(57)【要約】本発明は、aveC遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチド分子は、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの発酵培養において産生するクラス２：１アベルメクチンの量又は比を変更するのに使用できる。さらに、本発明は、ａｖｅＣ遺伝子が、失活されているか、クラス２：１アベルメクチンの産生量又は比を変更するように突然変異された、ベクター、宿主細胞、及びＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの突然変異株に関する。
2005517406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活されており且つ突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を発現するストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞がアベルメクチンのクラス２：１比を産生することができ、この比は、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞により産生される比と比較して減少しているものであるような、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のアミノ酸位置に相当するアミノ酸残基にアミノ酸置換の組み合わせをコードする突然変異をさらに含むことを除いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣの対立遺伝子、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物コード配列若しくは図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）記載のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又はそれらの縮重変異体と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、クラス２：１アベルメクチンがシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンであるときクラス２：１アベルメクチン比は０．３５：１以下である、ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
前記シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．２０：１以下である、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
前記アミノ酸置換の組み合わせが、
【化１】
2005517406.tif 000009
【化２】
2005517406.tif 000010
【化３】
2005517406.tif 000011
からなる群から選択された組み合わせを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活されており且つ突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を発現するストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞がアベルメクチンのクラス２：１比を産生することができ、この比は、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞により産生される比と比較して減少しているものであるような、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のアミノ酸位置に相当するアミノ酸残基にアミノ酸置換の組み合わせをコードする突然変異をさらに含むことを除いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣの対立遺伝子、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物コード配列若しくは図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）記載のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又はそれらの縮重変異体と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、クラス２：１アベルメクチンがシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンであるとき、クラス２：１アベルメクチン比は約０．４０：１以下に減少されており、且つ前記アミノ酸置換の組み合わせが
（ｂｆ）Ｄ４８Ｅ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ；及び
（ｂｇ）Ｙ２８Ｃ、Ｑ３８Ｒ、Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ
からなる群から選択された組み合せを含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
請求項１又は請求項４に記載の前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項６】
（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせが、
【化４】
2005517406.tif 000012
【化５】
2005517406.tif 000013
【化６】
2005517406.tif 000014
からなる群から選択された組み合わせを含む、方法。
【請求項７】
（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又は縮重変異体を含む細胞が、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを０．３５：１以下の比で産生できるものである、方法。
【請求項８】
前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせが、
【化７】
2005517406.tif 000015
【化８】
2005517406.tif 000016
【化９】
2005517406.tif 000017
からなる群から選択された組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．２０：１以下である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、新規Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記アミノ酸置換の組み合わせが、
（ｂｆ）Ｄ４８Ｅ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ；及び
（ｂｇ）Ｙ２８Ｃ、Ｑ３８Ｒ、Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ
からなる群から選択されたものである、方法。
【請求項１１】
【化１０】
2005517406.tif 000018
【化１１】
2005517406.tif 000019
【化１２】
2005517406.tif 000020
からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の細胞。
【請求項１２】
ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
（ｂｆ）Ｄ４８Ｅ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ；及び
（ｂｇ）Ｙ２８Ｃ、Ｑ３８Ｒ、Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ
からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含むストレプトミセス種の細胞。
【請求項１４】
ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞により産生されるシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンの組成物であって、前記シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンが前記細胞が培養された培地に存在しており、前記培地に存在するシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が０．３５：１以下である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に動物の健康の分野に有効である「ドラメクチン（ｄｏｒａｍｅｃｔｉｎ）」等のアベルメクチンを効率的に製造するための組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の発酵培養により産生されるクラス２：１アベルメクチン比を調節するのに用いることができる、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に関する。さらに、本発明は、ａｖｅＣ遺伝子を産生されるクラス２：１アベルメクチン比を調節するように突然変異させた、ベクター、形質転換された宿主細胞及び新規なＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの突然変異菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．１．アベルメクチン
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種は、強力な駆虫活性及び殺虫活性を有する一連の８種類の関連した１６員大環式ラクトンを含む、アベルメクチンを含む多種多様な二次代謝産物を産生する。これら８種の異なるが密接に関連した化合物は、Ａ１ａ、Ａ１ｂ、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂ、Ｂ２ａ及びＢ２ｂと称される。「ａ」系列の化合物は、Ｃ２５位の置換基が（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチルである天然アベルメクチンを意味し、「ｂ」系列は、Ｃ２５位の置換基がイソプロピルであるこれらの化合物を意味する。名称「Ａ」及び「Ｂ」は、Ｃ５位の置換基が、それぞれメトキシ及びヒドロキシであるアベルメクチンを意味する。数字「１」は、二重結合がＣ２２位、Ｃ２３位に存在するアベルメクチンを意味し、数字「２」は、Ｃ２２位に水素及びＣ２３位にヒドロキシを有するアベルメクチンを意味する。関連アベルメクチンのうち、ドラメクチン等のＢ１型アベルメクチンは、最も有効な抗寄生生物活性及び有害生物駆除活性を有するとされており、したがって、最も商業的に望ましいアベルメクチンである。
【０００３】
アベルメクチン及びＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の好気的発酵によるそれらの産生は、米国特許第４，３１０，５１９号及び第４，４２９，０４２号に記載されている。天然アベルメクチンの生合成は、イソ酪酸及びＳ−（＋）−２−メチル酪酸のＣｏＡチオエステル類似体から内因的に開始されると考えられている。
【０００４】
ランダム突然変異誘発による菌株の改善と、外因的に供給される脂肪酸を使用することとを組み合わせることにより、アベルメクチン類似体が効率的に産生されるようになった。分岐鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼを欠いているＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの突然変異体（ｂｋｄ欠失突然変異体）は、発酵に脂肪酸を補充したとき、アベルメクチンのみを産生することができる。分岐鎖デヒドロゲナーゼ活性を欠く突然変異体（例えば、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ５３５６７）のスクリーニング及び単離が、ヨーロッパ特許（ＥＰ）第２７６１０３号に記載されている。外因的に供給される脂肪酸の存在下でのこのような突然変異体の発酵では、用いられる脂肪酸に相当する４種のアベルメクチンのみが産生する。このように、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ５３５６７）の発酵にＳ−（＋）−２−メチル酪酸を補充することにより、天然アベルメクチンＡ１ａ、Ａ２ａ、Ｂ１ａ及びＢ２ａが産生し；発酵にイソ酪酸を補充することにより、天然アベルメクチンＡ１ｂ、Ａ２ｂ、Ｂ１ｂ及びＢ２ｂを産生し；発酵にシクロペンタンカルボン酸を補充することにより、４種の新規なシクロペンチルアベルメクチンＡ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２が産生する。
【０００５】
他の脂肪酸を補充すると、新規なアベルメクチンが産生される。８００種類を超える可能性のある前駆体をスクリーニングすることにより、６０種類を越える他の新規なアベルメクチンが同定されている（例えば、Ｄｕｔｔｏｎ等、１９９１、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４４：３５７−３６５；及びＢａｎｋｓ等、１９９４、Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．１４７：１６−２６参照）。さらに、５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を欠くＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの突然変異体は、実質的にＢ類似体アベルメクチンのみを産生する。その結果、分岐鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性と５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性の両方を欠くＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ突然変異体は、発酵を補充するのに用いられる脂肪酸に相当するＢアベルメクチンのみ産生する。したがって、このような二重突然変異体にＳ−（＋）−２−メチル酪酸を補充すると、天然アベルメクチンＢ１ａ及びＢ２ａのみが産生し、一方、イソ酪酸又はシクロペンタンカルボン酸を補充すると、それぞれ天然のアベルメクチンＢ１ｂ及びＢ２ｂ又は新規なシクロペンチルＢ１及びＢ２アベルメクチンが産生する。二重突然変異菌株にシクロヘキサンカルボン酸を補充するのは、商業的に重要な新規アベルメクチンであるシクロヘキシルアベルメクチンＢ１（ドラメクチン）を産生するのに好ましい方法である。このような二重突然変異体、例えば、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ５３６９２）の単離及び特性については、ＥＰ２７６１０３号に記載されている。
【０００６】
２．２．アベルメクチン生合成に関与する遺伝子
多くの場合において、二次代謝物の産生に関与する遺伝子及び特定の抗生物質をコードする遺伝子は、染色体上に一緒に塊となっている。このようなことは、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓポリケチドシンターゼ遺伝子クラスター（ＰＫＳ）の場合にみられる（Ｈｏｐｗｏｏｄ及びＳｈｅｒｍａｎ、１９９０、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ、２４：３７−６６参照）。したがって、生合成経路において遺伝子をクローニングする一つの方法は、薬物耐性遺伝子を単離後、その特定の抗生物質の生合成に関係する他の遺伝子について染色体の隣接する領域を試験することであった。重要な代謝産物の生合成に関与する遺伝子をクローニングするもう一つの方法として、突然変異体の相補性があった。例えば、特定の代謝産物を生産することができる生物からのＤＮＡライブラリーの一部分を、非生産性突然変異体に導入し、代謝産物の産生について形質転換体をスクリーニングする。さらに、他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種から得たプローブを用いたライブラリーのハイブリダイゼーションを使用して、生合成経路において遺伝子を同定し且つクローニングしている。
【０００７】
アベルメクチン生合成に関与する遺伝子（ａｖｅ遺伝子）は、他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ二次代謝産物の生合成に必要な遺伝子（例えば、ＰＫＳ）のように、染色体上に塊としてみられる。多数のａｖｅ遺伝子が、アベルメクチン生合成においてブロックされたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ突然変異体を相補するためにベクターを用いてうまくクローニングされた。このような遺伝子のクローニングは、米国特許第５，２５２，４７４号に記載されている。更に、Ｉｋｅｄａ等，１９９５，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４８：５３２−５３４は、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの４．８２Ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメントへのＣ２２，２３脱水工程を含む染色体領域（ａｖｅＣ）の局在化だけでなく、単一成分Ｂ２ａプロデューサーの産生を生じるａｖｅＣ遺伝子の突然変異について記載している。強力な駆虫化合物であるイベルメクチンは、アベルメクチンＢ２ａから化学的に製造することができるので、このようなアベルメクチンＢ２ａの単一成分プロデューサーは、イベルメクチンの商業生産に特に有用であると考えられる。
【０００８】
米国特許第６，２４８，５７９号（Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ等；２００１年６月１９日発行）は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１比が約０．７５：１に減少するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ遺伝子に対する一定の突然変異を記載している。
【０００９】
ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１２８２１（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社；２００１年２月２２日公開）は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１比が０．４０：１にさらに減少するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ遺伝子に対する一定のさらなる突然変異を記載している。
【００１０】
アベルメクチン産生の複雑さをさらに最小限とするａｖｅＣ遺伝子におけるさらなる突然変異又は突然変異の組み合わせ、例えば、アベルメクチンのＢ２：Ｂ１比をさらに減少させる突然変異を同定することは、商業的に重要なアベルメクチンの産生及び精製を簡略化するであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、ヌクレオチド配列が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活されており且つ突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を発現するストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞がアベルメクチンのクラス２：１比を産生することができ、この比は、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞により産生される比と比較して減少しているものであるような、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のアミノ酸位置に相当するアミノ酸残基にアミノ酸置換の組み合わせをコードする突然変異をさらに含むことを除いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣの対立遺伝子、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物コード配列若しくは図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）記載のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又はそれらの縮重変異体と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、クラス２：１アベルメクチンがシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンであるときクラス２：１アベルメクチン比は０．３５：１以下である、ポリヌクレオチド分子が提供される。より好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．３０：１以下である。より好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．２５：１以下である。より好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．２０：１以下である。
【００１２】
その特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、
【化１】
2005517406.tif 000003
【化２】
2005517406.tif 000004
からなる群から選択された組み合わせを含む。
【００１３】
さらに、本発明によれば、ヌクレオチド配列が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活されており且つ突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を発現するストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞がアベルメクチンのクラス２：１比を産生することができ、この比は、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞により産生される比と比較して減少しているものであるような、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のアミノ酸位置に相当するアミノ酸残基にアミノ酸置換の組み合わせをコードする突然変異をさらに含むことを除いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣの対立遺伝子、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物コード配列若しくは図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）記載のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又はそれらの縮重変異体と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、クラス２：１アベルメクチンがシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンであるとき、クラス２：１アベルメクチン比は約０．４０：１以下に減少されており、且つ前記アミノ酸置換の組み合わせが
（ｂｆ）Ｄ４８Ｅ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ；及び
（ｂｇ）Ｙ２８Ｃ、Ｑ３８Ｒ、Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ
からなる群から選択された組み合せを含む、ポリヌクレオチド分子が提供される。
【００１４】
さらに、本発明によれば、本発明のポリヌクレオチド分子を含む組換えベクターが提供される。
【００１５】
さらに、本発明によれば、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。好ましい実施態様によれば、宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞である。より好ましい実施態様によれば、宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞である。
【００１６】
さらに、本発明によれば、（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、新規なＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記アミノ酸置換の組み合わせが、上記した（ａ）〜（ｂｅ）から選択されたものである、方法が提供される。
【００１７】
さらに、本発明によれば、（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、新規なＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又は縮重変異体を含む細胞が、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを０．３５：１以下の比で産生できるものである、方法が提供される。その非制限的実施態様によれば、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体は、上記した（ａ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている。
【００１８】
その好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．３０：１以下である。非制限的実施態様によれば、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体は、上記した（ｆ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている。
【００１９】
そのより好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．２５：１以下である。非制限的実施態様によれば、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体は、上記した（ｗ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている。
【００２０】
そのより好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．２０：１以下である。非制限的実施態様によれば、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体は、上記した（ａｏ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている。
【００２１】
さらに、本発明によれば、（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、新規Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記アミノ酸置換の組み合わせが、上記した（ｂｆ）〜（ｂｇ）からなる群から選択されたものである、製造方法が提供される。その好ましい実施態様によれば、このような突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又は縮重変異体を含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．４０：１以下の比で産生できる。
【００２２】
さらに、本発明によれば、上記した（ａ）〜（ｂｅ）から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の細胞が提供される。その好ましい実施態様によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの種は、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓである。
【００２３】
さらに、本発明によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを０．３５：１以下の比で産生できるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞が提供される。その非限定的実施態様によれば、上記細胞は、上記した（ａ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【００２４】
その好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．３０：１以下である。非制限的実施態様によれば、上記細胞は、上記した（ｆ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【００２５】
そのより好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．２５：１以下である。その非制限的実施態様によれば、上記細胞は、上記した（ｗ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【００２６】
そのより好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．２０：１以下である。その非制限的実施態様によれば、上記細胞は、上記した（ａｏ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【００２７】
さらに、本発明によれば、上記した（ｂｆ）及び（ｂｇ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の細胞が提供される。その好ましい実施態様によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの種は、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓである。より好ましい実施態様によれば、上記細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．４０：１以下の比で産生できるＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞である。
【００２８】
さらに、本発明によれば、アベルメクチンの製造方法であって、本発明のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒａｖｍｉｔｉｌｉｓ細胞の菌株を、培地中で、それからアベルメクチンを産生するか又は誘発する条件下で培養することと、培養から上記アベルメクチンを回収することを含む、方法が提供される。
【００２９】
