(57)【要約】被包される貴金属ナノクラスタを含み、検知に使用することができる組成物が開示される。被包される貴金属ナノクラスタを調製する方法、および被包される貴金属ナノクラスタを使用する方法も開示される。前記貴金属ナノクラスタは、デンドリマーまたはペプチドによって被包されることが好ましい。被包される貴金属ナノクラスタは、特有のスペクトル放射を有する。前記スペクトル放射は、ナノクラスタのサイズおよび／またはデンドリマーの生成を制御することなど、被包材料の性質を制御することにより変化する。前記放射は、生物学的状態に関する情報を提供するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被包される貴金属ナノクラスタを含む水溶性蛍光ラベルを含む組成物。
【請求項２】
前記貴金属ナノクラスタは、２〜８の貴金属原子を含む、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記貴金属は金である、請求項１の組成物。
【請求項４】
前記貴金属は銀である、請求項１の組成物。
【請求項５】
前記貴金属は銅である、請求項１の組成物。
【請求項６】
前記被包される貴金属ナノクラスタの蛍光量子収量は、約１％より大きく、その飽和強度は、約１〜１０００Ｗ／ｃｍ２である、請求項１の組成物。
【請求項７】
低励起強度は、約４６０ｎｍで約３０Ｗ／ｃｍ２である、請求項６の組成物。
【請求項８】
前記蛍光ラベルは、偏極スペクトル放射を示し、双極子放射パターンを示す、請求項１の組成物。
【請求項９】
前記蛍光ラベルは、生物学的状態に関する情報を提供するスペクトル放射を有する、請求項１の組成物。
【請求項１０】
前記生物学的状態は、生物学的部分の量的、質的存在；生物学的部分の構造、組成および形態；環境下での、生物学的部分の局在性；生物学的部分、生物学的化合物の構造における変性、および細胞過程の変性との間の相互作用、からなる群から選択される請求項９の組成物。
【請求項１１】
前記貴金属ナノクラスタは、変化する電荷を有する、請求項１の組成物。
【請求項１２】
前記蛍光ラベルは励起されるとき、前記蛍光ラベルは約３から約８のｐＨ範囲にわたって蛍光を発する、請求項１の組成物。
【請求項１３】
前記蛍光ラベルのサイズは、直径が約１ｎｍ未満から１５ｎｍである、請求項１の組成物。
【請求項１４】
前記貴金属ナノクラスタは、光退色前に約１０８を越える光子を放射する、請求項１の組成物。
【請求項１５】
１個より多い貴金属ナノクラスタを含む組成物が励起されるとき、約８０％を超える前記貴金属ナノクラスタは、約３０分を超える間蛍光を発する、請求項１の組成物。
【請求項１６】
前記貴金属ナノクラスタは、５１４．５ｎｍまたは４７６ｎｍで、約３００Ｗ／ｃｍ２の連続的励起エネルギーで蛍光を発し、前記蛍光は飽和蛍光である、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
前記貴金属ナノクラスタは、デンドリマーに被包される、請求項１の組成物。
【請求項１８】
前記デンドリマーは、ポリ（アミドアミン）を含む、請求項１７の組成物。
【請求項１９】
前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第０世代、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代およびより高い世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群から選択される、請求項１８の組成物。
【請求項２０】
前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第２世代または第４世代の、末端にＯＨを有するポリ（アミドアミン）デンドリマーである、請求項１８の組成物。
【請求項２１】
前記貴金属ナノクラスタは、ペプチドに被包される、請求項１の組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドの長さは、約５〜５００のアミノ酸である、請求項２１の組成物。
【請求項２３】
前記ペプチドの長さは、約５〜２０のアミノ酸である、請求項２１の組成物。
【請求項２４】
前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に定義されるようなポリペプチド配列を含む、請求項２１の組成物。
【請求項２５】
デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタを調製する方法であって、
ａ）デンドリマー、貴金属を含む水溶液および水性溶媒を混合して、混合液を作製するステップと、
ｂ）還元剤を添加するステップと、
ｃ）次いで、十分な量の酸性化合物を添加して、前記混合液を中性範囲のｐＨに調節するステップと、
ｄ）ｐＨが調整された前記混合溶液を混合して、デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタを形成することを可能とするステップと
を含む方法。
【請求項２６】
前記還元剤は、光、化学還元剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記混合溶液の温度は、ステップａ）〜ステップｃ）で、約６５°Ｆ〜約１００°Ｆの間である、請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記混合溶液の温度は、約６８°Ｆ〜約７４°Ｆの間である、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記貴金属は、銀、金および銅からなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項３０】
貴金属を含む前記水溶液は、ＡｇＮＯ３、ＨＡｕＣｌ４・ｎＨ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・ｎＨ２Ｏからなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項３１】
貴金属を含む前記水溶液は、ＨＡｕＣｌ４・ｎＨ２Ｏであり、ｐＨが調整された前記混合溶液を、少なくとも１時間混合して、デンドリマーに被包される金ナノクラスタの形成を可能にする、請求項２５の方法。
【請求項３２】
ｐＨが調整された前記混合溶液を、約４８時間混合して、デンドリマーに被包される金ナノクラスタの形成を可能にする、請求項３１の方法。
【請求項３３】
約４６０ｎｍで、約３０Ｗ／ｃｍ２の低励起強度で励起されたとき、前記デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタは、偏極スペクトル放射を示す、請求項２５の方法。
【請求項３４】
前記デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタが励起されるとき、前記ナノクラスタのサイズによって少なくとも部分的に決定されるスペクトル放射を有する、請求項２５の方法。
【請求項３５】
約３〜８のｐＨ範囲にわたって、前記デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタは蛍光を発することが可能である、請求項２５の方法。
【請求項３６】
前記デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタは、光退色前に約１０６を越える光子を放射する、請求項２５の方法。
【請求項３７】
１個より多い被包される貴金属ナノクラスタが励起されるとき、約９０％を超える前記貴金属ナノクラスタは、５１４．５ｎｍまたは４７６ｎｍで、約３００Ｗ／ｃｍ２の連続的励起エネルギーにおいて約３０分を超える間蛍光を発する、請求項２５の方法。
【請求項３８】
前記デンドリマーは、ポリ（アミドアミン）を含む、請求項２５の方法。
【請求項３９】
前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第０世代、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代およびより高い世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群から選択される、請求項３８の方法。
【請求項４０】
蛍光を発することが可能なペプチドに被包される貴金属ナノクラスタを調製する方法であって、
ａ）ペプチド、貴金属を含む水溶液および蒸留水を混合して、混合液を作製するステップと、
ｂ）還元剤を添加するステップと、
ｃ）次いで、十分な量の酸性化合物を添加し、中性範囲のｐＨに前記混合液を調節するステップと、
ｄ）ｐＨが調整された前記混合溶液を混合して、ペプチドに被包される貴金属ナノクラスタを形成することか可能であるステップと、
を含む方法。
【請求項４１】
前記還元剤は、光、化学還元剤およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４０の方法。
【請求項４２】
ステップａ）における、貴金属とペプチドのモル比が約０．１：１である、請求項４０の方法。
【請求項４３】
前記混合溶液の温度は、ステップａ）〜ステップｃ）で、約６５°Ｆ〜約１００°Ｆの間である、請求項４０の方法。
【請求項４４】
前記混合溶液の温度は、約６８°Ｆ〜約７４°Ｆの間である、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記貴金属は、銀、金および銅からなる群から選択される、請求項４０の方法。
【請求項４６】
貴金属を含む前記水溶液は、ＡｇＮＯ３、ＨＡｕＣｌ４・ｎＨ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・ｎＨ２Ｏからなる群から選択される、請求項４０の方法。
【請求項４７】
前記ペプチドの長さは、約５〜５００のアミノ酸である、請求項４０の方法。
【請求項４８】
前記ペプチドの長さは、約５〜２０のアミノ酸である、請求項４０の方法。
【請求項４９】
前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に定義されるようなポリペプチド配列を含む、請求項４０の方法。
【請求項５０】
前記ペプチドに被包される貴金属ナノクラスタのサイズは、直径約１ｎｍ未満から約１５ｎｍである、請求項４０の方法。
【請求項５１】
前記ペプチドに被包される貴金属ナノクラスタは、約３〜９のｐＨ範囲にわたって蛍光を発することができる、請求項４０の方法。
【請求項５２】
前記ペプチドに被包される貴金属ナノクラスタは、光退色前に約１０６を越える光子を放射する、請求項４０の方法。
【請求項５３】
１個より多いペプチドに被包される貴金属ナノクラスタが励起されるとき、約９０％を超える前記貴金属ナノクラスタは、５１４．５ｎｍまたは４７６ｎｍで、約３００Ｗ／ｃｍ２の連続的励起エネルギーで、約３０分を超える間蛍光を発する、請求項４０の方法。
【請求項５４】
重要な分子を観察する方法であって、
ａ）重要な分子に、被包される貴金属ナノクラスタを含む水溶性蛍光ラベルであって、発光スペクトルを放射する蛍光ラベルを取り付けるステップと、
ｂ）前記蛍光ラベルの発光スペクトルを検知するステップと
を含む方法。
【請求項５５】
前記貴金属ナノクラスタは、２〜８の貴金属原子を含む、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記貴金属は、金、銀および銅からなる群から選択される、請求項５４の方法。
【請求項５７】
前記被包される貴金属ナノクラスタは、低励起強度で蛍光を発し、前記被包される貴金属ナノクラスタは、ナノクラスタ励起最大で、約１〜１０００Ｗ／ｃｍ２に及ぶ飽和強度を有する、請求項５４の方法。
【請求項５８】
前記低励起強度は、約４６０ｎｍで約３０Ｗ／ｃｍ２である、請求項５７の方法。
【請求項５９】
前記蛍光ラベルは、偏極スペクトル放射を示し、双極子放射パターンを示す、請求項５４の方法。
【請求項６０】
前記蛍光ラベルは、生物学的状態に関する情報を提供するスペクトル放射を有する、請求項５４の方法。
【請求項６１】
前記生物学的状態は、生物学的部分の量的、質的存在；生物学的部分の構造、組成および形態；環境下での、生物学的部分の局在性；生物学的部分、生物学的化合物の構造における変性、および細胞過程の変性との間の相互作用、からなる群から選択される請求項６０の方法。
【請求項６２】
前記蛍光ラベルが励起されるとき、前記蛍光ラベルは、約３〜９のｐＨ範囲にわたって、蛍光を発することができる、請求項５４の方法。
【請求項６３】
前記貴金属ナノクラスタは、光退色前に約１０６を越える光子を放射する、請求項５４の方法。
【請求項６４】
１個より多い貴金属ナノクラスタを含む組成物が励起されるとき、約８０％を超える前記貴金属ナノクラスタは、約３０分を超える間蛍光を発する、請求項５４の方法。
【請求項６５】
前記貴金属ナノクラスタは、５１４．５ｎｍまたは４７６ｎｍで、約３００Ｗ／ｃｍ２の連続的励起エネルギーで蛍光を発し、前記蛍光は飽和蛍光または不飽和蛍光である、請求項６４の方法。
【請求項６６】
前記被包される貴金属ナノクラスタにリンカー分子を取り付ける第一ステップをさらに含み、前記リンカー分子は、重要な分子に蛍光ラベルを取り付けることができる、請求項５４の方法。
【請求項６７】
前記重要な分子は、生物学的サンプル中に存在する、請求項５４の方法。
【請求項６８】
前記蛍光ラベルのサイズは、直径約１ｎｍ未満から１５ｎｍである、請求項５４の方法。
【請求項６９】
前記貴金属ナノクラスタは、デンドリマーに被包される、請求項５４の方法。
【請求項７０】
前記デンドリマーは、ポリ（アミドアミン）を含む、請求項６９の方法。
【請求項７１】
前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第０世代、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代およびより高い世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群から選択される、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第２世代または第４世代の末端にＯＨを有するポリ（アミドアミン）デンドリマーである、請求項７０の方法。
【請求項７３】
前記貴金属ナノクラスタは、ペプチドに被包される、請求項５４の方法。
【請求項７４】
前記ペプチドは、細胞中で発現する、請求項７３の方法。
【請求項７５】
前記ペプチドは、融合ポリペプチドを含む、請求項７３の方法。
【請求項７６】
前記ペプチドの長さは、約５〜５００のアミノ酸である、請求項７３の方法。
【請求項７７】
前記ペプチドの長さは、約５〜２０のアミノ酸である、請求項７３の方法。
【請求項７８】
前記ペプチドの長さは、約２０〜４０のアミノ酸である、請求項７３の方法。
【請求項７９】
前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に定義されるようなポリペプチド配列を含む、請求項７３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、金属クラスタ蛍光に基づく蛍光／発光プローブの新しいクラスの創作、そのようなプローブを調製する方法、およびその使用方法に関する。
【０００２】
背景技術
単一分子蛍光顕微鏡検査研究は、実質的にゼロバックグラウンドで弱い信号が観察されるという限界を示している。高い放射および強い発蛍光団の高強度レーザー励起に依存するそのような光学的方法は、極めて効率的なバックグラウンドの除去を要求する。特別のタンパク質または重要な構造を識別するために人工ラベルの導入に依存して、蛍光に基づいた方法は、光退色（プローブ破壊による信号の損失）および自己蛍光（生物学的媒体内の在来種からの自然に生じるバックグラウンド蛍光）の２つの追加の問題に苦慮する。これらの問題がありながら、蛍光顕微鏡検査法は、生物学的媒体をイメージしながら、単一分子および化学的感度の可能性を有する主要な光学方法である。
【０００３】
ほとんどのインビトロの蛍光ラベリングは、遊離型Ｎ−スクシンイミドエステル共役染料、溶剤露出アミン（しばしば、リシン残留物上に）、または自然に生じるまたは遺伝的に導入された溶剤露出システインについてのチオールへのマレイミド共役染料の標準化学結合によって行う。これらの２つの化学結合は、重要なタンパク質に、小さく、強い蛍光染料を取り付けることに引き続き非常に役立つ。そのような蛍光生体材料は、インビトロの単一分子の研究に適切であり、または、それらは、微量注入法または全体の細胞内で重要なタンパク質のバルク蛍光研究を行なう他の膜輸送方法のいずれかによって、高濃度の細胞へ再度導入することができる。タンパク質機能は、蛍光ラベルの取り付けサイズおよびポイントの両方によって変更されるだけでなく、しばしば、使用される化学結合のために、蛍光ラベリングのサイトは正確に知られていない。したがって、できるだけ小さな遺伝的にプログラムされたラベルは、極めて有利である。
【０００４】
さらに、生物系では、フラビン、ポルフィリン、およびすべて他の弱い蛍光性自然発生的な種からの自己蛍光バックグラウンドは、レーザーで引き起こされた蛍光信号を妨げる、大きなバックグラウンドを生成することができる。これらの問題のために、生物系内での、タンパク質のわずかのコピーの力学的研究は、長時間、非常に弱い非干渉性の照明で、それらが容易に観察することができるように、重大な光退色なしで、吸収し放射する新しい蛍光プローブの開発を非常に強くしている。そのような照明は、弱いバックグラウンド信号の励起に強く関連する発蛍光団の選択的な励起を可能にする。さらに、より弱い照明は、光毒性効果を最小限にすることにより生物学的生存性を保つ。不都合にも、単一分子の感度は、そのような高いバックグラウンドの中でインビボの研究に到達するのにまだ困難であり、より低いバックグラウンドでさえ、インビトロの研究を観察することは多くの場合困難である。
【０００５】
信号対雑音制限のために、単一分子の研究は、すべての関連する障害を備えた蛍光に基づく分析に制限される。単一の分子方法が「ピーリングバック（ｐｅｅｌｉｎｇ  ｂａｃｋ）」、環境的、機構的不均一性を検査する全体の平均で有効である一方、現在の技術は、高価なレーザーに基づいた設備、専門の合成法を要求し、利用可能な蛍光ラベルの弱い光学的性質または生物学的不和合によって、依然として基本的に制限されている。
【０００６】
いくつかの重要な実験は、単一分子顕微鏡の、生物活性に結びつく重大なステップを解く能力を独自に実証した（Ｌｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８２：１８７７−１８８２；Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３８８：３５５−３５８；Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９５，３７４：５５５−５５９；Ｈａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  １９９６，９３，６２６４−６２６８；Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８０：４５１−４５３；Ｄｅｎｉｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ２０００，９７：５１７９−５１８４；Ｈａ  ｅｔ  ａｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９，９６：８９３−８９８；Ｈａｒａｄａら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．．１９９９，７６：７０９−７１５；Ｋｉｎｏｓｉｔａ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２０００，７８：１４９Ｗｋｓｈｐ）。個々のモータータンパク質運動の研究において最も劇的に、タンパク質機能に対する機構的洞察および生体動態のサイクル内のサブステップが、困難な外部同期の必要なしで、直接視覚化されることができる（Ｆｕｎａｔｓｕら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９５，３７４：５５５−５９；Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８０：４５１−４５３；Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２０００．７８：１４９Ｗｋｓｈｐ；Ｙａｎａｇｉｄａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００，１２：２０−２５）。生体分子をさらに折り重ねることは、誤って折り畳まれた状態および折り畳まれた状態の両方に結びつく経路を明らかにするために調査された（Ｄｅｎｉｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ２０００，９７：５１７９−５１８４；Ｈａら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９，９６：８９３−８９８）。配向（Ｂａｒｔｋｏ，＆Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊ，Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３：３０５３−３０５６；Ｂａｒｔｋｏ＆Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊ，Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３：１１２３７−１１２４１；Ｂａｒｔｋｏら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００２，３５８：４５９−４６５；Ｈｏｌｌａｒｓ＆Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２０００，１１２：７８２２−７８３０）および蛍光共鳴エネルギー転送（ＦＲＥＴ）方法（Ｗｅｉｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９９，２８３：１６７６−１６８３）は、単一の分子レベルで開発され、さらに多くの実験が現在可能である。すべての単一分子の研究で、研究者は、重要なタンパク質の人工蛍光ラベリングに追いやられ、インビトロの観察に制限される。細胞中へのラベルが付けられたタンパク質の再導入は、まだ、有機的発蛍光団の大きな自己蛍光バックグラウンドおよび弱い光安定性によるインビボの単一の分子信号を生成しなければならない。
