(57)【要約】本発明は、ポリメラーゼ活性を制限する機能をも有するレポーター部分を含むヌクレオシドに関し、ヒドロラーゼ酵素で切断が可能な連結基を介して当該レポーター部分はヌクレオシドに結合することを特徴とする。ここで、当該ヒドロラーゼ酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択される。
2005517646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロラーゼ酵素で切断が可能な連結基を介してレポーター部分がヌクレオシドに結合していることを特徴とする、ポリメラーゼ活性を制限する機能をも有するレポーター部分を含むヌクレオシド、ここで、当該ヒドロラーゼ酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択される。
【請求項２】
式I
【化１】
2005517646.tif 000013
[式中、
Rはレポーター部分であり、
L1およびL5は任意の連結基であり、それぞれ、N、OおよびSのような他の原子をも含み得る炭化水素鎖を含む１以上の原子を含み、
L2およびL4は１以上のアミノ酸残基を含む任意の連結基であり、
L3はヒドロラーゼ酵素により酵素加水分解可能である連結基である]で示される化合物、
ここで、加水分解の切断は、当該連結基内または当該連結基に隣接して生じ得る、そしてヒドロラーゼ酵素がエステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択されることに特徴づけられる。
【請求項３】
連結基L3の酵素加水分解により、化学的に加水分解される不安定部分が生ずる、請求項２の化合物。
【請求項４】
当該塩基が、プリンまたはピリミジンを含み、特に塩基A、C、G、UおよびTまたはそれらの類似体のいずれかを含む、請求項２または３の何れかの化合物。
【請求項５】
当該糖がリボースまたはデオキシリボースまたはその類似体を含む、請求項２から４の何れかの化合物。
【請求項６】
モノ−、ジ−、またはトリ−ホスフェート基が当該糖と結合している、請求項２から５の何れかの化合物。
【請求項７】
トリホスフェート基が当該糖と結合している、請求項６の化合物。
【請求項８】
当該ペプチダーゼが、サブチリシン、プロテイナーゼK、エラスターゼ、ネプリリシン、サーモリシン、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼおよびウロキナーゼからなる群から選択される、請求項２から７の何れかの化合物。
【請求項９】
L3は、アラニン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-ロイシン、グリシン-ロイシン-セリン、グリシン-セリン-アラニン-アラニン-ロイシンおよびグリシン-アラニン-グリシン-ロイシンからなる群から選択したペプチドである、請求項２から８の何れかの化合物。
【請求項１０】
Rは、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、BODIPY(登録商標)色素、フェノキサジン色素、シアニン色素、アクリドン色素およびスクアレート色素からなる群から選択される、フルオロホアである、請求項２から９の何れかの化合物。
【請求項１１】
式II
【化２】
2005517646.tif 000014
[式中、
Rはレポーター部分であり、
L1およびL5は任意の連結基であり、それぞれ、N、OおよびSのような他の原子をも含み得る炭化水素鎖を含む１以上の原子を含み、
L2およびL4は１以上のアミノ酸残基を含む任意の連結基であり、
L3はペプチダーゼ酵素による酵素加水分解に感受性である連結基である]
の化学中間体。
【請求項１２】
L3は、アラニン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-ロイシン、グリシン-ロイシン-セリン、グリシン-セリン-アラニン-アラニン-ロイシンおよびグリシン-アラニン-グリシン-ロイシンからなる群から選択される、請求項１１の化学中間体。
【請求項１３】
Rは、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、BODIPY(登録商標)色素、フェノキサジン色素、シアニン色素、アクリドン色素およびスクアレート色素からなる群から選択される、請求項１１または１２の何れかの化学中間体。
【請求項１４】
化合物、5-N-[N-(6-フルオレセイン-5(および-6)カルボキサミドヘキサノイル)-Gly-Gly-Leu-β-アラニル]-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジントリホスフェート。
【請求項１５】
請求項６の少なくとも１つの化合物を含むことを特徴とする、ヌクレオチドのセット。
【請求項１６】
４つの天然塩基A、G、CおよびTのそれぞれ、およびそれらの類似体を含む、請求項１５のヌクレオチドのセット。
【請求項１７】
種々の塩基を有する請求項６の化合物のうちの少なくとも２つの化合物を更に含み、各化合物は種々のレポーター部分、Rを有することを特徴とする、請求項１５または１６の何れかのヌクレオチドのセット。
【請求項１８】
請求項６の４種の化合物であって、それぞれの化合物は、塩基A、G、CおよびTのそれぞれまたはその類似体が存在するよう、互いに異なる塩基を有し４種の化合物それぞれが、その他の３つの塩基を有するそれぞれの化合物のレポーター部分と識別できるレポーター部分を有することを特徴とする当該４種の化合物を含む、請求項１５から１７の何れかのヌクレオチドのセット。
【請求項１９】
核酸分子配列決定の方法であって、
a)プライマーおよび鋳型の複合体を固相に固定化すること、
b)請求項６の化合物の存在下ポリメラーゼと共にインキュベーションすること、
のステップを含む当該方法。
【請求項２０】
c)請求項６の化合物の組み込みを検出すること、
d)ヒドロラーゼ酵素の存在下、酵素切断可能基L3の酵素切断に適する条件でインキュベーションすること、
のステップを更に含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ヒドロラーゼ酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
当該ペプチダーゼは、サブチリシン、プロテイナーゼK、エラスターゼ、ネプリリシン、サーモリシン、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼおよびウロキナーゼからなる群から選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
e)ステップa)-d)を繰り返すこと、
を更に含む、請求項１９から２２の何れかの方法。
【請求項２４】
当該化合物の組み込みは、当該化合物に結合した単一のレポーター基の検出により測定される、請求項１９から２３の何れかの方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はヌクレオシドとヌクレオチドの類似体に関する。特に、本発明は、レポーター部分をヌクレオチドにつなぐ酵素加水分解性連結基を含むヌクレオチド類似体に関する。
【０００２】
背景技術
近年のDNA配列決定技術の改良は、大規模な配列決定の必要性の高まりに応えようとするものである。年々、鋳型核酸分子を固体表面に結合する方法が開発されつつある(例えば、US 5,302,509 および US 5,547,839参照)。その方法は、電気泳動分離ステップを行う必要はなく、および光学的検出技術(例えば、Nie et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997, 26: 567-96参照)を用い、単一分子のレベルで配列決定情報が得られることを目的としている。これにより、同時に複数サンプルを分析することも可能である。
【０００３】
その方法の１つの例は、Base Addition Sequencing Scheme (BASS)(例えば、Metzker et al., Nucleic Acids Res 1994, Vol.22, No.20; p. 4259-4267参照)である。BASSは、DNA合成を停止するブロッキング基を含む修飾ヌクレオチド類似体の組み込みを含む方法である。固体支持体に結合した鋳型にプライマーをアニールさせ、修飾ヌクレオチドを組み込む繰り返しサイクルにより配列データを得る。各サイクルでは、組み込んだ塩基をイン サイチュで同定しその後脱保護してブロッキング基を除き、次のサイクルでDNA合成を行う。
【０００４】
BASSのような方法はヌクレオチド類似体の使用に依存し、そのヌクレオチド類似体では、当該ヌクレオチドの糖の3'ヒドロキシル位にポリメラーゼ酵素ブロッキング(またはターミネーター)基がある。典型的に、ブロッキング基は、ターミネーターおよび標識／レポーター部分の組合せであり、それによって、組み込みヌクレオチドは検出され得、その一方、巨大な標識またはレポーター部分自体はポリメラーゼの更なるDNA合成をブロッキングする役割を果たす。便利なことに、ターミネーター基が、レポーター部分でもあるので、一度の反応により両方の機能が同時に除かれ、その後のDNA合成および読み取るべき次の塩基の組み込みの両方が可能となる。
【０００５】
