(57)【要約】本発明は、複合コアシェル型ナノ粒子及びその作製のための２工程法に関する。より詳細には、生物分子−コアシェル型ナノ粒子結合体、及びそれらの製造の方法に関する。本発明は、生物分子−コアシェル型ナノ粒子結合体を包含する生物分子の検出の方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）内側の金属含有ナノ粒子コア、及び
（ｂ）前記ナノ粒子コアを包囲する外側の非合金の金シェルからなるコアシェル型ナノ粒子。
【請求項２】
（ａ）内側の金属含有ナノ粒子コア、
（ｂ）前記ナノ粒子コアを包囲する外側の非合金の金シェル、及び
（ｃ）金シェルに付着したオリゴヌクレオチドからなるコアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、標的核酸の配列の一部と相補性の配列を有する請求項２に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項４】
前記内側の金属含有ナノ粒子コアは銀、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｃｏ、又はＮｉからなる請求項１又は２に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項５】
前記内側の金属含有ナノ粒子コアはＦｅＰｔ又はＦｅＡｕを含む合金からなる請求項１又は２に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項６】
前記内側の金属含有ナノ粒子コアは金属酸化物からなる請求項１又は２に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項７】
前記内側の金属含有ナノ粒子コアは磁性を有する請求項１又は２に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項８】
前記内側の金属含有ナノ粒子コアはＦｅ３Ｏ４又はＣｏ３Ｏ４からなる請求項６に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項９】
前記内側の金属含有ナノ粒子コアは半導体である請求項１又は２に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項１０】
前記内側の金属含有ナノ粒子コアはＣｄＳｅ又はＣｄＳからなる請求項９に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項１１】
前記金シェルは、厚さ約０．５〜約２単層の範囲にある請求項１又は２に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項１２】
（ｉ）ある程度のオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために十分な時間、第一の水溶液中で、オリゴヌクレオチドをナノ粒子と接触させる工程と、（ｉｉ）少なくとも１種の塩を前記水溶液に添加して、第二の水溶液を作成する工程と、（ｉｉｉ）追加のオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合できる別の期間、第二の水溶液中でオリゴヌクレオチド及びナノ粒子を接触させる工程とからなる段階的エージング工程において、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させる請求項２に記載のコアシェル型ナノ粒子。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結合可能な官能基を有する部分からなる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記塩の全量を、単回添加で、水に添加する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩を、時間をかけて徐々に添加する請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これらの塩の２種又はそれ以上の組合せ、リン酸緩衝液中のこれらの塩の内の１種、及びリン酸緩衝液中の２種又はそれ以上のこれらの塩の組合せから構成される群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記塩はリン酸緩衝液中の塩化ナトリウムである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子の表面に存在するオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体を生成する請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２の表面密度でナノ粒子の表面に存在する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドは約１５ピコモル／ｃｍ２から約４０ピコモル／ｃｍ２までの表面密度でナノ粒子の表面に存在する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１又は２のコアシェル型ナノ粒子を包含するナノ構造体。
【請求項２２】
（ａ）内側の銀ナノ粒子コア、及び
（ｂ）前記ナノ粒子コアを包囲する外側の非合金の金シェルからなる銀／金コアシェル型ナノ粒子。
【請求項２３】
（ａ）内側のＦｅ３Ｏ４ナノ粒子コア、及び
（ｂ）前記ナノ粒子コアを包囲する外側の非合金の金シェルからなる磁性コアシェル型ナノ粒子。
【請求項２４】
（ａ）内側の半導体ナノ粒子コア、及び
（ｂ）ナノ粒子コアを包囲する外側の非合金の金シェルからなる半導体コアシェル型ナノ粒子。
【請求項２５】
前記内側のナノ粒子コアは、ＣｄＳｅ又はＣｄＳからなる請求項２４に記載の半導体コアシェル型ナノ粒子。
【請求項２６】
表面プラズモン吸光ピークが、約５００〜５３０ｎｍにある請求項２〜２５のいずれか１項に記載のコアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体。
【請求項２７】
（ａ）内側の金属含有ナノ粒子コアを提供する工程と、
（ｂ）金塩を含有する溶液、及び０℃で還元剤を含有する溶液で、同時に、内側の金属含有ナノ粒子コアを処理して、前記ナノ粒子コアを包囲する非合金の金シェルを生成する工程と、
（ｃ）前記コアシェル型ナノ粒子を単離する工程とからなるコアシェル型ナノ粒子の製造方法。
【請求項２８】
前記金塩が、ＨＡｕＣｌ４、ＮａＡｕＣｌ４、ＫＡｕＣｌ４、又はＫＡｕ（ＣＮ）２からなる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記金塩が、ＨＡｕＣｌ４からなる請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
還元剤が、ＮａＢＨ４又はアスコルビン酸からなる請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
還元剤が、ＮａＢＨ４からなる請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
金塩及び還元剤は、約１：２〜約１：２０までの範囲にある比で存在する請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２７の方法により生成される製品。
【請求項３４】
金シェル厚が、約０．１５〜約０．６ｎｍまでである請求項３３に記載の製品。
【請求項３５】
（ａ）前記表面を、請求項２のコアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体を含有する溶液と、結合核酸とのコアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体のハイブリダイゼーションを可能にするために有効な条件下で接触させる工程と、
（ｂ）前記表面へのナノ粒子結合体の移動を促進するために、外側磁界にナノ粒子結合体を置いて、ナノ粒子結合体と核酸との間の相互作用を促進する工程と、
（ｃ）前記表面から、核酸とハイブリッド形成しなかった全てのナノ粒子結合体を除去する工程と、
（ｄ）ナノ粒子結合体との核酸のハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する工程とからなる、表面に結合した核酸の検出方法。
【請求項３６】
コアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体が、Ｆｅ３Ｏ４／金コアシェル型ナノ粒子からなる請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記工程（ｃ）は、洗浄溶液で表面を洗浄するか、又は磁界を逆に向けることによって行われる請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）結合標的分析物を含む表面を提供する工程と、
（ｂ）受容体が、分析物に特異的に結合し、結合核酸とのナノ粒子結合体の結合を可能にするのに有効な条件下で、前記表面をコアシェル型ナノ粒子受容体結合体を含有する溶液と接触させる工程と、
（ｃ）前記表面へのナノ粒子結合体の移動を促進するために、外側磁界にナノ粒子結合体を置いて、ナノ粒子結合体と標的分析物との間の相互作用を促進する工程と、
（ｄ）前記表面から、標的分析物とハイブリッド形成しなかった全てのナノ粒子結合体を除去する工程と、
（ｅ）ナノ粒子結合体との標的分析物の結合相互作用によって生じた検出可能な変化を観察する工程とからなる、表面に結合した標的分析物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本願は２００２年１２月２８日出願の米国特許出願第１０／０３４，４５１号及び２００２年１２月２８日出願のＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２５号の一部継続出願である。本願は、その全体を参照によって援用する２００１年５月２５日出願の米国特許仮出願第６０／２９３，８６１号からの優先権の利益を主張する。本願に報告される研究は、部分的に、ＮＳＦ認可番号ＣＨＥ−９８７１９０３号、ＡＲＯ認可番号ＤＡＡＧ５５−９７−１−０１３３号、及びＡＦＯＳＲ認可番号ＤＵＲＩＮＴによって支援されている。従って、米国政府は、本発明にある種の権利を有しうる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、コアシェル型ナノ粒子、コアシェル型ナノ粒子に基づく材料、コアシェル型ナノ粒子を含有するキット、並びに、核酸、ペプチド、及び蛋白質などの標的分子の検出のためのコアシェル型ナノ粒子の製造方法及び使用方法に関する。より詳細には、本発明は、ＤＮＡ修飾コアシェル型ナノ粒子、及び核酸などの標的分子を検出するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
