(57)【要約】本発明は、アスペルギルス・ニガーから単離された新規なホスホリパーゼをコードする遺伝子を含む新たに同定されたポリヌクレオチド配列に関する。本発明は、上記新規な遺伝子の全長ヌクレオチド配列、上記新規なホスホリパーゼの全長コード配列を含むcDNA配列、並びに上記全長機能性タンパク質のアミノ酸配列およびその機能性等価物を特徴とする。また、本発明は、これら酵素の工業的プロセスにおける使用方法および真菌感染症の診断方法にも関する。また、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された細胞および本発明のホスホリパーゼが遺伝的に改変されてその活性および/または発現レベルを増強または低減させている細胞も、本発明に属する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３および１４からなる群より選ばれるポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３および１４からなる群より選ばれるポリヌクレオチドに高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしえる、請求項１記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
糸状菌から得られる、請求項１または２記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
アスペルギルス・ニガーから得られる、請求項３記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号３、６、９、１２および１５からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むホスホリパーゼまたはそれらの機能性等価物をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号３、６、９、１２および１５からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含むホスホリパーゼまたはそれらの機能性等価物の少なくとも一つの機能性ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１，１３および１４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列またはそれらの機能性等価物を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１，１３および１４からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが適切な宿主細胞中における発現に適した調節配列と機能的に連結した、請求項１〜８のいずれか１項記載のベクター。
【請求項１１】
適切な宿主細胞が糸状菌である、請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項記載のベクターで形質転換した宿主細胞を培養する工程を含む、前記ポリヌクレオチドまたは前記ベクターを製造する方法。
【請求項１３】
配列番号３、６、９、１２および１５からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する単離ホスホリパーゼまたはその等価物。
【請求項１４】
アスペルギルス・ニガーから得られる、請求項１３記載の単離ホスホリパーゼ。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項記載のベクターを適切な宿主細胞中で発現させることによって得られる、単離ホスホリパーゼ。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項記載のホスホリパーゼの機能ドメインを含む組換えホスホリパーゼ。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項記載のベクターで適切な宿主細胞を形質転換する工程、および、前記細胞を前記ポリヌクレオチドが発現可能な条件下で培養する工程、および場合により前記ポリヌクレオチドまたはベクターにコードされたポリペプチドを前記細胞または培地から精製する工程、を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項記載のホスホリパーゼを製造する方法。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項記載のベクターを含む、組換え体宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１３〜１６のいずれか１項記載のポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１３〜１６のいずれか１項記載のホスホリパーゼと反応する精製抗体。
【請求項２１】
請求項１３〜１６のいずれか１項記載のホスホリパーゼを含む融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１３〜１６のいずれか１項記載のホスホリパーゼを添加することを含む、生地の製造方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法によって調製された生地から焼成品を製造する方法。
【請求項２４】
生地および／またはその焼成製品を製造するための請求項１３〜１６のいずれか１項記載のホスホリパーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)から単離された新規なホスホリパーゼをコードする遺伝子を含む新たに同定されたポリヌクレオチド配列に関する。本発明は、上記新規な遺伝子の全長ヌクレオチド配列、上記新規なホスホリパーゼの全長コード配列を含むcDNA配列、並びに上記全長機能性タンパク質およびその機能性等価物のアミノ酸配列に関する。また、本発明は、工業的プロセスにおけるこれらの酵素の使用方法および真菌感染症の診断方法にも関する、また、本発明には、本発明のポリヌクレオチドで形質転換させた細胞および本発明のホスホリパーゼを遺伝的に改変してその発現活性および/または発現レベルを増強または低減させた細胞も包含される。
【背景技術】
【０００２】
リン脂質は外側(sn-1)と中央(sn-2)位置との２つのエステル化脂肪酸を有するグリセリン主鎖からなるが、グリセリンの第３ヒドロキシル基はリン酸でエステル化されている。そのリン酸は、例えば、エタノールアミン(ホスファチジルエタノールアミン)、コリン(ホスファチジルコリン)のようなアミノアルコールにエステル化され得る。また、第３ヒドロキシル基は、リン酸によってエステル化する代りに、ジガラクトシルジグリセリドにおけるようなガラクトースまたはそのダイマーのような糖残基に結合することができる。
ホスホリパーゼは、本明細書においては、上述のジガラクトシルジグリセリドを含むリン脂質中の１個以上の結合の加水分解に関与する酵素として定義する。
上記脂肪アシル成分をグリセリン主鎖に結合させている上記エステル結合(1個以上)を加水分解する幾つかのタイプのホスホリパーゼ活性を区別することができる。
・ ホスホリパーゼA1 (EC 3.1.1.32)およびA2 (EC 3.1.1.4)は、ジアシルグリセロリン脂質からの上記sn-1およびsn-2位置それぞれの1個の脂肪アシル基の脱アシル化を触媒作用してリソリン脂質を生成させる。
・ リソホスホリパーゼ (EC 3.1.1.5；Nomenclature Committee of the international Union of Biochemistry and Molecular Biology (Enzyme Nomenclature, Academic Press, New York, 1992)によりホスホリパーゼBとも称する)は、リソリン脂質中の残りの脂肪アシル基の加水分解を触媒作用する。ホスホリパーゼBは、ペニシリウム ノタツム(Penicillium notatum)から報告されており(Saito et al., 1991, Methods in Enzymology 197:446-456)、ジアシルグリセロリン脂質からの両脂肪酸の脱アシル化を触媒作用し、リソホスホリパーゼ活性を固有的に有する。
・ ガラクトリパーゼ(EC 3.1.4.3)は、ジガラクトシルジグリセリドからの上記sn-1およびsn-2位置それぞれの1個または双方の脂肪アシル基の加水分解を触媒作用する。
ホスホリパーゼC (EC 3.1.4.3)は、グリセリン主鎖とホスフェート基間のホスフェートエステル結合を、例えば、下記のように加水分解する：
ホスファチジルコリン＋H2O = 1.2-ジアシルグリセリン＋リン酸コリン
ホスホリパーゼD (EC 3.1.4.4)は、ホスフェート基とアミンアルコール間のホスフェートエステル結合を、例えば、下記のように加水分解する：
ホスファチジルコリン＋H2O = コリン＋ホスファチジン酸
【０００３】
ホスホリパーゼは、微生物において好都合に生産することができる。微生物ホスホリパーゼは、各種の供給源から入手することができる；バチルス種は細菌酵素の一般的な供給源であり、一方、真菌酵素はアスペルギルス種において一般的に産生される。
ホスホリパーゼ活性を有する真菌酵素は、クリプトコッカス ネオフォーマンス(Cryptococcus neoformans) (Chen et al, 1997, Infection and Immunity 65:405-411)、フソバクテリウム ネクロホルム(Fusobacterium necrophorum) (Fifis et al, 1996, Veterinary Microbiology 49:219-233)、ペニシリウム ノタツム(Penicillium notatum) (ペニシリウム クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)としても知られている；Kawasaki, 1975, Journal of Biochemistry 77:1233-1244；Masuda et al., 1991, European Journal of Biochemisty 202:783-787)、ペニシリウム シクロピウム(Penicillium cyclopium) (Mustranta et al, 1995, Process Biochemistry 30:393-401)、サッカロミセス セレビシエ(Saccaromyces cerevisiae) (Ichimasa et al, 1985, Agric, Biol. Chem. 49:1083-1089；Paultauf et al, 1994, J. Biol. Chem. 269:19725-19730)、トルラスポラ デルブルエキー(Torulaspora delbrueckii) (旧名 サッカロミセス ロセイ(Saccharomyces rosei)；Kuwabara, 1988, Agric. Biol. Chem. 52:2451-2458；Watanabe et al, 1994, REMS Microbiological Letters 124:29-34)、ニューロスポラ クラッサ(Neurospora Crassa) (Chakravarti et al, 1981, Archives of Biochemistry and Biophysics 206:393-402)、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger) (Technical Bulletin、G-zymeTM G6999、Enzyme Bio-Systems社；Mustranta et al., 1995、前出)、コルチシウム セントリヒュガム(Corticium centrifugum) (Uehara et al, 1979, Agric. Biol. Chem. 43:517-525)、フサリウム オキシスポラム(Fusarium oxysporum) (WO 98/26057号)、およびフサリウム ソラニ(Fusarium solani (Tsung-Che et al., 1968, Phytopathological Notes 58:1437-38)のような種々の供給源から報告されている。
真菌ホスホリパーゼ遺伝子は、ペニシリウム ノタツム(Masuda et al., 1991、前出)、トルラスポラ デルブルエキー(Watanabe et al, 1994, FEMS Microbiology Letters 124:29-34)、サッカロミセス セレビシエ(Lee et al., 1994, Journal of Biological Chemistry 269:19725-19730)、アスペルギルス(JP 10155493号)、ニューロスポラ クラッサ(EMBL O42791)、およびシゾサッカロミセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe) (EMBL O13857)のような幾つかの供給源からクローン化されている。
【０００４】
ホスホリパーゼは、リン脂質乳化剤の改変におけるような多くの工業的用途において使用することができる。リン脂質乳化剤の例はレシチンであり、これは、極性脂質含有量が少なくとも60％である極性脂質と中性脂質双方の混合物である。リン脂質乳化剤は多くの食品および非食品用途を有し、例えば、卵レシチンは、例えば、乳製品、とりわけマヨネーズ、ドレッシング、ペストリー等における乳化剤として使用されており、大豆レシチンは、例えば、(低カロリー)ソース、パン、マーガリン、化粧品等における乳化剤として使用されており、他のレシチンは、例えばチョコレート、牛の飼料において使用されている。ホスホリパーゼによるリン脂質乳化剤の改変は、油/水混合物の乳化を増大させ得る。ホスホリパーゼによるリン脂質乳化剤の改変は、改変リン脂質乳化剤の添加によって得られるエマルジョンの安定性を広いまたは異なるpHおよび/または温度範囲に亘って増大させ得る。ホスホリパーゼによるリン脂質乳化剤の改変は、改変リン脂質乳化剤の添加によって得られるエマルジョンの安定性をCa2+またはMg2+イオンの存在下において増大させ得る。
【０００５】
ホスホリパーゼの工業的用途のもう１つの例は、これらホスホリパーゼを植物油加工中の植物油のデガミング(脱ゴム質化)において使用し得ることである。典型的なデガミング方法においては、レシチンは、植物油、例えば、大豆油、菜種(キャノーラ)油、アマニ油、ひまわり油から、油相を水洗することにより(水と油の高剪断条件下での混合がレシチンの大部分を水相中に送り込み、これをその後セパレーター内で取り出す)、取除かれて、なかんずく、植物油の安定性を増大させている。このいわゆる水デガミング相においては、急速水和性リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミンのみが容易に除去される。非水和性リン脂質/ホスファチド、主としてリン脂質は、50％までのマグネシウムおよび/またはカルシウム塩からなり、水デガミング工程において容易に除去することはできない。非水和性リン脂質/ホスファチドのホスホリパーゼA2への暴露は、これらのリン脂質を水中でより可溶性とし、従って、水デガミング相において抽出するのをより容易にする。ホスホリパーゼの工業的用途のもう１つの例は、これらホスホリパーゼを使用して、グルコースシロップを製造するための小麦グルテンまたは小麦澱粉の糖化(α-アミラーゼおよびグルコアミラーゼによる)中に生ずる沈降物を除去することである。沈降物の除去は、得られるグルコースシロップのその後の濾過を著しく速くする。ホスホリパーゼ酵素の上述の工業的用途はほんの２、３の例であり、この例示は限定を意味するものではない。
【０００６】
食品におけるホスホリパーゼの工業的用途のさらにもう１つの例は、ホスホリパーゼがベーキング用途において生地または焼成製品の品質を改良するのにとりわけ有用であることである。小麦粉は、約2.2〜2.9%の脂質を含有している。小麦脂質は、澱粉脂質(0.8〜0.9％)と非澱粉脂質(1.4〜2.0％)に分けることができる。澱粉脂質が極性リソリン脂質から主としてなるのに対し、非澱粉脂質は約40％の中性トリグリセリドと40％の極性リン-およびグリコ脂質からなる。小麦脂質画分の最適化のためには、ホスホリパーゼAを添加することによって、生地中in situにリン脂質を加水分解することができる。
例えば、EP-A-109244号およびWO98/26057号は、パン製造におけるこのホスホリパーゼAの使用を記載している。チェコスロバキア特許 AO 190 264号においては、ホスファチジン酸(ホスホリパーゼD加水分解の生成物)を生地およびパンの改良剤として使用している。EP-A-075463号においては、ホスホリパーゼAとホスホリパーゼDの組合せを使用して生地-状態調節剤としてのリソホスファチジン酸を産生させている。
WO 00/32758号は、脂肪分解酵素のアミノ酸配列に変更を加えて所望活性レベルを増大させることによる脂肪分解酵素変異体の作製を記載している。ベーキング用途においては、フミキュラ(Humicula)群または接合菌(Zygomycetes)群の脂肪分解酵素からの変異体が、この変異体がホスホリパーゼおよび/またはジガラクトシルジグリセリド活性を有するようであるので、とりわけ有用であること判明している。WO 98/45453号は、アスペルギルス チュビゲンシス(Aspergillus tubigensis) (これもジガラクトシルジグリセリドに対し高加水分解活性を示す)に由来し得るリパ−ゼ活性を有するポリペプチドを記載している。しかしながら、これらの酵素は、比較的低い特異的活性が悩みである。
上記各方法においては、組換えDNA技術によって得られるホスホリパーゼを使用することが有利である。そのような組換え酵素は、その伝統的な精製対応物を上回る多くの利点を有する。組換え酵素は、低コスト価格、高収率で、細菌またはウイルスのような汚染因子がないのみならず細菌毒素または他の酵素活性を汚染することなく産生させ得る。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、上記問題の全てではないにしてもその少なくとも１つに対処する。
本発明の目的は、改良された諸特性を有する新規なホスホリパーゼをコードする新規なポリヌクレオチドを提供することである。さらなる目的は、天然にまたは組換え的に産生させたホスホリパーゼ並びにこれらを産生する組換え株を提供することである。また、融合ポリペプチド並びに本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造および使用方法も本発明の１部である。さらに詳細には、本発明の１つの目的は、ガラクトリパ−ゼ活性も有するホスホリパーゼを提供することである。
また、本発明の１つの目的は、上述の問題の少なくとも１つを解決する新規なホスホリパーゼを提供すること、あるいは生地の改良された強度、生地の改良された弾力性、生地の改良された安定性、生地の低減された粘着性、生地の改良された延伸性、生地の改良された機械加工性、焼成製品の増大した容量、焼成製品の改良されたパン身構造、焼成製品の改良された柔らかさ、焼成製品の改良された風味、焼成製品の改良された品質変化防止性(anti-staling)、焼成製品の改良された色合い、焼成製品の改良された皮からなる群から選ばれる生地および/または焼成製品において使用する場合の１つ以上の改良された特性を有する、または広汎な基質特異性を有する新規なホスホリパーゼを提供することである。
【０００８】