さらに、本発明によれば、ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞により産生されるシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンの組成物であって、前記シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンが前記細胞が培養された培地に存在しており、前記培地に存在するシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が０．３５：１以下、好ましくは約０．３０：１以下、より好ましくは約０．２５：１以下、さらに好ましくは約０．２０：１以下である、組成物が提供される。特定の実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンの組成物は、突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞により産生される。この場合の、突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞は、突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子を発現しないが、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現する同様のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞と比較して、細胞により産生されるシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンのクラス２：１比の減少する遺伝子産物をコードするものである。
【００３０】
その好ましい実施態様によれば、組成物がシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が０．３５：１以下である場合、この組成物は、上記（ａ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される。
【００３１】
そのさらに好ましい実施態様によれば、組成物がシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．３０：１以下である場合、この組成物は、上記（ｆ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される。
【００３２】
そのさらに好ましい実施態様によれば、組成物がシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．２５：１以下である場合、この組成物は、上記（ｗ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される。
【００３３】
そのさらに好ましい実施態様によれば、組成物がシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．２０：１以下である場合、この組成物は、上記（ａｏ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される。
【００３４】
さらに、本発明によれば、ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞により産生されるシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンの組成物であって、前記シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンが前記細胞が培養された培地に存在しており、前記培地に存在するシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．４０：１以下であり、そして上記（ｂｆ）〜（ｂｇ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される、組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓからのＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の同定及び特性付け、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をそれらのアベルメクチン産生への影響についてスクリーニングするのに用いることができる新規なＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の構築、及び一定の突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物が、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓによって産生されるＢ２：Ｂ１比アベルメクチンを減少させることができるという知見に関する。一例として、本発明を、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列と同様であるヌクレオチド配列を有するか、又は図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）のＯＲＦのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子について、並びにそれに由来する突然変異したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子及びそれらの縮重変異体について、下記のセクションで説明する。しかしながら、本発明において記載されている原理は、例えば、とりわけＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ及びＳ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓを含む他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種からのａｖｅＣ相同遺伝子を含む他のポリヌクレオチド分子に同様に適用することができる。
【００３６】
５．１．Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド分子
本発明によれば、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの完全なａｖｅＣ  ＯＲＦ又はその実質的な部分を含む単離されたポリヌクレオチド分子であって、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体中のそのままの位置のａｖｅＣ  ＯＲＦから下流に位置する次の完全なＯＲＦを欠く単離されたポリヌクレオチド分子が提供される。
【００３７】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、好ましくはプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列と同様であるか；図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）のＯＲＦのヌクレオチド配列又はその実質的な部分と同じであるヌクレオチド配列を含む。本明細書において使用されるＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子の「実質的な部分」とは、図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）に示される完全なａｖｅＣ  ＯＲＦ配列の少なくとも約７０％を含む単離されたポリヌクレオチド分子を意味し、これは、機能的に同等なＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている。これに関して、「機能的に同等な」ＡｖｅＣ遺伝子産物は、天然ａｖｅＣ対立遺伝子が失活したＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２中で発現された場合、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２由来の野生型の機能性ａｖｅＣ対立遺伝子だけを代わりに発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２によって生産されるのと実質的に同様の比及び量のアベルメクチンを産生する遺伝子産物として定義される。
【００３８】
本発明の単離されたポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列の他に、図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）に示されるフランキングヌクレオチド配列のような、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの原位置のａｖｅＣ遺伝子の脇に生来位置するヌクレオチド配列をさらに含むことがある。
【００３９】
さらに、本発明によれば、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１のヌクレオチド配列、又は遺伝子コードの公知の縮重に基づくその縮重変異体を含む単離されたポリヌクレオチド分子が提供される。
【００４０】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド分子」、「ポリヌクレオチド配列」、「コード配列」、「オープンリーディングフレーム」及び「ＯＲＦ」は、一本鎖か又は二本鎖でありうるＤＮＡ及びＲＮＡ両方の分子を意味し、これは、ＡｖｅＣ遺伝子産物中に、又は適当な調節要素の制御下に置かれた場合の適当な宿主細胞発現系におけるＡｖｅＣ遺伝子産物に相同であるポリペプチド中に転写し且つ翻訳（ＤＮＡ）することができるか、又は翻訳（ＲＮＡ）することができる。コード配列には、原核性配列、ｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列及び化学合成されたＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含むことができるが、これらには限定されない。
【００４１】
図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）に示されるヌクレオチド配列は、ｂｐ４２位、ｂｐ１７４位、ｂｐ１７７位及びｂｐ１８０位に４個の異なったＧＴＧコドンを含む。上記した米国特許第６，２４８，５７９号に記載されているように、ａｖｅＣ  ＯＲＦ（図１；配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）の５’領域の多重欠失を構築して、これらのコドンのうちのどれが、タンパク質発現の出発部位としてａｖｅＣ  ＯＲＦにおいて機能できるか明確にしやすくした。ｂｐ４２の最初のＧＴＧ部位の欠失により、ＡｖｅＣ活性はなくならなかった。ｂｐ１７４位、ｂｐ１７７位及びｂｐ１８０位のＧＴＧコドンの全てを一緒にさらに欠失させると、ＡｖｅＣ活性が除去され、この領域がタンパク質発現に必要であるということがわかった。したがって、本発明は、可変長さａｖｅＣ  ＯＲＦを包含する。
【００４２】
さらに、本発明によれば、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列と相同であるか、図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）のａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又はその実質的な部分と相同であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子が提供される。Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列に相同であるポリヌクレオチド分子に言及するのに使用される場合の用語「相同」は、（ａ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列と同様のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするか、又は図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）に示されるａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列と同様のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするが、遺伝コードの縮重によるヌクレオチド配列への一つ又はそれ以上のサイレント変化を含む（すなわち、縮重変異体）；又は（ｂ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする又は図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の補体に、適度なストリンジェント条件、すなわち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ等（編者），１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現在のプロトコール），第１巻，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２．１０．３参照）の下でハイブリッドを形成し、上に定義の機能的に同等なＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味する。好ましい態様によれば、相同ポリヌクレオチド分子は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列の補体にか、又は図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）に示されるａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列の補体又はその実質的な部分に、高度なストリンジェント条件下、すなわち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中において６５℃でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション及び０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において６８℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ等，１９８９，上記）の下でハイブリッドを形成し、そして上記で定義した機能的に同等なＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする。
【００４３】
ＡｖｅＣ遺伝子産物及びその可能な機能的同等物の活性は、以下の実施例に記載のように、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって決定することができる。Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物の機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子には、他のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株中に存在する天然に存在するａｖｅＣ遺伝子、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  の他の種に存在するａｖｅＣ相同遺伝子、及び天然又は遺伝子操作された、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を含むことができる。
【００４４】
さらに、本発明によれば、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物コード配列によりコードされているアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列か、図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）又はその実質的な部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子が提供される。本明細書において使用される、図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）のアミノ酸配列の「実質的な部分」は、図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）に示されるアミノ酸配列の少なくとも約７０％を含むポリペプチドを意味し、これは、上記で定義したように、機能的に同等なＡｖｅＣ遺伝子産物を構成する。
【００４５】
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓからのＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列に言及するのに本明細書中で用いられる用語「相同」は、１個又はそれ以上のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で保存的に置換された以外は図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、ここにおいて、このアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ＧＥＮＢＡＮＫ，ＮＣＢＩ）のような任意の標準的なアミノ酸配列同一性アルゴリズムによって決定したときに、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列によってコードされるポリペプチド又は図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）のアミノ酸配列に少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列の同一性を有し、このような保存的置換により、上記で定義した機能的に同等な遺伝子産物を生じる。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野において周知である。このような置換を行うための規則には、とりわけＤａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，１９７８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，  Ｗａｓｈｉｎｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，第５巻，Ｓｕｐ．３に記載のものが含まれる。より詳細には、保存的アミノ酸置換は、酸性度又は極性において関連しているアミノ酸のファミリー内で一般的に生じる。遺伝子的にコードされるアミノ酸は、一般的に４つの群に分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、芳香族アミノ酸としても分類される。任意の特定のグループ内での、例えば、ロイシンとイソロイシン又はバリン、又はアスパラギン酸とグルタミン酸、又はトレオニンとセリン、又は任意の他のアミノ酸残基と構造的に関連したアミノ酸残基、例えば、類似した酸性度又は極性を有する又はそれらのいくつかの組合せにおいて類似性を有するアミノ酸残基との一つ又はそれ以上の置換によっては、一般的にポリペプチドの機能に対して顕著な影響はない。
【００４６】
本明細書中に開示されたポリヌクレオチド分子の製造及び操作は、当該技術の範囲内であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング），Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（実験マニュアル），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ等，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現在のプロトコール），Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ＆Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験マニュアル），第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｉｎｎｉｓ等（編者），１９９５，ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（ＰＣＲの方法），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；及びＥｒｌｉｃｈ（編者），１９９２，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰＣＲ技術），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（これらの全ては、引用することにより本明細書の内容とする）に記載されている組換え技術によっておこなうことができる。ＡｖｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードしているポリヌクレオチドクローンは、以下のセクション７に記載の方法が含まれるがこれには限定されない当該技術分野において公知の任意の方法を用いて同定することができる。ゲノムＤＮＡライブラリーは、ａｖｅＣ及びａｖｅＣ相同コード配列に関して、バクテリオファージライブラリーについてはＢｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ，１９７７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０に、そしてプラスミドライブラリーについてはＧｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：３９６１−３９６５に記載の方法などの方法を用いてスクリーニングすることができる。ここでは、例えば、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）中又はプラスミドｐＳＥ１１９（以下のセクション７に記載されている）中にａｖｅＣ  ＯＲＦを含むことが知られているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子は、これらスクリーニング実験においてプローブとして用いることができる。代わりの方法として、精製されたＡｖｅＣ相同遺伝子産物の部分的又は完全なアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列に該当するオリゴヌクレオチドプローブを合成してもよい。
【００４７】
５．２．組換え系
５．２．１．クローニングベクター及び発現ベクター 
さらに、本発明によれば、例えば、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦ又は任意のａｖｅＣ相同ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド分子のクローニング又は発現する場合に有用である組換えクローニングベクター及び発現ベクターが提供される。非制限的実施態様において、本発明により、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ遺伝子の完全なＯＲＦを含むプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）が提供される。
【００４８】
また、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のａｖｅＣ  ＯＲＦ、又はＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のａｖｅＣ  ＯＲＦ又はその一部分を含むポリヌクレオチド分子、又はＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物に関する以下の説明の全ても、明記又は前後関係によって示されない限り、下記で説明する突然変異されたａｖｅＣ対立遺伝子についてのものである。
【００４９】
種々の異なるベクターは、とりわけファージ、高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓシャトルベクターを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおいて特定的に用いるために開発されたものであり、これらのいずれかを用いて、本発明を実施することができる。また、多数の薬物耐性遺伝子も、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからクローニングされており、これら遺伝子のいくつかは、選択可能マーカーとしてベクター中に組み込まれた。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおいて用いるための現在のベクターの例は、とりわけＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，１９８０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１６９−１９０に示されている。
【００５０】
本発明の組換えベクター、特に発現ベクターは、好ましくは本発明のポリヌクレオチド分子のコード配列が、そのコード配列を転写及び翻訳してポリペプチドを生じるのに必要な一つ又はそれ以上の調節要素と機能的に結合しているように構築される。本明細書で用いられる用語「調節要素」は、誘導及び非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びポリヌクレオチドコード配列の発現を促進する及び／又は調節するのに役立つ当該技術分野において公知の他の要素をコードするヌクレオチド配列を含むが、これには限定されない。また、本明細書で用いられるコード配列は、調節要素が、コード配列の転写若しくはそのｍＲＮＡの翻訳又は両方を有効に調節し且つ可能にする場合、一つ又はそれ以上の調節要素と「機能的に関連」している。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチド分子を含有するように遺伝子操作されることができる典型的なプラスミドベクターには、とりわけｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びシャトルベクターｐＷＨＭ３（Ｖａｒａ等，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７１：５８７２−５８８１）が含まれる。
【００５２】
適当な調節要素と機能的に関連している特定のコード配列を含有する組換えベクターを構築するための方法は、当該技術分野において周知であり、これらを用いて本発明を実施することができる。これら方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え技術、合成技術、及びｉｎ  ｖｉｖｏ  遺伝的組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等，１９８９，上記；Ａｕｓｕｂｅｌ等，１９８９，上記；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９，上記；Ｉｎｎｉｓ等，１９９５，上記；及びＥｒｌｉｃｈ，１９９２，上記に記載の方法を参照されたい。
【００５３】
これらベクターの調節要素は、強度及び特異性が異なっていてもよい。用いられる宿主／ベクター系に応じて、多数の適当な転写及び翻訳要素のうちのいずれかを用いることができる。細菌についての転写調節領域又はプロモーターの非制限的例には、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、λ左右プロモーター、ｔｒｐ及びｌａｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーター、そしてより具体的にはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓに関して、ｅｒｍＥ、ｍｅｌＣ及びｔｉｐＡのプロモーター等が含まれる。具体的な実施態様によれば、サッカロポリスポラエリトレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）からの強力な構成性プロモーター、例えば、ｅｒｍＥプロモーターに隣接してクローニングされたａｖｅＣ  ＯＲＦ又はその突然変異させたＯＲＦを含有する発現ベクターを生成できる。米国特許第６，２４８，５７９号に記載されているように、ｅｒｍＥプロモーターを含むベクターを、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓに形質転換し、引き続き発酵生成物をＨＰＬＣ分析したところ、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同様の菌株による産生と比較して増加した力価のアベルメクチンが産生されることがわかった。
【００５４】
融合タンパク質発現ベクターを使用して、ＡｖｅＣ遺伝子産物融合タンパク質を発現することができる。精製された融合タンパク質を使用して、ＡｖｅＣ遺伝子産物に対する高血清を産生させたり、ＡｖｅＣ遺伝子産物の生化学的性状を研究したり、異なる生化学的活性を有するＡｖｅＣ融合タンパク質を遺伝子操作したり、又は発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物の同定又は精製しやすくするのに用いることができる。可能な融合タンパク質発現ベクターには、β−ガラクトシダーゼ及びｔｒｐＥ融合、マルトース結合タンパク質融合、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合、及びポリヒスチジン融合（担体領域）をコードする配列を含むベクターが含まれるが、これに限定されない。別の実施態様によれば、ＡｖｅＣ遺伝子産物又はその一部分は、例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ又はＳ．グリセオクロモジェネス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）のような  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの別の種又は菌株に由来するＡｖｅＣ相同遺伝子産物又はその一部分に融合することができる。このようなハイブリッドベクターは、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ細胞中に形質転換され且つ試験して、例えば、生産されるクラス２：１アベルメクチン比に対するそれらの影響を測定することができる。
【００５５】
