(57)【要約】  本発明は、ストレプトマイセス・アトロオリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）におけるレイナマイシンの合成を担う遺伝子クラスターの詳細な配列分析および特徴付けを提供する。レイナマイシン遺伝子クラスターは、ハイブリッドポリケチドシンターゼ／非リボソーム型ペプチドシンテターゼ経路を提供する。該経路を特徴付けする様々なモジュールおよび酵素ドメインを解明することにより、レイナマイシン、レイナマイシンアナログ、ならびに他の様々なポリケチド類、ペプチド、およびハイブリッドペプチドポリケチドの天然産物のための簡便な合成ルートを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１および２において同定される１個以上のレイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＯＲＦ−３５〜−１、ｌｎｍＡ〜ｌｎｍＺ、および＋１〜＋９）をコードする核酸；
表１および２において同定される１以上のレイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＯＲＦ−３５〜−１、ｌｎｍＡ〜ｌｎｍＺ、および＋１〜＋９）のいずれかによってコードされるポリペプチドをコードする核酸；
表２において同定されるプライマー対のいずれか１つおよびテンプレートとしてレイナマイシン産生生物の核酸を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される核酸のヌクレオチド配列を含む核酸；ならびに
縮合（Ｃ）ドメイン、アデニル化（Ａ）ドメイン、ペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、縮合／環化ドメイン（Ｃｙ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）様ドメイン、酸化ドメイン（Ｏｘ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、ホスホトランスフェラーゼドメイン、ペプチドシンテターゼドメイン、およびアミノトランスフェラーゼドメインからなる群より選択される少なくとも１つの触媒ドメインを含むタンパク質をコードし、ストリンジェントな条件下で表１および２において同定される１以上のレイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＯＲＦ−３５〜−１、ｌｎｍＡ〜ｌｎｍＺ、および＋１〜＋９）に特異的にハイブリダイズする核酸、
からなる群より選択される核酸を含む単離された核酸。
【請求項２】
前記核酸は、表１および２において同定される少なくとも２つのオープンリーディングフレームをコードする核酸を含み、前記オープンリーディングフレームは、−３５、−３４、−３３、−３２、−３１、−３０、−２９、−２８、−２７、−２６、−２５、−２４、−２３、−２２、−２１、−２０、−１９、−１８、−１７、−１６、−１５、−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−７、−５、−４、−３、−２、−１、ｌｎｍＡ、ｌｎｍＢ、ｌｎｍＣ、ｌｎｍＤ、ｌｎｍＥ、ｌｎｍＦ、ｌｎｍＧ、ｌｎｍＨ、ｌｎｍＩ、ｌｎｍＪ、ｌｎｍＫ、ｌｎｍＬ、ｌｎｍＭ、ｌｎｍＮ、ｌｎｍＯ、ｌｎｍＰ、ｌｎｍＱ、ｌｎｍＲ、ｌｎｍＳ、ｌｎｍＴ、ｌｎｍＵ、ｌｎｍＶ、ｌｎｍＷ、ｌｎｍＸ、ｌｎｍＹ、ｌｎｍＺ、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、および＋９からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記核酸は、表１および２において同定される少なくとも３つのオープンリーディングフレームをコードする核酸を含み、前記オープンリーディングフレームは、−３５、−３４、−３３、−３２、−３１、−３０、−２９、−２８、−２７、−２６、−２５、−２４、−２３、−２２、−２１、−２０、−１９、−１８、−１７、−１６、−１５、−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−７、−５、−４、−３、−２、−１、ｌｎｍＡ、ｌｎｍＢ、ｌｎｍＣ、ｌｎｍＤ、ｌｎｍＥ、ｌｎｍＦ、ｌｎｍＧ、ｌｎｍＨ、ｌｎｍＩ、ｌｎｍＪ、ｌｎｍＫ、ｌｎｍＬ、ｌｎｍＭ、ｌｎｍＮ、ｌｎｍＯ、ｌｎｍＰ、ｌｎｍＱ、ｌｎｍＲ、ｌｎｍＳ、ｌｎｍＴ、ｌｎｍＵ、ｌｎｍＶ、ｌｎｍＷ、ｌｎｍＸ、ｌｎｍＹ、ｌｎｍＺ、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、および＋９からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記核酸はモジュールをコードする、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターの核酸によってコードされるタンパク質の２以上の触媒ドメインを含むモジュールをコードする核酸を含み、ここで、前記触媒ドメインは、縮合（Ｃ）ドメイン、アデニル化（Ａ）ドメイン、ペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、縮合／環化ドメイン（Ｃｙ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）様ドメイン、酸化ドメイン（Ｏｘ）、エノイルレダクターゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、ホスホトランスフェラーゼドメイン、ペプチドシンテターゼドメイン、およびアミノトランスフェラーゼドメインからなる群より選択される、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記核酸は配列表の配列番号１または配列表の配列番号１の相補体由来のオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記核酸は、表２において同定されるプライマー対のいずれか１つ、およびテンプレートとしてレイナマイシン産生生物の核酸を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される核酸のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項８】
レイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはその対立変異体を含む単離された核酸。
【請求項９】
前記核酸は、レイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一塩基多型（ＳＮＰ）である核酸を含む、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
レイナマイシンの集成を指令するのに十分なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、単離された遺伝子クラスター。
【請求項１１】
ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）およびペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）の両方を含む単離された多機能タンパク質複合体であって、ここで、前記ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）またはペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）は、レイナマイシン遺伝子クラスター由来の核酸によってコードされて見出されるＰＫＳもしくはＮＲＰＳのアミノ酸配列を有する、単離された多機能タンパク質複合体。
【請求項１２】
ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）およびペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）の両方を含む多機能タンパク質複合体をコードする単離された核酸であって、ここで、前記ポリケチドシンターゼまたはペプチドシンテターゼは、その生来の状態で、レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスター中に存在する、単離された核酸。
【請求項１３】
表１および２において同定される１以上のレイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＯＲＦ−３５〜−１、ｌｎｍＡ〜ｌｎｍＺ、および＋１〜＋９）によってコードされる触媒ドメイン；
表２において同定されるプライマー対のいずれか１つを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される核酸の配列を有する核酸によってコードされる触媒ドメイン；ならびに
レイナマイシン遺伝子クラスターの核酸によってコードされるタンパク質の２以上の触媒ドメインを含むモジュール、
からなる群より選択されるポリペプチドを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、縮合（Ｃ）ドメイン、アデニル化（Ａ）ドメイン、ペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、縮合／環化ドメイン（Ｃｙ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）様ドメイン、酸化ドメイン（Ｏｘ）、エノイルレダクターゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、ホスホトランスフェラーゼドメイン、ペプチドシンテターゼドメイン、およびアミノトランスフェラーゼドメインからなる群より選択される酵素ドメインを含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
レイナマイシン遺伝子クラスターの核酸は、表１および２において同定される少なくとも２つのオープンリーディングフレームをコードする核酸を含み、前記オープンリーディングフレームは、−３５、−３４、−３３、−３２、−３１、−３０、−２９、−２８、−２７、−２６、−２５、−２４、−２３、−２２、−２１、−２０、−１９、−１８、−１７、−１６、−１５、−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−７、−５、−４、−３、−２、−１、ｌｎｍＡ、ｌｎｍＢ、ｌｎｍＣ、ｌｎｍＤ、ｌｎｍＥ、ｌｎｍＦ、ｌｎｍＧ、ｌｎｍＨ、ｌｎｍＩ、ｌｎｍＪ、ｌｎｍＫ、ｌｎｍＬ、ｌｎｍＭ、ｌｎｍＮ、ｌｎｍＯ、ｌｎｍＰ、ｌｎｍＱ、ｌｎｍＲ、ｌｎｍＳ、ｌｎｍＴ、ｌｎｍＵ、ｌｎｍＶ、ｌｎｍＷ、ｌｎｍＸ、ｌｎｍＹ、ｌｎｍＺ、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、および＋９からなる群より選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
レイナマイシン遺伝子クラスターの前記核酸は、表１および２において同定される少なくとも３つのオープンリーディングフレームをコードする核酸を含み、前記オープンリーディングフレームは、−３５、−３４、−３３、−３２、−３１、−３０、−２９、−２８、−２７、−２６、−２５、−２４、−２３、−２２、−２１、−２０、−１９、−１８、−１７、−１６、−１５、−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−７、−５、−４、−３、−２、−１、ｌｎｍＡ、ｌｎｍＢ、ｌｎｍＣ、ｌｎｍＤ、ｌｎｍＥ、ｌｎｍＦ、ｌｎｍＧ、ｌｎｍＨ、ｌｎｍＩ、ｌｎｍＪ、ｌｎｍＫ、ｌｎｍＬ、ｌｎｍＭ、ｌｎｍＮ、ｌｎｍＯ、ｌｎｍＰ、ｌｎｍＱ、ｌｎｍＲ、ｌｎｍＳ、ｌｎｍＴ、ｌｎｍＵ、ｌｎｍＶ、ｌｎｍＷ、ｌｎｍＸ、ｌｎｍＹ、ｌｎｍＺ、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、および＋９からなる群より選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは、レイナマイシン遺伝子クラスターの核酸によってコードされるタンパク質の２以上の触媒ドメインを含むモジュールを含み、ここで、前記触媒ドメインは、縮合（Ｃ）ドメイン、アデニル化（Ａ）ドメイン、ペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、縮合／環化ドメイン（Ｃｙ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）様ドメイン、酸化ドメイン（Ｏｘ）、エノイルレダクターゼドメイン（ＥＲ）、メチルトランスフェラーゼドメイン、ホスホトランスフェラーゼドメイン、ペプチドシンテターゼドメイン、およびアミノトランスフェラーゼドメインからなる群より選択される、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
モジュールを含む単離されたポリペプチドであって、ここで、前記モジュールは、レイナマイシン（ｌｎｍ）モジュールに特異的に結合する抗体に特異的に結合される、単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドは、レイナマイシンオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体に特異的に結合される、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２２】
前記細胞は、レイナマイシンまたはレイナマイシンアナログの集成を指令するのに十分なポリペプチドをコードする遺伝子クラスターを含む外因性核酸で形質転換される、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記細胞は細菌細胞である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２４】
前記細胞はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞は真核細胞である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞は昆虫細胞である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２７】
分子を化学的に修飾する方法であって、１以上のレイナマイシン生合成遺伝子クラスターオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドに対する基質である分子と、１以上のレイナマイシン生合成遺伝子クラスターオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドとを接触させる工程を含み、ここで、前記ポリペプチドは前記分子を化学的に修飾する方法。
【請求項２８】
前記方法は、前記分子と、レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターオープンリーディングフレームによってコードされる少なくとも２つの異なるポリペプチドとを接触させる工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法は、前記分子と、レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターオープンリーディングフレームによってコードされる少なくとも３つの異なるポリペプチドとを接触させる工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記接触工程は宿主細胞においてである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞は細菌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記接触工程はエクスビボである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記分子は、前記宿主細胞によって産生される内因性代謝物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記分子は外因的に供給された代謝物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記宿主細胞は真核細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記真核細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記分子はアミノ酸であり、前記ポリペプチドはペプチドシンテターゼである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドはアミノトランスフェラーゼである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
レイナマイシンを過剰発現する細胞。
【請求項４０】
前記細胞は、レイナマイシンオープンリーディングフレームｌｎｍＬによってコードされるポリペプチドを過剰発現する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
レイナマイシンを産生する細胞であって、ここで、前記レイナマイシンを合成する１以上のタンパク質は、１以上の異種核酸によってコードされる、細胞。
【請求項４２】
前記異種核酸は、表１および２において同定される少なくとも３つのオープンリーディングフレームを含み、前記オープンリーディングフレームは、−３５、−３４、−３３、−３２、−３１、−３０、−２９、−２８、−２７、−２６、−２５、−２４、−２３、−２２、−２１、−２０、−１９、−１８、−１７、−１６、−１５、−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−７、−５、−４、−３、−２、−１、ｌｎｍＡ、ｌｎｍＢ、ｌｎｍＣ、ｌｎｍＤ、ｌｎｍＥ、ｌｎｍＦ、ｌｎｍＧ、ｌｎｍＨ、ｌｎｍＩ、ｌｎｍＪ、ｌｎｍＫ、ｌｎｍＬ、ｌｎｍＭ、ｌｎｍＮ、ｌｎｍＯ、ｌｎｍＰ、ｌｎｍＱ、ｌｎｍＲ、ｌｎｍＳ、ｌｎｍＴ、ｌｎｍＵ、ｌｎｍＶ、ｌｎｍＷ、ｌｎｍＸ、ｌｎｍＹ、ｌｎｍＺ、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、および＋９からなる群より選択される、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
第１および第２のアミノ酸と、組換えにより発現されるレイナマイシン非リボソーム型ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）とを接触させることを含む、第１のアミノ酸を第２のアミノ酸に結合する方法。
【請求項４４】
前記ＮＲＰＳは、ＮＲＰＳ−１、およびＮＲＰＳ−２からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項４５】
前記接触工程は宿主細胞においてである、請求項４９に記載の方法。
【請求項４６】
第１および第２の脂肪酸と、組換えにより発現されるレイナマイシンポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）とを接触させる工程を含む、第１の脂肪酸を第２の脂肪酸に結合する方法。
【請求項４７】
前記ＰＫＳは、ｌｎｍＰＫＳ−１、ＰＫＳ−２、ＰＫＳ−３、ＰＫＳ−４、ＰＫＳ−５、およびＰＫＳ−６からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記接触工程は宿主細胞においてである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
レイナマイシンまたはレイナマイシンアナログを産生する方法であって、
前記レイナマイシンまたはレイナマイシンアナログの集成を指令するのに十分なポリペプチドをコードするレイナマイシン遺伝子クラスターを含む外因性核酸で形質転換した細胞を提供する工程；
レイナマイシンまたはレイナマイシンアナログの生合成を可能にする条件下で細胞を培養する工程；および
前記細胞から前記レイナマイシンまたはレイナマイシンアナログを単離する工程、
を含む方法。
【請求項５０】
レイナマイシンアナログを産生する方法であって、
レイナマイシン遺伝子クラスターを含む細胞を提供する工程；
遺伝子クラスターが、前記レイナマイシンアナログを合成する生合成経路をコードするように、相同組換えを介してレイナマイシン遺伝子クラスターを改変する核酸で細胞をトランスフェクトする工程；
レイナマイシンアナログの生合成を可能にする条件下で細胞を培養する工程；および
細胞からレイナマイシンアナログを単離する工程、
を含む方法。
【請求項５１】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む単離された核酸であって、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、
図５のｌｍｐによってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、ここで、前記核酸は、ストリンジェントな条件下で図５のｌｍｐによってコードされる配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズする核酸、
からなる群より選択される、単離された核酸。
【請求項５２】
前記核酸は、図５におけるｌｍｐの配列を含む、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５３】
前記核酸はベクターを含む、請求項５１に記載の核酸。
【請求項５４】
請求項５１に記載の核酸によってコードされるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを含むポリペプチド。
【請求項５５】
請求項５１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５６】
請求項５５に記載のベクターでトランスフェクトされた細胞。
【請求項５７】
アポキャリアタンパク質をホロキャリアタンパク質に変換する方法であって、前記アポキャリアタンパク質と、請求項５１に記載の核酸によってコードされる組換えホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよび補酵素Ａとを反応させ、それによってホロキャリアタンパク質を生成させる方法。
【請求項５８】
修飾されたレイナマイシン遺伝子クラスター核酸を含む細胞であって、前記細胞は、野生型細胞と比較して増加した量のレイナマイシンを産生する、細胞。
【請求項５９】
前記細胞は、レイナマイシン遺伝子クラスターから耐性遺伝子を過剰発現する、請求項５８に記載の細胞。
【請求項６０】
前記耐性遺伝子は、表２に列挙された遺伝子である、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６１】
表２において同定されるｌｎｍオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項６２】
前記抗体は単一鎖抗体である、請求項６１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００１年３月２６日に出願された米国特許出願第６０／２７８，９３５号（すべての目的についてその全体が参考として本明細書に援用される）の利益および優先権を主張する。
連邦政府の支援による研究および開発から生じた発明の権利に関する陳述
［適用不可］
【０００２】
技術分野
本発明は、ポリケチド合成および非リボソーム型ポリペプチド合成の分野に関する。詳細には、本発明は、レイナマイシンの生合成を担う遺伝子クラスターの単離、配列決定、および特徴付けに関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリケチドおよび非リボソーム型ペプチドは、エリスロマイシンおよびバンコマイシン（抗細菌剤）、ＦＫ５０６およびシクロスポリン（免疫抑制剤）、ならびにエポシロン、およびブレオマイシン、またはレイナマイシン（抗腫瘍剤）などの多くの臨床的に価値のある薬物を含む天然産物の２つの大きなファミリーである。ポリケチドおよび非リボソーム型ペプチドの生合成は、それぞれポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）（ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：２４６５；カッツ（Ｋａｔｚ）（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７：２５５７；Ｃ．コスラ（Ｃ．Ｋｈｏｓｌａ）、（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７：２５７７；イケダ（Ｉｋｅｄａ）およびオムラ（Ｏｍｕｒａ）、（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７：２５９１；スタントン（Ｓｔａｕｎｔｏｎ）およびウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７：２６１１；キャネ（Ｃａｎｅ）ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：６３）および非リボソーム型ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）（キャネ（Ｃａｎｅ）ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：６３．マラヒール（Ｍａｒａｈｉｅｌ）ら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：２６５１；フォン・ドレン（ｖｏｎ  Ｄｏｅｈｒｅｎ）ら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：２６７５）によって触媒される。特に、ＰＫＳおよびＮＲＰＳは、それぞれ、短いカルボン酸およびアミノ酸の連続縮合によるこれらの２つのクラスの天然産物の集成について極めて類似のストラテジーを使用し、同一の４'−ホスホパンテテイン補綴基を利用し、チオエステル結合を介して、伸長過程中に成長しているポリケチドまたはペプチド中間体を分岐（ｃｈａｎｎｅｌ）する。
【０００４】
Ｉ型ＰＫＳおよびＮＲＰＳの両方は、モジュールに構成される多機能タンパク質である。（モジュールは、１サイクルのポリケチドまたはペプチド鎖伸長および関連する修飾に必要なすべての酵素活性をコードする特殊なドメインの組として規定される。）モジュールの数および順序ならびに各ＰＫＳまたはＮＲＰＳタンパク質上のモジュール内のドメインのタイプは、組み入れようとするカルボン酸およびアミノ酸の数、順序、選択、および特定の伸長サイクルに関連する修飾を指令することによって、得られるポリケチドおよびペプチド産物の構造の変動を決定する。ＰＫＳ（キャネ（Ｃａｎｅ）ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：６３；カッツ（Ｋａｔｚ）およびダナディオ（Ｄａｎａｄｉｏ）（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：８７５（１９９３））ならびにＮＲＰＳ（キャネ（Ｃａｎｅ）ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：６３、スタケルハウス（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ）ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：６９；スタッヘルハウス（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ）ら（１９８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５７：３０８；ベルシャウ（Ｂｅｌｓｈａｗ）ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４，４８６）の両方のモジュールの構造は、多様な「非天然型」天然産物のコンビナトリアル生合成において首尾よく活用されており、カルボン酸およびアミノ酸の両方を最終産物に組み入れることが可能なハイブリッドＰＫＳおよびＮＲＰＳ系は、さらにより大きな化学構造多様性を生じることができる。
【０００５】
レイナマイシン（Ｌｎｍ）は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種より産生される新規の抗腫瘍抗生物質である（ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：３３３−３３５；ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：１７６８−１７７４；ナカノ（Ｎａｋａｎｏ）ら（１９９２）７２−７５頁、Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｅｘｐｏ．９ｔｈ、ラディッシュＭ．Ｒ．（Ｌａｄｉｓｃｈ，Ｍ．Ｒ．）およびボーズＡ．（Ｂｏｓｅ，Ａ．）編、ＡＣＳ：ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．））。その構造は、Ｘ線結晶学（ＨｉｒａｙａｍａおよびＭａｔｓｕｚａｗａ（１９９３）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９５７−１９５８）ならびに分光分析（ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：３３３−３３５；ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：１７６８−１７７４）によって示され、全合成（カンダ（Ｋａｎｄａ）およびフクヤマ（Ｆｕｋｕｙａｍａ）（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８４５１−８４５２；フクヤマ（Ｆｕｋｕｙａｍａ）およびカンダ（Ｋａｎｄａ）（１９４）Ｊ．Ｓｙｎｔｈ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｐａｎ，５２，８８８−８９９）によって確認された。それは、チアゾール含有１８員ラクタム環にスピロ縮合している通常認められない１，３−ジオキソ−１，２−ジチオラン部分（他のいずれの天然産物においてもこれまで見出されていない分子構造）を含有する（図１）。
【０００６】
Ｌｎｍは、グラム陽性およびグラム陰性細菌に対して広範な抗微生物活性スペクトルを示すが、菌類に対しては示さない。Ｌｎｍは、ＨｅＬａ  Ｓ３（ヒーラＳ３）、ｓａｒｃｏｍａ１８０（サルコーマ１８０）、Ｂ−１６、Ｃｏｌｏｎ２６（コロン２６）、およびｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｐ３８８（ローケミアＰ３８８）を含むマウス腫瘍モデルにおいてインビボで強力な抗腫瘍活性を示す。Ｌｎｍは、シスプラチン、ドキソルビシン、マイトマイシン、またはシクロホスファミドなどの臨床上重要な抗腫瘍薬物に対して抵抗性である腫瘍を摂取されたマウスモデルに対しても有効である（ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：３３３−３３５；ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：１７６８−１７７４；ナカノ（Ｎａｋａｎｏ）ら（１９９２）７２−７５頁、Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｅｘｐｏ．９ｔｈ、ラディッシュＭ．Ｒ．（Ｌａｄｉｓｃｈ，Ｍ．Ｒ．）およびボーズＡ．（Ｂｏｓｅ，Ａ．）編、ＡＣＳ：ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．））。Ｌｎｍは、ＤＮＡ合成を好適に阻害し、ＤＮＡと直接相互作用して、補因子としてのチオール剤の存在下でＤＮＡの一本鎖切断を生じる。ジチオラン部分におけるスルホキシド基の存在は、ＤＮＡ切断活性に必須である（Ｈａｒａら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９：５６７６−５６８１）。興味深いことに、単純な１，３−ジオキソ−１，２−ジチオラン類もまた、インビトロでのチオール依存性ＤＮＡ切断剤である（ベヘロージ（Ｂｅｈｒｏｏｚｉ）ら（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：３９６４−３９６６；ベヘロージ（Ｂｅｈｒｏｏｚｉ）ら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：１７６８−１７７４；ミトラ（Ｍｉｔｒａ）ら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１１６９１−１１６９２）。しかし、単純な１，３−ジオキソ−１，２−ジチオラン類およびＬｎｍによるＤＮＡ切断の機構は、個別に、分子状の酸素をポリスルフィド類によって仲介されるＤＮＡ切断酸素ラジカルに変換する１，３−ジオキソ−１，２−ジチオラン類による酸化的切断（ベヘロージ（Ｂｅｈｒｏｏｚｉ）ら（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：３９６４−３９６６；ベヘロージ（Ｂｅｈｒｏｏｚｉ）ら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３５：１７６８−１７７４；ミトラ（Ｍｉｔｒａ）ら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１１６９１−１１６９２）およびエピスルホニウムイオン中間体によって仲介されるＬｎｍによるアルキル化切断（ａｌｋｙｌａｔｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ）（ミトラ（Ｍｉｔｒａ）ら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：１１６９１−１１６９２；アサイ（Ａｓａｉ）ら（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：６８０２−６８０３；アサイ（Ａｓａｉ）ら（１９９７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：７２３−７２９）である（図１）。後者の機構は、Ｌｎｍによるチオール依存性ＤＮＡ切断に対する新規の作用態様を表す。
【０００７】
臨床的に有用なＬｎｍアナログを発見することを目的として、全合成（カンダ（Ｋａｎｄａ）およびフクヤマ（Ｆｕｋｕｙａｍａ）（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８４５１−８４５２；フクヤマ（Ｆｕｋｕｙａｍａ）およびカンダ（Ｋａｎｄａ）（１９４）Ｊ．Ｓｙｎｔｈ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｊａｐａｎ，５２，８８８−８９９；パッテンデン（Ｐａｔｔｅｎｄｅｎ）およびシュッカー（Ｓｈｕｋｅｒ）（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３２：６６２５−６６２８；パッテンデン（Ｐａｔｔｅｎｄｅｎ）およびシュッカー（Ｓｈｕｋｅｒ）（１９９２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ  Ｉ，１２１５−１２２１；カンダ（Ｋａｎｄａ）ら（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３３：５７０１−５７０４；パッテンデン（Ｐａｔｔｅｎｄｅｎ）およびテョム（Ｔｈｏｍ）（１９９３）Ｓｙｎｌｅｔｔ２１５−２１６）および天然のＬｎｍの化学修飾が調べられている。Ｃ−１８ヒドロキシおよびＣ−９ケト基ならびに１，３−ジオキソ−１，２−ジチオラン部分の両方での修飾は、改善された抗腫瘍活性およびインビボでの安定性を有する多くのＬｎｍアナログを生じており（Ｋａｎｄａら（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：９０９−９１２；Ｋａｎｄａら（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：１３３０−１３３２）、これは、Ｌｎｍ骨格に基づく新規の抗癌薬を作製するという見識を支持する。しかし、Ｌｎｍのような複雑な分子では、化学的全合成は実用的価値が極めて限られており、化学修飾のみが限定された官能基にアクセスすることができ、しばしば、臨時的な保護／脱保護工程を必要とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、レイナマイシン遺伝子クラスター（配列表の配列番号１を参照のこと）の単離および解明に関する。この遺伝子クラスター（核酸配列）は、レイナマイシンの生合成を指令するのに十分なポリペプチドをコードするすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。核酸は、「生来の」形式で使用することができ、広範な様式で組換えて新規の合成経路を作製することができる。
