ましい。固体または半固体の食品製品の表面に用いる具体的な方法には、細菌に本願の糖含有阻害性物質を接触させ、所望により病原体と炭水化物との複合体を洗い流すことが含まれる。この種の方法には、従来の抗生物質を適用することはできない。本発明の糖含有阻害性物質は、液状食品製品、濃縮物または粉末、例えば、ミルク、液状ミルク様製品およびジュース、ソフトドリンク、スポーツドリンク、アルコール飲料などの種々の飲料に対応することもできる。
【００８０】
具体的な態様においては、多価の形態の本発明の糖含有阻害性物質を液状食品製品または飲料製品に対して使用し、潜在的な病原体を多価結合体によって凝集させ、凝集複合体をその大きさや溶解性に基づいた方法によって除去する。非可溶性の凝集物は、沈殿物として標準的な方法、例えば、凝集物の上に存在する溶液をデカンテーションする方法や、より一般的且つ効果的なろ過法で除去することができる。ろ過法は、大きな凝集複合体を除去するのに用いることができる。
【００８１】
本発明の糖含有阻害性物質で処理する好ましい食品としては、種々の動物性食品製品、特に食肉製品および加工途中の製品が含まれる。下痢発症性E. coliを含む多くの病原体は、実質的に、正しく洗浄されていない野菜、果物、サラダおよび他の植物性食品から伝播する。洗浄が必要であるにもかかわらず、正しく洗浄されていないか汚染された水で洗浄された食物は、発展途上国で特に問題となっている。本発明は、洗浄することが必要な植物性食品や他の食品の安全性を向上させるための方法であって、病原体、特に食品製品中の病原性E. coliの量を制御するための方法にも関する。特に本発明は、食品からの感染を防止するための、家庭用製品および食品工業用製品にも関する。このような製品は、加工中の食品に利用することができる、粉末状または錠剤状の固体製品か、本発明で開示するレセプターの溶液を内包するカプセルであることが好ましい。このような製品は、発展途上国で発生する下痢、特に子供の下痢の予防に用いることができる。食品安全性向上製品は、旅行者の下痢の予防も目的とする。食品安全性向上製品および以下に述べる飼料安全性向上製品は、新規な安全性向上保存料であると考えられる。
【００８２】
飲料および水を精製するためのフィルター製品
汚染された飲料および水は胃腸器系の疾患、特に下痢の主要な原因である。本発明で開示するレセプターは、液状食品、飲料および水（特に、飲料用および食品を作るための水）に存在する病原性因子、特に毒素、毒性レクチンまたは細菌を精製するためのフィルターの作製に用いることもできる。
【００８３】
少なくとも二種のレセプター構造を用いることが好ましい。フィルターを得るために糖含有阻害性物質を結合させる固相材料を、例えばセルロース、プラスチック、アガロースおよびそれに類似した材料から製造する方法は知られている。本発明のフィルターには、公知技術であるアフィニティークロマトグラフィー用の材料も含まれる。このようなフィルターから結合物を除去するための方法は公知であり、具体的な態様においては、フィルターは、汚染物質を除去し、所望により熱または他の滅菌方法により滅菌した後で、再生する。
【００８４】
飼料安全性向上製品
上記の食品安全性向上製品は、動物用の固体および液状飼料ならびに動物用の飲料水に用いることもできる。保護する動物として好ましいものは愛玩動物、特にネコとイヌ、および家畜または農場動物（例えばウシや他の反芻動物、ブタ、ヒツジ、ウマ、飼鳥類（例えば鶏、アヒルや七面鳥）およびウサギ）が含まれる。
【００８５】
水、食品および飼料の安全性の分析
本発明の糖含有阻害性物質を組み合わせた標準的な分析および診断方法は、水、飲料、食品および飼料に対応し、レセプター炭水化物に結合している病原体の存在を評価することができる。汚染病原体の結合特異性に関する知見は、感染患者の治療計画をたてる時や、上記の病原体を除去または制御して食品の安全性を向上させるための方法に適用することができる。
【００８６】
本発明によって阻害することのできる、炭水化物に基づく他の相互作用
異なる種類の付着因子の阻害の他にも、本発明は、炭水化物−炭水化物相互作用および炭水化物−レクチン相互作用の阻害に用いることもできる。
【００８７】
糖含有阻害性物質は、少なくとも一種の病原体および／または少なくとも一種の病原性因子に対するレセプターに結合することによって、少なくとも一種の病原性因子を阻害する。病原体を阻害する少なくとも二種の糖含有阻害性物質を用いることが好ましく、少なくとも三種の糖含有阻害性物質を用いることがより好ましい。他の好ましい態様においては、少なくとも四種、五種、六種または七種の糖含有阻害性物質を用いる。
【００８８】
具体的な治療においては、少なくとも一種の糖含有阻害性物質を異なる時期に別々に投与する。これは、特に全種類の糖含有阻害性物質の投与が正常な細菌叢に負の影響を与える場合に有用である。治療用組成物を別々に投与することは、胃腸器系において安全な本発明の糖含有阻害性物質の種類が胃腸器系の栄養状態の影響を受けることからも有用である。
【００８９】
本発明とプロバイオテック細菌を一緒に用いる方法
本発明を細菌の結合、特に複数の細菌の結合を阻害するために用いる場合、いくつかの有益な細菌の結合も阻害されることが考えられる。正常な細菌叢は、例えばヒト胃腸器系において、多くの重要な機能を有する。従来の抗生物質を用いると、正常な細菌叢の破壊は、より大きな問題となる。
【００９０】
他の態様においては、少なくとも一種、好ましくは少なくとも二種または少なくとも三種の糖含有阻害性物質を、プロバイオテック微生物および／またはプレバイオテック化合物と共に投与する。本発明においてプロバイオテック微生物とは、例えば食品の消化、栄養およびビタミンの提供または病原性細菌からの組織表面の被覆といった有益な機能を有する無害な細菌を意味する。プロバイオテック細菌には、正常細菌叢から選ばれる一種または多種の細菌あるいは全体が含まれることが好ましい。好ましい態様においては、プロバイオテック細菌には、少なくとも一種類または一株または一種（species）の乳酸菌が含まれる。
【００９１】
プレバイオテック化合物とは、正常な細菌叢またはプロバイオテック微生物を支える物質である。好ましいプレバイオテック化合物には、プレバイオテック炭水化物（例えばプレバイオテック化合物として用いられるガラクトースオリゴ糖、キシロースオリゴ糖またはフルクトースオリゴ糖）が含まれ、プレバオイオテック活性を有する多糖および繊維（例えばイヌリンまたは修飾した澱粉）も含まれる。本発明は、食品または栄養補助的目的のために用いられる他の多糖、例えばキトサンまたはβ−グルカン（例えばオート麦のグルカン）を用いてコレステロールおよび脂肪を減少させる方法にも関する。好ましい態様においては、非還元末端にβ−結合したガラクトース残基を有する炭水化物のようなプレバイオテック化合物のように機能するように、少なくとも一種の糖含有阻害性物質を選択する。好ましい治療の方法においては、
ａ）病原体および正常な細菌叢と考えられるものの一部を、少なくとも一種、さらに好ましくは少なくとも二種の本発明の糖含有阻害性物質を用いて初めに除去し、そして
ｂ）プロバイオテック微生物および／またはプレバイオテック化合物を投与する。
上記の第一および第二の工程は逆の順番で行ってもよく、好ましくは大量のプロバイオテック微生物および／またはプレバイオテック化合物を用いてから、第一の工程を行う。本発明によると、工程の順番を変えながら、第一および／または第二の工程を数回繰り返すこともできる。第一および第二の工程は同時に行ってもよい。本発明の物質は、プロバイオテック微生物および／またはプレバイオテック化合物と共に投与することができるが、プロバイオテック微生物および／またはプレバイオテック化合物を本発明の組成物に含ませることもでき、その場合、第一および第二の工程は同時に行うことができる。
【００９２】
栄養補助食品および栄養補助飼料への用途
さらに、食品および飼料を含む栄養補助組成物の一部として糖含有阻害性物質を用いることができる。栄養補助組成物、栄養補助食品または栄養補助飼料に、単一物質の部分または単一物質そのものとして本発明のオリゴ糖レセプター配列を用いることが好ましく、本発明の糖含有阻害性物質を少なくとも二種包含する組成物を用いることがより好ましい。病原性因子レセプター型の糖含有阻害性物質を物質または組成物として、いわゆる機能性食品または機能化食品の一部として用いることが好ましい。機能性食品は、病原性因子がターゲット細胞または組織に結合するのを阻害するか防止することでヒトまたは動物の健康に対して好ましい効果を示す。本発明の糖含有阻害性物質または組成物は既に知られている食品や機能性食品組成物の一部として用いてもよい。機能性食品は、専門機関、例えば米国ＦＤＡ、によって許可されている他の許容される食品材料を包含してもよい。本発明の糖含有阻害性物質または組成物は栄養補助添加剤、好ましくは食品または飲料添加剤として機能性食品または機能性飲料を製造するために用いることができる。食品または食品添加剤は、例えば、ウシやその他の家畜が多量の糖含有阻害性物質または組成物を天然にその乳に産生するようにすることで得ることもできる。これは、動物がその乳に適切なグリコシルトランスフェラーゼを過剰発現させることで達成される。家畜の特定の品種または種を選択し、糖含有阻害性物質または組成物を多量に産生するように交配することができる。栄養補助組成物または栄養補助剤のための糖含有阻害性物質または組成物は、バクテリアや酵母などの微生物によって製造することもできる。
【００９３】
別の態様においては、糖含有阻害性物質は、食物または飼料中の有害または毒性のあるレクチンの阻害も目的とする。例えばレクチンコンカナバリンＡは、ナタマメの動物用飼料としての価値を下げる。いくつかのレクチン、例えばリシンレクチンは毒性が非常に高い。本発明で阻害する植物のレクチンまたは毒素あるいは細菌の毒素は、末端にGlcNAc、Glc、Xyl、Fru、Gal、GalNAc、NeuNAc、ManまたはFucを含むオリゴ糖を認識するものが好ましい。さらに好ましい植物のレクチンまたは毒素あるいは細菌の毒素は、本発明の単糖含有阻害性物質、例えば次のオリゴ糖配列を認識するものが好ましい：ManαdMan、GlcαdGlc、Glcβ3Glc、Glcβ6Glc、GlcNAcβ6Gal(NAc)e、GlcNAcβ3Gal、GlcNAcβ4GlcNAc、GalNAcβ4GlcNAc、Galβ4GlcNAc、Galα3Galβ4Glc/GlcNAc、GalNAcβ3Gal、GalNAcα3Gal、Galβ3Gal、Galα3Galβ4Gal、Galα4Gal、NeuNAcα3Gal、NeuNAcα6Gal、Fucα2Gal、Fucα3GlcNAcまたはFucα6GlcNAc（式中、ｄは２、３または６であり；ｅは０または１である）。糖含有阻害性物質は、レクチンまたはトキシンに結合する構造と同じ配列であるか、該構造の末端部分を模倣するものである。
【００９４】
