(57)【要約】本発明は、目的の分析物のイムノアッセイのための組成物及び方法に関する。分析物は、３種以上の抗体を用いるイムノアッセイにおいて検出されるが、各抗体は分析物上の異なるエピトープに特異的に結合するものである。目的の分析物が急性疾患の臨床マーカーである場合には、イムノアッセイによる該分析物の検出は、該疾患の発症の診断となる。
2005534907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３種の異なる抗体を含む、分析物を検出するためのイムノアッセイ組成物であって、少なくとも３種の異なる抗体が分析物上の少なくとも３種の異なるエピトープと結合可能であり、少なくとも３種の異なる抗体の少なくとも２種は該分析物の派生型（subform）上の少なくとも２種の異なるエピトープと結合可能であり、分析物上の少なくとも３種の異なるエピトープの少なくとも１種は該派生型上の結合に利用不可能である、上記組成物。
【請求項２】
ｍ種の異なる抗体を含む、分析物を検出するためのイムノアッセイ組成物であって、
（ａ）ｍ種の異なる抗体の少なくともｎ種は分析物上のｎ種の異なるエピトープに結合可能であり、
（ｂ）該分析物上のｎ種の異なるエピトープのｎ−１種未満は該分析物の派生型上の結合に利用可能なものであり、
ここで、ｍ及びｎは３と等しい又はそれ以上であり、ｍはｎと等しい又はそれ以上である、上記組成物。
【請求項３】
分析物が、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＴｎＣ、ＣＫ−Ｍ、ＣＫ−Ｂ、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＣＲＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＰＳＡ、ＰＣＡ、アポリポタンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項４】
少なくとも３種の抗体の少なくとも１種が、全長抗体、一本鎖抗体、又は抗体フラグメントを含む、請求項１記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項５】
抗体フラグメントがＦａｂフラグメントを含む、請求項４記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項６】
分析物がｃＴｎＩである、請求項１記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項７】
少なくとも３種の抗体の少なくとも１種と複合する共通メンバーをさらに含む、請求項１記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項８】
少なくとも３種の抗体の少なくとも１種が共通メンバーと共有結合している、請求項７記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項９】
共有結合が架橋剤に由来する架橋リンカーを含む、請求項８記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１０】
架橋剤が、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ［６−アミドカプロエート］、グルタルアルデヒド、アジピン酸ジヒドラジド、ビス−ジアゾ化ベンジジン、１，４−ブタンジグリシジルエーテル、ビス−マレイミドヘキサン、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アジドサリチル酸を含む、請求項９記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１１】
共通メンバーが微粒子である、請求項７記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１２】
微粒子が、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリスチレン／アクリル酸ビーズ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１１記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１３】
共通メンバーがシグナル生成エレメントを含む、請求項７記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１４】
シグナル生成エレメントが、放射性標識、金属粒子、蛍光色素、発色色素、標識化タンパク質、酵素、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１３記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１５】
酵素が、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１４記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１６】
シグナル生成エレメントと複合した少なくとも３種の抗体の少なくとも１種のモル比が約１：１〜約１０：１である、請求項１３記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１７】
シグナル生成エレメントと複合した少なくとも３種の抗体の少なくとも１種のモル比が約３：１である、請求項１６記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１８】
少なくとも３種の抗体の少なくとも２種がシグナル生成エレメントと複合している、請求項１３記載のイムノアッセイ組成物。
【請求項１９】
シグナル生成エレメントと複合した少なくとも３種の抗体の少なくとも２種のモル比が１：１〜１０：１である、請求項１８記載のイムノアッセイ組成物。 
【請求項２０】
４種の異なる抗体を含む、分析物を検出するためのイムノアッセイ組成物であって、４種の異なる抗体が分析物上の４種の異なるエピトープと結合可能であり、該分析物上の４種の異なるエピトープの少なくとも１種は該分析物の派生型上の結合に利用不可能であり、４種の異なる抗体の第１抗体及び第２抗体は表面に結合され、４種の異なる抗体の第３抗体及び第４抗体はそれぞれ酵素と複合され、第１抗体及び第２抗体の少なくとも１つは該分析物の派生型上の少なくとも１種のエピトープと結合可能であり、第３抗体及び第４抗体の少なくとも１つは該派生型上の少なくとも１種のエピトープと結合可能である、上記組成物。
【請求項２１】
分析物を検出するためのイムノアッセイ組成物であって、ｍ種の異なる抗体を含み、
（ａ）ｍ種の異なる抗体のｎ種が分析物上のｎ種の異なるエピトープと結合可能であり、
（ｂ）該分析物上のｎ種の異なるエピトープのｎ−１種未満が該分析物の派生型上の結合に利用可能であり、
（ｃ）ｎ種の異なる抗体のｐ種が表面と結合しており、
（ｄ）ｎ種の異なる抗体のｐ種がそれぞれ抗体と複合しており、
（ｅ）ステップ（ｃ）におけるｐ種の抗体の少なくともｐ−１種が該分析物の派生型上の少なくともｐ−１種の異なるエピトープと結合可能であり、そして
（ｆ）ステップ（ｄ）におけるｐ種の抗体の少なくともｐ−１種が該分析物の派生型上のｐ−１種の異なるエピトープと結合可能であり、
ただしｍ及びｎは４であり、ｐは２である、上記組成物。
【請求項２２】
１以上の感知エレメント、及び分析物の検出のためにイムノアッセイを行いうる少なくとも１つの表面を含むイムノアッセイ装置であって、少なくとも１つの表面が少なくとも２種の異なる抗体を含み、少なくとも２種の異なる抗体が分析物上の少なくとも２種の異なるエピトープと結合可能であり、少なくとも２種の異なる抗体の少なくとも１種は該分析物の派生型上の少なくとも１種のエピトープと結合可能であり、該分析物上の少なくとも２種の異なるエピトープの少なくとも１種は該派生型上の結合に利用不可能であり、少なくとも２種の異なる抗体は少なくとも１つの表面に結合する、上記イムノアッセイ装置。
【請求項２３】
１以上の感知エレメント、及び分析物の検出のためにイムノアッセイを行いうる少なくとも１つの表面を含むイムノアッセイ装置であって、
（ａ）少なくとも１つの表面がｍ種の異なる抗体を含み、
（ｂ）ｍ種の異なる抗体の少なくともｎ種が分析物上のｎ種の異なるエピトープと結合可能であり、
（ｃ）該分析物上のｎ種の異なるエピトープのｎ−１種未満が該分析物の派生型上の結合に利用可能であり、
（ｄ）ｍ種の異なる抗体の少なくともｎ種が少なくとも１つの表面と結合し、
ただしｍ及びｎは２と等しい又はそれ以上であり、ｍはｎと等しい又はそれ以上である、上記イムノアッセイ装置。
【請求項２４】
分析物が、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＴｎＣ、ＣＫ−Ｍ、ＣＫ−Ｂ、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＣＲＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＰＳＡ、ＰＣＡ、アポリポタンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２１（ａ）記載のイムノアッセイ装置。
【請求項２５】
少なくとも１つの表面が、ガラス、半導体、プラスチック、二酸化ケイ素、光形成性ＰＶＡ、光形成性ゼラチン、膜形成ラテックス、導電性金属、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２１（ａ）記載のイムノアッセイ装置。
【請求項２６】
導電性金属が銀、イリジウム、金、白金又はこれらの組み合わせを含む、請求項２５記載のイムノアッセイ装置。
【請求項２７】
少なくとも２種の抗体の少なくとも１種が少なくとも１つの表面に吸収又は吸着されている、請求項２１（ａ）記載のイムノアッセイ装置。
【請求項２８】
少なくとも２種の抗体の少なくとも１種が少なくとも１つの表面と共有結合している、請求項２１（ａ）記載のイムノアッセイ装置。
【請求項２９】
微粒子をさらに含み、ここで少なくとも２種の抗体が微粒子と結合し、微粒子が少なくとも１つの表面と結合するものである、請求項２１（ａ）記載のイムノアッセイ装置。
【請求項３０】
少なくとも２つの微粒子をさらに含み、ここで少なくとも２種の抗体の１種のみが少なくとも２つの微粒子の１つと結合し、少なくとも２つの微粒子が少なくとも１つの表面と結合するものである、請求項２１（ａ）記載のイムノアッセイ装置。
【請求項３１】
