(57)【要約】細胞、特に癌細胞の増殖を阻害する方法が提供される。この方法は、細胞内の１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質の細胞内レベルを上昇させることを含む。一局面において、この方法は細胞内の野生型ｒａｓタンパク質をコードする核酸分子を導入し、発現させることを含む。別の局面において、１つまたは複数のｒａｓタンパク質の細胞内レベルを、細胞内に１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質を導入することによって増加させる。本発明は、腫瘍または癌の治療における野生型タンパク質あるいは１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質をコードする核酸の治療的使用、または腫瘍または癌の形成の予防的抑制にも関する。ヒトまたは他の哺乳動物における癌を特徴づけまたは評価する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖を阻害する方法であって、該細胞内における１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質の細胞内レベルを増加させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞内における野生型ｒａｓタンパク質の細胞内レベルを、
ａ）野生型ｒａｓタンパク質に対するコード領域を含む核酸を該細胞内に導入すること、および
ｂ）該野生型ｒａｓタンパク質を該細胞内において発現させること
によって増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、ヒトまたは他の哺乳動物の腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸は、高レベルの野生型ｒａｓタンパク質コード領域の転写を引き起こすプロモーター配列を含むＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸は、ウイルスゲノムの一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記野生型ｒａｓタンパク質は、野生型Ｋ−ｒａｓタンパク質、野生型Ｎ−ｒａｓタンパク質および野生型Ｈ−ｒａｓタンパク質、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
野生型ｒａｓタンパク質の細胞内レベルを、１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質を前記細胞内に導入することによって前記細胞内で増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は、ヒトまたは他の動物における腫瘍細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記野生型ｒａｓタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質形質導入ドメインは、ヒト免疫欠損ウイルスＴＡＴタンパク質由来の１１アミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞内における野生型ｒａｓタンパク質のレベルを増加させる工程を含む、細胞内におけるＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの活性を減少させる方法。
【請求項１２】
哺乳動物の被検体における腫瘍を評価する方法であって、
該腫瘍から細胞を提供する工程、および
該細胞のゲノムにおける少なくとも１つの内因性ｒａｓ対立遺伝子において機能損失変異をアッセイする工程
を含む方法。
【請求項１３】
前記細胞のゲノムにおける前記内因性ｒａｓ対立遺伝子のうちの一方における活性化変異についてアッセイする工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能損失変異は、減少した細胞増殖活性を有する変異ｒａｓタンパク質の産生をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記機能損失変異は、健常細胞におけるｒａｓタンパク質レベルと比較して、前記腫瘍細胞におけるｒａｓタンパク質レベルの減少をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記機能損失変異は、野生型ｒａｓ対立遺伝子の全てまたは一部の損失をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
１つのｒａｓ対立遺伝子における機能損失変異および別のｒａｓ対立遺伝子における活性化変異の存在は予後不良を示唆する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記機能損失変異は、前記ｒａｓ対立遺伝子の第１、第２または第３のエキソンにある、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記機能損失変異は、前記細胞内における１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質の細胞内レベルを確定することによりアッセイされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記機能損失変異は、１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡの細胞内レベルを確定することによりアッセイされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記機能損失変異は、前記細胞のゲノムにおける１つまたは複数の野生型ｒａｓ対立遺伝子の有無を検出することによってアッセイされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記機能損失変異は、前記細胞内の１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質の細胞増殖活性を確定することによってアッセイされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物の被検体における腫瘍または癌を予防または処置する方法であって、野生型ｒａｓタンパク質をコードし、発現する野生型ｒａｓタンパク質または核酸を、該被検体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
野生型ｒａｓタンパク質は前記被検体における腫瘍に注射される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
野生型タンパク質をコードする核酸は前記被検体に注射される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト被検体から得られる癌細胞における１つまたは複数のｒａｓ対立遺伝子における機能損失変異をアッセイする工程を包含する、該被検体における癌の予後のための方法。
【請求項２７】
化学的発癌物質を異型接合ｒａｓノックアウトマウスに注射する工程を包含する、該マウスにおける肺腫瘍形成を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年８月２４日に出願された米国仮出願出願番号６０／３１４，６９３から優先権を主張しており、その全体を本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、少なくとも一部は国立衛生研究所からの助成金（Ｒ０１ＣＡ５８５５４号およびＲ０１ＣＡ７８７９７号）による支援を受けた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ｒａｓ遺伝子は、遺伝子の中のｒａｓスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ヒトおよび齧歯類を含むさまざまな種に存在する。このスーパー遺伝子ファミリーは、多くの多様な細胞内シグナル伝達経路に重要なグアニン三リン酸結合部位を有する構造的に関連するタンパク質をコードする、５０以上の遺伝子からなる。このスーパー遺伝子ファミリーのｒａｓサブファミリーは、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ（Ｋｒａｓ２としても知られる）、Ｎ−ｒａｓ、ならびにＲＡＰおよびＲＥＬ遺伝子からなる（Ｂｒｅｄｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｃｋ，  １９９９，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ，  ２９：２３２−４９；  Ｂｅａｕｐｒｅ  ａｎｄ  Ｋｕｚｒｏｃｋ，  １９９９，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  １７：１０７１−９．）。それぞれのヒトｒａｓ遺伝子の染色体上の位置は、当該分野において既知である。
【０００４】
３つのｒａｓ遺伝子（Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓ）は、約７〜３５キロ塩基対の染色体ＤＮＡにわたる６または７つのエキソンを包含する。特定のｒａｓ遺伝子によっては、タンパク質コード領域を含む４つまたは５つのエキソンが存在する。これらのコードエキソンの初めの３つの中には、ＧＤＰ／ＧＴＰ結合およびＧＴＰアーゼ機能のｒａｓタンパク質をコードする領域がある。３つのｒａｓ遺伝子は、約１８９アミノ酸長のｐ２１タンパク質をコードし、ｐ２１タンパク質は、活性なＧＴＰ結合状態にある場合は、細胞膜の内部表面に位置する。特に、チロシンキナーゼレセプターがそのリガンド（例えば、増殖（増殖）因子またはホルモン）の結合によって活性化される場合、ｐ２１−ｒａｓタンパク質の活性化によって細胞内シグナル伝達が開始する（Ｂｒｅｄｅｌ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｃｋ，  １９９９，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ，  ２９：２３２−４９．；  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  １９９５，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ，  ５：５１−５．；  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  １９９４，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ，  ４：７１−６．）。ｒａｓ／Ｅｒｋ経路におけるその後の下流シグナル伝達は、多数の転写因子を活性化し、これは、細胞型および外部刺激に依存して、細胞増殖または分化を調節する。
【０００５】
ｒａｓ／Ｅｒｋ経路は、幾つかのＧＴＰアーゼ活性タンパク質（ＧＡＰ）によって負に（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ）調節される。タンパク質複合体がｐ２１−ｒａｓとＧＡＰとの間に形成される場合、ｐ２１−ｒａｓタンパク質の微弱な固有のＧＴＰアーゼ活性を大きく高める（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  １９９５，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ，  ５：５１−５．；  Ａｈｍａｄｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７１：１６４０９−１５．  ）。この増加したＧＴＰアーゼ活性は、ＧＴＰをＧＤＰに触媒し、活性ＧＴＰ：ｐ２１−ｒａｓを、下流のシグナル伝達を停止させる不活性ＧＤＰ：ｐ２１−ｒａｓに戻す。内部シグナル伝達経路に関与する非レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、ｐ２１−ｒａｓおよびｒａｓ／Ｅｒｋ経路も活性化し得る（Ｒｏｚａｋｉｓ−Ａｄｃｏｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６０：６８９−９２．，  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  １９９３，  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ，  １７６：１−５；  Ｂａｌｔｅｎｓｐｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６０：１９５０−２．）。ｐ２１−ｒａｓタンパク質およびｒａｓ／Ｅｒｋ経路の調節は、上記引用文献に記載の多くのタンパク質の相互作用および酵素活性によって制御される。
【０００６】
ｒａｓ遺伝子の特に重要な局面は、それが腫瘍形成において重要な役割を果たすことである。野生型状態では、ｒａｓ遺伝子は非腫瘍形成性である。しかしながら、様々なｒａｓの変異（いわゆる「活性化」変異）は、ｒａｓ遺伝子を腫瘍形成性にし、ｒａｓ遺伝子の発現が動物において悪性疾患を引き起こしたり、培養細胞の形質転換を引き起こしたりする。野生型の非腫瘍形成性状態では、ｒａｓ遺伝子はいわゆる原癌遺伝子である。活性化変異を有するｒａｓ遺伝子は、癌遺伝子であるといわれる。
【０００７】
ｒａｓ遺伝子における活性化点変異は、他のどの原癌遺伝子よりも、より多くのヒト腫瘍型においてより高い頻度（全ヒト腫瘍の２５〜３０％）で検出されている（Ｂｅａｕｐｒｅ  ａｎｄ  Ｋｕｒｚｒｏｃｋ，  １９９９，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  １７：１０７１−９．；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，  ９８：１３−２４．，  Ｂｏｓ，  １９８９，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ４９：４６８２−９．；  Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｓｌｅｂｏｓ，  １９９２，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ５２：２６６５ｓ−６９ｓ．）。例えば、４０〜５０％の結腸癌（Ｂｏｓ，  ｅｔ  ａｌ，  １９８７，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２７：２９３−７．；  Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２７：２９８−３０３．；  Ｂｕｒｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，  ９３：２７−３１．）；８０％の膵臓癌（Ｂｕｒｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，  ９３：２７−３１．；  Ｍａｒｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ８０：６２２−６．；  Ｓｈｉｂａｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ５０：１２７９−８３．；  Ｐｉｎｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌ，  ４１：４２７−３４）；および３０〜５０％の肺腺癌（Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ  ａｎｄ  Ｓｌｅｂｏｓ，  １９９２，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ５２：２６６５ｓ−６９ｓ．；  Ｒｏｄｅｎｈｕｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ４８：５７３８−４１．；  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８８：１０８５−９．；  Ｓｕｚｕｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ５：１０３７−４３．；  Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，  １１：１９−２７．；  Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ５５：１４４４−７．）において、変異が検出される。Ｋ−ｒａｓ変異は、この腫瘍型において観察される活性化ｒａｓ変異のうちの、９０％を上回る割合を占める。さらに、活性化ｒａｓ変異は、骨髄起源、精上皮腫、乳癌、グリア芽細胞腫および神経芽細胞腫の造血性腫瘍（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）において見られる。ｒａｓ変異は、胃、膀胱、前立腺、皮膚、甲状腺、頭頸部、子宮内膜、肝臓、卵巣、腎臓、睾丸等の癌においても見られる。活性化されたｒａｓ原癌遺伝子は、多数の齧歯類において生成された自然発生腫瘍および化学誘導腫瘍においても検出されてきた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  ａｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，  ９８：１３−２４．；  Ｂａｌｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，  １９８８，  Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ５１：１４７−８２；  Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅｌｌｉｃｅｒ，  １９８７，  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ，  １８５：２９３−３０８．）。例えばＫ−ｒａｓ原癌遺伝子は、マウスの肺腫瘍において検出され���。
