(57)【要約】本発明は、インターフェロン−αタンパク質から構成されるハイブリッドインターフェロン融合タンパク質に関し、ここで、インターフェロン−αのＣ−末端領域が、インターフェロン−τのＣ末端領域によって置換されている。インターフェロン融合タンパク質をコードする核酸配列、このような配列を含む発現ベクター、およびこのインターフェロン融合タンパク質の治療適用もまた記載される。治療適用としては、抗ウイルス適用、抗細胞増殖適用、および抗炎症適用が挙げられる。本発明のインターフェロン融合ポリペプチドの１つの利点は、これらが、細胞を処置するために用いられる場合、より低い細胞傷害性の副作用を有することである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン／インターフェロン−τハイブリッドタンパク質であって、該タンパク質は、以下：
インターフェロンタンパク質のＣ末端領域が、インターフェロン−τのＣ末端領域で置換されている、インターフェロンタンパク質、
を含み、
ここで、該ハイブリッドタンパク質は、該インターフェロンタンパク質の細胞毒性に対して低下した細胞毒性を有する、ハイブリッドタンパク質。
【請求項２】
前記インターフェロンタンパク質が、Ｉ型インターフェロンタンパク質である、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項３】
前記Ｉ型インターフェロンタンパク質が、インターフェロン−αである、請求項２に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項４】
前記インターフェロン−αタンパク質が、ヒトインターフェロン−αである、請求項３に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項５】
前記ヒトインターフェロン−αが、ヒトインターフェロン−αＤである、請求項４に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項６】
前記インターフェロンタンパク質は、Ｃ末端の約０〜３０個のアミノ酸が置換されている、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項７】
前記インターフェロンタンパク質は、Ｃ末端の約１〜１０個のアミノ酸が置換されている、請求項６に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項８】
前記インターフェロンタンパク質は、Ｃ末端の最後の４個のアミノ酸が置換されている、請求項７に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項９】
前記ヒトインターフェロン−αＤのＣ末端領域が、残基１６３〜１６６にわたる配列に対応する、請求項５に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１０】
前記インターフェロン−τのＣ末端領域が、インターフェロン−τの残基１６３〜１７２にわたる配列に対応する、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１１】
前記インターフェロンタンパク質が、ヒトインターフェロン−αＤであり、そして該ヒトインターフェロン−αＤのＣ末端領域が、残基１６３〜１６６にわたり、そしてインターフェロン−τのＣ末端領域が、インターフェロン−τの残基１６３〜１７２にわたる配列に対応する、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１２】
前記ハイブリッドタンパク質が、前記インターフェロンタンパク質の細胞毒性に対して低下した細胞毒性を有する、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１３】
前記ハイブリッドタンパク質が、ＭＤＢＫ／ＶＳＶ抗ウイルス系において少なくとも約１×１０８の抗ウイルス単位／ｍｇの抗ウイルス活性を有する、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１４】
前記Ｉ型インターフェロンが、インターフェロン−βである、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１５】
前記インターフェロン−τが、ヒツジまたはウシのインターフェロン−τである、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１６】
前記ハイブリッドタンパク質が、ポリエチレングリコール処理されている、請求項１に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜１６に記載のハイブリッドタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１８】
インターフェロンハイブリッドタンパク質を作製する方法であって、該方法は、以下：
組換え発現系の中に請求項１７に記載の核酸分子を置く工程；
該核酸分子の発現に、該ハイブリッドタンパク質を産生するように影響を与える工程；および
該ハイブリッドタンパク質を回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記組換え発現系が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
以下：
請求項１に記載のハイブリッドタンパク質、および
薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、リバビリンをさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ウイルスに感染した細胞におけるウイルス複製を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を、該細胞における該ウイルスの複製を阻害するのに有効な量の請求項１に記載のハイブリッドタンパク質と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２３】
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を、腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項１に記載のハイブリッドタンパク質と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２４】
被験体における自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法は、該疾患を処置するのに有効な量の請求項１に記載のハイブリッドタンパク質を、被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２５】
被験体における慢性炎症を処置する方法であって、該方法は、該炎症を処理するのに有効な量の請求項１に記載のハイブリッドタンパク質を、被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
インターフェロンに応答性の疾患状態を処置する方法であって、該方法は、該疾患状態を処置するのに有効な量の請求項１に記載のハイブリッドタンパク質を、該疾患状態を有する被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記投与する工程が、経口、局所、吸入、経鼻および注入からなる群より選択される投与方法により行われる、請求項２２〜２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本明細書中で参考として援用される、２００１年８月１２日に出願された米国特許仮出願番号６０／３１１，８６６に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、インターフェロン−τに由来するＣ末端領域および別のインターフェロンに由来する領域からなるハイブリッドインターフェロンタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００３】
（参考文献）
【０００４】
【化１】
2005525784.tif 000002
【０００５】
【化２】
2005525784.tif 000003
【０００６】
【化３】
2005525784.tif 000004
【０００７】
【化４】
2005525784.tif 000005
【０００８】
【化５】
2005525784.tif 000006
【０００９】
【化６】
2005525784.tif 000007
（発明の背景）
インターフェロン（ＩＦＮ）は、種々の細胞型の増殖および機能に対する多面発現効果を示す構造的および機能的に関連したタンパク質のファミリーである。１９５７年の抗ウイルス剤としてのこれらの発見以来、ＩＦＮは、ナチュラルキラー細胞活性の調節および主要組織適合性抗原発現の調節を含む、種々の強力な免疫調節効果、ならびに悪性細胞に対する抗増殖活性を示すことが示されている（Ｗａｌｔｅｒら、１９９８）。
【００１０】
主要なクラスのＩＦＮは、ＩＦＮ−α、−β、−τおよび−ω（これらはまた、Ｉ型（酸安定）と命名される）、およびＩＦＮ−γ（ＩＩ型と命名される、酸不安定）である。以下の表Ｉは、主要なクラスのＩＦＮの局面をまとめる。
【００１１】
【表１】
2005525784.tif 000008
タンパク質のＩＦＮ−αファミリーは、現在、１個の偽遺伝子および同じタンパク質をコードする２個の遺伝子を含む、少なくとも１４個の遺伝子からなることが知られている。従って、１４個の遺伝子から作製される１２個の別々のＩＦＮαタンパク質が存在する。種々のＩＦＮ−αサブタイプは、アミノ酸配列レベルで約８０％の同一性を共有する。
【００１２】
インターフェロンα−１（ＩＦＮα１）（インターフェロンα−Ｄ（ＩＦＮαＤ）としても公知）は、広範な研究目的および臨床目的のＩ型インターフェロンである。最近の報告は、ヒトおよび動物における種々のウイルス疾患の処置における組換えＩＦＮαＤの効力を実証する（ＮｏｉｓａｋｒａｎおよびＣａｒｒ、２０００；Ｎｏｉｓａｋｒａｎら、１９９９）。ヒトＩＦＮαＤにおける臨床目的および研究目的に起因して、異なる発現系が、開発および使用されている。
【００１３】
１９８２年の組換えヒトＩＦＮαＤ（ｒＨｕＩＦＮαＤ）の発現は、Ｍｅｔｈｙｌｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ系およびＥ．ｃｏｌｉ系について記載されており、これらに系の両方は、ｌａｃプロモーターを利用した（Ｄｅ  Ｍａｅｙｅｒ，１９８２）。１９８４年に、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの科学者は、α因子プレプロシグナル配列と融合したＩＦＮαＤ遺伝子が、比較的低い生物学的活性を有した分泌ＩＦＮαＤタンパク質を生じる、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ系を報告した（Ｓｉｎｇｈ、１９８４）。数年後の１９８９年に、スタフィロキナーゼ非相同発現−分泌シグナルを用いる、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるヒトインターフェロン遺伝子の分泌発現が開発された（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，１９８９）。これらの研究において、Ｅ．ｃｏｌｉ系ではなく、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ系のみが、ｒＨｕＩＦＮαＤを培養培地中へ分泌し得た。Ｅ．ｃｏｌｉ中のｒＨｕＩＦＮαＤの細胞内発現に対する有意な改良が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、減少した比増殖速度で、タンパク質のより効率的発現を可能にする、発酵の間の流加培養様式における規定培地の使用により、１９９０年に報告された。しかし、１１年間にわたって、ヒトＩＦＮαＤの産生における、さらなる有意な改良は存在しない。
【００１４】
同定された最初のＩＦＮ−τは、１８〜１９ｋＤａタンパク質としてのヒツジＩＦＮ−τ（ＯｖＩＦＮ−τ）であった。数種のアイソフォームが、受胎産物（胚および周囲の膜）ホモジネートにおいて同定された（Ｍａｒｔａｌら、１９７９）。次いで、受胎産物培養培地中に放出された低分子量タンパク質が精製され、そして熱不安定、およびプロテアーゼに対して感受性の両方であることが示されている（Ｇｏｄｋｉｎら、１９８２）。ＯｖＩＦＮ−τは、本来、ヒツジ栄養膜タンパク質−１（ＯＴＰ−１）と呼ばれた。なぜならば、これは、ヒツジにおける母認識（ｍａｔｅｒｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）の臨界期の間に、ヒツジ受胎産物の栄養外胚葉により初めに産生される、最初の分泌タンパク質であったからである。引き続いての実験は、ＯｖＩＦＮ−τが、反芻動物（例えば、ヒツジおよびウシ）における妊娠に対する生理学的応答の確立のために必須の妊娠認識ホルモンであることを決定した（ＢａｚｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９９１）。
【００１５】
