(57)【要約】ミトコンドリアゲノム全体の突然変異の検査が、前立腺がんや非黒色腫皮膚がんのような疾患のための診断システムとして用いられている。ミトコンドリアゲノムにおける点突然変異（トランジション、トランスバージョン）、欠失、逆位、重複、組換え、挿入またはこれらの組合せを含む特徴的な突然変異および再配列が、前立腺がんおよび非黒色腫皮膚がんの初期のインジケータとして用いられている。さらに、4977bp、または他の関連する突然変異および（または）欠失とともに「共通欠失（common deletion）」が、老化の尺度として用いられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｔＤＮＡを含む被検体において病気の発生または進行を検出する方法であって、
ａ）被検体から生物学的試料を獲得する工程と、
ｂ）生物学的試料からＤＮＡを取り出す工程と、
ｃ）ｍｔＤＮＡの中の突然変異の存在を検出する工程と、
ｄ）生物学的試料のｍｔＤＮＡをデータベースと比較する工程とを備え、
データベースが、病気のないミトコンドリアＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項1の方法であって、
突然変異の存在を検出する工程が、
ａ）ｍｔＤＮＡの配列を決定する工程と、
ｂ）ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅する工程と、
ｃ）サザン、ノーザン、ウェスタンおよびサウスウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションする工程と、
ｄ）ＨＰＬＣを変性させる工程と、
ｅ）マイクロアレイ、遺伝子チップまたはバイオチップにハイブリダイゼーションする工程と、
ｆ）分子マーカー分析と、
ｇ）ａ）ないしｆ）のいずれかの組合せと、
からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、
配列が決定されるミトコンドリアＤＮＡは、病気と関連する既知のバイオマーカーが配置されているミトコンドリアゲノムの特異領域を有している、
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２の方法であって、
配列が決定されるミトコンドリアＤＮＡがミトコンドリアゲノム全体を有している、
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、
生物学的試料が、病気の潜在的部位であると疑われる組織からのものである、
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１の方法であって、
生物学的試料が、転移していると疑われる組織からのものである、
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１において、
病気が前立腺がんおよび非黒色腫皮膚がんのグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７において、
病気が前立腺がんである、
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７において、
病気が非黒色腫皮膚がんである、
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１において、
突然変異が、単一塩基対の突然変異、欠失、挿入およびトランスバージョンのグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１において、
突然変異がホモプラスミーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１において、
突然変異が任意のレベルのヘテロプラスミーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１において、
生物学的試料が、血液、唾液、頬の細胞、前立腺液、唾、汗、ＰＡＰ頚管組織、尿、皮膚細胞、骨、髪、リンパ組織、頚管塗抹、乳吸引物、おりもの、精液、月経液または生検組織からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
クレーム１ないし１３のいずれかにおいて、
データベースが、少なくとも有意性のある数のミトコンドリアＤＮＡ配列を有しており、ミトコンドリアＤＮＡ配列が母系および非母系双方の試料から獲得されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
ｍｔＤＮＡを含む被検体において病気の存在を検出する方法であって、
ａ）被検体から生物学的試料を獲得する工程と、
ｂ）生物学的試料からＤＮＡを取り出す工程と、
ｃ）ｍｔＤＮＡの中の突然変異の存在を検出する工程と、
ｄ）生物学的試料のｍｔＤＮＡをデータベースと比較する工程とを備え、
データベースが、病気のないミトコンドリアＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる、
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法であって、
突然変異の存在を検出する工程が、
ａ）ｍｔＤＮＡの配列を決定する工程と、
ｂ）ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅する工程と、
ｃ）サザン、ノーザン、ウェスタンおよびサウスウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションする工程と、
ｄ）ＨＰＬＣを変性させる工程と、
ｅ）マイクロアレイ、遺伝子チップまたはバイオチップにハイブリダイゼーションする工程と、
ｆ）分子マーカー分析と、
ｇ）ａ）ないしｆ）のいずれかの組合せと、
からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、
配列が決定されるミトコンドリアＤＮＡは、病気と関連する既知のバイオマーカーが配置されているミトコンドリアゲノムの特異領域を有している、
ことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６の方法であって、
配列が決定されるミトコンドリアＤＮＡが全ミトコンドリアゲノムを有している、
ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５の方法であって、
生物学的試料が、病気の潜在的部位であると疑われる組織からのものである、
ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５の方法であって、
生物学的試料が、転移していると疑われる組織からのものである、
ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１５において、
病気が前立腺がんおよび非黒色腫皮膚がんのグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１において、
病気が前立腺がんである、
ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２１において、
病気が非黒色腫皮膚がんである、
ことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１５において、
突然変異が、単一塩基対の突然変異、欠失、挿入およびトランスバージョンのグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１５において、
突然変異がホモプラスミーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１５において、
突然変異が任意のレベルのヘテロプラスミーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１５において、
生物学的試料が、血液、唾液、頬の細胞、前立腺液、唾、汗、ＰＡＰ頚管組織、尿、皮膚細胞、骨、髪、リンパ組織、頚管塗抹、乳吸引物、おりもの、精液、月経液または生検組織からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項２８】
クレーム１５ないし２７のいずれかにおいて、
データベースが、少なくとも有意性のある数のミトコンドリアＤＮＡ配列を有しており、ミトコンドリアＤＮＡ配列が母系および非母系双方の試料から獲得されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項２９】
ミトコンドリアＤＮＡ配列の突然変異によって示される病気素質または機能障害素質を決定する方法であって、
ａ）被検体から生物学的試料を獲得する工程と、
ｂ）生物学的試料からＤＮＡを取り出す工程と、
ｃ）ｍｔＤＮＡの中の突然変異の存在を検出する工程と、
ｄ）生物学的試料のｍｔＤＮＡをデータベースと比較する工程とを備え、
データベースが、病気のないミトコンドリアＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる、
ことを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９の方法であって、
突然変異の存在を検出する工程が、
ａ）ｍｔＤＮＡの配列を決定する工程と、
ｂ）ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅する工程と、
ｃ）サザン、ノーザン、ウェスタンおよびサウスウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションする工程と、
ｄ）ＨＰＬＣを変性させる工程と、
ｅ）マイクロアレイ、遺伝子チップまたはバイオチップにハイブリダイゼーションする工程と、
ｆ）分子マーカー分析と、
ｇ）ａ）ないしｆ）のいずれかの組合せと、
からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０の方法であって、
配列が決定されるミトコンドリアＤＮＡは、病気と関連する既知のバイオマーカーが配置されているミトコンドリアゲノムの特異領域を有している、
ことを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３０の方法であって、
配列が決定されるミトコンドリアＤＮＡが全ミトコンドリアゲノムを有している、
ことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項２９の方法であって、
生物学的試料が、病気の潜在的部位であると疑われる組織からのものである、
ことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項２９の方法であって、
生物学的試料が、転移していると疑われる組織からのものである、
ことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項２９において、
病気が前立腺がんおよび非黒色腫皮膚がんのグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３５において、
病気が前立腺がんである、
ことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３５において、
病気が非黒色腫皮膚がんである、
ことを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項２９において、
突然変異が、単一塩基対の突然変異、欠失、挿入およびトランスバージョンのグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項２９において、
突然変異がホモプラスミーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項２９において、
突然変異が任意のレベルのヘテロプラスミーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項２９において、
生物学的試料が、血液、唾液、頬の細胞、唾、前立腺液、汗、乳吸引物、おりもの、精液、ＰＡＰ頚管組織、尿、皮膚細胞、骨、髪、リンパ組織、おりもの、頚管塗抹または生検組織からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項４２】
クレーム２９ないし４１のいずれかにおいて、
データベースが、少なくとも有意性のある数のミトコンドリアＤＮＡ配列を有しており、ミトコンドリアＤＮＡ配列が母系および非母系双方の試料から獲得されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項４３】
ヒト検体の老化の進行状態を査定する方法であって、
ａ）ヒト検体から生物学的試料を獲得する工程と、
ｂ）生物学的試料からＤＮＡを取り出す工程と、
ｃ）ｍｔＤＮＡの中の突然変異の存在を検出する工程と、
ｄ）生物学的試料のｍｔＤＮＡをデータベースと比較する工程とを備え、
データベースが、病気のないミトコンドリアＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる、
ことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４３の方法であって、
突然変異の存在を検出する工程が、
ａ）ｍｔＤＮＡの配列を決定する工程と、
ｂ）ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅する工程と、
ｃ）サザン、ノーザン、ウェスタンおよびサウスウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションする工程と、
ｄ）ＨＰＬＣを変性させる工程と、
ｅ）マイクロアレイ、遺伝子チップまたはバイオチップにハイブリダイゼーションする工程と、
ｆ）分子マーカー分析と、
ｇ）ａ）ないしｆ）のいずれかの組合せと、
からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４３の方法であって、
配列が決定されるミトコンドリアＤＮＡは、病気と関連する既知のバイオマーカーが配置されているミトコンドリアゲノムの特異領域を有している、
ことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４３の方法であって、
配列が決定されるミトコンドリアＤＮＡが全ミトコンドリアゲノムを有している、
ことを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４３において、
突然変異が、単一塩基対の突然変異、欠失、挿入およびトランスバージョンのグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４３において、
突然変異がホモプラスミーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４３において、
突然変異が任意のレベルのヘテロプラスミーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４３において、
生物学的試料が、血液、唾液、頬の細胞、唾、前立腺液、汗、ＰＡＰ頚管組織、尿、皮膚細胞、骨、髪、リンパ組織、頚管塗抹、おりもの、乳吸引物、精液、月経液または生検組織からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項５１】
クレーム４３ないし５０のいずれかにおいて、
データベースが、少なくとも有意性のある数のミトコンドリアＤＮＡ配列を有しており、ミトコンドリアＤＮＡ配列が母系および非母系双方の試料から獲得されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項５２】
複数のヒトミトコンドリアＤＮＡ配列を有するデータベースであって、
ミトコンドリアＤＮＡ配列が、病気のない状態と関連する正常な制御配列と、病気の存在と関連する配列または病気素質を示す配列とからなるグループから選択されている、
ことを特徴とするデータベース。
【請求項５３】
請求項５２において、
病気が前立腺がんおよび非黒色腫皮膚がんのグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５２において、
ミトコンドリアＤＮＡ配列が、ヒト検体の老化のプロセスと関連している、
ことを特徴とする方法。
【請求項５５】
クレーム５３または５４において、
データベースが、有意性のある数のミトコンドリアＤＮＡ配列を有しており、ミトコンドリアＤＮＡ配列が母系および非母系双方の試料から獲得されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項５６】
病気の診断のためのキットであって、
使い捨てのチップと、マイクロアレイと、使い捨てチップを保持する手段と、ミトコンドリアＤＮＡを取り出す手段と、ミトコンドリアＤＮＡ配列のデータベースにアクセスするための手段とを備えた、
病気の診断のためのキット。
【請求項５７】
病気素質を決定するためのキットであって、
使い捨てのチップと、マイクロアレイと、使い捨てチップを保持する手段と、ミトコンドリアＤＮＡを取り出す手段と、ミトコンドリアＤＮＡ配列のデータベースにアクセスするための手段とを備えた、
病気素質を決定するためのキット。
【請求項５８】
複数の核酸要素と固形基質を有するアレイであって、
各核酸要素が病気の存在を示すとともに、ミトコンドリアＤＮＡとミトコンドリアＤＮＡから転写されたＲＮＡとからなるグループから選択されており、各核酸要素がアレイ上で特有の位置を有しており、固形基質に安定して結合している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項５９】
請求項５８において、
各核酸要素が前立腺がんを示している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項６０】
請求項５８において、
各核酸要素が非黒色腫皮膚がんを示している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項６１】
複数の核酸要素と固形基質を有するアレイであって、
各核酸要素が病気素質を示すとともに、ミトコンドリアＤＮＡとミトコンドリアＤＮＡから転写されたＲＮＡとｃＤＮＡとからなるグループから選択されており、各核酸要素がアレイ上で特有の位置を有しており、固形基質に安定して会合している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項６２】
請求項５８において、
各核酸要素が病気素質を示している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項６３】
請求項５８において、
各核酸要素が老化のプロセスと関係している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項６４】
患者の病気を診断する方法であって、
ミトコンドリアＤＮＡから得られた核酸試料を、固形基質と複数の核酸要素を有するアレイにハイブリダイゼーションする工程を備え、各核酸要素が病気の存在を示しており、各核酸要素が特有の位置を有するとともに固形基質に安定して結合しており、アレイを有する一つまたはそれ以上の核酸要素への核酸試料のハイブリダイゼーションが、病気の存在を示している、
ことを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項６４において、
病気が前立腺がんである、
ことを特徴とする方法。
【請求項６６】
請求項６５において、
前立腺液試料を患者から分離する工程をさらに備えた、
ことを特徴とする方法。
【請求項６７】
請求項６５において、
前立腺液試料から核酸試料を用意する工程をさらに備えた、
ことを特徴とする方法。
【請求項６８】
患者の非黒色腫皮膚がんを診断する方法であって、
ミトコンドリアＤＮＡから得られた核酸試料を、固形基質と複数の核酸要素を有するアレイにハイブリダイゼーションする工程を備え、各核酸要素が非黒色腫皮膚がんを示しており、各核酸要素が特有の位置を有するとともに固形基質に安定して結合しており、アレイを有する一つまたはそれ以上の核酸要素への核酸試料のハイブリダイゼーションが、非黒色腫皮膚がんの存在を示している、
ことを特徴とする方法。
【請求項６９】
請求項６８において、
皮膚試料を患者から分離する工程をさらに備えた、
ことを特徴とする方法。
【請求項７０】
請求項６９において、
皮膚試料から核酸試料を準備する工程をさらに備えた、
ことを特徴とする方法。
【請求項７１】
ｍｔＤＮＡを含む被検体においてヘテロプラスミーを検出する方法であって、
ａ）被検体から生物学的試料を獲得する工程と、
ｂ）生物学的試料からＤＮＡを取り出す工程と、
ｃ）試料上のＨＰＬＣを変性させる工程と、
を備えた方法。
【請求項７２】
ｍｔＤＮＡを含む被検体において病気と関連する突然変異を検出するための方法であって、
ａ）被検体から生物学的試料を獲得する工程と、
ｂ）生物学的試料からＤＮＡを取り出す工程と、
ｃ）ｍｔＤＮＡの中の突然変異の存在を検出する工程と、
ｄ）生物学的試料のｍｔＤＮＡをデータベースと比較する工程とを備え、
データベースが、病気のない共通集団のバリアントのデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる、
