(57)【要約】本発明は、ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換する非ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメイン、好ましくはマウスＣＤ１５４細胞外サブドメインをコードする第１のヌクレオチド配列と、ヒトＣＤ１５４受容体に結合するヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインをコードする第２のヌクレオチド配列とを含むキメラＣＤ１５４をコードする単離ポリヌクレオチド配列を提供する。第１のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ４０＋細胞など、細胞による前述のＣＤ１５４の発現に肝要な、非ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインと、抗マウスＣＤ１５４抗体に結合することによって、キメラＣＤ１５４の発現を検出する別の細胞外サブドメインとをさらにコードすることが好ましい。また、第２のヌクレオチド配列は、機能阻害性の抗ＣＤ１５４抗体が結合する、ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインをさらにコードすることが好ましい。本発明は、上述のポリヌクレオチド配列によってコードされるキメラＣＤ１５４、このポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター及び遺伝子ベクター、この発現ベクター又は遺伝子ベクターを含む宿主細胞、このキメラＣＤ１５４を生成する方法、並びにこのキメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター及び遺伝子構築体を利用する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラＣＤ１５４をコードする単離ポリヌクレオチド配列であって、ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換する非ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインをコードする第１のヌクレオチド配列と、ヒトＣＤ１５４受容体に結合するヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
細胞による前記ＣＤ１５４の発現に肝要な、非ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインを、前記第１のヌクレオチド配列がさらにコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
前記細胞がヒトＣＤ４０＋細胞である、請求項２に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記ヒトＣＤ４０＋細胞がヒトＣＬＬ細胞である、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
抗マウスＣＤ１５４抗体に結合することによって、前記キメラＣＤ１５４の発現を検出する細胞外サブドメインを、前記第１のヌクレオチド配列がさらにコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
前記第１のヌクレオチド配列が、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＶ内サブドメインをさらにコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記第１のヌクレオチド配列が、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩＩ又はドメインＩＩＩ内サブドメインをさらにコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換するドメインＩＩＩ内サブドメインを、前記第１のヌクレオチド配列がコードする、請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
前記第１のヌクレオチド配列が、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩ又はドメインＩＩ内サブドメインをコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
前記第１のヌクレオチド配列が、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩ又はドメインＩ内サブドメインをコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
前記第１のヌクレオチド配列が、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩをさらにコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
前記非ヒトＣＤ１５４がマウスＣＤ１５４である、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
機能阻害性の抗ＣＤ１５４抗体が結合するヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインを、前記第２のヌクレオチド配列がさらにコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
前記第２のヌクレオチド配列が、ヒトＣＤ１５４のドメインＩＶ内サブドメインをコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２からなる群から選択された配列である、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、及び２４からなる群から選択されたアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列。
【請求項１７】
ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換する、非ヒトＣＤ１５４第１サブドメインと、ＣＤ１５４受容体に結合するヒトＣＤ１５４第２サブドメインとを含む、キメラＣＤ１５４。
【請求項１８】
そのポリペプチドが、ヒトＣＤ１５４に比べて、細胞表面から、より切断されにくい、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項１９】
前記ＣＤ１５４の切断速度が、ヒトＣＤ１５４の切断速度に比べて、少なくとも９０％は小さい、請求項１８に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２０】
前記第１サブドメインが、細胞による前記キメラＣＤ１５４の発現に肝要である、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２１】
前記細胞がヒトＣＤ４０＋細胞である、請求項２０に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２２】
前記ヒトＣＤ４０＋細胞がＣＬＬ細胞である、請求項２１に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２３】
前記第１サブドメインが、抗マウスＣＤ１５４抗体に結合することによって、前記キメラＣＤ１５４の発現を検出する、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２４】
免疫原性がなく、そのため、抗ＣＤ１５４抗体による中和を受けない請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２５】
前記第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインを含む、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２６】
前記第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩＩ又はドメインＩＩＩ内サブドメインをさらに含む、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２７】
前記第１サブドメインが、ヒトＣＤ１５４の切断部位の一部を置換する請求項２６に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２８】
前記第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩ、又はサブドメイン若しくはドメインＩＩをさらに含む、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項２９】
前記第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩ又はドメインＩ内サブドメインをさらに含む、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項３０】
前記第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩをさらに含む、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項３１】
前記非ヒトＣＤ１５４がマウスＣＤ１５４である、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４。
【請求項３２】
前記第２サブドメインが、ヒトＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインを含む、請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４ポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項３４】
ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換するマウスＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインと、ＣＤ１５４受容体に結合するヒトＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインとを含むキメラＣＤ１５４を、前記ポリヌクレオチド配列がコードする、請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
ヒト細胞での前記マウスＣＤ１５４の発現に肝要な、マウスＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
マウスＣＤ１５４の、ドメインＩＩＩ又はドメインＩＩＩ内サブドメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
マウスＣＤ１５４の、ドメインＩＩ又はドメインＩＩ内サブドメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
マウスＣＤ１５４の、ドメインＩ又はドメインＩ内サブドメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチド配列が、マウスＣＤ１５４のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩをさらにコードする、請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項４０】
ウイルスＤＮＡ、又は細菌ＤＮＡをさらに含む請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項４１】
前記ウイルスＤＮＡが、アデノウイルスＤＮＡ、又はレトロウイルスＤＮＡからなる群から選択された、請求項４０に記載の発現ベクター。
【請求項４２】
少なくとも一部がアデノウイルスＤＮＡを含む請求項４１に記載の発現ベクター。
【請求項４３】
プロモーター領域をさらに含む請求項３３に記載の発現ベクター。
【請求項４４】
ポリアデニル化シグナル領域をさらに含む請求項４３に記載の発現ベクター。
【請求項４５】
プロモーター配列と、ポリアデニル化シグナル配列とに作用可能に連結した、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築体。
【請求項４６】
請求項３３に記載の発現ベクター、又は請求項４５に記載の遺伝子構築体を含む宿主細胞。
【請求項４７】
哺乳類細胞である、請求項４６の宿主細胞。
【請求項４８】
ヒト細胞である、請求項４７の宿主細胞。
【請求項４９】
腫瘍細胞である、請求項４６の宿主細胞。
【請求項５０】
抗原提示細胞である、請求項４６の宿主細胞。
【請求項５１】