その後のラウンドのDNA合成を行うには、これらのポリメラーゼ酵素ブロッキング基を、典型的には、それらが除去され得るように、連結基を介してヌクレオチドに結合させる。しかし、通常の配列決定ストラテジーは、反応混合物のpH変化を伴う高温のサイクリング(典型的には約95℃またはそれを超える温度)を必要とする。その条件は特定の化学結合の反応性を高める要因となり得る。従って、これまでのデータ収集に用いるヌクレオチドにブロッキングおよび標識基を結合させるための結合方法は、化学的条件(温度およびpHのような)の変化に耐え得る連結基を使用することに焦点が置かれている。例えば、ブロッキングおよび標識基は感光性連結基を介して結合し得、それによって、光照射(すなわち、光化学的手段、例えば、WO 93/05183参照)または化学的手段により切断可能である。
【０００６】
WO 01/92284は、レポーター部分およびポリメラーゼブロッキング基の両方を含むが、当該レポーター部分はポリメラーゼ酵素ブロッキング基として作用することはないヌクレオチドを開示する。当該ポリメラーゼ酵素ブロッキング基は酵素切断可能リンカーの手段により糖に結合している。
【０００７】
核酸配列決定のための標識試薬は、EP 0252683に開示されている。Igloi (BioTechniques, 1996, 21, 1084-1092)は、配列決定において有用性のあるヌクレオチド色素誘導体を報告する。何れのケースでも、安定プロピニルアミド連結基を用い、蛍光色素を、これら試薬の塩基に結合させている。
【０００８】
同様に、安定プロピニル連結基は、WO 97/ 00967 および WO/ 88 10264の色素標識ヌクレオチドに使用される。
【０００９】
既知ヌクレオチド類似体を使用すると多くの不利益が生ずる。
【００１０】
レポーター／ターミネーター基を取り除く既知の方法では、反応性化学物質または放射線による繰り返しの傷害をさけることができず、そのため塩基置換(base transformation)、クロスリンキング、または脱プリンのような反応によって鋳型DNA鎖は損傷し得る。
【００１１】
更に、ヌクレオチドの3'位に巨大なレポーター部分を結合することにより、DNAポリメラーゼの、ヌクレオチド認識能または許容能は低下し得る。僅かしか組み込まれないことに加えて、修飾ヌクレオチドは不活性(すなわち、組み込まれず)、阻害性(すなわち、DNA合成を阻害する)となり得るか、またポリメラーゼ酵素忠実度を改変し得る。
【００１２】
これらの作用の何れか１つまたはそれらの組合せは、得られた配列データの精度を低下し、特に、検出において、ノイズに対するシグナルの比を減少するであろう。更に、連続的なラウンドの酵素組み込みおよび切断から得られる配列データの量は制限されることを意味する。例えば、組み込みおよび切断の総合誤差約３％が蓄積すれば、ノイズに対するシグナルの比が減少して配列決定が更にできないという以前に、鋳型DNAから配列が得られるのは５塩基またはそれより少ない数の塩基のみであるという結果となる。
【００１３】
従って、ヌクレオチド類似体を改善する必要がある。その類似体は、以下の特徴を１以上有し得る：ポリメラーゼによる許容性；重合フェーズでの安定性；およびレポーター基は、鋳型鎖または鋳型プライマー複合体に与える損傷を最小にする条件下で効率的に除去され得る。好ましくは、類似体の改善により、１を超えるこれらの特徴が達成され、最も好ましくは、これらすべての特徴が達成される。
【００１４】
そのため、本発明の目的は、レポーター部分(ポリメラーゼ仲介組み込みの制限もする)が酵素加水分解可能連結基を介して結合するヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体を提供することである。ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体の連結基に結合した不安定部分を酵素加水分解で除去することが可能であるレポーター基を含む当該類似体を提供することもまた本発明の目的である。そのヌクレオチド類似体は、等温(isothermic)反応を含み、それゆえ当該ヌクレオチド類似体を高温にさらすこと、および化学的状態の望ましくない変化にさらすことは含まない配列決定反応での使用に最も適する。アレイに基づく配列決定技術(BASSのような)を含む適当な配列決定反応の条件下では、酵素切断可能基は実質的に安定するであろう。酵素加水分解性連結基を使用すれば、当該レポーター部分を除くための、激しい、鋳型損傷を伴う処理の必要はなくなる。
【００１５】
本発明の詳細な説明
本発明は、酵素加水分解により切断が可能であり、ヌクレオシドおよびヌクレオチドにレポーター部分を結合させるための連結基の使用を開示する。
【００１６】
従って、第一の態様では、本発明は、ヒドロラーゼ酵素で切断が可能な連結基を介してレポーター部分がヌクレオシドに結合していることを特徴とする、ポリメラーゼ活性を制限する機能をも有するレポーター部分を含むヌクレオシドを提供し、ここで、当該ヒドロラーゼ酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択される。
【００１７】
従来の酵素切断可能なヌクレオシドとは対照的に、当該レポーター部分は、検出可能標識を提供し、ポリメラーゼ酵素活性を制限する、二機能性である。そのため、本発明のヌクレオシドは、別のレポーター部分および別のポリメラーゼ酵素ブロッキング基を含むわけではない。
【００１８】
ヒドロラーゼは、水の付加を伴う化学結合の切断を触媒する酵素のクラスの何れかのメンバーとして定義される。
【００１９】
第二の態様では、本発明は、式I：
【化１】
2005517646.tif 000003
[式中、
Rはレポーター部分であり、
L1およびL5は任意の連結基であり、それぞれ、N、OおよびSのような他の原子をも含み得る炭化水素鎖を含む１以上の原子を含み、
L2およびL4は１以上のアミノ酸残基を含む任意の連結基であり、
L3はヒドロラーゼ酵素により酵素加水分解可能である連結基であり、ここで、加水分解の切断は、当該連結基内かまたは当該連結基に隣接して生じ得、ヒドロラーゼ酵素がエステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択されることを特徴とする]
の化合物を提供する。
【００２０】
好適には、連結基L3の酵素加水分解により、化学的に加水分解される不安定部分が生ずる。
【００２１】
適当な塩基は、プリンまたはピリミジンを含み、特に塩基A、C、G、UおよびTまたはそれらの類似体のいずれかを含む。
【００２２】
好適には、糖はリボースまたはデオキシリボースまたはその類似体を含む。従って、他のヌクレオシド類似体と合わせてリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドとなる。
【００２３】
好適には、モノ−、ジ−、またはトリ−ホスフェート基が糖と結合する。特定の好ましい実施態様では、トリホスフェート基が糖と結合する。
【００２４】
好ましい実施態様では、混成のリンカー基L1からL5は１０から２００結合の長さの鎖であり得、炭素、窒素、酸素および硫黄原子から選択される原子を含み得、当該リンカー基は、当該分野で既知のように、強固であっても柔軟であってもよく、不飽和であっても飽和であってもよい。混成のリンカー基は、ペプチド結合により結合する１以上のアミノ酸を更に組み込み得る。アミノ酸の組み込みは、標準的アミノ酸化学を用いるアミノ酸モノマーまたはオリゴマーの組み込みにより可能である(例えば、"Synthetic Peptides - A Users Guide" Ed. G. A. Grant; 1992参照)。
【００２５】
エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、ペニシリンアミダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択される加水分解酵素によるL3の加水分解により、ポリメラーゼ酵素レポーター部分(R)は当該化合物から分離する。
【００２６】
好ましい実施態様では、連結基L3は、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、およびホスホリラーゼからなる群から選択されるヒドロラーゼ酵素により切断可能である。好ましいペプチダーゼは、サブチリシン、プロテイナーゼK、エラスターゼ、ネプリリシン(neprilysin)、サーモリシン、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼおよびウロキナーゼを含む。適当な酵素は、マイルドな条件下で反応性があるものである(Handbook of Proteolytic Enzymes, Barrett et al., ISBN 0-12-079370-9参照)。特に好ましい実施態様では、酵素加水分解可能基はペニシリンアミダーゼにより切断可能である。
【００２７】
好ましくは、L3は、アラニン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-ロイシン、グリシン-ロイシン-セリン、グリシン-セリン-アラニン-アラニン-ロイシンおよびグリシン-アラニン-グリシン-ロイシンからなる群から選択したペプチドである。
【００２８】
エステラーゼは、以下の反応スキーム１に開示の一般反応を触媒する。
反応スキーム１
【化２】
2005517646.tif 000004
【００２９】
そのため、更に好ましい実施態様である第二の態様では、L3はエステル基を含む。
【００３０】
非特異的エステラーゼ活性は、多くの酵素システムと関連する。この活性は、生理学的機能および薬物代謝の両方に関連する。その非特異的カルボキシルエステラーゼ活性を用い、インビトロで分子を修飾し得る。しかし、やや高いpHおよび高い温度ではカルボキシエステルは安定性を欠くことより、核酸適用用の安定試薬の作成には不適当となり得る。
【００３１】