本発明は、新規なホスホリパーゼをコードする新規なポリヌクレオチドを提供する。さらに詳細には、本発明は、好ましくは高度にストリンジェントな条件下において、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれる配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。従って、本発明は、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれる１つ以上の配列と40％よりも高い相同性、たとえば約60％、好ましくは65％、より好ましくは70％、さらにより好ましくは75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％よりも高い相同性を有する核酸を提供する。
より好ましい実施態様においては、本発明は、糸状菌(とりわけ、アスペルギルス・ニガーが好ましい)から得ることのできるそのような単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
１つの実施態様においては、本発明は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその機能性等価物をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
さらに好ましい実施態様においては、本発明は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つの機能性ドメインまたはその機能性等価物をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
好ましい実施態様においては、本発明は、配列番号1、4、7、10および13からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むホスホリパーゼ遺伝子を提供する。別の局面においては、本発明は、アミノ酸配列が配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアスペルギルス・ニガーホスホリパーゼまたは該ポリペプチドの変異体もしくはフラグメントをコードするポリヌクレオチド、好ましくはcDNA、を提供する。好ましい実施態様においては、上記cDNAは、配列番号2、5、8、11および14からなる群から選ばれる配列またはその機能性等価物を有する。
【００１０】
さらに好ましい実施態様においては、本発明は、本発明のポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドを提供し、好ましくは、配列番号2、5、8、11および14からなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列を有する。
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクター、並びに本発明のDNAを増幅または検出するのに使用することができるプライマー、プローブおよびフラグメントにも関する。
さらに好ましい実施態様においては、本発明のポリヌクレオチド配列が、これにコードされるアミノ酸配列をアスペルギルス・ニガーまたは麹菌(A. oryzea)のような適切な宿主細胞中で発現するために適する調節配列と機能的に結合しているベクターを提供する。また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターの製造方法も提供する。
また、本発明は、本発明の異種または相同ポリヌクレオチドを含有する組換え産生させた宿主細胞にも関する。
【００１１】
別の実施態様においては、本発明は、本発明のホスホリパーゼの発現を有意に増大させているあるいはホスホリパーゼ活性を増大させている、組換え宿主細胞に関する。
別の実施態様においては、本発明は、本発明の異種または相同ポリヌクレオチドを含有し且つ本発明の機能性ホスホリパーゼを産生することができる組換え的に作製した宿主細胞、好ましくは本発明のホスホリパーゼを過発現することができる細胞、例えば、増大したコピー数の本発明の遺伝子またはcDNAを含むアスペルギルス株を提供する。
本発明の別の局面においては、精製したポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを含む。とりわけ好ましいのは、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能性等価物である。
また、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質も、本発明の範囲内に属する。本発明は、本発明のポリペプチドの製造方法も提供する。
また、本発明は、本明細書において説明するようなあらゆる工業的プロセスにおける本発明のホスホリパーゼの使用にも関する。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
ポリヌクレオチド
本発明は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するホスホリパーゼまたはその機能性等価物をコードするポリヌクレオチドを提供する。ホスホリパーゼ PLP03、PLP06、PLP15、PLP26およびPLP34をコードする５つの遺伝子の配列を、それぞれ、アスペルギルス・ニガーから得られた相応する各ゲノムクローンをシークエンシングすることによって決定した。本発明は、それぞれホスホリパーゼ PLP03およびPLP06およびPLP15およびPLP26およびPLP34をコードする遺伝子を含む各ポリヌクレオチド配列、並びにこれらの完全cDNA配列およびこれらのコード配列を提供する。従って、本発明は、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはその機能性等価物を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。
さらに詳細には、本発明は、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはその機能性等価物を含むポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下、好ましくは高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズしえる、単離されたポリヌクレオチドに関する。
有利には、そのようなポリヌクレオチドは、糸状菌、とりわけアスペルギルス・ニガーから得ることができる。さらに詳細には、本発明は、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列またはそれらの機能性等価物を有するポリペプチドの少なくとも１つの機能性ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１３】
本明細書において使用するとき、用語“遺伝子”および“組換え遺伝子”は、タンパク質、例えば、アスペルギルス・ニガーホスホリパーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、染色体DNAから単離し得る核酸分子を称する。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロンおよび調節配列を含み得る。さらにまた、遺伝子は、本明細書において定義するような単離核酸分子を称する。
本発明の核酸分子、例えば、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはその機能性等価物を有する核酸分子は、標準の分子生物学方法および本明細書において提示する配列情報を使用して単離することができる。例えば、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれる核酸配列の全部または１部をハイブリダイゼーションプローブとして使用することにより、本発明の核酸分子は、標準のハイブリダイゼーションおよびクローニング方法を使用して単離することができる(例えば、Sambrook, J. Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されているようにして)。
さらにまた、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれる核酸配列の全部または１部を含む核酸分子は、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群において含まれる配列情報に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によっても単離することができる。
本発明の核酸は、cDNA、mRNAまたはゲノムDNAを標準のPCR増幅方法に従うテンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして使用して増幅することができる。そのようにして増幅させた核酸は、適切なベクターとしてクローニングし、DNA配列分析によって特性決定することができる。
さらにまた、本発明のヌクレオチド配列に相応するまたは該配列に対しハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレオチドは、標準の合成方法により、例えば、自動化DNAシンセサイザーを使用して調製することができる。
【００１４】
１つの好ましい実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号2に示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号2の配列は、配列番号1に提示されているアスペルギルス・ニガーPLP03ホスホリパーゼ遺伝子のコード領域に相当する。このcDNAは、配列番号3に記載のアスペルギルス・ニガーPLP03ポリペプチドをコードする配列を含む。
第２の好ましい実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号5に示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号5の配列は、配列番号4に提示されているアスペルギルス・ニガーPLP06ホスホリパーゼ遺伝子のコード領域に相当する。このcDNAは、配列番号6記載のアスペルギルス・ニガーPLP06ポリペプチドをコードする配列を含む。
第３の好ましい実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号8に示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号8の配列は、配列番号7に提示されているアスペルギルス・ニガーPLP15ホスホリパーゼ遺伝子のコード領域に相当する。このcDNAは、配列番号9に記載のアスペルギルス・ニガーPLP15ポリペプチドをコードする配列を含む。
第４の好ましい実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号11の配列は、配列番号10に提示されているアスペルギルス・ニガーPLP26ホスホリパーゼ遺伝子のコード領域に相当する。このcDNAは、配列番号12に記載のアスペルギルス・ニガーPLP26ポリペプチドをコードする配列を含む。
第５の好ましい実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号14に示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号14の配列は、配列番号13に提示されているアスペルギルス・ニガーPLP34ホスホリパーゼ遺伝子のコード領域に相当する。このcDNAは、配列番号15に記載のアスペルギルス・ニガーPLP34ポリペプチドをコードする配列を含む。
【００１５】
別の好ましい実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはこれらの機能性等価物の相補鎖である核酸分子を含む。
別のヌクレオチド配列に対して相補的である核酸分子とは、他のヌクレオチド配列にハイブリダイズしそれによって安定な重複体を形成することができるような、他のヌクレオチド配列に対して十分に相補的な核酸分子である。
本発明の１つの局面は、本発明のポリペプチドまたは生物学的に活性なフラグメントもしくはドメインのようなその機能性等価物をコードする単離された核酸分子、並びに核酸分子の増幅または変異におけるPCRプライマーとしての使用に適する本発明のポリペプチドおよびそのような核酸分子のフラグメントをコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子に関する。
【００１６】
“単離されたポリヌクレオチド”（単離ポリヌクレオチド）または“単離された核酸”（単離核酸）とは、由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいてそれが直接隣接するコード配列の双方(5'末端のコード配列と3'末端のコード配列)とは直接隣接しないDNAまたはRNAである。即ち、１つの実施態様においては、単離された核酸は、コード配列に直接隣接する5'非コード(例えば、プロモーター)配列の幾つかまたは全てを含む。従って、上記用語は、例えば、ベクター中、自律複製プラスミドまたはウイルス中または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込んだ、あるいは他の配列から独立した別個の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生させたcDNAまたはゲノムDNAフラグメント)として存在する組換えDNAを含む。また、上記用語は、細胞物質、ウイルス物質、培養培地(組換えDNA法により産生させたとき)または化学先駆体もしくは他の化学物(化学合成したとき)を実質的に含まないさらなるポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の１部である組換えDNAも含む。さらにまた、“単離された核酸フラグメント”は、フラグメントとして天然には産生しないし且つ天然状態では見出せない核酸フラグメントである。
【００１７】
本明細書において使用するとき、用語“ポリヌクレオチド”または“核酸分子”は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えば、mRNA)並びにヌクレオチドアナログを使用して生成されたDNAまたはRNAのアナログを含むものとする。核酸分子は、一重鎖または二重鎖であり得るが、好ましくは二重鎖DNAである。核酸は、オリゴヌクレオチドアナログまたは誘導体(例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド)を使用して合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、例えば、改変された塩基対合能力またはヌクレアーゼに対する増大した耐性を有する核酸を調製することができる。
本発明のもう１つの実施態様は、本発明の核酸分子に対するアンチセンスである単離核酸分子を提供する。また、本明細書において説明する核酸分子の相補ストランドも、本発明の範囲内に属する。
【００１８】
シークエンシングの誤り
本明細書において提示するような配列情報は、誤って同定された塩基をも取込なければならないほど狭く解釈すべきでない。本明細書において開示した特定の配列は、糸状菌、とりわけアスペルギルス・ニガーからの完全な遺伝子を単離するために容易に使用することができるし、その遺伝子は、引続き、さらなる配列分析に供することができ、それによってシークエンシング誤差を同定することができる。
特に断らない限り、本発明においてDNA分子をシークエンシングすることによって決定した全てのヌクレオチド配列は自動化DNAシークエンサーを使用して決定したし、本発明において決定したDNA分子がコードするポリペプチドの全てのアミノ酸配列は上述のようにして決定したDNA配列の翻訳によって予測した。従って、この自動化方法によって決定するどのDNA配列についても当該技術において知られているように、本発明において決定したどのヌクレオチド配列も若干の誤差を含み得る。自動化により決定したヌクレオチド配列は、シークエンシングしたDNA分子の実際のヌクレオチド配列に対し、典型的には少なくとも約90％同一、より典型的には少なくとも約95％から少なくとも約99.9％同一である。実際の配列は、当該技術において周知の手動DNAシークエンシング方法を含む他の方法によってさらに正確に決定することができる。また、当該技術において知られているように、実際の配列に比較して決定したヌクレオチド配列中の1個の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを生じさせて、決定したヌクレオチド配列がコードする予測アミノ酸配列が、そのような挿入または欠失点から始まって、シークエンシングしたDNA分子が実際にコードするアミノ酸配列と完全に異なるようになるであろう。
当業者であれば、そのような誤って同定された塩基を特定することは可能であるし、またそのような誤差を如何にして修正するかは承知していることである。
【００１９】
核酸フラグメント、プローブおよびプライマー
本発明の核酸分子は、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれる核酸配列の１部またはフラグメントのみ、例えば、本発明のタンパク質の１部をコードするプローブ、プライマーまたはフラグメントとして使用することができるフラグメントを含み得る。ホスホリパーゼ遺伝子およびcDNAのクローニングにより決定したヌクレオチド配列は、他のホスホリパーゼ群メンバーおよび他の種からのホスホリパーゼホモログを同定および/またはクローニングするのに使用するように設計したプローブおよびプライマーの産生を可能にする。これらのプローブ/プライマーは、典型的には、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはその機能性等価物の少なくとも約12または15個、好ましくは約18または20個、好ましくは約22または25個、より好ましくは約30、35、40、45、50、55、60、65または75個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドに好ましくは高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。
本明細書において開示したヌクレオチド配列に基づくプローブは、例えば他の生物体中の同じまたは相同性タンパク質をコードする転写物(主としてmRNA)またはゲノム配列を検出するのに使用することができる。好ましい実施態様においては、上記プローブは、結合させた標識基をさらに含み、例えば、標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素共同因子であり得る。そのようなプローブは、ホスホリパーゼを発現する細胞の同定用の診断試験キットの１部としても使用することができる。
【００２０】
同一性および相同性
用語“相同性”または“％同一性”は、本明細書においては互換的に使用する。本発明の目的において、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の％同一性を決定するためには、各配列を最適の比較目的のために整列（アラインメント）させること(例えば、ギャップを第１のアミノ酸の配列または核酸配列中に第２アミノ酸または核酸配列との最適整列のために導入し得ること)が明確にされる。相応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置での各アミノ酸残基またはヌクレオチドをその後比較する。第１配列中の１つの位置が第２配列中の相応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合は、各分子はその位置で同一である。２つの配列間の％同一性は、各配列が占める同一位置数の関数である(即ち、％同一性 = 同一である位置の数/総位置数(即ち、重複位置数)×100)。好ましくは、２つの配列は、同じ長さである。