Ｎ末端アミノ酸配列を表す合成オリゴヌクレオチドを用いるヒツジ胚盤胞ライブラリーをプロービングすることにより得られたＩＦＮ−τ  ｃＤＮＡ（Ｉｍａｋａｗａら、１９８７）は、ヒト、マウス、ラットおよびブタ由来のＩＦＮ−αと４５〜５５％相同であり、そしてウシＩＦＮ−αＩＩと７０％の相同である、予想されるアミノ酸配列を有し、現在ＩＦＮΩと呼ばれている。異なるアイソフォームを表し得るいくつかのｃＤＮＡ配列が報告されている（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９８９；Ｋｌｅｍａｎｎら、１９９０；およびＣｈａｒｌｉｅｒ，Ｍ．ら、１９９１）。全ては、約１ｋｂであり、２３個のアミノ酸リーダー配列および１７２個のアミノ酸成熟タンパク質をコードする５８５塩基のオープンリーディングフレームを有する。同格でアミノ末端およびカルボキシル末端を有する４つのらせん状の束としてＩＦＮ−τの予想される構造は、Ｉ型  ＩＦＮとしてのその分類をさらに支持する（Ｊａｒｐｅら、１９９４）。
【００１６】
ＩＦＮ−τは、Ｉ型ＩＦＮに古典的に関連する活性の多くを表す（上記表１を参照のこと）一方で、ＩＦＮ−τと他のＩ型ＩＦＮとの間でかなりの差異を示す。殆どの顕著な差異は、上で詳述した、妊娠におけるその役割である。ウイルス誘導もまた異なる。ＩＦＮ−τを除く、全てのＩ型のＩＦＮは、ウイルスおよびｄｓＲＮＡにより容易に誘導される（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９２）。誘導されたＩＦＮ−α発現およびＩＦＮ−β発現は、一過性であり、約数時間続く。対照的に、ＩＦＮ−τ合成は、一旦誘導されると、数日間にわたって維持される（Ｇｏｄｋｉｎら、１９８２）。１細胞あたり、Ｉ型ＩＦＮよりも３００倍よりも多いＩＦＮ−τが産生される（ＣｒｏｓｓおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９１）。
【００１７】
他の差異は、ＩＦＮ−τ遺伝子の調節領域に存在し得る。例えば、ヒト栄養膜細胞株ＪＡＲの、ウシＩＦＮ−τについての遺伝子でのトランスフェクションは、抗ウイルス活性を生じた一方で、ウシＩＦＮ−Ω遺伝子でのトランスフェクションは、抗ウイルス活性を生じなかった。このことは、ＩＦＮ−τ遺伝子発現に関与する固有のトランス作用性因子を意味する。ＩＦＮ−τの近位のプロモーター領域（１２６〜転写開始部位）が、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮβの近位のプロモーター部位と非常に相同である一方で；−１２６〜−４５０の領域は、相同ではなく、そしてＩＦＮ−τ発現のみを増強するという観察（ＣｒｏｓｓおよびＲｏｂｅｒｔｓ、１９９１）はこのことと一致する。従って、他のＩ型ＩＦＮと比較した場合、異なる調節因子が、ＩＦＮ−τ発現に関与するようである。
【００１８】
ＩＦＮ−τ発現はまた、種の間で異なり得る。例えば、ＩＦＮ−τ発現は、反芻動物における受胎産物の発生の特定の段階（主に、１３〜２１日）に制限される（Ｇｏｄｋｉｎら、１９８２）が、予備的な研究は、ヒト形態のＩＦＮ−τが妊娠を通して構成的に発現されること（Ｗｈａｌｅｙら、１９９４）を示唆する。
【００１９】
有意に、インターフェロンの有用性が、毒性により制限されている。癌およびウイルス疾患の処置におけるインターフェロンの使用は、重篤な副作用を生じた。ＩＦＮ−αをｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  １９９１  ａｎｄ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ  ｉｎ  １９９２（Ｓａｉｔｏら、２０００）のように導入した。しかし、臨床的効力を生じるのに対する十分な投薬量（すなわち、約１×１０６単位／処置以上の量での）のＩＦＮ−αの使用は、通常、熱、頭痛、嗜眠、関節痛および筋痛により特徴付けられる「インフルエンザ様」症候群に関連する（Ｔｙｒｉｎｇら、１９９２）。５〜１０×１０６単位／処置以上の投薬量で、他の毒性（例えば、悪心、嘔吐および食欲不振）はより頻繁になる。神経精神病学的症状はまた、ＩＦＮ−α処置（Ｄｉｅｐｅｒｉｎｋら、２０００）と関連して報告されている。さらに、いくつかの研究は、ＩＦＮ−α処置の効力が、用量依存ではなく（Ｓａｉｔｏら、２０００）、そしてＩＦＮ−αでの処置が、新生物またはウイルス性肝炎を有する患者における自己免疫疾患の発症または悪化と関連することを示唆する（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｓａｅｎｚら、２０００）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従って、高い抗ウイルス活性および低い細胞毒性を有するインターフェロンタンパク質の要求がある。本発明は、これらの要求を満たすように設計される。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
従って、１つの局面では、本発明の目的は、インターフェロンタンパク質を含むインターフェロン／インターフェロン−τハイブリッドタンパク質（ここで、このインターフェロンタンパク質のＣ末端領域は、インターフェロン−τのＣ末端領域により置換される）を提供することである。１つの実施形態では、本発明は、非τ−インターフェロンタンパク質を含む非τ−インターフェロン／インターフェロン−τハイブリッドタンパク質（ここで、この非τ−インターフェロンタンパク質のＣ末端領域は、インターフェロン−τのＣ末端領域により置換される）を提供する。別の実施形態では、インターフェロンタンパク質は、Ｉ型インターフェロンタンパク質である。このＩ型インターフェロンタンパク質は、インターフェロン−αであり得る。好ましくは、インターフェロン−αは、ヒトインターフェロン−αである。１つの実施形態では、ヒトインターフェロン−αは、ヒトインターフェロン−αＤである。さらに別の実施形態では、インターフェロンタンパク質は、インターフェロン−βである。
【００２２】
ひとつの実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、以下の工程を包含するアッセイにおいて、ネイティブのインターフェロン（例えば、インターフェロン−α）に対して低い細胞傷害性を示し得る：少なくとも２０００の抗ウイルス単位／１ｍｌのハイブリッドを含む培養培地中で７日間、ＰＢＭＣの第１のサンプルをインキューベートする工程；抗ウイルス単位／１ｍｌとしてネイティブＩＦＮ−α１と同じ濃度を有する培養培地中で７日間、第２のＰＢＭＣをインキュベートする工程；および第１のサンプル中に残存する生細胞のパーセンテージを、第２のサンプル中に残存する生細胞のパーセンテージと比較して、それにより、生細胞のより高いパーセンテージが、培養培地中のＩＦＮ種の相対的に低い毒性を示す工程。
【００２３】
本発明の１つの実施形態では、インターフェロンタンパク質は、置換されたＣ末端領域を有さないが、代わりに、全長のインターフェロンタンパク質上に加えられたインターフェロン−τのＣ末端領域を有する。従って、インターフェロンタンパク質は、０個のアミノ酸が置換されたＣ末端を有する。別の実施形態では、インターフェロンタンパク質は、約１個〜３０個の間のアミノ酸が置換されたＣ末端を有する。さらに別の実施形態では、インターフェロンタンパク質は、置換されたＣ末端に約１個〜１０個の間のアミノ酸を有する。好ましくは、インターフェロンタンパク質は、最後の４個のアミノ酸が置換されたＣ末端を有する。関連する実施形態では、ヒトインターフェロン−αＤのＣ末端領域は、残基１６３〜１６６にわたる配列に対応する。
【００２４】
１つの実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、インターフェロン−τの残基１６３〜１７２にわたる配列に対応するインターフェロン−τのＣ末端領域を含む。好ましくは、インターフェロンタンパク質は、ヒトインターフェロン−αＤであり、そしてヒトインターフェロン−αＤのＣ末端領域は、残基１６３〜１６６にわたり、そしてインターフェロン−τのＣ末端領域は、インターフェロン−τの残基１６３〜１７２にわたる配列に対応する。
【００２５】
１つの実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、インターフェロンタンパク質または非τインターフェロンタンパク質の細胞毒性に対して、低下した細胞毒性を有する。別の実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、インターフェロンタンパク質または非τインターフェロンタンパク質の抗ウイルス活性に対して増加した抗ウイルス活性を有する。関連する実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、少なくとも約１×１０８個の抗ウイルス単位／１ｍｇのＭＤＢＶ／ＶＳＶ抗ウイルス系の抗ウイルス活性を有する。別の実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、少なくとも約２×１０８個の抗ウイルス単位／１ｍｇのＭＤＢＶ／ＶＳＶ抗ウイルス系の抗ウイルス活性を有する。
【００２６】
本発明は、インターフェロン−τタンパク質が、反芻動物のインターフェロン−τであることを企図する。１つの実施形態では、インターフェロン−τは、ヒツジまたはウシのインターフェロンーτである。本発明はまた、上記のハイブリッドタンパク質のいずれかが、ポリエチレングリコール処理され（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）得ることを企図する。
【００２７】
別の局面では、本発明は、上記のハイブリッドタンパク質のいずれかをコードする核酸分子を含む。さらに別の局面では、本発明は、インターフェロンハイブリッドタンパク質を作製する方法を包含する。この方法の実施に関する工程は、以下の工程を包含する：上記の核酸分子のいずれかを、組換え発現系に配置する工程；核酸分子の発現に作用して、ハイブリッドタンパク質を産生させる工程；およびハイブリッドタンパク質を回収する工程。１つの実施形態では、組換え発現系としては、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【００２８】
さらに別の局面では、本発明は、上記のように調製されたハイブリッドタンパク質、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を含む。この組成物はまた、リバビリンを含み得る。
【００２９】
本発明はまた、１つの局面において、ウイルスに感染した細胞におけるウイルス複製を阻害する方法を包含する。この方法は、細胞を、細胞中のウイルスの複製を阻害するのに有効な量のハイブリッドタンパク質と接触させる工程を包含する。
【００３０】
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法もまた企図される。この方法は、腫瘍細胞を、それらの増殖を阻害するのに有効な量のハイブリッドタンパク質と接触させる工程を包含する。
【００３１】
本発明の別の局面は、被験体における自己免疫疾患を処置する方法を包含する。この方法は、被験体に、この疾患を処置するのに有効な量の上記のように調製された任意のハイブリッドタンパク質を投与する工程を包含する。
【００３２】
本発明のさらに別の局面は、被験体における慢性炎症を処置する方法を包含する。この方法は、被験体に、炎症を処置するのに有効な量の上記のように調製された任意のハイブリッドタンパク質のいずれかを投与する工程を包含する。
【００３３】
本発明のさらに別の局面は、インターフェロンに応答性の疾患状態を処置する方法を包含する。この方法は、この疾患状態を有する被験体に、この疾患状態を処置するのに有効な量の上記のように調製された任意のハイブリッドタンパク質を投与する工程を包含する。
【００３４】
上記の方法のいずれかにおいて、投与は、経口、局所、吸入、経鼻および注入からなる群より選択される投与方法により実施され得る。
【００３５】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を、添付の図面と共に読む場合に、より完全に理解される。
【００３６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に示されない限り、本明細書中で用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明の当業者が用いるのと同じ意味である。従事者は、特に、当該分野の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら、１９９３の指示に従う。本発明は、これらが変化し得るように、記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬に制限されないことが理解される。
【００３７】
本明細書中で引用される全ての文献および特許は、本発明と共に用いられ得る組成物および方法論を記載および開示する目的のために、本明細書中で参考として明確に援用される。
【００３８】
「異種」核酸構築物または「異種」核酸配列は、それが発現される細胞に対してネイティブではない配列の部分を有する。制御配列に関して、異種とは、現在調節している同じ遺伝子発現を調節するようには、天然において機能しない制御配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）をいう。一般的に、異種核酸配列は、それらが存在する細胞またはゲノムの一部に対して内因的ではなく、そして感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどにより細胞に加えられていない。「異種」核酸構築物は、ネイティブの細胞において見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同じかまたは異なる、制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含み得る。
