(57)【要約】  本発明は、修飾脂質と治療薬とを含む治療薬用送達媒体であって、修飾脂質は脂質と、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）とを含み、生物学的溶液中では安定であるが所定の条件では不安定であるリンカーを介して前記脂質が前記ＤＴＳ部分に連結され、脂質と治療薬との複合体の形成後に前記ＤＴＳ部分が前記脂質に連結される治療薬用送達媒体を提供する。
2005515990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾脂質と治療薬とを含む治療薬用送達媒体であって、
前記修飾脂質は脂質と、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）とを含み、
細胞外の生物学的溶液中では安定でありかつ細胞内の生物学的溶液中および／または所定の条件では不安定であるリンカーを介して、前記脂質が前記ＤＴＳ部分に連結され、
脂質と治療薬との複合体の形成後に、前記ＤＴＳ部分が前記脂質に連結される、
治療薬用送達媒体。
【請求項２】
修飾脂質と治療薬とを含む治療薬用送達媒体を製造する方法であって、
（ａ）リンカー部分を含む脂質と、前記治療薬との複合体を形成させるステップと、
（ｂ）送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）を、前記リンカー部分を介して、前記脂質に連結するステップと
を含み、前記ＤＴＳ部分と前記脂質との間の連結部が、生物学的溶液中では安定であるが所定の条件では不安定である方法。
【請求項３】
前記連結部が、細胞表面と接触した時に不安定であるか、または細胞内で不安定である、請求項１または２に記載の発明。
【請求項４】
前記連結部が所定のｐＨ条件で不安定である、請求項１または２に記載の発明。
【請求項５】
前記連結部が５．０〜６．５のｐＨで不安定である、請求項４に記載の発明。
【請求項６】
前記連結部が還元条件下または細胞内の生物学的溶液中で不安定である、請求項１または２に記載の発明。
【請求項７】
前記修飾脂質が式：
【化１】
2005515990.tif 000049
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である］
で表される、上記請求項のいずれか一項に記載の発明。
【請求項８】
前記修飾脂質が式：
【化２】
2005515990.tif 000050
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。
ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。
Ｒ1はＨまたはヒドロカルビル基である。
Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である。
Ｒ3およびＲ5はＨおよびヒドロカルビル基から独立して選択される。
ＱはＯ、Ｓ、ＮＨから選択される］
で表される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発明。
【請求項９】
前記修飾脂質が式：
【化３】
2005515990.tif 000051
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。
ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。
Ｒ1はＨ、Ｏ-またはヒドロカルビル基である。
Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である］
で表される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１０】
前記修飾脂質が式：
【化４】
2005515990.tif 000052
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。
ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。
Ｒ1はＨ、Ｏ-またはヒドロカルビル基である。
Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である。
Ｒ3およびＲ5はＨおよびヒドロカルビル基から独立して選択される。
Ｑは適切な置換基である］
で表される、請求項９に記載の発明。
【請求項１１】
Ｑが、ＯＨ、ＳＨ、１級アミン、２級アミン、３級アミンおよびヒドロカルビルから選択される、請求項８または１０に記載の発明。
【請求項１２】
Ｒ1がＨである、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１３】
Ｃ＝Ｎ結合が酸不安定性または酸耐性である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１４】
Ｃ＝Ｎ結合が酸不安定性である、請求項１３に記載の発明。
【請求項１５】
Ｃ＝Ｎ結合が酸耐性である、請求項１３に記載の発明。
【請求項１６】
Ｙが存在する、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１７】
ＹがＯである、請求項７〜１６のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１８】
Ｙがヒドロカルビル基である、請求項７〜１６のいずれか一項に記載の発明。
【請求項１９】
Ｙが、−［ＣnＨn-2］a−［ＮＨ］b−［ＣＺ］c−［ＮＨ］d−［ＣＺ］e−ＮＨ−（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは０〜１０から独立して選択され、ｎは５〜１０であり、ＺはＯまたはＳである）から選択される、請求項１８に記載の発明。
【請求項２０】
ａが０または１である、請求項１９に記載の発明。
【請求項２１】
ｂが０または１である、請求項１９または２０に記載の発明。
【請求項２２】
ｃが０または１である、請求項１９、２０または２１に記載の発明。
【請求項２３】
ｄが０、１または２である、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の発明。
【請求項２４】
ｅが０または１である、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の発明。
【請求項２５】
ＺがＯである、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の発明。
【請求項２６】
ｎが５である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の発明。
【請求項２７】
Ｙが、−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−、および−Ｃ5Ｈ3−ＮＨ−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2Ｏ−、および−ＮＨ−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−から選択される、請求項７〜１６のいずれか一項に記載の発明。
【請求項２８】
Ｙが、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）−、−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＨ−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、および−ＮＨ−から選択される、請求項２７に記載の発明。
【請求項２９】
Ｘが存在する、請求項７〜２８のいずれか一項に記載の発明。
【請求項３０】
Ｘがヒドロカルビル基である、請求項７〜２９のいずれか一項に記載の発明。
【請求項３１】
ＡがＤＴＳ部分であり、かつＢが脂質である、請求項７〜３０のいずれか一項に記載の発明。
【請求項３２】
前記ＤＴＳ部分が送達および／または安定化部分である、上記請求項のいずれか一項に記載の発明。
【請求項３３】
前記ＤＴＳ部分が送達および／または安定化ポリマーである、上記請求項のいずれか一項に記載の発明。
【請求項３４】
前記ＤＴＳ部分が、一官能性または二官能性のポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、ポリ（ビニルアルコール）（「ＰＶＡ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）のような他のポリ（アルキレンオキシド）、並びにポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）、およびポリ（オキシエチル化グルコース）などのようなポリ（オキシエチル化ポリオール）から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載の発明。
【請求項３５】
ＤＴＳ部分が、さらにＤＴＳ部分に連結することができるさらなるリンカー基を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の発明。
【請求項３６】
前記ＤＴＳ部分が、ターゲッティング部分に連結することができるさらなるリンカー基を含む、請求項３５に記載の発明。
【請求項３７】
前記脂質がコレステロール基であるか、コレステロール基を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の発明。
【請求項３８】
前記コレステロール基がコレステロールである、請求項３７に記載の発明。
【請求項３９】
前記コレステロール基がカルバモイル結合またはエーテル結合を介してＸに連結される、請求項３７または３８に記載の発明。
【請求項４０】
前記脂質がポリアミン基を介してＸに連結される、請求項７〜３９のいずれか一項に記載の発明。
【請求項４１】
前記ポリアミン基が天然ポリアミンではない、請求項４０に記載の発明。
【請求項４２】
前記ポリアミン基に含まれる少なくとも２つのアミンが、エチレン（−ＣＨ2ＣＨ2−）基で互いに隔てられている、請求項４０または４１に記載の発明。
【請求項４３】
前記ポリアミンが、スペルミジン、スペルミン、カルドペンタアミンのいずれか一つである、請求項４２に記載の発明。
【請求項４４】
式：
【化５】
2005515990.tif 000053
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。
ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。
Ｒ1はＨまたはヒドロカルビル基である。
Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である。
Ｒ3およびＲ5はＨおよびヒドロカルビル基から独立して選択される。
ＱはＯＨ、ＳＨ、ＮＨから選択される］
の修飾脂質。
【請求項４５】
式：
【化６】
2005515990.tif 000054
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。
ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。
Ｒ1はＨ、Ｏ-またはヒドロカルビル基である。
Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である］
の修飾脂質。
【請求項４６】
式：
【化７】
2005515990.tif 000055
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。
ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である］
の修飾脂質。
【請求項４７】
請求項１０〜４３のいずれか一項に記載の特徴を特徴付けられる請求項４４、４５または４６に記載の修飾脂質。
【請求項４８】
ヌクレオチド配列または医薬活性剤との混合状態または会合状態にある、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４９】
治療用の、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の送達媒体または請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５０】
遺伝的障害または状態または疾患を処置するための医薬品の製造における、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の送達媒体または請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５１】
請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物から形成されるリポソーム／リポプレックス。
【請求項５２】
請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物からリポソーム／リポプレックスを形成させることを含む、リポソーム／リポプレックスの製造方法。
【請求項５３】
治療用の、請求項５１に記載のリポソーム／リポプレックス。
【請求項５４】
遺伝的障害または状態または疾患を処置するための医薬品の製造における、請求項５１に記載のリポソーム／リポプレックスまたは請求項５２に記載の方法によって製造されるリポソーム／リポプレックスの使用。
【請求項５５】
ヌクレオチド配列と、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の送達媒体、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物、請求項５１に記載のリポソーム／リポプレックス、または請求項５２に記載の方法によって製造されるリポソーム／リポプレックスのいずれか１つ以上との組合せ。
【請求項５６】
治療用の、請求項５５に記載の組合せ。
【請求項５７】
遺伝的障害または状態または疾患を処置するための医薬品の製造における、請求項５５に記載の組合せの使用。
【請求項５８】
医薬と混合され、任意選択により、医薬的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤とも混合された、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の送達媒体、または請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項５９】
医薬と混合され、任意選択により、医薬的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤とも混合された、請求項５１に記載のリポソーム／リポプレックスまたは請求項５２に記載の方法によって製造されるリポソーム／リポプレックスを含む医薬組成物。
【請求項６０】
実質的に、図面のいずれか一つを参照して本願明細書に説明されている、送達媒体、化合物、カチオン性リポソーム／リポプレックスまたは組成物。
【請求項６１】
実質的に、図面のいずれか一つを参照して本願明細書に説明されている方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化合物および送達媒体に関する。さらに本発明は、その化合物および送達媒体を製造する方法、ならびに治療、とりわけ遺伝子治療（特に遺伝子導入）および薬物送達における、前記化合物および送達媒体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療の一態様には、外来核酸（ＤＮＡなど）から発現されたタンパク質が所望の治療機能を果たすことができるように、細胞中に外来核酸を導入することが含まれる。
【０００３】
このタイプの治療法の例には、がんを治療するためのＴＫ、ＴＳＧまたはＩＬＧ遺伝子の挿入、嚢胞性線維症を治療するためのＣＦＴＲ遺伝子の挿入、神経変性障害および心血管障害を治療するためのＮＧＦ、ＴＨまたはＬＤＬ遺伝子の挿入、慢性関節リウマチを治療するためのＩＬ−１アンタゴニスト遺伝子の挿入、ＡＩＤＳおよびＣＭＶ感染を治療するためのＨＩＶ抗原およびＴＫ遺伝子の挿入、ワクチンとして作用する抗原およびサイトカインの挿入、異常ヘモグロビン症状態、例えば地中海貧血症などを治療するためのβ−グロビンの挿入などがある。
【０００４】
現在行われている多くの遺伝子治療研究では、Ａｄ３もしくはＡｄ５などのアデノウイルス遺伝子ベクター、または他の遺伝子ベクターが使用されている。しかしそれらの使用には重大な問題が伴っていた。そのため、危険の少ない非ウイルス的な遺伝子導入法の開発が促されることになった。
【０００５】
大きな可能性を持つ非ウイルス導入系の一つでは、陽イオン性リポソームを使用する。この場合は、通常、中性リン脂質と陽イオン性脂質とからなる陽イオン性リポソームが、細胞中にＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、および薬物を導入するために使用されている。多くの陽イオン性リポソームが市販されており、新しい陽イオン性脂質が最近、数多く合成されている。これらのリポソームの有効性はインビトロでもインビボでも例証されている。
【０００６】
陽イオン性リポソームの製造に役立つサイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドであり、「ＤＯＴＭＡ」とも呼ばれている。
【０００７】
最もよく使用される陽イオン性リポソーム系の一つは、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（一般に「ＤＯＰＥ」と呼ばれる）と陽イオン性脂質３β−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（一般に「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」と呼ばれる）との混合物からなる。
【０００８】
既知の陽イオン性リポソームは有効であるとはいえ、ヒト遺伝子治療における陽イオン性リポソームの遺伝子導入効率を最適化する必要は、まだ残っている。ヒトゲノムプロジェクトが完了した今、遺伝子治療と呼ばれる治療目的での遺伝子の使用が、医学に一大進歩をもたらすという期待がますます高まっている。これに関連して、まだウイルス技術ほど有効ではないが、科学界では、非ウイルス送達が、ヒトへの応用に最も安全な選択肢として、その認知度を高めつつある。
【０００９】
この分野では、ここ１０年間に、さまざまな既存技術の多くの要素（ウイルスタンパク質またはウイルスペプチド、リポソーム、ポリマー、ターゲッティング戦略およびステルス特性）を含む複雑な高分子構築物が出現して、かなりの進展があった。
【００１０】
ＷＯ０１／４８２３３には、ウイルスコアペプチド・ミュー（Ｍｕ）、プラスミドＤＮＡおよび陽イオン性リポソームから構成される三元複合体（ＬＭＤ）に基づくシステムが記載されている。この技術はインビトロで好結果が出ており、インビボでも有望な結果が得られている。しかし、既存の非ウイルス技術の場合と同様に、インビボで治療レベルに到達するには、さらなる進歩が必要である。
【００１１】
ＷＯ０１／４８２３３およびＷＯ０２／４８３８０には、糖質部分を持つ修飾脂質に基づくシステムが記載されている。これらの修飾脂質は安定であり、毒性も低いことがわかっている。
【００１２】
この目的を達するために、製剤は、生物学的溶液（血清、肺粘液）中で、これらの粒子を安定化し、なおかつ高効率なトランスフェクション能力を維持しなければならない。
【００１３】
この要件はすべての既存技術にとって主要な障害の一つである。現行の安定な製剤ではトランスフェクションはほとんど達成できず、現時点で最も効率のよいトランスフェクション剤は、この不安定性ゆえに、その応用範囲が著しく限定される。
【００１４】
（全身的適用のために血中に、または肺局所投与のために粘液中に）投与されると、これらの荷電複合体は塩および生体高分子に曝されて、強いコロイド凝集を起こし、その表面に生物活性要素（オプソニン）が吸着する。遺伝子媒体は、例えば沈殿、マクロファージによる粒子排除につながるタンパク質の結合、および破壊をもたらす表面の乱れなど、激しい変化を起こす。
【００１５】
インビトロおよびインビボでの細胞特異的ターゲッティング用の薬物送達系および遺伝子送達系を作製するには、治療上の利益を示すのに十分な活性を持つ、生物学的溶液に対して安定な送達系を製造するためのプロトコールが必要である。したがって、効率のよい薬物／遺伝子送達媒体が得られるように、安定性と活性との間に均衡を見いださなければならない。
【００１６】
酸不安定性脂質はエンドサイトーシス後にエンドソーム内で切断され、それゆえにサイトゾルへの薬物またはｐＤＮＡの放出を助けると考えられるが、その酸不安定性脂質を利用するアプローチが、わずかながら文献に記載されている。
【００１７】
薬物／ｐＤＮＡ放出を増強するための酸不安定脂質または還元感受性脂質−エンドソームなどの酸性コンパートメントからの薬物または遺伝子の放出を助ける目的で、酸不安定性（エステル、ビニルエーテル）リンカーまたは還元感受性リンカー（ジスルフィド）をリポソーム／リポプレックス内に導入するために、以下の戦略が教示されている。
【００１８】
オルトエステル：Ｎａｎｔｚら（１）によれば、オルトエステル含有脂質をｐＨ４．５にばく露すると、ばく露時間の記載はないが、その時間中に、３８℃で、この化合物の完全な加水分解が起こった。しかし、ｐＨ４．５はリソソームの条件であり、これらの新規脂質を含有するリポソーム製剤によってエンドソーム脱出が起こりうるという著者らの主張は、エンドソームコンパートメント内で直面するｐＨ範囲（初期エンドソームで６、後期エンドソームで５）からみて、正当化することはできない。
【００１９】
ジプラスメニル脂質：ビニルエーテル含有脂質は、脂肪酸アルデヒドとグリセロホスホコリンとに効率よく加水分解され、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２，３）によれば、２０％を超える脂質が加水分解されると、リポソームの透過性が増大する。この系は古典的な薬物送達にとっては面白いかもしれない。しかし、遺伝子送達については印刷中という告知があるだけでデータは記載されていない。
【００２０】
ジスルフィド結合：Ｈｕｇｈｅｓらは、エンドソームやサイトゾルなどの還元的環境でｐＤＮＡ／リポソーム複合体を選択的に不安定化する脂質へのジスルフィド結合の導入を報告した。脂質１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィド・オルニチン（ＤＯＧＳＤＳＯ）がＤＯＰＥと組み合わせて使用された（４）。この脂質の非ジスルフィド類似体と比較して最高５０倍の増強が報告された（５）。同様に、コレステリル−ヘミ−ジチオ−ジグリコリル−トリス（アミノエチル）−アミン（ＣＨＤＴＡＥＡ）が製造され、中性ヘルパー脂質としてのＤＯＰＥと組み合わせて使用された（６）。ＤＣ−Ｃｈｏｌリポソームと比較すると、トランスフェクション効率の増加と共に、細胞毒性の低下も観察された。ｐＤＮＡの放出を調整して導入遺伝子の発現を改善するための新規非ウイルス遺伝子送達系として、還元感受性リポポリアミン（ＲＳＬ）が、Ｓｃｈｅｒｍａｎら（７）によって記載されている。これらの化合物は脂質の主鎖のさまざまな位置にジスルフィド架橋を持ち、ミセルを形成し、ｐＤＮＡを直径約１００ｎｍの小粒子に圧縮する。これらは還元条件と血清に対して感受性であると報告された。
【００２１】
ジスルフィド結合を持つＰＥＧ脂質：還元条件にばく露すると天然リン脂質ＤＳＰＥを再生させる、新しい切り離し可能なポリエチレングリコールコンジュゲートｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥが、Ｈｕａｎｇら（８）によって報告された。ＤＯＰＥ：ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥ（１００：３，ｍ／ｍ）の製剤は、１ｍＭ  Ｃｙｓの存在下、ｐＨ７．２、３７℃で３０分以内に、封入されている蛍光団を放出するようである。
【００２２】
ポストコーティング（コンジュゲーション）によるステルスリポソームの製造−ステルスリポソームまたはステルスリポプレックスを製造するための最新のプロトコールでは、ポリエチレングリコール連結脂質が使用され、これが送達ベクター中にプレインキュベートされる（図１Ａおよび図１Ｂ）。最近になって初めて、リポソーム／リポプレックス表面との共有結合的非加水分解性結合を、確立されたチオール化学またはアミド結合化学を使って形成させるポストコーティング戦略が、Ｗａｇｎｅｒ（９）およびＸｕ（１０）によって報告された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、先行技術の課題を改善するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の一態様によれば、修飾脂質と治療薬とを含む治療薬用送達媒体であって、修飾脂質は脂質と、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）とを含み、生物学的溶液中では安定でありかつ所定の条件では不安定であるリンカーを介して前記脂質が前記ＤＴＳ部分に連結され、脂質と治療薬との複合体の形成後に前記ＤＴＳ部分が前記脂質に連結される治療薬用送達媒体が提供される。