【００２１】
当業者であれば、２つの配列間の相同性を決定するために数種のコンピュータプログラムが利用可能であることは承知していることであろう。例えば、２つの配列間の配列比較および％同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい実施態様においては、２つのアミノ酸配列間の％同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)のGAPプログラム中に組み込まれているNeedlemanおよびWunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))のアルゴリズムを使用し、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか並びにギャップ重み付け16、14、12、10、8、6または4および長さ重み付け1、2、3、4、5および6を使用して決定する。当業者であれば、これらの異なるパラメーターは全て僅かに異なる結果を与えるが、２つの配列の全体的％同一性は異なるアルゴリズムを使用した場合も有意には変わらないことを認識していることであろう。
【００２２】
さらに別の実施態様においては、２つのヌクレオチド配列間の％同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)のGAPプログラムを使用し、NWSgapndna. CMPマトリックス並びにギャップ重み付け40、50、60、70または80および長さ重み付け1、2、3、4、5または6を使用して決定する。もう１つの実施態様においては、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の％同一性は、ALIGNプログラム(バージョン 2.0) (http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgiで利用可能)に組み込まれているE. MeyersおよびW. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)のアルゴリズムを使用し、PAM120重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップペナルティ4を使用して決定する。
本発明の核酸およびタンパク質配列は、さらに“照会配列”として使用して、一般データベースに対して検索を行い、例えば、他の群メンバーまたは関連配列を同定することができる。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のBLASTNおよびBLASTXプログラム(バージョン 2.0)を使用して実施することができる。BLASTヌクレオチド検索は、BLASTNプログラム、スコア = 100、ワード長 = 12により実施して、本発明のPLP03核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索は、BLASTXプログラム、スコア = 50、ワード長 = 3により実施して、本発明のPLP03タンパク質分子に相同性のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のギャップ化アラインメントを得るためには、ギャップBLASTを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されているようにして使用することができる。BLASTおよびギャップBLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム(例えば、BLASTXおよびBLASTN)のデフォルトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００２３】
ハイブリダイゼーション
本明細書において、用語“ハイブリダイズする”とは、互いに対して少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、さらにより好ましくは少なくとも約80〜90％、さらに好ましくは少なくとも95％相同性である各ヌクレオチド配列が典型的に互いに対してハイブリダイズしたままであるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を記述することを意図している。
そのようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約45℃での6x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中におけるハイブリダイゼーション、続いて50℃、好ましくは55℃、好ましくは60℃、より好ましくは65℃での1xSSC、0.1％SDS中における１回以上の洗浄である。
【００２４】
高度にストリンジェントな条件には、例えば、5xSSC/5xデンハルト溶液(Denhardt's solution)/1.0% SDS中における68℃でのハイブリダイゼーションおよび室温での0.2xSSC/0.1% SDS中における洗浄が含まれる。あるいは、洗浄は、42℃で行っても良い。
当業者であれば、ストリンジェントおよび高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためにどのような条件を適用すべきかは承知している。そのような条件に関するさらなる手引きは、当該技術において、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；および Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.)において容易に利用することができる。
勿論、ポリA配列(mRNAの3'末端ポリ(A)領域のような)またはT(またはU)残基の相補的ストレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドがポリ(A)ストレッチまたはその相補物を含有する任意の核酸分子(例えば、実際上任意の二重鎖cDNAクローン)にハイブリダイズすることから、本発明の核酸の１部に特異的にハイブリダイズさせるのに使用する本発明のポリヌクレオチド中には含まれないであろう。
【００２５】
他の生物体からの全長DNAの取得
典型的な方法においては、他の生物体、例えば、糸状菌、とりわけ各種のアスペルギルスから構築されたcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。
例えば、各アスペルギルス株をノーザンブロット分析により相同なポリヌクレオチドについてスクリーニングすることができる。本発明のポリヌクレオチドに対して相同な転写体を検出するときは、当業者にとって周知の標準方法を使用して、適切な株から単離したRNAからcDNAライブラリーを構築することができる。また、全ゲノムDNAライブラリーを、本発明のポリヌクレオチドに対してハイブリダイズ可能なプローブを使用してスクリーニングしてもよい。
相同な遺伝子配列は、例えば、本明細書において教示しているようなヌクレオチド配列に基づき設計した２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを使用してPCRを実施することによっても単離することができる。
【００２６】
反応用のテンプレートは、本発明のポリヌクレオチドを発現することが知られているまたは発現する可能性のある株から調製したmRNAの逆転写によって得られたcDNAであり得る。PCR生成物は、サブクローニングしシークエンシングして、増幅配列が新たなPLP03核酸配列またはその機能性等価物の配列を示すのを確実にすることができる。
その後、PCRフラグメントを使用して、各種公知の方法により全長cDNAクローンを単離することができる。例えば、増幅フラグメントを標識して、バクテリオファージまたはコスミドcDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。また、標識フラグメントを使用してゲノムライブラリーをスクリーニングすることもできる。
PCR技術は、他の生物体からの全長cDNA配列を単離するためにも使用することができる。例えば、RNAは、標準の手順に従って適切な細胞または組織源から単離することができる。第１ストランド合成を開始させるため、増幅されたフラグメントの殆どの5'末端に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して逆転写反応をRNAに対して実施することができる。
その後、得られたRNA/DNAハイブリッドは、標準の末端トランスフェラーゼ反応を使用して“テーリング”することができ(例えば、グアニンにより)、このハイブリッドはRNA分解酵素H (RNase H)により消化することができ、その後、第２ストランド合成を開始することができる(例えば、ポリ-Cプライマーにより)。このようにして、増幅フラグメント上流のcDNA配列を、容易に単離することができる。有用なクローニング方法の検討のためには、例えば、前出のSambrook等および前出のAusubel等を参照されたい。
【００２７】
ベクター
本発明のもう１つの局面は、本発明のタンパク質またはその機能性等価物をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用するとき、用語“ベクター”は、ベクターに結合した別の核酸を輸送することのできる核酸分子を称する。１つのタイプのベクターは“プラスミド”であり、プラスミドは、更なるDNAセグメントを連結させ得る環状二重鎖DNAループを称する。別のタイプのベクターは、さらなるDNAセグメントをウイルスゲノム中に連結させ得るウイルスベクターである。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中で自己複製可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター)は、宿主細胞中に導入するときに宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらにまた、ある種のベクターは、それらを機能的に連結させた遺伝子の発現を指令させ得る。そのようなベクターは、本明細書においては、“発現ベクター”と称する。一般に、組換えDNA技術において使用される発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。用語“プラスミド”と“ベクター”は、プラスミドが最も一般的に使用される形のベクターであるので、本明細書においては、互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、等価の機能を奏するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス)のような他の形の発現ベクターも包含するものとする。
【００２８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適する形で、本発明の核酸を含む。その形とは、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に機能的に連結したた、発現に使用する宿主細胞に基づき選択される１つ以上の調節配列を含むこと意味する。組換え発現ベターにおいて、“機能的に連結した”とは、目的とするヌクレオチド配列を調節配列(１つ以上)に該ヌクレオチド配列の発現が(例えば、in vitro転写/翻訳系において、またはベクターを宿主細胞中に導入する場合には宿主細胞中で)可能であるように結合させることを意味するものとする。用語“調節配列”は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図している。そのような調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的または誘導性発現を指令する調節配列およびある種の宿主細胞中のみでヌクレオチド配列の発現を指令する調節配列(例えば、組織特異性調節配列)が含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計は形質転換させる宿主細胞の選択、所望タンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることは認識していることであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入し、それによって、本明細書において説明するような核酸によってコードされたタンパク質またはペプチド(例えば、ホスホリパーゼ、変異体ホスホリパーゼ、そのフラグメント、その変異体または機能性等価物、融合タンパク質等)を産生させることができる。
【００２９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞中でホスホリパーゼを発現するように設計することができる。例えば、本発明のタンパク質は、大腸菌およびバチルス種のような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用する)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)においてさらに説明されている。また、この組換え発現ベクターは、in vitroで、例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを使用して転写および翻訳することもできる。
【００３０】
本発明において有用な発現ベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド；バクテリオファージ；酵母エピソーム；酵母染色体因子；バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスに由来するベクター、並びにこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドおよびファージミドのような、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝的要素に由来するベクターが含まれる。
DNA挿入物は、適切なプロモーターに、例えば、２、３例を挙げれば、ファージラムダPLプロモーター、大腸菌 lac、trpおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスのプロモーターLTRに機能的に連結させるべきである。当業者であれば、他の適切なプロモーターは承知していることであろう。特定の実施態様においては、糸状菌においてホスホリパーゼの高発現レベルを指令させ得るプロモーターが好ましい。そのようなプロモーターは、当該技術において公知である。発現構築物は、転写開始、末端用の部位、および転写領域における翻訳用のリボソーム結合部位を含有し得る。発現構築物によって発現した成熟転写体のコード部分は、翻訳させるポリペプチドの末端に適切に配置された、開始部の翻訳開始AUGコドン、および終結コドンを含む。
【００３１】
ベクターDNAは、原核細胞または真核細胞中に通常の形質転換またはトランスフェクション方法により導入することができる。本明細書において使用するとき、用語“形質転換”および“トランスフェクション”は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション法、形質導入法、感染法、リポトランスフェクション法、カチオン性脂質介在トランスフェクション法またはエレクトロポレーション法のような各種の技術的に認識された外来核酸(例えば、DNA)の宿主細胞中への導入方法を称するものとする。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションする適切な方法は、Sambrook等 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)、およびその他の実験室手引書において見出することができる。
【００３２】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション方法に依存して、細胞のごく一部のみが外来DNAをそのゲノム中に組込み得ることが知られている。これらの組込み体を同定および選抜するためには、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性)をコードする遺伝子が注目する遺伝子と一緒に宿主細胞中に一般に導入される。好ましい選択マーカーとしては、G418、ハイグロマイシンおよびメタトレキサートのような薬剤に対する耐性を付与するマーカーがある。選択マーカーをコードする核酸は、好ましくは、本発明のタンパク質をコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入するか、あるいは別個のベクター上に導入することができる。導入核酸を安定的にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選抜によって同定することができる(例えば、選択マーカーを組込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する)。
【００３３】
原核生物中でのタンパク質の発現は、しばしば、融合または非融合タンパク質の発現を指令する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターによって大腸菌中で実施する。融合ベクターは、これらベクター中にコードされたタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端にいくつかのアミノ酸を付加させる。そのような融合ベクターは、典型的には、以下の３つの目的を奏する： 1) 組換えタンパク質の発現を増大させる；2) 組換えタンパク質の溶解性を増大させる；および 3) アフィニティ精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助長する。多くの場合、融合発現ベクターにおいては、タンパク質分解切断部位を融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入して、融合タンパク質の精製後、融合部分からの組換えタンパク質の単離を可能にする。そのような酵素またはその同族認識配列としては、Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼがある。
【００３４】
説明したように、発現ベクターは、好ましくは、選択マーカーを含有する。そのようなマーカーとしては、真核細胞培養用のジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性、および大腸菌および他の細菌における培養用のテトラシリンまたはアンピシリン耐性がある。適切な宿主の代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス(Streptomyces)およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)のような細菌細胞；酵母のような真菌細胞； Drosophila S2およびSpodoptera Sf9のような昆虫細胞；CHO、COSおよびボーズ(Bowes)メラノーマのような動物細胞；および植物細胞がある。上述した宿主細胞における適切な培養培地および条件は、当該技術において公知である。
