(57)【要約】本発明は、両親媒性物質が結合した疎水性タンパク質のリガンドを同定するための、アフィニティ選択に基づく方法に関する。本発明は、疎水性タンパク質と、リガンドのスクリーニングに適した疎水性タンパク質の単離方法も提供する。
2005506039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）疎水性標的タンパク質とリガンド分子との少なくとも１個の複合体の形成が促進されるように、両親媒性物質が結合している疎水性標的タンパク質を多数の分子に曝すことによるアフィニティ選択によってリガンド分子を選択する工程と、
（ｂ）該複合体を非結合分子から分離する工程と、
（ｃ）リガンド分子を同定する工程と
からなる疎水性タンパク質のリガンドを同定する方法。
【請求項２】
前記疎水性標的タンパク質を多数の分子に曝すことが、均一溶液相の条件下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疎水性標的タンパク質を多数の分子に曝すことが、不均一溶液相の条件下で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンド分子の選択が、多次元クロマトグラフィを使用して行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記疎水性標的タンパク質が、
（ａ）膜タンパク質と、
（ｂ）内在性膜タンパク質と
（ｃ）膜貫通タンパク質と、
（ｄ）モノトピック型膜タンパク質と、
（ｅ）ポリトピック型膜タンパク質と、
（ｆ）ポンプ・タンパク質と、
（ｇ）チャネル・タンパク質と、
（ｈ）受容体キナーゼタンパク質と、
（ｉ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質と、
（ｊ）膜結合酵素と、
（ｋ）輸送体タンパク質と
からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記多数の分子はマスコードされた分子ライブラリである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多数の分子はマスコードされていない分子ライブラリである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記両親媒性物質が、
（ａ）極性脂質と、
（ｂ）両親媒性高分子ポリマーと、
（ｃ）表面活性物質または界面活性剤と、
（ｄ）両親媒性ポリペプチドと
からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
リガンド分子の同定が、質量スペクトル分析によって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンド分子のデコンボリューションが質量スペクトル分析によって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体の前記非結合分子からの分離が、固相クロマトグラフィ媒体により行われる
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記疎水性標的タンパク質が、
（ａ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列と、
（ｂ）アフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列と、
（ｃ）疎水性タンパク質（ＨＰ）配列と
からなる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疎水性タンパク質配列が、
（ａ）膜タンパク質と、
（ｂ）内在性膜タンパク質と、
（ｃ）膜貫通タンパク質と、
（ｄ）モノトピック型膜タンパク質と、
（ｅ）ポリトピック型膜タンパク質と、
（ｆ）ポンプ・タンパク質と、
（ｇ）チャネル・タンパク質と、
（ｈ）受容体キナーゼタンパク質と、
（ｉ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質と、
（ｊ）膜結合酵素と、
（ｋ）輸送体タンパク質と
からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タグ配列が、
（ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号２９）と、
（ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号３０）と、
（ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３１）と、
（ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３２）と、
（ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号３３）と
からなる群から選択されるエピトープ・タグ配列を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記疎水性標的タンパク質が、
（ａ）タグ１−タグ２−ＨＰと、
（ｂ）タグ１−ＨＰ−タグ２と、
（ｃ）ＨＰ−タグ１−タグ２と
からなる群から選択された順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで並ぶ配列を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記疎水性標的タンパク質が、
（ａ）Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号７）と、
（ｂ）Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号８）と、
（ｃ）ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号９）と、
（ｄ）Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号１０）と、
（ｅ）ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号１１）と
からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疎水性標的タンパク質が、アミノ末端に異種シグナル配列（ＳＳ）をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記異種シグナル配列が、
（ａ）メリチン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１２）と、
（ｂ）ＧＰシグナル配列ＮＨ２−ＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）と、
（ｃ）ヘマグルチニン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１４）と、
（ｄ）ロドプシン・タグ１シグナル配列ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１５）と、
（ｅ）ロドプシン・タグＩＤ４シグナル配列ＮＨ２−ＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１６）と
からなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記タグ配列が、ヘキサヒスチジン配列（配列番号１７）とデカヒスチジン配列（配列番号１８）とをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記疎水性標的タンパク質が、
（ａ）ＧＰ６７  ＳＳ−Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、
（ｂ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号２０）と、
（ｃ）ヘマグルチニンＳＳ−ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号２１）と、
（ｄ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号２２）と、
（ｅ）ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号２３）と
からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）疎水性タンパク質をショ糖勾配超遠心法によって精製する工程と、
（ｂ）該疎水性タンパク質を抗体アフィニティ精製によって精製する工程と、
（ｃ）該疎水性タンパク質を固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィによって精製する工程と
からなる、疎水性タンパク質を単離する方法。
【請求項２２】
前記疎水性タンパク質が、
（ａ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列と、
（ｂ）アフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列と、
（ｃ）疎水性タンパク質（ＨＰ）配列と
からなる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記疎水性タンパク質配列が、
（ａ）膜タンパク質と、
（ｂ）内在性膜タンパク質と、
（ｃ）膜貫通タンパク質と、
（ｄ）モノトピック型膜タンパク質と、
（ｅ）ポリトピック型膜タンパク質と、
（ｆ）ポンプ・タンパク質と、
（ｇ）チャネル・タンパク質と、
（ｈ）受容体キナーゼタンパク質と、
（ｉ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質と、
（ｊ）膜結合酵素と、
（ｋ）輸送体タンパク質と
からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タグ配列が、
（ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号２９）と、
（ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号３０）と、
（ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３１）と、
（ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３２）と、
（ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号３３）と
からなる群から選択されるエピトープ・タグ配列を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記疎水性タンパク質が、
（ａ）タグ１−タグ２−ＨＰと、
（ｂ）タグ１−ＨＰ−タグ２と、
（ｃ）ＨＰ−タグ１−タグ２と
からなる群から選択された順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで並ぶ配列を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記疎水性タンパク質が、
（ａ）Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号７）と、
（ｂ）Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号８）と、
（ｃ）ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号９）と、
（ｄ）Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号１０）と、
（ｅ）ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号１１）と
からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記疎水性タンパク質が、アミノ末端に異種シグナル配列（ＳＳ）をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記異種シグナル配列が、
（ａ）メリチン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１２）と、
（ｂ）ＧＰシグナル配列ＮＨ２−ＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）と、
（ｃ）ヘマグルチニン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１４）と、
（ｄ）ロドプシン・タグ１シグナル配列ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１５）と、
（ｅ）ロドプシン・タグＩＤ４シグナル配列ＮＨ２−ＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１６）と
からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記タグ配列が、ヘキサヒスチジン配列（配列番号１７）とデカヒスチジン配列（配列番号１８）とをさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項３０】
前記疎水性標的タンパク質が、
（ａ）ＧＰ６７  ＳＳ−Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、
（ｂ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号２０）と、
（ｃ）ヘマグルチニンＳＳ−ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号２１）と、
（ｄ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号２２）と、
（ｅ）ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号２３）と
からなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）真核細胞におけるタンパク質発現用のベクター・ポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）下記の要素、すなわち
（ｉ）Ｎ末端メチオニン残基、
（ｉｉ）異種シグナル配列（ＳＳ）、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列、
（ｉｖ）アフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列、および
（ｖ）疎水性タンパク質（ＨＰ）配列
からなる人工的に改変された疎水性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と
を含む疎水性タンパク質の発現に適した単離核酸分子。
【請求項３２】
前記Ｎ末端メチオニン配列および前記異種シグナル配列が、
（ａ）ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２４）と、
（ｂ）ＭＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ（配列番号２５）と、
（ｃ）ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ（配列番号２６）と、
（ｄ）ＭＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号２７）と、
（ｅ）ＭＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号２８）と
からなる群から選択される請求項３２に記載の単離核酸分子。
【請求項３３】
前記タグ配列が、
（ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）と、
（ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）と、
（ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）と、
（ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）と、（ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）と
からなる群から選択されたエピトープ・タグ配列からなる請求項３３に記載の単離核酸分子。
【請求項３４】
前記人工的に改変された疎水性タンパク質の前記要素が、
（ａ）ＳＳ−タグ１−タグ２−ＨＰと、
（ｂ）ＳＳ−タグ１−ＨＰ−タグ２と、
（ｃ）ＳＳ−ＨＰ−タグ１−タグ２と
からなる群から選択された順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される請求項３３に記載の単離核酸分子。
【請求項３５】
前記タグ配列がヘキサヒスチジン配列（配列番号１７）とデカヒスチジン配列（配列番号１８）とをさらに含む請求項３４に記載の単離核酸分子。
【請求項３６】
前記人工的に改変された疎水性タンパク質が、
（ａ）ＧＰ６７−Ｍｙｃ−ＥＥ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、
（ｂ）メリチン−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥ（配列番号２０）と
からなる群から選択される請求項３５に記載の単離核酸分子。
【請求項３７】
（ａ）（ｉ）膜タンパク質、
（ｉｉ）内在性膜タンパク質、
（ｉｉｉ）膜貫通タンパク質、
（ｉｖ）モノトピック型膜タンパク質、
（ｖ）ポリトピック型膜タンパク質、
（ｖｉ）ポンプ・タンパク質、
（ｖｉｉ）チャネル・タンパク質、
（ｖｉｉｉ）受容体キナーゼタンパク質、
（ｉｘ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、
（ｘ）膜結合酵素、および
（ｘｉ）輸送体タンパク質
からなる群から疎水性標的タンパク質を選択する工程と、
（ｘｉｉ）該疎水性タンパク質に両親媒性物質が結合していることと、
（ｂ）（ｉ）極性脂質、
（ｉｉ）両親媒性高分子ポリマー、
（ｉｉｉ）表面活性物質または界面活性剤、および
（ｉｖ）両親媒性ポリペプチド
からなる群から該疎水性タンパク質に結合する両親媒性物質を選択する工程と、
（ｃ）該疎水性標的タンパク質と該リガンド分子との少なくとも１つの複合体の形成が促進されるように、均一溶液相の条件下、両親媒性物質が結合している該疎水性標的タンパク質をマスコード・ライブラリ由来の多数の分子に曝すことによるアフィニティ選択により、多次元クロマトグラフィを使用してリガンド分子を選択する工程と、
（ｄ）該複合体を非結合分子から分離する工程と、
（ｅ）質量スペクトル分析によって該リガンド分子を同定する工程と
からなる、疎水性タンパク質のリガンドを同定する方法。
【請求項３８】
（ａ）（ｉ）膜タンパク質、
（ｉｉ）内在性膜タンパク質、
（ｉｉｉ）膜貫通タンパク質、
（ｉｖ）モノトピック型膜タンパク質、
（ｖ）ポリトピック型膜タンパク質、
（ｖｉ）ポンプ・タンパク質、
（ｖｉｉ）チャネル・タンパク質、
（ｖｉｉｉ）受容体キナーゼタンパク質、
（ｉｘ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、
（ｘ）膜結合酵素、および
（ｘｉ）輸送体タンパク質
からなる群から疎水性標的タンパク質を選択する工程と、
（ｘｉｉ）該疎水性タンパク質に両親媒性物質が結合していることと、
（ｂ）（ｉ）極性脂質、
（ｉｉ）両親媒性高分子ポリマー、
（ｉｉｉ）表面活性物質または界面活性剤、および
（ｉｖ）両親媒性ポリペプチド
からなる群から該疎水性タンパク質に結合する両親媒性物質を選択する工程と、
（ｃ）疎水性標的タンパク質とリガンド分子との少なくとも１つの複合体の形成が促進されるように、不均一溶液相の条件下、両親媒性物質が結合している疎水性標的タンパク質をマスコードされていないライブラリ由来の多数の分子に曝すことによるアフィニティ選択により、多次元クロマトグラフィを使用してリガンド分子を選択する工程と、
（ｄ）複合体を非結合分子から分離する工程と、
（ｅ）質量スペクトル分析によって該リガンド分子を同定する工程と
からなる、疎水性タンパク質のリガンドを同定する方法。
【請求項３９】
（ａ）（ｉ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列、
（ｉｉ）（１）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号２９）、
（２）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号３０）、
（３）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３１）、
（４）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３２）、および
（５）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号３３）
からなる群から選択されるアフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列、
（ｉｉｉ）（１）膜タンパク質、
（２）内在性膜タンパク質、
（３）膜貫通タンパク質、
（４）モノトピック型膜タンパク質、
（５）ポリトピック型膜タンパク質、
（６）ポンプ・タンパク質、
（７）チャネル・タンパク質、
（８）受容体キナーゼタンパク質、
（９）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、
（１０）膜結合酵素、および
（１１）輸送体タンパク質
からなる群から選択される疎水性タンパク質（ＨＰ）配列
からなる疎水性タンパク質を選択する工程と、
（ｂ）該疎水性タンパク質をショ糖勾配超遠心法によって精製する工程と、
（ｃ）該疎水性タンパク質を抗体アフィニティ精製によって精製する工程と、
（ｄ）該疎水性タンパク質を固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィによって精製する工程と
からなる疎水性タンパク質を単離する方法。
【請求項４０】
（ａ）真核細胞におけるタンパク質発現用のベクター・ポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）下記の要素、すなわち
（ｉ）Ｎ末端メチオニン残基、
（ｉｉ）該Ｎ末端メチオニン配列および異種シグナル配列が、
（１）ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２４）、
（２）ＭＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ（配列番号２５）、
（３）ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ（配列番号２６）、
（４）ＭＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号２７）、および
（５）ＭＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号２８）
からなる群から選択される異種シグナル配列（ＳＳ）、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列、
（ｉｖ）（１）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）、
（２）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）、
（３）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）、
（４）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）、および
（５）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）からなる群から選択されるアフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列、
（ｖ）（１）膜タンパク質、
（２）内在性膜タンパク質
（３）膜貫通タンパク質、
（４）モノトピック型膜タンパク質、
（５）ポリトピック型膜タンパク質、
（６）ポンプ・タンパク質、
（７）チャネル・タンパク質、
（８）受容体キナーゼタンパク質、