【０００７】
単一の分子は、さらに実験の時間スケールを制限する多くの本質的に不適当な特性を有する。励起率は、生物学上、合理的な時間分解能（秒に対してｍｓ）および良好な信号対雑音を備えた関連情報をもたらすために非常に高くなければならない。最良の有機的蛍光の吸収断面積（すなわち、減衰係数、ε）が、室温（Ｍａｃｋｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，２７２：２５５−２５８）で、〜１０−１６ｃｍ２（すなわち、ε〜１０５Ｍ−１ｃｍ−１）であるので、高強度レーザー励起は、単一の分子蛍光研究用に利用される。さらに、有機分子は、光化学的に分解する前に、〜１０７の励起サイクルにのみ耐えることができる（Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３８８：３５５−３５８；Ｌｕ＆Ｘｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３８５：１４３−１４６；Ｍａｃｋｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，２７２：２５５−２５８）。１０６の励起／秒（〜５ｋＷ／ｃｍ２の励起強度および５％の典型的な収集／検出効率を使用して）では、これは時間分解能を１ｍｓ（理想化された〜７の信号対雑音比で）に制限し、１０秒までの光退色前に個々の分子に続く平均総使用時間を制限する。これが非常に生物学的に適切な時間スケールに関連する非常に大量のデータでありうる一方、励起サイクルの多くは、データを集める前に重要な分子を見つけることにより結局消費される。酸素の還元は、光退色前に時間をしばしば増加することができるが、有機色素の光安定性および全面的な明るさは、生物の単一分子の実験をすべて制限する。したがって、発蛍光団特性の進歩は、生物系におけるすべての単一分子の光学研究の継続的成功にとって重要である。
【０００８】
有機的な発蛍光団と同様の結合化学を要求して、水溶性ＩＩ−ＶＩ量子ドットは、生物学的ラベルとして最近提案され実証された（Ｂｒｕｃｈｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８１：２０１３−２０１６；Ｃｈａｎ＆Ｎｉｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９８，２８１：２０１６−２０１８；Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌｙｓｔ  ２０００，１２５：１０２９−１０３１）。ＺｎＳ保護膜を安定させるＣｄＳｅのような材料は、サイズ依存の光学性質を有し、非常に狭いサイズ分布で合成することができる（Ｍｕｒｒａｙら、Ｚ．Ｐｈｙｓ．Ｄ−Ａｔｏｍｓ  Ｍｏｌ．Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  １９９３，２６：Ｓ２３１−Ｓ２３３；Ｍｕｒｒａｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ：Ｓｏｃ．１９９３，１１５：８７０６−８７１５；Ｐｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０４：５９−６１）。これらのナノ材料の強い吸収、スペクトルの安定性およびサイズ調整可能な狭い放射は、一旦化学反応がこれらの材料を水溶性にするために外部のＺｎＳ層上で行なわれれば、生体ラベル化する際の励起可能性を示唆する（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｅｊｏら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２０００，８７：８５２６−８５３４；Ｄａｂｂｏｕｓｉら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９７，１０１：９４６３−９４７５）。表面の不動態化が全面的な量子ドット光学的性質において非常に重要であるので、予測可能な光学応答を有するタンパク質にそれらが再生可能で結合されることが可能なように、多くの注意が量子ドットの表面の不動態化に払われるべきである（Ｂｒｉｃｈｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８１：２０１３−２０１６；Ｃｈａｎ＆Ｎｉｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８１：２０１６−２０１８；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｅｊｏら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２０００，８７：８５２６−８５３４；Ｄａｂｂｏｕｓｉら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９７，１０１：９４６３−９４７５；Ｎｉｒｍａｌ＆Ｂｒｕｓ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２：４０７−４１４；Ｎｉｒｍａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８３：８０２−８０４）。実際、水可溶化の実現および表面の不動態化の成功は、今実を結び始めている。（Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９８：１７５９−１７６２；Ｊａｉｓｗａｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１：４７−５１；Ｗｕら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１：４１−４６；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  ｍａｔ．Ｓｃｉ．２００２．６：３６５−３７０；Ｇａｏら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．２００２．７：５３２−５３７；Ｍａｔｔｏｕｓｓｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２：１２１４２−１２１５０）。
【０００９】
それらの明るく、非常に狭いサイズ依存の放射が全く有望である一方、生物学的ラベルとしてＣｄＳｅを使用することに関する多数の問題はまだ存在する。それらの合成は、非常に有毒な前駆体を使用する高温の方法を必要とし、それらはラベル化してもよい（直径２〜６ｎｍ）タンパク質のサイズに匹敵し、それらは、外部的に重要なラベル化タンパク質を必要とし、細胞へラベル化されたタンパク質を再度導入することができる。したがって、弱い水銀灯励起で、強い振動子強度によって容易に量子ドットを観察することができ、それによって、より弱い吸収自己蛍光バックグラウンドの多くを回避するが、それらは、まだインビボまたはインビトロの単一分子の研究への理想的な解決ではない。
【００１０】
理想的には、できるだけ小さな遺伝的にプログラムされたラベルが重要なタンパク質上または隣接して発現することが望まれる。そのような理想的なラベルは、時間分解能を有する長時間単一分子観察を可能にするために、高いバックグラウンド蛍光がある状態でさえ、顕著な光安定性と同様に十分に強い吸収および放射を必要とする。そのような蛍光プローブはまだ存在しない。現在、単にアミノ酸、緑蛍光タンパク質からなることによる最良の利用可能なオプション（ＧＦＰ；Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３８８：３５５−３５８；Ｈｅｉｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ１９９４，９１：１２５０１−０４；Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９６，２７３：１３９２−５；Ｃｈａｔｔｏｒａｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ１９９６，９３：３６２−６７；Ｂｒｅｊｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ１９９７，９４：２３０６−１１；Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９５．２０；４４８−５５；Ｋａｉｎ＆Ｋｉｔｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，６３：３０５−２４）およびＤｓＲｅｄ（Ｇｒｏｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ２０００，９７：１１９９０−１１９９５；Ｊａｋｏｂｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２０００，４７９：１３１−１３５；Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，２０００，７：１１３３−１１３８；Ｙａｒｂｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ２００１，９８：４６２−４６７）は優れたインビボのラベル化に優れており、多くの著者（Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ１９９７，３８８−３５８；Ｍａｌｖｅｚｚｉ−Ｃａｍｐｅｇｇｉら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２００１．８１：１７７６−１７８５；Ｇａｒｃｉａ−Ｐａｒａｊｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ２０００，９７：７２３７−７２４２；Ｃｏｔｌｅｔら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００１，３３６，４１５−４２３；Ｌｏｕｎｉｓら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００１，２：３４７−３６０；Ｂａｒｃｉａ−ｐａｒａｊｏら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３：４３１−４３４；Ｇａｒｃｉａ−Ｐａｒａｊｏら、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ２００１，２：３４７−３６０；Ｇａｒｃｉａ−Ｐａｒａｊｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００１，９８：１４３９２−１４３９７；Ｂｌｕｍら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００２，３６２：３５５−３６１）によってインビトロの研究における単一分子レベルで観察された。
【００１１】
第１のそのような研究のうちの１つでは、ＧＦＰの明滅および光スイッチング能力が、２つの異なる光学的にアクセス可能な状態間で、ＧＦＰ発色団を往復させるために使用される光子として研究された（Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ１９９７，３８８：３５５−３５８）。ＧＦＰは、特に任意のタンパク質のＮまたはＣ末端に付着することができ、インビボで高い蛍光ラベルとして発現できるが、一方では特に単一分子レベルでの問題が依然として残る。ＧＦＰは、２７ｋＤまたは直径〜４ｎｍであり（Ｏｒｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９６，２７３：１３９２−５；Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９５，２０：４４８−５５）、したがって、それが取り付けられるタンパク質への大きな摂動になることができる。さらに、ＧＦＰは一度その最終配座（ｆｉｎａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）へ折り重なると放射が起こり、そのプロセスは〜１時間で処理され、そして、異なる細胞のすべての領域においてＧＦＰのラベル化の例が報告されているが、ＧＦＰは、時々、適切に付与された条件下で折り重ならない（Ｈｅｉｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ１９９４，９１；１２５０１−０４；Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９５．２０：４４８−５５）。さらに、単一の分子研究を考慮するとき、その放射は、著しく自己蛍光バックグラウンドでオーバーラップが、しかし、その放射強度は標準の外生の有機色素に単に匹敵し、そのことによりインビボの単一分子の研究は非常にやりがいがある。酸素に大部分は非感受性である一方、さらに典型的には標準有機色素（Ｄｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ１９９７，３８８：３５５−３５８）と同様に、〜１０７の励起サイクル後退色する。ＤｓＲｅｄは、部分的に、自己蛍光バックグラウンドとのオーバーラップを回避し、ＧＦＰのそれに関するＤｓＲｅｄの赤にシフトする（ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ）放射は利点でありうるが、その比較可能な蛍光強度および非常に低濃度においても四重体（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）を形成する傾向は、理想的な生物学的ラベルとしての使用を制限する（Ｌｏｕｎｉｓら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００１，１０５：５０４８−５０５４；Ｇａｒｃｉａ−Ｐａｒａｊｏら、Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ２００１，２：３４７−３６０；Ｖｅｒｋｈｕｓｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：２９６２１−２９６２４；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００２，５２５：１２３−１９）。したがって、理想的なラベルは、無機量子ドットの強い吸収、放射および光安定性、小サイズおよび有機色素の簡単な付着化学を、または好ましくは、ＧＤＰとＤｓＲｅｄのように、第１にタンパク質を精製、ラベル化、タンパク質を再注入せずに、任意の重要なタンパク質に取り付けられた単一分子の生物学的ラベルとしてインビボで発現される能力を組み合わせるものである。
【００１２】
要約すると、現在のラベリング法および材料は、無数のバルク研究、および多くのインビトロの単一分子の実験を可能にしているが、単一分子の実験は、最良の蛍光プローブにおいてさえも損失によって、依然として制限される。大幅に改善された光安定性、弱い照明のもとでも十分な強度の吸収と放射、容易な合成とタンパク質との共役、および調整可能な放射色を備えた新しい単一分子のプローブ技術が必要である。理想的には、そのような蛍光ラベルは、研究下のタンパク質が、まず過度に発現、精製、ラベル化されず、そして細胞へ再導入されずに、直接細胞内でラベル化されることができるよう遺伝的にプログラム可能であるべきである。
【００１３】
発明の要約
本発明の目的は、先行技術に関連する１つまたは複数の問題または不足を克服または少なくとも緩和することである。本発明は、単一分子またはバルク集合のいずれかで、分子の容易な研究を可能にする、新規で、独特の、強い蛍光ラベルを識別する必要を１つには実現する。前記組成物は、被包される貴金属ナノクラスタを含む水溶性蛍光ラベルを含む。一実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、２〜８の貴金属原子を含む。好ましい実施形態では、前記貴金属は、金、銀および銅からなる群から選択される。ある実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、変化する電荷を有する。
【００１４】
前記蛍光ラベルは、偏極スペクトル放射を示し、双極子放射パターンを示すことが好ましい。前記蛍光ラベルは、生物学的状態に関する情報を提供するスペクトル放射を有し、前記生物学的状態は、生物学的部分の量的、質的存在；生物学的部分の構造、組成および形態；環境下での、生物学的部分の局在性；生物学的部分、生物学的化合物の構造における変性、および細胞過程の変性との間の相互作用、からなる群から選択される。
【００１５】
本発明の蛍光ラベルは、約３から約８のｐＨ範囲にわたって蛍光を発することができることが好ましく、前記貴金属ナノクラスタは、光退色前に約１０６を越える光子、１０７を越える光子、１０８または１０９を越える光子を放射することが好ましい。一実施形態では、前記被包される貴金属ナノクラスタは、約１％を越える蛍光量子収量、およびナノクラスタスペクトル励起最大で、約１〜１０００Ｗ／ｃｍ２に及ぶ飽和強度を有する。
【００１６】
ある好ましい実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、デンドリマーに被包される。一実施形態では、前記デンドリマーは、ポリ（アミドアミン）を含み、前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第０世代、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代およびより高い世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群から選択される。別の実施形態では、前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第２世代または第４世代の末端にＯＨを有するポリ（アミドアミン）デンドリマーである。
【００１７】