１９９６年にＤＮＡなどの生物分子を利用する方法が報告され、相補的な認識要素で修飾された、ナノ粒子構築ブロックの構築物を機能性材料に導く分子認識特性が報告された１。これらの材料はＤＮＡに対して非常に感度が高く、選択的な診断方法の開発に広範な用途が見出された２。この材料合成アプローチは、ペプチドや蛋白質を含む広範な生物分子３、及び金や半導体量子ドットを含むナノ粒子の若干の集合４−９へ拡張された。新たなナノ粒子組成物を設計する各々の場合に、目的とする粒子の表面に生物分子を固定するための新たな修飾方法を開発する必要がある。このアプローチは広く利用されたが、成功例は限られていた。現在、金ナノ粒子の修飾方法は、多様な粒子サイズ及び、球体や桿状体を含む多様な表面構造に最適化及び一般化されている１，２，４，１０。金粒子はその表面が、荷電リガンドの弱く結合する層（例えば、シトレート）でしばしば安定化され、それらリガンドはより強力に結合する化学官能基を有する分子（例えば、チオール、アミン、及びジスルフィド）置換されうるため、修飾することが特に容易である。ＣｄＳｅ及びＣｄＳ量子ドットは、それらの表面に非常に強力に結合され、そして結果的に置換するのが困難である界面活性剤層を有するので、修飾するのがより困難であることが証明された５。銀ナノ粒子を有する安定なオリゴヌクレオチド結合体を作成するための成功した経路は、それらがＤＮＡハイブリダイゼーションを達成するために使用される条件下で、化学的に分解する傾向にあることが主な原因となり開発されなかった。主な進歩は、選択されたナノ粒子組成物の物理特性を有する一方で、金の表面化学を有しない粒子を設計する方法を考案することにある。ここでは、純粋な金粒子オリゴヌクレオチド結合体のための証明された製造方法を用いて、オリゴヌクレオチドで容易に官能化されうる銀コア及び非合金化金シェルから構成されるコア／シェル粒子を生じさせる低温法を提供する２ｄ。さらに、新規ナノ粒子組成物は、純粋な金システムと区別できる比色計の検出システムに接続するのに使用されうる２ａ，２ｄ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の１つの目的は、銀の光学的特性及び多くの物理的特性を示すが、金の安定性を示さないコアシェル型ナノ粒子を製造する容易な方法を提供することにある。これらのナ
ノ粒子の表面は、例えば、天然及び合成高分子、それに限定されないが、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリ−又はオリゴヌクレオチド、蛋白質、ペプチド、炭化水素、糖、及びハプテンを含めた選択的分子認識の能力のある分子のような多様な部分で修飾されて、それにより、ナノ粒子に有用な生物認識特性を供しうる。
【０００５】
本発明の別の目的は、Ｆｅ３Ｏ４、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、Ａｇ−Ａｕ合金、Ｃｏ、Ｃｕ、又はＰｔのようなコアの選択に起因して、調整可能な物理特性を有するが、しかし、生来の、及びオリゴヌクレオチドで修飾された、純粋な金粒子の表面化学及び安定性を有しないコア／シェル粒子の製造方法一般を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、コアシェル型ナノ粒子プローブの使用を伴う、選択的分子認識能力を有した分子の検出方法を提供することにある。これらの方法は、選択的分子認識に対処する条件下で、１つ又は複数の標的分子に、コアシェル型ナノ粒子プローブを接触させる工程、及び光学的変化の検出工程を有する。特定のコアシェル型ナノ粒子プローブの物理的特性は、例えば、電気又は磁界の利用を通してそれらの移動を誘導するなど、これらの方法に種々の追加の工程を可能とさせ得る。
【０００７】
本発明の別の目的は、本発明のコアシェル型ナノ粒子に基づいてナノ粒子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、複合コアシェル型ナノ粒子、これらのコアシェル型ナノ粒子を含有する組成物及びキット、並びに、核酸、蛋白質などの標的分子の検出のための複合コアシェル型ナノ粒子、特にＡｇ／金コアシェル型ナノ粒子を製造方法及び使用方法に関する。Ａｇナノ粒子「テンプレート」の存在下でのＮａＢＨ４によるＨＡｕＣｌ４の還元によって、これらのＡｇ／金コアシェル型ナノ粒子を製造し、紫外−可視分光法、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、及びエネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）微量分析によって特性を調べた。これらの粒子は合金となることがなく、銀の光学的特性及び表面化学、及び金の高い安定性を示す構造を有意に生じる。実験的及び理論的データは、金約１個の原子単層（〜３Å）で被覆された銀コア（直径〜１２ｎｍ）としてこれらの新規材料の構造的特徴を裏付ける。コアシェル型ナノ粒子はさらにアルカンチオールオリゴヌクレオチドで修飾され、相補オリゴヌクレオチドとの可逆ハイブリダイゼーションを経る構造を形成するため、拡張ナノ粒子ネットワーク構造を形成する。逆相アルミナ板上に、ＤＮＡ標的を有しないときの、及びＤＮＡ標的を有するときの、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を含有する適量の溶液をスポット付けすることによって、黄色から暗褐色までの固有の比色計移行が、裸眼によって観察され得る。分散及び凝集コア／シェル粒子の光学的特性は、ナノ粒子に基づいたＤＮＡ検出についての新たな比色計チャンネルを形成する。
【０００９】
本発明は、合金ではない金コアシェル型ナノ粒子を製造する方法及びそこから生成される製品を提供する。本発明の方法は、内側のナノ粒子コアを提供する工程と、金塩を含む溶液及び還元剤を含む溶液によって同時にコアを処理する工程と、コアシェル型ナノ粒子を単離する工程とを有する。その方法はまず、ナノ粒子コアを包囲する非合金の金シェルを提供する。これらの非合金の金コアシェル型ナノ粒子は、従来の金コアシェル型ナノ粒子では得られなかった驚異的に優れた分光特性を示し、核酸及び受容体などの分子で官能化されて、核酸、抗原、蛋白質、炭化水素などの標的分析物を標的にし、及び検出するために使用されうるナノ粒子結合体を生じ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のこれら及び他の目的は、以下の詳細な説明を考慮して明らかになる。
一実施態様において本発明は、ナノ粒子コア及び金シェルからなるコアシェル型ナノ粒
子を提供する。コア材料には、それに限定されないが、金属、半導体、及び磁性ナノ粒子を含めて、当業者に公知のあらゆるナノ粒子を包含し得る。好適な実施態様においてコア材料は、それに限定されないが、Ａｇ、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＦｅＰｔ、ＦｅＡｕ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｃｏ３Ｏ４及びＣｄＳｅ（又はＣｄＳ）を含めた金属又は磁性ナノ粒子から構成される。このようなナノ粒子を製造する方法は、当業界で公知である。例えば、シミッド  ジー．（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．）編「クラスター及びコロイド」（ＶＣＨ、ウェインハイム、１９９４年）、ハイアット  エム．エー．（Ｈａｙａｔ，Ｍ．Ａ．）編「コロイド状金；原理、方法、及び使用」（アカデミック  プレス、サンディエゴ、１９９１年）、マサート  アール．（Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．）ＩＥＥＥ  トランザクションズ  オン  マグネティックス  第１７巻  第１２４７頁（１９８１年）、アーマディ  ティ．エス．（Ａｈｍａｄｉ，Ｔ．Ｓ．）等  サイエンス  第２７２巻  第１９２４頁（１９９６年）、ヘングライン  エー．（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．）ら  ジャーナル  オブ  フィジカル
ケミストリー  第９９巻  第１４１２９頁（１９９５年）、カーティス  エー．シー（Ｃｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．）等  アンゲヴァント  ヒェミー  インターナショナル  エディション  イングリッシュ（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．）第２７巻
第１５３０頁（１９８８年）参照。
【００１１】
本発明は、合金ではない金コアシェル型ナノ粒子を製造する方法及びそこから生成される製品を提供する。本発明の方法は、内側のナノ粒子コアを提供する工程と、金塩を含む溶液及び還元剤を含む溶液によって同時にコアを処理する工程と、コアシェル型ナノ粒子を単離する工程とを有する。その方法はまず、ナノ粒子コアを包囲する非合金の金シェルを提供する。これらの非合金の金コアシェル型ナノ粒子は、従来の金コアシェル型ナノ粒子では得られなかった驚異的に優れた分光特性を示し、核酸及び受容体などの分子で官能化されて、核酸、抗原、蛋白質、炭化水素などの標的分析物を標的にし、及び検出するために使用されうるナノ粒子結合体を生じ得る。
【００１２】
本発明の方法を実施する上で、その方法は、コアを包囲する非合金の金シェルを生じるの好適なあらゆる温度で行われうる。温度は一般に、金シェルを発生するために使用される反応溶媒の選択に依存する。反応溶媒の適切、かつこれらに限定されない例としては、水、エタノール、メタノール、クエン酸三ナトリウム溶液、オレイン酸、トリオクチルホスフィンオキシド、及びトリオクチルホスフィンが挙げられる。本発明を実施する上で、クエン酸三ナトリウム溶液（０．３ｍＭ）が好適である。
【００１３】
本発明の方法を実施する上で、温度は、一般に、水又は水性反応溶液中で約０℃〜約４５℃までの範囲にある。有機溶媒については、温度は、一般に、オレイン酸及びトリオクチルホスフィンオキシドを使用する場合、約１３０℃〜約１８０℃までの範囲にある。
【００１４】
金塩は、それに限定されないが、ＨＡｕＣｌ４、ＮａＡｕＣｌ４、ＫＡｕＣｌ４、又はＫＡｕ（ＣＮ）２を含めた任意の適切な金塩を包含しうる。本発明を実施する上で好適な金塩は、ＨＡｕＣｌ４である。
【００１５】
還元剤は、それに限定されないが、ＮａＢＨ４、アスコルビン酸、ＮＨ２ＯＨ及びＮ２Ｈ４を含めた金塩溶液を含む金の価数を減じる能力のある任意の適切な還元剤を包含しうる。本発明を実施する上で、好適な還元剤は、ＮａＢＨ４である。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ナノ粒子コア、ナノ粒子を包囲する金シェル、及びコアシェル型ナノ粒子の金表面に付着したオリゴヌクレオチドからなる、コアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体を提供する。金表面上にオリゴヌクレオチドを付着させるあらゆる適切な方法を使用しうる。金表面上にオリゴヌクレオチドを付着させるのに特に好ましい方法は、米国特許出願第０９／３４４，６６７号（１９９９年６月２５日出願）、米国