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアゲノムの分野に関する。とくに、本発明は、ミトコンドリアゲノムの突然変異に関するとともに、疾患のほんの初期の段階におけるそのインジケータとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物科学における最近の大きな流れは、ヒトのゲノムプロジェクトであり、そのデータの商業的利用である。しかしながら、データが個人のレベルにおいて特定的なものではないため、この情報の使用および提供には例外的な制限がある。信じられないほどに、データはほんの少数の個人からのものであり、ヒトの集団に存在する変化をほとんど表しておらず、データを一般的な適用にのみ有用なものにしている。ヒトのゲノムの驚くほどの複雑さは、個人ベースへの適用を実行不可能なものにしている。ヒト一人の核のゲノムの配列を完全に決定するために、米国のエネルギー省および国家保健研究所は、１９８８年以来２５億ドルを投資している（http://www.ornl.gov/hgmis/project/budget.html）。
【０００３】
ミトコンドリアゲノム
ミトコンドリアゲノムは、コンパクトだが重要な核酸配列である。ミトコンドリアゲノムは、細胞呼吸に必要な酵素のサブユニットをコードする。ミトコンドリアＤＮＡつまりｍｔＤＮＡは、33億塩基対（base pairs: bp Andersonら(1981); Andrews ら(1999)）の巨大な核ゲノムに比べて、16,569 塩基対において核酸の非常に小さなゲノムである。その遺伝補体（genetic complement）は、その核細胞の相手の遺伝補体よりも天文学的に小さい（0.0005%）。しかしながら、連絡つまり化学的シグナルは、日常的に発生している（Sherrattら(1997)）。さらに、特定の核成分は、ミトコンドリア配列の維持および保持に対して責任がある。潜在的な疾患を示す核の再配列によってこれらの核領域が機能しなくなったとき、ｍｔＤＮＡ配列に突然変異が現れ始める。また、特定のミトコンドリアが、ミトコンドリアゲノムにおける体細胞突然変異によって誘発される欠失による細胞内破壊のために認定されるかもしれない。このような理論的なメカニズムは、これから発症しようとする病気の徴候として役立つかもしれない。ミトコンドリアを作成するのに、約3,000の遺伝子が必要であるが、これらのうちのたった37個がミトコンドリアゲノムによってコードされており、このことは、遺伝子座に対するミトコンドリアのかなりの依存性を示している（Naviaux(1997)）。
【０００４】
ｍｔＤＮＡの本質的な役割は、細胞代謝を燃焼させる細胞燃料であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生成である。重要なことに、ミトコンドリアゲノムは、その重要な機能に必要な酸化・還元反応を達成するために、ミトコンドリアゲノムによって供給された１３のポリペプチドに加えて（Leonard and Shapira(1997)）、核コードされた７０のタンパク質に依存している。種々の組織および器官が、異なる程度で酸化的リン酸化反応に依存している。さらに、ミトコンドリアゲノムの突然変異は、種々の慢性変性疾患に関係している（Gattermannら(1995)）。欠陥酸化的リン酸化反応（ＯＸＰＨＯＳ）に関連する疾患は、ｍｔＤＮＡの突然変異に関連していると考えられている（Byrne(1992)）。したがって、ｍｔＤＮＡの突然変異の激しさが増すことによりＯＸＰＨＯＳが減少するにつれて、種々の臨床的表現型を引き起こす、器官特有のエネルギー閾値が超えられることになる。
【０００５】
最近、フリス（Fliss）ら（2000）は、肺がんおよび膀胱がんからの第１期腫瘍において本来著しくホモプラスミーであったｍｔＤＮＡ突然変異の高周波が、突然変異ｍｔＤＮＡががん細胞において支配的であったことを示していることを発見した。点突然変異および欠失は、ミトコンドリアゲノムおよび膜に対して酸素のフリーラジカルによる障害であるところの、プログラムされていないが避けられない副作用であると考えられている（Miquelら(1992)）。ミトコンドリアゲノムが防御ヒストンを有していないばかりか、ミトコンドリアの酸素発生内膜の近傍で酸化損傷の影響を受けやすいので、このような理論は一応妥当性がある。さらに、ｍｔＤＮＡがコンパクトなゲノムを有しており、イントロンを有していないので、有毒な事象が、生化学的機能障害に帰着することになるコード配列に影響を与えやすくなる。この機能障害は、ｍｔＤＮＡ損傷のみならず核損傷につながる細胞酸化作用をさらに増加させ、これにより、細胞が癌進行状態に入る可能性を増加させる（Pentaら(2001)）。この点において、研究は、年齢の増加とともにｍｔＤＮＡの損傷が増加し（Cortopassi & Wang 1955）、それに続いて、いつかは起こる細胞死につながることになる呼吸機能の低下が生じる（Miquelら(1992)）ということを示している。
【０００６】
診断ツールとしてのｍｔＤＮＡ
ｍｔＤＮＡ配列の成長過程は、重要な診断ツールである。ｍｔＤＮＡの突然変異は、核の突然変異と関係していることが多いが、病気の症状を示す予備的なインジケータとしてしばしば用いられており、以下のような病気（これらには限定されないが）に関連するバイオマーカーとして作用している。すなわち、組織損傷、（直接）喫煙および間接喫煙による癌（Leeら(1998); Wei(1998)）、２０歳の頃に始まってその後増加するミトコンドリアゲノム突然変異の蓄積に基づいた寿命（von Wurmb(1998)）、発がん物質、変異原または紫外線にさらされることによるまたは突然変異により生じる転移性疾患（Birch-Machin(2000)）、骨関節症、心臓血管障害、アルツハイマー病、パーキンソン病（Shoffnerら(1993); Sherrattら(1997); Zangら(1998)）、年齢に関係した難聴（Seidmanら(1997)）、視神経の変性および心拍不整（Brownら(1997); Wallceら(1988)）、慢性進行性眼球突出症（Taniikeら(1992)）、粥状硬化症（Boglioloら(1999)）、乳頭状甲状腺がんおよび甲状腺腫瘍（Yehら(2000)）、ならびにその他の病気（例：Naviaux(1997); Chinnery および Turnbull(1997)）。
【０００７】
とくに、これらの変性は、点突然変異（トランジション、トランスバージョン）、欠失（一つの塩基から何千もの塩基への）、逆位、重複（一つの塩基から何千もの塩基への）、組換え、挿入（一つの塩基から何千もの塩基への）を含んでいる。また、特定の塩基対の変性、欠失または結合が、前立腺がん、皮膚がんおよび肺がんの早期発症ばかりでなく、老化（例：Polyakら(1998)）、早期老化、発がん物質にさらされること（Leeら(1998)）などと関係している。
【０００８】
ｍｔＤＮＡは卵を介してのみ子孫に伝えられるので、この遺伝手段を通じてミトコンドリア配列を理解するのは重要なことである。ｍｔＤＮＡの配列は、母系の血族間で広汎に変化する（Wardら(1991)）。したがって、病気に関連した突然変異は、この変化と比較して明確に理解されなければならない。たとえば、特定の癌に関連して、何人かの個人の配列に見られる特定のＴからＣへのトランジションは、実際には、特定の地理的領域に広まったつまり民族性に関連した、母系の血族における自然の変化であろう。たとえば、先住北アメリカ人は、異常に高い頻度で大人が糖尿病を発症する。また、すべての北米先住民は、Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＸで表される五つの基本的な母系血族によって、一般に特徴付けられている（Schurrら(1990); Stone および Stoneking(1993); Smithら(1999)）。血族Ａは、ミトコンドリアゲノムの663 bp(塩基対)において部位 Hae III に帰着することになる単純点突然変異によって識別される。しかしながら、この突然変異と成人の糖尿病発症との間に原因となる関係はなかった。また、血族集団内においてさえ、配列変性が存在する。
【０００９】
特定の血族に関連した特定のマーカーの外側には、人の集団における配列の変性よりももっと多く人の集団における変性がある（Eastonら(1996); Wardら(1991, 1993)）。このような相違は、病気が関連した突然変異の最適な識別のために理解されなければならない。したがって、縦構造の力を真似する（つまり、被験者が実質的な時間にわたって追跡する）母系研究のアプローチ（Parsonsら(1997)）が、病気との関連を持たない突然変異と対照的であるところの、病気と直接関連する突然変異を識別するのに用いられなければならない。さらに、タバコの間接喫煙、低レベルのアスベスト、鉛、すでに知られておりかつ多くの環境で低レベルのすべての突然変異原のような特定の物質が、特定の点突然変異の原因となるかもしれないが、必ずしも病気に特異性のあるマーカーではない。したがって、実質的なｍｔＤＮＡ配列データベースが、自然な進行過程としてのまたは作用因子にさらされることによる潜在的な病気を正確に予測するための明確な必要条件である。さらに、分子全体の配列が、そのすべての情報量のために決定されなければならない。点突然変異（トランジション、トランスバージョン）、欠失（一つの塩基から何千もの塩基への）、逆位、重複（一つの塩基から何千もの塩基への）、組換えおよび挿入（一つの塩基から何千もの塩基への）のすべてが、全ミトコンドリアゲノムにわたって全体として特徴付けられなければならない。これにより、ミトコンドリアゲノムにおいて利用可能なすべての情報を捕捉することが保証される。細胞質ミトコンドリアゲノム（16,569bp）は、核の場合と同様に、個人レベルでは、その配列が決定されたが、ミトコンドリアゲノムは、診断ツールとしての使用のために、集団レベルではその配列が決定されていない。
【００１０】
最近、ミトコンドリアは、アポトーシスおよび腫瘍生物学の他の局面における役割ゆえに、発がん性の進行過程において密接に結び付けられてきた（Green & Reed(1998); Pentaら(2001)）。とくに、ｍｔＤＮＡの体細胞突然変異は、多くのヒトの腫瘍で観察されてきた（Habanoら(1998); Polyakら(1998); Tamuraら(1999); Flissら(2000))。これらのうち後者の発見は、特定のｍｔＤＮＡ突然変異がホモプラスミーであると見られるという主張によって、より興味深いものとされた（Habanoら(1998); Polyakら(1998); Flissら(2000)）。また、研究者らは、紫外線照射（ＵＶ）が非黒色腫皮膚がん（ＮＭＳＣ）の病因および進行に重要であり(Weinstock(1998); Rees(1998))、ＵＶがヒトの皮膚においてｍｔＤＮＡの損傷を誘発する（Birch-Machin(2000a)）ということを見出した。
【００１１】
さらに、時間の経過により、ミトコンドリア配列は全体性を失う。たとえば、4977bpの欠失は、年齢とともに増加する（Fahnら(1996)）。２０歳のときに始まって、この欠失は、少数のミトコンドリアにおいて発生し始める。８０歳までに実質的な数の分子が欠失された。この欠失は、標準的な老化のプロセスを特徴付けており、そのようなものとして、このプロセスのバイオマーカーとして機能する。このような老化プロセスの定量化は、プロセスの進行を遅くするための医用またはその他の処置を可能にするかもしれない。
【００１２】
ｍｔＤＮＡは、主に集団遺伝学のツールとして、最近では法医学のツールとして、用いられてきたので、ミトコンドリアゲノムの薬への適用は見過ごされてきた。しかしながら、ｍｔＤＮＡの情報量が医用診断の分野に実質的に適用されていることがますます明らかになってきている。さらに、最近、大容量で多量処理のロボットＤＮＡシークエンサーシステムが出現するまで、ｍｔＤＮＡのすべての補体の配列を決定することは骨の折れる仕事であった。また、集団遺伝学は、制御領域において大きく変化した二つの地域から重要なデータを集めることができたが、これらの小さな地域は、ゲノム全体の１０％以下という小さな部分を代表しており、このことは、データのうちの分析力を有する９０％が使用されないということを意味している。重要なことではあるが、病気に関連した多くの変性は、制御領域の外側にある。ゲノム全体の特性は、正確でかつ高度に分析力のある診断のためには、すべての配列情報を含むようにみなされるべきである。
【００１３】
非黒色腫皮膚がん
ヒトの非黒色腫皮膚がん（ＮＭＳＣ）は、多くのコーカソイド人にもっともよく発生する癌である（Weinstock(1998); Rees(1998)）。これらの腫瘍の大部分は、基底細胞癌（ＢＣＣ）および扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。ＢＣＣは、局部的に浸潤性があり、著しいうつ状態を生じさせるがめったに転移しない。ＳＣＣは、著しい転移の可能性を示し、免疫抑制された患者における多発性ＮＭＳＣの発生は、重大な処置問題を生じさせる（Rees(1998)）。ＢＣＣにとって予め悪性の損傷は臨床的には何ら認定されていないが、ＳＣＣの中には、前駆体損傷、すなわち化学線角化症（ＡＫ）またはボーエン病（in situ 癌）（Rees(1998)）の領域から生じると考えられているものもある。
【００１４】
ＳＣＣは、いくつかの腫瘍抑制因子の発達中の関与を示唆するいくつかの染色体に影響を与えるヘテロ接合体の損失を示す。興味深いことに、ＡＫにおいては、ＳＣＣと比べて、同程度のまたは大きな遺伝的損失が前駆体において観察される（Rehmanら(1994); Rehmanら(1996)）。このことは、提案された発明においては重要なことである。というのは、腫瘍抑制因子の不活性化に加えて、他の機構がＳＣＣの発達に含まれていそうだということを示唆しているからである。
【００１５】
腫瘍形成におけるミトコンドリアの役割は、当初、腫瘍細胞が呼吸系傷害および高解糖作用を有していることが発見されたときに仮定されたものである（Shay & Werbin(1987)）。結腸がん（Penta(2001)らにより再調査されたHabanoら(1998); Polyakら(1998)）、膀胱、首、肺の第１期腫瘍（Flissら(2000)）、および胃の腫瘍（Tamuraら(1999)）におけるホモプラスミーｍｔＤＮＡ突然変異の高い発生率とともに、Green & Reed(1998)におけるミトコンドリアの役割を明らかにする最近の発見は、このような仮定をさらに支持するものである。さらに、これらのミトコンドリア突然変異が、高い分裂誘発性を有していることが示された活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルに影響を与えるかもしれないということが指摘された。
【００１６】
本願の発明者その他による過去の研究は、ｍｔＤＮＡの突然変異およびこれに関連したミトコンドリアの機能障害がヒトの変性疾患の重要な一因となっているということを示した（Birch-Machinら(1993); Chinneryら(1999); Birch-Machinら(2000b)）。これは、保護ヒストンの欠如に関連して細胞器官に生じた多量のＲＯＳのために、および核に比べて低い比率のｍｔＤＮＡ修復（Pascucciら(1997); Sawyer & van Houten; LeDouxら(1999)）のために、ミトコンドリアゲノムが突然変異にとくに影響を受けやすいからである。確かに、ｍｔＤＮＡの突然変異率は、核ＤＮＡよりも約１０倍高い（Wallace(1994)）。最近のヒトの腫瘍研究において認識されたｍｔＤＮＡ突然変異の多くは、ＲＯＳによる変異原にさらされる可能性を示している。このことは、ＮＭＳＣにおけるｍｔＤＮＡ突然変異の調査にとって重要である。というのは、ＵＶ誘発のＲＯＳがヒトの皮膚細胞におけるｍｔＤＮＡ欠失の発生に直接関わっているという最近の証拠があるからである。また、防御色素沈着または遺伝的素質のない個人におけるＮＭＳＣの最大の決定因子は、ＵＶである（Weinstock(1998)）。ＳＣＣにおいて前駆体損傷と推定されるものがまた、常時太陽にさらされた部位に際立って発見されている。このことは、重要である。というのは、Birch-Machin 研究所による成果が、太陽にさらされた体の異なる部位から採取された皮膚のミトコンドリアＤＮＡ損傷の発生における際立った違いを示しているからである。損傷の大部分は、常時太陽にさらされた部位に発見される（Krishananら(2002)）。
【００１７】
本願発明者のうちの一人は、ＵＶにさらされることがｍｔＤＮＡ損傷を誘発するということを定量的に示した最初の人であった（Birch-Machinら(1998)）。分子マーカーとしてのｍｔＤＮＡが、ヒトの皮膚において年齢による老化と光老化との間の関係を研究するのに用いられた。ヒトの皮膚の太陽への露出とその生活年齢とに対する、野生型ｍｔＤＮＡへの4977bp 欠失の比の変化を研究するために、３プライマー定量化ＰＣＲ法が用いられた。太陽から保護された部位（1.1%[1/90]）に比べて、太陽にさらされた部位（27%[27/100]）における高レベルの（つまり＞1%）4977bp 欠失のｍｔＤＮＡの発生が著しく増加した（Fishers exact test, P＜0.0001）。したがって、ｍｔＤＮＡの欠失または突然変異は、蓄積的な紫外線照射のマーカーとして有用である。
【００１８】
さらに、チミン二量体に対してモノクローナル抗体を含むサウスウェスタンブロットによるアプローチを用いた研究は、ＵＶが引き起こす、精製ｍｔＤＮＡへの損傷の存在の直接的な証拠を提供した（Rayら(1998)）。
【００１９】
しかしながら、単一の欠失の定量化のみでは、多くの可能な欠失または組合せおよび他の関連する突然変異のうちの一つを表わしているに過ぎないので、信頼できるＵＶバイオマーカーを提供しない（Birch-Machin(2000)）。本発明者らの研究グループによる最近の研究は、ＵＶにさらされることに派生して生じるｍｔＤＮＡの全欠失スペクトルを決定するために（Rayら(2000)）、すべてのミトコンドリアゲノムを増幅する長ＰＣＲ（ＬＸ−ＰＣＲ）技術を用いた。表皮がその下層の真皮から分離された７１の分割皮膚試料の長ＰＣＲ分析は、太陽にさらされることに関連して行われた。ＵＶに長くさらされるほど、表皮における欠失の数が著しく増加した（Kruskal-Wallis test, p=0.0015）。表皮における発見は、同様に長ＰＣＲ技術によって検出された、年齢によるｍｔＤＮＡ欠失の増加とは混同されていない。認識された欠失の大きなスペクトルは、ＵＶにさらされたことに関連するｍｔＤＮＡの変異荷重および偏在する性質を強調している。低コストのＰＣＲを用いた単一欠失の検出と比べて、長ＰＣＲは、高精度の技術であって、定量的ではないものの、皮膚のすべてのｍｔＤＮＡ損傷のより包括的な指数を提供するかもしれないということを示している。上記発明者のうちの一人による研究は、ｍｔＤＮＡがＵＶの重要な標的であって、このことが、皮膚の疾患におけるミトコンドリアの役割とともに、最近見直された（Birch-Machin(2000)）ということをはっきりと示している。
【００２０】
ＵＶ感度およびヒトの皮膚がんと主な共変関係にあるヒトの髪および皮膚の色が調査された。これらの調査は、皮膚がんの罹患性に関連する、個人または集団の太陽に対する感度とメラノコルチン１-受容体遺伝子の変異体との関連に集中して行われた（Smithら(1998); Healyら(1999); Flanaganら(2000); Healyら(2000); Hardingら(2000); Flanaganら(2002)）。しかしながら、これらの研究は、特定の皮膚の種類および（または）髪の色に関連して、ｍｔＤＮＡ配列における集団レベルの変化には取り組んではいなかった。
【００２１】
ヒトの腫瘍におけるｍｔＤＮＡ突然変異の最近の研究によって一般に答えられていない問題の一つは、これらの腫瘍に関連したミトコンドリアゲノムの欠失の発生である。これは、答えるべき重要な問題である。というのは、単一の患者の皮膚についての予備研究が、いくつかの腫瘍と正常な皮膚（ＡＫおよびＳＣＣ）との間の共通ｍｔＤＮＡ欠失の発生を示したからである（Pangら(1994)）。同様に、本発明者自身の予備データは、腫瘍内のｍｔＤＮＡ欠失の数が、正常な皮膚と比べて増加していることを示している。最後に、Birch-Machinおよびその他の者は、ｍｔＤＮＡ欠失の発生が、複製と同様に、ＵＶに長くさらされるほど増加するということを示した（Berneburgら(1999); Birch-Machinら(1998); Rayら(1999); Rayら(2000); Lindseyら(2001); Birch-Machinら(2001); Lowesら(2002); Krishnanら(2002)）。
【００２２】
腫瘍の発達に関連する問題は別にして、他の重要な問題が、ヒトの腫瘍におけるｍｔＤＮＡの最近の研究によって一般に答えられないでいる（Habanoら(1998); Flissら(2000)）。第１に、ヘテロプラスミーの変異レベルが重要な病気の変異についても示しているかもしれないので、ｍｔＤＮＡ突然変異が本当にホモプラスミーであるのかどうかが、技術的な制限のために明らかでないということである（Habanoら(1998); Polyakら(1998); Flissら(2000)）。第２に、一つの研究（Tamuraら(1999)）を別にしては、ｍｔＤＮＡ欠失の発生およびその潜在的なＮＭＳＣ用バイオメーカーとしての役割が、調査されなかった。研究者らは、共通欠失を見て、残りの１００かそこらの欠失を無視した。同様に、調査者らは、突然変異の定量化ではなく、突然変異を識別することに集中した。ｍｔＤＮＡ損傷のＡＴＰ生産に対するしたがって細胞機能に対する閾効果のために、欠失の発生を定量的手法で正確に評価することは重要なことである。また、欠失は、特徴付けることが難しい。特徴付けられなければならない欠失のラダーを生産する長ＰＣＲが、一般に用いられている。
【００２３】
現在のＮＭＳＣ診断は、切除された組織の病理的な鑑定である。したがって、ヒトをＮＭＳＣに罹りやすくする、ＵＶ誘発のＤＮＡ損傷のための早期マーカーの必要性が存在する。早期検出を可能にするとともに正確な診断を行える遺伝子ベースの診断ツールの必要性もまた存在している。
【００２４】
前立腺がん