糖含有阻害性物質または組成物を乳幼児用の食品の一部、好ましくは乳児用ミルクの一部として用いることは特に有用である。多くの乳児は、ヒトの天然乳の代わりとして特別な処方のミルクを与えられている。このような処方はヒト乳に存在する特別なラクトースに基づくオリゴ糖を欠くことがある。シアリル化および／またはフコシル化糖含有阻害性物質は、本発明において病原体レセプターとして開示しているが、機能性食品および乳幼児用ミルクに用いることも好ましい。少なくとも二種の糖含有阻害性物質を組み合わせて用いることが好ましい。下痢発症性Escherichia coliは特に乳児および幼児に高い感染性を示し、この疾患を鑑みると、この段階で感染を予防することは妥当である。
【００９５】
摂取される機能性食品（例えば、調製した乳児用ミルク）に含まれるヒト乳中の糖含有阻害性物質の好ましい濃度は、天然のヒト乳に含まれるオリゴ糖の合計濃度と同じ程度であることが好ましい。また、機能性食品に用いる糖含有阻害性糖類の合計濃度が、天然のヒト乳中の、本願の糖含有阻害性物質または組成物と同じ末端単糖残基を有する糖類の合計濃度と同一か同程度となるように用いる。
【００９６】
乳幼児用ミルクは、本発明の物質または組成物のほかに、乳幼児用ミルクに用いる他の物質、例えば、反芻動物のミルクから得られた画分（例えば、ホエータンパク質）、大豆タンパク質調製物またはタンパク質加水分解物を含有する。乳幼児用ミルクは、乳幼児用ミルクに有用であるか許容される他の炭水化物、例えばラクトースオリゴ糖やガラクトースオリゴ糖、を含んでいてもよい。
【００９７】
糖脂質は、天然では多価の状態で細胞膜に提示されている。このような提示方法は後述する固相アッセイ法や糖脂質またはネオ糖脂質のリポソームを形成することで模倣することができる。
【００９８】
好ましい結合体
疎水性ヘキサデシルアニリンの還元的アミン化反応によって製造される本発明のネオ糖脂質は、オリゴ糖を効果的に提示することができた。細菌結合に用いられていた従来のネオ糖脂質の大部分は、フォスファチジル エタノールアミン ネオ糖脂質のフォスフォロエステルなどの負の電位を帯びた基を有している。このような化合物の問題点は、この物質の負の電位とリン脂質構造を含む天然の生物学的結合である。負の電位を帯びた分子はタンパクやその他の生物学的物質との多数の非特異的結合に関与することが知られている。さらに多くのこのような構造は不安定であり、酵素学的または化学的に分解されることがある。本発明は、オリゴ糖配列の非酸性結合体に関するものであり、これはオリゴ糖配列は非酸性化学構造に結合していることを意味する。非酸性結合体は中性の物質であることが好ましく、これは糖含有阻害性物質が中性の、電位を帯びていない化学構造体に結合しているか、正に電位を帯びたポリマー、例えばキトサン、に結合していることを意味する。多価結合体の負の電位は、化学修飾によってなくすことができる。糖含有阻害性物質は、その機能を発揮するために必要な負に電荷を帯びた置換基（例えばカルボン酸基、リン酸エステルまたは硫酸エステル）を含んでいる場合がある。本発明において好ましい結合体は、多価の物質である。
【００９９】
従来技術においては、生物活性を有するオリゴ糖配列は、レセプター活性型オリゴ糖構造の一部を還元することで担体に結合していることが多い。アルキル鎖（-CH2-)nおよび／またはベンジル環を含有する疎水性のスペーサーが用いられている。しかし、疎水性構造は、一般的にタンパクやその他の生物活性分子との非特異的相互作用に関与することが知られている。
【０１００】
後述する実施例で得られたネオ糖脂質に関するデータによると、アッセイに用いた実験条件においてはネオ糖脂質化合物のヘキサデシニルアニリン部分は、研究に用いた細菌に対する非特異的結合を起こさなかった。ネオ糖脂質においては、糖結合体のヘキサデシニルアニリン部分は脂質層状の構造を形成すると考えられ、結合のためには存在していない。本発明は結合エピトープに属する単糖残基を還元すると結合が破壊されることを示す。さらに還元された単糖は、レセプターエピトープと多価に提示された構造体とを繋ぐ親水性スペーサーとして使えることを見出した。本発明によると、生物活性を有する糖含有阻害性物質を親水性スペーサーを介して多価またはオリゴ価の担体分子に結合し、多価またはオリゴ価の構造体を形成することが好ましい。本願においては、多価構造体（１０個を超える糖含有阻害性物質を含むもの）およびオリゴ価構造体（２〜１０個の糖含有阻害性物質を含むもの）を全ての多価構造体というが、用途によっては大きな多価構造体よりもオリゴ価の構造体のほうが好ましい場合がある。親水性スペーサーは少なくとも１つの水酸基を含む。更に好ましいスペーサーは少なくとも２つ、最も好ましくは３つの水酸基を含む。
【０１０１】
本発明で用いる多価結合体として好ましいものは、糖含有阻害性物質を多価に提示する構造体に結合している親水性スペーサーが、好ましくは１つまたは複数の−ＣＨＯＨ−および／またはアセトアミド−ＮＨＣＯＣＨ3やアルキルアミドなどのアミド側鎖を含む可動性鎖である。水酸基および／またはアセトアミド基はin vivoにおける酵素的加水分解からスペーサーを保護する。「可動性」という用語は、スペーサーが可動性の結合を含み、可動性ではない環構造を形成しないことを意味する。本発明において還元的アミン化反応によって得られた還元単糖残基は、可動性親水性スペーサーの一例である。可動性親水性スペーサーはネオ糖脂質や多価結合体の非特異的結合を防止するために最適である。これは、例えば、医薬や機能性食品におけるバイオアッセイ及び生物活性において必須な最適活性である。
【０１０２】
可動性親水性リンカーを有する結合体は以下の一般式（２）で表される。
[GI-O-(X)n-L1-CH(H/{CH1-2OH}p1)-{CH1OH} p2-{CH(NH-R)} p3-{CH1OH}p4-L2]m-Z（２）
（式中、
Ｌ1およびＬ2は結合基あって、各々独立に酸素原子、窒素原子、硫黄原子または炭素原子である結合原子あるいは置換基を形成する結合に含まれる２つの原子を包含し、該置換基を形成する結合は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2−、−Ｎ−、−Ｎ（ＣＯＣＨ3）−、−ＣＯ−ＮＨ−または−ＮＨ−ＣＯ−で表されるアミド基、−Ｎ−Ｎ−（ヒドラジン誘導体）、あるいは−Ｏ−Ｎまたは−Ｎ−Ｏで表されるアミノオキシ結合などであり；
ＧＩは糖含有阻害性物質であり；
Ｘは所望のスペーサー炭水化物であり；
Ｌ1は該Ｘである単糖の還元末端のＣ１位に結合した結合基であり、ｎが０の場合には、Ｌ1は該Ｘの−Ｏ−を置換して、該ＧＩの還元末端のＣ１位に直接結合しており；
ｐ１、ｐ２、ｐ３およびｐ４は各々独立に０〜７の整数であるが、ｐ１、ｐ２、ｐ３およびｐ４の少なくとも１つが１であり；
｛ＣＨ1-2ＯＨ｝p1が分岐構造を表す場合には、末端基となるＣＨ1-2ＯＨはＣＨ2ＯＨであり、ｐ１が１を超える場合には、該末端基をスペーサーである該Ｙの残りの部分に結合させるための第二級アルコール基である−ＣＨＯＨ−が存在し；
Ｒは好ましくはアセチル基（−ＣＯＣＨ3）、Ｚに連結する結合またはＣ1-4アシル基（好ましくは親水性の基、例えばヒドロキシアルキル）を包含する類似体形成基であり、Ｒが結合である場合にはＬ2は糖鎖末端基の１つまたは２つの原子であり、該Ｃ1-4アシル基はアミド構造、水素原子またはＣ1-4アルキル基を形成するアミンであり；
ｍは１を超える整数であり；
Ｚは多価の担体である。）
【０１０３】
本発明においては、糖含有阻害性物質は多価の形態またはオリゴ価の形態で、免疫反応および潜在的なアレルギー反応を起こすことのない非タンパク質性または非ペプチド性の担体に結合していることが好ましく、担体の主鎖が非抗原性多糖であることがより好ましい。
【０１０４】
治療に関連した診断方法および分析方法
さらに、本発明の病原性因子結合性の糖含有阻害性物質を病原性因子によって生じる病態の診断に用いることができる。診断用途には、糖含有阻害性物質を用いた病原性因子の型の同定方法も含まれる。本願で開示した炭水化物レセプターの結合に関連した病原性因子の型の同定は、特定の病原性因子に対する治療用炭水化物の効果的な組み合わせを決定するために用いることができる。これは、局地的な感染症に特異的な低コストの治療法を作製するのに有用であり、主要な病原性因子の炭水化物結合プロファイルは、地理的位置の違いや伝染中に変わる場合がある。
【０１０５】
本願で用いる「精製物（purified fraction）」という用語は、天然または人工の原料から精製または単離したオリゴ糖である。好ましい態様においては、精製物に含まれる少なくとも一種の活性オリゴ糖配列を分析および／または調整し、所望により関連する他の炭水化物構造の量も分析した。精製物では、その原料に由来する不活性物質（例えばタンパク質、単糖前駆体、ラクトースまたは脂肪）の量が減少している。有害であると考えられる物質、例えば合成の際に混入した有害な化学物質、アレルゲン性タンパク質あるいは宗教的または食文化的理由から道徳上有害であると考えられる物質は、最終製品が無害であると考えられる水準まで除去する。医療用途のための好ましい精製物は、実質的に純粋（即ち、純度が９８％以上）であるか、関連のない物質が精製物の質量の半分未満となるように調整されている。関連のない物質は、精製物の質量の２０％未満であることがより好ましく、精製物の質量の５％未満であることが最も好ましい。本発明の好ましい態様においては、少なくとも一種の動物の乳から精製物を製造する方法は、乳タンパク質および／または乳脂肪を少なくとも部分的に除去する工程を包含する。精製には、ろ過法（例えばゲルろ過または限外ろ過）に加えて、乾燥および／または濃縮工程が含まれてもよい。非医療用途のための好ましいの精製物は、実質的に純粋であるか、関連のない物質が精製物の質量の９５％未満である。関連のない物質は、精製物の質量の７５％未満であることがより好ましく、精製物の質量の２５％未満であることが最も好ましい。精製物はそのものを用いてもよいし、所望の製品の他の成分と共に用いてもよい。
【０１０６】
本発明の目的は、炭水化物を認識および／または分解するタンパク質を阻害することであって、該タンパク質は、病原性因子、食品または飼料に由来するタンパク質や同様に有害な抗体（例えば、自己免疫抗体またはアレルギー抗体）である。本発明の目的は、炭水化物を認識する病原性タンパク質の除去、またはその働きを阻害することである。
【０１０７】
本発明は、病原性因子に対するレセプターとして機能するオリゴ糖配列の用途にも関する。オリゴ糖配列を糖含有阻害性物質と共に用いることで、糖含有阻害性物質が本願に記載した病原性因子や食物のグリコシダーゼによって分解されるのを阻害することができる。病原性因子の複数の結合特異性を同時に阻害するためにオリゴ糖配列と糖含有阻害性物質とを組み合わせたものは、少なくとも二糖エピトープを必要とするレクチン特異性を阻害するためのオリゴ糖を選択し、特定の単糖、あるいはその模倣物または類似体によって阻害することのできる結合特異性に対して糖含有阻害性物質を使用した際に、特に有用である。
【０１０８】
糖脂質および炭水化物の命名は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨する命名法（Carbohydrate Res. 1998, 312, 167; Carbohydrate Res. 1997, 297, 1; Eur. J. Biochem. 1998, 257, 29）に従った。