ある他の好ましい実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、ペプチドに被包される。前記ペプチドの長さは、約５〜５００のアミノ酸であることが好ましい。他の実施形態では、前記ペプチドの長さは、約５〜２０のアミノ酸である。さらなる実施形態では、前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に定義されるようなポリペプチド配列を含む。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載されるように蛍光を発することができる、デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタを調製する方法であって、ａ）デンドリマー、貴金属を含む水溶液および水性溶媒を混合して、混合液を作製するステップと、ｂ）還元剤を添加するステップと、ｃ）十分な量の酸性化合物を添加し、中性範囲または生理的ｐＨに前記混合液を調節するステップと、ｄ）ｐＨが調整された前記混合溶液を混合して、デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタを形成することか可能であるステップとを含む方法を提供する。本発明は、さらに、本明細書に記載されるように、蛍光を発することが可能なペプチドに被包される貴金属ナノクラスタを調製する方法であって、ａ）ペプチド、貴金属を含む水溶液および水溶液を混合して混合液を作製するステップと、ｂ）還元剤を添加するステップと、ｃ）十分な量の酸性化合物を添加し、中性範囲のｐＨに前記混合液を調節するステップと、ｄ）ｐＨが調整された前記混合溶液を混合して、ペプチドに被包される貴金属ナノクラスタを形成することが可能であるステップとを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明は、生物学的状態を研究するために、本明細書に記載された蛍光ラベルを使用する方法をさらに包含する。本発明は、重要な分子を観察する方法であって、ａ）重要な分子に、被包される貴金属ナノクラスタを含む水溶性蛍光ラベルであって、可視または近赤外線波長の特定の範囲にわたって、発光スペクトルを放射する蛍光ラベルを取り付けるステップと、ｂ）前記蛍光ラベルの発光スペクトルを検知するステップとを含む方法を提供する。ある実施形態では、前記方法は、前記被包される貴金属ナノクラスタにリンカー分子を取り付ける第一ステップをさらに含み、前記リンカー分子は、重要な分子に蛍光ラベルを取り付けることができる。好ましい実施形態では、前記重要な分子は、生物学的サンプル中に存在する。１つの好ましい実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、ペプチドに被包される。前記ペプチドは、細胞中で生じることが好ましい。一実施形態では、前記ペプチドは融合ポリペプチドを含む。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、蛍光ラベルを含む組成物、該組成物を調製する方法、および前記組成物を使用する方法を提供する。本発明の組成物は、蛍光を発することができる被包される貴金属ナノクラスタを含む。前記蛍光ラベルは、公知の蛍光ラベルを超えるある利点を提供し、小さなサイズ、弱い照明下でのはるかに強い吸収および放射、容易な合成およびタンパク質への結合、調整可能な放射色、および直接細胞内でタンパク質がラベル化されることができるように遺伝的にラベルをプログラムするオプションが挙げられる。
【００２１】
本発明は、被包される貴金属ナノクラスタを含む水溶性蛍光ラベルを含む組成物を提供する。一実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、２〜８の貴金属原子を含む。好ましい実施形態では、前記貴金属は、金、銀および銅からなる群から選択される。
【００２２】
一実施形態において、前記蛍光ラベルは、偏極スペクトル放射および／または双極子放射パターンを示す。前記蛍光ラベルは、生物学的状態に関する情報を提供するスペクトル放射を有し、前記生物学的状態は、生物学的部分の量的、質的存在；生物学的部分の位置、構造、組成および形態；環境下での、生物学的部分の局在性；生物学的部分、生物学的化合物の構造における変性、および細胞過程の変性との間の相互作用、からなる群から選択される。
【００２３】
本発明の蛍光ラベルは、約３〜約８のｐＨ範囲にわたって蛍光を発することができ、前記貴金属ナノクラスタは、光退色前に約１０６を越える光子を放射する。さらなる実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、光退色前に約１０７、１０８または１０９を越える光子を放射する。
【００２４】
ある好ましい実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、デンドリマーに被包される。一実施形態では、前記デンドリマーは、ポリ（アミドアミン）を含み、第０世代、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代およびより高い世代のポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群から選択される。別の実施形態では、前記ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、第２世代または第４世代の末端にＯＨを有するポリ（アミドアミン）デンドリマーである。
【００２５】
ある他の好ましい実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、ペプチドに被包される。前記ペプチドの長さは、約５〜５００のアミノ酸であることが好ましい。他の実施形態では、前記ペプチドの長さは、約５〜２０のアミノ酸である。さらなる実施形態では、前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に定義されるようなポリペプチド配列を含む。
【００２６】
本発明は、デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタを調製する方法であって、ａ）デンドリマー、貴金属を含む水溶液および水性溶媒を混合し、混合液を作製するステップと、ｂ）還元剤を添加するステップと、ｃ）十分な量の酸性化合物を添加し、中性範囲または生理的ｐＨに前記混合液を調節するステップと、ｄ）ｐＨが調整された前記混合溶液を混合して、デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタを形成することか可能であるステップとを含む方法を提供する。本発明は、さらに、蛍光を発することが可能なペプチドに被包される貴金属ナノクラスタを調製する方法であって、ａ）ペプチド、貴金属を含む水溶液および水溶液を混合し混合液を作製するステップと、ｂ）還元剤を添加するステップと、ｃ）十分な量の酸性化合物を添加し、中性範囲または生理的ｐＨに前記混合液を調節するステップと、ｄ）ｐＨが調整された前記混合溶液を混合して、ペプチドに被包される貴金属ナノクラスタを形成することか可能であるステップとを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明は、生物学的状態を研究するために、前記蛍光ラベルを使用する方法をさらに包含する。本発明は、重要な分子を観察する方法であって、ａ）重要な分子へ被包される貴金属ナノクラスタを含む水溶性蛍光ラベルであって、可視または近赤外線波長の特定の範囲にわたって、発光スペクトルを放射する蛍光ラベルを取り付けるステップと、ｂ）前記蛍光ラベルの発光スペクトルを検知するステップとを含む方法を提供する。ある実施形態では、前記方法は、前記被包される貴金属ナノクラスタにリンカー分子を取り付ける第一ステップをさらに含み、前記リンカー分子は、重要な分子に蛍光ラベルを取り付けることができる。好ましい実施形態では、前記重要な分子は、生物学的サンプル中に存在する。１つの好ましい実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、ペプチドに被包される。前記ペプチドは、細胞中で生じることが好ましい。一実施形態では、前記ペプチドは、融合ポリペプチドを含む。
【００２８】
本明細書に記載された高い蛍光水溶性貴金属ナノクラスタ（ナノドット）は、それらの桁外れに強い吸収および放射による弱い水銀灯の励起で、単一のナノドットとして容易に観察される（Ｐｅｙｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２００１，２９１：１０３；Ｐｅｙｓｅｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ２００２，１０６：７７２５）。はるかに大きな定量ドットの強度に相当する吸収強度で、これらの高い蛍光性で桁外れに光安定性のナノドットは、単一分子およびバルク蛍光性生体ラベルとして、１つの実施形態で有用である。安定した生体適合性のある個々の貴金属ナノクラスタが生成されると、非常に小さく明るい発蛍光団として光活性化されたナノ材料の使用が非常に促進される。本発明のそのような明るく、容易に合成され、強固なナノ材料は、実験コストおよび複雑さを大幅に減少させ、現在可能なものより個々の分子からより多くの光子を生成することが可能な、光学的に励起した発蛍光団を提供することにより、単一の分子方法の可能性を拡大する。
【００２９】
本明細書に記載された本発明の１つの態様は、同時に非常に小さく、生体適合で、特定のインビトロおよびインビボラベリングに適切であり、容易に弱い水銀灯励起だけで単一の分子レベルで観察される、極めて強固で、桁外れに明るく、光活性化された生物学的ラベルの生成および特徴を提供する。最良の有機色素より、少なくとも２０倍の明るさで、明るさおよび合成のしやすさは、標準の安価なランプから作られる蛍光顕微鏡で、研究者が容易に単一分子の実験を行なうことを可能にする。本明細書に記載されるように、貴金属の原子のわずか数十への少数の原子だけが、単一分子レベルで容易に観察される極めて明るい化合物を生成することが必要である。その結果、貴金属ナノクラスタを被包する適切な生体適合の足場（一般にデンドリマー、遺伝的に最適化されたペプチドまたは他の適切な被包材料）は、これらを非常に有用にし、潜在的にインビボおよびインビトロのできるだけ最小のラベルを可能とする。
【００３０】
特に断りのない限り、本明細書で使用される用語は、関連技術における通常の熟練者によって従来の用法によって理解される。以下に提供される用語の定義に加えて、分子生物学の共通の用語の定義も、Ｒｉｅｇｅｒら、１９９１  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；ａｎｄ  ｉｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９８  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）に発見された。明細書および請求の範囲で使用されるように、「ａ」または「ａｎ」は、一つ以上を意味し、それが使用される情況に依存することが理解される。したがって、例えば、「細胞」への言及は、少なくとも１個の細胞を利用することができることを意味する。
【００３１】
本発明は、本明細書に含まれる発明の好ましい実施の形態および実施形態の以下の詳細な説明への言及によって、より容易に理解される。しかし、本発明の化合物、組成物および方法が開示され、説明される前に、本発明は、特定の貴金属、特定のポリペプチド、特定のデンドリマー、特定の条件または特定の方法等に限定されず、もちろん、変化してもよいことが理解され、ここで多数の修正および変化は、本技術分野の当業者に明らかである。さらに、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態だけについて記載するためにあり、制限するようには意図されないことは理解される。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「被包材料」は、貴金属ナノクラスタの１または複数の分子に取り付けられる、または物理的に関係することができる基質を指す。被包材料は、重要な分子に貴金属ナノクラスタを間接的に取り付けるための手段を提供することができ、環境から貴金属ナノクラスタを保護することができる。取り付けまたはリンケージは、共有結合、水素結合、吸着、吸収、金属結合、分子間力またはイオン結合、またはそれらの任意の組み合わせによる。本明細書で使用されるように、「被包される」は、前記貴金属ナノクラスタの１つ以上の分子が被包材料と物理的に結び付く、または被包材料に捕らえられることができることを意味し、被包材料の全体にわたって部分的にまたは完全に分散される、または、被包材料またはその任意の組み合わせに取り付けられるかまたはリンクされる。それによって、取り付けまたはリンケージは、共有結合、水素結合、吸着、吸収、金属結合、分子間力またはイオン結合、またはそれらの任意の組み合わせによる。
【００３３】
本発明によって包含される貴金属ナノクラスタは、任意の適切な被包材料によって被包されることができるが、デンドリマー、ポリペプチド、界面活性剤および非デンドリマーポリマーに限定されない。一実施形態では、前記デンドリマーは、ＰＡＭＡＭデンドリマーである。別の実施形態では、前記ポリペプチドは、長さが５〜５００アミノ酸の配列を含む。別の実施形態では、前記ポリペプチドは抗体を含む。
【００３４】
デンドリマーに関して本明細書で使用されるように、例えば、「被包される」は、前記貴金属ナノクラスタの１つ以上の分子がデンドリマーのコアと物理的に結び付く、または捕らえられることができることを意味し、デンドリマーの全体にわたって部分的にまたは完全に分散される、または、デンドリマーまたはその任意の組み合わせに取り付けられ、またはリンクされる。それによって、取り付けまたはリンケージは、共有結合、水素結合、吸着、吸収、金属結合、分子間力またはイオン結合、またはそれらの任意の組み合わせによる。前記デンドリマーのサイズ、形状および官能基の密度は、厳密によく知られた方法によって制御されることができるので、保有される材料（すなわち、貴金属ナノクラスタ）が前記デンドリマーと関係する多くの方法がある。例えば、（ａ）保有される材料と存在物の間、典型的にはデンドリマー表面あるいは表面付近にある官能基との間で、共有、クーロン、疎水、あるいはキレートタイプの結合をすることができ；（ｂ）保有される材料とデンドリマー内部に位置する部分との間で、共有、クーロン、疎水、あるいはキレートタイプの結合をすることができ；（ｃ）デンドリマーは、内部（空隙容量）に保有する材料を捕捉するための大部分空洞な内部を準備することができ（例えば、高密度星型デンドリマー内部と物理的にあるいは結合する）（例えば、デンドリマー内で、キレート、および完全または不完全な金属イオンの０価または０価でない原子価状態に還元することで引き起こされる磁性あるいは常磁性のコアまたは領域）、これらのデンドリマーは磁性内部を含み、生物学的に活性であり、かつデンドリマー表面と磁石またはそのようなものを利用して錯体化できる様々な存在物の収集に利用することができ、存在物の放出は、制御する部分を拡散することでデンドリマー表面を過密にすることによって光学的に制御することができ；あるいは（ｄ）前記現象の様々な組合せを利用することができる。
【００３５】
本明細書で使用されるように、用語「貴金属」は、金、銀、銅、およびプラチナ、パラジウム、オスミウム、イリジウム、ルテニウムおよびロジウムなどの白金族金属（ＰＧＭ）  からなる群から選択される元素群を指す。本発明の、ある好ましい実施形態では、前記貴金属は、金、銀および銅からなる群から選択される。他の好ましい実施形態では、前記貴金属は銀である。他の好ましい実施形態では、前記貴金属は金である。他の好ましい実施形態では、前記貴金属は銅である。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「ナノクラスタ」は、金属の２〜２７の原子の結合を指す。製造されたナノクラスタは知られており、特に、触媒、セラミックス、半導体および材料科学の分野でますます重要になっている。それらの重要性は、ナノクラスタ中の内部原子への表面原子の高い比率による。これは、高い表面反応性、増加した硬度および収率、強度、減少した延性、低温での液体のような挙動、およびサイズと関連する化学的、物理的、および／またはそれらのマクロスケールの対応物の特性とは異なる量子効果などの特性を付与する。その最も微細な区分では、元素は単一原子からなる。分子は、少数の原子の単純総和からなる。また、金属および他のマクロ結晶固体は、連続的３次元原子配列で、外へ伸びる結晶または多結晶格子を含む。原子と分子との次元は、オングストロームで測定され、１オングストロームは、１０−１０ｍまたは０．１ナノメーターである。金属などの微晶質固体中の結晶領域は、マイクロメートルのスケールで一般的に測定される。ナノクラスタは、単一の原子状態からナノ結晶性状態までの遷移を占め、約０．１〜３ｎｍの範囲の直径を有してもよい。本明細書に記載されるように、前記ナノクラスタは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７の原子を含むことが好ましい。他の好ましい実施形態では、前記ナノクラスタは、約２〜２７の原子、約２〜２５の原子、約２〜２０の原子、約２〜１５の原子、約２〜１０の原子または約２〜８の原子を含む。デンドリマーまたはペプチドなどの被包材料中の被包のために好ましいナノクラスタのサイズは、使用される金属の種類、所望の放射色および特定用途次第である。
【００３７】
本明細書で使用されるように、「ナノ粒子」は、約３〜約１００ナノメーターの直径を有し、いかなるサイズ、形状または形態を有し、本明細書に定義されるような貴金属を含んでいる粒子として定義される。
【００３８】
本明細書で使用されるように、「ナノドット」は、デンドリマーまたはペプチドのような被包材料に被包される貴金属ナノクラスタであり、前記被包される貴金属ナノクラスタは、低励起強度で蛍光を発することができる。前記被包される貴金属ナノクラスタは、約１％を超える蛍光量子収量を有しており、ナノクラスタ励起最大で、約１〜１０００Ｗ／ｃｍ２に及ぶ飽和強度を有することが好ましい。ある実施形態では、前記蛍光量子収量は、約２％、３％  、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％またはそれ以上より大きい。ある実施形態では、前記飽和強度は、約１〜１０００Ｗ／ｃｍ２、約１０〜８００Ｗ／ｃｍ２、または約１０〜５００Ｗ／ｃｍ２の範囲である。前記励起最大は、ナノクラスタ間で変化し、少なくともナノクラスタ中の金属原子の種類および金属原子の数に依存する。ナノクラスタの励起最大は、本技術分野においてよく知られた手段を使用して、当業者によって容易に決定される。
【００３９】
本明細書で使用されるように、用語「飽和強度」は、分子の吸収が飽和し、励起強度に関してもはや線形でない強度を指す。分子の非線形吸収のための飽和強度では、多光子吸収は、非線形相互作用力に引き上げられる強度にもはや依存しない。前記量子収量は、吸収された光子の数に対する放射された光子数の比として定義される。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「水溶性」は、水溶液中に溶解および／または懸濁を形成する能力を指す。前記蛍光ラベルは、水溶液に明らかに溶解してもよいが、それは、少なくとも一時的に水溶液中に分散、または懸濁を形成することが可能である。
【００４１】
本明細書で使用されるように、用語「蛍光」または「蛍光性の」は、ある分子が光を吸収し異なる波長の放射をする能力に基づいた物理的な現象である。第１の波長での光（光子）の吸収が終了したら、第２の波長および異なるエネルギーでの光子の放射に進む。本明細書で使用されるように、「蛍光ラベル」は、第１の波長で光を吸収し、第２の波長および異なるエネルギーで光子を放射する分子である。本明細書で使用されるように、「蛍光ラベル」は、「発光ラベル」と交換できるように使用され、用語「蛍光の」および「蛍光」は、それぞれ、用語「発光の」および「発光」と交換できるように使用される。このように、蛍光は、燐光およびラマン放射および用語「発光」によって示される全ての放射を含むことが意図される。本明細書で使用されるように、用語「飽和蛍光」は、分子がすべての入射強度で蛍光を発する能力を指す。前記蛍光ラベルは、被包される貴金属ナノクラスタを含むことが好ましい。本発明の蛍光ラベルは、水銀灯によって提供されるような、低励起強度で蛍光を発することが好ましい。前記低励起強度は、約４６０ｎｍで約３０Ｗ／ｃｍ２であることが好ましい。他の実施形態では、前記励起強度は、約３３０ｎｍ〜９００ｎｍの励起波長の範囲で、＜１Ｗ／ｃｍ２から１０ｋＷ／ｃｍ２まで及んでもよい。前記励起強度は、少なくともナノクラスタのサイズ、およびナノクラスタを含む金属に依存して変化することができ、本技術分野においてよく知られた方法を使用して、当業者によって容易に決定することができる。本明細書に記載されるように、前記蛍光ラベルが、弱い水銀灯によるように、低励起エネルギーで蛍光を発することができる一方、一実施形態では、レーザーによって活性化される時、蛍光ラベルは蛍光を発することができる。
【００４２】
