(57)【要約】本発明は創傷の治療用組成物に関し、前記組成物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物における創傷の治癒を促し、有効量のトール受容体（若しくはトール様受容体）リガンド又はその前駆体と適切な担体とを含む。前記リガンドは、ドロソフィラ・メラノガスター又はルシリア・セリカタのような昆虫に由来するシュペッツレ又はシュペッツレ様タンパク質であり得る。本発明は、本発明の組成物を創傷に施すことを含む創傷を治療する方法にも関し、本発明の組成物を有する支持材を含む創傷用包帯剤にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は非ヒト哺乳動物における創傷の治癒を促す創傷治療用組成物であって、有効量のトール受容体リガンド又はその前駆体と適切な担体とを含む前記組成物。
【請求項２】
トール受容体リガンド又はリガンド前駆体が、タンパク質のシステインノット スーパーファミリーのメンバー又はその活性な類似体である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
トール受容体リガンド又はリガンド前駆体が、昆虫由来のタンパク質、その活性な部分、又はそれらの活性な類似体である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
タンパク質がドロソフィラ・メラノガスター又はルシリア・セリカタに由来する、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
タンパク質の活性な部分がC-末端106アミノ酸ペプチドを含む、請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項６】
トール受容体リガンド前駆体をプロセッシングして活性なトール受容体リガンドを生成するのに適するプロテアーゼを更に含む、請求項１−５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
プロテアーゼが
(i) 生物ルシリア・セリカタによって分泌される；
(ii) FITCカゼインに対してpH 8.0-8.5で最適なタンパク質分解活性を示す；
(iii) トシル-Gly-Pro-Arg-AMCに対してタンパク質分解活性を示すが、Suc-Ala-Ala-Phe-AMCに対してはタンパク質分解活性を示さない；
(iv) FITCカゼイン及びトシル-Gly-Pro-Arg-AMCに対するタンパク質分解活性が、セリンプロテアーゼ阻害剤PMSF及びAPMSFによって阻害される；及び
(v) 固定化したアミノベンズアミジンによって結合される；
ことによって特徴付けられる、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ヒト又は非ヒト哺乳動物における創傷の治癒を促す創傷治療方法であって、請求項１−７のいずれか１項に記載の組成物を前記創傷に施すことを含む、前記方法。
【請求項９】
請求項１−７のいずれか１項に記載の組成物を有する支持材を含む、創傷用包帯剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は創傷の治療に関する。より詳しくは、本発明は創傷の治癒を促す物質、前記物質を取込んだ組成物及び包帯剤、並びに前記物質を用いて創傷を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有効な創傷治癒は、多くのメカニズムを伴う複雑な生理的過程であり、前記メカニズムとしては細胞の移動、増殖因子の分泌、脈管形成、組織の再造形及び創傷の固有なプロテイナーゼ/抗プロテイナーゼバランスが挙げられ、これらは協調して且つ明らかに段階的な様式で寄与して、制御された組織再生を速める。
創傷処置製品は、現在の医療行為に必要不可欠であり、特に慢性的な創傷又はやけどの患者の治療のために必要不可欠である。創傷の治癒に寄与する活性を有するとして、多くの様々な物質が以前に提示されている。そのような以前に提示された物質としては、ストレプトキナーゼ、コラゲナーゼ及びストレプトドルナーゼ（これらは全て細菌供給源から得られる）、ブロメライン（パイナップル由来）、プラスミン及びトリプシン（ウシから得られる）、並びにクリール(krill)酵素（甲殻類から得られる）が挙げられる。臨床試験データによって、これらの物質は創傷の治癒を促すことに部分的にのみ有効であることが示されている。