好ましい実施態様では、非常に安定なペプチド結合を、特異的に切断可能な基として使用する。当該連結基は、反応スキーム２に示すように適当なペプチダーゼで切断し、鋳型鎖または鋳型／プライマー複合体に損傷を与えることなくレポーター部分を取り除くことが可能である。脱保護後、更なるDNA合成により、次のサイクルである標識化類似体の付加が生じ得る。
【００３２】
次いで、R'およびR''の両方が１以上のアミノ酸残基であれば、ペプチダーゼは反応スキーム２に開示の以下の一般反応を触媒する。
反応スキーム２
【化３】
2005517646.tif 000005
【００３３】
好適には、連結基L3の酵素加水分解は、化学的に加水分解される不安定部分が生ずる。
【００３４】
L3(酵素学的に加水分解され化学的不安定型となり得る)が、リンカーバックボーン部ではない部分を含み、塩基またはレポーター基とは直接結合しない(例えば、連結基L2またはL4を介する)ように、リンカーをアセンブルし得る。そのため、そのような部分の、加水分解酵素による除去により形成された不安定連結基は直ちに化学的に加水分解され、当該リンカーの切断が促進される。これは、当該酵素により破壊される共有結合が、ヌクレオシドと標識との間にリンカーを構成する共有結合の連続鎖部分を形成していない点で、当該酵素による当該リンカーの直接の酵素切断とは異なる。この型の"リモート切断"の典型例は、L3がN-フェニルアセチルアミノアセタールからなる場合である。当該酵素ペニシリンアミダーゼは、当該分子のフェニルアセチル部分を特異的に認識し、アミド結合を加水分解し、酢酸フェニルおよびヘミアミナール(hemiaminal)を生ずる(例えば、WO 97/20855参照)。当該ヘミアミナールは、当該酵素の非存在下で加水分解を触媒する酸または塩基に高感受性である。そのため、L3がそのユニットを含むならば、ペニシリンアミダーゼによる処理は当該リンカーを化学的に不安定化し、加水分解を触媒する塩基または酸で切断される。これを反応スキーム３に示す。
反応スキーム３
【化４】
2005517646.tif 000006
【００３５】
この原理で動く他のシステムが案出され得、任意のリンカー設計にそのシステムが組み入れられ得る。この型のリンカー切断の特定の利点は、当該酵素認識および切断部位が、リンカー切断部位から離れており、当該リンカーの他のコンポーネント、標識またはヌクレオシドの近接による影響をあまり受け得ない、ことである。
【００３６】
従って、特に好ましい実施態様では、L3はペニシリンアミダーゼ切断部位を含む。ペニシリンアミダーゼはペニシリンアミノヒドロラーゼとしても知られる(EC 3.5.1.11)。
【００３７】
酵素切断可能基を含むリンカーを塩基部分に結合させるのに適当な方法は、例えば、Cavallaro et al. Bioconjugate Chem. 2001, 12, 143-151に開示されている。更なる方法が、Langer et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1981, 78, 6633-6637; Livak et al., Nucleic Acids Res, 1992, 20, 4831-4837 および Gebeyehu et al., Nucleic Acids Res, 1987, 15, 4513-4534に開示されている。
【００３８】
適当なレポーター部分、Rは、種々の既知のレポーティングシステムの何れか１つであり得る。それは、ヌクレオシド類似体を容易に検出可能とする手段である放射性同位体、例えば、ホスフェートまたはチオホスフェートまたはHホスホネート基に組み込まれた32P、33P、35Sまたは他に3Hまたは14Cまたはヨウ素同位体、であり得る。それは、マススペクトロメトリーまたはNMRで検出可能な同位体であり得る。それは、シグナル部分、例えば、酵素、ハプテン、フルオロホア、クロモホア、化学ルミネセンス基、ラマンラベル、ロイコ色素(leucodye)、電気化学的標識、またはマススペクトロメトリーによる検出のために適用されたシグナル化合物であり得る。
【００３９】
好ましい実施態様では、当該レポーター部分は、蛍光特性を有し、感度のよい蛍光検出器を用い検出できる。それは、フルオロホア、例えば、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、BODIPY(登録商標)色素、フェノキサジン色素、シアニン色素、およびスクアレート(squarate)色素(例えばWO 97/40104に開示)であり得る。好ましくは当該色素は、特許出願GB 0113435.2およびGB0113434.5に記載のようなアクリドン(acridone)誘導体である。最も好ましくは、当該レポーター部分はシアニン色素である。例えば、米国特許5,268,486に開示のシアニン色素類("Cy色素(商標)"と称する場合もある)は、生物適合性フルオロホアシリーズであり、それは、高い蛍光発光、環境安定性、および当該フルオロホアの内部分子骨格を変化させることにより選択され得る赤外線近辺にまで広がる発光波長域を特徴とする。
【００４０】
好ましい実施態様では、修飾ヌクレオチドは、依然として酵素による伸張に対応するものである、すなわち、それはまだポリメラーゼにより組み込まれ得る。適当なヌクレオチドおよびポリメラーゼの組合せを選択する手順は、Metzker et al., Nucleic Acids Res 1994, Vol. 22, No. 20, 4259-4267の記載から容易に適用されるだろう。特に、選択したポリメラーゼは、ヌクレオチドを選択的に組み込むことができることが望ましい。
【００４１】
他の好ましい実施態様では、本発明のヌクレオチドが、特定のポリメラーゼ酵素条件下、選択したポリメラーゼにより組み込まれると、レポーター基、Rは更なるポリマー伸張を制限し、ポリメラーゼによる付加を一定数とする。
【００４２】
本発明は、更に、5-N-(N-トリフルオロアセチル-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン; 5-N-(β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン; 5-N-(N-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Gly- Gly-Leu-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン; 5-トリフルオロアセチル-β-アラニル-N-(-Gly-Gly-Leu-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジンおよび5-N-[N-(6-フルオレセイン-5(および-6)カルボキサミドヘキサノイル)-Gly-Gly-Leu-β-アラニル]-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジンからなる群から選択される化学中間体を提供する。
【００４３】
第三の態様では、本発明は式II
【化５】
2005517646.tif 000007
[式中、
Rはレポーター部分であり、
L1およびL5は任意の連結基であり、それぞれ、N、OおよびSのような他の原子をも含み得る炭化水素鎖を含む１以上の原子を含み、
L2およびL4は１以上のアミノ酸残基を含む任意の連結基であり、
L3はペプチダーゼ酵素により酵素加水分解に感受性である連結基である]
の化学中間体を提供する。式IIの化学中間体は式Iの化合物の合成で色素-リンカー基として使用する。
【００４４】
好ましい実施態様では、L3は、アラニン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-ロイシン、グリシン-ロイシン-セリン、グリシン-セリン-アラニン-アラニン-ロイシンおよびグリシン-アラニン-グリシン-ロイシンからなる群から選択する。
【００４５】
好ましくは、レポーターR(または色素)は、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、BODIPY(登録商標)色素、フェノキサジン色素、シアニン色素、アクリドン色素およびスクアレート(squarate)色素からなる群から選択される。
【００４６】
第四の態様では、本発明は、5-N-[N-(6-フルオレセイン-5(および-6)カルボキサミドヘキサノイル)-Gly-Gly-Leu-β-アラニル]-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジントリホスフェートを含む化合物を提供する。
【００４７】
第五の態様では、本発明はヌクレオチドのセットを提供し、当該セットは、当該糖に結合するモノ-、ジ-またはトリホスフェート基を有する式１の少なくとも１つの化合物を含むという特徴を有する。好ましくは、当該セットは、４つの天然塩基A、G、CおよびTのそれぞれ、およびそれらの類似体を含む。
【００４８】
第五の態様の好ましい実施態様では、ヌクレオチドの当該セットは更に、種々の塩基を有する上記のような化合物のうち少なくとも２つの化合物を含み、各化合物は種々のレポーター部分、Rを有することを特徴とする。そのため、例えば、ヌクレオチドの当該セットは、Aを伴う化合物およびGを伴う化合物を含み得、ここで塩基Aを伴う当該化合物は第一のレポーター部分(R1)を有し、塩基Gを有する化合物は第二のレポーター部分(R2)を有し、第一および第二のレポーター分子は互いに識別可能である。
【００４９】
第五の態様の他の好ましい実施態様では、ヌクレオチドのセットは、上記のような４種の化合物であって、それぞれの化合物は、塩基A、G、CおよびTのそれぞれまたはその類似体が存在するよう、互いに異なる塩基を有し４種の化合物それぞれが、その他の３つの塩基を有するそれぞれの化合物のレポーター部分と識別できるレポーター部分を有することを特徴とする当該４種の化合物を含む。
