(57)【要約】ヒトＦａｓリガンド（ｈＦａｓＬ）に特異的に結合するヒト抗体、好ましくは組換えヒト抗体を開示する。これら抗体はｈＦａｓＬに対して高親和性を有し、ｈＦａｓＬ解離の解離速度が遅く、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＦａｓリガンド活性を中和する。本発明の抗体は、完全長抗体またはその抗原結合部分であり得る。本発明の抗体または該抗原結合部分は、例えばｈＦａｓリガンド活性が有害である障害に苦しんいるヒト被験者において、Ｆａｓリガンド活性を中和するのに有用である。組換え抗ｈＦａｓＬヒト抗体を発現させるための核酸、ベクター並びに宿主細胞、および組換えヒト抗体を合成するための方法もまた、本発明に包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４よりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項２】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、請求項１記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項３】
ＬＣＶＲが配列番号：２に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項４】
ＬＣＶＲが配列番号：２に示す配列を有するポリペプチドを含み、およびＨＣＶＲが配列番号１０に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項５】
ＬＣＶＲが配列番号：２に示す配列を有するポリペプチドを含み、およびＨＣＶＲが配列番号１８に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項６】
ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインが配列番号：４に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項７】
ＬＣＶＲのＣＤＲ２ドメインが配列番号：６に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項８】
ＬＣＶＲのＣＤＲ３ドメインが配列番号：８に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項９】
ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインが配列番号：４に示す配列を有するポリペプチドを含み、およびＬＣＶＲのＣＤＲ２ドメインが配列番号：６に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
ＬＣＶＲのＣＤＲ１ドメインが配列番号：４に示す配列を有するポリペプチドを含み、およびＬＣＶＲのＣＤＲ３ドメインが配列番号：８に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
ＬＣＶＲのＣＤＲ２ドメインが配列番号：６に示す配列を有するポリペプチドを含み、およびＬＣＶＲのＣＤＲ３ドメインが配列番号：８に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
ＨＣＶＲのＣＤＲ１ドメインが配列番号：１２または２０に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
ＨＣＶＲのＣＤＲ２ドメインが配列番号：１４または２２に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
ＨＣＶＲのＣＤＲ３ドメインが配列番号：１６または２４に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
ＨＣＶＲのＣＤＲ２ドメインが配列番号：１４または２２に示す配列を有するポリペプチドを含み、およびＨＣＶＲのＣＤＲ３ドメインが配列番号：１６または２４に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
ＨＣＶＲのＣＤＲ１ドメインが配列番号：１２または２０に示す配列を有するポリペプチドを含み、およびＨＣＶＲのＣＤＲ２ドメインが配列番号：１４または２２に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
ＨＣＶＲのＣＤＲ１ドメインが配列番号：１２または２０に示す配列を有するポリペプチドを含み、およびＨＣＶＲのＣＤＲ３ドメインが配列番号：１６または２４に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
ＬＣＶＲが配列番号：２に示す配列を有するポリペプチドを含み、およびＨＣＶＲが配列番号：１８に示す配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する、請求項１−１８のいずれかに記載の単離された抗体。
【請求項２０】
ＩｇＧ４重鎖定常領域を有する、請求項１−１８のいずれかに記載の単離された抗体。
【請求項２１】
Ｆａｂフラグメントである、請求項１−１８のいずれかに記載の単離された抗原結合部分。
【請求項２２】
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項１−１８のいずれかに記載の単離された抗原結合部分。
【請求項２３】
一本鎖Ｆｖフラグメントである、請求項１−１８のいずれかに記載の単離された抗原結合部分。
【請求項２４】
請求項１−２３のいずれかに記載の抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２６】
発現ベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
ｈＦａｓＬを請求項１−２３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む、ｈＦａｓＬ活性を阻害する方法。
【請求項２９】
請求項１−２３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合部分および製薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
被験者においてｈＦａｓＬ活性を阻害する方法であって、請求項２９に記載の医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含む方法。
【請求項３１】
ＦａｓＬ活性が有害である障害を処置または予防する方法であって、請求項２９に記載の医薬組成物をそれを必要とする被験者に投与することを含む方法。
【請求項３２】
障害が、全身性炎症反応症候群、敗血症、多臓器機能障害、急性呼吸窮迫症候群、重症敗血症、外傷、移植片対宿主病、臓器移植に伴う臓器拒絶、多発性硬化症、特発性肺線維症、変形性関節症、炎症性大腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性心筋梗塞、心筋症、心臓再潅流傷害、糖尿病、癌、ヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウィルス、劇症ウィルス性Ｂ型またはＣ型肝炎を含むがこれらに限られない肝障害、慢性Ｃ型肝炎ウィルス、慢性Ｂ型肝炎ウィルス、アルコール性肝炎、肝硬変および腎障害よりなる群から選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ＦａｓＬ活性を中和し、障害を処置する、請求項１−２３のいずれかに記載の抗体またはフラグメントの使用。
【請求項３４】
障害が、全身性炎症反応症候群、敗血症、多臓器機能障害、急性呼吸窮迫症候群、重症敗血症、外傷、移植片対宿主病、臓器移植に伴う臓器拒絶、多発性硬化症、特発性肺線維症、変形性関節症、炎症性大腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性心筋梗塞、心筋症、心臓再潅流傷害、糖尿病、癌、ヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウィルス、劇症ウィルス性Ｂ型またはＣ型肝炎を含むがこれらに限られない肝障害、慢性Ｃ型肝炎ウィルス、慢性Ｂ型肝炎ウィルス、アルコール性肝炎並びに肝硬変、および腎障害よりなる群から選択される、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１７として寄託されるハイブリドーマおよびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１８として寄託されるハイブリドーマよりなる群から選択されるハイブリドーマにより産生されるヒト抗体。
【請求項３６】
ヒトＦａｓリガンドに結合する、抗体３Ｅ１である単離されたヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項３７】
ヒトＦａｓリガンドに結合する、抗体４Ｇ１１である単離されたヒト抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項３８】
請求項３６または３７のいずれかに記載の単離されたヒト抗体および製薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
Ｆａｓリガンド（「ＦａｓＬ」）は、Ｆａｓ抗原（「Ｆａｓ」）発現細胞のアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質である。Ｆａｓ抗原発現細胞のアポトーシスは、ＦａｓＬが該細胞表面のＦａｓと結合することにより誘導され、その結果Ｆａｓ抗原を介して該細胞にアポトーシスシグナルが伝達されると考えられている。ヒト、マウスおよびラット由来のＦａｓＬの核酸およびタンパク質の配列は、米国特許６，３４８，３３４（引用により本明細書に含まれる）に開示されている。
【０００２】
ヒトＦａｓリガンド（「ｈＦａｓＬ」）は、ＴＮＦファミリーのメンバーである４０ｋＤａアミノ酸の、タイプＩＩ膜結合タンパク質である。膜結合型ＦａｓＬはメタロプロテイナーゼによって切断され、主として非共有結合性ホモトリマーである可溶性ＦａｓＬを生成することができる（Mariani, et al., Eur. J. Immunol. 25: 2303-7 (1995); Kayagaki, et al., J. Exp. Med. 182: 1777-83 (1995); Tanaka, et al., EMBO 14 (6): 1129-35 (1995) )。可溶性ＦａｓＬは、膜関連（membrane-associated)ＦａｓＬより細胞毒性が弱いようである(Nagata, Annu. Rev. Genet. 33: 29-55 (1999)）。
【０００３】
ＦａｓＬは主に活性化Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現し、一方Ｆａｓは様々なタイプの細胞上に発現する（Hanabuchi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4930-4 (1994); Suda, et. al., J. Immunol. 154: 3806-13 (1995); Arase, et. al., J. Exp. Med. 181 : 1235-8 (1995)）。Ｆａｓ−ＦａｓＬシグナル経路は、細胞のアポトーシスを誘導することにより免疫応答を調節するのに重要である。最近ＦａｓＬが好中球に対する強力な化学遊走物質であることが報告され、このことは本分子の炎症誘発機能を示唆する。Ｆａｓ−ＦａｓＬシグナル経路はまた、自己免疫疾患、腎障害、敗血症、ウィルス性肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザおよび移植片対宿主病を含む多様な疾患の病因に関与してる（例えば、Krammer, et al., Immunol. Rev. 142: 175-91 (1994); Nagata and Golstein, Science 267: 1449-56 (1995) ; Yagita, et al., Immunol. Rev. 146: 223-39 (1995); Elovaara, et al., Acta Neuropathologica, 98 (4): 355-62 (1999) ; Leroy, X. et al., APMIS, 109 (6): 469-73,2001 参照）。
【０００４】
マウス抗体配列を含むｈＦａｓＬに対する抗体およびヒト抗体配列の一部を有するキメラ抗体種が記載されている（例えば、国際特許公開番号ＷＯ９５／１８８１９および米国特許番号６，１１４，５０７および６，３４８，３３４および６，０９６，３１２（引用により本明細書に含まれる）参照）。しかしながら、キメラ抗体の使用には免疫原性の問題が残っている。組換えＤＮＡ技術によりヒト化抗体（即ちキメラ）を産生すると、結合親和性が予測不可能な抗体を含め、もたらされる結果が不確かである。米国特許６，３４８，３３４は、明示的ではないもののＦａｓＬに対する抗体を開示しているが、そのような抗体の構造的特徴について具体的には記載していない。
