(57)【要約】本発明は、複数のジスルフィド結合を有する異種ポリペプチドを産生するために、バクテリア内でツイン・アルギニン転座経路を用いるための方法を提供する。Tat経路を通じた分泌によって産生されるポリペプチド・ライブラリをスクリーニングする方法も提供される。本発明は、少なくとも１つのジスルフィド結合を有する異種ポリペプチド産生のための改善された方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路を通じた蛋白質排出を指示するリーダー・ペプチドを包含する発現カセットで遺伝子的に形質転換されるバクテリアであって、前記異種ポリペプチドがバクテリア細胞によって産生され、少なくとも１つのジスルフィド結合を包含することを特徴とするバクテリア。
【請求項２】
酸化性細胞質を有するとしてさらに定義される請求項１記載のバクテリア。
【請求項３】
前記異種ポリペプチドが、約２から約17のジスルフィド結合を含んでいることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項４】
前記異種ポリペプチドが生物学的に活性な形で産生されることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項５】
前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子からのものであることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項６】
前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIの相同物で構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来することを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項７】
前記バクテリアが、trxB遺伝子機能を減少または排除する突然変異体を包含することを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項８】
グラム陽性菌としてさらに定義される請求項１記載のバクテリア。
【請求項９】
グラム陰性菌としてさらに定義される請求項１記載のバクテリア。
【請求項１０】
前記バクテリアが大腸菌であることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項１１】
前記異種ポリペプチドが、バクテリアから分泌され、そしてバクテリアの周辺質から単離されるか、または内在性膜蛋白質であることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項１２】
前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの培養上清から単離可能であることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項１３】
前記異種ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチドであることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項１４】
前記異種ポリペプチドが、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項１５】
前記異種ポリペプチドが、未変性コンフォメーションのポリペプチド、突然変異したポリペプチド及び切断されたポリペプチドで構成される群から選択されることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項１６】
前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの細胞質細胞膜の表面上に発現することを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項１７】
前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの周辺質細胞膜の表面上に発現することを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項１８】
前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの周辺質内で発現することを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項１９】
前記異種ポリペプチドが、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項１記載のバクテリア。
【請求項２０】
バクテリア細胞内で少なくとも1つのジスルフィド結合を包含する少なくとも1つの異種ポリペプチドを産生する方法であって、前記方法が：
ａ）異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路を通じて蛋白質排出を指示するリーダー・ペプチドを包含する発現カセットを作製するステップと；そして、
ｂ）酸化性細胞質を包含するバクテリア細胞内で発現カセットを発現させるステップであって、前記異種ポリペプチドが産生され、少なくとも1つのジスルフィド結合を包含することを特徴とするステップ
で構成される方法。
【請求項２１】
前記異種ポリペプチドが、約１から約17のジスルフィド結合を含んでいることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記異種ポリペプチドのうち２つが、少なくとも１つのジスルフィド結合によって結合されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記異種ポリペプチドが、生物学的に活性な形で産生されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子からのものであることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIの相同物で構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
前記異種ポリペプチドが、バクテリア細胞から分泌されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記異種ポリペプチドが、バクテリアの周辺質から単離可能であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
前記異種ポリペプチドが、内在性膜蛋白質であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
前記異種ポリペプチドが、前記バクテリア細胞の培養上清から単離可能であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３０】
前記異種ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチドであることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３１】
前記異種ポリペプチドが、未変性コンフォメーションのポリペプチド、突然変異したポリペプチド及び切断されたポリペプチドで構成される群から選択されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３２】
前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの細胞質細胞膜の表面上に発現することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３３】
前記異種ポリペプチドが、前記バクテリアの周辺質細胞膜の表面上に発現することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３４】
前記異種ポリペプチドが、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３５】
分泌コンパートメント内の蛋白質酸化を再構成することができる突然変異ポリペプチドをコードする核酸を識別する方法であって、前記方法が：
ａ）酸化性活性を有する蛋白質の突然変異ポリペプチドをコードする核酸配列の上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを包含する発現カセットを取得するステップと；
ｂ）酸化性細胞質を有し、周辺質ジスルフィド結合形成が損なわれているバクテリア内で前記発現カセットを発現させるステップと；そして
ｃ）前記損なわれた周辺質ジスルフィド結合形成活性が、発現カセットの発現によって補完されて、分泌コンパートメント内の蛋白質酸化を再構成することができる突然変異ポリペプチドをコードする核酸配列を識別するステップ
で構成される方法。
【請求項３６】
組み合わせライブラリをスクリーニングする方法であって、上記方法が：
ａ）当該ポリペプチドのライブラリを生成するステップと；
ｂ）前記ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを配置する発現カセットを作製するステップと；
ｃ）酸化性細胞質を包含するバクテリア内で前記発現カセットを発現させるステップと；そして
ｄ）発現した分泌ポリペプチドをスクリーニングするステップ
で構成される方法。
【請求項３７】
前記発現に対するスクリーニングが、周辺質発現法及び細胞数測定スクリーニングまたはファージ・ディスプレイによるものであることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチドであることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳動物ポリペプチドが、抗体またはその断片であることを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来することを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記リーダー・ペプチドが、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIの相同物で構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来することを特徴とする請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、蛋白質分泌の分野に関するものである。本発明は、より具体的には、バクテリア内のツイン・アルギニン転座経路を通じた複数のジスルフィド結合を有する組み換え蛋白質の分泌に関するものである。
本発明は、2002年３月23日に出願された米国仮特許出願第60/367,130の優先権を主張するものであり、その開示全体が引用によって具体的に本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
バクテリア内において、細胞膜を通り抜ける蛋白質分泌の大半は、sec経路を介して生じる（Stuart and Neupert, 2000）。蛋白質は、細胞膜を通り抜ける蛋白質の運搬のための管としてはたらく小さな直径の孔を形成する３つの内在性膜蛋白質（SecY、SecE及びSecG）の複合体である『sec経路』を通って細胞膜を横断する。分泌されたポリペプチドは大部分は折り畳まれておらず、恐らくはランダム・コイルに類似しており、ATPの消費を必要とするプロセスで上記孔を効率的に通り抜ける。とりわけ、真核生物における蛋白質分泌は基本的に類似しており、ATP加水分解に付随して幅の狭い膜孔を通る折り畳まれていないポリペプチドの通り抜けにも関与する（Schatz and Dobberstein, 1996）。
【０００３】
