(57)【要約】本発明は、所望のタンパク質、好ましくは異種性のタンパク質を、好ましくは植物において、発現させる方法に関する。好適な態様において、前記植物は、倍加半数体ホモ接合性のトランスジェニック・タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物（Ｎｔｐ３０３に関してサイレンスされている）である。さらにまた、本発明は、本発明の核酸構築物を有する又は有さない前記植物に関する。前記トランスジェニック・タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物の繁殖体（Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）、収穫物（ｈａｒｖｅｓｔ）および組織材料（ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）も本発明の一部である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質を植物において発現するための方法であって：
ａ）第一ヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供することと（該第一ヌクレオチド配列は、少なくとも３４％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有し、所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列に対して動作可能に連結され、更に異種性プロモーターと動作可能に連結されている）、
ｂ）植物を前記核酸構築物と接触させて形質転換植物を取得することと、および
ｃ）前記形質転換植物を所望の前記タンパク質またはポリペプチドの発現を生じさせる条件に提示（ｓｕｂｊｅｃｔｉｎｇ）することと、および随意的に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）前記タンパク質またはポリペプチドを回収することと、
を含む方法。
【請求項２】
所望のタンパク質を植物において発現するための方法であって：
ａ）第一ヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供することと（該第一ヌクレオチド配列は、少なくとも４６％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４〜１５１に対して有するヌクレオチド配列、または少なくとも５１％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４〜７６に対して有するヌクレオチド配列、またはその組み合わせを具備し、所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列に対して動作可能に連結され、更に異種性プロモーターと動作可能に連結されている）、
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記第一ヌクレオチド配列が、少なくとも４６％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４〜１５１に対して有するヌクレオチド配列、または１００％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２７〜５０に対して有するヌクレオチド配列、またはその組み合わせを具備する方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記第二ヌクレオチド配列が異種性のタンパク質またはポリペプチドをコードする方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、前記タンパク質またはポリペプチドが倍加半数体ホモ接合性のトランスジェニック・タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物（ｎｔｐ３０３に関してサイレンスされている）において発現される方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、前記タンパク質が前記植物の花粉または種子において発現される方法。
【請求項７】
倍加半数体ホモ接合性のトランスジェニック・タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物（ｎｔｐ３０３に関してサイレンスされている）。
【請求項８】
請求項７に記載の植物であって、前記植物が第一ヌクレオチド配列を含む核酸構築物を具備する植物（ここで、該第一ヌクレオチド配列は、少なくとも３４％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有し、所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列に対して動作可能に連結され、更に異種性プロモーターに動作可能に連結されている）。
【請求項９】
請求項７に記載の植物であって、前記第一ヌクレオチド配列が、少なくとも４６％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４〜１５１に対して有するヌクレオチド配列、または少なくとも５１％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４〜７６に対して有するヌクレオチド配列、またはその組み合わせを具備する植物。
【請求項１０】
請求項９に記載の植物であって、前記第一ヌクレオチド配列が、少なくとも４６％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４〜１５１に対して有するヌクレオチド配列、または１００％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２７〜５０に対して有するヌクレオチド配列、またはその組み合わせを具備する植物。
【請求項１１】
請求項８〜１０の何れか１項に記載の植物であって、前記第二ヌクレオチド配列が異種性のタンパク質またはポリペプチドをコードする植物。
【請求項１２】
請求項７〜１１の何れか１項に記載の植物の繁殖材料（Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｍａｔｅｒｉａｌ）。
【請求項１３】
請求項７〜１１の何れか１項に記載の植物の収穫物材料（Ｈａｒｖｅｓｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）。
【請求項１４】
請求項７〜１１の何れか１項に記載の植物の組織。
【請求項１５】
ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合するリガンドであって、前記第一ヌクレオチド配列が、少なくとも３４％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有しているリガンド。
【請求項１６】
ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合するリガンドであって、前記第一ヌクレオチド配列が、少なくとも４６％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４〜１５１に対して有するヌクレオチド配列を具備するリガンド。
【請求項１７】
ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合するリガンドであって、前記第一ヌクレオチド配列が、少なくとも５１％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４〜７６に対して有するヌクレオチド配列を具備するリガンド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合するリガンドであって、前記第一ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２７〜５０のヌクレオチド配列を有しているヌクレオチド配列を具備するリガンド。
【請求項１９】
少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列（又はその部分）に特異的に結合するリガンドであって、前記第一ヌクレオチド配列が、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１４〜２１のヌクレオチド配列を有しているヌクレオチド配列およびヌクレオチド５９〜６６のヌクレオチド配列を有している相補鎖から転写されるリガンド。
【請求項２０】
所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列の翻訳を調節するための請求項１５〜１９の何れかに記載のリガンドの使用（ここで、前記第二ヌクレオチド配列は、前記第一ヌクレオチド配列に動作可能に連結される）。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
植物および動物における有性生殖は、配偶子の産生を必要とする。植物および動物界の間の配偶子発生の発生ステージには多くの細胞学的な差異が存在するが、いくつかの相似（ｐａｒａｌｌｅｌｓ）が存在する。植物において、同様に動物において、配偶子産生は、高度に規則正しいプロセスであり、１つの生理学的状態から次の状態への、有糸（ｍｉｔｏｔｉｃ）および減数（ｍｅｉｏｔｉｃ）分裂による幹細胞の転移により特徴づけられる。これらの一連の事象は、遺伝子発現における複数の変化により方向付けられる。
いくつかの植物および動物種の配偶子発生におけるいくつかのステージは、ほとんど如何なる転写活性も示すことなく進行する。これらのステージにおいて、前に合成されたｍＲＮＡｓは、更なる発生に必須の産物へと翻訳される。このことは、これらの種において、遺伝子発現の転写後制御（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）が配偶子発生における先導的な原則（ｌｅａｄｉｎｇ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）であることを示唆している。配偶子発生の間の遺伝子発現の転写後制御の例は、被子植物における雄性配偶体（花粉）の成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）および発芽（ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）である。未成熟の花粉は、小さい雄原細胞（ｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）および大きい栄養細胞（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）からなり、これらは非対称性のハプロイド有糸分裂（花粉有糸分裂Ｉ）を介して小胞子（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｓ）を形成する。続く発生の間、いくつかの種は第二ハプロイド有糸分裂（花粉有糸分裂ＩＩ）を有し、これにより三細胞性花粉（ｔｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｌｅｎ）を生じるが、これは大抵の種（即ち、二細胞性花粉）には存在しないプロセスである。二および三細胞性花粉の成熟は発生プロセスの一範囲により達成され、このプロセスは最終的に花粉の進行性の脱水及び該プロセスの休止状態（ｄｏｒｍａｎｃｙ）への転移を生じる。いくつかの植物種の花粉成熟は、ｒＲＮＡｓ、ｔＲＮＡｓ、ｍＲＮＡｓおよびリボソームの大量の蓄積を伴う。花粉が適合する柱頭に付着して花粉粒子の顕著な再水和を生じ、これが翻訳機構の急速な再活性化を生じる（この翻訳機構は以前に蓄積したｔＲＮＡｓ、ｒＲＮＡｓおよびｍＲＮＡｓを使用する）。これらの貯蔵型の産物から合成されたタンパク質は、花粉の前配偶子段階（ｔｈｅ  ｐｒｏｇａｍｉｃ  ｌｉｆｅ  ｓｔａｇｅ）、即ち花粉の発芽、続く花粉管の成長、および第二ハプロイド有糸分裂（二細胞性花粉の場合）、のために必要とされる。
【０００２】
花粉遺伝子発現の制御に関する転写後プロセスの重要性にもかかわらず、花粉遺伝子発現の転写後制御の根底にある機構に関しては僅かなことしか知られていない。花粉発現遺伝子（ｌａｔ５２）の翻訳制御に注目した技術には一研究のみが知られている（Ｂａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，  １０  （４），  ６１３−６２３）。この研究において、花粉特異的な翻訳制御における５’ＵＴＲの関与が示されている。より一般的には、翻訳の速度は、ｍＲＮＡｓにおけるシス作動性エレメントにより影響される。例えば、異なる真核生物機構のｍＲＮＡ種の翻訳レベルは、５’ＵＴＲ、コード配列、または３’ＵＴＲにおけるシス作動性エレメントにより調節される。これらのシス作動性エレメントは、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始または伸長に影響することにより作用する。
【０００３】
タバコ花粉タンパク質ＮＴＰ３０３の合成の制御は、転写後レベルで生じる。ｎｔｐ３０３遺伝子の転写物は、花粉有糸分裂Ｉ後に最初に検出可能であり、そして花粉成熟および引き続く花粉管成長の間に継続的に蓄積する（Ｗｅｔｅｒｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８  （６），  １１０１−１１１１）。対照的に、タンパク質は、花粉再水和の開始時にのみ検出可能な量で出現する（Ｗｉｔｔｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｓｅｘ．  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．  １２  （５），  ２７６−２８４）。従って、そのｍＲＮＡが蓄積するにもかかわらず、花粉発生の間にＮＴＰ３０３タンパク質の効率的な合成は生じず、この束縛は花粉発芽の開始時にのみ解かれる。しかしながら、どのシス作動性エレメント（ｎｐｔ３０３  ｍＲＮＡ中の）が、もし存在するなら、翻訳制御の本機構に作用するかは明確でない。特に、何らかのそのようなエレメントを使用してＮＰＴ３０３以外（例えば、異種性のタンパク質）のタンパク質の発現制御に使用できるかどうかは不明である。
【発明の記載】
【０００４】
定  義
以下は本発明において使用される用語の定義である。
【０００５】
植物
本明細書中で使用される、「植物」の用語は、植物全体（通常は形質転換技術を適用できる高等植物のクラスを含み、単子葉および双子葉類植物の双方を含む）か又は植物の部分〔例えば、根（ｒｏｏｔｓ）、茎（ｓｔｅｍｓ）、柄（ｓｔａｌｋｓ）、葉（ｌｅａｖｅｓ）、花弁（ｐｅｔａｌｓ）、果実（ｆｒｕｉｔｓ）、種子（ｓｅｅｄｓ）、塊茎（ｔｕｂｅｒｓ）、花粉（ｐｏｌｌｅｎ）、成長点（ｍｅｒｉｓｔｅｍｓ）、カルス（ｃａｌｌｕｓ）、ガク片（ｓｅｐａｌｓ）、鱗茎（ｂｕｌｂｓ）および花（ｆｌｏｗｅｒｓ）〕の何れかを意味する。本明細書中で使用される植物の用語は、限定されることなく、更に種子中の植物細胞（ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｅｅｄｓ）、懸濁培養物（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、胚（ｅｍｂｒｙｏｓ）、成長点領域（ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ）、カルス組織（ｃａｌｌｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ）、葉（ｌｅａｖｅｓ）、根（ｒｏｏｔｓ）、シュート（ｓｈｏｏｔｓ）、配偶体および胞子体組織（ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ）、花粉、プロトプラスト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）および小胞子（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｓ）を意味する。さらにまた、全器官における全植物組織が、本明細書中に使用される「植物」の用語の定義に含まれる。植物組織は、植物の分化型および未分化型の組織を含み（しかし、それらに限定されない）、これらには花粉、花粉管、花粉粒（ｐｏｌｌｅｎ  ｇｒａｉｎｓ）、根（ｒｏｏｔｓ）、シュート、シュート成長点（ｓｈｏｏｔ  ｍｅｒｉｓｔｅｍｓ）、子葉鞘節（ｃｏｌｅｏｐｔｉｌａｒ  ｎｏｄｅｓ）、雄穂（ｔａｓｓｅｌｓ）、葉、子葉花弁（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ  ｐｅｔａｌｓ）、胚珠（ｏｖｕｌｅｓ）、塊茎（ｔｕｂｅｒｓ）、種子、穀粒（ｋｅｒｎｅｌｓ）が含まれる。植物の組織は、プランタ（ｐｌａｎｔａ）、或いは器官、組織、または細胞培養物に存在するものであってもよい。本明細書中に使用される、単子葉植物（ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ  ｐｌａｎｔ）は、１つの子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）または胚（栄養物を保存および吸収する）の器官のみを有する種子を具備する植物を意味する。本明細書中に使用される、双子葉植物（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ  ｐｌａｎｔ）は、２つの子葉を有する種子を具備する植物を意味する。本発明に含まれる植物は、形質転換を受け入れる（ａｍｅｎａｂｌｅ）全ての植物である。