【０００５】
本明細書にて規定されるヒト抗体は、幾つかの理由から、ヒトの治療において使用するのに非ヒト抗体およびヒト化キメラ抗体より好都合である。ヒトモノクローナル抗体、即ち完全にヒトである抗体は、非ヒト部分を含む抗体よりヒトにおいて免疫応答を誘導しにくいようである。さらに、ヒト抗体は、ヒトにおいて「外来の」抗体として認識されにくいようである。このことから、ヒト抗体は非ヒト抗体または部分的ヒト抗体よりも体から除去されるのが遅くなるであろう。つまりヒト抗体は、非ヒト抗体または部分的ヒト抗体よりも低い投与量で、または少ない頻度で投与することができる。
【０００６】
種間反応性の可能性を最小限にするため、ＦａｓＬ、特にヒトＦａｓＬに対するヒト抗体は、ＦａｓＬに対して高親和性結合を示し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＦａｓ−ＦａｓＬシグナル経路の活性を妨害またはアンタゴナイズする能力を有する必要がある。本出願は、ｈＦａｓＬに対するものであり、かつｈＦａｓＬポリペプチドに対する高親和性結合、遅い解離速度およびＦａｓＬポリペプチドに関する少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ活性を妨害またはアンタゴナイズする能力を特徴とする、治療上有用なヒト抗体およびその抗原結合部分を開示する。
【０００７】
本発明は、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体およびその抗原結合部分を提供する。本発明の抗体は、ｈＦａｓＬポリペプチドに対する高親和性結合、遅い解離速度、およびＦａｓＬポリペプチドに関する少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｓｉｔｕ活性をアンタゴナイズする能力を特徴とする。
【０００８】
本発明は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４に示す配列よりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、好ましくは少なくとも２つのポリペプチド、を含む、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分を提供する。好ましい態様において、本発明は、配列番号：２に示す配列を有するポリペプチドを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、単離された抗ＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分を提供する。より好ましい態様において、本発明は、配列番号：２に示す配列を有するポリペプチドを含むＬＣＶＲおよび更に配列番号：１０に示す配列を有するポリペプチドを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本発明は、配列番号：２に示す配列を有するポリペプチドを含むＬＣＶＲおよび更に配列番号：１８に示す配列を有するポリペプチドを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様において、本発明は、配列番号：４、６、８、１２、１４、１６、２０、２２および２４に示す配列よりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、好ましくは少なくとも２、３、４、５または６つのポリペプチド、を含む単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分であって、該ポリペプチドが該抗体において好ましくは本明細書の表１、２または３に示すのと同じＣＤＲ位置に存在する、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４に示す配列よりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、好ましくは少なくとも２つのポリペプチド、を含む抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。好ましい態様において、本発明は、配列番号:２を含む抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。より好ましい態様において、本発明は、配列番号：２および１０または配列番号：２および１８に示す配列を含む抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。別の好ましい態様において、本発明は、配列番号：４、６、８、１２、１４、１６、２０、２２および２４に示す配列よりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリペプチド、好ましくは少なくとも２、３、４、５または６つのポリペプチド、を含む抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、該ポリペプチドが該抗体において好ましくは本明細書の表１、２または３に示すのと同じＣＤＲ位置に存在する単離された核酸分子を提供する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３に示す配列よりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド、好ましくは少なくとも２つのポリヌクレオチド、を含む、抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。好ましい態様において、本発明は、配列番号:１に示す配列を有するポリヌクレオチドを含む、抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。より好ましい態様において、本発明は、配列番号：２および１０または配列番号：２および１８に示す配列を有するポリヌクレオチドを含む、抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子提供する。別の好ましい態様において、本発明は、配列番号：３、５、７、１１、１３、１５、１９、２１および２３よりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチド、好ましくは少なくとも２、３、４、５または５つのポリヌクレオチド、を含む、抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、好ましくは該ポリペプチドが該抗体において本明細書の表１、２または３に示すのと同じＣＤＲ位置に存在する単離された核酸分子を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは 組換え発現ベクターを提供する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、本発明のベクター、好ましくは組換え発現ベクター、が導入されている宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明のベクター、好ましくは組換え発現ベクター、の全体または一部が宿主細胞染色体に組み込まれている宿主細胞を提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、本発明の宿主細胞を本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分が該細胞において発現するように培養培地にて培養することを含む、抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分を合成する方法を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、即ち抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分を調製する方法であって、本発明の発現ベクターを含む適切な本発明の宿主細胞を該ポリペプチドの発現および該ポリペプチドの精製を促進する条件下で培養することを含む方法、を提供する。この精製は、該宿主細胞、該宿主細胞が育てられる該培養培地、またはその両方からの精製であってよいと考えられる。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ｈＦａｓＬを本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体（またはその抗原結合部分）と接触させることを含む、ｈＦａｓＬ活性を阻害する方法を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、２つ以上の本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体を含むことが出来ると考えられる。
【００１８】
本発明の医薬組成物は更に、製薬的に許容される担体を含むことができる。
【００１９】
本発明はまた、ＦａｓＬ活性を中和するための方法およびＦａｓＬ活性が有害である障害を処置または予防する方法であって、それを必要とする被験者に治療上有効量の本発明の医薬組成物を送達することを含む方法を具現化する。好ましい態様において、ＦａｓＬ活性が有害である障害は以下のものである：全身性炎症反応症候群、敗血症、多臓器機能障害、急性呼吸窮迫症候群、重症敗血症,外傷、移植片対宿主病、臓器移植に伴う臓器拒絶、多発性硬化症、特発性肺線維症、変形性関節症、炎症性大腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性心筋梗塞、心筋症、心臓再潅流傷害、糖尿病、癌（好ましくは免疫応答から逃れる機構としてＦａｓＬを発現または過剰発現する癌タイプ；考えられる癌タイプには以下のものが含まれるがそれらに限定されない：乳癌、メラノーマ、卵巣癌、結腸癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫および肝細胞癌）、ヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウィルス、劇症ウィルス性Ｂ型またはＣ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎ウィルス、慢性Ｂ型肝炎ウィルス、アルコール性肝炎、肝硬変を含むがこれに限定されない肝障害、または慢性腎疾患、急性腎疾患および糖尿病性ネフロパシーを含むがこれらに限定されない腎障害。
【００２０】
更に別の態様において、本発明は、American Type Culture Collection（Manassas, Virginia）にＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１７として寄託されるハイブリドーマまたはＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１８として寄託されるハイブリドーマによって産生されるヒト抗体および該ヒト抗体を含む組成物を提供する。
【００２１】
具体的態様は変化させることができ、それらもやはり添付の請求項の範囲内であるため、本発明は以下に記載される具体的態様に限定されない。その代わり、本発明の範囲は添付の請求項によって定められるであろう。
【００２２】