【００３５】
細菌において使用するのに好ましいベクターには、Qiagen社から入手することができるpQE70, pQE60およびPQE-9；Stratagene社から入手し得るpBSベクター、ファージスクリプト(Phagescript)ベクター；ブルースクリプト(Bluescript)ベクター、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A；およびPharmacia社から入手し得るptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5がある。好ましい真核ベターには、Stratagene社から入手し得るPWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZT1およびpSG；およびPharmacia社から入手し得るpSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVLがある。他の適切なベクターは、当業者にとって容易に明らかであろう。
本発明において使用する公知の細菌プロモーターとしては、大腸菌lacIおよびlacZプロモーター、T3およびT7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモーターおよびtrpプロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(“RSV”)のプロモーターのようなレトロウイルスLTRのプロモーター、およびマウスメタロチオネイン-Iプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターがある。
【００３６】
ベクター中へのエンハンサー配列の挿入は、高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写を増大させ得る。エンハンサーは、通常およそ10〜300 bpのDNAのcis-作用因子であり、与えられた宿主細胞タイプ中でプロモーターの転写活性を増大させるように作用する。エンハンサーの例には、bp 100〜270の複製起点の後期側に位置するSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
小胞体の内腔中、細胞周辺腔または細胞外環境への翻訳タンパク質の分泌のために、適切な分泌シグナルを発現ポリペプチド中に組込むことができる。このシグナルは、発現ポリペプチドに対して内在性であっても異種シグナルであってもよい。
上記ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形で発現させることができ、また分泌シグナルのみならずさらなる異種機能性領域を含むことができる。このように、例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を上記ポリペプチドのN-末端に付加させて、精製中またはその後の取扱いおよび保存中の宿主細胞内での安定性および持続性を改良することができる。また、ペプチド成分を上記ポリペプチドに付加させて精製を容易にすることもできる。
【００３７】
本発明のポリペプチド
本発明は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列、または配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるポリヌクレオチド配列を適切な宿主内で発現させることによって得ることのできるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。また、上記ポリペプチドの機能性等価物を含むペプチドまたはポリペプチドも、本発明内に包含される。上記のポリペプチドは、用語“本発明のポリペプチド”に集合的に包含される。
用語“ペプチド”および“オリゴペプチド”は同義と考えられ(一般的に認められているように)、各用語は、その概念がペプチジル結合によってカップリングした少なくとも2個のアミノ酸の連鎖を示すことを必要とするので、互換的に使用することができる。用語“ポリペプチド”は、本明細書においては、7個よりも多いアミノ酸残基を含有する連鎖について使用する。本明細書における全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右に且つアミノ末端からカルボキシ末端への方向で記載する。本明細書において使用するアミノ酸の１文字コードは、当該技術において一般的に知られており、Sambrook等 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)において見出することができる。
【００３８】
“単離された”ポリペプチドまたはタンパク質とは、その生来の環境から取出されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。例えば、宿主細胞中で発現させた組換産生ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な方法、例えば、Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988)に開示されているような１工程精製法によって実質的に精製されている天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的において単離されたもの考える。
本発明のホスホリパーゼは、組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーのような周知の方法によって回収し精製することができる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー(“HPLC”)を精製に使用する。
本発明のポリペプチドには、天然精製生成物、化学合成手法の生成物、並びに例えば、細菌、酵母、真菌、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞のような原核または真核宿主から組換え法によって産生させた生成物が含まれる。組換え製造手法において使用する宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されることもグリコシル化されないこともある。さらに、本発明のポリペプチドは、幾つかの場合においては、宿主介在プロセスの結果として、開始修飾メチオニン残基も含み得る。
【００３９】
タンパク質フラグメント
また、本発明は、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントにも関する。
本発明のポリペプチドの生物学的活性フラグメントは、本発明のホスホリパーゼのアミノ酸配列(例えば、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列)と十分に同一であるか、または該配列に由来する、全長タンパク質よりも少ないアミノ酸数を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、且つ相応する全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示す。典型的には、生物学的活性フラグメントは、相応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のタンパク質の生物学的活性フラグメントは、例えば、長さにおいて10個、25個、50個、100個またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドであり得る。さらにまた、他のタンパク質領域が欠失している他の生物学的活性部分も、組換え法によって調製でき、本発明のポリペプチド生来の形の生物学的活性の１つ以上について評価することができる。
また、本発明は、上記ホスホリパーゼの生物学的活性フラグメントをコードする核酸フラグメントも特徴とする。
【００４０】
融合タンパク質
本発明のタンパク質またはその機能性等価物、例えば、その生物学的に活性な部分は、非ホスホリパーゼポリペプチド(例えば、異種アミノ酸配列)に機能的に連結させて融合タンパク質を調製することができる。本明細書において使用するとき、ホスホリパーゼ“キメラタンパク質”または“融合タンパク質”は、非ホスホリパーゼポリペプチドに機能的に連結したホスホリパーゼポリペプチドを含む。
好ましい実施態様においては、融合タンパク質は、本発明のホスホリパーゼの少なくとも１つの生物学的に活性なフラグメントを含む。別の好ましい実施態様においては、融合タンパク質は、本発明のホスホリパーゼの少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質においては、用語“機能的に連結した”とは、ホスホリパーゼと非ホスホリパーゼポリペプチドがホスホリパーゼのN-末端またはC-末端のいずれかで互いにインフレームで融合していることを意味するものとする。
【００４１】
例えば、１つの実施態様においては、上記融合タンパク質は、ホスホリパーゼ配列をGST配列のC-末端に融合させたGSTホスホリパーゼ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組換えホスホリパーゼの精製を容易にすることができる。別の実施態様においては、上記融合タンパク質は、そのN-末端において異種シグナル配列を含有するホスホリパーゼタンパク質である。ある種の宿主細胞(例えば、哺乳動物および酵母宿主細胞)においては、ホスホリパーゼの発現または分泌は、異種シグナル配列の使用によって増大させることができる。
別の例においては、バキュロウイルスエンベロープタンパク質のgp67分泌配列を異種シグナル配列として使用することができる(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992)。真核異種シグナル配列の他の例としては、メリチンおよびヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ(Stratagene社；カリフォルニア州ラ ホーヤ)の分泌配列がある。さらに別の例においては、有用な原核異種シグナル配列は、phoA分泌シグナル(Sambrook et al.,前出)およびプロテインA分泌シグナル(Pharmacia Biotech社；ニュージャージー州ピスカタウェー)を含む。
【００４２】
シグナル配列は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの分泌および単離を容易にするのに使用することができる。典型的には、シグナル配列は、一般的には１回以上の切断事象において分泌中の成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアを特徴とする。そのようなシグナルペプチドは、シグナル配列が分泌経路を通過するときに成熟タンパク質からシグナルの切断を可能にするプロセッシング部位を含有する。シグナル配列は、発現ベクターで形質転換させた真核宿主からの分泌のようにタンパク質の分泌を指令し、シグナル配列はその後または同時に切断される。その後、タンパク質は、細胞外の培地から技術的に知られた方法により容易に精製できる。また、シグナル配列は、GSTドメインによるような、精製を容易にする配列を使用して注目するタンパク質に結合させることもできる。即ち、例えば、上記ポリペプチドをコードする配列を、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列のようなマーカー配列に融合させることができる。本発明のこの局面ある種の好ましい実施態様においては、マーカー配列は、pQEベクター(Qiagen社)中で調整されたタグのようなヘキサヒスチジンペプチドであり、なかんずく、その多くは商業的に入手可能である。Gentz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。HAタグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相応する精製において有用なもう１つのペプチドである(このペプチドは、例えば、Wilson et al., Cell 37:767 (1984)に記載されている)。
【００４３】
好ましくは、本発明のキメラまたは融合タンパク質は、標準の組換えDNA法によって作製される。例えば、種々のポリペプチド配列をコードする各DNAフラグメントを、通常の方法に従い、例えば、連結反応のための平滑末端または付着末端の採用、適切な終結を与えるための制限酵素消化、適切であれば付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ、および酵素連結反応を使用することによって、インフレームで一緒に結合させる。別の実施態様においては、融合遺伝子を、自動化DNAシンセサイザーのような通常の通常の方法によって合成することができる。また、遺伝子フラグメントのPCR増幅を、２つの連続遺伝子フラグメント間に相補的突出部(オーバーハング)を生じさせるアンカープライマーを用いて実施し、その後アニーリングし再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成させることもできる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992を参照されたい)。さらにまた、融合成分をすでにコードしている多くの発現ベクターが商業的に入手可能である(例えば、GSTポリペプチド)。本発明の核酸は、そのような発現ベクター中にクローニングして、上記融合成分を上記融合成分に枠内で結合させて本発明のタンパク質を含有する融合タンパク質を発現するようにすることができる。
【００４４】
機能性等価物
用語“機能性等価物”および“機能性変異体”は、本明細書においては互換的に使用する。ホスホリパーゼをコードするDNAの機能性等価物は、本明細書において定義するようなアスペルギルス・ニガーホスホリパーゼの特定の機能を示すポリペプチドをコードする単離されたDNAフラグメントである。本発明のホスホリパーゼポリペプチドの機能性等価物は、本明細書において定義するようなアスペルギルス・ニガーホスホリパーゼの少なくとも１つの機能を示すポリペプチドである。従って、機能性等価物は、生物学的活性フラグメントも包含する。
機能性タンパク質等価物またはポリペプチド等価物は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸の保存的置換のみを含む、または非本質的アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を含み得る。従って、非本質的アミノ酸は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列において生物学的機能を実質的に変えることなく改変し得る残基である。例えば、本発明のホスホリパーゼタンパク質群中に保存されているアミノ酸残基は、とりわけ改変に順応し得ないものと予測される。さらにまた、本発明のホスホリパーゼタンパク質および他のホスホリパーゼの中に保存されたアミノ酸も、改変に対して順応性ではないだろう。
用語“保存的置換”とは、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換える置換を意味するものとする。これらの群は、当該技術において公知であり、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ-分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
【００４５】
機能性核酸等価物は、典型的には、サイレント変異、すなわちコードされたポリペプチドの生物学的機能を変化させない変異を含有する。従って、本発明は、特定の生物学的活性に対して本質的でないアミノ酸残基に変化を含むホスホリパーゼタンパク質をコードする核酸分子を提供する。そのようなタンパク質は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列とアミノ酸配列において異なるが、それらのタンパク質は少なくとも１つの生物学的活性を依然として保持している。１つの実施態様においては、上記単離された核酸分子は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上相同性である実質的に相同性のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
例えば、表現型的にサイレントアミノ酸置換をどのようにして行うかに関する手引きは、Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-1310 (1990)に提供されており、その著者らは、変化に対するアミノ酸配列の許容性を試験するには２つの主要方法があると示唆している。第１の方法は、変異が天然の選択により許容されたかまたは拒絶されたかという進化のプロセスに依存している。第２の方法は、遺伝子操作を使用してクローニングした遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入し、選択またはスクリーニングして機能を維持している配列を同定している。著者等が説明しているように、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換について驚くほど寛容であることを明らかにしている。著者等は、どの変化がタンパク質のある種の位置において寛容され得るかをさらに示している。例えば、殆どの埋め込まれたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするのに対し、表面側鎖の特徴は一般にほとんど保持されていない。他のそのような表現型的にサイレントな置換は、前出のBowie等および本明細書において引用した文献に記載されている。
【００４６】
配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるタンパク質に対し相同なタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号1および2、4および5、7および8、10および11、13および14それぞれからなる群から選ばれるコードヌクレオチド配列中に１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入して、コードされるタンパク質中に１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を導入することによって生成することができる。そのような変異は、部位特異的変異導入およびPCR介在変異導入のような標準方法によって導入することができる。
用語“機能性等価物”は、本発明において提供するようなアスペルギルス・ニガーホスホリパーゼのオルソログ(orthologues)も包含する。アスペルギルス・ニガーホスホリパーゼのオルソログは、他の種または株から単離し得るタンパク質であり、同様なまたは同一の生物学的活性を有する。そのようなオルソログは、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列に実質的に相同性であるアミノ酸配列を含むものとして容易に同定することができる。
【００４７】
