(57)【要約】ＩＧＦ−１と、その結合タンパク質、インスリンレセプター、及びＩＧＦレセプターとの相互作用をアンタゴナイズするペプチドを提供する。これらのＩＧＦアンタゴニストペプチドは、例えば様々な癌などの原因物質であるＩＧＦ−１に関連する疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(Xaa)1(Xaa)2Cys(Xaa)3(Xaa)4SerVal(Xaa)5AlaLeu(Xaa)6(Xaa)7CysMet(Xaa)8（配列番号：１）［ここで(Xaa)1(Xaa)2及び(Xaa)7はアミノ酸であり、(Xaa)3はPhe、Leu又はTyrであり、(Xaa)4はGlu、Asp、Ala、Gly、Thr又はSerであり、(Xaa)5はGlu、Asp、Ala又はGlyであり、(Xaa)6はArg又はLysであり、(Xaa)8はTyr又はArgである］の配列を有するペプチド。
【請求項２】
ペプチドのアミノ酸が全てＬ-アミノ酸である、請求項１のペプチド。
【請求項３】
(Xaa)8の後にグリシン残基をさらに有する、請求項１又は２のペプチド。
【請求項４】
(Xaa)4がGlu、Ala、Gly、Thr、又はSerであり、(Xaa)5がGlu、Ala、又はGlyであり、(Xaa)8がTyrである、請求項１ないし３の何れか１項のペプチド。
【請求項５】
(Xaa)4がGlu、Ala又はThrであり、(Xaa)5がAla又はGlyであり、(Xaa)8がTyrである、請求項１ないし４の何れか１項のペプチド。
【請求項６】
(Xaa)4がGlu又はAla、(Xaa)5がAla又はGly、(Xaa)8がTyrである、請求項１ないし５の何れか１項のペプチド。
【請求項７】
配列RNCFESVAALRRCMYG（配列番号：２）、MDCLASVEALKWCMYG（配列番号：３）、又はFECLTSVEALRGCMYG（配列番号：４）を含む、請求項１ないし３の何れか１項のペプチド。
【請求項８】
配列RNCFESVAALRRCMYG（配列番号：２）、又はMDCLASVEALKWCMYG（配列番号：３）を含む、請求項１ないし３の何れか１項のペプチド。
【請求項９】
(Xaa)1(Xaa)2Cys(Xaa)3(Xaa)4Asp(Xaa)5(Xaa)6Gly(Xaa)7(Xaa)8TyrCysTrp(Xaa)9（配列番号：５）［ここで(Xaa)1、(Xaa)4及び(Xaa)8はアミノ酸であり、(Xaa)2はArg、Lys、Gly、Ser又はThrであり、(Xaa)3はAla又はValであり、(Xaa)5はAla又はLeuであり、(Xaa)6はAla、Gly又はLeuであり、(Xaa)7はPhe、Tyr、Trp又はGlyであり、(Xaa)9はGlu、Asp、Ala又はGlyである］の配列を有するペプチド。
【請求項１０】
ペプチドのアミノ酸が全てＬ-アミノ酸である、請求項９のペプチド。
【請求項１１】
(Xaa)9の後にグリシン残基を更に有する、請求項９又は１０のペプチド。
【請求項１２】
(Xaa)2がGly、Ser、Arg又はThrであり、(Xaa)9がGlu、Ala又はAspである、請求項９ないし１１の何れか１項のペプチド。
【請求項１３】
(Xaa)2がGlu又はArgであり、(Xaa)5がLeuであり、(Xaa)6がAla又はGlyであり、(Xaa)7がPheであり、(Xaa)9がAlaである、請求項９ないし１１の何れか１項のペプチド。
【請求項１４】
配列LGCASDLAGFWYCWAG（配列番号：６）又はWRCVDDLGGFQYCWAG（配列番号：７）を有する、請求項９ないし１１の何れか１項のペプチド。
【請求項１５】
細胞障害剤又はポリエチレングリコールにコンジュゲートされた、請求項１ないし１４の何れか１項のペプチド。
【請求項１６】
請求項１ないし１５の何れか１項のペプチドを担体中に含む組成物。
【請求項１７】
血管形成剤又は化学療法剤をさらに含む、請求項１６の組成物。
【請求項１８】
注射又は吸入に適した、請求項１６又は１７の組成物。
【請求項１９】
請求項１６ないし１８の何れか１項の組成物を含む容器、及び組成物の利用のための使用者に対する説明書を有するキット。
【請求項２０】
インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）媒介性の現象に関係する疾患を持つ哺乳動物を治療するための方法であって、請求項１ないし１５の何れかの有効量のペプチドを哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２１】
前記疾患を治療する有効量の他の薬剤を哺乳動物に投与することを更に含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
薬剤が、成長阻害剤、血管形成阻害剤、又は細胞障害剤である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
薬剤が、化学療法剤、又は抗体である、請求項２１の方法。
【請求項２４】
哺乳動物がヒトである、請求項２０ないし２３の何れか１項の方法。
【請求項２５】
投与段階の前に、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＩＧＦ−１濃度の測定を含み、ＩＧＦ−１の基準範囲を超えて上昇したＩＧＦ−１濃度が、疾患の増大した危険を示す、請求項２０ないし２４の何れか１項の方法。
【請求項２６】
ボディサンプルが、腫瘍組織、血液、血漿、血清、乳、及び精液からなる群から選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
ＩＧＦ−１が、全ＩＧＦ−１、遊離ＩＧＦ−１又は複合ＩＧＦ−１である、請求項２５又は２６の方法。
【請求項２８】
疾患が、癌、ＩＧＦ−１により悪化する糖尿病合併症、末端肥大症、加齢性黄斑変性症、虚血性障害、又は外傷である、請求項２０ないし２７の何れか１項の方法。
【請求項２９】
癌が、インスリン様成長因子レセプターを発現する腫瘍を含む、請求項２８の方法。
【請求項３０】
癌が、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、又は肺癌である、請求項２８又は２９の方法。
【請求項３１】
癌が、乳癌又は前立腺癌である、請求項２８又は２９の方法。
【請求項３２】
疾患が前立腺癌であり、投与段階の前に、哺乳動物由来のボディサンプルにおける前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）濃度の測定を含み、ＰＳＡの基準範囲を超えて上昇したＰＳＡ濃度が、前立腺癌の増大した危険を示す、請求項２８又は２９の方法。
【請求項３３】
疾患が前立腺癌であり、投与段階の前に、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＩＧＦ−１濃度の測定、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるインスリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）濃度の測定、及びＩＧＦＢＰ−３濃度に対するＩＧＦ−１濃度の多変量調整処理による調整ＩＧＦ−１レベルの提供を含み、調整ＩＧＦ−１の基準範囲を超える調整ＩＧＦ−１レベルが、前立腺癌の増大した危険を示す、請求項２８又は２９の方法。
【請求項３４】
疾患が前立腺癌であり、投与段階の前に、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＩＧＦ−１濃度の測定、哺乳動物由来ボディサンプルにおけるインスリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）濃度の測定、哺乳動物由来のボディサンプルにおける前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）濃度の測定、及びＩＧＦＢＰ−３濃度とＰＳＡ濃度に対するＩＧＦ−１濃度の多変量調整処理による調整ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ／ＰＳＡ値の提供を含み、調整ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ／ＰＳＡの基準範囲を超える調整ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ／ＰＳＡ値が、重度の前立腺癌の増大した危険を示す、請求項２８又は２９の方法。
【請求項３５】
糖尿病合併症が、糖尿病性網膜症又は糖尿病性腎症である、請求項２８の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明はインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、特に（ＩＧＦ−１）に拮抗するペプチドに関する。これらのペプチドはＩＧＦによって引き起こされる又は媒介される疾患、例えば癌の治療に有効である。
【０００２】
（関連した開示内容の説明）
ＩＧＦ（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びＩＧＦ変異体）の作用及び活性に関して数多くの文献が存在する。ヒトＩＧＦ-１は、成長ホルモン（ＧＨ）の作用を調節するインスリン様及び細胞分裂促進的生物活性を有するソマトメジンのファミリーに属し、８．４のｐＩを有する（Rinderknecht及びHumbel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73：2365(1976)；Rinderknecht及びHumbel,  J. Biol. Chem., 253：2769(1978)）７６４９ダルトンのポリペプチドである（Van Wykら, Recent Prog. Horm. Res., 30：259(1974)；Binoux, Ann. Endocrinol., 41：157(1980)；Clemmons及びVan Wyk, Handbook Exp. Pharmacol., 57：161(1981)；Baxter, Adv. Clin. Chem., 25：49(1986)；米国特許第4,988,675号； WO91/03253; WO93/23071）。ＩＧＦｓはインスリンに構造的に類似しており、様々な細胞機能及び病気の進行に関与している。従って、ＩＧＦは様々な病気及び疾病における治療手段として示唆されてきた（総説として、Lowe, Scientific American (March/April 1996), p. 62を参照のこと）。
