(57)【要約】本発明は、サンプル中のプリオンを検出するための方法であって、プリオン感染を受けやすい細胞集団を提供すること、細胞集団をサンプルと接触させること、増殖用培養基質上で細胞をインキュベートすること、プリオンのコロニー形成をアッセイすることを含み、プリオンのコロニーの存在がサンプル中のプリオンの存在を示す方法に関する。さらに本発明は、プリオンを定量するための方法、及びプリオン感染に対して感受性がある細胞株に関する。
2005520560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のプリオンを検出するための方法であって、
（ｉ）プリオン感染を受けやすい細胞集団を提供すること、
（ii）細胞集団をサンプルと接触させること、
（iii）増殖用培養基質上で細胞をインキュベートすること、
（iv）プリオンのコロニー形成をアッセイすることを含み、
プリオンのコロニーの存在がサンプル中のプリオンの存在を示す方法。
【請求項２】
増殖用培養基質上で細胞をインキュベートすることが、
（ｉ）細胞を集密状態に達するまでインキュベートするステップ、
（ii）増殖用培養基質から細胞を剥離するステップ、
（iii）集密状態密度の約１０分の１の開始密度で、新鮮な培養基質上で細胞をインキュベートするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２のステップ（ｉ）〜（iii）をさらに２回行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
コロニー形成のアッセイが、
（ｉ）細胞を支持体に移すステップ、
（ii）ＰｒＰＳｃを可視化するステップ、
（iii）ＰｒＰＳｃを示すコロニーの有無を示すステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
コロニー形成のアッセイが、
（ｉ）細胞をニトロセルロース支持体に移すステップ、
（ii）プロテイナーゼＫで細胞を処理することによって、ＰｒＰｃを分解するステップ、
（iii）抗ＰｒＰ抗体を用いた染色によって、ＰｒＰＳｃを可視化するステップ、
（iv）ＰｒＰＳｃを示すコロニーの有無を示すステップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
細胞を支持体に移すことが、
（ｉ）細胞を増殖用培養基質から剥離するステップ、
（ii）細胞をカバーガラス上に接種するステップ、
（iii）細胞を約４日間インキュベートするステップ、
（iv）細胞を支持体上にブロッティングするステップを含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞を支持体に移すことが、
（ｉ）細胞を増殖用培養基質から剥離するステップ、
（ii）細胞を支持体に直接塗布するステップを含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
支持体がＥＬＩＳＰＯＴアッセイプレートを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
増殖用培養基質がプラスチック又はガラスを含むカバーガラスである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
増殖用培養基質上での細胞のインキュベーションが約６〜７日間である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細胞を約３日間サンプルと接触させる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
サンプルが固相物質を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細胞の固相物質への付着を可能にし、少なくとも３日間インキュベートすることによって、細胞をサンプルと接触させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞を固相物質と共に約８日間インキュベートする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞がＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
検出されるプリオンがＲＭＬである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のプリオンを定量するための方法であって、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施することを含み、プリオンのコロニー形成に関するアッセイのステップが、コロニー数を計数するステップをさらに含む方法。
【請求項１８】
検量線から存在するプリオン数を決定するために計数したコロニー数を使用して、サンプル中のプリオン数を推定することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検量線がｌｏｇ−ｌｏｇプロットである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アクセッション番号０２０３１３３７又は０３０３１８０１でＥＣＡＣＣに寄託された、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞系。
【請求項２１】
固相物質が増殖用培養基質を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリオンの細胞培養系（即ちｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイに関する。詳細には本発明は、プリオンの定量的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに関する。さらに本発明は、プリオンのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて有用な細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病の経過中、大部分はプロテアーゼ耐性である、ＰｒＰＳｃと示される凝集形のＰｒＰが、主に脳内に蓄積する。ＰｒＰＳｃは、プリオンの主な成分又は唯一の成分であると考えられている（ＭｃＫｉｎｌｅｙ他、１９９１；Ｏｅｓｃｈ他、１９８５）。ＰｒＰＣとＰｒＰＳｃの間で、元の配列の違いがまったく見られないので（Ｓｔａｈｌ他、１９９３）、この２種はそれらの立体配座のみが異なると考えられる。
【０００３】
脳又はリンパ細網器官中のプロテアーゼ耐性ＰｒＰの存在は、プリオン病の認められている、特徴的で特異的な特徴であるが、それは必ずしも感染因子のレベルと相関関係があるわけではない。感染性は、サンプルを指標マウスの脳内に注射し、明確な臨床症状が出現する時間を判定すること（インキュベーション時間法（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ他、１９８２））、又はサンプルの一連の希釈液を注射し、どの程度の希釈で５０％のマウスがスクレーピーになるかを判定すること（終点法（Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ、１９３８））によって、これまで定量されてきている。
【０００４】
大部分が神経組織に由来する、いくつかの細胞株、例えばＮ２ａ、ＧＴ１及びＰＣ１２系（Ｂｕｔｌｅｒ他、１９８８；Ｍａｒｋｏｖｉｔｓ他、１９８１；Ｒａｃｅ他、１９８７；Ｓｃｈａｔｚｌ他、１９９７）などだけでなく、ウサギ上皮細胞株（Ｖｉｌｅｔｔｅ他、２００１）及び中胚葉細胞株（ＳＭＢ細胞株）（Ｂｉｒｋｅｔｔｅ他、２００１）も、複数回の継代後のＰｒＰＳｃの蓄積及び／又は感染性により示されるように、プリオンによって感染する可能性がある。Ｎ２ａ又はＧＴ１細胞集団のごく少数が、マウス適合型のＲｏｃｋｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＲＭＬ）スクレーピー菌株によって容易に感染するが、Ｎ２ａ群から、感染を受けやすい亜系が確立されてきている（Ｂｏｓｑｕｅ及びＰｒｕｓｉｎｅｒ、２０００；Ｎｉｓｈｉｄａ他、２０００、Ｅｎａｒｉ、２００１）。特に選択した亜系においてＮ２ａ細胞は、ＰｒＰＳｃの蓄積及び感染の伝播により示されるように、プリオン感染を受けやすいが、そのプロセスは、高感度アッセイ及び定量アッセイとして使用するには有効ではないと考えられている。Ｂｏｓｑｕｅ及びＰｒｕｓｉｎｅｒは、亜系を高希釈度のスクレーピー感染マウス脳のホモジェネートに曝し、ＰｒＰＳｃのブロッティングアッセイが陰性になった希釈度を決定することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ用のそれらＮ２ａ亜系の適性を評価した。彼らは、この細胞培養アッセイは、ｉｎ  ｖivｏでのマウスのアッセイより数桁感度が低かったことを報告した（Ｂｏｓｑｕｅ及びＰｒｕｓｉｎｅｒ、２０００）。さらに、Ｂｏｓｑｕｅ及びＰｒａｓｉｎｅｒ（２０００）は、ＰｒＰＳｃのブロッティングアッセイをし、フィルムを黒色にすることによって、「感染」を評価しているが、本発明者らは、個々のコロニーを計数することによる定量を開示し、これは本明細書で説明する利点を有する。
【０００５】
脳又はリンパ細網器官中のプロテアーゼ耐性ＰｒＰの存在は、プリオン病の認められている独特な特徴であるが、それが感染因子のレベルに関する指標を与えるわけではない（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ他、１９８７；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ他、１９９３）。
【０００６】
従来技術において感染性は、最も一般的には脳内注射によってサンプルを指標マウスに導入し、明確で臨床的なスクレーピーの症状が出現する時間を判定することによって定量されている（インキュベーション時間法（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ他、１９８２））。この方法は実験動物の維持を含み、これは高価であり非常に労力を有する。このアッセイは、比較的高い感染量でさえも、臨床症状が進行し示されるのにかかる時間のために、終了するのに数カ月を要する。
【０００７】
他の従来技術の方法は、一連のサンプルの希釈物を指標マウスに注射し、どの程度の希釈で５０％のマウスがスクレーピーになるかを判定することを含む（終点法（Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ、１９３８））。この方法も多数の試験用動物を必要とし、高い維持及び労働コストを被る。スクレーピーの症状の評価は、時間を浪費する方法であり、主観性に影響される可能性がある。
【０００８】
Ｎ２ａ細胞及び特定の選択した亜系は、プリオンにより感染する可能性があることが観察されてきているが、従来技術の細胞株及び方法は、高感度アッセイ及び／又は定量アッセイとして使用するには有効ではないと考えられている（Ｂｏｓｑｕｅ及びＰｒｕｓｉｎｅｒ、２０００）。従来技術の細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行うのに有用な充分な感度を与えるわけではなく、それらの細胞株が「コロニー計数」技法に使用されたわけでもない。
【０００９】
本発明は、従来技術に関する問題点を克服しようとするものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、Ｎ２ａ亜株、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙを単離し、これはＲＭＬスクレーピープリオンなどのプリオンに、非常に感染しやすい。このＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株は、ときにはＮ２ａＰＤ８８又はＮ２ａＰＤ１１２、或いはさらにＮ２ａＰＤと呼ぶことができる。非感染性Ｎ２ａ細胞株は、ときにはＮＮ２ａ又はＮ２ａＲ３３、或いはさらにＮ２ａＡＴＣＣと呼ぶことができる。本発明者らは、カバーガラス上で増殖した単層の感染Ｎ２ａ細胞を膜上にブロッティングし、ＰｒＰＳｃに関してアッセイすると、斑点状のパターンが与えられたことを見出し、非感染細胞の菌叢中に埋め込まれた、感染細胞のミクロコロニーが可視化された状態であったことが示唆された（例えば図１を参照のこと）。
【００１１】
実際、感染した培養物を、１つのコロニーをカバーガラス上で識別することができるように希釈し、ブロッティングし、ＰｒＰＳｃに関してアッセイすると、この培養物がＰｒＰＳｃ陽性及び陰性コロニーを含んでいたことが、驚くことに見出された。本発明はこの知見、及びＰｒＰＳｃ陽性コロニーの割合は、細胞を感染させるために使用したサンプルのプリオン力価の関数であることが実証されたことに基づく。本発明者らは本明細書に、これらの驚くべき知見に基づく、定量的なプリオンのアッセイを記載する。
【００１２】
本発明者らが本明細書に記載する細胞株（Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ）に関して、マウスにおける終点滴定により決定することができる濃度と同等に低いプリオン濃度を、最高の精度で定量的に決定することが可能である。本発明のアッセイは、最も迅速なマウスのアッセイにおける２０週間と比較して、２週間以内に有利に終了することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、一態様では本発明は、サンプル中のプリオンを検出するための方法であって、
（ｉ）プリオン感染を受けやすい細胞集団を提供すること、
（ii）細胞集団をサンプルと接触させること
（iii）増殖用培養基質上で細胞をインキュベートすること、
（iv）プリオンのコロニー形成をアッセイすることを含み、
プリオンのコロニーの存在がサンプル中のプリオンの存在を示す方法を提供する。
【００１４】
プリオンに曝した後、及びプリオンのコロニー形成をアッセイする前に、細胞を有利に増殖させることができる。したがって本発明は、細胞をインキュベートし、増殖用培養基質上に再度平板培養するステップをさらに含む、上記の方法を提供する。このステップによって、元の固相サンプルから細胞を有利に除去することができる。したがって本発明は、増殖用培養基質上で細胞をインキュベートするステップが、サンプルから細胞を分離すること、及びその細胞をインキュベートすることを含む、上記の方法を提供する。
【００１５】
