(57)【要約】本発明は、それぞれが少なくとも一つのプローブから成る多数のスポットを含む１又は２以上のブロックに組織された生体素子上の信号を測定するための画像分析処理に関し、前記処理は、−デポジットが一定のピッチで形成され、前記スポットが周期的かつ規則的な信号の形態で現れ、−この周期的な特性が前記ブロックおよび前記スポットの位置を識別するために使用され、この周期性がｘおよびｙ方向における画像投影について探索され、−最初に周期的画像特性を用いて、前記スポットの位置を合わせるために画像のコントラストを増加させるのに分解フィルタが使用され、そしてまた、背景雑音及びスポット信号に起因するばらつきを最小化して各スポットを増幅するための非分解フィルタが使用される。
2005530167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれが少なくとも一つのプローブから構成される多数のスポットをそれぞれ具備した１又は２以上のブロックに組織化された生体素子上の信号を測定するための画像分析処理方法であって、前記処理方法は、
−デポジットが一定のピッチで形成され、前記スポットが周期的および規則的な信号の形態で現れるステップと、
−この周期的特性がブロックおよびスポットを位置決めるために使用され、この周期性がｘおよびｙにおける画像投影上で探索されるステップとを具備し、
さらに、
−分解フィルタが、第1に周期的画像特性を用いて前記スポットを位置決めするために前記画像コントラストを増加するのに使用され、且つ、非分解フィルタが背景雑音およびスポット信号によるばらつきを最小化するために使用されて各スポットを増幅するステップを具備することを特徴とする処理方法。
【請求項２】
生体素子の平面の前記ｘおよびｙ軸に直交する平均化された投影が前記周期的信号を増幅するために使用され、これにより、二つのヒストグラム
【数１】
2005530167.tif 000068
を得る請求項１記載の処理方法。
【請求項３】
その次ステップが、ｘおよびｙにおける前記画像の主な周波数を識別するためにディスクリート単一次元フーリエ変換（ＦＦＴＤ）を使用することであり、変換Ｐ（ω）の最大指数が値ω０を与え、これからｘおよびｙにおける繰り返し周期性λ０が推定される請求項２記載の処理方法。
【請求項４】
可変閾値が、ヒストグラム
【数２】
2005530167.tif 000069
に適用され、最適閾値が、数式
【数３】
2005530167.tif 000070
の最大値を与える値によって与えられ、そして前記周期性λの分布が、二つのヒストグラム
【数４】
2005530167.tif 000071
に沿って調べられ、サイズが２λ０のウィンドウが二つのヒストグラムに沿ってスライドし、そしてそこでは、これらヒストグラムのフーリエ変換の指数のばらつきが局所的に探索され、指数の欠落が存在する領域がブロック間の領域に対応し、そしてこの方法が前記画像の全体的なブレークダウンを提供する請求項３記載の処理方法。
【請求項５】
全体的なカットアウト行にセンタリングされた幅λ０で長さ２λ０のウィンドウが、各ブロックの境界の細かな画定を生じ、そして過大な強度および疑わしい信号が局所的に探索されることができ、そして前記信号の周りのブロックの限界が必要であれば再定義されてもよく、そして、このことが、前記限界の一方のサイドでλ０／２だけ前記ウィンドウを拡張し、それから他方のサイドについて拡張することにより達成され、そして前記信号が前記ウィンドウの前記二つの拡張のうちの一つについてのみ増加し、前記ブロックの前記限界がλ０だけ信号における増加がない隣接ブロックにシフトされ、そして前記信号に増加がなく又は前記信号が前記二つのシフトについて増加されれば、前記信号の何れかが、寄生信号であり、または前記二つのブロックが極めて接近しており、
両方のケースにおいて、前記信号が前記カットラインの右または左に属する確率が計算され、
且つ、Ｐ（ω）が、疑わしい信号を用いて又は用いずに各半投影について得られ、そして利得が
【数５】
2005530167.tif 000072
に等しく、前記利得が前記二つの半投影の一つについて１よりも大きさえすれば、考慮されている前記信号が、前記カットラインをλ０／２だけ前記隣接ブロックにシフトすることにより、それに割当てられ；前記二つのブロックの何れについても前記利得が１よりも大きくなければ、それは寄生信号であり、前記カットラインはシフトされず；前記利得が両方の半投影について１よりも大きければ、前記信号は、前記二つの半投影と同相であり、従って、前記ブロックが極めて接近し且つ同相であり、そして前記カットラインをλ０／２だけ前記隣接ブロックにシフトすることにより、前記利得が最も高いブロックに前記信号が割当てられる請求項４記載の処理方法。
【請求項６】
図示されないスポットは、
−  ヒストグラム
【数６】
2005530167.tif 000073
がブロックの行および列についてそれぞれ生成され、
−  ＦＦＴＤ変換が各ブロックにおいて前記二つのヒストグラムに適用され、
Ｐ（ω）の最大値が前記スポット繰り返しの周期性λ０を与え、
且つ、
−  ω０＝２π／λ０
−  Ａ：  前記投影の平均振幅
−  φ：  決定されるべき位相シフト
としたときに、最小二乗法が、
Ａｓｉｎ（ω０Ｘｉ＋φ）
なる数式のサイン曲線で投影を調整するために使用される請求項１記載の処理方法。
【請求項７】
デジタル復元アルゴリズムがこれらのヒストグラムに適用され、それは、初期の投影から開始し且つ殆ど同一の振幅を有する信号を再生成するために使用され、そして、閾値の使用は、前記生成されたヒストリーの二値化表現を発生すると共に前記存在するスポットの正確な位置を位置決めすることを可能にする請求項６記載の処理方法。
【請求項８】
前記二値化投影は、
【数７】
2005530167.tif 000074
のような正弦曲線関数を用いて畳み込みされ、且つ、前記畳み込み関数の最小値及び最大値を探索することが、全ての検出可能なスポットを囲むグリッドを自動的に再構築することを可能にする請求項７記載の処理方法。
【請求項９】
低励起かつ低検出の多数の画像が生成されると共に信号画像に蓄積される請求項１記載の処理方法。
【請求項１０】
高解像度の画像が生成され、且つ前記画像の解像度が、ｎ個の隣接画素をｎ個の画素の平均で置き換えることにより人為的に低減され、従って前記画像のサイズをｎの係数だけ提言し、そして同質性フィルタが、前記隣接画素に関して最も高い異質性を有する画素を除去するために適用される請求項１記載の処理方法。
【請求項１１】
各スポット内の画素が、存在する異なるタイプの画素：背景雑音、交配信号、寄生信号を識別するために分類される請求項１記載の処理方法。
【請求項１２】
修正されたＥＭアルゴリズムが適用され、ここで、前記二つまたは三つの主なクラスの内の一つに画素が属する計算された確率に対して閾値を適用することにより、何れのクラスにも属しない画素の概念が導入され、クラスが一層小さく形成される請求項１記載の処理方法。
【請求項１３】
・前記画素の不鮮明分布テーブルＣｉ（ｋ）を構築するステップから成る初期化ステップと、
・前記新たな不鮮明分布テーブルが計算される評価ステップと、
・混同パラメータθｍが再計算される最大化ステップと
を具備し、
これら少なくとも二つのステップは、log-確率クラス分けが収束するまで繰り返される請求項１２記載の処理方法。
【請求項１４】
混合パラメータを用いて、画素の実際の分布と前記計算された分布との間の前記計算された距離又は類似性に基づき新たな収束評価値が導入される請求項１３記載の処理方法。
【請求項１５】
−  前記画像について、重要な信号を極めてわずかだけ低減すると共に信号対雑音比を増加させることにより、背景雑音を低減させるための画像フィルタステップと、
−  前記背景雑音と前記交配信号との間の画像コントラストを増加させる分解フィルタステップと、
−  行および列におけるブロックの数に関する外部データから開始して前記生体素子の画像上の前記ブロックを位置決めするためのステップと、
−  ブロック内に交配が存在しないために信号が存在しないスポットの位置を含んで、各スポットの位置を自動的に決定するステップと、
−  前記スポットが自動的にセグメントに分解されて、前記反応を代表する画素を決定し、そして、平均、中間等によって前記スポット信号の評価値を計算するステップと
を具備する請求項１記載の処理方法。
【請求項１６】
前記周期的信号の局所的欠落の識別に基づく方法が、行による又は列による軸への前記スポット投影信号のフーリエ変換の指数のような、前記初期化ステップの間に使用される請求項１５記載の処理方法。
【請求項１７】
必要に応じて同一画像におけるスポットの位置合わせにより前記画像を調節するために、第１フィルタが前記フィルタステップの間に使用される請求項１５記載の処理方法。
【請求項１８】
特に前記スポットから発生する信号を増幅すると共に、他のタイプの信号のレベルを同じにするために、第２フィルタが、前記フィルタステップの間に使用される請求項１５記載の処理方法。
【請求項１９】
前記画像における前記各ブロックの位置が微調整される請求項１５記載の処理方法。
【請求項２０】
前記交配画素がＥＭ法を用いてセグメントに分解される請求項１５記載の処理方法。
【請求項２１】
使用される前記ＥＭ法における制約が緩和され、換言すると、仮定したクラスから遠く離れた画素が割当てられない請求項
２０記載の処理方法。
【請求項２２】
モルフォ数学的方法が、セグメントクラスを起こすために前記スポットのフレームに存在するオブジェクトを定義する請求項１５記載の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体素子(biochip)上の信号を測定するための画像分析処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体素子は、通常は顕微鏡用スライドの小さなソリッドサポート(solid support)から構成され、そのスライド上では、細胞遺伝子配列の特定のＤＮＡプローブが、明確に規定された位置において原位置(in situ)に移植または合成される。プローブは、約１０９個の同一分子を含む数平方マイクロメートルを占めるスポットに集められる。そして、スポットのセットは、文末にある参考文献[1]で述べられているような１０６スポット／ｃｍ２を上限とした複雑度の２次元マトリックスを構成する。
【０００３】
参考文献[2]で述べられているようなサポートに関するプローブアドレッシングタイプ(probe addressing type)が変化し、従って特有のジオメトリー(geometry)を課す：即ち、
