(57)【要約】１Ｄまたは２Ｄのフラットベッド電気泳動法またはフラットベッドクロマトグラフィによって、分離されあるいはされなかった物質が、前もって標識化されることなく、ＵＶ領域における蛍光測定によって、１４０〜３２０nmの波長範囲のＵＶ光線で励起させることにより刺激され、ＵＶ検出器で直接的に測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１４０〜３２０nmの波長範囲の励起光のためのＵＶ源（１）と、
ｂ）帯電物質のフラットベッド電気泳動法により分離するための分離媒体（２）、または帯電物質または中性物質のフラットベッドクロマトグラフィーにより分離するための分離媒体（２）と、
ｃ）前記ＵＶ源（１）による励起で１５０〜４００nmの波長範囲のＵＶ蛍光を発する、分離される物質、分離された物質および標識化されていない物質の、分離媒体（２）中に分散された領域と、
ｄ）ＵＶ蛍光放射のためのＵＶ検出器（３）と、
ｅ）励起放射および蛍光放射を、フィルタリングし、導きかつ/または増幅させるための光学部品または光電子部品と、を備えている装置。
【請求項２】
ＵＶ源が、レーザ、ＵＶランプまたは多光子励起のためのレーザであることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項３】
ＵＶ源が、分離媒体の表面で測定した場合、１cm2あたり０．１〜３５００mJのエネルギー密度を有していることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項４】
励起光の波長が１４０〜３２０nmであることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項５】
分離媒体が、金属酸化物、塩、紙、セルロースまたは架橋したゲル形成ポリマーであることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項６】
ゲル形成ポリマーが、ポリアクリルアミド、アガロースまたはデキストランであることを特徴とする、請求項５記載の装置。
【請求項７】
分離媒体（２）が、フラットベッドクロマトグラフィー（薄層クロマトグラフィー）で使用される分離媒体であることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項８】
分離媒体（２）が、担体に塗布されており、必要に応じてＵＶ透過性カバーを備えることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項９】
構成要素ｃ）の物質が、芳香族または複素芳香族の残基および/または場合によっては共役不飽和炭素二重結合および/または炭素へテロ原子二重結合および/または窒素多重結合および帯電した基を含むことを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項１０】
物質がたんぱく質であることを特徴とする、請求項９記載の装置。
【請求項１１】
ＵＶ蛍光が１５０〜４００nmの範囲にあることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項１２】
ＵＶ検出器が、ＣＣＤカメラ、光増幅器、半導体ダイオードまたは半導体ダイオード装置であることを特徴とする、請求項１記載の装置。
【請求項１３】
１Ｄまたは２Ｄフラットベッド電気泳動法により分離された物質を同定する方法であって、分離されていない物質および分離された物質に、電気泳動法による分離のため分離媒体中に光源を用いて照射して、発光した蛍光光を検出器を用いて測定する方法において、（ａ）ＵＶ範囲でのＵＶ光の作用によって、（ｂ）分離媒体中の蛍光を発する物質に、１５０〜３２０nmの波長のＵＶ光を直接的に照射し、（ｃ）ＵＶ蛍光を、ＵＶ感応性検出器を用いて１５０〜４００nmの波長で測定することを特徴とする方法。
【請求項１４】
分離された物質が、分離媒体の平面に垂直な電界を適用することによって、分離媒体から、載置された膜へと移されることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
膜が、ウエスタンブロット法で使用されるニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデンからなることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
移された物質の領域が標識化されていない抗体で処理され、ＵＶ領域での固有の蛍光がＵＶ放射による励起後に測定されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