【０００６】
動作可能に連結される
本明細書中に使用される、「動作可能に連結される」の用語は、２以上の核酸配列エレメントを意味し、該核酸配列エレメントは物理的に連結し、お互いに機能的相関関係にあることを意味する。例えば、プロモーターはコード配列と動作可能に連結し、もし前記プロモーターがコード配列の転写または発現を開始または制御できる場合、前記コード配列は前記プロモーター「の制御下」にあると理解すべきである。一般的に、２つの核酸配列が動作可能に連結される場合、それらは同じ配向（ｓａｍｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に及び通常は同じ読み枠に存在する。
それらは通常は基本的に近接（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）するが、そうでなくてもよい。
【０００７】
プロモーター
本明細書中で使用される「プロモーター」の用語は核酸断片を意味し、該核酸断片は機能して１以上の遺伝子の転写を制御し、前記遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に局在し、そしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写開始部位および任意の他のＤＮＡ配列に対する結合部位の存在により構造的に同定される。前記任意の他のＤＮＡ配列には、転写制御因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータタンパク質結合部位、並びに直接的に若しくは間接的に作用して前記プロモーターからの転写量を制御する当業者に既知の核酸の任意の他の配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
ハイブリダイジング核酸オルソログ（Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）およびハイブリダイジング５’ＵＴＲｓ
配列番号１のヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力のある任意のヌクレオチド配列は、本発明の５’ＵＴＲの部分であると定義される。厳密なハイブリダイゼーション条件は、本明細書中で次のように定義される。即ち、少なくとも２５、好ましくは５０、７５または１００、および最も好ましくは１５０以上のヌクレオチドの核酸配列を、約６５℃の温度で溶液（約１Ｍ塩、好ましくは６ｘＳＳＣを含有する溶液もしくは匹敵するイオン強度を有する任意の他の溶液）中でハイブリダイズし、６５℃で溶液（約０．１Ｍ塩未満、好ましくは０．２ｘＳＳＣを含有する溶液もしくは匹敵するイオン強度を有する任意の他の溶液）中で洗浄する条件である。好ましくは前記ハイブリダイゼーションは、一晩実施され（即ち、少なくとも１０時間）、好ましくは洗浄は少なくとも１時間、洗浄溶液を少なくとも２回交換して実施される。
これらの条件は、通常、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを許容する。中等度のハイブリダイゼーション条件は本明細書中で次のように定義される。即ち、少なくとも５０、好ましくは１５０以上のヌクレオチドの核酸配列を、約４５℃の温度で溶液（約１Ｍ塩、好ましくは６ｘＳＳＣを含有する溶液もしくは匹敵するイオン強度を有する任意の他の溶液）中でハイブリダイズし、室温で溶液（約１Ｍ塩、好ましくは６ｘＳＳＣを含有する溶液もしくは匹敵するイオン強度を有する任意の他の溶液）中で洗浄する条件である。好ましくは前記ハイブリダイゼーションは、一晩実施され（即ち、少なくとも１０時間）、好ましくは洗浄は少なくとも１時間、洗浄溶液を少なくとも２回交換して実施される。通常、これらの条件は、約５０％までの配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを許容する。当業者は、同一性が５０％および９０％間で変化している配列を特異的に同定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を修正することができる。
【０００９】
同種性（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）
「同種性」の用語は、特定（ｇｉｖｅｎ）の（組換え型）核酸またはポリペプチド分子と特定の宿主生物または宿主細胞との間の関係を示すために使用された場合、天然において前記核酸またはポリペプチド分子が、同種（ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の、好ましくは同品種もしくは同株の宿主細胞または宿主生物により産生されることを意味する。特定の宿主細胞に対して同種性である場合、ポリペプチドをコード化している核酸は、一般的に別のプロモーター配列と、或いは、妥当な場合には、別の分泌シグナル配列および／またはターミネーター配列と、その天然環境においてよりも、動作可能に連結する。
【００１０】
２つの核酸配列の同系性（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）を示すために使用された場合、同種性の用語は、１つの一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列とハイブリダイズし得ることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度（ｄｅｇｒｅｅ）は多くの要素に依存し得るものであり、その要素には、配列間の同一性の程度（ｅｘｔｅｎｔ）およびハイブリダイゼーション条件（例えば、後述される温度および塩濃度）が含まれる。好ましくは同一性の領域は５ｂｐよりも大きく、より好ましくは同一性の領域は１０ｂｐよりも大きい。
【００１１】
異種性（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）
異種性の用語は、核酸またはポリペプチド分子に関連して使用された場合、外来細胞（ａ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｃｅｌｌ）の核酸またはポリペプチドを意味し、それが存在する生物、細胞、ゲノムまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の部分として自然では発生しないことを、或いはそれが自然で見出されたものと異なる細胞で或いはゲノムまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ配列における１位置もしくは複数位置で見出されることを意味する。
異種性の核酸またはタンパク質は、それらが導入される細胞に対して内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）のものではなく、別の細胞から又は合成により若しくは組換えにより取得されたものである。一般に（必ずしもそうではないが）、かかる核酸は前記ＤＮＡが転写されるか又は発現される細胞により通常は産生されないタンパク質をコードし、同様に外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ＲＮＡは、前記外因性ＲＮＡが存在する細胞において通常は発現しないタンパク質をコードする。さらにまた、異種性のタンパク質またはポリペプチドは、それが導入された宿主生物、その組織もしくは細胞において通常は見出されない順序（ｏｒｄｅｒ）および／または方向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に配置された同種性エレメントから構成できる、即ち、前記タンパク質もしくはポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列は同種に由来するが、しかし、そのヌクレオチド配列は、組成および／またはゲノム上の遺伝子座における生来の形態から、意図的にヒトが介入することによって実質的に修飾される。また、異種性の核酸およびタンパク質は、外来の核酸またはタンパク質と称されてもよい。任意の核酸またはタンパク質（これらは、これらが発現される細胞に対して異種性または外来性であると当業者が認識するだろう核酸またはタンパク質である）は、本明細書において異種性の核酸またはタンパク質の用語により包含される。また、異種性の用語は核酸またはアミノ酸配列の非天然の組み合わせに対して適用される、即ち、この組み合わせは、組み合わされた配列の少なくとも２つがお互いに外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）である組み合わせである。
【００１２】
配列同一性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）
「配列同一性」は、当該技術分野において知られているように、２以上のアミノ酸（ポリペプチドもしくはタンパク質）または２以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関連性（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）であり、前記配列を比較することにより決定される。当該技術において、「同一性」のパーセンテージは、アミノ酸または核酸配列の間の配列同系性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の程度を示しており、かかる配列の記号（ｓｔｒｉｎｇｓ）の間の適合（ｍａｔｃｈ）により決定される。２つのアミノ酸配列は、前記ポリペプチドが保存されたアミノ酸置換においてのみ異なっている場合、「類似」していると考えられる。アミノ酸類似性の程度の決定において、当業者は「保存性」のアミノ酸置換を考慮する。保存性のアミノ酸置換は、類似する側鎖を有するアミノ酸の交換を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の一群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族―水酸化側鎖を有するアミノ酸の一群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の一群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の一群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の一群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；並びに、イオウ含有側鎖を有するアミノ酸の一群は、システインおよびメチオニンである。
好適な保存性アミノ酸置換群は、即ち：  バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、および  アスパラギン−グルタミンである。
本明細書において開示されたアミノ酸配列の置換バリアントは、開示された配列において少なくとも１残基が除去されて異なる残基がその場所に挿入されたものである。好ましくは、前記アミノ酸変化は保存性の変化である。自然に生じたアミノ酸の各々に対する好適な保存性置換は、即ち：  Ａｌａに対してｓｅｒ；Ａｒｇに対してｌｙｓ；Ａｓｎに対してｇｌｎまたはｈｉｓ；Ａｓｐに対してｇｌｕ；Ｃｙｓに対してｓｅｒまたはａｌａ；Ｇｌｎに対してａｓｎ；Ｇｌｕに対してａｓｐ；Ｇｌｙに対してｐｒｏ；Ｈｉｓに対してａｓｎまたはｇｌｎ；Ｉｌｅに対してｌｅｕまたはｖａｌ；Ｌｅｕに対してｉｌｅまたはｖａｌ；Ｌｙｓに対してａｒｇ；Ａｓｎに対してｇｌｎまたはｇｌｕ；Ｍｅｔに対してｌｅｕまたはｉｌｅ；Ｐｈｅに対してｍｅｔ，ｌｅｕまたはｔｙｒ；Ｓｅｒに対してｔｈｒ；Ｔｈｒに対してｓｅｒ；Ｔｒｐに対してｔｙｒ；Ｔｙｒに対してｔｒｐまたはｐｈｅ；および、Ｖａｌに対してｉｌｅまたはｌｅｕである。
【００１３】
「同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」および「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は既知の方法により容易に計算でき、この方法には文献〔Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．  ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．  ，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．  ，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；  ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．  ，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．  ，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：  １０７３  （１９８８）〕に記載された方法を含むが、これらに限定されない。
【００１４】
同一性を決定するための好適な方法は、試験される配列間で最大の適合性を提示するように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆が利用できるコンピュータプログラム中に暗号化（ｃｏｄｉｆｉｅｄ）される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好適なコンピュータプログラムは、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ〔Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．  ，  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  （１）：３８７  （１９８４）〕、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０  （１９９０）データベース類似性検索に使用できるプログラムのＢＬＡＳＴ２．０ファミリーには、次にものが含まれる、即ち：  ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド検索配列に対してヌクレオチドデーターベース配列）；ＢＬＡＳＴＸ（ヌクレオチド検索配列に対してタンパク質データーベース配列）；ＢＬＡＳＴＰ（タンパク質検索配列に対してタンパク質データーベース配列）；ＴＢＬＡＳＴＮ（タンパク質検索配列に対してヌクレオチドデーターベース配列）；およびＴＢＬＡＳＴＸ（ヌクレオチド検索配列に対してヌクレオチドデーターベース配列）である。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元〔ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５  ：４０３−４１０  （１９９０）〕から公衆が利用可能である。公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用し得る。