蛋白質排出のsec経路（及び真核生物の類似の経路）は、ここ25年以上にわたって研究されてきた。最近までその他の分泌経路が知られていなかったため、バイオテクノロジーの目的のための分泌蛋白質産生は、専らsec経路に頼ってきた。バイオテクノロジーの目的のためのsec経路の重要性が、蛋白質発現に有用な種々のリーダー・ペプチドに関する膨大な文献によって、及び分泌される蛋白質の流れをよくするための種々の方策によって強調されている。しかし、sec経路を介した蛋白質分泌は、いくつかの内在的な限界を免れない。例えば、いくつかの異種ポリペプチドはsec経路を介した運搬と不適合であり、従って分泌された形状では発現することができない。不適合なポリペプチドがSecYEG孔へ嵌り込むと、そこで不適合なポリペプチドは詰まってしまい、その結果、膜を通り抜けて完全に転位することができない。また、上記分泌機構が詰まって、天然蛋白質の輸送に利用できなくなるが、これは、成長の停止、そして最終的には細胞溶解を引き起こす現象である。異種分泌蛋白質の発現に関連する細胞毒性の影響はきわめて一般的であり、文献に詳しく述べられている。例えば、細胞毒性は、バクテリアでの組み換え抗体断片の発現における主要な問題のひとつである（Hayhurst and Georgiou 2001, Lou et al., 2001）。
【０００４】
sec経路を介して排出される蛋白質の折り畳みは、膜を通り抜ける転座に続いて生じる。原核生物及び真核生物の両方において、分泌コンパートメント内（グラム陰性菌の細胞周辺腔(periplasmic space)及び真核生物細胞の小胞体）での蛋白質折り畳み機構は、細胞質(cytoplasm)のそれとは大きく異なっている（Wulfing and Pluckthun 1994, a Danesse and Silhavy 1998）。特に、バクテリアの細胞周辺腔は、GroEL/GroES及びDnaK/DnaI/GrpEネットワークのような高度に洗練されたATP依存シャペロン・システムを欠いている（Baneyx, 1999）。蛋白質折り畳みのためにそうしたシャペロン・システムに依存する蛋白質は、バクテリア周辺質(bacterial periplasm)への分泌に引き続く、溶解性で生物学的に活性な形にしばしば達することができず、封入体として集積される（Bowden et al., 1991）。
【０００５】
多くの酵素は、細胞質内で合成されて、折り畳みの際に蛋白質に組み込まれる、モリブドプテリン、鉄-硫黄中心、FMN、FADなどのような共同因子を必要とする。そのような蛋白質がsec系を介して分泌されると、蛋白質が排出の前に折り畳まれていないので、共同因子の組込みは生じ得ない（Robinson 2000）。
【０００６】
さらに、sec排出機構に内在する生合成の制限によって、組み合わせ蛋白質ライブラリの機能的多様性が制限される（Lou et al., 2001, Hayhurst and Georgiou 2001, Arnold 2001）。組み合わせライブラリのスクリーニングにおいて、そして一般に、指示された蛋白質放出において、望まれる機能を示す選択されたクローンは、２つの『フィルター』、すなわち：細胞にとって毒性がある蛋白質、さもなければ発現と両立しない蛋白質を除去する『生合成フィルター』、そして、望まれる機能を有する蛋白質を選択すれる『機能フィルター』とを通過するそれらの能力に基づいて単離される。ディスプレイ技術（ファージ、バクテリアなど）を用いた組み合わせライブラリのスクリーニングにおいて、ポリペプチドは、それが線状ファージまたは微生物細胞のような生物学的粒子の表面にディスプレイされる前に、細胞質から分泌されなければならない。しかし、多くのポリペプチドは、sec経路を介した排出、またはバクテリアの細胞周辺腔内での折り畳みと両立しない。結果として、発現ライブラリのポリペプチド多様性は、特に、分泌によって課される制限によって限定される。これらの限定を回避することは、組み合わせライブラリのポリペプチド配列の多様性を拡大する可能性が高く、それによって、新規な結合蛋白質及び酵素を単離する能力が拡大する。
【０００７】
従って、先行技術は、大腸菌のようなバクテリアの細胞質から折り畳まれた蛋白質を効果的に排出させることを指示する方法が不十分である。さらに、先行技術は、多くの異種蛋白質、特にヒト蛋白質がバクテリア内で効果的に排出されないことを明確に示した。複合蛋白質の折り畳み及び排出のための方法における欠陥は、ファージ・ディスプレイのような方法によってスクリーニングされる組み合わせライブラリから、望まれる機能を有する蛋白質を単離する上での限界をしばしば提示する。本発明は、バクテリアからの複合ポリペプチド、特にバクテリア内のツイン・アルギニン転座経路を通じた複数のジスルフィド結合を有する蛋白質の分泌の方法を提供することによって本技術分野のこの長年にわたるニーズと要望を満たすものである。さらに、本発明は、ツイン・アルギニン転座経路を用いた細胞質から排出される組み合わせポリペプチド法のスクリーニングのための方法を開示する。
【発明の開示】
【０００８】
（発明の概要）
１つの態様で、本発明は、異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路を通じた蛋白質排出を指示するリーダー・ペプチドを包含する発現カセットで遺伝子的に形質転換されるバクテリアを提供し、上記異種ポリペプチドはバクテリア細胞によって産生され、少なくとも１つのジスルフィド結合を包含する。上記バクテリアは酸化性細胞質を有してもよい。本発明による特定の実施の形態で、上記異種ポリペプチドは約１から約17のジスルフィド結合を含むことができ、及び／又は生物学的に活性な形で産生されることができる。本発明による別の特定の実施の形態で、上記リーダー・ペプチドは、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子からのものでもよい。上記リーダー・ペプチドは、これら配列のいずれかの相同物をコードする遺伝子に由来してもよい。
【０００９】
本発明による１つの実施の形態で、提供されるバクテリアは、上記バクテリアが酸化性細胞質を有するようにさせる１つ以上の突然変異を含むことができる。上記バクテリアは、グラム陽性菌またはグラム陰性菌でもよい。本発明による１つの実施の形態で、上記バクテリアは大腸菌である。上記異種ポリペプチドは上記バクテリアから分泌され、バクテリアの周辺質または内在性膜蛋白質から単離することが可能である。上記異種ポリペプチドは、上記バクテリアの培養上清から単離することもできる。本発明による特定の実施の形態で、上記異種ポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチド、例えば、その抗体または断片である。別の実施の形態で、上記異種ポリペプチドは、未変性コンフォメーション(native conformation)のポリペプチド、突然変異したポリペプチド及び切断されたポリペプチドで構成される群から選択される。そのような異種ポリペプチドは、バクテリアの細胞質細胞膜の表面上、及び／又はバクテリアの周辺質細胞膜の表面上及び／又はバクテリアの周辺質内で発現することができる。
【００１０】
さらに別の実施の形態で、本発明は、バクテリア細胞内の少なくとも1つのジスルフィド結合を包含する少なくとも1つの異種ポリペプチドを産生する方法を提供し、上記方法は：ａ）異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路を通じて蛋白質排出を指示するリーダー・ペプチドを包含する発現カセットを作製するステップと；そして、ｂ）酸化性細胞質を包含するバクテリア細胞内の発現カセットを発現させるステップにおいて、上記異種ポリペプチドが産生され、少なくとも1つのジスルフィド結合を包含することを特徴とするステップとで構成される。本発明の１つの実施の形態で、上記異種ポリペプチドは、約１個から約17個のジスルフィド結合を含んでいる。上記異種ポリペプチドは、生物学的に活性な形で産生されてもよい。上記異種ポリペプチドのうち２つは、少なくとも１つのジスルフィド結合で結合することができる。上記方法で、上記リーダー・ペプチドは、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子からのものでもよい。本発明による特定の実施の形態で、そのような配列の相同物のリーダー・ペプチドが用いられる。
【００１１】
本発明による１つの実施の形態で、上記異種ポリペプチドは、バクテリア細胞から分泌されることができる。異種ポリペプチドは、バクテリアの周辺質から単離可能でもよく、及び／又は内在性膜蛋白質でもよい。異種ポリペプチドは、バクテリア細胞の培養上清から単離することもできる。異種ポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドでもよく、未変性コンフォメーションのポリペプチド、突然変異したポリペプチド及び切断されたポリペプチドで構成される群から選択されてもよい。異種ポリペプチドは、バクテリアの細胞質細胞膜の表面で発現してもよく、バクテリアの周辺質細胞膜の表面で発現してもよく、そして、その抗体または断片でもよい。
【００１２】
さらに別の態様で、本発明は、分泌コンパートメント内の蛋白質酸化を再構成することが可能な突然変異ポリペプチドをコードする核酸を識別する方法を提供し、上記方法は：ａ）酸化性活性を有する蛋白質の突然変異ポリペプチドをコードする核酸配列の上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを包含する発現カセットを取得するステップと；ｂ）酸化性細胞質を有し、周辺質ジスルフィド結合形成が損なわれているバクテリア内で上記発現カセットを発現させるステップと；そして、ｃ）上記損なわれた周辺質ジスルフィド結合形成活性が、発現カセットの発現によって補完されて、分泌コンパートメント内の蛋白質酸化を再構成することが可能な突然変異ポリペプチドをコードする核酸配列を識別するステップとで構成される。
【００１３】
さらにまた別の態様で、本発明は、組み合わせライブラリをスクリーニングするための方法を提供し、上記方法は：ａ）当該ポリペプチドのライブラリを産生するステップと；ｂ）ポリペプチドをコードする核酸配列の上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを配置する発現カセットを作製するステップと；ｃ）酸化性細胞質を包含するバクテリア内の発現カセットを発現させるステップと；そして、ｄ）発現した分泌ポリペプチドをスクリーニングするステップとで構成される。上記方法で、発現のスクリーニングは、周辺質発現、細胞数測定スクリーニングまたはファージ・ディスプレイによるものであってもよい。上記ポリペプチドは、哺乳動物のポリペプチドであってもよく、その抗体または断片でもよい。本発明による特定の実施の形態で、上記リーダー・ペプチドは、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来する。上記リーダー・ペプチドは、これらの配列の相同物からのものでもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
ツイン・アルギニン転座（Tat）経路を介した折り畳みと排出能の間の関係を調べるため、本発明者等は、一連の８個の推定されるTatリーダー・ペプチドと、細胞質内の蛋白質ジスルフィド結合の形成を可能にするか、または忌避するかのいずれかである同質遺伝子大腸菌株内のアルカリ・ホスファターゼとの間の融合物の細胞成分局在化を分析した。Tat輸送体を介する排出は、細胞質内で酸化的蛋白質折り畳みを可能にする株でのみ観察されることが示された。さらに、その他のジスルフィド含有蛋白質、すなわち、単鎖Fv及びヘテロ二量体FAB抗体断片は、酸化性細胞質を有する株のみで排出能を持つ。特に、機能性ヘテロ二量体FAB蛋白質は、単独の重鎖と融合したTatリーダー・ペプチドによって細胞質から排出されたことが示され、ジスルフィド結合二量体の形成が排出に先行することが示唆された。これらの結果は、未変性コンフォメーションを達成した蛋白質のみが、in vivoでTat輸送体を介して排出されることを示し、折り畳みの質的制御機序が排出プロセスに内在することを示唆している。ジスルフィド結合を有する蛋白質を排出するための能力、及びTat経路の折り畳み補強特性も多くの用途を有する。
【００１５】
本発明者等による研究成果は多くの用途を有する。構造的ジスルフィド結合を持つ蛋白質は、Tat経路によって効果的に排出され得ることが示された。酵素など産業上重要な多くの分泌蛋白質は、適切な折り畳みに必要な複数のジスルフィド結合を含んでいる。そのような蛋白質は、例えば、C:ox株のように、酸化性細胞質を有するバクテリア内のTat経路を介して分泌されてもよい。Tat経路を利用することの利点は、Sec経路によって排出される蛋白質がトランスロコンで『詰まっている』場合によく見られる細胞毒性の問題をTat経路が軽減できることである。第２に、Tat経路の折り畳みの質的制御特性は、組み合わせライブラリのスクリーニング実験で利用され、適切に折り畳まれることができない突然変異ポリペプチドを『取り除く』ことができる。
【００１６】