特許出願第０９／６０３，８３０号（２０００年６月２６日出願）、米国特許出願第０９／７６０，５００号（２００１年１月１２日出願）、米国特許出願第０９／８２０，２７９号（２００１年３月２８日出願）、米国特許出願第０９／９２７，７７７号（２００１年８月１０日出願）、並びに、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号（１９９７年７月２１日出願）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号（２０００年６月２６日出願）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号（２００１年１月１２日出願）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号（２００１年３月２８日出願）に記載されるエージングプロセスに基づく。これらの開示は、その全体が本明細書に援用される。エージング工程は、予想外に増強された安定性及び選択性を示すナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体を提供する。この方法は、ナノ粒子に結合可能な官能基を含む部分が、自身に共役結合で好適に結合されているオリゴヌクレオチドを提供する工程からなる。その部分及び官能基は、ナノ粒子に対するオリゴヌクレオチドの結合（すなわち、化学吸着又は共役結合による）を可能とさせるものである。例えば、アルカンチオール、アルカンジスルフィド又はそれらの５’又は３’末端に共役結合で結合した環状ジスルフィドを有するオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子を含めた多様なナノ粒子にそのオリゴヌクレオチドを結合するために使用しうる。
【００１７】
官能基を使用することによって、少なくともある程度のオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために十分な時間だけ、オリゴヌクレオチドを水中のナノ粒子と接触させる。このような時間は経験的に決定されうる。例えば、約１２〜２４時間の時間が優れた結果を示すことが分かった。オリゴヌクレオチドの結合のための他の適切な条件は、経験的に決定されうる。例えば、約１０〜２０ｎＭナノ粒子の濃度及び室温でのインキュベーションが、優れた結果を示す。
【００１８】
次に、少なくとも１種の塩を水に添加して、塩溶液を形成する。塩は、任意の適切な水溶性塩でありうる。例えば、塩は、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化セシウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸リチウム、硝酸セシウム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム、酢酸セシウム、酢酸アンモニウム、これらの塩の１種又はそれ以上の組合せ、又はリン酸緩衝液中のこれらの塩の内の１つでありうる。好適には、塩を、濃縮溶液として添加するが、しかし固形として添加しうる。塩を、一時に全部、水に添加するか、又は塩を、時間をかけて徐々に添加しうる。「時間をかけて徐々に」によって、時期によりずれて間隔をあけた間隔で、少なくとも２回の部分で、塩を添加することが意味される。適切な時間間隔は、経験的に決定されうる。
【００１９】
塩溶液のイオン強度は、少なくとも部分的には、互いからオリゴヌクレオチドの静電気的反発力を、そして正に荷電したナノ粒子に対しての負に荷電したオリゴヌクレオチドの静電気的引力か、又は負に荷電したナノ粒子からの負に荷電したオリゴヌクレオチドの静電気的反発力かのいずれかを克服するのに十分であるべきである。時間をかけて徐々に塩を添加することにより静電気的引力及び反発力を徐々に減らすことは、ナノ粒子におけるオリゴヌクレオチドの最高の表面密度を示すことが分かった。適切なイオン強度は、各塩又は塩の組合せについて経験的に決定されうる。好ましくは、塩化ナトリウムの濃度が、時間をかけて徐々に増大されるものであるが、リン酸緩衝液中で約０．１Ｍ〜約１．０Ｍまでの塩化ナトリウムの最終濃度は、優れた結果を示すことが分かった。
【００２０】
塩を添加した後、追加のオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために十分な時間の別の期間、オリゴヌクレオチド及びナノ粒子を、塩溶液中でインキュベートして、安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体を生じる。以下に詳細に記載されるとおり、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの増大した表面密度は、結合体を安定化させることが判明した。このインキュベーションの時間は経験的に決定されうる。約２４〜４８時間、好適には４０時間の総インキュベーション時間が優れた結果を示すことが判明した（これは、イ
ンキュベーションの総時間である。上に記されるとおり、塩濃度を、この時間をかけて徐々に増大させうる）。塩溶液でのインキュベーションのこの第二の期間は、「エージング」工程としてここに引用される。この「エージング」工程についての他の適切な条件も、経験的に決定されうる。例えば、室温及びｐＨ７．０でのインキュベーションは、優れた結果を示す。
【００２１】
エージング工程の使用によって生じた結合体は、エージング工程なしに生成されるものより相当により安定であることが分かった。上記されるとおり、この増大した安定性は、エージング工程により達成されるナノ粒子の表面におけるオリゴヌクレオチドの密度が増大したことによる。エージング工程により達成される表面密度は、ナノ粒子のサイズ及び型に、そしてオリゴヌクレオチドの長さ、配列及び濃度に依存する。ナノ粒子及びオリゴヌクレオチドの望ましい組合せについて、ナノ粒子を安定にするのに適切な表面密度及びそれを得るのに必要な条件は、経験的に決定されうる。一般に、少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度は、適切なナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体を提供するために適切である。好適には、表面密度は、少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２である。表面密度が大きすぎる場合、核酸及びオリゴヌクレオチド標的とハイブリッド形成する結合体のオリゴヌクレオチドの能力は減少されうるので、表面密度は、好ましくは、約３５〜４０ピコモル／ｃｍ２より大きくない。
【００２２】
本明細書において、「安定な」とは、結合体が生成された後の少なくとも６ヶ月の期間、オリゴヌクレオチドの大半がナノ粒子に付着した状態で残り、及びオリゴヌクレオチドが核酸及びオリゴヌクレオチド標的と、核酸の検出方法及びナノ製造方法で使用されるような標準的な条件下でハイブリッドを形成できることをいう。
【００２３】
さらに別の態様で、本発明は、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と、標的核酸配列の少なくとも一部との間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、本発明のコアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体を、標的核酸配列と接触させる工程からなる、核酸等の標的分析物の検出方法を提供する。さらに、蛋白質受容体及び他の特異的結合対の構成物は、オリゴヌクレオチドで官能化され、そしてオリゴヌクレオチドで修飾されたナノ粒子上に固定して、オリゴヌクレオチド修飾粒子の高い安定性を示すが、ＤＮＡよりむしろ蛋白質受容体によって検出される分子認識特性を示す新たな種のハイブリッド粒子を発生しうる。代替手段として、受容体で修飾されたオリゴヌクレオチドとの複数の受容体結合部位を有する蛋白質を官能化させて、その結果、上に検討された当初のナノ粒子構築機構で、無機ナノ粒子の内の１つの代わりに、蛋白質受容体複合体を、構築ブロックの１つとして使用しうる。分析物検出計画でのこれらの新規ナノ粒子−受容体結合体の使用は、標的の同定及び蛋白質−蛋白質相互作用についてのスクリーニングを含めた多数の方法で評価された。核酸検出のための条件、適切なハイブリダイゼーション、及びナノ粒子−受容体結合体を製造する方法については、米国特許番号第０９／３４４，６６７号（１９９９年６月２５日）、米国特許出願第０９／６０３，８３０号（２０００年６月２６日）、米国特許出願第０９／７６０，５００号（２００１年１月１２日）、米国特許出願第０９／８２０，２７９号（２００１年３月２８日）、米国特許出願第０９／９２７，７７７号（２００１年８月１０日）及び、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号（１９９７年７月２１日）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号（２０００年６月２６日）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号（２００１年１月１２日）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号（２００１年３月２８日）に記載されている。これら開示の全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。いったん本発明のコアシェル型ナノ粒子結合体が、標的分子に結合すると、コアシェル型ナノ粒子結合体の光学特徴における変化を容易に検出することが可能である。別の実施態様では、検出段階は、核酸のような標的分子とのナノ粒子結合体のハイブリダイゼーション又は結合をさらに増強する使用磁界の存在下で行われる。
【００２４】