【０００９】
従って、１つの実施態様において、本発明は、１）表１および２において同定される１以上のレイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＯＲＦ−３５〜−１、ｌｎｍＡ〜ｌｎｍＺ、および＋１〜＋９）をコードする核酸；２）表１および２において同定される１以上のレイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（ＯＲＦ−３５〜−１、ｌｎｍＡ〜ｌｎｍＺ、および＋１〜＋９）のいずれかによってコードされるポリペプチドをコードする核酸；３）表２において同定されるプライマー対のいずれか１つおよびテンプレートとしてレイナマイシン産生生物の核酸を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される核酸のヌクレオチド配列を含む核酸；ならびに４）縮合（Ｃ）ドメイン、アデニル化（Ａ）ドメイン、ペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、縮合／環化ドメイン（Ｃｙ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）様ドメイン、酸化ドメイン（Ｏｘ）、エノイルレダクターゼドメイン（ＥＲ）、メチルトランスフェラーゼドメイン、ホスホトランスフェラーゼドメイン、ペプチドシンテターゼドメイン、およびアミノトランスフェラーゼドメインからなる群より選択される少なくとも１つの触媒ドメインを含むタンパク質をコードし、ストリンジェントな条件下で１以上のｌｎｍＯＲＦ−３５〜−１、ｌｎｍＡ〜ｌｎｍＺ、および／または＋１〜＋９）に特異的にハイブリダイズする核酸、からなる群より選択される核酸を含む単離された核酸を提供する。
【００１０】
特定の実施態様では、単離された核酸は、レイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム−３５〜−１、ｌｎｍＡ〜ｌｎｍＺ、および＋１〜＋９からなる群より独立して選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、最も好ましくは少なくとも５つのオープンリーディングフレームをコードする核酸を含む。特に好適な実施態様では、単離された核酸はモジュールをコードする。もう１つの実施態様では、核酸は、レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターの核酸によってコードされる部分の２つ以上の触媒ドメインを含むモジュールをコードする核酸を含み、ここで、触媒ドメインは、縮合（Ｃ）ドメイン、アデニル化（Ａ）ドメイン、ペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、縮合／環化ドメイン（Ｃｙ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）様ドメイン、酸化ドメイン（Ｏｘ）、エノイルレダクターゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、ホスホトランスフェラーゼドメイン、ペプチドシンテターゼドメイン、およびアミノトランスフェラーゼドメインからなる群より選択される。特に好適な実施態様では、核酸は、配列表の配列番号１由来のオープンリーディングフレームまたはその相補体（例えば、表２に記載のような）を含む。他の好適な実施態様では、核酸は、表２において同定されるプライマー対のいずれか１つおよびテンプレートとしてレイナマイシン産生生物（例えば、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ））の核酸を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される核酸のヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
なおさらにもう１つの実施態様では、本発明は、レイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはその対立遺伝子変異体（例えば、レイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一塩基多型（ＳＮＰ））を含む単離された核酸を提供する。
【００１２】
もう１つの実施態様では、本発明は、レイナマイシンの集成を指令するのに十分なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、単離された遺伝子クラスターを提供する。
【００１３】
１つの実施態様では、本発明は、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）およびペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）の両方を含み、ここで、ポリケチドシンターゼまたはペプチドシンテターゼは、レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターよってコードされるＰＫＳもしくはＮＲＰＳのアミノ酸配列を有する、多機能タンパク質複合体をコードする単離された核酸を提供する。
【００１４】
本発明はまた、多様なタンパク質を提供する。即ち、１つの実施態様では、本発明は、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）およびペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）の両方を含み、ここで、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）および／またはペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）は、レイナマイシン遺伝子クラスター由来の核酸によってコードされて見出されるＰＫＳもしくはＮＲＰＳのアミノ酸配列を有する、単離された多機能タンパク質複合体を提供する。
【００１５】
もう１つの実施態様では、本発明は、１）１以上のレイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（例えば、ＯＲＦ３５〜−１、ｌｎｍＡ〜ｌｎｍＺ、および＋１〜＋９（例えば、表２において同定されるような））によってコードされる触媒ドメイン；２）表２において同定されるプライマー対のいずれか１つを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される核酸の配列を有する核酸によってコードされる触媒ドメイン；ならびに３）レイナマイシン遺伝子クラスターの核酸によってコードされるタンパク質の２以上の触媒ドメインを含むモジュールからなる群より選択されるポリペプチドを提供する。好適な実施態様では、該ポリペプチドは、縮合（Ｃ）ドメイン、アデニル化（Ａ）ドメイン、ペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、縮合／環化ドメイン（Ｃｙ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）様ドメイン、酸化ドメイン（Ｏｘ）、エノイルレダクターゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、ホスホトランスフェラーゼドメイン、ペプチドシンテターゼドメイン、およびアミノトランスフェラーゼドメインからなる群より選択される酵素ドメインを含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、レイナマイシン（ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム１〜７２からなる群より独立して選択される少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、最も好ましくは少なくとも５つのオープンリーディングフレームによってコードされるドメインを含む。特定の実施態様では、該ポリペプチドは、レイナマイシン遺伝子クラスターの核酸によってコードされるタンパク質の２以上の触媒ドメインを含むモジュールを含むことができ、ここで、該触媒ドメインは、縮合（Ｃ）ドメイン、アデニル化（Ａ）ドメイン、ペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメイン、縮合／環化ドメイン（Ｃｙ）、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）様ドメイン、酸化ドメイン（Ｏｘ）、エノイルレダクターゼドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、ホスホトランスフェラーゼドメイン、ペプチドシンテターゼドメイン、およびアミノトランスフェラーゼドメインからなる群より選択される。
【００１６】
もう１つの実施態様では、本発明は、モジュールを含み、ここで、該モジュールは、レイナマイシン（ｌｎｍ）モジュール（例えば、ｌｎｍポリペプチドと交差反応性である）に特異的に結合する抗体に特異的に結合される、単離されたポリペプチドを提供する。好適な実施態様では、ポリペプチドは、レイナマイシンオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体によって特異的に結合される。
【００１７】
特定の実施態様では、本発明は、本明細書に記載の１以上の核酸のいずれかを含む発現ベクターを提供する。核酸は、好ましくは、プロモーター（例えば、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターなど）に操作可能に連結される。また、そのようなベクターでトランスフェクトおよび／または形質転換された宿主細胞も提供される。即ち、１つの実施態様では、本発明は、レイナマイシンまたはレイナマイシンアナログの集成を指令するポリペプチドをコードする遺伝子クラスターを含む外因性核酸、および／またはｌｎｍ遺伝子クラスターに修飾を導入するのに十分な核酸（例えば、相同組換えを介して）でトランスフェクトならびに／あるいは形質転換された宿主細胞（例えば、細菌細胞）を提供する。特に好適な細胞として、真核細胞、昆虫細胞、および細菌細胞（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明はまた、分子を化学的に修飾する方法を提供する。方法は、１以上のレイナマイシン生合成遺伝子クラスターオープンリーディングフレーム（例えば、レイナマイシン中間代謝物）によってコードされるペプチドに対する基質である分子と１以上の生合成遺伝子クラスターオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドトを接触させ、これによって、ポリペプチドは分子を化学的に修飾することを要する。好適な実施態様では、方法は、分子と、レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターオープンリーディングフレームによってコードされる少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つ、最も好ましくは少なくとも５つの異なるポリペプチドとを接触させることを含む。接触工程は、エクスビボであるかまたは宿主細胞（例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの細菌）においてであり得る。該分子には、宿主細胞により産生される内因性代謝物かまたは外因的に供給される代謝物が含まれる。特定の実施態様では、細胞は真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞、および昆虫細胞）である。特定の実施細胞では、（基質）分子はアミノ酸であり、ポリペプチドはペプチドシンテターゼである。特定の実施態様では、ポリペプチドはアミノトランスフェラーゼである。
【００１９】
さらにもう１つの実施態様では、本発明は、レイナマイシンを過剰発現する細胞を提供する。特に好適な細胞は、レイナマイシンオープンリーディングフレームｌｎｍＧおよび／またはｌｎｍＬによってコードされるポリペプチドを過剰発現する。
【００２０】
本発明はまた、第１のアミノ酸を第２のアミノ酸に結合させる方法を提供する。方法は、第１および第２のアミノ酸と組換え的に発現させたレイナマイシン非リボソーム型ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）（例えば、ＮＲＰＳ−１、ＮＲＰＳ−２など）とを接触させることを含むことを要する。接触工程は、エクスビボであるかまたは宿主細胞（例えば、細菌）においてであり得る。
【００２１】
本発明はまた、第１の脂肪酸を第２の脂肪酸に結合させる方法を提供する。方法は、第１および第２の脂肪酸と組換え的に発現させたレイナマイシンポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）（例えば、ＰＫＳ−１、ＰＫＳ−２、ＰＫＳ−３、ＰＫＳ−４、ＰＫＳ−５、ＰＫＳ−６）とを接触させることを要する。接触工程は、エクスビボであるかまたは宿主細胞（例えば、細菌）においてであり得る。
【００２２】
１つの実施態様では、本発明は、レイナマイシンまたはレイナマイシンアナログを産生させる方法を提供する。方法は、レイナマイシンまたはレイナマイシンアナログの集成を指令するのに十分なポリペプチドをコードするレイナマイシン遺伝子クラスターを含む外因性核酸で形質転換された細胞を提供すること；レイナマイシンまたはレイナマイシンアナログの生合成を可能にする条件下で細胞を培養すること；および細胞からレイナマイシンまたはレイナマイシンアナログを単離することを要する。
【００２３】
もう１つの実施態様では、本発明は、レイナマイシンアナログを産生させる方法を提供する。方法は、レイナマイシン遺伝子クラスターを含む細胞を提供すること、相同組換えを介してレイナマイシン遺伝子クラスターを変更する核酸で細胞をトランスフェクトすること、レイナマイシンアナログの生合成を可能にする条件下で細胞を培養すること；および細胞からレイナマイシンアナログを単離することを要する。
【００２４】
さらにもう１つの実施態様では、本発明は、  ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする核酸を含む単離された核酸であって、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする前記核酸は、１）図５のｓａｍ（ストレプトマイセス・アトロオリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ）によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸；２）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、ここで、前記核酸は、ストリンジェントな条件下で図５のｓａｍ（ストレプトマイセス・アトロオリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ）によってコードされる配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズする、核酸からなる群より選択される、単離された核酸を提供する。特に好適な実施態様では、核酸は、図５におけるｌｍｐの配列を含む。上記のように、核酸はベクターを含み、そのようベクターを含む細胞が本明細書において提供される。上記のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ核酸によってコードされるポリペプチドも提供される。
【００２５】
本発明はまた、アポキャリアタンパク質をホロキャリアタンパク質に変換する方法であって、該アポキャリアタンパク質と、上記のｌｎｍＰＰＴａｓｅ核酸によってコードされる組換えホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよび補酵素Ａとを反応させ、それによってホロキャリアタンパク質を生成させる、上記方法を提供する。
【００２６】
さらになおもう１つの実施態様では、本発明は、修飾されたレイナマイシン遺伝子クラスター核酸を含む細胞であって、該細胞は、野生型細胞と比較して増加した量のレイナマイシンを産生する、上記細胞を提供する。特に好適な細胞は、レイナマイシン遺伝子クラスターから耐性遺伝子（例えば、表２に列挙された耐性遺伝子）を過剰発現する。
【００２７】
本発明はまた、表２において同定されるｌｎｍオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。抗体としては、無傷な（ｉｎｔａｃｔ）酵素、酵素フラグメント、および単一鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
定義
「ポリケチドシンターゼ」（ＰＫＳ）は、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）に関連する多機能酵素を指す。ＰＫＳは、アシルチオエステル（通常、アセチル、プロピオニル、マロニルまたはメチルマロニル）間の反復型（脱炭酸的）クライゼン縮合を介するポリケチドの生合成を触媒する。各縮合後、それらは、成長しているポリケチド鎖のβケト基上のケト還元、脱水素、およびエノイル還元を含む還元サイクルのすべてもしくは一部を触媒するかまたは触媒しないことによって産物に構造変動性を典型的に導入する。ＰＫＳは、縮合サイクルを変動することに加えて、鎖長全体、プライマーおよび伸長単位の選択、ならびに特に方向性ポリケチドの場合、発生期のポリケチド鎖の位置特異的環化を制御することによって、多量の構造多様性をそれらの産物に組み入れる。炭素鎖が、各特定の産物に特徴的な長さにまで成長した後、炭素鎖は、典型的に、チオ開裂またはアシル基転移によりシンターゼから遊離する。即ち、ＰＫＳは、所定のポリケチドを産生するために共に作用する酵素のファミリーからなる。ＰＫＳの２つの一般的なクラスが存在する。１つのクラスは、Ｉ型ＰＫＳとして公知であり、エリスロマイシンなどのマクロライド系薬剤に対するＰＫＳに相当する。これらの「複合的」または「モジュールの」ＰＫＳは、いくらかの大きな多機能タンパク質の集成体を含み、該タンパク質は、それらの間に、炭素鎖の集成および修飾の各工程のための個別の活性部位の組を担持している（コーテス（Ｃｏｒｔｅｓ）ら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：１７６；ドナジオ（Ｄｏｎａｄｉｏ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：６７５；マックニール（ＭａｃＮｅｉｌ）ら（１９９２）Ｇｅｎｅ１１５：１１９）。ＰＫＳの活性部位の数およびタイプの変動からこのクラスにおける構造多様性が生じる。このクラスのＰＫＳは、ＰＫＳの１次配列における活性部位の数およびクラスター化とポリケチド骨格の構造との間の１対１相関性を示す。第２のクラスのＰＫＳは、ＩＩ型ＰＫＳと呼ばれ、芳香性化合物に対するシンターゼに相当する。ＩＩ型ＰＫＳは、典型的に、反復使用される活性部位の単一の組を有する（ビブ（Ｂｉｂｂ）ら（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：２７２７；シャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）ら（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：２７１７；ファーナンデス−モレノ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ）ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９２７８）。
【００２９】
「非リボソーム型ペプチドシンターゼ」（ＮＲＰＳ）は、しばしばチオテンプレート合成（クラインカウフ（Ｋｌｅｉｎｋａｕｆ）およびフォン・ドエフェルン（ｖｏｎ  Ｄｏｅｈｒｅｎ）（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１：２５９−２８９）として公知である非リボソーム機構によってペプチドの合成を担う真核生物または原核生物起源の酵素複合体を指す。２０以上のアミノ酸長までであり得るそのようなペプチドは、直鎖状、環状（シクロスポリン、チロシジン、マイコバシリン、サーファクチンなど）または分岐環状構造（ポリミキシン、バシトラシンなど）を有することができ、しばしば、タンパク質中には存在しないアミノ酸またはメチル化もしくはエピマー化を介して修飾されたアミノ酸を含有する。
【００３０】
「モジュール」は、１サイクルのポリケチドまたはペプチド鎖伸長および関連する修飾に必要なすべての酵素活性をコードする特殊なドメインの組を指す。
【００３１】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、生来の状態で見出されるように、物質に通常伴う成分を実質的または本質的に含まない物質を指す。核酸および／またはポリペプチドについて、該用語は、天然で、それらに典型的に隣接する配列がもはや隣接しない核酸またはポリペプチドを指すことができる。
【００３２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書において交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。該用語は、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学アナログであるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに当てはまる。該用語はまた、ポリペプチドを作製するアミノ酸を接続する従来のペプチド結合上の変異体を含む。
【００３３】
用語「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」または本明細書における文法的等価物は、共に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、一般にホスホジエステル結合を含有するが、但し場合によっては、以下に概要するように、例えば、ホスホルアミド（ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９（１０）：１９２５）および本明細書に記載の参考文献；レッツシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；スプリンズル（Ｓｐｒｉｎｚｌ）ら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；レッツシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７；サワイ（Ｓａｗａｉ）ら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５，レッツシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｎｌ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；ならびにパウエルズ（Ｐａｕｗｅｌｓ）ら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ２６：１４１９）、ホスホロチオエート（マグ（Ｍａｇ）ら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７；および米国特許第５，６４４，０４８号明細書）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら（１９８９）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１１  ：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（エグホルム（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと）、ならびにペプチド核酸骨格および結合（エグホルム（Ｅｇｈｏｌｍ）（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；メイエル（Ｍｅｉｅｒ）ら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６；カールスソン（Ｃａｒｌｓｓｏｎ）ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８０：２０７を参照のこと）を含む代替的骨格を有し得る核酸アナログが含まれる。特に、核酸は、陽性骨格（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７）、非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号明細書、同第５，６３７，６８４号明細書、同第５，６０２，２４０号明細書、同第５，２１６，１４１号明細書および同第４，４６９，８６３号明細書；アンゲウ（Ａｎｇｅｗ．）（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ３０：４２３；レッツシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；レッツシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ１３：１５９７；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２ａｎｄ３，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｙ．Ｓ．サングフイ（Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ）およびＰ．ダン・クック（Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ）編；メスマエカー（Ｍｅｓｍ���ｅｋｅｒ）ら（１９９４），  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；ジェフス（Ｊｅｆｆｓ）ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））ならびに非リボソーム骨格を含み、米国特許第５，２３５，０３３号明細書および同第５，０３４，５０６号明細書ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ  ６ａｎｄ７，  ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｙ．Ｓ．サングフイ（Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ）およびＰ．ダン・クック（Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ）編に記載の骨格を含む。１以上の炭素環式糖を含有する核酸も核酸の規定内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｌ６９−１７６頁を参照のこと）。いくらかの核酸アナログがＲａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎｅ２，１９９７、３５頁に記載されている。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾を行って、標識などのさらなる部分の付加を容易にするか、または生理学的環境におけるその様な分子の安定性および半減期を増加してもよい。
【００３４】
用語「異種の」は、コーディング配列および制御配列などの核酸に関し、組換え構築物の領域とは通常関連せず、および／または特定の細胞とは通常関連しない配列を指す。従って、核酸構築物の「異種の」領域は、天然では他の分子との関連が見出されない別の核酸分子内にあるかまたは該核酸分子に付着した核酸の同定可能なセグメントである。例えば、構築物の異種領域は、天然ではコーディング配列との関連が見出されない配列が隣接するコーディング配列を含み得る。異種コーディング配列のもう１つのレイは、コーディング配列自体が天然では見いだされない（例えば、生来の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物である。同様に、宿主細胞には通常存在しない構築物で形質転換された宿主細胞は、本発明の目的のために異種であるとみなされる。
【００３５】
「コーディング配列」または特定のポリペプチド（例えば、ＰＫＳ、ＮＲＰＳなど）を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に配置された場合にインビトロおよび／またはインビボで究極的に該ポリペプチドに転写および／または翻訳される核酸配列である。特定の実施態様では、コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コーディング配列には、原核生物または真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえ含まれるが、これらに限定されない。好適な実施態様では、転写終了配列は、通常、コーディング配列の３’側に配置される。
【００３６】
発現「制御配列」は、集合的に、プロモーター配列、リボソーム配列、ポリアデニル化シグナル、転写終了配列、上流制御ドメイン、エンハンサーなどを指し、宿主細胞にコーディング配列の転写および翻訳を集合的に提供する。所望の遺伝子の転写および翻訳が可能である限り、必ずしもこれらのすべての制御配列が組換えベクターに存在する必要はない。
【００３７】
「組換え」は、２つのＤＮＡまたはＲＮＡ分子間のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列のセクションの再構築を指す。「相同組換え」は、各ＤＮＡ分子に存在する相同または相補的ヌクレオチド配列によってハイブリダイズする２つのＤＮＡ分子間に生じる。
【００３８】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」は、プローブがその標的配列に好ましくハイブリダイズし、より低い適度か、またはまったくストリンジェントでない程度では他の配列にもハイブリダイズする条件を指す。サザンおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験に関する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメータ下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、ティジェッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）（１９９３）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｒｚｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ、ニューヨーク州エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において見出される。一般に、高いストリンジェントのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特異的配列に対する熱融点（Ｔm ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔm は、標的配列の５０％が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする（規定されたイオン強度およびｐＨでの）温度である。極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブに対するＴm に等しくなるように選択される。
【００３９】
サザンまたはノーザンブロットにおいてフィルター上に１００個を超える相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションに対するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを有する５０％ホルムアミドであり、ハイブリダイゼーションは１晩行われる。高いストリンジェントな洗浄条件の例は７２℃で約１５分間の０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液に関する説明についてはサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （第２版）第１〜３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（ＮＹ）を参照のこと）。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄を低ストリンジェンシー洗浄よりも先に行い、バックグランドプローブシグナルを除去する。例えば１００ヌクレオチドを超える二重鎖の例示的中等度ストリンジェンシー洗浄は４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば１００ヌクレオチドを超える二重鎖の例示的低ストリンジェンシー洗浄は４０℃で１５分間の４〜６×ＳＳＣである。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて関連しないプローブについて観察される非より２倍（またはそれより高い）シグナル対ノイズ比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。核酸がコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸はなお実質的に同定である。このことは、例えば、遺伝子コードによって容認される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーが作製される場合に生じる。
【００４０】
