(57)【要約】本発明は、目的のハプロタイプを含む標的核酸または遺伝子断片を同定すること、およびプライマー依存の転写物、プローブ、またはプライマー依存の転写／プライマー複合物のいずれかによってディスプレイされる少なくとも１つのパラメーターを検出することを含んでなる、遺伝子ハプロタイプを決定する方法を提供する。さらに、核酸または遺伝子断片を少なくとも１つのプローブで標識し、該核酸分子または遺伝子断片の速度を、プローブによってディスプレイされた少なくとも１つのパラメーターで逐次的に測定することによって検出することを含んでなる遺伝子ハプロタイプを決定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）
（ｉ）ハプロタイプに関連する第１の遺伝子変異を認識するプライマーを標的核酸分子または遺伝子断片とハイブリダイズさせ、標識されたプライマーに依存する転写物を該標的核酸または遺伝子断片から生じさせ、
（１）該プライマーの下流にある第２の遺伝子変異を認識する少なくとも１つの標識プローブを、前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること、または
（２）該プライマーの下流にある第２の遺伝子変異を認識する少なくとも１つの非標識プローブを前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること
により目的のハプロタイプを含む標的核酸分子または遺伝子断片を同定すること、および
（ｂ）前記プライマーに依存する転写物、前記少なくとも１つのプローブ、またはプライマーに依存する転写物／プローブの複合体のうちの１つによってディスプレイされた少なくとも１つのパラメーターを検出し、それによりディスプレイされたパラメーターをハプロタイプと関連付けること
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。
【請求項２】
ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、蛍光強度、発光、発光強度、化学発光、化学発光強度、光吸収、電気リアクタンス、共同ハイブリダイゼーション（cooperative hybridization）からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程（ｂ）の前に標識されていない核酸から分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項４に記載の方法
【請求項８】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項１記載の方法。
【請求項１０】
プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
核酸が、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＸからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
プローブが、
（ａ）少なくとも１つの核酸または遺伝子フラグメント；および
（ｂ）少なくとも１つの固体物質
と連携している、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）
（ｉ）ハプロタイプに関連する第１の遺伝子変異を認識するプライマーを標的核酸分子または遺伝子断片とハイブリダイズさせ、プライマーに依存する転写物を該標的核酸または遺伝子断片から生じさせ、
（１）該プライマーの下流にある第２の遺伝子変異を認識する少なくとも１つの標識プローブを、前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること、または
（２）該プライマーの下流にある第２の遺伝子変異を認識する少なくとも１つの非標識プローブを前記標識されたプライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること
により目的のハプロタイプを含む標的核酸分子または遺伝子断片を同定すること、および
（ｂ）前記プライマーに依存する転写物、前記少なくとも１つのプローブ、またはプライマーに依存する転写物／プローブの複合体のうちの１つによってディスプレイされた少なくとも１つのパラメーターを検出し、それによりディスプレイされたパラメーターをハプロタイプと関連付けること
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。
【請求項１５】
ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、蛍光強度、発光、発光強度、化学発光、化学発光強度、光吸収、電気リアクタンス、共同ハイブリダイゼーション（cooperative hybridization）からなる群から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程（ｂ）の前に標識されていない核酸から分離する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項１７に記載の方法
【請求項２１】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項１４記載の方法。
【請求項２３】
プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
核酸が、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＸからなる群から選択される請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項１４記載の方法。
【請求項２６】
プローブが、
（ａ）少なくとも１つの核酸または遺伝子フラグメント；および
（ｂ）少なくとも１つの固体物質
と連携している、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも２つのプローブで標識すること；および
（ｂ）該プローブによってディスプレイされる１つのパラメーターにおける配列の変化を測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること、
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。
【請求項２８】
ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、発光、化学発光、光吸収、電気リアクタンスおよび共同ハイブリダイゼーション（cooperative hybridization）からなる群から選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程（ｂ）の前に標識されていない核酸から分離する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項３０に記載の方法
【請求項３４】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項２７記載の方法。
【請求項３６】
プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
核酸が、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＤＮＡからなる群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項２７記載の方法。
【請求項３９】
プローブが、
（ａ）少なくとも１つの核酸または遺伝子フラグメント；および
（ｂ）少なくとも１つの固体物質
と連携している、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも２つのプローブで標識すること；および
（ｂ）該プローブによってディスプレイされる少なくとも２つのパラメーターにおける配列の変化を測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること、
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。
【請求項４１】
ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、発光、化学発光、光吸収、電気リアクタンス、共同ハイブリダイゼーション（cooperative hybridization）およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項２７記載の方法。
【請求項４２】
工程（ｂ）のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項２７に記載の方法。
【請求項４３】
前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程（ｂ）の前に標識されていない核酸から分離する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４４】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項３０に記載の方法
【請求項４７】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４８】
プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項２７記載の方法。
【請求項４９】
プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項５０】
核酸が、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＤＮＡからなる群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項５１】
プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項２７記載の方法。
【請求項５２】
プローブが、
（ａ）少なくとも１つの核酸または遺伝子フラグメント；および
（ｂ）少なくとも１つの固体物質
と連携している、請求項２７に記載の方法。
【請求項５３】
（ａ）核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも２つのプローブで標識すること；および
（ｂ）該プローブによってディスプレイされるパラメーターを同時に測定することによって該核酸分子または遺伝子断片を検出し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること（ここで該パラメーターは共同ハイブリダイゼーションではない）、
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。
【請求項５４】
ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、発光、化学発光、光吸収および電気リアクタンスからなる群から選択される請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
工程（ｂ）のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項２７に記載の方法。
【請求項５６】
前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程（ｂ）の前に標識されていない核酸から分離する、請求項２７に記載の方法。
【請求項５７】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項３０に記載の方法。
【請求項５８】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項３０に記載の方法。
【請求項５９】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項３０に記載の方法