ＡｖｅＣ融合タンパク質を遺伝子操作して、精製に有用な領域を含むようにすることができる。例えば、ＡｖｅＣ−マルトース結合タンパク質融合は、アミロース樹脂を用いて精製することができ；ＡｖｅＣ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズを用いて精製することができ；ＡｖｅＣ−ポリヒスチジン融合は、二価ニッケル樹脂を用いて精製することができる。別の方法として、担体タンパク質又はペプチドに対する抗体を、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製に用いることができる。例えばモノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌクレオチド配列を遺伝子操作して、調節要素と機能的に関連した発現ベクターにし、発現されたエピトープがＡｖｅＣポリペプチドに融合するように位置させることができる。例えば、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ標識（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）をコードするヌクレオチド配列（親水性マーカーペプチド）は、標準的な方法によって発現ベクター中に、例えば、ＡｖｅＣポリペプチドのカルボキシル末端に相当する点に挿入することができる。次に、発現されたＡｖｅＣポリペプチド−ＦＬＡＧ（商標）エピトープ融合生成物を、商業的に入手可能な抗ＦＬＡＧ（商標）抗体を用いて検出し且つアフィニティー精製することができる。
【００５６】
ＡｖｅＣ融合タンパク質をコードしている発現ベクターは、特定のプロテアーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含有するように遺伝子操作して、発現されたＡｖｅＣポリペプチドが、特定のプロテアーゼを用いた処理によって担体領域又は融合パートナーから放出されることができるようにすることもできる。例えば、融合タンパク質ベクターは、とりわけトロンビン又は因子Ｘａの切断部位をコードしているＤＮＡ配列を含むことができる。
【００５７】
ａｖｅＣ  ＯＲＦから上流の及びそれを含む読み枠のシグナル配列を、公知の方法によって発現ベクター中に遺伝子操作して、発現される遺伝子産物の輸送及び分泌を支配するようにすることができる。シグナル配列の非制限的例には、とりわけα因子、免疫グロブリン、外膜タンパク質、ペニシリナーゼ及びＴ細胞受容体由来のものが含まれる。
【００５８】
本発明のクローニングベクター又は発現ベクターを用いて形質転換された又はトランスフェクションされた宿主細胞の分泌しやすくするために、ベクターを、リポーター遺伝子産物又は他の選択可能マーカーのコード配列をさらに含むように遺伝子操作することができる。このようなコード配列は、好ましくは上記のように調節要素コード配列と機能的に関連している。本発明において有用なリポーター遺伝子は、当該技術分野において周知であり、とりわけグリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ｘｙｌＥ及びチロシナーゼをコードしているものが含まれる。選択可能マーカーをコードしているヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知であり、これには、抗生物質又は代謝拮抗物質に耐性を与える遺伝子産物をコードする、又は栄養要求必要条件を与えるものが含まれる。このような配列の例には、とりわけエリスロマイシン、チオストレプトン又はカナマイシンへの耐性をコードするものが含まれる。
【００５９】
５．２．２．宿主細胞の形質転換
さらに、本発明によれば、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターを含む形質転換された宿主細胞、及びそれに由来する新規な菌株又は細胞系が提供される。本発明の実施において有用な宿主細胞は、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞であるが、他の原核細胞又は真核細胞を用いることもできる。このような形質転換された宿主細胞には、典型的には、とりわけ組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡのベクターを用いて形質転換された細菌、又は組換えベクターを用いて形質転換された酵母のような微生物が含まれるが、これには限定されない。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチド分子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞中で機能するためのものであるが、例えば、クローニング又は発現の目的のために、他の細菌又は真核細胞中に形質転換することもできる。Ｅ．ｃｏｌｉ  菌株は、典型的には、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ（受託番号３１３４３）から入手可能な、及び市販元（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのＤＨ５α菌株などを用いることができる。好ましい真核宿主細胞には、酵母細胞が含まれるが、哺乳動物細胞又は昆虫細胞も有効に利用することができる。
【００６１】
本発明の組換え発現ベクターは、好ましくは実質的に均一な細胞培養物からの一つ又はそれ以上の宿主細胞中に導入、例えば、形質転換又はトランスフェクションする。発現ベクターは、一般的に既知の方法によって、例えば、プロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈降、塩化カルシウム処理、マイクロインジェクション、エレクロトポレーション、組換えウイルスとの接触によるトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、形質導入、接合、又は微粒子銃などによって宿主細胞中に導入される。形質転換細胞の選択は、上記のように組換えベクターに関連した標準法によって、例えば、選択可能マーカー、例えば、抗生物質耐性を発現する細胞について選択することによって行うことができる。
【００６２】
発現ベクターがいったん宿主細胞中に導入されると、宿主細胞染色体中又はエピソームによるａｖｅＣコード配列の組み込み及び維持については、標準的な方法、例えば、サザンハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含めたＰＣＲ分析、又は予想される遺伝子産物を検出する免疫学的検定によって確認することができる。組換えａｖｅＣコード配列を含有及び／又は発現する宿主細胞は、（ｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｉｉ）「マーカー」遺伝子機能の存在を検出すること；（ｉｉｉ）宿主細胞中でのａｖｅＣ特異的ｍＲＮＡ転写物の発現によって測定される転写レベルを評価すること；及び（ｉｖ）例えば、免疫検定によって又はＡｖｅＣ生物学的活性（例えば、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ宿主細胞中でＡｖｅＣ活性を示す具体的な比及び量のアベルメクチン生産）の存在によって測定される成熟ポリペプチド生成物の存在を検出することを含む、当該技術分野において周知である少なくとも４種類の一般的な手法のいずれかによって同定することができる。
【００６３】
５．２．３．組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の発現及び特性決定
生来の又は突然変異させたａｖｅＣコード配列が適当な宿主細胞中に安定して導入されたら、その形質転換された宿主細胞をクローン増殖させ、得られた細胞を、生来の又は突然変異させたＡｖｅＣ遺伝子産物の産生を最大するのに寄与する条件下で増殖させることができる。このような条件には、典型的には細胞を高密度まで増殖させることが含まれる。発現ベクターが誘導プロモーターを含む場合、適当な誘導条件、例えば、温度シフト、栄養素の消耗、無償インデューサー（例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）のような炭水化物類似体）の添加、過剰の代謝副生成物の蓄積等を、発現を誘導するのに必要に応じて使用する。
【００６４】
発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が宿主細胞内に保持される場合、それら細胞を採取し且つ溶解させ、そしてその溶解産物から、タンパク質分解を最小限にする当該技術分野において公知の抽出条件下、例えば、４℃で又はプロテアーゼインヒビターの存在下で、又は両方などで生成物を単離し且つ精製する。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が宿主細胞から分泌される場合、枯渇した栄養培地を単純に集めて、それから生成物を単離することができる。
【００６５】
発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物は、必要に応じて、細胞溶解産物又は培地から、次の方法、すなわち、硫酸アンモニウム沈降、サイズ分画、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離及びアフィニティークロマトグラフィーの任意の組合せが含まれるがこれに限定されない標準法を用いて単離する又は実質的に精製することができる。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が生物学的活性を示す場合、その標品の増加純度は、適当な検定の使用によって精製法の各段階で監視することができる。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が生物学的活性の有無には無関係に、それは、例えば、サイズ、又はそれ以外の場合にはＡｖｅＣに特異的な抗体との反応性に基づいて、又は融合標識の存在によって検出することができる。本明細書で用いられるＡｖｅＣ遺伝子産物は、その産物が特定の標品中の約２０重量％を越えるタンパク質を構成する場合に「実質的に精製」されている。さらに、本明細書で用いられるＡｖｅＣ遺伝子産物は、その産物が特定の標品中の少なくとも約８０重量％のタンパク質を構成する場合に「単離」されている。
【００６６】
したがって、本発明によれば、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列によってコードされるアミノ酸配列又は図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）のアミノ酸配列又はその実質的な部分並びに突然変異型及びその縮重変異体を含む、組換え発現されて単離された又は実質的に精製されたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物が提供される。
【００６７】
さらに、本発明によれば、ＡｖｅＣ遺伝子産物を製造する方法であって、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の産生を促進する条件下で培養し、このベクターは、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子であって、宿主細胞中のポリヌクレオチド分子の発現を制御する一つ又はそれ以上の調節要素と機能的に関連しているポリヌクレオチド分子を含み、そして細胞培養物からＡｖｅＣ遺伝子産物を回収することを含む方法が提供される。
【００６８】
組換え発現されたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物は、ＡｖｅＣ遺伝子産物機能を変化させ、それによってアベルメクチン生合成を調節する化合物をスクリーニングすること、及びＡｖｅＣ遺伝子産物に対する抗体を増加させることを含む種々の目的に有用である。
【００６９】
充分な純度のＡｖｅＣ遺伝子産物が得られたら、それをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、アベルメクチン生合成経路で適当な生成物を生産する場合の生物学的活性等を含めた標準法によって特性決定することができる。例えば、ＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸配列は、標準的なペプチド配列決定法を用いて決定することができる。ＡｖｅＣ遺伝子産物は、親水性分析（例えば、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：３８２４参照）又は類似のソフトウェアアルゴリズムを用いて、ＡｖｅＣ遺伝子産物の疎水性領域及び親水性領域を決定するようにさらに特性決定することができる。構造分析は、具体的な二次構造を推定するＡｖｅＣ遺伝子産物の領域を同定するようにおこなうことができる。Ｘ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７−１３）、コンピュータモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ及びＺｏｌｌｅｒ（編者），１９８６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現在のコミュニケーション），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）のような生物物理学的方法は、ＡｖｅＣ遺伝子産物とその基質との間の相互作用部位をマッピングし且つ検討するのに用いることができる。これら研究から得られる情報を用いて、ａｖｅＣ  ＯＲＦ中の突然変異のための新規な部位を選択して、より望ましいアベルメクチン産生特性を有する新規なＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株を開発することができる。
【００７０】
５．３．ＡveC突然変異体の構成及び使用
本発明の主要な目的は、Ｂ１：Ｂ２アベルメクチンの比の変化、最も好ましくは減少を生じる、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのaveC対立遺伝子における新規な突然変異を同定することにある。したがって、本発明によれば、野生型aveC対立遺伝子のみを発現することを除いて同じである菌株の細胞と比較してアベルメクチン産生の検出可能な変化を示すＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ細胞の新規な菌株を産生するのに有用なポリヌクレオチド分子が提供される。好ましい実施態様によれば、このようなポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子だけを発現する以外は同じである菌株の細胞と比較して減少したクラス２：１比でアベルメクチンを生産する新規なＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞の菌株を産生するのに有用である。また、このような菌株の細胞は、単一の野生型のaveC対立遺伝子のみを発現すること以外は同じである菌株の細胞よりも多い量のアベルメクチンを産生するように追加の突然変異を含むこともできる。
【００７１】
ａｖｅＣ対立遺伝子又はコード配列の突然変異には、一つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加をＡｖｅＣ遺伝子産物中に導入する、又はＡｖｅＣ遺伝子産物の切断を引き起こす、又はその任意の組合せ、及び所望の結果を生じる任意の突然変異が含まれる。このような突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子配列は、それらの任意の縮重変異体を含むことを意図している。例えば、本発明によれば、ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体、又はプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている配列又はその縮重変異体、又は図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）に示されるＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又はその縮重変異体のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であるが、これは、ＡｖｅＣ遺伝子産物中の選択された位置にアミノ酸置換の組み合せをコードする突然変異を更に含む、ポリヌクレオチド分子が提供される。非制限的実施態様において、このような置換は、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のアミノ酸２５位、２８位、３５位、３６位、３８位、４０位、４１位、４８位、５５位、６１位、７８位、８４位、８９位、９０位、９９位、１０７位、１０８位、１１１位、１２０位、１２３位、１３６位、１３８位、１３９位、１４１位、１５４位、１５９位、１６３位、１７９位、１９２位、１９６位、１９８位、２００位、２０２位、２２０位、２２８位、２２９位、２３０位、２３１位、２３４位、２３８位、２３９位、２５０位、２５２位、２６６位、２７５位、２７８位、２８９位又は２９８位に相当するＡｖｅＣ遺伝子産物の一つ以上のアミノ酸位置で生じる。置換されるアミノ酸位置の好ましい組み合わせは、アミノ酸残基Ｄ４８、Ａ６１、Ａ８９、Ｌ１３６、Ｓ１３８、Ａ１３９、Ｒ１６３、Ｇ１７９、Ｖ１９６、Ａ１９８、Ｅ２３８及びＰ２８９の一つ以上を含む。アミノ酸置換の具体的に好ましい組み合わせは、Ｄ４８及びＧ１７９の両方並びにより具体的にはＤ４８Ｅ及びＧ１７９Ｓの両方に置換を含む。シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１比の減少を生じるアミノ酸置換の組み合わせの具体例を、図６Ａ〜６Ｊにまとめて示す。
【００７２】
したがって、本発明によれば、ヌクレオチド配列が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活されており且つ突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を発現するストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞がアベルメクチンのクラス２：１比を産生することができ、この比は、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞により産生される比と比較して減少しているものであるような、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のアミノ酸位置に相当するアミノ酸残基にアミノ酸置換の組み合わせをコードする突然変異をさらに含むことを除いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣの対立遺伝子、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物コード配列若しくは図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）記載のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又はそれらの縮重変異体と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、クラス２：１アベルメクチンがシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンであるときクラス２：１アベルメクチン比は０．３５：１以下である、ポリヌクレオチド分子が提供される。より好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．３０：１以下である。より好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．２５：１以下である。より好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．２０：１以下である。
【００７３】
その特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ１９８Ｇ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５３８があげられる（図６参照）。
【００７４】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｂ）：Ｇ４０Ｓ、Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５５９があげられる。
【００７５】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｃ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５６７があげられる。
【００７６】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｄ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５７０及びｐＳＥ５７２があげられる。
【００７７】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｅ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ２００Ｇ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５７１があげられる。
【００７８】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｆ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５０１及びｐＳＥ５４６があげられる。
【００７９】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｇ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５１０があげられる。
【００８０】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｈ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５１２があげられる。
【００８１】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｉ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５１９があげられる。
【００８２】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｊ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ１９８Ｇ、Ｐ２０２Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５２６があげられる。
【００８３】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｋ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５２８があげられる。
【００８４】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｌ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ１９８Ｇ、Ｅ２３８Ｄ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５３０があげられる。
【００８５】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｍ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ１９８Ｇ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５３１があげられる。
【００８６】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｎ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ８４Ｐ、Ｇ１１１Ｖ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ１９８Ｇ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５３４があげられる。
【００８７】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｏ）：Ｙ２８Ｃ、Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５３５があげられる。
【００８８】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｐ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ１０７Ｔ、Ｓ１０８Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｓ１９２Ａ、Ｅ２３８Ｄ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５４２があげられる。
【００８９】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｑ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｒ２５０Ｗからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５４５があげられる。
【００９０】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｒ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５４８があげられる。
【００９１】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｓ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ１９８Ｇ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５５２があげられる。
【００９２】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｔ）：Ｄ４８Ｅ、Ｆ７８Ｌ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５５７があげられる。
【００９３】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｕ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｆ２７８Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５６４及びｐＳＥ５６５があげられる。
【００９４】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｖ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５６８があげられる。
【００９５】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｗ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｇ１１１Ｖ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５４３があげられる。
【００９６】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｘ）：Ｄ２５Ｇ、Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｖ１４１Ａ、Ｉ１５９Ｔ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５０４があげられる。
【００９７】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｙ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ９０Ｇ、Ｌ１３６Ｐ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５０８があげられる。
【００９８】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｚ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｇ１１１Ｖ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５１１があげられる。
【００９９】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａａ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５２０があげられる。
【０１００】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｂ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓ、Ｓ２３１Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５２３があげられる。
【０１０１】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｃ）：Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５２７があげられる。
【０１０２】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｄ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｆ９９Ｓ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５３９があげられる。
【０１０３】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｅ）：Ｇ３５Ｓ、Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５４０があげられる。
【０１０４】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｆ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５４７があげられる。
【０１０５】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｇ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｇ１１１Ｖ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ１９８Ｇ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５５０があげられる。
【０１０６】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｈ）：Ｓ４１Ｇ、Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５５８があげられる。
【０１０７】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｉ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓ、Ｐ２５２Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５６３があげられる。
