(57)【要約】本発明は、細胞工学用のポリマー表面上に高密度の細胞特異的リガンドを固定化する方法について述べる。この方法は、高密度の官能基を生成する表面グラフト重合方法と、この表面の官能基に細胞特異的リガンドを結合させる化学結合工程を組み合わせる。この表面機能付与方法は、ポリマー製メンブレン、フィルム、繊維、中空繊維、発泡体など、様々な形態のポリマー材に適用することができる。同様に、細胞特異的リガンドを用いて組織工学用足場に機能を付与することができる。
2005537813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞工学および組織工学用ポリマー材を改質する方法であって、ポリマー表面に結合された細胞特異的リガンドのクラスターを備えている方法。
【請求項２】
上記リガンドは、肝細胞に特異的である請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記ポリマー表面は、織り地、不織地、編み地、編組み地または繊維状である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連の出願）
本願は、２００２年９月６日に「ポリマー表面へのリガンドのクラスターの固定化方法および細胞工学上の利用」の名称で出願された米国仮出願第６０／４０８，７８９号に関連し、該仮出願に対する優先権を主張するものであって、その全体が本明細書に引用の形で盛り込まれている。
【０００２】
本発明は、細胞工学および組織工学用ポリマー材の機能付与に関する。本発明は、高密度の細胞特異的リガンドをポリマー材表面に固定化する方法に関する。これらの表面機能化ポリマー材（２次元または３次元；非生分解性または生分解性）は、細胞または組織を技術的に作成する目的で設計される。
【背景技術】
【０００３】
急性肝不全（ＡＦＬ）は、７０％もの高い死亡率を有する生命を脅かす疾病であり、米国では、年間３万人を超える死亡者を出している。大部分のＡＬＦ患者にとって最善の策は肝臓移植であるが、ドナーの深刻な不足がこの方策の広範な適用を阻んでいる（非特許文献１）。生命を脅かす肝臓外の合併症を防止あるいは処置する集中治療の下であれば、さらに生命を維持できる肝機能が残っている患者の何分の１かを回復させることができる。生体機能を与えることはできないが、一時的な肝臓補助システムによって生命を維持するならば再生が可能な肝臓を持つ患者群も存在する。バイオ人工肝補助装置（ＢＬＡＤ）は、そのような補助システムを提供して、ドナーが得られるまで、あるいは悪化した肝臓が再生するまで肝機能を一時的に代替し、患者の生命を維持させることを目的としている。ＢＬＡＤは、３つの主要な構成要素、すなわち、重要な肝臓の表現型を示す細胞と、これら表現型の発現を促進し持続させる足場すなわち基質と、肝細胞と潅流血液との間の生化学反応および生体的輸送を容易にするバイオリアクタとから構成されている（非特許文献２，３）。
【０００４】
肝細胞は足場依存性細胞であるので、効を奏するＢＬＡＤ構成を決定する要因の一つは、肝細胞の付着と機能維持にとって適切な足場すなわち基質である（非特許文献４）。肝細胞培養用の基質として、コラーゲン（非特許文献５，６）、フィブロネクチン（非特許文献７）、ラミニン（非特許文献８）などの様々な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質や、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ（非特許文献９）などの細胞接着ペプチドが使用されている。肝細胞の付着性および生存能は、これらＥＣＭタンパク質で被覆された表面上で組織培養を行うことによって向上させることができる。この向上は、ＥＣＭタンパク質内の細胞接着ペプチド（例えば、ＲＧＤ）と肝細胞表面の受容体インテグリンとの間の相互作用によるものと考えられているが、その機序は依然として不明である。コラーゲンゲルまたはMatrigel（商標）のオーバレイを用いて培養構成を３次元に変更すれば、初代ラット肝細胞の肝機能の維持と寿命を大幅に向上させることができるであろう（非特許文献１０）。にもかかわらず、そのようなヒドロゲル系をバイオリアクタ構成に適用することは非常に難題である。
【０００５】
ガラクトシル化された表面は、そのガラクトースリガンドと肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）との特異的な相互作用のゆえに、肝細胞培養基質として魅力的な別の選択肢である。いくつかの研究により、固定化されたガラクトースリガンドが肝細胞の付着性向上と、細胞機能の維持を可能にすることが分かっている（非特許文献１１−１３）。固定化ガラクトースリガンドとしては、ガラクトピラノシル基が固定化されたポリアクリルアミドゲル（１１）や、ポリ−Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド（ＰＶＬＡ）で被覆されたポリスチレン表面（非特許文献１４）などがある。後者のポリスチレン表面は、肝細胞接着性を向上させ、アルブミン合成機能を２週間持続させることが分かっている（非特許文献１４）。この効果は、ガラクトシルリガンド（すなわちＰＶＬＡ）の表面密度に依存していた。低密度のＰＬＶＡ（０．１５ｎｍｏｌ／ｃｍ2のガラクトースに相当）で被覆された表面は、伸展する形態と低濃度の胆汁酸分泌を発生させる一方、より高密度のＰＶＬＡ被覆（２．３ｎｍｏｌ／ｃｍ2のガラクトースに相当）は、丸い形態を維持するとともに、肝細胞凝集体の形成を誘発して、高濃度の胆汁酸分泌と長期の生存能を発現する（非特許文献１５，１６）。
【非特許文献１】ツァナカキス(Tzanakakis) ES, ヘス(Hess) DJ, ジーラフ(Sielaff) TD, フー(Hu) WS 「組織工学により作成された体外肝臓補助装置(Extracorporeal tissue engineered liver-assist devices)」アンニュアル・レビュー・オブ・バイオメディカル・エンジニアリング(Annu Rev Biomed Eng) 2000; 2:607-632