【００５０】
第六の態様では、本発明は、核酸分子配列決定の方法であって、
a)プライマーおよび鋳型の複合体を固相に固定化すること、
b)糖に結合したモノ-、ジ-またはトリホスフェート基を有する式Iの化合物の存在下ポリメラーゼと共にインキュベーションすること、
のステップを含む当該方法を提供する。
【００５１】
第六の態様の１つの実施態様では、プライマーおよび鋳型は、適当なハイブリダイゼーション条件下でインキュベーションし、その後、当該複合体を固相に固定化することにより複合化し得る。更なる実施態様では、当該プライマーまたは当該鋳型を固相に固定化し、その後、適当なハイブリダイゼーションパートナー(すなわち、それぞれ鋳型またはプライマー)を導入することにより当該複合体を形成し得る。また更なる他の実施態様では、固相に固定化した当該複合体は、"プライマー"および"鋳型"の両方を含む単一の核酸分子であり得、例えば、固定化したポリ-またはオリゴ-ヌクレオチドはヘアピン構造を有し得る。
【００５２】
適当なポリメラーゼは、DNAポリメラーゼ、逆転写酵素およびRNAポリメラーゼを含む、鋳型依存塩基付加を行う酵素である。適当な天然または操作したポリメラーゼには、以下に限らないが、T7ポリメラーゼ、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠失している大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、大腸菌DNAポリメラーゼIII、Sequenase(商標)、φ29DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼフリーPfu、エキソヌクレアーゼフリーVent(商標)ポリメラーゼ、Thermosequenase、Thermosequenase II、Tth DNAポリメラーゼ、Tts DNAポリメラーゼ、MuLv逆転写酵素またはHIV逆転写酵素が含まれる。適当なポリメラーゼの選択は、ポリメラーゼと特定修飾ヌクレオチドとの間の相互作用に依存する(Metzker et al., Nucleic Acids Res 1994, Vol.22, No.20; p. 4259-4267に開示されるように)。
【００５３】
カルボキシルエステル結合基のようなヒドロラーゼ切断可能連結基を含むヌクレオチドは、BASSのような、アレイに基づく配列決定に使用する配列決定反応での使用に適当である。その反応は、サイクルシーケンシングとは異なって、等温性であり、そのため、反応条件のよりよいコントロールを可能とする。特に、配列決定反応は、比較的低い温度(典型的に70℃未満)で生じ、そのため、カルボキシルエステル結合のような酵素切断可能連結基を、これらの配列決定反応条件下で安定にし得る。従って、本発明の第六の態様に有用であり得るポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼおよび非熱安定性ポリメラーゼを含む。
【００５４】
第六の態様の好ましい実施態様では、当該方法は、
c)糖に結合したモノ-、ジ-またはトリホスフェート基を有する式Iの化合物の組み込みを検出すること、
d)酵素の存在下、酵素切断可能基L3の酵素切断に適する条件でインキュベーションすること、
のステップを更に含む。
【００５５】
好ましくは、ヒドロラーゼ酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択される。
【００５６】
酵素切断可能基の酵素加水分解に適する条件は、含まれる酵素の性質に依存するであろう。カルボキシエステラーゼのような酵素は広範囲の条件下で活性であり、コファクターを必要としない。市場で入手可能なカルボキシエステラーゼは、pH7.0とpH8.0との間のマイルドなpH条件下(例えば、0.1M NaCl、0.05M Tris.HCl、pH 7.5)でエステルを加水分解するであろう。
【００５７】
適当なペプチダーゼは、サブチリシン、プロテイナーゼK、エラスターゼ、ネプリリシン(neprilysin)、サーモリシン、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼおよびウロキナーゼからなる群から選択され得る。ペプチダーゼによる切断に適当な条件は以下の実施例５に記載する。
【００５８】
第六の態様の他の実施態様では、当該方法は、
e)ステップa)-d)を繰り返すこと、
を更に含む。
【００５９】
第六の態様の好ましい実施態様では、ステップd)の酵素はペニシリンアミダーゼである。
【００６０】
第六の態様の好ましい実施態様では、当該化合物の組み込みは、当該化合物に結合した単一のレポーター基の検出により測定される。
【００６１】
端的には、本発明の第二の態様により修飾ヌクレオチドを用いる配列決定反応は以下のように行い得る。プライマー鋳型複合体を固体表面に固定化し、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を欠失している大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントのようなポリメラーゼ、および市場で入手可能なピロホスファターゼをも含む適当な緩衝液の存在下で修飾ヌクレオチドと接触させる。当該反応物を、ポリメラーゼ仲介塩基付加反応に適する条件下でインキュベーションし、その後、洗浄緩衝液を用いる洗浄による組み込まれていないヌクレオチドおよび酵素の除去に適する条件下でインキュベーションする。好適には、当該洗浄緩衝液は、おおよそpH6からpH9の安定pHに維持する有機塩のような緩衝性試薬を含み、固体表面から非共有結合分子を除去するよう一価性またはニ価性陽イオンおよび界面活性剤も更に含み得る。修飾ヌクレオチドが蛍光レポーター分子を含む場合、組み込みヌクレオチドは蛍光を測定することにより検出される。同定後、鋳型を、適当な酵素活性を有する過剰のタンパク質を含む緩衝性溶液と接触させ、酵素切断活性のための条件下でインキュベーションする。例えば、ヌクレオチドにレポーター部分を連結する酵素切断可能基がペプチド基である場合、当該溶液は、ペプチダーゼ活性を有する過剰のタンパク質を含む。酵素の作用後、酵素切断による可溶性産物は上記のように洗浄することにより除去する。洗浄ステップ後、固定化鋳型は、ポリメラーゼ反応に使用する過剰の緩衝液で洗浄し、そしてポリメラーゼ仲介塩基付加、組み込みヌクレオチドの検出および酵素切断活性のステップを繰り返し、更なる配列データを得る。
【００６２】
特定の記載
明確化のため、本発明の特定の実施態様を以下の図面および実施例と関連させて記載する：
図１(実施例１)は式Iの化合物を合成する反応スキームを示す。
図２(実施例２)は式Iの化合物の酵素切断を示す。
図３(実施例３)はペニシリンアミダーゼ切断可能リンカーを伴うヌクレオチドの合成の反応スキームを示す。
実施例４はDNAポリメラーゼによる式Iの化合物の組み込みを記載する。
実施例５はFamHex-GGL-β-A-2'dUのプロテアーゼ仲介切断を示す。
実施例６はプロテアーゼ切断可能リンカーを伴う色素標識ヌクレオシドの調製を記載する。
【実施例】
【００６３】
実施例１
ペプチドに基づくリンカーを含む式Iの化合物の一例の合成の反応スキームを図１に示す。
i)5-N-(N-トリフルオロアセチル-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (2)
5-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (1) (1.3g, 4.6mmol) および N-トリフルオロアセチル-β-アラニンスクシンイミジルエステル (1.29g, 4.6mmol)を室温でDMF (10mL)に溶解した。トリエチルアミン (0.46g, 0.6mL, 4.6mmol)を添加し、当該溶液を室温で一夜撹拌した。次いで、溶媒を真空で除去した。次いで、残渣をジクロロメタン : メタノール (1:1)に再溶解し、フラッシュシリカゲルカラム (ジクロロメタン : メタノール, 9:1)で溶出させた。適当な画分から溶媒を除去(Rf 0.1, ジクロロメタン : メタノール 9 :1)し、白色泡(0.7g, 34%)として標題化合物を得た。
1H NMR (300MHz, d6-DMSO) δ 11.62 (1H, s, N3-H), 9.48 (1H, t, br, CF3CONH), 8.48(1H, t, J5.4Hz, プロパルギル NH), 8.15 (1H, s, H-6), 6.09 (1H, app t, J6.6Hz, H-1'), 5.25 (1H, d, J4.5, 3'-OH), 5.10 (1H, t, J4.5Hz, 5'-OH), 4.22 (1H, m, H-4'), 4.07 (2H, d, J5.1Hz, プロパルギル CH2), 3.77 (1H, m, H-3'), 3.61-3.51 (2H, m, H-5'), 3.40-3.33(2H, β-ala CH2CONH part obs. by HDO), 2.37 (2H, t, J6.9Hz, β-ala CH2NHTFA), 2.10 (2H, dd, J4.8Hz, H-2'); 13C NMR (75.45MHz, d6-DMSO) δ 169.37, 161.61, 156.19 (q, J2 C-F 35.9Hz), 115.85 (q, J1C-F 286.5Hz), 98.06, 89.45, 87.62, 84.70, 74.44, 70.23, 70.13, 61.02, 35.78, 33.80, 28.58, 25.20, 8.75; MS (ES+) m/z 449 (M+H)+, 466(M+H2O)+. 