人体または動物の体もしくは植物から取り出した試料中の疾病の特異な物質を分離して同定するための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の装置の使用、または請求項１３〜１６のいずれか１項記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＵＶ放射源と、ＵＶ励起放射を導くための光学エレメントと、電気泳動法による分離可能な物質の染色されていない個々の点が配置されたフラットベッド電気泳動法（flat bed electrophoresis）による分離媒体と、ＵＶ蛍光放射を導くための光学部品と、ＵＶ検出器とを有する装置に関する。この装置は、ＵＶ領域での自然蛍光放射により、電気泳動法によって分離可能な物質の、直接的な測定および検出のために用いられる。
【０００２】
電気泳動法、特にゲル電気泳動法は、以前より、質量および/または電荷に基づいて帯電した分子を分離することに関し、その価値が認められている。この方法は、薬理活性化合物および農薬、ならびにこれらの物質の代謝産物を、定性的および定量的に分析するために、ならびに細胞および体液中の、アミノ酸、オリゴペプチドおよびポリペプチド（たんぱく質）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、単糖類、オリゴ糖類および多糖類、ならびに別の生物学的物質を分離して試験するために、用いられる。特にゲル電気泳動法は、近年、細胞の研究（プロテオミクス）に関連してその重要性が増している。実験規模でのカラム（チゼリウスの装置）においてゲル電気泳動法以外の公知の方法は、微量を分離するためのキャピラリゲル電気泳動法、様々な平らな無機系または有機系の分離媒体（シリカゲル、金属酸化物、紙、セルロース、アガローススゲル、デキストランゲル、ポリマーゲル、膜および特にポリアクリルアミドゲル）を使用する、水平方向または垂直方向電気泳動装置でのフラットベッド電気泳動法を含む。電気泳動法による分離は、様々な分離メカニズム、例えば電荷量の比、等電点の相違（等電点電気泳動法）または大きさに基づいて行われ、この場合、濃度勾配ゲルまたは帯電ＳＤＳ複合体を使用する。等電点電気泳動法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法との組合せは、２−Ｄゲル電気泳動法と呼ばれ、特に細胞の研究（プロテオミクス）に関連して確立された。分離を１次元でのみ平らな担体上で行う場合、それは１−Ｄフラットベッド電気泳動法と呼ばれる。
【０００３】
吸収スペクトルを記録し、特定の波長での発光放射を測定することによる、吸収スペクトル法または蛍光スペクトル法のようなスペクトル分析法によって、分析すべき物質を検出すると有利であり、通常、キャピラリ電気泳動法［例えば、U. B. Soetebeerら、Journal of Chromatography B、745（2000）、271〜278頁参照］または液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）が用いられている。キャピラリゲル電気泳動法で使用されるゲルは液体（イオン交換ゲル）であり、液体クロマトグラフィーの場合には、液体の吸収およびバックグラウンド放射に関してほとんど干渉が観察されないので、自然蛍光の測定には問題がない。
【０００４】
１Ｄおよび２Ｄフラットベッド電気泳動法では、固体の分離媒体が使用され、したがってこの場合、低ＵＶ領域（１９０〜２８０nm）では分離媒体（担体およびバッファ系）のバックグラウンドが高すぎるので、必要レベルの感度で不可視の物質を同定するために吸収を利用することができない。また、非常に薄いＵＶ透過ゲルを使用してこの問題を解消することもできない。
【０００５】
したがって、通常、表面上の物質で占有されている領域（点、線）を、分離後、直接的にまたはデジタル画像法によって視覚化し、必要であれば定量化するために、物質固有の染色法が用いられる。「電気泳動ゲルにおける核酸とたんぱく質の染色」、Biotech. Histochem. （2001）76（3）、127〜132頁、L. R. Williamsには、異なる染色法の概要が記載されている。一般に、染色反応中に染色溶液及び脱色溶液において任意の「ブリードアウト」を回避するために、ゲルに試料を固定させる固定剤を物質固有の染色を行う前に使用することが必要となる。これらは、それ自体に不都合な変化を生じさせ得る。
【０００６】
たんぱく質を視覚化させるための公知の方法は、アミドブラック［C. M. Wilson、Anal. Biochem. 6、263〜278頁（1979）］またはクマシーブルー染色液［S. Fazekas de St. Grothら、Biochim. Biophys. Acta 1、377〜391頁（1963）］を使用した染色であるが、これらの方法では、感度が低いことが特に不都合であることが分かった。しかし、異なるポリペプチドが定量的に染色液と反応するという利点がある。
【０００７】
十分に感度の高いたんぱく質分析の方法は、銀イオンの沈殿およびたんぱく質とのそれらの結合［B. R. Oakly et al.、Anal. Biochem. 105、361〜363頁（1980）］（つまり、銀染色）であるが、この方法では、特に、ダイナミックレンジが狭く、後続の検査に支障が出てしまう。この染色法の別の欠点は、染色の際に異なるたんぱく質の間で、濃く染まるたんぱく質もあるが、より薄く染まるたんぱく質もあり、差異を生じるということである。したがって、未知のたんぱく質試料については、異なるたんぱく質の相対的な量または相対度数を推定するのは不可能である。しかし、このようなことは、細胞の調査研究（プロテオミクス）の分野での基本的な前提条件の１つである。