前立腺がんは、しばしば診断される固形腫瘍であって、前立腺上皮に生じることが多い（Huangら(1999)）。１９９７年、１０００万近いアメリカの男性は、その存在が前立腺がんを示唆する前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の検査を受けた（Woodwell(1999)）本当に、このことは、さらに多くの数の男性が初期のデジタル前立腺触診（ＤＲＥ）を受けたということを示している。同じ年に、３１００万人の男性がＤＲＥを受けた（Woodwell(1999)）。さらに、米国において、前立腺がんを新たに診断したケースが年間179,000件であると見積もられている（Landisら(1999)）。これは、カナダの男性において、２番目に最も多く診断された癌であり、癌死亡率の中で２番目に多い原因である。１９９７年、前立腺がんは、カナダの男性（28%）において、初めて診断された癌の19,800件を占めた（National Cancer Institute of Canada）。４９歳を越えるすべての男性の３０〜４０％はいくつかの癌性前立腺細胞を有しているが、これらの男性のうちの２０〜２５％のみが臨床的に重要な形態の前立腺がんを有している（SpringNet-CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/j803a.htm）。前立腺がんは、性的な要因および外因性の要因の双方を含む種々の組織学的性質、すなわち、社会経済的状態、食品、地理、ホルモン不安定、家族の病歴、および遺伝体質を現わす（Konishiら(1997); Haywardら(1998)）。
【００２５】
危険性の観点からは、家族性前立腺がんと遺伝性前立腺がんとは、同義の語とはみなされない。家族性がんは、家族内での発生を指しているが、遺伝しない。この形態は、前立腺がんの２５％までを占めている（Walsh & Partin(1997)）。遺伝性とは、罹患性遺伝子のメンデル性遺伝をする亜型の前立腺がんのことを指しており、報告されたケースの約９％を占めている。前立腺がんに対する家族の陽性の病歴は、これらの罹患性遺伝子が前立腺がんの発達および進行に重要な役割を果たしているということを示唆している。最近、男性を前立腺がんにかかりやすくするものとして、染色体１およびＸにおける感受性遺伝子が識別されており、これにより、遺伝性がんの病因に対する大きな病識が提供されている（Berthonら(1998); Xuら(1998)）。
【００２６】
前立腺がんの予後は、主に、診断時における腫瘍の病期および進行度による。限局性の前立腺がんのみが根治療法によって治療することが可能である。標準的な検出は、依然として、デジタル前立腺触診やＰＳＡ試験、生検を行った前立腺組織の組織病理検査に頼っている。生検は、悪性腫瘍を確認するのに用いられているが、これは早期検出技術ではない。残念なことではあるが、初期の腫瘍の中には、触診の間に識別することができないものもある。ＰＳＡ試験は、６０〜７０％の特異性を有するとともに、７０〜８０％の感度を有している（personal communication, Dr. Sunil Gulavita, Northwestern Ontario Cancer Centre）。共通の組織学段階を有する腫瘍のための診断を改良する新しい技術は、フローサイメトリー法（Shankeyら(1995)）を採用する倍数性ＤＮＡ分析である。しかしながら、この技術は、癌の進行の後半段階になって明らかになる染色体の変化を測定しており、ＤＮＡ構造の小さな変化または染色体の逆位、あるいは初期の癌における相互転座の検出には十分な感度を有していない。予後は診断時の病気の段階に大きく左右されるため、本発明においては、初期の検出に集中している。
【００２７】
前立腺がんの遺伝子異常についての我々の理解は乏しい。前立腺がんに対する研究は、以下の領域における知識を発達させることに集中した。１）癌原遺伝子（Buttyanら(1987)）。２）腫瘍抑制遺伝子（p53,p73,  KAII and MMACI/PTEN; Dongら(1995); Cairnsら(1997)）。３）転移におけるテロメア／テロメラーゼ活性。前立腺細胞におけるテロメラーゼのアップレギュレーションおよびテロメアＤＮＡの増幅は、診断のための効果的なマーカーを提供するかもしれない。さらに、テロメアが治療のための部位として役立つかもしれない（Ozenら(1998)）。多くのグループが、染色体１の短いアームに「前立腺がん遺伝子」のための証拠を提供した。多くの研究は、この領域内で特異遺伝子座を特定することが必要とされている。このマーカーが男性を家族性前立腺がんに罹りやすくするいくつかの可能な遺伝子のうちの一つにすぎないということが示唆されてきた。他の研究は、Ｘ染色体の上の可能なマーカー部位を示した（Xuら(1998)）。もしいくつかの前立腺がんが多因性を有していれば、このような場合にすべての関連する核遺伝子間の相互作用を認識して理解するのは難しいので、ｍｔＤＮＡが重要な診断ツールとなる。
【００２８】
確かに、前立腺がんの研究における主要な問題は、腫瘍の段階を効果的に決定して識別することができる分子マーカーを識別することである。分子マーカーは、急速に転移病に進行する新生の前立腺腫瘍の場合と、腫瘍に発展することがほとんどない場合とを区別することができるかもしれない。今日まで、研究は、主に核ゲノムの内部に隠れた秘密に集中して行われてきた。その一方で、ずっと小さなｍｔＤＮＡゲノムが核内部の事象のバロメーターとして作用するように思われており、そのようなものとして、ヒトの前立腺がんの早期検出のための手段を提供している（Zevianiら(1990)）。重要なことに、この点において、ミトコンドリアは、アポトーシスおよび腫瘍生物学の他の面におけるその役割ゆえに、発がんのプロセスに関係してきた（Green & Reed(1998)）。とくに、ｍｔＤＮＡの体細胞突然変異が、多くのヒトの腫瘍において観察されてきた（Polyakら(1998); Tamuraら(1999); Flissら(2000)）。しかしながら、過去の研究は、母系のｍｔＤＮＡのクローン性を考慮していなかったので、もっぱら代表的な面を見てきただけであった。このような代表的な面だけを見た限定的な研究は、ある時点における突然変異を示しているにすぎない。これは、突然変異とこれに対応する病状との間の正確な関連を与えるかもしれないし、あるいは与えないかもしれない。代表的な面を見つつ母系を採用した研究は、ｍｔＤＮＡの突然変異を時間をかけて追跡するという利点を有しており、これにより、縦方向の構造の力をまねる。
一般的な集団異型である突然変異は、病気と関連した突然変異と対照的に、いずれも識別可能である。
【００２９】
老化
老化は、分子レベルおよび細胞レベルの双方において時間の経過による変化の蓄積からなる。しかしながら、老化のプロセスを引き起こす特定の分子構造は、解明されないで残っている。老化のプロセスを説明しようとして、年取った検体におけるミトコンドリアゲノムが、同じ母系からの若い検体のゲノムと比較された。老化に関連した一つの欠失は、共通欠失または4977-bp欠失として知られている。老化の研究は、この共通欠失および制御領域における多形現象に限定されてきた。この突然変異を明確に理解するためには、すべてのゲノムが分析されなければならない。その他の欠失は、1992年の Weiから改作された表１に見られる。
【表１】
2005506057.tif 000002
【００３０】
酸素フリーラジカルは、ＡＴＰ生産の標準的な副産物であるが、この欠失の確実な原因であり、年齢とともに頻度が増加する。現存する文献は、筋肉および脳のような細胞分裂しない組織においてｍｔＤＮＡ突然変異と、生活年齢と、全体の老化のプロセスとの間に強力な関係があることを実証している。しかしながら、年齢に関連した腫瘍の事象と年齢に関係しない腫瘍とを区別するためには、比較母系研究が必要とされている。
【００３１】
最近、種々の慢性変性疾患が、ｍｔＤＮＡの突然変異から起因していることが示された（Gattermanら(1995)）。変性ＯＸＰＨＯＳに関連した病気がｍｔＤＮＡ突然変異に密接に関連していると考えられている（Byrne(1992)）。さらに、これらの筋障害がミトコンドリアゲノムの4977-bpの共通欠失にしばしば関連していることが示された（Liuら(1977)）。この大きな欠失はまた、正常に年老いた人の種々の組織において、ヘテロプラスミーレベルで発見されており、老化のミトコンドリア理論（Mitochondrial Theory of Aging）と一致している（Harman(1981)）。これは、欠失頻度の増加（Cortopassi & Wang(1995)）、およびこれに続いて起こる、結果として老齢期の細胞死につながることになる呼吸機能の衰退（Miquelら(1992)）を通じて、明らかである。早期の遺伝子診断は患者の予後を向上させるので、病気素質または機能障害素質の早期発見は、医学の介入のための最良の機会を与える。
【００３２】
代表的な面だけの構造を採用した過去の研究は、ｍｔＤＮＡの突然変異、欠失、および（または）その組合せと老化との関連つまり因果関係を確立した。正確なデータを得るためには、年齢に特異性のある欠失および（または）突然変異の比率が簡潔に決定されなければならない。集団レベルでの特定の病気とは対照的に、突然変異を老化のプロセスに起因すると考えることは重要なことである。この情報は、いかにしてｍｔＤＮＡの損傷が時間をかけて生じるのかについての理解には不可欠である。さらに、予知を行うとともに最終的に分子レベルで老化を遅らせるためには、これらの特定の突然変異の結果、頻度、および老化の時間的側面における関係が知られなければならない。研究者らは、母系を通じて集団のデータの評価を必要とする、この比率を未だ決定していない。したがって、老化のプロセスを追跡するバイオメーカーの必要性が存在する。
【００３３】
したがって、早期の段階の癌、老化、またはＤＮＡ要素を備えた、その他のヒトの病気を示す突然変異のための膨大な核ゲノムを監視する単純かつ簡単なシステムの必要性が存在する。ミトコンドリアゲノムの欠失に関連する非黒色腫皮膚がん、前立腺がん、肺がんおよび老化のための簡単な診断システムの必要性についても存在する。病気を引き起こすｍｔＤＮＡの突然変異と、単に集団内および集団間の変異を示す突然変異とを識別する診断システムの必要性が存在する。
【００３４】
本発明の目的は、癌、老化、ＤＮＡ要素を有するその他のヒトの病気と関連した早期トランジションのために巨大な核ゲノムを監視するための単純で簡単なシステムを提供することにある。
【発明の開示】
【００３５】
本発明の一実施例においては、尿、前立腺液、皮膚細胞、唾液のような組織または体液試料を含む小さな生物学的試料が、個人から採取される。病気の形態を示す細胞を識別するために、これらの試料は、組織学的検査を含む任意の適切な方法を用いて検査される。レーザー捕捉を含む（これには限定されないが）任意の適切な方法を用いて、病気の形態を示す識別細胞が試料から採取され、そこからのｍｔＤＮＡの配列が決定され、続いて、健康および病気の双方に関連する既知のミトコンドリア配列のデータベースと比較される。
【００３６】
好ましい実施例では、病気と関連するｍｔＤＮＡ配列の変異を決定するために、すべてのミトコンドリアゲノムの配列が集団レベルで決定される。
【００３７】
他の実施例では、突然変異の進行の存在が、病気の始まりおよび進行を表している。突然変異（遺伝）荷重はまた、病気の進行状態つまり病状を示している。
【００３８】
好ましい実施例では、前立腺液からのｍｔＤＮＡ配列が、前立腺がんと明らかに関係する、正常で一時的な転移ｍｔＤＮＡ配列のデータベースと比較されている。この比較データの組は、母系の研究に基づいており、さらに、一般の集団に存在するミトコンドリア族に現れる変異とは対称的に、病気と明らかに関連したｍｔＤＮＡ変異の明らかな例を供給する母系データベースに蓄積されている集団に存在するその他の正常な母系変異の研究に基づいている。
【００３９】
病気素質を示す特異母系があるかもしれない。
【００４０】
他の実施例においては、疑わしいと考えられている非黒色腫皮膚がんからのｍｔＤＮＡ配列が、非黒色腫皮膚がんと明らかに関係する正常なｍｔＤＮＡ配列のｍｔＤＮＡ配列データベースと比較される。
【００４１】
本発明の一つの特徴部分によれば、ｍｔＤＮＡを含む被検体において病気の発生または進行を検出する方法が提供されている。この方法は、被検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、ｍｔＤＮＡの中の突然変異の存在を検出することとを有している。突然変異の存在を検出する工程が、ｍｔＤＮＡの配列を決定することと、ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅することと、サウスウェスタンブロッティングすることと、変性ＨＰＬＣを行うことと、マイクロアレイ、遺伝子チップまたはバイオチップにハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）することと、分子マーカー分析と、これらの組合せとからなるグループから選択されている。さらに、生物学的試料のｍｔＤＮＡがデータベースと比較されており、このデータベースが、病気のないｍｔＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる。
【００４２】
本発明の一つの特徴部分によれば、ヒト検体において病気の存在を検出する方法が提供されている。この方法は、ヒト検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡの突然変異を検出することと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡ配列をデータベースと比較することとを備えている。このデータベースは、病気のないミトコンドリアＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる。特異病に関連したミトコンドリアＤＮＡの突然変異率は、病気の進行および予後の重要なインジケータである。このことは、病気のステージの特定ができるようにして、優れた病気干渉や特定の療法に帰着することになる病気の特定を向上させる。
【００４３】
さらに他の実施例においては、ヘテロプラスミー検出の感度を増加させることが、試験の早期識別能力を向上させる。
【００４４】
また、本発明は、転移によってターゲットされた重要な部位を観察することによって病気の進行を監視するのに用いられてもよい。
【００４５】
ミトコンドリアＤＮＡ配列の突然変異によって示される病気素質または機能障害素質を決定する方法が提供されている。この方法は、ヒト検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡの中の突然変異を検出することと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡ配列をデータベースと比較することとを備えている。このデータベースは、病気または機能障害にかかりやすい個人と病気または機能障害にかかりにくい個人とのミトコンドリアＤＮＡ配列に関連した突然変異のデータを含んでいる。
【００４６】
好ましい実施例においては、ミトコンドリアＤＮＡの配列を決定するのに、ＤＮＡマイクロアレイが使用されている。その他の技術を用いることも可能である。たとえば、検体または完全ヒトゲノムの直接配列決定法、SNaP shotTM、ＳＮＰ検出、リアルタイムＰＣＲ、または当該分野で標準的なその他の方法である。
【００４７】
本発明のさらに他の特徴部分によれば、ヒト検体の老化の進行状態を査定する方法が提供されている。この方法は、ヒト検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡの中の突然変異を検出することと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡ配列をデータベースと比較することとを備えている。データベースは、老化に関連したＴＤＮＡの突然変異のデータを含んでいる。
【００４８】
ｍｔＤＮＡ突然変異の存在を検出する工程が、ｍｔＤＮＡの配列を決定することと、ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅することと、サザン、ノーザン、ウェスタンおよびサウスウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションすることと、変性ＨＰＬＣを行うことと、マイクロアレイ、バイオチップまたは遺伝子チップにハイブリダイゼーションすることと、分子マーカー分析と、これらのいずれかの組合せとから選択されている。
【００４９】
本発明のさらに他の実施例によれば、複数のヒトミトコンドリアＤＮＡ配列を有するデータベースが提供されている。ミトコンドリアＤＮＡ配列は、病気のない状態と関連する正常な制御配列と、病気の存在と関連する配列または病気素質を示す配列とからなるグループから選択されている。
【００５０】
病気の診断のためのキットが提供されている。このキットは、使い捨てのチップと、マイクロアレイと、使い捨てチップを保持する手段と、ミトコンドリアＤＮＡを取り出す手段と、ミトコンドリアＤＮＡ配列のデータベースにアクセスする手段とを備えている。
【００５１】
本発明のさらに他の特徴部分によれば、患者の病気を診断する方法が提供されている。この方法は、ミトコンドリアＤＮＡから得られた核酸試料を、固形基質と複数の核酸要素を有するアレイにハイブリダイゼーションすることを備えている。各核酸要素は病気の存在を示しており、各核酸要素は特有の位置を有するとともに、固形基質に安定して結合している。アレイを有する一つまたはそれ以上の核酸要素への核酸試料のハイブリダイゼーションが、前立腺がんの存在を示している。
【００５２】
本発明のさらに他の特徴部分によれば、病気素質を決定するためのキットが提供されている。このキットは、使い捨てのチップと、マイクロアレイと、使い捨てチップを保持する手段と、ＤＮＡを取り出す手段と、ミトコンドリアＤＮＡ配列のデータベースにアクセスする手段とを備えている。
【００５３】
本発明の他の実施例によれば、ミトコンドリアＤＮＡ配列の突然変異により示される病気または機能障害の素質を決定しまたは徴候を示すための方法が提供されている。この方法は、ヒト検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からミトコンドリアＤＮＡを取り出すことと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡの配列を決定することと、生物学的試料のミトコンドリアＤＮＡ配列をデータベースと比較することとを備えている。データベースは、病気のないｍｔＤＮＡ配列に関連した突然変異の集団レベルのデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる。
【００５４】
本発明のさらに他の実施例によれば、患者の非黒色腫皮膚がんを診断する方法が提供されている。この方法は、ミトコンドリアＤＮＡから得られた核酸試料を、固形基質と複数の核酸要素を有するアレイにハイブリダイゼーションすることを備えている。各核酸要素は非黒色腫皮膚がんを示しており、各核酸要素は特有の位置を有するとともに、固形基質に安定して結合している。アレイを有する一つまたはそれ以上の核酸要素への核酸試料のハイブリダイゼーションが、非黒色腫皮膚がんの存在を示している。あるいは、非特異的突然変異が、癌の進展する閾効果（threshold effect）を超えた閾効果に到達するかもしれない。同様にして、前立腺がんについても診断可能である。
【００５５】
本発明の他の実施例によれば、ｍｔＤＮＡを含む被検体においてヘテロプラスミーを検出する方法が提供されている。この方法は、被検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、試料上で変性ＨＰＬＣを実行することとを備えている。
【００５６】
本発明の他の特徴部分によれば、ｍｔＤＮＡを含む被検体において病気と関連する突然変異を検出する方法が提供されている。この方法は、被検体から生物学的試料を獲得することと、生物学的試料からＤＮＡを取り出すことと、ｍｔＤＮＡの中の突然変異の存在を検出することと、生物学的試料のｍｔＤＮＡをデータベースと比較することとを備えている。データベースは、病気のない共通集団のバリアントのデータと、病気が関連したミトコンドリアゲノムのデータとを含んでいる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
本発明の方法は、ｍｔＤＮＡに関連した病気を診断するのに用いることができる。本発明による方法は、生物学的試料から個人のミトコンドリアゲノムを増幅し、ミトコンドリアゲノムの一部、好ましくは個人のすべてのミトコンドリアゲノムの配列をすでに知られた任意の手段を用いて決定する。多くの試料を迅速にスクリーンするのに、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を用いるようにしてもよい。ＤＨＰＬＣは、突然変異のホットスポットに集中させることができる。通常のシークエンスにおける２０〜２５％と比べて、ＤＨＰＬＣは、突然変異の検出に関しては、２％のヘテロプラスミーを自動シークエンスするよりも感度がよい。低レベルのヘテロプラスミー（＜２％）を検出する方法を開発してもよい。
【００５８】
本明細書中で使用されるように、ｍｔＤＮＡにおける突然変異の「存在」は、ヘテロプラスミー突然変異を含んでおり、したがって、突然変異したＤＮＡが存在する試料の中には、いくつかの正常なｍｔＤＮＡが付加的に存在していると考えられる。
【００５９】
本明細書中で使用される「紫外線角膜炎（actinic kerotoses）」は、扁平上皮がんの前駆物質表皮損傷を意味している。
【００６０】
本明細書中で使用される「老化（aging）」は、分子レベルおよび細胞レベルの双方において、時間の経過につれての変化の蓄積を意味している。
【００６１】
本明細書中で使用される「対立遺伝子（alleles）」とは、染色体の特異部位を占める一定のＤＮＡ配列におけるいくつかの変形形態のうちの一つを意味している。
【００６２】
本明細書中で使用される「付着（attaching）」または「接着（spotting）」は、核酸が共有結合、水素結合またはイオン作用（イオン結合）を介して基質に不可逆に結合されるように、核酸を固形基質の上に配置して核酸アレイを形成する工程を意味している。
【００６３】
本明細書中で使用される「基底細胞がん（basal cell carcinoma）」は、皮膚細胞の癌の一類型である