【０００８】
全ての変異が腫瘍形成性であるｒａｓ遺伝子をもたらすとは限らないため、ｒａｓ内の全ての変異が「活性化する」とは限らない。ｒａｓ原癌遺伝子の変異の活性化は、常にとは限らないが、遺伝子の１２番目、１３番目および６１番目のコドンにおいて優勢に起こる。活性化変異は、コドン５９、６３、１１６、１１７、１１９、１４５および１４６においても見られる。これらの変異の結果は、外部刺激の非存在下において、細胞内のｒａｓ／Ｅｒｋシグナル伝達経路を継続的にアップレギュレートすることである。したがって、細胞増殖において重要な役割を果たすシグナル伝達経路は、構造的にオンになる（ｔｕｒｎｅｄ  ｏｎ）（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  １９９４，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ，  ４：７１−６．；  Ｌｏｗｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ，  １９９３，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ６２：８５１−９１）。変異型腫瘍形成性ｐ２１と野生型ｐ２１との生物学的活性の最初に観察された差異は固有のＧＴＰアーゼ活性であり、バリン−１２腫瘍形成性変異と比較して、野生型において１０倍高かった。その後、固有のＧＴＰアーゼ活性を、ヒト腫瘍および野生型ｒａｓタンパク質において観察されるｐ２１の幾つかの変異形態を区別するのに用いることはできないことがわかった（Ｔｒａｈｅｙ  ａｎｄ  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  １９８７，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３８：５４２−５．）。ＧＡＰの発見後、コドン１２、１３または６１に変異を有する腫瘍形成性ｐ２１と野生型ｐ２１との主な生化学的差異は、活性ｐ２１：ＧＴＰ複合体におけるＧＴＰ加水分解を誘導するＧＡＰの能力であることが示された。ＧＡＰ誘導性加水分解は、ｒａｓのこの変異形態よりも野生型ｐ２１において１０００倍であり得る（Ｖｏｇｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３５：９０−３．；  Ｇｉｂｂｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８５：５０２６−３０．）。したがって変異形態は、野生型よりも長く活性ＧＴＰ形態で残存し、変異形態による継続的なシグナル伝達は、少なくとも一部は、腫瘍形成性を招く。
【０００９】
活性化されたｒａｓ癌遺伝子は、遺伝学的に「優性」といわれてきた。優性な遺伝子変異は、たとえその遺伝子の相同な野生型対立遺伝子が同一の細胞にも発現しても、その遺伝子の表現型を産生するものである。変異遺伝子産物によって産生される表現型は、同一の遺伝子の野生型対立遺伝子の発現の結果生じる表現型を支配するといわれる。活性化されたｒａｓ対立遺伝子は腫瘍形成性であるため、たとえ野生型対立遺伝子も発現したとしても、ｒａｓ癌遺伝子は優性な変異といわれる（Ｂａｒｂａｃｉｄ，  １９８７，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ５６：７７９−８２７；  Ｍａｒｓｈａｌｌ，  １９９１，  Ｐａ  Ｍｅｄ，  ９４：１０．）。
【００１０】
しかしながら、ｒａｓ癌遺伝子が優性であるとの特徴づけは、満足でない場合がある。真の「優性な」変異をコードする遺伝子は、遺伝子発現の通常のレベル（上昇あるいは過剰発現レベルではない）で、および上記のようにその遺伝子の相同な非変異型対立遺伝子の発現の存在下で、その遺伝子の表現型を産生する。幾つかの研究により、形質転換ｒａｓ癌遺伝子は通常のレベルで発現せず、通常のレベルよりも高いレベルで発現するということが示唆されている。例えば、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞の他に変異型ｒａｓ対立遺伝子でインビトロで形質転換された他の齧歯類細胞においても、変異型ｒａｓ対立遺伝子は、対照細胞よりも高いレベルで発現する（Ｈｕａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９４：９６１４−９．；  Ｙｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８６：３０７０−４．；  Ｇｕｅｒｒｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８１：２０２−５．；  Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｅ，  １９８４，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１０：４６９−７５．）。さらに、ヒト腫瘍細胞株から単離された第一の腫瘍形成性ｒａｓ対立遺伝子であった変異型ＥＪ  Ｈ−ｒａｓ１対立遺伝子は、１２番目のコドン変異だけでなく、通常のｒａｓ対立遺伝子と比較して少なくとも１０倍発現を増加させる、最後のイントロンにおける変異も含む（Ｃｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：１１９−２４．）。最終的に、Ｆｉｎｎｅｙ  およびＢｉｓｈｏｐ（Ｆｉｎｎｅｙ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ，  １９９３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６０：１５２４−７．）は相同組み換えを用いて、ある野生型Ｈ−ｒａｓ対立遺伝子を形質転換変異型Ｈ−ｒａｓ対立遺伝子に置換した。通常のおよび変異型のＨ−ｒａｓ相同遺伝子の双方が同程度に発現したが、異型接合細胞は形質転換されなかった。自然に形質転換された細胞が異型接合細胞の培養から生じ、形質転換された細胞の変異型対立遺伝子は増幅されていた。これらの特定の研究により、ｒａｓ癌遺伝子の腫瘍形成能は高い発現レベル（優性な変異と矛盾した要件）によって決まるということが示唆された。
【００１１】
活性化されたｒａｓ癌遺伝子の腫瘍形成活性は、優性な変異の活性として適切に特徴づけされていないため、活性化されたｒａｓ癌遺伝子の形質転換または腫瘍形成活性のより完全な記載を必要とする。このような記載は、癌（特に、活性化されたｒａｓ癌遺伝子によって引き起こされた癌）のより良い治療を提供すると考えられる。このような記載により、ｒａｓ癌遺伝子によって引き起こされた癌のより良い診断法および予後判定法も提供される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
既存の抗ｒａｓ療法は、転写後に生物学的に活性となるように変更されなければならない不活性な前駆体としてｒａｓタンパク質を合成する（Ｃａｓｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８６：８３２３−７．；  Ｈａｎｃｏｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｅｌｌ，  ５７：１１６７−７７．）、という事実を活用する。このような改変の第一ステップは、炭素数１５のイソプレノイド（すなわちファルネソール）を、ファーネシルトランスフェラーゼ（ＦＴａｓｅ）によりＣＡＡＸモチーフのＣ末端システインに付加することである（Ｈａｎｃｏｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｃｅｌｌ，  ５７：１１６７−７７．）。ゲラニルゲラニル化は、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ−Ｉ（ＧＧＴアーゼ−Ｉ）によってＣＡＡＸモチーフへの炭素数２０の部分の付加をもたらす、別の転写後のステップである。既存の抗ｒａｓ療法は、これらの転写後のステップを選択的に妨げる戦略を利用する（Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６８：７６１７−２０．；  Ｔａｍａｎｏｉ，  １９９３，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ，  １８：３４９−５３．；  Ｌｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７０：２６７７０−３．）。これらの戦略が有する１つの問題は、これらの転写後のステップの阻害が、活性化されたｒａｓタンパク質の活性のみでなく、腫瘍サプレッサー活性を有する既存の野生型ｒａｓタンパク質も阻害することである。別の問題は、ｒａｓタンパク質以外のタンパク質が、上記のように転写後に変更されることである。したがって、これらのステップの阻害は、ｒａｓ以外のタンパク質が影響されると思われるという点で、非特異性である。本明細書に記載された方法（野生型ｒａｓの発現）は、これらの欠失の支配下にない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
野生型ｒａｓ遺伝子は、特に、腫瘍形成性または形質転換表現型が活性化されたｒａｓ遺伝子または活性化されたｒａｓシグナル伝達経路によって引き起こされる場合、細胞の腫瘍形成性または形質転換表現型を抑制する（すなわち、細胞増殖を阻害する）ことを本発明者らは見出した。したがって、本発明は、細胞、特に癌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞内における１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質の細胞内レベルを増加させることを含む。一局面においては、この方法は、野生型ｒａｓタンパク質をコードする細胞に核酸分子を導入することを含む。導入された核酸はＤＮＡであり得て、この場合、この核酸は野生型ｒａｓタンパク質をコードする配列に動作可能に結合する転写プロモーターをさらに含む。導入された核酸は、野生型ｒａｓタンパク質または断片をコードし、細胞内のポリペプチドに翻訳されることが可能であるＲＮＡでもあり得る。いずれの場合においても、１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質の細胞内レベルの増加が起こり、細胞増殖が阻害される。増殖細胞がヒトまたは他の動物の腫瘍の範囲内にある場合、細胞増殖の阻害は腫瘍の拡大を停止または減速し、腫瘍の大きさを減少させ、または人体から腫瘍を除去しさえする。
【００１４】
別の局面においては、１つまたは複数のｒａｓタンパク質の細胞内レベルは、１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質を細胞内に導入することによって増加する。野生型ｒａｓタンパク質の細胞内への導入は、タンパク質形質導入ドメインをタンパク質に加えることによって促進され得る。タンパク質形質導入ドメインは、タンパク質の取り込みを促進する。このよう内在化したｒａｓタンパク質は、タンパク質を取り込んだ細胞の増殖を阻害する。タンパク質形質導入ドメインを含むｒａｓタンパク質は、注射または吸入等の手段によりヒトまたは他の動物に効果的に投与されることが可能である。
【００１５】
本発明は、腫瘍または癌の治療において１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質をコードする野生型ｒａｓタンパク質または核酸の治療的使用、または腫瘍または癌の形成の予防的抑制にも関する。特定の癌（すなわち、ハイリスク群）と診断される確率が平均以上であり、野生型ｒａｓの予防的使用の候補者と思われるヒトの群が存在する。このようなヒトの群は、特定の環境的状況（例えば、ヘビースモーカー）に暴露されるため、特定の癌への家族性感受性のために（例えば、感受性の増加を引き起こす遺伝子の遺伝的継承）、または他の理由のために、ハイリスクであり得る。このような野生型ｒａｓの治療的または予防的使用は、治療に有効な量の１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質またはこのようなタンパク質をコードする核酸分子を、個体に投与することを含む。
【００１６】
本発明は、細胞内の野生型ｒａｓタンパク質、またはその増殖抑制断片の濃度を増加させることによって細胞内のＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの活性を減少させる方法も提供する。細胞内の濃度を増加させることは、細胞である野生型ｒａｓタンパク質をコードするＤＮＡ分子を導入して発現させること、または１つまたは複数の野生型ｒａｓタンパク質を細胞に導入することのいずれかによって提供される。
【００１７】
本発明は、ヒトまたは他の哺乳動物の癌を特徴づけし、評価する方法も提供する。一実施形態においては、この方法は、被検体から得られた腫瘍細胞のゲノムの１つまたは複数の内因性ｒａｓ対立遺伝子における機能損失変異をアッセイすることを含む。別の実施形態においては、この方法は、１つまたは複数の内因性ｒａｓ対立遺伝子における機能損失変異、および被検体から得られた腫瘍細胞の１つまたは複数のｒａｓ対立遺伝子における活性化変異をアッセイすることを含む。特定の場合においては、機能損失変異は、癌細胞において減少したレベルのｒａｓタンパク質の産生をもたらす。他の場合においては、機能損失変異は、野生型ｒａｓタンパク質が有する増殖抑制機能を失ったｒａｓタンパク質の産生をもたらす。活性化されたｒａｓによって引き起こされた最も活動的な癌は、活性化されたｒａｓ対立遺伝子および野生型ｒａｓの増殖抑制活性を欠如する第二のｒａｓ対立遺伝子の双方を含むため、この方法は、このような癌およびこのような癌を有するヒトまたは動物の予後の診断を提供する。
【００１８】
本発明は、異型接合ｒａｓノックアウトマウスにおける肺腫瘍形成を誘導する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
（定義）
