(57)【要約】本発明は、第１細胞および第２細胞を融合させる方法および装置に関する。具体的には、方法は、ピペット・システム（３３）を使用して流体充填コンテナ（４０）において、第１細胞および第２細胞を２つの電極（３５）間において位置決めすることを含む。第１細胞および第２細胞は、各電極から分離されて保持される。これが達成された後、所定の波形を有する電流が、所定の電場を生成して、それにより細胞を融合させるように、電極（３５）に印加される。
2005534296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）流体充填融合コンテナの２つの電極間において、各電極から分離されている第１細胞および第２細胞を位置決めすることと、
ｂ）所定の融合パルスを生成して、それにより該細胞を融合させるために、所定の波形を有する電流を該電極に印加することと、からなる第１細胞と第２細胞とを融合させる方法。
【請求項２】
前記細胞が、前記電極間において懸濁液に保持される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞を互いに向けて押しやるように適合されるＤＥＰ場を生成することを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の波形が、前記ＤＥＰ場を表す電流を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＥＰを第２の電極対に印加することを含む請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ａ）ＤＥＰ電流を第２電極対に印加することと、
ｂ）前記融合コンテナにおいて前記第１細胞を位置決めし、交流電場が、前記第１細胞を前記第２の電極対の一方に向けて引き付けるように作用することと、
ｃ）前記融合コンテナにおいて前記第２の細胞を位置決めし、交流電場が、前記第２の細胞を前記第１の細胞に引き付けるように作用することと、を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の細胞および前記第２の細胞の少なくとも一方が、前記第２の電極対の少なくとも一方と接触して位置決めされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ａ）第１コンテナに保持されている第１細胞の群からの前記第１細胞と、
ｂ）第２コンテナに保持されている第２細胞の群からの前記第２細胞と、を引き付けるように、ピペットを使用して前記第１細胞および前記第２細胞を選択する工程を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）前記ピペットを使用して、前記融合コンテナにおいて前記第１細胞を位置決めする工程と、
ｂ）前記ピペットを使用して、前記第１細胞に隣接して、前記融合コンテナにおいて前記第２細胞を位置決めする工程と、
ｃ）前記第１細胞および前記第２細胞がほぼ前記電極間に位置するように、前記電極を位置決めする工程と、とを含む前記融合コンテナにおいて前記第１細胞および前記第２細胞を位置決めする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ピペットが、
ａ）前記第１、前記第２、および前記融合コンテナに対して前記ピペットを移動させるように適合される駆動システムと、
ｂ）前記ピペットを作動させ、それによりポートを経て流体を排出または吸引するように適合される作動装置とに結合され、前記ピペットを移動および作動させるために、該駆動装置および該作動装置に結合されたコントローラを使用することを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記コントローラに、
ａ）前記ポートが、それぞれのコンテナにおいて流体懸濁液に保持されている、所定の
特性を有する細胞に隣接するように、前記ピペットを移動させる工程と、
ｂ）前記ポートを経て流体を吸引して、それにより該細胞および周囲の流体を吸引するように前記ピペットを作動させる工程とを含む、細胞を選択する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記コントローラが、
ａ）前記ポートが前記融合コンテナにおいて前記第１細胞に隣接するように、前記ピペットを移動させる工程と、
ｂ）前記ピペットに前記ポートを経て流体を排出させ、それにより前記第２を前記融合コンテナの前記流体内に排出する工程と、
ｃ）前記ポートが、前記第１細胞および前記第２細胞の両方に可能な限り近接するように、前記ピペットを移動させる工程と、
ｄ）前記ピペットに前記ポートを経て流体を吸引させ、それにより前記第１細胞および前記第２細胞ならびに周囲の流体を吸引する工程と、
ｅ）前記ピペットに前記第１細胞および前記第２細胞を前記融合コンテナの前記流体内に排出させる工程と、
ｆ）前記第１細胞および前記第２細胞が所定の距離内にあるようになるまで、工程（ｃ）から（ｅ）を繰り返す工程と、を含む前記ピペットを使用して前記第１細胞に隣接して前記第２細胞を位置決めする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電極が、前記融合コンテナに対して前記電極を移動させるように適合される電極駆動システムに結合され、該電極駆動システムに結合されたコントローラを使用して、前記電極を前記融合室において位置決めする工程を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記電極が、信号生成装置に結合され、該信号装置に所定の電流を前記電極に印加させる工程を含む、前記電流を前記電極に印加する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１細胞および前記第２細胞が、それぞれの細胞タイプを有し、信号生成装置に結合されたコントローラを使用して、前記第１細胞および前記第２細胞の該細胞タイプに従って前記電流を選択する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１細胞および前記第２細胞が、同じタイプの細胞であり、細胞の前記第１群および前記第２群が、同じ群である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ほぼ以上に記述した通りである、第１細胞と第２細胞とを融合させる方法。
【請求項１８】
ａ）流体充填融合コンテナと、
ｂ）使用時に該融合コンテナにおいて位置決めされるように適合される少なくとも２つの電極と、
ｃ）ｉ）それぞれのコンテナに保持されている第１細胞の群から第１細胞を選択することと、
ｉｉ）それぞれのコンテナに保持されている第２細胞の群から第２細胞を選択することと、
ｉｉｉ）前記電極間における該融合コンテナにおいて、前記第１細胞および前記第２細胞を位置決めするための選択装置と、
ｄ）前記電極に結合され、所定の波形を有する場を前記電極間において生成して、それにより前記細胞を融合させるように適合される信号生成装置と、を含む第１細胞と第２細胞とを融合させる装置。
【請求項１９】
前記選択装置がピペットである請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
ａ）前記第１、前記第２、および前記融合コンテナに対して前記ピペットを移動させるように適合される駆動システムと、
ｂ）前記ピペットにポートを経て流体を排出または吸引させるように適合される作動装置と、をさらに含む請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記電極が前記融合コンテナに結合された請求項１８から２０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２２】
前記融合コンテナに対して前記電極を移動させるように適合される電極駆動システムをさらに含む請求項１８から２０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２３】
前記電流波形が融合パルスを含み、前記信号生成装置が、電場パルスを生成して、それにより前記細胞を融合させるために、該融合パルスを前記電極に印加するように適合される、請求項１８から２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
前記電流波形がＤＥＰ電流を含み、前記信号生成装置が、ＤＥＰ場を生成して、それにより前記細胞を互いに向けて押しやるために、該ＤＥＰ電流を前記電極に印加するように適合される、請求項１８から２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２５】
１対の第２電極を含み、該一対の第２電極が第２信号生成装置に結合され、該第２信号生成装置がＤＥＰ電流を生成するように適合され、該ＤＥＰ電流がＤＥＰ場を生成して、それにより前記細胞を互いに向けて押しやるために該一対の第２電極に印加される、請求項１８から２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２６】
前記一対の第２電極が前記融合コンテナの表面上に提供される請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
ａ）前記ピペットと、
ｂ）前記電極と、
ｃ）前記信号生成装置との少なくとも１つの動作を制御することによって、前記細胞の前記融合を制御するように適合されるコントローラをさらに含む、請求項１８から２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記コントローラが、
ａ）プロセッサが前記ピペットを移動および作動させるように適合される、前記駆動システムおよび前記作動装置と、
ｂ）プロセッサが前記電極を移動させるように適合される、前記電極駆動システムと、
ｃ）プロセッサが前記信号生成装置に前記所定の波形を有する電流を生成させるように適合される、前記信号生成装置との少なくとも１つに結合されたプロセッサを含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記コントローラが前記コンテナ内における細胞の位置を検出するように適合された検出器を含み、前記プロセッサが、検出された細胞の位置に応答して前記電極および前記ピペットの少なくとも一方を移動させるように該検出器に応答する、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記処理システムが、使用者から入力コマンドを受信するための入力を含む請求項２８または請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
前記プロセッサが、いくつかの異なる所定の波形を表す波形データを記憶するストアに結合され、前記プロセッサが、前記使用者から受信した前記入力コマンドに応答して、該いくつかの所定の波形の１つを選択するように適合される請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
前記プロセッサが、前記使用者から受信した前記入力コマンドに応答して、前記電極および前記ピペットの少なくとも一方を移動させるように適合される請求項３０または３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記コントローラが、請求項１から１７のいずれかの前記方法を装置に実施させることによって、前記細胞を融合させるように適合される請求項２７から３２のいずれかに記載の装置。
【請求項３４】
ほぼ以上に記述した通りである、第１細胞と第２細胞とを融合させる装置。
【請求項３５】
第１細胞と第２細胞とを融合させる装置を制御するコントローラであって、該装置が、
ａ）流体充填融合コンテナと、
ｂ）少なくとも２つの電極と、
ｃ）選択装置と、
ｄ）該電極に結合された信号生成装置とを含み、
使用時、
ｉ）該選択装置に、
（１）それぞれのコンテナに保持されている第１細胞の群から第１細胞を選択させ、
（２）それぞれのコンテナに保持されている第２細胞の群から第２細胞を選択させ、
（３）該電極間の該融合コンテナにおいて、懸濁液に保持されている該第１細胞および該第２細胞を位置決めさせることと、
ｉｉ）該信号生成装置に、所定の波形を有する場を該電極に印加させ、それにより該細胞を融合させることとによって、該細胞を融合させるように適合されるコントローラ。
【請求項３６】
前記融合コンテナにおいて前記電極を位置決めするようにさらに適合される請求項３５に記載のコントローラ。
【請求項３７】
ａ）前記第１、前記第２、および前記融合コンテナに対して前記ピペットを移動させるように適合される駆動システムと、
ｂ）前記ピペットに、ポートを経て流体を排出または吸引させるように適合される作動装置と、
ｃ）前記融合コンテナに対して前記電極を移動させるように適合される電極駆動システムと、
ｄ）前記信号生成装置との少なくとも１つに結合されたプロセッサと、を含む請求項３６に記載のコントローラ。
【請求項３８】
前記コンテナ内における細胞の位置を検出するように適合された検出器を含み、前記プロセッサが、検出された細胞の位置に応答して、前記電極および前記ピペットの少なくとも一方を移動させるように、該検出器に応答する請求項３７に記載のコントローラ。
【請求項３９】
使用者からの入力コマンドを受信するための入力を含む、請求項３７または３８に記載のコントローラ。
【請求項４０】
前記プロセッサが、いくつかの異なる所定の波形を表す波形データを記憶するためのストアに結合され、前記プロセッサが、前記使用者から受信した前記入力コマンドに応答して
、該いくつかの所定の波形の１つを選択するように適合される、請求項３９に記載のコントローラ。
【請求項４１】
前記プロセッサが、前記使用者から受信した前記入力コマンドに応答して、前記電極および前記ピペットの少なくとも一方を移動させるように適合される、請求項３５または請求項４０に記載のコントローラ。
【請求項４２】
前記電流波形が、融合パルスを含み、前記信号生成装置に、電場パルスを生成して、それにより前記細胞を融合させるために、該融合パルスを前記電極に印加させるように適合される請求項３５から４１のいずれか１項に記載のコントローラ。
【請求項４３】
前記電流波形がＤＥＰ電流であり、ＤＥＰ場を生成して、それにより前記細胞を互いに向けて押しやるために、前記信号生成装置に該ＤＥＰ場を前記電極に印加させるように適合される請求項３５から４２のいずれか１項に記載のコントローラ。
【請求項４４】
前記装置が１対の第２電極であり、該一対の第２電極が第２信号生成装置に結合され、コントローラが、該第２信号にＤＥＰ電流を生成させるように適合され、該ＤＥＰ電流、ＤＥＰ場を生成して、それにより前記細胞を互いに向けて押しやるために、該一対第２電極に印加される請求項３５から４２のいずれか１項に記載のコントローラ。
【請求項４５】
請求項１８から３４のいずれか１項に記載の装置と共に使用されるように適合される請求項３５から３４４のいずれか１項に記載のコントローラ。
【請求項４６】
前記装置に請求項１から１７のいずれかの前記方法を実施するように適合される請求項４５に記載のコントローラ。
【請求項４７】
ほぼ以上に記述した通りである、第１細胞と第２細胞とを融合させる装置を制御するコントローラ。
【請求項４８】
適切な処理システムによって実行されるとき、請求項３５から４７のいずれか１項の前記コントローラとして該処理システムを動作させるコンピュータ実行可能コードを含む、第１細胞と第２細胞を融合させる装置を制御するためのコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項４９】
前記処理システムが、前記装置に請求項１から１７のいずれかの前記方法を実施させるように適合される請求項４８に記載のコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項５０】
適切な処理システムによって実行されるとき、該処理システムをほぼ以上に記述した通りに動作させるコンピュータ実行可能コードを含む、第１細胞と第２細胞を融合させる装置を制御するためのコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項５１】
ａ）使用時に流体を包含し、ポートを含むノズルと、
ｂ）該ノズルに結合され、該ポートを経て流体を吸引および／または排出するように適合される作動装置と、
ｃ）該ポートに隣接する該ノズルに結合され、印加される電場が、該ポートに隣接して位置決めされた１つまたは複数の粒子に結合されることを可能にするために、第２電極と共動するように適合される電極とを含む、粒子を操作するためのピペット・システム。
【請求項５２】
前記電極が導電管から形成される請求項５１に記載のピペット・システム。
【請求項５３】
前記電極が約１０ｍｍの直径を有するステンレス鋼管から形成される請求項５２に記載のピペット・システム。
【請求項５４】
流体充填コンテナに対してピペット・システムを移動させ、それにより粒子を該コンテナにおいて位置決めする、または該コンテナから除去することを可能にするように適合される駆動システムを含む、請求項５１から５３のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項５５】
前記コンテナにおいて位置決めされた前記電極と第２電極との間において、所定の電場を生成するための前記電極に結合された信号生成装置を含む請求項５４に記載のピペット・システム。