【００２５】
本発明の一態様によれば、修飾脂質と治療薬とを含む治療薬用送達媒体を製造する方法であって、（ａ）リンカー部分を含む脂質と治療薬との複合体を形成させるステップ、（ｂ）送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）を、前記リンカー部分を介して、前記脂質に連結するステップを含み、前記ＤＴＳ部分と前記脂質との間の連結部が生物学的溶液中では安定であり、かつ所定の条件では不安定である方法が提供される。
【００２６】
本発明の一態様によれば、式：
【化１】
2005515990.tif 000003
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。Ｒ1はＨまたはヒドロカルビル基である。Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である。Ｒ3およびＲ5はＨおよびヒドロカルビル基から独立して選択される。ＱはＯ、Ｓ、ＮＨから選択される］
の修飾脂質が提供される。
【００２７】
本発明の一態様によれば、式：
【化２】
2005515990.tif 000004
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。Ｒ1はＨ、Ｏ-またはヒドロカルビル基である。Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である］
の修飾脂質が提供される。
【００２８】
本発明の一態様によれば、式：
【化３】
2005515990.tif 000005
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である］
の修飾脂質が提供される。
【００２９】
本発明のもう一つの態様によれば、治療用の、本発明の化合物もしくは送達媒体または本発明の方法によって製造される化合物が提供される。
【００３０】
本発明のもう一つの態様によれば、遺伝的障害または状態または疾患を処置するための医薬品の製造における、本発明の化合物もしくは送達媒体または本発明の方法によって製造される化合物もしくは医薬媒体の使用が提供される。
【００３１】
本発明のもう一つの態様によれば、本発明の化合物もしくは送達媒体または本発明の方法によって製造される化合物もしくは送達媒体から形成されるリポソーム／リポプレックスが提供される。
【００３２】
本発明のもう一つの態様によれば、リポソーム／リポプレックスを製造する方法であって、本発明の化合物もしくは送達媒体または本発明の方法によって製造される化合物もしくは送達媒体からリポソーム／リポプレックスを形成させることを含む方法が提供される。
【００３３】
本発明のもう一つの態様によれば、治療用の、本発明のリポソーム／リポプレックスまたは本発明の方法によって製造されるリポソーム／リポプレックスが提供される。
【００３４】
本発明のもう一つの態様によれば、遺伝的障害または状態または疾患を処置するための医薬品の製造における、本発明のリポソーム／リポプレックスまたは本発明の方法によって製造されるリポソーム／リポプレックスの使用が提供される。
【００３５】
本発明のもう一つの態様によれば、ヌクレオチド配列または医薬活性剤と、本発明の化合物もしくは送達媒体、本発明の方法によって製造される化合物もしくは送達媒体、本発明のリポソーム／リポプレックス、または本発明の方法によって製造されるリポソーム／リポプレックスのいずれか１つ以上との組合せが提供される。
【００３６】
本発明のもう一つの態様によれば、治療用の、本発明の組合せが提供される。
【００３７】
本発明のもう一つの態様によれば、遺伝的障害または状態または疾患を処置するための医薬品の製造における、本発明の組合せの使用が提供される。
【００３８】
本発明のもう一つの態様によれば、医薬と混合された、任意選択により、医薬的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤とも混合された、本発明の化合物もしくは送達媒体または本発明の方法によって製造される化合物もしくは送達媒体を含む医薬組成物が提供される。
【００３９】
本発明のもう一つの態様によれば、医薬と混合された、任意選択により、医薬的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤とも混合された、本発明のリポソーム／リポプレックスまたは本発明の方法によって製造されるリポソーム／リポプレックスを医薬組成物が提供される。
【００４０】
本発明の他のいくつかの態様は、本願特許請求の範囲で定義する。
【００４１】
本発明者らは、ヌクレオチドなどの治療薬または「小分子」などの他の医薬活性剤を含有する特定の送達媒体を提供することが、多くの点で有利であることを見いだした。脂質とＤＴＳ部分とを含み、それらの間の連結部が細胞外の生物学的溶液中では安定であり、かつ細胞内の生物学的溶液中および／または所定の条件では不安定であるような送達媒体を提供することにより、以下のことが可能になる。
・コアベクターの完全性を損なわずに、薬物および遺伝子送達系の表面保護および／または機能化（ターゲッティング）を行うこと。
・ターゲッティング部分などのＤＴＳ部分を薬物または遺伝子送達媒体に一時的または永続的に導入すること。ＤＴＳ部分の永続性は、脂質上またはＤＴＳ部分上の基を選択することによって制御することができる。
・薬物／遺伝子送達媒体とＤＴＳ＋標的分子との自己集合をもたらすワンポット反応。この自己集合は１回の集合からなってもよいし、１ポットでの段階的反応によってもたらされる段階的な集合を含んでもよい。どちらの態様でも、この方法論では、過剰な未反応試薬類の簡単な透析により、面倒な精製操作が回避される。
・脂質へのＤＴＳ部分の取り付けの強さは、特定のｐＨ条件で加水分解を起こすように、トリガー可能である。
【００４２】
本方法の後コーティング・ワンポット方法論は、典型的には、アルデヒドおよびケトンと反応して−Ｃ＝Ｎ−（シッフ塩基様）共有結合を形成するというアミノキシの選択的で高い反応性に基づいている。重要なことに、この反応は塩基性ｐＨの水性環境でも酸性ｐＨの水性環境でも行うことができる。その上、水性条件にばく露しても、ＮＨＳ活性化カルボニルや他のエステルで起こるような反応性基の部分分解は起こらない。したがって、反応性種、例えばアルデヒド／ケトンおよびアミノキシまたはチオールおよびアルコールの安定性により、加水分解／分解によって反応性種を失うことなく、表面反応を完全に制御することができる。言い換えると、後コーティングされる化合物（リガンド）の数は、適用するリガンド（後コンジュゲートされる種）と連結物（ｌｉｇａｔｅ）（リポソーム／リポプレックス／ミセルの表面上にある反応性種）の化学量論によって、容易に制御される。また、アルデヒドとケトンの反応性は異なるので、コンジュゲートしたリガンドと連結物の安定性を調節することができる。アルデヒドはケトンよりもはるかに反応性が高いので、ケトン類似体よりも速くかつ安定な付加物を形成する。そのため、より安定な付加物を形成させるにはアルデヒドを使用することが好ましく、より不安定な結合を形成させるにはケトンが用いられるだろう。しかし、アルデヒドとケトンはどちらも、置換基の性質に依存して、アミノキシ含有化合物に対して異なる安定性を示しうることは強調しておく必要がある。したがって、アルデヒドとケトンはどちらも、一時的結合および永続的結合に応用することができる。
【００４３】
本発明者らは、リポプレックスへの官能基選択的な酸不安定性および非不安定性カップリング戦略を使って、ポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）などの安定化部分の後カップリングを達成した。これにより、血清が誘発するリポプレックスの分解および沈殿に対する耐性の大幅な増加、ならびに生物学的に妥当な条件での安定化部分の調節可能な放出がもたらされる。リポプレックスに必要な安定化の度合いは、適用する安定化部分のモル比によって選択される。また本発明者らは、ターゲッティング部分を使用することにより、例えばＰＥＧ安定化リポプレックスに葉酸を後カップリングすることなどにより、ターゲッティング能が得られると共に、トランスフェクション効力の増強を達成できることも見いだした。また、この技術により、透析を使った簡単な精製も可能になる。
【００４４】
安定化部分とリポプレックスの間、例えばＰＥＧとアミンまたはヒドラジドユニットとの間にシッフ塩基が形成される場合は、ＰＥＧ部分などの安定化部分を酸不安定性にすることができる。酸耐性は、安定化部分をリポプレックスのアミノキシユニットに反応させることによって得ることができる。特に有望な安定化ユニットは、一方のアルデヒドとのシッフ塩基の形成によってリポプレックスを安定化するために使用することができるジアルデヒド−ＰＥＧである。もう一つのアルデヒドは、アミノキシ含有ターゲッティングリガンドを付加することによって、ターゲッティング目的に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
好ましい一態様では、連結部は、細胞表面との接触時に、または細胞内で、不安定である。
【００４６】
好ましい一態様では、連結部は、所定のｐＨ条件で不安定である。当業者は、要求されるｐＨ条件で不安定になるように、連結部を設計することができるだろう。要求されるｐＨ条件は、典型的には、送達媒体または脂質が見いだされる条件とはかなり異なる条件になるだろう。
【００４７】
好ましい一態様では、連結部は、５〜６．５のｐＨ、例えば５．３〜６．２、または５〜６、または５．５〜６．５のｐＨで不安定である。当業者は他のｐＨを想定することもできる。例えば、連結部は、腫瘍細胞に見られるｐＨで不安定であることができ、これは典型的には６．５〜７．０である。連結部は、胃腸管にみられるｐＨで、例えば典型的にはｐＨ１．５〜２．５である胃にみられるｐＨで、不安定であってもよい。
【００４８】
好ましい一態様では、連結部は、還元条件下で不安定である。
【００４９】
生物学的溶液中で安定であり、かつ所定の条件で不安定であるような適切なリンカーは、どれでも使用できることは、業者には理解されるだろう。好ましいリンカーをここで説明する。
【００５０】
好ましい一態様では、修飾脂質は、式：
【化４】
2005515990.tif 000006
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。Ｒ1はＨまたはヒドロカルビル基である。Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である。Ｒ3およびＲ5はＨおよびヒドロカルビル基から独立して選択される。ＱはＯ、Ｓ、ＮＨから選択される］
で表される。
【００５１】
本明細書で使用する「ヒドロカルビル基」という用語は、少なくともＣおよびＨを含む基を意味し、任意選択により他の適切な置換基を１つ以上含んでもよい。そのような置換基の例として、ハロ、アルコキシ、ニトロ、アルキル基、環式基などを挙げることができる。置換基は環式基であることができるばかりでなく、置換基の組合せによって環式基が形成されてもよい。ヒドロカルビル基が２個以上のＣを含む場合は、それらの炭素原子が互いに連結されている必要は必ずしもない。例えば、少なくとも２つの炭素が、適切な要素または基を介して連結されていてもよい。したがってヒドロカルビル基はヘテロ原子を含んでもよい。適切なヘテロ原子は当業者には明らかだろう。適切なヘテロ原子としては、例えば硫黄、窒素および酸素などが挙げられる。ヒドロキシカルビル基の非限定的な例はアシル基である。
【００５２】
典型的なヒドロカルビル基は炭化水素基である。この場合、「炭化水素」という用語は、直鎖状でも分枝鎖状でも環状でもよいアルキル基、アルケニル基もしくはアルキニル基、またはアリール基のいずれかを意味する。炭化水素という用語には、前記のような基であって、所望により置換されているものも包含される。炭化水素が置換基を持つ分枝状の構造である場合は、その置換は炭化水素主鎖上にあっても、分枝上にあってもよく、また置換は、炭化水素主鎖上および分枝上にあってもよい。
【００５３】
好ましい一態様では、修飾脂質は、式：
【化５】
2005515990.tif 000007
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。Ｒ1はＨ、Ｏ-またはヒドロカルビル基である。Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である］
で表される。
【００５４】
好ましい一態様では、修飾脂質は、式：
【化６】
2005515990.tif 000008
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。Ｒ1はＨ、Ｏ-またはヒドロカルビル基である。Ｒ2は非共有電子対またはＲ4であって、この場合、Ｒ4は適切な置換基である。Ｒ3およびＲ5はＨおよびヒドロカルビル基から独立して選択される。Ｑは適切な置換基である］
で表される。
【００５５】
好ましくは、Ｒ2はＲ4である。Ｒ4は任意の適切な置換基から選択することができる。適切な置換基として、電子吸引基、例えばハロゲン化炭化水素、特にフッ化炭化水素、パラニトロフェノールなどのニトロフェノールが挙げられる。
【００５６】
好ましくは、Ｑは、ＯＨ、ＳＨ、１級アミン、２級アミン、３級アミンおよびヒドロカルビルから選択される。
【００５７】
好ましい一態様では、修飾脂質は、式：
【化７】
2005515990.tif 000009
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である］
で表される。
【００５８】
好ましい一態様では、ＡはＤＴＳ部分であり、Ｂは脂質である。Ａが脂質、ＢがＤＴＳ部分であってもよいことは、当業者には理解されるだろう。
【００５９】
任意選択によるリンカーＹ
好ましい一態様では、任意選択によるリンカーＹが存在する。
【００６０】
Ｙは、一態様として、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびヒドロカルビル基から選択することができる。
【００６１】
好ましい一態様では、ＹがＯ（酸素）である。この態様の場合、本発明の修飾脂質は、式：
【化８】
2005515990.tif 000010
で表すことができる。
【００６２】
これに代わる一態様では、Ｙはヒドロカルビル基である。
【００６３】
好ましいＹは、−［ＣnＨn-2］a−［ＮＨ］b−［ＣＺ］c−［ＮＨ］d−［ＣＺ］e−ＮＨ−（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは０〜１０から独立して選択され、ｎは５〜１０であり、ＺはＯまたはＳである）から選択される。
【００６４】
ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、好ましくは０〜５から、より好ましくは０〜３から、または０、１もしくは２から選択される。
【００６５】
非常に好ましい一態様では、
・ａが０または１であり、および／または
・ｂが０または１であり、および／または
・ｃが０または１であり、および／または
・ｄが０、１または２であり、および／または
・ｅが０または１である。
【００６６】
他の非常に好ましい態様では、ＺがＯである。
【００６７】
他の非常に好ましい態様では、ｎが５である。
【００６８】
一態様では、Ｙがオリゴマー部分またはポリマー部分、例えばＰＥＧである。
【００６９】
一態様では、Ｙは−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−、および−Ｃ5Ｈ3−ＮＨ−から選択される。
【００７０】
一態様では、Ｙは、
−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−、
−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）−、
−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2Ｏ−、
−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−、
−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＣＨ2ＳＨ）−、
−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ2Ｏ−、
−ＮＨ−ＣＨ2−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、
−ＮＨ−
から選択される。
【００７１】
好ましい一態様では、リンカーＸはポリアミン基を含むか、ポリアミン基を介して脂質に連結される。
【００７２】
本ポリアミン基は、結果として得られるリポソーム／リポプレックスのＤＮＡ結合能力および遺伝子導入効率を増大させるので、有利であると考えられる。
【００７３】
ある実施形態では、ポリアミン基は、好ましくは、非天然ポリアミンである。アミノ官能性が増加するとリポソーム／リポプレックスの全体的正電荷が増えるので、ポリアミン頭部は有利であると考えられる。また、ポリアミンはＤＮＡを強く結合し、しかもＤＮＡを安定化することが知られている。さらに、ポリアミンは細胞内にもともと存在するので、毒性の問題も最小限に抑えられると考えられる。
【００７４】
もう一つの実施形態では、好ましくは、本発明のポリアミン基の２つ以上のアミン基が、天然ポリアミン化合物のアミン基を隔てている自然界には見られない１つ以上の基で、隔てられている（すなわち好ましくは、本発明のポリアミン基は、自然にはない間隔を持っている）。
【００７５】
本ポリアミン基では、好ましくは、そのポリアミン基に含まれる少なくとも２つのアミンが互いにエチレン（−ＣＨ2ＣＨ2−）基によって隔てられる（間隔を置いて配置される）。
【００７６】
好ましくは、本ポリアミン基の各アミンは、エチレン（−ＣＨ2ＣＨ2−）基によって隔てられる（互いに間隔を置いて配置される）。
【００７７】
適切なポリアミンの典型例として、スペルミジン、スペルミン、カルドペンタアミン（ｃａｌｄｏｐｅｎｔａｍｉｎｅ）、ノルスペルミジンおよびノルスペルミンが挙げられる。ポリアミンは、好ましくは、スペルミジンまたはスペルミンである。というのも、これらのポリアミンは一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡと相互作用することが知られているからである。これに代わる好ましいポリアミンはカルドペンタアミンである。
【００７８】
任意選択によるリンカーＸ
好ましい態様では、任意選択によるリンカーＸが存在する。
【００７９】
ある態様では、任意選択によるリンカーＸが存在しない。
【００８０】
好ましい一態様では、Ｘはヒドロカルビル基である。
【００８１】
ある態様では、Ｘが存在する場合、Ｘは炭化水素基である。これは、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基から選択される炭化水素基であることができる。これは、置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基から選択される炭化水素基であることができる。
【００８２】
Ｒ1
上述のように、ＤＴＳ部分の永続性は、脂質上またはＤＴＳ部分上のＲ1基の選択（本発明の製造方法または本発明の組成物におけるＲ1基の選択−アルデヒドまたはケトンの選択）によって制御することができる。
【００８３】
好ましい一態様では、Ｒ1はＨおよびヒドロカルビル基から選択される。
【００８４】
好ましい一態様では、Ｒ1はＨおよび炭化水素基から選択される。
【００８５】
好ましい一態様では、Ｒ1はＨおよび炭素数１〜１０の炭化水素基から選択される。
【００８６】
好ましい一態様では、Ｒ1はＨ、炭素数１〜１０のアルキル基、および炭素数１〜１０のアリール基から選択される。
【００８７】
好ましい一態様では、Ｒ1はＨ、炭素数１〜５のアルキル基（メチル基、エチル基など）、および炭素数６のアリール基から選択される。
【００８８】
好ましい一態様では、Ｒ1はＨである。
【００８９】
Ｒ2
好ましくはＲ2はＲ4である。Ｒ4は任意の適切な置換基から選択される。適切な置換基として、電子吸引基、例えばハロゲン化炭化水素、特にフッ化炭化水素、パラニトロフェノールなどのニトロフェノールが挙げられる。
【００９０】
ある態様では、Ｒ4は、Ｈならびに置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基から選択される。Ｒ4は、Ｈならびに置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、アルケニル基およびアルキニル基から選択してもよい。
【００９１】
ある態様では、Ｒ4はＨである。
【００９２】
ある態様では、Ｒ2はＨである。
【００９３】
Ｃ＝Ｎ
Ｃ＝Ｎ結合は酸不安定性であっても酸耐性であってもよい。
【００９４】
好ましい一態様では、Ｃ＝Ｎ結合は酸不安定性である。
【００９５】
ある態様では、Ｃ＝Ｎ結合は酸耐性である。
【００９６】
ＤＴＳ部分
送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）は、例えば脂質の安定性、溶解度、生物学的利用率および／または特定の生体物質に対する親和性（ターゲッティング）を向上させることなどによって、その脂質の生物学的性質を強化するために使用される。
【００９７】
好ましい一態様では、ＤＴＳ部分は送達および／または安定化部分である。
【００９８】
好ましい一態様では、ＤＴＳ部分は送達および／または安定化ポリマーである。
【００９９】
ＤＴＳ部分は、好ましくは、一官能性または二官能性のポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、ポリ（ビニルアルコール）（「ＰＶＡ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）のような他のポリ（アルキレンオキシド）、並びにポリ（オキシエチル化グリセロール）、ポリ（オキシエチル化ソルビトール）およびポリ（オキシエチル化グルコース）などのようなポリ（オキシエチル化ポリオール）から選択される。
【０１００】
背景技術であるＵＳ−Ａ−２００１／００２１７６３で議論されているように、ポリマーは、ホモポリマーでも、上述したポリマーのモノマーに基づくランダムコポリマー、ブロックコポリマーおよびターポリマーでもよく、直鎖状でも分枝鎖状でもよく、また、ｍＰＥＧや、リンカーへの結合に利用できる一活性部位を持つ他のキャップ付き一官能性ＰＥＧと同様の置換ポリマーでも、無置換ポリマーでもよい。
【０１０１】
適切な他のポリマーの具体例として、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（アクリロイルモルホリン）（「ＰＡｃＭ」）およびポリ（ビニルピロリドン）（「ＰＶＰ」）が挙げられる。ＰＶＰとポリ（オキサゾリン）は当分野では周知のポリマーであり、その製造と、ｍＰＥＧについて述べる合成における使用法は、当業者にはすぐにわかるはずである。ＰＡｃＭとその合成および使用法は、ＵＳ−Ａ−５，６２９，３８４およびＵＳ−Ａ−５，６３１，３２２に記載されている。
【０１０２】
本発明で利用することができる適切なターゲッティング部分として、抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体（Ｈｅｒ＿ｎｅｕ）および一本鎖ヒト抗体断片（例えばＦｖ）、リガンド、例えば葉酸部分、糖質エピトープ（ＧＭ３、アミノラクトース、ビタミン、成長因子、ペプチド、例えばＲＧＤおよびテネイシン、ならびにトランスフェリンやアルブミンなどのタンパク質が挙げられる。
【０１０３】
本発明で利用することができる適切な送達部分として、膜活性ペプチドおよび膜活性タンパク質、例えば毒素およびＴＡＴが挙げられる。
【０１０４】
本発明の好ましい一態様では、ＤＴＳ部分が、さらにもう一つの部分（例えばＤＴＳ部分）に連結することができるさらにもう一つのリンカー基を含む。したがって、化合物の機能性に変更を加えるためにさらに修飾して追加のＤＴＳ部分を持たせることが可能なＤＴＳを用意することができる。例えば、第１のＤＴＳ部分は、そのＤＴＳを取り付ける脂質によって形成されるリポソーム／リポプレックスを安定化しうる。リポソーム／リポプレックスの形成後に、そのリポソーム／リポプレックスを特定の生物学的標的にターゲッティングするのに有用なさらにもう一つのＤＴＳを付与することができる。