キンバエ(green bottle fly)のルシリア・セリカタ(Lucilia sericata)の幼虫（蛆虫）は、生きている生物として著しい創傷治癒属性を有することが知られている。ルシリア・セリカタの幼虫を用いる創傷清拭治療は、幅広く受け入れられた医療行為となっている。しかしながら、前記幼虫が通常処置不能な創傷を治癒する程度まで傷を清浄する仕事をする方法については、文献ではほとんど報告されていない。
効き目があっても、多くの患者にとって生きている幼虫は不快であり、生きている幼虫を創傷に対して使用すること及びその未精製分泌物を創傷に導入すること（生きている幼虫が用いられる場合に、必然的に起る）は、多くの患者及び多くの医療従事者にとって受け入れられない。生きている生物の使用は、患者における感染又はアレルギー反応の危険性も増加させる。
【発明の開示】
【０００３】
（発明の提示）
大まかに言って、本発明は、ヒト又は非ヒト哺乳動物における創傷の治癒を促す創傷治療用組成物に関し、前記組成物は、有効量のトール(toll)受容体リガンド又はその前駆体と適切な担体とを含む。本明細書において“トール受容体”という用語は、ドロソフィラ(Drosophila)のトール受容体のヒト及び非ヒト相同体を含むものとして理解されるべきであって、前記相同体は、本技術分野ではしばしばトール様(toll-like)受容体（TLR）と呼ばれ、生得的な免疫認識受容体の保存されたファミリーを表している。前記生得的な免疫認識受容体は、哺乳動物、昆虫及び植物で保存されているシグナル経路に連結されており、生得的な免疫防御を媒介する遺伝子の活性化をもたらす。従って、疑いを避けるために、本明細書で用いられる用語“トール受容体”はトール受容体及びトール様受容体を意味し、本明細書で用いられる用語“ト−ル受容体リガンド”は前記に応じて解釈されるべきである。本明細書において、用語“リガンド”は、天然に生成されたリガンド自体、及びそれらの合成類似体であって天然のリガンドと同じ機能を有するもののいずれもを含むとして理解されるべきである。本発明の特定の態様によると、リガンドは、ヒトのトール受容体の構成性リガンド又は誘導性リガンドから選択されてもよく、セリンプロテアーゼのようなプロテアーゼによってプロセッシングされてもよく、又はされなくてもよい。
【０００４】
典型的には、トール受容体リガンド又はそのリガンド前駆体は、タンパク質のシステインノット(cysteine knot)サブファミリーのメンバー、又はそれらの活性な類似体(analogue)である。前記ファミリーの各メンバーは、活性なＣ-末端ドメインに密集している７つのシステイン残基を含む。前記ファミリーの各メンバーは二量体を形成して特異的な受容体に結合し得るが、二量化の様式はそれぞれ異なる。前記タンパク質は全て、ユニークな立体的フォールディング（システインノット）をとり、細長いβストランドと、珍しい結合性を示す３つのジスルフィド架橋とによって特徴付けられる。本発明の組成物に使用することができ且つタンパク質のシステインノットスーパーファミリーに属する特に適切なリガンドの例は、ドロソフィラ由来のシュペッツレ(spatzle)タンパク質、又はその活性な部分（例えば、Cell 76,677-688に記載されているC-末端106アミノ酸ペプチド）である。前記ファミリーに由来する他のリガンドは、TIBS 1998, July 23(7)(239-242)に記載されている。本発明の特に好ましい態様では、本発明のトール受容体リガンドが、前述のような幼虫生活環を有する昆虫の幼虫期の間に発現されるシュペッツレ様タンパク質又はその合成類似体である。そのような昆虫の例は、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)及びルシリア・セリカタである。
【０００５】
トール受容体リガンド前駆体を含む本発明の組成物は、トール受容体リガンド前駆体をプロセッシングして活性なトール受容体リガンドを生成するのに適切なプロテアーゼを、更に含み得る。そのようなプロテアーゼは、典型的にはセリンプロテアーゼであって、例えばトリプシン様酵素又はキモトリプシン様酵素であろう。適切なトリプシン様プロテアーゼは、以下の点によって特徴付けられる：