本発明は、さらに、本発明のコアシェル型ナノ粒子結合体に基づいたナノ製造の方法を提供する。ナノ粒子から材料を製造するナノ構造体及び方法は、米国特許出願第０９／３４４，６６７号（１９９９年６月２５日）、米国特許出願第０９／６０３，８３０号（２０００年６月２６日）、米国特許出願第０９／７６０，５００号（２００１年１月１２日）、米国特許出願第０９／８２０，２７９号（２００１年３月２８日）、米国特許出願第０９／９２７，７７７号（２００１年８月１０日）、並びに、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号（１９９７年７月２１日）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号（２０００年６月２６日）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号（２００１年１月１２日）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号（２００１年３月２８日）に記載されている。その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。その方法は、選択配列を有する少なくとも１つの型の連結オリゴヌクレオチドを提供する工程からなり、そして各型の連結オリゴヌクレオチドの配列は少なくとも２つの部分を有する。その方法はさらに、そこに付着したオリゴヌクレオチドを有する１つ又はそれ以上の型のコアシェル型ナノ粒子を提供する工程を有し、そして各型のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の一部と相補性のある配列を有する。連結オリゴヌクレオチド及びナノ粒子を、連結オリゴヌクレオチドへの、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で接触させて、その結果所望のナノ材料又はナノ構造体を形成する。
【００２５】
本発明はナノ製造の別の方法を提供する。この方法は、そこに付着したオリゴヌクレオチドを有する本発明の少なくとも２つの型のコアシェル型ナノ粒子を提供することを特徴とする。第一の型のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第二の型のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのものと相補性のある配列を有する。第二の型のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第一の型のナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体上のオリゴヌクレオチドのものと相補性のある配列を有する。第一及び第二の型のナノ粒子を、互いにナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で接触させて、その結果、所望のナノ材料又はナノ構造体を形成する。
【００２６】
本発明はさらに、そこに付着したオリゴヌクレオチドを有するコアシェル型ナノ粒子から構成されるナノ材料又はナノ構造体を提供し、そしてナノ粒子は、オリゴヌクレオチド・コネクターによって互いに支持される。
【００２７】
以下の実施例は、本発明の特定の実施態様を示すのに役立ち、そして範囲又は概念でそれを限定しない。特定の明らかな代替物及び変更は、当業者に対しては明確である。
実施例１：２段階合成を介して製造されるＡｇ／金コアシェル型ナノ粒子の合成
この実施例は、Ａｇ／金コアシェル型ナノ粒子を製造するための本発明の方法を例示する。Ａ部では、銀コアを製造する方法を記述する。Ｂ部では、Ａｇ／金コアシェル型ナノ粒子を製造する方法を提供する。銀ナノ粒子は、２つの重要な理由で、材料合成でブロックを構築するための、そして生物学的標識として所望の組成物である。（１）銀粒子は、粒子サイズにより、〜３９０と４２０ｎｍの間の表面プラズモン帯を示す１１。これは、金のもの（５２０−５８０ｎｍ）と異なるスペクトル領域である。（２）銀粒子についての表面プラズモン帯の吸光係数は、同じサイズの金粒子についてのもののおよそ４倍大きい１２。したがって、ＤＮＡで官能化された銀粒子は、ＤＮＡ／ナノ粒子複合構造体の光学特性をテイラー化する機会のみならず、表面プラズモン帯の位置及び強度に依る新たな診断システムに対する経路をも提供する（例えば、吸収又は散乱に基づいた比色計システム、又はＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）及びＳＥＲＳ（表面増感ラマン分光）検出システム）。
【００２８】
実験的には、銀ナノ粒子は、金粒子を修飾するための確立されたプロトコールを使用し
て、アルキルチオで修飾されたオリゴヌクレオチドによって有効に表面処理されないことが明らかにされた２。実際に、このような方法を介して製造された銀粒子−ＤＮＡ結合体は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを達成するのに必要な塩濃度（０．０５Ｍ  ＮａＣｌ又はそれ以上）を示す溶液中で加熱した場合に不可逆に凝集する。ここで、コア／シェル・アプローチ法は、この問題を克服するために使用された。このアプローチ法では、薄い金シェルを、銀ナノ粒子上で成長させ、そしてアルキルチオ−オリゴヌクレオチドで容易に修飾されうる金外側表面を有する粒子を形成した。このアプローチ法は、Ｃｕ及びＰｔのような他の粒子を製造するために一般化されて、コアの選択により、テイラー化可能な物理的特性を示すが、生来の、そしてオリゴヌクレオチドで修飾された純粋な金粒子の表面化学及び安定性を有しない一連のコア／シェル粒子を作成しうる。
【００２９】
Ａ．銀ナノ粒子コアの製造
銀ナノ粒子は、クエン酸三ナトリウム溶液中の硼水素化ナトリウムによる硝酸銀の還元により合成された銀ナノ粒子であった。銀ナノ結晶を合成する２つの方法は、以下に記述され、そしてその結果得られるコアナノ結晶を比較した。
【００３０】
方法番号１：ＡｇＮＯ３（２．２ｍｇ）及びクエン酸ナトリウム２水和物（８．２ｍｇ）を、２５０ｍｌフラスコ中の９９ｍｌのナノピュア水に溶解させた。攪拌しながら、そしてＡｒ下で、このフラスコを、１５分間、氷浴に入れた。その後、１ｍｌの硼水素化ナトリウム溶液（０．１４Ｍ）を、溶液に注入した。１時間攪拌した後、溶液を室温まで加温した。銀ナノ粒子（直径〜１２ｎｍ）を得た。さらなる精製なしに、これらの銀ナノ粒子は、金シェル成長のために直接的に使用されうる。
方法番号２：ＡｇＮＯ３（２．２ｍｇ）及びクエン酸ナトリウム２水和物（８．２ｍｇ）を、２５０ｍｌフラスコ中の９８ｍｌのナノピュア水に溶解させた。攪拌しながら、そしてＡｒ雰囲気下で、このフラスコを、１５分間、氷浴に入れた。その後、１ｍｌの硼水素化ナトリウム溶液（０．１４Ｍ）を、溶液に注入した。１時間攪拌した後、溶液を、室温まで加温した。銀ナノ粒子（直径〜１２ｎｍ）を得た。ビス（ｐ−スルホナトフェニル）−フェニルホスフィン（ＢＳＰＰ、１７ｍｇ）を、銀ナノ粒子溶液に入れ、そして一夜攪拌した。続いて、銀ナノ粒子を精製し、そして１２ｋＲＰＭ〜２０ｋＲＰＭの間の勾配遠心分離によって単離した。沈殿物から得られた銀ナノ粒子含有適量を合せ、そしてナノピュア水に分散させた。
【００３１】
比較結果：方法番号２により製造された銀粒子は、方法番号１によって製造されたものと比較してよりよいサイズ分布を示す（方法番号２についてはδ＝１８％；方法番号１についてはδ＝３０％）。しかし、継続研究は、いずれの方法によって製造された銀粒子も、銀／金コアシェル型ナノ粒子を発生するためのコアとして十分に役立つことを示した。
【００３２】
Ｂ．銀／金コアシェル型ナノ粒子の製造
この段階では、上に記述された銀コアの表面での金シェル成長を記述される。銀ナノ粒子については、還元剤ＮａＢＨ４を用いたＨＡｕＣｌ４の還元により、金シェルを、銀コア表面上で成長させた。還元された金は、銀ナノ粒子の表面化学能力が低いこと、及びこれらの２つの材料の間のほぼゼロの格子ミスマッチのために、部分的に、銀表面に対して親和性を示す。銀コアナノ結晶上で金を成長させる２つの方法は、以下に記述され、そしてその結果生じるコアシェル型ナノ粒子を比較した。銀コア粒子を、上に記述された方法番号１によって製造した。
【００３３】
方法番号１：約５０μＬ〜６００μＬ／分の間の速度で、銀ナノ粒子懸濁液に、０℃でのＨＡｕＣｌ４（２ｍＭ）及びＮａＢＨ４（６ｍＬ）溶液（ナノピュア水中で）を同時に滴下で添加することにより、銀シェル（ほぼ１つの単層厚）を、銀ナノ粒子の表面上で成長させた（１００ｍｌの０．３ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液中の０．２５ナノモルの銀
粒子）。希薄金前駆体の同時滴下での添加は、これらの金形成剤の濃度を約２μＭに維持することによって、金クラスター核形成部位の形成を阻害する。十分なＨＡｕＣｌ４及びＮａＢＨ４を、ナノ粒子に添加して、粒子上に１つの単層の金を生じた（シェル厚の計算のための方程式１参照）後、添加を停止させた。
方程式１：
Ｖコア＝４／３＊π＊Ｒ３；
Ｖコア／シェル＝４／３＊π＊（Ｒ＋ａ）３、
式中、ａは、シェル厚である（Ａｕの１単層について０．３ｎｍ）；
Ｖシェル＝Ｖコア／シェル−Ｖコア；
Ｎシェル＝ｄシェル＊Ｖシェル／ＦＷシェル；
式中、Ｖシェルは、シェルの体積である；
Ｎシェルは、シェルのモル数である；
ｄシェルは、シェル材料の密度である（金については、ｄ＝１９．３ｇ／ｍｌ）；
ＦＷシェル、シェル材料の式量（金については、ＦＷ＝１９６．９７ａｍｕ）。
【００３４】
金を、５％過剰で添加し、１２ｎｍ球体と考えて、０．８ｍｇのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ及び３．７ｍｇのＮａＢＨ４と計算した。いったん５％過剰を達成すると、溶液の添加を停止し（シェルの形成を停止する）、そして３０μモルのビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルホスフィン（ＢＳＰＰ）を添加した。その後、銀／金コアシェル型ナノ粒子を、遠心分離により精製し、そしてナノピュア水（直径１２．４ｎｍ、（δ＝１８％））で分散させ、９６％収率及び約５．５：１の銀対金の比を示した。
【００３５】
方法番号２：金シェル（厚さ、およそ１単層）を、室温で、約５０μＬ〜６００μＬ／分の比で、滴下での添加を介してＨＡｕＣｌ４（２ｍＭ）及びＮａＢＨ４（６ｍＭ）で同時に処理することによって、そのシェルを銀ナノ粒子（１００ｍｌの０．３ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液中で０．２５ナノモルの銀粒子）の表面で成長させた。希薄金前駆体の同時滴下での添加は、これらの金形成試薬の濃度を約２μＭに維持することによって、金クラスター核形成部位の形成を阻害する。ナノ粒子に、十分なＨＡｕＣｌ４及びＮａＢＨ４を添加して、粒子上に１単層の金を生じた（５％過剰で、１２ｎｍ球体と考えて、０．８ｍｇのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ及び３．７ｍｇのＮａＢＨ４と計算した）後、反応を停止させ、そして３０μモルのＢＳＰＰを添加した。その後、銀／金コアシェル型ナノ粒子を、遠心分離により精製し、そしてナノピュア水に分散させて、約９０％の重量パーセント収率、及び約１２．５ｎｍの平均粒子サイズ、及び約６．３：１の銀対金比を示した。
【００３６】
比較結果：方法番号１（０℃での合成）を介して生成されたコアシェル型ナノ粒子は、方法番号２（室温での合成）により生成されたコアシェル型ナノ粒子に比べて、０．５Ｍ
ＮａＣｌ溶液中でよりよい安定性を示すことが分かった。この結果は、一部には、室温での成長速度より０℃でのシェル成長の速度が遅いことをによる。
【００３７】
（ｃ）検討