Tat経路が蛋白質分泌の新しい機序として発見されてからまだ５年も経っていないが、これは最初に光合成生物のチラコイド膜で、続いてバクテリア内で発見された（Settles et al., 1997; Weiner et al., 1998）。この分泌機序は、この形態の排出に関与する蛋白質のリーダー・ペプチドで発見されたシグニチャーArg-Argモチーフのために、『ツイン・アルギニン転座』またはTAT経路と命名された。プロテオミクス及びバイオインフォマティクス分析に基づいた予測によると、大腸菌または枯草菌のようなバクテリア内で分泌される蛋白質の５−８％は、TAT経路を介して転位される（Berks et al. 2000, Robinson and Bolhuis 2001）。この経路の主な特徴を、未だ不明の点が非常に多いが、以下に述べる。
【００１７】
第１に、sec経路やその他の分泌機序によって排出されるポリペプチドは折り畳まれていない形状で膜を通り抜け、排出が完了した後にそれらの未変性コンフォメーションに到達するのに対して、TAT経路を介して分泌される蛋白質は、先ず細胞質内で折り畳まれ、その後コンパクトで未変性に似た状態で膜を通って転位される。事実、この理由によって、TAT経路は、共同因子の組込みまたは細胞質内での種々のサブユニットの構築に必要な蛋白質の排出を担っている（Rodrigue et al. 1999, Robinson 2000, Sanders et al. 2001）。分泌は、SecYEG  トランスロコンを通じてではなく、TatABC及びＥ蛋白質によって形成される恐らくはより大きな直径を有する孔を通じて生じる（Sargent et al. 2001）。少なくとも120 kDaまでの分子量の大きな蛋白質は、TAT経路を通じて排出されることが文献に述べられている。さらに、TAT経路を通じた分泌は、ATPの加水分解と関連しているのではなく、膜を通過するプロトンの非対称分布またはΔpHによって引き起こされる。
【００１８】
蛋白質にTAT機構を標的にさせるために必要なリーダー・ペプチドは、sec特異的リーダーよりも長く、疎水性が小さい。TAT特異的リーダー・ペプチドは、アミノ末端領域が伸長されているため、及びＣ領域の塩基性残基がより多いために、平均してアミノ酸14個分長い（Cristobal et al., 1999）。しかし、TAT特異的リーダー・ペプチドの疎水性領域は、グリシン及びトレオニン残基の発生率が高いために著しく短い。植物と原核生物の両方のTAT特異的リーダー・ペプチドの顕著な特徴は、sec特異的リーダー・ペプチドにはない、独特な保存配列モチーフ(S/T)-R-R-x-F-L-K（配列識別番号No:９）の存在である（Robinson and Bolhuis, 2001）。この配列モチーフは、周知であり予測されているTAT基質のリーダー・ペプチド内のアミノ末端領域／疎水性核境界に配置される（Berks, Mol 1996）。シグナル・ペプチド内のどちらのアルギニン残基の突然変異も、蛋白質転座の効率を著しく減少させる（Cristobal et al., 1999）。
【００１９】
コムギpre-23K及びpre-Hcf136のツイン・アルギニン（RR）モチーフは、チラコイドTAT経路による標的化に不可欠である。このモチーフは、一般にTATリーダー・ペプチドの中心的な特徴である。バクテリアのツイン・アルギニン・シグナル・ペプチドは、チラコイドTATシグナルと類似しており、高い効率で植物チラコイドへのTAT依存標的を指示することができる。しかし、大部分のバクテリアのシグナル・ペプチドは、特別な機能を示すツイン・アルギニン・モチーフに加えて、保存配列エレメントを含んでいる。ツイン・アルギニンの次の位置２には、フェニルアラニンへの重いバイアスがあり、上記シグナルの多くは位置４にリシンを含んでいる。周知のチラコイド・ツイン・アルギニン・シグナルのいずれも、この位置にフェニルアラニンを含まず、ただ１つだけ（シロイヌナズナP29）がツイン・アルギニン・モチーフの次の第４残基としてリシンを含んでいる。これら高度に保存された特徴の正確な役割は不明である。フェニルアラニン残基は、ロイシンによって置換され得るが、過度の影響なしにアラニンによって置換されることはなく、フェニルアラニンの側鎖というより、むしろ疎水性が重要な決定基であり得ることを示す。同様に、リシン残基の置換は排出を阻害しない（Robinson and Bolhuis, 2001）。
【００２０】
TAT排出系の新規性の故に、TAT排出系は、未だに蛋白質発現のため、またはその他バイオテクノロジーの用途のために活用されていない。しかし、本発明によって、TAT経路は、バクテリア内での蛋白質分泌のための既存技術（例えば、Sec経路を介して）に関連した限界を克服する潜在性を提供することが示される。TAT経路を介して排出される蛋白質は、限定された一連の折り畳みアクセサリ・ファクターを含んでいる周辺質と比較すると、未変性蛋白質構造の形成を助けるための、より広範な機序を提供する細胞質で折り畳みを行なう。重要なことに、上に述べられたように、TAT経路は、共同因子を含んでいるか、または、折り畳みの間に結びつかなければならず、従って、sec経路を介して個別に排出されることがない複数のサブユニットから成る、複合蛋白質の排出のための唯一の生理学的経路を代表する（Robinson 2000）。恐らくはTatABC転座複合体の直径が大きいため、TAT経路を介した排出が、蛋白質のチャネル内での詰まり、または細胞毒性効果につながるという周知の事例はない。sec経路を介した分泌はATPの消費という結果を招くのに対して、TAT排出はΔpHにのみ依存し、従って、細胞を排出する力はより小さい（Musser and Theg 2000）。最後に、TAT特異的排出に関連する種々の折り畳みに関する考察及びより低い毒性によって、蛋白質ディスプレイのためのTAT経路の利用は、組み合わせライブラリで発現されるポリペプチドの多様性を拡大できることが示唆され、この事実はまた、機能的に優れた蛋白質変異体の単離にも適用すべきである。
【００２１】
TAT経路を介したジスルフィド結合を通常含んでいる蛋白質の排出は１つの問題を提起する。TAT経路は、通常既に折り畳まれた蛋白質を基質として受け取る。しかし、細胞質は高度に還元性なため、ジスルフィド結合をそれらの未変性の状態で含んでいる蛋白質は、折り畳みが行われず、従って、TAT経路を介した排出のための基質として受け取ることは不可能である。事実、これまでの広範な研究によれば、折り畳みのためにジスルフィド結合を必要とする蛋白質は、TAT経路を介して排出されないことが示されている（Stanley et al., 2002）。
【００２２】
従って、TAT経路を通じた分泌のために細胞質を酸化性状態に変化させる必要がある。通常、バクテリアの細胞質は、蛋白質内でのジスルフィド結合形成を強力に抑制するグルタチオン及びチオレドキシンのような還元性成分の存在のために、還元状態に維持される（Ritz and Beckwith, 2001）。Bessetteらによるこれまでの研究の結果、ジスルフィド結合の効果的な形成を可能にする高度に酸化性な細胞質を有するバクテリア株が設計されるに至った（Bessette et al., 1999）。
【００２３】
Bessetteらによって示されるように、大腸菌は、２つの主要なチオール還元系：チオレドキシン及びグルタチオン-グルタレドキシン経路のうちのいずれかの存在下で好気的成長に依存している。チオレドキシンとグルタレドキシンの両方が、それぞれチオレドキシン・レダクターゼ（TrxB）及びグルタチオンの働きによって還元状態に保たれる。グルタチオンは、gshAおよびgshB遺伝子産物によって合成される。gor遺伝子の産物である酵素グルタチオン・オキシドレダクターゼは、酸化されたグルタチオンを還元し、グルタチオン-グルタレドキシン系の触媒回路を完成するために必要である。これらチオール還元経路の両方が、trxB gorまたはtrxB gshA 二重変異体での突然変異によって除去された場合、細胞は極度にゆっくりと成長した。しかし、これらの細胞は、還元体DTTを成長培地へ添加することによって回復可能である。trxB gorまたはtrxB gshA株をDTTを含んでいる培地で成長させ、その後DTTを欠いた培地に移した場合、細胞質はtrxB gor株の場合よりも一層酸化性になった。DTTの存在下で成長させた場合でさえも、trxB gshA及びtrxB gor株の両方は、成長の速い誘導体を高い頻度で生み出した。これらの株のtrxB、 gshA、及びgor対立遺伝子は非復帰無発現変異であり、成長の速い誘導体は、遺伝子外抑圧突然変異から生じなければならない。
【００２４】
続いて、これら成長の速い誘導体は、アルキル・ヒドロペルオキシダーゼ（ahpC）遺伝子の遺伝子外抑圧突然変異を集積したことが判定された。その結果生じるahpW対立遺伝子は、細胞質内のジスルフィド結合形成を損なうことなく通常の（非還元性）培地で効率的な成長を可能にする。従って、trxB、gor ahpW突然変異体株（大腸菌DR473またはFA113など）は、細胞質内のジスルフィド結合形成を助ける能力を示し、栄養分のある培地と最小培地の両方で対応する野生型株DHB4と同様によく成長することもできる。本明細書に述べられた研究で、大腸菌DR473-Aは、周辺質のオキシダーゼdsbAを不活性化する突然変異も含んでいる。加えて、DR473-Aは、DR473のDsbB 誘導体である。DsbBは、通常DsbAの酸化体としてはたらき、いずれかの酵素を欠いた突然変異体は、細胞周辺腔の蛋白質の酸化で損傷を受ける。そうした突然変異体は、周辺質内ではなく、細胞質内にジスルフィド結合を形成することができる。
【００２５】
本明細書で開示されるのは、大腸菌トリメチルアミンＮ酸化物レダクターゼ（TorA）Tat特異的シグナル配列と複数のジスルフィド蛋白質をコードする種々の遺伝子の間の転写融合である。これらの蛋白質には：（ａ）一次配列に連続する２つのジスルフィド結合を含んでいる大腸菌アルカリ・ホスファターゼ（PhoAは、sec経路分泌及びin vivoでのジスルフィド結合形成のための共通のレポーターである。）；（ｂ）４つの分子内及び１つの分子間ジスルフィド結合を含んでいる抗ジゴキシン抗体断片（Fab）；（ｃ）合計９つのジスルフィド結合を持つクリングル2及びプロテアーゼ・ドメインから成るヒト組織プラスミノゲン・アクチベータの切断型（vtPA）；そして、（ｄ）大腸菌チオレドキシンの変異体（TrxA）などがある。後者の蛋白質は、酸化性株DR473の細胞質で発現し、TAT経路を介して排出される場合、周辺質内で一般的な酸化体としての機能を果たせることが示されている。この場合、細胞質で予め酸化され、TAT経路を介して周辺質へ分泌されたTrxAは、細胞周辺腔でのジスルフィド結合の形成のための通常の経路が欠けているdsbB突然変異体を補完することができる。予め酸化されたチオレドキシン変異体の排出は、バクテリアの周辺質に酸化体を提供し、従って、酵素DsbA及びDsbBのような通常の周辺質バクテリア酸化体の欠失によって引き起こされる欠陥を修復するためにはたらく。酸化されたチオレドキシンによって修復されるDsbAまたはDsbB突然変異体の欠陥には、細胞運動性、最小培地での成長、及び線状ファージによる伝染性などがある。
【００２６】
本発明の１つの態様で、バクテリア細胞内に複数のジスルフィド結合を含んでいる生物学的に活性な異種ポリペプチドを産生するための方法が提供される。この方法によって産生される異種ポリペプチドは、最大17個までのジスルフィド結合を含んでいてもよく、上記ポリペプチドは、バクテリアから分泌されることも可能である。さらに、上記ポリペプチドは、バクテリア細胞の培養上清である周辺質から単離されてもよく、あるいは、内在性膜蛋白質である。上記方法は、初めに異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路を通じて蛋白質排出を指示するリーダー・ペプチドを配置する発現カセットを作製するステップと、その後酸化性細胞質を有する大腸菌FA113または大腸菌DR473のようなバクテリア内で異種ポリペプチドを発現させるステップとを含んでいる。
【００２７】
当業者に十分周知の方法を用いて、適切な転写及び翻訳制御シグナルを含んでいる発現カセットまたはベクターを作製することが可能である。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y.に述べられている技術を参照されたい。本発明によるベクターには、プラスミド・ベクター、ウイルス・ベクター及び染色体組込みベクターなどがある。
【００２８】
本明細書に開示される分泌方法は、製薬及びバイオプロセス業界にとって重要な数多くの真核生物蛋白質に適用できる。現在、４つ以上のジスルフィド結合を持つ技術的に重要な蛋白質の産生は、コストが高く複雑であり、ジスルフィド結合の形成に好都合な環境を提供する、より高等な真核生物での発現、または封入体からの再折り畳みのいずれかに依存しなければならない（Hockney, 1994; Geargion and Valax, 1996）。例えば、組織プラスミノゲン・アクチベータ（tPA）は、現在バクテリアの封入体で産生されている。典型的な手順では、上記蛋白質は、種々のカオトロピック剤を用いて封入体から放出され、その後還元剤を利用することによって単離され、再折り畳みが行なわれる。一般に再折り畳みによって、生物学的に活性な物質の収量は低くなる。