（９）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、
（１０）膜結合酵素、および
（１１）輸送体タンパク質
からなる群から選択される疎水性タンパク質（ＨＰ）配列
を含む人工的に改変された疎水性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と
を含む、疎水性タンパク質の発現に適した単離核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理学および医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、新規な薬剤および医学的診断の開発に特に関連の深い個別のリガンド分子の同定のため、疎水性タンパク質をスクリーニングすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
疎水性タンパク質（ＨＰ）の機能のアゴニストおよびアンタゴニストの開発において、疎水性タンパク質は製薬産業に独自の問題を提起している。この問題は、ＨＰが容易に精製されず、単離された形で働くことが難しいこと（例えば溶解度の問題）から生じている。疎水性タンパク質が無極性であると仮定すると、このタンパク質はとりわけ細胞の脂質２重層とその内部の細胞小器官に結合している可能性がある。非限定的な例として、疎水性タンパク質という用語には、膜タンパク質、内在性膜タンパク質、膜貫通タンパク質、モノトピック型膜タンパク質、ポリトピック型膜タンパク質、ポンプ・タンパク質（酵素のサブクラス）、チャネル・タンパク質、受容体キナーゼタンパク質、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、膜結合酵素、輸送体タンパク質などが含まれる。これらのタンパク質は、細胞内および細胞間のシグナル伝達と、細胞とその環境との一般的な関係、例えば溶質移動などにおいて、しばしば重要な役割を果たす。したがって疎水性タンパク質は、薬物開発の重要な標的である。
【０００３】
ヒトゲノム・プロジェクトによって、ゲノムにコードされた親水性および疎水性のタンパク質の構造と機能とに関する膨大な量の情報が提供されることになる。例えば、ヒトゲノムでは１，７００〜５，０００個のＧタンパク質共役受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）が発見されると予測される（マルキーズ、エーら（Ｍａｒｃｈｅｓｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．第２０巻：３７０ページ；ヘニコフ、エスら（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２７８巻：６０９ページ）。しかし、疎水性タンパク質に結合するリガンドを同定するための適切なスクリーニング方法がないので、ヒトゲノム・プロジェクトによって同定された何百ものＧＰＣＲは、その研究を進めるための既知のリガンドを全く持っていないオーファン（孤児）受容体として分類されることになる。ＧＰＣＲは医学に非常に重要であるので、例えば配列データや変異体データ、リガンド結合データに関する情報を提供するべく個別のデータベースが確立されている（ホーン、エフら（Ｈｏｒｎ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２６巻：２２７〜２８１ページ）。したがって当技術分野では、ＨＰリガンド同定のためのスクリーニング方法、特に処理能力の高い方法の開発が必要とされている。
【０００４】
従来技術では、アフィニティ選択に基づいたＨＰのスクリーニングの記録がない。その代わりこれらの標的は、機能的アッセイまたはリガンド置換アッセイでスクリーニングされる。ＨＰをスクリーニングするのに使用される全てのリガンド置換アッセイおよびほとんどの機能的アッセイは、細胞を用いた形式で実施される（例えば、いずれも細胞を用いたメラノフォア・アッセイを開示するジャヤウィックレム、シー  ケー（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ，Ｃ．Ｋ．）およびコスト、ティー  エー（Ｋｏｓｔ，Ｔ．Ａ．）（１９９７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第８巻：６２９〜６３４ページならびにチェン、ジーら（Ｃｈｅｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  第５７巻：１２５〜１２４ページ；細胞を用いた蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づいたアッセイを開示するメア、エルら（Ｍｅｒｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  第４巻：３６３〜３６９ページ；および細胞を用いたエクオリン・アッセイを開示するシェーファー、エム  ティーら（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ＆Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１９巻：９２７〜９３８ページ参照）か、または未精製の細胞膜調製物を用いる（例えば、ミクロソームを用いたアッセイを開示するクロムリッシュら（Ｃｒｏｍｌｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．）の米国特許第５，５４３，２９７号参照：および膜調製物を使用した放射リガンド置換アッセイを開示するラベラ、エフ  エスら（Ｌａｂｅｌｌａ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．）Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．（１９８５年）第４４巻：２８０６〜２８１１ページ参照）かのいずれかである。これらのスクリーニング形式は分子レベルの定義が不明確であり、シグナル対ノイズ比が低く、偽陽性が生じ、標的タンパク質が発現する程度のばらつきおよび遺伝子発現パラメータの大きなばらつきの影響を受ける。
【０００５】
非常にまれであるが、スクリーニングのためにＨＰ標的が精製される。例えば、界面活性剤（デタージェント）で可溶化された形に精製されたＣＯＸ−２は、均一溶液相アッセイでその酵素活性をモニタリングすることによりスクリーニング可能であり、このアッセイにおいて酵素活性に対する小分子阻害剤を薬物リードとして同定し得る（ソング、ワイら（Ｓｏｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第４２巻：１１５１〜１１６０ページ、およびバーネット、ジェイら（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  第１２０９巻：１３０〜１３９ページ参照）。代替例として、スクリーニングのためにＨＰを担体に結合することが可能である（スクラー、エル  エーら（Ｓｋｌａｒ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  第２８巻：９７６〜９８５ページ；ビエリ、シーら（Ｂｉｅｒｉ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第１７巻：１１０５〜１１０８ページ；およびシュミット、イー  エルら（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｅ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９８年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７０巻：１３３１〜１３３８ページ参照）。しかし、機能に関する読出し情報を使用するスクリーニング・アッセイでは、標的の機能を前もって推測する。また、医学的診断に使用される多くの造影剤の場合と同様に、多くの所望のタンパク質リガンドはアッセイ可能な機能を変化させず、タンパク質に単に結合するだけである。
【０００６】
水溶性タンパク質に対するリガンドを同定するためのアフィニティ選択は、当技術分野で知られている。例えば、ナッシュら（Ｎａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．）による国際公開番号第９９／３５１０９号は、アフィニティ選択と質量分析による結合リガンドの同定との組合せに有用なマスコード・コンビナトリアル・ライブラリを生成するための方法について述べている。ジンダルら（Ｊｉｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．）による国際特許出願の国際公開番号第９７／０１７５５号は、標的分子に結合したリガンドのアフィニティ選択について、その後の多次元クロマトグラフィ法によるリガンド分子の単離と組み合わせて述べている。さらに、パントリアノら（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）による米国特許第６，０２０，１４１号は、熱シフト・アッセイによるリガンドの同定と組み合わせたアフィニティ選択の方法について述べている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リガンドのアフィニティ選択およびリガンド同定によるこれらの進歩にもかかわらず、純粋なＨＰを生物学的に活性な高次構造に維持するために必要な過剰な両親媒性物質の存在が障害となるため、水に不溶なＨＰ標的にアフィニティ選択を適用するには基本的な問題が依然として存在している。
【０００８】
水溶性タンパク質の調製と純粋なＨＰの調製との相違を理解することが重要である。ＨＰは、ＨＰの疎水性部分と両親媒性物質の疎水性部分との間の疎水的相互作用によって溶媒和する。純粋な水溶性タンパク質の調製では、全ての緩衝成分が親水性であり、水和によって、あるいは静電結合またはイオン結合に加わることによって、タンパク質を溶媒和する。それに対し、純粋なＨＰを調製する際の両親媒性物質は、コロイドとしての性質を溶液にもたらす。一般にＨＰは、１００〜１０，０００倍の過剰なモル濃度の界面活性剤中で精製される。これらの両親媒性の界面活性剤分子は、ＨＰおよびスクリーニングされる薬物分子の両方と相互作用する。さらに両親媒性物質は、ほとんどのタンパク質とちょうど同じ大きさの、ミセルやリポソームなどの高分子アセンブリを形成する。これらの高分子アセンブリは、両親媒性物質に可溶化されたＨＰの溶液にコロイドとしての性質をもたらし、ＨＰと可溶性タンパク質とがさらに区別される。
【０００９】
可溶性タンパク質標的と比較すると、ＨＰ−両親媒性物質の調製は特に複雑であるため、結合リガンドの検出が妨げられ、スクリーニング感度が低下し、高率で偽陽性となる。典型的な調製において、このような複雑な問題を引き起こす分子の実体を、ＨＰ−両親媒性物質の複合体（２０μＭ、ＨＰ：両親媒性物質：：１：５〜２５０；ＭＷ＝５０〜５００ｋＤ）と、ミセル（５０００μＭ  ＭＷ＝６０ｋＤ）と、モノマー両親媒性物質（５００μＭ；ＭＷ＝１２００）とであると特定することが可能である。同じような水溶性タンパク質の調製では、２０μＭのタンパク質だけを得ることになる。どちらの場合も、緩衝剤（例えばトリスまたはリン酸ナトリウム）と塩（例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ）を含ませることも可能である。ＨＰタンパク質の調製では、様々な両親媒性物の存在により、可溶性タンパク質の調製では見られない特別な複雑さが示される。
【００１０】
したがって当技術分野では、ＨＰ標的の特定の生物学的機能とは関係なく両親媒性物質の存在下で実施可能な、アフィニティ選択に基づいたＨＰスクリーニング法が、引き続き求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＨＰ標的の特定の生物学的機能とは関係なく両親媒性物質の存在下で実施可能な、アフィニティ選択に基づいたＨＰスクリーニング法を提供する。
【００１２】
本発明は、両親媒性物質の存在下で薬物様小分子のＨＰに対する特異的結合の検出を可能にすることによって、ＨＰリガンドのアフィニティ選択に関連した問題を解決する。さらに本発明は、スクリーニングを行うのに有用な精製ＨＰを生成するための新規な方法および組成物も提供する。これらの発見は、組成物および方法を含む本発明を提供するために利用されている。
【００１３】
第１の態様では、本発明は、（ａ）疎水性標的タンパク質とリガンド分子との少なくとも１個の複合体の形成が促進されるように、両親媒性物質が結合している疎水性標的タンパク質を多数の分子に曝すことによるアフィニティ選択により、リガンド分子を選択する工程と、（ｂ）該複合体を非結合分子から分離する工程と、（ｃ）リガンド分子を同定する工程とからなる、疎水性タンパク質のリガンドを同定する方法を提供する。
【００１４】
第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質を多数の分子に曝すことが、均一溶液相の条件下で行われる。第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質を多数の分子に曝すことが、不均一溶液相の条件下で行われる。第１の態様のある実施形態では、リガンド分子の選択が、多次元クロマトグラフィを使用して行われる。
【００１５】
第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質が、膜タンパク質、内在性膜タンパク質、膜貫通タンパク質、モノトピック型膜タンパク質、ポリトピック型膜タンパク質、ポンプ・タンパク質、チャネル・タンパク質、受容体キナーゼタンパク質、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、膜結合酵素、および輸送体タンパク質からなる群から選択される。
【００１６】
第１の態様のある実施形態では、多数の分子はマスコードされた分子ライブラリである。第１の態様のある実施形態では、多数の分子はマスコードされていない分子のライブラリである。第１の態様のある実施形態では、両親媒性物質が、（ａ）極性脂質と、（ｂ）両親媒性高分子ポリマーと、（ｃ）表面活性物質（サーファクタント）または界面活性剤と、（ｄ）両親媒性ポリペプチドとからなる群から選択される。第１の態様のある実施形態では、リガンド分子の同定が、質量スペクトル分析によって行われる。第１の態様のある実施形態では、リガンド分子のデコンボリューションが、質量スペクトル分析によって行われる。第１の態様のある実施形態では、複合体の非結合分子からの分離が、固相クロマトグラフィの媒体を用いて行われる。
【００１７】
第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質が、（ａ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列と、（ｂ）アフィニティ精製に有用な少なくとも２つのタグ配列と、（ｃ）疎水性タンパク質（ＨＰ）配列とからなる。前記態様のある実施形態では、疎水性タンパク質配列が、（ａ）膜タンパク質と、（ｂ）内在性膜タンパク質と、（ｃ）膜貫通タンパク質と、（ｄ）モノトピック型膜タンパク質と、（ｅ）ポリトピック型膜タンパク質と、（ｆ）ポンプ・タンパク質と、（ｇ）チャネル・タンパク質と、（ｈ）受容体キナーゼタンパク質と、（ｉ）Ｇタンパク共役受容体タンパク質と、（ｊ）膜結合酵素と、（ｋ）輸送体タンパク質とからなる群から選択される。前記態様のある実施形態では、タグ配列が、（ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）と、（ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）と、（ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）と、（ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）と、（ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）と、（ｆ）ロドプシン・タグ（ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰＷＱＦＳＭ−ＣＯＯＨ）（配列番号６）とからなる群から選択されたエピトープ・タグ配列からなる。
【００１８】
第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質が、（ａ）タグ１−タグ２−ＨＰと、（ｂ）タグ１−ＨＰ−タグ２と、（ｃ）ＨＰ−タグ１−タグ２とからなる群から選択された順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで並ぶ配列からなる。前記態様のある実施形態では、本発明は、疎水性標的タンパク質が、（ａ）Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体（ｍＡＣｈＲ）（配列番号７）と、（ｂ）Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号８）と、（ｃ）ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号９）と、（ｄ）Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号１０）と、（ｅ）ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号１１）とからなる群から選択される方法を提供する。前記態様のある実施形態では、本発明は、疎水性標的タンパク質が、アミノ末端に異種シグナル配列（ＳＳ）をさらに含む方法を提供する。前記態様のある実施形態では、異種シグナル配列が、（ａ）メリチン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１２）と、（ｂ）ＧＰシグナル配列ＮＨ２−ＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）と、（ｃ）ヘマグルチニン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１４）と、（ｄ）ロドプシン・タグ１シグナル配列ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１５）と、（ｅ）ロドプシン・タグＩＤ４シグナル配列ＮＨ２−ＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１６）とからなる群から選択される。前記態様のある実施形態では、タグ配列がヘキサヒスチジン配列（配列番号１７）とデカヒスチジン配列（配列番号１８）とをさらに含む。前記態様の別のある実施形態では、疎水性標的タンパク質が、（ａ）ＧＰ６７  ＳＳ−Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、（ｂ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号２０）と、（ｃ）ヘマグルチニンＳＳ−ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号２１）と、（ｄ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号２２）と、（ｅ）ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号２３）とからなる群から選択される。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、（ａ）疎水性タンパク質をショ糖勾配超遠心法によって精製する工程と、（ｂ）疎水性タンパク質を抗体アフィニティ精製によって精製する工程と、（ｃ）疎水性タンパク質を固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィによって精製する工程とからなる疎水性タンパク質を単離する方法を提供する。
【００２０】
第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質が、（ａ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列と、（ｂ）アフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列と、（ｃ）疎水性タンパク質（ＨＰ）配列とからなる。前記態様のある実施形態では、疎水性タンパク質配列が、（ａ）膜タンパク質と、（ｂ）内在性膜タンパク質と、（ｃ）膜貫通タンパク質と、（ｄ）モノトピック型膜タンパク質と、（ｅ）ポリトピック型膜タンパク質と、（ｆ）ポンプ・タンパク質と、（ｇ）チャネル・タンパク質と、（ｈ）受容体キナーゼタンパク質と、（ｉ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質と、（ｊ）膜結合酵素と、（ｋ）輸送体タンパク質とからなる群から選択される。第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質のタグ配列が、（ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）と、（ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）と、（ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）と、（ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）と、（ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）と、（ｆ）ロドプシン・タグ（ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰＷＱＦＳＭ−ＣＯＯＨ）（配列番号６）とからなる群から選択されたエピトープ・タグ配列からなる。第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質が、（ａ）タグ１−タグ２−ＨＰと、（ｂ）タグ１−ＨＰ−タグ２と、（ｃ）ＨＰ−タグ１−タグ２とからなる群から選択された順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで並ぶ配列からなる。
【００２１】
第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質が、（ａ）Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号７）と、（ｂ）Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号８）と、（ｃ）ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号９）と、（ｄ）Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号１０）と、（ｅ）ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号１１）とからなる群から選択される。前記態様のある実施形態では、疎水性タンパク質がアミノ末端に異種シグナル配列（ＳＳ）をさらに含む。前記態様のある実施形態では、異種シグナル配列が、（ａ）メリチン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１２）と、（ｂ）ＧＰシグナル配列ＮＨ２−ＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）と、（ｃ）ヘマグルチニン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１４）と、（ｄ）ロドプシン・タグ１シグナル配列ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１５）と、（ｅ）ロドプシン・タグＩＤ４シグナル配列ＮＨ２−ＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１６）とからなる群から選択される。第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質のタグ配列が、ヘキサヒスチジン配列（配列番号１７）とデカヒスチジン配列（配列番号１８）とからさらになる。
【００２２】
前記態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質が、（ａ）ＧＰ６７  ＳＳ−Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、（ｂ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号２０）と、（ｃ）ヘマグルチニンＳＳ−ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号２１）と、（ｄ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号２２）と、（ｅ）ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号２３）とからなる群から選択される。