【０１０５】
上記のさらなるリンカーは、マレイミド基、ハロゲン化炭素、アルデヒドおよびケトンから選択することができる。上記のさらなるリンカーは好ましくはケトンである。
【０１０６】
上記のさらなるリンカーは、まず、連結部を形成することができる基を少なくとも２つは持っている第１のＤＴＳ部分に連結することによって用意することができる。それら２つの基の一方は、第１のＤＴＳ部分を脂質に連結する際に利用することができる。上記２つの基の他方は、第１のＤＴＳ／脂質複合体に第２のＤＴＳ部分を連結する際に利用することができる。第１のＤＴＳ部分は、好ましくは、安定化部分である。この態様では、さらなる修飾に先だって、系が安定化される。第２のＤＴＳ部分は、好ましくは、ターゲッティング部分である。
【０１０７】
脂質
好ましい一態様では、脂質は、コレステロール基またはグリセロール／セラミド主鎖であるか、またはそれを含む。脂質様の構造またはポリアミンはどれでも適切である。
【０１０８】
前記コレステロール基は、好ましくは、コレステロールである。
【０１０９】
前記コレステロール基は、好ましくは、カルバモイル結合を介してＸまたはＹに連結される。
【０１１０】
前記コレステロール基はコレステロールまたはその誘導体であることができる。コレステロール誘導体の例として、１つ以上の環ＣＨ2基またはＣＨ基および／または１つ以上の直鎖ＣＨ2基またはＣＨ基が適当に置換されている置換誘導体が挙げられる。これに代えて、またこれに加えて、１つ以上の環式基および／または１つ以上の直鎖基が不飽和であってもよい。
【０１１１】
好ましい一態様では、前記コレステロール基がコレステロールである。コレステロールは結果として得られるリポソーム二重層を安定化するので、コレステロールは有利であると考えられる。
【０１１２】
コレステロール基は、好ましくは、カルバモイル結合を介して任意選択によるリンカー基に連結される。この結合は、結果として得られるリポソーム／リポプレックスが低い細胞毒性または最低限の細胞毒性しか持たないので、有利であると考えられる。
【０１１３】
非常に好ましい一態様では、脂質は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃｈｏｌである。さらにもう一つの非常に好ましい態様では、Ｂは脂質−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃｈｏｌである。
【０１１４】
さらなる態様
式：
【化９】
2005515990.tif 000011
で表される本発明の修飾脂質は、任意の方法によって製造することができる。アミノキシ化合物およびアルデヒドまたはケトンからの製造は特に有利であることを、本発明者らは見いだした。
【０１１５】
本発明のもう一つの態様によれば、式：
【化１０】
2005515990.tif 000012
の修飾脂質を製造する方法であって、（ｉ）式：
【化１１】
2005515990.tif 000013
の化合物と、（ｉｉ）式：
【化１２】
2005515990.tif 000014
の化合物
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。Ｒ1はＨ、Ｏ-またはヒドロカルビル基である。Ｒ2は非共有電子対、Ｈ、またはヒドロカルビル基である］
とを反応させることを含む方法が提供される。
【０１１６】
本発明のもう一つの態様によれば、（ｉ）式：
【化１３】
2005515990.tif 000015
の化合物、（ｉｉ）式：
【化１４】
2005515990.tif 000016
の化合物
［式中、ＡおよびＢの一方は脂質であり、ＡおよびＢの他方は、送達、ターゲッティングまたは安定化部分（ＤＴＳ部分）である。ＸおよびＹは独立して任意選択によるリンカー基である。Ｒ1およびＲ2は独立してＨまたはヒドロカルビル基である］
を含む組成物が提供される。
【０１１７】
Ｒ2は、好ましくは、Ｈまたはヒドロカルビル基である。
【０１１８】
好ましい一態様では、Ｒ2はＨである。
【０１１９】
本発明の製造方法は、好ましくは、水性媒質中または完全な水性媒質中で行われる。
【０１２０】
さらに本発明は、ここに定義する本発明の製造方法によって製造される化合物、ここに定義する本発明の製造方法によって得られる化合物、および／またはここに定義する本発明の製造方法によって得ることができる化合物も提供する。
【０１２１】
本化合物は、好ましくは、ヌクレオチド配列との混合状態または会合状態にある。
【０１２２】
そのヌクレオチド配列は、遺伝子治療などの治療に役立ちうる発現系の一部または全部であることができる。
【０１２３】
好ましい一態様では、本発明の化合物は、濃縮されたポリペプチド／核酸複合体との混合状態にあって、非ウイルス核酸送達ベクターになる。濃縮されたポリペプチド／核酸複合体として、好ましくは、本出願人による同時係属出願ＷＯ０１／４８２３３に開示されているものが挙げられる。上記ポリペプチドまたはその誘導体は、好ましくは、核酸複合体に結合する能力を持つ。上記ポリペプチドまたはその誘導体は、好ましくは核酸複合体を濃縮する能力を持つ。上記核酸複合体は、好ましくは、上記ポリペプチドまたはその誘導体に対して異種である。
【０１２４】
本化合物は、好ましくは、医薬活性剤との混合状態または会合状態にある。この医薬活性剤は、ＰＮＡ、ＯＤＮ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド、タンパク質、および抗がん剤ドキソルビシンなどの薬物から選択することができる。
【０１２５】
陽イオン性リポソーム／リポプレックスは、好ましくは、本発明の化合物および例えばＤＯＴＭＡまたはＤＯＰＥなどの中性リン脂質から形成される。この中性リン脂質は、好ましくは、ＤＯＰＥである。
【０１２６】
以下に、単なる例示を目的として、添付の図面を参照しながら本発明をさらに詳しく説明する。
【０１２７】
以下の実施例では本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例】
【０１２８】
合成
一般事項：1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、内部標準として残留同位体溶媒（ＣＤＣｌ3，δH＝７．２６ｐｐｍ）を使用して、Ｂｒｕｃｋｅｒ  ＡＭ５００、Ｂｒｕｃｋｅｒ  ＤＲＸ400、Ｂｒｕｃｋｅｒ  ＤＲＸ300またはＪｅｏｌ  ＧＸ−２７０Ｑ分光計で記録した。質量スペクトルはＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＡｕｔｏＳｐｅｃＱ質量分析計（Ｂｒｕｃｋｅｒ）またはＭＡＬＤＩ（Ｂｒｕｃｋｅｒ）で記録した。ＨＰＬＣ（分析用およびセミ分取用）は日立（Ｍｅｒｃｋ）システムで行った。
【０１２９】
略号：ＤＩＥＡ，ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ，ジメチルホルムアミド；ＤＣＭ，ジクロロメタン；ＥＤＣ，１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドクロライド；ＥＤＴ，１，２−エタンジチオール；ＨＢＴＵ，Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート；ＨＡＴＵ，Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール（ａｚａｂｅｎｔｏｔｒｉａｚｏｌ）−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート；ＭＴＢＥ，メチル−ｔ−ブチルエーテル；ＯｐＦ，ペンタフルオロフェノール；ＰＣＳ，光子相関分光法；ＴＦＡ，トリフルオロ酢酸。
【０１３０】
ターゲッティング化合物
概説：葉酸ユニットを持つターゲッティングリガンドであって、葉酸のγ−カルボキシ基が固相上のアミノ酸の遊離アミンに共有結合されて、ペプチドと葉酸との間にアミド結合が形成されているものを構築した。葉酸受容体はすべてのがん細胞株上に過剰発現している。二重の戦略、すなわち図１Ｂおよび図１Ｃの図解に従って、（ａ）ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ−ｍａｌまたはＣＨＯ−ＰＥＧ−ｍａｌなどのポリエチレングリコールユニットのマレイミド基への、Ｃ末端システイン残基のチオール基を介した葉酸リガンドの後カップリング、ならびに（ｂ）（ｃ）リポプレックスに後カップリングしたジアルデヒドの第２の遊離アルデヒド基への、アミノキシユニットを介した後カップリング、を適用した。
【０１３１】
葉酸−（Ｇｌｙ）3−（Ａｒｇ）3−（Ｇｌｙ）3−Ｃｙｓ−ＯＨ
【化１５】
2005515990.tif 000017
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ワング樹脂（負荷量０．５３ｍｍｏｌ／ｇ，２００ｍｇ）をＤＭＦ中で１６時間膨潤させ、ＤＭＦで十分に洗浄した。ＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を使ってＦｍｏｃ脱保護（５分×２）を行った後、ＤＭＦで十分に洗浄した。各カップリングステップには、３当量のアミノ酸、５当量のＤＩＥＡおよび３当量のＨＢＴＵを使用した。各カップリングを３０分間行った後、３当量のＤＩＥＡの存在下にＤＭＦ中の酢酸無水物（１０％）でキャッピングした。ＴＦＡ（１０ｍＬ）、水（０．５ｍＬ）、ＥＤＴ（０．２５ｍＬ）、チオアニソール（０．５ｍＬ）およびフェノール（０．７５ｇ）からなる溶液３ｍＬを使って、ペプチドを３時間切断した。ＭＴＢＥ（２０ｍＬ）を加えてペプチドを沈殿させた後、３０００ｒｐｍで遠心分離した（２０分間）。上清を除去し、黄色いペプチドを水（３ｍＬ）に溶解した。ＨＰＬＣ分析（日立，Ｃ18カラム，勾配０−４０％アセトニトリル，４０分，流速１ｍＬ／分）では、λmax＝２８９ｎｍで吸収する２つの主要ピークが得られた。粗製ペプチドのＭＡＬＤＩ分析では、［Ｍ+］に対応する１つの主要ピークがｍ／ｚ＝１３５５に得られた。ＬａＣｈｒｏｍセミ分取用Ｃ18カラム、流速７ｍＬ／分、モニタリング波長λ＝２１４ｎｍを使って、Ｇｉｌｓｏｎセミ分取用ＨＰＬＣシステムで、粗製ペプチドを精製した。遊離チオールの存在を、陽性チオール試験（エルマン試験、ＤＴＮＢ試験ともいう：０．１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ3緩衝液（ｐＨ８）に溶解した４０ｍｇの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を調製した。この溶液１ｍＬに、２０μＬのペプチド（１０ｍｇ／ｍＬ）を加えたところ、遊離のチオールにより、直ちに黄変した）。ＭＡＬＤＩ  ｍ／ｚ＝１３５５．８４［Ｍ+］。ＨＰＬＣ分析（Ｃ18，０−４０％アセトニトリル，４０分，流速１ｍＬ／分，ｔr＝１５分，単一ピーク）。
【０１３２】
葉酸−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−ＣＯＮＨ（ＣＨ2）3−ＮＨ−ＣＨ2−ＯＮＨ2
【化１６】
2005515990.tif 000018
【０１３３】
概説：このターゲッティングリガンドは、図１に記載の後カップリング戦略の一部として、ＬＤまたはＬＭＤ系の表面にあるジアルデヒド−ＰＥＧ2000の第２のアルデヒド官能基にカップリングするために合成した。
【０１３４】
実験手順：ＤＣＭ（５０ｍＬ）に懸濁したＢｏｃ−ＮＨＣＯ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ（０．５ｇ，２．６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１０３７ｍｇ，１．０５当量）、ＤＭＡＰ（９６０ｍｇ，３当量）およびＦｍｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＮＨ3Ｃｌ（７７０ｍｇ，１当量）を１６時間撹拌して透明な溶液を得た。クエン酸（７％，１００ｍＬ×３）を使って塩基性化合物を抽出し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた。1Ｈ  ＮＭＲσ（ｐｐｍ）８．４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ），８．１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−Ｆｍｏｃ），７．８（ｄ，２Ｈ，７．４Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．６（ｄ，２Ｈ，７．４Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．４（ｄ×ｄ，２Ｈ，７．２Ｈｚ，７．２Ｈｚ），７．３２（ｄ×ｄ×ｄ，２Ｈ，４Ｈｚ，７．４Ｈｚ，１．１Ｈｚ），５．６（ｍ，１Ｈ，ＮＨ−アミノキシ），４．２５（ｄ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），４．２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2−アミノキシ），４．１（ｍ，１Ｈ，Ｆｍｏｃ），１．５５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2），１．３（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）。Ｂｏｃ基の脱保護は、ＴＦＡ／水（８０％）中で１．５時間行った。生成物のアイデンティティを質量分析法（ＥＳＩ）で確認した。ｍ／ｚ＝４１０［Ｍ＋Ｋ］+。ＨＰＬＣ（Ｃ18，０−１００％ＣＨ3ＣＮ，４０分），ｔR＝２７．５２分。
【０１３５】
ＳＰＰＳ：クロロトリチル樹脂（０．５ｇ，１．４ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＣＭ中で膨潤させた後、Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ2）3−ＮＨＣＯ−ＣＨ2−ＯＮＨ2（３２０ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３２０ｍｇ，３．７当量）を添加し、３時間振とうした。吸光係数ε（Ｆｍｏｃ）＝７８００Ｍ-1ｃｍ-1を使って、樹脂の正確な負荷量をＵＶ（３００ｎｍ）で決定した。負荷量は０．１２８ｍｍｏｌと決定された。続いて、Ｆｍｏｃ−アミノ酸をカップリングするために、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に３当量のアミノ酸、５当量のＨＢＴＵおよび５当量のＤＩＥＡを取り、１時間カップリングした。ＤＭＦ中のピペリジン（２０％）を使ってＦｍｏｃ脱保護を行った。葉酸（２８３ｍｇ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解した後、ＥＤＣ（１２５ｍｇ，１当量）およびＮＨＳ（７３ｍｇ，１当量）およびＤＩＥＡ（２２０  Ｌ，１０当量）を添加して、２時間カップリングした。樹脂からの切り離しは、ＴＦＡ（４．９ｍＬ／０．１２５ｍＬ水／０．１２５ｍＬトリイソプロピルシラン）を使って行った。その黒い溶液をＭＴＢＥ中で沈殿させて、黄色い水溶性の沈殿物を得た。ＭＡＬＤＩ  ｍ／ｚ  １４５７．８９［Ｍ+］。この粗生成物を凍結乾燥し、日立セミ分取用ＨＰＬＣ（Ｃ18，０―１００％ＣＨ3ＣＮ，４０分）で精製した。ｔR＝１８．６分。
【０１３６】
ポリエチレングリコールの誘導体
概説：新規ポリエチレングリコール誘導体を、二重の目的で、すなわち（ｉ）これらのＰＥＧ誘導体をリポプレックスの表面に後カップリングするために、アミノキシ脂質１および２６（ｄ）のアミノキシ基と選択的に反応する官能基選択的部分を導入することと、（ｉｉ）酸性ｐＨで切断することができる酸不安定性リンカー（ｃｉｓ−アコニット酸）（トリガー可能性）（ｅ）および（ｆ）を含むポリエチレングリコール誘導体とを目的として合成した。この第２の戦略により、脂質とＰＥＧ部分の間のトリガー可能（酸不安定）な結合が全体として増加するはずである12。
【０１３７】
ＣＨＯ−ＰＥＧ3400−ｍａｌ
【化１７】
2005515990.tif 000019
ＤＣＭ中のＮＨＳ−ＰＥＧ−ｍａｌ（１００ｍｇ，０．０２９ｍｍｏｌ）および１−アミノ−２−ジメトキシ−エタン（３当量，９．１ｍｇ，１０μＬ）を１時間撹拌してから、ＨＡＴＵ（１当量，１１ｍｇ）を加えて、１６時間撹拌した。ＤＣＭをすべて蒸発させ、水（２ｍＬ）を加え、凍結乾燥して白色粉末を得て、それを水（０．６ｍＬ）に溶解した。ＴＦＡ（２．４ｍＬ）を加え、１時間撹拌した。反応混合物を液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。油状残渣をＣＤＣｌ3に取り出すとエマルションになったので、これを凍結乾燥した。ＣＤＣｌ3（２ｍＬ）を添加すると透明な溶液になった。その溶液のうち０．８ｍＬを1Ｈ  ＮＭＲに使用した。９ｐｐｍ（アルデヒド）の大きな共鳴により、過剰の出発物質がまだ残っていることがわかった。合わせたクロロホルム溶液にＭＴＢＥをゆっくり添加したところ、白色の沈殿が生じた。これを遠心分離（３０００ｒｐｍ／５分）し、上清を除去し、残渣を水に取り出し、凍結乾燥した。1Ｈ  ＮＭＲ分析用に２２ｍｇの白色粉末をＣＤＣｌ3（０．８ｍＬ）に溶解した。σ（ｐｐｍ）１２（０．５Ｈ，ＣＯＯＨ），９．６（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），９（０．１Ｈ，ＣＨＯ出発物質），７．３（ＣＨＣｌ3），６．７（ｓ，１Ｈ，ｍａｌ），６．６（ｓ，０．１Ｈ，ｍａｌ），６．５（ｓ，１Ｈ，ｍａｌ），３．５（ｓ，１５０Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−ＰＥＧ），２．９（ｓ，ブロード，４−６Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2−ｍａｌ），１．１（ｓ，３−５Ｈ，−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−）。この1Ｈ  ＮＭＲから、正しい生成物が約８０％の推定純度で得られ、残りは遊離のカルボン酸化合物であることがわかった。残存している微量のＴＦＡと出発物質を除去するために、生成物をさらに２回凍結乾燥したところ、水に不溶な、ナイロン様の白色ポリマーが得られた。中性／塩基性条件下でアルデヒドが重合したものと思われる。
【０１３８】
ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌ
【化１８】
2005515990.tif 000020
ＤＣＭ  ３９０ｍＬに溶解した１００ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ3400−ｍａｌ（米国Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｓ）に、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の１，２−ジアミノエタン（３９０μＬ）を３０分かけて滴下し、室温で１時間撹拌した。反応を完了させるために２０ｍｇのＨＢＴＵ（英国Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ）を加え、室温で１６時間撹拌した。ＤＣＭをすべて蒸発させ、残渣を水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（５ｍＬ）に取り出し、その透明な溶液を液体窒素で凍結して、凍結乾燥したところ、水に容易に溶解する白色粉末を得た。生成物をもう一度凍結乾燥してから、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。ＤＩＥＡ（２５μＬ）およびｃｉｓ−アコニット酸無水物（６当量，２７ｍｇ）（英国Ｓｉｇｍａ）を加え、反応液を１６時間撹拌した。後処理：水（２０ｍＬ）を加え、ジエチルエーテル（５０ｍＬ×３）で抽出した。水層を有機層から分離し、凍結乾燥した。この生成物の試料を分析用ＨＰＬＣ（Ｃ4，０−１００  ＣＨ3ＣＮ，ＴＦＡなし）で分析した。ｔR＝２６分、３０分（主ピーク）および３３分に３つのピーク。３０分のピークを単離し、ＭＡＬＤＩで分析した。ｍ／ｚ＝３９２２［Ｍ+］；３９２２±４４×ｎ（±１０＞ｎ＝ポリエチレングリコールの不均質性）。７５ｍｇ（約０．０１４５ｍｍｏｌ）のｃｉｓ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌをＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した後、ペンタフルオロフェノール（５当量，１４ｍｇ）、ＨＡＴＵ（英国ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；５当量，２８ｍｇ）およびＤＩＥＡ（１５当量，３８μＬ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。後処理：水（２０ｍＬ）を加え、ジエチルエーテル（２５ｍＬ×２）、酢酸エチル／ジエチルエーテル（１：１；５０ｍＬ×１）で抽出し、水相を凍結乾燥したところ、赤／褐色粉末を得た。その化合物を溶解するためにジクロロメタン（２ｍＬ）を加えた後、ＭＴＢＥを滴下したところ、赤／褐色の沈殿物を得た。その沈殿物を遠心分離（３０００ｒｐｍ／５分）によって集め、水に取り出して、凍結乾燥したところ、赤／褐色粉末を得た。２２ｍｇをＣＤＣｌ3に溶解して、1Ｈ−ＮＭＲによって分析した。σ（ｐｐｍ）８．５（ｓ，２Ｈ，ＣＯＮＨ），７．４（ｓ，ＣＨＣｌ3），６．５（ｓ，１Ｈ，ａｃｏｎ−ＣＨ＝Ｃ），６．４（ｓ，ブロード，ｍａｌ−Ｈ），５．８（ｓ，ブロード，ｍａｌ−Ｈ’），４（ｓ，１５０Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−ＰＥＧ），３．５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ），３．２（２Ｈ，ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ），１．３（ｓ，ブロード，４Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2−ｍａｌ）。イオン化可能な基がすべてブロックされているので、ＥＳＩとＭＡＬＤＩでは質量は検出されなかった。ＨＰＬＣ分析（Ｃ4，０−１００  ＣＨ3ＣＮ，ＴＦＡなし），ｔR＝２１−３４分（ＰＥＧに特有な幅広いピーク）。
【０１３９】
ビス−ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ6000
【化１９】
2005515990.tif 000021
ＮＨ2−ＰＥＧ6000−ＮＨ2（１００ｍｇ，０．０１６７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解した後、ｃｉｓ−アコニット酸無水物（１０当量，２６ｍｇ）を加え、２時間撹拌したところ、黄色の溶液が得られた。この溶液は４時間後には赤色に変色した。溶媒をすべて蒸発させ、水１０ｍＬを加え、過剰のｃｉｓ−アコニット酸無水物をジエチルエーテル（２０ｍＬ×３）で抽出し、水相を凍結乾燥したところ、黄／赤色粉末を得た。ＨＰＬＣから、反応は完了していないことがわかった。この粉末をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（３５μＬ）およびｃｉｓ−アコニット酸無水分物（２６ｍｇ）を加え、反応混合物を５０℃で３時間加熱し、上述のように後処理した。ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した赤／褐色粉末に、ＥＤＣ（１２．７ｍｇ，４当量）およびＯｐＦ（１２．２ｍｇ，４当量）を加え、室温で１６時間撹拌した。後処理：水（１０ｍＬ）を加え、ジエチルエーテル（２０ｍＬ×３）で抽出した。水層を凍結し、凍結乾燥したところ、白色粉末を得た。これをＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解した。ＭＴＢＥを添加したところ赤／褐色沈殿物が生じた。これを遠心分離（３０００ｒｐｍ，５分）し、上清を除去し、残渣を水（２ｍＬ）に取り出して、凍結乾燥した。その赤／褐色粉末をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解した。ＭＴＢＥを加えると赤／褐色沈殿が生じた。これを遠心分離（３０００ｒｐｍ，５分）し、上清を除去し、残渣を水（２ｍＬ）に取り出し、凍結乾燥することにより、赤／褐色粉末を得た。
【０１４０】
コレステロール誘導体
トリガー可能な脂質の合成