さらに、サンプルの繰越しによって、アッセイ中に問題が引き起こされる可能性がある。サンプルがホモジェネートを含むとき、このことは特に重要である。なぜなら、コロニーを計数するときに、微量の粒子状の脳のホモジェネートが、バックグラウンドの読み取り値に寄与する可能性があるからである。この問題点を克服するために、本発明は有利なことに、サンプルと接触させた後、プリオンのコロニー形成をアッセイする前に、細胞を分離し再度平板培養することによって、バックグラウンドのサンプル繰越しの減少をもたらす。したがって本発明は、上記の方法であって、増殖用培養基質上で細胞をインキュベートするステップが、
（ｉ）細胞を集密状態に達するまでインキュベートするステップ、
（ii）増殖用培養基質から細胞を剥離するステップ、
（iii）集密状態密度の約１０分の１の初発密度で、新鮮な培養基質上において細胞をインキュベートするステップを含む方法を提供する。問題のあるバックグラウンドの低下は、この分離ステップの導入と共に低下する。有利なことに、２回又は３回、或いはそれより多くこのステップを繰り返すことによって、バックグラウンドはさらに低下する。２回の分離の後、５〜１０％のバックグラウンドを維持することができる。３回の分離の後、バックグラウンドは取るに足らない量に低下する。したがって、分離ステップの最適な数は３である。したがって本発明は、ステップ（ｉ）〜（iii）をさらに２回行う、記載の方法を提供する。
【００１６】
プリオンのコロニー形成に関するアッセイは、ＰｒＰＳｃを調べることによって有利に実施することができる。したがって他の実施形態では、本発明は、上記の方法であって、コロニー形成のアッセイが、
（ｉ）細胞を支持体に移すステップ、
（ii）ＰｒＰＳｃを可視化するステップ、
（iii）ＰｒＰＳｃを示すコロニーの有無を示すステップを含む方法を提供する。
【００１７】
ＰｒＰＳｃによるプリオンのコロニー形成に関するアッセイは、最初にＰｒＰｃを分解し、ＰｒＰＳｃのみを残すことによって行うことができ、これは有利なことに、抗ＰｒＰ抗体を使用して容易に検出することができる。したがって本発明は、上記の方法であって、コロニー形成のアッセイが、
（ｉ）細胞をニトロセルロース支持体に移すステップ、
（ii）プロテイナーゼＫで細胞を処理することによって、ＰｒＰを分解するステップ、
（iii）抗ＰｒＰ抗体を用いた染色によって、ＰｒＰＳｃを可視化するステップ、
（iv）ＰｒＰＳｃを示すコロニーの有無を示すステップを含む方法を提供する。
【００１８】
操作可能な培養基質上でコロニーを生成することが、コロニーのアッセイに関して好都合である。有利には、これらはカバーガラスであってよい。したがって本発明は、上記の方法であって、細胞を支持体に移すことが、
（ｉ）細胞を増殖用培養基質から剥離するステップ、
（ii）細胞をカバーガラス上に接種するステップ、
（iii）細胞を約４日間インキュベートするステップ、
（iv）細胞を支持体上にブロッティングするステップを含む方法を提供する。
【００１９】
他の実施形態（小コロニー又は単一細胞の実施形態（「スクレーピー細胞」又は「ＳＣ」アッセイ）と呼ばれることもある）では、自動計数装置を使用してコロニーをアッセイすることが有利である。この実施形態では、カバーガラス上への接種及びインキュベートをせずに、細胞を支持体に直接塗布することが有利である。したがって本発明は、上記の方法であって、細胞を支持体に移すことが、細胞を増殖用培養基質から剥離するステップ、及び細胞を支持体に直接塗布するステップを含む方法を提供する。有利には、計数装置はＥＬＩＳＰＯＴ読み取り装置の形をとってよい。したがって本発明は、上記の方法であって、支持体がＥＬＩＳＰＯＴアッセイプレートを含む方法を提供する。
【００２０】
アッセイの細胞を支持するために、カバーガラスを使用することが好都合である。したがって本発明は、上記の方法であって、増殖用培養基質がプラスチック又はガラスを含むカバーガラスである方法を提供する。
【００２１】
コロニーは、それらがある大きさに達するとアッセイするのがさらに容易である。これは有利には、細胞を６〜７日間増殖用培養基質上で、インキュベートすることによってもたらされる。したがって本発明は、上記の方法であって、増殖用培養基質上での細胞のインキュベーションが約６〜７日間である、方法を提供する。カバーガラス上に置かれる細胞の数は重要である。感染コロニーの割合が小さいと予想される場合、約１３０，０００個までの細胞をカバーガラス上に置くことができ、さらに小さいであろう個々のコロニーを識別することができる。多数のコロニーが予想される場合、その数の細胞が均一に黒い層を与えると思われ、わずか５００個以下の細胞をカバーガラス上に置くことができると思われ、したがってコロニーはさらに大きい。したがって本発明者らは、未知のサンプル用に、さまざまな細胞数、それぞれのサンプルに関してカバーガラス（１３ｍｍ径）当たり５００〜１３０，０００個の細胞を有する、いくつかのカバーガラスを調製する。コロニーの数は、通常は平板培養する細胞数の約４０〜５０％である（「培養効率」）。実際の効率は、参照サンプルを平行して施す限り、計算において何の役割も果たさない。
【００２２】
サンプルは、約３日以内に細胞によって効率的に取り込まれる。したがって本発明は、上記の方法であって、細胞を約３日間サンプルと接触させる方法を提供する。
【００２３】
プリオンが固相培養基質上に存在するとき、それをアッセイすることができることは、本発明の利点である。したがって本発明は、上記の方法であって、サンプルが固相物質を含む方法を提供する。
【００２４】
固相サンプルをアッセイするときは、細胞の前記固相サンプルへの付着を可能にして、プリオン感染性の取り込みを容易にすることが有利である。したがって本発明は、上記の方法であって、細胞の固相物質への付着を可能にし、少なくとも３日間インキュベートすることによって、細胞をサンプルと接触させる方法を提供する。場合によっては、インキュベーション時間を延長することができる。したがって本発明は、上記の方法であって、細胞を固相物質と共に約８日間インキュベートする方法を提供する。
【００２５】
本明細書で開示するように、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株は有利なことに、プリオン感染に対して非常に感受性がある。したがって本発明は、上記の方法であって、細胞がＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞である方法を提供する。さらに本発明は、本明細書で以下に記載する寄託済みのＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株を提供する。
【００２６】
Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞は、ＲＭＬプリオンによる感染に対して非常に感受性がある。したがって本発明は、上記の方法であって、検出されるプリオンがＲＭＬである方法を提供する。
【００２７】
さらに本発明は、サンプル中のプリオンを定量する方法であって、プリオンのコロニー形成に関するアッセイのステップが、コロニー数を計数するステップをさらに含む、上記の方法を実施することを含む方法を提供する。プリオン数の絶対的な決定は、マウスのアッセイで得られる数、即ちＬＤ５０単位との比較によって、有利に行うことができる。したがって本発明は、上記の方法であって、検量線から存在するプリオン数を決定するために計数したコロニーの数を使用して、サンプル中のプリオン数を評価することをさらに含む方法を提供する。検量線は、本明細書で以下に記載するｌｏｇ−ｌｏｇ曲線であることが有利である。したがって本発明は、検量線がｌｏｇ−ｌｏｇプロットである、上記の方法を提供する。
【００２８】
したがって本発明は、プリオン感染性をアッセイするための方法に関する。特に本発明は、プリオン感染性をアッセイするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法に関するものであり、これにより有利なことに、動物モデルにおいてアッセイする必要性が軽減される。さらに本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプリオン感染性を定量的にアッセイするための方法を提供する。さらに本発明は、本明細書で記載するｌｏｇ−ｌｏｇ検量法などの、プリオン感染性の定量アッセイを検量するための方法を提供する。
【００２９】
本発明は有利なことに、固相培養基質上に存在するプリオンを、定量的にアッセイするための方法を提供する。
【００３０】
本発明は有利なことに、プリオン感染性の定量アッセイを容易にする細胞株を提供する。本発明は、定量的プリオンアッセイ用の細胞株を生成させるための方法も提供する。
【００３１】
本発明の方法は有利なことに、プリオンに対するさらに高い感染性を与える。
【００３２】
従来技術の技法とは対照的に、本発明者らは、ＰｒＰＳｃのブロッティングアッセイをし、フィルムを黒色にすることによって、「感染」を評価しているわけではなく、本発明者らは、本明細書に記載するようにコロニーを計数することによって、プリオン感染性を有利に定量する。このことは、定量が一層正確であり、感度を制限する可能性がある、フィルムのバックグラウンドを差し引かなければならないことに関する問題を回避するので有利である。
【００３３】
明らかであろうが、本発明は、プリオンを増殖させる方法であって、感受性細胞株を本明細書に記載するようにプリオンに感染させること、及び前記感染細胞株を増殖させることを含む方法をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
概要
本発明者らは細胞株を単離し、指標マウスの終点滴定アッセイと同程度の感度で感染性のアッセイを可能にする、典型的には２×１０−７まで希釈した脳ホモジェネートの感染性の検出を可能にする手順を開発してきている。細胞が感染しているかどうかを判定するための基準はプロテアーゼ耐性ＰｒＰの蓄積であり、実際に測定されるのは感染因子の細胞への伝染であることに留意しなければならない。
【００３５】
本発明者らは、ＲＭＬスクレーピープリオンなどのプリオンに非常に感染しやすいＮ２ａ亜系、及びこれらに耐性のある細胞株を単離している。この作業の行程中に、本発明者らは、単層の慢性的に感染したＮ２ａ細胞が、膜上にブロッティングすると、ＰｒＰＳｃに関するアッセイで斑点状のパターンが与えたことを観察し、非感染細胞の菌叢中に埋め込まれた、感染細胞のミクロコロニーが現れていたことが示唆された。実際、感染した培養物を１つのコロニーをカバーガラス上で識別することがきるように希釈すると、あるものはＰｒＰＳｃ陽性であり、他のものはＰｒＰＳｃ陰性であったことは明らかであった。したがって本発明者らは、ニトロセルロース膜で濾別した、個々のＰｒＰＳｃ陽性細胞を識別することが可能であると決定した。本発明者らは、ＰｒＰＳｃ陽性細胞の割合が、細胞を感染させるために使用したサンプルのプリオン力価の一次関数であった条件を確立し、本発明者らはこれらの発見に基づく定量的アッセイを開発した。感受性Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株に関して、本発明者らは、マウスにおける終点滴定により決定することができる濃度と同等に低い、プリオン濃度を定量することができる。本発明のアッセイは、最も迅速なマウスのアッセイ［Ｆｉｓｃｈｅｒ、１９９６＃３６０２］における２５週間と比較して、わずかなコストで２週間で有利に終了することができる。
【００３６】
プリオン、ＰｒＰｃ及びＰｒＰＳｃ
本明細書で使用するように、用語「プリオン」は、タンパク質を含む感染粒子を指し、これは適切な宿主において伝染性の海綿状脳症を引き起こす。
【００３７】
ＰｒＰＳｃは、立体配座イソ形のＰｒＰｃ（正常形のプリオンタンパク質）であり、プリオンの主な成分又は一部の成分であると考えられている。
【００３８】
ＰｒＰＳｃの可視化
ＰｒＰＳｃは、任意の適切な手段によって可視化することができる。例えばこれは、立体配座−特異的分子と存在するＰｒＰタンパク質を結合させて、ＰｒＰＳｃを示すことによるものであってよい。立体配座−特異的分子は、ＰｒＰＳｃに特異的な抗体分子であってよい。
【００３９】
ＰｒＰＳｃを可視化するための好ましい手法は、例えばプロテアーゼＫによる消化によってＰｒＰｃを除去し、次いで抗ＰｒＰ抗体などのＰｒＰ結合分子を使用して、残りのＰｒＰＳｃを示すことである（ＰｒＰＳｃはプロテアーゼＫによる消化に対する耐性があるので、ＰｒＰ分子のみがプロテアーゼＫによる消化の後に抗ＰｒＰ抗体によって示されるであろう。）。
【００４０】
好ましいＰｒＰ抗体には、６Ｈ４及びＩＣＳＭ１８がある。二次的な複合体は、読み取り（計数）をどのように行うかに応じて適切に選択する。
【００４１】
細胞株
本発明の方法は、任意の適切な細胞株を使用することができる。適切な細胞株は、アッセイしているプリオンによる感染を受けやすい細胞株であり、即ち使用する細胞株は、アッセイしている一群のプリオンを維持することができなければならない。例えばＲＭＬプリオンをアッセイするとき、使用する細胞株は、ＲＭＬプリオンの感染を受けやすいものでなければならない。原則として、アッセイしているプリオンに感染を受けやすいことが知られている任意の細胞株を、本発明の方法で使用することができる。
【００４２】
本発明の方法で使用するのに適した細胞株は、それらのプリオン感染性に関して選択することができる。例えば、「同胞種（sib）選択法」によって細胞株を生成することができる。本発明の方法で使用するための、細胞株を選択するこの方法の変形を実施例５に示す。
【００４３】
実施例５は、本発明の方法において有用な、他の考えられるプリオン／細胞株の組合せを述べる。
【００４４】
好ましい実施形態では、使用する細胞株はＮ２ａ／Ｇａｒｙである。非常に好ましい実施形態では、アッセイされるプリオンはＲＭＬプリオンであり、使用する細胞株はＮ２ａ／Ｇａｒｙである。
【００４５】
Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株
本発明はＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株を提供する。この細胞株は、ＡＴＣＣから入手可能な親細胞株Ｎ２ａに由来している。その由来は、実施例１に記載する。Ｎ２ａ／Ｇａｒｙは驚くことに、従来技術の細胞株よりもプリオンに対する感受性がはるかに強いことが見出されている。したがってＮ２ａ／Ｇａｒｙは、従来技術の細胞株と比較して有利な性質を有する。Ｎ２ａ／Ｇａｒｙは、ブダペスト条約に従いＥＣＡＣＣによって寄託されている。
【００４６】
生物の寄託
Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞の寄託は、ブダペスト条約に従いある寄託機関によって行われている。
【００４７】
その寄託機関は、Centre for Applied Microbiology and Research、Porton Down、Salisbury、Wiltshire、SP40JG、United Kingdomという住所を有する、European Collection of Cell Culturesである。