【０００８】
さらに最近の刊行物［Analytical Biochemistry 301、91〜96頁（2002）］で、D. Kazminらは、トリプトファンを含有しているたんぱく質をＵＶ光の作用下でトリクロロ酢酸またはクロロホルムで処理し、励起された可視蛍光放射（変性トリプトファンの自然蛍光）によって、ポリアクリルアミドゲルから分離したたんぱく質で占有されている領域を可視化することを提案している。したがって、自然蛍光のスペクトルは、ＵＶ領域から可視領域に移動する。
【０００９】
公知の別の方法は、電気泳動法による分離後、可視領域で蛍光を発する染色液で染色する方法である。利点は、測定される強さの量への依存性について線形性（ダイナミックレンジ）が高いということである。しかし、化学薬品による処理によって、低分子量の物質が洗い流されて検出されないことにつながり得ることが特に不都合である。さらに、化学薬品の作用に関係して物質が変化する可能性も無視することができず、このことは、試料中の全ての物質の定量的な反応を保証できないことを意味する。
【００１０】
同様のまたは同一の欠点は、分離前に、物質を蛍光染色液、共有結合する染色液で、染色する場合にもある。これは、高い感度で定量的な検出を保証するので、たんぱく質を分析する一般的な方法となっている。しかし、この技術の大きな欠点は、分析試料中の物質が化学的に変化すること（質量および等電点の両方）、特定の染色液のために開発された特別なシステムのみ、検出のために使用できないということである。したがって、この方法は、安価ではない。さらに、蛍光染色液が存在することによって、後続の試験、例えば質量スペクトル測定が妨げられてしまう。
【００１１】
一般に、染色液は、質量スペクトル測定の前に、酵素消化の前に、またはブロッティングの前に、再度除去される。これらは分離された物質に変化を生じさせうる。グリコシル化たんぱく質は、この点に関して特に影響を受けやすく、しばしば検出することができない。さらに、追加の手順ステップは時間がかかり、廃棄されなければならない化学廃棄物が生じてしまう。このようにして生じる不安を回避するために、測定に関連して、しばしば２〜４枚のゲルプレートを使用し、後続の測定のために参照プレートから物質を分離させることを目的として、２枚は測定プレートとして、もう２枚は参照プレートとして使用する。材料の大量消費が、特に欠点であることが分かっている。
【００１２】
Analytical Biochemistry 191、58〜64頁（1990）で、H. Yamamotoらは、標識化されていない、２−Ｄゲル電気泳動に関連して分離された物質を、画像描写するための濃度測定法を記載している。この方法では、適切な波長を選択することで、物質領域の吸収スペクトルをＵＶ領域から可視領域まで記録する。この方法は、その感度が十分でなく、特に、近年たんぱく質の分析（プロテオミクス）に関して生じている要求には適さない。
【００１３】
今までのところ、特に、アクリルアミドゲルまたは別の固体ゲル（通常は架橋されている）中のたんぱく質を同定し視覚化する場合、１Ｄまたは２Ｄフラットベッド電気泳動法（ポリアクリルアミドゲルを使用する場合にはＰＡＧＥと略される）を用いて電気泳動法により分離された物質を、物質を前処理したり変化させたりすることなしに、直接的に同定する方法は何も開示されてない。このような方法は、前述の欠点、例えば感度の低さ、固定、脱色、標識化、物質（たんぱく質）が異なる場合に異なった度合いで染色されることおよび共有結合する染色液のため物質（たんぱく質）が変化することを、回避するために強く要望されている。
【００１４】
驚くべきことに、電気泳動法によって分離可能な物質のＵＶ領域での固有蛍光がＵＶ放射により励起されて測定される場合、１Ｄまたは２Ｄフラットベッド電気泳動法およびフラットベッドクロマトグラフィー（薄層クロマトグラフィー）に関して、直接的な測定および/または画像描写が可能であることが分かった。ダイナミックレンジは予想外にも広く、グリコシル化されたたんぱく質を直接的に検出する測定手段を用いることも可能である。さらに、測定の感度は、驚くべきことに、帯域あたり１〜５ナノグラムの範囲での検出が可能な程度までに高くなっている。したがって、この直接的な測定は、少量の物質、例えば細胞溶解物を検出するのに特に適している。
【００１５】
本発明は、まず、以下の構成要素、つまり、
ａ）１４０〜３２０nmの波長範囲の励起光のためのＵＶ源（１）と、
ｂ）フラットベッド電気泳動法によって帯電物質を分離するための分離媒体（２）、もしくはフラットベッドクロマトグラフィーによって帯電物質または天然物質を分離するための分離媒体（２）と、