【００２９】
本明細書に開示される分泌方法は、複数のジスルフィド結合を持つ複雑な真核生物蛋白質を経済規模で産生する効果的な方法を提供する。さらに、本明細書に開示される方法によって産生される蛋白質は、正しく十分に折り畳まれ、宿主細胞からいったん単離されると、再活性化またはそれに続く処理の必要なしに生物学的に活性である。本明細書で用いられるように、17以上のジスルフィド結合を有する生物学的に活性な分子を生成することも可能であろうが、上記開示される方法によって生成される生物学的に活性な分子は、通常４つ以上のジスルフィド結合を有する分子である。これらのジスルフィド結合は、特定の配向から生じて、未変性蛋白質の正しい折り畳みを促進する。新生形成蛋白質の不適切な配向から生じる複数のジスルフィド結合は、誤った折り畳みまたは生物学的活性の喪失または欠如につながり得る。本発明によって述べられる方法を用いて、複数のジスルフィド結合を含んでいる生物学的に活性なポリペプチドが正しく折り畳まれ、ジスルフィド結合が形成されて三次、及び適切な場合には四次構造を提供し、基質及び／または触媒特性に関して未変性機能活性を有する分子になる。
【００３０】
本発明の方法によって解決される１つの直近の問題は、複数のジスルフィド結合を有する蛋白質が、折り畳まれ、その結果、活性なコンフォメーションで周辺質へ今度は排出可能なことである。複数のジスルフィド結合を有する複雑な蛋白質は、初期のポリペプチドがそれらの未変性コンフォメーションに達することを容易にする折り畳みアクセサリ・ファクターの完全な補完の助けによって細胞質内で折り畳み可能である。その後折り畳まれた蛋白質は、機能的形状で細胞周辺腔または成長培地へ分泌され、従って、封入体に関連する問題を軽減して修復を単純化する。さらに、活性な組み換え蛋白質は、２つのバクテリア・コンパートメント（細胞質及び周辺質）に同時に集積し、従来両方のコンパートメントに活性な形で同時に集積することができなかった数多くの複雑な蛋白質の総収量がより大きくなる。
【００３１】
本発明の別の態様で、蛋白質の酸化を分泌コンパートメントで再構成することができる変異したポリペプチドを識別する方法が提供される。上記方法は、酸化性活性を有する蛋白質をコードする変異されたポリペプチドのライブラリの上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを配置する発現カセットを作製するステップを含んでいる。その後、上記発現カセットは、酸化性
細胞質を有し、周辺質ジスルフィド結合形成経路が損なわれているバクテリア内で発現する。蛋白質の酸化を再構成することができる変異したポリペプチドは、周辺質ジスルフィド結合形成から生じた活性を発現させるバクテリアから単離される。１つの実施の形態で、酸化性細胞質を有し、周辺質ジスルフィド結合形成経路が損なわれている代表的なバクテリアは、大腸菌DR473-Aまたは大腸菌DR473-Bであり、上記変異したポリペプチドは、変異したチオレドキシン１（TrxA）をコードする。
【００３２】
さらに、TAT分泌に関する本発明は、組み合わせライブラリ・スクリーニングでの使用のために活用することができる。現在、ライブラリ・スクリーニングのための蛋白質ディスプレイ技術は、細胞質からのポリペプチド鎖の排出に依存している。これまでのところ、ファージ・ディスプレイ、バクテリア・ディスプレイ、周辺質発現及び細胞数測定スクリーニング(PECS)のようなあらゆる大腸菌ディスプレイ技術が、sec経路を利用して蛋白質分泌を実現している。しかし、sec経路を介した分泌に特有の限界のために、ディスプレイされたライブラリのうちわずかな遺伝子のみが、蛋白質を実際に機能的形状で発現させる。例えば、sec孔に詰まったポリペプチド配列は細胞質内で余りにも速く折り畳みが行なわれるか、または、共同因子の関与を必要とするか、あるいは、細胞質シャペロンの関与が適切に発現することができずに、その結果ライブラリから排除される。sec経路を介した排出のための必要条件によって課される生合成的制限は、Tat経路を用いることによって解消、または少なくとも軽減することができる。これは、ライブラリ内で発現する配列の多様性を増加させる可能性が高く、また、望まれる機能的特性を有する新規な蛋白質の単離を容易にするであろう。
【００３３】
Tat経路を介した排出は、２つの蛋白質ライブラリ・スクリーニング法：ファージ・ディスプレイとPECS（周辺質発現及び細胞数測定スクリーニング）を併せて用いることができる。前者は、現在蛋白質ライブラリ・スクリーニングに最も広く用いられる形式である。他方、周辺質発現及び細胞数測定スクリーニングは、蛋白質が溶解性の形状でバクテリア周辺質で発現して、生物学的表面に繋ぎ止められない唯一のライブラリ・スクリーニング法である（Chen et al, 2001）。周辺質発現及び細胞数測定スクリーニングは、リガンド結合蛋白質を種々のライブラリから単離するための強力で迅速な技術である。簡潔に述べると、細胞周辺腔へ分泌される蛋白質のライブラリを発現させる大腸菌細胞を、標的リガンドの蛍光接合体で培養する。適切な培養条件下で、12 kDaの大きさのリガンドを細胞周辺腔内で、蛋白質の漏出または細胞の生存を損なわずに均衡させる。従って、バクテリア細胞のエンベロープは、透析バッグとして効果的に機能し、遊離リガンドでなく、蛋白質:蛍光-リガンド複合体を選択的に保持する。その後、より強い蛍光をディスプレイする細胞を流動細胞計測法によって単離する（Chen et al, 2001）。
【００３４】
周辺質発現及び細胞数測定スクリーニングのただ１つの必要条件は、蛋白質が周辺質に局在することなので、排出のためにsec経路の代わりにTat経路を用いるのが簡単である。他方、ファージ上の蛋白質ディスプレイと関連した分泌経路を変えることは、より複雑である。蛋白質は、線状ファージ上でファージ蛋白質p3との融合物としてディスプレイされる。p3との融合物は、細胞質から、通常sec特異的pe1Bリーダー配列を用いて分泌される（Hoogenboom et al. 1998）。分泌後、上記p3融合蛋白質は、細胞膜（周辺質側）に存在し（Endeman and Model 1995）、その後、細胞から外膜の孔を通って最終的に押し出される初期ファージ粒子に組み込まれる（Russell 1998）。上記p3蛋白質は、適切な折り畳みに必要であって、そして、通常蛋白質が細胞周辺腔に分泌された後に形成される、４つのジスルフィド結合を含んでいる（Kremser and Rashed 1994）。しかし、Tat経路は、細胞質内で既に未変性に似たコンパクトなコンフォメーションに達した蛋白質を排出する。従って、ファージ・ディスプレイのために用いられる分泌経路を切り替えるために、Tat特異的リーダー・ペプチドをp3融合物のＮ末端に付加するだけでなく、酸化性細胞質を有する株を用いることが必要である。上に述べられたように、FA113のようなtrxB gor ahpC突然変異株の細胞質における酸化的折り畳みは、ジスルフィド結合を有する蛋白質のTat特異的排出の必要条件である。
【００３５】
従って、本発明のさらに別の態様で、当該ポリペプチドのライブラリの上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを包含する発現カセットを作製するステップを含んでいる組み合わせライブラリをスクリーニングする方法が提供される。その後、上記ライブラリは、TAT経路を通じてポリペプチドを発現させ、分泌することによってスクリーニングされる。一般に、上記ライブラリは、大腸菌FA113または大腸菌DR473のようなバクテリア内で発現することができ、そして、上記ライブラリは、周辺質発現及び細胞数測定スクリーニングまたは当業者に十分周知のその他のスクリーニング法によってスクリーニングすることができる。
【００３６】
本明細書で用いられるように、『ポリペプチド』または『当該ポリペプチド』とは、約10個以上のアミノ酸を有するペプチド及び蛋白質を意味する。ポリペプチドが『異種』であるとは、それらが、CHO細胞によって産生されるヒト蛋白質、または哺乳動物細胞によって産生される酵母菌ポリペプチド、またはポリペプチドの未変性供給源でないヒト細胞株から産生されるヒトポリペプチドのように、用いられる宿主細胞と異質であることを意味する。当該ポリペプチドの例には、レニンのような分子、成長ホルモン（ヒト成長ホルモンを含む）、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポ蛋白質、α1-抗トリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンβ鎖、プロインスリン、トロンボポエチン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子（VIIIC因子、IX因子、組織因子及びウィルブランド因子など）、抗凝固因子（Ｃ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性剤など）、プラスミノゲン・アクチベータ（ヒトtPAまたはウロキナーゼなど）、哺乳動物トリプシン・インヒビター、脳由来神経栄養成長因子、カリクレイン、CTNF、gp 120、抗HER-2、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、哺乳動物膵臓トリプシン・インヒビター、抗体、抗体断片、プロテアーゼ・インヒビター、治療用酵素、リンフォカイン、サイトカイン、成長因子、神経栄養因子、インスリン鎖またはプロインスリン、免疫毒素、ボンベシン、トロンビン、腫瘍壊死因子αまたはβ、エンケファリナーゼ、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、ミュラー管阻害物質、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、プロレラキシン、マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド、微生物蛋白質（βラクタマーゼなど）、DNAアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（VEGF）、ホルモンまたは成長因子のレセプター、インテグリン、ＡまたはＤ蛋白質、リウマチ因子、神経栄養因子（ニューロトロフィン-3、-4、-5または-6）、または神経成長因子（NGFβなど）、カルディオトロフィン（心臓肥大因子）（カルディオトロフィン-1など）、血小板由来増殖因子（PDGF）、線維芽細胞増殖因子（αFGF及びβFGFなど）、上皮成長因子（EGF）、形質転換成長因子（TGF）（TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4またはTGF-β5など）、インスリン様増殖因子I及びインスリン様増殖因子II、des-IGF-I（脳IGF-I）、インスリン様増殖因子結合蛋白質、CD蛋白質（CD-3、CD-4、CD-8及びCD-19）、エリスロポエチン、骨誘導因子、骨形成蛋白質（BMP）、インターフェロン（αインターフェロン、βインターフェロン及びγインターフェロン）、コロニー刺激因子（CSF）（例えば、M-CSF、GM-CSF及びG-CSF）、インターロイキン（Il）（IL-1からIL-10など）、スーパーオキシド・ジスムターゼ、Ｔ細胞レセプター、表面膜蛋白質、崩壊促進因子、AIDSエンベロープの一部のようなウイルス抗原、運搬体蛋白質、ホーミング・レセプター、アドレシン、調節蛋白質、gp 120(IIIb)のような抗原、あるいは上に挙げられたいずれかのペプチドの誘導体または活性断片などである。上記ポリペプチドは、未変性または変異したポリペプチドでもよく、そうした哺乳動物ポリペプチドの好ましい供給源には、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、オオカミ及び齧歯類の供給源などがあり、ヒト蛋白質が特に好ましい。以下の実施例は、本発明の種々の実施の形態を説明する目的のために提供されるものであり、いかなる意味でも本発明の限定は意図されていない。
【実施例１】
【００３７】
プラスミドとライブラリ作製