【００１５】
ポリペプチド配列比較のための好適なパラメータには次のものが含まれる、即ち：アルゴリズム：である。これらのパラメータに関して有用なプログラムは、「Ｏｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐより）として公衆が利用可能である。上述のパラメータは、アミノ酸比較（エンドギャップに対するペナルティーなし）のための初期設定パラメータである。
【００１６】
核酸配列比較のための好適なパラメータには次のものが含まれる、即ち：アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３  （１９７０）；比較マトリックス；マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティー：ギャップ長ペナルティー：３である。入手可能なものは、ギャッププログラムとしてＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓに存在）から販売されているものである。上述のパラメータは、核酸比較のための初期設定パラメータである。
【００１７】
リガンド
本明細書中に使用される、「リガンド」の用語は、標的ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡに特異的に結合する因子（ａｇｅｎｔ）を意味する。本明細書中の「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」の用語は、非特異的な相互作用と異なることが測定可能である結合を意味する。特異的結合は、例えば、ある因子の結合をコントロール因子の結合と比較して決定することにより測定可能であり、このコントロール因子は一般的に結合活性を有さない類似構造の因子であり、例えば特異的結合配列を欠除した類似サイズのＲＮＡ分子である。特異的結合は、前記因子が標的ＲＮＡに対してコントロール因子よりも高い測定可能な親和性を有している場合に存在する。結合の特異性は、例えば、特定の標的に結合することが知られているコントロール因子との競合により決定できる。例えば、特定の因子の特異的結合は、結合に関して同じ因子または標的ＲＮＡと特異的に結合する異なる因子と競合させることにより実証することが可能である。特異的結合は、分子の結合が第二の因子によって競合的に阻害される場合に示される。本明細書中に使用される、「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」の用語は、低および高親和性の特異的結合の双方を含む。特異的結合は、例えば、少なくとも約１ｍＭ以上のＫｄを有する低親和性結合因子により提示できる。また、特異的結合は、少なくとも約１μＭ以下のＫｄを有する高親和性結合因子により提示できる。高および低親和性結合因子の間の差は、約ファクター１，０００である。前記因子は、標的ＲＮＡが生来の（ｎａｔｉｖｅ）又は代替の（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）コンフォメーションである場合に、或いは部分的もしくは全体的に未フォールドまたは変性されている場合に標的ＲＮＡと結合し得る。
本発明によると、リガンドは標的ＲＮＡ上のどこにでも結合する因子であり得るが、しかし好ましくは前記リガンドは標的ＲＮＡの指摘された（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ）ヌクレオチド配列上に結合する。リガンドは実質的に任意の因子でよく、金属類、ペプチド、タンパク質、脂質類、多糖類、小有機物分子（ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ヌクレオチド（非自然的に生じたものを含む）及びその組み合わせが含まれるが、これらには限定されることはない。
【００１８】
メッセンジャーＲＮＡ
本明細書中の「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」の用語は、タンパク質コードＤＮＡのアンチセンス鎖（アンチコード鎖または鋳型）のＲＮＡの一時的な相補的コピーを意味する。真核細胞において、通常それは比較的長いプレｍＲＮＡ（一次転写物またはｈｎＲＮＡとも称される）として転写され、これは次にプロセスされて（なお核内で）イントロンが除去される。更に転写後の修飾も生じ得る。成熟ｍＲＮＡは、次に細胞質へと輸送され、そこでリボソーム上でタンパク質へと翻訳される。さらにまた、一般にｍＲＮＡは、タンパク質配列を特定する領域を含み、この配列は各側に５’および３’非翻訳領域（５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ）と称される非翻訳領域を有している。
【００１９】
アンチセンス核酸
本明細書中に使用される「アンチセンス核酸」の用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡ分子を意味し、これは標的一次転写物またはｍＲＮＡの全て若しくは部分にたいして相補的であり、標的ヌクレオチド配列の翻訳をブロックする。
【発明の詳細記載】
【００２０】
第一側面として、本発明は、所望のタンパク質またはポリペプチドを植物において発現させるための方法に関し、該方法は以下の工程を含む、即ち：
【００２１】
ａ）第一ヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供することと（該第一ヌクレオチド配列は、少なくとも３４％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有し、所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列に対して動作可能に連結され、更に異種性プロモーターと動作可能に連結されている）、
【００２２】
ｂ）植物を前記核酸構築物と接触させて形質転換植物を取得することと、および
【００２３】
ｃ）前記形質転換植物を所望の前記タンパク質またはポリペプチドの発現を生じさせる条件に提示（ｓｕｂｊｅｃｔｉｎｇ）することと、および随意的に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）前記タンパク質またはポリペプチドを回収することと、を含む。
【００２４】
本発明によると、前記核酸構築物は第一ヌクレオチド配列を含み、該第一ヌクレオチド配列は少なくとも３４％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有する（ＢＬＡＳＴＮ  ２．２．ｅｘｉｓｔｅｎｃｅＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して）。本発明による核酸構築物は、好ましくは第一ヌクレオチド配列を含み、この第一ヌクレオチド配列は少なくとも３６％、より好ましくは少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有する。本発明の特に好適な態様において、前記核酸構築物は第一ヌクレオチド配列を含み、この第一ヌクレオチド配列は１００％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有する。配列番号１として本明細書中に記載されたヌクレオチド配列は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのｎｔｐ３０３遺伝子の５’ＵＴＲ配列である。
【００２５】
更なる態様において、本発明は、所望のタンパク質を植物において発現させるための方法に関し、該方法は以下の工程を具備する、即ち：
【００２６】
ａ）第一ヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供することと（該第一ヌクレオチド配列は、少なくとも４６％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド１０４−１５１に対して有するヌクレオチド配列、または少なくとも５１％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４−７６に対して有するヌクレオチド配列、またはその組み合わせを含み、所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列に対して動作可能に連結され、更に異種性プロモーターと動作可能に連結されている）、
【００２７】
ｂ）植物を前記核酸構築物と接触させて形質転換植物を取得することと、および
【００２８】
ｃ）前記形質転換植物を所望の前記タンパク質またはポリペプチドの発現を生じさせる条件に提示（ｓｕｂｊｅｃｔｉｎｇ）することと、および随意的に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）前記タンパク質またはポリペプチドを回収することと、を含む。
【００２９】
好ましくは、前記第一ヌクレオチド配列は、少なくとも４８％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および特に１００％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４−１５１に対して有するヌクレオチド配列、または少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および特に１００％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４−７６に対して有するヌクレオチド配列、またはその組み合わせ、を含む。
【００３０】
上述の方法の別態様において、前記第一ヌクレオチド配列は、少なくとも４６％、４８％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および特に１００％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４−１５１に対して有するヌクレオチド配列、または１００％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２７−５０に対して有するヌクレオチド配列、またはその組み合わせ、を含む。配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２７−５０は、８ＧＡＡユニットの反復からなる。好ましくは、前記第一ヌクレオチドは、７、６、５、４または３のＧＡＡユニットからなるヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
本発明によるヌクレオチド配列は、ＲＮＡの形態で又はゲノムＤＮＡ（即ち、イントロン、ｃＤＮＡ若しくは合成ＤＮＡを含むＤＮＡ）を含むＤＮＡの形態で存在できる。前記ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってもよく、一本鎖はコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。安定性または他の理由のために修飾された主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明の更なる一部である。さらにまた、非通常の塩基（例えば、イノシン）または修飾塩基（例えば、トリチル化塩基）も本発明の一部である。また、前記ヌクレオチド配列は、本発明によるヌクレオチド配列の対立遺伝子変種（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）であってもよい。必要であれば、前記ヌクレオチド配列を、意図する発現ホストの既知のコドン嗜好性（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を利用できるように、調製または合成により変化させることが可能である。例えば、単子葉植物および双子葉植物のコドン嗜好性およびＧＣ含量嗜好性が異なっていることが示されている（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７  ：  ４７７−４９８  （１９８９））。
【００３２】
本発明による方法の好適な態様において、前記核酸構築物は所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列を具備し、この第二ヌクレオチド配列は上記に規定した第一ヌクレオチド配列の何れか１つと動作可能に連結される。所望のタンパク質またはポリペプチドは同種性のタンパク質またはポリペプチドであってもよいが、本発明の好適な態様において、所望のタンパク質またはポリペプチドは異種性のタンパク質である。異種性のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列は、全体または部分において当該技術における既知の任意の供給源に由来するものであってもよく、これらには細菌性もしくはウイルス性のゲノムまたはエピソーム、真核生物の核もしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくは化学合成したＤＮＡが含まれる。
前記第二ヌクレオチド配列は、非中断型翻訳領域（ａｎ  ｕｎｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を構成してもよく、またそれは１以上のイントロン（このイントロンは、適切なスプライスジャンクションで囲まれる）を含んでいてもよく、それは更に異なる供給源に由来する天然の又は合成の分節（ｓｅｇｍｅｎｔｓ）から構成されていてもよい。本発明の方法による所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列は、好ましくは完全長ヌクレオチド配列であるが、該完全長ヌクレオチド配列の機能的に活性な部分または他の部分であってもよい。所望のタンパク質またはポリペプチドは、前記植物において、例えば、昆虫耐性；乾燥耐性（ｄｒｏｕｇｈｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）；疾病耐性；除草剤耐性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）；免疫；栄養物、ミネラルもしくは水の土壌からの摂取の改善；または代謝修飾を授与する（ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ）タンパク質またはポリペプチドであってもよい。別態様において、前記植物は、所望のタンパク質またはポリペプチドを過剰産生するために使用される。所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列は、シグナル配列を含んでいてもよく、この配列は所望のタンパク質またはポリペプチドを前記細胞もしくは組織における特異的な位置に発現された際に方向付ける。かかるシグナル配列は、所望のタンパク質またはポリペプチドをオルガネラ、他の植物細胞または細胞間隙（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅ）へと方向付ける配列を含むが、これらに限定されない。さらにまた、所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列は、タンパク質精製およびタンパク質検出（例えば、ウエスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ）を促進する配列を含むことができる（例えば、ｃ−ｍｙｃまたはポリヒスチジン配列）。
【００３３】
