(57)【要約】  核酸の操作方法、特に、オリゴヌクレオチドの使用を含めたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および組合せによる増幅、ならびにこのようなオリゴヌクレオチドを包含するキット、そしてまた多数の核酸断片がＰＣＲおよび電気泳動により操作される方法における結果改善を可能にする入れ子式ＰＣＲの使用を包含する方法。オリゴヌクレオチドは、電気泳動におけるサイズ標準、ならびに存在する物質の相対量の算定を可能にする内部対照を提供する。結果改善は、研究中のシステムにおいて転写されるｍＲＮＡのプロファイリングの方法において達成され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖化産物ＤＮＡ分子の集団の提供方法であって、以下の：
試料中のｍＲＮＡ分子のポリＡ尾をオリゴＴアダプターとアニーリングするが、このオリゴＴアダプターは３’オリゴＴ部分および５’一次バックプライマーアニーリング配列を含み；
鋳型としてｍＲＮＡを用いてｍＲＮＡ分子と相補的なｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより一次ｃＤＮＡ鎖の集団を提供し；
ｍＲＮＡを除去し；
各一次鎖と相補的な二次ｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供し；
ＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素で二本鎖ｃＤＮＡ分子を消化して、消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供するが、各消化二本鎖ｃＤＮＡ分子は制限酵素消化により提供される付着末端を有し；
アダプターオリゴヌクレオチドの集団を消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端にライゲートするが、付着アダプターオリゴヌクレオチドは各々、付着末端と相補的な末端配列、一次フォワードプライマーアニーリング配列、ならびに一次フォワードプライマーアニーリング配列と付着末端の間の二次フォワードプライマーアニーリング配列を含み、それにより各々が一次鎖および二次鎖を含む二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を提供するが、この場合、二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖は各々３’末端付着アダプターオリゴヌクレオチドを含み、そして二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖は各々オリゴＴアダプター配列と相補的な３’末端配列を含み；
前記二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製し；
一次フォワードプライマーアニーリング配列とアニーリングする配列を含む一次フォワードプライマー、ならびに一次バックプライマーアニーリング配列とアニーリングする配列を含む一次バックプライマーを用いてｍＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有する二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子に関して一次ポリメラーゼ連鎖反応を実施し；
二次フォワードプライマーの集団および二次バックプライマーの集団を用いて、一次ポリメラーゼ連鎖反応の産物に関して二次ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するが、
この場合、二次フォワードプライマーは各々、付着アダプターオリゴヌクレオチドの二次フォワードプライマーアニーリング配列とアニーリングする配列を含み、そして
制限酵素がＩＩ型酵素である場合、二次フォワードプライマーは各々少なくとも１つの３’末端可変ヌクレオチドをそして任意に１つより多い３’末端可変ヌクレオチドを含むが、この場合、可変ヌクレオチド、あるいは可変ヌクレオチド内の対応する位置では各二次フォワードプライマーは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択されるヌクレオチドであるか、あるいはそれらを有し、それにより二次フォワードプライマーの集団が一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内のプライマーアニーリング配列と隣接して、二次フォワードプライマーの集団内の二次フォワードプライマーの可変ヌクレオチド（単数または複数）と相補的なヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；あるいは
制限酵素がＩＩＳ型酵素である場合、二次フォワードプライマーは一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は、鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内に、付着アダプターオリゴヌクレオチドの集団内の付着アダプターオリゴヌクレオチドの末端配列と相補的なヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
二次バックプライマーは、オリゴＴ配列ならびに次式：（Ｇ／Ｃ／Ａ）（Ｘ）n（式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｎはゼロ、少なくとも１または１より大きい数である）に従う３’可変部を含み；それにより、二次バックプライマーの集団が二次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖内のポリＡと隣接して、二次バックプライマーの集団内の二次バックプライマーの可変部分と相補的な単数または複数のヌクレオチドを含む鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
それによりポリメラーゼ連鎖反応増幅の実施が二本鎖化産物ＤＮＡ分子の集団を提供し、この各々は、一次鎖産物ＤＮＡ分子および二次鎖産物ＤＮＡ分子を含む
ことを包含する前記方法。
【請求項２】
以下の：
長さに基づいて二本鎖化産物ＤＮＡ分子を分離し；そして
前記二本鎖化産物ＤＮＡ分子を検出し；
それにより試料中に存在するｍＲＮＡの集団に関するパターンが、前記二本鎖化産物ＤＮＡ分子の長さと（ｉ）二次フォワードプライマー可変ヌクレオチド（単数または複数）（この場合、ＩＩ型制限酵素が用いられる）または（ｉｉ）付着アダプターオリゴヌクレオチド末端配列（この場合、ＩＩＳ型制限酵素が用いられる）の組合せにより提供される
ことをさらに包含する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下の：
二次の異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて試料に関する付加的パターンを生成し、そして
別個の実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて生成されたパターンを、既知のｍＲＮＡに関して確定されたかまたは予測されたシグナルのデータベースと比較する
ことをさらに包含する、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
別個の実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて生成されるパターンを、以下の：
（ｉ）各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに対応し得るデータベース中の全ｍＲＮＡを列挙して、各実験に関して試料中におそらくは存在するｍＲＮＡ分子の一覧表を作成し、そして
（ｉｉ）各実験に関して、二本鎖化産物ＤＮＡ分子と明確に対応しないｍＲＮＡを列挙して、各実験に関して試料中に明確に存在しないｍＲＮＡの一覧表を作成し、次に
（ｉｉｉ）各実験に関しておそらくは存在するｍＲＮＡ分子の一覧表から試料中に明確に存在しないｍＲＮＡ分子を除去し、そして
（ｉｖ）試料中におそらくは存在するｍＲＮＡ分子ならびに試料中に明確に存在しないｍＲＮＡ分子の一覧表を、（ｉｉｉ）における各実験に関して作製された各一覧表を組合せることにより作成する；
ことにより、ｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較し、
それにより試料中に存在するｍＲＮＡ分子のプロフィールを提供する
ことを包含する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
別個の実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて生成されるパターンを、以下の：
（ｉ）各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに対応し得るデータベース中の全ｍＲＮＡを列挙し、そして式Ｆｉ＝ｍ1＋ｍ2＋ｍ3（式中、Ｆｉは断片からのシグナルの強度であり、数字はデータベース中のｍＲＮＡの単位元である）という一組の方程式を作成し（この場合、二本鎖化産物ＤＮＡに対応し得る各ｍＲＮＡは右手側の項として現れる）；
（ｉｉ）各実験に関して、各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに明確に対応しないｍＲＮＡを列挙し、そして各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに明確に対応しない各遺伝子に関して式０＝ｍ4（式中、数字はｍＲＮＡ単位元である）の方程式を書き；
（ｉｉｉ）連立方程式のシステムを作成するために方程式組を併合するが、この場合、方程式の数値は生物体中の遺伝子の数より大きく；
（ｉｖ）連立方程式のシステムを解答することにより、各遺伝子の発現レベルの量を確定する
ことによりｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較し、
それにより試料中に存在するｍＲＮＡ分子のプロフィールを提供する
ことを包含する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
以下のプライマー配列：
以下の配列を有する一次フォワードプライマー：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGC-3’（配列番号２６）
以下の配列を有する一次バックプライマー：
5’-TTCACGCTGGACTGTTTCGG-3’（配列番号２７）
以下の配列を有する二次フォワードプライマー：
5’-GTGTCTTGGATGC-3’（配列番号３５）、および
以下の配列を有する二次バックプライマー：
5’-(T)ZVN1N2（ここで、ｚは10〜40であり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、Ｎ1は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、そしてＮ2は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）
が用いられ得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
二本鎖化産物ＤＮＡ分子の一集団を提供するためのｃＤＮＡ断片の増幅方法であって、各ｃＤＮＡ断片が、ポリＡ尾を含むｍＲＮＡ分子の３’断片のコピーを含む上方鎖、および上方鎖と相補的である下方鎖を含む方法であり、上方鎖がその５’末端に以下のアダプター（１）配列：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGCGTGTCTTGGATGC-3’
を含み、そして下方鎖がその３’末端に以下のアダプター（２）配列：
5’-p(N)xGCATCCAAGACACGCCTGACTCACAAATGTCCT-3’
を含む方法であり、そして下方鎖がその５’末端に以下のアダプター（３）配列：
5’-CCAATTCACGCTGGACTGTTTCGG-(T)y-3’
を含み、そして上方鎖がその３’末端に以下のアダプター（４）配列：
5’-(A)yCCGAAACAGTCCAGCGTGAATTGG-3’
を含み、この場合、上方および下方鎖は、ｃＤＮＡ断片の制限消化後にアダプター配列（１）および（２）のアダプターのライゲーションにより提供され、ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、そしてｘは制限消化により生成されるオーバーハングの塩基の数に対応する方法であって、入れ子式ポリメラーゼ連鎖反応を実施することを包含するが、この場合、一次ポリメラーゼ連鎖反応が、以下の配列を有する一次フォワードプライマー：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGC-3’（配列番号２６）、および
以下の配列を有する一次バックプライマー：
5’-TTCACGCTGGACTGTTTCGG-3’（配列番号２７）
を用いて実施され、そして二次ポリメラーゼ連鎖反応が、
以下の配列を有する二次フォワードプライマー：
5’-GTGTCTTGGATGC-3’（配列番号３５）、および
以下の配列を有する二次バックプライマー：
5’-(T)ZVN1N2（ここで、ｚは10〜40であり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、Ｎ1は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、そしてＮ2は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）
を用いて実施される方法。
【請求項８】
前記二次バックプライマーが標識される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記二次バックプライマーがシーケンシング機により読取り可能な蛍光染料で標識される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
電気泳動により、ならびに以下の配列：
5’-CTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTCGCCCTTGGATGCCT-3’（配列番号２８）、および
3’-AGGACGTCCAAATTTGCTTAAGCGGGAACCTACGGAGATC-5’（配列番号２９）
のタンデムにライゲートされたオリゴヌクレオチドを含むサイズ標準との比較により集団中の二本鎖化産物ＤＮＡ分子の長さを確定することを包含する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
電気泳動により、ならびに以下の配列：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGCGTGTCTTGGATGC(N)pV(A)z’ACCGAAACAGTCCAGCGTGAATTGG-3’（配列番号３０）
（ここで、Ｎは任意のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり、そしてｐはポリヌクレオチドの所望の全体長を提供するための数であるが、この場合、ｐは好ましくは600〜700であり、Ｖ’はＴ、ＣまたはＧでありそしてｚ’は10〜40である）
を用いることにより、集団中の二本鎖化産物ＤＮＡ分子の長さを確定することを包含する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ポリＡ尾を含むｍＲＮＡ断片のｃＤＮＡコピーを増幅するための入れ子式ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー組であって、以下の：
以下の配列を有する一次フォワードプライマー：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGC-3’（配列番号２６）、
以下の配列を有する一次バックプライマー：
5’-TTCACGCTGGACTGTTTCGG-3’（配列番号２７）
以下の配列を有する二次フォワードプライマー：
5’-GTGTCTTGGATGC-3’（配列番号３５）、および
以下の配列を有する二次バックプライマー：