ポリケチドおよび／またはポリペプチドの「ライブラリー」あるいは「コンビナトリアルライブラリー」は、ＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳならびに／あるいはハイブリッドＰＫＳ／ＮＲＰＳ（あるいは合成エレメントの他の可能な組み合わせ）遺伝子クラスターによって触媒的に産生されるポリケチドおよび／またはポリペプチド（あるいは他の分子）の集合を意味することが意図される。ライブラリーは、芳香性、モジュラーまたは菌類のＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ由来の生来、相同もしくは変異遺伝子の任意の組み合わせを含有する遺伝子クラスターによって生成することができる。遺伝子の組み合わせは、単一のＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ遺伝子クラスター、例えば、ａｃｔ、ｆｒｅｎ、ｇｒａ、ｔｃｍ、ｗｈｉＥ、ｇｒｉｓ、ｅｒｙなどから誘導することができ、必要に応じて、ポリペプチド、ポリケチド、または他の分子のさらなる修飾を触媒することが可能なテーラリング（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）酵素をコードする遺伝子を含むことができる。あるいは、遺伝子の組み合わせは、ＮＲＰＳおよび／またはＰＫＳの類別から合理的または確率的に誘導することができる。そのようにして生成されるポリケチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいは他の分子のライブラリーは、生物学的、薬学的または他の活性について試験もしくはスクリーニングすることができる。
【００４１】
「無作為類別」とは、芳香性、モジュールまたは菌類のＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ遺伝子クラスターから誘導される多様なＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ酵素、モジュール、活性部位あるいはそれらの部分をコードする遺伝子、相同物もしくは変異体の任意の組み合わせおよび／または順序を意図する。
【００４２】
「遺伝子操作された宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術あるいは異種ＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳならびに／あるいはハイブリッドＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子クラスターが挿入されている宿主細胞を使用して生来のＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ遺伝子クラスターが改変されるかまたは欠失されている宿主細胞を意味する。従って、該用語は、天然において存在する変異事象を包含しない。「宿主細胞」は、本発明のＰＫＳ、ＮＲＰＳ、および／またはハイブリッド遺伝子クラスターを有する組換えベクターのレシピエントとして使用することができるかあるいは使用されている単細胞実体として培養される原核微生物または真核生物の細胞株から誘導される細胞である。該用語は、トランスフェクトされている本来の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶然あるいは意図的変異のために、形態学においてまたは本来の親に対して相補的であるゲノムもしくは総ＤＮＡにおいて完全に同一である必要はない。所望のＰＫＳをコードするヌクレオチド配列の存在などの関連特性によって特徴付けられるべき親に十分に類似する親細胞の子孫は定義に含まれ、上記の用語に含まれる。
【００４３】
発現ベクターは、適切な宿主において遺伝子／ＤＮＡのクローニングされたコピーの転写および／またはそれらのｍＲＮＡの翻訳を指令する核酸配列として本明細書において規定される。そのようなベクターを使用して、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞などの多様な宿主において遺伝子またはｃＤＮＡを発現させることができる。発現ベクターとしては、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特に設計されたプラスミドまたはウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。特に設計されたベクターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞などの宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞における自律複製のための複製開始点、選択マーカー、必要に応じて１以上の制限酵素部位、必要に応じて構成性または誘導性プロモーターを含有する。好適な実施態様では、発現ベクターは、１以上のＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳドメインならびに／あるいは分子をコードするＤＮＡ配列が、適切な宿主においてこれらのシンターゼおよび／またはシンテターゼの産物の発現を生じることが可能な適切な制御配列に操作可能に連結される複製可能なＤＮＡ構築物である。制御配列としては、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列ならびに転写および翻訳の終了を制御する配列などが挙げられる。
【００４４】
「レイナマイシン（Ｌｎｍ）オープンリーディングフレーム」、または「レイナマイシンＯＲＦ」、または「Ｌｎｍ  Ｏｒｆ」は、レイナマイシンの生合成において使用される酵素活性を有するポリペプチドまたはポリペプチドドメインをコードする核酸オープンリーディングフレームを指す。
【００４５】
「ＰＫＳ／ＮＲＰＳ／ＰＫＳ」系は、２つのＰＫＳによって隣接されるＮＲＰＳを含む合成系を指す。「ＮＲＰＳ／ＰＫＳ／ＮＲＰＳ」系は、２つのＮＲＰＳによって隣接されるＰＫＳを含む合成系を指す。「ハイブリッドＰＫＳ／ＮＲＰＳ系」または「ハイブリッドＮＲＰＳ／ＰＫＳ系」は、少なくとも１つのＰＫＳおよび１つのＮＲＰＳモジュールを含むハイブリッド合成系を指す。該系は、複数のモジュールを含むことができ、順序は変動することができる。
【００４６】
「レイナマイシン生合成遺伝子によってコードされるポリペプチドに対する基質である生物学的分子」は、Ｌｎｍ遺伝子クラスターのオープンリーディングフレームによってコードされる１以上のポリペプチドによって化学的に修飾される分子を指す。「基質」は、レイナマイシンの生合成に典型的に参加する生来の分子であってもよく、ポリペプチドによって同様に作用され得る他の任意の分子であることができる。
【００４７】
「多型」は、種のいくつかのメンバーのＤＮＡ配列の変動である。多型は従って、多型の存在のために変異していない配列を有し得る種のメンバーもあれば（即ち、本来の「対立遺伝子」）、一方で変異した配列を有し得るメンバーもある（即ち、変異体または変異「対立遺伝子」）という点で「対立遺伝子的である」とも呼ばれる。最も簡単な場合では、ただ１つの変異した配列が存在し得、該多型は２対立遺伝子と呼ばれる。２対立遺伝子ジプロイド生物体の場合、３つの遺伝子型が可能である。それらは、一方の対立遺伝子に対しホモ接合性であるか、他方の対立遺伝子に対しホモ接合性であるかまたはヘテロ接合性であることができる。２対立遺伝子ハプロイド生物体の場合、それらは一方の対立遺伝子かまたは他方の対立遺伝子を有することができ、従って、ただ２つの遺伝子型のみが可能である。代替的変異の発生は３対立遺伝子などの多型を生じることができる。対立遺伝子は、変異を含むヌクレオチドで参照することができる。
【００４８】
「一塩基多型」または「ＳＮＰ」はそれらの特徴的属性によって規定される。そのような多型の中心的属性は、それが多型部位「Ｘ」を含有することであり、最も好ましくは多型の変動の部位である単一のヌクレオチドによって占められている（ゴエレット（Ｇｏｅｌｅｔ）およびクナップ（Ｋｎａｐｐ）米国特許出願０８／１４５，１４５号明細書）。ＳＮＰを同定するための方法は当業者に周知である（米国特許第５，９５２，１７４を参照のこと）。
【００４９】
以下の略語が本明細書において使用される：Ａ、アデニル化；ＡＣＰ、アシルキャリアタンパク質；ＡＴ、アシルトランスフェラーゼ；ｌｎｍ、レイナマイシン；Ｃ、縮合；ＣＬ、補酵素Ａリガーゼ；Ｃｙ、縮合／環化；ＤＨ、デヒドラターゼ；ＥＲ、エノイルレダクターゼ；ＫＲ、ケトラダクターゼ；ＫＳ、ケトアシルシンターゼ；ＭＴ、メチルトランスフェラーゼ；ＮＲＰＳ、非リボソーム型ペプチドシンテターゼ；ｏｒｆ、オープンリーディングフレーム；Ｏｘ、酸化；ＰＣＰ、ペプチジルキャリアタンパク質；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＰＫＳ、ポリケチドシンターゼ；ＡｒＣＰ、アリールキャリアタンパク質；ｂｐ、塩基対；ＣｏＡ、補酵素Ａ；ＤＴＴ、ジチオトレイトール；ＦＡＳ、脂肪酸シンターゼ；ｋｂ、キロ塩基；ＰＰＴａｓｅ、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ；ＴＣＡ、トリクロロ酢酸；ＴＥ、チオエステラーゼ。
【００５０】
図面の簡単な説明
図１はレイナマイシン（Ｌｎｍ）の構造およびその酸化的およびアルキル化ＤＮＡ切断の提唱された機構を示す。
【００５１】
図２はレイナマイシン生合成遺伝子クラスターを有するＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）由来の１３２ｋｂ  ＤＮＡの地図を示す。
【００５２】
図３はＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）由来のレイナマイシン生合成遺伝子クラスターの遺伝子機構を示す。ＮＲＰＳおよびＰＫＳ遺伝子を中実矢印で示す。
【００５３】
図４はハイブリッドＮＲＰＳ／ＰＫＳに関与するＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）における提唱されたＬｎｍ生合成経路を示す。略語：Ａ、アデニル化；ＡＣＰ、アシルキャリアタンパク質；ＡＴ、アシルトランスフェラーゼ；Ｃ、縮合；ＣＬ、補酵素Ａリガーゼ；Ｃｙ、縮合／環化；ＤＨ、デヒドラターゼ；ＥＲ、エノイルレダクターゼ；ＫＲ、ケトラダクターゼ；ＫＳ、ケトアシルシンターゼ；Ｏｘ、酸化；ＭＴ、メチルトランスフェラーゼ；ＰＣＰ、ペプチジルキャリアタンパク質；ＴＥ、チオエステラーゼ。
【００５４】
図５はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｌｎｍ  ｐｐｔａｓｅと他の種のｐｐｔａｓｅフラグメントとのアラインメントを示す。ＳＣ５Ａ７（配列表の配列番号２２３）、ｃｏｌｏｒ（配列表の配列番号２２４）、Ｓｖｐ（配列表の配列番号２２５）、ｇｒｉｓ（配列表の配列番号２２６）、ａｌｂｕａ（配列表の配列番号２２７）、ｌｎｍ（配列表の配列番号２２８）、コンセンサス（配列表の配列番号２２９）。
【００５５】
図６はｌｎｍＧ発現を改変するとレイナマイシンの発現がどのように改変されるかを示す。ｌｎｍＧの不活性化により、レイナマイシンを産生する能力が完全に破壊されているＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）変異株を生じる。ｌｎｍＧ過剰発現プラスミドをＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ｌｎｍＧ変異体に導入すると、レイナマイシンを産生する能力が回復するだけではなく、野生型Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）株と比較してレイナマイシンの過剰発現が生じる。従って、ｌｎｍＧの発現がｅｒｍＥ* プロモーターの制御下にある低コピー数（１０）のプラスミドで形質転換されたＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ｌｎｍＧ変異体は、野生型Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）株と同様のレベルのレイナマイシンを産生する。ｌｎｍＧの発現がｅｒｍＥ* プロモーターの制御下にある中程度コピー数（３００）のプラスミドで形質転換されたＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ｌｎｍＧ変異体は、野生型Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）株よりも３〜５倍多いレイナマイシンを産生する。
【００５６】
図７はＬｎｍ  ＮＲＰＳおよびＰＫＳ遺伝子を操作することによって調製することができる新規のＬｎｍアナログの例を示す。
【００５７】
図８はＳN １またはＳN ２機構を介する−ＮＨ2 もしくはＨ2 Ｏによるエピスルホニウムイオンの求核攻撃を示す。
【００５８】
図９〜９Ｃはレイナマイシン生合成を操作することによる新規レイナマイシンの産生を示す。図９Ａ：ＬｎｍＨはアミノ酸配列解析に基づく未知の機能のタンパク質である。ＬｎｍＨの不活性化により、もはやレイナマイシンを産生しないが、ＨＰＬＣ分析に基づいて少なくとも２つの新たなレイナマイシン代謝物を蓄積するＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）変異体を生じる。低コピー数プラスミド中のｅｒｍＥ* プロモーター下のＬｎｍＨの過剰発現によってＬｎｍＨ変異体を補充することにより、野生型Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）株と同じ代謝物プロフィールを有する変異株はレイナマイシン産生を回復する。９Ｂでは、様々な濃度のＤ−アラニンで補充した発酵培地中のレイナマイシンの産生を比較した。２５ｍＭのＤ−アラニンを添加した場合にレイナマイシンの産生を３〜５倍改善することができる。図９Ｃは、２つのＰ−４５０ヒドロキシラーゼ（ＬｎｍＡまたはＬｎｍＺ）のうちのいずれか一方を不活性化すると新規のレイナマイシン系薬剤の産生を生じることができ、このうち１つは図７に示される８−デヒドロキシル−Ｌｎｍであり得ることを示した。
【００５９】
図１０はレイナマイシン生合成におけるｌｎｍＧおよびｌｎｍＩの標的化された遺伝子の不活性化の結果を示し、レイナマイシン産生におけるクローン化された遺伝子クラスターの関与を確立している。ｌｎｍＧは、既知のポリケチドシンターゼに対し高いアミノ酸配列相同性を示す２ドメインタンパク質である。ＬｎｍＩは、既知のポリケチドシンターゼおよび非リボソームペプチドシンテターゼに高いアミノ酸配列相同性を示す多ドメインタンパク質である。標的化された遺伝子の置き換えによるｌｎｍＧおよびｌｎｍＩをそれぞれ不活性化すると、もはやレイナマイシンおよびその生合成中間体を産生しないＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）変異株を産生する。これは、ＨＰＬＣ分析によって確認した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
本発明は、レイナマイシン（Ｌｎｍ）の合成を指令する遺伝子クラスターの単離、同定、および特徴付けに関する。レイナマイシンは、新規の１，３−ジオキソ−１，２−ジチオラン構造を有するハイブリッドポリケチドおよび非リボソーム型ペプチド起源のマクロラクタムである。Ｌｎｍは、臨床上重要な抗癌薬に耐性である腫瘍モデルを含む腫瘍モデルにおいてインビボで強力な抗腫瘍活性を示す。改善された抗腫瘍活性を有するＬｎｍアナログが化学修飾によって作製されており、これは、Ｌｎｍ骨格に基づく新規の抗癌薬を作製するという見識を支持するが、天然のＬｎｍはインビトロで不安定であるため、Ｌｎｍの化学的な抗癌薬への開発が妨げられている。
【００６１】
ポリケチドおよび非リボソーム型ペプチドの両方の遺伝子操作は一般に、新規の「非天然の」天然産物を作製する意味で非常に成功している。同様の様式で、「コンビナトリアル生合成」としても公知であるこれらの遺伝子に基づくアプローチをＬｎｍ生合成に拡張することにより、新規の抗癌薬の開発のための有用な「リード化合物」を提供することが期待される新規のＬｎｍアナログを作製するための能力が提供される。
【００６２】
本明細書に記載のレイナマイシン合成経路は、ハイブリッドポリケチド−ペプチド生合成を利用する。ポリケチドおよびポリペプチドは、それぞれ、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）および非リボソーム型ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）により成長している鎖に伸長単位を反復付加することによって顕著に類似の様式で集成させることができる。ポリケチドの場合、伸長単位は典型的に脂肪酸（アシルＣｏＡチオエステルとして活性化される）である一方、ポリペプチドのための伸長単位は典型的にアミノ酸（アミノアシルアデニル酸として活性化される）である。ＰＫＳおよびＮＲＰＳ系は、伸長単位の数、配列、および組み入れの特異性を規定するためのモジュール機構を発展させ、４’−ホスホパンテテイン補綴基を利用し、伸長過程中に成長している中間体を分岐（ｃｈａｎｎｅｌ）している。
【００６３】
ポリケチド代謝物は、多量の構造多様性を示すが、なお共通の生合成機構を共有する。ポリケチドの炭素骨格は、連続的な脱炭酸的縮合によって短いカルボン酸から集成され、このプロセスはＰＫＳによって触媒される。２つのタイプの細菌性ＰＫＳが特徴付けされ、ポリケチドの生化学が説明されている（カッツ（Ｋａｔｚ）およびダナディオ（Ｄａｎａｄｉｏ）（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：８７５−９１２；ハンチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）およびフジイ（Ｆｕｊｉ）、（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：２０１−３８；キャネ（Ｃａｎｅ）（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：２４６３−２７０５；キャレラス（Ｃａｒｒｅｒａｓ）ら（１９９７）Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．１８８：８５−１２６；キャネ（Ｃａｎｅ）ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：６３−６８；スタウントン（Ｓｔａｕｎｔｏｎ）およびウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）（１９９８）Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．１９５：４９−９２；ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）およびシェルマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３７−６６）。Ｉ型酵素は、マクロライド、ポリエーテル、またはポリエン抗生物質のような還元型ポリケチドの生合成におけるポリケチド鎖伸長の各サイクルを触媒するためのモジュールと呼ばれる非反復的に使用される特殊な活性部位の組を有する多機能タンパク質である（キャネ（Ｃａｎｅ）（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：２４６３−２７０５；キャネラス（Ｃａｒｒｅｒａｓ）ら（１９９７）Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．１８８：８５−１２６；スタウントン（Ｓｔａｕｎｔｏｎ）およびウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）（１９９８）Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．１９５：４９−９２）。ＩＩ型酵素は、反復的に試用される活性の単一の組を担持し、テトラサイクリン系薬剤などの芳香性ポリケチドの合成のためのいくらかの一機能タンパク質からなる多酵素複合体である（キャネ（Ｃａｎｅ）（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：２４６３−２７０５）。両方の系における成長しているポリケチド中間体は、伸長プロセス中の４’−ホスホパンテテイン補因子を介してＰＫＳ酵素のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）への共有結合を保持している（シェン（Ｓｈｅｎ）ら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：３８１８−３８２１；キャレラス（Ｃａｒｒｅｒａｓ）およびコスラ（Ｋｈｏｓｌａ）（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７：２０８４−２０８８）。
【００６４】
非リボソーム型ペプチドは生物活性ペプチドの構造的に多様なファミリーであり、タンパク質構成アミノ酸および非タンパク質構成アミノ酸の両方から非リボソーム的に集成され、このプロセスはＮＲＰＳによって触媒される。意外なことに、ＮＲＰＳは、Ｉ型ＰＫＳと類似の多モジュール構造を有し、これらのモジュールは、ペプチド産物の構成性アミノ酸を活性化し、修飾し、アミドまたはエステル結合によって結合するＮＲＰＳの機能的基本単位を表す（キャネ（Ｃａｎｅ）（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：２４６３−２７０５；キャレラス（Ｃａｒｒｅｒａｓ）ら（１９９７）Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．１８８：８５−１２６；キャネ（Ｃａｎｅ）ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：６３−６８；キャネ（Ｃａｎｅ）およびワルシュ（Ｗａｌｓｈ）（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：Ｒ３１９−Ｒ３２５；コンズ（Ｋｏｎｚ）およびマラヒール（Ｍａｒａｈｉｅｌ）（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：Ｒ３９−Ｒ４８；フォン・ドレン（ｖｏｎ  Ｄｏｅｈｒｅｎ）ら（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：Ｒ２７３−Ｒ２７９）。モジュールは、それぞれが物理的に共に結合するか、またはタンパク質／タンパク質認識を介して相互作用し、ペプチド産物に組み入れられるアミノ酸の数および配列を指令することができる。個々のモジュールは、アシルアデニレートとして構成性アミノ酸の活性化を触媒するドメイン（Ａドメイン）（ワインレブ（Ｗｅｉｎｒｅｂ）ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７：１５７５−１５８４；スタヒルハウス（Ｓｔａｃｈｌｈａｕｓ）およびマラヒール（Ｍａｒａｈｉｅｌ）（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６１６３６１６９；コンズ（Ｋｏｎｚ）ら（１９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：９２７−９３７；モーツ（Ｍｏｏｔｚ）およびマラヒール（Ｍａｒａｈｉｅｌ）（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６８４３−６８５０；スタヒルハウス（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ）ら（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：４９３−５０５；チャリス（Ｃｈａｌｌｉｓ）ら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：２１１−２２４）、各アミノ酸活性化ドメイン（チオレーションドメインまたはＰＣＰ）のＣ末端領域に共有結合する４’−ホスホパンテテイン補因子のスルフヒドリル基による活性化されたアミノ酸のチオエステル化（ゲリング（Ｇｅｈｒｉｎｇ）ら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：１７−２４；ランバロット（Ｌａｍｂａｌｏｔ）ら（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：９２３−９３６；ワインレブ（Ｗｅｉｎｒｅｂ）ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７：１５７５−１５８４；スタヒルハウス（Ｓｔａｃｈｌｈａｕｓ）およびマラヒール（Ｍａｒａｈｉｅｌ）（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：６１６３−６１６９；コンズ（Ｋｏｎｚ）ら（１９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：９２７−９３７；ムーツ（Ｍｏｏｔｚ）およびマラヒール（Ｍａｒａｈｉｅｌ）（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６８４３−６８５０；スタヒルハウス（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ）ら（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：４９３−５０５；チャリス（Ｃｈａｌｌｉｓ）ら（２０００）Ｃｈ���ｍ．Ｂｉｏｌ．７：２１１−２２４；スタヒルハウス（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ）ら（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：９１３−９２１；フェイフェル（Ｐｆｅｉｆｅｒ）ら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４：７４５０−７４５９；ハエセ（Ｈａｅｓｅ）ら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：１１６−１２２；クアドリ（Ｑｕａｄｒｉ）ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：１５８５−１５９５；ローズ（Ｒｏｓｅ）ら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：１６２８−１６３５；ク（Ｋｕ）ら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：２０３−２０７；ロイター（Ｒｅｕｔｅｒ）ら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：６８２３−６８３１）、ならびに規定された配列を有する特定のペプチド鎖の形成を生じる整合されたドメイン（縮合またはＣドメイン）間のカルボキシチオエステル活性化アミノ酸のペプチド転移によって特徴付けられる（スタヒルハウス（Ｓｔａｃｈｌｈａｕｓ）ら（１９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２２７７３−２２７８１）。
【００６５】
Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸への変換のためのエピマー化（Ｅ）ドメイン（Ｍａｒａｈｉｅｌら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９７：２６５１−２６７３）、メチル基をアミド窒素（Ｉｄ）に添加するためのＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）ドメイン、複素環式環の形成のための環化（Ｃｙ）ドメイン（コンズ（Ｋｏｎｚ）ら（１９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：９２７−９３７）、アルデヒド産物の還元的遊離のための還元ドメイン（エマン（Ｅｈｍａｎｎ）ら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：６１７１−６１７７）、およびチアゾリジンからチアゾールへの酸化（Ｏｘ）（モルナル（Ｍｏｌｎａｒ）ら（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｍ．，７：９７−１０９）または組み入れられたアミノ酸のαヒドロキシル化（Ｏｘ’）（シラコウスキー（Ｓｉｌａｋｏｗｓｋｉ）ら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３７３９１−３７３９９）のための酸化ドメインなどのペプチド産物の修飾を担うさらなるドメインも同定されている。
【００６６】
レイナマイシンなどのハイブリッドペプチド−ポリケチド代謝物は、アミノ酸およびカルボン酸基本ブロックの両方によって構造的に特徴付けられる。アミノ酸およびカルボン酸からのハイブリッドペプチド−ポリケチド代謝物の集成は、ＮＲＰＳおよびＰＫＳの特徴を有するハイブリッドＮＲＰＳ−ＰＫＳ系によって触媒される（デュ（Ｄｕ）ら（２００１）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇ．３：７８−９５；デュ（Ｄｕ）およびシェン（Ｓｈｅｎ）（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．４：２１５−２２８）。相互作用するＮＲＰＳおよびＰＫＳモジュールは、同一のタンパク質上の洗浄の順序において触媒ドメインを配置することによって、共有結合できるか、または相互作用モジュール間の正確な対形成を確実にするために特定のタンパク質−タンパク質認識を利用して、２以上の個別のタンパク質上に物理的に配置することができるかのいずれかである。１つのそのようなハイブリッド系は、ブレオマイシン生合成、ＢｌｍＩＸ  ＮＲＰＳ／Ｂｌｍ  ＶＩＩＩ  ＰＫＳ／Ｂｌｍ  ＶＩＩ  ＮＲＰＳ系、ハイブリッドＮＲＰＳ／ＰＫＳおよびＰＫＳ／ＮＲＰＳ系の両方の特徴を組み合わせることによって、例示される（例えば、ＵＳＳＮ  ＰＣＴ／ＵＳ００／００４４５；シェン（Ｓｈｅｎ）ら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２７：１５５−１７１）。
【００６７】
１つの局面では、本発明は、（ｌｎｍ）レイナマイシンの生産者であるストレプトマイセス・アトロオリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）由来の特徴的なＮＲＰＳおよびＰＫＳ遺伝子からなるクローニングされたおよび特徴付けられた（ＬＮＭ）レイナマイシン遺伝子クラスター（約６１．３ｋｂ）を提供する。クローニングならびに単離された（ｌｎｍ）レイナマイシン遺伝子クラスターおよびそのサブユニット（例えば、ＯＲＦ）は、レイナマイシンおよび／またはレイナマイシンアナログを組換え的に発現させる方法を提供する。従って、１つの実施態様では、本発明は、レイナマイシン合成機構またはそのサブユニットをコードする核酸、レイナマイシンおよび／またはレイナマイシンアナログを発現するように組換え的に修飾された細胞、ならびにそのような細胞において組換え的に発現されるレイナマイシンもしくはレイナマイシンアナログを提供する。
【００６８】
他のポリケチドシンターゼまたは非リボソーム型ペプチドシンテターゼと同様に、レイナマイシン合成経路はモジュールに組織化され、各モジュールは１つのサブユニット（例えば、脂肪酸および／またはアミノ酸）の付加ならびに／あるいは修飾を触媒する。各モジュールは多くのモジュールに組織化され、各ドメインは特徴的な活性（例えば、活性化、縮合、縮合／環化など）を有する。モジュール（単数および複数）自体内の触媒ドメインは、しばしば同一線上に整列され、各ＰＫＳおよびＮＲＰＳポリペプチド上のＮＨ2 −〜ＣＯＯＨ末端の生合成モジュールの順序ならびにそれぞれ内の触媒ドメインの数およびタイプは、得られる産物における構造および機能エレメントの順序を決定する。
【００６９】
究極的に形成される産物のサイズおよび複雑性は、それぞれこれらの多モジュール酵素におけるキャリアタンパク質ドメインの数および置き換えの関数である反復されるアシル鎖伸長工程の回数によって部分的に制御される。そのようなどメインの数の組成および順序は、修飾を、例えば、レイナマイシンに導入して、レイナマイシンアナログを産生させるか、または異なるかもしくは完全に新規の分子を産生させるかのいずれかになるように変更することができる。そのような「組換え」は、レイナマイシン触媒ドメインおよび／またはモジュール間の組換えのみには限定されず、レイナマイシンモジュールおよび／またはサブユニットと他のＰＫＳならびに／あるいはＮＲＰＳモジュールおよび／またはサブユニット（例えば、ブレオマイシンサブユニット）との間の組換えにも関与する。さらに、合成経路がＰＫＳおよびＮＲＰＳモジュールおよび／または触媒ドメインを組み入れることができることを発見したことにより、ハイブリッドＰＫＳ／ＮＲＰＳシンターゼを利用することができる。
【００７０】
従って、１つの実施態様では、本発明は、他のポリケチドシンターゼおよび／または他の非リボソーム型ペプチドシンテターゼによりコンビナトリアル生合成で多様なペプチドおよび／またはポリケチド、および／またはハイブリッドポリペプチド／ポリケチド中間体（レイナマイシン、レイナマイシン中間体または分路代謝物を含むがこれらに限定されない）を作製するためのｌｎｍ遺伝子クラスターモジュールおよび／または触媒ドメインの使用を意図する。
【００７１】
特に、多様なｌｎｍ  ＯＲＦは、アミノトランスフェラーゼ、ペプチドシンテターゼ、チオエステラーゼ、デカルボキシラーゼなどを含むがこれらに限定されない特徴的な酵素活性を示すことが注目される。これらのｏｒｆによってコードされるタンパク質は、単独または多様な標的基質を修飾するための他の活性ドメインとの組み合わせで使用することができる。
【００７２】
本発明はまた、新規のＰＰＴａｓｅ（そのフラグメントは図５に示され、ｌｎｍと命名されている）の発見および特徴付けを含む。このＰＰＴａｓｅはクローニングし、ポリケチド、ペプチド、ハイブリッドペプチドおよびポリケチド代謝物、ハイブリッドポリケチドおよびペプチド代謝物、または両タイプの代謝物の組み合わせの操作された生合成において使用することができる。ＰＰＴａｓｅはまた、アポペプチジルキャリアタンパク質（Ｉ型およびＩＩ型の両方）ならびにアシルキャリアタンパク質（Ｉ型およびＩＩ型の両方）をホロタンパク質に変換するのに使用することもできる。
【００７３】
特定の好適な実施態様では、本発明は、レイナマイシンを産生させる（例えば、内因性レイナマイシン産生をアップレギュレートして、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）以外の細胞においてレイナマイシンの産生を可能にする）および／または多様な修飾されたレイナマイシン系薬剤（レイナマイシンアナログ）を作製するためのレイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターモジュールおよび／または触媒ドメインの使用を意図する。
【００７４】
本明細書において提供される実施例および付随するプライマーにより、当業者は、本発明の（ｌｎｍ）レイナマイシン遺伝子クラスター、その構成性ｏｒｆ、多様なモジュール、または酵素ドメインを単離することが可能である。単離された核酸成分を使用して、上記で同定される１以上のポリペプチドおよび／またはポリケチドのインビボ（例えば、組換え）合成のために１以上のポリペプチド成分を発現させることができる。（ｌｎｍ）レイナマイシンクラスターポリペプチドは、多様な高分子のエクスビボ集成のために使用することができることも理解されるであろう。
【００７５】
Ｉ．  Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）におけるレイナマイシンの生合成経路