大腸菌チオレドキシン（TrxA）発現プラスミドを以下のように作製した。野生型チオレドキシン１及びdsbA活性部位を有するチオレドキシン１（trx-AdsbA -CPHC-）を、PCRによってそれぞれプラスミドpFA3及びpFA6から（Mossner et al., 1999）プライマーSalI-TrxA-F（5'-ctctcgtcgacatgagcgataaaattattcac-3'）（配列識別番号NO:１）及びR-TrxA-Hind3（5'-ctctcaagcttacgccaggttagcgtcgag-3'）（配列識別番号NO:２）と共に増幅した。これらのプライマーは、SalI及びHindIII制限酵素認識部位をTrxA遺伝子のそれぞれ5'及び3'末端で導入する。PCR増幅断片を、SalI及びHindIII部位でpBAD33（Guzman et al., 1995）へクローニングされたトリメチルアミンＮ酸化物レダクターゼ（TorA）のpBAD33-TorAプラスミド（シグナル配列（初めの150塩基対))へクローニングし、pBAD33-TorA::TrxA及びpBAD33-TorA::Trx-AdsbAを得た。これら２つのプラスミドをテンプレートとして用いて、TorA::TrxA及びTorA::Trx-AdsbA挿入物を、BspHI（NcoI適合）及びHindIII制限酵素認識部位をTrxA遺伝子のそれぞれ5'及び3'末端で導入するプライマーと共にPCRによって増幅した。これらPCR増幅断片を、pTrc99a（Amersham Pharmacia）へNcoI/HindIII部位でクローニングし、pTrc99a-TorA::TrxA及びpTrc99a-TorA::Trx-AdsbAを得た。
【００３８】
TrxA-CXXCライブラリを以下のように作製した。無作為化したオリゴヌクレオチド・プライマーを使ったオーバーラップPCR法を用いてTrxAライブラリをランダム・アミノ酸と共に位置34及び35で作製した（-CXXC-モチーフ）。pBAD33-TorA::TrxAをテンプレートとして用いて、TrxAのＮ末端部分を、プライマーSalI-TrxA-F（5'-ctctcgtcgacatgagcgataaaattattcac-3'）（配列識別番号NO:３）及びN-ovlpTrxA-R（5'-ctctgcccagaaatcgacga-3'）（配列識別番号NO:４）で増幅し、一方、Ｃ末端部分を変異プライマーTrxA-CXXC-F（5'-tcgtcgatttctgggcagagtggtgcNNNNNNtgcaaaatgatcgcccgat-3'）（配列識別番号NO:５）及びR-TrxA-HindI（5'-ctctcaagcttacgccaggttagcgtcgag-3'）（配列識別番号NO:６）で増幅した。両方のPCR増幅断片をオーバーラップPCRのためのテンプレートとしてSalI-trxA-F及びR-TrxA-HindIIIプライマーと共に用いた。このオーバーラップPCRの生成物を、野生型trxAをコードする断片の除去後に、pTrc99a-TorA::TrxAへSalI及びHindIII部位でクローニングし、これによってpTrc99a-TorA::TrxACXXCプラスミド・ライブラリを得た。そのpTrc99a-TorA::TrxACXXCプラスミド・ライブラリをDR473 dsbBへ電気穿孔し、ルリー・ベルターニ（LB）培地プレート上に１mlあたり100μgのアンピシリンと共に培養した。
【実施例２】
【００３９】
運動性アッセイ
初めに単一のコロニーを、M9カゼイン培地（１X M9最小塩類（Sigma, M6030）、0.4％（w/v）グリセロール、0.1％（w/v）カゼイン酵素水解物（Sigma, C0626）、２mM MgSO4、0.05 mg/mlチアミン）で対応する抗生物質と共に37℃で振動しながら１晩培養した。１晩経過した培養物をOD600に基づいて希釈し、約100個の細胞をM9CASEIN運動性プレート（0.3％（w/v）寒天及び適切な抗生物質を添加したM9CASEIN培地）上にプロットした。その後、細胞を37℃で40時間培養した。
【００４０】
運動性を回復させる能力を有するtrxA-CXXCライブラリのクローンをスクリーニングするために、約2000個の抗アンピシリン・コロニーをプールし、１晩M9CASEIN培地で37℃で振動しながら培養した。１晩経過した培養物を希釈し（2 x 10-6）、M9CASEIN運動性プレート上で約100μgのアンピシリンと共に培養した。37℃で36時間培養した後、約3600個の抗アンピシリン・コロニーを得た。個々のコロニーを運動性『ハロー』の有無及び大きさに基づいて選択した。
【実施例３】
【００４１】
アルカリ・ホスファターゼ（PHOA）のTAT特異的排出
大腸菌アルカリ・ホスファターゼ（PhoA）遺伝子を、発現ベクターpBAD33-TorAを用いてTorAリーダー・ペプチドに融合した。その結果生じたTorA-PhoA融合蛋白質を、酸化性細胞質（株DR473-A、図１Ａ、レーン２）と共に株内に産生された場合に周辺質へ排出した。対照的に、還元性細胞質（図１Ａ、レーン１）を有する同質遺伝子親株（株DHB4-A）の周辺質コンパートメント内に測定可能なPhoA蛋白質はなかった。重要なことは、大量のPhoA蛋白質が合成され、DHB4-A及びDR473-A細胞の両方の細胞質に集積されたことである。しかし、細胞質及び周辺質コンパートメントの両方での活性の完全な欠如によって明らかなように、DHB4-Aの還元性細胞質は、PhoAの適切な折り畳みを抑制する（図１Ｂ）。DHB4-Aの細胞質でのPhoAの不完全な折り畳みによって、２つの明確な結果が得られたと考えられる：ｉ）ウェスタン・ブロット上の数多くのより低分子のバンドによって明示されるように、DHB4-A細胞の細胞質において誤って折り畳まれたPhoA蛋白質の著しい分解はなかった（図１Ａ、レーン３）；ii）細胞質内の酸化的折り畳みの欠如によって、PhoAはTAT依存分泌と両立しなくなり、測定可能なPhoA蛋白質（図１Ａ）またはアルカリ・ホスファターゼ活性（図１Ｂ）は、DHB4周辺質画分で観察されなかった。
【００４２】
上の研究で、DHB4-A及びDR473-A突然変異体の両方は、周辺質酸化体dsbAでの突然変異の故に、周辺質蛋白質を酸化することが全くできなかった。従って、DR473-A細胞でPhoA活性を可能にするジスルフィド結合の形成は、細胞質内のみで生じることができる。また、これらのジスルフィドは、TAT経路を通じた排出の間原型のままに保たれた。
【００４３】
図１Ａにおいて、矢印Ａは、原型のままのTorAシグナル・ペプチドを有する前駆蛋白質を示し、矢印Ｂは、シグナル・ペプチダーゼによって除去されるTorAシグナル・ペプチドを有する成熟蛋白質であり、そして、矢印Ｃは、より低分子の分解産物である。GroEL及びDsbCを、それぞれ細胞質及び周辺質分画マーカーとして用いた。GroELが細胞質画分で優性であり、DsbCは周辺質画分で優性であるという観察によって、細胞成分分画がうまく行なわれたことが示される。
【実施例４】
【００４４】
ヒト組織プラスミノゲン・アクチベータ（VTPA）の切断型のTAT特異的排出
PhoAに関して上に概要が説明されたような同様の実験を、TorAリーダー・ペプチドとの融合物として発現するヒト組織プラスミノゲン・アクチベータ（vtPA）の切断型について行なった。tpAの切断型をコードする遺伝子（Bessette et al. 2001）を、pBAD33-TorAでTorAリーダーをコードする配列と融合した。図２に示されるように、TorA-vtPA融合蛋白質が細胞内で還元性細胞質と共に発現する場合（DHBA-4）、非常に低レベルのプラスミノゲン活性がすべての細胞溶解物で観察された。この活性の大部分は周辺質コンパートメントに分画され（図２Ｂ）、DHB4-Aの還元性細胞質内であっても、少量のvtPAが適切に折り畳まれ、従って、TAT経路によって排出可能であることを示唆する。驚くべきことに、同じTorA- vtPAコンストラクトがDR473-A細胞の酸化性細胞質で産生された場合、非常に高レベルのtPA活性が、細胞溶解物全体で観察された（図２Ａ）。細胞成分の分画の際、大部分のtPA酵素活性は周辺質に局在した。注目すべきことに、DR473-A細胞の周辺質画分でのtPA活性は、DHB4-A細胞で観察された活性と比較して極めて高かった（図２Ｂ）。
【実施例５】
【００４５】
抗ジゴキシン抗体断片のTAT特異的排出
ジゴキシンに特異的な抗体の重鎖（Levis et al. 2001）は、アラビノース誘導プロモータを含んでいるpBAD33-TorA発現ベクターのTorAリーダー・ペプチドにイン・フレームで融合した。その融合の概略図を図３Ａに示す。注目すべきことに、上記抗体の抗原結合断片（Fab）は、合計５つのジスルフィド結合、すなわち、重鎖の可変及び定常領域をFabの軽鎖の可変及び定常領域に共有結合させる４つの分子内橋上結合及び１つの分子間橋上結合を含んでいる。このコンストラクトの１つのユニークな特徴は、TAT排出シグナルが、重鎖の可変領域にのみ付加されたことである。従って、活性なFabの周辺質集積は、排出の前にTorA重鎖融合物による軽鎖の補充を必要とした。この方法で、TorA重鎖は、鎖間ジスルフィド橋上結合が初めに細胞質内に形成される場合に限って、周辺質へ軽鎖を『肩車』して運搬する。
【００４６】
PhoA及びvtPAの場合のように、還元性細胞質（DHB4-A）を有する細胞内のTorA-Fab融合蛋白質の発現は、周辺質または細胞質画分のいずれにおいても検出可能なFabには事実上至らなかったことが観察された（図３Ｂ、レーン１及び３）。対照的に、酸化性細胞質（DR473-A）を有する細胞内での同じコンストラクトの発現は、周辺質及び細胞質画分の両方においてFabの集積に至った（図３Ｂ、レーン２及び４）。注目すべきことに、ウェスタン・ブロット分析によって検出されるようなFab蛋白質の大部分は、周辺質コンパートメントに局在した。重要なことは、Fab抗体の存在を、マウス軽鎖配列を認識する一次抗体を使って調べたことである。従って、図３Ｂに見られるバンドによって、軽鎖が重鎖によって適切に補充され、細胞周辺腔へ送られたことが確かめられる。また、図３には、細胞質マーカー蛋白質GroEL及び周辺質マーカー蛋白質DsbCの局在も示された。細胞質及び周辺質内それぞれでの上記２つのマーカー蛋白質の局在は、細胞成分の分画がうまく行なわれたことを示している。
【００４７】
図３Ｃに示されるELISAのデータは、Fab活性がDR473-A細胞のみで検出可能であり、同質遺伝子親株DHB4-Aでは検出されないことを明らかに示している。さらに、Fab活性の大部分は周辺質画分と関連しており、その結果抗体断片のTAT特異的排出が確かめられた。
【実施例６】
【００４８】
変異型チオレドキシン（VTRXA）のTAT特異的排出
以下の実施例は、TAT分泌経路の利用がいかにして酸化性細胞質から周辺質蛋白質への酸化性等価物の運搬（ジスルフィド結合）運搬を可能にするかを示すものである。バクテリアの鞭毛の集合は、周辺質内のジスルフィド結合を形成する能力が損なわれた突然変異細胞内で（すなわち、dsbAまたはdsbB突然変異体で）バラバラにされる。これは、鞭毛構造に組み立てられて適切に機能するためには、鞭毛Ｐリング蛋白質（FIgI）がジスルフィド結合を必要とするからである（Dailey and Berg, 1993）。この表現型は、細胞が運動性プレート上で培養される場合に容易に理解できる。図４Ｂに示されるように、DR473細胞は運動性プレート上で大きな運動性『ハロー』を示すのに対して、dsbBを欠失したDR473-B細胞は非運動性である（図４Ａ）。
【００４９】
TorAシグナル配列との融合による野生型チオレドキシン１（TrxA）の周辺質へのTAT依存排出は、酸化性細胞質及び損なわれた周辺質ジスルフィド結合形成経路（DR473 dsbB）の両方を有する株で発現する場合、運動性を回復できなかった（データ示さず）。TrxAのより酸化性である変異型（vTrxAPH）のTAT特異的排出もを回復できなかった（データ示さず）。-Cys-Gly-Pro-Cysモチーフ内のジペプチド配列Ala-Hisをチオレドキシン活性部位へ導入することによって、チオレドキシン１のより酸化性である変異型（vTrxAPH）を作製した。Gly-Proの代わりとしてAla-Hisへ置換することによって、チオレドキシンの酸化還元電位は増加する（Marin, 1995）。
【００５０】