【請求項６０】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項３０に記載の方法。
【請求項６１】
プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項２７記載の方法。
【請求項６２】
プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項６３】
核酸が、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＤＮＡからなる群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項６４】
プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項２７記載の方法。
【請求項６５】
プローブが、
（ａ）少なくとも１つの核酸または遺伝子フラグメント；および
（ｂ）少なくとも１つの固体物質
と連携している、請求項２７に記載の方法。
【請求項６６】
（ａ）核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも２つのプローブで標識すること；および
（ｂ）該プローブによってディスプレイされる少なくとも２つのパラメーターを同時に測定することによって該核酸分子または遺伝子断片を検出し、さらに分子がミクロスフェア、ナノスフェア、およびバーコード粒子からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること（ここで該パラメーターは共同ハイブリダイゼーションではない）、
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。
【請求項６７】
ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、発光、化学発光、光吸収および電気リアクタンスからなる群から選択される請求項５３記載の方法。
【請求項６８】
工程（ｂ）のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項２７に記載の方法。
【請求項６９】
前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程（ｂ）の前に標識されていない核酸から分離する、請求項２７に記載の方法。
【請求項７０】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項３０に記載の方法。
【請求項７１】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項３０に記載の方法。
【請求項７２】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項３０に記載の方法
【請求項７３】
標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項３０に記載の方法。
【請求項７４】
プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項２７記載の方法。
【請求項７５】
プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項７６】
核酸が、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＤＮＡからなる群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項７７】
プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項２７記載の方法。
【請求項７８】
プローブが、
（ａ）少なくとも１つの核酸または遺伝子フラグメント；および
（ｂ）少なくとも１つの固体物質
と連携している、請求項２７に記載の方法。
【請求項７９】
（ａ）核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも１つのプローブで標識すること；および
（ｂ）ある時間での差を測定することにより核酸分子または遺伝子断片の速度を検出し、プローブは第１の位置で第１の検出器により、第２の位置で第２の検出器により測定されるパラメーターをディスプレイし、プローブがマイクロスフェア、ナノスフェアおよびバーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法。
【請求項８０】
前記速度がＣＣＤ検出器により視覚的に検出される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
（ａ）核酸分子または遺伝子断片を、第１のプローブおよび第２のプローブで標識することであって、該第１のプローブと第２のプローブハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識し；および
（ｂ）第１のプローブによってディスプレイされる第１のパラメーターと第２のプローブによってディスプレイされる第２のパラメーターを逐次的に測定することによって核酸分子または遺伝子断片の速度を検出することであって、該第１または第２のプローブがマイクロスフェア、ナノスフェアおよびバーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法。
【請求項８２】
前記速度がＣＣＤ検出器により視覚的に検出される、請求項８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのプローブとの相互作用によってマーキングされた核酸断片または分子を直接検出することによる、遺伝子ハプロタイプを同定するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
研究者たちは、ヒトゲノムにおいて一塩基の変化、塩基の挿入または塩基の欠失が起こりうる数百万ものヌクレオチドの位置を同定してきた。個人の遺伝的構成物におけるこれら遺伝子の多様性（GVs）は、遺伝性疾患、疾患に対する素因、治療物質を代謝する能力、治療物質の代謝速度、治療物質の副作用などを決定づける。
【０００３】
代表的には、２以上のヘテロ接合体部位が存在する２つの染色体を有する組織または細胞（即ち、ヒトおよび動物におけるすべての正常な体細胞組織）から得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡの試料中では、通常、（ｉ）ＤＮＡ配列決定、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドとゲノムＤＮＡまたは全ｃＤＮＡまたはそれらから得られた増幅産物との核酸ハイブリダイゼーション、（ｉｉｉ）ゲノムＤＮＡまたは全ｃＤＮＡまたはそれらから得られた増幅産物から得られたプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション、または（ｉｖ）多様性検出のための大部分の増幅に基づく方法（most-amplification-based scheme）等の遺伝子型による解析法を用いた場合、どのヌクレオチドが共に１つの染色体に属しているのかを知ることは不可能である。
【０００４】
ハプロタイプは、純血種を用いて隣り合った変化のグループの転位を分類することによって推論することができるが、医学的研究のおいてしばしばそうであるように、無関係な人が研究の対象であるときには、純血種の解析はほとんどかまたは全く使用されない。無関係な人のハプロタイプを決定するいくつかの方法が存在する。スキャンした１または２つの変異のそれぞれに対するアレル特異的ＰＣＲプライマーの設定に基づいた方法（Michalatos-Beloin, et al., Nucl. Acids Res. 24: 4841-4843 (1996)）；しかし、これらの方法は一般にハプロタイプ分析される各部位のついてカスタマイズする必要があり、それゆえ時間がかかり高価である。さらに、これらの方法では、ハプロタイプを決定できるのは２０キロベース未満の領域に限られる。
【０００５】
研究者たちは、さらに上記の表現型の多様性を引き起こすのは単にＧＶｓの存在であるだけでなく、個人の染色体におけるＧＶｓの分布または配置であることを明らかにした(Hess, P., et al., Impact of pharmacogenomics on the clinical laboratory, Mol. Diagn. 4: 289-98 (1999)；Davidson, S. , Research suggests importance of haplotypes over SNPs, Nature Biotechnology 18: 1134-5 (2000)）。例えば、２人の人は染色体の特定の領域における３つのＧＶｓについてヘテロ接合体であり得るが、そのうちの１人はハプロタイプ（ＧＶ配置）が２人の間で異なるために遺伝性疾患を有する。影響を受けていない人においては、２つのＧＶが１つの染色体に存在し、他方のＧＶはもう一方の染色体に存在するが、疾患を有する個人には、３つのＧＶが同じ染色体に存在する。
【０００６】
ハプロタイプを決定する能力は、遺伝性疾患の研究および個人に特化した治療の発展の鍵を握る。ハプロタイプを決定する現在の方法は時間がかかり、扱いにくい。ほとんどの既存の方法は多くの工程を要し、多くの試料を試験するおよび／または関係するハプロタイプを決定するための特定のソフトウエアを使用する必要がある（例えば、本明細書の一部を構成する、米国特許第6,183, 958号（Stanton）；米国特許第6,235, 502号（Weissman）を参照）。
【０００７】
アフィメトリクス（Affymetrix）は、ハプロタイプの決定に使用することができるチップの技術を用いた方法を記載した。２つのＧＳ部位に対するオリゴヌクレオチドプローブは同じチップの部位と連結する。両プローブに対する核酸のハイブリダイゼーションは、両プローブに対する協同的ハイブリダイゼーションによって生じるハイブリッド収量の、別々のプローブのいずれか一方に対するハイブリダイゼーションと比較した増加によって決定付けられる(Gentalen, E., et al., A novel method for determining linkage between DNA sequences: hybridization to paired probe arrays, Nucleic Acids Res. 27 (6): 1485-91 (1999))。この方法は、各チップ部位について２つのプローブの解析に限られる。さらに、この方法は約２０００塩基以上は離れていないＧＶ部位の解析に限られる。さらに、チップ技術は、有効な使用のためには、有意の量の標的の物質を必要とする。標的の核酸はＰＣＲまたは同様の増幅法を用いて、解析前に増幅することができるが、これらのさらなる工程は解析を煩雑なものにし、試料中の不純物の混入によって影響を受ける工程が増える。
【０００８】
本明細書の一部を構成する米国特許第５，１０４，７９１号（Abbottら）は、２つの核酸プローブを用いた標的核酸を検出する方法を記載している。１つのプローブは粒子に結合したキャプチャープローブであり、もう１つのプローブはレポーター核酸プローブである。標的の検出は、粒子（マイクロスフェア）および、発光、蛍光、放射能等であってよいレポータープローブを平行して検出することによって行う。しかしながら、本発明とは異なり、この方法は核酸プローブの使用に限られる。さらに、この方法はハプロタイプを決定する手段としては考えられなかった。さらに、この方法は、１回あたり２つのＧＶの解析に限定される。
【０００９】
本明細書の一部を構成するＣａｉらのＰＣＴ公開第ＷＯ０１／９０４１８は、１つの染色体に由来する、ＳＮＰ等の隣接する遺伝子マーカーに特異的な２つの識別可能な発光標識の同時検出に基づく、１分子法を使用することを示している。しかし、この特許は、ハプロタイプを決定するために、色の区別または発光の寿命を含む発光を識別するための技術を必要とする。対照的に、本発明は、ハプロタイプを決定するために、ある特定のプロトコルを用いて、単一の標識またはプローブを使用することができる。単一の標識または区別することができない同じ色素で標識した２つのプローブを用いることが可能である。