分析物及び該分析物の派生型上の異なるエピトープと結合する第３抗体をさらに含む、請求項２１（ａ）記載のイムノアッセイ装置。
【請求項３２】
感知エレメントが、電極、バイオセンサー、電界効果トランジスタ、弾性表面波装置、導光板、光ファイバー、キュベット、放射能検出器、イムノクロマトグラフィー装置、物理的、原子力的、化学的、生化学的、電気的、若しくは光学的検出を促進する試薬、又はその組み合わせを含む、請求項２１（ａ）記載のイムノアッセイ装置。
【請求項３３】
好適な容器に少なくとも３種の異なる抗体を含むイムノアッセイキットであって、少なくとも３種の抗体が分析物上の少なくとも３種の異なるエピトープと結合可能であり、少なくとも３種の異なる抗体の少なくとも２種は該分析物の派生型上の少なくとも２種の異なるエピトープと結合可能であり、該分析物上の少なくとも３種の異なるエピトープの少なくとも１種は該派生型上の結合に利用不可能である、上記イムノアッセイキット。
【請求項３４】
好適な容器にｍ種の異なる抗体を含むイムノアッセイキットであって、
（ａ）ｍ種の異なる抗体の少なくともｎ種が分析物上のｎ種の異なるエピトープと結合可能であり、
（ｂ）該分析物上のｎ種の異なるエピトープのｎ−１種未満が該分析物の派生型上の結合に利用可能であり、
ただしｍ及びｎは３と等しい又はそれ以上であり、ｍはｎと等しい又はそれ以上である、上記イムノアッセイキット。
【請求項３５】
分析物が、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＴｎＣ、ＣＫ−Ｍ、ＣＫ−Ｂ、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＣＲＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＰＳＡ、ＰＣＡ、アポリポタンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３３記載のイムノアッセイキット。
【請求項３６】
分析物及び該分析物の派生型を含むサンドイッチイムノアッセイ製品であって、該分析物上の少なくとも３種の異なるエピトープは少なくとも３種の異なる抗体による結合に利用可能であり、３種の異なる抗体の少なくとも２種は該分析物上の異なるエピトープに結合し、該分析物上の３種の異なるエピトープの２種は該派生型上の結合に利用可能であり、３種の異なる抗体の少なくとも２種は該派生型上の異なるエピトープに結合し、該分析物上の少なくとも３種の異なるエピトープの少なくとも１種は該派生型上の結合に利用不可能である、上記サンドイッチイムノアッセイ製品。
【請求項３７】
分析物、該分析物の派生型、及びｍ種の異なる抗体の少なくとも２種を含むサンドイッチイムノアッセイ製品であって、
（ａ）該分析物が、それぞれｍ種の異なる抗体の１種と結合可能な少なくともｎ種の異なるエピトープを含み、
（ｂ）ｍ種の異なる抗体の少なくとも２種が、それぞれ該分析物上の異なるエピトープに結合し、
（ｃ）該分析物上のｎ種の異なるエピトープのｎ−１種未満が該分析物の派生型上の結合に利用可能であり、
（ｄ）ｍ種の異なる抗体の少なくとも２種が、それぞれ該分析物の派生型上の異なるエピトープと結合し、
ただしｍ及びｎは３と等しい又はそれ以上であり、ｍはｎと等しい又はそれ以上である、上記サンドイッチイムノアッセイ製品。
【請求項３８】
分析物が、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＴｎＣ、ＣＫ−Ｍ、ＣＫ−Ｂ、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＣＲＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＰＳＡ、ＰＣＡ、アポリポタンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、請求項３６記載のサンドイッチイムノアッセイ製品。
【請求項３９】
少なくとも３種の抗体の少なくとも１種、及び少なくとも２種の抗体の少なくとも１種がシグナル生成エレメントを含む、請求項３６記載のサンドイッチイムノアッセイ製品。
【請求項４０】
患者が心筋梗塞に罹患しているか否かを判定する方法であって、
（ａ）心筋梗塞の罹患が疑われる患者からのサンプルを、少なくとも２種の抗体を結合した表面に適用するステップであって、少なくとも２種の抗体がｃＴｎＩ上の少なくとも２種の異なるエピトープと結合可能であり、少なくとも２種の抗体の少なくとも１種がｃＴｎＩの派生型上の少なくとも１種の異なるエピトープと結合可能であり、ｃＴｎＩの少なくとも１種のエピトープは該派生型上の結合に利用不可能である、上記ステップ；
（ｂ）ｃＴｎＩ及び該派生型上のまた別のエピトープと結合する第３抗体を含む試薬を添加するステップ；並びに
（ｃ）第３抗体の結合の程度を測定するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項４１】
患者が心筋梗塞に罹患しているか否かを判定する方法であって、
（ａ）心筋梗塞の罹患が疑われる患者からのサンプルを、ｃＴｎＩ及びｃＴｎＩの派生型上の第１エピトープと結合可能な第１抗体を結合した表面に適用するステップ；
（ｂ）少なくとも第２抗体及び第３抗体を別々に又は一緒に添加するステップであって、少なくとも第２抗体及び第３抗体はｃＴｎＩ上の少なくとも２種の異なるエピトープと結合可能であり、少なくとも第２抗体及び第３抗体は第１エピトープに結合不可能であり、少なくとも第２抗体及び第３抗体の少なくとも１つはそれぞれｃＴｎＩの派生型上の少なくとも１種の異なるエピトープと結合可能であり、ｃＴｎＩの少なくとも１種のエピトープは該派生型上の結合に利用不可能である、上記ステップ；並びに
（ｃ）少なくとも第２抗体及び第３抗体の結合の程度を測定するステップ、
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患及び医学事象、とりわけ心筋梗塞（「ＭＩ」）の診断に関する。より具体的には、本発明は、それぞれ臨床マーカーに対して異なる特異性を有する複数の抗体を用いた疾患又は医学事象（特にＭＩ）の臨床マーカーの検出に関する。本発明はまた、疾患及び医学事象、特にＭＩの診断に使用される試薬及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性疾患の診断は、多くの場合イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）、すなわち、特に疾患の急性期中に濃度が急速に変化する場合には、生物学的液体中のタンパク質、酵素及びホルモンのような臨床マーカーの異常レベルの検出に基づいている。従って、ＭＩの発症のような急性疾患の発症を迅速かつ簡便に診断しうるＥＬＩＳＡ系は、著しく重要である。
【０００３】
過去において、ＭＩの発症を診断するための臨床マーカーには乳酸デヒドロゲナーゼ（「ＬＤＨ」）及びグルタミンオキサロ酢酸トランスアミナーゼ（「ＧＯＴ」）があるが、これらは非常に特異的なわけではなかった。ＬＤＨ及びＧＤＨに関する問題のため、ＭＩの診断のための臨床マーカーとしてクレアチンキナーゼのＭＢイソ酵素（「ＣＫ−ＭＢ」）を使用していた。しかしながら、ＣＫ−ＭＢは骨格筋及び骨格筋傷害後の血液中にも見出すことができる。従って、ＣＫ−ＭＢは心筋に対して完全に特異的ではない。ＭＩの臨床マーカーとしてのＣＫ−ＭＢの別の欠点は、骨格筋中のＣＫ−ＭＢレベルが、骨格筋の再生の程度、ＭＩの試験を行うとき又はその試験結果を分析するときに多くの場合に知ることのできない情報によって変化することである。ＣＫ−ＭＢの試験の別の欠点は、ＣＫ−ＭＢレベルが胸痛発症後に僅か２〜３日しか上昇を維持しないことである。その時点後に入院した患者にとって、ＣＫ−ＭＢ試験の価値は限定されたものであろう。従って、ＣＫ−ＭＢをアッセイする場合の特異性が欠けており、かつそれを診断ツールとして使用するための時間枠が限定されているので、ＣＫ−ＭＢはＭＩを診断するための理想的な臨床マーカーではない。
【０００４】
心臓トロポニンＩ（「ｃＴｎ１」）は、現在、ＭＩ後に極めてすぐに血清中で検出可能であり、かつＭＩ発症後２〜３日を超えて存在する正確な心臓特異的生物学的パラメーターとして使用される。トロポニンは、心臓組織中に３種のサブユニットの複合体として：すなわち、トロポニンＴ（「ＴｎＴ」）、トロポミオシン結合サブユニット；トロポニンＣ（「ＴｎＣ」）、Ｃａ２＋結合サブユニット；及びトロポニンＩ（「ＴｎＩ」）、アクトミオシンＭｇ２＋ＡＴＰアーゼを阻害するサブユニットとして存在する。ＴｎＩは、心筋及び横紋筋にカルシウム感受性を与える細いフィラメントの調節タンパク質である。
【０００５】
ヒトトロポニンＩは、３種のイソ型、すなわち、２種の骨格筋イソ型（速筋及び遅筋）（ＭＷ＝１９．８ｋＤａ）、及びＮ末端上に追加の３１残基を有して２３ｋＤａの分子量となる心臓ＴｎＩイソ型（「ｃＴｎＩ」）（２０９アミノ酸）に存在する。心臓ＴｎＩは、それがイソ型のみで存在する場合には、独特に心筋中に位置している。心臓ＴｎＩは、ヒト血清中にＭＩ後に急速（約４〜６時間以内）に出現する。それは１８〜２４時間後にピークレベルに達し、６〜１０日まで血流中で上昇したレベルを維持する。結果として、心筋から循環中に放出されたｃＴｎＩは、心筋障害に極めて特異的である。
【０００６】
血中の上昇したｃＴｎＩレベルは、ＭＩの診断、並びに他の心臓関連事象及び疾患との識別に使用することができる。ヒトｃＴｎＩを正確に検出可能なイムノアッセイ系は、ＭＩの発症を診断するための医学界に役立つであろう。ｃＴｎＩ試験の実用性に関するさらなる情報については、Ａｐｐｌｅ及びＷｕ，Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｒｅｄｅｆｉｎｅｄ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，３７７−９，（２００１）を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０００７】
心臓ＴｎＩは、タンパク質分解的切断、リン酸化、化学的酸化、化学的還元、アミノ酸残基の切断、及びアミノ酸部分の化学的修飾等の修飾の結果として、血中に複数の派生型（subform）として存在する。例えば、アミノ酸１〜２５及び１５０〜２０９は、タンパク質分解の結果として、血清中のｃＴｎＩ派生型上には一般的に見出されない。血流中を循環するｃＴｎＩの多くの異なる派生型は、他のタンパク質との複合体として見出される。Ｋａｔｒｕｋｈａ（１９９７）参照。例えば、ｃＴｎＩは、ｃＴｎＴ及びｃＴｎＣと複合体形成していることがある（「ｃＩＴＣ」）。
【０００８】