【請求項５６】
前記駆動システム、前記作動装置および前記信号生成装置を制御して、それにより、
ａ）前記ピペットを使用して前記第２電極に隣接して前記コンテナにおいて前記粒子を位置決めすることと、
ｂ）前記コンテナにおいて前記粒子に隣接して前記ピペット・ポートを位置決めすることと、
ｃ）前記信号生成装置を稼動させることとによって粒子に電場を印加するように適合されるコントローラと、を含む、請求項５５に記載のピペット・システム。
【請求項５７】
前記コントローラが、
ａ）前記ピペットを使用して、前記第２電極に隣接して前記コンテナにおいて第１細胞を位置決めすることと、
ｂ）前記ピペットを使用して、前記第１細胞に隣接して前記コンテナにおいて第２細胞を位置決めすることと、
ｃ）前記第１細胞および前記第２細胞が、ほぼ前記電極間にあるように、前記第１細胞および前記第２細胞に隣接して前記ピペット・ポートを位置決めすることと、
ｄ）所定の場のシーケンスが前記細胞に印加され、それにより前記細胞を融合させるように、前記信号生成装置を稼動させることとによって、細胞を融合させるように適合される請求項５６に記載のピペット・システム。
【請求項５８】
ａ）放射源と、
ｂ）該放射源に結合された第１端部と、前記ポートに隣接する前記ノズルに結合された第２端部とを有し、それにより、該放射源からの放射が、使用時に前記ポートに隣接して位置決めされた粒子に当たることを可能にする、導波路とをさらに含む、請求項５１から５７のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項５９】
前記粒子によって放出される放射を検出するように適合された検出器を含む請求項５８に記載のピペット・システム。
【請求項６０】
前記検出器が前記導波路の前記第１端部に結合され、それにより前記粒子から放出された放射を検出する請求項５９に記載のピペット・システム。
【請求項６１】
前記放射源がレーザである請求項５８から６０のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項６２】
前記導波路が光ファイバ・ケーブルである請求項５８から６１のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項６３】
前記導波路が前記ノズルから形成され、前記ノズルが、前記放射源からの前記放射が前記
ノズルに入り、前記ノズルの少なくとも一部に沿って進むことを可能にするように成形された部分を含み、前記放射が、前記ポートを経て前記ノズルから放出される請求項５８から６２のいずれか１項に記載のピペット・システム
【請求項６４】
ａ）前記作動装置を稼動させ、それにより前記ポートを経て流体を吸引および／または排出することと、
ｂ）前記放射源を稼動させ、それにより粒子を放射に暴露させることとの少なくとも一方を実施するように適合されるコントローラを含む、請求項５８から６３のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項６５】
前記駆動システムが、
ａ）前記ポートが粒子に隣接するように、ピペット・システムを位置決めすることと、
ｂ）前記放射源を稼動させ、それにより該粒子を放射に暴露させることと、
ｃ）該粒子によって放出されるあらゆる放射を検出することと、
ｄ）前記検出された放射に従って、該粒子が所定の特性を有するかを判定することと、
ｅ）成功した比較に従って前記作動装置を稼動させ、それにより前記ポートを経て流体を前記ノズル内に吸引して、それにより該粒子を回収することとによって、前記コンテナから所定の特性を有する粒子を回収するように適合されるコントローラに結合される、請求項５４および請求項６４に記載のピペット・システム。
【請求項６６】
前記作動装置が、
ａ）流体リザーバと、
ｂ）前記ノズルを該流体リザーバに結合する柔軟管と、
ｃ）該管を部分的に圧縮するように位置決めされたアームと、
ｄ）ｉ）該管をさらに圧縮して、それにより前記ポートを経て流体を排出することと、
ｉｉ）該管を減圧して、それにより前記ポートを経て流体を吸引することとの少なくとも一方を実施するために、該アームを移動させるように適合される作動装置駆動システムとを含む、請求項５１から６３のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項６７】
前記作動装置が、
ａ）前記管および／または膀胱に対して、前記アームを移動させるための第１作動装置ドライブと、
ｂ）使用時に前記管と接触するアーム端部分から形成され、該アーム端部分を伸張または収縮させるように適合される第２作動装置とを含む、請求項６６に記載のピペット・システム。
【請求項６８】
前記作動装置駆動システムに結合され、前記作動装置駆動システムを動作させて、それにより前記ポートを経て流体を吸引または排出するように適合されるコントローラを含む、請求項６６または請求項６７に記載のピペット・システム。
【請求項６９】
前記駆動システムが、
ａ）前記ポートが粒子に隣接するように、ピペット・システムを位置決めすることと、
ｂ）前記作動装置を稼動させ、それにより前記ポートを経て流体をノズル内に吸引して、それにより該粒子を回収することとによって、前記流体から粒子を回収するように適合されるコントローラに結合される、請求項５４および請求項６８に記載のピペット・システム。
【請求項７０】
前記管が、シリコン管から形成される、請求項６３から６９のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項７１】
添付の図面を参照してほぼ以上に記述した通りである粒子を操作するためのピペット・システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１細胞と第２細胞とを融合させる方法および装置に関し、詳細には、電気融合によってハイブリッド細胞を生成する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書におけるあらゆる従来の技術に対する参照は、その従来の技術がオーストラリアにおける共通の一般的な知識の一部を形成することを認めるものでも任意の形態で示唆するものでもなく、またそのように取られるべきではない。
【０００３】
従来、ポリエチレン・グリコールを使用する化学的融合、ウィルスもしくはウィルスたんぱく質などの生物学的方法、または懸濁液における細胞の電気融合など、様々な技法を使用して細胞を共に融合させることが知られていた。化学的手段または生物学的手段によって実施される融合の方法は、汚染、低効率、および細胞毒に関連する問題の悪影響をしばしば受ける。
【０００４】
ハイブリッド細胞を生成するために電気融合を使用することには、いくつかの利点がある。融合条件は、融合される細胞のタイプに応じて、化学的融合または生物学的融合が可能とするものより良好に制御および最適化し得る。これにより、電気融合は、細胞融合効率を向上させることが可能になる。
【０００５】
電気融合の基本は、細胞膜を機械的に破壊し、かつ細胞間接触点において孔を形成するために、十分な電圧を細胞膜にわたって誘起する電場に、密接に膜接触している細胞の対を暴露させることである。理想的には、孔は、２つの細胞間において細胞材料を移送するのを可能にし、具体的には２つの核が１つになり、その後融合することを可能にするように、十分なサイズであるべきである。孔のこの形成は、細胞間接触以外の点において形成されたあらゆる孔が迅速に封止されるように、可逆的でもあるべきである。
【０００６】
誘電泳動（ＤＥＰ）として知られる他の工程では、融合前に良好な細胞接触を保証するために、不均一な交流電場が細胞に印加される。通常、融合コンテナにおいて電極間に多数の細胞の「パール・チェーン」を形成するために、ＤＥＰが使用される。
【０００７】
電気融合は、化学的工程および生物学的工程に対していくつかの利点を有するが、すべてのこれらの方法は、多数の細胞を同時に融合させる。したがって、ハイブリッド細胞を形成するために必要な細胞の対化は、完全に無作為である。したがって、現在の方法は、未融合細胞および自己融合細胞を最終培養物から排除し得るように、化学的に鋭敏な不死細胞を必要とするという点で限定される。
【０００８】
さらに、これらの「バルク」法は、未加工細胞からハイブリッド創出することにも適していない。通常、融合方法は、所望の細胞間において細胞接触を保証するために、数百万の細胞を必要とする。いくつかの場合、融合させる目的の細胞の数は、わずかに数１０から数１００である可能性がある。さらに、融合工程からの細胞がプレート・アウトされ、未融合細胞を除去する化学的選択工程が行われる回収段階では、最終産物におけるクローン純度は保証されない。細胞のこのプレーティングは、極端に時間もかかる。
【０００９】
したがって、より少数の細胞を選択して、電気的に融合させ、成長のために回収し得る方法を提供することが望ましい。
少数の細胞について電気融合を実施するのに適切なシステムの例が、ＷＯ９３／０５１
６６に記載されている。これは、配位子でコーティングされた電極を使用する装置を記載する。使用時、配位子は、相補配位子を担持する目的の細胞を引き付けるために使用される。配位子が結合された後、細胞は、電極に有効に結合される。したがって、この時点で、目的の細胞は、パートナ細胞と接触することが可能であり、これにより、細胞を融合させることが可能になる。
【００１０】
しかし、これらの技法には、いくつかの欠点がある。第１に、目的の細胞は、電気融合工程中、電極と接触して保持される。その結果、細胞は通常、細胞を損傷させる傾向がある強い電場の影響を受ける。第２に、この技法は、電極に引き付けられたいくつかの目的の細胞、およびいくつかのパートナ細胞についてのみ実施し得る。したがって、これは、うまく融合されたあらゆる細胞が、融合しない細胞から分離される可能性があることを意味するが、これは、複雑な手続きであることがある。この技法の他の欠点は、細胞が電極に結合して、擬似融合が起きることが珍しくないことである。
【００１１】
個々の細胞について細胞融合を実施するシステムの第２例が、ＷＯ０１／０９２９７に記載されている。この例では、細胞は、細胞を光学的にトラップすること、および微小電極で押すことの組合せを使用して操作される。細胞が互いに対して適切に位置決めされた後、細胞が融合するように、電場が細胞に印加される。
【特許文献１】ＷＯ９３／０５１６６
【特許文献２】ＷＯ０１／０９２９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、この装置には、いくつかの重大な欠点がある。第１に、細胞を操作するために必要なレーザおよび関連する光学機器が存在することにより、装置が高価になり、構成に時間がかかり、使用が複雑になる。第２に、電極は、押すことによる細胞の操作を可能にするように、細胞のサイズより著しく小さくなくてはならない。その結果、電極は、やはり高価になり、構築が困難で、極端に壊れやすくなり、それにより装置のコストおよび複雑さがさらに増大する。
【００１３】
この他に、電極で細胞に触ることにより、細胞の燃焼などの更なる問題が起きることがある。細胞が押されたときに信号が電極に印加されていない場合においてさえ、電極は、電極が最後に使用されたときからの残留場を保持することがある。この場合、細胞と電極との接触により、場が放電して、細胞を損傷することがある。
【００１４】
最後に、レーザ・トラッピングおよび電極を使用して、細胞を操作することは、ＷＯ０１／０９２９７に記載されているように、手作業では達成が困難である。これは、この装置を使用して細胞融合を実施するために、訓練が必要であることを意味するだけでなく、細胞融合工程自体が、時間のかかることがあることをも意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１の広範な形態において、本発明は、第１細胞と第２細胞とを融合させる方法を提供し、方法は、
ａ）第１細胞および第２細胞を選択することと、
ｂ）融合コンテナに充填された流体にある２つの電極間において、第１細胞および第２細胞を位置決めし、第１細胞および第２細胞が、各電極から分離されて懸濁液において保持されることと、
ｃ）細胞を融合させるために、所定の波形を有する電流を電極に印加することとを含む。
【００１６】
通常、細胞は、電極間において懸濁液に保持される。
方法は、細胞を互いに向けて押しやるように適合されるＤＥＰ場を生成することを通常含む。
【００１７】
所定の波形は、ＤＥＰ場を表す電流を含む可能性がある。代替として、方法は、１対の第２電極にＤＥＰを印加することを含むことが可能である。
方法は、
ａ）ＤＰＥ電流を第２電極の対に印加することと、
ｂ）第１細胞を融合コンテナにおいて位置決めし、交流電場が、第１細胞を第２対の電極の一方に向けて第１細胞を引き付けるように作用することと、
ｃ）第２細胞を融合コンテナにおいて位置決めし、交流電場が、第２細胞を第１細胞に向けて引き付けるように作用することとを一般に含む。
【００１８】
第１細胞および第２細胞の少なくとも一方は、一般に、第２対の電極の少なくとも一方と接触して位置決めされる。
第１細胞および第２細胞を選択する方法は、ピペットを使用して、
ａ）第１コンテナに保持された第１細胞の群からの第１細胞と、
ｂ）第２コンテナに保持された第２細胞の群からの第２細胞とを取り出すことを通常含む。
【００１９】
２つの電極間において第１細胞および第２細胞を位置決めする方法は、
ａ）ピペットを使用して、融合コンテナにおいて第１細胞を位置決めすることと、
ｂ）ピペットを使用して、第１細胞に隣接して、融合コンテナにおいて第２細胞を位置決めすることと、
ｃ）第１細胞および第２細胞がほぼ電極間に位置するように、電極を位置決めすることとを通常含む。
【００２０】
ピペットは、
ａ）第１、第２、および融合コンテナに対してピペットを移動させるように適合される駆動システムと、
ｂ）ピペットを作動させ、それによりポートを経て流体を排出するまたは吸引するように適合される作動装置とに通常結合される。
【００２１】
この場合、方法は、ピペットを移動および作動させるために、駆動システムおよび作動装置に結合されたコントローラを使用することを通常含む。
細胞を選択する方法は、コントローラが、
ａ）ポートが、所定の特性を有し、かつそれぞれのコンテナにおいて流体懸濁液に保持されている細胞に隣接するように、ピペットを移動させることと、
ｂ）ポートを経て流体を吸引して、それにより細胞および周囲の流体を吸引するように、ピペットを作動させることとを含むことが好ましい。
【００２２】
ピペットを使用して、第１細胞に隣接して第２細胞を位置決めする方法は、コントローラが、
ａ）ポートが融合コンテナにおいて第１細胞に隣接するように、ピペットを移動させることと、
ｂ）ピペットに、ポートを経て流体を排出させ、それにより第２を融合コンテナの流体内に排出させることと、
ｃ）ポートが第１細胞および第２細胞の両方に可能な限り近くなるように、ピペットを移動させることと、
ｄ）ピペットに、ポートを経て流体を吸引させ、それにより第１細胞および第２細胞な
らびに周囲の流体を吸引させることと、
ｅ）ピペットに、第１細胞および第２細胞を融合コンテナの流体内に排出させることと、
ｆ）第１細胞および第２細胞が所定の距離内になるまで、工程（ｃ）から（ｅ）を繰り返すこととを一般に含む。
【００２３】
電極は、融合コンテナに対して電極を移動させるように適合される電極駆動システムに結合される可能性がある。この場合、方法は、電極駆動システムに結合されたコントローラを使用して、融合室において電極を位置決めすることを通常含む。
【００２４】
電極は、信号生成装置に結合される可能性がある。この場合、交流を印加する方法は、信号生成装置に所定の波形を電極に印加することを含む。
第１細胞および第２細胞がそれぞれの細胞タイプを有する場合、方法は、信号生成装置に結合されたコントローラを使用して、第１細胞および第２細胞の細胞タイプに従って電流を選択することを含むことが好ましい。
【００２５】
第１細胞および第２細胞は、同じタイプの細胞である可能性があり、細胞の第１群および第２群は、同じ群である可能性がある。
第２の広範な形態において、本発明は、第１細胞と第２細胞とを融合させる装置を提供する。装置は、
ａ）流体充填融合コンテナと、
ｂ）使用時に融合コンテナにおいて位置決めされるように適合される少なくとも２つの電極と、
ｃ）ｉ）それぞれのコンテナに保持された第１細胞の群から第１細胞を選択し、
ｉｉ）それぞれのコンテナに保持された第２細胞の群から第２細胞を選択し、
ｉｉｉ）懸濁液に保持されている第１細胞および第２細胞を融合コンテナにおいて位置決めするための選択装置と、
ｄ）電極に結合され、所定の波形を有する場が電極間において生成され、それにより細胞を融合させるように適合される信号生成装置とを含む。
【００２６】
選択装置は、ピペットであることが好ましい。
装置は、一般に、
ａ）第１、第２、および融合コンテナに対してピペットを移動させるように適合される駆動システムと、
ｂ）ピペットにポートを経て流体を排出または吸引させるように適合される作動装置とをさらに含む。
【００２７】
電極は、融合コンテナに結合される可能性がある。
代替として、装置は、融合コンテナに対して電極を移動させるように適合される電極駆動システムを含むことが可能である。
【００２８】
電流の波形は、融合パルスを通常含み、信号生成装置は、電場パルスを生成して、それにより細胞を融合させるように、融合パルスを電極に印加するように適合される。
電流の波形は、ＤＥＰ電流をも含むことが好ましく、信号生成装置は、ＤＥＰ場を生成して、それにより細胞を互いに向けて押しやるために、ＤＥＰ電流を電極に印加するように適合される。