5’-(T)ZVN1N2（ここで、ｚは10〜40であり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、Ｎ1は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、そしてＮ2は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）
を含む前記プライマー組。
【請求項１３】
以下の：
請求項１２記載のプライマー組；ならびに
以下の配列のアダプターオリゴヌクレオチド組
を包含するキットであって、一次アダプターオリゴヌクレオチドが上方鎖配列：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGCGTGTCTTGGATGC-3’（配列番号３１）
および下方鎖：
5’-p(N)xGCATCCAAGACACGCCTGACTCACAAATGTCCT-3’
を有し、二次アダプターオリゴヌクレオチドが下方鎖配列：
5’-CCAATTCACGCTGGACTGTTTCGG-(T)y-3’
および上方鎖配列：
5’-(A)yCCGAAACAGTCCAGCGTGAATTGG-3’
（ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ｘは1、2、3または4である）を有するキット。
【請求項１４】
以下の配列：
5’-CTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTCGCCCTTGGATGCCT-3’（配列番号２８）、および
3’-AGGACGTCCAAATTTGCTTAAGCGGGAACCTACGGAGATC-5’（配列番号２９）
のタンデム結繋オリゴヌクレオチドを含むサイズ標準を包含するキットであって、タンデムにライゲートされたオリゴヌクレオチドが上流プライマー結合部位と下流オリゴＡ配列との間に挿入されるベクターからタンデム結繋オリゴヌクレオチドが増幅可能であるキット。
【請求項１５】
ベクターの集団を包含する請求項１４記載のキットであって、集団中のベクターが0〜25反復のタンデムにライゲートされたオリゴヌクレオチドを含み、前記上流プライマー結合部位を結合する前記プライマーおよび前記オリゴＡを結合するプライマーを用いた増幅が異なる長さのサイズマーカーオリゴヌクレオチドの集団を提供するキット。
【請求項１６】
配列：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGCGTGTCTTGGATGC(N)pV(A)z’ACCGAAACAGTCCAGCGTGAATTGG-3’（配列番号３０）
（ここで、Ｎは任意のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり、そしてｐはポリヌクレオチドの所望の全体長を提供するための数であるが、この場合、ｐは好ましくは600〜700であり、Ｖ’はＴ、ＣまたはＧでありそしてｚ’は10〜40である）の内部対照ポリヌクレオチドを包含する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
１つまたは複数のＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を包含する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
ポリメラーゼ連鎖反応の実施に用いるための構成成分を包含する、請求項１３〜１７記載のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の操作に、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に関する。特に本発明は、オリゴヌクレオチドおよび組合せ、ならびにこのようなオリゴヌクレオチドを包含するキット、さらにまた入れ子式ＰＣＲの使用を包含する方法に関する。本発明の実施形態は、多数の核酸断片がＰＣＲおよび電気泳動により操作される方法に置ける結果改善を可能にする。本発明はさらに、電気泳動におけるサイズ標準、ならびに存在する物質の相対量の算定を可能にする内部対照として用いるためのオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、研究中のシステムにおいて転写されるｍＲＮＡのプロファイリングの方法における結果改善を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム中に存在する遺伝子の総数の分画のみが、任意の所定の細胞中で発現される。細胞中で発現される遺伝子の総数の相対的小分画は、その生涯工程を、例えば細胞の内在的および外在的特性、例えば発生および分化、恒常性、傷害に対するその応答、細胞周期調節、加齢、アポトーシス等を確定する。
【０００３】
遺伝子発現の変化は、正常細胞発達の経過、ならびに疾患状態、例えば癌の出現を決定する。任意の所定の細胞中での遺伝子発現のプロフィールはその性質に対する直接的因果関係を有するため、地球規模での遺伝子発現の分析方法は、重大な意味を有する。遺伝子発現プロフィールの同定は、生物体における正常な生物学的工程の理解だけでなく、遺伝子発現の変化に関連したヒト、動物および植物における種々の疾患または症状の予後および治療に対する鍵を提供する。さらに、示差的遺伝子発現は疾患に対する素質、感染性作因および外的処置に対する応答性に関連するため（Alizadeh et al., 2000; Cho et al., 1998; Der et al., 1998; Iyer et al., 1999; McCormick, 1999; Szallasi, 1998）、このような遺伝子発現プロフィールの同定は、疾患に関する強力な診断ツールを、そしてこのような疾患を治療するかまたは予防するための新規の薬剤の同定のためのツールを提供し得る。この技法は、遺伝子発見のためも非常に強力である。
【０００４】
これを達成するための唯一の手段は、一実施形態において優先的に、大規模に、特定時間に、特定の組織／細胞中で発現される全ての遺伝子を測定することである。10年未満以前は、単一実験において細胞中の全ての転写体の濃度を同時に測定することができるという概念は実行不可能であると考えられた。しかしながら過去わずかの年月でのＤＮＡマイクロアレイの使用およびその他の技術的進歩は、この分野における関心の途方もない高まりを刺激した（Bowtell, 1999; Brown and Botstein, 1999; Duggan et al., 1999; Lander, 1999; Southern et al., 1999）。
【０００５】
マイクロアレイはいくつかの欠点を有するが、しかし遺伝子発現の検出および定量のための多数の代替的方法が利用可能である。これらの例としては、ノーザンブロット分析（Alwine et al., 1977）、Ｓ１ヌクレアーゼ防御検定（Berk and Sharp, 1977）、遺伝子発現の逐次分析（ＳＡＧＥ）（Velculescu et al., 1995）ならびにｃＤＮＡライブラリーのシーケンシング（Okubo et al., 1992）が挙げられる。しかしながらこれらは全て、全体的遺伝子発現分析に適していない低処理量アプローチである。示差的表示（Liang and Pardee, 1992）および関連技法は、固体支持体に基づいていないことにより、マイクロアレイ技法と対照を成す。マイクロアレイに対するこれらの技法の利点は、実験を遂行するのに従来の配列情報を必要としない点である。しかしながら示差的表示および関連技法は、それらを大規模遺伝子発現分析に不適切にする以下の2つの欠点を有する：（ｉ）各実験において試験中である遺伝子の同定は、全ての実験においてｃＤＮＡの各々のクローニングおよび配列分析後にのみ確定され得る、そして（ｉｉ）ｍＲＮＡは全ての実験において多数回同定される。
【０００６】
ＰＣＲに基づいた多数の方法が提唱されている。ゲノムＤＮＡの大規模制限断片長多型性に関する方法（KeyGene EP0969102）は、1つまたは2つの制限酵素によるゲノムＤＮＡの酵素的切断、ならびにその断片への特定アダプターのライゲートを包含する。CeleraのジーンタグGeneTag法は、独自のＰＣＲ断片が各ｃＤＮＡに関して生成されるという原則に基づいている。断片は、蛍光キャピラリー電気泳動により分離され、次にCeleraが所有権を有するアルゴリズムを用いてサイズ予測され、定量される。次にそのコグネイトＰＣＲ断片の蛍光強度により、特定ｍＲＮＡの量が確定される。Celera所有ジーンタグGeneTagデータベースを用いて、ｃＤＮＡ断片ピークがそれらの対応する遺伝子名と照合される。別の方法（米国特許第6010850号および第5712126号）は、ＰＣＲにおいて非３’断片を抑制するためのＹ字形アダプターを用いる。したがってこのｃＤＮＡは制限酵素で消化され、Ｙ字形アダプターに結繋される。Ｙ字形アダプターは、３’断片の選択的増幅を可能にする。デジタル遺伝子技法（http://www.dgt.comあるいは任意のウエブブラウザーを用いてＤＧＴを見出す）は、各々がシグナル遺伝子を表し、各遺伝子が1回だけ示される独自の３’断片の表示を提供する。該方法（米国特許第5459037号）は、３’断片を単離し、サブクローニングし、大腸菌中のライブラリーとしてサブクローニング化断片を増殖し、プラスミドを抽出し、挿入物をｃＲＮＡに転換した後ＤＮＡに戻し、そして次にＰＣＲ増幅することを包含する。
【０００７】
発現遺伝子の直接同定を可能にするＰＣＲベースのｍＲＮＡプロファイリング方法をわれわれは以前に記載した（GB0018016.6およびPCT/IB01/01539）。要するに、試料中のｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡを一端で制限酵素消化に付して、他端を、一方の鎖の５’末端のオリゴＴ（本来、ｍＲＮＡ分子の３’末端のポリＡと相補的である）により、固体支持体（例えばビーズ、例えば磁気またはプラスチック製、あるいは例えば遠心分離または磁気作用、あるいは細分手法のための亜小室を有する微細加工反応小室（ここで化学物質は小室を通過して洗浄される）により、洗浄中に保持され得る任意のその他の固体支持体）に固定される。アダプターは、ｃＤＮＡ分子の遊離（消化）端に結繋され、ＰＣＲが、ｃＤＮＡ両端（一方はｃＤＮＡの一方の鎖の３’末端でアダプターとアニーリングするよう意図され、他方は（ｍＲＮＡ中の元のポリＡに対応して）ｃＤＮＡの他方の鎖の３’末端でポリＡとアニーリングするようオリゴＴを含有する）でアニーリングするプライマーを用いて実施される。ＩＩＳ型酵素の使用に関しては、各プライマーは、相補的配列（一方の鎖に関するアダプターに隣接するかまたは他方の鎖に関するポリＡに隣接する）を用いてｃＤＮＡのサブセットを増幅する可変ヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの配列を含む。ＩＩＳ酵素に関しては、酵素が二本鎖ＤＮＡを切断する場合に生成される異なる可能性がある付着末端と結繋するアダプターが用いられる。したがってアダプターの集団は、ＩＩＳ型酵素による切断／消化後に、ＤＮＡの集団内の考え得る全ての付着末端と相補的であるよう用いられ得る。アダプターとアニーリングするプライマーが、ＰＣＲに用いられる。
【０００８】
プライマーは標識され、そして標識は関連プライマー可変部における対応する位置の関連Ａ、Ｔ、ＣまたはＧヌクレオチドに対応し得る。これは、ＰＣＲで産生される二本鎖ＤＮＡが標識されるということを、そして標識と生成物ＤＮＡの長さの組合せが特徴的シグナルを提供するということを意味する。別の状況では、生成物の長さと（ｉ）ＩＩ型酵素消化に関して用いられるＰＣＲプライマーまたは（ｉｉ）ＩＩＳ型消化に関して用いられるアダプターの組合せが特徴的シグナルを提供する。
【０００９】
これから、各遺伝子は単一断片を生じ、したがって各完全プロフィールは各遺伝子を1回示す；しかしながらプロフィール中の各断片は、同一副反応中に生じる同一長の断片を偶然生じさせる多数の遺伝子に対応し得る、ということが理解されるはずである。これが、簡単なデーベース検索がほとんどの遺伝子を非多義的に同定するためには十分でないことの理由である。用いられる酵素を変えることにより、多数の個々のプロフィールが生成され、これがより強力な組合せ同定アルゴリズムを使用させ得る（GB0018016.6およびPCT/IB01/01539）。
【００１０】
特に単一プライマー対を用いて増幅される試料に関して、ハイブリダイゼーションベースの方法をはるかに超える感受性および再現可能性を有する優れた定量的データをＰＣＲベースの方法が提供することは明らかである。
【００１１】
任意のＰＣＲベースのＲＮＡプロファイリング法の定量的データの信頼性を増大するための改良の領域を、本発明者等はここに確立した。
【発明の開示】
【００１２】
本発明者等が同定した反応の態様は、以下のものに関する：
１．電気泳動のためのキャピラリー上での副反応ならびにその他のキャピラリー−キャピラリー作用の示差的負荷；
２．電気運動的注入中のイオン間の競合のための毛管上への長短断片の示差的負荷；
３．サイズ標準に対して判定される場合の、特にサイズ標準が判定されている断片と配列組成が定量的に異なる場合の、電気泳動における断片の見掛けのサイズにおける配列依存性変動；
【００１３】
４．用いられるＤＮＡポリメラーゼの特性により生じる異なる長さおよび／または配列組成の断片に関する示差的増幅効率；
５．ＰＣＲ中に生じるバックグラウンド非特異的断片。目的は、単一反応試験管中の数百の断片の同時増幅から、信頼できる定量的情報を得ることである。各反応における断片は全て単一プライマー対で、したがって普通は同一効率で増幅されるが、しかしＤＮＡポリメラーゼが延長中に長い方の断片を減少させる傾向を有するため、差異が依然として生じ得る。これは、酵素依存性である（即ち、異なる種または異なる製造元からの酵素は特定の効率曲線を有する）増幅効率の低下を生じ得る。さらに、増幅効率に配列組成依存性差が存在する。これらの作用を複合したものが、キャピラリー電気泳動が実施される方法のために生じる示差的注入の作用であり、この場合、断片が長いほど、キャピラリー上に低効率的に負荷される傾向がある。
【００１４】
本発明は、ＰＣＲベースのＲＮＡプロファイリングにおける定量的誤差を低減するために用いられ得るプライマーおよび内部対照に関する。
【００１５】
本発明に従って入れ子式ＰＣＲに用いるためのプライマーはＤＮＡ断片を増幅するのに有用であり、この場合、ＤＮＡの一方の鎖はポリＡ尾を含むｍＲＮＡの断片に対応する。このような増幅は、種々の状況において、例えばGB0018016.6およびPCT/IB01/01539も参照しながら、本明細書中でさらに考察されるような、ＲＮＡプロファイリングおよびフィンガープリンティングの実施形態において有用であるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明の一態様に従って、二本鎖化産物ＤＮＡ分子の集団の提供方法であって、以下の：
試料中のｍＲＮＡ分子のポリＡ尾をオリゴＴアダプターとアニーリングするが、このオリゴＴアダプターは３’オリゴＴ部分および５’一次バックプライマーアニーリング配列を含み；
鋳型としてｍＲＮＡを用いてｍＲＮＡ分子と相補的なｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより一次ｃＤＮＡ鎖の集団を提供し；
ｍＲＮＡを除去し；
各一次鎖と相補的な二次ｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供し；
ＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素で二本鎖ｃＤＮＡ分子を消化して、消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供するが、各消化二本鎖ｃＤＮＡ分子は制限酵素消化により提供される付着末端を有し；
【００１７】
アダプターオリゴヌクレオチドの集団を消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端に結繋するが、付着アダプターオリゴヌクレオチドは各々、付着末端と相補的な末端配列、一次フォワードプライマーアニーリング配列、ならびに一次フォワードプライマーアニーリング配列と付着末端の間の二次フォワードプライマーアニーリング配列を含み、それにより各々が一次鎖および二次鎖を含む二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を提供するが、この場合、二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖は各々３’末端付着アダプターオリゴヌクレオチドを含み、そして二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖は各々オリゴＴアダプター配列と相補的な３’末端配列を含み；