所望のタンパク質またはポリペプチドは、産業的な又は薬用（薬学的）の適用を有していてもよい。産業的な適用を有するタンパク質またはポリペプチドの例には、例えば、リパーゼ（例えば、洗浄剤産業において使用される）、プロテアーゼ（特に洗浄剤産業、醸造などに使用される）、細胞壁分解酵素〔例えば、セルラーゼ、ペクチナーゼ、ベータ．−１，３／４−およびベータ．−１，６−グルカナーゼ、ラムノガ―ラクチュロナーゼ（ｒｈａｍｎｏｇａ−ｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ）、マンナナーゼ（ｍａｎｎａｎａｓｅｓ）、キシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅｓ）、プルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅｓ）、ガラクタナーゼ（ｇａｌａｃｔａｎａｓｅｓ）、エステラーゼ等、果実処理ワイン製造等または飼料に使用される〕、フィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅｓ）、ホスホリパーゼ、グリコシダーゼ〔例えば、アミラーゼ、ベータ．−グルコシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ（ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅｓ）、ラムノシダーゼ（ｒｈａｍｎｏｓｉｄａｓｅｓ）、アピオシダーゼ（ａｐｉｏｓｉｄａｓｅｓ）等〕、乳酵素（ｄａｉｒｙ  ｅｎｚｙｍｅｓ）（例えば、キモシン）などの酵素が含まれる。哺乳類の（および好ましくはヒトの）、治療上の、美容の若しくは診断上の適用を有するタンパク質もしくはポリペプチドおよび／または酵素には、インシュリン、血清アルブミン（ＨＳＡ）、ラクトフェリン、ヘモグロビンαおよびβ、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；骨形成タンパク質）、成長因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ等）、ペプチドホルモン（例えば、カルシトニン、ソマトメジン、成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インターロイキン（ＩＬ−ｘ）、インターフェロン（ＩＦＮ−ｙ）が含まれるが、これらに限定されない。
例えば、熱不安定性毒素Ｂ−サブユニット、コレラ毒素Ｂ−サブユニット、外被表面タンパク質肝炎Ｂウイルス、キャプシドタンパク質ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）ウイルス、糖タンパク質Ｂヒトサイトメガロウイルス、糖タンパク質Ｓ、インターフェロン、および伝播性の胃腸炎コロナウイルスレセプターなどを含むワクチンとして使用するための細菌性およびウイルス性の抗原も含まれる。更に、前記タンパク質の変異体またはアナログをコード化している遺伝子も含まれる。
【００３４】
本発明の一態様において、前記核酸構築物は、更に第二ヌクレオチド配列の転写の制御および開始のためのプロモーターを具備する。
好ましくは前記プロモーターは、選択した宿主細胞における第二ヌクレオチド配列の発現を生じさせる能力を有する。前記プロモーター（例えば、花粉特異的な又は異種性の）は、上記のヌクレオチド配列の何れか１つに動作可能に連結される。本発明の好適な態様において、前記プロモーターは、植物プロモーター（即ち、植物細胞において転写を開始する能力を有するプロモーター）である。植物プロモーター（本明細書中に使用される）は、組織特異的な、組織好適な（ｔｉｓｓｕｅ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）、細胞型特異的な、誘導性の及び構成的なプロモーターを含む。組織特異的なプロモーターは、特定の組織のみにおいて転写を惹起するプロモーターであり、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または転写を開始させるために必要な他の因子のための、および／または正確に特定組織内又はその組織の特定細胞内でコード配列の発現を制御するための認識シグナルを提供するＤＮＡの配列を意味している。組織特異的な様式の発現は、個々の組織に又は組織の組み合わせにおいてのみ存在し得る。本発明の好適な態様において、前記発現は花粉または種子特異的であり、即ち、前記発現は花粉または種子のみに特異的である。花粉特異的および種子特異的プロモーターは、花粉特異的遺伝子ｎｔｐ３０３（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ）およびｚｍ１３（Ｚ．  ｍａｙｓ）および種子特異的遺伝子ｄｃ８（Ｄ．  ｃａｒｏｔａ）、ｒａｂ１７（Ｚ．  ｍａｙｓ）、ｒａｂ１６ｂ（Ｏ．  ｓａｔｉｖａ）およびｅｍ（Ｔ．  ａｅｓｔｉｖｕｍ）のプロモーターを含むが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターのグループは、文献（Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｊ．  Ｗ．  ＆  Ｃｏｒｕｚｚｉ，  Ｇ．  Ｍ．  ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４，  ２７５−３０３  （１９９０））により概説されており、胚特異的プロモーター〔例えば、胚性の貯蔵タンパク質ダイズβ−コングリシニン遺伝子、インゲンマメのレグミン遺伝子、β−ファゼオリン遺伝子並びにアブラナのナピン（ｎａｐｉｎ）およびクルシフェリン（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ）遺伝子のプロモーター〕、胚乳特異的プロモーター〔例えば、トウモロコシ・ゼイン遺伝子、コムギ・グルテニン遺伝子およびオオムギ・ホルデイン（ｈｏｒｄｅｉｎ）遺伝子のプロモーター〕、果実特異的プロモーター〔例えば、トマトエチレン応答性  Ｅ８遺伝子のプロモーター〕、塊茎特異的プロモーター〔例えば、ジャガイモのクラス−Ｉパタチンプロモーター〕並びに、葉特異的プロモーター〔例えば、リブロース−１，５−バイフォスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子および葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のプロモーター〕を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
組織好適プロモーターは、特定の組織（例えば、葉、根、茎、花または種子）における転写を優先的に惹起するプロモーターである。
【００３６】
細胞型特異的プロモータ（Ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）は、１以上の器官における特定の細胞型〔例えば、根または葉における脈管細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ）〕において主に発現を駆動するプロモータである。
【００３７】
誘導性プロモータは、誘導物質に対する応答において、１以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を活性化する能力を有するプロモータである。前記ＤＮＡ配列または遺伝子は、誘導物質が非存在の際には転写されない。当該技術において既知の誘導物質には、高塩濃度；冷、熱または毒性エレメント；および病原体または疾患因子（例えば、ウイルス）が含まれる。或いは、誘導物質は、化学的な因子（例えば、除草剤、タンパク質、成長制御剤、代謝物またはフェノール類化合物）であってもよい。前記誘導物質は、照明因子〔例えば、多様なモダリティー（波長、強度、フルエンス（ｆｌｕｅｎｃｅ）、方向および持続時間）での暗および明条件〕であってもよい。誘導性プロモーターの活性化は、前記誘導物質の適用により達成される。一般的な誘導性プロモータのグループには、Ｄｒｏｓｐｈｉｌｉａ  ｍｅｌａｆｚｏｇａｓｔｅｒのｈｓｐ７０熱ショックプロモータ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の冷誘導性プロモータ（ｃｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびエタノールにより誘導されるアルコール脱水素酵素プロモータが含まれるが、これらに限定されない。特異的な植物の誘導性プロモーターには、テトラサイクリン−誘導性プロモーターおよびα−アミラーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
構成的プロモータは、多くの環境条件下で及び多くの異なる組織型において活性なプロモータである。構成的プロモータのグループには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータもしくは１９Ｓプロモータ、ユビキチンプロモータ、ＴＭＶの被膜プロモータ、キャッサバベイン（ｃａｓｓａｖａ  ｖｅｉｎ）モザイクウイルスプロモータ（ＣｓＶＭＶ）、ライスアクチン−１プロモータおよびアグロバクテリウム属遺伝子に関連する調節性領域〔例えば、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ）、マンノピンシンターゼ（Ｍａｓ）もしくはオクトピンシンターゼ（Ｏｃｓ）〕が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
好ましくは本発明による核酸構築物は、任意の供給源に由来する、ベクター（特にプラスミド、コスミドまたはファージにおける）或いは一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの（直鎖状もしくは環状の）ヌクレオチド配列であって、これらのヌクレオチド配列のいくつかがユニーク構築物へと接合（ｊｏｉｎｅｄ）もしくは組換えられている。このユニーク構築物は本発明の何れか１つのヌクレオチド配列を細胞（特に植物細胞に）にセンスもしくはアンチセンスの方向性で導入する能力を有する。ベクターの選択は、考慮する組換え手順と使用する宿主細胞とに依存する。前記ベクターは、自律的に複製するベクターであってもよい、またはそれが統合された染色体と共に複製してもよい。好ましくは、前記ベクターは、選択マーカーを具備する。有用なマーカーは、選択した宿主細胞に依存する。また、有用なマーカーは当業者に公知である。前記タンパク質が葉または根から取得される場合、ウイルスベクターでの細胞の感染により、標的となる細胞の多くが核酸を受け取ることができるという利点を有する。更に、ウイルス性ベクター内にコードされる分子（例えば、ウイルス性ベクター中に含まれるｃＤＮＡにより）は、ウイルス性ベクター核酸を取り込んだ細胞において効率的に発現される。現在知られる手順を用いて配送可能である適切なベクターには、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、パポーバウイルスベクター（例えば、ヒトパピローマウイルスベクター、ポリオーマウイルス  ベクター、ＳＶ４０ベクター）、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、オーエスキー病ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、アルファヘルペスウイルスベクター等が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
ウイルスベクターの全体の総説（特に非複製細胞を修飾するために適切なウイルスベクター）、およびかかるベクターを所望のポリヌクレオチドの発現に関してどのように使用するかについては、本〔ＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ：〕に記載されている。アグロバクテリウムベースのプラスミドベクターが、植物ゲノム中への核酸構築物の安定的な形質転換に関して好適である。形質転換ベクターの選択は、考慮する形質転換手順と使用する宿主細胞とに依存する。バイナリーＴｉベクター（アグロバクテリウムが媒介する遺伝子移入に使用できる）には、ｐＢＩＮ１９、ｐＣ２２、ｐＧＡ４８２およびｐＰＣＶ００１が含まれる。
【００４１】
本発明の核酸構築物の１以上のコピーを含有する組換え型の宿主細胞〔例えば、哺乳類（ヒトを除く）、植物、動物、昆虫、真菌または細菌の細胞〕は、本発明の付加的な課題である。宿主細胞は、核酸構築物（例えば、ベクター）を具備し、該核酸構築物の複製および／または発現を援助する細胞を意味する。適切な細菌の例は、グラム陽性菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの数種）またはグラム陰性菌（例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの数種）である。真菌細胞のグループにおいて、好ましくは酵母細胞が使用される。酵母における発現は、酵母株（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  およびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を用いることにより達成できる。
【００４２】
さらにまた、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエおよびＳｆ９の細胞）を宿主細胞として使用することが可能である。或いは、適切な発現系は、バキュロウイルス系または哺乳類細胞〔例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはボーウェメラノーマ細胞（Ｂｏｗｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ）〕を用いた発現系であってもよい。植物における形質転換手順に関して、適切な細菌には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓが含まれる。
【００４３】
本発明の別側面は植物に関し、この植物は遺伝的に改変（好ましくは本発明の方法により）されて、本明細書の上記に規定したような核酸構築物を具備する植物である。前記核酸構築物は、好ましくは、インビトロまたは少なくとも外部プランタ（ｅｘ  ｐｌａｎｔａ）において操作または修飾された核酸配列を含んでいる構築物である。従って、前記核酸構築物は、好ましくは天然に見出されていない核酸配列の組み合わせを有する植物を提供する。前記核酸構築物は、好ましくは自律的複製因子（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として安定して保持される、または、より好ましくは前記核酸構築物は植物ゲノム中に統合され、この場合、前記構築物は、通常は植物ゲノム中のランダムな位置に（例えば、非相同組換えにより）統合される。本発明に好適な植物には、タバコ、ジャガイモ、甜菜（ｓｕｇａｒ  ｂｅｅｔ）、ダイズ（ｓｏｊａ）、トウモロコシ、コメ、ルピナス（ｌｕｐｉｎ）、アルファルファ、シロイヌナズナおよびアブラナが含まれる。安定的に形質転換された（トランスジェニック）植物または植物細胞は、既知の方法により産生されたものである。「安定的な形質転換」の用語は、植物、その組織または細胞に、外来ＤＮＡを植物ゲノム中に導入または取り込ませる方法を適用することを意味する。これらの方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを介した遺伝子移入、微小粒子照射による精製ＤＮＡの導入、プロトプラストの電気穿孔法および微量注入または植物細胞へのＤＮＡの貫通（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）および導入を促進するためのシリコン繊維の使用を含むが、これらに限定されない。双子葉類の植物は、アグロバクテリウム媒介の遺伝子導入により最も頻繁に形質転換される（例えば、再生している植物のプロトプラストまたは細胞培養物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓと共培養することにより形質転換される）。一般に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓが形質転換に使用された場合、形質転換ベクターは好ましくは共統合（ｃｏｉｎｔｉｇｒａｔｉｎｇ）ベクターまたはバイナリーベクターである。双子葉類の植物は、更にリーフディスクの形質転換により、ポリエチレングリコール誘導ＤＮＡ導入によるプロトプラスト形質転換により、電気穿孔法、超音波処理または微量注入、同様に組織または胚へのマイクロもしくはマクロインジェクションによるインタクト細胞または組織の形質転換、組織電気穿孔法、乾いた胚のＤＮＡ含有溶液中でのインキュベーション、種子の減圧浸潤および微粒子照射遺伝子導入により形質転換できる。単子葉の植物は、例えば、微粒子照射（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、プロトプラストへの電気的もしくは化学的に誘導するＤＮＡ取り込み、部分的に透過性の細胞の電気穿孔法、花部（ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓ）へのＤＮＡのマクロインジェクション、小胞子（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｓ）および前胚（ｐｒｏ−ｅｍｂｒｙｏｓ）へのＤＮＡのマイクロインジェクション、出芽花粉へのＤＮＡ導入および胚への腫脹（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）によるＤＮＡ統合を介して形質転換される。