【００１０】
しかし、Ｃａｉらは、所定のハプロイドに２つのマーカーが共に存在すると、単一の分子決定および同定を用いることにより、迅速な測定ができることを指摘している。伝統的に、会合試験は少数のマーカーが関係する単純な、一遺伝子性の疾患についてのみ成功しており、異なるハプロタイプの可能な組み合わせは限られる。従って、ハプロタイプは、多くの人のタイプ分け、ホモ接合型の可能性および親の情報によって、遺伝子型から推定することができる。しかし、大部分の疾患は複雑で複数の遺伝子が関係している。多遺伝子会合試験のためには、より多くのマーカーが必要であり、可能なハプロタイプの数は膨大である。これらの場合、遺伝子型からハプロタイプを推定するのは非常に困難である。ハプロタイプの推定のために多くの精巧なアルゴリズムが開発されており、それらは典型的には７０〜９０％の精度である。そのような精度は、大量のＳＮＰをタイプ分けするときには有用ではなく、また臨床診断を目的とするには精度が低い。さらに、親のゲノムＤＮＡを入手することが、不可能であったり現実的でないことが多い。これは深刻な問題であり、ＸおよびＹ染色体がバルク法で識別されるに十分相違している性染色体上にある場合を除いて、ハプロタイプを直接決定する簡単な方法は存在しない。
【００１１】
Ｃａｌらにおいて示されているように、遺伝子型に基づく遺伝子プロファイルでは２つの染色体上のＳＮＰの位置が分からないために不完全であることがある。例えば、同じ遺伝子に、ＡとＢという２つの遺伝子マーカー（またはＳＮＰ）があるとする。ａＡ／ｂＢ（ＡとＢは野生型または天然に存在する優性の表現型を表し、ａおよびｂは２つの突然変異を表する）の遺伝子型については、ａｂ／ＡＢとＡｂ／ａＢの２つの可能なハプロタイプの組み合わせが存在する。ａｂ／ＡＢを有する人の疾患の表現型は、Ａｂ／ａＢを有する人と比べて比較的軽度である。これは、ａｂ／ＡＢを有する人がインタクト（無傷）な遺伝子のコピーを１つ有し、Ａｂ／ａＢを有する人がインタクトなコピーをいずれの染色体上にも有しないからである。このような場合について、常套的な臨床条件において、２つの突然変異が同じ染色体上に存在しているか異なる染色体上に存在している（ハプロタイプ）かを見つけることができれば、将来の危険性の予測や疾患の診断に特に有用である。
【００１２】
ハプロタイプを判別するための別の慣用的手段は、アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（アレル特異的ＰＣＲ(Ruano, G.,et al., Haplotype of multiple polymorphisms resolved by enzymatic amplification of single DNA molecule, PNAS 87: 6296-6300 (1990))）であり、直接のハプロタイプ判別に最も慣用的に使用される方法である。これらの反応では、ＳＮＰ−特異的ＰＣＲプライマーを設計して２つの染色体に由来する特定のハプロタイプを区別し増幅する。このような反応は、ストリンジェントな反応条件と、各試薬について個々に最適化する必要がある。従って、この方法は、大規模で高スループットハプロタイプ判別には適切ではない。さらに重要なことに、そのような解析は数キロベース以上離れたＳＮＰのタイプ分けが不可能である。さらに、そのような増幅を基礎とするタイプ分けは、試料を扱っている間に試料ＤＮＡ以外の少量のゲノムＤＮＡの汚染によって煩雑になることが多い。
【００１３】
Ｃａｌらのその他のハプロタイプの判別法は単一の精子または単一の染色体の測定が挙げられる（Ruano, supra; Zhang L., Whole genome amplification from a single cell : Implications for genetic analysis, PNAS 89: 5847-5851 (1992); Vogelstein, B., Digital PCR, PNAS 96 (16): 9236-9241 (1999); Wahlestedt C. , et al., Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids, PNAS 97: 5633-5638 (2000)）。単一精子ソート分析では、個々のソートされた精子細胞に由来するＰＣＲ増幅されたＤＮＡの遺伝子型を判別する。２つのハプロタイプを明らかにするに十分統計学的に信頼性を得るために、ある個人に由来する複数の精子細胞（少なくとも３〜５）をタイプ分けする。原則的には、この方法は煩雑であり、これまでのところ、成功している研究室は数少ない。この分子クローニング法は、個人のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の標的領域をベクターへクローニングし、単一のコロニーから得られたＤＮＡの遺伝子型を判別することからなる。２つのハプロタイプを入手するためには、一人あたり複数のコロニーが必要である。この方法は多くの研究室で用いられているが、非常に手間と時間がかかり、実行するのが困難な場合がある。研究者たちは容易な代替手段が他にないために、この方法を使わざるを得ない。
【００１４】
最後に、Caiらは、ＡＦＭ (Atomic Force Microscopy)画像処置によるハプロタイプ分析 (Wooley, A. T.ら、カーボンナノチューブを用いたキロベースサイズのＤＮＡの直接のハプロタイプ分析、Nature Biotechnology 18: 760-763 (2OOO)；Tato T.A.ら、力によるハプロタイプ分析、Nature Biotechnology 18: 713-713 (2000) は、個人のＤＮＡ分子上の多型部位を直接可視化するための新しい方法である。この方法は、高解像度の単層のカーボンナノチューブプローブを用いるＡＦＭを利用して１００〜１００００塩基を含むＤＮＡ断片の複数の多型部位を直接読み取る。この方法では、ＤＮＡ断片中の標的配列に対する標識されたオリゴヌクレオチドプローブの特異的なハイブリダイゼーションの後、ＡＦＭによりその標識の存在と空間的な配置を直接読み取る。しかしながら、そのようなシステムのスループットおよび感度はこれからも実証されるべきものであり、現在１日あたり２００試料（各１０画像）を処理することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
総じて、Caiらは、性染色体を用いること以外に、現在ハプロタイプを決定する簡単な方法は、一般には存在しないことを指摘している。ハプロタイプを決定するために２つの識別可能な色素を用いることが必要なCaiらの方法とは対象的に、単一の色素または２つの判別不可能な色素を用いることができるより簡便で効果的な方法が本発明において開発された。さらに、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅またはクローニングや広範な最適化を必要とする大部分の先行技術とは違い、本発明は、ハプロタイプを決定するためのより直接的な方法を確立する。
【００１６】
ハプロタイプを決定するための単純で直接的な方法は、診断や生物医学的調査にとって相当の価値がある。このことは、特に、分析毎に複数のＧＶ部位を解析し、ＧＶ部位が２０キロベースも離れているような方法に該当する。ハプロタイプ分析のさらなる有用な特徴は、同じ分析方法で複数の遺伝子領域についてGVハプロタイプを決定する能力であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、相違する配列または特定の多型変異を有する核酸のハプロタイプを直接同定するための方法を提供する。この多型変異は、挿入、欠失または一塩基の置換であり得る。解析された多型部位は２０ｋｂ以上離れていても良い。本発明の方法は１回の分析で複数の遺伝子領域における複数のＧＶについてのハプロタイプを決定するために使用することができる。
【００１８】
一般に、本発明は、ある特定の技術を用いて識別不可能な少なくとも１つのプローブ、少なくとも２つの発光プローブと相互作用する核酸、またはそのプローブが遺伝子変異の部位を表する標的上の特異的な配列と相互作用する１つの発光および１つの非発光プローブを数える（即ち計数する）方法を提供する。プローブは標的と逐次にまたは同時に相互作用する。標的としては、核酸、核酸断片、プラスミドおよび遺伝子断片等のその他の分子が挙げられる。プローブは、核酸、オリゴヌクレオチド、核酸変異体、例えばＰＮＡまたはＬＮＡ、ペプチド、タンパク質、色素、脂質、薬物、または小分子であってよい。与えられた実験では任意の種類のプローブの組み合わせを用いることができる。ハプロタイプの決定は、プローブによって影響を受けるまたは依存する１またはそれ以上のパラメーターの測定に基づく。
【００１９】
さらに、本発明はヌクレオチドマーカーの単一分子検出の利点とフリーの溶液またはふるいにかけられた単一分子キャピラリー電気泳動技術を併せ持つ。
【００２０】
したがって、本発明は、目的のハプロタイプを含む標的核酸分子または遺伝子断片を同定することを含んでなる、遺伝子のハプロタイプを決定するための方法であって、（ｉ）第１の遺伝子変異を認識するプライマーを、標的の核酸分子または遺伝子断片とハイブリダイズさせることであって、標的プライマーに依存する転写が標的の核酸または遺伝子断片から生じ；（１）そのプライマーの下流の第２の遺伝子変異を認識する少なくとも１つの標識されたプローブを、プライマー依存転写物とハイブリダイズさせる、（２）またはそのプライマーの下流の第２の遺伝子変異を認識する少なくとも１つの非標識プローブをプライマー依存転写物とハイブリダイズさせる；および（ｂ）プライマー依存の転写物の１つのよって表される少なくとも１つのパラメーター、少なくとも１つのプローブまたはプライマー依存の転写物複合体を検出し、それにより、ディスプレイされたパラメーターをハプロタイプに関連付けること
を含む方法を提供する。
【００２１】
さらに、
（ａ）
（ｉ）ハプロタイプに関連する第１の遺伝子変異を認識するプライマーを標的核酸分子または遺伝子断片とハイブリダイズさせ、標識されたプライマーに依存する転写物を該標的核酸または遺伝子断片から生じさせ、
（１）該プライマーの下流にある第２の遺伝子変異を認識する少なくとも１つの標識プローブを、前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること、または
（２）該プライマーの下流にある第２の遺伝子変異を認識する少なくとも１つの非標識プローブを前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること
により目的のハプロタイプを含む標的核酸分子または遺伝子断片を同定すること、および
（ｂ）前記プライマーに依存する転写物、前記少なくとも１つのプローブ、またはプライマーに依存する転写物／プローブの複合体のうちの１つによってディスプレイされた少なくとも１つのパラメーターを検出し、それによりディスプレイされたパラメーターをハプロタイプと関連付けること
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法を提供する。
【００２２】
さらに、（ａ）核酸分子または遺伝子断片を、ハプロタイプを定義するおのおの異なる遺伝子変異を認識する少なくとも２つのプローブで標識すること；および（ｂ）プローブによって表される１つのパラメーターにおける配列の変化を測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること、を含む方法を提供する。
【００２３】
さらに、（ａ）核酸分子または遺伝子断片を、おのおのハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも２つのプローブで標識すること；および（ｂ）そのプローブによってディスプレイされた少なくとも２つのパラメーターにおける配列の変化を測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出すること、を含んでなる方法を提供する。