【００２３】
第３の態様では、本発明は、（ａ）真核細胞におけるタンパク質発現用のベクター・ポリヌクレオチド配列と、（ｂ）下記の要素、すなわち（ｉ）Ｎ末端メチオニン残基、（ｉｉ）異種シグナル配列（ＳＳ）、（ｉｉｉ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列、（ｉｖ）アフィニティ精製に有用な少なくとも２つのタグ配列、および（ｖ）疎水性タンパク質（ＨＰ）配列からなる人工的に改変された疎水性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列とからなる、疎水性タンパク質の発現に適した単離核酸分子を提供する。前記態様のある実施形態では、Ｎ末端メチオニン配列および異種シグナル配列が、（ａ）ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２４）と、（ｂ）ＭＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ（配列番号２５）と、（ｃ）ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ（配列番号２６）と、（ｄ）ＭＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号２７）と、（ｅ）ＭＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号２８）とからなる群から選択される。
【００２４】
前記態様のある実施形態では、タグ配列が、（ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）と、（ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）と、（ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）と、（ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）と、（ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）とからなる群から選択されたエピトープ・タグ配列からなる。
【００２５】
第３の態様のある実施形態では、人工的に改変された疎水性タンパク質の要素が、（ａ）ＳＳ−タグ１−タグ２−ＨＰと、（ｂ）ＳＳ−タグ１−ＨＰ−タグ２と、（ｃ）ＳＳ−ＨＰ−タグ１−タグ２とからなる群から選択された順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される。前記態様のある実施形態では、人工的に改変された疎水性タンパク質が、（ａ）ＧＰ６７  ＳＳ−Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、（ｂ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号２０）と、（ｃ）ヘマグルチニンＳＳ−ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号２１）とからなる群から選択される。第３の態様のさらなる実施形態では、タグ配列が、ヘキサヒスチジン配列（配列番号１７）とデカヒスチジン配列（配列番号１８）とからさらになる。
【００２６】
第４の態様では、本発明は、疎水性タンパク質のリガンドを同定する方法であって、（ａ）（ｉ）膜タンパク質、（ｉｉ）内在性膜タンパク質、（ｉｉｉ）膜貫通タンパク質、（ｉｖ）モノトピック型膜タンパク質、（ｖ）ポリトピック型膜タンパク質、（ｖｉｉ）ポンプ・タンパク質、（ｖｉｉｉ）チャネル・タンパク質、（ｉｘ）受容体キナーゼタンパク質、（ｘ）Ｇタンパク共役受容体タンパク質、（ｘｉｉ）膜結合酵素、および（ｘｉｉｉ）輸送体タンパク質からなる群から疎水性標的タンパク質を選択する工程と、該疎水性タンパク質に、（ｉ）極性脂質、（ｉｉ）両親媒性高分子ポリマー、（ｉｉｉ）表面活性物質または界面活性剤、および（ｉｖ）両親媒性ポリペプチドからなる群から選択される両親媒性物質が結合していることと、（ｂ）疎水性標的タンパク質とリガンド分子との少なくとも１つの複合体の形成が促進されるように、均一または不均一な溶液相の条件下、両親媒性物質が結合している疎水性標的タンパク質をマスコード・ライブラリ由来の多数の分子に曝すことによるアフィニティ選択により、多次元クロマトグラフィを使用してリガンド分子を選択する工程と、（ｃ）非結合分子から複合体を分離する工程と、（ｄ）質量スペクトル分析によってリガンド分子を同定する工程とからなる方法を提供する。
【００２７】
第５の態様では、本発明は、疎水性タンパク質に対するリガンドを同定するための方法であって、（ａ）（ｉ）膜タンパク質、（ｉｉ）内在性膜タンパク質、（ｉｉｉ）膜貫通タンパク質、（ｉｖ）モノトピック型膜タンパク質、（ｖ）ポリトピック型膜タンパク質、（ｖｉｉ）ポンプ・タンパク質、（ｖｉｉｉ）チャネル・タンパク質、（ｉｘ）受容体キナーゼタンパク質、（ｘ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、（ｘｉｉ）膜結合酵素、および（ｘｉｉｉ）輸送体タンパク質からなる群から疎水性標的タンパク質を選択する工程と、疎水性タンパク質に、（ｉ）極性脂質、（ｉｉ）両親媒性高分子ポリマー、（ｉｉｉ）表面活性物質または界面活性剤、および（ｉｖ）両親媒性ポリペプチドからなる群から選択される両親媒性物質が結合していることと、（ｂ）疎水性標的タンパク質とリガンド分子との少なくとも１つの複合体の形成が促進されるように、均一または不均一な溶液相の条件下、両親媒性物質が結合している疎水性標的タンパク質をマスコードされていないライブラリ由来の多数の分子に曝すことによるアフィニティ選択により、多次元クロマトグラフィを使用してリガンド分子を選択する工程と、（ｃ）非結合分子から複合体を分離する工程と、（ｄ）質量スペクトル分析によってリガンド分子を同定する工程とからなる方法を提供する。
【００２８】
第６の態様では、本発明は、疎水性タンパク質を単離する方法であって、（ａ）（ｉ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列と、（ｉｉ）（Ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号２９）、（Ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号３０）、（Ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３１）、（Ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３２）、および（Ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号３３）からなる群から選択されたアフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列と、（ｉｉｉ）（Ａ）膜タンパク質、（Ｂ）内在性膜タンパク質、（Ｃ）膜貫通タンパク質、（Ｄ）モノトピック型膜タンパク質、（Ｅ）ポリトピック型膜タンパク質、（Ｆ）ポンプ・タンパク質、（Ｇ）チャネル・タンパク質、（Ｈ）受容体キナーゼタンパク質、（Ｉ）Ｇタンパク共役受容体タンパク質、（Ｊ）膜結合酵素、および（Ｋ）輸送体タンパク質からなる群から選択された疎水性タンパク質（ＨＰ）配列とからなる疎水性タンパク質を選択する工程と、（ｂ）疎水性タンパク質をショ糖勾配超遠心法によって精製する工程と、（ｃ）疎水性タンパク質を抗体アフィニティ精製によって精製する工程と、（ｄ）疎水性タンパク質を固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィによって精製する工程とからなる方法を提供する。
【００２９】
第７の態様では、本発明は、（ａ）真核細胞におけるタンパク質発現用のベクター・ポリヌクレオチド配列と、（ｂ）下記の要素、すなわち（ｉ）Ｎ末端メチオニン残基と、（ｉｉ）Ｎ末端メチオニン配列および異種シグナル配列が、（１）ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２４）、（２）ＭＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ（配列番号２５）、（３）ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ（配列番号２６）、（４）ＭＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号２７）、および（５）ＭＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号２８）からなる群から選択される異種シグナル配列（ＳＳ）と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列と、（ｉｖ）（１）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）、（２）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）、（３）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）、（４）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）、および（５）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）からなる群から選択されるアフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列と、（ｖ）（１）膜タンパク質、（２）内在性膜タンパク質、（３）膜貫通タンパク質、（４）モノトピック型膜タンパク質、（５）ポリトピック型膜タンパク質、（６）ポンプ・タンパク質、（７）チャネル・タンパク質、（８）受容体キナーゼタンパク質、（９）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、（１０）膜結合酵素、および（１１）輸送体タンパク質からなる群から選択される疎水性タンパク質（ＨＰ）配列とを含む人工的に改変された疎水性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列とを含む、疎水性タンパク質の発現に適した単離核酸分子を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、薬理学および医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、新規な薬剤および医学的診断の開発に特に関連の深い個別のリガンド分子の同定のため、疎水性タンパク質をスクリーニングすることに関する。
【００３１】
本明細書で引用される特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を明らかにする。発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、および本明細書で引用された参考文献を本願明細書に援用する。これらの出典と本明細書との矛盾は、後者を優先することによって解消される。
【００３２】
本発明は、ＨＰ標的の特定の生物学的機能とは無関係に両親媒性物質の存在下で実施可能な、アフィニティ選択に基づいたＨＰスクリーニング法を提供する。
【００３３】
本発明の態様は、分子生物学、細胞生物学、および免疫学の分野で一般的な技法および方法を利用する。これらのタイプの方法に有用な実験室用参考文献は、当業者に容易に利用可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第２版、サムブルック、ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュ、ビー  エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｂ．Ｆ．）、およびマニアティス、ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）編、（１９８９年）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）［ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）所在］；ハーロー・アンド・レーン（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）所在］を参照されたい。
【００３４】
本明細書における本発明は、疎水性タンパク質の調製および精製に関し、また疎水性タンパク質に特異的に結合するリガンドを同定する方法に関する。本明細書で使用する「疎水性タンパク質」という用語は、両親媒性物質と共に調製された任意の精製タンパク質を指す。あるいはこの用語は、純度１％を超えて精製され、または純度１０％を超えて精製され、または純度２５％を超えて精製され、または純度５０％を超えて精製されたときに、安定性（保存寿命または凍結融解サイクルに耐える能力）を高めるため、あるいは酵素分析、リガンド結合アッセイ、円偏向２色性、平均サイズ、形状、または密度の流体力学的評価、高次構造に特異的な抗体との相互作用を含めた一般的な実験室技法により観察される高次構造の完全性を維持するため、機能的アッセイに両親媒性物質の存在を必要とするかもしくはその存在が利益となる、任意のタンパク質を指してもよい。好ましい実施形態において、本発明の疎水性タンパク質は哺乳動物の疎水性タンパク質である。特に好ましい実施形態では、本発明の疎水性タンパク質はヒトの疎水性タンパク質である。
【００３５】
「疎水性タンパク質」という用語は、疎水性タンパク質の同定のために設計されたアルゴリズムの下記の非限定的な例、すなわち（ａ）ＤＡＳ−Ｄｅｎｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ法を使用した、原核細胞における膜貫通領域の予測（ストックホルム大学）、エム、チェルゾ（Ｍ．Ｃｓｅｒｚｏ）、イー、ワリン（Ｅ．Ｗａｌｌｉｎ）、アイ、シモン（Ｉ．Ｓｉｍｏｎ）、ジー、フォン・ヘイネ（Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ）、およびエー、エロフソン（Ａ．Ｅｌｏｆｓｓｏｎ）：原核生物の膜タンパク質における膜貫通αへリックスの予測：Ｄｅｎｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ法（Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins:the Dense Alignment Surface method ）；Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．第１０巻、第６号、６７３〜６７６ページ、１９９７年；（ｂ）ＨＭＭＴＯＰ−タンパク質の膜貫通ヘリックスおよびトポロジーの予測（ハンガリー科学アカデミー）、ジー  イー、タスナディ（Ｇ．Ｅ．Ｔｕｓｎａｄｙ）およびアイ、シモン（Ｉ．Ｓｉｍｏｎ）（１９９８年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２８３巻、４８９〜５０６ページ；（ｃ）隠れマルコフモデル予測、イー  エル  エル、ゾーンハンマー（ＥＬＬ  Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ）、ジー、フォン  ヘイネ（Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ）、およびエー、クロー（Ａ．Ｋｒｏｇｈ）：Ａ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．分子生物学のためのインテリジェント・システムに関する第６回国際会議要旨集（ＩＳＭＢ９８）、１７５〜１８２ページ、１９９８年；（Ｄ）ＴＭＡＰ−多重配列アライメントに基づく膜貫通検出（カロリンスカ研究所（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；スウェーデン）参考文献なし：ＵＲＬ  http//www.mbb.ki.se/tamp/ を参照のこと；および（ｅ）ＴｏｐＰｒｅｄ  ２−膜タンパク質のトポロジー予測（ストックホルム大学）を用いたバイオインフォマティクス支援手段によって同定されたタンパク質も含む。「膜タンパク質構造予測、疎水性の分析と正電荷の分布の偏り（Membrane Protein Structure Prediction,Hydrophobicity Analysis and the Positive-inside Rule）」、ガンナー  フォン  ヘイネ（Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２年）第２２５巻、４８７〜４９４ページ、ならびにエム、チェルゾ（Ｍ．Ｃｓｅｒｚｏ）、イー、ワリン（Ｅ．Ｗａｌｌｉｎ）、アイ、シモン（Ｉ．Ｓｉｍｏｎ）、ジー、フォン  ヘイネ（Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ）、およびエー、エロフソン（Ａ．Ｅｌｏｆｓｓｏｎ）：原核生物の膜タンパク質における膜貫通αへリックスの予測：Ｄｅｎｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ法（Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins):the Dense Alignment Surface method）；Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．第１０巻、第６号、６７３〜６７６ページ、１９９７年。
【００３６】
これらの方法の比較のため、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ誌、第１０巻、第６号（１９９７年）に記載されている「原核生物の膜タンパク質における膜貫通αへリックスの予測：Ｄｅｎｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ法（Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins:the dense alignment surface method ）」、ミクロス  チェルゾ（Ｍｉｋｌｏｓ  Ｃｓｅｒｚｏ）、エリック  ワリン（Ｅｒｉｋ  Ｗａｌｌｉｎ）、イスタヴァン  シモン（Ｉｓｔｖａｎ  Ｓｉｍｏｎ）、ガンナー  フォン  ヘイネ（Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ）、およびアーン・エロフソン（Ａｒｎｅ  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ）を参照されたい。
【００３７】
単なる典型的な例として、疎水性タンパク質（本明細書で使用される用語として）の非限定的な例を表１に示す。これらのタンパク質は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のローカス名で表示されるように、ＧｅｎＢａｎｋにリスト化されている。
【００３８】
【表１】
2005506039.tif 000003
【表１Ａ】
2005506039.tif 000004
【表１Ｂ】
2005506039.tif 000005
当業者には理解されるように、疎水性タンパク質のリガンドを同定する方法は、小分子を結合するリガンドのスクリーニング方法と同義である。さらに、本明細書で使用するように、「スクリーニング」という用語は、例えば疎水性タンパク質などのポリペプチドと小分子との相互作用を検出するのに使用される手順を指し、Ｋｄ＜２００μＭでタンパク質に結合するリガンドと、タンパク質に結合しないかまたはＫｄ＞２００μＭでタンパク質に非常に弱く結合するにすぎない大きなリガンド集合とを区別するのに有用である。
【００３９】
本発明は、疎水性タンパク質リガンドの同定において、質量スペクトル分析（質量分析）法（ＭＳ）を利用する。ＭＳ技法は、疎水性タンパク質を含有するサンプルを分析するためにはまれにしか行われないが、その理由はこれらのサンプルが界面活性剤の両親媒性物質を含有するからである。界面活性剤は、検体のイオン形成、すなわちＭＳにとって極めて重要な現象を抑制し、ＭＳを著しく妨げるので、疎水性タンパク質のＭＳ分析がうまく行われたという報告はほとんどない。それにもかかわらず、いくつかの研究室は、ＭＳ分析の前に界面活性剤を除去する方法を明らかにすることにより精製済みの疎水性タンパク質のＭＳ分析を行うことを試みてきた。これらの研究室の全てが、タンパク質サンプルを検出器にかけるためにマトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）を使用する。
【００４０】
しかし、疎水性タンパク質のサンプルを調製する既知の方法全てが、ＭＳ分析の前にポリペプチドから界面活性剤を抽出するために有機溶媒および／または酸を使用する。そのような処理によりポリペプチドが変性し、変性によりリガンドが検体の疎水性タンパク質に結合することができなくなる。疎水性タンパク質とリガンドとの相互作用に関する研究にＭＳを使用することに興味を持っている研究者にとって、変性を生じる調製法は適切ではない。さらに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる分析のため膜タンパク質を調製することは、本発明によって提供される方法に比べて労力を要する仕事である。
【００４１】
これとは対照的に、ある好ましい実施形態では、本発明は、膜タンパク質サンプルがＳＥＣ分離からＭＳ検出器に移るときにそのサンプルを流体として扱うことが可能であるエレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）ＭＳを使用する。したがって、ＭＳ分析は、サンプルがＲＰＣカラムに送られた後３０秒未満で進行する。
【００４２】
質量スペクトル分析の前にタンパク質サンプルから界面活性剤を除去しなければならない理由は周知であり、例えば下記の参考文献：（ａ）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９７年）第２２巻：２４４〜２５０ページ；ジェイ  ピーシー  ヴィッサーズ（Ｊ．ＰＣ．Ｖｉｓｓｅｒｓ）、ジェイ  ピー  シャーベット（Ｊ．−Ｐ、  Ｃｈｅｒｖｅｔ）、ケイ  サンボーン（Ｋ．Ｓａｎｂｏｒｎ）、およびジェイ  ピー  ザルツマン（Ｊ．−Ｐ  Ｓａｌｚｍａｎｎ）；（ｂ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）第３巻：１９７５〜１９８３ページ；アール  アール  オゴルザレク  ルー（Ｒ．Ｒ．Ｏｇｏｒｚａｌｅｋ  Ｌｏｏ）、エヌ  デールズ（Ｎ．Ｄａｌｅｓ）およびピー  シー  アンドリュース（Ｐ．Ｃ．Ａｎｄｒｅｗｓ）；（ｃ）Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（１９９５年）第３０巻：１４６２〜８ページ、ロシンカ  ビー（Ｒｏｓｉｎｋｅ  Ｂ）、ストルパット  ケイら（Ｓｔｒｕｐａｔ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９６年）第２７０巻：５１９〜５１ページ；ベアビス  アールシー（Ｂｅａｖｉｓ，ＲＣ）およびチェイト  ビーティー（Ｃｈａｉｔ，ＢＴ）；およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０年）第８７巻：６８７３〜７ページ；ベアビス
アールシー（Ｂｅａｖｉｓ，ＲＣ）およびチェイト  ビーティー（Ｃｈａｉｔ，ＢＴ）；ファーンレイ  アイ  エムら（Ｆｅａｒｎｌｅｙ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、（１９９６年）第２４巻：１２〜９１７ページ、に示されている。
【００４３】
第１の態様では、本発明は、疎水性タンパク質のリガンドを同定する方法であって、（ａ）疎水性標的タンパク質とリガンド分子との少なくとも１個の複合体の形成が促進されるように、両親媒性物質に結合された疎水性標的タンパク質を多数の分子に曝すことによるアフィニティ選択により、リガンド分子を選択する工程と、（ｂ）この複合体を非結合分子から分離する工程と、（ｃ）リガンド分子を同定する工程とからなる方法を提供する。
【００４４】