多くの場合、血流中でのｃＴｎＩの化学的修飾及び複合体形成は、ｃＴｎＩの若干の派生型上に存在するＥＬＩＳＡ試薬のための結合部位を除去又はブロックし、これによりＥＬＩＳＡ試薬のエピトープを結合できないようにする。ｃＴｎＩのエピトープ及びｃＴｎＩの不安定性に関するさらなる情報についは、Ｍｏｒｊａｎａら，Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８），２８，１０５−１１１；Ｇａｅｌｌｅ  Ｆｅｒｒｉｅｒｅｓら．Ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ：ｐｒｅｃｉｓｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），４４，４８７−４９３；Ｋａｔｒｕｋｈａら，Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ  ｉｓ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｆｒｅｅ  ｆｏｒｍ  ｂｕｔ  ａｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９７），４３，１３７９−１３８５；及びＫａｔｒｕｋｈａら，Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），４４，２４３３−２４４を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【０００９】
大部分の市販の重要な臨床マーカー分析物に関しては、分析物の特定のエピトープと結合する多くの有効なモノクローナル抗体が開発されている。抗体間の相違は、分析物と結合する特異的な位置、分析物との親和性、及びサンプル中の他の潜在的な干渉物との交差反応性である。ＥＬＩＳＡアッセイは、伝統的には、捕捉試薬又はシグナル試薬として使用するために利用可能な抗体を対で試験することにより開発されてきた。
【００１０】
ｃＴｎＩのためのＥＬＩＳＡアッセイの開発において、使用する抗体及び酵素試薬の最適化に多くの努力が費やされた。しかしながら、エピトープが、血清中に存在するｃＴｎＩの多くの派生型上の結合及び他のタンパク質との複合体形成に利用不可能であるという可能性は、ｃＴｎＩの検出を著しく困難にし、現在のＥＬＩＳＡ試薬がサンプル中の実際のｃＴｎＩレベルを過少評価する原因となる。さらに、結合に利用可能な異なるエピトープを有するｃＴｎＩの多くの異なる派生型は、現在のＥＬＩＳＡアッセイがサンプルからサンプルへの、試薬セットから試薬セットへの、そして時間の関数としての著しく異なる結果を与える原因となる。
【００１１】
従って、急性疾患事象、特にＭＩを診断するために、臨床マーカー及びその派生型、特にｃＴｎＩを検出する方法を開発する必要がある。本発明はこの必要を満たすものであり、かつ臨床マーカー及びその派生型、特にｃＴｎＩを検出するための試薬、キット及び装置を提供する。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、目的の分析物の検出に関する。目的の分析物はｃＴｎＩでありうる。本発明の例示的な実施形態において、目的の分析物の検出のためのイムノアッセイ組成物は、３種以上の抗体を含むことができるが、各抗体は分析物上の異なるエピトープと結合可能なものである。分析物と結合する３種の異なる抗体の少なくとも２種は、分析物の派生型上の少なくとも２種の異なるエピトープにも結合可能である。目的の分析物上のエピトープの少なくとも１種は、派生型上の結合に利用不可能である。
【００１３】
本発明の別の例示的な実施形態において、目的の分析物を検出するのためのイムノアッセイ装置は、２種以上の抗体を含むことができ、各抗体は該分析物上の異なる抗体と結合するものであり、そして該２種以上の抗体は少なくとも１つの表面と結合しているものである。分析物と結合する２種の異なる抗体の少なくとも１種はまた、該分析物の派生型上の少なくとも１種の異なるエピトープとも結合可能である。目的の分析物上のエピトープの少なくとも１種は、派生型上の結合に利用不可能である。
【００１４】
本発明の別の例示的な実施形態において、目的の分析物を検出するためのイムノアッセイキットは、３種以上の抗体を含むことができ、各抗体は該分析物上の異なる抗体と結合可能であるものである。分析物と結合する３種の異なる抗体の少なくとも２種は、該分析物の派生型上の少なくとも２種の異なるエピトープとも結合可能である。目的の分析物上のエピトープの少なくとも１種は、派生型上の結合に利用不可能である。
【００１５】
本発明の別の例示的な実施形態において、サンドイッチイムノアッセイ製品は、目的の分析物及び該分析物の派生型を含むことができる。分析物上の少なくとも３種の異なるエピトープは、少なくとも３種の異なる抗体との結合に利用可能である。少なくとも３種の異なる抗体は、分析物上の異なるエピトープと結合している。分析物上の３種のエピトープの少なくとも２種は、派生型上の結合に利用可能である。少なくとも３種の抗体の少なくとも２種は、派生型上の異なるエピトープと結合している。目的の分析物上のエピトープの少なくとも１種は、派生型上の結合に利用不可能である。
【００１６】
本発明の別の例示的な実施形態において、患者のサンプルを、ｃＴｎＩ上の異なるエピトープと結合する少なくとも２種の抗体を含む表面に適用することにより、患者を心筋梗塞のような急性疾患の発症について診断することができる。ここで、２種の抗体の少なくとも１種は、ｃＴｎＩの派生型上の異なるエピトープと結合可能であり、少なくとも２種の抗体の少なくとも１種のエピトープは、派生型上の結合に利用不可能である。次いで、第３抗体を添加し、これはｃＴｎＩ及び派生型上の別のエピトープと結合する。次いで、ｃＴｎＩ及び派生型への第３抗体の結合の程度を測定する。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１は、目的の分析物の検出のための標準サンドイッチアッセイを示し、捕捉抗体（Ａｂ１）及びシグナル抗体（Ａｂ２）は、目的の分析物（Ａｎ）のそれぞれ第１及び第２エピトープ（ｅ１及びｅ２）に対するものである。シグナル抗体は、基質（Ｓ）から生成物（Ｐ）への変換によるシグナル生成のために使用される酵素（Ｅｎｚ）で標識される。
【００１８】
図２は、３種のエピトープ（ｅ１、ｅ２及びｅ３）を有する目的の分析物（Ａｎ）の説明である。分析物が修飾されるか、複合体を形成するか、又は別の立体配座をとると、抗体による結合に利用不可能である１種以上のエピトープを有する派生型が生成する。結合に利用不可能である各エピトープは円で示されており、その一方で結合に利用可能であるエピトープは円なしで示されている。各派生型は、追加のエピトープが抗体による結合に利用不可能であるようにさらに修飾されていてもよい。
【００１９】
図３は、１種の捕捉抗体（Ａｂ１）及び２種以上のシグナル抗体（Ａｂ２及びＡｂ３）を用いる、目的の分析物（Ａｎ）及びその派生型を検出するための改変サンドイッチアッセイを示す。このアッセイは、該分析物、並びに捕捉抗体のための少なくとも１種のエピトープ（ｅ１）及びシグナル抗体のための少なくとも１種のエピトープ（ｅ２又はｅ３）を有する該分析物の全ての派生型の存在を検出することができる。結合のための全てのエピトープは、抗体と結合したものとして示されている。しかしながら、分析物及びその派生型は、１種だけの捕捉抗体及び検出対象の１種のシグナル抗体と結合することが必要である。
【００２０】
図４は、２種以上の捕捉抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）及び１種のシグナル抗体（Ａｂ３）を用いる、目的の分析物（Ａｎ）及びその派生型を検出するための改変サンドイッチアッセイを示す。このアッセイは、該分析物、並びにシグナル抗体のための少なくとも１種のエピトープ（ｅ３）及び捕捉抗体のための少なくとも１種のエピトープ（ｅ１又はｅ２）を有する該分析物の全ての派生型の存在を検出することができる。結合のための全てのエピトープは、抗体と結合したものとして示されている。しかしながら、分析物及びその派生型は、１種だけの捕捉抗体及び検出対象の１種のシグナル抗体と結合することが必要である。
【００２１】
図５は、２種以上の捕捉抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）及び２種以上のシグナル抗体（Ａｂ３及びＡｂ４）を用いる、目的の分析物（Ａｎ）を検出するための改変サンドイッチアッセイを示す。このアッセイは、該分析物、並びに捕捉抗体のための少なくとも１種のエピトープ（ｅ１又はｅ２）及びシグナル抗体のための少なくとも１種のエピトープ（ｅ３又はｅ４）を有する該分析物の全ての派生型の存在を検出することができる。結合のための全てのエピトープは、抗体と結合したものとして示されている。しかしながら、分析物及びその派生型は、１種だけの捕捉抗体及び検出対象の１種のシグナル抗体と結合することが必要である。
【００２２】
図６は、目的の分析物（Ａｎ）上の異なるエピトープ（ｅ１又はｅ２）と結合性であり、かつ共通メンバーと複合した１種の抗体（Ａｂ１）又は２種以上の抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）を示すが、該共通メンバーは表面（図６Ａ）、微粒子（図６Ｂ）、及び酵素のようなポリペプチド（図６Ｃ）であるものである。
【００２３】
図７は、異なる抗体（Ａｂ１又はＡｂ２）と個々に複合した共通メンバーの混合物を示し、目的の分析物（Ａｎ）上の異なるエピトープ（ｅ１又はｅ２）と結合する各抗体がアッセイされるが、該共通メンバーは微粒子（図７Ａ）又は酵素のようなポリペプチド（図７Ｂ）であるものである。
【００２４】
図８は、２種以上の抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）と複合した共通メンバー（微粒子など）を示し、これは表面のような別の共通メンバーと複合しているが、２種以上の捕捉抗体は、（ｉ）異なる微粒子と個々に複合している（図８Ａ）か、又は（ｉｉ）微粒子上で一緒に複合している（図８Ｂ）ものである。
【００２５】
図９は、アミノ酸１〜２５及び１５０〜２０９を除いた心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の派生型の一次構造を表し、またｃＴｎＩ抗体のエピトープのための位置を示す。
【００２６】
図１０は、遊離ｃＴｎＩ及び２つのレベルのｃＩＴＣを添加した全血サンプルに対する第１捕捉抗体（ＣＢ１）、第２捕捉抗体（ＣＢ２）、又は第１及び第２捕捉抗体の混合物（ＣＢ１２）を用いて調製した、種々の単一使用アッセイに由来する電流シグナルを示す。
【００２７】