合成の概要：ポリエチレングリコール誘導体を使った後カップリング戦略に適した、種々のコレステロール系陽イオン性脂質およびコレステロール系中性脂質を製造した。４つの脂質をさらなる修飾の普遍的出発点とした。第１の脂質が、（２−アミノエチル）カルバミン酸コレステリルエステル（０１）、第２の脂質が、４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミン（８）である。次に、０１と８をそれぞれさらに修飾して、それぞれセリン含有脂質（１３，１４）およびシステイン含有脂質（１５，１６）とした。脂質０１を修飾して中性アミノキシ脂質１９とし、脂質８をさらに修飾して荷電アミノキシ脂質２６とした。第３の基本脂質、グリセリルコレステリル脂質２０を修飾して、ヒドラジド脂質２３とした。最後に、第４の出発脂質、コレステリル−カルバメートを修飾して、ヒドラゾン脂質２４にした。概要については表１を参照されたい。
【０１４１】
【表１】
2005515990.tif 000022
【０１４２】
合成法：乾燥ＣＨ2Ｃｌ2は五塩化リンを使って蒸留し、他の溶媒は必要に応じて乾燥済みのものを購入した。薄層クロマトグラフィー（Ｔｌｃ）はコーティング済みのＭｅｒｃｋ−Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０  Ｆ254アルミニウム基材プレートで行い、適宜、紫外線、ヨウ素、酸性モリブデン酸アンモニウム（ＩＶ）、酸性エタノール性バニリンまたは他の薬剤で可視化した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、都合のよい溶媒を使って、Ｍｅｒｃｋ−Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０（２３０〜４００メッシュ）で行い、適宜、紫外線（２５４ｎｍ）、ヨウ素、酸性モリブデン酸塩（ＩＶ）、酸性エタノール性バニリン、マンガン酸カリウム（ＶＩＩＩ）水溶液、アセトン中の４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンジルハイドロールまたはヨウ素で可視化した。赤外スペクトルはＮａＣｌ板を使ってＪａｓｃｏ  ＦＴ／ＩＲ  ６２０で記録した。質量スペクトル（陽イオンエレクトロスプレー）はＶＧ−７０７０Ｂ装置またはＪＥＯＬ  ＳＸ−１０２装置を使って記録した。1Ｈおよび13Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、内部標準として残留同位体溶媒を使って、Ｂｒｕｃｋｅｒ  ＤＲＸ３００機、ＤＲＸ４００機またはＪｅｏｌ  ＧＸ−２７０Ｑ機で記録した。
【化２０】
2005515990.tif 000023
【０１４３】
（２−アミノエチル）カルバミン酸コレステリルエステル（０１）
【化２１】
2005515990.tif 000024
クロロギ酸コレステリル（７．５ｇ，０．０１６７ｍｏｌ）をエチレン−１，２−ジアミン（１８０ｍｌ）に溶解し、その混合物を１５時間撹拌した。反応を水で停止し、ジクロロメタンで抽出した。有機抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な標題化合物０１（５．５ｇ，０．０１１６，７３％）を得た。
【０１４４】
２−（コレステリルオキシカルボニル）アミノエタノール（２）
【化２２】
2005515990.tif 000025
エタノールアミン（１５ｍｌ，０．２４６  ｍｏｌ，２．２当量）をＤＣＭ（３５ｍｌ）に溶解し、氷浴を使って０℃に冷却した。ＤＣＭ（３００ｍｌ）に溶解したクロロギ酸コレステリル（５０ｇ，０．１１２ｍｏｌ，１当量）を１時間かけて滴下したところ、この間に白色の沈殿が生成した。反応液を室温まで温め、１８時間撹拌し続けた。沈殿物を濾過によって取り除き、溶液を飽和ＮａＨＣＯ3（７５ｍｌ×２）および水（７５ｍｌ×２）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、溶媒を減圧下で除去することにより、２−（コレステリルオキシカルボニル）アミノエタノール  ２（４４ｇ，８７％）を得た。δH（３００ＭＨｚ）５．３９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），５．０２（１Ｈ，ｍ，Ｎ−Ｈ），４．５２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．７４（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ５．５Ｈｚ，Ｈ−２’），３．３５（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ５Ｈｚ，Ｈ−１’），２．３８−２．２５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），２．０８−１．７２（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−７，Ｈ−８），１．６４−１．０５（２１Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−９，Ｈ−１１，Ｈ−１２，Ｈ−１４，Ｈ−１５，Ｈ−１６，Ｈ−１７，Ｈ−２０，Ｈ−２２，Ｈ−２３，Ｈ−２４，Ｈ−２５），１．０２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９），０．９３（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ，Ｈ−２１），０．８９（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６．５Ｈｚ，Ｈ−２６，Ｈ−２７），０．６９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）。ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）４６９（Ｍ＋Ｎａ）+，４７４（Ｍ＋Ｈ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）+。
【０１４５】
２−［（コレステリルオキシカルボニル）アミノ］エチルメタンスルホネート（３）
【化２３】
2005515990.tif 000026
０℃のＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶解した２−［（コレステリルオキシカルボニル）アミノ］エタノール  ２（０．４５ｇ，０．９６ｍｍｏｌ，１．０当量）およびトリエチルアミン（０．４ｍｌ，２．８８ｍｍｏｌ，３．０当量）に、塩化メタンスルホニル（０．１９ｍｌ，２．４０ｍｍｏｌ，２．５当量）の溶液を滴下した。反応液を室温まで温め、３０分間撹拌した。反応が完了したことをｔｌｃで確認した後、氷を加えて反応を停止した。次に、その反応混合物を飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液（１５ｍｌ）に注ぎ、エーテル（１０ｍｌ×３）および食塩水（１０ｍｌ×１）で抽出し、乾燥した（Ｎａ2ＳＯ4）。溶媒を減圧下で除去し、得られた白色固体をクロマトグラフィー（エーテル）にかけることにより、メタンスルホン酸２−［（コレステリルオキシカルボニル）アミノ］エチル  ３（０．４８ｇ，９０％）を得た。δH（３００ＭＨｚ）５．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ５Ｈｚ，Ｈ−６），５．００（１Ｈ，ｍ，Ｎ−Ｈ），４．５２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），４．３２（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ５Ｈｚ，Ｈ−２’），３．５５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１’），３．０６（３Ｈ，ｓ，ＯＭｓ），２．３６−２．２９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），２．０４−１．８１（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−７，Ｈ−８），１．６４−１．０５（２１Ｈ，ｍ，Ｈ−１，Ｈ−９，Ｈ−１１，Ｈ−１２，Ｈ−１４，Ｈ−１５，Ｈ−１６，Ｈ−１７，Ｈ−２０，Ｈ−２２，Ｈ−２３，Ｈ−２４，Ｈ−２５），１．０２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９），０．９３（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６．５Ｈｚ，Ｈ−２１），０．８９−０．８７（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６．５Ｈｚ，Ｈ−２６，Ｈ−２７），０．６９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）。ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）５７４（Ｍ＋Ｎａ）+，５５２（Ｍ＋Ｈ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）+。
【０１４６】
４−アザ−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノール（４）
【化２４】
2005515990.tif 000027
丸底フラスコに、２−［（コレステリルオキシカルボニル）アミノ］エチルメタンスルホネート  ３（１５．６ｇ，０．０２９ｍｏｌ，１．０当量）および３−アミノ−ブタン−１−オール（１５０ｍｌ，７．５ｍｍｏｌ，１０当量）をロードした。反応が完了したことをｔｌｃで確認した後（約３日）、ＤＣＭ（１００ｍｌ）およびＫ2ＣＯ3（６ｇ）を加え、３０分間撹拌した。次に、その懸濁液を、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）の短いパッド越しに濾過し、ＤＣＭ、エタノールおよび１０％ＮＥｔ3／ＥｔＯＨで十分に洗浄した。溶媒を減圧下で除去したところ、黄色油状物を得た。これをＤＣＭ（１０ｍｌ）に再溶解し、水（３ｍｌ×３）および食塩水（３ｍｌ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）した。溶媒を減圧下で除去し、クロマトグラフィーで精製することにより、４−アザ−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノール  ４（１２．４５ｇ，８１％）を得た。δH（３００ＭＨｚおよび２７０ＭＨｚ）５．３８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），４．４８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．７７（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ５Ｈｚ，Ｈ−５’），３．２６（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１’），２．９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６Ｈｚ，Ｈ−２’），２．８２（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６Ｈｚ，Ｈ−３’），２．３０−２．２３（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），２．００−１．７６（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−７，Ｈ−８），１．７４−１．００（２３Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−１，Ｈ−９，Ｈ−１１，Ｈ−１２，Ｈ−１４，Ｈ−１５，Ｈ−１６，Ｈ−１７，Ｈ−２０，Ｈ−２２，Ｈ−２３，Ｈ−２４，Ｈ−２５），０．９９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９），０．９２−０．９０（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ，Ｈ−２１），０．８７−０．８５（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ，Ｈ−２６，Ｈ−２７），０．６８（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）。ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）５４３（Ｍ＋Ｎａ）+，５３１（Ｍ＋Ｈ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）+  １４５，１０５，９１（Ｃ7Ｈ7）+，８１（Ｃ6Ｈ9）+，５５。
【０１４７】
４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノール（５）
【化２５】
2005515990.tif 000028
ＤＣＭ（１８ｍｌ）に溶解した４−アザ−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノール  ４（３ｇ，５．６４ｍｍｏｌ，１当量）および二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１．２６ｇ，５．６４ｍｍｏｌ，１．０当量）に、ＮＥｔ3（０．９ｍｌ，６．１８ｍｍｏｌ，１．１当量）を加え、得られた溶液をｔｌｃで調べた。反応が完了してから、反応混合物を飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液（１５ｍｌ）に注ぎ込み、ＤＣＭ（４０ｍｌ×２）で抽出した。合わせた有機抽出物を水（４０ｍｌ×３）で洗浄し、乾燥した（Ｎａ2ＳＯ4）。溶媒を減圧下で除去することにより、４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノール  ５（３．１９ｇ，９０％）を得た。δH（２７０ＭＨｚ）５．３６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），４．４８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．５３（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ５Ｈｚ，Ｈ−５’），３．４０−３．２５（６Ｈ，ｍ，Ｈ−１’，Ｈ−２’，Ｈ−３’），２．３０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），２．００−１．７０（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−７，Ｈ−８），１．０５（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ  Ｈｓ  ３×ＣＨ3），１．６０−１．００（２３Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−１，Ｈ−９，Ｈ−１１，Ｈ−１２，Ｈ−１４，Ｈ−１５，Ｈ−１６，Ｈ−１７，Ｈ−２０，Ｈ−２２，Ｈ−２３，Ｈ−２４，Ｈ−２５），０．９８（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９），０．９３−０．９０（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ，Ｈ−２１），０．８８−０．８６（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ，Ｈ−２６，Ｈ−２７），０．６５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）。ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）６４３（Ｍ＋Ｎａ）+，６３１（Ｍ＋Ｈ）+，５３１（Ｍ−Ｂｏｃ），３６９（Ｃｈｏｌ）+，１６３，１４５，１０９，９１（Ｃ7Ｈ7）+，８１（Ｃ6Ｈ9）+，５７。
【０１４８】
４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシルメタンスルホネート（６）
【化２６】
2005515990.tif 000029
この製造は、２−［（コレステリルオキシカルボニル）アミノ］エチルメタンスルホネート  ２の製造に関して上述した方法により、０．０１１４ｍｏｌ規模で行い、クロマトグラフィー（エーテル）後に、４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシルメタンスルホネート  ６（０．７３ｇ，０．８７％）を得た。δH（３００ＭＨｚ）５．３８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），４．４９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），４．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６Ｈｚ，Ｈ−５’），４．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ５Ｈｚ，Ｈ−２’），３．５５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−１’），３．５５−３．３５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−３’），３．１６（３Ｈ，ｓ，ＯＭｓ  ＣＨ3），２．３５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），２．１２−１．７０（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−７，Ｈ−８），１．３８（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ  Ｈｓ  ３×ＣＨ3），１．６７−１．００（２３Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−１，Ｈ−９，Ｈ−１１，Ｈ−１２，Ｈ−１４，Ｈ−１５，Ｈ−１６，Ｈ−１７，Ｈ−２０，Ｈ−２２，Ｈ−２３，Ｈ−２４，Ｈ−２５），０．９６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９），０．９３−０．９１（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ，Ｈ−２１），０．８８−０．８６（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ，Ｈ−２６，Ｈ−２７），０．６９（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）。ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）６０９（Ｍ−Ｂｏｃ），３６９（Ｃｈｏｌ）+，１４５，１２１，１０５，９５（Ｃ7Ｈ11）+，８１（Ｃ6Ｈ9）+，６９，５５。
【０１４９】
４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサジド（７）
【化２７】
2005515990.tif 000030
丸底フラスコ中で、メタンスルホン酸４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシル（７．０ｇ，９．８８ｍｍｏｌ，１当量）、アジ化ナトリウム（３．２ｇ，０．０４９ｍｏｌ，５当量）およびヨウ化ナトリウム（１．５６ｇ，９．８８ｍｍｏｌ，１．０当量）を、すべて窒素下に置いた。無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）を撹拌しながら加え、還流冷却器を装着し、８０℃で５．５時間加熱した。反応が完了したことをｔｌｃで確認した後、フラスコを室温に戻し、ＤＭＦを減圧下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃに再溶解した。これを炭酸水素ナトリウム（５０ｍｌ×２）、水（１０ｍｌ×２）および食塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）した。次に、溶媒を減圧下で除去し、クロマトグラフィー（石油エーテル１：エーテル１）で精製することにより、４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサンアミン  ７（５．７ｇ，８８％）を得た。δH（３００ＭＨｚ）５．３８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），４．８５（１Ｈ，ｍ，Ｎ−Ｈ），４．５３−４．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．３８−３．２８（８Ｈ，ｍ，Ｈ−５’，Ｈ−３’，Ｈ−２’，Ｈ−１’），２．３６−２．２５（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），１．９０−１．７８（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−７，Ｈ−８），１．４８（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ  Ｈｓ  ３×ＣＨ3），１．６３−１．０５（２３Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−１，Ｈ−９，Ｈ−１１，Ｈ−１２，Ｈ−１４，Ｈ−１５，Ｈ−１６，Ｈ−１７，Ｈ−２０，Ｈ−２２，Ｈ−２３，Ｈ−２４，Ｈ−２５），１．０１（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９），０．９３−０．９１（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ，Ｈ−２１），０．８８−０．８６（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ，Ｈ−２６，Ｈ−２７），０．６８（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）。ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）６５６（Ｍ＋Ｈ）+，５５６（Ｍ−Ｂｏｃ），３６９（Ｃｈｏｌ）+，１４５，１２１，１０５，９５（Ｃ7Ｈ11）+，８１（Ｃ6Ｈ9）+，５７。
【０１５０】
４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミン（８）
【化２８】
2005515990.tif 000031
ＴＨＦ（２２ｍｌ）に溶解して撹拌した４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキサンアミン  ７（２．０ｇ，３．０５ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＴＨＦ（３．５ｍｌ）中のトリメチルホスフィン（３．５１ｍｍｏｌ，１．１５当量）を加えた。反応が完了したことをｔｌｃで確認した後、水（３．５ｍｌ）とアンモニア水（３．５ｍｌ）を加え、さらに１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。クロマトグラフィー（ｕｌｔｒａ／２）で精製することにより、４−アザ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ6（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシルアミン  ８（１．４４ｇ，７６％）を白色固体として得た。δH（２７０ＭＨｚ，ＣＨＣｌ3）５．３６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６），４．４６−４．４４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３），３．３１−３．２２（６Ｈ，ｍ，Ｈ−３’，Ｈ−２’，Ｈ−１’），２．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ  ６Ｈｚ，Ｈ−５’），２．２９（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４），２．０５−１．７９（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−７，Ｈ−８），１．４５（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ  Ｈｓ  ３×ＣＨ3），１．７８−１．０５（２３Ｈ，ｍ，Ｈ−４’，Ｈ−１，Ｈ−９，Ｈ−１１，Ｈ−１２，Ｈ−１４，Ｈ−１５，Ｈ−１６，Ｈ−１７，Ｈ−２０，Ｈ−２２，Ｈ−２３，Ｈ−２４，Ｈ−２５），０．９８（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９），０．９１−０．８８（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ，Ｈ−２１），０．８６−０．８３（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ，Ｈ−２６，Ｈ−２７），０．６６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８）。ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）６３０（Ｍ＋Ｈ）+，５３０（Ｍ−Ｂｏｃ），３６９（Ｃｈｏｌ）+，１４５，１２１，１０９，９５（Ｃ7Ｈ11）+，８１（Ｃ6Ｈ9）+，６１，５７。