【００３９】
本明細書中で用いられる場合、用語「ベクター」とは、異なる宿主細胞の間での転移のために設計された核酸構築物をいう。「発現ベクター」とは、外来の細胞において異種ＤＮＡフラグメントを取込みそして発現する能力を有するベクターをいう。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、「発現カセット」または「発現ベクター」は、標的細胞においてか、またはインビトロで、特定の核酸の転写を可能にする一連の規定の核酸エレメントを用いて、組換え的かまたは合成的に生成された核酸構築物である。組換え発現カセットは、プラスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、または核酸フラグメントへと取込まれ得る。代表的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分としては、とりわけ、他の配列、転写されるべき核酸配列、およびプロモーターが挙げられる。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合、用語「プラスミド」とは、クローニングベクターとしてもちいられる、環状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物をいい、これは、多くの細菌およびいくつかの真核生物における染色体外自己修復遺伝子エレメントを形成する。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、用語「選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列」とは、宿主細胞において発現し得るヌクレオチド配列をいい、そして、ここで、選択可能なマーカーの発現が、発現された遺伝子を含む細胞に、対応する選択剤の存在下で増殖する能力を与える。
【００４３】
本明細書中で用いられる場合、用語「プロモーター」および「転写開始因子」とは、下流の遺伝子の転写を指向するように機能する核酸配列をいう。プロモーターは、一般的に、標的遺伝子が発現される宿主細胞に適切である。プロモーターは、他の転写調節核酸配列および翻訳調節核酸配列（「制御配列」ともいわれる）と共に、所定の遺伝子を発現するために必要である。一般的に、転写調節配列および翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳停止配列、ならびにエンハンサー配列または活性化因子配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
「キメラ遺伝子」または「異種核酸構築物」は、本明細書中で規定される場合、異なる遺伝子の部分（調節エレメントを含む）で構成され得る非ネイティブ遺伝子（すなわち、宿主に導入された遺伝子）をいう。宿主細胞の形質転換のためのキメラ遺伝子構築物は、代表的に、異種タンパク質コード配列に（または選択マーカーキメラ遺伝子においては、形質転換宿主細胞に抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子に）作動可能に連結された転写調節領域（プロモーター）で構成される。宿主細胞への形質転換のための本発明の代表的なキメラ遺伝子は、構成性または誘導性の転写調節領域、タンパク質コード配列、およびターミネーター配列を含む。キメラ遺伝子構築物はまた、標的タンパク質の分泌が所望される場合、シグナルペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列を含み得る。
【００４５】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、「作動可能に連結されている」。例えば、分泌リーダーをコードするＤＮＡは、それが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが、コード配列の転写に影響を与える場合、その配列に作動可能に連結されており；または、リボソーム結合部位は、それが、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結されている」は、連結されるＤＮＡ配列が、連続的であり、分泌リーダーの場合は、連続的かつリーディングフェーズ内であることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続的である必要はない。連結は、便利な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実施法に従って使用される。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、コード領域の前後の領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「テイラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン））を含んでも含まなくともよい。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、「組換え体」は、異種核酸配列の導入によって改変された細胞もしくはベクター、または細胞が、そのように改変された細胞に由来することに対する言及を含む。従って、例えば、組換え細胞は、人為的介入の結果として、その細胞のネイティブ（非組換え）形態内では、同一形態において見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に発現されるか、発現抑制されるか、もしくは発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【００４８】
細胞への核酸配列の挿入の関係で、用語「導入された」は、「トランスフェクション」、または「形質転換」もしくは「形質導入」を意味し、そして核酸配列が、その細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ得るか、自己レプリコンに変換されるか、または一過的に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）場合、真核生物細胞または原核生物細胞への核酸配列の組み込みに対する言及を含む。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、用語「発現」は、ポリペプチドが、遺伝子の核酸配列に基づいて生成されるプロセスをいう。このプロセスは、転写および翻訳の両方を含む。
【００５０】
用語「シグナル配列」は、細胞外への成熟形態のタンパク質の分泌を促進する、そのタンパク質のＮ末端部分のアミノ酸配列をいう。成熟形態の細胞外タンパク質は、シグナル配列を欠いている。シグナル配列は、分泌プロセスの間に切断される。
【００５１】
用語「宿主細胞」は、ベクターを含み、発現構築物の複製および／または転写、あるいは転写および翻訳（発現）を支持する細胞を意味する。本発明において使用するための宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、または哺乳動物細胞）であり得る。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、用語「活性」および「生物学的に活性」は、特定の標的タンパク質に付随する生物学的活性（例えば、酵素活性）をいう。所定のタンパク質の生物学的活性は、当業者によりそのタンパク質に代表的に属された任意の生物学的活性をいう。
【００５３】
「Ｃ型肝炎ウイルスまたはＨＣＶ」とは、非Ａ型非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）を引き起こす病原性型、およびそれらに由来する弱毒化型または欠損妨害粒子のウイルス種をいう。ＨＣＶゲノムは、ＲＮＡを含む。ＲＮＡ含有ウイルスは、報告によれば組み込まれたヌクレオチドあたり１０−３〜１０−４のオーダーで、比較的高い比率の自然突然変異を有する。遺伝子型の異質性および流動性は、ＲＮＡウイルスにおいて固有のものであるので、毒性または無毒性であり得るＨＣＶ種の中で複数の型／亜型が存在する。種々のＨＣＶ型または単離体の増幅、同定、検出、および単離は、文献において証明される。
【００５４】
状態を「処置すること」とは、その状態の症状を低減し、かつ／またはその状態の重篤度を低下させるのに有効な治療的物質を投与することをいう。
【００５５】
「経口」とは、口による投与または胃もしくは腸中への直接的投与（胃投与を含む）を含む任意の経路をいう。
【００５６】
「ＯＡＳレベル」とは、血中２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）タンパク質の濃度または活性をいう。
【００５７】
「酵母」は、子嚢胞子由来（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、担子胞子由来（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母、および不完全真菌に属する酵母（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）を意図する。子嚢胞子由来酵母は、２つのファミリー（ＳｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）に分かれる。後者は、以下の４つのサブファミリーから構成される：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ、Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｃ（例えば、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）。担子胞子由来（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母としては、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属およびＦｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ属が挙げられる。不完全菌類に属する酵母は、２つのファミリー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａ（例えば、Ｓｐｏｒｏｈｏｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｂｕｌｌｅｒａ属）およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属））に分けられる。本発明にとって特に興味深いものは、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＣａｎｄｉｄａ属内の種である。特に興味深いのは、Ｐｉｃｈｉａ種Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。酵母の分類は将来変わり得るので、本発明の目的のためには、酵母は、Ｓｋｉｎｎｅｒらに記載されるとおりに規定されるべきである。前述のものに加えて、当業者は、おそらく酵母の生物学および酵母遺伝学の取り扱いに精通している。例えば、Ｂａｃｉｌａら；ＲｏｓｅおよびＨａｒｒｉｓｏｎ；Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら；（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００５８】
本発明のヌクレオチド配列は、酵母プロモーターに作動可能に連結される場合、酵母宿主細胞において目的の生物学的に活性な成熟異種タンパク質を産生するために有用である。このように、本発明のハイブリッド前駆体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、酵母宿主細胞への導入のために発現カセット中に提供される。これらの発現カセットは、ハイブリッド前駆体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結された転写開始領域を含む。このような発現カセットは、調節領域の転写調節下にあるようにするためのヌクレオチド配列の挿入のための複数の制限部位を備える。この発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに含み得る。
【００５９】
クローニングベクターまたは発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し得、それにより２つの生物において（例えば、発現のためにヒトまたは昆虫の細胞、ならびにクローン化および増幅のために原核生物細胞において）維持されることを可能にする。
【００６０】
クローニングベクターおよび発現ベクターは両方とも、そのベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。さらに、発現ベクターの組み込みのために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列、好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同な配列を含む。この組み込みベクターは、ベクター中の包含のために適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞における特定の位置に指向され得る。組み込みベクターのための構築物は、当該分野において周知である。
【００６１】