請求項１７に記載のキメラＣＤ１５４を生成する方法であって、そのタンパク質を発現するのに適した条件下で、請求項４６に記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項５２】
細胞の表面のＣＤ１５４受容体に結合可能なリガンドの濃度を上昇させる方法であって、請求項１に記載の、キメラＣＤ１５４をコードする単離ポリヌクレオチド配列を前記細胞に導入することを含み、これにより、前記キメラＣＤ１５４が、ヒトＣＤ１５４に比べて、前記細胞の表面から、より切断されにくくなる方法。
【請求項５３】
前記単離ポリヌクレオチド配列が、請求項３３に記載の発現ベクター、又は請求項４５に記載の遺伝子構築体を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞がその表面にＣＤ１５４受容体を発現する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
免疫系細胞の活性化を引き起こす方法であって、請求項１に記載の、キメラＣＤ１５４をコードする単離ポリヌクレオチド配列を、前記細胞内に導入して、前記キメラＣＤ１５４を前記細胞の表面に発現することを含む方法。
【請求項５６】
患者の腫瘍を治療する方法であって、請求項１に記載の、キメラＣＤ１５４をコードする単離ポリヌクレオチド配列を、腫瘍細胞内に導入して、前記キメラＣＤ１５４を前記細胞の表面に発現することを含む方法。
【請求項５７】
ヒト患者から前記腫瘍細胞を得ること；及び
前記キメラＣＤ１５４をコードする前記ポリヌクレオチド配列を前記細胞内に導入した後、前記腫瘍細胞を前記ヒト患者に、注入によって戻すこと
をさらに含む請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学分野、免疫学分野、遺伝子工学分野、及び医学分野に関する。特に、本発明は、細胞表面に発現された際に、対応する自然リガンドより安定であるが、自然リガンドの受容体結合機能を保持し、かつ免疫原性がない新規キメラリガンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、悪性細胞を異物として認識し、身体からこれらを取り除くことによって、悪性細胞を排除する。これを達成するために、免疫系は抗体応答と、細胞応答との両方を引き起こす。これらの反応は両方とも、免疫系における多数の異なる細胞間の相互作用を必要とする（Ａｂｂａｓ、細胞及び分子免疫学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２０００年）。
【０００３】
免疫反応は、通常、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原由来ペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、その表面にもつＴリンパ球（Ｔ細胞）から始まる。Ｔ細胞はさらに、その表面に様々なポリペプチドを発現し、これらは、さらに詳細に下記に説明するように、免疫介在性応答に関わる細胞にある受容体に結合するため、「リガンド」と呼ばれる。Ｔ細胞受容体は、悪性細胞由来の抗原など、ＭＨＣ結合抗原に結合した際に活性化され、リガンドをその表面に発現する。このリガンドは、短時間細胞表面に存在するのみであり、いったん細胞表面からリガンドが取り除かれると、受容体をもつ細胞に対する、Ｔ細胞の結合能は失われる。そのようなリガンドの１つが、ＣＤ１５４と呼ばれるものである。
【０００４】
ＣＤ１５４は、ＴＮＦスーパーファミリーと総称される、より大きなリガンドファミリーの１メンバーである（Ｇｒｕｓｓら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１：７５〜１０５、１９９５年、及びＬｏｃｋｓｌｅｙら、Ｃｅｌｌ、１０４：４８７〜５０１、２００１年）。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーには、Ｆａｓリガンド（「ＦａｓＬ」）、ＴＮＦα、ＬＴα、リンフォトキシン（ＴＮＦβ）、ＣＤ１５４、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＴＷＥＡＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＡＩＴＲリガンド、エクトジスプラシン（ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ）、ＢＬＹＳ、ＶＥＧＩ、及びＯＸ４０リガンドが含まれる。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、４つのドメインを含む保存された２次構造を共有する。即ち、それらは、細胞内ドメインのドメインＩ；細胞膜内外にまたがり、膜貫通ドメインとして知られているドメインＩＩ；細胞膜に最も近い細胞外アミノ酸からなるドメインＩＩＩ；及び、遠位細胞外ドメインのドメインＩＶである。（Ｋｉｐｐｓら、国際公開Ｗ０９８／２６０６１、１９９８年６月１８日公開）。通常、少なくともドメインＩＶの一部を親分子から切断することが可能である。この切断された断片は、しばしば、完全なリガンドと同じ生物活性を示し、従来、ＴＮＦファミリーメンバーの「可溶型」と称されている。
【０００５】
Ｉ）ＣＤ１５４の生物活性
ＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンドとしても知られている）と、その同族受容体であるＣＤ４０との相互作用は、免疫認識において肝要である。（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：８８１〜９２２、１９９４年；Ｌａｍａｎ  Ｊ．Ｄ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５９〜１０８、１９９６年）。ＣＤ１５４は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介した、抗原提示細胞のＴ細胞受容体への結合に続き、ＣＤ４＋Ｔ細胞で一時的に発現される。（Ｒｏｙ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２４９７〜２５１０、１９９３年；Ｈｅｐｍａｎｎ  Ｐ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：９６１〜９６４、１９９３年；Ｃａｓｔｌｅ  Ｂ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：１７７７〜１７８８、１９９３年；Ｃａｎｔｗｅｌｌ  Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：９８４〜９８９、１９９７年）。これによって、次に、Ｂ細胞、樹枝状細胞、単球、及びマクロファージを含む、ＣＤ４０発現性抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化が引き起こされうる。（Ｒａｎｈｅｉｍ  Ｅ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：９２５〜９３５、１９９３年；Ｒａｎｈｅｉｍ  Ｅ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：２２６〜２３５、１９９５年）。そのようなＣＤ４０活性化細胞は、ウイルス又は腫瘍などの、外来抗原に対する、特異的かつ有効な免疫応答を導く、免疫活性化イベントのカスケードを引き起こすことができる。ＣＤ４０のリガンドに遺伝的欠陥をもつ個体に、深刻な免疫不全があることが発見されたことによって、ＣＤ４０とＣＤ１５４との相互作用の重要さが強調される。（Ｋｏｒｔｈａｕｅｒ  Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６１：５３９〜５４１、１９９３年；Ａｒｕｆｆｏ  Ａ．ら、Ｃｅｌｌ、７２：２９１〜３００、１９９３年）。そのような患者は、胚中心形成障害、イソタイプ転換不全、並びに様々な細菌性病原菌及びウイルス性病原菌に対する著しい感受性を伴った免疫不全症候群を患っている。
【０００６】
ＣＤ１５４がこのように免疫調節に肝要な分子であるため、ヒトＣＤ１５４の発現は、いくつかの機構によって制御されている。第１に、膜上に発現されたＣＤ１５４は切断可能であり、ＣＤ１５４受容体、即ちＣＤ４０に、結合可能なＣＤ１５４細胞外部分を、可溶性分子として遊離することができる。タンパク質分解酵素が、ヒトＣＤ１５４をこのリガンド上の異なった部位で切断し、ＣＤ４０に結合可能であり、かつ免疫応答を刺激できる可溶型ＣＤ１５４を遊離することが示されている。（Ｐｉｅｔｒａｖａｌｌｅ  Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：５９６５〜５９６７、１９９６年；Ｐｉｅｔｒａｖａｌｌｅ  Ｆ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６：７２５〜７２８、１９９６年）。例えば、ＣＤ１５４がＰｈｅ１１１とＡｌａ１２３との間で切断されることが、一研究によって示されており（Ｐｉｅｔｒａｖａｌｌｅ  Ｆ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２６：７２５〜７２８、１９９６年）、さらにＭｅｔ１１３における切断も報告されている。第２に、ＣＤ１５４と、その同族受容体との相互作用によって、細胞表面におけるＣＤ１５４発現の急速な下方調節（ｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を誘導できる。（Ｃａｎｔｗｅｌｌ  Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：９８４〜９８９，１９９７年）。第３に、ＣＤ１５４遺伝子の転写は緊密に調節されており、ＴＣＲライゲーション後４〜６時間に、ＲＮＡ合成及びタンパク質合成における、このリガンドの発現が最大となり、続いて急速に減少する（同上）。併せて、これらの調節機序によって、特定抗原に対する免疫応答の特異性が確実となる。ＣＤ１５４発現の緊密な制御を維持することの重要さは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を患う個体によって例証される。これらの患者は、ＣＤ１５４の過剰発現と、血漿中の可溶性ＣＤ１５４濃度の上昇とが観測されており、制御されていないＣＤ１５４発現がＳＬＥ疾病活性に寄与することを示唆する。（Ｋａｔｏ  Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１：１１３３〜１１４１、１９９８年；Ｖａｋｋａｌａｎｋａ  Ｒ．Ｋ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、４２：８７１〜８８１、１９９９年）。
【０００７】
免疫療法におけるＣＤ１５４使用の可能性が活発に調査されている。ＣＤ１５４は強力な免疫賦活剤であるため、主として、癌治療薬としてのＣＤ１５４に研究の焦点が集められているが、これは腫瘍細胞の抗原提示性が通常弱く、活発な抗腫瘍反応を活性化することができないためである。例えば、複製欠陥をもつアデノウイルスベクターを用いて、ＣＤ１５４を発現するように改変された、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）Ｂ細胞は、ＣＬＬ抗原提示性を増進し、無改変のＣＬＬ  Ｂ細胞に対して、自家Ｔ細胞細胞傷害性を誘導することができる。（Ｋａｔｏ  Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１：１１３３〜１１４１、１９９８年）。加えて、Ａｄ−ＣＤ１５４で改変されたＣＬＬ  Ｂ細胞を用いた第一相臨床試験は、有望な治療結果を示した。（Ｗｉｅｒｄａ  Ｗ．Ｇ．ら、Ｂｌｏｏｄ、９６：２９１７〜２９２４、２０００年）。同様に、動物モデルにおいて、ＣＤ１５４を発現するように、様々な腫瘍型を改変することで、有効な抗腫瘍免疫応答を誘導できることが他の研究によって示された。
【０００８】
Ｂ細胞及び他の腫瘍を操作する研究は、ＣＬＬ及びＢ細胞リンパ腫の場合のように、腫瘍細胞自体の抗原提示性を促進することによって、又は、ＣＤ４０陰性腫瘍の場合のように、抗腫瘍免疫応答を開始することができる樹枝状細胞など、バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）抗原提示細胞を活性化することによって行われる。しかし、別の研究では、ある種の腫瘍、特に乳癌に対する直接的増殖阻害効果が、ＣＤ１５４にあるかもしれないとも示唆されている。（Ｔｏｎｇ  Ａ．Ｗ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｓ．、７：６９１〜７０３、２００１年；Ｈｉｒａｎｏ  Ａ．、Ｂｌｏｏｄ、９３：２９９９〜３００７、１９９９年）。加えて、ある種のリンパ腫の増殖を、ＣＤ４０のライゲーションによって直接阻害することができるという証拠がある。（Ｗｉｌｓｅｙ  Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５８：２９３２〜２９３８、１９９７）。従って、ＣＤ１５４免疫療法は、広範囲の腫瘍に対して効果をもつはずである。