【０１０９】
Gal、Glc、GlcNAc および Neu5AcはＤ型であり、FucはＬ型であり、全ての単糖残基はピラノース環構造であるものとする。グルコサミンはGlcNまたはGlcNH2と示し、ガラクトサミンはGalNまたはGalNH2と示す。グリコシド結合は略記で示す場合と正式名称で示す場合とあり、Neu5Ac-残基のα３およびα６結合はそれぞれα２−３およびα２−６結合と同じである。他の単糖残基については、α１−３、β１−３、β１−４およびβ１−６結合はそれぞれα３、β３、β４およびβ６と略すことができる。ラクトサミンはＮ−アセチルラクトサミン（Galβ4GlcNAc）を示し、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）またはその他の天然のシアル酸を示す。本願においてグリカンという用語は、ヒトまたは動物に存在する糖結合体、特に糖脂質または糖タンパクに含まれるオリゴ糖や多糖鎖を広く包含する。脂肪酸と塩基の略記命名法においては、コロンの前の数字が分子の炭素数の長さを示し、コロンの後の数字が分子の二重結合の合計を示す。
【０１１０】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１１】
材料と方法
材料  −  ＴＬＣシリカゲル６０（アルミニウム）プレートはMerck製（ドイツ国、ダルムシュタット）である。実験に用いた全てのグリコスフィンゴ脂質は我々の研究室で得たものである。β−ガラクトシダーゼ（Escherichia coli）はBoehringer Mannheim社（ドイツ国）、ハムのＦ１２培地はGibco社（英国)、35Ｓ−メチオニンはAmersham社（英国）、そしてＦＣＳ（ウシ胎児血清）はSera-Lab社（英国）より購入した。β４−ガラクトシダーゼ（Streptococcus pneumoniae）、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（Streptococcus pneumoniae）およびシアリダーゼ（Arthrobacter ureafaciens）はOxford GlycoSystems（英国、アビントン）のものである。ヘリコバクター ピロリ臨床単離株（００２株および０３２株）はそれぞれ胃潰瘍および十二指腸潰瘍の患者から単離したものであり、スウェーデン国、エレブル医学センター（Orebro Medical Center）のD. Danielsson博士によって寄贈されたものである。基準株である１７８７５株はゲーテボルグ大学カルチャーコレクション（ＣＣＵＧ）のものである。
【０１１２】
グリコスフィンゴ脂質類  −  図７に示した実験に用いた純粋なグリコスフィンゴ脂質は、（Karlsson, 1987）の記載に従って、表２に示した原料の全酸性画分または全非酸性画分から得た。一般的に、個々のグリコスフィンゴ脂質は全グリコスフィンゴ脂質画分のアセチル化（Handa, 1963）によって得られ、シリル酸カラムクロマトグラフィを繰り返すことで分離し、次いでマススペクトル分析（Samuelsson et al., 1990)、ＮＭＲ（Falk et al., 1979a,b,c; Koerner Jr et al., 1983）および分解的手法（degradative procedures）（Yang Hakomori, 1971; Stellner et al., 1973）によって構造的に特徴付けた。ウサギ胸腺由来の糖脂質については後述する。
【０１１３】
糖脂質類の精製  −  酸性グリコスフィンゴ脂質類はウサギ胸腺のアセトン粉末（米国、アーカンソー州、ノースアーカンソー、Pel-Freeze製）１０００ｇから単離した。アセトン粉末はSoxhlet装置（Soxhlet Apparatus）によって、クロロフォルム／メタノール ２／１（特に記載がない限り容量比）を用いて２４時間抽出し、さらにクロロフォルム／メタノール／水 ８／１／１で３６時間抽出した。抽出した脂質２４０ｇはフォルチ分配（Folch et al., 1957）に付し、回収した親水性相はＤＥ２３セルロース（ＤＥＡＥ）（英国、メイドストン、Whatman製）によるイオン交換ゲルクロマトグラフィに付した。単離工程によって２.５ｇの酸性グリコスフィンゴ脂質が得られた。ガングリオシドはシアル酸の数に基づいて、イオン交換ゲルを用いたガラス製カラム（内径５０ｍｍ）によるオープン管状クロマトグラフィで分離した。カラムは、凹状のグラジエント（予めプログラムされているグラジエントｎｏ．４）を調製するＨＰＬＣポンプ（米国、カリフォルニア州、System Gold Chromatographic Software および Beckman Instruments Inc.製）につなぎ、グラジエントはメタノールで開始して、０．５Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＮＨ4のメタノール溶液で終了した。流速は４ｍｌ／分で各８ｍｌの画分を２００個回収した。３００〜４００ｍｇのガングリオシド混合物をそれぞれ５００ｇのDEAE Sepharose（CL6、ベッド高さ：約１３０ｍｍ）（スウェーデン国、ウプサラ、Pharmacia社）にアプライした。
モノシアル化ガングリオシドはシリカカラム（SH-044-10、３００ｍｍｘ２２ｍｍ（内径）、孔径：１２０Å、粒子径：１０μｍ）（日本国、京都府、Yamamura Ltd.製）を用いたＨＰＬＣでさらに分離した。約１５０ｍｇのモノシアル化ガングリオシドをそれぞれアプライし、直線的な溶出グラジエント（クロロフォルム／メタノール／水を６０／３５／８〜１０／１０／３、４ｍｌ／分、２４０画分）を用いた。
【０１１４】
部分酸加水分解  −  ガングリオシドの脱シアル化は、１００℃の１．５％ ＣＨ3ＣＯＯＨ水溶液中で行い、その後、得られた産物をＮａＯＨで中和し、窒素下で乾燥した。炭水化物骨格の部分分解には、沸騰水浴中で０．５Ｍ ＨＣｌを用いて７分間加水分解を行った。その後、得られた産物を中和し、Ｃ／Ｍ／Ｈ2Ｏ，（８：４：３，ｖ／ｖ）2で分配した。下相を回収し、窒素下で蒸発し、回収した糖脂質を分析に用いた。
【０１１５】
酵素加水分解による、ヘキサグリコシルセラミドからのペンタグリコシルセラミドの調製  −  ヘプタグリコシルセラミド（４ｍｇ、ウサギ胸腺由来)（構造１、表１）の酸性脱シアリル化（上記参照）によって得られたヘキサグリコシルセラミド（構造２、表１）をＣ／Ｍ（２：１）に再溶解し、小さなシリカゲルカラム（０．４ｘ５ｃｍ）にアプライした。このカラムはＣ／Ｍ／Ｈ2Ｏ（６０：３５：８，ｖ／ｖ）で溶出した。１本が約０．２ｍｌの画分を複数回収し、炭水化物の存在を試験した。回収したヘキサグリコシルセラミド(２．０ｍｇ）は１．５ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２（１．５ｍｇ／ｍｌタウロデオキシコレートナトリウム、０．００１Ｍ ＭｇＣｌ2およびβ−ガラクトシダーゼ（E. coli、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを基質として測定した活性が５００Ｕ）を含有）に溶解し、サンプルを３７℃で一晩インキュベートした。次に、Ｃ/Ｍ/Ｈ2Ｏ（１０:５:３）を用いて分画し、下相に含まれる糖脂質をシリカゲルクロマトグラフィ（０．４ｘ５ｃｍのカラム）を用いてヘキサグリコシルセラミドについて上述した方法で精製した。混入している界面活性剤を全て除去するために、クロマトグラフィを２回繰り返した。最終的に回収したペンタグリコシルセラミドは０．７ｍｇであった。
【０１１６】
糖脂質のエンドグリコシルセラミダーゼによる消化（ItoとYamagata, 1989）  −  反応混合物は、２００μｇの糖脂質、８０μｇのタウロデオキシコレートナトリウムおよび０．８ｍＵの酵素を１６０μｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものだった。サンプルは３７℃で一晩インキュベートし、その後、水（１４０μｌ）とＣ／Ｍ（２：１，容量比，１５００μｌ）を加え、振とうした後、遠心分離に付した。上相は窒素下で乾燥し、少量の水に再度溶解し、水で飽和させたSephadex G-25カラム（０．４ｘ１０ｃｍ）を用い、水で溶出することで脱塩した。１本が約０．１ｍｌの画分を複数回収し、そこに含まれる糖の存在を試験した。
【０１１７】
糖質のパーメチル化  −  パーメチル化はLarson et al., 1987に従って行った。NeedsとSelvendran 1993にて推奨されているように、ヨウ化メチルを加える前に水酸化ナトリウムをサンプルに加えた。いくつかの実験においては、糖質はメチル化の前にＮａＢＨ4で還元した。この場合、ヨウ化メチルの終濃度がＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド)／ヨウ化メチルが１：１となるようにヨウ化メチルの量を増加した（HanssonとKarlsson, 1990)。
【０１１８】
ガスクロマトグラフィー／マススペクトル分析  −  ガスクロマトグラフィーはｏｎ−カラム（on-column）インジェクターとフレームイオン化検出器を設置したHewlett-Packard 5890AシリーズIIガスクロマトグラフィー装置で行った。パーメチル化オリゴ糖は、架橋PS264（フィルム厚：０．０３μｍ）でコートされた溶融シリカキャピラリーカラム（１１ｍｘ０．２５ｍｍ（内径））（Fluka製）を用いて分析した。サンプルは酢酸エチルに溶解し、ｏｎ−カラムに８０℃で注入した。温度は８０℃から３９０℃に１０℃／分で昇温し、３９０℃に２分維持するようにプログラムされていた。パーメチル化オリゴ糖のガスクロマトグラフィー／マススペクトル分析はJEOL SX-102マススペクトルに接続されたHewlett-Packard 5890AシリーズIIガスクロマトグラフィー装置を用いて行った（HanssonとKarlsson, 1990）。ＦＡＢ-ＭＳ分析はJEOL SX-102マススペクトルで行った。陰イオンＦＡＢスペクトルはＸｅ原子砲撃（10 kV）およびマトリックスとしてトリエタノールアミンを用いて得た。
【０１１９】
ＮＭＲスペクトル分析  −  プロトンＮＭＲスペクトルは１１．７５ＴでJeol Alpha 500（日本国、東京、日本電子製）を用いて記録した。サンプルは分析前に重水素で置換しておき、スペクトルは３０℃において、デジタル解像度が０．３５Ｈｚ／ｐｔの条件下で記録した。化学シフトは内部溶液シグナルを用いてＴＭＳ（テトラメチルシラン）に対する相対値として示した。
【０１２０】