【０１５１】
保護セリン誘導体（９）
無水ジクロロメタン中のＮ−α−Ｂｏｃ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−セリン（７４ｍｇ，０．２８１ｍｍｏｌ）をＤＭＡＰ（４０ｍｇ，０．３２４ｍｍｏｌ），ＨＢＴＵ（１２８ｍｇ，０．３３７ｍｍｏｌ）およびアミン  ０１（１００ｍｇ，０．２１６ｍｍｏｌ）で逐次処理し、その混合物を窒素雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応を水で停止し、ジクロロメタンで抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）した抽出物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な９（０．１４９ｍｍｏｌ，６９％）を得た。δH（２７０ＭＨｚ，ＣＨＣｌ3）６．７（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．３（２Ｈ，ｍ），５．０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４（１Ｈ，ｍ），４．１（１Ｈ，ｍ），３．７（１Ｈ，ｍ），３．２−３．４（５ｈ，ｍ），２．２９（２Ｈ，ｍ），２．０５−１．７９（５Ｈ，ｍ），１．４５（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ），１．１５（９Ｈ，ｓ），１．７８−１．０５（２３Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９１−０．８８（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ），０．８６−０．８３（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ），０．６６（３Ｈ，ｓ）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）７１７（Ｍ＋Ｈ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）。
【０１５２】
保護システイン誘導体（１０）
【化２９】
2005515990.tif 000032
無水ジクロロメタン中のＮ−α−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（３１９ｍｇ，０．６８９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＡＰ（１９５ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３１１ｍｇ，０．８２ｍｍｏｌ）およびアミン  ０１（２５０ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）で逐次処理し、その混合物を窒素下、室温で１５時間撹拌した。反応を水で停止し、ジクロロメタンで抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）した抽出物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な１０（０．５１７ｍｍｏｌ，９８％）を得た。δH（２７０ＭＨｚ，ＣＨＣｌ3）７．２−７．５（１５Ｈ，ｍ），６．３（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．３（１Ｈ，ｍ），５．０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．８（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４（１Ｈ，ｍ），３．７（１Ｈ，ｍ），３．２−３．４（４Ｈ，ｍ），２．７（１Ｈ，ｍ），２．５（ｌＨ，ｍ），２．２９（２Ｈ，ｍ），２．０５−１．７９（５Ｈ，ｍ），１．４５（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ），１．１５（９Ｈ，ｓ），１．７８−１．０５（２３Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９１−０．８８（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ），０．８６−０．８３（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ），０．６６（３Ｈ，ｓ）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）９４０．５（Ｍ＋Ｎａ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）。
【０１５３】
保護セリン誘導体（１１）
【化３０】
2005515990.tif 000033
無水ジクロロメタン中のＮ−α−Ｂｏｃ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−セリン（４１ｍｇ，０．１５５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＡＰ（６６ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．１８０ｍｍｏｌ）およびアミン  ８（７５ｍｇ，０．１１９ｍｍｏｌ）で逐次処理し、その混合物を窒素雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応を水で停止し、ジクロロメタンで抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）した抽出物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な１１（０．０９０ｍｍｏｌ，７６％）を得た。δH（２７０ＭＨｚ，ＣＨＣｌ3）６．５（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．２−５．５（２Ｈ，ｍ），５．１５（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．８（１Ｈ，ｍ），４．４（１Ｈ，ｍ），４．１（１Ｈ，ｍ），３．７（１Ｈ，ｍ），３．２−３．４（９Ｈ，ｍ），２．２９（２Ｈ，ｍ），２．０５−１．７９（５Ｈ，ｍ），１．４５（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ），１．４３（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ），１．１５（９Ｈ，ｓ），１．７８−１．０５（２３Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９１−０．８８（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ），０．８６−０．８３（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ），０．６６（３Ｈ，ｓ）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）８７４（Ｍ＋Ｈ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）。
【０１５４】
システイン誘導体（１２）
【化３１】
2005515990.tif 000034
無水ジクロロメタン中のＮ−α−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−Ｌ−システイン（３５９ｍｇ，０．７７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＡＰ（２２０ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３５２ｍｇ，０．９３ｍｍｏｌ）およびアミン  ８（２７０ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）で逐次処理し、その混合物を窒素下、室温で１５時間撹拌した。反応を水で停止し、ジクロロメタンで抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）した抽出物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な１２（０．３９３ｍｍｏｌ，９１％）を得た。δH（２７０ＭＨｚ，ＣＨＣｌ3）７．２−７．５（１５Ｈ，ｍ），６．３（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．３（１Ｈ，ｍ），５．０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．８（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４（１Ｈ，ｍ），３．７（１Ｈ，ｍ），３．２−３．４（８Ｈ，ｍ），２．７（１Ｈ，ｍ），２．５（１Ｈ，ｍ），２．２９（２Ｈ，ｍ），２．０５−１．７９（５Ｈ，ｍ），１．４５（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ），１．１５（９Ｈ，ｓ），１．７８−１．０５（２３Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９１−０．８８（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ），０．８６−０．８３（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ），０．６６（３Ｈ，ｓ）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）１０９７．５（Ｍ＋Ｎａ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）。
【０１５５】
（２−アミノエチル）カルバミン酸コレステリルエステルのセリン誘導体（１３）
【化３２】
2005515990.tif 000035
トリフルオロ酢酸（１８ｍｌ）、ジクロロメタン（５ｍｌ）およびトリイソプロピルシラン（２ｍｌ）の混合物に化合物９（１００ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を溶解し、得られた溶液を室温で２時間撹拌した。その溶液を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な１３（０．１１ｍｍｏｌ，７９％）を得た。δH（２７０ＭＨｚ，ＣＨＣｌ3）７．８（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．３（１Ｈ，ｍ），５．０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４（１Ｈ，ｍ），３．８５（１Ｈ，ｍ），３．６５（１Ｈ，ｍ），３．２−３．４（５Ｈ，ｍ），２．２９（５Ｈ，ｍ），２．０５−１．７９（７Ｈ，ｍ），１．７８−１．０５（２３Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９１−０．８８（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ），０．８６−０．８３（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ），０．６６（３Ｈ，ｓ）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）５６０．２（Ｍ＋Ｈ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）。
【０１５６】
（２−アミノエチル）カルバミン酸コレステリルエステルのシステイン誘導体（１４）
【化３３】
2005515990.tif 000036
トリフルオロ酢酸（１８ｍｌ）、ジクロロメタン（５ｍｌ）およびトリイソプロピルシラン（２ｍｌ）の混合物に化合物１０（４２０ｍｇ，０．４５７ｍｍｏｌ）を溶解し、得られた溶液を室温で２時間撹拌した。その溶液を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な１４（０．２２４ｍｍｏｌ，４９％）を得た。δH（２７０ＭＨｚ，ＣＨＣｌ3）７．７（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．３（１Ｈ，ｍ），５．０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４（１Ｈ，ｍ），４．１（１Ｈ，ｍ），３．６（１Ｈ，ｍ），３．２−３．４（４Ｈ，ｍ），２．９３（１Ｈ，ｍ），２．８７（１Ｈ，ｍ），２．２９（４Ｈ，ｍ），２．０５−１．７９（５Ｈ，ｍ），１．７８−１．０５（２３Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９１−０．８８（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ），０．８６−０．８３（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ），０．６６（３Ｈ，ｓ）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）６１６．３（Ｍ＋Ｋ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）。
【０１５７】
（２−アミノエチル）カルバミン酸コレステリルエステルのセリン誘導体（１５）
【化３４】
2005515990.tif 000037
トリフルオロ酢酸（１８ｍｌ）、ジクロロメタン（５ｍｌ）およびトリイソプロピルシラン（２ｍｌ）の混合物に化合物１１（７０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）を溶解し、得られた溶液を室温で２時間撹拌した。その溶液を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な１５（０．０４６ｍｍｏｌ，５８％）を得た。δH（２７０ＭＨｚ，ＣＨＣｌ3）８．３（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．３（１Ｈ，ｍ），５．０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４（１Ｈ，ｍ），３．９（１Ｈ，ｍ），３．８（１Ｈ，ｍ），３．６（１Ｈ，ｍ），３．２−３．４（８Ｈ，ｍ），２．２９（５Ｈ，ｍ），２．０５−１．７９（７Ｈ，ｍ），１．７８−１．０５（２３Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９１−０．８８（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ），０．８６−０．８３（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ），０．６６（３Ｈ，ｓ）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）６１７（Ｍ＋Ｈ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）。
【０１５８】
（２−アミノエチル）カルバミン酸コレステリルエステルのシステイン誘導体（１６）
【化３５】
2005515990.tif 000038
トリフルオロ酢酸（１８ｍｌ）、ジクロロメタン（５ｍｌ）およびトリイソプロピルシラン（２ｍｌ）の混合物に化合物１２（３９０ｍｇ，０．３６３ｍｍｏｌ）を溶解し、得られた溶液を室温で２時間撹拌した。その溶液を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な１６（０．２４３ｍｍｏｌ，６７％）を得た。δH（２７０ＭＨｚ，ＣＨＣｌ3）８．０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．３（１Ｈ，ｍ），５．０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４（１Ｈ，ｍ），３．６（１Ｈ，ｍ），３．２−３．４（８Ｈ，ｍ），２．９６（１Ｈ，ｍ），２．８９（１Ｈ，ｍ），２．２９（５Ｈ，ｍ），２．０５−１．７９（７Ｈ，ｍ），１．７８−１．０５（２３Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ），０．９１−０．８８（３Ｈ  ｄ，Ｊ  ６Ｈｚ），０．８６−０．８３（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ  １Ｈｚ  ６Ｈｚ），０．６６（３Ｈ，ｓ）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ）６３３．３（Ｍ＋Ｈ）+，３６９（Ｃｈｏｌ）。
【０１５９】
Ｂｏｃ化中性アミノキシ脂質（１８）
【化３６】
2005515990.tif 000039
無水ジクロロメタン中の化合物１７（１４５ｍｇ，０．７５８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＡＰ（２９２ｍｇ，２．３９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３７３ｍｇ，０．９８７ｍｍｏｌ）およびアミン  ０１（２７２ｍｇ，０．５７６ｍｍｏｌ）で逐次処理し、その混合物を窒素雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応を７％クエン酸水溶液で停止し、ジクロロメタンで抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）した抽出物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な１８（３０２ｍｇ，８１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）８．５６（ｓ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨＯＣＨ2），８．２（ｂｒ，ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2），５．５（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ６），５．４（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ），４．５（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−３），４．３（ｓ，２Ｈ，（ＣＯ）ＣＨ2ＯＮＨ2），３．４（ｍ，２Ｈ，Ｏ（ＣＯ）ＮＨＣＨ2ＣＨ2），３．３（ｍ，２Ｈ，Ｏ（ＣＯ）ＮＨＣＨ2ＣＨ2），２．３２（ｍ，２Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２４），１．４６（ｓ，３Ｈ，Ｂｏｃ），０．９４−２．１０（Ｃｈｏｌ  Ｃ−１，２，４，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７，２０，２２，２３，２５），１．０（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１９），０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２１），０．８３，０．８２（２×ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５および２．０Ｈｚ），０．６８（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１８）：3Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）１６９．６（ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ2ＯＮＨ2），１５７．９（Ｂｏｃ），１５６．６（ＯＣＯＮＨ），１３９．７（Ｃ−５），１２２．４（Ｃ−６），８２．８（Ｂｏｃ），７６．２（（ＣＯ）ＣＨ2ＯＮＨ2），７４．４（Ｃ−３），５６．６（Ｃ−１４），５６．０（Ｃ−１７），４９．９（Ｃ−９），４２．２（Ｃ−１３），４０．６（Ｃ−４），３９．４−４０．６（Ｃ−１２，Ｃ−４，Ｏ（ＣＯ）ＮＨＣＨ2ＣＨ2 オーバーラップしている），３８．４（Ｃ−２４），３６．９（Ｃ−１），３６．４（Ｃ−１０），３６．１（Ｃ−２２），３５．７（Ｃ−２０），３１．８０（Ｃ−８），３２１．７９（Ｃ−７），２８．１（Ｃ−１６およびＢｏｃ  オーバーラップしている），２８．０（Ｃ−２），２７．９（Ｃ−２５），２４．２（Ｃ−１５），２３．７（Ｃ−２３），２２．７（Ｃ−２６），２２．５（Ｃ−２７），２０．９（Ｃ−１１），１９．２（Ｃ−１９），１８．６（Ｃ−２１）および１１．８（Ｃ−１８）。ＥＳＩ−ＭＳ  ６４６［Ｍ＋Ｈ］+；ＨＲＭＳ：計算値（Ｃ37Ｈ64Ｎ3Ｏ6として）：６４６．４７９５１２；実測値：６４６．４７９８７４。
【０１６０】
中性アミノキシ脂質（１９）
【化３７】
2005515990.tif 000040
次に、プロパン−２−オール（３ｍｌ）中の化合物１８（８６ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）を、４Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン（３ｍＬ）で処理し、その混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を最少量の１：５プロパン−２−オール：ジオキサンに再溶解し、エーテルを使って生成物１９を白色固体として沈殿させた（２８ｍｇ，８４％）。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ4−ＭｅＯＤ）５．３５（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ６），４．８（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ），４．５（ｓ，２Ｈ，（ＣＯ）ＣＨ2ＯＮＨ2），４．４（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−３），３．３（ｍ，２Ｈ，Ｏ（ＣＯ）ＮＨＣＨ2ＣＨ2），３．１（ｍ，２Ｈ，Ｏ（ＣＯ）ＮＨＣＨ2ＣＨ2），２．３２（ｍ，２Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２４），０．９４−２．１０（Ｃｈｏｌ  Ｃ−１，２，４，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７，２０，２２，２３，２５），１．０（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１９），０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２１），０．８３，０．８２（２×ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５および２．０Ｈｚ），０．６８（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１８）；3Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）１７１．４（ＮＨ（ＣＯ）ＣＨ2ＯＮＨ2），１５８．３（ＯＣＯＮＨ），１４０．５５（Ｃ−５），１２３．２（Ｃ−６），７５．４（（ＣＯ）ＣＨ2ＯＮＨ2）７１．９（Ｃ−３），５７．５（Ｃ−１４），５７．０（Ｃ−１７），５１．０（Ｃ−９），４３．０（Ｃ−１３），４０．２（Ｃ−４），４０．０−４０．６（Ｃ−１２，Ｃ−４），Ｏ（ＣＯ）ＮＨＣＨ2ＣＨ2  オーバーラップしている），３９．２（Ｃ−２４），３７．８（Ｃ−１），３７．３（Ｃ−１０），３６．９（Ｃ−２２），３６．６（Ｃ−２０），３２．７（Ｃ−８），３２．６（Ｃ−７），２８．９（Ｃ−１６），２８．８（Ｃ−２），２８．７（Ｃ−２５），２４．９（Ｃ−１５），２４．５（Ｃ−２３），２３．２（Ｃ−２６），２２．９（Ｃ−２７），２１．８（Ｃ−１１），１９．７（Ｃ−１９），１９．２（Ｃ−２１）および１２．３（Ｃ−１８）。ＥＳＩ−ＭＳ  ５４６［Ｍ＋Ｈ］+。