【００６４】
ii)5-N-(β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (3)
5-N-(N-トリフルオロアセチル-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (2)を室温で濃アンモニア水溶液(concentrated aqueous ammonia)中に溶解した。当該溶液を室温で一夜撹拌し得る。次いで、溶媒を真空で除去し、黄白色の泡(0.62g, 100%)として標題化合物を得た。
1H NMR (300MHz, d6-DMSO) δ 8.61 (1H, t, J5.1Hz, プロパルギル NH), 8.16 (1H, s, H-6), 6.09 (1H, app t, J6.6Hz, H-1'), 4.21 (1H, m, H-4'), 4.10 (2H, d, J5.1Hz, プロパルギル CH2), 3.79 (1H, m, H-3'), 3.59 (2H, m, H-5'), 2.96 (2H, t, J6.9Hz, β-ala CH2), 2.44 (2H, t partly obs., β-ala CH2), 2.10 (2H, m, H-2'); 13C NMR (75.45MHz, d6-DMSO) δ 169.23, 161.61, 149.41, 143.76, 97.98, 89.25, 87.64, 84.74, 74.60, 55.46, 35.31, 32.36, 28.62, 25.20; MS (ES+) m/z 353(M+H)+.
【００６５】
iii)5-N-(N-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Gly-Gly-Leu-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (4)
5-N-(β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (3) 0.1g (0.28mmol) および N-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Gly-Gly-Leuスクシンイミジルエステル (0.17g, 0.3mmol)を丸底フラスコに計って入れ、次いで、無水DMF (1mL)に溶解させた。次いで、トリエチルアミン (0.061g, 0.08mL, 0.6mmol)を加え、当該反応混合物を室温で撹拌した。２．５時間後、溶媒を真空で除去し、残渣をジクロロメタン-メタノール (9:1)中に再溶解し、ジクロロメタン-メタノール (9:1、次いで8:2)で溶出させた。それを回収し、Rf 0.5の物質(material)(8:2 ジクロロメタン : メタノール)を含む画分から溶媒を除去した。白色固体0.04g (18%)として標題化合物を得た。
1H NMR (300MHz, d6-DMSO) δ 11.60 (1H, s, br, N3-H), 8.38 (1H, t, アミド NH), 8.15 (1H, s, H-6),  7.95 (1H, t, アミド NH), 7.90 (1H, d, アミド NH), 7.88 (2H, d, J7.5Hz, Fmoc), 7.70 (2H, d, J7.5Hz, Fmoc), 7.62 (1H, t, アミド NH), 7.41 (2H, t, J7.5Hz, Fmoc), 7.30 (2H, t, J7.5Hz, Fmoc), 6.09 (1H, app t, J6.6Hz, H-1'), 5.24 (1H, d, br, 3'-OH), 5.09 (1H, t, 5'-OH), 4.29-4.18 (4H, m), 4.05 (2H, m), 3.79-3.54 (5H, m), 2.25 (2H, m, β-ala CH2), 2.10 (2H, m, H-2'), 1.51 (1H, sept., ロイシル CH2CH(CH3)2), 1.42 (2H, m, ロイシル CH2CH(CH3)2), 0.84-0.78 (6H, 2d, ロイシル CH2CH(CH3)2); MS (ES+) m/z 802(M+H)+.
【００６６】
iv)5-N-(-Gly-Gly-Leu-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (5)
5-N-(N-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Gly-Gly-Leu-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン(4)を室温で無水DMFに溶解した。次いで、ピペリジンを添加し、当該溶液を室温で一夜撹拌した。溶媒および揮発試薬を真空で除去した。当該生成物を更なる精製をすることなく使用した。MS (ES+) m/z 580(M+H)+.
【００６７】
v)5-N-[N-(6-フルオレセイン-5(および-6)カルボキサミドヘキサノイル)-Gly-Gly-Leu-β-アラニル]-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (6)
5-N-(-Gly-Gly-Leu-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (5) (11.2 μmol)および6-(フルオレセイン-5(および 6)カルボキサミドヘキサン酸スクシンイミジルエステル (0.098g, 16.8μmol)を室温でDMF (0.2mL)に溶解した。トリエチルアミン (3μL, 22.4μmol)を添加し、その溶液を室温で一夜静置した。溶媒および揮発性試薬を真空で除去した。当該残渣をジクロロメタン-メタノール-酢酸 90:9:1で洗浄し、反応していない色素および残ったトリエチルアミンを除いた。次いで、当該固体残渣をメタノール-水に溶解し、逆相HPLC(定組成水(isocratic water)-メタノール 1:1 / C18 固定相)で精製した。適当な画分を凍結乾燥した後橙色のパウダーとして標題化合物(5.3μmol)を得た。
1H NMR (300MHz, d4-MeOH) δ 8.47 (1H, s), 8.28 (1H, s), 8.20-8.00 (3H, m), 7.31 (1H, d), 7.10-7.00 (4H, m), 6.21 (1H, app t, H-1'), 4.6 (1H, m), 4.30 (2H, m), 4.21 (2H, d, プロパルギル CH2), 3.9-3.6 (7H, m, グリシル α-H, H-5', ロイシル α-H), 2.5-2.1 (6H, m, H-2', β-ala CH2, カプロアミド CH2CONH), 2.75-1.4 (12H, カプロアミド CH2, ロイシル CH2CH(CH3)2), 0.80 (6H, 2d, ロイシル CH2CH(CH3)2); MS (ES+) m/z 1051(M+H)+; UV λmax 498nm (MeOH-NH4OH, pH9).
【００６８】
vi)5-N-[N-(6-フルオレセイン-5(および-6)カルボキサミドヘキサノイル)-Gly-Gly-Leu-β-アラニル]-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジントリホスフェート
確立されているトリホスフェート合成(例えば、K. Burgess & D. Cook., Chem. Rev. 2000, 100, 2047-2059およびその文献で引用されている文献参照)を用い、5-N-(N-フルオレニルメチルオキシカルボニル-Gly-Gly-Leu-β-アラニル)プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン (4)を色素-標識化トリホスフェートに変換し得る。次いで、化合物(4)のそのトリホスフェートを、化合物(5)の調製に用いた条件と同じ条件下、ピペリジンで処理し得、次いで、化合物(6)の調製のため上記のように標識した。
【００６９】
実施例２: 5-N-[N-(6-フルオレセイン-5(および-6)カルボキサミドヘキサノイル)-Gly-Gly-Leu-β-アラニル]-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン(FamHex-GGL-β-A2'dU)のプロテアーゼ仲介切断
図２は、プロテアーゼ酵素、サブチリシンによるFamHex-GGL-β-A2'dUの加水分解切断を示す。化合物６は、ロイシン残基で切断するサブチリシン(サブチロペプチダーゼＡ(Subtilopeptidase A), VIII型, Sigma Chemical Company, UK)によって37℃、pH7.5での２時間のインキュベーションで容易に消化され、図に示したヌクレオシドおよび色素標識産物が生ずる。
【００７０】
実施例３: ペニシリンアミダーゼ切断可能リンカーを用いるヌクレオチド合成
図３は、ペニシリンアミダーゼ切断可能リンカーを用いヌクレオチドを作成する反応スキームである。