【００４８】
寄託者は、Medical Research Council(MRC)of 20 Park Crescent、London、WIB 1AL、United Kingdomである。
【００４９】
寄託は２００２年３月１３日に行われた。
【００５０】
寄託は、本出願の出願日前に行われた。
【００５１】
この寄託のアクセッション番号は、０２０３１３３７である。
【００５２】
Ｎ２ａ細胞は、「Ｎｅｕｒｏ−２ａ」（「Ｎ２ａ」）と指定されたマウスの神経芽腫細胞であり、アクセッション番号ＣＣＬ−１３１としてＡＴＣＣに寄託されている。Ｎ２ａ細胞の性質は、当分野において知られている。Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株は、本明細書に記載するようにＮ２ａの親に由来する。
【００５３】
これらのＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を作製する方法の記載事項は、本明細書中、実施例１などにおいて見つけることができる。
【００５４】
Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞の学名（即ち分類学上の記載）は、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓサブクローンＮ２ａ／Ｇａｒｙである。Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞の他の性質の記載事項は、特に実施例の項の記載事項中で見つけることができる。これらの細胞は、本発明の方法において、例えばプリオンのアッセイ、及びプリオンの定量などにおいて有用である。
【００５５】
マイコプラズマ又は他の因子によって、細胞が感染状態になる可能性がある。マイコプラズマの治癒は、当業者に知られている。実際、多くのサービス研究所が、わずかな料金でこの日常的手順を行うであろう。本発明のアッセイで使用する細胞は、マイコプラズマを含まないことが好ましい。Ｎ２ａ／Ｇａｒｙの他の寄託物は、マイコプラズマを含まないものとして確認されている。この寄託物のアクセッション番号は０３０３１８０１である。残りの詳細は、寄託日が２００３年３月１８日であること以外は、上記の通りである。
【００５６】
細胞集団
細胞集団は複数の細胞を指し、言い換えると用語「集団」は、２つ以上の細胞を意味する。本発明の方法では、サンプルを細胞集団と接触させ、次いでプリオンにより感染状態になった細胞の数を、コロニー／細胞ブロッティングアッセイ、即ち略して「コロニーアッセイ」によって評価する。用語コロニーアッセイは、小コロニー又は単一細胞のコロニーアッセイを含み、これは以下でより詳細に論じる（「スクレーピー細胞」又は「ＳＣ」アッセイと呼ばれることもある）。群を構成する正確な細胞数は当のアッセイの形式に依存し、これらはアッセイに使用する当の形式、増殖用培養基質上の利用可能な表面積、接触させるサンプルの大きさ、又は他の要因に従って変わることは予想されるはずである。異なるアッセイ形式で使用するための細胞の最適数の例は、実施例の項で見つけることができる。２４ウエルプレートでは、培地１ｍｌ中において、ウエル当たり約１００，０００個の細胞集団を使用することができる。サンプルが液体又は懸濁液であるとき、細胞集団として細胞単層を使用することが好都合である。明らかに、単層群中に存在する細胞の正確な数は、使用する単層の領域、及び単層の細胞の密度に応じて変わる。９６ウエルプレートでは、細胞単層を使用することが好都合である。サンプルがスチール製ディスク又はプラスチック製（例えばＴｈｅｒｍａｎｏｘ（商標））ディスクなどのディスクを含むとき、細胞集団はディスクの表面積に応じた数を構成すると思われる。この数は、約８日間の増殖を可能にする密度で、ディスク上に細胞が接種されるように、選択しなければならない。この数は細胞の増殖率に従って変わることは明らかであり、培養細胞の取り扱いの当業者によって容易に評価される。適切な数は、１ｃｍ２当たり約１００〜１０００個の細胞の範囲である。本明細書に示す指導を参照しながら、個々のアッセイ状況で使用するために細胞集団の個々の大きさを変えることは、充分に当業者の能力の範囲内にある。
【００５７】
好ましい実施形態では、細胞集団は単一細胞株を含む。細胞集団は、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞集団であることが好ましい。
【００５８】
サンプルとの接触
サンプルと細胞集団の接触は、生存可能な細胞とサンプルの結合をもたらし、プリオンがサンプル中に存在する場合にはプリオンの吸着を可能にする任意の形をとってよい。細胞とサンプルの接触は、サンプルを細胞培地に加える形をとってよく、或いはサンプルが固相中にあるときは、細胞をサンプルに接種する形をとってよい。サンプルがワイヤー又はディスクであるとき、細胞を接種することが好ましい。しかしながら、ワイヤー又はディスクを、ワイヤー又はディスクの表面上で増殖すると思われる細胞集団に、同様に導入することができ、これによって細胞を接種する必要性が軽減されることは明らかであろう。
【００５９】
サンプルと細胞集団の接触が、サンプルと群中のそれぞれの単一細胞との接触を必ずしも含むわけではないが、一般的には群との接触を含み、したがって前記群によって含まれる数個の細胞との接触を含むことは明らかであろう。例えば、サンプルがワイヤー又はディスク、或いは他の固相物質であるとき、群のごく一部分が固相サンプルと付着し、これによって固相物質と接触すると予想すべきである。他の細胞は固相サンプルと接触して、次いで他の表面と付着させることができる。明らかに、サンプルがホモジェネートを含むとき、このような実施形態では、ほぼ完全な細胞集団を接触させることができることは、当業者には明らかであろう。しかしながら、サンプルと細胞集団の接触は、通常は前に説明した群との接触を概略的に意味する。
【００６０】
サンプル
サンプルは、プリオンを収容することができる任意の物質であってよい。本発明の方法は、広範囲の形のサンプルに有利に施すことができる。例えば、サンプルは脳ホモジェネート、金属製ワイヤーなどの金属デバイス、プラスチック製又はガラス製ディスクなどの固体ディスクの形、或いは細胞集団と接触可能な任意の他の適切な形であってよい。
【００６１】
支持体
コロニーアッセイを行う際には、ＰｒＰＳｃを可視化するために、細胞を支持体に移動させることが有利である。支持体は、当該の分子（ＰｒＰ分子）を保持することができる、任意の支持体であってよい。アッセイの形式に応じて、異なる形の支持体が、処理の容易さを確実にするために、或いは他の物理的要件に見合うためなどに、異なる状況において好ましい可能性がある。好ましい実施形態では支持体は、ニトロセルロース膜などのニトロセルロースを含む。任意の適切な方法によって、細胞を支持体に移動させることができる。好ましい方法は細胞のブロッティングであり、この場合ニトロセルロース膜を細胞上に載せ、インキュベートし、次いで培養基質から除去し、細胞の支持体への移動をもたらす。移動の後、好ましくは４０℃で１時間、膜を乾燥させる。さらに好ましい方法は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐを支持体として含むプレートなどの、ＥＬＩＳＰＯＴプレート上に細胞を直接塗布することであり、これは自動計数用途に非常に有利である。
【００６２】
増殖用培養基質への細胞の移動
プリオンのコロニー形成をアッセイするとき、増殖用培養基質を用いて、細胞をインキュベートする。増殖用培養基質上に置く前に細胞をサンプルと接触させる本発明の実施形態では、したがって細胞は、サンプルと接触させた後で増殖用培養基質に移動させる。この移動の正確な方式は、アッセイの個々の状況又は形式に応じて変わるであろう。例えば、移動ステップは単に、細胞が存在する培養基質から増殖用培養基質に細胞を広げることを含むだけであってよい。サンプルが金属製ワイヤーであるとき、この形の移動が好ましい。この実施形態では、細胞を金属製ワイヤーサンプルと接触させ、細胞をサンプル（ワイヤー）に付着させる。従って移動は、このワイヤーを増殖用培養基質上に置きインキュベートすることにより行われ、このとき細胞の本来の移動及び増殖によって、ワイヤーから増殖用培養基質への移動がもたらされる。他の実施形態では、既存の培養基質から細胞を除去し、増殖用培養基質上に再度平板培養する（「接種する」）ことができる。既存の培養基質がプラスチック製、金属製、又はガラス製のディスクであるとき、この形式の移動が好ましい。培養基質からの細胞のすすぎ落とし、トリプシン処理、又は他のこのような剥離手段などの、任意の適切な手段によって、既存の培養基質から細胞を除去／剥離することができる。次いで、生成した細胞懸濁液を増殖用培養基質と接触させ、移動を終了させる。他の実施形態では、細胞はプリオンでコーティングされたプラスチック製、金属製、又はガラス製の表面上で、数日間増殖させ、ニトロセルロース膜に直接ブロッティングすることができる。
【００６３】
サンプルからの細胞の分離
サンプルとの接触後のサンプルからの細胞の分離が、いくつかの実施形態では、例えば、サンプルがワイヤーを含むときなど、本発明のアッセイの実施を容易にするために、望ましい可能性がある。分離は、当分野で知られている任意の適切な手段によるものであってよい。
【００６４】
サンプルからの細胞の分離は単に、細胞を洗浄することを意味するものであってよく、例えばサンプルが脳ホモジェネートを含むときは、繰り返し培地を交換することによって、細胞を洗浄することができる。サンプルからの細胞の分離は、サンプルがディスク又はワイヤーを含むときなどは、剥離を意味するものであってよい。さらに、サンプルからの細胞の分離は、サンプルがワイヤーを含み、次いでこれを増殖用培養基質でインキュベートし、これによって分離を行うときなどは、細胞をサンプルから広げ、それによって分離状態にすることを単に意味するものであってよい。
【００６５】
サンプルから細胞を分離することと、細胞を増殖用培養基質に移動させることの間に、さらなるインキュベーションステップを導入することが望ましい可能性がある。このことは、例えば細胞数を増大させるために有利である可能性がある。この実施形態では、コロニーアッセイのために増殖用培養基質に移動させる前の間、必要に応じて細胞を培養、分離、及び再度平板培養することができる。好ましい実施形態、特にサンプルが金属製ワイヤーであるときは、アッセイのために増殖用培養基質に移動させる前に１週間、細胞を場合によってはインキュベートすることができ、或いはアッセイのために増殖用培養基質に移動させる前に３週間又はそれ以上、インキュベートすることができる。
【００６６】
多量のＰｒＰＳｃを含む希釈していない脳ホモジェネートを使用して単層を感染させるとき（例えばＢＳＥプリオンに対する感受性の調査において）、充分なＰｒＰＳｃを単層に付着させて、実際すでに感染している細胞以外の、ＰｒＰＳｃに関する陽性反応を与えることができる。この「偽陽性」効果は、非感受性細胞の単層を平行して使用することによって調べることができる。このような対照層がＰｒＰＳｃ「斑点」を示す場合、ホモジェネートに曝した感受性及び非感受性細胞の単層を、例えば１：５、好ましくは１：１０に分離し、再度単層に増殖させてアッセイしなければならないことを意味する。このプロセスは、元のＰｒＰＳｃを希釈除去し、陰性対照中に「斑点」が存在しなくなるまで、続けなければならない。したがって、ブロッティングアッセイにおけるＰｒＰＳｃの残留は、細胞が感染していることを意味する。３ラウンドの１：１０分離及び再増殖を、使用することが好ましい。
【００６７】
増殖用培養基質
本発明のアッセイは、増殖用培養基質上で細胞をインキュベートして、コロニーを形成することを含む。増殖用培養基質は、アッセイにおいて使用する細胞に適した、任意の増殖用培養基質であってよい。例えば増殖用培養基質は、ガラス又はプラスチック、或いは誘導体プラスチックを含むことができる。好ましい実施形態では、増殖用培養基質は、６ウエルの組織培養プレートに置かれた、２５ｍｍのプラスチック製カバーガラスを含む。
【００６８】
検量線
検量線は、本発明のアッセイを使用して、サンプル中の知られている量のプリオンをアッセイすることによって作製する。マウス試験系などの知られている動物モデルにおけるサンプルの滴定によって、定量を動物の感染性アッセイと関連付けることができる。サンプルを単に比較するだけの本発明の実施形態では、絶対的な定量は必要とされない可能性がある。この場合、所与の量のサンプルのコロニー数を比較することなどによる、相対的な定量で充分である。他の実施形態では、検量線を作製し参照することによる絶対的な定量を、有利に行うことができる。さらなる詳細に関しては、定量用の典型的な検量線を表す図２ｃを含めた、実施例の項を参照のこと。
【００６９】
実施例２、実験２は、ｉｎ  ｖivｏのマウスプリオンのアッセイとコロニーアッセイを相関させる。
【００７０】
コロニー
本発明の方法において述べるコロニーは、プリオンによる感染を受ける細胞の小さな亜集団又はクローンである。プリオン感受性細胞がプリオンに曝されると、それらのサブセットが感染状態になる可能性があることが、驚くことに見出されてきている。これらの感染細胞が増殖し、プリオンを有し、そのプロセス中にＰｒＰＳｃを蓄積させる。これらの細胞は、感染細胞の個別のプール又はクローンを効率よく形成し、これらは、使用する細胞株の付着性及び本明細書に記載するアッセイの形式のために、密接に結合した状態である。このようにして、全細胞バックグラウンド又は単層中のＰｒＰＳｃを可視化することにより、感染細胞の小コロニーを観察することができる。このＰｒＰＳｃは驚くことに、プリオン感染した細胞の亜集団（即ち、コロニー、好ましくは別個のコロニー）の増殖に対応する、小さなパッチ又はスポット中に見られる。本発明のアッセイが最適化及び定量を目的とするのは、これらのスポット様パッチ又はコロニーである。これらのコロニーは、小さなディスク又はスポットと類似した、点様又は斑点様の外見を有する顆粒形を有する。多数のコロニーが存在するとき、個々のコロニーを区別することがさらに困難になる可能性がある。なぜなら、別個のコロニーの端部が、互いに合流するか接する可能性があるからである。このことは、増殖用培養基質上に低密度でコロニーを平板培養することによって、有利に回避することができる。これらのコロニーのさらに詳細な外見及び形態の例は、添付の図面に見ることができる、例えば図１、３及び５を参照のこと。計数することによって、コロニーを定量することができる。定量に最も適した密度で、増殖用培養基質上において細胞をインキュベートすることによって、このことを最適化することができる。好ましい密度を示す実施例の項を参照しながら、試行錯誤によってこれを決定することができる。
【００７１】