【０１６１】
コレステリルグリシン（２０）
【化３８】
2005515990.tif 000041
０℃のジオキサン（３５ｍｌ）中のクロロギ酸コレステロール（１ｇ，２．２３ｍｍｏｌ）に、水（１５ｍｌ）中のＮＥｔ3（４２４μＬ，２．２３ｍｍｏｌ）およびグリシン（１７０ｍｇ，２．２３ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を室温で終夜撹拌した。反応を７％クエン酸水溶液で停止し、ジクロロメタンで抽出した。抽出物を乾燥し、減圧下で濃縮し、得られた残渣をクロマトグラフィーで精製することにより、化合物２０を白色固体として得た（６８０ｍｇ，６３％）。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）５．３５（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ６），５．１５（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ），４．５（ｓ，２Ｈ，（ＣＯ）ＣＨ2ＯＮＨ2），４．５（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−３），３．９５（ｍ，２Ｈ，Ｏ（ＣＯ）ＮＨＣＨ2），２．３２（ｍ，２Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２４），０．９４−２．１０（Ｃｈｏｌ  Ｃ−１，２，４，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７，２０，２２，２３，２５），１．０（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１９），０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２１），０．８３，０．８２（２×ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５および２．０Ｈｚ），０．６８（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１８）；3Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）１５９．３（ＯＣＯＮＨ），１４２．４（Ｃ−５），１２５．４（Ｃ−６），７５．４（（ＣＯ）ＣＨ2ＯＮＨ2），７１．９（Ｃ−３），５７．５（Ｃ−１４），５７．０（Ｃ−１７），５１．０（Ｃ−９），４３．０（Ｃ−１３），４０．０−４０．６（Ｃ−１２，Ｃ−４），３９．２（Ｃ−２４），３７．８（Ｃ−１），３７．３（Ｃ−１０），３６．９（Ｃ−２２），３６．６（Ｃ−２０），３２．７（Ｃ−８），３２．６（Ｃ−７），２８．９（Ｃ−１６），２８．８（Ｃ−２），２８．７（Ｃ−２５），２４．９（Ｃ−１５），２４．５（Ｃ−２３），２３．２（Ｃ−２６），２２．９（Ｃ−２７），２１．８（Ｃ−１１），１９．７（Ｃ−１９），１９．２（Ｃ−２１）および１２．３（Ｃ−１８）。ＭＳ−ＦＡＢ＋：５１０［Ｍ＋Ｎａ］+。
【０１６２】
Ｂｏｃ化コレステリル−グリシル−ヒドラジド（２２）
【化３９】
2005515990.tif 000042
無水ジクロロメタン中の化合物２１（３３ｍｇ，０．２４６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＡＰ（７３ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１０９ｍｇ，０．２８７ｍｍｏｌ）および２０（１００ｍｇ，０．２０５ｍｍｏｌ）で逐次処理し、その混合物を窒素雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応を７％クエン酸水溶液で停止し、ジクロロメタンで抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）した抽出物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製することにより、純粋な２２（１０３ｍｇ，８３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）８．６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ2ＮＨ2ＣＯ），６．９（ｂｒ，ＣＨ2ＣＯＮＨ2ＮＨ2Ｂｏｃ），５．８（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ−Ｏ（ＣＯ）ＮＨ），５．４（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ６），４．５（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−３），３．９（ｓ，２Ｈ，（ＣＯ）ＣＨ2ＮＨ（ＣＯ）Ｏ），２．３２（ｍ，２Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２４），１．４６（ｓ，３Ｈ，Ｂｏｃ），０．９４−２．１０（Ｃｈｏｌ  Ｃ−１，２，４，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７，２０，２２，２３，２５），１．０（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１９），０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２１），０．８３，０．８２（２×ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５および２．０Ｈｚ），０．６８（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１８）；3Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）１６９．７（ＢｏｃＮＨ2ＮＨ2ＣＯ），１５６．７（Ｂｏｃ），１５５．６（ＯＣＯＮＨ），１３９．６（Ｃ−５），１２２．６（Ｃ−６），８２．０（Ｂｏｃ），７４．９（Ｃ−３），５６．６（Ｃ−１４），５６．２（Ｃ−１７），４９．９（Ｃ−９），４２．９（Ｇｌｙ  ＣＨ2），４２．３（Ｃ−１３），３９．７（Ｃ−４），３９．４−６（Ｃ−１２），３８．４（Ｃ−２４），３６．９（Ｃ−１），３６．５（Ｃ−１０），３６．２（Ｃ−２２），３５．８（Ｃ−２０），３１．８０（Ｃ−８），３１．７９（Ｃ−７），２８．２（Ｃ−１６およびＢｏｃ  オーバーラップしている），２８．１（Ｃ−２），２７．９（Ｃ−２５），２４．２（Ｃ−１５），２３．９（Ｃ−２３），２２．８（Ｃ−２６），２２．５（Ｃ−２７），２１．０（Ｃ−１１），１９．３（Ｃ−１９），１８．７（Ｃ−２１）および１１．８（Ｃ−１８）。ＥＳＩ−ＭＳ  ５０２［Ｍ＋Ｈ］+，５４２［Ｍ＋Ｋ］+；ＨＲＭＳ：計算値（Ｃ35Ｈ59Ｎ3Ｏ5Ｎａとして）：６２４．４３５２４２；実測値：６２４．４３６３５６。
【０１６３】
コレステリル−グリシル−ヒドラジド（２３）
【化４０】
2005515990.tif 000043
次に、プロパン−２−オール（１ｍｌ）中の化合物２２（４０ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）を、４Ｍ  ＨＣｌ／ジオキサン（１ｍＬ）で処理し、その混合物を室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を最少量の１：５プロパン−２−オール：ジオキサンに再溶解し、ヘキサン類を使って生成物２３を白色固体として沈殿させた（２８ｍｇ，８４％）；1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ4−ＭｅＯＤ）７．８（ｂｒ，ＣＨ2ＣＯＮＨ2ＮＨ2），５．５（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ６），４．６（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−３），４．０（ｓ，２Ｈ，（ＣＯ）ＣＨ2ＮＨ（ＣＯ）Ｏ），２．３２（ｍ，２Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２４），１．４６（ｓ，３Ｈ，Ｂｏｃ），０．９４−２．１０（Ｃｈｏｌ  Ｃ−１，２，４，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７，２０，２２，２３，２５），１．０（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１９），０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２１），０．８３，０．８２（２×ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５および２．０Ｈｚ），０．６８（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１８）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ｄ4−ＭｅＯＤ）１６９．７（ＮＨ2ＮＨ2ＣＯ），１５６．６（ＯＣＯＮＨ），１４０．３（Ｃ−５），１２３．２（Ｃ−６），７５．９（Ｃ−３），５７．４（Ｃ−１４），５６．８（Ｃ−１７），５０．８（Ｃ−９），４８．４（ｇｌｙ  ＣＨ2），４２．９（Ｃ−１３），４０．４（Ｃ−４），４０．１（Ｃ−１２），３９．０（Ｃ−２４），３７．６（Ｃ−１），３７．２（Ｃ−１０），３６．８（Ｃ−２２），３６．５（Ｃ−２０），３２．５（Ｃ−８），３２．４（Ｃ−７），２８．８（Ｃ−１６），２８．７（Ｃ−２），２８．６（Ｃ−２５），２４．８（Ｃ−１５），２４．４（Ｃ−２３），２３．１（Ｃ−２６），２２．９（Ｃ−２７），２１．７（Ｃ−１１），１９．７（Ｃ−１９），１９．０（Ｃ−２１）および１２．２（Ｃ−１８）。ＥＳＩ−ＭＳ：５４１．７［Ｍ＋Ｋ］+。
【０１６４】
コレステリル−カルバメート−ヒドラジド（２４）
【化４１】
2005515990.tif 000044
０℃のジクロロメタン（９０ｍｌ）中のクロロギ酸コレステロール（１．０ｇ，２．２３ｍｍｏｌ）にヒドラジン水和物（１ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、その反応液を室温までゆっくりと温めて、終夜撹拌した。反応を７％クエン酸水溶液で停止し、ジクロロメタンで抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ4）した抽出物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をジクロロメタン／ヘキサン類から結晶化することにより、２４を白色固体として得た（０．７５ｇ，７６％）；1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）５．４（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ６），４．５５（ｍ，１Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−３），４．７−３．３（Ｏ（ＣＯ）ＮＨＮＨ2），２．３２（ｍ，２Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２４），１．４６（ｓ，３Ｈ，Ｂｏｃ），０．９４−２．１０（Ｃｈｏｌ  Ｃ−１，２，４，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７，２０，２２，２３，２５），１．０（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１９），０．８９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４，Ｃｈｏｌ  Ｃ−２１），０．８３，０．８２（２×ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５および２．０Ｈｚ），０．６８（ｓ，３Ｈ，Ｃｈｏｌ  Ｃ−１８）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）１５８．３（ＯＣＯＮＨ），１３９．５（Ｃ−５），１２２．７（Ｃ−６），７５．２（Ｃ−３），５６．６（Ｃ−１４），５６．１（Ｃ−１７），４９．９（Ｃ−９），４２．２（Ｃ−１３），３９．７（Ｃ−４），３９．４（Ｃ−１２），３８．４（Ｃ−２４），３６．９（Ｃ−１），３６．５（Ｃ−１０），３６．１（Ｃ−２２），３５．７（Ｃ−２０），３１．８（Ｃ−８），３１．７７（Ｃ−７），２８．２（Ｃ−２５），２８．０（Ｃ−１６），２７．９（Ｃ−２），２４．２（Ｃ−１５），２３．８（Ｃ−２３），２２．８（Ｃ−２６），２２．５（Ｃ−２７），２１．０（Ｃ−１１），１９．２（Ｃ−１９），１８．６（Ｃ−２１）および１１．８（Ｃ−１８）。ＥＳＩ−ＭＳ：４８４．６３［Ｍ＋Ｋ］+。
【０１６５】
（Ｂｏｃ）アミノオキシ脂質（２５）
【化４２】
2005515990.tif 000045
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３６ｇ，３．１３ｍｍｏｌ，１当量）、１７（０．６ｇ，３．１３ｍｍｏｌ，１当量）、およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．６８ｇ，３．１３ｍｍｏｌ，１当量）をＥｔＯＡｃ（９０ｍｌ）に溶解し、その不均一混合物を室温で終夜撹拌した。次に、その混合物を、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）の短いパッド越しに濾過することにより、白色沈殿として生成したジシクロヘキシル尿素を除去し（６０ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄）、ＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解した８（１．９７ｇ，３．１３ｍｍｏｌ，１当量）に加えた。トリエチルアミン（６ｍＬ）を添加することにより、この不均一反応をｐＨ８に維持した。得られた混合物を室温で終夜撹拌した。完了後に、混合物を濾過し、溶媒を減圧下で除去し、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ９２：７：１）で精製することにより、２５を白色固体として得た。収量（２．３ｇ，９０％）；1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．３３−５．３５（ｍ，１Ｈ，Ｈ６’），４．４−４．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），４．３（ｓ，２Ｈ，Ｈ９０，３．２−３．４２（ｍ，８Ｈ，Ｈ１，Ｈ２，Ｈ４，Ｈ６），２．２３−２．３５（ｍ，２Ｈ，Ｈ４’），１．７−２．１（ｍ，７Ｈ，Ｈ２’，Ｈ７’，Ｈ８’，Ｈ５），１．４４−１．４６（ｍ，１８Ｈ，２Ｂｏｃ），１−１．７３（ｍ，２１Ｈ，Ｈ１’，Ｈ９’，Ｈ１１’，Ｈ１２’，Ｈ１４’−Ｈ１７’，Ｈ２２’−Ｈ２５’），０．９８（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９’），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１’），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６’およびＨ２７’）および０．６５（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８’）；ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝８０３［Ｍ＋Ｈ］+，７０３［Ｍ−Ｂｏｃ］+，６４７，６０３［Ｍ−２Ｂｏｃ］+，３６９，２７９，２５５，２３５，２０４，１４５，９５，６９。
【０１６６】
荷電アミノキシ脂質（１）
【化４３】
2005515990.tif 000046
ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）に溶解した２５（１．１ｇ，１．３６ｍｍｏｌ，１当量）に、０℃で、ＴＦＡ（２ｍｌ，２０．４ｍｍｏｌ，１５当量）を加えた。その溶液を室温で５時間撹拌した。完了後に、ＴＦＡを反応混合物から共沸させるために、トルエンを加えた。溶媒を減圧下で除去し、クロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ／ＮＨ3  ９２：７：１→７５：２２：３）で精製することにより、１を白色固体として得た（７０９ｍｇ，収率：８６％）；ＩＲ（ＣＨＣｌ3）：νmax＝３３０６，２９４８，２８５０，２２４６，１６９８，１６４７，１５４１，１４６７，１２５３，１１３３；1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ＝５．２６−５．４（ｍ，１Ｈ，Ｈ６’），４．４−４．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ３’），４．１２（ｓ，２Ｈ，Ｈ９），３．３４−３．４１（ｍ，２Ｈ，Ｈ２），３．１５−３．３（ｍ，２Ｈ，Ｈ４），２．６−２．７４（ｍ，４Ｈ，Ｈ１およびＨ６），２．１４−２．３９（ｍ，２Ｈ，Ｈ４’），１．６２−２．１（ｍ，７Ｈ，Ｈ２’，Ｈ７’，Ｈ８’，Ｈ５），１．０２−１．６（ｍ，２１Ｈ，Ｈ１’，Ｈ９’，Ｈ１１’，Ｈ１２’，Ｈ１４’−Ｈ１７’，Ｈ２２’−Ｈ２５’），０．９６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１９’），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ，Ｈ２１’），０．８３（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ，Ｈ２６’およびＨ２７’）および０．６６（ｓ，３Ｈ，Ｈ１８’）；ＭＳ（ＦＡＢ+）：ｍ／ｚ＝６０３［Ｍ＋Ｈ］+，３６９［Ｃｈｏｌ］+，１６０，１３７，１０９，９５，８１，６９，５５。
【０１６７】
アミノキシ脂質１を含有するリポソームおよびリポプレックスの安定性
（Ａ）アミノキシ脂質１を持たないＬＭＤ系に関する研究
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８（６０：４０，モル比）リポソームから構成される標準的製剤比１２：０．６：１のＬＭＤを安定性解析に付した。ＬＭＤをさまざまな量のＰＥＧ2000−ジアルデヒドと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中で１６時間インキュベートした。次に、試料をＯｐｔｉＭＥＭに加え、それぞれのサイズをＰＣＳで２０分間にわたって測定した（図２）。ＰＥＧ2000−ジアルデヒド量の増加には、明らかな安定化効果が観察された。この安定化から、シッフ塩基の形成が起こること、そしてそれが、リポプレックス（ＤＯＰＥ，脂質Ｂ１９８）の表面露出アミンと、ＰＥＧに由来するアルデヒドとの間にＣ＝Ｎ共有結合を形成することによって粒子を安定化することが示唆される。ＬＭＤ表面へのポリエチレングリコールの非特異的吸収という可能性を排除するために、それぞれチオール、アミンまたは２つのアミン官能基を持つＰＥＧ誘導体を使って、対照実験を行った（図３）。その結果は、アルデヒド含有ＰＥＧとアミノキシ官能基との特異的相互作用を明確に示唆するものであり、他の官能化ＰＥＧ誘導体は極めて弱い非特異的作用しか示さない。示唆されたシッフ塩基の形成を証明するために、本発明者らは、脂質Ｂ１９８の１０％をアミノキシ脂質１で置き換えたＬＭＤ製剤に取り組んだ。
【０１６８】
生化学物質および化学物質：
ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）はＡｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄ（米国アラバマ州アラバスター）から購入した。プラスミドｎｉｓ−ｐＣＭＶβガラクトシダーゼはＢａｙｏｕ  Ｂｉｏｌａｂｓ（米国ルイジアナ州ハラハン）によって製造された。脂質Ｂ１９８は本発明者らの研究室で合成された。ミューペプチドは、標準的なＦｍｏｃ系メリフィールド固相ペプチド化学により、ワング樹脂上で合成した。
【０１６９】
合成：
リポソームの製造：
リポソームは次のように製造した。ジクロロメタン中の適当な脂質混合物を１００ｍｌ丸底フラスコ内で薄層状に乾燥させ、それをさらに２時間真空乾燥した。その脂質薄層を４ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）中で水和させて、脂質の最終濃度を５ｍｇ／ｍｌにした。押出による小さな単膜小胞の製造は、短い超音波処理の後、窒素下で押出機（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を使って、重ねた２枚のポリカーボネートフィルター（孔径０．１μｍ，Ｏｓｍｏｎｉｄｓ）を通して、懸濁液を１０回押し出すことによって行った。押し出されたリポソームの脂質濃度は、スチュワード（Ｓｔｅｗａｒｄ）アッセイによって決定した。
【０１７０】
ＭＤおよびＬＭＤおよびＬＤの製造
ＬＤ（脂質：ＤＮＡ）複合体およびＬＭＤ（脂質：ミュー：ＤＮＡ）複合体の製造：ＤＮＡ原液（通例、１．２ｍｇ／ｍｌ）を、蒸留水に溶解したミューの希釈溶液をボルテックスで混合したものに、０．６の重量比で添加して、ＤＮＡの最終濃度を０．２ｍｇ／ｍｌにした。次に、そのＭＤ溶液を、リポソームに、１：１２のＤＮＡ：脂質重量比で、ボルテックスしながらゆっくり加えた。最後に、４ｍＭ  Ｈｅｐｅｓに希釈したショ糖を添加すると、４ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，６％ショ糖中に所望のＤＮＡ濃度のＬＭＤ調製物が得られる。０．２ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液をリポソームに、１：１２のＤＮＡ：脂質重量比で、ボルテックスしながらゆっくりと加えた。最後に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）に希釈したショ糖を添加すると、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７），６％ショ糖中に所望のＤＮＡ濃度のＬＤ調製物が得られる。
【０１７１】
リポソームＢ１９８：ＤＯＰＥ（５０：５０）を含むＬＭＤ系に関する安定性試験
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８（６０：４０，モル比）リポソームから構成される０．１５ｍｇ／ｍｌ（ＤＮＡ濃度）のＬＭＤを、ＯｐｔｉＭＥＭでの安定性解析に付した。ＬＭＤをさまざまな量のＰＥＧ2000−ジアルデヒドと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートし、最終濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調節した。次に、試料をＯｐｔｉＭＥＭに加え、それぞれのサイズを、動的光散乱法を使って、光子相関分光計（Ｎ４  ｐｌｕｓ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定した。使用したパラメータは次のとおりである。２０℃、０．０８９０ｃＰ（粘度）、反射率１．３３、角度９０°、６３２．８ｎｍ（波長）。ＰＥＧ2000−ジアルデヒド量の増加には、明らかな安定化効果が観察された。