本発明のアフィニティ・スクリーニング法は、機能的選択法と区別される。機能的選択法は、ある特異的なタンパク質−リガンド相互作用またはタンパク質−タンパク質相互作用を有意であると認める基準に基づいてリガンドを選択することを含み、そのようなリガンド選択は、タンパク質に起因し得る作用（例えば酵素の化学触媒作用）、またはタンパク質とその他のある分子との間の何らかの相互作用（例えば、非酵素の場合は、タンパク質と既知の小分子リガンドとの相互作用）を確認することのいずれかに依存する。手短に言えば、これらのスクリーニング法は一般に、酵素的アッセイまたは生体機能的アッセイあるいはリガンド置換アッセイに基づくものである。
【００４５】
本発明の方法の様々な実施形態は、新規な薬物リードを発見するために自動リガンド同定システム（ＡＬＩＳ）を利用することが可能である。ＡＬＩＳは、化合物のその標的タンパク質に対する親和性に基づいてリガンドを選択し、質量スペクトル分析によってリガンドを同定する（国際特許出願国際公開番号第９９／３５１０９号を参照のこと）。本明細書で述べる発明では、両親媒性物質と複合したＨＰにＡＬＩＳを利用する。
【００４６】
本明細書で使用する「アフィニティ選択」という用語は、選択されたタンパク質標的に対するある分子の親和性に基づいたリガンド選択を意味し、そのようなリガンド選択は、タンパク質がその小分子に結合すること以外、問題のタンパク質の機能的活性には左右されない。
【００４７】
本明細書で使用する「両親媒性物質」という用語は、疎水性ポリペプチドの水溶性を高める界面活性剤、リン脂質、または表面活性物質としての性質を通常有する任意の分子、特に、水溶液中で会合コロイドとして振る舞うことが知られている任意の分子を指すのに使用され、そのような両親媒性物質の非限定的な例には、リン脂質およびその他の極性脂質（例えばホスファチジルコリン、リゾリン脂質、コレステロール、レシチン、セラミドなど）；両親媒性高分子ポリマー（例えばクリストフ  トリベット（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ  Ｔｒｉｂｅｔ）およびジーン−ルク  ポポット（Ｊｅａｎ−Ｌｕｃ  Ｐｏｐｏｔ）の研究（トリベット  シーら（Ｔｒｉｂｅｔ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｌ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６年）第９３巻：１５０４７〜５０ページ））；アルキルサッカライド、アルキルチオグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、コール酸塩およびＣＨＡＰＳシリーズ、ＦＯＳ−ＣＨＯＬＩＮＥ（登録商標）シリーズ、ＣＹＭＡＬ（登録商標）シリーズもしくはＣＹＧＬＵ（登録商標）シリーズなどの胆汁酸誘導体、グルカミド、ならびにアルキルポリオキシエチレンなどを含む表面活物物質；または両親媒性構造をとることが知られているポリペプチド（例えばシー  イー  シャフマイスター（Ｃ．Ｅ．Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ）およびアール  エム  ストラウド（Ｒ．Ｍ．Ｓｔｒｏｕｄ）の研究（シャフマイスター、シー  イーら（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．）、ＲＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３年）第２６２巻：７３４〜８ページ））が含まれるであろう。
【００４８】
本明細書で使用する「多数の分子」という用語は、疎水性標的タンパク質に対する特異的結合性に関して試験される複数の分子を指す。「分子」という用語は、サイズが１５０〜５０００原子質量単位（ａｍｕ）の範囲内にある任意の化合物を意味する。そのような化合物は、当技術分野で知られている任意の手段によって生成することが可能である。多数の分子を生成する特に好ましい方法は、コンビナトリアル・ケミストリーを利用する。「コンビナトリアル・ライブラリ」は、構造上関連のある、もしくは関連のない１組の化学的もしくは生化学的構築単位を、所与の化合物の長さに対してあらゆる可能な方法で結合することによって形成される、複数の分子または化合物を指す。あるいはこの用語は、特定の１組の化学的構築単位を選択的に結合することによって形成される、複数の化学的または生化学的化合物を指す。例えば、２０種のアミノ酸をランダムに結合して６量体ペプチドにすると、６４００万種以上の化合物を生成することになる。「コンビナトリアル・ライブラリ」の手法によれば、可能な限り多くの異なる化合物が作製され、次いで、問題の標的分子、例えば疎水性タンパク質に対する結合活性に関してそれらをスクリーニングすることにより候補化合物が選択される。
【００４９】
現在、コンビナトリアル・ライブラリを構築するための、当技術分野で周知の数多くの方法がある。非限定的な例として、下記の参考文献は、コンビナトリアル・ライブラリを構築するための方法を提供する：いくつか例を挙げると、米国特許第６，１４７，３４４号；（国際公開第９９／３５１０９号；第６，１１４，３０９号；第６，０２５，３７１号；第６，０１７，７６８号；第５，９６２，３３７号；第５，９１９、９５５号；および第５，８５６，４９６号がある。本明細書で使用する「多数の分子」という用語は、例えば体液、組織または細胞から得られた複数の天然分子または天然化合物を指してもよい。これらのサンプルを、リガンド・スクリーニング・プロトコルで使用する前にインビトロで、例えばタンパク質分解により消化するなどして処理してもよい。
【００５０】
第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質を多数の分子に曝すことが、均一溶液相の条件下で行われる。第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質を多数の分子に曝すことが、不均一溶液相の条件下で行われる。第１の態様のある実施形態では、リガンド分子の選択は多次元クロマトグラフィを使用して実施される。
【００５１】
本明細書で使用する「均一溶液相」という用語は、起こりうるタンパク質−リガンド相互作用を促進する目的でタンパク質と１つまたは複数のリガンドとを組み合わせたタンパク質調製物を意味するが；そのような調製物は、タンパク質もリガンドも支持要素に結合しないよう−４０〜６０℃の温度範囲においてはゾルの状態であり；これらの調製物は、カットオフ・サイズが５．０μＭの半透膜を通過するか、もしくは沈降係数が５００スベドベリ未満のように挙動するかのいずれか、またはその両方であり；そのような調製物の例には、両親媒性物質に可溶化されたタンパク質や、プロテオリポソームに取り込まれたタンパク質、細胞由来のウイルス様粒子に取り込まれたタンパク質などと、リガンドとの組合せが含まれると考えられる。
【００５２】
本明細書で使用する「不均一溶液相」という用語は、起こりうるタンパク質−リガンド相互作用を促進する目的でタンパク質と１つまたは複数のリガンドとを組み合わせたタンパク質調製物を意味するが；そのような調製物は、タンパク質またはリガンドのいずれかが支持要素に結合するよう−４０〜６０℃の温度範囲において混合物の状態であり；これらの調製物は、カットオフ・サイズが５．０μＭの半透膜を通過することができないか、もしくはこれらが５００スベドベリを超える沈降係数を有するかのように挙動するかのいずれか、またはその両方であり；そのような調製物の例には、タンパク質が共有結合もしくは非共有結合または両親媒性物質の自己会合に依存する結合のいずれかを介してビーズ／固定要素に付着している、ビーズ／固定要素の表面に存在するタンパク質とリガンドの組合せ、または固定相に固定されたリガンドとタンパク質との組合せが含まれると考えられる。
【００５３】
本明細書で使用される「多次元クロマトグラフィ」という用語は、連携する複数のクロマトグラフ法を含むサンプル処理手順を意味する。クロマトグラフ法の代表的なタイプには、（１）固相クロマトグラフィ媒体：小粒子（＜５μＭ）、固体多孔質キャスティング、フィルタ、または半透膜を含めた様々な材料のいずれかであって、一般に樹脂、ゲル、固定化人工膜、固相要素もしくはその他の名称で呼ばれるものであり、かつクロマトグラフィまたは電気泳動による分離または分画化のように、その表面上またはその表面を通って可溶化検体が通過し、またはその表面と可溶化検体とが相互に作用する固定表面を提供する目的で使用されるものと、（２）液相クロマトグラフィ媒体：固相クロマトグラフィ媒体と組み合わせて使用する場合、電気泳動による分離または分画化における使用に適した溶液または流体とが含まれる。
【００５４】
第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質は、膜タンパク質、内在性膜タンパク質、膜貫通タンパク質、モノトピック型膜タンパク質、ポリトピック型膜タンパク質、ポンプ・タンパク質、チャネル・タンパク質、受容体キナーゼタンパク質、Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、膜結合酵素、および輸送体タンパク質からなる群から選択される。
【００５５】
第１の態様のある実施形態では、多数の分子はマスコードされた分子ライブラリである。第１の態様のある実施形態では、多数の分子はマスコードされていない分子ライブラリである。
【００５６】
本明細書で使用する「マスコード・ライブラリ」という用語は、マスコードされたコンビナトリアル・ライブラリを指す。マスコード・コンビナトリアル・ライブラリの化合物は、一般式がＸ（Ｙ）ｎであって、Ｘは骨格であり、各Ｙは周辺部分であり、ｎは１より大きい整数で典型的には２から約６までである。本明細書で使用する「骨格」という用語は、２つ以上の周辺部分が共有結合を介して結合している分子の一部分を指す。骨格は、マスコードされた化合物群の各メンバに共通な、分子の一部分である。本明細書で使用する「周辺部分」という用語は、骨格に結合した分子の一部分を指す。マスコードされた化合物群の各メンバは骨格に結合したｎ個の周辺部分の組合せを含むことになり、この一連の化合物がマスコード・コンビナトリアル・ライブラリを形成する。マスコード・ライブラリについては、本願明細書に援用される特許出願国際公開番号第９９３５１０９Ａ１号にさらに詳細に述べられている。
【００５７】
本明細書で使用する「マスコードされていない分子のライブラリ」という文言は、マスコード・コンビナトリアル・プロセスによって作製されたのではない任意の複数の分子または化合物を意味する。したがってこの用語には、コンビナトリアル・ライブラリを作製するその他の方法のいずれか、および全てが含まれる。さらにこの用語は、標的タンパク質の構造に基づいて薬物を設計しようとする「構造に基づく薬物設計」の方法によって構築された化合物群と、体液、組織、または細胞から得られた天然の化合物ライブラリも含む。
【００５８】
第１の態様のある実施形態では、両親媒性物質が、（ａ）極性脂質と、（ｂ）両親媒性高分子ポリマーと、（ｃ）表面活性物質または界面活性剤と、（ｄ）両親媒性ポリペプチドとからなる群から選択される。第１の態様のある実施形態では、リガンドの同定を質量スペクトル分析によって行う。第１の態様のある実施形態では、リガンド分子のデコンボリューションを質量スペクトル分析によって行う。第１の態様のある実施形態では、非結合分子からの複合体の分離を固相クロマトグラフィ媒体により行う。
【００５９】
本明細書で使用する「リガンド（の）同定」という用語は、スクリーニングで検出された小分子の構造組成を正確に特定し得る任意のプロセスを意味する。
【００６０】
第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質は、（ａ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列と、（ｂ）アフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列と、（ｃ）疎水性タンパク質（ＨＰ）配列とからなる。この態様のある実施形態では、疎水性タンパク質配列が、（ａ）膜タンパク質と、（ｂ）内在性膜タンパク質と、（ｃ）膜貫通タンパク質と、（ｄ）モノトピック型膜タンパク質と、（ｅ）ポリトピック型膜タンパク質と、（ｆ）ポンプ・タンパク質と、（ｇ）チャネル・タンパク質と、（ｈ）受容体キナーゼタンパク質と、（ｉ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質と、（ｊ）膜結合酵素と、（ｋ）輸送体タンパク質とからなる群から選択される。この態様のある実施形態では、タグ配列が、（ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）と、（ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）と、（ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）と、（ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）と、（ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）と、（ｆ）ロドプシン・タグ（ＮＨ２ＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰＷＱＦＳＭ−ＣＯＯＨ）（配列番号６）とからなる群から選択されるエピトープ・タグ配列を含む。
【００６１】
第１の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質が、（ａ）タグ１−タグ２−ＨＰと、（ｂ）タグ１−ＨＰ−タグ２と、（ｃ）ＨＰ−タグ１−タグ２とからなる群から選択された順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで並ぶ配列を含む。この態様のある実施形態では、本発明は、疎水性標的タンパク質が、（ａ）Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号６）と、（ｂ）Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号７）と、（ｃ）ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号９）と、（ｄ）Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号１０）と、（ｅ）ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号１１）とからなる群から選択される方法を提供する。この態様のある実施形態では、本発明は、疎水性標的タンパク質がアミノ末端に異種シグナル配列（ＳＳ）をさらに含む方法を提供する。この態様のある実施形態では、異種シグナル配列が、（ａ）メリチン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１２）と、（ｂ）ＧＰシグナル配列ＮＨ２−ＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）と、（ｃ）ヘマグルチニン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１４）と、（ｄ）ロドプシン・タグ１シグナル配列ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１５）と、（ｅ）ロドプシン・タグＩＤ４シグナル配列ＮＨ２−ＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１６）とからなる群から選択される。この態様のある実施形態では、タグ配列が、ヘキサヒスチジン配列（配列番号１７）とデカヒスチジン配列（配列番号１８）とをさらに含む。さらにこの態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質が、（ａ）ＧＰ６７  ＳＳ−Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、（ｂ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号２０）と、（ｃ）ヘマグルチニンＳＳ−ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号２１）と、（ｄ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号２２）と、（ｅ）ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号２３）とからなる群から選択される。
【００６２】
第２の態様では、本発明は、（ａ）疎水性タンパク質をショ糖勾配超遠心法によって精製する工程と、（ｂ）疎水性タンパク質を抗体アフィニティ精製によって精製する工程と、（ｃ）疎水性タンパク質を固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィによって精製する工程とからなる疎水性タンパク質を単離する方法を提供する。
【００６３】
第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質が、（ａ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列と、（ｂ）アフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列と、（ｃ）疎水性タンパク質（ＨＰ）配列とからなる。この態様のある実施形態では、疎水性タンパク質配列が、（ａ）膜タンパク質と、（ｂ）内在性膜タンパク質と、（ｃ）膜貫通タンパク質と、（ｄ）モノトピック型膜タンパク質と、（ｅ）ポリトピック型膜タンパク質と、（ｆ）ポンプ・タンパク質と、（ｇ）チャネル・タンパク質と、（ｈ）受容体キナーゼタンパク質と、（ｉ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質と、（ｊ）膜結合酵素と、（ｋ）輸送体タンパク質とからなる群から選択される。第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質のタグ配列が、（ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）と、（ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）と、（ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）と、（ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）と、（ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）と、（ｆ）ロドプシン・タグ（ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰＷＱＦＳＭ−ＣＯＯＨ）（配列番号６）とからなる群から選択されるエピトープ・タグ配列を含む。第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質が、（ａ）タグ１−タグ２−ＨＰと、（ｂ）タグ１−ＨＰ−タグ２と、（ｃ）ＨＰ−タグ１−タグ２とからなる群から選択された順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで並ぶ配列を含む。
【００６４】
第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質が、（ａ）Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号７）と、（ｂ）Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号８）と、（ｃ）ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号９）と、（ｄ）Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号１０）と、（ｅ）ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号１１）とからなる群から選択される。この態様の実施形態では、疎水性タンパク質が、アミノ末端に異種シグナル配列（ＳＳ）をさらに含む。この態様のある実施形態では、異種シグナル配列が、（ａ）メリチン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１２）と、（ｂ）ＧＰシグナル配列ＮＨ２−ＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１３）と、（ｃ）ヘマグルチニン・シグナル配列ＮＨ２−ＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１４）と、（ｄ）ロドプシン・タグ１シグナル配列ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号１５）と、（ｅ）ロドプシン・タグＩＤ４シグナル配列ＮＨ２−ＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１６）とからなる群から選択される。第２の態様のある実施形態では、疎水性タンパク質のタグ配列が、ヘキサヒスチジン配列（配列番号１７）とデカヒスチジン配列（配列番号１８）とをさらに含む。
【００６５】
第２の態様のある実施形態では、疎水性標的タンパク質が、（ａ）ＧＰ６７  ＳＳ−Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、（ｂ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグ（配列番号２０）と、（ｃ）ヘマグルチニンＳＳ−ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶタグ−Ｍｙｃタグ（配列番号２１）と、（ｄ）メリチンＳＳ−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグ（配列番号２２）と、（ｅ）ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶタグ−８Ｈｉｓタグ（配列番号２３）とからなる群から選択される。
【００６６】
第３の態様では、本発明は、（ａ）真核細胞におけるタンパク質発現用のベクター・ポリヌクレオチド配列と、（ｂ）下記の要素、すなわち（ｉ）Ｎ末端メチオニン残基、（ｉｉ）異種シグナル配列（ＳＳ）、（ｉｉｉ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列、（ｉｖ）アフィニティ精製に有用な少なくとも２つのタグ配列、および（ｖ）疎水性タンパク質（ＨＰ）配列からなる人工的に改変された疎水性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列とからなる、疎水性タンパク質の発現に適した単離核酸分子を提供する。
【００６７】
「真核細胞におけるタンパク質発現用のベクター・ポリヌクレオチド配列」という文言は、真核細胞内での複製を可能にする複製起点と、選択可能なマーカー、例えば抗生物質耐性マーカーと、構造遺伝子の転写を促進するための、ウイルス、原核細胞、もしくは真核細胞由来のプロモーター配列要素とからなる任意のポリヌクレオチド配列を意味する。ベクター・ポリヌクレオチド配列の起源は、ウイルス、原核細胞、真核細胞、またはこれらを組み合わせたものである。当技術分野で理解されるように、ベクター配列は真核細胞での発現のために設計されているが、任意選択で原核細胞の複製起点を含んでもよい。適切なベクター・ポリヌクレオチド配列の非限定的な例には、下記のもの、すなわちｐＶＬ１３９２（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、［米国カリフォルニア州サンディエゴ所在］）やｐＢＡＣ−１（登録商標）（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、［米国ウィスコンシン州マディソン所在］）などのバキュロウイルス・ベクターと、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、［米国カリフォルニア州サンディエゴ］）やｐＴｒｉＥｘ−１（登録商標）（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）［米国ウィスコンシン州マディソン所在］）などの哺乳動物の発現ベクターが含まれる。
【００６８】
適切なＤＮＡ配列は、様々な手順によってベクターに挿入し得る。一般にＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている手順によって、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順およびその他の手順は、当業者の技術の範囲内とみなされる。