ｃ）前記ＵＶ源（１）による励起で１５０〜４００nmの波長範囲のＵＶ蛍光を発する、分離される物質、分離された物質および標識化されていない物質の、分離媒体（２）中に分散されている領域と、
ｄ）ＵＶ蛍光放射のためのＵＶ検出器と、
ｅ）励起放射および蛍光放射をフィルタリングし、導きかつ/または増幅させるための光学部品または光電子部品と、を有している装置に関する。
【００１６】
ＵＶ源（１）は、レーザまたはＵＶランプ、例えば水銀蒸気ランプ、ＫｒＦランプ、Ｘｅフラッシュライトランプ、エキシマガス放出ランプ（TuiLaserのｅ−ランプ）または一光子励起または多光子励起のためのレーザであってもよい。ランプを使用する場合には、所望の波長は、光フィルタ、格子または別の光学エレメントに接続することによって発生させることができ、また、十分なエネルギー密度を生み出すためにレンズによって収束させることもできる。レーザは、フェトム秒〜ミリ秒の範囲のパルス長を有する連続レーザまたはパルスレーザであってもよい。ＵＶレーザは、たいていは、可視領域で放射する周波数逓倍レーザである。放射光を、複数の証明による場合と同様、直接、収束され、または拡張光として、ゲルへと方向付けることができる。出力密度およびエネルギー密度は、同時に物質を著しく損傷することなしに測定可能な蛍光信号を生成するように選択される。エネルギー密度は、例えば１秒当たり０．１〜３５００、好ましくは１〜５００、特に好ましくは１〜５０mJ/cm2であってもよい。たんぱく質を測定する場合、１秒当たり約３５mW/cm2の値が特に適している。これらのＵＶ光源は、市販されている。２８０nm（８４０nmの振動数）の波長、８０MHzおよび１００フェトム秒のパルス長で操作され、１５０mWの出力を有しているSpectra Physicsレーザ（Tsunami型）が、特に適していることが分かっている。同様に、JDS Uniphaseの、４倍波Ｎｄ：ＹＡＧレーザシステム（波長２６６nm、パルス長５００ps、出力４mW）も、特に適していることが分かっている。
【００１７】
励起ＵＶ光の波長は、好ましくは、１４０〜３２０nm、特に好ましくは２２０〜３００nmである。
【００１８】
分離媒体（２）は、異なる平らな材料からなる。これらの材料は、使用される移動相に可溶であってはならず、誘電性を有さなくてはならない。この材料は、無機材料、例えば金属酸化物およびケイ酸塩のような塩であってよい。例としては、酸化アルミニウム、酸化チタン、シリカゲルおよび珪藻土がある。別の適する材料は、紙およびセルロースである。必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルおよびデキストランゲルのような架橋されたゲル形成ポリマーが、特に適する材料である。
【００１９】
分離および/または後続の測定のために、分離媒体を、誘電性または導電性の担体、ガラス、石英またはプラスチック、金属酸化物および金属に対して塗布することができる。ＵＶ放射を反射する材料、例えば研磨された金属プレートまたは金属被覆されたプラスチックプレートが、この目的のために特に適している。
【００２０】
電気泳動法による分離のための多くの分離媒体は公知であり、文献にも記載されており、市販されている。したがって、この分離媒体についてここでは詳細には述べない。しかし、その分離媒体は、原則として、たんぱく質分離の重要な分野において使用されるポリアクリルアミドをベースとしたゲルであると言及してよいであろう。高い測定感度を達成できるようにするために、分離媒体は有利に低いＵＶ吸収およびＵＶ蛍光を示す。
【００２１】
本発明の装置では、電気泳動分離媒体は、フラットベッドまたは薄層クロマトグラフィーのための分離媒体に置き換えることもでき、同時にこれらの分離媒体は、低いＵＶ吸収およびＵＶ蛍光を有利に示す。クロマトグラフィー分離媒体は、ＵＶ放射を伴う励起状態であるＵＶ領域の固有蛍光を有している分子を、例えば吸収の相違および/または大きさの相違に従って分離することができる様々な平らな材料から構成してもよい。これらの材料は、使用される移動相に可溶であってはならず、必要であれば分離層として担体に塗布される。またこれらの材料は、細かく分割された無機材料、例えば金属酸化物およびケイ酸塩のような塩であってよい。例としては、酸化アルミニウム、酸化チタン、シリカゲルおよび珪藻土が挙げられる。別の適する材料は、紙およびセルロースである。必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルおよびデキストランゲルのような架橋されたゲル形成ポリマーは、細かく分割された材料として担体上で層を形成することもでき、特に適する材料である。フラットベッドクロマトグラフィーは、帯電物質および非帯電物質の両方に対して使用することができる。
【００２２】
できるだけ平らな表面を得るためならびに乾燥および劣化を防ぐために、分離媒体には、励起光および蛍光の両方に対して光学的に透過性のカバーを設けることができ、放射光をゲルへと方向付け、かつ蛍光放射をカバーを通して有利に測定する。ＵＶ放射光に対して透過性を有する材料は公知である。これらの材料は、便宜上フィルムとして設計されているプラスチックであってもよい。石英ガラスもきわめてよく適している。