また、ＩＧＦ系は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及びインスリンに対する膜結合レセプターからも構成されている。タイプ１のＩＧＦレセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）は構造上インスリンレセプターと極めて関連があり、そのシグナル経路のいくつかを共有する(Jones 及びClemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995))。ＩＧＦ−２レセプターは、細胞内シグナルを伝達しないと思われるクリアランスレセプターである(Jones及びClemmons, 上掲)。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２は、インスリンレセプターに対してよりもＩＧＦ−１Ｒに対してさらに高い親和性で結合するため、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の多くの効果は、おそらくＩＧＦ−１Ｒにより仲介されているらしい(Humbel, Eur. J Biochem. 190: 445-462 (1990); Ballard等, "Does IGF-I ever act through the insulin receptor?", in Baxter等 (編), The Insulin-Like Growth Factors and Their Regulatory Proteins, (Amsterdam: Elsevier, 1994), pp. 131-138)。ＩＧＦ−１Ｒの初めの３つのドメインの結晶構造は決定されている(Garrett等, Nature, 394, 395-399 (1998))。
【０００３】
ＩＧＦ−１Ｒは正常な細胞増殖と発育における重要な因子である(Daughaday及びRotwein, Endocrine Rev., 10: 68-91 (1989))。しかしながら、増えてきた証拠により、ＩＧＦ−１Ｒシグナルは腫瘍細胞の成長、細胞のトランスフォーメーション、及び腫瘍形成においても重要な役割果たしていることが示唆される(Baserga, Cancer Res., 55:249-252 (1995); 総説としてKhandwala等, Endocr. Rev., 21: 215-244 (2000)参照)。重要な例には、ＩＧＦ−１Ｒに対するアンチセンスＲＮＡ処理によるマウス悪性腫瘍細胞の転移性表現系の消失(Long等, Cancer Res., 55:1006-1009 (1995))、及びＩＧＦ−１Ｒ抗体の添加によるヒトメラノーマ細胞運動 (Stracke等, J Biol. Chem., 264:21554-21559 (1989))及びヒト乳癌細胞成長(Rohlik等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 149:276-281 (1987))のインビトロにおける阻害が含まれる。
ＩＧＦ−１がインビトロにおける乳癌細胞増殖を促進するとの観察に基づき、ＩＧＦｓは強い乳癌細胞分裂促進因子である(Cullen等, Cancer Res., 50:48-53 (1990))。乳癌はＩＧＦ−２及びＩＧＦ−１Ｒを発現し、自己分泌ループに基づく増殖パラダイムに対する全ての必要なエフェクターを提供する(Quinn等, J Biol. Chem., 271: 11477-11483 (1996); Steller等, Cancer Res., 56: 1761-1765 (1996))。乳癌は８人に１人の女性を冒している一般的な悪性腫瘍で、北米の女性において癌による死因の第一位となっており(LeRoith等, Ann. Int. Med., 122: 54-59 (1995))、介入の新規な合理的治療法が必要となっている。ＩＧＦ−１はアポトーシスを抑制することができるため、ＩＧＦ−１Ｒｓを欠損する又は妥協したＩＧＦ−１Ｒシグナル経路を持つ細胞は、アポトーシスを介して選択的に死滅する腫瘍細胞を生み出すことができるかもしれない(Long等, Cancer Res., 55: 1006-1009 (1995))。さらに、糖尿病などの他の疾病状態との関連で、ＩＧＦシグナルの変動は、腎症(Horney等, Am. J Physiol. 274: F1045-F1053 (1998))及び網膜症(Smith等, Science, 276: 1706-1709 (1997))の合併症を悪化させる原因となり得ることが最近明らかになっている。
ＩＧＦ−１結合タンパク質（ＩＧＦＢＰｓ）は、少なくとも６つの血清タンパク質のファミリーであり(Jones及びClemmons, 上掲 ; Bach及びRechler, Diabetes Reviews, 3: 38-61 (1995))、ＩＧＦｓのＩＧＦ−１Ｒへのアクセスを調節する。また、それらは、循環血中及び組織ＩＧＦ−１ＲレベルでのＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の濃度も調節する(Clemmons等, Anal. NY Acad. Sci. USA, 692: 10-21 (1993))。ＩＧＦＢＰｓは様々な親和性及び特異性でＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２と結合する(Jones及びClemmons, 上掲 ; Bach及びRechler, 上掲)。例えば、ＩＧＦＢＰ−３はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２と似たような親和性で結合する一方、ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−６は、それらがＩＧＦ−１と結合するよりもさらに高い親和性でＩＧＦ−２と結合する(Bach及びRechler, 上掲 ; Oh等, Endocrinology, 132,1337-1344 (1993))。
【０００４】
多くの場合、外来性のＩＧＦＢＰの添加はＩＧＦ−１の効果を鈍くする。例えば、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞に対するエストラジオールの成長刺激効果はＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡの減少及びタンパク質の蓄積に関与する一方、抗エストロゲンであるＩＣＩ １８２７８０は成長阻害とＩＧＦＢＰ−３ｍＲＮＡとタンパク質レベルの増大を引き起こす(Huynh等, J Biol. Chem., 271 : 1016-1021 (1996); Oh等, Prog. Growth Factor Res., 6: 503-512 (1995))。レチノイン酸によるインビトロでの乳癌細胞の増殖阻害は腫瘍細胞による変更されたＩＧＦＢＰ分泌又は減少したインビボの循環ＩＧＦ−１レベルに関与することも報告されている(LeRoith等, Ann. Int. Med., 122: 54-59 (1995); Oh等, (1995), 上掲)。この発見とは逆に、抗エストロゲンであるタモキシフェンによるＭＣＦ−７細胞の処理は、減少したＩＧＦＢＰ産生とは無関係の様式でＩＧＦ−１Ｒシグナルを減少させる(Lee等, J Endocrinol., 152 : 39 (1997))。ＩＧＦＢＰｓの一般的な抗増殖効果に対する更なる裏づけとして、ＩＧＦＢＰ−３が腫瘍抑制因子であるｐ５３の標的遺伝子であるとの特筆すべき発見がある(Buckbinder等, Nature, 377: 646-649 (1995))。このことは、ｐ５３のサプレッサー活性が、一部、ＩＧＦＢＰ−３産生及びその結果生じるＩＧＦ作用の阻害によって媒介されていることを示唆する（Buckbinder等, 上掲）。これらの結果は、ＩＧＦＢＰｓが、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２によって制御される傍分泌／自己分泌過程を調節することによって細胞増殖をブロックし得ることを示す。これらの観察に対する必然的な結果は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）がＩＧＦＢＰ−３プロテアーゼであり、活性化するとＩＧＦＢＰ−３のタンパク質分解的不活性化によりＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２作用に対する腫瘍細胞の感受性を増大させるとの知見をもたらす(Cohen等, J. Endocr., 142: 407-415 (1994))。ＩＧＦＢＰｓはＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２と複合体を形成し、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２のＩＧＦ−１Ｒへのアクセスを妨げる(Clemmons等, Anal. NY Acad. Sci. USA, 692: 10-21 (1993))。ＩＧＦＢＰ−１，−２及び−３はインビトロで細胞に添加すると細胞の成長を阻害する (Lee等, J Endocrinol., 152: 39 (1997); Feyen等, J Biol. Chem., 266: 19469-19474 (1991))。さらに、ＩＧＦＢＰ−１(McGuire等, J Natl. Cancer Inst., 84: 1335-1341 (1992); Figueroa等, J Cell Physiol., 157: 229-236 (1993))、ＩＧＦＢＰ−３(Oh等, (1995), 上掲 ; Pratt及びPollak, Biophys. Res. Commun., 198 : 292-297 (1994))及びＩＧＦＢＰ−２は全てＩＧＦ−１又はエストロゲンで誘導される乳癌細胞の増殖をナノモル濃度で阻害することが示されている。これらの知見は、ＩＧＦＢＰｓがＩＧＦ作用の強力なアンタゴニストであるとの見解を支持する。また、ＩＧＦとの相互作用とは無関係に、ＩＧＦＢＰ−３の自らの細胞表面レセプターを介した細胞への直接的な効果に関する証拠も存在する(Oh等, J Biol. Chem., 268: 14964- 14971 (1993); Valentinis等, Mol. Endocrinol., 9: 361-367 (1995))。総合すると、これらの知見はＩＧＦ及びＩＧＦ−１Ｒの治療的用途に対する標的としての重要性を明らかにするものである。
【０００５】
