(57)【要約】ウイルス、バクテリア（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノ細菌、クラミディア、リケッチアなどのような細胞間および細胞内のバクテリアを含む）、酵母、カビ、真菌、プリオン、または単独または組み合わせてＴＳＥの原因となる同様のもの、および単細胞もしくは多細胞の寄生生物など、１種以上の活性な生物学的汚染物質または病原体のレベルを低下させるためのアルブミン含有製剤を殺菌する方法が開示される。これらの方法は、血漿タンパク質画分などのアルブミン含有製剤を照射によって殺菌することを含む。
2005505552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線感受性のアルブミン含有製剤を殺菌する方法であって、該方法が、
（ｉ）前記アルブミン含有製剤に、前記アルブミン含有製剤を前記放射線から保護するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を加える工程と、
（ｉｉ）前記アルブミン含有製剤を、前記アルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合の適当な放射線で照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
放射線感受性のアルブミン含有製剤を殺菌する方法であって、該方法が、
（ｉ）前記アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を、前記アルブミン含有製剤を前記放射線から保護するのに有効なレベルまで減少させる工程と、
（ｉｉ）前記アルブミン含有製剤を、前記アルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合の適当な放射線で照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
放射線感受性のアルブミン含有製剤を殺菌する方法であって、該方法が、
（ｉ）前記アルブミン含有製剤の温度を、前記アルブミン含有製剤を放射から保護するのに有効なレベルまで低下させる工程と、
（ｉｉ）前記アルブミン含有製剤を、前記アルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合の適当な放射線で照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
放射線感受性のアルブミン含有製剤を殺菌する方法であって、該方法が、
（ｉ）（ａ）前記アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を減少させること、
（ｂ）前記アルブミン含有製剤の温度を低下させること、および
（ｃ）前記アルブミン含有製剤に少なくとも１種の安定剤を加えること
からなる群から選択される少なくとも１種の安定化方法をアルブミン含有製剤に適用する工程と、
（ｉｉ）前記アルブミン含有製剤を、前記アルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合の適当な放射線で照射する工程と
を含み、前記少なくとも１種の安定化方法と照射の割合が共にアルブミン含有製剤を前記放射線から保護するのに有効であることを特徴とする方法。
【請求項５】
放射線感受性のアルブミン含有製剤を殺菌する方法であって、該方法が、
（ｉ）（ａ）アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を減少させること、
（ｂ）アルブミン含有製剤の温度を低下させること、および
（ｃ）アルブミン含有製剤に少なくとも１種の安定剤を加えること
からなる群から選択される少なくとも２種の安定化方法をアルブミン含有製剤に適用する工程と、
（ｉｉ）前記アルブミン含有製剤を、前記アルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合の適当な放射線で照射する工程と
を含み、前記少なくとも２種の安定化方法が共にアルブミン含有製剤を前記放射線から保護するのに有効であり、さらに、少なくとも２種の安定化方法を任意の順で実行してもよいことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記溶媒は水であることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記残留水分含有量を有機溶媒の添加によって減少させることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記溶媒は有機溶媒であることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項９】
前記残留溶媒含有量を減少させた後に前記アルブミン含有製剤を有機溶媒に懸濁させることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項１０】
前記有効な割合は約３．０ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１１】
前記有効な割合は約２．０ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１２】
前記有効な割合は約１．０ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１３】
前記有効な割合は約０．３ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１４】
前記有効な割合は約３．０ｋＧｙ／時間より大きいことを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１５】
前記有効な割合は少なくとも約６．０ｋＧｙ／時間であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１６】
前記有効な割合は少なくとも約１８．０ｋＧｙ／時間であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１７】
前記有効な割合は少なくとも約３０．０ｋＧｙ／時間であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１８】
前記有効な割合は少なくとも約４５ｋＧｙ／時間であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルブミン含有製剤を低酸素雰囲気中に維持することを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項２０】
前記アルブミン含有製剤を少なくとも１種の希ガスを含む雰囲気中に維持することを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項２１】
前記希ガスはアルゴンであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルブミン含有製剤を真空中に維持することを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項２３】
前記残留溶媒含有量を凍結乾燥、乾燥、濃縮、溶質の添加、蒸発、化学抽出、噴霧乾燥およびガラス化からなる群から選択される方法により低下させることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項２４】
前記残留溶媒含有量は、約１５％未満であることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項２５】
前記残留溶媒含有量は、約１０％未満であることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項２６】
前記残留溶媒含有量は、約３％未満であることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項２７】
前記残留溶媒含有量は、約２％未満であることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項２８】
前記残留溶媒含有量は、約１％未満であることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項２９】
前記残留溶媒含有量は、約０．５％未満であることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項３０】
前記残留溶媒含有量は、約０．０８％未満であることを特徴とする請求項２、４または５に記載の方法。
【請求項３１】
前記アルブミン含有製剤を照射する前記工程の前に、少なくとも１種の増感剤を前記アルブミン含有製剤に添加することを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項３２】
前記アルブミン含有製剤は、ウイルス、バクテリア、酵母、カビ、真菌、プリオンまたは単独または組み合わせてＴＳＥの原因となる同様の作用因、および単細胞もしくは多細胞の寄生生物からなる群から選択される少なくとも１種の生物学的汚染物質または病原体を含むことを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１種の安定剤は酸化防止剤であることを特徴とする請求項１、４または５に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種の安定剤は遊離基捕捉剤であることを特徴とする請求項１、４または５に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種の安定剤は組合せ安定剤であることを特徴とする請求項１、４または５に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１種の安定剤はリガンドであることを特徴とする請求項１、４または５に記載の方法。
【請求項３７】
前記リガンドはヘパリンであることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１種の安定剤は、反応性酸素種による損傷を低減させることを特徴とする請求項１、４または５に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１種の安定剤は、アスコルビン酸またはその塩もしくはエステル；グルタチオン；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；尿酸またはその塩もしくはエステル；メチオニン；ヒスチジン；Ｎ−アセチルシステイン；リポ酸；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；没食子酸またはその誘導体；没食子酸プロピル、およびこれらの２種以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１、４または５に記載の方法。
【請求項４０】
前記２種以上の追加の安定剤の前記混合物は、アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと尿酸またはその塩もしくはエステルの混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと、尿酸またはその塩もしくはエステルと、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；尿酸またはその塩もしくはエステルの混合物；リポ酸；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；没食子酸またはその誘導体；没食子酸プロピル；ならびに、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１種の安定剤は、ジペプチド安定剤であることを特徴とする請求項１、４または５に記載の方法。
【請求項４２】
前記ジペプチド安定剤は、グリシルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、カルノシンおよびアンセリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記放射線は粒子線または電磁放射線あるいはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項４４】
前記電磁放射線は、電波、マイクロ波、可視および不可視光、紫外線、Ｘ線、γ線およびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記放射はγ線であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項４６】
前記放射は電子ビーム線であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項４７】
前記放射は可視光であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項４８】
前記放射は紫外線であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項４９】
前記放射はＸ線であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項５０】
前記放射は多色の可視光であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項５１】
前記放射は多色の赤外線であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項５２】
前記放射線は可視光および紫外線の１つ以上の波長の組合せであることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項５３】
前記照射は周囲温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項５４】
前記照射は周囲温度より低い温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項５５】
前記照射は前記アルブミン含有製剤の凝固点より低い温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項５６】
前記照射は前記アルブミン含有製剤の共融点より低い温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項５７】
前記照射は周囲温度より高い温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、４または５に記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも１種のアルブミン含有製剤と、放射線による殺菌後の所期の使用のために前記アルブミン含有製剤を保存するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５９】
少なくとも１種のアルブミン含有製剤を含む組成物であって、前記アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量が、放射線による殺菌の後の所期の使用のためにアルブミン含有製剤を保存するのに有効なレベルであることを特徴とする組成物。
【請求項６０】
前記残留溶媒含有量は、約１５％未満であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項６１】
前記残留溶媒含有量は、約１０％未満であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項６２】
前記残留溶媒含有量は、約５％未満であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項６３】
前記残留溶媒含有量は、約２％未満であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項６４】
前記残留溶媒含有量は、約１％未満であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項６５】
前記残留溶媒含有量は、約０．５％未満であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項６６】
前記残留溶媒含有量は、約０．０８％未満であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項６７】
前記アルブミン含有製剤はガラス質であるかまたはガラス化されていることを特徴とする請求項５８または５９の組成物。
【請求項６８】
前記アルブミン含有製剤は、モノクローナル免疫グロブリン、ポリクローナル免疫グロブリン、グリコシダーゼ、スルファターゼ、ウロキナーゼ、トロンビンおよびファクターＶＩＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質をさらに含むことを特徴とする請求項５８または５９の組成物。
【請求項６９】
前記アルブミン含有製剤のタンパク質濃度は少なくとも約０．５％であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項７０】
前記アルブミン含有製剤のタンパク質濃度は少なくとも約１％であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項７１】
前記アルブミン含有製剤のタンパク質濃度は少なくとも約５％であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項７２】
前記アルブミン含有製剤のタンパク質濃度は少なくとも約１０％であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項７３】
前記アルブミン含有製剤のタンパク質濃度は少なくとも約１５％であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項７４】
前記アルブミン含有製剤のタンパク質濃度は少なくとも約２０％であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項７５】
前記アルブミン含有製剤のタンパク質濃度は少なくとも約２５％であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項７６】