【００６９】
ある実施形態では、本発明は、上述の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核細胞でも酵母細胞などの下等真核細胞でもよく、または宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞でもよい。宿主細胞への上記構築物の導入は、形質導入または形質転換またはトランスフェクションまたはエレクトロポレーションなどの（ただしこれらに限定されない）当技術分野で知られている任意の手段によって実施可能である。
【００７０】
適切な異種シグナル配列（ＳＳ）の例には、ミツバチのメリチンＳＳ（ＮＨ２−ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号１２）（テッシヤー、ディー  シー（Ｔｅｓｓｉｅｒ  Ｄ．Ｃ．）、（１９９１年）Ｇｅｎｅ、第９８巻：１７７ページ）（インビトロゲンドットコム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）のｐＭｅｌＢａｃ製品も参照のこと）、バキュロウイルスｇｐ６７  ＳＳ（ＮＨ２−ＭＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ−ＣＯＯＨ）（配列番号１３）（クレッチュマー、ティーら（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．）、（１９９６年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１９５巻：９３〜１０１）、インフルエンザＡ型ウイルス・ヘマグルチニンＳＳ（ＮＨ２−ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号１４）（ヴェルホーエン、エム（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．）、（１９８０年）Ｎａｔｕｒｅ、第２８６巻：７７１〜７７６ページ）、ロドプシン・タグ１  ＳＳ（ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ）（配列番号１５）、またはロドプシン・タグＩＤ４  ＳＳ（ＮＨ２−ＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号１６）が含まれる。一般に、そのような適切なＳＳの長さは７５ａａよりも短くなる。これらのシグナル配列は、動物細胞で発現したときにタンパク質から切断されても切断されなくてもよい。例えばロドプシン・タグ１は、細胞により原形質膜に提示された場合はタンパク質から切断されないが、ロドプシン・タグＩＤ４シグナル配列は切り離される。
【００７１】
適切なエピトープ・アフィニティ・タグの非限定的な例には、ＦＬＡＧ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号２９）、”ＥＥ”（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号３０）、ヘマグルチニン（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３１）、ｍｙｃ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３２）、または単純ヘルペスウイルス・タグ（”ＨＳＶ”；ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号３３）が含まれる。
【００７２】
疎水性タンパク質に関するこれらの設計要素は、下記の順序、すなわち（１）ＳＳ−タグ１−タグ２−ＨＰ；（２）ＳＳ−タグ１−ＨＰ−タグ２；（３）ＳＳ−ＨＰ−タグ１−タグ２；のうちの１つの順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される。
【００７３】
この態様のある実施形態では、Ｎ末端メチオニン配列と異種シグナル配列が、（ａ）ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２４）と、（ｂ）ＭＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ（配列番号２５）と、（ｃ）ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ（配列番号２６）と、（ｄ）ＭＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号２７）と、（ｅ）ＭＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号２８）とからなる群から選択される。
【００７４】
この態様のある実施形態では、タグ配列が、（ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）と、（ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）と、（ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）と、（ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）と、（ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）と、（ｆ）ロドプシン・タグ（ＮＨ２−ＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰＷＱＦＳＭ−ＣＯＯＨ）（配列番号６）とからなる群から選択されるエピトープ・タグ配列を含む。
【００７５】
第３の態様のある実施形態では、人工的に改変された疎水性タンパク質の要素が、（ａ）ＳＳ−タグ１−タグ２−ＨＰと、（ｂ）ＳＳ−タグ１−ＨＰ−タグ２と、（ｃ）ＳＳ−ＨＰ−タグ１−タグ２とからなる群から選択された順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される。この態様の実施形態では、人工的に改変された疎水性タンパク質が、（ａ）ＧＰ６７−Ｍｙｃ−ＥＥ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、（ｂ）メリチン−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥ（配列番号２０）と、（ｃ）ヘマグルチニンＳＳ−ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶ−Ｍｙｃ（配列番号２１）とからなる群から選択される。第３の態様の別の実施形態では、タグ配列が、ヘキサヒスチジン配列（配列番号１７）とデカヒスチジン配列（配列番号１８）とをさらに含む。第３の態様のある実施形態では、人工的に改変された疎水性タンパク質が、（ａ）ＧＰ６７−Ｍｙｃ−ＥＥ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲ（配列番号１９）と、（ｂ）メリチン−Ｆｌａｇ  Ｔａｇ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥ（配列番号２０）と、（ｃ）ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶ−８Ｈｉｓ（配列番号２１）とからなる群から選択される。
【００７６】
単離ポリヌクレオチドのＨＰ配列は、両親媒性物質の存在下で単離されるタンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドでよい。あるいはこの用語は、純度１％を超えて精製され、または純度１０％を超えて精製され、または純度２５％を超えて精製され、または純度５０−９９％を超えて精製されたときに、安定性（保存寿命または凍結融解サイクルに耐える能力）を高めるため、あるいはリガンド結合アッセイ、円偏向２色性、平均サイズ、形状、または密度の流体力学的評価、高次構造に特異的な抗体との相互作用を含めた一般的な実験室技法により観察される高次構造の完全性を維持するため、機能的アッセイに両親媒性物質の存在を必要とするかもしくはその存在が利益となる、任意のタンパク質を指してもよい。好ましい実施形態では、本発明の疎水性タンパク質は哺乳動物の疎水性タンパク質である。特に好ましい実施形態では、本発明の疎水性タンパク質はヒト疎水性タンパク質である。
【００７７】
単離ポリヌクレオチドのＨＰ配列は、疎水性タンパク質の同定のために設計されたアルゴリズムに関する下記の非限定的な例、すなわち（ａ）ＤＡＳ−Ｄｅｎｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ法を使用した原核細胞における膜貫通領域の予測（ストックホルム大学）、チェルゾ、エムら（Ｃｓｅｒｚｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．第１０巻：６７３〜６７６ページ；（ｂ）ＨＭＭＴＯＰ−タンパク質の膜貫通ヘリックスおよびトポロジーの予測（ハンガリー科学アカデミー）、ジー  イー、タスナディ（Ｇ．Ｅ．Ｔｕｓｎａｄｙ）およびアイ  シモン（Ｉ．Ｓｉｍｏｎ）、１９９８年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２８３巻、４８９〜５０６ページ；（ｃ）隠れマルコフモデル予測、ゾーンハンマー、イー  エル  エルら（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、タンパク質配列における膜貫通ヘリックスを予測するための隠れマルコフモデル（A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences ）、分子生物学のためのインテリジェント・システムに関する第６回国際会議要旨集（ＩＳＭＢ９８）、１７５〜１８２ページ；（Ｄ）ＴＭＡＰ−多重配列アライメントに基づく膜貫通検出（カロリンスカ研究所（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；スウェーデン）（参考文献なし：ＵＲＬ  http//www.mbb.ki.se/tamp/ を参照のこと）および（ｅ）ＴｏｐＰｒｅｄ２−膜タンパク質のトポロジー予測（ストックホルム大学）、フォン  ヘイネ、ジー（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．）（１９９２年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２５巻、４８７〜４９４ページおよびチェルゾ、エムら（Ｃｓｅｒｚｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．第１０巻、６７３〜６７６ページ；を用いたバイオインフォマティクス支援手段によって同定されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００７８】
本発明のＨＰポリヌクレオチドによってコードし得るタンパク質の代表的かつ非限定的な例を、本明細書の表１に示す。
【００７９】
適切なＧｅｎＢａｎｋ受入番号により上記に特定された全ての核酸配列および該核酸配列によってコードされる各アミノ酸配列を、引用により本願明細書に援用する。
【００８０】
第４の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）膜タンパク質、（ｉｉ）内在性膜タンパク質、（ｉｉｉ）膜貫通タンパク質、（ｉｖ）モノトピック型膜タンパク質、（ｖ）ポリトピック型膜タンパク質、（ｖｉｉ）ポンプ・タンパク質、（ｖｉｉｉ）チャネル・タンパク質、（ｉｘ）受容体キナーゼタンパク質、（ｘ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、（ｘｉｉ）膜結合酵素、および（ｘｉｉｉ）輸送体タンパク質からなる群から疎水性標的タンパク質を選択する工程と、疎水性タンパク質に、（ｉ）極性脂質、（ｉｉ）両親媒性高分子ポリマー、（ｉｉｉ）表面活性物質または界面活性剤、および（ｉｖ）両親媒性ポリペプチドからなる群から選択される両親媒性物質が結合していることと、（ｂ）疎水性標的タンパク質とリガンド分子との少なくとも１つの複合体の形成が促進されるように、均一または不均一な溶液相の条件下、両親媒性物質が結合している疎水性標的タンパク質をマスコード・ライブラリ由来の多数の分子に曝すことによるアフィニティ選択により、多次元クロマトグラフィを使用してリガンド分子を選択する工程と、（ｃ）非結合分子から複合体を分離する工程と、（ｄ）質量スペクトル分析によってリガンド分子を同定する工程とからなる、疎水性タンパク質のリガンドを同定する方法を提供する。
【００８１】
第５の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）膜タンパク質、（ｉｉ）内在性膜タンパク質、（ｉｉｉ）膜貫通タンパク質、（ｉｖ）モノトピック型膜タンパク質、（ｖ）ポリトピック型膜タンパク質、（ｖｉｉ）ポンプ・タンパク質、（ｖｉｉｉ）チャネル・タンパク質、（ｉｘ）受容体キナーゼタンパク質、（ｘ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、（ｘｉｉ）膜結合酵素、および（ｘｉｉｉ）輸送体タンパク質からなる群から疎水性標的タンパク質を選択する工程と、疎水性タンパク質に、（ｉ）極性脂質、（ｉｉ）両親媒性高分子ポリマー、（ｉｉｉ）表面活性物質または界面活性剤、および（ｉｖ）両親媒性ポリペプチドからなる群から選択される両親媒性物質が結合していることと、（ｂ）疎水性標的タンパク質とリガンド分子との少なくとも１つの複合体の形成が促進されるように、均一または不均一な溶液相の条件下、両親媒性物質が結合している疎水性標的タンパク質をマスコードされていないライブラリ由来の多数の分子に曝すことによるアフィニティ選択により、多次元クロマトグラフィを使用してリガンド分子を選択する工程と、（ｃ）非結合分子から複合体を分離する工程と、（ｄ）質量スペクトル分析によってリガンド分子を同定する工程とからなる、疎水性タンパク質に対するリガンドを同定する方法を提供する。
【００８２】
第６の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列、（ｉｉ）（Ａ）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号２９）、（Ｂ）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号３０）、（Ｃ）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３１）、（Ｄ）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３２）、および（Ｅ）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号３３）からなる群から選択されるアフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列、（ｉｉｉ）（Ａ）膜タンパク質、（Ｂ）内在性膜タンパク質、（Ｃ）膜貫通タンパク質、（Ｄ）モノトピック型膜タンパク質、（Ｅ）ポリトピック型膜タンパク質、（Ｆ）ポンプ・タンパク質、（Ｇ）チャネル・タンパク質、（Ｈ）受容体キナーゼタンパク質、（Ｉ）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、（Ｊ）膜結合酵素、および（Ｋ）輸送体タンパク質からなる群から選択される疎水性タンパク質（ＨＰ）配列からなる疎水性タンパク質を選択する工程と、（ｂ）疎水性タンパク質をショ糖勾配超遠心法によって精製する工程と、（ｃ）疎水性タンパク質を抗体アフィニティ精製によって精製する工程と、（ｄ）疎水性タンパク質を固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィによって精製する工程とからなる、疎水性タンパク質を単離する方法を提供する。
【００８３】
第７の態様では、本発明は、（ａ）真核細胞におけるタンパク質発現用のベクター・ポリヌクレオチド配列と、（ｂ）下記の要素、すなわち（ｉ）Ｎ末端メチオニン残基と、（ｉｉ）Ｎ末端メチオニン配列および異種シグナル配列が、（１）ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２４）、（２）ＭＶＲＴＡＶＬＩＬＬＬＶＲＦＳＥＰ（配列番号２５）、（３）ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡ（配列番号２６）、（４）ＭＭＮＧＴＥＧＰＮＦＹＶＰＦＳＮＫＴＧＶＶＲＳＰＦＥＡＰＱＹＹＬＡＥＰ−ＣＯＯＨ（配列番号２７）、および（５）ＭＧＫＮＰＬＧＶＲＫＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ（配列番号２８）からなる群から選択される異種シグナル配列（ＳＳ）と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの膜貫通ドメイン配列と、（ｉｖ）（１）ＦＬＡＧタグ（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）、（２）ＥＥタグ（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ）（配列番号２）、（３）ヘマグルチニン・タグ（ＮＨ２−ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号３）、（４）ｍｙｃタグ（ＮＨ２−ＫＨＫＬＥＱＬＲＮＳＧＡ−ＣＯＯＨ）（配列番号４）、および（５）ＨＳＶタグ（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号５）からなる群から選択されるアフィニティ選択に有用な少なくとも２つのタグ配列と、（ｖ）（１）膜タンパク質、（２）内在性膜タンパク質、（３）膜貫通タンパク質、（４）モノトピック型膜タンパク質、（５）ポリトピック型膜タンパク質、（６）ポンプ・タンパク質、（７）チャネル・タンパク質、（８）受容体キナーゼタンパク質、（９）Ｇタンパク質共役受容体タンパク質、（１０）膜結合酵素、および（１１）輸送体タンパク質からなる群から選択される疎水性タンパク質（ＨＰ）配列とを含む人工的に改変された疎水性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列とからなる、疎水性タンパク質の発現に適した単離核酸分子を提供する。
【００８４】
以下の実施例は、本発明の、ある好ましい実施形態をさらに例示するものであり、本発明の範囲をどのようにも限定するものではない。
（実施例１）
ＣＯＸ−１のアフィニティ選択およびＡＬＩＳによる同定
ケイマン・ケミカル社（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）［米国ミシガン州アナーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）所在］の精製ヒツジＣＯＸ−１（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで＞９５％）を、界面活性剤を交換することによってスクリーニング用に調製した。納品時にタンパク質に含まれていた界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ−２０を除去するために、イオン交換クロマトグラフィを行った。８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−８．０、０．０９％  Ｔｗｅｅｎ−２０、２７０μＭ  ＤＤＣ、および２４０μＭ  ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤβＭ）の緩衝液中に０．２７ｍｇ／ｍＬのＣＯＸ−１溶液を約６ｍＬ、すなわち理論上の収量が１．８ｍｇとなるものを、８０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２４０μＭ  ＤβＭ（ＴＢＳ−ＡＧＤ）の緩衝液を含んだＰｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱカラムにアプライした。このカラムを、流量５ｍＬ／分で１０分間、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で展開した。タンパク質溶出画分を、２８０ｎｍの吸光度をモニタすることによって同定した。
【００８５】
この処理の後、タンパク質含有試料１８ｍＬを合わせ、製造業者の使用説明書に従って（ミリポアインコーポレイティッド社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）［米国マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）所在］）Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）−３０  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）で濃縮した。その結果、濃度約１．８ｍｇ／ｍｌのＣＯＸ−１が得られ、これをスクリーニング用に１．３ｍｇ／ｍＬ（２０μＭ  ＣＯＸ−１）に希釈した。最終的なタンパク質調製物中の緩衝液は、２．４ｍＭ  ＤβＭ、８０ｍＭ  ｔｒｉｓ−８．０、約５０ｍＭ  ＮａＣｌからなると推定された。このＣＯＸ−１溶液に、ケイマン・ケミカル社（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）が用いる処理手順に従って２０μＭヘミンと３００μＭ  ジエチルジチオカルバメート（ＤＤＣ）を即座に添加した。
【００８６】
次いで、ＣＯＸ−１タンパク質調製物を添付のサンプル調製標準操作手順書（ＳＯＰ、表２）に従ってサンプル調製に使用した。
【００８７】
【表２】
2005506039.tif 000006
【表２Ａ】
2005506039.tif 000007
このサンプル調製ＳＯＰにより、ＣＯＸ−１と、約２５００種の薬物様小分子からなり、各分子の濃度が１μＭであるマスコード・コンビナトリアル・ライブラリとを組み合わせる結合アッセイが実施される。サンプルを、４℃で３０分間インキュベートした。全体積が１２μＬなので、サンプルは２４０ｐｍｏｌのタンパク質と１２ｐｍｏｌの各ライブラリ成分とを含有していた。対照試験として、無関係の膜タンパク質、ジアシルグリセロールキナーゼ（カルビオケムインコーポレイティッド社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州サンディエゴ所在］）も同じ緩衝液で２０μＭに調製し、同じ２５００種のライブラリと共にインキュベートし、同様に処理した。
【００８８】
次いでこれらの混合物を個々にＡＬＩＳ分析に供した。適度に高い親和性の任意のリガンドが、ＣＯＸ画分の収集時にＣＯＸに結合していれば、質量スペクトル分析によってその質量が同定される。マスコードであるおかげで、構築単位とコア分子との厳密な組合せを識別することが可能である（米国特許第６，１４７，３４４号参照）。同じ化合物がジアシルグリセロールキナーゼの対照実験で生じなければ、その化合物はＣＯＸ−１に特異的なリガンドとして同定してよい。
【００８９】
次いで混合物を個々に、下記のように修正を加えたＡＬＩＳ分析に供した。流量２ｍＬ／分の溶出緩衝液ＴＢＳ（８０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％ＤＭＳＯ）を用いて、４．６ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍのＳＥＣカラムで０℃でサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を実施することにより、界面活性剤に可溶化された大きなタンパク質を薬物様小分子から分離した。タンパク質を含有する溶出ＳＥＣ画分を、２３０ｎｍでモニタするＵＶ−ＶＩＳ検出によって特定し、サンプルループを経て低流量（１００μＬ／分）の逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）システムへ移した。ＲＰＣカラム（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）製Ｃ−１８；１ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍ）を６０℃に維持して、複合体からのリガンドの解離を促進させる。このＲＰＣカラムから、５％〜９５％アセトニトリル（０．１％ギ酸対イオン）水溶液（重量／０．１％ギ酸）で５分間の勾配を用いてリガンドを溶出し、分析のため高分解能の質量分析計に供する。適度に高い親和性の任意のリガンドが、そのＣＯＸ画分の収集時にＣＯＸに結合していれば、質量スペクトル分析によってその質量が同定される。マスコードであるおかげで、構築単位とコア分子との厳密な組合せを識別することが可能である（米国特許第６，１４７，３４４号参照）。同じ化合物がジアシルグリセロールキナーゼの対照実験で生じなければ、その化合物はＣＯＸ−１に特異的なリガンドとして同定してよい。図６は、ＡＬＩＳを使用した非結合小分子からのタンパク質の分離を示す。