【００２９】
装置は、１対の第２電極を含む可能性がある。第２電極の対は、第２信号生成装置に結合され、第２信号生成装置は、ＤＥＰ電流を生成するように適合され、ＤＥＰ電流は、ＤＥＰ場を生成して、それにより細胞を互いに向けて押しやるために、第２電極の対に印加
される。
【００３０】
この場合、第２電極の対は、融合コンテナの表面上に提供される。
装置は、
ａ）ピペットと、
ｂ）電極と、
ｃ）信号生成装置とによって細胞の融合を制御するように適合されるコントローラをも通常含む。
【００３１】
コントローラは、
ａ）プロセッサがピペットを移動および作動させるように適合される、駆動システムおよび作動装置と、
ｂ）プロセッサが電極を移動させるように適合される、電極駆動システムと、
ｃ）プロセッサが信号生成装置に所定の波形を有する場を生成させるように適合される、信号生成装置との少なくとも１つに結合されるプロセッサを通常含む。
【００３２】
コントローラは、コンテナ内において細胞の位置を検出するように適合された検出器を含む可能性がある。この場合、プロセッサは、検出された細胞の位置に応答して電極およびピペットの少なくとも一方を移動させるように、検出器に応答し得る。
【００３３】
代替として、または追加として、処理システムは、使用者から入力コマンドを受信するための入力を含む可能性がある。
プロセッサは、いくつかの異なる所定の波形を表す波形データを記憶するストアに結合することが可能であり、プロセッサは、使用者から受信した入力コマンドに応答していくつかの所定の波形の１つを選択するように適合される。
【００３４】
プロセッサは、使用者から受信した入力コマンドに応答して電極およびピペットの少なくとも一方を移動させるように適合させることも可能である。
通常、コントローラは、装置に本発明の第１の広範な形態の方法を実施させることによって、細胞を融合させるように適合される。
【００３５】
第３の広範な形態において、本発明は、第１細胞と第２細胞とを融合させる装置を制御するコントローラを提供する。装置は、
ａ）流体充填融合コンテナと、
ｂ）少なくとも２つの電極と、
ｃ）選択装置と、
ｄ）電極に結合された信号生成装置とを含み、
使用時、コントローラは、
ｉ）選択装置に、
（１）それぞれのコンテナに保持された第１細胞の群から第１細胞を選択させ、
（２）それぞれのコンテナに保持された第２細胞の群から第２細胞を選択させ、
（３）懸濁液に保持されている第１細胞および第２細胞を、電極間の融合コンテナにおいて位置決めさせることと、
ｉｉ）融合コンテナにおいて電極を位置決めすることと、
ｉｉｉ）信号生成装置に所定の波形を有する場を電極に印加させ、それにより細胞を融合させることとによって、細胞を融合させるように適合される。
【００３６】
コントローラは、融合コンテナにおいて細胞を位置決めするようにも適合し得る。
この場合、コントローラは、
ａ）第１、第２、および融合コンテナに対してピペットを移動させるように適合される
駆動システムと、
ｂ）ピペットにポートを経て流体を排出または吸引させるように適合される作動装置と、
ｃ）融合コンテナに対して電極を移動させるように適合される電極駆動システムと、
ｄ）信号生成装置との少なくとも１つに結合されたプロセッサを通常含む。
【００３７】
電流の波形は、融合パルスを通常含み、コントローラは、電場パルスを生成して、それにより細胞を融合させるように、信号生成装置に融合パルスを電極に印加させるように適合される。
【００３８】
電流の波形は、ＤＥＰ電流を通常含み、コントローラは、ＤＥＰ場を生成して、それにより細胞を互いに向けて押しやるために、信号生成装置にＤＥＰ電流を電場に印加させるように適合される。
【００３９】
装置は、１対の第２電極を含むことが可能であり、第２電極の対は、第２信号生成装置に結合され、コントローラは、第２信号生成装置にＤＥＰ電流を生成させるように適合され、ＤＥＰ電流は、ＤＥＰ場を生成して、それにより細胞を互いに向けて押しやるために、第２電極に対に印加される。
【００４０】
コントローラは、通常、本発明の第２の広範な形態の装置と共に使用されるように動作するように適合される。
この場合、コントローラは、装置に、本発明の第１の広範な形態の方法を実施させるように適合されることが好ましい。
【００４１】
第４の広範な形態において、本発明は、第１細胞と第２細胞とを融合させる装置を制御するために、コンピュータ・プログラム・プロダクトを提供する。コンピュータ・プログラム・プロダクトは、適切な処理システムによって実行されるとき、処理システムを本発明の第３の広範な形態のコントローラとして動作させるコンピュータ実行可能コードを含む。
【００４２】
第５の広範な形態において、本発明は、粒子を操作するためのピペット・システムを提供する。ピペット・システムは、
ａ）使用時に流体を包含し、ポートを含むノズルと、
ｂ）ポートを経て流体を吸引および／または排出するように適合される、ノズルに結合された作動装置と、
ｃ）ポートに隣接するノズルに結合され、印加される電場を、ポートに隣接して位置決めされた１つまたは複数の粒子に結合することが可能であるように、第２電極と共動するように適合される電極とを含む。
【００４３】
電極は、一般に、導電管から形成される。
電極は、約１０ｍｍの直径を有するステンレス鋼管から形成される可能性がある。
ピペット・システムは、ピペット・システムを流体充填コンテナに対して移動させ、それにより粒子をコンテナの流体において位置決めする、またはコンテナの流体から除去することを可能にするように適合される駆動システムを含むことが可能である。
【００４４】
ピペット・システムは、コンテナにおいて位置決めされた電極と第２電極との間に、所定の電場を生成するための電極に結合された信号生成装置を含むことが可能である。
ピペット・システムは、駆動システム、作動装置、および信号生成装置を制御して、それにより、
ａ）ピペットを使用して、第２電極に隣接してコンテナにおいて粒子を位置決めするこ
とと、
ｂ）コンテナにおいて粒子に隣接してピペット・ポートを位置決めすることと、
ｃ）信号生成装置を稼動させることとによって、電場を粒子に印加するように適合されるコントローラを通常含む。
【００４５】
コントローラは、
ａ）ピペットを使用して、第２電極に隣接してコンテナにおいて第１細胞を位置決めすることと、
ｂ）ピペットを使用して、第１細胞に隣接してコンテナにおいて第２細胞を位置決めすることと、
ｃ）第１細胞および第２細胞がほぼ電極間にあるように、第１細胞および第２細胞に隣接してピペット・ポートを位置決めすることと、
ｄ）所定の場のシーケンスを細胞に印加して、それにより細胞を融合させように、信号再生装置を稼動させることとによって、細胞を融合させるように通常適合される。
【００４６】
ピペット・システムは、
ａ）放射源と、
ｂ）放射源に結合された第１端部と、ポートに隣接するノズルに結合された第２端部とを有し、それにより、放射源からの放射が、使用時にポートに隣接して位置決めされた粒子に当たることが可能になる導波路とをさらに一般に含む。
【００４７】
ピペット・システムは、粒子によって放出される放射を検出するように適合された検出器を含むことが可能である。
検出器は、導波路の第１端部に結合することが可能であり、それにより粒子から放出された放射を検出する。
【００４８】
放射は、通常、レーザであるが、ＬＥＤなどの他の源が使用される可能性がある。
導波路は、光ファイバ・ケーブルとすることが可能であり、または代替として、ノズルから形成することが可能である。ノズルは、放射源からの放射がノズルに入り、ノズルの少なくとも一部に沿って通過することを可能にするように成形された部分を含み、放射は、ポートを経てノズルから放出される。
【００４９】
ピペット・システムは、
ａ）作動装置を稼動させ、それによりポートを経て流体を吸引および／または排出させることと、
ｂ）放射源を稼動させ、それにより粒子を放射に暴露させることとの少なくとも一方を実施するように適合されるコントローラを一般に含む。
【００５０】
駆動システムは、コントローラに結合することが可能であり、コントローラは、
ａ）ポートが粒子に隣接するように、ピペット・システムを位置決めすることと、
ｂ）放射源を稼動させ、それにより粒子を放射に暴露させることと、
ｃ）粒子によって放出されるあらゆる放射を検出することと、
ｄ）検出された放射に従って、粒子が所定の特性を有するかを判定することと、
ｅ）成功した比較に従って、作動装置を稼動させ、それによりポートを経て流体をノズル内に吸引し、それにより粒子を回収することとによって、コンテナから所定の特性を有する粒子を回収するように適合される。
【００５１】
作動装置は、
ａ）流体リザーバと、
ｂ）ノズルを流体リザーバに結合する柔軟管と、
ｃ）管を部分的に圧縮するように位置決めされたアームと、
ｄ）ｉ）管をさらに圧縮して、それにより流体をポートから排出することと、
ｉｉ）管を減圧して、それによりポートを経て流体を吸引することとの少なくとも１つを実施するために、アームを移動させるように適合される作動装置駆動システムとを含むことが可能である。
【００５２】
作動装置駆動装置は、
ａ）管に対してアームを移動させるための第１作動装置ドライブと、
ｂ）使用時に管と接触するアーム端部部分から形成され、アーム端部部分を伸張または収縮させるように適合される第２作動装置ドライブとを一般に含む。
【００５３】
ピペット・システムは、作動装置駆動システムに結合されたコントローラを通常含み、コントローラは、作動装置駆動システムを動作させ、それによりポートを経て流体を吸引または排出するように適合される。
【００５４】
駆動システムは、コントローラに結合することが可能であり、コントローラは、
ａ）ポートが粒子に隣接するように、ピペット・システムを位置決めすることと、
ｂ）作動装置駆動システムを稼動させ、それによりポートを経てノズル内に流体を吸引して、それにより粒子を回収することとによって、流体から粒子を回収するように適合される。
【００５５】
管は、シリコン管材料から形成し得る。
本発明の例について、添付の図面を参照してここで記述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明の実施に適切な装置の例について、図１、２、および３を参照してここで記述する。
図１に示すように、装置は、撮像システム１１、制御システム１２、および信号生成装置１３に結合された処理システム１０を含む。制御システム１２は、図示するように、ピペット・システム１４および電極システム１５に結合される。
【００５７】
処理システム１０は、バス２６を介して共に結合された、プロセッサ２０、メモリ２１、入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイス２２、画像インターフェース２３、制御インターフェース２４、および信号インターフェース２５を含む。したがって、処理システムは、適切にプログラムされたコンピュータ、専用ハードウェアなど、いくつかのシステムのいずれか１つである可能性がある。あらゆる事象において、Ｉ／Ｏデバイスは、コンピュータ・モニタなどのディスプレイ、キーボード、およびマウス、ジョイスティック、トラックボールなどの１つまたは複数の他の入力デバイスを通常含む。
【００５８】
撮像システム１１は、顕微鏡３１に結合されるＣＣＤカメラなどのカメラ３０を含む。撮像システム１１は、画像インターフェース２３を介して処理システムに接続される。
ピペット・システム１４は、駆動システム３２を介して制御システム１２に結合される、３３において全体的に示すピペットを含む。使用時、制御システム１２は、制御インターフェース２４を介してプロセッサに結合され、それにより、以下でより詳細に記述するように、駆動システム３２を使用して、ピペットの運動および動作を制御することが可能になる。
【００５９】
同様に、電極システム１５は、駆動システム３４を介して制御システム１２に結合された２つの電極３５から形成される。再び、以下でより詳細に記述するように、制御システム１２により、駆動システム３４は、電極の位置を制御することが可能になる。
【００６０】
使用時、システムにより、使用者が、ピペット・システム１４を使用して個々の細胞を選択し、移動させることが可能になる。適切な細胞が互いに並んで配置されるとき、これにより、電極３５を使用して電場を細胞に印加して、それにより細胞を融合させることが可能になる。
【００６１】
これを達成するために、装置は、ピペット３３および電極３５が、４０において全体的に示す井戸アレイに対して移動することが可能であるように、図２に概略的に示すように構成される。これにより、図示するように、細胞が、井戸４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８の間を移動することが可能になる。
【００６２】
ピペットおよび電極３５の移動は、対応する駆動システム３２、３４の動作によって達成される。したがって、処理システム１０を使用して、ピペット３３および電極３５の位置決めを制御することが可能であり、これにより、ピペット３３および電極３５を井戸４１、．．．、４８のそれぞれの１つの中に挿入して、その内部において位置決めすることが可能になる。
【００６３】
さらに、顕微鏡３１は、Ｉ／Ｏデバイス２２を使用して、選択された井戸の内容物の表示を使用者に対して表示し得るように、選択された井戸４１、．．．、４８を撮像するように構成される。
【００６４】
一般に、処理システム１０は、Ｉ／Ｏデバイス２２を介して使用者から受信した入力コマンドに従って、ピペット３３および電極３５を制御するように適合される。これを達成するために、処理システム１０は、
・井戸アレイ４０の画像を使用者に対してＩ／Ｏデバイス２２に提示する
・ピペット・システム１４を移動させ、必要であれば作動させるために、Ｉ／Ｏデバイス２２を介してコマンド入力に応答する
・電極３５を移動させるために、Ｉ／Ｏデバイス２２を介してコマンド入力に応答する
・電気信号を電力信号３５に印加するために、Ｉ／Ｏデバイス２２を介してコマンド入力に応答する
などのいくつかの機能を同時に実施することが可能でなければならない。
【００６５】
これは、メモリ２１に記憶されている適切なアプリケーション・ソフトウェアをプロセッサ２０に実行させることによって達成される。
ピペットを図３においてより詳細に示す。図示するように、ピペット３３は、室を画定するハウジング５０から形成され、室は、図示するように、圧電要素５２によって２つの部分５１Ａ、５１Ｂに分割される。室５１Ｂは、ポート５３によって柔軟管５４に結合される。柔軟管５４は、図示するように、開口５８を有する成形ガラス・ノズル５７の上において位置決めされた雌結合５６と共動するように適合される雄結合５５を含む。
【００６６】
使用時、室５１Ｂ、ポート５３、柔軟管５４、およびガラス・ノズル５７は、流体で充填され、室５１Ａは、空気で充填されて、封止される。リード５９を介して電流を圧電要素５２に印加することにより、要素が移動し、移動の方向は、印加電流の極性に依存する。
【００６７】
したがって、使用時、開口５８が井戸４１、．．．、４８の１つの流体において位置決めされた状態で、圧電要素５２を矢印６０の方向に移動させることにより、室５１Ｂの容積が増大し、それにより、流体が開口５９を経て吸引される。同様に、圧電要素５２を矢印６１の方向に移動させることにより、室５１Ｂの容積が減少し、それにより、流体が開口５８を経て排出される。
【００６８】
したがって、ピペットは、リード５６に印加される電流の極性に応じて、開口５８を経て流体を吸引または排出するように稼動し得る。したがって、使用時、リード５６は、必要に応じてピペットを稼動させるのに適切な電流が可能になるように、駆動システム３２、または別の稼動システムに結合される。
【００６９】
細胞を融合させるために装置が使用される方式について、ここで記述する。
概観
本発明による細胞を融合させる方法の概観について、ここで図４を参照して記述する。
【００７０】
具体的には、工程１００において、使用者は、融合される細胞を選択する。工程１１０において、細胞は、融合井戸に配置される。
工程１２０において、細胞を融合させるために、所定の電場が、選択された細胞に印加される。
【００７１】
電場に配置された細胞は、細胞のごく近傍の電場を歪ませる。場の歪みは、粒子の幾何学的形状ならびに電気特性、および回りの粒子の幾何学的形状ならびに電気特性に依存する。生細胞は、ポタシウム（Ｋ＋）イオンなどのイオンの蓄積および比較的大きい誘電率のために、非常に導電性である内部（細胞質）を有する。膜の周囲は、非常に小さい導電率およびより小さい誘電率を有する。
【００７２】
したがって、細胞の内側および外側の両方における場の歪みの程度は、印加された電場の周波数の非常に強い関数である。その結果、不均一な電場に配置されたとき、細胞は、印加された場の周波数に関して大きさおよび方向が複雑に変化する力を受ける。この効果は、適切な電極を介して創出される無線周波数交流電場を使用して、生細胞を選択的に操作するために使用し得る。ＡＣ電場における粒子の運動は、「誘電泳動」（ＤＥＰ）と呼ばれ、粒子上のあらゆる正味の電荷とは無関係である。
【００７３】
通常１０〜１０，０００ｋＨｚの範囲にある無線周波数電場の印加は、２つの細胞に対して正のＤＥＰ力を及ぼし、細胞を互いに密接に接触するように押しやる。したがって、接触点において各細胞膜の電気的破壊を誘起するために、より強い電場が使用される。この被制御エレクトロポレーションは、可逆有糸分裂にいくらか類似した細胞融合の工程をトリガする。これにより、融合された２つの元の細胞の組合せである遺伝子組成を有する融合ハイブリッド細胞が創出される。
