(57)【要約】細胞核に、ヒストン活性を阻害する成分（ただしＨＡＭＬＥＴを除く）を導入することを含む細胞を殺す方法である。本方法は、例えばガンの治療においてまたは抗菌活性のために有用であり得る。ヒストンは治療化合物を選択するためのスクリーニング方法の基礎として用いることができ、これらも説明され、特許請求されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストン活性を阻害する成分（ただしＨＡＭＬＥＴを除く）を細胞核に導入することを含む、細胞を殺す方法。
【請求項２】
成分は、ヒストンと特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
成分は、Ｈ２、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンと結合する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
成分は、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンと結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
成分は、Ｈ４ヒストンと結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
成分は、Ｈ３ヒストンと結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
成分は、ヒストン特異的抗体またはその結合フラグメントを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
成分は、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで作用して、機能的ヒストンの発現を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
成分は、センスまたはアンチセンスＲＮＡコンストラクトを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
成分は、該成分を細胞に移動させることができるキャリアータンパク質またはペプチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
成分は、細胞内でヌクレオソームと共に局在する標的化物質をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
標的化物質は、核標的化シグナルペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
成分は、腫瘍または未分化細胞に特異的な細胞特異的な標的化試薬をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
成分をコードするヌクレオチド配列を含み、そしてインビボで細胞中で該配列を発現することができるベクターと、該細胞とを接触させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
被試験成分とヒストンとを接触させること、および、それらの間の相互作用を検出することを含む、細胞を殺すことができる成分のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ヒストンは、Ｈ３またはＨ４である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒストンは、ヒトまたはウシである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
被試験成分を標識し、次に、固定されたヒストン標的と接触させる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
被試験成分を支持体に固定し、溶液中のヒストンと接触させ、未結合材料を除去し、そして結合したヒストンを検出する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ヒストンは、標識されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被試験成分とヒストン溶液とを接触させること、および、沈殿を検出することを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ヌクレオソームが形成される条件下で、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法を用いて同定された成分と、ＤＮＡおよびヒストンとを接触させる工程、および、該ヌクレオソームの形成を検出する工程をさらに含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
成分が細胞核中で不溶性複合体を形成するかどうかを測定する工程をさらに含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞を殺すことに用いられる請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法を用いて同定された成分。
【請求項２５】
ヒストン結合物質、および、移動ペプチド、核標的化物質または細胞特異的な標的化試薬の少なくとも１種を含む、細胞を殺すことができる成分。
【請求項２６】
ヒストン結合物質は、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法を用いて同定された物質である、請求項２５に記載の成分。
【請求項２７】
成分は、ポリペプチドである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分をコードする核酸。
【請求項２８】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
ガンの治療に用いられる医薬の製造における請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分の使用。
【請求項３０】
細菌感染の治療に用いられる医薬の製造における請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分の使用。
【請求項３１】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分を、細菌またはそれらの環境に適用することを含む、殺菌または細菌制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を殺す方法に関し、同様に、治療（例えば腫瘍の治療または抗菌用途）におけるこれらの方法の使用に関する。本発明はさらに、これら治療方法において有用な可能性がある化合物または試薬をスクリーニングする方法、同様に、この方法において有用な新規の試薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡＭＬＥＴ（Ｈｕｍａｎ  α−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ  ｍａｄｅ  ｌｅｔｈａｌ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ(腫瘍細胞に致死的なヒトα−ラクトアルブミン)）は、腫瘍細胞において細胞死を誘導する分子複合体である。実際に、その効果は、腫瘍細胞およびいくつかの未熟細胞に対して選択的であり、健康な分化細胞はＨＡＭＬＥＴに反応して細胞死を起こすことはない。この選択性は、ＨＡＭＬＥＴは、腫瘍細胞において特定の標的に達するが、耐性細胞ではそれらに達しないことを意味する。
【０００３】
本発明で用いられる用語「ＨＡＭＬＥＴ」は、α−ラクトアルブミン（ヒト由来でもよいし、そうでなくてもよい）の生物学的に活性な複合体を意味し、これは、ｐＨ４.６で沈殿させた乳汁のカゼイン分画から単離すること、イオン交換クロマトグラフィーとゲルクロマトグラフィーとを組み合わせること（例えば欧州特許第０７７６２１４号（Ａ）で説明されたように）、または、Ｃ１８：１脂肪酸で示されるヒトミルクカゼインからの補因子（Ｗ０９９／２６９７９で説明したような）の存在下で、α−ラクトアルブミンをイオン交換クロマトグラフィーで処理することにより入手可能である。