【００９０】
対照実験では、この方法でスクリーニングされたＣＯＸ−１により、既知のＣＯＸ−１リガンドを大量の小分子混合物から抽出可能であることが実証された（図７）。被験ライブラリが、２５μＭメクロフェナメート（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍａｔｅ）、２５μＭインドメタシン、各１μＭの様々な被験ライブラリからなる場合、これら既知のＣＯＸ−１リガンドはＡＬＩＳスクリーニング法によって回収、同定される。
【００９１】
この実験により、３３０，０００種の薬物様小分子全体をスクリーニングした後、４１種の小分子がＣＯＸ−１リガンドとして同定されたが、その１例を図８に示す。これらのＣＯＸ−１リガンド分子を、小規模ライブラリに対する２つのスクリーニンにより同定したが、さらなる試験に向けてそれらの単一の分子の調製物を用意する。さらにこれらのヒット分子の多くは、既知のＣＯＸ−１リガンドであるメクロフェナメートと結合に関して競合することが観察される（図９）。
（実施例２）
質量スペクトル分析による、ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質に結合しているリガンドの同定
従来のクローニング法に従い、ムスカリン性アセチルコリン受容体のｍ２サブタイプ（ｍ２Ｒ）をコードする遺伝子構築物を、バキュロウイルス発現ベクターにクローニングした（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、第６版、１９９９年、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ所在］を参照のこと）。この遺伝子構築物は、アミノ末端メチオニンのすぐ後に読み枠を合わせてメリチン・シグナル配列（配列番号１２）が続き、そのすぐ後に読み枠を合わせてＦＬＡＧ  Ｍ１エピトープ・タグ（配列番号１）が続き、そのすぐ後に読み枠を合わせてｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体（ＮＣＢＩ受入番号Ｘ０４７０８）の配列が続くポリペプチドをコードするものであった。したがって完全長ポリペプチド配列は、以下のとおりであった。
【００９２】
【化１】
2005506039.tif 000008
発現されると、メリチン・シグナル配列はＡｌａ（２１）の後で切断され、ＦＬＡＧ  Ｍ１抗体樹脂（シグマ（Ｓｉｇｍａ）［米国ミズーリ州セントルイス所在］）が特異的に結合するアミノ末端ＦＬＡＧエピトープが現れる。このバキュロウイルス発現ベクターは、従来の方法（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、第６版、１９９９、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ所在］）により昆虫細胞において上記ポリペプチドを発現させる目的でバキュロウイルスを生成させるために使用した。
【００９３】
ＦＬＡＧタグｍ２Ｒを精製するために、上記ポリペプチドを発現する昆虫細胞６０ｇを０．６ＬのＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＬ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁し、そのサンプルを窒素キャビテーションによりホモジナイズした。ホモジネートを４℃で３０分間、５００×ｇの遠心分離にかけて、ホモジナイズされていない細胞を除去した。ペレットを廃棄し、上澄みを４℃で４５分間、１００，０００×ｇの超遠心分離にかけた。超遠心分離後の上澄みを廃棄し、ペレット化した細胞膜を、０．５％（重量／容積）のジギトニンを含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｄ緩衝液）中に再懸濁して、タンパク質濃度を２．５ｍｇ／ｍＬにした。この懸濁液を４℃で６０分間撹拌しながらインキュベートした後、４℃で４５分間、１００，０００×ｇの超遠心分離にかけて、不溶物をペレットとした。可溶性の上澄みを、抗体アフィニティ精製を行うために、ＴＢＳ−Ｄ緩衝液で予め平衡化したＦＬＡＧ  Ｍ１抗体樹脂の５ｍＬカラムに流速０．７ｍＬ／分でアプライした。可溶性物質をＦＬＡＧ  Ｍ１抗体樹脂にロードした後、カラムを５０ｍＬのＴＢＳ―Ｄ緩衝液で洗浄し、次いでＦＬＡＧタグｍ２Ｒタンパク質を１００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチド（シグマ（Ｓｉｇｍａ）［米国ミズーリ州セントルイス所在］）を含有するＴＢＳ―Ｄ緩衝液でカラムから溶出させた。精製されたＦＬＡＧタグ付きｍ２Ｒを含有する溶出カラム画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。
【００９４】
ムスカリン性リガンドを結合することが可能な精製ＦＬＡＧタグｍ２Ｒタンパク質の濃度を算定するために、ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）の方法（ピーターソン、ジー  エルら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻；１７８０８ページ）に従ってガラス繊維フィルタ結合アッセイを実施した。
【００９５】
このｍ２Ｒ調製物は、ＦＬＡＧペプチド１００μｇ／ｍＬを含むＴＢＳ−Ｄ中の６μＭのｍ２Ｒからなるものであった。各ｍ２Ｒポリペプチドは、多数のジギトニン分子と可逆的に会合可能であり、化学量論上ｍ２Ｒ：ジギトニンが１：５〜５００で膜タンパク質−界面活性剤複合体を生成する。この調製物を、以下に概説するサンプル調製プロトコルによるＡＬＩＳサンプル調製用の、ｍ２Ｒストックとした。
【００９６】
その他の試薬ストックを調製した。保存シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ）を実施例１の方法に従って調製し、ＴＢＳ中に濃度６μＭのＣＯＸを得た。個々のリガンドストック（シグマ（Ｓｉｇｍａ）［米国ミズーリ州セントルイス所在］）ピレンゼピン、キヌクリジニルベンジラート（ＱＮＢ）、およびアトロピンを、ＴＢＳ中４００μＭに調製した。４つのコンビナトリアル・ケミカル・ライブラリを、平均２５００〜５０００種の薬物様小分子の各濃度が４００μＭとなるように、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製した。これら４つの薬物ライブラリを、ＮＭＧ−６６、ＮＧＭ−４１、ＮＧＬ−１０−Ａ−４１、およびＮＧＬ−１１６−Ａ−４７０とした。ＤＭＳＯに溶解したアトロピンを上記個々の薬物ライブラリに添加することによって４００μＭアトロピンを含有する４つの被験ライブラリストックを調製し、ＮＭＧ−６６＋アトロピンストック、ＮＧＭ−４１＋アトロピンストック、ＮＧＬ−１０−Ａ−４１＋アトロピンストック、およびＮＧＬ−１１６−Ａ−４７０＋アトロピンストックを得た。ＤＭＳＯに溶解したＱＮＢを上記個々の薬物ライブラリに添加することによって４００μＭ  ＱＮＢを含有する４つの被験ライブラリストックを調製し、ＮＭＧ−６６＋ＱＮＢストック、ＮＧＭ−４１＋ＱＮＢストック、ＮＧＬ−１０−Ａ−４１＋ＱＮＢストック、およびＮＧＬ−１１６−Ａ−４７０＋ＱＮＢストックが得られた。５％ジギトニン１００μＬと水４．６ｍＬを合わせ、さらに４００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５を合わせ、次いで４２℃で平衡化することによって、プレミックス緩衝液を調製した。
【００９７】
タンパク質（被験タンパク質ｍ２Ｒまたは対照タンパク質ＣＯＸ）を、リガンド（ＱＮＢ単独、アトロピン単独、ピレンゼピン単独、アトロピン＋薬物ライブラリ、またはＱＮＢ＋薬物ライブラリ）と組み合わせた、あるいは対照としてタンパク質をＤＭＳＯと組み合わせた結合反応物を調製した。各場合において、ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯに可溶化されたリガンドが２μＬ入ったポリプロピレン・チューブにプレミックス緩衝液３８μＬを分注し、ボルテックス撹拌によって混合し、室温で１０分間、８，０００×ｇで遠心分離して不溶性物質を除去した。水性のＤＭＳＯ単独または水性のＤＭＳＯに溶解されたリガンドのいずれかを含有する（薬物ライブラリを含まない場合と含む場合）清澄化した上澄み（２μＬ）を、４℃のポリプロピレン・チューブに移した。標的タンパク質ｍ２Ｒ（８μＬ）または対照タンパク質ＣＯＸ（８μＬ）を上澄みに添加し、ピペッティングにより十分混合し、４℃で６０分間インキュベートした。
【００９８】
次いでこれらの結合反応調製物をＡＬＩＳ分析にかけた。結合反応調製物は、平衡結合状態が確立される方法で、４．８μＭの標的膜タンパク質（ｍ２Ｒ）または４．８μＭの対照膜タンパク質（ＣＯＸ）と、各濃度が１〜１０μＭの約２５００種の多数の薬物様小分子とを混合する。次いでタンパク質に対する高親和性リガンド（Ｋｉｄ＜１００μＭ）をＡＬＩＳにより同定する。対照タンパク質ＣＯＸには結合しない標的タンパク質ｍ２Ｒの小分子リガンドを、標的タンパク質に特異的なリガンドとみなす。これとは別に、多数の薬物分子を用いた実験と比較するため、ｍ２ＲまたはＣＯＸと個々の（個別の）ｍ２Ｒリガンドとを組み合わせた結合反応物も調製した。このＡＬＩＳ分析は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）の後に逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）、その後に質量スペクトル（ＭＳ）分析を行う一連の操作によって下記のように進めた。
【００９９】
これらの調製された結合反応混合物を、個別にＡＬＩＳ分析にかけた。適度に高い親和性でｍ２Ｒに結合したリガンドを、下記のようにタンパク質含有ＳＥＣ画分と共に回収した。流速２ｍＬ／分の、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％ＤＭＳＯの溶出緩衝液を使用して、４℃で４．６ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍのＳＥＣカラム上でＳＥＣにより、界面活性剤に可溶化された大きな分子を非結合の薬物様小分子から分離した。タンパク質含有画分を、２３０ｎｍでモニタする紫外線電子吸収分光法で同定した。
【０１００】
タンパク質含有画分を、サンプル・ループを介して低流量（１００μＬ／分）ＲＰＣシステムへ移した。ＲＰＣカラム（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）製Ｃ−１８；１ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍ）を６０℃に維持して、複合体からのリガンドの解離を促進させる。このＲＰＣカラムから、５％〜９５％アセトニトリル（０．１％ギ酸対イオン）水溶液（重量／０．１％ギ酸）で５分間の勾配を用いてリガンドを溶出し、分析のため高分解能の質量分析計に供する。タンパク質−界面活性剤ｍ２Ｒ複合体に対するその高い親和性により、タンパク質含有ＳＥＣ画分と共に回収された質量分析済みのリガンドを、その精確な質量を予測することによって同定した。
【０１０１】
実験では、このようにＡＬＩＳ分析でスクリーニングされたｍ２Ｒにより、ｍ２Ｒ−界面活性剤複合体に対して高い親和性を有する既知のｍ２Ｒリガンドのその高親和性に基づいて、既知のｍ２Ｒリガンドを多数の薬物様小分子の混合物から抽出可能であることが実証された。このＡＬＩＳ形式のスクリーニングでは、薬物ライブラリが存在しない場合にｍ２Ｒ−界面活性剤複合体に結合したｍ２Ｒリガンドを回収するのと全く同様に、薬物ライブラリからｍ２Ｒリガンドが回収された（図１０）。
【０１０２】
これらの実験のデータを図１０に示す。これらの実験では、各濃度が１〜１０μＭである約２５００種の薬物様小分子を提示するコンビナトリアル薬物ライブラリ（ＮＧＭ−６６、ＮＧＭ−３４０、ＮＧＬ−１０−Ａ−４１、ＮＧＬ−１１６−Ａ−４７０）が存在しない状態またはその存在下で、２．０μＭ  ｍ２Ｒと１０μＭピレンゼピン、ＱＮＢ、またはアトロピンとを混合することによって、平衡結合反応が確立された。結合反応物をＡＬＩＳ分析にかけ、リガンド回収の程度を、質量分析計のシグナル強度によって定量した。ｘ軸は、ピレンゼピン、ＱＮＢ、およびアトロピンのそれぞれの質量に対する質量スペクトルのシグナル応答を相対的な単位で表す。
（実施例３）
ＨＰリガンドのアフィニティに基づいた選択およびＡＬＩＳ同定における置換アッセイ  代表的なＨＰとして、ｍ２  ｍＡＣｈＲをピーターソンらの方法（ピーターソン、ジー  エルら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻：１７８０８ページ）に従い精製する。標的タンパク質をＴＢＳ−ＡＧＤ緩衝液中で２０μＭの濃度に調整し、濃度１μＭの既知のムスカリン性リガンド、ピレンゼピン（分子量＝４２４．３）と共にインキュベートする。対照試験として、無関係の膜タンパク質、グリコホリンも、ＴＢＳ−ＡＧＤ中で２０μＭに調製し、濃度１μＭの化合物ピレンゼピン（分子量＝４２４．３）と共にインキュベートする。
【０１０３】
ｍ２  ｍＡＣｈＲ／ピレンゼピン混合物にマスコード化合物ライブラリを加え、サンプルを分析し、ライブラリ化合物によってＨＰタンパク質からピレンゼピンが外れて置換されたかどうか決定する。ピレンゼピンの置換は、ライブラリ化合物が、ピレンゼピン自体と同じ部位にピレンゼピンより緊密に結合することを示す。
【０１０４】
置換アッセイは、下記のように実施する。ｍ２  ｍＡＣｈＲと、１μｍのピレンゼピンと、１μＭの各ライブラリ化合物との混合物をＡＬＩＳ分析にかける。この分析では、ピレンゼピンの質量に対応するＭＳシグナルをモニタし、ライブラリ化合物の質量は無視する。ライブラリ化合物によって、ピレンゼピンの質量に対応するＭＳシグナルが定量的に低減される場合、ライブラリ化合物によって、ＨＰタンパク質、この場合はｍＡＣｈＲタンパク質から、ピレンゼピンが外れて置換されたと推測される。ライブラリ化合物とのインキュベーションにより、ピレンゼピンの質量に対応するＭＳシグナルが変化しない場合、ライブラリ化合物はｍ２  ｍＡＣｈＲリガンドを含まないと考えられる。ライブラリ化合物とのインキュベーションを行った場合と行わない場合のピレンゼピンＭＳシグナルを比較することによって、ライブラリ化合物がピレンゼピンと置換されたがどうか、したがってｍＡＣｈＲタンパク質に結合したかどうか評価することが可能である。
（実施例４）
ｍ２  ｍＡＣＨＲマスコード・リガンドのアフィニティ選択およびＡＬＩＳによる同定
代表的なＨＰとして、ｍ２  ｍＡＣｈＲをピーターソンらの方法（ピーターソン、ジー  エル（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．）（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻：１７８０８ページ）に従い精製する。該タンパク質をＴＢＳ−ＡＧＤ緩衝液中で２０μＭに調整し、各濃度が１μＭであるマスコード化合物の２５００分子のライブラリと共にインキュベートする。２２℃で３０分間インキュベートした後、ＡＬＩＳ分析までの間サンプルを４℃に冷却する。対照試験として、無関係の膜タンパク質、グリコホリンも、ＴＢＳ−ＡＧＤ中で２０μＭに調製し、マスコード・ライブラリと共にインキュベートする。化合物がｍＡＣｈＲに特異的に結合するかどうかを決定するため、ｍＡＣｈＲ−化合物の混合物をＡＬＩＳ分析により分析する。タンパク質のピークを回収しＭＳにより測定したとき、マスコード・ライブラリのメンバの１つに相当する質量が現れれば、その化合物は結合リガンドであると特定される可能性がある。その同じ化合物がグリコホリン対照実験では現れない場合、その時はその化合物をｍＡＣｈＲに特異的なリガンドであると特定することが可能である。マスコードであるおかげで、構築単位とコアとの厳密な組合せを特定することが可能である（アニスら（Ａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）による米国特許第６，１４７，３４４号参照）。ＭＳ−ＭＳ分析（アニスら（Ａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）による米国特許第６，１４７，３４４号参照）を使用することにより、コアに構築単位を組み合わせたものの正確な構造を特定することも可能である。
（実施例５）
ＣＯＸ−１リガンドのアフィニティ選択と、オンライン蛍光検出を用いる修正ＡＬＩＳによる同定
代表的なＨＰとして、ＣＯＸ−１タンパク質をジョンソンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）の方法に従い仔ヒツジの精嚢から精製した（ジョンソン、ジェイ  エル（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ．Ｌ．）（１９９５年）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．第３２４巻：２６〜３４ページ）。ＣＯＸ−１サンプルを、ＴＢＳ−ＡＧＥ（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８００ｍＭドデシルβ−Ｄ−マルトシド、２．５％ＤＭＳＯ）中で２０μＭに調整し、各化合物の濃度が１μＭである２５００種のマスコード化合物のライブラリと混合してインキュベートする。２２℃で３０分間インキュベートした後、そのサンプルをＡＬＩＳ分析までの間４℃に冷却した。全体積は１２μＬであるので、サンプルは２４０ｐｍｏｌのタンパク質と、１２ｐｍｏｌの各ライブラリ成分とを含有する。対照試験として、無関係の膜タンパク質、グリコホリンも、ＴＢＳ−ＡＧＤ中で２０μＭに調製し、同じ２５００分子のライブラリと共にインキュベートして、同様に処理する。
【０１０５】
次いでこの混合物を下記のように修正ＡＬＩＳ分析に個々に供する。流量２ｍＬ／分の溶出緩衝液ＴＢＳ（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％ＤＭＳＯ）を用いて、４．６ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍのＳＥＣカラムで０℃でサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を実施することにより、界面活性剤に可溶化された大きなタンパク質を薬物様小分子から分離する。タンパク質を含有する溶出ＳＥＣ画分を、２４０〜２５０ｎｍで励起しかつ３４０ｎｍでの発光をモニタするオンライン蛍光検出によって特定し、サンプルループを介して低流量（１００μＬ／分）逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）システムへ移す。ＲＰＣカラム（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）製Ｃ−１８；１ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍ）を６０℃に維持して、複合体からのリガンドの解離を促進させる。このＲＰＣカラムから、５％〜９５％アセトニトリル（０．１％ギ酸対イオン）水溶液（重量／０．１％ギ酸）で５分間の勾配を用いてリガンドを溶出し、分析のため高分解能の質量分析計に供する。適度に高い親和性のリガンドが、ＣＯＸ−１画分の回収時にＣＯＸ−１に結合していれば、質量スペクトル分析によってそのリガンドの質量が同定される。
【０１０６】
マスコードであるおかげで、構築単位とコア分子との厳密な組合せを特定することが可能である（アニスら（Ａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）による米国特許第６，１４７，３４４号参照）。同じ化合物がグリコホリン対照実験では現れない場合、その化合物はＣＯＸ−１タンパク質の特異的なリガンドとして同定し得る。
（実施例６）
ＣＯＸ−１リガンドのアフィニティ選択と、オンライン光散乱検出を用いる修正ＡＬＩＳによる同定
代表的なＨＰとして、ＣＯＸ−１タンパク質をジョンソンら（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）の方法に従い仔ヒツジの精嚢から精製した（ジョンソン、ジェイ  エル（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ．Ｌ．）（１９９５年）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．第３２４巻：２６〜３４ページ）。ＣＯＸ−１サンプルを、ＴＢＳ−ＡＧＥ（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８００ｍＭドデシルβ−Ｄ−マルトシド、２．５％ＤＭＳＯ）中で２０μＭに調整し、各化合物の濃度が１μＭである２５００種のマスコード化合物のライブラリと混合してインキュベートする。２２℃で３０分間インキュベートした後、そのサンプルを、修正ＡＬＩＳ分析までの間４℃に冷却する。全体積は１２μＬであるので、サンプルは２４０ｐｍｏｌのタンパク質と、１２ｐｍｏｌの各ライブラリ成分とを含有する。対照試験として、無関係の膜タンパク質、グリコホリンもＴＢＳ−ＡＧＤ中で２０μＭに調製し、同じ２５００分子のライブラリと共にインキュベートし、同様に処理する。
【０１０７】
次に、これら対照混合物および試験混合物を下記のように修正ＡＬＩＳ分析に個々に供する。流量２ｍＬ／分の溶出緩衝液ＴＢＳ（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％ＤＭＳＯ）を用いて、４．６ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍのＳＥＣカラムで０℃でサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を実施することにより、界面活性剤に可溶化された大きなタンパク質を薬物様小分子から分離する。タンパク質を含有する溶出ＳＥＣ画分を、オンライン光散乱検出によって特定し、サンプルループを介して低流量（１００μＬ／分）逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）システムヘ移す。ＲＰＣカラム（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）製Ｃ−１８；１ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍ）を６０℃に維持して、複合体からのリガンドの解離を促進させる。このＲＰＣカラムから、５％〜９５％アセトニトリル（０．１％ギ酸対イオン）水溶液（重量／０．１％ギ酸）で５分間の勾配を用いてリガンドを溶出し、分析のため高分解能の質量分析計に供する。適度に高い親和性のリガンドが、ＣＯＸ−１画分の回収時にＣＯＸ−１に結合していれば、質量スペクトル分析によってそのリガンドの質量が同定される。
【０１０８】
マスコードであるおかげで、構築単位とコア分子との厳密な組合せを特定することが可能である（アニスら（Ａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）による米国特許第６，１４７，３４４号参照）。同じ化合物がグリコホリン対照実験で現れない場合、その化合物はＣＯＸ−１タンパク質の特異的なリガンドとして同定し得る。
（実施例７）
ｍ２  ｍＡＣＨＲに結合するリガンドの不均一溶液相のスクリーニング：アフィニティ選択およびＡＬＩＳ分析を用いる同定
ＨＰリガンドを、タグ付き標的配列を固体支持体に固定化する不均一溶液相のスクリーニング法を使用することによってスクリーニングすることも可能である。例えば、免疫沈降（ＩＰ）に基づくスクリーニング・プロトコルで沈降性固定要素として使用するために、抗ｆｌａｇ抗体を吸着させたプロテインＡアガロースビーズ（抗ｆｌａｇビーズ）を準備する。
【０１０９】
概要を述べると、ＴＢＳ−ＡＧ緩衝液（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８００ｍＭドデシルβ−Ｄ−マルトシド）を使用して、プロテインＡアガロースの５０％（容積／容積）スラリ（サンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、［米国ミズーリ州セントルイス所在］）１００μＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内で、室温で、（１）ビーズを１ｍＬのＴＢＳ−ＡＧと合わせる、（２）サンプルをひっくり返すことによって２０分間混合する、（３）１００００×ｇで遠心分離し、その後慎重に上澄みを除去してペレット状のアガロースビーズをチューブの底に残す、というサイクルを３回実施して洗浄する。