前記アルブミン含有製剤のタンパク質濃度は少なくとも約５０％であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項７７】
前記アルブミン含有製剤のタンパク質濃度は前記アルブミン含有製剤を放射線から保護するのに有効であることを特徴とする請求項５９の組成物。
【請求項７８】
前記アルブミン含有製剤は、前記残留溶媒含有量を減少させた後に、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項７９】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする血液量減少性ショックを治療する方法。
【請求項８０】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする火傷を治療する方法。
【請求項８１】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする心肺バイパス術を受けているヒトにおいて流体量を維持する方法。
【請求項８２】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする急性肝不全を治療する方法。
【請求項８３】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする、急性腹膜炎、膵臓炎、縦隔炎および過剰蜂巣炎、からなる群から選択される症状に罹患している患者においてタンパク質に富んだ流体の隔離を防止する方法。
【請求項８４】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする低アルブミン血症を治療する方法。
【請求項８５】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする浮腫を伴うかまたは浮腫を伴わない低蛋白血症を治療する方法。
【請求項８６】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする成人呼吸窮迫症候群を治療する方法。
【請求項８７】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする新生児の溶血性疾病を治療する方法。
【請求項８８】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする急性ネフローゼを治療する方法。
【請求項８９】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする腎臓透析を受けているヒトにおいてショック症状または低血圧を防止する方法。
【請求項９０】
火傷、粉砕性外傷、腹部の急性症状、脱水症、感染または赤血球ではなく血漿流体の損失が主である他の原因によるショックを治療する方法であって、該方法が請求項１、２、３、４または５の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項９１】
請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤の有効量を、それを必要とするヒトに投与することを特徴とする、出血によるショックを治療する方法。
【請求項９２】
細胞を培養する方法の改良であって、前記改良が請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤を前記細胞の成育媒地に添加することを特徴とする改良。
【請求項９３】
細胞を培養することにより細胞代謝産物を生産する方法の改良であって、請求項１、２、３、４または５の方法によって殺菌された前記アルブミン含有製剤を細胞の成育媒地に添加することを特徴とする改良。
【請求項９４】
前記産物はタンパク質であることを特徴とする請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記産物は組換えタンパク質であることを特徴とする請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記アルブミン含有製剤は、ヘモグロビン、アンチトロンビンＩＩＩ、多糖、ワクチン、コラーゲン、ゼラチン、トリプシン、ウシ胎児血清、トランスフェリン、インシュリン、ヒト成長ホルモン、ファクターＩＸ、フィブリノーゲン、ファクターＸＩＩＩ、ファクターＸＩＩＩａ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩａ、成長因子、免疫毒素、骨形態形成タンパク質、骨形成タンパク質、サイトカイン、ファクターＸＩおよび血漿からなる群から選択される少なくとも１つの生物学的材料をさらに含むことを特徴とする請求項５８または５９に記載の組成物。
【請求項９７】
前記アルブミン含有製剤は、心臓弁、皮膚、骨、血管、神経、靭帯および角膜からなる群から選択される少なくとも１つの組織をさらに含むことを特徴とする請求項５８または５９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルブミン含有製剤を殺菌し、その中に存在する、ウイルス、細菌（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチアのような）細胞間−および細胞内細菌）、酵母、カビ、真菌、プリオンもしくはＴＳＥに対して単独もしくは組み合わせて応答しうる同様の作用因および／または単細胞もしくは多細胞の寄生生物のような活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下させる方法に関する。本発明は、特に、血漿タンパク質画分（ＰＰＦ）産物のようなアルブミン含有製剤を照射により殺菌する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルブミンは、高度に可溶性である楕円状のタンパク質（ＭＷ６６，５００）であり、血漿のコロイド浸透圧の７０〜８０％を占める。従って、アルブミンは、循環血液量を調節するのに重要である。静脈内注射されると、５％アルブミンは、注入された容積とほぼ等しい量まで循環血漿量を増加する。この余分の流体は、血液濃縮を弱め、血液の粘度を低下させる。容積の膨張の程度および持続時間は初期の血液量に依存する。血液量の減少を伴う患者の治療をする場合、注入されたアルブミンの効果は、多くの時間にわたって持続する。正常な血液量の個体では、血液希釈は非常に短時間続く。
【０００３】
アルブミンはまた、輸送タンパク質であり、天然に存在し、治療用であり、且つ循環中に毒性の物質に結合する。
【０００４】
アルブミンは、細胞外の水の至る所に分布し、６０％を超える身体アルブミンのプールが血管外液区画にある。７０ｋｇの男性の身体アルブミン総量は、約３５０ｇであり、循環の寿命は１５〜２０日であり、ターンオーバー１日当たり約１５ｇである。
【０００５】
末梢の浮腫を防止または逆転させるために必要な最小の血清アルブミンレベルは未知である。明らかに、これは患者間で変動するが、デシリットル当たり２．５ｇ近辺であるという幾つかの証拠がある。この濃度は２０ｍｍＨｇの血漿浸透圧を提供する（５．２ｇ／ｄＬの全タンパク質濃度と等価である。）。
【０００６】
血漿タンパク質画分を含むアルブミン含有製剤は、度々治療用にヒトおよび動物に提供される。例えば、アルブミン含有製剤は、しばしば、１以上の以下の徴候に対してヒトに投与される。ショックを伴うかまたは伴わない血液量減少；アルブミンの不十分な産生（栄養不良、やけど、重い傷害、先天性無アルブミン血症、肝疾患、感染、悪性腫瘍、または内分泌障害による）から生じうる低アルブミン血症（hypoalbumenimia）、過度の異化（やけど、重い傷害、膵炎、甲状腺中毒症、天疱瘡、またはネフローゼによる）、身体からのアルブミンの損失（出血、過剰な腎排泄、やけどによる滲出、滲出性腸疾患、または剥脱性皮膚病による）および／または身体内のアルブミン再配分（生命の危険を伴う手術、腹水を伴う硬変、または種々の炎症性症状による）；心肺バイパス手術前またはその手術中；およびやけとおよび硬変の治療。
【０００７】
治療用途のためのアルブミンを含有する多くの異なる製剤が市販されているか、または市販されていた。これらには、例えばＡｌｂｕｍｉｎａｒ（登録商標）（Ｃｅｎｔｅｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、Ｂｕｍｉｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐｌａｓｂｕｍｉｎ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（Ａｌｐｈａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）、アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）（Ｈｕｍａｎ）（Ｉｍｍｕｎｏ−ＵＳ）、Ａｌｂｕｍａｒｃ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ）、およびヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｗｉｓｓ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ）が含まれる。種々の血漿タンパク質画分製品も市販されているか、または市販されていた。これらには、例えばＰｌａｓｍａ−Ｐｌｅｘ（登録商標）（Ｃｅｎｔｅｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、Ｐｒｏｔｅｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）およびＰｌａｓｍａｔｅｉｎ（登録商標）（Ａｌｐｈａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）が含まれる。
【０００８】
アルブミンはまた、治療用途を意図した天然または組み換えのタンパク質製剤中に安定剤として使用される。例えば、アルブミンは現在、血友病Ａ用のファクターＶＩＩＩを含有する治療用製剤（例えばＢａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ／ＩｍｍｕｎｏからのＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標））、多発性硬化症用のインターフェロンβ−１ｂを含有する治療用製剤（例えば、Ｂｅｒｌｅｘ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））、貧血用のエリスロポエチンを含有する治療用製剤（例えば、ＡｍｇｅｎからのＥｐｏｇｅｎ（登録商標））、ゴーシェ病用の酵素、すなわちβ−グルコセレブロシダーゼの修飾形態であるアルグルセラーゼを含有する治療用製剤（例えば、ＧｅｎｚｙｍｅからのＣｅｒｅｄａｓｅ（登録商標））および遺伝性の欠損症用のアンチトロンビンＩＩＩを含有する治療用製剤（例えば、ＢａｙｅｒからのＴｈｒｏｍｂａｔｅ  ＩＩＩ（登録商標）またはＰａｒｍａｃｉａ＆ＵｐＪｏｈｎからのＡｔｎａｔｉｖ（登録商標））に安定剤として見出される。このような製剤中には、アルブミンは全タンパク質含量の９９％超を占める。
【０００９】
アルブミンはまた、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルスワクチン、および、麻疹、おたふくかぜおよび風疹の生ウイルスワクチン（例えば、ＭｅｒｃｋからのＭＭＲII（登録商標））、狂犬病ワクチン（例えば、ＣｈｉｒｏｎからのＲａｂＡｖｅｒｔ（登録商標）およびＰａｓｔｅｕｒ−ＭｅｒｉｅｕｘからのＩｍｏｖａｘ（登録商標））および経口ポリオワクチン（Ｅｖａｎｓ／ＭｅｄｅｖａからのＥｖａｎｓ  Ｐｏｌｉｏ  Ｖａｃｃｉｎｅ（登録商標））のようなワクチン製剤中に安定剤として見出される。再度言うが、このような製剤中に、アルブミンは全タンパク質含量の９９％超を占める。
【００１０】
アルブミン含有製剤は、所望の生成物を産生する細胞（組み換え体またはその他のもの）の培養物を含めた細胞培養用の培地中、およびワクチン製造の栄養素配合物としても使用される。このような製剤は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＩｎｔｅｒｇｅｎおよびＶａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌから市販されている。
【００１１】
ヒト、獣医学、診断および／または実験の用途で調製されたアルブミンを含有する多くの製剤には、不要であり、潜在的に危険な生物学的汚染物または病原体、例えば、ウイルス、細菌（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチアのような細胞外および細胞内の細菌を含む）、酵母、カビ、真菌、プリオン、またはＴＳＥおよび／または単細胞しくは多細胞寄生生物に単独もしくは組み合わせて応答しうる同様の作用因が含有される。したがって、生物学的材料中の任意の生物学的汚染物または病原体を、その製品を使用する前に不活性化することが最も重要である。例えば輸血、血液因子の置換治療、器官の移植、並びに、静脈内、筋肉内または注射もしくは導入の他の形態によって矯正されるかまたは治療されるヒトの治療の他の形態で、患者にその製品を直接投与することになっている場合、これは特に重大である。さらに、これは、様々な種類の血漿および／または血漿誘導体または他の生物学的材料を含有し、かつマイコプラズマ、プリオン、細菌性、ウイルス性および他の生物学的汚染物もしくは病原体にさらされうる細胞または組み換え細胞の培地で、またはこれらの培養物を介して調製される、様々な生物学的材料にとって重要なことである。
【００１２】
生物学的材料を製造するほとんどの方法は、この材料から１以上の汚染物または１以上の病原体を除去または不活性化するのではなく、むしろこの材料を特定の生物学的汚染物についてスクリーニングまたは試験する方法を含む。生物学的汚染物または病原体について陽性の試験結果が出る材料は単に使用しない。スクリーニングの手順の例には、血液提供者から得られたヒト血液中の特定のウイルスについて試験することが含まれる。しかしながら、かかる手順には必ずしも信頼性があるとは限らず、特に非常に数が少ない一定のウイルスの存在を検出することはできない。このことは、偽陰性結果に関連する結果を考慮すれば、試験の評価または確実性を下げる。偽陰性の結果は、ある場合、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の場合には、生命にかかわり得る。さらに、一部の事例では、製品が汚染されているか否かを検出するのに、数か月ではないにしても、数週間かかることがある。したがって、生物学的材料を製造する間および／またはその製造後に汚染物または病原体を殺すかまたは不活性化する技術を適用することが望まれるであろう。
【００１３】
更に、今日まで、生物学的材料内のプリオンを特定するための信頼性のある試験またはアッセイであって、潜在的なドナーまたは感染材料を洗い出すのに適したものは存在しない。これは、その材料の所望の活性をそのまま維持しながら生物学的材料内のプリオンを破壊する効果的な手段の必要性を高める役割を果たす。
【００１４】
ウイルスを不活性化する技術の可能性を判定する実験を行う場合、関係がある実際のウイルスはほとんど利用されない。これは、試験を行う者に対する安全性への配慮と、封じ込めの設備および廃棄物処理に関連する困難性と経費が主因である。それらのかわりに、同一のファミリーおよびクラスのモデルウイルスを使用する。
【００１５】
一般に、不活性化するのが最も困難なウイルスは、タンパク質からできている外部シェルをもつものであり、しかも、それらの中で、不活性化するのが最も困難なものは、最小サイズのものであることが認められている。このことは、それらウイルスの小型サイズが、これらの小さなゲノムに起因しているので、γ線照射および他のほとんどの照射の形態において真実であることが明らかとなっている。分子に対する放射線の直接的効果の規模は、分子のサイズに正比例し、標的分子が大きくなるほど、効果が大きくなる。推論のとおり、γ線照射は、ウイルスゲノムが小さいほど、ウイルスを不活性化するのに必要な放射線量は高くなることが明らかとなった。
【００１６】
ヒトおよび動物に由来する生物学的材料について懸念すべきウイルスのうち、最小であり、そのため最も不活性化が困難であるものは、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のファミリーと、わずかに大きいタンパク質で被覆された肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）に属するものである。ヒトにおいては、パルボウイルスＢ１９とＡ型肝炎は重要な病原体である。ブタ由来の材料では、対応する最小のウイルスはブタパルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）である。このウイルスはヒトに無害であるので、ヒトＢ１９パルボウイルスとＡ型肝炎のモデルウイルスとして選択されることが多い。このモデルパルボウイルスの不活性化の実証が、用いられている方法がヒトＢ１９ウイルスとＡ型肝炎を死滅させる適切な証拠となり、さらに、拡大解釈すると、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、その他のものなどの大型で、それほど耐久性がないウイルスを死滅させる適切な証拠となると考えられる。
【００１７】
より最近の取り組みでは、製品中の汚染物を除去または不活性化する方法に的が絞られてきた。かかる方法には、熱処理、濾過、ならびに製品への化学不活性化剤または化学増感剤の添加が含まれる。
【００１８】
米国食品医薬品局の現在の基準では、アルブミン含有製剤の熱処理は、感受性のある生物学的材料に損傷を与えることができる、最小で約１０時間、約６０℃まで加熱されることが必要である。実際に、熱不活性化は、ある生物学的材料の５０％以上の生物活性を無効化する可能性がある。
【００１９】
濾過には、物理的に汚染物を除去するために製品を濾過することが含まれる。残念ながら、またこの方法により、高分子量を有する製品も除去されるかもしれない。さらに、ある場合には、小型ウイルスはフィルタによって除去されないかもしれない。
【００２０】