【００１８】
前記二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製し；
一次フォワードプライマーアニーリング配列とアニーリングする配列を含む一次フォワードプライマー、ならびに一次バックプライマーアニーリング配列とアニーリングする配列を含む一次バックプライマーを用いてｍＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有する二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子に関して一次ポリメラーゼ連鎖反応を実施し；
【００１９】
二次フォワードプライマーの集団および二次バックプライマーの集団を用いて、一次ポリメラーゼ連鎖反応の産物に関して二次ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するが、
この場合、二次フォワードプライマーは各々、付着アダプターオリゴヌクレオチドの二次フォワードプライマーアニーリング配列とアニーリングする配列を含み、そして
【００２０】
制限酵素がＩＩ型酵素である場合、二次フォワードプライマーは各々少なくとも１つの３’末端可変ヌクレオチドをそして任意に１つより多い３’末端可変ヌクレオチドを含むが、この場合、可変ヌクレオチド、あるいは可変ヌクレオチド内の対応する位置では各二次フォワードプライマーは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択されるヌクレオチドであるか、あるいはそれらを有し、それにより二次フォワードプライマーの集団が一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内のプライマーアニーリング配列と隣接して、二次フォワードプライマーの集団内の二次フォワードプライマーの可変ヌクレオチド（単数または複数）と相補的なヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；あるいは
【００２１】
制限酵素がＩＩＳ型酵素である場合、二次フォワードプライマーは、一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は、鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内に、付着アダプターオリゴヌクレオチドの集団内の付着アダプターオリゴヌクレオチドの末端配列と相補的なヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
【００２２】
二次バックプライマーは、オリゴＴ配列ならびに次式：（Ｇ／Ｃ／Ａ）（Ｘ）n（式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｎはゼロ、少なくとも１または１より大きい数である）に従う３’可変部を含み；それにより、二次バックプライマーの集団が二次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖内のポリＡと隣接して、二次バックプライマーの集団内の二次バックプライマーの可変部分と相補的な単数または複数のヌクレオチドを含む鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
【００２３】
それによりポリメラーゼ連鎖反応増幅の実施が二本鎖化産物ＤＮＡ分子の集団を提供し、この各々は、一次鎖産物ＤＮＡ分子および二次鎖産物ＤＮＡ分子を含む
ことを包含する方法が提供される。
【００２４】
一次鎖からのｍＲＮＡの除去は、当該技術分野で利用可能な任意のアプローチによるものであり得る。これは、例えばＲＮアーゼによる消化（これは部分消化であり得る）および／または二次ｃＤＮＡ鎖を合成するＤＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡの置換を包含し得る（例えばClontechTMＳＭＡＲＴTM系におけると同様）。
【００２５】
本方法はさらに、以下の：
長さに基づいて二本鎖化産物ＤＮＡ分子を分離し；そして
前記二本鎖化産物ＤＮＡ分子を検出し；
それにより試料中に存在するｍＲＮＡの集団に関するパターンが、前記二本鎖化産物ＤＮＡ分子の長さと（ｉ）二次フォワードプライマー可変ヌクレオチド（単数または複数）（この場合、ＩＩ型制限酵素が用いられる）または（ｉｉ）付着アダプターオリゴヌクレオチド末端配列（この場合、ＩＩＳ型制限酵素が用いられる）の組合せにより提供される
ことを包含し得る。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態による方法は、以下の：
二次の異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて試料に関する付加的パターンを生成し、そして
別個の実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて生成されたパターンを、既知のｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較する
ことをさらに包含し得る。
【００２７】
パターンは、別個の実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて、以下の：
（ｉ）各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに対応し得るデータベース中の全ｍＲＮＡを列挙して、各実験に関して試料中におそらくは存在するｍＲＮＡ分子の一覧表を作成し、そして
（ｉｉ）各実験に関して、二本鎖化産物ＤＮＡ分子と明確に対応しないｍＲＮＡを列挙して、各実験に関して試料中に明確に存在しないｍＲＮＡの一覧表を作成し、次に
（ｉｉｉ）各実験に関しておそらくは存在するｍＲＮＡ分子の一覧表から試料中に明確に存在しないｍＲＮＡ分子を除去し、そして
（ｉｖ）試料中におそらくは存在するｍＲＮＡ分子ならびに試料中に明確に存在しないｍＲＮＡ分子の一覧表を、（ｉｉｉ）における各実験に関して作製された各一覧表を組合せることにより作成する；
ことにより、ｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースを用いて生成され、
それにより試料中に存在するｍＲＮＡ分子のプロフィールを提供し得る。
【００２８】
別個の実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて生成されるパターンは、以下の：
（ｉ）各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに対応し得るデータベース中の全ｍＲＮＡを列挙し、そして式Ｆｉ＝ｍ1＋ｍ2＋ｍ3（式中、Ｆｉは断片からのシグナルの強度であり、数字はデータベース中のｍＲＮＡの単位元である）という一組の方程式を作成し（この場合、二本鎖化産物ＤＮＡに対応し得る各ｍＲＮＡは右手側の項として現れる）；
（ｉｉ）各実験に関して、各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに明確に対応しないｍＲＮＡを列挙し、そして各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに明確に対応しない各遺伝子に関して式０＝ｍ4（式中、数字はｍＲＮＡ単位元である）の方程式を書き；
（ｉｉｉ）連立方程式のシステムを作成するために方程式組を併合するが、この場合、方程式の数値は生物体中の遺伝子の数より大きく；
（ｉｖ）連立方程式のシステムを解答することにより、各遺伝子の発現レベルの量を確定する
ことによりｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較され、
それにより試料中に存在するｍＲＮＡ分子のプロフィールを提供し得る。
【００２９】
以下のプライマー配列が用いられ得る：
以下の配列を有する一次フォワードプライマー：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGC-3’（配列番号２６）
以下の配列を有する一次バックプライマー：
5’-TTCACGCTGGACTGTTTCGG-3’（配列番号２７）
以下の配列を有する二次フォワードプライマー：
5’-GTGTCTTGGATGC-3’（配列番号３５）、および
以下の配列を有する二次バックプライマー：
5’-(T)ZVN1N2（ここで、ｚは10〜40であり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、Ｎ1は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、そしてＮ2は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）。
【００３０】
ｚが10〜40である場合、これは、オリゴＴ連を提供し、この場合、10〜40個のＴが存在する。好ましくは15〜30であり、そして15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30であり得る。さらに好ましくは約25個存在する。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、二本鎖化産物ＤＮＡ分子の一集団を提供するためのｃＤＮＡ断片の増幅方法であって、各ｃＤＮＡ断片が、ポリＡ尾を含むｍＲＮＡ分子の３’断片のコピーを含む上方鎖、および上方鎖と相補的である下方鎖を含む方法であり、上方鎖がその５’末端に以下のアダプター（１）配列：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGCGTGTCTTGGATGC-3’
を含み、そして下方鎖がその３’末端に以下のアダプター（２）配列：
5’-p(N)xGCATCCAAGACACGCCTGACTCACAAATGTCCT-3’
を含む方法であり、そして下方鎖がその５’末端に以下のアダプター（３）配列：
5’-CCAATTCACGCTGGACTGTTTCGG-(T)y-3’
を含み、そして上方鎖がその３’末端に以下のアダプター（４）配列：
5’-(A)yCCGAAACAGTCCAGCGTGAATTGG-3’
を含み、この場合、上方および下方鎖は、ｃＤＮＡ断片の制限消化後にアダプター配列（１）および（２）のアダプターの結繋により提供され、ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、そしてｘは制限消化により生成されるオーバーハングの塩基の数に対応する方法であって、入れ子式ポリメラーゼ連鎖反応を実施することを包含するが、この場合、一次ポリメラーゼ連鎖反応が、以下の配列を有する一次フォワードプライマー：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGC-3’（配列番号２６）、および
以下の配列を有する一次バックプライマー：
5’-TTCACGCTGGACTGTTTCGG-3’（配列番号２７）
を用いて実施され、そして二次ポリメラーゼ連鎖反応が、
以下の配列を有する二次フォワードプライマー：
5’-GTGTCTTGGATGC-3’（配列番号３５）、および
以下の配列を有する二次バックプライマー：
5’-(T)ZVN1N2（ここで、ｚは10〜40であり、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、Ｎ1は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、そしてＮ2は任意であり、存在する場合はＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）
を用いて実施される方法を提供する。
【００３２】
二次バックプライマーは、例えばシーケンシング機により読取り可能な蛍光染料で標識され得る。
二本鎖化ｃＤＮＡは、試料中のｍＲＮＡから生成され得る。この二本鎖化ｃＤＮＡは、制限酵素消化に付されて、各々が制限酵素消化により提供された付着末端を有する消化二本鎖ｃＤＮＡ分子を提供し得る。
【００３３】
アダプターの集団は、消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端に結繋され、それにより各々一次鎖および二次鎖を含む二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を提供するが、この場合、二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖は各々３’末端アダプターオリゴヌクレオチドを含み、そして二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖は各々３’末端ポリＡ配列を含む。
【００３４】
次にこれらの二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子は精製され得る。したがってｍＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有するｃＤＮＡ断片の実質的に純粋な集団が提供される。
【００３５】
二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の精製は、熟練者に利用可能な任意の適切な手段により達成され得る。例えばｃＤＮＡ分子の一端のポリＡまたはポリＴ配列はビオチンでタギングされて、ストレプトアビジン被覆ビーズとの結合によりこれらの二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の精製を可能にする。あるいはこれらの二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の単離は、ＰＣＲ前に、オリゴＴおよび／またはオリゴＡプローブとの結合によって、ハイブリダイゼーション選択により達成され得る。
【００３６】
好ましくは、３’末端ポリＡ配列を有する鎖を含む消化二本鎖ｃＤＮＡ分子は、アダプターオリゴヌクレオチドを結繋する前に精製される。これは、アダプターの非特異的結繋を防止するという利点を有する。またこれは、熟練者に利用可能な方法のいずれか、例えば上記のようなビオチンタギングによる精製を用い得る。
【００３７】
ｃＤＮＡ配列の３’末端は、制限消化前に固定される。この実施形態では、ｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡの一端は、５’末端のオリゴＴ（本来、ｍＲＮＡ分子の３’末端のポリＡと相補的である）により、固体支持体（例えばビーズ、例えば磁気またはプラスチック製、あるいは例えば遠心分離または磁気作用、あるいは細分手法のための亜小室を有する微細加工反応小室（ここで化学物質は小室を通過して洗浄される）により、洗浄中に保持され得る任意のその他の固体支持体）に固定される。ｃＤＮＡ配列の他方端は制限酵素消化を施され、そしてアダプターは遊離（消化）端に結繋される。したがって上記の消化二本鎖ｃＤＮＡ分子または二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の精製は、固体支持体上に所望の分子を保持しながら、過剰物質を洗い落とすことにより達成され得る。
【００３８】
ＰＣＲは、ｃＤＮＡ両端（一方はｃＤＮＡの一方の鎖の３’末端でアダプターとアニーリングするよう意図され、他方は（ｍＲＮＡ中の元のポリＡに対応して）ｃＤＮＡの他方の鎖の３’末端でポリＡとアニーリングするようオリゴＴを含有する）でアニーリングするプライマーを用いて実施される。ＩＩ型酵素による使用に関しては、各プライマーは、相補的配列を有するｃＤＮＡのサブセットを増幅する可変ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列を含む（一方の鎖に関するアダプターに隣接するかまたは他方の鎖に関するポリＡに隣接する）。ＩＩＳ型酵素に関しては、酵素が二本鎖ＤＮＡを切断する場合に生成されるおそらくは異なる付着末端と結繋するアダプターが用いられる。したがってアダプターの集団は、ＩＩＳ型酵素による切断／消化後に、ＤＮＡの集団内の考え得る全ての付着末端と相補的であるよう用いられ得る。アダプターとアニーリングするプライマーが、ＰＣＲに用いられる。