本明細書において「野生型」とは、特定の遺伝子を含む生物体または細胞の大部分に見られる配列である遺伝子のヌクレオチド配列またはその遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をいう。遺伝子またはタンパク質が野生型でない場合、それは変異体である。変異体遺伝子は、野生型遺伝子の配列とは異なるヌクレオチド配列を有する。変異体タンパク質は、野生型タンパク質の配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
【００２０】
本明細書において、野生型ｒａｓタンパク質は「増殖抑制」活性と呼ばれる活性を有する。細胞内における野生型ｒａｓ活性または付加的野生型ｒａｓ活性の発現後、増殖抑制活性は、野生型ｒａｓ活性または付加的野生型ｒａｓ活性が発現されなかった細胞と比較して、細胞の１つまたは複数の増殖パラメータまたは増殖パラメータの減少または阻害として測定される。これらの細胞に対してなされた多くの異なる測定は、増殖抑制活性を示す。例えば、細胞周期時間の減少、細胞分割時間の減少、およびＧ１細胞周期フェーズ期間の減少は、野生型ｒａｓの増殖抑制活性の指標である。野生型ｒａｓ活性が発現される細胞が腫瘍、癌または形質転換細胞である場合、軟寒天中におけるコロニーの形成効率の減少または病巣形成の減少等の性質の測定は、対照と比較して野生型ｒａｓの増殖抑制活性の指標である。野生型ｒａｓ活性が発現される細胞がヒトまたは動物の腫瘍の一部を含む、または一部である場合、腫瘍の大きさの減少、腫瘍増殖速度の減少または転移速度の低下は、野生型ｒａｓの増殖抑制活性の指標である。
【００２１】
本発明で重要なのは、細胞内に発現される野生型ｒａｓ遺伝子が細胞増殖を阻害または抑制することである。細胞増殖の阻害または抑制とは当業者には周知の用語であり、細胞分割を減速または停止させて細胞数が増加しないようにすることを指す。このような細胞増殖の減速の大きさは変化し得る。本明細書において、腫瘍を含む細胞増殖の変更は、本願の範囲内である。細胞増殖の減速または停止を示す様々な細胞特性の測定は、本願の実施例に記載される。本願の範囲内である腫瘍を含む細胞の野生型ｒａｓによる細胞増殖抑制のさらなる局面は、アポトーシス（プログラムされた細胞死）および細胞分化の誘導である。
【００２２】
本明細書において「不活化変異」または「機能損失変異」とは、ｒａｓ遺伝子がコードするｒａｓタンパク質の増殖抑制活性を排除または減少するｒａｓ遺伝子中のまたは遺伝子周囲の変異を指す。この一例は、遺伝子が発現したｒａｓタンパク質の量の減少をもたらさない遺伝子のコード領域内の１つまたは複数の置換、欠失、挿入または複製であるが、１分子当たりを基準として、変異を含むｒａｓタンパク質は、不活化変異を含まないｒａｓタンパク質よりも小さい増殖抑制活性を定量的に有する。このタイプの不活化変異は、ｒａｓ遺伝子の１つまたは複数の、初めの３つのコードエキソン内に起こりやすいと考えられる。
【００２３】
不活化変異の別の例は、ｒａｓ遺伝子中の、遺伝子近傍の、または遺伝子に影響する変異であり、その遺伝子からはｒａｓタンパク質は発現されない、または発現量が減少する。このような変異は、例えば、ｒａｓプロモーターの転写活性を減少させること、遺伝子からの転写物の異常なスプライシングまたはスプライシングの減少を引き起こすこと、または細胞内のｒａｓ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の半減期を減少させることが可能である。この場合、１分子当たりを基準として、産生されたｒａｓタンパク質は野生型ｒａｓタンパク質と同一の増殖抑制活性を定量的に有し得るが、このような変異を含む細胞は野生型ｒａｓタンパク質の量が減少するため、ｒａｓ増殖抑制活性の量が減少する。
【００２４】
他の変異は、ｒａｓ対立遺伝子全体の欠失またはＤＮＡ配列からタンパク質が産生されないのに十分なｒａｓ対立遺伝子の欠失をもたらす。他のタイプの変異はｒａｓ遺伝子配列内の内部複製を含み、１つのタイプはタンデム複製である。
【００２５】
細胞内の野生型ｒａｓ増殖抑制活性量の減少が、特定のｒａｓ遺伝子内または遺伝子周辺の、ＤＮＡのシトシン残基のメチル化の増加または変化にも起因し得ることも認識すべきである。細胞のＤＮＡのこのような後成的変化は異常メチル化をもたらし、当該分野において周知であり、一般には遺伝子からの翻訳レベルの減少をもたらすと知られている。
【００２６】
野生型ｒａｓの増殖抑制活性が、細胞中のＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ活性の減少と関連があることは認識されるべきである。ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼはｒａｓシグナル伝達経路の下流にあり、これは当該分野では周知である。細胞内における野生型ｒａｓタンパク質濃度の増加は、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの活性の減少をもたらす（実施例２参照）。
【００２７】
本発明は、細胞内における野生型ｒａｓタンパク質濃度の増加によって細胞内のＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ活性を減少させる方法も提供する。
【００２８】
本明細書において「活性化変異」または「機能獲得変異」とは、一般にｒａｓ遺伝子のコード配列内の変異を指し、これは形質転換、腫瘍形成性または発癌性活性を有するｒａｓタンパク質の産生をもたらす。生化学的に、活性化変異を含むｒａｓタンパク質（活性化ｒａｓタンパク質とも呼ばれる）は、ＧＴＰアーゼ活性が減少することもあり、その結果、ｒａｓタンパク質が活性なＧＴＰ結合状態に固定される。活性化ｒａｓタンパク質は、ヌクレオチド結合親和性も減少することがあり、そのため、ｒａｓが結合するＧＤＰがより速い速度でＧＴＰと交換される。ＧＡＰタンパク質は、ＧＴＰ結合ｒａｓのＧＤＰ結合ｒａｓへの変換を引き起こす能力が減少することもある。これら全ての場合は、ＧＴＰ結合ｒａｓの蓄積をもたらし、これは、シグナル伝達を引き起こすｒａｓである。活性化変異は、ｒａｓ遺伝子のコドン１２、１３、５９、６１、６３、１１６、１１７、１１９、１４５および１４６において見られることが知られる。このような変異は、タンパク質のグアニンヌクレオチド結合部位にまたは部位の近傍に起こる。これらコドン内の全ての変異がｒａｓの活性化を同程度引き起こすとは限らない。同様に、これらコドン内の全ての変異が活性化するとは限らない。これらコドンの１つまたは複数内の一部の変異は機能損失変異である可能性がある。活性化変異は多数の技法によって検出され、その幾つかは、Ｂｏｓらによる米国特許第５，５９１，５８２号に記載される（その中の情報は、参考として本明細書により援用される）。
【００２９】
本明細書において、ＤＮＡ分子の細胞への「導入」とは、ＤＮＡ分子を細胞へ導く当該分野において既知の様々な方法を指す。単離されたＤＮＡを細胞へ導入するこのような方法の１つは、トランスフェクションとして知られる。このようなトランスフェクションは、細胞によるＤＮＡの取り込みを促進する細胞またはＤＮＡの様々な処理を用いて広く行われる。例えば、細胞を化学的処理してＤＮＡ透過性にすることができる。例えば、細胞が内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）できるリポソームへＤＮＡを組み込むことによってもＤＮＡを処理することができる。
【００３０】
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、ウイルスを用いて細胞内へ導入されることも可能である。例えば、細胞内へ導入される野生型ｒａｓタンパク質をコードするｃＤＮＡは、ウイルスゲノム内にクローン化される。このようなウイルスによる細胞の感染は、ウイルスゲノムの細胞への導入をもたらす。クローン化遺伝子はウイルスゲノムの一部であるため、クローン化遺伝子はウイルスゲノムと共に細胞内へ導入される。このようなウイルス「ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムを有することが可能である。多数のこのようなウイルスベクターは、当業者には周知である。遺伝子（例えば、野生型ｒａｓ）を有し、そのゲノムにクローン化されたウイルスベクターは、「組み換え」ウイルスと称され得る。
【００３１】
本明細書において「腫瘍形成性」、「形質転換」および「腫瘍性（新形成の）」とは、癌または悪性細胞の特性（すなわち表現型）を有する細胞を指す。様々なこのような特性は、当業者には周知である。例えば、腫瘍形成性細胞が動物に注射される場合は腫瘍を形成するが、非腫瘍形成性細胞は動物への注射後に腫瘍を形成しない。本明細書において、いわゆる「癌遺伝子」は、細胞内への導入および細胞内での発現後に、非癌性細胞を癌性にする遺伝子である。本明細書において、このような癌遺伝子の１つは、活性化変異を含むｒａｓ遺伝子である。このようなｒａｓ遺伝子は、「活性化された」ｒａｓ遺伝子と呼ばれ得る。「抗癌遺伝子」または「腫瘍サプレッサー」遺伝子は、細胞内への導入および細胞内での発現後に、癌性細胞を非癌性にする遺伝子である。本明細書において、このような腫瘍抑制遺伝子の１つは、野生型ｒａｓ遺伝子である。
【００３２】
「新形成」（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）とは、通常よりも迅速に細胞増殖により増殖し、新たな増殖を開始する刺激が中断した後も増殖を継続させる異常組織の形成および増殖をもたらすプロセスを意味する。
【００３３】
（様々なコピー数の野生型ｒａｓによるマウスにおける腫瘍発生）
これらの研究は、肺腫瘍形成における野生型Ｋ−ｒａｓの影響を確定するために計画された。Ｋ−ｒａｓ対立遺伝子欠損マウスは生存できず、胎児性肝臓障害および貧血のために妊娠１２〜１４日の間に死亡する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  １１：２４６８−８１．）ため、そのマウスは試験することができなかった。しかしながら、異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスは、マウスの近交系由来の肺腫瘍のほぼ１００％が活性化されたＫ−ｒａｓ対立遺伝子を示すため、肺腫瘍形成における野生型Ｋ−ｒａｓの役割を評価するための良好な代替物である（Ｙｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８６：３０７０−４）。これらの研究は、以下に記載のように行われた。
【００３４】
（動物およびＦ１異型接合体の産生）
６週齢のＡ／Ｊ、１２９／ＳｖｌｍＪおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｍａｉｎｅ）から入手した。１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−（Ｋ−ｒａｓ「ノックアウト」）マウスは、以前報告されたように（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  １１：２４６８−８１．）作成した。ノックアウトマウスは、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に新たな遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトの挿入変異を含んだ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  １１：２４６８−８１．）。動物は、ＨＥＰＡフィルターをかけた環境制御室（２４±１℃、１２／１２時間の明／暗サイクル）で、堅木の床敷きおよびダストカバーを有するプラスチックケージに収容された。動物は、Ｒｏｄｅｎｔ  Ｌａｂ  Ｃｈｏｗ（＃５００１；  Ｐｕｒｉｎａ）であり、水は自由給餌させた。７日間の隔離後、動物をペアにして、（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１および（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウスの産生のための飼育コロニーを作成した。全ての動物の体重を、研究期間の間、月１回モニタリングした。
【００３５】
（マウスの遺伝子型の特定）
尾組織切除物（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）を、（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１および（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウスからそれぞれ採取し、溶解溶液（プロナーゼ０．４ｍｇ／ｍｌ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でホモジナイズして３７℃で一晩インキュベートした後、フェノール−クロロホルム抽出し、氷冷アルコールで析出させた。各マウスの切除した尾から単離されたＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、Ｋ−ｒａｓ標的化変異の存在に対して遺伝子型を特定した。すなわち、一対のＰＣＲプライマー（ｏＩＭＲ０１３：５’−ＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣ−３’、ｏＩＭＲ０１４：５’−ＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＧＡＧＡＴＣ−３’）を用いて、新たな挿入断片から２８０ｂｐの産物を増幅した。別の対のＰＣＲプライマー（ｏＩＭＲ０１５：５’−ＣＡＡＡＴＧＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＧＧＴＧ−３’  ＴＣＲ  Ｃｄ−１、ｏＩＭＲ０１６：５’−ＧＴＣＡＧＴＣＧＡＧＴＧＣＡＣＡＧＴＴＴ−３’）を用いて、１５０ｂｐの産物を内部標準として増幅した。野生型Ｋ−ｒａｓ対立遺伝子の双方（Ｋ−ｒａｓ（＋／＋））を有するＤＮＡは、たった１５０ｂｐの断片しか提示しなかったが、野生型Ｋ−ｒａｓ対立遺伝子および標的化変異（＋／−）対立遺伝子を有するＤＮＡは、ＰＣＲ後に１５０ｂｐおよび２８０ｂｐバンドを示した。このスクリーニングは、確認のために少なくとも１回は繰り返された。異型接合体雄性１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−マウスを、Ａ／ＪおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌と交尾させた。子孫の５０％がＫ−ｒａｓ標的化変異（ｔｍ１）を有しており、残りの５０％は野生型Ｋ−ｒａｓ対立遺伝子のみを有していた。
【００３６】
（Ｋ−ｒａｓ＋／−マウスにおける肺腫瘍形成）
ウレタン誘導性肺腫瘍形成およびＭＮＵ誘導性肺腫瘍形成の双方の研究のための実験計画を図１ａに示す。６週齢の（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１、および（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１ハイブリッドマウスを、Ｋ−ｒａｓ遺伝子型および発癌処理のタイプによって１２の群に無作為抽出した。ウレタン（カルバミン酸エチル）（純度＞９９％）およびＮ−メチルニトロソウレア（ＭＮＵ）（純度９９％）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から入手した。これらの化学的発癌性物質は、バイオアッセイでの使用の直前に調製した。ウレタンおよびＭＮＵ双方は、通常の生理食塩水に溶解した。ウレタン処理のために、１００匹の雄性マウス（（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１マウス１７匹、（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス１２匹、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１マウス１５匹、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス１９匹、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１マウス１９匹、および（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス１８匹を含む）をバイオアッセイに用いた。全ての動物に、０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中のウレタン（１ｍｇ／ｇ（体重））を、単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。