【００２３】
これらの物質は、１次元または２次元方向で分離媒体に分散されていてよい。これらの物質は、検出のために化学的に変性されることはない。これらの物質を、励起させて、ＵＶ光を放射することが可能でなくてはならない。このような物質は、例えば芳香族または複素芳香族の残基、および/または必要であれば共役不飽和炭素二重結合または炭素へテロ原子二重結合または多重窒素結合を含んでいる。ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、ＳおよびＰの群から選択することができる。さらに、これらの物質は、電気を帯びた基、例えば酸性基（例えばカルボキシ基、リン酸またはホスホン酸基、ホウ酸またはボロン酸基、および/または硫黄またはスルホン酸基）および/または塩基性のオニウム基（例えばアンモニウム基）を含む。
【００２４】
分離媒体は、分離操作の直後に測定することができ、別の態様では、試料を保存することができる。保存前には、分離媒体中の物質の領域を、それ自体公知の方法で固定する。たんぱく質分離のために使用されるゲルの場合には、例えばメタノールまたはエタノールのようなアルコールで処理することによって行われる。
【００２５】
蛍光放射の波長は、好ましくは、１５０〜４００、特に好ましくは２３０〜４００nmである。
【００２６】
測定原理を、物質としてたんぱく質を用いて説明する。たんぱく質は、アミノ酸である、フェニルアラニン、トリプトファンおよび/またはチロシンを含んでおり、それぞれ、２８２nm、３０３nmおよび３４８nmの波長で最大に発光する。吸光係数は２００〜３２０nmの波長範囲で高く、したがって、たんぱく質は本発明の測定原理に特に適している。前述の構造的なエレメントを含む多くの無機物質は、類似の性質を示し、本発明の装置での測定を容易に行うことができる。これらの物質は、例えば、後で電気泳動により分離することのできる遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）も含む。
【００２７】
ＵＶ検出器（３）は、蛍光強度を測定するための光検出器であってもよく、多くの種類のものが市販されている。適切な検出器の例は、光電子倍増管、光ダイオード（半導体ダイオードまたは半導体ダイオード基板または配列）およびＵＶ感応性ＣＣＤカメラである。ＣＣＤカメラ（デジタル画像記録および再生機能を有する電子カメラ）が好ましい。ＵＶ感応性ＣＣＤカメラは、例えばAndor社（ＵＳＡ）により販売されている。
【００２８】
構成要素（ｄ）は、不都合なバックグラウンド放射光および/または散乱放射光を除くための光学フィルタであってもよく、フィルタは、プレート（３）とＵＶ検出器との間の光線経路上に配置される。励起光の波長を設定するためおよびＵＶ光源から発生した不都合な放射光を除くために、光学フィルタを使用することもできる。この構成要素は、偏光または励起光の集光のためのミラー、プリズムまたは回折エレメントであってもよい。放射光を導くまたは収束させるために用いられるレンズまたはレンズシステムも適している。球面レンズは、レーザ光線を拡大するために用いることができる。感度を増大させるための光増幅器（残留光増幅器）を用いることもできる。規定された時間間隔での照射を可能にする制動エレメントも、ＵＶ光源とプレート（３）との間に配置することができる。
【００２９】
図１は、本発明の装置の実施態様を示す。ＵＶレーザ（１）のレーザ光線（４）は、凸レンズ（５）によって拡大され、分離媒体（２）のカバー（６）へと方向付けられる。カバーは、ステンレス製の研磨された鋼板（８）上に塗布されたアクリルアミドゲル（７）の層を保護する。照射によって、ＵＶ蛍光（９）を発生する分離された物質の領域は、アクリルアミドゲルに設けられ、その表面上に分散されている。蛍光放射光（９）は、球面レンズ（１０）および（１１）を経由して、ＵＶ検出器（３）、例えばＵＶ感応性ＣＣＤカメラへと誘導される。球面レンズ（１０）と（１１）との間には、例えば３００〜３７５nmの波長範囲に対する、帯域通過フィルタ（１２）が配置されている。
【００３０】
本発明の装置は、１Ｄまたは２Ｄゲル電気泳動法のためのプレートの分離媒体（例えばゲル）中またはフラットベッドクロマトグラフィーのための分離媒体中の物質を直接的に測定するのに飛びぬけて適しており、物質を分離前または分離後に標識化する必要がない。分離されていないまたは分離された物質（検体）は、簡単な方法で、ブロッティング（分離媒体のプレートに垂直に作用する電界の効果）によって、適用された膜上に直接的に転写することもでき、本発明の装置を用いて、標識化されていない使用抗体を直接的に測定することができる。使用されている標準的な方法と比較して、本方法は、以下の実質的な利点を提供する。
ａ）測定/視覚化のための化学物質の使用が完全に回避されること、
ｂ）測定にかかる時間が実質的に短縮すること、
ｃ）化学物質による変性の結果として物質が変質すること、および変性方法の結果として物質が洗浄除去されてしまうことが完全に回避されること、