5-ヒドロキシメチル-5',3'-ジ-O-p-トルイル-2'-デオキシウリジン (7)(確立されている方法で作成(T. Ueda, Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Vol. 1.Ed. L. B. Towensend)およびN-[α-チオエチル-N'-トリフルオロアセチルアミノプロピル ベンズアミド]フェニルアセトアミド (8)(Flitsch et. al., Tetrahedron Letters 1998, 39, 3819-3822 およびその文献で引用されている文献; Flitsch et. al. WO 97/20855)を、N-ヨードスクシンイミドの存在下で合わせ、化合物(9)を得ることができる。当該化合物(9)をナトリウムメトキシドのメタノール溶液で処理し、その後、トリフルオロ酢酸エチルのメタノール溶液で処理することにより、当該化合物(9)を中間体(10)に変換し得る。確立されているトリホスフェート合成条件(例えば、K. Burgess, D. Cook. Chem. Rev. 2000, 100, 2047-2059およびその文献で引用されている文献参照)でヌクレオシド(10)をトリホスフェート(11)に変換し得る。次いで、適当な緩衝性水溶液中で、6-[フルオレセイン-5(および-6)-カルボキサミドヘキサン酸スクシンイミジルエステルのような独占的に販売されている標識試薬に化合物(11)を接触させて当該トリホスフェートをレポーター基で標識し、(12)を作成し得る。
【００７１】
実施例４: DNA ポリメラーゼアッセイ
DNAポリメラーゼによる蛍光標識デオキシヌクレオチドトリホスフェートの取り込み
(i)材料
以下のオリゴヌクレオチド(Interactiva Biotechnologie, Germany)をヌクレオチド組み込みのアッセイに使用した。
プライマー配列:-
【化６】
2005517646.tif 000008
鋳型オリゴヌクレオチド:-
【化７】
2005517646.tif 000009
【００７２】
蛍光標識したヌクレオチドは以下の源から得た:-
Molecular Probes Inc:
TE中に1mMのAlexa Fluor 546-14-dUTP
TE中に1mMのAlexa Fluor 568-5-dUTP
TE中に1mMのAlexa Fluor 594-5-dUTP
【００７３】
Nen, UK:
フルオレセイン-12-dUTP
クマリン-5-dUTP
テトラメチルローダミン-6-dUTP
テキサスレッド-5-dUTP
リサミン-5-dUTP
ナプトフルオレセイン-5-dUTP
フルオレセインクロロトリアジニル-4-dUTP
ピレン-8-dUTP
ジエチルアミノクマリン-5-dUTP
【００７４】
Amersham Biosciences, UK:
Cy3 dUTP 
Cy5 dUTP 
【００７５】
(ii)オリゴヌクレオチド標識
製造者プロトコールに従い、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Amersham Biosciences)を用い、オリゴヌクレオチド１を[ガンマ-33P]ATP (Amersham Biosciences)で標識した。
【００７６】
(iii)プライマー伸張反応
それぞれの20μlプライマー伸張反応物には、1x(最終濃度)Thermosequenase(商標)緩衝液(Amersham Biosciences)、0.05mM(最終濃度)33P標識オリゴヌクレオチド1、0.125mM(最終濃度)鋳型オリゴヌクレオチド、0.125mM(最終濃度)色素標識ヌクレオチドおよび0.165ユニット(最終濃度)の酵素が含まれており、それらは、0.5ml 熱サイクリングマイクロチューブ中で合わせた。当該反応物を95℃で1分間変性させ、その後、48℃で45分間インキュベーションした。
【００７７】
0.1%(w/v)キシレンシアノール、0.1%(w/v)ブロモフェノールブルーおよび80%フォルムアミドを含む停止緩衝液5μlを加え、反応停止した。当該反応物を3分間90℃に加熱し、次いで氷冷した。
【００７８】
1xTBE中の14%変成ポリアクリルアミドゲル(それぞれSequagel, Flowgen Ltd, UK and Sigma Chemical Co., UK)を、1x TBEランニング緩衝液中、30分間40W定電力(constant power)でプレランした。次いで、変成反応物の8μlアリコートを各レーンにアプライし、サンプルを1.5時間40W定電力で電気泳動した。当該ゲルを蛍光スクリーン(Amersham Biosciences)に1時間さらし、イメージを、Storm(商標) Imager (Amersham Biosciences)で製造者ガイドラインに従って検出した。
【００７９】
(iv)結果
４種類の標識ヌクレオチドすべてをThermosequenaseを用い組み込んだ。鋳型２、３、４および５には、それぞれ１、２、３、または８連続のA残基があった。連続している蛍光標識ヌクレオチドの数は鋳型および蛍光種に依存し、以下に要約する。
【表１】
2005517646.tif 000010
【００８０】
当該鋳型に３以上の連続dA残基(オリゴヌクレオチド4および5)がある場合ですら、加えたヌクレオチドの数は明らかに２塩基未満であった。二番目の塩基付加の効率は、結合した標識に依存するように思われた。クマリンなどの幾つかの蛍光では、２連続の塩基付加は比率が非常に高いように思われた。
【００８１】
実施例５: 5-N-[N-(6-フルオレセイン-5(および-6)カルボキサミドヘキサノイル)-Gly-Gly-Leu-β-アラニル]-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジン(6)(FamHex-GGL-β-A-2'dU)のプロテアーゼ仲介切断
基質FAMHEX-GGL-β-A 2'dU(上記の化合物6)の10μgアリコートを、5mM 酢酸カルシウムを含む0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液pH 7.5に溶解した。当該基質溶液を、サブチリシン(サブチロペプチダーゼＡ, VIII型, Sigma Chemical Co. UK)0.5ユニットを含む200μl中、37℃で2時間消化した。
【００８２】
得られた消化物をMicrocon YM10 Concentrator (Milipore Ltd., UK)で限外濾過し、濾液を、Sephasil(商標)ペプチドC-18カラム(Amersham Biosicences, UK)を装着したHPLC (Gilson 170, Gilson, UK)で分析した。438 nmで４つの吸収ピークが当該基質および生成物で観察された。これらは、50%から70%のアセトニトリル勾配によって29.8(I)、32.6(II)、26.7(III)および37.1(IV)分間で溶出した。当該ピーク群を回収し、MALDI-TOFマススペクトロメトリー(Bruker Biflex II, Brucker, Germany)で分析した。アセトニトリル中の10mg/ml 3-ヒドロキシケイ皮酸および1% TFAによるマトリクスを分析に使用した。当該マススペクトロメーターは、100mM Bradykinin 1-7 (Sigma Chemical Co., UK)でキャリブレートした。
【００８３】
消化されていない基質が有意なピーク(I)となっており、そのピークには未処理基質分子が含まれていることがマススペクトロメトリーで判った。残りの他のピークは、おそらく合成工程の残りである未処理分子のコンポーネントに対応していた。サブチリシンによる基質消化の後、ピークIは実質的に減少し、ピークIIは438nmの吸光度が増加した。後者のピークには分子量717の分子イオンが含まれており、それらのイオンは、基質のロイシン残基のカルボキシル側のペプチド結合を加水分解することにより生ずる蛍光リンカー部分に相当した。これらはサブチリシン酵素によるリンカー切断と一致した。ピークIIIおよびIVには目に見えた変化はなく、これは、それらはプロテアーゼ酵素の基質とはならないことを示唆する。
【００８４】
実施例６: プロテアーゼ切断可能リンカーを用いた色素標識ヌクレオシド調製
プロテアーゼ切断可能リンカーでの使用が適当なリンカーモチーフを調製し、以下の手順で同定した。
(i)一般的なライブラリーアミノ酸の結合手順
5-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジンをロードしたポリスチレン樹脂を、標準的な固相化学的方法で調製した。当該樹脂は、21の使い捨てフィルター容器(容器あたり10-20 mg)に分配した。当該樹脂が入っているフィルターチューブを真空マニフォールドに置き、DCMを加え当該樹脂を活性化(swell)させ、余分なものは破棄した。同定目的でミクロタグを当該容器に加えた。Fmoc-AA-OH(またはFmoc-Ahx-OH)、DICおよびHOBtのDCM/DMF溶液を調製した。活性化アミノ酸の適当な溶液を加え、当該反応容器(当該マニフォールドと結合した)をフラットベッドシェーカーに水平においた。当該容器を3-3.5時間激しく撹拌した。当該反応混合物を当該容器から取り出し、当該樹脂をDMF (5 x 1ml)、DCM (5 x 1ml)、MeOH (5 x 1ml)、Et2O (3 x 1ml)、(洗浄の体積はフィルターチューブあたりで表している)で洗浄した。