【００２４】
さらに、（ａ）おのおのハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも２つのプローブで核酸分子または遺伝子断片を標識すること；および（ｂ）そのプローブによってディスプレイされたパラメーターを同時に測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し（ここで、パラメーターは協同的ハイブリダイゼーションではない）、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法を提供する。
【００２５】
さらに、（ａ）おのおのハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも２つのプローブで核酸分子または遺伝子断片を標識すること；および（ｂ）そのプローブによってディスプレイされた少なくとも２つのパラメーターを同時に測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し、ここで、パラメーターは協同的ハイブリダイゼーションではなく、さらに、プローブは、マイクロスフェア、ナノスフェアおよびバーコード粒子からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法を提供する。
【００２６】
さらに、（ａ）おのおのハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも２つのプローブで核酸分子または遺伝子断片を標識すること；および（ｂ）時間における差を検出することにより核酸分子または遺伝子断片の速度を検出し、プローブは第１の位置で第１の検出器により測定され、第２の位置で第２の検出器により検出され、プローブは、マイクロスフェア、ナノスフェアおよびバーコード粒子からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の他の特徴、態様および利点は、以下の記載、実施例および添付した請求の範囲を参照することによってより理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
略語および定義
特に記載しない限り、以下で定義する用語は以下の意味を有する：
ハプロタイプ：本明細書で用いる「ハプロタイプ」は、遺伝型を含む各遺伝子の１つの対立遺伝子の組を意味する。さらに、１つの染色体または染色体の一部にある対立遺伝子の組、即ち関連する遺伝子の対立遺伝子の１つの組を意味する。本発明においては、ハプロタイプは好ましくは、与えられた個人に存在し、表現型に関連しうる二対立遺伝子マーカーの組合せを意味する。
対立遺伝子：「対立遺伝子」は、染色体上の同じ位置（座）を占める、いずれか１つの一連の２以上またはそれ以上の異なる遺伝子を意味する。常染色体は対になっているので、各常染色体の座は２個存在する。両染色体が同じ対立遺伝子を有する場合、同じ座を占有し、この状態を、この対立遺伝子についてホモ接合体という。２つの座の対立遺伝子が異なる場合、その人または細胞は両対立遺伝子についてヘテロ接合体という。
【００２９】
座：本明細書で用いられる、用語「座」は、特定の形質についての遺伝子が位置する連鎖地図におけるまたは染色体上の部位を意味する。遺伝子の対立遺伝子のいずれか１つがこの部位に存在しうる。
【００３０】
多型：本明細書において用いられる「多型」は、異なるゲノムまたは個人の間の２またはそれ以上の別のゲノム配列または対立遺伝子の存在を意味する。「多型」は、特定のゲノム配列の２またはそれ以上の変異体が集団において認められ得る状態をいう。「多型部位」は、変異が生じる座である。単一ヌクレオチド多型、即ちＳＮＰ、は、１個の塩基対の変化である。典型的には、単一ヌクレオチド多型は、多型部位での、あるヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置き換えである。１個のヌクレオチドの欠失または１個のヌクレオチドの挿入もまた１個のヌクレオチド多型を生じる。本発明においては、「単一ヌクレオチド多型」は好ましくは単一ヌクレオチド置換を意味する。典型的には、異なるゲノム間で、または異なる個人間で、多型部位は２つの異なるヌクレオチドによって占有されうる。
【００３１】
二対立遺伝子マーカー：本明細書において用いられる、「二対立遺伝子マーカー」は、集団において極めて高い頻度で２つの対立遺伝子、好ましくは単一ヌクレオチド多型を有する多型を意味する。
【００３２】
相互相関：
相互相関は、２つの生データの組ｇｊおよびｈｋを解析にかけて、それぞれの検出器（好ましくは光検出器）からのデータの組を以下の式に当てはめる。
【数１】
2005525787.tif 000002
［式中、Ｎはデータポイントの総数である］。このデータ相互相関は、［好ましくは単一分子解析システムで］特定の分子が第１の検出器から第２の検出器へ通過する時間に対応するある時間のずれ（ｊ）での、検出器からの第１のデータの組［好ましくはバックグラウンドレベルより上の光子カウント］（ｇ）が、第２の検出器からのデータの組［好ましくはバックグラウンドより上］（ｈ）と値が近くなる場合に大きくなる。試料に与えた電場を有する単一分子電気泳動装置において、キャピラリーの長さ方向に配置した光子検出器間の検出に関する時間のずれ（ｊ）は、検出された分子の電気泳動速度に関連する。キャピラリーに電場を与えず、試料をキャピラリーから注入した同じ装置では、光子の放出検出に関する時間のずれ（ｊ）はすべての分子について同じであり、注入スピードに関連する。
【００３３】
色素：本明細書において用いられる「色素」なる用語は、色材に用いられる物質または発光もしくは蛍光を生じることが可能な物質を意味する。色素は、特定の波長の吸収光または放射光であってよい。色素は、プローブおよび／または標的に、挿入され、非共有結合しまたは共有結合していてもよい。色素はそれ自身、副溝（minor groove）、十字型、ループまたはその他の立体構造を有する核酸のエレメントを検出するプローブのようにプローブを構成する。色素としてはＢＯＤＩＰＹおよびＡＬＥＸＡ色素、Ｃｙ［ｎ］色素、ＳＴＢＲ色素、臭化エチジウムや関連の色素、アクリジノレンジ、二量体シアニン色素、例えばＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、ＢＯＢＯ，ＴＯＰＲＯおよびＰＯＰＯおよびそれらの誘導体、ビス−ベンズイミド、OliGreen、PicoGreenおよび関連の色素、シアニン色素、フルオレセイン、ＬＤＳ７５１、ＤＡＰＩ、ＡＭＣＡ、カスケードブルー、ＣＬ−ＮＥＲＦ、ダンシルジアルキルアミノクマリン、４',５'−ジクロロ−２'，７'−ジメトキシフルオレセイン、２'，７'−ジクロロフルオレセイン、ＤＭ−ＮＥＲＦ、エオシン、エリスロシン、フルオロセイン、ヒドロキシクマリン、イソスルファンブルー、リサミンローダミンＢ、マラカイトグリーン、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＮＢＤ、オレゴングリーン、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン、ローダルグリーン、２',４',５',７'-テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｘ−ローダミンおよびプローブまたは標的と相互作用するかコンジュゲートを形成するその他の色素が挙げられる。当業者は、本発明の範囲内で用いることができるその他の色素を認識するであろう。限定的なリストではなく、本発明の標識されたヌクレオチドを検出するために使用することができる、現在知られているまたは将来知られるすべての色素を包含する。
【００３４】
プローブ：本明細書において用いられる「プローブ」は、標的に存在する特定のヌクレオチド配列を同定するために用いることができる、定義された核酸断片、または生物化学的または生物学的分子または複合体を意味する。定義された核酸断片は、同定される特定のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいる。
【００３５】
蛍光寿命：本明細書において用いられる「蛍光寿命」なる用語は、Ｎ個の励起蛍光の集団が、蛍光およびその他の不活性化経路による励起エネルギーの消失によりＮ／ｅに指数関数的に減少するのに必要な時間を意味する。
【００３６】
蛍光偏光：本明細書において用いられる「蛍光偏光」なる用語は、液体中の蛍光性分子が平面偏光により励起されると、蛍光性分子中のフルオロフォアが励起状態で定常状態を維持しているとき、同一平面に偏光蛍光を発する（即ち、その光は偏光を保持する）、平蛍光分子の特性を意味する。
【００３７】
質量：本明細書において用いられる「質量」なる用語は、力と加速度に関連する物理的な「比例の定数」を意味する。
【００３８】
正味電荷：本明細書において用いられる「正味電荷」なる語は、ある分子についてひとまとめにしたすべての原子の電荷の極性を考慮に入れた合計を意味する。
【００３９】
形：本明細書において用いられる「形」なる語は、分子または分子複合体の３次元構造および分子または分子複合体が溶液中にあるときのそのような３次元構造の変化した形を意味する。
【００４０】
拡散：本明細書において用いられる「拡散」なる語は、分子の１つの場所から別の場所へのゆっくりとした移動を意味する。
【００４１】
電気泳動速度：本明細書において用いられる「電気泳動速度」なる語は、バックグラウンドの電解質に対する電場の影響下での荷電したまたは非荷電の分析対象の速度を意味する。キャピラリーシステムにおける電気泳動速度は、動電気学的速度および電気浸透力の複合的指標である。
【００４２】
蛍光：本明細書において用いられる「蛍光」なる語は、通常高い周波数の放射による照射中の金属からの、または電子の衝撃に由来する、放射物、通常は光、を意味する。
【００４３】
蛍光強度：本明細書に置いて用いられる「蛍光強度」は、蛍光試料からの放射を測定する検出システムの出力を意味する。さらに、単位時間あたりに検出される光子の数（好ましくはミリ秒および好ましくはバックグラウンドの閾値以上の）を意味する。
【００４４】
発光：本明細書において用いられる「発光」なる語は、温度の上昇以外の何らか理由に関する物質からの光の放出を意味する。
【００４５】
発光強度：本明細書において用いられる「発光強度」は、発光試料からの発光を測定する検出システムの出力を意味する。さらに、単位時間あたりに検出される発光の数（好ましくはミリ秒および好ましくはバックグラウンドの閾値以上の）を意味する。
【００４６】
化学発光：本明細書において用いられる「化学発光（Chmiluminescence）」なる語は、科学的エネルギーの光エネルギーへの直接の変換によって生じる発光を意味する。化学発光（Chmoluminescence）ともいう。
【００４７】
化学発光強度：本明細書において用いられる「化学発光強度」なる語は、化学発光試料からの発光を測定する検出システムの出力を意味する。さらに、単位時間あたりに検出される光子の数（好ましくはミリ秒および好ましくはバックグラウンドの閾値以上の）を意味する。
【００４８】
光吸収：本明細書において用いられる「光吸収」なる語は、対象または物質によって反射されない光エネルギー（波長）を意味する。
【００４９】
電気共鳴：本明細書において用いられる「電気共鳴」は、ある部分のインダクタンスまたは容量によるＡＣ電流に与えられる抵抗を意味する。
【００５０】
ＰＮＡ：本明細書において用いられる「ＰＮＡ」は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマー（新しいクラスの分子：リン酸骨格が変化しない「ペプチド様」（ポリアミド）骨格で置き換わっているＤＮＡの類縁体（模擬体））を意味する。
【００５１】
ＬＮＡ：本明細書中において用いられる「ＬＮＡ」は、新規なクラスの核酸類縁体である、ロックされた核酸（Locked Nucleic Acids）を意味する。ＬＮＡモノマーは、２'-Ｏ位を４'Ｃ−位に連結するメチレンリンカーによって制限されたフラノース環立体配置を含むＲＮＡヌクレオシドと構造的に類似する二環系化合物である。便宜上、１またはそれ以上のＬＮＡ修飾を含むすべての核酸はＬＮＡと称する。ＬＮＡオリゴマーはワトソン−クリック塩基対の規則に従い、相補的なオリゴクレオチドとハイブリダイズする。ＬＮＡプローブの設計、合成およびハイブリダイゼーションは当分野において周知である。