−例えば、ＶＬＳＩＰＳ(Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis)として知られる光化学アドレッシングによる原位置追跡ヌクレオチド合成方法(in situ trace nucleotides synthesis method)：この方法は、多数の異なるプローブを極めて迅速に合成することができる。
−機械的または電気的アドレッシングによる以前に合成されたプローブの固化(fixation)。機械的なアドレッシングについては、プローブは、サンプリングされて微量ピペットまたはロボット制御ピンによりスライド上に置かれる。
【０００４】
サポートは、構築されてもよいし、構築されなくてもよい。例えば、生体素子は、知られているように、金電極を有するウェル(well)のマトリックスから構成されている。電気重合(electropolymerization)は、通常のピロール(pyrrole)と、プローブが共有固定されたピロールとの間の各電極上で形成される。
【０００５】
公知技術によるこれら全ての方法は、単一のステップにおいて、参考文献[3]で述べられているように、蛍光色素(fluorochrome)または他の分子によって予めマークされた何千ものＤＮＡ分子の混合(mix)を選別し定量化するために使用できる二次元マトリックスを結果としてもたらす。所定位置における交配率(hybridizing rate)は、送信信号の強度を発端として決定され、それは、マークされ研究された分子の混合に存在する分子の性質および量を同時に示す。多くのコンディション(condition)を同時に研究することも可能である。この場合、各コンディションは、異なる蛍光色素でマークされる必要があり、そしてそれらは、生体素子上に交配(hybridize)される前に混合(mix)される必要がある。従って、スライド読み取りステップ(slide reading step)の間、各蛍光色素について一つの画像が存在する。
【０００６】
例えば、生体素子を作る一つのステップにおいて、プローブは、多数のピンを有するプリントヘッドまたはリングを備えたロボットによりデポジット(deposit)される。多数のリング、例えば４リングを有するこのタイプのロボットは、少量のサンプルを取るために使用され、デポジット自体は、スライドの表面と接触する前にリングを通り抜ける小さなドット(dot)から構成される。多数のくぼみ又は堅いピンを有するロボットシステム、例えば４８は、サンプルを取って、それらをサポートの表面上にデポジットするために使用される。
【０００７】
デポジットのジオメトリーは、ロボットヘッドのジオメトリー、プローブを保存するために使用されるプレートのタイプ、ピンのサイズ、各スポット間のピッチ等に依存する。一般に、多数の相異なるブロックにグループ化されたスポットのセットが得られ、各ブロックはピンに対応する。
【０００８】
図１は、４つのピンを有するヘッド又はプローブ１０および生体素子１１のプレートを有するリングで構成されるデポジットを示す。スライドがスキャナーによって読み取られた後、蛍光発光の強度（または、混合が初期に共交配(co-hybridize)された場合には複数の強度）が各スポットで定量化される。
【０００９】
そして、画像取得は、異なる蛍光発光信号の強度を測定するために、励起(excitation)後に生体素子のデジタル画像を作成するステップから成る。生体素子は、使用される蛍光色素（単数または複数）の吸収波長(absorption wavelengths)に応じた励起レーザーを備えたスキャナーによって読み取られる。蛍光発光強度は、光電子増倍管によって測定される。得られた画像の品質および解像度は、使用されるスキャナーに依存する。共焦点(confocal)または非共焦点(non-confocal)のスキャナー、ＣＣＤカメラスキャナー等のような、異なるタイプの機器を使用することができる：
【００１０】
−共焦点スキャナーは、焦点面のまわりに小さなフィールド深度で小さなエリアｘ，ｙを励起することができる高品質システムのレンズを備える。この領域における蛍光性発光(fluorescent emission)は光電子増倍管上の点で再生され、この領域は、画像の約一つの画素に対応する。焦点面に含まれる信号のみが読み取られ、そしてこのスライスおよびこの領域の外側の全ては検出器に到達しない。埃のような寄生信号(parasite signal)は、レンズの焦点面になければ最小化される。そうでなければ、二つの隣接領域における信号間の混合(mix)は存在しない。従って、埃は良好に分離され、そしてその後の処理により排除することができる。他方、取得平面(acquisition plane)はとても薄いので、光電子増倍管の読み取り誤差を修正し、より雑音の少ない画像を得るためには、スライド上に多くの通路(passage)を作ることが必要である。
【００１１】
−非共焦点スキャナーは、このような正確な合焦を与えることはできない。読み取られた信号はレーザー領域から発生し、そしてとても厚いスライドを備える。電子増倍管上の的確な点で読み取られた強度は、特定の近傍(specific neighborhood)内の平均に相当する。従って、信号は強度を弱める。この結果、画像が非常になめらかになり、コントラストが低くなり、
−ＣＣＤカメラスキャナーは、画像を取得するための高精度のカメラを使用する。この画像品質は、取得時間に直接的に依存する。
【００１２】
この読み取りステップは極めて重要である。コントラストと背景雑音強度と解像度との間の適切な譲歩は、画像（スポットの位置、埃の位置、信号のセグメンテーション等）を分析することにおける困難性を克服し、かつ結果の信頼性を最適化するために不可欠である。スキャナーの精度および解像度は、ＤＮＡ生体素子の分析のための制御要素である。
【００１３】
フィルタ法は、このステップを最適化し、画像解像度を統計的に改善するために使用することができる。
【００１４】
デジタル画像、例えば１６ビットＴｉｆｆ(Tag-based Image File Format)形式の画像は、スキャナーからの出力で得られる。この形式は、格納されるフィルタのサイズと、情報品質、換言するとコード化できる強度レベルの数との間の適切な譲歩である。従って、それは、多くの異なるスキャナーから生じた画像を記録するために非常に頻繁に使用される。さらに、このタイプのＴｉｆｆ形式は、どのシステムにも固有ではなく、容易に操作でき、相補的な個人情報の追加を可能にする。
【００１５】
各画素の強度は、最低強度（０）から最高強度（６５５３５）まで、６５５３６グレイシェード(gray shade)の等級で個別化(discretize)される。画素は、画像上で最小の測定可能領域である。その強度は、生体素子上の対応解像度表面積(corresponding resolution surface area)で発せられた平均蛍光発光を表す。それは、このタイプの画像上で測定し得る最小の共交配単位(smallest hybridizing unit)である。強度は、スライドの対応領域に固定されたＤＮＡ分子の数に比例する。スポット上の分子密度は、必ずしも同質(homogeneous)である必要はない。異なる強度を有する可変数の画素から構成されるスポットは、極めて異質(heterogeneous)な信号を有し得る。図２に示されるように、画像は、相対アドレスが完全に識別された多数のスポットの形態である。
【００１６】
本発明によって解決されるべき課題は、
−各プローブを検出すると共にその交配レベル(hybridizing level)を定量化するために、交配領域(hybridizing area)を正確に位置決めすることである。スポットの位置決めは、画像分析処理の自動化における制限ステップ(limiting step)の一つである。交配データの信頼性と再現性を保証するためには最高の精度を必要とする。従来技術には、スポット／信号を位置決めするための完全自動ソフトウェアは存在しない。
【００１７】
−交配のみによる蛍光発光強度を極めて精度よく定量化し、背景雑音、および埃または寄生信号に起因した信号を排除することである。
【００１８】
生体素子画像上のスポットを精度よく位置決めするための手順を自動化することにおける困難性は、３つの主な制約に起因している：
−拡散雑音(diffuse noize)および人工物(artefact)の存在：スライドの蛍光発光、交配されないプローブおよび埃は、画像上の異方性背景雑音、
−スポットの位置の変動
−スポットの不明確なジオメトリー
の主な原因となる。
【００１９】
各スポットは、異質(heterogeneous)の強度を有する可変数の画素から構成される。これは、第１には、使用されるロボットに依存する円形のスポットを多かれ少なかれ発生するプローブ位置法に起因し、第２には、プローブ上で交配されたＤＮＡの量に起因する。図３に示されるように、スポットは、リング(ring)又は円盤(disk)の形状であってもよく、あるいは、それらは、小さな異質(heterogeneous)なサブ領域のセットから構成されてもよい。
【００２０】
スポットのジオメトリーにおけるこの異質性(heterogeneity)と埃または人工物の存在は、スポットのサイズを考慮すると問題があり、従来の形態的な検出法が不十分であることの理由を説明している。従って、ナイロン膜上のラジオマークされたＤＮＡの位置決めのために使用される参考文献[4]に規定されているようなプロファイル検出(contour detection)に基づく方法、または、２Ｄページゲル(2D PAGE gels)上のプロテイックスポット(proteic spot)の位置決めのために開発された方法は、小さなスポット（ナイロン膜上のスポットよりも約１０倍小さい）に適用できない。これら３つの問題の存在、すなわち、極めて小さいスポットサイズ、それらの不明確な形態、および異方性背景雑音は、これらの方法を不適切なものにしている。
【００２１】
従来技術による蛍光発光信号抽出ソフトウェアは、通常、４つのステップに基づいている：
−ブロック画定ステップ(block delimitation step)、
−グリッド位置決めステップ、
−交配ゾーンに属する画素を決定するステップ、
−スポット蛍光発光強度評価値（平均、中間など）を計算するステップ。
【００２２】
全てのこのソフトウェアは、交配領域のジオメトリーについての正確なパラメータ設定を必要とする。
【００２３】
参考文献[5]で述べられているように、あるソフトウェアにおいては、交配領域の位置決めは、グリッドの半自動配置(semi-automatic placement)から始まる。各スポットブロックは、手動で画像上に位置決めされなければならない。各ブロックについて、次のステップは、グリッドを配置するために、２次元マトリックスの正確なパラメータ（行の数、列の数、スポット間のピッチ、スポットサイズ）を提供することであり、そのマトリックスはそれを埋め合わせるものである。これらのジオメトリックパラメータと保護された分析(protected analysis)との組み合わせにおいて、画像は、フレームにセグメント化され、その内部では、多かれ少なかれ円形の可変サイズのマスクが交配領域を画定する。このマスクは最大強度にセンタリングされる。