大抵の他の成長因子とは異なり、ＩＧＦｓは、循環中、高濃度で存在しているが、ほんの僅かな割合ＩＧＦｓのみがタンパク質に結合していない。例えば、ヒト又はげっ歯類において、血液中のＩＧＦｓのうち１％未満が「遊離」又は非結合形態であることが一般に知られている(Juul等, Clin. Endocrinol., 44: 515-523 (1996); Hizuka等, Growth Regulation, 1: 51-55 (1991); Hasegawa等, J. Clin. Endocrinol. Metab., 80: 3284-3286 (1995))。血中のＩＧＦｓの圧倒的に多くは、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２、ＩＧＦＢＰ−３と、酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）と呼ばれる大きなタンパク質から構成されている非共有結合的に結合した３量体複合体の一部分として循環している。ＩＧＦ，ＩＧＦＢＰ−３及びＡＬＳの３量体複合体は、およそ１５０，０００ダルトンの分子量を有しており、この複合体の循環中における機能は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２に対する蓄積及びバッファーとして役立つためであり、遊離ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２の急速な変化を防いでいることが示唆されている。
ＩＧＦ−１が関連する経路の下方制御及び上方制御は両方とも、幾つかのヒトの疾患に関連しているので、ＩＧＦ−１シグナル伝達の正常なレベルの維持は適切な細胞機能に重要である。細胞増殖率は、ある種の上皮細胞型の形質転換の危険と正に相関する(Cohen及びEllwein, Science, 249: 1007 (1990); Cohen及びEllwein, Cancer Research, 51:6493 (1991))。相対的に高い血漿ＩＧＦ−１及び低い血漿ＩＧＦ結合タンパク質−３は、閉経前の女性の乳癌、男性の前立腺癌、男性及び女性の結腸直腸癌、並びに男性及び女性の肺癌の危険性と大きく関わり；ＩＧＦと癌の間の関連を示す更なるインビトロ及びインビボ研究が「Insulin-Like Growth Factors and Cancer」Cytokine Bulletin, R&D Systems (Fall 2000版), 2-3頁に見られる。ＩＧＦｓは正常又はトランスフォームした前立腺上皮細胞に対する分裂促進的及び抗アポトーシス的な影響を持つ(Hsing等, Cancer Research, 56: 5146 (1996); Culig等, Cancer Research, 54: 5474 (1994); Cohen等, Hormone and Metabolic Research, 26: 81 (1994); Iwamura等, Prostate, 22: 243 (1993); Cohen等, J. Clin. Endocrin. & Metabol., 73: 401 (1991); Rajah等, J. Biol. Chem., 272: 12181 (1997))。循環するＩＧＦ−１の多くは肝臓由来であるが、組織中でのＩＧＦの生物活性は循環するＩＧＦｓ及びＩＧＦＢＰｓのレベルのみならず、ＩＧＦｓ、ＩＧＦＢＰｓ、及びＩＧＦＢＰプロテアーゼの局所的生産にも関与する(Jones及びClemmons, Endocrine Reviews, 16: 3 (1995))。循環ＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰ−３（主要な循環ＩＧＦＢＰ(Jones及びClemmons, 上掲)）のレベルにおいて人による可変性が考慮され(Juul等, J. Clin. Endocrinol. & Metabol., 78: 744 (1994); Juul等, J. Clin. Endocrinol. & Metabol., 80: 2534 (1995))、血清ＩＧＦ−１レベルにおける不均一性は組織中のＩＧＦ生物活性の不均一性を反映しているようである。ＩＧＦを軸とする構成要素と関連するマーカーは、ＰＳＡが同じように使用されているため、前立腺癌に対する危険マーカーとして使用し得る(WO 99/38011)。さらに、ＩＧＦ−１血清濃度の減少が、末端肥大症の患者における臨床スコアの増大と関連することが分かっている（Triainer 等, New England J. Med., 342: 1171-1177 (2000)）。
【０００６】
ＩＧＦＢＰｓに結合するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２上の領域を同定する多くの研究が行われている(Bayne等, J. Biol. Chem., 265: 15648-15652 (1990); Dubaquie及びLowman, Biochemistry, 38: 6386-6396 (1999);及び米国特許第5,077,276; 5,164,370;及び 5,470,828号)。例えば、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２のＮ末端領域がＩＧＦＢＰｓとの結合に重要であることが明らかとなっている(米国特許第5,077,276; 5,164,370;及び5,470,828号)。従って、ｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−１と命名された天然のＩＧＦ−１変異体はＩＧＦＢＰと不十分にしか結合しない。
同様な研究量がＩＧＦ−１Ｒと結合するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２上の領域を同定することに傾けられてきた(Bayne等, 上掲; Oh等, Endocrinology (1993), 上掲)。ＩＧＦ−１中の位置２４，３１及び６０におけるチロシン残基はＩＧＦ−１のＩＧＦ−１Ｒとの結合に重要であることが見出された(Bayne等, 上掲)。一又は複数のこれらチロシン残基が置換されている変異体ＩＧＦ−１分子は、漸次、低減されたＩＧＦ−１Ｒとの結合性を示した。上掲のBayne等においても、このようなＩＧＦ−１の変異体がＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦＢＰｓと結合できるかどうか調べられた。彼らは、ＩＧＦ−１Ｒと結合するために使用されるものとは全く異なるＩＧＦ−１とＩＧＦ−２上の残基がＩＧＦＢＰｓとの結合に用いられることを見出した。従って、ＩＧＦＢＰｓに対する低減した結合性を示すＩＧＦ変異体を産生することは可能であるが、それらはＩＧＦ−１Ｒと十分に結合するので、インビトロにおける活性アッセイでは維持された活性を示す。
また、ＩＧＦＢＰｓには結合するがＩＧＦレセプターには結合せず、その結果インビトロにおける活性アッセイでは低減した活性を示すＩＧＦ変異体も報告された (Bar等, Endocrinology, 127: 3243-3245 (1990))。(1-27, gly4, 38-70)-hIGF-1と命名されたこの変異体において、 ヒトＩＧＦ−１のＣ領域の残基２８−３７が４つの残基のグリシンブリッジによって置換されている。
【０００７】
他の切断されたＩＧＦ−１変異体が開示されている。例えば、特許文献において、WO96/33216は、真正のＩＧＦ−１の残基１−６９を有する切断された変異体について記述する。EP742,228は、２本鎖ＩＧＦ−１スーパーアゴニストについて開示するが、これらは、短縮されたＣ領域を持つ天然に生じる一本鎖ＩＧＦ−１の誘導体である。ＩＧＦ−１類似体は化学式：ＢＣｎ，Ａを持ち、ここでＢはＩＧＦ−１又はその機能的類似体のＢ領域であり、ＣはＩＧＦ−１又はその機能的類似体のＣ領域であり、ｎはＣ領域のアミノ酸の数で約６から約１２であり、ＡはＩＧＦ−１又はその機能的類似体のＡ領域である。
さらに、Cascieri等, Biochemistry, 27: 3229-3233(1988)は、３種がＩＧＦ−１Ｒへの親和性が低下していた、ＩＧＦ−１の４種の変異体について開示している。これらの変異体は：（Ｐｈｅ２３、Ｐｈｅ２４、Ｔｙｒ２５）ＩＧＦ−I（タイプ１及び２のＩＧＦ及びインスリンレセプターへの親和性がヒトＩＧＦ−１と同等）、（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−１及び（Ｓｅｒ２４）ＩＧＦ−１（ヒト胎盤ＩＧＦ−１Ｒ、胎盤インスリンレセプター、及びラット及びマウス細胞のＩＧＦ−１Ｒへの親和性がＩＧＦ−１よりも低い）、そしてdesoctapeptide（Ｌｅｕ２４）ＩＧＦ−１（位置２４の芳香族性の消失がｈＩＧＦ−１のカルボキシル末端のＤ領域の欠損と連結している）である。これら４種の変異体は、ヒト血清結合タンパク質へ標準的な親和性を有している。
Bayne等, J. Biol. Chem., 263:6233-6239(1988)は、ヒトＩＧＦ−１の４種の構造アナログを開示している：ＩＧＦ−１の最初の１６アミノ酸がインスリンのＢ鎖の最初の１７アミノ酸で置換されたＢ鎖変異体、（Ｇｌｎ３，Ａｌａ４）ＩＧＦ−１，（Ｔｙｒ１５，Ｌｅｕ１６）ＩＧＦ−１，及び（Ｇｌｎ３，Ａｌａ４，Ｔｙｒ１５，Ｌｅｕ１６）ＩＧＦ−１。これらの研究により、血清結合タンパク質及びタイプ２ＩＧＦレセプターと高親和性の結合性を維持する原因となるＩＧＦ−１の幾つかの領域が同定される。
【０００８】
他の研究において、Bayne 等, J.Biol.Chem., 264: 11004-11008(1988)は、ＩＧＦ−１の３種の構造アナログを開示している：（１−６２）ＩＧＦ−１で、ＩＧＦ−１のＣ−末端のＤ領域の８個のアミノ酸を欠くもの、ＩＧＦ−１のＣ領域の残基２８−３７が４残基グリシンブリッジによって置換されている（１−２７，Ｇｌｙ４，３８−７０）ＩＧＦ−１；及び（１−２７，Ｇｌｙ４，３８−６２）ＩＧＦ−１で、Ｃ領域のグリシン置換とＤ領域欠失を伴うものである。Peterkofsky等, Endocrinology, 128: 1769-1779(1991)は、Bayne等, 上掲（vol.264）のＧｌｙ４変異体を使用したデーターを開示する。
Cascieri 等, J.Biol.Chem. 264: 2199-2202(1989)は、ＩＧＦ−１のＡ領域の特定の残基が、インスリンＡ鎖上のこれらに相当する残基と置換されている３種のＩＧＦ−１アナログを開示している。これらアナログは：（Ｉｌｅ４１、Ｇｌｕ４５、Ｇｌｎ４６、Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１、Ｓｅｒ５３、Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−１で、その残基４１がスレオニンからイソロイシンへ置換され、Ａ領域の残基４２−５６が置換されているＡ鎖変異体；（Ｔｈｒ４９、Ｓｅｒ５０、Ｉｌｅ５１）ＩＧＦ−１；及び（Ｔｙｒ５５、Ｇｌｎ５６）ＩＧＦ−１である。