抗体は、ジスルフィド結合により相互に接続した２つの重鎖（Ｈ）（完全長の場合約５０−７０ｋＤａ）および２つの軽鎖（Ｌ）（完全長の場合約２５ｋＤａ）である４つのポリペプチド鎖より構成されるイムノグロブリン分子である。軽鎖はκおよびλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定める。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書においてはＨＣＶＲと略す）および重鎖定常領域より構成される。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡについては３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）およびＩｇＭおよびＩｇＥについては４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）より構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてはＬＣＶＲと略す）および軽鎖定常領域より構成される。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインより構成される。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は更に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高可変性の領域に細かく分けることができ、間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が組み入れられている。各ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ並んでいる３つのＣＤＲおよび４つのＦＲより構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知の慣習に従う（Kabat, ”Sequences of Proteins of Immunological Interest”, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987および1991)；Chothia, et al., J.Mol. Biol. 196: 901-17 (1987)；Chothia, et al., Nature 342: 878-83 (1989) ）。抗体が特定の抗原に結合する機能的能力は、主としてＣＤＲによって決定される。
【００２３】
本明細書で用いる「抗体」なる用語は、本質的にモノクローナル抗体を意味する。モノクローナル抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であってよい。モノクローナル抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体および／またはヒト化抗体のＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントであってもよい。更に、モノクローナル抗体は、一本鎖ＦＶフラグメントであってもよい。
【００２４】
本明細書で用いる「ヒト抗体」なる用語は、該抗体がヒト細胞において産生されるか否かに関わらず、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン領域において、あるいはその組換えおよび／または変異型において生じる核酸配列情報によってコードされる可変および定常領域を有する、（ｉ）インタクト（intact）な抗体、（ｉｉ）実質的にインタクトな抗体、（ｉｉｉ）抗原結合部位を含む抗体の一部分、または（ｉｖ）Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２を含む抗体の一部分である。「ヒト抗体」なる用語はまた、一本鎖ＦＶフラグメントの形をとるよう操作されたヒト抗体を含む。
【００２５】
キメラ、ヒト化またはＣＤＲ移植抗体は、少なくとも１つの非ヒトＦｃ、ＦＲまたはＣＤＲ領域を含み、本明細書で意味するヒト抗体ではない。
【００２６】
「ｈＦａｓＬ」なる用語は、Suda, et al., Cell 75: 1169-78 (1993)に記載される、腫瘍壊死因子リガンドファミリーのメンバーであるヒトＦａｓリガンドを意味する。ｈＦａｓＬの機能は、Krammer, et al., Immunol. Rev. 142: 175-91 (1994)；Nagata and Golstein, Science 267 (5203): 1449-56 (1995)；および Yagita, et al., Immunol. Rev. 146: 223-39 (1995)に詳述される。「Ｆａｓリガンド」なる用語は、ｈＦａｓＬおよび他の種由来のｈＦａｓＬのホモログを包含する意味である。「ｈＦａｓＬ」および「ＦａｓＬ」なる用語はまた、標準的組換え発現方法によって調製できるか、あるいは市場において購入することができる (Alexis（登録商標）Biochemicals, カタログ＃：522-001) 形のもの、および合成することができる形のものを含む意味である。
【００２７】
「可溶性」なる用語は、ＦａｓＬとともに用いる場合、「膜関連」または「膜結合」型ＦａｓＬの切断型を意味する。可溶性ＦａｓＬは、膜結合ＦａｓＬの細胞外ドメインの少なくとも一部分を含む可溶性フラグメントを意味する。可溶性ＦａｓＬは、可溶性分子をもたらす、ＦａｓＬの細胞外領域の特異的部位でのメタロプロテイナーゼ切断によって生じる（Hohlbaum, etal., J. Exp. Med. 191 (7): 1209-20 (2000); Tanaka, et al.,Nat. Med. 2 (3): 317-22 (1996)；および Kayagaki, et al, J.Exp. Med. 182 (6): 1777-83 (1995))。膜結合型のように、可溶性ＦａｓＬはＦａｓと結合してアポトーシスを誘導することができる。
【００２８】
本発明の抗体または抗体フラグメントに関する「生物学的性質」または「生物学的特徴」なる用語、あるいは「活性」または「生物活性」なる用語は、本明細書において互換的に使用され、エピトープ親和性および特異性（例えばｈＦａｓＬに結合する抗ｈＦａｓＬヒト抗体）、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて標的としたポリペプチドの活性（例えばＦａｓＬ生物活性）をアンタゴナイズする能力、該抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、および該抗体の免疫原性を含むが、それらに限定されない。当業界において認識されている他の確認可能な抗体の生物学的性質または特徴には、例えば、交差反応性（即ち、通常標的としたポリペプチドの非ヒトホモログとの、あるいは他のタンパク質または組織との反応性）および哺乳類細胞において高いタンパク質発現レベルを保つ能力が含まれる。前述の性質または特徴は、当業界において知られる技術を用いて観察または測定することができ、それには、ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、BIAcore（登録商標）表面プラズモン共鳴解析、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ中和アッセイ（例えば実施例１、２および３）、およびヒト、霊長類、または要すれば他の起源を含む相異なる起源由来の組織切片を用いる免疫組織化学が含まれるが、それらに限定されない。
【００２９】
本明細書で用いる「エピトープ」なる用語は、抗体が結合することができるタンパク質分子の領域を意味する。「免疫原性エピトープ」は、その完全タンパク質が免疫原である場合に、抗体応答を引き起こすそのタンパク質の部分と規定される。例えば、Geysen,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984) を参照されたい。本発明で用いる抗体の「抗原結合部分」とは、該抗原結合部分が抗体に含まれる場合に、該抗体が結合するエピトープと相互作用または結合する抗体の領域を意味する。抗原結合部分は完全長抗体との関連においてでなくとも存在し得るもので、それがなおエピトープと相互作用または結合するか否かによらず、依然として該抗体の抗原結合部分と考えることができる。
【００３０】
「阻害」または「阻害する」とは、阻害を受けているもの、例えば活性、疾患または病状等（これらに限定されない）の、進行または重症度を中和する、アンタゴナイズ（拮抗）する、制止する、予防する、抑止する、遅める、妨害する、停止させる、または逆転させることを意味する。
【００３１】
核酸またはタンパク質（例えば抗体）との関係で用いられる「単離された」なる用語は、その天然の出所において通常関連している少なくとも１つの混入物質（それぞれ核酸またはタンパク質）の中から同定または分離された核酸配列またはタンパク質を意味する。単離された核酸またはタンパク質は、自然界において見られる形または配列とは相違する形または配列にて存在する。それに対し、非単離核酸またはタンパク質は自然界に存在する状態にて見られる。好ましくは、「単離された抗体」は、相異なる抗原特性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ｈＦａｓリガンドポリペプチド以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない単離された抗体）である。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「精製」または「精製する」とは、対象とする成分、例えばタンパク質または核酸から、何らかの混入物質を取り除くプロセスの結果を意味する。それにより、その試料における精製成分の割合が増加する。好ましい態様において、該抗体は、（１）ローリー法で測定した場合に抗体の重量で９５％以上、最も好ましくは重量で９９％以上まで、および（２）還元または非還元条件下でクーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製されるであろう。
【００３３】
「カバット（Kabat）ナンバリング」および「カバット（Kabat）ラベリング」なる用語は、本明細書において同義的に用いられる。これらの用語は当業界にて認識されており、抗体の重鎖および軽鎖可変領域において他のアミノ酸残基よりもより可変性の（例えば超可変）アミノ酸残基をナンバリングするシステムを意味する（Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of Proteins of lmmunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991))。
【００３４】
ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと機能的関係に配置される場合に、「作動可能に連結される」。例えば、ポリペプチドが該ポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現する場合、シグナルペプチドまたは分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡと作動可能に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響する場合、該配列に作動可能に連結される。
【００３５】
免疫付与に際し内生のイムノグロブリンを産生せずにヒト抗体を産生する能力のあるトランスジェニック動物（例えばマウス）を、本発明に用いることができる。ヒト生殖細胞系列イムノグロブリン遺伝子アレイを、そのような生殖細胞系列変異マウスに転移すると、抗原暴露に対してヒト抗体が産生されるであろう。例えば、Jakobovits, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-5 (1993); Jakobovits, et al., Nature 362: 255-8 (1993); Bruggemann, et al., Year in Immun. 7: 33 (1993); Nature 148: 1547-53 (1994), Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Gross, et al., Nature 404 : 995-9 (2000)；および米国特許番号５，８７７，３９７；５，８７４，２９９；５，８１４，３１８；５，７８９，６５０；５，７７０，４２９；５，６６１，０１６；５，６３３，４２５；５，６２５，１２６；５，５６９，８２５；および５，５４５，８０６を参照されたい。
【００３６】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいて産生することができる (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-8 (1992) )。ColeらおよびBernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能なそれら技術に含まれる(Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Berner,et al., J. Immunol. 147: 86-95 (1991))。
【００３７】
組換えヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（あるいは、ヒトＩｇ配列のトランジェニック動物を用いる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞性突然変異誘発）を受ける場合があり、つまり、組換え抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列に関する配列に由来するが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖細胞系列レパートリーの中に天然には存在しない場合がある。