【００３７】
ＭＮＵ処理群に対して、８３匹の雄性マウス（（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１マウス１４匹、（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス１３匹、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１マウス１４匹、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス１５匹、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１マウス１３匹、および（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス１４匹を含む）をバイオアッセイに用いた。全ての動物に、０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中のＭＮＵ（５０ｍｇ／ｇ（体重））を、単回ｉ．ｐ．注射した。
【００３８】
マウスにおける肺腫瘍発生は異なる遺伝的背景に大きく依存するため、３匹の異なるＦ１マウスを、起こり得る株特異性効果を回避するために用いた。ウレタン処理１８週後、およびＭＮＵ処理１２週後に、全１２群からの動物をＣＯ２窒息により安楽死させた。肺腫瘍組織および正常組織の一部を摘出し、液体窒素中で瞬間凍結させた。各腫瘍の代表的な部分を、組織病理学検査のためにＴｅｌｌｙｅｓｎｉｃｚｋｙ溶液に固定化した。それぞれの肺を、解剖顕微鏡で検査し、腫瘍の数および大きさを得た。腫瘍の体積は、各腫瘍の三次元的大きさを測定することによって、および直径として３回測定の平均値を用いることにより確定された。半径（直径／２）を確定し、「体積＝（４／３）πｒ３（ｒ−半径）」によって全腫瘍体積を算出した。一元配置の分散分析を用いて、対照群と処理群とのマウスあたりの肺腫瘍数の差異を確定した。二元配置の分散分析を用いて、対照群と処理群との肺腫瘍の数および大きさの双方の差異を確定した。
【００３９】
図１ａに示すように、６週齢の（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１または（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス（野生型または異型接合Ｋ−ｒａｓノックアウトのいずれか）に、ウレタンを１ｍｇ／ｇ（体重）の投与量で単回腹腔内注射した。ウレタンによる処理の１８週後、全３群の異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスには、同型接合野生型対応物よりも有意に多くかつ大きな肺腫瘍が発生した。図１に示すように、（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスのウレタンによる処理により、野生型（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１マウスの同一の発癌性物質による処理よりも、肺ごとに４倍多い腫瘍が産生された。同様に、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１および（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスのウレタン処理により、それぞれの野生型同腹仔の処理よりも、肺ごとに４〜５倍多くの腫瘍をもたらした（図１ｂ）。全肺腫瘍体積へのさらなる著しい効果、すなわち、Ａ／Ｊ×１２９／ＳｖＪ背景、１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ背景およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖマウス背景を有する異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスにおける、それぞれ３０倍、１９倍および８倍を超える体積増加があった（図１ｃ）。
【００４０】
異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスからの大きな肺腫瘍の大部分（＞６０％）は、腺癌であった（図２ｂ、図２ｄおよび図２ｆ）。一方、ウレタンまたはＮ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）のいずれかで処理された野生型マウスからの腫瘍は、いずれも小さな肺腺腫であった（図２ａ、図２ｃ、および図２ｅ）。図２ｃおよび図２ｅに示されるように、腺腫は単一型増殖パターンによって特徴づけされ、一般に十分に分化した細胞から成っていた。異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスからの肺腫瘍の約６０％は腺癌であった（図２ｄおよび図２ｆ）。マウスの肺腺癌は、分化の程度が異なる細胞から構成されていた（図２ｆ）。これらの腫瘍は、正常な肺胞構造の完全な損失、細胞核／細胞質比、細胞核集中（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）および細胞学的異型の増加、増殖パターンの不均一性、および近接した細気管支または血管への侵入を示した。これらの結果は、野生型Ｋ−ｒａｓの損失が未分化悪性肺腫瘍の発生に有意に寄与することを示唆する。
【００４１】
これらの観察は予想外であり、肺の発癌を化学的に誘導する間、Ｋ−ｒａｓの野生型対立遺伝子が腫瘍サプレッサーとして作用することを示唆した。発癌性物質としてＭＮＵを用いた第２の肺腫瘍バイオアッセイを行った。ＭＮＵは代謝活性化を必要としない直接作用アルキル化剤であるが、一方ウレタンは代謝活性化を必要とする前発癌性物質である。（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１、（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１または（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウスは、ウレタンについて記載されたプロトコルと類似のものを用いて、ＭＮＵで処理された。図１ｄおよび図１ｅに見られるように、ＭＮＵによるＫ−ｒａｓ欠損マウスの処理により、腫瘍多様性が４〜６倍増加し、３つのマウス背景の全てにおいて腫瘍体積が３２〜５０倍増加した。
【００４２】
（肺腫瘍におけるＫ−ｒａｓ活性化変異）
上記のマウスにおける肺腫瘍を、Ｋ−ｒａｓ活性化変異に関して分析した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて肺腫瘍からＤＮＡを単離し、ＰＣＲ反応のテンプレートとして用い、次いでＰＣＡ産物のＤＮＡの配列決定を行った。Ｋ−ｒａｓエキソン１および２のためのＰＣＲプライマーの配列は、以前記載された（Ｙｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８６：３０７０−４．）。また、ＰＣＲ反応を行い、以前記載されたように（Ｙｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８６：３０７０−４．）ＰＣＲ産物を直接配列決定した。
【００４３】
表１に示されるように、Ｋ−ｒａｓの第１のエキソンおよび第２のエキソンにおいて行われた配列分析により、Ｋ−ｒａｓ野生型マウスから分析された全てのウレタン誘導性腫瘍は、コドン６１の２番目の位置においてＡＴからＴＡへの塩基転換を含むことが明らかになった。類似の頻度およびタイプのＫ−ｒａｓ変異は、ウレタンで処理された異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスからの肺腫瘍において観察された。同様に、野生型マウスまたは異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスのいずれかからのＭＮＵ誘導性肺腫瘍全ては、Ｋ−ｒａｓにおけるコドン１２の２番目の位置においてＧＣからＡＴへの塩基転換を含んでいた（表１）。
【００４４】
（表１：肺腫瘍において検出されたＫ−ｒａｓ遺伝子における活性化変異）
【００４５】
【表１】
2005504062.tif 000002
（マウス肺腫瘍における末端染色体６のＬＯＨ）
この研究においては、出願人らはＫ−ｒａｓ活性化変異とＫ−ｒａｓ領域におけるマーカーの損失（異型接合性またはＬＯＨの損失）との関係をさらに調べた。この関係は、腫瘍におけるＫ−ｒａｓの他の野生型対立遺伝子の損失を示唆する。
【００４６】
国立毒性学プログラム（ＮＴＰ）は、Ｋ−ｒａｓ変異およびＬＯＨ分析のためにＢ６Ｃ３Ｆ１マウスから２組のマウス肺腫瘍を提供した。第１の組は、吸引により０、１、２または４ｍｇ／ｍ３のＶ２ＰＯ５に２年間暴露されたマウス由来であった。第２の組は、クロロプレンで処理されたマウス由来であった。肺腫瘍の多様性データおよびクロロプレン誘導性腫瘍のＫ−ｒａｓ変異分析が報告された（Ｓｉｌｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ２０：６５７−６２．；  １９９６，  ＮＴＰ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ４６７，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ９６−３９５７，  ＮＩＥＨＳ，  ＮＩＨ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  ＮＣ）。対立遺伝子型（ａｌｌｅｌｏｔｙｐｉｃ）分析を、Ｖ２ＰＯ５研究において４２個のマウス肺腫瘍（２個は無処理マウス由来、４０個はＶ２ＰＯ５暴露マウス由来である）を用いて、マーカーＤ６ＭＩＴ１４で行った。Ｄ６ＭＩＴ１４は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｓｔｓｖｉｌｌｅ，  Ａｌａｂａｍａ）から入手された。標準的なＰＣＲ反応を行い、目に見える差異を観察することができた場合に対立遺伝子の損失を記録した。クロロプレン誘導性肺腫瘍をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。したがって、Ｄ６ＭＩＴ１４マーカーを用いては満足なＰＣＲ結果を得ることができなかった。Ｋ−ｒａｓ近傍のＬＯＨを評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣ３Ｈマウスとの間で多様であり、一本鎖コンホメーション多形性分析技法である、マーカーＤ６ＭＣＯ１２（プライマー配列：Ｄ６ＭＣＯ１２−１Ｆ  ５’ＧＡＴＧＴＣＡＡＡＣＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣ３’（配列番号＿）およびＤ６ＭＣＯ１２−１Ｒ  ５’ＧＣＧＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴ３’（配列番号＿））を用いた。マーカーとしてＫ−ｒａｓのコドン６１の変異（ＣＡＡ→ＣＴＡ）を用いて、結果をさらに確認した。
【００４７】
表２にまとめられたように、４０個の五酸化バナジウム（Ｖ２ＰＯ５）誘導性肺腺癌をＫ−ｒａｓ活性に関して調べ、２９個（７３％）は変異を有していた。また、これらの腫瘍を、マーカーＤ６ＭＩＴ１４でのＫ−ｒａｓの領域におけるＬＯＨに関して類別し、これらのうち１８個が対立遺伝子欠損を示した（表２）。Ｖ２ＰＯ５誘導性腫瘍に見られる最も頻繁なＫ−ｒａｓ変異は、コドン１２の２番目の塩基におけるＧＡのＡＴへの塩基転位またはＧＡのＴＡへの塩基転換のいずれかであった（データは示さず）。Ｄ６ＭＩＴ１４は、Ｋ−ｒａｓの０．５−ｃＭ内にマッピングされる（Ｍａｎｅｎｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，  ９：６３９−４６．）。Ｄ６ＭＩＴ１４における対立遺伝子の損失は、腫瘍におけるＫ−ｒａｓ変異と密接に相関しており、対立遺伝子損失を有する１８個の腫瘍うち１６個（８９％）がＫ−ｒａｓ変異も有していた。Ｋ−ｒａｓコドン６１変異（ＣＡＡ→ＣＴＡ）およびＤ６ＭＣＯ１２（Ｋ−ｒａｓに約５ｃＭ近接）を用いて、出願人らはこれらのサンプル中におけるＬＯＨの程度を調べた。図３ｂおよび図３ｃおよび表２に示されるように、対立遺伝子損失を有する１９個の腫瘍のうち１６個（８４％）はＫ−ｒａｓ変異も有しており、このことは、これらのマーカーにおける対立遺伝子損失とＫ−ｒａｓ活性化との密接な相関を示唆する。これらの結果は、Ｋ−ｒａｓ野生型マウスにおける肺腫瘍の発生の低下や大きさの縮小は、野生型Ｋ−ｒａｓ対立遺伝子の維持の結果であることも示唆する。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析を１８個のウレタン処理肺腫瘍で行い、このうち６個は（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１、６個は（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１、６個は（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１マウス由来であった。ｗｔ／ｗｔマウス由来の１８個の肺腫瘍は、対立遺伝子損失を含まなかった。（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１マウス由来の肺腫瘍におけるＬＯＨ状態を分析した代表的な結果を図３ａに示す。
【００４８】
（表２  マウス肺腫瘍においてＫ−ｒａｓ活性化と関係する遠位染色体６におけるＬＯＨ）
【００４９】
【表２】
2005504062.tif 000003
ａ：ＬＯＨおよびＫ−ｒａｓの変異データは、Ｈｅｇｉ  ｅｔ  ａｌ．からのものである（Ｈｅｇｉ，ｅｔ  ａｌ．、１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５４：６２５７−６４）。
ｂ：Ｋ−ｒａｓ変異データは、Ｓｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．からのものである（Ｓｉｌｌｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０：６５７−６６２）。
【００５０】
（診断および予後アッセイ）
本発明は、ヒトまたは動物における腫瘍または癌を特徴付けする方法を提供する。一局面においては、この方法は、ｒａｓ遺伝子中のまたは遺伝子近傍の変異を検出するために、腫瘍または癌由来のサンプル中の１つまたは複数のｒａｓ遺伝子の１つまたは複数の対立遺伝子の分析を含む。一実施形態においては、特異的Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓに対する対立遺伝子を分析する。他の実施形態においては、多様なＨ−ｒａｓ遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子またはＮ−ｒａｓ遺伝子に対する対立遺伝子を分析する。この分析は通常、腫瘍または癌細胞のゲノムからのＤＮＡのある形態の遺伝子型特定を含み、様々な方法でなされ得る。好ましくは、この分析はｒａｓ遺伝子のあるタイプのＤＮＡ配列決定を含む。配列分析を含まない遺伝子型特定は、遺伝子中の１つの塩基対が変更されているタイプの変異を検出することはできない可能性がある。
【００５１】
あるタイプの分析においては、腫瘍または癌から単離されたＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって分析される。ｒａｓ遺伝子の領域、あるいは周辺の領域を選択し、その領域におけるゲノムＤＮＡとハイブリダイズするＰＣＲプライマーを作製する。このようなプライマーは、ｒａｓ遺伝子内の任意の公知の配列に向けて、またはゲノム配列が知られているｒａｓ遺伝子周辺の領域に向けて作製され得る。用いられることか可能なｒａｓ遺伝子周辺の領域のこのような組の１つは、多様なミクロサテライトマーカーであり、この配列およびヒト全体の位置ならびに幾つかの動物ゲノムは、当該分野において知られている。ＰＣＲ反応にプライマーを用いて、目的のｒａｓ遺伝子を含むゲノム領域を増幅させる。ｒａｓ遺伝子を含むゲノム領域全体を増幅させるために１回のＰＣＲ反応を用いもよい。あるいは、目的のｒａｓ遺伝子の異なる領域をそれぞれ増幅させる、複数回のＰＣＲ反応を用いてもよい。好ましくは、目的のｒａｓ遺伝子のコード領域全体を増幅させるようにＰＣＲ反応を用いる。さらに、イントロン内および目的のｒａｓ遺伝子周辺のゲノム領域を増幅してもよい。