クローニングベクターおよび発現ベクターは、代表的には選択マーカーを含む。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するか、（ｂ）栄養素要求性欠損を捕うか、または（ｃ）天然培地から利用可能でない必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてはＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【００６２】
「ＩＦＮ−τ」とは、米国特許第５，９３９，２８６号（その全体が本明細書中に明確に援用される）に示されるＩＦＮ−τ配列、または図１０に示されるＩＦＮ−τ配列およびヒツジＩＦＮ−τ配列に対して、７０％より高いか、または好ましくは約８０％より高いか、またはより好ましくは約９０％より高いか、そしてなおより好ましくは約９５％より高いアミノ酸相同性を有するインターフェロンタンパク質のファミリーの任意の１つをいう。アミノ酸相同性は、例えば、デフォルトパラメーターを用いるＡＬＩＧＮプログラムを使用して決定され得る。このプログラムは、配列比較プログラムのＦＡＳＴＡバージョン１．７パッケージに見出される（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ  １９８８；Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０；Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｏｘ  ４４０，Ｊｏｒｄａｎ  Ｈａｌｌ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡから入手可能なプログラム）。
【００６３】
「ＩＦＮ−α」とは、図１０に示されるＩＦＮ−αＤアミノ酸配列を含むインターフェロンタンパク質のファミリーの任意の１つ、およびこのタンパク質の活性に有意に影響しないアミノ酸置換および変更（例えば、中性アミノ酸置換）を有するタンパク質をいう。好ましくは、この配列は、図１０のＩＦＮ−αＤ配列、および図１０に示される配列に対して約７０％より高いか、または好ましくは約８０％より高い、またはより好ましくは約９０％より高い、そしてなおより好ましくは約９５％より高いアミノ酸配列相同性を有するタンパク質を含む。アミノ酸相同性は、例えば、上記のような、デフォルトパラメーターを用いるＡＬＩＧＮプログラムを使用して決定され得る。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＦＮ発現」とは、上記のＩＦＮ遺伝子の転写および翻訳をいい、その産物は、前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、およびそれらの誘導体を含む。例として、ＩＦＮ発現についてのアッセイとしては、標準的な細胞変性保護アッセイ、ウェスタンブロット分析およびノーザンブロット分析ならびにＩＦＮ  ｍＲＮＡについての逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＦＮの生物学的活性」および「生物学的に活性なＩＦＮ」とは、ＩＦＮ、またはＩＦＮの任意のフラグメント、誘導体、もしくはアナログに関連する生物学的活性（例えば、酵素活性）、そして具体的には、標準的な細胞変性保護アッセイを使用して測定され得る抗ウイルス活性が挙げられる。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、ＩＦＮに関連するタンパク質に対して用語「の改変形態」とは、ネイティブタンパク質の誘導体または改変体形態を意味する。すなわち、あるタンパク質「の改変形態」は、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入（アミノ酸置換が特に好ましい）を含む誘導ポリペプチド配列を有する。このアミノ酸置換、挿入または欠失は、そのポリペプチド配列内の任意の残基において起こり得、これは、そのタンパク質の生物学的活性に干渉する。改変体タンパク質または誘導体タンパク質をコードする対応する核酸配列は、その遺伝子またはコード配列の「変異」形態または「改変」形態とみなされ、かつ本発明の範囲内に包含される。
【００６７】
「改変体」は、以下によりネイティブポリペプチドから誘導されるポリペプチドを意図する：ネイティブタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆる短縮）または付加；ネイティブポリペプチドにおける１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；あるいはネイティブポリペプチドにおける１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換。このような改変体は、例えば、遺伝子多型または人的操作から生じ得る。このような操作の方法は、一般的に当該分野で公知である。
【００６８】
例えば、このポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、ハイブリッドＩＦＮのいずれかをコードするクローン化ＤＮＡ配列における変異により調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当該分野で周知である。例えば、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）のモデル（本明細書中に参考として援用される）に見られ得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸と交換すること）が好ましくあり得る。保存的置換の例としては、Ｇｌｙ＜＝＞Ａｌａ、Ｖａｌ＜＝＞Ｉｌｅ＜＝＞Ｌｅｕ、Ａｓｐ＜＝＞Ｇｌｕ、Ｌｙｓ＜＝＞Ａｒｇ、Ａｓｎ＜＝＞Ｇｌｎ、およびＰｈｅ＜＝＞Ｔｒｐ＜＝＞Ｔｙｒが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
ハイブリッドＩＦＮの改変体を構築する際に、改変体が所望の活性を有し続けるように改変が行われる。明らかに、改変体タンパク質をコードするＤＮＡにおいてなされた任意の変異は、その配列をリーディングフレームからはずして配置してはならず、そして好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補的領域を生じない。
【００７０】
従って、本発明のタンパク質は、ハイブリッドＩＦＮ／ＩＦＮ−τおよびそれらの改変体を含む。これらの改変体は、ネイティブタンパク質に対して実質的に相同であり、かつ機能的に等価である。ネイティブタンパク質のアミノ酸配列に対して、そのアミノ酸配列の少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％が同一である場合、ネイティブタンパク質の改変体は、ネイティブタンパク質に対して「実質的に相同」である。改変体は、わずか１個、２個、３個、または４個のアミノ酸によって異なり得る。「機能的に等価」は、その改変体の配列が、ネイティブＩＦＮと実質的に同じ生物学的活性を有するタンパク質を産生する鎖を規定することを意図する。実質的な配列バリエーションを含むこのように機能的に等価な改変体もまた本発明に包含される。従って、ハイブリッドＩＦＮタンパク質の機能的に等価な改変体は、治療的に有用であるのに十分な生物学的活性を有する。「治療的に有用」は、治療目的（例えば、１型単純疱疹ウイルス誘導脳炎に対する保護）を達成するのに有効であることを意図する。
【００７１】
機能的等価性を決定するための方法が、当該分野で利用可能である。生物学的活性は、ＩＦＮタンパク質の活性を測定するために特別に設計されたアッセイを使用して測定され得、これらとしては、本発明において記載されるアッセイおよび米国特許第６，２０４，０２２号（その全体が、本明細書に明確に参考として援用される）に記載されるアッセイが含まれる。さらに、生物学的に活性なネイティブタンパク質に対して惹起された抗体は、機能的に等価な改変体に結合する能力について試験され得、ここで有効な結合は、ネイティブタンパク質のコンホメーションと類似のコンホメーションを有するタンパク質の指標である。
【００７２】
（ＩＩ．ハイブリッドインターフェロン融合タンパク質）
本発明は、ＩＦＮ−τのＣ末端領域により付与される減少した毒性に関する知見を利用する。この知見は、ＩＦＮ−τ由来のＣ末端部分および非τインターフェロンＩ型ポリペプチドに由来するＮ末端部分を有するハイブリッドインターフェロン融合タンパク質を産生するために使用されるキメラＤＮＡ構築物を支持する。このような非τインターフェロンＩ型ポリペプチドの例としては、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−αの種々のアイソフォームが挙げられる。
【００７３】
図１０を参照して、このようなハイブリッドインターフェロン融合タンパク質またはポリペプチドＨＶＶ（キメラ核酸分子によりコードされ得るか、またはネイティブの化学的ライゲーションにより産生され得る）は、ＩＦＮ−αＤのアミノ酸１位〜アミノ酸１６３位を含むＮ末端、およびＩＦＮ−τのアミノ酸１６３位〜アミノ酸１７２位までを含むＣ末端を有する。Ｎ末端セグメントは、非τインターフェロンポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を含み、これは、キメラ核酸分子の５’末端セグメントによりコードされ得る。Ｃ末端セグメントは、ＩＦＮ−τポリペプチドのＣ末端アミノ酸配列を含み、これは、キメラ核酸分子の３’末端セグメントによりコードされ得る。
【００７４】
上流が非τインターフェロンに対応する配列であり、そしてその下流がＩＦＮ−τに対応するアミノ酸残基位置の最適の接合点は、本明細書中に記載される機能的アッセイ（例えば、実施例５に記載される抗ウイルスアッセイおよび実施例６に記載される毒性アッセイ）と組み合わせて、ＩＦＮ−τ（１６３〜１７２）内かまたはそれを超えて伸張するより長い領域およびより短い領域に対応するペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用して、本明細書中に記載される方法により同定され得る。例えば、ヒトＩＦＮ−αＤのアミノ酸１〜１６６およびＩＦＮ−τの最後の１０個のＣ末端アミノ酸を含む本発明のハイブリッドまたはキメラインターフェロンが、ＩＦＮ−αに関連するか通常はＩＦＮ−αに起因する生物学的活性と共に、インターフェロンτに関連する低い毒性を有することが企図される。例えば、ＩＦＮ−α／ＩＦＮ−τハイブリッドは、例えばＩＦＮ−αの毒性を低減し得るが、ＩＦＮ−α抗ウイルス特性を妨害しないか全く増加させない。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態は、Ｎ末端セグメントの配列がヒトＩＦＮ−αＤに由来し、そしてＣ末端セグメントがヒツジＩＦＮ−τに由来する融合タンパク質である。他の適切なＩＦＮ配列は、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の公の配列保存機関から得られ得る。
【００７６】
上で指摘したように、本発明のハイブリッドインターフェロン融合タンパク質組成物について企図される考慮すべき利点は、例えば、治療剤として認められているネイティブ非τＩ型インターフェロンと比較して、この組成物の減少した毒性である。このハイブリッド組成物は、ＩＦＮ−τの減少した細胞傷害性と共に、認められている非τＩ型ＩＦＮと同じ生物学的活性を有し得る。
【００７７】
（ＩＩＩ．ハイブリッドインターフェロンタンパク質の産生）
本発明は、一局面において、非τインターフェロン／インターフェロンτハイブリッドタンパク質を産生する方法を包含する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現宿主が、適切な核酸配列を含むベクターで形質転換される場合、大量の比較的純粋で機能的に活性な非τインターフェロン／インターフェロンτハイブリッドタンパク質の産生が可能であることが発見されている。本発明を実施する際の工程が以下に考慮される。
【００７８】
本発明において有用な配列、方法および組成物は、以下に見出され得る：米国特許第５，９５８，４０２号（１９９９年９月２８日発行）；同第５，９４２，２２３号（１９９９年８月２４日発行）；１９９９年８月２４日；同第５，７３８，８４５号（１９９８年４月１４日発行）；同第５，９３９，２８６号（１９９９年８月１７日発行）；同第６，２０４，０２２号（２００１年３月２０日発行）；同第５，９０６，８１６号（１９９９年５月２５日発行）；同第６，０６０，４５０号（２０００年５月９日発行）；および同第６，３７２，２０６号（２００２年４月１６日発行）；（それぞれが、その全体を本明細書中に参考として援用される）。本発明において有用なさらなる配列、方法および組成物は、同時係属中の米国特許出願番号０９／９１０，４０６（２００１年７月１９日出願）；および同１０／１３７，１２７（２００２年５月２日出願）に見出され得る。
【００７９】
（Ａ．Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞）
非τインターフェロン／インターフェロンτハイブリッドタンパク質の発現のために選択された宿主は、好ましくは酵母である。本発明の方法において使用される酵母は、Ｐｉｃｈｉａ属内の種である。特に興味深いものは、Ｐｉｃｈｉａ種Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。１つの代表的なＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、Ｘ−３３である。