【非特許文献２】アレン(Allen) JW, ハッサネイン(Hassanein) T, バーティア(Bhatia) SN「バイオ人工肝臓装置の進歩(Advances in bioartificial liver devices)」ヘパトロジー(Hepatology) 2001; 34(3):447-455
【非特許文献３】ザウアー(Sauer) IM, オーベルメイヤー(Obermeyer) N, カルダッシス(Kardassis) D, テルヴァス(Theruvath) T, ガーラック(Gerlach) JC「ハイブリッド型肝臓補助システムの開発(Development of a hybrid liver support system)」アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシーズ(Ann NY Acad Sci) 2001; 944:308-19
【非特許文献４】ル・クリュイズ(Le Cluyse) EL, ブロック(Bullock) PL, パーキンソン(Parkinson) A「ラット肝細胞の長期培養における正常な肝構造および肝機能の修復と維持に関する手法(Strategies for restoration and maintenance of normal hepatic structure and function in long-term cultures of rat hepatocytes)」アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ(Adv Drug Deliv Rev) 1996; 22:133-186
【非特許文献５】タグチ(Taguchi) K, マツシタ(Matsushita) M, タカハシ(Takahashi) M, ウチノ(Uchino) J「コラーゲンゲル２層間でサンドイッチ培養された肝細胞を有する人工肝の開発(Development of a bioartificial liver with sandwiched-cultured hepatocytes between two collagen gel layers)」アーティフィシャル・オーガンズ(Artif Organs) 1996; 20(2):178-185
【非特許文献６】ダン(Dunn) JC, ヤルムシュ(Yarmush) ML, ケーベ(Koebe) HG, トンプキンス(Tompkins) RG「肝細胞機能および細胞外マトリックス形状(Hepatocyte function and extracellular matrix geometry): サンドイッチ構造での長期培養(long-term culture in a sandwich configuration)」ザ・ＦＡＳＥＢ・ジャーナル(FASEB J) 1989; 3(2):174-177
【非特許文献７】サンチェス(Sanchez) A, アルヴァレス(Alvarez) AM, パガン(Pagan) R, ロンセロ(Roncero) C, ヴィラーロ(Vilaro) S, ベニート(Benito) M, ファブレガ(Fabregat) I「フィブロネクチンは初代培養のラット胎児肝細胞の形態、細胞組織化および遺伝子発現を調節する(Fibronectin regulates morphology, cell organization and gene expression of rat fetal hepatocytes in primary culture.)」ジャーナル・オブ・ヘパトロジー(J Hepatol) 2000; 32(2):242-250
【非特許文献８】オダ(Oda) H, ノザワ(Nozawa) K, ヒトミ(Hitomi) Y, カキヌマ(Kakinuma) A「ラミニンリッチな細胞外マトリックスはラット肝細胞培養において高濃度の肝細胞核因子４を維持する(Laminin-rich extracellular matrix maintains high level of hepatocyte nuclear factor 4 in rat hepatocyte culture.)」バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem Biophys Res Commun) 1995; 212(3):800-805
【非特許文献９】カーライル(Carlisle) ES, マリアッパン(Mariappan) MR, ネルソン(Nelson) KD, トーメス(Thomes) BE, ティモンズ(Timmons) RB, コンスタンチネスキュ(Constantinescu) A, エバーハート(Eberhart) RC, バンケイ(Bankey) PE「パルス状プラズマ堆積とポリエチレングリコールのカップリングによる肝細胞接着の向上(Enhancing hepatocyte adhesion by pulsed plasma deposition and polyethylene glycol coupling)」ティッシュ・エンジニアリング(Tissue Eng) 2000; 6(1):45-52
【非特許文献１０】モーグ(Moghe) PV, ベルティオーメ(Berthiaume) F, エゼル(Ezzell) RM, トナー(Toner) M, トンプキンス(Tompkins) RG, ヤルムシュ(Yarmush) ML「肝細胞の極性と機能の維持における培養マトリックスの構成と組成(Culture matrix configuration and composition in the maintenance of hepatocyte polarity and function)」バイオマテリアルズ(Biomaterials) 1996; 17(3):373-385
【非特許文献１１】ワイゲル(Weigel) PH「ラット肝細胞はアシアロ糖タンパク質受容体のパッチを介して合成ガラクトシド表面に結合する(Rat hepatocytes bind to synthetic galactoside surfaces via a patch of asialoglycoprotein receptors.)」ザ・ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J Cell Biol) 1980; 87(3 Pt 1):855-861