銀ナノ粒子を、文献の方法１３によって製造した。その後、粒子を、ＢＳＰＰ（０．３ｍＭ）で表面処理し、勾配遠心分離により精製し（一次フラクションを収集する；直径〜１２ｎｍ）、そしてナノピュア水中に分散させた。およそ１単層厚の金シェルを、０℃で、滴下による添加を介してＨＡｕＣｌ４及び硼水素化ナトリウムで同時処理することによって、その金シェルを銀ナノ粒子（１００ｍＬの０．３ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液中の０．２５ナノモルの銀粒子）の表面上で成長させた。還元した金は、それの格子ミスマッチがほぼゼロであるために、部分的に、銀表面に対して親和性を示す１４。０℃での希薄金前駆体の同時滴下による添加は、これらの金形成試薬の濃度を約２μＭに維持することによって、金クラスター核形成の形成を阻害する。十分なＨＡｕＣｌ４及びＮａＢＨ４を、ナノ粒子に添加して、粒子上に１単層の金を生じさせた（５％過剰、１２ｎｍ球体と
考えて、０．８ｍｇのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ及び３．７ｍｇのＮａＢＨ４を計算した）後、反応を停止させ、そして３０ｍＭのＢＳＰＰ（０．３ｍｌ）を添加した。その後、銀／金コアシェル型ナノ粒子を、遠心分離により精製し、そしてナノピュア水に分散させた（粒子直径１２．４ｎｍ、（δ＝１８％））。図１Ａは、ヒタチ８１００電子顕微鏡を使用して得られた銀／金コアシェル型ナノ粒子のＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）画像を示す。１滴のナノ粒子溶液を、炭素被覆銅グリッド上に沈着させることによって、典型的なＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）標本を作製した。濾紙及び真空での乾燥により、過剰溶液を逃がした。これらのコアシェル型ナノ粒子での銀：金比は、その粒子のエネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）微量分析により５．２：１であることが明らかにされた（図１Ｂ）。図１Ｂは、銀コア・ナノ粒子（破線）及び銀／金コアシェル型ナノ粒子（実線）のＥＤＸスペクトルを示す。Ｌ及びＭは、高い状態から、それぞれ、原子のＬ及びＭシェルへの電子移動を示す。電界放出走査型電子顕微鏡法（ＦＥＳＥＭ）ヒタチ４５００で、ＥＤＸ分析を行った。シリコン板上に１滴のナノ粒子溶液を沈着させることによって、ＳＥＭ標本を作製した。銀／金比は、３．１＋／−０．６Åの金シェル厚に対応し、そしてそれは、金原子のおよそ１単層と対応する。
【００３８】
明らかに、コアシェル型ナノ粒子の吸光度スペクトルは、シトレートで安定化した純粋銀粒子についてのものに非常に類似する。銀の表面プラズモン帯は、同じ波長で維持するが、しかし約１０％まで低下させ、そして金プラズモン帯は、５００ｎｍで、僅かなねじれとして観察される。これらのスペクトル特性は、金シェル成長の強力な証拠を供する。様々な手段を使用して、他の者が、金被覆銀ナノ粒子を製造したことに注目すべきである１５。しかし、それらの手段は、銀／金合金に至り１５ａ、このような粒子の吸光度スペクトルは、特徴的赤色移行とプラズモン共鳴の広がりを示す。さらに、合金化された銀／金粒子の溶液を集中的に製造する場合、それらを、匹敵する銀／金比を示すコアシェル型ナノ粒子と容易に区別できる（支援情報を参照）。実際に、本発明の方法によって製造されたコア／シェル銀／金ナノ粒子は、銀プラズモン帯の赤色移行で観察されたものはないまま、コアの光学特性を保有する（図１Ｃ）。Ｍｉｅ理論を使用して、１１．８ｎｍ銀コアと単層金シェルから構成される粒子の吸光度スペクトルを計算した１１。計算されたスペクトルは、粒子の実験的に測定されたスペクトルとほとんど重ね合わせられる（図１Ｃ、挿入図）。図１Ｃは、挿入図が、銀粒子（破線）及び銀／金コアシェル型ナノ粒子（実線）の計算された吸光度スペクトルを示すことを特徴とする銀コア（破線）及び銀／金コア／シェル（実線）の紫外−可視スペクトルを示す。ＨＰ８４５３ダイオードアレイ分光光度計を使用して、紫外−可視スペクトルを得た。
実施例２：銀／金コアシェル型ナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体の製造
この実施例には、標的核酸を検出するためのプローブとしての銀／金コアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体の製造が記述されている。２つの方法を使用し、そしてその後、得られたプローブを、安定性について比較した。結合体を製造するときに使用されるオリゴヌクレオチド配列は、図２ａに示される。文献による標準ホスホラミダイト化学を使用して、これらの配列を合成した。（ジェームズ  ジェイ．ストーホフ（Ｊａｍｅｓ
Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ）、ロバート  エルガニア（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅｌｇｈａｎｉａ）、ロバート  シー．ミューチック（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．Ｍｕｃｉｃ）、チャド  エイ．マーキン（Ｃｈａｄ  Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、及びロバート  エル．レッツィンガー（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ  第１２０巻  第１９５９頁、（１９９８年））。
【００３９】
（ａ）コアシェル型ナノ粒子結合体の製造
方法番号１：８〜１０ＯＤ（約５００μＬ中）のアルカンチオ−オリゴヌクレオチド（最終オリゴヌクレオチド濃度は、約２μＭである）で、１０ｍＬの水性コアシェル型ナノ粒子コロイド（方法番号１から得られた）を送出することによって、適切なプローブ・オリゴヌクレオチドを有するナノ粒子プローブを製造した。一夜（約１５時間）静置した後
、１００ｍＭ濃リン酸緩衝液を使用して、その溶液を、１０ｍＬリン酸緩衝液（ｐＨ７）にし、そして０．５時間後、塩（２ＭＮａＣｌ水溶液から得られた）を、０．０５Ｍ  ＮａＣｌに添加し、約８時間静置させ、その後、さらに０．１ＭまでＮａＣｌを添加し、そして約８時間の追加の静置時間の後、さらに、約０．３ＭまでＮａＣｌを添加し、そして最終〜８時間静置させた。過剰ＤＮＡを除去するために、１．５ｍＬエッフェンドルフ管を使用して、１８，０００ｒｐｍで、３０分間、コロイドを遠心分離にかけた。その上清の除去に続いて、油状沈殿物を、捨てた上清に等しい体積で、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）溶液で洗浄し、遠心分離し、そして０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、０．０１％アジド溶液に分散させた。最終コロイドを冷蔵し、そして後に使用するために保存した。
【００４０】
方法番号２：８〜１０ＯＤのアルカンチオール−オリゴヌクレオチド（最終オリゴヌクレオチド濃度は、約２μＭである）で、１０ｍＬの水性コロイドを送出することによって、適切なプローブ・オリゴヌクレオチドを有するナノ粒子プローブを製造した。一夜（〜１５時間）静置した後、１００ｍＭ濃リン酸保存緩衝液を使用して、その溶液を、１０ｍＬリン酸緩衝液（ｐＨ７）にし、そして塩を０．１Ｍ  ＮａＣｌに添加し、約２０時間静置させ、そしてさらに〜８時間後、再度塩を０．３Ｍまで添加した。混合物を、約４から８時間まで静置させた。過剰のＤＮＡを除去するために、１８，０００ｒｐｍで、３０分間、１．５ｍＬエッフェンドルフ管を使用して、コロイドを遠心分離した。上清の除去に続いて、油状沈殿物を、捨てた上清に等しい体積で、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）溶液で洗浄し、遠心分離し、そして０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、０．０１％アジド溶液に分散させた。最終コロイドを冷蔵し、そして後に使用するために保存した。
【００４１】
（ｂ）コアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体の安定性の評価
上に記述される２つの方法により製造されたコアシェル型ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体を、上の２方法の各々で記述されるとおりの塩析手段を使用して比較した。
【００４２】
方法１により、塩濃度を、０．０５Ｍ  ＮａＣｌから０．１Ｍ  ＮａＣｌまで、そしてその後、０．３Ｍ  ＮａＣｌまでに増大させた。方法２により、塩濃度を、２段階：直接的に０．ｌＭ  ＮａＣｌまで、そしてその後、０．３Ｍ  ＮａＣｌまで増大させた。方法１は、方法２により製造されたものと比較した時に、高品質のナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体を生じる。方法２を介して、約１５％のナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体は、適切な品質のものでない。コアシェル型ナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体品質は、紫外−可視分光学により評価される。利用できる品質の結合体は、４００ｎｍに中心を置く表面プラズモン吸収ピークを示す紫外−可視スペクトルを示す一方で、品質の乏しい（不適切な）結合体は、明らかに低下させられた吸収ピーク、及び４５０−５５０ｎｍへの赤色移行を示す。
【００４３】
（ｃ）検討
３’−及び５’−アルカンチオール封止オリゴヌクレオチドを用いたこれらのコアシェル型ナノ粒子の表面修飾は、１３ｎｍ金粒子について使用されるものと一致する手段を用いて達成された２ｄ。明らかに、オリゴヌクレオチドで修飾された粒子は、純粋な金ナノ粒子の安定性を示し、そして無期限に１Ｍ  ＮａＣｌ溶液中に懸濁されうる。これは、匹敵する溶液条件下で、不可逆に凝集するオリゴヌクレオチド修飾銀／金合金粒子を越える明らかな利点を表すが、本発明のオリゴヌクレオチドで修飾されたコアシェル型ナノ粒子の安定性を示さない。
【００４４】
さらに、コアシェル型ナノ粒子は、連結オリゴヌクレオチドと相補的にハイブリダイゼーションを受けて、溶液の同時に起こる黒ずみを伴う凝集構造を形成する。しかし、際立