【００８０】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは、アルコールオキシダーゼの産生を誘導することにより、その唯一の炭素源としてメタノールを代謝し得る（Ｃｒｅｇｇ、１９９３）。大部分のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現株は、１つ以上の栄養素要求性変異を有し、これにより、形質転換の際に適切な選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターの選択が可能となる。形質転換の前に、これらの株は、天然培地で増殖するが、最少培地で増殖するためには、適切な栄養素を補給する必要がある。本発明のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株には、野生型の比率（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｒａｔｅ）のメタノールで増殖する株（Ｍｕｔ＋）が含まれ、そしてＡＯＸ遺伝子の１つまたは両方における欠失のためにメタノールを利用する能力が変化した株もまた含まれる。外因性タンパク質の分解を低減する際に有効であり得るプロテアーゼ欠損株もまた企図される（Ｂｒｉｅｒｌｅｙ，１９９８；およびＷｈｉｔｅら、１９９５）。
【００８１】
本発明の実施に適切な酵母および他の微生物宿主の選択は、当該分野の技術範囲内である。発現のための酵母宿主を選択する場合、適切な宿主は、とりわけ、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、および全体的生長力を有することが示されている宿主を含み得る。酵母および他の微生物は、一般的に、以下を含む種々の供給源から入手可能である：ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）；ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）；Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ）；およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のような製造供給元。
【００８２】
（Ｂ．酵母発現ベクター）
本発明における使用のための発現ベクターは、酵母における作動のために設計されたキメラ遺伝子（または発現カセット）を含み、これは、その発現カセットから上流および下流に随伴配列を有する。これらの随伴配列は、プラスミド起源またはウイルス起源であり、そしてそのベクターが細菌から所望の酵母宿主にＤＮＡを移動させるのを可能にするのに必要な特徴をそのベクターに提供する。適切な形質転換ベクターは、以下に記載される。発現プラスミドの適切な構成要素（転写イニシエーターおよび翻訳イニシエーター、シグナル配列、ハイブリッドＩＦＮのコード配列、ならびに適切な転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーターを含む）もまた、以下に考察される。１つの例示的な構築物は、図５Ａ〜５Ｃに示されるｐＰＩＣＺα−ＨＶＶプラスミド配列である。
【００８３】
（ｉ．転写イニシエーターおよび翻訳イニシエーター）
本発明のヌクレオチド配列は、酵母プロモーターに作動可能に連結された場合の酵母宿主細胞において目的の生物学的に活性な成熟異種タンパク質を産生するのに有用である。このようにして、本発明のハイブリッド前駆体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、酵母宿主細胞中への導入のための発現カセットにおいて提供される。これらの発現カセットは、ハイブリッド前駆体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結した転写開始領域を含む。このような発現カセットは、ヌクレオチド配列を調節領域の転写調節下にあるように挿入するための複数の制限部位を備える。
【００８４】
転写開始領域（酵母プロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼに結合部位を提供して、そのコード配列の下流（３’側）の翻訳を開始する。このプロモーターは、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得、そして特定の酵母宿主に対してネイティブでもアナログでも外因性でも異種でもよい。さらに、このプロモーターは、天然配列でもあるいは合成配列でもよい。外因性は、転写開始領域が導入される目的のネイティブ酵母においてその転写開始領域が見出されないということを意味する。
【００８５】
適切なネイティブ酵母プロモーターとしては、野生型α因子プロモーター（これは、以下に詳細に記載される）、およびその他の酵母プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、このプロモーターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）、ぺルオキシソームマトリックスタンパク質（ＰＥＸ８）、およびＧＴＰａｓｅをコードするＹＰＴ１プロモーターを含むリストから選択される。より好ましくは、プロモーターは、アルコールオキシダーゼＡＯＸ１プロモーターである。
【００８６】
（ａ．ＡＯＸ１プロモーター）
Ｐｉｃｈｉａは、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子ＡＯＸ１およびＡＯＸ２をコードするが、ＡＯＸ１遺伝子は、酵母細胞における広範な大多数のアルコールオキシダーゼ活性の原因である（Ｔｓｃｈｏｐｐら、１９８７；Ｅｌｌｉｓら、１９８５；およびＣｒｅｇｇら、１９８９）。ＡＯＸ１遺伝子の発現は、ＡＯＸ１プロモーターにより転写レベルにおいて厳しく制御されている。メタノール増殖細胞において、約５％のポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＡＯＸ１由来である；しかし、大部分のほかの炭素源で増殖する細胞において、ＡＯＸ１メッセージは、検出できない（Ｃｒｅｇｇら、１９８８）。
【００８７】
ＡＯＸ１遺伝子の調節は、以下の２つの機構を含むようである：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ１遺伝子の調節に類似の、抑制／脱抑制（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）機構および誘導機構。ＧＡＬ１調節と異なり、炭素源（例えば、倍地中のグルコース）の抑制がないこと、ＡＯＸ１の実質的な転写は起こらない。メタノールの存在は、高レベルの転写を誘導するために不可欠である（Ｔｓｃｈｏｐｐら、１９８７）。
【００８８】
（ｂ．ＧＡＰプロモーター）
ノーザンおよびレポーター活性化の両方の結果は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＡＰ遺伝子プロモーターが、ＡＯＸ１プロモーターで見られたレベル（Ｗａｔｅｒｈａｍら、１９９７）に匹敵するレベルで、グルコースでの強い構成性発現を生じることを示す。グリセロール増殖細胞およびメタノール増殖細胞におけるＧＡＰプロモーター活性レベルは、グルコースについて観察されたレベルのそれぞれおよそ３分の２および３分の１である。ＧＡＰプロモーターを使用する利点は、メタノールが誘導に必要なく、そしてある炭素源から別の炭素源へと培養物を移す必要もなく、株の増殖がより簡単に行えることである。しかし、ＧＡＰプロモーターは、構成的に発現されるので、酵母に対して毒性であるタンパク質の産生には良い選択ではないかもしれない。
【００８９】
（ｃ．ＦＬＤ１プロモーター）
ＦＬＤ１遺伝子は、グルタチオン依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（窒素源としての特定のメチル化アミンおよび炭素源としてのメタノールの代謝に必要な主要な酵素）をコードする（Ｓｈｅｎら、１９９８）。このＦＬＤ１プロモーターは、単一の炭素源としてメタノール（および窒素源として硫酸アンモニウム）か、または単一の窒素源としてメチルアミン（および炭素源としてグルコース）のいずれかを用いて誘導され得る。メタノールまたはメチルアミンを用いた誘導の後、ＰＦＬＤ１は、ＡＯＸ１プロモーターからメタノール誘導により得られたレベルと同様のレベルのβ−ラクタマーゼレポーター遺伝子を発現し得る。ＦＬＤ１プロモーターは、メタノールまたはメチルアミン（安価な非毒性窒素源）のいずれかを使用して高レベルの発現を誘導する柔軟性を提供する。
【００９０】
（ｄ．ＰＥＸ８プロモーターおよびＹＰＴ１プロモーター）
いくつかのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株については、ＡＯＸ１プロモーター、ＧＡＰプロモーターおよびＦＬＤ１プロモーターは、強力すぎ得、高すぎるレベルの遺伝子を発現し得る。特定の外因性遺伝子については、ＰＡＯＸ１からの高レベルの発現は、細胞の翻訳後機構を圧倒して、外因性タンパク質の有意な割合での誤った折り畳み、プロセシングされないこと、または誤った局在を引き起こし得るという証拠が存在する（Ｔｈｉｌｌら、１９９０；Ｂｒｉｅｒｌｅｙ，１９９８）。これらの適用および他の適用のために、適度に発現するプロモーターが望ましい。この目的のために、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＥＸ８およびＹＰＴ１プロモーターが使用され得る。ＰＥＸ８遺伝子は、ぺルオキシソームの生物発生に不可欠なぺルオキシソームマトリックスタンパク質をコードする（Ｌｉｕら、１９９５）。これは、低いが有意なレベルでグルコースで発現され、そして細胞がメタノールに移されると適度に誘導される。ＹＰＴ１遺伝子は、分泌に関与するＧＴＰａｓｅをコードし、そしてそのプロモーターは、炭素源としてグルコース、メタノールまたはマンニトールのいずれかを含有する培地において低いが構成性レベルの発現を提供する（Ｓｅａｒｓら、１９９８）。
【００９１】
（ｅ．代替のプロモーター）
１つの酵母プロモーターの上流活性化因子配列（これにより誘導性発現が可能になる）および別の酵母プロモーターの転写活性化領域から構成される合成ハイブリッドプロモーターもまた、酵母宿主における機能的プロモーターとして作用する。
【００９２】
酵母認識プロモーターはまた、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合して、コード配列の翻訳を開始する天然に存在する非酵母プロモーターを含む。このようなプロモーターは、当該分野で利用可能である。例えば、Ｃｏｈｅｎら（１９８０）；Ｍｅｒｃｅｒｅａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）；およびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）；（これらの各々が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００９３】
（ｉｉ．シグナル配列およびリーダー配列）
目的のタンパク質をコードすることに加えて、発現カセットのキメラ遺伝子は、適切な場合にハイブリッドＩＦＮタンパク質のプロセシングおよび転位を可能にするシグナルペプチドをコードし得る。
【００９４】
本発明の目的のために、このシグナルペプチドは、酵母分泌タンパク質の成熟形態の前駆体ポリペプチドについてのＮ末端配列であるプレシークエンス（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）である。ハイブリッド前駆体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、形質転換された酵母宿主細胞において発現される場合、このシグナルペプチド配列は、目的の成熟異種タンパク質を含むハイブリッド前駆体ポリペプチドを、小胞体（ＥＲ）中に指向させるように機能する。ＥＲの管腔内への移動は、酵母宿主細胞の分泌経路への最初の段階を示す。本発明のシグナルペプチドは、酵母宿主細胞に対して異種またはネイティブであり得る。本発明のシグナルペプチド配列は、公知の天然に存在するシグナル配列か、またはシグナルペプチドの機能に不利な影響を及ぼさない上記のようなシグナル配列の任意の改変体であり得る。
【００９５】
ＥＲへの進入の間に、このシグナルペプチドは、プロセシング部位で前駆体ポリペプチドから切断される。このプロセシング部位は、インビボで酵母タンパク質分解酵素により認識される任意のペプチド配列を含み得る。このプロセシング部位は、シグナルペプチドの天然に存在するプロセシング部位であり得る。より好ましくは、天然に存在するプロセシング部位は、改変されるか、またはこのプロセシング部位は、好ましいプロセシング部位となるように合成的に誘導される。「好ましいプロセシング部位」は、インビボで、酵母タンパク質分解酵素により、天然に存在する部位よりも効率的に切断されるプロセシング部位を意図する。好ましいプロセシング部位の例としては、二塩基性ペプチド、特に２つの塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの任意の組み合わせ（すなわち、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、またはＡｒｇ−Ａｒｇ）、最も好ましくはＬｙｓ−Ａｒｇが挙げられるが、これらに限定されない。これらの部位は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＫＥＸ２遺伝子によりコードされるエンドペプチダーゼにより切断される（Ｊｕｌｉｕｓら（１９８３））。ＫＥＸ２エンドペプチダーゼが、目的の成熟異種タンパク質のペプチド配列内の部位を切断する場合、他の好ましいプロセシング部位は、目的のペプチド配列がインタクトであるように利用され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと）。
