(57)【要約】ＬｉＡｌＨ４での還元によってジスルフィド含有メイタンシノイドエステルよりメイタンシノールを調製する方法。該メイタンシノールは細胞結合剤／メイタンシノイド複合体の調製に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素化リチウムアルミニウムでＤ−ＤＭ１−ＳＭｅを還元することを含む、メイタンシノールの調製方法。
【請求項２】
Ｄ−ＤＭ１−ＳＭｅを少なくとも４当量の水素化リチウムアルミニウムに加える、請求項１の方法。
【請求項３】
水素化リチウムアルミニウムがテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中にある、請求項１の方法。
【請求項４】
反応温度が約−５℃〜約１０℃である、請求項１の方法。
【請求項５】
Ｄ−ＤＭ１−ＳＭｅの約９６％がメイタンシノールに変換される、請求項１の方法。
【請求項６】
請求項１の方法によって調製されるメイタンシノール。
【請求項７】
請求項１の方法によって調製されたメイタンシノールを、細胞結合剤／メイタンシノイド複合体に変換することによって調製される、細胞結合剤／メイタンシノイド複合体。
【請求項８】
細胞結合剤が抗体である、請求項７の細胞結合剤／メイタンシノイド複合体。
【請求項９】
以下の工程：
（ａ）  請求項１の方法によって調製されたメイタンシノールを式ＩＩの化合物を用いてエステル化して、ジスルフィド含有メイタンシノイドエステルを形成させる工程；
（ｂ）  工程（ａ）によって調製されたジスルフィド含有メイタンシノイドエステルを、チオール含有メイタンシノイドに還元する工程；
（ｃ）  ジチオピリジル基を細胞結合剤に導入する工程；および
（ｄ）  工程（ｂ）によって得られたチオール含有メイタンシノイドを、工程（ｃ）のジチオピリジル細胞結合剤に、ジスルフィド結合によって結合させる工程；
を含む方法によって調製される細胞結合剤／メイタンシノイド複合体。
【請求項１０】
細胞結合剤が抗体である、請求項９の細胞結合剤／メイタンシノイド複合体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明はジスルフィド含有メイタンシノイドエステルからのメイタンシノールの調製方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
高い細胞毒性を有するメイタンシノイド薬剤およびその治療用途は米国特許第５，２０８，０２０号に記載されている。これらの薬剤は細胞毒性メイタンシノイドを抗体のごとき細胞結合剤に結合させ、腫瘍活性化プロドラッグとして有用である。
【０００３】
これらの免疫コンジュゲート薬剤を、ジスルフィド結合を介して抗体と結合したメイタンシノイドエステルより調製することができる。メイタンシノイドエステルは、米国特許第６，３３３，４１０号に記載のように、メイタンシノールおよびそのアンサマイトシン前駆体より調製される。Actinosynnemaの発酵からのアンサマイトシンの製造は、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／７７３６０、ならびに米国特許第４，１６２，９４０号；第４，２２８，２３９号；第４，３５６，２６５号および第４，４５０，２３４号に記載されている。
【０００４】
メイタンシノールは、高価な出発材料であり、その前駆体の供給源は発酵法に限られている。メイタンシノイドエステルの製造に使用される反応条件では、所望の立体異性体、不要な立体異性体および未反応のメイタンシノールをおよそ等量生じる。よって、次のエステル化反応に使用するために、該反応で生じた不要な立体異性体からメイタンシノールを回収することが望ましい。
【０００５】
（発明の要約）
本発明の１つの態様は、水素化リチウムアルミニウムを用いたジスルフィド含有メイタンシノイドエステルの還元を含むメイタンシノールの調製方法である。
【０００６】
本発明のもう１つの態様は、本発明の方法によって調製されたメイタンシノールより調製される細胞結合剤／メイタンシノイド複合体である。
【０００７】
（発明の詳細な記載）
特許および特許出願を含むがそれらに限定されない全ての出版物は、参照によってその全てが記載されたものとして本明細書に組み込まれる。
【０００８】
本発明は、水素化リチウムアルミニウム（ＬｉＡｌＨ４）を用いたメイタンシノイドエステルＤ−ＤＭ１−ＳＭｅ（ＩＶ）の還元によるメイタンシノールの調製方法を提供する。Ｄ−ＤＭ１−ＳＭｅは、アミノ酸誘導体によるメイタンシノールのエステル化で生じる不要な異性体である。回収されたメイタンシノールを再利用して、さらなる所望のＬ−ＤＭ１−ＳＭｅ異性体（ＩＩＩ）を得ることができる。
【０００９】
本発明は、本発明の方法によって得られたメイタンシノールから調製される抗体／メイタンシノイド複合体も提供する。
【００１０】
チオール含有メイタンシノイドエステルＤＭ１の調製に有用なジスルフィド含有メイタンシノイドエステルを、スキーム１に示すように、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）の存在下で、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体であるＮ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオプロパノイル）−Ｌ−アラニン（ＩＩ）をメイタンシノール（Ｉ）と反応させることによって調製することができる。該反応によって、所望の異性体であるＬ−ＤＭ１−ＳＭｅ（ＩＩＩ）、不要な異性体であるＲ−ＤＭ１−ＳＭｅ（ＩＶ）、および未反応のメイタンシノールがほぼ等量ずつ得られる。未反応のメイタンシノールをクロマトグラフィーによって異性体の混合物から分離し、次いで所望のＬ−異性体を分離用クロマトグラフィーによってＲ−異性体から分離する。Ｌ−ＤＭ１−ＳＭｅをジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元し、免疫コンジュゲート薬剤の調製に有用なＤＭ１を得る（スキーム２）。