【００７４】
次いで工程１３０において、融合細胞は、一般に回収井戸に配置され、その後工程１４０において、細胞が融合したことを確認するために、所定の時間期間後に検査される。
次いで、１５０において融合細胞を収集して、必要に応じて使用し得る
詳細な記述
本発明の装置を使用する方法の詳細な例について、図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、および５Ｄを参照してここで記述する。
【００７５】
この例では、井戸アレイ４０は、標的井戸４１、パートナ井戸４２、洗浄井戸４３、融合井戸４４、回収井戸４５、およびハイブリッド井戸４６を含む。この目的について、以下でより詳細に記述する。
【００７６】
工程２００において、目的の細胞およびパートナ細胞は、それぞれ、標的井戸およびパートナ井戸に配置される。この手続きは、いくつかの方式で達成される可能性がある、細胞の適切な準備を一般に含む。したがって、たとえば、これは、細胞がサンプル・プレートから回収されて、適切な酵素液において洗浄されることを必要とする可能性がある。
【００７７】
次いで、井戸アレイは滅菌され、その後、流体が、使用される井戸内に装入される。次いで、目的の細胞およびパートナ細胞は、それぞれ、標的井戸４１およびパートナ井戸４２に配置され、細胞は、それぞれの酵素溶液の懸濁液において保持される。
【００７８】
工程２１０において、使用者は、ピペット３３を使用して標的井戸４１から目的の細胞を選択する。これを達成するために、使用者は、標的井戸４１が撮像システムによって撮像されるように、井戸アレイ４０を構成する。したがって、標的井戸４１は、カメラ３０が画像信号を生成して、これを画像インターフェース２３に移送することが可能であるように、顕微鏡３１の下に配置される。次いで、画像信号は、一般に、画像インターフェース２３においてある事前処理を受け、その後、あらゆるその後の他の処理のために、プロセッサ２０に移送される。
【００７９】
したがって、たとえば、画像インターフェース２３は、入り画像信号から画像を捕獲するために使用される画像捕獲カードから形成される可能性がある。次いで、捕獲画像は、プロセッサ２０によってフォーマットされ、その後、Ｉ／Ｏデバイス２２を使用して使用者に呈示される。
【００８０】
使用者は、適切な目的の細胞が示されるまで、顕微鏡３１と井戸アレイとの相対位置を調節する。次いで、使用者は、処理システム１０を使用して、ピペット３３の位置を制御する。具体的には、これは、ジョイスティックＩ／Ｏデバイス２２を有することによって通常達成され、プロセッサ２０は、ジョイスティックからの信号に応答して、制御インターフェース２１を介して制御システム１２に伝達されるコマンドを生成する。制御システムは、適切なステッパまたはＤＣサーボ・モータなどの駆動システム３２に結合される運動制御対処増幅器から通常形成される。
【００８１】
適切な感度制御を使用することによって、これにより、ピペットの位置を高精度に制御することが可能になる。ピペットがディスプレイに呈示された画像に示されるように、顕微鏡を構成することによって、これにより、使用者は、ピペット開口５８が選択された細胞に隣接するようにピペット３３を位置決めすることが可能になる。
【００８２】
この時点で、使用者は、開口５８を経て流体を吸引するように、ピペット３３を稼動させる。細胞および周囲の流体は、ピペット内に吸引され、目的の細胞を標的井戸４１から除去することが可能になる。
【００８３】
井戸内において個々のセルを分離することが困難であることがある。これは、ピペットに、ピペット開口５８を介して流体を繰り返して吸引および排出させるように、ピペットを繰り返して動作させることによって克服し得る。流体媒体の攪拌と、ピペット開口５８を経た細胞の反復運動とにより、細胞を周囲の細胞から分離することが通常可能になる。
【００８４】
この例を、流体がピペット開口５８から排出される際の流体力学的流線７０を示す図６Ａに示す。図示するように、一定の力の線を表す流体力学的流線は、ピペット開口５８から外向きに広がる。同様に、７１、７２において示す細胞は、流体流において飛沫同伴されるので、これは、細胞７１、７２がピペット開口５８から排出される際に、細胞を分離させる傾向がある。
【００８５】
あらゆる事象において、使用者が工程２１０において目的の細胞を選択した後、使用者は、洗浄井戸４３の融合媒体において目的の細胞を洗浄する。これを実施するために、それぞれの細胞を包含するピペットは、上述したように撮像システム１１および制御システム１２を使用してピペット３３を移動させるために、洗浄井戸４３において位置決めされ
る。ピペット３３が洗浄井戸４３内において位置決めされた後、ピペットは、ピペット開口５８を介して流体を吸引および排出するように、繰り返して稼動される。このようにして、細胞は、繰り返して洗浄井戸４３の融合媒体に配置され、次いで除去される。この行為により、細胞は洗浄される。
【００８６】
さらに、工程２３０において、使用者が目的の細胞を融合井戸４４に移送するとき、これは、洗浄井戸４３においてピペット３３を位置決めして、ピペット開口５８を経て目的の細胞をピペット３３に吸引することによって達成される。したがって、この時点で、目的の細胞は、標的井戸４１に包含される媒体とは対照的に、融合媒体において囲まれている。
【００８７】
次いで、工程２３０において、使用者は、ピペット３３を使用して、目的の細胞を融合井戸４４内に配置する。工程２１０から２３０は、パートナ細胞について繰り返され、パートナ細胞は、工程２３０において、目的の細胞に並ぶ融合井戸４４に配置される。
【００８８】
各細胞について別々に工程２１０から２３０を実施する代替として、目的の細胞およびパートナ細胞は、それぞれの井戸から選択され、次いで、洗浄井戸４３において共に洗浄されて、融合井戸４４に同時に移送されることが可能である。
【００８９】
以下でより詳細に記述するように、細胞７１、７２を互いに対して隣接して位置決めすることが好ましい。これを達成するために、まず、目的の細胞またはパートナ細胞７１を融合井戸４４に配置し、次いで、それに隣接して、他のパートナ細胞または目的の細胞７２を配置することが好ましい。
【００９０】
一般に、第２細胞７２を追加することにより、流体が流体井戸４４内に移送される際ので、これにより、第１細胞７１も運動する。したがって、両方の細胞をピペットに同時に吸引し得るまで、ピペットを繰り返して稼動させることが必要である。図６Ｂに示すように、細胞７１、７２がピペット開口内に同時に吸引されるとき、力の流体力学的流線７０は、流体が開口５８に入る際に収束する。したがって、これにより、細胞７１、７２は共に吸引される。次いで、細胞をピペット３３から排出することが可能であり、細胞は、実施される融合工程のために十分密接している。
【００９１】
あらゆる事象において、工程２３０において、使用者が、融合井戸において目的の細胞およびパートナ細胞を位置決めした後、工程２４０において、使用者は、電極３５を融合細胞４４に配置するように構成する。再び、これを達成するために、撮像システム１１は、Ｉ／Ｏデバイス２２が使用者に融合細胞４４の画像を提示するように位置決めされる。
【００９２】
次いで、使用者は、Ｉ／Ｏデバイス２２を介して適切なコマンドを提供することによって、電極３５の位置を変更し得る。再び、これは、それぞれのジョイスティックなどに制御信号をプロセッサ２０に提供させることによって、通常達成される。次いで、プロセッサは、制御インターフェース２４を介して適切なコマンド信号を制御システム１２に伝達する。次いで、制御システムは、駆動システム３４を稼動させ、それにより、電極３５は、使用者によって指示されたように移動する。
【００９３】
この段階における電極３５、細胞７１、７２、およびピペット３３の相対位置決めの例を、融合が実施される前の融合井戸の透視図および端面図を示す図６Ｃおよび６Ｄに示す。したがって、図示するように、細胞７１、７２は、電極３５のほぼ間において、互いに近接して位置決めされる。この段階において、細胞は、以下においてより詳細に記述するように、あらゆる事象において、印加された電場によって共に押しやられるので、接触している必要はない。
【００９４】
図５Ｂに示したように、次の工程は、工程２６０において、使用者が、細胞に印加される電場のシーケンスを決定することであり、その後、工程２７０において、処理システム１０および信号生成装置１３を使用して、決定されたパルス・シーケンスを生成する。
【００９５】
使用者が電場を決定する方式は、本発明の特定の実施態様に応じて異なる。これが達成される可能性がある第１例を、工程２８０、２９０において示す。この場合、処理システム１０は、所定の電場をパートナ細胞および目的の細胞に印加する。次いで、電場における細胞の応答を使用して、ＤＥＰ電場に使用される電気パラメータを決定する（細胞を１つにするために）。応答は、細胞の任意の特定の対を融合させるために必要な融合パルス・シーケンス（周波数および振幅を含む）を決定するためにも使用し得る。具体的には、処理システム１０は、所定の周波数を有する場を印加する。次いで、細胞を互いに向けて移動させるように細胞を引き付ける力が、必要な条件について最適である最適周波数が決定されるまで、周波数を微調整し得る。ＤＥＰ電場に対する細胞のこの応答は、上述したように、細胞内における電気双極子の生成により生じる。
【００９６】
電場に対する細胞の応答は、プロセッサ２０に適切な画像認識ソフトウェアを実行させることによって自動的に、または使用者によって手動で、監視し得る。次いで、プロセッサは、メモリ３２に記憶されているいくつかのパルス・シーケンスから１つのパルス・シーケンスを選択する。事前にプログラムされたパルス・シーケンスは、所望の応答を得るために印加される場に従って、ルック・アップ表（ＬＵＴ）などに記憶されている。この情報は、初めに決定することが必要である可能性があることが理解されるであろう。したがって、新しい系統の目的の細胞およびパートナ細胞の組合せが融合されるたびに、これを首尾よく達成するために使用されるパルス・シーケンスが、所望の応答が観測された融合パラメータの完全セットに関する情報と共に、ＬＵＴおよびメモリ２１に記憶される。次いで、プロセッサ２０は、応答の指示を使用して、ＬＵＴからパルス・シーケンスを選択し得る。
【００９７】
代替として、事前にプログラムされたパルス・シーケンスは、目的の細胞とパートナ細胞との組合せの各特定のタイプに従って、ＬＵＴに記憶し得る。再び、この情報は、初めに決定することが必要である。しかし、新しい目的の細胞とパートナ細胞との組合せが融合されるたびに、パルス・シーケンスを記憶することによって、これにより、プロセッサ２０は、工程３００において使用者によって提供された細胞のタイプに従って、工程３１０において、パルス・シーケンスを選択することが可能になる。
【００９８】
あらゆる事象において、細胞に印加された電気パルス・シーケンスにより、工程３２０において、細胞はＤＥＰによって細胞を融合される。
工程３３０において、細胞が融合井戸４４に依然としてある間、使用者は、細胞が融合して融合細胞を創出したかを判定するために、細胞の形態および電気的振舞いの両方を調査する。形態および電気的振舞いが、融合にとって好都合であることが明らかである場合、工程３６０において、融合物は、ピペット３３を使用して回収井戸４５に移送される。細胞融合の初期段階は、数分のみ行われ、通常はほとんどのタイプの細胞について１０分以下であり、したがって、使用者は、単にＩ／Ｏデバイス２２上で細胞を見て、これから、融合工程が成功したかを判定し得る。工程３４０において、細胞が融合していないと判定される場合、使用者は、工程３５０において、ピペット３３で未融合細胞を単に廃棄して、工程２１０において新しい細胞を選択するために戻る。
【００９９】
回収井戸４５に配置された後、融合細胞は約４５分間放置され、その後、工程３７０において再び検査される。この時間中、細胞は、細胞の成長を促進するように、適切な培養媒体の懸濁液において保持される。工程３８０において、融合細胞が完全には融合してい
ないと判定される場合、工程３９０において、使用者は、ピペット３３を使用して未融合細胞を廃棄し、工程２１０において新しい細胞を選択する。
【０１００】
そうでない場合、工程４００において、使用者は、ピペット３３を使用して、融合細胞をそれぞれのハイブリッド井戸４６に移送する。工程４１０において、融合細胞は、ハイブリッド井戸において培養され、細胞は、融合が成功であるかを判定するために、工程４２０において、培養工程後および培養工程中監視される。
【０１０１】
パルス・シーケンス
上記で簡単に記述したように、２つの細胞の融合を制御するために、様々なパルス・シーケンスが使用される可能性がある。様々なパルス・シーケンスの生成は、メモリ２１に記憶されている所定のパルス・シーケンスに従って、プロセッサ２０に信号生成装置１３を制御させることによって達成される。パルス・シーケンスは、上記で概述したように、ＬＵＴデータ・アレイおよび関連するパラメータに一般に記憶され、または、融合点において適切な式およびデータ・アレイを使用して計算される。プロセッサ２０は、メモリ２１に記憶されている必要なパラメータなどを取り出して、この情報を信号インターフェース２５に伝達する。
【０１０２】
この例では、信号インターフェース２５は、決定されたパラメータを使用して所望のパルス・シーケンスを確定する、任意の信号生成装置などの形態にある。したがって、信号生成装置は、パルス・シーケンスを表す信号を生成して、これを高周波数信号増幅器に移送し、これにより、所望のパルス・シーケンスが必要に応じて電極に移送することが可能になる。
【０１０３】
他の形態のパルス・シーケンスの生成を使用することも可能であることが理解されるであろう。
あらゆる事象において、細胞を融合させるために使用される可能性がある様々な電気パルス・シーケンスの例について、ここで記述する。これらの例のそれぞれにおいて、関数は、時間領域ｔにおいて確定される。
【０１０４】
基本的なパルス・シーケンス・プロファイルは、式に関して確定することが可能である。
【０１０５】
【数１】
2005534296.tif 000003
上式で、Ａは定数、
Ｂは定数（およびＡに等しい可能性がある）
Ｃ（ｔ）はパルスを記述する関数
Ｃ（ｔ）は、以下の関数の１つに通常基づくが、これは本質的ではないことが理解されるであろう。
【０１０６】
【数２】
2005534296.tif 000004
上式で、Ｋ、Ｑ、α、およびζは、定数である。
基本的なパルス・シーケンスは、複雑なシーケンスを創出するために、組み合わせて、オーバーレイすることが可能である。このいくつかの例を以下に列挙し、かつ図７Ａから７Ｇに示す。
【０１０７】
図７Ａは、正弦波によって分離された２つの単極方形パルスからなる基本的なＤＣ融合パルス・シーケンスの第１例を示す。これらのパルス・シーケンスの生成を管理するために使用される式は、以下の通りである。
【０１０８】
【数３】
2005534296.tif 000005
図７Ｂは、正弦波によって分離された双極方形パルスからなる基本的なＤＣ融合パルス・シーケンスの第２例を示す。これらのパルス・シーケンスの生成を管理するために使用される式は、以下の通りである。
【０１０９】
【数４】
2005534296.tif 000006
図７Ｃは、正弦波によって分離された振幅が増大し、かつ周波数が異なる正弦波（異なる周波数の）からなる基本的なＡＣ融合パルスの第３例を示す。これらのパルス・シーケンスの生成を管理するために使用される式は、以下の通りである。
【０１１０】
【数５】
2005534296.tif 000007
図７Ｄは、正弦波によって分離された基本的なＤＣおよび指数関数パルスの第４例を示
す。これらのパルス・シーケンスの生成を管理するために使用される式は、以下の通りである。
【０１１１】
【数６】
2005534296.tif 000008
図７Ｅは、正弦波によって分離された基本的なＤＣおよび指数関数パルスの第５例を示す。これらのパルス・シーケンスの生成を管理するために使用される式は、以下の通りである。
【０１１２】
【数７】
2005534296.tif 000009
図７Ｆは、線形曲線でたたみ込まれた基本的なＤＣパルス・シーケンスの第６例を示す。これらのパルス・シーケンスの生成を管理するために使用される式は、以下の通りである。
【０１１３】
【数８】
2005534296.tif 000010
注意、余分なＤＣパルスが、明瞭化のために図７Ｆに示されている。
図７Ｇは、指数関数的崩壊曲線でたたみ込まれた基本的なＤＣパルスの第７例を示す。これらのパルス・シーケンスの生成を管理するために使用される式は、以下の通りである。
【０１１４】
【数９】
2005534296.tif 000011
注意、余分なＤＣパルスが、明瞭化のために図７Ｇに示されている。
特有の例
図１の装置を使用して人−人ハイブリドーマを生成する概要について、ここで記述する。全体的に、説明は、以下の工程の段階を中心とする。
【０１１５】
・融合のための細胞の準備
・融合のための装置の設定
・融合のために準備された細胞の操作
・ハイブリッド融合物を得るための細胞の選択対の電気融合
融合のための細胞の準備
抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、以下のプロトコルに従って準備された。軟膜が、オーストラリア赤十字血液銀行（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）［オーストラリア・ニュー・サウス・ウェールズ州シドニー（Ｓｙｄｎｅｙ）在］から、健康なドナー（ＨＩＶ、Ｂ型肝炎（Ｈｅｐ−Ｂ）、Ｃ型肝炎（Ｈｅｂ−Ｃ）、ＨＴＬＶ−Ｉ、および梅毒について血清反応陰性）から得られる。ＰＢＭＣが、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（アマーシャム・ファーマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１７−１４４０−０３）に対する密度遠心分離によって隔離される。次いで、Ｂ細胞が、融合のために隔離される。未利用Ｂ細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、骨髄細胞、好塩基細胞、血小板、早期赤血球系細胞の磁気欠乏によって、ＭＡＣＳ  Ｂ細胞隔離キット（ミルテニュ・バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏＴｅｃ）、４６９−０１）でＰＢＭＣから隔離される。Ｆ４で表される人骨髄腫細胞線が、不死パートナ細胞として使用された。
【０１１６】
融合のための装置の設定
２０ｍｌのシリンジ（＃１）に、培養器において温められた（３７Ｃにおいて３０分）ＲＰＭＩ媒体（＃２）が装填された。シリンジを使用して、温められたＲＰＭＩ液の大きな液滴が、ペトリ皿（＃３）の中心に付着された。次いで、この皿は、ピペットより下に位置するように、倒立顕微鏡（ニコンＴＥ２０００）の上に配置された。ピペットは、まず、７０％アルコール／水溶液の繰返し洗浄で滅菌された。次いで、ピペットは、先端がＲＰＭＩの液適に浸るように降下された。シリコン管（＃４）の全長の一端（適切なコネクタ（＃５）を有する）が、第２シリンジに添付され、他端がピペットに添付された。次いで、シリンジを使用して、ＲＰＭＩが管を通ってピペット内に吸引された。気泡が、管に沿って、またはピペットにおいて、あらゆる箇所において形成されないことを保証するために、慎重に行われた。ＲＰＭＩ充填シリンジを使用して、圧電作動装置が完全に充填され、正のメニスカスがノズルの上に形成されるまで、流体が、圧電作動装置のノズル内に注入された。次いで、第２シリンジは、シリコン管から徐々に分離された。ＲＰＭＩで充填された第１シリンジを使用して、正のメニスカスがコネクタの口の上にできるまで、シリコン管の未結合端部は、流体を上に乗せられた。次いで、管は、圧電ノズル５４に結合された。
【０１１７】
各ピペット・ノズル５４が、毛細管（１２０μｍの内径）（＃７）から引き延ばされる。
次いで、電極３５は、〜４００〜５００μｍ離れて配置されるまで、計数線を使用して位置合わせされた。
【０１１８】
次いで、以前に準備されたパートナ細胞が、９６井戸プレート（＃６）の単一の井戸に移送され、リンパ球が、同じプレートの別の井戸に付着された。
次いで、ピペットは、パートナ細胞を包含する井戸に挿入され、適切なパートナ細胞が選択された。次いで、この（単一）細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％胎児仔牛血清を包含する新鮮井戸に移送された。次いで、ピペットは、標的抗原に特有の以前に格納されたＢリンパ球を包含する井戸に挿入された。次いで、融合に適切なＢリンパ球が選択された。以前の井戸に戻り、リンパ球細胞は、パートナ細胞と並んで、ピペットから排出された。次いで、両細胞とも、融合に適切であるかについて視角的に検査された。
【０１１９】
融合前の細胞の操作
次いで、ピペットを使用して、両細胞を、適切なｐＨおよび浸透圧の１％プロナーゼとソルビトール溶液との酵素溶液を包含する井戸に移送した。細胞は、この媒体に５分間浸漬され、その後、細胞が環境の変化に順応することを可能にするために、ピペット開口５８を経て徐々に吸入して、排出することによって、融合媒体（一般に、適切なｐＨおよび浸透圧のソルビトール溶液から形成される）において「洗浄」された。細胞が浸透圧の変化に適応した後、ピペットを使用して、細胞が互いに５〜１０μｍの範囲内にあるように、細胞を流体力学的に構成した。次いで、ピペットは、井戸から除去された。
【０１２０】
電極３５が、井戸に挿入され、以前に構成された細胞が電極間において中心にあり、かつ同一線上にあるように構成された。各電極は、カルフォルニアン・ファイン・ワイヤ・カンパニー（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｎ  Ｆｉｎｅ  Ｗｉｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）［米国カルフォルニア州在］によって製造された１８０μｍの直径のニッケル合金ワイヤから構築される。電極の構成、形状、および細胞への近さは、細胞間においてＤＥＰを誘起するために、適切な電場パターンを生成し得るように、特別に設計される。
【０１２１】
電極は、増幅器を経て任意の信号生成装置に接続され、使用者によって以前に確定された様々な波形に合致する一連の電圧が印加された。電極に印加された第１波形は、正弦波であり、５００キロヘルツの周波数、および増幅器の後でピーク間が約６Ｖの振幅を有していた。中性粒子が交流不均一電場の存在のために分極する誘電泳動として知られる現象により、細胞は、細胞が合体する引力を受けた。
【０１２２】
次いで、場の振幅は、良好な膜接触が細胞間で行われることを保証するために、５秒間、１５Ｖのピーク間に増大された。この増大された場において、細胞は上部電極に向かってわずかにドリフトし、これを相殺するために、顕微鏡のステージは、電極間における細胞の位置を訂正し、かつ保持するために、電極に対して調節された。
【０１２３】
ハイブリッド融合を得るための細胞の選択対の電気融合
細胞が適切に構成された後、融合パルス・シーケンスに合致する場のパターンが印加された。この事例では、融合パルス・シーケンスは、２つのパルス列からなり、各列は、それぞれが８０μｓの持続時間である、振幅が９０Ｖの２つのＤＣパルスからなった（約１８０ｋＶの電場をもたらす）。パルスは、１００μｓの持続時間だけ分離され、各列は、５００ミリ秒だけ分離され、この間の介在時間において、ＤＥＰ場が、細胞を良好に接触させて維持するために印加された。融合パルス・シーケンスの後、細胞が融合している間、細胞間の良好な接触を維持するために、増大されたＤＥＰ場が印加された。
【０１２４】
成長媒体への細胞の回収
電極３５が、融合井戸から収縮され、ピペット３３が、新しく創出された細胞がピペット開口５８の近傍にあるように、装入されて、操作された。次いで、細胞が、ピペット内に吸引され、ピペットは、井戸から収縮された。このようにして、細胞は、ハイブリドーマ媒体媒体（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ）を包含する新鮮井戸に移送された。新しい融合細胞は、この媒体に存在する唯一の細胞であった。
【０１２５】
自動化
上記の記述は、装置の手動使用を中心としており、細胞、電極、およびピペットの位置決めは、使用者によって入力されたコマンドに従って制御される。
【０１２６】
しかし、代替として、処理システム１０は、装置を自動的に制御するように適合し得る。これを達成するために、プロセッサ２０は、メモリ２１に記憶されている画像認識アプリケーション・ソフトウェアを実行する。これにより、処理システムは、撮像システム１
１から受信した画像を使用して、井戸４１、．．．、４８内の細胞の位置を決定し、ならびに、電極３３およびピペット３３の位置を決定することが可能になる。
【０１２７】
このことから、プロセッサ２０は、上記で概述した手続きを自動的に実施するようにプログラムされることが理解されるであろう。したがって、処理システムは、画像の細胞の外見に従って、目的の細胞およびパートナ細胞を自動的に選択するように適合される。次いで、細胞は、融合を実施することが可能であるように、融合井戸４４に配置される。再び、この工程中、プロセッサ２０は、細胞および電極の位置を制御する。
【０１２８】
次いで、プロセッサは、細胞に印加されるパルス・シーケンスを決定して、電極３５を介してパルス・シーケンスを印加する。これが完了した後、プロセッサ２０は、融合工程が成功であるかを判定するために、細胞を監視し得る。
【０１２９】
これは、「Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ」という名称の我々の同時係属出願に記載された装置を使用して達成される可能性があることが有利である。
修正
実験は、７０の融合細胞のうち実際には１つ程度に少ない細胞が、有糸分裂に必要ない電子を保持し、これらの安定な細胞線のうち、はるかにより小さい割合が、当該のたんぱく質を分泌することになることを示した。したがって、単一細胞融合の利点と、融合細胞の高いスループットとを組み合わせた装置を有することが所望される。上述した装置のスループットを向上させる技法を提供する装置の例について、ここで記述する。
【０１３０】
細胞を融合させるのに適切な装置の第２例について、図８Ａおよび８Ｂを参照してここで記述する。
具体的には、装置は、図１から３に関して上述した装置とほぼ同じである。しかし、この例では、装置は、内部に組み込まれた電極を有する修正された井戸アレイ４０を含む。したがって、電極３５は、必要ではなく、電極システム１５が、以下でより詳細に記述するように、井戸アレイ内において電極を使用する。
【０１３１】
修正井戸アレイの例を図８Ａに示す。図示するように、井戸アレイ８０は、融合井戸８１を含む。融合井戸８１の内部には、電極８２Ａ、８２Ｂ、８３Ａ、８３Ｂ、８４Ａ、８４Ｂ、８５、８５Ｂのいくつかの対が取り付けられている。この例では４対の電極のみが示されているが、適切なサイズの融合井戸が提供される場合、より多数の電極が使用される可能性があることが理解されるであろう。
【０１３２】
電極は、図８Ｂに示すように、下面８６の上に〜２μｍの厚さにめっきされた金から通常形成される。井戸アレイは、図示するように、１つまたは複数の回収井戸８７、８８を備える可能性もある。
【０１３３】
使用時、所定のパルス・シーケンスが、図示した電極対８２、８３、８４、８５を使用して、融合される細胞７１、７２に印加される可能性がある。
使用時、使用者は、上述したように、融合される細胞７１、７２を選択し、ピペットを使用して電極８２のそれぞれの対間において細胞を位置決めする。細胞７１、７２が電極８２間において位置決めされた後、上述した方式で細胞を融合させるために、所定のパルス・シーケンスが、電極に印加される可能性がある。
【０１３４】
このことから、点線によって示すように、４対の細胞が、融合井戸８１において随時位置決めされる可能性があることが理解されるであろう。４対の細胞を同時に融合させることが可能であるが、電極８２、８３、８４、８５の各対において生成された場のシーケンスが干渉する可能性がある。したがって、いくつかの場合、細胞の各対を順次融合させる
ことが好ましい。
【０１３５】
これを達成するために、処理システム１０は、第１所定パルス・シーケンスを電極８２に印加し、これに電極８３への第２所定パルス・シーケンスが続くなどと適合し得る。したがって、異なる細胞が同じ回収井戸において融合することを可能にするために、異なる場のシーケンスが電極の異なる対に印加される可能性があることが理解されるであろう。
【０１３６】
細胞を融合させる装置の第３例について、図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃを参照してここで記述する。具体的には、図９Ａは、電極９１Ａ、９１Ｂの第１対、および電極９２Ａ、９２Ｂの第２対を有する融合井戸９０を示す。使用時、電極９１は、第１信号生成装置９３に結合され、電極９２Ａ、９２Ｂは、第２の９４に結合される。この場合、第１信号生成装置および第２信号生成装置は、図１に示した単一の信号生成装置１３と置き換わり、したがって、信号生成装置９３、９４は、適切なインターフェース２５を介して処理システム１０に結合され、これにより、その動作を制御することが可能になる。
【０１３７】
この例では、電極９２Ａ、９２Ｂを使用して、融合井戸９０内の適切な位置において提供される細胞の双極子を誘起するように適合されるＤＥＰ場を生成する。これを使用して、細胞を電極９２Ａ、９２Ｂの選択された１つに引き付け、それにより細胞を融合井戸内において適切に位置決めすることが可能になる。
【０１３８】
したがって、使用時、ＡＣ信号生成装置９４は、ＤＥＰ場を生成するように稼動される。次いで、上述した方式と同様の方式で、細胞９５を融合井戸９０に装入するために、ピペットが使用される。この場合、細胞９５は、電極９２Ａに引き付けられ、したがって、図示するように位置合わせされる。この固有の引力は、上記で概述した技法と比較して、融合井戸９０内において細胞を位置決めしなければならない精度を低減し、その後の処理中、細胞９５を適所に保持するように動作することが理解されるであろう。
【０１３９】
図９Ｂに示すように、電極は、融合井戸９０の底面上にめっきされた金の層から通常形成されるので、細胞が電極９２Ａと接触する可能性があるが、細胞と電極９２Ａとの間の接触点は、通常、ごく小さい。したがって、これらの電極は、以下で記述するように、わずかにマイクロメートルの高さであり、より強い強さの融合パルスではなく、比較的弱い強さのＤＥＰ場を供給するためにのみ使用されるので、細胞は、手続きによって損傷されず、融合井戸９０から容易に回収される。
【０１４０】
あらゆる事象において、いくつかの第１細胞９５が室９０において位置決めた状態で、いくつかの第２細胞９６が、第１細胞９５に隣接して位置決めされる可能性がある。使用時、第１細胞９５において誘起された双極子は、図９Ａに示すように、いくつかの細胞対を形成するように、第２細胞９６を引き付ける。
【０１４１】
必要な細胞が融合井戸９０内において適所に保持された後、第１信号生成装置９３を介して融合パルスを電極９１Ａ、９１Ｂに印加し得る。この融合パルスは、電極９１Ａ、９１Ｂに印加された簡単なＤＣ電流からなる可能性があり、または、より複雑な波形から形成される可能性がある。同様に、電極９２Ａ、９２Ｂは、第２信号生成装置からの信号に従ってＤＥＰ場を生成するために使用される。
【０１４２】
したがって、図７Ａ〜７Ｇに示した信号において示したように、細胞が経験する全電場は、全体的に交代するＤＥＰ場からなり、重ね合わされた融合パルスが、ほぼＤＣの場から形成される。この例では、電極の単一セットを使用してこれを達成する代わりに、融合パルスは、電極９１の第１対によって生成され、ＤＥＰ場は、電極９２の第２対によって生成される。
【０１４３】
記述したこの例では、電極９１は、固定電極として細胞において提供し得る。しかし、代替として、細胞９５、９６が適所に配置された後、細胞において電極を位置決めされる可能性がある。これは、いくつかの利点を有し、具体的には、細胞の配置を妨該する電極における漂遊電流を回避する。そのような構成において使用される電極の例を図９Ｃに示す。
【０１４４】
この構成は、いくつかの利点を有する。
第１に、電極９２によって生成されるＤＥＰ場に第１細胞を配置することを可能にすることにより、融合井戸９０において細胞をはるかにより容易に構成することが可能になる。具体的には、上述したように、細胞９５は、ＤＥＰ場によって適所に保持され、それにより、他の細胞が追加されるとき、配置後に細胞９５が運動しないことが保証される。これにより、５つの細胞の直径程度に接近した間隔で細胞を配置することが可能になり（これは、明瞭化のために図には示されていない）、融合井戸９０において多数の細胞を精確に位置合わせすることが可能になる。
【０１４５】
第２に、第２細胞９６は、生成されたＤＥＰ場によって第１細胞９５に引き付けられ、それにより、９７において示すように、細胞は、細胞対を形成するように、自然に位置合わせされる。これは、融合室９０内の適切な位置において細胞対を形成し得る実際の速度を非常に補助する。具体的には、これにより、ピペットの手動動作を使用してさえ、２、３分など、比較的短期間において、いくつかの細胞対を形成することが可能になる。
【０１４６】
第３に、融合パルスは第１電極９１によって提供されるので、細胞は、第２電極との接触によって損傷されず、それにより細胞が電極の付近において位置決めされる、または電極とは接触しないことを必要とせずに、細胞９６、９６を融合井戸９０内に挿入することが可能になる。細胞が、第１電極９１からかなり離れて適所において保持されるので、これにより、より強い場の強さを融合パルスに使用することが可能になり、細胞融合が成功する機会が増大する。
【０１４７】
これをさらに改善するために、融合パルスが電極９１間において生成される際に、電極９２によって生成されるＤＥＰ場を瞬間的に増大し得る（〜５０ｍｓ）。この目的は、融合中に細胞間の良好な膜間接触を保証するために、井戸９５、９６において生成される双極子の強さを増大させ、それにより増大した力で細胞を共に押しやることである。これは、細胞融合が成功する機会を増大させるように作用する。融合パルスが印加された後、融合をさらに補助するために、増大したＤＥＰ場をパルシング後に短時間維持し得る。
【０１４８】
最後に、この構成の他の有益な結果は、融合井戸９０においていくつかの細胞対９７を構成して、ほぼ同一の場の条件に暴露し得ることである。これにより、ほぼ同一の融合特性を有する細胞のバッチを準備することが可能になる。これは、融合の一貫性を保証するように作用し、実験目的で融合細胞のバッチを生成することが可能になる。
【０１４９】
細胞を融合させる装置の第４例について、図１０から１２を参照してここで記述する。
この例では、図１から３の装置と同様の装置が再び使用され、電極３５の１つが、ピペット３３の上に提供される電極によって置き換えられる。ピペットの例を図１０に示す。