蛋白質活性部位（-CXXC-）のランダムアミノ酸を有するTrxAのライブラリを上に述べたように作製し、TorAシグナル配列と融合した。活性部位配列Cys-Ala-Cys-Cys（配列識別番号NO:７）を含んでいる1つの突然変異体チオレドキシンを単離した。このtrxA変異型（vTrxAAC）は、酸化性細胞質を有する株で産生すると、部分的に運動性を回復することができた（図４Ａのコントロール株DR473-Bと比較した図４ＣのDR473-B）。推定されるように、vTrxAACは、細胞質での最適な酸化のために、そして、周辺質でいったんそのジスルフィドを蛋白質へ運搬するために適した酸化還元電位で均衡するのであろう。特に、TorAシグナル配列のvTrxAACとの融合は、還元性細胞質を有する同質遺伝子株（MC1000 dsbB）で発現し、運動性は回復しなかった（図４Ｄ）。これらの結果により、酸化性細胞質は、酸化還元等価物（ジスルフィド結合）をTAT経路を介して周辺質へ運搬することが必要なことが示される。図４Ｅにより、変異型TrxA（vTrxAAC）が酸化性細胞質から細胞周辺腔へ排出されることが確かめられる。レーン３の下方のバンドは染色体の複製から発現したw t TrxA蛋白質に相当する。同質遺伝子型trxA突然変異体DR473にはこの下方のバンドがない（レーン２及び４）。
【実施例７】
【００５１】
組み合わせライブラリ・スクリーニングにおけるTAT分泌の利用
組み合わせライブラリ・スクリーニングでTAT分泌経路を活用するため、突然変異させた１群の遺伝子を、Tat特異的リーダー・ペプチドで発現することができる。特に、scFv抗体は、免疫化動物から作製されたものか、または未変性免疫レパートリーの代表的なもののいずれかである抗体の組み合わせライブラリから単離することができる。PCRを用いて、IgG重鎖及び軽鎖をscFvsへ構築し（Hoogenboom et al. 1998）、周辺質発現及び細胞質スクリーニング（PECS）またはファージ・ディスプレイに好適な、または微生物での発現を必要とするその他の組み合わせライブラリ・スクリーニング形式に好適なベクターへ挿入した。スクリーニング完了後、２つの抗体のそれぞれと結合して、Tatで発現するスクリーニング・ライブラリに誘導されるクローンの配列を決定し、リガンド結合クローンのアミノ酸配列を特定する。
【００５２】
従って、本発明は、１つの実施の形態において、バクテリア細胞内に少なくとも１つのジスルフィド結合を有する少なくとも１つの生物学的に活性な異種ポリペプチドを産生する方法に関するものであり、上記方法は：異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流でツイン・アルギニン転座経路を通じて蛋白質排出を指示するリーダー・ペプチドを配置する発現カセットを作製するステップと；そして、バクテリア内で上記発現カセットを発現させるステップにおいて、上記異種ポリペプチドが生物学的に活性な形状で産生されることを特徴とするステップとで構成される。一般に、この方法によって産生される異種ポリペプチドは、約２から約17のジスルフィド結合を含んでいる。この方法を用いて、少なくとも１つのジスルフィド結合によってつながれる２個の異種ポリペプチドを産生することができる。特定の実施の形態で、上記リーダー・ペプチドは、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIで構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来する。さらに、上記リーダー・ペプチドは、大腸菌TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD及びYaeIの相同物で構成される群から選択される蛋白質をコードする遺伝子に由来する。この方法の１つの実施の形態で、上記バクテリアは酸化性細胞質を有する。この方法において有用である代表的なバクテリアには、大腸菌trxB突然変異体、大腸菌gor突然変異体及び大腸菌trxB gor二重変異体などがある。一般に異種ポリペプチドは、バクテリア細胞から分泌されるか、バクテリア細胞の周辺質から単離されるか、または内在性膜蛋白質である。オプションとして、異種ポリペプチドは、バクテリア細胞の培養上清から単離される。一般に、この方法によって産生される異種ポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドである。例えば、哺乳動物ポリペプチドは組織プラスミノゲン・アクチベータまたは抗体断片でもよい。異種ポリペプチドは、未変性コンフォメーションのポリペプチド、突然変異させたポリペプチド及び切断されたポリペプチドでもよい。
【００５３】
本発明は、分泌コンパートメント内の蛋白質酸化を再構成することが可能な突然変異したポリペプチドを識別する方法にも関するものであり、上記方法は：酸化活性を有する蛋白質をコードする突然変異ポリペプチドのライブラリを生成するステップと；突然変異ポリペプチドの上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを配置する発現カセットを作製するステップと；酸化細胞質及び損なわれた周辺質ジスルフィド結合形成経路を有するバクテリア内で発現カセットを発現させるステップと；バクテリアでの周辺質ジスルフィド結合形成から生じるバクテリア活性を測定するステップと；そして、周辺質ジスルフィド結合形成から生じる活性を発現させるバクテリア細胞を回収するステップにおいて、回収されたバクテリアで発現する突然変異ポリペプチドが分泌コンパートメント内で蛋白質酸化を再構成することが可能なことを特徴とするステップとで構成される。
【００５４】
本発明は、組み合わせライブラリをスクリーニングするための方法にも関するものであり、上記方法は：当該ポリペプチドのライブラリを生成するステップと；ポリペプチドの上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを配置する発現カセットを作製するステップと；バクテリア内で発現カセットを発現させるステップと；そして、発現した分泌ポリペプチドをスクリーニングするステップとで構成される。本技術分野の当業者であれば、いずれかの有用な技術によって発現した分泌ポリペプチドをスクリーニングすることが可能であろうが、代表的な技術には、周辺質発現、細胞数測定スクリーニング及び／又はファージ・ディスプレイなどがある。一般に、本発明において有用なポリペプチドは、約２から約17のジスルフィド結合を有する抗体断片のような哺乳動物のポリペプチドである。
【００５５】
本発明は、組み合わせライブラリをスクリーニングするための方法にも関するものであり、上記方法は：当該ポリペプチドのライブラリを生成するステップと；ポリペプチドの上流でツイン・アルギニン転座経路に特異的なリーダー・ペプチドを包含する発現カセットを作製するステップと；酸化性周辺質を有するバクテリア内で上記発現カセットを発現させるステップと；そして、バクテリア内でのポリペプチドの発現をスクリーニングするステップとで構成される。一般に、上記ポリペプチドは哺乳動物のポリペプチドである。本発明で有用なバクテリアは、trxB遺伝子に突然変異を有することができる。本発明で有用なポリペプチドは、約２から約17のジスルフィド結合を含んでいてもよい。
【実施例８】
【００５６】
バクテリアの株、培養及び誘導条件
用いたバクテリアの株及びプラスミドを表１に記載する。APの排出をモニターするために、LB培地で１晩培養した細胞を、0.2％グルコース、１μg/mlビタミンＢ１、１mM MgSO4、50μg/ml 18アミノ酸（メチオニン及びシステインを除く）を添加したM9塩類で100倍の希釈度で継代し、その後30℃で培養した。scFv及びFab抗体断片の発現のために、１晩経過した培養液から新鮮なLB培地（５％ v/v）へ細胞を継代し、その後30℃で培養した。蛋白質合成は、細胞がOD600−0.5に達した時にIPTGを最終濃度0.1 mMまで加えることによって誘導した。適切な場合には、pBAD-ΔssDsbCからのDsbCの共発現を0.2％アラビノースを用いて誘導した。抗生物質の選択は、プラスミドのすべてのマーカーに対して以下の濃度を維持した：アンピシリン、100μg/ml；クロラムフェニコール、25μg/ml；カナマイシン、50μg/ml；及びスペクチノマイシン、100μg/ml。
【００５７】
【表１】
2005520569.tif 000002
【実施例９】
【００５８】
酵素活性アッセイ
APを発現させる細胞を誘導から３時間後に回収し、上記のような100 mMヨードアセトアミドで処理し、遠心分離によってペレット化し、そして、冷却浸透圧衝撃法によって分画した（Sargent et al., 1998）。可溶性蛋白質を、標準としてのBSAを使って、Bio-Rad活性アッセイによって定量化した。AP活性及びβガラクトシダーゼ活性のアッセイを先に述べたように行なった（Derman et al., 1993）。≧95％のβガラクトシダーゼ活性が細胞質画分に見られた分画実験からのデータのみを報告する。試料を初めにヨードアセトアミドで処理したことを除き、APのトリプシン抵抗性を先に述べたように評価した（Sone et al., 1997）。
【００５９】
ELISAをLevy et al., (2001)に準じて行なった。ウェスタン・ブロット法を先に述べたようにChen et al. (2001)に従って行なった。
【実施例１０】
【００６０】
アルカリ・ホスファターゼは、酸化性細胞質を有する株のみでTATを介して排出されることが可能である
バクテリア内で、チオレドキシン及びグルタレドキシン経路は、蛋白質チオールの酸化を強力に忌避する、高度に還元性な状態に細胞質を維持する（Ritz and Beckwith, 2001）。この理由のために、ジスルフィド結合を必要とする蛋白質は、より酸化性な環境へ排出されなければならない。アルカリ・ホスファターゼ（AP）は、通常Sec特異的リーダー・ペプチドを介して細胞周辺腔へ分泌され、そこでアルカリ・ホスファターゼは、DsbAによって急速に酸化され、蛋白質の安定性と触媒作用に不可欠である、その２個のジスルフィド結合を形成する（Sone et al., 1997）。これまでの研究により、APのTat特異的リーダー・ペプチドとの融合物は、Tat経路を介して排出されるのではないことが示された（Berks, 1996: Kebir and Kendall, 2002; Reinartz et al., 1998; Sambasivarao et al., 1990; Stanley et al., 2002）。本発明者等は、AP融合物がTat経路を介して排出されないのは、そうした蛋白質は、ジスルフィド結合の形成を妨げる強力な還元性状態に維持されている細胞質内で通常折り畳まれていないという事実によるものではないかと推論した。これを詳しく調べて、折り畳みとTat排出能の関係を検討するために、本発明者等は、細胞質内でのジスルフィド結合の形成が可能である大腸菌突然変異体、または逆に周辺質内で蛋白質の酸化を無効にする大腸菌突然変異体の有用性を利用した。
【００６１】
Beckwith及び同僚ら（Bassette et al., 1999）は、APがそのシグナル配列なしに、大腸菌DR473（trxB gor ahpC）のような酸化性突然変異体株の細胞質内で発現する場合、ジスルフィド結合が容易に形成され得ることを示した。便宜上、この株のバックグラウンドは、細胞質と周辺質の両方が酸化性なので、C:ox/P:oxと称する（図５）。dsbA誘導体において、周辺質の蛋白質酸化が損なわれる（Belin and Boquet, 1993）。従って、DR473のdsbA誘導体をC:ox/P:redと称する。DR473のdsbA細胞において、AP内のジスルフィド結合形成は、細胞質内でのみ生じることが可能である。
【００６２】
Tat経路を介する排出を指示することが示されている１連の８つのリーダー・ペプチドはAPと融合し、DHB4、DR473、DR473 dsbA、そして最終的にDR473 tatB::kan及びDR473 tatC::specで発現する。後者２つの株のバックグラウンドにおいて、tatBまたはtatCの突然変異不活性化は、Tat経路を通じた排出を損なうと予測されている。細胞を最小培地で培養し、APの細胞成分分布を判定した。細胞回収後、細胞試料を100 mMヨードアセトアミドで処理し、浸透圧衝撃による分画の間のジスルフィド結合形成を回避し、その後、細胞質及び周辺質画分でのAP酵素活性を判定した。分画の間の細胞質コンポーネントの漏出の程度は、βガラクトシダーゼ活性及びGroELの細胞成分分布によって判定され、５％未満であった（ウェスタン・ブロット法による検出）。
【００６３】