【非特許文献１２】コバヤシ(Kobayashi) A, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「基層としてラクトース担持ポリスチレンを用いた肝実質細胞の接着と分離の制御(Control of adhesion and detachment of parenchymal liver cells using lactose-carrying polystyrene as substratum)」ジャーナル・オブ・バイオマテリアル・サイエンス・ポリマー・エディション(J Biomater Sci Polym Ed) 1992; 3(6):499-508
【非特許文献１３】ヤン(Yang) J, ゴトウ(Goto) M, イセ(Ise) H, チョー(Cho) CS, アカイケ(Akaike) T「肝細胞捕捉用足場としてのガラクトシル化アルギン酸塩(Galactosylated alginate as a scaffold for hepatocytes entrapment)」バイオマテリアルズ(Biomaterials) 2002; 23(2):471-479
【非特許文献１４】トベ(Tobe) S, タケイ(Takei) Y, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「アシアロ糖タンパク質モデルポリマー上での初代培養ラット肝細胞の組織再構成(Tissue reconstruction in primary cultured rat hepatocytes on asialoglycoprotein model polymer)」アーティフィシャル・オーガンズ(Artif Organs) 1992; 16(5):526-532
【非特許文献１５】コバヤシ(Kobayashi) A, ゴトウ(Goto) M, セキネ(Sekine) T, マスモト(Masumoto) A, ヤマモト(Yamamoto) N, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「ラクトース担持ポリスチレンによるラット肝細胞の分化および増殖の調節(Regulation of differentiation and proliferation of rat hepatocytes by lactose-carrying polystyrene)」アーティフィシャル・オーガンズ(Artif Organs) 1992; 16(6):564-567
【非特許文献１６】コバヤシ(Kobayashi) A, ゴトウ(Goto) M, コバヤシ(Kobayashi) K, アカイケ(Akaike) T「受容体を介在させた、アシアロ糖タンパク質の合成ポリマーモデルによる肝細胞の分化および増殖の調節(Receptor-mediated regulation of differentiation and proliferation of hepatocytes by synthetic polymer model of asialoglycoprotein)」ジャーナル・オブ・バイオマテリアル・サイエンス・ポリマー・エディション(J Biomater Sci Polym Ed) 1994; 6(4):325-342
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
最適のＢＬＡＤ性能を得るためには、高親和性の接着と高密度の細胞培養を容易にする高ガラクトースリガンド密度の基質を作成することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この研究課題において、発明者らは、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）グラフト技術を用いて高密度の固定化ガラクトースリガンドを実現する表面改質方法を開発した（図１）。ガラクトースの結合と表面固定化ガラクトースリガンドの結合活性とが特徴づけられた。高密度の肝細胞培養物を用いて、肝細胞の付着性、形態および機能に対する表面ガラクトース部分の効果をコラーゲン被覆基質と比較して調査した。
【０００８】
本発明は、ポリマー表面に高密度の細胞特異的リガンドを固定化する２つの方法について述べており、第１の固定化方法は以下の３つの工程を備えている。すなわち、
（１）まず、２次元または３次元構造の形状のポリマー材（例えば、フィルム、シート、メンブレン、繊維、中空繊維、フォーム、織物、編物、組物など）を（アルゴン、酸素、アンモニアなどの状態下での）プラズマ処理、オゾン処理または紫外線照射などによって活性化し、表面にフリーラジカル（遊離基）または官能基を生成する。
【０００９】
（２）これら予め活性化された表面をモノマー溶液と反応させ、ポリマー鎖にカルボキシル基、アミノ基、水酸基、スルフヒドリル基などの官能基をグラフトする。第１の工程中に生成された表面上のフリーラジカルまたは官能基は、グラフト重合の開始剤となる。
【００１０】
（３）第２の工程で生成された官能基に、特定細胞種用のリガンドを化学結合によって結合させる。リガンドの結合のために、リガンド上またはポリマー表面上の官能基に応じて様々な化学反応を利用することが可能である。
【００１１】
第２の方法は２つの工程を備えている。すなわち、
（１）（官能基、例えば、カルボキシル基やアミノ基を有する）ポリマー鎖を紫外線開始反応によりポリマー表面に直接グラフトする。例えば、ＰＥＴメンブレンをアクリル酸溶液（０．０１％ないし１０％）に浸漬し、５ないし１０分間紫外線照射にさらした後、水で十分に洗浄する。
【００１２】
（２）第１の工程で生成された官能基に、肝細胞に特異的なリガンドを化学結合によって結合させる。リガンドの結合のために、リガンド上またはポリマー表面上の官能基に応じて様々な化学反応を利用することが可能である。通常は、ＥＤＣカップリング反応を用いて、機能付与された表面にリガンドを結合させる。