(i) 生物ルシリア・セリカタによって分泌される；
(ii) FITC-カゼインに対して、pH 8.0-8.5にて最適なタンパク質分解活性を示す；
(iii) トシル(tosyl)-Gly-Pro-Arg-AMCに対してタンパク質分解能力を示すが、Suc-Ala-Ala-Phe-AMCに対してタンパク質分解能力を示さない；
(iv) FITC-カゼイン及びトシル-Gly-Pro-Arg-AMCに対するタンパク質分解活性が、セリンプロテアーゼ阻害剤PMSF及びAPMSFによって阻害される；及び
(v) 固定化されたアミノベンズアミジンによって結合される。
本発明の組成物に有用なプロテアーゼは、ルシリア・セリカタの幼虫の排泄性/分泌性（ES）分泌物中に天然に存在している。
【０００６】
幼虫のES分泌物は、蛍光タンパク質基質フルオレセインイソチオシアネート-カゼイン（FITC-カゼイン）を加水分解する場合、8.0-8.5の古典的なpH最適条件を示す。FITC-カゼインの加水分解をモニターするのに先立って、不可逆性の低分子量阻害剤4-(アミジノフェニル)メタンスルホニルフルオリド（APMSF；全てのトリプシン様セリンプロテアーゼに対する阻害剤であるが、キモトリプシン様セリンプロテイナーゼに対する阻害剤ではない）又はフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF；全てのセリンプロテイナーゼに対する阻害剤）を用いて幼虫のES分泌物をプレインキュベーションすることによって、幼虫のES分泌物が２つの種類のセリンプロテイナーゼ活性；トリプシン様活性及びキモトリプシン様活性を有することが示されている。そのような二重の活性は、蛍光ペプチド基質のトシル-Gly-Pro-Arg-AMC（トリプシン様プロテイナーゼに対して選択する）及びSuc-Ala-Ala-Phe-AMC（キモトリプシン様プロテイナーゼに対して選択する）の加水分解をモニターすることによって確かめられる。“AMC”は7-アミノ-4-メチルクマリンを表し、“Suc”はスクシニルを表している。
【０００７】
ルシリア・セリカタのES分泌物中で検出される優勢なセリンプロテイナーゼ活性に加えて、他のあまり優勢でない活性が存在する。アスパルチル及びメタロプロテイナーゼ活性の存在が検出されたが、システイニル活性は全く見られない。FITC-カゼイン加水分解をモニターすることによって示されるアスパルチル活性は、pH 5.0において著しく、クラス特異的阻害剤ペプスタチンAによって都合よく阻害される。存在するメタロプロテイナーゼ活性は、ロイシンアミノペプチドを加水分解するES分泌物の能力によって証明され、エキソペプチダーゼの存在を明らかにしている。エキソペプチダーゼは、ペプチドにおける遊離の-NH2アミノ酸を認識する。ルシリア・セリカタESによるロイシンアミノペプチド加水分解は、古典的メタロプロテイナーゼ阻害剤であるZn2+キレート剤1,10-フェナントロリンによってのみ阻害される。この阻害は、メタロプロテイナーゼ酵素の性質を有するエキソペプチダーゼの存在を反映している。
ES分泌物は、約0.88 U/Lであると算出されるα-アミラーゼ活性を有する。さらに、幼虫のES分泌物中にフォスファターゼ活性（オルトリン酸のモノエステル結合の加水分解）が存在するが、その活性は、プロテイナーゼと比較した場合におよそ50倍低い。リパーゼ活性（脂肪酸エステル類に見出されるエステル結合の加水分解）も同定される。このリパーゼ活性は、ES分泌物が阻害剤PMSFと共にプレインキュベートされる場合には検出されず、このことは、前記加水分解が分泌物中のセリンプロテイナーゼによることを示している。
【０００８】
我々の研究から、幼虫のES分泌物の優勢な活性のクラスがセリンプロテイナーゼ活性であって、２種類のセリンプロテイナーゼ活性が存在し、その一つはキモトリプシン酵素由来、もう一つはトリプシン酵素由来であることが結論付けられ得る。プロセッシングプロテアーゼは、クロマトグラフィー法によって未精製のES分泌物から実質的に純粋な形態で得られ得る。ES分泌物は、ルシリア・セリカタの幼虫から採取されて、固定化したアミノベンズアミジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーを行われる。アミノベンズアミジンは、トリプシン様セリンプロテイナーゼの可逆性阻害剤である。クロマトグラフィー法によって“フロースルー(flow through)”材料、すなわち固定化した試薬によって結合されなかった材料を収集した後、固定化した試薬によって結合されている酵素は、遊離のアミノベンズアミジンの添加によって溶出されて、別々に収集され得る。