【０１５０】
図示するように、ピペットは、円筒管１０１から形成され、かつノズル５７に結合される電極１００を含むことによって修正される。電極１００は、図示するように開口５８が管１０１に含まれるように、ノズル５７に結合される。
【０１５１】
使用時、ピペットは、ポートを経て流体を吸引および排出するために、ほぼ上述したよ
うに使用される可能性がある。これは、上述したように、井戸から細胞を回収して、細胞を融合井戸に配置することを可能にするために使用し得る。
【０１５２】
この例では、融合井戸は、第２電極をさらに含む。第２電極は、図２に示した電極３５の１つと同様の別の電極である可能性がある。次いで、電極１００と電極３５との間で、細胞を位置決めし得る。信号生成装置は、所定のパルス・シーケンスを電極１００、３５に印加するために使用され、これにより、上述したように細胞が融合することが可能になる。
【０１５３】
代替として、電極は、図８Ａおよび８Ｂに示した電極と同様な方式で、融合井戸の下面において提供される可能性がある。
他の選択肢として、第２ピペット３３Ｂが、それぞれの電極１００Ｂを備える可能性がある。結果的な装置構成は、図１１および１２に示す通りであり、ピペット・システム１４は、図示するように、２つの駆動システム３２Ａ、３２Ｂおよび２つのピペット３３Ａ、３３Ｂから形成される。したがって、この例では、ピペット３３Ａ、３３Ｂの上に提供される電極１００Ａ、１００Ｂは、電極システム１５を形成する。
【０１５４】
あらゆる事象において、上述した方式で細胞７１、７２を融合させることを可能にするために、２つの電極１００Ａ、１００Ｂの間に電場を生成し得る。
第２ピペットの提供は、いくつかの追加の利点を提供することが理解されるであろう。
【０１５５】
具体的には、各ピペット３３Ａ、３３Ｂは、第１ピペット３３Ａを使用して第１細胞７１を位置決めし、次いで第２ピペット３３Ｂを使用して第２細胞７２を位置決めすることによって、それぞれの細胞７１、７２を互いに隣接して位置決めするために使用される。細胞が適切に位置決めされた後、電極９０Ａ、９０Ｂの間においてパルス・シーケンスを生成することが可能であり、それにより細胞は融合する。
【０１５６】
いくつかの追加の開発も、ピペットについて実施し得る。これらは、レーザ、ＬＥＤなどの放射源、および適切な検出器の提供を含む。
この例を図１３Ａに示す。図示するように、ピペット３３は、放射をノズル５７に沿って、かつ開口５８を通して向けるように構成されるＬＥＤ１０２、および電極１００を、図示するように含む。ＬＥＤは、通常、リード１０３を介して処理システム１０に結合され、これにより、処理システムは、必要に応じてＬＥＤを選択的に稼動させることが可能になる。これにより、開口に隣接する細胞７１を放射に暴露させることが可能になる。
【０１５７】
これは、いくつかの理由で実施し得る。したがって、たとえば、これは、細胞の単一照明を提供するために実施される可能性がある。具体的には、細胞を照明することにより、細胞と周囲の流体媒体とのコントラストの増大が提供され、これにより、カメラが細胞を解像することがより容易になる。これにより、使用者に呈示される画像を見ることがより容易になり、ならびに、細胞の自動検出がより容易になる。
【０１５８】
この他に、照明により、細胞を蛍光マーカなどでラベル付けすることが可能になり、たとえば「Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ」という名称の我々の同時係属特許出願において記載されているように、検出器が、所定の特性を有する細胞を検出することが可能になる。この場合、ＬＥＤからの可視放射が、マーカを蛍光させるのに十分な強さを有していない可能性がある。これは、紫外線波長において動作するＬＥＤを使用することにより達成して克服される可能性がある。代替として、これは、図１３Ｂに示すようなレーザに基づくシステムを使用して達成される可能性がある。
【０１５９】
この例では、レーザ１０５、または適切なフィルタを有するＵＶバーナなどの他の放射
源が、光ファイバ１０６に結合される。光ファイバ１０６は、ゴム管（図示せず）などの適切な固定手段を使用して、ピペット・ノズル５７に結合される。光ファイバ１０６は、適切なフィルタ１０８を介して、光ダイオード管などの検出器１０７にも結合される。
【０１６０】
使用時、レーザから放出される放射は、細胞を暴露させるために使用される。光ファイバ・ケーブル１０６に当たる、その後細胞から反射された、または細胞によって放出されたあらゆる放射は、検出器１０７に伝達される。処理システムは、検出器からの信号を分析し、これらを使用して、懸濁液に保持されている細胞の群から個々の細胞を選択して除去する。
【０１６１】
この他に、図１６に示すシステムの例では、各ピペット３３Ａ、３３Ｂは、異なる波長を有するＬＥＤ１０２Ａ、１０２Ｂを備えることが可能である。これにより、たとえば２者択一マーカを使用することにより、異なる特性を有する細胞を検出することを可能にする、または処理システム１０もしくは使用者が、それぞれの細胞がどのピペットの付近にあるかを決定することを可能にするために、異なる波長の放射によって細胞を暴露させることが可能になる。
【０１６２】
これにより、処理システムが撮像システム１１を使用して、各細胞７１、７２を暴露している放射の波長から、どのピペット３３Ａ、３３Ｂが細胞に隣接するかを決定することも可能になる。これにより、たとえば適切なラベルを使用することによって、各細胞が放射のそれぞれの波長に応答するように構成することによって、異なる所定の特性を有する細胞７１、７２を検出することも可能になる。
【０１６３】
これは、システムの自動化を補助し、いくつかの細胞対を以下のように迅速に融合させるのを可能にする方法に備える。
１．源井戸の複数の細胞が、ＬＥＤ１０２Ａからの放射に暴露される。
【０１６４】
２．図１４に示すように、所定の特性を有する細胞７１が、処理システム１０によって検出され、ピペット３３Ａに吸引されて、格納される。
３．源井戸の複数の細胞が、ＬＥＤ１０２Ｂからの放射に暴露される。
【０１６５】
４．同様の方式で、所定の特性を有する細胞７２が、処理システム１０によって検出され、ピペット３３Ｂに吸引されて、格納される。
５．両方のピペット３３Ａ、３３Ｂが、融合井戸４４内に挿入される。
【０１６６】
６．各細胞タイプ７１、７２のそれぞれの１つが、各ピペット３３Ａ、３３Ｂから同時に排出され、それにより、流体力学的力が、図１５に示すように、細胞７１、７２を共に引き出す。
【０１６７】
７．細胞がそれぞれのピペット３３Ａ、３３Ｂから排出されるとき、流体流が切頭されるように、処理システムが、撮像システム１１を使用して、細胞の位置を検出する。
８．たとえば図１２に示すように、電極間において細胞を共に引き寄せるように、ＤＥＰ場が印加される。この時点において、細胞は、膜接触を補助するために、増大（増幅）されたＤＥＰ場を使用して共に押される。
【０１６８】
９．信号生成装置１３が、電極１００Ａ、１００Ｂを介して、所定のパルス・シーケンスを細胞７１、７２に印加する。
１０．細胞が、融合を補助するために、増大（増幅）されたＤＥＰ場を使用して、再び共に押される。
【０１６９】
１１．ピペット３３Ａ、３３Ｂが、井戸内の新しい位置に移動する。
１２．図１６に示すように、いくつかの融合物７３が提供されるまで、工程６〜１１を必要な回数繰り返す。
【０１７０】
１３．すべての細胞対が排出されたとき／融合されたとき、ピペットは、井戸を通って戻り、融合物を回収する。
１４．融合物が、単一クローンまたは群を回収するために、回収される。
【０１７１】
この技法は、たとえば図３に示したピペットを適切に修正することによって、電極１００Ａ、１００Ｂが存在しない状態で実施し得る。
また、細胞を磁気により格納することを可能にする、細胞をラベル付けする技法も存在する。この例では、小さい金属ビードが、当該の細胞を識別するマーカとして使用される。これは、所望の特性を有する細胞をビードに融合させて、それにより細胞の混合物からを抽出し得ることを保証することによって達成される。
【０１７２】
これは、たとえば、ビードを当該の抗体でコーティングし、次いでビードを細胞の培養物に混合することによって達成し得る。表面上において適切な受容体を表している細胞は、ビードに結合される。次いで、培養物は、管を通してろ過されて、ラベル付き細胞を引き付け、保持する数千の小さいビードを含む外部磁場に配置され、一方、ラベル付けされていない細胞を洗浄して、廃棄することが可能になる。外部磁場が除去された後、管を経て結合細胞を洗浄し、所望するように隔離し得る。
【０１７３】
これは、電磁石を組み込むように修正されたピペットを使用して、より小さい規模で達成される可能性があることとが理解されるであろう。
適切に修正されたピペットの例について、図１７を参照してここで記述する。この例では、１１０において全体的に示すピペットは、ピペット・ノズル１１２の回りに位置決めされたグラファイト層１１１を含む。いくつかの銅巻線１１３が、電磁石を形成するように、グラファイト核の回りに提供される。使用時、銅巻線は、１１４において全体的に示すＤＣ信号生成装置に結合され、それにより、巻線は、場の線１１５によって表される磁場を生成するように、ソレノイドとして作用する。
【０１７４】
銅巻線は、実施態様に応じて、いくつかの層において提供される可能性があり、電気分解が生じるのを防止するために、エポキシの層に埋め込まれる可能性がある。
巻線の端部は、可変ＤＣ信号生成装置および抵抗（Ｒ）に接続される。電流を巻線に流すことにより（レンツの法則を考慮する）、磁場が誘起され、その強度は、下式によって与えられるように、印加されるＤＣ電圧（Ｖ）に比例する。
【０１７５】
【数１０】
2005534296.tif 000012
上式で、ｎ＝単位長さあたりの巻数
ｕ＝自由空間の透磁率
である。
【０１７６】
使用時、ピペットは、１１７において示すように、流体媒体に懸濁される可能性がある、または基板１１６の上にある可能性があるいくつかの細胞の付近に位置決めされる。この場合、細胞の少なくともいくつかは、上記で概述したビードなど、適切な磁気マーカに添付される。
【０１７７】
使用時、金属粒子、したがって金属粒子が添付されている細胞は、磁場に引き付けられ、磁場内に引き付けられ、したがって通常の方式でピペット内に吸引し得る。これにより、細胞を磁気マーカに結合し、したがってある特性を有する細胞を選択することが可能になる。
【０１７８】
受容体のより高い密度（より多数の磁気マーカ）を有する細胞は、同じ磁場の強度についてより少ない受容体を有する細胞より、細胞に対して及ぼされるより大きな力を有するはずであることが理解されるであろう。したがって、ＤＣ電圧が増大するにつれ、より多数の細胞が、磁場の影響に引き付けられるはずである。この場の勾配は、他の分類基準を見込むことが可能である。
【０１７９】
所望されない細胞が収集されないことを保証するために、流体をノズルから排出することによって、ピペットをフラッシュ・アウトすることが可能である。この場合、磁気マーカに結合されていないあらゆる細胞が、流体と共にピペットから排出され、一方、マーカに結合されている細胞は、磁場の作用によって適所に保持される。この場合、選択された細胞が排出されるとき、磁場を非活動化することが可能であり、これにより、細胞および添付マーカを通常の方式で排出することが可能になる。
【０１８０】
他の開発は、使用される作動装置の代替形態についてである。作動装置のこの形態の例を図１８Ａ、１８Ｂに示す。
図示するように、この例では、管５４は、ストップコック６２およびリザーバ６３を介してポンプ６４に接続される。作動装置６５が、柔軟管５４に隣接して位置決めされ、これにより、図１８Ｂに示すように、管をクランプすることが可能になる。
【０１８１】
このことから、ソレノイドなどの作動装置のあらゆる形態が使用される可能性があることが理解されるであろう。しかし、この例では、作動装置は、駆動システム３２の一部を形成する、ＤＣまたはストッパ・モータ６７に結合されたねじ込みねじドライブ６６から形成される。使用時、これにより、作動装置を矢印６９の方向において±５ｍｍだけ移動させることが可能になる。
【０１８２】
作動装置の先端は、それに結合された圧電スタック６８を有することが可能であり、これにより、作動装置の端部の微細制御（±２０μｍの変位）が可能になる。再び、圧電スタックは、駆動システム３２の一部を形成する。
【０１８３】
使用時、ピペットは、システムを充填するのに十分な流体を有するコンテナ内に開口５８を配置することによって、適切な流体媒体で装填される。システムを経て流体を吸引するポンプまたは他のそのような手段が稼動され、流体が、ピペットのノズル５７を経て吸引される。システムが装填されて、管に気泡が存在しないとき、さらなる流体流を防止するために、ストップコック６２が閉鎖され、ポンプ６４がオフになる。
【０１８４】
開口５８は、依然として流体媒体に浸漬されているが、作動装置６５は図２Ｂに示すように、シリコン管５４が直径のほぼ半分に圧縮されるように調節される。したがって、使用時、ポート４１が井戸の流体において位置決めされた状態で、作動装置６５を矢印６９の方向に移動させることにより、管５４が圧縮または解法され、それにより流体がポート４１を経て排出または吸引される。これにより、図３のピペットに関して上記で記述したように、井戸から細胞を回収することが可能になる。
【０１８５】
これに対する変形形態を図１８Ｃおよび１８Ｄに示す。これらの例では、作動装置６５は、柔軟管５４において提供される膀胱５４Ａに隣接して位置決めされる。この場合、膀胱は、管より大きい断面積を有し、したがって、管５４と比較して、単位長さあたりより
大きい流体容積を包含する。これは、２つの主要な利点を有する。具体的には、より大きい断面積は、作動装置のより広範な移動に備える。これと膀胱の流体容積の増大との組合せは、管５４上での作動装置の行為と比較するとき、より多くの流体が変位することを見込む。
【０１８６】
結果として、これは、開口５８を経て排出または吸引される流体の量に対するより優れた制御を提供し、ピペットを使用して個々の細胞を取り出すことについて、より優れた精度を見込む。
【０１８７】
この事例では、膀胱において十分な液体を提供することによって、図１８Ｃに示すように、ストックコック６２、リザーバ６３、またはポンプ６４を提供することが必要ではないことが理解されるであろう。具体的には、膀胱およびピペットは、膀胱から排出されている流体の量で充填することが可能であり、その後、膀胱は、作動装置と共動するように位置決めされ、それにより、開口５８を経て流体を吸引または排出することが可能であるように、作動装置の位置を調節することが可能になる。
【０１８８】
代替として、膀胱は、図１８Ｄに示すように、管５４Ｂによって、ストックコック６２、リザーバ６３、およびポンプ６４に接続し得る。
したがって、上述したシステムにより、個々の細胞を容易に融合させることが可能になる。細胞は、図３に示したピペットを使用して操作されるので、これにより、セルの操作は、従来の技術よりはるかに容易になる。したがって、これは、個々の細胞の融合を実施し得る速度および容易さを増大させるように作用する。さらに、電極は、細胞に接触することを全く必要とせず、したがって、融合工程前または融合工程中に、細胞の損傷を低減する、または防止するのに役立つ。
【０１８９】
この他に、装置は、全体として、一般により複雑ではなく、したがって、コストを低減するのに役立ち、ならびに細胞融合を実施するための装置の使用を容易にする。その結果、上述したシステムを使用する融合は、一般に、従来の技術より迅速かつ安価に達成し得る。
【０１９０】
上述した例の範囲内において使用し得る他の開発は、細胞を切断することを可能し、ならびに井戸の表面または電極に接着した細胞を解放することを可能にするために、切断器具を提供することである。適切な切断器具の例を図１９に示す。図示するように、切断器具は、ヒンジ１２２または他の適切な接続によって切断器具に旋回式に取り付けられた刃１２１を有する支持ポスト１２０を含む。
【０１９１】
使用時、ポストは、マイクロ・マニピュレータ（図示せず）に結合され、それにより、それぞれの井戸内においてポストを位置決めすることが可能になる。ポストは、矢印１２３によって示すように回転することが可能であり、これにより、刃を切断される細胞より上に位置決めすることが可能になる。細胞が自由細胞１２４である場合、細胞は、一般に、１２５において示すように、ピペットまたは他の適切なマニピュレータを使用して、適所に保持される。
【０１９２】
位置決めされた後、ポストは、刃の先端が、プラスチック・プレートの底面の柔軟プラスチックと咬合するように降下される。ポストをさらに降下させることにより、刃は、ヒンジ１２２の回りに旋回し、経路に配置された細胞などの物体を通って「断裁」する。刃が、当該対象を通って切断し、プレートの底面と完全に平行になるとき、運動は停止される。
【０１９３】
上述した様々な例の機能は、いくつかの構成のいずれか１つにおいて組み合わされる可
能性があることが理解されるであろう。これにより、たとえば、磁気または放射敏感マーカに従って、細胞を自動的に選択することが可能になる。次いで、細胞を融合井戸において構成して、融合させることが可能であり、融合物は、自動的に取り出されて、回収井戸において位置決めされる。
【０１９４】
自動細胞選択および融合を実施する装置の特有の例について、図２０および２１を参照してここで記述する。