【００３８】
抗ＦａｓＬ抗体に関する「中和する」または「アンタゴナイズする」なる用語、あるいは、「ＦａｓＬ活性をアンタゴナイズ（中和）する抗体」または「ＦａｓＬをアンタゴナイズ（中和）する」なる句は、ＦａｓＬとの結合または相互作用の結果ＦａｓＬポリペプチドによって誘導される生物学的活性を阻害する抗体、またはその抗原結合部分を意味する。ＦａｓＬ生物学的活性の阻害は、１つまたはそれ以上のＦａｓＬ生物学的活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ指標を測定することによって評価でき、それにはＦａｓＬ仲介細胞内シグナルの誘導、アポトーシス、好中球走化性、またはＦａｓＬ受容体結合実験における受容体結合の阻害を含まれるがこれらに限定されない。ＦａｓＬ生物学的活性の指標は、当業界において知られている幾つかのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの１つまたはそれ以上によって評価することができる。好ましくは、抗体がＦａｓＬ活性を中和またはアンタゴナイズする能力は、Ｆａｓ-ＦａｓＬ仲介アポトーシスの阻害によって評価する。
【００３９】
本明細書において同義的に用いられる「個人」、「被験者」および「患者」なる用語は哺乳類を意味し、それにはマウス、サル、ヒト、哺乳類家畜、哺乳類競技用動物および哺乳類ペットが含まれるがこれらに限定されない。
【００４０】
本明細書で用いる「Ｋｏｆｆ」なる用語は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数を意味する。抗ｈＦａｓＬヒト抗体の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）は、概ね実施例３に記載されるように、BIAcore（登録商標）表面プラズモン共鳴によって測定することができる。通常、BIAcore（登録商標）解析は、リガンド(バイオセンサー・マトリックスに固定された組換えＦａｓＬ ポリペプチド）と検体（溶液中の抗体）との間のリアルタイム結合相互作用を、BIAcoreシステム(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定する。ＳＰＲはまた、検体（バイオセンサー・マトリックス上の抗体）を固定し、そして溶液中に存在するリガンドを与えることによっても行うことができる。抗原／抗体複合体について低解離定数とは、１０−３／秒以下、好ましくは１０−４／秒以下、より一層好ましくは１０−５／秒以下のＫｏｆｆを意味する。
【００４１】
本明細書で用いる「ＫＤ」なる用語は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味する。本発明の目的については、ＫＤは実施例３に示すように測定することできる。特定のエピトープとの結合性および／または親和性が高い抗体は、１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下のＫＤを有する。
【００４２】
「ベクター」なる用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を包含し、プラスミドおよびウィルスベクターを含むがこれらに限定されない。一部のベクターはそれらが導入された宿主細胞において自己複製することができ、一方他のベクターは宿主細胞へ導入された後宿主細胞ゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、一部のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（あるいは単に「発現ベクター」）と呼ばれる。
【００４３】
「宿主細胞」なる用語は、本発明の組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドの受け手となり得る、または受け手となっている個々の細胞または細胞培養を包含する。宿主細胞は１の宿主細胞の子孫を包含し、該子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異および／または変化のため、もとの親細胞と（形態または全ＤＮＡ相補鎖において）必ずしも完全に同一でない場合がある。宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドがトランスフェクトされた、あるいは感染した細胞を包含する。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞はまた「組換え宿主細胞」と呼ばれる。好ましくは、宿主細胞は細菌または哺乳類である；哺乳類の場合、それは好ましくはＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯまたは２９３細胞である。
【００４４】
本発明は、ｈＦａｓＬポリペプチド、その抗原性フラグメント、またはｈＦａｓＬ活性に特異的であり、かつそれを中和するヒトモノクローナル抗体に関する。
【００４５】
ＦａｓＬポリペプチド、その抗原性フラグメントあるいはエピトープ保持体、またはｈＦａｓＬ活性、好ましくはｈＦａｓＬのＦａｓに対する結合、に高度に特異的であり、かつそれを中和する、抗体重および／または軽鎖フラグメントもまた開示される。このようにＦａｓＬに対する結合の特異性が高いことが、そのような特異性を有する抗ｈＦａｓＬヒト抗体、その抗原結合部分およびヒトモノクローナル抗体を、Ｆａｓ−ＦａｓＬ関連疾患に対して免疫療法的に用いることを可能にする。
【００４６】
ある態様において、本発明は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、を含む、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。配列番号：４、６、８、１２、１４、１６、２０、２２および２４に示される配列は、本発明の抗体に存在する場合、好ましくは本発明の抗体において本明細書の表１、２または３に示されるのと同じＣＤＲ位置に、およびそれらが配列番号：２（配列番号：４、６および８について）、配列番号：１０（配列番号：１２、１４およびｌ６について）および配列番号：１８（配列番号：２０、２２および２４について）に存在するように、位置づけられる。
【００４７】
好ましい態様において、本発明は、２ｘ１０−７Ｍ以下、より好ましくは２ｘ１０−８Ｍ以下、およびより一層好ましくは２ｘ１０−９Ｍ以下の平衡解離定数、即ちＫＤにて可溶性ＦａｓＬ ポリペプチド（またはその抗原性フラグメント）に結合し（固相BIAcore（登録商標）表面プラズモン共鳴によって室温で測定した場合）、低ｋｏｆｆ速度定数にてＦａｓＬポリペプチドから解離し、かつＦａｓＬポリペプチド活性をアンタゴナイズする能力有する、単離された抗ＦａｓＬヒト抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００４８】
本発明の別の態様は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて、膜結合ＦａｓＬに対して１０ｎＭ以下（あるいは９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、あるいは５ｎＭ以下）のＩＣ５０にて、あるいは可溶性ＦａｓＬに対して０．２ｎＭ以下（あるいは０．１９ｎＭ以下、０．１８ｎＭ以下、０．１７ｎＭ以下、あるいは０．１５ｎＭ以下）のＩＣ５０にて、ＦａｓＬ仲介アポトーシスを阻害する、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。このような本発明の抗原結合部分は、単独で、あるいはｈＦａｓＬヒト抗体の中に存在し得る。より好ましい態様において、その単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体は、１ｘ１０−７Ｍ以下、より好ましくは１ｘ１０−８Ｍ以下、より一層好ましくは１ｘ１０−９Ｍ以下の平衡解離定数、即ちＫＤにて（固相BIAcore（登録商標）によって室温で測定した場合）、可溶性ＦａｓＬポリペプチドに結合する。前述の速度および中和基準を満たす抗ｈＦａｓＬヒト抗体の例には、実施例１、２および３に記載される３Ｅ１および４Ｇ１１抗体が含まれる。
【００４９】
最も好ましい本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体は、本明細書において３Ｅ１と呼ばれるものである。この３Ｅ１抗体は、それぞれ配列番号:２および配列番号:１０に示す配列を有するポリペプチドを含むＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを有する（本明細書の表１および３を参照のこと）。３Ｅ１のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲをコードする典型的ポリヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号:１および配列番号：９に示す。
【００５０】
別の態様において、好ましい抗ｈＦａｓＬヒト抗体は、本明細書において４Ｇ１１と呼ばれるものである。４Ｇ１１抗体は、それぞれ配列番号:２および配列番号:１８に示す配列を有するポリペプチドを含むＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを有する（本明細書の表２および３を参照のこと）。４Ｇ１１のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲをコードする典型的ポリヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号:１および配列番号：１７に示す。
【００５１】
別の態様において、本発明は、３Ｅ１および４Ｇ１１の各抗体につき、配列番号：１０または配列番号：１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＨＣＶＲを含み、更に配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＬＣＶＲを含む、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体Ｆａｂおよび抗ｈＦａｓＬヒト抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを提供する。更に別の態様において、本発明は、配列番号：４、６、８、１２、１４、１６、２０、２２および２４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２、３、４、５または６つのポリペプチドを含む、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分を提供する。配列番号：４、１２または２０に示すアミノ酸配列は、本発明の抗体に存在する場合、好ましくはＣＤＲ１に位置する。配列番号：６、１４または２２に示すアミノ酸配列は、本発明の抗体に存在する場合、好ましくはＣＤＲ２に位置する。また、配列番号：８、１６または２４に示すアミノ酸配列は、本発明の抗体に存在する場合、好ましくはＣＤＲ３に位置する。好ましい態様により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて可溶性ＦａｓＬ仲介アポトーシスを０．５ｎＭ以下、より好ましくは約０．３以下、より好ましくは約０．１５ｎＭ以下のＩＣ５０にて；あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて膜結合ＦａｓＬ誘導増殖またはアポトーシスを１０ｎＭ以下、好ましくは約９、８、７、６または５ｎＭ以下のＩＣ５０にて阻害する、単離された抗ｈＦａｓＬヒト抗体またはその抗原結合部分が提供される。
【００５２】
別の態様において、本発明はまた、本明細書に記載される抗ｈＦａｓＬヒト抗体を産生する細胞株を対象とする。発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は、当業界にて知られる通常のスクリーニング技術を用いて単離することができる。本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体を産生する幾つかの細胞株がＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）に寄託されている。ヒトＩｇＧ４κである３Ｅ１を分泌するマウスハイブリドーマ（HuMab-mouse（登録商標）由来)は整理番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１７がつけられており、また、ヒトＩｇＧ４κである４Ｇ１１を分泌するマウスハイブリドーマ（HuMab-mouse（登録商標）由来)は整理番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４０１８がつけられている。最も好ましい本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体は、少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２、３、４、５または６つの超可変領域（即ちＣＤＲ）内に、上記ＡＴＣＣ寄託抗体の１つまたはそれ以上に存在するのと同じ、あるいは本質的に良く似たアミノ酸配列を有する。