前記スペクトル放射は、本発明の蛍光ラベルのために決定することができる。原子および原子（または分子）の集合は、レベル間のエネルギー差の吸収または放射により、量子力学の規定する電子エネルギーレベル間で遷移することができる。放射または吸収された光の波長は、光子が２つの軌道間のエネルギー差を持つような状態である。このエネルギーは、プランク定数と光速度の積ｈｃを光の波長で割ることにより計算されてもよい。したがって、原子または原子の集合は、原子の詳細な原子構造によって示されるように、ある波長だけ（または等しい周波数またはエネルギー）を吸収する、または放射することができる。対応する光が、プリズムまたは分光写真器を通るとき、それは波長によって、空間的に分離される。対応するスペクトルは、連続性を示してもよいし、または連続輝線（発光スペクトル）上に重ねてもよい。したがって、原子が多く衝突（低密度のために）しないとき、発光スペクトルは生成される。前記輝線は、分子または原子の集合中の励起状態がより低いレベルに遷移するとき、放射される光子に相当する。本発明の好ましい実施形態では、前記蛍光ラベルのスペクトル放射は、偏極される。他の実施形態では、ナノクラスタ特性によって、前記放射は、偏極の異なる程度を示してもよい。ある実施形態では、前記被包される貴金属ナノクラスタは、双極子放射パターンを示す。前記蛍光ラベルのスペクトル放射特性は、使用される被包材料、デンドリマーの生成、試験環境のｐＨ、ナノドットが形成される環境ｐＨ、ペプチド配列によって決定される貴金属ナノクラスタのためのペプチドの親和力、ナノクラスタのサイズおよび被包される貴金属ナノクラスタを形成するために使用される特定の貴金属からなる群から選択された１つ以上の特性によって、少なくとも部分的に決定されることが好ましい。
【００４３】
前記貴金属ナノクラスタは、変化する電荷を有することが好ましい。本明細書で使用されるように、用語「変化する電荷」は、完全にまたは不完全に貴金属ナノクラスタを還元することができるか、または負に帯電することができるということを指す。ある応用では、ある電荷の貴金属ナノクラスタは好ましい。貴金属ナノクラスタの電荷は、よく知られた方法を使用して、当業者によって容易に決定される。
【００４４】
本発明の貴金属ナノクラスタは、直径３ｎｍ未満が好ましく、直径２ｎｍまたは１ｎｍ未満とすることができる。被包後、前記被包される貴金属ナノクラスタは、直径で１ｎｍ未満から約１５ｎｍを超えて変動することができる。前記被包される貴金属ナノクラスタのサイズは、使用される被包材料に大部分は依存する。例えば、一実施形態では、ＩｇＧなどの抗体は、前記貴金属ナノクラスタを被包するために使用される。これらの抗体は、直径が約１０ｎｍである。大きな１０〜５０ｎｍの被包される貴金属ナノクラスタは、画像化のために、インビボのリンパ系によってフィルター処理することができる。
【００４５】
本明細書で使用されるように、「樹枝状ポリマー」は、コアへの、またはそのコアから分岐層の逐次的または世代的の添加によって形成された規則的な樹枝状分岐を示すポリマーである。用語「樹枝状ポリマー」は、「デンドリマー」を包含し、それは、コア、少なくとも１つの内部分岐層および表面分岐層によって特徴づけられる。（Ｄｖｏｒｎｉｃ＆Ｔｏｍａｌｉａ  ｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ｉｎ  Ｂｒｉｔａｉｎ、６４１〜６４５、１９９４年８月参照）。「デンドロン」は、直接またはデンドリマーを形成するリンク部分を介して、コアまたはコアに接続することができる焦点から出る分岐を有する一種のデンドリマーである。多くのデンドリマーは、共通のコアにつながれた２つ以上のデンドロンを含む。しかし、用語「デンドリマー」は、単一のデンドロンを包含するために広く使用される。本発明では、好ましいデンドリマーは、ポリ（アミドアミン）またはＰＡＭＡＭデンドリマーであるが、他のデンドリマーの使用が熟考される。前記デンドリマーは、第０世代、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代またはより高い世代のデンドリマーからなる群から選択されることが好ましい。前記デンドリマーは、いかなる末端を有してもよく、ＯＨ末端、ＣＯＯＨ末端、ＮＨ２末端を含むがこれに限定されるものではない。選択される前記デンドリマーの世代は、被包される貴金属ナノクラスタのための所望の応用に依存して変化する。
【００４６】
最も好ましい樹枝状ポリマーは、密度の高い星型高分子であるが、樹枝状ポリマーは、対称および非対称の分岐デンドリマー、カスケード分子、アルボロール（ａｒｂｏｒｏｌ）等を含むがこれに限定されるものではない。本明細書に開示されたＰＡＭＡＭデンドリマーは、分岐アームが等しい長さであるという点で対称である。前記分岐は、前の世代分岐上の末端ＮＨ２基の水素原子で生じる。
【００４７】
たとえ、分岐層を規則的に逐次的に添加することによって形成しないとしても、高分岐ポリマー、例えば、高分岐ポリオールは、分岐パターンがデンドリマーのものに近い規則性の程度を示す樹枝状ポリマーと同等であってもよい。
【００４８】
サイズおよび形状が制御された領域を有するトポロジーポリマーは、それらの反応的な末端基（「架橋デンドリマー」として呼ばれる）を介して、互いに関係するデンドリマーである（共有して架橋された例として、または以下定義されるような他の結合を介して）。「２つ以上の密度の高い星型デンドリマーが互いに結合されるとき、それらは「凝集体」または「密度の高い星型凝集体」と呼ばれる。
【００４９】
したがって、樹枝状ポリマーは、架橋デンドリマーおよびデンドリマー凝集体を含む。樹枝状ポリマーは、デンドリマーの世代的単分散および世代的多分散溶液の両方を包含する。単分散溶液中のデンドリマーは、実質的にすべて同じ世代であり、その結果、一定のサイズおよび形状である。多分散系溶液でのデンドリマーは、異なる世代デンドリマーの分布を含む。
【００５０】
樹枝状ポリマーは、また、表面改質デンドリマーを包含する。例えば、ＰＡＭＡＭデンドリマーの表面は、アミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）の添加によって改質されてもよい。
【００５１】
本明細書で使用されるように、デンドリマーを指すときの用語「世代」は、デンドリマーの開始コアに添加される反復単位の層の数を意味する。例えば、第１世代デンドリマーは、開始コアおよび反復単位の１つの層を含み、第２世代デンドリマーは、開始コアおよび反復単位等の２つの層を含む。世代（例えば、世代番号および反復単位のサイズ、および性質）の逐次的構築は、デンドリマーの次元およびそれらの内部の性質を決定する。
【００５２】
デンドリマーを生物学的基質にリンクする方法は、本技術分野の当業者によく知られており、リンカー分子を使用することが挙げられる。例えば、チオール反応種は、両機能的な架橋剤、Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアン酸塩のイソシアン酸塩端に、デンドリマー水酸基を結合し、チオール反応マレイミドをタンパク質に結合するために残すことにより作製することができる。
【００５３】
本明細書で使用されるように、用語「光退色」は、すべてのプロセスを含み、それらは、励起波長で生成される蛍光灯の強度の還元をもたらす。本発明の実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、光退色前に約１０６、１０７、または１０８を越える光子を放射する。より好ましい実施形態では、前記貴金属ナノクラスタは、光退色前に約１０９を越える光子を放射する。光退色は、当業者によって容易に評価される。
【００５４】
本発明のある好ましい実施形態で、前記被包される貴金属ナノクラスタが励起されるとき、約８０％を超える前記貴金属ナノクラスタは、約３０分間を越えて蛍光を発する。前記貴金属ナノクラスタは、５１４．５ｎｍまたは４７６ｎｍで、約３００Ｗ／ｃｍ２の連続的励起エネルギーで蛍光を発することが好ましい。別の実施形態では、約９０％を超える前記貴金属ナノクラスタは、約３０分間を越えて蛍光を発することが好ましい。他の実施形態では、８０％または９０％を超える前記ナノクラスタは、約１％を超える蛍光量子収量、および３０分を越える時間継続して放射される１〜１０００Ｗ／ｃｍ２変動する飽和強度を有する。
【００５５】
一実施形態では、デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタは、生体膜を横切って、前記貴金属ナノクラスタを強く結合するペプチドに、貴金属ナノクラスタを供給するために使用される。前記貴金属ナノクラスタに結合する強度は、当業者によって容易に決定され、蛍光強度の視覚的評価を挙げることができる。好ましい実施形態では、デンドリマーは、第０世代、第１世代または第２世代などのより低い世代デンドリマーである。他の実施形態では、前記デンドリマーは、第３世代、第４世代またはより高い世代のデンドリマーなどのより高い世代のデンドリマーである。ある実施形態では、前記ペプチドは、ある範囲のｐＨで、前記貴金属ナノクラスタを結合する。前記ペプチドは、１〜１０、より好ましくは２〜９、より好ましくは３から８のｐＨの範囲で、前記貴金属ナノクラスタを安定して結合する。他の実施形態では、前記ペプチドは、９、８、７、６、５、４または３のｐＨで、前記貴金属ナノクラスタを安定して結合する。この実施形態は、インビトロおよびインビボでタンパク質の容易なラベル化を可能とする。
【００５６】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、任意長さのヌクレオチドの重合体形態、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかを含めるように本明細書で使用される。この用語は、分子の一次構造のみを言及するため、前記用語は、三重、二重または単鎖ＲＮＡと同様に、三重、二重または単鎖ＤＮＡを含む。さらに、それはメチル化および／またはキャッピングによってなどの修飾およびポリヌクレオチドの無修飾形式を含む。より詳細には、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」は以下のものを含む、ポリデオキシヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またＣ−グルコースである他のタイプのポリヌクレオチド、および非ヌクレオチドバックボーンを含む他のポリマー、例えばポリイミド（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ））、およびポリモルホリノ（ＮｅｕｇｅｎｅとしてＡｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ社（オレゴン州コーヴァリス）から市販されている）ポリマー、およびＤＮＡおよびＲＮＡに見られる塩基対および塩基スタッキングとなる配列の核塩基を含むポリマーを供給する合成配列特異核酸ポリマー。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」間の長さに意図した区別はなく、これらの用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを言及する。したがって、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’、５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホルアミデイト、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、２重および３重鎖ＤＮＡ、同様に２重および３重鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡ間のハイブリッド、またさらに公知のタイプの修飾、例えば、本技術分野で知られているラベル、メチル化、「キャップ」、類似体を備えた自然に生じるヌクレオチドの１つ以上の置換、インターヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）修飾、例えば、非荷電の連鎖（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデイト、カルバメートなど）を有するもの、負に荷電された連鎖（例えば、ホスホロチオネート、ホスホロジチオネート等）を有するもの、および正に荷電された連鎖（例えば、アミノアルキルホスホルアミデイト、アミノアルキルホスホトリエステル）を有するもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなどを含む）のようにペンダント部分を有するもの、介入物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を有するもの、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属など）を有するもの、アルキル化剤を有するもの、修飾連鎖を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、さらにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの未修飾の形態のものである。ＤＮＡは、特にデオキシリボ核酸である。
【００５７】
これらの用語は、さらに、遺伝子コード領域の３’末端および５’末端の両方にある翻訳されていない配列：コード領域の５’末端から上流の配列の、少なくとも約１０００のヌクレオチド、および、遺伝子のコード領域の３’末端から下流の配列の、少なくとも約２００のヌクレオチドを包含する。共通塩基を除き、イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他のものは、アンチセンス、ｄｓＲＮＡおよびリボザイム対のために使用することができる。例えば、ウリジンとシチジンのＣ−５プロピン類似体を含むポリヌクレオチドは、ＲＮＡに高い親和力で結び付き、かつ遺伝子発現の有力なアンチセンスの抑制剤であると示された。リン酸ジエステルバックボーンへの修飾、またはＲＮＡのリボース糖基中の２’−水酸基などの他の修飾もなすことができる。アンチセンスのポリヌクレオチドおよびリボザイムは、完全にリボヌクレオチドからなることができ、または混合リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。発明のポリヌクレオチドは、ゲノムの調製、ｃＤＮＡ調製、インビトロ合成、ＲＴ−ＰＣＲおよびインビトロインビボの転写を含めて、任意の手段によって生成されてもよい。
【００５８】
「分離された」核酸分子は、核酸（すなわち、他のポリペプチドをコード化する配列）の自然源に存在する他の核酸分子から実質的に分けられるものである。「分離された」核酸は、その自然に生じるレプリコン中で、当然核酸（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）に隣接する配列のうちのいくつかがないことが好ましい。例えば、クローン化核酸は分離されると考えられる。核酸も、それが人間の介入によって変更されているか、その自然なサイトでない遺伝子座か位置に配置したとき、またはそれがトランスフェクションによって細胞へ導入されるとき、分離されると考えられる。さらに、「分離された」核酸分子は、自然に関係している他の細胞物質のいくつかから、あるは組み換え技術によって生産される時は培地から、あるいは化学合成される時は化学的前駆体または他の化学物質から、遊離することができる。
【００５９】
特に以下のものは「分離された核酸」から除外される：自然に生じる染色体（染色体拡散など）、人工染色体ライブラリ、ゲノムライブラリ、およびインビトロでの核酸調製またはトランスフェクト／形質転換の宿主細胞の調製に存在するｃＤＮＡライブラリ、ここで宿主細胞はインビトロでの異形調製あるいは単一コロニーの異形集団として培養される。また、指定された核酸が、核酸の数の５％未満をベクター分子中へ挿入させる上記ライブラリーは、特に除外される。全体の細胞であるゲノムＤＮＡまたは全体の細胞ＲＮＡの調製は、さらに特に除外される（機械的に剪断されるまたは酵素的に消化される全体の細胞の調製を含む）。さらに特に除外されるのは、インビトロで調製されるあるいは電気泳動によって分離される異形混合、としての全細胞調製であり、ここで本発明の核酸は電気泳動培地の異形核酸からさらに分離されない（例えば、アガロースゲルあるいはナイロンブロット中の異形バンド個体群から単一バンドを摘出することによってさらに分離される）
１つの好ましい実施形態では、貴金属ナノクラスタを結合するペプチドをコード化する、分離された核酸は、細胞へ導入され、前記ペプチドは生じ、前記貴金属ナノクラスタを結合する。ある実施形態では、前記貴金属ナノクラスタを結合するペプチドをコード化する、分離された核酸は、さらにキメラのポリヌクレオチドまたは融合ポリヌクレオチドになり得る。本明細書で使用されるように、「キメラのポリヌクレオチド」または「融合ポリヌクレオチド」は、第２の核酸配列に操作しやすくリンクされた前記貴金属ナノクラスタを結合するペプチドをコード化する核酸を含む。好ましくは前記第２の核酸配列は結合せず、前記貴金属ナノクラスタを強く結合せず、両方の異なるポリヌクレオチド配列を有し、前記貴金属ナノクラスタを結合するペプチドをコード化する核酸とは異なる機能を有するタンパク質をコード化する。融合ポリヌクレオチド内では、用語「操作しやすくリンクされた」は、両方の配列が、使用される配列に起因する、提案された機能を実現するように、前記貴金属ナノクラスタおよび前記第２の核酸配列をそれぞれ結合するペプチドをコード化する核酸が、それぞれ互いに融合されることを示すように意図される。第２の核酸配列は、前記貴金属ナノクラスタを結合するペプチドをコード化する核酸のＮ−末端またはＣ−末端に融合されることができる。
【００６０】
細胞へ核酸を導入するための手順は、当業者によく知られており、トランスフェクション、形質転換または形質導入、電気穿孔法、粒子衝撃、アグロインフェクション等を含むがこれらに限定されない。ある実施形態では、前記核酸は、その後、細胞へ導入されるベクターまたは発現カセットに組み入れられる。宿主細胞への核酸の導入に適切な他の方法は、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９および他のＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．４４，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄ：Ｇａｒｔｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｄａｖｅｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｌｅｒｓｅｙ等の研究所手順（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌｓ）である。
【００６１】
本明細書で使用されるように、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された少なくとも４つのアミノ酸の鎖を指す。前記鎖は、線形、分岐、環状またはそれらの組み合わせであってもよい。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ここで交換可能に使用される。用語は、生成物質の特定の長さを指さない。したがって、「ペプチド」「オリゴペプチド」、「タンパク質」は、ポリペプチドの定義内に含まれる。前記用語は、例えばグリコシル化、アセチル化およびリン酸化反応等の、ポリペプチドの翻訳後修飾を含む。さらに、タンパク質断片、類似体、変異または変種タンパク質、融合タンパク質等は、ポリペプチドの意義の範囲内に含まれる。
【００６２】
本発明は、さらにキメラのポリペプチドまたは融合ポリペプチドを提供する。本明細書で使用されるように、「キメラのポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は第２のポリペプチドに効果的にリンクされた貴金属ナノクラスタを結合するポリペプチドを含む。前記第２のポリペプチドは、貴金属ナノクラスタ最適化結合ポリペプチド、例えば、本明細書に記載されたように貴金属ナノクラスタを安定して結合しないポリペプチドと実質的に同一でないアミノ酸配列を有することが好ましい。融合ポリペプチドに関して、本明細書で使用されるように、用語「効果的にリンクされた」は、両方の配列が、使用される配列に起因する提案された機能を果たすように、２つのポリペプチドが互いに融合されることを示すように意図される。前記第２のポリペプチドは、貴金属ナノクラスタを結合するポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合されることができる。そのような融合ポリペプチドは、単一の分子またはバルク研究を促進し、インビボまたはインビトロでペプチドの直接ラベルを付けることを可能とする。