【０１１０】
ビーズを洗浄した後、ビーズのペレット５０μＬを１．０ｍＬのＴＢＳ−ＡＧ中に入れる。この混合物に、ＴＢＳ―ＡＧ緩衝液に溶かした１ｍｇ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ５０μＬを添加し、混合物を４℃で６０分間インキュベートして、タンパク質がビーズに非特異的に結合するのを阻止する。この混合物に、１．０μｇ／ｍＬの抗ｆｌａｇ抗体（シグマ社［米国モンタナ州セントルイス所在］）を１０μＬ添加し、混合物を４℃で６０分間インキュベートする。並行して、同様に処理した別の対照アガロース・ビーズ調製物を、抗ｆｌａｇ抗体の代わりにＴＢＳ−ＡＧ  １０μＬで処理する。次いで抗フラグ抗体を吸着させたビーズと対照ビーズとを洗浄して、過剰な抗体およびタンパク質を除去し、最後にＴＢＳ−ＡＧ緩衝液０．１０ｍＬに再懸濁し、０．５ｍＬエッペンドルフチューブに移す。
【０１１１】
ｍ２  ｍＡＣｈＲ−ｆｌａｇタグ−Ｈｉｓタグタンパク質を発現するＣＨＯ細胞を培養し、溶解し、ホモジナイズする。ｍ２  ｍＡＣｈＲを含有する細胞膜を、ショ糖ステップ勾配超遠心分離により精製する。このショ糖ステップ勾配超遠心分離工程により、ほとんどの非膜タンパク質および細胞破壊片が除去される。超遠心分離工程により、膜様の細胞内下部構造の特定の集団を単離することも可能である。ｍＡＣｈＲに富む膜を、界面活性剤（ドデシル−β−マルトシド、ＤβＭまたはＣＹＭＡＬ−７；（アナトレース社（Ａｎａｔｒａｃｅ）［米国オハイオ州モーミー（Ｍａｕｍｅｅ）所在］））により可溶化し、アフィニティ精製の３工程に供する。
【０１１２】
初めに、ポリヒスチジン・タグの付加されたＣ末端を利用するために金属キレート・アフィニティ・クロマトグラフィ（ＭＣＡＱ）を使用し、その後、第２のアフィニティ精製、すなわちＦＬＡＧタグの付加されたＮ末端に基づく抗体アフィニティ精製を行うことになる（コビルカ、ビー  ケー（Ｋｏｂｉｌｋａ，Ｂ．Ｋ．）（１９９５年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２３１巻：２６９ページ）。第３に、固体化ｍＡＣｈＲリガンド３−（２’−アミノベンズヒドリルオキシ）−トロパン（ＡＢＴ）のカラムを通したリガンド・アフィニティ精製を行い、その後、脱塩工程により活性ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質の最終的な濃縮が行われる。
【０１１３】
サンプルを、ＴＢＳ−ＡＧＤ緩衝液でｍＡＣｈＲタンパク質が２０μＭになるよう調整し、各化合物の濃度が１μＭである２５００種のマスコード化合物のライブラリと共にインキュベートする。体積４０μＬ中で反応を行う。２２℃で３０分間インキュベートした後、そのサンプルをＭＳ分析までの間４℃に冷却する。比較試験として、β−ガラクトシダーゼをＴＢＳ−ＡＧＤ中で２０μＭになるよう同様に調製し、マスコード・ライブラリと共にインキュベートする。
【０１１４】
ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質−化合物の混合物を、下記の手順により、ＭＳ分析による分析用に調製する。ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質またはβ−ガラクトシダーゼタンパク質のいずれかを用いた試行由来の、精製タンパク質−ライブラリ混合物を、それぞれ体積２０μＬずつに２分割する。ｍ２  ｍＡＣｈＲ−ライブラリ混合物の場合、一方をＩＰ用に抗ｆｌａｇビーズ（抗ｆｌａｇ／プロテインＡアガロース）と合わせ、もう一方を対照アガロース・ビーズ（緩衝液／プロテインＡアガロース・ビーズ）と合わせることによって模擬ＩＰに供する。同様にβ−ガラクトシダーゼ混合物の場合、一方の２０μＬを対照ＩＰ用に抗ｆｌａｇビーズと合わせ、他方の２０μＬを、対照アガロース・ビーズと合わせることによって模擬ＩＰに供する。ひっくり返すことによって混合し、これらのＩＰを引き続き４℃で６０分間進行させる。その後、各ＩＰを室温で、（１）ビーズを１ｍＬのＴＢＳ−ＡＧと合わせる、（２）ひっくり返すことによって２分間混合する、（３）１００００ｇで遠心分離し、その後慎重に上澄みを除去してチューブの底にペレット状のアガロース・ビーズを残す、というサイクルを３回実施して洗浄する。最後に、各５０μＬのベッド・ボリュームのビーズ調製物を、次にさらに５０μＬのＴＢＳ（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁し、４℃に保持する。このプロセスの完了時には、４種の不均一ビーズ調製物、すなわち（１）ｍ２  ｍＡＣｈＲ／抗ｆｌａｇ／プロテインＡアガロース（ｍ２ビーズ）と、（２）ｍ２  ｍＡＣｈＲ／緩衝液／プロテインＡアガロース・ビーズ（ｍ２対照ビーズ）と、（３）β−ガラクトシダーゼ／抗ｆｌａｇ／プロテインＡアガロース・ビーズ（β−ｌａｃビーズ）と、（４）β−ガラクトシダーゼ／緩衝液／プロテインＡアガロース・ビーズ（β−ガラクトシダーゼ対照ビーズ）が作製される。
【０１１５】
これらのビーズを基にした調製物は、下記の手法でスクリーニングするのに有用な不均一溶液相系を構成する。各１００μＬのビーズ調製物を５０μＬの３０％アセトニトリル水溶液と混合し、６０℃に５分間加熱して、結合しているリガンドをタンパク質から解離させる。次いで混合物を１０，０００×ｇで遠心分離にかけてビーズをペレット化し、上澄み中の解離タンパク質を新しいチューブに移す。
【０１１６】
ＩＰ手順により、リガンドのアフィニティ選択と、結合していないライブラリ分子からのｍ２ｍＡＣｈＲ−リガンド複合体の物理的分離との両方が可能になる。これらの上澄みは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８０ｍＭドデシルβ−Ｄ−マルトシド、および１０％アセトニトリルを含有する。これらの上澄みサンプル約６０μＬを個々に、低流量（１００μＬ／分）逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）システムに注入する。ＲＰＣカラム（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）製  Ｃ−１８；１ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍ）を６０℃に維持する。このＲＰＣカラムから、５％〜９５％アセトニトリル（０．１％ギ酸対イオン）水溶液（重量／０．１％ギ酸）で５分間の勾配を用いてリガンドを溶出し、分析のため高分解能の質量分析計に供する。
【０１１７】
ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質ビーズの上澄み中にあり、ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質対照ビーズ、β−ｌａｃライブラリのビーズ、またはβ−ｌａｃ対照ビーズの上澄みにはない質量で２５００分子のマスコード・ライブラリのある化合物に相当する質量を観測することによって、ｍ２  ｍＡＣｈＲ−リガンドを同定する。この手順で選択されたマスコード化合物の構造は、容易に特定される（アニスら（Ａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）による米国特許第６，１４７，３４４号参照）。ＭＳ−ＭＳ分析（アニスら（Ａｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）による米国特許第６，１４７，３４４号参照）を使用することにより、コアと構築単位の組み合わせの正確な構造を示すことも可能である。
（実施例９）
ｍ２  ｍＡＣＨＲに結合するリガンドの不均一溶液相のスクリーニング：アフィニティ選択およびＭＳ分析と組み合わせた置換アッセイを使用する同定
Ｆｌａｇタグが付加されたｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質を、本明細書で既に概説したように精製し、濃度２０μＭになるようＴＢＳ−ＡＧＤ緩衝液に再懸濁する。タンパク質を、各化合物の濃度が１μＭである２５００のマスコード化合物のライブラリと、１μＭのピレンゼピン、すなわちｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質の既知のリガンドと共に、体積４０μＬ中でインキュベートする。２２℃で３０分間インキュベートした後、ＭＳ分析までの間サンプルを４℃に冷却した。比較試験として、β−ガラクトシダーゼを同様に２０μＭになるようＴＢＳ−ＡＧＤ中に調製し、マスコード・ライブラリおよびピレンゼピンと共にインキュベートする。
【０１１８】
ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質またはβ−ガラクトシダーゼのいずれかを用いた試行由来の精製タンパク質−ライブラリ−ピレンゼピン混合物を、それぞれ体積２０μＬずつに２分割する。ｍ２  ｍＡＣｈＲ−ライブラリ−ピレンゼピン混合物の場合、一方をＩＰ用に抗ｆｌａｇビーズ（抗ｆｌａｇ／プロテインＡアガロース）と合わせ、他方を対照アガロース・ビーズ（緩衝液／プロテインＡアガロース・ビーズ）と合わせることによって模擬ＩＰに供する。プロテインＡアガロース・ビーズは、本明細書で既に述べたように調製する。同様にβ−ガラクトシダーゼ混合物の場合、一方の２０μＬを対照ＩＰ用に抗ｆｌａｇビーズと合わせ、他方の２０μＬを対照アガロース・ビーズと合わせることによって模擬ＩＰに供する。ひっくり返すことによって混合し、これらのＩＰを引き続き４℃で６０分間進行させる。次いで各ＩＰを室温ので、（１）ビーズを１ｍＬのＴＢＳ−ＡＧと合わせる、（２）ひっくり返すことによって２分間混合する、（３）１００００ｇで遠心分離し、その後慎重に上澄みを除去してチューブの底にペレット状のアガロース・ビーズを残す、というサイクルを３回実施して洗浄する。最後に、各５０μＬのベッド・ボリュームのビーズ調製物を、次にさらに５０μＬのＴＢＳ（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁し、４℃に保持する。このプロセスの完了時には、４種の不均一なビーズ調製物、すなわち（１）ｍ２  ｍＡＣｈＲ／抗ｆｌａｇ／プロテインＡアガロース（ｍ２ビーズ）と、（２）ｍ２  ｍＡＣｈＲ／緩衝液／プロテインＡアガロース・ビーズ（ｍ２対照ビーズ）と、（３）β−ガラクトシダーゼ／抗ｆｌａｇ／プロテインＡアガロース・ビーズ（β−ガラクトシダーゼ・ビーズ）と、（４）β−ガラクトシダーゼ／緩衝液／プロテインＡアガロース・ビーズ（β−ガラクトシダーゼ対照ビーズ）が作製される。
【０１１９】
これらのビーズを基にした調製物は、下記の手法でスクリーニングするのに有用な不均一溶液相系を構成する。各１００μＬのビーズ調製物を５０ｍＬの３０％アセトニトリル水溶液と混合し、６０℃に５分間加熱して、結合しているピレンゼピンをタンパク質から解離させる。次いで混合物を１０，０００×ｇで遠心分離にかけ、ビーズをペレット化し、上澄み中の解離タンパク質を新しいチューブに移す。ＩＰ手順により、リガンドのアフィニティ選択と、結合していないライブラリ分子からのｍ２  ｍＡＣｈＲ−リガンド複合体の物理的分離との両方が可能になる。これらの上澄みは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８０ｍＭドデシルβ−Ｄ−マルトシド、１０％アセトニトリル、および＜５０ｐｍｏｌのピレンゼピンを含有する。これらの上澄み約６０μＬを、低流量（１００μＬ／分）逆相クロマトグラフィ（ＲＰＣ）システムに注入する。ＲＰＣカラム（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）製  Ｃ−１８；１ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍ）を６０℃に維持する。このＲＰＣカラムから、５％〜９５％アセトニトリル（０．１％ギ酸対イオン）水溶液（重量／０．１％ギ酸）で５分間の勾配を用いてリガンドを溶出し、分析のため高分解能の質量分析計に供する。
【０１２０】
ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質対照ビーズ、β−ガラクトシダーゼ・ライブラリ試験ビーズ、またはβ−ガラクトシダーゼ対照ビーズの上澄み由来のピレンゼピンに相当する質量は、ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質ビーズのＭＳ分析におけるピレンゼピンの質量応答値よりも高いはずである。したがって２５００分子のマスコード・ライブラリは、ピレンゼピンよりも高い親和性でｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質に結合するリガンドを含有することが推測される。ヒットを含むライブラリを、ヒットを含まないその他のライブラリの中からこのように検出し選択することが可能である。
（実施例１０）
多重化による疎水性タンパク質スクリーニング成果の向上
両親媒性物質−可溶化ＨＰを、スクリーニング成果を高める３次元高次構造に維持するには、ＨＰを、スクリーニング・サンプル調製物中で多重化する。多重化は、標的タンパク質といくらかの既知のモル当量の１つ以上のアクセサリタンパク質（ＡＰ）とを組み合わせた、任意の調製方法を指すよう定義される。ＡＰの使用に関して最も好ましいスクリーニング条件の選択が行われるように、５つの独立した基準が明らかにされている：その基準とは、（１）ＡＰの存在下で、ＡＰの非存在下よりも高い親和性で標的ＨＰが既知のアゴニストに結合することが観察されること；（２）ＡＰの存在下で、ＡＰの非存在下よりも高い親和性で標的ＨＰが既知のアンタゴニストに結合することが観察されること；（３）ＡＰの存在下で、ＨＰが、酵素アッセイ、インビトロアッセイ、または細胞を用いるアッセイをおこなった場合により高い機能活性を有することが示されること；（４）ＡＰの存在下、ＨＰがその多量体化状態を変化させることが示されること；および（５）ＡＰの存在下、ＨＰがより高い高次構造上の安定性または不変性を有することが示されること、である。
【０１２１】
第１の例として、Ｇαｉ１β１γ２−グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）をヘテロトリマーＡＰとして用いたｍ２  ｍＡＣｈＲの多重化スクリーニング法を示す。Ｇαｉ１β１γ２−ＧＤＰ複合体は、下記の方法によって示されるように、その存在によってｍ２  ｍＡＣｈＲのアンタゴニストＮ−メチルスカポラミン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｓｃａｐｏｌａｍｉｎｅ）（ＮＭＳ）に対する親和性が５倍高まるため、ｍ２  ｍＡＣｈＲに対するＡＰであると確認された。リンケン（Ｒｉｎｋｅｎ）およびハガ（Ｈａｇａ）の方法（リンケン、エー（Ｒｉｎｋｅｎ，Ａ．）およびハガ、ティー（Ｈａｇａ，Ｔ．）（１９９３年）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．第３０１巻：１５８〜１６４ページ）により実施された３Ｈ−ＮＭＳ結合アッセイから、３Ｈ−ＮＭＳに対するｍ２  ｍＡＣｈＲの見掛けのＫｄが０．１７ｎＭであり、一方、ｍ２  ｍＡＣｈＲ−Ｇαｉ１β１γ２−ＧＤＰ複合体のＫｄが４３２ｎＭであることが示された。このＨＰ／ＡＰ複合体をスクリーニングするため、ｍ２  ｍＡＣｈＲ／Ｇαｉ１β１γ２−ＰＬを実施例１１で説明するように調製し、リガンド化合物とのインキュベーション段階で５０μＭ  ＧＤＰを結合緩衝液に添加し、本明細書に示すアフィニティ選択およびＡＬＩＳまたは修正ＡＬＩＳを利用する方法のいずれかに従ってリガンド結合に関してスクリーニングを行った。
【０１２２】
第２の例として、ヒトオピオイド受容体の、ヘテロダイマー化したκおよびδサブタイプの多重化スクリーニングを示す。ヒトκオピオイド受容体は、ジョーダン（Ｊｏｒｄａｎ）およびデヴィ（Ｄｅｖｉ）の方法（ジョーダン、ビー  エー（Ｊｏｒｄａｎ，Ｂ．Ａ．）およびデヴィ、エル  エー（Ｄｅｖｉ，Ｌ．Ａ．）、（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  第３９９巻：６９７〜７０８ページ）によって示されるように、その存在によってヒトδオピオイド受容体の多量体化状態がモノマーからヘテロダイマーに変化するので、ヒトδオピオイド受容体に対するＡＰであることが確認された。
【０１２３】
スクリーニング用にδ／κオピオイド受容体ヘテロ二量体複合体を調製するには、以下の方法を使用する。ヒトκオピオイド受容体を精製し、ＴＢＳ−ＡＧ中に透析分離し、濃度５０μＭになるようにする。ヒトδオピオイド受容体を精製し、ＴＢＳ−ＡＧ中に透析分離し、濃度５０μＭになるようにする。これら２つの等体積の調製物を合わせて二量体化させる。
【０１２４】
次いで二量体化したオピオイド受容体複合体を、本明細書に示すアフィニティ選択およびＡＬＩＳまたは修正ＡＬＩＳを利用した方法のいずれかに従い、リガンド結合に関してスクリーニングする。
（実施例１１）
定義されたＧＰＣＲプロテオリポソーム（ＧＰＣＲ−ＰＬ）の調製方法
界面活性剤に可溶化されたＧＰＣＲに高次構造上の安定性をもたらすため、界面活性剤ミセルによる可溶化を、以下の基準、すなわち：（１）ＰＬの脂質組成が、ＰＬの脂質含量の９０％を構成する６種以下の個別の脂質部分を有するものと定義され、特徴付けられること、（２）ＨＰ−ＰＬ調製物の９０％が、３桁以内に収まる明確な単峰形の粒子サイズ分布を有し、平均的な粒子サイズが５〜１００００ｎｍの範囲内であること、（ｃ）ＰＬ調製物の収量＞５０ｎＭ  ＨＰであること；を満たすものとして定義されたプロテオリポソームによる可溶化に変更した。
【０１２５】
ｍ２  ｍＡＣｈＲタンパク質を含むＨＰ−ＰＬを調製するため、下記の手順を使用する。合成脂質（アバンティポーラーリピッズ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）［米国アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在］）Ｄ−リボ−フィトスピンゴシン−１−ホスフェートおよびセラミド−Ｃ１８：０をそれぞれクロロホルムに溶かしたものを、ガラスの試験管内で一緒にして１ｍＬの体積（それぞれ５ｍＭ）とし、アルゴン流中で２４時間、室温でクロロホルムを蒸発させる。次いで脂質残分をＴＢＳ  ０．４０ｍＬで湿らせ、２８℃で３０分間超音波処理し、混合物を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移す。この脂質混合物に、ピーターソン、ジー  エルら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）が記述するように調製した５０μＭ  ｍ２  ｍＡＣｈＲを０．２ｍＬ添加する（ピーターソン、ジー  エルら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻：１７８０８ページ）。この結果、脂質とタンパク質との粗製混合物が得られる。
【０１２６】
次いでタンパク質−脂質粗製混合物を、５分、２２℃の槽中の超音波処理を３０分間隔で（６回）実施しながら８℃で３時間インキュベートする。次いでこの混合物を２０℃で、製造業者のプロトコルに従って（アバンティポーラーリピッズ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）［米国アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在］）容積の小さい押出し機で１００ｎｍポリカーボネート膜に１１回通す。この結果、体積０．６ｍＬのＰＬ粗製物、１６μＭ  ｍ２  ｍＡＣｈＲ、および過剰な両親媒性物質（ＤｂＭおよび脂質）が得られる。過剰な脂質および界面活性剤を除去するため、予め４℃でＴＢＳで平衡化した１０ｍＬの脱塩体（Ｇ−５０セファデックス（ｓｅｐｈａｄｅｘ、登録商標）カラム）に、ＰＬ粗製物を通過させる。ＰＬ粗製物を脱塩カラムに通した後、４℃のＴＢＳを使用してその物質をカラムから溶出する。この脱塩操作は、流速０．５ｍＬ／分で実施する。タンパク質濃度は、サンプル１０μＬと０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １０μＬとを合わせ、その混合物をバイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）比色タンパク質アッセイ（バイオラッドインコーポレイテッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）所在］）に使用することにより推定する。次いでＴＢＳで希釈することにより濃度を１０μＭに調整する。
【０１２７】
コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）のＮ４サブミクロン・パーティクル・アナライザを使用して、製造業者のプロトコルに従いサイズ分布を明らかにする。これとは別に、サイズ分布と平均粒子サイズの評価を、流速１．０ｍＬ／分で溶出緩衝液ＴＢＳを用いた分析用ＳＥＣカラム（Ｇ２０００ＳＷＸＬ、５×３００ｍｍ、５μｍ；トーソーハース（ＴｏＳｏ−Ｈａａｓ））に、２８０ｎｍでモニタするＵＶ検出器を取り付け、１２℃に冷却した状態で２０μＬを注入することにより分析ＳＥＣによって実施する。８．２３分に溶出する単一ピークによりＧＰＣＲ−ＰＬの保持時間が同定され、これを分子サイズ・マーカー溶出時間の標準曲線と比較し、ＧＰＣＲ−ＰＬの見掛けの平均サイズが９４０，０００ダルトンのタンパク質のサイズに匹敵することが示された。
【０１２８】
プロテオリポソームは、ＡＰと複合体を形成したＨＰを用いて調製することもできる。この手順では、界面活性剤ミセルによる可溶化を、以下の基準、すなわち：（１）ＰＬの脂質組成が、ＰＬの脂質含量の９０％を構成する６種以下の個別の脂質部分を有するものと定義され、特徴付けられたこと、（２）ＨＰ−ＰＬ調製物の９０％が、３桁以内に収まる明確な単峰形の粒子サイズ分布を有し、平均的な粒子サイズが５〜１００００ｎｍの範囲内であること、（３）ＰＬ調製物の収量＞５０ｎＭ  ＨＰであること；（４）ＰＬ調製物が、アクセサリタンパク質（ＡＰ）と呼ばれる少なくとも１つの他のタンパク質を含み、その存在により標的ＨＰにとって好ましい高次構造が維持されること；を満たすものとして定義されたプロテオリポソームへの可溶化に変更する。
【０１２９】
ｍ２  ｍＡＣｈＲを有するＨＰ−ＰＬを調製するため、下記の手順を使用した。合成脂質（アバンティポーラーリピッズ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）［米国アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在］）Ｄ−リボ−フィトスピンゴシン−１−ホスフェートとセラミド−Ｃ１８：０をそれぞれクロロホルムに溶かしたものを、ガラスの試験管内で一緒にして１ｍＬの体積（それぞれ５ｍＭ）にし、アルゴン流中で２４時間、室温でクロロホルムを蒸発させる。次いで脂質残分を０．４０ｍＬのＴＢＳに２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えたもの（ＴＢＳＭ）で湿らせ、２８℃で３０分間超音波処理し、混合物を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移す。これとは別に、記述（参照文献）に従い精製した１００μＭ  Ｇβ１γ２と１００μＭ  Ｇαｉ１とを等体積で合わせることによって５０μＭ  Ｇαｉ１β１γ２を調製し、ＴＢＳＭに８００ｍＭ  ＤｂＭを加えたものに透析分離した（ＴＢＳＭ−ＡＧ）。該脂質混合物に、ピーターソン、ジー  エルら（Ｐｅｔｒｅｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）が記述するように（ピーターソン、ジー  エルら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻；１７８０８ページ）調製した５０μＭ  ｍ２  ｍＡＣｈＲを０．２ｍＬと、５０μＭ  Ｇαｉ１β１γ２を０．２ｍＬ添加する。この混合物に、５０ｍＭ  ＧＤＰを１０μＬ添加する。その結果、脂質、ＨＰ、およびＡＰの粗製混合物が得られる。
【０１３０】