【００９６】
機能的シグナルペプチド配列は、酵母細胞からの異種タンパク質の細胞外分泌を起こすのに不可欠である。さらに、ハイブリッド前駆体ポリペプチドは、この分泌プロセスをさらに促進するために、酵母分泌タンパク質の分泌リーダーペプチド配列を含み得る。存在する場合、このリーダーペプチド配列は、一般的に、シグナルペプチド配列プロセシング部位の直ぐ３’側である。「分泌リーダーペプチド配列」は、前駆体ポリペプチド（本発明の目的のためには、分泌される成熟異種タンパク質を含むハイブリッド前駆体ポリペプチドである）の、ＥＲからゴルジ装置への移動、そしてゴルジ装置から、細胞膜を横切って細胞壁領域および／または増殖培地への分泌のための分泌小胞への移動を指向させるペプチドを意味する。このリーダーペプチド配列は、酵母宿主細胞に対してネイティブでも異種でもよい。
【００９７】
本発明のリーダーペプチド配列は、シグナルペプチド配列の供給源として作用した同じ酵母の分泌タンパク質に対する天然に存在する配列でも、異なる酵母の分泌タンパク質に対する天然に存在する配列でも、合成配列でもよく、あるいは、リーダーペプチドの機能に不利な影響を及ぼさないそれらの任意の改変体でもよい。
【００９８】
（ａ．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅα−因子プレプロペプチド）
本発明の目的のために、存在する場合のリーダーペプチド配列は、好ましくは、シグナルペプチド配列の供給源として作用した同じ酵母の分泌タンパク質に由来し、より好ましくは、α−因子タンパク質に由来する。前駆体α−因子タンパク質をコードする多数の遺伝子がクローン化されており、そしてそれらの組み合わされたシグナルリーダーペプチド配列が同定されている。例えば、Ｓｉｎｇｈら（１９８３）を参照のこと。α−因子シグナルリーダーペプチド配列は、酵母において異種タンパク質を発現するために使用されている。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔら（１９８３）；Ｂｉｔｔｅｒら（１９８４）；およびＳｍｉｔｈら（９８５）を参照のこと。
【００９９】
α−因子（約１１残基長のオリゴヌクレオチド接合フェロモン）は、約１００残基長と２００残基長との間、より代表的には約１２０〜１６０残基長のより大きな前駆体ポリペプチドから産生される。この前駆体（プレ）ポリペプチドは、シグナル配列（約１９〜２３（より代表的には２０〜２２残基）、リーダー配列（プロ）（約６０〜６６残基）、および成熟フェロモン配列の代表的に２〜６のタンデム反復を含む。このシグナルぺプチド配列および全長α−因子リーダーペプチド配列が使用され得るが、本発明はまた、両方のエレメントがハイブリッド前駆体分子中に存在する場合に、シグナルペプチドと共に使用され得る短縮α−因子リーダーペプチド配列を企図する。
【０１００】
このシグナル配列のプロセシングは、３つの段階を含む。第１の段階は、小胞体におけるシグナルペプチダーゼによるプレシグナルの除去である。第２に、Ｋｅｘ２エンドペプチダーゼが、プロリーダー配列のＡｒｇ−Ｌｙｓ間を切断する。この直後に、Ｇｌｕ−Ａｌａ反復が、存在する場合、Ｓｔｅ１３タンパク質により切断される（Ｂｒａｋｅら、１９８４）。
【０１０１】
本発明のハイブリッド前駆体ポリペプチド配列がリーダーペプチド配列（例えば、α因子リーダー配列）を含む場合、そのリーダーペプチド配列３’末端にすぐ隣接したプロセシング部位があり得る。このプロセシング部位は、酵母宿主細胞にネイティブなタンパク質切断酵素が酵母分泌リーダーペプチド配列を、ここでは目的の成熟異種タンパク質のネイティブなＮ末端プロペプチド配列の５’末端から、または成熟異種ハイブリッドＩＦＮについてのペプチド配列の５’末端から切断することを可能にする。プロセシング部位は、目的の成熟異種タンパク質が、正確にプロセシングされ得るように、酵母タンパク質切断酵素によりインビボで認識される、任意のペプチド配列を含み得る。このプロセシング部位のペプチド配列は、リーダーペプチド配列のネイティブプロセシング部位の天然に存在するペプチド配列であり得る。より好ましくは、この天然に存在するプロセシング部位は、改変されるか、またはこのプロセシング部位が、上記の好ましいプロセシング部位であるように、合成により得られる。
【０１０２】
（ｂ．別のシグナル配列）
適切なシグナル配列はまた、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸ホスファターゼ（ＰＨＯ１）および植物レクチンであるＰｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  凝集素由来のＰＨＡ−Ｅ（ＣｅｒｅｇｈｉｎｏおよびＣｒｅｇｇ，２０００；ならびにＲａｅｍａｅｋｅｒｓら，１９９９）を含み得る。さらに、そのシグナル配列は、合成により得られ得るか、または当業者に利用可能なハイブリダイゼーションプローブ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと）を使用して、ゲノムｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから決定され得る。
【０１０３】
上記のように本発明に従って、酵母シグナルペプチドおよび分泌リーダーペプチドの配列は、酵母宿主細胞の分泌経路を通じて、成熟異種ＩＦＮαＤの配列を方向付け得る、本発明のハイブリッド前駆体ポリペプチドの一部を示す。
【０１０４】
（ｉｉｉ．ハイブリッドＩＦＮペプチドコード配列）
例示的ハイブリッドＩＦＮコード配列は、表２−ＨＶＶに示される。コード配列の起源は、実施例１において議論されており、図１〜４に例示される。
【０１０５】
適切な場合、ハイブリッドＩＦＮペプチドをコードするヌクレオチド配列および目的の任意のさらなるヌクレオチド配列は、形質転換酵母における増大した発現のために最適化され得る。すなわち、これらのヌクレオチド配列は、改善された発現のために酵母好適コドンを使用して合成され得る。目的の酵母に好適なヌクレオチド配列を合成するための方法は、当該分野で利用可能である（例えば、米国特許第５，２１９，７５９号および同第５，６０２，０３４号（これらは、その全体が本明細書中に参考として明示的に援用される）を参照のこと）。
【０１０６】
さらなる配列改変は、酵母宿主におけるヌクレオチドコード配列の発現を増強することが既知である。これらとしては、以下が挙げられる：偽のポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および遺伝子発現のために有害であり得る他のこのような十分に特徴付けられた配列などをコードする配列の排除。その配列のＧ−Ｃ含量が、宿主細胞において発現される既知の遺伝子を参照して計算されるように、所定の細胞宿主に平均的なレベルに調節され得る。可能な場合、ヌクレオチドコード配列は、推定ヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるために改変される。
【０１０７】
（ｉｖ．転写および翻訳のターミネーター）
発現カセットの終結調節領域は、転写開始領域に対してネイティブであってもよいし、別の供給源に由来してもよく、このことにより、この領域が酵母宿主により認識される。終結領域は、ネイティブα因子転写終結配列の終結領域であってもよく、別の酵母により認識される終結配列（例えば、上記で言及した酵素の終結配列）であってもよい。転写終結領域は、発現を増強するために、特に、そのｍＲＮＡの安定性のために選択され得る。
【０１０８】
好ましくは、転写ターミネーターは、Ｍａｔ−α（α因子）転写ターミネーターである。より好ましくは、この転写終結配列は、図１に示されるＡＯＸ１転写終結領域である。
【０１０９】
（ｖ．選択マーカー）
選択マーカーとしては、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのいずれかに由来する生合成経路遺伝子ＨＩＳ４、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡＲＧ４、およびＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓに由来する、ブレオマイシン関連薬物であるゼオシンに対する耐性を付与するＳｈ  ｂｌｅ遺伝子（Ｃｒｅｇｇら，１９８５；ＣｒｅｇｇおよびＭａｄｄｅｎ，１９８９；ならびにＨｉｇｇｉｎｓら，１９９８）が挙げられる。より最近開発された生合成マーカーのセットとしては、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＤＥ１（ＰＲ−アミドイミダゾールスクシノカルボキサミドシンターゼ）、ＡＲＧ４（アルギニノスクシネートリアーゼ））およびＵＲＡ３（オロチジン５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）遺伝子が挙げられる。
【０１１０】
（ｖｉ．形質転換ベクターの構築）
異種ハイブリッドＩＦＮタンパク質についての場合のように、ハイブリッド前駆体ポリペプチドに存在する他の要素の各々は、既知の天然に存在するポリペプチド配列であり得るか、または合成により得られ得る（本明細書中に記載のエレメントの機能に有害な影響を及ぼさないそれらの任意の改変体を含む）。「有害な効果」とは、エレメントの改変形態を含むことが、そのエレメントのネイティブ形態を含むハイブリッド前駆体ポリペプチドと比較して、目的の分泌成熟異種タンパク質の成体活性の減少を生じることを意図する。
【０１１１】
発現カセットを調製する際に、種々のヌクレオチド配列フラグメントが、適切な方向で、かつ適切な場合には、適切なリーディングフレーム中に配列を提供するために、操作され得る。この目的に向かって、アダプタまたはリンカーを使用して、ヌクレオチド配列を接続してもよいし、他の操作が、簡便な制限部位、余分なヌクレオチドの除去、制限部位の除去などを提供するために含められてもよい。この目的のために、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換（例えば、トランジションおよびトランスバージョン）が含められてもよい。特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。
【０１１２】
本発明の発現カセットは、レプリコン（例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ミニ染色体）に連結され得、従って、インビボで自発的にＤＮＡを複製し得る発現ベクターを形成し得る。好ましくは、そのレプリコンは、プラスミドである。このようなプラスミド発現ベクターは、クローニング目的で原核生物宿主内での安定な維持、および発現目的で酵母宿主細胞内への組み込みを可能にする１以上の複製系において、好ましくは、２つの複製系において維持される。
【０１１３】
さらに、プラスミド発現ベクターは、高コピー数または低コピー数のプラスミドとして組み込まれ得る。発現カセットの複数の組み込みコピーを含む株は、ときおり、単一コピー株よりも多くの異種タンパク質を生じ得る（Ｃｌａｒｅら，１９９１）。
【０１１４】
（Ｂ．酵母細胞の形質転換）
酵母細胞は、種々の標準的技術（エレクトロポレーション、微粒子ボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、スフェロプラスト生成法、または完全細胞法（例えば、塩化リチウムおよびポリエチレングリコールを伴う方法）（Ｃｒｅｇｇら，１９８５；Ｌｉｕら，１９９２；Ｗａｔｅｒｈａｍら，１９９６；ならびにＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ，１９９８）が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて上記の発現構築物で形質転換される。
【０１１５】
（Ｃ．培養および分泌ハイブリッドＩＦＮタンパク質の獲得）
形質転換体を、適切な栄養培地中で増殖し、適切な場合、確実に内因性ＤＮＡが維持されるように、選択圧下で維持する。発現が誘導性である場合、増殖を、酵母宿主が、高密度の細胞を生じ得るようにし得、次いで発現が誘導される。例示的ハイブリッドＩＦＮタンパク質の組換え生成物であるＨＶＶは、実施例２に記載される。ＨＶＶの部分的精製を、実施例３に記載する。
【０１１６】
本発明の重要な局面に従って、形質転換Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが、実施例４に開示されるように、約２．７５×１０８Ｕ／ｍｇ〜約３×１０８Ｕ／ｍｇの比活性を有するハイブリッドＩＦＮタンパク質を発現および分泌し得ることが見いだされた。比活性の決定を、当業者に公知の抗ウイルスアッセイによって行い得る。例示的抗ウイルスアッセイは、実施例５に記載される。別の抗ウイルスアッセイは、ＰｏｎｔｚｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９８５（本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載される。
【０１１７】
（Ｄ．分泌ヒトＩＦＮαＤの単離）
ｒＨｕＩＦＮαＤをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける分泌タンパク質として発現するという主要な利点の１つは、Ｐｉｃｈｉａが、非常に低レベルの夾雑ネイティブタンパク質しか培養培地中に分泌しないということである。このことは、低タンパク質含有量を有する最小Ｐｉｃｈｉａ増殖培地の使用と組み合わせた場合、培地中の総タンパク質の大部分を構成する、生物学的に活性なｒＨｕＩＦＮαＤの効率的な分泌をもたらした。