【００６３】
本発明のある実施形態では、前記貴金属ナノクラスタを結合するペプチドは、長さが５〜１０００のアミノ酸、１〜８００のアミノ酸または５〜５００のアミノ酸である。ある実施形態では、前記ペプチドは、長さが約５〜１０アミノ酸である。他の実施形態では、前記ペプチドは、長さが約１０〜２０、または２０〜４０のアミノ酸である。一実施形態では、前記ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に定義されるようなポリペプチド配列を含む。
【００６４】
本発明は、さらに本明細書に記載されるような特性を有する被包される貴金属ナノクラスタ調製のための方法を包含する。一実施形態では、デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタを調製する方法は、ａ）デンドリマー、貴金属を含む水溶液および水性溶媒を混合して、混合液を作製するステップと、ｂ）還元剤を添加するステップと、ｃ）次いで、十分な量の酸性化合物を添加して、前記混合液を中性範囲のｐＨに調節するステップと、ｄ）ｐＨが調整された前記混合溶液を混合して、デンドリマーに被包される貴金属ナノクラスタを形成することを可能とするステップとを含む。別の実施形態では、蛍光を発することが可能なペプチドに被包される貴金属ナノクラスタを調製する方法は、ａ）ペプチド、貴金属を含む水溶液および蒸留水を混合して、混合液を作製するステップと、ｂ）還元剤を添加するステップと、ｃ）次いで、十分な量の酸性化合物を添加し、中性範囲のｐＨに前記混合液を調節するステップと、ｄ）ｐＨが調整された前記混合溶液を混合して、ペプチドに被包される貴金属ナノクラスタを形成することか可能であるステップとを含む。
【００６５】
これらの方法では、貴金属ナノクラスタを光活性化するために、還元剤を混合溶液に添加する。前記還元剤は、化学還元剤、光またはそれらの組み合わせを含む群から選択されることが好ましい。これらの方法のある実施形態では、前記貴金属ナノクラスタを光活性化するために還元剤として光を使用することができる。これらの方法のある他の実施形態では、化学還元剤を還元剤として使用することができる。一実施形態では、前記貴金属ナノクラスタを光活性化するために、光を還元剤と組み合わせて使用する。前記被包される貴金属ナノクラスタを調製するプロセスは、約６５°Ｆ〜約１００°Ｆの間の温度で行うことが好ましい。前記混合溶液の温度は、ステップａ）からｃ）で約６８°Ｆ〜約８０°Ｆの間であることがより好ましく、約６８°Ｆ〜約７４°Ｆの間であることがさらに好ましい。
【００６６】
前記化合物の調製で使用される貴金属を含む前記水溶液は、ＡｇＮＯ３、ＨＡｕＣｌ４・ｎＨ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・ｎＨ２Ｏからなる群から選択されることが好ましい。一実施形態では、前記貴金属を含む水溶液はＡｇＮＯ３である。別の実施形態では、前記貴金属を含む水溶液は、ＨＡｕＣｌ４・ｎＨ２Ｏである。さらなる実施形態では、前記貴金属を含む水溶液は、ＣｕＳＯ４・ｎＨ２Ｏである。
【００６７】
一実施形態では、貴金属を含む前記水溶液は、ＨＡｕＣｌ４・ｎＨ２Ｏであり、還元剤が前記混合溶液に添加され、ｐＨが調整された混合溶液は、デンドリマーに被包される金ナノクラスタの形成を可能とするために、少なくとも１時間混合される。別の実施形態で、ｐＨ調整された前記混合溶液は、デンドリマーに被包される金ナノクラスタの形成を可能とするために、約４８時間混合される。別の実施形態では、デンドリマーに被包される金、銀、銅ナノクラスタの形成を可能とするために、被包される貴金属ナノクラスタは、可視光線または紫外線を有する放射による光還元によって作製される。
【００６８】
別の実施形態で、前記被包材料がペプチドであるとき、ステップａ）での貴金属対ペプチドモル比は約０．１：１が好ましい。別の実施形態では、ステップａ）での貴金属対ペプチドモル比は、約０．１：１未満であり、他の実施形態では、それは０．１：１以上、また１：１以上とすることもできる。
【００６９】
ある実施形態では、前記被包される貴金属ナノクラスタの蛍光ラベルは、生物学的サンプル中に存在する。ある好ましい実施形態では、前記貴金属ナノクラスタを被包するペプチドは、細胞内で発現され、「遺伝的にプログラムされた」とも呼ばれる。本明細書で使用されるように、用語「発現」は、転写および／またはペプチドの翻訳を包含する。他の実施形態では、前記貴金属ナノクラスタを被包されるペプチドは、生体サンプルへ導入される。本明細書で使用されるように、「生物学的サンプル」は、例えば、血漿、血清、脊髄分泌液、精液、リンパ液、皮膚の外部の部分、呼吸器、腸および尿生殖器、涙、唾液、ミルク、血球、腫瘍、器官およびインビトロの細胞培養成分を含むがこれらに限定されるものではなく、単離された細胞、組織または体液のサンプルを指す（細胞培養培養液で、細胞の成長に起因する条件培地、推定上のウイルス性感染細胞、組み換え細胞および細胞成分を含むがこれらに限定されるものではない。）。前記蛍光ラベルは、任意のタイプの有機体の細胞で使用することができ、前記有機体は、原核生物または真核生物である。本発明の好ましい実施形態では、前記有機体は真核生物である。本発明の限定されない真核細胞の例は、動物、植物、菌類、原生生物および他の微生物からの細胞を含む。ある実施形態では、前記細胞は、多細胞生物の部分、例えば、植物または動物である。
【００７０】
本明細書に述べるように、デンドリマーのサイズまたはペプチドの配列と同様に、被包されるナノクラスタの組成物の選択は、半導体ナノ結晶の特有のスペクトル放射波長に影響する。したがって、当業者が認識するように、本明細書に記載されるようなナノドットの特別の組成物は、モニターされているスペクトル領域に基づいて選択される。例えば、可視範囲、または赤、青または近赤外範囲のエネルギーを放射するナノドットは、設計することができる。一実施形態では、前記被包される貴金属ナノクラスタは、減少するナノクラスタサイズを備えたより高いエネルギー放射を表示する。
【００７１】
本発明の水溶性被包される貴金属ナノクラスタは、他のそれほど信頼性のないラベル化法が一般的に使用されている様々な分析での使用を見出した。上記分析法は、蛍光顕微鏡検査法、組織学、細胞学、病理学、フローサイトメトリー、ＦＩＳＨおよび他の核酸ハイブリダイゼーション分析、信号増幅分析、ＤＮＡおよびタンパク質配列決定、結合タンパク質競合測定法とＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ、免疫組織化学法、タンパク質および核酸分離、均一系アッセイ、多重化、ハイスループットスクリーニング、染色体分析等を含み、これらに限定されない。上記被包される貴金属のナノクラスタの蛍光ラベルは、受理可能な環境で、任意のリポーター分子ベースの分析で使用することができる。
【００７２】
ある好ましい実施形態では、本発明の被包される貴金属のナノクラスタの蛍光ラベルは、単一またはバルク分子の研究で使用される。本発明は、重要な分子を観察する方法であって、ａ）重要な分子に、被包される貴金属ナノクラスタを含む水溶性蛍光ラベルであって、発光スペクトルを放射する蛍光ラベルを取り付けるステップと、ｂ）前記蛍光ラベルの発光スペクトルを検知するステップとを含む方法を包含する。本明細書で使用されるように、発光スペクトルの検知は、蛍光ラベルの光学放射特性の決定を包含する。単一分子の研究は、信号の強度、配向および寿命から分子の発光スペクトル、および近隣の分子でのエネルギー伝達の程度まで、局所性の環境の様相を決定することができる。単一分子の研究は、個々の分子を操作し、かつ分子モーターまたは共有結合によって生成された力を測定するために使用された。新しい調査技術の開発は、分子の相互作用についてのリアルタイム観察および生細胞内での輸送を可能とする。これらのツールは、個体群の個々の部分を、検査、識別したり、細胞の亜個体群や基礎構造と定量的に比較することができる。。単一の分子研究は、空間的な情報、および他のものを使用して得ることが不可能な、より静的な技術である一時的な情報を提供するべき可能性を有する。単一の分子研究は、細胞内のスペースで、単一分子のインビボの動態的変動上で測定がなされる、または長期間にわたる単一分子の挙動を観察することを可能にする。単一分子方法を使用して、個体群を平均せずに、細胞集合で個々の部分の時間軌道および反応経路を研究することが可能になる。エキソサイトーシス、チャンネルを通した流出、または転写複合体の集合のような細胞過程を視覚化することができる。対立遺伝子の多様性によって生成された構造または機能の個々の差は、単一分子のレベルで検知できる。さらに、特定の組織中またはある発達段階の、遺伝子または遺伝子のグループの統合発現のモニターについて、これらの技術を使用して行なうことができる。そのため、被包される貴金属ナノクラスタ蛍光プローブを使用することにより、生物学的状態に関する情報を提供するスペクトル放射の決定が可能となる。本明細書で使用されるように、用語「生物学的状態」は、生物学的部分の量的、質的存在；生物学的部分の構造、組成および形態；環境下での、生物学的部分の局在性；生物学的部分、生物学的化合物の構造における変性、および細胞過程の変性との間の相互作用、などの条件を決定することを指す。
【００７３】
本発明の方法および組成物は、被包される貴金属ナノクラスタを含む蛍光ラベルを重要な分子へ取り付けることができる、リンカー分子の使用をさらに含んでもよい。
【００７４】
クローニング用の標準技術、ＤＮＡリガーゼに関する酵素反応用のＤＮＡ隔離、増幅および精製、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等、および様々な分離技術は、本技術分野の当業者に知られており一般に使用されるものである。多くの標準技術は、以下のものに記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｕ（ｅｄ．）１９９３  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８，Ｐａｒｔ  Ｉ；Ｗｕ（ｅｄ．）１９７９  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８；Ｗｕら、（Ｅｄｓ．）１９８３  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００  ａｎｄ  １０１；Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ＆  Ｍｏｌｄａｖｅ（Ｅｄｓ．）１９８０  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ（ｅｄ．）１９７２  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，１９８１  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；Ｓｃｈｌｅｉｆ  ＆  Ｗｅｎｓｉｎｋ，１９８２  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇ１ｏｖｅｒ（ｅｄ．）１９８５  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ．）１９８５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；ａｎｄ  Ｓｅｔｌｏｗ＆Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ  １９７９  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。使用される略語および命名法は、本分野での標準と考えられ、本明細書に引用された専門雑誌で一般に使用される。
【００７５】
この出願の全体にわたって、様々な出版物が参照される。これらの発行物と、これらの発行物全体における引用のすべての開示は、本発明が関係する最先端技術についてより完全に記載するするために、この出願に参照として本明細書に含めることとする。次の実施形態は、本発明への請求項の範囲を制限することを意図しておらず、ある実施形態の例となるように意図される。当業者によって考えられる例示された方法におけるいかなる変形も、本発明の範囲内にあるように意図される。
【００７６】
実施例
実施例１
デンドリマーに被包された銀ナノクラスタの生成
方法
ＰＡＭＡＭは、溶液（Ｃｒｏｏｋｓら、Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００１，３４：１８１；Ｏｔｔａｖｉａｎｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００２，３５：５１０５；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：１２５２；Ｖａｒｎａｖｓｋｉら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００１，１１４：１９６２）の金属イオンを隔離することが知られている。したがって、ＰＡＭＡＭ  Ｇ４−ＯＨおよびＧ２−ＯＨデンドリマー（それぞれ第４および第２世代ＯＨを末端に有するポリ（アミドアミン）、アルドリッチ）は、爆気および脱気水溶液の両方にＡｇナノクラスタを濃縮し、安定させて可溶性にするために利用された。蒸留水（１８ＭΩ）１ｍＬへ、０．５μｍｏｌのＧ４−ＯＨおよび１．５μｍｏｌＡｇＮＯ３を溶かし、１６０μｍｏｌの酢酸で前記溶液を中性に調整することにより、銀イオンは容易にデンドリマーと相互に作用する。小さなナノ粒子（直径＞３ｎｍ）を作製するために通常使用されるように、文献では、一般に、ＮａＢＨ４（Ｃｒｏｏｋｓら、Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００１，３４：１８１；Ｏｔｔａｖｉａｎｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００２，３５：５１０５；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：１２５２；Ｖａｒｎａｖｓｋｉら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００１，１１４：１９６２）などの少量の還元剤を加える。ナノ粒子ではなく、デンドリマーに被包されるナノクラスタ（「ナノドット」）を作製するために、還元剤を反応に加えなかった。これら溶液の蛍光の調査は、周囲の空気、窒素および／または排気された（１０−５トル）環境中の清潔なカバーグラス上に溶液１０ｍｌを置き、その後、帯域通過フィルター処理された水銀灯で標準ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡を介して青色光（４５０〜４８０ｎｍ）照射することにより行われた。結果は、酸化またはデンドリマー生成の程度に影響されなかった。
【００７７】
結果
最初に、可視吸収または蛍光は、これら溶液から観察されなかったが、光活性化は、白色光への露出の前および後に、溶液吸収スペクトル（図１Ａ）によって明瞭に実証された。最初に、デンドリマーだけが、２８４ｎｍで単一の吸収を備えたスペクトルに寄与した。光活性化の後、前記溶液は、小さな光還元された銀ナノドット（Ａｇ２−Ａｇ８）（Ｒａｂｉｎら、Ｇ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９９，３１２：３９４；Ｂｏｎａｃｉｃ’−Ｋｏｕｔｅｃｋｙら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００１，１１５：１０４５０）の吸収により３４５ｎｍおよび４３０ｎｍに２つの新しいピークを示した。光活性化中に同時に作製された小さな銀ナノドットのサイズと幾何学の差は、可視領域の至る所で多色の蛍光を生じた。このサイズの銀のナノクラスタは、強い可視吸収および放射（Ｒａｂｉｎら、Ｇ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９９，３１２：３９４；Ｂｏｎａｃｉｃ’−Ｋｏｕｔｅｃｋｙら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００１，１１５：１０４５０；Ｌｉｎｎｅｒｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９０，１１２：４６５７；Ｍｏｓｔａｆａｖｉら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９０，１６７：１９３）を有すると知られていたただ一つのクラスタである。小さなサイズは、光活性化された蛍光性ナノドット溶液（図１Ｂ）の質量分析によって確認された。水素化ホウ素還元溶液は、３９８ｎｍで強い表面プラズモン吸収の特性を持つ、より大きな銀ナノ粒子（３〜７ｎｍ）を生じたが、本質的に蛍光はない（図１Ａ）。したがって、蛍光銀ナノドットだけがプラズモン吸収なしで現われたので、それらは、確実に３ｎｍよりはるかに小さく、恐らく２ｎｍ未満である。
【００７８】
吸収の変化と関連して、銀イオンがデンドリマーホストの内部で光還元されるとともに、蛍光は照射時間の増加につれて成長した。６秒内で、視界は、続くわずかな光活性化（図２Ａ〜Ｄ）と共に、個々の明滅する蛍光性種で満たされた。これらの非常に明るく安定した蛍光性の特徴は、すべて高度に偏極され、明確な双極子放射パターン（図２Ｅ、Ｂａｒｔｋｏ  ＆  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３：１１２３７）および個々のエミッターの明滅する動態（Ｌｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８２：１８７７；Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３８８：３５５；Ｈｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１：６９３６）特性を示した。この銀の制限された環境での光活性化の完成後、蛍光銀デンドリマーナノドットは、平均放射強度およびスペクトル特性の両方において、非常に安定していた。前記デンドリマーは、そのためにナノクラスタを安定させて、ＡｇＯフィルム（Ｐｅｙｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９１：１０３；Ｐｅｙｓｅｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：７７２５）上のものに比べて、それらの光学的性質を向上させた。小さなＡｇナノクラスタの結合エネルギーは励起エネルギー未満であるので、デンドリマーのかご効果は、光解離を防ぐことによりナノクラスタ蛍光を安定させ向上させるために、希ガスマトリックス（Ｒａｂｉｎら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９９，３１２：３９４）と同様に作用する。水がＡｇＯフィルム（Ｍｉｈａｌｃｅａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３：７１７２）上のＡｇナノクラスタ蛍光を消すと知られている一方、デンドリマーに被包される銀ナノドットは、水溶液において高度に蛍光性で、完全に安定していた。したがって、光化学的に生成されたＡｇナノクラスタも、デンドリマーの内部で保護され、それによって、溶液中の消光剤との相互作用を防いだ。
【００７９】
光活性化されたナノドット溶液のイオンスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、光活性化されていない、つまり非蛍光性のナノドット溶液で、ｎ＝２〜４のデンドリマー＋Ａｇｎの強い濃縮を示した（図１Ｂ）。光活性化されていないナノドット溶液では、一旦溶液が光活性化されると（Ｚｈｅｎｇ  ＆  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４：１３９８２−１３９８３）、２から高々８つの原子までのサイズでデンドリマーに被包されるＡｇナノクラスタからの放射を明瞭に示し、デンドリマー＋Ａｇ２およびより大きなナノクラスタピークは観察不可能であった。
【００８０】