【０００９】
ＩＩ）現在のＣＤ１５４構築体の欠点
ＣＤ１５４は潜在的に強力な治療薬であるが、臨床治療で用いられるＣＤ１５４の形態によって、安全性と有効性との両方が大きく影響されるであろう。
【００１０】
例えば、ＣＤ１５４の細胞外受容体結合ドメインのみから構成される組換え型可溶性ＣＤ１５４（ｒｓＣＤ１５４）は、機能を有する。（Ａｒｍｉｔａｇｅ  Ｒ．Ｊ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：２３２６〜２３３１、１９９３年；Ｌａｎｅ  Ｐ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：１２０９〜１２１３、１９９３年）。しかし、ＣＤ４０の最適シグナル伝達には、ＣＤ４０受容体が細胞表面で多量体化する必要があるため、ｒｓＣＤ１５４は、細胞膜上に発現した自然なＣＤ１５４ほどには、ＣＤ４０シグナル伝達を誘導するのに有効ではない。（Ｓｃｈｗａｂｅ  Ｒ．Ｆ．ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１６：２１７〜２２６、１９９７年）。この結果、受容体シグナル伝達を促進するために、ロイシンジッパードメイン又はＣＤ８ドメインなどのリガンド多量体化ドメインが、ｒｓＣＤ１５４のＮ末端ドメインに構築された。（Ｌａｎｓ  Ｐ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１２０９〜１２１３、１９９３年；Ｍｏｒｒｉｓ  Ａ．Ｅ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：４１８〜４２３、１９９９年）。同様に、可溶性ＣＤ１５４は、膜で発現されたＣＤ１５４ほど、抗原提示細胞を強く刺激しないため、ＣＤ４０の架橋にも最適ではない。
【００１１】
さらに、ＣＤ４０シグナル伝達を媒介する可溶性試薬は、有害な生理作用を引き起こすことがある。例えば、可溶性ＣＤ１５４−ＣＤ８融合タンパク質を注入されたマウスは、肺に炎症を起こした。（Ｗｉｌｅｙ  Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：２９３２〜２９３８、１９９７年）。同様に、免疫無防備状態のマウスにＣＤ４０活性化モノクローナル抗体を投与したところ、致命的な腸病変が誘導された。（Ｈｉｘｏｎ  Ｊ．Ａ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．、７：１３６〜１４３、２００１年）。有害な効果は可溶性のＴＮＦ−α、ＦａｓＬ、及びＴＲＡＩＬの投与の後にもみられたため、可溶性ＣＤ１５４の全身性投与に伴う毒性は、ＴＮＦファミリーに一般的な特徴と思われる。
【００１２】
可溶性ＣＤ１５４の別の欠点は、全身性投与後における、可溶性ＴＮＦファミリーメンバーの半減期が短いことである。（Ｓｐｒｉｓｓ  Ｄ．Ｒ．ら、Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、１３１：２０６〜２２７、１９８７年；Ｆｕｎａｈａｓｈｉ  Ｉ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６７：４４７〜４５５）。このように半減期が短いことによって、ｒｓＣＤ１５４の用量をより高くするか、又は一定期間にわたって持続注入することが必要となるであろう。これは、毒性が生じる可能性を増大させるだけではなく、困難で時間のかかる手順を経て、多量のｒｓＣＤ１５４タンパク質を単離する必要性を生じさせうるものでもある。
【００１３】
可溶性ＣＤ１５４を用いることには内在的な問題があるため、膜に発現された完全長ヒトＣＤ１５４が、より良い代替であると思われる。しかし、自然なヒトＣＤ１５４にも、その有効性、又は安全性を制限するかもしれない特性がある。前述のように、完全長ＣＤ１５４は切断され、可溶性分子として遊離されるため、ｒｓＣＤ１５４に関して述べたのと同様の毒性を生じさせる可能性をもっている。さらに、膜結合ＣＤ１５４がタンパク質分解による切断を受けることによって、このタンパク質の機能的能力が低下するかもしれない。推定切断部位をＣＤ１５４から欠失させることで、このタンパク質の新陳代謝を低下させることができるが、多数のタンパク質分解切断部位が存在するため、これによってＣＤ１５４のプロセシングが完全に排除されることはない。（Ｍａｚｚｅｉ  Ｇ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７０：７０２５〜７０２８、１９９５年；Ｐｉｓｔｒａｖａｌｌｅ  Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７１：５９６５〜５９６７、１９９６年）。さらに、完全長ヒトＣＤ１５４を用いることには、このタンパク質の細胞型特異的発現という、他ほど明白ではない問題も伴う。例えば、ある種の細胞型、特にＢ細胞由来の細胞では、ヒトＣＤ１５４の発現が阻止されている。（Ｋａｔｏ  Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１：１１３３〜１１４１、１９９８年；Ｃａｎｔｗｅｌｌ  Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、３：９８４〜９８９、１９９７年）。
【００１４】
興味深いことに、マウスＣＤ１５４（ｍＣＤ１５４）は自然なヒトＣＤ１５４よりも、またｒｓＣＤ１５４よりも治療適用に有利のようである。マウスＣＤ１５４は、ヒトＣＤ１５４に比べて、タンパク質分解による切断に対して、比較的強い抵抗性を有する。そのうえ、ｍＣＤ１５４は、ヒトＣＤ１５４の発現を阻止するＢ細胞由来の細胞（しばしばＣＤ４０＋細胞と呼ばれる）を含めたほとんどの細胞型で発現される（同上）。このため、ＣＤ４０＋細胞の１タイプであるＣＬＬ細胞における、ＣＤ１５４遺伝子療法の臨床試験で、ｍＣＤ１５４が発現された。（Ｗｉｅｒｄａ  Ｗ．Ｇ．、Ｂｌｏｏｄ、９６：２９１７〜２９２４（２０００年））。
【００１５】
それでもなお、ヒトでｍＣＤ１５４を用いることには、それに固有な問題がある。例えば、Ａｄ−ＣＤ１５４で改変したＣＬＬ細胞を患者に反復注射した後、白血病細胞の減少量は、後続する注射の度に減少した。ＣＬＬ患者の４人のうち３人が、５回目の反復注射までに、ｍＣＤ１５４発現細胞の活性に対して不応となった。この活性喪失は、マウスＣＤ１５４分子に対する抗体を生じたことによる可能性が高く、これ以上の治療を不可能にするものである。ＣＤ１５４に対する抗体の結合及び中和の形成を測定するアッセイによって、Ａｄ−ｍＣＤ１５４で形質導入されたＣＬＬ細胞を反復注射した際、３回目の注射までに、抗マウスＣＤ１５４抗体が生じていることが示された。さらに、抗ＣＤ１５４抗体は、マウスＣＤ１５４の機能も中和するかもしれない。従って、ｍＣＤ１５４の総合的安全性、発現安定性、及び短期的有効性にもかかわらず、ヒトにおける、ｍＣＤ１５４の長期反復投与は困難であろう。
【００１６】
現在のＣＤ１５４構築体の欠点を考えると、ヒトＣＤ１５４及びマウスＣＤ１５４の両方にみられる特性をもつ、疾患治療に好ましいＣＤ１５４構築体が必要なことは明らかであろう。好ましいＣＤ１５４構築体は、Ｂ細胞由来のリンパ球系細胞を含む様々な細胞型で発現されるものであろう。さらに、そのようなＣＤ１５４構築体は、膜安定化され、タンパク質分解による切断に対して抵抗性を有し、そのため、可溶型ＣＤ１５４を生成しにくいものであろう。しかし、好ましいＣＤ１５４構築体は、自然なＣＤ１５４がもつ受容体結合機能を保持しているであろう。これらの特性は両方とも、ｍＣＤ１５４にみられるものである。さらに、好ましいＣＤ１５４構築体は、ヒトへ投与した後、受容体結合に重要なドメインで、免疫を引き起こさないであろうものであり、従って、機能の中和を受けないであろう。本発明は、そのようなＣＤ１５４構築体を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、ヒトＣＤ１５４及びマウスＣＤ１５４の最も有益な特性をもち、従って、疾患治療に安全かつ有効である新規キメラＣＤ１５４ポリペプチドに関する。具体的には、このキメラＣＤ１５４は、Ｂ細胞を含めた様々な細胞型で発現できるであろう。このキメラＣＤ１５４は、細胞膜上に発現された際に、タンパク質分解に対する耐性が低下し、従って、より安定であろう。さらに、このキメラＣＤ１５４は免疫原性がないであろうと考えられ、従って抗ＣＤ１５４抗体による中和を受けないであろう。最後に、このキメラＣＤ１５４は、ヒトＣＤ１５４の受容体結合能を保持するであろうと考えられ、従って、ヒトにおいて、ヒトＣＤ１５４と同じタイプの免疫応答を引き起こすであろう。
【００１８】
これらの新規キメラＣＤ１５４ポリペプチドは、少なくとも２つの異なった生物種からのＣＤ１５４ドメイン又はサブドメイン、好ましくはヒトＣＤ１５４及びマウスＣＤ１５４を含むキメラである。これらのポリペプチドは、ヒトＣＤ１５４領域、及び非ヒトＣＤ１５４領域を結合して、免疫応答に対する刺激を最大にするので、「免疫刺激性因子」、即ちＩＳＦと名付けた。具体的には、ヒトＣＤ１５４の切断部位を含有する、ＣＤ１５４の少なくとも１つのドメイン又はサブドメインを、非ヒトＣＤ１５４、好ましくはマウスＣＤ１５４の対応するドメイン又はサブドメインで置換する。さらに、これらのキメラポリペプチドは、ＣＤ１５４受容体に対する結合性を有する、ヒトＣＤ１５４のドメイン又はサブドメインから構成される。本発明は、キメラＣＤ１５４をコードする新規ポリヌクレオチド配列、新規ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及びキメラＣＤ１５４を生成する方法にも関する。最後に、本発明は、この発現ベクターを用いて形質移入された細胞の免疫応答性を改善する方法、及び腫瘍を治療する方法に関する。
【００１９】
従って、この発明の一態様は、ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換する非ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインをコードする第１のヌクレオチド配列と、ヒトＣＤ１５４受容体に結合するヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインをコードする第２のヌクレオチド配列とを含むキメラＣＤ１５４をコードする単離ポリヌクレオチド配列に関する。
【００２０】
この発明の一態様は、細胞による前述のＣＤ１５４の発現に肝要な非ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインを、第１のヌクレオチド配列がさらにコードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００２１】
この発明の一態様は、発現を行う細胞が、ヒトＣＤ４０＋細胞である上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００２２】
この発明の一態様は、発現を行う細胞が、ヒトＣＬＬ細胞である上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００２３】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、第１のヌクレオチド配列がさらに細胞外ドメインをコードし、この細胞外ドメインが抗マウスＣＤ１５４抗体に結合するため、この単離ポリヌクレオチド配列によってコードされたリガンドの発現を検出する際に、この細胞外ドメインが有用である単離ポリヌクレオチド配列である。
【００２４】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、非ヒトＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインを、第１のヌクレオチド配列がコードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００２５】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩＩ、又はドメインＩＩＩ内サブドメインを、第１のヌクレオチド配列がコードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００２６】