図２０に示すように、制御システム１２は、ステージ３７に結合された駆動システム３６を含むステージ・システム１６にさらに結合され、処理システム１０は、刺激システム１７に結合される。刺激システム１７は、選択井戸の懸濁液に保持された細胞の群から所定の特性を有する細胞を回収することを可能にするように、細胞を刺激するために使用される。
【０１９５】
細胞がマーカでラベル付けされる選択を達成するために、マーカは、必要な所定の特性を有する細胞にのみ接着する、およびまたは浸透するように適合される。刺激システム１７は、マーカ細胞を刺激して、それにより所定の特性を有する細胞を識別する。刺激システム１７は、図１３に関して記述したシステムと同様の放射に基づくシステム、または、図１７に関して記述したシステムと同様の磁気に基づくシステムである可能性がある。以下の例は、放射に基づく手法の使用を中心とする。
【０１９６】
装置の構成を図２１においてより詳細に示す。
図示するように、ステージ３７は、取り付けられた顕微鏡３１を内部に有する開口１７０を含む。このことから、顕微鏡３１は、通常、倒立顕微鏡であることが理解されるであろう。
【０１９７】
使用時、ステージ３７は、回収される細胞を含む選択井戸１７１を受けるように適合される。ステージは、開口１７２より上に位置決めされた融合井戸９０をも受ける。使用時、選択井戸１７１は、開口１７０の上に位置決めされ、これにより、カメラ３０は、顕微鏡３１を介して、選択井戸１７１の内側の画像を得ることが可能になる。使用時、処理システム１０は、ステージ３７を矢印１７３、１７４によって示す方向に移動させるように、駆動システム３６を制御するように適合される。
【０１９８】
これにより通常はフレーム・グラバなどである画像インターフェース２３を使用して、処理システム１０によって、選択井戸の内容物の表示を捕獲し得ることが可能になる。次いで、駆動システム３２、３５、ならびに３６および刺激システム１７を制御するために、画像が処理システム１０によって使用される可能性がある。さらに、または代替として、Ｉ／Ｏデバイス２２を使用して、画像が使用者に表示される可能性がある。
【０１９９】
ピペットは、図示するように、ノズル５７を井戸１７１に挿入することが可能であるように、ステージ３７に隣接して位置決めされる。ピペット３３は、ピペットが、矢印１７５、１７６、１７７によって示すように、井戸に対して移動することが可能であるように、駆動システム３２に結合される。したがって、駆動システム１２は、５μｍ＜の解像許容差および繰返し精度を備える３つの独立制御軸を有するマイクロマニピュレータ・システムを通常含む。このシステムは、プロセッサ２０によって実行される専用ソフトウェアによって制御される。
【０２００】
あらゆる事象において、所定の特性を有する細胞は、光ファイバ・ケーブル１０６を介してノズル５７に結合された放射源１０５を使用して細胞を放射に暴露させることによって識別される。これにより、検出器１０７は、光ファイバ・ケーブル１０６およびフィルタ１０８を経て細胞によって放出される放射を受信して、それにより所望の特性を有する
細胞を決定することが可能になる。
【０２０１】
この事象では、粒子の検出は、磁気的に実施され、これは、図１７に関して上述したように達成される可能性があることが理解されるであろう。
次いで、処理システム１０は、上述したように、選択井戸１７１から細胞を除去して、これらを融合井戸９０に配置するように、ピペット・システム１４を制御し得る。この工程中、細胞が必要に応じて位置決めされることを保証するために、ＤＥＰ場が、電極９２に印加される。この他に、ステージ３７は、カメラ３０が開口１７２を通して融合井戸９０を撮像することを可能にするように移動される。
【０２０２】
次いで、融合が、ほぼ上述したように実施され、融合細胞は、必要に応じて除去される。
したがって、上記のシステムは、細胞の操作ならびに融合、および具体的には、単一細胞のミニバルク細胞融合またはマクロバルク融合細胞に適切な装置を記述する。これに関して、細胞という用語は、あらゆる細胞、ベクトル、粒子、分子、リポソーム、および他のそのような小胞を網羅することを意図する。
【０２０３】
具体的には、技法は、たとえば我々の同時係属出願「Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、２００３年５月３０日出願に記載されているように、幹細胞の融合の目的に特に有利である。
【０２０４】
これにより、組織交換および／または組織回復治療、もしくは身体のある範囲の臓器または組織領域に有用な組織または細胞を生成するために、技法を使用することが可能になる。結果的な組織または細胞は、非融合細胞から生成される類似の分子と比較して、改良された、またはより有効な特性を有するある範囲のサイトカイン、酵素、ホルモンなどを分泌する、または生成する可能性もある。
【０２０５】
この場合、細胞は、生成される融合物が、特定の目的に適用可能な特性を有するように、所望の特性を有するように選択される。
幹細胞ならびに成熟細胞、および移植ならびに回復において使用される応用分野の適切なリストを表１に示す。すべてのそのような幹細胞および成熟細胞が、本発明によって考慮され、かつ包含される。表１において示すように、脳、表皮、皮膚、膵臓、腎臓、肝臓、胸部、肺、筋肉、心臓、眼球、骨、脾臓、または免疫システムなどから、あらゆる人、または哺乳類、もしくは哺乳類以外の動物、あるいは鳥類種の成熟細胞が得られる可能性がある。免疫システムの細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単核細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびＢベルを含む。本発明は、哺乳類（人を含む）、哺乳類以外の動物、および鳥類種などのあらゆる源からの幹細胞および成熟細胞の融合を考慮することに留意されたい。人以外の哺乳類の例は、家畜動物（たとえば、羊、豚、牛、馬、ロバ、山羊）、コンパニオン・アニマル（たとえば、猫、犬）、実験試験用動物（たとえば、ねずみ、ラット、うさぎ、モルモット、ハムスター）、および捕獲された野生動物を含む。哺乳類以外の動物は、爬虫類、両生類、昆虫、節足動物、および蜘蛛類を含む。鳥類種は、家禽、鳥（たとえば、あひる、エミュー、ダチョウ）、および大型の鳥を含む。
【０２０６】
【表１】
2005534296.tif 000013
2005534296.tif 000014
2005534296.tif 000015
組織の交換治療または増強治療に細胞を使用することに関して、細胞の少なくとも１つのポピュレーションは、処置される被験者または組織適合性整合被験者（すなわち、ＨＬＡ整合被験者）に由来する可能性がある。さらに、誕生時、被験者が、生命の後の段階において被験者（または他の適切な被験者）に使用される細胞または組織を格納する可能性がある。そのような組織は、胎盤組織、臍帯組織、包皮、血液、または胎児に関連する他の子宮組織を含む。
【０２０７】
追加の使用は、同時係属出願に記載されている。
当業者なら、多くの変更および修正が明らかになることを理解するであろう。当業者に明らかになるすべてのそのような変更および修正は、本発明が以前に記述したように広範に明らかにしている精神および範囲内にあると見なされるべきである。
【０２０８】
したがって、上記の記述は、細胞融合を中心としているが、技法は、あらゆる細胞、ベクトル、分子、リポソーム、および他のそのような小胞に全般的に適用することが可能であることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】細胞を融合させる装置の例のブロック図。
【図２】図１の装置の概略図。
【図３】図１のピペットの概略図。
【図４】図１の装置を使用して細胞を融合させる工程の概観のフローチャート。
【図５Ａ】図１の装置によって実施される細胞を融合させる工程のフローチャート。
【図５Ｂ】図１の装置によって実施される細胞を融合させる工程のフローチャート。
【図５Ｃ】図１の装置によって実施される細胞を融合させる工程のフローチャート。
【図６Ａ】図３のピペット内に吸引されている細胞の概略図。
【図６Ｂ】図３のピペットから排出されている細胞の概略図。
【図６Ｃ】図１の装置の動作中、融合井戸における電極および細胞の構成の概略図。
【図６Ｄ】図１の装置の動作中、融合井戸における電極および細胞の構成の概略図。
【図７Ａ】図１の装置において使用される可能性があるパルス・シーケンスの例を示す図。
【図７Ｂ】図１の装置において使用される可能性があるパルス・シーケンスの例を示す図。
【図７Ｃ】図１の装置において使用される可能性があるパルス・シーケンスの例を示す図。
【図７Ｄ】図１の装置において使用される可能性があるパルス・シーケンスの例を示す図。
【図７Ｅ】図１の装置において使用される可能性があるパルス・シーケンスの例を示す図。
【図７Ｆ】図１の装置において使用される可能性があるパルス・シーケンスの例を示す図。
【図７Ｇ】図１の装置において使用される可能性があるパルス・シーケンスの例を示す図。
【図８Ａ】細胞を融合させる装置の第２例の概略的な平面図。
【図８Ｂ】図８Ａの修正された井戸アレイの概略的な側面図。
【図９Ａ】細胞を融合させる装置の第３例の概略的な平面図。
【図９Ｂ】図９Ａに示した細胞の１つの概略的な側面図。
【図９Ｃ】図９Ａの第１電極の概略的な透視図。
【図１０】電極を含むように修正された図３のピペットの概略図。
【図１１】図１０に示したピペットを２つ使用するように適合された図１の装置の修正バージョンのブロック図。
【図１２】図１１の装置の概略図。
【図１３Ａ】放射源を含むように修正された図１０のピペットの概略図。
【図１３Ｂ】代替放射源を含むように修正された図３のピペットの概略図。
【図１４】いくつかの細胞を取り出している図３のピペットの概略図。
【図１５】その後の融合のために細胞を位置決めする図１１のピペットの概略図。
【図１６】図１１のピペットおよび融合された細胞の概略図。
【図１７】放射源を含むように修正された図３のピペットの概略図。
【図１８Ａ】代替作動装置を有する図３のピペットの概略図。
【図１８Ｂ】図１８Ａの作動装置の動作の概略図。
【図１８Ｃ】膀胱と共に使用されるように修正された図１８Ａのピペットの第１例の概略図。
【図１８Ｄ】膀胱と共に使用されるように修正された図１８Ａのピペットの第２例の概略図。
【図１９】細胞を切断するために使用される切断器具の概略図。
【図２０】細胞を自動的に融合させる装置の例のブロック図。
【図２１】図２０の装置の概略図。
【図１】
2005534296.tif 000016
【図２】
2005534296.tif 000017
【図３】
2005534296.tif 000018
【図４】
2005534296.tif 000019
【図５Ａ】
2005534296.tif 000020
【図５Ｂ】
2005534296.tif 000021
【図５Ｃ】
2005534296.tif 000022
2005534296.tif 000023
2005534296.tif 000024
2005534296.tif 000025
2005534296.tif 000026
2005534296.tif 000027
2005534296.tif 000028
【図１０】
2005534296.tif 000029
【図１１】
2005534296.tif 000030
【図１２】
2005534296.tif 000031
2005534296.tif 000032
2005534296.tif 000033
【図１４】
2005534296.tif 000034
【図１５】
2005534296.tif 000035
【図１６】
2005534296.tif 000036
【図１７】
2005534296.tif 000037
2005534296.tif 000038
2005534296.tif 000039
【図１９】
2005534296.tif 000040
【図２０】
2005534296.tif 000041
【図２１】
2005534296.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月22日(2004.6.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも第１と第２の電極の一対を選択する工程と、
ａ）細胞の対をそれぞれ位置決めして、各細胞対の第１と第２の細胞は流体充填融合コンテナの２つの電極間にあり、各細胞対は、各電極からと他の細胞対から分離されていることと、
ｂ）所定の融合パルスを生成して、それにより該細胞を融合させるために、所定の波形を有する電流を該電極に印加することと、からなる第１細胞と第２細胞とを融合させる方法。
【請求項２】
前記細胞が、前記電極間において懸濁液に保持される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞を互いに向けて押しやるように適合されるＤＥＰ場を生成することを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の波形が、前記ＤＥＰ場を表す電流を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＥＰを第２の電極対に印加することを含む請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ａ）ＤＥＰ電流を第２電極対に印加することと、
ｂ）前記融合コンテナにおいて前記第１細胞を位置決めし、交流電場が、前記第１細胞を前記第２の電極対の一方に向けて引き付けるように作用することと、
ｃ）前記融合コンテナにおいて前記第２の細胞を位置決めし、交流電場が、前記第２の細胞を前記第１の細胞に引き付けるように作用することと、を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の細胞および前記第２の細胞の少なくとも一方が、前記第２の電極対の少なくとも一方と接触して位置決めされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ａ）第１コンテナに保持されている第１細胞の群からの前記第１細胞と、
ｂ）第２コンテナに保持されている第２細胞の群からの前記第２細胞と、を引き付けるように、ピペットを使用して前記第１細胞および前記第２細胞を選択する工程を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ａ）前記ピペットを使用して、前記融合コンテナにおいて前記第１細胞を位置決めする工程と、
ｂ）前記ピペットを使用して、前記第１細胞に隣接して、前記融合コンテナにおいて前記第２細胞を位置決めする工程と、
ｃ）前記第１細胞および前記第２細胞がほぼ前記電極間に位置するように、前記電極を位置決めする工程と、とを含む前記融合コンテナにおいて前記第１細胞および前記第２細胞を位置決めする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ピペットが、
ａ）前記第１、前記第２、および前記融合コンテナに対して前記ピペットを移動させるように適合される駆動システムと、
ｂ）前記ピペットを作動させ、それによりポートを経て流体を排出または吸引するように適合される作動装置とに結合され、前記ピペットを移動および作動させるために、該駆動装置および該作動装置に結合されたコントローラを使用することを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記コントローラに、
ａ）前記ポートが、それぞれのコンテナにおいて流体懸濁液に保持されている、所定の特性を有する細胞に隣接するように、前記ピペットを移動させる工程と、
ｂ）前記ポートを経て流体を吸引して、それにより該細胞および周囲の流体を吸引するように前記ピペットを作動させる工程とを含む、細胞を選択する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記コントローラが、
ａ）前記ポートが前記融合コンテナにおいて前記第１細胞に隣接するように、前記ピペットを移動させる工程と、
ｂ）前記ピペットに前記ポートを経て流体を排出させ、それにより前記第２を前記融合コンテナの前記流体内に排出する工程と、
ｃ）前記ポートが、前記第１細胞および前記第２細胞の両方に可能な限り近接するように、前記ピペットを移動させる工程と、
ｄ）前記ピペットに前記ポートを経て流体を吸引させ、それにより前記第１細胞および前記第２細胞ならびに周囲の流体を吸引する工程と、
ｅ）前記ピペットに前記第１細胞および前記第２細胞を前記融合コンテナの前記流体内に排出させる工程と、
ｆ）前記第１細胞および前記第２細胞が所定の距離内にあるようになるまで、工程（ｃ）から（ｅ）を繰り返す工程と、を含む前記ピペットを使用して前記第１細胞に隣接して前記第２細胞を位置決めする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電極が、前記融合コンテナに対して前記電極を移動させるように適合される電極駆動システムに結合され、該電極駆動システムに結合されたコントローラを使用して、前記電極を前記融合室において位置決めする工程を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記電極が、信号生成装置に結合され、該信号装置に所定の電流を前記電極に印加させる