【００６４】
本明細書中で使用される「ボーエン病（Bowen’s disease）」は、in situ 表皮がんを意味している。
【００６５】
本明細書中で使用される「診断上の（diagnostic）」または「診断する（diagnosing）」とは、病気の診断または処置の要素として突然変異またはその組合せの存在または非存在を用いることを意味している。突然変異の検出は、病気の症状の診断の一ステップとなり得る。
【００６６】
本明細書中で使用される「病気（disease）」は、機能障害またはその他の異常な肉体状態を含んでいる。
【００６７】
本明細書中で使用される「病気が関連したミトコンドリアゲノム（disease associated mitochondrial genomes）」とは、特定の病気を示すまたは特定の病気に関連した突然変異を含むゲノムを意味している。
【００６８】
本明細書中で使用される「データベース（database）」とは、電子記憶システム（標準的な産業ソフトウエアを用いたコンピュータベースの）を意味しており、このシステムは、研究者らがヌクレオチドの配列構造を素早く決定するのを可能にする回収可能な情報を蓄積し提供する能力を有している。このデータベースはまた、生物学的試料を提供する個人の記述情報についても蓄積している。この記述情報は、生物学的試料に相関関係がある健康状態およびその他の関連項目を含む。
【００６９】
本明細書中で使用される「欠失（deletions）」とは、核酸の連続的な配列からＤＮＡの一部位を取り除くことを意味している。一旦欠失が発生すると、その隙間は端部を再結合することによって修復される。欠失は、一つの塩基から何千またはそれ以上の大きさの塩基までその大きさが変化し得る。
【００７０】
本明細書中で使用される「重複（duplications）」とは、ＤＮＡの特異配列が複製されて、元の複製の後方または前方にまたはゲノムのいずれかの部位に、一つまたはそれ以上挿入されることを意味している。
【００７１】
本明細書中で使用される「ヘテロプラスミー（heteroplasmy）」は、突然変異の比率によって定義される。野生型ｍｔＤＮＡ分子については、１００％突然変異ｍｔＤＮＡが「ホモプラスミーの（homoplasmic）」と称される。ヘテロプラスミーの（heteroplasmic）突然変異は、ミトコンドリアゲノムのすべての複製においてではないが、いくつかの複製において発生する突然変異である。
【００７２】
本明細書中で使用される「ホモプラスミー（homoplasmy）」とは、すべてのミトコンドリア配列が同一であることを意味している。
【００７３】
本明細書中で使用される「逆位（inversions）」は、一連のＤＮＡの長さが切除されて、逆向きに再挿入されることを指している。
【００７４】
本明細書中で使用される「母性遺伝（maternal inheritance）」とは、卵の細胞質を介して受け継がれるミトコンドリアを意味している。
【００７５】
本明細書中で使用される「母系（maternal line）」は、母親から次の世代に代々引き継がれるミトコンドリアＤＮＡのクローン配列を指している。
【００７６】
本明細書中で使用される「ミトコンドリア（mitochondria）」とは、細胞プロセスのためのＡＴＰを生成する真核細胞質細胞小器官を意味している。
【００７７】
本明細書中で使用される「突然変異（mutation）」は、野生型配列からのＤＮＡ配列内の任意の変化を包含しており、これには、点突然変異、トランジション、挿入、トランスバージョン、転位、欠失、逆位、重複、組換え、またはこれらの組合せが含まれる。
【００７８】
本明細書中で使用される「突然変異荷重（mutation load）」は、関与遺伝子またはすべての遺伝子の機能低下につながることになるｍｔＤＮＡにおける突然変異の増加を指している。
【００７９】
本明細書中で使用される「核酸アレイ（nucleic acid array）」は、異なる核酸が１平方センチ当たり２０を超える密度で固形支持部の一方の面に付着された複数の特定の核酸を指している。各核酸は、予め選択された、同一でない領域において、固形支持部の面に付着されている。一実施例においては、固形支持部の面に付着された核酸は、ＤＮＡである。好ましい実施例においては、固形支持部の面に付着された核酸は、ｃＤＮＡである。他の好ましい実施例においては、固形支持部の面に付着された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されたｃＤＮＡである。好ましくは、本発明による核酸アレイは、少なくとも１５０ヌクレオチドの長さの核酸を有している。好ましくは、核酸アレイは、６，０００ヌクレオチド以下の長さの核酸を有している。より好ましくは、核酸アレイは、５００ヌクレオチド以下の長さの核酸を有している。他の実施例では、アレイは、固形支持部の一方の面に付着された少なくとも１０の異なる拡散を有している。さらに他の実施例では、アレイは、固形支持部の一方の面に付着された少なくとも１０，０００の異なる拡散を有している。本明細書中で使用される「核酸（nucleic acid）」という語は、「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」と互換性がある。
【００８０】
本明細書中で使用される「核酸ターゲット（nucleic acid target）」または「ターゲット核酸（target nucleic acid）」は、一つまたはそれ以上の種類の化学的結合を介して、通常は相補的な塩基対合を介して、相補的配列の核酸要素に結合できる核酸と定義される。本明細書中で使用されるように、核酸ターゲットは、天然塩基（例：Ａ，Ｇ，ＣまたはＴ）と、修飾塩基（7-ジアゾグアノシン、イノシンなど）を含む。また、核酸プローブの塩基は、ハイブリダイゼーションと干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって結合されていてもよい。これにより、核酸ターゲットは、構成塩基がホスホジエステル結合よりもむしろペプチド結合によって結合されたペプチド核酸であってもよい。好ましくは、核酸ターゲットは、ヒトの組織または体液の抽出物から取り出されている。より好ましくは、核酸ターゲットは、ヒトの組織または体液の抽出物から合成された一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。
【００８１】
本明細書中で使用される「核（nucleus）」は、真核細胞の中のもっとも有名な細胞小器官を意味しており、すべての染色体ＤＮＡを有している。
【００８２】
本明細書中で使用される「ＰＳＡ試験（PSA Test）」は、前立腺に特異性のある抗原試験を意味しており、この抗原は、前立腺がんを示す血液中の抗原である。
【００８３】
本明細書中で使用される「点突然変異（point mutation）」は、ＤＮＡ中の単一のヌクレオチドの変化を意味している。
【００８４】
本明細書中で使用される「多型性（polymorphism）」とは、対立遺伝子またはｍｔＤＮＡゲノムの集団内における配列の変化を意味している。
【００８５】
本明細書中で使用される「前駆体障害（precursor lesions）」とは、潜在的な病気との関連を示すＤＮＡ変異またはその組合せを意味している。
【００８６】
本明細書中で使用される「病気素質（predisposed to a disease or a predisposition to a disease）」は、病気または機能障害と関連性がある突然変異の存在または欠如のために、人が病気または機能障害を持つようになる危険性が非常に高い、あるいは、平均的な人よりも病気または機能障害を早期に発症する危険性が非常に高いということを意味している。
【００８７】
本明細書中で使用される「予め選択された領域（preselected region）」、「予め限定された領域（predefined region）」または「独特の位置（unique position）」は、核酸の堆積のために用いられている、または用いられた、あるいは用いられようと意図されている基質上の局所領域を指している。別の言い方をすれば、ここでは、「選択領域（selected region）」または単に「領域（region）」のことを指している。予め選択された領域は、任意の適切な形状（例：円形、矩形、楕円形、楔状など）を有している。いくつかの実施例においては、予め選択された領域は、約１cm2より小さく、より好ましくは１mm2より小さく、さらに一層好ましくは０．５mm2よりも小さい。また、いくつかの実施例では、領域は約０．１２５〜０．５mm2である。
【００８８】
本明細書中で使用される「体細胞突然変異（somatic mutation）」は、受精後のＤＮＡ配列の変化を意味している。
【００８９】
本明細書中で使用される「固形基質（solid substrate）」または「固形支持部（solid support）」は、堅いまたは部分的に堅い面を有する要素のことを指している。「基質（substrate）」または「支持部（support）」という語は、ここでは、「固形基質（solid substrate）」または「固形支持部（solid support）」という語と互換性がある。固形支持部は、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライドなどとして存在する、生物学的、非生物学的、生体的または非生体的なもの、あるいはこれらのうちの任意の組合せでよい。基質は、シリコン面またはガラス面、あるいは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）フッ化ビニリデン、ポリスチレン、ポリカーボネート、または６６ナイロンやニトロセルロース、これらの組合せのような帯電膜であることが多い。好ましい実施例では、固形の支持部はガラスである。好ましくは、基質の少なくとも一つの面が実質的に平坦になっている。好ましくは、固形支持部の面は、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基などを含む（これらには限定されないが）官能基を有している。一実施例では、面は透光性を有している。
【００９０】
本明細書中で使用される「扁平上皮がん（squamous cell carcinoma）」は、皮膚細胞の癌の一類型である。
【００９１】
本明細書中で使用される「安定して結合（stably associated）」とは、共有結合、水素結合またはイオン作用（イオン結合）を介してアレイを形成するために、固形基質に不可逆に結合している核酸を指している。これにより、核酸が、アレイと安定して結合している他のすべての核酸に対して、あるいは、アレイが分析（すなわち、ハイブリダイゼーションまたはスキャン）される条件下で固形基質上で予め選択された他のすべての領域に対して、予め選択された特有の位置を維持している。
【００９２】
ミトコンドリアＤＮＡ配列の「有意性のある（statistically significant）」数は、標準的なカイ二乗設計的アルゴリズムを用いて、つまり観測値対期待値を決定することによって、決定される。
【００９３】
本明細書中で使用される「トランジション」とは、窒素を含む同じ塩基、つまりピリミジンからピリミジン、またはプリンからプリンへの置換を意味している。一方のピリミジンが他のピリミジンによって置き換えられる、あるいは一方のプリンが他方のプリンによって置換される突然変異。
【００９４】
本明細書中で使用される「トランスバージョン」は、窒素を含む異なる塩基の置換、つまりプリンからピリミジン、またはピリミジンからプリンへの置換を意味している。一方のプリンがピリミジン置き換えられる（置換される）またはその逆に置換される突然変異。
【００９５】
特異病のｍｔＤＮＡおよび診断
本発明の一実施例においては、ｍｔＤＮＡ配列を比較することにより、前立腺がんや非黒色腫皮膚がんのような特異な病気を診断するとともに老化を観察するための方法が提供されている。核ＤＮＡではなくｍｔＤＮＡを用いて、前立腺がんのような病気を診断することは、いくつかの利点を有している。第１に、ｍｔＤＮＡは、複雑なゲノムではなく、個人レベルおよび集団レベルにおいて容易に理解される。このため、正常なゲノムおよび病気が関連したゲノムを有する大きなｍｔＤＮＡデータベースが、個人の診断を非常に正確なものにする。したがって、病気に関連した変種（variation）が理解される。第２に、ｍｔＤＮＡは、核ＤＮＡよりも１０倍突然変異率が高い（Wallace(1992)）。病気の前段階を示唆する核再配列が、素早くミトコンドリアと結合して、体細胞突然変異として現れる。第３に、ｍｔＤＮＡが母性遺伝パターン（maternal inheritance pattern）を有しており、すべてのミトコンドリアが同じｍｔＤＮＡから始まるので、ｍｔＤＮＡは本質的にクローンである。このため、このクローン状態からの変種は、簡単に検出される。また、ｍｔＤＮＡが組換えの説得力ある証拠を示さないので、配列における何らかの変種は体細胞の事象である。突然変異がある任意のミトコンドリアは、一つのミトコンドリアにつき多くの（コピー数2〜10の）ミトコンドリアゲノムが、また一つの細胞につき多くの（500〜2,000の）ミトコンドリアが存在していることの結果として、ある意味では「劣性（recessive）」である。さらに、ミトコンドリアゲノムは、損傷を受けたゲノムを有するミトコンドリアの非常に高いレベル（９０％まで）を許容できる。このことは、残存する野生型ｍｔＤＮＡによる相補性を通じて起こる（Chomynら(1992)）。しかしながら、突然変異したゲノムは、通常小さいため、野生型ゲノムに対して複製の利点を有しており（Hayashiら(1991)）、したがって、突然変異したｍｔＤＮＡはクローン拡大する。このことは、核遺伝子と異なり、ｍｔＤＮＡ突然変異がいる細胞に対する選択がほとんどないかまたは全くないということを示唆している。このような高い突然変異率のために、ｍｔＤＮＡに現れる突然変異および（または）欠失は、細胞の寿命の間維持され、種々の変異原にさらされたことの記録として役立つ。ｍｔＤＮＡの全体性（integrity）は、核修復機構によって維持される。これらの遺伝子座における欠陥は、多数のミトコンドリア欠失と関連する常染色体優性異常（autosomal dominant disorder）に帰着することになることが示唆されている（Zevianiら(1990)）。したがって、ｍｔＤＮＡは、種々の癌またはその他の病気と関連した初期の核事象の初期の見張り役として機能する。最後に、ミトコンドリアゲノムは、その配列を決定することができ、個人ベースで突然変異を監視することができる。
【００９６】
非黒色腫皮膚がんの診断
本発明の好ましい実施例では、非黒色腫皮膚がん（ＮＭＳＣ）におけるｍｔＤＮＡの変化や固形腫瘍の発達を示す前駆体損傷の初期診断のためのシステムが提供されている。共通欠失（common deletion）、関連する突然変異、ｍｔＤＮＡにおいて未だ特徴付けられていない欠失の発生のような特定の変化が、潜在的な皮膚がんの信頼できるバイオマーカーとして役立つ。ヒトのＮＭＳＣおよびその前駆体損傷におけるすべてのｍｔＤＮＡゲノムの突然変異指紋（フィンガープリント）が決定される。このようにして、ｍｔＤＮＡの変化が、ヒトの皮膚がんおよびその前駆体損傷の早期バイオマーカーとして確立される。次に、変性ＨＰＬＣが、注目されている配列において低レベルのヘテロプラスミーを評価するのに用いられる。このようなアプローチはまた、その他のヒトの腫瘍における早期変化の発達の見通しを提供することができる。
【００９７】
前立腺がんの診断
本発明の他の実施例においては、前立腺がんの診断のためのシステムが提供されている。年齢に関連した、ｍｔＤＮＡ欠陥の蓄積は、中年および老年に流行っている前立腺がんのようなある種の臨床疾患の発現に人をかかりやすくする。好ましい実施例においては、前立腺がんのルーチン・スクリーニングが、前立腺液からのミトコンドリアゲノム配列決定を通じて行われる。がん細胞に変異した上皮細胞の存在が、前立腺液からのｍｔＤＮＡの増幅を通じて決定される。このことは、デジタル直腸内診およびＰＳＡのような現行の診断技術の影を薄くしている。最近、Flissら（2000）は、膀胱がんの患者の尿のサンプルの中に突然変異のｍｔＤＮＡを認定した。前立腺液における同様の発見が、前立腺がんのための、侵襲でない（non-invensive）早期検出方法を提供する。全体として前立腺がんと対照的に、若い患者において攻撃的で成長の速い細胞の分化と同様にして、異なるタイプの前立腺がんを診断することが可能である。
【００９８】
老化と関連する突然変異の評価
本発明によるシステムおよび方法は、4977bpの「共通欠失」やミトコンドリアゲノムの他の突然変異（Liuら(1977))のような突然変異の増加頻度に基づいて、老化を評価するのに用いられてもよい。この情報は、健康調査データと協働して、同じ突然変異/欠失に帰着する別個の原因の統計上重要な区別を可能にする。幸いなことに、ｍｔＤＮＡは、卵を通じてのみ遺伝し、本来、本質的にクローンである（Van De Graaff & Fox(1955)）。このことは、年齢が関連した欠失の信頼できる頻度を決定するために、幾世代かにわたって母系の突然変異／欠失の注意深く管理された研究を可能にする。この情報は、老化のプロセスを遅らせる処置方法を開発するのに用いられてもよい。
【００９９】
試料の収集
生物学的試料は、ｍｔＤＮＡ配列のデータベースを構築する目的でまたは個人に診断検査を行う目的で、任意の既知の手段によって集めることができる。データベースの作成のために前もって用意される試料は、以下のものを含むが、これらには限定されない。すなわち、腫瘍バンク、皮膚がんおよび前立腺がん（これらには限定されない）のような特異病を高い頻度で発症するグループまたは集団からの母系研究および健康状態や老化の評価とともに、同じ母系から影響を受けた人および影響を受けていない人の母系研究。たとえば、生物学的試料を収集して記録するのに、FTAョ Gene Cardsョ が用いられてもよい。適切な試料は、中皮（体腔上皮）、上皮または内皮から得られた任意の組織または体液を含んでいる。このような組織および体液は、以下のものを含むが、これらには限定されない。すなわち、血液、唾、頬細胞、唾液、前立腺液、汗、骨、髪、リンパ組織、子宮頸管塗抹、乳吸引物、おりもの、精液、月経出血および生検組織。好ましくは、約１００μlの血液、１００μg〜２５mgの固形組織が試料とされた。皮膚がんが疑われる場合には、（正常な、ＮＭＳＣの、および前駆体損傷からの）皮膚細胞または皮膚組織が皮膚生検またはルーチン・サクション・ブリスタリング法により採取される。病気が疑われる場合には、初期治療の医師、癌研究者またはその他の専門家は、患者から正常な組織と病気が疑われる組織の双方を抽出する。
【０１００】
たとえば、前立腺または皮膚の腫瘍の試料の場合、微小分割されてパラフィンが埋め込まれた組織の同型体の横断面（５ミクロン）は、一つのスライドがヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色される前に、パラフィンが取り除かれる。同型体は、当該分野で標準的なことではあるが、メチルグリーン（ＭＧ）を用いて染色されている。ＨＥ染色は、正常、前駆体について、および腫瘍の進行の適用可能な格付けについて、病理学者により格付けされる。同型体ＭＧスライドは、格付け細胞の製造者推薦（Arcturus）によると、レーザー捕捉に用いられる。
【０１０１】
ｍｔＤＮＡの抽出
分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）に記載されているように、ＤＮＡの抽出は、当該分野で知られている任意の方法を用いて行われ、これに続いて、ミトコンドリアゲノムの配列が決定される。
【０１０２】
ｍｔＤＮＡの配列決定
＜ＰＣＲ＞
本発明によるポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。ＰＣＲ法は、当該分野の当業者にはよく知られている。ＰＣＲには、増幅される核酸の存在、増幅される配列の両側に位置する二本鎖のオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝剤および塩が必要である。ＰＣＲの手法は、当該分野ではよく知られている。ＰＣＲは、MullisおよびFaloona(1987)の Methods Enzymolの155:335（引用によって本明細書中に含まれる）に記載されているように実行される。
【０１０３】
一般に、ＰＣＲは、鋳型（template）ＤＮＡ（少なくとも１fg；より有効的には１〜1000 ng）および少なくとも２５pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実行される。典型的な反応混合物は、２μlのＤＮＡ、２５pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μlの１０Ｘ ＰＣＲ緩衝剤１（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、０．４μlの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、０．１５μl（または２．５ユニット）の Taq ＤＮＡ ポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、および総量２５μlの脱イオン水を含んでいる。流動パラフィン（mineral oil）で覆われて、ＰＣＲは、プログラム可能な熱循環器を用いて実行される。
【０１０４】
ＰＣＲサイクルの各ステップの長さおよび温度は、サイクルの数とともに、実際上、過酷な必要条件によって調整されている。アニール温度およびタイミングは、プライマーが鋳型にアニールすると期待される効率と、許容されるミスマッチの程度との双方によって決定される。プライマーのアニールする条件の厳しさを最適化することができる能力は、当該分野における通常の技術者の一人の知識の範囲内である。３０〜７２℃の範囲のアニール温度が用いられている。一般に、鋳型分子の初期の変性が通常９２〜９９℃の範囲の温度で４分間発生し、変性からなる２０〜４０サイクル（９４〜９９℃で１５秒〜１分間）がこれに続いて、アニーリング（上述のように決定された温度で１〜２分間）および伸長（７２℃で１分間）が生じる。最終の伸長工程は、一般に７２℃で４分間実行され、次に４℃で（０〜２４時間）不定の工程がこれに続く。