この発明の一態様は、ヒトＣＤ１５４の切断部位の一部を置換するドメインＩＩＩのサブドメインを、第１のヌクレオチド配列がコードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００２７】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩ又はドメインＩＩ内サブドメインを、第１のヌクレオチド配列がさらにコードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００２８】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩ又はドメインＩ内サブドメインを、第１のヌクレオチド配列がさらにコードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００２９】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを、第１のヌクレオチド配列がさらにコードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００３０】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、非ヒトＣＤ１５４がマウスＣＤ１５４である上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００３１】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、機能阻害性の抗ＣＤ１５４抗体が結合する領域を置換するヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインを、第２のヌクレオチド配列がさらにコードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００３２】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、ヒトＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインを、第２のヌクレオチド配列がコードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００３３】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、この配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２からなる群から選択された上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００３４】
この発明の一態様は、上述の配列などの、上記単離ポリヌクレオチド配列であって、この配列が、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、及び２４からなる群から選択されたアミノ酸配列を、コードする上記単離ポリヌクレオチド配列である。
【００３５】
この発明の一態様は、ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換する非ヒトＣＤ１５４第１サブドメインと、ＣＤ１５４受容体に結合するヒトＣＤ１５４第２サブドメインとを含むキメラＣＤ１５４である。
【００３６】
この発明の一態様は、ヒトＣＤ１５４に比べて、細胞表面から、より切断されにくい上記キメラＣＤ１５４である。
【００３７】
この発明の一態様は、ＣＤ１５４の切断速度が、ヒトＣＤ１５４の切断速度に比べて、少なくとも９０％は小さい、上記キメラＣＤ１５４である。
【００３８】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、非ヒトＣＤ１５４第１サブドメインが、細胞によるこのキメラＣＤ１５４の発現に肝要である上記キメラＣＤ１５４である。
【００３９】
この発明の一態様は、発現を行う細胞がヒトＣＤ４０＋細胞である上記キメラＣＤ１５４である。
【００４０】
この発明の一態様は、発現を行う細胞がヒトＣＬＬ細胞である上記キメラＣＤ１５４である。
【００４１】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、非ヒトＣＤ１５４第１サブドメインが、抗マウスＣＤ１５４抗体に結合することによって、キメラＣＤ１５４の発現を検出するのに有用である、上記キメラＣＤ１５４である。
【００４２】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、免疫原性がなく、そのため、抗ＣＤ１５４抗体による中和を受けない、上記キメラＣＤ１５４である。
【００４３】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインを含む、上記キメラＣＤ１５４である。
【００４４】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩＩ又はドメインＩＩＩ内サブドメインをさらに含む、上記キメラＣＤ１５４である。
【００４５】
この発明の一態様は、第１サブドメインが、ヒトＣＤ１５４の切断部位の一部を置換する、上記キメラＣＤ１５４である。
【００４６】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩ、又はサブドメイン若しくはドメインＩＩをさらに含む、上記キメラＣＤ１５４である。
【００４７】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩ又はドメインＩ内サブドメインをさらに含む、上記キメラＣＤ１５４である。
【００４８】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、第１サブドメインが、非ヒトＣＤ１５４のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩをさらに含む、上記キメラＣＤ１５４である。
【００４９】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、非ヒトＣＤ１５４がマウスＣＤ１５４である、上記キメラＣＤ１５４である。
【００５０】
この発明の一態様は、上述のキメラＣＤ１５４などの、上記キメラＣＤ１５４であって、第２サブドメインが、ヒトＣＤ１５４のドメインＩＶ内サブドメインを含む、上記キメラＣＤ１５４である。
【００５１】
この発明の一態様は、上記単離ポリヌクレオチド配列の１つを含む発現ベクターである。
【００５２】
この発明の一態様は、ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換するマウスＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインと、ＣＤ１５４受容体に結合するヒトＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインとを含むキメラＣＤ１５４を、ポリヌクレオチド配列がコードする上記発現ベクターである。
【００５３】
この発明の一態様は、上述の発現ベクターなどの、上記発現ベクターであって、ヒト細胞でのマウスＣＤ１５４の発現に肝要な、マウスＣＤ１５４ドメインＩＶ内サブドメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む上記発現ベクターである。
【００５４】
この発明の一態様は、上述の発現ベクターなどの、上記発現ベクターであって、マウスＣＤ１５４の、ドメインＩＩＩ又はドメインＩＩＩ内サブドメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む上記発現ベクターである。
【００５５】
この発明の一態様は、上述の発現ベクターなどの、上記発現ベクターであって、マウスＣＤ１５４の、ドメインＩＩ又はドメインＩＩ内サブドメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む上記発現ベクターである。
【００５６】
この発明の一態様は、上述の発現ベクターなどの、上記発現ベクターであって、マウスＣＤ１５４の、ドメインＩ又はドメインＩ内サブドメインをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む上記発現ベクターである。
【００５７】
この発明の一態様は、上述の発現ベクターなどの、上記発現ベクターであって、マウスＣＤ１５４の、ドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む上記発現ベクターである。
【００５８】
この発明の一態様は、上述の発現ベクターなどの、上記発現ベクターであって、ウイルスＤＮＡ又は細菌ＤＮＡを含む上記発現ベクターである。
【００５９】
この発明の一態様は、ウイルスＤＮＡが、アデノウイルスＣＤＡ、又はレトロウイルスＤＮＡからなる群から選択された、上記発現ベクターである。
【００６０】
この発明の一態様は、上記発現ベクターの少なくとも一部がアデノウイルスＤＮＡを含む、上記発現ベクターである。
【００６１】
この発明の一態様は、上述の発現ベクターなどの、上記発現ベクターであって、プロモーター領域をさらに含む上記発現ベクターである。
【００６２】
この発明の一態様は、ポリアデニル化シグナル領域をさらに含む上記発現ベクターである。
【００６３】
この発明の一態様は、プロモーター配列と、ポリアデニル化シグナル配列とに作用可能に連結した、上記単離ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築体である。
【００６４】
この発明の一態様は、上記発現ベクター、又は上記遺伝子構築体を含む宿主細胞である。
【００６５】
この発明の一態様は、宿主細胞が哺乳類細胞である、上記宿主細胞である。
【００６６】
この発明の一態様は、この哺乳類細胞がヒト細胞である、上記宿主細胞である。
【００６７】
この発明の一態様は、上述の宿主細胞などの、上記宿主細胞であって、この宿主細胞が腫瘍細胞である、上記宿主細胞である。
【００６８】
この発明の一態様は、上述の宿主細胞などの、上記宿主細胞であって、この宿主細胞が抗原提示細胞である、上記宿主細胞である。
【００６９】
この発明の一態様は、上記キメラＣＤ１５４を生成する方法であって、そのタンパク質を発現するのに適した条件下で、上記宿主細胞を培養することを含む方法である。
【００７０】
この発明の一態様は、細胞の表面のＣＤ１５４受容体に結合可能なリガンドの濃度を上昇させる方法であって、上記キメラＣＤ１５４をコードする単離ポリヌクレオチド配列を前記細胞内に導入することを含み、これにより、このキメラＣＤ１５４が、ヒトＣＤ１５４より、細胞の表面から、より切断されにくくなっている方法である。
【００７１】
この発明の一態様は、細胞の表面のＣＤ１５４受容体に結合可能なリガンドの濃度を上昇させる上記方法であって、単離ポリヌクレオチド配列が上記発現ベクター又は上記遺伝子構築体を含む、方法である。
【００７２】
この発明の一態様は、細胞の表面のＣＤ１５４受容体に結合可能なリガンドの濃度を上昇させる上記方法であって、細胞がその表面にＣＤ１５４受容体を発現する、方法である。
【００７３】
この発明の一態様は、免疫系細胞の活性化を引き起こす方法であって、上記キメラＣＤ１５４をコードする単離ポリヌクレオチド配列を細胞内に導入して、このキメラＣＤ１５４を細胞の表面に発現することを含む方法である。
【００７４】
この発明の一態様は、患者の腫瘍を治療する方法であって、上記キメラＣＤ１５４をコードする単離ポリヌクレオチド配列を、腫瘍細胞内に導入して、このキメラＣＤ１５４を細胞の表面に発現することを含む方法である。
【００７５】
この発明の一態様は、患者の腫瘍を治療する上記方法であって、ヒト患者から腫瘍細胞を得ること、及び、キメラＣＤ１５４をコードする上記ポリヌクレオチド配列を細胞内に導入した後、この腫瘍細胞をヒト患者に、注入によって戻すことをさらに含む方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
どの図面も含めて、すべての引用文献を、あたかも完全に本明細書に記載したように参照により組み込む。
【００７７】
定義
本明細書で使用する際、「ＣＤ１５４」又は「キメラＩＳＦ構築体」という用語は、１つの種からのＣＤ１５４の少なくとも１つのドメイン又はサブドメインと、別の種からのＣＤ１５４の少なくとも１つのドメイン又はサブドメインからなるリガンドのことをいう。キメラＣＤ１５４が由来する、この少なくとも２つの種は、ヒトＣＤ１５４及びマウスＣＤ１５４であることが好ましい。
【００７８】
本明細書で使用する際、「サブドメイン」という用語は、ＣＤ１５４のドメインの一部である少なくとも２つのアミノ酸からなる配列のことをいう。「サブドメイン」には、１つ又は複数のアミノ酸を欠失しているアミノ酸配列も包含され、このような欠失には、この配列の末端から切りつめられている１つ又は複数のアミノ酸も含まれる。
【００７９】
本明細書で使用する際、「切断部位」という用語は、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列のことをいい、このプロテアーゼは、通常、ＣＤ１５４を発現している細胞の表面から、ＣＤ１５４を切断するマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍｍｐ）である。ＣＤ１５４の切断部位は、通常、ＣＤ１５４のドメインＩＩＩ及びドメインＩＶの境界、又はその周辺に見いだされる。本発明によると、そのような切断部位の１つは、ヒトＣＤ１５４で概ねアミノ酸１０８及びアミノ酸１１６の間にある領域を含む。
【００８０】
本明細書で使用する際、「対応する」という用語は、１つの種のＣＤ１５４ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に相同な、別の種のＣＤ１５４ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関することをいう。この相同性は、ドメイン境界の位置など、異なった種のＣＤ１５４の間にある２次構造の類似性に基づく（下記表１参照）。