化学増感の方法には、ウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡに結合する有害な薬剤、および、ＵＶまたは放射線のいずれかによって活性化される有害な薬剤の添加が含まれる。この放射線は、ウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡに結合する、ＤＮＡ／ＲＮＡバックボーン中の化学結合を切断する、および／またはウイルスがもはや自己複製することができないようにこれを架橋結合もしくは複合体化する、反応性中間体および／または遊離基を生じさせる。この手順では、増感剤が有毒であり、変異原性または発癌性でなくとも、患者に投与することができないので、製剤から未結合の増感剤を洗浄する必要がある。
【００２１】
製品へのγ線照射は、製品を殺菌する別の方法である。γ線は、高い総線量で与えられる場合、ウイルスと細菌を死滅させるのに有効である（非特許文献１および非特許文献２）。しかしながら、この分野の刊行された文献には、γ線が、血液、血液製剤、タンパク質およびタンパク質含有製品などの放射線感受性製品に損傷を与え得ることが報告されている。特に、高放射線量が赤血球、血小板および顆粒球にとって有害であることが示されている（非特許文献２）。特許文献１には、タンパク質製品は、タンパク質製品の効力（viability）を保持するためには、照射前に凍結しなければならないことを開示している。この特許は、「もしタンパク質材料が、例えば、周囲温度である間に、γ線が照射された場合、その材料は完全に損なわれ、すなわち、材料の活性が実質的には効果がないほど低くなる」と推断している。しかし、残念ながら、もし、照射目的で凍結し、次いで患者への投与前に解凍させたならば、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）のような感受性生物学的材料の多くは効力と活性を失う可能性がある。
【００２２】
上で論じた問題から、製剤に悪効果を及ぼすことなく、活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下させるために有効なアルブミン含有製剤を殺菌する方法が求められている。
【００２３】
【特許文献１】
米国特許第４，６２０，９０８号明細書
【非特許文献１】
Keathly et al., "Is There Life After Irradiation? Part 2," BioPharm July-August, 1993
【非特許文献２】
Leitman, "Use of Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post Transfusion Graft-vs-Host Disease," Transfusion Science 10: 219-239 (1989)
【非特許文献３】
Meyer and Boyd, Analytical Chem., 31, 215-219, 1959
【非特許文献４】
May, et al., J. Biol. Standardization, 10, 249-259, 1982
【非特許文献５】
Centers for Biologics Evaluation and Research, FDA, Docket No.89D-0140,. 83-93 ; 1990
【非特許文献６】
Rohwer, Nature, 308, 5960, pp.658-662, 1984
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、本発明の目的は、アルブミン含有製剤に悪効果を及ぼすことなく活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下させることによって、アルブミン含有製剤を殺菌する方法を提供することである。本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な記述に記載されており、一部は、その記載から明白になるか、あるいは本発明の実施により理解することができる。本発明のこれらの目的および利点は、記載した記述において特に指摘した組成物と方法、ならびにこれについての特許請求の範囲によって実現され達成される。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
これらの目的および他の目的に従って、本発明の第１の実施形態は、（ｉ）アルブミン含有製剤を放射線から保護するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を、アルブミン含有製剤に添加することと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を、放射線によりこの材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、アルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００２６】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）アルブミン含有製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまでアルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を低下させることと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を、放射線によりアルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、アルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００２７】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）アルブミン含有製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまでアルブミン含有製剤の温度を低下させることと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を放射線により、この材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、アルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００２８】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）（ａ）アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）アルブミン含有製剤に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）アルブミン含有製剤の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程をアルブミン含有製剤に適用することと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を、放射線によりアルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程および照射の割合が、共に放射線からアルブミン含有製剤を保護するのに効果的である、放射線感受性の、アルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００２９】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）（ａ）アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）アルブミン含有製剤に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）アルブミン含有製剤の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程をアルブミン含有製剤に適用することと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を、放射線によりアルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程が任意の順序で行われ、共に放射線からアルブミン含有製剤を保護するのに効果的である、放射線感受性の、アルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００３０】
また、本発明は、アルブミンと、放射線による殺菌後、それの企図する使用のためにこの製剤を保存するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を含むアルブミン含有製剤を提供する。
【００３１】
本発明はまた、残留溶媒含有量が、放射線による殺菌後、それの企図する使用のためにこの製剤を保存するのに有効な量まで低下されたアルブミン含有製剤を提供する。
【００３２】
本発明はまた、アルブミンおよび少なくとも１種の安定剤を含有するアルブミン含有製剤であって、残留溶媒含有量が低下されており、安定剤の量および残留溶媒含有量のレベルが共に、放射線による殺菌後、それの企図する使用のためにこの製剤を保存するのに有効である製剤を提供する。
【００３３】
本発明はまた、製剤の全タンパク質濃度が、放射線による殺菌後、その企図する使用のために製剤を保存するのに効果的であるアルブミン含有製剤を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
Ａ．定義
他に特に定めがない限り、本明細書において用いられているすべての技術的および科学用語は、当該技術分野の技術者によって一般に理解されているのと同一の意味を有することを意図している。
【００３５】
本明細書で使用する用語、単数形を示す「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には、文脈に他に特段の明らかな指示がない限り、複数の言及を含んでいる。
【００３６】
本明細書で使用する、用語「アルブミン含有製剤」は、血液タンパク質アルブミン、組み換えおよびトランスジェニック、天然の配列および修飾されたものの両方、または変異体もしくはこれらの誘導体を含有する生きた生物に由来するかこれらから得られる任意の製剤を意味することを意図している。アルブミン含有製剤の例示には、Ａｌｂｕｍｉｎａｒ（登録商標）（Ｃｅｎｔｅｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、Ｂｕｍｉｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐｌａｓｂｕｍｉｎ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ａｌｂｕｔｅｉｎ（登録商標）（Ａｌｐｈａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）、Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｈｕｍａｎ）（Ｉｍｍｕｎｏ−ＵＳ）およびＡｌｂｕｍａｒｃ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ）、並びに、例えばＰｌａｓｍａ−Ｐｌｅｘ（登録商標）（Ｃｅｎｔｅｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、Ｐｒｏｔｅｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）およびＰｌａｓｍａｔｅｉｎ（登録商標）（Ａｌｐｈａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）を含めた結晶タンパク質画分の製品が含まれるがこれらに限定されない。
【００３７】
本明細書では、「殺菌する」という用語は、本発明に従って処理されているアルブミン含有製剤中に見出される、少なくとも１種の活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下させることを意味することを意図する。
【００３８】
本明細書では、「生物学的材料」という用語は、生きた生物に由来するか、またはこれから得られる任意の物質を意味することを意図する。生物学的材料の例示には、以下のものが含まれるがこれらに制限されない。細胞；組織；血液もしくは血液成分；組み換えおよびトランスジェニックタンパク質、並びにタンパク質様材料を含めたタンパク質；消化酵素、例えばトリプシン、キモトリプシン、α−ガラクトシダーゼおよびイズロノデート−２−スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎｏｄａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）などを含めた酵素；モノおよびポリ免疫グロブリンを含めた免疫グロブリン；植物性薬品；食品など。生物学的材料の好ましい例には、以下のものが含まれるがこれらに限定されない。靱帯、腱、神経、脱塩された骨基質、移植片、関節、大腿骨、大腿骨頭などを含めた骨；歯；皮膚移植片；骨髄細胞懸濁物（全体または加工されたもの）を含めた骨髄；心臓弁；軟骨；角膜；動脈および静脈；心臓、肝臓、肺、腎臓、腸、膵臓、肢および趾、脂質；炭水化物；天然、無原線維性、アテロメリック（ａｔｅｌｏｍｅｒｉｃ）、可溶性および不溶性、組み換えおよびトランスジェニック、天然配列および修飾されたものを含めたコラーゲン；ＮＯ−カルボキシキトサン（ＮＯＣＣ）を含めたキチンおよびその誘導体；幹細胞、ランゲルハンス細胞の小島および遺伝子組み換えにより変化された細胞を含む他の移植用の細胞；赤血球細胞；単球を含めた白血球細胞；並びに血小板。
【００３９】
本明細書では、「生物学的汚染物または病原体」という用語は、アルブミン含有製剤と直接的にまたは間接的に接触した際に、アルブミン含有製剤、またはその受容者に悪効果を及ぼし得る汚染物または病原体を意味することを意図する。かかる生物学的汚染物または病原体には、一般に、アルブミン含有製剤中で発見されるか、あるいは前記製剤を感染させることが当業者に知られているウイルス、細菌（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチアのような細胞間および細胞内の細菌を含む）、酵母、カビ、真菌、プリオン、またはＴＳＥおよび／または単細胞しくは多細胞寄生生物に単独もしくは組み合わせて応答しうる同様の作用因が含有される。生物学的汚染物または病原体の例としては、以下のものが含まれるがこれに限定されない。ヒト免疫不全ウイルスおよび他のレトロウイルス、ヘルペスウイルス、フィロウイルス、シルコウイルス、パラミクソウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、およびこれらの変異体を含む）、ポックスウイルス、トーガウイルス、エプスタインバーウイルスおよびパルボウイルスのようなウイルス；エシェリヒア属、バチルス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属およびスタフィロコッカス属のような細菌；トリパノゾーマ属とマラリア原虫（プラズモディウム種を含む）のような寄生生物；酵母；カビ；真菌；マイコプラズマおよびウレアプラズマ；クラミジア；Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉのようなリケッチア；並びに、プリオンおよび動物の伝達性海綿状脳症として知られる１以上の疾患状態、例えば、スクラピー、ミンクの伝染性脳症、慢性消耗病（ミュールジカおよびヘラジカで一般に観測される）、ネコの海綿状脳症、ウシの海綿状脳症（狂牛病）、クロイツフェルト−ヤコブ病（変異型クロイツフェルト−ヤコブ病を含む）、致命的な家族性不眠症、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｅｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、クールーおよびアルパーズ症候群に対して、単独または組み合わせて応答しうる同様の作用因。本明細書では、「活性な生物学的汚染物または病原体」という用語は、単独でまたは他の因子、例えば第２の生物学的汚染物もしくは病原体または天然のタンパク質（野生型または突然変異体）または抗体と組み合わせて、アルブミン含有製剤および／またはその受容者に悪効果を及ぼす可能性がある生物学的汚染物または病原体を意味することを意図する。
【００４０】
本明細書では、「血液成分」という用語は、全血から分離することができる１以上の成分を意味することを意図しており、以下のものを含むがこれらに限定されない。赤血球細胞、白血球細胞および血小板のような細胞性血液成分；血液凝固因子、酵素、アルブミン、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、免疫グロブリンのような血液タンパク質；および血漿、血漿タンパク質画分（ＰＰＦ）、寒冷沈降物、血漿画分および血漿含有組成物のような液体血液成分。
【００４１】
本明細書では、「細胞性血液成分」という用語は、赤血球細胞、白血球細胞、幹細胞および血小板のような細胞を含む全血の１以上の成分を意味することを意図する。
【００４２】
本明細書では、「血液タンパク質」という用語は、全血中に通常見出される１以上のタンパク質を意味することを意図する。ヒトを含めた動物に見出される血液タンパク質の実例には以下のものが含まれるがこれらに限定されない。凝固因子（ファクターＶＩＩおよびファクターＩＸのようなビタミンＫ−依存性のものおよびファクターＶＩＩＩおよびフォン・ビルブラント因子のようなビタミンＫ−非依存性のもの）；アルブミン；高密度リポタンパク質および低密度リポタンパク質を含めたリポタンパク質；相補性タンパク質；免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＥのようなグロブリンなど。血液タンパク質の好ましいグループは、ファクターＩ（フィブリノーゲン）、ファクターＩＩ（プロトロンビン）、ファクターＩＩＩ（組織因子）、ファクターＶ（プロアクセレリン）、ファクターＶＩ（アクセレリン）、ファクターＶＩＩ（プロコンベルチン、血清プロトロンビン変換体）、ファクターＶＩＩＩ（抗血友病因子Ａ）、ファクターＩＸ（抗血友病因子Ｂ）、ファクターＸ（スチュアート−プラウアー因子）、ファクターＸＩ（血漿トロンボプラスチン前駆体）、ファクターＸＩＩ（ハーゲマン因子）、ファクターＸＩＩＩ（プロトランスグルタミナーゼ）、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）、ファクターＩａ、ファクターＩＩａ、ファクターＩＩＩａ、ファクターＶａ、ファクターＶＩａ、ファクターＶＩＩａ、ファクターＶＩＩＩａ、ファクターＩＸａ、ファクターＸａ、ファクターＸＩａ、ファクターＸＩＩａおよびファクターＸＩＩＩａ。血液タンパク質の他の好ましいグループには、ヘモグロビンおよび種々の成長因子、並びにこれらのタンパク質の誘導体のような赤血球細胞内に見出されるタンパク質が含まれる。更に別の、血液タンパク質の好ましいグループには、Ｐｌａｓｍａ−Ｐｌｅｘ（登録商標）（Ｃｏｎｔｅｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、Ｐｒｏｔｅｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐｌａｓｍａｎａｔｅ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）およびＰｌａｓｍａｔｅｉｎ（登録商標）（Ａｌｐｈａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）のような商業的に利用可能な血漿タンパク質画分製品が含まれる。