好ましい実施形態では、プリオンのコロニー形成は、「小コロニー」又は「単一細胞」コロニーアッセイ（ＳＣアッセイ）によってアッセイする。この実施形態では、コロニーは初期段階でアッセイすることが有利である。細胞／コロニーは、大きな細胞コロニーに過剰増殖する前に、直接アッセイすることもできる。この実施形態では、「コロニー」は非常に少数の細胞を含むことができ、単一細胞のみを含むこともできる。
【００７２】
本明細書に記載する定量、検量、及び他の技術は、本発明の「小コロニー」（又は「単一細胞」）の実施形態に等しく適用される。
【００７３】
手動計数と自動計数、コロニーを増殖させるかどうか、又はそれらを初期に、或いは単一細胞としてアッセイするかどうかの選択は、当業者の必要性及び／又はアッセイ時に利用可能な装置に応じて、当業者によって行うことができる。ＳＣアッセイがスピード、高スループット及びオートメーションの利点を有し、一方コロニーの過剰増殖及びブロッティングによるコロニーアッセイは、実施するのがそれほど難しくはなく、安価の装置を用いて行うことができ、少数サンプルを分析するのに好ましい可能性があることは、理解されるであろう。
【００７４】
本発明は、実施例５に記載するような、ヒト、ウシ、ヒツジ、ネズミ、ヒト以外の霊長類、ヤギ、オグロジカ、ネコ科動物、及びハムスタープリオンに感受性がある細胞株だけには限らないが、これらを含む。
【００７５】
さらに本発明は、金属、プラスチック、ガラスの表面に固定又は付着したプリオンを使用して、感受性細胞クローンに感染を移す方法に関する。
【００７６】
さらに本発明は、金属、プラスチック及びガラスからなるワイヤー又はニードルを一時的に挿入し、次いで本明細書に記載するコロニーアッセイ法によって、これらのワイヤー又はニードルをアッセイすることにより、プリオンに関して組織をアッセイするための方法に関する。
【００７７】
本発明は、固形培養基質に吸着あるいは結合したプリオンの感染性をアッセイするための方法を記載する。実施例の項に示すこれらの方法は、アッセイの細胞と固形培養基質を直接接触させることを含む。理論に縛られることは望まないが、プリオンは固形培養基質に不可逆的に結合するわけではなく、脱着及び拡散することができると考えられる。この場合、細胞と試験する固形培養基質の直接的な接触を避ける、アッセイを行うことができることが当業者には明らかであろう。例えば、非常に短い距離を空けて、例えば数ミクロン空けて、細胞と培養基質を並置し、次いでアッセイを行うことにより、アッセイを行うことができる。さらに、２つの培養基質を同様に並置することによって、ある固形培養基質から他の固形培養基質に感染を移すことができる可能性がある。感染を移した培養基質を直接的な接触によって、或いは前に説明した並置によって、次いでアッセイすることができる。
【００７８】
サンプルの繰越し
スクレーピー感染した脳のホモジェネートは、Ｎ２ａ細胞の単層に付着することができるＰｒＰＳｃ粒子を含み、スクレーピー感染した細胞からのシグナルと類似のバックグラウンドシグナルを与えるので、培養物を好ましくは３回の回数で１：１０に分離して、外来の粒子を希釈除去することが有利である可能性がある。この手順の有効性は、ＰｒＰＳｃの蓄積を妨げるＰｒＰに対する抗体の存在下及び不在下で培養を行うこと［Ｅｎａｒｉ、２００１＃５５７３］、又は感受性及び「非感受性」細胞をプリオンサンプルに曝すことによって調べることができる。本発明者らが記載する条件下では、感受性細胞をプリオンに曝し、次いで３回の１：１０分離の後に検出されたスクレーピー陽性の「スポット」は、ほぼ完全にｄｅ  ｎｏｖｏ感染細胞によるものであり、分離ステップによるバックグラウンドシグナルの充分な低下が実証される。
【００７９】
感染の不在下でさえも１０〜２０倍ＰｒＰを過剰発現する細胞の、ＰｒＰ抗体による連続的な処理によって、「スポット」の蓄積を引き起こす可能性があり、これは低レベルのプロテイナーゼＫ処理の後で続き、おそらくエンドサイトーシス及びＰｒＰ−抗体複合体の凝集によるものであることに留意しなければならない。アッセイの２４時間前に抗体を除去することによって、この現象を防ぐことができる。
【００８０】
コロニーの計数
計数することによって、コロニーを定量することが有利である。計数は、例えば肉眼による手段、又は本明細書に記載する自動式手段などの、任意の手段によるものであってよい。
【００８１】
コロニーアッセイの一実施形態では、細胞を、単層を形成し、その後のバックグラウンドを低下させるための任意選択の有利な第３の分離の後に、カバーガラス上に平板培養し、ミクロコロニーに発展させ、膜に移動させる。ＰＫ処理の後、ＰｒＰＳｃ陽性のミクロコロニーを、化学発光イムノアッセイにより目に見える状態にし、Ｘ線フィルム上に記録された生成スポットを肉眼により計数した。この手順は、高精度の機器を必要としない。
【００８２】
しかしながらこの手順は、有利に自動化することができる。小コロニー（単一細胞又はスクレーピー細胞（ＳＣ））アッセイは、１種のＰｒＰＳｃ陽性細胞は、Ｅｌｉｓｐｏｔ膜上で濾別すると、ＰｒＰに関する酵素関連イムノアッセイによって、識別することができるという発見に基づくものである。アッセイは９６ウエルプレート形式で行うことができ、ウエル当たり約２０００までの「スポット」を顕微鏡下で解像することができ、適切なＥｌｉｓｐｏｔスキャニング装置によって数分以内に、自動式に計数することができる。応答は、０〜２０００で直線的であると考えられる。最も確固たる直線的応答は、０〜１０００で見られる。
【００８３】
末期のＲＭＬ感染マウスからの脳ホモジェネートの希釈液に適用される、アッセイの直線範囲は、２×１０−７と１０−５個の間であり、一方、動的応答は１０−４に及ぶ。低い希釈率では、スポット数のさらなる増大は存在せず、理論に縛られることは望まないが、非感染状態の脳中にも存在するホモジェネートのいくつかの成分が、アッセイに阻害的である可能性があると思われる。
【００８４】
ＳＣアッセイは、開始（単層の作製）から終了（コロニー計数）まで１４日間を要する。ｔｇａ２０マウス（ＰｒＰ過剰発現マウス、短いインキュベーション時間）を使用する、マウスの感染性アッセイは、少なくとも１４０日間を要する［Ｆｉｓｃｈｅｒ、１９９６＃３６０２］。
【００８５】
マウスの感染性アッセイの定量に固有の問題は、［ＭｃＬｅａｎ、２０００＃５６１２］中で述べられている。本発明者らは、表２に示すように３０匹のマウスを使用して、終点滴定により１種のプリオンサンプルをアッセイするためのコストは、ＳＣアッセイのサンプル当たり約２ポンドの支出と比較して（６ウエル／サンプル；プレート当たり３０ポンド；装置の譲渡なしで）、約４５０ポンド（７．５ポンド／１日／マウス；２００日×３０マウス×０．０７５ＢＰ）であると推測する。ＳＣアッセイが、プリオンに関する大部分のｉｎ  ｖivｏアッセイに置き換わり、これによって広範囲のマウスの安定状態に貢献することができる可能性がある。
【００８６】
他の適用例
ＧＴ１及びＰＣ１２系（Ｂｕｔｌｅｒ他、１９８８；Ｍａｒｋｏｖｉｔｓ他、１９８１；Ｒａｃｅ他、１９８７；Ｓｃｈａｔｚｌ他、１９９７）、ウサギ上皮細胞株（Ｖｉｌｅｔｔｅ他、２００１）及び中胚葉細胞株（ＳＭＢ細胞株）を、本発明においてそれぞれ使用することができる。感受性細胞株を、本明細書に記載するようにプリオンの攻撃によって選択することができる。したがって、これらの感受性細胞株は、本発明のアッセイで使用することができる。これらの適用例は、他のプリオン種、例えばＮ２ａ細胞株を容易に感染させることができないプリオン種の、感染性のアッセイにおいて特に有利である。
【００８７】
本発明は以下の実施例によって説明されるが、本発明は実施例に記載される実施態様に制限されるものではない。以下の図面を参照しつつ本実施例を説明する。
（実施例）
【実施例１】
【００８８】
ＲＭＬプリオンに対する感受性が非常に高いＮ２ａ由来の細胞株の単離。
ＡＴＴＣからの研究用ストックからの６５個の個々のＮ２ａクローンを、本質的に（Ｂｏｓｑｕｅ及びＰｒｕｓｉｎｅｒ、２０００）に記載されたようにＲＭＬプリオンに対する感受性に関してスクリーニングした。６つの感受性、１１の弱感受性、及び４８の非感受性クローンを同定した。Ｎ２ａ／Ｇａｒｙとして指定したクローンは、Ｎ２ａ／Ｂｏｓ２と指定された以前に単離されたＲＭＬ感受性クローンよりも、ＲＭＬプリオンに対する感受性が２桁強いことが見出された（Ｅｎａｒｉ他、２００１）。Ｎ２ａ／Ｂｏｓ２クローンは、ＰｒＰ発現プラスミドでトランスフェクトしたＮ２ａ細胞培養物から選択されたが、それがＰｒＰを過剰発現することはなかった（Ｅｎａｒｉ他、２００１）。
【００８９】
本発明者らはＮ２ａ／Ｇａｒｙという名称のＮ２ａ細胞株を単離し、これは以前に記載された系よりも、ＲＭＬスクレーピープリオンを脳ホモジェネートに懸濁させたものに対する感受性が数桁強かった（Ｂｏｓｑｕｅ及びＰｒｕｓｉｎｅｒ、２０００；Ｅｎａｒｉ他、２００１）。驚くことに、本明細書に記載するように行うと、Ｎ２ａＧａｒｙ細胞を使用するプリオンコロニーアッセイは、指標マウスにおける終点滴定アッセイと少なくとも同程度の感受性があり、１桁迅速であり、及び数桁安価であった。感受性細胞が感染しているかどうかを判定するための基準は、プロテアーゼ耐性ＰｒＰの蓄積であるが、本発明者らのコロニーアッセイで実際測定されるのは、サンプルから細胞への感染因子の移動であることに留意しなければならない。
【００９０】
このＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株は、本明細書に記載する、プリオン感染性に関する細胞培養アッセイ（「コロニーアッセイ」）において有用である。
【実施例２】
【００９１】
コロニーアッセイによる、マウスのスクレーピーに感染した脳ホモジェネートのアッセイ
実施例２−実験１：
末期のスクレーピー病状マウスからの、スクレーピーに感染した脳の１０％ホモジェネートを０．０１％の濃度までＰＢＳで段階希釈して、その希釈以外には、担体として０．０１％の非感染状態のマウスの脳ホモジェネートにして、チューブ及びピペットチップの壁への吸着による感染性の損失を回避した。
【００９２】
プリオン感受性細胞の半集密状態の単層を、２０，０００個のＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を９６ウエルプレートのウエルに接種し、２４時間インキュベートすることによって作製した。これらの細胞は、３日間０．２ｍｌのさまざまな希釈のホモジェネートに曝すことによって、サンプル（ホモジェネート）と接触させた。洗浄後、細胞を２４ウエルプレートのウエルに移動させ、さらに４日間培養した（このステップは、コロニー収率を５０％を超えて低下させずに短縮することができる）。細胞を計数し、２，０００、８，０００、３２，０００及び１２８，０００個の細胞を、プラスチック製カバーガラス上に平板培養することによって、増殖用培養基質上でインキュベートし、７日後に最初にニトロセルロース膜に移動させることによって、プリオンのコロニー形成に関してアッセイし、次いでＰｒＰＳｃ陽性コロニーを、プロテイナーゼＫによる処理、及びＰｒＰ抗体による染色によって識別した（図１）。
【００９３】
さらに少しだけ詳細には、コロニーをニトロセルロース膜に移動させ、４０℃で１時間乾燥させ、５マイクログラムのプロテイナーゼＫ／ｍｌで処理し、変性し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング剤（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉ１１、ＵＳＡ）を用いて１時間ブロッキングし、抗体６Ｈ４、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１で免疫染色し、強い化学発光によって可視化した（ＥＣＬキット、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉ１１、ＵＳＡ）。
【００９４】
ホモジェネートの希釈液に対してプロットした、平板培養した１０４個の細胞当たりの陽性コロニーの数の対数は、ｌｏｇ／ｌｏｇ目盛りで直線を与えた（図２）。これが検量線として有用であることは明らかである。
【００９５】
実施例２−実験１ａ
これは実験１と同様に行う。ただし、サンプルと接触させた後、洗浄ステップの後に、細胞をインキュベートし、カバーガラス上に平板培養する前に１：１０に３回分離する。これによって有利に、バックグラウンドの染色が低下し、アッセイの精度が改善される。
【００９６】
実施例２−実験２：
コロニー単位とＬＤ５０単位の相関関係：知られているＬＤ５０力価を有するＲＭＬ脳ホモジェネートに行うコロニーアッセイ。
知られているＬＤ５０力価を有する、ＲＭＬ脳ホモジェネート４．１及び５．０は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ａｄｒｉａｎｏ  Ａｇｕｚｚｉ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｋａｎｔｏｎｓｓｐｉｔａｌ  Ｚｕｒｉｃｈの提供品であった。この２つは、約１０９ＬＤ５０単位／脳１ｇの力価を有していた。
【００９７】
２００００個のＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞をＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳに溶かしたものを、９６ウエルプレートのウエルに平板培養した。２４時間後に培地を、１０−４、１０−５及び１０−６（１０％ホモジェネート＝１０−１）の最終濃度で、２００マイクロリットルのＲＭＬ．４．１及び５．０脳ホモジェネート（０．３２Ｍスクロースに懸濁させた１％懸濁液として供給された、遠心分離済み）と交換した。３日後、細胞をＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳで２回洗浄し、再懸濁させ計数した。次いで細胞を、５００、２．０００、８．０００及び３２．０００の細胞数で、２５ｍｍのカバーガラス上に平板培養した。場合によっては、細胞を１：１０に分離し、カバーガラス上に平板培養して上記ののと同様にバックグラウンドシグナルを低下させる前に、３回再増殖させた。７日後、コロニーをニトロセルロース膜に移し、ＰｒＰＳｃ陽性コロニーを決定した。
【００９８】
ＰｒＰＳｃ−ｐｏｓ．コロニー／１０．０００個の平板培養した細胞
ＲＭＬ希釈液
１０（−４）  １０（−５）  １０（−６）
ＲＭＬ４．１  ４２３        ６２          ８        
ＲＭＬ５．０  ３８０        ３３          ７        
【００９９】
コロニーアッセイとＬＤ５０マウスアッセイの感度を比較する：
ＬＤ５０マウスアッセイ：脳ホモジェネートの感染性を（半定量的に）検出するためには、１０匹のマウスに、それぞれ少なくとも１ＬＤ５０単位の感染物質を注射しなければならない。１ＬＤ５０単位が、３０マイクロリットルのサンプル中に含まれなければならない、即ち１ｍｌ当たり３３ＬＤ５０単位でなければならない。したがって、ホモジェネートの１０−６．５希釈液によって、陽性の結果が与えられる。