【０００４】
ＨＡＭＬＥＴの細胞性の標的は、共焦点顕微鏡法と細胞内分画とを組み合わせて調べられている［Ｈａｋａｎｓｓｏｎ等，１９９９年，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４６，４５１〜６０］。ＨＡＭＬＥＴは、細胞表面に結合し、細胞質に入り込み、そこでミトコンドリアと相互作用してミトコンドリアを活性化する。最終的にこのタンパク質は細胞核に入り込み、そこで蓄積される。
【０００５】
本出願人は、耐性細胞と感受性細胞とがいずれも同様の効率でＨＡＭＬＥＴをそれらの表面に結合させることを発見し、この段階は識別をするための事象ではないことを示している。これに対して、核での蓄積は死細胞でしか起こらず、すなわちこの段階は、耐性細胞から感受性細胞を区別していることを示す。共焦点顕微鏡法によれば、核での蓄積は不可逆的と考えられ、すなわち、ＨＡＭＬＥＴを核区画内部に結合させ保持させる核標的が存在することを示す。
【０００６】
本出願人が、ＨＡＭＬＥＴの核内分布をさらに詳細に調べたところ、このタンパク質は核小体に相当する領域に選択的に局在していることを発見し、これによりＨＡＭＬＥＴがクロマチン構造の調節に関与する分子と相互作用することが示唆される。
【０００７】
さらに研究した結果、核内のＨＡＭＬＥＴの標的が同定された。驚くべきことに、ＨＡＭＬＥＴは、特定のヒストンタンパク質、およびヌクレオソームと相互作用することがわかった。それゆえに、この相互作用は、細胞を細胞死経路に不可逆的に固定する事象であると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
腫瘍は、しばしば健康な細胞で細胞死を誘導する刺激に対して非感受性であり、それに
よって寿命を伸ばしている。それらは制御不可能なように増殖し、組織の境界を重視しなくなる。ＨＡＭＬＥＴの腫瘍細胞において、選択的に細胞死を誘導する能力は極めて珍しい。ＨＡＭＬＥＴは、様々な腫瘍細胞、例えばヒトおよびその他の起源のリンパ腫や癌腫を殺す。従って、ＨＡＭＬＥＴの細胞内の標的を理解することは、腫瘍細胞で機能性を維持する細胞死プログラムを理解するのに有用であり得る。ＨＡＭＬＥＴの核への効果により、ＤＮＡ損傷および細胞死に関する新しいメカニズムが実証される。この新しい作用機序により、新しい治療法やスクリーニングの可能性が生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、細胞を殺す方法を提供し、この方法は細胞核にヒストン活性を阻害する成分（ただしＨＡＭＬＥＴを除く）を導入することを含む。
【００１０】
コアヒストンは、進化上保存されたタンパク質であり、ＤＮＡの統合性と機能を維持するのに役立つ。これらは、高い電荷を有する塩基性タンパク質であり、一次構造の相同性は低いが、三次構造モチーフであるヒストンフォールド（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｆｏｌｄ）を共通して有し［Ａｒｅｎｔｓ等，１９９１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０１４８〜５２］、主要なＤＮＡ結合に関与する。ヌクレオソームは、左巻きスーパーへリックスの１.６５ターンにおいて約１４６ｂｐのＤＮＡで囲まれたコアヒストンオクタマーからなる［Ａｒｅｎｔｓ等，１９９３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０４８９〜９３］。隣接したヌクレオソームは、リンカーＤＮＡとリンカーヒストンＨ１で連結される。コアヒストンオクタマーは、１つの(Ｈ３−Ｈ４)2テトラマーと、テトラマーの両端それぞれに位置する２つのＨ２Ａ−Ｈ２Ｂダイマーからなる。Ｎ末端のヒストンテールは、より高次のクロマチン構造を調節し、翻訳後修飾（例えばアセチル化、リン酸化およびメチル化）を受ける可能性がある［Ｓｔｒａｈｌ，２０００年，Ｎａｔｕｒｅ．４０３，４１〜５］。
【００１１】
一般的に、ヒストン活性を阻害するために、本成分はヒストン分子に結合し、遊離ヒストンの場合はヌクレオソーム形成を防ぎ、または、すでにヌクレオソームが形成されている場合はクロマチン形成を防ぐ。
【００１２】
特に、本成分は、Ｈ２、Ｈ３および／またはＨ４ヒストン、好ましくはＨ３および／またはＨ４ヒストンと結合するべきである。一実施形態において、本成分は、Ｈ４ヒストンと結合するべきである。その他の実施形態において、本成分は、Ｈ３ヒストンと結合するべきである。適切には、本成分は、ヌクレオソームアセンブリでそれらが使用されることを防ぐのに十分な高い親和性で、遊離ヒストンと結合する。これは、本成分が、細胞核におけるＨＡＭＬＥＴの結合を模擬している可能性を意味する。
【００１３】
以下、より詳細に説明するが、本出願人は、腫瘍細胞におけるＨＡＭＬＥＴの核での蓄積に関する分子的な原理を研究し、ヒストンを核標的として同定した。
【００１４】
ＨＡＭＬＥＴは、インタクトなヌクレオソームでヒストンと相互作用し、ＨＡＭＬＥＴは、低濃度で、生理学的なイオン強度で、遊離ヒストンのＤＮＡフラグメントへのアセンブリを開始させること示された。ＨＡＭＬＥＴはＤＮＡと結合しないため、この効果はヒストンを介してなされるはずである。
【００１５】
ＨＡＭＬＥＴと相互作用するタンパク質が核画分から単離され、これはヒストンと同定され、その特異性は精製ヒストンを用いて確認された。ＨＡＭＬＥＴはヒストンＨ３に対しては高い親和性を示し、Ｈ４に対しては中程度の親和性を示し、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂに対しては低い親和性を示し、Ｈ１に対しては親和性を示さないことが示された。続いて、ＨＡＭＬＥＴは、予め形成されたヌクレオソームで天然ヒストンと相互作用し、ヌクレオソームアセンブリに影響を与えることが示された。ＨＡＭＬＥＴの核での蓄積は、このヒストンとヌクレオソームに対する親和性により生じ、すなわちこの相互作用によりクロマチン構造の崩壊が起こると考えられる。
【００１６】
ＨＡＭＬＥＴの活性を模擬するために、本発明の方法で用いられる成分はこの活性を妨害するべきである。従って、本発明の方法は細胞のクロマチンアセンブリまたはリモデリング活性が阻害されるような方法で、抗体またはそれらの結合フラグメントのようなヒストンに特異的に結合する成分を含んでもよい。あるいはこのような成分は、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで機能的タンパク質の発現を阻害するように作用する成分であってもよい。このような成分は、例えば当業界で認識されているようなセンスまたはアンチセンスＲＮＡコンストラクトを含んでもよい。
【００１７】
本成分は、細胞を透過し、核に入り込むような方法で細胞に適用されるべきである。このような適用が自然に起こらない場合（例えばＨＡＭＬＥＴ）、本成分を細胞に移動させることができるキャリアータンパク質またはペプチドに本成分を結合させてもよい。移動因子の例としては、ＨＩＶ由来のｔａｔタンパク質または単純疱疹ウイルスＩ型外皮タンパク質ＶＰ２２、またはそれらの機能的フラグメント、もしくは相同体（例えばＷＯ９８／３２８６６を参照）、同様に、Ｗ０９９／１１８０９で説明したようなアンテナペディアのホメオドメインが挙げられる。
【００１８】
あるいは、本成分がタンパク質またはペプチド（例えば抗体）である場合、そのタンパク質またはペプチドの細胞内発現を行ってもよい。この場合、本成分をコードしその配列を細胞中で発現する核酸配列を含み、細胞に入り込むことができるベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）と、細胞とを接触させる。
【００１９】
ベクターの特定の例としては、核を標的化する機構を有するウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターが挙げられる。
【００２０】
あるいは、本成分はさらに標的化物質を含んでもよく、このような物質は、細胞内で核を特異的に標的化し、最も効果的に細胞死が引き起こされるようにヒストンの阻害を確実に起こすことができる。例えば、このような物質としては、アルファウイルスのようなウイルス由来の核標的化シグナルペプチド（ＮＴＳ）が挙げられる。一般的に、核標的化シグナルは、ゲノムのリシンが豊富なエリアに位置し、少なくとも３個、一般的には４個の連続したリシンを有する領域を含み、例えばＣｈｅｌｓｋｙ等，１９８９年，Ｍｏｌ＋Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，ｐ２４８７〜２４９２で説明されたものがある。