図１１は、６．０ｎｇ／ｍＬのｃＩＴｃ複合体でスパイクした全血サンプルから、調製直後及び室温で１日後に、ＣＢ１又はＣＢ２で被覆したセンサー、並びに第１抗体と複合したシグナル生成酵素（ＥＣ１）、第２抗体と複合したシグナル生成酵素（ＥＣ２）、又はＥＣ１及びＥＣ２の混合物（ＥＣ１２）を用いて調製したカートリッジを使用して得られた電流シグナルを示す。
【００２８】
図１２は、ＡＬＰとＦａｂとの異なる比を有するＦａｂ−ＡＬＰ複合物に関する溶出プロフィールを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
詳細な説明
１．定義
本発明の理解を助けるために、幾つかの用語を以下に定義する。
【００３０】
「分析物」は、少なくとも３種の異なる抗体が結合可能である生物学的又は化学的物質を意味し、そして少なくとも３種の異なる抗体が結合することが可能な、該分析物の派生型を包含する。
【００３１】
「抗体」は、目的の分析物又はその派生型上のエピトープと特異的に結合するポリペプチド又はその誘導体を意味する。
【００３２】
「捕捉抗体」又は「捕捉試薬」は、目的の分析物又はその派生型と特異的に結合する抗体を意味するが、該抗体は、該分析物又はその派生型と結合する（ｉ）前、（ｉｉ）その後、又はその間（ｉｉｉ）に、表面上に固定化されているものである。
【００３３】
シグナル生成エレメントのシグナルを説明するために使用する場合の「検出する」、「検出された」又は「検出可能な」は、バックグラウンドから識別可能であるシグナルを意味する。
【００３４】
「エピトープ」は、目的の分析物又はその派生型上の抗体又は他の結合メンバーのための結合部位を意味する。エピトープは、抗体による結合のためにそのエピトープが存在しないか又は接近不可能であるならば、「結合に利用不可能」である。
【００３５】
「イムノアッセイ」又は「サンドイッチイムノアッセイ」は、同時サンドイッチ、フォワードサンドイッチ及びリバースサンドイッチイムノアッセイを意味し、かつその競合イムノアッセイを包含し、それら全ては当業者が十分に理解しているものである。
【００３６】
分析物を説明するために使用する場合の「派生型（subform）」は、化学反応の生成物、少なくとも２種の異なる抗体が結合可能である他の生物学的若しくは化学的物質、その別の立体配座、又はそれらの組み合わせとの複合体のメンバーを意味する。
【００３７】
「感知エレメント」は、シグナルを検出できる任意の手段又は装置を意味する。
【００３８】
「シグナル抗体」又は「シグナル試薬」は、目的の分析物又はその派生型と特異的に結合する抗体を意味するが、該抗体は、シグナル生成エレメントと共有結合、疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン性相互作用、ファン・デル・ワールス力、又はその組み合わせにより結合するものである。
【００３９】
「シグナル生成エレメント」は、（ｉ）検出可能なシグナルを直接若しくは間接的に生成するか、又は（ｉｉ）それ自体が検出可能である、生物学的、化学的又は放射性物質を意味する。
【００４０】
「表面」は、溶液から分離できる支持体を意味する。
【００４１】
２．分析物
本発明は、分析物又はその派生型の検出に関する。分析物は、急性疾患事象に罹患したと考えられる患者に由来する疾患状態の臨床マーカーであってよいが、該臨床マーカーは１種以上の派生型にも存在するものである。本発明により分析することのできる急性疾患状態において、目的の急性疾患事象の時点で、その後で、又はその前に、有意な量で放出される、一過性に上昇した血中物質でありうる。臨床マーカー分析物の一過性に上昇した濃度は、内因性変換因子が臨床マーカーに作用して分析物の派生型を生成すると、低下する。臨床マーカーに由来する派生型は、最初にそれぞれが生成され、次いで内因性変換因子により代謝されるので、連続的に一過性に上昇することがある。一過性上昇の期間は、短くて２〜３時間ないし長くて数週間であってよい。
【００４２】
分析物は、心臓発作、卒中のような急性疾患事象の場合、又は骨折若しくは血腫のような外傷の場合に、少量で放出される生物学的物質（例えばタンパク質、糖タンパク質、酵素など）であってよい。分析物は、通常はこのような増加量で存在することがなく、内因性変換因子により経時的に１種以上の派生型に変換されうる。内因性変換因子は、限定されるものではないが、タンパク質分解切断、リン酸化、化学的酸化、化学的還元、アミノ酸残基の切断、及びアミノ酸部分の修飾がある。分析物は、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＣＫ−Ｍ、ＣＫ−Ｂ、ミオグロビン、ｈＣＧ、ＴＳＨ、ＦＳＨ、肺炎球菌性ＰＣＡ、アポリポタンパク質、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、脳ナトリウム排泄性タンパク質（ＢＮＰ）及びそのプロ形態であるｐｒｏ−ＢＮＰ、ヒト白血球抗原及びヒトアポリポタンパク質を包含するが、これらに限定されるものではない。好ましい分析物はｃＴｎＩである。
【００４３】
分析物は、抗体による結合に利用可能である少なくとも３種の異なるエピトープを有する（図２）。分析物の派生型は、抗体による結合に利用可能である少なくとも２種の異なるエピトープを有し、そして派生型のエピトープは分析物にも存在する（図２）。分析物の少なくとも１種のエピトープは、派生型上の結合に利用不可能である。派生型上の結合に利用不可能である分析物のエピトープは、複合体形成又は別の立体配座、並びに上記内因性変換因子の結果としてのものであってよい。
【００４４】
分析物は未変性又は天然形態のものでありうる。分析物はまた、未変性又は天然形態の誘導体であってもよい。例えば、ｃＴｎＩの場合には、分析物は全長ｃＴｎＩモノマー、又は遊離しているか若しくはｃＩＴＣ複合体の一部である、該モノマーの誘導体であってよい。加えて、分析物はＭＩに関連して血清中に放出されるｃＴｎＩの任意の形態であってよい。分析物はまた、血清中に存在するｃＴｎＩ（図９に示すｃＴｎＩを含むが、これに限定されるものではない）の任意の修飾形態であってもよい。分析物はまた、該分析物の任意の前駆体上の結合に利用不可能である１種以上のエピトープを有するｃＴｎＩの任意の修飾形態であってもよい。分析物であるためには、唯一の必要条件は、ｃＴｎＩの修飾形態又は誘導体形態が、３種の異なる抗体による結合に利用可能な少なくとも３種のエピトープを有する必要があることである。
【００４５】
本発明はまた、高感度が要求される場合には、低濃度で存在する分析物及びその派生型の検出に使用することができる。
【００４６】
３．イムノアッセイ
分析物は、図１に示すサンドイッチアッセイに基づく系を用いて典型的に検出されているが、捕捉のための第１モノクローナル又はポリクローナル抗体は表面と結合されており、そして第２モノクローナル又はポリクローナル抗体はシグナル生成エレメント（例えば、酵素）で標識されている。市販のイムノアッセイ製品及びそれらの基礎となる技術に関するさらなる情報については、Ｗｉｌｄ（編），Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ，１９９４を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる。しかしながら、典型的サンドイッチアッセイは、捕捉抗体、シグナル抗体又は両者のためのエピトープを結合に利用不可能にする複合体形成、別の立体配座又は修飾を受けた分析物を十分に検出することができない。
【００４７】
本発明は、分析物及びその１種以上の派生型を検出するためのサンドイッチアッセイの使用に関する（図２）。分析物の派生型は、変異、複合体形成、化学修飾、タンパク質分解又は再編成を含む原因によるものでありうる。本発明はまた、１種以上の関連する分析物、例えば活性タンパク質及びその不活性前駆体、又は単一検出アッセイが開発されている類似の分析物クラスを検出するためにも使用することができる。
【００４８】
目的の分析物又はその１種以上の派生型は、分析物上の２種以上のエピトープに特異的な抗体を用いて、（ｉ）サンドイッチの捕捉側（図４）、（ｉｉ）サンドイッチのシグナル側（図３）、又は（ｉｉｉ）両方（図５）でイムノアッセイを行うことにより検出することができる。目的の分析物上の少なくとも３種のエピトープを全体として標的とすることにより、本発明の多重サンドイッチアッセイは、一定のエピトープが派生型上の結合に利用不可能であっても、捕捉抗体が結合可能である少なくとも１種のエピトープ及びシグナル抗体による結合に利用可能である少なくとも１種のエピトープがある限り、分析物及びその派生型の存在を検出することができる。従って、本発明は、サンプル内に出現する分析物及びその複数の派生型を検出することが可能である。
【００４９】
当業者は、本明細書に記載した本発明が、目的の分析物上のエピトープと特異的に結合可能である任意の結合メンバーの使用により、目的の分析物を検出できることを理解するであろう。結合メンバーは、細胞外又は細胞内受容体、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸、及びその誘導体を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の実施における複数の抗体の使用は、典型的なサンドイッチアッセイにおけるポリクローナル抗体の使用とは対照的である。加えて、本発明のほうが優れている。ポリクローナル調製物において、認識される特定のエピトープ及び調製物中の種々の抗体の割合は、一般的に未知である。さらに、認識されるエピトープ及び種々の抗体の割合は、ポリクローナル調製物間で変化する。ポリクローナル手法における別の欠点は、ポリクローナル調製物内の個々の抗体の結合が多様な結合親和性を有することである。結果として、ポリクローナル調製物の大部分が、標準以下の分析性能を有するか、又は調製物中の他の抗体と競合するエピトープと結合する抗体である。これに対し、本発明は、より効果的なアッセイ特性を有する制御された多重エピトープ試薬の調製を可能にする。なぜならば、結合親和性がより良好であり、かつ所定のアッセイシグナルに必要な試薬がより少ないからである。
【００５１】
本発明の一つの例示的な実施形態において、イムノアッセイは、表面と結合した第１抗体（すなわち、「捕捉抗体」又は「捕捉試薬」）、並びに少なくとも第２抗体及び第３抗体に基づくが、各抗体は分析物上の異なるエピトープと結合するものである。表面と結合していない抗体は、シグナル生成エレメント（すなわち、「シグナル抗体」又は「シグナル試薬」）で標識される。図３参照。
【００５２】
本発明の別の例示的な実施形態において、イムノアッセイは、少なくとも第１及び第２捕捉抗体、並びに第３抗体に基づく。表面と結合していない抗体は、シグナル抗体としうる。図４参照。
【００５３】