【００３９】
プライマーは標識され、そして標識は関連プライマー可変部における対応する位置の関連Ａ、Ｔ、ＣまたはＧヌクレオチドに対応し得る。これは、ＰＣＲで産生される二本鎖ＤＮＡが標識されるということを、そして標識と生成物ＤＮＡの長さの組合せが特徴的シグナルを提供するということを意味する。別の状況では、生成物の長さと（ｉ）ＩＩ型酵素消化に関して用いられるＰＣＲプライマーまたは（ｉｉ）ＩＩＳ型消化に関して用いられるアダプターの組合せが特徴的シグナルを提供する。
【００４０】
したがって本発明がプロファイリング状況に用いられる場合、各遺伝子（試料中のｍＲＮＡ）は単一断片を生じ、したがって各完全パターンは各遺伝子を1回示す。パターンは、試料に特徴的であり得る。
【００４１】
一試料に関して生成されるシグナルのパターン、あるいは試料間で異なると同定された１つまたは複数の個々のシグナルは、当該配列を同定するために既知の配列のデータベースから生成されるパターンと比較され得る。
【００４２】
分化または細胞周期の異なる条件または段階下での異なる細胞または同一細胞から、あるいは形質転換化（腫瘍形成性）細胞および正常細胞から生成されるパターンが比較され、パターンの差が同定され得る。これは、分化または細胞周期の異なる条件または段階下での細胞間であるいは同一細胞中で、あるいは正常および腫瘍形成細胞間で異なる細胞過程にその発現が関与する配列の同定を可能にする。
【００４３】
しかしながら一パターンにおける各断片は、同一副反応中に生じる同一長の断片を偶然生じさせる多数の遺伝子に対応し得る。分析中に二重項として現れるこれらの多数の遺伝子は、簡単なデーベース検索により区別され得ない。
【００４４】
本手法により非多義的に同定され得る遺伝子の数を増大するために、異なる制限酵素を用いて二次の個々のパターンが得られる。これは、組合せ同定アルゴリズムを用いて、パターンを、既知のｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較させ得る。これは、「断片同定」の節で考察される理由のために、非多義的に同定され得る遺伝子の数を非常に増大する。
【００４５】
組合せアルゴリズムは、コンピューターにより以下のように実施され得る：
１．各実験における断片に対応するデータベース中の遺伝子全てが列挙される。これは各実験に関して考え得る発現遺伝子の一覧表を作成する。
２．次に、各実験に関して、断片に明確に対応しない遺伝子が列挙される（即ち、実験で見出されなかった長さを有する断片を示すであろうもの）。これは各実験に関する明確な非発現遺伝子の一覧表を作成する。
【００４６】
３．各実験における非発現遺伝子が次に、各々の他の実験においておそらくは発現される遺伝子の一覧表から除去される。
４．結果は、ほとんどの場合、各断片が単一候補遺伝子同定を保持する各実験に関する一覧表である。
【００４７】
好ましいアルゴリズムは、断片の同定および定量の両方を可能にする。この実施形態は、生物対中の全てのまたはほとんどの遺伝子が同定されている場合に特に適しており、以下のように実施され得る：
１．各実験における断片に対応するデータベース中の遺伝子は全て列挙される。これは、各実験に関しておそらくは発現される遺伝子の一覧表を生成する。各実験における各断片に関して、式Ｆｉ＝ｍ1＋ｍ2＋ｍ3（式中、１、２、３等は遺伝子のｉｄであり、Ｆｉは断片からのシグナルの強度である）の方程式が書き表される。電気泳動における断片ピークに対応し得る各遺伝子は、右手側の一項として現れる。
例えば162 bpでのピークがデータベース中の遺伝子２３４、６４７および７８に対応し、それが強度2546を有する場合には、対応する方程式は以下のように書き表される：
2546＝ｍ234＋ｍ647＋ｍ78
【００４８】
２．次に各実験に関して、断片と明確に対応しない遺伝子が列挙される（即ち、実験においては見出されなかった長さを有する断片を生じるもの）。これは、各実験に関する明確な非発現遺伝子の一覧表を生成する。その一覧表の各遺伝子に関して、方程式は次式のように書き表される：
0＝ｍ657
（式中、上記と同様に６５７は遺伝子ｉｄである）。
【００４９】
３．したがって連立方程式のシステムが、未知数ｍ（＝生物体中の遺伝子数）および方程式ｎ＝ｋｍ（式中、ｋは実験数である）を用いて得られる。全ての遺伝子が全実験において一重項として作動する場合には、各遺伝子はそれ自体の方程式中に出現するため、ｎ＝ｋｍである。それらが二重項または多重項として作動するほど、ｎは小さくなる。しかしながらｎ＞ｍである限り、システムは過大確定され、したがって標準計算方法を用いて解答されて、最小二乗解法を見つけ出す。例えばＭＡＴＬＡＳにおけるバックスラッシュ演算子が用いられ得る。
【００５０】
４．システムの解法は、その発現レベルの最良近似値を各遺伝子に与える。解法は最小二乗解法であり得る。実施される実験数が多いほど、近似値はより良好になる。誤差は、余りをコンピューター処理することにより（即ち、方程式中に概算遺伝子活性を挿入して、算定ピーク強度を得て、それを測定強度と比較することにより）、概算され得る。模擬試験は、50 000の未知数での100 000の方程式のシステムは標準パソコンで16時間で解答され得る、ということを示す。
【００５１】
アルゴリズムは、試料中に存在するｍＲＮＡのプロフィールを生成する。細胞周期の異なる条件または異なる段階下での2つの異なる細胞型または同一細胞型に関するプロフィールが比較され得る。これは、2つの細胞型において示差的に発現される配列の同定を可能にする。さらに発現における定量的ならびに定性的差が同定され得る。
【００５２】
本明細書中に開示されたような本発明のプロファイリング方法の一実施形態に用いるために、制限酵素は一般に、用いられる断片分析法で容易に分離され、長さ確定され得るサイズ分布を得るよう、選択される。制限酵素で切断することにより得られる単離３’末端断片の分布は、1/x（ここで、ｘは長さである）に比例する。分布の規模は、切断の確率によっている。酵素が4096（6塩基対認識配列）で1回切断する場合、分布は一般的キャピラリー電気泳動法のためには広がりすぎる。1/1024または1/512が好ましい。ＨａｅＩＩは、その縮重認識モチーフのために、1/1024を切断する。ＦｏｋＩは、それがフォワードまたはリバース方向に5つの塩基対を認識するため、1/512を切断する。4 bp−カッターは1/256を切断し、これは、二重項が起こりやすい圧縮されすぎた分布を生じる。したがってＨａｅＩＩおよびＦｏｋＩのような酵素が好ましい。
【００５３】
したがって好ましい実施形態に用いられる制限酵素は、1/256〜1/4096 bp、好ましくは1/512または1/1024 bpの切断頻度で、二本鎖ＤＮＡを切断し得る。
制限酵素がＩＩ型制限酵素である場合、ＨａｅＩＩ、ＡｐｏＩ、ＸｈｏＩＩまたはＨｓｐ９２１を用いるのが好ましい。制限酵素がＩＩＳ型制限酵素である場合、ＦｏｋＩ、ＢｂｖＩまたはＡｌｗ２６１を用いるのが好ましい。その他の適切な酵素は、ＲＥＢＡＳＥにより同定される（rebase.neb.com）。
【００５４】
好ましくは制限酵素は、二本鎖ＤＮＡを消化して2〜4個のヌクレオチドの付着末端を提供する。ＩＩＳ型酵素に関しては、4ヌクレオチドの付着末端が好ましい。
上記のように、二次、または二次および三次の異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素（単数または複数）を用いて、試料に関する付加的パターンを生成することにより、より多くの情報が得られる。
【００５５】
ＩＩ型酵素による消化後にＰＣＲのために用いられるフォワードプライマーにおいて、単一可変ヌクレオチド、あるいは1つより多い、例えば2または3つのヌクレオチドの可変ヌクレオチド配列が存在し得る。可変配列中の各位置には、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの各々が集団中に示されるよう、フォワードプライマーが提供され得る。
【００５６】
バックプライマー（オリゴｄＴを含む）においては、ｎは0、1または2であり得る。
アダプター配列における変異性は付着末端により提供されるため、ＩＩＳ型制限酵素が用いられるＰＣＲのために用いられるプライマーには可変性ヌクレオチドは必要でない。一般に、ＩＩＳ型制限酵素が用いられる場合、制限酵素に関して考え得る付着末端は全て集団中で表示され、そして各アダプターが別個の反応容器中の試料の分画に結繋され得るよう、アダプターの集団が提供される。その場合、各反応容器中に用いられるアダプターは既知であり、この情報と二本鎖化産物ＤＮＡ分子の長さとの組合せは所望の特徴的パターンを提供する。
【００５７】
好ましい実施形態では、アダプターを結繋する場合、アダプターは、例えば化学的に、一方の鎖上で遮断され得る。これは、遮断基、例えば３’デオキシオリゴヌクレオチドまたは５’オリゴヌクレオチドを用いて達成され得るが、この場合、リン酸基は窒素、ヒドロキシルまたは別の遮断部分により置き換えられている。これは、他方の非遮断鎖での結繋を可能にし、そして特異性を改良するために用いられ得る。250:1より大きい特異性が得られる。ＰＣＲは、単一結繋鎖から進行し得る。さらに、材料および方法の節に記載されているように、結繋特異性および／または効率を改良する結繋条件が確認されている。これらの条件は4つまでの可変塩基対とのアダプターの結繋において特異性を達成するのに有益である、ということが判明した。
【００５８】
便宜のために、多数のアダプターが単一反応容器中に併合され得るが、この場合、所定の容器中の各々の異なるアダプター（ＩＩＳ型制限酵素消化により提供される潜在的付着末端の集団内の一付着末端と相補的な異なる末端配列を有する）は、異なるプライマーアニーリング配列を含む。例えば3つの異なるアダプターが1反応容器中に併合され得る。対応する一次プライマーが次に用いられ、そしてこれらは、それぞれの異なるアダプターオリゴヌクレオチドから生じる生成物間を区別するために標識され得る。
【００５９】
ＩＩ型酵素が用いられる場合、フォワードプライマーが標識され得るが、しかし個々のポリメラーゼ連鎖反応増幅が別個の反応容器中で実施される場合、フォワードプライマーが用いられることは既知である。そうでなければ、標識化は、フォワードプライマー配列がどちらの二本鎖ＤＮＡ産物分子を提供しているかに関する便利な情報を提供する。
【００６０】
3つの異なるフォワードプライマーＰＣＲ増幅が各反応容器中で実施され、各フォワードプライマーが適切に標識される（任意に標識化サイズマーカーを用いて）、というのが便利である。
【００６１】
分離は、キャピラリーまたはゲル電気泳動を用い得る。反応当たり1標識が用いられ、キャピラリーまたはレーン当たり4つの染料を用い、そのうちの1つはサイズマーカーを保有し得る。
【００６２】
このようにして、一次試料中のｍＲＮＡの一集団に特徴的なパターンが得られる。
本発明のさらなる一態様において、本明細書中の他の箇所でさらに考察されているように、サイズマーカーが提供される。このようなサイズマーカーは、電気泳動において、特に遺伝子断片の長さを確定するためのプロファイリング法において有用であり、その長さは、上記のような遺伝子断片の一集団の各々に関して特長的なシグナルの構成成分として用いられ得る。
【００６３】
本発明のさらなる態様では、本明細書中の他の箇所に記載されたような内部対照が提供される。断片長を確定するための電気泳動のために核酸を負荷した場合、内部対照は負荷効率における差を補償するために用いられ、この場合、一集団中で増幅される各断片の相対量は、上記のように遺伝子断片の集団の各々に関する特徴的シグナルの構成成分として用いられる。
【００６４】
他の箇所で考察されているように、一次試料中に存在するｍＲＮＡ分子の一集団に特徴的な一次パターンは、二次試料中に存在するｍＲＮＡ分子の一集団に特徴的な二次パターンと比較され得る。差は、上記の一次パターンおよび上記の二次パターン間で同定され、その発現が上記一次パターンおよび上記二次パターン間の差をもたらす核酸が同定されるかおよび／または生成され得る。
【００６５】
補足または代替物として、その長さと用いられる一次プライマーまたはアダプターオリゴヌクレオチドの組合せにより二本鎖化産物ＤＮＡに関して提供されるシグナルは、既知の発現ｍＲＮＡに関するシグナルのデータベースと比較され得る。試料中の既知の発現ｍＲＮＡが同定され得る。
【００６６】
次に、一次試料に関する二次の個々のパターンを得るために、異なる制限酵素を用いて、プロトコールが反復され得る。異なる実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素により生成されるパターンが、上記のアルゴリズムにより、既知のｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較され、したがってより強力な断片同定を提供する。その結果生じたプロフィールは次に、2つの細胞集団により発現される配列における定量的または訂正的差を同定するために、異なる条件下でまたは分化の異なる段階で、異なる細胞型からのまたは同一細胞型からの試料のプロフィールと比較され得る。
【００６７】
一般的慣例に従って、予防措置および最適化過程が熟練者により講じられ得る。
標識は蛍光染料であるのが便利であり、標準シーケンシング機を用いて読取られるそれらの長さに基づいて、関連シグナル（例えばゲル上）が電気泳動後に二本鎖化産物ＤＮＡ分子を分離させる。
３’末端ｃＤＮＡ断片のライブラリーは固体支持体上で調製され得るが、この場合、各転写体は独自の断片により示される。ライブラリーは、蛍光プライマーを用いたＰＣＲ増幅後に、キャピラリー電気泳動機上に表示され得る。各電気泳動図中の帯域の数を低減するために、例えば以下の2つの方法（α）および（β）のうちの一方を用いて、初期ライブラリーが細分され得る。
【００６８】
（α）通常ＩＩ型酵素を用いて生成されるライブラリーに関しては、アダプターは各断片の付着末端にライゲートされる。アダプターは、制限酵素により生成される付着末端と相補的な部分およびプライマーがアニーリングする部分を含む。一プライマーアニーリング配列、あるいは最小量の交差ハイブリダイゼーションを示す小数の、例えば2または3の異なる配列を用いて、その少数の個々の反応を単一反応容器中で進行させ得る。次にライブラリーは多数の異なる反応容器中に分割され、各容器中の断片のサブセットは、未知の配列中に突出する2〜3の余分の塩基を保有する３’（オリゴＴ）および５’（ユニバーサルアダプター）末端と適合性であるプライマーを用いてＰＣＲ増幅される。したがって各反応において、突出塩基の異なる組合せは、断片のサブセットの選択的増幅を引き起こす。
【００６９】
（β）ＩＩＳ型酵素により生成されるライブラリー（それらの認識配列の外側を切断して、遺伝子特異的付着末端を提供する）に関しては、ライブラリーは多数の異なる反応容器に分割される。全ての考え得る付着末端がその組中に示されるよう、ユニバーサル不変部分および可変付着末端を含有する一組のアダプターが意図される。各反応容器中で、単一のこのようなアダプターが結繋される。アダプターを保有する各容器中の断片のサブセットは次に、ユニバーサル高緊縮プライマーを用いて増幅される。
【００７０】
両方法において、その結果生じる反応物は、断片長および存在度を定量するキャピラリー電気泳動機上で別個に走行され得るが、これは、原試料中の対応するｍＲＮＡの相対的存在度を示す。
各遺伝子断片に関しては、以下のものが既知である：
−  遺伝子断片（例えば4〜8塩基）を生成するために用いられる制限酵素部位；
−  その長さ；
−  副反応（細分法により示されるが、しかし一般に付加的4〜6塩基に対応する）。
細分が伸長に実行される場合、データベースからの既知の配列を用いて各断片を同定するために十分な情報が生成される。これは、断片長分布（酵素により示される）および細分（突出塩基によりおよび／または付着末端により（ＩＩＳ型）示される）の組合せを選択することにより実施され得る。2塩基（16の副反応）という少ない、あるいは8という多い（65536副反応）数の塩基が用いられ得る；小ゲノムが分析されている場合、少数の副反応で十分であり得る；高処理量分析法が利用可能である場合、多数の副反応が非常に多数の遺伝子の分離を可能にする。実際、4〜6塩基が通常は用いられる。
【００７１】
上記のように、入れ子式ＰＣＲに用いるためのプライマーは、本発明の実施態様として提供される。
【００７２】
本発明は、電気泳動におけるサイズマーカーとして有用なオリゴヌクレオチドも、さらなる態様において提供する。実験の節で以下にさらに考察されるように、本発明のサイズマーカーは、＜1 bpの長さ確定の解明を達成するために用いられ得る。