ｄ）後続の試験のための、例えば質量スペクトル分析による化学的な後処理が省かれること、
ｅ）後続の検査のために変性されていない物質を提供するために、分析的分離および予備的分離を同時に行う標準的な方法と比較して、予備的分離が省かれること、
ｆ）混合物中の分離すべき全ての物質、例えば糖たんぱく質が、たんぱく質混合物の場合でも同様に検出されること、
ｇ）銀標識化に匹敵するきわめて高い感度、さらには染色液および蛍光による標識化を行った場合には広いダイナミックレンジが得られること、
ｈ）染色液/蛍光によって変性されていない物質が測定されること、
ｉ）公知のたんぱく質に対して行った質量スペクトル分析によって明らかであるように、少なくとも３５mJ/cm2まではＵＶ放射によってたんぱく質の顕著な分解が起こらないこと、および
ｊ）参照材料として分離媒体が追加的に使用されないことである。
【００３１】
本発明は、１Ｄまたは２Ｄフラットベッド電気泳動法によって分離される物質を同定するための方法にも関し、分離されていないまたは分離された物質に、電気泳動法による分離のための分離媒体中に光源によって照射を行い、発光した蛍光光を検出器を使用して測定する方法であって、（ａ）ＵＶ領域のＵＶ光の作用によって、蛍光を発する物質に、（ｂ）分離媒体中に、１４０〜３２０nmの波長のＵＶ光を直接的に照射し、（ｃ）ＵＶ蛍光を、ＵＶ感応性検出器を用いて１５０〜４００nmの波長で測定する。本方法は、帯電または非帯電物質を分離できるフラットベッドクロマトグラフィー中の分離媒体に対しても用いることができる。
【００３２】
装置に関して前述した実施態様および好ましい実施態様も、この方法に適用することができる。
【００３３】
試料のデジタル画像は、様々な方法で作成することができる。
１）一時に同時に全表面を励起して蛍光させ、デジタルカメラで分離媒体全体の画像を記録する。
２）試料をセグメントで検分し、個々のエレメントをコンピュータ内で組み合わせて全体の画像を得る。これに関連し、１つのセグメントは、所望のように（約２００nmのレーザ焦点によって制限）小さくすることができ、または所望のように（（１）と同様）大きくすることができる。１つのセグメントは、１つの画像（例えばいくつかの点を含む）となることができ、または後から得られる画像中に１つの点にしかならない（スキャナの原理）。選択されたセグメントが小さくなれば、蛍光はより効果的に集光できる。集光の効率が高くなると測定時間が短縮され、測定される物質に対する潜在的なＵＶによる損傷が減少し、装置の感度が向上する。スキャナの原理に基づいて全試料を検分するためには、ａ）試料自体を移動させる、ｂ）検出器を移動させる、ｃ）励起源を移動させる、ｄ）励起光および発光を偏光させる、またはａ）〜ｄ）の組み合せを用いることができる。
【００３４】
試料または試料のセグメントは、検出限界を改善するために繰り返し検分することができる。
【００３５】
周波数多重化の原理を利用した、様々な波長に対して市販されているＵＶレーザを、有利に本発明の方法に対して用いることができる。このレーザは、連続レーザまたはパルスレーザであってもよい。パルスレーザは、特に異なるパルス長のものが適しており、マイクロ秒〜フェトム秒の範囲であってもよく、公知である。励起された蛍光放射は、個々のパルス間に本質的に存在する寿命を有しており、ＵＶ検出器にわずかな励起放射しか当たらない、または励起放射が当たらないということを意味することから、フェトム秒の範囲にある短いパルス長が、特に有利である。励起放射は、９０°よりも小さな角度でプレート（８）に対して垂直に放射されると有利である。
【００３６】
測定を、様々な形式で行うことができる。原則的には、励起光を、全分離媒体が照射されるように拡大することができ、これは、例えば、辺の長さが長すぎない場合に可能である。プレートは、測定に対して十分な蛍光放射を得るために、一回または数回照射される。
【００３７】
本方法は、きわめて変更が容易である。特に、条件を、感光性物質が損傷しないように調節することができ、多量の分解も抑制することができる。本方法は、自動化および標準化するのにも適しており、工業的な応用に対して特に価値がある。
【００３８】
ＵＶスペクトロメータをＵＶ検出器として用いる場合には、物質の領域は、例えば１８０〜４００nmの波長範囲に渡りスペクトル測定し、決めることができる。このようにして、蛍光放射の特徴的な波長を利用することができ、分離媒体上で直接的に、または分離された物質領域をＵＶ検出器を用いて同定した後に、特異な物質を同定する。
【００３９】
質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）または別の方法のような、さらなる検査のために物質領域を移すことに関して、物質が無色であり、したがって、不可視であり、肉眼で識別できないという事実を考慮にいれなくてはならない。物質領域を移す１つの選択肢は、プラスチックフィルム上に透明のネガフィルムを準備することがあり、例えば、フィルムを、物質領域を示すために分離媒体（ゲル）の表面上に載置することができる。別のものとしては、適切なコンピュータプログラムを用いて自動式に移すことがあり、プログラムは、デジタル式の記録を評価し、移動させる試料のための機械的な装置を制御する。別の選択肢では、例えば、可視レーザ（レーザポインタ）を使用して、物質領域を手動で移動するために指し示すものである。