【００４３】
本明細書では、「液体血液成分」という用語は、血漿（凝固に先立って見出される、ヒトまたは動物の全血の、液体の非細胞性部分）および血清（凝固の後に見出される、ヒトまたは動物の全血の、液体の非細胞性部分）のような、液体の１以上の非細胞性成分を意味することを意図している。
【００４４】
本明細書では、「生物学的適合溶液」という用語は、アルブミン含有製剤が、例えば、懸濁または溶解されることによって暴露され、かつ、生存可能に維持されている溶液、すなわち、それらの本質的な生物学的および生理学的特性を保持する溶液を意味することを意図する。
【００４５】
本明細書では、「生物学的適合緩衝溶液」という用語は、材料の完全性を維持するのに適切なｐＨ特性および浸透圧特性（例えば、張性、オスモル濃度および／またはコロイド浸透圧）を有する生物学的適合溶液を意味することを意図する。好適な生物学的適合緩衝溶液は、一般に、４から８．５のｐＨ値を有しており、等張性であるか、あるいは、ほんのわずか低張性または高張性である。生物学的適合緩衝溶液は知られており、当業者によって容易に利用され得る。
【００４６】
本明細書では、「安定剤」という用語は、照射されるアルブミン含有製剤への損傷を、該材料の安全性と有効な利用を妨げるのには不十分なレベルまで低下させる化合物または材料を意味することを意図する。安定剤の実例には、これに限定されるものではないが、以下の物が含まれる。抗酸化剤；スピントラップ剤を含めた遊離基補足剤；組み合わせ型安定剤、すなわちタイプＩおよびタイプＩＩの両方の光力学的反応を消光する際に有効な安定剤；および結合している分子を安定化する、ヘパリンのようなリガンド。安定剤の好ましい例には以下のものが含まれるがこれらに限定されない。エタノール；アセトン；６，８−ジメルカプトオクタン酸（リポ酸）およびその誘導体および類似体（アルファ、ベータ、ジヒドロ、ビソノルおよびテトラノルリポ酸）、チオクト酸、６，８−ジメルカプトオクタン酸、ジヒドロロポエート（ＤＬ−６，８−ジチオールオクタン酸メチルエステル）、リポアミド、ビソノルメチルエステルおよびテトラノルジヒドロリポ酸、フラン脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、およびそれらの塩類および誘導体を含めた脂肪酸；ケルセチン、ルチンおよびその誘導体、アピゲニン、アミノフラボン、カテキン、ヘスペリジン、およびナリンギンのような、フラボノイド、フェニルプロパノイドおよびフラベノール；β−カロチンを含めたカロチン；Ｃｏ−Ｑ１０；キサントフィル；グリセロール、マンニトールのような多価アルコール；キシロース、グルコース、リボース、マンノース、フルクトースおよびトレハロースのような糖；ヒスチジン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、グルタミン酸、トリプトファン、カプリル酸ナトリウム、Ｎ−アセチルトリプトファン、およびメチオニンのようなアミノ酸およびその誘導体；アジ化ナトリウムなどのアジ化物；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼのような酵素；１，３−ジメチル尿酸およびジメチルチオ尿素のような尿酸およびその誘導体；アロプリノール；グルタチオンおよび還元グルタチオンおよびシステインのようなチオール；セレンのような微量元素；ビタミンＡ、ビタミンＣ（アスコルビン酸ナトリウムおよびパルミトイルアスコルビン酸のようなその誘導体および塩類を含む）、ならびにビタミンＥ（および酢酸トコフェロールとα−トコトリエノールのようなその誘導体および塩類）のようなビタミン；クロマノール−アルファ−Ｃ６；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマ−２  カルボン酸（トロロクス）および誘導体；ゼラチンおよびアルブミンのような外来タンパク質；トリス−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（ＭＣＩ−１８６）；シチオロン；プエルセチン；クリシン；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）；イミダゾール；メトキシソラレン（ＭＯＰＳ）；１，２−ジチアン−４，５−ジオール；ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような還元物質；コレステロール；プロブコール；インドール誘導体；チメロサール；ラザロイドおよびチリラザドメシレート（tirilazad mesylate）；プロアンテノール；プロアントシアニジン；硫酸アンモニウム；ペゴルゴテイン（ＰＥＧ−ＳＯＤ）；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−アルファ−フェニルニトロン（ＰＥＮ）；４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（Ｔｅｍｐｏｌ）；アスコルビン酸塩、尿酸塩およびトロロクスＣの混合物（Ａｓｃ／ｕｒａｔｅ／Ｔｒｏｌｏｘ  Ｃ）；グリシルグリシンおよびカルノシンのようなタンパク質およびペプチドであって、各アミノ酸がそのＤまたはＬ形態であり得るもの；ジオスミン；ププロガリン（ｐｕｐｕｒｏｇａｌｉｎ）；これに限定されるものではないが、没食子酸プロピルを含めた没食子酸とその誘導体；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムおよびシリマリン。特に好ましい例には、タイプＩおよびタイプＩＩの両方の光力学的反応を消光する際に効果的な単一安定剤または安定剤の組み合わせ、および、気体として適用できおよび／またはエバポレーション、低圧および同様な方法で容易に除去可能である揮発性安定剤が含まれる。
【００４７】
本明細書では、「残留溶媒含有量」という用語は、アルブミン含有製剤中の遊離している液体の量または割合を意味することを意図する。遊離している液体（freely available liquid）は、アルブミン含有製剤の１種以上の非液体成分と結合しないかもしくは複合体を形成しない、アルブミン含有製剤中に存在する、水または有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ポリエチレングリコールなど）のような液体を意味する。遊離している液体には細胞内の水が含まれる。本明細書で記載されている水のような関連のある残留溶媒含有量は、ＦＤＡ承認の変法カールフィッシャー法（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）によって決定されたレベルを意味する。他の溶媒の残留レベルの定量は、どの溶媒を使用するかに応じて、当技術分野でよく知られている手段によって決定することができる。また、溶質と残留溶媒の比率は、溶媒内の溶質の濃度を反映したものであると考えることができる。そのように表現されている場合、溶質の濃度が高いほど、残留溶媒の量は低い。
【００４８】
本明細書では、「増感剤」という用語は、ウイルス性汚染物、細菌性汚染物、プリオン汚染物、および／または寄生生物汚染物を選択的に標的とし、放射線による不活性化に対するそれらの感受性をより高めるようにし、その結果、増感剤非含有の場合よりも、照射率もしくは線量を低くして使用する、および／または、照射時間を短くして使用することができる物質を意味することを意図する。好適な増感剤を説明する例としては、これに限定されるものではないが、以下の物が含まれる：ソラレンおよびその誘導体および類似体（３−カルボエトキシソラレンを含む）；イナクチンおよびその誘導体および類似体；ハロゲン置換基および、第四級アンモニウムイオンまたはホスホニウムイオンのような水可溶化成分を含有するアンゲリシン、ケリンおよびクマリン；核酸結合化合物；臭素化ヘマトポルフィリン；フタロシアニン；プルプリン；ポルホリン；ジヘマトポルフィリンエステルのハロゲン化誘導体または金属原子置換された誘導体、ヘマトポルフィリン誘導体、ベンゾポルフィリン誘導体、ヒドロジベンゾポルフィリンジマレイミド、ヒドロジベンゾポルフィリン、ジシアノジスルホン、テトラカルボエトキシヒドロジベンゾポルフィリン、およびテトラカルボエトキシヒドロジベンゾポルフィリンジプロピオンアミド；ハロゲンまたは金属原子で修飾されていてもよいドキソルビシンおよびダウノマイシン；ネトロプシン；ＢＤペプチド、Ｓ２ペプチド；Ｓ−３０３（ＡＬＥ化合物）；ヒペリシン、メチレンブルー、エオシン、フルオレセイン（およびそれらの誘導体）、フラビン、メロシアニン５４０のような色素；ベルガプテンのような光活性化合物；ならびにＳＥペプチド。加えて、プリオンに結合し、これによって放射線による不活性化に対するこれらの感受性を高める原子も使用することができる。このような原子の実例は銅イオンであろう。このイオンは、先のタンパク質に結合し、タンパク質内の他の原子よりも高いＺ数により、照射、特にガンマ線照射の間にプリオンタンパク質がエネルギーを吸収する確率を高める。
【００４９】
本明細書では、「タンパク質様材料」という用語は、少なくとも１種のタンパク質またはペプチド含む生きた生物から誘導されるかまたはそれから得られる任意の材料を意味することを意図している。タンパク質様材料は、天然に存在する材料（その本来の状態または加工／精製および／または誘導体化の後のもの）、または、化学合成もしくは組み換え／トランスジェニック技術および必要に応じて加工／精製および／または誘導体化することにより製造された、人工的に製造された材料であり得る。タンパク質様材料の実例には以下のものが含まれるがこれに限定されない。細胞培養で製造されるタンパク質およびペプチド；乳および乳製品；腹水；ホルモン；成長因子；動物組織から抽出または単離された医薬品（例えばヘパリンおよびインスリン）、または植物質を含めた材料；新鮮な画分、凍結した画分および凍結乾燥した画分、および血漿タンパク質画分を含めた血漿；フィブリノーゲンおよびこれらの誘導体、フィブリン、フィブリンＩ、フィブリンＩＩ、可溶性フィブリンおよびフィブリンモノマー、および／またはフィブリンシーラント製品；全血；タンパク質Ｃ；タンパク質Ｓ；α−１抗トリプシン（α−１プロテアーゼ阻害剤）；ブチル−コリンエステラーゼ；クマリンの医薬品（ワルファリン）のような抗凝固剤；ストレプトキナーゼ；組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；ウロキナーゼ；ノイポゲン（ｎｅｕｐｏｇｅｎ）；抗トロンビン−３；α−グルコシダーゼ；（胎児）ウシ血清／ウマ血清；獣肉；抗血清、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、遺伝子工学で改良または産生された抗体を含めた免疫グロブリン；アルブミン；α−グロブリン；β−グロブリン；γ−グロブリン；凝固タンパク質；相補性タンパク質；およびインターフェロン。
【００５０】
本明細書では、「放射線」という用語は、照射される１以上の消化酵素の製剤の少なくとも数種類の成分を殺菌するのに十分なエネルギーの放射線を意味することを意図する。放射線の種類は、これに限定されるものではないが、以下のもの、すなわち、（ｉ）微粒子（ニュートロン、電子および／または陽子のような亜原子粒子の流れ）；（ｉｉ）電磁気（電波、可視光線（単色および多色）および不可視光線、紫外線、Ｘ線、γ線、ならびにそれらが混ぜ合わさったもののような種々の電磁界から発生するもの）、および（ｉｉｉ）音波および圧力波が含まれる。かかる放射線は、γ線ようなイオン化（照射された材料中でイオンを生じうる）放射線として、および、可視光線のような非イオン化放射線として記載されていることが多い。かかる放射線源はいろいろであるが、一般に、十分な放射線が、殺菌を行うのに適切な時間かつ適切な割合で与えられる限り、特定の照射源の選択は、重要ではない。実際には、γ線は通常、コバルトまたはセシウムのアイソトープにより発生するが、一方、紫外線およびＸ線は、それぞれ紫外線およびＸ線を放射する装置により発生され、そして、電子は、機械による発生が含まれる「電子ビーム」照射として知られている方法で材料を殺菌するために用いられることが多い。可視光線は、単色および多色の両方とも、機械によって発生され、実際には同じ機械または異なる機械で発生される赤外線および紫外線のような不可視光線と組み合わされうる。
【００５１】
本明細書では、「保護する」という用語は、照射されるアルブミン含有製剤に対する任意の損傷（さもなければ、その材料の照射によって起こるであろう任意の損傷）を、照射後の材料の安全性と有効な使用を妨げるのには不十分なレベルまで、低下させることを意味することを意図する。言い換えれば、物質または実行するプロセスの存在が、その物質またはプロセスが存在しない場合よりも照射による材料の損傷を低下させるのであれば、その物質またはプロセスは、照射からアルブミン含有製剤を「保護」する。したがって、アルブミン含有製剤は、その材料を保護する物質の存在下で照射を行った後、またはその材料を保護するプロセスの実行後に照射を行った後では、安全且つ有効に使用できるが、同一の条件下であるがその物質の非存在下またはそのプロセスを実行しないで照射した後では、安全且つ有効に使用することはできない。
【００５２】
Ｂ．特に好ましい実施形態
本発明の第１の実施形態は、放射線に感受性であるアルブミン含有製剤を殺菌する方法であって、該材料を殺菌し、且つ該材料を放射線から保護するのに有効な割合で、該材料を殺菌するのに有効な時間、放射線によりアルブミン含有製剤を照射することを含む法王に向けられる。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）アルブミン含有製剤を放射線から保護するのに有効な量で少なくとも１種の安定剤を、アルブミン含有製剤に添加することと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を、放射線によりこの材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、アルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００５４】
本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）アルブミン含有製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまでアルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を低下させることと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を、放射線によりアルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性のアルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００５５】
本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）アルブミン含有製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまでアルブミン含有製剤の温度を低下させることと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を放射線によりアルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性のアルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００５６】
本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）（ａ）アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）アルブミン含有製剤に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）アルブミン含有製剤の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程をアルブミン含有製剤に適用することと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を、放射線によりアルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程および照射の割合が、共に放射線からアルブミン含有製剤を保護するのに効果的である、放射線感受性のアルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００５７】
本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）（ａ）アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）アルブミン含有製剤に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）アルブミン含有製剤の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程をアルブミン含有製剤に適用することと、（ｉｉ）アルブミン含有製剤を、放射線によりアルブミン含有製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程が任意の順序で行われ、共に放射線からアルブミン含有製剤を保護するのに効果的である、放射線感受性のアルブミン含有製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００５８】