【００５３】
本発明の抗体を発現させるため、原核生物（細菌）および真核生物発現システム（例えば酵母、バキュロウィルス、植物、哺乳類その他の動物細胞、トランスジェニック動物およびハイブリドーマ細胞）、並びにファージディスプレイ発現システムを含む、様々な宿主発現システムを用いることができる。適した細菌発現ベクターの例は、ｐＵＣ１１９（Ｓｆｉ）であり、適した真核生物発現ベクターは、減弱化ＤＨＦＲ選択システムを有する改変ｐｃＤＮＡ３．１ベクターである。他の抗体発現システムも当業界にて知られており、本明細書において考慮される。多数の適した哺乳類宿主細胞が当業界にて知られており、それにはＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳＯおよび２９３細胞が含まれるがそれらに限定されない。
【００５４】
本発明の抗体は、宿主細胞におけるイムノグロブリン軽および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。組換えにより抗体を発現させるため、該抗体のイムノグロブリン軽および重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つまたはそれ以上の組換え発現ベクターを、軽および重鎖が宿主細胞において発現するように、宿主細胞にトランスフェクトする。好ましくは、組換え抗体は宿主細胞が培養される培地中に分泌され、そこから該抗体を回収することができる。抗体重および軽鎖遺伝子を獲得し、これら遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、そして該ベクターを宿主細胞に導入するには、標準的組換えＤＮＡ手法を用いる。このような標準的組換えＤＮＡ技術は、例えばSambrook, Fritsch, and Maniatis (Eds.), Molecular Cloning ; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989); Ausubel, et al (Eds. ) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989); およびBossらによる米国特許番号４，８１６，３９７に記載される。
【００５５】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡは、該ＨＣＶＲコード化ＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当業界にて知られている。例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)を参照のこと。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。該重鎖定常領域は、Kabat（前述）に記載されるように、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域およびそのアロタイプ変異体であってよいが、最も好ましくはＩｇＧ４またはＩｇＧｌ定常領域である。あるいは、抗原結合部分は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）であってよい。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子については、そのＨＣＶＲコード化ＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。
【００５６】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離されたＤＮＡは、該ＬＣＶＲコード化ＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当業界にて知られている。例えば、Kabat（前述）参照のこと。これら領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。該軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であってよい。
【００５７】
ｓｃＦｖ遺伝子を創出するため、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲコード化ＤＮＡフラグメントを、フレキシブルなリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントに作動可能に連結し、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域をそのフレキシブルなリンカーによってつないで、該ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列が連続した一本鎖タンパク質として発現できるようにする。例えば、Bird, et al., Science 242: 423-6 (1988); Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83 (1988); McCafferty, et al., Nature 348: 552-4 (1990) 参照。
【００５８】
本発明の抗体を発現するため、前述のようにして得た部分的あるいは完全長軽および／または重鎖をコードするＤＮＡを、該遺伝子が転写および翻訳調節配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入する。これに関して、「作動可能に連結される」なる用語は、ベクター内の転写および翻訳調節配列がそれらの目的とする抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する機能を果たすように、該抗体遺伝子が該ベクターにライゲートされることを意味する。該発現ベクターおよび発現調節配列は、用いる発現宿主細胞と適合するように選択する。該抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ、より典型的には、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。該抗体遺伝子は標準的方法により該発現ベクターに挿入する。更に、該組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗ｈＦａｓＬヒト抗体軽および／または重鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗ｈＦａｓＬヒト抗体軽および／または重鎖遺伝子は、該シグナルペプチドが該抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームにて作動可能に連結されるように、該ベクターにクローニングすることができる。該シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドであっても、異種性シグナルペプチドであってもよい。
【００５９】
本発明の組換え発現ベクターは、抗体重および／または軽鎖遺伝子に加え、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を保有する。「制御配列」なる用語は、必要に応じて、抗体鎖遺伝子の転写および翻訳を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニレーションシグナル）を含む意味である。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、のような因子に依存し得る。哺乳類宿主細胞発現にとって好ましい制御配列には、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を誘導するウィルスエレメント、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、Simian Virus 40（ＳＶ４０）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマウィルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、が含まれる。
【００６０】
本発明の組換え発現ベクターは、抗体重および／または軽鎖遺伝子および制御配列に加えて、更なる配列、例えば宿主細胞において該ベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および１つまたはそれ以上の選択可能マーカー遺伝子、を保有してもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする。例えば、選択可能マーカー遺伝子は典型的には、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートのような薬物に対する耐性を、そのベクターが導入されている宿主細胞に与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増殖と共にＤＨＦＲマイナス宿主細胞において使用）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、およびグルタミン合成酵素（ＧＳ）陰性細胞株（例えばＮＳ０）における選択／増殖のためのＧＳが含まれる。
【００６１】
軽および／または重鎖の発現のため、重および／または軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的技術、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどによって、宿主細胞にトランスフェクトする。本発明の抗体は、理論的には原核生物あるいは真核生物宿主細胞のいずれにおいても発現させることが可能だが、好ましくは真核生物細胞、最も好ましくは哺乳類宿主細胞であり、なぜならそのような細胞は正しく折りたたまれかつ免疫学的に活性がある抗体を組み立て、そして分泌するようだからである。本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞)（Urlaub and Chasin, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20 (1980)に記載されるＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159: 601-21 (1982)に記載されるようなＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用）を含む)、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２／０細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、該抗体は、該宿主細胞における該抗体の発現、より好ましくは、該宿主細胞が育てられる培養培地中への該抗体の分泌、に十分な期間、該宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的精製方法を用いて該宿主細胞および／または該培養培地から回収することができる。
【００６２】
宿主細胞はまた、インタクト抗体の一部分またはフラグメント、例えばＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子を産生するのに使用することができる。上記手法のバリエーションが本発明の範囲内であることは理解されるであろう。例えば、宿主細胞に本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれか（しかし両方ではない）をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることが望ましい場合がある。組換えＤＮＡ技術はまた、ｈＦａｓリガンドに対する結合に不要な軽および重鎖のいずれか、または両方をコードする、一部または全てのＤＮＡを除去するために用いることができる。そのような切断ＤＮＡ分子から発現する分子もまた、本発明の抗体に包含される。
【００６３】