【０１００】
コロニーアッセイ：本発明者らのアッセイの条件下で脳ホモジェネートの１０−４希釈液から生じる、４００コロニー単位（即ち１０，０００個の平板培養した細胞当たりの陽性コロニー）の値を使用し、少なくとも１００，０００個の細胞を平板培養することができることを考えると、１コロニーは１０−７．６希釈で生じると思われる。
【０１０１】
したがって、コロニーアッセイの感度は、マウスアッセイの感度と少なくとも同程度であるか、それより良い可能性がある。
【０１０２】
コロニー単位とＬＤ５０単位の均一性を調べる：
前に与えた例では、マウスの脳は１ｇ当たり１０９ＬＤ５０単位を含む。コロニー単位に関しては、１０−４希釈の２００マイクロリットルの脳ホモジェネートが、約４００コロニー／細胞１０，０００個（４００コロニー単位）をもたらすことを考えると、脳１ｇ当たり１０７．３コロニー単位が存在する（５×４００×１０４）。したがって、１コロニー単位は、約５０ＬＤ５０単位（１０９／１０７．３）に等しい。コロニー単位は、１０，０００個の平板培養した細胞当たりのコロニーの数として定義されることに留意されたい。
【０１０３】
時間的要因：
この実施例で実施するのと同様に、コロニーアッセイは、開始（単層の作製）から終了（コロニー計数）まで１１日間を要した。ｔｇ２０マウス（これらは、本発明者らが利用可能な短いインキュベーション時間を有するマウスである）を使用する、終点アッセイは、少なくとも１２０日間を要する（Ｆｉｓｃｈｅｒ他、１９９６）。低力価のサンプルに適用するとき、マウスのインキュベーション時間アッセイに特有な問題は、ＭｃＬｅａｎ及びＢｏｓｔｏｃｋ（２０００）中で述べられている。
【０１０４】
要約すると、コロニーアッセイは、マウスのＬＤ５０終点アッセイと少なくとも同程度の感度があり、少なくとも１０倍迅速であり、数桁安価である。
【実施例３】
【０１０５】
固形培養基質と結合したプリオンの、コロニーアッセイによる定量
本発明者らは、スクレーピー感染した脳のホモジェネートに曝されるか、又はわずか５分間完全な脳中に挿入される、スチール製又は金ワイヤーなどの金属製デバイスは、プリオンと強く結合することを以前に示しており、このことは、指標マウスの脳に挿入すると、完全に洗浄した後に、それらがスクレーピーを効果的に引き起こすことができるという事実によって示される（Ｆｌｅｃｈｓｉｇ他、２００１）。典型的には、スクレーピー感染した脳に一時的に挿入されるスチール製ワイヤーによって、同じ脳からの２０μｌの１％ホモジェネートと同程度に効果的に、指標マウスにおいて疾患が引き起こされる（Ｆｌｅｃｈｓｉｇ他、２００１）。
【０１０６】
本発明者らは現在、金属表面だけでなくプラスチック表面も（及びガラスを含むことができる他の表面も）プリオンと強く結合し、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞などの付着性感受性細胞に感染を移すことを示している。
【０１０７】
サンプルは、スチール製ディスク（ＦＥ２４０３１０  ＡＩＳＩ  ３１６ステンレス鋼ディスク、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、及びプラスチック製ディスク（改変型ポリエステルからなるＮｕｎｃ  Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス）の形であり、これらをスクレーピー感染した脳のホモジェネートのさまざまな希釈液に曝し、ＰＢＳで完全に洗浄し、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞と共に接種することにより、プリオン感受性細胞（Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞）の群と接触させた。８日後、細胞を表面から剥離し、５００、１，５００又は５，０００個の細胞を、カバーガラス上に平板培養することによって、増殖用培養基質上においてインキュベートした。７日後、ＰｒＰＳｃ陽性ミクロコロニーの形成（プリオンコロニーの形成）を、ブロッティングアッセイによって判定した。図３は、１％脳ホモジェネートに曝した後に、１４のＰｒＰＳｃ陽性コロニー／細胞５０００個が、金属製ディスクに関して発見され、７５／５０００細胞がプラスチック製カバーガラスに関して発見されたことを示す。他のアッセイにおいて本発明者らは、ポリプロピレン、Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ、及び低い程度でポリスチレンが、効率良くプリオンと結合し、付着性Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞に感染を移したことを実証する（図４）。
【実施例４】
【０１０８】
浸漬ワイヤーによるコロニーアッセイを使用する、生体内のプリオン感染性の判定
マウス脳内のプリオンのレベルを判定するために、これまではマウスを犠牲にして、脳ホモジェネートの力価を測定することが必要とされている。麻酔をかけたマウスの脳内への一時的なワイヤーの挿入（「ワイヤー浸漬」）、次に指標マウスへの持続的な移植による感染性の評価によって、異なる時間において同一マウス中のプリオンのレベルを判定し、例えば実験処理の影響を調べることが現在可能である。長期のインキュベーション時間のために、ＰｒＰを過剰発現するトランスゲニック指標マウス菌株においても、本発明によって提供されるより一層迅速なコロニーアッセイによって、浸漬ワイヤー又はニードルに付着したプリオンを測定することは有用である。
【０１０９】
ＣＤ１マウスに、ＲＭＬスクレーピープリオンを脳内に接種し、感染後１９、２５、４１及び６１日に選別した。陽性対照として、ＲＭＬプリオンの脳内接種後１４０日で選別した、末期病状のＣＤ１マウスを使用した。サンプルはスチール製ワイヤーの断片（５×０．１５ｍｍ）を含んでおり、さまざまな時間地点で選別した、スクレーピー感染ＣＤ１マウスの脳及び脾臓に、５分間これを挿入した。ＰＢＳでワイヤーを完全に洗浄した後、表面に結合した感染因子の量を、指標マウスへの持続的な挿入によって、及びコロニーアッセイによって分析した。浸漬用に使用した脳及び脾臓は均質にして、コロニーアッセイによってアッセイした。表１及び図５は、浸漬ワイヤーのコロニーアッセイは、平板培養した細胞１０４個当たり４０〜５０コロニーの、感染後１４０日までは強い陽性であり、ホモジェネートのコロニーアッセイによって、２．４×１０７コロニー単位／脳１ｇが与えられたことを示す。指標マウスにおいて測定した（Ｂｕｅｌｅｒ他、１９９３）、感染後１４０日の脳ホモジェネートの感染力価は、約１０８．６ＬＤ５０単位／１０％脳ホモジェネートである。４０日及び６０日で、浸漬ワイヤーのコロニーアッセイは検出限界であり、平板培養した細胞１０５個当たり約１０コロニーであった。４０日のホモジェネートのコロニーアッセイは陰性であり、６０日のホモジェネートは、２×１０６コロニー単位／脳１ｇを与えた。
【０１１０】
感染後５６日で指標マウスにおいて測定した、ホモジェネートの感染力価は、約１０５．４ＬＤ５０単位／１０％脳ホモジェネート１ｍｌであった、これは、１０ＬＤ５０単位の検出は、約４μｇの脳組織を必要とすることを意味する。３０ｕ１の１％ホモジェネート、即ち約３００μｇの脳組織は、脳内に容易に注射することができるので、その検出限界は理論上は、ワイヤーアッセイによる検出の限界より約１００倍高い。プラスチック表面は、プリオンを感受性細胞に移動させる際には、スチール表面より約５倍効率が良いので、スチール製ワイヤーではなくプラスチック製ニードルを使用することによって、アッセイの有効性が相当増大するはずである。
【０１１１】
【表１】
2005520560.tif 000003
【０１１２】
接種後の指定の時間で、ワイヤー断片を選別したマウスの脳内に挿入し、洗浄し、２４ウエルプレートのウエル内に置き、１ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地当たり１００．０００個のＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を含む、１ｍｌの細胞懸濁液と共にインキュベートした。３日後にワイヤーを、１ｍｌの新鮮なＯＰＴＩＭＥＭ培地を含む、新しいウエルに移動させ（約３００個の細胞がそれぞれのワイヤーに付着していた）、さらに６日間培養した。集密状態まで増殖した後、１：７．５の希釈で合計３週間、細胞を週に２回分離させた。ＰｒＰＳｃ陽性細胞の数を決定するために、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を異なる細胞量で平板培養し、コロニーに増殖させた。２．０００−８．０００−３２．０００及び１２８．０００個の細胞の細胞懸濁液を、６ウエルプレートのプラスチック製カバーガラス（２５ｍｍ径）上に平板培養した。増殖の６日後、ＰｒＰＳｃ陽性コロニーの数を、細胞のブロッティングアッセイによって決定した。
【０１１３】
細胞のブロッティングアッセイ
コロニーをニトロセルロース膜に移動させ、４０℃で１時間乾燥させ、プロテイナーゼＫで処理し、変性させ、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング剤（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉ１１、ＵＳＡ）を用いて１時間ブロッキングし、抗体６Ｈ４、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１で免疫染色し、強い化学発光によって可視化した（ＥＣＬキット、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉ１１、ＵＳＡ）。
【実施例５】
【０１１４】
ＢＳＥ及びＣＪＤへの適用
マウスＰｒＰ発現プラスミドでトランスフェクトしＰｒＰを過剰生成する、Ｎ２ａ及びＧＴ１−７細胞のクローンは、２２Ｌ、１３９Ａ及びＣｈａｎｄｌｅｒ菌株に対して感受性があるが、２２Ａ又は８７Ｖ菌株に対しては感受性がないことが報告されてきている（Ｎｉｓｈｉｄａ他、２０００）。これらの著者は、ＰｒＰの過剰生成はプリオンに対する感受性に重要であることを示唆している。Ｂｏｓｑｕｅ及びＰｒｕｓｉｎｅｒは、非形質転換Ｎ２ａ及びＧＴｌ−ｔｒｋ亜系を選択し、ＲＭＬに対して感受性があるが、１３９Ａ（Ｎｉｓｈｉｄａ他の発見とは対照的）、３０１Ｖ又はＭＥ７プリオンに対しては感受性がない系を発見した。Ｅｎａｒｉ他（Ｅｎａｒｉ他、２００１）は、Ｎ２ａ細胞をＰｒＰ発現プラスミドでトランスフェクトし、ＲＭＬ感受性の亜系を同定した；興味深いことに、最も感受性のある亜系はＰｒＰを過剰発現せず、一方いくつかの耐性系はＰｒＰを過剰発現した。これは、プリオン感受性は、ＰｒＰの発現レベルとは無関係の形質であり、従来技術の技法で使用された細胞などの非クローンＮ２ａ細胞集団は、いくつかがその形質を発現し他は発現しない細胞を含むことを示唆する。理論に縛られることは望まないが、感受性細胞中のＰｒＰの発現によって、プリオンに対するその感受性、又はＰｒＰＳｃ発現のレベルがさらに増大する可能性がある。
【０１１５】
コロニーアッセイをＢＳＥ、ＣＪＤ及び他のプリオン菌株に施すために、これらのプリオン菌株に対して感受性がある細胞株を、以下のように同定する。感受性細胞はプリオンドナーの配列を有するＰｒＰを含むはずであることが予想されるが、前に示唆されたように、他の「感受性形質」が必要とされる可能性がある。プリオンに対して感受性がある細胞株は、「同胞種選択法」によって探すことができる。この手法では、明確な数の細胞のいくつかのプールを、当該のプリオン菌株に曝し、分離によって数倍に増殖させ、ブロッティングアッセイによってアッセイする（Ｂｏｓｑｕｅ及びＰｒｕｓｉｎｅｒ、２０００）。陽性のプールが同定されると、より少数の細胞を含む亜プールを、同じ手順によってアッセイする。これにより、感受性細胞の累進的増大がもたらされ、最終的にはクローン感受性群が生じる。
【０１１６】
例えば、最初の細胞集団が１：１０００で感受性細胞を含む場合、以下の戦略を適用することができる：
【０１１７】
サイクル１．２００細胞の２０プール（平均４つの陽性プールをあたえるためのもの）を、約２０，０００〜３０，０００個の細胞にそれぞれ増殖させ、約５０００細胞の３つの等分試料を凍結させる。２〜３０００細胞の２つの等分試料を約２０，０００細胞に増殖させ、３日間プリオンに曝し、２週間培養し、２０，０００個の細胞を、まったく同様に大きなカバーガラス上に、ＰｒＰＳｃブロッティング用に平板培養して、感染細胞を含むプールを同定し、陽性コロニーの数を決定する。
【０１１８】
サイクル２．陽性プールはここでは、１：２００以上の感受性細胞を含むはずである。最大数の陽性コロニーを与えたプールの凍結サンプルを解凍し、４０細胞の２０プールを、約２０，０００〜３０，０００個の細胞にそれぞれ増殖させ、前と同様に処理した。平均して４つの陽性プールが存在するはずである。
【０１１９】
サイクル３．陽性プールは、１：４０の陽性細胞を有しているはずである。最大数の陽性コロニーを与えるプールの凍結サンプルを解凍し、１０細胞の２０プールを、前と同様に処理した。約５つの陽性プールが与えられるはずである。
【０１２０】
サイクル４．陽性プールは、１：１０の陽性細胞を有しているはずである。最も陽性であるプールから、５０の単一細胞を平板培養し、２０，０００〜３０，０００個の細胞に増殖させ、それぞれのクローンの等分試料を前と同様にアッセイする。
【０１２１】
多数のプール、又は多数の細胞を含むプールで始めることが、当然ながら可能である。
【０１２２】
この方法で使用する細胞株は、さまざまな種、上皮、不死化胚の脳細胞、又は所望の感受性の系を生み出す可能性がある他の系からの、神経外胚葉由来のものであってよい。
【０１２３】
浸漬アッセイと組み合わせて、ウシ、ヒツジ、ヒト及び他の動物に適用可能な、最小限の侵襲性手順によってプリオンを検出することが、したがって可能である。ＰｒＰＳｃ（プリオン感受性の指標）は、プリオン病に罹患しているヒト及びヒツジの脳内だけでなく、扁桃内でも検出されてきている。
【０１２４】
この実施例では、コロニーアッセイは前の例で述べたのと同様に行い、これらの細胞株をＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株に必要に応じて置き換える。
【実施例６】
【０１２５】
プリオン感染に対する異なる感受性を有する細胞株の作製
概要