【００７３】
本発明のさらなる態様に従って、以下の配列を有するタンデム結繋オリゴヌクレオチドを含むサイズ標準が提供される：
5’-CTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTCGCCCTTGGATGCCT-3’（配列番号２８）、および
3’-AGGACGTCCAAATTTGCTTAAGCGGGAACCTACGGAGATC-5’（配列番号２９）
この場合、タンデム結繋オリゴヌクレオチドは、タンデムにライゲートされたオリゴヌクレオチドが上流プライマー結合部位と下流オリゴＡ配列との間に挿入されるベクターから増幅可能である。
【００７４】
ベクターの一集団がさらに提供されるが、この場合、集団中のベクターは、上記の上流プライマー結合部位を結合する上記のプライマーおよび上記のオリゴＡを結合するプライマーを用いて、異なる長さのサイズマーカーオリゴヌクレオチドの一集団を提供する0〜25反復の増幅のタンデムにライゲートされたオリゴヌクレオチドを含む。
【００７５】
サイズマーカーが含入され、そして例えば制限酵素消化によりサイズマーカーが切り出され得る、あるいはサイズマーカーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され得るベクターまたは組換えベクターがさらに提供される。
【００７６】
好ましい実施形態では、サイズマーカーは、上流プライマー結合部位と下流オリゴＡとの間のベクター中に配置されて、異なる数のタンデム反復の挿入物を含有するベクターの一集団中の異なる長さのサイズマーカーの増幅を可能にし、この増幅は、上流プライマー結合部位を結合するフォワードプライマー、ならびに下方鎖タンデム反復オリゴヌクレオチドの最後のヌクレオチドと相補的な３’ヌクレオチドにより、ベクター中のオリゴＡの５’末端に結合するよう固定されるオリゴｄＴプライマーを用いる。
【００７７】
本発明はさらに、内部対照として有用な二本鎖断片を提供するが、この場合、核酸の試料は、電気泳動のために、特にキャピラリー電気泳動機中に投入される。精確な量での内部対照の含入は、機械中に投入される異なる核酸試料の量に関する定量的データの標準化を可能にし、測定量と存在する実際量との関連付けをより精確にさせる。内部対照は、その上方鎖がアダプター配列上方鎖、その後の任意の所望長の任意配列、その後のＴ、ＣまたはＧから選択されるアンカー塩基、その後のＲＴオリゴｄＴプライマーと相補的な配列からなる二本鎖断片である。長さは、試料から来る断片を妨げないよう（短い範囲により多くの断片が存在する）十分長く、例えば約470 bpであるよう選択される。
【００７８】
したがって本発明に従って提供される内部対照の実施形態は、以下の配列を有し得る：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGCGTGTCTTGGATGC(N)pV(A)z’ACCGAAACAGTCCAGCGTGAATTGG-3’（配列番号３０）
（ここで、Ｎは任意のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）であり、そしてｐはポリヌクレオチドの所望の全体長を提供するための数であるが、この場合、ｐは好ましくは300〜700、好ましくは350〜450、好ましくは600〜700であり、Ｖ’はＴ、ＣまたはＧでありそしてｚ’は10〜40、好ましくは15〜30、さらに好ましくは約25である）。数ｚ’は、ＲＴプライマー中のオリゴＴ配列と相補的なオリゴＡ配列を提供するよう選択される（配列番号３３および配列番号３４参照）。任意の配列（Ｎ）pは、好ましくは低断片密度を有する配列である。
【００７９】
内部対照は、その上方鎖がアダプター配列上方鎖（配列番号３１）、任意の所望長の任意配列、Ｔ、ＣまたはＧから選択されるアンカー塩基、ならびにＲＴプライマーと相補的な配列（配列番号３３または配列番号３５）からなる二本鎖分子である。全体的長さは、試料から来る断片を妨げないよう十分長く、例えば約470 bpであるよう選択される。上記の式に従った全体的長さは、（33＋ｐ＋1＋ｚ’＋25）であり、したがってｚ’が10〜40である場合には、約470の全体的長さを有する断片に関しては、ｐは約371〜401であり得る。ＲＴプライマー中のオリゴＴ配列と相補的な任意の所定数のｚ’に関しては、ｐはしたがって所望の全体長に関して選択され得る。
【実施例】
【００８０】
実験的例証および比較ならびに考察
入れ子式ＰＣＲ系を意図したが、これは、入れ子式ＰＣＲを用いた場合でも、二次ＰＣＲ過程におけるプライマーの1つが固定オリゴｄＴプライマーでなければならないという制約を伴って設計された多数のプライマー対の試験を包含する。これは、ポリアデニル化配列の開始の位置を固定し、オリゴｄＴから離れた末端でのアダプター（およびその結果としてプライマー）のアニーリングにより限定される長さを増幅核酸断片に与える。
【００８１】
ｍＲＮＡを含有する複合反応混合物に関して優れた結果を生じる入れ子式ＰＣＲプロトコールを意図したが、この場合、一分画のみがライゲート上流アダプターを保有する。
【００８２】
試験した全てのポリメラーゼが、オリゴｄＴ配列中を延長する場合にスリップする傾向を有するため、蛍光標識を、用いられる場合は、オリゴｄＴプライマー上に載せた（それを他の物の上に載せると、フォワードプライマーは、オリゴｄＴ紐全体に延長される鎖を標識して、途切れ途切れのスプリットピークパターンを生じる）。非標識化一次ＰＣＲを伴う入れ子式ＰＣＲは、アダプターを欠く断片の線状増幅を克服する（それらはオリゴｄＴ配列を有し、そして所望の断片より256倍多くの量で始動するため、それらは二次ＰＣＲにおいて標識される）。
【００８３】
λファージＤＮＡならびに線虫C. Tenans遺伝子ＲＢＤから無作為配列を選択することにより、一次ＰＣＲのためのプライマーを得た。図３はこれらの実験の結果を示し、そして選択された任意のプライマー対（図中の標識化Ｅ／Ｆ）は以下のものであった：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGC-3’（λから−配列番号２６）および
5’-TTCACGCTGGACTGTTTCGG-3’（ＲＢＤから−配列番号２７）。
【００８４】
GB0018016.6およびPCT/IB01/01539に記載されたプライマーの長さを系統的に変更することにより、同様の方法で、二次ＰＣＲのためのフォワードプライマーを得たが、任意のプライマーは13ヌクレオチド長であった（5’-GTGTCTTGGATGC-3’（配列番号３５））。このプライマーを、上記の出願にきさいされたように固定オリゴｄＴプライマーと一緒に用いた：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV（配列番号３６）、即ち(T)25V（ここで、ＶはＡ、ＧまたはＣである）。この系における３’アンカリングは、適正および不適正アンカーを有するポリ（Ａ）を保有する断片に関してサンガーシーケンシング反応を実施することにより示されるように、作動した（表１参照）。表に示したように、鋳型のアンカーと適合した固定プライマーのみが、読取り可能配列を生じる。
【００８５】
GB0018016.6およびPCT/IB01/01539に従ってＲＮＡプロファイリングにＩＩＳ型酵素とともに用いるためのアダプターを、本発明の入れ子式ＰＣＲに対応するよう意図した：
上方鎖：
5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGCGTGTCTTGGATGC-3’（配列番号３１）
および下方鎖：
5’-pNNNNGCATCCAAGACACGCCTGACTCACAAATGTCCT-3’（配列番号３２）
（ここで、NNNNは256個の異なる潜在的付着末端に対応し（各位置でのＡ、Ｔ、ＣおよびＧの組合せ）、そしてｐは５’リン酸塩を意味する）。上方鎖は、例えば３’デオキシシトシンで遮断されて、下方鎖上での結繋を強要され、下方鎖は非リン酸化のままで、上方鎖上での結繋を強要され得る。一次ＰＣＲのための鋳型配列を保有する再設計オリゴｄＴプライマーを、入れ子式ＰＣＲを可能にするためにＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写のために用いた：
5’-CCAATTCACGCTGGACTGTTTCGG(T)z-3’（配列番号３３）
（ここで、ｚは10〜40、好ましくは15〜30、さらに好ましくは約25である（この後者は、5’-CCAATTCACGCTGGACTGTTTCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（配列番号３４）という配列を提供する））。このＲＴプライマーは、固相とともに用いるために任意に５’−ビオチニル化される。本発明の一実施形態に従った完全入れ子式ＰＣＲ系を図２に要約する。
【００８６】
本発明者等はさらに、３’末端ＲＮＡ断片を模倣するよう意図されたサイズおよび定量標準を開発した。このような断片はしばしば、反復性であり、末端にポリアデニレートストレッチを含有する。タンデム反復配列が上流プライマー結合部位と下流オリゴｄＡ配列（例えばオリゴｄＡ（２５））との間のベクター中に挿入されるよう、ベクターに任意40-merをタンデム結繋し、次に異なる数の挿入40-merを有するクローンを選択することにより、サイズ標準を設計した：
5’-CTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTCGCCCTTGGATGCCT-3’（配列番号２８）、および
3’-AGGACGTCCAAATTTGCTTAAGCGGGAACCTACGGAGATC-5’（配列番号２９）
これら2つの鎖は、各末端にオーバーハング（ＣＴＡＧ）を残してアニーリングする。リガーゼを用いて、タンデム反復構造を生成し得る。このようなベクターの一組から、ベクター配列中の固定オリゴｄＴプライマー（例えば（Ｔ）25Ｃ）および上流プライマーを用いて、所望の断片を増幅し得る。上流プライマーの位置を変えることにより、各ベクター（一定数の反復を保有する）は、異なるサイズの断片を生成し得る。例えば一実施形態では、0〜25反復を有するベクターの一集団が提供されて、単一増幅反応における0〜1000 bpに及ぶ断片の生成を可能にする。サイズ標準のいくつかの有益な態様は、以下に関して活用され得る：
【００８７】
１．その一般的組成はｃＤＮＡ３’断片の組成を模倣し、同様の方法でキャピラリー電気泳動による移動を可能にする。
２．全てのまたはいくつかのサイズ標準断片を同時増幅することにより、増幅効率のサイズ依存性に関する標準曲線を作成することができる。このような曲線を用いて、所定の酵素に関する各反応においてこの作用に関して照査し得る。
３．既知の存在度のサイズ標準断片を異なる蛍光染料で標識された未知の断片と同時注入することにより、各サイズ標準ピークの面積を用いて、異なる断片長での示差的注入効率に関して照査し得る。
【００８８】
双曲線関数を標準曲線と適合させて、残余（即ち局所サイジング誤差）をコンピューター処理することにより、サイズ標準を立証した。サイズ標準は、全範囲に亘って、亜塩基対精度を示した。
【００８９】
本発明者等はさらに、3つの異なる末端形成ヌクレオチドを用いてアダプター配列を既知長の断片に結繋し、その結果生じたものをベクター中に挿入することにより、3つ全ての固定オリゴｄＴプライマー（即ち、固定塩基がＡ、ＧまたはＣである場合）を用いて増幅するための内部対照を意図した。この内部対照は、アダプター結繋前に反応に付加され（それが前結繋されるため）、全てのその後の仮定中の示差的ピペット分取ならびに負荷におけるキャピラリー−キャピラリー差に関して照査する。
【００９０】
図５および６は、この系のＲＮＡプロファイリングを用いて得られた結果の特質を要約する。
【００９１】
サブセット（フレーム）を生成するための未知の配列中に突出する１つまたは複数の塩基を有するＰＣＲプライマーの使用
標準技法に従って、ＲＮＡを精製した。ＲＮＡを65℃で10分間変性させて、オリゴテックスOligotexビーズ（Qiagen）に付加し、ビーズと共有結合したオリゴｄＴ鋳型とアニーリングさせた。鋳型としてオリゴテックスビーズに結合されたｍＲＮＡを用いて、一次ｃＤＮＡ合成を実施した。したがってこの一次鎖ｃＤＮＡは、オリゴテックスビーズと共有結合するようになる（Hara et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 7097）。上記のHara et alに記載されたように、二次鎖合成を実施した。要するに、オリゴｄＴによりプライムされたｍＲＮＡから逆転写酵素（ＲＴ）により一次鎖を合成した。ｍＲＮＡを切断するＲＮアーゼ、ならびにＲＮアーゼにより残された小ＲＮＡ断片をプライムオフし、それが進行すると他のＲＮＡ断片を置換するＤＮＡポリメラーゼにより二次鎖を生成した。オリゴテックスビーズに結合された二本鎖ｃＤＮＡを精製し、ＨａｅＩＩで制限消化した。ＨａｅＩＩを用いた。代替的酵素としては、ＡｐｏＩ、ＸｊｏＩＩおよびＨｓｐ９２１（ＩＩ型）、ならびにＦｏｋＩ、ＢｂｖＩおよびＡｌｗ２６１（ＩＩＳ型）が挙げられる。ｃＤＮＡを再び精製して、オリゴテックスに結合されたｃＤＮＡの分画を保持した。
【００９２】
アダプターをｃＤＮＡのＨａｅＩＩ部位に結繋した。アダプターは、ＨａｅＩＩ部位と相補的な配列および余分なヌクレオチドを含有して、全てのｃＤＮＡのＰＣＲのためのユニバーサル鋳型を提供した。次にｃＤＮＡを再び精製して、塩、タンパク質および非結繋アダプターを除去した。
【００９３】
ｃＤＮＡを、96ウエル皿中の96等プールに分けた。各ウエル中の精製断片の一サブセットのみをＰＣＲ増幅するために、多重ＰＣＲを以下のように設計した。
【００９４】
５’プライマーはユニバーサル鋳型と相補的であるが、しかし2つの塩基を未知の配列に延長した。これらの塩基のうちの第一のものは、チミンまたはシトシンで、ＨａｅＩＩ部位の揺らぎ塩基に対応したが、一方、第二のものはグアニン、シトシン、チミンまたはアデノシンのうちのいずれかであった。各５’プライマーを、炭素スペーサーにより、ＡＢＩプリズムキャピラリーシーケンサーにより検出可能な蛍光色素に蛍光的に結合させた。蛍光色素は、二次塩と調和した。各ウエルに、4つ全ての蛍光色素（それゆえ4つの二次塩基全て）を有する4つのプライマーを投入した。半数のウエルには、チミジン一次塩基を有するプライマーを、そして半数にはシトシン一次塩基を有するものを投入した。
【００９５】
３’プライマーはオリゴｄＴであり、したがって元のｍＲＮＡのポリアデニル化配列と相補的であった。未知の配列に延びる3つの塩基を用いて各プライマーを設計し、その第一のものはグアニン、アデノシンまたはシトシンであり、一方他の2つは4つの塩基のいずれかであった。各ウエルに単一３’プライマーを投入した。したがってＰＣＲ反応は384の副反応に多重化した：各々において4つの蛍光色素チャンネルを有する96ウエル。
【００９６】
標準ＰＣＲ反応ミックス、例えば緩衝剤、ヌクレオチド、ポリメラーゼを付加した。ペルティエサーマルサイクラー（ＰＴＣ−200）で、ＰＣＲを実行した。この実験に用いた各プライマー対は、そのプライマー対の独特の4つのヌクレオチド組合せを含有する遺伝子のみを認識し、増幅する。これらの遺伝子の各々のＰＣＲ断片のサイズは、ポリアデニル化およびもっとも近いＨａｅＩＩ部位間の長さに対応する。
【００９７】
その結果生じたＰＣＲ産物をイソプロパノール沈降させて、ＡＢＩプリズムキャピラリーシーケンサーに投入した。したがってＡＢＩプリズムとともに供給された検出器およびソフトウェアを用いて定量された各断片のサイズおよび蛍光により、発現遺伝子を示すＰＣＲ断片を分離した。
【００９８】
用いたプライマーの組合せは、各蛍光チャンネルおよび試料中の〜70ＰＣＲ産物という理論的平均をもたらす（所定の試料中で発現される20％の遺伝子および合計140,000個の遺伝子を基礎にして）。ＨａｅＩＩ制限消化後に既知の遺伝子から生成されるポリアデニル化を含めた３’断片の統計学的サイズ分布の分析は、概算で80％が断片単独のフレームおよび長さに基づいて独自に同定され得る、ということを示した。ＡＢＩプリズムは、1〜2,000ヌクレオチド間に0.5％の分解能を有する。この不確実性を考慮して、〜60％の発現遺伝子が独自に同定され得る。同一プロトコールを用いるが、しかしＨａｅＩＩ酵素を別の5塩基切断制限酵素に置き換えた付加的平行実験を用いると、理論的限界がゲノム中の全転写体の〜96％に、そして実際限界（ＡＢＩプリズムの分解能を考えると）が〜85％に増大される。
【００９９】