【００２４】
参照文献[6]は、少しばかり自動化されて信頼性のあるスポットを使用するソフトウェアについて述べている。しかしながら、プローブデポジションジオメトリーについての全ての情報を供給すること、換言すると、画像の各ブロックにおける行および列の数を供給することを必要とする。ブロックは、画像における最初のスポットの位置を供給した後に分離される。そして、プレグリッド(pre-grid)は、先に供給されたパラメータに応じて異なるスポットのまわりに自動的に配置される。各フレームは、個々に分析されて、交配領域のセンタリング(centering)を最適化する。スポットはもはや適切に識別されないので、各スポットのセンター(center)は、マス(mass)の中心についてと同じ方法で、それ自身のフレームのセンターによって近似的に決定される。例えば、画素強度Ｉ（ｘ，ｙ）を有する画像Ｉについて、ｘに沿った強度のセンターは、次の評価によって与えられる。
【００２５】
【数１】
2005530167.tif 000003
【００２６】
従来技術によるこれらソフトウェア問題の何れも、上述した４ステップについて完全自動解法を提案していない。画定ステップ(delimitation step)は特に不利にしている。デポジットのジオメトリーについての全ての知識が入力されなければならず、且つ、通常、ブロックは画像上に位置決めされなければならない。半自動グリッド位置決めステップは、低コントラストの画像の領域に関する信頼性の深刻な欠如をもたらす。しかしながら、定量化は、分析処理を遂行するためには的確かつ正確でなければならない。位置決めの欠陥は、避けられない誤差の源である。生体素子全体の入念のチェックが、スポット蛍光発光強度評価値を計算するためのステップの最後に必要である。多くの問題が低コントラストの領域で見られる。
【００２７】
これら初期化(initialization)、検証(verification)および補修(reworking)ステップの全ては、スポットを定量化することを開始する前に不可欠であり、かつ多くの時間をとる。実験室では、単一の実験は、何百もの生体素子の使用に基づいていてもよい。従って、オペレータとの最小限の相互通信を要し且つ検証ステップを最小化する高速で効率的なソフトウェアを開発することが不可欠である。
【００２８】
更に、スポット蛍光発光強度の測定は、使用されるソフトウェアによって負担され、使用されるデポジションタイプには必ずしも適さない。
【００２９】
従って、本発明の目的は、生体素子に関するプローブ反応速度(probe reaction rate)を測定するための画像分析処理を提案することにより上述の問題を解決することにある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、それぞれが少なくとも一つのプローブを有する多数のスポットをそれぞれ備えた１又は２以上のブロックに組織化された生体素子上の信号を測定するための画像分析処理に関し、
−デポジットが一定のピッチで形成され、前記スポットが周期的かつ規則的な信号の形態で現れ、
−この周期性特性が前記ブロックおよび前記スポットの位置を識別するために使用され、この周期性がｘおよびｙ方向における画像投影について探索される
処理であって、
−最初に周期的画像特性を用いて前記スポットの位置を決めるため、画像コントラストを増加させるのに分解フィルタ(degrading filters)が使用され、そしてまた、背景雑音及びスポット信号に起因するばらつきを最小化して各スポットを増幅するための非分解フィルタが使用されることを特徴とする。
【００３１】
有利には、周期的信号が増幅されて、二つのヒストグラム
【００３２】
【数２】
2005530167.tif 000004
【００３３】
が得られるように、生体素子の平面におけるｘおよびｙの二つの軸を用いて平均化正投影(averaged orthogonal projection)が使用される。そして、ｘおよびｙにおける画像の主要な周波数を識別するために、ディスクリート単一次元(discrete single dimensional)のフーリエ変換（ＦＦＴＤ）が使用され、変換Ｐ（ω）の最大の指数(power)が値ω０を与え、そこからｘおよびｙにおけるスポットの反復周期性λ０が推定される。可変閾値(variable threshold)が、二つのヒストグラム
【００３４】
【数３】
2005530167.tif 000005
【００３５】
に適用でき、最適な閾値(threshold)は、数式
【００３６】
【数４】
2005530167.tif 000006
【００３７】
の最大を与える値によって与えられ、そして、周期性λの分布が二つのヒストグラム
【００３８】
【数５】
2005530167.tif 000007
【００３９】
に沿って調べられ、２λ０のサイズのウィンドウが二つのヒストグラムに沿ってスライドする。これらヒストグラムのフーリエ変換の指数のばらつき(variation)は局所的に探索され、指数の損失が存在する領域はブロック間の領域に対応し、且つこの方法は画像の全体的なカットアウト(global cutout)を提供する。
【００４０】
全体的カットラインにセンタリングされた幅がλ０で長さが２λ０のウィンドウは、各ブロックの境界の細かな限界を生成するために使用され、そして過大な強度の存在、故に疑わしい信号は局所的に探索され、必要であれば信号のまわりのブロックの限界は再定義されてもよい。これは、最初に、限界の片側でλ０／２だけウィンドウを拡張し、次に他側で拡張することによりなされ、そしてもし信号がウィンドウの二つの拡張のうちの一つについてのみ増加すれば、ブロックの限界は、信号の増加が存在しない隣接ブロックにλ０だけシフトされ、もし、信号に増加が存在しないか又は二つのシフトについて信号が増加されれば、信号が寄生信号であるか、または、二つのブロックが極めて接近しているかのどちらかであり、そして両方のケースにおいて、信号がカットラインの左か右に属する確率が計算され、そして、Ｐ（ω）が、寄生信号と共に又は寄生信号なしで各半投影(half projection)について得られ、そして得られた利得(gain)は
【００４１】
【数６】
2005530167.tif 000008
【００４２】
に等しい。もし、利得が二つの半投影のうちの一つについてのみ１よりも大きければ、考えられる信号は、λ０／２だけカットラインを隣接ブロックにシフトすることにより、それに割当てられ；もし、利得が二つのブロックのうちの何れについても１よりも大きくなければ、それは寄生信号であり、そしてカットラインはシフトされず；もし、利得が両方の半投影について１よりも大きければ、信号は二つの半投影と同相(in phase)であり、従ってブロックは、極めて接近し且つ同相であり、そして、カットラインをλ０／２だけ隣接ブロックにシフトすることにより、信号は利得が最も高いブロックに割当てられる。
【００４３】
有利には、照射されないスポットは、次のように分離される：
−ヒストグラム
【００４４】
【数７】
2005530167.tif 000009
【００４５】
は、ブロックの行および列についてそれぞれ作成され、
−ＦＦＴＤ変換が、各ブロックにおける二つのヒストグラムに適用され、
Ｐ（ω）の最大値は、スポット繰り返しの周期性λ０を与え、
且つ、最小二乗法が、次の数式のサイン曲線で投影を調整するために使用される。
【００４６】
【数８】
2005530167.tif 000010
【００４７】
ここで、
− ω０＝２π／λ０
− Ａ：投影の平均振幅
− φ：決定されるべき位相シフト
【００４８】
次のステップは、これらのヒストグラムにデジタル復元アルゴリズム(digital reconstruction algorithm)を適用するためのステップであり、それは、初期投影から開始し、ほとんど同じ振幅を有する信号を再生成するために使用され、そして閾値の使用は、生成されたヒストグラムの二値表現を生み出し、且つ存在するスポットの正確な位置を決定することを可能にする。
【００４９】
二値投影は、畳み込み関数(convolution function)の最小および最大値を探索することにより、
【００５０】
【数９】
2005530167.tif 000011
【００５１】
のような、λ０の正弦曲線関数を用いて畳み込み(convolute)でき、そして全ての検出可能なスポットを包み込むグリッドを自動的に復元することが可能となる。
【００５２】
有利には、低励起(low excitation)かつ低検出の多くの画像は、生成されて単一画像に蓄積され得る。
【００５３】
有利には、高解像度画像が生成され、そして画像の解像度は、ｎ個の隣接画素をｎ個の画素の平均で置き換えることにより人為的に低減され、従ってｎなる係数によって画像のサイズを低減し、そして、同質フィルタ(homogeneity filter)が、隣接画素に関して最も大きい異質性(heterogeneity)を有する画素を排除するために適用される。
【００５４】
有利には、各スポット内の画素は、異なるタイプの存在する画素：背景雑音、交配信号、寄生信号を識別するために分類できる。
【００５５】
有利には、修正されたＥＭアルゴリズムが適用され、そのアルゴリズムでは、画素が二つ又は三つの主要なクラスのうちの一つに属する計算された確率に閾値を適用することにより、どのクラスにも属さない画素の概念が導入され、クラスがより小さく作られる。
【００５６】
次のステップが使用される：
・初期化ステップ。これは画素の不鮮明分布テーブルＣｉ（ｋ）を構築するステップから構成される。
・評価ステップ。このステップでは、新たな不鮮明分布テーブルが計算される。
・最大化ステップ。このステップでは、混合パラメータθｍが再計算される。
そして、これらの最後の二つのステップは、log−確率クラス分け(log-probability classification)が収束するまで繰り返される。
【００５７】
混合パラメータを用いて計算された分布と実際の画素の分布との間の計算された距離または類似性に基づき、新たな収束評価器が導入され得る。
【００５８】
有利な一実施形態において、本発明は、画像分析処理に関し、次のステップを備える：
−重要な信号を極めてわずかだけ低減させると共に信号対雑音比を増加させることにより、背景雑音を低減するための画像フィルタステップと、