本発明の別の例示的な実施形態において、イムノアッセイは、少なくとも第１及び第２捕捉抗体、並びに第３及び第４抗体に基づく。表面と結合していない抗体は、シグナル抗体としうる。図５参照。
【００５４】
４．抗体
本発明の抗体は、目的の分析物又はその派生型上の結合に利用可能なエピトープと特異的に結合する任意の抗体であってよい。本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ，ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥのクラス、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及び一本鎖抗体を含むそのフラグメント及び誘導体を包含する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体、又はその混合物であって分析物又はその派生型のエピトープに十分な結合特異性を示すものを包含する。モノクローナル抗体並びにそのフラグメント及び誘導体が本発明の実施において好ましい。本発明の抗体は、相互に十分に分離された分析物のエピトープに、該抗体が分析物又はその派生型との結合を互いに干渉しないように結合することが好ましい。目的の分析物のために適切な抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて、該分析物上の既知のエピトープ部位への利用可能な抗体のマッピング組み合わせにより選択することができる。
【００５５】
抗体フラグメントの調製には、ペプシン、パパイン、フィシン及びトリプシンのような普通の酵素の使用を含む多くの方法が存在する。抗体の調製及び抗体のフラグメント作製に関するさらなる情報については、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８８を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる。
【００５６】
本発明の抗体は、ヒトｃＴｎＩに特異的であってよい。抗体は、図９に示すように、ｃＴｎＩの一次配列上に位置するエピトープを特異的に認識することができる。抗体は、図９に示した抗体から選択することもできる。
【００５７】
５．捕捉
本発明の捕捉抗体は、１種以上の抗体を表面と結合させることにより固定化することができる。例えば、図６Ａ及び図６Ｂ参照。多種多様な化合物を表面として採用することができ、主な考慮事項は、表面への抗体の結合、シグナル生成エレメントとの干渉がないこと、及び標識の検査との干渉がないことである。特に、蛍光又は色素原スペクトルを測定する場合には、表面は干渉を与えてはならない。
【００５８】
天然及び合成両方の有機及び無機ポリマーを表面として採用することができる。好適なポリマーの例は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリ（４−メチルブチレン）、ブチルゴム及び他の合成ゴム、シリコーンゴム及び、シラスティックポリマー、ポリエステル、ポリイミド、セルロース及びセルロース誘導体（例えば、酢酸セルロース、ニトロセルロースなど）、アクリレート、メタクリレート、ビニルポリマー（例えば、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニルなど）、ポリスチレン及びスチレングラフトポリマー、スチレン−アクリロニトリルコポリマー、レーヨン、ナイロン、ポリ酪酸ビニル、ポリホルムアルデヒドなどを包含する。表面として採用できる他の材料は、シリカゲル、シリコンウエハー、ガラス、紙、不溶性タンパク質、金属、メタロイド、金属酸化物、磁性材料、半導体材料、セメントなどである。加えて、ゲルを形成する物質、すなわち、ゼラチンのようなタンパク質、リポ多糖、シリケート、アガロース、ポリアクリルアミド又はデキストランのような数種の水相を形成するポリマー、ポリアルキレングリコール（例えば、アルキレンは２〜３個の炭素原子を有する）、又は界面活性剤、例えばリン脂質のような両染性化合物、長鎖（１２〜２４個の炭素原子）アルキルアンモニウム塩などが包含される。
【００５９】
表面は、ポリスチレン、スチレン−（ビニルモノマー）コポリマー（スチレン−アクリロニトリルコポリマーなど）を包含するスチレンコポリマー、ポリオレフィン（ポリエチレン及びポリプロピレンなど）、並びにアクリレート及びメタクリレートのポリマー及びコポリマー、並びにそれらの混合物を含むことができる。
【００６０】
表面は、粒子形態の磁化性材料を含むこともできる。このような磁化性材料による典型的な干渉は、反応ステップのそれぞれに磁化性粒子を添加することにより最小限にできる。各ステップで生じる磁性干渉をほぼ等しくすることができ、従ってかかる干渉は効果的に解消される。磁化性粒子は、磁場を印加して該粒子を濃縮することにより血清又は他の溶液から容易に分離することができる。
【００６１】
捕捉抗体は、抗体結合部位を著しく減少させることがなく、かつ表面から該抗体が脱離することなく液体及び洗浄液から表面の分離を可能とする程度に十分に結合する結合方法により、表面と結合させることができる。非共役結合は、吸着、イオン結合、ファン・デル・ワールス吸着、静電気的結合、及び他の非共役結合により達成することができる。抗体は共役結合により表面と結合させることもできる。
【００６２】
抗体を表面に共役結合で付着させるための手法は、Ｉ．Ｃｈｉｂａｔａにより  ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ，Ｈａｌｓｔｅｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８、及びＡ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０５９  （１９７０）に記載されており、これらの内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる。表面をタンパク質で被覆し、そして米国特許第４，２１０，４１８号に記載の手法を用い、例えばカップリング剤としてグルタルアルデヒドを用いてカップリングさせることができる。別の手法において、ポリエーテルイソシアネートのような遊離イソシアネート基を有する層で被覆することができる。そえに対して水溶液中の抗体をアプライすることは、必要条件である結合をもたらす。別の手法において、米国特許第３，７２０，７６０号に記載されたように、抗体を臭化シアンによりヒドロキシル化材料にカップリングさせることができる。さらに他の手法において、ブドウ球菌プロテインＡを表面と結合させることができ、そして抗体のＦｃ鎖を該プロテインＡと複合させることができる。
【００６３】
捕捉抗体を付着により表面と結合させたのち、化学的に架橋させることができる。使用できる架橋剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、グルタルアルデヒド、アジピン酸ジヒドラジド、ビス−ジアゾ化ベンジジン、１，４−ブタンジグリシジルエーテル、ビス−マレイミドヘキサン、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジル４−アジドサリチル酸を包含するが、これらに限定されるものではない。ＥＤＣは遊離カルボキル基を有する任意の表面に使用することができる。これら試薬及び多くの他の類似の試薬は当技術分野で周知である。
【００６４】
６．共通メンバーへの抗体の複合
別の例示的な実施形態において、上記の任意の結合（複合）方法を用いて、同一又は異なる抗体を共通メンバーと複合することができる。共通メンバーは、上記のように粒子、微粒子（図６Ｂ）、ポリペプチド（図６Ｃ）、化学リンカー、又は表面（図６Ａ）を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
共通メンバーは２種以上の抗体と複合させることができ、各抗体はアッセイされる分析物上の異なるエピトープと結合するものである。図６参照。例えば複合反応の化学量論が制御される方法を用いて、複数の抗体を共通メンバーと制御したモル比で複合させることができる。
【００６６】
加えて、複数の共通メンバーを異なる抗体と個々に複合させることができ、各抗体はアッセイされる分析物上の異なるエピトープと結合するものである。図７参照。異なる抗体のモル比は、複数の共通メンバーと複合した抗体とを混合するなどの方法を用いて制御することができる。
【００６７】
ａ．微粒子
抗体は、上記の任意の複合方法を用いて微粒子と結合させることができる。カップリング方法の選択に際して種々の因子を考慮することができ、それらは粒子の種類及び大きさ、カップリング剤、反応物の濃度、一段階又は多段階反応、反応の緩衝液及びｐＨ、保存緩衝液、及びブロッキング剤を包含するが、これらに限定されるものではない。微粒子の使用に関するさらなる詳細については、Ｂａｎｇｓ  ＴｅｃｈＮｏｔｅ  ＃２０１“Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ”；Ｂａｎｇｓ  ＴｅｃｈＮｏｔｅ  ＃２０４“Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ”；Ｂａｎｇｓ  ＴｅｃｈＮｏｔｅ  ＃２０５“Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ”；Ｓｅｒａｄｙｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ“Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ”（１９９９）；Ｈａｇｅｒ，Ｈ．Ｊ．“Ｌａｔｅｘ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔｓ”；米国特許第３，８５７，９３１号；及びＷｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９１，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬを参照されたい。これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【００６８】
７．シグナル