【００５２】
その後、ＰＣＲ産物の分析を行う。ＰＣＲ産物の分析は、様々なタイプであり得る。行う分析のタイプは通常、分析を行っている人が検出しようとしている変異のタイプに依存する。例えば、対照細胞（すなわち、野生型ｒａｓ遺伝子を有することが知られる細胞）由来のＤＮＡを用いた同一のＰＣＲ産物の大きさと比較して、腫瘍または癌細胞ゲノム由来の特定のＰＣＲ産物の大きさを分析することは、ゲノム領域におけるＤＮＡの挿入または欠失を検出することができる。当該分野では知られているが、ゲノムを増幅するために２つのＰＣＲプライマーを用いる領域の間のゲノム領域においてＤＮＡの挿入がある場合、得られるＰＣＲ産物は、挿入が起こらなかったゲノム由来のＤＮＡを用いて得られた同一のＰＣＲ産物の大きさと比較してより大きい。同様に、２つのＰＣＲプライマーの間のゲノムにおけるＤＮＡの欠失は、欠失を含まないゲノム由来のＤＮＡを用いて得られた対照ＰＣＲ産物と比較してより小さいＰＣＲ産物をもたらす。このような分析は、野生型ゲノム由来の産物と比較して、ＰＣＲ産物の大きさに比較的大きな変化（例えば、最小でも１０％の変化）を検出する。通常、ＰＣＲ産物の大きさは、２つ以上のＰＣＲ産物の相対的な大きさを比較することによって確定される。例えば、ｒａｓ変異が疑われるゲノム由来のＰＣＲ産物の大きさは、ｒａｓ変異が存在しないことが知られるゲノム由来の同一のＰＣＲ産物の大きさと比較される。相対的な大きさは、ゲル電気泳動において起こる電場中のＰＣＲ産物の移動を用いて容易に比較される。アガロースゲル電気泳動は、この目的のためにしばしば用いられる。
【００５３】
ＰＣＲ産物を分析する別の方法は、ＰＣＲ産物の全てまたは一部のヌクレオチド配列を確定することによる。この分析方法は、１０％未満のＰＣＲ産物の相対的な大きさの変化を検出する。この方法は、相対的な大きさの変化をもたらさないＤＮＡ配列の変化も検出する。例えば、２つの異なる細胞由来のＤＮＡの増幅から得られた同一のＰＣＲ産物の配列決定および配列比較は、単一または複数のヌクレオチド塩基の変化やＤＮＡ領域の置換等を検出することができる。ＤＮＡの配列決定方法またはＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定方法は、分子生物学の技術分野において既知である。配列決定の連鎖停止方法がしばしば用いられる。ＤＮＡの配列決定は、自動配列決定機によってしばしば行われる。
【００５４】
別のタイプの分析においては、ＲＮＡ、好ましくは腫瘍または癌細胞から単離されたｍＲＮＡをテンプレートとして用いて、逆転写反応においてＤＮＡを作製する。その後、逆転写されたＤＮＡは、試験中のｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡ内にあることが知られる配列を有するＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ反応におけるテンプレートとして用いられる。特定のｒａｓ遺伝子のｍＲＮＡ配列の全長を増幅するために、上記のように様々なｍＲＮＡプライマーを選択することができる。これは、上記のような１回のＰＣＲ反応または複数回のＰＣＲ反応を用いて行うことができる。その後、すでに記載されたのとほぼ同様にＰＣＲ産物の分析を行う。あるタイプの分析においては、ＰＣＲ産物の有無または対照と比較したその大きさの変化は、ｒａｓゲノム領域内の大きな挿入または欠失等の大きな変化を示す。さらに、このような分析はＰＣＲ産物のゲル電気泳動を用いて広く行われる。別のタイプの分析においては、ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列は、当該分野において周知の方法を用いて決定される。
【００５５】
当該分野で周知の他の方法も、ｒａｓ遺伝子、転写物、またはいずれかの野生型と比較しての変更の存在をアッセイするために使用することができる。これらの方法のいくつかに、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＲＮアーゼ保護アッセイ、Ｓ１ヌクレアーゼアッセイ等がある。
【００５６】
ｒａｓＤＮＡおよびＲＮＡを変異に関して分析する方法に加えて、ｒａｓタンパク質自身を、もしあれば、変化に関してアッセイすることも可能である。例えば、当該分野において、特定のｒａｓタンパク質をコードする遺伝子内の特異的変異の存在に依存して、様々なｒａｓタンパク質（Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓ）に特異的に結合する様々な抗体が周知である。例えば、タンパク質をコードする遺伝子の特異的コドンにおける活性化変異がある場合に限り、ｒａｓタンパク質に結合する抗体が利用できる。他の抗体は、タンパク質が変異を含まないかまたは少なくとも十分特徴づけされた活性化変異を含まない場合に限り、ｒａｓタンパク質に結合する。このような区別して結合する抗体の機能の基礎は通常、特定のｒａｓタンパク質のコンホメーションである。例えば変異は、特異的抗体が結合するまたはしないようにｒａｓタンパク質のコンホメーションの変化を引き起こす。このタイプの抗体の多くは、市販されている（例えば、Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。したがって、抗体の利用によって、特異的変異ｒａｓタンパク質が腫瘍または癌細胞に存在するかどうかを確定することができる。特異的変異が存在するかどうか確定することもできる。
【００５７】
このような抗体は、当該分野において既知の様々なアッセイを用いてｒａｓタンパク質を分析するために用いられる。例えば、免疫沈降、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学は、一般に用いられる方法である。抗体を用いる他のアッセイは、当該分野において既知であり、用いられることが可能である。ある抗体は、１つまたは複数のこのようなアッセイにおいて良好な結果をもたらし得る。
【００５８】
記載されるように、ｒａｓ遺伝子の異常メチル化は、細胞内の野生型ｒａｓ活性発現の減少をもたらす。細胞中の特定の遺伝子の異常メチル化を検出するための、当該分野において既知である様々な方法がある。ある方法においては、ＤＮＡ中の同一のヌクレオチド配列を認識するが配列内の特定のヌクレオチドがメチル化されるかどうかによって配列を区別して切断する、一組の制限エンドヌクレアーゼを用いる。その後、切断されたＤＮＡは、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ部位にわたるプローブを用いて、サザンブロッティングによって分析される。対照細胞と比較して腫瘍または癌細胞由来のゲノムＤＮＡにおける部位のメチル化の変化は、サザンブロットにおけるＤＮＡ断片のバンドパターンの差異によって検出される。異常メチル化を検出するための他の方法には、メチル化シトシンを異なるヌクレオチド塩基に変化させるゲノムＤＮＡの亜硫酸水素処理が含まれる。その後、変化した塩基は様々な技法（メチル化感受性ＰＣＲはこの技法の１つである）を用いて検出される。他の方法には、様々なＤＮＡ配列決定技法が含まれる。このような技法の１つは、ゲノム配列決定である。他の方法は知られており、用いられることが可能である。
【００５９】
腫瘍または癌細胞のｒａｓ遺伝子、ＲＮＡまたはタンパク質を特徴付けするためのこのようなアッセイの結果を、診断または予後に用いることができる。野生型ｒａｓは増殖抑制活性を有するため、この活性の存在は上記のアッセイが用いられる患者にとって望ましい。一般に、患者にとって最も望ましくない状況は、野生型ｒａｓ増殖抑制活性が腫瘍または癌由来の細胞に存在しない状況である。より望ましい状況、およびより良い予後を伴う状況は、一般に腫瘍または癌細胞における野生型ｒａｓ増殖抑制活性がある状況である。
【００６０】
（治療剤または予防剤としての野生型ｒａｓ遺伝子）
本発明は、増殖抑制活性を有する野生型ｒａｓタンパク質の細胞において発現の増加を引き起こすことにより、細胞増殖を阻害または抑制する方法も提供する。この活性の発現の増加を、様々な方法により引き起こすことができる。通常、このような方法は、野生型ｒａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の細胞へ導入することを含む。ＤＮＡまたはＲＮＡは、このような細胞に導入され得る。ｒａｓタンパク質を細胞に導入することも可能である。ある場合には、既に細胞内にある遺伝子由来の野生型ｒａｓ活性の発現の増加を引き起こす薬剤を投与することも可能である。
【００６１】
当然のことながら、被検体が野生型ｒａｓで処理されることが可能な腫瘍または癌を有する場合、これらの方法は治療に用いられる。この方法を、腫瘍または癌を形成しそうな個体においてその形成を抑制するのに用いることもできる。腫瘍または癌を有する個体の、腫瘍または癌細胞における野生型活性が減少しているかまたは活性がない場合、ｒａｓの発現の増加を引き起こす方法を用いることが好ましい。しかしながら、野生型ｒａｓ活性がある場合に本発明の方法を用いることもできるが、既知のｒａｓシグナル伝達経路は、腫瘍または癌の形成および増殖に寄与するようにさらに活性化される。ｒａｓ以外の遺伝子またはｒａｓシグナル伝達経路以外の経路が個体の腫瘍または癌に寄与する場合も、本発明の方法を用いることができる。
【００６２】
これらの方法において、「野生型ｒａｓタンパク質」とは、上述したｒａｓスーパー遺伝子ファミリーのメンバーによりコードされる任意の野生型タンパク質をまとめて指す。より好ましくは、用いられる野生型ｒａｓタンパク質は、スーパー遺伝子ファミリーのｒａｓサブファミリーのメンバー（すなわち、Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ）によりコードされる。最も好ましくは、野生型ｒａｓタンパク質はＫ−ｒａｓタンパク質である。本発明の方法において用いられる遺伝子およびタンパク質は、齧歯類由来のものであることもあるが、ヒト由来のものであることが好ましい。これらのタンパク質およびそれらをコードする配列は、当該分野において既知である。このような遺伝子およびタンパク質の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎによって提供されるデータベースまたは他の類似のデータベースにおいて、インターネット上で見ることができる。
【００６３】
ｒａｓタンパク質、またはｒａｓをコードするＤＮＡやＲＮＡの増殖抑制活性の存在は、１つまたは複数の様々なアッセイにより確定される。このようなアッセイのある群には、培養物中のまたは動物中の細胞に遺伝子またはタンパク質を導入すること、およびその後、その遺伝子またはタンパク質の細胞増殖への効果を測定することが含まれる。増殖抑制活性は、増殖の阻害を引き起こす。別の方法は、遺伝子またはタンパク質を細胞へ導入すること、およびその後、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの活性を測定することである。この測定は、当該分野において既知の生化学的アッセイを使用することによって行うことができる。
【００６４】
この方法は、ヒトまたは動物体内のタンパク質投与後の安定化または半減期の増加をもたらすｒａｓ遺伝子またはそれがコードされたタンパク質への修飾のためにも提供される。修飾された、短縮または部分タンパク質が、抗増殖性、増殖抑制性、抗腫瘍発生性、抗腫瘍形成性、抗悪性等であると言うことができるある活性を保つ限り、野生型ｒａｓ遺伝子またはタンパク質に対する任意の修飾が本発明の範囲内であることに留意することは重要である。
【００６５】
野生型ｒａｓ遺伝子は、様々な手段を用いて導入されることが可能である。これらの手段の多くは、遺伝子療法の技術分野において周知である。野生型ｒａｓ活性をコードするまたは野生型ｒａｓ活性の刺激を引き起こすウイルスベクターを用いる、腫瘍または癌細胞のトランスフェクションまたは感染等の様々な方法を用いて、遺伝子を導入することができる。
【００６６】
本発明は、例えばヒトまたは動物の腫瘍を含む細胞等のヒトまたは動物に存在する細胞に、野生型ｒａｓ遺伝子を導入するために提供される。ヒトまたは動物中にある細胞に遺伝子を導入するための様々な方法がある。ある好ましい方法は、腫瘍を含む細胞にウイルスが感染するように、クローン化された野生型ｒａｓ遺伝子を含む組み換えウイルスを、ヒトまたは動物へ投与することを用いる。ヒトまたは動物中にある細胞に遺伝子を導入する別の方法は、野生型ｒａｓをコードする精製されたＤＮＡを、ヒトまたは動物に直接投与することを含む。このような投与は、ＤＮＡの注射によって行うことができる。このような手段は、一般にワクチン分野で、特にいわゆる「ＤＮＡワクチン」の投与のために用いられる。
【００６７】
野生型ｒａｓ活性をコードするポリヌクレオチド配列を細胞内に導入するために、ポリヌクレオチド配列のタンパク質コード領域は通常、ｍＲＮＡへの転写に加えてｍＲＮＡの野生型ｒａｓへの翻訳も促進する配列に結合する。これを行うための当該分野において一般的なストラテジーは、クローン化されたタンパク質コード配列の発現を促進する配列を含むベクターに、ｒａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をクローン化することである。
【００６８】
発現ベクターは通常、遺伝子発現を促進する配列を含む。発現媒体は、タンパク質コード配列のアセンブリを含む転写ユニットおよび転写および翻訳を調節するエレメントを含むことが可能である。転写調節エレメントは一般に、転写を開始するエレメントを含む。このようなエレメントのタイプとしては、プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。プロモーターは、構成的、誘導的または組織特異的であり得る。転写調節エレメントは、転写を停止させる、またはＲＮＡの３’末端処理のためのシグナル（ポリアデニル化のためのシグナル）を提供するものも含む。翻訳調節配列は通常、配列をコードするタンパク質の一部であり、翻訳開始コドンおよび翻訳停止コドンを含む。タンパク質コード領域の一部である付加的配列（例えば、細胞膜にタンパク質を導く配列、シグナル配列等）があってもよい。
【００６９】
細胞内に導入されるｒａｓ配列は、細胞内に導入された後、高レベルで発現する（すなわち、導入されたポリヌクレオチド配列が細胞内でｒａｓタンパク質を大量に産生する）ことが好ましい。細胞内に導入されたポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を引き起こす技法は、当該分野において既知である。このような技法は、配列を細胞内に導入させるとすぐにポリヌクレオチド配列の転写が増加することを含むことが多いが、これらに限定されない。このような技法は導入されたポリヌクレオチド配列を高レベルで（ａｔ  ａ  ｈｉｇｈ  ｒａｔｅ）開始させる転写プロモーターの使用を含むことが多い。このような様々なプロモーターが存在し、当該分野で既知である。このようなプロモーターは、ウイルス由来であることが多い。このようなプロモーターは、様々な細胞のタイプにおけるポリヌクレオチド配列の、効率的な転写をもたらすことができる。このようなプロモーターは、構成的（例えばヒトサイトメガロウイルス由来のＣＭＶエンハンサー／プロモーター）または誘導的（例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルス由来のＭＭＴＶエンハンサー／プロモーター）であり得る。様々な構成的および誘導的プロモーターおよびエンハンサーが当該分野において知られている。特異的な細胞型におけるポリヌクレオチド配列の転写をもたらす、他のプロモーター（いわゆる「腫瘍特異的プロモーター」）も用いることができる。特異的組織において発現する様々なプロモーターが存在し、当該分野において知られている。例えば、発現が神経、肝臓、上皮細胞および他の細胞に特異的であるプロモーターが存在し、当該分野において知られている。このようなＤＮＡ分子を作製する方法（すなわち、組み換えＤＮＡ法）は、当業者には周知である。
【００７０】