本発明の特定の方法に従えば、安定剤はアルブミン含有製剤を放射線で照射する前に添加される。この安定剤は、放射線からアルブミン含有製剤を保護するのに有効な量でアルブミン含有製剤に添加されることが好ましい。安定剤の適切な量は、使用される本発明の特定の方法の特定の特徴、例えば使用される特定の安定剤および／または照射される特定のアルブミン含有製剤の性質および特性および／またはその意図した使用に依存して変動し得、その量は当業者によって経験的に決定することができる。
【００５９】
本発明の方法によれば、アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量は、放射線によるアルブミン含有製剤の照射前に低下させることができる。残留溶媒含有量は、アルブミン含有製剤を放射線から保護するのに有効レベルまで低下されることが好ましい。好適なレベルの残留溶媒含有量は、照射されている特定のアルブミン含有製剤の性質および特性および／またはその意図した使用に依存して変動し得、その含有量は、当業者によって経験的に決定することができる。具体的な値よりも、特定の範囲内に残留溶媒含有量を維持することが望ましい、アルブミン含有製剤が存在しうる。
【００６０】
溶媒が水である場合、そして特に１以上の消化酵素の製剤が固相である場合、残留溶媒含有量は一般に約１５％未満、典型的には約１０％未満、より典型的には約９％未満、更に典型的には約８％未満、通常は約５未満、好ましくは約３．０％未満、さらに好ましくは約２．０％未満、よりさらに好ましくは約１．０％未満、更に好ましくは約０．５％未満、更に好ましくは約０．２％未満、最も好ましくは０．０８未満である。
【００６１】
溶媒は非水性溶媒であることが好ましく、照射の際に遊離基を形成する傾向のない非水性溶媒あることがより好ましく、照射の際に遊離基を形成する傾向がなく、且つ溶解された、酸素または照射の際に遊離基を形成する傾向のある１または複数の他のガスがほとんどないかあるいは全く存在しない非水性溶媒であることが最も好ましい。揮発性非水性溶媒が特に好ましく、安定剤である非水性溶媒、例えばエタノールおよびアセトンが特に好ましい。
【００６２】
本発明の特定の実施形態では、溶媒は、水と非水性溶媒の混合物またはエタノールおよび／またはアセトンのような溶媒であり得る。このような実施形態では、非水性溶媒は照射の際に遊離基を形成する傾向のない非水性溶媒であることが好ましく、照射の際に遊離基を形成する傾向がなく、且つ溶解された、酸素または照射の際に遊離基を形成する傾向のある１または複数の他のガスがほとんどないかあるいは全く存在しない非水性溶媒であることが最も好ましい。揮発性非水性溶媒が特に好ましく、安定剤である非水性溶媒、例えばエタノールおよびアセトンが特に好ましい。
【００６３】
好ましい実施形態では、残留溶媒が水である場合、アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量は、水を溶解することができる非水性溶媒にアルブミン含有製剤を溶解するかまたは懸濁することによって低下させることができる。好ましくは、このような非水性溶媒は、溶解された、酸素または照射の際に遊離基を形成する傾向のある１または複数の他のガスがほとんどないかあるいは全く存在しない非水性溶媒である。
【００６４】
アルブミン含有製剤が液相である場合、残留溶媒含有量の低下は、溶質の濃度を高めることによるなどの、多くの手段のいずれかによって達成することができる。この手段では、溶媒に溶解されたアルブミン含有製剤内のタンパク質の濃度を、一般には少なくとも約０．５％、典型的には少なくとも約１％、通常は少なくとも約５％、好ましくはすくなくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、更に好ましくは少なくとも約２０％、更により好ましくは少なくとも約２５％、最も好ましくは少なくとも約５０％に増加することができる。
【００６５】
本発明の特定の実施形態では、特定のアルブミン含有製剤の残留溶媒含有量は具体的な点よりもむしろ所定の範囲内にあることが見出され得る。特定のアルブミン含有製剤の好ましい残留溶媒含有量に対するこのような範囲は当業者によって経験的に決定され得る。
【００６６】
いかなる操作性の理論に拘束されるものではないが、残留溶媒含有量の低下は、アルブミン含有製剤の自由度を下げること、遊離基を生成する標的数を減少すること、およびこれらの遊離基の溶解性を制限しうることが考えられる。したがって、同様の結果は、その共融点未満またはその凝固点未満に、アルブミン含有製剤の温度を下げることによって、または、アルブミン含有製剤の自由度を同じように下げるためにガラス化することによって達成することができるであろう。これらの結果は、他の場合で許容されるものよりも高い割合および／または線量の放射線の使用を可能にし得る。したがって、本明細書に開示された方法は、アルブミン含有製剤に許容できない損傷、すなわちアルブミン含有製剤の安全で有効な使用を妨げるであろう損傷、を生じない任意の温度で実施することができる。好ましくは、本明細書に開示された方法は、周囲温度または周囲温度未満、例えば照射されるアルブミン含有製剤の共融点もしくは凝固点未満で行われる。
【００６７】
本発明の方法によれば、損傷の「許容できるレベル」は、使用される本発明の特定の方法の特定の特徴、例えばアルブミン含有製剤の性質および特性、および／または使用されるジペプチド安定剤、および／または照射されるアルブミン含有製剤の意図した使用に依存して変化し得、これは当業者によって経験的に決定することができる。したがって、損傷の「許容できないレベル」は、殺菌されるアルブミン含有製剤の安全で有効な使用を妨げる損傷のレベルである。所与のアルブミン含有製剤の損傷の特定のレベルは、当業者に公知の方法および技術のいずれかを用いて決定することができる。
【００６８】
アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量は、アルブミン含有製剤に許容できないレベルの損傷を生じさせることなく、アルブミン含有製剤から溶媒を減少させるための、当業者に公知の方法および技術のいずれかによって低下させることができる。このような方法には、エバポレーション、濃縮、遠心による濃縮、ガラス化および噴霧乾燥が含まれるがこれらに限定されない。
【００６９】
アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を低下させるための特に好ましい方法は、凍結乾燥である。
【００７０】
アルブミン含有製剤の残留溶媒含有量を低下させるための他の好ましい方法は、ガラス化である。この方法は、当業者に公知に方法および技術のいずれかで実現することができ、これには例えば、アルブミン含有製剤の共融点を上げるために溶質および追加の溶質（例えば蔗糖）を添加し、これに続いて水のような残留溶媒を除去するためにアルブミン含有製剤に減圧を徐々に適用することが含まれる。得られたガラス状材料は、残留溶媒含量が低下される。
【００７１】
本発明の方法によれば、殺菌されるアルブミン含有製剤は、当業者によく知られておりその者に利用可能な手段によって、固体表面上に固定化することができる。例えば、殺菌されたアルブミン含有製剤は、生物学的または非生物学的基材上のコーティングとしてまたはその上の表面として存在しうる。
【００７２】
本発明の方法で使用される放射線は、処理されるアルブミン含有製剤の殺菌に有効な任意の放射線であり得る。放射線は電子ビームを含めた微粒子であり得る。好ましくは、放射線は、ｘ−線、赤外線、可視光線、紫外線、および様々な波長の電磁放射線の混合物を含めた電磁放射線である。特に好ましい放射線の形態はγ線である。
【００７３】
本発明の方法によれば、アルブミン含有製剤は、アルブミン含有製剤の殺菌に有効であるが、その材料に許容できないレベルの損傷をもたらさない割合で、放射線を用いて照射される。適切な割合は、使用される本発明の方法の特定の特徴、例えば照射されるアルブミン含有製剤の性質および特性、関係のある放射線の特定の形態、および／または不活性化される特定の生物学的汚染物または病原体、に依存して変化し得る。照射の適切な割合は、当業者によって経験的に決定され得る。照射の割合は殺菌手順の継続期間中一定であることが好ましい。これが実行できないか、さもなければ望まれない場合、可変または断続的な照射を用いてもよい。
【００７４】
本発明の方法によれば、照射率は、生成物回収と操作を完了するのに必要な時間との最も有利な組み合わせを得るために最適化することができる。低い割合（＜３ｋＧｙ／時間）および高い割合（＞３ｋＧｙ／時間）の両方が、そのような結果を達成するために、本明細書に記載した方法に利用することができる。照射の割合はアルブミン含有製剤を殺菌しつつ、アルブミン含有製剤の回収を最適化するように選択されることが好ましい。照射の割合を低下することは、アルブミン含有製剤の損傷を減少させることになるが、特定の所望の全線量を達成するのに必要な照射時間も長くなる。したがって、より高い線量は、例えば戦略的問題およびコストを最小化するための、ある環境では好ましく、そして、照射からアルブミン含有製剤を保護するための本発明に記載の方法に従って使用される場合には、そのような線量が可能である。
【００７５】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、照射率は、約３．０ｋＧｙ／時間以下、さらに好ましくは約０．１ｋＧｙ／時間から３．０ｋＧｙ／時間の間、よりさらに好ましくは約０．２５ｋＧｙ／時間から２．０ｋＧｙ／時間の間、より一層好ましくは、約０．５ｋＧｙ／時間から１．５ｋＧｙ／時間の間、最も好ましくは、約０．５ｋＧｙ／時間から１．０ｋＧｙ／時間の間である。
【００７６】
本発明の別の特に好ましい実施形態によれば、照射率は、少なくとも約３．０ｋＧｙ／時間、さらに好ましくは、少なくとも約６ｋＧｙ／時間、さらにより好ましくは、少なくとも約１６ｋＧｙ／時間、より一層好ましくは、少なくとも３０ｋＧｙ／時間、最も好ましくは、少なくとも４５ｋＧｙ／時間以上である。
【００７７】
本発明の方法によれば、殺菌されるアルブミン含有製剤は、アルブミン含有製剤の殺菌に有効な時間、放射線により照射される。照射率と組み合わせた適当な照射時間により、アルブミン含有製剤に適用される適切な照射の線量が得られる。好適な照射時間は、関連する放射線の特定の形態および照射率、および／または照射されている特定のアルブミン含有製剤の性質および特性に依存して変動し得る。好適な照射時間は、当業者によって経験的に決定することができる。
【００７８】
本発明の方法によれば、殺菌されるアルブミン含有製剤は、その材料に許容できないレベルの損傷をもたらさないが、アルブミン含有製剤の殺菌に有効な総線量までの放射線で照射される。放射線の好適な総線量は、使用される本発明の方法の特定の特徴、例えば照射されるアルブミン含有製剤の性質および特性、関係のある放射線の特定の形態、および／または不活性化される特定の生物学的汚染物または病原体、に依存して変化し得る。照射の適切な割合は、当業者によって経験的に決定され得る。放射線の総線量は、好ましくは少なくとも２５ｋＧｙ、より好ましくは少なくとも４５ｋＧｙ、よりさらに好ましくは少なくとも７５ｋＧｙ、より一層好ましくは、少なくとも１００ｋＧｙ以上、例えば１５０ｋＧｙまたは２００ｋＧｙ以上である。
【００７９】
厚さおよび放射線源からの距離のような、照射されるアルブミン含有製剤の特定の寸法は、当業者によって経験的に決定されうる。
【００８０】
本発明の特定の方法によれば、アルブミン含有製剤への照射の有害な影響を最小にするために本明細書に記載された方法を使用すると共に、例えばアルブミン含有製剤中の１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体に関する照射の効率を高めるために、有効量の少なくとも１つの増感剤化合物を照射の前にアルブミン含有製剤に、任意に添加することができる。好適な増感剤は、当業者に公知であり、それにはソラレンおよびその誘導体並びにイナクチンおよびその誘導体が含まれる。
【００８１】
本発明の方法によれば、アルブミン含有製剤の照射は、殺菌されるアルブミン含有製剤に対して有害ではない任意の温度で行うことができる。好ましい一実施形態によれば、アルブミン含有製剤は周囲温度で照射される。代替の好ましい実施形態によれば、アルブミン含有製剤は、低い温度、すなわち０℃、−２０℃、−４０℃、−６０℃、−７８℃または−１９８℃のような周囲温度未満の温度で照射される。本発明この実施形態によれば、アルブミン含有製剤の凝固点または共融点で、またはそれ未満で照射されることが好ましい。別の代替の好ましい実施形態によれば、アルブミン含有製剤は高い温度、すなわち３７℃、６０℃、７２℃または８０℃のような周囲温度を超える温度で照射される。何れの理論にも拘束されることを望むものではないが、高温での使用は、１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体への照射の効果を高め、したがってより低い総線量の放射線を用いることを可能にする。
【００８２】
最も好ましくは、アルブミン含有製剤の照射は、照射からこの製剤を保護する温度で行う。好適な温度は当業者により経験的に決定されうる。
【００８３】
本発明の特定の実施形態では、照射が行われる温度は、具体的な点ではなく所定の範囲内にあることが見出され得る。特定のアルブミン含有製剤の照射のために好ましいこのような温度範囲は、当業者により経験的に決定され得る。
【００８４】
本発明の方法によれば、アルブミン含有製剤は、殺菌されるアルブミン含有製剤に有害でない任意の圧力で行われ得る。好ましい一実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤は、高い圧力で照射される。より好ましくは、アルブミン含有製剤は、音波の適用または揮発性物質の使用により高い圧力で照射される。何れの理論に拘束されることを望むものではないが、高い圧力の使用は、１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体への照射の効率を高め、および／または１以上の安定剤によってもたらされる保護を増強し、これによってより低い総線量の放射線を使用することを可能にする。適切な圧力は、当業者によって経験的に決定され得る。
【００８５】
一般に本発明の方法によれば、殺菌を受けるアルブミン含有製剤のｐＨは約７である。しかし、本発明の幾つかの実施形態では、アルブミン含有製剤は７未満のｐＨ、好ましくは６以下のｐＨ、より好ましくは５以下のｐＨ、より一層好ましくは、４以下のｐＨ、最も好ましくは３以下のｐＨを有し得る。本発明の代替の実施形態では、アルブミン含有製剤は、７を超えるｐＨ、好ましくは８以上のｐＨ、より好ましくは９以上のｐＨ、より一層好ましくは１０以上のｐＨ、最も好ましくは１１以上のｐＨを有し得る。本発明の特定の実施形態によれば、殺菌を受ける製剤のｐＨは、この製剤に含まれる１または複数の酵素の等電点またはその近傍である。好適なｐＨレベルは、当業者によって経験的に決定され得る。
【００８６】
同様に、本発明の方法によれば、アルブミン含有製剤の照射は、処理されるアルブミン含有製剤に有害でない任意の雰囲気下で行うことができる。１つの好ましい実施形態によれば、アルブミン含有製剤は、低酸素雰囲気下または不活性雰囲気に保たれる。不活性雰囲気が使用される場合、その雰囲気は、ヘリウムまたはアルゴンのような希ガス、より好ましくは、より高分子量の希ガス、最も好ましくはアルゴンである。他の好ましい実施形態によれば、アルブミン含有製剤は照射されている間真空下に保たれる。本発明の特に好ましい実施形態によれば、アルブミン含有製剤（凍結乾燥されたもの、液体または凍結されたもの）は照射前には、真空下または不活性雰囲気（好ましくはヘリウムもしくはアルゴンのような希ガス、より好ましくはより高分子の希ガス、最も好ましくはアルゴン）で貯蔵される。本発明の代替の好ましい実施形態によれば、液体のアルブミン含有製剤は、凍結乾燥のような溶媒を減少させる事前のステップを用いても、用いなくても、照射の前には、この液体に溶解されている気体、特に酸素の量を低下させるために低圧下に保持される。このような脱気処理は当業者に公知のいずれかの方法を用いて行われ得る。
【００８７】
他の好ましい実施形態では、アルブミン含有製剤が酸素を含有するか、または、該製剤中に溶解されているかもしくは該製剤に付随した他のガスを含有する場合、製剤内または製剤に付随したこれらのガスの量は、当業者に公知であるかまたは当業者に利用可能な方法および技術のいずれか、例えば処理される製剤を保存する容器（硬いかもしくは軟らかいもの）内を制御された減圧にすること、または製剤をほぼ同じ容積の容器に収容することによって低下させることができる。
【００８８】
本発明の特定の実施形態では、処理されるアルブミン含有製剤が組織である場合、少なくとも１種の安定剤を、当業者に公知であり、利用できる方法および技術のいずれかに従って導入することができる。その導入方法には、好ましくは減圧下、高温および／またはジメチルスルホキシドのような浸透増強剤の存在下で、安定剤を含有する溶液に組織を浸漬することが含まれる。組織に少なくとも１種の安定剤を導入する他の方法には、好ましくは圧力下および／または高温で１種以上の安定剤を含有する気体を適用すること、１種以上の安定剤または１種以上の安定剤を含有する溶液を組織に直接注入すること、組織を減圧下に置き次いで安定剤を含有する気体または溶液を導入すること、およびこれらの方法の２以上の組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。１種以上の安定剤をこのような方法によって組織に導入することもできる。
【００８９】
本明細書に記載されている１以上の特徴を組み合わせて用いることによって、１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体に対する照射プロセスの適切な有効性を保持しながら、照射によって引き起こされるアルブミン含有製剤に対する望まない効果をさらに最小限にすることができることが理解されよう。例えば、安定剤の使用に加えて、特定のアルブミン含有製剤はまた、照射前に凍結乾燥され、低い温度に保持され、真空下に保持されて、望まない効果を更に最小にすることができる。
【００９０】
放射線に対する特定の生物学的汚染物または病原体の放射線に対する感受性は、Ｄ37値として知られる、試料中の３７％のその作用因を除く全てを不活化または死滅させるのに必要な線量を決定することにより一般に計算される。アルブミン含有製剤の所望の成分はまた、３７％のこれらの所望の生物学的および生理学的特性を除く全てを排除するのに必要な照射線量に等しいＤ37値を有すると考えることができる。