本発明の抗体の組換え発現のための好ましいシステムにおいては、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム仲介トランスフェクションによってＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞に導入する。該組換え発現ベクター内において、該抗体重および軽鎖遺伝子は、その遺伝子の高レベルの転写を誘導するため、各々エンハンサー／プロモーター制御エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウィルス等由来、例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御エレメントあるいはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御エレメント）に作動可能に連結される。該組換え発現ベクターはまた、メトトレキサート選択／増殖を用いてベクターをトランスフェクトされた細胞（例えばＣＨＯ細胞）を選択することを可能にする、ＤＨＦＲ遺伝子を保有する。選択された形質転換体である宿主細胞を培養し、抗体重および軽鎖を発現させ、そしてインタクト抗体を該培養培地から回収する。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、該宿主細胞を培養し、そして該抗体を培養培地から回収するには、標準的分子生物学技術を使用する。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ヒトイムノグロブリン遺伝子ついてのトランスジェニック動物（例えばマウス）において発現させることができる（例えば、Taylor, et al., Nucleic Acids Res. 20: 6287-95 (1992)参照）。植物も改変し、本発明の抗体またはその抗原結合部分を発現するトランスジェニック植物を創出することもできる。
【００６４】
前述の観点から、本発明の別の態様は、本発明の抗体および抗体部分の組換え発現に用いることができる核酸、ベクターおよび宿主細胞組成物に関する。好ましくは、本発明は、１つまたはそれ以上の３Ｅ１または４Ｇ１１のＣＤＲをコードする領域を含む単離された核酸を提供し、より一層好ましくはそれらＣＤＲは、発現タンパク質（例えば抗体またはその抗原結合部分）において、それらが３Ｅ１または４Ｇ１１抗体に存在する場合と同じ該抗体構造内のＣＤＲ部位に存在する。好ましくは、本発明は、３Ｅ１または４Ｇ１１の重鎖可変領域および／または３Ｅ１または４Ｇ１１の軽鎖可変領域をコードする領域を含む、単離された核酸を提供する。即ち、ある態様において、本発明は、３Ｅ１の抗体重鎖可変領域である配列番号：１６に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ３および／または配列番号：１４に示す配列を有する重鎖ＣＤＲ２および／または配列番号：１２に示す配列を有する３Ｅ１重鎖ＣＤＲ1を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。より好ましくは、単離された核酸は、配列番号：１０に示す配列を有する抗体重鎖可変領域（３Ｅ１の完全ＨＣＶＲ領域）を含むポリペプチドをコードする。
【００６５】
別の態様において、本発明は、配列番号：２４に示す配列を有する４Ｇ１１重鎖の重鎖可変領域であるＣＤＲ３および／または配列番号：２２に示す配列を有する４Ｇ１１重鎖ＣＤＲ２および／または配列番号：２０に示す配列を有する４Ｇ１１重鎖ＣＤＲ1を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。より一層好ましくは、単離された核酸は、配列番号：１８に示す配列を含む抗体重鎖可変領域（４Ｇ１１の完全ＨＣＶＲ領域）を含むポリペプチドをコードする。
【００６６】
本発明の抗体に存在する重鎖および／または軽鎖は、本発明のＣＤＲのさまざまな組み合わせ、例えば、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２；ＣＤＲ１およびＣＤＲ３；ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、を含んでよいと考えられる。（配列番号：４、１２または２０に示す配列を有するＣＤＲ１；配列番号：６、１４または２２に示す配列を有するＣＤＲ２；配列番号：８、１６または２４に示す配列を有するＣＤＲ３）。好ましくはＣＤＲ配列は、本発明の抗体に存在する場合、本発明の抗体において、それらが３Ｅ１または４Ｇ１１抗体に存在する場合と同じＣＤＲ位置に存在する。該ＣＤＲは、本発明の他の抗体において、それらが３Ｅ１または４Ｇ１１抗体において存在するのとは異なる鎖に存在してもよいを考えられる。しかしながら、最も好ましくは、該ＣＤＲ配列は、本発明の抗体に存在する場合、それらが３Ｅ１または４Ｇ１１抗体において存在する場合と同じＣＤＲ位置かつ同じ鎖（軽鎖または重鎖）に存在する。
【００６７】
更に別の態様において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域（即ち３Ｅ１または４Ｇ１１のＬＣＶＲ)をコードする、単離された核酸を提供する。好ましくは本核酸は配列番号：１のヌクレオチド配列を含むが、当業者は、遺伝コードの縮重のため、他のヌクレオチド配列が配列番号：２のアミノ酸配列をコードすることができることを理解しているであろう。該核酸は、該ＬＣＶＲのみをコードすることも、あるいは該ＬＣＶＲに作動可能に連結した抗体軽鎖定常領域をコードすることもできる。ある態様において、本核酸は、組換え発現ベクターに存在する。
【００６８】
更に別の態様において、本発明は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域（即ち３Ｅ１のＨＣＶＲ)をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸は、配列番号：９のヌクレオチド配列を含む場合があるが、当業者は、遺伝コードの縮重のため、他のヌクレオチド配列が配列番号：１０のアミノ酸配列をコードすることができることを理解しているであろう。該核酸は該ＨＣＶＲのみをコードすることも、あるいは、例えば、該ＨＣＶＲに作動可能に連結された重鎖定常領域をコードすることもできる。例えば、該核酸は、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１定常領域を含むことができる。ある態様において、本核酸は組換え発現ベクターに存在する。
【００６９】
更に別の態様において、本発明は、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域（即ち４Ｇ１１のＨＣＶＲ)をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸は、配列番号：１７のヌクレオチド配列を含む場合があるが、当業者は、遺伝コードの縮重のため、他のヌクレオチド配列が配列番号：１８のアミノ酸配列をコードすることができることを理解しているであろう。本核酸は、該ＨＣＶＲのみをコードすることも、あるいは該ＨＣＶＲに作動可能に連結した重鎖定常領域をコードすることもできる。別の態様において、本核酸は、組換え発現ベクターに存在する。
【００７０】
本発明はまた、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを提供する。例えば、ある態様において、本発明は、以下のものをコードする組換え発現ベクターを提供する:
ａ）配列番号：１０および１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体重鎖；および
ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体軽鎖。
【００７１】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞を提供する。好ましくは、該宿主細胞は哺乳類宿主細胞であり、より好ましくは該宿主細胞はＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞またはＣＯＳ細胞である。また更に本発明は、適した培養培地において本発明の組換えヒト抗体が合成されるまで本発明の宿主細胞を培養することによって本発明の組換えヒト抗体を合成する方法を提供する。該方法は更に、該培養培地、該宿主細胞またはその両方から該組換えヒト抗体を単離することを含むことができる。
【００７２】
本発明の完全抗体、それらのダイマー、個々の軽および重鎖、または他のイムノグロブリン型は、発現させた後、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換、親和性、逆相疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当業界の標準的手法に従い精製することができる。医薬用途としては、少なくとも約９０から９５％の均一性である実質的に純粋なイムノグロブリンが好ましく、約９８から９９%またはそれ以上の均一性が最も好ましい。部分的に、あるいは所望の均一性まで精製した後、本明細書に示すように、該ポリペプチドを治療または予防に使用することができる。
【００７３】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、被験者に対する投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分および製薬的に許容される希釈体、担体、および／または賦形剤を含有する。投与用の医薬組成物は、選択した投与様式に適するように設計され、製薬的に許容される希釈体、担体および／または賦形剤、例えば分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定剤等が適宜使用される。
【００７４】
本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体を含有する医薬組成物は、Ｆａｓ-ＦａｓＬ相互作用関連する病態の危険性がある、あるいはその病態を示す哺乳類に、標準的投与技術を用いて静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔内、舌下あるいは坐剤投与により投与することができる。
【００７５】
本発明の抗体は、非経口投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。静脈内または腹腔内または皮下注射による末梢性全身送達が好ましい。そのような注射に適した器具は明快であり、当業界にて既知である。
【００７６】
医薬組成物は、典型的には無菌であり、製造および保存条件下で安定でなければならない。それ故、医薬組成物をその製剤の製造後にろ過滅菌してもよく、あるいは別の方法で微生物学的に許容されるようにしてもよい。静脈内注入のための典型的組成物は、液体、例えば無菌リンガー溶液の容量が２５０ｍＬ程度、および抗体濃度が１からｌ００ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上であろう。本発明の治療薬は、全て保存のため凍結または凍結乾燥して、使用前に適した無菌担体において再構成することができる。凍結乾燥および再構成は抗体活性喪失の程度を変化させる場合がある（例えば、常套的イムノグロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より活性喪失が大きい傾向がある）。それを補うように投与量を調節しなければならない場合がある。通常、ｐＨ６から８の間のｐＨが好ましい。
【００７７】
ＦａｓＬは、免疫および炎症性因子が関与する様々な疾患に関連する病態において重要な役割を果たす。それ故、本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体を含有する医薬組成物は、自己免疫あるいは炎症性疾患を処置または予防するために使用することができ、それには、全身性炎症反応症候群、敗血症、多臓器機能障害、急性呼吸窮迫症候群、重症敗血症、外傷、移植片対宿主病 、臓器移植に伴う臓器拒絶、多発性硬化症、特発性肺線維症、変形性関節症、炎症性大腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性心筋梗塞、心筋症、心臓再潅流傷害、糖尿病、癌（例えば、免疫応答から逃れる機能としてＦａｓＬを発現する癌、および乳癌、メラノーマ、卵巣癌、結腸癌、ＮＳＣＬＣ、リンパ腫および肝細胞癌のような癌タイプを含む)、ヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウィルス、および劇症ウィルス性Ｂ型またはＣ型肝炎を含む肝障害（これらに限定されない）、慢性Ｃ型肝炎ウィルス、慢性Ｂ型肝炎ウィルス、アルコール性肝炎、および肝硬変、および急性腎疾患、慢性腎疾患、糖尿病性腎症を含む腎障害（これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