特定の理論に結び付けることなく、ｌｎｍ遺伝子クラスターの遺伝子組織化およびＬｎｍ生合成の酵素学は、マクロライドおよびブレオマイシンなどのハイブリッドペプチド−ポリケチド代謝物に緊密に近似すると考えられる。Ｌｎｍのマクロライド系薬剤に対する一般的な構造類似性および特にブレオマイシンなどのチアゾール含有ハイブリッドペプチド−ポリケチド代謝物に対する構造類似性は、Ｌｎｍ生合成のための経路に対する実質的データを提供する。本発明者らは、Ｌｎｍマクロラクタム骨格の合成は、２ＮＲＰＳおよび６ＰＫＳ分子からなるハイブリッドＮＲＰＳ／ＰＫＳ系に関与し、各工程で、組み入れようとするアミノ酸またはカルボン酸、ならびに特定のサイクルの伸長に関連する修飾を指定すると考えている（図４）。上記のハイブリッドＮＲＰＳ／ＰＫＳ生合成（図４）では、Ｌｎｍ生合成は、アミノアシルチオエステルとしてＬ−アラニンを活性化するＮＲＰＳモジュールであるＮＲＰＳ−１で開始し、Ｌ−アラニンをＤ−アラニンにエピマー化して、Ｌｎｍ生合成のための段階を設定する。しかし、特定の実施態様では、Ｄ−アラニンはＮＲＰＳ−１の直接的基質であり得る。ＮＲＰＳ−２は、一般にＬ−システイン（典型的に標識Ｃｙで特徴付けられる）およびチアゾール形成のためのＯｘドメインを指定する。次に、ＮＲＰＳ−２−結合ペプチジル中間体は、ＰＫＳ−１モジュールにより伸長され、そのＫＳドメインは、ＮＲＰＳ／ＰＫＳハイブリッドにおいてＮＰＲＳモジュールと相互作用することが公知であるＫＳに相同であり、そのＡＣＰドメインは、伸長単位としてマロニルＣｏＡを指定すべきｌｎｍＧのアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインによって配置される（ヘイドック（Ｈａｙｄｏｃｋ）ら（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３７４：２４６−２４８）。
【００７６】
鎖伸長は、さらなる５つのＰＫＳ分子、ＰＫＳ−２、ＰＫＳ−３、ＰＫＳ−４、ＰＫＳ−５、およびＰＫＳ−６を利用して、マロニルＣｏＡのさらなる５つの分子の連続組み入れによって促進する。個々のＰＫＳ分子に対する伸長単位としてのマロニルＣｏＡに対する基質特異性がＡＴドメインの配列解析から容易に決定されるｌｎｍＧの同一のＡＴドメインによって、５つのすべてのＰＫＳ分子のＡＣＰドメインへのマロニルＣｏＡの充填が触媒される（ヘイドック（Ｈａｙｄｏｃｋ）ら（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３７４：２４６−２４８）。ｌｈｍＧのＡＴドメインは、６つのすべてのＰＫＳモジュールに対する伸長単位としてマロニルＣｏＡを要求するため、Ｃ−６でのメチル基の導入のためにさらなる水素化工程が生じなければならない。マクロライド間の水素化は、しばしば、シトクロムＰ−４５０ヒドロキシラーゼによって触媒され、いくらかのマクロライド生合成遺伝子クラスターから同定されている（ロドリグエズ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら（１９９５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２７：１１７−１２０；ウェベル（Ｗｅｂｅｒ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１１４−１１７；キュエ（Ｘｕｅ）ら（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：６６１−６６７）。
【００７７】
これらのタイプのヒドロキシラーゼの候補は、ｌｎｍＡ、ｌｎｍＢ、およびｌｎｍＺなどのレイナマイシン生合成について実際に同定されている（図４）。マクロライド環のメチル化は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）からメチル基を誘導して、以前から認められており、メチルトランスフェラーゼドメインにより触媒されている（デュエ（Ｄｕｅ）ら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７：６２３−６４２）。おそらくレイナマイシンのＣ−６メチル基の誘導を担うであろうｌｎｍＪのＰＫＳ４においてＭＴドメインが同定されている（図４）。最後に、これまでに生合成遺伝子クラスターが唯一特徴付けられているマクロラクタムであるリファマイシンの生合成（オーガスト（Ａｕｇｕｓｔ）ら（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，５：６９−７９）をモデルにして、本発明者らは、個別のアミドシンターゼが、Ｌｎｍシンターゼ複合体からの全長ペプチド／ポリケチド中間体の遊離、および線状中間体からマクロラクタムへの環化を触媒するものと提唱している。
【００７８】
ＩＩ．  レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスター
レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターを含む核酸は表２において同定され、本明細書において提供される配列表に列挙されている（配列表の配列番号１）。特に、表１は、遺伝子およびレイナマイシンの生合成を担うオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の機能を同定しており、表２は、レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターを含む多くのＯＲＦを同定し、ＯＲＦによってコードされる触媒ドメインの活性を同定し、該ｏｒｆの増幅および単離のためのプライマーを提供している。
【００７９】
実施例１において例示されるように、レイナマイシン（ｌｎｍ）クラスターは、いくらかのＰＫＳモジュールに続いてＮＲＰＳモジュールならびにいくらかの耐性および調節遺伝子を含む。
表１．レイナマイシン生合成遺伝子クラスターおよびフランキング領域におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の機能の概要。配列表の配列番号はＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列を指す。
┌───┬──┬───────────────┬───────┬──┐
│ＯＲＦ│アミ│  提唱される機能              │配列相同物    │配列│
│      │ノ酸│                              │（ジェンバンク│表の│
│      │番号│                              │受託番号）    │配列│
│      │    │                              │              │番号│
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-35   │289 │おそらく抗生物質耐性          │ SpcN         │    │
│      │    │                              │ (AAD50455)   │2   │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-34   │502 │推定FAD 依存性オキシゲナーゼ  │ EncM         │    │
│      │    │                              │ (AAF81732)   │3   │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-33   │1237│スブチリシン様分泌型プロテアー│ SAM-P45      │4   │
│      │    │ゼ                            │ (BAA12040)   │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-32   │262 │不明                          │              │5   │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-31   │401 │おそらくNADHデヒドロゲナーゼII│ (E75456)     │6   │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-30   │306 │ RNAポリメラーゼ ECF型σ因子  │ BH0672       │7   │
│      │    │                              │ (BAB04391)   │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-29   │327 │おそらくマクロライド2'−ホスホ│ MphA         │8   │
│      │    │トランスフェラーゼ            │ (D16251)     │    │
└───┴──┴───────────────┴───────┴──┘
表１（続き）
┌───┬──┬───────────────┬───────┬──┐
│-28   │198 │おそらくtetR−ファミリー転写調│ (T37015)     │９  │
│      │    │節因子                        │              │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-27   │538 │抗生物質流出タンパク質        │ ActVA-1      │10  │
│      │    │                              │ (S18539)     │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-26   │300 │推定ヒドロキシラーゼ          │ SnoaW        │11  │
│      │    │                              │ (AAF01810)   │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-25   │197 │おそらくシアナミドヒドラターゼ│ (P22143)     │12  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-24   │353 │ヒスチジノールリン酸アミノトラ│ (P45358)     │13  │
│      │    │ンスフェラーゼ                │              │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-23   │774 │推定転写調節因子              │ (T34847)     │14  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-22   │72  │MbtH様タンパク質              │ (AAG02368)   │15  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-21   │1105│非リボソーム型ペプチドシンテタ│ (T30289)     │16  │
│      │    │ーゼ                          │              │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-20   │330 │おそらく調節タンパク質        │ SyrP         │    │
│      │    │                              │ (U88574)     │17  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-19   │335 │おそらく調節タンパク質        │ SyrP         │    │
│      │    │                              │ (U88574)     │18  │
└───┴──┴───────────────┴───────┴──┘
表１（続き）
┌───┬──┬───────────────┬───────┬──┐
│-18   │313 │不明                          │              │19  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-17   │341 │推定脂肪酸デサチュラーゼ      │ (AAA99932)   │20  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-16   │433 │ジアミノピメリン酸(DAP）デカル│ (P00861)     │21  │
│      │    │ボキシラーゼ                  │              │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-15   │794 │推定ペプチダーゼ              │（NP 422131) │22  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-14   │432 │抗生物質輸送タンパク質        │ SpcT         │23  │
│      │    │                              │ (AAD50454)   │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-13   │1134│非リボソーム型ペプチドシンテタ│ (T30289)     │24  │
│      │    │ーゼ                          │              │    │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-12   │276 │保存領域、機能不明            │（NP 421851) │25  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-11   │549 │非リボソーム型ペプチドシンテタ│ NosA         │    │
│      │    │ーゼ                          │ (AF204805)   │26  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-10   │235 │チオエステラーゼ              │ (AAC01736)   │27  │
├───┼──┼───────────────┼───────┼──┤
│-9    │276 │短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクタ│ LimC         │28  │
│      │    │ーゼ                          │ (CAB54559)   │    │
└───┴──┴───────────────┴───────┴──┘
表１（続き）
┌───┬──┬────────────────┬──────┬──┐
│-8    │920 │非リボソーム型ペプチドシンテター│ AcmB       │29  │
│      │    │ゼ                              │ (T14591)   │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│-7    │195 │おそらくN-カルバモイル−サルコシ│ Ta0454     │    │
│      │    │ンアミダーゼ                    │ (CAC11596) │30  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│-6    │343 │ヒドロゲナーゼ発現／形成タンパク│ HypE       │31  │
│      │    │質                              │ (P24193)   │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│-5    │791 │ヒドロゲナーゼ成熟タンパク質    │ HypF       │32  │
│      │    │（調節因子）                    │ (P30131)   │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│-4    │447 │セリンヒドロキシメチルトランスフ│ GlyA       │33  │
│      │    │ェラーゼ（SHMT）                │ (O29406)   │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│-3    │238 │おそらくグルタミンアミドトランス│ (C83609)   │34  │
│      │    │フェラーゼ                      │            │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│-2    │1745│非リボソーム型ペプチドシンテター│ BlmVI      │35  │
│      │    │ゼ                              │ (AF210249) │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│-1    │462 │非リボソーム型ペプチドシンテター│ PvdD       │36  │
│      │    │ゼ                              │ (S53999)   │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmA  │399 │シトクロムP450ヒドロキシラーゼ  │ RapN       │37  │
│      │    │                                │ (T30231)   │    │
└───┴──┴────────────────┴──────┴──┘
表１（続き）
┌───┬──┬────────────────┬──────┬──┐
│lnmB  │78  │フェレドキシン                  │ (T30230)   │38  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmC  │115 │不明                            │            │39  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmD  │438 │おそらく3-オキソアジピン酸エノー│ PcaL       │40  │
│      │    │ル−ラクトンヒドロキシラーゼ／4-│ (AAC38246) │    │
│      │    │カルボキシムコノラクトンデカルボ│            │    │
│      │    │キシラーゼ                      │            │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmE  │307 │不明                            │            │41  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmF  │265 │おそらくエノイルCoA ヒドラターゼ│ PksH       │42  │
│      │    │                                │ (P40805)   │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmG  │795 │おそらくマロニル-CoAアシルトラン│ FenF       │43  │
│      │    │スフェラーゼ／エノイルレダクター│ (T44805)   │    │
│      │    │ゼ                              │            │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmH  │274 │不明                            │            │44  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmI  │4437│ハイブリッド非リボソーム型ペプチ│ MtaC/MtaB  │45  │
│      │    │ドシンテターゼ／ポリケチドシンタ│ (AF188187) │    │
│      │    │ーゼ                            │            │    │
└───┴──┴────────────────┴──────┴──┘
表１（続き）
┌───┬──┬────────────────┬──────┬──┐
│lnmJ  │7349│ポリケチドシンターゼ／チロシンフ│MtaB        │46  │
│      │    │ェノールリアーゼ／ケトアジピン酸│(AF188287)／│    │
│      │    │−エノールラクトンヒドロラーゼ  │PcaL        │    │
│      │    │                                │(AAC38246)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmK  │319 │保存領域、機能不明              │TaD         │47  │
│      │    │                                │(CAB46503)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmL  │86  │アシルキャリアタンパク質        │TaE         │48  │
│      │    │(ACP、II型)                     │(CAB46504)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmM  │416 │ ACPシンターゼ (FabH相同物)     │TaF         │49  │
│      │    │                                │(CAB46505)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmN  │267 │チオエステラーゼ（II型)         │GrsT        │50  │
│      │    │                                │(P14686)    │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmO  │227 │おそらく転写活性因子            │NtcA        │51  │
│      │    │                                │(AAC14592)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmP  │82  │ペプチジルキャリアタンパク質    │(CAB99152)  │52  │
│      │    │(PCP、II型)                     │            │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmQ  │516 │非リボソーム型ペプチドシンテター│(AAG02343)  │53  │
│      │    │ゼ（Ａドメインのみ、II型)       │            │    │
└───┴──┴────────────────┴──────┴──┘
表１（続き）
┌───┬──┬────────────────┬──────┬──┐
│lnmR  │575 │ ABC輸送体成分(ATPヒドロラーゼ) │MoaD        │54  │
│      │    │                                │(T45539)    │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmS  │287 │ ABC輸送体成分（膜貫通タンパク質│AgaC        │55  │
│      │    │）                              │(T45530)    │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmT  │321 │ ABC輸送体成分（膜貫通タンパク質│AgaB        │56  │
│      │    │）                              │(T45531)    │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmU  │513 │ ABC輸送体成分（ペリプラズムオリ│OphA        │57  │
│      │    │ゴペプチド結合タンパク質)       │(S77572)    │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmV  │120 │不明                            │            │58  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmW  │516 │4-クマリン酸 CoAリガーゼ        │(T08074)    │59  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmX  │243 │保存領域、機能不明              │(CAC04222)  │60  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmY  │474 │抗生物質流出タンパク質          │Mct         │61  │
│      │    │                                │(AAD32747)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmZ  │400 │シトクロムP450ヒドロキシラーゼ  │MycG        │62  │
│      │    │                                │(S51594)    │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│lnmZ' │134 │不明                            │            │63  │
└───┴──┴────────────────┴──────┴──┘
表１（続き）
┌───┬──┬────────────────┬──────┬──┐
│+1    │216 │保存領域、機能不明              │(C70555)    │64  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│+2    │272 │チオエステラーゼ                │GrsT        │65  │
│      │    │                                │(P14686)    │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│+3    │345 │保存領域、機能不明              │(CAC18692)  │66  │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│+4    │236 │おそらくtetR−ファミリー転写調節│HemR        │67  │
│      │    │因子                            │(BAA21913)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│+5    │539 │抗生物質耐性タンパク質          │CarA        │68  │
│      │    │                                │(AAC32027)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│+6    │322 │おそらくヒドロラーゼ／ラクトナー│VgbB        │69  │
│      │    │ゼ                              │(AAC61670)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│+7    │551 │ ABC輸送体                      │VarM        │70  │
│      │    │                                │(BAA96297)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│+8    │469 │アデノシルホモシステイナーゼ    │SahH        │71  │
│      │    │                                │(CAB88907)  │    │
├───┼──┼────────────────┼──────┼──┤
│+9    │303 │5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸レ│MetF        │72  │
│      │    │ダクターゼ                      │(054253)    │    │
└───┴──┴────────────────┴──────┴──┘
表２．レイナマイシン生合成遺伝子クラスターおよびフランキング領域においてどうていされる個々のＯＲＦの増幅のためのＯＲＦ、推定された機能、アミノ酸配列相同物、およびＰＣＲプライマー
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│ ORF＃│位置    │提唱される機能    │タンパク質│プライマー│配列│
│      │        │                  │相同物    │          │表の│
│      │        │                  │          │          │配列│
│      │        │                  │          │          │番号│
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-35   │3489-   │おそらく抗生物質耐│SpcN      │前方：    │73  │
│      │4358    │性                │(AAD50455)│後方：    │74  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-34   │5108-   │推定FAD 依存性オキ│EncM      │前方：    │75  │
│      │6616    │シゲナーゼ        │(AAF81732)│後方：    │76  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-33   │7431-   │スブチリシン様分泌│SAM-P45   │前方：    │77  │
│      │11144   │型プロテアーゼ    │(BAA12040)│後方：    │78  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-32   │11141-  │不明              │          │前方：    │79  │
│      │11812   │                  │          │後方：    │80  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-31   │11809-  │おそらくNADHデヒド│(E75456)  │前方：    │81  │
│      │13014   │ロゲナーゼII      │          │後方：    │82  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-30   │13011-  │ RNAポリメラーゼ  │BH0672    │前方：    │83  │
│      │13931   │ ECF型σ因子      │(BAB04391)│後方：    │84  │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
表２（続き）
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│-29   │14271-  │おそらくマクロライ│MphA      │前方：    │85  │
│      │15254   │ド2'−ホスホトラン│(D16251)  │後方：    │86  │
│      │        │スフェラーゼ      │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-28   │16277-  │おそらくtetR−ファ│(T37015)  │前方：    │87  │
│      │15681   │ミリー転写調節因子│          │後方：    │88  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-27   │16467-  │抗生物質流出タンパ│ActVA-1   │前方：    │89  │
│      │18083   │ク質              │(S18539)  │後方：    │90  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-26   │18480-  │推定ヒドロキシラー│SnoaW     │前方：    │91  │
│      │19382   │ゼ                │(AAF01810)│後方：    │92  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-25   │20377-  │おそらくシアナミド│(P22143)  │前方：    │93  │
│      │19784   │ヒドラターゼ      │          │後方：    │94  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-24   │20662-  │ヒスチジノールリン│(P45358)  │前方：    │95  │
│      │21723   │酸アミノトランスフ│          │後方：    │96  │
│      │        │ェラーゼ          │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-23   │21994-  │推定転写調節因子  │(T34847)  │前方：    │97  │
│      │24318   │                  │          │後方：    │98  │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-22   │24524-  │MbtH様タンパク質  │(AAG02368)│前方：    │99  │