神経外胚葉細胞株Ｎ２ａは、感染及びＰｒＰＳｃの蓄積により実証されるように、マウスのスクレーピープリオンのいくつかの菌株による感染に対して適度に感受性がある。本発明者らは高感受性Ｎ２ａ亜系を単離し、コロニー又は細胞計数手順に基づく、プリオン感染性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの定量アッセイにおいて増殖させた。感受性Ｎ２ａ細胞を３日間プリオンに曝し、３回１：１０に分離し、ＰｒＰＳｃ含有細胞の割合をイムノアッセイによって測定した。動的範囲は３ｌｏｇのプリオン濃度に広がり、２ｌｏｇにわたり直線的である。このアッセイはマウスの接種アッセイとほぼ同程度の感度があり、１桁迅速であり、数桁安価である。
【０１２６】
Ｎ２ａ細胞のサブクローニング、増殖及び保存
Ｎ２ａ細胞は、通常はＯｐｔｉｍｅｍ−ＦＣＳ中で培養する。高感受性サブクローンのサブクローニング及び同定の後［Ｅｎａｒｉ、２００１＃５５７３］、細胞を約３世代増殖させる。Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ（Ｎ２ａＰＤ）細胞を、Ｎ２ａ細胞をサブクローニングすることにより、上記のように単離した［Ｅｎａｒｉ、２００１＃５５７３］。さらにサブクローニングし、ＲＭＬの１０−６希釈液で攻撃することにより、ＳＣアッセイにより最高の応答性を与える、クローンＮ２ａＰＤ１１２及びＮ２ａＰＤ８８を作製し、これらを感受性がある系として選択した（Ｎ２ａｌ／Ｇａｒｙとも指定する）。
【０１２７】
Ｎ２ａＲ３３などの、１０−４のＲＭＬ希釈液に曝した後に、ＰｒＰＳｃの蓄積を示さなかったクローンは、「非感受性が」亜系として選択した。選択したクローンを約３世代増殖させ、それぞれ５０等分試料を、凍結容器（「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」（Ｎａｌｇｅｎｅ）を使用して、凍結培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ−ＦＣＳ、６％ＤＭＳＯ）において−８０℃で凍結させ、液体窒素中に保存した。作業用ストックは、考えられる感受性の悪化を避けるために、約４世代を超えて増殖させることはなかった。慢性的に感染した細胞を、ＲＭＬ（Ｉ２４２４）の１０−４希釈液を用いた、新たに感染したＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞の６回の１：１０分離の後に得た。
【０１２８】
ＲＭＬプリオンに対する感受性が非常に高い又は耐性がある、Ｎ２ａ由来の細胞株の単離。
ＡＴＴＣストック培養物からの６５個のＮ２ａクローンを、ＲＭＬプリオンに対する感受性に関して個別にスクリーニングした。９６ウエルプレート中の単層を、ＲＭＬ脳ホモジェネートに曝し、洗浄し３回継代し、各回に１：１０に分離した。最終的な単層を、本質的に［Ｂｏｓｑｕｅ、２０００＃４９９３］に記載されたのと同様に、ブロッティング手順によりＰｒＰＳｃに関してアッセイした。６つの感受性、１１の弱感受性、及び４８の明らかに非感受性のクローンを同定した。Ｎ２ａＰＤとして指定したクローンは、非クローンＡＴＴＣストックよりも、ＲＭＬプリオンに対する感受性が２桁強かった。サブクローニングの第２ラウンドによって、非クローン細胞より３桁感受性が強い、細胞株Ｎ２ａ／Ｇａｒｙが生成した（以下の図９ｂを参照のこと）。いくつかの「非感受性」の系を、高濃度のＲＭＬホモジェネートに曝すことによって単離し、細胞の選択によってＰｒＰＳｃの蓄積はほとんど、或いはまったく示されず、クローンＮ２ａＲ３３は、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞より３桁感受性が弱かった（図６ａ）。
【実施例７】
【０１２９】
プリオン感染に関するコロニーアッセイ
背景
本発明者らは、希釈したプリオン調製物に曝した集密状態の細胞層に、細胞ブロッティングアッセイを施すと、スポット状のパターンが生じ、非感染細胞の背景に埋め込まれた、個々のＰｒＰＳｃ陽性ミクロコロニーの存在が示唆されたことを示した。これは実際確かであることが証明され、この驚くべき発見によって、本発明の定量的なｉｎ  ｖｉｔｒｏのプリオン感染性アッセイを開発することが可能であった。
【０１３０】
Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を使用するコロニーアッセイ
ＡＴＴＣＮ２ａ細胞、感受性Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞、及び「非感受性」Ｎ２ａＲ３３細胞を、さまざまな希釈液（１０−３〜１０−８）の感染した脳のホモジェネートに平行して曝し、連続的に３回１：１０に分離して、接種物（以下参照）から繰り越されたＰｒＰＳｃを希釈除去した。集密状態に達した後、１０５、１０４、又は１０３個の細胞を、非感染Ｎ２ａＰＤ細胞と混合させて、全体を細胞１０５個にし、カバーガラス上に平板培養し、４日間増殖させ、細胞ブロッティングイムノアッセイを施した［Ｂｏｓｑｕｅ、２０００＃４９９３］。図６ａに示すように、陽性コロニーの数は、平板培養した細胞の数にほぼ比例し、接種物の希釈液の増大と共に直線的に低下した。１０−５のＲＭＬ感染した脳ホモジェネートに曝したＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞によって、平板培養した１００，０００個の細胞当たり２４０個の陽性コロニーが与えられたのに対し、「非感受性」細胞によって、６個の陽性コロニーが与えられ；これらは低い感染率、又は接種物からのＰｒＰＳｃの残留繰越しのいずれかが原因であった。以下に示すように、「非感受性」細胞は実際、感染に対する感受性が非常に弱かった。
【０１３１】
図６ｂは、コロニーの数は、１０−７〜１０−４のＲＭＬ脳ホモジェネート希釈液の、ほぼ直線的な関数であることを示す（１０％脳ホモジェネート＝１０−１）。この実験では、脳ホモジェネートの感染性は１０９ＬＤ５０単位／脳１ｇであり、１０ＬＤ５０単位によって、平板培養した１００，０００個の細胞当たり約１．２のスクレーピー陽性コロニーが与えられた。図６Ｂの曲線などの参照曲線を使用して、未知のサンプルの感染性を決定することができる。これは、本発明の感受性の絶対的定量の一例である。
【実施例８】
【０１３２】
プリオン感染性に関する、「小コロニー」又は「単一細胞」（「スクレーピー細胞」）アッセイ
概略
前に実証したように、コロニーアッセイは、サンプルの感染性を分析するのに非常に有用である。しかしながら、コロニーアッセイは比較的労力がかかる可能性があり（視覚的にコロニーを計数することを含む）、細胞を異なる密度で平板培養して、解像することができるコロニー数を最適化することを必要とする可能性がある。
【０１３３】
この実施例では、多数のサンプルの同時的処理及び自動式の定量を可能にする、アッセイの改変の仕方を実証する。
【０１３４】
「Ｅｌｉｓｐｏｔ」技法による１種のＰｒＰＳｃ陽性細胞の検出
適切な状況下において、１種のＰｒＰＳｃ陽性細胞を、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって可視化することができることを、本発明者らは確認した。したがって、感染細胞にコロニーを形成させるのではなく、本発明者らは有利に、明確な数の細胞をＥｌｉｓｐｏｔプレートの膜上で濾過し、細胞を溶解させプロテイナーゼＫ（ＰＫ）により消化した。ＰｒＰＳｃ陽性細胞を、モノクローナルＰｒＰ抗体及びアルカリホスファターゼ結合抗ＩｇＧ１抗血清を使用して、可視化した。陽性細胞を、Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ  Ｅｌｉｓｐｏｔシステム及びＷｅｌｌｓｃａｎソフトウェアを使用して計数した。
【０１３５】
最適感受性及びシグナル−ノイズ比に関する重要なパラメーターは、膜に堆積した細胞の数に対するＰＫ濃度である。本発明者らは、慢性的にスクレーピー感染したＮ２ａ細胞と非感染Ｎ２ａ細胞の、異なる割合の混合物を調製し、合計２５，０００個の細胞（膜を通過する流速を低下させない、ほぼ可能な最大数）、及び５，０００個の細胞をそれぞれ濾別し、高いシグナルノイズ比、フィルタに施した細胞数と計数した陽性「スポット」の数の間の直線的関係を得るのに最適な、ＰＫ濃度を決定した（図７）。
【０１３６】
非感染細胞はＰＫ処理の不在下でさえ、陽性シグナルを与えず、これはおそらく、ＰｒＰＣが溶解用緩衝液によって溶解され、フィルタを介して洗浄されたためである。興味深いことに、適度なＰＫ処理によりシグナル強度が改善され、これによって検出可能な感染細胞の数がいくらか増大した。過剰なレベルのＰＫによって、スポット数が減少した。なぜなら、前に示したように、ＰｒＰＳｃの耐性は絶対的なものではないからである［Ｋｕｃｚｉｕｓ、１９９９＃４６４６］［Ｂｕｉｅｌｅｒ、１９９４＃６２５２］。本発明者らのアッセイの条件下では、５０００個及び２５，０００個の細胞に関する、最適ＰＫ濃度はそれぞれ、９０分で０．２５μｇ／ｍｌ及び０．５μｇ／ｍｌであった。細胞の中間数に関する最適値は、これらの図を参照しながら当業者により決定することができる。
【０１３７】
２５，０００個の細胞をフィルタに塗布すると、アッセイの動的範囲は、約２０００の陽性細胞まで及んだ（典型的には２０〜４０の「スポット」のバックグランドで）。
【０１３８】
Ｅｌｉｓｐｏｔ技法によって記録した感染性アッセイ
感受性細胞をスクレーピー感染した脳のホモジェネートに曝した後に、図８の実験中に示すように、感染培養物を３回１：１０に分離して、ホモジェネート中に存在するＰｒＰＳｃ陽性粒子を希釈除去することが有利である。２００００個の感受性細胞（Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ）（ＰＤ８８））及び「非感受性」（ＮＮ２ａ）細胞をそれぞれ、９６ウエルプレートのウエルに平板培養し、１２時間培養し、ＲＭＬ感染した脳のホモジェネートの１０−４希釈液に３日間曝した。次いで細胞を懸濁させ、１：１０に分離した。３日後に集密状態に達し、細胞を再度１：１０に分離した。この手順は、もう１回繰り返した。それぞれのステップで、集密状態に達した後、２５，０００個の細胞を８連で、Ｅｌｉｓｐｏｔプレートの膜上で濾過した。平行して、感染及び以下のすべてのステップを、モノクローナルＰｒＰ抗体（ＩＣＳＭ１８、［Ｗｈｉｔｅ、２００３＃６２８９］、Ｂｅｒｉｎｇｕｅ他）の存在下において、Ｍａｂ６Ｈ４の存在下での慢性的にスクレーピー感染したＮ２ａ細胞中の、ＰｒＰＳｃの蓄積を妨げる条件下で行った［Ｅｎａｒｉ、２００１＃５５７３］。感染の３日後、約２，２００の免疫反応「スポット」の数は、ＰｒＰＳｃの蓄積がＰｒＰ抗体によって阻害されたどうかに関係なく、感受性細胞と非感受性細胞の両方で同等であり（図８）、この段階で大多数のスポットは、既存のＰｒＰＳｃによるものであったことが示された。第３の分離の後、抗体処理したサンプル中のスポット数は、抗体不在の約２，２００スポットという値と比較して、基本レベルに減少し、元のＰｒＰＳｃ粒子が希釈除去された、及び／又は完全に分解されたことが示された。同様に、ＲＭＬに曝し３回１：１０に分離した「非感受性」細胞は典型的には、「スポット」の約５０、元のレベルの２．５％未満の減少をもたらした。ＰｒＰ抗体が培地中に存在すると、この値は１０へとさらに減少し、「非感受性」細胞が、非常に低い有効性では合ったが、感染に対して感受性があったことが示唆される。したがって、感受性細胞のプリオンへの暴露、次に３回の１：１０分離後に検出された、スクレーピー陽性「スポット」は、ほぼ完全にｄｅ  ｎｏｖｏ感染細胞よるものである。
【０１３９】
アッセイの用量応答性検量線
本発明者らは、プリオン、この実施例ではＲＭＬプリオンに対する用量応答性を決定した。感受性及び「非感受性」Ｎ２ａ細胞をそれぞれ、Ｏｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳ中に１０−７〜１０−３に希釈した、ＲＭＬ感染した脳のホモジェネートに曝し、前と同様に処理した。図９ａは、さまざまな希釈でのサンプルのＥｌｉｓｐｏｔフィルタを示し、図９ｂは自動式に評価したデータのプロットを示し、２×１０−７と１０−５の間の直線性、及び１０−４までの動的応答を示す。
【０１４０】
プリオン感染性に関するコロニーアッセイの、他のパラメーターの最適化
単層の細胞密度：感受性Ｎ２ａ細胞の単層を、ウエル当たりに１０４、２×１０４及び４×１０４個を平板培養し、それらを増殖させることによって作製した。単層を、記載したように希釈したＲＭＬ感染した脳ホモジェネートに３日間曝して、ＳＣアッセイによって分析した。このようにして、感染（即ち、サンプルとの接触）に最適な細胞密度を決定した。
【０１４１】
感染に対する露出時間：
２×１０４個の感受性Ｎ２ａ細胞を平板培養することにより作製した単層を、ＲＭＬ感染した脳の希釈液に１、２及び３日間曝し、ＳＣアッセイを前と同様に行った。このようにして、感染（即ち、サンプルとの接触）に関する最適な露出時間を決定した。
【０１４２】
非感染脳ホモジェネートの「ＳＣスポット」生成に対する影響：
１０−４及び１０−３希釈で生じるスポットが類似していたという発見により、ホモジェネートの成分による感染効率の阻害が示唆された。多量の非感染ＣＤ１脳ホモジェネートを、スクレーピー感染した脳のホモジェネート（ＲＭＬ２１２１、２．９５×１０８ＬＤ５０単位／１ｇ）の、１０−４、１０−５又は１０−６希釈液（Ｏｐｔｉｍｅｍ−ＦＣＳに希釈したもの）に加え、スポット収率をＳＣアッセイによって測定した。図１０に示すように、非感染脳ホモジェネートを加えると、「スポット」の累進的な損失があった。１０−５ＲＭＬに関しては、均質化した脳組織３３０μｇ／１ｍｌの濃度で、スポット数が半分になる。したがって本発明は、プリオン感染の抑制物質としての、均質化した非感染脳組織の使用を提供する。さらに本発明は、プリオン感染を抑制するための薬剤の製造における、均質化した非感染脳組織の使用を提供する。
【実施例９】
【０１４３】
マウスの終点滴定アッセイと、スクレーピー細胞アッセイの比較：
末期病状のＲＭＬ感染ＣＤ１マウス（Ｉ２４２４）の脳ホモジェネートを、一連で１０倍に希釈し、それぞれの希釈液の３０μｌの等分試料を、５匹のＴｇａ２０マウスそれぞれの皮内に注射した。平行して、１００μｌの等分試料を、腹腔内に投与した。表２に示すように、１０−６より低い希釈液を皮内注射すると、５匹のマウスすべてがスクレーピーになったが、１０−７希釈では、５匹のマウスのわずか３匹（１０％脳ホモジェネート＝１０−１希釈）がスクレーピーになり、１０−８希釈液の接種後は、５匹のマウスはいずれもスクレーピーにならなかった。同じ脳のホモジェネートは、ＳＣアッセイによってアッセイすると、１０−７希釈液に関して、２５，０００個の細胞（「ＳＣ単位」）当たりで２６±２３の「スポット」を生成した（バックグラウンド＝１±１個のスポット）。したがってこれらの結果は、１０−７希釈液のバックグラウンドを有意に超える（ｐ＝０．０３）。これらの基準によって、マウス感染性アッセイとＳＣアッセイは、ほぼ同程度の感度を有することが実証される。
【０１４４】
【表２】
2005520560.tif 000004
【０１４５】