【０１０５】
＜ＤＮＡ配列決定＞
ミトコンドリアゲノムの配列を決定するための任意の既知の手段が用いられてよい。好ましくは、ｍｔＤＮＡは、配列の決定に先立って、ＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲ生成物は、直接その配列が決定されるか、あるいはバクテリア宿主に配置されるベクターにクローン化される。ＤＮＡシークエンス法の例は、Brumley, R.L. Jr.および Smith, L.M.（1991）による「横型超薄ゲル電気泳動による高速ＤＮＡシークエンス（Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis）」(Nucleic Acids Res. 19:4121-4126)と、Luckey, J.A.ら(1993)による「毛細管ゲル電気泳動による高速ＤＮＡシークエンス（High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis）」(Methods Enzymol. 218: 154-172)とに見出される。ｍｔＤＮＡの配列決定およびＰＣＲを組み合わせて使用することは、Hopgood, R.ら(1992)による「ＰＣＲ生成物から直接ヒトのｍｔＤＮＡの配列を自動的に決定するための方法（Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products）」(Biotechniques 13:82-92)および Tanaka, M ら(1996)による「ｍｔＤＮＡの自動配列決定（Automated sequencing of mtDNA）」(Methods Enzymol 264:407-421)に記述されている。
【０１０６】
＜欠失分析および検出＞
好ましいアプローチは、伸長鋳型（Expand Long Template）ＰＣＲシステム（Boehringer Mannheim）を用いた伸長（long extension）ＰＣＲ（ＬＸ−ＰＣＲ）技術である。ＬＸ−ＰＣＲ技術は、Birch-Machin 研究所において確立され実証されたものであるが、これを用いることにより、単一の欠失の事象と対比して、ｍｔＤＮＡのすべてのスペクトルのために迅速にスクリーンする機会が提供される。
【０１０７】
全ｍｔＤＮＡの中のｍｔＤＮＡ4977欠失の比率を評価するのに、半定量化ＰＣＲ法（Corral-Debrinskiら(1991)）を用いることができる。
【０１０８】
また、サザンブロットや同位元素で標識化されたプローブ技術、および当該分野で標準的な他の任意の技術を欠失検出にも用いるようにしてもよい。
【０１０９】
＜ＰＣＲ生成物の配列決定＞
ＰＣＲ生成物の配列を決定するのに、任意の既知の手段が用いられてよい。好ましくは、すべてのＤＮＡ配列は、ABI Big Dye TerminatorTM技術と、各々重鎖および軽鎖のための一連の７２オーバラッププライマーとを用いたジデオキシ配列決定法によって特徴付けられている。配列決定は、一つについて、または幾つかについて、あるいは310，3100または3700のＡＢＩプラットフォームの組合せについて、生じる。配列決定反応は、製造者の推薦に応じて実行される。
【０１１０】
変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ：Denaturing High Performance Liquid Chromatography）を用いたミトコンドリアゲノムの突然変異分析
ミトコンドリアゲノムの配列決定および突然変異のホットスポットの識別に先立って、多くの試料の中の突然変異を迅速にスクリーンするのに、ＤＨＰＬＣを用いることができる。この技術は、低レベルのヘテロプラスミー（heteroplasmy）の識別に高感度を提供する。これは、ホモプラスミーな（homoplasmic）変化を検出することはできないが、伝統的な配列決定技術を補完するものである。最近腫瘍内で識別されたホモプラスミーの突然変異は別にして、報告された大多数のｍｔＤＮＡの突然変異はヘテロプラスミーである（Chinneryら(1999)）。これらのヘテロプラスミーな（heteroplasmic）ｍｔＤＮＡ変化は、ｍｔＤＮＡのＰＣＲ増幅の後にヘテロ二本鎖（heteroduplexes）に帰着する。ヘテロプラスミーなｍｔＤＮＡ突然変異のための迅速なスクリーニングは、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ：Denaturing High Performance Liquid Chromatography）という比較的新しい技術を用いて決定される。この技術は、ヘテロプラスミーな点突然変異に関して５％よりも低いレベルまで、すべてのｍｔＤＮＡゲノムを迅速にスクリーンして識別するのに最近用いられてきた（Van den Boschら(2000)）。
【０１１１】
このＤＨＰＬＣは、完全自動化スクリーニングを提供する WaveTM DNA Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha. USA) に基づいて実行されてもよい。ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーな突然変異をスクリーンするのに、同じ技術を用いることが可能である。好ましくは、すべてのｍｔＤＮＡゲノムは、van den Boschら(2000)により記述された二つの異なるＰＣＲ条件を用いることによって、１３のオーバラップ断片においてＰＣＲにより増幅されている。１〜２kbのＰＣＲ生成物が、９０〜６００bpの断片に分解され、その最適な溶融温度で分割される。突然変異は、二つのピークで表され、２％ヘテロプラスミーよりも低いような低比率の突然変異は、ピークの肩部（shoulder）として表される。
【０１１２】
ＤＮＡ配列の決定は、当該分野で知られているマイクロアレイを用いて行うことも可能である。
【０１１３】
データの分析
一旦配列が決定されると、正常なｍｔＤＮＡ配列および病気が関連したｍｔＤＮＡ配列が、データベースでの比較のために記録される。再配列決定装置（resequensing devices）、マイクロアレイ技術（micro-array technology）、一体型微少流体増幅・分析システム（integrated microfluidic amplification and analysis system）、高速・高処理突然変異検出法（high-speed, high-throughput, mutation detection method）およびその他の方法がすべて本発明の方法とともに用いられてよい。
【０１１４】
個人のミトコンドリアゲノムの配列決定から得られたデータは、集団レベルのデータと比較される。データは、上述したように、試料の入手およびｍｔＤＮＡの配列決定を通じて、獲得される。好ましくは、データベースは、母系研究からの情報を含んでいる。集団レベルデータは、データベースに保有されている。任意の適切なデータベースを使用可能である。
【０１１５】
臨床および生物学的データの多次元評価研究データベース（multidimensional evaluation research database）が用いられている。これは、この事業に携わる研究所によって集められた情報の収集、加工および流布のために必要なバイオ情報科学の基盤を提供する。このデータベースは、動的かつ強力な資源となるネットワークとリンクする中央電子システムである。
【０１１６】
データベースは、任意の既知の手段、好ましくは安全なインターネットを介して、アクセスされるようにしてもよい。好ましくは、データベースは、サーバーに構築されるとともに最適な性能および測定可能な特徴部分を通じて多数のユーザーをサポートするアプリケーションサーバーの使用を採用するｅ-コマース・アルゴリズムを用いて開発されている。別個の「ウエブ」サーバーは、すべての内容、アプリケーションおよび処理がユーザーに到達する前にそこを通じて流れなければならない中央ポイントとして機能し得るので、ウエブサイトのアーキテクチャーの基礎を提供することができる。
【０１１７】
当該分野で知られているデータ発掘アルゴリズムは、データからパターン、集団およびモデルを発見するのに利用されている（SAS 2000）。さらに、知能アルゴリズムおよび方法は、突然変異の発生、突然変異率、病気検出のための突然変異のパターン、情報回収、およびその他の複雑な配列分析ソフトウエアのために、開発されるだろう。
【０１１８】
核酸要素およびプローブ
本発明は、ターゲット核酸配列に特異的に結合する核酸要素およびプローブを提供する。ターゲット核酸配列は、前立腺がん、非黒色腫皮膚がんなどの病気を示すものとして、検出されるべき核酸または核酸の一領域である。本発明のマイクロアレイを用いて分析されるべきターゲット核酸配列は、好ましくは、ヒトの組織または体液の試料から採取されている。本発明は、ＲＮＡ、ＲＮＡに対応する核酸（つまりｃＤＮＡ）、またはＤＮＡからなるターゲット核酸配列を提供する。核酸要素は、本発明によるアレイを構成するための固形支持部と安定して結合している。核酸要素は、一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲ断片でもよい。
【０１１９】
本発明はまた、プローブを構成するポリヌクレオチド配列を提供する。本明細書中で用いられているように、「プローブ」という語は、ターゲット領域に配列を有するプローブにおいて少なくとも一つの配列の相補性のために、ターゲット核酸に配列を有する二重構造を形成するオリゴヌクレオチドを指している。プローブは、当該分野で知られる方法により、標識化されていてもよい。本発明によるプローブは、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【０１２０】
診断装置
本発明は、特異病を診断しまたは特異突然変異を識別するのに用いられるバイオチップ、遺伝子チップまたはマイクロアレイのような診断装置を含んでいる。配列が決定されたすべてのミトコンドリアゲノムは、塩基対配列の一致構造を生成するように評価されるとともに、特定の病気または機能疾患に関連した突然変異および塩基対欠失の比率の抑制指数を付与される。診断装置は、次に、バイオチップ、遺伝子チップまたはマイクロアレイを生成するのに使用される。
【０１２１】
特定の病気、病状または機能障害に関連した配列が一旦識別されると、オリゴヌクレオチドのアレイへのｍｔＤＮＡのハイブリダイゼーションが特定の突然変異を識別するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションの任意の既知の手法が用いられてよい。好ましくは、野生型または突然変異領域とマッチするオリゴヌクレオチドプローブおよび制御プローブを有しているアレイが用いられる。マイクロアレイまたは遺伝子チップのような市販可能なアレイが適している。これらのアレイは、適合した何千もの制御プローブ対をスライドまたはマイクロチップの上に有している。ゲノムおよびＤＮＡ配列分析におけるマイクロアレイの使用について記述する雑誌の記事は、www.gene-chips.com で入手可能である。
【０１２２】
＜マイクロアレイ＞
ポリヌクレオチドアレイは、一つまたはそれ以上のターゲット核酸配列を有する試料内で多数のポリヌクレオチドの分析を可能にする高速処理技術を提供する。本発明のアレイは、遺伝子発現分析、病気の診断および予後（例：治療、ドラッグスクリーニングなどに対する患者の反応の監視）に有用である。
【０１２３】
病気、老化またはその他健康が関連した突然変異を示すｍｔＤＮＡのポリヌクレオチド配列の任意の組合せが、マイクロアレイの構築のために用いられる。
【０１２４】
マイクロアレイを用いて分析されるべきターゲット核酸試料は、上述したように、十分な量のｍｔＤＮＡを含む任意のヒトの組織または体液、好ましくは前立腺液、固形腫瘍、血液または尿から採取される。ターゲット核酸試料は、相補核酸要素/ターゲット複合体のハイブリダイゼーションのパターンを生じさせるのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、ポリヌクレオチド要素と接触させられる。
【０１２５】
＜マイクロアレイの構築＞
マイクロアレイは、固形支持部の一方の面に付着した複数の特定（unique）のポリヌクレオチドを有している。ポリヌクレオチドの各々は、予め選択された同一でない領域において固形支持部の面に付着している。アレイ上の各関連試料は、以下により詳細に記述されるように、既知のアイデンティティー（identity）、通常は既知の配列のポリヌクレオチド成分を有している。本発明においては、考えられる任意の基質を採用するようにしてもよい。
【０１２６】
アレイは、既知の任意の手段を用いて構成される。核酸要素は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や逆転写（ＲＴ）のような，確立された技術を用いて生成されてもよい。これらの手法は、当該分野で現在知られている技術と類似している（例えば  PCR Strategies, Michael A. Innis (Editor), et al.(1995) および PCR: Introduction to Biotechniques Series, C.R. Newton, A. Graham (1997) 参照）。増幅されたポリヌクレオチドは、当該分野でよく知られた方法（例：カラム精製）によって精製される。ポリヌクレオチドは、所望のポリヌクレオチドの合成の間に生成された不完全な生産物およびポリマーが実質的にないときには、純粋であると考えられている。好ましくは、精製されたポリヌクレオチドもまた、分子の結合作用を妨げたり邪魔をしたりする汚染物が実質的にないだろう。
【０１２７】
本発明のアレイにおいては、ポリヌクレオチドの構成成分が、固形支持部の表面に安定して結合している。支持部は、可撓性のあるまたは堅い固形支持部である。
【０１２８】
本発明においては、核酸要素が付着する任意の固形支持部を用いてよい。適切な固形支持部の材料の例は、以下のものを含むが、これらには限定されない。すなわち、ガラスおよびシリカゲルのようなケイ酸塩、セルロース紙、ニトロセルロース紙、ナイロン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ラテックス、ラバー、およびテフロンTMのようなフッ化炭素樹脂。
【０１２９】
堅い支持要素は、スライドやビード（これらには限定されない）を含む幅広い種類の形状で用いられてよい。スライドは、いくつかの機能上の利点を提供しており、固形支持部の好ましい形態である。その平坦な面のために、ガラススライドを用いることにより、プローブやハイブリダイゼーション試薬が最小にされる。スライドはまた、試薬のターゲット応用を可能にし、一定の温度に保持するのを容易にし、洗浄を容易にするとともに、固形支持部に固定化されたＲＮＡおよび（または）ＤＮＡの直接的な視覚化を容易にする。固形支持部に固定化されたＲＮＡおよび（または）ＤＮＡの除去についても、スライドを用いることにより容易になる。
【０１３０】
固形支持部として選択される特定の材料は、記述された機能を提供する限りにおいて、本発明に本質的なものではない。通常、本発明を生産しまたは使用する者は、コスト面、入手可能性、最終生成物において期待される応用条件、および全製造工程の需要に基づいて、最良の市販可能な材料を選択するだろう。
【０１３１】
本発明の核酸要素を基質に付着させる（スポッティングと称される工程）ための多くの手法が用いられている。たとえば、ポリヌクレオチドは、米国特許第5,807,522号の技術を用いて付着されている。なお、当該米国特許は、ポリマー付着の方法を教示するために、引用することによって本明細書の中に含まれている。あるいは、スポッティングは、密着印刷技術（contact printing technology）を用いて実行される。
【０１３２】
各構成成分に存在するポリヌクレオチドの量は、アレイが採用される分析の間にターゲットポリヌクレオチド配列の検出および十分なハイブリダイゼーションを提供するのに十分であろう。一般に、アレイの固形支持部と安定して結合する各核酸要素の量は、少なくとも約０．１ngであり、好ましくは少なくとも約０．５ngであり、より好ましくは少なくとも約１ngである。各核酸の量は、せいぜい１０００ngまたはそれ以上であり、通常は約２０ngを超えない。拡散要素が、全体として円の大きさを有するスポット内において固形支持部の上にスポットされる場合、スポットの直径は、一般に約10〜5,000μmの範囲であり、大抵約20〜2,000μmであり、普通は約50〜１,000μmである。
【０１３３】
プローブが標識化されるターゲット以外の試料においてポリヌクレオチドに対する非特異性結合またはクロス・ハイブリダイゼーションを監視するために、制御ポリヌクレオチドは、アレイ上にスポットされて、ターゲット発現制御ポリヌクレオチドおよびミスマッチ制御ヌクレオチドとして用いられてもよい。このため、ミスマッチプローブは、ハイブリダイゼーションが特異的かそうでないかを示す。たとえば、もしターゲットが存在していれば、完全にマッチしたプローブがミスマッチプローブよりも常に明るいはずである。また、もしすべて中央のミスマッチが存在していれば、ミスマッチプローブが突然変異を検出するのに使用される。
【０１３４】
＜ターゲットの準備＞
マイクロアレイのためのターゲットは、ヒトの体液または組織の試料から採取される。ハイブリダイゼーションに先立って、ターゲット核酸試料を増幅するのが望ましいであろう。当該分野の当業者は、どんな増幅方法が用いられようとも、もし定量的結果が望ましいのであれば、増幅されたポリヌクレオチドの相対的頻度を制御しまたは維持する方法を使用するように注意しなければならないということを理解するだろう。「定量」増幅の方法は、当該分野の当業者には周知である。たとえば、定量ＰＣＲは、同じプライマーを用いて既知の量の制御配列を同時に増幅することを含んでいる。このことは、ＰＣＲ反応を較正するのに用いられる内部基準を提供する。高密度のアレイは、増幅されたポリヌクレオチドの定量化のための内部基準に特異性を有するプローブを含んでいてよい。定量ＰＣＲのための詳細なプロトコルは、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis らによる Academic Press, Inc. N.Y.(1990)に提供されている。その他の適切な増幅方法は、以下のものを含むが、これらには限定されない。すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Innis, et al., PCR Protocols. A guide to Methods and Application. Academic Press, Inc. San Diego, (1990)）, リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ligase chain reaction）(Wu and Wallace, Genomics, 4: 560(1989), Landegren, et al., Science, 241: 1077(1988) and Barringer, et al., Gene, 89: 117(1990), transcription amplication（Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173(1989)) および自動継続配列複製（self-sustained sequences replication）(Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990))。
【０１３５】
本発明は、標識ターゲットまたは標識プローブを提供する。本発明においては、分子内に付着されまたは組み込まれた、分析的に検出可能な任意のマーカーを用いてよい。分析的に検出可能なマーカーは、分析的に検出されて定量化される任意の分子、原子団または原子を指している。本発明への使用に適した検出可能な標識は、分光、光化学、生化学、免疫化学、電気的、光学または化学的手段によって検出可能な任意の構成成分を含んでいる。本発明に有用な標識は、標識化ストレプタビジン抱合体で染色されるビオチン、磁気ビード（例：DynabeadsTM）、蛍光染料（例：フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質など）、放射能標識（例：３Ｈ，１２５Ｉ，３５Ｓ，１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例：西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡ（エンザイムイムノアッセイ）において一般に使用されているその他のもの）、および金コロイド、着色ガラス、プラスチックビード（例：ポリスチレン、ポリプロプレン、ラテックスなど）のような比色標識を含んでいる。このような標識の使用について教示する特許は、米国特許第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号、第4,366,241号を含んでいる。
【０１３６】
このような標識を検出する手段は、当該分野の当業者にはよく知られている。したがって、たとえば、放射能標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンター用いて検出され、蛍光マーカーは、放出した光を検出する光検出器を用いて検出される。酵素標識は、典型的には、基質に酵素を与え、基質上の酵素反応により生成される反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、着色標識を単に視覚化することによって検出される。
【０１３７】