│      │24742   │                  │          │後方：    │100 │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
表２（続き）
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│-21   │24778-  │非リボソーム型ペプ│(T30289)  │前方：    │101 │
│      │28095   │チドシンテターゼ  │          │後方：    │102 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-20   │28128-  │おそらく調節タンパ│SyrP      │前方：    │103 │
│      │29120   │ク質              │(U88574)  │後方：    │104 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-19   │29117-  │おそらく調節タンパ│SyrP      │前方：    │105 │
│      │30124   │ク質              │(U88574)  │後方：    │106 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-18   │30172-  │不明              │          │前方：    │107 │
│      │31113   │                  │          │後方：    │108 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-17   │31140-  │推定脂肪酸デサチュ│(AAA99932)│前方：    │109 │
│      │32165   │ラーゼ            │          │後方：    │110 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-16   │32199-  │ジアミノピメリン酸│(P00861)  │前方：    │111 │
│      │33500   │(DAP）デカルボキシ│          │後方：    │112 │
│      │        │ラーゼ            │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-15   │35984-  │推定ペプチダーゼ  │ (NP 4221│前方：    │113 │
│      │33600   │                  │31)       │後方：    │114 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-14   │37313-  │抗生物質輸送タンパ│SpcT      │前方：    │115 │
│      │36015   │ク質              │(AAD50454)│後方：    │116 │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
表２（続き）
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│-13   │40721-  │非リボソーム型ペプ│(T30289)  │前方：    │117 │
│      │37317   │チドシンテターゼ  │          │後方：    │118 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-12   │41548-  │保存領域、機能不明│ (NP 4218│前方：    │119 │
│      │40718   │                  │51)       │後方：    │120 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-11   │41709-  │非リボソーム型ペプ│NosA      │前方：    │121 │
│      │43358   │チドシンテターゼ  │(AF204805)│後方：    │122 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-10   │43412-  │チオエステラーゼ  │(AAC01736)│前方：    │123 │
│      │44119   │                  │          │後方：    │124 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-9    │44116-  │短鎖デヒドロゲナー│LimC      │前方：    │125 │
│      │44946   │ゼ／レダクターゼ  │(CAB54559)│後方：    │126 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-8    │44970-  │非リボソーム型ペプ│AcmB      │前方：    │127 │
│      │47732   │チドシンテターゼ  │(T14591)  │後方：    │128 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-7    │47820-  │おそらくN-カルバモ│Ta0454    │前方：    │129 │
│      │48407   │イル−サルコシンア│(CAC11596)│後方：    │130 │
│      │        │ミダーゼ          │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-6    │48545-  │ヒドロゲナーゼ発現│HypE      │前方：    │131 │
│      │49576   │／形成タンパク質  │(P24193)  │後方：    │132 │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
表２（続き）
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│-5    │49599-  │ヒドロゲナーゼ成熟│HypF      │前方：    │133 │
│      │51974   │タンパク質（調節因│(P30131)  │後方：    │134 │
│      │        │子）              │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-4    │52006-  │セリンヒドロキシメ│GlyA      │前方：    │135 │
│      │53349   │チルトランスフェラ│(O29406)  │後方：    │136 │
│      │        │ーゼ（SHMT）      │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-3    │53346-  │おそらくグルタミン│(C83609)  │前方：    │137 │
│      │54062   │アミドトランスフェ│          │後方：    │138 │
│      │        │ラーゼ            │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-2    │54157-  │非リボソーム型ペプ│BlmVI     │前方：    │139 │
│      │59394   │チドシンテターゼ  │(AF210249)│後方：    │140 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│-1    │59420-  │非リボソーム型ペプ│PvdD      │前方：    │141 │
│      │60808   │チドシンテターゼ  │(S53999)  │後方：    │142 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│lnmA  │60948-  │シトクロムP450ヒド│RapN      │前方：    │143 │
│      │62147   │ロキシラーゼ      │(T30231)  │後方：    │144 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│lnmB  │62159-  │フェレドキシン    │(T30230)  │前方：    │145 │
│      │62395   │                  │          │後方：    │146 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│lnmC  │62682-  │不明              │          │前方：    │147 │
│      │63029   │                  │          │後方：    │148 │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
表２（続き）
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│InmD  │63116-  │おそらく3-オキソア│PcaL      │前方：    │149 │
│      │64432   │ジピン酸エノール−│(AAC38246)│後方：    │150 │
│      │        │ラクトンヒドロキシ│          │          │    │
│      │        │ラーゼ／4-カルボキ│          │          │    │
│      │        │シムコノラクトンデ│          │          │    │
│      │        │カルボキシラーゼ  │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmE  │64500-  │不明              │          │前方：    │151 │
│      │65423   │                  │          │後方：    │152 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmF  │65441-  │おそらくエノイル  │PksH      │前方：    │153 │
│      │66238   │CoA ヒドラターゼ  │(P40805)  │後方：    │154 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmG  │66268-  │おそらくマロニル-C│FenF      │前方：    │155 │
│      │68655   │oAアシルトランスフ│(T44805)  │後方：    │156 │
│      │        │ェラーゼ／エノイル│          │          │    │
│      │        │レダクターゼ      │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmH  │68725-  │不明              │          │前方：    │157 │
│      │69549   │                  │          │後方：    │158 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│lnmI  │69681-  │ハイブリッド非リボ│MtaC/MtaB │前方：    │159 │
│      │82994   │ソーム型ペプチドシ│(AF188187)│後方：    │160 │
│      │        │ンテターゼ／ポリケ│          │          │    │
│      │        │チドシンターゼ    │          │          │    │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
表２（続き）
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│InmJ  │82991-  │ハイブリッドポリケ│MtaB      │前方：    │161 │
│      │105040  │チドシンターゼ／チ│(AF188287)│後方：    │162 │
│      │        │ロシンフェノールリ│／PcaL    │          │    │
│      │        │アーゼ／ケトアジピ│(AAC38246)│          │    │
│      │        │ン酸−エノールラク│          │          │    │
│      │        │トンヒドロラーゼ  │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmK  │105037- │保存領域、機能不明│TaD       │前方：    │163 │
│      │105996  │                  │(CAB46503)│後方：    │164 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmL  │105993- │アシルキャリアタン│TaE       │前方：    │165 │
│      │106253  │パク質(ACP、II型) │(CAB46504)│後方：    │166 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmM  │106250- │ ACPシンターゼ (Fa│TaF       │前方：    │167 │
│      │107500  │bH相同物）        │(CAB46505)│後方：    │168 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmN  │107557- │チオエステラーゼ  │GrsT      │前方：    │169 │
│      │108360  │（II型）          │(P14686)  │後方：    │170 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmO  │108395- │おそらく転写活性因│NtcA      │前方：    │171 │
│      │109078  │子                │(AAC14592)│後方：    │172 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│lnmP  │109122- │ペプチジルキャリア│(CAB99152)│前方：    │173 │
│      │109370  │タンパク質        │          │後方：    │174 │
│      │        │(PCP、II型)       │          │          │    │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
表２（続き）
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│InmQ  │109367- │非リボソーム型ペプ│(AAG02343)│前方：    │175 │
│      │110917  │チドシンテターゼ  │          │後方：    │176 │
│      │        │(Aドメイン）      │          │          │    │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmR  │112700- │ ABC輸送体成分    │MoaD      │前方：    │177 │
│      │110973  │                  │(T45539)  │後方：    │178 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmS  │113560- │ ABC輸送体成分    │AgaC      │前方：    │179 │
│      │112697  │                  │(T45530)  │後方：    │180 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmT  │114522- │ ABC輸送体成分    │AgaB      │前方：    │181 │
│      │113557  │                  │(T45531)  │後方：    │182 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmU  │116060- │ ABC輸送体成分    │OphA      │前方：    │183 │
│      │114519  │                  │(S77572)  │後方：    │184 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│lnmV  │116494- │不明              │          │前方：    │185 │
│      │116132  │                  │          │後方：    │186 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmW  │118041- │4-クマリン酸 CoAリ│(T08074)  │前方：    │187 │
│      │116491  │ガーゼ            │          │後方：    │188 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmX  │118780- │保存領域、機能不明│(CAC04222)│前方：    │189 │
│      │118049  │                  │          │後方：    │190 │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
表２（続き）
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│InmY  │120239- │抗生物質流出タンパ│Mct       │前方：    │191 │
│      │118815  │ク質              │(AAD32747)│後方：    │192 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmZ  │121638- │シトクロムP450ヒド│MycG      │前方：    │193 │
│      │120436  │ロキシラーゼ      │(S51594)  │後方：    │194 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│InmZ' │121757- │不明              │          │前方：    │195 │
│      │122161  │                  │          │後方：    │196 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│+1    │122832- │保存領域、機能不明│(C70555)  │前方：    │197 │
│      │122182  │                  │          │後方：    │198 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│+2    │123664- │チオエステラーゼ  │GrsT      │前方：    │199 │
│      │122846  │                  │(P14686)  │後方：    │200 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│+3    │123898- │保存領域、機能不明│(CAC18692)│前方：    │201 │
│      │124935  │                  │          │後方：    │202 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│+4    │125516- │おそらくtetR−ファ│HemR      │前方：    │203 │
│      │124806  │ミリー転写調節因子│(BAA21913)│後方：    │204 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│+5    │125637- │抗生物質耐性タンパ│CarA      │前方：    │205 │
│      │127256  │ク質              │(AAC32027)│後方：    │206 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│+6    │127231- │おそらくヒドロラー│VgbB      │前方：    │207 │
│      │128199  │ゼ／ラクトナーゼ  │(AAC61670)│後方：    │208 │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
表２（続き）
┌───┬────┬─────────┬─────┬─────┬──┐
│+7    │129971- │ ABC輸送体        │VarM      │前方：    │209 │
│      │128316  │                  │(BAA96297)│後方：    │210 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│+8    │131727- │アデノシルホモシス│SahH      │前方：    │211 │
│      │130318  │テイナーゼ        │(CAB88907)│後方：    │212 │
├───┼────┼─────────┼─────┼─────┼──┤
│+9    │132616- │5,10−メチレンテト│MetF      │前方：    │213 │
│      │131705  │ラヒドロ葉酸レダク│(054253)  │後方：    │214 │
│      │        │ターゼ            │          │          │    │
└───┴────┴─────────┴─────┴─────┴──┘
* 機能の割り当ては、ギャップド・ブラスト（Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬＡＳＴ）およびＰＳＩ−ブラスト（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ）（参考文献１）解析に基づいた。用語「おそらく」は、少なくとも１つの重要な相同物の生化学的機能が確認されていることを示す；用語「推定」は、相同物の機能が配列類似性からの推測に過ぎないことを示す。
ＤＮＡの相補鎖に対して翻訳されたＯＲＦに下線を付す。
【００８０】
本発明はまた、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）由来の４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）のクローニングおよび配列を提供する。Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）由来のＰＰＴａｓｅの配列は、図５に例示されているアミノ酸パイルアップ（ｐｉｌｅｕｐ）分析において「ｌｎｍ」と命名されている。残りは、他のペプチドおよび／またはポリケチド産生微生物由来のＰＰＴａｓｅである。本明細書に記載のＬｎｍ  ＰＰＴａｓｅは、化学構造多様性の作製のためのレイナマイシンＮＲＰＳ−ＰＫＳ遺伝子の操作された生合成を容易にする。
【００８１】
本明細書において提供される配列情報（例えば、プライマーの配列およびＰＰＴａｓｅの配列）を使用して、標準的な方法（例えば、ＰＣＲ増幅）に従って、ＰＰＴａｓｅ核酸を日常的に単離することができる。
【００８２】
ＩＩＩ．レイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスター、モジュール、および酵素ドメイン
上記のように、１つの実施態様では、本発明は、インビボで発現させることによる新規および既知の両方のポリケチド、ペプチド、およびポリケチド／ポリペプチドハイブリッドの効率的な組換え産生のための新規のＮＲＰＳおよびＰＫＳ遺伝子を提供する。１つの実施態様では、そのような合成はインビトロで行われる。しかし、インビトロでの合成さえも、組換え的に発現されたＰＫＳ、ＮＲＰＳ、またはそれらの酵素ドメインを典型的に利用する。従って、上記のＰＫＳまたはＮＲＰのタンパク質成分の発現が所望されることも多い。
【００８３】
典型的に、経路のタンパク質成分および／またはＮＲＰＳ／ＰＫＳ経路の産物の発現は、発現ベクターに主体ＰＫＳまたはＮＲＰＳを配置し、細胞が所望の産物を発現するように、該ベクターで細胞をトランスフェクトすることによって達成される。
【００８４】
Ａ）核酸の単離／調製
１つの実施態様では、本発明は、レイナマイシンの組換え発現のための核酸を提供する。そのような核酸は、レイナマイシンの集成を指令するのに十分なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む単離された遺伝子クラスターを含む。
【００８５】
本発明の他の実施態様では、酵素によって合成された既知のポリマーに変体を導入することによって、修飾されたレイナマイシン（例えば、レイナマイシンアナログ）、新規のポリケチド、ポリペプチド、およびそれらの組み合わせ（ポリケチド／ポリペプチドハイブリッド）が造成される。そのような変体は、例えば、特定の方法、例えば、ポリマー内の単一のモノマー単位を別の単位で置き換えることにより、予測される構造の誘導分子を造成することによって既知の分子を修飾するような設計によって導入することができる。あるいは、例えば、系統的または偶発的に既知のＰＫＳ中の１以上のモジュールまたは酵素ドメインを代替的モジュールまたはドメインの集合で置き換えることにより既知のポリマーの分子変体のライブラリーを作成することによって、変体を無作為に作製することができる。代替的／修飾されたＰＫＳ、ＮＲＰＳおよびハイブリッド系の産生について以下に記載する。
【００８６】
本明細書において提供されるプライマーおよび配列情報を使用すれば、当業者は、本明細書に記載のレイナマイシンＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳモジュールならびに／あるいは酵素ドメイン（ＯＲＦ）を日常的に単離／クローニングすることができる。例えば、上記の表２において提供されるＰＣＲプライマーを使用して、本明細書において同定されるｏｒｆのいずれかを増幅することができる。さらに、本明細書において提供されるレイナマイシン（ｌｎｍ）遺伝子クラスターの配列情報（例えば、配列表の配列番号１を参照のこと）を使用すれば、個々のＯＲＦ、ＯＲＦの組み合わせ、遺伝子などの増幅に適切な他のプライマーの設計も日常的である。
【００８７】
典型的に、そのような増幅は、テンプレートとして必要な遺伝子（例えば、ストレプトマイセス・アトロオリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ））を含有する生物体のＤＮＡを利用する。典型的な増幅条件は、５０μＬの最終容積中にテンプレートとしての５ｎｇのＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）のゲノムまたはプラスミドＤＮＡ、２５ｐｍｏｌｅの各プライマー、２５μＭ  ｄＮＴＰ、５％ＤＭＳＯ、２単位のＴａｑポリメラーゼ、１×緩衝液を含み、２０％グリセロールを伴うかまたは伴わない。ＰＣＲは、（例えば、ジーン・アンプ・ＰＣＲシステム２４００（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００）（パーキン−エルマー／ＡＢＩ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＡＢＩ））上で）以下の循環スキームで行われる：９４℃で５分間の初期変性、９４℃で４５秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間の２４〜３６サイクル、続いて、７２℃でさらに７分間。当業者であれば、例えば、収量などを改善するためのそのようなプロトコルの最適化は日常的であることを理解するであろう（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；イニス（Ｉｎｎｉｓ）（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｌｉｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、アカデミック出版社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などを参照のこと）。さらに、制限部位を導入して、増幅された配列のベクターへのクローニングを容易にするように、プライマーを設計することもできる。
【００８８】
本明細書に記載の情報を使用すれば、所望される配列をクローニングするための他の配列は当業者に明らかであろう。例えば、ＰＫＳもしくはＮＲＰＳモジュールまたは目的の酵素ドメインは、遺伝子を発現する細胞から誘導されるｃＤＮＡもしくはゲノムラブラリーをスクリーニングするか、または上記を含むことが公知であるベクターから遺伝子を誘導することなどによる組換え方法を使用して、上記を発現する生物体から得ることができる。次いで、標準的な技術を使用して遺伝子を単離し、他の所望されるＮＲＰＳおよび／またはＰＫＳモジュールあるいはドメインと組み合わせることができる。問題の遺伝子がすでに適切なベクターに存在する場合、所望される通り、該遺伝子をインサイチュで他のＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳサブユニットと組み合わせることができる。目的の遺伝子はまた、クローニングするよりもむしろ合成的に生成することもできる。ヌクレオチド配列は、所望される特定のアミノ酸配列に適切なコドンで設計することができる。一般に、配列が発現される意図された宿主に好適なコドンを選択するであろう。標準的な方法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから完全な配列を集成し、完全なコーディング配列に集成させることができる（例えば、エッジ（Ｅｄｇｅ）（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；ナンバイル（Ｎａｍｂａｉｒ）ら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；ジェイ（Ｊａｙ）ら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと）。さらに、オーダーメードの遺伝子合成が商業的に利用可能であることが注目される（オペロン・テクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州アラミダ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ））。
【００８９】
多くのクローニングの行使を介して当業者に指令するのに十分なそのような技術および指示の例は、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）（１９８９）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２、アカデミック出版社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ））；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻、  コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（ＮＹ）；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（１９  １９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ア・ジョイントベンチャー・ビトウィーン・グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・インク・アンド・ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インク（ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）、米国特許第５，０１７，４７８号明細書；ならびに欧州特許第０，２４６，８６４号明細書において見出される。
【００９０】
Ｂ）発現ベクターおよび宿主細胞
広範な発現ベクターおよび宿主細胞がレイナマイシンもしくはレイナマイシンアナログの合成、またはレイナマイシン生合成経路を含むポリペプチドの発現に適切である。
【００９１】
ベクターの選択は、発現させようとする配列に依存する。任の導入可能なクローニングベクターを、本発明の核酸構築物のためのクローニングベクターとして使用することができる。しかし、大きなクラスターを発現させようとする場合、プラスミド、コスミド、Ｐｌ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＨＡＣまたは類似のクローニングベクターを、宿主細胞にヌクレオチド配列をクローニングするために使用することができる。例えば、ファージミド、コスミド、およびＢＡＣは、ここでそれぞれＭ１３ファージおよびλファージにおけるよりも大きなフラグメントのＤＮＡを挿入し、安定に増殖させる能力があるため、有利なベクターである。この方法での使用が認められるファージミドは、一般に、プラスミドと線状ファージクローニングビヒクルとの間のハイブリッドを含む。この方法での使用が認められるコスミドは、一般に、ｃｏｓ部位が挿入されているλファージに基づくベクターを含む。レシピエントプールクローニングベクターは、任意の適切なプラスミドであり得る。変異体のプールが挿入されるクローニングベクターは同一であってもよく、または異なる遺伝子マーカーを有し、発現するように構築されてもよい（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上掲）。異なるマーカー遺伝子を有するそのようなベクターを用いることの有用性を活用して、首尾よい導入の決定を容易にすることができる。
【００９２】