【００２１】
さらにＨＡＭＬＥＴの活性を模擬するために、本成分は、腫瘍または未分化細胞に特異的な標的化試薬をさらに含んでもよく、例えば腫瘍特異的抗体またはそれらの結合フラグメントが挙げられる。
【００２２】
本発明のさらなる形態は、細胞を殺すことができる成分のスクリーニング方法からなり、前記方法は、被試験成分とヒストンとを接触させること、およびそれらの間の相互作用を検出することを含む。
【００２３】
本スクリーニング方法による生成物は、製薬上の用途を有し得るため（特にガン治療において）、用いられるヒストンは適切にはヒト由来であるが、ヒストン間での高度な保存性を考慮して、スクリーニング方法にその他のヒストン、特にウシヒストンを用いてもよい。
【００２４】
適切には、検出される相互作用は、ヒストンがＤＮＡテンプレートへのトランスファー
を防ぎ、インビボでのヌクレオソームまたはクロマチン生成を防ぐことができるような十分に高い親和性で、本成分がヒストン（特にＨ３）に結合するような相互作用である。どのような特定の場合においても結合親和性が十分に高いかどうかを二次スクリーニングの材料としてもよい。しかしながら、適切には、用いられるスクリーニング方法は最も高い親和性を有する成分が選択されるような方法である。
【００２５】
適切なスクリーニング方法は当業界でよく認識されていると思われる。
例えば、本成分は、例えば可視標識（例えば放射性標識または蛍光標識）または免疫学的技術（例えば成分と抗体とを結合させることによる）を用いて標識することができ、このような標識としては、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼがあり、これはＥＬＩＳＡ技術を用いて可視化することができる。標識された成分は、例えばカラムまたはゲルに固定されたヒストン標的に接触させる。本成分がヒストンに結合した場合、標識の可視化により検出可能である。シグナル強度は少なくとも結合親和性の予備的な指標を提供し得る。
【００２６】
しかしながら、好ましくは、用いられる方法はハイスループットスクリーニングで処理できる方法である。例えば、被試験成分は支持体に固定されていてもよく、例えば、アレイ上またはプレート上のウェル中に固定することができる。次に、それらを溶液中でヒストンと接触させ、未結合材料を溶出させる。次に、例えばＥＬＩＳＡ法を用いて結合したヒストンを検出する。好ましくは、結合した材料が容易に検出できるようにヒストンそれ自体を可視標識で標識する。
【００２７】
最終的に、本出願人は、高い親和性で結合することにより、溶液からヒストンを沈殿させることができることを発見した。従って、その他の可能なスクリーニング方法は、被試験成分とヒストン溶液とを接触させることおよび沈殿を検出することを含む。
【００２８】
一実施形態において、アプトマーを製造しスクリーニング方法における試験成分として利用することができる。この方法で結合成分の最適な形状が同定されれば、必要に応じてこの形状を模擬する化合物を製造してもよい。
【００２９】
適切な二次スクリーニング方法は、ヒストンへ結合させることによって、本成分はヌクレオソーム形成を改変できるかどうかを測定することを含み得る。これは、以下で説明される方法を用いて試験することができる。特に、二次スクリーニング工程はヒストンおよびＤＮＡからヌクレオソーム形成を試みることを含んでもよく、好ましくは、本成分の存在下でヌクレオソームが標識される。これは、例えば以下で説明される「ソルトジャンプ(Ｓａｌｔ  ｊｕｍｐ)」法を含む方法を用いて行うことができる。
【００３０】
従って、特定の実施形態において、本発明の方法は上で説明したようなヒストン結合能力によって同定された成分とＤＮＡおよびヒストンとをヌクレオソームが形成されるような条件下で接触させる工程、および前記ヌクレオソームの形成を検出する工程をさらに含み得る。本成分が、少なくとも数種の濃度でヌクレオソーム形成またはアセンブリを阻害できる場合、さらなる評価のためにその成分を選択してもよい。
【００３１】
適切な条件は、以下のヌクレオソームアセンブリへのＨＡＭＬＥＴの効果を測定するために行われた実験で説明する。
【００３２】
あるいは、または、それに加えて本成分をさらにスクリーニングして腫瘍細胞でＨＡＭＬＥＴがするように、それらが細胞核で不溶性複合体を形成するかどうかを測定することができる。これは、本成分を標識し、次に本成分を細胞抽出物の核画分とインキュベートすることによって達成することができる。次に、例えば以下で説明したような塩抽出法を適用して核材料を可溶化することができる。本成分が不溶性画分に残留しているか、または可溶化されたかは、可溶性および不溶性画分に保持された標識材料の量をモニターすることによって測定することができる。
【００３３】
上述のスクリーニング方法を用いて細胞を殺すことにおいて使用するために同定された成分は化学物質でもよいし、タンパク質またはペプチドでもよく、これらは本発明のさらなる形態を形成する。これらは、化合物コレクションまたはライブラリーから得ることができ、または、スクリーニングプロセスのために合成することができる。
【００３４】
本発明のさらなる形態を形成する特定の新規の成分は細胞を殺すことができ、ヒストン結合物質および少なくとも１種の移動ペプチド、核標的化物質または細胞特異的な標的化試薬を含む成分である。ヒストン結合物質は、上で説明したようなスクリーニングを用いて同定された物質が可能である。あらゆる細胞特異的な標的化試薬は、適切には、腫瘍または未分化細胞に特異的であり、適切には腫瘍細胞特異的な抗体またはそれらの結合フラグメントである。
【００３５】
また、このような成分をコードする核酸も新規であり、本発明のさらなる形態を形成し得る。これら核酸を用いるベクターの形質転換に用いて細胞中で本成分をインビボ発現させることができる。この特定の場合において、移動ペプチドをコードする配列はなくてもよい。
【００３６】
特定の実施形態において、本成分はヒストン結合物質、移動ペプチド、核標的化物質、および細胞特異的な標的化試薬を含み得る。
【００３７】
特に、これら化合物はガンなどの症状の治療で、または抗菌剤としての用途を有する可能性が有り、これら方法も本発明のさらなる形態を形成する。これら化合物を含む医薬組成物も本発明のその他の形態を形成し、この場合、これら化合物は適切な投与単位で当業界での通常実施形態に従って製薬上許容できるキャリアーに結合させる。
【００３８】
ＨＡＭＬＥＴのヒストンに対する親和性は、以下で説明する数種の異なる技術を用いて示された。核抽出物中で相互作用するタンパク質をＨＡＭＬＥＴのオーバーレイによって局在させヒストンと同定した。天然のフォールドしたコンフォメーション（ｆｏｌｄｅｄ  ｃｏｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有する精製ヒストンは、セファロースに固定されたＨＡＭＬＥＴと結合し、驚くべきことに、溶液中でＨＡＭＬＥＴと肉眼的に見える沈殿も形成することがわかった。Ｈ３およびＨ４は高い効率で沈殿し、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂタンパク質も沈殿したが効率は低かった。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）実験で、天然コアヒストンオクタマーに対するＨＡＭＬＥＴの親和性を確認した。これらの結果から、Ｈ３は細胞核中のＨＡＭＬＥＴの一次標的であり、すなわちこの相互作用は腫瘍細胞におけるＨＡＭＬＥＴの効果にとって重要であることを示す。
【００３９】
ＨＡＭＬＥＴは低濃度でインタクトなヌクレオソームと相互作用し、生理学的なイオン強度でＤＮＡフラグメントでの遊離ヒストンのアセンブリを開始させることが示された。ＨＡＭＬＥＴはＤＮＡと結合しないことから、この効果はヒストンを介してなされているはずである。それゆえにＨ３およびＨ４への高い親和性での結合により、アセンブリを高めることができ、これはヒストンの裸のＤＮＡへのパッケージングを補助することができると考えられる。ＨＡＭＬＥＴは低濃度で凝集したＤＮＡ−ヒストン複合体を不安定にし、ヌクレオソーム形成の状況を改善できることが示される。
【００４０】