【００５２】
ＤＮＸ：本明細書において用いられる「ＤＮＸ」は、１またはそれ以上の架橋ヌクレオチドアナログからなる核酸プローブを意味する。このアナログは、ハイブリダイゼーションによりプローブと標的核酸との間の共有結合を促進し、架橋を起こすために光活性化を必要とする。
【００５３】
表現型：本明細書において用いられる「表現型」なる語は、目視できる、検出可能なまたはさもなければ測定可能な生物の特性、例えば疾患の症状、または疾患のかかりやすさ等を意味する。
【００５４】
ハイブリダイゼーション：本明細書において用いられる「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基の対合による２本の一本鎖核酸による二本鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、正確に相補的な核酸鎖の間で、またはミスマッチのマイナーな領域を含む核酸鎖の間で起こり得る。二対立遺伝子マーカーの一形態とハイブリダイズし、他のものとはハイブリダイズしないようにし、それゆえ２つの異なる対立遺伝子の形態を識別することができるように特異的なプローブを設計することができる。対立遺伝子特異的なプローブは、対で用いることができ、対の１つはもとの対立遺伝子を含む標的配列と完全な一致を示し、他方は、別の対立遺伝子を含む標的配列と完全な一致を示す。ハイブリダイゼーションの条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度の有意の違い、好ましくは、それによって対立遺伝子の一方に対してのみハイブリダイズする、本質的に二元的な応答が存在する十分にストリンジェントな条件である。プローブが正確に相補的な標的配列に対してのみハイブリダイズする、ストリンジェントな、配列特異的なハイブリダイゼーション条件は、当分野において周知である（Sambrook etal., Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N. Y. , 2001）。ストリンジェントな条件は配列に依存し、種々の状況において異なる。一般にストリンジェントな条件は、所定のイオン強度とpHにおいて特定の配列について、熱融点（Tm）よりも約５℃低い温度になるように選択する。
【００５５】
多重プローブハプロタイプ決定法の応用
ディプロイド細胞は任意の遺伝子または少なくとも１つの識別可能な変異を有するいずれか一方の染色体断片において２つのハプロタイプをディスプレイする。ハプロタイプ変異は多くの良く研究されている単一ヌクレオド変異、例えば単一ヌクレオチド多型よりもより密接に相関している。従って、ハプロタイプの研究は、疾患の素因または感受性、治療的介入に対する応答および医薬において目的とするその他の表現型を含む様々な表現型の遺伝子的基礎を理解するのに価値がある。
【００５６】
第一世代のマーカーは、ＲＦＬＰであり、これは制限フラグメントの長さを変える変異である。しかし、ＲＦＬＰを同定しタイピングするのに使用される方法は、比較的、材料と時間を多く消費する。第２世代の遺伝子マーカーはＶＮＴＲであり、これはミニサテライトまたはマイクロサテライトのいずれかに分類される。ミニサテライトはタンデムリピートＤＮＡ配列が５〜５０リピートの単位で存在し、０．１〜２０キロベースの長さにわたってヒト染色体の領域に分布している。これらは多くの可能性のある対立遺伝子を示すので、それらの情報量は非常に多い。ミニサテライトは、サザンブロッティングを行って試験を行う人の核酸試料に存在するタンデムリピートの数を同定することによりスコアリングを行う。しかしながら、サザンブロッティングによってタイピングできる可能性のあるＶＮＴＲは１０４個に過ぎない。さらに、ＲＦＬＰおよびＶＮＴＲマーカーはいずれも、開発と大量の分析にコストと時間がかかる。
【００５７】
ＳＮＰまたは二対立遺伝子マーカー等のＧＶはＲＦＬＰやＶＮＴＲと同様に用いることができるがいくつかの利点を有する。ＳＮＰはヒトゲノムにおいて多く存在し最も頻度の高い種類の変異である。推定１０7を超える数の部位がヒトゲノムの３×１０9塩基対に散在している。従って、ＳＮＰは、ＲＦＬＰまたはＶＮＴＲマーカーよりも頻度が高く一様に存在し、そのようなマーカーは目的の遺伝子座の近傍に見られるという可能性が大きいことを意味する。ＳＮＰはＶＮＴＲマーカーよりも変異が少ないが変異はより安定している。
【００５８】
さらに、特徴付けられたＳＮＰの異なる形態は容易に識別されることが多いので、慣用的に容易にタイプ分けすることができる。二対立遺伝子マーカーは単一ヌクレオチドベースの対立遺伝子を有し、これらは２つの共通する対立遺伝子のみを有し、高度な平行検出と自動化されたスコアリングが可能である。従って、本発明の方法は、大量の個人の、迅速で高スループットのハプロタイプ分析の可能性をもたらす。
【００５９】
二対立遺伝子マーカーはゲノムに数多く存在し、情報量が十分で多数の解析が可能である。これら利点の複合的効果は家族における連鎖解析、アレル共有法、集団における連鎖不均衡試験、ケースコントロール集団の関連試験に用いることができる。二対立遺伝子マーカーは複雑な形質に関わる遺伝子を同定するために行うための関連試験が可能である。関連試験は、無関係のケースおよび対照集団におけるマーカー対立遺伝子の頻度を調べ、一般に多遺伝子性または特発性の形質の決定に用いられる。関連試験は、通常の集団において行われ、罹患家族の関係する人に対して行う試験（連鎖試験）には限定されない。異なる遺伝子にける二対立遺伝子マーカーを、疾患または処置に対する応答との直接の関連について平行にスクリーニングすることができる。
【００６０】
この多重遺伝子法は、特定の表現型、薬物応答、特発性の形質または複合的な遺伝的病因を有する疾患の状態に対する複数の遺伝子因子の相乗効果を調べるための必要な統計的検出力を与えるので、様々なヒト遺伝子試験にとっての強力なツールである。
【００６１】
ハプロタイプ決定に関する本発明の一態様では、標的ゲノムＤＮＡは１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて断片に切断する。任意の核酸供給源を、精製されたまたは精製されていない形態で出発核酸として用いることができるが、目的とする特定の核酸配列を含んでいるまたは含んでいると考えられる。ＤＮＡまたはＲＮＡは細胞、組織、体液などから以下に記載するようにして抽出することができる。本発明の遺伝子分析法において用いるための核酸は任意のほ乳類の供給源から得ることができるが、核酸試料を得る試験対象および個人は好ましくはヒトである。
【００６２】
解析に付するゲノムＤＮＡの供給源に関しては、生体から得た任意の試料を特に制限されることなく用いることができる。これらの試料としては、本明細書に記載された本発明の方法によって試験することができる生物学的試料が挙げられ、ヒトおよび動物の体液が挙げられる。全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液および呼吸器系、消化器系および泌尿生殖器系の様々な外分泌物、涙、唾液、乳、白血球細胞、骨髄腫など；生物学的液、例えば培養細胞上清；腫瘍および非腫瘍組織およびリンパ節組織を含む固定組織標本；および骨髄穿刺液および固定細胞標本。本発明において用いられるゲノムDNAの好ましい供給源は、各ドナーの末梢静脈血から得る。生物学的試料からゲノムＤＮＡを調製する技術は当業者に周知である。
【００６３】
例えば、ＤＮＡ試料を以下のようにして末梢血静脈血から調製することができる：３０ｍLの末梢静脈血をＥＤＴＡの存在下でドナーから採取する。細胞（ペレット化した）を２０００ｒｐｍにて１０分間の遠心により集める。赤血球を溶解液（最終体積５０ｍL：１０ｍＭＴｒｉｓ（pH7.6）；５ｍＭ ＭgＣl2）中で溶解してもよい。次いで、溶解溶液中でペレットを再懸濁した後、上清中に残っている赤血球を除去するのに必要な回数溶液を遠心する（１０分間、２０００ｒｐｍ）。次いで白血球のペレットを、（ａ）３ｍLのＴＥ１０−２（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍL、ＥＤＴＡ２ｍＭ）／ＮａＣｌ ０．４Ｍ；（ｂ）２００μL ＳＤＳ １０％；および（ｃ）５００μLプロテイナーゼＫ（ＴＥ１０−２／ＮａＣｌ ０．４Ｍ中２ｍgのプロテイナーゼ）からなる溶解溶液３．７ｍLを用いて４２℃にて一晩溶解した。
【００６４】
上記の静脈血血清、またはゲノムＤＮＡの任意の供給源から得られた標的核酸の２本鎖をエンドヌクレアーゼにより断片に消化し、分離する。以下に記載するプロトコルに依存して、単一の又は異なるＧＶ部位に特異的ないずれか一方または２つのプローブペプチド核酸（ＰＮＡ）（本明細書の一部を構成する米国特許第５，５３９，０８２号（Nielsen））を核酸標的にハイブリダイゼーションさせることができる。標的核酸およびＧＶプローブのハイブリダイズした混合物を解析して個人の標的核酸断片に対する１または２つのＧＶプローブの同時の結合を検出する。
【００６５】
当分野で知られている任意のＧＶマーカーを、本明細書に記載されたハプロタイプ分析法、例えば以下の表１のウェブサイトのいずれかにおいて、本発明の標的ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡと共に用いることができる。
表１
The Genetic Annotation Initiative (http://Ipg.nci.nih.gov/lpg_small)
ＮＩＨは一般に癌および腫瘍形成に関連すると考えられるＳＮＰの候補に関する情報を含むサイトを運営している。
dbSNP Polymorphism Repository (http://www.ncbi.nim.nih.gov/SNP/)
生物医学の研究において広範に利用可能なＳＮＰに関する情報を含む、ＮＩＨが運営するより包括的なデータベース。
HUGO Mutation Database Initiative (http://ariel.its.unimelb.edu.au/-cotton/mdi.htm)
ＳＮＰを含むヒトの突然変異に関する情報に系統的にアクセスするように作られているデータベース。本サイトはHuman Genome Organization (HUGO)によって運営されている。
ヒトSNPデータベース (http:/lwww-genome.wi.mit.edu/snp/human/index.html)
Whitehead Institute for Biomedical Research Genome Instituteにより運営。
本サイトは、マッピングおよび配列決定についての数多くのWhiteheadリサーチプロジェクトによって生じたＳＮＰについての情報を含む。
ヒトゲノムＳＮＰデータベースにおける日本人のＳＮＰ(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/)
本サイトは、染色体によって体系化されたＳＮＰへのアクセスを提供している。
本サイトは東京大学によって運営されている。
HGBase (http://hgbase.interactiva.de/)
HGBASEはヒトゲノムにおけるすべての既知の配列変化をまとめ、遺伝子型が一般的な疾患、薬物応答、およびその他の表現型にどのように影響を及ぼすかを調査しする試みであり、スェーデンのKarolinska研究所により運営されている。
ＳＮＰコンソーシアムデータベース(http://snp.cshl. org/)
大手製薬および情報処理企業の協力によって得られたＳＮＰおよび関連情報のコレクション。
GeneSNPs (http://www.genome.utah.edu/genesnps/)
ユタ大学によって運営されており、本サイトは、遺伝子の変化と環境刺激および生体異物との間の関係を理解に向け、アメリカ環境衛生研究所の主導によって得られたＳＮＰに関する情報が含む。