−前記背景雑音と前記交配信号との間の画像コントラストを増加させる分解フィルタステップと、
−行および列におけるブロックの数に関する外部データを発端として生体素子の画像上のブロックを位置決めするが、或る場合にはこれら二つの項目のデータを省略するためのステップと、
−ブロック内に交配(hybridizing)が存在しないために信号のないスポットの位置を含んで、各スポットの位置を自動的に決定するためのステップと、
−スポットが自動的にセグメントに分解されて反応を代表する画素を決定し、且つ前記スポット信号の評価値が、平均(average)、中央(median)等によって計算されるステップ。
【００５９】
有利には、位置決めステップ中に、行又は列による軸上へのスポット投影信号のフーリエ変換の指数のような、前記周期的信号の局所的欠損の識別に基づく方法が使用される。
【００６０】
有利には、フィルタステップ中に、必要であれば、同一ブロックにおけるスポットの配列によって、第１フィルタが画像を修正するために使用される。また、このフィルタステップ中に、特に前記スポットから生じた信号を増幅すると共に他のタイプの信号を平らにする。
【００６１】
有利には、前記画像における各ブロックの位置は、微調整(refine)される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
本発明による処理は、それぞれが少なくとも一つのプローブから成る多数のスポットをそれぞれ備えた１又は２以上のブロックに組織化された生体素子を形成する固体基板(solid substrate)上に配列されたプローブの反応速度を測定するための画像分析処理である。
【００６３】
読み取りフェーズ(read phase)中に得られた画像は、一定のピッチに配置されて比較的良好に配列されたスポットの多数のブロックから構成される。
【００６４】
本発明による処理において、上述の画像分析における４つの主要なステップは、従来技術による装置に存在する困難性を考慮にいれ、即ち：
−スポットのブロックの画定(delimitation)、
−交配領域を決定するための各ブロックの周りのグリッドの位置、
−スポットに属する画素の画定、
−スポット蛍光発光強度の評価値の計算、
は、独立に処理され、それらを可能な限り自動化する。
【００６５】
使用されるロボットのヘッドの固定されたジオメトリーは、このヘッドに適合するピンの数に依存して４×４または４８×１２ブロックのような同質なｘ×ｙブロックとして近似され得るブロックの形成をもたらす。もしブロックが同質でなければ（ブロックがスポットの最後で欠落している）、処理は、同質ブロックについてと同じ方法で行われるであろう。空のスポットフレームは後で排除される。デポジション(deposition)は一定のピッチでなされるので、スポットは周期的かつ規則的な信号の形態で現れる。信号の周期性は、各スポットのブロック間で失われる。
【００６６】
本発明による処理は、この周期性を使用して、スポットおよびブロックの位置を識別する。この周期性は、それぞれｘおよびｙにおいて画像の行および列に関して検索される。しかしながら、画像において有り得るばらつきのため、これらの投影は、全てのタイプの画像については直接的に使用できない。
【００６７】
＜スポットのブロックの限界＞
ブロックは、多かれ少なかれ、ｘおよびｙに沿って良好に配列される。軸に直交する平均化された投影は、主な周期性信号を増幅するために使用され、そして唯一の人為的タイプ信号(singular artefact type signals)が最小化される。その結果は、図４に示されるような二つのヒストグラム
【００６８】
【数１０】
2005530167.tif 000012
【００６９】
であり、第１には行における全画素についてであり、第２には列における画素についてである。
【００７０】
【数１１】
2005530167.tif 000013
【００７１】
【数１２】
2005530167.tif 000014
【００７２】
ここで、
−  Ａｉ，ｊ：  座標（ｉ，ｊ）での画素の強度、
−  ｎｉ：  画像の高さおよび幅の関数としての軸の次元
である。
【００７３】
そして、単一次元ディスクリートフーリエ変換（ＦＦＴＤ）は、画像の主要な周波数を識別するために使用できる。この数学的なツールは、画像分析において極めて頻繁に使用され、その結果は、オリジナル空間の周波数表現である。
【００７４】
全体画像に関して２Ｄ ＦＦＴＤ変換を使用することは一層困難であるから、これら二つのヒストグラム
【００７５】
【数１３】
2005530167.tif 000015
【００７６】
についての作業の選択は速度を理由としてなされる。
【００７７】
変換Ｐ（ω）の指数は、例えば、ω＝２π／λとなるようなωの値について計算され、λは、使用されるロボットについてのスポット間の距離の最小および最大振幅に対応する区間[１０画素，５０画素]に含まれてもよく、それぞれ：
【００７８】
【数１４】
2005530167.tif 000016
【００７９】
である。
Ｐ（ω）の最大値は値ω０を与え、その値から、スポット繰り返し周期性λ０が推定される。
【００８０】
図５はＰ（ωｉ）のダイアグラムを示す。
区間(interval)は、もしそれが著しく異なれば、デポジション周波数にできる限り適合される。
【００８１】
背景雑音は、周期性λ０に寄生(parasite)を持ち込む。従って、可変閾値が、二つのヒストグラム
【００８２】
【数１５】
2005530167.tif 000017
【００８３】
に適用される。この閾値の値は次のように決定される。次の比(ratio)は、閾値Ｓ０の第１の値について計算され、任意的に非常に低く固定される。
【００８４】
【数１６】
2005530167.tif 000018
【００８５】
ここで、Ｐ（ωｉ）は、値
【００８６】
【数１７】
2005530167.tif 000019
【００８７】
についてＰ（ω）の計算値に対応し、ここで、
【００８８】
【数１８】
2005530167.tif 000020
【００８９】
である。
【００９０】
そして、上記閾値の値は固定されたステップによって増加され、この計算が繰り返される。最適な閾値は、上述の数式（３）について最大値を与える値によって与えられる。
【００９１】
そして、周期性λの分布は、二つのヒストグラム
【００９２】
【数１９】
2005530167.tif 000021
【００９３】
に沿って調べられる。サイズが２λ０のウィンドウは、これらのヒストグラムに沿ってスライドする。Ｐ（ω０）値のダイアグラムを示す図６に示されるように、Ｐ（ω０ｍａｘ）が、先に決定された閾値よりも大きな強度値について、各計算位置についてこのウィンドウに沿って得られ、ここで：
【００９４】
【数２０】
2005530167.tif 000022
【００９５】
である。
ブロック間の領域において、Ｐ（ω０）は、ブロックの限界が識別できるように最小値を通過する。
【００９６】
その軸の一つに沿ったｎ個のブロックを含む画像について、ブロック間にはｎ＋１の空間が存在する。しかし、欠落スポットのため、Ｐ（ω０）信号は、ｎ＋１最小値以上を通過してもよい。全欠落スポットに対応するブロック間の領域は、最も低い最小値を生じる。従って、ブロックの数を知れば、行上および列上のｎ＋１の関連値を抽出することは容易である。そして、図７に示されるようなオリジナル画像から開始し、且つその画像を図８に示す期待されるブロックに分解することが可能である。
【００９７】
しかしながら、多くの場合、ブロックは良好に配列されていない。各ブロックの限界の位置は、各ブロックのカットラインに沿ってスライドするウィンドウを用いて微調整される。例えば、このウィンドウの長さは、二つのブロック間のカットラインと平行に、２λ０であってもよく、且つその幅はカットラインと垂直にλ０であってもよい。このウィンドウはカットラインにセンタリングされる。このウィンドウはスライドするが、もしその内部で計算された平均信号がカットラインに沿った平均信号よりも著しく大きくなれば（例えば、平均＋２σ）、この増加は１又は２以上のスポットの存在によるものかもしれない。従って、信号がカットラインの各サイドのブロックの一つと同相(in phase)であるのかがチェックされる。
【００９８】
第１のステップにおいて、ウィンドウが限界の一方のサイドでλ０／２だけ拡張され、それから他方のサイドで拡張される：
−もし平均信号がウィンドウの二つの拡張のうちの一つについてのみ増加すれば、ブロック限界は信号が増加されない隣接ブロックにおいてλ０だけシフトされる。
【００９９】
もし信号に増加が存在しなければ、又はもし信号が二つのシフトについて増加されれば、このことは、それが寄生信号であるか、または二つのブロックが極めて接近していることのどちらかを意味する。両方の場合において、カットラインの右および左に属する信号の確率が計算される。これは、投影を、スライディングウィンドウの高さに対応する画像のストライプの、考えられるカットラインに平行とすることによりなされる。カットラインに垂直な次元について、ストライプは、互いに隣接する二つの連続したブロックを置くことに対応し、そして次元平行について、それは、スライディングウィンドウの高さに対応する。そして、結果は、二つの連続したブロックからのストライプの投影である。カットラインは、カットラインの各サイドでλ０／２だけシフトされ、そして値Ｐ（ω）は、得られた各半投影について計算（数式３）される。そして、シフトのそれぞれは、半投影の一つにおいて疑わしい信号を含み、そして排除する。従って、Ｐ（ω）は、疑わしい信号と共に、または疑わしい信号なしで各半投影について得られる。そして、得られた利得が計算できる：
【０１００】
【数２１】
2005530167.tif 000023
【０１０１】
もし利得が二つの半投影の一方のみについて１よりも大きければ、考慮される信号は、隣接ブロックにおいてλ０／２だけカットラインをシフトすることにより、それに割当てられる。もし利得が二つのブロックの何れについても１よりも大きくなければ、それは寄生信号である。カットラインはシフトされない。もし利得が二つの半投影について１よりも大きければ、信号は二つの投影と同相である。従って、ブロックは、近接し且つ同相であり、そして信号は、隣接ブロックにおいてλ０／２だけカットラインをシフトすることにより、利得が最も高いブロックに割当てられる。ブロックがどこに属するかについての最後の判定は、後述するカージナル又はパリティルール(cardinal or parity rule)によって決定される。従って、各ブロックの限界が定義できる。カットラインがシフトされたときの隣接ブロックにおける重複を避けるため（限界が、提案された値よりも小さいか大きい値だけシフトされなければならないこともあり得る）、シフトは、シフト方向における局所的最小値を探索することによってなされる。