ＦａｓＬ活性が有害である前述の疾患の少なくとも１つを処置するための本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体の使用もまた、本明細書において考慮される。更に、ＦａｓＬ活性が有害である前述の疾患の少なくとも１つを処置するための医薬の製造において使用するための、本発明の抗ｈＦａｓＬヒト抗体の抗体の使用が考えられる。
【００７９】
本明細書で用いる、「処置」、「処置する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。該効果は、完全または部分的に疾患またはその症状を予防する点からみて予防的な場合があり、かつ／または、疾患および／または該疾患に起因する悪影響を部分的または完全に治癒する点からみて治療的な場合がある。本明細書で用いる「処置」とは、哺乳類、特にヒト、における疾患の処置を対象としており、以下のものが含まれる：（ａ）該疾患にかかりやすい可能性があるがまだかかっているとは診断されていない被験者において該疾患が発症するのを予防する；（ｂ）該疾患を阻害する、即ちその進行を止める；および（ｃ）該疾患を緩和する、即ち該疾患の後退を引き起こす。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、好ましくは「治療上有効量」または「予防上有効量」の本発明の抗体である。「治療上有効量」とは、必要な用法および期間において、所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。抗体の治療上有効量は、個人の病状、年齢、性別および体重のような因子、および個人において抗体または抗体部分が所望の応答を引き出す能力に従い変化し得る。治療上有効量はまた、抗体またはその抗原結合部分の有毒または有害な効果より、治療上有益な効果が上回るものである。「予防上有効量」とは、必要な用法および期間において、所望の予防結果を達成するのに有効な量を意味する。典型的には、予防的投与量は疾患の初期段階より前または初期段階の被験者に使用されるので、予防上有効量は治療上有効量より少ないであろう。
【００８１】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的あるいは予防的応答）を与えるように調節し得る。例えば、１回ボーラスで投与してもよく、時間をかけて何回かに分けて投与してもよく、あるいは、治療状況の要求に従い、その投与量を比例的に減少させるか増加させてもよい。
【００８２】
ｈＦａｓＬに結合する能力を考慮すると、本発明の抗体は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学のような常套的免疫測定法を用いて、（例えば、血清または血漿のような生物試料において）ＦａｓＬポリペプチドを検出するために使用することができる。本発明は、ＦａｓＬを生物試料において検出する方法であって、生物試料を本発明の抗体または抗体部分と接触させ、そしてｈＦａｓＬに結合した抗体（または抗体部分）あるいは非結合抗体（または抗体部分）のいずれかを検出し、それにより該生物試料においてｈＦａｓＬを検出することを含む方法を提供する。結合または非結合抗体の検出を促進するため、該抗体を直接または間接的に検出可能な物質で標識する。適した検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。適した酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ 、アルカリフォスファターゼ、ベータガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる；適した補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる；適した蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレセイン（dichlorotriazinylamine fluorescein）、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが含まれる；発光物質の例にはルミノールが含まれる；および放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
【００８３】
検出可能な物質で標識したＦａｓＬスタンダードおよび非標識抗ｈＦａｓＬヒト抗体を利用して、競合的免疫測定法により、生体液においてＦａｓＬを測定することができる。本測定法においては、該生物試料、標識ＦａｓＬスタンダードおよび抗ｈＦａｓＬヒト抗体を一緒にして、非標識抗体に結合した標識ＦａｓＬスタンダードの量を測定する。試料中のＦａｓＬの量は、抗ｈＦａｓＬヒト抗体に結合した標識ＦａｓＬスタンダードの量に逆比例する。
【００８４】
本発明の抗ｈＦａｓＬ抗体は、ＦａｓＬ発現の診断検査に使用してもよい。競合的結合実験、直接的または間接的ＥＬＩＳＡサンドイッチ測定法および不均一または均一相において行う免疫沈降法のような、当業界にて知られる様々な診断検査技術が使用可能である。例えば、 Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158を参照のこと。本アッセイに用いる抗体は、検出可能成分で標識することができる。検出可能成分は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを産生することができるべきである。例えば、検出可能成分は、ラジオアイソトープ、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、またはｌ２５Ｉ、蛍光または化学発光化合物（例えばフルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリン)、または酵素 (例えば、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼ）であってよい。抗体を検出可能成分に結合するための当業界にて既知の方法は、いずれも使用することができる。
【実施例】
【００８５】
実施例１：可溶性ｈＦａｓＬを用いるＪｕｒｋａｔアッセイにより測定した機能的活性
ＦａｓＬ／エンハンサー（enhancer）培地は４Ｘ濃度にて調製する。1Ｘ培地は、Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイ培地（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（３：１）、１０％ＦＢＳ，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン）中に、５０ｎｇ／ｍｌ組換えヒト可溶性ＦａｓＬ(Alexis（登録商標）Biochemicals、カタログ＃５２２−００１)および１μｇ／ｍｌ抗ＦＬＡＧ  Ｍ２マウスモノクローナル抗体(エンハンサー；Sigma Chemical Co.、カタログ＃Ｆ−３１６５)を含有する。１Ｘ培地は「１００％アポトーシス」の対照として使用する。ＦａｓＬまたはエンハンサーを含まないＪｕｒｋａｔ細胞培地を「０％アポトーシス」の対照として使用する。
【００８６】
培地を１時間室温でインキュベートする。各測定につき、４Ｘエンハンスド（enhanced）Ｆａｓリガンド培地または対照試料のいずれかを、９６ウェルプレートの各ウェルに２５μｌ添加する。次に、阻害物質試料（３Ｅ１または４Ｇ１１抗ｈＦａｓＬ抗体)または対照試料のいずれかを各ウェルに２５μｌ添加する。この添加により、すべての試料および培地がもとの濃度の半分に希釈される。試料を室温で４５−６０分インキュベートする。次に、１０６細胞／ｍｌの濃度のＪｕｒｋａｔ細胞５０μｌを各ウェルに添加する。この添加により１ＸエンハンスドＦａｓＬ、初めの１／４の濃度の試料、および５ｘ１０４Ｊｕｒｋａｔ細胞／ウェルが生じる。該プレートを３７℃、５％ＣＯ２において３時間インキュベートする。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬(Roche、カタログ＃１  ６４４  ８０７)を１０μｌ／ウェルの濃度で添加する。該プレートを再び３７℃、５％ＣＯ２において約１８時間インキュベートする。その後、プレートを分光光度プレートリーダーにおいて４５０ｎｍの最適波長で読む。結果は、両抗ｈＦａｓＬヒト抗体、３Ｅ１および４Ｇ１１が、本アッセイにおいて可溶性ＦａｓＬ仲介アポトーシスを中和するのに有効であることを示す。
【００８７】
実施例２：膜結合ＦａｓＬを用いるＣＨＯ−Ｋ１／Ｊｕｒｋａｔアッセイ
３Ｅ１および４Ｇ１１抗体が膜関連ＦａｓＬの活性を遮断する能力についてアッセイするため、非切断型ｈＦａｓＬを安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（Ｄｅｌ．ｈｕＦａｓＬ  ＣＨＯ−Ｋ１と呼ばれる）を加工する。この細胞株は、Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養した場合にＪｕｒｋａｔアポトーシスを誘導するＦａｓＬを表面レベルで発現する。
【００８８】
接着性ＣＨＯ−１細胞培地を、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（３：１）、５％ＦＢＳ、４０μｇ／ｍｌＬ−プロリン（Sigma）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Sigma）および６００μｇ／ｍｌＧ４１８を用いて調製する。各測定につき、約１０４のＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ｄｅｌ．ｈｕＦａｓＬまたは親ＣＨＯ−Ｋ１のいずれか）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２において一晩インキュベートする。培地を除去し、阻害物質試料（３Ｅ１または４Ｇ１１抗体；一定の濃度範囲にわたる段階的希釈）または対照（培地）のいずれかを１００μｌ各ウェルに添加する。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２において１時間インキュベートする。Ｊｕｒｋａｔ細胞（２．５ｘ１０５細胞／ウェル)５０μｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２において２時間インキュベートする。ＷＳＴ−１細胞増殖試薬１０μ１を各ウェルに添加する。プレートを再び３７℃、５％ＣＯ２において４時間インキュベートする。その後、該プレートを分光光度プレートリーダーにおいて４５０ｎｍの最適波長で読む。結果は、両抗体、３Ｅ１および４Ｇ１１が、本アッセイにおいて膜結合ＦａｓＬ仲介アポトーシスを遮断するのに有効であることを示す。
【００８９】
実施例３：モノクローナル抗体の親和性測定
様々な抗ｈＦａｓＬ抗体の、組換えヒト可溶性（ｒｈｓ）ＦａｓＬ(Alexis（登録商標）Biochemicals、カタログ＃５２２−００１）に対する親和性を、BIAcore（登録商標）2000装置を用いて測定する。BIAcore（登録商標）は、表面プラズモン共鳴の光学的性質を利用して、デキストラン・バイオセンサー・マトリックス内において相互作用しているタンパク質濃度の変化を検出する。特記する場合を除き、試薬および材料は全て、BIAcore（登録商標）AB (Upsala, Sweden)から購入する。測定は全て室温で行う。試料はＨＢＳ−ＥＰ緩衝液(１５０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４)に溶解する。ヤギ抗ヒトＦｃ抗体を、アミンカップリングキットを用いて、Ｂ１センサーチップのフローセル１および２上に５００レスポンス・ユニット（ＲＵ）のレベルにて固定する。
【００９０】
複数の解析サイクルによりｒｈｓＦａｓＬの結合を評価する。各サイクルは、流速５０μｌ／分で行い、以下の段階より構成される：１μｇ／ｍｌの抗ｈＦａｓＬ３Ｅ１抗体１０μｌの注入、ｒｈｓＦａｓＬ２４０μｌの注入（１００ｎＭからはじめて、各サイクルにつき段階的に２倍希釈する）、それに続く２０分の解離、および１０ｍＭ  グリシン・ハイドロクロライド、ｐＨ１．５、５０μｌを使用する再生。各サイクルの会合および解離速度は、BIA評価ソフトウェアの「大量輸送を用いるLangmuir 1:1 （Langmuir 1:1 with mass transport）」結合モデルを用いて評価する。
【００９１】
実施例４：組換え可溶性Ｆａｓリガンドを用いるＨｅｐＧ２アポトーシスアッセイ