ＧＶプローブのハイブリダイゼーションは、単一分子電気泳動によって検出する(Castro, A.,et a/., Single-molecule electrophoresis, Anal. Chem. 67 (18): 3181-86 (1995))。図１および２に示した単一分子電気泳動装置は、蛍光タグを有する個々の分子を検出するための超高感度の手段である。
【００６６】
レーザーエピイルミネーションを共焦点蛍光検出と組み合わせて用い、極めて少量の溶媒を試験する。２つの励起レーザー１０および１２を顕微鏡の対物レンズ１４を介して焦点を合わせ、少なくとも１つのプローブで標識したＤＮＡ試料を励起する。ＤＮＡ希釈溶液を用いると、標識したＤＮＡフラグメントは焦点を合わせたレーザービーム内には一定時間存在しないであろう。個々のＤＮＡが励起領域に拡散するとき、ＤＮＡの標識は検出可能になる。蛍光は顕微鏡の対物レンズ１４によって集められ、多色ビームスプリッタ１３を通過し、二色ビームスプリッタ１５内で２つの感光光子計測検出器１６および１８の間に分光される。
【００６７】
例示した装置は、前掲のCaiらによって示されている周知のレーザーエピイルミネーションおよび共焦点蛍光発光集光の設計に基づいている。試料２４のプローブ体積の直線寸法は、１フェムトリットル（ｆｌ）（Ringlerら、1993）のオーダーのプローブ体積になる、ミクロンまたはそれ以下のオーダーである。レーザー１０または１２は、レーザー光線との接触によって励起されるプローブ検出の性質によって特定の波長で作動させることができる。例えば、レーザー１０は、４９６ｎｍでＡｒ＋レーザーによりフルオレセインのフルオロフォアを励起する。レーザー１２は、６３３ｎｍで作動するヘリウムネオンレーザーでフルオロファアＮ,Ｎ'−ビスカルボキシペンチル−５,５−ジスルフォナートピンドジカルボシアニン(Cy5)を励起することができる。
【００６８】
検出器１６および１８は１個の光子の計測が可能な光ダイオードである。検出器１６の検出チャネルは、例えばフルオレセイン発光を検出のためにバンドパスフィルター（フィルターは示さず）がかけられている。検出器１８からの検出チャネルは、例えばCy5発光を検出するためのバンドパスフィルター（フィルターは示さず）がかけられている。顕微鏡の対物レンズ１４の画像のピンホール１７は、オーバーラップする、焦点のあったレーザービームの直近への２つの検出器１６および１８の視野を制限する。
【００６９】
第１の態様では、液体の試料を含む細いガラス製キャピラリーチューブにレーザー光線を光学的に焦点を合わせる（図２）。電流をチューブ内の溶液に与え、融通のきかない（in lockstep）チューブ内に蛍光分子を移動させる。分子は各レーザービームを通過するので、各蛍光分子の発光が起こる。別のフラクション内で、励起分子の解放が起こり、検出可能な集中的発光が起きる。各分子がレーザービームを通過するのにかかる時間、各分子による励起発光サイクルが何回も繰り返される。１個の蛍光分子からの発光を入射ビームに対して直角に集め、光検出器上の顕微鏡の対物レンズによって焦点を合わせる。フィルターを用いてレーザーからの励起光を検出器に到達するように維持する。２つのレーザービーム間の蛍光分子の通過時間を測定する。２つのレーザー光線の間を蛍光分子が通過する時間を測定する。この特徴的な電気泳動的速度は各分子の大きさ、電荷および形に依存する。電気泳動的速度は、記載したハプロタイプ分析法の特定の態様においてプローブおよび標的分子を識別するために用いられるパラメーターの１つである。装置は、１秒間あたり数百個を検出する。
【００７０】
第２の態様では、この例示した装置において、標的ＤＮＡの希釈溶液中の１マイクロタイター滴（例えば、５マイクロリットル）の試料２４を顕微鏡カバーガラスの下側で懸濁する。カバーガラスを読取台にマウントして蛍光検出プローブ体積を、レーザーで試料の滴の体積をスキャンする。パーソナルコンピュータ２２には、２つの検出チャネル間の相互相関を実時間で計算するデジタル相関カード（ＡＬＶ５０００／Ｅ）が格納されている。
【００７１】
試料２４中の個々のＤＮＡフラグメントが、顕微鏡の対物レンズ１４によって定義される励起領域を拡散するとき、ＤＮＡフラグメント上の蛍光標識されたプローブは蛍光を発する。蛍光は集められ、２つの高感度検出器１６および１８の間に分光される。１つのハイブリダイゼーションプローブのみを有するＤＮＡフラグメントからのシグナルは、１つの検出器によってのみ記録される。各検出器によって記録された強度をコンピュータ２２によって相互相関し、例えば１または２のプローブが同じＤＮＡフラグメントに存在している場所を探す。
【００７２】
単一分子電気泳動
単一分子電気泳動法は、個々の分子の電気泳動速度−電場の影響下で溶液中を分子が移動する速度−の測定からなり、測定された速度を、特定の分子種に特徴的な速度と比較することによって分子を同定する。分子の電気泳動速度は、大きさ、形およびイオン電荷およびその分子が含まれる溶液の化学的環境によって決まる。従って、電気泳動速度は、各分子種に独特の同定指標を与える。
【００７３】
単一分子電気泳動は２つの光線に分光されるレーザー源、試料コンパートメント、集光光学系、２つの単光子検出器、およびコンピュータ制御の検出電子部品からなる。試料コンパートメントは、２つのリザーバを含み、一方は陽極で他方は陰極である。リザーバには分析中の溶媒を保持し、チューブによってキャピラリーセルにつながっている。キャピラリーセルに焦点を合わせた２つのレーザー光線は、２５０ミクロンの距離離れた５ミクロンのスポットを生じる。
【００７４】
電極に電圧をかけると、溶液中の分子はその分子の電荷に依存して陽極または陰極へ向かって移動する。溶液中の個々の分子は２つのレーザー発光のスポットを通過するときに蛍光を発する。次いで、各々の発光に由来する光子は顕微鏡の対物レンズによって集められて、単光子アバランシェ光ダイオードによって検出される。検出電子回路は、時間開閉ウィンドゥ（tima-gated window）セットを用いて遅延蛍光光子のみを検出することにより、ラマン効果およびレイリー散乱を排除する。装置は各分子が２つのレーザー光線の間を通過するのにかかった時間を測定し、この情報を用いて分子の電気泳動速度を計算する。次いで、コンピュータは、試料中ですべての化学種についてピークを示す電気泳動速度のヒストグラムを作成する。
【００７５】
単一分子電気泳動法は、分子の蛍光を測定することに依存するものであるが、その分子に蛍光タグ分子を付加することにより非蛍光分子も検出することができる。さらに、実験条件のいくつか、特に緩衝液の組成、ｐＨ、粘度、キャピラリーの内側表面のコーティング、励起および発光波長は、分析される具体的な試料化合物の最良の分離を達成するように最適化することができる。実際、キャピラリー電気泳動について特別に開発された分析プロトコルの多くは本方法に直接応用することが可能である。長年、研究者たちは、小さい有機分子や無機イオンから様々な種類の薬物や天然物に及ぶ多くの様々な化学種の分離のために様々なキャピラリー電気泳動法の最適化を行ってきた。
【００７６】
本明細書に記載された新しい方法は、自由溶液キャピラリー電気泳動（システム自動化、スピードおよび再現性）の利点と単一分子の検出の卓越した感度とを併せ持つことになる。本方法の感度および汎用性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはその他の方法を用いる大規模なＤＮＡ増幅を行うことなく、蛍光イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション、およびＤＮＡフィンガープリンティング法の開発に道を開き得る。ＰＣＲは効果の高い増幅メカニズムであるが、多数のＰＣＲサイクルの使用は汚染によっておよびまだ完全に理解されていないメカニズムによって生じる不明確性を誘発することがある。単一のフルオロフォア、核酸およびタンパク質の混合物の分析に関する能力が示される上に、本法は、試料成分の超高感度な分析を必要とする他の多くの分野に応用することができる。
【００７７】
上記のようにして調製された試料は四角のガラス製キャピラリーチューブ（一辺２００μｍ）に注入される。直径５μｍの円形のレーザー光線を、試料を入れたキャピラリーを垂直に通過させる。レーザーで誘発された蛍光を、入射レーザー光線に対して直角に配置させた適当な高感度検出器（単光子アバランシェ光ダイオード、即ち「ＳＰＡＤ」）を用いて検出する。このシステムのインターロゲーション体積（interrogation volume）は、レーザー光線の直径と検出器への光を検出する光学系によって選択されたレーザー光線の一部（セグメント）によって決定される。この例では、インターロゲーション体積を適当な試料濃度で、単一分子（単一の核酸標的フラグメント）が、観察を行っている間の各時間間隔の間のインターロゲーション体積中に存在するように設定する。
【００７８】
２つの検出器を用いる。各検出器についての光路は、レーザー光線の同じ領域に向けられており、それ故、各検出器は同一の用量を「問い合わせる」。２つの異なるペプチド核酸ＧＶプローブを用い、各プローブはそれぞれ、同じＤＮＡ鎖にある異なるＧＶにハイブリダイズする。一方のプローブは、蛍光ローダミン６Ｇで末端が標識されており、もう一方のプローブは蛍光ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲで末端が標識されている。５３２ｎｍでプローブを励起し、各プローブは蛍光を異なった識別できる波長の蛍光を発する。各検出器への光路には、各ＳＰＡＤが実験に用いた２つの蛍光ＧＶプローブのうちの１つのみを検出するように光フィルターが組み込まれている。２０００ボルトの電圧を試料に通すと、試料成分がキャピラリーを移動する。データを、２ｍｓ間隔で連続的に各々の検出器で観察された多数の蛍光光子から集める。集めたデータを解析して蛍光がいつ両波長で同時に検出されたのかを求める。両ＧＶプローブの同時検出は、両ＧＶプローブが単一の核酸フラグメントにハイブリダイズしたことを示している。１ｐＭ以下のプローブ濃度で、蛍光プローブの同時検出は起こらない。結果として、ホモジニアスな分析方式を用い、結合しなかったプローブを試料を分析する前に除去する必要はない。これは、ＤＮＡを検出するための、Castroら (Single-molecule detection of specific nucleic acid sequences inunamplified genomic DNA, Anal. Chem. 69 (19): 3915-20 (1997))によって示されているフローサイトメトリー法と類似している。ゲノムＤＮＡが標的である場合、２つのＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、個々のＤＮＡフラグメントにおけるＧＶプローブに対するハプロタイプを示す。
【００７９】
蛍光の代替法を用い、同時または逐次のプローブと標的との相互作用を検出することができる。検出可能なパラメーターには、質量、電荷、形、蛍光寿命、蛍光極性、核酸などが挙げられる。プローブは核酸、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ペプチド、タンパク質または特にＧＶ部位と相互作用し得る任意の他の分子であってよい（本明細書の一部を構成するNielsenの米国特許第５，５３９，０８２号；http://www.exiquon.com（最後にアクセスした日２００２年１０月２４日）を参照）。プローブは１つのパラメーターに影響を及ぼし、または複数のパラメーターを分析し、各パラメーターは１またはそれ以上のプローブによって影響される。
【００８０】
同時２プローブハプロタイプ分析
本発明のべつの態様では、１つの蛍光ＧＶプローブと１つのマスＧＶプローブ（非蛍光）を用いる。マスプローブは、単一のペプチド核酸（ＰＮＡ）１５マーに共有結合した単一のナノスフェアからなる。使用したナノスフェアを合成し、精製して推定の分子量と電荷を有するナノスフェア集団を作製する（Bhalgat, M. K., et al., Green-and red-fluorescent nanospheres for the detection of cell surface receptors by flow cytometry, J. Immunol. Methods 219 (1-2): 57-68 (1998)）。その結果、ナノスフェア−ＰＮＡプローブもまた推定の分子量と電荷を有する。キャピラリー中の試料溶液に電流を流すと、溶液中の分子が、各分子の電荷／質量比に依存する速度でキャピラリーを移動する。