【００８１】
本明細書で使用する際、「より切断されにくい」という句は、タンパク質分解による切断に対して、自然なヒトＣＤ１５４が有する耐性に比べて、キメラＣＤ１５４が有する、より高い耐性のことをいい、この耐性は、所与の数の細胞が一定期間に生成する可溶性ＣＤ１５４の量によって測定されるものである。本発明のキメラＣＤ１５４は、自然なＣＤ１５４の切断速度より、少なくとも９０％遅い速度で切断され、そのため「より切断されにくい」ものであることが好ましい。
【００８２】
本明細書で使用する際、「発現ベクター」という用語は、組換えヌクレオチド配列を発現する核酸であって、細胞を感染させ、さらにこの細胞中でそれ自体を複製することができる核酸のことをいう。典型的な発現ベクターには、組換えＤＮＡ技法において用いられるプラスミド、及び細菌又は動物細胞中で複製可能な様々なウイルスが含まれる。多数の発現ベクターが文献に記載されている。Ｃａｎｔｗｅｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、表題「慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞のアデノウイルスベクター感染（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ）」（１９９６年）；Ｗｏｌｌ，Ｐ．Ｊ．及びＩ．Ｒ．Ｈａｒｔ、Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｉ．、６  Ｓｕｐｐｌ  １：７３（１９９５年）；Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｔ．、Ａ．Ｊ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、Ｊ．Ｅ．Ｂｏｙｄ、及びＧ．Ｍ．Ｌｅｅｓ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３：１９０（１９９６年）；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍ．Ｊ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：１７２（１９９６年）；Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ，Ｅ．、Ｄ．Ｌｕ、Ｓ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ、及びＫ．Ｋ．Ｗｏｎｇ、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：１５９（１９９６年）；Ｇｌｏｒｉｏｓｏ，Ｊ．Ｃ．、Ｎ．Ａ．ＤｅＬｕｃａ、及びＤ．Ｊ．Ｆｉｎｋ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４９：６７５（１９９５年）；Ｆｌｏｔｔｅ、Ｔ．Ｒ．、及びＢ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２：３５７（１９９５年）；Ｒａｎｄｒｉａｎａｒｉｓｏｎ−Ｊｅｗｔｏｕｋｏｆｆ，Ｖ．及びＭ．Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．、２３：１４５（１９９５年）；Ｋｏｈｎ，Ｄ．Ｂ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、７：５６（１９９５年）；Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．及びＳ．Ｊ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．、５１：１２（１９９５年）；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．、５：４３７（１９９４年）；並びにＡｌｉ，Ｍ．、Ｎ．Ｒ．Ｌｅｍｏｉｎｅ、及びＣ．Ｊ．Ｒｉｎｇ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１：３６７（１９９４年）。
【００８３】
キメラＣＤ１５４をコードするヌクレオチド配列
上述のように、ＴＮＦスーパーファミリーのリガンド（「ＴＮＦリガンド」）は、いくつかのドメインからなる類似２次構造をもつ（Ｋｉｐｐｓら、国際公開ＷＯ９８／７６０６１、１９９８年６月１８日公開）。ＴＮＦスーパーファミリーのリガンドのいくつかにおける、ドメイン境界を表１に示す。ヒトＴＮＦαのエックス線結晶構造に基づいて、ヒトＣＤ１５４の受容体結合部の予測二次構造が推定されている（Ｐｅｉｔｓｃｈら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、５：２３３〜２３８、１９９３年）。他のＴＮＦリガンドにおける受容体結合部の２次構造は、ヒトＴＮＦαとの比較から、コンピューター解析を用いて推論した。
【表１】
2005537785.tif 000002
＊これらのドメインは、ｃＤＮＡにおける開始メチオニンの第１ヌクレオチドを、ヌクレオチド番号１として用い、ヌクレオチドにおける各ドメインの境界を示すことで特定される。
本発明によると、ここに示されたヌクレオチド境界は、既に特定されている境界からかなり変動する可能性があるが、それでもなお本発明において有用なドメインを画定するものである。
【００８４】
ＣＤ１５４分子をコードするヌクレオチド配列が、ヒト、マウス、及びウシなどの異なった種の間で類似していることから考えて、１つの種に由来するＣＤ１５４の１つのドメイン又はサブドメインをコードするヌクレオチド配列は、別の種に由来するＣＤ１５４の対応するヌクレオチド配列と置換可能であり、それによってキメラＣＤ１５４をコードするハイブリッドポリヌクレオチド配列が得られる。
【００８５】
別の種の対応する配列と置換されるヌクレオチド配列は、機能上の理由によって選択される。即ち、選択された配列が、望ましい機能を提供若しくは修正するドメイン若しくはサブドメインをコードするか、又は標的リガンド遺伝子の望ましくない機能を排除するドメイン若しくはサブドメインをコードするという理由によって選択される。
【００８６】
ヒトＣＤ１５４の少なくとも一部が親分子から切断されて、可溶性の分子になることが当技術分野で知られている。上述のように、この可溶型は概して望ましくない。従って、タンパク質分解酵素によって認識される切断部位を含むヒトＣＤ１５４のアミノ酸又はアミノ酸配列を、この切断部位を含まない非ヒトＣＤ１５４のアミノ酸又はアミノ酸配列で置換することは、この問題を少なくとも部分的に好転させるものであろう。非ヒトＣＤ１５４は、マウスＣＤ１５４であることが好ましい。
【００８７】
本発明によると、ヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインは、ドメインＩＩＩとドメインＩＶとの境界、又は境界近くに、切断プロテアーゼによって認識、切断される少なくとも１つの、アミノ酸又はアミノ酸配列を含む。本発明によると、少なくともそのような切断部位の１つがヒトＣＤ１５４のヌクレオチド３２２から３４８、即ちアミノ酸１０８から１１６の間にある。
【００８８】
さらに、本発明によると、ヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインは、ヒトＣＤ１５４受容体（例えば、ＣＤ４０）に結合する少なくとも１つの、アミノ酸又はアミノ酸配列を含んでいる。この理由から、ＣＤ１５４の可溶性型でさえ、抗原提示細胞上でＣＤ１５４受容体に結合することができ、さらに免疫応答に活発に参加することができる。従って、自然なＣＤ１５４の受容体結合性を保持するためには、ヒトＣＤ１５４のこの細胞外領域を保存しなければならない。
【００８９】
従って、本発明の現在好ましい一実施形態は、ヒトＣＤ１５４の切断部位に対応し、かつこれを置換する非ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインをコードする第１のヌクレオチド配列を含むキメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列である。この発明によると、ＣＤ１５４切断部位を含むヒトＣＤ１５４サブドメインを、非ヒトＣＤ１５４の対応するサブドメインで置換することによって、ヒトＣＤ１５４より、顕著に切断されにくいキメラＣＤ１５４が得られる。
【００９０】
この第１のヌクレオチド配列は、ＣＤ４０リガンドなどのヒトＣＤ１５４受容体に結合するのに必要な、ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインをコードする第２のヌクレオチド配列に作用可能に連結される。このようにして、本発明によって提供されるポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１５４受容体を発現するヒト細胞に結合するキメラＣＤ１５４をコードする。
【００９１】
さらに、本発明によると、マウスＣＤ１５４又はヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインは、マウス及びヒト細胞膜上で、この分子の発現を可能にする少なくとも１つの、アミノ酸又はアミノ酸配列を含む。例えば、図９は、マウスＣＤ１５４又はヒトＣＤ１５４の両方がＨｅＬａ細胞によって発現されることを示す。しかし、マウスのＣＤ１５４は、上述のように、ヒトＣＤ１５４と比べて、より広範囲の多様な細胞によって発現され、これにはヒト細胞も含まれる。事実、マウスＣＤ１５４は、ヒトＣＤ４０＋細胞、具体的にはＣＬＬ細胞など、ヒトＣＤ１５４を通常発現しないヒト細胞でも発現されうる。ヒトＣＤ１５４とマウスＣＤ１５４との間にあるこのような発現の相違は、図９に示すデータによっても確認される。即ち、ヒトＣＤ１５４分子の発現に関わるヒトＣＤ１５４のアミノ酸又はアミノ酸配列を、非ヒト分子の発現に関わるマウスＣＤ１５４のアミノ酸又はアミノ酸配列で置換することは、この問題に対し少なくとも部分的に対処するものである。
【００９２】
従って、本発明の好ましい実施形態では、このキメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列は、マウス及びヒト細胞で、マウスＣＤ１５４分子の発現に肝要なマウスＣＤ１５４細胞外サブドメインを、さらにコードする第１のヌクレオチド配列を含む。このようにして、本発明によって提供されるポリヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ１５４を通常発現しないヒトＣＤ４０＋細胞を含めた、様々な細胞型で発現可能なキメラＣＤ１５４をコードする。この実施形態はマウスＣＤ１５４の使用に関するものであるが、本発明では、ヒト細胞で発現されうる他の非ヒトＣＤ１５４の使用も考慮される。
【００９３】
さらに、本発明によると、マウスＣＤ１５４細胞外ドメインは、マウスＣＤ１５４特異的抗体に結合するアミノ酸又はアミノ酸配列であって、そのためキメラＣＤ１５４の発現を検出するのに使用されるアミノ酸又はアミノ酸配列も含む。このようにして、キメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列の発現を、通常はＦＡＣＳ又は免疫組織学的手法によって、特異的に検出することができ、これにより自然なヒトＣＤ１５４の発現から識別できる。
【００９４】
従って、本発明の好ましい実施形態では、このキメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列は、抗マウスＣＤ１５４抗体に結合することによって、キメラＣＤ１５４の発現を検出する非ヒトＣＤ１５４細胞外サブドメインを、さらにコードする第１のヌクレオチド配列を含む。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態では、この第１のヌクレオチド配列は、非ヒトＣＤ１５４、好ましくはマウスＣＤ１５４のドメインＩＶ内サブドメインをコードする。マウスＣＤ１５４のこのサブドメインＩＶは、ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換するアミノ酸配列、マウス及びヒト細胞でマウスＣＤ１５４分子の発現に肝要なアミノ酸配列、並びに、本発明のキメラＣＤ１５４の検出に使用されるアミノ酸配列を含む。さらに、この第１のヌクレオチド配列は、ドメインＩＩＩとドメインＩＶとの境界にあるか、又はこれにすぐ隣接している非ヒトＣＤ１５４のドメインＩＩＩ内サブドメインをコードすることもできる。本発明によると、このサブドメインは、ヒトＣＤ１５４切断部位の一部を含む。
【００９６】
第１のヌクレオチド配列は、マウスＣＤ１５４のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩをさらにコードすることが好ましく、これは、この構築体によって、キメラＣＤ１５４のヒト細胞での発現が改善されることが示されているためである。別法として、第１のヌクレオチド配列は、マウスＣＤ１５４のドメインＩＩＩ若しくはそのサブドメイン、及び／又はマウスＣＤ１５４のドメインＩＩ若しくはそのサブドメイン、及び／又はマウスＣＤ１５４のドメインＩ若しくはそのサブドメインをコードすることもできる。