より高い濃度で、ＨＡＭＬＥＴはヌクレオソームアセンブリを崩壊さることが、ヌクレオソームバンドが消滅したことにより示された。また、ＨＡＭＬＥＴをヒストンと混合し
た後にＤＮＡ添加した場合、ヌクレオソームは形成されなかったが、これは、ＨＡＭＬＥＴに対する高い親和性により、ヒストンとＤＮＡとの結合が防がれることを示す。これは、同じ条件下でヌクレオソームアセンブリを誘導する既知のヌクレオソームアセンブリタンパク質（ＮＡＰ−１）とは対照的であった（Ｉｓｈｉｍｉ等，(１９８７年)Ｅｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１９〜２４）。結果として、ＨＡＭＬＥＴは、ゲルに入り込むことなくウェルに残留したＤＮＡとの凝集体からヒストンを放出することができた。
【００４１】
ＨＡＭＬＥＴは、低濃度でヌクレオソームアセンブリを高めるが、従来のヌクレオソームアセンブリタンパク質のように作用しないことが示される。ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンに対する親和性によりクロマチンをフリーズさせ、それにより、細胞の転写、複製および組換えを防ぐことが可能と考えられる。動的研究により、実際にＨＡＭＬＥＴ処理後数分以内にＤＮＡおよびＲＮＡ合成が阻害されたことが示された。
【００４２】
その他のヒストン結合タンパク質が同定されており、クロマチンアセンブリおよびリモデリングの際にシャペロンとして作用することが示された（Ｉｔｏ等（１９９７年）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２，５９３〜６００）。これらタンパク質は、ヒストン結合の可逆性に依存しており、なぜならこれらタンパク質は細胞質中の合成部位から核へヒストンを運搬しなければならず、シャペロンは成熟ヌクレオソーム複合体の一部ではないためである。しかしながら、ＨＡＭＬＥＴはこの分子とは相同性を有していないと考えられる。
【００４３】
これらの発見は、腫瘍細胞の核中でのＨＡＭＬＥＴ蓄積に関して考えられる分子的な説明を示している。核中でＨＡＭＬＥＴはクロマチンアセンブリを防ぎ、インタクトクロマチンを妨害できるので、不可逆的ダメージと細胞死を生じさせる。この細胞死は従来の細胞のアポトーシス機構とは無関係に生じるべきである。ＨＡＭＬＥＴは細胞質中において、ヒストンの核への運搬を防ぐことが可能であるため、ＨＡＭＬＥＴはクロマチンアセンブリを阻害し、複製、転写および組換えをブロックし、細胞死を起こす。
【００４４】
また、このＤＮＡ損傷および細胞死に関する新しいメカニズムは、どのようにしてＨＡＭＬＥＴがこれら多数の異なる腫瘍細胞型で細胞死を引き起こすことができるのかを説明するものでもある。例えばｐ５３突然変異や、ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの過剰発現によって、典型的なアポトーシスシグナルを回避する多くの腫瘍の例がある（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ等，２００２年，Ｃｅｌｌ，２，５９３〜６００）。しかしながら、本出願人は、ＨＡＭＬＥＴがｐ５３遺伝子型やｂｃｌ−２発現にかかわらず細胞死を誘導することを発見した。それゆえに、ＨＡＭＬＥＴにより刺激された細胞死メカニズムは、究極的にいってゲノム複製に必要とされるクロマチンアセンブリ機構を攻撃するものであって、より基礎的なメカニズムと考えられる。このメカニズムは、細胞死の活性化および／または実行におけるミトコンドリアおよびカスパーゼの活性化を伴う従来のアポトーシス機構の関与を排除するものではない（Ｋｏｈｌｅｒ等，１９９９年，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４９，２６０〜２６８）。
【００４５】
以下、下記の添付の図面を参照しながら、実施例を用いて本発明を特に説明する。
図１：核抽出物中でのＨＡＭＬＥＴとヒストンとの相互作用。（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＡ５４９細胞溶解物から核を単離し、小球菌ヌクレアーゼ（ｍｉｃｒｏ ｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ）で消化してクロマチンを可溶化し、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で溶解した。核抽出物をポリアクリルアミドＳＤＳゲルで泳動し、ＰＶＤＦメンブレンにブロットし、125Ｉ標識ＨＡＭＬＥＴまたはモノクローナル抗Ｈ３抗体に接触させた。放射標識したＨＡＭＬＥＴをオーバーレイしたメンブレンブロットから、４つのバンドへの結合が示され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析またはＮ末端配列解析によりヒストンと同定された。
【００４６】
図２：精製ヒストンとの相互作用に関する証拠。（Ａ）精製ウシヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理し、ゲルを銀染色した。パラレルゲルをＰＶＤＦメンブレンにブロットし、125Ｉ標識ＨＡＭＬＥＴと共にインキュベートした。ＨＡＭＬＥＴはヒストンＨ３およびＨ４には強く結合し、Ｈ２Ｂには弱く結合した。ヒストンＨ２ＡおよびＨ１への結合は検出されなかった。（Ｂ）ＨＡＭＬＥＴ−セファロースへのヒストンのアフィニティークロマトグラフィー。ＨＡＭＬＥＴ−セファロースからヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４がほぼ等量で溶出された。何もついていない（ｃｌｅａｎ）セファロースマトリックスへの結合はなかった。（Ｃ）ビアコアセンサーチップへのヒストンオクタマー結合。ビオチン化ＨＡＭＬＥＴを、ストレプトアビジンセンサーチップに結合させた。天然コアヒストンオクタマー（１００μｇ／ｍｌ）をチップ上に流し、共鳴ユニットで結合を測定し（実線）、コーティングしていない表面と比較した（点線）。
【００４７】
図３：ＨＡＭＬＥＴによる溶液からのコアヒストンの沈殿。天然コアヒストンをＨＡＭＬＥＴまたはα−ラクトアルブミンと混合した。沈殿と上清を銀染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ＨＡＭＬＥＴはヒストンＨ３およびＨ４を沈殿させたが、α−ラクトアルブミンはいずれのヒストンとも沈殿を形成しなかった。
【００４８】
図４：ＨＡＭＬＥＴはクロマチンに結合し、クロマチンアセンブリに影響を与える。クロマチンはソルトジャンプ法により、単離された天然コアヒストンおよび放射標識された２５６ｂｐのＤＮＡフラグメントからアセンブリされた（レーン１）。生成物をＰＡＧＥ、続いてオートラジオグラフィで分析した結果、非特異的ヒストン−ＤＮＡフラグメントの混合物で構成されていることが示された（バンド３）。ＤＮＡフラグメント上のヒストンオクタマーの位置に依存して、変異モノヌクレオソーム種が形成される（バンド２ａ、ｂおよびｃ）。予めアセンブルされたヌクレオソームに対するＨＡＭＬＥＴの効果を示す（レーン２〜７）。高めた濃度のＨＡＭＬＥＴをクロマチン混合物に加え、生成物を分析した。レーン２〜３：ＨＡＭＬＥＴは遊離ヒストンまたは凝集ヒストンに結合し、ＤＮＡフラグメントへのそれらのアセンブリを促進させ、ヌクレオソームバンドを増加させる（ｉ）（ピーク比は４：１）。レーン５〜７：ＨＡＭＬＥＴはヌクレオソームと結合し、低い電気泳動移動度の新しいバンドを形成した（ii）。レーン４〜７；ＨＡＭＬＥＴはヌクレオソームでヒストンに結合し、それらをＤＮＡから除去し、ヌクレオソームバンドを減少させた（iii）。ＨＡＭＬＥＴはまた、非特異的ヒストン−ＤＮＡ凝集体を分解した（iii）。
【００４９】
図５：ＨＡＭＬＥＴはクロマチンに結合し、クロマチンアセンブリに影響を与える。ヒストンと放射標識したＤＮＡフラグメントを０.２Ｍ  ＮａＣｌ中で混合し、自発的なヌクレオソームアセンブリをソルトジャンプ工程を行わずに研究した。開始混合物（レーン２および１０）は、数種のモノヌクレオソームを含むが、主として非特異的な凝集体であった（バンド１）。レーン１および９において、ソルトジャンプ後のヌクレオソームアセンブリをコントロールとして示す。自発的なヌクレオソームアセンブリに対するＨＡＭＬＥＴの効果を示す（レーン２〜８）。レーン５〜７：ＨＡＭＬＥＴは遊離ヒストンまたは凝集ヒストンに結合し、ＤＮＡフラグメントへのそれらのアセンブリを促進させ、ヌクレオソームバンドを増加させた（ｉ）。レーン６〜８：ＨＡＭＬＥＴはヌクレオソームと結合し、低い電気泳動移動度の新しいバンドを形成した（ii）。レーン８：ＨＡＭＬＥＴはヌクレオソームでヒストンと結合し、それらをＤＮＡから除去し、ヌクレオソームバンドを減少させた（iii）。レーン３〜８：ＨＡＭＬＥＴはまた、非特異的ヒストン−ＤＮＡ凝集体を分解した（iii）。等モル量のＢＳＡは、これら効果を示さなかった。