試料中の各ｍＲＮＡのレベルは、ＡＢＩプリズムにおけるシグナル強度に対応する。この分析における各断片に独特の情報、即ち8.5ヌクレオチド（例えばＨａｅＩＩ認識配列）およびポリアデニル化からＨａｅＩＩ制限部位までのサイズを併合すると、各ｍＲＮＡの単位元（ＥＳＴ、遺伝子またはｍＲＮＡ単位元）はしたがって確立され得る。全ての既知の遺伝子およびユニジーンunigeneＥＳＴクラスターに関する検索可能データベースを、以下のように構築した。
【０１００】
部分的相同断片のクラスターを含有する公的データベースであるユニジーンをダウンロードした（しかし本発明は、単一またはクラスターか断片の任意の組とともに用いられる）。各クラスターに関しては、ポリＡシグナルおよびポリＡ配列を含有する断片を全て、上流ＨａｅＩＩ部位に関して走査した。ＨａｅＩＩ部位が見出されない場合には、ＨａｅＩＩ部位が見出されるまで、同一クラスターからの配列を用いて、５’に向けて断片を延長した。次に、ＨａｅＩＩおよびポリＡ配列に隣接する塩基対からフレームを確定し、ＨａｅＩＩ消化物の長さを算定した。フレームおよび長さを、迅速読出しのためのデータベースにおける索引として用いた。
【０１０１】
ＡＢＩプリズムからの出力をデータベースに対して実行し、したがってこの試験の試料中に含入されるＲＮＡ中で実際に発現される任意の１つまたは複数の既知の遺伝子およびＥＳＴ発現レベルの同定を可能にした。
【０１０２】
サブセット（フレーム）を生成するためのＩＩＳ型酵素により生成される付着末端との多数アダプターの結繋とその後のユニバーサルプライマーによるＰＣＲ
別の組の実験では、方法を簡素化し、分解能増大を達成した。前節に記載したように固体支持体上でｃＤＮＡを合成したが、今回は磁気ダイナビーズDynaBead（材料および方法に記載されている）を用いる。次にｃＤＮＡを、4または5ヌクレオチドの認識配列を有するクラスＩＩＳエンドヌクレアーゼで切断した。
【０１０３】
クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼは、それらの認識配列から精確な距離で二本鎖ＤＮＡを切断する（クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの例では、認識配列から9および13ヌクレオチド）。クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼのその他の例としては、ＢｂｖＩ、ＳｆａＮＩおよびＡｌｗ２６Ｉ、ならびにSzybalski et al. (1991) Gene, 100, 13-26に記載されたその他のものが挙げられる。上記のように固体支持体を用いて、ｃＤＮＡの３’部分を次に精製した。ｃＤＮＡを次に256の分画に分け、そして異なるアダプターを各分画中の断片に結繋した。
【０１０４】
例えばＦｏｋＩ切断は、4つのヌクレオチド５’オーバーハングをもたらし、各オーバーハングは遺伝子特異的であるがしかし任意の塩基の組合せからなる。これら4つの位置における単一の考え得るヌクレオチド組合せを保有する一アダプターを各分画中に、即ち総計256のアダプターおよび分画を用いた。
【０１０５】
デオキシオリゴヌクレオチドの使用による一鎖上でのアダプターの化学的遮断により、所定のヌクレオチド組合せを保有するアダプターの、断片集団中の相補的ヌクレオチド配列との高特異的結繋を達成した。その結果、一方の鎖に関してのみライゲーションを起こさせた。
【０１０６】
4つの塩基対オーバーハングを保有する単一鋳型を用いて、ライゲーションの特異性を試験した。このオーバーハングと正確に相補てきであるか、あるいは1、2または3つの不適正を有するアダプターを設計した。アダプターを鋳型に結繋し、ＰＣＲを実施して、アダプター配列の各々から得られた生成物の相対量を査定した。
【０１０７】
上方の鎖の３’末端（ならびにＰＣＲ過程での干渉を防止するために下方鎖の３’末端でも）にデオキシヌクレオチドを含むことにより遮断されたアダプターに関して高特異性が達成される、ということが判明した。結果を図３に示す。配列ＧＣＣＧは、鋳型オリゴヌクレオチドの配列と正確に相補的である。この配列を保有する生成物の量は、１つまたは複数の不適正を有する配列を保有する生成物の量の約250倍である、ということが分かる。それゆえ結繋反応は高特異性を伴って進行する、ということが分かる。
【０１０８】
リン酸基が窒素基により置き換えられるオリゴヌクレオチドを下方鎖の５’末端に導入することにより化学的に遮断されたアダプターもライゲーション特異性を改善することが判明したが、しかし改善の程度は上記のアダプターの場合より低いことが判明した。
【０１０９】
さらに、高反応効率を付与する結繋条件を用いた（材料および方法に記載されているような）。
【０１１０】
再び固体支持体を利用して、次にｃＤＮＡを精製して、余分な非ライゲート・アダプターを除去した。アダプター配列の定常部分と相補的な一ユニバーサルプライマーおよびポリＡ尾と相補的なものを用いて、256分画に関してＰＣＲを実施した。
【０１１１】
３’プライマーはオリゴｄＴであり、したがって元のｍＲＮＡのポリアデニル化配列と相補的であった。各プライマーを未知の配列に延びる塩基、グアニン、アデノシンまたはシトシンを用いて設計した（二次またはさらなる塩基が含まれ、グアニン、アデノシン、チミンまたはシトシンのいずれかである）。各ウエルに、3つの考え得る３’プライマーの混合物を投入した。これは、３’プライマーが常にポリメラーゼをポリＡ尾の最初に向けて、限定されたそして再現可能な断片長を生じる、ということを保証した。
【０１１２】
この第二のプロトコールの利点は、多数のフレーム中へのスリッティングが、ＰＣＲでなく結繋過程で起こり、ＰＣＲにおける高緊縮性不変的プライマーの使用を可能にする、という点である。これは、特異性および再現可能性の改善をもたらす。別の利点は、任意の4−塩基オーバーハングと適合性の256のアダプターの一組が、異なる配列を認識するがしかし依然として4塩基オーバーハングを生じるＩＩＳ型酵素を用いた多数の実験において再使用され得る、という点である。
【０１１３】
その結果生じたＰＣＲ産物を精製し、ＡＢＩプリズムキャピラリーシーケンサーに入れた。したがってＡＢＩプリズムとともに提供される検出器およびソフトウェアを用いて定量した各断片のサイズおよび蛍光により、発現遺伝子を表すＰＣＲ断片を分離した。
【０１１４】
ＡＢＩプリズムは4つの検出チャンネルを有するため、異なる蛍光を用いて、4つの別個のフレームを各反応容器中で適用し得る。4つの異なるユニバーサルフォーワードプライマー（５’末端）は、それらの間の非交差ハイブリダイゼーションを用いて設計されていた。これらのプライマーの使用は、256の反応を64に低減させた。代替的実施形態では、3つのプライマーおよび3つのアダプターを用いて、ＡＢＩプリズム中の1つのチャンネルがサイズ参照のために用いることを可能にする。反応の総数はその場合86である。
【０１１５】
オリゴｄＴプライマーのアニーリング温度を増大することも望ましい。これは、任意の配列を有する尾部を付加し（フォーワードプライマーのいずれかと交差ハイブリダイズしない）、オリゴｄＴを含有する長いプライマーを、任意配列と同一の、高融点を有する短いプライマーと混合することにより可能になった。次に低温で最初の数回のサイクルを実施し、この時点ではオリゴｄＴプライマーのみがアニーリングし、その後、全ての断片が付加された尾部を有した。これは次に、長い尾部が存在することによって、その後のサイクルを高温で実施させた（この時点では短いプライマーのみがアニーリングする）。このアプローチはＰＣＲの特異性を増大し、バックグラウンドを低減する。
【０１１６】
用いたプライマーの組合せは、各蛍光チャンネルおよび試料中の〜80ＰＣＲ産物という理論的平均をもたらす（所定の試料中で発現される20％の遺伝子および合計100,000個の転写体を基礎にして）。ＦｏｋＩ制限消化後に既知の遺伝子から生成されるポリアデニル化を含めた３’断片の統計学的サイズ分布の分析は、概算で67％が断片単独のフレームおよび長さに基づいて独自に同定され得る、ということを示した。同一プロトコールを用いるが、しかしＦｏｋＩ酵素を別の5塩基切断クラスＩＩＳ制限酵素に置き換えた付加的平行実験を用いると、理論的限界がゲノム中の全転写体の〜89％に、そして三次実験収率が〜99％に増大される。
【０１１７】
これらの数値は、実際には2つの実験において二重項として作動する遺伝子が、本発明に従って組合せアルゴリズムを用いてその二重項相手の少なくとも1つが発現されない（機会は96％）場合、依然として独特であると同定され得るため、概算値以下である。このそして同様の作用は、上記の計算では無視された。
【０１１８】
この分析における各断片に独特の情報、即ち9ヌクレオチド（例えばＦｏｋＩ認識配列および切断部位）およびキャピラリー配列から得られるポリアデニル化からＦｏｋＩ制限部位までのサイズを併合すると、各ｍＲＮＡの単位元（ＥＳＴ、遺伝子またはｍＲＮＡ単位元）がそれゆえ確立され得る。既知の遺伝子全てに関する検索可能データベースを、上記と同様に構築した。
【０１１９】
断片同定
試料に関する多数の独立したパターンに基づいた本発明の組合せアルゴリズムは、遺伝子同定に関する多数の利点を提供する。
【０１２０】
最初に、実施される実験数が多いほど、所定の遺伝子がそれらのうちの少なくとも1つにおいて一重項断片として作動し、したがって非多義的に同定され得る見込みが高い。所定の遺伝子が全ての実験において二重項として作動する場合でも、実験のうちの1つにおけるその二重項相手のうちの1つが別の実験において一重項として作動すべきであり、そこに存在しない場合には、それは依然として同定され得る。
【０１２１】
例えば遺伝子ＡおよびＢに対応する162 bpで実験Ｉにおける断片が存在し、ＡおよびＣに対応する36 bpに実験ＩＩにおける断片が存在する場合には、実験ＩにおいてはＣを調べ（それがそこで一重項として作動する必要がある場合、214 bpでと表示し、そしてそれが存在しない場合、即ち214 bpでピークでない場合には、Ｉにおいては162 bpでのピークがＡとして同定され得る）、そして実験ＩＩにおいてはＢを調べ得る。この簡単な手法は、2つの実験だけが実施された場合でも、非多義的に同定され得る遺伝子の数を大いに増大する。
【０１２２】
ＡＢＩプリズムキャピラリー電気泳動機からの概算誤差率を用いたコンピューターシミュレーションは、全遺伝子の85〜99％が、正常断片長誤差の存在下でも正しく同定され得る、ということを示す。
【０１２３】
第二に、これらの組合せアルゴリズムはともに、断片サイズまたは遺伝子３’末端長についての不確実性を克服するために用いられ得る。これは、試料から得られる断片ピーク数＋明らかに発現されないとして排除され得る遺伝子の数が候補遺伝子の総数（即ち生物体中の遺伝子数）より大きい限り、アルゴリズムは各断片に遺伝子を割り当てるのに成功する。数学形態のアルゴリズムに関しては、方程式の数が候補遺伝子の数より大きい場合に、システムは解答され得る。
【０１２４】
したがって候補遺伝子数は、各断片に関する正しい候補を首尾よく選択する能力を失うことなく、ある点まで増大され得る。断片の長さが未知である場合、考え得る断片長の各々を有する断片との適正は、存在し得る遺伝子の一覧表に加えられ得る。同様に、データベース中の３’末端の位置が未知である場合には、断片により示される位置に３’末端を有する全ての遺伝子が、存在し得る遺伝子の一覧表に付加され得る。擬陽性は、上記の条件を満たすならば、アルゴリズムにより自動的にその後排除される。
【０１２５】
擬陽性を排除するシステムの力は、断片の数ならびに明確に存在しないとして排除され得る遺伝子の数の両方を増大するので、より多数の独立したプロフィールを実施することにより増大され得る。
【０１２６】
細分の最適数が確定され得る
反応を細分する目的は、多遺伝子に対応する断片ピークの数を提言するためである。
2つの因子：副反応の数および断片のサイズ分布：が二重項の数を確定する。
【０１２７】
最適サイズ分布は、検出方法によっている。キャピラリー電気泳動は、約500 bpまでの単一塩基対分解能を、その後は約0.15％分解能を有する。したがって広がりすぎる分布は有用でない。しかし狭い分布は、その場合、遺伝子が何がなんでも分解能を解明し得ない真の二重項（正確に同じ長さを有する）として作動し始めるため、同様に困難を示し得る。
【０１２８】
確率1/512で切断する酵素を用いて切断する場合に、長さｎの断片を見出す確率は、以下のように示される：
Ｐ1（ｎ）＝（511/512）n（1/512）
【０１２９】
反応が192の副反応に分けられる場合、所定の副反応において長さｎの断片を見つけ出す確率は、以下のように示される：
Ｐ2（ｎ）＝（511/512）n（1/512）（1/192）
【０１３０】
Ｍ個の考え得る遺伝子からの単一遺伝子に対応するこの断片の確率は、以下のように示される：
Ｐ独自（ｎ）＝Ｐ2（ｎ）（１−Ｐ2（ｎ））(M-1)
【０１３１】
言い換えれば、これは、一遺伝子がその長さの一断片を提供し、他の全てが提供しない確率である。
【０１３２】
単一実験において独自に同定され得る遺伝子の総数は、全検出可能長全体を合計することにより得られる。
【０１３３】
計器の不正確さを考慮に入れると、Ｐ独自は、以下のようになる：
Ｐ独自（ｎ）＝Ｐ2（ｎ）（（１−Ｐ2（ｎ））(M-1)）(1+2En)
（式中、Ｅは不正確さの大きさである）。これは、他の遺伝子が同一長＋／−因子Ｂを有さない場合、独自の遺伝子が同定され得る、ということを符号で表している。
【０１３４】
例えばヒトにおいて50 000個の遺伝子が存在する場合、われわれの計器は0.2％の誤差を融資、1000 bpまでの断片を検出し得るし、全ての配列の1/512を切断する酵素を用いてわれわれは切断して、192の副反応に細分し、次に、単一実験では独自に全遺伝子の56％を、2つの実験では80％、そして3つの実験では96％を同定し得る。
【０１３５】
Mathematicaにおいて、独自に同定可能な遺伝子の数は以下のように算定し得る：
Prob[n_]:=（511/512）^ｎ*1/512*1/192
Sum[50000* Prob[n]((1- Prob[n]) ^50000) ^1 + 0.002n,{n,1,1000}]*192
パラメーターを変えることにより、同定確率に及ぼす作用を迅速に観察し得る。
【０１３６】
上記のように、より多くの実験を実施する場合、より強力な組合せ同定法が用いられ得るが、しかしそれらは全て、増大数の単集合遺伝子から利益を得る。
【０１３７】
材料および方法
下記に、元のプライマーを、GB0018016.6およびPCT/IB01/01539の場合と同様に記載する。したがってプライマーＡおよびＢをＰＣＲのために用いて、アダプターからプライムする。本発明の実施態様に従って、特に本発明の態様の構成成分として本明細書中に開示されたアダプターおよび／またはその他のプライマーと組合せて、プライマー対ＥおよびＦを代わりに用い得る。
セクション１  −  ＩＩ型制限酵素を使用
【０１３８】
総ＲＮＡからのｍＲＮＡの単離
純ｍＲＮＡがビーズに結合されるまで、オリゴテックスOligotexプロトコールに従って総ＲＮＡ20 μｇからｍＲＮＡを単離し、洗浄して、清浄にする。回転沈降させて、20 μlの蒸留水中に再懸濁する。懸濁液は、0.5 mgのオリゴテックスを含有するはずである。
【０１３９】
反応物を2 x 10 μl中で細長断片化する。70℃で10分間加熱変性して、次に氷上で急冷する。以下のプロトコールの各々を用いて、一次鎖ｃＤＮＡを合成する：
【０１４０】
ＡＭＶを用いた一次鎖ｃＤＮＡ合成
一次鎖緩衝液を付加する：5 μlの5x ＡＭＶ緩衝液、2.5 μlの10 mMｄＮＴＰ、2.5 μｌの40mMピロリン酸ナトリウム、0.5 μlのＲＮアーゼ阻害剤、2 μlのＡＭＶ  ＲＴ、2.5 μlの5 mg/mlＢＳＡ。
【０１４１】
42℃で60分間インキュベートする。総容積：25 μl（注：より多くの希釈オリゴテックス懸濁液を得るためには、100 μl中で実行するのがより良好であり得る）。
【０１４２】
ＡＭＶを用いた二次鎖ｃＤＮＡ合成
12.5 μlの10x ＡＭＶ二次鎖緩衝液（500 mMのトリス、ｐＨ7.2、900 mMのＫＣｌ、30 mMのＭｇＣｌ2、30 mMのＤＴＴ、5 mg/mlのＢＳＡ）、29 Uの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、1 UのＲＮアーゼＨを付加して、ｄＨ2Ｏで最終容積を125 μlとする。
14℃で2時間インキュベートする。
【０１４３】
制限酵素切断および脱リン酸化
オリゴテックス／ｃＤＮＡ複合体を回転沈降させて、1.8 μlの10x ＦｏｋＩ緩衝液、16.2 μｌのＨ2Ｏ、2 μｌのＦｏｋＩ、1 μの仔ウシ腸ホスファターゼ（次の過程における自己結繋を防止するために付着末端を脱リン酸化するために含まれる）中に再懸濁する。