Clemmons等, J. Biol. Chem., 265:12210-12216 (1990)は、ＩＧＦＢＰ−１のリガンド特異性及びＩＧＦ−１の生物活性の調節におけるＩＧＦＢＰ−１の役割を研究するために、ＩＧＦ−１Ｒ又は結合タンパク質のいずれかに対する結合親和性を減少させたＩＧＦ−１アナログの使用について開示している。
【０００９】
WO94/04569は、ＩＧＦ−１と結合することができ、ＩＧＦ−１の生物学的活性を促進することができる天然のＩＧＦＢＰ以外の特異的結合分子を開示する。
ＩＧＦ変異体研究の動向は主に、ＩＧＦＢＰに結合しないがＩＧＦレセプターへの保持された結合を示すＩＧＦ変異体を作成することに向いている。このような分子研究の背景にある考えは、ＩＧＦＢＰの主要な活性がＩＧＦの活性阻害であることを提唱するものである。これらの変異体のうち最も重要なものは、幾つかのＩＧＦ結合タンパク質に対しては選択的に減少するが、ＩＧＦレセプターに対しては維持される親和性を示す天然分子のｄｅｓ（１−３）ＩＧＦ−１である(米国特許番号5,077,276; 5,164,370; 5,470,828)。
ＩＧＦＢＰ−１と結合し、ＩＧＦ−１がこの結合タンパク質に結合するのを阻止し、よってＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ−１の混合物に由来する「遊離ＩＧＦ」活性を解き放すペプチドについて、最近記述されている(Lowman 等, Biochemistry, 37: 8870-8878 (1998); 1998年10月15日に公開されたWO98/45427; Lowman 等, International Pediatric Nephrology Association, Fifth Symposium on Growth and Development in Children with Chronic Renal Failure (New York, March 13,1999))。
しかしながら、特異的なアンタゴニストがないため、スクリーニング、病気の予防又は治療におけるＩＧＦとＩＧＦＢＰ間の相互作用の利用には限界があった。これまでに、癌の治療における潜在的な治療上の添加剤としてのＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２アンタゴニストの適用について記述する刊行物は１件のみ存在することが知られている(Pietrzkowski等, Cancer Res., 52: 6447-6451 (1992))。この報告において、ＩＧＦ−ＩのＤ領域に対応するペプチドはＩＧＦ−１／２アンタゴニストとしての使用のために合成されている。このペプチドは、ＩＧＦ−１に対して不確かな阻害活性を示した。Ｄ領域はＩＧＦ−１Ｒとの結合においては重要な役割を演じておらず、むしろインスリンレセプターとのＩＧＦ−１の結合において重要であるため、観察された阻害の根拠は不明である(Cooke等, Biochem., 30: 5484-5491 (1991); Bayne等, J. Biol.Chem., 264: 11004-11008 (1998); Yee 等, Cell Growth and Different., 5: 73-77 (1994))。また、活性のメカニズムがＩＧＥ−１Ｒ接点における相互作用の遮断によるものである、ＩＧＦアンタゴニストは、このようなアンタゴニストの不利な点であるインスリンレセプターでのインスリン活性を有意に改変させることができる。
【００１０】
現在、ある種のＩＧＦ−１アンタゴニストがWO00/23469に記載されており、ここには、ＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ結合の原因となるＩＧＦＢＰ及びＩＧＦペプチドの一部、即ち、少なくとも全長ＩＧＦＢＰと同等な結合親和性でＩＧＦと結合するＩＧＦＢＰ又はその修飾体の単離されたＩＧＦ結合ドメインを開示する。また、その特許文献は、ＩＧＦのＩＧＦレセプターに対する結合を減少させ、及び／又はＩＧＦＢＰの結合ドメインと結合するＩＧＦアンタゴニストについても開示する。このようなアンタゴニスト及び断片の開示されている使用は、癌を有する対象の治療及び対象の癌予防、ＩＧＦにより悪化した糖尿病合併症の治療及びＩＧＦにより悪化する糖尿病合併症の予防、あるいは虚血性障害を有する対象の治療又は対象の虚血性障害予防におけるものである。
さらに、EP639981は、ＩＧＦ−１レセプターのアンタゴニストとして機能する短いペプチドを含む医薬組成物を開示する。医薬組成物中で使用されるペプチドは、２５アミノ酸未満で構成され、ＩＧＦ−１由来のＣ又はＤ領域の少なくとも一部を含み、ＩＧＦ−１によって誘導されるＩＧＦ−１レセプターの自己リン酸化を阻害する。細胞増殖の阻害方法及び癌、再狭窄及び喘息などの望ましくない細胞増殖に関連する疾患に罹りやすい又は罹ったと疑われる個体の治療方法が開示される。
【００１１】
特異的ＩＧＦ−１アンタゴニストの生成は、少なくとも一部にはＩＧＦ及びＩＧＦＢＰの構造研究における困難性のため、制限されてきた。回折研究に適するＩＧＦ−１の結晶を得ることができないために、例えば、ブタインスリンの結晶構造に基づいてＩＧＦ−１の構造を推定することが、ＩＧＦ−１に関し利用可能な最も重要な構造ロードマップであった(Blundell等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 180-184 (1978))。また、ＩＧＦｓの三次構造、レセプター結合、及び抗原性について開示するBlundell等, Fed. Proc., 42: 2592 (1983)も参照のこと。化学的に修飾され、変異導入されたＩＧＦ−１の研究に基づいて、ＩＧＦ−Ｉとインスリン間の多くの共通の残基、特に位置２３−２５の芳香族残基がＩＧＦ−１Ｒインスリンレセプター接触部位の一部として同定されている。ＮＭＲ及び制限付き分子動力学計算を用いて、ＩＧＦ−１の構造決定が最近報告された(Cooke等, 上掲)。その結果得られた最小化された構造は、修飾されたＩＧＦ−１に対する実験的知見、並びにインスリンの構造活性研究による推定によく適合することが示された。さらに、De Wolf等, Protein Sci., 5: 2193 (1996)は、ミニＩＧＦ−１の溶液構造を開示する。Sato等, Int. J. Pept., 41: 433 (1993)は、１Ｈ−ＮＭＲ及びディスタンスジオメトリー法によって決定されたＩＧＦ−１の３次元構造を開示する。Torres等, J Mol Biol., 248: 385 (1995)は、ヒトＩＧＦ−２の溶液構造及びそのレセプターと結合タンパク質相互作用との関係を開示する。Laajoki 等, J. Biol. Chem., 275: 10009 (2000)は、ｌｏｎｇ−［Ａｒｇ（３）］ＩＧＦ−１の決定構造及びバックボーン動力学を開示する。
様々なペプチドライブラリーから同定されたアゴニスト又はアンタゴニスト活性のどちらかを有するインスリン様成長因子レセプター及び／又はインスリンに結合可能なペプチド配列が、2001年10月4日公開のWO01/72771に記載されている。
治療又は診断の目的のために、ＩＧＦアンタゴニストとして作用して循環ＩＧＦのレベル並びにレセプター反応を制御する分子に対する要求が、当分野において引き続きある。
【００１２】
（発明の概要）
従って、本発明は請求の範囲に記載した通りである。一実施態様では、本発明は、次の配列を有するファミリー１のペプチドを提供する：(Xaa)1(Xaa)2Cys(Xaa)3(Xaa)4SerVal(Xaa)5AlaLeu(Xaa)6(Xaa)7CysMet(Xaa)8（配列番号：１）、ここで(Xaa)1(Xaa)2及び(Xaa)7は任意のアミノ酸であり、(Xaa)3はPhe、Leu又はTyrであり、(Xaa)4はGlu、Asp、Ala、Gly、Thr又はSerであり、(Xaa)5はGlu、Asp、Ala又はGlyであり、(Xaa)6はArg又はLysであり、(Xaa)8はTyr又はArgである。(Xaa)4はGlu 、Ala、Gly、Thr又はSerであり、(Xaa)5はGlu、Ala又はGlyであり、(Xaa)8はTyrである。上記配列の好ましいペプチドは、(Xaa)4がGlu、Ala又はThrであり、(Xaa)5がAla又はGlyであり、(Xaa)8がTyrであるもの等である。より好ましいものは、(Xaa)4がGlu又はAla、(Xaa)5がAla又はGly、(Xaa)8がTyrのペプチドである。さらにより好ましいものは、配列RNCFESVAALRRCMYG（配列番号：２）、MDCLASVEALKWCMYG（配列番号：３）、又はFECLTSVEALRGCMYG（配列番号：４）を含むペプチドである。最も好ましいものは、配列番号２又は３を含むペプチドである。
他の態様では、本発明は次の配列を有するファミリー２のペプチドを提供する：(Xaa)1(Xaa)2Cys(Xaa)3(Xaa)4Asp(Xaa)5(Xaa)6Gly(Xaa)7(Xaa)8TyrCysTrp(Xaa)9（配列番号：５）、ここで(Xaa)1、(Xaa)4及び(Xaa)8は任意のアミノ酸であり、(Xaa)2はArg、Lys、Gly、Ser又はThrであり、(Xaa)3はAla又はValであり、(Xaa)5はAla又はLeuであり、(Xaa)6はAla、Gly又はLeuであり、(Xaa)7はPhe、Tyr、Trp又はGlyであり、(Xaa)9はGlu、Asp、Ala又はGlyである。ここでの好ましいペプチドは、(Xaa)2がGly、Ser、Arg又はThrであり、(Xaa)9がGlu、Ala又はAspであるもの等である。より好ましいものは、(Xaa)2がGlu又はArg、(Xaa)5がLeu、(Xaa)6がAla又はGly、(Xaa)7がPhe、(Xaa)9がAlaのペプチドである。このファミリーの最も好ましいペプチドは、配列LGCASDLAGFWYCWAG（配列番号：６）又はWRCVDDLGGFQYCWAG（配列番号：７）を含むものである。
好ましくは、これら２つのファミリーのペプチドの全てのアミノ酸がＬ-アミノ酸である。また、これらのファミリーのペプチドが、上記のファミリー１では(Xaa)8の後に、上記のファミリー２では(Xaa)9の後に、グリシン残基を有することが好ましい。
【００１３】
本発明はまた、細胞障害剤又はポリエチレングリコールと結合したペプチドを含む複合体を提供する。ここでの細胞障害剤は、一度内部移行した殺細胞での作用によるものでありうる。
これらのペプチドの使用は、少なくとも、外因性又は内因性ＩＧＦの生物学的活性をアンタゴナイズする使用の全てを包含する。それは、以下に説明されるように、ＩＧＦアンタゴニスト、例えばＩＧＦＢＰ−３又はＩＧＦ−１に対する抗体が有用である症状の治療、診断、又は予防に使用される。