第２のレーザー光線と関連する光検出器を第１の光線／検出器の下流のキャピラリー上に向ける。第２のレーザー光線は、第１のレーザー光線を通過する分子が第２のレーザー光線も同様に通過するよう設定する。両レーザー光線／検出器システムは第１のＧＶプローブからの蛍光を測定する。
【００８１】
特注のソフトウェアを用いて、蛍光分子が第１の検出器と第２の検出器の間を通過するのにかかる時間を測定する。この移動時間（電気泳動速度）は、観察された分子または複合体の電荷／質量比に依存する。このシステムでは、３種類の蛍光分子／複合体が観察可能である：
（ａ）蛍光プローブ；
（ｂ）蛍光プローブ＋標的；および
（ｃ）蛍光プローブ＋マスプローブ＋標的。
この３種類の分子は各々、溶液中での特定の移動時間を有しており、識別することができる（Long, D., et al., Electrophoretic mobility of composite objects in free solution: application to DNA separation, Electrophoresis 17 (6): 1161-6 (1996)）。この例では、プローブ−標的の蛍光を測定することにより同時発光が検出され、マスプローブと結合することにより電気泳動速度の変化（変化した電荷／質量比）が生じた。
【００８２】
逐次２プローブハプロタイプ分析
標的核酸との逐次的相互作用もまたハプロタイプの決定に用いることができる。プローブと標的核酸との逐次的相互作用は、ある時間間隔を置いて単一の検出器で、または別個の検出器で検出することができる。特定の標的分子を識別する手段が維持される限り、プローブの逐次的相互作用を検出することができる。逐次的プローブ結合の検出は、１またはそれ以上のプローブが標的核酸と強固に結合しない条件の下では特に有用である。
【００８３】
標的核酸との逐次的なプローブ相互作用をモニターする例を示す。この例では、プローブはマスプローブ（ＰＮＡ＋ナノスフェア）と蛍光オリゴヌクレオチドプローブからなる。この例では標的核酸フラグメントも蛍光を発する。標的プローブおよび第２のプローブは、異なった識別可能な波長の蛍光を発する。個々の蛍光標的核酸フラグメントは、それらフラグメントが電場に応答してガラス製キャピラリーを通過するように通る。キャピラリーの長さに沿ってレーザー誘導の蛍光を発するようにレーザー光線を作成し、蛍光を検出するためにＣＣＤ探知器を用いる。キャピラリーを移動する蛍光標識した核酸フラグメントはＣＣＤ検出器でピクセルからピクセルに移動することが観察される（Shortreed, M. R.,et al;., High-throughput single-molecule DNA screening based on electrophoresis, Anal. Chem. 72 (13): 2879-85 (2000)）。核酸は一定の電荷／質量を有し、結果としてすべてのフラグメントはある特定の速度でシステムを移動する。マスプローブに結合した核酸フラグメントは、新たな、特定の速度（電荷／質量比の変化のために）を有する。核酸標的が第２のプローブに関連した波長で蛍光性になると第２のプローブの結合は検出される。
【００８４】
遺伝子領域におけるいくつかのＧＶ部位の複数の分析を、各ＧＶ部位に関する異なった、識別可能な特徴を用いることによって、本発明を用いて１回の分析で行うことができる。例えば、４つのプローブ−識別可能な蛍光を有する２つのプローブと２つのマスプローブ（それぞれ異なる、識別可能な質量）を、蛍光プローブから識別可能な蛍光標的と共に使用することができる。このようなシステムを用いて４つの異なるＧＶ部位にあるハプロタイプを決定することができる。
【００８５】
標的およびプローブの単一粒子電気泳動（Castro, et al., Anal. Chem. 67, 前掲）を本発明とともに用いて複数の遺伝子領域を１回の分析で分析することができる。各遺伝子領域は複数のＧＶ部位について解析することができる。本発明のこの応用では、各標的の遺伝子領域（核酸フラグメント）が分析される領域から電気泳動的に識別可能なように、標的フラグメントのサイズを確定する。同様に、分析される遺伝子領域のそれぞれについてプローブおよび標的の種々の組合せが電気泳動的に識別可能なように、プローブ質量と電荷を確立する。結果として、電荷／質量比を用いて遺伝子領域を同定し、標的とのプローブ相互作用を変化した電荷／質量比または別のプローブパラメーター（蛍光等）によって検出する。
【００８６】
実施例
以下の実験例は説明を目的として記載するものであって限定ではない。
実施例１−ハプロタイプ単一プローブ検出
ハプロタイプを決定するための本発明の一態様では、第１のＧＶ部位を特定のオリゴヌクレオチドプライマーによって検出する。熱ＤＮＡポリメラーゼを用いて転写をプライマーから開始し、伸張産物を作製する。熱サイクルを３０サイクル反復して複数の伸張産物を各テンプレートから作製する。伸張産物上の下流のＧＶとハイブリダイズする単一の蛍光ＰＮＡプローブ（Alexa６８０色素）を、ＰＮＡの伸張産物とのハイブリダイゼーションが可能な条件下でこの伸張産物に付加する。室温で３０分インキュベーションした後、ハイブリダイズしなかったＰＮＡを、Microcon 30 YMフィルター／濃縮器を用いて試料の遠心することにより試料から除去する。フィルターに残った試料物質を３０ｍMのgly−gly緩衝液（pH8.2）に懸濁する。伸張産物に第２のＧＶ部位が存在すれば、Microconフィルターに残った試料に伸張産物−ＰＮＡハイブリッドが含まれているであろう。試料を希釈して、伸張産物の推定最終濃度１０〜５００ｆＭにする。試料の励起は、出力が各レーザー光線あたり１．５ｍＷで６３５ｎｍの励起波長の固体レーザーを用いて行った。２つのレーザー光線とAlexa680色素からの蛍光を検出するのに適当な２つの検出器を上記に記載したように用い、試料中の分子の電気泳動速度を測定する。フリーのＰＮＡの速度以外の速度を有する蛍光分子を計測する。このような分子は、伸張産物−ＰＮＡハイブリッドを示し、ハプロタイプを示すことに供する。
【００８７】
別法として、試料が検出キャピラリーを介して注入され電場が存在しないような条件下で、上記で調製した試料を単一分子電気泳動装置にて分析する。この装置の設定では、すべての分子が同じ速度で検出器を通過する。試料の処理と同様にして、結合しなかったＰＮＡが除去されるように処理した対照の試料（ＰＮＡプローブ＋標的ＤＮＡ）を蛍光分子について分析（光子によって検出）し、蛍光を対照と試料の間で比較する。両方のＧＶが存在しプローブのハイブリダイゼーションが起こるならば、対照試料中では蛍光分子はほとんど検出されず、試料中に多数の蛍光分子が検出される。
【００８８】
ハプロタイプ分析の本発明の別の態様では、第１のＧＶ部位を特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて検出する。第２のＧＶに特異的な結合しなかったＰＮＡプローブを試料に添加し、熱ポリメラーゼを用いてプライマーから転写を開始する。アミノアリルｄＵＴＰを転写により伸張産物に取り込ませる。プライマーの下流に第２のＧＶが存在すれば、ハイブリダイズしたＰＮＡプローブは、この時点で転写をブロックするであろう。３０サイクルの熱サイクルを用いて複数の伸張産物をテンプレートから作製する。アミン反応性Alexa680色素をＡＲＥＳ標識キットに記載されているように伸張産物中に導入したアミンとコンジュゲーションさせる。試料をMicrocon 30YMフィルター／濃縮器で遠心することにより取り込まれなかった色素を試料から除去する。フィルターに残った試料を３０ｍMのgly−gly緩衝液（pH8.2）に懸濁する。試料を希釈して、伸張産物の推定最終濃度１０〜５００ｆＭにする。次いで、試料を単一分子電気泳動装置を用いて分析する。試料の励起は、出力が各レーザー光線あたり１．５ｍＷで６３５ｎｍの励起波長の固体レーザーを用いて行う。２つのレーザー光線とAlexa680色素からの蛍光を検出するのに適当なフィルターを有する２つの検出器を上記に記載してようにして用い、試料中の分子の電気泳動速度を測定する。試料中に、第２の、下流のＧＶ部位が存在すれば、ＰＮＡはこの部位で転写をブロックし、決まった長さの転写産物が生じる。単一分子電気泳動装置を用いて分析したとき、これらの産物からの蛍光は単一の速度で検出されない。
【００８９】
実施例２−同時ハイブリダイゼーション
原理：Alexa680は、標的およびプローブを標識して２つの核酸プローブと標的核酸との同時ハイブリダイゼーションを検出する。単一分子検出装置を用いて分析された分子の蛍光強度が、標的、プローブおよび単一のプローブ−標的ハイブリダイゼーション複合体の蛍光強度を超えているとき、同時ハイブリダイゼーションが分子レベルで起こったと考えられる。Alexa680で標識した一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８（ｓｓＭ１３）のＳＭＥ分析の解析によって２msec“bin”あたり２０〜９０光子の発光が得られ、まれに９０光子を超える。Alexa680で標識したＭ１３ｍｐ１８ＲＦ（ｄｓＭ１３）のＮｃｉ制限消化によって生じた３本鎖フラグメントは、２０〜８０光子の光子を発し、ごくまれに８０光子を超える。２つの試料を、ｓｓＭ１３Alexa680（標的）およびｄｓＭ１３Alexa680制限フラグメント（プローブ）と合わせる。変性および再生の後、各制限フラグメントから得た一方の鎖を重複しないようにｓｓＭ１３標的とハイブリダイズさせることができる。これらのハイブリッド分子によって生じた光子の数はｓｓＭ１３標的から放出された光子（最大約９０）、およびハイブリダイズする各一本鎖プローブから放出された光子（各プローブにつき最大約４０）の合計である。ハイブリッドの場合、一本鎖の標的単独または二本差のプローブ単独と比較して、高い平均の数の光子の放出が見られる。この実験計画はさらに、標識した標的と標識した２本鎖のプローブの両方が一緒になっているが変性していない。この対照試料には実験試料と同じ濃度の分子が含まれているが、一本鎖プローブは一本鎖の標的とハイブリッドを形成しないので、２ｍｓｅｃあたり最大で約９０光子よりも多くの発光は起こらない。
【００９０】
方法：プローブフラグメントを作製するための制限消化
ｍ１３ＭＰ１８ＰＦ（ＮＥＢ）をＮｃｉ Ｉで消化し、約４ｋｂ、２ｋｂおよび５ｋｂの３つのフラグメントを得た。制限消化物をフェノール抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを４０μLのＴＥ緩衝液（pH８．０）に再懸濁した。
【００９１】
１．ＤＮＡ標的およびプローブの蛍光標識。機能的アミン基を、Label IT Amine Modifying Kit (Mirus, Madison,WI)を用いて、１Ｍgの未処理のｓｓＭ１３ｍｐ１８（ＮＥＢ）および１ＭgのＮｃｉ Ｉ消化ＤＮＡに加えた。ＤＮＡを、アミン修飾試薬と３７℃にて１時間インキュベーションした。次いで、各試料をエタノール沈殿し、５μLの水に再懸濁した。Alexa 680サクシニミジルエステル色素をＡＲＥＳ Alexa 680キット（Molecular Probes, Eugene,OR)を用いて、アミン修飾ＤＮＡとカップリングした。１〜５μgのＤＮＡを５μLのＨ2Ｏ中、３μLの２５ｍg／ｍLの炭酸水素ナトリウム、２μLの色素とインキュベーションした。次いで、各紙薬をエタノール沈殿しMicrocon-30カラム（Millipore）にアプライした。各Microcon-30に１ｍLの水を通し、微量の未反応のアミン修飾試薬またはAlexa色素の試料を取り除いた。最終の試料体積を０．２ｍLとした。
【００９２】
２．ハイブリダイゼーション反応および単一分子解析