１０−５希釈液では３００μｌの脳ホモジェネートが、１０３９スクレーピー陽性細胞／細胞２５，０００個（１０３９ＳＣ単位）をもたらし、１０−６希釈液では７５ＳＣ単位がもたらされたことを考慮すると、約１０８．４７ＳＣ単位／脳１ｇ（３．３×１／２（［１０３９×１０５］＋［７５×１０６］））が存在する。同じサンプルが由来するマウスの脳は、１０８．３８ＬＤ５０単位／１ｇを含んでいた。したがって、この実験の条件下では、１ＳＣ単位は、約１．２３ＬＤ５０単位（１０８．４７／（１０８．３８））に等しい。しかしながら、理論に縛られることは望まないが、ＳＣ単位は本明細書において定義され、さらにＳＣ単位は、抗体の親和性及び濃度、並びにＥｌｉｓｐｏｔ装置による計数用に選択されるパラメーターに依存する可能性があることを、述べなければならない。したがって、別個のアッセイからの結果を比較する際に、参照用のプリオン調製物、好ましくはマウスの力価測定用のスクレーピー脳ホモジェネートを含むことは重要である。
【０１４６】
表３は、知られているＬＤ５０力価を有する３つの他のＲＭＬ脳ホモジェネートに行った、ＳＣアッセイの結果を示す。
【０１４７】
【表３】
2005520560.tif 000005
【０１４８】
ＳＣ単位とＬＤ５０単位の比は、異なる研究室で調製しマウスのアッセイによりアッセイした、４つの別個の脳ホモジェネートに関して０．２〜３．５の範囲であり；この広がりはおそらく、マウスの感染性アッセイの不正確さによるものである［ＭｃＬｅａｎ、２０００＃５６１２］。
【０１４９】
マウスの感染性アッセイ及びＳＣアッセイより決定した、接種後の異なる時間でのマウス脳のホモジェネートの感染性。
マウスの感染性アッセイとＳＣアッセイの感度をさらに比較するために、野生型ＣＤ１マウスからの脳ホモジェネートを、接種後の異なる時間で両方の方法によりアッセイした。表４に示すように、両方の方法共に、皮内接種後の第１９、２５及び４１日には感染性を検出しなかったが、６１日及び１４０日後に、両方の方法によって感染性を検出した。
【０１５０】
【表４Ａ】
2005520560.tif 000006
【表４Ｂ】
2005520560.tif 000007
【０１５１】
ＣＤ１マウスに、０．０３ｍｌのＲＭＬ  Ｉ２４２４（１％、約７．５×１０４ＬＤ５０単位）を皮内接種した。１９、２５、４１及び６１日後、マウスを選別した；同様に接種したマウスを、感染後１４０日で陽性対照として選別した。脳ホモジェネートを調製し、表２に記載したようにマウスの感染性をアッセイする。ＳＣアッセイの基底値は９±５であり、これは差し引かれた値ではなかった。希釈は脳組織に対するものである（１０％＝１０−１）。陽性の値を太字で示す。
【実施例１０】
【０１５２】
コロニーアッセイ
他に述べない限り、すべてのステップは室温で行う。ＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮＡＣｌ、０，１％のＴｗｅｅｎ２０）を、１０×ストック溶液から使用する前に調製する。２００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）−１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＯＦＣＳ）に溶かした、２００００個の感受性Ｎ２ａ細胞（倍増時間約２４時間）を、９６ウエルプレートのウエルに平板培養した。２４時間後３７℃において、この培地をＯＦＣＳの０．３ｍｌのサンプルと交換する。３日後、集密状態の単層（約１０５個の細胞）を、軽いピペッティングによって懸濁させる。それぞれのサンプルの３０−ｕｌの等分試料を、２７０μｌのＯＦＣＳを含む９６ウエルプレートのウエル中に置き、集密状態まで増殖させた。細胞は前と同様に、１：１０に分離し、さらに２回１：１０に分離する。
【０１５３】
第３の分離、集密状態に達した後に、細胞を３００μｌのＯＦＣＳに懸濁させ、計数する。２００、１０００、５，０００及び２５，０００個の細胞の３連の等分試料を、２４ウエル（又は６ウエル）プレート中の、１３ｍｍ（又は２４ｍｍ）のＴｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＵＫ）上に堆積させる。４日後３７℃において、コロニー（平板培養効率約４０％）を、溶解用緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に浸した、ニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、０，４５μｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）上にブロッティングする。この膜を１時間３７℃で乾燥させ、５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（特異的活性３０ｍＡＵ／ｍｇ、Ｍｅｒｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｗｅｓｔ  Ｄｒａｙｔｏｎ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＵＫ）を含む溶解用緩衝液中で、９０分間３７℃でインキュベートし、水で２回すすぎ、２ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）中で、１０分間インキュベートする。この膜を、３Ｍのグアニジニウムチオシアネート（＞９９％、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に１０分間置き、水で５回すすぎ、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液中で１時間インキュベートし、抗ＰｒＰ抗体６Ｈ４（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；１：５．０００）又はＩＣＳＭ１８（Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎｇｅ、Ｐｒｉｏｎ  Ｕｎｉｔ；１：５０００）と共に、ＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）、１％無脂肪乾燥ミルク（Ｍａｒｖｅｌ）中で１時間振とうさせ、次いでＴＢＳＴで４回５分間洗浄した。膜は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ；ＴＢＳＴ中に１：７．５００、１％無脂肪乾燥ミルク）と共に、１時間インキュベートする。１×ＴＢＳＴで５分間５回洗浄した後、膜をフィルタ紙（タンパク質が上側）上で乾燥させ、ＥＣＬ試薬（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に３分間浸し、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）に感光させる。ＰｒＰＳｃ陽性コロニーを計数し、平板培養した細胞の数に対して表す。
【実施例１１】
【０１５４】
スクレーピー細胞（ＳＣ）アッセイ（「小コロニー」又は「単一細胞」アッセイとも呼ばれる）
溶液はすべて濾過し、プレートはアッセイ中は粉塵から保護する。ＴＢＳＴは、使用前に１０×ストック溶液から新鮮に調製する。他に述べない限り、すべてのステップは室温で行う。細胞を感染及び増殖させるために、前の実施例１０と同じ手順に従う。
【０１５５】
第３の分離、集密状態に達した後に、次いで細胞を２５０μｌのＰＢＳに懸濁させ、計数し（約５００個の細胞／１μｌ）、２５，０００又は５，０００個の細胞を、Ｅｌｉｓｐｏｔプレート（Ｍｕｌｔｉ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｉｍｍｎｏｂｉｌｏｎ−Ｐ９６ウエル濾過用プレート、滅菌済み、０．４５μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｕ．Ｋ．）Ｌｔｄ．，Ｗａｔｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）の、少なくとも３つのウエルのそれぞれ（２００μｌのＰＢＳを含む）にピペッティングし、７０％エタノールを用いて活性化させ、ＰＢＳで２回すすぐ。吸引力をＥｌｉｓｐｏｔ濾過装置に施し、プレートは５０℃で１時間乾燥させる。それぞれのウエルに、５０μｌプロテイナーゼＫ（２５，０００個の細胞に関しては溶解緩衝液中に０．５μｇ／ｍｌ、５，０００個の細胞に関しては０．２５μｇ／ｍｌで最適化させた）を加え、９０分後に３７℃で吸引除去する。１６０μｌのＰＢＳで洗浄した後、サンプルを１６０μｌのＰＭＳＦに１０分間に曝し、１６０μｌのＰＢＳで１回洗浄する。１６０μｌの３Ｍグアニジニウムチオシアネート−１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と共に１０分間インキュベートした後、フィルタを吸引により１６０μｌの１×ＰＢＳで４回洗浄し、１６０μｌのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋと共に４５分間インキュベートする。５０μｌのＰｒＰ抗体ＩＣＳＭ１８（１×ＴＢＳＴ中に１：５０００／１％無脂肪ミルク粉末）を加え、１時間後に上清を吸引除去し、ウエルを１６０μｌの１×ＴＢＳＴで７回洗浄する。５０μｌの抗ＩｇＧ１−ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａｂａｍａ  ＵＳＡ；１×ＴＢＳＴ中に１：４，５００／１％ミルク粉末）を、１時間加える。１６０μｌの１×ＴＢＳＴで８回洗浄した後、プレートを乾燥させる。それぞれのサンプルに、５０μｌのアルカリホスファターゼ結合基質（製造者、Ｂｉｏ−Ｒａｄにより奨励されるように調製したもの）を８分間加え、ウエルは１６０μｌの水で２回洗浄する。プレートは、評価まで暗所に−２０℃で保存する。
【０１５６】
ＰｒＰＳｃ陽性細胞を、Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ  Ｅｌｉｓｐｏｔシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＶ−Ｃ２０Ａカラーカメラ、ＫＬ１５００ＬＣＤスキャナーを備えるＳｔｅｍｉ２０００−Ｃ立体顕微鏡、及びＩｍａｇｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｃｅｓｔｅｒ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫからのＷｅｌｌｓｃａｎソフトウェア）を使用して計数した。設定を最適化して、ＰｒＰＳｃ陽性を有するウエルの数と陰性対照サンプルを有するウエルの数の最大比を与え、一方サンプル数は可能な限り多く保つ。パラメーターは、製造者の教示書に従い、プログラムのトレーニング特徴を使用して調整する。
（参照文献）
2005520560.tif 000008
2005520560.tif 000009
2005520560.tif 000010
【０１５７】
ここで本発明を実施例によって記載するが、これは実施例中に記載する実施形態を制限するものとしてみなすべきではない。実施例は、以下の図面に言及する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】段階希釈したＲＭＬ感染した脳のホモジェネートの、コロニーのアッセイを示す図である。２００００個のＮ２ａ  Ｇａｒｙ細胞を、９６ウエルプレートのウエル、Ｏｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳに平板培養した。２４時間後に培地を、示した希釈（１０−１＝１０％脳ホモジェネート）の２００マイクロリットルのＲＭＬ脳ホモジェネートと交換した。１０％ホモジェネートは、末期的病状のＲＭＬスクレーピー感染マウスから調製した。希釈液を０．０１％非感染脳ホモジェネートにして、吸着の損失を防いだ。３日後、細胞層をＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳで２回洗浄し、２４ウエルプレートのウエルに移した。他の４日後、細胞を懸濁させ、指定の細胞数を２５ｍｍのカバーガラス上に置いた。７日後、コロニーをニトロセルロース膜に移し、ＰｒＰＳｃ陽性コロニーを決定した。（ａ）平板培養した３２，０００個の細胞は、それぞれ１０−７及び１０−８の希釈で、３３個及び１個のコロニーを与えた（ｂ）平板培養した１２８，０００個の細胞は、それぞれ１０−７及び１０−８の希釈で、１２１個及び１７個のコロニーを与えた。
【図２】用量応答性のコロニーアッセイを示す図である。Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を、図１の凡例に記載したのと同様に、ＲＭＬ感染した脳のホモジェネートの一連の希釈液に曝した。５００、２０００、８，０００及び３２，０００個の細胞を、それぞれの希釈液に関して２５ｍｍのカバーガラス上に平板培養し、７日後にブロッティングアッセイを施した。（ａ）平板培養した細胞数の関数としての、ＰｒＰＳｃ陽性コロニーの数。５０未満のコロニー数（括弧内）を、他の計算用に使用することはなかった。（ｂ）１０，０００個の細胞当たりで再度計算した（ａ）からのデータ。（ｃ）コロニー数／１０，０００個の細胞と、ＲＭＬの希釈液（ｂからのもの）の二重対数プロットによって、直線が与えられる。
【図３】金属製及びプラスチック製ディスクからＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞への、プリオンの移動を示す図である。金属製ディスク（１０ｍｍ径、１００％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１時間洗浄し、完全にすすいだもの）、及びカバーガラス（Ｎｕｎｃ  ｔｈｅｒｍａｎｏｘ、１３ｍｍ径）を、２４ウエルプレート中で２００μｌの１％ＲＭＬと共に一晩振とうさせ、１ｍｌのＰＢＳで５回洗浄し、空気乾燥させた。これらのディスクを２４ウエルプレートのウエル中におき、１ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳに溶かした約８０００個のＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を加え、付着させた。８日後、細胞をディスクの表面からすすぎ落とし、計数し、５００、１５００及び５０００個の細胞を、２５ｍｍのＴｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス上に堆積させた。１週間後、コロニーをニトロセルロースフィルタに移し、ＰｒＰＳｃ陽性コロニーを識別した。