シグナル試薬は、多数の任意の一般的方法により、抗体をシグナル生成エレメントと複合させることにより調製することができる。複合物は、例えば、遊離スルフヒドリル基を利用し、利用可能なジスルフィド結合からスルフヒドリル基を生成するか、又は追加のスルフヒドリルを抗体上に導入することにより調製することができる。次いで、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）のような結合剤を用いて、活性化抗体をシグナル生成エレメントと複合させることができる。抗体複合物の調製に関するさらなる情報については、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ“ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＩｇＧ１  Ｆａｂ  ａｎｄ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”＃４４８８０；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ“ＳＭＣＣ，Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ”＃２２３６０，＃２２３２２；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ“ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｋｉｔ”＃  ３１４９３；Ｂｅａｌｅ，Ｄ．（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ｓｏｍｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｘｐ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１，２８７−２９６；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．（１９８６）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚ  １２１，６５２−６６３；Ｋｉｎｇ，ＴＰ，Ｋｏｃｈｏｕｍｉａｎ，Ｌ．（１９７９），Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎ  Ｍｅｔｈ  ２８，２０１−２１０；Ｂｒｉｎｋｌａｙ，ＭＡ  （１９９２），Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｙｅｓ，ｈａｐｔｅｎｓ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ  ３，２−１３；及びＴｅｃｈＮｏｔｅ  ＃２０４，“Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ”，Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ  Ｒｅｖ．＃００１  ８／４／９９を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【００６９】
本発明のシグナル生成エレメントは、放射性標識、金属粒子、色素原、蛍光色素、標識化タンパク質及び酵素を包含するが、これらに限定されるものではない。シグナル生成エレメントが酵素である場合には、該酵素は、基質の除去又は生成物の生成を検出することができる反応を触媒する。例示的な酵素は、アミラーゼ、ポリヌクレオチダーゼ、アルギナーゼ、アデナーゼ、アミノポリペプチダーゼ、ペプシン、リパーゼ、カタラーゼ、チロシナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリオキサラーゼ、アルドラーゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリラーゼ及びヘキソキナーゼを包含するが、これらに限定されるものではない。例示的な酵素は、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びフェノールオキシダーゼをも包含する。基質から生成物への酵素的変換は、光学的又は電子化学的手段により測定することができる。
【００７０】
ａ．シグナル生成エレメントと複合した複数の抗体
サンドイッチアッセイの感度は、分析装置の検出領域内での捕捉試薬及び表面へのシグナル試薬の非特異的吸着のレベルにより大部分が制限される。このような表面はキュベット、吸い上げエレメント、電極などの壁を包含する。サンプル中の分析物のレベルが低い場合には、測定されたシグナルの著しい量がバックグラウンドであり、従ってサンプル中の分析物の濃度に関連しない。シグナル試薬が分析装置内の表面に非特異的に吸着する傾向は、シグナル抗体の形成に使用される抗体及びシグナル生成エレメント、並びに架橋剤の固有特性の関数である。加えて、分析装置に用いられる材料（例えば、プラスチックの種類）並びに洗浄及び基質含有溶液の組成は、このような非特異的タンパク質吸着を最小限にするように一般的に最適化される。特に、種々の界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ  ２０、Ｂｒｉｊ  ３５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００は、アッセイ装置内でのシグナル試薬と他の成分との望ましくない相互作用を最小限にするためにサンドイッチアッセイにおいては殆ど必ず用いられる。血清アルブミンのような非酵素タンパク質、ゼラチンのような変性タンパク質、及び不活化酵素を、シグナル試薬の非特異的吸着レベルを低下するために、表面ブロッキング剤として加えることもできる。アッセイの全成分を最適化した場合でさえも、検出可能な非特異的シグナル試薬吸着レベルが依然として存在する。この非特異的吸着は、アッセイに用いられるシグナル試薬の量に比例する。従って、より少ないシグナル試薬の使用及び同じモル量の低分子量シグナル試薬の使用は、アッセイにおいてより低いバックグラウンドシグナルを生じるだろう。
【００７１】
シグナル試薬は、バックグラウンドシグナルレベルの低下に寄与する可能性のある抗体のフラグメント、例えばＦａｂフラグメントを含むことができる。シグナル試薬の分子量の低下により、拡散が考慮されるため、結合段階に必要な時間を短縮することができる。シグナル試薬は２種以上の抗体を含むこともできるが、該抗体は、シグナル試薬の全体的大きさを最小限にすることによりバックグラウンドシグナルレベルを低下することもできる一方で、目的の分析物の存在に応答してシグナルを生成するその能力を最大にするものである。シグナル試薬の２種以上の抗体は、分析物の２種以上の異なるエピトープと結合することができ、該エピトープは、該分析物の２種以上のエピトープが該シグナル試薬の２種以上の抗体と結合した場合に、シグナル抗体−分析物複合体の安定化に導くことが可能なものである。
【００７２】
シグナル試薬が２種以上の抗体を含む場合には、該抗体は１種以上の異なるエピトープと結合することができる。
【００７３】
シグナル生成エレメントを２種以上の抗体と複合させることができ、各抗体は目的の分析物上の異なるエピトープと結合する。図６Ｃ参照。複合した抗体とシグナル生成エレメントとのモル比は、反応条件及び複合反応のための化学量論の選択により制御することができる。
【００７４】
それぞれ１：１より大きいモル比で、第１抗体を第１シグナル生成エレメントと複合させることができ、そして第２抗体を第２シグナル生成エレメントと複合させることができ、次いで混合するが、第１及び第２抗体は、それぞれ目的の分析物上の異なるエピトープと結合するものである。図７Ｂ参照。第１及び第２抗体のモル比も制御することができる。
【００７５】
シグナル生成エレメントは、単一抗体と、又は同一分析物上の異なるエピトープに対する２種以上の抗体と複合させることができるが、該シグナル抗体は約１：１００〜約１：１．００１のシグナル生成エレメントと抗体集団との比を含む。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：９０〜約１：１．００１の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：８０〜約１：１．００１の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：７０〜約１：１．００１の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：６０〜約１：１．００１の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：５０〜約１：１．００１の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：４０〜約１：１．００１の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：３０〜約１：１．００１の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：２０〜約１：１．００１の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：１０〜約１：１．００１、約１：２０〜約１：１０、約１：３０〜約１：２０、約１：４０〜約１：３０、約１：５０〜約１：４０、約１：６０〜約１：５０、約１：７０〜約１：６０、約１：８０〜約１：７０、約１：９０〜約１：８０、及び約１：１００〜約１：９０の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：５〜約１：１．００１、約１：１０〜約１：５、約１：１５〜約１：１０、約１：２０〜約１：１５、約１：２５〜約１：２０、約１：３０〜約１：２５、約１：３５〜約１：３０、約１：４０〜約１：３５、約１：４５〜約１：４０、及び約１：５０〜約１：４５の比で複合させることもできる。シグナル生成エレメントは抗体集団と、約１：３．３の比で複合させることもできる。
【００７６】
シグナル生成エレメントは、分析物又はその派生型上の異なるエピトープとそれぞれ結合可能である第１及び第２抗体と複合させることができるが、第１抗体と第２抗体との比は、約１：５０〜約５０：１である。第１抗体と第２抗体との比は、約１：１０〜約１０：１、約１：５〜約５：１、約１：３〜約３：１、及び約１：２〜約２：１であってもよい。
【００７７】
８．シグナル及び検出
シグナルは、放射線、光学的、電気化学的方法など（これらに限定されるものではない）を用いて感知エレメントにより、又は当技術分野で公知のいくつかの他の変換手段により測定することが可能であり、シグナル生成エレメントにより生成させることができる。感知エレメントは、電極、バイオセンサー、電界効果トランジスタ、弾性表面波装置、導光板、光ファイバー、キュベット、放射能検出器、物理的、原子力的、化学的、生化学的、電気的、若しくは光学的検出を促進する試薬、又はその組み合わせであってよい。