分析的酵素試験  −  Oxford GlycoSystemsの酵素試験を、終濃度が０．３％となるようにTriton X-100を各インキュベーション混合物に加える以外は製造者の推奨する方法に従って行った。シアリダーゼとβ４−ガラクトシダーゼの混合物を消化に用いる場合には、β４−ガラクトシダーゼキットのインキュベーション用緩衝液を用いた。β-ヘキソサミニダーゼが消化混合物に含まれる場合には、この酵素キットの緩衝液を用いた。インキュベーション混合物の酵素濃度は以下の通りである：Hexβ4HexNAc−ガラクトシダーゼ（S. pneumoniae）は８０ｍＵ/ｍｌ、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ（S. pneumoniae）は１２０ｍＵ/ｍｌ、シアリダーゼ（Arthrobacter ureafaciens）は１Ｕ/ｍｌ。基質の濃度は約２０μＭだった。酵素消化は３７℃で一晩行った。消化後のサンプルは乾燥し、Ｃ/Ｍ/Ｈ2Ｏ（６０:３０:４．５、容量比）で飽和させた小さなSephadex G-25（０．３ｇ）カラムで脱塩した（WellsとDittmer, 1963)。各サンプルは同じ溶媒２ｍｌに溶解したものをカラムにアプライし、２．５ｍｌのＣ/Ｍ/Ｈ2０（６０:３０:４．５）および２．５ｍｌのＣ/Ｍ（２:１）で溶出した。アプライした溶液および洗浄液を回収し、窒素下で蒸発させた。
【０１２１】
その他の分析方法  −  ヘキソースはDubois et al. 1956に従って検出した。
【０１２２】
脱−Ｎ−アセチル化  −  GlcNAc／GalNAc残基のアセトアミド成分のアミンへの変換は、公知の記載（Angstrom et al., 1998）に従って、種々のグリコスフィンゴ脂質を無水ヒドラジンで処理することで行った。
【０１２３】
細菌の培養  −  ヘリコバクター ピロリは１５％（容量比）のグリセロールを含有するトリプシン ソイブロス中で−８０℃で保存した。細菌は初めにＧＡＢ−ＣＡＭＰアガー（Soltesz et al., 1988）中で湿度９８％の微好気条件下（Ｏ2：５〜７％、ＣＯ2：８〜１０％およびＮ2：８３〜８７％）、３７℃で４８〜７２時間培養した。標識する際には、コロニーをＧＡＢ−ＣＡＭＰアガーに接種したが、図１に示した結果を得る際には代わりにブルセラアガー（ミシガン州、デトロイト、Difco製）を用いた。０．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．３で希釈した５０μＣｉの35Ｓ−メチオニン（英国、Amersham製）をプレートの上から振り掛けた。３７℃の微好気条件下で１２〜２４時間インキュベートした後、細胞をそぎ取り、ＰＢＳで３回洗浄し、１ｘ１０8ＣＦＵ／ｍｌとなるようにＰＢＳに再懸濁した。この方法の代わりに、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Sera-Lab製)を添加したハムＦ１２培地（英国、Gibco BRL製)にコロニーを接種した。標識には、培地１０ｍｌ当たり５０μＣｉの35Ｓ−メチオニンを添加し、振とうしながら微好気条件下で２４時間インキュベートした。細菌を遠心分離で回収し、培養物の純度と球状細胞が低濃度であることは位相差顕微鏡で確認した。ＰＢＳで２回洗浄した後、１ｘ１０8ＣＦＵ／ｍｌとなるようにＰＢＳに再懸濁した。いずれの標識方法で得られる懸濁液も、比活性がヘリコバクター ピロリ１００体あたり約１ｃｐｍとなった。
【０１２４】
ＴＬＣバクテリアオーバーレイアッセイ  −  クロロフォルム／メタノール／水 ６０:３５:８（容量比）の溶媒系を用い、ガラスまたはアルミで裏打ちされたシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（ドイツ国、ダルムシュタット、Merck製）で薄層クロマトグラフィを行った。化学的検出はアニサアルデヒド染色（Waldi, 1962)で行った。バクテリアオーバーレイアッセイは公知の方法（Hansson et al., 1985)で行った。グリコスフィンゴ脂質（１〜４μｇ／レーン、または図の判例に示した濃度）をアルミで裏打ちされたシリカゲルプレートによるクロマトグラフィに付し、ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン１：３（容量比）を用いた０．３〜０．５％ポリイソブチルメチルメタクリレート溶液で１分間処理し、乾燥した後、２％ウシ血清アルブミンと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳに２時間浸漬した。放射線標識された細菌（ＰＢＳで１ｘ１０8ＣＦＵ／ｍｌ、且つ１〜５ｘ１０6ｃｐｍ／ｍｌとなるように希釈したもの）をクロマトグラムに振り掛けて２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで繰り返し濯いだ。クロマトグラムを乾燥させた後、ＸＡＲ-５Ｘ線フィルム（米国、ニューヨーク州、ロチェスター、Eastman Kodak Co.,製）に１２〜７２時間露光した。
【０１２５】
結果
ヘプタグリコシルセラミドであるNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerはウサギ胸腺より上述した方法に従ってＨＰＬＣで精製した。構造は、ＮＭＲおよびマススペクトルで特徴付けた（データは示していない)。七糖ガングリオシドは、本願発明者らの試験した大部分の単離ヘリコバクター ピロリ株（約６０株）に結合した。
【０１２６】
ヘプタグリコシルセラミド材料中に存在する可能性のある微量の異性体成分を検出するために、ガングリオシドを脱シアル化し、エンドグリコセラミダーゼで処理し、その後、放出されたオリゴ糖をパーメチル化し、ガスクロマトグラフィおよびＥＩ／ＭＳで分析した（図１)。予想される炭水化物配列Hex-HexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hexを有する２つの糖質を六糖領域から同定し、それらをｍ／ｚ２１９、４６４、６６８、９１３および１１１８のフラグメントイオンによって確認した。メチル化の前に（ＮａＢＨ4による還元によって）炭水化物がアルジトールに変換された場合には、既に記載されているイオンの他に、はっきりとしたフラグメントイオンがｍ／ｚ２３５、６８４および１１３３に検出された（データは示さない)。全材料の９０％以上を占めた主要な糖質（ピークＢ、図１)は、ｍ／ｚ １８２に見られる強いフラグメントイオンによって特徴付けられ、β4GlcNAc（ネオラクト系列、２型炭水化物鎖）の存在を証明した。小さな糖質（ピークＡ、図１）は１型鎖（ラクト系列）の典型的なスペクトルを示し、ｍ／ｚ １８２の非常に弱いフラグメントイオンとｍ／ｚ ２２８の強いフラグメントイオンが検出された。調製物は、さらにトレース量のその他の糖陽性の物質を含んでおり、これは同じ系列の四糖含有糖類および五糖含有糖類である可能性がある。フコース含有糖類は混合物に存在しなかった。アシアロガングリオシドの純度はＦＡＢ／ＭＳおよびＮＭＲスペクトロスコピーで試験した。ヘキサグリコシルセラミドの陰イオンＦＡＢ／ＭＳ（図２Ａ）は予想した炭水化物配列を証明し、セラミド類は主としてスフィンゴシンとＣ１６:０脂肪酸（ｍ/ｚ ５３６．５）からなることを示した。ヘキサグリコシルセラミドに対して得られたＮＭＲスペクトル（図３Ａ）はβ−カップリングを有するアノマー領域（Ｊ〜８Ｈｚ）に対して４つの主要なダブレットを示した。これらの強度比は２:２:１:１であった。４．６５５ｐｐｍ（GlcNAcβ3)、４．２５６ｐｐｍ（内部Galβ4)、４．２０３ｐｐｍ（末端Galβ4）および４．１６６ｐｐｍ（Glcβ）はnLcOse6-Cerについて既に報告されている結果（Clausen et al., 1986）と符合していた。さらに小さなダブレットが４．８０４ｐｐｍに検出され、これは１．８１ｐｐｍの小さなメチルシグナル（大きな２型メチル共鳴の肩に見られるもの）と共に１型鎖の小さな画分の存在を示した。４．１５〜４．２５ｐｐｍの領域における重なりのために、この１型結合の位置と分布を決定することはできなかった。１型結合の全量は約１０％だった。ヘキサグリコシルセラミドをβ−ガラクトシダーゼで消化して得たペンタグリコシルセラミドに含まれる１型鎖も約５％（図３Ｂ）であり、１型結合は糖鎖内部領域および外部領域において均等に分布されている、即ち、糖脂質の約５％が１型−１型であると考えられる。
【０１２７】
糖脂質の結合活性が主要なネオラクト（２型）構造と関連しているかを調べるためにアシアロ−糖脂質をβ４−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミニダーゼで処理し、処理産物をＴＬＣおよびオーバーレイ試験によって検討した（図４）。予想した通り、最初の酵素はヘキサグリコシルセラミドをペンタグリコシルセラミドに変換し（Ａ、レーン３）、２つの酵素の混合物はラクトシルセラミドに分解した（Ｂ、レーン６)。ＴＬＣプレートを目視で観察したところ、いずれの反応も完全またはほぼ完全であった。同様の結果がシアリダーゼ処理産物および酸処理産物についても得られた。ヘキサグリコシルセラミドのβ４−ガラクトシダーゼ分解は、ＴＬＣプレート上の糖脂質の対応領域のヘリコバクター ピロリ結合活性の消失を伴い、同時にペンタグリコシルセラミド中の領域における強い活性の出現が見られた（Ｃ、レーン３）。更なるペンタグリコシルセラミドの酵素分解の結果、この領域における結合活性は消失した。四糖領域における結合活性の出現は見られなかった。ＴＬＣプレートの化学染色に対する感度は、全てのトレース量の物質を視覚化するには低かった。
【０１２８】
別の実験において、親ガングリオシドを部分酸分解に付し、放出された糖脂質のヘリコバクター ピロリ結合活性を検討した。図５は加水分解物のＴＬＣ（Ａ）と35Ｓで標識したヘリコバクター ピロリを加水分解物にオーバーレイしたオートラジオグラム（Ｂ）を示す。ヘキサ−、ペンタ−、テトラ−およびジ−グリコシルセラミド領域に位置する糖脂質は結合活性を示したが、トリグリコシルセラミドは不活性であった。
【０１２９】
少なくとも３種のヘリコバクター ピロリ株（１７８７５株、００２株と０３２株）で試験したヘキサ−、ペンタ−およびテトラ−グリコシルセラミドの結合活性は同等であった。
【０１３０】
ヘキサグリコシルセラミドから末端ガラクトースを外し、シリカゲルクロマトグラフィで精製した強い結合を示すペンタグリコシルセラミドについて詳細に検討した。この糖脂質の陰イオンＦＡＢ／ＭＳスペクトルから炭水化物配列がHexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hex-であることが確認され、ヘキサグリコシルセラミドと同じセラミド組成物が見られた（図２Ｂ）。ペンタグリコシルセラミドより得られたプロトンＮＭＲスペクトル（図３Ｂ）にはアノマー領域中に５つの主要なβ−ダブレット、即ち、４．６５３ｐｐｍ（内部GlcNAcβ3)、４．６１５ｐｐｍ（末端GlcNAcβ3)、４．２６１ｐｐｍ（２倍強度、内部Galβ4）および４．１６６ｐｐｍ（Glcβ）が検出された。これらはGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerと符合し、末端Galβを失った六糖化合物とも一致した。さらに小さなβ−ダブレットが、３置換GlcNAcβ（１型鎖）に対応する４．７８７ｐｐｍに検出された。予想したメチルシグナルはより大きな１．８２ｐｐｍのメチルシグナルの肩に見られたが、ピークの重なりがこれらシグナルの定量を妨げた。アノマープロトンの積分値から計算したところ、糖脂質の約６％が１型鎖であった。従って、２型と１型炭水化物鎖の相対比は六糖糖脂質のそれと同様であった。ヘキサグリコシル画分およびペンタグリコシル画分の両方についてＴＬＣプレートに見られる２つのスポットは、β４−ガラクトシダーゼに対する感受性から判断して、糖鎖の組成による差ではなくセラミドの多様性を反映していた。上方のペンタ領域のスポットは、アシアロガングリオシドの非選択的加水分解およびアシアロ産物からの４−結合ガラクトース選択的開裂の両方の場合に出現した。さらに、上方のクロマトグラフィ副画分を有するヘキサグリコシルセラミドをβ４−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミニダーゼで分解した場合には、得られるラクトシルセラミドは２つの明確なクロマトグラフィ上のバンドを示した。クロマトグラフィ上では相同なヘキサグリコシルセラミドは１つのラクトシルセラミドバンドについてのみ得られた。ペンタ領域の上方および下方の副画分はいずれもオーバーレイ試験で高い活性を示した。