本明細書において定義したように、用語“実質的に相同”とは、第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と、前記第１のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が前記第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と共通ドメインを有するように、前記第２のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と十分な数または最低限の数の同一または等価(例えば、同様な側鎖を有する)のアミノ酸またはヌクレオチドを含有することをいう。例えば、約60％、好ましくは65％、より好ましくは70％、さらにより好ましくは75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の同一性を有する共通ドメインを含有する各アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、本明細書においては、十分に同一性であると定義する。
また、他のホスホリパーゼ群のメンバーをコードし、従って、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸も、本発明の範囲に属する。さらにまた、異なる種からのホスホリパーゼタンパク質をコードし、従って配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸も、本発明の範囲に属する。本発明のDNAの変異体(例えば、天然のアレル変異体)およびホモログに相応する核酸分子は、本明細書において開示したcDNAまたはその適切なフラグメントを好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準ハイブリダイゼーション法に従うハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書において開示した核酸とのその相同性に基づき単離することができる。
本明細書において開示したアスペルギルス・ニガー配列の天然に存在するアレル変異体に加えて、当業者であれば、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれるヌクレオチド配列中に変異を導入し、それによってタンパク質の機能を実質的に変えることなくホスホリパーゼタンパク質のアミノ酸配列中に変化をもたらし得ることは、理解するであろう。
【００４８】
本発明の別の局面においては、改良されたホスホリパーゼが提供される。改良されたホスホリパーゼは、少なくとも１つの生物学的活性が改良されているタンパク質である。そのようなタンパク質は、変異をコード配列の全部または１部に沿って（飽和変異導入によるようにして）無作為に導入することによって得ることができ、得られた変異体は組換え的に発現させ、生物学的活性についてスクリーニングすることができる。例えば、当該技術はホスホリパーゼの酵素活性を測定する標準アッセイ法を提供しており、従って、改良されたタンパク質は容易に選択することができる。
好ましい実施態様においては、本ホスホリパーゼは、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する。別の実施態様においては、本ホスホリパーゼは、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し実質的に相同であり、それぞれ配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるホスホリパーゼの少なくとも１つの生物学的活性を保持しているが、上述したような自然変異または変異導入によってアミノ酸配列において異なっている。
【００４９】
さらに好ましい実施態様においては、本ホスホリパーゼは、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれる核酸に対してハイブリダイズし得る、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る、単離された核酸フラグメントによってコードされるアミノ酸配列を有する。従って、本ホスホリパーゼは、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
とりわけ、本ホスホリパーゼは、配列番号3に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質であり；あるいは、本ホスホリパーゼは、配列番号6に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質であり；あるいは、本ホスホリパーゼは、配列番号9に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質であり；あるいは、本ホスホリパーゼは、配列番号12に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質であり；あるいは、本ホスホリパーゼは、配列番号15に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００５０】
また、本発明のタンパク質の機能性等価物は、例えば、本発明のタンパク質の変異体、例えば短縮変異体の組合せライブラリーをホスホリパーゼ活性についてスクリーニングすることによって同定することができる。１つの実施態様においては、変異体の多様性ライブラリーは核酸レベルにおいてコンビナトリアル変異導入によって生成される。変異体の多様性ライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素により結合して遺伝子配列とし、潜在的タンパク質配列の縮重された組が個々のポリペプチドとしてあるいはより大きな融合タンパク質の組として発現されるようにする(例えば、ファージディスプレイ法において)ことによって生成することができる。本発明のポリペプチドの潜在的変異体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成させるのに使用し得る種々の方法が存在する。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は、当該技術において公知である(例えば、Narang (1983) Tetrahedron 39:3；Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323；Itakura et al. (1984) Science 198:1056；Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたい)。
【００５１】
さらに、本発明のポリペプチドのコード配列のフラグメントライブラリーを使用して、その後の変異体選択のスクリーニングのための多様性ポリペプチド集団を生成させることも可能である。例えば、コード配列フラグメントのライブラリーは、注目するコード配列の二重鎖PCRフラグメントをヌクレアーゼでニックが分子当りおよそ1回のみ生ずる条件下で処理し、二重鎖DNAを変性し、DNAを復元して種々のニックの入った生成物からのセンス/アンチセンス対を含み得る二重鎖DNAを生成させ、再生させた二重鎖から一重鎖部分をS1ヌクレアーゼによる処理によって除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターへ結合させることによって生成させ得る。この方法により、注目するタンパク質の種々の大きさのN-末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【００５２】
点変異または短縮により生成したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子生成物をスクリーニングするためおよびcDNAライブラリーを選択した特性を有する遺伝子生成物についてスクリーニングするための幾つかの方法が当該技術において知られている。大きな遺伝子ライブラリーのスクリーニングにおいて、高スループット分析に供しやすい最も広く使用されている方法は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングし、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換させ、そしてコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が当該遺伝子(その生成物が検出された)をコードするベクターの単離を容易にする条件下において発現させることを含む。再帰的アンサンブル変異導入(REM)、即ち、ライブラリー中の機能性変異体の頻度を上げる方法を本発明のタンパク質の変異体を同定するスクリーニングアッセイと組合せて使用することができる(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815；Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331)。
当業者にとっては、本ホスホリパーゼのアミノ酸配列中に変化をもたらし得るDNA配列多型が集団内に存在し得ることは自明であろう。そのような遺伝的多型は、天然のアレル変異のために異なる集団からの細胞中または１つの集団内からの細胞中にも存在し得る。アレル変異体も機能性等価物を含み得る。
本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、機能性ポリペプチドをコードしていないポリヌクレオチドも含み得る。そのようなポリヌクレオチドは、PCR反応用のプローブまたはプライマーとして機能する。
【００５３】
本発明の核酸は、これらの核酸が機能性または非機能性ポリペプチドのいずれをコードするかどうかにかかわらず、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーとして使用することができる。ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードしていない本発明の核酸分子の使用は、なかんずく、(1) 本発明のホスホリパーゼをコードする遺伝子またはそのアレル変異体をcDNAライブラリーから単離すること、例えばアスペルギルス・ニガー以外の生物体由来のcDNAライブラリーから単離すること；(2) Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)に記載されているように、PLP03遺伝子の正確な染色体位置付けを得るための分裂中期染色体スプレッディングに対するin situハイブリダイゼーション(例えば、FISH)；(3) 特異的な組織および/または細胞におけるホスホリパーゼmRNA発現を検出するためのノーザンブロット分析；および (4) 与えられた生物学的サンプル(例えば、組織)中のホスホリパーゼプローブにハイブリダイズ可能な核酸の存在を分析する診断手段として使用し得るプローブおよびプライマーを含む。
【００５４】
また、ホスホリパーゼをコードする遺伝子またはcDNAの機能性等価物の取得方法も本発明に包含される。そのような方法は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれる配列またはその変異体の全部または１部をコードする単離された核酸を含む標識プローブを取得し；ライブラリー中の核酸フラグメントへの上記標識プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下において、上記標識プローブを用いて核酸フラグメントライブラリーをスクリーニングし、それによって核酸二重鎖を形成させ；そして、任意の標識二重鎖中の上記核酸フラグメントから全長遺伝子配列を調製してホスホリパーゼ遺伝子に関連する遺伝子を取得することを必要とする。
【００５５】
１つの実施態様においては、本発明の核酸は、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13および14からなる群から選ばれる核酸配列またはその相補配列に対し少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上相同である。
別の好ましい実施態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対し少なくとも40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上相同である。
【００５６】
宿主細胞
別の実施態様においては、本発明は、本発明に包含される核酸を含有する細胞、例えば、形質転換宿主細胞または組換え宿主細胞を特徴とする。“形質転換細胞”または“組換え細胞”とは、本発明の核酸を組換えDNA法によって導入した細胞(またはその祖先が本発明の核酸が導入されていた細胞)である。原核細胞および真核細胞のどちらも含まれ、例えば、細菌、真菌、酵母等が含まれ、特に好ましいのは、糸状菌、とりわけアスペルギルス・ニガーの細胞である。
挿入配列の発現を調節し、あるいは遺伝子生成物を特定の所望の形で修飾しまたはプロセッシングする宿主細胞を選択することができる。タンパク質生成物のそのような修飾(例えば、グリコシル化)またはプロセッシング(例えば、切断)は、タンパク質が最適に機能することを容易にすることがある。
【００５７】
種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセッシングおよび修正において特徴的且つ特異的なメカニズムを有する。発現させた外来タンパク質の所望の正確な修正およびプロセッシングを確実にするように、分子生物学および/または微生物学技術において当業者によく知られた適切な細胞株または宿主系を選定することができる。この目的のためには、１次転写体の適切なプロセッシング機構、遺伝子生成物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。そのような宿主細胞は、当該技術において周知である。
また、宿主細胞としては、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK,、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38のような哺乳動物細胞株、および脈絡叢細胞株もある。
必要に応じて、本発明のポリペプチドは、安定的にトランスフェクションされた細胞株によって産生させ得る。哺乳動物細胞の安定的トランスフェクションに適する多くのベクターは、一般的に入手でき、そのような細胞株の構築方法も、一般的に、例えば、Ausubel等(前出)において知られている。
【００５８】
抗体
本発明は、さらに、本発明のホスホリパーゼに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体のような抗体を特徴とする。
本明細書において、用語“抗体(Ab)”または“モノクローナル抗体(Mab)”とは、PLP03タンパク質に特異的に結合し得る完全な分子および抗体フラグメント(例えば、FabおよびF(ab')2フラグメントのような)を含むことを意味する。FabおよびF(ab')2フラグメントは、完全な抗体のFcフラグメントを欠き、循環からより急速に消滅し、完全抗体の非特異組織結合性をあまり有さない(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983))。即ち、これらのフラグメントが好ましい。
本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製することができる。例えば、ホスホリパーゼまたはその抗原性フラグメントを発現する細胞を動物に投与してポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導することができる。好ましい方法においては、ホスホリパーゼの調製物を調製し精製して調製物が天然不純物を実質的に含まないようにする。その後、そのような調製物を動物に導入して、比活性のより大きなポリクローナル抗血清を産生させる。
【００５９】
最も好ましい方法においては、本発明の抗体は、モノクローナル抗体(またはそのホスホリパーゼ結合性フラグメント)である。そのようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製することができる(Kohler et al., Nature 256:495 (1975)；Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)；Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981))。一般に、そのような手法は、動物(好ましくは、マウス)を本発明のタンパク質によりまたは本発明のタンパク質を発現する細胞により免疫することを含む。そのようなマウスの脾臓細胞を抽出し、適切なミエローマ細胞株と融合させる。任意の適切なミエローマ細胞株を本発明に従って使用することができる；しかしながら、好ましくは、メリーランド州ロックビルのAmerican Type Culture Collectionから入手することができる親ミエローマ細胞株(SP2O)を使用する。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をHAT培地中で選択的に維持し、その後、Wands等(Gastro-enterology 80:225-232 (1981))に記載されているようにして、制限希釈によりクローニングする。次に、そのような選択によって得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、PLP03抗原を結合することができる抗体を分泌するクローンを同定する。一般に、このポリペプチドは、前出のAusubel等に記載されているようにして、KLHのような担体タンパク質に結合させ、アジュバントと混合し、宿主哺乳類中に注入することができる。
【００６０】
具体的には、注目するポリペプチドを注射することによって種々の宿主動物を免疫することができる。適切な宿主動物の例としては、ウサギ、マウス、モルモットおよびラットがある。限定するものではないが、フロイントのアジュバント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロニック(pluronic)ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、BCG (カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム パルヴム(Corynebacterium parvum)のような種々のアジュバントを使用して、宿主種に依存する免疫応答を増強させ得る。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血清に由来する複数抗体分子の不均質集団である。
そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDのような任意の免疫グロブリン種およびそれらの任意のサブクラスを有し得る。本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養し得る。
【００６１】