【００７８】
９．イムノアッセイ装置
目的の分析物のイムノアッセイは、１つ以上の感知エレメント及び上記のように改変サンドイッチイムノアッセイが行われる表面を含むイムノアッセイ装置で行うことができる。装置表面は、分析物上の異なるエピトープとそれぞれ結合可能である２種以上の抗体を含むことができる。２種の抗体の少なくとも１種はまた、分析物の派生型上の同一エピトープと結合可能である。分析物上のエピトープの少なくとも１種は、派生型上の結合に利用不可能である。
【００７９】
本発明の装置は、カートリッジ、カラム、シリンジ、キュベット、又は当技術分野で公知の他の分析装置若しくは系を含む。カートリッジは、米国特許第５，０９６，６６９号に記載されたような型のものであってよい。他のカートリッジ形状の例は、米国特許第５，４１６，０２６号、第５，５９３，６３８号、第５，４４７，４４０号、第５，６２８，９６１号、第５，５１４，２５３号、第５，６０９，８２４号、第５，６０５，６６４号、第５，６１４，４１６号、第５，７８９，２５３号、第６，０３０，８２７号、及び第６，３７９，８８３号に見出される。さらに他のカートリッジ形状は、ＰＣＴ／ＵＳ００／３１１５８号、ＰＣＴ／ＵＳ０１／０４３４５号及び同時継続中の米国特許出願第１０／０８７，７３０号に記載されている。上記の開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【００８０】
イムノアッセイ装置の表面は、当業者に公知の任意の適切な表面であってよく、ガラス、半導体、プラスチック、二酸化ケイ素、光成形性ＰＶＡ、光成形性ゼラチン、膜形成ラテックス、及び導電性金属を包含するが、これらに限定されるものではない。導電性金属表面は、銀、イリジウム、金、白金、及びその合金であってよい。
【００８１】
抗体は、イムノアッセイ装置の表面に吸収、吸着又は共有結合させることができる。抗体は、ＰＶＡ、ゼラチン及びラテックス層に吸収させるか、又はそれらの表面に吸着させることができる。抗体は、ガラス、金属、半導体、プラスチック、二酸化ケイ素、光成形性ＰＶＡ、及び導電性金属に吸着させることができる。２種以上の抗体を上記のように微粒子に結合させることができるが、微粒子は上記のように表面に結合する。イムノアッセイ装置は、分析物上の異なるエピトープと結合する第３抗体を含むこともできる。
【００８２】
イムノアッセイ装置の感知エレメントは、当技術分野で公知の任意の型のものであってよく、電極、バイオセンサー、電界効果トランジスタ、弾性表面波装置、導光板、光ファイバー、キュベット、放射能検出器、イムノクロマトグラフィー装置、物理的、原子力的、化学的、生化学的、電気的、若しくは光学的検出を促進する試薬、又はその組み合わせを包含するが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
１０．イムノアッセイキット
イムノアッセイキットは、上記のように改変サンドイッチイムノアッセイにおいて目的の分析物及びその派生型を検出するために使用することができる。キットは分析物上の異なるエピトープとそれぞれ結合可能である３種又はそれ以上の抗体を含むことができる。３種の抗体の少なくとも２種はまた、分析物の派生型上の同一エピトープと結合可能である。分析物上のエピトープの少なくとも１種は、派生型上の結合に利用不可能である。
【００８４】
１１．サンドイッチイムノアッセイ製品
サンドイッチイムノアッセイ製品は、目的の分析物及びその派生型を含むことができる。分析物上の少なくとも３種のエピトープは、少なくとも３種の異なる抗体による結合に利用可能である。分析物は、少なくとも３種の異なる抗体と結合していてよく、各抗体は分析物上の異なるエピトープと結合する。分析物上の３種のエピトープの少なくとも２種は、少なくとも３種の異なる抗体の少なくとも２種による派生型上の結合に利用可能である。派生型は、分析物と結合する３種の異なる抗体の少なくとも２種と結合することができ、各抗体は派生型上の異なるエピトープと結合する。分析物の少なくとも１種のエピトープは、派生型上の結合に利用不可能である。分析物及び分析物の派生型と結合した抗体の少なくとも１種は、シグナル抗体であってよい。
【００８５】
１２．分析物についてのアッセイ方法
サンプルは、上記のようにサンドイッチイムノアッセイを行うことにより分析物及びその派生型の存在についてイムノアッセイすることができる。少なくとも３種の異なる抗体が用いられるが、各抗体は分析物上の異なるエピトープと結合可能であるものである。分析物と結合可能である抗体の少なくとも２種は、捕捉抗体若しくはシグナル抗体、又はその組み合わせである。分析物上のエピトープの少なくとも１種は、派生型上の結合に利用不可能である。
【００８６】
イムノアッセイ対象のサンプルを、１種以上の捕捉抗体を含む表面に加える。次いで、１種以上のシグナル抗体を加える。別法として、１種以上の捕捉抗体を含む表面にサンプルを適用する前又はその間に、１種以上のシグナル抗体をサンプルに加え得る。未結合シグナル抗体を除去したのち、１種以上のシグナル抗体の結合の程度を上記のように測定する。シグナルは、存在するか又は捕捉抗体が結合可能である少なくとも１種のエピトープ、及び存在するか又はシグナル抗体が結合可能である少なくとも１種の第２エピトープを有する分析物並びに分析物の全ての派生型により生成されるだろう。
【００８７】
１３．急性疾患の診断方法
目的の分析物及びその派生型は、患者が急性医学事象に罹患したかどうかを判定するためにイムノアッセイすることができる。サンプルを患者から採取し、上記アッセイ方法を用いて目的の分析物及びその派生型の存在についてイムノアッセイすることができる。シグナル抗体により生じたシグナルを対照値と比較することができる。対照を超えて検出されるシグナル、又は数時間若しくは数日にわたる一連のアッセイに由来するシグナルの連続は、患者が急性医学事象に罹患したことを示すものである。
【００８８】
急性医学事象は、臨床マーカーに関連する任意の疾患状態であってよいが、該臨床マーカーは、本明細書に記載した改変イムノアッセイにおける分析物となるものである。医学事象は、例えば心筋梗塞であってよい。目的の分析物は、例えばＴｎＩ、ＴｎＴ、ＴｎＣ、ＣＫ−Ｍ、ＣＫ−Ｂ、ＣＫ−ＭＢ、ミオグロビン、ＴＳＨ、ＦＳＨ、ＣＲＰ、ＢＮＰ、ｐｒｏ−ＢＮＰ、ＰＳＡ、ＰＣＡ、アポリポプロテイン、及びその組み合わせであってよい。
【００８９】
１４．急性疾患の発症時間の診断方法
目的の分析物及びその派生型は、患者が急性医学事象に罹患した時を判定するためにイムノアッセイすることができる。サンプル、又は異なる時点で得られるサンプルのセットを患者から採取し、上記アッセイ方法を用いて目的の分析物及びその派生型の存在についてイムノアッセイすることができる。患者が急性医学事象に罹患した時を測定するために、シグナル抗体により生成されたシグナルの量を、時間に対する分析物の量の標準曲線と相関させることができる。当業者であれば本明細書に記載した方法を用いて標準曲線を作成することができる。
【００９０】
１５．急性疾患の重症度の診断方法
目的の分析物及びその派生型は、患者が罹患した急性医学事象の重症度を測定するためにイムノアッセイすることができる。サンプル、又は異なる時点で得られるサンプルのセットを患者から採取し、上記アッセイ方法を用いて目的の分析物及びその派生型の存在についてイムノアッセイすることができる。シグナル抗体により生成されたシグナルの量を、患者が罹患した医学事象の重症度と相関させることができる。
【００９１】
本発明を全般的に説明してきたが、下記の実施例は本発明をより十分に説明するために提供されるものである。これらの実施例は例示のみを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００９２】
粒子へのｃＴｎＩ捕捉抗体の結合
ポリスチレン／アクリル酸ラテックスの直径０．２μｍのスフェア（Seradyn）を最初にｐＨ６．２の０．０５Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ、Sigma Aldrich）緩衝液中で交換することにより、ｃＴｎＩに特異的な抗体と結合したビーズ粒子を調製した。このラテックススフェアの２％ｗ／ｗ溶液に、ｃＴｎＩ抗体（同じ０．０５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中で交換した緩衝液）を、ラテックススフェアの質量に対して制御した質量比で加えた。この溶液を４℃で１５分間攪拌し、抗体で被覆されたビーズを制御した遠心により分離した。典型的に十分な抗体を加えてラテックスビーズ表面を十分に飽和した（ラテックス粒子の質量の８％〜１５％）。次いで、この微粒子の遠心ペレットをＭＥＳ緩衝液中に１％ｗ／ｖの密度で再懸濁し、１〜 １０ｍＭのＥＤＣを加えて、吸着抗体をラテックススフェアに共有結合で架橋した。この懸濁液を４〜１２時間反応させ、この時点でラテックス粒子を遠心により分離し、ＭＥＳ緩衝液中に１％で再懸濁し、ＥＤＣの添加を繰り返した。上記方法を用いて、ＣＢ１（１９Ｃ７、Hytest Inc.）又はＣＢ２（３４５０３２２８Ｐ、Biospacific Inc.）を含む微粒子捕捉試薬を調製した。ＣＢ１及びＣＢ２両方を含むＣＢ１２微粒子は、上記方法を用い、２種の捕捉抗体の混合物を加えることにより調製した。
【実施例２】
【００９３】
シグナル抗体の調製
下記方法を用いて、シグナル試薬として使用するアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識化Ｆａｂ複合物を調製した。アルカリホスファターゼ（Biozyme）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液交換した。ＡＬＰの１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌを２５重量％（溶液中のＡＬＰ重量に対して）のヘテロ２機能性架橋剤スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ［６−アミドカプロエート］（ＬＣＳＭＣＣ、Pierce）と反応させた。架橋剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Sigma）中の溶液として加えた。この溶液を室温で４５分間反応させ、その後に遠心して沈殿を除去した。この活性化ＡＬＰをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０脱塩カラム（Sigma Aldrich）により未反応ＬＣＳＭＣＣから分離した。
【００９４】