【００４４】
所望のタンパク質またはポリペプチドを植物中で発現させる別の方法には、ウイルスベースのベクターからの一過性発現による方法がある。高効率で複製するウイルスは、一部の例において、宿主植物全体に感染することが可能であり、所望のタンパク質またはポリペプチドを大量に発現させる潜在力を発揮することは知られている。
【００４５】
この代替法に使用できるベクターは、トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）、ポテックスウイルス（ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）およびポティウイルス（ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）である。
或いは、宿主細胞（例えば、植物細胞）における発現と同様、所望のタンパク質またはポリペプチドは、本発明の核酸構築物に由来するＲＮＡｓを使用した無細胞翻訳系において産生できる。
【００４６】
本発明の方法において、前記核酸構築物は、更に随意的に前記方法に適切な当該技術分野の既知の他の調節性因子を具備することが可能である。これらは、鉄応答エレメント（ＩＲＥ）、翻訳のシス調節性エレメント（ＴＬＲＥ）または５’ＵＴＲｓにおけるｕＯＲＦｓおよび３’ＵＴＲｓにおけるポリ（Ｕ）ストレッチを含む、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ並びに同種性および／または異種性のヌクレオチド配列のコード化ヌクレオチド配列に存在するエレメントを含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記調節性因子は、本発明によるヌクレオチド配列およびプロモーターに動作可能に連結される。
【００４７】
形質転換した組織または細胞（例えば、葉のピース、茎の分節、根のみならず、懸濁液により培養されたプロトプラストまたは植物細胞も）が本発明による方法で取得された場合、植物全体（ｗｈｏｌｅ  ｐｌａｎｔｓ）を前記形質転換された組織または細胞から適切な培地〔この培地は随意的に当該技術において既知の抗生物質または殺生剤（ｂｉｏｃｉｄｅｓ）を形質転換した細胞を選択するために含んでいてもよい〕中で再生できる。
【００４８】
生じた形質転換植物は、好ましくは選択の手段により同定される。本発明による核酸構築物は、それゆえ、好ましくは処理した植物において、選択またはスクリーニングされる能力を提供できるマーカー遺伝子をも含む。
【００４９】
選択可能なマーカーは、一般に植物の形質転換イベントに好適であるが、しかし、全ての植物種に対するものは入手不可能である。適切な選択可能マーカーは抗生物質または除草剤の耐性遺伝子であればよく、培養において植物のいくつかの（ｓｏｍｅ）細胞に挿入された際に、抗生物質または除草剤への暴露に耐える能力を付与する。別のタイプのマーカー遺伝子は、組織化学的な又は生化学的なアッセイによりスクリーンし得るものである（たとえ遺伝子を選択できなくとも）。かかる植物の形質転換の実績（ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ）において有用であることが見出されている適切なマーカー遺伝子は、ＧＵＳ遺伝子である。文献〔Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ，  ６：〕は、ＧＵＳアッセイの一般的なプロトコールを開示する。前記ＧＵＳ遺伝子は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（切断に際して青色を呈する）の切断を触媒する酵素をコードする。従って、ＧＵＳ遺伝子の使用は、植物に導入されたＤＮＡの発現を、植物の組織化学的な分析により検出するための簡易なアッセイを提供する。形質転換プロセスの例において、植物において発現され探索される遺伝子は、ＧＵＳ遺伝子にタンデムに連結される。タンデム構築物で植物を形質転換でき、生じた植物をＧＵＳ酵素の発現に関して分析できる。マーカー遺伝子の別の例は、ルシフェラーゼである。このマーカーの利点は、基質の適用および続く検出における、非破壊的な処置にある。形質転換された植物を、所望の遺伝子の発現により同定することも可能である。
【００５０】
次の工程において、前記の形質転換した植物、その部分もしくは細胞を、所望のタンパク質またはポリペプチドの発現を生じさせる条件に提示（ｓｕｂｊｅｃｔｉｎｇ）する、そして随意的に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）前記タンパク質またはポリペプチドを回収する。回収する工程は、発現させたタンパク質またはポリペプチドおよび使用した宿主細胞に依存するが、タンパク質またはポリペプチドの分離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）を含んでいてもよい。タンパク質／ポリペプチドに適用する場合、「分離」の用語はタンパク質がその生来の環境（ｎａｔｉｖｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）外の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で見出されることを示している。好適な形態において、分離されたタンパク質は、実質的に他のタンパク質（特に、他のホモロガスなタンパク質）から遊離している。４０％純粋形態（ｐｕｒｅ  ｆｏｒｍ）を超える、より好ましくは６０％純粋形態を超えるタンパク質が提供されることが好ましい。更により好ましくは、前記タンパク質を高度に精製された形態で提供することが好ましく、即ち、８０％純粋以上、より好ましくは９５％純粋以上、および更により好ましくは９９％純粋以上（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した際に）の形態で提供することが好ましい。必要に応じて、前記第二ヌクレオチド配列は、融合タンパク質をコードさせるために異種性のヌクレオチド配列とライゲーションしてもよく、これによりタンパク質精製およびタンパク質検出（例えば、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにおいて）が促進される。
【００５１】
適切な異種性の配列は、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、金属−結合ポリヒスチジン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼおよびベータ−ガラクトシダーゼなどのタンパク質をコード化しているヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。前記タンパク質は非ペプチド担体、タグまたはラベルに連結されてもよく、これらは前記タンパク質の追跡をインビボおよびインビトロの両方において促進し、前記タンパク質の基質への結合の確認（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および定量を可能とするものである。かかるラベル、タグまたは担体は当該技術分野において公知であり、ビオチン、放射性ラベルおよび蛍光ラベルを含むが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明による方法の特に好適な態様において、所望のタンパク質またはポリペプチドの発現のために使用される植物は、倍加半数体（ホモ接合性の）トランスジェニックタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物〔Ｎｔｐ３０３に関してサイレンス（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）された〕である。前記トランスジェニック植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｐｅｔｉｔ  ｈａｖａｎａに由来し、このトランスジェニック植物はアンチセンスｎｔｐ３０３で形質転換され、葯培養（ａｎｔｈｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を介して選択された。４０の独立の形質転換した苗木（ｐｌａｎｔｌｅｔｓ）を、インビトロの葯培養により葯から作出した。それらのうち４つは、倍加半数体（ｄｏｕｂｌｅｄ  ｈａｐｌｏｉｄｓ）であり、ハプロイドの花粉を産生できた。配偶子内のこれらの倍加半数体の形態学的および農学的（ａｇｒｏｎｏｍｉｃ）な特性を、それらの野生型の親と比較した。トランスジェニック植物およびそれが産生する花は、野生型と正確に同じである。更に、それは正常な量の花粉を産生するが、しかし交配により子孫はできない〔即ち、前記植物は雄性不稔（ｍａｌｅ  ｓｔｅｒｉｌｅ）である〕。
【００５３】
しかしながら、前記花粉をインビトロで発芽させることが可能であり、その花粉管成長は野生型の花粉の花粉管成長と類似している。花粉のプランタ発芽（Ｉｎ  ｐｌａｎｔａ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）は貧弱（ｐｏｏｒ）で、形成された数個の花粉管（ｐｏｌｌｅｎ  ｔｕｂｅｓ）は花柱（ｓｔｙｌｅ）に１０ｍｍ成長した後に成長を停止する。
【００５４】
好ましくは、所望のタンパク質またはポリペプチドは、花粉管または本発明の方法に使用された植物の種子において発現される。インビトロでの花粉管の大量培養は、文献〔Ｓｃｈｒａｕｗｅｎ  および  Ｌｉｎｓｋｅｎｓ  （１９６７）  Ａｃｔａ  Ｂｏｔ．  Ｎｅｅｒｌ．  １６  （５），  １７７−１７９〕に記載の発芽チャンバー中で達成できる。
【００５５】
さらにまた、本発明の一部は、倍加半数体ホモ接合性トランスジェニックタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物（Ｎｔｐ３０３に関してサイレンスされた）である。好ましくは、前記トランスジェニック植物は、上記に記載の核酸構築物の何れか１つを含む。前記トランスジェニック植物の繁殖体（Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）、収穫物（ｈａｒｖｅｓｔ）および組織物質（ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）〔葉、根、苗条（ｓｈｏｏｔｓ）および花が含まれるが、これらに限定されない）〕も、本発明の一部（ａ  ｐａｒｔ）である。
【００５６】
本発明のなお更なる側面は、ＲＮＡ分子に具備される本発明の第一ヌクレオチド配列に特異的に結合するリガンドに関し、これにより前記第一ヌクレオチド配列に動作可能に連結された所望のタンパク質またはポリペプチドコード化している第二ヌクレオチド配列の翻訳を制御する。
【００５７】
本発明の一態様において、本発明のリガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は少なくとも３４％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有している）。配列番号１により表わされるヌクレオチド配列はＤＮＡ形態であるが、しかし当業者はこのヌクレオチド配列がＲＮＡ形態である場合、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）で置換しなければならないことを理解する。好ましくは、本発明のリガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は少なくとも３６％、より好ましくは少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有する）。本発明の特に好適な態様において、本発明のリガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は１００％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列に対して有している）。配列番号１として本明細書中に記載されたヌクレオチド配列は、上記記載のように、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのｎｔｐ３０３遺伝子の５’ＵＴＲ配列である。
【００５８】
本発明の更なる一態様において、前記リガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は、少なくとも４６％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４−１５１に対して有するヌクレオチド配列を具備する）。
【００５９】
好ましくは、前記リガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は、少なくとも４８％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および特に１００％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４−１５１に対して有するヌクレオチド配列を具備する）。本発明の好適な一態様において、前記リガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列（またはその部分）に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は、少なくとも４６％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド１０４−１５１に対して有するヌクレオチド配列から転写される）。本発明の別態様において、前記リガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は、少なくとも５１％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４−７６に対して有するヌクレオチド配列を具備する）。好ましくは、前記リガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は、少なくとも５５％、より好ましくは６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％および特に１００％のヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４−７６に対して有するヌクレオチド配列を具備する）。本発明の好適な一態様において、前記リガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列（またはその部分）に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は、少なくとも５１％ヌクレオチド配列同一性を配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４−７６に対して有するヌクレオチド配列から転写される）。
【００６０】
本発明の更なる別態様において、本発明のリガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２７−５０のヌクレオチド配列を有しているヌクレオチド配列を具備する）。
【００６１】