【００１３】
肝細胞に特異的な生体機能的基質および足場を利用するには、足場／基質の肝細胞（初代肝細胞または肝細胞系）を最適の培地（無血清培地または血清含有培地）で培養することが必要である。
【００１４】
以下の例が示すように、ガラクトースリガンド結合方法と併せてポリアクリル酸（ＰＡＡ）グラフト技術を用いることにより、表面リガンド密度が高くかつリガンド移動度が高い肝細胞特異的表面を作成することに成功した。そのようなガラクトシル化ＰＥＴ基質は、効率的な細胞付着を支援するとともに、肝細胞凝集体の形成を誘発した。この生体機能基質上で培養された肝細胞のアルブミン合成機能は、コラーゲン被覆表面上でのそれに比べてよく維持されていた。この研究により、肝臓組織工学において、特にバイオ人工肝補助装置の設計に対して、肝細胞特異的生体機能基質を利用することが可能であることが示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
細胞外マトリックスは、肝細胞の表現型維持において重要な役割を果たすことが分かっている（文献１７，１８参照）。コラーゲン被覆表面（文献１９参照）とガラクトース含有ポリマー（ＰＶＬＡ）被覆表面（非特許文献１５参照）は、劇的に異なる細胞挙動を発生させた。コラーゲン被膜上に培養された肝細胞は平坦な形状の単分子層を形成したが、ＰＶＬＡ被膜は丸い形態と凝集体の形成を促した。これらの研究は、恐らくは相対的に低い表面リガンド密度のゆえに、相対的に低い細胞接種密度を用いて実行された。本稿は、基質表面上にはるかに多量のリガンドをもたらす表面改質方法を提供した。この方法は、ＰＥＴフィルム表面にＰＡＡ鎖をグラフトする表面プラズマ処理と、その後のガラクトースリガンドの結合を伴った。
【００１６】
グラフト重合は、材料表面を改質するのに有効な手法である（文献２０参照）。グラフト重合は、表面に機能を付与して材料の生体適合性を向上させるために広く利用されている。グラフト重合手法は、改質の程度を自由に調節することも可能にする。本研究では、表面にＰＡＡグラフト化によって大量のカルボキシル基を導入するように、条件が最適化された。このことは、ひいては、ガラクトースリガンドの表面密度を高密度（０．５１３μｍｏｌ／ｃｍ2）にすることになった。最大リガンド密度は、ポリスチレン表面へのＰＶＬＡ被覆によって達成される密度（２．３ｎｍｏｌ／ｃｍ2のガラクトース密度）よりも約２２０倍高かった。
【００１７】
この構成では、ＰＡＡ鎖は、結合されたリガンドに高い移動性を付与するスペーサの働きもする。この特徴は、高いリガンド密度と相まって、ＦＩＴＣ−レクチン結合実験が示すように、表面結合リガンドの結合親和性を高くすることになった。ラットのアシアロ糖タンパク質受容体など、レクチンは、３種類のサブユニットと多数の結合部位からなる、糖質リガンドを特異的に結合させるタンパク質である。研究により、糖質とレクチンとの結合親和性が、クラスター化された多重結合により、一価の態様に比べて数桁分増大することが明らかになっている（文献２１，２２参照）。発明者らは、高濃度のガラクトースと高移動度の表面ガラクトースリガンドがそのようなリガンドクラスターを表面上に多数発生させることになり、したがって、肝細胞の高い付着性を仲介することができる（文献２３参照）という仮説を立てた。この仮説は、ガラクトシル化されたＰＥＴフィルムとＦＩＴＣ−レクチンとの間の結合が、溶液中の超過量（１５０倍）の遊離ガラクトースによって大きくは阻害され得ないことを示す結果によって支持される。
【００１８】
肝細胞の凝集体形成と機能維持は、リガンド密度に依存する（図６）。PET-Gal表面に対する肝細胞付着効率は、表面リガンド密度とともに上昇し、コラーゲン被覆表面上の肝細胞付着効率と同じの７８％の横ばい状態（ガラクトース密度＞４７ｎｍｏｌ／ｃｍ2）に達した。リガンド密度が９ｎｍｏｌ／ｃｍ2を超えると広範囲の凝集体形成が明白になる一方で、約４８ｎｍｏｌ／ｃｍ2の表面リガンド密度のときは、尿素合成機能が上記横ばい状態に達した。スフェロイド形成に付随して、リガンド密度が高い（４７．５ないし５１３ｎｍｏｌ／ｃｍ2）基質に付着した肝細胞のほうが、リガンド密度が低い表面に付着した肝細胞よりも尿素合成機能が高かった。
【００１９】
このリガンド固定化方法は、多数の細胞工学および組織工学用途に広く利用して、細胞特異的リガンドを所望の密度で結合させることができる。この手法が一般性をもつことは、この方式を様々なポリマー材、生分解性および非生分解性ポリマーに２次元構成にも３次元構成にも広く適用可能であることを意味している。別の材料の一例は、生分解性ポリマーであるε−カルプロラクトン(carprolactone)・エチレンエチルフォスフェイト共重合体（Ｐ（ＣＬ−ｃｏ−ＥＥＰ））である。ガラクトシル化ＰＥＴ基質と同様に、ガラクトシル化Ｐ（ＣＬ−ｃｏ−ＥＥＰ）基質は、未改質の基質の細胞付着率（５０．４％）よりもはるかに高い細胞付着率（９０．２％）を示した。コラーゲンが被覆されたＰ（ＣＬ−ｃｏ−ＥＥＰ）メンブレンは、８１．７％の細胞付着率を示した。ガラクトシル化Ｐ（ＣＬ−ｃｏ−ＥＥＰ）基質上で培養された肝細胞は、未改質表面上での３日目の飛散状の接着性とは対照的に、スフェロイドを形成した（図７）。コラーゲン被覆メンブレンは、予想通り、単分子層の形成を促した。
【００２０】
細胞−基質間相互作用は、多数の組織工学システムで細胞の挙動を調節する際の主要なパラメータである。基質による肝細胞の挙動調節の機序を理解することは、最適の肝細胞機能を維持するのに適した足場の設計にとってきわめて重要である。本稿において説明した化学的に特定の基質は、機序の研究にとって優れたモデルとなるであろう。そして、この細胞−基質間相互作用に関与する様々な因子、例えば、リガンドの種類、リガンド密度および多数のリガンドによる相乗効果を体系的に評価することを可能にするであろう。
【実施例】
【００２１】
以下の実施例は、実例として示されたものであり、いかようにも本発明を限定することを意図したものではない。
【００２２】