一旦作製されたならば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、本発明のタンパク質またはその機能性等価物の特異的認識についてイムノアッセイ、例えば、前出のAusubel等に記載されているような標準の方法を使用するウェスタンブロットまたは免疫沈降分析のような、イムノアッセイにおいて試験する。本発明のタンパク質またはその機能性等価物に特異的に結合する抗体は、本発明において使用することができる。例えば、そのような抗体は、本発明のタンパク質を病原性または非病原性のアスペルギルス株中で(例えば、アスペルギルス抽出物中で)検出するイムノアッセイにおいて使用することができる。
【００６２】
好ましくは、本発明の抗体は、高頻度の荷電残基のような基準により、抗原性でありそうな本発明のタンパク質のフラグメントを使用して生成される。例えば、そのようなフラグメントは、PCRの標準方法により作製され、次いで、pGEX発現ベクター(Ausubel等、前出)中にクローニングされる。その後、融合タンパク質を大腸菌中で発現させ、前出のAusubel等に記載されているようなグルタチオンアガロースアフィニティマトリックスを使用して精製する。所望であれば、いくつかの(例えば、2または3)の融合体を各タンパク質について作製し、各融合体を少なくとも２羽のウサギに注入することができる。抗血清は、典型的には少なくとも３回のブースター注射を含む一連の注射により上昇させ得る。典型的には、抗血清は、組換えPLP03ポリペプチドまたはその機能性等価物を免疫沈降させる能力についてチェックし、一方、無関係のタンパク質を免疫反応の特異性に対する対照として使用することができる。
また、１本鎖抗体の作製について記載された方法(米国特許第4,946,778号および第4,704,692号)を使用して本発明のタンパク質またはその機能性等価物に対する１本鎖抗体を作製することもできる。ファージディスプレイライブラリーを作成しスクリーニングするキットは、例えば、Pharmacia社から商業的に入手可能である。
さらに、抗体提示ライブラリーの作成およびスクリーニングにおいて使用するのにとりわけ適する方法および試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；PCT公告 WO 92/18619号；PCT公告 WO 91/17271号；PCT公告 WO 20791号；PCT公告 WO 92/20791号；PCT公告 WO 92/15679号；PCT公告 WO 93/01288号；PCT公告 WO 92/01047号；PCT公告 WO 92/09690号；PCT公告 WO 90/02809号；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372；Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse et al. (1989) Science 246;1275-1281；Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734において見出することができる。
【００６３】
本発明のタンパク質またはその機能性等価物を特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、本発明のタンパク質またはその機能性等価物をコードする遺伝子の発現を検出するために、例えば、他のアスペルギルス株において検出するために、使用することができる。例えば、本発明のタンパク質は、アスペルギルス細胞または抽出物の通常のイムノアッセイにおいて容易に検出できる。適切なアッセイ法としては、限定するものではないが、ウェスタンブロット法、ELISA法、ラジオイムノアッセイ(RIA)法等がある。
“特異的に結合する”とは、抗体が特定の抗原、例えば、本発明のタンパク質を認識してこれに結合するが、サンプル中の他の無関係の分子に実質的に認識し結合することはないことを意味する。
抗体は、例えば、ポリペプチド抗原を樹脂上に固定するアフィニティクロマトグラフィー法によって精製することができる。
本発明のタンパク質に対する抗体(例えば、モノクローナル抗体)は、アフィニティクロマトグラフィーおよび免疫沈降のような標準の方法によって本発明のタンパク質を単離するのに使用できる。さらにまた、そのような抗体は、上記タンパク質(例えば、細胞分解物または細胞上清中の)を検出して上記タンパク質発現の量およびパターンを評価するのに使用することができる。また、本抗体は、例えば、細胞または組織中のタンパク質レベルを臨床検査手順の１部としてモニターし、例えば、アスペルギルス症の診断における与えられた治療処方の有効性を確認する診断上でも使用することができる。
【００６４】
抗体を検出可能な物質と結合させることにより、検出が容易になり得る。検出可能な物質の例には、各種酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼがあり；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが含まれ；発光物質の例には、ルミノールがあり；生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれ；適切な放射性物質には、125I、131I、35Sまたは3Hが含まれる。
抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、タンパク質の表面に位置する領域、例えば、親水性領域である。タンパク質の疎水性プロットは、親水性領域を同定するのに使用することができる。
【００６５】
本発明のタンパク質の抗原性ペプチドは、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるアミノ酸配列の少なくとも7個、好ましくは10、15、20または30個の連続アミノ酸残基を含み、上記ペプチドに対して生成された抗体が上記タンパク質との特異的な免疫複合体を形成するような上記タンパク質のエピトープを包含する。上記抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、本発明のタンパク質の表面に位置するタンパク質領域、例えば、親水性領域、疎水性領域、アルファヘリックス含有領域、ベータ-ストランドまたはシート含有領域、コイル領域、ターン領域および可撓性領域である。
【００６６】
イムノアッセイ
生物学的サンプル中の本発明のタンパク質の定性的または定量的測定は、技術的に公知の任意の方法を使用して行い得る。抗体をベースとする技術は、生物学的サンプル中の特異的ポリペプチドレベルをアッセイするのに特別な利点を提供する。これらにおいては、特異的認識は一次抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)によって与えられるが、二次検出系は、蛍光、酵素または他の接合二次抗体を使用することができる。結果として、免疫複合体が得られる。
従って、本発明は、下記の各工程を含む、ある生物体がアスペルギルスに感染しているかどうかを診断する方法を提供する：
・アスペルギルスに感染した疑いのある生物体から生物学的サンプルを単離する工程；
・前記生物学的サンプルを本発明の抗体と反応させる工程；
・免疫複合体が形成されたかどうかを決定する工程。
また、ウェスタンブロットまたはドット/スロットアッセイにおけるタンパク質の遊離のために、例えば、尿素または中性変性剤によって、組織を抽出することができる。この方法は、体液にも応用することができる。
【００６７】
本発明のタンパク質を検出するのに有用な他の抗体に基づく方法には、酵素免疫吸着アッセイ法(ELISA)およびラジオイムノアッセイ(RIA)法のようなイムノアッセイ法が含まれる。例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質を検出し定量するための免疫吸着物質および酵素標識プローブのどちらとしても使用することができる。サンプル中に存在する特定のタンパク質の量は、直線回帰コンピュータアルゴリズムを使用して、標準調製物中に存在する量に対する参照により算出することができる。別のELISAアッセイにおいては、２つの異なるモノクローナル特異性抗体を使用して生物学的液体中の本発明のタンパク質を検出することができる。このアッセイにおいては、１方の抗体を免疫吸着剤として、他方を酵素標識プローブとして使用する。
上記の各方法は、“ワンステップ”または“ツーステップ”アッセイとして本質的に実施することができる。“ワンステップ”アッセイは、本発明のタンパク質を固定抗体と接触させ、洗浄せずに、混合物を標識抗体と接触させることを含む。“ツーステップ”アッセイは、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを含む。他の通常の方法も適切なものとして使用することができる。アッセイ系の１つの成分を支持体上に固定し、それによって系の他の成分を上記成分と接触させサンプルから容易に取出すことが通常好ましい。
適切な酵素標識としては、例えば、オキシダーゼ由来のものがあり、これらは、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒作用する。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体/基質反応によって生成する過酸化水素濃度を測定することによりアッセイすることができる。
酵素以外に、他の適切な標識には、ヨウ素(125I、13II)、炭素(14C)、イオウ(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(112In)およびテクネチウム(99mTc)のような放射性同位元素、並びにフルオレセインおよびローダミン、およびビオチンのような蛍光標識が含まれる。
【００６８】
試験化合物の本発明のタンパク質に対する特異的結合は、例えば、本発明のタンパク質を基体、例えば、96ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル表面上に可逆的または不可逆的に固定させることによってin vitroで検出することができる。ポリペプチドおよび他の小分子を固定させる方法は、当該技術において周知である。例えば、上記マイクロタイタープレートは、本発明のタンパク質で、溶液中のタンパク質(典型的には、1〜100μlの容量中の0.05〜1 mg/ml濃度の)を各ウェル中に加え、プレートを室温ないし37℃で0.1〜36時間インキュベートすることによってコーティーングすることができる。プレートに結合していないタンパク質は、プレートからの過剰の溶液を振盪し、次いでプレートを水または緩衝液で洗浄(1回または繰返して)することによって除去することができる。典型的には、ポリペプチドは、水または緩衝液中に含まれる。その後、結合ポリペプチドを含まない緩衝液でプレートを洗浄する。プレート上の空いているタンパク質結合部位をブロックするために、プレートを結合ポリペプチドとは無関係のタンパク質でブロッキングする。例えば、Tris-HCl中2 mg/ml濃度の300μlのウシ血清アルブミン(BSA)が適している。適切な基体には、所定の架橋化学成分を含有する基体(例えば、例えばCorning Costar社(マサチューセッツ州ケンブリッジ)のポリスチレン、スチレン、ポリプロピレン基体のようなプラスチック基体)が含まれる。必要に応じて、ビーズ粒子、例えば、アガロースビーズまたはセファロースビーズを基体として使用してもよい。
【００６９】
試験化合物の本発明のタンパク質への結合は、当該技術において公知の任意の各種方法によって検出することができる。例えば、特異性抗体をイムノアッセイにおいて使用することができる。必要に応じて、抗体を標識し(例えば、蛍光または放射性同位元素によって)、直接検出することができる(例えば、West and McMahon, J. Cell Biol. 74:264, 1977を参照されたい)。また、２次抗体を検出において使用することもできる(例えば、抗-AN97抗体のFc部分に結合する標識抗体)。別の検出方法においては、本発明のタンパク質を標識し、その標識を検出する(例えば、本発明のタンパク質を放射性同位元素、蛍光体、発色団等で標識することにより)。さらにまた別の方法においては、光学的に検出することができるタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質(これはUV光下で検出することができる)との融合タンパク質として本発明のタンパク質を産生させる。別の方法においては、本発明のタンパク質をホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α-ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼのような検出可能な酵素活性を有する酵素と共有結合させるかあるいは融合させる。これらの酵素をコードする遺伝子はクローニングされており、当業者による使用において容易に利用することができる。所望であれば、融合タンパク質は抗原を含んでもよく、そのような抗原は通常の方法を使用してポリクローナルまたはモノクローナル抗体によって検出および測定することができる。適切な抗原には、酵素(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびα-ガラクトシダーゼ)および非酵素ポリペプチド(例えば、BSAおよびグロブリンのような血清タンパク質、およびカゼインのような乳タンパク質)が含まれる。
【００７０】
エピトープ、抗原および免疫原
別の局面においては、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ担持部分を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトープは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。“免疫原性エピトープ”は、タンパク質全体が免疫原であるときに抗体応答を誘導させるタンパク質の１部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上のいくつかの座に限定されるものと信じられている。一方、抗体が結合し得るタンパク質分子領域は、“抗原性エピトープ”として定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、抗原性エピトープの数よりも一般に少ない。例えば、Geysen, H. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1984)を参照されたい。
【００７１】
抗原性エピトープを担持する(即ち、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域を含有する)ペプチドまたはポリペプチドの選択に関しては、タンパク質配列の1部を模倣する比較的短い合成ペプチドがこの部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を一般的に生じさせ得ることが当該技術において周知である。例えば、Sutcliffe, J. G. et al., Science 219:660-666 (1984)を参照されたい。タンパク質反応性血清を誘導し得るペプチドはタンパク質の一次配列中に頻度高く提示されており、１群の単純な化学法則によって特徴付けることができ、インタクトなタンパク質の免疫優性領域(即ち、免疫原性エピトープ)にもアミノ末端またはカルボキシル末端にも限定されない。極めて疎水性であるペプチドおよび6個以下の残基のペプチドは、上記模倣タンパク質に結合する抗体を誘導するには一般に有効ではなく；それより長い可溶性のペプチド、とりわけプロリン残基を含有するペプチドは、通常有効である。前出のSutcliffe等、661頁。例えば、これらの手引きに従って設計された、インフルエンザウイルスの血球凝集素HAIポリペプチド鎖配列の75％に及ぶ8〜39個の残基を含有する20例のペプチドのうち18例は、HA1タンパク質または完全なウイルスと反応する抗体を誘導し；MuL Vポリメラーゼ由来の12例/12例のペプチドおよび狂犬病グリコプロテイン由来の18例/18例のペプチドは、それぞれのタンパク質を沈降させる抗体を誘導した。
【００７２】
従って、本発明の抗原性エピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体のような抗体を産生させるのに有用である。即ち、抗原性エピトープ担持ペプチドで免疫したドナー由来の脾臓細胞の融合によって得られたハイブリドーマは、一般に、高い割合で天然タンパク質と反応性の抗体を分泌する。前出のSutcliffe等、663頁。抗原性エピトープ担持ペプチドまたはポリペプチドによって生成させた抗体は上記模倣タンパク質を検出するのに有用であり、異なるペプチドに対する抗体は翻訳後プロセッシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の運命を追跡するに使用することができる。幾分短いペプチド(例えば、9個のアミノ酸)でも免疫沈降アッセイにおいて結合し、より大きいペプチドに置き換わり得ることが明らかにされているので、ペプチドおよび抗-ペプチド抗体は模倣タンパク質の種々の定性または定量アッセイ、例えば、拮抗アッセイにおいて使用することができる。例えば、Wilson, I.A. et al., Cell 37:767-778 at 777 (1984)を参照されたい。また、本発明の抗-ペプチド抗体は、例えば、当該技術において周知の方法を使用する吸着クロマトグラフィーにより、上記模倣タンパク質の精製においても有用である。
【００７３】
上記の手引きに従い設計される本発明の抗原性エピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる好ましくは少なくとも7個、より好ましくは少なくとも9個、最も好ましくは約15〜約30個のアミノ酸の配列を含有する。しかしながら、約30〜約50個のアミノ酸または本発明のポリペプチドの全体アミノ酸配列までおよび全体配列を含む任意の長さを含有する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大きい部分を含むペプチドおよびポリペプチドも、本発明のエピトープ担持ペプチドまたはポリペプチドであると考えられ、上記模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、本エピトープ担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を与えるように選択される(即ち、上記配列は比較的親水性の残基を含み、高度に疎水性の配列は排除されることが好ましい)；プロリン残基を含有する配列がとりわけ好ましい。
【００７４】
本発明のエピトープ担持ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を使用する組換え手段のような、ペプチドまたはポリペプチドを製造する通常のいかなる方法によっても調製することができる。例えば、抗-ペプチド抗体を産生させるために、短いエピトープ担持アミノ酸配列を、組換え産生および精製の際、および免疫の際に担体として作用する大きなポリペプチドに融合させることができる。
また、エピトープ担持ペプチドは、公知の化学合成方法を使用して合成することもできる。例えば、Houghtenは、HAIポリペプチドセグメントの単一のアミノ酸変異体を表す10〜20mgの248種の13残基のペプチドのような、多数のペプチドの簡単な合成方法を記載しており、これらは４週間足らずで調製され（ELISA形結合試験により）特性決定されている。Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985)。この“同時複数ペプチド合成(Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS))”法は、Houghten等の米国特許第4,631,211号(1986年)にさらに記載されている。この手法においては、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂が別々の溶媒透過性パケットに収容され、固相法に含まれる多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にしている。完全に手動的方法によって、500〜1000またはそれ以上の合成を同時に実施することができる。前出のHoughten等、5134頁。