本発明はまた、担体中に上記ペプチドの一つを含む組成物を提供する。好ましくはこの組成物は無菌であり、担体は製薬的に許容される担体である。また、組成物は、血管形成剤又は化学療法剤をさらに含み、また注射又は吸入に適していることが好ましい。また、組成物を含む容器、及び組成物の利用のための、使用者に対する説明書を有するキットが提供される。
他の態様では、本発明は、ＩＧＦ−１媒介性の現象に関係する疾患を持つ哺乳動物を治療するための方法であって、上記のペプチド又は組成物の任意のものを有効量、哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。より具体的には、本発明は、ＩＧＦ−１媒介性の現象に関係する疾患又は疾病に罹っている、あるいは罹りやすい哺乳動物を治療する方法であって、ここに記載されているようなペプチドの治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、この方法は、前記疾患を治療する有効量の他の薬剤を哺乳動物に投与することを更に含む。この薬剤は、成長阻害剤、血管形成阻害剤、又は細胞障害剤、又は化学療法剤、又は抗体でありうる。他の好ましい態様では、哺乳動物はヒトである。
【００１４】
さらに好ましい実施態様では、上記方法の投与段階の前に、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＩＧＦ−１の濃度を測定し、ＩＧＦ−１の基準範囲を超えて上昇したＩＧＦ−１濃度が、疾患の増大した危険を示す。ボディサンプルは、好ましくは腫瘍組織、血液、血漿、血清、乳、及び精液からなる群から選択される。他の好ましい実施態様では、ＩＧＦ−１は全ＩＧＦ−１、遊離ＩＧＦ−１又は複合ＩＧＦ−１であり、疾患は癌、ＩＧＦ−１により悪化する糖尿病合併症、好ましくは糖尿病性網膜症、又は糖尿病性腎症、末端肥大症、加齢性黄斑変性症、虚血性障害、又は外傷である。
疾患が癌である場合、それは、好ましくはインスリン様成長因子レセプターを発現する腫瘍を含む。さらに癌は、好ましくは乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、又は肺癌であり、より好ましくは乳癌又は前立腺癌である。疾患が前立腺癌である場合、該方法は、好ましくは投与段階の前に、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＰＳＡ濃度の測定を含み、ＰＳＡの基準範囲を超えて上昇したＰＳＡ濃度が、前立腺癌の増大した危険を示す。あるいは、疾患が前立腺癌である場合、該方法は、好ましくは投与段階の前に、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＩＧＦ−１濃度の測定、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＩＧＦＢＰ−３濃度の測定、及びＩＧＦＢＰ−３濃度に対するＩＧＦ−１濃度の多変量調整処理による調整ＩＧＦ−１レベルの提供を含み、調整ＩＧＦ−１の基準範囲を超える調整ＩＧＦ−１レベルが、前立腺癌の増大した危険を示す。あるいはまた、疾患が前立腺癌である場合、該方法は、好ましくは投与段階の前に、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＩＧＦ−１濃度の測定、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＩＧＦＢＰ−３濃度の測定、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＰＳＡ濃度の測定、及びＩＧＦＢＰ−３濃度とＰＳＡ濃度に対するＩＧＦ−１濃度の多変量調整処理による調整ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ／ＰＳＡ値の提供を含み、調整ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ／ＰＳＡの基準範囲を超える調整ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ／ＰＳＡ値が、重度の前立腺癌の増大した危険を示す。
【００１５】
本発明はさらに、本発明の任意のペプチドの様々な投与形態を提供し、限定するものではないが、ペプチドの非経口、経口、直腸及び肺投与に適したものを含む。ここでの好ましい態様では、吸入に適した治療的投与形態が提供され、本発明は、ＩＧＦ媒介性又はＩＧＦ関連のプロセス又は現象に関係する疾患又は疾病の、本発明のペプチドの肺投与による治療的処置を提供する。さらに詳細には、本発明は、ここでのペプチドの、吸入による肺投与に関する。従って、本発明は、ＩＧＦ媒介性又はＩＧＦ関連プロセス又は現象を阻害又は抑制するのに有効な量の、本発明のペプチドと、分散剤とを含むエアロゾル製剤を提供する。一実施態様では、液体エアロゾル製剤で、前記ペプチドの何れか１つを提供することができる。あるいは、ペプチドを乾燥粉末エアロゾル製剤としても提供できる。従って、本発明によれば、ここでのペプチドの他の非経口投与経路に代わる、効果的な非浸潤性のものを提供する製剤が、ＩＧＦ媒介性又はＩＧＦ関連の現象の処置のために提供される。
また、上記ペプチドの１つをコード化する単離された核酸も提供され、インビボ又はエキソビボ遺伝子治療に使用することができる。
【００１６】
（好ましい実施態様の説明）
Ａ．定義
ここで使用される「哺乳動物」は哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む。好ましくは、ここでの哺乳動物はヒトである。用語「非成熟」は、周産期年齢（出生時低体重乳児など）から思春期までの哺乳動物を意味し、後者は、全成長潜在能力に達していないものである。
ここで使用される「ＩＧＦ」は、天然インスリン様成長因子−１及び天然インスリン様成長因子−２、並びにその天然の変異体、例えば脳ＩＧＦ、他にdes(1-3)ＩＧＦ−１として知られるものを意図する。
ここで使用される「ＩＧＦ−１」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヒトを含むあらゆる種、好ましくはヒト由来のインスリン様成長因子−１を意図し、外因性投与に言及される場合は、天然、合成、又は組換えの任意の供給源からである。ヒト天然配列、成熟ＩＧＦ-１、より好ましくはＮ末端メチオニンを有さないものは、例えば、1987年8月5日公開のEP 230,869; 1984年12月19日公開のEP 128,733; 又は1988年10月26日公開のEP 288, 451に記載された方法によって調製される。より好ましくは、この天然配列ＩＧＦ-１は、組換え生産され、ジェネンテック社，サウス  サンフランシスコ，カリフォルニアから臨床実験用に入手可能である。
ここで使用される「ＩＧＦ−２」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヒトを含むあらゆる種、好ましくはヒトからのインスリン様成長因子-２を指し、外因性投与に言及する場合は、天然、合成、又は組換えの任意の供給源からである。これは、例えば上掲のEP 128,733に記載された方法によって調製できる。
【００１７】
「ＩＧＦＢＰ」又は「ＩＧＦ結合性タンパク質」は、循環性であるか否かによらず（即ち、血清又は組織中）、ＩＧＦ-１又はＩＧＦ−２に通常は付随又は結合又は複合体形成するタンパク質又はポリペプチドを指す。このような結合タンパク質は、レセプターを含まない。この定義は、ＩＧＦＢＰ-１、ＩＧＦＢＰ-２、ＩＧＦＢＰ-３、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＧＦＢＰ-５、ＩＧＦＢＰ-６、Ｍａｃ２５（ＩＧＦＢＰ-７）、及びプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）又は内皮細胞特異的分子（ＥＳＭ-１）、並びにＩＧＦＢＰに高い相同性を持つ他のタンパク質を包含する。Ｍａｃ２５は、例えば、Swisshelm等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472-4476 (1995)及びOh等, J. Biol. Chem., 271: 30322-30325 (1996)に記載されている。ＰＳＦはYamauchi等, Biochemical Journal, 303:591-598 (1994)中に記載されている。ＥＳＭ-１は、Lassalle等, J. Biol. Chem., 271: 20458-20464 (1996)に記載されている。他の同定されたＩＧＦＢＰについては、例えば、1990年6月27日公開のEP 375,438; 1990年5月23日公開のEP 369,943; 1989年10月5日公開のWO 89/09268; Wood等, Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988); Brinkman等, The EMBO J., 7: 2417-2423 (1988); Lee等, Mol. Endocrinol., 2: 404-411 (1988); Brewer等, BBRC, 152: 1289-1297 (1988); 1988年12月7日公開のEP 294,021; Baxter等, BBRC, 147: 408-415 (1987); Leung等, Nature, 330: 537-543 (1987); Martin等, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986); Baxter等, Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229-235 (1988); 1989年9月21日公開のWO 89/08667; 1989年10月19日公開のWO 89/09792; Binkert等, EMBO J., 8: 2497-2502 (1989)を参照のこと。
【００１８】
用語「ボディサンプル」は、哺乳動物、好ましくはヒトからの生物学的試料を意味し、組織、細胞、及び体液を含む。例えば、腫瘍組織、腫瘍細胞、血清、血漿、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳汁、乳、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、組織培養培地、組織抽出液、及び細胞抽出液を含む。好ましくは、ボディサンプルは腫瘍組織、血液、血漿、血清、乳、又は精液である。
ここで使用される「ヒトＩＧＦレセプター」は、ヒトに見られるＩＧＦに対する任意のレセプターであり、ヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方が結合するヒトの１型及び２型ＩＧＦレセプター、例えば胎盤ＩＧＦ−１Ｒなどを含む。