Alexa 680標識した一本鎖のＭ１３標的（最終濃度２０ｐＭ）とAlexa680で標識した二本鎖プローブ（最終濃度５０ｐＭ）とを１２０ｍＭのＮaＣl、１０ｍＭのＴｒｉｓ（pH８．０）および５ｍＭのＥＤＴＡ中で混合することにより２種類の試料を調製した。ハイブリダイズする試料をpHを上げることにより変性させた後、Label IT アミン修飾キット (Mirus, Madison,WI)にて提供され記載されている緩衝液を用いて再生した。両試料を、室温で４時間インキュベーションした。最終濃度１ｐＭ標的および２．５ｐＭのプローブの最終濃度について単一分子検出による分析のために、試料を分析用５０ｍＭＧlyＧly（pH８．２）中で２０倍に希釈した。試料を、１μL／分の速度で装置のキャピラリーへ注入し、データを１６分間集める。両データのセットを１００光子またはそれ以上の相互相関について分析する。
【００９３】
変性および再生した試料は、１６分間でのデータにおいて２ｍｓｅｃあたり＞１００光子の相互相関が５６４回あった。変性した対照試料は、２ｍｓｅｃあたり＞１００光子のの相互相関が４回のみであった。標的に対する２つの蛍光プローブの同時ハイブリダイゼーションが、ハイブリッドを形成することができる標的およびプローブ分子と比較して、標的／プローブハイブリッド分子によって放出された光子の数の増加によって検出することができることを示す。個人の標的分子に対する２つの異なるＧＶプローブの同時ハイブリダイゼーションはハプロタイプを決定するのに十分である。
【００９４】
記載したこの実験において用いるプローブは大量であり、標的の短い部位（８〜３０塩基対）に対して相補的なプローブを用いてハプロタイプ分析を改善する。そのような分析を以下に記載する。
【００９５】
目的は２つの異なる３ｋｂのｓｓＬＮＡプローブを作製することである（１×平均シグナル強度）、それぞれｓｓＭ１３ｍｐ１８の短い座（種々のＧＶ座と等価）に対する親和性を有する。さらなる長さのプローブは、プローブの認識部分のための標識された「テール」として供する。蛍光色素を有するこれらのプローブ尾部を標識することによって、BioProfile Coporation's 単一分子電気泳動装置を用いて解析したときに平均２倍の蛍光強度を発するｓｓＭ１３ｍｐ１８とｓｓＬＮＡプローブを含むハイブリッド分子を検出することができる。
【００９６】
材料：ＬＮＡオリゴ（Proligo）Ｍ１３ｍｐ１８h5594L6017（200nm，HPLC 80）5'-AGG GAA GAA AGC GAA AGG AGG CTG CCA GCG ACG AG (配列番号１);M13mp18h6702L6017 (200 nm, HPLC 80)5'-AAC CAA TAG GAA CGC CAT CAG CTG CCA GCG ACG AG (配列番号２); ラムダファージＤＮＡ (SigmaカスタムD-3654);NovaTaq PCRキット(Novagen カタログ番号 71005-3): デオキシヌクレオチド三リン酸(10, umol dNTPs) (Promega カタログ番号U1330);ARESTM Alex Fluor（登録商標）680 ＤＮＡ標識キット(Molecular Probes カタログ番号A-21672);MinElute（商標）PCR 精製キット (Qiagen カタログ番号28004); GeneCapsule（商標） (Geno Technology, Inc.)；MJ リサーチＤＮＡエンジン(MJ Research, Inc. カタログ番号：PTC-0020, PTC-0225); 8-ストリップ0.2 mL 薄壁チューブ (MJ Research, Inc. カタログ番号：TBS- 0201); 0.2 mL薄壁チューブ用の8-ストリップキャップ(MJ Research, Inc. カタログ番号：TCS-0801)。
【００９７】
方法と結果
０．２ｍLの薄壁熱サイクルチューブ中以下の組成（最終濃度）を用いて、ラムダファージＤＮＡの４５２１塩基のフラグメントを増幅するためにＰＣＲ反応混合物を準備する：Lambda5kLeftオリゴ (250nM); Lambda5kRightオリゴ(250 nM);10×PCR緩衝液＋MgC(1×) ; dNTPミックス(0.2mM) ; NovaTaqTM (5 units);ラムダファージＤＮＡ(約500ng) ; 滅菌水を加えて最終の体積を５０μLとする。試料を３０サイクルの熱サイクルに付し、標準的なＰＣＲ温度サイクルレジメント（regiment）を用いて予測した大きさのＰＣＲ増幅物を作製した。
【００９８】
０．７％アガロースゲル中での電気泳動によりＰＣＲ増幅物を分析した後、増幅物が予測した大きさであることを確認するために臭化エチジウム染色を行う。GeneCapsule（商標）およびGeneCapsule（商標）に記載された方法を用いて４，５２１塩基のアプリコンを切断する。GeneCapsule（商標）はまた、取り込まれていないフリーのヌクレオチドおよびオリゴを除去する。切断されたフラグメントの濃度を、反応混合物の臭化エチジウム染色されたアリコートの蛍光を既知の濃度の染色された核酸との比較に基づいて見積もる。
【００９９】
精製したアプリコンを用いてｓｓＬＮＡプローブを作製する。０．２ｍLの薄壁熱サイクルチューブ内で以下の成分を十分混合することによりＬＮＡオリゴのそれぞれについて別々のＤＮＡポリメラーゼ伸張反応を準備する：M13mp18h5594L6017またはM13mp18h6702L6017 (250nM); 10× PCR 緩衝液＋MgCl2 (1×) ;d [GAC] TPミックス(40 M dGTP, 40 M dATP, 40 M dCTP) ; アミノアリル-dUTP (60 M) ;dTTP(10, μＭ) ;NovaTaq（商標）(25 units); 4,521塩基ラムダPCRアプリコン (500 ng)。滅菌水を加えて最終体積を５０μLとする。ストリップキャップをチューブにかぶせ、温度を標準的なＰＣＲ温度サイクルレジメを用いてサイクルさせ、約３ｋｂの伸張産物を作製する。MinElute（商標）キットマニュアルの説明にしたがって、伸張反応産物をMinElute（商標）ＰＣＲ精製キットを用いて精製する。エタノール沈殿の工程は、この精製の後、色素カップリング反応の前にＴｒｉｓ緩衝液を除去することが必要である。溶出した伸張産物を５μLのヌクレアーゼ不含水に再懸濁する。
【０１００】
色素カップリング反応を行い、ｓｓＬＮＡプローブを蛍光標識する。ＡＲＥＳ（商標）Alex Fluor(登録商標)680ＤＮＡ標識キットのマニュアルのステップ４．１〜４．７に従い、色素をアミン修飾プローブにカップリングさせる。ＡＲＥＳ（商標）マニュアルのステップ５．１〜５．２には、別のMinElute（商標）ＰＣＲ精製カラムおよびエタノール沈殿を含む標識後の洗浄手順が記載されている。
【０１０１】
標識したｓｓＬＮＡプローブを、各プローブについて最終濃度１００ｐMに希釈した５０ｍＭのＧlyＧly緩衝液（pH８．２）に再懸濁する。各プローブの少量を、予めシリコン処理した１．５ｍLのチューブに分注し、さらに５０ｍＭのＧlyＧly緩衝液（pH８．２）中で１０〜５０ｆＭの濃度に希釈する。これらの希釈物を単一分子電気泳動装置にて分析し以下を確認する：各プローブを個々に検出する能力、各ｓｓＬＮＡプローブの相対的な平均強度を検出する能力、および各プローブの実際の濃度を測定する能力。
【０１０２】
ｓｓＬＮＡプローブおよびｓｓＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ両方を含むハイブリダイゼーション反応を開始する。以下の成分（最終濃度）を、予めシリコン処理した１．５ｍLのチューブ内で混合する：M13mp18h5594L6017 (10 pM);M13mp18h6702L6017 (10 pM);ssM13mp18 DNA (1 pM); 予め濾過したハイブリダイゼーション緩衝液(5×SSC,0.1％N-ラロイルサルコシン, 0.02％SDS), 滅菌水を加えて１００μLとする）ハイブリダイゼーション反応物を６５℃で１６時間インキュベーションする。新しい予めシリコン処理した１．５ｍLチューブに少量ずつ分注し、５０ｍＭＧlyＧly緩衝液（pH８．２）中で約１０ｆＭのｓｓＭ１３ｍｐ１８テンプレート濃度に対し１：１００に希釈する。
【０１０３】
１×および２×平均シグナル強度を有する分子の集団を検出する。１×平均シグナル強度分子は、伸張反応後依然としてラムダフラグメントに結合しているハイブリダイズしていないｓｓＬＮＡプローブおよびＬＮＡプローブを示す。２×シグナル強度を有する分子はｓｓＭ１３ｍｐ１８との両プローブのハイブリッドを示す。このようなＧＶの分析は、標的のハプロタイプを決定するのに十分である。
【０１０４】
その他の態様
ここに記載された発明および請求の範囲は、ここに開示された特定の態様はいくつかの態様を説明することを意図するものであり、その態様の範囲に限定されない。任意均等な態様が本発明の範囲に属すると意図する。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて本発明の様々な修飾が上記の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾もまた添付された請求の範囲に属すると意図される。
【０１０５】
引用した文献
上記で引用した文献は、それぞれの文献、特許または特許出願があたかも参考のために本明細書においてその全体が組み込まれるように具体的かつ個別に示されたかのように、本明細書において同じ程度で参考のために組み込まれる。本明細書における文献の引用は、そのような文献が本発明の先行技術であると自認するものであると解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】標識した単一分子の蛍光検出による迅速ハプロタイプ分析用装置の一例である。２つの励起レーザー１０および１２を、顕微鏡の対物レンズ１４を介して焦点を合わせ、少なくとも１つのプローブによって標識されたＤＮＡ試料２４を励起する。励起状態のプローブからの発光は顕微鏡の対物レンズ１４によって集められ、多元的ビームスプリッタ１３を通過し、２つの感受性光子計数検出器１６および１８の間で二色ビームスプリッタ１５によってスペクトル的に分光される。検出器１６および１８は、単光子測定アバランシェ光ダイオード（single photon counting avalanche photodiode）である。レーザー１０および１２は、レーザービームとの接触で励起される検出プローブの性質によって特定の波長で操作することができる。検出器１６からの検出チャネルは、予め決まった波長を検出するためにバンドパスフィルターがかけられている（フィルターは示さず）。検出器１８からの検出チャネルは同じまたは異なる予め決まった波長の発光を０検出するためのバンドパスフィルターがかけられている（フィルターは示さず）。２つのプローブで標識されたＤＮＡは両検出器に登録される。一方のプローブで標識されたＤＮＡを検出器１６または１８の１つの検出器で検出する。検出器１６または１８による最初の記録を、相互相関させて両方の標識を含むＤＮＡ断片の存在を検出する。顕微鏡の対物レンズ１４の画像のピンホール１７は、オーバーラップする、焦点のあったレーザービームの直近への２つの検出器１６および１８の視野を制限する。パーソナルコンピュータ２２には、２つの検出チャネル間の相互相関を実時間で計算するデジタル相関カードが格納されている。
【０１０７】
【図２】キャピラリーフローセル３０を示す装置の一例である。レーザービーム１０および１２は、液体の試料２４を含む細いガラス製キャピラリーチューブに焦点が合う。電流をチューブ内の溶液に与え、融通のきかない（in lockstep）チューブ内で蛍光分子を移動させる。分子は各レーザービーム１０および１２を通過するので、各蛍光分子の発光が起こる。別のフラクション内で、励起分子の解放が起こり、検出可能な発光が起きる。この光を検出器１６および１８で検出する。各分子がレーザービームを通過するのにかかる時間、各分子による励起発光サイクルが何回も繰り返される。１個の蛍光分子からの発光を入射ビームに対して直角に集め、光検出器１６および１８上の顕微鏡の対物レンズによって焦点を合わせる。フィルター（示さず）を用いてレーザーからの励起光を検出器に到達するように維持する。２つのレーザービーム間の蛍光分子の通過時間をＰＣ２２によって測定する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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