【０１７２】
この安定化から、シッフ塩基の形成が起こること、そしてそれが、リポプレックス（ＤＯＰＥ，脂質Ｂ１９８）の表面露出アミンと、ＰＥＧに由来するアルデヒドとの間にＣ＝Ｎ共有結合を形成することによって粒子を安定化することが示唆される。ＬＭＤ表面へのポリエチレングリコールの非特異的吸収という可能性を排除するために、それぞれチオール、アミンまたは２つのアミン官能基を持つＰＥＧ誘導体を使って、対照実験を行った（図３）。その結果は、アルデヒド含有ＰＥＧとアミノキシ官能基との特異的相互作用を明確に示唆するものであり、他の官能化ＰＥＧ誘導体は極めて弱い非特異的作用しか示さない。
【０１７３】
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８（５０：５０，モル比）リポソームから構成される０．１５ｍｇ／ｍｌ（ＤＮＡ濃度）のＬＭＤを、血清での安定性解析に付した。ＬＭＤをさまざまな量のＰＥＧ2000−ジアルデヒドと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートし、最終濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調節した。次に、組成の異なるＬＭＤ  ６０μｌを２４０μｌの血清と混合し、その混合物を穏やかに振とうしながら３７℃でインキュベートした。次に、ブランク参照試料として血清のみを使用して、さまざまな時点で、６００ｎｍでの吸光度をＵｌｔｒｏｓｐｅｃ  ４０００分光光度計（Ｐｈａｍａｒｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ，英国ケンブリッジ）で記録した。ＰＥＧ2000−ジアルデヒド量の増加には、有意な安定化効果は観察されなかった（図７）。ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：コレステロール（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ＤＮＡ濃度）のＬＤを、血清での解析に付した。ＬＤをさまざまなモルパーセンテージ（脂質の総モル含量に対する値）のＰＥＧ２０００−ジアルデヒド、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ３４００−ｍａｌ、ＮＨＳ−ＰＥＧ３０００−ｍａｌと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートし、最終濃度を０．０９ｍｇ／ｍｌに調節した。次に、組成の異なるＬＤ  １６．６μｌを５０μｌの血清と混合し、その混合物を３７℃でインキュベートした。得られた粒子のサイズを光子相関分光計で測定するために、さまざまな時点で、５μｌのＬＤを試料として採取した（測定に際して試料をＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）で希釈した）。図１２。
【０１７４】
これにより、リポプレックス（ＤＯＰＥ，Ｂ１９８）の露出したアミンとＰＥＧ−ジアルデヒドとの間に形成されるシッフ塩基が、血清中ではあまり安定ではないことが示唆される。このＰＥＧの効果は、ＬＭＤ（Ｂ１９８：ＤＯＰＥ）のような不安定な製剤には弱く（図７）、ＬＤ（ＤＯＰＥ，Ｂ１９８，コレステロール）のような、より安定な製剤では、より顕著である。
【０１７５】
図１２は、ｐＨ感受性のＯｐｆ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ−Ｍａｌが、リポプレックスのアミンに活発にカップリングしており、極めて強い安定化効果をもたらすことを示唆している。
【０１７６】
セリン脂質１３含有リポソームを使った研究
ＤＯＰＥ：セリン脂質１３（５０：５０）リポソームを使って、標準的な１２：０．６：１比（リポソーム：ミュー：ｐＤＮＡ）のＬＭＤベクターを形成させ、さまざまな量のＰＥＧ2000−ジアルデヒドの存在下で、安定性プロファイルを明らかにした。この複合体を、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中で１６時間平衡化させた後、試料をＯｐｔｉＭＥＭに加えた。ＰＥＧの存在量とＬＭＤおよびその複合体の安定性との間には明瞭な関係を確認することができた。ＰＥＧを添加しなかったＬＭＤのサイズが極めて迅速に増加したのに対して、２０％のＰＥＧ（重量比，リポソームに対して約６％モルに相当）を添加すると、サイズはゆっくりと増加した（図８）。脂質とＰＥＧ−ジアルデヒドとの間に共有結合が特異的に形成されることを示す証拠は、チオール化ＰＥＧとの比較によって得られる。アルデヒド含有ＰＥＧだけが安定なＬＭＤをもたらし、他のＰＥＧは安定化パターンを示さない。総合すると、これらの実験は、ポリエチレングリコールとセリンコレステロール系化合物の表面アミン基との間にシッフ塩基様の共有結合が形成されることを示唆している。
【０１７７】
ＤＯＰＥ：セリン脂質１３（５０：５０）リポソームから構成される標準的製剤比１２：０．６：１のＬＭＤを血清での安定性解析に付した。ＬＭＤをさまざまな量のＰＥＧ2000−ジアルデヒドと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中で２０時間インキュベートした。次に、１００μｇ／ｍｌで組成の異なるＬＭＤ  ６０μｌを、２４０μｌの血清と混合し、その混合物を穏やかに振とうしながら３７℃でインキュベートした。次に、ブランク参照試料として血清のみを使用して、さまざまな時点で、６００ｎｍでの吸光度を記録した。ＰＥＧ2000−ジアルデヒド量の増加には、有意な安定化効果が観察された（図９）。
【０１７８】
これは、ＬＭＤの表面露出セリンとＰＥＧ−アルデヒドとの間に形成されるシッフ塩基が、血清が誘発する凝集を減少させるのに十分な安定性を持つことを示唆している。
【０１７９】
トランスフェクション実験：
ＯｐｔｉＭＥＭおよび血清（９０％）におけるＰａｎｃ−１細胞でのトランスフェクションプロトコール
概説：培養Ｐａｎｃ−１細胞または培養ＯＶＣＡＲ−１細胞を、４８穴培養プレートに１ウェルあたり２×１０5細胞の密度で接種し、３７℃および５％ＣＯ2にて、ＤＭＥＭ中で約７０％コンフルエントまで生育した。細胞をＰＢＳ中で洗浄した後、トランスフェクション培地を各ウェルに投入した（０．２５０ｍｌの血清またはＯｐｔｉＭｅｍ）。０．５μｇのＬＭＤ（ＤＮＡ）を各ウェルに１時間加えた。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、通常培地（ＮＧＭ）中で２４時間成長させた。細胞をプレートから掻き落とし、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの化学発光リポーター遺伝子アッセイキットを使って、β−Ｇａｌ発現量をアッセイした。
【０１８０】
結果：トランスフェクションの結果から、ＰＥＧ−ビスアルデヒドの量が増加するにつれて、活性の減少が観察されることがわかる。これは、ＰＥＧがＬＭＤに共有結合（シッフ塩基形成）することと合致し、それは、ＰＥＧ−ＳＨ対照がトランスフェクションレベルに影響を及ぼさなかったことで、さらに裏付けられる。トランスフェクションの減少は、ＰＥＧをＬＭＤ表面に取り付けたために正電荷が遮蔽されて細胞によるベクターの取り込みが減少したため、あるいは、ＰＥＧの細胞内での阻害的作用によるものと考えうる。
【０１８１】
結論
アルデヒド／ケトン官能化ＰＥＧと（ａ）アミンまたは（ｂ）セリン含有脂質（例えばセリン脂質１３）との表面反応が達成された。結果として生じる結合は極めて不安定（ａ）であるか、より安定（ｂ）である。どちらの場合も、縮合反応の過程で生成する唯一の副生成物は水である。したがってこの方法は、トランスフェクション活性の一部を保ち（図１０および図１１）、強力な安定化プロファイルを示す、極めて強力かつ洗練された薬物または遺伝子送達系の安定化方法である。この概念は、薬物／遺伝子送達ベクターの安定化と機能性とのバランスをとるのに理想的である。さらにまた、この概念は、薬物／遺伝子送達ベクターと二官能性ステルス化合物およびチオール含有ターゲッティングリガンドとの容易なワンポット反応も可能にする。
【０１８２】
後カップリング、血清安定化、トリガー可能性およびインビトロ・トランスフェクションプロファイル
概説：表１に挙げたトリガー可能脂質のそれぞれを、脂質Ｂ１９８およびＤＯＰＥと共に第３の脂質として、最適化した比でリポソームに配合した（図参照）。１００ｎｍ膜を通してリポソームを押出し（１０回）、ＰＣＳでサイズを測定した。ｐＤＮＡのＨＥＰＥＳ（４ｍＭ）希釈溶液をゆっくり添加して、ｐＤＮＡの最終濃度を０．１ｍｇ／ｍＬにすることにより、ＬＤ（リポソーム＋ｐＤＮＡ）を製造した。直ちに使用しない場合は、ＬＤを６％ショ糖の存在下、４℃で保存した。３つの製剤、すなわち脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／コレステロール（４５：３０：２５）、脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／脂質２３、および脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１は、特に興味深いことがわかった。
【０１８３】
脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／コレステロール
血清安定性
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：コレステロール（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤを、血清にさらした後に解析した。ＬＤをさまざまなモルパーセンテージ（脂質の総モル含量に対する値）のＰＥＧ2000−ジアルデヒド、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌ、ＮＨＳ−ＰＥＧ3400−ｍａｌと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートした。最終濃度を０．０９ｍｇ／ｍｌに調節した。次に、組成の異なるＬＤ  １６．６μｌを５０μｌの血清と混合し、その混合物を３７℃でインキュベートした。得られた粒子のサイズをＰＣＳで測定するために、さまざまな時点で、５μｌのＬＤを試料として採取した（測定に際して各試料をＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）で希釈した）。
【０１８４】
結論
その結果から、リポプレックス（ＤＯＰＥ，脂質Ｂ１９８）の露出したアミンとＰＥＧ−ジアルデヒドとの間に形成されるシッフ塩基が、血清中ではあまり安定ではないことが示唆される。このＰＥＧの効果は、ＬＭＤ（脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ）のような不安定な製剤には弱く（図７）、ＬＤ（ＤＯＰＥ／脂質Ｂ１９８／コレステロール）のような、より安定な製剤では、より顕著である（図１２）。
【０１８５】
図１２は、ｐＨ感受性のＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ−ｍａｌが、リポプレックスのアミンに活発にカップリングしており、極めて強い安定化効果をもたらすことを示唆している。
【０１８６】
脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／脂質２３
血清安定性
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質２３（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤを、血清へのばく露後に解析した。ＬＤをさまざまなモルパーセンテージ（脂質の総モル含量に対する値）のＰＥＧ2000−ジアルデヒド、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌ、ＰＥＧ6000−ＳＨと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートし、最終濃度を０．０９ｍｇ／ｍｌに調節した。次に、組成の異なるＬＤ  １６．６μｌを５０μｌの血清と混合し、その混合物を３７℃でインキュベートした。さまざまな時点で、５μｌのＬＤを試料として採取し、そのサイズをＰＣＳで測定した（測定に際して試料をＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）で希釈した）。
【０１８７】
ｐＨ放出
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質２３（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤを、ｐＨ５．３へのばく露後に、血清における安定性解析に付した。ＬＤをさまざまなモルパーセンテージ（脂質の総モル含量に対する値）のＰＥＧ2000−ジアルデヒドまたはＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートし、最終濃度を０．０９ｍｇ／ｍｌに調節した。血清安定性実験（上記と同様）に先立って、ＨＣｌを添加することにより、ＬＤをｐＨ５．３で３時間インキュベートした。
【０１８８】
トランスフェクション
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質２３（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ＤＮＡ濃度）のＬＤを、上述のトランスフェクションプロトコールに従って、ＯＶＣＡＲ−１細胞にトランスフェクトした。
【０１８９】
ターゲッティング
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質２３（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤ（ｐＤＮＡ：脂質比＝１：１４）をターゲッティング実験に付した。まず、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌの溶液を、葉酸−システインペプチドの溶液と共に、ｐＨ８で１時間インキュベートすることによってＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｃｙｓ−葉酸とし、次に、それをＬＤ溶液に加えた（脂質の総モル含量に対して１モル％または１０モル％）。ターゲッティングペプチドを添加せずにＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌ溶液を同じ処理にかけることにより、対照ＬＤを製造した。
【０１９０】
その混合物をＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートし、同じ緩衝液に対して２４時間透析（ＭＣＯ＝１００００）することにより、４０μｇ／ｍｌの標的指向性ＬＤ溶液を得た。次に、組成の異なるＬＤ  ３７．５μｌを５０μｌの血清と混合し、その混合物を３７℃でインキュベートした。得られた粒子のサイズをＰＣＳで測定するために、さまざまな時点で、８μｌのＬＤを試料として採取した（測定に際して各試料をＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）で希釈した）。
【０１９１】
上述したトランスフェクションプロトコールに従って、これらのＬＤをＯＶＣＡＲ−１細胞にトランスフェクトした。
【０１９２】
結論
図１３は、中性ヒドラジド脂質２３を含むＬＤの高い安定性を証明している。このことから、リポプレックスのヒドラジドとＰＥＧ2000−ジアルデヒドとの間に形成されるカルボキシルヒドラゾン付加物は血清中で極めて安定であることが示唆される。ＰＥＧ6000−ＳＨを使った対照実験は、この効果が、血清安定な付加物を形成するアルデヒド官能基によるものであることを、明瞭に示している。
【０１９３】
図１３から、ｐＨ感受性ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌはヒドラジン脂質２３に強く結合して、血清耐性の高いリポプレックス製剤をもたらすことが示唆される。
【０１９４】
図１４は、このアッセイ条件では、ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌと結合したＬＤ（脂質２３を含むもの）も非修飾ＬＤも、ｐＨインキュベーションによる影響を受けない（図１３と同様の結果）ことを示している。ｐＨ感受性ヒドラゾン付加物はｐＨ（５．３）による影響を強く受け、図１３の場合よりもはるかに不安定な粒子をもたらす。図１９は、ヒドラジン脂質２３を含む安定なＬＤが、９５％含有培地でさえ、トランスフェクトしないことを示している。ＰＥＧ量の増加に伴って観察されるトランスフェクションの減少は、ＬＤへのＰＥＧの共有結合と合致する。これは、ＰＥＧを取り付けたことで細胞によるベクターの取り込みが減少したため、またはＰＥＧの細胞内での阻害的作用によるものと考えうる。
【０１９５】
図２０は、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌと、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｃｙｓ−葉酸が、どちらもＬＤに効率よくカップリングされることを示している。１０モル％のＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌまたは１０モル％のＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｃｙｓ−葉酸で修飾した場合、このＬＤは極めて安定である。
【０１９６】
図２２は、後修飾ＬＤ系の潜在的ターゲッティング能力を示している。十分なターゲッティング部分をリポプレックスに結合すると（１０モル％）、ＯＶＣＡＲ−１細胞株の葉酸受容体のターゲッティングにより、明らかな増加（１０％血清では３倍、９５％血清では６倍）が観察される。９５％血清における１０％ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｃｙｓ−葉酸ＬＤのトランスフェクションレベルは、同じ条件での非修飾粒子のトランスフェクションレベルと同等である。
【０１９７】
要約：これらの結果は全体として、ＰＥＧ−ジアルデヒドのアルデヒドに結合したヒドラジド脂質２３は、ｐＨ感受性であるが血清耐性を持つコンジュゲートをもたらすことを示唆している。ｃｉｓ−アコニチル結合を持つＰＥＧは、このアッセイ条件下ではｐＨ放出をもたらさなかったが、さらに厳しいインビトロ／インビボ条件では、ｐＨ感受性であると予想される13-15。
【０１９８】
インビトロトランスフェクションの結果は、結果として得られる粒子が、９５％血清のような非常に厳しい条件下でさえ、トランスフェクトできることを証明している。この粒子の安定性を、そのｐＨ放出潜在力およびそのトランスフェクション能力と組み合わせると、全身的適用に理想的であると考えられる。
【０１９９】
結果として得られるリポプレックスは、葉酸受容体を使ってターゲッティングすることができる。この粒子は著しく安定であり、ターゲッティング部分を持たないものよりも効率よくトランスフェクトする。
【０２００】
脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１
血清安定性
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：アミノキシ脂質１（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤを、血清へのばく露後に解析した。ＬＤをさまざまなモルパーセンテージ（脂質の総モル含量に対する値）のＰＥＧ2000−ジアルデヒド、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌ、およびＰＥＧ6000ＳＨと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートし、最終濃度を０．０９ｍｇ／ｍｌに調節した。次に、組成の異なるＬＤ  １６．６μｌを５０μｌの血清と混合し、その混合物を３７℃でインキュベートした。さまざまな時点で、５μｌのＬＤを試料として採取し、得られた粒子のサイズをＰＣＳで測定した（測定に際して試料をＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）で希釈した）。
【０２０１】
ｐＨ放出
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：アミノキシ脂質１（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ＤＮＡ濃度）のＬＤを、ｐＨ５．３へのばく露後に、血清における安定性解析に付した。ＬＤをさまざまなモルパーセンテージ（脂質の総モル含量に対する値）のＰＥＧ2000−ジアルデヒドまたはＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートし、最終濃度を０．０９ｍｇ／ｍｌに調節した。血清安定性実験（上記と同様）に先立って、ＨＣｌを添加することにより、ＬＤをｐＨ５．３で３時間インキュベートした。
【０２０２】
トランスフェクション
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：アミノキシ脂質１（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤを、上述のトランスフェクションプロトコールに従って、ＯＶＣＡＲ−１細胞にトランスフェクトした。
【０２０３】
ターゲッティング
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：アミノキシ脂質１（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ＤＮＡ濃度）のＬＤ（ｐＤＮＡ：脂質比＝１：１２，ｗ／ｗ）をターゲッティング実験に付した。まず、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌの溶液を、葉酸−システインペプチドの溶液と共に、ｐＨ８で１時間インキュベートすることによってＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｃｙｓ−葉酸とし、次に、それをＬＤ溶液に加えた（脂質の総モル含量に対して１モル％または１０モル％）。ターゲッティングペプチドを添加せずにＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌ溶液を同じ処理にかけることにより、対照ＬＤを製造した。
【０２０４】
その混合物をＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートし、同じ緩衝液に対して２４時間透析することにより、４０μｇ／ｍｌの標的指向性ＬＤ溶液を得た。
【０２０５】
次に、組成の異なるＬＤ  ３７．５μｌを５０μｌの血清と混合し、その混合物を３７℃でインキュベートした。得られた粒子のサイズをＰＣＳで測定するために、さまざまな時点で、８μｌのＬＤを試料として採取した（測定に際して各試料をＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）で希釈した）。
【０２０６】
次に、上述したトランスフェクションプロトコールに従って、これらのＬＤをＯＶＣＡＲ−１細胞にトランスフェクトした。
【０２０７】
結論
図１５から、リポプレックスのアミノキシ脂質１とＰＥＧ2000−ジアルデヒドとの間に形成される結合は、血清中で極めて安定であることが示唆される。ＰＥＧ6000−ＳＨを使った対照実験では、そのような効果は得られなかった。
【０２０８】
図１５から、ｐＨ感受性ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌはリポプレックスのアミノキシ脂質１に強く結合して、非常に強い安定化効果をもたらすことが示唆される。
【０２０９】
図１６は、このアッセイ条件では、ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌおよびＰＥＧ2000ジアルデヒドと結合したＬＤも非修飾ＬＤも、ｐＨインキュベーションによる影響を受けない（図１５と同様の結果）ことを示している。
【０２１０】