実施例１．ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）メンブレン表面への高密度ガラクトースリガンドの固定化（図１）
グッドフェロー(Goodfellow)社（英国）から厚さ１００μｍのＰＥＴフィルムを購入した。メルク(Merck)社（ドイツ）からアクリル酸（ＡＡｃ）とガラクトースを購入した。ピアス(Pierce)社（米国）からＮ−ヒドロキシスクシニミド(Sulfo-NHS)を購入した。特に明記しない限り、シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)社からその他全ての化学物質を購入した。
【００２３】
ポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）によるＰＥＴ表面グラフト化
ＰＥＴフィルムを寸法２．５ｃｍｘ５ｃｍの小片に切り分け、超音波水槽内で５分間アルコール洗浄した。これらＰＥＴフィルムを石英製円筒形グロー放電セル（米国アナテック社(Anatech Ltd.)Model SP100)の平行な２枚の電極板の間に配置し、０．５Ｔｏｒｒのアルゴンガス圧力下で３０秒間グロー放電にさらした。プラズマパワーと無線周波数をそれぞれ３０Ｗと４０ｋＨｚに維持した。その後、アルゴンプラズマで処理したＰＥＴフィルムを３０分間酸素ガスにさらし、パイレックス（登録商標）ガラス管内で、１０容積％のアクリル酸（ＡＡｃ）を含む水溶液３０ｍＬに浸漬した。ＡＡｃ溶液をアルゴンを用いて３０分間十分に脱気し、アルゴン雰囲気下で密封した。反応混合物をロータリー光化学反応装置（千葉県の理工科学産業株式会社製Riko RH400-10W）の１００Ｗ高圧水銀ランプを用いて３０分間紫外線照射にさらした。水槽を用いて反応温度を２５℃に維持した。グラフト重合後、ＰＥＴフィルムをガラス管から取り出し、ソックスレー抽出装置内で十分に水洗いした。
【００２４】
１−Ｏ−（６´−アミノヘキシル）−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＡＨＧ）の合成
ガラクトースリガンドＡＨＧを、文献２４，２５で報告されている手順をわずかに変更して合成した。
【００２５】
ＡＨＧとＰＡＡグラフト化ＰＥＴフィルムとの結合
ＰＡＡグラフト化ＰＥＴフィルムを直径１５ｍｍの円板状に切り分けた。各円板を、２ｍｇＡＦＧおよび１ｍｇSulfo-NHSを含むリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０、１ｍＬ）に浸漬した。各ウェルにそれぞれ異なる量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド）（ＥＤＣ）を添加し、混合物を３日間反応させた。カップリング効率を最適化するため、（Ａ）反応開始時に５０ｍｇ／ｍＬ、（Ｂ）反応開始時に３０ｍｇ／ｍＬ、（Ｃ）３日間毎日１０ｍｇ／ｍＬ、（Ｄ）３日間毎日２０ｍｇ／ｍＬのそれぞれ異なるＥＤＣ添加態様を検査した。
【００２６】
カルボキシル基密度の測定
表面積３ｍｍ2の改質ＰＥＴフィルムの試料を、トルイジン青Ｏ（ＴＢＯ）の０．１ｍＭ水酸化ナトリウム（ｐＨ１０）溶液１ｍＬ（０．５ｍＭ）で室温で５時間絶えず振盪させながら培養した。超過量の０．１ｍＭ水酸化ナトリウム溶液で洗浄することによって未複合化染料を除去した。サンプルを５０％酢酸溶液１ｍＬ中で１０分間振盪させながら培養させることによって、ＰＥＴフィルム上で複合化したＴＢＯを表面から脱離させた。酢酸溶液中のＴＢＯ濃度を、ベックマン分光光度計DU640Bを用いて６３３ｎｍにおける光学密度で測定した。表面上のカルボキシル基密度は、ＴＢＯがカルボキシル酸と１対１の比で複合化すると想定することによって（文献２６参照）、複合化ＴＢＯの含有量から算出された。
【００２７】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）
一定持続時間１００ｍｓ、パスエネルギー４０ｅＶの単色型ＡｌＫ線のＸ線光源（１４８６．６ｅＶフォトン）を有するクレイトス(Kratos)社製AXIS His分光計により、ＸＰＳ計測を行った。陽極電流は１５ｍＡであった。分析チャンバ内の圧力は、計測毎に５．０ｘ１０-8Ｔｏｒｒに維持された。
【００２８】
結果
ＰＥＴフィルムは、最初に低温プラズマによって処理され、続いて酸素に暴露されることにより、ＰＥＴメンブレン表面に過酸化物基が導入された。紫外線光の下で、過酸化物基を活性化させてラジカル開始中心を形成し、それにより、その後、ＡＡｃのグラフト重合が開始された。ＰＡＡグラフト化の程度は、プラズマ処理のパワーと持続時間、紫外線処理の強度と持続時間、およびアクリル酸溶液の濃度によって調節された。最適化された条件下では、トルイジン青Ｏ染色によって測定されたとおり、ＰＡＡグラフト化ＰＥＴフィルム上で、５３０ｎｍｏｌ／ｃｍ2（３８．７μｇ／ｃｍ2）の平均カルボキシル基密度が達成された。
【００２９】
ＰＥＴ表面上のカルボキシル基に対してガラクトース部分を結合させるため、アミノヘキシル基がガラクトース環のＣ１位に結合されたガラクトース誘導体を用いた。このＡＨＧ誘導体は、ガラクトシル基とＰＡＡ鎖上の結合点との間に短いスペーサを生成することによって、結合反応を容易にするとともに、リガンドの細胞受容体への接近容易性を高めた。ＡＨＧの末端アミノ基は、標準的なＥＤＣ化学反応により、表面上のカルボキシル基と結合された（文献２７参照）。この縮合反応は、Sulfo-NHSの助けを借りて実行された。ＥＤＣは、水溶液中で急速に失活する（文献２８参照）。Sulfo-NHSが添加されることにより、活性エステル中間体の安定性が増し、最終的に結合効率が向上した。結合効率は、反応の前後の表面のカルボキシル量の変化を分析することによって求められた。カップリング条件を最適化するとともに、最大結合効率を達成するため、ＥＤＣをそれぞれ異なる態様で反応溶液に添加した。すなわち、３日間にわたって３回の割当て分を添加する場合と、反応の開始時に一度の供給で添加する場合である。ＡＨＧ結合効率の結果を図２に示した。ＡＨＧの濃度と添加の態様は、その結合効率に大きな影響を及ぼした。ＥＤＣ濃度５０ｍｇ／ｍＬでは、１日間の反応後に表面カルボキシル基の転換率が６２％であったのに対して、ＥＤＣ濃度１０ｍｇ／ｍＬでは、わずか２４％の転換率しか得られなかった。１日を超えて反応時間をさらに増やしても、表面カルボキシル基の転換率は向上しなかった。２０ｍｇのＥＤＣが反応溶液（１ｍＬ）に３日間毎日添加された場合に、最大カップリング効率（９７％）が達成された。ガラクトシル化ＰＥＴフィルム上のカルボキシル量は、この条件下では、わずか１７ｎｍｏｌ／ｃｍ2であった。これは、表面上のガラクトースリガンド５１３ｎｍｏｌ／ｃｍ2に相当する。