【０１３１】
ネオラクト系列の六糖、五糖または四糖のグリコスフィンゴ脂質（構造２、４と５、表１）は、ＴＬＣオーバーレイ法による準定量試験によって試験した。糖脂質の希釈系列をシリカゲルプレートにアプライし、ヘリコバクター ピロリに対する結合を標識した細菌のオーバーレイおよびオートラジオグラフィ後に目視で評価した（図６）。最も活性の高い種はペンタグリコシルセラミドであり、少なくとも０．０３９ｎｍｏｌ/スポット（７回の実験の平均値、標準偏差はδn-1＝０．０１６ｎｍｏｌ）の陽性反応をＴＬＣプレート上で示した。ヘキサ−およびテトラ−グリコシルセラミドはそれぞれ約０．２と０．３ｎｍｏｌの糖脂質／スポットのヘリコバクター ピロリを結合した。
【０１３２】
試験した系列において、高次糖脂質類に対するヘリコバクター ピロリの結合は非常に再現性が高かった。ペンタグリコシルおよびヘキサグリコシルセラミドに対して記録されたヘリコバクター ピロリ０３２株の結合頻度は〜９０％（プレートの合計数は約１００）だった。
【０１３３】
イソレセプターの存在と結合特異性を明示した結合アッセイ（図７）
ウサギ胸腺由来のネオラクトコアを有する七糖グリコスフィンゴ脂質であるNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerおよびそこから誘導したテトラ〜ヘキサグリコシルセラミドの他に、ネオラクト系列の他の糖脂質類に対しても結合特異性は存在した。
【０１３４】
薄層プレートで分離した精製グリコスフィンゴ脂質に対するヘリコバクター ピロリ（０３２株）の結合をオーバーレイアッセイで検出した結果を図７に示した。これらの結果は、他の精製グリコスフィンゴ脂質に関する結果と共に表２にまとめた。ヘリコバクター ピロリのネオラクトテトラオシルセラミドに対する結合（レーン１）ならびにNeu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerから誘導した五糖および六糖グリコスフィンゴ脂質に対する結合（レーン５と６）は、上記の結果と同一であった。しかし、予想に反し、結合はGalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（ｘ2グリコスフィンゴ脂質、レーン７）および脱フコシル化Ａ６-２グリコスフィンゴ脂質GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（ｎｏ.１２、表２）にも見られた。Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（Ｂ５グリコスフィンゴ脂質、レーン２）も結合活性を有するという結果と合わせて、これらの結果は、各グリコスフィンゴ脂質にそれぞれ特異的な付着因子が複数存在するのではなく、交差結合の可能性を示した（下記参照)。さらに、上述した異なるグリコスフィンゴ脂質含有五糖の伸長物の中で細菌付着因子によって許容されたものはGalβ4が胸腺由来GlcNAcβ3−末端化合物に結合したものだけだった（レーン６）。従って、その他の伸長構造であるNeu5Ac-x2（レーン８）とGalNAcβ3-B5（ｎｏ.２５、表２）は結合を示さなかった。Ｂ５の内部GlcNAcβ3のアセトアミド基は結合に必須であり、この成分の無水ヒドラジンによる脱−Ｎ−アセチル化は結合の完全な消失を招いた（レーン３）。これはネオラクトテトラオシルセラミドを同様に処理した場合と同じであった（ｎｏ.６、表２）。
【０１３５】
上述したように、４種の結合活性を有する五糖グリコスフィンゴ脂質（ｎｏ．１０〜１３、表２）が存在し、いずれもネオラクトコアを有することは、分析結果の裏に潜んだ理由が同じ付着部位に対する交差結合であることを示唆した。
【０１３６】
ネオラクト結合エピトープの脱線状化  ウサギ胸腺の七糖化合物を化学的および酵素学的に分解して得た構造体（ｎｏ.１、５、１０と２１、表２）の相対結合強度は、三糖配列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3が最小結合配列を構成する可能性を示唆した。従って、六糖化合物においては、末端Galβ4による阻害効果が予想され、ネオラクトテトラオシルセラミドにおいては、エピトープの３つの糖のうち２つしか存在しないので、末端GlcNAcβ3の欠失は結合強度を低下させると考えられる。内部GlcNAcβ3の必要性は、アセトアミド基を脱−Ｎ−アセチル化してアミンにしたネオラクトテトラオシルセラミドおよびＢ５（ｎｏ.６と１４、表２）が共に細菌に対する結合を失ったことによって明示される。この結合性の欠失は、付着因子とアセトアミド成分との好ましい相互作用の欠失および／またはこれらグリコスフィンゴ脂質の好ましい立体配座の変化によって生じると考えられる。しかし、内部Galβ4の配置の変化によって結合エピトープに対する接触に立体障害が生じる状況を描くことは難しい。従って、最小結合配列がGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3配列を含まなければならないことを確立したので、今度は、Ｐ1、Ｈ５-２および２つのシアリルパラグロボシド構造（ｎｏ.１５、１８〜２０、表２）が結合性を欠く理由は、これら伸長物が提案した結合エピトープに直接干渉するという考えによって合理化するのは容易である。さらに、ウシ バターミルク由来のグリコスフィンゴ脂質（Teneberg et al., 1994)、即ちネオラクトテトラオシルセラミドの内部Galβ4にβ６−結合した側鎖Galβ4GlcNAcβ（ｎｏ.２６、表２）は、結合エピトープへの接触がブロックされているために結合しない。
【０１３７】
表２の種々の結合活性五糖配列の伸長物は、胸腺由来構造においてはGalβ4の付加のみが許容されることを示し、これは４−ＯＨの位置が赤道配座でも軸配座でもよく、それに続く立体障害による結合親和性の欠失を示した。Neu5Acα3のｘ2への付加や、GalNAcβ3のＢ５への付加の結果、結合は完全に失われる（ｎｏ.２４と２５、表２）。さらに、Ｈ５-２におけるFucα2単位の負の影響は、ヘリコバクター ピロリがＡ６−２とＢ６−２（ｎｏ.２２と２３、表２）の両方に結合しないことによって確認された。Ｂ５と同じ三糖が末端にある伸長構造（ｎｏ.２８、表２）については、２つ目の内部結合エピトープが存在するにもかかわらず、Ｂ５と同様に、この末端三糖が観察された結合を担っていた。しかし、五糖配列に関してウサギ胸腺由来六糖化合物に観察された結合強度と同様に、最後から２番目のGalβ4が結合強度を低下させることが予想されるので、内部エピトープに対する結合は排除される可能性が高い。ウサギ胸腺由来七糖化合物のシアル酸残基は本願で用いた細菌株による結合に影響を与えないので、この結果から、エピトープ領域外に存在するはずであることを指摘しておく。シアル酸依存性または非依存性のヘリコバクター ピロリの結合が得られるかどうかは、細菌の株と培養条件の両方に依存する（Miller-Podraza et al., 1996,1997a,b)。
【０１３８】
以上をまとめると、ネオラクト系列のグリコスフィンゴ脂質の結合エピトープは、最大活性を得るためには三糖配列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3を含まなければならない。本願で用いた潜在的なイソレセプターの結合パターンの比較から演繹されることは、重要ではない末端GlcNAcβ3のアセトアミド基と同じ残基の４-ＯＨを除けば、大部分の三糖は結合を生じるために重要である。結合特異性を立証する分子モデリングの結果は、別件として発表する。
【０１３９】
β３ガラクトシダーゼを用いたレセプターアナログの製造方法の一例
六糖であるGalβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc（１ｍｇ）（英国、Dextra labs製）を４００ｍＵのβ３／６ガラクトシダーゼ（米国、カリフォルニア州、Calbiochem製）で製造者の推奨する方法に従って一晩処理した。ＨＰＬＣ精製工程後に０．６ｍｇの五糖を得た。この糖をマススペクトルで分析したところ、純度は９８％を超えていた。五糖の一部およびマルトへプタオース（米国、セントルイス、Sigma製）をシアノボロハイドライドを用いて４−ヘキサアデシニルアニリン（ＨＤＡと略す、スウエーデン国、ストックホルム、Aldrich製）で還元的にアミン化した（Halina Miller-Podraza, いずれ発行される)。産物をマススペクトルで特徴づけ、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA および マルトへプタオース(red)-HDA［“(red)-”は糖質の還元末端グルコースおよびヘキサアデシニルアニリン（ＨＤＡ）のアミン基の還元的アミン化によって得られたアミン結合構造である］ことが確認された。化合物GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDAは、上述したＴＬＣオーバーレイアッセイにおいてヘリコバクター ピロリに対して観察可能な結合活性を示したが、一方、マルトへプタオース(red)-HDAは全く不活性であった。この例は四糖であるGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galがヘリコバクター ピロリに結合する構造であることを示す。還元によってGlc-残基のピラノース環構造が壊れるので還元末端Glc-残基は結合には必要ないと考えられる。
【０１４０】
病原性因子に対するグリカンレセプターを生じるグリコシダーゼ反応の例
ａ）Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、
Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerおよび
Neu5Acα3Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCerをα３−シアリダーゼと反応させて、グリコスフィンゴ脂質である
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、
Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer（合成した構造はｎｏ．５、表２）および
Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCerをそれぞれ形成する。
ｂ）Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerを上述のようにβ−ガラクトシダーゼ（例えば、E.coliまたはStreptococcus pneumoniae由来のβ−ガラクトシダーゼ（但し、単独で用い、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは用いない））と反応させて、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerを形成する。
ｃ）Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerを上述のようにβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとβ−ガラクトシダーゼの両方で処理し、Galβ4GlcβCerを形成する。
ｄ）Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerをα−フコシダーゼ（例えば、アーモンドの実由来のα3/4−フコシダーゼ）で処理し、Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCerを合成する。
ｅ）糖タンパク質および糖脂質に提示されている血液型のＢ型抗原（Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ-）を含むヒト赤血球をウシ腎臓由来α−フコシダーゼ（米国、インディアナ州、インディアナポリス、Boehringer-Mannheim Biochemicals製）で（Krivan et al, 1986）の記載に従って処理し、Clostridium difficileのトキシンＡに対するレセプターであるGalα3Galβ4GlcNAcβ-を形成する。
【０１４１】
グリコシダーゼ酵素阻害剤の使用例
D-ガラクトノ-1,4-ラクトン（米国、セントルイス、Sigma製）によるβ−ガラクドシダーゼ酵素の阻害：  ナタマメ由来のβ−ガラクドシダーゼ（EC 3.2.1.23；米国、セントルイス、Sigma製）を、モデルオリゴ糖であるGalβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc（米国、セントルイス、Sigma製）から末端ガラクトースを切り離すのに用いる。遷移状態のガラクトシダーゼの類似体である阻害剤は種々のガラクトシダーゼに対して活性を示し（Huber と Brockbank, 1987；実際の活性型はD-ガラクトノ-1,5-ラクトンであると考えられ）、ナタマメのβ−ガラクドシダーゼは上記と同様に他の２型ラクトサミン（例えばGalβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc）を切断するが、Galβ3GlcNAc−配列やグリコスフィンゴ脂質を切断するには特定の条件が必要である。反応１においては、２５ｎｍｏｌのGalβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcを１００ｍＵのナタマメ由来β−ガラクドシダーゼと共に４５μｌの５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）溶液中で、３７℃で８時間インキュベートする。反応２は反応１と同じ条件であるが、更に５５ｍＭのD-ガラクトノ-1,4-ラクトンを含み、反応１と同じ条件で８時間インキュベートする。反応１の主要な産物はGalとGlcNAcβ3Galβ4Glcであるが、未反応物質をＨＰＬＣおよび質量分析で観察するのは、通常、難しい。反応２の反応混合物には、上記物質に加えて、典型的な例では５０％を超える未処理のGalβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcが含まれる。
【０１４２】
Nohleら（1985）の方法に基づく、Neu5Ac2en（2,3-無水-2-デオキシ-N-アセチルノイラミン酸、DANA）によるVibrio cholerae由来シアリダーゼの阻害：  モデル化合物であるNeu5Acα3Galβ4Glc（１ｍＭ；ウシミルクから精製）を１０ｍＵのVibrio cholerae由来シアリダーゼ（１０μｌ；ドイツ国、マールブルグ、Behringwerke製）および種々の濃度のNeu5Ac2en（１μＭ〜１０ｍＭ）と共に、１４ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．４）中、３７℃で３０分間インキュベートする。反応レベルは比色アッセイで測定することができ、遊離したNeu5AcについてはＨＰＬＣで分析する。酵素は、飽和濃度のNeu5Ac2enによって非常に効果的に阻害され、酵素の５０％阻害は１５μＭのNeu5Ac2enで達成される。
【０１４３】
【表１】
2005504017.tif 000002
【０１４４】
【表２】
2005504017.tif 000003
【０１４５】
表２の脚注
ａ  グリコスフィンゴ脂質の略記命名法は近年推奨されている方法（Nomenclature of glycolproteins, 1988）に従った。
ｂ  グリコスフィンゴ脂質の原料は、次の略語を用いて示した：ＲＴ、ウサギ胸腺；ＨＥ、ヒト赤血球；ＲＥ、ウサギ赤血球；ＨＭ、ヒト胎便；ＲＣＣ、ラット結腸癌；ＢＢ、ウシ バターミルク；ＤＳＩ、イヌ小腸。
ｃ  結合強度は以下のように定義した：「＋」はグリコスフィンゴ脂質を４μｇアプライしたＴＬＣプレートのオートラジオグラムが有意に黒くなったことを示し；「−」は結合がないことを示し；「（＋）」は「＋」と「−」の中間程度にオートラジオグラムが黒くなったことを示す。
ｄ  Ｎｏ．２７を穏やかな酸加水分解に付し、続いてβ−ガラクトシダーゼで処理してＮｏ．１０を調製した。
ｅ  グリコスフィンゴ脂質Ｎｏ．３、６、８および１４は、無水ヒドラジンを用いた処理により、それぞれＮｏ．２、５、７および１３から調製した。
ｆ  Ｎｏ．１９のノイラミニダーゼ処理により調製した。
ｇ  ヒト脳由来ＧＭ１ガングリオシドの穏やかな酸加水分解により調製した。
ｈ  Ｎｏ．２２を０．０５Ｍ ＨＣｌ中、８０℃で２時間インキュベートすることにより調製した。
【０１４６】
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【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１Ａ】ヘキサグリコシルセラミドをエンドグリコセラミダーゼで消化して得たパーメチル化オリゴ糖のＥＩ／ＭＳ。上の図はオリゴ糖のガスクロマトグラムであり、下の図はガスクロマトグラムのピークＡのＥＩ／ＭＳスペクトルである。
【図１Ｂ】図１Ａに示したガスクロマトグラムのピークＢのＥＩ／ＭＳスペクトルである。
【図２Ａ】ヘキサグリコシルセラミドの陰イオンＦＡＢマススペクトルである。
【図２Ｂ】ペンタグリコシルセラミドの陰イオンＦＡＢマススペクトルである。
【図３Ａ】六糖からなる糖脂質のアノマー領域を示すプロトンＮＭＲスペクトルであり、微量な１型成分に対して良好なシグナル／ノイズ比を達成するために一晩かけてスペクトルを取得した。
【図３Ｂ】五糖からなる糖脂質のアノマー領域を示すプロトンＮＭＲスペクトルであり、微量な１型成分に対して良好なシグナル／ノイズ比を達成するために一晩かけてスペクトルを取得した。
【図４】ウサギ胸腺グリコスフィンゴ脂質の酵素分解を示す。シリカゲルの薄層プレートはＣ／Ｍ／Ｈ2Ｏ（容量比は６０：３５：８）で展開した。ＡとＢは４−メトキシベンザアルデヒドで視覚化したプレートであり、Ｃは35Ｓでラベルしたヘリコバクター ピロリをオーバーレイした後のオートラジオグラムである。レーン１：ヘプタグリコシルセラミド（構造１、表１）、レーン２：脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド（酸処理後に得たもの）、レーン３：β４−ガラクトシダーゼで処理した脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド、レーン４：シアリダーゼおよびβ４−ガラクトシダーゼで処理したヘプタグリコシルセラミド、レーン５：ヒト赤血球由来の参照用グリコスフィンゴ脂質類（ラクトシルセラミド、トリヘキソシルセラミドおよびグロボシド）、レーン６：β４−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミダーゼで処理した脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド、レーン７：シアリダーゼ、β４−ガラクトシダーゼおよびβ−ヘキソサミダーゼで処理したヘプタグリコシルセラミド。
【図５】ウサギ胸腺ヘプタグリコシルセラミド（構造１、表１）の部分酸加水分解後に得たＴＬＣ産物を示す。展開溶媒は図４と同じである。Ａは４−メトキシベンザアルデヒドで視覚化したプレートであり、Ｂは35Ｓでラベルしたヘリコバクター ピロリをオーバーレイした後のオートラジオグラムである。レーン１：ヘプタグリコシルセラミド、レーン２：脱シアリル化ヘプタグリコシルセラミド（酸処理後）、レーン３：ペンタグリコシルセラミド、レーン４：加水分解物、レーン５：参照用グリコスフィンゴ脂質類（図４と同じ）。
【図６Ａ】グリコスフィンゴ脂質の希釈系列。ＴＬＣプレート上の結合活性をバクテリアオーバーレイ法で測定した。展開溶媒は図４と同じである。等モル量の種々の糖脂質をプレートで展開した。糖脂質の定量は六炭糖の含量に基づく。ヘキサグリコシルセラミドおよびペンタグリコシルセラミド（構造２と３、表１）を用い、各糖脂質の量（ｐｍｏｌ）はレーン１：１２８０、レーン２：６４０、レーン３：３２０、レーン４：１６０、レーン５：８０、レーン６：４０、レーン７：２０とした。
【図６Ｂ】グリコスフィンゴ脂質の希釈系列。ＴＬＣプレート上の結合活性をバクテリアオーバーレイ法で測定した。展開溶媒は図４と同じである。等モル量の種々の糖脂質をプレートで展開した。糖脂質の定量は六炭糖の含量に基づく。ペンタグリコシルセラミドおよびテトラグリコシルセラミド（構造２と３、表１）を用い、各糖脂質の量（ｐｍｏｌ）はレーン１：１２８０、レーン２：６４０、レーン３：３２０、レーン４：１６０、レーン５：８０、レーン６：４０、レーン７：２０とした。