当該分野において、ベクターとは、細胞で結合した別の核酸またはポリヌクレオチド配列の導入を媒介することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターの１つのタイプはエピソーム（すなわち、染色体外複製が可能な核酸）である。他のタイプのベクターは、ベクターが導入される細胞のゲノムの一部になる。挿入されたＤＮＡ配列の発現を導くことができるベクターは、「発現ベクター」と称され、プラスミド、ウイルスまたは他のタイプの当該分野において知られている分子を含み得る。
【００７１】
代表的には、ベクターは、ｒａｓポリヌクレオチド配列の挿入を可能にする、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。ベクターは、非形質転換細胞から形質転換細胞を同定し、分離する働きをする化合物をコードするマーカー遺伝子（例えば、優性抗生物質抵抗性遺伝子）をさらに含み得る。
【００７２】
本発明において用いられるベクターのタイプの１つは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルスおよびレトロウイルスを含む様々なウイルスファミリーに一般に準じる、組み換えウイルスである。このような組み換えウイルスは一般に、ベクター感染した宿主細胞における外因性ポリヌクレオチド配列の発現を引き起こすことができるプロモーターの制御下において、外因性ポリヌクレオチド配列（本明細書においてはｒａｓ遺伝子）を含む。
【００７３】
ウイルスベクターのタイプの１つは、ゲノムに挿入された外因性ポリヌクレオチド配列を有する、欠損アデノウイルスである。「欠損アデノウイルス」という用語は、標的細胞において自己複製できないアデノウイルスを指す。一般に、欠損アデノウイルスのゲノムは、感染細胞におけるウイルスの複製に必要な配列を欠如している。このような配列は、部分的に、または好ましくは、完全にゲノムから除去される。標的細胞に感染できるようにするために、欠損ウイルスは、コンストラクトをインビボで調製する間にウイルス粒子の封入を可能にするのに十分な本来のゲノム由来の配列を含む。ウイルスが含む他の配列は、遺伝学的に必要な「シスにある（ｉｎ  ｃｉｓ）」であると言われる任意の配列である。
【００７４】
別のタイプのウイルスベクターは、ゲノムに挿入された外因性ポリヌクレオチド配列を有する欠損レトロウイルスである。このような組み換えレトロウイルスは、当該分野において既知である。本発明における使用のための組み換えレトロウイルスは、ヘルパーウイルスの汚染がないことが好ましい。ヘルパーウイルスとは、複製欠損でない、組み換えレトロウイルスのパッケージングの間に生じることがあるウイルスである。
【００７５】
非欠損または複製型ウイルスベクターを用いることもできる。このようなベクターは、ウイルスの複製に必要な配列を保持する。
【００７６】
他のタイプのベクターは、プラスミドベクターである。
【００７７】
一局面においては、本発明の方法は、細胞において野生型ｒａｓのレベルが増加するように、ｒａｓポリヌクレオチド配列（好ましくはベクターに含まれる）を特異的な細胞に導入することを含む。本明細書において、このようなＤＮＡ分子（複数可）（具体的には、１つまたは複数のｒａｓポリヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ分子）の、細胞への導入または伝達は、ＤＮＡ分子を細胞へ導くための当該分野において知られている様々な方法のいずれかを指す。単離されたＤＮＡを細胞へ導入するこのような方法の１つは、トランスフェクションとして知られている。このようなトランスフェクションは一般に、細胞によるＤＮＡの取り込みを促進する細胞またはＤＮＡの様々な処理を用いて行われる。例えば、細胞を化学的に処理して、ＤＮＡ透過性にすることができる。例えば、細胞が内在化できるリポソームにＤＮＡを含むことによって、ＤＮＡを処理することもできる。好ましくは、トランスフェクションを用いて、プラスミドＤＮＡを細胞へ導入する。
【００７８】
上記のように、ウイルスを用いて、ｒａｓポリヌクレオチド配列を細胞内に導入することもできる。例えば、細胞に導入されるポリヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムにクローン化される。このようなウイルスによる細胞の感染は、ウイルスゲノムの細胞への導入をもたらす。このようなクローン化されたポリヌクレオチド配列はウイルスゲノムの一部であるため、ウイルスゲノムと共に細胞に導入される。このようなウイルス「ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムを有することができる。多数のこのようなウイルスベクターは、当業者には周知である。ゲノムにクローン化された、例えばｒａｓタンパク質をコードするクローン化ポリヌクレオチド配列を有するウイルスベクターは、「組み換え」ウイルスと称される。ウイルスを用いてのＤＮＡ分子の伝達は、ポリヌクレオチド配列を、動物の特定の細胞または腫瘍に伝達させるのに特に有用である。このような技法は、遺伝子療法として当該分野において広く知られている。
【００７９】
ヒトまたは動物の患者中にある細胞に、ポリヌクレオチド配列を導入する別の方法は、ｒａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む精製されたＤＮＡを、ヒトまたは動物に直接投与することを含む。このような投与は、ＤＮＡの注射によって、またはＤＮＡのトランスフェクションによってさえも行うことができる。このような手段は、ワクチン分野において、具体的にはいわゆる「ＤＮＡワクチン」を投与するために、広く用いられる。
【００８０】
ヒトまたは動物に野生型ｒａｓ遺伝子を投与するためにどんな手段を用いても、このような手段は、腫瘍細胞に優先的に導入され、非腫瘍細胞にはあまり優先的に導入されない野生型ｒａｓ遺伝子をもたらす。例えば、ヒトまたは動物のある細胞型（例えば、腫瘍細胞型）を特異的に感染させる組み換えウイルスをもたらす技法が、当該分野において知られている。ウイルスに対しては、このような「ターゲッティング」は、組み換えウイルスに対する細胞レセプターの処置（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）および／またはウイルスに対する細胞レセプターを認識してそれに結合するウイルスリガンドの処置によって達成されることが可能である。このような手段は、野生型ｒａｓ遺伝子を動物またはヒトの腫瘍細胞に導入するために用いられる場合、本願の範囲内である。
【００８１】
外因性ポリヌクレオチド配列を、他の細胞ではなく特異的細胞に導入するための遺伝子伝達および遺伝子療法の技術分野において知られている方法がある。例えば、ヒトまたは動物にある細胞型（例えば、腫瘍細胞型）を特異的に感染させる組み換えウイルスをもたらす技法が、当該分野において知られている。ウイルスに対しては、このような「ターゲッティング」は、組み換えウイルスに対する細胞レセプターの処置および／またはウイルスに対する細胞レセプターを認識してそれに結合するウイルスリガンドの処置によって達成されることが可能である。このような手段は、ｒａｓポリヌクレオチド配列を動物またはヒトの腫瘍細胞に導入するために用いられる場合、本願の範囲内である。
【００８２】
ｒａｓポリヌクレオチド配列が細胞内に導入された後、具体的には、ポリヌクレオチド配列が導入された細胞および／または導入されたポリヌクレオチド配列を発現している特異的細胞を確定するための技法が用いられる。ポリヌクレオチド配列の存在および／またはポリヌクレオチド配列の発現を調べるための様々な技法が存在し、当該分野において既知である。このような技法の幾つかは、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ウェスタンブロッティング、ＲＮアーゼ保護、放射性ヨウ素摂取アッセイ等を含む。
【００８３】
（治療剤としての野生型ｒａｓタンパク質）
本発明の別の局面は、ｒａｓタンパク質を細胞に導入することによって細胞増殖を阻害または抑制する方法を提供する。タンパク質を細胞に導入するための様々な方法が存在する。タンパク質を細胞に導入するための当該分野において知られている様々な方法がある。ある方法においては、タンパク質を結合または融合させて、細胞へ入ることを導く短いペプチドにする。あるペプチドのこのような群は、タンパク質形質導入ドメインと呼ばれる。タンパク質を細胞へ導入する別の方法は、脂質担体を用いる。例えば、リポソームに関与するタンパク質は、リポソームが細胞に入るまたは細胞と融合する場合、細胞に入ることができる。タンパク質を細胞に導入する他の方法が知られている。マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションが、その方法の２つである。他の方法も知られている。
【００８４】
このような方法としては、Ｎａｇａｈａｒａらによる出版物（Ｎａｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  ４：１４４９−５２）に、およびＤｏｗｄｙの研究室からの出版物（Ｎａｇａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  ４：１４４９−５２．；  Ｓｃｈｗａｒｚｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５：１５６９−７２．；  Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  ３２２：５０８−２１；  Ｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ６１：４７４−７．，  Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  ３３２：３６−４９；  Ｓｎｙｄｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，  ２００１，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，  ３：１４７−５２．；  Ｂｅｃｋｅｒ−Ｈａｐａｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２４：２４７−５６．）に記載されるような、「タンパク質形質導入」または「タンパク質療法」が挙げられるがこれらに限定されない。これらの出版物は参考として本明細書において援用される。
【００８５】
一実施形態においては、ヒト免疫欠損ウイルスＴＡＴタンパク質（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，  １９８８，  Ｃｅｌｌ，  ５５：１１７９−８８．；  Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，  １９８８，  Ｃｅｌｌ，  ５５：１１８９−９３．）由来の「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）である、１１アミノ酸配列を、野生型ｒａｓタンパク質に融合させる。その後、精製されたタンパク質を細胞表面と接触させ、その細胞の増殖を阻害または抑制するように機能する野生型ｒａｓタンパク質をその細胞に取り込む。融合したＰＴＤを含む野生型ｒａｓタンパク質を、ヒトまたは動物の腫瘍を含む細胞に導入することが望ましい場合は、そのタンパク質を様々な方法によってヒトに投与する。好ましくは、そのタンパク質は、注射（例えば静脈に）によって、またはエーロゾル中の吸入によって投与される。
【００８６】
融合したＰＴＤを含む野生型ｒａｓタンパク質は、ＰＴＤをコードするＤＮＡ配列を有する野生型ｒａｓ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を融合することによって生成されることが好ましい。大量の融合タンパク質が生成されるように、融合遺伝子の生物体への導入、および生物体における高レベルでの遺伝子発現を促進するベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）に、得られるｒａｓ−ＰＴＤ融合遺伝子を組み込むことが好ましい。融合遺伝子を含むベクターを発現することができるこのような生物体の１つは細菌、好ましくは大腸菌である。他の生物体も当業者に広く用いられる。融合タンパク質をこれらの生物体のいずれかにおいて高レベルで発現させた後、当業者に既知のタンパク質精製技法を用いて、融合タンパク質を生物体から精製する。
【００８７】
野生型ｒａｓタンパク質は、ヒトまたは他の動物に、好ましくは薬学的組成物中で投与される。送達に適した剤形は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｏａ，  Ｐａ．，  １９８５）に見られる。これらの薬学的組成物は、様々な薬物送達システムにおける使用に適している（Ｌａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，  １９９０）。
【００８８】
組成物中の野生型ｒａｓタンパク質は、単一の投与または一連の接種に適している。この薬学的組成物は、非経口投与、局所投与または経口投与を対象としている。非経口投与は、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与または筋内投与によることが好ましい。非経口投与は、肝臓の動脈または胆管へのカテーテル挿入等による患者の肝臓に対して優先的に行われ得る。非経口投与のために、組成物にはｒａｓタンパク質および適切な無菌担体（水、水性緩衝液、０．４％生理食塩水溶液、０．３％グリシン、ヒアルロン酸または当該分野において既知の無毒性非イオン性界面活性剤のエマルジョン等）が含まれる。組成物は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、酢酸ナトリウムおよび乳酸ナトリウム等の緩衝剤や湿潤剤等の、生理的状態に近づけるための物質をさらに含んでもよい。なお、薬学的に許容可能な組成物中のｒａｓタンパク質の投与に加えて、ｒａｓタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、このような組成物の一部として投与してもよい。
【００８９】
従来の無毒性な固体担体中のｒａｓタンパク質を含む固体組成物としては、例えば、グルコース、スクロース、マンイトール、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロースまたはセルロース誘導体、炭酸ナトリウムおよび炭酸マグネシウム等が挙げられる。固体組成物の経口投与のために、ＨＣＶ様粒子は、組成物を１０％〜９５％、より好ましくは２５％〜７５％含むことが好ましい。
【００９０】
治療または予防に有効な投与量のｒａｓタンパク質組成物を、個体に投与する。組成物は単回投与として投与されてもよいが、それよりも、何日、何週、さらには何ヶ月にもわたる一連の投薬としてもよい。本明細書における有効な治療投与量とは、腫瘍の増殖を阻害する、または腫瘍の退縮さえ引き起こす投与量である。このような投与量により、腫瘍の転移も阻害または抑制される。本明細書における有効な予防投与量とは、腫瘍の形成を抑制する投与量である。
【００９１】
（ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼに対する野生型ｒａｓの発現）
本発明の別の局面は、ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの活性を阻害する方法を提供する。ＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼ活性の阻害は、上記のように、野生型ｒａｓタンパク質をコードする遺伝子または野生型ｒａｓタンパク質の、細胞への導入後に起こる。
【実施例】
【００９２】
本発明のさらなる詳細は以下の実施例において見出すことができ、これらの実施例は本発明の範囲をさらに定義する。本明細書に引用した全ての参照は、その全てが参照により本明細書において明示的に援用される。
【００９３】
（実施例１．  野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子による腫瘍細胞株の増殖阻害）