ＡｇＯフィルム（Ｐｅｙｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９１：１０３；Ｐｅｙｓｅｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：７７２５）上のナノクラスタの研究に反して、単一のナノクラスタ分光法は、これらの可溶性デンドリマーに被包される銀ナノドット上で容易に行なわれた。ＡｇＯの上のＡｇｎ、および水溶性ナノドット溶液（図３）のバルクスペクトルが区別不能であった一方、個々のＡｇナノドットは、ＡｇＯフィルム（図３）上のバルクナノドットサンプルまたは個々のナノクラスタのいずれかより、はるかに狭く、より安定した発光スペクトルを有していた。ＡｇＯフィルム上のナノクラスタサイズが励起で絶えず修正されたので、個々のナノクラスタは大きなスペクトルシフト（Ｐｅｙｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２９１：１０３；Ｐｅｙｓｅｒら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：７７２５）を示すことが観察された。対照的に、５つの安定し、容易に識別された蛍光スペクトルは、これらの高度に分散されたデンドリマーに被包された銀ナノドットから得られ（図３）、バルクスペクトルがわずか５ナノクラスタサイズによって占められたことを示す。バルクナノドットフィルムまたは溶液のものよりかなり狭い、室温単一ナノドット蛍光スペクトルは、明白なスペクトル拡散を示さなかった。ナノドットに追加の銀を組み入れることができず、デンドリマーがナノドット蛍光を安定させたので、蛍光の断続は容易に観察されたが、単一ナノドット放射は、５３３ｎｍ、５５３ｎｍ、５８９ｎｍ、６１１ｎｍおよび６４８ｎｍの最大値で完全に安定していて強かった。ＩＩ−ＶＩナノ粒子との比較では、これらのナノドットは、３００Ｗ／ｃｍ２で、＞３０分間の５１４．５ｎｍまたは４７６ｎｍの連続的励起の間、個々の特徴の〜８０％が蛍光性のままであるという、光安定性を示した。前記ナノドット光活性化、明滅、双極子放射パターン、スペクトル安定性、質量分析および蛍光は、小さなサイズのナノドットに関してのみ観察され、８原子未満のサイズの個々のデンドリマーに被包されたＡｇｎナノクラスタが、観察された放射を生じさせたことがさらに確認された。蛍光は、デンドリマーなしで同様に調製された溶液、または銀なしで調製された溶液では観察されなかった。可溶性および安定化に重大な、前記デンドリマーは、ナノクラスタを収納し、保護して、強い放射引き起こし、一層の光還元／ナノクラスタの成長を防ぐ、銀の制限された環境を提供する。
【００８１】
これらの方法によって、非常に光安定性で水溶性銀ナノドットは、周囲条件での直接の光還元によって、デンドリマーにうまく作製された。そのような銀ナノドットは、水溶液およびフィルムにおいて完全に安定していて、高度に蛍光性であり、弱い水銀灯励起（３０Ｗ／ｃｍ２）で、単一分子レベルで容易に観察される。デンドリマー結合（例えば、チオール反応種は、タンパク質に結合するためにチオール反応マレインイミドを残して、二官能性架橋剤、Ｎ−（ｐ−マレインイミドフェニル）のイソシアン酸塩の末端へデンドリマー水酸基を結合することにより作ることができる）の合成制御によって、そのような単純なナノ材料の生物学的ラベルとしての使用を見出し、それによって、単一分子の研究が、高価なレーザー源なしで非常に広く行えるようになる。極度に光活性化された放射および光退色までの大変長い寿命は、化学生物系の研究のためにこれらの魅力的な新しいナノ材料を提供する。
【００８２】
実施例２
個々のＡｇナノドットの特性
１．５ｎｍ（５１７ｇ／ｍｏｌ）から４．５ｎｍ（１４２１５ｇ／ｍｏｌ）に及ぶ直径（ＭＷ）を有するある範囲のＰＡＭＡＭデンドリマー世代（Ｇ０−ＯＨ〜Ｇ４−ＯＨ）が、高度な蛍光Ａｇｎナノドットをもたらすために使用された。非常に明るい蛍光が、８．０〜３．０のｐＨの範囲にわたって観察された。ＰＡＭＡＭのこれらの異なる世代は、ナノクラスタ分布にわたる制御の手段を可能にした。より低いデンドリマー世代で作製されたナノドットは、より高いデンドリマー世代で作製されたナノドットとは異なる発光スペクトルを示した。スペクトルと強度において非常に安定したナノドット放射だけではなく、それらは、非常に明瞭で安定した双極子放射パターン（図２Ｅ）を有する高度な偏極放射を示した。Ｂａｒｔｋｏ＆Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３：３０５３−３０５６；Ｂａｒｔｋｏ＆Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３：１１２３７−１１２４１；及びＢａｒｔｋｏら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００２，３５８：４５９−４６５に記述されるように、放射パターンの観察は、溶液で、または固定化特性での方向動態を理解するために開発された三次元の配向方法の利用を可能にした。
【００８３】
これら個々のＡｇナノドットについて、多くの光物理学的パラメーターも特徴づけられた（図４Ａ）。量子ドットよりはるかに小さい一方、低励起強度（４６０ｎｍで３０Ｗ／ｃｍ２、４５０ｎｍの励起最大に接近している）での非常に明るいナノドット蛍光は、非常に短い蛍光寿命に起因する。機器応答の解析後に、個々のナノドットの寿命は、２倍のＴｉ：サファイアレーザーからの４００ｎｍの励起で、時間相関単一光子計数法の測定で、第１サブ１００ｐｓの成分（９２％）を示した。前記ナノドットは、さらにより遅い（１．６ｎｓ）減衰成分を有する。非常に速い緩和は、基底と励起状態との間に非常に強い関係を示し、それによって、非常に小さな（いくつかの原子）ナノクラスタからの非常に強い遷移モーメントを生じる。
【００８４】
個々のナノドットの吸収断面積は、飽和強度測定を通して測定された（図４Ｂ）。これらは、よく知られた飽和強度、寿命および蛍光量子収量を有する、よく特徴づけられた単一ＤｉＩＣ１８分子（Ｍａｃｋｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，２７２：２５５−２５８）と比較された。これらの実験は、Ａｇナノドットが、最良の有機色素より２０倍強く、最良のＣｄＳｅ量子ドットとほぼ同一である吸収断面積を有することを示す。さらに、単一のＤｉＩ分子および単一のナノドットに吸収された光子の総数の比較を通して、ナノドット蛍光量子収量のより低い推定値は、少なくとも〜３０％であると計算された。さらに、これらのＡｇナノドットは、３０Ｗ／ｃｍ２で連続的な５１４．５ｎｍ、＞＞３０分間の励起において、＞９０％の個々の特徴が蛍光性をのこしている、はるかに大きなＩＩ−ＶＩ量子ドットに匹敵する光安定性を示した。一般的には、連続的な光励起の１時間を越える時間、飽和に近い＞１０６光子／秒の放射をするが、典型的な個々のナノドットは、光退色前に１０９を超えて放射する。これは、放射する光子の合計が、最良の既存の染料の放射より２桁大きい。従って、これらのナノドットは、広範囲の生物系内での短時間、および長時間の単一分子動態の両方を探査する機会を提供する。
【００８５】
したがって、デンドリマーに被包される水溶性銀のナノクラスタ（Ａｇナノドット）は、周囲の条件で直接の光還元によって作製された。そのような銀ナノドットは、溶液およびフィルムの両方において完全に安定しており、４５０ｎｍの吸収極大に非常に接近して励起されたとき、弱い水銀灯励起（３０Ｗ／ｃｍ２）で、単一分子レベルで容易に観察された。デンドリマー結合の合成制御で、そのような単一のナノ材料は、生物学的ラベルとして非常に有用であり、それによって、単一の分子研究を高価なレーザーなしで、非常に広く行えるようになる。極度の光活性化された放射および光退色までの大変長い寿命は、生物系の研究のためにこれらの魅力的な新しいナノ材料を提供する。
【００８６】
実施例３
デンドロンに被包される金のナノクラスタの生成
従来の研究は、近赤外（Ｌｉｎｋら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：３４１０−３４１５）、赤（Ｈｕａｎｇ  ＆  Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００１，１０５：１２４９８−１２５０２）および青（Ｗｉｌｃｏｘｏｎら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９８，１０８：９１３７−９１４３）の放射で、ナノクラスタサイズの減少に対して増加する高いエネルギー放射で、２８原子からより小さな粒子（＜１．２ｎｍ）のサイズの蛍光性の表面が不動態化された金ナノクラスタを生じた。１００万倍に向上された、バルク金フィルム（Ｍｏｏｒａｄｉａｎ，Ａ．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．１９６９，２２：１８５−１８７）に匹敵する蛍光定量φＦを有するＡｕナノクラスタが作製されたが、１０−３〜１０−４の量子収量および多分散系のナノ粒子サイズ分布は、それらが良好な発蛍光団であることを妨害した（Ｌｉｎｋら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：３４１０−３４１５；Ｈｕａｎｇ  ＆  Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００１，１０５：１２４９８−１２５０２）。本発明は、水溶性で、単分散で、青色放射するＡｕ８ナノドットを開示する。前記Ａｕ８ナノドットは、生体適合ＰＡＭＡＭデンドリマー（Ｔｏｍａｌｉａ，Ｓｃｉ．Ａｍ．１９９５，２７２：６２−６６）によって被包され、安定させられた時、４１±５％の蛍光量子収量を示し、他の報告された金のナノクラスタの１００倍以上改良された（Ｌｉｎｋら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：３４１０−３４１５；Ｈｕａｎｇ  ＆  Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００１，１０５：１２４９８−１２５０２）。より大きいＡｕｎナノドットも、全可視領域にわたり強い発光で生産された。
【００８７】
第２および第４世代ＯＨを末端に有するＰＡＭＡＭ（それぞれＧ２−ＯＨ、Ｇ４−ＯＨ、アルドリッチ）は、水とメタノール溶液での金ナノクラスタを安定させて可溶性にするために利用された。蒸留水（１８ＭΩ）２ｍＬへ、０．５μｍｏｌのＧ４−ＯＨまたはＧ２−ＯＨ、および１．５μｍｏｌＨＡｕＣｌ４・ｎＨ２Ｏを溶かすことによって、金イオンはデンドリマーへ捕捉され、溶液中へ当量のＮａＢＨ４をゆっくり添加することにより還元された。還元された金原子は、小さなナノドット（デンドリマーに被包されるナノクラスタ）および大きなナノ粒子を形成するために、デンドリマー内に凝集された。反応と凝集過程が終わるまで、前記溶液は２日間攪拌された。続いて大きな金ナノ粒子（Ｃｒｏｏｋｓら、Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００１，３４：１８１−１９０；Ｅｓｕｍｉら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９８，１４：３１５７−３１５９）を取り除くために、遠心分離（１３０００ｇ）によって、精製された。無色透明の金ナノドット溶液が残った。２８５ｎｍの純粋なデンドリマーピーク（図５Ａ参照）と比較して弱いが、デンドリマーに被包される金ナノクラスタの明瞭な吸収スペクトルは、純粋なデンドリマー吸収を引くことにより得られた。それは、６０ｎｍのバンド幅（ＦＷＨＭ）で３８４ｎｍの新しい吸収帯が、最終の蛍光性Ａｕナノドット溶液に現われた図５Ｂから見ることができる。大きな金ナノ粒子の吸収スペクトルに反して、５２０ｎｍの表面プラズモン吸収はこの溶液から観察されなかった。これは、ナノドットが２ｎｍより小さいことを示す（Ｃｒｏｏｋｓら、Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００１，３４：１８１−１９０；Ｅｓｕｍｉら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９８，１４：３１５７−３１５９）。
【００８８】
３８４ｎｍおよび４５０ｎｍの励起と放射の最大値をそれぞれ備えた強い青い発光が、デンドリマーに被包される金ナノドット溶液からはっきりと観察された（図６）。蛍光励起最大および帯域幅は、図５Ｂのナノドット吸収帯と同一であった。Ｇ２−ＯＨおよびＧ４−ＯＨデンドリマーは、判別不能な蛍光性溶液を生じたが、同じ合成条件の下で、Ｇ０デンドリマーは、黒色金固体を有する非蛍光性溶液だけを生じた。これらの異種混合溶液は、より高い第２および第４世代ＰＡＭＡＭと異なり、低い第０世代デンドリマーは、十分に金ナノクラスターを保護せず安定させないことを示唆する。驚くべきことに、３８４ｎｍ励起について、Ｇ４−ＯＨおよびＧ２−ＯＨに被包された金ナノドットのための合成された蛍光量子収量は、参照として同様に放射する硫酸キニーネを使用したところ、４１％±５％であった。前記量子収量は、メタノール中でさらに５２％＋５％に増加した。放射の時間依存は、２つの寿命成分（図７Ａ）があることを示し、それらは、金ナノドット放射（Ｌｉｎｋら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：３４１０−３４１５）の特性である。短い寿命成分は、７．５ｎｓであり、放射において支配的であり（９３％）、金ナノドットの低い位置ｄ軌道と励起したｓｐバンドとの間の一重項遷移から発生した。長い寿命成分（２．８μｓ、７％）は、三重項−一重項バンド内遷移（Ｌｉｎｋら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：３４１０−３４１５；Ｈｕａｎｇ  ＆  Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００１，１０５：１２４９８−１２５０２）によってもよい。
【００８９】
明確なデンドリマー構造は、イオンスプレー（ＥＳＩ）質量分析で、被包されるナノクラスタサイズの分析を可能にした。図７Ｂに示されるように、Ａｕ８は、蛍光性溶液での主要なＡｕを含む成分であり、その多くは、試料調製と無関係に蛍光強度と直接関連する。還元条件、Ａｕ濃度およびデンドリマー世代によって、異なるＡｕを含むピークが、質量スペクトルに現われる。いかなる場合も（＞２０の異なる調製されたサンプル）、青の蛍光強度は、単に、質量スペクトルで観察された、Ａｕ８を含む種の多量と関係があった。８価電子（各Ａｕ原子からの一つ；Ｌｉｎら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，３０：９１−９５）を有する安定したナノクラスタと一致して、この支配的なナノクラスタは、すべての中性酸化状態で、高還元ＢＨ４−の１００倍を超え、ナノドットの蛍光性を変えないことが確認された。Ｈ２Ｏの代わりに、Ｄ２Ｏに溶解されて、デンドリマー親ピークに関連のある予期された変更を通じて確認され、水の５つの分子も、親水性ＰＡＭＡＭデンドリマー−Ａｕ複合体に関係していることが分かった。５つの水は、好ましい数であるようにみえるが、Ａｕ８に対応するより小さなピークも、１〜６に及ぶ水分子の他の数で、他の同様に調製されたサンプルの質量スペクトルで観察された。Ａｕ８を含むピークは、蛍光性Ａｕナノドット溶液で観察されただけであり、異なって調製した溶液の蛍光強度は、直接Ａｕ８ナノドットピークのみの相対存在量に比例した。さらに、ＨＡｕＣｌ４とＡｕＢｒ３を使用するＡｕナノドットの調製により、同一の質量スペクトルを備えた判別不能な蛍光性溶液を生じた。これは、高い効率的な青色の放射が、Ａｕ８ナノドットに起因することを示した。異なる色放射が、相対的なＡｕ：デンドリマー濃度の調節により生成されて、より大きなＡｕナノドットを生成する。
【００９０】
上述されるように、金のナノドットからの発光は、充満したｄバンドおよびｓｐ伝導バンド（Ｌｉｎｋら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００２，１０６：３４１０−３４１５；Ｈｕａｎｇ  ＆  Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００１，１０５：１２４９８−１２５０２；Ｍｏｈａｍｅｄら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２０００，３１７：５１７−５２３）の間の遷移から発生すると考えられる。ナノクラスタ・サイズが減少するとともに、各バンドにおける個別の状態間の間隔は増加し、より大きなナノドットからのものに関する蛍光の青色シフトを導く。異なって調製された、より大きなナノクラスタの１００倍の蛍光量子収量の向上が、恐らく２つの要因に起因する。非常に小さなＡｕ８ナノクラスタ中に存在するより低い状態密度は、内部発光しない応力緩和経路を最小限にする。さらに、より大きなデンドリマーケージは、よりよく溶液での消光剤からこれらのナノクラスタ／ナノドットを保護する。この後者の解釈は、蛍光性Ａｕナノドットを安定させることができない第０世代デンドリマーによって示唆される。さらに、精製された溶液では、ナノドット蛍光（Ｄｕｌｋｅｉｔｈら、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．２００２，８９，ａｒｔ．ｎｏ．−２０３００２；Ｈｕａｎｇ  ＆  Ｍｕｒｒａｙ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００２，１８：７０７７−７０８１）を消す大きな金ナノ粒子はない。
【００９１】
結論として、単分散のＡｕ８ナノドットは、デンドリマーＰＡＭＡＭ水溶液中で合成され安定された。Ａｕ８ナノドットは、強いサイズの特定放射を示し、その量子収量は、水溶液中で４１％と測定された。量子収量の１００倍以上の増強により、新規な発蛍光団としての金ナノドットの実用化が可能になる。
【００９２】
実施例４
デンドライトに被包される銅ナノクラスタの生成
第２および第４世代ＯＨを末端に有するＰＡＭＡＭ（それぞれＧ２−ＯＨ、Ｇ４−ＯＨ、アルドリッチ）は、水とメタノール溶液での銅ナノクラスタを安定させて可溶性にするために利用された。蒸留水（１８ＭΩ）２ｍＬへ、０．５μｍｏｌのＧ４−ＯＨまたはＧ２−ＯＨ、および１．５μｍｏｌ硫酸銅を溶かすことによって、銅イオンはデンドリマーへ捕捉され、溶液中へ当量のＮａＢＨ４をゆっくり添加することにより還元された。還元された銅原子は、明るい黄色の銅ナノドット溶液を残して、小さなナノドット（デンドリマーに被包されるナノクラスタ）およびナノ粒子を形成するために、デンドリマー内に凝集された。
【００９３】
３９２ｎｍおよび４７０ｎｍの励起と放射の最大限を備えた強い青い発光は、それぞれ、デンドリマーに被包される銅ナノドット溶液（図８）からはっきりと観察された。前記実験は、ＰＡＭＡＭデンドリマーの異なる世代で繰り返され、放射と励起のスペクトルが決定した。前記量子収量は、異なる生成デンドリマーに被包される銅ナノクラスタのために決定される。前記デンドリマー構造は、イオンスプレー（ＥＳＩ）質量分析で、被包されるナノクラスタ・サイズの分析が可能となる。還元条件、銅濃度およびデンドリマー世代によって、異なる銅を含むピークが、質量スペクトルに現われる。デンドリマーに被包された銅ナノクラスタのさらなる特性は、デンドリマーに被包された銀ナノドットの実施例５〜６に記載されるように行なわれる。
【００９４】
実施例５
水溶性で、光活性化された蛍光性Ａｇナノドットの生成の最適化および制御
デンドリマーおよび化学還元剤が、大きな金属および半導体ナノ粒子の合成のために一般に使用されている一方、はるかに小さなＡｇナノドットは、単に適切なモル比で所望のＰＡＭＡＭデンドリマーの水溶液に、０．５ｍＭのＡｇＮＯ３水溶液を添加して、中性ｐＨに調節することにより容易に合成される。一般に、化学還元剤は添加されないが、同様の結果は、光活性化を回避するために、ゆっくり少量のＮａＢＨ４を添加することにより達成することができる。化学還元剤を添加しない溶液では、それらが暗やみの中で維持される限り、可視吸収および蛍光はこれらの混合物で観察されない。しかし、５分間１００Ｗのフィルター処理されないＨｇランプで、全体の溶液の光活性化後、４５０ｎｍ近い可視吸収および強い蛍光の両方が現われた。前記溶液が顕微鏡を介してより高い強度で照らされた時、はるかに速い光活性化が小さな体積内に生じた。
【００９５】
一方、このナノドットの合成プロセスは、非常によく機能し、可視スペクトルの全体にわたる蛍光を備えたナノドットの広い分布を引き起こす。合成されたナノドットの分散を狭くするために、スペクトル特性が、生成条件と関連していなければならない。あるナノクラスタサイズは、特定の励起および濃度条件下で優先的に作製される可能性がある。例えば、全蛍光強度とすべての放射色は使用されたデンドリマーの世代に依存することが注目され、第０世代デンドリマーは０．３：１の低いＡｇ：デンドリマー比において原色の黄色と緑の高蛍光ナノドットを形成し、一方、第４世代のＰＡＭＡＭは３：１のかなり高いＡｇ：デンドリマーを必要としすべての色のナノドットを形成した。反応条件は、Ａｇ：デンドリマー比率および第０〜第４、またはより高い世代のデンドリマーでの反応での濃度の両方を調節することにより最適化される。単に各デンドリマー世代の蛍光を生産し始める比率で機能して、最も小さな放射ナノクラスタの濃度は優先的に向上される。各溶液からの一定分量は、異なる時間、異なる波長領域で照射される。これら溶液は、化学および光還元プロセスを比較するために、サブ化学量的に、添加されたＮａＢＨ４溶液を介して得られたものと比較される。各試料溶液の一定分量は、エレクトロイオンスプレー化を使用し、光活性化されていない溶液からの信号と比較される質量分析によって分析される。蛍光顕微鏡検査法およびＥＳＩ−ＭＳを備えた並列分析は、最も小さなナノクラスタのスペクトルの符号定数を識別する。