【００５０】
図６：ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンと予備混合した場合、クロマチンアセンブリを防ぐ。コアヒストンをＨＡＭＬＥＴまたはＮＡＰ−１とプレインキュベートし、続いてＤＮＡフ
ラグメントを添加し、アセンブルした生成物をＰＡＧＥで分析した。ヒストン−ＤＮＡ混合物は非特異的凝集体を形成した（ＡおよびＢのレーン１）。ＮＡＰ−１添加（Ａ，レーン２〜７）は濃度依存性のヌクレオソームアセンブリを起こした（バンド１および２）。ＨＡＭＬＥＴ添加の後（Ｂ，レーン２〜８）、ヌクレオソームは形成されなかったが、非特異的凝集体は分解した。
【００５１】
図７：インビボでのＨＡＭＬＥＴ−ヒストン相互作用。125Ｉ−ＨＡＭＬＥＴで６時間処理したＨｅＬａ細胞からの核は、塩抽出、ＲＮアーゼＩでの可溶化または小球菌ヌクレアーゼでのクロマチンの可溶化のいずれかによってサブフラクション化し、いずれの処理も塩の存在下で可溶性タンパク質を放出させた。いずれかの処理の後の可溶性および不溶性分画を遠心分離で分離し、それぞれの分画に関する放射活性を測定し、トータルの核関連放射活性をパーセンテージで示した。ヌクレアーゼでの切断の後に残留した不溶性材料には、細胞に吸収されたＨＡＭＬＥＴの大部分が含まれており、これを可溶化し、125Ｉ−ＨＡＭＬＥＴでのブロットオーバーレイ分析で処理した（コントロールとしてコアヒストンを用いた）。
【実施例】
【００５２】
〔実施例１〕
材料および方法
α−ラクトアルブミンの精製、および、ＨＡＭＬＥＴへの変換：ＨＡＭＬＥＴは、脂肪酸補因子Ｃ１８：１で安定化されたヒトα−ラクトアルブミンのフォールディング変異（ｆｏｌｄｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ）である。以前の説明通りに、天然α−ラクトアルブミンをヒト乳汁から精製し、活性型（ＨＡＭＬＥＴ）に変換した［Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，２０００年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６］。
【００５３】
タンパク質の標識：以前に説明されたラクトペルオキシダーゼ法に従って、ＨＡＭＬＥＴを125Ｉで標識した［Ｈａｋａｎｓｓｏｎ，１９９９年，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２４６，４５１〜６０］。ＨＡＭＬＥＴを、製造元の説明書に従ってビオチン化した（ベーリンガー・マンハイム社，ドイツ）。
【００５４】
細胞培養および細胞死の生物学的試験：Ａ５４９（ＡＴＣＣ，ＣＬＬ１８５）、Ｊｕｒｋａｔ（ヨーロピアン・セル・カルチャー・コレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、番号８８０４２８０３）および初代ＨＲＴＥＣ（ヒト尿細管上皮）細胞を説明通りに培養した［Ｈａｋａｎａｓｏｎ，１９９５年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２，８０６４〜８］。細胞をＨＡＭＬＥＴで処理し、インキュベーションの６時間または２４時間後、説明通りに細胞の生存率およびＤＮＡフラグメント化を測定した［上述のＨａｋａｎｓｓｏｎ，１９９５年，上述のＳｖｅｎｎｓｓｏｎ，２０００年］。
【００５５】
ＨＡＭＬＥＴの細胞内局在：リアルタイムの細胞内局在研究のために、上述の細胞培養条件下で、アレクサ（Ａｌｅｘａ）のフルオロ（Ｆｌｕｏｒ）で標識したＨＡＭＬＥＴ（７μＭ）と共にＡ５４９細胞またはＨＲＴＥＣ細胞をインキュベートし、ニコンのエクリプス８００顕微鏡（ニコン，日本）に備え付けられたバイオ・ラッドの１０２４共焦点レーザー走査装置（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ，ヘメル−ヘムプステッド，イギリス）で分析した。
【００５６】
ゲル電気泳動：ヒストンおよび核抽出物をトリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（１５または１６％）で分離した。ビ−トリス（Ｂｉ−Ｔｒｉｓ）ゲル（４〜２０％）を用いて、ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）のＮｕｐａｇｅ  Ｍｉｎｉ  Ｃｅｌｌ  II（ノベックス，サンディエゴ，カリフォルニア州）でウシヒストン−ＨＡＭＬＥＴ沈殿を分離した。クーマシーブルーまたは銀染色でタンパク質バンドを可視化した［Ｗｒａｙ等，１９８１年，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１８，１９７〜２０３］。クロマチンサンプルの電気泳動は、４％ポリアクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝２９：１，ｗ／ｗ）で、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）（Ｈａｍｉｃｈｅ等，１９９８年，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ.，２７３，９２６１〜９）中で、または、ＴＥＧ緩衝液（２５ｍＭトリス，１９０ｍＭグリシン緩衝液，１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む，ｐＨ８.３）（Ｈａｍｉｃｈｅ等，（１９９６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３，７５８８〜９３）中で、室温でなされた。フォスフォイメージャー（フジＰＣ−Ｂａｓ）を用いて、放射活性を定量した。あるいは、クロマチンをＳＹＢＲグリーンで染色し、フルオロイメージャー（モレキュラー・ダイナミクス）で検出した。
【００５７】
核抽出物：Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＡ５４９細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、ホモジナイズ用緩衝液（Ｊｕｒｋａｔ細胞用：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2および２ｍＭ  ＣａＣｌ2、ならびにＡ５４９細胞用：５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、いずれの緩衝液も１０μｇ／ｍｌロイペプチン，２０μｇ／ｍｌアンチパインおよびＰＭＳＦを含む）に、氷上で１５分間懸濁した。細胞をホモジナイズし（ダウンス(Ｄｏｕｎｃｅ)型ホモジナイザー，乳棒サイズ４１１）、スクロースを最終濃度０.２５Ｍになるまで加えた。１０００ｇで１０分間遠心分離することにより核を回収し、小球菌ヌクレアーゼで３７℃で１０分間消化した（Ｍｏｒａｌｅｓ等（２０００年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０，７２３０〜７，シグマ，セントルイス，ミズーリ州，米国）。５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して反応を止め、１０００ｇで遠心分離することにより消化した核を回収し、１ｍＭ  ＥＤＴＡに溶解させた。バイオ・ラッドＤＣタンパク質分析キットでタンパク質濃度を測定した。
【００５８】
ヒストン：別個に精製したウシヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をロシュ・ダイアグノスティックス（ブロンマ，スウェーデン）から購入した。天然のフォールドしたヒストンをカモ類の赤血球の核から得た（Ｓｉｍｏｎ等，１９７９年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６，６８９〜９６）。キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のヒストンをＥ.ｃｏｌｉで発現させ、精製し、オクタマーにアセンブルさせた（Ｌｕｇｅｒ，Ｋ．等(１９９７年)Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２，３０１〜３１１）。ヒストンのフォールドと機能的な完全性をＤＮＡ上のヌクレオソームアセンブリにより確認した（以下参照）。