【０１０２】
＜各スポットの周りのグリッド位置＞
全画像の数学的形態学研究に基づく位置は、スポットのジオメトリーにおける異質性、ある点での交配の起こりうる欠落、および低コントラストのスポットの存在によって異なる。従って、図９は、スポットの画像を示す。さらに、照射されないスポット、換言するとプローブがデポジットされた領域、を分離することは重要であるが、その領域では、分析された混合のマークされないＤＮＡが交配される。この交配の欠落は、生物学者にとっては重要な情報である。あらためてもう一度、我々は、信号周期性問題を用いて軸上への直交投影から始める。従って、照射されないスポットの位置は外挿できる。
【０１０３】
ブロックの位置についてと同様の方法で、ヒストグラム
【０１０４】
【数２２】
2005530167.tif 000024
【０１０５】
が、数式（１）をそれに適用することにより、ブロックの行および列についてそれぞれ作成される。そして、図１０は、ヒストグラム
【０１０６】
【数２３】
2005530167.tif 000025
【０１０７】
を示す。
【０１０８】
スポット信号の周期性測定λ０は、各ブロックの二つのヒストグラムにＦＦＴＤ変換を適用することにより微調整される。もう一度、数式（２）におけるＰ（ω）の最大値が、スポット繰り返し周期性λ０を与える。
【０１０９】
交配ゾーンの理論上の位置（照射され又は照射されないスポット）は、最二乗法を用いて識別されて次の数式のサイン曲線を用いて投影を調整する：
【０１１０】
【数２４】
2005530167.tif 000026
【０１１１】
ここで、
−  ω０＝２π／λ０
−  Ａ：  投影の平均振幅
−  φ：  決定されるべき位相シフト
【０１１２】
投影の平均振幅Ａはつぎのように計算される：
【０１１３】
【数２５】
2005530167.tif 000027
【０１１４】
サイン曲線の位相は、期間λ０に関して計算されたヒストグラム
【０１１５】
【数２６】
2005530167.tif 000028
【０１１６】
のプロファイルに沿って振幅Ａの正弦曲線パターンをスライドさせることにより計算される。各位置について、パターンと投影との間のＲＭＳ(Root Minimum Square)値が計算される。
【０１１７】
【数２７】
2005530167.tif 000029
【０１１８】
得られた最小のＲＭＳｉ値は、パターンがスポットラインからの信号と最もよく調整される位置を与える。この位置ｊから得られた位相シフトは次のようである：
φ＝−ω０×ｊ          （８）
【０１１９】
図１１は、サイン曲線の投影の位置合わせ(alignment)を示す。
スポットの平均位置は、ヒストグラム
【０１２０】
【数２８】
2005530167.tif 000030
【０１２１】
の最大値を識別することにより正確に識別される。ここで、ヒストグラム
【０１２２】
【数２９】
2005530167.tif 000031
【０１２３】
は図１２に示される。
【０１２４】
従って、ヒストグラムの値がセンタリングされる。そして、デジタル復元アルゴリズムは、ほとんど同じ振幅の信号が初期の投影から再構成されるように、これらのヒストグラムに適用される。そして、図１３ａは、デジタル復元後のヒストグラム
【０１２５】
【数３０】
2005530167.tif 000032
【０１２６】
を示す。
【０１２７】
そして、閾値は、復元されたヒストグラムを二値化するために使用され、スポットの正確な位置を決定するために使用される。図１３ｂは二値化されたヒストグラム
【０１２８】
【数３１】
2005530167.tif 000033
【０１２９】
を示す。
【０１３０】
デポジション中に、スポットのずれ(deviance)が観測され、それは、最適なサイン曲線と、投影自体または二値化された投影との間の局所的な隔たりをもたらす。
【０１３１】
発散(divergence)を補償するために、適用された正弦曲線関数が次のように最適化される：
【０１３２】
【数３２】
2005530167.tif 000034
【０１３３】
ここで、パラメータαは、デポジットのずれに関するサイン曲線を修正する。量αは、
【０１３４】
【数３３】
2005530167.tif 000035
【０１３５】
が最小になるように選ばれる。
【０１３６】
復元されたヒストグラムは、高コントラストのスポットの位置を正確に定義するために使用される。理論上の位置を与えるサイン曲線からの情報を加えることにより、低すぎて検出できないコントラストを有する全スポットを見つけ出すことができる。理論上の位置（サイン曲線）と実際の位置（二値化された投影）との間の重複は、次のようなλ０の正弦曲線関数を用いて、二値化された投影をコンボリュート(convolute)することにより最適化される：
【０１３７】
【数３４】
2005530167.tif 000036
【０１３８】
図１４ａは、調整前の正弦曲線関数および投影を示す。
図１４ｂは、調整後の正弦曲線関数および投影を示す。
【０１３９】
畳み込み関数(convolution function)の最小値および最大値を探索することにより、全ての検出可能なスポットを囲むグリッドを自動的に復元(reconstruct)することが可能である。そして、欠落スポットの位置は、畳み込み関数（数式１１）と正弦曲線関数（数式９）との間をクロスチェックすることにより推論される。畳み込み関数の最大値のそれぞれは、次のようなユークリッド距離を最小化する正弦曲線関数（９）の最大値に割当てられる：
【０１４０】
【数３５】
2005530167.tif 000037
【０１４１】
ここで、
Ｎｍａｘ：  識別された最大値の数。
【０１４２】
欠落スポットは、畳み込み関数に割当てられなかった正弦曲線関数（９）の最大値に対応する。従って欠落スポットの位置が推定できる。後述のように定義されるサイズルールとスポット位相は、ブロックの最後で追加スポットの行または列の割当てを避けるために適用される。
【０１４３】
畳み込み関数信号は、制限曲線関数（９）の最大値と同相でなければ、スポットの行または列として定義できない。
【０１４４】
初期に、畳み込み関数（１１）の最大値は、ｉ＋λ０／４とｉ＋λ０／２との間の隣接した最大値を持ち得る（これらの閾値は、明らかに、使用されるスライドのタイプの関数のようなパラメータによって定義できる）。
【０１４５】
最後に、畳み込み関数の極度な最大値について（例えば、軸上のスポットのブロックを画定する）、最大値にセンタリングされた量の和は次のように定義され：
【０１４６】
【数３６】
2005530167.tif 000038
【０１４７】
ここで、ｎｍａｘ＝見つけ出された最大値の数であり、
且つ、正弦曲線関数の二つの隣接した最小値にセンタリングされた量は次のように定義され：
【０１４８】
【数３７】
2005530167.tif 000039
【０１４９】
ここで、ｎｍｉｎ＝見つけられた最小値の数であり、
【０１５０】
【数３８】
2005530167.tif 000040
【０１５１】
のようになるべきである。
【０１５２】
これらのルールが適用されるとき、各ブロックの終わり(end)が自動的に画定される。
【０１５３】
次のステップは、各ブロックの行および列、最初と最後をチェックするためである。列又は行又は始まりでのスポットが照射されていないブロックは検出されない。
【０１５４】
これらの照射されていないスポットの位置は、異なるブロック間でカージナルルールを適用することにより見つけ出される。各ブロックにおいて最も可能性のある数が計算される。行または列が欠落したブロックにおいて、この追加の行又はこの列が、考慮されたブロックの各サイドおよび上下に位置されたブロックのスポットの数に制限された正弦曲線関数間のユークリッド距離を最小化するように、この行および列が正弦曲線関数（９）を用いてブロックのエンドの一つに割当てられる。この操作(operation)は、１以上の行または１以上の列が終わりで欠落していれば、必要なだけ何回でも繰り返されてもよい。
【０１５５】
図１５は、ブロック上に自動的に配置されたグリッドの例を示す。
生体素子のブロックは、必ずしも全て同じサイズである必要はない。行および列の数は、選択されたデポジション方法、特定の方法に適応できる選択されたルールに依存する。
【０１５６】
＜各スポットにおける画素の識別＞
一旦、スポットの位置が見つけ出されると、画像分析における最後の二つのステップが実施されなければならない。これら二つのステップは、独立に実行されてもよく、独立でなくてもよい。
【０１５７】
ＤＮＡ生体素子によって得られた画像の同質性(homogeneity)は、使用されるデポジションのタイプ：機械的なデポジション又はインクジェット(ink jet)によるデポジションに依存する。
【０１５８】
解決すべき課題は変わっていない。換言すれば、各スポットについて、交配信号を含む重要な画素、背景雑音レベル、および寄生画素を決定することである。図１６は、機械的デポジションによって得られるスポットの例を示す。
【０１５９】
図１７に示されるように、背景雑音および寄生画素の悪い評価(bad estimate)は、信号の悪い評価をもたらす。この図１７は、スポットにおける画素の分布、背景雑音における画素の平均プラス１．５倍の背景雑音の標準偏差よりも大きな画素を用いて計算されるスポット強度の平均を示す。
【０１６０】
この問題に対する二つの可能性のある解が存在する：それは、
−参考文献[7]に述べられているように、期待値から過度の分布のスポットを除去すること
−または、実際に交配信号を現すスポットにおける画素を選択すること
である。
【０１６１】
交配信号の最良の位置を得るためには、同質の画像、換言すれば、同じタイプの画素が僅かだけ分散(disperse)された画像（背景雑音、交配信号）を配列することは重要である。このタイプの分散は、取得コンディション(acquisition condition)に大きく依存し、これは弱い信号および強い信号の検出を最適化するのに十分である。
【０１６２】
図１８は、例えばパッカードスキャナー(Packard scanner)を用いて同一の強度に正規化された、４つの異なるコンディションの下で得られた同一スポットの異なる画像を示す；
ａ）１０μｍの解像度、高速パス、利得＝１００ ＰＭＴ １００（任意スケール）での単一画像、
ｂ）１０μｍ解像度、低速パス、利得＝８０ ＰＭＴ ８０（任意スケール）での単一画像、
ｃ）１０μｍ解像度、高速パス、利得＝８０ ＰＭＴ ８０（任意スケール）での１０個の独立画像、そして単一画像における画像の平均および重ね合わせ(superposition)、