本発明の好適な態様において、前記リガンドは、ＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列（又はその部分）に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２７−５０のヌクレオチド配列を有しているヌクレオチド配列から転写される）。
【００６２】
本発明の好適な態様において、前記リガンドは、少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ分子に含まれる第一ヌクレオチド配列（又はその部分）に特異的に結合する（ここで前記第一ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド１４−２１のヌクレオチド配列を有しているヌクレオチド配列およびヌクレオチド５９−６６のヌクレオチド配列を有している相補鎖から転写される）。
【００６３】
必要に応じて、上記のリガンドの組み合わせを使用できる。
本発明のリガンドは、金属類、ペプチド、タンパク質、脂質類、多糖類、小有機物分子（ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、ヌクレオチド（非自然的に生じたものを含む）及びその組み合わせであってもよい。好ましくは、本発明のリガンドは、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチドまたはその組み合わせである。
【００６４】
本発明のリガンドとして使用できる金属には、Ｍｇ２＋、Ｋ＋（Ｇ−ｑｕａｒｔｅｔ；Ｇ−カルテット）、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋およびＰｔＣｌ２が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明のリガンドとして使用できる脂質には、リポチトオリゴサッカライド（ｌｉｐｏｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ；ＬＣＯｓ）、陽イオン性脂質、陰イオン性脂質および両イオン性脂質が含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明のリガンドとして使用できる多糖体には、リポチトオリゴサッカライド（ＬＣＯｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明のリガンドとして使用できる小有機物分子には、カフェイン、ポフィリン（ｐｏｐｈｙｒｉｎｅ）、ペプチド類、ヘム、芳香族構造（ａｒｏｍａｔｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）およびｆ．ｅ．  ネオマイシンにおけるＮＨ２基と組み合わせたＯＨ（水酸基）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、これらの小有機物分子は、５０を超え約２，５００ダルトン未満の、最も好ましくは約４００ダルトン未満の分子量を有する。
【００６８】
本発明のリガンドとして使用できるヌクレオチドには、アンチセンス核酸分子が含まれるが、これらに限定されない。前記アンチセンス核酸分子は、アンチセンスＲＮＡ分子、アンチセンスＤＮＡ分子およびその誘導体〔例えば、８〜２０ユニットの長さを有するＨＮＡ、フォスホロチオエート―ＤＮＡ（ｆｏｓｆｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ＤＮＡ）、アンチセンスＰＮＡ分子〕から選択できる。
【００６９】
６０ＡＡ（アミノ酸）までの長さを有するペプチドを本発明のリガンドとして使用できる。
【００７０】
本発明に使用できるリガンドの重要なグループは、ＲＮＡと相互作用できるタンパク質を包含する。これらのＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、とりわけプレ−ｍＲＮＡｓのプロセッシング、ｍＲＮＡの核から細胞質への輸送、ｍＲＮＡ安定化、ｍＲＮＡの翻訳効率および数種のｍＲＮＡｓの隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を媒介するように思われる。本発明のリガンドとして使用できるＲＮＡ結合タンパク質には、ＲＮＡ結合タンパク質モチーフ、例えば、とりわけ（ヘテロ核）リボ核タンパク（ＲＮＰ）モチーフ、Ａｒｇリッチモチーフ、ＲＧＧボックス、ＫＨモチーフおよび二重鎖ＲＮＡ−結合モチーフ〔総説としてＢｕｒｄおよびＤｒｅｙｆｕｓｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：  ６１５−６２１  （１９９４）を参照〕を具備するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。これらのモチーフは、配列および構造に依存的なＲＮＡエレメントの双方を認識する。さらにまた、タンパク質、例えば、とりわけＲＮＡヘアピン結合因子、ＲＮＡ認識モチーフを有するタンパク質、ＧＡＡ結合タンパク質、セリンリッチドメインを有するＲＮＡ結合タンパク質、熱ショックタンパク質および細胞核酸結合タンパク質（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）をリガンドとして使用できる。
【００７１】
好ましくは、本発明のリガンドは、宿主細胞において自然に生じるものであり、この中にはＲＮＡ分子に具備される第一ヌクレオチド配列が存在する。或いは、前記リガンドを、当該技術における既知の方法によって宿主細胞へ導入することも可能である。
【００７２】
所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列の翻訳を制御するための、本発明のリガンドの使用（前記第二ヌクレオチド配列は前記第一ヌクレオチド配列に動作可能に連結されている）も本発明の一部である。前記第二ヌクレオチド配列は、本発明の同種性または異種性のタンパク質またはポリペプチドをコード化できる。前記リガンドの、ＲＮＡ分子に具備される第一ヌクレオチドに対する特異的な結合は、一方で所望のタンパク質またはポリペプチドをコード化している第二ヌクレオチド配列の翻訳の減少を生じ得る。或いは、前記結合は、翻訳の増加を生じてもよい。翻訳における増加は、特にタンパク質またはポリペプチドの結合により媒介され、これはＨ−Ｉ構造におけるＲＮＡの二本鎖断片（ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｐｉｅｃｅ）と特異的に結合する（３２頁、２〜４行を参照）。このタンパク質は、アミノ酸配列  Ｓ（ＲＫ）（ＲＫ）Ｘ（ＡＰ）ＲＫ（ＮＱＨ）Ｋを含有し、ここで次のセットが保存されたアミノ酸置換として考慮される、Ｒ，Ｋ；Ａ，Ｐ；ＮＱＨ。
【実施例】
【００７３】
材料および方法
植物材料（Ｐｌａｎｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ．  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１の温室生育植物体を、微粒子照射（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）のための花粉および葉組織の供給源として使用した。花粉発生間の異なるキメラ遺伝子の一過性発現を評価するために、後期二細胞ステージ（ｔｈｅ  ｌａｔｅ−ｂｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔａｇｅ）での未成熟花粉を、無菌的に３５ｍｍ長の花蕾（ｆｌｏｗｅｒ  ｂｕｄ）からＭ１メディウム（Ｍ１  ｍｅｄｉｕｍ）に文献（Ｔｕｐｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｓｅｘ．  ４  （４）：  ２８４−２８７）に記載のように分離した。花粉管成長の間の異なる遺伝子融合構築物の一過性発現を、成熟花粉を用いて測定した〔この花粉は、裂開性の（ｄｅｈｉｓｃｅｎｔ）タバコ花から分離した〕（Ｈｅｒｐｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｓｅｘ．  ５，３０４−３０９）。
【００７４】
分離後、花粉ペレット（ｐｏｌｌｅｎ  ｐｅｌｌｅｔ）を１００μｌ  Ｍ１−メディウムに１０８細胞／ｍｌの密度で懸濁した。微粒子照射に対して花粉を固定するため、花粉懸濁液を、Ｍ１培地を固化した（ｓｏｌｉｄｉｆｉｅｄ）１％寒天上に配置した無菌Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（アマシャム）の表面上にピペットした。照射後、後期二細胞性の又は成熟した花粉を含む膜を、それぞれ１０ｍｌのＭ１メディウム又はリードメディウム（Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  １７４，１０１−１１５）に浸漬した。前記後期二細胞性花粉（ｌａｔｅ−ｂｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｌｅｎ）を、２５℃、暗条件、強い振盪条件でインキュベーションした。遠心分離後、成熟花粉を１０ｍｌチューブ（０．５ｍｌリード培地を含有する）中に懸濁し、次に暗条件において２０時間インキュベーションした。
【００７５】
照射の前後の葉組織の処理を、文献〔Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８，  ２１１−２１８〕に記載のように実施した。
【００７６】
全てのケースにおいて、照射を固化した培地に植物材料を配置して６０分間以内に実施した。
【００７７】
異なるＵＴＲｓを含有している遺伝子融合構築物の調製
全てのケースにおいて、ホタルルシフェラーゼ翻訳領域の修飾型（ｌｕｃ＋）またはＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのルシフェラーゼ  ｃＤＮＡ（ｒｌｕｃ）の何れかをレポーター遺伝子として使用した。ｌｕｃ＋  ｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により、ｐＧＬ３ベクター（プロメガ）上で、５’末端にＮｃｏＩ部位を導入したフォワード配列特異的プライマー（５’−ＡＴＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣ；ＮｃｏＩ部位は下線；配列番号２）および３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入したリバース配列特異的プライマー（５’−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣ；ＢａｍＨＩ部位は下線；配列番号３）を用いて増幅した。ｒｌｕｃ  ｃＤＮＡを、ＰＣＲによりｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター（プロメガ）上で、以下の配列特異的プライマーを用いて増幅した、該プライマーは即ち：  ５’−ＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＡＡＧ  （ＮｃｏＩ部位は下線；配列番号４）および５’−ＧＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＡＧ  （ＢａｍＨＩ部位は下線；配列番号５）である。３５Ｓｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’の構築のために、ｌｕｃ＋のＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ルシフェラーゼ遺伝子の除去後、ｐＲＴＳ２ＬＵＣ  （Ｂａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，  １０  （４），  ６１３−６２３）のＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションした。ｐＲＴＳ２ＬＵＣ（Ｄａｖｉｄ  Ｔｗｅｌｌ博士により供与された）は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｔｏｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）、４４塩基対長の合成ポリリンカー（本明細書においてｓｙｎ４４  ５’と称される）、ルシフェラーゼｃＤＮＡ（Ｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）およびＣａＭＶ３５Ｓ  ３’非翻訳領域  （Ｔｏｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  １５，５８９０）を具備する。
【００７８】
ほとんど同一の構築物が構築され（３５Ｓ  Ｒｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’）、この構築物においてｌｕｃ＋遺伝子はｒｌｕｃコード領域により置換された。ｎｔｐ３０３  ＵＴＲｓおよびＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（ｐＲＨｌ−１  ３５Ｓ３０３  ５’／３０３  ３’）の双方を有している遺伝子融合構築物を取得するために、ｓｙｎ４４  ５’ＵＴＲをｐＲＨ４−１からＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ制限酵素を用いて除去した。８  （１）  １１−１７用いて増幅した、該プライマーは、即ち：  ５’−ＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＧＡＡＧ（ＸｈｏＩ部位は下線；配列番号６）および５’−ＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣ（ＮｃｏＩ部位は下線；配列番号７）である。ＰＣＲに続いて、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲをＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ消化で取得し、３５Ｓｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’構築物（ｓｙｎ４４  ５’ＵＴＲを欠除している）にライゲーションしてプラスミッド３５Ｓ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’を作出した。オリゴヌクレオチド  ５’−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＣＴＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＡＴＣＴＧ（ＢａｍＨＩ部位は下線；配列番号８）および５’−ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＡ（ＳａｃＩ部位は下線；配列番号９）を使用してｎｔｐ３０３  ３’ＵＴＲを産生した（ｎｔｐ３０３ゲノムクローンを鋳型として用いた）。このＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、３５Ｓ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’にクローン化してＣａＭＶ３５Ｓ  ３’ＵＴＲを置換し、３５Ｓ３０３  ５’／３０３  ３’を作出した。
【００７９】
ｎｔｐ３０３プロモーターを含んでいる遺伝子融合構築物は、以下のように作出された。
【００８０】