【００７５】
本発明のエピトープ担持ペプチドまたはポリペプチドは、当該技術における周知の方法に従い、抗体を誘導するために使用することができる。例えば、Sutcliffe et al.、前出；Wilson et al.、前出；Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914；および Bittle, F.J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)を参照されたい。一般に、動物は、遊離のペプチドで免疫することができる；しかしながら、抗-ペプチド抗体力価は、そのペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)または破傷風トキソイドのようなマクロ分子担体に結合させることによって増強することができる。例えば、システイン含有ペプチドは、マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)のようなリンカーを使用して担体に結合させ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な結合剤を使用して担体に結合させ得る。ウサギ、ラットおよびマウスのような動物は、例えば、約100μgのペプチドまたは担体タンパク質とフロイントのアジュバントを含有するエマルジョンの腹腔内および/または皮内注射により、遊離ペプチドまたは担体結合ペプチドのいずれかによって免疫される。例えば、固形表面に吸着させた遊離ペプチドを使用するELISAアッセイによって検出し得る抗-ペプチド抗体の有用な力価を得るためには、数回のブースター注射が、例えば、約2週間の間隔で必要かもしれない。免疫した動物からの血清中の抗-ペプチド抗体力価は、抗-ペプチド抗体の選択により、例えば、当該技術において周知の方法に従う固形支持体上の上記ペプチドへの吸着および選択した抗体の溶出により増強され得る。
【００７６】
本発明の免疫原性エピトープ担持ペプチド、即ち、タンパク質全体が免疫原である場合に抗体応答を誘導するタンパク質のペプチド部分は、当該技術において公知の方法に従い、同定される。例えば、前出のGeysen等、1984年は、酵素免疫吸着測定法において反応させるのに十分な純度を有する数百種のペプチドの固形支持体上での迅速同時合成手法を開示している。その後、合成ペプチドと抗体との相互作用を、支持体からペプチドを取出すことなく、容易に検出している。このようにして、当業者であれば、所望タンパク質の免疫原性エピトープを担持するペプチドは、普通に同定することができる。例えば、Geysen等は、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質中の免疫学的に重要なエピトープの位置付けを、該タンパク質の全体213個のアミノ酸配列をカバーし得る全208種のヘキサペプチドの重複する組を合成することによって、7アミノ酸という解像度で行った。その後、20個のアミノ酸全てでエピトープ内の全ての位置を順次置換したペプチドの完全置換組を合成し、抗体との反応における特異性を与える特定のアミノ酸を決定した。このように、本発明のエピトープ担持ペプチドのペプチドアナログは、この方法により日常的に調製することができる。Geysenの米国特許第4,708,781号(1987年)には、所望タンパク質の免疫原性エピトープを担持するペプチドを同定する方法がさらに記載されている。
【００７７】
さらにまた、Geysenの米国特許第5,194,392号(1990年)には、注目する抗体の特定のパラトープ(抗原結合部位)に対して相補性であるエピトープの位相等価物(即ち、“ミモトープ”)であるモノマー(アミノ酸または他の化合物)の配列の一般的な検出または決定方法が記載されている。さらに一般的には、Geysenの米国特許第4,433,092号(1989年)は、注目する特定のレセプターのリガンド結合部位に対し相補性であるリガンドの位相等価物であるモノマー配列の検出または決定方法を記載している。同様に、ペルアルキル化オリゴペプチド混合物に関するHoughten, R. A.等の米国特許第5,480,971号(1996年)は、線状C1〜C7アルキルペルアルキル化オリゴペプチドおよびそのようなペプチド群およびライブラリー、並びに注目する受容体分子に優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためのそのようなオリゴペプチド群およびライブラリーの使用方法を開示している。このように、本発明のエピトープ担持ペプチドの非ペプチドアナログも、これらの方法により日常的に調製することができる。
【００７８】
ホスホリパーゼの工業的プロセスにおける使用
また、本発明は、いくつかの工業的および製薬的プロセスにおける本発明のホスホリパーゼの使用にも関する。これらのプロセスについて得られている長期の経験にもかかわらず、本発明のホスホリパーゼは、現在使用されている酵素を上回る多くの有意な利点を特徴とする。具体的な用途に依存して、これらの利点は、低生産コスト、基質に対する高特異性、抗原性の低さ、望ましくない副次的活性の低さ、適切な微生物において産生させたときの高収率、より適切なpHおよび温度範囲、最終製品のより良好な風味並びに食品等級および食品適法性(kosher aspect)のような特徴を含み得る。
【００７９】
本発明のホスホリパーゼの重要な特徴は、これらのホスホリパーゼが種々の用途に理想的に適する最適pHおよび温度の全範囲を網羅することである。例えば、多くの大規模プロセスは、例えば、微生物感染のリスクを制御するために、50℃以上の比較的高処理温度が有利である。本発明のいくつかのホスホリパーゼは、この要求を満たしているが、同時に、これらのホスホリパーゼがさらなる加熱処理による不活性化に耐えるほどの熱安定性は有していない。この後者の特徴は、残留酵素活性のないパンのような焼成製品のような最終製品を得る生産経路を可能にする。同様に、多くの飼料および食品は僅かに酸性のpH値を有し、結果として、酸性または中性近くのpH最適値を有するホスホリパーゼがそれらの加工において好まれる。本発明のホスホリパーゼは、この条件も同様に満たす。
本発明のホスホリパーゼは、リン脂質を加水分解することまたはその特定の開裂生成物を得ることが望まれる任意の用途において使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドの使用により、リソリン脂質、ジアシルグリセリン、コリン-またはエタノールアミンホスフェート、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミンおよび各種ホスファチデートを得ることができる。本発明のホスホリパーゼは、好ましくは、活性に最適なpHにおいて使用する。
本発明のホスホリパーゼは、炭水化物水溶液またはスラリー、特に澱粉加水分解物、とりわけ濾過するのが難しい小麦澱粉加水分解物をデガミングしてその濾過性を改良し濁った濾液を得るのに使用することができる。この処理は、当該技術において周知の方法を使用して実施することができる。例えば、EP-A-219,269号およびEP-A-808,903号を参照されたい。
【００８０】
本発明のホスホリパーゼは、食用油を当該ポリペプチドで処理してリン脂質の大部分を加水分解し、加水分解リン脂質を含有する水性相を食用油から単離することによって食用油中のリン脂質分を低減させる方法において使用することができる。そのような方法は、リン脂質を含有する任意の食用油、例えば、大豆油、菜種油およびひまわり油のような植物油の精製に応用することができる。ホスホリパーゼ処理前に、上記食用油は、好ましくは、例えば、湿式精製により、予備処理してスライム(粘液)を除去する。典型的には、上記食用油は、ホスホリパーゼによる処理の開始時にリン脂質としてのリンを50〜250 ppm含有し、上記処理により、リン値を5〜10 ppmより低くすることができる。ホスホリパーゼ処理は、ホスホリパーゼの水溶液を、好ましくは10μm未満の平均直径を有する液滴として分散させることによって実施する。水の量は、油に対して好ましくは0.5〜5質量％である。必要に応じて乳化剤を添加することができる。エマルジョンを維持するために機械的攪拌をおこなうことができる。ホスホリパーゼ処理は酵素性能を最大にする約3.5〜約5範囲のpHで実施することができ、または、トリグリセリンのアルカリ性加水分解(鹸化)を抑制するために約1.5〜3(例えば、2〜3)範囲のpHを使用することもできる。pHは、クエン酸、クエン酸塩緩衝液または塩酸を添加することによって調整することができる。適切な温度は、一般に30〜70℃(とりわけ30〜45℃、例えば、35〜40℃)である。反応時間は、典型的には1〜12時間(例えば、2〜6時間)である。適切な酵素量は、通常0.1〜10 mg/l (例えば、0.5〜5 mg/l)である。ホスホリパーゼ処理は、バッチ方式で、例えば、攪拌による１つのタンク中で実施することができ、または、連続的に、例えば、1連の攪拌タンク反応器で行うことも出来る。ホスホリパーゼ処理の後、水性相と油相の分離を行う。分離は、通常の手段、例えば、遠心分離によって実施することができる。水性相はホスホリパーゼを含有しており、この酵素はプロセス経済性を改良するのに再使用することができる。当該処理は、当該技術において公知の任意の方法を使用して実施することができる。例えば、米国特許第5,264,367号、EP-A-654,527号、JP-A-2-153997号を参照されたい。
【００８１】
焼成製品は、基本成分の小麦粉、水および任意成分としての塩とから通常調製される生地から製造する。焼成製品によるが、他の任意成分は、砂糖、風味料等である。発酵膨張製品においては、酸(発生性化合物)と重炭酸塩との組合せのような化学発酵膨張系の次に、主としてパン酵母を使用する。生地の取扱い特性および/または焼成製品の最終特性を改良するために、改良された特性を有する加工助剤を開発する絶え間のない努力がなされている。改良すべき生地特性としては、機械加工性、ガス保持能力等がある。改良すべき焼成製品の特性としては、パン塊容量、パン皮のパリパリ性(crispiness)、パン身のキメおよび柔軟性、風味および旨味、および賞味期限がある。現在存在する加工助剤は、２つの群、即ち、化学添加剤および酵素に分けることができる。
改良特性を有する化学添加剤としては、アスコルビン酸、ブロメートおよびアゾジカーボネートのような酸化剤；L-システインおよびグルタチオンのような還元剤；モノ/ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル(DATEM)、ステアロイル乳酸ナトリウム(SSL)またはステアロイル乳酸カルシウム(CSL)のような生地状態調節剤として作用するあるいはグリセリンモノステアレート(GMS)等のようなパン身軟化剤として作用する乳化剤；トリグリセリド(油脂)またはレシチンのような脂肪物質等がある。
現在では、化学添加剤は酵素に置換わる傾向にある。酵素は、より天然の化合物であり、従って、消費者により受容れられるものとみなされている。適切な酵素は、澱粉分解酵素、アルビノキシラン-および他のヘミセルロース分解酵素、セルロース分解酵素、酸化酵素、脂肪物質分解酵素およびタンパク質分解酵素からなる群から選択することができる。
また、本発明は、有効量の本発明のホスホリパーゼを生地に取り込むことを含む生地または焼成製品の製造方法にも関し、本発明のホスホリパーゼは、当該ポリペプチドを取り込んでいない生地または焼成製品に比較して生地または生地から得られた焼成製品の１つ以上の特性を改善する。
【００８２】
本明細書において、用語“生地に取り込む”とは、本発明のホスホリパーゼを生地、生地を製造するいずれかの成分、および/または、生地を製造する生地成分のいずれかの混合物、に添加することとして定義する。換言すれば、本発明のホスホリパーゼは、生地調製の任意の工程で添加することができ、１または２以上の工程で添加することができる。本発明のホスホリパーゼは、当該技術において周知の方法を使用して生地成分に添加され、混練され、ベーキングされて焼成製品が製造される。例えば、米国特許第4,567,046号、EP-A-426,211号、JP-A-60-78529号、JP-A-62-111629号およびJP-A-63-258528号を参照されたい。
本明細書において、用語“有効量”とは生地および/または焼成製品の注目する少なくとも１つの特性に対して測定可能な効果を生じさせるのに十分である、本発明のホスホリパーゼの量として定義する。
【００８３】
本明細書において、用語“改良された特性”とは、生地および/または生地から得られる製品、とりわけ焼成製品の任意の特性であって、本発明のホスホリパーゼを取り込んでいない生地または製品と比較して、本発明のホスホリパーゼの作用により改良されている特性として定義する。改良された特性には、限定するものではないが、生地強度の増大、生地弾力性の増大、生地安定性の増大、生地粘着性の低減、改良された生地延伸性、焼成製品の改良された風味、焼成製品の改良された品質変化防止性が含まれる。
改良された特性は、以下の実施例において説明する本発明の方法に従い本発明のポリペプチドを添加しておよび添加しないで製造した各生地および/または焼成製品の比較によって確認することができる。官能検査品質は、焼成製品業界においてよく確立されている手法を使用して評価することができ、例えば、熟練した風味試験者パネルの使用を含み得る。
【００８４】
本明細書において、用語“生地強度の増大”とは、一般により一層の弾力特性を有しおよび/または成型および成形するのにより一層の仕事量を必要とする生地の特性として定義する。
本明細書において、用語“生地弾力性の増大”とは、ある種の物理的歪みを受けた後にその元の形状を回復するより一層高い性向を有する生地の特性として定義する。
本明細書において、用語“生地安定性の増大”とは、機械的傷害に対する感受性がより一層小さく、従って、その形状および容量をより一層良好に維持する生地の特性として定義する。
本明細書において、用語“生地粘着性の低減”とは、付着性向、例えば生地製造装置中の表面に付着する性向がより一層低い、そして、熟練した試験焼き職人により経験的に評価されるかまたは当該技術において知られているようなテクスチャー アナライザー(例えば、TAXT2)の使用により測定される生地の特性として定義する。
本明細書において、“改良された生地延伸性”とは、増大した歪みまたは引伸ばしに破壊することなく供し得る生地の特性として定義する。
本明細書において、用語“生地の改良された機械加工性”とは、一般に粘着性がより一層低くおよび/またはより一層堅固でありおよび/またはより一層弾力性である生地の特性として定義する。
本明細書において、用語“焼成製品の増大した容量”は、典型的には伝統的な菜種置換方法（rapeseed displacement method）によって測定した一定パン塊の比容積(容積/質量)として測定する。
本明細書において、用語“焼成製品の改良されたパン身構造”とは、より一層微細でおよび/またはより一層薄いパン身中の気泡壁および/またはパン身中の気泡のより一層均一/均質な分布を有する焼成製品の特性として定義し、通常、熟練した試験焼き職人により経験的に評価される。
用語“焼成製品の改良された柔軟性”とは、“堅さ”の反対であり、本明細書においては、より一層容易に圧縮され、そして、熟練した試験焼き職人により経験的に評価されるかまたは当該技術において知られているようなテクスチャー アナライザー(例えば、TAXT2)の使用により測定される焼成製品の特性として定義する。
用語“焼成製品の改良された風味”は、熟練した試験パネルによって評価する。
本明細書において、用語“焼成製品の改良された品質変化防止性”とは、保存中の諸品質パラメーター（例えば、柔軟性および/または弾力性）の低減された劣化速度を有する焼成製品の特性として定義する。
【００８５】
本明細書において、用語“生地”は、混練またはロール加工するのに十分に堅固である穀物粉および他の成分との混合物として定義する。生地は、新鮮な、凍結した、事前露出した(pre-bared)あるいは予備ベーキングしたものであり得る。凍結生地の製造は、「凍結および冷蔵した生地およびバター」（Frozen and Refrigerated Doughs and Batters）にKulpおよびLorenzによって記載されている。
本明細書において、用語“焼成製品”は、柔らかいまたはパリパリする(crisp)特性のいずれかを有する、生地から製造される一切の製品として定義する。白色、明色または暗色いずれかの本発明によって有利に製造し得る焼成製品の例は、典型的にはローフまたはロール形のパン(特に、白色パン、全粒コムギパンまたはライ麦パン)、フランスバケットタイプパン、パスタ、ピタパン、トルティーヤ、タコス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クッキー、パイ皮、蒸しパンおよびパリパリしたパン等である。
本発明の方法において使用する本発明のホスホリパーゼおよび/または他の酵素は、当該使用に適する任意の形状であってよく、例えば、乾燥粉末、凝集粉末または粒状物、とりわけ非粉塵性粒状物；液体、とりわけ安定化液体；またはWO01/11974号およびWO02/26044号に記載されているような保護化酵素の形であってよい。粒状物および凝集粉末は、通常の方法により、例えば、本発明のホスホリパーゼを流動床造粒機内の担体上にスプレーすることにより製造することができる。担体は、適切な粒度を有する粒状コアからなり得る。担体は、可溶性または不溶性の、例えば、塩(NaClまたは硫酸ナトリウムのような)、糖(サクロースまたはラクトースのような)、糖アルコール(ソルビトールのような)、澱粉、米、ひき割りトウモロコシ、または大豆であってよい。本発明のホスホリパーゼおよび/または追加の酵素は、遅延放出配合物中に含ませることができる。遅延放出配合物の製造方法は、当該技術において周知である。確立された方法に従って砂糖、糖アルコールまたは他のポリオール、および/または乳酸または他の有機酸のような栄養上許容し得る安定剤を添加することにより、例えば、液体酵素調製物を安定化させることができる。
【００８６】
本発明のホスホリパーゼは、EP-A-0619947号、EP-A-0659344号およびWO 02/49441号に記載されているような酵母含有組成物中にも取り込ませることが出来る。
穀物粉のプレミックス中に含ませるには、本発明のポリペプチドは乾燥製品、例えば、非粉塵性粒状物の形であるのが有利であり、一方、液体と一緒に含ませるには、本発明のポリペプチドは有利には液体形である。
１種以上の追加の酵素を生地中に取り込ませることも出来る。追加の酵素は、哺乳動物および植物を含む任意の起源、好ましくは微生物(細菌、酵母または真菌)起源であってよく、当該技術において通常使用する方法によって取得することができる。
【００８７】