【００９１】
本発明の特定の好ましい実施形態によれば、アルブミン含有製剤の殺菌は、アルブミン含有製剤のＤ37値を同時に低下させることなく、生物学的汚染物または病原体のＤ37値を低下させる条件下で行われる。本発明の他の好ましい実施形態によれば、アルブミン含有製剤の殺菌は、アルブミン含有製剤のＤ37値の増加をもたらす条件下で行われる。本発明の最も好ましい実施形態によれば、アルブミン含有製剤の殺菌は、生物学的汚染物および病原体のＤ37値の低下をもたらし、同時にアルブミン含有製剤のＤ37値を高める条件下で行われる。
【００９２】
（実施例）
以下の例は本発明を例示するものであるが、それを限定するものではない。他の適当な修正や適応例も当業者が通常経験する種類のものであって、完全に本発明の技術思想の範囲に含まれる。なお、特に断らない限り、照射はすべて60Ｃｏ源を使用して行った。
【実施例１】
【００９３】
この実験では、残留溶媒含有量のレベルを変え、揮発性安定剤を存在させまたは存在させずに血漿タンパク質画分を照射した（室温１．９ｋＧｙ／時間、総線量４５ｋＧｙ）。
【００９４】
方法
ガラスバイアル中、市販の血漿タンパク質画分を含む試料（２ｍｇ／ｍｌ）を、少量のエタノールおよびアセトンを含み含水率９％、またはエタノールもしくはアセトンを実質的に含まず含水率約１％となるように調製した。試料をガンマ線照射し（室温で１．９ｋＧｙ／時間、総線量４５ｋＧｙ）、次に、構造が完全であるかどうか分析した。構造の完全性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＳＥＣおよび逆相ＨＰＬＣによって決定した。
【００９５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、３つの１２．５％のゲルを次の調合処方に従い調製した。すなわち、アクリルアミド４．２ｍｌ；４×−トリス（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ；水３．３ｍｌ；１０％ＡＰＳ溶液１００μｌ；およびＴＥＭＥＤ１０μｌとし、電気泳動ユニットに置き、１×泳動用バッファー（トリス塩基１５．１ｇ；グリシン７２．０ｇ；ＳＤＳ５．０ｇの水溶液１ｌを５倍希釈したもの）を用いた。照射した試料および対照試料（１ｍｇ／ｍｌ）をＥｐｐｉｎｄｏｒｆチューブ中、試料バッファー（＋／−ベータ−ＭＥ）で希釈し、次いで数分間遠心分離した。各希釈試料（約１０μｇ）２０μｌを分析した。
【００９６】
逆相ＨＰＬＣについては、各試料を最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように水に溶解した。次いで、これらの溶液を、所望の濃度まで０．１％のトリフルオロ酢酸中で連続的に希釈した。各試料１０μｇをＡｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００（Ｃ−８）２．１×３０ｍｍを用いたＭｉｃｒｏｂｏｒｅ  ＨＰＬＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １３０Ａ分離システム、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎ）に装入した。溶媒Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸；溶媒Ｂ：７０％アセトニトリル、３０％水、０．０８５％トリフルオロ酢酸。
【００９７】
ＨＰＬＳＥＣについては、各試料を０．４μｇ／μｌまで希釈し、その５０μｌをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ−Ｂｉｏｓｅｐ  Ｓ３０００（分子量範囲５ｋＤａ〜７００ｋＤａ）上に装入した。分析濃度２０μｇ：２ｍｇ／ｍｌのストック溶液２０μｌ＋溶離用バッファー（５０ｍＭＮａＰi＋１００ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ６．７）８０μｌ；流速１ｍｌ／分。
【００９８】
結果
両試料とも照射量が４５ｋＧｙに達するまでにアルブミンの若干の分解が見られたが、少量のエタノールおよびアセトンを含む含水率９％の試料では分解が少なく、含水率がより低く揮発性安定剤を実質的に含まない試料より構造の回収が大きかった。しかし、両試料とも構造の回収は、アルブミンを後で使用するには十分であった。
【００９９】
より具体的には、図１Ａに示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、少量のエタノールおよびアセトンを含む含水率９％の試料からはアルブミンモノマーがより良好に回収されることを示している。同様に、図１Ｂに示されるように、ＨＰＬＳＥＣでは少量のエタノールおよびアセトンを含む含水率９％の試料では凝集がより少ないことも示されている。図１Ｃに示されるように、逆相ＨＰＬＣは照射した試料と対照との間での有意な差を示さなかった。
【実施例２】
【０１００】
ヒトアルブミン（２５％）を、ハムスターに適応させたスクラピー（２６３Ｋ株）から得た１０％脳ホモジェネートで１：１００スパイク処理した。ボルテックスを用いて試料を混合し、スクラピーでスパイク処理したアルブミンを４個の６ｍｌアリコートとして１０ｍｌ血清バイアルに分けた。１個のバイアルを凍結させた対照として−８０℃で保存した。３個のバイアルを市販の照射設備に運んだ。１個のバイアル（０ｋＧｙ対照）はバクテリアの増殖を防止するために冷却した。残りのバイアルは、総線量２６ｋＧｙまたは５０ｋＧｙとなるまで室温（２０〜２５℃）において０．４ｋＧｙ／時間の割合で照射した。放射線の線量は、各バイアルに付けた線量計、およびバイアル近くに置いた外部線量計によって評価した。照射した試料および０ｋＧｙ対照について、スクラピー感染力を分析した。
【０１０１】
感染力アッセイは、１２匹のハムスターに試料０．０５ｍｌを大脳内接種し、次いで、それらを観察のために６か月まで保持することによって行った。臨床上の３つの終了点、すなわち、よろめき（ｗｏｂｂｌｅ）、起立不能（ｆａｉｌｕｒｅ−ｔｏ−ｒｅａｒ）および死亡を評価した。非照射対照と比較して、より高い線量で処理した試料の接種を受けた群では特定の臨床上の徴候が現われるまで少なくとも８〜１０日の遅れがあった。データを、限定的希釈系列モード（Ｒ．Ｒｏｗｈｅｒ（未発表データ））で感染させた多数の動物についてのインキュベーション時間の照射量応答から作られた計算図表（ｎｏｍｏｇｒａｍ）と比較した。この計算図表は、（よろめきによって裏付けられる）疾病状態の開始日をｌｏｇ10ＬＤ50接種と相関させた。
【０１０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動および高速サイズ排除クロマトグラフィー（high performance size exclusion chromatography）によって生物学的材料（アルブミン）に対する放射の影響を以下のように決定した。
【０１０３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｉｎｉ−Ｖｅｒｔｉｃａｌ  Ｕｎｉｔ  ＳＥ２５０／ＳＥ２６０を用い、８％ポリアクリルアミドゲル中で行った。試料をＰＢＳ中で１：１００に、次いで５％β−メルカプトエタノールを加えまたは加えないＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で１：１希釈した。試料は１レーン当たり１２．５μｇを装入した。分子量マーカーは低分子量標準（Ｌｏｗ−Ｒａｎｇｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）とした。１２５ボルトで３０分間電気泳動を行った。ゲルは０．１％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０の５０％メタノール溶液、１０％酢酸で染色し、５％メタノール、９％酢酸で脱染色した。
【０１０４】
ＨＰＳＥＣは、１３０Ａ分離システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で７．８×３００ｍｍ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＳＥＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒｅｎｃｅ、ＣＡ）を用いて実行した。０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６．７）の溶離バッファーを使用前に０．２２μｍフィルターを用いて濾過した。アルブミン溶液を溶離バッファー中の最終濃度が１．２５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、２５μｌ（３１．２５μｇタンパク質）を注入した。流速は１ｍｌ／分とした。２８０ｎｍの吸収で検知した。
【０１０５】
結果
非照射の対照では、疾病（よろめき）の開始までのインキュベーション時間の中央値は７５日であった。照射した試料については、疾病の開始までのインキュベーション時間の中央値は、総線量２５ｋＧｙで８８日であり、５０ｋＧｙまで照射した試料では９０日であった。計算図表との比較によれば、ｌｏｇ10力価は、非照射対照では６．５、２５ｋＧｙおよび５０ｋＧｙに照射した試料ではそれぞれ、４．８および４．６との評価値が得られた。これらの評価に基づくと、２５ｋＧｙおよび５０ｋＧｙまで照射した試料についての減少係数の中央値は、それぞれ１．７と１．９であった。これらは減少係数の中央値の評価を表わすが、この実験によって予測される最大の可能な減少量を表わすものではない。これを行うためには、対照群の９５％信頼区間（ＣＩ）の最小値を、照射処理群の９５％ＣＩの最大値と比較するべきである。この計算によれば、９５％ＣＩ内での力価の最大の減少係数が得られるであろう。５０ｋＧｙ群については、この値は対数値で３．５の減少であった。
【０１０６】
放射線に対する生物学的汚染物質または病原体の感受性は、しばしば、そのＤ37値として表わされる。これは、活性な生物学的汚染物質または病原体の数を照射前の３７％に減少させるのに必要な放射量を表わす。したがって、具体的な生物学的汚染物質または病原体については、Ｄ37が低い程、照射の影響を受けやすい。スクラピープリオンのＤ37はおよそ４７ｋＧｙ（非特許文献６）であることが実験的に決定されている。ここに記載した方法を利用すると、スクラピープリオンのＤ37は、予想外にもわずか４．５ｋＧｙになることが判明した。すなわち、この実験の中で使用する方法および処方を用いればプリオンのＤ37が減少した。したがって、この実験では、使用する生物学的材料（市販の治療用ヒトアルブミン２５％溶液）の完全性を維持しつつスクラピープリオンの破壊を増加させることに成功した。
【０１０７】
処理対象のアルブミンを含む製剤の本質的な生物学的および生理学的特性を維持しつつスクラピープリオンの破壊を増すことに成功した。この特定の生物学的材料（ヒトアルブミン２５％溶液）を、総線量２５、５０および１００ｋＧｙのガンマ線照射を用いて照射前および照射後で調べた。ゲル電気泳動（図２Ａ〜２Ｂ）によって示されるように、アルブミンは、５０ｋＧｙまでの放射量で大部分は無傷なままであり、断片化や凝集は少量のみであり、モノマー状アルブミンの減少量はわずかであった。結果は、それらがアスコルビン酸塩および／またはハムスターを含むかどうかにかかわらずアルブミン試料のすべての場合について類似していた。より高線量では、小さな変化がアルブミン試料で見られ、大半はアルブミンの重合の増加の形態であった。
【０１０８】
ＨＰＳＥＣを使用してより詳細な分析を行った。図２Ｃ〜２Ｆに示されるように、照射により、アルブミンモノマーの量は減少し（１０．５分にピーク）、ダイマーの量は増加し（９分）、ポリマーの量は増加した（７．２分）。これらの変化はすべてアスコルビン酸塩存在下で最小となった。１２．６分および１５．３分での残留ピークはそれぞれアスコルビン酸塩およびＮ−アセチルトリプトファン安定剤のものである。
【実施例３】
【０１０９】
この実験では、凍結乾燥したアルブミン（５％ウロキナーゼを含む）に対し、約４℃において１．８４７ｋＧｙ／時間の割合で総線量１０または４０ｋＧｙになるまで照射を行った。
【０１１０】
ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷ×1３０ｃｍ×７．８ｍｍカラムを使用して、ゲル濾過によって試料を分析した（分離範囲２０ｋＤａ〜７，０００ｋＤａ、溶離バッファー０．１Ｍリン酸ナトリウム／０．１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、流速１ｍｌ／分）。
【０１１１】
図３Ａに示されるように、凍結乾燥し総線量１０ｋＧｙまたは４０ｋＧｙのいずれかまで照射した時には、アルブミンに変化はなかった。これに対して、図３Ｂに示されるように、液体のアルブミン試料では総線量４０ｋＧｙまで照射した時に、顕著な分解を示した。
【実施例４】
【０１１２】
この実験では、アルブミン溶液（２５％）の試料を調製し、試料の半分にはアルゴンを注入した。
【０１１３】
試料を総線量１８．１、２３および３０．４ｋＧｙまで、それぞれ０．９１、０．９２または１．０１ｋＧｙ／時間の割合でそれぞれ照射した。照射した試料は、凝集と断片化についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、および二量化と重合についてはＨＰＬＳＥＣによって分析した。
【０１１４】
図４Ａ〜４Ｂに示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、総線量３０．４ｋＧｙを照射した試料でさえ、断片化（還元ゲル上の６６ｋＤａバンド以下のダブレット）および凝集（非還元ゲル上の１１６ｋＤａバンド）は少量のみであることを示した。
【０１１５】
ＨＰＬＳＥＣは次のピークを示した。
【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
ＨＰＬＳＥＣによって示されるように、照射に先立ちアルゴン注入した試料では観察される二量化の量が減少した。
【実施例５】
【０１１８】
この実験では、総線量を変えて（１０、３０または５０ｋＧｙ）、−２０℃で血漿タンパク質画分を照射した。
【０１１９】
方法
ガラスバイアル中、少量のエタノールおよびアセトンを含む含水率９％の溶媒を低減したレベルで用い市販の血漿タンパク質画分試料を調製した。試料を、−２０℃において１．６０８ｋＧｙ／時間、総線量１０、３０または５０ｋＧｙでガンマ線照射し、次に、構造が完全であるかどうか分析した。構造の完全性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＳＥＣによって決定した。
【０１２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥについては、４つの１２．５％のゲルを次の調合処方に従い調製した。すなわち、アクリルアミド４．２ｍｌ；４×−トリス（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ；水３．３ｍｌ；１０％ＡＰＳ溶液１００μｌ；およびＴＥＭＥＤ１０μｌとし、電気泳動ユニットに置き、１×泳動用バッファー（トリス塩基１５．１ｇ；グリシン７２．０ｇ；ＳＤＳ５．０ｇの水溶液１ｌを５倍希釈したもの）を用いた。照射した試料および対照試料（１ｍｇ／ｍｌ）をＥｐｐｉｎｄｏｒｆチューブ中、試料バッファー（＋／−ベータ−ＭＥ）で希釈し、次いで数分間遠心分離した。各希釈試料（約１０μｇ）２０μｌを分析した。
【０１２１】
ＨＰＬＳＥＣについては、各試料３１μｇをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １３０Ａ分離システムにおいてＢｉｏｓｅｐ  ＳＥＣ  Ｓ３０００の７．７×３００ｍｍカラム上に装入した。５０ｍＭＮａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．７）および１００ｍＭＮａＣｌ中の流速１ｍｌ／分。
【０１２２】
結果
５Ａ〜５Ｂに示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では総線量５０ｋＧｙに至るまで、照射試料からアルブミンモノマーが定量的に回収されることが示される。同様に、図５Ｃ〜５Ｆに示されるように、ＨＰＬＳＥＣでは、総線量５０ｋＧｙに至るまで、照射試料のうちのいずれでも凝集の増加を示していない。
【実施例６】
【０１２３】
この実験では、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手したハムスター胎児腎臓（ＢＨＫ）細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）２０％（体積／体積）を含む培地上で増殖させ、また、これらが最終的に０．２５％ＦＢＳ（これは正常なＦＢＳ要求量の５％である）だけで増殖できるように、ゆっくり順応させた。次いで、ＦＢＳを減少させるとともに、１．６０８ｋＧｙ／時間で総線量５０ｋＧｙまで−２０℃の温度で照射した、または照射しない市販の血漿タンパク質画分を、血漿タンパク質画分を培地（６００ｍｇ）に対し０．３％重量／体積となるように培地に添加した。
【０１２４】
結果
非照射血漿タンパク質画分を含む培地上で増殖させたＢＨＫ細胞と、総線量５０ｋＧｙまで照射した血漿タンパク質画分を含む培地上で増殖させたＢＨＫ細胞との間には顕著な差はなかった。
【実施例７】
【０１２５】
この実験では、総線量を変えて−８０℃でブタパルボウイルス（ＰＰＶ）を含む血漿タンパク質画分に照射した。
【０１２６】
方法
２．５ＭＮａＣｌ中２０％ＰＥＧ８０００を使用してＰＰＶストック＃７を調製した。ＰＥＧで沈殿させたウイルスペレットを、ＰＥＧバッファー（０．ｌＭＮａＣｌ、０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。
【０１２７】
方法１
５０μｌのＰＫ−１３培地またはＰＰＶストック＃７を２ｍｌホイートンバイアルに入れ、４０℃で一夜乾燥させた。液が乾燥したら、市販の血漿タンパク質画分５０ｍｇを加え、バイアルに栓をし、次いで、総線量１０、３０または４５ｋＧｙとなるまで−８０℃において５．２０２ｋＧｙ／時間の割合で照射した。
【０１２８】
方法２
市販の血漿タンパク質画分５０ｍｇを、２ｍｌホイートンバイアルに入れ、次いで、１５０μｌのＰＫ−１３培地または１５０μｌの希釈したＰＰＶストック＃７（１００μｌＰＫ−１３培地＋５０μｌＰＰＶ）のいずれかと、溶解するまで混合した。バイアルに栓をし、次いで、総線量１０、３０または４５ｋＧｙとなるまで−８０℃において５．２０２ｋＧｙ／時間の割合で照射した。