本発明の範囲内で用語「アミノ酸」とはその最も広い意味で使用され、天然発生Ｌ−α−アミノ酸または残基を意味する。天然発生アミノ酸について一般的に使用されている１文字及び３文字略号がここでも使用される(Lehninger, Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92(Worth Publishers, New York 1975）。この用語はＤ-アミノ酸並びにアミノ酸類似物などの化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなどの通常はタンパク質に組み込まれない天然発生アミノ酸、及びこの分野でアミノ酸の特徴であると知られた特性を持つ化学合成された化合物を含む。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同様のペプチド化合物のコンホメーション的制限を可能にするフェニルアラニン又はプロリンの類似物又は模倣物は、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物は、ここで、アミノ酸の「機能的等価物」と呼ばれる。アミノ酸の他の例は、Roberts及びVellaccio, The Peotides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5 p341 (Academic Press, Inc, N.Y. 1983)に列挙される。
【００１９】
ここで使用される「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸変化は、結果的なペプチドのアミノ酸配列に変化を生じない。例えば、類似の極性の一又は複数のアミノ酸は等価に作用し、ペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない。保存的アミノ酸置換の最大の組は以下の通りである：
（１）疎水性：His, Trp, Tyr, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala;
（２）中性の親水性：Cys, Ser, Thr;
（３）極性：Ser, Thr, Asn, Gln;
（４）酸性／負に荷電：Asp, Glu;
（５）荷電：Asp, Glu, Arg, Lys, His;
（６）塩基性／正に荷電：Arg, Lys, His;
（７）塩基性：Asn, Gln His, Lys, Arg;
（８）鎖配向に影響する残基：Gly, Pro; 及び
（９）芳香族：Trp, Tyr, Phe, His。
【００２０】
さらに、「構造的に類似した」アミノ酸は、特定のアミノ酸の幾つかと保存的に置換できる。構造的に類似するアミノ酸のグループは：（Ile, Leu, 及びVal）；（Phe及びTyr）；（Lys及びArg）；（Gln及びAsn）；（Asp及びGlu）；及び（Gly及びAla）を含む。この点において、アミノ酸は、側鎖の嵩、電荷及び／又は疎水性に基づいて置換されると理解される。アミノ酸残基は主に４つのグループに分類される：
酸性：残基は生理学的ｐＨにおけるＨイオンの喪失によって負の電荷を帯びており、この残基は水溶液によって、ペプチドが水溶液中にある際に含まれているペプチドの立体配置における表面位置を求めるように誘引される。
塩基性：残基は生理学的ｐＨにおけるＨイオンとの結合により正の電荷を帯びており、この残基は水溶液によって、ペプチドが生理学的ｐＨの水性媒体中にある際に含まれているペプチドの立体配置における表面位置を求めるように誘引される。
中性／非極性：残基は生理学的ｐＨで荷電せず、この残基は水溶液に反発して、ペプチドが水性媒体中にある際に含まれているペプチドの立体配置における内部位置を求める。これらの残基は「疎水性残基」とも呼ばれる。
中性／極性：残基は生理学的ｐＨで荷電していないが、この残基は水溶液によって、ペプチドが水性媒体中にある際に含まれているペプチドの立体配置における外部位置を求めるように誘引される。
【００２１】
「アミノ酸」残基は、それらの側鎖基について環状又は非環状、芳香族又は非芳香族として更に分類することができ、これらの名称は当業者の常識である。下の表は、生じうる保存的置換の型を示す。
2005504723.tif 000002
【００２２】
例えば、ここに記載する標準的な固相合成技術で合成されたペプチドは、アミノ酸を含む置換のために遺伝子にコードされたアミノ酸に限定されない。遺伝子コードにコードされない共通に見られるアミノ酸は、例えば、国際公開公報WO 90/01940及び下記の表に記載されるもの、並びに、例えば、Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノアジピン酸（Ａａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２-アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノブチル酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２-アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙについての２-アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬｅｕ及びＩｌｅについてのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓについてのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての２，３-ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、及びＧｌｎについてのＮ-エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓについてのヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓについてのアロヒドロキシリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒについての３-(及び４-)ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌについてのアロ-イソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａについてのｐ-アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａについてのＮ-メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅについてのＮ-メチルイソロイシイン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについてのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎについてのシトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ＰｈｅについてのＮ-メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ-(Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、又はＩ-)フェニルアラニン、トリフルオロフェニルアラニンである。
【００２３】
2005504723.tif 000003
2005504723.tif 000004
2005504723.tif 000005
【００２４】
「ペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸を持つ分子であり、少なくとも約６０アミノ酸を持つポリペプチドを含む。好ましくは、ペプチドは約１０から約６０アミノ酸を持ち、より好ましくは約１０−２５、最も好ましくは約１２−２５アミノ酸を持つ。本定義には、直鎖状及び環状ペプチド、ペプチド誘導体、それらの塩、又は光学異性体が含まれる。
ここで使用される「アミノ酸側鎖に含まれるアミド結合形成置換基」、「側鎖アミド結合形成置換基」、及びその文法的な変形は、（１）カルボキシ置換基が他の分子に含まれるアミノ基とアミド結合を形成する能力のある、つまり、カルボキシ置換基が他の分子に含まれるアミノ基と反応してアミド結合を形成する、アミノ酸の側鎖（「Ｒ」基）に含まれる任意のカルボキシ置換基；及び（２）アミノ置換基が他の分子に含まれるカルボキシ基とアミド結合を形成する能力のある、つまり、アミノ置換基が他の分子に含まれるカルボキシ基と反応してアミド結合を形成する、アミノ酸の側鎖（「Ｒ」基）に含まれる任意のアミノ置換基を含むと定義される。
ここで使用される「差次的に取り外しできる」保護又は保護基は、第１のアミド結合形成置換基と第２のアミド結合形成置換基を保護する能力のある、任意の対になった保護基と定義され、それは、対の一方のメンバーで保護された第１のアミド結合形成置換基を、対の他方のメンバーで保護された第２のアミド結合形成置換基を脱保護させない条件下で、脱保護することが可能である。また、差次的に取り外しできる保護基は、ここで「直交性」の保護基とも呼ばれ、このような保護基によって与えられる、差次的に取り外しできる保護は、ここで「直交性」の保護とも呼ばれる。
【００２５】
ここで使用される用語「治療」とは、治癒的な処置及び予防的又は防御的な対策の両方を意図する。治療を必要とするものとは、疾患を既に有するもの、並びに疾患を有しやすいもの又は疾患を有すると診断されたもの又は疾患が防御されるべきものを含む。継続的な治療又は投与とは、基本的に少なくとも毎日、一日以上治療を中断することのない治療を意図する。断続的な治療又は投与、あるいは断続的な方法での治療又は投与とは、継続的ではないが本質的には周期的である治療を意図する。ここでの治療計画は、継続的又は断続的の何れかでありうる。予防的な対策が適する対象は、疾患、例えば癌の、一以上の既知の危険因子を有するものを含む。
ここで使用される用語「肺性投与」は、本発明の製剤の、吸入による肺経由の投与を指す。ここで使用される用語「吸入」は、空気の肺胞への取り込みを指す。特定の例では、取り込みは、本発明の製剤の、噴霧器又は他のエアロゾル供給装置による吸入ではあるが自己投与によっても、例えば呼吸装置をつけた患者への呼吸装置を通した投与によっても行われる。本発明の製剤に関して使用される用語「吸入」は、「肺性投与」と同義語である。
【００２６】