【００８５】
(ii)一般的なライブラリーFmocの脱保護の手順
DMFを当該容器に加え当該樹脂を活性化(swell)させ得る。破棄後、DMF中のDMF 20% ピペリジンを加え、当該容器を１時間撹拌し続けた。脱保護混合物を破棄し、当該樹脂をDMF(5 x 1ml)、DCM(5 x 1ml)、MeOH(5 x 1ml)、Et2O(3 x 1ml)で洗浄した。
【００８６】
アミノ酸結合およびFmoc脱保護手順を、それぞれのチューブに加えた種々の組合せの活性化アミノ酸を用いて繰り返し行い、化合物のライブラリーを作成した。すべての当該樹脂部分には最後にFmoc-Ahx-OHアミノ酸を加えた。最後のFmoc脱保護後、以下の手順により、当該化合物を色素で標識し、固体支持体から切断した。
【００８７】
(iii)一般的なフルオロホア結合手順
フルオレセインイソチオシアネート異性体IおよびNEt3のDMF(1 ml)溶液を事前に活性化(pre-swollen)させた樹脂(DMF)に加えた。当該樹脂を一夜撹拌し、次いで、DMF(5 x 1 ml)、DCM(5 x 1 ml)、MeOH(5 x 1 ml)およびEt2O (5 x 1 ml)で洗浄した。
【００８８】
(iv)一般的な切断手順
DCM (0.2 ml)中の5% TFAを樹脂(8から14 mg)に加え、2分間静置した。DCM (0.3 ml)を加え、当該樹脂を3分間静置し、その後、DCM/TFA混合物を回収した。DCM (0.2 ml)中の5% TFAを添加し、当該樹脂を2分間静置した。MeOHを一滴およびDCM(0.3 ml)を加え、当該樹脂を3分間静置した。この切断手順を繰り返し(x〜3回)、可能な限り化合物を放出させた。HPLCで測定すると平均ローディングは0.430 mmole/gであった。
【００８９】
(v)プロテアーゼ切断アッセイ
調製したすべての化合物を、好ましいプロテアーゼの選択によりアッセイし、最も適するリンカー／プロテアーゼの組合せを決定した。ヌクレオシド約10μgの水溶液(5μl)を、プロテアーゼ酵素に適する緩衝液中で、当該酵素１ユニット(酵素ストック溶液によって1-3μl)と混合した。溶液の最終体積は200μlとした。次いで、酵素に最適の温度に当該溶液を2時間保持し、次いで、遠心分離で当該溶液を、10,000D分子量の大きさのものは除去する膜[Amicon Microcon YM-10]に通し、当該酵素を除いた。適当なプロテアーゼ基質反応物および標準コントロール溶液をまた同じ方法で調製し処理した。すべての溶液を、C18逆相h.p.l.c(0.1%TFA/水: 0.042%TFA/アセトニトリル、95:5-0:100直線状勾配)を用い分析した。当該リンカーの完全な切断は、幾つかの新規産物がh.p.l.c.で見られるときに確認され、その一部はヌクレオシドクロモホアのみを保有するものもあった。
【００９０】
(vi)プロテアーゼ切断可能リンカーを用いる、典型的な色素標識ヌクレオチドトリホスフェートの調製
適当なリンカーモチーフをヌクレオシドライブラリーから選択した後、プロテアーゼ切断可能リンカーを組み込むように色素標識ヌクレオチドトリホスフェートを下記のように調製した。
a)色素リンカー基の調製
式IIによる、色素リンカー基の一例の合成は下記の通りである。
【００９１】
Cy5 カルボン酸(100mg, 0.17mmol)[Amersham Biosciences]およびN,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボレート(57mg, 0.19mmol)[Fluka]を、オーブン乾燥した丸底フラスコに計って入れた。次いで、無水ジメチルスルホキシド(250μl)[Aldrich]を添加し、当該固形物を溶解した。次いで、純粋(Neat)なジイソプロピルエチルアミン(32mg, 0.25mmol, 43μl)[Aldrich]を加えた。次いで、生じた溶液を4時間室温で撹拌した。出発物質(Rf 0.2)からN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(Rf 0.5)への完全な変換を薄層クロマトグラフィー(4:1 ジクロロメタン:メタノール)で確認した。H2N-GlyGlyLeu-OH(42mg, 0.17mmol)[Bachem]溶液を、無水ジメチルスルホキシド中のペプチドを60℃で加熱することにより調製した。次いで、溶液を室温に冷却し、次いで、Cy5-カルボン酸 N-ヒドロキシスクシンイミジル エステル溶液に直ちに加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌した。薄層クロマトグラフィー(4:1 ジクロロメタン:メタノール)による分析により、活性エステル(Rf 0.5)から、薄層クロマトグラフィーに固定された新規生成物への完全変換を確認した。次いで、大半の溶媒を真空により除去し、暗い青色オイルの粗生成物を得た。当該オイルをメタノール(80μl)中に再溶解した。次いで、当該溶液の半分をフラッシュシリカゲルカラムの上部に加え、次いで、ジクロロメタン:メタノール:酢酸79:20:1の溶液で溶出させた。画分を回収し、青色がかった化合物が最も多い画分をプールした。次いで、溶媒を真空下で除去し、暗い青色の固体として精製したCy5-GlyGlyLeu複合物を得た。
δH (CD3OD, 300MHz) 8.3(2H, 2t, ビニル性), 7.8(2H, m, 芳香性), 7.6-7.3(5H, m, 芳香性), 6.6(1H, t, ビニル性), 6.4(1H, d, ビニル性), 6.2(1H, d, ビニル性), 4.4(1H, m, ロイシン α-H), 4.1(2H, dd, -C4H8CH2CONH), 4.0(1H, d, Gly a-H), 3.8(2H, s, Gly a-H), 3.7(1H, d, Gly a-H), 3.6(3H, s, CH3N+), 2.4(2H, dd, CH2N), 2.0-1.5(9H, m, 4xCH2, Leu CH(CH3)2), 0.85(6H, s, Leu CH(CH3)2);  δC (CD3OD, 75.45MHz) 177.5, 176.2, 174.3, 172.2, 156.6, 155.0, 145.9, 143.3, 143.1, 142.7, 142.1, 129.9, 128.0, 127.3, 126.9, 123.5, 121.2, 112.7, 110.8, 105.7, 104.1, 56.8, 55.8, 51.0, 45.2, 43.7, 42.9, 36.3, 31.4, 28.3, 27.8, 27.3, 26.1, 23.8, 22.2, 18.0, 13.1; λmax 642nm.
【００９２】
b)色素-リンカー基とヌクレオシドの結合
Cy5-GlyGlyLeu-OH(3.1mg, 3.9μmol)およびN,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボレート(1.4mg, 4.7μmol)[Fluka]を1mLプラスチックチューブ中に計って入れた。次いで、無水ジメチルスルホキシド(50μL)[Aldrich]を加え、その後、ジイソプロピルエチルアミン(0.74mg, 5.8μmol, 1μl) [Aldrich]を加えた。当該反応混合物を激しく撹拌し、次いで、室温で一時間静置した。無水ジメチルスルホキシド(50μl)中の5-アリルアミノ-2'-デオキシウリジン-5'-トリホスフェートトリエチルアンモニウム塩(3.8mg, 4.1μmol)溶液を加えた。当該溶液を激しく撹拌し、次いで、室温で静置し得る。当該反応物を逆相h.p.l.cでモニターし、少量の新規物質の存在を確認した。当該反応混合物を0.1M 重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)緩衝液で希釈し、凍結乾燥し、粘着性の残渣を得た。次いで、当該残渣を水(200μl)に再溶解し、次いで、準備した逆相h.p.l.cカラム(30分間の0.1M TEAB-アセトニトリル95:5-0:100の直線状勾配)で溶出させた。新規物質を含む画分を回収し凍結乾燥した。更なる精製をイオン交換h.p.l.cで行い、凍結乾燥後に青色の泡として望ましい産物を得た。
δH (D2O, 300MHz) 7.9-7.1 (8H, m, 芳香性), 6.4-5.9 (5H, m, ビニル性), 6.1 (1H, obs, H-1'), 4.3-3.0(9H, m), 2.2(2H, m, H-2'), 2.0-1.5 (3H, m), 0.8 (6H, m); δP (D2O, 300MHz) 6.3, -11.1, -21.7; λmax 644nm.