本発明の特定の実施態様では、ＰＫＳ、ＮＲＰＳ、もしくはＮＲＰＳ／ＰＫＳ遺伝子または遺伝子クラスターを宿主（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））細胞に導入するためにベクターが使用される。特定の宿主細胞において使用するための多くのベクターは当業者に周知であり、例えば、マルパルティダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）およびホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３０９：４６２−４６４；カオ（Ｋａｏ）ら、（１９９４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：５０９−５１２；ならびにホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）ら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：１１６−１６６（すべて多様なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）宿主における使用のためのベクターについて記載している）に記載されている。
【００９３】
特定の実施態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における導入および維持を可能にする配列を含むストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ベクターが使用される。そのようなストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）／大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターについては記載されている（例えば、ベラ（Ｖａｒａ）ら、（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：５８７２−５８８１；グイルホイレ（Ｇｕｉｌｆｏｉｌｅ）およびハットチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８５５３−８５５７を参照のこと）。
【００９４】
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）は、チオストレプトン（Ｔｈｉ）およびアプラマイシン（Ａｐｒ）に感受性である。即ち、１つの実施態様では、ｐＧＭ６０（ムス（Ｍｕｔｈ）ら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１９：３４１−３４８）、ＴｈｉR マーカーを担持するベクター、およびＡｐｒR マーカーを担持するｐＫＣ１１３９（ビールマン（Ｂｉｅｒｍａｎ）ら（１９９２）Ｇｅｎｅ，１１６：４３−４９）ベクターは、ｌｎｍ核酸の発現に特に良好に適切である。プロトプラストのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介形質転換（ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）ら（１９８５）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．、ジョン・インス・ファウンデーション（Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）：英国ノリッジ（Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ））かまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７からの接合（ビールマン（Ｂｉｅｒｍａｎ）ら（１９９２）Ｇｅｎｅ，１１６：４３−４９）のいずれかによるプラスミドＤＮＡのＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）への導入が成功し、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）においてインビボでＬｎｍ生合成を操作することが可能であることが実証された。
【００９５】
集合的に、本発明のｌｎｍ遺伝子クラスター、１以上のＯＲＦ、１以上のｌｎｍモジュール、もしくは１以上のｌｎｍドメインをコードする遺伝子配列、またはそのフラグメントは、当業者に既知の方法を使用して、発現ベクターに挿入することができる。好適な発現ベクターは、所望されるＮＲＰＳおよび／またはＰＫＳコーディング配列またはそのフラグメントに操作可能に連結された制御配列を含む。本発明による使用に適切な発現系は、真核および原核宿主細胞において機能する系を含む。しかし、上記で説明したように、原核生物系が好適であり、特に、ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）に適合する系が特に興味深い。そのような系における使用のための制御エレメントは、必要に応じてオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含有するプロモーターを含む。特に有用なプロモーターは、１以上のａｃｔプロモーターなどのＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳから誘導される制御配列を含む。しかし、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）およびマルトースなどの糖代謝酵素から誘導されるプロモーターなどの他の細菌性プロモーターも本発明における使用が認められる。さらなる例は、トリプトファン（ｔｒｐ）、βラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系、バクテリオファージλＰＬ、およびＴ５などの生合成酵素から誘導されるプロモーター配列を含む。さらに、天然では生じないｔａｃプロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号明細書）もまた、細菌宿主細胞において機能する。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）では、ｅｒｍＥおよびｔｃｍＧ（シェン（Ｓｈｅｎ）およびハットチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０７２６−３０７３３）などの構成性プロモーター、ならびにａｃｔＩおよびａｃｔＩＩＩ（プレパー（Ｐｌｅｐｅｒ）ら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，３７８：２６３−２６６；ピーパー（Ｐｉｅｐｅｒ）ら、（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：１１３７３−１１３７４；ならびにワイズマン（Ｗｉｅｓｍａｎｎ）ら、（１９９５）Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．２：５８３−５８９）などの制御可能なプロモーターを含む多くのプロモーターが記載されている。
【００９６】
宿主細胞の増殖に関連するＰＫＳ置換配列の発現の調節を可能にする他の調節配列も所望され得る。調節配列は当業者に公知であり、例としては、調節化合物の存在を含む化学物質または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフにする配列が挙げられる。他のタイプの調節エレメントもベクター、例えば、エンハンサー配列中に存在することができる。
【００９７】
選択マーカーも組換え発現ベクターに含めることができる。形質転換された細胞株の選択に有用な多様なマーカーが公知であり、一般に、発現により細胞が適切な選択培地上で増殖する場合、形質転換された細胞に選択可能な表現型が付与される遺伝子を含む。そのようなマーカーは、例えば、抗生物質耐性または感受性をプラスミドに付与する遺伝子を含む。あるいは、いくらかのポリケチドは、天然に着色されており、この特徴は、本発明の構築物によって首尾よく形質転換された細胞を選択するためのビルトインマーカーを提供する。
【００９８】
多様なＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳクラスターあるいは目的のサブユニットを、個別の制御エレメントを有するか、もしくは例えば、単一のプロモーターの制御下にある個々のカセットとして１以上の組換えベクターにクローニングすることができる。ＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳサブユニットは、ハイブリッドＰＫＳが作製されるように他のＰＫＳサブユニットの容易な消失および挿入を可能にするためのフランキング制限部位を含むことができる。そのような独特な制限部位の設計は当業者に既知であり、部位特異的変異誘発およびＰＣＲなどの上記の技術を使用して、達成することができる。
【００９９】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）におけるＰＫＳまたはＮＲＰＳをコードする遺伝子クラスターを含む遺伝子クラスターなどの大きな核酸をクローニングおよび発現させる方法は、当業者に周知である（例えば、スタッツマン−エングワル（Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ）およびハットチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３１３５−３１３９；モタメディ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）およびハットチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：４４４５−４４４９；グリム（Ｇｒｉｍ）ら（１９９４）Ｇｅｎｅ，１５１：１−１０；カオ（Ｋａｏ）ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：５０９−５１２；ならびにホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）ら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：１１６−１６６を参照のこと）。いくつかの例では、１００ｋｂをかなり超える核酸配列が、ベクターに基づく方法を使用して、原核細胞を含む細胞に導入されている（例えば、オソエガワ（Ｏｓｏｅｇａｗａ）ら、（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５２：１−８；ヲーン（Ｗｏｏｎ）ら、（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５０：３０６−３１６；フアング（Ｈｕａｎｇ）ら、（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：４２０２−４２０９を参照のこと）。
【０１００】
レイナマイシン、レイナマイシンアナログ、レイナマイシン分路代謝物、ｌｎｍモジュール、ｏｒｆ、または触媒ドメインなどの組換え産生のための宿主細胞は、組換えＰＫＳ、ＮＲＰＳまたはＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子クラスターを有する可能性を伴う任意の生物体から誘導することができる。従って、本発明の宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずからも誘導することができる。しかし、好適な宿主細胞は、多くのポリケチドおよびペプチドの豊富な生産者である菌糸型細菌のクラスである放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）から構築される細胞である。本発明での使用のために特に好適な属は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）である。従って、例えば、特に、Ｓ．バーチシラス（Ｓ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ）、Ｓ．アンボファシエンス（Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｓ．アベルミチリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、Ｓ．アズレウス（Ｓ．ａｚｕｒｅｕｓ）、Ｓ．シナモネンシス（Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｓ．クラコイ（Ｓ．ｃｕｒａｃｏｉ）、Ｓ．エリスレウス（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅｕｓ）、Ｓ．フラジエ（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）、Ｓ．ガリラエウス（Ｓ．ｇａｌｉｌａｅｕｓ）、Ｓ．グラウスセンス（Ｓ．ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ．ヒグロスコピカス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．パルバルス（Ｓ．ｐａｒｖｕｌｕｓ）、Ｓ．ペイセチウス（Ｓ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）、Ｓ．リモーサス（Ｓ．ｒｉｍｏｓｕｓ）、Ｓ．ロセオフルバス（Ｓ．ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ）、Ｓ．サーモトレランス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｓ．ビオラセオルバー（Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）は、主題発明に簡便な宿主細胞を提供し、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が好適である（例えば、多様なポリケチド産生生物およびそれらの天然産物の説明については、ホップウッドＤ．Ａ．（Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．）およびシェルマンＤ．Ｈ．（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｈ．）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ（１９９０）２４：３７−６６；Ｏ’ハガンＤ．（Ｏ’Ｈａｇａｎ，Ｄ．）Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ（エリス・ホルウッド社（Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、１９９１）を参照のこと）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における相同遺伝子発現に関連する２つの一般的な問題は、（１）可溶化および再生のさらなる工程を必要とし、しばしば不活性酵素を生じる封入態の形成、ならびに（２）得られる酵素の不適切な翻訳後プロセシングである。これらの問題は、上記のようにストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）においてストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）起源の遺伝子を発現させることによって、回避することができる。好適な実施態様では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）シャトルベクター（例えば、ｐＷＨＭ３、ｐＷＨＭ６０１、ｐＡＮＴ１２００、ｐＡＮＴ１２０１、ｐＧＭ６０、ｐＫＣ１１３９）を使用するクローニングが好ましい。シ���トルベクターを使用すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でほとんどのサブクローニングを容易に行うことができる。上記のように、特に好適なベクターは、ｐＧＭ６０、ｐＫＣ１１３９を含む。標的遺伝子の制御された発現を所望する場合、ｐＭＲ５は、転写がａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４転写調節因子の制御下にあるａｃｔＩおよびａｃｔＩＩプロモーター対を担持するため、ｐＭＲ５（マックダニエル（ＭｃＤａｎｉｅｌ）ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：１５４６−１５５０）は良好な選択である。このベクターは、ごく最近、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）およびＳ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）において、本発明者らにより、Ｂｌｍ  ＮＲＰＳおよびＰＫＳ遺伝子を含む多様なＰＫＳ（マックダニエル（ＭｃＤａｎｉｅｌ）ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：１８４６−１８５１；ピーパー（Ｐｉｅｐｅｒ）ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，３７８：２６３−２６６）遺伝子の発現に使用されている。
【０１０１】
さらに、ＮＲＰＳのＰＣＰドメインかまたはＰＫＳのＡＣＰドメインのいずれかの保存されたセリン残基へのＣｏＡの４’−ホスホパンテテイン部分の共有結合による翻訳後修飾を触媒する４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの新規のファミリーが最近同定されている（ゲーリング（Ｇｅｈｒｉｎｇ）ら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：１７−２４；ランバロット（Ｌａｍｂａｌｏｔ）ら（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３：９２３−９３６；ワルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：３０９−３１５）。現在、ＮＲＰＳまたはＰＫＳ遺伝子および４’−ホスホパンテテイントランスフェラーゼ遺伝子の過剰発現（デュ（Ｄｕ）およびシェン（Ｓｈｅｎ）（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：５０７−５１７；コックス（Ｃｏｘ）ら（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４０５：２６７−２７２；ク（Ｋｕ）ら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：２０３−２０７）によってインビボでかまたは４’−ホスホパンテテイントランスフェラーゼの存在下でＣｏＡによるアポＡＣＰまたはアポＰＣＰのホスホパンテテイニル化（デュ（Ｄｕ）およびシェン（Ｓｈｅｎ）（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：５０７−５１７；コックス（Ｃｏｘ）ら（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４０５：２６７−２７２）によってインビトロでのいずれかで機能的ホロ−ＮＲＰＳまたはＰＫＳを過剰発現させることが可能である。インビボおよびインビトロ方法の両方が本発明者らの研究室で確立されており（デュ（Ｄｕ）およびシェン（Ｓｈｅｎ）（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：５０７−５１７）、翻訳後修飾の必要性が生じれば、機能的ＮＲＰＳおよびＰＫＳ酵素の産生に適用することができる。
【０１０２】
特定の実施態様では、本発明は、ＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ遺伝子を欠くかあるいは天然に存在するＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ遺伝子が実質的に欠失されたかいずれかの遺伝子操作された細胞を利用することができる。これらの宿主細胞は、活性ポリケチドの産生のために多様なＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ遺伝子クラスターをコードする組換えベクターで形質転換することができる。本発明は、増殖サイクルの適切な段階での顕著な量の産物、例えば、レイナマイシンの産生を提供する。そのようにして産生されるレイナマイシン、レイナマイシンアナログ、または他のポリケチド、ペプチド、もしくはハイブリッドポリケチド／ペプチド代謝物は、問題である代謝物のタイプに依存する多くの疾患の治療のための治療剤として使用することができる。
【０１０３】
上記のベクターおよび宿主細胞を使用して、その後の単離のためにポリケチドおよび／またはポリペプチド合成モジュールの多様なタンパク質成分を発現させ、ならびに／あるいは１以上の所望される生体分子（例えば、レイナマイシン、レイナマイシンアナログなど）の生物学的合成を提供する。レイナマイシン、および／またはレイナマイシンアナログ、ならびに／あるいはレイナマイシン（ｌｎｍ）クラスターの１以上のタンパク質を、以後の単離および／または特徴付けのために発現（例えば、過剰発現）させる場合、タンパク質は、タンパク質の発現に適切な任意の原核または真核細胞で発現させる。１つの実施態様では、タンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるレイナマイシンの過剰発現については、実施例１に記載されている。
【０１０４】
特定の実施態様では、真核宿主細胞が好ましい（例えば、特定のグリコシル化パターンが所望される場合）。適切な真核宿主細胞は当業者に周知である。そのような真核細胞としては、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、菌類細胞、および多様な哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ細胞株および様々な骨髄腫細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
Ｃ）タンパク質／ポリケチドの回収
ポリペプチドおよび／またはポリケチドの回収は、当業者に周知の標準的方法に従って達成される。従って、例えば、ｌｎｍクラスタータンパク質を発現および単離しようとする場合、単離（例えば、Ｈｉｓ6）タグを容易にするための簡便なｔａｇでタンパク質を発現させることができる。他の標準的なタンパク質精製技術も適切であり、当業者に周知である（例えば、クアドリ（Ｑｕａｄｒｉ）ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７：１５８５−１５９５；ナカノ（Ｎａｋａｎｏ）ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３２：３１３−３２１などを参照のこと）。
【０１０６】
同様に、レイナマイシンの成分（例えば、モジュールおよび／または酵素ドメイン）を使用して、多様な生体分子（例えば、ポリケチド、ポリペプチドなど）を発現させる場合、当業者に周知の標準的な方法（例えば、カレラス（Ｃａｒｒｅｒａｓ）およびコスラ（Ｋｈｏｓｌａ）（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７：２０８４−２０８８；ドイチュエル（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍ．ドイチュエル（Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）編を参照のこと）に従って、所望される産物および／または分路代謝物が単離される。ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：１７６８−１７７４の開示内容および効率的な培養系に若干の変更を加えて使用し、レイナマイシンを発現させた（実施例１を参照のこと）。発現させたレイナマイシンの精製についても実施例１に記載している。
【０１０７】
Ｄ）最適化された発現系
プラスミドＤＮＡのストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種への導入のために、典型的に４つの方法が使用される：ＰＥＧを仲介するプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合、およびファージインフェクション。標準的なプロトコルがストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）実験マニュアル（ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）ら（１９８５）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ：英国ノリッジ（Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ））において利用可能であり、様々なストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種のためのいくらかの異なる形質転換形が説明されている（リウ（Ｌｉｕ）およびシェン（Ｓｈｅｎ）（２０００）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｒｍｏｔｈｅｒ．，４４；３８２−３９２；リヘンステイン（Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ）ら（１９９０）Ｇｅｎｅ，８８：８１−８６；ザング（Ｚａｎｇ）ら（１９９７）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８３：２１７−２２１；マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）およびバルツ（Ｂａｌｔｚ）（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２：１８０−１８５；ガルシア−ドミングエズ（Ｇａｒｃｉａ−Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）ら（１９８７）Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５３：１３７６−１３８１；アイドー（Ａｉｄｏｏ）ら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３６：６５７−６６２；イリング（Ｉｌｌｉｎｇ）ら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３５：２２８９−２２９７）。
【０１０８】
実施例１は、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）について最適化したトランスフェクション形について説明している。接合アプローチを追及したところ、以外にも成功した。胞子（１×１０9 ）に、５０℃で１０分間ではなく、４２℃で２０分間熱ショックを与え、続いて、３０℃で６時間までインキュベーションを行う。熱ショック４時間後から３０分ごとに、顕微鏡による確認で胞子の発芽をモニターすることができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（所望の構築物を有する）培養物を新たに調製し、ＩＳＰ−４改変培地上で接合を行う。例えば、２８℃で５日間インキュベーション後、見かけ上陽性な前接合体（ｅｘ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が同定される。本発明者らは、非複製構築物ｐＹＣ２１の接合／組込み効率は約１．８×１０-8であり、自己複製構築物の接合効率を５×１０-7と結論した。
【０１０９】
ＩＶ．レイナマイシンおよびレイナマイシンアナログの合成
１つの実施態様では、本発明は、レイナマイシン系薬剤を合成する方法および組換え的に合成されたレイナマイシン系薬剤を提供する。上記のように、これは、一般に、完全なレイナマイシンおよび／またはレイナマイシンアナログの合成を指令するのに十分なレイナマイシン遺伝子クラスターの成分を含有する生物体（例えば、細菌細胞）を提供することによって達成される。
【０１１０】
１つの実施態様では、レイナマイシンクラスター全体、またはそのフラグメント（例えば、相同組換えを介してクラスターに修飾を導入するために設計される）をストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株（例えば、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ））にクローニングされる。Ｋａｏら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：５０９−５１２は、Ｓａｃｃ．エリスメア（Ｓａｃｃ．ｅｒｙｔｈｍｅａ）からＳ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）へ３０ｋｂ  ＤＥＢＳ遺伝子をクローニングし、Ｓ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）において６−デオキシエリスロノリドＢを産生させたが、これらの方法を使用して、レイナマイシンクラスターの異種発現のための発現プラスミドを構築することができる。この方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における相同二重組変え事象による温度感受性プラスミドとシャトルベクターとの間のＤＮＡの伝達に関与する（シオ（Ｓｓｓｉｏ）ら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３４３−３４５）。
【０１１１】
１つの好適な実施態様では、レイナマイシンクラスターまたはそのフラグメントに及ぶ２つの末端、あるいは組換え構築物は、ｐＣＫ６などのクロラムフェニコール耐性（ＣＭR ）である温度感受性プラスミドにクローニングされる。次いで、ＣｍR レシピエントプラスミドおよび所望の構築物を含有するアプラマイシン耐性（ＡｐR ）ｐＫＣ５０５ドナーコスミドで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を同時形質転換することによって、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＤＮＡをドナーから温度感受性レシピエントへ解放し、続いて、３０℃でクロラムフェニコールおよびアプラマイシン選択を行う。両プラスミド（ＣｍR 、ＡｐR ）を有するコロニーを、クロラムフェニコールおよびアプラマイシンプレート上で４４℃に移すと、２つのプラスミド間の単一の組換え事象によって形成される同時組込み体のみが生存する。次いで、生存しているコロニーをＣｍR プレート上３０℃で増殖させ、第２の組換え事象を介する同時組込み体の切開によって形成される組換えプラスミドを選択する。所望の構築物をＣｍR 温度感受性プラスミドにクローニングすると、相同組換え事象と同様の手段によって、容易に任意のプラスミドに移動する。
【０１１２】
実施例１に例示される網１つの系は、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）は３０℃で極めて良好に増殖し、３５℃を超える温度では増殖しない。さらに、それは、アプロマイシン（ａｐｒｏｍｙｃｉｎ）（Ａｍ）およびチオストレプトン（Ｔｈｉｏ）の両方に高い感受性を呈する。従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）シャトルベクターｐＯＪ２６０（自殺ベクター、ＡｍR ）およびｐＫＣ１１３９（自己複製ベクター、ＡｍR ）を使用して、所望のｌｍｐまたはｌｍｐ修飾構築物を作製することができる。
【０１１３】
本発明の方法および構築物を使用して、内因性レイナマイシンの発現を改変することができる。本明細書において提供されるｌｎｍ遺伝子クラスター情報を使用すれば、当業者は、内因性レイナマイシンの合成を調節することができる。特に、レイナマイシンの合成レベルを改変するために、ｌｎｍ遺伝子クラスターを含む様々なＯＲＦの発現を増加または減少してもよい。
【０１１４】
内因性遺伝子の発現を改変する方法は当業者に周知である。典型的に、そのような方法は、調節しようとする特定の遺伝子の発現を制御する調節配列の全部もしくは一部を改変または置き換えることに関与する。好適な実施態様では、１以上のｌｎｍＯＲＦの上流の調節配列（例えば、生来のプロモーター）が改変される。
【０１１５】
これは、典型的に、相同組換えを使用して、異種核酸を生来の調節配列に導入することによって達成される。１以上のｌｎｍ  ＯＲＦの発現をダウンレギュレートするためには、リーディングフレームを改変するかまたはプロモーターを破壊するかのいずれかである簡単な変異が適切である。ｌｎｍ  ＯＲＦの発現をアップレギュレートするために、生来のプロモーターを、通常の転写レベルよりも高く誘導する異種プロモーターで置換することができる。特に好適な実施態様では、問題の構造遺伝子または上流配列を含む核酸配列は、異種組換え構築物を標的化するために利用される。内因性遺伝子の発現を改変するための相同組換えの使用については、米国特許第５，２７２，０７１号明細書、ＷＯ９１／０９９５５、ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９６／２９４１１、ＷＯ９５／３１５６０、およびＷＯ９１／１２６５０に詳細に記載されている。
【０１１６】
さらに、またはあるいは、特定のＯＲＦを、野生型の生物体よりも高いレベルで発現する構築物を誘導することができる。例えば、レイナマイシン生合成を操作することによるレイナマイシンの産生収量の改善については、例としてｌｎｍＧを使用して実証されている。ＬｎｍＧは、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）（第１ドメイン）およびエノイルレダクターゼ（ＥＲ）（第２ドメイン）に相同なアミノ酸配列を有する２ドメインタンパク質である。ｌｎｍＧの不活性化により、レイナマイシンを産生する能力が完全に破壊されているＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）変異株を生じる。この結果は、ｌｎｍＧ、およびそれによってクローン化された遺伝子クラスターがレイナマイシン産生をコードすることを明白に確立する。
【０１１７】
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ｌｎｍＧ変異体にｌｎｍＧ過剰発現プラスミドを導入すると、レイナマイシンを産生する能力を回復するだけではなくて、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）株と比較して、レイナマイシンの過剰発現を生じる。従って、図６に示されるように、ｌｎｍＧの発現がｅｒｍＥプロモーターの制御下にある、低コピー数（１０）プラスミドで形質転換されたＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ｌｎｍＧ変異体は、野生型のＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）株と同様のレベルのレイナマイシンを産生する。ｌｎｍＧの発現がｅｒｍＥプロモーターの制御下にある、中程度のコピー数（３００）プラスミドで形質転換されたＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ｌｎｍＧ変異体は、野生型のＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）株よりも３〜５倍多いレイナマイシンを産生する。
【０１１８】
１つの特定の実施態様では、本発明は、修飾されたレイナマイシン系薬剤またはレイナマイシンアナログを合成する方法を提供する。典型的に、そのような実施態様では、レイナマイシンアナログは、特定の変動を個々のＮＲＰＳおよび／またはＰＫＳ酵素ドメインもしくはモジュールに導入することによるか、あるいはＮＲＰＳまたはＰＫＳ酵素ドメインおよび／またはモジュールがレイナマイシン遺伝子クラスターに出現する線上での順序を再プログラムすることによって合成される。前者は、レイナマイシン骨格において標的化された修飾を有するレイナマイシンアナログを生じ、後者は、多様な配列における他の伸長単位のレイナマイシン生合成への組み入れを可能にする。