上述のような本発明のリガンドは、本技術分野で既知のペプチド合成及び精製の通常経路に従って、合成的に調製され精製されてもよい。リガンドは、活性を高めるため及び/又はリガンドが創傷部位で活性を維持する期間を延長させるために、アミノペプチダーゼ活性に対して保護されてもよい。アミノペプチダーゼ活性に対する保護は、例えば、非コード異常アミノ酸を用いるリガンドのCOOH置換部位におけるアミド化及び/又はイソスターによるCO-NHアミド結合の置き換えによって達成され得る。
【０００９】
本発明のリガンドは、創傷に施されて、治療につながる増殖因子の側面(profile)を導入し得る。例えば、純粋な形態又は無菌担体中の一つ以上のリガンドが、創傷部位を覆って散在させられてもよく、又は担体中に組込まれて創傷に施されてもよい。例えば、緩慢放出又は制御放出の様式でリガンドを創傷に送達し得る適切な材料中に、リガンドが取込まれても又は封入されてもよい。そのような適切な材料の例は、調剤されて制御放出の様式でペプチドを放出し得るポリ(ラクチド-コ-グリコリド)又はPLGAの粒子である。あるいは、一つ以上のリガンドが包帯剤中に取込まれて、創傷を覆って施され得る。そのような包帯剤の例としては、創傷治癒材料を含む緩慢放出性親水コロイド粒子又は創傷治癒材料を含むスポンジが組込まれている段階状又は層状の包帯剤が挙げられ、前記包帯剤は任意で通常の包帯剤が層状にかぶせられていてもよい。現在使用されている種類の親水コロイド包帯剤、例えば“グラニュフレックス(Granuflex)”の商標の下で入手可能な親水コロイド包帯剤が改変されて、創傷に対してリガンドを放出してもよい。
本発明は、ヒト又は非ヒトにおける創傷の治癒を促す創傷の治療方法にも関し、その方法は、本発明の組成物を創傷に施すことを含む。さらなる側面では、本発明は、本発明の組成物を有する支持材を含む創傷用包帯剤を提供する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
［1. 本発明のプロセッシングプロテアーゼの単離及びアッセイ］
アミノベンズアミジンアガロース上におけるルシリア・セリカタESのアフィニティークロマトグラフィーによって、トリプシン様セリンプロテイナーゼを精製した。0.5 M NaClを含む0.025 M トリス-HCl緩衝液pH 8.0を20 mL用いて、カラムマトリックス（1 mL）を平衡化した。未精製ES（0.5 mL、70 μg/mLタンパク質）は、カラムに装荷する前に、等体積の緩衝液で希釈した。クロマトグラフィーを通して、画分（0.5 mL）を収集した。カラム体積の6.5倍の緩衝液を用いて洗滌して、非結合タンパク質を除去した後、遊離アミノベンズアミジンリガンド（400 μM、2 mL）を用いて、結合材料の溶出を誘発した。前記画分の280 nmにおける吸光度の読みを用いて非結合（フロースルー）ピーク及び結合ピークの位置を確立し、次にそれらピークをアッセイのために収集した。溶出プロフィールは、図１に示されている。
【００１１】
アミノベンズアミジンアガロースは、トリプシン様セリンプロテアーゼを結合する。前記カラムへの幼虫酵素分泌物の装荷に続いて、非結合材料がそのまま通り抜け、これを“フロースルー”（ピークI）として収集した。カラム緩衝液への遊離アミノベンズアミジンの添加は、結合プロテイナーゼの溶出（ピークII）を誘発した。非結合（フロースルー）材料は、APMSFによって影響されないプロテイナーゼ活性を含んでいた（おそらくは、キモトリプシン様酵素を含んでいる）。一方、アミノベンズアミジン溶出ピークにおける活性はAPMSFによって実質的に（80％）消失し、これによりトリプシン様セリンプロテイナーゼ活性の精製が示された。カラム画分の残留活性は、図２で示されている。