った色の変化で、裸眼で観察されたものはない（図２）。オリゴヌクレオチドで修飾された純粋金ナノ粒子のように、これらの銀／金コア／シェル凝集体構造を含むナノ粒子は、二重鎖リンカーの「融解温度」（Ｔｍ）より上でその凝集体を加熱することにより、分解されうる（図１Ｄ）。紫外−可視分光学は、ＤＮＡで誘導された構築物上にコア／シェル粒子のプラズモン共鳴の赤色移行及び低下を示す（図１Ｄ、挿入図）。図１Ｄは、緩衝溶液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ＝７）中のハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチド修飾銀／金コア／シェル粒子から形成された凝集体の温度変性（「融解」）曲線を示す。オリゴヌクレオチド配列は、図２Ａで供される。図１Ｄ挿入図は、分散オリゴヌクレオチドで修飾された銀／金コア／シェル粒子（実線）及びハイブリダイゼーションを介して形成された凝集（破線）オリゴヌクレオチドで修飾された銀／金コア／シェル粒子の紫外−可視スペクトルを示す。銀及び銀／金コア／シェル粒子の紫外−可視スペクトル（図１ｃ及び図１ｄの挿入図）は、ＨＰ８４５３ダイオードアレイ分光光度計を使用して得られた。熱変性実験（図１Ｄ）は、ＨＰ８９０９０ａペリティエール温度制御装置を具備したＨＰ８４５３ダイオードアレイ分光光度計を使用して行われた。１分／ｄｅｇ（度）の保持時間で、温度を、２５から７０℃まで増大させて、銀／金コア／シェル・プローブ／標的オリゴヌクレオチド凝集体の紫外−可視特徴を、１分間隔で記録した。
【００４５】
相補的ＤＮＡにより誘導される粒子構築工程をも、純粋な金システムとの比較に対処するＣ１８−逆相アルミナＴＬＣ板上で監視できる。図２ｂ及び２ｃで示されるスポット試験結果は、以下のとおり得られた。適切なオリゴヌクレオチド標的（２４ピコモル、３μＬ）の溶液を、２００μＬの各銀／金コアシェル型ナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体を含む６００μＬ薄壁ＰＣＲ管に添加した。室温で、３０分間、静置した後、その溶液を、温度制御加熱装置に移した。設定点の温度が達成された（エタノール熱量計で監視して、０．５℃増大）後、２．５μＬ量の銀−金プローブ／標的オリゴヌクレオチド溶液を、ピペットで、逆相アルミナ板に移したときに、混合液を５分間平衡にさせ、そして乾燥させた。
【００４６】
図２に示されるとおり、コア・シェル粒子で、固有の黄色から暗褐色への変化が、相補的標的（図２Ｂ−Ｉ及び２Ｂ−ＩＩ）の存在下で、粒子構築物上で観察される。溶液温度が、ＤＮＡ二重鎖リンカーのＴｍより上であるときに、黄色のスポットが、逆相アルミナ支持体上に形成される（図２Ｂ−ＩＩＩ）ことに注目すべきである。これらの新たな銀／金コア／シェル・プローブの特性を、純粋な金ナノ粒子（同一のオリゴヌクレオチド配列を有する）から誘導されるものと比較すると（図２Ｃ）、コア／シェル粒子が、１つの標本で２つの異なるオリゴヌクレオチド標的を監視するために最終的に使用されうる金システムと異なる第二の比色計の変化に対する経路を提供することをだれもが認識する。このような能力は、複数の色のフォーマットが必須である研究基本及び臨床のゲノムアッセイの両方にとって重要でありうる１６。
実施例３：銀、銀／金コア／シェル及び銀／金合金ナノ粒子オリゴヌクレオチド結合体の比較
この実施例では、実施例１（方法番号１）に記述されるとおりに製造された銀／金コアシェル型ナノ粒子を、金ナノ粒子２及び文献の方法により製造される銀／金合金ナノ粒子と比較した。リンク  エス．（Ｌｉｎｋ，Ｓ．）、ワン  ゼット．エル．（Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｌ．）、エル−サイード  エム．エー．（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｍ．Ａ．）  ジャーナル
オブ  フィジカル  ケミストリーＢ  第１０３巻  第３５２９頁、１９９９年参照。文献の手段に続いて、０．８ｍｇのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ及び１．８ｍｇのＡｇＮＯ３を、９５ｍｌのナノピュア水に溶解させた。溶液を還流するまで加熱し、そして５ｍｌの１％クエン酸ナトリウムをその溶液に添加した。さらに３０分間還流した後、溶液を、室温まで冷却させた。合金粒子の紫外−可視スペクトルは、９０ｎｍ（０．６２ｅＶ）の半値全幅（ＦＷＨＭ）で４２８ｎｍに表面プラズモン帯を示す。対照的に、匹敵する銀／金比
での銀／金コアシェル型ナノ粒子の紫外−可視スペクトルは、５８ｎｍ（０．４５ｅＶ）のＦＷＨＭで４００ｎｍに表面プラズモン帯を示す。
【００４７】
３’−及び５’−アルカンチオールで封止されたオリゴヌクレオチドを有するこれらのコア／シェル及び合金ナノ粒子の表面修飾は、１３ｎｍ金粒子について使用されたものと一致する手段を使用して達成された。ストーホフ  ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）、エルガニアン  アール．（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．）、ムーチック  アール．シー．（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．）、マーキン  シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、レッツィンガー  アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）  ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ  第１２０巻  第１９５９頁、１９９８年参照。明らかに、オリゴヌクレオチドで修飾されたコアシェル型ナノ粒子は、純粋な金ナノ粒子の安定性を示し、そして無期限に１Ｍ  ＮａＣｌ溶液で懸濁されうる（図３）。対照的に、オリゴヌクレオチドで修飾された銀／金合金粒子は、０．１Ｍの塩濃度になったときに不可逆に凝集する（図３）。
【００４８】
粒子／ＤＮＡ結合体の安定性を評価する別の方法は、ＤＮＡ融解試験を使用する。コアシェル型ナノ粒子／ＤＮＡ結合体は、０．１から１．０Ｍまでの範囲に入る塩濃度で、標的ＤＮＡと可逆的にハイブリッド形成でき、そして得られるナノ粒子凝集体は、融解温度より上で加熱したときに、「融解」しうる。このハイブリダイゼーション／脱ハイブリダイゼーション工程は、コア／シェル粒子に対して完全に可逆性である。コア／シェル粒子／ＤＮＡ結合体は、１００サイクル後、分解を示さず、そしてそれは、ＤＮＡハイブリダイゼーションを達成するのに必要な低塩濃度（０．０５Ｍ  ＮａＣｌ）下でさえ不可逆に凝集する銀／金合金粒子／ＤＮＡ結合体と鋭敏に対照をなす。
実施例４：Ｐｔ／金コアシェル型ナノ粒子の製造
本実施例では、本発明の方法によるＰｔ／金コアシェル型ナノ粒子の製造が記述されている。Ａ部では、一夜反応でのＫ２ＰｔＣｌ４の水素還元により、Ｐｔコアナノ粒子を製造した。Ｂ部では、金シェルを、Ｐｔコア上で成長させた。
【００４９】
（ａ）Ｐｔコアナノ粒子の製造
５００ｍｌ三つ首フラスコ中で、Ｋ２ＰｔＣｌ４（８．３ｍｇ）及びポリアクリル酸ナトリウム（２０ｍｇ）を、２００ｍｌのナノピュア水に溶解させた。攪拌しながら、一夜、Ｈ２を、反応溶液に通気させた。これは、精製及び単離されたＰｔナノ粒子を生じ、それにより直径約１２ｎｍのナノ粒子を得た。
【００５０】
（ｂ）Ｐｔ／金コアシェル型ナノ粒子の製造
１００ｍｌの１２ｎｍＰｔナノ粒子溶液（０．２５ナノモル、上記手段によって製造されるとおり）を、２５０ｍｌ三つ首フラスコに入れた。ナノ粒子溶液に、同時にＨＡｕＣｌ４及びＮａＢＨ４を、滴下で、０℃で加えた。希薄金前駆体の同時滴下添加は、これらの金形成試薬の濃度を約２μＭに維持することにより、金クラスター核形成部位の形成を阻害する。十分量のＨＡｕＣｌ４及びＮａＢＨ４を、ナノ粒子に添加して、Ｐｔナノ粒子上に金の１単層を生成した（５％過剰で、１２ｎｍ球体と考えて計算した：１．６ｍｇのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ及び４ｍｇのＮａＢＨ４）後、反応液へのこれらの試薬の添加を停止した。Ｐｔコア及びＰｔ／金コアシェル型ナノ粒子の紫外−可視スペクトルは、図４に示される。
実施例５：磁性Ｆｅ３Ｏ４／金コアシェル型ナノ粒子の製造
この実施例には、本発明の方法による磁性金ナノ粒子の製造が記述されている。Ａ部では、Ｆｅ３Ｏ４磁性コアナノ粒子を製造した。Ｂ部では、金シェルを、磁性コア上で成長させた。Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、ＦｅＰｔ及びＦｅＡｕのような他の磁性コアが、Ｆｅ３Ｏ４の代わりに使用されうる。図６は、磁性金ナノ粒子を製造するコア／シェルアプローチ法を示す。
【００５１】
（ａ）Ｆｅ３Ｏ４コアナノ粒子の製造
典型的な合成では、以下のとおりＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を製造した。第一に、０．８６ｇのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ及び２．３５ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを、不活性Ａｒ（ｇ）雰囲気下で、５０ｍＬナノピュア水に溶解させた。その溶液を、激しく攪拌しながら、８０℃まで加熱した。５ｍＬのアセトン中の１００ｍｇの生のデカン酸の溶液を、Ｆｅ溶液に添加し、続いて５ｍＬの２８％（ｗ／ｗ）ＮＨ３／Ｈ２Ｏを添加した。別の生のデカン酸を、５分かけて、５×０．２ｇ量で、その懸濁液に添加した。反応を、攪拌しながら、８０℃で、３０分間進行させて、安定で水基本の懸濁液を生成した。懸濁液の形成に続いて、反応液を室温までゆっくりと冷却した。粒子表面での表面交換に対処するために、得られたＦｅ３Ｏ４ナノ粒子（５．０ナノモル）を、さらに、一夜、チオレクチック酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｒｅｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）（０．１ミリモル）溶液で処理した。硫黄イオンが、Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の表面上で酸素に取って代り、それにより金シェルについての成長部位を供した。このリガンド交換方法は、Ｃｏ３Ｏ４磁性コアの製造にとっても必要である。
【００５２】
（ｂ）Ｆｅ３Ｏ４／金コアシェル型ナノ粒子の製造
金シェルを成長させる手段は、実施例１で記述されるコア／シェル銀／金製品のものに類似する。Ｆｅ３Ｏ４／金シェル成長の紫外−可視スペクトルは、図５に示される。使用される磁界では、Ｆｅ３Ｏ４／金コア／シェル・粒子は、優れた常磁性粒子として挙動する（図７）。ＤＮＡ官能化磁性体−金ナノ粒子の磁性特性は、図８Ａ，８Ｂに示されている。図８Ｃは、ＤＮＡ官能化磁性体−金ナノ粒子のＴＥＭ画像を示し（平均直径＝１８ｎｍ、シェル厚＝２ｎｍ、（コア直径＝１４ｎｍ））、そして図８Ｄは、標的ＤＮＡに連結した磁性体−金ナノ粒子プローブについての融解曲線を示す。プローブａ＝３’ＨＳ−Ａ２０−ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＡＡＴ  ＡＡＴ−５’、プローブｂ＝３’ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＣＴＡ  ＴＴＣ  ＣＴＡ−Ａ２０−ＳＨ５’、標的ａ’ｂ’＝５‘−ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＴＴＡ
ＴＴＧ  ＴＴＡ．．．ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＧＡＴ−３’。
実施例６：磁性Ｃｏ／金コアシェル型ナノ粒子の製造
本実施例では、本発明の方法による磁性金ナノ粒子の製造が記述されている。Ａ部では、Ｃｏ磁性コアナノ粒子を製造した。Ｂ部では、金シェルを、Ｃｏ磁性コア上に成長させた。
【００５３】
（ａ）Ｃｏナノ粒子コアの製造
Ｏ−ジクロロベンゼン（１５．９ｇ）、トリオクチルホスフィンオキシド（０．１ｇ）、及び０．２ｍｌのオレイン酸を、５０ｍｌ三つ首フラスコに入れ、そして１８０℃まで加熱した。Ｃｏ２（ＣＯ）８（３ｍｌのＯ−ジクロロベンゼン中の０．６５ｇ）の溶液を、加熱溶液への注入により添加した。この添加の後、反応温度を、１時間、１８０℃に維持させた。その後、反応溶液を、室温まで冷却した。直径約１２ｎｍのＣｏナノ粒子を、９５％の収率で生じた。図９は、Ｃｏナノ粒子についてのＴＥＭ画像を示す。
【００５４】
（ｂ）Ｃｏ／金コアシェル型ナノ粒子の製造
以下は、Ｃｏ／金コアシェル型ナノ粒子のための典型的な被覆プロトコールである。
Ｃｏナノ粒子（０．０１μモル）を、５０ｍｌ三つ首フラスコ中のＯ−ジクロロベンゼン（１２ｇ）に溶解させた後、トリオクチルホスフィンオキシド（０．１ｇ）を、Ｃｏ溶液に添加した。溶液を１８０℃に加熱し、その時点で、金−シェル保存溶液１及び２（以下参照）を、同時に滴下で、約５０μｌ−５００μｌ／分の速度で、熱反応溶液に添加した。十分量の保存溶液１及び２を添加（約５％過剰）した後、反応溶液を、さらに３０分間、１８０℃で維持した。続いて、反応を停止させるために室温に、反応液を冷却した。
【００５５】
金シェル保存溶液を、以下のとおり製造した：保存溶液１、ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ（
０．１ｇ）及びｎ−ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（０．１ｇ）を、Ｏ−ジクロロベンゼン（１０ｇ）に溶解させた。保存溶液２、１，１−ヘキサデカンジオール（０．１２ｇ）を、Ｏ−ジクロロベンゼン（１０ｇ）に溶解させた。
実施例７  ＣｄＳ、ＣｄＳｅ／金コアシェル型ナノ粒子の製造
本実施例には、本発明の方法による金被覆半導体量子ドットの製造について記述されている。Ａ部では、ＣｄＳｅ（又はＣｄＳ）半導体コア・ナノ粒子を製造した。Ｂ部では、金シェルを、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ半導体コア上で成長させた。
【００５６】
（ａ）ＣｄＳｅ（又はＣｄＳ）ナノ粒子の製造
ナノピュア水（１００ｍｌ）、クエン酸ナトリウム（１００ｍｇ）、及び過塩化カドニウム（２５ｍｇ）を、２５０ｍｌ三つ首フラスコに入れ、そして溶液のｐＨを、約９．０に調整した。３０分間、Ａｒで通気して、その後、溶液を、１００℃に加熱した。１，３−ジメチル−２−セレノウレア（又は１，３−ジメチル−２−チオウレア）の溶液（４ｍｌ、０．０２Ｍ）を、熱溶液に注入した。２分後、溶液を、室温に冷却した。ＣｄＳｅ（又はＣｄＳ）ナノ粒子を、セントリコンの濾過により溶液から分離し、そしてナノピュア水に再分散させた。
【００５７】
（ｂ）ＣｄＳｅ（又はＣｄＳ）／金コアシェル型ナノ粒子の製造
以下は、ＣｄＳｅ（又はＣｄＳ）／金コアシェル型ナノ粒子についての典型的被覆プロトコールである。
【００５８】
ＣｄＳｅ（又はＣｄＳ）ナノ粒子（直径〜４ｎｍ、１０ナノモル）を、２５０ｍｌ三つ首フラスコ中のナノピュア水（１００ｍｌ）に溶解させた後、クエン酸ナトリウム（０．２ｇ）を、ナノ粒子溶液に添加した。溶液を、０℃に冷却し、その時点で、金−シェル保存溶液１及び２（下記参照）を、同時に、滴下で、約５０μｌ−２００μｌ／分の速度で、反応溶液に添加した。十分量の保存溶液１及び２を添加した（約５％過剰）後、反応溶液を、０℃で、さらに３０分間、維持させた。続いて、反応溶液を、室温まで加温した。セントリコン濾過によりその溶液から分離して、ＣｄＳｅ（又はＣｄＳ）／金コアシェル型ナノ粒子を得た。
【００５９】
金シェル保存溶液を、以下のとおり製造した。保存溶液１、ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ（４．１ｍｇ）を、ナノピュア水（５ｍｌ）に溶解させた。保存溶液２、ＮａＢＨ４（７．４ｍｇ）を、０℃でナノピュア水（５ｍｌ）に溶解させ、そして使用のために０℃に保持した。
【００６０】
（参考文献）
１．  マーキン  シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、レッツィンガー  アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、ムーチック  アール．シー．（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．）、ストーホフ  ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）  ネイチャー  第３８２巻  第６０７頁、１９９６年。
【００６１】
２．  （ａ）  エルガニアン  アール．（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．）、ストーホフ  ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）、ムーチック  アール．シー．（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．）、レッツィンガー  アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、マーキン  シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）  サイエンス  第２７７巻  第１０８７頁、１９９７年。
【００６２】
（ｂ）  タトン  ティ．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）、レッツィンガー  アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、マーキン  シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）  サイエンス  第２８９巻  第１７５７頁、１９９９年。
【００６３】
（ｃ）  タトン  ティ．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）、ルー  ジー．（Ｌｕ，Ｇ．）、マーキン  シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）  ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ  第１２３巻  第５１６４頁、２００１年。
【００６４】
（ｄ）  ストーホフ  ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）、アルガニアン  アール．（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．）、ムーチック  アール．シー．（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．）、マーキン  シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、レッツィンガー  アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）  ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ  第１２０巻  第１９５９頁、１９９８年。
【００６５】
３．  （ａ）  マン  エス．（Ｍａｎｎ，Ｓ．）、シェントン  ダブリュ．（Ｓｈｅｎｔｏｎ，Ｗ．）、リー  エム．（Ｌｉ，Ｍ．）、コノリー  エス．（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｓ．）、フィッツモーリス  ディ．（Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅ，Ｄ．）  アドバンスト  マテリアルズ第１２巻  第１４７頁、２０００年
（ｂ）  ニーマイヤー  シー．エム．（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ｍ．）、バーガー  ダブリュ．（Ｂｕｒｇｅｒ，Ｗ．）、ペプリース  ジェイ．（Ｐｅｐｌｉｅｓ，Ｊ．）  アンゲヴァント  ヒェミー  インターナショナル  エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．）第３７巻  第２２６５頁、２０００年。
【００６６】
４．  アリビサトス  エー．ピー．（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ，Ａ．Ｐ．）、ジョンソン
ケイ．ピー．（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．）、ペン  エックス．（Ｐｅｎｇ，Ｘ．）、ウィルソン  ティ．イー．（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．Ｅ．）、ロウェス  シー．ジェイ．（Ｌｏｗｅｔｈ  Ｃ．Ｊ．）、ブルチェス  エム．ピー．ジュニア（Ｂｒｕｃｈｅｚ，Ｍ．Ｐ．，Ｊｒ．）、シュルツ  ピー．ジー．（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．）  ネイチャー  第３８２巻  第６０９頁、１９９６年。
【００６７】
５．  ミッチェル  ジー．ピー．（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｇ．Ｐ．）、マーキン  シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、レッツィンガー  アール．エル．（ＬｅｔｓｉｎｇｅｒＲ．Ｌ．  ）  ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ  第１２１巻  第８１２２頁、１９９９年。
【００６８】
６．  チャン  ダブリュ．シー．ダブリュ．（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｗ．）、ニー  エス．（Ｎｉｅ，Ｓ．）  サイエンス  第２８１巻  第２０１６頁、１９９８年。