標識は、当該分野の当業者によく知られた多くの手段のうちのいずれかによって組み込まれる。なお、好ましい実施例においては、標識は、試料のポリヌクレオチドの準備における増幅工程の間に同時に組み込まれている。このため、たとえば、標識化プライマーまたは標識化ヌクレオチドとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、標識化された増幅生成物を提供するだろう。好ましい実施例においては、上述したように、標識化ヌクレオチド（フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を用いた転写増幅は、標識を転写ポリヌクレオチドに導入している。あるいは、標識は、元のポリヌクレオチド試料（例：ｍＲＮＡ，ポリＡ ｍＲＮＡ，ｃＤＮＡなど）に、または増幅完了後の増幅生成物に直接加えてられてもよい。ポリヌクレオチドに標識を付ける手段は、当該分野の当業者にはよく知られており、たとえば、試料のポリヌクレオチドを標識（例：fluorophore）に結合するポリヌクレオチドリンカーの次の付着（連鎖反応）およびポリヌクレオチドをキナーゼ化することによるニックトランスレーションや端部標識化（end-labeling）（例えば標識化ＲＮＡとの）を含んでいる。
【０１３８】
好ましい実施例では、ターゲットは、マイクロアレイから発生した信号を平均化するために、マイクロアレイ上のプローブを制御するように雑種核酸を作る一つまたはそれ以上の制御分子を含んでいる。標識化された平均化ターゲットは、上述したようにマイクロアレイ上にスポットされるオリゴヌクレオチドを制御するように完全に相補的なポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション後に平均化制御から得られた信号は、ハイブリダイゼーション条件の変化、標識強度の変化、効率の「読み（reading）」の変化、完全なハイブリダイゼーション信号をアレイ間で変化させる他の要因の変化のための制御を提供する。
【０１３９】
＜ハイブリダイゼーション条件＞
ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションは、プローブまたはターゲット核酸要素およびその相補的ターゲットが相補的な塩基対合を通じて安定したハイブリッド二重構造を形成することができる条件下で、変性プローブまたはターゲット核酸要素およびターゲットポリヌクレオチドを提供することを含んでいる。ハイブリッド二重構造を形成しないポリヌクレオチドは、付着された検出可能な標識の検出を通じて検出されるべきハイブリッド形成のポリヌクレオチドを残したまま、洗い流される。ポリヌクレオチドは、温度を上げたり、ポリヌクレオチドを含む緩衝液の塩濃度を下げたりすることによって変性することが、一般に認識されている。低緊縮条件（low stringency conditions）下(例：低温および/または高濃度塩分)では、アニーリングされた配列が完全に相補的でない場合においても、ハイブリッド二重構造体（例：ＤＮＡ：ＤＮＡ，ＲＮＡ：ＲＮＡ，ＲＮＡ：ＤＮＡ，ｃＤＮＡ：ＲＮＡ，ｃＤＮＡ：ＤＮＡ）が形成される。このため、ハイブリダイゼーションの特異性は、低緊縮時には減少する。これとは逆に、高緊縮（higher stringency）時(例：高温または低濃度塩分)においては、成功したハイブリダイゼーションがほとんどミスマッチを要求しない。ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、当該分野の当業者にはよく知られている（例えば、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Polynucleotide Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y.(1993)）。
【０１４０】
ハイブリダイゼーションに続いて、ハイブリッド形成されずに標識化されたまたは標識化されていないポリヌクレオチドが、好都合なことに洗浄によって支持面から取り除かれる。これにより、ハイブリッド形成されたターゲットポリヌクレオチドのパターンが支持面上に生成される。種々の洗浄液が当該分野の当業者に知られており、これらが用いられてよい。結果として生じるところの、標識化されてハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドおよび（または）ポリヌクレオチドのハイブリッド形成のパターンは、種々の方法で視覚化されて検出されてよい。特定の検出方法が試験ポリヌクレオチドの特定の標識に基づいて選択されており、代表的な検出手段は、シンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィー、蛍光測定、比色測定、発光測定などを含んでいる。
【０１４１】
＜イメージ獲得およびデータ分析＞
上述したように、ハイブリダイゼーション、任意の洗浄工程および（または）その後の処理に続き、その結果として生じるハイブリダイゼーションのパターンが検出される。ハイブリダイゼーションパターンを検出しまたは視覚化する際には、標識の強度または信号値が検出されるだけでなく、定量化される。このことは、ハイブリダイゼーションの各スポットからの信号が測定されて、既知の数の端部標識化ターゲットポリヌクレオチドにより発せられる信号に対応する単位値と比較され、これにより、ハイブリダイゼーションパターンにおいてアレイ上の特定のスポットにハイブリッド形成される各端部標識化ターゲットのコピー数の数または絶対値が得られるということを意味している。
【０１４２】
アレイへのハイブリッド形成から集められたデータを分析する手法は、当該分野ではよく知られている。たとえば、ハイブリッド形成の検出が蛍光標識を含んでいる場合には、データ分析は、集められたデータから基質位置の関数として蛍光強度を決定し、異常値つまり所定の統計分布から外れているデータを除去し、残りのデータから試験ポリヌクレオチドの相対的な結合親和性を計算する工程を含み得る。残りのデータは、関連するオリゴヌクレオチドと（または）ポリヌクレオチドと試験ポリヌクレオチドとの間の結合の親和性に応じて変化する各領域の強度を備えたイメージとして示されている。
【０１４３】
検出または視覚化に続いて、ハイブリッド形成のパターンが、ハイブリッド形成パターンを生成するようにアレイと接触した標識化ターゲットポリヌクレオチド試料の遺伝子の特徴のみならず、標識化ターゲットポリヌクレオチド試料が取り出された生理学的出所についての定量的情報を決定するのに用いられている。遺伝子の特徴は、試料内に存在するポリヌクレオチドの型に関する、すなわち相補性を有する遺伝子の型のみならず試料内の特定のポリヌクレオチドのコピー数に関する情報を意味している。
【０１４４】
＜診断検査または予後検査＞
本発明は、病気を検出するための診断検査を提供する。本発明はまた、治療に対する患者の反応を観察するための予後検査をも提供する。本発明の方法によれば、病気の存在または治療に対する患者の反応が、患者から体液または組織試料を採取することによって検出される。体液または組織の試料から、核酸を含む試料が用意される。試料から抽出された核酸は、固形基質および複数の核酸要素を含むアレイに対してハイブリッド形成される。各要素は、病気あるいは病気素質または機能障害素質の存在を示している。この診断検査によれば、アレイ上の一つまたはそれ以上の核酸要素に対する、核酸を含む試料のハイブリッド形成が、病気、病気素質または機能障害素質を示しており、さらに予後検査の場合には、治療に対する患者の反応を示している。
【０１４５】
本発明のその他の有用性は、上述したように、また以下の例に示すように、当該分野の当業者にはすぐに明らかとなるだろう。
【０１４６】
本発明は、以下の実例においてさらに詳細に記述されている。多数の変更例や変形例が当該分野の当業者には明らかであるので、これらの実例は単なる例示にすぎない。
【０１４７】
実例１：前立腺腫瘍
前立腺液の採取または前立腺腫瘍を切除する外科手術に続いて、変異細胞または癌細胞を特定するために、生検スライドが準備される。正常、良性または悪性の細胞を組織部分から分離するのに、レーザー捕捉微小切断（ＬＣＭ：Laser Capture Microdissection）顕微鏡検査が用いられる。前癌性細胞や癌細胞浸潤グループのような、対象となっている罹病細胞の入手は、周囲の外性細胞の中から可能である。
【０１４８】
これらの各細胞からのすべてのＤＮＡ抽出物は、Arcturus Engineering Inc. によって概略示されたプロトコルの変形例に応じて精製される。ＤＮＡは、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）および０．１％のＴｗｅｅｎ２０内において、１mg/mlのプロテイナーゼＫ（ＰＫ）の５０μlの容積をもって、４２℃で一晩かけて細胞から抽出された。４２℃で一晩培養した後、培養炉から管が取り出された。試料は、6400rpm（2000 x g）で５min遠心分離された。CapSureTMが管から取り外されて廃棄された。管は、９５℃で１０分間培養されて（ＰＫは不活性）、室温まで冷却された。５〜５０μlの試料がＰＣＲ増幅のために用いられた。
【０１４９】
精製に続いて、超可変領域１（ＨＶ１）、超可変領域２（ＨＶ２）およびすべての１２Ｓ領域のための適切なプライマーを用いてＬＸ−ＰＣＲにより、個々の試料が増幅される。次に、これらのＰＣＲ生成物は、当該分野でよく知られた高速処理法を用いて配列決定される。
【０１５０】
実例２：太陽にさらされた皮膚からのｍｔＤＮＡの非コード領域の複製
Qiagen により供給された DNeasyTM キットを使用して、実例１に記述されたように、組織試料からＤＮＡが抽出された。太陽にさらされたことに関連した非コード領域（ＮＣＲ）のタンデム重複の発生を調査するのに、「背中合わせ（back to back）」のプライマー法が用いられた。３２歳に匹敵する、太陽にさらされた体の部位（n=24）および太陽から保護された体の部位（n=10）からのヒトの皮膚の分割試料が調査された。
【０１５１】
Brockingtonら(1993) およびLeeら(1994)からの以下の重複プライマーが用いられた。
C  L336  AAC ACA TCT CTG CCA AAC CC   20 mer
D  H335  TAA GTG CTG TGG CCA GAA GC   20 mer
E  L467  CCC ATA CTA CTA ATC TCA TC   20 mer
F  H466  AGT GGG AGG GGA AAA TAA TG   20 mer
【０１５２】
プライマー対であるＣ/ＤおよびＥ/Ｆは、非コード領域の直列反復における二つの隔てられた組の部位において、「背中合わせ（back to back）」である。このため、もしこれらの部位に重複が存在していれば、直列反復は単に生成物を生成するだけである。生成される生成物は、２６０bpおよび（または）これより少ない２００bpの共通バリアントである。変更されたＰＣＲ条件は、以下のとおりである。総量100ngの細胞ＤＮＡ、200μMの ｄＮＴＰ、２．５Ｕ HotStar Taq ポリメラーゼおよびＰＣＲ緩衝液（Qiagen, UK）、９４℃４分間を１サイクル、９４℃ x１分間、５５℃ x １分間および７２℃ x １分間を３６サイクル、ならびに７２℃７分間を１サイクルである。
【０１５３】
太陽への露出の増加とともに、重複の発生の増加が観察された。太陽にさらされた皮膚からの試料と太陽から保護された皮膚からの試料とについてそれぞれ１０/２４で重複が確認され、０/１０で重複が確認されなかった（Fisher’s exact test, p=0.015）（Birch-Machin and Krishnan 2001）。もっとも頻度の高い重複のサイズは、２００および２６０塩基対であった。興味深いことに、これらの同じ試料はまた、実例６に記述されている、確立された定量化３プライマーＰＣＲ分析によって決定されたような高レベル（＞1%）の4977bpの共通ｍｔＤＮＡ欠失を含んでいた。
【０１５４】
実例３：ヒトのＮＭＳＣおよびその前駆体損傷におけるｍｔＤＮＡの突然変異フィンガープリント
Qiagen によるDNeasyTM を用いて、実例１に記述されたヒトの皮膚組織試料からＤＮＡが抽出された。特定のプライマーを用いて、ｍｔＤＮＡは、ＰＣＲおよびこれに続くＤＮＡ試料の準備（Qiagen）によって増幅された。突然変異は、BigDyeTM Terminator Cycle 配列決定を用いた自動配列決定（PE Applied Biosystems）によって認識された。このようなやり方は、Healyら(2000)および Heardingら(2000)に記述されている。偽遺伝子やその他の核遺伝子座を増幅しないことで知られている、確立されたＰＣＲプライマー対を用いて、すべての16,569bpのヒトのミトコンドリアゲノムの配列が決定される。推定される任意のＤＮＡ変化は、改訂された「ケンブリッジ」ヒトｍｔＤＮＡ文献（Andrewsら(1999)）と比較することによって確認される。腫瘍のｍｔＤＮＡから得られた配列は、まず、既知の多型性（Andrewsら(1999); MITOMAP）のために比較され、次に、純粋な体細胞突然変異を認識するために、正常な皮膚からのｍｔＤＮＡ配列と比較される。
【０１５５】
完全自動化スクリーン処理を提供するＤＨＰＬＣが、WAVETM DNA Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha, USA) において実行される。同じ技術は、皮膚腫瘍ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーのためにスクリーンするのに用いられる。
【０１５６】
実例２に記述されたような背中合わせ（back to back）プライマー法を用いて、非コード領域（ＮＣＲ）の非常に変化しやすい部分においてＤＮＡ長さの突然変異（つまりタンデム重複）のパターンが迅速にスクリーニングされる。
【０１５７】
実例４：ヒトのＮＭＳＣおよびその前駆体損傷におけるすべてのミトコンドリアゲノムの欠失スペクトル
扁平上皮細胞がん（ＳＣＣＳ）、基底細胞がん（ＢＣＣＳ），およびボーエン病や化学線角化症のような推定される前駆体損傷におけるｍｔＤＮＡ損傷が、太陽にさらされた体の異なる部位から採取された隣の皮膚と比較された。すべてのミトコンドリアゲノムを増幅してｍｔＤＮＡのすべての欠失スペクトルを決定するために、長ＰＣＲ技術（ＬＸ−ＰＣＲ）（Rayら(1998)）が用いられた。無数の特異欠失が、すべてのミトコンドリアゲノムにおいて発生するのが観察された。しかしながら、すべての欠失が非黒色腫皮膚がんと相関関係を有するとは限らないが、正確な診断方法のためには、病気と関連する欠失が知られなければならない。
【０１５８】
ＤＮＡは、生産者の推薦に応じて、市販のキット（Qiangen）を用いて抽出される。すべてのミトコンドリアゲノムは、Expand TM Long Template PCR SystemsTM (Boehringer Manheim, スイス)を用いて、別個の二つの反応で増幅される。使用されるＰＣＲプライマーは、ケンブリッジ配列（Andrewsら(1999)）の以下の領域をカバーする、Kleinleら(1997)により記述されたものである。すなわち、ＤＩＡ(ヌクレオチド(nt)336-363)，ＤＩＢ(nt 282-255)，ＯＬＡ(nt 5756-5781)，およびＯＬＢ(nt 5745-5781)である。これらの大きな生成物は、核偽遺伝子の増幅を排除する。プライマーの配列は以下のとおりである。
DIAF:(336-363)  5' AACACATCTCTGCCAAACCCCAAAAACA 3'
OLBR:(5745-5721)  5' CCGGCGGCGGGAGAAGTAGATTGAA 3'
OLAF:(5756-5781)  5' GGGAGAAGCCCCGGCAGGTTTGAAGC 3'
DIBR:(282-255)  5' ATGATGTCTGTGTGGAAAGTGGCTGTGC 3'
【０１５９】
増幅は、１６pmolの各プライマー、５００μmolのｄＮＴＰ、２２．５MmのＭｇＣｌ２および界面活性剤（キット）を含む１０ x ＰＣＲの緩衝剤、０．７５μlの酵素（３．５ x １０３単位/ml）および５０〜２００ngの全ＤＮＡを含む５０マイクロリッターの反応液内で実行される。一つの反応がゲノムの11,095bpの部分を生成し、他の反応が5,409bpの長さに帰着する（例えばKleinleら(1997)）。ＰＣＲ増幅条件は、９３℃で１分３０秒の変性段階と、これに続く、９３℃３０秒、６０℃３０秒および６８℃１２分の１０サイクルと、さらにこれに続く、同じ温度変化の２０サイクルであって各サイクルに５秒の延長時間が加えられたものとから構成されている。そして、９３℃３０秒、６０℃３０秒および６８℃２６分の最終サイクルがある。再生産性を確保するために、１％アガロースゲル上で既知の量のＤＮＡが分離されており、少なくとも同じ量のＤＮＡを有している試料のみが分析に含まれている。
【０１６０】
表２に示すように、腫瘍試料においてＵＶにさらされる時間が増えるほど、平均的に多数の欠失が発見されている。
【表２】
2005506057.tif 000003
【０１６１】
実例５：老化およびｍｔＤＮＡ
ヌクレオチドの塩基対の配列をその特異分子および可能な時間変化のために最終的に明確にするために、与えられた組織から抽出されたｍｔＤＮＡのすべての配列が、時間的な母系比較（つまり曾孫から祖父母までの）を用いて、迅速かつ正確に決定される。これらの特徴付けは、大きな集団の中の特異な母系間で、健康状態および老化のインジケータと比較される。この組み合わされた情報は、同じ突然変異/欠失に帰着することになる別個の原因の間の重要な統計的区別を与えるとともに、バイオマーカーとして用いられるｍｔＤＮＡ配列が、その有効性を確立するために、要求された特異性指数と感度を有しているということを証明している。また、塩基対の欠失および突然変異の比率が、一貫性のために、母方の４世代にわたって種々の組織で比較される。最近の方法論の発達は、血液試料において老化に影響を与える塩基対欠失の検出を可能にするとともに（Bassamら(1991)）、ｍｔＤＮＡを研究するのに、骨格筋の代わりに血液試料が用いられてもよいという可能性を高めた（Von Wurmbら(1998)）。ｍｔＤＮＡの欠失および/または突然変異の代表例として、筋肉組織の代わりに白血球を採用する有効性を確立した後で、次の工程は、白血球中のｍｔＤＮＡのみを評価するだけである。次に、ｍｔＤＮＡの欠失/突然変異が、既述したようにして決定される。
【０１６２】
骨格筋または白血球は、患者から採取された。ＤＮＡは、実例１で実行されたようにして抽出された。以下のプライマーが用いられた。
12ST1:(1257-1279)   5' TATACCGCCATCTTCAGCAAAC 3'
12ST2:(1433-1411)  5' TACTGCTAAATCCACCTTCGAC 3'
D1F: 5' CCTTACACTATTCCTCATCACC 3'
D1R: 5' TGTGGTCTTTGGAGTAGAAACC 3'
【０１６３】
増幅は、２．０μmolの各プライマー、２５０μmolのdNTP、１０ x PCR緩衝剤（Thermopol Reaction Buffer）、ウシ血清アルブミン、０．５単位のDeep vent ポリメラーゼ、および５０−２００ng の全ＤＮＡを含む５０マイクロリッターの反応液中で実行された。ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性段階（ホットスタート）と、これに続く、９４℃３０秒間、６０℃６０秒間、７２℃１０分間の最終延長がある７２℃３０秒間の３０サイクルとから構成されている。２％アガロースゲルにおいて、１２５ボルトで６０分間、ゲル電気泳動が実行された。そして、臭化エチジウムで染色され、ＵＶ光の下で視覚化された。再生産性を確保するために、２％アガロースゲル上で既知の量のＤＮＡが分離されており、同じ量のＤＮＡを有している試料のみが分析に含まれている。
【０１６４】
実例６：３-プライマーＰＣＲによる４９７７bp共通ｍｔＤＮＡ欠失の定量化検出
適切な個所において、１-５％よりも高いレベルを検出する３-プライマーＰＣＲ法による、または１％よりも低く１０−４％までのレベルを検出する希釈ＰＣＲ法による、定量的方法で共通欠失の発生が決定される（実例７参照）。試料は採取され、ＤＮＡは、実例１に既述したようにして抽出された。ＤＮＡ試料中において欠失ｍｔＤＮＡおよび野生型（ｗｔ）ｍｔＤＮＡの双方の比率を同時に検出して定量化するために、３-プライマーＰＣＲ法が用いられる（Birch-Machinら(1998)に既述されたように）。プライマーＡおよびＣは、重鎖位置13720-13705および9028-9008にそれぞれ対応しており（Andersonら(1981)）、プライマーＢは、軽鎖位置8273-8289位置に対応している。プライマーＣは、共通欠失内のｍｔＤＮＡ領域に位置しており、プライマーＡおよびＢは、欠失領域の側面に位置している。したがって、プライマーＢおよびＣは、ｗｔ-ｍｔＤＮＡを増幅するだけであり、プライマーＡおよびＢは、欠失ｍｔＤＮＡを増幅するだけである（欠失のない二つのプライマー間の距離である約５．５kbは、以下に述べるように、我々のＰＣＲ条件の下で増幅するには長すぎる）。
【０１６５】
三つのプライマーの使用は、ｗｔ-ｍｔＤＮＡに対応する長いバンド（755bp）と「共通欠失」にいる欠失ｍｔＤＮＡに対応する短いバンド（470bp）という二つのバンドの同時検出を可能にした。ＰＣＲ反応混合物（総量２５μl）は、総量１００ngの細胞ＤＮＡと、２００μＭのｄＮＴＰと、１０ｍＭのトリス‐ＨＣＬ（pH 8.8）と、５０ｍＭのＫＣｌと、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２と、０．１％のトリトンＸ-１００と、２．５ＵのTaq DNA ポリメラーゼ（BioTaq, BiolineUK Limited, London）、２５pmolのプライマーＡ，Ｂ、６．２５pmolのプライマーＣ、および３μCi of [α-３２P]-dATP。ＰＣＲ条件は、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１５分間の最終延長を含む７２℃２分間の２５サイクルであった。次に、これらのＰＣＲ生成物は、６％の非変性ポリアクリアミドゲルを用いて電気泳動された。そして、放射性ＰＣＲ断片が、ImageQuantTMソフトウエア（Molecule Dynamics, Chesham UK）を用いた分析によって定量化された。