【０１０８】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｊ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｆ２３４Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５６６があげられる。
【０１０９】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｋ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５７３及びｐＳＥ５７８があげられる。
【０１１０】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｌ）：Ｑ３６Ｒ、Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５７４があげられる。
【０１１１】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｍ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｒ１６３Ｑ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５７５及びｐＳＥ５７６があげられる。
【０１１２】
別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｎ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５７７があげられる。
【０１１３】
その特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｏ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５０２及びｐＳＥ５２４があげられる。
【０１１４】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｐ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｋ１５４Ｅ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５０３があげられる。
【０１１５】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｑ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｋ１５４Ｒ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５０５があげられる。
【０１１６】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｒ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５０６があげられる。
【０１１７】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｓ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ａ１９８Ｇ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５０７があげられる。
【０１１８】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｔ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ｇ１９６Ａ、Ｅ２３８Ｄ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５０９があげられる。
【０１１９】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｕ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５１４及びｐＳＥ５２５があげられる。
【０１２０】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｖ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｖ１２０Ａ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５１５があげられる。
【０１２１】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｗ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ａ１９８Ｇ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５１７があげられる。
【０１２２】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｘ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｇ１１１Ｖ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５１８があげられる。
【０１２３】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｙ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ｅ２３８Ｄ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５２９及びｐＳＥ５５４があげられる。
【０１２４】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ａｚ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ１９８Ｇ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５３２があげられる。
【０１２５】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｂａ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ａ１９８Ｇ、Ｖ２２０Ａからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５３６があげられる。
【０１２６】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｂｂ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ｅ２３８Ｄ、Ｒ２３９Ｈ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５３７があげられる。
【０１２７】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｂｃ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５４１があげられる。
【０１２８】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｂｄ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ｅ２３８Ｄ、Ｐ２８９Ｌからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５４９及びｐＳＥ５５３があげられる。
【０１２９】
その別の特定の実施態様によれば、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｂｅ）：Ｄ４８Ｅ、Ａ６１Ｔ、Ａ８９Ｔ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｆ、Ｇ１７９Ｓ、Ｖ１９６Ａ、Ｅ２３８Ｄからなる群から選択された組み合わせを含む。これらのアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的例として、ｐＳＥ５５１があげられる。
【０１３０】
さらに、本発明によれば、ヌクレオチド配列が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活されており且つ突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を発現するストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞がアベルメクチンのクラス２：１比を産生することができ、この比は、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞により産生される比と比較して減少しているものであるような、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のアミノ酸位置に相当するアミノ酸残基にアミノ酸置換の組み合わせをコードする突然変異をさらに含むことを除いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣの対立遺伝子、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物コード配列若しくは図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）記載のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又はそれらの縮重変異体と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、クラス２：１アベルメクチンがシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンであるとき、クラス２：１アベルメクチン比は約０．４０：１以下に減少されており、且つ前記アミノ酸置換の組み合わせが
（ｂｆ）Ｄ４８Ｅ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ；及び
（ｂｇ）Ｙ２８Ｃ、Ｑ３８Ｒ、Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ
からなる群から選択された組み合せを含む、ポリヌクレオチド分子が提供される。
【０１３１】
（ｂｆ）群のアミノ酸置換をコードするプラスミドの非制限的な例として、ｐＳＥ５５６及びｐＳＥ５６９があげられる。（ｂｇ）群のアミノ酸置換をコードしているプラスミドの非制限的な例として、ｐＳＥ５６１があげられる。
【０１３２】
本発明では、上記したアミノ酸置換は、このような置換を生じるａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体のヌクレオチド配列に対する修飾によりおこなうことができることを意図している。例えば、生来のコドン配列又はその縮重変異体を同じアミノ酸置換をコードするいくつかの別のコドンに変更することにより、ここに記載されているアミノ酸置換のほとんどをおこなうことが可能である。上記したアミノ酸置換をコードできる種々の可能な配列は、本発明の開示及び遺伝子コードの公知の縮重から、当業者には容易に明らかとなろう。上記で列挙した各具体的な組み合わせについての非限定的な実施態様によれば、アミノ酸置換は、図６に示した非サイレント的ヌクレオチドの変更によりおこなうことができる。
【０１３３】
本明細書で使用される表現「アミノ酸置換の組み合わせは、・・・・からなる群の組み合わせを含む」等は、本発明によるＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換が、少なくとも具体的に列挙した置換を含み、また、他のアミノ酸置換、又はアミノ酸欠失、又はアミノ酸付加、又はこれらの組み合わせを含んでいてもよく、ここでＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ細胞における得られたＡｖｅＣ遺伝子産物の発現が、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチン比の所望の減少を生じることを意味する。
【０１３４】
ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体に対する突然変異は、種々の公知の方法、例えば、誤りがちのＰＣＲを使用することによるか、又はカセット突然変異誘発のいずれかにより実施することができる。例えば、オリゴヌクレオチドに対する突然変異誘発を用いて、ａｖｅＣ対立遺伝子又はＯＲＦの配列を一定方法で、例えば、一つ又はそれ以上の制限部位、又は終止コドンをａｖｅＣ対立遺伝子又はＯＲＦ内の特定の領域に導入するように変更することができる。ランダムフラグメント化、突然変異誘発の反復サイクル及びヌクレオチドシャッフリングを含む、米国特許第５，６０５，７９３号、米国特許第５，８３０，７２１号及び米国特許第５，８３７，４５８号に記載のような方法は、ａｖｅＣ突然変異をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの大きなライブラリーを生成するのにも使用できる。
【０１３５】
標的突然変異は、特にそれらがＡｖｅＣ遺伝子産物中の一つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基を変更するのに役立つ場合に有用なことがある。例えば、米国特許第６，２４８，５７９号に記載されているように、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）のＡｖｅＣ遺伝子産物の演繹したアミノ酸配列と、Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：５）及びＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：４）由来のＡｖｅＣ相同遺伝子産物の演繹したアミノ酸配列を比較すると、これら種間にアミノ酸残基の有意に保存された部位があることが明らかである。これら保存アミノ酸残基の一つ又はそれ以上の変化を生じる標的突然変異誘発は、アベルメクチン産生において望ましい変更を示す新規な突然変異菌株を産生するのに有効である。
【０１３６】
ランダム突然変異誘発も有用であり、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞を紫外線又はｘ線にあてるか、又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン、スルホン酸エチルメタン、亜硝酸又はナイトロジェンマスタードのような化学的突然変異原に暴露することによっておこなうことができる。突然変異誘発技術の概要については、例えば、上記したＡｕｓｕｂｅｌ，１９８９を参照されたい。
【０１３７】
いったん突然変異したポリヌクレオチド分子が生成したら、それらをスクリーニングして、それらがＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ中でアベルメクチン生合成を調節することができるかどうかを確認する。好ましい態様によれば、突然変異したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ａｖｅＣ遺伝子が失活してａｖｅＣネガティブ（ａｖｅＣ-）バックグラウンドを与えるＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株を相補することによって調べる。非制限的方法において、突然変異したポリヌクレオチド分子をスプライシングして、一つ又はそれ以上の調節要素と機能的に関連した発現プラスミドにするが、このプラスミドは、好ましくは形質転換された細胞の選択を可能にする一つ又はそれ以上の薬物耐性遺伝子も含む。次に、このベクターを、公知の方法を用いてａｖｅＣ-宿主細胞に形質転換し、そして形質転換された細胞を選択し、適当な発酵培地中においてアベルメクチン生産を可能にする又は誘導する条件下で培養する。例えば、好適なスターターサブユニットを培地に含め、当該技術分野において公知なアベルメクチン産生に最適な条件下で培養することにより実施する。次に、発酵生成物を、ＨＰＬＣによって分析して、突然変異したポリヌクレオチド分子が宿主細胞を相補する能力について測定する。ｐＳＥ１８８、ｐＳＥ１９９、ｐＳＥ２３１、ｐＳＥ２３９及びｐＳＥ２９０〜ｐＳＥ２９７を含む、アベルメクチンのＢ２：Ｂ１比を減少させることができる突然変異したポリヌクレオチド分子を有するいくつかのプラスミドベクターを、以下のセクション８．３に例示する。このようなプラスミドベクターの他の例を、図６に列挙する。
【０１３８】
本発明の上記した方法のいずれかを、好ましくはシクロヘキサンカルボン酸を補充した発酵培養培地を用いて実施できるが、他の好適な脂肪酸前駆体、例えば、表１にあげた脂肪酸前駆体のいずれか一つ又はメチルチオ乳酸を使用してもよい。
【０１３９】
望ましい方向でのアベルメクチン産生を調節する突然変異させたポリヌクレオチド分子が同定されると、ヌクレオチド配列における突然変異の位置を決定できる。例えば、突然変異ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ＰＣＲにより単離し、公知の方法を用いてＤＮＡ配列分析に附することができる。突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子のＤＮＡ配列を、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のＤＮＡ配列と比較することにより、アベルメクチン産生の変更の原因となる突然変異（単一又は複数）を決定することができる。例えば、残基５５（Ｓ５５Ｆ）、１３８（Ｓ１３８Ｔ）、１３９（Ａ１３９Ｔ）又は２３０（Ｇ２３０Ｄ）のいずれかにおける単一アミノ酸置換か、又は１３８位（Ｓ１３８Ｔ）及び１３９位（Ａ１３９Ｔ又はＡ１３９Ｆ）における二重置換を含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物は、産生されるクラス２：１アベルメクチン比が変更されるようなＡｖｅＣ遺伝子産物機能の変化を生じたが（以下のセクション８参照）、ここで、列挙されるアミノ酸位置は、図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）に示される位置に相当する。さらに、次の７種の突然変異の組合せが、各々アベルメクチンのクラス２：１比を効果的に減少させることがわかった：（１）Ｄ４８Ｅ／Ａ８９Ｔ；（２）Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔ／Ｇ１７９Ｓ；（３）Ｑ３８Ｐ／Ｌ１３６Ｐ／Ｅ２３８Ｄ；（４）Ｆ９９Ｓ／Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔ／Ｇ１７９Ｓ；（５）Ａ１３９Ｔ／Ｍ２２８Ｔ；（６）Ｇ１１１Ｖ／Ｐ２８９Ｌ；（７）Ａ１３９Ｔ／Ｋ１５４Ｅ／Ｑ２９８Ｈ。本発明によれば、アベルメクチンのシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１比を減少させる突然変異の５９種類のさらなる組み合わせが提供され、これらは、図６に示され、且つ添付の特許請求の範囲で列挙されている。
【０１４０】
本明細書で用いられるＡ１３９Ｔのような上記表示は、表示の位置（この場合、ポリペプチドの１３９位（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２参照）での単一文字表示による最初のアミノ酸残基（この例では、アラニン（Ａ））を示し、その後に最初のアミノ酸残基に取ってかわるアミノ酸残基（この例では、トレオニン（Ｔ））を示している。
【０１４１】
本明細書において、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体又は本発明のベクター又は単離ポリヌクレオチド分子においてａｖｅＣ対立遺伝子によりコードされているアミノ酸残基が配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２の特定のアミノ酸残基「に相当する」と称される場合、又はアミノ酸置換が、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２の特定の番号付けされたアミノ酸残基のもの「に相当する」特定の位置で生じると称される場合、これは、ＡｖｅＣ遺伝子産物において同じ相対位置でのアミノ酸残基を指すことを意図している。当業者は、これを、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２としてここで示されているアミノ酸配列を参照することにより迅速に決定することができる。
【０１４２】
本明細書において、特定の突然変異をコードしているａｖｅＣ対立遺伝子における特定の突然変異は、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１に示すような特定のヌクレオチド位置「に相当する」ａｖｅＣ対立遺伝子における特定のヌクレオチド位置での塩基の変更としてあげられる場合、又はａｖｅＣ対立遺伝子におけるヌクレオチド位置が配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１における特定のヌクレオチド位置「に相当する」と称される場合、ａｖｅＣヌクレオチド配列又はその縮重変異体における同じ相対位置でのヌクレオチドを指すことを意図している。当業者は、これを、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１としてここで示されているヌクレオチド配列を参照することにより迅速に決定することができる。
【０１４３】
本明細書においてシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンの比を指す用語「約」は、具体的に述べた数値に、述べた値の１０％をプラス又はマイナスした値を指す。
【０１４４】
本発明のポリヌクレオチド分子は、「単離」してもよい。このことは、（ｉ）異なるヌクレオチド配列を有する他のポリヌクレオチド分子を実質的に含有しない程度まで精製するか、又は（ｉｉ）自然発生しない環境、例えば、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のａｖｅＣ対立遺伝子又はその突然変異型が、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞以外の細胞に存在する環境に存在するか、又は（ｉｉｉ）自然発生しない形態、例えば、より短いＤＮＡ片、例えば、細菌染色体から消化した制限断片であり、主にａｖｅＣコード領域又はその突然変異型を含み、その関連調節配列を有するか又は有さないものとしてか、又は続いて、細菌細胞（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞以外）の染色体等のＤＮＡの非相同片、又はプラスミド又はファージ等のベクターのＤＮＡに組み込むか、又は生来のａｖｅＣ対立遺伝子のもの以外の座でのＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体に組み込んだ形態で存在することを意味する。
【０１４５】
さらに、本発明によれば、本発明のポリヌクレオチド分子を含む組み換えベクターが提供される。このような組み換えベクターを使用して、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体のａｖｅＣ対立遺伝子の部位に対して本発明の突然変異させたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子のいずれかを標的として、例えば、相同的組み換えにより、ａｖｅＣ  ＯＲＦ又はその一部分に挿入するか、又はそれと置き換えることができる。しかしながら、本発明によれば、このようにして提供される本発明の突然変異させたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子も、ａｖｅＣ対立遺伝子以外の部位のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体に挿入したとき、又はＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ細胞にエピゾーム的に維持したときに、アベルメクチン生合成を調節する役割を果たすことができる。したがって、さらに、本発明によれば、本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターが提供される。このベクターを使用して、ａｖｅＣ遺伝子以外のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体における部位にポリヌクレオチド分子を挿入したり、又はエピゾーム的に維持することができる。
【０１４６】
非制限的な実施態様によれば、ベクターは、遺伝子置換ベクターである。このベクターを使用して、本発明による突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体をＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞に挿入することにより、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの新規な菌株を生成することができる。ここで、その細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現する以外は同じ菌株の細胞と比較して、減少したクラス２：１比でアベルメクチンを産生することができるものである。このような遺伝子置換ベクターは、このようにして提供される発現ベクター、例えば、以下のセクション８で例示する発現ベクター、に存在する突然変異させたポリヌクレオチド分子を用いて構築することができる。
【０１４７】
さらに、本発明によれば、突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体をＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞に挿入して、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現する以外は同じである菌株の細胞と比較してアベルメクチンの産生量を変更して産生する新規な細胞菌株を生成することができるベクターが提供される。好ましい実施態様によれば、細胞により産生されるアベルメクチンの量が増加する。具体的な実施態様ではあるが非制限的な実施態様によれば、このようなベクターは、当該技術分野において公知の強力なプロモーター、例えば、ａｖｅＣ  ＯＲＦから上流に位置し且つそれと機能的に関連しているＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａからの強力な構成性ｅｒｍＥプロモーターなどをさらに含む。このようなベクターは、プラスミドｐＳＥ１８９の突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子を使用し、米国特許第６，２４８，５７９号に記載の方法により構築できる。
【０１４８】
本発明によれば、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの野生型菌株においてａｖｅＣ遺伝子を不活性化するのに有用である遺伝子置換ベクターが提供される。非制限的実施態様によれば、このような遺伝子置換ベクターを、以下のセクション８．１で例示するプラスミドｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）中に存在する突然変異したポリヌクレオチド分子を用いて構築することができる（図３）。さらに、本発明によれば、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体における原位置のａｖｅＣ遺伝子の脇に生来位置するヌクレオチド配列、例えば、図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）に示すフランキングヌクレオチド配列、を含むか、又はこのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を含む遺伝子置換ベクターが提供される。このベクターは、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣ  ＯＲＦを欠失させるのに使用できる。
【０１４９】
さらに、本発明によれば、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。この宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子又は組み換えベクターのための宿主として使用することができる原核細胞又は真核細胞であることができる。好ましい実施態様によれば、宿主細胞は、細菌性細胞である。より好ましい実施態様によれば、宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞である。より好ましい実施態様によれば、宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞である。
【０１５０】
さらに、本発明によれば、（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、新規なＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記アミノ酸置換の組み合わせが、上記した（ａ）〜（ｂｅ）から選択されたものである、方法が提供される。
【０１５１】
さらに、本発明によれば、（ｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、新規なＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又は縮重変異体を含む細胞が、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを０．３５：１以下の比で産生できるものである、方法が提供される。その非制限的実施態様によれば、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体は、上記した（ａ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている。
【０１５２】
その好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．３０：１以下である。その非制限的実施態様によれば、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体は、上記した（ｆ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている。
【０１５３】
そのより好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．２５：１以下である。その非制限的実施態様によれば、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体は、上記した（ｗ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている。
【０１５４】