【図４】異なるプラスチック表面からＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞への、プリオンの移動を示す図である。プラスチック製ディスク（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン及びＴｈｅｒｍａｎｏｘ、１３ｍｍ径）を、２４ウエルプレート中で２００μｌの１％ＲＭＬと共に一晩振とうさせ、１ｍｌのＰＢＳで５回洗浄し、空気乾燥させた。これらのディスクを９６ウエルプレートのウエル中におき、１ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳに溶かした約８，５００個のＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を加え、付着させた。４日後、細胞を表面からすすぎ落とし、計数し、５００、１５００及び５０００個の細胞を、２５ｍｍのＴｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス上に堆積させた。１週間後、本明細書に記載したのと同様に、コロニーをニトロセルロースフィルタに移し、ＰｒＰＳｃ陽性コロニーを識別した。
【図５】感染後に異なる時間でマウスの脳中に５分間「浸した」、スチール製ワイヤーに付着したプリオンの、コロニーアッセイを示す図である。この図は、ＣＤ１マウスの接種後４１日（Ｃ１及びＣ３）、６１日（Ｄ１及びＤ３）及び１４０日（Ｅ１ａ、Ｅ３ａ）に浸したワイヤーの、平板培養した３２，０００個の細胞に関するデータを示す。
【図６】コロニーアッセイにより決定した、感染ＲＭＬホモジェネートの希釈液とＰｒＰＳｃ陽性コロニー数の間の、用量応答性の関係を示す図である。２×１０４個の感受性Ｎ２ａ細胞（Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ）（Ａ）及び「非感受性」細胞（Ｎ２ａＲ３３）（Ｂ）を、示したように、さまざまなＲＭＬの希釈液（Ｉ２４２４、表２参照）をＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳに溶かしたものと共にインキュベートした。３日後に細胞を懸濁させ、１：１０に分離し、３日間増殖させた。さらに２回分離した後、１０５、１０４、及び１０３個の細胞を、非感染Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞と混合させて、細胞１０５個という最終的な数を与え、２５ｍｍのＴｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス上に平板培養した。増殖の４日後、本明細書に記載したように細胞をニトロセルロース膜に移し、ＰｒＰＳｃ陽性コロニーの数を決定した。膜上の細胞数は一定に保った。なぜなら、プロテアーゼＫによる消化の程度は、膜上のタンパク質の量に依存するからである（図７参照）（Ｃ）ＲＭＬ希釈液と、平板培養した１０，０００個の細胞当たりのＰｒＰＳｃ陽性コロニー数の、二重対数プロット。アッセイは全く同様に行った。
【図７】スクレーピー細胞アッセイ用の、プロテアーゼＫ濃度の最適化を示す図である。さまざまな数の慢性的に感染状態のＮ２ａ細胞を、Ｅｌｉｓｐｏｔプレートの膜上で濾過した。細胞の合計数は、非感染Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を用いて２５，０００（ａ）又は５，０００（ｂ）個の細胞に調整した。５０℃で１時間乾燥させた後、サンプルを、さまざまな濃度のプロテアーゼＫ（図７ａ：丸（０．５マイクログラムＰＫ／ｍｌ）、四角（１マイクログラムＰＫ／ｍｌ）、三角（０マイクログラムＰＫ／ｍｌ）、逆三角（２マイクログラムＰＫ／ｍｌ）、ひし形（５マイクログラムＰＫ／ｍｌ）；図７ｂ：六角形（０．２５マイクログラムＰＫ／ｍｌ）、５つ星（０．３７５マイクログラムＰＫ／ｍｌ）、４つ星（０．１２５マイクログラムＰＫ／ｍｌ）、丸（０．５マイクログラムＰＫ／ｍｌ）、三角（１マイクログラムＰＫ／ｍｌ））を含む５０ｕｌの溶解緩衝液と共に、９０分間３７℃でインキュベートし、実施例中に記載するように処理した。３連サンプルの平均値±ＳＤを示す。
【図８】３連続の分離は、初回接種からのＰｒＰＳｃ粒子を希釈除去するのに、最適であることを示す図である。２×１０４個の感受性Ｎ２ａ細胞（Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ）（ＰＤ８８）灰色のバー）、及び「非感受性」Ｎ２ａ細胞（白色のバー）を、示したように、５ｕｇ／ｍｌの抗ＰｒＰ抗体ＩＣＳＭ１８の存在下又は不在下において、ＲＭＬの１０−４希釈液（Ｉ２４２４）をＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳに溶かしたものと共にインキュベートした。対照として、細胞をＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳ単独でインキュベートした（ＲＭＬ及びＩＣＳＭ１８の不在下で）。感染の３日後、細胞を懸濁させ、細胞２５，０００個の等分試料を濾別し、ＰｒＰＳｃ陽性スポットの数を、小コロニーアッセイ（スクレーピー細胞又は単一細胞アッセイ）によって決定した。感受性及び非感受性細胞はＰｒＰＳｃ陽性シグナルを生み出し、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＰｒＰＳｃ蓄積を妨げるＰｒＰ抗体を用いた処理によって、スポットの数が減少することはなく、既存のＰｒＰＳｃ粒子によって、すべてのスポットを計算することができることが示される。３回の１：１０の分離の後、非感受性細胞、及び抗体で処理した感受性細胞は、感受性細胞により与えられる２％未満のスポットを示した。非感染Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞及びＮ２ａＲ３３細胞、それぞれの群の５番目及び６番目のバーに関するスポットの数は、それぞれバックグラウンドシグナルを表す。８連の平均値±ＳＤを示す。
【図９Ａ】スクレーピー細胞アッセイにより決定した、ＲＭＬホモジェネートの希釈液とＰｒＰＳｃ陽性細胞数の間の、用量応答性の関係を示す図である。２×１０４個の感受性Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞（Ｎ２ａＰＤ８８、Ｎ２ａＰＤ１１２）、及び「非感受性」細胞（Ｎ２ａＲ３３及びＮ２ａＡＴＣＣ）を、示したように、ＲＭＬのさまざまな希釈液（Ｉ２４２４）をＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳに溶かしたものと共に、３日間インキュベートした。細胞を３回１：１０に分離した後、細胞２５，０００個の等分試料をＥｌｉｓｐｏｔプレートのウエルに濾過し、ＰｒＰＳｃ陽性細胞の数を、小コロニーアッセイによって決定した。Ａ．さまざまな希釈のＲＭＬＩ２４２４又は培地（対照）に曝した、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞により与えられるスポットを示す、Ｅｌｉｓｐｏｔプレートの代表的なウエル。
【図９Ｂ】Ｂ．「スポット」の数と、感受性Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞（閉円ＰＤ８８）、感受性Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞（開円ＰＤ１１２）、「非感受性」Ｎ２ａＲ３３細胞（閉四角）、及び「非感受性」Ｎ２ａＡＴＣＣ細胞（開円、上表）のＲＭＬ希釈液の二重対数の図。「非感受性」細胞は、感受性細胞より約３ｌｏｇ感受性が低い。下側の表は、示した直線的応答範囲５×１０−６〜１０−５で、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞（中実円）を使用する別のアッセイを示す。４連の測定値の平均値±ＳＤを示す。２５．０００の非感染Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞によって与えられる、バックグラウンドスポットの数は、ダッシュ線によって示す。
【図１０】非感染ホモジェネートの阻害効果を示す図である。２×１０４個の感受性Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞を、示したように、３００ｃｌのＲＭＬ（Ｉ２４２４）希釈液（１０−４、円及び１０−５、四角即ち中実円＝ＲＭＬの１０−４希釈液）；中実四角＝ＲＭＬの１０−５希釈液））をＯｐｔｉｍｅｍ−１０％ＦＣＳに溶かした、多量の非感染ＣＤ１ホモジェネートを含むものと共に、３日間インキュベートした。細胞を３回１：１０に分離した後、細胞２５，０００個の等分試料をＥｌｉｓｐｏｔプレートのウエルに濾過し、スポットの数を、小コロニー／単一細胞アッセイ（ＳＣアッセイ）によって決定した。スポット数の最大の阻害は、３００μｇのＣＤ１ホモジェネート（１０−２希釈液に対応する）を加えることによって決定した。スポットの数は、３×１０−５希釈液に対応する最少量の加えたＣＤ１（１μｇ）の、値の割合として表す。４連の測定値の平均値±ＳＤを図１０に示す。
【図１】
2005520560.tif 000011
【図２】
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【図３】
2005520560.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005520560.tif 000017
【図８】
2005520560.tif 000018
【図９Ａ】
2005520560.tif 000019
【図９Ｂ】
2005520560.tif 000020
【図１０】
2005520560.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月2日(2004.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のプリオンを検出するための方法であって、
（ｉ）プリオン感染を受けやすいＮ２ａ／Ｇａｒｙ細胞集団を提供すること、
（ii）細胞集団をサンプルと接触させること、
（iii）増殖用培養基質上で細胞をインキュベートすること、
（iv）プリオンのコロニー形成をアッセイすることを含み、
プリオンのコロニーの存在がサンプル中のプリオンの存在を示す方法。
【請求項２】
増殖用培養基質上で細胞をインキュベートすることが、
（ｉ）細胞を集密状態に達するまでインキュベートするステップ、
（ii）増殖用培養基質から細胞を剥離するステップ、
（iii）集密状態密度の約１０分の１の初発密度で、新鮮な培養基質上で細胞をインキュベートするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２のステップ（ｉ）〜（iii）をさらに２回行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
コロニー形成のアッセイが、
（ｉ）細胞を支持体に移すステップ、
（ii）ＰｒＰＳｃを可視化するステップ、
（iii）ＰｒＰＳｃを示すコロニーの有無を示すステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
コロニー形成のアッセイが、
（ｉ）細胞をニトロセルロース支持体に移すステップ、
（ii）プロテイナーゼＫで細胞を処理することによって、ＰｒＰｃを分解するステップ、
（iii）抗ＰｒＰ抗体を用いた染色によって、ＰｒＰＳｃを可視化するステップ、
（iv）ＰｒＰＳｃを示すコロニーの有無を示すステップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
細胞を支持体に移すことが、
（ｉ）細胞を増殖用培養基質から剥離するステップ、
（ii）細胞をカバーガラス上に接種するステップ、
（iii）細胞を約４日間インキュベートするステップ、
（iv）細胞を支持体上にブロッティングするステップを含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
細胞を支持体に移すことが、
（ｉ）細胞を増殖用培養基質から剥離するステップ、
（ii）細胞を支持体に直接塗布するステップを含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
支持体がＥＬＩＳＰＯＴアッセイプレートを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
増殖用培養基質がプラスチック又はガラスを含むカバーガラスである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
増殖用培養基質上での細胞のインキュベーションが約６〜７日間である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
細胞を約３日間サンプルと接触させる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
サンプルが固相物質を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細胞の固相物質への付着を可能にし、少なくとも３日間インキュベートすることによって、細胞をサンプルと接触させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞を固相物質と共に約８日間インキュベートする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
固相物質が増殖用培養基質を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
検出されるプリオンがＲＭＬである、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のプリオンを定量するための方法であって、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を実施することを含み、プリオンのコロニー形成に関するアッセイのステップが、コロニー数を計数するステップをさらに含む方法。
【請求項１８】
検量線から存在するプリオン数を決定するために計数したコロニー数を使用して、サンプル中のプリオン数を推定することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検量線がｌｏｇ−ｌｏｇプロットである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アクセッション番号０２０３１３３７又は０３０３１８０１でＥＣＡＣＣに寄託された、Ｎ２ａ／Ｇａｒｙ細胞株。
【国際調査報告】
2005520560.tif 000022
2005520560.tif 000023