融合蛋白質を、活性なAPの形成が厳密に酸化性細胞質に依存しているかどうかに基づいて２つに分類した（表１）。Tatリーダー・ペプチドの第１のクラス（クラスＩ：ssFdnG、ssFdoG、ssHyaA、ssTorA）は、C:ox依存及びTat依存でAPを周辺質へ排出することがわかった。換言すると、周辺質でのAP活性の集積は、酸化性細胞質と原型のままのTat機構の両方を有する株でのみ生じる。特に、クラスIリーダーが、還元性細胞質を有する（すなわち、C:red/P:oxである）親株DHB-4で発現した場合、バックグラウンドAP活性のみが観察された。しかし、C:ox株において、AP活性のかなりの画分（全体の25-50％）が周辺質に見られた。重要なことに、周辺質AP活性はDsbAに依存せず、従って、C:ox P:red細胞（すなわち、DR473 drbA内）と比較すると、C:ox/P:ox細胞内におけるのと実質的に同じであった。この発見により、APの酸化は、排出に先立って細胞質内のみで生じることが示される。周辺質内での活性蛋白質の集積は、完全に排出を阻止することが知られている置換である、リーダー・ペプチドのシグニチャーRRモチーフがKK配列に変更された場合に停止した。同様に、C:ox P:ox株でのtatBまたはtatCのいずれかの不活性化は、周辺質でのAP酵素活性のほぼ完全な喪失を招き、一方、細胞質活性は実質的に変化しなかった。４つのクラスITatリーダー・ペプチドのうちの１つ（ssHyaA）に関して、排出はtatB株で部分的にのみ阻害された。
【００６４】
図６Ａ−Ｃは、種々の株バックグラウンドにおける、１つのクラスIリーダー・ペプチド融合物であるssFdnG-APの細胞成分分布を示す。C:ox株バックグラウンドでのtatCの不活性化は、低レベルの細胞質融合蛋白質という結果に至った。同様に、より少量のssFdnG-AP融合物がC:red細胞の細胞質で観察された。ssFdnG-AP前駆物質に対応する、より高分子量の種は、４−20％アクリルアミド濃度勾配ゲルで分析することができよう（図８Ｄ）。このHMW種は、リーダー・ペプチドにトリプシン感受性部位が存在するので、トリプシンで培養することによって成熟蛋白質と同一の電気泳動度を有するバンドに処理することができるであろう（Kebir and Kendall, 2002）。上記成熟蛋白質は、完全長OmpAの消滅を招く条件下でトリプシンに対する完全な抵抗性を有した（図６Ｄ）。さらに、APの未変性で、完全に酸化された形状のみがトリプシン抵抗性であるというSone et al, (1997)の観察と一致するこれらの研究において、AP酵素活性が全く消失しないことが明らかにされた。
【００６５】
８つのTatリーダー・ペプチドのうちの４つ（クラスII；ssDmsA、ssSufI、ssYacK及びssYcbK）は、wt株DHB4（C:red/P:ox）で高いAP活性を示した。さらなる分析によって、クラスIIのリーダー・ペプチドは、Tat及びSec経路の両方に関与できることが示された。特に、Sec経路に関与する能力は以下によって明らかであった：（ｉ）dsbA+細胞に対するdsbA突然変異体での周辺質AP活性の著しい減少によって明らかであった（DHB-4 (C:red/P:ox)とDHB-4 dsbA(C:red/P:red)を、そしてまた、DR473 (C:ox/P:ox)とDR473 dsbA (C:ox/P:red)を比較されたい）。４個のクラスIIリーダー・ペプチドのすべてについて、dsbA突然変異株での周辺質AP活性のレベルは同質遺伝子型dsbA+大腸菌で得られたレベルのおよそ60％であった。（ii）tatBまたはtatC突然変異体における著しい周辺質AP活性の出現。（iii）やはり42℃にシフトされたwt細胞と比較した、複製を許容しない42℃の温度へのシフトアップの後のsecA条件的突然変異体（株MM52 secA5I(ts)、C:red/P:ox）におけるAP活性の喪失（Tullman, DeLisa, Kawarasaki and Georgiou による近刊の稿本）。クラスIIのリーダー・ペプチドがTat経路にも関与する能力は、Dr473 dsbA (C:ox/P:red)細胞の周辺質画分における高いAP活性の存在によって明示される。
【実施例１１】
【００６６】
抗体断片のTAT排出
APに加えて、クラスIリーダー・ペプチドは、C:ox株の細胞質からの細胞内及び細胞間ジスルフィド結合を有するその他の蛋白質排出を媒介することができるであろう。単鎖抗体（scFv）は、２つの細胞間ジスルフィド結合を含んでおり、１つはVH、もう１つはVl鎖にある。26-10抗ジゴキシンscFc（Levy et al., 2001）をクラスITatリーダー・ペプチドであるssTorAと融合し、C:ox/P:ox細胞の細胞周辺腔内での抗原結合蛋白質の集積をELISAによってモニターした（図７）。ほぼ45％のジゴキシン結合活性が細胞周辺腔に局在した。周辺質内の活性な抗ジゴキシンscFv抗体の集積はDR473 dsbA (C:ox/P:red)では影響を及ぼさなかったが、tatC突然変異体でのバックグラウンド・レベルを減少させた。
【００６７】
FAB抗体は、重鎖（VH-CH1）及び軽鎖（Vl-Cl）が分子間ジスルフィド結合によって結合されているヘテロ二量体蛋白質である。加えて、FAB蛋白質はさらに４つの鎖内ジスルフィド、すなわち、重鎖及び軽鎖内にそれぞれ２つずつを含んでいる。軽鎖（Vl-Cl）に続くssTorA-VH-CH1融合物をコードする遺伝子から成るジシストロンのオペロンを作製した（図８Ａ、Levy et al., 2001）。このコンストラクトにおいて、軽鎖はリーダー・ペプチドを含まず、従って、細胞質から自然には排出されない。DR473 dsbA（すなわち、C:ox/P:red）における蛋白質合成の誘導によって、少量ではあるが、有意な量の軽鎖ポリペプチドの浸透圧衝撃画分での集積に至ることがわかった。FAB軽鎖に特異的な抗マウスIgG F(ab')2抗体を用いたウェスタン・ブロット分析によって、透圧衝撃画分でのVl-Clの強度は、細胞質内での強度の約15−20％であることが示された（データ示さず）。軽鎖とFAB蛋白質のいずれも、tatC突然変異株の透圧衝撃画分内またはDHB4 dsbA (C:red/P:ox)細胞からは検出されなかった。
【００６８】
重鎖と軽鎖を予め会合することがTat経路を介した分泌に必要とされる場合、正しく折り畳まれたFABの収量を高める条件によって、排出効率を増加することができる。trxB gor aphC突然変異体（DsbCのaraプロモーターからの共発現を可能にするため、C:ox株FA113をこれらの研究で用いた）の周辺質で発現する抗ジゴキシンFABの収量は、周辺質ジスルフィド・イソメラーゼDsbC（ΔssDsbC）のシグナル配列を持たない型が発現する際に著しく増加する（Levy et al., 2001）。この仮説と一致して、ΔssDsbCを共発現させる細胞で、浸透圧衝撃画分における軽鎖バンドの強度は、細胞質での70％であった（上に言及されたように、ΔssDsbCなしでの15−20％と比較して）。FABジゴキシン結合活性の同様な分配をELISAによって検出した（図８Ｃ）。FA113 tatC::spec株において、FABは周辺質画分で全く検出されず、細胞質に残存する蛋白質量の著しい減少も観察された。本発明者等は、tat遺伝子の欠乏が、しばしば細胞質内のTat基質蛋白質の不活性化または分解を招くことを観察してきた（Angelini et al., 2001; Santini et al., 2001）。同様に、軽鎖蛋白質またはFAB結合活性は、大腸菌DHB4（図８Ｂ及び図８Ｃ）あるいは、ssTorAのRRジペプチドがKKによって置換された場合に全く検出されなかった。
【００６９】
最後の実験として、ハプテン・ジゴキシンと結合可能な機能性FAB蛋白質がin vivoで形成されることが示された。大腸菌を高張液（5X PBS）で培養すると、周辺質蛋白質は細胞から漏出することができないのに対して、蛍光リガンドは周辺質内で均衡可能なほどに外膜透過性が増大する（Chen et al., 2001）。蛍光リガンドを結合させる細胞は、従って、流動細胞計測法によって検出することが可能である。ssTorA-VH-CH1及びVl-Clを発現させ、ジゴキシン-フルオレセイン複合体と共に培養されるC:ox/P:ox細胞は、コントロール細胞（C:red/P:ox、図８Ｄ）と比較して細胞蛍光発光の著しい増加を示した。無処置細胞におけるin situでのジゴキシン結合活性の検出は、FAB蛋白質でのジスルフィド結合形成が細胞分画の間に起きていたという可能性をさらに排除する。
【実施例１２】
【００７０】
考察
Tat経路を、脂質二重層膜を通り抜ける蛋白質転座のその他すべての形態から傑出したものにしているその顕著な特徴は、二次、または恐らくは三次構造で安定度が既に想定されているポリペプチドを排出する能力である。細胞質または細胞周辺腔で酸化的蛋白質折り畳み選択性を遺伝子的に促進するその能力によって、本発明者等は：（ｉ）共同因子を含んでいない、そして、（ii）十分に特徴づけされた折り畳み動力学を示す、蛋白質の排出能のための必要条件を調べることができた。
【００７１】
細胞質内でのジスルフィド結合形成を可能にする突然変異株及びそれらのdsbA誘導体である、wt大腸菌の周辺質画分におけるAP集積の比較によって(表２）、８つのリーダー・ペプチドすべてについて、細胞質での酸化的折り畳みがTat排出の前提条件であることが明らかになった。Soneらは、Cys-168-Cys-178ジスルフィドを欠失している部分的に酸化されたAPは蛋白質分解性に関して不安定であり、そして、DegPによってin vivoで速やかに分解されることを示した（Sone et al., 1997）。従って、われわれの研究における（degP+株バックグラウンド）AP融合物の安定な周辺質集積、そして浸透圧衝撃画分におけるssFdnG-APのAPドメインのトリプシン安定性（図６Ａ−Ｄ）によって、AP融合物の排出される形状は、完全に酸化されなければならないことが示される。これらの検討材料に基づいて、Tat孔は、完全に酸化され、未変性ジスルフィド結合を含んでいるAPを転位することができるという結論に達した。上記蛋白質が二量体として排出されるのか、あるいは、酸化されて折り畳まれた単量体の会合は細胞周辺腔への転座に続いて生じるかどうかについて確かめることはできなかった。但し、in vitroでは、二量化はＡＰの折り畳みでのゆっくりとしたステップを表わすとはいえ（Walker and Gilbert, 1994）、後者のメカニズムがより妥当であると思われる。
【００７２】
【表２】
2005520569.tif 000003
すべてのシグナル配列は、イン・フレームで大腸菌AP（Δ1-22）と融合し、その融合物はベクターpTrc99Aに挿入された（Experimental Procedures参照）。
*細胞を回収直後に100 mMヨードアセトアミドで処理し、次のサンプリング・プロセス中のジスルフィド結合形成を防止した。AP活性は、25℃でｐH8.0で加水分解されたp-ニトロフェニル・フォスフェイト（μmol）の１分あたりの量として計算した。AP活性の報告された数値は、２つの独立した研究（ｎ＝６）からの３つの個別の測定の平均値である。標準誤差は、報告されたすべてのデータの10％未満である。括弧内の値は、周辺質画分内の酵素活性全体のパーセンテージを示す。
a：未変性リーダー・ペプチド内でΔ2-20を有するAP、b：リーダー・ペプチドはＣ領域正電荷を運ぶ、nd：検出不能。
【００７３】
８つのうち４つのリーダー・ペプチド（クラスＩ：ssFdnG、ssFdoG、ssHyaA、ssTorA）について、排出は以下の事実によって明らかにされるように、専らTat経路を介して生じる：（ｉ）浸透圧衝撃画分のAP酵素活性はDsbAの存在または非存在によって影響を受けない；そして、（ii）排出は、KKによる、リーダー・ペプチド内、tatC突然変異体内、そして、ssHyaA以外のtatB突然変異体内での不変異体RRの置換によって完全に除去される。ヒドロゲナーゼの排出におけるTatBの役割は、一部議論の対象になってきた（Walker and Gilbert, 1994）。TatBは、非生理学的基質コリシンの排出には不要であり（Ize et al., 2002）、また、TatBの植物相同体であるHcfl06も、酸素放出複合体の葉緑体16-及び23-KDaサブユニットの分泌にとって不可欠ではないことが報告されている（Roy and barkan, 1998）。
【００７４】
クラスIリーダー・ペプチドとのAP融合物を発現させる細胞において、細胞溶解物中の約26％（ssTorAの場合）から約60％（ssHyaAの場合）の酵素活性総量が、周辺質画分に見られた。観察されたAP排出の効率は、未変性Tat基質、及び異種蛋白質とのTat融合物に典型的である（Thomas et al., 2001; Stanley et al., 2002; Angelini et al., 2001; DeLisa et al., 2002; Yahr and Wickner, 2001）。上に述べられたように、実際にTat輸送体が、酸化された単量のAPを優先的に排出するのであれば、細胞質内に残存する酵素的に活性な蛋白質は、排出と両立しない二量化蛋白質を表わすであろう。加えて、種々の量の不活性で、排出不能なAPの集積が細胞質で認められた。C:ox細胞内の不活性細胞質APはトリプシン感受性を持ち、その発生量は、より高い培養温度下で、高いコピー数のプラスミドからの融合物の発現の際に高められ、用いられるリーダー・ペプチドにも依存的である（データ示さず）。対照的に、検証されたいずれのコンストラクトについても、周辺質画分での不活性AP融合物の形跡は見つからなかった。一部の例で（例えば、図６ＤのssFdnG-AP）、周辺質内のAP融合蛋白質の一部は、前駆物質の予想された電気泳動度を有する、より高分子のバンドとして泳動した。このHMW種は、恐らくはTatリーダー・ペプチド内の感受性部位の存在という理由により、トリプシンによって成熟バンドへ処理された（Kebir and Kendall, 2002）。