そのより好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．２０：１以下である。その非制限的実施態様によれば、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体は、上記した（ａｏ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている。
【０１５５】
さらに、本発明によれば、（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、新規Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記アミノ酸置換の組み合わせが、（ｂｆ）及び（ｂｇ）からなる群から選択されたものである、製造方法が提供される。その好ましい実施態様によれば、このような突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又は縮重変異体を含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．４０：１以下の比で産生できる。
【０１５６】
ａｖｅＣ対立遺伝子をそのように突然変異させることにより、又は突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子若しくはその縮重変異体をそのように導入することにより、上記であげた工程により、新規なＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株が得られる。
【０１５７】
さらに、本発明によれば、上記した（ａ）〜（ｂｅ）から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の細胞が提供される。その好ましい実施態様によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの種は、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓである。
【０１５８】
さらに、本発明によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを０．３５：１以下の比で産生できるＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞が提供される。その非限定的実施態様によれば、上記細胞は、上記した（ａ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【０１５９】
その好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．３０：１以下である。その非制限的実施態様によれば、上記細胞は、上記した（ｆ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【０１６０】
そのより好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．２５：１以下である。その非制限的実施態様によれば、上記細胞は、上記した（ｗ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【０１６１】
そのより好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比は、約０．２０：１以下である。その非制限的実施態様によれば、上記細胞は、上記した（ａｏ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【０１６２】
さらに、本発明によれば、上記した（ｂｆ）及び（ｂｇ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の細胞が提供される。その好ましい実施態様によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの種は、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓである。そのより好ましい実施態様によれば、上記細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．４０：１以下の比で産生できるＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞である。
【０１６３】
上記であげた突然変異のいずれも、プラスミド等の染色体外要素上の本発明の細胞上に存在することができるけれども、このような突然変異は、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体に組み込んだａｖｅＣコード配列に存在し、好ましくは必ずというわけではないけれども、生来のａｖｅＣ対立遺伝子の部位に存在することが好ましい。
【０１６４】
このような新規な細胞菌株は、ドラメクチン等の商業的に望ましいアベルメクチンの大規模生産に有用である。
【０１６５】
さらに、本発明によれば、アベルメクチンの製造方法であって、本発明のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ細胞を、培地中で、それからアベルメクチンを産生するか又は誘発する条件下で培養することと、培養から上記アベルメクチンを回収することを含む、方法が提供される。好ましい実施態様によれば、この方法に使用される細胞は、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを０．３５：１以下の比、より好ましくは約０．３０：１以下の比、より好ましくは約０．２５：１以下の比、より好ましくは約０．２０：１以下の比で産生する。
【０１６６】
その好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを０．３５：１以下の比で産生する細胞は、上記（ａ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【０１６７】
そのさらに好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．３０：１以下の比で産生する細胞は、上記（ｆ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【０１６８】
そのさらに好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．２５：１以下の比で産生する細胞は、上記（ｗ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【０１６９】
そのさらに好ましい実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．２０：１以下の比で産生する細胞は、上記（ａｏ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【０１７０】
別の実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを約０．４０：１以下の比で産生する細胞は、上記（ｂｆ）〜（ｂｇ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む。
【０１７１】
本発明の方法によれば、ドラメクチン等の商業的に価値のあるアベルメクチンの産生効率が増加する。
【０１７２】
さらに、本発明によれば、ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞により産生されるシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンの組成物であって、前記シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンが前記細胞が培養された培地に存在しており、前記培地に存在するシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が０．３５：１以下、好ましくは約０．３０：１以下、より好ましくは約０．２５：１以下、さらに好ましくは約０．２０：１以下である、組成物が提供される。特定の実施態様によれば、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンの組成物は、突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞により産生される。この場合の、突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞は、突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子を発現しないが、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現する同様のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞と比較して、細胞により産生されるシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比の減少する遺伝子産物をコードするものである。
【０１７３】
その好ましい実施態様によれば、組成物がシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が０．３５：１以下である場合、この組成物は、上記（ａ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される。
【０１７４】
そのさらに好ましい実施態様によれば、組成物がシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．３０：１以下である場合、この組成物は、上記（ｆ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される。
【０１７５】
そのさらに好ましい実施態様によれば、組成物がシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．２５：１以下である場合、この組成物は、上記（ｗ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される。
【０１７６】
そのさらに好ましい実施態様によれば、組成物がシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．２０：１以下である場合、この組成物は、上記（ａｏ）〜（ｂｅ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される。
【０１７７】
さらに、本発明によれば、ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞により産生されるシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンの組成物であって、前記シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンが前記細胞が培養された培地に存在しており、前記培地に存在するシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．４０：１以下であり、そして上記（ｂｆ）及び（ｂｇ）からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含む細胞により産生される、組成物が提供される。
【０１７８】
新規なアベルメクチン組成物は、細胞を、例えば、部分的又は完全に枯渇した発酵培養液中で培養した培地に存在することが好ましいけれども、アベルメクチン組成物を、公知の生化学的精製方法、例えば、硫酸アンモニウム沈降、透析、サイズ分画、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等により、培養液から部分的又は実質的に精製してもよい。
【０１７９】
上記したようなシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の比を減少させて産生できる細胞を含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの新規な菌株を得る他に、本発明は、さらなる突然変異をＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞に組み込んでアベルメクチン産生の特性をさらに改善することができることを意図している。非限定的実施態様によれば、本発明の細胞は、さらに修飾を含んでいてアベルメクチンの産生レベルを増加することができる。一実施態様によれば、このような細胞は、（ｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの細胞におけるaveC対立遺伝子を突然変異させるか、又は（ｉｉ）突然変異させたaveC対立遺伝子若しくはその縮重変異体をＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞に導入するが、ここで突然変異させた対立遺伝子の発現により、単一の野生型aveC対立遺伝子のみを発現する以外は同じである菌株の細胞と比較して、突然変異させたaveC対立遺伝子を発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの菌株の細胞により産生されるアベルメクチンの量が増加するものであり、そして単一の野生型aveC対立遺伝子のみを発現する菌株の細胞により産生されるアベルメクチンの量と比較してアベルメクチンを増加した量で産生する形質転換細胞を選択することにより調製できる。例えば、ａｖｅＣ  ＯＲＦから上流に挿入され、且つａｖｅＣ  ＯＲＦと動作可能に関連している強力なプロモーター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ由来の強力な構成性ｅｒｍＥプロモーターを含むようにaveC対立遺伝子を修飾することができる。別の実施態様によれば、一つ以上の突然変異を、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＲ１及び／又はａｖｅＲ２遺伝子に導入することにより、米国特許第６，１９７，５９１号（Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ等；２００１年３月６日発行）に記載のアベルメクチン産生のレベルを増加することができる。
【０１８０】
５．４．アベルメクチンの使用
アベルメクチンは、駆虫薬、外部寄生生物撲滅薬、殺虫薬及びダニ駆除薬として特に有用である高活性な抗寄生生物薬である。本発明の方法によって製造されるアベルメクチン化合物は、これら目的のいずれにも有用である。例えば、本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、ヒトにおける種々の疾患又は状態、とりわけ当該技術分野において公知の寄生生物感染によって引き起こされる疾患又は状態を治療するのに有用である。例えば、Ｉｋｅｄａ及びＯｍｕｒａ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７（７）：２５９１−２６０９を参照。より詳細には、本発明により製造されるアベルメクチン化合物は、ヒト、家畜、ブタ、ヒツジ、家禽、ウマ又はウシに感染できる寄生線虫のような内部寄生生物によって引き起こされる種々の疾患又は状態を治療する場合に効果的である。
【０１８１】
より詳細には、本発明により製造されるアベルメクチン化合物は、ヒトに感染する線虫、更には、様々な動物種に感染する線虫に対して有効である。このような線虫には、鉤虫属（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）、アメリカ鉤虫属（Ｎｅｃａｔｏｒ）、回虫属（Ａｓｃａｒｉｓ）、ストロンギロイデス属（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、旋毛虫属（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、毛頭虫属（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、鞭虫属（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、蟯虫属（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）のような胃腸寄生虫、及びフィラリア蠕虫のように血液又は他の組織若しくは器官中、及び  Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ及び  Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａの腸管内状態抽出物中で見出される寄生虫が含まれる。
【０１８２】
本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、例えば、マダニ、ダニ、シラミ、ノミ、クロバエ類、刺咬性昆虫、又は特にウシ及びウマに影響を与えることがある移行性双翅類幼虫によって引き起こされる哺乳類及び鳥類の節足動物外寄生を含む外部寄生生物感染を治療するのにも有用である。
【０１８３】
本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、例えば、特に、ゴキブリ、イガ、カツオブシムシ及びイエバエなどの家庭害虫、さらには貯蔵穀物及び農業用植物の害虫であって、クモダニ、アリマキ、イモムシ及び、特にバッタのような直翅類昆虫を含む害虫に対する殺虫剤としても有用である。
【０１８４】
本発明によって製造されるアベルメクチン化合物を用いて治療することができる動物には、ヒツジ、ウシ、ウマ、シカ、ヤギ、ブタ、家禽を含めた鳥類、及びイヌ及びネコが含まれる。
【０１８５】
本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、具体的に意図される使用、治療される宿主動物の具体的な種、及び関与する寄生生物又は昆虫に適した製剤において投与される。殺寄生生物薬としての使用には、本発明によって製造されるアベルメクチン化合物を、カプセル剤、大型丸剤、錠剤又は液状飲薬の形で経口投与することができ、又は他に、滴下剤として、又は注射によって、又は植込錠として投与することができる。このような製剤は、標準的な獣医学慣例によって慣用的に製造される。したがって、カプセル剤、大型丸剤又は錠剤は、デンプン、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム等のような崩壊剤及び／又は結合剤を更に含有する適当な微粉希釈剤又は担体と一緒に活性成分を混合することによって製造することができる。飲薬製剤は、分散助剤又は湿潤剤等と一緒に水溶液中に活性成分を分散させることによって製造することができる。注射用製剤は、滅菌液剤の形で製造することができ、これは、他の物質、例えば、その溶液を血液と等張にするのに充分な塩類及び／又はグルコースなどを含有できる。
【０１８６】
このような製剤は、活性化合物の重量に関して、患者、又は治療される宿主動物の種、感染の重症度及び種類、及び宿主の体重によって異なる。一般的に、経口投与の場合、単一用量として又は分割用量で与えられる約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者又は動物の体重）の用量の活性化合物を、１〜５日間投与することで十分である。しかしながら、臨床症状に基づいて、例えば、医師又は獣医師によって決定されるように、これよりも高い又は低い投薬量範囲が指示される場合がある。
【０１８７】
他に、本発明によって製造されるアベルメクチン化合物は、動物用飼料と組み合わせて投与しうるが、この目的には、普通の動物用試料と混合するための濃厚飼料添加物又はプレミックスを製造することができる。
【０１８８】
殺虫剤としての使用に、及び農業病害虫を処理には、本発明により製造されるアベルメクチン化合物は、標準的な農学慣例によって、噴霧剤、散布剤、乳剤等として適用することができる。
【実施例】
【０１８９】
６．実施例：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの発酵およびＢ２：Ｂ１アベルメクチンの分析
分岐状鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよび５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの両方の活性を欠く菌株は、発酵培地に脂肪酸を補充しない場合、アベルメクチンを産生しない。この実施例では、このような突然変異体において、種々の脂肪酸の存在下で生合成を開始するとき、広範囲のＢ２：Ｂ１比のアベルメクチンを得ることができるということを示す。
【０１９０】
６．１．材料および方法
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ５３６９２を、Ｓｔａｒｃｈ（Ｎａｄｅｘ，Ｌａｉｎｇ  Ｎａｔｉｏｎａｌ）２０ｇ；Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ（Ｔｒａｄｅｒ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）１５ｇ；Ａｒｄａｍｉｎｅ  ｐＨ（Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）５ｇ；炭酸カルシウム１ｇから成る種培地中で調製された全ブイヨンとして−７０℃で貯蔵した。最終容積を、水道水を用いて１リットルに調整し、ｐＨは７．２に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１９１】
上記標品の融解懸濁液２ｍｌを用いて、５０ｍｌの同培地が入っているフラスコに接種した。２８℃においてロータリーシェーカー上、１８０ｒｐｍで４８時間インキュベーション後、２ｍｌのブイヨンを用いて、Ｓｔａｒｃｈ８０ｇ；炭酸カルシウム７ｇ；Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ５ｇ；リン酸水素二カリウム１ｇ；硫酸マグネシウム１ｇ；グルタミン酸０．６ｇ；硫酸第一鉄七水和物０．０１ｇ；硫酸亜鉛０．００１ｇ；硫酸マンガン０．００１ｇから成る産生培地５０ｍｌが入っているフラスコに接種した。最終容積を、水道水を用いて１リットルに調整し、ｐＨは７．２に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１９２】
種々のカルボン酸基質（表１参照）を、メタノール中に溶解させ、接種から２４時間後に発酵ブイヨンに加えて、０．２ｇ／リットルの最終濃度にした。その発酵ブイヨンを２８℃で１４日間インキュベーション後、ブイヨンを遠心分離し（２，５００ｒｐｍ、２分間）、上澄みを捨てた。菌糸体ペレットを、アセトン（１５ｍｌ）を用い、次にジクロロメタン（３０ｍｌ）を用いて抽出し、有機相を分離し、濾過した後、蒸発乾固させた。残留物を、メタノール（１ｍｌ）中に取り、２４０ｎｍに設定した走査型ダイオードアレイ検出器を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １０９０Ａ液体クロマトグラフを用いたＨＰＬＣにより分析した。用いたカラムは、４０℃で維持したＢｅｃｋｍａｎｎ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  Ｃ−１８、５μｍ、４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムであった。２５μｌの上のメタノール溶液をカラムに注入した。溶離は、８０：２０〜９５：５のメタノール−水の直線勾配を用いて０．８５ｍｌ／分で４０分間にわたっておこなった。２種類の標準濃度のシクロヘキシルＢ１を用いて、検出器応答を検量し、Ｂ２およびＢ１のアベルメクチンの曲線下面積を測定した。
【０１９３】
６．２．結果
Ｂ２およびＢ１のアベルメクチンについて観察されたＨＰＬＣ保持時間、および２：１比率を表１に示す。
【０１９４】
【表１】
2005517406.tif 000005
【０１９５】
表１に示されたデータは、極めて広範囲のＢ２：Ｂ１アベルメクチン生成物比を示し、供給される脂肪酸側鎖スターター単位の性状によって、クラス２化合物のクラス１化合物への脱水変換の結果に顕著な差があることがわかる。これは、ＡｖｅＣタンパク質への変更によって生じるＢ２：Ｂ１比の変化が、特定の基質に特異的でありうるということを示している。したがって、特定の基質を用いて得られるＢ２：Ｂ１比の変化を示す突然変異体に関するスクリーニングは、その基質の存在下でおこなう必要がある。続いての以下の実施例では、シクロヘキサンカルボン酸をスクリーニング基質として用いる。しかしながら、この基質は、単に本発明の可能性を示すのに用いられ、発明の適応性を限定するものではない。
【０１９６】
７．実施例：ａｖｅＣ遺伝子の単離
この実施例では、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体のある領域の単離および特性決定を記載する。下に示されるように、ａｖｅＣ遺伝子は、産生されるシクロヘキシル−Ｂ２対シクロヘキシル−Ｂ１（Ｂ２：Ｂ１）アベルメクチン比を変更できることが確認された。
【０１９７】
７．１．材料および方法
７．１．１．ＤＮＡ単離用のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの増殖
次の方法により、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを増殖させた。Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ３１２７２の単一コロニー（単一コロニー単離物＃２）を、Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ５ｇ；Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏペプトン５ｇ；デキストロース２．５ｇ；ＭＯＰＳ５ｇ；Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ寒天１５ｇを含有する１／２強度ＹＰＤ−６上で分離した。最終容積は、ｄＨ2Ｏを用いて１リットルに調整し、ｐＨは７．０に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１９８】
上の培地中で増殖した菌糸体を用いて、２５ｍｍｘ１５０ｍｍ試験管中の１０ｍｌのＴＳＢ培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ３０ｇ、１リットルｄＨ2Ｏ中、１２１℃で２５分間オートクレーブ処理される）に接種し、これを２８℃で振とうしながら（３００ｒｐｍ）４８〜７２時間維持した。
【０１９９】
７．１．２．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからの染色体ＤＮＡ単離
上記のように増殖した菌糸体のアリコート（０．２５ｍｌまたは０．５ｍｌ）を、１．５ｍｌミクロ遠心管中に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって細胞を濃縮した。上澄みを捨て、細胞を、２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する０．２５ｍｌのＴＳＥ緩衝液（２０ｍｌの１．５Ｍスクロース、２．５ｍｌの１ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．０、２．５ｍｌの１Ｍ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０および７５ｍｌのｄＨ2Ｏ）中に再懸濁させた。これらの試料を、３７℃で振とうしながら２０分間インキュベーションし、ＡｕｔｏＧｅｎ  ５４０（商標）自動核酸単離装置（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）中に加え、Ｃｙｃｌｅ  １５９（装置ソフトウエア）を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって用いてゲノムＤＮＡを単離した。
【０２００】
別法として、５ｍｌの菌糸体を１７ｍｍｘ１００ｍｍ試験管に入れ、３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を濃縮し、上澄みを除去した。細胞を、１ｍｌのＴＳＥ緩衝液中に再懸濁させ、３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって濃縮し、上澄みを除去した。細胞を、２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する１ｍｌのＴＳＥ緩衝液中に再懸濁させ、３７℃で振とうしながら３０〜６０分間インキュベーションした。インキュベーション後、０．５ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加え、そして細胞を、溶解が完了するまで３７℃でインキュベーションした。その溶解産物を６５℃で１０分間インキュベーションし、室温まで冷却し、２本の１．５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管に分け、０．５ｍｌフェノール／クロロホルム（０．５Ｍトリス，ｐＨ８．０を用いて予め平衡化された５０％フェノール；５０％クロロホルム）を用いて１回抽出した。水相を取り出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて２〜５回抽出した。１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．８を加えることによってＤＮＡを沈澱させ、その混合物を氷上で１０分間インキュベーションし、その混合物を５℃において１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして上澄みを清浄な試験管に取り出し、それに１容のイソプロパノールを加えた。次に、イソプロパノールを加えた上澄み混合物を、氷上で２０分間インキュベーションし、５℃において１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄みを除去し、そしてＤＮＡペレットを、７０％エタノールを用いて１回洗浄した。ペレットを乾燥させた後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。
【０２０１】
７．１．３．ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからのプラスミドＤＮＡ単離
菌糸体のアリコート（１．０ｍｌ）を、１．５ｍｌミクロ遠心管中に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって細胞を濃縮した。上澄みを捨て、細胞を１．０ｍｌの１０．３％スクロース中に再懸濁させ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって濃縮し、上澄みを捨てた。次に、細胞を、２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する０．２５ｍｌのＴＳＥ緩衝液中に再懸濁させ、３７℃で振とうしながら２０分間インキュベーションし、ＡｕｔｏＧｅｎ  ５４０（商標）自動核酸単離装置中に加えた。プラスミドＤＮＡは、Ｃｙｃｌｅ  １０６（装置ソフトウエア）を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって用いて単離した。
【０２０２】