【００５９】
ＤＮＡ：ウニの５ＳＲＮＡ遺伝子を含む２５６ｂｐのフラグメント（ＳｉｍｐｓｏｎおよびＳｔａｆｆｏｒｄ（１９８３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８０，５１〜５）を、プラスミドｐＬＶ４０５−１０（ｒｅｆ）のＥｃｏＲ１消化物（ニューイングランドバイオラボ社，ビバリー，マサチューセッツ州）から、ゲルで精製した。［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク，イギリス）でＤＮＡを末端標識した。
【００６０】
クロマチンアセンブリ：核タンパク質粒子を得るために、「ソルトジャンプ」法に従ってヒストンオクタマーを直鎖状ＤＮＡにアセンブルさせた［Ｓｔｅｉｎ，１９７９年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０，１０３〜３４］。32Ｐで標識した２５６ｂｐのフラグメントと、キャリアーＤＮＡ（スーパーコイルプラスミドＤＮＡ，最終ＤＮＡ濃度２００μｇ／ｍｌ）を、２Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）中でヒストンと混合した（ヒストン：ＤＮＡの質量比は０.４〜０.６）。この混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、０.５Ｍ  ＮａＣｌに希釈し、同じ温度で３０分間インキュベートし、最後に、ＴＥ緩衝液に対して４℃で２時間透析した。ゲルのＳＹＢＲグリーン染色に関する実験のために、キャリアープラスミドＤＮＡを、非放射活性の２５６ｂｐのＤＮＡフラグメントで置換した。クロマチンを４℃で保存した。
【００６１】
オーバーレイ：核抽出物と市販のヒストンをＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ（ポリ(ビニリデンジフルオリド)）メンブレンにブロットした。溶液Ｓａｔ１（エタノールアミン６.１ｇ／ｌ，グリシン９ｇ／ｌ，ポリビニルピロリドン１０ｇ／ｌ，メタノール２５％）およびＳａｔ２（エタノールアミン６.１ｇ／ｌ，グリシン９ｇ／ｌ，トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０  １.２５ｇ／ｌ，ゼラチン加水分解産物５ｇ／ｌ，メタノール２５％）でそれぞれ１５分間ブロッキングした後、メンブレンをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ，０.０５％トウィーン−２０）で３×１５分間洗浄し、ＰＢＳ中の125Ｉ標識ＨＡＭＬＥＴと共に一晩インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔ（６×１５分間）で洗浄し、乾燥させた。結合したＨＡＭＬＥＴをＳＴＯＲＭ８４０フォスフォイメージャー（モレキュラー・ダイナミクス社）を用いて検出した。
【００６２】
タンパク質配列解析および同定：核抽出物をＰＶＤＦメンブレンにブロットし、クーマシーブルーで染色し、配列解析されるバンドを切り出し、アプライドバイオシステムズのモデル４７７Ａペプチドシーケンサーでエドマン分解によりＮ末端アミノ酸配列解析を行った。ＰａｔＳｃａｎソフトウェアを用いてスイスプロットのデータベースのタンパク質と配列を比較した（http://www-unix.mcs.anl.gov/compbio/PatScan/HTML/patscan.html）。
【００６３】
マススペクトロメトリー：核抽出物からの１２、１４、１６および１７ｋＤａのバンドをゲルから切り出し、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）のスカウト３８４レフレックス（Ｓｃｏｕｔ  ３８４  Ｒｅｆｌｅｘ）IIIマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計を用いたマススペクトロメトリー分析用に調製した［Ｌｏｒｅｎｚｏ，２００１年，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６，１２２０１〜１１］。
【００６４】
アフィニティークロマトグラフィー：ＨＡＭＬＥＴを製造元の説明書に従ってＣＮＢｒ活性化セファロース４ＢTM（アマシャム・ファルマシア・バイオテクＡＢ，ウプサラ，スウェーデン）に固定した。ゲルを０.２Ｍ  ＮａＣｌを含むＴＥ緩衝液中のコアヒストンと室温で２時間混合し、洗浄し、結合材料をＳＤＳ電気泳動緩衝液中で沸騰させることにより溶出させた。溶出させた材料をＰＡＧＥで分析した。
【００６５】
表面プラスモン共鳴：ビアコアのＸファシリティ（ビアコアＡＢ，ウプサラ，スウェーデン）で、ビオチン化ＨＡＭＬＥＴをＳＡセンサーチップに固定した。ヒストンオクタマーを連続希釈液にアプライした。流速は、固定中は５μｌ／分、分析中は２０μｌ／分とした。フロー緩衝液として、０.０５％トウィーン−２０および１Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳを用いた。１０または２０ｍＭ  ＨＣｌで表面を再生させた。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ２.２ソフトウェアでデータを分析した。
【００６６】
ＨＡＭＬＥＴによるヒストン沈殿：ヒストン（ロシュ，２５μｇ）とＨＡＭＬＥＴ（２５μｇ）をＰＢＳ中で混合した。沈殿を回収し、上清と沈殿を４〜１２％ビス−トリスゲル（ノベックス）上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＧＥに付した。参照として純粋なヒストンサンプルを泳動した。
【００６７】
沈殿中でＨＡＭＬＥＴを検出するために、125Ｉ標識ＨＡＭＬＥＴを反応液に加え、蛍光スクリーンスキャナーでゲルを分析した。
【００６８】
総コアヒストン（細胞からの天然型，２.５μｇ）を０.２Ｍ  ＮａＣｌを含むＴＥ緩衝液中でＨＡＭＬＥＴ（２.５μｇ）と混合した。この混合物を室温で５分間放置し、遠心分離（７０００ｇ，２分間）して沈殿を回収した。沈殿と上清を１５％レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）ＰＡＧＥで分析した。
【００６９】
結果
ヒストンは核抽出物中でＨＡＭＬＥＴの標的である。このようなＨＡＭＬＥＴが広範囲の腫瘍細胞を殺すことはすでに示されている。その上、レーザー走査型共焦点顕微鏡法により核での局在が示された（ＷＯ９９／２７９６７）。このような局在の研究から、ＨＡＭＬＥＴは、腫瘍細胞中で識別可能な核成分と相互作用すると考えられる。これらは、125Ｉ標識したＨＡＭＬＥＴを用いた上述のオーバーレイ分析において、Ａ５４９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞の核抽出物を用いて同定された。ＨＡＭＬＥＴは、およその分子量１２、１４、１６および１７ｋＤａの４つのバンドに高い強度で結合することが示された（図１Ａ）。
【００７０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、１７、１６、１４および１２ｋＤａのバンドが、ヒストンＨ３、Ｈ２Ｂ、Ｈ３（タンパク質分解された形態）およびＨ４と同定された。１７ｋＤａのバンドは、ヒストンＨ３とＮ末端相同性を示し、モノクローナル抗Ｈ３抗体を用いた免疫ブロットにより同一性が確認された（示さず）。１４ｋＤａのバンドは、Ｈ３と配列相同性を示したが、Ｎ末端テールの最初の２１個のアミノ酸が欠失していた（図１）。このＨ３の形態は、タンパク質分解の後に得られたフラグメントに相当し、その結果としてこのバンドは、テール領域に向けられた抗Ｈ３抗体によって認識されなかった。これに対して、ＨＡＭＬＥＴはこのＨ３の形態に結合し、すなわち相互作用はヒストンテールに頼らないことがわかった。
【００７１】