【図７】Ａは４−メトキシベンザアルデヒドで検出した分離グリコスフィンゴ脂質を示す薄層クロマトグラムであり、Ｂはそこに放射線標識したヘリコバクター ピロリ０３２株を結合させた分離グリコスフィンゴ脂質を示すオートラジオグラムである。アルミニウムで裏打ちしたシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（Merck製）上で、クロロフォルム／メタノール／水の容量比が６０：３５：８の溶媒系を用いてグリコスフィンゴ脂質を分離した。結合アッセイは、「材料と方法」の欄で記載したように行った。オートラジオグラフィは７２時間行った。各レーンは以下のグリコスフィンゴ脂質を含んでいた：  レーン１：Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（ネオラクトテトラオシルセラミド）、４μg； レーン２：Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｂ５グリコスフィンゴ脂質）、４μg; レーン３：Galα3Galβ4GlcNH2β3Galβ4Glcβ1Cer、４μg； レーン４：Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｂ６ ２型 グリコスフィンゴ脂質)、４μg； レーン５：GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、４μg； レーン６：Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、４μg； レーン７：GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（ｘ2グリコスフィンゴ脂質)、４μg； レーン８：NeuAcα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（NeuAc-x2）、４μg； レーン９：Fucα2Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（Ｈ５ ２型 グリコスフィンゴ脂質）、４μg；そして レーン１０：NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer（シアリルネオラクトテトラオシルセラミド）、４μg。グリコスフィンゴ脂質の材料は表２と同じである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年9月3日(2003.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖からなる少なくとも１種の糖含有阻害性物質を感染症の治療用薬物の製造に用いる方法であって、該糖含有阻害性物質は、GlcNAcβ, GalNAcβ, Galβ, Galα, GalNAcα, Fucα, ManαおよびNeu5Acαからなる群より選ばれるピラノース環構造を含み、且つアグリコンに結合していることを特徴とする方法。
【請求項２】
該アグリコンが、単糖を模倣した構造体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該単糖を模倣した構造体が、多水酸基化合物であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該アグリコンが、親水性リンカーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該アグリコンが、該糖含有阻害性物質を担体に結合させている非単糖スペーサーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ピラノース環構造を含む該糖含有阻害性物質が、GlcNAcβ, GalNAcβ, Galα, GalNAcα, Fucα, ManαおよびNeu5Acαからなる群より選ばれる化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
下記式（Ｉ）で表される少なくとも１種のオリゴ糖配列を該糖含有阻害性物質と共に用いることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u      （Ｉ）
（式中、ｐ、ｒ、ｓおよびｕは各々独立に０または１の整数であり、ｙは３位または４位の結合位置を表し、ｚは３位または４位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
ｐが１であり、且つ、ｙが３である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、ｒは１であり；
ｐが１であり、且つ、ｙが４である場合には、HexはGlcβであり、ｒは１であり；そして
ｐが０であり、且つ、ｚが４である場合には、HexがGalβであり、且つ、ｒが１であるか、あるいはHexがGalαであり、且つｒが０である。）
【請求項８】
該糖含有阻害性物質が、Ｎ−グリコシド結合、Ｓ−グリコシド結合またはＣ−グリコシド結合を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該糖含有阻害性物質を、オリゴ価または多価の形態で用いることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該糖含有阻害性物質を、一価の形態で用いることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該薬物が、胃腸器系における細菌感染の治療用であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該薬物が、口腔における感染症の治療用であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該薬物が、肺における細菌感染の治療用であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該オリゴ糖配列が、下記式からなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
Galβ4Glc, GalNAcβ4Galβ4Glc, Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glc,
Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc, Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc,
Galα4Galβ4GlcNAc, Galα4GalβGlc, Galβ3GlcNAc, Galβ4GlcNAc,
Galα3Galβ4Glc, Galα3Galβ4GlcNAc, GalNAcα/β3Galβ4GlcNAc,
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc, そして GlcNAcβ3Galβ4Glc。
【請求項１５】
該糖含有阻害性物質が、α−アノマー構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該糖含有阻害性物質が、NeuNAcαであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該糖含有阻害性物質が、Fucαであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ピラノース環構造を含む該糖含有阻害性物質が、GlcNAcβ, GalNAcβおよびGalαからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ピラノース環構造を含む該糖含有阻害性物質が、GlcNAcβおよびGalNAcβからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ピラノース環構造を含む該糖含有阻害性物質が、GlcNAcβ, ManαおよびFucαからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも二種の異なる糖含有阻害性物質を用いることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも三種の異なる糖含有阻害性物質を用いることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
該感染症が、Helicobacter pyloriまたは下痢発症性E. coliの存在によって生じる感染症であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
インフルエンザの治療用薬物、または細菌とインフルエンザウイルスとの共感染の治療用薬物の製造に、NeuNAcαを該糖含有阻害性物質として用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
オセルタミビル、ザナミビルおよびRWJ-270201からなる群より選ばれる糖含有阻害性物質を、インフルエンザに関連した二次細菌感染症の治療用薬物の製造に用いる方法。
【請求項２６】
該糖含有阻害性物質が、細菌とインフルエンザウイルスとの共感染の治療用であることを特徴とする、請求項１または２５に記載の方法。
【請求項２７】
該共感染が肺炎または気管支炎の原因となることを特徴とする、請求項１または２５に記載の方法。
【請求項２８】
該感染症がインフルエンザに関連した二次細菌感染症であり、該糖含有阻害性物質を請求項７の式（Ｉ）で定義されているオリゴ糖配列と共に用いることを特徴とする、請求項１または２５に記載の方法。
【請求項２９】
該感染症が、Streptococcus pneumoniae、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas auruginosa、Pseudomonas cepacia、Xanthomonas maltophilia、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzaeおよびStaphylococcus aureusからなる群より選ばれる細菌による感染症であることを特徴とする、請求項１または２５に記載の方法。
【請求項３０】
GlcNAcβ, GalNAcβ, Galβ, Galα, GalNAcα, Fucα, ManαおよびNeu5Acαからなる群より選ばれるピラノース環構造を含む糖含有阻害性物質を含有してなる、グリコシダーゼ酵素に対する阻害性物質。
【請求項３１】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む組成物であって、食物または飼料の質を向上させるための添加剤となる治療剤または栄養補助組成物を製造するための組成物。
【請求項３２】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている少なくとも二種の阻害性物質の精製物を含む組成物を、胃腸器系における感染症を予防または治療するための薬物の製造に用いる方法。