【０１２９】
ＴＣＩＤ50分析
ＰＫ−１３培地（ＤＭＥＭ  ＡＴＣＣ＃３０２０００２、１０％ＦＢＳ  Ｇｉｂｃｏ＃２６１４００７９、１％  Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ／Ｌ−グルタミン  Ｇｉｂｃｏ＃１０３７８０１６）８５０μｌを各バイアルに加え全量１ｍｌとした。
【０１３０】
次いで、１３ｍｍフィルター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ＃４４５４）および３ｍｌの注射器を使用して試料を濾過殺菌した。ＰＫ−１３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−６４８９）をＰＫ−１３増殖培地中に維持し、９６穴プレート中に４０％の細胞密度で感染前日に播種した。細胞が７０〜８０％の細胞密度になった時点で、所望の照射試料（ＰＫ−１３培地または希釈したＰＰＶストック＃７のいずれかを含む）５０μｌを４つのウェルに加えた。
【０１３１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
照射に続いて、試料のストック溶液をＨＰＬＣ水（１０ｍｇ／ｍｌ）で調製し、次いで希釈した（２ｍｇ／ｍｌ）。次いで、試料を２×サンプルバッファー（ＤＴＴを含むまたはＤＴＴを含まない）で１：１希釈した。次いで、方法１からの試料については５μｇ（１０μｌ）を、方法２からの試料については１０μｇ（１０μｌ）をゲル上に装入した。
【０１３２】
結果
方法１に従い−８０℃で照射したＰＰＶ処理血漿タンパク質画分は、総線量４５ｋＧｙを使用して３．９ｌｏｇのウイルス致死を示した（０．０８４ｌｏｇ／ｋＧｙ）。方法２に従い−８０℃で照射したＰＰＶ処理血漿タンパク質画分は、５．５４ｌｏｇのウイルス致死を示した（０．１２３ｌｏｇ／ｋＧｙ）。これらの結果を図６にグラフで示す。照射した血漿タンパク質画分は、ＰＫ−１３細胞において細胞変性の結果を引き起こさなかった。
【０１３３】
−８０℃で照射したＰＰＶ処理血漿タンパク質画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用によっても分析した。これらの結果は図６Ｂ〜６Ｃに示す。
【実施例８】
【０１３４】
この実験では、アルブミンおよび第ＶＩＩＩ因子を含む凍結製剤を照射した。
【０１３５】
方法
アルブミンおよび第ＶＩＩＩ因子を含む試料を冷凍し総線量４５ｋＧｙまでガンマ照射した。
【０１３６】
結果
図７に示されるように、対照（非照射）試料のＦＶＩＩＩ活性と、冷凍し４５ｋＧｙまでガンマ線照射した試料のＦＶＩＩＩ活性の間の差はなかった。
【実施例９】
【０１３７】
この実験では、血漿タンパク質画分（９５〜９８％のヒト血清アルブミンを含む）を様々な条件下で照射した。
【０１３８】
方法
ＰＰＦの構造的完全性および安定性を示差走査熱量分析（ＤＳＣ）（これは生物学的巨大分子の短期安定性および長期安定性を測定するのに最も鋭敏で最も直接的なアプローチである）を使用して特徴付けた。これらの物理化学的な特性に対する照射の影響は同一の溶媒条件／処方の下で、照射ＰＰＦと非照射試料（トラベル対照）との比較によって評価した。結果は、ＰＰＦ製品への損傷を最小限に抑えたγ線照射処理最適条件を選択するための熱力学的および構造的基礎をもたらす。γ線照射の最適条件（ｐＨ、イオン強度、温度、線量、線量率）は、所望の結果を得るために、照射ＰＰＦと非照射ＰＰＦとの間の違いによって選択することができる。
【０１３９】
ＰＰＦ５％の溶液の加熱低温殺菌を、安定剤（４ｍＭＮ−アセチルトリプトファン（ＡＴ）または４ｍＭ  カプリル酸塩（ＣＡ）、または４ｍＭＡＴおよび４ｍＭＣＡの組合せのいずれか）の存在下に６０℃で１０時間行った。安定剤は、必要な加熱の間、ＰＰＦ安定性を増大させるために、非照射および照射ＰＰＦの両者に加えた（γ線照射後に加えた）。照射は、−８０℃において５ｋＧｙ／時間の線量率を用いて総線量５０ｋＧｙまで行った。照射ＰＰＦは約１％の水分を含んでいた。
【０１４０】
熱的な不安定性の指標としてアルブミン凝集体の形成を以下によってモニターした。すなわち、（ｉ）３７０ｎｍでの光散乱；（ｉｉ）還元または非還元条件下で行うＳＤＳ  ＰＡＧＥ；および（ｉｉｉ）ＨＰＬＣ。ＰＰＦ粉末を１×ＰＢＳバッファーに溶解し、ｐＨを７．０に調節し、タンパク質濃度を５０ｍｇ／ｍｌに調節した。蓋をしたポリプロピレンチューブに試料を入れ、サーモスタット付水浴中で６０℃に加熱した。走査熱量分析を用い、低温殺菌の前後において照射ＰＰＦおよび非照射ＰＰＦの変性温度（Ｔmax）および変性エンタルピー（ΔＨcal）を比較することにより、構造安定性およびＰＰＦの完全性を決定した。
【０１４１】
結果
照射ＰＰＦおよび非照射ＰＰＦの構造完全性の比較
照射ＰＰＦおよび非照射ＰＰＦの（ａ）還元条件下および（ｂ）非還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥでは、５０ｋＧｙまで照射した材料と非照射材料との間では、γ線照射によってもたらされるアルブミンの分解および／またはチオール関与重合体化について有意の差はなかった（ＰＡＧＥのバンド強度にわずかな変化があるのみであった）。
【０１４２】
ＤＳＣ実験から得られる熱量分析プロフィールの観測された違いは、照射した試料の三次構造の安定性における変化を示した。注目すべき最大の違いは、非照射物質と比較して、ＰＰＦの変性転移における協同性（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ）の減少および変性エンタルピーの減少にかかわるものであった。
【０１４３】
照射ＰＰＦおよび非照射ＰＰＦの超過熱容量の比較デコンボリューション分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、変性転移が最大となる温度の低下には、（その構造的安定性が異なる）アルブミン分子集団が加わったことが関係していることを示した。タンパク質における高安定性および低安定性画分両方の生成は、変性転移における協同性の減少として現われ、これは通常、天然タンパク質の三次構造を安定化させる内部相互作用ネットワークの減少として解釈される。照射ＰＰＦの変性転移における協同性の損失（これは非照射ＰＰＦに対する熱量分析プロフィールを変化させる）は、天然分子集団全体における分子間の損傷と見るべきではなく、照射が標的とする分子のうちのいくつかの安定性の変化として見るべきである。照射ＰＰＦの変性推移の脱−協同性は分子への顕著な損傷を示すものではないが、アルブミンの不安定化はさらなる熱低温殺菌ステップに関して重要である。つまり、その熱安定性（Ｔｄ）が６０℃未満であるアルブミン分子の不安定画分は、熱処理による変性から保護しなければならない。
【０１４４】
γ線照射後のアルブミンの回収に対するＰＰＦ粉末中含水量の影響
−２０℃、４５ｋＧｙ、１．８ｋＧｙ／時間で照射した様々な含水量を有するＰＰＦ粉末の熱量分析走査から、次のことが判明した。ＰＰＦ粉末中の含水量が８．６％から液体状態まで増加するにつれ、熱量分析曲線下の面積は減少するが、これは、γ線照射後の天然構造を有するアルブミン分子集団の減少として解釈される。液体状態で照射したＰＰＦは最多の損傷を示す。
【０１４５】
異なる線量率（１．８ｋＧｙ／時間または６．５ｋＧｙ／時間）および含水量（９％または１％）のγ線照射後のアルブミン構造の回収は、照射温度（−８０℃、−２０℃または２０℃）の関数として変化する。アルブミン回収の定量的な値は、照射または非照射ＰＰＦのエンタルピー比として計算できる。全変性エンタルピーの減少は、より高い含水量を有するＰＰＦ粉末に対する照射が分子の回収を低下させることを示した。これらの結果は、これらの条件下でのγ線照射によるＰＰＦへの損傷が恐らくは遊離基の生成から生じた副次的効果に関係していることを示す。
【０１４６】
ガンマ照射後のアルブミンの回収に対する温度の影響
アルブミン構造の回収は、ＰＰＦ照射の温度に強く依存しており、照射温度が低下するにつれて増加した。−８０℃では、低含水量試料の構造回収はより高い含水量の試料より良好であった。
【０１４７】
ＰＰＦに対する市販安定剤の影響
ヒトＰＰＦの熱的安定性に対するＣＡおよびＡＴの影響を、示差走査熱量分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって検討した。
【０１４８】
４ｍＭ  ＡＴの存在下では、アルブミンの変性が生じる温度（Ｔm）は６５．４から６７．６℃に上昇した。同様に、４ｍＭＣＡの存在下では、最大熱容量温度（Ｔmax）は、６５．４から７２．０３℃に上昇した。しかし、４ｍＭＡＴおよび４ｍＭＣＡを両方存在させた場合、アルブミンの熱安定性の増加は４．６℃にとどまり、Ｔmが６５．４から７０．５℃に変わったにすぎなかった。
【０１４９】
ＣＡとＡＴはいずれも照射ＰＰＦに同様の安定化効果があるが、その大きさは同等な溶媒条件下でわずかに低い。４ｍＭのＣＡおよびＡＴは大きなタンパク質変性を防止したが、照射したタンパク質の場合、６０℃まで加熱すると、混濁をもたらす高分子の凝集体の１０〜１５％のオリゴマー化を回避できないかもしれない。
【０１５０】
ＣＡの濃度を８ｍＭまで増加させると、アルブミンの熱の安定性が著しく増大する。すなわち、変性が４ｍＭＣＡ濃度で６５．４℃と比較して、８２℃になった。これは、４ｍＭより大きな濃度では、カプリル酸塩がアルブミンを十分安定させる能力を有し、６０℃（これは抗ウイルス性のための低温殺菌のために一般に使用される温度である）での変性に対する抵抗力を付与することを示す。
【０１５１】
ＨＰＬＣ分析は、低温殺菌前、ＣＡ存在下での照射ＰＰＦまたは非照射ＰＰＦが本質的にモノマー性であることを示した。加熱後、加熱により生じた高分子量凝集体の量は、非照射材料よりも照射ＰＰＦの場合の方がより高かった。照射ＰＰＦ中で誘導された凝集体のパーセンテージは、ＣＡ単独よりもＣＡとＡＴの両者が存在する方がほぼ２倍低く、これは、ＰＰＦ中でＣＡに加えてのＡＴの存在はその熱安定性を有意には増加させないが、それは６０℃で１０時間の加熱の間、アルブミン凝集を阻害することを示す。ＰＰＦ中でのアルブミンの熱誘導性凝集は、ＰＢＳバッファー中よりバッファーを用いていないＰＰＦ溶液でより顕著であった。
【０１５２】
変性および生じた凝集体の性質を試験するため還元条件の下でＳＤＳ  ＰＡＧＥを実行し、より高い分子量の凝集体に対応するバンドが消えることが判明した。これは、γ線照射したアルブミンを６０℃の熱処理に１０時間以上さらすと、分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を通して安定なタンパク質複合体が生じることを示している。０．２２ｍのフィルターによる濾過では凝集した分子を天然モノマー形から分離できない。分子間凝集が起こる程度は、ＰＰＦ溶液のｐＨおよびイオン強度ならびにその濃度に依存する。
【０１５３】
塩酸の添加によってタンパク質溶液を低ｐＨ値（６．５〜４．５）とするか、またはＰＰＦ溶液が低温殺菌前にｐＨ７．０に適切に調節されなかった場合、それは６０℃への暴露の最初の１０分間で徐々に重合した。アルブミンに結合するＣＡの親和性はｐＨを７．０から５．５まで低下させるとわずかに増加するが、安定剤の所与の濃度（４ｍＭ）では、必要とされる６０℃の加熱の間にタンパク質の変化を最小限にするのに十分ではなかった。
【０１５４】
−２０℃および−８０℃で照射した試料についての６０℃での低温殺菌の前後で行ったＰＰＦのサーモグラムは、両方の処理（γ線照射および低温殺菌）後のアルブミン分子の損傷がＰＰＦ粉末を−８０℃で照射した時により少ないことを示した。
【実施例１０】
【０１５５】
この実験では、血漿タンパク質画分（９５−９８％のヒト血清アルブミンを含む）を様々な条件下で照射した。
【０１５６】
方法
ＰＰＦの凍結乾燥粉末のγ線照射は−８０℃、５０ｋＧｙ（５．０２ｋＧｙ／時間）とした。
【０１５７】
結果
アスコルビン酸塩を１００ｍＭの濃度でＰＰＦに添加したところ、アスコルビン酸塩なしで照射した場合と比べ、γ照射した材料のバンドの強度が著しく改善されることが、還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示された。これは、γ線についてのタンパク質の分解が、アスコルビン酸塩存在下ではアスコルビン酸塩がない場合よりも少ないこと示している。
【０１５８】
１００ｍＭアスコルビン酸塩存在下、低温殺菌前の照射または非照射材料について行ったＨＰＬＣ分析は、照射または非照射タンパク質は、ポリペプチド鎖の化学的完全性ならびにモノマーおよびマルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）の量では実際上同一であることを示した。
【０１５９】
（ａ）アスコルビン酸塩の存在下、および（ｂ）非存在下ならびに（ｃ）アスコルビン酸塩単独での照射または非照射ＰＰＦについて熱量分析走査を用い、これらの形態の熱的安定性を評価した。ＰＰＦの熱量分析測定はＰＢＳの緩衝液中、ｐＨ７．０で行い、すべての実験で用いたタンパク質濃度は４．４ｍｇ／ｍｌとした。１００ｍＭアスコルビン酸塩存在下での照射および非照射ＰＰＦについての熱量分析走査の比較は、γ線照射後におけるその回収において著しい改善を示す。アスコルビン酸塩の存在下に熱で誘導した変性の熱量分析プロフィールは、アスコルビン酸塩なしの場合とは異なっているが、照射と非照射ＰＰＦについては、これらは非常に類似している。
【０１６０】
得られた結果は以下の点を示す：（ａ）１００ｍＭの濃度のアスコルビン酸塩はγ線照射における構造上の損傷からアルブミンを保護する；（ｂ）アスコルビン酸塩は、酸化反応に触媒作用を及ぼす金属存在下で７０℃に加熱することで化学変化（酸化と推測される）を示す；（ｃ）熱量分析は、照射の際のアスコルビン酸塩の変化（それらは恐らく遊離基との相互作用によって引き起こされる）は定量的に評価することができ、遊離基による損傷からタンパク質を保護するのに必要なアスコルビン酸塩の最適濃度の正確な決定が可能になる。
【０１６１】
γ照射および非照射のＰＰＦ（アスコルビン酸塩が存在する状態と存在しない状態で低温殺菌したもの）のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドの強度の比較により、アルブミンはアスコルビン酸塩の存在しない状態でよりも１００ｍＭアスコルビン酸塩の存在する状態下で照射および低温殺菌した時に、分解がより少ないことが示された。
【０１６２】
（ａ）非加熱のおよび（ｂ）低温殺菌したＰＰＦの１００ｍＭナトリウムの等価な溶液（ｐＨ７．０、１００ｍＭアスコルビン酸塩を含む）について熱量分析走査を行ったところ、６０℃で１０時間以上にわたって加熱照射されたＰＰＦは、タンパク質構造に何らの変化も引き起こさず、これは熱低温殺菌後の非照射アルブミンのそれに似ていることが示された。どちらのタンパク質でも変性転移が最高になる温度は同一であり、それらが同様の構造的安定性を有することを示していた。低温殺菌の前後における照射アルブミンおよび非照射アルブミン両者の熱量分析プロフィール形状の小さな差は、アスコルビン酸塩存在下における高温下でのタンパク質の安定性増大によるものであった。アスコルビン酸塩存在下では、熱変性に対するアルブミンの安定性は３．８℃分増加した。この安定化は、６０℃での加熱を延長することに対してタンパク質構造をさらに保護する。
【０１６３】
照射および非照射材料間の主要な違いは、熱容量の発熱ピークが最大になる温度にあった。発熱効果は、γ線照射の結果、アスコルビン酸塩の酸化形への転換に伴うものであった。γ照射されたアスコルビン酸塩では、加熱によって誘導されるこの転換プロセスは４３℃で起こるが、一方、非照射アスコルビン酸塩では、このプロセスは５０℃で最大になる。これは、アスコルビン酸塩をγ線照射に暴露するとその化学構造が変化し、非照射アスコルビン酸塩に比べ、照射アスコルビン酸塩は酸化形への転換がより起こりやすくなることを示している。
【０１６４】
照射および非照射アルブミンの構造的完全性の定量的評価は、以下のように変性推移のエンタルピーの比較から、両者の間の違いは１５％未満であることが示された。これは、アスコルビン酸塩が存在しない状態（この場合、低温殺菌後に照射したＰＰＦの回収はほぼ７０％と見積もられた）よりも遥かに良好であった。
【０１６５】
アスコルビン酸塩が存在する状態と存在しない状態で低温殺菌した後の照射および非照射ＰＰＦのＨＰＬＣ分析は、低温殺菌した後ＰＰＦ中のモノマー／マルチマー集団の定量的評価を可能にするが、これは、アスコルビン酸塩が存在しない状態では、６０℃、１０．５時間の非照射ＰＰＦの低温殺菌が、ほぼ１２．４％の凝集体を生じさせることを示した。γ照射したＰＰＦでは低温殺菌により凝集体の量は３６．３％まで増加した。１００ｍＭアスコルビン酸塩存在下でのＰＰＦの低温殺菌は、Ｓ−Ｓ架橋した凝集体をほぼ１４％低減して２２．８％とした。
【実施例１１】
【０１６６】
この実験では、ペーストに由来するヒト血清アルブミンを、様々な条件下で照射した。
【０１６７】
方法
主にアルブミンを含む画分Ｖのペースト状沈殿を、水中で再構成して、ヒトアルブミンを生じるように処理した。最終溶液は、ｐＨ７．０のバッファーを用いていない溶液に、９７％のアルブミン含有量を有するタンパク質２０ｍｇ／ｍｌを含んでいた。再構成したペーストからのアルブミンの全収率は約３０〜３５％であった。画分Ｖのペースト状沈殿を閉じたガラスバイアル中、−８０℃で１．８ｋＧｙ／時間で総線量５０ｋＧｙまで照射した。トラベル対照試料を同一条件下に保存した。放射率をアラニン線量計によって測定し、手続きに従って温度ファクターで補正した。市販安定剤であるカプリル酸塩（ＣＡ）およびＮ−アセチルトリプトファン（ＡＴ）を低温殺菌前に４ｍＭ濃度までアルブミン溶液に加えた。低温殺菌は、６０℃で１０時間連続加熱を行った。
【０１６８】
結果
ペーストから精製したアルブミンのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、安定剤がある状態およびない状態で精製アルブミンが約９６％の純度を有することを示した。５０ｋＧｙまでのγ線照射は、高分子量および低分子量のアルブミン分子集団（これらはポリペプチド鎖の分解およびそのＳ−Ｓ架橋した凝集体への会合によって生じる。）を生じた。後者は還元条件下で低分子量断片に転換する。これらの集団は両方ともかなり小さく、全タンパク質の約８％であった。低温殺菌は、バンドの強度に変更を生ぜず、１０時間の加熱でも化学的分解はなかった。γ線照射されたタンパク質の低温殺菌の最も重要な結果は、それが分子間架橋を引き起こし、ゲル上で高分子量の凝集体として現われることである。この凝集状態は、非照射アルブミンの場合には観察されなかった。
【０１６９】