３Ｅ１および４Ｇ１１抗体による組換え可溶性ＦａｓＬの中和を評価するため、ＨｅｐＧ２(肝細胞癌；ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６５）細胞株を使用する。細胞培地は、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（３：１）、１０％ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを用いて調製する。各測定につき、ＨｅｐＧ２細胞を培地２００μｌ中１ｘ１０４細胞／ウェルの濃度にて９６ウェル・ポリ−Ｄ−リジン・コート・プレートにまく。細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベートする。培地を除去し、６０μｇ／ｍｌの硫酸ブレオマイシン（Sigma Chemical、カタログ＃Ｂ８４１６）を含有する培地１００μｌと置き換える。プレートを湿度チャンバーを用いて一晩インキュベートする。
【００９２】
ヒトＦａｓＬ−ＦＬＡＧのストック溶液をアッセイ培地を用いて調製する（最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌ  ＦａｓＬおよび１μｇ／ｍｌ  抗ＦＬＡＧエンハンサー（エンハンスドＦａｓＬ形成のため））。該ストック溶液の一部に抗ＦａｓＬ抗体を添加し、阻害物質を有するエンハンスドＦａｓＬ培地を調製する。各溶液を室温で１時間インキュベートする。１００％アポトーシス対照試料として、エンハンスドＦａｓＬ溶液５０μｌ／ウェルを、既にウェル中に存在するブレオマイシン含有培地に添加する。阻害物質試料として、エンハンスドＦａｓＬ＋抗体溶液１００μｌ／ウェルを、既にウェル中に存在するブレオマイシン含有培地に添加する。その後、該プレートを３７℃、５％ＣＯ２において一晩培養する。
【００９３】
ＷＳＴ−１細胞増殖試薬と培地を１：１にて希釈する。２０μｌの希釈済ＷＳＴ−１を各ウェルに添加する。該プレートを再び３７℃、５％ＣＯ２において一晩培養する。その後、該プレートを分光光度プレートリーダーにおいて４５０ｎｍの最適波長で読む。結果は、抗体濃度が減少すると、アポトーシスが増加することを示す。
【００９４】
実施例５：重および軽鎖抗原結合領域のクローニングおよびシークエンス
以下のプロトコールを用いて、中和ヒトｍＡｂ３Ｅ１の重および軽鎖の可変領域をクローニングし、シークエンスした。
【００９５】
２ｘ１０６のハイブリドーマ細胞より、Micro-Fast Track プロトコール（Invitrogen、該キットと共に配布）を用いてｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡのアリコットを１４，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心し、その後ペレットを７０％エタノールで洗浄することにより、ｍＲＮＡのエタノール沈殿２００μｌから cDNA Cycle キット(Invitrogen)を用いてｃＤＮＡを調製する。風乾ペレットを１１．５μｌの滅菌水に再懸濁し、該キットの説明に従いｃＤＮＡを調製する。エタノールを用いてｃＤＮＡを沈殿させ、そして３０μｌの水に再懸濁してＰＣＲに使用する。
【００９６】
ＰＣＲ反応は、重および軽鎖の可変領域の５’末端における縮重プライマーを、その定常領域内の３’プライマーとペアにして設計する。５０μｌの各反応について、ｃＤＮＡを１μｌを使用する。該反応はＰｆｕＩを使用するように設計し、２０サイクル続く。 ＰＣＲ産物は、各反応につき５μｌを２％アガロースゲルに泳動してチェックする。陽性反応を、Zero Blunt TOPO PCR クローニングキット（Invitrogen）を用いてクローニングする。陽性クローン由来のミニプレップをシークエンスし、生産的（productive）遺伝子再構成について解析する。独立したＰＣＲ反応および複数のクローンのシークエンスから得られた結果より、本発明の配列が明らかになった。
【００９７】
実施例６：初代ラット肝細胞アッセイ
アポトーシスは、有害な肝障害、劇症肝不全、肝細胞癌、免疫性肝疾患およびウィルス性肝炎に関与している(Kanzler and Galle, Sefrrinars Cafzcer Biol. 10 (3): 173-84 (2000) )。以前の研究により、初代ヒト肝細胞はＦａｓＬによって誘導されるアポトーシスの影響を受けやすいことが示された。より簡単に得られる初代ラット肝細胞により、これら細胞が同じくｈＦａｓＬによって誘導されるアポトーシスの影響を受けやすいことが示された。Ｆａｓ-ＦａｓＬ相互作用によって誘導される細胞内シグナル伝達を表しているラット肝細胞死およびカスパーゼ活性化が抗ｈＦａｓＬヒトモノクローナル抗体、３Ｅおよび４Ｇ１１によって阻害されることを示すため、本アッセイシステムを用いる。
【００９８】
１２ウェルプレート中のマトリゲルにおけるラット初代肝細胞、７Ｘ１０５細胞／ウェルを購入する(In Vitro Technologies、カタログ＃Ｍ００７１７ＭＧ）。細胞を以下の条件にて４または２４時間インキュベートする：（１）非刺激、（２）ヒトＦａｓＬ刺激、（３）ｈＦａｓＬ刺激＋ＦａｓＬ阻害（３Ｅ１および４Ｇ１１抗体を使用）、または（４）ｈＦａｓＬ刺激＋カスパーゼ３阻害。これら細胞を２つのアッセイに従い解析する：（ａ）乳酸脱水素酵素解析、および（ｂ）カスパーゼ３／８解析（それぞれ実施例６ａおよび６ｂに例示）。細胞からの乳酸脱水素酵素放出は、何らかの方法による細胞死を示す。細胞からのカスパーゼ３および／または８の放出は、Ｆａｓ-ＦａｓＬ仲介アポトーシスを示す。
【００９９】
実施例６ａ：乳酸脱水素酵素解析
乳酸脱水素酵素ＬＤ−Ｌ２０試薬（Sigma Chemical、カタログ＃２２８−２０）は、乳酸脱水素酵素活性の定量的、速度論的測定に使用する、乳酸とＮＡＤの混合物である。乳酸脱水素酵素（ＬＤ）は、乳酸のピルビン酸への酸化を触媒し、同時にＮＡＤを還元する。ＮＡＤＨが形成されると、λ３４０ｎｍの吸収が増加する。λ３４０ｎｍの吸収増加率は、その試料におけるＬＤ活性と正比例する。
【０１００】
９６ウェルプレートにおいて、細胞培養培地中の試料１０μｌを、事前に加熱したＬＤ−Ｌ試薬２００μｌと混合する。該プレートを６０秒間のインキュベーション中３７℃プレートリーダーに置き、λ３４０ｎｍでの吸収を３つの時点：０、３０、６０秒において読む。はじめの吸収測定値（０秒の時点）を最後の吸収測定値（６０秒の時点）から差し引き、Δ吸収／分を得る。Δ吸収／分は、試薬供給元より提供される計算に従いＬＤ活性（Ｕ／Ｌ）に変換される。結果は、抗体が存在すると細胞からの乳酸脱水素酵素の放出が大幅に減少し、細胞死の減少が表されることを示す。
【０１０１】
実施例６ｂ：カスパーゼ３／８解析
アポトーシスプロセスの相異なる段階で活性化する特異的カスパーゼ（３、８、または９／６）の活性を検出するため、ApoAlert Caspase Fluorescent Assay Kit (Clontech、カタログ＃Ｋ２０２６−２)を使用する。基質に結合する７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）は、試料中の適切なカスパーゼによって蛋白分解性に切断され、λ５０５ｎｍにてＡＦＣ蛍光を放つ。
【０１０２】
９６ウェル黒色プレートにおいて、細胞溶解液５０μｌを反応緩衝液５０μｌおよびカスパーゼ−３またはカスパーゼ−８基質５０μｌと混合する。該混合物を３７℃で１時間インキュベートし、蛍光プレートリーダーにおいて励起λ４００ｎｍ／発光λ５０５ｎｍにて読む。アポトーシス試料からの発光を非誘導および阻害対照と比較することにより、プロテアーゼ活性の増加を測定することができる。結果は、ＦａｓＬ＋抗ｈＦａｓＬ抗体を含有する試料において、カスパーゼ３／８活性化が完全に阻害されることを示す。
【０１０３】
実施例７：天然ＦａｓＬが発現上昇したＪｕｒｋａｔ細胞を用いる機能的活性
Ｔ細胞受容体ＣＤ３複合体に対する固定化抗体を用いてＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を刺激すると、細胞活性化および天然ＦａｓＬの発現上昇が誘導される。その後、活性化誘導細胞死が起こり、それは細胞生存率または活性化カスパーゼ３活性を評価することによって直接測定することができる。抗ＦａｓＬ抗体（３Ｅ１を使用したが、４Ｇ１１または他の本発明の抗体も使用できると考えられる）が細胞死を遮断する能力を測定するため、本システムを使用した。
【０１０４】
組織培養用処理未処理（Non-tissue culture-treated）９６ウェル平底プレートを、抗ヒトＣＤ３抗体（５０μｌ／ウェル、１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ）を用いて４℃で一晩コートした。次にプレートをＰＢＳで洗浄し、非結合抗体を除去した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を単独で、もしくは様々な濃度（Ｊｕｒｋａｔアッセイ培地の最終容量１００μｌにおいて５μｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍｌ）の阻害物質（３Ｅ１抗体）または対照ＩｇＧ４と一緒に該ウェルに添加し（５０，０００細胞／ウェル）、そして２４時間３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。次に、ＷＳＴ−１試薬（例えば、Panveraより入手可能）を添加し（１０μｌ／ウェル）、プレートを更に２４時間インキュベートした。プレートは、分光光度プレートリーダーにおいて４５０ｎｍにて読んだ。ＷＳＴ−１は、生存細胞の数を測定するために用いられる。結果は、本アッセイで使用した抗ｈＦａｓＬ抗体が、本アッセイにおいて天然ＦａｓＬ仲介アポトーシスを中和するのに有効であることを示した。
【０１０５】
あるいは、２４ウェルプレート（非組織培養用（non-tissue culture））を、前述のように抗ＣＤ３抗体を用いてコートした。次に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（２００，０００細胞／ウェル）を単独で、あるいは阻害物質または対照抗体と一緒に添加し（最終容量４００μｌ）、３７℃、５％ＣＯ２において２４または４８時間インキュベートした。その後細胞を回収し、洗浄した。細胞を透過処理し（Cytoperm/Cytofix, Pharmingen、＃５５４７２２）、抗活性化カスパーゼ３−ＦＩＴＣ抗体 (Pharmingen ＃５５９３４１)で染色し、フローサイトメーターで細胞染色を評価した。結果は、該抗ｈＦａｓＬ抗体がカスパーゼ３活性化を阻害するのに有効であることを示した（カスパーゼ３活性は細胞アポトーシスをもたらす）。
【０１０６】
実施例８：抗ＦａｓＬ抗体がＨＩＶ感染ヒトＴ細胞のアポトーシスを阻害する
末梢血Ｔ細胞は、免疫応答が刺激されるまで通常休止状態にある。しかしながら、ＨＩＶ感染患者の末梢Ｔ細胞は、表面Ｆａｓの発現上昇およびＦａｓＬの誘導を含む、活性化された表現型を示す。この表面Ｆａｓ-ＦａｓＬ相互作用が、多くの末梢の非ＨＩＶ感染Ｔ細胞の喪失に、アポトーシスを介して関与すると考えられる。抗ＦａｓＬ 抗体がこの細胞死を遮断することが出来るかを調べるため、以下の実験を行った。
【０１０７】
ＨＩＶ感染患者の全血から、Ficoll-Hypaqueを用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製した。細胞を、単独の、またはＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）および組換えＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）を含む培地において、７００，０００細胞／ウェルにて２４ウェルプレートに添加し、更に該細胞を活性化した。該細胞を、抗ＦａｓＬ抗体と、または該抗体無しで、インキュベートした（最終容量５００μｌにおいて２μｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌ）。プレートを３７℃、５％ＣＯ２において２４時間または７２時間インキュベートした。次に細胞を回収し、洗浄し、抗ＣＤ４−ＰＥ抗体とインキュベートした。その後再び細胞を洗浄し、透過処理し、抗活性化カスパーゼ３−ＦＩＴＣ抗体で染色し、フローサイトメーターにて細胞染色を評価した。結果は、該抗ｈＦａｓＬ抗体が、ＣＤ４陽性およびＣＤ４陰性末梢血リンパ球の両方において、カスパーゼ３の活性を、つまりはアポトーシスを減少させるのに有効であることを示した。
【０１０８】
【表１】
2005520523.tif 000002
【表２】
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【表３】
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【０１０９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月18日(2004.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005520523000001.app
【国際調査報告】
2005520523.tif 000020
2005520523.tif 000021