【００３０】
実施例２．表面結合ガラクトシル基のＦＩＴＣ−レクチンとの結合親和性
表面積３ｍｍ2のＰＥＴフィルムの試料を（シカクマメ(psophocarpus tetragonolobus)２５０μｇ／ｍＬ由来の）ＦＩＴＣ−レクチン溶液２５０μＬで３７℃で１時間培養した。試料を十分に水洗いし、オリンパス社製FLUOVIEW共焦点顕微鏡（εex４８８ｎｍ）で観察した。それと並行する実験では、改質ＰＥＴフィルムを培養する前に、ＦＩＴＣ−レクチン溶液に遊離ガラクトースを添加し、５ｍｇ／ｍＬの最終濃度をもたらした。
【００３１】
ＦＩＴＣ−レクチンを用いて、表面結合ガラクトースリガンドの結合活性を確認した。この研究で使用されたレクチンは、シカクマメ(psophocarpus tetragonolobus)由来であり、ガラクトースまたはＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンに特異的に結合することができた。その結合を共焦点蛍光顕微鏡で視覚化するため、ＦＩＴＣで標識したレクチンを用いた。それぞれ異なるＰＥＴフィルム（未改質のもの、ＰＡＡグラフト化されたものおよびガラクトシル化されたもの）をＦＩＴＣ−レクチンで３７℃で１時間培養し、観察前に十分に洗浄した。これらのフィルムの共焦点蛍光画像から、ガラクトシル化ＰＥＴフィルムが高いＦＩＴＣ蛍光発光を示す一方、未改質ＰＥＴフィルムおよびＰＡＡグラフト化ＰＥＴフィルムは顕著な蛍光発光を全く示さないことが分かった。
【００３２】
表面結合ガラクトースリガンドとＦＩＴＣ−レクチンとの間の結合親和性を評価するため、レクチン溶液に添加された遊離ガラクトースを用いて競合実験を実施した。ガラクトシル化ＰＥＴフィルムを、未改質ＰＥＴフィルム上の遊離ガラクトースリガンド量の１５０倍に相当する５ｍｇ／ｍＬの遊離ガラクトースとともにＦＩＴＣ−レクチンで培養した。遊離ガラクトースの存在下でＦＩＴＣ−レクチンで培養したガラクトシル化ＰＥＴフィルムの蛍光画像は、遊離ガラクトースが存在しない中でＦＩＴＣ−レクチンで培養したガラクトシル化ＰＥＴフィルムの蛍光画像と比較して、蛍光強度の低下が全く示されなかった。この競合的な結合反応は、ＦＩＴＣ−レクチンで培養した未改質ＰＥＴメンブレンおよびＰＡＡグラフト化ＰＥＴメンブレンを用いた並行する試験では、そのメンブレン上に極わずかな蛍光発光しか発生させなかったことから、ＦＩＴＣ−レクチンまたはＦＩＴＣ−レクチン／ガラクトース複合体の吸着の結果であるとは言えないであろう。この結果は、表面結合ガラクトースリガンドが、可溶性ガラクトースよりもはるかに高い受容体に対する結合親和性を有していることを示した。
【００３３】
実施例３．それぞれ異なる表面で培養された肝細胞の付着率および形態
体重２５０ないし３００ｇの雌ウィスタ(Wister)ラットから、上述した２段階原位置コラゲナーゼ潅流（文献２９参照）により肝細胞を採取した。ＮＩＨの「実験動物の管理と使用に関する指針(NIH guidelines for the care and use of laboratory animals)（ＮＩＨ広報No.85-23 Rev. 1985）」を順守した。トリパンブルー除去術を用いて肝細胞生存率を９０ないし９５％であると測定した。
【００３４】
未改質および改質ＰＥＴフィルムを直径１５ｍｍの円板状に切り分け、２４ウェル組織培養プレートの各ウェルに５ないし１０μＬのクロロフォルムで固定させた。７０％エタノールで３時間培養し、ＰＢＳで３度洗浄することにより、プレートを殺菌した。コラーゲン被覆表面を対照として使用し、各ウェルに０．５ｍＬコラーゲン溶液（ＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍＬ）を入れ、プレートを４℃で一晩放置することにより調製した。各ウェル内の溶液を吸引し、ウェルをＰＢＳで３度洗浄した。
【００３５】
細胞付着率測定に、５種類の表面、すなわち、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）、コラーゲン被覆ＴＣＰＳ、未改質ＰＥＴ、ＰＡＡグラフト化ＰＥＴおよびガラクトース固定化ＰＥＴを使用した。抽出したばかりの肝細胞を、ＢＳＡ１ｍｇ／ｍＬ、ペニシリン１００単位／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬが補足されたWilliam’s Eagle培地に１．２ｘ１０6細胞個／ｍＬの密度で懸濁させ、上記それぞれ異なる表面にウェルあたり３００μＬで分注した。これにより、２ｘ１０5細胞個／ｃｍ2の表面細胞培養密度を得た。細胞を５％ＣＯ2の加湿された培養器内で培養した。１時間後、未付着の細胞を含んだ培地を吸引した。未付着の肝細胞の数を血球計で測定した。表面上の付着肝細胞数と接種密度から細胞付着率を算出した。その結果を図３に示した。３７℃で１時間の培養後、肝細胞は、ＴＣＰＳおよび未改質ＰＥＴ表面に対して１５％未満の付着率で低い親和性を示した。ＰＡＡグラフト化ＰＥＴ表面は、ＴＣＰＳおよびＰＥＴメンブレンよりも高い細胞付着率（３９％）を示した。対照的に、ガラクトース化ＰＥＴ表面上の細胞付着率は、ＰＡＡ結合ＰＥＴ表面上の細胞付着率の２倍（８０％）であり、コラーゲン被覆ＴＣＰＳ上の細胞付着率（８４％）に匹敵していた。それぞれ異なる表面に付着させた肝細胞を、ＢＳＡ１ｍｇ／ｍＬ、ＥＧＦ１０ｎｇ／ｍＬ、インシュリン０．５μｇ／ｍＬ、デキサメタゾン５ｎＭ、リノール酸５０ｎｇ／ｍＬ、ペニシリン１００単位／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬが補足されたWilliam’s Eagle培地で６日間培養した。培地は、毎日補充された。採取された培地を１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離にかけ、その上澄みをアルブミンアッセイのために２０℃で保存した。様々な培養時点で、これら基質上の肝細胞の形態を位相差光学系を備えた倒立顕微鏡（カールツァイス社製）で観察し、デジタルカメラで記録した。