野生型Ｋ−ｒａｓが、Ｒ１６という名の形質転換ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８６：３０７０−４．）およびＬＭ２という名のマウス肺腫瘍細胞株（ＭｃＤｏｎｉｅｌｓ−Ｓｉｌｖｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｅｘｐ  Ｌｕｎｇ  Ｒｅｓ，  ２７：２９７−３１８．）の増殖を阻害する、トランスフェクション研究を行った。いずれの細胞株も、変異型Ｋ−ｒａｓ対立遺伝子を含んでいた。Ｒ１６は、Ｋ−ｒａｓ中のコドン１２の２番目の位置におけるＧＣからＡＴへの塩基転位を含むマウス肺腫瘍ＤＮＡにより形質転換されたＮＩＨ／３Ｔ３由来である。Ｒ１６細胞は、変異型Ｋ−ｒａｓの高レベルの発現（野生型Ｋ−ｒａｓ対立遺伝子よりも約１０倍高い）を示した。ＬＭ２は、Ａ／Ｊマウス株におけるウレタン誘導性肺腫瘍から確立された、転移性腫瘍細胞株である。ＬＭ２は、Ｋ−ｒａｓのコドン６１の２番目の位置におけるＡＴからＧＣへの塩基転位を含んでいた。
【００９４】
野生型Ｋ−ｒａｓを含む発現ベクターは、Ａ／Ｊマウスの正常な肺から単離された全ｍＲＮＡの、マウスｃＤＮＡ配列由来のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより単離された、野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂに対する全長マウスｃＤＮＡから作製された（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｅｍｂｏ  Ｊ，  ４：１１９９−２０３．）。野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂ発現コンストラクトは、ｃＤＮＡのｐＣＲ３．１哺乳動物発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へのライゲーションによって作製される。その後、発現コンストラクトは、Ｍａｘｉ−ｔｉｐ  ５００カラム（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて精製され、トランスフェクション実験に使用する前に、確認のために配列決定された。
【００９５】
同一の継代のＲ１６およびＬＭ３細胞を、クローン（すなわち、ｐＣＲ３．１ベクターのみ、およびリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いる野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂ）の１．５〜２μｇの精製プラスミドＤＮＡを用いて、同一の条件下でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、Ｇ４１８における選択により選択された。Ｇ４１８耐性Ｒ１６細胞を直接アッセイし、Ｇ４１８耐性ＬＭ２細胞を安定なクローンにサブクローン化した。これらの細胞は、増殖速度およびコロニー形成効率の分析のために用いられた。増殖速度は、各ウェルに２０００個の細胞を播種した１２ウェルシャーレを用いて、これらの細胞から確定された。１０％のＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、二連式ウェルにおいてＲ１６細胞をインキュベートした。１０％のＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＣＭＲＬ１０６６中で、ＬＭ２細胞を培養した。プレーティング後１、２、４、６および８日目に細胞を計数した（図４および５参照）。コロニー形成アッセイのために、トランスフェクト細胞の各サブクローン用に４つのシャーレ（各直径１０ｃｍ）を用いた。各シャーレに１０００個の細胞を播種し、１０％のＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＤＭＥＭ中で１２日間インキュベートした。その後、細胞を１０％緩衝ホルマリンで固定化し、クリスタルバイオレットで染色し、目に見えるコロニー（直径１．５ｍｍを超える）を計数した。トランスフェクト野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂの発現は、トランスフェクトクローンによって運ばれる独自の配列を利用するＲＴ−ＰＣＲによって、これらのサブクローンにおいて、およびコロニー形成アッセイから選択されたコロニーにおいてモニタリングされた。具体的には、ｃＤＮＡは、野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂを用いてトランスフェクトされたＧ４１８耐性細胞から単離されるＲＮＡから生成される。その後、これらのｃＤＮＡに関して、転写開始位置の後ろに位置するベクター配列（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’）およびＫ−ｒａｓ４Ｂイントラジェニックコード配列（５’ＣＴＣＴＡＴＣＧＴＡＧＧＧＴＣＧＴＡＣ３’）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【００９６】
図４ａに示されるように、野生型Ｋ−ｒａｓのＲ１６細胞へのトランスフェクションは、細胞増殖を有意に阻害した（６日目までに８０％阻害）。空のベクター対照細胞において６５個を超えるコロニーが増殖したが、野生型Ｋ−ｒａｓトランスフェクトＮＩＨ／３Ｔ３細胞から生じたコロニーは非常に少数（１０個未満）しか観察されなかった（図４ｂおよび図４ｃ）。野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のＬＭ２へのトランスフェクションは、Ｇ４１８耐性細胞（ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｈ）の選択されたクローンの１つにおいて、細胞増殖を有意に阻害した（４日目までに９０％阻害）（図５ａ）。ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｈは、比較的高レベルのトランスフェクト野生型Ｋ−ｒａｓを発現した（図５ｄ）。２００個を超えるコロニーが空のベクター対照細胞において増殖したが、ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｈ細胞においては非常に少数のコロニー（１０個未満）しか見られなかった（図５ｂおよび図５ｃ）。ＬＭ２細胞由来の平均３０個のコロニーは、約３倍低いレベルのトランスフェクト野生型Ｋ−ｒａｓ（ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｌと表す）を発現したが（図５ｄ）、このことは、野生型Ｋ−ｒａｓの抑制効果は投与量依存性であることを示唆する（図５ｂ〜図５ｄ）。
【００９７】
トランスフェクト野生型Ｋ−Ｒａｓの阻害効果を、腫瘍形成性Ｋ−Ｒａｓのタンパク質発現の減少によって説明することができるかどうか試験した。ＬＭ２細胞は、Ｋ−ｒａｓのコドン６１におけるＣＡＡからＣＧＡへの変異を含む。この変異型Ｋ−Ｒａｓを認識するのに利用可能な抗体は存在しないため、代替的方法を用いた。ＧＤＰ結合でなくＧＴＰ結合Ｒａｓは、ｃ−ＲａｆのＲａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）と、特に関連し得る。細菌によって発現したＧＳＴ−ＲＢＤを、ＬＭ２細胞株のＫ−ＲａｓのＧＴＰ結合性腫瘍形成性形態を単離するためのアフィニティマトリクスとして用いた。
【００９８】
ＬＭ２細胞を、マイルドな溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、５μｇ／ｍｌ  アプロチニン、１ｍＭ  ベンズアミジン）に溶解し、遠心分離により清浄にした。Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ）によりタンパク質濃度を確定し、インキュベーション前に、サンプルを予めグルタチオンアガロースに結合させたＲａｆのＧＳＴ−ＲＢＤ（４０μｇ）（Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７０：２９０１−５．）、またはグルタチオンアガロースのみのいずれかで同等化した。混合の２時間後、ビーズを洗浄し、結合したタンパク質をＳＤＳサンプル処理緩衝液で溶出した。結合したＫ−ｒａｓタンパク質は、α−Ｋ−ｒａｓ  Ｆ２３４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたウェスタンブロットにより可視化した。
【００９９】
図６ａに示されるように、様々な程度のトランスフェクト野生型タンパク質発現を有する全ての試験細胞株において、等量の腫瘍形成性Ｋ−Ｒａｓが単離された。ＬＭ２−４Ｓ−１１およびＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｈは、比較的高レベルのトランスフェクト野生型Ｋ−Ｒａｓを発現したが、一方、ＬＭ２−４Ｓ−３、ＬＭ−２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  ＬおよびＬＭ２−４Ｓ−Ｍ１は比較的低レベルのトランスフェクト野生型Ｋ−Ｒａｓを有していた。陽性対照として、２９３細胞をＫ−ＲａｓＶ１２（ｐＣＤＮＡ３−Ｋ−ＲａｓＶ１２；ＧＴＰ結合）またはＫ−ＲａｓＮ１７（ｐＣＤＮＡ３−Ｋ−ＲａｓＮ１７；ＧＤＰ結合）のいずれかでトランスフェクトし、Ｋ−ＲａｓＶ１２のみがＧＳＴ−ＲＢＤと関連していた（図６ａ）。データは、腫瘍形成性Ｋ−Ｒａｓの発現が野生型形態の過剰発現に影響されないことを示す。
【０１００】
（実施例２．  野生型Ｋ−ＲａｓによるＥＲＫ活性阻害）
これらの研究は、野生型Ｋ−Ｒａｓの発現がＥＲＫ活性に影響を与えることを確定した。ＭＡＰキナーゼの活性は、細胞の形質転換において重要な役割を果たすことが知られている。ＥＲＫ活性を、抗リン酸ＥＲＫ抗体を用いたイムノブロッティングによって確定した。ＥＲＫ活性は、活性化ループのリン酸化によって直接調節され、これは抗リン酸ＥＲＫによって認識される。ＥＲＫキナーゼ活性は、抗リン酸ＥＲＫイムノブロットを用いて検出されるシグナルと直接相関する。
【０１０１】
実施例１に記載したように、ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  ＨおよびＬＭ２−４Ｓ−１１細胞株を、これらの研究に用いた。ＨＥＫ２９３細胞も、対照として用いた。ＥＲＫ活性を分析するために、ＨＥＫ２９３およびＬＭ２細胞を、それぞれ１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭおよびＣＭＬＲ１０６６培地中で培養した。５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを用いて、ＥＲＫ活性を１０分間刺激した。ＥＧＦによる刺激を受けなかったＨＥＫ細胞を陰性対照とし、ＥＧＦにより刺激されたＨＥＫ２９３細胞を陽性対照として用いた。上記実施例１に記載したように、細胞をＳＤＳサンプル処理緩衝液中で直接溶解し、抗ＥＲＫ抗体または抗リン酸ＥＲＫ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
【０１０２】
図６ｂに示すように、野生型Ｋ−Ｒａｓの発現レベルとＥＲＫ活性との間の逆相関が観察された。ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  ＨおよびＬＭ２−４Ｓ−１１細胞株は、比較的高レベルのＫ−Ｒａｓ発現を有しており（図５ｄ）、ベクター対照細胞よりも有意に低いＥＲＫ活性を示した（図６ｂ）。一方、ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｌ、ＬＭ２−４Ｓ−３およびＬＭ２−４Ｓ−Ｍ１細胞は、比較的低レベルのＫ−Ｒａｓ発現を有しており（図５ｄ）、比較的標準的なＥＲＫ活性を示した（図６ｂ）。
【０１０３】
（実施例３．  トランスフェクト野生型Ｋ−ｒａｓは、トランスフェクト細胞株のインビボ腫瘍増殖を阻害した）
この研究は、ヌードマウスのＲ１６およびＬＭ２細胞により、野生型Ｋ−ｒａｓが腫瘍の発達を阻害することを示した。上記実施例１に記載されたように、野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂまたは空のベクターをＲ１６およびＬＭ２細胞にトランスフェクトした。胸腺欠損マウス（４〜６週齢）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｍａｉｎｅ）から入手された。対数増殖期の約１００万個の細胞を、各ヌードマウスの脇腹に皮下注射し、サブクローンあたり５匹の動物を用いた。動物の健康をモニタリングし、腫瘍の大きさを毎日チェックし、腫瘍の潜伏時間（出現の時間）および大きさ（ｍｍ３）を記録した。細胞注射の２〜４週間後、マウスを安楽死させて腫瘍重量を測定した。全てのヌードマウス腫瘍における野生型Ｋ−ｒａｓクローンの発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認した。
【０１０４】
図７ａ〜図７ｄに示すように、ベクター対照細胞を注射した５匹のマウス全てにおいては大きな腫瘍が発生していたが、一方、野生型Ｋ−ｒａｓを運ぶＲ１６細胞およびＬＭ２細胞を注射した５匹のマウスにおいては小さな腫瘍しか観察されなかった。野生型Ｋ−ｒａｓトランスフェクト群における腫瘍は、ベクター対照マウスの腫瘍（約１．９ｇおよび約０．６ｇ）と比較して、有意に小さかった（約０．３ｇおよび約０．０５ｇ）（Ｐ＜０．０００１）（図７ｄ）。これらの結果は、野生型Ｋ−ｒａｓがＲ１６およびＬＭ２細胞の腫瘍形成能を阻害することを示唆した。
【０１０５】
（実施例４．  ウイルスベクターを用いての野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子のヒトへの投与）
野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子をアデノウイルスゲノムに組み換えることによって、組み換え型アデノウイルスを構築する。標準的な方法を用いてウイルスを増殖させ、精製する。組み換え型Ｋ−ｒａｓアデノウイルスがＫ−ｒａｓ遺伝子を発現する能力を試験するために、培養細胞を感染させ、タンパク質抽出物を感染細胞から作製し、この抽出物はＫ−ｒａｓタンパク質に特異的する。Ｋ−ｒａｓを発現する組み換え型アデノウイルスは、腫瘍を有するヒトに投与する。その後、組み換え型アデノウイルスを投与されたヒトの腫瘍増殖をモニタリングする。
【０１０６】
（実施例５．  タンパク質形質導入を用いた野生型Ｋ−ｒａｓタンパク質のヒトへの投与）
野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子の５’末端と融合したヒト免疫欠損ウイルスＴＡＴ遺伝子由来の、１１アミノ酸タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）をコードするヌクレオチド配列を有する野生型Ｋ−ｒａｓ遺伝子を含む、細菌プラスミド発現ベクターを構築する。プラスミドは、タンパク質（Ｋ−ｒａｓ：ＰＴＤ融合タンパク質）のアミノ末端と融合した１１アミノ酸ＰＴＤを有する野生型Ｋ−ｒａｓタンパク質を産生する大腸菌に形質転換される。Ｋ−ｒａｓ：ＰＴＤ融合タンパク質は、形質転換された大腸菌から、標準的なタンパク質精製手段を用いて精製する。精製したＫ−ｒａｓ：ＰＴＤ融合タンパク質は、腫瘍を有するヒトに投与する。投与は、静脈内注射またはエーロゾルの吸入のいずれかにより行う。ヒトに投与するＫ−ｒａｓ：ＰＴＤ融合タンパク質は、特定の投与経路に許容可能な薬学的調製物に含まれる。
【０１０７】
（実施例６．  活性化ｒａｓおよび野生型ｒａｓの損失によって引き起こされる癌診断）
ヒトの腫瘍由来の組織サンプルを生検から得る。組織サンプルに含まれる細胞を溶解し、標準的な方法を用いて細胞からＤＮＡを単離する。単離したＤＮＡは、Ｋ−ｒａｓタンパク質をコードするＫ−ｒａｓゲノム配列の領域を増幅するプライマーを用いたＰＣＲに付す。その後、増幅したＰＣＲ産物の配列決定を行う。得られたＤＮＡ配列を分析して、既知の活性化変異が存在するかどうか確定し、野生型Ｋ−ｒａｓタンパク質の増殖抑制活性の排除をもたらすＫ−ｒａｓのさらなる変異が存在するかどうかも確定する。
【０１０８】
（実施例７．  野生型ｒａｓの損失に関連する癌の特徴づけ）