カラム画分を、非還元性SDSサンプル緩衝液（4％SDS、20％グリセロール及び0.02％ブロモフェノールブルーを含む0.5 M トリス-HCl、pH 6.8）を用いて、0.1％ヒトヘモグロビンを含む12％SDSポリアクリルアミドゲル上の電気泳動によって調べた。2.5％トリトンX-100中（1時間）と蒸留水中（15分間）とで洗滌することによって、SDSを除去した。0.1 M トリス-HCl緩衝液pH 8.0の中で37℃にて一晩インキュベーションすることにより、ゲル中のヘモグロビン基質のタンパク質分解を行い、クーマシーブリリアントブルーでのタンパク質染色によって、プロテイナーゼ酵素の位置に対応する明瞭なバンドが現れた（図３）。出発画分及びフロースルー画分の各々は複数のプロテイナーゼ活性を示したが、アミノベンズアミジン溶出画分はただ一つのバンドを示した。このように、アミノベンズアミジン溶出画分において先に同定した（図２）トリプシン様酵素は、およそ25 kDaの分子量を有することが示された（図３）。
【００１２】
［2. FITC-カゼインを用いた幼虫酵素（ES）のタンパク質分解作用の調査］
FITC-カゼインのタンパク質分解におけるルシリア・セリカタESの活性を、pH 8にて、次のようにES(0.25 μg)の異なる提示を用いて調査した。
Ａ．    ES＋H2O
Ｂ．    ES＋エタノール
Ｃ．    0.2 mM PMSFでプレインキュベートしたES
Ｄ．    0.6 mM PMSFでプレインキュベートしたES
Ｅ．    1 mM PMSFでプレインキュベートしたES
Ｆ．    0.04 mM APMSFでプレインキュベートしたES
Ｇ．    0.12 mM APMSFでプレインキュベートしたES
Ｈ．    0.2 mM APMSFでプレインキュベートしたES
【００１３】
ルシリア・セリカタESのタンパク質分解活性は、不可逆性セリンプロテイナーゼ阻害剤PMSFとプレインキュベーションすると阻害された。ESを1 mM PMSFでプレインキュベートした場合に、そのタンパク質分解活性は全て阻害された。PMSFはエタノールに溶解し、ESの活性に対するこの溶媒の影響は無視できた。対照的に、ESを不可逆性“トリプシン様”特異的阻害剤APMSFでプレインキュベートした場合は、およそ50％の残留セリンプロテイナーゼ活性がESから検出された。APMSFの存在下の残留活性は、キモトリプシン様酵素の存在を示す。得られた活性（％）の値は、次のようであった。
Ａ．    100％
Ｂ．    85.5％
Ｃ．    13.8％
Ｄ．    18％
Ｅ．    0％
Ｆ．    43.5％
Ｇ．    47％
Ｈ．    54％
これらの結果は、図４にグラフ化して示されている。
【００１４】
［3. 特異的基質に対する幼虫酵素(ES)のタンパク質分解活性の調査］
APMSF及びPMSF存在下でのトシル-Gly-Pro-Arg-AMC（a）とSuc-Ala-Ala-Phe-AMC（b）とに対するルシリア・セリカタES（0.25 μg）の活性を、次のようにESの異なる提示を用いて調査した。
（a）
Ａ．    ES
Ｂ．    0.025 mM APMSFでプレインキュベートしたES
Ｃ．    0.05 mM APMSFでプレインキュベートしたES
Ｄ．    1 mM PMSFでプレインキュベートしたES
（b）
Ｅ．    ES
Ｆ．    0.2 mM APMSFでプレインキュベートしたES
Ｇ．    1 mM PMSFでプレインキュベートしたES
【００１５】
得られた残留活性（％）の値は、次のようであった。
（a）
Ａ．    100％
Ｂ．    14.3％
Ｃ．    3.6％
Ｄ．    0％
（b）
Ｅ．    100％
Ｆ．    86.8％
Ｇ．    1.3％
これらの結果は、図５にグラフ化して示されている。
(a)に対する結果は、ルシリア・セリカタESにおける“トリプシン様”セリンプロテイナーゼ活性の存在を明らかにしている。トシル-Gly-Pro-Arg-AMCの加水分解（セリンプロテイナーゼであるトロンビン及びプラスミンに対して選択的）は、1 mM PMSF及び0.05 mM APMSFによって阻害された。しかしながら、ルシリア・セリカタによるキモトリプシン基質Suc-Ala-Ala-Phe-AMCの加水分解は、PMSF（1 mM）によってのみ阻害され、過剰量のAPMSF（キモトリプシンを阻害しない）によっては阻害されなかった。この結果は、二つの異なるサブクラスのセリンプロテイナーゼがESに存在することの更なる証拠を提供する。