別法として、１．５ｍｌの菌糸体を１．５ｍｌミクロ遠心管中に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって細胞を濃縮した。上澄みを捨て、細胞を１．０ｍｌの１０．３％スクロース中に再懸濁させ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心分離によって濃縮し、上澄みを捨てた。細胞を、２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する０．５ｍｌのＴＳＥ緩衝液中に再懸濁させ、３７℃で１５〜３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、０．２５ｍｌのアルカリ性ＳＤＳ（０．３Ｎ  ＮａＯＨ，２％ＳＤＳ）を加え、そして細胞を５５℃で１５〜３０分間または溶液が透明になるまでインキュベーションした。酢酸ナトリウム（０．１ｍｌ，３Ｍ、ｐＨ４．８）をそのＤＮＡ溶液に加えた後、これを氷上で１０分間インキュベーションした。それらＤＮＡ試料を、５℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを清浄な試験管に取り出し、０．２ｍｌフェノール：クロロホルム（５０％フェノール：５０％クロロホルム）を加え、静かに混合した。そのＤＮＡ溶液を、５℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上層を清浄な  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ試験管に取り出した。イソプロパノール（０．７５ｍｌ）を加え、その溶液を静かに混合後、室温で２０分間インキュベーションした。そのＤＮＡ溶液を、５℃において１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄みを除去し、そしてＤＮＡペレットを、７０％エタノールを用いて洗浄し、乾燥させ、ＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。
【０２０３】
７．１．４．Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡ単離
形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ単コロニーを、５ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（１リットルのｄＨ2Ｏ中に  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１０ｇ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス５ｇおよびＮａＣｌ １０ｇ，ｐＨ７．０，１２１℃で２５分間オートクレーブ処理され且つ１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充）中に接種した。その培養物を一晩インキュベーションし、１ｍｌアリコートを１．５ｍｌミクロ遠心管中に入れた。それら培養試料を、ＡｕｔｏＧｅｎ  ５４０（商標）自動核酸単離装置中に加え、プラスミドＤＮＡを、Ｃｙｃｌｅ  ３（装置ソフトウエア）を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって用いて単離した。
【０２０４】
７．１．５．Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓプロトプラストの調製および形質転換
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの単コロニーを、１／２強度ＹＰＤ−６上で単離した。その菌糸体を用いて、２５ｍｍｘ１５０ｍｍ試験管中の１０ｍｌのＴＳＢ培地に接種後、これを２８℃で振とうしながら（３００ｒｐｍ）４８時間インキュベーションした。１ｍｌの菌糸体を用いて、５０ｍｌのＹＥＭＥ培地に接種した。ＹＥＭＥ培地は、１リットルにつき、Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ３ｇ；Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏペプトン５ｇ；Ｄｉｆｃｏ  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ；スクロース ３００ｇを含有する。１２１℃で２５分間オートクレーブ処理後、次を加えた。２．５Ｍ  ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（別個に、１２１℃で２５分間オートクレーブ処理される）２ｍｌ；およびグリシン（２０％）（濾過滅菌される）２５ｍｌ。
【０２０５】
菌糸体を、３０℃で４８〜７２時間増殖させ、５０ｍｌ遠心管（Ｆａｌｃｏｎ）中において３，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって採取した。上澄みを捨て、菌糸体をＰ緩衝液中に再懸濁させた。Ｐ緩衝液は、スクロース２０５ｇ；Ｋ2ＳＯ4 ０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ２．０２ｇ；Ｈ2Ｏ６００ｍｌ；Ｋ2ＰＯ4（０．５％）１０ｍｌ；微量元素溶液２０ｍｌ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（３．６８％）１００ｍｌ；およびＭＥＳ緩衝液（１．０Ｍ，ｐＨ６．５）１０ｍｌを含有する。（*微量元素溶液は、１リットルにつき、ＺｎＣｌ2４０ｍｇ；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ ２００ｍｇ；ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １０ｍｇ；ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ １０ｍｇ；Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ １０ｍｇ；（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ １０ｍｇを含有する）。ｐＨを６．５に調整し、最終容積を１リットルに調整し、その培地を０．４５ミクロンフィルターを介して熱濾過した。
【０２０６】
菌糸体を、３，０００ｒｐｍで２０分間ペレット化し、上澄みを捨て、菌糸体を、２ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する２０ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させた。その菌糸体を３５℃で振とうしながら１５分間インキュベーションし、顕微鏡検査して、プロトプラスト形成の程度を確認した。プロトプラスト形成が完了した時点で、プロトプラストを、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、プロトプラストを１０ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させた。プロトプラストを、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを除去し、プロトプラストを２ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させ、約１ｘ１０9個のプロトプラストを２．０ｍｌ低温バイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）に分配した。
【０２０７】
１ｘ１０9個のプロトプラストが入っているバイアルを、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを除去し、プロトプラストを０．１ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させた。２〜５μｇの形質転換用ＤＮＡをプロトプラストに加えた直後に、０．５ｍｌ作業用Ｔ緩衝液を加えた。Ｔ緩衝液基剤は、ＰＥＧ−１０００（Ｓｉｇｍａ）２５ｇ；スクロース２．５ｇ；Ｈ2Ｏ ８３ｍｌを含有する。ｐＨは、１Ｎ  ＮａＯＨ（濾過滅菌される）を用いて８．８に調整し、Ｔ緩衝液基剤を濾過滅菌し且つ４℃で貯蔵した。使用の同日に作られる作業用Ｔ緩衝液は、Ｔ緩衝液基剤 ８．３ｍｌ；Ｋ2ＰＯ4（４ｍＭ） １．０ｍｌ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（５Ｍ） ０．２ｍｌ；およびＴＥＳ（１Ｍ、ｐＨ８） ０．５ｍｌであった。作業用Ｔ緩衝液の各成分は、個々に濾過滅菌された。
【０２０８】
Ｔ緩衝液を、プロトプラストに加えてから２０秒以内に、１．０ｍｌのＰ緩衝液をさらに加え、プロトプラストを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを捨て、プロトプラストを０．１ｍｌのＰ緩衝液中に再懸濁させた。次に、プロトプラストを、ＲＭ１４培地上にプレーティングした。この培地は、スクロース２０５ｇ；Ｋ2ＳＯ4 ０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １０．１２ｇ；グルコース １０ｇ；Ｄｉｆｃｏ  Ｃａｓａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ ０．１ｇ；Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ；Ｄｉｆｃｏ  Ｏａｔｍｅａｌ  Ａｇａｒ ３ｇ；Ｄｉｆｃｏ  Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ ２２ｇ；ｄＨ2Ｏ ８００ｍｌを含有する。その溶液を、１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理後、次の滅菌原液を加えた。Ｋ2ＰＯ4（０．５％） １０ｍｌ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（５Ｍ） ５ｍｌ；Ｌ−プロリン（２０％） １５ｍｌ；ＭＥＳ緩衝液（１．０Ｍ，ｐＨ６．５） １０ｍｌ；微量元素溶液（上記と同様） ２ｍｌ；シクロヘキシイミド原液（２５ｍｇ／ｍｌ） ４０ｍｌ；および１Ｎ  ＮａＯＨ ２ｍｌ。２５ｍｌのＲＭ１４培地をプレートに分別し、プレートを使用前に２４時間乾燥させた。
【０２０９】
プロトプラストを、９５％湿度において３０℃で２０〜２４時間インキュベーションした。チオストレプトン耐性形質転換細胞を選択するために、１２５μｇ／ｍｌチオストレプトンを含有する１ｍｌの上層用緩衝液を、ＲＭ１４再生プレート上に均一に広げた。上層用緩衝液は、１００ｍｌにつき、スクロース１０．３ｇ；微量元素溶液（上記と同様）０．２ｍｌ；およびＭＥＳ（１Ｍ，ｐＨ６．５）１ｍｌを含有する。プロトプラストを、９５％湿度において３０℃で７〜１４日間、チオストレプトン耐性（Ｔｈｉｏr）コロニーが目に見えるまでインキュベーションした。
【０２１０】
７．１．６．Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  プロトプラストの形質転換
Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ６４（Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕ．Ｋによって提供）を、場合によって、形質転換に用いた。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓを成長させ、プロトプラスト形成させ、そして形質転換するための方法および組成物は、Ｈｏｐｗｏｏｄ等，１９８５，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの遺伝子操作、実験マニュアル），Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕ．Ｋ．に記載され、そこに記載のように実施される。プラスミドＤＮＡは、上記セクション７．１．３に記載のように、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ形質転換細胞から単離した。
【０２１１】
７．１．７．Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  菌株の発酵分析
１／２強度ＹＰＤ−６上で４〜７日間増殖させたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌糸体を、８ｍｌのプレフォーム培地および２個の５ｍｍガラスビーズが入っている１ｘ６インチ試験管中に接種した。プレフォーム培地は、可溶性デンプン（低粘度ノリデンプンか、又はＫＯＳＯ、日本コーンスターチ社、名古屋）２０ｇ／Ｌ；Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ １５ｇ／Ｌ；Ａｒｄａｍｉｎｅ  ｐＨ ５ｇ／Ｌ（Ｃｈａｍｐｌａｉｎ  Ｉｎｄ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）；ＣａＣＯ3 ２ｇ／Ｌ；培地中最終濃度５０ｐｐｍの２−（＋／−）−メチル酪酸、６０ｐｐｍのイソ酪酸および２０ｐｐｍのイソ吉草酸を含有する２ｘ  ｂｃｆａ（「ｂｃｆａ」は、分岐状鎖脂肪酸を意味する）を含有する。ｐＨを７．２に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０２１２】
その試験管を、角度１７度で、２９℃において２１５ｒｐｍで３日間振とうした。種培養物の２ｍｌアリコートを用いて、デンプン（低粘度ノリデンプン又はＫＯＳＯ）１６０ｇ／Ｌ；Ｎｕｔｒｉｓｏｙ（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＩＬ）１０ｇ／Ｌ；Ａｒｄａｍｉｎｅ  ｐＨ １０ｇ／Ｌ；Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ２ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２ｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ2 ０．００２ｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００２ｇ／Ｌ；ＣａＣＯ3 １４ｇ／Ｌ；２ｘ  ｂｃｆａ（同上）；およびシクロヘキサンカルボン酸（ＣＨＣ）（ｐＨ７．０で２０％溶液として調製される）８００ｐｐｍを含有する産生用培地２５ｍｌが入っている３００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに接種した。ｐＨを６．９に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。（上記したように、ＣＨＣ以外のスターターユニットを代わりに利用できる（例えば、表１参照））
【０２１３】
接種後、フラスコを、２９℃において２００ｒｐｍで振とうしながら１２日間インキュベーションした。インキュベーション後、２ｍｌ試料をフラスコから取り出し、８ｍｌのメタノールを用いて希釈し、混合し、その混合物を１，２５０ｘｇで１０分間遠心分離してペレット片とした。次に、上澄みを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（２５ｃｍｘ４．６ｍｍ内径）を用いたＨＰＬＣにより、０．７５ｍｌ／分の流量および２４０ｎｍでの吸光度による検出を用いて検定した。移動相は、８６／８．９／５．１のメタノール／水／アセトニトリルであった。
【０２１４】
７．１．８．Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＰＫＳ遺伝子の単離
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ３１２７２，ＳＣ−２）染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーを調製し、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子のフラグメントから調製したケトシンターゼ（ＫＳ）プローブとハイブリッド形成させた。コスミドライブラリーの調製についての詳細な説明が、上記したＳａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９になされている。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ染色体ＤＮＡライブラリーの調製についての詳細な説明が、上記したＨｏｐｗｏｏｄ等，１９８５になされている。ケトシンターゼハイブリッド形成領域を含有するコスミドクローンは、ｐＥＸ２６（Ｄｒ．Ｐ．Ｌｅａｄｌａｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより快く提供されたもの）からの２．７Ｋｂ  ＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩフラグメントへのハイブリダイゼーションによって同定した。約５ｎｇのｐＥＸ２６を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを用いて消化した。その反応混合物を、０．８％  ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）上に加えた。２．７Ｋｂ  ＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩフラグメントを、電気泳動後のゲルから切り取り、そのゲルから、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  製のＧＥＬａｓｅ（商標）を用い、Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを用いてＤＮＡを回収した。２．７Ｋｂ  ＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩフラグメントを、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（デオキシシチジン５’−三リン酸，テトラ（トリエチルアンモニウム）塩，［α−32Ｐ］−）（ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用い、ＢＲＬ  Ｎｉｃｋ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって用いて標識した。典型的な反応は、０．０５ｍｌ容積中で行った。５μｌの停止緩衝液の添加後、標識されたＤＮＡを、包含されていないヌクレオチドから、Ｇ−２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ（商標）Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって用いて分離した。
【０２１５】
約１，８００種のコスミドクローンを、コロニーハイブリッド形成によってスクリーニングした。  Ｓａｃｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＫＳプローブに強くハイブリッド形成した１０種類のクローンを同定した。コスミドＤＮＡを含有するＥ．ｃｏｌｉコロニーをＬＢ液体培地中で増殖させ、コスミドＤＮＡを、各培養物から、ＡｕｔｏＧｅｎ  ５４０（商標）自動核酸単離装置中でＣｙｃｌｅ  ３（装置ソフトウエア）を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって用いて単離した。制限エンドヌクレアーゼ地図およびサザンブロットハイブリダイゼーション分析により、それらクローンの内の５種類が、重複染色体領域を含有することがわかった。５種類のコスミド（すなわち、ｐＳＥ６５、ｐＳＥ６６、ｐＳＥ６７、ｐＳＥ６８、ｐＳＥ６９）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓゲノムＢａｍＨＩ制限地図を、重複コスミドの分析およびハイブリダイゼーションによって構築した（図４）。
【０２１６】
７．１．９．アベルメクチンＢ２：Ｂ１比を調節するＤＮＡの同定およびａｖｅＣ  ＯＲＦの同定
次の方法を用いて、ｐＳＥ６６コスミドクローンに由来するサブクローン化フラグメントの、ＡｖｅＣ突然変異体におけるアベルメクチンＢ２：Ｂ１比の調節能について調べた。ｐＳＥ６６（５μｇ）を、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。その反応混合物を、０．８％ＳｅａＰｌａｑｕｅ（商標）ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）上に加え、２．９Ｋｂ  ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、電気泳動後のゲルから切り取り、そのゲルから、ＧＥＬａｓｅ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  を用いてＤＮＡを回収した。約５μｇのシャトルベクターｐＷＨＭ３（Ｖａｒａ等，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：５８７２−５８８１）を、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。約０．５μｇの２．９Ｋｂインサートおよび０．５μｇの消化したｐＷＨＭ３を一緒に混合し、１単位のリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と一緒に２０μｌの全容積中において、製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって１５℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、５μｌの連結反応混合物を、７０℃で１０分間インキュベーションし、室温まで冷却し、そして用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞（ＢＲＬ）を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡは、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、２．９Ｋｂ  ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩインサートの存在は、制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１１９と命名した。
【０２１７】
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株１１００−ＳＣ３８（Ｐｆｉｚｅｒ内菌株）のプロトプラストを、上記セクション７．１．５に記載のように、調製し且つｐＳＥ１１９を用いて形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８は、シクロヘキサンカルボン酸を補充した場合、アベルメクチンシクロヘキシルＢ１型と比較して、有意に多いアベルメクチンシクロヘキシルＢ２型を産生する突然変異体である（約３０：１のＢ２：Ｂ１）。Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓプロトプラストを形質転換するのに用いられるｐＳＥ１１９は、Ｅ．ｃｏｌｉ  菌株ＧＭ２１６３（Ｄｒ．Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｕｒａｔｏｒ，Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手される）か、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＭ１（ＢＲＬ）か、又はＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ菌株ＴＫ６４から単離した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１１９を含有するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株１１００−ＳＣ３８の形質転換細胞は、約３．７：１の変更された比率のアベルメクチンシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシル−Ｂ１を産生した（表２）。
【０２１８】
ｐＳＥ１１９が、ＡｖｅＣ突然変異体におけるアベルメクチンＢ２：Ｂ１比を調節しうるということが確認されたら、インサートＤＮＡを配列決定した。約１０μｇのｐＳＥ１１９を、プラスミドＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって用いて単離し、そしてＡＢＩ  ３７３Ａ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列決定した。配列データは、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐプログラム（ＧＣＧ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて集め且つ整理した。ＤＮＡ配列およびａｖｅＣ  ＯＲＦを、図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）に示す。
【０２１９】
ｐＳＥ１１８と称される新規のプラスミドを、次のように構築した。約５μｇのｐＳＥ６６を、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。その反応混合物を、０．８％  ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）上に加え、２．８Ｋｂ  ＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、電気泳動後のゲルから切り取り、そのゲルから、ＧＥＬａｓｅ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを用いてＤＮＡを回収した。約５μｇのシャトルベクターｐＷＨＭ３を、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。約０．５μｇの２．８Ｋｂインサートおよび０．５μｇの消化したｐＷＨＭ３を一緒に混合し、１単位のリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と一緒に２０μｌの全容積中において、製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって１５℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、５μｌの連結反応混合物を、７０℃で１０分間インキュベーションし、室温まで冷却し、それを用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡは、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、２．８Ｋｂ  ＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩインサートの存在を、制限分析によって確認した。このプラスミドを、ｐＳＥ１１８と命名した。ｐＳＥ１１８およびｐＳＥ１１９中のインサートＤＮＡは、約８３８のヌクレオチドが重複する（図４）。
【０２２０】
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラストを、上記のようにｐＳＥ１１８を用いて形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１１８を含有するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株１１００−ＳＣ３８の形質転換細胞は、菌株１１００−ＳＣ３８と比較して、アベルメクチンシクロヘキシルＢ２：アベルメクチンシクロヘキシルＢ１の比を変化させなかった（表２）。
【０２２１】
７．１．１０．Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体ＤＮＡからのａｖｅＣ遺伝子のＰＣＲ増幅
ａｖｅＣ  ＯＲＦを含有する約１．２Ｋｂフラグメントを、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ染色体ＤＮＡから、上記で得られたａｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって単離した。それらＰＣＲプライマーは、Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（テキサス）によって供給された。右方向プライマーは、５’−ＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：６）であり；左方向プライマーは、５’−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡＧ−３’（配列番号：７）であった。ＰＣＲ反応は、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて製造元から供給された緩衝液中で、および１００μｌの最終容積中に３００μＭ  ｄＮＴＰ、１０％グリセロール、各２００ｐｍｏｌプライマー、０．１μｇ鋳型および２．５単位の酵素の存在下、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ熱サイクラーを用いて行われた。最初のサイクルの熱プロフィールは、９５℃で５分間（変性工程）、６０℃で２分間（アニーリング工程）および７２℃で２分間（伸長工程）であった。引き続きの２４サイクルは、変性工程を４５秒に短縮し、アニーリング工程を１分に短縮したことを除き、同様の熱プロフィールを有していた。
【０２２２】
ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル中で電気泳動させ、約１．２Ｋｂの単一ＤＮＡバンドを検出した。このＤＮＡをゲルから精製し、２５ｎｇの直鎖状ブラントｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、１：１０モルのベクター対インサート比で、製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって連結した。その連結反応混合物を用いて、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、約１．２Ｋｂインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドを、ｐＳＥ１７９と命名した。
【０２２３】
ｐＳＥ１７９からのインサートＤＮＡを、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩを用いた消化によって単離し、電気泳動によって分離し、そのゲルから精製し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩを用いて消化されているシャトルベクターｐＷＨＭ３と、１μｇの全ＤＮＡ濃度において１：５モルのベクター対インサート比で連結した。その連結反応混合物を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、約１．２Ｋｂインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１８６（図２，ＡＴＣＣ２０９６０４）と命名し、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離した。
【０２２４】
７．２．結果