合計２２個の腺癌および８個の大細胞癌腫の遺伝子型を、染色体１２における異型接合性の損失に関して特定した。これらの腫瘍と対になった正常組織とは、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，  ＯＨ）およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  ＯＨ）から得た。全ての腫瘍は、病理学者によって病理組織学的に分類された。高分子量のＤＮＡが腫瘍組織および正常組織の双方から、それぞれ出版されたプロトコル（Ｂｌｉｎ，  Ｎ．  ＆  Ｓｔａｆｆｏｒｄ，  Ｄ．Ｗ．  （１９７６）．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３，  ２３０３−８．）に従って単離された。対立遺伝子損失は、染色体１２ｐ上の８個の多様なマイクロサテライトマーカー（Ｄ１２Ｓ８９、Ｄ１２Ｓ３５８、Ｄ１２Ｓ３１０、Ｄ１２Ｓ１６０６、Ｄ１２Ｓ１５９６、Ｇ６０５４１、Ｄ１２Ｓ１６１７およびＤ１２Ｓ１５９２（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．））を用いたＰＣＲによってアッセイされた。全てのマーカーは、８％変性ポリアクリルアミドゲル上で記録された。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに一晩暴露し、ＬＯＨを可視的に記録した。４０％以上の差異が見られたサンプルのみを対立遺伝子損失として記録した。ＰＣＲ直接配列決定分析を用いて、Ｋｒａｓ２遺伝子のコドン１２の変異を、全ての肺腺癌および大細胞癌腫のＤＮＡにおいて確定した。肺腫瘍由来のＫｒａｓ２エキソン１のＰＣＲ増幅を、Ｍ．，  Ｗａｎｇ，  Ｙ．，  Ｓｔｏｎｅｒ，  Ｇ．，  Ｙｏｕ，  Ｌ．，  Ｍａｒｏｎｐｏｔ，  Ｒ．，  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｓ．Ｈ．  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｍ．  （１９９２）．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８９，  ５８０４−８に記載のように行った。Ｋｒａｓ２エキソン１に対するＰＣＲプライマー配列は、以下の通りであった：Ｋｒａｓ２−１Ｆ：５’−ＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴ−３’（配列番号＿）およびＫｒａｓ２−１Ｒ：５’−ＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡ−３’（配列番号＿）。１１４ｂｐのＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いて溶出した。コドン１２の変異は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡアナライザー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出された。
【０１０９】
Ｋｒａｓ２領域に注目して、合計８個のマイクロサテライトマーカーを分析した。それぞれのマーカーに対する対立遺伝子型データを表３にまとめる。２２個の腺癌のうちの１１個（５０．０％）および８個の大細胞癌腫のうちの４個（５０．０％）は、用いたマーカーの少なくとも１つにおいて対立遺伝子の損失を有することがわかった。図８ａは、８個のマイクロサテライトマーカーにおける染色体１２ｐの対立遺伝子型分析の代表的な結果を示す。Ｋｒａｓ２変異分析に関して、本発明者らのデータは、２２個の腺癌のうちの９個（４０．９％）および８個の大細胞癌腫のうちの３個（３７．５％）は、コドン１２においけるＫｒａｓ２の変異（ＧＧＴ→ＴＧＴ、ＣＧＴ、ＧＡＴ、ＧＣＴおよびＧＴＴ塩基転位；図８ｂ、表３）を含むことを示した。ＬＯＨ分析およびＫｒａｓ２変異データを組み合わせると、腺癌および大細胞癌腫において観察される染色体１２ｐ上の対立遺伝子損失の大部分は、活性化されたＫｒａｓ２変異と一致した。約８２％（１１個のうちの９個）の腺癌および７５％（４個のうちの３個）の大細胞癌腫は、それぞれ活性化されたＫｒａｓ対立遺伝子を保持していたが、染色体１２ｐの対立遺伝子の損失を示した。１２ｐ上の１つまたは複数の遺伝子座においてＫｒａｓ２変異およびＬＯＨを有する１２個の腫瘍を図９に示す。中でも、腫瘍ＨＣＧ０６８８Ｌ、５７９６Ａ、ＨＣＧ１５９５Ａ、ＨＣＧ１６１０ＬおよびＨＣＧ１６１８Ａは、分析した参考マーカーの完全な損失を示し、一方、腫瘍３６３Ａは、最も近い参考マーカー（Ｄ１２Ｓ３１０およびＤ１２Ｓ１５９２）において異型接合性を保持していたが、Ｄ１２Ｓ１５９６マーカーのみを損失した。腫瘍１６７Ａおよび５４７１Ａもまた、最も近い参考マーカー（Ｄ１２Ｓ１５９２）において異型接合性を保持していたが、Ｋｒａｓ２が位置するマーカーＤ１２Ｓ１６１７／Ｇ６０５４１に関して末端欠失を示した（図９）。ＬＯＨデータは、最小領域のＬＯＨをマーカー（Ｄ１２Ｓ１６０６およびＤ１２Ｓ１６１７／Ｇ６０５４１）に局在化させた。フィジカルゲノムマップ（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｍａｐ）は、約８００ｋｂ領域のこれら２つのマーカーに挟まれた位置にＫｒａｓ２遺伝子を配置している。この結果は、野生型Ｋｒａｓ２対立遺伝子が、ヒト肺腺癌および大細胞癌腫において欠如することを示唆する。
【０１１０】
（表３：非小細胞肺癌における染色体１２におけるＬＯＨ）
【０１１１】
【表３】
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１ａ：マーカーについて情報性がある腫瘍の数を検査した。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウスを用いた肺腫瘍バイオアッセイ。ａ：実験計画、ｂおよびｄ：それぞれ、ウレタン処理マウスおよびＭＮＵ処理マウスにおける肺腫瘍多様性、ｃおよびｅ：それぞれ、ウレタン処理マウスおよびＭＮＵ処理マウスにおける肺腫瘍負荷。白いバーはＫ−ｒａｓ＋／＋マウスを、黒いバーはＫ−ｒａｓ＋／−マウスをそれぞれ表す。Ａ／Ｊ：（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ）Ｆ１、１２９／ＳｖｌｍＪ：（１２９／ＳｖｌｍＪ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ）Ｆ１、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ）Ｆ１。星印はＰ＜０．０００１（野生型動物と比較）を示す。
【図２】異型接合Ｋ−ｒａｓ欠損マウス由来の肺腫瘍。ａおよびｂ：それぞれ、（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１および（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス由来肺の全体的な顕微鏡写真。Ｋ−ｒａｓ欠損マウスにおける腫瘍多様性が、野生型マウスと比較して著しく増加していることに注目、ｃおよびｄ：それぞれ、（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１および（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス由来の、４倍での肺腫瘍（腺腫対癌腫）の淡い顕微鏡写真、ｅおよびｆ：それぞれ、（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１および（Ａ／Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／−）Ｆ１マウス由来の、４０倍での肺腫瘍。肺胞細気管支腺腫（ｅ）における腫瘍細胞は単形性であり、一方、肺胞細気管支癌腫（ｆ）における腫瘍細胞は多形性である。核は大きさや形が異なっており、目立った複数の核小体を含む。
【図３】マウス肺腫瘍における染色体６上のＬＯＨ。ａ．（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１野生型マウス由来の肺腫瘍におけるＬＯＨ状態に関する、Ｋ−ｒａｓイントロン２多形性領域のＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析の代表的な図。レーン１：Ａ／Ｊマウス対照ＤＮＡ、レーン２：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス対照ＤＮＡ、レーン３〜７：（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／Ｓｖ−Ｋ−ｒａｓ＋／＋）Ｆ１野生型腺腫由来の肺腫瘍。ｂ．Ｋ−ｒａｓコドン６１変異（ＣＡＡ→ＣＴＡ）をマーカーとして用いた、クロロプレン誘導性Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス肺腺癌のＬＯＨ分析の代表的な図。パネル７：Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス対照ＤＮＡ、パネル３：クロロプレン誘導性ＬＯＨ非含有Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス肺腺癌、パネル１、２、４〜６：クロロプレン誘導性ＬＯＨ含有Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス肺腺癌。ｃ．マーカーＤ６ＭＣＯ１２の代表的な図を示す。レーン１：ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス対照ＤＮＡ、レーン２：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス対照ＤＮＡ、レーン３：Ｂ６Ｃ３マウス対照ＤＮＡ、レーン４〜１８：クロロプレン誘導性Ｂ６Ｃ３Ｆ１マウス肺腺癌。
【図４】形質転換ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（Ｒ１６）における野生型Ｋ−ｒａｓによる増殖抑制。ａ．ベクター対照対Ｋ−ｒａｓ４ＢトランスフェクトＲ１６細胞の増殖曲線。同一継代レベルにおけるＲ１６細胞を、ｐＣＲ３．１ベクターのみまたは野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂのいずれかの精製プラスミドＤＮＡ１．５〜２μｇを用いた同一の条件下でトランスフェクトした。１〜６日目に、Ｇ４１８耐性Ｒ１６細胞を計数した。各データポイントは２回の実験の平均である。ｂおよびｃ：トランスフェクト野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂによるコロニー形成の阻害。１０００個のＧ４１８耐性Ｒ１６細胞を４つのシャーレ（１０ｃｍ）にそれぞれ播種し、１０％のＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＤＭＥＭ中で１２日間インキュベートした。その後、細胞を１０％緩衝ホルマリンで固定化してクリスタルバイオレットで染色し、目に見えるコロニー（＞直径１．５ｍｍ）を計数した。星印はＰ＜０．０５（ベクタートランスフェクト細胞と比較）を示す。
【図５】マウス肺腫瘍細胞株（ＬＭ２）の野生型Ｋ−ｒａｓによる増殖抑制。ａ．ベクター対照対Ｋ−ｒａｓ４ＢトランスフェクトＬＭ２細胞の増殖曲線。同一継代のＬＭ２細胞を、ｐＣＲ３．１ベクターのみまたは野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂのいずれかの精製プラスミドＤＮＡ１．５〜２μｇを用いた同一の条件下でトランスフェクトした。Ｇ４１８耐性ＬＭ２細胞を、安定なクローンにサブクローン化した。このクローンの１つをＬＭ２−４Ｓ−７と命名し、これは比較的高レベルのトランスフェクト野生型Ｋ−ｒａｓを発現し、ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｈと表した。ＬＭ２−４Ｓ−４と命名された別のクローンは、約３倍低いレベルのトランスフェクト野生型Ｋ−ｒａｓを発現し、ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｌと表した。Ｇ４１８耐性ベクター対照、ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  ＨおよびＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｌ細胞を、１〜４日目に計数した。各データポイントは２回の実験の平均である。星印はＰ＜０．０５（ベクタートランスフェクト細胞と比較）を示す。ｂおよびｃ：トランスフェクト野生型Ｋ−ｒａｓ４Ｂによるコロニー形成の阻害。１０００個のＧ４１８耐性ベクター対照、ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  ＨおよびＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｌ細胞を、４つのシャーレ（１０ｃｍ）にそれぞれ播種し、１０％のＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＣＭＲＬ１０６６中で１２日間インキュベートした。その後、細胞を１０％緩衝ホルマリンで固定化してクリスタルバイオレットで染色し、目に見えるコロニー（＞直径１．５ｍｍ）を計数した。星印はＰ＜０．０５（ベクタートランスフェクト細胞と比較）を示す。ｄ．トランスフェクトＫ−ｒａｓ４Ｂクローンにより運ばれた独自の配列のＲＴ−ＰＣＲ。レーン１〜１４：ＬＭ２−４Ｓ−１、ＬＭ２−４Ｓ−２、ＬＭ２−４Ｓ−３、ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｌ、ＬＭ２−Ｋ−ｒａｓ４Ｂ  Ｈ、ＬＭ２−４Ｓ−８、ＬＭ２−４Ｓ−９、ＬＭ２−４Ｓ−１０、ＬＭ２−４Ｓ−１１、ＬＭ２−４Ｓ−Ｌ１、ＬＭ２−４Ｓ−Ｌ３、ＬＭ２−４Ｓ−Ｌ４、ＬＭ２−４Ｓ−Ｍおよびベクター対照。
【図６】野生型Ｋ−Ｒａｓを発現するＬＭ２細胞のＫ−ＲａｓおよびＥＲＫの活性化状態。ａ．Ｒａｓ活性化。ＬＭ２細胞株から得られた溶解物を、グルタチオンアガロースと結合したＧＳＴ−ＲＢＤまたはグルタチオンアガロースのみとインキュベートした（パネル左）。結合したＫ−Ｒａｓは、α−ＫＲａｓ  Ｆ２３４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたウェスタンブロットにより検出した。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｋ−ＲａｓＶ１２およびＫ−ＲａｓＮ１７に対する発現ベクターを用いてトランスフェクトして溶解し、上記のような同一の結合アッセイに付した（パネル右）。ｂ．ＥＲＫ活性。全細胞溶解物は、抗ＥＲＫ（パネル上）および抗リン酸ＥＲＫ（パネル下）抗体によりプローブした。ＥＧＦにより刺激されなかったＨＥＫ２９３細胞を陰性対照として用い、ＥＧＦにより刺激されたＨＥＫ２９３細胞を陽性対照とした。イムノブロットにおける二重線は、ＥＲＫ１（４４ＫＤ）およびＥＲＫ２（４２ＫＤ）に相当する。
【図７】野生型Ｋ−ｒａｓトランスフェクト腫瘍細胞の、ヌードマウス腫瘍発生アッセイ。ａおよびｂ：ヌードマウス腫瘍発達の阻害（左側−ベクター対照、右側−Ｋ−ｒａｓ４Ｂトランスフェクト細胞）、ｃ：腫瘍の大きさ測定、ｄ：最終的なヌードマウス腫瘍重量の測定。星印はＰ＜０．０５（ベクタートランスフェクト細胞と比較）を示す。
【図８】Ａ：非小細胞肺癌におけるＬＯＨを示す代表的なオートラジオグラフ。上記各オートラジオグラフ：マイクロサテライトマーカー、矢印：対立遺伝子損失、Ｎ：正常ＤＮＡ、Ｔ：腫瘍ＤＮＡ。各サンプルに対して、パネル左：ＬＯＨ非含有肺腫瘍、パネル右：ＬＯＨ含有肺腫瘍。Ｂ：Ｋｒａｓ２遺伝子コドン１２の変異の代表的な例。左側：Ｋｒａｓ２変異非含有肺腫瘍、右側：Ｋｒａｓ２遺伝子第１２コドン変異（ＧＧＴ→ＴＧＴ塩基転位）含有肺腫瘍。
【図９】非小細胞肺癌における染色体１２のＬＯＨマップ。１つまたは複数の病巣においてＬＯＨを示した１４個のサンプルを示す。左側：１２個のサンプルも、活性化されたＫｒａｓ２対立遺伝子を保持していた。右側：２個のサンプルはＫｒａｓ２変異を含まなかった。染色体１２の遺伝子マップは、ＮＣＢＩ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ由来である。Ｌ：大細胞癌腫、Ａ：腺癌。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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