【００９７】
さらに、本発明によると、マウスＣＤ１５４又はヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインは、抗ＣＤ１５４抗体に結合して、それによってリガンドの免疫の活性化効果を中和できる少なくとも１つのアミノ酸又はアミノ酸配列を含む。このアミノ酸又はアミノ酸配列は、通常、ＣＤ１５４の三次構造において、ＣＤ１５４の同族受容体であるＣＤ４０に結合する領域と同じであるか、又は実質上同様である。上述のように、マウスＣＤ１５４は、抗ＣＤ１５４抗体産生において、より大きな応答を引き起こす。従って、マウスＣＤ１５４は、ヒトＣＤ１５４より、抗ＣＤ１５４抗体による結合及び中和に対する感受性がさらに高く、その結果、ヒトにおけるマウスＣＤ１５４の反復投与は、長期的に問題を引き起こすことになる。即ち、マウスＣＤ１５４を投与するか、又は、抗ＣＤ１５４抗体が結合する領域がマウス由来であるＣＤ１５４構築体を投与すると、投与されたＣＤ１５４に対する免疫原性の応答が生じ、さらにそのため、免疫応答を刺激する効果が減少する。従って、抗ＣＤ１５４抗体の結合に関わる領域をヒトＣＤ１５４にして、投与の際のどんな免疫原性効果も阻止するか又は最小に抑えることが好ましい。
【００９８】
従って、本発明の現在好ましい一実施形態は、抗ＣＤ１５４抗体が結合する細胞外サブドメインをさらにコードし、かつヒトＣＤ１５４配列である第２のヌクレオチド配列を含むキメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列である。このようにして、本発明によって提供されるポリヌクレオチド配列は、ヒトに投与した際に免疫原性がないキメラＣＤ１５４をコードする。
【００９９】
第２のヌクレオチド配列は、ヒトＣＤ１５４のドメインＩＶ内サブドメインをコードするものが好ましい。即ち、現在好ましいポリヌクレオチド配列は、マウスＣＤ１５４の別のドメインＩＶ内サブドメインに作用可能に連結したヒトＣＤ１５４のドメインＩＶ内サブドメインをコードする。
【０１００】
上述のように、ドメインＩＶはマウスＣＤ１５４のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩに連結されることが好ましい。そのような好ましいポリヌクレオチド配列の例を、本明細書で使用する際、配列番号１、３、５、７、９、及び１１として提供する。これらは、それぞれＩＳＦ３０、３２、３４、３６、３８、及び４０と名付けられたキメラＣＤ１５４構築体をコードする。下記表２は、これらのキメラ構築体が有するマウスＣＤ１５４及びヒトＣＤ１５４との相同性を表す。
【表２】
2005537785.tif 000003
【０１０１】
別法として、ドメインＩＶをヒトＣＤ１５４のドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩに連結することもできる。そのようなポリヌクレオチド配列の例を、配列番号２、４、６、８、１０、及び１２として提供する。これらは、それぞれＩＳＦ３１、３３、３５、３７、３９、及び４１と名付けられたキメラＣＤ１５４構築体をコードする。下記表３は、これらのキメラ構築体が有するマウスＣＤ１５４及びヒトＣＤ１５４との相同性を表す。
【表３】
2005537785.tif 000004
＊このシリーズの構築体は、断片１のヌクレオチド３２１と、断片２のヌクレオチド３２２との間で、ヒトＣＤ１５４には存在する２７ヌクレオチドの領域（ヌクレオチド３２２〜３４８）、即ちヒトＣＤ１５４のドメインＩＩＩとドメインＩＶの一部におおよそ対応する領域を欠失している。
【０１０２】
ＩＩＩ）キメラＣＤ１５４ポリペプチド
従って、コードされているキメラＣＤ１５４は、非ヒトＣＤ１５４第１サブドメインと、好ましくは、ヒトＣＤ１５４の切断部位を置換するマウスＣＤ１５４、及びＣＤ１５４受容体に結合するヒトＣＤ１５４第２サブドメインとを含む。この結果、このキメラＣＤ１５４は、ヒトＣＤ１５４に比べて、細胞表面から、より切断されにくくなっており、しかしそれにもかかわらず、自然なＣＤ１５４がもつ同族受容体への結合能を保持している。このように細胞表面から切断されにくくなっていることは、キメラＣＤ１５４の切断速度が、ヒトＣＤ１５４の切断速度より、少なくとも９０％は遅くなっていることに反映されている。
【０１０３】
さらに、マウスＣＤ１５４第１サブドメインは、マウス及びヒト細胞でマウスＣＤ１５４を発現するのに肝要であり、従って、ヒト細胞によるキメラＣＤ１５４の発現を可能にするものである。この結果、このキメラＣＤ１５４は、ＣＬＬ細胞も含めて、ヒトＣＤ１５４を通常発現しないヒトＣＤ４０＋細胞でも発現することができる。
【０１０４】
さらに、マウスＣＤ１５４第１サブドメインは、マウスＣＤ１５４特異的抗体に結合するため、キメラＣＤ１５４の発現を検出することが可能であり、従って、キメラＣＤ１５４の発現を、自然なヒトＣＤ１５４の発現から識別する。
【０１０５】
ヒトＣＤ１５４第２サブドメインは、抗ＣＤ１５４抗体が結合するものを含むことが好ましい。ヒトＣＤ１５４において、これらの抗体に対する感受性が低下していることを考えると、結果として得られるキメラＣＤ１５４は、免疫原性がなく、かつそれゆえに、抗体中和を引き起こさないものである。
【０１０６】
非ヒトＣＤ１５４第１サブドメインは、ドメインＩＶ内サブドメインと、ＣＤ１５４切断部位の一部に対応し、かつドメインＩＩＩ及びドメインＩＶの境界にあるか、又はこの境界にすぐ隣接しているドメインＩＩＩ内サブドメインとを含むことが好ましい。ヒトＣＤ１５４第２サブドメインも、ドメインＩＶ内サブドメインを含む。好ましい実施形態では、ドメインＩ〜ＩＩＩもマウスＣＤ１５４を含む。そのような好ましいキメラ構築体の例を、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、及び２３として提供する。これらは、ＩＳＦ３０、３２、３４、３６、３８、及び４０に対応する。下記表４は、これらのキメラ構築体が有するマウスＣＤ１５４及びヒトＣＤ１５４とのこの相同性を表す。
【表４】
2005537785.tif 000005
【０１０７】
別法として、ドメインＩ〜ＩＩＩは、ヒトＣＤ１５４を含んでもよい。そのような好ましい構築体の例を、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、及び２４として提供する。これらは、ＩＳＦ３１、３３、３５、３７、３９、及び４１に対応する。下記表５は、これらのキメラ構築体が有するマウスＣＤ１５４及びヒトＣＤ１５４との相同性を表す。
【表５】
2005537785.tif 000006
＊このシリーズの構築体は、断片１のアミノ酸１０７と、断片２のアミノ酸１０８との間で、ヒトＣＤ１５４には存在する９アミノ酸の領域（アミノ酸１０８〜１１６）、即ちヒトＣＤ１５４のドメインＩＩＩとドメインＩＶの一部におおよそ対応する領域を欠失している。
【０１０８】
遺伝子構築体
本発明では、標的細胞中でキメラＣＤ１５４を発現できる本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、又は他のどのような遺伝子構築体も考慮される。
【０１０９】
本発明において有用な発現ベクターは、哺乳類遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、又は昆虫遺伝子に由来する調節ヌクレオチド配列など、適当な転写調節ヌクレオチド配列又は翻訳調節ヌクレオチド配列に、作用可能に連結されたキメラＣＤ１５４をコードするポリヌクレオチド配列を含む。そのような調節配列には、転写プロモーター又はエンハンサー、転写を制御するオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ中のリボソーム結合部位をコードする配列、及び、転写、翻訳開始、又は転写終結を制御する適当な配列など、遺伝子発現を制御する役割をもつ配列も含まれる。
【０１１０】
特に有用な調節配列には、様々な哺乳類遺伝子、ウイルス遺伝子、微生物遺伝子、又は昆虫遺伝子に由来するプロモーター領域が含まれる。プロモーター領域は、本発明のキメラＣＤ１５４をコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつその全体を通した転写の開始を指示する。有用なプロモーター領域には、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の末端反復配列（ＬＴＲ）中に発見されたプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサー／プロモーター領域、ｌａｃプロモーター、アデノウイルスから単離されたプロモーター、及び、当業者が真核細胞、原核細胞、ウイルス、若しくは微生物細胞における遺伝子発現に有用であると理解していると思われる他の任意のプロモーターも含まれる。真核細胞中で遺伝子及びタンパク質を発現するのに有用な他のプロモーターには、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウイルスに由来するプロモーター配列及びエンハンサー配列など、哺乳類細胞プロモーター配列及びエンハンサー配列が含まれる。特に有用であるのは、ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターであり、これらは、ＳＶ４０などのウイルスにおいて、通常、ウイルス複製起点に隣接して見いだされる。当業者ならば、具体的にどの有用なプロモーターを選択するかは、正確にどの細胞系を用いるかに依存し、かつ特定の細胞系の中でポリヌクレオチド配列を発現するのに用いられる遺伝子構築体に関する、他の様々なパラメータに依存することを理解するであろう。
【０１１１】
従って、本発明で考慮されるある種の遺伝子構築体は、プロモーター配列、又はプロモーター配列及びエンハンサー配列に作用可能に連結され、かつ、メッセンジャーＲＮＡの終止及びポリアデニル化を指示するポリアデニル化配列に作用可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含む。ＣＭＶプロモーター、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を用いて、このポリヌクレオチド配列を構築することが好ましい。
【０１１２】
宿主細胞
本発明では、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター又は他の遺伝子構築体で、形質転換又は形質移入される様々な宿主細胞も考慮される。これらの宿主細胞は、原核細胞であっても、又は真核細胞であってもよい。
【０１１３】
好ましい実施形態のいくつかでは、宿主細胞は、単球、マクロファージ、及びＢ細胞など、哺乳動物の正常な抗原提示細胞である。他の好ましい実施形態では、宿主細胞は、これらの細胞に本発明のポリヌクレオチド配列を導入した際に、バイスタンダー抗原提示細胞を刺激できる正常細胞であってもよい。本発明では、本来、免疫系に抗原を提示できないが、抗原提示に必要な分子をコードする遺伝子で遺伝子操作可能な体細胞も考慮される。このような遺伝子操作は、これらの細胞が人工の抗原提示細胞として機能できるようにする。その後、これら人工の抗原提示細胞にキメラＣＤ１５４をコードするポリヌクレオチド配列を導入することもできる。特定の細胞が、細胞増殖又はリンフォカインの産生など、抗原提示細胞として機能できるか否かを判定する様々なテストは、文献を通じて周知であり、従って、本発明におけるこの態様は容易に判定できるものである。
【０１１４】
上記の正常ヒト細胞に加えて、本発明では、キメラＣＤ１５４をコードするポリヌクレオチド配列を、免疫系細胞及び固形癌細胞などの様々な腫瘍性又は悪性細胞中に導入することが考慮される。考慮されるそのような腫瘍細胞には、急性単球性白血病（ＡＭＬ）、急性骨髄単球性白血病（ＡＭＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病又は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）などの白血病細胞が含まれる。リンパ腫、神経こう腫、乳癌、子宮頚部腫よう、卵巣癌、肺癌、膀胱癌又は前立腺癌から得られた細胞も考慮される。
【０１１５】
最後に、本発明の好ましい実施形態では、キメラＣＤ１５４をコードするポリヌクレオチド配列が、ＣＤ１５４の同族受容体であるＣＤ４０を細胞表面に発現する細胞に導入される。
【０１１６】
キメラＣＤ１５４ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター及び構築体の使用方法
免疫応答の調節におけるＣＤ１５４とその同族受容体との相互作用の重要性を認識して、本発明では、キメラＣＤ１５４をコードするポリヌクレオチド配列を細胞内に導入することによって、ＣＤ４０又は他のなんらかの同族受容体に結合できる膜安定化されたリガンドの濃度を増大し、これによって、キメラＣＤ１５４が、自然なＣＤ１５４より、細胞の表面から切断されにくくなっている方法も考慮される。キメラＣＤ１５４は、タンパク質分解に対してより切断されにくいため、同族の受容体に結合して、細胞溶解反応又は免疫応答を誘導する機能が増強されている。
【０１１７】