ここで使用される用語「腸管外」は、本発明のペプチドの腸以外による身体への導入、特に静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、心室内、及び皮下（ｓ．ｃ．）経路を意味する。
ここで使用される用語「エアロゾル」は、空気懸濁物を指す。特に、エアロゾルは本発明の製剤の粒子化及びその空気中での懸濁を意味する。本発明によると、エアロゾル製剤は、吸入又は肺性投与のためにエアロゾル化、即ち粒子化及び空気中への懸濁に適した、本発明のペプチドを含む製剤である。
ここで使用する用語「分散剤」とは、ペプチドのエアロゾル化又は肺組織でのタンパク質の吸収、又は両方を助ける薬剤を意味する。好ましくは分散剤は製薬的に許容可能である。
ここで使用する用語「製薬的に許容可能な」とは、一般的に、連邦または州政府の規制当局に承認されたもの、あるいは米国薬局方、又は動物、特にヒトに使用するための他の一般に認められた薬局方に列挙されているものを意味する。
【００２７】
「疾患」とは、ＩＧＦ、好ましくはＩＧＦ−１によって生じる、媒介される又は悪化する、あるいはそれに関するあらゆる状態であり、ここでのペプチドによる治療によって利益を得るであろう任意の状態のことである。これには慢性及び急性疾患又は疾病が含まれ、哺乳動物を問題の疾患に罹りやすくする病理学的状態を含む。ここで治療されるべき疾患の非限定的な例には、望まれない細胞増殖に関する疾患、例えば良性腫瘍、癌、再狭窄、及び喘息；末端肥大症；炎症性、血管原性又は免疫学的疾患；虚血性障害、例えば脳卒中、心筋虚血、腎臓への虚血性障害；糖尿病合併症、例えば糖尿病性網膜症又は神経症；視覚関連疾患；又は神経、グリア、アストロサイト、視床下部、及び他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性及び胞胚腔性の疾患を含む。視覚関連疾患は、加齢性黄斑変性症；眼科手術、例えば水晶体摘出、核膜移植、緑内障濾過手術及び核膜移植；屈折率を矯正する手術、すなわち、放射状核膜切除術、さらに強膜黄斑孔及び変性の手術；網膜裂孔；硝子体網膜症；角膜の白内障疾患、例えば放射状角膜切除術の後遺症；ドライアイ；ウィルス性結膜炎；潰瘍性結膜炎；目の創傷、例えば角膜上皮創傷；シェーグレン症候群；黄斑性及び網膜性浮腫；視覚狭小化瘢痕；及び網膜虚血を含む。好ましくは、このような疾患は、癌、糖尿病合併症、虚血性障害、末端肥大症、再狭窄、視覚関連疾患、又は喘息である。治療の効果は、例えば細胞増殖又は成長の減少、腎クリアランスの改善、視力の改善、又はＩＧＦレセプターに結合できるＩＧＦの量の減少を含む、臨床的な徴候又は症状によって評価することができる。
【００２８】
「有効量」なる用語は、哺乳動物の疾病又は疾患を治療するために効果的なペプチドの量を意味する。癌の場合、例えば、有効量のペプチドは、癌細胞の数を減少させ；腫瘍サイズを減少させ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させる）；腫瘍の転移を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させる）；ある程度腫瘍の成長を阻害し；及び／又は疾患に関連した一又は複数の症状をある程度軽減しうる。ペプチドが、存在する癌細胞を成長阻害する及び／又は殺傷しうる程度まで、それは細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性でありうる。癌治療について、インビボでの効力は、例えば病状の進行時間(ＴＴＰ)の評価、及び／又は応答速度(ＲＲ)の測定によって測定される。
【００２９】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を称するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胚の腺癌、及び胚の扁平上皮癌が含まれる）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃の癌（胃腸癌が含まれる）、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫(hepatoma)、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮体及び子宮の癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の癌、並びにＢ細胞リンパ腫（低級／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ；中級／濾胞性ＮＨＬ；中級びまん性ＮＨＬ；高級免疫芽細胞性ＮＨＬ；高級リンパ芽球性ＮＨＬ；高級小非分割細胞ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；外套細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストロームのマクログロブリン病を含む）；慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球白血病(ＡＬＬ)；ヘアリー細胞白血病；及び慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）を含む。好ましくは、癌はＩＧＦレセプターを発現する腫瘍、より好ましくは乳癌、肺ガン、結腸直腸癌、又は前立腺癌、さらに最も好ましくは乳癌又は前立腺癌である。
【００３０】
「疾患を治療する他の薬剤」とは、その有効量で問題の疾患を治療しうる、ここでのペプチド以外の任意の薬剤である。これには、成長阻害剤、血管形成阻害(angiostatic)剤、又は細胞障害剤を含む。好ましくは、該薬剤は、化学療法剤又は抗体、好ましくは成長阻害抗体、細胞死を誘発する抗体、又はアポトーシスを誘発する抗体である。
ここで用いられる用語「細胞障害剤」は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質を意図する。この用語は放射性同位体（例えばＡｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、及び断片及び／又はその変異体を含む細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又は小分子毒素等の毒素を含むことを意図する。
【００３１】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(商品名)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin)（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）； エレウテロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、コロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンθＩ１（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと））；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin)；ビスフォスフォネート、例えばクロドロネート；エスペラミシン(esperamicin)； 並びにネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルチノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(商品名)ドキソルビシン(モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン(mitomycins）、例えばマイトマイシンＣ、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、スト��プトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin )のようなメイタンシノイド(maytansinoids)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びタキソテア(登録商標)ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(商品名)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE(商品名)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイド、例えばレチノイ��酸；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述のものの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体を含む。
【００３２】
また、この定義に含まれるものには、腫瘍でホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）であり、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX(商品名)タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON(商品名)トレミフェン；副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(商品名)酢酸メゲストロール、AROMASIN(商品名)エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(商品名)ボロゾール、FEMARA(商品名)レトロゾール、及びARIMIDEX(商品名)アナストロゾール；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に付着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤（例えば、ANZIOZYME(登録商標)リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤；遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(商品名)ワクチン、LEUVECTIN(商品名)ワクチン、及びVAXID(商品名)ワクチン；PROLEUKIN(商品名)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(商品名)トポイソメラーゼＩ阻害剤；ABARELIX(商品名)rGnRH；及び上記のものの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体を含む。