【０１１９】
好適な実施態様では、レイナマイシンアナログを生じるためのｌｎｍ遺伝子クラスターの修飾は、２つの異なるアプローチのうちの一方によって達成される。一方のアプローチでは、ｌｎｍ酵素ドメインおよび／またはモジュールを指令された様式（即ち、それらは予め選択された方法で変更される）で改変する一方、もう１つのアプローチでは、無作為／偶発的改変がｌｎｍクラスターに導入され、得られる産物をスクリーニングして、所望の特性を有する産物を同定する。
【０１２０】
Ａ）ｌｎｍ遺伝子の特定の操作によるレイナマイシンアナログの合成
ｌｎｍ遺伝子は、特定の変異かあるいはＮＲＰＳまたはＰＫＳ酵素ドメインもしくはモジュールの線上の順序を再プログラムすることによって、再操作することができる。このアプローチでは、野生型ｌｎｍ対立遺伝子（ＯＲＦ）は、異なる順序で多様なｌｎｍ  ＯＲＦを含有する変異構築物で置き換えられる（組換えられる）。これらの変異体は、適切な宿主（例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）かまたは異種宿主）に導入され、発現される。ＮＲＰＳ（スタヘルハウス（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ）ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：６９−７２）およびＰＫＳ（ドナディオ（Ｄｏｎａｄｉｏ）ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７１１９−７１２３，ドナディオ（Ｄｏｎａｄｉｏ）ら（１９９５）Ｊ．Ａｍ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：９１０５−９１０６，コルテス（Ｃｏｒｔｅｓ）ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１４８７−１４８９）は両方とも再プログラムにかなりの耐性を示したため、ｌｎｍクラスターのこれらの修飾により、予測される構造改変を有するレイナマイシンアナログが産生される。
【０１２１】
このアプローチを使用して、Ｌｎｍの生合成を管理する遺伝子を合理的に操作することにより、化学修飾によって調製するのが極めて困難であるかまたは全合成するには多大な労力がかかる新規のＬｎｍアナログの調製が可能である。そのようなアナログの例としては、ｌｎｍＡ、ｌｎｍＢ、またはｌｎｍＺなどのＣ−８ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子およびＣ−６メチルトランスフェラーゼをコードするｌｈｍＪのＰＫＳ−４のＭＴドメインを個別または両方、それぞれに不活性化して作製することができる（図４、図７）８−デヒドロキシ−Ｌｎｍ、６−デメチル−Ｌｎｍ、および８−デヒドロキシル−６−デメチル−Ｌｎｍ（図７）が挙げられる。
【０１２２】
水性条件下のＬｎｍの安定性はｐＨに依存し：ｐＨ６でｔ1/2 ＞２０時間、ｐＨ７でｔ1/2 ＝８時間、およびｐＨ８でｔ1/2 ＜１時間である（アサイ（Ａｓａｉ）ら（１９９７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：７２３−７２９）。チオールの存在下で、Ｌｎｍは、さらに短いｔ1/2 を示し、分解して２つの主要な付加物ＡおよびＢを形成することによって不活性化される（図８）。従って、８−デヒドロキシル−Ｌｎｍにおけるように８−ヒドロキシル基の除去は付加物Ｂの形成を排除すべきであり、活性型のエピスルホニウムイオンの濃度を効率的に増大する。付加物Ａは、ＤＮＡの代わりにＨ2 Ｏによるエピスルホニウムイオンの求核攻撃から生じ、アルキル化ＤＮＡ切断を生じる。エピスルホニウムイオンの求電子中心（Ｃ−６）は、Ｌｎｍの３°炭素であるため、Ｈ2 ＯまたはＤＮＡの−ＮＨ2 基による後者の求核攻撃は、ＳN １機構によって進行するようである。従って、２つの求核基の間にはほとんど差異が認められない（アサイ（Ａｓａｉ）ら（１９９７）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：７２３−７２９）。対照的に、６−ジメチルＬｎｍは、求電子中心として２°炭素を有するエピスルホニウムイオンを造成する。後者の中間体はより安定であるべきであり、ＳN ２機構を介してＤＮＡをアルキル化するようである。従って、Ｈ2 Ｏよりも極めて強力な求核基であるため、ＤＮＡの−ＮＨ2 基の方が選択的にアルキル化されてＤＮＡの切断を生じるべきであり、Ｈ2 Ｏは、エピスルホニウムを攻撃して不活性な付加物Ａを形成するほど強い求核基ではないかもしれない（少なくともＤＮＡの存在下では不利に競合する）。最後に、８−デヒドロキシル−６−デメチル−Ｌｎｍは、改善された安定性およびＤＮＡせつだんにたいするせんたくせいを示すべきであり、良好な薬物候補としての役割を果たす（図８）。
【０１２３】
他の好適な実施態様は、オキサゾールまたはビチアゾール部分を有するＬｎｍの合成（それぞれ、オキサゾリル−Ｌｎｍまたはジチアゾリル−Ｌｎｍ）を意図する（図７）。前者は、ＮＲＰＳ−２のシステイン特異的Ａドメインをセリン特異的Ａドメインで置き換え得（シェン（Ｓｈｅｎ）ら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２７：１５５−１７１）、後者はＮＲＳＰ−２モジュールを、ブレオマイシン遺伝子クラスター由来のビチアゾール形成ＮＲＰＳモジュールで置き換えることによって生じ得る（ＰＣＴ／ＵＳ００／００４４５を参照のこと）。オキサゾールおよびチアゾールは、薬物−ＤＮＡ認識に重要な役割を果たすことが公知であるため（リ（Ｌｉ）ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：１１８８−１１９３；ロイ（Ｒｏｙ）ら（１９９９）Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．，１６：２４９−２）、これらの新規のオキサゾールまたはビチアゾール含有Ｌｎｍアナログは、抗癌剤として改善された効力を示し得るとみなすことは合理的である。これらの５つの例はＬｎｍ  ＮＲＰＳ／ＰＫＳ遺伝子の合理的な操作によって調製され得るＬｎｍアナログのタイプの代表例に過ぎず、その選択は、Ｌｎｍの作用機構を考慮することにより影響を受ける。本発明者らは、ＬｎｍのＮＲＰＳおよびＰＫＳ遺伝子の遺伝子操作によって他の多様な変更をＬｎｍに導入することができると考えている。
【０１２４】
ドメインまたはモジュールのいずれかの交換によってＮＲＰＳおよびＰＫＳの両方を操作することは、所望の構造の変更を有する新規のペプチド（スタウヘルハウス（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ）ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：６９−７２；ベルシャウ（Ｂｅｌｓｈａｗ）ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：４８６−４８９；スタウヘルハウス（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ）ら（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：４９３−５０５；デ・フェルラ（ｄｅ  Ｆｅｒｒａ）ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２５３０４−２５３０９；エルスネル（Ｅｌｓｎｅｒ）ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：４８１４−４８１９；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５７：３０８−３１８；スタウヘルハウス（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ）およびマラヒール（Ｍａｒａｈｉｅｌ）（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５２：１７７−１８６）およびポリケチド（ドナディオ（Ｄｏｎａｄｉｏ）ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：７１１９−７１２３；コルテス（Ｃｏｒｔｅｓ）ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１４８７−１４８９；カオ（Ｋａｏ）ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：５０９−５１２；カオ（Ｋａｏ）ら（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：１１６１２−１１６１３；カオ（Ｋａｏ）ら（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：９１０５−９１０６；マックダニエル（ＭｃＤａｎｉｅｌ）ら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：４３０９−４３１０；ピーパー（Ｐｉｅｐｅｒ）ら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１８４６−１８５１；ベッドフォルド（Ｂｅｄｆｏｒｄ）ら（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３：８２７−８３１；オリニク（Ｏｌｉｙｎｙｋ）ら（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３：８３３−８３９；マックダニエル（ＭｃＤａｎｉｅｌ）ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：１８４６−１８５１；ヤコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）ら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：３６７−３６９；ゴハレ（Ｇｏｋｈａｌｅ）ら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：４８２−４８５；ルアン（Ｒｕａｎ）ら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：６４１６−６４２５；スタッシ（Ｓｔａｓｓｉ）ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９５：７３０５−７３０９）を作製するのに非常に成功している。ＮＲＰＳおよびＰＫＳ両方のドメインまたはモジュール境界は良好に規定されているが、個々のドメインまたはモジュール交換実験の有効性は好ましくは経験的に決定される。
【０１２５】
特定の好適な実施態様では、マクロラクタムを単離し、質量スペクトルならびに１−Ｄおよび２−Ｄ  ＮＭＲ分析に供して、ｌｎｍＡ、ｌｎｍＢ、ｌｎｍＺ、および／またはｌｎｍＪにおけるＰＫＳ−３のＭＴドメイン（それぞれ８−デオキシル−ＬＮＭ、または６−デメチル−Ｌｎｍを生じる）の不活性化を決定する。同様のストラテジーを使用して、８−デヒドロキシル−６−デメチル−Ｌｎｍの産生のためのヒドロキシラーゼおよびメチルトランスフェラーゼ遺伝子の二重不活性化、ならびにオキサゾリル−Ｌｎｍおよびジチアゾリル−Ｌｎｍを産生するＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）組換え株を構築するためのＬｎｍ  ＮＲＰＳ−２の所望されるドメインまたはモジュール置換を行う。
【０１２６】
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）におけるＬｎｍ生合成のインビボ・インビトロ操作は、特定の実施態様において、ここで実行可能であることが実証されているが、新たに開発された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）人工染色体（ソシオ（Ｓｏｓｉｏ）ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３４３−３４５）かまたは多プラスミドアプローチ（タング（Ｔａｎｇ）ら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ，８７：６４０−６４２；キュエ（Ｘｕｅ）ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６：１１７４０−１１７４５）のいずれかによって、ｌｎｍ遺伝子クラスター全体を、例えば、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）またはＳ．コエリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）にクローニングする方法が利用可能であり、使用することができる。
【０１２７】
レイナマイシン生合成を操作することによる新規のレイナマイシンの産生は、ｌｎｍＨを例として実証されている。ＬｎｍＨは、アミノ酸配列解析に基づいて機能不明のタンパク質である。ｌｎｍＨを不活性化すると、もはやレイナマイシンを産生しないがＨＰＬＣ分析上で少なくとも２つの新規のレイナマイシン代謝物を蓄積するＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）変異体を生じる（図９を参照のこと）。これらの新規の代謝物の産生は、ＯＲＦ４３の不活性化から広範に生じる。低コピー数プラスミドのｅｒｍＥ* 下でのｌｎｍＨの過剰発現によってｌｎｍＨ変異体を補正すると、変異体株にレイナマイシン産生が回復して、野生型Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）株と同じ代謝プロフィールを有する。
【０１２８】
Ｂ）ｌｎｍ遺伝子の「無作為」修飾によるレイナマイシンアナログの合成
無作為に修飾したメガシンテターゼの産物を発現するｌｎｍクラスターの遺伝子を無作為／偶発的に改変し、次いで所望の活性について産物をスクリーニングすることによっても、レイナマイシンアナログを合成することができる。ｌｎｍクラスターの遺伝子を「無作為に」改変する方法については以下に記載する。
【０１２９】
Ｖ．他の合成系の作製
レイナマイシンまたは修飾されたレイナマイシンの産生に加えて、レイナマイシン遺伝子クラスターまたはそのエレメントは、それ自体であるいはＮＲＰＳおよび／またはＰＫＳモジュールならびに／あるいは  様々なポリケチド、ポリペプチド、ポリケチド／ポリペプチドハイブリッド、様々なオキサゾールおよびチアゾール、様々な糖、様々なメチル化ポリペプチド／ポリケチドなどを含むがこれらに限定されない広範な化合物を産生するための他のＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ系の酵素ドメインと組み合わせて使用することができる。上記の修飾されたレイナマイシンの産生に関して、大きなモジュールＰＫＳ、ＮＲＰＳ、およびハイブリッドＰＫＳ／ＮＲＰＳ系を使用して、触媒的生合成により、インビボまたはインビトロでそのような化合物を産生させることができる。そのような合成を指令するメガシンテターゼは、例えば、ポリケチドおよび／またはポリペプチドならびに／あるいはハイブリッドＰＫＳ／ＮＲＰＳ経路の予め決定された改変／修飾によって、合理的に設計することができる。あるいは、特定の経路の無作為修飾により様々なメガシンテターゼを有する細胞の大きなコンビナトリアルライブラリーを生成し、次いで、目的のモジュール（単数または複数）の産生について選択することができる。特定の実施態様では、メガシンテターゼ／修飾された経路のそのようなライブラリーを使用して、所望の活性についてそれ自体をスクリーニングすることができる化合物の大きな複合的コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。
【０１３０】
Ａ）生体分子の指令された修飾
レイナマイシン生合成遺伝子クラスターおよび／またはその変体のエレメントは、広範な「指令された」生合成プロセス（即ち、ここで、プロセスは、１以上の特に予め選択された代謝物を修飾および／または合成するために設計される）に使用することができる。特定のオープンリーディングフレームまたはオープンリーディングフレームの組み合わせによってコードされるポリペプチドを利用して、生物学的分子の特定の化学修飾を実施することができる。
【０１３１】
従って、例えば、ポリペプチドシンテターゼをコードするオープンリーディングフレームを使用して、アミノ酸をもう１つのアミノ酸に結合させることによりアミノ酸を化学的に修飾することができる。当業者であれば、ここで提供される情報を利用して、「生来の」レイナマイシン生合成代謝物を基質分子として使用するか、または問題の特定の酵素の基質として作用することが可能な他の分子を使用して、文字通り無数の化学修飾および／または合成を実施することができる。他の基質は、日常的スクリーニングによって同定することができる。特定の基質に対する特異的活性について酵素をスクリーニングする方法は、当業者に周知である。
【０１３２】
例えば、所望のレイナマイシン遺伝子クラスターオープンリーディングフレームを含む宿主細胞を提供することによってインビボで、ならびに／あるいはレイナマイシン遺伝子クラスターｏｒｆによってコードされるポリペプチドおよび適切な基質および／または補因子を提供することによってインビボで、生合成を実施することができる。
【０１３３】
Ｂ）新規の合成経路の指令された操作
本発明の多数の実施態様では、酵素によって合成された既知のポリマーに変動を導入するように既知のＰＫＳまたはＮＲＰＳを修飾することによって、新規のポリケチド、ポリペプチド、およびそれらの組み合わせが造成される。そのような変動は、例えば、ポリマー内の単一のモノマー単位をもう１つの単位と置き換え、それによって予測される構造の特殊な分子を造成することによって、例えば、特定の方法で既知の分子を修飾するための設計によって、導入することができる。そのような変動は、１以上の分子を既知のＰＫＳまたはＮＲＰＳに添加するか、あるいは既知のＰＫＳまたはＮＲＰＳから１以上の分子を取り出すことによっても作製することができる。そのような新規のＰＫＳまたはＮＲＰＳは、組換え方法およびインビトロ合成方法を含む様々な技術を使用して作製することができる。
【０１３４】
これらの方法のいずれかを使用して、ＰＫＳドメインをＮＲＰＳに導入するか、またはその逆を行い、それによって、ペプチドおよびポリケチド構造ドメインの両方を含む新規の分子を作製することが可能である。例えば、既知のポリケチドを産生するＰＫＳ酵素は、ポリケチドにペプチド部分を付加するさらなる分子を含むように修飾することができる。これらの方法を使用して合成される新規の分子は、標準的な方法を使用して、抗生物質活性、細胞周期に対する影響、細胞骨格に対する影響などの目的の任意の活性についてスクリーニングすることができる。
【０１３５】
組換え体あるいはインビトロ合成方法を使用して、新規のＰＫＳまたはＮＲＰＳをデノボで造成することによって、新規のポリケチド、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを作製することもできる。即ち、特定のポリマーを造成するために、そのような新規の整列のドメインを設計することができる。モジュールを組み合わせることによって新規のＰＫＳまたはＮＲＰＳを造成することに加えて、本発明の方法を使用して、成長しているポリペプチドまたはポリケチド鎖に新たなモノマー単位を付加することができる新規の分子を作製することができる。各モジュールの正体、従って、モジュールに拭かされるモノマーの正体は、モジュールを含む機能的ドメインの正体および数によって決定されるため、モジュール内の機能的ドメインの新規の組み合わせを造成することによって、新規のモノマー単位を生成することが可能である。そのような新規のモジュールは、例えば、特定のモノマーをポリケチドもしくはポリペプチドに付加する特定のモジュールを作製するための設計によって造成することができるか、または新規のモジュールのライブラリーを生成するようにドメインの無作為な会合によって造成することもできる。そのような新規のモジュールは、組換えまたはインビトロ合成手段によって作製することができる。
【０１３６】
生来のＮＲＰＳおよび／またはＰＫＳサブユニット配列に変異を作製することができ、変異体が他のＰＫＳおよび／またはＰＫＳサブユニットと共に機能して、同定可能なポリケチドおよび／またはポリペプチドの合成を集合的に触媒することが可能な限り、そのような変異は生来の配列の代わりに使用される。そのような変異は、変異を含む合成オリゴヌクレオチドを調製して、制限エンドヌクレアーゼ消化を使用してＮＲＰＳおよび／またはＰＫＳサブユニットをコードする遺伝子に変異された配列を挿入することなどによる従来の技術を使用して、生来の配列に作製することができる（例えば、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４８；ガイセルソダー（Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒ）ら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ５：７８６）。あるいは、ミスマッチ二重鎖の融解温度よりも低い温度で、生来のヌクレオチド配列にハイブリダイズするミスマッチプライマー（一般に１０〜２０ヌクレオチド長）を使用して、変異を生じさせることもできる。特に、プライマーの長さおよび塩基組成を比較的狭い限界内に保持し、変異塩基を中心に配置することにより、プライマーを作製することができる（ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）（１９８３）Ｍｅｔｈ，Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８）。ＤＮＡポリメラーゼを使用してプライマー伸長を生じ、産物をクローニングして、プライマー伸長鎖の分離よって誘導される変異ＤＮＡを含有するクローンを選択する。選択は、ハイブリダイゼーションプローブとしての変異プライマーを使用して達成することができる。複数点の変異を作製するための技術も適用可能である（例えば、ダルビー−マックファーランド（Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ）ら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ７９：６４０９）。ＰＣＲ変異誘発も、所望される変異を生じさせるための使用に認められる。
【０１３７】
Ｃ）ＰＫＳ／ＮＲＰＳ経路の無作為修飾
もう１つの実施態様では、例えば、１以上のＰＫＳまたはＮＲＰＳモジュールおよび／または酵素ドメインを無作為に変異することにより既知のプライマーの分子変体のライブラリーを作製することによって、あるいは既知のＰＫＳまたはＮＲＰＳ内の１以上のモジュールまたは酵素ドメインを代替的モジュールおよび／または酵素ドメインの集合で置き換えることによって、変動を無作為に作製することができる。
【０１３８】
ＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳモジュールは、単一の多モジュール酵素に組み合わせて、それによって、これらの方法を使用して得られる可能な組み合わせ数を劇的に増加させることができる。標準的な組換えまたは核酸増幅方法を使用して、例えば、クラメリ（Ｃｒａｍｅｒｉ）ら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９１：２８８−２９１、ならびに米国特許第５，６０５，７９３号明細書および同第５，８３７，４５８号明細書に記載のＤＮＡシャッフリング方法に類似して、多様なモジュールまたは酵素ドメインをコードする核酸配列をシャッフルして、配列の新規の整列を作製することによって、これらの組み合わせを作製することができる。さらに、例えば、コンビナトリアル合成方法によって、新規の組み合わせをインビトロで作製することができる。標準的な方法を使用して、新規のポリマー、またはポリマーライブラリーを、任意の特定の活性についてスクリーニングすることができる。
【０１３９】
上記のようにして得られるヌクレオチド配列の無作為変異誘発は、制限エンドヌクレアーゼ部位内の配列を変更して、プラスミドに無作為にオリゴヌクレオチドリンカーを挿入するか、Ｘ線もしくは紫外光の照射によるか、インビトロＤＮＡ合成中に不正確なヌクレオチドを組み入れることによるか、誤りがちなＰＣＲ変異誘発によるか、合成変異を調製することによるかまたは化学物質でインビトロでＤＮＡを損傷することなどによって、当該分野において公知のいくらかの異なる技術によって達成することができる。化学的変異としては、例えば、二亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ジドラジンまたはギ酸などの塩基を損傷または除去し、それによって正常な塩基対形成を妨げる薬剤、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、またはアクリジンなどのヌクレオチド前駆体のアナログ、プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどの挿入剤が挙げられる。一般に、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントを化学物質で処置し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、変異プラスミドのプールまたはライブラリーとして増殖させる。
【０１４０】
「組換え増大化変異誘発」を使用して、無作為酵素変体の大きな集団をインビボで構築することができる。この方法は、例えば、２以上のプールの１０6 個の変異体を用い、野生型のそれぞれは、上記で十分に説明した任意の簡便な変異誘発を使用して作製され、次いで、クローニングベクターに挿入されるヌクレオチド配列をコードする。
【０１４１】
Ｄ）非ｌｎｍクラスターエレメントの組み入れおよび／または修飾
指令されたまたは無作為のいずれかのアプローチでは、新規の組み合わせのモジュールおよび／または酵素ドメインをコードする核酸が細胞に導入される。１つの実施態様では、細胞の染色体内の内因性ＰＫＳまたはＮＲＰＳの１以上のドメインを置き換えるように、１以上のＰＫＳまたはＮＲＰＳドメインをコードする核酸が細胞に導入される。内因性遺伝子置換は、相同組換えなどの標準的な方法を使用して達成することができる。ＰＫＳ、ＮＲＰＳ全体、またはそれらの組み合わせをコードする核酸は、細胞が新規の酵素を産生することができ、従って、新規のポリマーを合成することができるように、細胞に導入することができる。好適な実施態様では、そのような核酸は、必要に応じて、遺伝子の発現、発現している細胞の生存などに影響を及ぼす「遺伝子クラスター」と呼ばれる多くのさらなる遺伝子と共に細胞に導入される。特に好適な実施態様では、そのような細胞は、他のＰＫＳまたはＮＲＰＳをコードする遺伝子または遺伝子クラスターを何ら有さず、従って、細胞に導入された遺伝子によって合成されるポリマーの直接単離が可能である。
【０１４２】
さらに、組換えベクターは、単一のＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ遺伝子クラスター由来の遺伝子を含むことができるか、あるいは例えば、もう１つの遺伝子クラスターから対応する遺伝子によって置き換えられる１つのクラスターに対する遺伝子によるハイブリッド置換ＰＫＳ遺伝子を含んでもよい。例えば、ＡＣＰは、産物の構造に影響を及ぼすことなく、異なるシンターゼ間で容易に交換可能であることが見出されている。さらに、所定のＫＲは、鎖長の異なるポリケチド鎖を認識し、減少させることができる。従って、これらの遺伝子は、本明細書に記載の構築物において自由に交換可能である。従って、本発明の置換クラスターは、究極的に機能して同定可能なポリケチドおよび／またはペプチドを産生する任意の組み合わせのＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ遺伝子の組から誘導することができる。
【０１４３】
ハイブリッド置換クラスターの例としては、特に、２以上のａｃｔ遺伝子クラスター、ｗｈｉＥ遺伝子クラスター、フレノリシン（ｆｒｅｎ）、グラナチシン（ｇｒａ）、テトラセノマイシン（ｔｃｍ）、６−メチルサリチル酸（６−ｍｓａｓ）、オキシテトラサイクリン（ｏｔｃ）、テトラサイクリン（ｔｅｔ）、エリスロマイシン（ｅｒｙ）、グリセウシン（ｇｒｉｓ）、ナナオマイシン、メデルマイシン、ダウノルビシン、タイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎ）、カルボマイシン、スピラマイシン、アベルメクチン、モネンシン、ノナクチン、クラマイシン、リファマイシンおよびカンジシジンシンターゼ遺伝子クラスターから誘導される遺伝子を有するクラスターが挙げられるが、これらに限定されない。（多様なＰＫＳに関する考察については、例えば、ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）およびシェルマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｂｉｅｔ．２４：３７−６６；Ｏ'ハガン（Ｏ'Ｈａｇａｎ）（１９９１）を参照のこと）ポリケチド代謝物、エリス・ホルウッド社（Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）。
【０１４４】
ａｃｔ、ｆｒｅｎ、ｔｃｍ、ｇｒｉｓ、およびｇｒａ遺伝子クラスターから誘導される成分を有する多くのハイブリッド遺伝子クラスターが構築されている（例えば、米国特許第５，７１２，１４６号明細書を参照のこと）。上記の他のハイブリッド遺伝子は、本明細書に記載の開示内容を使用して容易に産生され、同定可能なポリケチド、ポリペプチドまたはポリケチド／ポリペプチドハイブリッドの産生についてスクリーニングすることができる。
【０１４５】
宿主細胞（例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））は、集合的に機能的ＰＫＳ／ＮＲＰＳの組（例えば、レイナマイシンもしくはレイナマイシンアナログ）、またはＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ遺伝子、モジュール、活性部位、またはその部分の無作為の組み合わせを含むカクテルをコードする１以上のベクターで形質転換することができる。ベクターは、ＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳサブユニットあるいはカクテル成分、あるいはその変異体の生来またはハイブリッドの組み合わせを含む。上記で説明したように、遺伝子クラスターは、完全な生来の遺伝子クラスターに対応する必要はないが、所望される産物の産生を触媒するのに必要なＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳ成分だけはコードする必要がある。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の芳香性ＰＫＳでは、炭素鎖の集成には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の産物が必要である。ＯＲＦ１はケトシンターゼ（ＫＳ）およびアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）活性部位（ＫＳ／ＡＴ）をコードし；ＯＲＦ２は鎖長決定因子（ＣＬＦ）、ＯＲＦ１産物に類似するがＫＳおよびＡＴモチーフを欠くタンパク質をコードし；ＯＲＦ３は個別のアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）をコードする。いくつかの遺伝子クラスターも、ケトレダクターゼ（ＫＲ）および発生期のポリケチド骨格の環化に関与するシクラーゼをコードする。しかし、同定可能なポリケチドを産生するためには、唯一ＫＳ／ＡＴ、ＣＬＦ、およびＡＣＰが存在する必要があることが見出されている。従って、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から誘導される芳香性ＰＫＳの場合、これら３つの遺伝子は生来のクラスターの他の成分を伴うことなく、１以上の組換えベクターに含まれ、「最小の」置換ＰＫＳ遺伝子クラスターを構成することができる。
【０１４６】
Ｅ）開始および伸長単位の変動
ＰＫＳならびに／あるいはＮＲＰＳモジュールおよび／またはドメインを変動することに加えて、開始単位および／または伸長単位を変動することによって、多様なＰＫＳ／ＮＲＰＳ系により産生される産物の変動が得られる。即ち、例えば、開始単位、例えば、アセチルＣｏＡ、マロアミルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、酢酸、酪酸、イソ酪酸などについては、かなりの程度の変動性が存在する。さらに、天然に存在するＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳは、伸長単位を変動することについていくらかの体制を示している。
【０１４７】
Ｆ）産物のスクリーニング
特に、ｌｎｍ遺伝子クラスターの１以上のモジュールおよび／または酵素ドメインを使用して大きなコンビナトリアルライブラリーが合成される場合、しばしば、所望の活性について、得られる成分をスクリーニングすることが所望される。目的の多様な活性（例えば、細胞傷害性、抗微生物活性、特に化学的活性など）について化合物（例えば、ポリペプチド、ポリケチド、糖、チアゾール）をスクリーニングする方法は、当業者に周知である。
【０１４８】
大量の化合物が産生される場合、しばしば、「ハイスループットシステム」（ＨＴＳ）を使用してそのような化合物を迅速にスクリーニングすることが所望される。ハイスループットアッセイシステムは当業者に周知であり、多くのそのようなシステムが市販されている。（例えば、ザイマーク社（Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．）、マサチューセッツ州ホプキントン（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）；エアー・テクニカル・インダストリーズ（Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、オハイオ州メントール（Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ）；ベックマン・インスツルメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．）カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）；プリサイジョン・システム社（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州ナティック（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ））。これらのシステムは、すべてのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体の小分け、時間指定されたインキュベーション、アッセイに適切な検出器内のマイクロプレートの最終読み取りを含む手順全体を典型的に自動化する。これらの設定可能なシステムは、ハイスループットおよび迅速な立ち上げならびに高度の柔軟性およびカスタマイズを提供する。そのようなシステムの製造者は、典型的に、多様なハイスループットスクリーニングのための詳細なプロトコルを提供する。
【０１４９】
ＶＩ．インビトロ合成