【０１６６】
実例７：低レベル（＜１％）の共通ｍｔＤＮＡ欠失を定量的に検出するための連続希釈ＰＣＲ法
組織/細胞試料から抽出されたすべてのｍｔＤＮＡ中の共通欠失の比率を評価するために、半定量化ＰＣＲ法（Corral-Debrinskiら(1991)）が用いられる。生物学的試料が採取され、実例１に示すようにして、ＤＮＡが抽出された。ＤＮＡ試料は、まず、制限酵素 Bam HI（１μlの酵素および工業用に供給された１μlの緩衝剤）を用いて３７℃で９０分間かけて線状にされた。（最初１０倍の希釈液があった完全ｍｔＤＮＡのために）２倍の工程で連続希釈が実行された。そして、以下のプライマーを用いて、各希釈液（１μl）についてＰＣＲが実行された。
完全mtDNAのためのプライマー
L3108(nt3108-3127)
H3717(nt3717-3701)
共通欠失のためのプライマー
L8282(nt8282-8305)
H13851(ntl3851-13832)
【０１６７】
反応条件は以下のとおりである。
９４℃２分間を１サイクル、９４℃４５秒間、５１℃３０秒間（完全ｍｔＤＮＡ）、５６℃３０秒間（共通欠失）および７２℃１分間を３４サイクル、最後に７２℃８分間を１サイクル。すべてのＰＣＲ反応は、以下の混合物（５０μl）内で実行された。１μlの試料ＤＮＡ、０．６μＭの前進（forward）プライマー、０．６μＭの復帰（reverse）プライマー、０．２ｍＭの dNTP、５μlの GeneAmpR 10x PCR 緩衝剤（Perkin Elmer）、０．２μlの AmplitaqRのＤＮＡのポリメラーゼ（Perkin Elmer）、オートクレーブされた３５．７５μlの２倍無菌蒸留水。
【０１６８】
電気泳動に続いて、ＰＣＲ生成物がＵＶ照通装置（TMW-20, Flowgen Ltd., Lichfield, UK）で視覚化されるとともに、イメージ捕捉措置（Flowgen LTD., Lichfield, UK により供給された Alpha Imager 2000, Alpha Innotech Corporation, ）を用いて、ゲルのデジタル像が得られた。関連するイメージ解析ソフトウエア（Alpha Ease v3.3, Alpha Innotech Corp.）は、直接希釈において各ＰＣＲ生成物についての統一吸光度（ＩＯＤ：Integrated Optical Density）の算出を可能にした。ＩＯＤ値が零の帯域は、完全ｍｔＤＮＡおよび欠失ｍｔＤＮＡの双方について得られた。対応する希釈値が、以下のように、試料内の共通欠失の比率を計算するのに用いられている。
共通欠失（％）＝［全ｍｔＤＮＡ希釈因子（IOD Zero）ｘ 100］/［共通欠失希釈因子（IOD Zero）］
【０１６９】
実例８：変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）
試料が採取され、実例１と同様にして、ＤＮＡが抽出された。Van den Boschら(2000)により記述された二つの異なるＰＣＲ条件を用いることにより、１３の重複断片についてＰＣＲが実行された。以下は、ＰＣＲのための三つのｍｔＤＮＡ特異プライマー対である。
ｉ．オリゴ配列
Mt3118F  CCCTGTACGAAAGGACAAGAG
Mt3334R  TGAGGAGTAGGAGGTTGG
Mt8207F  CCCATCGTCCTAGAATTAATTCC
Mt8400R  ATGGTGGGCCATACGGTAG
Mt14427F  CCCATGCCTCAGGATACTCCTC
Mt14997R  GCGTGAAGGTAGCGGATG
【０１７０】
1-2 kb のＰＣＲ生成物は、90‐600 bp の断片に温浸され、最適な融解温度で分解された。突然変異は、二つのピークで表され、２％ヘテロプラスミーよりも低いような低い比率の突然変異は、ピークの「肩部」で表される。
【０１７１】
ＤＨＰＬＣは、二つの溶離液（pH 7.0）からなる流動相を用いて実行される。緩衝液Ａは、トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）を含んでおり、これは、ＤＮＡ上で負に帯電したリン酸基およびカラム表面の双方と相互作用する。緩衝液Ｂは、２５％変性剤アセトニトリルを有するＴＥＡＡを含んでいる。断片は、一定の流速においてアセトニトリルの１次勾配をもって溶離した。アセトニトリルの濃度を上げると、断片が変性する。以下の表３は、製造者の指示にしたがってWAVEMAKER ソフトウエア（Transgenomics）を用いることにより、生成したＰＣＲ反応のＤＨＰＬＣのための標準的な方法の一例を示している。
【表３】
2005506057.tif 000004
【０１７２】
種々の heteroduplexes において成功した分解の温度は、以下に詳細に示されており、表２の関連位置に置き換えることができる。
断片        融解温度（℃）    緩衝液Ｂの濃度勾配（％）
Mt3118F     59                51-59
Mt8207F     58                50-58
Mt14427F    56                60-68
【０１７３】
参考文献
Anderson S, et al., Nature 290:457-464, 1981.
【０１７４】
Andrews RM, et al., Nature Genetics 23(2):147, 1999.
【０１７５】
Barringer, et al., Gene 89:117, 1990.
【０１７６】
Bassam BJ, Caetano-Anolles PM, Gresshoff PM., Anal. Biochem. 196:80-83, 1991.
【０１７７】
Berneburg M, et al., J. Biol. Chem. 274(22):1 5345-15349, 1999.
【０１７８】
Berthon P, Valeri A, Cohen-Akeninc A, Drelon E, Paiss T, Wohr G, Latil A et al., Am. J. Hum. Genet., 62:1416-1424, 1998.
【０１７９】
Birch-Machin MA, et al., Methods in Toxicology, Volume 2, 51-69, 1993.
【０１８０】
Birch-Machin MA, et al., J. Invest. Dermatol., 110:149-152, 1998.
【０１８１】
Birch-Machin MA, オンライン会議報告書（Sunburnt DNA），生化学・分子生物学国際学会。New Scientist, 2000(a).
【０１８２】
Birch-Machin MA, Taylor RW, Cochran B, Ackrell BAC, Tumbull DM. Ann Neurol 48:330-335, 2000(b).
【０１８３】
Birch-Machin MA, Clin. Exp. Dermatol,. 25(2), 141-146, 2000(c).
【０１８４】
Birch-Machin MA and Krishnan K. Mitochondrion, 1, p45 (2001).
【０１８５】
Birch-Machin MA, Lindsey J. Lusher M and Krishnan K. Mitochondrion, 1 Suppl. 1, S30 (2001).
【０１８６】
Bogliolo M, et al., Mutagenesis, 14:77-82, 1999.
【０１８７】
Brierley EJ, Johnson MA, Lightowlers RN, James O, Turnbull DM., Ann Neurol 43(2):217-223, 1998.
【０１８８】
Brockington, et al., Nature Genet 4:67-71, 1993.
【０１８９】
Brown M.D., et al., Am J. Humn Genet, 60:381-387, 1997.
【０１９０】
Brumley R.L. Jr. and Smith L.M., 1991, 水平極薄ゲル電気泳動による高速DNA配列決定。Nucleic Acids Res. 19:4121-4126.
【０１９１】
Buttyan R, Sawczuk IS, Benson MC, Siegal JD, Olsson CA., Prostate 11:327-337, 1987.
【０１９２】
Byrne E., Curr Opin Reumatol 4(6):784-793, 1992.
【０１９３】
Cairns P, Okami K, Halachmi S, Halachmi N, Esteller M, Herman JG, Jen J et al., Cancer Res 57:4997-5000, 1997.
【０１９４】
Chee M, et al., Science 274:610-614, 1996.
【０１９５】
Chinnery PF, Howel N, Turnbull DM., J. Med. Genet. 36:425-436, 1999.
【０１９６】
Chinnery PF and Turnbull DM., Lancet 354 (supplement 1):17-21, 1999.
【０１９７】
Chinnery PF and Turnbull DM., Lancet 354 (supplement 1):17-21, 2000.
【０１９８】
Chollat-Traquet C, Tobacco or health: a WHO programme., Eur J Cancer, 28(2-3):311-315, 1992.
【０１９９】
Chomyn A, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(10):4221-4225, 1992.
【０２００】
Cohen D, Barton G, The cost to society of smoking cessation., Thorax. 53(2):S38-42, 1998.
【０２０１】
Corral-Debrinski et al., Mutat Res, 275:169-180, 1991.
【０２０２】
Cortopassi G.A. and Arnheim H., 高齢のヒトの組織における特異ミドコンドリアDNA欠失の検出。Nucleic Acids Tes. 18, 6927-6933, 1990.
【０２０３】
Cortopassi G, Wang E., Biochim Biophys Acta 1271(1):171-176, 1995.
【０２０４】
Croteau DL, Stierum RH, Bohr VA, Mutat Res 434(3):137-148, 1999.
【０２０５】
分子生物学の現行プロトコル。
【０２０６】
Davis RM, Boyd GM, Schoenborn CA,「一般的礼儀」と受動喫煙の排除。Results of the 1987 National Health Interview Survey. JAMA 263(16):2208-10, 1990.
【０２０７】
Dong JT, Isaacs WB, Rinker-Schaeffer CW, Vukanovic J, Ichikawa T, Isaaca JT, Barrett JC., Science 268:884-886, 1995.
【０２０８】
Driezen P, Brown KS., Searchable database of questionnaire items from populations surveys of tobacco use in Canada: A summary report to the Ontario Tobacco Research Unit (Toronto, Ontario), 1999.
【０２０９】
Easton RD, Merriwether AD, Crews DE, and Ferrell RE., Am. J. Hum. Genet. 59:202-212, 1996.
【０２１０】
Fahn H, Wang L, Hseith R, Chang S, Kao S, Huang M, and Wei Y. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine, 154:1141-1145, 1996.
【０２１１】
Fahn HJ, Wang LS, Kao SH, Chang SC, Huang MH, Wei YH., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 19(6):901-9, 1998.
【０２１２】
Finegold D., Mitochondrial Disease-Primary Care Physican's Guide. Psy-Ed. Corp D/B/A Exceptional Parents Guide: 12, 1997.
【０２１３】
Flanagan N, Birch-Machin MA, Rees JL., Hum Mol Genet 9(17):2531-2537, 2000.
【０２１４】
Flanagan N, Ray AJ, Todd C, Birch-Machin MA and Rees JL., J Invest. Dermatol (2001) 117 (5) 1314-1317.
【０２１５】
Fliss MS, et al. Science 287:2017-2019, 2000.
【０２１６】
Gattermann N, Berneburg M, Heinisch J, Aul C, Schneider W., Leukemia 9(10):1704-10, 1995.
【０２１７】
Green R, Reed JC., Science 281(5381):1309-1312, 1998.
【０２１８】
Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87:1874, 1990.
【０２１９】
Gulavita, Sunil Dr. Northwestern Ontario Cancer Centre - Personal Communication.
【０２２０】
Habano S, Nakamura, Sugai T., Oncogene 17(15):1931-1937, 1998.
【０２２１】
Harding RM, et al., Am. J. Hum. Genet. 66, 1351-1361, 2000.
【０２２２】
Harman D., Proc Nati Acad Sci USA 78(11):7124-8, 1981.
【０２２３】
Hattori et al., ヒトの心臓における、欠失ミドコンドリアDNAの年齢依存性増加：possible contributory factor to presbycardia, AM. Heart J., 121, 1735-1742, 1991.
【０２２４】
Hayashi J, Ohta S, Kikuchi A, Takemitsu M, Goto Y, Nonaka I., Proc Natl Acad Sci USA 88(23):10614-10618, 1991.
【０２２５】
Hayward SW, Grossfeld GD, Tlsty TD, Cunha GR., Int J Oncol 13:35-47, 1998.
【０２２６】
Healy E, Birch-Machin MA, Rees JL. Chapter 1 1. ヒトメラノコルチン１レセプター遺伝子。In the Melanocortin Receptors (Cone RD(ed)). Humana Press Inc. New Jersey, USA, 1999.
【０２２７】
Healy E, Birch-Machin MA, Rees JL., Lancet 355, 1072-1073, 2000.
【０２２８】
Hearst N, Hulley SB. Using secondary data, In Designing clinical research: an epidemiological approach. Ed. Hulley S. and Cummings S., Baltimore: Williams & Wilkins, pages 53-62, 1988.
【０２２９】
Hopgood R., et al., 1992, PCR試料からの直接の、ヒトmtDNAの自動配列決定方法。Biotechniques 13:82-92.
【０２３０】
Hsieh RH and Wei YH,ヒト筋ミトコンドリアDNAにおける年齢依存性多発性欠失。in preparation 1992.
【０２３１】
Huang GM, Ng WL, Farkas J, He L, Liang HA, Gordon D, Hood R., Genomics 59(2):178-86, 1999.
【０２３２】
http://www.ornl.gov/hgmis/project/budget.html
【０２３３】
Ikebe et al., パーキンソン病および老化におけるストリアートゥムでの欠失ミトコンドリアDNAの増加。Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 1044-1048, 1990.
【０２３４】
Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Application, Academic Press Inc. San Diego, 1990.
【０２３５】
Kaiserman MJ, Chronic Dis Can 18(1):13-9, 1997.
【０２３６】
Kalra J, Chaudhary AK, Prasad K., Int. J. Exp. Pathol. 72(1):1-7, 1991.
【０２３７】
Katayama et al., 老齢のヒトの骨格筋における欠失ミトコンドリアDNA。Biochem. Int., 25, 47-56, 1991.
【０２３８】
Kleinle S, et al., Human Genet. 290:457-465, 1997.
【０２３９】
Konishi N, Cho M, Yamamoto K, Hiasa Y. Pathol. Int. 47:735-747, 1997.
【０２４０】
Krishnan K and Birch-Machin MA. British Journal of Dermatology (2002), 146,723.
【０２４１】
Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173, 1989.
【０２４２】
Landis SH, Murray T, Bolden S, Wingo PA. Cancer J. Clin. 49:8-31.
【０２４３】
Landis, SH, et al., CA Cancer J. Clin. 49:8-31, 1999.
【０２４４】
Landegren et al., Science, 241:1077, 1988.
【０２４５】
LeDoux SP, et al., Mutat Res 434(3):149-159, 1999.
【０２４６】
Lee HC, et al., FEBS Letters 354:79-83, 1994.
【０２４７】
Lee HC, Lu CY, Fahn HJ, Wei YH. Federation of European Biochemical Societies, 441:292-296, 1998.
【０２４８】
Lee HC, et al., Arch. Biochem. Biophys. 362(2):309-16, 1999.
【０２４９】
Leonard & Shapira 1997.
【０２５０】
Lindsey J, Lusher M, Krishnan KJ and Birch-Machin MA., British Journal of Dermatology (2001), 144,655.
【０２５１】
Li Y, et al., In: Oxygen Radicals and the Disease Process, Amsterdam, The Netherlands: Harwood Academic Publishers, 237-277, 1997.
【０２５２】
Linnane et al., 1990.
【０２５３】
Liu CS, Kao SH, Wei YH. Environ. Mol. Mutagen 30(1):47-55, 1997.
【０２５４】
Lowes S, Krishnan K, Lindsey J, Lusher M and Brich-Machin MA. British Journal of Dermatology (2002), 146,736.
【０２５５】
Luckey J. A., et al., 1993, 毛細管ゲル電気泳動による高速DNA配列決定。Methods Enzymol. 218:154-172.
【０２５６】
McCormack, Douglas. Website: http://cormactech.com/dna, 2001.
【０２５７】
Meibner C, von Wurmb N, Oehmichen M., Int. J. Legal Med. 110:288-291, 1997.
【０２５８】
Michikawa Y, Mazzucchelli F, Bresolin N, Scarlato G, Attardi G., Science, 286:774-779, 1999.
【０２５９】
Miquel J, de Juan E, Sevila I. EXS 62:47-57, 1992.