【００１６】
［4. トール受容体及びトール様受容体に対するリガンド］
上述するように、本発明の組成物に用いられ得るリガンドは、特定の態様に従って、ヒトのトール受容体に対する構成性リガンド及び誘導性リガンドから選択されてもよく、またセリンプロテアーゼのようなプロテアーゼによってプロセッシングされても又はされなくてもよい。具体的な例は、ドロソフィラ・メラノガスターから得られるトール受容体リガンドであるシュペッツレタンパク質であって、そのプロセッシング前及びプロセッシング後の両方の形態がある。シュペッツレは、Cell(1994), 76, 677-688に記載され特徴付けられている。
ルシリア・セリカタの異なる発育段階に由来するシュペッツレ様タンパク質（シュペッツレの相同体又は類似体）も、本発明でトール受容体リガンドとして用いられ得る。前記タンパク質は、ドロソフィラのシュペッツレタンパク質に対して生じた抗体を用いて同定され得る。前記タンパク質はルシリア・セリカタのシュペッツレ様タンパク質に富む発育段階から精製されてもよく、生理食塩水中への抽出によって抽出物を得て、次にその抽出物を抗体アフィニティークロマトグラフィーカラムに装荷して、精製が達成され得る。このように同定されたシュペッツレ様タンパク質は、ヒト白血球のトール受容体と結合する(engage)能力についてテストされ得る。ヒト末梢血単核（HPBM）細胞がルシリア・セリカタ由来のシュペッツレ様タンパク質と共培養されてから前記HPBM細胞の増殖がチミジン取り込みを用いて測定されてもよい。それと提携して、ルシリアシュペッツレの相同体又は類似体のサイトカイン分泌（TNF-α）を誘導する能力が、既知のトール受容体（LPS-細菌性リポポリサッカライド）と並行してモニターされ得る。
トール様受容体のリガンドは、Cytokine and Growth Factor Reviews 11(2000)219-232に記載されている。
【００１７】
（実施例）
誘導した蛆虫血リンパにおけるLPS様活性を同定する研究を行った（ルシリア・セリカタの幼虫を用いた）。
L.セリカタの幼虫は、無菌の肝臓/寒天溶液中、シュードモナス・エルジノザ(Pseudomonas aeruginosa)の存在下（誘導）又は非存在下（非誘導）で育てた。無菌のL.セリカタの幼虫は、Surgical Materials Testing Laboratory SMTL（Princess of Wales Hospital, Bridgend CF31 1RQ）から入手した。幼虫は、Sherman（1995）により記載された培地で育てた。前記培地は、腐敗したブタの肝臓とバクトアガーとを含み、閉鎖容器中でオートクレーブすることによって滅菌した。前記閉鎖容器は、容器の内側と外側との間で気体及び水分の交換は可能にされているが、細菌の容器内への侵入は妨げられている。幼虫用の栄養培地の薄い層を、前記容器の底に用意した。
無菌の第一齢幼虫（200）を200 μLの滅菌したリン酸緩衝生理食塩水に懸濁して、前記容器に移した。28℃にておよそ48時間加湿器において無菌状態下で育てて、幼虫を樹立させた。シュードモナス・エルジノザの変異体PAO P47を10 mLのルーリア-ベルターニ（LB）培地に接種して、振盪しながら37℃にて一晩育てた。その培養物の1 mL（生存数およそ108）を前記容器に接種し、前記幼虫を前記細菌の存在下で育てた。
P.アルジノザ培養物での接種を用いなかったことを除いて、上述の手順を繰り返した。
【００１８】
48時間インキュベーションした後、上述する手順から得た第二齢後期の幼虫を、次のように別々に処理した。
無菌状態下で、前記幼虫を肝臓-寒天溶液から取り出して、滅菌したユニバーサルチューブへ移した。蛆虫を滅菌した冷PBSで洗滌し、次に70％エタノール中で洗滌して、最後にフィルターペーパー上で乾かした。次に、滅菌した外科手術刀を用いて幼虫のかぎ状器官(hooks)の基部を切断した。次に、滅菌した黄色エッペンドルフチップを有する20 μLのピペットを用いて、血リンパを採取し、20 μg/mLのアプロチニン（プロテアーゼ阻害剤）及び40 μMのフェニルチオカルバミド（メラニン化阻害剤）を含む予備冷却したエッペンドルフチューブの中に移した。15,000 gで4℃にて10分間遠心分離した後、予備冷却したチューブに上清を収集して、必要とするまで−80℃で保持した。この方法を用いたとき、消化管内容物は血リンパに混入しなかった。また、LB溶液又はプレートでの一晩培養によって判断して、血リンパにはP.アルジノザが混入していなかった。