【００３６】
それぞれ異なる表面で培養された肝細胞は、それぞれ異なる形態を示した（図４）。細胞接種２時間後に、ＰＡＡグラフト化ＰＥＴフィルムおよびガラクトシル化ＰＥＴフィルム上の肝細胞が丸い形態を維持する一方で、コラーゲン被覆ＴＣＰＳ上に付着された肝細胞はこの時点で伸展を開始した。１日間の培養後、ＰＡＡグラフト化ＰＥＴフィルムおよびガラクトシル化ＰＥＴフィルム上の肝細胞は、それぞれ異なる形態をとった。ガラクトース結合ＰＥＴフィルム上では、肝細胞が凝集体を形成したが、ＰＡＡグラフト化ＰＥＴフィルム上の肝細胞は相対的に変化しないままであった。この時点で、コラーゲン被覆ＴＣＰＳ上の細胞は密集単分子層を形成した。それぞれ異なる表面上での肝細胞の形態の相違は、３日後ないし７日後により明確になった。ＰＡＡグラフト化ＰＥＴフィルム上の肝細胞は、大部分が丸い１個の細胞の形で出現し、最大でも数個の細胞からなるいくつかの小さな凝集体であった。これに対して、ガラクトシル化表面上の肝細胞は、最大の移動性を示し、大きな凝集体を形成した。極わずかな孤立した細胞または小凝集体が表面上に残った。コラーゲン被覆表面上では、肝細胞がその特徴的な単分子層形態を維持した。５日目に核を２つ有する細胞が出現し、肝細胞が増殖期に入っていることを示した。
【００３７】
実施例４．それぞれ異なる表面上で培養された肝細胞のアルブミン合成機能
様々な時点で採集された培地内のアルブミン濃度を、フレンド(Friend)，Ｊ．Ｒ．他によって報告された手順（文献３０参照）に従って、競合的な固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。要約すれば、試料を順次希釈し、ラットアルブミンに対するペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体（米国ＩＣＮ社製）を０．６μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。３７℃で２時間培養した後、各試料の１００μＬアリコートを９６ウェルMaxisorp（商標）プレート（米国ヌンク社(Nunc Inc.)製）に移した。各試料をラットアルブミン濃度０．２μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液１００μＬ／ウェルで培養することによってプリコートし、使用前に、０．０５％Tween-20のＰＢＳ溶液で３回洗浄した。試料をウェルに入れた状態で、加湿チャンバ内で室温で２時間培養した。その後、プレートを０．０５％Tween-20のＰＢＳ溶液で３回洗浄し、プレートに1-Step Turbo TMB基質（米国、ピアス(Pierce)社）を１００μＬ／ウェルで充填した。プレートを加湿チャンバ内で室温で３０分ないし４５分間培養し、２ＮＨ2ＳＯ4１００μＬを添加することによって反応を停止させた。各ウェル内の溶液の４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）をマイクロプレートリーダー（バイオラッドラボラトリーズ(Bio-rad Laboratories)社Model 550）で測定した。試料のラットアルブミン濃度を、ラットアルブミンを基準どおりに用いた光学密度から算出した。
【００３８】
肝細胞の機能を時間の関数としてのアルブミン合成レベルによって評価した（図５）。ＰＡＡグラフト化基質上で培養された肝細胞のアルブミン合成機能は、１日後で１日あたりかつ細胞１００万個あたり１０μｇまで急速に低下し、時間が経つにつれて低下し続けた。ガラクトシル化ＰＥＴ表面およびコラーゲン被覆表面上で培養された肝細胞は、４日間同じレベルの合成機能を示した後、コラーゲン被覆基質上では次第に低下した。ガラクトシル化ＰＥＴ表面上の肝細胞の合成機能は、少なくとも１週間同じレベルを維持した。
【００３９】
＜文献＞
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２７．ハーマンソン(Hermanson) GT「複合化技術(Bioconjugate Techniques)」アカデミック・プレス・インコーポレーテッド(Academic Press, Inc.) 1996, p173-176
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３０．フレンド(Friend) JR, ウー(Wu) FJ, ハンセン(Hansen) LK, レンメル(Remmel) RP, フー(Hu) WS「肝細胞スフェロイドの形成と特徴づけ(Formation and characterization of hepatocyte spheroids)」、モーガン(Morgan) JR, ヤルムシュ(Yarmush) ML編「組織工学的方法およびプロトコル(Tissue engineering methods and protocols)」ヒューマナ・プレス・インコーポレーテッド(Humana Press Inc.); 1999. p245-252
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ガラクトースをＰＥＴフィルムに結合させるための表面改質方法を示す図である。