ＨＡＭＬＥＴと精製ヒストンとの相互作用：これらの結果により、ＨＡＭＬＥＴは腫瘍細胞中でヒストンと結合することが示された。これら相互作用をさらに理解するために、精製ヒストンタンパク質を用いた。まず、市販の精製ウシヒストンＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を用いて、ＨＡＭＬＥＴの様々なヒストンタンパク質に対する親和性を調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ブロットを放射標識したＨＡＭＬＥＴと共にインキュベートした（図２Ａ）。Ｈ２Ｂへの弱い結合、Ｈ４への中程度の結合、および、Ｈ３への高い親和性での結合が観察された。オーバーレイ分析では、ＨＡＭＬＥＴはヒストンＨ１またはＨ２Ａに結合しなかった。
【００７２】
ＨＡＭＬＥＴのヒストンに対する親和性をアフィニティークロマトグラフィーでさらに試験した。ＨＡＭＬＥＴを、ＣＮＢｒで活性化したセファロースに固定し、コアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４）の混合物をアプライした。洗浄して未結合タンパク質を除去した後、ＳＤＳローディング緩衝液でマトリックスから結合したヒストンを溶出させた。溶出物は、４種のヒストンをほぼ等量を含んでいた（図２Ｂ）。
【００７３】
ＨＡＭＬＥＴのヒストンに対する親和性を、ＨＡＭＬＥＴでコートしたビアコアセンサーチップを用いて表面プラズモン共鳴で確認した。２種の異なるヒストン調製物を用いた。ウシヒストンＨ３調製物は、実験時間中に解離が生じた痕跡がなかったことから実質的に不可逆的な結合であることがわかった（データは示さず）。その上、Ｈ３は、界面活性剤、塩、酸などを用いても、チップから強制的に溶出させることができなかった。続いて、天然コアヒストンオクタマーを用いたところ、それらは高い親和性でＨＡＭＬＥＴ表面に結合した（図２Ｃ説明される）。
【００７４】
これらの結果から、ＨＡＭＬＥＴは、単離されたコアヒストンと高い親和性で結合することが示される。
【００７５】
ＨＡＭＬＥＴは溶液からヒストンを沈殿させる：精製ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をそれぞれ溶液中でＨＡＭＬＥＴと混合した。この溶液は即座に乳白色になり、やがて試験管の底に白色沈殿が蓄積された。
【００７６】
この沈殿をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、主としてヒストンＨ３およびＨ４を含み、少量のＨ２ＡおよびＨ２Ｂを含むことがわかった（図３）。ＨＡＭＬＥＴも沈殿中に含まれていた（示さず）。天然α−ラクトアルブミンをコントロールとして用いたところヒストンの沈殿は形成されず（図３）、ＨＡＭＬＥＴ非存在下ではヒストンは沈殿しなかった（示さず）。
【００７７】
ＨＡＭＬＥＴはインビトロでクロマチンと相互作用する：結合分析および沈殿分析の結果から、ＨＡＭＬＥＴは、インビボで可溶性ヒストンおよび／またはヌクレオソームと直接的に相互作用可能であること、およびＨＡＭＬＥＴは腫瘍細胞中でクロマチン構造に影響を与えることが示された。まず、この仮説をインビトロでインタクトなヌクレオソームを用いて検証した。
【００７８】
「ソルトジャンプ」法により、インビトロでヒストンとＤＮＡからヌクレオソームを形成した［上述のＳｔｅｉｎ，１９７９年］。等モルのコアヒストンを２Ｍ  ＮａＣｌ中で標識された２５６ｂｐのＤＮＡフラグメントとキャリアープラスミドと混合し、モル濃度を０.５Ｍ  ＮａＣｌに迅速に落としてヌクレオソーム−アセンブリを誘導した。このような条件下で、Ｈ３／Ｈ４テトラマーはＤＮＡと結合し、Ｈ２Ａ／Ｈ２Ｂダイマーと組み合わされ、完全なヌクレオソームを形成した（図４）。
【００７９】
この方法で得られた予め形成されたヌクレオソームをＨＡＭＬＥＴと混合し、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動で試験した（図４）。２種類の効果が観察された。低濃度では、ＨＡＭＬＥＴはヌクレオソームバンドを増加させたが、これは混合物中に残存するＤＮＡとヒストンからのさらなるヌクレオソームアセンブリを示す。より高い濃度では、ＨＡＭＬＥＴは、モノヌクレオソームバンドの減少を引き起こし、それに伴って新しいバンドが出現したが、この新しいバンドはＨＡＭＬＥＴとヌクレオソームの複合体からなると考えられる。
【００８０】
ＨＡＭＬＥＴをヒストン−ＤＮＡ混合物に加え、ソルトジャンプ工程を行わないでクロマチンアセンブリを定量した（図５）。ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンオクタマーあたり最大５０分子を有する濃度依存性のヌクレオソームアセンブリを引き起こすことが示された。より高いＨＡＭＬＥＴ濃度では、モノヌクレオソームバンドは減少し、新しいバンドが出現した（図４，バンドii）。平行して、遊離のＤＮＡのバンドの増加に関連する濃度を観察したところ、ヒストンと結合しそれらの非特異的なＤＮＡとの結合を防ぐＨＡＭＬＥＴの能力と一致していた。ＢＳＡをコントロールとして用いたところ、ヌクレオソームアセンブリに効果を有さなかった。コントロール実験を行い、ＨＡＭＬＥＴがＤＮＡと結合するかどうかを調査した。遊離の２５６ｂｐのＤＮＡをＨＡＭＬＥＴと混合し、ネイティブポリアクリルアミドゲルで分析した。結合は検出されなかった（示さず）。
【００８１】
それゆえに、ＨＡＭＬＥＴはヒストンとの直接的な相互作用によりインタクトなヌクレオソームに結合し、その結合によりヌクレオソームアセンブリが改変されると考えられる。その上この結果より、ＨＡＭＬＥＴは高濃度でクロマチンからヒストンを置き換えることができることが示される。
【００８２】
ＨＡＭＬＥＴのヌクレオソームアセンブリに対する効果：この結果より、ＨＡＭＬＥＴはヌクレオソームアセンブリに影響を与えることが示された。この点を明らかにするため、「ソルトジャンプ」工程を行わないヌクレオソームアセンブリを調べた。ヌクレオソームアセンブリをモノヌクレオソームバンドの強度として定量した（図５）。
【００８３】
ＨＡＭＬＥＴは、劇的な濃度依存性のヌクレオソームアセンブリの増加を、ヌクレオソームあたり最大１：５０の分子で引き起こすことが示された。それゆえに、ＨＡＭＬＥＴはヌクレオソームアセンブリを高めると考えられる。
【００８４】
より高いＨＡＭＬＥＴ濃度でモノヌクレオソームバンドは減少し、新しいバンドが出現した（図５，バンドii）。これは、ヌクレオソームとＨＡＭＬＥＴの複合体と考えられる。平行して、大きいヒストン−ＤＮＡ凝集体が消費され、遊離のＤＮＡバンドの増加が観察されたが、これはＨＡＭＬＥＴが凝集体を分解しＤＮＡを放出したことを示す。
【００８５】
ＢＳＡはヌクレオソームアセンブリに効果を有さないことから、これらの効果はＨＡＭＬＥＴに特定のものである（図５）。
【００８６】
ＨＡＭＬＥＴはヒストンとＤＮＡからのクロマチンのアセンブリを高め、クロマチンと複合体を形成すると考えられる。最終的にこの結果は、ＨＡＭＬＥＴは高濃度でヒストンをクロマチンから引き離すことができることを示す。
【００８７】
ＨＡＭＬＥＴはクロマチンアセンブリタンパク質ではない：クロマチンアセンブリタンパク質は、ヒストンをＤＮＡに運搬し、ヌクレオソーム形成を高めることができる。我々のモデルにおいて、ＮＡＰ−１（ヌクレオソームアセンブリタンパク質１）をポジティブコントロールとして用いた。ＮＡＰ−１をヒストンと混合し、この混合物にＤＮＡフラグメントを加え、アセンブルしたヌクレオソームをトリス−グリシン緩衝液系を用いたネイティブＰＡＧＥで検出した。ＮＡＰ−１は濃度依存性の方法でヌクレオソームアセンブリを誘導することが示された（図６Ａ）。
【００８８】
同じ分析系を用いてＨＡＭＬＥＴがクロマチンアセンブリタンパク質として作用できるかどうか試験したが、ＨＡＭＬＥＴはヌクレオソームアセンブリを誘導しなかった（図６Ｂ）。これに対して、ＨＡＭＬＥＴはヒストンが標識されたＤＮＡに結合しないようにすると考えられる。
【００８９】
これらの結果より、ＨＡＭＬＥＴがアセンブルしたヌクレオソームではなく遊離ヒストンと相互作用し得る場合、ＨＡＭＬＥＴは極めて高い親和性で遊離ヒストンと結合し、それによりヌクレオソームアセンブリを阻害することが確認された。
【００９０】