ｎｔｐ３０３のゲノムクローンを鋳型として使用して、５７８塩基対長のプロモーター断片（転写開始点を含む）を増幅した（Ｗｅｔｅｒｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）、プライマーは５’−ＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＣＡＣＴＣＧＣＡＡＣＧＴＧＴＧＴ（ＨｉｎｄＩＩＩ部位は下線；配列番号１０）および５’−ＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＣＡＣＴＡＴＴＣＡＣＣＡＴ（ＸｈｏＩ部位は下線；配列番号１１）を用いた。増幅したｎｔｐ３０３プロモータ断片（ｎｔｐ３０３遺伝子の最小の上流領域として実証された領域を含み、この領域は花粉発現を方向付ける能力を有する）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏｌで消化し、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの除去後に、３５Ｓ  Ｒｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’、３５Ｓ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’および３５Ｓ３０３  ５’／３０３  ３’にライゲーションして各々Ｒｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’、３０３  ５’／３５Ｓ  ３’および３０３  ５’／３０３  ３’を作出した。ｎｔｐ３０３プロモーター、ｎｔｐ３０３  ＵＴＲｓおよびレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ  ｃＤＮＡ（Ｒ３０３  ５’／３０３  ３’）を含む構築物を取得するために、ｌｕｃ＋遺伝子を３０３  ５’／３０３  ３’からＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、その後にｒｌｕｃコード領域をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位にライゲーションした。ｎｔｐ３０３プロモーターにより制御され且つｌｕｃ＋遺伝子を発現する構築物は、他の全ての構築物に使用されたものよりも長いバージョンの合成リンカーを具備していた。この９９塩基対長の合成リーダーは、ｐＮＢＬ５２−４４プラスミド（Ｄａｖｉｄ  Ｔｗｅｌｌ博士から供与された）を鋳型として用いたＰＣＲにより取得された。この断片（本明細書においてｓｙｎ９９  ５’と称される）は、下記のプライマーを用いて増幅された、即ち：  ５’−ＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＧＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣ  （ＸｈｏＩ部位は下線；配列番号１２）および５’−ＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＧＧ  （ＮｃｏＩ部位は下線；配列番号１３）である。ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲを３０３  ５’／３５Ｓ  ３’および３０３  ５’／３０３  ３’から除去後、ｓｙｎ９９  ５’ＵＴＲをＸｈｏｌおよびＮｃｏＩ部位にクローン化し、それぞれｓｙｎ９９  ５’／３５Ｓ  ３’およびｓｙｎ９９  ５’／３０３  ３’構築物を作出した。
【００８１】
ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ（Δ５’ＵＴＲ）の修飾を含んでいる構築物は、出発物質として３０３  ５’／３５Ｓ  ３’構築物におけるｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲを用いたＰＣＲにより全てが取得された。ＰＣＲにより取得された断片を、配列決定して完全に前記配列内のミスマッチを排除した。一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に使用した全ての構築物は、ｐＵＣ１９プラスミド中に保持された。
【００８２】
微粒子照射（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
マイクロキャリア（Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ）、破裂板（ｒｕｐｔｕｒｅ  ｄｉｓｋ）、およびマクロキャリア（ｍａｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ）をバイオラッドから購入した。
マイクロキャリアの調製およびコーティングを、製造者のマニュアル（バイオラッド）にしたがって実施した。後期二細胞性花粉および成熟花粉の微粒子照射形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のために、我々は照射毎に２５０μｇ金粒子（それぞれ、１μｍおよび１．６μｍのサイズを有する）を使用した。前記マイクロキャリアは、全量１μｇ  ＤＮＡ（０．７μｇ試験プラスミッドＤＮＡおよび０．３μｇノーマライゼイションプラスミッドＤＮＡを含有する）でコートされた。
【００８３】
試験プラスミッド（ｎｔｐ３０３プロモーターおよびｌｕｃ＋遺伝子、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターおよびｌｕｃ＋遺伝子、或いはｎｔｐ３０３プロモーターおよびｒｌｕｃ遺伝子を含有する）を、ノーマライゼイションプラスミッド（それぞれ、Ｒｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’、３５Ｓ  Ｒｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’およびｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’）と共に共沈（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）させた。ｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’とｓｙｎ９９  ５’／３５Ｓ  ３’とは、ＳＹＮ４４  ５’リーダーをＳＹＮ９９  ５’リーダーの代わりに含有していることを除いて、同一である。
【００８４】
微粒子照射を、バイオラッドのヘリウム駆動型ＰＤＳ−１０００／Ｈｅシステムを用いて実施した。花粉および葉の微粒子照射形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関して、下記の照射パラメータを使用した、即ち：標的距離  ６ｃｍ、ギャップ距離（ａ  ｇａｐ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）  １／４インチ、微粒子／ストッピングスクリーン距離（ｍａｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ／ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）  ８ｍｍ、チャンバー減圧  ２８ｍｍＨｇ、および破裂板の破裂圧力（ａ  ｂｕｒｓｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）  １１００ｐｓｉ。
【００８５】
ルシフェラーゼアッセイ
組織の粒子照射およびインキュベーションの後に、異なる遺伝子融合構築物の一過性発現の定量的判定を、市販のデュアル―ルシフェラーゼＴＭレポーターアッセイシステム（プロメガ）を用いて実施した。このアッセイにおいて、ｌｕｃ＋およびＲＬＵＣルシフェラーゼの活性を、単一サンプル抽出物（ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｅｘｔｒａｃｔ）から、２つの自動インジェクターを備えたルミノメーター（Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＶＩＣＴＯＲ２ＴＭ，  ＥＧ  ＆  Ｇ  Ｗａｌｌａｃ）を用いて連続的に測定した。アッセイに使用した緩衝液の調製を、製造者のマニュアル（プロメガ）にしたがって実施した。インキュベーション後、発育している（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）花粉を１０ｍｌのグレイナーチュウブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｔｕｂｅ）に移し、遠心分離（２分間、２，５００ｒｐｍ）により回収した。出芽している（Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ）花粉を、遠心分離（５分間、１，０００ｒｐｍ）により回収した。全てのケースにおいて、花粉ペレットを１００μｌの１ｘパッシブ溶解緩衝剤（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ；プロメガ）に懸濁し、液体窒素中で粉にした。花粉抽出物をルシフェラーゼ活性アッセイに使用するまで−７０℃で保存した。抽出物（１０μｌ）をマイクロタイタープレート中にピペッティングし、その後に前記プレートをルミノメーター中に配置した。１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩ（プロメガ）を自動的に注入し、その後（２秒後）、フォトン（ｐｈｏｔｏｎｓ）を１０秒間計数した。ｌｕｃ＋発光の定量の直後、反応を停止（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）させ、ＲＬＵＣ反応を１００μｌのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ（Ｒ）  試薬（プロメガ）を自動的に添加した後に開始した。また、ＲＬＵＣ発光を１０秒間測定した（注射後２秒）。独立した実験間での同じ試験レポーター遺伝子の発現の可変性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を補正するために、ｌｕｃ＋：各構築物に対して、少なくとも６回の独立した照射を実施した。
【００８６】
［実施例１］
ＵＴＲ遺伝子融合構築物
いくつかの遺伝子融合構築物（ｎｔｐ３０３プロモーター、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子並びに５’−および３’ＵＴＲｓの異なる組み合わせを含んでいる）を構築してｎｔｐ３０３のＵＴＲｓの花粉発生および花粉管成長の間の遺伝子発現を調節する能力を調査した（図１）。構築物の名称は、それらの５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲｓ（５’ＵＴＲ／３’ＵＴＲ）を称している。構築物の名称の前の大文字で記される「３５Ｓ」または「Ｒ」の略語は、前記構築物が各々ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターまたはレニラルシフェラーゼコード領域を具備することを示している。
【００８７】
ＵＴＲ遺伝子融合構築物は、微粒子照射により、発育している又は成熟した花粉に導入された。それらの一過性発現を、２０時間のインビトロ発生または発芽の後に発光測定により測定した。照射効率の差異を修正するため、第二の構築物を共照射した。該構築物は、ｎｔｐ３０３プロモーター、合成５’ＵＴＲ（ｓｙｎ４４  ５’）、カリフラワーモザイクウイルス終結配列（３５Ｓ  ３’）およびレニラのルシフェラーゼレポーター遺伝子を含んでいる（Ｒｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’）。ホタルルシフェラーゼ構築物の一過性発現の値を、レニラルシフェラーゼ構築物の値に対してノーマライズした。
【００８８】
花粉発生および花粉管成長の間の一過性発現におけるｎｔｐ３０３  ＵＴＲｓの効果を、ｎｔｐ３０３  ＵＴＲｓ（３０３  ５’／３０３  ３’）を含んでいる構築物の発現レベルと、コントロールＵＴＲｓ（ｓｙｎ９９  ５’またはｓｙｎ４４  ５’ＵＴＲおよび３５Ｓ  ３’ＵＴＲ）を含んでいる構築物の発現レベルとを比較することにより調査した。花粉管成長の２０時間後、３０３  ５’／３０３  ３’の発現は、それぞれ約６０および６倍、ｓｙｎ９９  ５’／３５Ｓ  ３’およびｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’の発現よりも高かった（図２ｂ）。
【００８９】
発現レベルにおける差異は、５時間前に照射された花粉の管において既に観察された。発現レベルでの、このような大きな差異は、ｎｔｐ３０３  ＵＴＲｓ構築物の照射後に２０時間インキュベーションした発育している花粉では観察されなかった。ここで、ｎｔｐ３０３  ＵＴＲｓは、約４倍高い発現レベル（ｓｙｎ９９  ５’／３５Ｓ  ３’ＵＴＲｓの発現レベルよりも）、また若干低い発現レベル（ｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’の発現レベルよりも）を生じさせた（図２ａ）。コントロールＵＴＲｓを含んでいる構築物の発現レベルは、花粉発生および花粉管成長の間で多かれ少なかれ同じであった（図２ａおよび２ｂ）。この結果は、これらのコントロールＵＴＲｓにより媒介された発現が、それらが試験された発生段階とは独立していることを明確に示している。
【００９０】
ｎｔｐ３０３  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲのどちらが花粉発生および花粉管成長の間の遺伝子発現のレベルを決定するのかを検査するため、遺伝子融合構築物（ｎｔｐ３０３  ５’／  ３５Ｓ  ３’またはｓｙｎ４４  ５’／ｎｔｐ３０３  ３’ＵＴＲｓを含んでいる）の一過性発現レベルをｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’の一過性発現レベルと比較した。
【００９１】
花粉管成長の間、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲは、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を、コントロール５’ＵＴＲよりもほぼ８倍高いレベルにまで増加させた（図３ｂ）。この増強効果は、ｎｔｐ３０３  ３’ＵＴＲ構築物においては欠除していた。コントロールＵＴＲｓおよびｎｔｐ３０３ＵＴＲを含んでいる構築物の発現レベルにおいて、如何なる有意差も花粉発生の間に観察されなかった（図３ａ）。
【００９２】
成長している花粉管においてｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲにより媒介された発現増強が、５’ＵＴＲおよびホタルルシフェラーゼ翻訳領域の間の特異的な相互作用の結果であるとの可能性を除外するために、前記ホタルルシフェラーゼ翻訳領域をレニラルシフェラーゼ翻訳領域により置換した（構築物  ｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’および３０３  ５’／３０３  ３’において）。ホタルおよびレニラのルシフェラーゼｍＲＮＡｓは、互いに有意な配列同一性を有していない。これらの構築物の発現のノーマライゼイションは、特定の構築物（ｓｙｎ４４  ５’ＵＴＲ、３５Ｓ終結配列およびホタルルシフェラーゼ翻訳領域を含んでいる）との共照射により達成された。図４に示されるように、ｎｔｐ３０３  ＵＴＲｓは、コントロールＵＴＲｓの発現レベルより約７倍高い発現レベルを生じたこのｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲの増強効果はホタルルシフェラーゼｍＲＮＡｓに関しても見出されているので、この結果はｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲおよび翻訳領域の間で特異的な相互作用が生じる可能性を排除する。
【００９３】
［実施例２］
花粉管成長の間の翻訳増強