工程を含む、前記電流を前記電極に印加する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１細胞および前記第２細胞が、それぞれの細胞タイプを有し、信号生成装置に結合されたコントローラを使用して、前記第１細胞および前記第２細胞の該細胞タイプに従って前記電流を選択する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１細胞および前記第２細胞が、同じタイプの細胞であり、細胞の前記第１群および前記第２群が、同じ群である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ほぼ以上に記述した通りである、第１細胞と第２細胞とを融合させる方法。
【請求項１８】
ａ）流体充填融合コンテナと、
ｂ）使用時に該融合コンテナにおいて位置決めされるように適合される少なくとも２つの電極と、
ｃ）ｉ）それぞれのコンテナに保持されている第１細胞の群から第１細胞を選択することと、
ｉｉ）それぞれのコンテナに保持されている第２細胞の群から第２細胞を選択することと、
ｉｉｉ）前記電極間における該融合コンテナにおいて、前記第１細胞および前記第２細胞をそれぞれ個々に位置決めして、それによって、細胞の対が各電極と他の細胞対から分離されるための選択装置と、
ｄ）前記電極に結合され、所定の波形を有する場を前記電極間において生成して、それにより、前記少なくとも１つの細胞の対の第１の細胞と第２の細胞とをそれぞれ融合させるように適合される信号生成装置と、を含む第１細胞と第２細胞とを融合させる装置。
【請求項１９】
前記選択装置がピペットである請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
ａ）前記第１、前記第２、および前記融合コンテナに対して前記ピペットを移動させるように適合される駆動システムと、
ｂ）前記ピペットにポートを経て流体を排出または吸引させるように適合される作動装置と、をさらに含む請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記電極が前記融合コンテナに結合された請求項１８から２０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２２】
前記融合コンテナに対して前記電極を移動させるように適合される電極駆動システムをさらに含む請求項１８から２０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２３】
前記電流波形が融合パルスを含み、前記信号生成装置が、電場パルスを生成して、それにより前記細胞を融合させるために、該融合パルスを前記電極に印加するように適合される、請求項１８から２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
前記電流波形がＤＥＰ電流を含み、前記信号生成装置が、ＤＥＰ場を生成して、それにより前記細胞を互いに向けて押しやるために、該ＤＥＰ電流を前記電極に印加するように適合される、請求項１８から２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２５】
１対の第２電極を含み、該一対の第２電極が第２信号生成装置に結合され、該第２信号生成装置がＤＥＰ電流を生成するように適合され、該ＤＥＰ電流がＤＥＰ場を生成して、それにより前記細胞を互いに向けて押しやるために該一対の第２電極に印加される、請求項
１８から２３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２６】
前記一対の第２電極が前記融合コンテナの表面上に提供される請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
ａ）前記ピペットと、
ｂ）前記電極と、
ｃ）前記信号生成装置との少なくとも１つの動作を制御することによって、前記細胞の前記融合を制御するように適合されるコントローラをさらに含む、請求項１９から２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記コントローラが、
ａ）プロセッサが前記ピペットを移動および作動させるように適合される、前記駆動システムおよび前記作動装置と、
ｂ）プロセッサが前記電極を移動させるように適合される、前記電極駆動システムと、
ｃ）プロセッサが前記信号生成装置に前記所定の波形を有する電流を生成させるように適合される、前記信号生成装置との少なくとも１つに結合されたプロセッサを含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記コントローラが前記コンテナ内における細胞の位置を検出するように適合された検出器を含み、前記プロセッサが、検出された細胞の位置に応答して前記電極および前記ピペットの少なくとも一方を移動させるように該検出器に応答する、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記処理システムが、使用者から入力コマンドを受信するための入力を含む請求項２８または請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
前記プロセッサが、いくつかの異なる所定の波形を表す波形データを記憶するストアに結合され、前記プロセッサが、前記使用者から受信した前記入力コマンドに応答して、該いくつかの所定の波形の１つを選択するように適合される請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
前記プロセッサが、前記使用者から受信した前記入力コマンドに応答して、前記電極および前記ピペットの少なくとも一方を移動させるように適合される請求項３０または３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記コントローラが、請求項１から１７のいずれかの前記方法を装置に実施させることによって、前記細胞を融合させるように適合される請求項２７から３２のいずれかに記載の装置。
【請求項３４】
ほぼ以上に記述した通りである、第１細胞と第２細胞とを融合させる装置。
【請求項３５】
第１細胞と第２細胞とを融合させる装置を制御するコントローラであって、該装置が、
ａ）流体充填融合コンテナと、
ｂ）少なくとも２つの電極と、
ｃ）選択装置と、
ｄ）該電極に結合された信号生成装置とを含み、
使用時、
ｉ）該選択装置に、
（１）それぞれのコンテナに保持されている第１細胞の群から第１細胞を選択させ、
（２）それぞれのコンテナに保持されている第２細胞の群から第２細胞を選択させ、
（３）該電極間の該融合コンテナにおいて、懸濁液に保持されている該第１細胞および
該第２細胞を個々に位置決めして、それによって該細胞対は、各電極および他の各細胞対から分離されることと、
ｉｉ）該信号生成装置に、所定の波形を有する場を該電極に印加させ、それにより、少なくとも一対の細胞の第１の細胞と第２の細胞とをそれぞれ融合させることとによって、該細胞を融合させるように適合されるコントローラ。
【請求項３６】
前記融合コンテナにおいて前記電極を位置決めするようにさらに適合される請求項３５に記載のコントローラ。
【請求項３７】
ａ）前記第１、前記第２、および前記融合コンテナに対して前記ピペットを移動させるように適合される駆動システムと、
ｂ）前記ピペットに、ポートを経て流体を排出または吸引させるように適合される作動装置と、
ｃ）前記融合コンテナに対して前記電極を移動させるように適合される電極駆動システムと、
ｄ）前記信号生成装置との少なくとも１つに結合されたプロセッサと、を含む請求項３６に記載のコントローラ。
【請求項３８】
前記コンテナ内における細胞の位置を検出するように適合された検出器を含み、前記プロセッサが、検出された細胞の位置に応答して、前記電極および前記ピペットの少なくとも一方を移動させるように、該検出器に応答する請求項３７に記載のコントローラ。
【請求項３９】
使用者からの入力コマンドを受信するための入力を含む、請求項３７または３８に記載のコントローラ。
【請求項４０】
前記プロセッサが、いくつかの異なる所定の波形を表す波形データを記憶するためのストアに結合され、前記プロセッサが、前記使用者から受信した前記入力コマンドに応答して、該いくつかの所定の波形の１つを選択するように適合される、請求項３９に記載のコントローラ。
【請求項４１】
前記プロセッサが、前記使用者から受信した前記入力コマンドに応答して、前記電極および前記ピペットの少なくとも一方を移動させるように適合される、請求項３５または請求項４０に記載のコントローラ。
【請求項４２】
前記電流波形が、融合パルスを含み、前記信号生成装置に、電場パルスを生成して、それにより前記細胞を融合させるために、該融合パルスを前記電極に印加させるように適合される請求項３５から４１のいずれか１項に記載のコントローラ。
【請求項４３】
前記電流波形がＤＥＰ電流であり、ＤＥＰ場を生成して、それにより前記細胞を互いに向けて押しやるために、前記信号生成装置に該ＤＥＰ場を前記電極に印加させるように適合される請求項３５から４２のいずれか１項に記載のコントローラ。
【請求項４４】
前記装置が１対の第２電極であり、該一対の第２電極が第２信号生成装置に結合され、コントローラが、該第２信号にＤＥＰ電流を生成させるように適合され、該ＤＥＰ電流、ＤＥＰ場を生成して、それにより前記細胞を互いに向けて押しやるために、該一対第２電極に印加される請求項３５から４２のいずれか１項に記載のコントローラ。
【請求項４５】
請求項１８から３４のいずれか１項に記載の装置と共に使用されるように適合される請求項３５から４４のいずれか１項に記載のコントローラ。
【請求項４６】
前記装置に請求項１から１７のいずれかの前記方法を実施するように適合される請求項４５に記載のコントローラ。
【請求項４７】
ほぼ以上に記述した通りである、第１細胞と第２細胞とを融合させる装置を制御するコントローラ。
【請求項４８】
適切な処理システムによって実行されるとき、請求項３５から４７のいずれか１項の前記コントローラとして該処理システムを動作させるコンピュータ実行可能コードを含む、第１細胞と第２細胞を融合させる装置を制御するためのコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項４９】
前記処理システムが、前記装置に請求項１から１７のいずれかの前記方法を実施させるように適合される請求項４８に記載のコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項５０】
適切な処理システムによって実行されるとき、該処理システムをほぼ以上に記述した通りに動作させるコンピュータ実行可能コードを含む、第１細胞と第２細胞を融合させる装置を制御するためのコンピュータ・プログラム・プロダクト。
【請求項５１】
ａ）使用時に流体を包含し、ポートを含むノズルと、
ｂ）該ノズルに結合され、該ポートを経て流体を吸引および／または排出するように適合される作動装置と、
ｃ）該ポートに隣接する該ノズルに結合され、印加される電場が、該ポートに隣接して位置決めされた１つまたは複数の粒子に結合されることを可能にするために、第２電極と共動するように適合される電極とを含む、粒子を操作するためのピペット・システム。
【請求項５２】
前記電極が導電管から形成される請求項５１に記載のピペット・システム。
【請求項５３】
前記電極が約１０ｍｍの直径を有するステンレス鋼管から形成される請求項５２に記載のピペット・システム。
【請求項５４】
流体充填コンテナに対してピペット・システムを移動させ、それにより粒子を該コンテナにおいて位置決めする、または該コンテナから除去することを可能にするように適合される駆動システムを含む、請求項５１から５３のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項５５】
前記コンテナにおいて位置決めされた前記電極と第２電極との間において、所定の電場を生成するための前記電極に結合された信号生成装置を含む請求項５４に記載のピペット・システム。
【請求項５６】
前記駆動システム、前記作動装置および前記信号生成装置を制御して、それにより、
ａ）前記ピペットを使用して前記第２電極に隣接して前記コンテナにおいて前記粒子を位置決めすることと、
ｂ）前記コンテナにおいて前記粒子に隣接して前記ピペット・ポートを位置決めすることと、
ｃ）前記信号生成装置を稼動させることとによって粒子に電場を印加するように適合されるコントローラと、を含む、請求項５５に記載のピペット・システム。
【請求項５７】
前記コントローラが、
ａ）前記ピペットを使用して、前記第２電極に隣接して前記コンテナにおいて第１細胞を位置決めすることと、
ｂ）前記ピペットを使用して、前記第１細胞に隣接して前記コンテナにおいて第２細胞を位置決めすることと、
ｃ）前記第１細胞および前記第２細胞が、ほぼ前記電極間にあるように、前記第１細胞および前記第２細胞に隣接して前記ピペット・ポートを位置決めすることと、
ｄ）所定の場のシーケンスが前記細胞に印加され、それにより前記細胞を融合させるように、前記信号生成装置を稼動させることとによって、細胞を融合させるように適合される請求項５６に記載のピペット・システム。
【請求項５８】
ａ）放射源と、
ｂ）該放射源に結合された第１端部と、前記ポートに隣接する前記ノズルに結合された第２端部とを有し、それにより、該放射源からの放射が、使用時に前記ポートに隣接して位置決めされた粒子に当たることを可能にする、導波路とをさらに含む、請求項５１から５７のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項５９】
前記粒子によって放出される放射を検出するように適合された検出器を含む請求項５８に記載のピペット・システム。
【請求項６０】
前記検出器が前記導波路の前記第１端部に結合され、それにより前記粒子から放出された放射を検出する請求項５９に記載のピペット・システム。
【請求項６１】
前記放射源がレーザである請求項５８から６０のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項６２】
前記導波路が光ファイバ・ケーブルである請求項５８から６１のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項６３】
前記導波路が前記ノズルから形成され、前記ノズルが、前記放射源からの前記放射が前記ノズルに入り、前記ノズルの少なくとも一部に沿って進むことを可能にするように成形された部分を含み、前記放射が、前記ポートを経て前記ノズルから放出される請求項５８から６２のいずれか１項に記載のピペット・システム
【請求項６４】
ａ）前記作動装置を稼動させ、それにより前記ポートを経て流体を吸引および／または排出することと、
ｂ）前記放射源を稼動させ、それにより粒子を放射に暴露させることとの少なくとも一方を実施するように適合されるコントローラを含む、請求項５８から６３のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項６５】
前記駆動システムが、
ａ）前記ポートが粒子に隣接するように、ピペット・システムを位置決めすることと、
ｂ）前記放射源を稼動させ、それにより該粒子を放射に暴露させることと、
ｃ）該粒子によって放出されるあらゆる放射を検出することと、
ｄ）前記検出された放射に従って、該粒子が所定の特性を有するかを判定することと、
ｅ）成功した比較に従って前記作動装置を稼動させ、それにより前記ポートを経て流体を前記ノズル内に吸引して、それにより該粒子を回収することとによって、前記コンテナから所定の特性を有する粒子を回収するように適合されるコントローラに結合される、請求項５４および請求項６４に記載のピペット・システム。
【請求項６６】
前記作動装置が、
ａ）流体リザーバと、
ｂ）前記ノズルを該流体リザーバに結合する柔軟管と、
ｃ）該管を部分的に圧縮するように位置決めされたアームと、
ｄ）ｉ）該管をさらに圧縮して、それにより前記ポートを経て流体を排出することと、
ｉｉ）該管を減圧して、それにより前記ポートを経て流体を吸引することとの少なくとも一方を実施するために、該アームを移動させるように適合される作動装置駆動システムとを含む、請求項５１から６３のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項６７】
前記作動装置が、
ａ）前記管および／または膀胱に対して、前記アームを移動させるための第１作動装置ドライブと、
ｂ）使用時に前記管と接触するアーム端部分から形成され、該アーム端部分を伸張または収縮させるように適合される第２作動装置とを含む、請求項６６に記載のピペット・システム。
【請求項６８】
前記作動装置駆動システムに結合され、前記作動装置駆動システムを動作させて、それにより前記ポートを経て流体を吸引または排出するように適合されるコントローラを含む、請求項６６または請求項６７に記載のピペット・システム。
【請求項６９】
前記駆動システムが、
ａ）前記ポートが粒子に隣接するように、ピペット・システムを位置決めすることと、
ｂ）前記作動装置を稼動させ、それにより前記ポートを経て流体をノズル内に吸引して、それにより該粒子を回収することとによって、前記流体から粒子を回収するように適合されるコントローラに結合される、請求項６８に記載のピペット・システム。
【請求項７０】
前記管が、シリコン管から形成される、請求項６３から６９のいずれか１項に記載のピペット・システム。
【請求項７１】
添付の図面を参照してほぼ以上に記述した通りである粒子を操作するためのピペット・システム。
【国際調査報告】
2005534296.tif 000043
2005534296.tif 000044
2005534296.tif 000045
2005534296.tif 000046