好ましい実施態様においては、追加の酵素は、アルファ-アミラーゼ(酵母によって発酵可能な糖を得るのにまた品質変化を遅延させるのに有用)またはベータ-アミラーゼのようなアミラーゼ；シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ；ペプチダーゼ、とりわけエクソペプチダーゼ(風味増強において有用)；トランスグルタミナーゼ；リパ−ゼ(生地または生地成分中に存在する脂質を改変して生地を軟質化させるのに有用)；ホスホリパ−ゼ；セルラーゼ；ヘミセルラーゼ、とりわけキシラナーゼのようなペントサナーゼ(生地の延伸性を増大させるペントサンの部分加水分解において有用)；プロテアーゼ(とりわけ硬質小麦粉を使用する場合のグルテン減衰において有用)；プロテインジスルフィドイソメラーゼ、例えば、WO 95/00636号に開示されているようなプロテインジスルフィドイソメラーゼ；グリコシルトランスフェラーゼ；ペルオキシターダーゼ(生地コンシステンシーを改良するのに有用)；ラッカーゼ；または、オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、アルドースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、リポキシゲナーゼもしくはL-アミノ酸オキシダーゼ(生地コンシステンシーを改良するのに有用)であり得る。
１種以上の追加の酵素活性を本発明の方法に従って加える場合、これらの活性は、本発明のポリペプチドと別々にあるいは一緒に、必要に応じてパン改良用および/または生地改良用組成物の構成成分(１種以上)として加えることができる。他の酵素活性は、上述の酵素のいずれであってもよく、確立されたベーキング手順に従って取り込ませることができる。
【００８８】
また、本発明は、本発明の方法によって得られる生地をベーキングして焼成製品を製造することを含む、焼成製品の製造方法にも関する。焼成製品を製造するための生地のベーキングは、当該技術において周知の方法を使用して実施することができる。
また、本発明は、本発明の方法によって製造される、生地および焼成製品それぞれにも関する。
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを含む、生地および/または生地から製造される焼成製品用のプレミックス、例えば、穀物粉組成物の形のプレミックスにも関する。用語“プレミックス”とは、本明細書においては、その通常の意味において、即ち、工業的パンベーキングプラント/設備においてだけでなく小売ベーカリーにおいても使用され得る一般的に穀物粉を含むベーキング材料の混合物として理解されるものとして定義する。プレミックスは、本発明のポリペプチドまたは前記ポリペプチドを含む本発明のパン改良用および/または生地改良用組成物を穀物粉、澱粉、砂糖または塩のような適切な担体と混合することによって調製することができる。本プレミックスは、他のパン改良用および/または生地改良用添加剤、例えば、上述した酵素を含む任意の添加剤を含有してよい。
【００８９】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを含む、粒状物または凝集粉末形態のベーキング用添加剤にも関する。該ベーキング用添加剤は、95％(質量)よりも多い25〜500μm範囲の粒子を含む狭い粒度分布を有する。
生地および焼成製品の製造において、本発明は、前記で定義した加工助剤、例えば、酸化剤(例えば、アスコルビン酸)、還元剤(例えば、L-システイン)、オキシドレダクターゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ)および/または多糖類修飾酵素(例えば、α-アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、枝分れ化酵素等)のような他の酵素および/またはタンパク質修飾酵素(例えば、エンドプロテアーゼ、エクソプロテアーゼ、枝分れ化酵素等)のような化学加工助剤と組合せて使用することができる。
【００９０】
実施例１  アスペルギルス・ニガーの発酵
本明細書において開示したようなヌクレオチド配列によってコードされるホスホリパーゼを、そのDNA配列を含有する発現プラスミドを構築し、アスペルギルス・ニガー株をこのプラスミドで形質転換し、そのアスペルギルス・ニガー株を下記の方法で生育させることによって得た。
アスペルギルス・ニガー株の新鮮胞子(106〜107)を20 mlのCSL培地(100mlフラスコ、バッフル)中に接種し、34℃および170rpmで20〜24時間増殖させた。100mlのCSM培地(500mlフラスコ、バッフル)中への5〜10mlのCSL予備培養物の接種後、上記株を34℃および170rpmで3〜5日間発酵させた。
細胞を含まない上清を、遠心分離によって50mlのグレイナー(Greiner)チューブ中に得た(30分間、5000rpm)。上清をGF/Aワットマンガラス微小繊維フィルター (150 mm)上で予備濾過して大きい粒子を除去し、４N KOHでpH 5に調整し(必要に応じて)、0.2μm(ビン頂部)フィルター上で吸引により滅菌濾過して真菌物質を除去した。上清を4℃(または−20℃)で保存した。
CSL培地は、以下からなっていた(1リットル当りの量)：100gのコーン・ステープ・ソリッズ(Corn Steep Solids) (Roquette社)、1gのNaH2PO4*H2O、0.5gのMgSO4*7H2O、10gのグルコース*H2Oおよび0.25 gのバシルドン(Basildon) (発泡防止剤)。各成分を半分量の水中に溶解し、pHをNaOHまたはH2SO4でpH 5.8に調整し、バッフルおよび発泡ボールを含む100mlの各フラスコを20mlの発酵培地で満たし、120℃で20分間滅菌し、その後、室温に冷却後に5000IU/mlのペニシリンと5mg/mlのストレプトマイシンを含有する200μlの溶液を各フラスコに添加した。
CSM培地は、以下からなっていた(1リットル当りの量)：150gのマルトース*H2O、60gのソイトーン(Soytone) (ペプトン)、1gのNaH2PO4*H2O、15gのMgSO4*7H2O、0.08gのTween 80、0.02gのバシルドン(発泡防止剤)、20gのMES、1gのL-アルギニン。各成分を半分量の水中に溶解し、pHをNaOHまたはH2SO4でpH 6.2に調整し、バッフルおよび発泡ボールを含む500mlの各フラスコを100mlの発酵培地で満たし、120℃で20分間滅菌し、その後、室温に冷却後に5000IU/mlのペニシリンと5mg/mlのストレプトマイシンを含有する1mlの溶液を各フラスコに添加した。
【００９１】
実施例２  本発明のホスホリパーゼの精製
工程１：限外濾過液の調製
実施例１において得られた各培養物の上清を限外濾過して、酵素活性測定およびベーキング試験を阻害し得る低分子汚染物を除去した。30mlの上清の限外濾過を、10kDaカットオフ値を有するフィルターを備えたミリポア ラブスケール(Millipore Labscale) TFF装置中で実施した。
色合いに応じて、各サンプルを、0.5mMのCaCl2を含む40ml容量の100mMの冷リン酸塩緩衝液 pH 6.0で3〜5回洗浄した。この酵素溶液の最終容量は30mlであった。今後、この溶液を“限外濾過液”と称する。
工程２：A280およびHPSECによるホスホリパーゼ濃度の測定
ホスホリパーゼに帰属させ得る280 nmにおける吸光度(A280)およびホスホリパーゼの算出した分子吸光係数から上記限外濾過液中のホスホリパーゼ濃度を算出した。A280の測定は、Uvikon XL Secomam分光光度計(Beun de Ronde社、オランダ国アブコウデ)で実施した。
酵素の分子吸光係数は、酵素分子当りのチロシン、トリプトファンおよびシステイン残基数から算出することができる(S.C. Gill and P.H. von Hippel, Anal. Biochem. 182, 319-326 (1989))。これらアミノ酸の分子吸光係数は、それぞれ、1280、5690および120 M-1.cm-1である。本発明のホスホリパーゼ中のチロシン、トリプトファンおよびシステイン残基の数は、配列番号3、6、9、12および15からなる群から選ばれるタンパク質配列から推定することができる。本発明のホスホリパーゼの算出吸光係数を表１に要約する。
【００９２】
表１
2005525818.tif 000002
【００９３】
ホスホリパーゼに起因する280 nmでの限外濾過液の吸光度(A280)は、酵素サンプルの純度に依存する。この純度を、HPSEC (高性能サイズ排除クロマトグラフィー)を使用して、TSK SW-XLカラム(300*7,8 mm；MW範囲 10〜300 kDa)によって測定した。溶出緩衝液は、25 mMのリン酸ナトリウム緩衝液 pH 6.0からなり、1 ml/分の流量で使用した。5〜100μlのサンプルを注入した。280 nmでの吸光度を測定した。
本発明のホスホリパーゼに起因する限外濾過液のA280を、上記クロマトグラムにおけるそれぞれのホスホリパーゼピークのピーク表面と280 nmで吸光する各ピークの総表面との比から得た。その後、限外濾過液中のホスホリパーゼ濃度を、限外濾過液のA280に上述の比を掛け、各ホスホリパーゼにおける算出吸光係数(1 mg/ml溶液；表１最右列)で割ることによって算出した。
【００９４】
実施例３  活性測定
実施例２で得られた各限外濾過液を下記の酵素活性測定に供した：
・ホスホリパーゼA1またはA2
・リソホスホリパーゼ
・ホスホリパーゼC
・ガラクトリパーゼ活性
・真菌アルファ-アミラーゼ
ホスホリパーゼAは、基質として1,2-ジチオジオクタノイル-ホスファチジルコリンを使用して、分光光学的に測定した。ホスホリパーゼAは、1位置(PLA1)または2位置(PLA2)のスルフィド結合を加水分解し、それによって4チオ-オクタン酸を遊離させ、この酸は、その後の反応において、4,4'-ジチオピリジンと反応して4-チオピリドンを生成する。後者は、334 nmに吸収のある4-メルカプトピリジンと互変異性的に平衡にある。反応は、0.1 Mの酢酸塩緩衝液 pH 4.0 + 0.2%のTriton-X110中で37℃で実施する。ホスホリパーゼA 1単位(PLA)は、上記反応条件において1分当り1マイクロモルの4チオ-オクタン酸を遊離させる酵素量として定義する。
【００９５】
リソホスホリパーゼ活性は、リソホスファチジルコリンを基質として使用して、31P-NMR分光光学的に測定した。リソホスホリパーゼは、エステル結合を加水分解し、それによってグリセリン成分から脂肪酸を遊離させる。そのようにして形成されたグリセロールホスホコリンを、NMRを使用して定量する。
反応は、1 mg/mlのリソホスファチジルコリンと5 mMのCaCl2をさらに含有する50 mMの酢酸緩衝液 pH 4.5中で、55℃で30分間実施する。
１リソホスホリパーゼ単位(LPC)は、上記反応条件において1分当り1マイクロモルの4グリセロールホスホコリンを生成させる酵素量として定義する。
【００９６】
ホスホリパーゼC活性は、基質としてパラ-ニトロフェニルホスホリルコリンを使用して、分光光学的に測定した。ホスホリパーゼCは、エステル結合を加水分解し、それによって405 nmに吸収のあるパラ-ニトロフェノールを遊離させる。
反応は、20 mMのCaCl2、0.25％のTriton X-100および20 mMのパラ-ニトロフェニルホスホリルコリンをさらに含有する100 mMの酢酸緩衝液 pH 5.0中で、37℃で7分間実施する。反応を停止し、pHを0.75容量の1 M TRIS溶液を１容量のアッセイ混合物に添加することによって上昇させ、その後、405 nmでの吸光を測定する(ε405 nm = 18500 M-1.cm-1)。
ホスホリパーゼC 1単位は、上記反応条件において1分当り1マイクロモルのパラ-ニトロフェノールを生成させる酵素量として定義する。
ガラクトリパ−ゼ活性は、基質としてジガラクトシルジグリセリドを使用し、Hirayama and Matsuda (1972) Agric. Biol. Chem. 36, 1831に記載された方法に従い、H-NMR分光測定により測定した。ガラクトリパーゼは、脂肪酸とグリセリン骨格間のエステル結合を加水分解し、それによって一方または両方の脂肪酸を遊離させる。
反応は、4 mMのCaCl2、0.2％のTriton X-100および1 mg/mlのジガラクトシルジグリセリド(脂質生成物)さらに含有する50 mMの酢酸緩衝液 pH 4.5中で、30℃で30分間実施する。
ガラクトリパーゼ1単位は、上記反応条件において1分当り1マイクロモルの脂肪酸を生成させる酵素量として定義する。
【００９７】
真菌アルファ-アミラーゼの活性は、ファデバス(Phadebas)アミラーゼ試験タブレット(Pharmacia社)を使用して測定した。ファデバスタブレットは、水不溶性澱粉基質とこの基質に架橋により結合した青色染料を含有する。基質は、真菌アミラーゼによって加水分解され、溶液中に溶解する染色された可溶性マルトデキストリンを放出する。参照真菌アルファアミラーゼ活性を含有する溶液を用いて較正曲線を作成した。
参照および未知サンプルから、適切な希釈液を50 mMのリンゴ酸緩衝液 pH 5.5中で調製した。5 mlの各サンプルを30℃で5分間インキュベートし、ファデバスタブレットを添加し、15分後に、1.0 mlの0.5 N水酸化ナトリウムを添加することによって反応を停止させた。混合物を5分間で室温に冷却し、その後、4.0 mlの水を添加し、手で振盪し、15分後、各サンプルを4700 rpmで10分間遠心処理した。上部層の吸光を620 nmで測定した。OD 620 nmは、真菌アルファアミラーゼ活性の尺度である。
真菌アミラーゼ1単位(FAU)は、本明細書においては、1時間当り1グラムの澱粉(100％乾燥物)を上記反応条件において既知の力価を有するヨウ素溶液との反応後に620 nmでの透過度を有する生成物に転化する酵素量として定義する。
【００９８】
表２a
実施例２において調製したような限外濾過液中のホスホリパーゼ活性
2005525818.tif 000003
【００９９】
表２b     実施例２において調製したような限外濾過液のA280nm法
により測定した単位/mgタンパク質でのホスホリパーゼ活性
2005525818.tif 000004
上述の活性以外に、グルコアミラーゼおよびキシラナーゼの微小な活性も存在するが、これらの酵素が実施例４において説明するベーキング試験において干渉しないほどに低い量であった。
【０１００】
実施例４  ベーキング試験１：小ローフ
小ローフを、200gの穀物粉(比80/20のKolibriTM/IbisTM)、1.4gの乾燥パン酵母(FermipanR)、4gの塩、3gの砂糖、10mgのアスコルビン酸、116gの水および2gの油脂を混合することによって得られた150グラムの生地片からベーキングした。ピンミキサー中で6分15秒間混合した後、生地を150グラム片に分割し、30℃で45分間ねかせ、パンチングし、さらに25分間ねかせ、成型し、釜入れした。ねかせは、90〜100％の相対湿度で行った。30℃で70分の最後のねかせ後、生地を225℃で20分間ベーキングした。
ベーキング試験における種々のホスホリパーゼの種々の効果(表３)を、限外濾過液と同じ量で添加した真菌アミラーゼを含有する対照と比較した(限外濾過液中の真菌アミラーゼ活性については、表２を参照されたい)。このことは、ホスホリパーゼと一緒に添加した真菌アミラーゼの量が（他のパラメーターではなく）特にローフ体積に影響を与えていることから必要であった。対照量の添加真菌アミラーゼを含むパン体積を100％とした。
【０１０１】
表３
2005525818.tif 000005
【０１０２】
ローフ体積は、Bread Volume Measurer(パン容量計量器) BVM-3 (RI Cards Instruments社、スウェーデン国ビケン)によって測定した。この測定の原理は、回転中のパンの周りのセンサーによって測定した超音波の反射に基づく。測定時間は45秒とした。
生地の粘着性と延伸性は、表３に示す尺度を使用して公認パン焼き職人により評価した。対象につき2個のローフの平均を測定した。
これらの試験の後、生地片を丸め、１回目のねかせを30℃で45分間実施し、その後、生地をパンチングし、成型し、釜入れし、30℃で75分間ねかせた。ねかせ中の相対湿度は、85％にセットした。
その後、ねかせた生地の安定性を、気泡、裂けた側面パン皮およびパン皮の不規則弯曲表面の存在によって判定した。生地片を225℃で20分間ベーキングした。ローフ容量をBVM-3法により測定した：表においては、同じ対象物からベーキングした2個のパンの平均を提示している。
パン身構造は、表３に示す尺度を使用して公認パン焼き職人により判定した。ローフをポリエチレンバッグ中に3日間室温で保存した後、パン身堅さをStevens Texture Analyserを使用して測定した。各ローフ中心からの2cm厚の2枚のスライスを、1.5インチ(3.81cm)直径、5mmの圧縮深さ(25％)および0.5mm/秒の圧縮速度のプローブを使用して、上記テクスチャーアナライザーにより分析した。表においては、2回測定の平均を示している。
パン皮色合は、表３に示す尺度に従って公認パン焼き職人により判定した。参照としては、オランダ型焼きパン(Dutch tin bread)における標準製法を使用した。
【０１０３】
パン身色合は、表３に示す尺度に従って公認パン焼き職人により判定した。対照パンのパン身色合を正常(3)として判定した。正対照としては、対照と同じ組成＋0.5％大豆粉末を有する２つの対象物のパンを使用した。ねかせおよびベーキング手順は、大豆粉末を含まない対照対照の手順と同じである。後者は、“優れている”と判定する。
パンの張出し頂部は、ベーキング用焼型に対する頂部の垂れ下りによって判定した；頂部端部が低いほど、判定は低い。垂れ下りが少ないほど、判定は良好である。
【０１０４】
表４
本発明のホスホリパーゼのベーキング性能
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【０１０５】
実施例５  ベーキング試験２：バタール
本発明のホスホリパーゼのベーキング性能をフランスタイプのパン、いわゆる“バタール”において試験した。標準ベーキング法におけるバタールの調製は、3000gの約20℃の小麦粉、70gの圧搾酵母、60gの塩、68ppmのアスコルビン酸、17ppmのFermizymeR P200 (真菌α-アミラーゼ)、30ppmのFermizymeR HS2000(真菌ヘミセルラーゼ)、7ppmのBakezymeR P500および1680mlの水(8〜10℃)を螺旋ミキサー(Diosna社：速度１で2分間；速度２で100Wh入力)中で混合することによって実施した。生地温度は27℃とした。生地の機械加工性をパン焼き職人によって手で分析した。生地を32℃および90％RHのねかせキャビネット内で15分間の塊りのままねかせた。その後、生地を350gの6片に分割し、丸め、32℃および90％RHで15分間ねかせた。この期間終了時に、生地片を型取りして成形し、32℃および90％RHでの90分間の最終ねかせを行った。十分にねかせた生地を生地片の長さにおいてカットし、240℃のオーブン中で30分間初期に蒸気を添加しながらベーキングした。室温に冷却後、ローフ容量をBVM法により測定した(実施例４参照)。
各パンの破壊、破片および形状を、表５の点数を使用して公認パン焼き職人により室温への冷却直後に分析した。室温の密閉箱での16時間(１夜)の保存後、パン身品質を公認パン焼き職人により評価した。各パンの値は、１対象物に由来する。
【０１０６】
表５
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【０１０７】
表６
本発明のホスホリパーゼのベーキング性能
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*小麦粉質量およびA280法により測定した酵素質量基準のppm
【配列表】
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【国際調査報告】
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