シグナル試薬中に導入する抗体のＦａｂフラグメントを全抗体のペプシン（Sigma）消化により生成し、Ｓ２００  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌサイズ排除カラム（Amersham Pharmacia）を用いて分離した。得られたＦ（ａｂ）２フラグメントを６０ｍＭメルカプトエチルアミン（ＭＥＡ、Sigma Aldrich）中で４５分間３７℃で化学的に還元して２種のＦａｂフラグメントを生成し、これらをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０脱塩カラムを用いて脱塩することにより過剰のＭＥＡから分離した。次いで、Ｆａｂフラグメントを活性化ＡＬＰに加え、４℃で２〜１２時間反応させた。等体積の０．１Ｍグリシン（Sigma）、０．０１Ｍシステイン（Pierce）（ＰＢＳ  ｐＨ７．４中）で反応を停止した。次いで、反応生成物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００カラムを用いて分画してＦａｂフラグメントを含むシグナル試薬を得た。ＦａｂフラグメントとＡＬＰとの特定モル比を有するシグナル試薬は、上記反応においてＦａｂ２フラグメントとＡＬＰとの比を変えることにより得た。図１２は、１；１、１：３、１：６及び１：１０のＡＬＰ：Ｆａｂ比を有するＡＬＰ−Ｆａｂシグナル試薬に関する溶出プロフィールを示す。
【００９５】
上記方法を用いて、ＥＣ１（Ｇ１２９Ｃ、Biospacific Inc.）又はＥＣ２（Ｇ１３０、Biospacific Inc.）を含むＡＬＰ−標識化シグナル試薬を調製した。ＥＣ１及びＥＣ２両方を含むＥＣ１２シグナル試薬は、上記方法を用いて２種のＦａｂフラグメントを１：１のモル比で混合したのち、この混合物を活性化ＡＬＰに加えることにより調製した。
【実施例３】
【００９６】
ｃＴｎＩ捕捉抗体を用いたＥＬＩＳＡセンサーの調製
下記方法を用いて、ＥＬＩＳＡセンサー上に抗体標識化粒子の固定化層を含む分析物検出器を作製した。簡単に述べると、酸化ケイ素ウエハーについての慣用の半導体薄層技術を用いて、分析物検出器に用いる電流センサーを製造する。米国特許第５，５５４，３３９号に記載の方法を用いて、実施例１に記載した捕捉抗体の溶液を微細分散することにより、ｃＴｎＩ捕捉領域を生成する。この粒子含有懸濁液の液滴を乾燥させて、該センサー表面上にｃＴｎＩ捕捉領域を形成する。これらのセンサーチップを別個の電子化学的接地用チップと共に、レーザー切断してセンサー、接地用チップ及び液体チャンネルのための開口部を有する、両面テープガスケットで覆われたプラスチック底板に取り付ける。この底板アセンブリーにプラスチックカバーを加えて液体用導管を形成する。実施例２の酵素標識化シグナル試薬を、捕捉抗体として同一ＥＬＩＳＡセンサー上に印刷する。ＰＢＳ及び保存剤を含む１％〜５０％糖溶液中でシグナル試薬を製剤化する。この組成物は、血液サンプル中へのシグナル試薬の速やかな溶解をもたらすことが認められた。組み立てたカートリッジを成形して、携帯用電子化学的分析器に使用できる使い捨てカートリッジを得る。
【実施例４】
【００９７】
単一又は複数の捕捉抗体を用いるｃＴｎＩの検出の比較
米国特許第５，０９６，６６９号（これは参照により本明細書に組み入れられる）に記載された一般型のｃＴｎＩ測定用分析系を用いた。簡単に述べると、ＣＢ１、ＣＢ２及びＣＢ１２捕捉抗体を含むラテックスミクロスフェアで被覆したセンサーを用いて、実施例３に記載したようにｃＴｎＩアッセイ用カートリッジを作製した。遊離ｃＴｎＩ（Scripps Laboratories）又はＩＴＣ複合体（Hytest Ltd）を加えた３種の全血サンプル中でｃＴｎＩをアッセイした。実施例２に記載したシグナル試薬ＥＣ１２を用いて、ＡＬＰによる基質の脱リン酸から電気活性生成物が生成されることに基づいて電流シグナルを生成させた。電気活性生成物の量は、検出可能なｃＴｎＩの量に比例する。
【００９８】
図１０は、ＣＢ１捕捉試薬を含むカートリッジのシグナルレベルが遊離ｃＴｎＩ（菱形の点）及び２種のＩＴＣ複合体のレベル（四角及び三角の点）の両方に対して高いことを示す。これとは対照的に、ＣＢ２捕捉試薬を含むカートリッジは、特にＩＴＣ複合体に対して、より低いシグナルを与える。ＣＢ１２ハイブリッド捕捉試薬を用いたカートリッジは、ｃＴｎＩの両方の形態に対してＣＢ１又はＣＢ２捕捉試薬と比較して改善されたシグナル生成を示す。ＣＢ１２捕捉試薬の改善された性能は驚くべきである。なぜならば、このハイブリッド試薬は、単独ではＣＢ１抗体よりも著しく低い性能を有するＣＢ２抗体を含むからである。
【実施例５】
【００９９】
単一又は複数のシグナル抗体を用いるｃＴｎＩの検出の比較
６．０ｎｇ／ｍＬ  ｃＩＴＣ複合体を添加した全血サンプル中で、ｃＴｎＩを調製直後及び室温で１日のインキュベーション後に、実施例３に記載したＣＢ１及びＣＢ１２捕捉試薬、並びに実施例２に記載したＥＣ１、ＣＥ２又はＥＣ１２シグナル試薬を含むラテックスミクロスフェアで被覆したセンサーを有するカートリッジを用いてアッセイした。図１１は、ＥＣ１シグナル試薬がＥＣ２シグナル試薬よりも高いシグナル生成を示すことを実証する。ｃＴｎＩの老化（例えば、タンパク質分解変性）を刺激するために１日のインキュベーション後に、ＥＣ１シグナル試薬に関するシグナルレベルは著しく低下する。対照的に、ＥＣ２試薬のシグナルレベルは中程度の低下しか示さない。ハイブリッドシグナル試薬ＥＣ１２のシグナル生成は、サンプルを１日インキュベートした後は特に、２種の単一抗体シグナル試薬のそれぞれよりも驚くほど優れている。
【実施例６】
【０１００】
心筋梗塞の診断としての血清中のｃＴｎＩの検出
心筋梗塞の罹患が疑われる患者、並びに対照個体から全血サンプルを採取する。全血サンプル中でｃＴｎＩを、実施例３に記載したＣＢ１２捕捉試薬、及び実施例２に記載したＥＣ１２シグナル試薬を含むラテックスミクロスフェアで被覆したセンサーを有するカートリッジを用いてアッセイする。ＭＩの罹患が疑われる患者に由来するサンプルにおけるシグナル生成を、対照に由来するシグナルのレベルと比較する。対照より大きいシグナルレベルは、該患者がＭＩに罹患したことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】目的の分析物の検出のための標準サンドイッチアッセイを示し、捕捉抗体（Ａｂ１）及びシグナル抗体（Ａｂ２）は、目的の分析物（Ａｎ）のそれぞれ第１及び第２エピトープ（ｅ１及びｅ２）に対するものである。
【図２】３種のエピトープ（ｅ１、ｅ２及びｅ３）を有する目的の分析物（Ａｎ）の説明である。
【図３】１種の捕捉抗体（Ａｂ１）及び２種以上のシグナル抗体（Ａｂ２及びＡｂ３）を用いる、目的の分析物（Ａｎ）及びその派生型を検出するための改変サンドイッチアッセイを示す。
【図４】２種以上の捕捉抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）及び１種のシグナル抗体（Ａｂ３）を用いる、目的の分析物（Ａｎ）及びその派生型を検出するための改変サンドイッチアッセイを示す。
【図５Ａ−Ｅ】２種以上の捕捉抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）及び２種以上のシグナル抗体（Ａｂ３及びＡｂ４）を用いる、目的の分析物（Ａｎ）を検出するための改変サンドイッチアッセイを示す。
【図５Ｆ−Ｉ】２種以上の捕捉抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）及び２種以上のシグナル抗体（Ａｂ３及びＡｂ４）を用いる、目的の分析物（Ａｎ）を検出するための改変サンドイッチアッセイを示す。
【図６】目的の分析物（Ａｎ）上の異なるエピトープ（ｅ１又はｅ２）と結合性であり、かつ共通メンバーと複合した１種の抗体（Ａｂ１）又は２種以上の抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）を示すが、該共通メンバーは表面（図６Ａ）、微粒子（図６Ｂ）、及び酵素のようなポリペプチド（図６Ｃ）であるものである。
【図７】異なる抗体（Ａｂ１又はＡｂ２）と個々に複合した共通メンバーの混合物を示し、目的の分析物（Ａｎ）上の異なるエピトープ（ｅ１又はｅ２）と結合する各抗体がアッセイされるが、該共通メンバーは微粒子（図７Ａ）又は酵素のようなポリペプチド（図７Ｂ）であるものである。
【図８】２種以上の抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）と複合した共通メンバー（微粒子など）を示し、これは表面のような別の共通メンバーと複合しているが、２種以上の捕捉抗体は、（ｉ）異なる微粒子と個々に複合している（図８Ａ）か、又は（ｉｉ）微粒子上で一緒に複合している（図８Ｂ）ものである。
【図９】アミノ酸１〜２５及び１５０〜２０９を除いた心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の派生型の一次構造を表し、またｃＴｎＩ抗体のエピトープのための位置を示す。
【図１０】遊離ｃＴｎＩ及び２つのレベルのｃＩＴＣを添加した全血サンプルに対する第１捕捉抗体（ＣＢ１）、第２捕捉抗体（ＣＢ２）、又は第１及び第２捕捉抗体の混合物（ＣＢ１２）を用いて調製した、種々の単一使用アッセイに由来する電流シグナルを示す。
【図１１】６．０ｎｇ／ｍＬのｃＩＴｃ複合体でスパイクした全血サンプルから、調製直後及び室温で１日後に、ＣＢ１又はＣＢ２で被覆したセンサー、並びに第１抗体と複合したシグナル生成酵素（ＥＣ１）、第２抗体と複合したシグナル生成酵素（ＥＣ２）、又はＥＣ１及びＥＣ２の混合物（ＥＣ１２）を用いて調製したカートリッジを使用して得られた電流シグナルを示す。
【図１２】ＡＬＰとＦａｂとの異なる比を有するＦａｂ−ＡＬＰ複合物に関する溶出プロフィールを示す。
【図１】
2005534907.tif 000003
【図２】
2005534907.tif 000004
【図３】
2005534907.tif 000005
【図４】
2005534907.tif 000006
【図５Ａ−Ｅ】
2005534907.tif 000007
【図５Ｆ−Ｉ】
2005534907.tif 000008
【図６】
2005534907.tif 000009
【図７】
2005534907.tif 000010
【図８】
2005534907.tif 000011
【図９】
2005534907.tif 000012
【図１０】
2005534907.tif 000013
【図１１】
2005534907.tif 000014
【図１２】
2005534907.tif 000015
【国際調査報告】
2005534907.tif 000016
2005534907.tif 000017
2005534907.tif 000018