37℃で1時間インキュベートする。
回転沈降させて、品質管理のために上清を除去する。
【０１４４】
ホスファターゼ不活性化
70 μlのＴＥを付加する。70℃に10分間加熱する。室温に冷却して、10分間放置する。
【０１４５】
結繋（ライゲーション）
2 μlの10x結繋緩衝液、100xアダプター、2 μlのリカーゼ中に再懸濁し、Ｈ2Ｏで20 μｌとする。
オリゴテックスから二次鎖を徐々になくす。ローターが始動すると、ビーズおよび一次鎖がペレット化され、Ｔａｑが同時に反応ミックス中に滴下する。
【０１４６】
キャピラリー電気泳動による定量
長いキャピラリーおよび長い試験時間を用いて、断片分析に関して設定されたＡＢＩプリズム3700に96ウエルプレートを載せる。出力は、検出された各ピークに関する断片長（塩基対）およびピーク高／面積の表である。
例えば、データベースを参照しながら上記と同様に、同定に向けて進行する。
【０１４７】
セクション２  −  ＩＩＳ型制限酵素を使用
ストレプトアビジンダイナビーズの調製（ビーズにオリゴ体を結合する）
【０１４８】
200 μlのＢ＆Ｗ緩衝液（Dynabeads）中で200 μlのダイナビーズを洗浄し、次に400 μlのＢ＆Ｗ緩衝液中にビーズを再懸濁する。
【０１４９】
400 μlのＨ2Ｏ中に1250 ｐｍｏｌのビオチンＴ２５プライマーを懸濁し、ビーズと混合する。室温で15分間インキュベートする。手短に回転し、次に600 μlの上清を除去する。ビーズを計量分配し、少なくとも30秒間、磁気上に置く。
【０１５０】
ビーズを200 μlのＢ＆Ｗ緩衝液で2回洗浄し、次に200 μlのＢ＆Ｗ緩衝液中に再懸濁する。
【０１５１】
総ＲＮＡからのｍＲＮＡのビーズとの結合
200 μlの再懸濁ビーズを1.5 mlのエッペンドルフ管中に移す。少なくとも30秒間、磁気上に置く。上清を除去し、100 μlの結合緩衝液（20 mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ7.5；1.0 MのＬｉＣＬ；2 mMのＥＤＴＡ）中に再懸濁する。洗浄を反復し、100 μlの結合緩衝液中にビーズを再懸濁する。
【０１５２】
〜75 μgの総ＲＮＡまたは2.5 μgのｍＲＮＡをＲＮアーゼ無含有水または10 mMトリス−ＨＣｌで100 μlに調整する。
【０１５３】
ビーズを予熱ＲＮＡ溶液と十分に混合する。室温（ｒｔ）で3〜5分間回転するかまたはそうでなければ混合することにより、アニーリングする。少なくとも30秒間、磁気上に置く。200 μlの洗浄緩衝液Ｂ（10 mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ7.5；0.15 MのＬｉＣＬ；1 mMのＥＤＴＡ）で2回洗浄する。
【０１５４】
一次鎖合成
上記のように磁気を用いて、200 μlの1x ＡＭＶ緩衝液（Promega）で少なくとも2回ビーズを洗浄する。5 μlの5xＡＭＶ緩衝液；2.5 μｌの10 mMｄＮＴＰ；2.5 μｌの40 mMピロリン酸ナトリウム、0.5 μlのＲＮアーゼ阻害剤、2 μlのＡＭＶ  ＲＴ（Promega）、1.25 μlの10 mg/mlＢＳＡ；11.25 μlのＨ2Ｏ（ＲＮアーゼ無含有）（総容積25 μl）と一緒に混合する。
42℃で1時間インキュベートする。
【０１５５】
二次鎖合成
100 μlの二次鎖混合物（6.25 μlのトリス、ｐＨ7.5；11.25 μlの1 MＫＣｌ；15 μlのＭｇＣｌ2；3.75 μlのＤＴＴ；6.25 μlのＢＳＡ；1 μｌのＲＮアーゼＨ、3 μｌのＤＮＡｐｏｌＩ；53.5 μlのＨ2Ｏ）（総容積100 μl）を直接一次鎖反応物に付加する。
14℃で2時間、混合しながらインキュベートする。
【０１５６】
切断
ＴＥ（10 mMのトリス、1 mMのＥＤＴＡ、ｐＨ7.5）で2回、100〜200 μlのＮＥＢ緩衝液で2回、磁気上でビーズを洗浄する。30 μlのＮＥＢ緩衝液中に再懸濁する。
1 μlの適切なＩＩＳ型酵素を付加し、混合する。
37℃で1〜2時間インキュベートし、しばしば混合する。上記のように磁気を用いて1350 μl中でＴＥで3回、次に1350 μlの結繋緩衝液で2回洗浄する。
リガーゼ酵素を含有する1606 μlの2xリガーゼ緩衝液中に再懸濁する。
アダプター結繋（256の異なる容器中）
総容積10 μlに対して4 μl  中に30 pmolのアダプターを含有する256のウエル中に6 μl切断鋳型／ウエルを分取する。混合しながら37℃で1時間インキュベートする。ＴＥ80 μl中で2回洗浄し、20 μｌのＨ2Ｏ中に希釈する。
【０１５７】
アダプターおよびプライマー設計
これらの実施態様におけるアダプターを以下に示す（５’−３’）。各対は相補的である短い鎖と長い鎖からなる。長い鎖は、ＦｏｋＩ切断により生成される付着末端と相補的な4つのヌクレオチドを有する（4x4x4x4の合計＝256の考え得るアダプター）。
【０１５８】
上方の短いほうの鎖の標識化バージョンも、フォワードＰＣＲプライマーとして役立つ。
【０１５９】
5’-CCAAACCCGCTTATTCTCCGCAGTA-3’（配列番号４）
5’-NNNNTACTGCGGAGAATAAGCGGGTTTGG-3’（配列番号５）
【０１６０】
5’-GTGCTCTGGTGCTACGCATTTACCG-3’（配列番号６）
5’-NNNNCGGTAAATGCGTAGCACCAGAGCAC-3’（配列番号７）
【０１６１】
5’-CCGTGGCAATTAGTCGTCTAACGCT-3’（配列番号８）
5’-NNNNAGCGTTAGACGACTAATTGCCACGG-3’（配列番号９）
【０１６２】
アダプターの各々を一方の鎖上で遮断する。これは、以下に示すように、デオキシ（ｄｄ）オリゴヌクレオチドを用いて、３’末端で上方鎖を遮断することにより達成され得る。
【０１６３】
5’(OH)-CCAAACCCGCTTATTCTCCGCAGTddA-3’（配列番号４）
5’(P)-NNNNTACTGCGGAGAATAAGCGGGTTTGG-(OH)3’（配列番号５）
【０１６４】
5’(OH)-GTGCTCTGGTGCTACGCATTTACCddG-3’（配列番号６）
5’(P)-NNNNCGGTAAATGCGTAGCACCAGAGCAC-(OH)3’（配列番号７）
【０１６５】
5’(OH)-CCGTGGCAATTAGTCGTCTAACGCddT-3’（配列番号８）
5’(P)-NNNNAGCGTTAGACGACTAATTGCCACGG-(OH)3’（配列番号９）
【０１６６】
あるいは遮断は、下方鎖の５’末端のリン酸基を窒素、ヒドロキシルまたはその他の遮断部分で置き換えることにより達成され得る。
【０１６７】
リバースプライマーを以下に示す：
5’-CTGGGTAGGTCCGATTTAGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’（配列番号１０）
5’-CTGGGTAGGTCCGATTTAGGC-3’（配列番号１１）
ここで、3つの長いリバースプライマーの全体に関して、Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧである。
【０１６８】
ユニバーサルＰＣＲ
18 μlのＰＣＲ緩衝液（緩衝剤、酵素、ｄＮＴＰ、3つのユニバーサルアダプタープライマー、アンカー化オリゴ−Ｔプライマー）を付加する。
【０１６９】
各分画を以下のように増幅する：
ホットスタート
加熱する
Ｔａｑを70℃で付加する（または熱活性化Ｔａｑを用いる）
2サイクル
94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で1分
25サイクル
94℃で30秒、61℃で30秒、72℃で1分
最後に
72℃で5分、4℃に冷却
【０１７０】
温度変動を最小限にし、そしてプラトー期のモニタリングを可能にするためには、回転実時間ＰＣＲ装置が好ましい。このような機械を用いて、Ｔａｑポリメラーゼを各管のカップ中に投入し、ホットスタートを実施した後、ローターを始動して、オリゴテックスから二次鎖を徐々になくす。ローターが始動すると、ビーズおよび一次鎖がペレット化され、Ｔａｑが同時に反応ミックス中に滴下する。
【０１７１】
キャピラリー電気泳動による定量
長いキャピラリーおよび長い試験時間を用いて、断片分析に関して設定されたＡＢＩプリズム3700に96ウエルプレートを載せる。出力は、検出された各ピークに関する断片長（塩基対）およびピーク高／面積の表にある。
【０１７２】
考察
ほとんどのマイクロアレイ（アフィメトリックスAffymetrixを除く）は、ハイブリダイゼーションに基づいて、ガラスまたは膜表面にｃＤＮＡをスポッティングする。これは、本発明の実施形態を用いて1日で実施され得るものに匹敵する分析に関するゲノム中の各遺伝子のｃＤＮＡのクローニング、増幅およびスポッティングを要する。
【０１７３】
マイクロアレイは全て、各遺伝子についての従来の知識、例えばｃＤＮＡのクローニングおよびシーケンシング、あるいは発現配列タグを要する。本発明の実施形態は、それらの存在に関するいかなる従来の情報もなしに、ゲノム中に発現される全ての遺伝子の同定および定量を可能にする。
【０１７４】
目下、哺乳類における最大数の遺伝子の発現の定量を可能にするアフィメトリックスは、最大で32,000個の遺伝子を網羅する。本発明の実施形態は、ゲノム中の全遺伝子に適用され得る。
【０１７５】
マイクロアレイベースの技法は全て、アレイが生成される種に限定され、そして当該種に関する配列情報の利用可能性によっている。本発明の実施形態は、いかなる従来のｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列情報も必要とせずに、植物から動物までの全ての種に適用され得る。
【０１７６】
マイクロアレイはしばしば、スプライスバリアント間を区別できず、そして常に稀な対立遺伝子を検出できない。
【０１７７】
本発明の実施形態は、試料中に存在する実際の転写体の検出を可能にする。
マイクロアレイベースの技法は全て、ＤＮＡハイブリダイゼーション後の量の間接的測定に基づいている。実コピー数は、本発明を用いて定量され得る。
【０１７８】
ハイブリダイゼーションベースの技法は、非常に予測不可能な、そして非線状性のハイブリダイゼーション動態によっている。本発明の実施形態は、指数関数的な再現可能な競合的ポリメラーゼ連鎖反応を用いる。
【０１７９】
本発明の実施形態はある種の競合的ＰＣＲに基づいており、即ち反応中の断片は全て同一プライマー対（または同数の非常によく似たプライマー対）により増幅されるため、誤差が最小限にされる。本発明は、広範な動的範囲に亘って遺伝子発現の約2倍差（約2.5の大きさのオーダー）を熟練研究者に再現可能的に検出させ、他の技法と非常に競合的である。
【０１８０】
本発明の実施形態はＰＣＲベースであるため、感受性は出発物質と交換され得る。言い換えれば、少量のＲＮＡを用いて開始し、少ない余分のＰＣＲサイクルを実行することが可能である。ＰＣＲは指数関数的であるため、余分のサイクルは、約2〜3％だけ実験変動に付加しながら、物質要件を削減する。したがって有用なデータは、精度はより多数の試料を用いて増大される一方で、2〜3個という少ない、あるいは1個の細胞からでさえ、生成され得る。
【０１８１】
有意のパーセントの遺伝子の遺伝子発現の定量を可能にするマイクロアレイ技法は、非常に広範囲に及ぶ。特許請求された32,000の独自ＥＳＴを網羅するアフィメトリックスマイクロアレイは、400 USD／実験の費用を要する。
【化１】
2005515792.tif 000002
【化２】
2005515792.tif 000003
【０１８２】
以下は、本発明の好ましい実施形態であり、この場合、本発明の１つまたは複数のプライマーと、本発明のサイズ標準および／または内部対照の任意の組合せが用いられ得る：
【０１８３】
１．試料中に存在するｍＲＮＡ分子のプロフィールの提供方法であって、以下の：
鋳型としてｍＲＮＡを用いて各ｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより一次ｃＤＮＡ鎖の集団を提供し；
ｍＲＮＡを除去し；
各一次鎖と相補的な二次ｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供し；
ＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素で二本鎖ｃＤＮＡ分子を消化して、消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供するが、各消化二本鎖ｃＤＮＡ分子は制限酵素消化により提供される付着末端を有し；
アダプターオリゴヌクレオチドの集団を消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端に結繋するが、アダプターオリゴヌクレオチドは各々、付着末端と相補的な末端配列およびプライマーアニーリング配列を含み、それにより各々が一次鎖および二次鎖を含む二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を提供するが、この場合、二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖は各々３’末端アダプターオリゴヌクレオチドを含み、そして二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖は各々３’末端ポリＡ配列を含み；
【０１８４】
前記二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製し；
一次プライマーの集団および二次プライマーを用いてｍＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有する二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子に関してポリメラーゼ連鎖反応を実施するが；
この場合、一次プライマーは各々、アダプターオリゴヌクレオチドのプライマーアニーリング配列とアニーリングする配列を含み、そして
制限酵素がＩＩ型酵素である場合、一次プライマーは各々少なくとも１つの３’末端可変ヌクレオチドをそして任意に１つより多い３’末端可変ヌクレオチドを含むが、この場合、可変ヌクレオチド、あるいは可変ヌクレオチド内の対応する位置では各一次プライマーは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択されるヌクレオチドであるか、あるいはそれらを有し、それにより一次プライマーの集団が一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内のプライマーアニーリング配列と隣接して、一次プライマーの集団内の一次プライマーの可変ヌクレオチド（単数または複数）と相補的なヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；あるいは
【０１８５】
制限酵素がＩＩＳ型酵素である場合、一次プライマーは一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は、鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内に、アダプターオリゴヌクレオチドの集団内のアダプターオリゴヌクレオチドの末端配列と相補的なヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
【０１８６】
二次プライマーは、オリゴＴ配列ならびに次式：（Ｇ／Ｃ／Ａ）（Ｘ）n（式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｎはゼロ、少なくとも１または１より大きい数である）に従う３’可変部を含み；それにより、二次プライマーの集団が二次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖内のポリＡと隣接して、二次プライマーの集団内の二次プライマーの可変部分と相補的な単数または複数のヌクレオチドを含む鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
【０１８７】
それによりポリメラーゼ連鎖反応増幅が二本鎖化産物ＤＮＡ分子の集団を提供し、この各々は、一次鎖産物ＤＮＡ分子および二次鎖産物ＤＮＡ分子を含み、
長さに基づいて二本鎖化産物ＤＮＡ分子を分離し；そして
上記二本鎖化産物ＤＮＡ分子を検出し；
【０１８８】