ｄ）５μｍ解像度、高速パス、利得＝８０ ＰＭＴ ８０（任意スケール）、最遠の画素を排除して１０μｍへの低減。
【０１６３】
この図において、スポットは、４つの異なるコンディションの下で得られた同一のスポットである。強い励起(strong excitation)および強い検出(strong detection)を適用することと、弱いスポットについて高い信号／背景雑音比で同質の画像を得ることが困難であることが分かる。取得コンディションが図１８ａおよび１８ｂに示されている。
【０１６４】
他の変形は、低励起かつ低検出で多くの画像を作成することから成り、それは単一画像に蓄積される。図１８ｃに示されるように、１．３８の係数で、信号／背景雑音比または信号／交配信号比における正味の改良が観測される（本明細書文末の表１を参照）。この改良は、背景雑音信号についてよりもスポット信号についての方が速い。“交配(hybridizing)”に起因した信号および背景雑音として分類される信号間の重複または混合は、画像が蓄積するほど速く減少する。しかしながら、取得の数が増えると、現象を失わせる蛍光発光が観測され、強い信号について一層大きい。しかしながら、信号の強度は、背景雑音につきものであり、従って蓄積の制御が不適切だと、交配信号の評価に誤差が存在し得る。
【０１６５】
背景雑音の分散(variance)が低減されるので、低強度スポットについての受容閾値(acceptance threshold)は低くされる。
【０１６６】
従って、同一のスライドから多くの取得をなすことは、常に望ましいくもないし、可能でもない。一つの変形は、高解像度画像を作ることであり、そしてｎ個の画像の平均によってｎ個の隣接画像を置き換えることにより画像の解像度を人為的に低減させることである。
【０１６７】
そして、図１８ｄは、この変形を用いて１０μｍに調節された５μｍでの得られた画像を示し、それはｎ＝４に対応する。
【０１６８】
そして、同質のフィルタは、隣接画素に比較して最も大きな異質性(heterogeneity)を有する画素を排除することにより適用される。異質性は、選択された同質性評価の２σ（標準分散）以上で評価される。この場合、選択された同質性評価は、平均化される４つの画素にセンタリングされた１６画素のウィンドウの平均であり、ここで、σは、１６画素の同一ウィンドウに関して計算される。
【０１６９】
４つの測定は独立である。同一の誤差が４つの画素上で起こる確率は極めて低い。得られた結果は、１．８の係数で低減された雑音強度を有する画像である。この場合では、背景雑音の強度は、係数２．３で低減され、そして信号／背景雑音比または信号／交配信号は、１．２７の係数で増加する。他方、平均強度および交配信号の分散は、ほんのわずか修正されるだけであり、それは、１．１２の係数で信号／雑音比において利得がより低くなるという結果をもたらす。蓄積に関しては、交配信号を保持すること、および背景雑音の平均および分散を、提案されたフィルタによって低減することは、スポット受容閾値強度(spot acceptance threshold intensity)を低減する手段である。従って、失われる蛍光発光の問題は排除される。
【０１７０】
多くの場合、５μｍの解像度で素子(chip)を走査することは不可能である。代案は、ＤＮＡチップの１０μｍの解像度で画像から始まるフィルタを用いて構成され、スポットに含まれる信号についてほんのわずかだけ分解(degrading)するか、あるいは全く分解せず、且つ背景雑音の分散(variance)を最小化する。このフィルタは、画像スポットの信号／雑音比を増やし、従って素子の感度(sensitivity)を増加させる。
【０１７１】
このフィルタは、スポットの位置と、画像背景雑音の位置との間の境界を画定するビグネット(vignette)に基づいている。スポットビグネットに含まれる各画素について、一旦、スポット領域が画像上で画定すると、画素上にセンタリングされたクロス(cross)が考慮され、このクロスは、例えば直径２λの円に記される。クロスの垂直ブランチの平均Ｍｖは、どのビグネットにも属していない画素について計算される。同一の計算Ｍｈが、
【０１７２】
【数３９】
2005530167.tif 000041
【０１７３】
のように、クロスの水平ブランチについてなされる。ここで、
【０１７４】
【数４０】
2005530167.tif 000042
【０１７５】
である。
この計算は、全てのビグネットにおける全画素について繰り返され、そして各ビグネットにおける各画素で予期される背景雑音の推定をもたらす。
各スポットでの背景雑音計算を評価するため、ビグネットにおける各画素は、Ｍｈ＜ＭｖであればＭ＝Ｍｈ、そうでなければＭ＝Ｍｖのように、量Ｍによって代用される。
【０１７６】
図２４において、スポット位置が、背景雑音に比較して完全に目に見えないことが理解される。従って、推定は極めて細かな詳細部における局所的な背景雑音を調べるための機会を提供する。結果として得られる背景雑音画像はオリジナル画像から取り去られる。結果として得られる画像は、以下に述べるようにスポットを定量化するために使用される。
【０１７７】
一旦、電子的雑音が最小化されると、各スポット内の画素を分類することは、異なるタイプの存在する画素（背景雑音、交配信号および寄生信号）を識別する手段である。
【０１７８】
信号タイプ画素のみが保持されるという事は、通常の品質基準で除去されるべき指標(measure)を修復(restore)または保持(keep)する手段である（参考文献[7]および[8]参照）。画素比によって画素を計算することによるセグメントへの近似的な分解(breakdown)は、図１９に示されるように交配信号と背景雑音が近すぎる場合にはこれらを区別するのに十分ではなく、同図は、画素によって同一スポット画素の二つの画像を比較することにより得られたグラフの例を与える。ＥＭ(Estimation, Maximization)アルゴリズムアプローチ（参考文献[9]参照）が使用されてもよい。しかしながら、信号が、純粋なガウス分布に従わないことが示されている（参考文献[4]参照）。
【０１７９】
ガウス分布に基づく２または３クラスの従来のＥＭアルゴリズムを適用することにより、図２０に示された分布が得られ、それは、ｂｇ：背景雑音の評価された分散、実際の分散：交配信号における画素の分散で、ＥＭ法でスポットにおける存在する画素の異なるポピュレーション(population)の評価を示す。この方法では飽和しない画素が識別される。
【０１８０】
この例は、適用されたガウス仮説(gaussian assumption)が各クラスの実際の分布と比較して広すぎるということを明確に示している。これは、このアルゴリズムが、背景雑音または信号のどちらか又は寄生信号で、信号と雑音との間の遷移画素を割当てるという事実に起因している。
【０１８１】
この方法に対する修正は、２つ又は３つの主なクラスのうちの一つに属する計算された確率に関する閾値を適用することにより、どのクラスにも属さない画素の概念を導入し、且つクラスを一層小さくする。
【０１８２】
そして、理論的に最も大きなポピュレーションを有するクラスであり、且つ通常は中間クラスに対応する交配信号を有するクラスを決定することが可能である。
【０１８３】
図２１ａは、画素クラス；ｂｇを有するｌｏｇ確率によって評価される収束：背景雑音の評価される分布、実際の分布：交配信号における画素の分布、およびオフセット：飽和する画素、を見つけ出すための修正されたＥＭ法の適用例を示す。
【０１８４】
図２１ｂは、画素クラス；ｂｇを有するＲＭＳ−ｌｏｇ−確率を用いて評価された収束：背景雑音の評価された分布、実際の分布：スポットおよびオフセットにおける画素の分布：飽和している画素、を見つけ出すための修正されたＥＭ法の適用例を示す。
【０１８５】
従って、修正されたＥＭ法を用いることにより、背景雑音はスポット内で測定され、故に、もはや過小または過大評価することなく、ネガティブスポットの問題を排除できる。
【０１８６】
このタイプの分析は独立に実行されるので、画像の完全な重ね合わせ(superposition)の問題が排除される。さらに背景雑音に最も近い信号は以前として確実に測定され得る。
【０１８７】
＜ＥＭ法＞
各スポットのキャッシュ画定の自動休止後、本方法は、画素を３つのクラスに繰り返しクラス分けするステップから構成される。混合(mix)のパラメータは、このクラス分けをなすために最小化される。
【０１８８】
最初の近似として、画素は、２つにクラス分けされ、そして、必要であれば３つのクラス：背景雑音、交配信号、あるいは飽和している画素に分類される。
【０１８９】
・＜初期化ステップ１＞
最初のステップは、不鮮明画素分布テーブルＣｉ０（ｋ）を構築するステップから構成され、ここで、ｉは強度であり、ｋはクラスである。文末の表２に示されたこのテーブルは、値１が背景雑音クラスに割当てられ、強度が背景雑音＋２シグマ（スポットの外側のリファレンスでとられる）の値よりも小さい画素については値０が交配信号クラスに割当てられるように構築される。不鮮明分布テーブルＣｉ０（ｋ）は、強度が背景雑音＋２シグマの値（スポットの外側にリファレンスとして使用される）よりも大きな画素について、信号クラスに対しては値１に等しく設定され、背景雑音クラスに対しては値０に等しく設定される。初期では、６５５００よりも大きな信号は飽和しており、且つ含まれないと考えられる。
【０１９０】
二つのクラス（Ｋ＝２）を有するこの最初の不鮮明分布テーブルは、二つのクラスを有する第１セグメンテーションのために構築される。
【０１９１】
そして、次のステップは、次のように各クラスの確率Ｐ（ｋ）を定義することである。
【０１９２】
【数４１】
2005530167.tif 000043
【０１９３】
ここで、
−  ｎｉは、強度レベルｉを有する画素の数であり、
−  Ｃｉ０（ｋ）は、強度レベルｉをクラスｋに割当てる確率であり、
−  Ｐ（ｋ）は、クラスｋの確率密度(probability density)であり、
−  ｋは、考慮に入れられるクラスの数である（この第１のモデルでは、Ｋ＝２）。
【０１９４】
混合パラメータ
【０１９５】
【数４２】
2005530167.tif 000044
【０１９６】
は、次のように定義される。
【０１９７】
【数４３】
2005530167.tif 000045
【０１９８】
ここで、
−  ｎｉは、強度レベルｉの画素の数であり、
−  Ｃｉ０（ｋ）は、強度レベルｉをクラスｋに割当てる確率であり、
−  μｏ（ｋ）は、ステップ０におけるクラスｋの平均であり、
−  σｏ（ｋ）は、クラスｋの標準偏差である。
【０１９９】
・＜評価ステップ２＞
新たな不鮮明分布テーブルは、次のようにパラメータθｍ−１から計算される。
【０２００】
【数４４】