７．  マトゥーシ  エイチ．（Ｍａｔｔｏｕｓｓｉ，Ｈ．）、モーロ  ジェイ．エム．（Ｍａｕｒｏ，Ｊ．Ｍ．）、ゴールドマン  イー．アール．（Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｅ．Ｒ．）、アンダーソン  ジー．ピー．（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｐ．）、サンダー  ブイ．シー．（Ｓｕｎｄａｒ  Ｖ．Ｃ．）、ミクレック  エフ．ブイ．（Ｍｉｋｕｌｅｃ  Ｆ．Ｖ．）、バウェンディ  エム．ジー．（Ｂａｗｅｎｄｉ，Ｍ．Ｇ．）  ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ  第１２２巻  第１２１４２頁、２０００年。
【００６９】
８．  ヒー  エル．（Ｈｅ，Ｌ．）、ムジック  ディ．エム．（Ｍｕｓｉｃｋ，Ｄ．Ｍ．）、ナイスワーナー  エス．アール．（Ｎｉｃｅｗａｒｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．）、サーリナ
エフ．ジー．（Ｓｓａｌｉｎａｓ，Ｆ．Ｇ．）、ベンコヴィック  エス．ジェイ．（Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．）、ナタン  エム．ジェイ．（Ｎａｔａｎ，Ｍ．Ｊ．）、キーティング  シー．ディ．（Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｃ．Ｄ．）  ジャーナル  オブ  アメリカン
ケミカル  ソサイエティ  第１２２巻  第９０７１頁、２０００年。
【００７０】
９．  パタック  エス．（Ｐａｔｈａｋ，Ｓ．）、チョイ  エス．ケー（Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｋ．）、アーンハイム  エヌ．（Ａｒｎｈｅｉｍ，Ｎ．）、トムソン  エム．イー．（
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．）  ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ  第１２３巻  第４１０３頁、２００１年。
【００７１】
１０．  マーティン  ビー．アール．（Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ｒ．）、ダーモディ  ディ．ジェイ．（Ｄｅｒｍｏｄｙ，Ｄ．Ｊ．）、ライス  ビー．ディ．（Ｒｅｉｓｓ，Ｂ．Ｄ．）、ファン  エム．（Ｆａｎｇ，Ｍ．）、リオン  エル．エー．（Ｌｙｏｎ，Ｌ．Ａ．）、ナタン  エム．ジェイ．（Ｎａｔａｎ，Ｍ．Ｊ．）、マルーク  ティ．イー．（Ｍａｌｌｏｕｋ，Ｔ．Ｅ．）  アドバンスト  マテリアルズ  第１１巻  第１０２１頁、１９９９年。
【００７２】
１１．マルバネイ  ピー．（Ｍｕｌｖａｎｅｙ，Ｐ．）  ラングムア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）  第１２巻  第７８８頁、１９９６年。
１２．  リンク  エス．（Ｌｉｎｋ，Ｓ．）、ワン  ゼット．エル．（Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｌ．）、エル−サイード  エム．エー（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｍ．Ａ．）  ジャーナル  オブ  フィジカル  ケミストリーＢ  第１０３巻  第３５２９頁、１９９９年。
【００７３】
１３．  ウング  ティ（Ｕｎｇ，Ｔ．）、リズ−マーザン  エル．エム．（Ｌｉｚ−Ｍａｒｚａｎ，Ｌ．Ｍ．）、マルバネイ  ピー．（Ｍｕｌｖａｎｅｙ，Ｐ．）  ラングムア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）  第１４巻  第３７４０頁、１９９８年。
【００７４】
１４．  リンド  ディ．アール．（Ｌｉｄｅ，Ｄ．Ｒ．）編、「化学及び物理学のハンドブック」、シーアールシー・プレス、ボカラトン、１９９２年。
１５．  （ａ）マルバネイ  ピー．（Ｍｕｌｖａｎｅｙ，Ｐ．）、ギエルシグ  エム．（Ｇｉｅｒｓｉｇ，Ｍ．）、ヘングライン  エー．（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ）  ジャーナル  オブ  フィジカル  ケミストリー  第９７巻  第７０６１頁、１９９３年
（ｂ）リバス  エル．（Ｒｉｖａｓ，Ｌ．）、サンチェ−コルテス  エス．（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｏｒｔｅｓ，Ｓ．）、ガルシア−ラモス  ジェイ．ブイ．（Ｇａｒｃｉａ−Ｒａｍｏｓ；Ｊ．Ｖ．）、モルチロ  ジー．（Ｍｏｒｃｉｌｌｏ，Ｇ．）、ラングムア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）１６巻、９７２２頁、２０００年。
【００７５】
（ｃ）イゲウラビド（Ｙｇｅｕｒａｂｉｄｅ）  米国特許第６，２１４，５６０号
１６．  シュロック  イー．（Ｓｃｈｒｏｃｋ，Ｅ．）、デュマノアール  エス．（ｄｕＭａｎｏｉｒ，Ｓ．）、ヴェルドマン  ティ．（Ｖｅｌｄｍａｎ，Ｔ．）、シェール  ビー．（Ｓｃｈｏｅｌｌ．Ｂ．）、ウィンバーグ  ジェイ．（Ｗｉｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．）、ファーガソン  スミス  エム．エー．（ＦｅｒｇｕｓｏｎＳｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．）、ニン  ワイ．（Ｎｉｎｇ，Ｙ．）、レッドベター  ディ．エイチ．（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｄ．Ｈ．）、バーアム  アイ．（ＢａｒＡｍ，Ｉ．）、ソエンクセン  ディ．（Ｓｏｅｎｋｓｅｎ，Ｄ．）、ガリーニ  ワイ．（Ｇａｒｉｎｉ，Ｙ．）、リエド  ティ．（Ｒｉｅｄ，Ｔ．）、サイエンス  第２７３巻  第４９４頁、１９９６年
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】Ａｇ／金コアシェル型ナノ粒子のＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）画像。
【図１Ｂ】Ｌ及びＭが、それぞれ高い状態から原子のＬ殻，Ｍ殻への電子移動を意味することを特徴とする、銀コアナノ粒子（破線）及び銀／金コアシェル型ナノ粒子（実線）のＥＤＸ（エネルギー分散型Ｘ線）スペクトル。
【図１Ｃ】銀コア（破線）及びＡｇ／金コア／シェル（実線）の紫外−可視スペクトル（挿入図は、銀ナノ粒子（破線）及びＡｇ／金コアシェル型ナノ粒子（実線）の計算された吸光スペクトルを示す）。
【図１Ｄ】緩衝溶液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭリン酸緩衝剤、ｐＨ＝７）中のハイブリッド化されたオリゴヌクレオチド修飾Ａｇ／金コアシェル型ナノ粒子から形成される凝集体の熱変性曲線（挿入図は、ハイブリダイゼーションから形成される分散オリゴヌクレオチドで修飾されたＡｇ／金コアシェル型ナノ粒子（実線）及び凝集（破線）オリゴヌクレオチドで修飾されたＡｇ／金コアシェル型ナノ粒子の紫外−可視スペクトルを示す。基本配列は、図２Ａに示される。）
【図２】（Ａ）メルカプトアルキル−オリゴヌクレオチド修飾Ａｇ／金コア／シェル粒子及びポリヌクレオチド標的を示す。ＣＳ：コア／シェル；アルキル：プロピル（左）及びヘキシル（右）。ＤＮＡスポット試験は、（Ｂ）１２．４−ｎｍＡｇ／金ナノ粒子プローブ及び（Ｃ）１３−ｎｍ金ナノ粒子プローブ：（Ｉ）標的なし、（ＩＩ）室温で標的を伴って、（ＩＩＩ）ハイブリッド化ＤＮＡのＴｍ（５３．０℃）より上の温度である５８．０℃で、標的を伴って使用する。
【図３】様々な塩濃度でのＡｇ、Ａｇ／Ａｕ合金、及びＡｇ／Ａｕコアシェル型ナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合体の相対的安定性を示すグラフ。
【図４】Ｐｔコア（破線）及びＰｔ／金コアシェル型ナノ粒子（実線）の紫外−可視スペクトル。
【図５】厚さ０、０．３ｎｍ、０．６ｎｍ、及び０．９ｎｍでのＦｅ３Ｏ４ナノ粒子の表面での金成長の紫外−可視スペクトル。
【図６】磁性金ナノ粒子を製造するためのコア／シェルアプローチ法を示す概念図。
【図７】使用された磁界の存在下で、超常磁性粒子としてのＦｅ３Ｏ４／金コアシェル型ナノ粒子の挙動を示す。磁界の存在下で、磁性金ナノ粒子を含む溶液は、赤色を現す。磁界を２時間の間に亙って印加した場合、溶液は、ナノ粒子が磁力に向けて移動するときに無色になる。
【図８Ａ】ＤＮＡ官能化磁性体−金ナノ粒子の磁力特性を示すグラフ。
【図８Ｂ】ＤＮＡ官能化磁性体−金ナノ粒子の磁力特性を示すグラフ。
【図８Ｃ】ＤＮＡ官能化磁性体−金ナノ粒子（平均直径＝１８ｎｍ、シェル厚＝２ｎｍ、（コア直径＝１４ｎｍ））のＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）画像。
【図８Ｄ】標的ＤＮＡに結合された磁性体−金ナノ粒子プローブの融解曲線。プローブａ＝３’ＨＳ−Ａ２０−ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＡＡＴ  ＡＡＴ−５’、プローブｂ＝３’ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＣＴＡ  ＴＴＣ  ＣＴＡ−Ａ２０−ＳＨ５’、標的ａ’ｂ’＝５’−ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＴＴＡ  ＴＴＧ  ＴＴＡ．．．ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＡＡＧ  ＧＡＴ−３’。
【図９】Ｃｏナノ粒子のＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）画像。
【図１Ａ】
2005520125.tif 000002
【図１Ｂ】
2005520125.tif 000003
【図１Ｃ】
2005520125.tif 000004
【図１Ｄ】
2005520125.tif 000005
【図２】
2005520125.tif 000006
【図３】
2005520125.tif 000007
【図４】
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【図５】
2005520125.tif 000009
【図６】
2005520125.tif 000010
【図７】
2005520125.tif 000011
【図８Ａ】
2005520125.tif 000012
【図８Ｂ】
2005520125.tif 000013
【図８Ｃ】
2005520125.tif 000014
【図８Ｄ】
2005520125.tif 000015
【図９】
2005520125.tif 000016
【国際調査報告】
2005520125.tif 000017
2005520125.tif 000018
2005520125.tif 000019