【請求項３３】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む、肺における疾患の予防または治療に用いるための組成物。
【請求項３４】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む、ヒトの治療に用いるための組成物。
【請求項３５】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む、動物の治療に用いるための組成物。
【請求項３６】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている少なくとも二種の阻害性物質の精製物を包含する、胃腸器系における感染症の予防または治療に用いるための栄養補助組成物または栄養補助剤。
【請求項３７】
プロバイオテック微生物またはプレバイオテック化合物を更に包含することを特徴とする、請求項３６に記載の栄養補助組成物または栄養補助剤。
【請求項３８】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む組成物をろ過材の一部として用い、液状の食物、飲料および水から病原体をろ過により除去する方法。
【請求項３９】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む組成物を用いる診断方法。
【請求項４０】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質であって、食物または飼料の質を向上させるための添加剤となる治療剤または栄養補助組成物を製造するための阻害性物質。
【請求項４１】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を少なくとも二種包含する乳児用ミルク。
【請求項４２】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を少なくとも二種包含する食品保存料。
【請求項４３】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を含む組成物を食品の表面に被覆することを特徴とする、食品の安全性を向上させるための方法。
【請求項４４】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を少なくとも二種包含する口腔衛生製品。
【請求項４５】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を少なくとも二種包含する口腔衛生製品。
【請求項４６】
該製品が、練り歯磨、うがい薬、タブレットおよびチューインガムからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項４４または４５に記載の口腔衛生製品。
【請求項４７】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されているオリゴ糖配列を少なくとも一種包含する局所用製品、洗剤または化粧品。
【請求項４８】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている、異なる種類のオリゴ糖配列を少なくとも二種包含する、局所用製品、洗剤または化粧品。
【請求項４９】
練り歯磨、うがい薬、タブレットおよびチューインガムからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項４７または４８に記載の局所用製品、洗剤または化粧品。
【請求項５０】
請求項１〜８、１４〜２０および３０のいずれかにおいて定義されている阻害性物質を、生体外における病原体の非診断的阻害または凝集に用いる方法。
【請求項５１】
該病原体がE. coliであることを特徴とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
グリコシダーゼ酵素の阻害剤を疾病の治療用薬物の製造に用いる方法であって、該グリコシダーゼ酵素は患者の糖結合体を加水分解して病原性因子に対する中性多糖レセプターを露呈させ、露呈された中性多糖レセプターは下記式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列を含み、該病原性因子は真菌、ウイルス、毒素または細菌であることを特徴とする方法。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u      （Ｉ）
（式中、ｐ、ｒ、ｓおよびｕは各々独立に０または１の整数であり、ｙは３位または４位の結合位置を表し、ｚは３位または４位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
ｐが１であり、且つ、ｙが３である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、ｒは１であり；
ｐが１であり、且つ、ｙが４である場合には、HexはGlcβであり、ｒは１であり；そして
ｐが０であり、且つ、ｚが４である場合には、HexがGalβであり、且つ、ｒが１であるか、あるいはHexがGalαであり、且つ、ｒが０である。）
【請求項５３】
該グリコシダーゼ酵素の阻害剤が、α−シアリダーゼ、α−フコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、エンド−β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼおよびα−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼからなる群より選ばれる一種または数種のグリコシダーゼを阻害することを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該露呈された中性多糖レセプターが、糖脂質または糖タンパク質の一部であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
該オリゴ糖配列が、下記式からなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
Galβ4Glc, GalNAcβ4Galβ4Glc, Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glc,
Galα4Galβ4GlcNAc/Glc, Galβ3GlcNAc, Galβ4GlcNAc,
Galα3Galβ4GlcNAc/Glc, GalNAcα/β3Galβ4GlcNAc, そして
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc/Glc。
【請求項５６】
該病原性因子がウイルスであることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
該ウイルスがヒトインフルエンザウイルスまたはロタウイルスであることを特徴とする、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
該病原性因子が毒素であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
該毒素が、シガトキシン、シガ様トキシン、Escherichia coli由来の熱不安定毒素またはClostridium difficile由来のトキシンＡであることを特徴とする、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
該疾病が、尿路感染症、慢性表在性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、ヒトの胃における非ホジキンリンパ腫、胃腺癌、心臓病、皮膚病、肝臓病、膵臓病、乳幼児突然死症候群またはClostridium difficileに起因する下痢であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
該病原性因子が、Streptococcus pneumoniae、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas auruginosa、Pseudomonas cepacia、Xanthomonas maltophilia、Haemophilus influenzae、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter pyloriおよびStaphylococcus aureusからなる群より選ばれる細菌であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
該グリコシダーゼ酵素の阻害剤が、オセルタミビル、ザナミビルまたはRWJ-270201であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
該疾病が、インフルエンザに関連した二次感染症であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項６４】
インフルエンザに関連した該二次感染症が肺炎であることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
該疾病が、該患者の胃腸器系に存在するヘリコバクター ピロリに起因する疾病であることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項６６】
医薬的効果を生じる量のグリコシダーゼ酵素阻害剤を患者に投与することを包含する、病態の治療方法であって、
該阻害剤は請求項２または１１で定義されている糖含有阻害性物質であり、
グリコシダーゼ酵素は患者の糖結合体を加水分解して病原性因子に対する中性多糖レセプターを露呈させ、露呈された中性多糖レセプターは下記式（Ｉ）で表されるオリゴ糖配列を含み、該病原性因子は真菌、ウイルス、毒素または細菌であることを特徴とする方法。
[Galβy]p[Hex(NAc)rα/βz]sGalβ4Glc(NAc)u      （Ｉ）
（式中、ｐ、ｒ、ｓおよびｕは各々独立に０または１の整数であり、ｙは３位または４位の結合位置を表し、ｚは３位または４位の結合位置を表し、HexはGalまたはGlcであるが、
但し、
ｐが１であり、且つ、ｙが３である場合には、HexはGalβまたはGlcβであり、ｒは１であり；
ｐが１であり、且つ、ｙが４である場合には、HexはGlcβであり、ｒは１であり；そして
ｐが０であり、且つ、ｚが４である場合には、HexがGalβであり、且つ、ｒが１であるか、あるいはHexがGalαであり、且つ、ｒが０である。）
【国際調査報告】
2005504017.tif 000093
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