2005530167.tif 000046
【０２０１】
ここで、
【０２０２】
【数４５】
2005530167.tif 000047
【０２０３】
である。
・＜最大化ステップ３＞
混合パラメータθｍは、新たな分布テーブルＣｍｉ（ｋ）を発端として再計算される。
ステップ２および３は、次のように定義されるlog−確率のクラス分けが収束するまで繰り返される。
【０２０４】
【数４６】
2005530167.tif 000048
【０２０５】
このアプローチは、次のことを課す。
【０２０６】
【数４７】
2005530167.tif 000049
【０２０７】
しかしながら、画素が各クラスにおいて一方または他方に属するかどうかを計算するために使用される量θ（Ｋ）は、考慮されたクラスから極めて遠い中間画素について著しく低くてもよい。
【０２０８】
ＥＭアルゴリズムの定義は、これらの画素をクラスのうちの一つに割当てることを必要とし、それは、クラス分布を拡大し、従って異なるクラスの人為的な混合を生成する。結果は、選択された可観測の交配強度の悪い評価である（平均、中間など）。この問題は、θ（Ｋ）のような、これらの離れた画素について０に収束するように量φＫを修正することにより、距離を緩和するための方法を用いることにより克服できる。
【０２０９】
【数４８】
2005530167.tif 000050
【０２１０】
これらのコンディションの下で、確率Ｃｉ（０）およびＣｉ（１）は０に向かって収束する。従って、考慮されている混合パラメータについてあまりにも遠すぎる画素は、このステップでは二つのクラスの何れにも割当てられない。また、画素は、このステップにおける計算にも使用されない。
【０２１１】
同様に、log−確率の収束は、早期にクラス分けを止めることにより、容易にクラスを拡大できる。従って、新たな収束評価値(convergence estimator)が、混合パラメータを用いて再計算された分布と実際の画像の分布との間の計算された距離または類似性に基づき導入される。ＲＭＳ-log-確率は次のようである。
【０２１２】
【数４９】
2005530167.tif 000051
【０２１３】
例えば、ＲＭＳ＝１／Ｒを有することができ、ここで、Ｒは、混合から計算された理論上の分布と実際の分布曲線との間の相関係数である。
【０２１４】
評価は、この評価値(estimator)が収束するときに止まる。結果は、実際の分布に非常に近いクラスである。
【０２１５】
スポットが飽和している画素（６５５００以上）を含む場合、新たな不鮮明区画テーブル(blurred partition table)が、６５５３５画素（行）に至るまでテーブルを満たす新たなレベル及び追加のクラスＫ＝３（列）で生成される。新たな列は、レベル６５５００に至るまで０に等しく初期化され、それから最終レベルに至るまで１に初期化される。既存の列における追加のレベルは０に初期化される。全体の手続は、この新たなマトリックスを用いて再び開始される。数式（１５），（１７），（１８），（２１）における上限は、６５５００から６５５３５に増加する。
【０２１６】
＜スポットの位置の検出を改善するための画像の改良＞
スポットの位置は、背景雑音とスポット信号との間のコントラストが存在するときに、一層容易に決定される。このコントラストは、信号の比例性(proportionality)を必ずしも保持しない分解フィルタ(degrading filter)を用いることにより増加できる。フィルタされた画像は、スポットの位置を見つけ出すために使用されるだけである。定量化は、原画像(raw image)から開始され、あるいは非分解フィルタ(non-degrading filter)を用いてフィルタされた画像から開始されて行われる。
【０２１７】
提案された分解フィルタは、必要とされる信号の周期性に基づいている。閾値は、投影
【０２１８】
【数５０】
2005530167.tif 000052
【０２１９】
に適用され、もし、
【０２２０】
【数５１】
2005530167.tif 000053
【０２２１】
または、もし
【０２２２】
【数５２】
2005530167.tif 000054
【０２２３】
であれば、投影（数式１）から開始し、結果は、
【０２２４】
【数５３】
2005530167.tif 000055
【０２２５】
であるる。ここで、
−  ｍａｘｉｍａｇｅは、画像における最も高い検出強度を表す。
−  値５００および６５５３５は、画像における必要な再分布振幅に応じて変えられてもよい。
【０２２６】
閾値は、数式（３）を最大化するように選択され：
【０２２７】
【数５４】
2005530167.tif 000056
【０２２８】
が、修正された投影
【０２２９】
【数５５】
2005530167.tif 000057
【０２３０】
から計算される。一旦、閾値が決定されると、画像Ａｉｊ＜閾値における画素が画像において０（Ａｉｊ＝０）に訂正され、そして、画像Ａｌｉｊ＞閾値における画素が、
【０２３１】
【数５６】
2005530167.tif 000058
【０２３２】
に訂正される。
画素Ａｌｉｊ＞閾値を、例えばＡｉｊ＝５００のような一定値で置き換えることを選択することも可能であろう。
【０２３３】
そして、第２の“ロウパス”タイプのフィルタが適用され、画素（ｉ，ｊ）上にセンタリングされたサイドに沿って（ａ＋１）画素のウィンドウにおける信号の平均を次のような画像における各画素（ｉ，ｊ）に割当てる。
【０２３４】
【数５７】
2005530167.tif 000059
【０２３５】
そして、多数の寄生信号は除去され、これらフィルタの適用は、図２２ａおよび２２ｂに示される結果与える。ここで、図２２ａは、フィルタリング前の画像を示し、そして図２２ｂは、フィルタリング後の同一画像を示す。
【０２３６】
この閾値及びこの分布に加えて、スポットに属する画素の強度は、サイズ２λのウィンドウにおけるλの周波数に同期して画素を増幅することにより増幅できる。これは、次のような書くが素Ｘｉｊを再定義することにより簡単に行われる。
【０２３７】
【数５８】
2005530167.tif 000060
【０２３８】
この増幅は、双方向的であり、例えば、次のようなＸｉｊ上にセンタリングされた、高さ２λで幅２λのクロスを考慮する。
【０２３９】
【数５９】
2005530167.tif 000061
【０２４０】
一般に、増幅関数(amplifying function)は、探索された事象(phenomenon)の期間を考慮に入れる任意の周期関数であってもよい。例えば、各画素の強度は、考慮された画素にセンタリングされたウィンドウにおいて計算されたフーリエ変換の指数の一部が乗じられ得る。
【０２４１】
背景雑音の分散を考慮に入れるだけの信号／雑音比の使用に代わるものは、次のように定義される量Ｑを決定するステップから構成される。
【０２４２】
【数６０】
2005530167.tif 000062
【０２４３】
ここで、Ｉｓｐｏｔは背景雑音で測定された平均強度であり、Ｉｂｇは背景雑音の平均強度であり、σｓｐｏｔは信号の標準偏差であり、σｂｇは背景雑音の標準偏差である。
【０２４４】
画像についてのこの平均係数Ｑは、非分解フィルタの適用後の画像の品質における顕著な改善を示し、それは、画像に適用された処理に応じて２または３の係数で値Ｑを増加させる。
【０２４５】
＜スポットの再配列（画像のカット）＞
或るケースでは、スポットは、ｘにおいて又はｙにおいてうまく配列されず、それは、ブロック間のカットラインを決定すること及びグリッドを位置決めすることを一層困難にする。この問題は、次のように画像における最初のｍ行のヒストグラムを計算することにより克服できる。
【０２４６】
【数６１】
2005530167.tif 000063
【０２４７】
そして、行ｍ＋１は、＋λ０／２と−λ０／２との間のαトランスレーション(translation)または可能な全てのオフセットでヒストグラムに付け加えられ、次のようになる。
【０２４８】
【数６２】
2005530167.tif 000064
【０２４９】
ヒストグラム
【０２５０】
【数６３】
2005530167.tif 000065
【０２５１】
のフーリエ変換の指数の値は、各トランスレーションαについて計算される。スコア(score)を最大化するシフトαｍａｘの値が保持される。行ｍ＋１は、画像における量αｍａｘだけシフトされる。この手順は、行位置ｍ＝λ０から開始して位置ｘ＝ｎ−λ０までの画像における全行について実施され、ここでｎは最終行である。同一の手順がｙにおける画像に適用されてもよい。
【０２５２】
ＥＭ法についての補足として、接続性(connectivity)（参考文献[10]参照）を用いて、各フレーム上でモルフォ数学的(morphomathematical)アプローチが実行できる。これらのオブジェクト(object)は、マトリックスＣｉ（ｋ）において追加のクラスを定義し初期化するために使用される。見つけられた各オブジェクトは、飽和画素クラスおよび背景雑音画素クラスに加えて、クラスを定義する。ＥＭ法は、異なるオブジェクトのクラスを併合してもしなくてもよく、そして、例えば埃によって引き起こされる寄生画素を排除しながら交配信号における画素のクラスを定義するために使用されてもよい。
【０２５３】
図２３ａ，２３ｂ，２３ｃは、次のように、３つの実施例において、スポットを定量化するためにたどられる全てのスポットを示す：
−  単一画像についての完全処理。その処理には、非分解フィルタステップ、分解フィルタステップ、ブロックの全体的な位置決め、ブロック位置の微調整、スポットの画定、各スポットにおける画素のセグメントへの分解、および各スポットについての強度評価値の計算から成るシーケンスが存在する。
−  多数の画像についての完全処理。画像重ね合わせステップを有する図２３ａに示されるようなステップと同一のサポートスライド(support slide)についての異なる交配コンディションでなされる。
−  画像についての最小処理。この処理には、図２３ａに示される二つの予備フィルタステップは存在しない。
【０２５４】
【表１】
2005530167.tif 000066
【０２５５】
【表２】
2005530167.tif 000067
【０２５６】
＜参考文献＞
[1] McGall, G., Labadie, J., Brock, P., Walfraff, G., Nguyen, F. & Hinsgerg, W. (1996). "Light directed synthesis of high density oligonucleotide arrays using semiconductor phoresists" (Proc. Nat1. Acad. Sei. USA, 93, 13555-13559).