（上述のように調製した）誘導及び非誘導血リンパ上清のTNF-α放出に対する影響を、‘サンドイッチ’ELISAを用いてヒト末梢血単核細胞（PBMC）でテストして、LPSと比較した。
三人の健康なヒトボランティア（ドナー1、2及び3）から承諾を得て、血液標本を入手した。三人のドナーの各々に由来するヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、Histopaque 1077（Sigma, Poole, UK）による600 gにて20分間の浮遊密度遠心分離によって、へパリン処理した全血から単離した。中間層から採取したPBMCを、RPMI 1640培地を用いて２回洗滌し、AIM-V培地に再懸濁した。
【００１９】
次に、105個のPBMCを96ウェルプレート上に蒔いて培養し、増加性濃度の非誘導/誘導血リンパと、ポジティブコントロールとしてのE.coli血清型055：B5由来のLPSとを100 μLずつでインキュベートした。24時間のインキュベーションの後、細胞上清を収集して、マウス抗ヒトTNF-α抗体でプレコーティングした96ウェルプレート上に添加した。20 ng/mLから出発する標準ヒトTNF-αの連続希釈物を並列に並べて含めた。見込まれるTNF-αを、一晩放置して捕捉して、0.05％（v/v）PBS/Tween 20で３回洗滌した後、ビオチン化マウス抗ヒトTNF-α抗体の添加を用いて、捕捉抗体を検出した。0.05％（v/v）PBS/Tween 20を用いた最終洗滌の後、ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼをウェルに添加して、テトラメチルベンジジンを基質として用いて10分間発色させて、その発色をDynexプレートリーダーで450 nmにて読取った。全てのアッセイは、二連で行った。
この結果は、図６にグラフ化して示されている。図６において、(A)列は三人のドナーの各々に由来するLPS処理したPBMCについて得られたプロットを示しており、LPS（μg/mL）に対して検出したTNF-α（ng/mL）の関係が示されている。(B)列は、血リンパ処理したPBMCサンプルの各々について、血リンパ濃度に対する最大LPS応答を超えて生成した％TNF-α（％LPSとして示される）を示している。(B)列のプロットは、誘導血リンパ及び非誘導血リンパの両方についての結果を示している。この研究によって、誘導血リンパはヒトPBMCからのTNF-α分泌を刺激することが実証される。ここで記述すべき重要なことは、LB溶液又はプレートにおける一晩培養によって判断して、血リンパにはP.アルジノザが全く混入していなかったことである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アミノベンズアミジンアガロースからのセリカタ・ルシリアESの溶出プロフィールを示す。
【図２】アミノベンズアミジンアガロースゲルからセリカタ・ルシリアESを溶出したカラム画分のプロテイナーゼ残留活性を示す。
【図３】アミノベンズアミジンアガロースゲルからセリカタ・ルシリアESを溶出したカラム画分に電気泳動を行い、クーマシーブリリアントブルーでタンパク質染色した結果を示す。
【図４】APMSF/PMSFの存在下でのL.セリカタES(0.25 μg)によるFITC-カゼインの加水分解活性を示す。
【図５】APMSF/PMSFの存在下でのL.セリカタES(0.25 μg)によるトシル-Gly-Pro-Arg-AMC及びSuc-Ala-Ala-Phe-AMCの加水分解活性を示す。
【図６】ヒト末梢血単核細胞からのTNF-α放出に対する誘導及び非誘導血リンパ上清の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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