ＡＴとＣＡ存在下、低温殺菌の前後にγ線照射を行った後のアルブミン試料のＨＰＬＣ分析で、照射がモノマー形を犠牲にしてダイマーとマルチマーがわずかに増大していることが判明した。マルチマーは、断片化したポリペプチド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥを参照）によって形成され、ＨＰＬＣの非還元条件下のＳ−Ｓ架橋によって安定化した。６０℃、１０時間の低温殺菌により、アルブミン分子塊の顕著な再構成が起こり、照射アルブミンにおいて高分子量凝集体を形成した。
【０１７０】
ＡＴおよびＣＡが存在しない状態での照射および非照射アルブミンの両者のＤＳＣ分析は、照射アルブミンの主要な画分の熱的安定性が非照射タンパク質に類似したままだったことを示した。しかし、照射アルブミンは、天然アルブミンより安定性の低い分子の幾つかの画分を有していた。
【０１７１】
照射アルブミンおよび非照射アルブミンの超過熱容量関数のデコンボリューション分析は以下のことを示した。非照射アルブミンの熱容量関数は変性転移の単純な２−状態モデルに適合するが、非照射アルブミンはより複雑な挙動を示した。これはその熱的安定性において異なった少なくとも２つの独立したアルブミン分子集団からなる。一方の集団は、非照射アルブミンの熱的安定性において類似した分子によって示され、他方は不安定化された分子を伴っていた。照射アルブミンの最後の画分は、低温殺菌（６０℃）の温度で変性を最も受けやすく、Ｓ−Ｓ架橋凝集体の生成原因かもしれない。市販安定剤ＡＴおよびＣＡを加えると、照射および非照射アルブミンの安定性が増大した。
【０１７２】
安定剤の存在下に、非照射分子の９０％以上は、６０℃以上で熱的安定性を有しており、したがって６０℃の低温殺菌を行っても熱的損傷が避けられた。照射分子の大半は、やはりＣＡとＡＴ存在下で安定したが、分子の一部（１０〜１５％）は安定性が６０℃以下であった。この画分が低温殺菌で不可逆的に変性されると予想される。
【０１７３】
低温殺菌の前後に照射または非照射のアルブミンのＤＳＣ分析で、６０℃以下の熱的安定性を有する画分が加熱の間に変性された形に変換されたことが判明した。照射アルブミンの変性転移ピークは、低温殺菌の後により協同的になり、アルブミン集団のうち安定性の低い画分を犠牲にして（これは変性された形に変換された）、天然構造が豊富になることを示している。
【０１７４】
ＨＰＬＣを使用して、γ線照射および低温殺菌に続くアルブミン塊の回収を決定する。モノマー、マルチマーおよび低分子量断片からなる集団をＰｅａｋＦｉｔプログラムを使用して、これらの形のピークパーセンテージから評価した。照射後の塊の損失は、主に少量のポリマー（約２％）の形成に伴うものである。
【０１７５】
γ線照射および低温殺菌の両方の後でのアルブミンの三次構造回収のパーセンテージを、タンパク質の構造の完全性のマーカーとして、安定化エンタルピーのＤＳＣ分析に基づいて決定した。γ線照射されたペーストに由来するアルブミンの回収は８１〜８２％であり、これは、照射したＰＰＦ粉末由来のアルブミンについて事前に評価した値７８〜８０％に近かった。市販安定剤ＣＡおよびＡＴを４ｍＭの濃度で別々にまたは４ｍＭの濃度の複合物として加えた場合とで、アルブミン回収の有意な差は観察されなかった。
【０１７６】
γ線照射されたアルブミンを低温殺菌すると、６０℃、１０時間の加熱の間に不安定化した分子集団の変性のためにさらにタンパク質構造の約１０％が失われる。これに対し、非照射アルブミンでは２％であった。
【０１７７】
低温殺菌後、アルブミンを照射し、その後、損傷を受けた分子を除去するため１０ｍＭＮａ−Ａｃバッファー中ｐＨ４．９で透析して沈殿させ、透析および遠心分離による不溶物質の除去の後に、アルブミンのＨＰＬＣ分析を行うと、低温殺菌によって誘導される架橋した凝集体の量が著しく減少することを示した。しかし、この方法の問題点は、凝集体された材料の７０％が好適にも除去されるにもかかわらず、完全なタンパク質の相当量がｐＨ４．９で透析中に除去されたという点であった。
【０１７８】
保護添加剤は、その捕捉能力およびエタノール／水の可溶性に基づいて選択した。添加剤は有機溶液と水溶液の間で異なる可溶性を有するという能力はペースト（有機母液）中のタンパク質を保護するのに必要である。そこでは、それらは本質的に可溶性であり、それらが不溶な水溶液中で再構成する際に、その除去を容易にする。
【０１７９】
捕捉剤と安定剤を均一に分配させ有機的環境に溶解させるため、０℃でアルブミンペーストに加えた。添加剤を含むペーストを凍結し、−８０℃での照射用に調製する。次いで、アルブミンを照射または非照射ペーストから精製した。
【０１８０】
様々な捕捉剤の存在下、−７２℃で５０ｋＧｙ（４．６ｋＧｙ／時間）を照射したペーストに由来するアルブミンのＳＤＳ  ＰＡＧＥは、照射が全材料の約１０％の断片化をもたらし、それは捕捉剤の存在によって改善されなかったということを示す。
【０１８１】
様々な安定剤の存在下、ＤＳＣに基づいて画分Ｖアルブミンの構造の回収を比較することにより、ラウリン酸（９１％）およびビタミンＥ（８７．３％）存在下でアルブミンの最良の回収が観察されることが示された。しかし、アルブミンの回収は高いように見えたが、これらの数値はその全体像を反映するものではなかった。なぜなら、すべての場合にタンパク質の全収率は、捕捉剤なしと比べて約４０％だからである。添加剤が存在すると、アルブミンの可溶性が著しく変化して不溶性凝集体を形成した。
【実施例１２】
【０１８２】
この実験では、ＳＤＳの存在下または不在下でアルブミンを照射した。
【０１８３】
結果
１００μＭＳＤＳが存在すると、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．０）中で測定されるアルブミンの熱的安定性が６４℃から８０．５℃まで増大した。このような低濃度では、強い変性剤としてよく知られているＳＤＳがアルブミン構造に対しては２０℃以上それを安定させるという反対の効果を有していた。これは、ＳＤＳがアルブミンに特異的に結合する能力を有し、それはラウリン酸などの脂肪酸の結合能力に匹敵することを示した。
【０１８４】
ＳＤＳなしで照射したアルブミンにＳＤＳを加えると、γ線照射で損傷を受けていないアルブミン部分のみが安定化される結果となった。判明したことによれば、タンパク質の７８％がＳＤＳと結合するその能力を保持したが、分子の２５％は照射後にこの能力を失い、安定させることができなかった。リガンド結合試験により、照射によって損傷を受けなかった天然分子集団を、本来の結合特性を失ったものから容易に識別し分離することが可能になった。後者のアルブミン分子画分は６０℃の加熱処理に耐えられず、低温殺菌後に変性した材料部分を生じるはずである。低温殺菌材料の熱容量ピークは、低温殺菌の前に観察される低安定集団を欠いており非照射タンパク質の熱容量ピークに形において近い。この観察は、アルブミンの天然形と変性形を識別することができる方法（例えば、天然形とのみ相互作用するリガンド結合マトリックス）によって、低温殺菌後に、照射された画分から天然アルブミンを分離し得ることを示した。
【０１８５】
１００μＭＳＤＳが存在する状態および存在しない状態で照射されたアルブミンのＤＳＣ分析は、部分的な熱容量の変性前の値に有意な差を示した。これは、ＳＤＳの存在により、タンパク質が、照射される間に変性状態へ変形することから保護されることを示している。この熱力学の基準によれば、ＳＤＳが存在しない状態で照射したアルブミンは、ＳＤＳ存在下に照射したタンパク質より、より多くの変性された物質を含んでいた。
【０１８６】
低温殺菌の前後において、ＳＤＳがない状態で照射した同じアルブミン試料のＨＰＬＣ分析は、これらの試料（ＳＤＳなしで照射したもの）の６０℃における１０．５時間の低温殺菌が、架橋した外見上の凝集体をもたらすことを示した。これらの高ＭＷ凝集体は、分子集団（それらは照射の際に既に変性され、そのために熱的安定性が、低温殺菌の６０℃より低かった）に由来するものであった。γ線照射中に損傷を受けず、したがってＳＤＳによって安定させることができたアルブミン分子は、加熱低温殺菌中にその完全性を維持した。
【０１８７】
これらの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、アルブミンがγ線照射によって損傷を受け、変性形に変換された場合、変性した分子が１０時間の低温殺菌中にＳ−Ｓ架橋凝集体を形成することを示した。非照射アルブミン（それは主に天然形であった）は、低温殺菌中に凝集を示さなかった。
【０１８８】
実験は、ＳＤＳの存在が低温殺菌時にアルブミンの回収を改善できる（単にアルブミンの熱的安定性を６０℃以上に増大させる場合）だけでなく、照射中にこれが存在するとγ線照射後のその回収も改善できることを示している。
【０１８９】
アルブミンを変性させることなく、アルブミンに対して最大の保護効果があるＳＤＳの最適濃度を決定するために、様々な濃度のＳＤＳ存在下でたんぱく質の回収を、２つの処方、すなわち、凍結したもの、および凍結乾燥したもので検討した。以下の照射条件を使用した：５０ｋＧｙ（４ｋＧｙ／時間）、−７２℃。
【０１９０】
以下のようにＳＤＳを含む試料を調製した：画分Ｖペーストから精製されたアルブミンにＳＤＳを加えた。ＳＤＳ（２８８．３８Ｄａ）およびアルブミン（６６４７０Ｄａ）の分子量に基づいてモル比を計算した。試料を−５３℃で含水率約１０％（正確には測定しなかった）まで凍結乾燥した。凍結乾燥した試料にドライアイス（約７２℃）上で１．４２ｋＧｙ／時間、５０ｋＧｙまで照射を行い、照射後、粉末からＰＢＳバッファー、ｐＨ７．０に再構成した。実験の具体的目的によるが、再構成した試料を、特定の生物物理学の測定のために必要な濃度に希釈するか、ＰＢＳのバッファーに対して透析した。
【０１９１】
実験の別のセットは５％アルブミン上で行った。このアルブミンは、市販安定剤であるＡＴおよびＣＡをそれぞれ４ｍＭ濃度で含む以外は、ペースト由来アルブミンと構造上の何れの特性の違いも示さなかった。ＳＤＳを製品に加え、試料をドライアイス上で１．４１５ｋＧ／時間、５０ｋＧｙまで照射した。
【０１９２】
低温殺菌の前後にＳＤＳが存在する状態および存在しない状態で、５％アルブミンの照射試料および対照試料のＳＤＳ  ＰＡＧＥを行ったところ、ＳＤＳをモル比で１：１０含む場合はＳ−Ｓ架橋した凝集体の消失がもたらされることが示され、これはＳＤＳが存在しない状態で低温殺菌後に観察されていたことであった。ＳＤＳが１：１のモル比で存在する場合は凝集体を形成しないように保護するのには十分ではなかった。
【０１９３】
照射されたアルブミン試料のＨＰＬＣ分析によれば、γ線照射はダイマーおよびマルチマー含有量にわずかな増加を示すのみであり、一方、６０℃での熱処理は、分子間Ｓ−Ｓ架橋によって形成される顕著な量の高ＭＷ凝集体を生じることが示された。１：１０のモル比でＳＤＳが存在する状態でアルブミンのＨＰＬＣ分析を行ったところ、ＳＤＳアルブミンのこの濃度は、照射アルブミンを凝集から完全に保護し、特にそれを非照射タンパク質から識別できないようにすることが示された。
【０１９４】
ＳＤＳが存在しない状態および存在する状態で液体処方中に照射したアルブミンのＤＳＣ分析を行ったところ、照射中にＳＤＳが存在すると、アルブミンの熱的安定性が増大するだけでなく、より重要なことに、照射後のタンパク質構造の回収を著しく増大させることが示された。ＳＤＳなしで照射したアルブミンと比較して、ＳＤＳ存在下でのタンパク質の回収は９０％まで増加した。熱量分析曲線上の照射アルブミンの熱吸収ピークの位置は、９０％を超える照射された分子が６０℃を超える安定性を有することを示した（これは、６０℃で低温殺菌をする際のタンパク質の保護にとって重要であると予想される）。
【０１９５】
低温殺菌に続く、照射または非照射アルブミンのＤＳＣ分析は、照射された試料のＳＤＳなしでの低温殺菌が照射アルブミンのほぼ２０％の変性を招き、一方、ＳＤＳ存在下での低温殺菌がタンパク質構造に影響しないことを示した。アルブミン構造に対するＳＤＳの安定化効果は、低温殺菌時における損傷から照射タンパク質を保護した。
【０１９６】
様々な量のＳＤＳ存在下で、γ線照射および低温殺菌に続くアルブミン構造の回収を比較したところ、タンパク質／ＳＤＳのモル比１：１でＳＤＳが存在する場合、照射時にタンパク質回収はわずかに増加するのみであることが示された。しかし、この濃度では、それは低温殺菌中に照射されたアルブミンを変性から保護しなかった。これに対し、タンパク質／ＳＤＳモル比を１：１０まで増加させると、安定性が増大して、γ照射および低温殺菌のどちらからもアルブミンが保護された。
【０１９７】
本発明について十分な説明を行ってきたが、本発明の範囲またはその任意の実施形態から外れることなく、広範囲の等価な条件、処方および他のパラメーターで本発明の方法が実行できることが、当業者には理解されるであろう。
【０１９８】
本願で引用した特許および刊行物はすべて、参照によってその全体が本願に完全に組み込まれる。任意の刊行物の引用は出願日に先立つその開示のためにあり、そのような刊行物が先行技術であるという承認として解釈されてはならず、本発明が先の発明によるそのような刊行物に先立つ資格がないとして解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１Ａ】種々のレベルの残留溶媒含有量および揮発性安定剤の存在下または非存在下で照射された血漿タンパク質画分を示す。
【図１Ｂ】種々のレベルの残留溶媒含有量および揮発性安定剤の存在下または非存在下で照射された血漿タンパク質画分を示す。
【図１Ｃ】種々のレベルの残留溶媒含有量および揮発性安定剤の存在下または非存在下で照射された血漿タンパク質画分を示す。
【図２Ａ】照射され、スクラピーの感染力についてアッセイされたハムスターに適合させたスクラピー（２６３Ｋ株）からの１０％脳ホモジネートで１：１００スパイク処理されたヒトアルブミン（２５％）を示す。
【図２Ｂ】照射され、スクラピーの感染力につてアッセイされたハムスターに適合させたスクラピー（２６３Ｋ株）からの１０％脳ホモジネートで１：１００スパイク処理されたヒトアルブミン（２５％）を示す。
【図２Ｃ】照射され、スクラピーの感染力につてアッセイされたハムスターに適合させたスクラピー（２６３Ｋ株）からの１０％脳ホモジネートで１：１００スパイク処理されたヒトアルブミン（２５％）を示す。
【図２Ｄ】照射され、スクラピーの感染力につてアッセイされたハムスターに適合させたスクラピー（２６３Ｋ株）からの１０％脳ホモジネートで１：１００スパイク処理されたヒトアルブミン（２５％）を示す。
【図２Ｅ】照射され、スクラピーの感染力につてアッセイされたハムスターに適合させたスクラピー（２６３Ｋ株）からの１０％脳ホモジネートで１：１００スパイク処理されたヒトアルブミン（２５％）を示す。
【図２Ｆ】照射され、スクラピーの感染力につてアッセイされたハムスターに適合させたスクラピー（２６３Ｋ株）からの１０％脳ホモジネートで１：１００スパイク処理されたヒトアルブミン（２５％）を示す。
【図３Ａ】１０〜４０ｋＧｙの総線量で照射された、凍結乾燥アルブミン（５％ウロキナーゼを含む）を示す。
【図３Ｂ】１０〜４０ｋＧｙの総線量で照射された、凍結乾燥アルブミン（５％ウロキナーゼを含む）を示す。
【図４Ａ】予めアルゴンのスパージングを行うかまたは行わずに照射されたアルブミンの試料を示す。
【図４Ｂ】予めアルゴンのスパージングを行うかまたは行わずに照射されたアルブミンの試料を示す。
【図５Ａ】１８．１、２３および３０．４ｋＧｙの総線量で照射され、そして、凝集および断片化に対してはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２量化および重合に対してはＨＰＬＳＥＣによりアッセイされたアルブミン溶液（２５％）の試料を示す。
【図５Ｂ】１８．１、２３および３０．４ｋＧｙの総線量で照射され、そして、凝集および断片化に対してはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２量化および重合に対してはＨＰＬＳＥＣによりアッセイされたアルブミン溶液（２５％）の試料を示す。
【図５Ｃ】１８．１、２３および３０．４ｋＧｙの総線量で照射され、そして、凝集および断片化に対してはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２量化および重合に対してはＨＰＬＳＥＣによりアッセイされたアルブミン溶液（２５％）の試料を示す。
【図５Ｄ】１８．１、２３および３０．４ｋＧｙの総線量で照射され、そして、凝集および断片化に対してはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２量化および重合に対してはＨＰＬＳＥＣによりアッセイされたアルブミン溶液（２５％）の試料を示す。
【図５Ｅ】１８．１、２３および３０．４ｋＧｙの総線量で照射され、そして、凝集および断片化に対してはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２量化および重合に対してはＨＰＬＳＥＣによりアッセイされたアルブミン溶液（２５％）の試料を示す。
【図５Ｆ】１８．１、２３および３０．４ｋＧｙの総線量で照射され、そして、凝集および断片化に対してはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２量化および重合に対してはＨＰＬＳＥＣによりアッセイされたアルブミン溶液（２５％）の試料を示す。
【図６Ａ】ガンマ線照射後にＰＰＶ−スパイク化血漿タンパク質画分に導入されたウイルスにおける減少を示すグラフである。
【図６Ｂ】照射された血漿タンパク質画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すゲルである。
【図６Ｃ】照射された血漿タンパク質画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すゲルである。
【図７】アルブミン含有製剤中のファクターＶＩＩＩおよびガンマ線照射後のファクターＶＩＩＩの活性を示すグラフである。
【図１Ａ】
2005505552.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2005505552.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2005505552.tif 000010
【図２Ｅ】
2005505552.tif 000011
【図２Ｆ】
2005505552.tif 000012
【図３Ａ】
2005505552.tif 000013
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505552.tif 000105
2005505552.tif 000106
【国際調査報告】
2005505552.tif 000107