図１８は、９５％血清におけるアミノキシ脂質１を含むＬＤの優位性を証明している（脂質Ｂ１９８：ＤＯＰＥから構成されるＬＤは９５％血清中ではほとんどトランスフェクトしない）。ＰＥＧ量の増加に伴って観察されるトランスフェクションの減少は、ＬＤへのＰＥＧの共有結合と合致する。これは、ＰＥＧを取り付けたことで細胞によるベクターの取り込みが減少したため、またはＰＥＧの細胞内での阻害的作用によるものと考えうる。
【０２１１】
図２１は、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌと、ＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｃｙｓ−葉酸が、どちらもＬＤに効率よくカップリングされることを示している。１０モル％のＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｍａｌまたは１０モル％のＯｐＦ−ａｃｏｎ−ＰＥＧ3400−ｃｙｓ−葉酸で修飾すると、このＬＤは、より安定である。
【０２１２】
図２３は、後修飾ＬＤ系の潜在的ターゲッティング能力を示している。十分なターゲッティング部分をリポプレックスに結合すると（１０モル％）、ＯＶＣＡＲ−１細胞株の葉酸受容体のターゲッティングにより、明らかな増加（１０％血清では３．６倍、９５％血清では７．２倍）が観察される。
【０２１３】
要約：これらの結果は全体として、ＰＥＧ2000−ジアルデヒドのアルデヒドに結合したアミノキシ脂質１がｐＨ感受性コンジュゲートをもたらさないことを示唆している。ｃｉｓ−アコニチル結合を持つＰＥＧは、このアッセイ条件下ではｐＨ放出を示さなかったが、さらに厳しいインビトロ／インビボ条件では、ｐＨ感受性であると予想される16。インビトロトランスフェクションの結果は、結果として得られる粒子が、９５％血清のような非常に厳しい条件下でさえ、極めて効率よくトランスフェクトできることを証明している。結果として得られるリポプレックスは、葉酸受容体を使ってターゲッティングすることができる。この粒子は、ターゲッティング部分を持たないものと比べて、９５％血清中で安定であり、はるかに効率よくトランスフェクトする。
【０２１４】
脂質１４、１６、２４含有リポソーム製剤を使った研究
血清安定性
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質１４またはＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質１６（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１３ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤを、血清にさらした後に解析した。ＬＤをさまざまなモルパーセンテージ（脂質の総モル含量に対する値）のＰＥＧ2000−ジアルデヒドと共に、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中、４℃で１６時間インキュベートした。最終濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調節した。次に、組成の異なるＬＤ  ６０μｌを２４０μｌの血清と混合し、その混合物を３７℃でインキュベートした。さまざまな時点で６００ｎｍでの吸光度を記録した（濁度）。
【０２１５】
トランスフェクション
ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質１４、ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質１６、ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質２４、ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質Ｂ１９８、ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：コレステロールおよびＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：アミノキシ脂質１（４５：３０：２５，モル比）から構成されるＬＤを、さまざまなモルパーセンテージのＰＥＧ2000−ジアルデヒドで修飾した。これらのＬＤを、上述のトランスフェクションプロトコールに従って、Ｐａｎｃ−１細胞にトランスフェクトした。
【０２１６】
結論
図２４ａは、脂質１４を含むリポプレックスの露出したシステインとＰＥＧ−ジアルデヒドとの間に形成される結合が、血清中であまり安定ではないことを示唆している。この本来不安定な製剤に対するジアルデヒドＰＥＧの効果は弱く、高いＰＥＧ比（２５モル％）でしか顕著にならない。
【０２１７】
図２４ｂは、脂質１６を含むリポプレックスの露出したシステインとＰＥＧ−ジアルデヒドとの間に形成される結合が、血清中で安定であることを示唆している。このＰＥＧの効果は顕著である。
【０２１８】
図１７は、ＰＥＧ量の増加に伴ってトランスフェクションの減少（１０％含有培地中）が観察されることを示しており、これはＬＤへのＰＥＧの共有結合と合致する。これは、ＰＥＧを取り付けたことで細胞によるベクターの取り込みが減少したため、またはＰＥＧの細胞内での阻害的作用によるものと考えうる。
【０２１９】
要約：これらの結果は全体として、システイン含有脂質１６および１４がＰＥＧ2000−ジアルデヒドのアルデヒドに結合することを示唆している。高いモルパーセントのＰＥＧと結合させた場合、結果として得られる複合体は、血清中でより安定であり、１０％血清含有培地ではＰａｎｃ−１に対して低いトランスフェクションレベルを示す。脂質２４を含むＬＤは成長培地中でトランスフェクトすることができる。
【０２２０】
生物学的評価ＩＩ：エクスビボ・トランスフェクション試験
概説
以下に詳述するように、ウィスターラットから海馬切片を調製し、リポソーム組成が異なる３タイプのリポプレックスと共にインキュベートした。すなわち、製剤Ｉ：脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ（５０：５０，ｍ／ｍ）を含むリポプレックス、製剤ＩＩ：脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１（３０：６０：１０，ｍ／ｍ／ｍ）を含むリポプレックス、製剤ＩＩＩ：脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１（３０：６０：１０，ｍ／ｍ／ｍ）を含むリポプレックスをジアルデヒド2000（１０％）と共にインキュベートしたもの。
【０２２１】
海馬切片の調製
この研究は、２７〜２１日齢のウィスターラット（ＷＡＧ／ＧＳｔｏ，ロシア・モスクワ）で行った。迅速な断頭の後、下記の組成を持つ冷（４℃）溶液が入ったペトリ皿に、ラットの脳を直ちに移した。１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2および２０ｍＭグルコース（溶液１）。起こりうるニューロンの損傷を減らすために、カルシウム塩は省いた。その溶液を、９５％Ｏ2／５％ＣＯ2混合ガスで絶えず酸素供給することにより、ｐＨ＝７．４を維持した。興奮性結合のラメラ構造が保全されるように、胞状線維（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｆｉｂｒｅｓ）に沿って、カミソリの刃を使って手作業で海馬切片（３００〜４００μｍ厚）を切り出した。プレインキュベーション中は、切片を以下の細胞外溶液に完全に沈めた。３０〜３１℃の１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｍＭグルコース（溶液２）（ｐＨ７．４，９５％Ｏ2／５％ＣＯ2を吹き込んだもの）。実験は以下の組成の細胞外溶液中で行った。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭグルコース（溶液３）（ｐＨ＝７．４、酸素供給なし）。リポプレックスと共にインキュベートしている間、事例１では、酸素供給は前もって行うだけで負荷操作中は酸素供給を行わずに溶液２中に切片を１時間保ち、インキュベーション後は、酸素供給しながら溶液２中に切片を８時間保った。また、事例２では、酸素供給なしで溶液３（アミノ酸および血清）中に、切片を１時間保った。リポプレックスは細胞外溶液から除去しなかった。切片を３７℃のＣＯ2培養器中に２４時間以上保った。
【０２２２】
結果
図２５  写真１および写真３は、リポソーム製剤、脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１（３０：６０：１０，ｍ／ｍ／ｍ）からなる製剤ＩＩでトランスフェクトした後の切片の表面にある小膠細胞を表す。リポプレックスは食作用によって補集されるようである。写真２は、製剤ＩＩでトランスフェクトした後の、海馬のＣＡ１領域の錐体ニューロンを表す。写真４は、製剤ＩＩＩでトランスフェクトした後の錐体ニューロンの層（低倍率）を表す。
【０２２３】
結論
後コーティングした試料ＩＩＩは、蛍光顕微鏡で検出した場合、平均１２０〜１４０μｍの有意な組織侵入（エンドサイトーシス）を示し、調査した表面の下に浅く広がった蛍光を示した。試料１および試料２は食作用を受けたが、表面に露出していた。
【０２２４】
生物学的評価ＩＩＩ：インビボ・トランスフェクション試験
概説
雌ＭＦ−１マウス（３５ｇ）を２００μｌのケタミン：ロンプン（ｒｏｍｐｕｎ）（２：１  ｖ／ｖ）で麻酔し、総体積３０μｌのＰＢＳ中に動物１匹あたり１０μｇ、２０μｇまたは３０μｇのｐＤＮＡ量で、一連の異なるリポプレックス構築物を鼻腔内滴下によって投与した。リポプレックス試料はすべて、ショ糖の最終濃度１０％および総ｐＤＮＡ量１００μｇで、ＨＥＰＥＳ  ４ｍＭ（ｐＨ７）中に、０．１ｍｇ／ｍＬのｐＤＮＡ濃度で調製した。各試料を、ジアルデヒド2000と共に４℃で７２時間インキュベートした後、真空ロータリーエバポレータ（ｒｏｔａｖａｐ）でｐＤＮＡの最終濃度が１．０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した（すなわち最終総体積は１００μＬである）。製剤をよりよく制御できるように、ｐＤＮＡ成分を前もってアデノウイルスコアペプチド・ミューまたはＣ18−ミューで濃縮しておいた。
【０２２５】
試料
標準ＬＭＤ（ａ）
・濃縮種；μ，０．６重量当量
・プラスミド：ｐＮＧＶＬ−１（β−ガラクトシダーゼ，７．５ｋｂ）、１当量
・リポソーム：Ｂ１９８／ＤＯＰＥ，１２重量当量
ＬＭＤ（ＡＯ）（ｂ）
・濃縮種；μ，０．６重量当量
・プラスミド：ｐＮＧＶＬ−１（β−ガラクトシダーゼ，７．５ｋｂ）、１当量
・リポソーム：Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１（３０：６０：１０，ｍ／ｍ／ｍ），１２重量当量。
ＬＭＤ（ＡＯ／ＰＥＧ−アルデヒド）（ｃ）
・濃縮種；μ，０．６重量当量
・プラスミド：ｐＮＧＶＬ−１（β−ガラクトシダーゼ，７．５ｋｂ）、１当量
・リポソーム：Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／ＡＯ１（３０：６０：１０，ｍ／ｍ／ｍ），１２重量当量
・５％ＰＥＧ2000−ジアルデヒド。
ＬＭＤ１８（ＡＯ）（ｄ）
・濃縮種；Ｃ１８−μ，０．６重量当量
・プラスミド：ｐＮＧＶＬ−１（β−ガラクトシダーゼ，７．５ｋｂ）、１当量
・リポソーム：Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／ＡＯ１（３０：６０：１０，ｍ／ｍ／ｍ），１２重量当量。
ＬＭＤ１８（ＡＯ／ＰＥＧ−アルデヒド）（ｅ）
・濃縮種；Ｃ１８−μ，０．６重量当量
・プラスミド：ｐＮＧＶＬ−１（β−ガラクトシダーゼ，７．５ｋｂ）、１当量
・リポソーム：Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／ＡＯ１（３０：６０：１０，ｍ／ｍ／ｍ），１２重量当量
【０２２６】
手順
雌ＭＦ−１マウス（３５ｇ）を２００μｌのケタミン：ロンプン（２：１  ｖ／ｖ）で麻酔し、総体積３０μｌのＰＢＳに入った１匹あたり１０μｇ、２０μｇまたは３０μｇのＬＭＤ構築物を、鼻腔内滴下によって投与した。４８時間後に動物を屠殺し、気管と肺を切除した。組織を１ｍｌの溶解緩衝液中でホモジナイズし、β−ｇａｌ発現量をＥＬＩＳＡにより、市販のアッセイキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使って決定した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイシステム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使って決定した各試料のタンパク質含量で、β−ｇａｌのレベルを標準化した。
【０２２７】
図２６  ｐＤＮＡの鼻腔内投与量１０、２０および３０μｇ／匹での試料ＬＭＤａ〜ｅのインビボ効力。プラスミドＮＧＶＬ−１（７．５ｋｂ  β−ｇａｌ）。Ａ，μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ；Ｂ  μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／ＡＯ１；Ｃ，μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／ＡＯ１＋５％ＰＥＧ2000−ジアルデヒド；Ｄ，Ｃ１８−μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／ＡＯ１；Ｅ，Ｃ１８−μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／ＡＯ１＋５％ＰＥＧ2000−ジアルデヒド。
【０２２８】
結果および結論
ジアルデヒドを後コーティングしたリポプレックス（ｃ）は、ｐＤＮＡ  ３０μｇ／匹の用量で、陽性アデノウイルス対照の約１０％のトランスフェクション効率を与えた。他の試料は測定可能なトランスフェクション効力を示さなかった。
【０２２９】
本明細書で言及した刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。ここに説明した本発明の方法およびシステムのさまざまな変更態様および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱しなくても、当業者には明白だろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明したが、特許請求の範囲に記載する発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解すべきである。実際、ここに記載した本発明の実施形態のさまざまな変更態様であって生物学、化学または関連分野の当業者に自明であるものは、本願特許請求の範囲に包含されるものとする。
【０２３０】
［引用文献］
【表２Ａ】
2005515990.tif 000047
【表２Ｂ】
2005515990.tif 000048
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】図１Ａはリポソームへのターゲッティング部分のプレ挿入、ポストロードを表す。図１Ｂはリポソームへのターゲッティング部分のポスト挿入を表す。図１Ｃは、プレロードされた薬物／遺伝子媒体系への水性環境でのスペーサー、ターゲッティング化合物のワンポットカップリングを表す。
【図２】ＰＥＧ−ｂｉｓ−ＣＨＯの存在下でのＯｐｔｉＭＥＭにおけるＬＭＤ（Ｂ１９８）の安定性アッセイを表す図である。
【図３】ＯｐｔｉＭＥＭにおけるＬＭＤ（Ｂ１９８／ＤＯＰＥ）（４０：６０）の安定性アッセイを表す図である。
【図４】ＯｐｔｉＭＥＭにおけるＰＥＧ−ｂｉｓ−ＣＨＯの存在下でのＬＭＤ（Ｂ１９８／アミノキシ脂質１）（３０：１０）の安定性アッセイを表す図である。
【図５】ＯｐｔｉＭＥＭにおけるＬＭＤ（Ｂ１９８／アミノキシ脂質１／ＤＯＰＥ）（３０：１０：６０）の安定性アッセイを表す図である。
【図６】グラフを示す。
【図７】グラフを示す。
【図８】グラフを示す。
【図９】グラフを示す。
【図１０】グラフを示す。
【図１１】グラフを示す。
【図１２】血清中でインキュベートした後の、さまざまなＰＥＧで修飾したＬＤ  ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：コレステロール（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）のサイズ測定を表す図である。
【図１３】ＰＣＳで測定した、血清中でインキュベートした後の、ＬＤ（ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８）：脂質２３（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）のサイズプロファイルを表す図である。
【図１４】ｐＨ５．３で３時間インキュベートしてから血清を添加した後の、さまざまなＰＥＧで修飾したＬＤ  ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質２３（４５：３０：２５，モル比）のサイズ測定を表す図である。
【図１５】血清中でインキュベートした後の、さまざまなモル％のＰＥＧで修飾したＬＤ  ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：アミノキシ脂質１（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）のサイズ測定を表す図である。
【図１６】ｐＨ５．３で３時間インキュベートしてから血清を添加した後の、さまざまなモル％のＰＥＧで修飾したＬＤ  ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：アミノキシ脂質１（４５：３０：２５，モル比）のサイズ測定を表す図である。
【図１７】ＰＥＧ2000−ジアルデヒドのモルパーセンテージが異なるさまざまなＬＤの、Ｐａｎｃ−１細胞でのトランスフェクションを表す図である。
【図１８】ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質−アミノキシ脂質１（４５：３０：２５，モル比）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤ（ｐＤＮＡ：脂質比＝１：１２）を、１モルパーセントおよび１０モルパーセントの異なるＰＥＧで修飾し、ＯＶＣＡＲ−１細胞にトランスフェクトした実験を表す図である。
【図１９】ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質２３（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤ（ｐＤＮＡ：脂質比＝１：１３）を１モルパーセントおよび１０モルパーセントの異なるＰＥＧで修飾し、ＯＶＣＡＲ−１細胞にトランスフェクトした実験を表す図である。０はＰＥＧなしに相当する。
【図２０】血清中でインキュベートした後の、さまざまなモル％のＰＥＧで修飾したＬＤ  ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質２３（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）のサイズ測定を表す図である。
【図２１】血清中でインキュベートした後の、さまざまなモル％のＰＥＧで修飾したＬＤ  ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：アミノキシ−脂質１（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）のサイズ測定を表す図である。
【図２２】ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質２３（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤ（ｐＤＮＡ：脂質比＝１：１４）をターゲッティング実験にかけて、ＯＶＣＡＲ−１細胞にトランスフェクトした実験を表す図である。
【図２３】ＤＯＰＥ：脂質Ｂ１９８：脂質−アミノキシ脂質１（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）リポソームから構成される０．１ｍｇ／ｍｌ（ｐＤＮＡ）のＬＤ（ｐＤＮＡ：脂質比＝１：１２）をターゲッティング実験にかけて、ＯＶＣＡＲ−１細胞にトランスフェクトした実験を表す図である。
【図２４】図２４ａは、血清中でインキュベートした後の、さまざまなモル％のＰＥＧ2000−ジアルデヒドで修飾したＬＤ  ＤＯＰＥ：脂質１６（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）の濁度測定を表す。図２４ｂは、血清中でインキュベートした後の、さまざまなモル％のＰＥＧ2000−ジアルデヒドで修飾したＬＤ  ＤＯＰＥ：脂質１４（４５：３０：２５，ｍ／ｍ／ｍ）の濁度測定を表す。
【図２５】写真１および写真３は、リポソーム製剤、脂質Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１（３０：６０：１０，ｍ／ｍ／ｍ）からなる製剤ＩＩでトランスフェクトした後の切片の表面にある小膠細胞を表す。リポプレックスは食作用によって補集されるようである。写真２は、製剤ＩＩでトランスフェクトした後の、海馬のＣＡ１領域の錐体ニューロンを表す。写真４は、製剤ＩＩＩでトランスフェクトした後の錐体ニューロンの層（低倍率）を表す。
【図２６】ｐＤＮＡの鼻腔内投与量１０、２０および３０μｇ／匹での試料ＬＭＤａ〜ｅのインビボ効力を表す図である。プラスミドＮＧＶＬ−１（７．５ｋｂ  β−ｇａｌ）。Ａ，μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ；Ｂ  μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１；Ｃ，μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１＋５％ＰＥＧ2000−ジアルデヒド；Ｄ，Ｃ１８−μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１；Ｅ，Ｃ１８−μ／Ｂ１９８／ＤＯＰＥ／アミノキシ脂質１＋５％ＰＥＧ2000−ジアルデヒド。
【図１Ａ】
2005515990.tif 000056
【図１Ｂ】
2005515990.tif 000057
【図１Ｃ】
2005515990.tif 000058
【図２】
2005515990.tif 000059
【図３】
2005515990.tif 000060
【図４】
2005515990.tif 000061
【図５】
2005515990.tif 000062
【図６】
2005515990.tif 000063
【図７】
2005515990.tif 000064
【図８】
2005515990.tif 000065
【図９】
2005515990.tif 000066
【図１０】
2005515990.tif 000067
【図１１】
2005515990.tif 000068
【図１２】
2005515990.tif 000069
【図１３】
2005515990.tif 000070
【図１４】
2005515990.tif 000071
【図１５】
2005515990.tif 000072
【図１６】
2005515990.tif 000073
【図１７】
2005515990.tif 000074
【図１８】
2005515990.tif 000075
【図１９】
2005515990.tif 000076
【図２０】
2005515990.tif 000077
【図２１】
2005515990.tif 000078
【図２２】
2005515990.tif 000079
【図２３】
2005515990.tif 000080
【図２４ａ】
2005515990.tif 000081
【図２４ｂ】
2005515990.tif 000082
【図２５】
2005515990.tif 000083
【図２６】
2005515990.tif 000084
【国際調査報告】
2005515990.tif 000085
2005515990.tif 000086
2005515990.tif 000087
2005515990.tif 000088
2005515990.tif 000089
2005515990.tif 000090
2005515990.tif 000091
2005515990.tif 000092
2005515990.tif 000093
2005515990.tif 000094