ＨＡＭＬＥＴは腫瘍細胞核において不溶性なヒストンを含む複合体を形成する：125Ｉ−ＨＡＭＬＥＴで処理したＨｅＬａ細胞から核を精製し、ＨＡＭＬＥＴを含む核画分を精製した（図７）。トータルの核関連の放射活性を測定した後、核を０.３Ｍ  ＫＣｌで抽出し、可溶性核タンパク質を放出させた。不溶性核画分に、９５％を超える放射活性が残存した。さらに、ＲＮアーゼＩと０.２５Ｍ  ＮａＣｌで処理することによって核を可溶化した。標識されたＨＡＭＬＥＴ（９１％）が不溶性画分に残存していた。最後に、０.２５Ｍ  ＫＣｌの存在下で小球菌ヌクレアーゼにより切断してクロマチンを可溶化した。この処理により、核からクロマチンが放出されたが（示さず）、大半のＨＡＭＬＥＴ（９１％）と多少のクロマチン（示さず）は不溶性画分に残存した。この画分を、９５℃でレムリー緩衝液の溶液にし、ＰＡＧＥで分析した。放射標識したタンパク質を用いてブロッティングすることにより、ＨＡＭＬＥＴと相互作用する分子種を同定した。ブロットで、ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンＨ３とＨ４を認識した（図７）。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】核抽出物中でのＨＡＭＬＥＴとヒストンとの相互作用を示す。
【図２】精製ヒストンとの相互作用に関する証拠を示す。
【図３】ＨＡＭＬＥＴによる溶液からのコアヒストンの沈殿を示す。
【図４】ＨＡＭＬＥＴはクロマチンに結合し、クロマチンアセンブリに影響を与えることを示す。
【図５】ＨＡＭＬＥＴはクロマチンに結合し、クロマチンアセンブリに影響を与えることを示す。
【図６】ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンと予備混合した場合、クロマチンアセンブリを防ぐことを示す。
【図７】インビボでのＨＡＭＬＥＴ−ヒストン相互作用を示す。
【図１】
2005525811.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月7日(2004.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互作用がヒストンテールと独立している様式でヒストンと相互作用し、かつヒストン活性を阻害する成分（ただしＨＡＭＬＥＴを除く）を細胞核に導入することを含む、細胞を殺す方法。
【請求項２】
成分は、ヒストンと特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
成分は、Ｈ２、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンと結合する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
成分は、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンと結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
成分は、Ｈ４ヒストンと結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
成分は、Ｈ３ヒストンと結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
成分は、ヒストン特異的抗体またはそれらの結合フラグメントを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
成分は、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで作用して、機能的ヒストンの発現を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
成分は、センスまたはアンチセンスＲＮＡコンストラクトを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
成分は、該成分を細胞に移動させることができるキャリアータンパク質またはペプチドをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
成分は、細胞内でヌクレオソームと共に局在する標的化物質をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
標的化物質は、核標的化シグナルペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
成分は、腫瘍または未分化細胞に特異的な細胞特異的な標的化試薬をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
成分をコードするヌクレオチド配列を含み、そしてインビボで細胞中で該配列を発現することができるベクターと、該細胞とを接触させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
被試験成分と、ヒストンテールを欠くヒストンとを接触させること、および、それらの間の相互作用を検出することを含む、細胞を殺すことができる成分のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ヒストンは、Ｈ３またはＨ４である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒストンは、ヒトまたはウシである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
被試験成分を標識し、次に、固定されたヒストン標的と接触させる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
被試験成分を支持体に固定し、溶液中でヒストンと接触させ、未結合材料を除去し、そして結合したヒストンを検出する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ヒストンは、標識されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
被試験成分とヒストン溶液とを接触させること、および、沈殿を検出することを含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ヌクレオソームが形成される条件下で、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法を用いて同定された成分と、ＤＮＡおよびヒストンとを接触させる工程、および、該ヌクレオソームの形成を検出する工程をさらに含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
成分が細胞核中で不溶性複合体を形成するかどうかを測定する工程をさらに含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細胞を殺すことに用いられる請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法を用いて同定された成分。
【請求項２５】
ヒストン結合物質、および、移動ペプチド、核標的化物質または細胞特異的な標的化試薬の少なくとも１種を含む、細胞を殺すことができる成分。
【請求項２６】
ヒストン結合物質は、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法を用いて同定された物質である、請求項２５に記載の成分。
【請求項２７】
成分は、ポリペプチドである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分をコードする核酸。
【請求項２８】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
ガンの治療に用いられる医薬の製造における請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分の使用。
【請求項３０】
細菌感染の治療に用いられる医薬の製造における請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分の使用。
【請求項３１】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の成分を、細菌またはそれらの環境に適用することを含む、殺菌または細菌制御方法。
【国際調査報告】
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