【００１１】
【表１】
2005525423.tif 000002
【表２】
2005525423.tif 000003
【００１２】
本発明の方法は、スキーム３に示すように、還元反応にてＤ−ＤＭ１−ＳＭｅ（ＩＶ）をＬｉＡｌＨ４と反応させる工程を含む。該反応は水混和性極性有機溶媒中で行われる。好ましくは、反応温度は約−５℃〜約１０℃である。最も好ましくは、約２０℃のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のＤ−ＤＭ１−ＳＭｅ（ＩＶ）の溶液を、約−５℃に冷却したＬｉＡｌＨ４のＴＨＦ溶液に加える。
【００１３】
【表３】
2005525423.tif 000004
【００１４】
メイタンシノールのＤ−アミノアシルエステルであるＤ−ＤＭ１−ＳＭｅ（ＩＶ）は、米国特許第６，３３３，４１０号に開示されるように、ＤＣＣおよびＺｎＣｌ２の存在下にて、化合物ＩＩのごときジスルフィド含有Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体とのエステル化によって、メイタンシノールより調製される。ジスルフィド結合基を含むメイタンシノールのＬ−およびＤ−アミノアシルエステルが得られる。該立体異性体を分離して、Ｄ−ＤＭ１−ＳＭｅを回収し、本発明の方法に使用する。
【００１５】
ＬｉＡｌＨ４およびＴＨＦを、Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO)のごとき化学薬品供給会社より購入することができる。
【００１６】
本発明の方法を用いて、本発明の方法によって調製された式Ｉの化合物を細胞結合剤／メイタンシノイド複合体へ変換することによって、細胞結合剤／メイタンシノイド複合体を作製することができる。本発明の方法によって得られた式Ｉの化合物を、米国特許第５，２０８，０２０号に記載のように細胞結合剤／メイタンシノイド複合体に変換し、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン含有メイタンシノイド誘導体を得ることができる。次いで、これらの誘導体は細胞結合剤、好ましくは抗体に、様々なリンカーを介してコンジュゲートされ、腫瘍活性化プロドラッグとして有用である。好ましくは該結合はジスルフィド結合である。
【００１７】
典型的な細胞結合剤／メイタンシノイド複合体を、以下の工程：
（ａ）  請求項１の方法によって調製されたメイタンシノールを、式ＩＩの化合物とエステル化して、ジスルフィド含有メイタンシノイドエステルを得る工程；
（ｂ）  工程（ａ）によって調製されたジスルフィド含有メイタンシノイドエステルを、チオール含有メイタンシノイドに還元する工程；
（ｃ）  ジチオピリジル基を細胞結合剤に導入する工程；および
（ｄ）  工程（ｂ）によって得られたチオール含有メイタンシノイドを、工程（ｃ）のジチオピリジル細胞結合剤に、ジスルフィド結合によって結合させる工程；
を含む方法によって調製することができる。
【００１８】
本発明は以下の具体的かつ非限定的な実施例にて記載される。
【実施例】
【００１９】
Ｄ−ＤＭ１−ＳＭｅからのメイタンシノールの調製
本明細書中で使用される全ての試薬は、以下に記載のように調達される。
【００２０】
磁気撹拌子を入れた１５mlのセプタムキャップ付バイアルを、水素化リチウムアルミニウム (THF中1M, 0.52 mL, 5.19x10-4モル, 4.2当量, Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO)で満たし、溶液を−５℃に冷却した。無水ＴＨＦ (5 mL, Aldrich Chemical Co.) 中のＮ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオプロパノイル）−Ｄ−アラニルメイタンシン(100 mg, 1.28 x 10 -4モル, 1当量, ChemSyn Laboratories, Lenexa, KS)溶液を、温度が８℃を超えないような速度で加えた。反応混合物を再び−５℃に冷却し、反応の進行を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって監視した。２時間後、反応が完了し、ＨＰＬＣアッセイによりメイタンシノールはピークエリア９５．９％の主要な生成物として示された。２つの異なるＨＰＬＣシステムにおいて、該生成物はメイタンシノールの保持時間に一致し、ＬＣ／ＭＳでは所望の分子量を有していた。該反応を既知の標準的な技術によって行うことができる。Reagents for Organic Synthesis, Volume 1, Feiser and Feiser, pp583-584, 1967を参照。
【００２１】
本発明を、その精神または本質的な特性を逸脱することなく他の特定の形態にて実施してもよく、従って、本発明の範囲を示すものとしては添付の請求項よりも前記の明細書を参照にされたい。
【国際調査報告】
2005525423.tif 000005