それにより試料中に存在するｍＲＮＡ分子の集団に関するパターンが、上記二本鎖化産物ＤＮＡ分子の長さと、（ｉ）一次プライマー可変ヌクレオチド（単数または複数）（ＩＩがた制限酵素が用いられる場合）、あるいは（ｉｉ）アダプターオリゴヌクレオチド末端配列（ＩＩＳ型制限酵素が用いられる場合）の組合せにより提供される
実施形態。
【０１８９】
入れ子式ＰＣＲが開示されたように実施されるこのような実施形態では、言及された一次および二次プライマーは、入れ子式ＰＣＲの二次ＰＣＲに用いられ（それぞれ二次フォワードプライマーおよび二次バックプライマーと呼ばれる）が、その前には、一次フォワードプライマーおよび一次バックプライマーが用いられて二次ＰＣＲのための鋳型を提供する一次ＰＣＲが実行される。一次ＰＣＲにおいては、付着アダプターオリゴヌクレオチドの下方鎖の３’部分とアニーリングする一次フォワードプライマーが用いられ、一方、ポリＡ領域から伸びるアダプターの上方鎖の３’部分とアニーリングするバックプライマーが用いられる。
【０１９０】
２．以下の：
二次の、異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて試料に関する付加的パターンを生成し；そして
別個の実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて生成されたパターンを、既知のｍＲＮＡに関して確定されたかまたは予測されたシグナルのデータベースと比較する
ことをさらに包含する実施形態。
【０１９１】
別個の実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて生成されるパターンを、以下の：
（ｉ）各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに対応し得るデータベース中の全ｍＲＮＡを列挙して、各実験に関して試料中におそらくは存在するｍＲＮＡ分子の一覧表を作成し、そして
（ｉｉ）各実験に関して、二本鎖化産物ＤＮＡ分子と明確に対応しないｍＲＮＡを列挙して、各実験に関して試料中に明確に存在しないｍＲＮＡの一覧表を作成し、次に
【０１９２】
（ｉｉｉ）各実験に関しておそらくは存在するｍＲＮＡ分子の一覧表から試料中に明確に存在しないｍＲＮＡ分子を除去し、そして
（ｉｖ）試料中におそらくは存在するｍＲＮＡ分子ならびに試料中に明確に存在しないｍＲＮＡ分子の一覧表を、（ｉｉｉ）における各実験に関して作製された各一覧表を組合せることにより作成する；
ことにより、ｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較し、
それにより試料中に存在するｍＲＮＡ分子のプロフィールを提供する
ことを包含する実施形態。
【０１９３】
４．  別個の実験において少なくとも2つの異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて生成されるパターンを、以下の：
（ｉ）各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに対応し得るデータベース中の全ｍＲＮＡを列挙し、そして式Ｆｉ＝ｍ1＋ｍ2＋ｍ3（式中、Ｆｉは断片からのシグナルの強度であり、数字はデータベース中のｍＲＮＡの単位元である）という一組の方程式を作成し（この場合、二本鎖化産物ＤＮＡに対応し得る各ｍＲＮＡは右手側の項として現れる）；
（ｉｉ）各実験に関して、各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに明確に対応しないｍＲＮＡを列挙し、そして各実験における二本鎖化産物ＤＮＡに明確に対応しない各遺伝子に関して式０＝ｍ4（式中、数字はｍＲＮＡ単位元である）の方程式を書き；
（ｉｉｉ）連立方程式のシステムを作成するために方程式組を併合するが、この場合、方程式の数値は生物体中の遺伝子の数より大きく；
（ｉｖ）連立方程式のシステムを解答することにより、各遺伝子の発現レベルの量を確定する
ことによりｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較し、
それにより試料中に存在するｍＲＮＡ分子のプロフィールを提供する
ことを包含する実施形態。
【０１９４】
５．アダプターオリゴヌクレオチド（付着アダプターオリゴヌクレオチド）を結繋する前に、３’末端ポリＡ配列を含む鎖を含む消化二本鎖ｃＤＮＡ分子を精製することを包含する実施形態。
【０１９５】
６．以下の：
ｉ）前記一次ｃＤＮＡ鎖を合成する前に、各ｍＲＮＡ分子のポリＡ尾を支持体に結合されたポリＴオリゴヌクレオチドとアニーリングすることにより固体支持体上に試料中のｍＲＮＡ分子を固定し、それにより支持体に結合された二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供し；そして
ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ分子を消化して支持体に結合された消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供後、アダプターオリゴヌクレオチドの前記集団を消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端に結繋する前に、支持体に結合されていない物質を洗い落とすことにより支持体に結合された消化二本鎖ｃＤＮＡ分子を精製し；そして
ｉｉｉ）アダプターオリゴヌクレオチドの集団を消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端に結繋して、前記二本鎖ｃＤＮＡ鋳型分子を提供後、二本鎖ｃＤＮＡ分子に関する前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施する前に、支持体に結合されていない物質を洗い落とすことにより、二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製する
ことを包含する実施形態。
【０１９６】
７．制限酵素が1/256〜1/4096 bpの切断頻度で二本鎖ＤＮＡを切断する実施形態。
８．切断頻度が1/512または1/1024 bpである実施形態。
９．制限酵素がＩＩ型制限酵素である実施形態。
１０．制限酵素が二本鎖ＤＮＡを消化して、2〜4個のヌクレオチドの付着末端を提供する実施形態。
【０１９７】
１１．制限酵素がＨａｅＩＩ、ＡｐｏＩ、ＸｈｏＩＩおよびＨｓｐ９２１からなる群から選択される実施形態。
１２．一次プライマー（二次フォワードプライマー）が各々1個の可変ヌクレオチドを有する実施形態。
１３．一次プライマーが各々2個の可変ヌクレオチドを有し、その各々がＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり得る実施形態。
１４．一次プライマー（二次フォワードプライマー）が各々3個の可変ヌクレオチドを有し、その各々がＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり得る実施形態。
【０１９８】
１５．Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのいずれかが上記可変ヌクレオチドであるかまたは一次プライマーの可変ヌクレオチド内の上記の対応する位置に存在することを示すために各一次プライマー（二次フォワードプライマー）が標識で標識される実施形態。
１６．制限酵素がＩＩＳ型制限酵素である実施形態。
１７．制限酵素が二本鎖ＤＮＡを消化して、2〜4個のヌクレオチドの付着末端を提供する実施形態。
【０１９９】
１８．制限酵素がＦｏｋＩ、ＢｂｖＩ、ＳｆａＮＩおよびＡｌｗ２６１からなる群から選択される実施形態。
１９．アダプターオリゴヌクレオチドの集団中のアダプターオリゴヌクレオチドが異なる末端配列を有する異なるアダプターオリゴヌクレオチドからの別個の反応容器中の消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の付着末端に結繋される実施形態。
２０．各反応容器が単一アダプターオリゴヌクレオチド末端配列を含入する実施形態。
２１．各反応容器が多数のアダプターオリゴヌクレオチド末端配列を含入し、反応容器中の各アダプターオリゴヌクレオチドが同一反応容器中に異なる末端配列ならびに末端配列からのプライマーアニーリング配列および他のアダプターオリゴヌクレオチド配列のプライマーアニーリング配列を含み、各反応容器中のポリメラーゼ連鎖反応増幅に用いられている多数の一次プライマーに対応する実施形態。
【０２００】
２２．ｎが0である実施形態。
２３．ｎが1である実施形態。
２４．ｎが2である実施形態。
２５．一次プライマー（二次フォワードプライマー）または二次プライマー（二次バックプライマー）が標識される実施形態。
２６．標識がシーケンシング機により読取り可能な蛍光染料である実施形態。
２７．二本鎖ＤＮＡ分子がシーケンシングゲルまたはキャピラリー上での電気泳動により長さに基づいて分離され、パターンが電気泳動図として生成される実施形態。
２８．一次試料中に存在するｍＲＮＡ分子の一次プロフィールが二次試料中に存在するｍＲＮＡの二次プロフィールと比較される実施形態。
【０２０１】
２９．上記一次プロフィールと上記二次プロフィール間の差が同定される実施形態。
３０．その発現が上記一次プロフィールと上記二次プロフィール間の差をもたらす核酸が同定されおよび／または生成される実施形態。
３１．既知のｍＲＮＡの試料中での存在が同定される実施形態。
【０２０２】
表１
アンカリング特異性の確定。ポリアデニル化尾を指示アンカー塩基（第一段）とともに保有する6つの異なるクローン（列）を、固定プライマー（最上列に示されている）を用いてシーケンシングした。＋は、良好な配列を示し、−は、配列の不存在を示す。固定プライマーが不適正アンカーを有するカラムから生成物を生じた例は示されていない。Ｔ３およびＴ７プライマーを、陽性対照として用いた。
【０２０３】
【表１】
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【０２０４】
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は、ＩＩ型制限酵素（ＨａｅＩＩ）を用いた、試料の単一パターン特徴の生成へのアプローチを略記する。
【図２】図２は、ＩＩＳ型制限酵素（ＦｏｋＩ）を用いた、試料の単一パターン特徴の生成への代替的アプローチを略記する。
【図３】図３は、一鎖上で遮断されたアダプターに関する結繋の特異性を査定する実験の結果を示す。4つの塩基対一本鎖オーバーハングを有する単一鋳型オリゴヌクレオチドを用い、これと精確に相補的な、あるいは1、2または3つの不適正を伴う一本鎖化領域を有するアダプターを設計した。アダプターを鋳型オリゴヌクレオチドに結繋し、生成物をＰＣＲを用いて増幅した。
【０２０６】
【図４】図４は、本発明の組合せアルゴリズムを用いて、試料中に存在するｍＲＮＡ分子に関する全プロフィールを生成するための方法の実施形態を略記する。過程Ｉ〜ＶＩＩを以下に示す：  過程Ｉでは、ｍＲＮＡが、オリゴ−ｄＴ尾を保有する磁気ビーズ上に捕捉される。  過程ＩＩでは、相補的ＤＮＡ鎖が合成され、依然としてビーズに結合される。  過程ＩＩＩでは、ｍＲＮＡが取り出され、二次ｃＤＮＡ鎖が合成される。二本鎖ｃＤＮＡは、ビーズに共有結合されたままである。  過程ＩＶでは、二本鎖ｃＤＮＡが2つの別個のプールに分割される。各プールは、異なる制限酵素で消化される。ｍＲＮＡの３’末端に対応するｃＤＮＡの配列は、ビーズに結合されたままである。  過程Ｖでは、アダプターがｃＤＮＡの消化末端にライゲートされる。本発明のこの実施形態では、256個の異なるアダプターが256の別個の反応において結繋される。さらにまた本発明のこの実施形態では、他方の鎖からのみＰＣＲが進行するよう、アダプターが一方の鎖上で遮断される。  過程ＶＩでは、分画の各々が単一ＰＣＲプライマー対を用いて増幅される。  過程ＶＩＩでは、ＰＣＲ産物がキャピラリー電気泳動に付される。これは、制限酵素の各々により消化されるプールの各々に関する個別パターンを生じる。これらのパターンは次に、試料中で発現される遺伝子を同定するために、本発明の組合せアルゴリズムを用いて比較され得る。
【図５】図５は、本発明の一実施形態に従ったサイズ標準の使用を例示する。下方パネルは、10 bpから1010 bpに進行するサイズ標準を示す。上方パネルは、保持時間（検出器に達する時間；Ｙ軸）対既知の断片サイズ（Ｘ軸）をプロットすることにより得られた標準曲線を示す。中間パネルは、サイズ標準が上方パネルに示した方程式に数的に合致した場合の残余を示す。市販サイズ標準に対比して、サイジング誤差は全範囲を通して+/- 1 bpより下にとどまる。
【０２０７】
【図６】図６は、本発明の一実施形態に従った入れ子式ＰＣＲ系の大要を示す。鋳型は、そのポリＡ尾へのポリＡアダプターの結合により固体支持体（ビーズとして示されている）上に捕捉されたｃＤＮＡ断片、ならびにポリＡ尾に対して遠位の、例えば断片がＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素を用いて消化された末端でアニーリングするアダプター配列（例えば本明細書中の他の箇所でさらに考察されている）を含む。一鋳型のみが示されているが、しかし本発明は一般に、多数の断片の消化により生成される断片の集団（例えば試料中に存在する総ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピー）の増幅に関する。入れ子式ＰＣＲでは、プライマーが各末端でアダプターとアニーリングする（図の左に示したフォワードプライマーおよび図の右に示したバックプライマー）初回のＰＣＲ（ＰＣＲ＃１）と、次の多プライマーを用いて集団中の異なる鋳型を増幅する2回目のＰＣＲ（ＰＣＲ＃２）が存在する。左に示したフォワードプライマーはアダプターの可変部とアニーリングし、消化ｃＤＮＡ断片の配列中に伸びるが、一方、バックプライマーはポリＡ尾との接合部にアニーリングする。バックプライマーは、図には標識されたとして示されており、3つの考え得るバックプライマー  −バックプライマーの左に示された３’ヌクレオチドとしてのＡ、ＧまたはＣを有する（残りはオリゴＴである）−は、異なる標識で標識される（Ａ、ＧまたはＣは、元のｍＲＮＡ中のポリＡ尾に対応して、上方鎖中のポリＡ配列直前のＴ、ＣまたはＧ残基と相補的である）。生成物は、各初期鋳型ｃＤＮＡ断片に関して、ポリＡ尾からアダプターアニーリング部位までの距離それ自体を表す限定長を有し、この場合、消化に実際に用いられる制限酵素がｃＤＮＡを切断する。
【図７】図７では、左パネルは、支持された異なるプライマー対（本明細書中の他の箇所に開示されたようなプライマーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ；Ｓｚ−サイズマーカー）を用いて、単純鋳型（適切な鋳型配列を保有する二本鎖ＤＮＡ分子）を増幅した結果を示す。プライマー対Ｅ／Ｆは明らかに、優れた収量を消磁、プライマー−二量体作用、例えばＣ／Ｅにより示されるものを示さない。右パネルは、鋳型配列を保有しないＤＮＡの複合ミックスの存在下での単純標的の増幅を示す。これもまた、プライマー対Ｅ／Ｆは明らかにもっとも特異的であり、プライマーＡ／Ｂにより示されるスメアに対比して、特定標的帯域の下にかすかな帯域のみを示す。プライマーＡは、配列番号４の配列を有する。プライマーＢは、配列番号１１の配列の配列を有し、プライマーＥは配列：5’-AGGACATTTGTGAGTCAGGC-3’（配列番号２６）を有し、プライマーＦは配列5’-TTCACGCTGGACTGTTTCGG-3’（配列番号２７）を有する。
【図８】図８は、キャピラリー電気泳動により得られたシグナルの一部分を示す。グラフ中の各ピークは、元の試料中の一断片に対応する。長い断片ほどキャピラリー中のポリマーにより電気泳動中に遅延されるため、時間（横軸）は断片長に対応する。縦軸は蛍光シグナル強度に対応し、元の試料中の各断片クラスの存在度を示す。明示した部分は、異常に高い再現性を示し、この場合、同一試料に関して実施された2つの個々の反応は、ほとんど区別区可能なピークパターンを示す。
【図９】図９は、図８と同一の実験を示すが、但し、明灰色で示した反応においてアダプターを結繋する場合、リガーゼを省いた。ＰＣＲバックグラウンドのほぼ完全な欠如が明らかであり、バックグラウンドシグナルの総量が総シグナルの0.1％未満に寄与することは注目に値する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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