[2] Ramsay, G (1997). DNA chips: state of the art. "Nature Biotechnologies" 16, 40-44.
[3] Service, R.F. (1998). "DNA chips survey an entire genome". Science 281, 1122.
[4] S. Granjeaud, C. Nguyen, D. Rocha, R. Lutton, and B. R. Jordan. "From hybridization to numerical values: a practical, high throughput quantification system for high density filter hybridization". Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 12:151-62, 1996.
[5] Y. Chen, E. R. Dougherty, and M. L. Bittner. "Ratio-based decisions and quantitative analysis of cDNA microarray images". Journal of Biomedical Optics, 2(4): 364-74, 1997.
[6] reference Internet Dapple: "www.cs.wustl.edu/r j.buhler/research/dapple/"
[7] Kadoka K, Miki R, Bono H, Shimizu K, Okazaki Y, Hayashizaki Y. (2001) "Preprocessing implementation for microarray (PRIM): an efficient method for processing cDNA microarray data. Physiol Genomics" 19; 4(3): 183-8.
[8] Wang X, Ghosh S, Guo SW. (2001) "Quantitative quality control in microarray image processing and data acquisition. Nucleic Acids Research", 29, 15 e75.
[9] Celeux, G. and Diebolt, J. (1991) "The EM and the SEM algorithms for mixtures: Statistical and numerical aspects". Cahier du CERO 32, 135-151.
[10] D Marr: "Vision", EDW. h. freemar and co 1982.
【０２５７】
＜用語解説＞
プローブ(probe)：  核酸分子。シーケンスは検索されたシーケンスと相互補完的である。ＤＮＡチップについて、それらはサポートに固定される。
ＤＮＡまたはデオキシリボ核酸：  遺伝子情報についてのサポート分子。
ｍＲＮＡ：  伝令リボ核酸。遺伝子にコード化された遺伝子メッセージが核から細胞質に運ばれる分子形態。このｍＲＮＡは、プロテインの合成のために細胞質において使用される。
ｃＤＮＡまたは相補ＤＮＡ：  反転写(inverse transcription)によって得られたｍＲＮＡと相補的な一本鎖ＤＮＡ(single strand DNA)。ＤＮＡのようではなく、それはイントロン(intron)を何ら有しない。それはまた、ポリメラーゼＤＮＡによって第１の鎖をコピーすることによる二本鎖の形態であってもよい。
コンディション(condition)：  特定のコンディションでセルから抽出さえた全てのＲＮＡまたはｃＤＮＡを表す。
順序付け(sequencing)：  核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）におけるベース(base)またはプロテイン(protein)のアミノ酸の順序（シーケンス）を決定するために使用される処理。
レトロ転写(retro-transcription)：  ｍＲＮＡ分子から始めて相補ＤＮＡ分子の合成を可能とする酵素反応。
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction; ポリメラーゼ連鎖反応）：  重合連鎖反応。ＤＮＡまたはｃＤＮＡモジュールのための指数関数的な増幅技術。それは、ＤＮＡの小片およびポリメラーゼＤＮＡタグから始めて、与えられたＤＮＡ分子の多数（数百万）の同一コピーを得るために使用される。この反応は体外で行われる。
分子交配(Molecular hybridizing)：  二つの核シーケンス(nuleic sequence)をマッチングさせることの効果。それは、核ベースの相補性、特にＤＮＡとＲＮＡまたはｃＤＮＡのらせん構造との間の相補性の原理に基づいている。セル(cell)またはティッシュ(tissue)内の核酸シーケンスを実演するために使用される。
差交配(differential hybridizing)：  二つの異なるサンプルから出力された分子の競合交配(competitive hybridizing)。
画素(pixel)：  実験室で使用されるスキャナーの場合には、画像の強度の単位であり、使用される解像度に応じて５または１０ミクロンの領域(area)に対応する。
セージ(sage)：  “遺伝子発現のシリアル分析”(Velculescuet at al, 1995)。セルのトランスクリプトーム(transcriptome)の定量的測定のための技術。
ゲノム(Genome)：  固体(individual)または種(species)のための全てのＤＮＡ。
トランスクリプトーム(transcriptome)：  ゲノムからセルに時刻ｔで転写された全ての伝令ＲＮＡ。
プロテオーム(proteome)：  時刻ｔでのセルにおける全てのプロテイン。
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】従来技術による装置を用いてプローブメード(probe made)の位置を示す図である。
【図２】代表的な素子の画像を示す図である。
【図３】異なるタイプの得られたスポットを示す図である。
【図４】ヒストグラムＨｉ（列における画像の投影）を示す図である。
【図５】Ｐ（ωｉ）ダイアグラムを示す図である。
【図６】Ｐ（ω０）ダイアグラムを示す図である。
【図７】オリジナル画像を示す図である。
【図８】カットアウト画像を示す図である。
【図９】ブロックの画像を示す図である。
【図１０】ヒストグラムＨｉを示す図である。
【図１１】サイン曲線の投影の配列を示す図である。
【図１２】ヒストグラムＨｉを示す図である。
【図１３ａ】デジタル復元後のヒストグラムを示す図である。
【図１３ｂ】二値化されたヒストグラムを示す図である。
【図１４ａ】調整前の正弦曲線関数および投影を示す図である。
【図１４ｂ】調整後の正弦曲線関数および投影を示す図である。
【図１５】ブロックに自動的に配置されたグリッドの例を示す図である。
【図１６】機械的なデポジションで得られたスポットの例を示す図である。
【図１７】スポットにおける画素の分布を示す図である。
【図１８ａ】４つの異なるコンディションで得られた同一スポットの１つ目の画像を示す図である。
【図１８ｂ】４つの異なるコンディションで得られた同一スポットの２つ目の画像を示す図である。
【図１８ｃ】４つの異なるコンディションで得られた同一スポットの３つ目の画像を示す図であり、異なる１つ目のコンディション下でフィルタされた画像を示す図である。
【図１８ｄ】４つの異なるコンディションで得られた同一スポットの４つ目の画像を示す図であり、異なる２つ目のコンディションでフィルタされた画像を示す図である。
【図１９】異なる波長（異なる交配コンディション）での画素ごとに、同一スポットの二つの画像を比較することにより得られたグラフの例を示す図である。
【図２０】従来のＥＭ法を用いてスポットに存在する画素の異なるポピュレーション(population)の評価を示す図である。
【図２１ａ】log−確率で評価された収束で画素クラスを定義する修正されたＥＭ法の適用例を示す図である。
【図２１ｂ】RMS-log-確率で評価された収束で画素クラスを見つけ出す修正されたＥＭ法の適用例を示す図である。
【図２２ａ】フィルタリング前の画像を示す図である。
【図２２ｂ】分解フィルタリング後の画像を示す図である。
【図２３ａ】本発明による単一画像についての完全処理を示すフローチャートである。
【図２３ｂ】本発明による画像の重ね合わせ(superposition)を用いた同一スライドの異なる交配コンディションでの多数の画像についての完全処理を示すフローチャートである。
【図２３ｃ】本発明による上記処理を実施するために使用される画像についての最小処理を示すフローチャートである。
【図２４ａ】素子の初期画像を示す図である。
【図２４ｂ】スポットでの背景雑音の外挿により得られた背景雑音の画像を示す図である。
【図１】
2005530167.tif 000075
【図２】
2005530167.tif 000076
【図３】
2005530167.tif 000077
【図４】
2005530167.tif 000078
【図５】
2005530167.tif 000079
【図６】
2005530167.tif 000080
【図７】
2005530167.tif 000081
【図８】
2005530167.tif 000082
【図９】
2005530167.tif 000083
【図１０】
2005530167.tif 000084
【図１１】
2005530167.tif 000085
【図１２】
2005530167.tif 000086
2005530167.tif 000087
2005530167.tif 000088
2005530167.tif 000089
【図１５】
2005530167.tif 000090
【図１６】
2005530167.tif 000091
【図１７】
2005530167.tif 000092
【図１８】
2005530167.tif 000093
【図１９】
2005530167.tif 000094
【図２０】
2005530167.tif 000095
【図２１ａ】
2005530167.tif 000096
【図２１ｂ】
2005530167.tif 000097
2005530167.tif 000098
2005530167.tif 000099
【図２３ａ】
2005530167.tif 000100
【図２３ｂ】
2005530167.tif 000101
【図２３ｃ】
2005530167.tif 000102
2005530167.tif 000103
【国際調査報告】
2005530167.tif 000104
2005530167.tif 000105
2005530167.tif 000106
2005530167.tif 000107
2005530167.tif 000108
2005530167.tif 000109
2005530167.tif 000110
2005530167.tif 000111