【図２】それぞれ異なるＥＤＣ添加態様を用いて達成されたガラクトースリガンド結合効率を示す図であり、（Ａ）は反応前に５０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣを添加した場合、（Ｂ）は反応前に３０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣを添加した場合、（Ｃ）は３日間毎日１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣを添加した場合、（Ｄ）は３日間毎日２０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣを添加した場合である。
【図３】それぞれ異なる表面への肝細胞の付着率を示す図であり、ＴＣＰＳは組織培養ポリスチレン表面、ＰＥＴは未改質ＰＥＴフィルム、PET-COOHはＰＡＡがグラフト化されたＰＥＴフィルム、PET-Galはガラクトースが結合されたＰＥＴフィルム、TCPS-Collagenはコラーゲンが被覆されたＴＣＰＳ表面である。
【図４】それぞれ異なる基質上で培養された肝細胞のそれぞれ異なる時点での形態を示す顕微鏡写真である（凡例は図３を参照）。
【図５】それぞれ異なる基質上で培養された肝細胞の、培養時間の関数としてのアルブミン合成機能を示すグラフ図である（凡例は図３を参照）。
【図６】肝細胞の凝集体形成と機能維持はリガンド密度に依存することを示す顕微鏡写真及びグラフ図である。
【図７】ε−カルプロラクトン(carprolactone)・エチレンエチルフォスフェイト共重合体上でのスフェロイドの形成を示す顕微鏡写真である。
【符号の説明】
【００４１】
なし
【図１】
2005537813.tif 000003
【図２】
2005537813.tif 000004
【図３】
2005537813.tif 000005
【図４】
2005537813.tif 000006
【図５】
2005537813.tif 000007
【図６】
2005537813.tif 000008
【図７】
2005537813.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月22日(2005.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラフト重合を利用した細胞の付着および機能維持用基質であって、
表面に遊離基または官能基の少なくとも一方を有する少なくとも２次元のポリマー材と、
上記遊離基または官能基の少なくとも一方にグラフト化されたポリマー鎖と、
上記遊離基または官能基の少なくとも一方に結合されたリガンドとを備えた基質。
【請求項２】
上記少なくとも２次元のポリマー材は、フィルム、シート、メンブレン、繊維、中空繊維、フォーム、織物、編物および組物からなる群から選択される請求項１記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項３】
上記遊離基または官能基の少なくとも一方は、上記少なくとも２次元のポリマー材の表面を活性化することによってもたらされる請求項１記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項４】
上記活性化は、プラズマ処理、オゾン処理および紫外線照射からなる群から選択される請求項３記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項５】
上記プラズマ処理は、アルゴン、酸素およびアンモニアのうちの少なくとも１つの状態下にある請求項４記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項６】
上記官能基は、カルボキシル基、アミノ基、水酸基およびスルフヒドリル基からなる群から選択される請求項１記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項７】
上記ポリマー鎖は、紫外線開始反応により上記ポリマー表面にグラフト化される請求項１記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項８】
上記ポリマー鎖はポリアクリル酸からなる請求項１記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項９】
上記リガンドはガラクトースリガンドである請求項１記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項１０】
上記ポリマー鎖は、上記結合されたリガンドに高い移動度を付与するスペーサの働きをする請求項１記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項１１】
上記ポリマー鎖はε−カルプロラクトン・エチレンエチルフォスフェイト共重合体からなる請求項１記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項１２】
上記少なくとも２次元のポリマー材はポリエチレンテレフタレートである請求項１記載の細胞の付着および機能維持用基質。
【請求項１３】
ポリマー表面にリガンドを高密度に固定化する方法であって、
２次元または３次元構造のポリマー材を提供する工程と、
上記ポリマー材の表面を活性化する工程と、
上記表面に遊離基または第１の官能基群を生成する工程と、
上記遊離基または官能基群をモノマー溶液と反応させることにより、グラフト重合を開始させて第２の官能基群を有するポリマー鎖を形成する工程と、
上記第２の官能基群にリガンドを結合する工程を含む方法。
【請求項１４】
上記ポリマー材は、フィルム、シート、メンブレン、繊維および中空繊維構造の少なくとも１つを有している請求項１３記載のポリマー表面にリガンドを高密度に固定化する方法。
【請求項１５】
上記繊維または中空繊維は、織物、編物または組物とされている請求項１４記載のポリマー表面にリガンドを高密度に固定化する方法。
【請求項１６】
上記ポリマー材の表面を活性化する工程は、アルゴン、酸素およびアンモニアのうちの少なくとも１つの状態下でのプラズマ処理を含んでいる請求項１３記載のポリマー表面にリガンドを高密度に固定化する方法。
【国際調査報告】
2005537813.tif 000010
2005537813.tif 000011
2005537813.tif 000012