【００４０】
本発明の方法は、ゲル電気泳動法またはフラットベッドクロマトグラフィーによって物質を分離し検査する全ての分野で適用することができる。重要な分野は、体液またはこれに対応する抽出物および濃縮物を分析するための生化学的調査の分野である。これに関して、たんぱく質の分析（プロテオミクス）は、特に重要である。本方法は、特定の物質の存在により疾病の特異な存在が示されるような場合、診察用の検査に使用することができる。さらに、本発明の方法は、植物および恒温動物を含む動物の体液中の薬理活性化合物および農薬の分布および分解を検査するのに用いることができる。本方法は、活性化合物の効果（分離されたたんぱく質またはヌクレオチド配列への活性化合物の結合）を特徴付けるおよび/または決定するため、ならびに活性化合物の品質を監視するために用いることもできる。さらに、本方法は、分離媒体上のたんぱく質のさらなる検査のために、特に、分離された物質領域を分離媒体から膜へと移し、蛍光染色液により標識化されている抗体を添加することによって同定する、ウエスタンブロッド法または類似の方法の分析のために用いることができる。本方法の特別な利点は、標識化されていない抗体を、励起することによって検出し、本発明の方法（この場合、膜が分離媒体に相当する）によるＵＶ領域でその固有蛍光を測定することにある。
【００４１】
本方法は、きわめて感度が高く、１〜５ナノグラムの量を測定することさえ可能となる。したがって、本方法は、きわめて少量の物質を検査するのに特に適している。
【００４２】
診察用の検査のためには、本方法は、１つまたはいくつかの疾病の特異な物質を同定することによって後続の医学的処置のために信頼性の高い情報を提供するように、試料の調製、分離条件、測定条件および分離後の評価に関連して便宜上自動化されかつ標準化される。診察用の検査は、人体または動物の体からもしくは植物から取り出した、体液（血液、尿、血漿、胃液または腸液、もしくは植物液汁）または組織の標本のような試料を用いて行う。これらの試料は、必要であれば分離の前に調製（精製および濃縮、化学的前処理または細胞溶解物の調製）する。
フラットベッド電気泳動法またはフラットベッドクロマトグラフィは、広く分析に用いられ、特にリリース分析に用いられる。確実に、この適用分野においては、本発明の装置または本発明の方法により、手順のシーケンスの単純化と化学廃棄物の回避により、特に高い程度で経済可能性を増加させることができる。
【００４３】
本発明は、人体または動物の体からもしくは植物から得られた試料中の疾病の特異な物質を分離し同定するための、本発明の装置の使用もしくは本発明の方法の使用にも関する。
【００４４】
以下の実施例によって本発明を詳細に説明する。
実施例１：細胞抽出液中に存在するたんぱく質の分離
実験装置は、図１に示す装置に相当する。Spectra Physics ＵＶレーザ（Tsunami（登録商標）、８４０nm、８０MHz、１００fsパルス長、２８０nm励起光への３倍波、出力１５０mW）を、ＵＶ光源として使用する。辺の長さ１cmの正方形の照射領域を形成するために使用するダイヤフラムを、凸レンズ（５）と分離媒体（２）との間に配置した。分離媒体（２）の表面での出力密度は、４０mW/cm2であった。照射時間は１秒であった。用いたＵＶ検出器は、LaVision Biotec Deutschlandの市販のＵＶ感応性ＢＣＣＤカメラ（ＱＥ＞６５％）であった。１cm2の大きさの領域により、２つのNikon ＵＶレンズ（１０５nm、ｆ＝４．５）を通して画像を映し、コンピュータで全体の画像へ組み立てた。３００〜３７５nmの波長範囲に対するＵＶ帯域通過フィルタを、２つのレンズの間に配置した。５６の画像の合計を、選択された形式である８×７cm（ミニゲル；３回蒸留した水中で膨張させた後、分離中よりも約２０％大きくなる）に記録した。このために、分離媒体を、位置決めテーブルの１cm間隔の格子へと手動で移動させた。
分離媒体（２）は、市販の厚み１mmのポリアクリルアミドゲルの層として、ステンレス鋼プレート（８）へと塗布した。このポリアクリルアミドゲルを、厚み１mmの石英プレート（６）でカバーした。
２−Ｄゲル電気泳動法による分離は、両性電解質の担体を使用して等電点電気泳動法（ＩＥＦ）（１次元）とＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２次元）との組み合わせとして、Klose、J. Methods Mol Biol、1999、112、147〜172にしたがって行った。