次いでＨＰ／ＡＰ−脂質粗製混合物を、５分、２２℃の槽中の超音波処理を３０分間隔で（６回）実施しながら８℃で３時間インキュベートする。次いでこの混合物を２０℃で、製造業者のプロトコルに従って（アバンティポーラーリピッズ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）［米国アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在］）容積の小さい押出し機で１００ｎｍポリカーボネート膜に１１回通す。この結果、体積０．８ｍＬのＰＬ粗製物、１２μＭ  ｍＡＣｈＲ、１２μＭ  Ｇαｉ１β１γ２、および過剰な両親媒性物質（ＤｂＭおよび脂質）が得られる。過剰な脂質および界面活性剤を除去するため、予め４℃でＴＢＳにより平衡化した１０．０ｍＬの脱塩体（Ｇ−５０セファデックス・カラム）に、ＰＬ粗製物を通過させる。ＰＬ粗製物を脱塩カラムに通した後、４℃のＴＢＳを使用してその物質をカラムから溶出する。この脱塩操作は、流速０．５ｍＬ／分で実施する。タンパク質濃度は、サンプル１０μＬと０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １０μＬとを合わせ、その混合物をバイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）比色タンパク質アッセイ（バイオラッドインコーポレイテッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）所在］）に使用することにより推定する。次いでＴＢＳで希釈することにより濃度を２０μＭに調整する。
【０１３１】
サイズ分布を明らかにするために、製造業者のプロトコルに従いコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）のＮ４サブミクロン・パーティクル・アナライザを使用する。これとは別に、サイズ分布と平均粒子サイズの評価を、流速１．０ｍＬ／分で溶出緩衝液ＴＢＳを用いた分析用ＳＥＣカラム（Ｇ２０００ＳＷＸＬ、５×３００ｍｍ、５μｍ；トーソーハース（ＴｏＳｏ−Ｈａａｓ））に、２８０ｎｍでモニタするＵＶ検出器を取り付け、１２℃に冷却した状態で２０μＬを注入することにより分析ＳＥＣによって実施する。注入後８．２３分に溶出する単一ピークによりＨＰ／ＡＰ−ＰＬの保持時間が同定され、これを分子サイズ・マーカー溶出時間の標準曲線と比較する。その結果得られる見掛けの平均サイズは９４０，０００ダルトンのタンパク質のサイズに匹敵することが示された。
【０１３２】
スクリーニング対照として使用される対照ＡＰ−ＰＬは、以下の基準、すなわち：（１）ＰＬの脂質組成が、ＰＬの脂質含量の９０％を構成する６個以下の個別の脂質部分を有するものと定義され特徴付けられること、（２）ＨＰ−ＰＬ調製物の９０％が、３桁以内に収まる明確な単峰形の粒子サイズ分布を有し、平均的な粒子サイズが５〜１００００ｎｍの範囲内であること、（３）ＰＬ調製物が、標的ＨＰが存在しないこと以外は類似のＨＰ／ＡＰ−ＰＬを正確に模倣するよう設計されること、という基準を満たすよう作製される。
【０１３３】
ｍ２  ｍＡＣｈＲを有するＡＰ−ＰＬを調製するため、下記の手順を使用する。合成脂質（アバンティポーラーリピッズ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）［米国アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在］）Ｄ−リボ−フィトスピンゴシン−１−ホスフェートとセラミド−Ｃ１８：０をそれぞれクロロホルムに溶かしたものを、ガラスの試験管内で一緒にして１ｍＬの体積（それぞれ５ｍＭ）にし、アルゴン流中で２４時間、室温でクロロホルムを蒸発させる。次いで脂質残分を０．４０ｍＬのＴＢＳに２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えたもの（ＴＢＳＭ）で湿らせ、２８℃で３０分間超音波処理し、混合物を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移す。これとは別に、ホウ、ワイら（Ｈｏｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００年）第２７５巻：３８９６１〜６ページの記述に従って精製した１００μＭ  Ｇβ１γ２と１００μＭ  Ｇαｉ１とを等体積で合わせることによって５０μＭ  Ｇαｉ１β１γ２を調製し、ＴＢＳＭに８００ｍＭ  ＤｂＭを加えたものに透析分離した（ＴＢＳＭ−ＡＧ）。該脂質混合物に、ＴＢＳ−ＡＧを０．２ｍＬと、５０μＭ  Ｇαｉ１β１γ２を０．２ｍＬ添加する。この混合物に、５０ｍＭ  ＧＤＰを１０μＬ添加する。その結果、脂質およびＡＰの粗製混合物が得られる。タンパク質濃度は、サンプル１０μＬと０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １０μＬとを合わせ、その混合物を、製造業者の使用説明書に従ってバイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）比色タンパク質アッセイに使用することにより推定する。次いでＴＢＳで希釈することにより濃度を１０μＭに調整する。
【０１３４】
次いでＡＰ−脂質粗製混合物を、５分、２２℃の槽中の超音波処理を３０分間隔で（６回）実施しながら８℃で３時間インキュベートする。次いでこの混合物を２０℃で、製造業者のプロトコルに従って（アバンティポーラーリピッズ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）［米国アラバマ州アラバスター（Ａｌａｂａｓｔｅｒ）所在］）容積の小さい押出し機で１００ｎｍポリカーボネート膜に１１回通す。この結果、体積０．８ｍＬのＰＬ粗製物、１２μＭ  ｍＡＣｈＲ、１２μＭ  Ｇαｉ１β１γ２、および過剰な両親媒性物質（ＤｂＭおよび脂質）が得られる。過剰な脂質および界面活性剤を除去するため、予め４℃でＴＢＳにより平衡化した１０．０ｍＬの脱塩体（Ｇ−５０セファデックス・カラム）に、ＰＬ粗製物を通過させる。ＰＬ粗製物を脱塩カラムに通した後、４℃のＴＢＳを使用して、その物質をカラムから溶出させる。この脱塩操作は、流速０．５ｍＬ／分で実施する。
【０１３５】
サイズ分布を明らかにするために、製造業者のプロトコルに従いコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）のＮ４サブミクロン・パーティクル・アナライザを使用する。これとは別に、サイズ分布と平均粒子サイズの評価を、流速１．０ｍＬ／分で溶出緩衝液ＴＢＳを用いた分析用ＳＥＣカラム（Ｇ２０００ＳＷＸＬ、５×３００ｍｍ、５μｍ；トーソーハース（ＴｏＳｏ−Ｈａａｓ））に、２８０ｎｍでモニタするＵＶ検出器を取り付け、１２℃に冷却した状態で２０μＬを注入することにより分析ＳＥＣによって実施する。８．２３分に溶出する単一ピークによりＡＰ−ＰＬの保持時間が同定され、これを分子サイズ・マーカー溶出時間の標準曲線と比較する。得られた見掛けの平均サイズは、９４０，０００ダルトンのタンパク質のサイズに匹敵する。
【０１３６】
次いで本明細書で述べたプロテオリポソームを、本明細書に示すアフィニティ選択およびＡＬＩＳまたは修正ＡＬＩＳを利用する方法のいずれかに従い、リガンド結合についてスクリーニングする。
（実施例１２）
ＨＰの２重エピトープ・アフィニティ精製
本発明のタグ付きＨＰタンパク質をコードする核酸配列の構築は、核酸クローニングの技術分野で一般的な通常の手順を利用する当業者の技術範囲に十分含まれる。
【０１３７】
タグ付きＨＰ、例えばメリチン−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグタンパク質や、メリチン−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥタグタンパク質を、ウイルス発現系の製造業者（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）により提供される方法に従って、組換えバキュロウイルスから生成する。
【０１３８】
概要を述べると、組換えウイルスを、その組換えタンパク質発現能に基づいて選択する。発現タンパク質を、感染昆虫細胞を界面活性剤により可溶化した細胞溶解物のウェスタン・ブロット分析により確認する。Ｆｌａｇエピトープ、ＥＥエピトープ、またはＨＰタンパク質そのもののいずれかを認識する１次抗体を使用し、ウェスタン・ブロットによりＨＰタンパク質が発現するかどうか、またはＨＰタンパク質がどの程度発現するかを明らかにする。可能であれば、発現タンパク質が機能を有することを確認するために、機能的アッセイを行う。例えばメリチン−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタグタンパク質の場合、リンケン（Ｒｉｎｋｅｎ）およびハガ（Ｈａｇａ）の方法（リンケン、エー（Ｒｉｎｋｅｎ，Ａ．）およびハガ、ティー（Ｈａｇａ，Ｔ．）（１９９３年）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．第３０１巻：１５８〜１６４ページ）に従って細胞を用いた３Ｈ−Ｎ−メチルスカポラミン結合分析を行い、それによって、ウイルスに誘導されたタンパク質発現が機能を有し、細胞当たりの受容体が０．５×１０６個のＢｍａｘと、０．１０ｎＭのＫｄとを示すことが確認された。次いでこのバキュロウイルスを、従来の方法（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在］）によって２．０×１０８ｐｆｕ／ｍＬに達する高い力価に増幅した。
【０１３９】
次に、タンパク質を単離するため大量の昆虫細胞培養物を得る。概要を述べると、高力価のウイルスストックが所定の構築物を生成するとすぐに、Ｓｆ２１昆虫細胞をバイオリアクタ内で波動撹拌しながら（ウェーブバイオテクノロジー（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）［米国ニュージャージー州ベッドミンスター（Ｂｅｄｍｉｎｓｔｅｒ）所在］）細胞密度２×１０６／ｍＬまで増殖させる１０リットル規模の生産を１０回実施した。生産する各タンパク質について、これらの細胞に感染効率（ＭＯＩ）５で高力価ウイルスストックを接種し、感染後２日で細胞をハーベストした。
【０１４０】
次いでＨＰタンパク質を可溶化する。例えば、ｍＡＣｈＲタンパク質発現細胞を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって回収する。１０回のバイオリアクタによる生産の全ての細胞ペレットを一緒にし、その細胞ペレットを、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌ  ペプスタチンおよび１μｇ／ｍｌ  ｐメチルスルホニルフルオライド、ならびに２０ｍＭ  ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤｂＭ）を加えた氷冷ＴＢＳ緩衝液５００ｍＬに再懸濁する。この細胞スラリを、Ａ型乳棒のＤｏｕｎｃｅホモジナイザで４℃で５０回のストロークに供し、細胞を破砕して膜タンパク質を可溶化する。この懸濁液を清澄にするために、該物質を４℃で６０分間、４００００×ｇで遠心分離にかけて、不溶性物質を除去する。次いで上澄みを回収し、可溶性メリチン−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥタンパク質の供給源として使用する。（注記：ミツバチのメリチン・シグナル配列は、発現および昆虫細胞原形質膜への移動の過程で細胞プロテアーゼにより切断される。それ以降は、該可溶化タンパク質をＦｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥと呼ぶ）。
【０１４１】
次いで各可溶化組換えＨＰを、抗体アフィニティ・カラムでアフィニティ精製を２回行うことにより精製する。抗ＥＥタグカラムと抗Ｆｌａｇタグカラムの両方を同じように準備する。概要を述べると、製造業者のプロトコルに従って（アマシャムファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ［米国ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）所在］）、３５ｍｇの精製抗エピトープ抗体を結合緩衝液中に透析し、ＣＮＢｒ活性化セファロース・ビーズ１０ｍＬに結合させる。次いで樹脂を１．２×１５ｃｍポリプロピレン・カラムに移し、次にエピトープ・アフィニティ・カラムを４℃でＴＢＳ−ＡＧを用いて平衡化する。
【０１４２】
次に、５０ｍＬの可溶化ＨＰタンパク質、例えばＦｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥを、毎分０．２ｍＬの流速で抗ＥＥアフィニティ・カラムにアプライする。次いで、カラム体積の５倍量のＴＢＳ−ＡＧにより同じ流速でそのカラムを洗浄した。次いで特異的に結合したＨＰを、ＴＢＳ−ＡＧ中体積１５ｍＬに可溶化して１０ｍＭとした過剰なＥＥペプチド（ＮＨ２−ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ−ＣＯＯＨ；シグマゲノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）［米国ミズーリ州セントルイス所在］）の大量添加によりカラムから溶出させる。次いで溶出液を、抗Ｆｌａｇタグ・アフィニティ・カラムに同様にアプライし、同様に洗浄し、過剰な抗ＦＬＡＧペプチド（ＮＨ２−ＤＹＫＤＤＤＤＫ−ＣＯＯＨ；シグマゲノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）［米国ミズーリ州セントルイス所在］）でカラムから溶出させる。次いでこの物質を、１００倍容のＴＢＳ−ＡＧを２回交換して４℃で１晩透析する。
【０１４３】
次いでショ糖勾配超遠心分離を使用して、誤って折り畳まれたポリペプチドを除去する。概要を述べると、該物質を、ＴＢＳ−ＡＧに溶かした５％〜２５％ショ糖の不連続なステップ勾配に供し、４℃で４時間、１０００００×ｇでベックマンＳＷ  Ｔｉ．５０ロータにより遠心分離する。適正な高次構造のＨＰ、例えばＦｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥは、５％〜２５％の界面で回収される。次いでこの物質を、１００倍容のＴＢＳ−ＡＧを２回交換して４℃で１晩の最後の透析に供する。
【０１４４】
ＨＰ溶液のタンパク質濃度を、比色タンパク質アッセイ（バイオラッドラボラトリーズインコーポレイテッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）［米国カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）所在］）によって決定し、必要に応じて希釈または撹拌限外濾過セル（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）［米国マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）所在］）で濃縮することによって、５０μＭに調整する。界面活性剤濃度も、ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）Ｃ−１８カラムを使用してＲＰＣ−ＵＶで決定し、この場合、リガンドの混合物５０μＬを、２０分かけて、５％〜９５％アセトニトリル（０．１％ギ酸対イオン）水溶液（ｗ／０．１％ギ酸）の勾配を使用して溶出し、分析のため高分解能質量分析計へ供する。ＤｂＭのＲｔは、同一の条件下で個別に対照実験を行うことにより決定する。界面活性剤の量を定量するためには、タンパク質サンプルからのＤｂＭピークの面積を、既知濃度のＤｂＭサンプルのＤｂＭピーク高をアッセイする同一条件下の複数回のＲＰＣから作製された標準曲線と比較する。界面活性剤濃度が０．４８ｍＭ（４×ｃｍｃ）よりも低いと推定される場合、ＴＢＳに溶かした高濃度のＤｂＭを少量添加することによって調整する。
（実施例１３）
ＨＰのエピトープ・アフィニティおよび金属キレート・アフィニティ・クロマトグラフィ（ＭＣＡＣ）
ＨＰはまた、例えばヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶ−８Ｈｉｓに代表されるように、エピトープ・アフィニティ・タグおよび金属キレート・アフィニティ・タグを備えて構成される。概要を述べると、製造業者（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ所在］）により提示される下記の方法に従って、ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶ−８Ｈｉｓをコードする単離核酸分子を組換えバキュロウイルスの産生に使用する。ウイルス産生、大量の昆虫細胞培養およびタンパク質発現、エピトープ・アフィニティ・カラムの調製、可溶化ＨＰの調製、ならびにエピトープ・アフィニティ精製は、ＨＳＶエピトープ・アフィニティ・カラムを調製する際に抗ＦＬＡＧ抗体の代わりに抗ＨＳＶ抗体を使用し、ＦＬＡＧペプチドの代わりにＨＳＶペプチド（ＮＨ２−ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ−ＣＯＯＨ；シグマゲノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ））を使用してヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶ−８Ｈｉｓタンパク質をカラムから溶出すること以外、全て本明細書で既に述べたように行った。また、ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶ−８Ｈｉｓタンパク質にはＥＥエピトープがないので、ＥＥエピトープを使用するエピトープ・アフィニティ精製は使用しない。（注記：ヘマグルチニンＳＳシグナル配列は、一部の細胞株では発現および昆虫細胞の原形質膜への移動の過程で細胞プロテアーゼによって切断される可能性がある。それ以降は、該可溶化タンパク質をラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶ−８Ｈｉｓと呼ぶ。
【０１４５】
アフィニティ精製の最終ステップでは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））１０ｍＬを１．２×１５ｃｍのポリプロピレン・カラムに充填し、そのカラムを流速０．２ｍＬ／分で４℃のＴＢＳ−ＡＧ  １００ｍＬで平衡化することにより調製したＭＣＡＣカラムに、ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶ−８Ｈｉｓを流速０．２ｍＬ／分でアプライする。ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶ−８Ｈｉｓがカラムに結合したら、そのカラムを５ｍＭのイミダゾールを含有するＴＢＳ−ＡＧ  １００ｍＬで洗浄する。次いでこのカラムを、同じ流速でＴＢＳ−ＡＧ中の５ｍＭ〜３５０ｍＭイミダゾールの５０ｍＬ直線勾配で展開し、０．５ｍＬずつ画分を回収する。活性ｍＡＣｈＲを含有する画分は、既知の放射性リガンド結合アッセイによって評価されるとおり、１９０〜２４０ｍＭのイミダゾール濃度に相当する体積１１ｍＬ中に溶出する。次いでこの物質を、１００倍容のＴＢＳ−ＡＧを３回交換して４℃で１晩透析し、過剰なイミダゾールを除去する。次いでこの物質を、ショ糖勾配超遠心分離にかけ、本明細書で既に述べたようにタンパク質および界面活性剤の濃度を測定し調整する。
（実施例１４）
精製ＨＰの特徴付け
本明細書で生産したＨＰの最終的な調製物の純度を確認するために、各サンプルを５〜１２％Ｎｏｖｅｘ（登録商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［米国カリフォルニア州サンディエゴ所在］）ゲル上で、製造業者の使用説明書に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供する。ゲル・レーン当たりサンプル１０μｇをロードし、タンパク質サンプルを銀染色法によって視覚化する（ピーターソン、ジー  エルら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻：１７８０８ページ）。これらの方法により調製したｍＡＣｈＲタンパク質の特異的な活性を、ピーターソン、ジー  エルら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）の方法（ピーターソン、ジー  エルら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻：１７８０８ページ）に従って決定する。本明細書で述べた方法では一般に、タンパク質の特異的な活性は、ｍＡＣｈＲタンパク質１ｍｇ当たりの特異的リガンド結合が１１〜１６ｎｍｏｌの範囲内になるよう決定される。
【０１４６】
リガンド・アフィニティ・クロマトグラフィは、本発明のＨＰを特異的な活性に関して評価することが可能なもう１つの測定法である。例えば本明細書で述べた方法により精製したｍＡＣｈＲは、固定化ｍＡＣｈＲリガンド３−（２’−アミノベンズヒドリルオキシ）−トロパン（ＡＢＴ）のカラムに通して既知リガンドのアフィニティ・クロマトグラフィにかけることが可能である。
【０１４７】
均等物
当業者なら、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の数多くの均等物を、通常の実験を行うだけで理解しまたは確かめることが可能であろう。そのような均等物は、上記の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】ＨＰタンパク質ＧＰ６７  ＳＳ−Ｍｙｃタグ−ＥＥタグ−ヒトｍ２  ｍＡＣｈＲのアミノ酸配列（配列番号１９）を示す図。
【図２】ＨＰタンパク質メリチン−Ｆｌａｇタグ−ヒトβ２アドレナリン受容体−ＥＥのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す図。
【図３】ＨＰタンパク質ヘマグルチニンＳＳ−ヒトニューロキニン３受容体−ＨＳＶ−Ｍｙｃのアミノ酸配列（配列番号２１）を示す図。
【図４】ＨＰタンパク質メリチン−Ｆｌａｇタグ−ヒトｍ１  ｍＡＣｈＲ−ＥＥのアミノ酸配列（配列番号２２）を示す図。
【図５】ＨＰタンパク質ヘマグルチニンＳＳ−ラットｍ３  ｍＡＣｈＲ−ＨＳＶ−８Ｈｉｓのアミノ酸配列（配列番号２３）を示す図。
【図６】ＡＬＩＳスクリーニング・システムの性能をモニタするために開発されたコンピュータ・インターフェースのスクリーンショットにより表示されるＳＥＣクロマトグラム。ＳＥＣカラムに注入した後のサンプル注入に伴う溶出時間に対して２３０ｎｍでの相対吸光度を垂直軸上にプロットする。この表示は、６種の異なる結合反応混合物の分析に関する分離プロフィルをまとめたものである。いずれの場合も、混合物は、各２５μＭのインドメタシンおよびメクロフェナメートと、１０μＭのＣＯＸ−１と、各１μＭの約２５００種の個々のスクリーニング化合物とからなる。１２〜１５秒の間で溶出するピークは、分析のために質量分析計に送られるＳＥＣ画分を含有するＣＯＸ−１に該当する。１７秒後に溶出するピークは、非結合のライブラリ分子に該当する。
【図７】図１に示す試験ライブラリから抽出された２つの既知ＣＯＸ−１リガンド（ＮＳＡＩＤ  ＬＭ；インドメタシンおよびメクロフェナメートからなる）について測定された回収率を示す質量スペクトル分析図。異なる日（１０／１５および１０／１８）の異なるＣＯＸ−１調製物は、競合ライブラリ（ＮＧＬ−１５−Ａ−１３７、ＮＧＬ−１０−Ａ−４１、ＮＧＬ−１１６−Ａ−４７０、ＮＧＭ−５１、ＮＧＭ−１０８、ＮＧＭ−１７７）が存在しない状態で、または存在下で、既知のリガンドを結合する。標準曲線と比較することにより、質量スペクトル分析では、各回収リガンドのピコモルレベルの測定が可能になる。測定は、インドメタシンとメクロフェナメートの両方について３連で実施した。
【図８】ＡＬＩＳによって同定された１例であるＣＯＸ−１リガンドの構造を示す図。ＮＧＬ−１７７−Ａ−１１２８−Ａ−２ａと呼ばれるこの化合物は、ＡＬＩＳスクリーニングによってＣＯＸ−１リガンドであると同定された化合物の１例である。
【図９】ＣＯＸ−１結合に関するメクロフェナメートとの競合を示す棒グラフ。選択されたＣＯＸ−１ヒット化合物は、各約１μＭで、頭にＮＧＬ−ｘと付いた１０文字の名称で識別されるが、これらがＣＯＸ−１への結合に関して２５μＭメクロフェナメートと競合するかどうかを決定するため個々に試験を行った。メクロフェナメートまたは被験リガンドのいずれかの質量に相当する質量スペクトルの応答を定量化した。ＣＯＸ−１結合に関してメクロフェナメートと競合する被験リガンドでは、「リガンド＋競合物質」の応答が、「リガンド−競合物質」の応答よりも低くなる。また、メクロフェナメートの応答は、上述の「リガンド＋競合物質」の試行に関して「ＣＯＸ１＋２５μＭメクロフェナメートの試行」の場合より低くなる。例えば、ＮＧＬ−１６９−Ａ−１１５１−Ａ−４で表される試験化合物はメクロフェナメートと競合するが、ＮＧＬ−１７５−Ａ−１１２７−Ａ−１で表される試験化合物は、はっきりと競合するとは言えない。
【図１０】ＡＬＩＳ法による質量スペクトル分析のシグナル強度によって定量したＭ２Ｒ１リガンド回収率の程度を示す棒グラフ。ｘ軸は、ピレンゼピン、ＱＮＢ、およびアトロピンの各質量に対する質量スペクトルのシグナル応答を相対単位で表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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