【００９６】
この実験のセットは、ナノドットサンプル内のＡｇナノクラスタサイズの分散を解明することを支援する。前記ナノドットがほんの少数の原子を含んでいるので、ナノドットサイズは、恐らく、１つのデンドリマー当たり銀原子の予測可能な個体群を付与するポアソンの統計（少数の統計）に大まかに従う。しかし、ポアソンの統計は、さらに計数統計にバイアスをかける他の相互作用は存在しないと想定する。異なるナノクラスタが、異なる条件下で多かれ少なかれ安定しているので、ナノドット生成条件の調整は、修正されたポアソン分布を生じ、相対的な個体群の実験の立証を、各サイズのナノドット特性の識別にとって重大なものとする。濃度の調節は、付与された濃度で反応進行度によって調節された相対的な個体群を変更するべきである。ポアソンの統計からのオフセットは、相対的な平衡濃度の直接計量法、および特定のナノクラスタサイズの任意の優先的安定化となる。したがって、デンドリマー所定量に対するＡｇ濃度を変更し、質量分析による光活性化および蛍光顕微鏡検査法の前後に混合物を分析することは、ナノドット組成物を管理する平衡定数に関する詳細情報を生じる。これらの実験は、各ＰＡＭＡＭ世代のナノドット内、および平衡定数内の所望の銀ナノクラスタサイズを優先的に生成するために必要なＡｇ濃度を決定する。
【００９７】
さらに、付与された色のナノドットの数は、カラーＣＣＤカメラおよび蛍光分光計を使用して、蛍光顕微鏡視界の中で数えられる。イメージ・シミュレーション、取り付けおよび処理ソフトウェアは、イメージおよび数学的な処理のために理想的なオープンシェルプログラミング環境である、ＩＤＬ（対話型データ言語、リサーチ・システムズ社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．））に記載されている。単一分子の蛍光スペクトル測定は、これを行う単調な方法になりえる一方、付与されたサンプルの中に存在する異なる放射粒子の数を決定するために、個々のナノドットの代表試料は、分光計で調査される。一旦、個々のスペクトル純度およびナノドット放射の狭さが確認されれば、個々の特徴は、カラーＣＣＤカメラで数えられる。カラー画像を生成する標準モザイクフィルタを備えたシングルチップＣＣＤは、４つのピクセル（赤を検出するための１つ、青のための１つ、および緑のための２つ）を使用し、１つの合成色ピクセルを生成する。小さく、回折限界的な特徴は、シングルチップカラーＣＣＤ上の正確な色を引き起こすために十分なピクセルをカバーしない。そのようなカメラによって検知された時、サンプル位置のいかなる小さな変化も、異なる数の赤、青および緑のピクセルの検知により、放射中の色変化として実際に登録される。各特徴は小規模のため、３チップのＣＣＤは、正確な色情報を与える。３チップのＣＣＤを使用して、各パーティクルの放射色は識別され、ユーザ定義粒子計数ソフトウェアは、自動的に各色ナノドットの数を数えるために使用される。各タイプのナノドット溶液内の特定のナノクラスタサイズに色を指定するために、個々のナノドットからの蛍光性の色分散は、それぞれ光活性化されたか、または化学的に還元された溶液の質量スペクトルと直接関連する。ＣＣＤが単に全面的な色を与えている一方、前記分光計は、高感度および時間分解能で、ナノドット放射のスペクトル幅を特徴づける。したがって、前記組み合わせは、生成条件の付与されたセットに起因する個々のナノドットおよびそれらの分散を正確に特徴づけるために重要である。
【００９８】
実施例６
特定Ａｇナノドットサイズの合成の最適化
ＰＡＭＡＭデンドリマーならびにＡｇイオンおよび原子の公知のｐＨ感度は、Ａｇナノクラスタサイズを制御し、したがって、スペクトル特性を制御するために使用される。ＰＡＭＡＭは、ｐＨが減少する一方、サイズが増加することがよく知られている（Ｋｌｅｉｎｍａｎら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２０００，１０４：１１４７２−１１４７９；Ｌｅｅら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００２  ３５：４５１０−４５２０；および  Ｂｏｓｍａｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９９  ９９：１６６５−１６８８）。このサイズ変化は、デンドリマー外部を著しくより浸透性にし、それらの内部中でナノクラスタまたはナノ粒子を提供するためにより大きな空洞を生成する。高いｐＨでは、前記デンドリマーは、かなりコンパクトで、それによって、イオンがデンドリマーコアに達することを防ぐ。このサイズ挙動は、より基礎的な環境に対する銀の選択をうまく補足する。その結果、Ａｇイオンおよび金属ナノクラスタは、デンドリマー内部上の基礎的なアミンと強く相互作用する。ｐＨの減少につれて、前記デンドリマー内部へのＡｇの分割は、著しく増加する。増加したデンドリマー浸透性およびＡｇの酸性ｐＨでデンドリマー内部と相互作用する優先性は、両方とも、より大きなナノクラスタが、低いｐＨでより容易に形成されることを示す。ｐＨが、より高いデンドリマー世代により重要な効果があるので、ｐＨ研究は、第４世代Ｇ４−ＯＨおよびＧ４−ＮＨ２ＰＡＭＡＭデンドリマーで行なわれる。このスキームは、優先的に、ナノドットサイズ分布をより大サイズおよびより小サイズへ移すために使用される。ｐＨの機能として、バルク吸収および発光スペクトルは測定され、上述されるような付与された色の個々のナノドットが数えられる。ナノドット分散は、ナノドットのスペクトル特性にわたる制御を獲得するために、デンドリマー世代およびｐＨの両方の機能として分析される。一旦、ナノドットが作製されれば、ＰＡＭＡＭホスト内で、形成されたナノドットの安定性を分析するために、ｐＨはｐＨ７に戻される。直接的に光学特性の変化をナノドットサンプル内のＡｇナノクラスタサイズの変化と関連させるために、ＥＳＩ−ＭＳは、すべてのそのような溶液上で行なわれる。同時に、これらの方法は、ＰＡＭＡＭデンドリマー内の特定のＡｇナノクラスタサイズに関連したスペクトル特性の決定を可能にする。
【００９９】
デンドリマーに被包されるナノドットの光物理学的特性
バルク寿命測定は、４００ｎｍ（８２ＭＨｚの繰り返し率、２００ｆｓのパルス幅）、１０ＧＨｚのＳｉフォトダイオード、および２０Ｇサンプル／秒ディジタルオシロスコープで、倍周波チタンサファイアレーザーを利用する時間領域のナノドット上で行われる。繰り返しモードにおいて、この組み合わせは、５０ｐｓの時間分解能でポイントをサンプリングすることができる。この高速な検出システムは、光学顕微鏡を介してバルクサンプルのために機能するように十分に敏感であるが、個々のナノドットについては、時間相関単一光子計数法ボード（ピコカント社）、および、比較的遅いが非常に敏感な、アバランシェフォトダイオードが使用され、それはともに、ＡＰＤジッターによって寿命が〜３００ｐｓに制限される。機器応答性のデコンボリューションで、Ａｇナノドットの主要な蛍光寿命成分は、〜１００ｐｓで決定された。したがって、Ａｇナノドットの群からの比較的明るい放射の１００ｐｓ以下の寿命の容易な測定のために、より速い検出システムが使用される。多数の寿命が存在するとき、異なる時間成分をデコンボリューションすることは、時間領域方法で極めて容易である。
【０１００】
吸収断面積測定は、単一のＤｉＩＣ１８分子、大変よく特徴づけられた吸収断面積を備えた染料、および単一の分子レベル（Ｂａｒｔｋｏ，＆  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３：３０５３−３０５６；Ｂａｒｔｋｏ  ＆  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３：１１２３７−１１２４１；ａｎｄ  Ｂａｒｔｋｏら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００２，３５８：４５９−４６５）で機能されるものとの比較を介してなされる。明滅する種および同時に双極子放射パターンを示す種の識別を通して単一分子の振る舞いを確認することは、付与されたサンプルの正確な濃度が不明であると言うことを回避でき、単一分子の既知の吸収断面積に関する吸収強度の簡単な測定と飽和強度の比較を可能にする。個々のナノドットスペクトル、付与されたナノドット溶液内のそれらの分散、およびそれらの対応する吸収断面積の組み合わせを使用して、各ナノドット種の濃度が付与されたサンプル内で決定される。これは、付与された溶液内の、付与された色ナノドットの光学濃度の決定に役立ち、デンドリマーと銀の初期濃度の使用によってナノドット組成物の平衡定数が決定される。
【０１０１】
各サイズナノドットの測定された濃度および全溶液吸収へのその寄与を使用して、付与されたナノドットタイプの光学濃度が決定される。メタノールローダミン６Ｇ溶液との比較を通じて、同じ光学濃度のナノドット溶液が調製される。蛍光量子収量は、標準ローダミン溶液のうちの、１つのものと同一のナノドット光学濃度の波長で励起させることによって測定される。その特有の、（はるかに小さなものだが、溶液中の他のナノクラスタからの測定された寄与を計上した後の）スペクトルウィンドウ内に見るとき、所望のナノクラスタの蛍光強度に対するローダミン蛍光強度の比率は、各ナノドットの量子収量を直接生じる。このレシオメトリック方法は、吸収された光子の数が、ローダミン６Ｇ参照および調査されるナノドットの両方に対して同じであるので、絶対的なナノドット濃度を知る必要なしに、正確な量子収量の測定を可能にする。同時に、バルクおよび単一分子のサンプルの両方の、質量分析および光物理学的特性は、決定的に各色ナノドットのサイズおよび光物理学的サインを決定する。この情報は、さらに、優先的に他のものに関する１つのナノドットサイズを高めるために、改善された合成方法論に結びつく。
【０１０２】
蛍光安定性
環境上の相互作用に大部分は影響されないので、デンドリマーの安定した放射は、さらに種々様々の異なる環境で、付与されたナノドットのための定量的に同様の放射を引き起こすと認められる。環境に左右されないそのような特性は、表面上のトラップ状態の存在により、表面不動態化が全面的な光物理学的特性にとって重大であるＩＩ−ＶＩ（例えばＣｄＳｅ）量子ドットとは明確に対照的である（Ｂｒｕｃｈｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８１：２０１３−２０１６；Ｃｈａｎ  ＆  Ｎｉｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８  ２８１：２０１６−２０１８；Ｎｉｒｍａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６  ３８３：８０２−８０４；Ｈｕｙｎｈら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１９９９  １１：９２３；Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ，Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ  １９９７，２１：５６−６０；Ｋｌｉｍｏｖら、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｂ  ２０００，６１：Ｒ１３３４９−Ｒ１３３５２）。前記デンドリマーに被包されるナノドットは、水溶性デンドリマーコア内に発色団を置くことにより、そのような困難を回避するように見える。明滅（蛍光間欠性）は、イオン強度とｐＨの機能として調査される。リン酸緩衝液および酢酸ナトリウム／酢酸のような一般に用いられている緩衝液は、イオン強度を調節する一方、同時にｐＨを制御するために使用される。アクリルアミドから染料までの範囲の異なる吸収を有する消光剤は、Ａｇナノドットからのエネルギー伝達の分析のために各ナノドット溶液に添加される。Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒの消光の研究は、消光の範囲、および環境からのナノクラスタ安定化および分離に対するデンドリマーの影響を決定するために行なわれる。しかし、短期間の寿命は、これらのナノドットが大部分は消光に左右されなくなることを示唆する。環境上の相互作用により何らかの変更が生じるかを分析するために、明滅および全放射強度に加えて、蛍光寿命およびスペクトルも測定される。しかし、それらの非常に強い遷移および短い寿命で、それらは、ＦＲＥＴドナー・アクセプター対で、優れたアクセプターを作る。光物理学的動態における変化が、変更された明滅する動態または平均的な蛍光効率の全面的低減に起因するかどうかを、バルクおよび単一分子の実験の両方は解読する。デンドリマーのホスト密度およびサイズも調節される。Ａｇナノドット明滅動態、および第０〜第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマーでの光物理学的パラメーターは、連続的により大きくより高い密度デンドリマーホストによって付与された保護を直接的に決定するために調査される。これらの研究により、直接、デンドリマーコアへの溶媒、および消光剤の浸透の範囲が分析される。
【０１０３】
配向動態
直線的に偏極された個々の表面境界ナノドットの配向動態は２つの理由で調査される。小さなＡｇナノクラスタの幾何学的変化は、非常に異なる吸収および放射波長に帰着すると考えられ（Ｈａｒｂｉｃｈら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９０，９３：８５３５−８５４３；Ｆｅｄｒｉｇｏら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９３，９９：５７１２−５７１７；Ｒａｂｉｎら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２０００，３２０：５９−６４）、エネルギー伝達測定に使用されるか、または個々のタンパク質の配向運動の追跡に使用されるかにかかわらず、配向情報は、生物学的ラベル化実験に非常に役立つ。これは、はるかに大きなＣｄＳｅ量子ドットと対照的であり、それらは直線的に偏極されないが、しかし、その代りに、すべての方向に放射し、独特な「暗い」軸（Ｅｍｐｅｄｏｃｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９９，３９９：１２６−１３０）によって特徴づけられる。したがって、ナノクラスタの配向動態を任意の観察されたスペクトルの変化と関連させることは、構造変化がさらに異なる有色Ａｇナノドットを生じさせるかどうかを理解するために非常に重要である。これらの実験も、色放射パターンを得るために、３チップのカラーＣＣＤで行なわれる。スペクトルが確かに狭い単一のナノドットであることを確認するために、蛍光スペクトルは、１５０ｌ／ｍｍ回析格子を使用して、顕微鏡連結分光写真器を介して得られる。配向軌道は、デンドリマーホスト内の任意のナノクラスタ可動性に起因する正確な３Ｄナノクラスタ配向動態に続くために、光学顕微鏡を介して見られるようなインターフェース（Ｂａｒｔｋｏら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３：３０５３−３０５６；Ｂａｒｔｋｏ  ＆  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３：１１２３７−１１２４１；Ｈｏｌｌａｒｓ  ＆  Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２０００，１１２：７８２２−７８３０；Ｈｅｌｌｅｎ  ＆Ａｘｅｌｒｏｄ，Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ｂ−Ｏｐｔ．Ｐｈｙｓ．１９８７，４：３３７−３５０）での双極性放射モデルに適する。
【０１０４】
実施例７
銀ナノドットのペプチド被包
生物系に本来的な莫大な多様性を利用することを試み（Ｗｈａｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０５：６６５−６６８；Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９６，８９２−５；ａｎｄ  Ｓｅｅｍａｎ  ＆  Ｂｅｌｃｈｅｒ，２００２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９  Ｓｕｐｐｌ  ２：６４５１−５）、短い９つのアミノ酸のペプチドが、Ａｇｎナノクラスタ蛍光を安定化することができることが実証された。配列ＡＨＨＡＨＨＡＡＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する短いペプチドは、ＮａＢＨ４上の大きな金属および半導体ナノパーティクルと相互作用することが最近報告された（Ｄｊａｌａｌｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２  １２４：１３６６０−１３６６１；Ｓｌｏｃｉｋら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００２  ２：１６９−１７３）。本明細書に記載された穏やかな光活性化手順を使用して、０．１：１のＡｇ：ペプチドモル比で非常に高い蛍光ペプチドに被包されるナノドットは、化学還元剤なしで製造された。これらの比率は、他の足場内のナノドット生産に必要なより高い比率を行うより多くの蛍光種を引き起こす。等価な足場濃度で、３：１のＡｇ：デンドリマー比率は、デンドリマー被包に必要であり、はるかに大きな比率（より高いＡｇ濃度を有する）は、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）から蛍光を生産するのに必要であり、両方の結果、ペプチドが優先的にナノクラスタを結合することが強く暗示される。そのような先行結果は、非特異性ラベル化がこの最適化されていないペプチドのためにさえ非常に強いペプチド銀相互作用により問題でないことを示す。さらに、このペプチドを使用して、蛍光イメージは、ほぼすべての赤およびオレンジのエミッターが欠けており、より大きなデンドリマーによって安定されたナノドットより狭い蛍光分布を示す。したがって、ペプチド被包のこの最初の試みさえのより強くより特殊である結合でさえ、より狭いサイズ分布を備えたペプチド足場内の優先的により短い波長の（おそらくより小さい）Ａｇナノクラスタ放射を生成する。この結果は、提案されたスクリーニングによって、高い選択的ナノドット結合ペプチドを識別することができ、異なるペプチドが、異なるサイズ／色のナノドットを安定させるという仮説を支持する。
【０１０５】
非常に小さく、高い蛍光性で、桁外れに光安定性な、水溶性Ａｇナノドットは、ＰＡＭＡＭデンドリマーおよび短いペプチドの両方によって被包されるほんの少数の原子から製造された。非常に有利な光学的性質は、桁外れに光安定性をもたらし、強く吸収し、すべての可視領域においてサイズ依存の放射を有する放射種をもたらす。より強力なラベリング法および材料を作製し特徴づけるために、単一分子の顕微鏡および水溶性貴金属ナノクラスタを利用することができる。これら特定の多色のラベルは、高感度、非常に向上された容易さ、および実験の単純性を有する単一分子の実験を可能にする。このタイプの新しい蛍光プローブ開発は、生物系の複雑さを解く際に、単一分子の方法の一般的な適用可能性およびユーティリィティに重要である。
【０１０６】
実施例８
銀ナノドット被包のための最適ペプチド識別
Ａｇが、生体適合で無毒になりえるので、それは最も小さく最も明るいインビボで実行できる蛍光性生体ラベルを同時に開発する独特の機会を提供する。これらの同じ方法は、ペプチド足場内の金、銅のナノドット組成物に適用することができる。デンドリマーに被包されるナノドットは、既に小さく、非常に明るい生体適合のラベルとして使用することができる。ＧＦＰよりはるかに小さいが、３．２７２ｋＤの第２世代ＰＡＭＡＭデンドリマーは、ほとんどの有機色素よりさらに大きい。生物学的ラベルとしてＡｇナノドットを使用する可能性をさらに調査するために、異なったサイズの金属ナノクラスタと結合することができる特定のペプチド配列が識別され、生体分子の特定にマルチカラーラベル化のための真の可能性が評価される。Ａｇナノドット蛍光用のペプチドライブラリーを作り探索することによって、最もしっかりと拘束力のある配列が識別される。これらの配列内に形成されたナノドットは、安定、光活性化および光物理学的特性について分析される。相対的安定性もデンドリマーホストに対して評価される。このように、ナノクラスタの転移は、デンドリマーとペプチドの間で調査される。