【０２６０】
MITOMAP: A human mt genome database (www.gen.emory.edu/mitomap.html).
【０２６１】
Mullis and Faloona Methods Enzymol 155, 335, 1987.
【０２６２】
Nachman MW, Brown WM, Stoneking M, Aquardo CF., Genetics 142:53-963, 1996.
【０２６３】
National Cancer Institute of Canada, Canadian cancer statistics 2000., National Cancer Institute of Canada., Toronto, Ont. 2000.
【０２６４】
Naviaux RK., Mitochondrial Disease-Primary Care Physican's Guide. Psy-Ed. Corp D/B/A Exceptional Parents Guide: 3-10, 1997.
【０２６５】
Newton CR and Graham A., Introduction to Biotecniques Series 1997.
【０２６６】
Oefner PJ, Underhill PA., Current protocols in human genetics 19, 7.10.1-12, 1998.
【０２６７】
Ozen M, et al., Prostate 36:264-271, 1998.
【０２６８】
Pang et al., Arch. Biochem. Biophys. 312:534-538, 1994.
【０２６９】
Parsons TJ, et al., Nature Genet. 15(4):363-368, 1997.
【０２７０】
Pascucci B, et al., J. Mol. Biol. 273(2):417-427, 1997.
【０２７１】
Penta JS, Johnson FM, Wachsman JT, Copeland WC., Mut. Res. 488, 119-133, 2001.
【０２７２】
Polyak Y, et al., Nature Genet. 20(3):291-293, 1998.
【０２７３】
Ray AJ, Rees JL, Birch-Machin MA., J. Invest. Dermatol. 110:692, 1998.
【０２７４】
Ray AJ, Rees JL, Birch-Machin MA., Brit. J. Dermatol. 140:788, 1999.
【０２７５】
Ray AJ, Pickersgill L, Turner R, Nikaido O, Rees JL, Birch-Machin MA., J. Invest. Dermatol 115(4):674-679, 2000.
【０２７６】
Rees JL, Skin cancer. In: The Genetic Basis of Human Cancer, eds Vogelstein B, Kinzler K. New York: McGraw-Hill, pp527-536, 1998.
【０２７７】
Rehman I, Quinn AJ, Healy E, Rees JL. Lancet 344:788-789, 1994.
【０２７８】
Rehman I, Takata M, Wu YY, Rees JL. Oncogene 12:2483-2490, 1996.
【０２７９】
SAS Enterprise Mining Users Guide, SAS Inc., 2000.
【０２８０】
Sawyer E, Van Houten B., Mutation Res. 434(3):161-176, 1999.
【０２８１】
Schurr TG, Ballinger SW, Gan Y, Hodge JA, Merriwether DA, Lawrence DN, Knowler WC, Weiss KM, and Wallace DC., Am. J. Hum. Genet. 46:613-623, 1990.
【０２８２】
Seidman M.D. et al., Arch. Otolaryngol Head Neck Surg., 123:1039-1045, 1997.
【０２８３】
Shankey TV, Jin JK, Dougherty S, Flanigan RC, Graham S, Pyle JM., Cytometry 21:30-39, 1995.
【０２８４】
Shay JW, Werbin H., Mutat. Res: 186:149, 1987.
【０２８５】
Sherrat EJ, Thomas AW, Alcolado JC., Clin. Sci. 92:225-235, 1997.
【０２８６】
Shoffner JM, Brown MD, Torroni A, Lott MT, Cabell MF, Mirra SS, Beal MF, Yang C, Gearing M, Salvo R, Watts RL, Juncos JL, Hansen LA, Crain BJ, Fayad M, Reckford CL, and Wallace DC., Genomics 17:171-184, 1993.
【０２８７】
Smith DG, Malhi RS, Eshleman J, Lorenz JG and Kaestle FA., Am. J. Hum. Genet. 110:271-284, 1999.
【０２８８】
Smith R, Birch-Machin MA, Rees JL. J. Invest. Dermatol. 111:101-104, 1998.
【０２８９】
SpringNet - CE Connection: Screening, Diagnosis: Improving Primary Care Outcomes. Website: http://www.springnet.com/ce/j803a.htm.
【０２９０】
Stone AC and Stoneking M. Amer. J., Phys. Anthro. 92(4):463-471, 1993.
【０２９１】
Tamura S, et al., Eur. J. Cancer [A] 35(2):316-319, 1999.
【０２９２】
Tanaka M. et al., 1996, mtDNAの自動配列決定。Methods Enzymol. 264:407-421.
【０２９３】
Taniike M. et al., BioChem BioPhys Res Comun, 186:47-53, 1992.
【０２９４】
Taylor RW, Birch-Machin MA, Bartlett K, Turnbull DM., J Biol Chem, 269, 3523-3528, 1994.
【０２９５】
Tijssen, P. (ed) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Polynucleotide Probes, Elsevier, N.Y., 1993.
【０２９６】
Tori et al., 加齢に関連した、ヒト横隔膜ミトコンドリアDNAの欠失。AM. J. Respir. Cel. l Mol. Biol. in press, 1992.
【０２９７】
Van De Graff KM, Fox SI., Concepts of Human Anatomy and Physiology., Dubuque: WM. C. Brown Publishers, 1995.
【０２９８】
Van den Bosch BJC, et al., Nucleic Acids Res. 28:89, 2000.
【０２９９】
von Wurmb N, Oehmichen, M, Meissner, C., Mutat Res. 422:247-254, 1998.
【０３００】
Wallace DC., Annu Rev Biochem, 61:1175-1212, 1992.
【０３０１】
Wallace DC. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8739-8746, 1994.
【０３０２】
Wald and Wallace, D.C., ヒトおよびマウスのミトコンドリア病。Science, 5 (283):1482-1497, 1999.
【０３０３】
Wald NJ, Hackshaw, AK, タバコの喫煙：疫学的概観。Br Med Bull. 52(1):3-11, 1996.
【０３０４】
Wallace et al., レーバー遺伝性視神経症に関連したミトコンドリアDNAの突然変異。Science, 1427-1429.
【０３０５】
Walsh PC, Partin AW. Cancer 80:1871-1874, 1997.
【０３０６】
Ward RH, Frazier BL, Dew-Jager K, Paabo S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8720-8724, 1991.
【０３０７】
Ward 1993.
【０３０８】
Wei YH, Pang C, You B, Lee H. Ann. NY Acad. Sci. 786:82-101, 1996.
【０３０９】
Wei YH. Proceedings of the Nat. Sci. Council of the Republic of China April 22 (2):5567, 1998.
【０３１０】
Weinstock MA: In: JJ Stern RS, MacKie RM and Weinstock MA, Grob (eds) Epidemiology, Blackwell (UK). pp121-128, 1998.
【０３１１】
Woodwell DA. National Ambulatory Medical Care Survey: 1997 Summary. Advance data from vital and health statistics; no. 305. Hyattsville, Maryland: National Center for Health Statistics. 1999.
【０３１２】
Wu & Wallace Genomics, 4:560, 1989.
【０３１３】
Xu J, et al., Nature Genet 20:175-179, 1998.
【０３１４】
Yamaguchi KT, et al., Free Radical Res. Commun. 16(3):167-74, 1992.
【０３１５】
Yeh J.J., et al., Oncogene Journal, 19:2060-2066, 2000.
【０３１６】
Yen et al., 加齢に関連した、ヒト肝ミトコンドリアDNAの5kb欠失。Biochem., Biophys., Res. Commun., 178, 124-131, 1991.
【０３１７】
Yen et al., 加齢に関連した、ヒト肝ミトコンドリアDNAの6kb欠失。Biochem. Int. 26, 457-468, 1992.
【０３１８】
Zeviani M, et al., Am. J. Hum. Genet. 47:904-914, 1990.
【０３１９】
Zhang et al., 老齢のヒトにおける多発性ミトコンドリアDNA欠失。FEBS Lett, 297, 34-38, 1992.
【０３２０】
Zhang C., et al., BioChem. BioPhys. Res. Comun., 195:1104-1110, 1993.
【国際公開パンフレット】
2005506057.tif 000005
2005506057.tif 000006
2005506057.tif 000007
2005506057.tif 000008
2005506057.tif 000009
2005506057.tif 000010
2005506057.tif 000011
2005506057.tif 000012
2005506057.tif 000013
2005506057.tif 000014
2005506057.tif 000015
2005506057.tif 000016
2005506057.tif 000017
2005506057.tif 000018
2005506057.tif 000019
2005506057.tif 000020
2005506057.tif 000021
2005506057.tif 000022
2005506057.tif 000023
2005506057.tif 000024
2005506057.tif 000025
2005506057.tif 000026
2005506057.tif 000027
2005506057.tif 000028
2005506057.tif 000029
2005506057.tif 000030
2005506057.tif 000031
2005506057.tif 000032
2005506057.tif 000033
2005506057.tif 000034
2005506057.tif 000035
2005506057.tif 000036
2005506057.tif 000037
2005506057.tif 000038
2005506057.tif 000039
2005506057.tif 000040
2005506057.tif 000041
2005506057.tif 000042
2005506057.tif 000043
2005506057.tif 000044
2005506057.tif 000045
2005506057.tif 000046
2005506057.tif 000047
2005506057.tif 000048
2005506057.tif 000049
2005506057.tif 000050
2005506057.tif 000051
2005506057.tif 000052
2005506057.tif 000053
2005506057.tif 000054
2005506057.tif 000055
2005506057.tif 000056
2005506057.tif 000057
2005506057.tif 000058
2005506057.tif 000059
2005506057.tif 000060
2005506057.tif 000061
2005506057.tif 000062
2005506057.tif 000063
2005506057.tif 000064
2005506057.tif 000065
2005506057.tif 000066
2005506057.tif 000067
2005506057.tif 000068
2005506057.tif 000069
2005506057.tif 000070
2005506057.tif 000071
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506057.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】平成15年1月17日(2003.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005506057.tif 000073
2005506057.tif 000074
2005506057.tif 000075
2005506057.tif 000076
2005506057.tif 000077
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
Brockingtonら(1993)およびLeeら(1994)からの以下の重複プライマーが用いられた。
SEQ ID NO: 1
C  L336  AAC ACA TCT CTG CCA AAC CC   20 mer
SEQ ID NO: 2
D  H335  TAA GTG CTG TGG CCA GAA GC   20 mer
SEQ ID NO: 3
E  L467  CCC ATA CTA CTA ATC TCA TC   20 mer
SEQ ID NO: 4
F  H466  AGT GGG AGG GGA AAA TAA TG   20 mer


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
ＤＮＡは、生産者の推薦に応じて、市販のキット（Qiangen）を用いて抽出される。すべてのミトコンドリアゲノムは、Expand TM Long Template PCR SystemsTM（Boehringer Manheim, スイス）を用いて、別個の二つの反応で増幅される。使用されるＰＣＲプライマーは、ケンブリッジ配列（Andrewsら(1999)）の以下の領域をカバーする、Kleinleら(1997)により記述されたものである。すなわち、ＤＩＡ(ヌクレオチド(nt)336-363)，ＤＩＢ(nt 282-255)，ＯＬＡ(nt 5756-5781)，およびＯＬＢ(nt 5745-5781)である。これらの大きな生成物は、核偽遺伝子の増幅を排除する。プライマーの配列は以下のとおりである。
SEQ ID NO: 5
DIAF:(336-363)  5' AACACATCTCTGCCAAACCCCAAAAACA 3'
SEQ ID NO: 6
OLBR:(5745-5721)  5' CCGGCGGCGGGAGAAGTAGATTGAA 3'
SEQ ID NO: 7
OLAF:(5756-5781)  5' GGGAGAAGCCCCGGCAGGTTTGAAGC 3'
SEQ ID NO: 8
DIBR:(282-255)  5' ATGATGTCTGTGTGGAAAGTGGCTGTGC 3'


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
骨格筋または白血球は、患者から採取された。ＤＮＡは、実例１で実行されたようにして抽出された。以下のプライマーが用いられた。
SEQ ID NO: 9
12ST1:(1257-1279)   5' TATACCGCCATCTTCAGCAAAC 3'
SEQ ID NO: 10
12ST2:(1433-1411)  5' TACTGCTAAATCCACCTTCGAC 3'
SEQ ID NO: 11
D1F: 5' CCTTACACTATTCCTCATCACC 3'
SEQ ID NO: 12
D1R: 5' TGTGGTCTTTGGAGTAGAAACC 3'


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
実例８：変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）
試料が採取され、実例１と同様にして、ＤＮＡが抽出された。Van den Boschら(2000)により記述された二つの異なるＰＣＲ条件を用いることにより、１３の重複断片についてＰＣＲが実行された。以下は、ＰＣＲのための三つのｍｔＤＮＡ特異プライマー対である。
ｉ．オリゴ配列
SEQ ID NO: 13
Mt3118F  CCCTGTACGAAAGGACAAGAG
SEQ ID NO: 14
Mt3334R  TGAGGAGTAGGAGGTTGG
SEQ ID NO: 15
Mt8207F  CCCATCGTCCTAGAATTAATTCC
SEQ ID NO: 16
Mt8400R  ATGGTGGGCCATACGGTAG
SEQ ID NO: 17
Mt14427F  CCCATGCCTCAGGATACTCCTC
SEQ ID NO: 18
Mt14997R  GCGTGAAGGTAGCGGATG




【手続補正書】
【提出日】平成15年12月2日(2003.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｔＤＮＡを有する被検体において、病気、機能障害または老化に関連する突然変異を検出する方法であって、
ａ．被検体から生物学的試料を用意することと、
ｂ．生物学的試料からＤＮＡを抽出することと、
ｃ．ｍｔＤＮＡ内の突然変異の存在を検出することと、
ｄ．突然変異が正常な集団内または集団間の変異に関連しているかどうか、あるいは突然変異が病気、機能障害または老化に関連しているかどうかを決定することと、
を備えた方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、
生物学的試料のｍｔＤＮＡの全変異荷重を決定することをさらに備えた、
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１の方法において、
生物学的試料が被検体の正常組織からのものである、
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１の方法であって、
突然変異が正常な集団内または集団間の変異に関連しているかどうか、あるいは突然変異が病気、機能障害または老化に関連しているかどうかを決定する工程において、
ａ）生物学的試料のｍｔＤＮＡをデータベースと比較することを備え、
データベースが、集団内変異および集団間変異のデータと、病気、機能障害または老化と関連する突然変異のデータとを有しており、
ｂ）任意的に、生物学的試料の全変異荷重を決定することを備えている、
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
診断のための請求項１の方法の使用であって、
診断が、病気素質または機能障害素質、病気または機能障害の早期発見、病気または機能障害の発生、病気または機能障害の存在、病気または機能障害の進行からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項１の方法において、
突然変異の存在を検出する工程が、
ａ．ｍｔＤＮＡの配列を決定することと、
ｂ．ＰＣＲによってｍｔＤＮＡを増幅することと、
ｃ．サザン、ノーザン、ウェスタンおよびサウスウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションすることと、
ｄ．変性ＨＰＬＣを行うことと、
ｅ．マイクロアレイ、遺伝子チップまたはバイオチップにハイブリダイゼーションすることと、
ｆ．分子マーカー分析と、
ｇ．ａ）ないしｆ）のいずれかの組合せと、
からなるグループから選択されている、
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６の方法において、
配列が決定されるミトコンドリアＤＮＡが全ミトコンドリアゲノムを有している、
ことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１の方法において、
病気が非黒色腫皮膚がんである、
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１の方法において、
病気が前立腺がんである、
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１の方法において、
突然変異が任意のレベルのヘテロプラスミーである、
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項４の方法において、
データベースが、少なくとも有意性のある数のミトコンドリアＤＮＡ配列を有しており、ミトコンドリアＤＮＡ配列が母系、非母系、または双方から得られている、
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
病気の診断のためのキットであって、
使い捨てのチップと、マイクロアレイと、使い捨てチップを保持する手段と、ミトコンドリアＤＮＡの抽出のための手段と、ミトコンドリアＤＮＡ配列のデータベースにアクセスするための手段とを備えた、
病気の診断のためのキット。
【請求項１３】
病気素質を決定するためのキットであって、
使い捨てのチップと、マイクロアレイと、使い捨てチップを保持する手段と、ミトコンドリアＤＮＡの抽出のための手段と、ミトコンドリアＤＮＡ配列のデータベースにアクセスするための手段とを備えた、
病気素質を決定するためのキット。
【請求項１４】
請求項１２または１３のいずれかにおいて、
病気が非黒色腫皮膚がんである、
ことを特徴とするキット。
【請求項１５】
請求項１２または１３のいずれかにおいて、
病気が前立腺がんである、
ことを特徴とするキット。
【請求項１６】
複数の核酸要素および固形基質を有するアレイであって、
各核酸要素が、病気、機能障害または老化の存在を示し、あるいは、病気、機能障害または老化に関連する塩基対欠失または突然変異の比率のための抑制指数に関連するとともに、ミトコンドリアＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡから転写されたＲＮＡ、およびｃＤＮＡからなるグループから選択されており、各核酸要素がアレイ上に特有の位置を有し、固形基質に安定して結合している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項１７】
複数の核酸要素および固形基質を有するアレイであって、
各核酸要素が、病気素質、機能障害素質または老化素質を示し、あるいは、病気、機能障害または老化に関連する塩基対欠失または突然変異の比率のための抑制指数に関連するとともに、ミトコンドリアＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡから転写されたＲＮＡ、およびｃＤＮＡからなるグループから選択されており、各核酸要素がアレイ上に特有の位置を有し、固形基質に安定して結合している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項１８】
請求項１６または１７のいずれかにおいて、
各要素が前立腺がんを示している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項１９】
請求項１６または１７のいずれかにおいて、
各要素が非黒色腫皮膚がんを示している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項２０】
請求項１６または１７のいずれかにおいて、
各要素が老化に関連している、
ことを特徴とするアレイ。
【請求項２１】
ｍｔＤＮＡを含む被検体においてヘテロプラスミーを検出する方法であって、
ａ）被検体から生物学的試料を用意することと、
ｂ）生物学的試料からＤＮＡを抽出することと、
ｃ) 試料に変性ＨＰＬＣを実行することと、
を備えた方法。
【請求項２２】
複数のヒトミトコンドリアＤＮＡ配列を有するデータベースであって、
ミトコンドリアＤＮＡ配列が、病気のない状態と関連する正常な制御配列と、集団内変異と関連する配列と、集団間変異と関連する配列と、病気の存在と関連する配列と、病気素質を示す配列とからなるグループから選択されている、
ことを特徴とするデータベース。
【国際調査報告】
2005506057.tif 000078
2005506057.tif 000079
2005506057.tif 000080
2005506057.tif 000081
2005506057.tif 000082
2005506057.tif 000083
2005506057.tif 000084
2005506057.tif 000085
2005506057.tif 000086
2005506057.tif 000087
2005506057.tif 000088
2005506057.tif 000089