本発明は、免疫系の標的として、又は外来の標的に対して応答する免疫系の一部として、免疫反応に参加するどんなヒト細胞にも有用である。この方法には、ポリヌクレオチド又はベクターを宿主細胞中に注入するのに用いられる、エクスビボの方法、生体内方法、及び他の様々な方法が含まれる。この方法には、腫瘍又は腫瘍床に直接注射することも含まれる。
【０１１８】
従って、本発明は、対象である動物又はヒトから細胞を単離することを含むエクスビボの方法も考慮される。単離された細胞に、本発明のキメラＣＤ１５４をコードするポリヌクレオチド配列が導入される。これらの細胞は、その後、対象の特定部位で再導入されるか、又は対象の循環系に直接再導入される。本発明の好ましい実施形態では、癌マーカーや抗原など、細胞を特定する分子を含めた、細胞表面マーカーを用いて、これらの細胞を対象から特異的に単離することができる。
【０１１９】
本発明では、最初に対象から細胞を取り除かずに、対象である動物又はヒト身体中の所望の細胞に、キメラＣＤ１５４をコードするポリヌクレオチド配列を導入することも考慮される。生体内、即ち対象の身体中の特定細胞に、ポリヌクレオチド配列を導入する方法は周知であり、これらには、発現ベクターを使用すること、及び様々な遺伝子構築体を対象に直接注射することが含まれる。通常の適用においては、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、循環系又は対象の局部に導入して、所望の細胞がベクターで特異的に感染されるようにする。他の好ましい実施形態では、対象のもつ腫瘍床にベクターが直接注射され、本発明のポリヌクレオチド配列は、腫瘍床に含まれる少なくともいくつかの細胞に導入される。
【０１２０】
本発明では、キメラＣＤ１５４をコードするポリヌクレオチド配列を含み、さらにプロモーター及びポリアデニル化配列を含むことも可能な遺伝子構築体を、対象である動物又はヒトに直接注射することも考慮される。そのような有用な方法の例は、（Ｖｉｌｅら、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ、５：５９〜６５、１９９４年）に記載されている。この遺伝子構築体は、対象である動物又はヒトの筋肉又は他の部位に直接注射することもできるし、又は対象の腫瘍又は腫瘍床に直接注射することもできる。
【０１２１】
腫瘍を治療する方法
本発明は、腫瘍を治療する方法も目的としており、この方法は、本発明のポリヌクレオチド配列を腫瘍細胞に挿入して、コードされているキメラＣＤ１５４が腫瘍細胞の表面に発現されるようにすることを含む。本発明では、ヒト腫瘍の生体内における治療、及びエクスビボにおける治療の両方が考慮される。
【０１２２】
腫瘍を治療する好ましい一方法において、この方法はさらに、最初に対象から腫瘍細胞を得るステップと、本発明のポリヌクレオチド配列をこれらの細胞に挿入して、これらの腫瘍細胞の表面にキメラＣＤ１５４が発現されるようにするステップと、これらの細胞を対象に再投与することで戻すステップとを含む。当業者ならば、形質転換した腫瘍細胞を対象に再投与するのに適用できる方法が多数あることを理解するであろう。
【実施例１】
【０１２３】
１．ヒトＨｅＬａ細胞及びＣＬＬ細胞におけるキメラアクセサリー分子リガンドの発現
ａ．キメラアクセサリー分子リガンドの遺伝子を含む遺伝子構築体及び遺伝子療法ベクターの構築
配列番号１〜配列番号１２のキメラアクセサリー分子リガンド遺伝子（別名、ＩＳＦ  ３０〜ＩＳＦ４１）は以下の通り調製され、さらにクローニングされた。
ｉ．２つの異なった遺伝子種からのドメインを用いるキメラアクセサリー分子リガンド遺伝子の調製
本発明のキメラ構築体は、遺伝子融合及び部位指定変異の、十分に特徴付けされている２つの方法で設計した。例えば、ヒトドメインＩＶ領域と、マウスドメインＩＩＩとの融合など、大きなドメインの置換は、Ｈｏ４８によって記載された遺伝子融合技法によって実施した。比較的小さい遺伝子置換又はアミノ酸置換は、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））によって記載された、「ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ」部位指定変異プロトコールによって行った。キメラＩＳＦ遺伝子は、ｐｃＤＮＡ３真核細胞発現ベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））にサブクローニングした。キメラＩＳＦインサートには、異種ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列が隣接する。
【０１２４】
ｉｉ．アデノウイルス合成
キメラＩＳＦ−ｐｃＤＮＡ３プラスミドを、制限酵素のＮｒｕｌ及びＳｍａ  Ｉで消化し、ｐＣＤＮＡ３からのＣＭＶプロモーター、キメラＣＤ１５４遺伝子、及びｐＣＤＮＡ３からのポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片を切り出した。消化したＤＮＡを１％のアガロースゲルで分離にすることにより、この断片をゲル精製した後、アデノウイルスシャトルベクターＭＣＳ（ＳＫ）ｐＸＣＸ２のＥｃｏＲＶ部位に、このＤＮＡ断片を挿入、連結した。このプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのポリリンカー配列がＥ１領域にクローニングされている、プラスミドｐＸＣＸ２の改変プラスミドである（Ｊ．Ｒ．Ｔｏｚｅｒ、ＵＣＳＤ、未公開データ、１９９３年９月）。キメラＩＳＦ−ＭＣＳ（ＳＫ）ｐＸＣＸ２プラスミドを精製した後、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のリン酸カルシウムＰｒｏｆｅｃｔｉｏｎキットを用い、製造会社の指示に従って、このシャトルプラスミド５μｇと、ＪＭ１７プラスミドの５μｇとを、２９３ＡＣ２細胞に同時導入した。形質移入に続き、これらの細胞を５日間培養して、相同組換及びウイルス合成を行わせた。その後、全細胞及び上清を採取し、凍結融解を３回行って、細胞随伴アデノウイルスの放出を行った。
【０１２５】
最初のウイルス産生に続いて、プラーク精製を行い、それによってこのウイルスのクローン性単離集団を得た。簡潔には、卓上遠心機で、５分間、１０００ｒｐｍ、遠心することにより、凍結融解したウイルス上清から残骸を除いた。その後、６ウェル組織培養プレート内に集密状態に増殖させた２９３ＡＣ２細胞を、このウイルス上清の系列希釈で、１〜２時間、感染させた。感染後培地を吸引し、細胞に、４％ウシ胎児血清と、５６℃に保持した０．６５％アガロースとを含むＤＭＥＭ培地を重層した。４〜６日間インキュベーションした後、分離しているプラークを培地１ｍｌに採取し、引き続き、ウイルスの増幅に用いた。
【０１２６】
アデノウイルスの大規模調製は、２９３ＡＣ２の量を増やしながら、連続的に、この細胞を感染させることで行った。精製したアデノウイルスは、次に塩化セシウムのステップ勾配上で精製した。この方法は、塩化セシウム勾配を利用し、密度が１．４５ｇ／ｃｍ３及び１．２０ｇ／ｃｍ３であるステップ勾配を通して、ウイルス粒子の濃縮を行う。このステップ勾配中では、２９３ＡＣ２で増殖させたウイルス試料を、ＳＷ４０ローター（ベックマン社（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）内で、４℃、２５０００ｒｐｍで２時間、遠心する。ウイルスバンドは、２７ゲージの針及びシリンジを用いて単離し、セファデックスＧ−２５のＤＮＡグレードカラム（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））を用いて脱塩した。ウイルスは、１０％グリセロールを含むリン酸緩衝食塩水に対して脱塩し、−７０℃で保存した。ウイルスの最終力価は、アニオン交換ＨＰＬＣによって測定した。
【０１２７】
ｂ．ＣＬＬ細胞及びＨｅＬａ細胞におけるキメラアクセサリー分子リガンド遺伝子の発現及び機能
ｉ．発現
（図３）は、ＨｅＬａ細胞を、各ＩＳＦ構築体をそれぞれ含むｐｃＤＮＡ３プラスミドで形質移入した後の、これらＨｅＬａ細胞における、ＩＳＦ構築体（即ち、ＩＳＦ３０〜ＩＳＦ３９）のパネルの多数の発現を示す。ＨｅＬａ細胞は、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、ＩＳＦ−ｐｃＤＮＡ３プラスミドで一過性に形質移入した。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００は、ＨｅＬａへの効率的遺伝子導入を可能とするリポソームベースの形質移入試薬である。形質移入の２日後、細胞表面におけるキメラＣＤ１５４の発現に関して、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。簡潔には、培地を吸引し、分離溶液（１０ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ、ｐＨ８）を添加することによって、接着細胞をウェルから分離した。この分離溶液は、ＣＤ１５４がトリプシン感受性部位で非特異的に切断されると、発現の評価において偽陰性となる可能性があるため、それを避けるために、より一般的であるトリプシン処理緩衝液に代わって用いられる。細胞がプレートから分離した後、細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液（３％ＦＣＳ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳからなる）で一度洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に細胞約１０７個／ｍｌに再懸濁し、５×１０５（５０μｌ）個の細胞を丸底のプラスチック製９６ウェルマイクロウェルプレートに播種した。ＣＤ１５４に特異的なＰＥ結合抗体（抗体クローンＭＲ−１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｉｎｃ．）を添加し、４℃に３０分間置いた。細胞を二度ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、データを取得するためにＦＡＣＳチューブに移した。非特異的抗体結合を対照とするために、すべての試料を適当なイソタイプ対照抗体で染色した。さらに、１０ｎｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムをすべての染色反応に添加することによって、死細胞及び残骸を分析から除外した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、細胞のＣＤ１５４発現をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１２８】
（図３）の結果は、全てのキメラＣＤ１５４ベクターが、ＣＤ１５４特異的抗体で検出可能な細胞表面リガンドとして発現されていることを示し、リガンドの全体的なタンパク質三次構造が維持されていることを示唆する。さらに、細胞表面における発現は、自然なマウスＣＤ１５４と同等であるか、又はさらに良い。
【０１２９】
ｉｉ．キメラアクセサリー分子リガンドの機能アッセイ
（図４）は、（図２）に記載したＩＳＦパネルのいくつかの構築体における、ＣＤ４０陽性細胞系の１つであるＲａｍｏｓ  Ｂ細胞を活性化する機能的能力を示す。Ｒａｍｏｓ細胞は、ＩＳＦ−ｐｃＤＮＡ３で形質移入されたＨｅＬａ細胞の上に、上述の通りに重層した。重層した１日後、接着していないラモス細胞を採取し、ＣＤ７０発現及びＣＤ９５発現をフローサイトメトリーによって分析した。これらの２つの細胞表面マーカーは、ＣＤ４０活性化後に、より高いレベルで発現されている。（Ｋａｔｏ  Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０４：９４７〜９５５、１９９９年）。このデータは、全てのＩＳＦ構築体が、自然なマウスＣＤ１５４と同程度の強度でＲａｍｏｓ細胞を活性化することを示す。これは、キメラＣＤ１５４構築体において、ＣＤ１５４の全体的なタンパク質三次構造と、受容体特異性とが維持されていることのさらなる証明である。
【０１３０】
１．ＣＤ１５４の患者抗体中和及び結合データ
（図５）は、自然なマウスＣＤ１５４の機能を中和できる抗体を含んだＣＬＬ患者血漿（第一相ＣＤ１５４臨床試験から収集した）に対する、ＩＳＦ構築体の感受性示す。簡潔には、（図３）に記載したようにＩＳＦ−ｐｃＤＮＡ３で形質移入されたＨｅＬａ細胞の上にＲａｍｏｓ細胞を重層した。同時に、ｍＣＤ１５４中和抗体を含む患者血漿を、同時インキュベーション中に添加した。１日インキュベーションした後、（図４）に記載したように、Ｒａｍｏｓ細胞を採取し、ＣＤ７０及びＣＤ９５の細胞表面発現に関して分析した。このデータは、患者血漿が、予想通り、ｍＣＤ１５４によるＲａｍｏｓの活性化を阻害することを示す。対照的に、ＩＳＦの機能は、患者血漿によって阻害されなかった。
【０１３１】