【０１１８】
基本的に、この分泌発現系のまさに本質は、培地へこのタンパク質を単純に分泌して、精製プロセスにおける第１工程として作用させることを可能にする。このことにより、モレキュラーシーブおよびイオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、透析、溶媒−溶媒抽出などのような技術を用いるさらなる精製のための、直接的かつ簡単な手順が得られる。このような方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０およびＳｃｏｐｅｓ，１９８２に記載される。
【０１１９】
実施例３に記載されるように、１回のモレキュラーシーブクロマトグラフィーにより、本質的に、高分子量の夾雑タンパク質を排除して、非常に高い抗ウイルス活性を有する、非常に純粋なハイブリッドＩＦＮ（図８）を残した。
【０１２０】
（ＩＶ．応用）
本発明のこのハイブリッドＩＦＮタンパク質は、種々の癌およびウイルス疾患（他のインターフェロンが、以前に示された活性を有する癌および疾患を含む）を処置することにおける有用性が見いだされる。例えば、米国特許第４，８８５，１６６号、同第４，９７５，２７６号、および同第５，９３９，２８６号（これらの各々は、それらの全体が本明細書中に明示的に参考として援用される）を参照のこと。本発明が処置を企図する１つの例示的ウイルス病は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。
【０１２１】
ＨＣＶは、全世界で推定１億７０００万人が罹患し、いくつかの国において人口の１０％を超えている、主な公衆衛生的問題である（Ｌｅｃｈｎｅｒら，２０００）。ＨＣＶは、感染血液および血液製剤（Ｃｕｔｈｂｅｒｔら，１９９４；Ｍａｎｓｅｌｌら，１９９５）の輸液によって主に伝播する。疾病管理予防センターは、ＨＣＶが、米国において毎年、急性肝炎の新たな１６０，０００症例の原因であると推定している。従って、有効な抗ＨＣＶ剤が医学的に早急に必要である。
【０１２２】
ＨＣＶは、ポジティブ鎖であり、脂質エンベロープに包まれた、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科の約１万のヌクレオチド長のＲＮＡウイルスである（Ｃｈｏｏら，１９８９）。ＨＣＶは、Ｂ型肝炎ウイルスとは異なり、ＤＮＡ中間体がなく、従って、宿主ゲノムに組み込むことができない（Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒら，１９９６）。ＨＣＶがクローニングされたが、そのウイルスは、インビトロで培養することが困難であった（Ｔｒｅｐｏ，２０００）。ＨＣＶは、非常に潜伏期間が長く、感染個体の８５％において慢性的感染を生じるが、この潜伏の機構は未知である（Ｔｒｅｐｏ，２０００）。
【０１２３】
ＨＣＶの処置は、炎症および肝細胞損傷の減少を助け、従って、肝硬変および肝細胞癌を予防する（Ｈｏｒｉｉｋｅら，１９９８；Ｂｅｎｖｅｇｎｕら，１９９８）。ＨＣＶについて現在利用可能な治療は、感染患者の小さな亜集団についてのみ有効である（Ｍａｇｒｉｎら，１９９４；Ｃｈｏｏら，１９９１；Ｃｈｏｏら，１９８９）。ＩＦＮ−αは、米国においては１９９１年に、日本においては１９９２年に、慢性Ｃ型肝炎についての治療として導入された（Ｓａｉｔｏら，２０００）。しかし、上記のように、臨床的有効性を生じるに十分な投薬量での（すなわち、約１×１０６単位／処置以上の量での）ＩＦＮ−αの使用は、通常、多数の重篤な副作用と関連する。
【０１２４】
本発明のハイブリッドタンパク質の低い細胞傷害性によって、本発明のハイブリッドタンパク質は、ＨＣＶのような病気についての魅力的な候補薬物である。
【０１２５】
（Ｖ．薬学的組成物）
本発明のハイブリッドインターフェロン融合タンパク質は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って処方され得る。インターフェロンまたはインターフェロン様化合物を含む処方物は、以前に記載されている。一般に、本発明の組成物は、ハイブリッドインターフェロンの有効量が、組成物の有効な投与を容易にするために、適切なキャリアと合わせられるように、処方され得る。
【０１２６】
これらの治療において使用される組成物はまた、種々の形態にあり得る。これらとしては、例えば、固体、半固体および液体の投薬形態（例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液、または懸濁液、リポソーム、坐剤、注射用溶液、および注入用溶液）が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療適用に依存する。組成物はまた、好ましくは、従来の薬学的に受容可能なキャリアおよびアジュバント（これらは、当業者に公知である）を含む。好ましくは、本発明の組成物は、単位用量の形態であり、通常、患者に、１日１回以上投与される。
【０１２７】
ハイブリッドインターフェロン融合ポリペプチドまたは関連ポリペプチドは、任意の薬学的に受容可能な投薬形態（経口摂取、吸入、経鼻スプレー、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、病巣内注射、または皮下注射が挙げられる）において患者に投与され得る。具体的には、他のインターフェロン化合物について使用される組成物および方法は、これらの化合物の送達のために使用され得る。
【０１２８】
しかし、本発明の化合物の１つの主な利点は、本発明のハイブリッドＩＦＮタンパク質の極端に低い細胞傷害性である。この低細胞傷害性のために、一般に他のインターフェロン（例えば、ＩＦＮα）化合物について利用され得る濃度よりも高い濃度で、ハイブリッドインターフェロン組成物を投与することが可能である。従って、本発明のハイブリッドインターフェロン組成物は、約５×１０４から２×１０７単位／日、約５×１０７単位／日まで、または好ましくは約１×１０８単位／日まで、さらになお好ましくは、約１×１０１０単位／日までの割合で投与され得ることが企図される。別の実施形態において、本発明のハイブリッドインターフェロン組成物は、約５×１０１１単位／日の投薬量にて、または好ましくは約５×１０１２単位／日まで投与される。
【０１２９】
全身投与のためには、高用量が好ましい。当然のことながら、本発明の組成物および方法が、他の治療剤、例えば、リバビリンと組み合わせて使用され得ることが理解されるべきである。
【０１３０】
リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、プリンヌクレオシドアナログであり、これは、ウイルスｍＲＮＡ合成を妨害し、広範なＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスの複製をインビボおよびインビトロで阻害することが見いだされた（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら，１９８６；Ｂａｌｚａｒｉｎｉら，１９９１）。リバビリンは、アミノトランスフェラーゼレベルを正常化することにおいて効果があるが、慢性Ｃ型肝炎患者における血清ＨＣＶ  ＲＮＡ力価に対する影響はわずかしかないことが示された（Ｄｉ  Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅら，１９９２）。しかし、リバビリンの有益な効果が一過性であるとしても（Ｃｌａｒｋｅ，２０００；Ｋｏｓｋｉｎａｓら，１９９５）、重篤な副作用が原因で、リバビリンが、ＩＦＮ−αと組み合わせて耐性であることが困難であり得る（Ｃｏｔｌｅｒら，２０００）。従って、本発明のハイブリッドＩＦＮタンパク質と組み合わせたリバビリンは、好ましくは、ネイティブＩＦＮ−αと組み合わせたリバビリンであり得る。
【０１３１】
患者の状態が一旦改善されると、必要に応じて、維持用量が投与される。続いて、投与量または頻度、またはその両方が、症状の関数として、改善された状態が維持されるレベルまで減少され得る。症状が所望のレベルまで緩和された場合、処置は、中断すべきである。しかし、患者は、疾患症状の任意の再発の際に、長期間ベースで断続的な処置を必要とし得る。
【０１３２】
前述から、本発明の種々の目的および特徴をどのように満たすかが理解され得る。
【０１３３】
【表２】
2005525784.tif 000009
（ＶＩＩ．実施例）
以下の実施例は、本明細書中に記載の発明をさらに例示し、如何様にも、本発明の範囲を限定するとは意図されない。
【０１３４】
（実施例１：ＨＶＶクローニングストラテジー）
ＨＶＶ分子は、ＨｕＩＦＮαＤ分子（Ｃ末端由来の最後の４つのアミノ酸が、ヒツジＩＦＮ−τ由来のＣ末端の１６アミノ酸と置換されている）からなるハイブリッド分子である。得られたアミノ酸コード配列を使用して、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現のために最適化したコドン使用頻度で対応するＤＮＡコード配列を生成した。そのＤＮＡコード配列を、オリゴヌクレオチドフラグメント（長さが約１５０塩基対；図１〜４）のＧ２とよばれる細菌ベクター（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）への連続的クローニングによって、合成により構築した。特異的制限酵素で消化した重複する合成オリゴヌクレオチド（長さが４０ｂｐ未満）の連結によって、４つの１５０塩基対フラグメント（ＨＶＶフラグメント１〜４）の各々に５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを作製して、ベクターへのクローニングを簡単にした。
【０１３５】
Ａ．クローニング工程＃１
切断されるベクター：Ｇ２
切断酵素：ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ
連結されるフラグメント：フラグメント１（図１）
新たなベクター名：Ｇ２ＨＶＶ１Ｆ１。
【０１３６】
Ｂ．クローニング工程＃２
切断されるベクター：Ｇ２ＨＶＶ１Ｆ１
切断酵素：ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
連結されるフラグメント：フラグメント２（図２）
新たなベクター名：Ｇ２ＨＶＶ１Ｆ２。
【０１３７】
Ｃ．クローニング工程＃３
切断されるベクター：Ｇ２ＨＶＶ１Ｆ２
切断酵素：ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ
連結されるフラグメント：フラグメント３（図３）
新たなベクター名：Ｇ２ＨＶＶ１Ｆ３。
【０１３８】
Ｄ．クローニング工程＃４
切断されるベクター：Ｇ２ＨＶＶ１Ｆ３
切断酵素：ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
連結されるフラグメント：フラグメント４（図４）
新たなベクター名：Ｇ２ＨＶＶ１Ｆ４。
【０１３９】
Ｅ．最終チェック
切断酵素：ＳａｃＩＩ。
【０１４０】
ＨＶＶ遺伝子を、Ｇ２ＨＶＶｌＦ４ベクターから切り出し、プラスミド上のＸｈｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位を利用して、ｐＰＩＣＺ−α  ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）に連結した。ＨＶＶ１−ｐＰＩＣＺ−α構築物の配列を、図５Ａ〜５に記載する。
【０１４１】
（実施例２：Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＨＶＶの組換え生成）
選択されたポジティブＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＨＶＶ形質転換体を、ＢＭＧＹ培地中で一晩増殖させ、次いで、その細胞を、ＢＭＭＹ−メタノール含有培地中で２のＯＤ６００を使用して、誘導した。培養物に、誘導の２４時間後および４８時間後に、１ｍｌの１０％メタノールを供給した。培養の７２時間後に、培養上清全体を回収し、濾過滅菌し、コロイド性クーマシー（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した１４％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ｐＰＩＣＺαコントロールプラスミド形質転換体からの上清を、ネガティブコントロールとして使用した。図７に示されるように、結果により、クローンＨＶＶ−１６が、最も強力なＨＶＶ発現を生じたことが示される。
【０１４２】
（実施例３：ＨＶＶ精製）
図８は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ上清からのＨＶＶタンパク質の部分的精製を例示する。培養上清（２０ｍｌ容量）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで緩衝液交換し、ＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ２６／６０  Ｓ−１００サイズ排除カラムにロードする前に、最終容量２ｍｌまで濃縮した（分画前）。サンプル注入後の最初の１２０ｍｌのフロースルーを１ｍｌ／分にて回収し、画分１と称した。２０ｍｌの３つの画分を、各々回収し、それぞれ画分２、画分３、および画分４と称した。画分２、画分３、および画分４を、１ｍｌまで濃縮し、１４％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、Ｎｏｖｅｘコロイド状ブルー染色キットを用いて染色した。
【０１４３】
（実施例４：ＨＶＶ抗ウイルス比活性）