【００９３】
(vii)サブチリシンによるリンカー切断
ヌクレオシド約10μgの水溶液(5μl)を、サブチリシン酵素に適する緩衝液中で、当該酵素１ユニット(酵素ストック溶液0.5U μl-1を2μl)と混合した。次いで、酵素に最適の温度に当該溶液を2時間保持し、次いで、遠心分離で当該溶液を、10,000D分子量の大きさのものは除去する膜[Amicon Microcon YM-10]に通し、当該酵素を除いた。適当なサブチリシン基質反応物および標準コントロール溶液をまた同じ方法で調製し処理した。濾液を、C18逆相h.p.l.c(0.1%TFA/水: 0.042%TFA/アセトニトリル、95:5-0:100直線状勾配)を用い分析した。当該リンカーが完全に切断すると、4.2 および 25.2分に新規産物が生じた(出発物質の保持時間＝24.2分間)。4.2分の当該ピークには、ヌクレオチドクロモホアのみが含まれていた。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】式Iの化合物を合成する反応スキームを示す。
【図２】式Iの化合物の酵素切断を示す。
【図３】ペニシリンアミダーゼ切断可能リンカーを伴うヌクレオチドの合成の反応スキームを示す。
【配列表】
2005517646.tif 000011
2005517646.tif 000012
【図１】
2005517646.tif 000015
【図２】
2005517646.tif 000016
【図３】
2005517646.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月15日(2003.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロラーゼ酵素で切断が可能な連結基を介してレポーター部分がヌクレオシドの塩基に結合していることを特徴とする、ポリメラーゼ活性を制限する機能をも有するレポーター部分を含むヌクレオシド、ここで、当該ヒドロラーゼ酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択される。
【請求項２】
式I
【化１】
2005517646.tif 000018
[式中、
Rはレポーター部分であり、
L1およびL5は任意の連結基であり、それぞれ、N、OおよびSのような他の原子をも含み得る炭化水素鎖を含む１以上の原子を含み、
L2およびL4は１以上のアミノ酸残基を含む任意の連結基であり、
L3はヒドロラーゼ酵素により酵素加水分解可能である連結基である]で示される、請求項１の化合物、
ここで、加水分解の切断は、当該連結基内または当該連結基に隣接して生じ得る、そしてヒドロラーゼ酵素がエステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択されることに特徴づけられる。
【請求項３】
連結基L3の酵素加水分解により、化学的に加水分解される不安定部分が生ずる、請求項２の化合物。
【請求項４】
当該塩基が、プリンまたはピリミジンを含み、特に塩基A、C、G、UおよびTまたはそれらの類似体のいずれかを含む、請求項２または３の何れかの化合物。
【請求項５】
当該糖がリボースまたはデオキシリボースまたはその類似体を含む、請求項２から４の何れかの化合物。
【請求項６】
モノ−、ジ−、またはトリ−ホスフェート基が当該糖と結合している、請求項２から５の何れかの化合物。
【請求項７】
トリホスフェート基が当該糖と結合している、請求項６の化合物。
【請求項８】
当該ペプチダーゼが、サブチリシン、プロテイナーゼK、エラスターゼ、ネプリリシン、サーモリシン、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼおよびウロキナーゼからなる群から選択される、請求項２から７の何れかの化合物。
【請求項９】
L3は、アラニン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-ロイシン、グリシン-ロイシン-セリン、グリシン-セリン-アラニン-アラニン-ロイシンおよびグリシン-アラニン-グリシン-ロイシンからなる群から選択したペプチドである、請求項２から８の何れかの化合物。
【請求項１０】
Rは、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、BODIPY(登録商標)色素、フェノキサジン色素、シアニン色素、アクリドン色素およびスクアレート色素からなる群から選択される、フルオロホアである、請求項２から９の何れかの化合物。
【請求項１１】
式II
【化１】
2005517646.tif 000019
[式中、
Rはレポーター部分であり、
L1およびL5は任意の連結基であり、それぞれ、N、OおよびSのような他の原子をも含み得る炭化水素鎖を含む１以上の原子を含み、
L2およびL4は１以上のアミノ酸残基を含む任意の連結基であり、
L3はペプチダーゼ酵素による酵素加水分解に感受性である連結基である]
の化学中間体。
【請求項１２】
L3は、アラニン-アラニン-アラニン、アラニン-アラニン-ロイシン、グリシン-ロイシン-セリン、グリシン-セリン-アラニン-アラニン-ロイシンおよびグリシン-アラニン-グリシン-ロイシンからなる群から選択される、請求項１１の化学中間体。
【請求項１３】
Rは、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、BODIPY(登録商標)色素、フェノキサジン色素、シアニン色素、アクリドン色素およびスクアレート色素からなる群から選択される、請求項１１または１２の何れかの化学中間体。
【請求項１４】
化合物、5-N-[N-(6-フルオレセイン-5(および-6)カルボキサミドヘキサノイル)-Gly-Gly-Leu-β-アラニル]-プロパルギルアミノ-2'-デオキシウリジントリホスフェート。
【請求項１５】
請求項６の少なくとも１つの化合物を含むことを特徴とする、ヌクレオチドのセット。
【請求項１６】
４つの天然塩基A、G、CおよびTのそれぞれ、およびそれらの類似体を含む、請求項１５のヌクレオチドのセット。
【請求項１７】
種々の塩基を有する請求項６の化合物のうちの少なくとも２つの化合物を更に含み、各化合物は種々のレポーター部分、Rを有することを特徴とする、請求項１５または１６の何れかのヌクレオチドのセット。
【請求項１８】
請求項６の４種の化合物であって、それぞれの化合物は、塩基A、G、CおよびTのそれぞれまたはその類似体が存在するよう、互いに異なる塩基を有し４種の化合物それぞれが、その他の３つの塩基を有するそれぞれの化合物のレポーター部分と識別できるレポーター部分を有することを特徴とする当該４種の化合物を含む、請求項１５から１７の何れかのヌクレオチドのセット。
【請求項１９】
核酸分子配列決定の方法であって、
a)プライマーおよび鋳型の複合体を固相に固定化すること、
b)請求項６の化合物の存在下ポリメラーゼと共にインキュベーションすること、
のステップを含む当該方法。
【請求項２０】
c)請求項６の化合物の組み込みを検出すること、
d)ヒドロラーゼ酵素の存在下、酵素切断可能基L3の酵素切断に適する条件でインキュベーションすること、
のステップを更に含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
ヒドロラーゼ酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
当該ペプチダーゼは、サブチリシン、プロテイナーゼK、エラスターゼ、ネプリリシン、サーモリシン、パパイン、プラスミン、トリプシン、エンテロキナーゼおよびウロキナーゼからなる群から選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
e)ステップa)-d)を繰り返すこと、
を更に含む、請求項１９から２２の何れかの方法。
【請求項２４】
当該化合物の組み込みは、当該化合物に結合した単一のレポーター基の検出により測定される、請求項１９から２３の何れかの方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
既知ヌクレオチド類似体を使用すると多くの不利益が生ずる。
当該糖部分に連結基を介して結合するレポーター基を有するヌクレオシドの開示が当分野には多くある(例えば、EP0850949、WO97/00967、WO99/64437、US5,998,603)。
同様に、当該塩基に連結基を介して結合するレポーター基を有するヌクレオシドについての他の報告が当分野にある(例えば、WO 88/10264、Conflone (J Heterocyclic Chem, 1990, 27, 31-46)、Sauer et al. (J Chem Soc, Faraday Trans, 1999, 1, 2471-2477)、Prober et al (Science, 1987, 238, 336-341)およびTong et al (J Org Chem, 1993, 58, 2223-2231)。しかし、これらの文書のうち、ヒドロラーゼ酵素という手段による当該連結基の切断を示唆または証明するものはない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
従って、第一の態様では、本発明は、ヒドロラーゼ酵素で切断が可能な連結基を介してレポーター部分がヌクレオシドの塩基に結合していることを特徴とする、ポリメラーゼ活性を制限する機能をも有するレポーター部分を含むヌクレオシドを提供し、ここで、当該ヒドロラーゼ酵素は、エステラーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、グリコシダーゼおよびホスホリラーゼからなる群から選択される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
好ましい実施態様では、当該レポーター部分は、蛍光特性を有し、感度のよい蛍光検出器を用い検出できる。それは、フルオロホア、例えば、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、BODIPY(登録商標)色素、フェノキサジン色素、シアニン色素、およびスクアレート(squarate)色素(例えばWO 97/40104に開示)であり得る。好ましくは当該色素は、WO02/099424およびWO02/099432に記載のようなアクリドン(acridone)誘導体である。最も好ましくは、当該レポーター部分はシアニン色素である。例えば、米国特許5,268,486に開示のシアニン色素類("Cy色素(商標)"と称する場合もある)は、生物適合性フルオロホアシリーズであり、それは、高い蛍光発光、環境安定性、および当該フルオロホアの内部分子骨格を変化させることにより選択され得る赤外線近辺にまで広がる発光波長域を特徴とする。


【手続補正書】
【提出日】平成16年7月23日(2004.7.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005517646000001.app
【国際調査報告】
2005517646.tif 000020
2005517646.tif 000021
2005517646.tif 000022
2005517646.tif 000023
2005517646.tif 000024
2005517646.tif 000025
2005517646.tif 000026