さらに、免疫原性の別の尺度として、患者血漿中のＣＤ１５４特異的抗体との結合に関して、ＩＳＦ構築体をテストした。再度、ＩＳＦ−ｐｃＤＮＡ３プラスミドで形質移入されたＨｅＬａ細胞を、患者血漿の系列希釈と共に４℃で、３０分間インキュベートした。その後、細胞から、結合していない抗体を洗い落とし、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）に特異的な蛍光標識抗体で染色した。この二次染色の後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。（図６）は、ＩＳＦ構築体それぞれに対する、（図５）に記載した患者血漿抗体の結合が、ｍＣＤ１５４に対する結合に比べ、減少していることを示す。少量の結合抗体が検出可能であるが、（図４）の結果に基づくと、これがＩＳＦ機能に有害でないことは明らかである。さらに、ＩＳＦ３０より少ない抗体結合が、ＩＳＦ３５で検出されている。これらの結果は、ＩＳＦ３５が、ＩＳＦ３０より多くのヒトＣＤ１５４領域を含む（図２参照）という事実によって説明される。まとめると、これらＩＳＦ構築体には、患者産生抗体によるリガンド中和の原因となる免疫原性領域がないため、（図５及び図６）の結果は、最適化されたＣＤ１５４構築体の評価基準を満たすものである。
【０１３２】
２．アデノウイルスを媒介としたＩＳＦ発現及び機能
ＩＳＦ導入遺伝子のそれぞれをコードする組換えアデノウイルスが、ＨｅＬａ細胞に感染して、ＩＳＦの細胞表面発現を導く活性をテストした。アデノウイルスで、感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ）比を増大させながらＨｅＬａ細胞を感染させた際の、ＨｅＬａ細胞における、選択されたＩＳＦ構築体の発現を、マウスＣＤ１５４をコードするアデノウイルス（Ａｄ−ｍＣＤ１５４）で感染させた細胞と比較して、（図７）に示す。第１に、このデータは、これらアデノウイルスベクターが無傷であり、かつ所定のＩＳＦ導入遺伝子を含むものであることを示す。第２に、このデータは、ＩＳＦ構築体がｍＣＤ１５４と少なくとも同程度の強度で発現されることをさらに確認する。従って、ＩＳＦ構築体がキメラである状態は、アデノウイルス感染及びＣＤ１５４発現に対して、高度の許容性をもつ細胞系での発現に有害とならない。
【０１３３】
（図８）は、上述のアデノウイルスベクターで感染させた後の、ＣＬＬ  Ｂ細胞における、ＩＳＦ構築体の発現を示す。ＣＬＬは、ＨｅＬａとは異なり、アデノウイルスで感染させることが困難であり、さらにヒトＣＤ１５４の発現を阻止する。図に見られるように、アデノウイルスで感染させた後、ＣＬＬ細胞において、ＩＳＦ構築体を、ｍＣＤ１５４と同様の発現強度で発現することができる。従って、これらのベクターは、ヒトＣＤ１５４の発現に対して抵抗性をもつ細胞型での発現という、最適化されたＣＤ１５４構築体のもう１つの評価基準を満たすものである。
【０１３４】
好ましいＣＤ１５４構築体に関するもう１つの評価基準として、ＣＬＬ  Ｂ細胞の細胞活性化を、（図８）に記載したＩＳＦ構築体をコードするアデノウイルスベクターで感染させた後に検査した。感染の２日後に、ＣＤ４０活性化に特有の表面マーカーのパネルでＣＬＬ細胞を染色し、マーカーに変化があるかどうかを検査した。（図９）は、これらのマーカーの発現に変化をもたらしたＩＳＦの発現を示す。これらの変化は、Ａｄ−ｍＣＤ１５４で感染させた細胞と同程度であるか、又はさらに大きいものであった。
【０１３５】
最後に、細胞によって発現された後、タンパク質分解によって可溶性分子に切断されることが知られているヒトＣＤ１５４に比べて、本発明のキメラＣＤ１５４ポリペプチドの少なくとも１つは、図１０に見られるように、有意に安定であり、かつタンパク質分解による切断に対して抵抗性をもつ。ＨｅＬａ細胞は、感染させなかったか、或いは、ヒトＣＤ１５４又はＩＳＦ３５のどちらかをコードするアデノウイルスにＭＯＩ  １０で感染させた。感染の２日後、培養上清を収集し、可溶性リガンドが存在するかどうか、ヒトＣＤ１５４特異的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）を用いて測定した。可溶性ＣＤ１５４の量は、このＥＬＩＳＡ（Ａｎｃｅｌｌ  Ｉｎｃ．）において、既知量の可溶性ＣＤ４０リガンド−ＣＤ８融合タンパク質の滴定に基づいて計算した。上清で検出された可溶性リガンドの量を、図１０の棒グラフに示した。可溶性ＩＳＦ３５が検出できないため、この図は、可溶性リガンドを遊離するタンパク質分解による切断に対して、ＩＳＦ３５が抵抗性をもつことを示すものである。対照的に、ヒトＣＤ１５４は容易に可溶性ＣＤ１５４へと切断され、その濃度が＞１２０ｎｇ／ｍｌに達している。さらに、細胞表面におけるＩＳＦ３５の発現が図６に示したものと類似のレベルにあることが、感染ＨｅＬａ細胞のＦＡＣＳ分析によって示されているため、ＨｅＬａ細胞によるＩＳＦ３５発現の不足によって、このような可溶性ＩＳＦ３５の欠如が起きているのではないといえる。
【０１３６】
好ましい方法及び装置の実施形態を示し、かつ説明したが、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、多様な変更を行えることが当業者には明らかであるだろう。本発明は、請求の範囲及びその法的均等物による場合を除き、限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】本発明のキメラＣＤ１５４をコードする例示的ポリヌクレオチドを示し、またキメラＣＤ１５４の特定の特性に関連するサブドメインの位置を指し示す概略図である。マウスＣＤ１５４に由来するドメイン又はサブドメインには、陰影がついている。
【図２】本発明の例示的キメラＣＤ１５４ポリペプチド（即ち、ＩＳＦ３０〜ＩＳＦ３９）の発現を、マウスＣＤ１５４（ｍＣＤ１５４）、及びＣＤ１５４を含まない対照プラスミドｐｃＤＮＡ３と比較して示す一連の蛍光活性化細胞併別（ＦＡＣＳ）ヒストグラムである。ｍＣＤ１５４及び各ＩＳＦ構築体を含むｐｃＤＮＡ３プラスミドで、ＨｅＬａ細胞を形質移入した後、発現を測定した。陰影がついた領域は、形質移入されていないＨｅＬａ細胞の発現を示し、陰影がついていない領域は、形質移入されたＨｅＬａ細胞の発現を示す。
【図３】細胞表面表現型マーカーＣＤ７０及びＣＤ９５のＲａｍｏｓ  Ｂ細胞による発現を活性化する機能的能力であって、本発明の例示的キメラＣＤ１５４ポリペプチド（即ち、ＩＳＦ３０〜ＩＳＦ３９）で形質移入されたＨｅＬａ細胞の機能的能力を、マウスＣＤ１５４（ｍＣＤ１５４）、及びＣＤ１５４を含まない対照プラスミドと比較して示す一連のＦＡＣＳヒストグラムである。陰影がついた領域は、非活性化細胞による細胞表面マーカーの発現を示し、細線下の陰影がついてない領域は、対照ｐｃＤＮＡ３プラスミドで形質移入されたＨｅＬａ細胞によって活性化されたＢ細胞による細胞表面マーカーの発現を示す。また、太線下の陰影がついてない領域は、ｍＣＤ１５４又はＩＳＦ構築体で形質移入されたＨｅＬａ細胞によって活性化されたＢ細胞による細胞表面マーカーの発現を示す。
【図４】自然なマウスＣＤ１５４の機能を中和できる、患者血漿中の抗体の結合に対する感受性であって、本発明の例示的キメラＣＤ１５４ポリペプチド（即ち、ＩＳＦ３０〜ＩＳＦ３９）の感受性を、マウスＣＤ１５４（ｍＣＤ１５４）、及びヒトＣＤ１５４（ｈＣＤ１５４）と比較して示す一連のＦＡＣＳヒストグラムである。この感受性は、Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞と、ｍＣＤ１５４又は例示的ＩＳＦ構築体の１つを含むｐｃＤＮＡ３プラスミドで形質移入されたＨｅＬａ細胞とを同時インキュベーションし、中和抗体を含む血漿を添加し、約１日のインキュベーションの後に、Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞を採集し、ＣＤ７０及びＣＤ９５細胞表面マーカーの発現分析を行うことによって測定した。陰影がついた領域は、形質移入されていないＨｅＬａ細胞とＲａｍｏｓ細胞をインキュベートしたため、活性化されていない細胞表面マーカーの発現を示し、細線下の陰影がついていない領域は、抗体を含む血漿とインキュベートされた細胞における細胞表面マーカーの発現を示す。また、太線下の陰影がついた領域は、血漿とインキュベートされなかった細胞における細胞表面マーカーの発現を示す。
【図５】ＣＤ１５４の機能を中和できる患者血漿中の抗体に対する感受性であって、本発明の選択されたキメラＣＤ１５４ポリペプチド（ＩＳＦ３０及びＩＳＦ３５）の感受性を、マウスＣＤ１５４（ｍＣＤ１５４）、及び対照プラスミドと比較して示す一連のＦＡＣＳヒストグラムである。この感受性は、ｍＣＤ１５４、ＩＳＦ３０、及びＩＳＦ３５を含むｐｃＤＮＡ３プラスミドでＨｅＬａ細胞を形質移入し、中和抗体を含む患者血漿と形質移入された細胞をインキュベートした後に測定した。陰影がついた領域は、血漿とインキュベートされなかった細胞に結合した抗体の量を示し、陰影がついていない領域は、血漿とインキュベートされた細胞に結合した抗体の量を示す。
【図６】感染多重度（ＭＯＩ）比を増大させながら、ｍＣＤ１５４、ＩＳＦ３２、及びＩＳＦ３５を含むアデノウイルスベクターでＨｅＬａ細胞を感染させた際の、本発明の選択されたキメラＣＤ１５４ポリペプチド（ＩＳＦ３２及びＩＳＦ３５）のＨｅｌａ細胞における発現を、マウスＣＤ１５４（ｍＣＤ１５４）と比較して示す一連のＦＡＣＳヒストグラムである。陰影がついた領域は、感染させられていないＨｅＬａ細胞の発現を示し、陰影がついていない領域は、上記のアデノウイルスベクターで感染されたＨｅＬａ細胞の発現を示す。
【図７】ｍＣＤ１５４、ＩＳＦ３２、及びＩＳＦ３５を含むアデノウイルスベクターで感染させた後の、ＣＬＬ  Ｂ細胞による、本発明の選択されたＣＤ１５４ポリペプチド（ＩＳＦ３２及びＩＳＦ３５）の発現を、マウスＣＤ１５４（ｍＣＤ１５４）及び非感染細胞と比較して示す一連のＦＡＣＳヒストグラムである。陰影がついた領域は、感染させられていないＣＬＬ  Ｂ細胞の発現を示し、陰影がついていない領域は、上記のアデノウイルスベクターで感染されたＣＬＬ  Ｂ細胞の発現を示す。
【図８】本発明の選択されたＣＤ１５４ポリペプチド（ＩＳＦ３２及びＩＳＦ３５）を発現するＨｅＬａ細胞と、同時培養されたＣＬＬ  Ｂ細胞の活性化を、マウスＣＤ１５４（ｍＣＤ１５４）と比較して示す一連のＦＡＣＳヒストグラムである。この活性化は、細胞表面表現型マーカーであるＣＤ８０、ＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ５４、及びＣＤ２７の発現における、ＣＤ４０活性化に特有な変化を検出することによって測定した。陰影がついた領域は、活性化されていないＣＬＬ  Ｂ細胞の細胞表面マーカーの発現を示し、細線下の陰影がついていない領域は、ＣＤ１５４を含まない対照アデノウイルスＡＤ−ＬａｃＺで形質移入されたＨｅＬａ細胞と同時培養したＣＬＬ  Ｂ細胞の活性化を示す。また、太線下の陰影がついていない領域は、ｍＣＤ１５４、ＩＳＦ２３、及びＩＳＦ３５で形質移入されたＨｅＬａと同時培養されたＣＬＬ  Ｂ細胞の活性化を示す。
【図９】ＨｅＬａ細胞及びＣＬＬ  Ｂ細胞を形質移入にした後の、本発明の選択されたＣＤ１５４ポリペプチド（ＩＳＦ５、ＩＳＦ１２、ＩＳＦ２４、及びＩＳＦ３２）の発現を、ヒトＣＤ１５４及びマウスＣＤ１５４と比較して示す一連のＦＡＣＳヒストグラムである。陰影がついた領域は、形質移入されていない細胞における発現を示し、陰影がついていない領域は、おのおの指定されたＩＳＦ構築体で形質移入された細胞における発現を示す。この図は、ヒトＣＤ１５４及びマウスのＣＤ１５４と同様に、選択されたＩＳＦ構築体も、ＨｅＬａ細胞で発現されることを示す。しかし、この図は、ＣＬＬ  Ｂ細胞が通常、マウスＣＤ１５４の発現を阻止しないが、ヒトＣＤ１５４の発現を阻止することも確認する。ＣＬＬ  Ｂ細胞は、２つのＩＳＦ構築体、即ち、完全にマウスＣＤ１５４からなるドメインＩＶをもつＩＳＦ５と、大部分がマウスＣＤ１５４からなるドメインＩＶをもつＩＳＦ３２とを発現する。これは、ＣＬＬ  Ｂ細胞におけるマウスＣＤ１５４の発現を可能にする調節要素が、ドメインＩＶ領域に局在していることを示す。従って、ＩＳＦ１２及びＩＳＦ２４はＣＬＬ  Ｂ細胞であまり発現されないが、これはＩＳＦ１２のドメインＩＶが完全にヒトＣＤ１５４からなり、一方、ＩＳＦ２４のドメインＩＶはマウスＣＤ１５４も含むが、ＣＬＬ細胞でのこの分子の発現を調節する領域を包含するヒトＣＤ１５４の領域も含むためである。
【図１０】本発明の選択されたＣＤ１５４ポリペプチド（ＩＳＦ３５）及びヒトＣＤ１５４を有するアデノウイルスで、ＨｅＬａ細胞を感染させた２日後に生成された可溶性リガンドの量を示す棒グラフである。生成された可溶性ＣＤ１５４の量は、ヒトＣＤ１５４特異的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）を用いて検出し、このＥＬＩＳＡにおける、既知量の可溶性ＣＤ４０リガンド−ＣＤ８融合タンパク質の滴定に基づいて計算した。このグラフは、ＩＳＦ３５が、可溶性ＩＳＦ３５を生む切断に対して耐性をもつことを、可溶性ＣＤ１５４を生むヒトＣＤ１５４の切断、及び非感染細胞における可溶性ＣＤ１５４の不在と比較して示す。ＩＳＦ３５は、切断に対して、有意に強い抵抗性をもち、可溶性ＩＳＦ３５を全く生成しない。対照的に、ヒトＣＤ１５４は容易に可溶性ＣＤ１５４に切断され、その濃度が＞１２０ｎｇ／ｍｌに達している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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