【０１０７】
実験アプローチ
多くのタンパク質配位子相互作用研究により、他の分子に結合するペプチドを識別するためのファージディスプレイ技術が使用される（Ｗｏｌｃｋｅ  ＆  Ｗｅｉｎｈｏｌｄ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２００１，２０：１２３９−４１；Ｋｒｏｏｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９４，２０４：８４９−５４；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  １９９６，９：６５２−７（１９９６）；Ｓｔｅｒｎ  ＆  Ｇｅｒｓｈｏｎｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，８７，１３７−５４）。強力なアプローチではあるが、ファージディスプレイは、相互作用コンポーネントのうちの１つに固体表面上で動けなくされることを要求する。ファージに基づいたペプチドライブラリースクリーニングの適用は、特有の無機材料の合成および安定化で最近実証された（Ｗｈａｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０５：６６５−６６８；Ｌｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９６：８９２−８９５；Ｓｅｅｍａｎ  ＆  Ｂｅｌｃｈｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００２，９９：６４５１−６４５５）。溶液中で標的ペプチドはＡｇナノクラスタ蛍光を強力に安定させるので、Ａｇｎ結合ペプチドは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）と結び付けられた、大腸菌に基づいたシステム（ＦｌｉＴｒｘのランダムペプチドディスプレイライブラリー、インビトロゲン）と関係させる。２つの技術のコンビネーションは、溶液に基づいた検査戦略を与える。ＦｌｉＴｒｘペプチドライブラリーは、主な細菌の鞭毛のタンパク質（ＦｌｉＣ）およびチオレドキシン（ＴｒｘＡ）を使用して、大腸菌の表面上にペプチドを表示する。市販のＦｌｉＴｒｘライブラリーは、チオレドキシンの活性部位ループに挿入されたランダムドデカペプチドの種々のセットからできており、それは、フラジェリンの重要でない部分にそれ自体挿入される。ランダムドデカペプチドは、ＴｒｘＡ内で形成されたジスルフィド結合によって抑制される。培養にトリプトファンを添加することは、ペプチド・タンパク質融合の発現を引き起こすときがあり、これは、ペプチド融合がすべて同時に表示されることを保証する。タンパク質融合が引き起こされた時、融合タンパク質は抑制されたペプチドディスプレイを可能にして、細菌細胞表面上の鞭毛へ搬出され組み立てられる。これらのペプチドが、高いコピー数の大腸菌細胞の外部上で生産されるとともに、Ａｇナノドット蛍光の安定化のために分析されるのはこれらのペプチドである。その後、細菌の個体数は蛍光を放射する細菌を分離するために、フローサイトメトリーを備えた蛍光特性によって識別される。
【０１０８】
表示されたＦｌｉＴｒｘペプチド上のＡｇｎナノドット生産の最適化
細菌の表面上のペプチドに被包されるナノドット組成物のための最適光還元条件は、予め識別されたＡｇｎを使用して、光学の顕微鏡使用によって決定される（実施例７を参照）。ナノペプチド配列およびフランキングＢｇｌＩＩ、およびＥｃｏＲＶ認識配列をコード化するオリゴヌクレオチドは、合成され、インビトロゲン社から得られたｐＦｌｉＴｒｘベクターの多重クローンサイトにクローン化される（オペロン社）。この構成は、上述されるようなフラジェリンの非本質的な部分にペプチドを挿入する。プラスミドは、分離され、宿主株ＧＩ８２６（インビトロゲン）に形質転換され、その結果大腸菌の表面にペプチドが表示される。その後、この株は、ＦＡＣＳでＦｌｉＴｒｘライブラリーをスクリーニングするときに、蛍光性のペプチドに被包されるＡｇナノドットを作製するのにふさわしい光活性化および化学還元条件を識別するために使用される。青色光で照射された時、およびＡｇナノドットを生成する効率と同様にＢＨ４−還元にさらされた時、細胞実行可能性は評価される。最初に、個々の細菌からの蛍光の合計は、光学の顕微鏡使用によって様々なＡｇ＋濃度のために光還元時間の機能として測定される。この手続きは極めて容易で、溶液（Ｔａｎｉ  ＆  Ｍｕｒｏｆｕｓｈｉ，Ｊ．Ｉｍａｇ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，９８：１−９；Ｓｔｅｌｌａｃｃｉら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００２，１４：１９４；Ｅａｃｈｕｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９９，５０：１１７−１４４）での電子供与体を備えた光化学的に縮小するＡｇイオンからなる。この手順は、電子的に励起した分子（Ｔａｎｉ  ＆  Ｍｕｒｏｆｕｓｈｉ，Ｊ．Ｉｍａｇ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４，９８：１−９；Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９８，１０２：５２８７−５２９７；Ｓｔｅｌｌａｃｃｉら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００２，１４：１９４；Ｅａｃｈｕｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９９，５０：１１７−１４４）のものに関するＡｇの有利なエネルギー準位によりよく働く。光還元は、ほんの少数の原子（すなわち、Ａｇ２〜８）からなるＡｇナノクラスタのための異なる還元電位によりナノクラスタサイズおよび色を制御する機会を提供する。あるいは、化学還元は当量のＮａＢＨ４または他の還元剤をゆっくり添加することによって行うことができ、それによって蛍光性ナノドットが得られる。最も高い蛍光性Ａｇナノドットラベル化大腸菌細胞を生産する条件は、すべてのライブラリー探索研究のための初期条件になる。識別された、強い蛍光を生産する条件を使用して、蛍光性細菌の培養は、ＦＡＣＳ分析用リン酸緩衝液中で洗浄され、続いて懸濁される。試料調製のプロセスの間に細菌表面に存在する蛍光の安定性を評価するために、大腸菌のこの洗浄された懸濁も、顕微鏡ステージ上の蛍光の合計のために再分析される。
【０１０９】
ランダムペプチドディスプレイライブラリーを介しての、配列を結合する特定のＡｇナノドットの識別
特に、Ａｇナノクラスタと相互作用するペプチド配列を識別するために、１．８×１０８の多様性を含む、商用ディスプレイライブラリー（インビトロゲン）は、最初に使用される。調製したライブラリーは、５０個のバイアルに分割し凍結され、Ａｇナノドット結合条件を最適化し、蛍光の総計として測定される。バイアルはそれぞれ、ほとんどのペプチドライブラリーを含み、光学顕微鏡のステージ上の低拡大対物レンズを介して、最適のＡｇ結合条件のために分析される。まず、ライブラリー培養は、融合フラジェリンの発現を引き起こすために、６時間トリプトファンの存在で成長する。前記培養はリン酸緩衝液で洗浄され、次に、光還元によってＡｇナノドットを形成するために硝酸銀で培養される。
【０１１０】
フローサイトメトリーは、細胞／粒子サイズを蛍光と関連させることができる。ＦＳＣ（前方散乱、相対的なサイズを定義する）およびＳＳＣ（前方散乱、相対的な粒状を定義する）のドットプロットは、ＦＡＣＳを使用する局在化のために細菌個体群を指定するゲートを定義するために生成される（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラム）。細菌は全体の蛍光強度分布に従ってソートされる。３つの蛍光を検知するチャンネルが利用可能である。３０ｎｍの幅を備えた５３０ｎｍのＦＬ１、４２ｎｍの幅を備えた２５８５ｎｍのＦＬ２および上記幅を備えた３６５０ｎｍのＦＬであり、各々またはそれらの組み合わせは、細胞局在化のために利用することができる。Ａｇのナノクラスタの非結合ペプチドを備えた大多数の細菌が、最小の蛍光を持ち、重要な蛍光を備えたものだけが回復されることが期待される。しかし、各チャンネルの蛍光の強度は、前方散乱と共に使用され、Ａｇｎ結合および安定化に起因する高い蛍光性の細胞を識別する。集めた細菌は、単一のコロニーを分離するために、アンピシリン選択Ａｇ寒天平板上に培養される。単一のコロニーはそれぞれ、関連する蛍光発現型を確認するために、フローサイトメトリーおよび光学顕微鏡で再び保存されテストされる。一旦蛍光の強度が決定されれば、プラスミドＤＮＡは、明るいナノドット蛍光を備えたそれらの細菌、および直接配列分析によって決定されたペプチド配列から分離される。陽性クローンからの配列の整列は、隣接する共通ペプチド配列を生成してもよく、あるいは、不連続の保存された残留物によって形成された構造モチーフが認識されてもよい。定義された配列は、固相ペプチド合成法によって合成され、そしてそのＡｇナノドットへの結合特性は、上述した研究に類似した、蛍光顕微鏡法、光物理学的特性および質量分析法を使用して特徴づけられる。
【０１１１】
ＦｌｉＴｒｘペプチドディスプレイシステムへのユーザ定義ライブラリーの作製
商業ライブラリースクリーンの使用の代わり、フラジェリンディスプレイライブラリーは、ｐＦｌｉＴｒｘベクターを使用して、異なるペプチド長さで生成することができる。ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＶの制限認識配列によって隣接された１５ｂｐ（５ａ．ａ．）、２７ｂｐ（９ａ．ａ．）、４５ｂｐ（１５ａ．ａ．）および６０ｂｐ（２０ａ．ａ．）の変性オリゴヌクレオチドが合成される（オペロン社）。オリゴヌクレオチドの混合は、これらの２つの酵素で消化され、ｐＦｌｉＴｒｘベクターへクローン化され、それは同じ酵素でカットされた。クローンの収集から分離されたプラスミドは、テスト株ＧＩ８２６へ形質転換され、そして上述したようにスクリーニング手順が繰り返し行われる。
【０１１２】
この方法は、生体適合の高い蛍光性ナノドットを形成するために結合する、特定のＡｇナノクラスタを選択するために、アミノ酸の自然な多様性を利用する。多くの点で、これは、Ｎｉを備えた特定の相互作用によって精製される、重要なタンパク質のＮ−またはＣ−末端に遺伝的に（Ｈｉｓ）６−タグを取り付ける共通の方法に類似する。同じように、この研究で定義された分類されるＡｇｎ結合ペプチドは、特に選択的にＡｇナノクラスタを結合、それによって、それらの蛍光を増強する。さらに、ＦＡＣＳ中の多数の蛍光検知チャンネルは、さらに優先的に異なるサイズを安定させるペプチド一連、したがって色、ナノドットの識別を可能にする。
【０１１３】
Ａｇｎナノクラスタ結合ペプチドの特性
一旦最適のペプチド長さおよび配列が規定通りに識別され合成されれば、デンドリマーに被包される上記ナノドットのために記載されるように、蛍光性ナノクラスタの環境上の安定および光物理学的特性は直接分析される。特定の配列は、ＰＡＭＡＭデンドリマーホスト中で可能なものより、はるかに狭い放射を持つ特定のナノクラスターサイズを優先的に安定させているかもしれないが、ペプチドのそれぞれの特色を備えて被包されたナノクラスターのそれぞれのタイプ数を識別する同一粒子計数方法が特徴づけられる。実際、Ａｇナノドット蛍光を可能にし安定化に使用される予備ペプチドにおいてでさえ、ナノドットサイズ分布を狭めることはデンドリマー被包に関係するように見える。より塩基性の残基用のＡｇｎの親和性のため、より大きなナノクラスターは、おそらくより塩基性の配列によって優先的に安定化されるであろう。これは、おそらくサイズ分け、従ってペプチド−Ａｇ結合相互作用におけるナノドット選択性である。従って、Ａｇナノドット結合ペプチドの遺伝子選択性は、ペプチドの多様性をもたらし、異なるナノクラスターをそれぞれ安定化させる。これは、異なる光学的性質を備えた一連の異なるプログラム可能なラベルをもたらし、その各々は、独立した単一の生体分子ラベルとして使用することができる。質量分析（ＥＳＩおよびＭＡＬＤＩ）は、各識別されたＡｇｎ結合ペプチド内のナノクラスタサイズ分布、および付与された色のエミッターの数とのその相関性を決定するために、合成され、続いてＡｇｎナノドット結合のためにテストされるすべてのペプチド上で行なわれる。この関連する単一ナノドット蛍光顕微鏡検査法、バルク吸収および放射、および異なるペプチドおよび銀のイオン濃度のための質量分析分析は、直接、ＦＡＣＳライブラリスクリーニングを介して、識別された各ペプチドの結合定数を特徴づける。
【０１１４】
実施例９
デンドリマーとペプチドとの間のＡｇナノクラスタの転移
銀塩類は、一般に水中での可溶性が非常に制限されるため、ＡｇＣｌは、恐らく、その非常に小さな溶解度積、および生物学的媒体の中に存在する多量の塩化物イオンにより、生物学的に適切な溶液から沈殿する。これは、上記提案された研究の中で定義されたペプチドへのＡｇｎナノクラスタを送達するための潜在的な問題を示し、高い蛍光性Ａｇナノクラスタの直接の送達を制限するかもしれない。しかし、Ａｇナノクラスタは、デンドリマーホストの中で被包されるとき、非常に安定していて、生理的ＮａＣｌ濃度で、それらの非常に明るい蛍光を保持することが分かった。小さい第２世代ＰＡＭＡＭデンドリマーさえ、ＡｇＣｌ沈殿から有効にＡｇナノクラスタを保護する。さらに、デンドリマーは、生体膜を横切ってそれらの内部内に含まれた材料を容易に輸送することがよく知られており（Ｔｏｔｈら、ＳＴＰ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．１９９９，９：９３−９９；Ｂｉｅｌｉｎｓｋａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０００，２１：８７７−８８７；Ｌｕｏら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００２，３５：３４５６−３４６２；Ｙｏｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９９，１６，：１７９９−１８０４；Ｗｉｗａｔｔａｎａｐａｔａｐｅｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０００，１７：９９１−９９８；Ｅｓｆａｎｄ，＆  Ｔｏｍａｌｉａ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ２００１，６：４２７−４３６）、インビボのラベル化実験の開発における価値ある特性である。その結果、強くＡｇナノクラスタを結合する識別されたペプチドにＡｇナノクラスタを直接転移するために、小さなＰＡＭＡＭデンドリマーは媒体として調査される。Ａｇナノドット転移は、ペプチドの識別および選択と同じスクリーニング法で調査される。ＦｌｉＴｒｘライブラリーにおいてペプチドを効果的にラベル化するための銀イオン濃度を最適化する代わりに、デンドリマーに被包されるナノドット濃度が、ナノドット交換をモニターするための、顕微鏡ステージ（１０倍の対物レンズを備えた）上で溶液を観察する間に調節される。一旦、大腸菌細胞を識別化する条件が識別されれば、ペプチドライブラリーは、デンドリマーからのナノドットを得ることができるペプチドを含む細胞のために特に選別される。フローサイトメトリーが、散乱および蛍光に基づいて細胞を選択することができるので、非常に小さなデンドリマーは、両方のチャンネルにおいて検出できない。細胞だけが、収集を始めるのに十分な光を散乱するのに十分に大きく、それによって、デンドリマーに被包されるナノドット蛍光による偽陽性を回避する。さらに、ＦｌｉＴｒｘライブラリー内の各細菌は、それぞれ何千ものペプチドコピーを有し、それにより、はるかに強い蛍光信号の可能性を提供する。強い蛍光および散乱光を示す細胞だけが集められ、アンピシリン選択で成長し、シーケンスされる。ペプチドライブラリーナノドット転移へのそのようなデンドリマーは、デンドリマーに被包されるナノドットがより容易に回避することができる特定のｐＨのような、特定の環境条件下のより低い世代ＰＡＭＡＭデンドリマーのために支持される。したがって、最もｐＨが安定したペプチドに被包されるナノドットは、将来のラベル化実験において���用性がある。この付加的スクリーニング法は、デンドリマーからＡｇナノクラスターを優先的に抽出するためのペプチドをさらに選択し、インビトロおよびインビボの両方においてタンパク質の容易なラベル化のための可能性を開く。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１Ａは、銀／デンドリマー水溶液のＵＶ−可視吸収スペクトルを提供する。（１）は、デンドリマーホスト（１：１２  デンドリマー：Ａｇ）の銀イオンのＮａＢＨ４の還元を介して調製された、大きな非蛍光のデンドリマーに被包される銀ナノ粒子の強いプラズモン吸収（３９８ｎｍ）特性を示す。（２）は、光活性化前の還元されない非蛍光１：３（デンドリマー：Ａｇ）溶液の吸収スペクトルを示す。（３）は、高い蛍光銀ナノドットを生成するために光活性化／光還元後の同じ溶液を示す。図１Ｂは、光活性化Ｇ２−ＯＨ  ＰＡＭＡＭ（ＭＷ：３２７２ａｍｕ）−ＡｇＮＯ３溶液のイオンスプレー質量スペクトルを提供する。Ａｇナノドットピークは、Ａｇ原子質量（１０７．８ａｍｕ）によって一定間隔で配置され、蛍光光活性化ナノドット溶液のみに現われる。
【図２】図２Ａ−Ｄは、水性デンドリマーに被包される銀ナノドットの時間依存光活性化を実証する、水銀灯励起（４５０〜４８０ｎｍ、３０Ｗ／ｃｍ２、縮尺バー＝１５μｍ）ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ顕微鏡像を示す。各３００ｍｓのＣＣＤフレームは、０秒、０．３秒、１．５秒および６秒の照明時間で増加する蛍光を示す。図２Ｅは、水溶液中で表面境界銀ナノッドット放射パターンを示す。単一分子の表示、異方性放射パターンおよび蛍光明滅は、弱いＨｇランプ励起下で容易に観察される。
【図３】図３は、室温単一ナノドット共焦点蛍光スペクトル（４７６ｎｍＡｒ＋レーザー励起、４９６ｎｍロングパスフィルタ、３００ｍｍモノクロメーターによる分散）を示す。５つの一般的なナノドットに関する放射最大限は、５３３ｎｍ、５５３ｎｍ、５８９ｎｍ、６１１ｎｍおよび６４８ｎｍである。バルク銀ナノドット溶液（トップ）の全体蛍光スペクトルは、大部分がこれらの５つのスペクトルタイプからなり、それらは、ＡｇＯ表面上のそれとは判別不能である。
【図４】図４Ａは、単一のナノドット蛍光寿命を示し、５Ｂは、一般的なデンドリマーに被包されるナノドットの飽和強度測定を示す。５Ａでは、４００ｎｍ励起寿命は、３００ｐｓの機器応答性によって制限されるが、解析後にサブ１００ｐｓのコンポーネント（９２％）および１．６ｎｓコンポーネント（８％）を示す。４Ｂで、様々なナノドット中の量子収量における変化から発生する全体の強度差と共に、飽和が〜４００Ｗ／ｃｍ２（共振を使用せず、５１４．５ｎｍの励起）で生じる。前記有機色素、ＤｉＩＣ１８は、比較のために、１０ｋＷ／ｃｍ２の飽和強度を有する。ＤｉＩに対する比較は、〜３０％の蛍光量子収量のより低い評価をもたらす。
【図５】図５Ａは、ＵＶ−Ｖが水溶性金ナノドットおよび純粋なデンドリマー溶液の吸収スペクトルであることを示す。図５Ｂは、ＰＡＭＡＭに被包されるＡｕナノドットの３８４ｎｍの吸収を表すＡでの吸収スペクトルの差を示す。
【図６】図６は、室温でのＧ４−ＯＨ  ＰＡＭＡＭに被包される金ナノクラスタの励起および発光スペクトルを示す。前記励起スペクトルは「１」で表示され、一方、前記発光スペクトルは「２」で表示される。
【図７】図７Ａは、水溶液中での金ナノドットの寿命測定を示す。機器応答性および適合するナノドットデータは、７．５ｎｓ（９３％）および２．８ｐｓ（７％）の寿命を示す。図７Ｂは、Ｇ２−ＯＨ＋Ａｕ８＋５Ｈ２Ｏ＋Ｈ＋のための４９４０の予期されるｍ／ｚを備えた、Ｇ２−ＯＨ  ＰＡＭＡＭ被包される金ナノドットのＥＳＩ質量スペクトルを示す。
【図８】図８は、室温でのＰＡＭＡＭデンドリマーに被包される銅ナノクラスタの励起および発光スペクトルを示す。前記励起スペクトルは「１」で表示され、一方、前記発光スペクトルは「２」で表示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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