ＩＥＦは、ゲルで充填されたガラスロッド（直径０．９mm、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、アクリルアミド３．５％、ピペラジンジアクリルアミド０．３％、および両性電解質担体の合計量４％、ｐＨ２〜１１）内で行った。たんぱく質は、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞［Edgell、C、J. S. Proc Natl Acad Sci USA 1983、80、3734〜3737］の溶解物から得た。たんぱく質約１０μgを、長さ７センチメーターのＩＥＦゲルの陽極端部に塗布し、非平衡ｐＨ勾配電気泳動法（ＮＥＰＨＧＥ）の条件下で、Ｖｈ１８４２に対して焦点を合わせた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＩＥＦゲルを濃縮ゲルとして使用して、アクリルアミド１５％のゲル中で行った。ゲルの寸法は、７０×６０×１ミリメーターである。
分離後、たんぱく質をゲル（酢酸１０％、エチルアルコール５０％、３回蒸留した水４０％）中に一晩固定させた。測定前に、ゲルを、４５分間、３回蒸留した水５０ml中で洗浄し（バックグラウンド蛍光を減少させるため）、鋼製プレート上に配置し、石英ガラスプレートでカバーした。
カメラを、ＵＶ蛍光の画像を記録するために用いた。この場合、画像処理での擬似カラー描写のために暗点が形成される。この描写によって、分離されたたんぱく質を黒点として描写する標準的な「銀染色」法と比較することが容易になる。得られた画像は、銀イオンを使用して視覚化した場合の分離で得られたものと比較可能である。
【００４５】
実施例２：感度の測定
実施例１に記載の装置を使用した。Invitrogen １Ｄゲルプレート（カールスルーエ、ドイツ、NOVEX１２％トリスグリシンゲル、孔数（well）１２または１０、厚み１mm、No. EC60052またはEC6005）（様々な分子量のたんぱく質を装填）（リゾチーム（１４．６kDa、トリ）、ウシ・アンヒドラーゼ（２９kDa）、ＧＡＰＤＨ（ウサギ、３６kDa）、ＢＳＡ（ウシ、６６kDa）およびホスホリラーゼ（ウサギ、９７．４kDa））［小腔（lacuna）］）。ゲルへの装填後、５００、２５０、１００、５０、２５、１０、５および１ngが、帯域ごと（たんぱく質ごと）に存在するように、これらのたんぱく質を同量混合し、ＳＤＳバッファ（ＮＯＶＥＸトリスグリシンＳＤＳ変性試料バッファＬＣ２６７６）で希釈した。分離は、［Laemmli U.K.、1970、Nature 227、680〜685］にしたがって行った（泳動バッファはＮＯＶＥＸトリスグリシンＳＤＳ泳動バッファＬＣ２６７５）。試料は、５０Ｖの一定電圧で１０分間で移動させ、溶媒前面（試料バッファ中に存在するブロモフェニルブルー）が低いほうのゲル端部に到達するまで、ゲルを移動させることができた（１４５Ｖ一定で、約１．５時間）。
分離後、たんぱく質を、実施例１に記載したようにゲル中で固定させた。さらに、測定前に、ゲルを４５分間、３回蒸留した水５０ml中で洗浄し、鋼製プレート上に配置し、石英ガラスプレートでカバーした。
分離後、分離された領域を、実施例１に記載の手順にしたがって、ならびに銀標識化の方法およびクマシーブルーによる染色方法にしたがって視覚化し、比較した。実施例１に記載の手順にしたがって得られた感度では、１〜５ngの検出限界が得られ、これは、銀標識化法による検出限界に匹敵する。クマシーブルーを使用した方法では、検出限界は１０〜５０ngであった。
【００４６】
実施例３：２８６nmレーザシステムの使用
実験装置は、図１に示したものであり、また実施例１で説明したものに相当する。しかし、JDS Uniphase ＵＶレーザシステム（４倍波Ｎｄ：ＹＡＧ、波長２６６nm、パルス長５００ps、出力４mW）をＵＶ光源として使用した。実施例２に記載のゲルを、分離システムとして使用した。実質的により安価なレーザシステムを使用することによって、実施例１および実施例２に記載した結果と、量的および質的に何ら相違のない結果が得られることが分かった。しかし、出力がより低いために、これに対応してより長い時間の照射を行う必要があった（３０倍の長さ）。
【００４７】
実施例４：ニトロセルロース膜を使用したブロッティング法
図１に示した装置を使用し、実施例３で説明した分離を行った場合、ニトロセルロース膜に移し、標識化されていない抗体フラグメント（Sigma Aldrichの抗ラビットＩｇＧ抗体フラグメント、製品番号Ｒ−９１３０）で５００マイクロメーターの直径の点を標識化した後、たんぱく質（Sigma Aldrichの多クローン性ラビットＩｇＧ抗体フラグメント、製造番号Ｉ−５００６）を量的に検出することも可能であった。１点あたりの濃度は１ngであり、それより低い濃度も可能であった。これにより、例えばブロッティング法においての、応用の可能性が広がる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の装置の実施態様を示したものである。
【図１】
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【国際調査報告】
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