【００７５】
クラスIITatリーダー・ペプチド（ssDmsA、ssSufI、ssYacK及びssYcbK）は、還元性細胞質を有する細胞から多少AP排出をすることができる。このAP活性は、C:red tatBまたはtatC突然変異体では破壊されず、蛋白質の周辺質への排出がTat機構に関与しなかったことを示す。クラスIIリーダー・ペプチド融合物がC:ox/P:ox細胞で発現した場合、周辺質内の活性APの量は、42％（ssSufI-APの場合）から100％以上（ssDmsAの場合）の間で増加した。しかし、C:ox株DR473nodsbAの不活性化は、周辺質APの著しい減少を招いた。これらの結果について考えられる２つの説明は、誤って折り畳まれたか、または折り畳まれていないAPの転座はTat機構を介して生じる、あるいは、クラスIIリーダー・ペプチドはSec及びTat輸送体の両方に関与できる、のうちいずれかである。C:red細胞でのAP活性の排出は、複製を許容しない温度下(42℃で大腸菌MMC52)で培養されたsecA51(ts)突然変異株で排除されるという発見によって、後者の仮説が支持される。Sec及びTat分泌機構の両方に関与できるクラスIIリーダー・ペプチドの能力は、HyaAリーダー・ペプチドと融合した異種チトクロームｃの排出はSec経路を介してヘム共同因子の非存在下で進行可能であって、一方ヘムが周辺質と酵素的に結合された場合にTatは優勢な排出経路になることを発見したSanders et al. (2001)による最近の研究と一致している。これまでの研究により、Tatリーダー・ペプチドのＣ末端における正電荷の存在は『Sec回避』シグナルとして機能できる（Cristobal et al., 1999; Bogsch et al., 1997）ことが示された。ssDmsA、ssSufI及びssYacKはすべてこの領域に荷電したアミノ酸を有しているが、Ｃドメイン正電荷のみではSec経路を介した無差別の排出を抑制するには、少なくともこれらのリーダーがAPと融合される場合には不十分であると考えられる。
【００７６】
APをTat経路を介して排出させようとした、これまでのいくつかの試みは成功しなかった（Berks, 1996; Reinartz et al., 1998; Sambasivarao et al., 1990; Stanley et al., 2002）。一部の例で、細胞周辺腔でAP活性が検出されたが、排出はTat経路に依存しなかった（Stanley et al., 2002）。ここに提示された分析により、これら従来の所見を以下に説明する：APのTatを介した排出は周辺質での酸化的折り畳みに依存するが、一部のリーダー・ペプチドはSec及びTat経路の両方に関与することができる。これら２つの経路の中で排出の流れは、ポリペプチドの折り畳み動力学に恐らくは依存し、Tat系を通じて排出される折り畳まれた分子及び折り畳みの臨界状態にまだ達していない蛋白質はSec経路を利用することができる。
【００７７】
APに加えて、本発明者等は、scFv及び抗体FAB断片のようなその他の複数ジスルフィド蛋白質との融合物は、細胞質が酸化的蛋白質折り畳みを促進する株で発現する場合にのみTat経路を介する排出の能力を持つようになるという事実を発見した。周辺質でのFAB抗体の集積はC:ox株でのみ観察することができ、原型のままのTat機構、及び重鎖上の機能性リーダー・ペプチドの存在に依存した。これらの所見に対する最も簡単な説明は、２つの鎖が折り畳まれた蛋白質のTat排出に続いて分子間ジスルフィドによって結合されるようになる細胞質内において、FABが先ず構築されるというものである。細胞質内でΔssDsbCの共発現を介するFABの折り畳み効率を増大させることによって、FABの排出効率が大きく高められる。完全に折り畳まれたFab分子の周辺質への排出は、たとえ２つの鎖のうち１つだけがリーダー・ペプチドを含んでいるとしても、排出の『ヒッチハイカー』モードを表わすものであり、それによって、リーダーのないポリペプチドは、分泌機構と関与できる第２のポリペプチドとの会合を介して排出される（Rodrigue et al., 1998）。
【００７８】
上記の結果は以下の決定的な証拠を提供する：（ｉ）細胞質内での折り畳みの非存在下において、Tat経路を介した蛋白質排出はない；そして、（ii）少なくとも43 kDa（単量のAPのサイズ）までの折り畳まれた蛋白質、及び細胞質内でサブユニットを構築しなければならない蛋白質は、折り畳まれたコンフォメーションでバクテリアTat経路を介してin vivoで排出される。ジスルフィド結合の非存在下でのAP、scFv及びFAB蛋白質の排出不能は、Tat転座機構の不可欠な部分である質的制御機構の存在を示す。Tat蛋白質のみが転座に必要なため、折り畳み質的制御機構は、膜内でTatABCE蛋白質に内在するものでなければならない。例えば、Tatコンポーネントの細胞質ドメインは、折り畳まれていない蛋白質中間体での露出した細胞質ドメインへ結合させることによってシャペロンとして機能することができよう。あるいは、誤って折り畳まれた蛋白質との相互作用によって、Tat転座孔の構築、またはいったん形成された孔のゲート開閉のいずれかが抑制されるであろう。C:red株内でクラスIリーダー・ペプチドと融合された折り畳まれていないAPの排出を可能にするTat突然変異体を単離することは、これら２つの機構を区別するのに役立つであろうし、現在それが進行中である。
【００７９】
本明細書に開示され、特許請求されるすべての組成物及び方法は、本発明の開示に照らして過度の実験を行なうことなく作製、実施することができる。本発明による組成物及び方法は、好ましい実施の形態という形で述べられてきたが、当業者には、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく本明細書に述べられた組成物及び方法、及び上記方法のステップまたは一連のステップに変形を適用できることが明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するいくつかの作用物は、本明細書に述べられた作用物質と置き換えることができ、同一または類似の結果が得られることが明らかであろう。当業者にとって明らかなすべてのそうした類似の置換物及び変形は、添付請求項によって定義されるような本発明の精神、範囲及び概念の範囲内にあるとみなされる。
【００８０】
参考文献
下に挙げる参考文献は、それらが、背景を補足、説明、提供し、あるいは、本明細書で用いられる方法、技術及び／又は組成物を教示する程度に、引用によって本明細書に組み込まれる。
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【図面の簡単な説明】
【００８１】
上に述べられた本発明の特徴、利点及び目的、そして明らかになるであろうその他の事項が達成され、詳細に理解されるように、上に簡潔に要約された本発明のより詳細な記述といくつかの実施の形態が、添付された図表で説明される。これらの図表は本明細書の一部を形成する。しかしながら、添付図表は本発明の好ましい実施の形態を説明するものであり、従って、それらの範囲を限定するものとはみなされないことに注意されたい。
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａは、種々の株でTorA-PhoA融合物を発現させる大腸菌細胞からの周辺質及び細胞質画分のウェスタン・ブロットを示す図である。図１Ｂは、株DHB4-A（−で示される還元性細胞質）またはDR473-A（＋で示される酸化性細胞質）株の周辺質画分及び細胞質画分で検出されたアルカリ・ホスファターゼ活性を示す図である。
【図２Ａ−Ｂ】大腸菌DHB4-A（還元性細胞質）またはDR473-A（酸化性細胞質）のいずれかでのTorA-vtPA融合物の発現の際の全細胞溶解物、無処置のスフェロプラスト（図２Ａ）または周辺質画分（図２Ｂ）におけるvtPA活性の分布を示す図である。
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａは、TorA-Fab抗体融合物の概要を示す図である。図３Ｂは、酸化性（＋）または還元性（−）細胞質（それぞれDR473-AまたはDHB4-A）のいずれかを有する株の周辺質画分またはスフェロプラスト画分（細胞質）におけるFab抗体蛋白質の分布を示すウェスタン・ブロットを示す図である。図３Ｃは、ELISAによってモニターされるような図３Ｂに示される試料に対する抗体結合活性を示す図である。
【図４Ａ−Ｅ】細胞の運動性プレートを示す図であり、図４ＡはDR473-Bを、図４BはDR473を、図４ＣはTorA-TrxAAC融合物を発現させるDR473-Bを、図４Ｄは還元性細胞質を有するDR473-BのMC1000 dsbB同質遺伝子ペアレントを示し、図４Ｅは種々の株の周辺質及び細胞質画分におけるチオレドキシンの分布を示すウェスタン・ブロットである。
【図５】図５は、種々の株のバックグラウンドにおけるAPの折り畳み及び排出を示す図である。Ox及びredは、特定の細胞成分コンパートメントにおける酸化性及び還元性の酸化還元電位を意味する。C:ox（DR473）細胞において、APは細胞質内での折り畳みが可能であり、従って、Tat経路のための基質として機能することができる。APの局在性は、C:ox/P-red株DRA（DR473 dsbA）では損なわれない。tatC（またはtatB）のC:ox/P:ox株内での欠失は、AP排出を阻害する。
【図６Ａ−Ｄ】図６Ａは、ssFdnG-APの細胞成分局在性を示す図である。ssFdnG-APを発現させる細胞からの周辺質（図６Ａ）及び細胞質（図６Ｂ）画分の免疫ブロット法である。試料は、細胞蛋白質全体の量に基づいて標準化し、12％SDS-PAGEゲル上で分析した。GroELを、抗GroEL血清で精査することによって分画マーカーとして用いた。図６Ｃは図６Ａ及び図６Ｂにおけるのと同じ周辺質（黒べた）及び細胞質（空白）画分に対するAPの活性を示す図である。図６ＤはC:ox/P:ox及びC:ox/P:redから回収された周辺質画分のトリプシン感受性分析を示す図である。試料は４−20％のSDS-PAGEゲル上で分離し、抗AP及び抗OmpA血清で精査した。
【図７】scFv抗体のTat排出を示す図である。周辺質及び細胞質でのELISAによるscFvの検出である。周辺質（黒べた）及び細胞質（空白）試料を連続的に希釈し、同量の蛋白質全体量からはじめた。報告されたデータは４倍希釈のものからで、２つの別個の研究の平均値である。
【図８Ａ−Ｄ】図８Ａは、抗ジゴキシン抗体断片（FAB）のTat排出を示す、FAB抗体のTat排出である。図８Ｂは、TorA-Fab融合物及びΔssDsbCを共発現させる細胞から回収された周辺質（レーン１−３）及び細胞質（レーン４−６）画分のウェスタン・ブロット法を示す図である。用いられた株は：（１、４）C:ox/P:ox；（２、５）C:ox/P:ox/tatC及び（３、６）C:red/P:oxである。すべてのレーンに同量の蛋白質全体量を添加し、抗マウスIgG F(ab')2抗体を用いてFAB軽鎖を検出した。GroELをスフェロプラスト画分の分画マーカーとして用いた。図８Ｃは、（a,b）C:red/P:ox；（c,d）C:ox/P:ox/tatC及び（e,f）C:ox/P:ox細胞から回収された周辺質（a,c,e）及び細胞質（b,d,f）画分のELISAを示す図である。図８Ｄは、TorA-Fab及びΔssDsbCを発現させ、FITC-ジゴキシンでラベル付けされたC:red/P:ox細胞（上図）及びC:ox/P:ox細胞（下図）の流動細胞計測法分析を示す図である。
【配列表】
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図４Ａ−Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｄ】
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【国際調査報告】
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