ｐＳＥ１１９からの２．９Ｋｂ  ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントは、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株１１００−ＳＣ３８中に形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチン産生の比率を有意に変化させたということが確認された。Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株１１００−ＳＣ３８は、通常は、約３０：１のＢ２：Ｂ１比を有するが、２．９Ｋｂ  ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを含むベクターを用いて形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチンの比率は約３．７：１に減少した。形質転換細胞培養物の発酵後分析は、形質転換用ＤＮＡの存在を示した。
【０２２５】
２．９Ｋｂ  ｐＳＥ１１９フラグメントを配列決定し、約０．９Ｋｂ  ＯＲＦを同定したが（図１）（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）、これは、Ｂ２生成物だけを産生するように予めどこか他のところで突然変異しているＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントを包含する（Ｉｋｅｄａ等，１９９５，上記）。このＯＲＦまたはその該当する推定ポリペプチドの既知のデータベース（ＧｅｎＥＭＢＬ，ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に対する比較は、既知のＤＮＡまたはタンパク質配列との強い相同性を全く示さなかった。
【０２２６】
表２は、種々のプラスミドを用いて形質転換されたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株１１００−ＳＣ３８の発酵分析を示す。
【０２２７】
【表２】
2005517406.tif 000006
【０２２８】
８．実施例：Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ突然変異体の構築
この実施例では、上記の組成物および方法を用いて、いくつかの異なるＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ突然変異体の構築を説明する。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの遺伝子中に突然変異を導入する方法についての概要が、Ｋｉｅｓｅｒ及びＨｏｐｗｏｏｄ，１９９１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０４：４３０−４５８  によって記載されている。より詳細な説明が、Ａｎｚａｉ等，１９８８，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．ＸＬＩ（２）：２２６−２３３及びＳｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ等，１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４（１）：１４４−１５４になされている。これら参考文献は、それらの全体が引用することにより本明細書の内容とされる。
【０２２９】
８．１．Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣ遺伝子の失活
失活したａｖｅＣ遺伝子を含有するＡｖｅＣ突然変異体を、以下で詳述されるいくつかの方法を用いて構築した。
【０２３０】
第一の方法では、ｐＳＥ１１９（上記セクション７．１．９に記載のプラスミド）中のａｖｅＣ遺伝子に内在する６４０ｂｐ  ＳｈｐＩ／ＰｓｔＩフラグメントを、Ｓａｃｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａからのｅｒｍＥ遺伝子（エリスロマイシン耐性に関する）と交換した。このｅｒｍＥ遺伝子は、ｐＩＪ４０２６（Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｕ．Ｋ．によって提供される；Ｂｉｂｂ等，１９８５，Ｇｅｎｅ ４１：３５７−３６８  も参照されたい）から、ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化後、電気泳動によって単離され、そのゲルから精製された。この約１．７Ｋｂフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＧＥＭ７Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に連結し、その連結反応混合物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に、製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、約１．７Ｋｂインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２７と命名した。
【０２３１】
ｐＳＥ１１８（上記セクション７．１．９に記載される）を、ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動し、そして約２．８Ｋｂ  ＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩインサートをゲルから精製した。ｐＳＥ１１９を、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動し、そして約１．５Ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩインサートをゲルから精製した。シャトルベクターｐＷＨＭ３を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化した。ｐＳＥ２７を、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動し、そして約１．７Ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＳｐｈＩインサートをゲルから精製した。４種全部のフラグメント（すなわち、約２．８Ｋｂ、約１．５Ｋｂ、約７．２Ｋｂ、約１．７Ｋｂ）を、４方連結で互いに連結した。連結反応混合物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に、製造業者から提供された取り扱い説明書にしたがって形質転換した。プラスミドＤＮＡは、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１８０（図３；ＡＴＣＣ２０９６０５）と命名した。
【０２３２】
ｐＳＥ１８０を、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ６４中に形質転換し、形質転換されたコロニーを、チオストレプトンおよびエリスロマイシンへの耐性によって同定した。ｐＳＥ１８０は、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓから単離され、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓプロトプラストを形質転換するのに用いられた。４種類のチオストレプトン耐性Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ形質転換細胞を同定し、そしてプロトプラストを製造し、ＲＭ１４培地上の非選択的条件下でプレーティングした。プロトプラストを再生した後、単コロニーを、エリスロマイシン耐性の存在およびチオストレプトン耐性の不存在についてスクリーニングして、失活したａｖｅＣ遺伝子の染色体組込みおよび遊離レプリコンの損失が示された。一つのＥｒｍrＴｈｉｏs形質転換細胞を同定し、菌株ＳＥ１８０−１１と命名した。全染色体ＤＮＡを、菌株ＳＥ１８０−１１から単離し、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩまたはＳｐｈＩを用いて消化し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動によって分割し、ナイロン膜に移し、ｅｒｍＥプローブにハイブリッド形成させた。これら分析により、ｅｒｍＥ耐性遺伝子の染色体組込み、及び付随する６４０ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントの欠失が、二重交差変化によって起こっていることがわかった。菌株ＳＥ１８０−１１の発酵生成物のＨＰＬＣ分析により、通常のアベルメクチンがもはや産生されないことがわかった（図５Ａ）。
【０２３３】
ａｖｅＣ遺伝子を失活させる第二の方法では、１．７Ｋｂ  ｅｒｍＥ遺伝子を、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１の染色体から除去し、ａｖｅＣ遺伝子における６４０ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＳｈｐＩ欠失をそのままにした。遺伝子置換プラスミドを、次のように構築した。ｐＳＥ１８０を、ＸｂａＩを用いて部分消化し、約１１．４Ｋｂフラグメントをゲルから精製した。その約１１．４Ｋｂバンドは、１．７Ｋｂ  ｅｒｍＥ耐性遺伝子を欠いている。次に、そのＤＮＡを連結し且つＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドを、ｐＳＥ１８４と命名し、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＭ１中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離した。このプラスミドを用いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。プロトプラストは、菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞から製造し、ＲＭ１４上の単コロニーとしてプレーティングした。プロトプラストが再生した後、単コロニーを、エリスロマイシン耐性およびチオストレプトン耐性両方の不存在についてスクリーニングして、失活したａｖｅＣ遺伝子の染色体組込みおよびｅｒｍＥ遺伝子を含有する遊離レプリコンの損失が示された。一つのＥｒｍsＴｈｉｏs形質転換細胞を同定し、ＳＥ１８４−１−１３と命名した。ＳＥ１８４−１−１３の発酵分析により、通常のアベルメクチンが産生されなかったことおよびＳＥ１８４−１−１３がＳＥ１８０−１１と同様の発酵プロフィールを有することがわかった。
【０２３４】
ａｖｅＣ遺伝子を失活させる第三の方法では、ＰＣＲを用いてｎｔ４７１位のＣの後に２個のＧを加えることによってＢｓｐＥ１部位を生じることにより、染色体ａｖｅＣ遺伝子中にフレームシフトを導入した。遺伝子操作されるＢｓｐＥ１部位の存在は、遺伝子置換を検出する場合に有用であった。ＰＣＲプライマーは、ａｖｅＣ遺伝子中にフレームシフト突然変異を導入するように設計され、Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によって供給されたものである。右方向プライマーは、５’−ＧＧＴＴＣＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＣＧ−３’（配列番号：８）であり、左方向プライマーは、５’−ＡＡＣＴＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：９）であった。ＰＣＲ条件は、上記セクション７．１．１０に記載されたのと同様であった。６６６ｂｐ  ＰＣＲ産物を、ＳｐｈＩを用いて消化して、それぞれ２７８ｂｐおよび３８８ｂｐの二つのフラグメントを生じた。３８８ｂｐフラグメントをゲルから精製した。
【０２３５】
遺伝子置換プラスミドを、次のように構築した。シャトルベクターｐＷＨＭ３を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。ｐＳＥ１１９を、ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動し、そして約８４０ｂｐフラグメントをゲルから精製した。ｐＳＥ１１９を、ＥｃｏＲＩおよびＸｍｎＩを用いて消化し、その消化物を電気泳動によって分割し、そして約１．７Ｋｂフラグメントをゲルから精製した。４種類全部のフラグメント（すなわち、約７．２Ｋｂ、約８４０ｂｐ、約１．７Ｋｂおよび３８８ｂｐ）を、４方連結で互いに連結した。連結反応混合物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡを、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１８５と命名し、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＭ１中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを、アンピシリン耐性形質転換細胞から単離した。このプラスミドを用いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラストを形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１８５は、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株１１００−ＳＣ３８中に形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチン比をほとんど変化させなかった（表２）。
【０２３６】
ｐＳＥ１８５を用いてＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのプロトプラストを形質転換して、染色体ａｖｅＣ遺伝子中でフレームシフト突然変異を生じさせた。プロトプラストを、チオストレプトン耐性形質転換細胞から製造し、ＲＭ１４上で単コロニーとしてプレーティングした。プロトプラストが再生した後、単コロニーを、チオストレプトン耐性の不存在についてスクリーニングした。チオストレプトン感受性コロニーからの染色体ＤＮＡを単離し、染色体中に組み込まれたフレームシフト突然変異の存在についてＰＣＲによってスクリーニングした。それらＰＣＲプライマーは、ａｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計され、Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（テキサス）によって供給されたものである。右方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＣＡＡＧＧＡＴＡＣＧＧＧＧＡＣＴＡＣ−３’（配列番号：１０）であり、左方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＡＣ−３’（配列番号：１１）であり、ＰＣＲ条件は、上記セクション７．１．１０に記載されたのと同様であった。得られたＰＣＲ産物は５４３ｂｐであったが、ＢｓｐＥ１を用いて消化された場合、３６８ｂｐ、９６ｂｐおよび７９ｂｐの三つのフラグメントが認められ、失活したａｖｅＣ遺伝子の染色体組込みおよび遊離レプリコンの損失が明らかとなった。
【０２３７】
ａｖｅＣ遺伝子中にフレームシフト突然変異を含有するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ突然変異体の発酵分析により、通常のアベルメクチンがもはや産生されないこと、及びこれら突然変異体が、菌株ＳＥ１８０−１１およびＳＥ１８４−１−１３と同様の発酵ＨＰＬＣプロフィールを有することがわかった。一つのＴｈｉｏs形質転換細胞を同定し、菌株ＳＥ１８５−５ａと命名した。
【０２３８】
さらに、１１６位のトリプトファン（Ｗ）をコードしているコドンの終止コドンへの変化を引き起こす、ｎｔ５２０位をＧからＡに変化させるａｖｅＣ遺伝子中の突然変異を生じさせた。この突然変異を含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株は、通常のアベルメクチンを産生せず、且つ菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３及びＳＥ１８５−５ａと同様の発酵プロフィールを有していた。
【０２３９】
さらに、（ｉ）２６６位のアミノ酸をグリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変化させる、ｎｔ９７０位をＧからＡへ、および（ｉｉ）２７５位のアミノ酸をチロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）に変化させる、ｎｔ９９６位をＴからＣへと両方とも変化させるａｖｅＣ遺伝子中の突然変異を生じさせた。これら突然変異を含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株（Ｇ２６６Ｄ／Ｙ２７５Ｈ）は、通常のアベルメクチンを産生せず、且つ菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３及びＳＥ１８５−５ａと同様の発酵プロフィールを有していた。
【０２４０】
このようにして提供されたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣ失活突然変異菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３、ＳＥ１８５−５ａ等により、ａｖｅＣ遺伝子中の他の突然変異の影響を評価するスクリーニング手段が提供される。ｐＳＥ１８６は、ａｖｅＣ遺伝子の野生型コピーを含有するが、これをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離した。このｐＳＥ１８６  ＤＮＡを用いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。機能性ａｖｅＣ遺伝子のｉｎ  ｔｒａｎｓ存在により、菌株ＳＥ１８０−１１に通常のアベルメクチン産生を回復させることができた（図５Ｂ）。
【０２４１】
８．２．クラスＢ２：Ｂ１比を変更するａｖｅＣ遺伝子中の突然変異の分析
上記のように、不活性ａｖｅＣ遺伝子を含有するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１を、機能性ａｖｅＣ遺伝子を含有するプラスミド（ｐＳＥ１８６）を用いた形質転換によって相補した。菌株ＳＥ１８０−１１は、下記のようにａｖｅＣ遺伝子中の他の突然変異を特性決定するための宿主菌株としても利用された。
【０２４２】
染色体ＤＮＡを、菌株１１００−ＳＣ３８から単離し、ａｖｅＣ遺伝子のＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。１．２Ｋｂ  ＯＲＦを、ａｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって単離した。右方向プライマーは配列番号：６であり、左方向プライマーは配列番号：７であった（上記セクション７．１．１０参照）。ＰＣＲおよびサブクローニングの条件は、セクション７．１．１０に記載されたのと同様であった。１．２Ｋｂ  ＯＲＦのＤＮＡ配列分析は、５５位のアミノ酸をセリン（Ｓ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変化させる、ｎｔ３３７位をＣからＴに変化させるａｖｅＣ遺伝子の突然変異を示す。Ｓ５５Ｆ突然変異を含有するａｖｅＣ遺伝子を、ｐＷＨＭ３中にサブクローニングして、ｐＳＥ１８７と称されるプラスミドを生じ、これを用いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基５５の変化（Ｓ５５Ｆ）をコードしているａｖｅＣ遺伝子の存在は、菌株ＳＥ１８０−１１に通常のアベルメクチン産生を回復させることができたが（図５Ｃ）、しかしながら、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１比は、ｐＳＥ１８６を用いて形質転換された、約１．６：１のＢ２：Ｂ１比を有した菌株ＳＥ１８０−１１と比較したところ、約２６：１であり（表３）、単一の突然変異（Ｓ５５Ｆ）により、シクロヘキシル−Ｂ１に対するシクロヘキシル−Ｂ２の産生量が調節されることがわかった。
【０２４３】
２３０位のアミノ酸をグリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変化させる、ｎｔ８６２位をＧからＡに変化させるａｖｅＣ遺伝子中のもう一つの突然変異を同定した。この突然変異（Ｇ２３０Ｄ）を有するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株は、約３０：１のＢ２：Ｂ１比でアベルメクチンを産生する。
【０２４４】
８．３．Ｂ２：Ｂ１比を減少させる突然変異
シクロヘキシル−Ｂ１に対するシクロヘキシル−Ｂ２の産生量を減少させるいくつかの突然変異を、次のように構築した。
【０２４５】
１３９位のアミノ酸をアラニン（Ａ）からトレオニン（Ｔ）に変化させる、ｎｔ５８８位をＧからＡに変化させるａｖｅＣ遺伝子中の突然変異を同定した。Ａ１３９Ｔ突然変異を含有するａｖｅＣ遺伝子を、ｐＷＨＭ３中にサブクローニングして、ｐＳＥ１８８と称されるプラスミドを生じ、これを用いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、ＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基１３９の変化（Ａ１３９Ｔ）をコードしている突然変異したａｖｅＣ遺伝子の存在により、菌株ＳＥ１８０−１１にアベルメクチン産生を回復させることができたが（図５Ｄ）、Ｂ２：Ｂ１比は約０．９４：１であり、この突然変異は、シクロヘキシル−Ｂ１に対するシクロヘキシル−Ｂ２の産生量を減少させることがわかった。公表されている結果だけでなく、上記の突然変異の結果も、ａｖｅＣ遺伝子の失活又はＢ１型に対するＢ２型アベルメクチンの産生の増加を示しているだけであったので、この結果は、予想外のものであった（表３）。
【０２４６】
Ａ１３９Ｔ突然変異は、Ｂ２：Ｂ１比をより好ましいＢ１方向に変更したので、アミノ酸１３８位のセリンの代わりにトレオニンをコードした突然変異を構築した。したがって、ｐＳＥ１８６を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、ＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＧＥＭ３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローン化した。このプラスミドを、ｐＳＥ１８６ａと命名し、これを、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、それらＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で分離し、そして約３．８Ｋｂおよび約０．４Ｋｂの二つのフラグメントをゲルから精製した。ｐＳＥ１８６からの約１．２ＫｂインサートＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いて、ｎｔ５８５位に単一塩基変化を導入した。ＰＣＲプライマーは、ｎｔ５８５位に突然変異を導入するように設計され、Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（テキサス）によって供給された。右方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＧＡＣＧ−３’（配列番号：１２）であり、左方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡＴＡＣＡ−３’（配列番号：１３）であった。ＰＣＲ反応は、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣゲノムＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて製造元から提供された緩衝液中において、５０μｌの最終容積中に２００μＭ  ｄＮＴＰ、各２００ｐｍｏｌプライマー、５０ｎｇ鋳型ＤＮＡ、１．０Ｍ  ＧＣ−Ｍｅｌｔおよび１単位の  ＫｌｅｎＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘの存在下で行われた。最初のサイクルの熱プロフィールは、９４℃で１分間；次に、９４℃で３０秒間および６８℃で２分間を２５サイクル；および６８℃で３分間を１サイクルであった。２９５ｂｐのＰＣＲ産物を、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化して、２５４ｂｐフラグメントを放出したが、これを、電気泳動によって分割し、ゲルから精製した。３種類全部のフラグメント（約３．８Ｋｂ、約０．４Ｋｂおよび２５４ｂｐ）を、３方連結で互いに連結させた。その連結反応混合物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１９８と命名した。
【０２４７】
ｐＳＥ１９８を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、ＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＷＨＭ３中にクローン化し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１９９と命名し、これを用いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基１３８の変化（Ｓ１３８Ｔ）をコードしている突然変異したａｖｅＣ遺伝子の存在は、菌株ＳＥ１８０−１１に通常のアベルメクチン産生を回復させることができたが、しかしながら、Ｂ２：Ｂ１比は０．８８：１であり、この突然変異は、シクロヘキシル−Ｂ１に対するシクロヘキシル−Ｂ２の産生量を減少させることがわかった（表３）。このＢ２：Ｂ１比は、上記のようにｐＳＥ１８８を用いた菌株ＳＥ１８０−１１の形質転換によって生じたＡ１３９Ｔ突然変異について認められる比０．９４：１よりも低い。
【０２４８】
もう一つの突然変異を、アミノ酸１３８位および１３９位両方にトレオニンを導入するように構築した。ｐＳＥ１８６からの約１．２ＫｂインサートＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いた。ＰＣＲプライマーは、ｎｔ５８５位および５８８位に突然変異を導入するように設計され、Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（テキサス）によって供給された。右方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣ−３’（配列番号：１４）であり、左方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号：１５）であった。ＰＣＲ反応は、この項目の直ぐ上に記載された条件を用いておこなった。４４９ｂｐのＰＣＲ産物を、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化して、２５４ｂｐフラグメントを放出したが、これを、電気泳動によって分割し、ゲルから精製した。ｐＳＥ１８６ａを、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化し、それらＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上で分離し、そして約３．８Ｋｂおよび約０．４Ｋｂの二つのフラグメントをゲルから精製した。３種類全部のフラグメント（約３．８Ｋｂ、約０．４Ｋｂおよび２５４ｂｐ）を、３方連結で互いに連結させ、その連結反応混合物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２３０と命名した。
【０２４９】
ｐＳＥ２３０を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、ＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＷＨＭ３中にクローン化し、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドを、ｐＳＥ２３１と命名し、これを用いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を発酵によって分析した。Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔをコードしている二重突然変異したａｖｅＣ遺伝子の存在は、菌株ＳＥ１８０−１１に通常のアベルメクチン産生を回復させることができたが、しかしながら、Ｂ２：Ｂ１比は０．８４：１であり、この突然変異により、上記のようなｐＳＥ１８８またはｐＳＥ１９９を用いた菌株ＳＥ１８０−１１の形質転換による減少よりもさらに、シクロヘキシル−Ｂ１に対してのシクロヘキシル−Ｂ２の産生量を減少させることがわかった（表３）。
【０２５０】
もう一つの突然変異を、シクロヘキシル−Ｂ１に対するシクロヘキシル−Ｂ２の産生量をさらに減少するように構築した。Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔ突然変異は、Ｂ２：Ｂ１比をより好ましいＢ１方向に変更したので、アミノ酸１３８位にトレオニンおよびアミノ酸１３９位にフェニルアラニンを導入するように突然変異を構築した。ｐＳＥ１８６からの約１．２ＫｂインサートＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いた。ＰＣＲプライマーは、ｎｔ５８５位（ＴをＡに変化させる）、５８８位（ＧをＴに変化させる）および５８９位（ＣをＴに変化させる）に突然変異を導入するように設計され、Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（テキサス）によって供給された。右方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号：１６）であり、左方向ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号：１５）であった。ＰＣＲ反応は、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣゲノムＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、製造元から提供された緩衝液中において、５０μｌの最終容積中に２００μＭ  ｄＮＴＰ、各２００ｐｍｏｌのプライマー、５０ｎｇ鋳型ＤＮＡ、１．１ｍＭ酢酸Ｍｇ、１．０Ｍ  ＧＣ−Ｍｅｌｔ  および１単位の  Ｔｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの存在下おこなった。最初のサイクルの熱プロフィールは、９４℃で１分間；次に、９４℃で３０秒間および６８℃で２分間を２５サイクル；および６８℃で３分間を１サイクルであった。４４９ｂｐのＰＣＲ産物を、ＡｐａＩおよびＫｐｎＩを用いて消化して、２５４ｂｐフラグメントを放出したが、これを、電気泳動によって分割し、ゲルから精製した。３種類全部のフラグメント（約３．８Ｋｂ、約０．４Ｋｂおよび２５４ｂｐ）を、３方連結で互いに連結させた。その連結反応混合物を、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドを、ｐＳＥ２３８と命名した。