本発明のさらなる実施態様では、レイナマイシン系薬剤および他のポリケチドおよび／またはポリペプチドがインビトロで合成および修飾される。ここの酵素ドメインまたはモジュールは、インビトロで使用して、単位を修飾し、および／または単一のモノマー単位を成長しているポリケチドもしくはポリペプチド鎖に付加することができる。１つのアプローチでは、組換え的に発現され、次いで提供されるすべての所望される合成活性を提供するメタシンテターゼ、所望の産物の合成を指令するためのバイオリアクター中の適切な基質および緩衝液系。もう１つのアプローチでは、多様なＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳが異なる溶液において提供され、成長しているポリマー鎖は連続して複数の溶液に誘導され、それぞれは単一（またはいくらかの）ＰＫＳもしくはＮＲＰＳモジュールを含有する。なおもう１つの実施態様では、ＰＫＳおよび／またはＮＲＰＳモジュールもしくは酵素ドメインが提供されて固相支持体に付着し、成長している高分子を含有する液体が表面を通過し、それによって、ＰＫＳまたはＮＲＰＳは標的基質と作用する能力を呈する。
【０１５０】
１つの好適な実施態様では、複数のポリマー鎖（各ポリマー鎖は固体支持体、溶液の集合に付着し、それぞれ単一のＰＫＳまたはＮＲＰＳモジュールを含有する）の連続導入を容易にする自動化された手段を使用することによって、ポリケチドもしくはポリペプチド、またはそれらの組み合わせのコンビナトリアルライブラリーが造成される。これらの自動化された手段を使用して系統的に配列を変動させることができ、ここで、各ポリマー鎖は様々な溶液に導入され、それによってコンビナトリアルライブラリーが造成される。モノマー単位の連続付加による分子のコンビナトリアルライブラリーを造成するための多くの方法が当該分野において周知であり、例えば、ＷＯ９７／０２３５８に記載されている。
【０１５１】
ＶＩＩＩ．キット
さらにもう１つの実施態様では、本発明は、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを提供する。１つの好適な実施態様では、キットは、１以上のｌｎｍ遺伝子クラスターＯＲＦおよび／または１以上のＰＫＳもしくはＮＲＰＳモジュールもしくは酵素ドメインを含有する１以上の容器を含む。特定のキットは、ｌｎｍ  ｏｒｆをコードするベクターおよび／またはそのようなベクターを含有する細胞を含むことができる。キットは、必要に応じて任意の試薬および／または本明細書に記載のアッセイの実施を容易にする装置を含むことができる。そのような試薬には、標識、標識化された抗体、バイオリアクター、細胞などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５２】
さらに、キットは、本発明の方法の実施についての指示（即ち、プロトコル）を含有する取扱説明書を含むことができる。好適な取扱説明書は、ｌｎｍモジュールまたはＯＲＦを造成もしくは修飾する、ならびに／あるいは１以上のｌｎｍモジュールおよび／または酵素ドメインを使用して分子を合成もしくは修飾するためにキット内容物を利用するプロトコルを提供する。取扱説明書は典型的に書面または印字された材料であるが、それらに限定されるわけではない。そのような説明書を保存し、末端ユーザーに対しそれらを連絡することが可能ないかなる媒体も本発明により意図される。そのような媒体としては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような媒体は、そのような取扱説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでもよい。
【０１５３】
実施例
以下の実施例は例示のために付与されるものであって、本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【０１５４】
ストレプトマイセス・アトロオリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）由来の抗腫瘍マクロラクタムレイナマイシンの生合成遺伝子クラスター：チアゾール生合成遺伝子を同定およびクローニングするための新規のアプローチ
本実施例では、本発明者らは、（１）Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）のコスミドライブラリーの構築、（２）保存されたシクラーゼ−ドメインプローブのＰＣＲ増幅、（３）標的Ｌｎｍ生合成遺伝子クラスターおよびフランキング領域を含む重複コスミドクローンの同定ならびにマッピング、（４）Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）におけるＬｎｍ産生物の精製、ＨＰＬＣおよび質量スペクトル（ＭＳ）分析、（５）遺伝子クラスター由来の１１ｋｂ  ＤＮＡの配列決定および配列解析、（６）遺伝子系の開発、ならびに（７）Ｌｎｍ非産生変異体を作製するための遺伝子破壊によるＬｎｍ生合成をコードするクローン化された遺伝子クラスターの確認について説明する。
【０１５５】
材料および方法
ゲノムＤＮＡの単離
本研究では標準的プロトコルに従うものとする（キーセル（Ｋｉｅｓｅｒ）ら（２０００）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、英国ノリッジ（Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅｎｇｌａｎｄ）；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））。
【０１５６】
コスミドライブラリーの構築
（１）コスミドベクターｐＯＪ４４６：既製品ｐＯＪ４４６は研究所のストック由来であった（リウ（Ｌｉｕ）およびシェン（Ｓｈｅｎ）（２０００）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：３８２−３９２；スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（２０００）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：１８０９−１８１７；デュ（Ｄｕ）ら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．７：６２３−６４２）。サンプルは、ＨｐａＩ消化、脱リン酸化され、次いでＢａｍＨＩ消化したｐＯＪ４４６であり、即ち、約２ｋｂアーム〜約８ｋｂアームの混合物である。
【０１５７】
（２）部分消化ＤＮＡ挿入物の調製：標準プロトコル（ラオ（Ｒａｏ）ら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：１６６−１９８；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上掲）に従って、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）のゲノムＤＮＡをＭｂｏＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州）で部分消化した。合計５０μｇのＤＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で９００μｌに希釈し、１００μｌの１０×緩衝液を添加した。ＤＮＡ溶液を氷上で少なくとも２時間放置する。１０本の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに標識を付し、氷上に置く。４０μｌのＤＮＡ溶液をチューブＮｏ．１にアリコートとして取る；残りのチューブ（Ｎｏ．２〜Ｎｏ．１０）に２０μｌのＤＮＡ溶液をアリコートとして取る。１０単位（１μｌ）のＭｂｏＩをチューブＮｏ．１に添加し、氷上でよく混合する。２０μｌの混合物Ｎｏ．１をチューブＮｏ．２に移し混合する。２０μｌの混合物Ｎｏ．２をチューブＮｏ．３に移し、混合し、チューブＮｏ．９まで繰り返す。混合物Ｎｏ．９の２０μｌを捨てる。チューブＮｏ．１０には酵素を添加しない。１０本の反応混合物を３７℃の水浴中で３０分間インキュベートする。２μｌの０．２Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０；最終濃度５ｍＭ）を添加して反応を終了する。反応物を７０℃で１５分間加熱し、酵素を不活性化する。４μｌの６×ＤＮＡ充填緩衝液を各チューブに添加し、１０μｌの各サンプル０．３％ゲルに掛ける。無傷（ｉｎｔａｃｔ）のλＤＮＡをコントロールとして使用する。ゲルは、少なくとも４時間ゆっくりと行う。ラージスケールＤＮＡの部分消化に最適の条件は以下の通りである：３００μｌ容積中０．６単位のＭｂｏＩを伴う３０μｇのＤＮＡ。部分消化したＤＮＡ溶液を等容積のｄｄＨ2 Ｏで希釈し、フェノール：クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈殿させる。１８０μｌのｄｄＨ2ＯにＤＮＡを再溶解し、１０単位のＣＩＰ（ＮＥＢ）で３７℃で４時間処置する。再度フェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行う。最後に、１０μｌのｄｄＨ2 ＯにＤＮＡを再溶解する（約２μｇ／μｌ）。
【０１５８】
（３）ベクター−挿入物連結反応：５μｌのＭｂｏＩ部分消化、脱リン酸したＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ＤＮＡフラグメント（約１０μｇ）を、１０μｌの容積中の２μｌのＨｐａＩ切断、脱リン酸およびＢａｍＨＩ消化したｐＯＪ４４６（約４μｇ）と、１００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）で１６℃で１晩連結させた。
【０１５９】
（４）連結反応混合物のパッケージング：製造者の指示に従って、４μｌの連結反応混合物を、１バイアルのギガパックｋＩＩＩ  ＸＬエキストラクト（Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  ｅｘｔｒａｃｔ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州（ＣＡ））でパッケージングした。パッケージされたファージ粒子を含有する５００μｌのＳＭ緩衝液を得て、４℃で保存した。
【０１６０】
（５）コスミドライブラリーの力価の決定およびライブラリーの増幅：製造者の指示（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に従って、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4 中新鮮宿主細胞の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−ブルーＭＲＦ’（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）懸濁液を調製した。２５μｌの１：１０および１：５０希釈ファージ粒子溶液を２５μｌの宿主細胞（ＯＤ600 ＝０．５）と混合し、３７℃で２０分間インキュベートした。５５０μｌのＬＢ培地を各サンプルに添加し、３７℃で１時間ゆっくりと振盪しながらインキュベートした。各サンプルのアリコート（５０μｌ、４５０μｌ）を直径１５０ｍｍのＬＢプレート（１００μｇ／ｍｌのアプラマイシンを有する）上に拡げた。プレートを３７℃で１晩インキュベートした。コロニーの数を計数し、コスミドライブラリーの力価を算出した。コスミドＤＮＡは、１６個の無作為のコロニーから調製し、ＢａｍＨＩで消化し、ライブラリーの品質を試験するために、フラグメントを０．８％ゲルで分離した。Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）のゲノムサイズの３倍に対する１次ファージストック等価物を、ＸＬ１−ブルーＭＲＦ’（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）細胞に形質導入し、１００μｇ／ｍｌのアプラマイシンを有するＬＢプレート上で増殖させた。コロニーの細胞を、アプラマイシンを有するＬＢ培地に回収した。滅菌グリセロールを添加し、最終濃度を２０％とし、永久コスミドライブラリーストックとして−８０℃で保存した。
【０１６１】
縮重ＰＣＲプライマー
シクラーゼドメイン増幅のためのプライマーの組は次の通りである：ＣｙＦＰ（５’−ＧＣＧＣＣＡＣＧＡＧＣＣＧＴＴＹＣＣＮＹＴＮＡＣ−３’、配列表の配列番号２１５）およびＣｙＲＰ（５’−ＧＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＲＳＡＣＮＡＣＮＧＧ−３’、配列表の配列番号２１６）；オキシダーゼドメイン増幅のためのプライマーの組は次の通りである：ＯｘＦＰ（５’−ＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＮＧＴＮＣＡＲＡＣ−３’、配列表の配列番号２１７）およびＯｘＲＰ（５’−ＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＫＭＮＣＣＮＧＣＹＴＣ−３’、配列表の配列番号２１８）。これらのプライマーは、「コンセンサス−縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー」ストラテジー（ローズ（Ｒｏｓｅ）ら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１６２８−１６３５）によって設計し、キャンパス内オリゴ合成施設（ＵＣ−デイビス（ＵＣ−Ｄａｖｉｓ、カリフォルニア州））により合成した。ＰＫＳに対するプライマーの組は次の通りである：ＰＫＳＦＰ（５’−ＧＣＳＴＣＣＣＧＳＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＴＣ−３’、配列表の配列番号２１９）およびＰＫＳＲＰ（５’−ＡＧＳＧＡＳＧＡＳＧＡＧＣＡＧＧＣＧＧＴＳＴＣＳＡＣ−３’、配列表の配列番号２２０）；ＰＴＳに対するプライマーの組は次の通りである：ＰＴＳＦＰ（５’−ＡＴＣＴＡＣＡＣＳＴＣＳＧＧＣＡＣＳＡＣＳＧＧＣＡＡＧＣＣＳＡＡＧＧＧ−３’、配列表の配列番号２２１１）およびＰＴＳＲＰ（５’−ＡＷＴＧＡＧＫＳＩＣＣＩＣＣＳＲＲＧＩＭＧＡＡＧＡＡ−３’）。これらのプライマーは研究室のストックから入手した。
【０１６２】
ＰＣＲ増幅
すべてのＰＣＲ反応は、タッチダウンプログラム付熱循環装置ジーン・アンプ・２４００（ＧｅｎｅＡｍｐ  ２４００）（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、カリフォルニア州（ＣＡ））上で実施した。典型的なＰＣＲ反応（５０μｌ容積）は、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、５ｎｇのテンプレート、７．５％ＤＭＳＯ、１００ｎＭｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌ各プライマー、２．５単位のＴａｇＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）インディアナ州（ＩＮ））を有する１×ＰＣＲ緩衝液からなる。シクラーゼドメインの増幅では、プログラムは次の通りである：稼動前変性（９４℃で４分間）→１０サイクルのランプ増幅（９４℃で４５行間の変性→１０サイクル中６５℃〜５５℃で１分間のアニーリング開始→７２℃で１．５分間の伸長）→５５℃での一定のアニーリング温度での２５サイクルの増幅→稼動後伸長（７２℃で１０分間）。オキシダーゼドメインの増幅では、ＰＣＲプログラムは、ランプ温度が６０℃〜５０℃であり、伸長時間が４５秒間であることを除いて同じである。ＰＫＳのＰＣＲでは、伸長時間を１分間とした。ＰＴＳのＰＣＲでは、プログラムはシクラーゼドメイン増幅のプログラムと同一であった。各末端でのシクラーゼドメインおよびオキシダーゼドメインの両方を含有する大きなフラグメントの増幅では、ＣｙＦＰおよびＯｘＲＰをＰＣＲプライマーの組として使用した。ランプ温度は６５℃〜５５℃であり、伸長時間は５分間であった。
【０１６３】
サブクローニングおよび配列決定
ＰＣＲ混合物をアガロースゲル中で分離した。対象のフラグメントをゲル抽出キット（Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州（ＣＡ））により回収した。ＰＣＲフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））にサブクローニングした。他の制限酵素によって精製されるＤＮＡフラグメントを、ｐＢＳＳＫベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ））、またはｐＳＰ７２、またはｐＧＥＭシリーズ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））の適切な部位にサブクローニングした。組換えプラスミドＤＮＡは、キアプレップ・スピン・ミニプレップ・キット（ＱｉａＰｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））により調製した。ＤＮＡの配列決定は、デイビスＤＮＡシークエンシング社（Ｄａｖｉｓ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｉｎｃ．）（デイビス（Ｄａｖｉｓ）、カリフォルニア州（ＣＡ））により実施した。ＤＮＡの配列は、ＧＣＧパッケージ（ＧＣＧ社、ウィスコンシン州）により解析し、ＮＣＢＩデータベースを対象に検索（ｂｌａｓｔ）した。  
【０１６４】
ライブラリーのスクリーニング
ＰＣＲ増幅した１．１ｋｂのシクラーゼドメインフラグメントをジゴキシゲニン（ＢＭＢ）で標識し、標準的なコロニーハイブリダイゼーション手順（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上掲）に従って、コスミドライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用した。陽性クローンを単離し、それらのコスミドＤＮＡを、アルカリ溶解法（Ｉｄ）によって調製した。コスミド１１の左端およびコスミド１の右端（それぞれｐＹＣ９−２およびｐＹＣ２５）由来のサブクローニングをプローブとして使用し、コスミドウォーキングを実施した。
【０１６５】
コスミドクローンのマッピングおよびショットガンクローニング
コスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩまたはＡａｔＩＩで消化し、０．８％アガロースゲルで分離した。フラグメントのパターンを解析してコンティグ地図を作成した。サザンハイブリダイゼーションを実施して、初期スクリーニングの変動およびマッピングを確認した。２つの重複コスミド（コスミド１および１１）由来のすべての１８ＢａｍＨＩフラグメント（ライブラリーに収容した８ｋｂのコスミドベクターを除く）を、ショットガンクローニング方法によってｐＢＳＳＫのＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。
【０１６６】
レイナマイシンの発酵、精製およびＨＰＬＣ分析
発酵方法は、ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：１７６８−１７７４から適応した。５０ｍｌの種培養物を２２℃で４８時間、適切に振盪しながら増殖させ、１０ｍｌを使用して、２×５０ｍｌの発酵槽に接種した。培養物を２２℃で４８時間発酵させた。接種１８時間後にモニター付ダイアイオン（Ｄｉａｉｏｎ）ＨＰ−２０樹脂（スペルコ（ＳＵＰＥＬＣＯ）、ペンシルバニア州（ＰＡ））（５％（Ｗ／Ｖ））を追加した。発酵させたブロスをプールしＨ2 ＳＯ4 でｐＨを２．０に調整した。２層のチーズクロスを介しろ過により樹脂をブロスから取り出した。１０容積のメタノールにより粗Ｌｎｍ調製物を樹脂から溶出させ、減圧エバポレーションによって溶媒を濃縮した。ダイナマックス（Ｄｙｎａｍａｘ）ＳＤ−２００  ＨＰＬＣシステム（ライニン（Ｒａｉｎｉｎ）カリフォルニア州（ＣＡ））マイクロソルブ（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）ＭＶ  Ｃ１８逆送カラム（バリアン（Ｖａｒｉａｎ）、カリフォルニア州（ＣＡ））によりレイナマイシンの混入物からのＨＰＬＣ分離を実施した。真正のレイナマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）は、トウキョウ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｔｏｋｙｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（協和発酵工業株式会社、東京）より提供された。
【０１６７】
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）のＰＥＧ仲介プロトプラスト形質転換
１．１ｋｂＰＣＲ増幅Ｃｙドメインフラグメントを：（１）構築物ｐＹＣ１２を作製するためにｐＯＪ２６０／ＥｃｏＲＩ部位、（２）構築物ｐＹＣ２０を作製するためにｐＫＣ１１３９／ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした；ｐＹＣ１２およびｐＹＣ２０のＤＮＡを非メチル化宿主株ＥＴ１２５６７から調製し、アルカリ溶液で変性させ、ＰＥＧ仲介プロトプラスト形質転換（リウ（Ｌｉｕ）およびシェン（Ｓｈｅｎ）（２０００）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：３８２−３９２）に使用した。
【０１６８】
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１間の接合
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１間の接合の実験は、先に記載の手順（リウ（Ｌｉｕ）およびシェン（Ｓｈｅｎ）（２０００）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：３８２−３９２）によって実施した。ｐＹＣ１２により入手した３つの前接合体（ＹＣ１２Ｃ１、ＹＣ１２Ｃ２およびＹＣ１２Ｃ３と命名した）をさらに精製し、サザン分析のためにゲノムＤＮＡを調製した。
【０１６９】
結果および考察
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）コスミドライブラリーの構築
変更を加えた手順（ラオ（Ｒａｏ）ら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：１６６−１９８；キーセル（Ｋｉｅｓｅｒ）ら（２０００）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、英国ノリッジ（Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅｎｇｌａｎｄ））により、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）から高分子量ゲノムＤＮＡを単離した。主な変更は溶解時間を６０分間にまで延長するためであった。Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）の細胞壁はリゾチーム処置に対してかなり耐性であると思われる。３０分間の溶解時間を使用した最初の試みでは、平均で約４０ｋｂのＤＮＡサンプルしかえられなかった。酵素の量を減少して、ＭｂｏＩによる部分消化を行った。消化したサンプルの一部をアガロースゲル上で解析し、ライブラリー構築のためのゲノムＤＮＡフラグメントの正確なサイズを得た。
【０１７０】
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）主要コスミドライブラリーは、５００μｌのＳＭ緩衝液（３３５ｃｆｕ／μｌ）中に１．６７５×１０5 コロニー形成単位（ｃｆｕ）を含有し、ゲノムサイズの５０倍と等価である。１６個の無作為に選択されたコスミドコロニーのアルカリミニ調製およびＢａｍＨＩ消化は、挿入物の平均サイズが約４０ｋｂであることを示した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞でライブラリーを１回増幅させた。滅菌グリセロールを細胞培養物添加し、２０％の最終濃度とした。増幅されたライブラリーのアリコート（各１０ｍｌ）を−８０℃で保存した。この増幅されたライブラリーの力価は約１０5 ｃｆｕ／μｌであった。
【０１７１】
シクラーゼ（Ｃｙ）ドメインのＰＣＲ増幅
予想１．１ｋｂフラグメントを、シクラーゼドメインＰＣＲプライマーの組（ＣｙＦＰ＋ＣｙＲＰ）で増幅した。単一のプライマーによるコントロール反応でも増幅されたバンドが得られたが、１．１ｋｂフラグメントは、両プライマーの存在での反応に対し独特なバンドであると思われる。このフラグメントは、ｐＹＣ１としてｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ）ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローニングした。ｐＹＣ１の両末端を配列決定した。ブラスト（Ｂｌａｓｔ）の結果は、既知のＮＲＰＳのシクラーゼドメインに対する相同性を示した。
【０１７２】
Ｌｎｍクラスターのマッピング、サブクローニングおよび部分配列決定
ジゴキシゲニン標識１．１ｋｂＣｙドメインプローブを使用して、約４×１０００ｃｆｕのコスミドライブラリーをスクリーニングし、１５ウェルの単離された陽性クローンを得た。１２クローン由来のコスミドＤＮＡを調製し、酵素（ＢａｍＨＩ）消化、サザンハイブリダイゼーション、ならびにＣｙドメイン、Ｏｘドメイン、ＰＫＳドメインまたは／およびＰＴＳドメインの存在に対するＰＣＲ診断に供した。
【０１７３】
はじめに、４つのコスミド（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．６およびＮｏ．１１）は、最も長い染色体領域（合計で６３ｋｂ）を含むことが見出され、ＰＣＲ診断データは予想されたドメイン構成を支持した。後に、コスミドＮｏ．１およびＮｏ．１１の他の末端をそれぞれｐＹＣ２５およびｐＹＣ９−２．１としてサブクローニングし、プローブとして使用して、両方向へ伸長するさらなるコスミドクローンを得た。これらのコスミドの相対的位置をマッピングし、図２に例示する。続いて、ｌｎｍ遺伝子クラスター全体の配列およびそのフランキング領域（約１３５ｋｂ）を決定し、解析した（図３を参照のこと）。レイナマイシン生合成遺伝子クラスターにおけるオープンリーディングフレームの推測された機能を、表１および表２において本明細書にまとめている。
【０１７４】
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）の遺伝子系の開発
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）は３０℃で極めて良好に増殖するが３５℃を超える温度では増殖しない。アプロマイシン（ａｐｒｏｍｙｃｉｎ）（Ａｍ）およびチオストレプトン（Ｔｈｉｏ）に対して高い感受性を示す（それぞれ１０μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌで完全阻害）ことが見出されている。従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）シャトルベクターｐＯＪ２６０（自殺ベクター、ＡｍR ）およびｐＫＣ１１３９（自己複製ベクター、ＡｍR ）を選択して、それぞれ遺伝子破壊構築物ｐＹＣ１２およびｐＹＣ２０を作製した。形質転換体／前接合体の選択のための抗生物質（Ａｍ）の濃度は、５０μｇ／ｍｌである。
【０１７５】
ＴＳＢ培地は、プロトプラスト調製物の最も高い収量を与えるが、再生率は極めて低い（０．０１％未満）。３０％ショ糖を有するＴＳＢから作製したプロトプラストは、０．２％の再生率を有する。ＹＥＭＥは、０．６％と最も高いプロトプラスト再生率を生じた。すべてのプロトプラストサンプルは、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を補充したＲ２ＹＥプレート上で作製した。約１×１０9 個のプロトプラストおよび２μｇのＤＮＡを各形質転換実験に使用した。ｐＹＣ２０構築物で試行実験を実施した。初期選択プレートから見かけ上７個の陽性形質転換体を得た。１つのみが、栄養増殖培地（ＴＳＢ）および胞子形成培地（ＩＳＰ−４）上に２ラウンドの再接種後にも良好な増殖を維持した。形質転換効率を計算したところ約８×１０-8であった。
【０１７６】
形質転換と再生とをあわせた効率は僅か約１×１０-9で極めて低いが、接合アプローチを試みたところ、驚くべきことに成功した。胞子（１×１０-9）を、５０℃で１０分間ではなく、４２℃で２０分間熱ショックを与え、続いて、３０℃で６時間までインキュベーションした。熱ショック４時間後から３０分ごとに、顕微鏡による確認で胞子の発芽をモニターした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＹＣ１２またはｐＹＣ２０のいずれかを有する）培養物を新たに調製した。接合は、ＩＳＰ−４改変培地で行った。２８℃で５日間インキュベーション後、見かけ上陽性な前接合体（ｅｘ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を、それぞれｐＹＣ１２またはｐＹＣ２０を有する初期選択プレートから増殖させた。従って、非自己複製構築物ｐＹＣ１２の接合／組込み効率を計算したところ約１．８×１０-8であり、自己複製構築物ｐＹＣ２０の接合効率は５×１０-7であった。ｐＹＣ１２により得られる３つの前接合体（ＹＣ１２Ｃ１、ＹＣ１２Ｃ２およびＹＣ１２Ｃ３と命名する）をさらに精製し、解析した。
【０１７７】
ゲノムＤＮＡハイブリダイゼーションにより、Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）における標的ＮＲＰＳ遺伝子の正確な破壊を確認した。Ｃｙドメインをプローブとした場合、野生型は、ＮｃｏＩ消化で４．６ｋｂのサイズのハイブリダイズされたバンドを生じたが、３つのすべての独立した前接合体（ＹＣ１２Ｃ１〜Ｃ３、同一であるようである）は、９．２ｋｂを生じ、ベクター単一交差事象後に予想されるサイズである。ベクター（ｐＯＪ２６０）ＤＮＡをプローブとしたところ、ＤＮＡはハイブリダイズしなかったが、３つの前接合体は同じ９．２ｋｂの陽性バンドを有した。
【０１７８】
Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）野生型および変異体におけるＬｎｍ産生物の分析
記載された手順（ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：１７６８−１７７４）に従って、粗Ｌｎｍサンプルを５０ｍｌの４日間２段階発酵ブロスから抽出した。さらにＨＰＬＣによりＬｎｍ産生物を分析した（図１０）。ＨＰＬＣから精製したサンプルも質量分析に供した。ＬｎｍはＣ22Ｈ26Ｎ2 Ｏ6 Ｓ3 の分子式および５１１．２の分子量を有する（ハラ（Ｈａｒａ）ら（１９８９）Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：１７６８−１７７４）。野生型Ｌｎｍサンプルでは主要なＭＳのピークが認めれたが、ＹＣ１２Ｃ１では認められなかった。これにより、ＨＰＬＣは、失われたＨＰＬＣのピークがＬｎｍのピークであるこという結果を示すことを確認した（図１０）。
【０１７９】
要約すると、ｌｎｍ生合成をコードする１８０ｋｂの遺伝子クラスターをＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）からクローニングし、このうち１３５ｋｂを配列決定した。配列解析は、Ｌｎｍがハイブリッド非リボソームペプチドシンテターゼおよびポリケチドシンターゼ形によって生合成されることを示した。現在、これらの遺伝子を使用して、レイナマイシンの産生を改善し、薬物先導物として新規のレイナマイシンアナログの産生のための微生物株を操作し、他の非リボソームペプチドシンテターゼ遺伝子、ポリケチドシンターゼ遺伝子、および化学構造多様性を作製するためのコンビナトリアル生合成において天然産物の生合成を担う他の酵素をコードする遺伝子と組み合わせて遺伝子材料として使用することができる。
【０１８０】
アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）における天然産物の生合成のインビボでの操作のための効率的な遺伝子系が開発されている。アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）へのプラスミドＤＮＡの導入のための条件は、プロトプラスト仲介形質転換および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）接合の両方について最適化されている。アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）におけるレイナマイシン生合成の遺伝子操作は、Ｌｎｍ非産生アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）変異体の単離を生じるＮＲＰＳモジュールの破壊によって実証されている。後者は、Ｌｎｍ生合成をコードするクローン化された遺伝子クラスターを確認しただけでなく、Ｌｎｍ生合成を管理する遺伝子を操作することによって、アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）において新規のＬｎｍアナログを作製する可能性を実証した。
【０１８１】
本明細書に記載の実施例および実施態様は例示のみを目的とし、それを参考として様々な改変または変更が加えられることが当業者に示唆され、本出願の種子および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきである。本明細書のいて引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために、参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】レイナマイシン（Ｌｎｍ）の構造およびその酸化的およびアルキル化ＤＮＡ切断の提唱された機構を示す。
【図２】レイナマイシン生合成遺伝子クラスターを有するＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）由来の１３２ｋｂ  ＤＮＡの地図を示す。
【図３】Ｓ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）由来のレイナマイシン生合成遺伝子クラスターの遺伝子機構を示す。ＮＲＰＳおよびＰＫＳ遺伝子を中実矢印で示す。
【図４】ハイブリッドＮＲＰＳ／ＰＫＳに関与するＳ．アトロオリバセウス（Ｓ．ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）における提唱されたＬｎｍ生合成経路を示す。
【図５】ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ｌｎｍ  ｐｐｔａｓｅと他の種のｐｐｔａｓｅフラグメントとのアラインメントを示す。
【図６】ｌｎｍＧ発現を改変するとレイナマイシンの発現がどのように改変されるかを示す。
【図７】Ｌｎｍ  ＮＲＰＳおよびＰＫＳ遺伝子を操作することによって調製することができる新規のＬｎｍアナログの例を示す。
【図８】ＳN １またはＳN ２機構を介する−ＮＨ2 もしくはＨ2 Ｏによるエピスルホニウムイオンの求核攻撃を示す。
【図９Ａ】レイナマイシン生合成を操作することによる新規レイナマイシンの産生を示す。図９Ａ：ＬｎｍＨはアミノ酸配列解析に基づく未知の機能のタンパク質である。
【図９Ｂ】レイナマイシン生合成を操作することによる新規レイナマイシンの産生を示す。図９Ｂでは、様々な濃度のＤ−アラニンで補充した発酵培地中のレイナマイシンの産生を比較した。
【図９Ｃ】レイナマイシン生合成を操作することによる新規レイナマイシンの産生を示す。図９Ｃは、２つのＰ−４５０ヒドロキシラーゼ（ＬｎｍＡまたはＬｎｍＺ）のうちのいずれか一方を不活性化すると新規のレイナマイシン系薬剤の産生を生じることができ、このうち１つは図７に示される８−デヒドロキシル−Ｌｎｍであり得ることを示した。
【図１０】レイナマイシン生合成におけるｌｎｍＧおよびｌｎｍＩの標的化された遺伝子の不活性化の結果を示し、レイナマイシン産生におけるクローン化された遺伝子クラスターの関与を確立している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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