ＨＶＶタンパク質を、実施例３に記載のように、サイズ排除ゲルクロマトグラフィーを用いて、ＨＶＶクローン１６（図７）のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ組換え培養上清から部分的に精製した。４つの異なる精製実験（サンプルＩＤ：Ｓ−００１８；Ｓ−００１９；Ｓ−００６３；およびＳ−００６４）からの画分３（図８）を、各々１ｍｌまで濃縮し、各サンプルの総タンパク質濃度および抗ウイルス活性を、以下の実施例５に記載されるように決定した。結果を、以下の表３に示す。
【０１４４】
【表３】
2005525784.tif 000010
（実施例５：定量的抗ウイルスアッセイ）
Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質を補充したＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭを用いて、９６ウェル平底プレート中でコンフルエントになるまで増殖させる。一旦細胞がコンフルエントに達すると、アッセイ培地は、２％  ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭである。ＶＳＶのチャレンジ用ウイルス調製物を、ウイルス単独での一晩（すなわち、１６〜２４時間）のインキュベーションの後に、コンフルエントなＭＤＢＫ細胞の１００％  ＣＰＥを与える、最適作業希釈液を決定するために、予備的に対数連続希釈において試験する。ＶＳＶ希釈範囲は、９６ウェルプレート中で最終総容量２００μｌ／ウェルで、１希釈液あたり、４つの複製ウェルを使用すると、１０−１〜１０−６／５０μｌ／ウェルである。１００％  ＣＰＥを生じるウイルスの希釈液に基づいて、ＴＣＩＤ５０を決定する。現在では、使用される感染性ストックウイルスは、１０６．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌを有する。このアッセイにおいて使用されるウイルス粒子の実際の数は、１０３．５ＴＣＩＤ５０／ウェルである。
【０１４５】
そのインターフェロンを試験するために、ＭＤＢＫ細胞を、コンフルエントになるまで増殖させ、その後に増殖培地を除去し、細胞を滅菌ＰＢＳで１回洗浄する。次いで、インターフェロンサンプルを含有する培地、またはコントロールとしてインターフェロンなしの培地を、上記のアッセイ培地を使用して、１００μｌ／ウェルにて、連続１０倍希釈（例えば、１０−１〜１０−１０）を三連で添加する。次いで、その細胞を、３７℃にて１８時間インキュベートする。組換えＨｕＩＦＮαＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｌ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を、標準的インターフェロンコントロールとして使用し得る。インターフェロンインキュベーション工程の後に、細胞をＰＢＳで洗浄で２回洗浄した後に、１００μｌ／ウェルの所定のウイルス希釈液（１０３．５ＴＣＩＤ５０／ウェル）を添加する。ウイルスを、インターフェロン処理試験ウェルおよび非処理ウェルの両方に添加し、３７℃にてさらに１６〜２４時間インキュベートする。次いで、１００μｌの培地を、各ウェルから取り出し、１００μｌの０．２％  ニュートラルレッド溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で置換し、３７℃にて１時間インキュベートする。全ての培地を取り出し、細胞を、ＰＢＳで２回穏やかに洗浄した後、１００μｌの酸アルコール（５０％  エタノール、１％  酢酸）を添加する。溶解した色素のＡ５５０を、Ｂｉｏ−Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ  ＶＴ）で読み取る。保護％を、以下の式を用いて計算する：
保護％＝［ＡＶＧ（Ａ５５０試験ウェル）−ＡＶＧ（Ａ５５０ウイルスコントロールウェル］×１００／［ＡＶＧ（Ａ５５０未処理細胞コントロールウェル）］
１抗ウイルス単位（Ｕ）を、５０％保護と規定する。インターフェロン力価（単位／ｍｌ）を、細胞単層の５０％保護を示す希釈液（サンプルの０．１ｍｌあたり）の逆数×１０として読み取る。
【０１４６】
一旦インターフェロンの抗ウイルス単位／ｍｌが、１０倍希釈範囲で決定されると、このデータを使用して、このアッセイにおけるインターフェロンの２倍希釈範囲（最大１０の希釈液）についての開始希釈液を決定する。これにより、試験されるインターフェロンについてのより正確な抗ウイルス単位／ｍｌ値が与えられる。この比色アッセイは、Ｃｒａｗｆｏｒｄ−Ｍｉｋｓｚａおよび（１９９４）により刊行されたアッセイの改変であることに注意すること。
【０１４７】
（実施例６：末梢血単核球においてＩＦＮαアナログを試験するインビトロ毒性アッセイ）
ＨｕＩＦＮα、ＯｖＩＦＮτ、およびＩＦＮハイブリッドタンパク質のインビトロ毒性を、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用して比較した。全血の淡黄色層画分を、ＰＢＳで１：４希釈し、Ｎｙｃｏｐｒｅｐ  １．０７７（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）上に重層した。６００×ｇで２０℃にて２０分間遠心分離した後、ＰＢＭＣ（界面にバンド状になっている）を、ピペットを用いて取り出した。次いで、その細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、９６ウェルプレートにおいて５×１０５細胞／ウェルの濃度にてプレートした。プレートした後、その細胞を、２０００Ｕ／ｍｌ〜１２８，０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮα、ＩＦＮτ、またはＩＦＮハイブリッドタンパク質を用いて、三連にて処理した。１２日間インキュベートした後、その細胞は、アネキシンＶアッセイ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、すぐアッセイできる状態であった。これらのアッセイは、本発明者らの実験室で慣用的に使用されており、一致した信頼性のある定量的結果を与えたことに注意のこと。
【０１４８】
（アネキシンＶアッセイ：）
アネキシンＶは、リン脂質であるホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して高い親和性を有する、３５〜３６ｋＤのＣａ２＋依存性のリン脂質結合タンパク質である。アポトーシス性の細胞において、膜ＰＳを、原形質膜の内側リーフレットから外側リーフレットにトランスロケーションする。アネキシンＶは、膜ＰＳを露出しているアポトーシスの初期段階を受けている細胞に結合する。従って、生存を示す色素である（ｖｉｔａｌ  ｄｙｅ）ヨウ化プロピジウムと組み合わせた、アネキシンＶを用いた染色により、初期のアポトーシス性細胞の同定が可能である。このアッセイは、アポトーシスを既に受けた細胞と、壊死の結果として死亡した細胞との間とは区別しない。
【０１４９】
３ウェルからＰＢＭＣを採取し、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ａｓｓａｙマニュアルにより具体的に示されるように、アネキシンＶアッセイのために調製する。アネキシンＶアッセイキットは、細胞染色に必要な試薬の全てが付属している。染色された細胞を獲得し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。ＰＢＭＣ集団内にアポトーシスの基本レベル（アネキシンＶは陽性、ヨウ化プロピジウムは陰性）および壊死（アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムが二重陽性）があり、このレベルが、各ドナーによってわずかに異なることに注意することが重要である。従って、未処理集団を使用して、アポトーシスの基本レベルと死細胞の基本レベルを規定する。各サンプルについてのデータを、合計１０，０００細胞からの特異的細胞死％（アネキシンＶ＋またはヨウ化プロピジウム＋）として示し、以下の式を用いて獲得した：
％特異的細胞死＝（未処理ウェルからのアネキシンＶ＊陽性細胞％）×１００
（処理ウェルからのアネキシンＶ陽性細胞％）
＊注：ヨウ化プロピジウム染色に基づいて特異的細胞死％を計算する場合、アネキシンＶ値を、ヨウ化プロピジウム値と置換すること。
【０１５０】
（実施例７）
ヒトＰＢＭＣ（５×１０５／ウェル）を、ｒＨｕＩＦＮ  またはｒｏＩＦＮ  いずれかとともに１．５×１０５抗ウイルスＵ／ｍｌにて１２日間インキュベートし、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムで二重染色した。特異的細胞死％を、以下の式を用いることにより計算した：
［（コントロールウェルからのＡＶ＋細胞％またはＰＩ＋細胞％）／（処理ウェルからのＡＶ＋細胞％またはＰＩ＋細胞％）×１００］。
【０１５１】
【表４】
2005525784.tif 000011
【０１５２】
【表５】
2005525784.tif 000012
（実施例８：フローサイトメトリーにより分析された特異的細胞死％）
図９は、フローサイトメトリーにより分析した特異的細胞死％を示す。ヒトＰＢＭＣ（５×１０５／ウェル）を、ｒＨｕＩＦＮαまたはｒｏＩＦＮτのいずれかとともに、１．５×１０５抗ウイルスＵ／ｍｌにて、９日間、１０日間、および１２日間インキュベートし、次いで、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムで二重染色した。特異的細胞死％を、以下の式を使用することによって計算した：
［（コントロールウェルからのＡＶ＋細胞％またはＰＩ＋細胞％）／（処理ウェルからのＡＶ＋細胞％またはＰＩ＋細胞）×１００］。列および記号は、それぞれ、アネキシンＶ計算値およびヨウ化プロピジウム計算値を示す。
【０１５３】
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個々に参考として援用されることを示すのと同程度まで、本明細書中に参考として援用される。
【０１５４】
本発明は、特定の実施形態に関して記載されてきたが、種々の変更および改変が、本発明から逸脱することなく行われ得ることは、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、ＨＶＶフラグメント１を作製するために用いたオリゴヌクレオチド、および最終連結産物配列を示す。
【図２】図２は、ＨＶＶフラグメント２を作製するために用いたオリゴヌクレオチド、および最終連結産物配列を示す。
【図３】図３は、ＨＶＶフラグメント３を作製するために用いたオリゴヌクレオチド、および最終連結産物配列を示す。
【図４】図４は、ＨＶＶフラグメント４を作製するために用いたオリゴヌクレオチド、および最終連結産物配列を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、ＨＶＶ−ｐＰＩＣＺ−α構築物の配列および選択した制限部位を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、ＨＶＶ−ｐＰＩＣＺ−α構築物の配列および選択した制限部位を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、ＨＶＶ−ｐＰＩＣＺ−α構築物の配列および選択した制限部位を示す。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、選択したＨＶＶタンパク質情報を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、選択したＨＶＶタンパク質情報を示す。
【図７】図７は、１％メタノールでの誘導の７２時間後のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＨＶＶ組換え培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図８】図８は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ上清由来のＨＶＶタンパク質の部分精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図９】図９は、フローサイトメトリーにより分析した、ＰＢＭＣ細胞のパーセント比細胞死を示す。
【図１０】図１０は、選択したインターフェロンタンパク質のアミノ酸配列アライメントを示す。
【配列表】
2005525784.tif 000013
2005525784.tif 000014
【図１】
2005525784.tif 000015
【図２】
2005525784.tif 000016
【図３】
2005525784.tif 000017
【図４】
2005525784.tif 000018
【図５Ａ】
2005525784.tif 000019
【図５Ｂ】
2005525784.tif 000020
【図５Ｃ】
2005525784.tif 000021
【図６Ａ】
2005525784.tif 000022
2005525784.tif 000023
【図７】
2005525784.tif 000024
【図８】
2005525784.tif 000025
【図９】
2005525784.tif 000026
【図１０】
2005525784.tif 000027
【国際調査報告】
2005525784.tif 000028
2005525784.tif 000029
2005525784.tif 000030
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