【０２５１】
ｐＳＥ２３８を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、ＥｃｏＲＩを用いて消化されているｐＷＨＭ３中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、正しいインサートの存在を、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２３９と命名し、これを用いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換細胞を、発酵生成物のＨＰＬＣ分析によって分析した。Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｆをコードしている二重突然変異したａｖｅＣ遺伝子の存在は、菌株ＳＥ１８０−１１に通常のアベルメクチン産生を回復させることができたが、しかしながら、Ｂ２：Ｂ１比は０．７５：１であり、この突然変異により、上記のようなｐＳＥ１８８、ｐＳＥ１９９またはｐＳＥ２３１を用いた菌株ＳＥ１８０−１１の形質転換による減少よりもさらに、シクロヘキシル−Ｂ１に対するシクロヘキシル−Ｂ２の産生量を減少させることがわかった（表３）。
【０２５２】
【表３】
2005517406.tif 000007
【０２５３】
さらに別の突然変異を、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１に記載の；および米国特許第５６０５７９３号、第５８１１２３８号、第５８３０７２１号及び第５８３７４５８号にも記載のＤＮＡシャッフリング法を用いて、シクロヘキシル−Ｂ１に対するシクロヘキシル−Ｂ２の産生量を相さらに減少するように構築した。
【０２５４】
突然変異したａｖｅＣ遺伝子を含有するＤＮＡシャッフリングされたプラスミドを、コンピテントｄａｍ  ｄｃｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性形質転換細胞から単離し且つ用いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性形質転換細胞を単離し、そして１：１またはそれより小さいシクロヘキシル−Ｂ２：シクロヘキシル−Ｂ１比を有するアベルメクチン産生についてスクリーニングした。１：１またはそれより小さいＢ２：Ｂ１比でアベルメクチンを産生するＳＥ１８０−１１形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列を決定した。
【０２５５】
シクロヘキシル−Ｂ１対するシクロヘキシル−Ｂ２の生産量が減少した８種の形質転換細胞を同定した。これら形質転換細胞の中で得られる最低のＢ２：Ｂ１比は、０４０：１であった（表４）。プラスミドＤＮＡを、８種の形質転換細胞それぞれから単離し、ＤＮＡ配列を決定して、ａｖｅＣ遺伝子中の突然変異を決定した。突然変異は、次の通りである。
【０２５６】
ｐＳＥ２９０は、ｎｔ３１７位でＴからＡへ、ｎｔ３５３位でＣからＡへ、ｎｔ４３８位でＧからＡへ、そしてｎｔ１１５５位でＴからＡへの４種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ３１７位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ４８位のアミノ酸をＤからＥへ変化させ、ｎｔ４３８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ８９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．４２：１であった（表４）。
【０２５７】
ｐＳＥ２９１は、ｎｔ２７２位でＧからＡへ、ｎｔ５８５位でＴからＡへ、ｎｔ５８８位でＧからＡへ、そしてｎｔ７０８位でＧからＡへの４種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ５８５位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３８位のアミノ酸をＳからＴへ変化させ、ｎｔ５８８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させ、そしてｎｔ７０８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１７９位のアミノ酸をＧからＳへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．５７：１であった（表４）。
【０２５８】
ｐＳＥ２９２は、ｐＳＥ２９０と同様の４種類のヌクレオチド突然変異を含有する。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．４０：１であった（表４）。
【０２５９】
ｐＳＥ２９３は、ｎｔ２４位でＡからＧへ、ｎｔ２８６位でＡからＣへ、ｎｔ４９７位でＴからＣへ、ｎｔ５５４位でＣからＴへ、ｎｔ５８０位でＴからＣへ、そしてｎｔ８８６位でＡからＴへの６種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ２８６位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ３８位のアミノ酸をＱからＰへ変化させ、ｎｔ５８０位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３６位のアミノ酸をＬからＰへ変化させ、そしてｎｔ８８６位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ２３８位のアミノ酸をＥからＤへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．６８：１であった（表４）。
【０２６０】
ｐＳＥ２９４は、ｎｔ４６９位でＴからＣへ、ｎｔ５８５位でＴからＡへ、ｎｔ５８８位でＧからＡへ、ｎｔ７０８位でＧからＡへ、ｎｔ８３３位でＣからＴへ、そしてｎｔ１１８４位でＧからＡへの６種類のヌクレオチド突然変異を含有する。さらに、１７３位、１７４位および１７５位でｎｔを欠失している。ｎｔ４６９位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ９９位のアミノ酸をＦからＳへ変化させ、ｎｔ５８５位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３８位のアミノ酸をＳからＴへ変化させ、ｎｔ５８８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させ、そしてｎｔ７０８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１７９位のアミノ酸をＧからＳへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．５３：１であった（表４）。
【０２６１】
ｐＳＥ２９５は、ｎｔ５８８位でＧからＡへ、そしてｎｔ８５６位でＴからＣへの２種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ５８８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させ、そしてｎｔ８５６位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ２２８位のアミノ酸をＭからＴへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．８０：１であった（表４）。
【０２６２】
ｐＳＥ２９６は、ｎｔ１５５位でＴからＣへ、ｎｔ５０５位でＧからＴへ、ｎｔ１０３９位でＣからＴへ、ｎｔ１２０２位でＣからＴへ、そしてｎｔ１２１０位でＴからＣへの５種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ５０５位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１１１位のアミノ酸をＧからＶへ変化させ、そしてｎｔ１０３９位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ２８９位のアミノ酸をＰからＬへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．７３：１であった（表４）。
【０２６３】
ｐＳＥ２９７は、ｎｔ３７７位でＧからＴへ、ｎｔ５８８位でＧからＡへ、ｎｔ６３３位でＡからＧへ、そしてｎｔ１０６７位でＡからＴへの４種類のヌクレオチド突然変異を含有する。ｎｔ５８８位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１３９位のアミノ酸をＡからＴへ変化させ、ｎｔ６３３位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ１５４位のアミノ酸をＫからＥへ変化させ、そしてｎｔ１０６７位でのヌクレオチド変化は、ＡＡ２９８位のアミノ酸をＱからＨへ変化させる。このプラスミドを有する細胞によって生じるＢ２：Ｂ１比は、０．６７：１であった（表４）。
【０２６４】
【表４】
2005517406.tif 000008
【０２６５】
追加のラウンドのＤＮＡシャフリングを実施して、以下のようにシクロヘキシル−Ｂ１アベルメクチンに対するシクロヘキシル−Ｂ２アベルメクチンの産生量をさらに減少させた。
【０２６６】
半合成シャフリング
最良のクローンを、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９７／２００７８（Ｍａｘｙｇｅｎ社）に記載の方法を用いてシャフリングした。減少したＢ２：Ｂ１比に最もよく対応する有益な置換をコードする個々のオリゴヌクレオチドを、aveC鋳型ストランドに対して５モル過剰となるようにシャフリング反応に添加した。オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドの不一致を、完全同一の２０のヌクレオチドによりフランキングしてシャフリング反応中に確実に適切に組み込まれるようにした。オリゴヌクレオチドは、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）から購入したものである。
【０２６７】
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのＨＴＰ増殖
独立したクローンを、形質転換プレートから選び、深い９６ウエルシードプレートにおける２００μｌＲ５培地（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ等「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（実用Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ遺伝学）」，２０００，Ｎｏｒｗｉｃｈ，英国，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）に接種し、震盪しながら３０℃で増殖させた。各ウエルに、ガラスビーズを分注し、菌糸体を分散するとともに、培養液を攪拌した。この間に、培養液が均一となり、且つ高密度に増殖した。４〜５日後、シード培地培養液２０μｌを、産生プレートに分注し、残りの量は、グリセロールを最終濃度２０％まで添加した後、マスタープレートとして−８０℃で凍結させた。産生プレートを、加湿下、１２〜１４日間３０度でインキュベーションした。インキュベーションの５〜８日後に、菌株の胞子形成が生じた。産生プレートを、固体面を確保するためにアガロース１％を添加することを除いて、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９９／４１３８９（Ｐｆｉｚｅｒ社）に記載されているのと実質的に同様に操作した。
【０２６８】
抽出及びＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスクリーニング
合計１ｍｌの酢酸エチルを各ウエルに添加し、室温で２０分間震盪しながらインキュベーションした。約７５０μｌの酢酸エチル相を回収し、９６ウエルプレートに移し、一晩蒸発させた。得られた沈殿を、１００μｌメタノール  １ｍＭ  ＮａＣｌに再懸濁し、そのうちの５μｌ溶液を、９６ウエルフォーマットにおいてオートサンプラーにより質量分析計に注入し、液体クロマトグラフィーや他の分離をおこなうことなくフローインジェクション相で直接分析した。化合物を、電気スプレーイオン化によりイオン化し、２つの別個のチャンネルを、２つのＭＳ／ＭＳ遷移についてモニターした。Ｂ１ナトリウム化イオンについてのＭＳ／ＭＳ遷移は、ｍ／ｚ９２１〜ｍ／ｚ７７７であり、Ｂ２ナトリウム化イオンについては、ｍ／ｚ９３９〜ｍ／ｚ７９５である（正モード）。Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ−７０００，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ−ＬＣ質量分析計及びＬｅａｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｗｉｎ−Ｐａｌオートサンプラーを、この高スループットスクリーニングに使用した。各ウエル位置についての別個のＢ１クロマトグラム及びＢ２クロマトグラムを積分して、対象物を同定した。
【０２６９】
シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が０．３５：１以下であるアミノ酸置換の５７の新しい組み合わせを、同定した（図６）。これらの新しい突然変異のいくつかでは、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．３０：１以下で産生することができ、いくつかは、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．２５：１以下で産生することができ、いくつかは、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が約０．２０：１以下で産生することができる。シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを０．３７又は０．３８の比で産生できる２つの新しい突然変異が同定された。
【０２７０】
生物材料の寄託
次のプラスミドを、１９９８年１月２９日に、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０８５２，ＵＳＡのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し、次の受託番号が付与された。
プラスミド 受託番号
プラスミドｐＳＥ１８０                    ２０９６０５
プラスミドｐＳＥ１８６                    ２０９６０４
【０２７１】
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの現在の住所は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０，ＵＳＡである。
【０２７２】
上記でとりあげた全ての特許、特許出願及び刊行物は、それらの全体が引用することにより本明細書の内容とされる。
【０２７３】
本発明は、本明細書中に記載の、本発明の個々の態様の単一説明としての具体的実施態様により範囲が限定されるものではなく、機能的に均等な方法および成分は、本発明の範囲内である。実際に、本明細書中に示され且つ記載されるものに加えて、本発明の種々の変更は、上記の説明及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣ  ＯＲＦを含むＤＮＡ配列（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）および推定のアミノ酸配列（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２）である。
【図２】Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ遺伝子のＯＲＦ全体を含むプラスミドベクターｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）である。
【図３】Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦ中に挿入されたＳａｃｃ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）である。
【図４】同定された５種類の重複コスミドクローン（すなわち、ｐＳＥ６５，ｐＳＥ６６，ｐＳＥ６７，ｐＳＥ６８，ｐＳＥ６９）を含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のアベルメクチンポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターのＢａｍＨＩ制限地図であり、ｐＳＥ１１８とｐＳＥ１１９との間の関係も示す。
【図５Ａ】Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株によって産生される発酵生成物のＨＰＬＣ分析を示した図であり、失活したａｖｅＣ  ＯＲＦを含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１についてのものである。ピーク定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較によって行われた。シクロヘキシルＢ２保持時間は７．４〜７．７分；シクロヘキシルＢ１保持時間は１１．９〜１２．３分であった。
【図５Ｂ】図５Ａと同様な分析を示した図であり、ｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）を用いて形質転換されたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１についてのものである。
【図５Ｃ】図５Ａと同様な分析を示した図であり、ｐＳＥ１８７を用いて形質転換されたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１についてのものである。
【図５Ｄ】図５Ａと同様な分析を示した図であり、ｐＳＥ１８８を用いて形質転換されたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＳＥ１８０−１１についてのものである。
【図６Ａ】第二ラウンドの「遺伝子シャフリング」により同定されたａｖｅＣ対立遺伝子に対する突然変異によりコードされているアミノ酸置換の組み合わせと、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１産生の比に対するそれらの影響を集めたリストである。各プラスミドについて、「突然変異」としてある欄において、上のボックスには、アミノ酸置換が記載されており、下のボックスには、アミノ酸置換を生じるヌクレオチド塩基の変化が記載されている。括弧内のヌクレオチド塩基の変化は、サイレント変化、すなわち、アミノ酸配列の変化を生じないものである。
【図６Ｂ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｃ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｄ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｅ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｆ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｇ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｈ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｉ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｊ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｋ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｌ】図６Ａと同様なリストである。
【図６Ｍ】図６Ａと同様なリストである。
【図１】
2005517406.tif 000021
【図２】
2005517406.tif 000022
【図３】
2005517406.tif 000023
【図４】
2005517406.tif 000024
【図５Ａ】
2005517406.tif 000025
【図５Ｂ】
2005517406.tif 000026
【図５Ｃ】
2005517406.tif 000027
【図５Ｄ】
2005517406.tif 000028
【図６Ａ】
2005517406.tif 000029
【図６Ｂ】
2005517406.tif 000030
【図６Ｃ】
2005517406.tif 000031
【図６Ｄ】
2005517406.tif 000032
【図６Ｅ】
2005517406.tif 000033
【図６Ｆ】
2005517406.tif 000034
【図６Ｇ】
2005517406.tif 000035
【図６Ｈ】
2005517406.tif 000036
【図６Ｉ】
2005517406.tif 000037
【図６Ｊ】
2005517406.tif 000038
【図６Ｋ】
2005517406.tif 000039
【図６Ｌ】
2005517406.tif 000040
【図６Ｍ】
2005517406.tif 000041
【配列表】
2005517406000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月26日(2004.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド配列が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活されており且つ突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を発現するストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞がアベルメクチンのクラス２：１比を産生することができ、この比は、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞により産生される比と比較して減少しているものであるような、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のアミノ酸位置に対するアミノ酸残基においてアミノ酸置換の組み合わせをコードする突然変異をさらに含むことを除いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣの対立遺伝子、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物コード配列若しくは図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）記載のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又は遺伝子コードの縮重によって当該ヌクレオチド配列に対して１以上のサイレントな変更を含むそれらの変異体と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、クラス２：１アベルメクチンがシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンであるときクラス２：１アベルメクチン比は０．３５：１以下である、ポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
前記シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．２０：１以下である、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
前記アミノ酸置換の組み合わせが、
【化１】
2005517406.tif 000042
【化２】
2005517406.tif 000043
【化３】
2005517406.tif 000044
からなる群から選択された組み合わせを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が失活されており且つ突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を発現するストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞がアベルメクチンのクラス２：１比を産生することができ、この比は、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを発現するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞により産生される比と比較して減少しているものであるような、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：２のアミノ酸位置に対するアミノ酸残基にアミノ酸置換の組み合わせをコードする突然変異をさらに含むことを除いて、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣの対立遺伝子、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡｖｅＣ遺伝子産物コード配列若しくは図１（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１）記載のＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのａｖｅＣ  ＯＲＦのヌクレオチド配列又は遺伝子コードの縮重によって当該ヌクレオチド配列に対して１以上のサイレントな変更を含むそれらの変異体と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、クラス２：１アベルメクチンがシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンであるとき、クラス２：１アベルメクチン比は約０．４０：１以下に減少されており、且つ前記アミノ酸置換の組み合わせが
（ｂｆ）Ｄ４８Ｅ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ；及び
（ｂｇ）Ｙ２８Ｃ、Ｑ３８Ｒ、Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ
からなる群から選択された組み合せを含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
請求項１又は請求項４に記載の前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項６】
（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子コードの縮重によって当該ヌクレオチド配列に対して１以上のサイレントな変更を含むその変異体を導入することを含む、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせが、
【化４】
2005517406.tif 000045
【化５】
2005517406.tif 000046
【化６】
2005517406.tif 000047
からなる群から選択された組み合わせを含む、方法。
【請求項７】
（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子コードの縮重によって当該ヌクレオチド配列に対して１以上のサイレントな変更を含むその変異体を導入することを含む、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又は縮重変異体を含む細胞が、シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを０．３５：１以下の比で産生できるものである、方法。
【請求項８】
前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせが、
【化７】
2005517406.tif 000048
【化８】
2005517406.tif 000049
【化９】
2005517406.tif 000050
からなる群から選択された組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチン比が、約０．２０：１以下である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）菌株の細胞における前記ａｖｅＣ対立遺伝子を突然変異させて、前記突然変異により前記ＡｖｅＣ遺伝子産物におけるアミノ酸置換の組み合わせを生じさせるか、（ｉｉ）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の細胞に、アミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードしている突然変異させたａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を導入することを含む、新規Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ菌株の製造方法であって、前記アミノ酸置換の組み合わせが、
（ｂｆ）Ｄ４８Ｅ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ；及び
（ｂｇ）Ｙ２８Ｃ、Ｑ３８Ｒ、Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ
からなる群から選択されたものである、方法。
【請求項１１】
【化１０】
2005517406.tif 000051
【化１１】
2005517406.tif 000052
【化１２】
2005517406.tif 000053
からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の細胞。
【請求項１２】
ストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）の細胞である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
（ｂｆ）Ｄ４８Ｅ、Ｓ１３８Ｔ、Ａ１３９Ｔ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ；及び
（ｂｇ）Ｙ２８Ｃ、Ｑ３８Ｒ、Ｄ４８Ｅ、Ｌ１３６Ｐ、Ｇ１７９Ｓ、Ｅ２３８Ｄ
からなる群から選択されたアミノ酸置換の組み合わせを含むＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする突然変異させたストレプトミセスアベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ａｖｅＣ対立遺伝子又はその縮重変異体を含むストレプトミセス種の細胞。
【国際調査報告】
2005517406.tif 000054
2005517406.tif 000055
2005517406.tif 000056
2005517406.tif 000057
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