花粉管成長の間のｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲにより媒介される増強が転写後制御イベントまたは転写のバースト（即ち、転写調節）の何れの結果から生じるかを調査するために、我々はｓｙｎ９９  ５’／３５Ｓ  ３’、３０３  ５’／３５Ｓ  ３’およびｓｙｎ９９  ５’／３０３  ３’の発現および転写のレベルを決定した（表１）。花粉抽出物から分離された１０μｇのトータルＲＮＡ（ルシフェラーゼ活性から測定される発現レベルの決定に関しても使用された）を、３２Ｐ−標識ルシフェラーゼプローブでハイブリダイズした。転写レベルは、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡのハイブリダイゼーションシグナルの共照射されたＲｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’構築物のレニラルシフェラーゼｍＲＮＡハイブリダイゼーションシグナルに対する比率を計算することによって決定された。花粉管成長の２０時間後、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲは、ｓｙｎ９９  ５’ＵＴＲの転写レベルよりも約２倍高い相対転写レベル（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ）を示した。ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲを含んでいる構築物は、相対的な発現を５０倍増加させた（ｓｙｎ９９  ５’／３５Ｓ  ３’と比較して）。従って、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲを含んでいる花粉管成長キメラルシフェラーゼ（ｐｏｌｌｅｎ  ｔｕｂｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の転写物は、コントロール５’ＵＴＲを含んでいるルシフェラーゼｍＲＮＡｓよりもより効率的に翻訳される。
【００９４】
表１：異なるＵＴＲ遺伝子融合構築物の相対的な転写〔相対的なｌｕｃ  ｍＲＮＡ量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）として表わされる〕および翻訳（相対的なＬＵＣ活性として表わされる）のレベルの分析参考にした方法論の記載に関しては結果の部分を参照のこと。括弧内の値は、ｓｙｎ９９  ５’／３５Ｓ  ３’構築物の相対値に対してノーマライゼイション後の相対的な転写および翻訳のレベルを表わす。測定値は花粉管成長の２０時間後にアッセイしたものである。
【００９５】
【表１】
2005504551.tif 000002
【００９６】
［実施例３］
遺伝子発現の５’ＵＴＲ媒介性の増強は、成長している花粉管以外の他の細胞タイプにおいても生じる
【００９７】
発育している花粉管におけるｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ媒介性の発現の増強が、花粉特異的な環境に限定されたものであるかを試験するために、構築物ｓｙｎ４４  ５’／３５Ｓ  ３’および３０３  ５’／３０３  ３’を、それらのｎｔｐ３０３プロモーターをＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターで置換することにより再構築した。ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターは、花粉管においてほとんど不活性であるが、しかし胞子体（ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃ）組織においては高度に活性である。これらの構築物の成熟花粉および若葉（ｙｏｕｎｇ  ｌｅａｖｅ）への微粒子照射に引き続く２０時間のインビトロインキュベーションの後に、一過性発現をアッセイした。これらの構築物の発現のノーマライゼイションを、共照射した構築物（この構築物は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ｓｙｎ４４  ５’ＵＴＲ、レニラルシフェラーゼレポーター遺伝子および３５Ｓ  ３’ＵＴＲを含んでいる）の発現レベルに対して実施した。成長している花粉管において、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲは、一過性発現をコントロールＵＴＲｓよりも約５倍高いレベルにまで増加させた（図５ａ）。発現レベルにおける差異は、同じＵＴＲの組み合わせを有するがｎｔｐ３０３プロモーターに連結された構築物のレベルと近似するものであった（図５ａおよび２ｂを比較されたし）。若葉において、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲは、発現をコントロールＵＴＲｓよりも約２倍高いレベルにまで増加させた（図５ｂ）。これらのデータは、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ媒介性の発現の増強が成長している花粉管以外の他の細胞タイプ〔例えば、胞子体細胞（ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）〕において生じることを実証している。
しかしながら、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ媒介性の発現の増強は、成長している花粉管において最大である。
【００９８】
［実施例４］
花粉管成長の間の発現増強は、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ内の特異的な領域に起因する
【００９９】
図６は、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲの予測された二次構造（ＲＮＡｄｒａｗソフトウェアパッケージで分析した）を表わしている（Ｈｏｆａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｃｈｅｍ．  Ｍｏｎｔｈｌｙ  １２５，１６７−１８８）。そこにはＨ−Ｉ（配列番号１のヌクレオチド４−７６）およびＨ−ＩＩ（配列番号１のヌクレオチド１０４−１５１）と称される、２つの推定上のステムループ構造が記載されている。Ｈ−Ｉステムループ構造は５’末端に局在し、そして計算されたエネルギー値（ΔＧ）  −６４ｋＪ／モルを有している。この構造は、外部ループにＧＡＡトリプレットの８リピート（配列番号１のヌクレオチド２７〜５０）と予測されたＨ−Ｉ構造に二本鎖ＲＮＡ〔ＧＡＡＧＡＡＧＡ（１４−２１）および相補鎖ＴＣＴＴＣＴＴＣ（５９−６６）からなる〕とを含む。Ｈ−ＩＩ構造は、翻訳開始部位から２２ヌクレオチド上流に局在し、そして計算されたエネルギー値（ΔＧ）  −２６ｋＪ／モルを有している。花粉管成長の間の発現増強における、Ｈ−ＩおよびＨ−ＩＩ構造内に存在する配列の効果が、一連のｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ欠損構築物（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）により調査された（図７ａおよびｃ）。これらの構築物は成熟花粉に照射され、それらの発現は花粉管成長の２０時間後にアッセイされた（図７ｂおよびｄ）。レポーター遺伝子発現のほとんど完全な不活性化が、完全なＨ−ＩＩ構造を含んでいるｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲの３’末端の最後の７０ヌクレオチドの削除の後に達成された（Δ７０  ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’）（図７ｂ）。Ｈ−ＩＩ構造のみを内部欠損（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）させた後も同様であった（ΔＨ−ＩＩ  ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’）（図７ｄ）。
【０１００】
双方のケースにおいて、発現値は、バックグランド値〔即ち、ルシフェリン基質の自家蛍光（ａｕｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）の測定値〕と同様の範囲であった。図７ｂは、Ｈ−Ｉステムループ構造内に欠損を有する遺伝子融合構築物の一過性発現を示している。一過性発現の最低レベルは、（ＧＡＡ）８リピートを内部欠損させた後に認められた（ΔＧＡＡ  ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’）。この発現レベルは、ｓｙｎ９９リーダーを含んでいるコントロール構築物の発現レベルに匹敵するものであった（データ示さず）。約９４％の一過性発現における減少が、（ＧＡＡ）８リピートを含む５’末端で最初の５５ヌクレオチドを欠損させた後に生じた（Δ５５  ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’）。ｎｔｐ３０３  ５’  ＵＴＲの５’末端での最初の２９ヌクレオチドの削除（Δ２９  ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’）は、非修飾ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲと比較した一過性発現において若干の減少のみを生じた。これらの結果は、ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ内に欠損を含むルシフェラーゼ転写物が非修飾ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲを含んでいる転写物よりも低レベルで発現したことを明確に実証している。
【０１０１】
Ｈ−ＩもしくはＨ−ＩＩ構造の又はその構造内部の欠損は、一過性発現における異なる減少を生じた。増強効果の欠除は（ＧＡＡ）８リピートの削除後に観察され、一方で完全なＨ−ＩＩ構造の削除は発現において完全な崩壊（ｃｏｌｌａｐｓｅ）を生じた。
【０１０２】
［実施例５］
ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲにおけるＨ−ＩおよびＨ−ＩＩ構造は、翻訳効率に影響する
【０１０３】
５’ＵＴＲ欠損構築物の一過性発現における減少が、転写または翻訳効率の何れの変化の結果であるかを、いくつかのｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ欠損構築物の相対的な転写および翻訳のレベルを測定することにより調査した（表２）。完全なＨ−ＩＩ構造の欠損を含んでいる構築物（Δ７０  ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’およびΔＨ−ＩＩ  ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’）の相対転写レベルは、ｓｙｎ９９  ５’／３５Ｓ  ３’のレベルよりも
低いレベルまで低下した。（ＧＡＡ）８リピートの内部欠損（ΔＧＡＡ  ３０３  ５’／３５Ｓ  ３’）は、非修飾ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲを含んでいる構築物の転写レベルよりも若干低い相対転写レベルを生じたが、しかし相対的な転写レベルは、合成５’ＵＴＲを含んでいる構築物のものよりも高く残存していた。相対転写レベルにおける（ＧＡＡ）
８リピートまたはＨ−ＩＩ構造の欠損の効果とは対照的に、より劇的な効果が相対翻訳レベル（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ）に関して観察された。
【０１０４】
相対的な翻訳レベルにおける劇的な減少はＨ−ＩＩ構造を欠損させた後に観察され、ノーマライズした翻訳レベルの値はバックグランド値の範囲であった。（ＧＡＡ）８リピートの削除は、ほとんど２倍低い相対翻訳レベル（３０３  ５’／３０３  ３’と比較して）を示した。これらのデータから、我々はＨ−ＩまたはＨ−ＩＩ構造の何れかの削除後に観察された発現の低下は、主に翻訳効率の減少の結果であると結論付けた。翻訳効率減少における最も重篤な影響は、Ｈ−ＩＩ構造の削除後に認められた。
【０１０５】
表２：異なるｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ遺伝子融合構築物の相対的な転写（相対的なｌｕｃ  ｍＲＮＡ量として表わされる）および翻訳（相対的なＬＵＣ活性として表わされる）のレベルの分析参考にした方法論の記載に関しては結果の部分を参照のこと。括弧内の値は、ｓｙｎ９９  ５’／３５Ｓ  ３’構築物の相対値に対してノーマライゼイション後の相対的な転写および翻訳のレベルを表わす。測定値は花粉管成長の２０時間後にアッセイしたものである。
【０１０６】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本研究に使用されたＵＴＲ遺伝子融合構築物の模式図および名称を示す図である。
【図２】発育している花粉（Ａ）および成長している花粉管（Ｂ）におけるＵＴＲ遺伝子融合構築物の一過性発現を示す図である。Ｒｌｕ／１０ｓｅｃ−１は、１０秒間の測定時間毎の相対的な光ユニット（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）を意味しており、これは試験構築物の絶対的な発現を基準構築物の該発現でノーマライズすることにより決定される。
【図３】発育している花粉（Ａ）および成長している花粉管（Ｂ）におけるＵＴＲ遺伝子融合構築物の一過性発現を示す図である。Ｒｌｕ／１０ｓｅｃ−１は、１０秒間の測定時間毎の相対的な光ユニット（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）を意味しており、これは試験構築物の絶対的な発現を基準構築物の該発現でノーマライズすることにより決定される。
【図４】成長している花粉管におけるレニラルシフェラーゼ翻訳領域を含んでいるＵＴＲ遺伝子融合構築物の一過性発現を示す図である。Ｒｌｕ／１０ｓｅｃ−１は、１０秒間の測定時間毎の相対的な光ユニット（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）を意味しており、これは試験構築物の絶対的な発現を基準構築物の該発現でノーマライズすることにより決定される。
【図５】成長している花粉管（Ａ）および若葉（Ｂ）における、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを含んでいるＵＴＲ遺伝子融合構築物の一過性発現を示す図である。Ｒｌｕ／１０ｓｅｃ−１は、１０秒間の測定時間毎の相対的な光ユニット（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）を意味しており、これは試験構築物の絶対的な発現を基準構築物の該発現でノーマライズすることにより決定される。
【図６】ｎｔｐ３０３の５’ＵＴＲの予測された二次構造を示す図である。構造予測およびΔＧ値の計算は、ＲＮＡｄｒａｗソフトウェアパッケージを用いて実施した。Ｈ−ＩおよびＨ−ＩＩは、２つの予測されたヘアピン−ループ構造を表わす。５’ＵＴＲの記載に関しては結果の部分を参照のこと。
【図７−１】ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ  Ｈ−Ｉ（ＡおよびＣ）およびＨ−ＩＩ（ＢおよびＣ）変異の模式図および発現効果を示す図である。修飾したｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲｓの詳細な記載に関しては結果の部分を参照のこと。Ｒｌｕ／１０ｓｅｃ−１は、１０秒間の測定時間毎の相対的な光ユニット（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）を意味しており、これは試験構築物の絶対的な発現を基準構築物の該発現でノーマライズすることにより決定される。測定値は花粉管成長の２０時間後にアッセイしたものである。
【図７−２】ｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲ  Ｈ−Ｉ（ＡおよびＣ）およびＨ−ＩＩ（ＢおよびＣ）変異の模式図および発現効果を示す図である。修飾したｎｔｐ３０３  ５’ＵＴＲｓの詳細な記載に関しては結果の部分を参照のこと。Ｒｌｕ／１０ｓｅｃ−１は、１０秒間の測定時間毎の相対的な光ユニット（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）を意味しており、これは試験構築物の絶対的な発現を基準構築物の該発現でノーマライズすることにより決定される。測定値は花粉管成長の２０時間後にアッセイしたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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