【００３３】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞の増殖を、インビトロ及び／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意図する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ期に細胞の割合を有意に減少させるものでありうる。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール(登録商標)パクリタキセル、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。また、Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びara-Cである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見ることができる。
「成長阻害」抗ＨＥＲ２抗体の例は、ＨＥＲ２に結合して、ＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞の成長を抑制するものである。好ましい成長阻害抗ＨＥＲ２抗体は、成長阻害がＳＫＢＲ３細胞の抗体への暴露から６日後に決定される場合に、抗体濃度約０．５から３０μg/mlで２０％よりも大きく、好ましくは５０％よりも大きく(例えば約５０％から１００％)細胞培養物のＳＫＢＲ３乳癌細胞の成長を阻害する(1997年10月14日公開の米国特許第5,677,171号参照)。
【００３４】
「細胞死を誘発する」抗体は、生存可能な細胞を生育不能にするものである。細胞は、抗体が結合する抗原を発現するもの、特に、抗原を過剰発現する細胞である。好ましくは、細胞は癌細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロで、細胞はＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。インビトロ細胞死は、抗体依存性細胞媒介細胞障害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性障害（ＣＤＣ）によって誘発される細胞死を識別するために、補体及び免疫エフェクター細胞の無い状態で確かめてもよい。従って、細胞死に関するアッセイは、熱不活性化血清（すなわち、補体の無い状態）を用いて、免疫エフェクター細胞の無い状態で実施してもよい。抗体が細胞死を誘発するか否かを確かめるために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Mooreら. Cytotechnology, 17: 1-11(1995)）又は７ＡＡＤの取り込みによって評価した膜整合性の損失を、未処理細胞と関連させて評価することができる。
【００３５】
「アポトーシスを誘発する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)によって判定されるようなプログラム細胞死を誘発するものである。細胞は、抗体が結合する抗原を発現するものであり、抗原を過剰発現するものでありうる。細胞は、腫瘍細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱の細胞である。インビトロで、細胞はＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化は以下の実施例に開示されているようにＤＮＡラダーリングにより評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／染色質凝結は低二倍体(hypodiploid)細胞の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、抗体が結合する抗原を発現する細胞を用いたアネキシン結合アッセイにおいて、アポトーシスを誘発する抗体は、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するという結果を生じるものである。
【００３６】
アポトーシスを誘発する抗体の例には、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体７Ｆ３（ATCC HB-12216）、及び７Ｃ２（ATCC HB 12215）、さらにそのヒト化及び／又は親和性成熟変異体；抗ＤＲ５抗体3F11.39.7（ATCC HB-12456）；3H3.14.5（ATCC HB-12534）；3D5.1.10（ATCC HB-12536）；及び3H3.14.5（ATCC HB-12534）、さらにそのヒト化及び／又は親和性成熟変異体；ヒト抗ＤＲ５レセプター抗体16E2及び20E6、更にその親和性成熟変異体（WO98/51793、文献明示によりここに取り込まれたものとみなす）；抗ＤＲ４抗体4E7.24.3（ATCC HB-12454）；4H6.17.8（ATCC HB-12455）；1H5.25.9（ATCC HB-12695）；4G7.18.8（ATCC PTA-99）；及び5G11.17.1（ATCC HB-12694）、更にそのヒト化及び／又は親和性成熟抗体を含む。
関心のある抗体が結合した抗原のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow及びLane編(New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。
個々で使用される場合の用語「標識」は、ポリペプチドに直接又は関節的に結合する検出可能な化合物又は組成物を意図する。標識は、それ自体検出可能（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）であっても、あるいは酵素標識の場合には検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
【００３７】
本発明は、ＩＧＦ−１をアンタゴナイズする機能を有する様々なペプチドに関する。特に、このようなペプチドの１つのファミリー（ファミリー１）は次の配列を有する：(Xaa)1(Xaa)2Cys(Xaa)3(Xaa)4SerVal(Xaa)5AlaLeu(Xaa)6(Xaa)7CysMet(Xaa)8（配列番号：１）、ここで(Xaa)1(Xaa)2及び(Xaa)7は任意のアミノ酸であり、(Xaa)3はPhe、Leu又はTyrであり、(Xaa)4はGlu、Asp、Ala、Gly、Thr又はSerであり、(Xaa)5はGlu、Asp、Ala又はGlyであり、(Xaa)6はArg又はLysであり、(Xaa)8はTyr又はArgである。(Xaa)4はGlu 、Ala、Gly、Thr又はSerであり、(Xaa)5はGlu、Ala又はGlyであり、(Xaa)8はTyrである。上記配列の好ましいペプチドは、(Xaa)4がGlu、Ala又はThrであり、(Xaa)5がAla又はGlyであり、(Xaa)8がTyrであるもの等である。より好ましいものは、(Xaa)4がGlu又はAla、(Xaa)5がAla又はGly、(Xaa)8がTyrのペプチドである。さらにより好ましいものは、配列RNCFESVAALRRCMYG（配列番号：２）、MDCLASVEALKWCMYG（配列番号：３）、又はFECLTSVEALRGCMYG（配列番号：４）を含むペプチドである。最も好ましいものは、配列番号２又は３を含むペプチドである。
このようなペプチドの第２のファミリー（ファミリー２）は次の配列を含む：(Xaa)1(Xaa)2Cys(Xaa)3(Xaa)4Asp(Xaa)5(Xaa)6Gly(Xaa)7(Xaa)8TyrCysTrp(Xaa)9（配列番号：５）、ここで(Xaa)1、(Xaa)4及び(Xaa)8は任意のアミノ酸であり、(Xaa)2はArg、Lys、Gly、Ser又はThrであり、(Xaa)3はAla又はValであり、(Xaa)5はAla又はLeuであり、(Xaa)6はAla、Gly又はLeuであり、(Xaa)7はPhe、Tyr、Trp又はGlyであり、(Xaa)9はGlu、Asp、Ala又はGlyである。ここでの好ましいペプチドは、(Xaa)2がGly、Ser、Arg又はThrであり、(Xaa)9がGlu、Ala又はAspであるもの等である。より好ましいものは、(Xaa)2がGlu又はArg、(Xaa)5がLeu、(Xaa)6がAla又はGly、(Xaa)7がPhe、(Xaa)9がAlaのペプチドである。このファミリーの最も好ましいペプチドは、配列LGCASDLAGFWYCWAG（配列番号：６）又はWRCVDDLGGFQYCWAG（配列番号：７）を含むものである。
好ましくは、これら２つのファミリーのペプチドの全てのアミノ酸がＬ-アミノ酸である。また、これらのファミリーのペプチドが、上記のファミリー１では(Xaa)8の後に、上記のファミリー２では(Xaa)9の後に、グリシン残基を有することが好ましい。
【００３８】
（ペプチドの作成）
本発明のペプチドを、化学合成によって、あるいは組換え技術を用いることによって作成することができる。これらの方法は当分野で周知である。化学合成、特に固相合成は、短い（例えば５０残基未満）ペプチド又は非天然の異常なアミノ酸を含むもの、例えばＤ−Ｔｙｒ、オルニチン、アミノ−アジピン酸などに好適である。組換え法は、より長いペプチドに好適である。組換え手法は、より長いポリペプチドに好ましい。組換え法が選択される場合、合成遺伝子は新規に構築されてもよく、あるいは天然遺伝子を、例えばカセット突然変異誘発により突然変異させてもよい。
ここでのペプチドのアミノ酸置換に適した任意の残基又は領域を同定する有用な方法は、アラニンスキャンニング突然変異誘発と呼ばれ、Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)に記載されている。ここで、残基又は一群の標的残基は、同定され（例えば、Arg、Asp、His、Lys、及びGlu等の荷電残基）、中性又は負に荷電しているアミノ酸へ置換されて細胞内又は外におけるアミノ酸と周辺の水性環境との相互作用に影響する。次に、置換に対して機能的な感受性を示すこれらのドメインを、更なる又は他の変異体を置換部位に或いは置換部位の間に導入することによって洗練させる。従って、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予定されるが、変異の性質そのものは予定される必要はない。例えば、与えられた部位で突然変異の性能を最適化するために、アラニンスキャンニング又はランダム突然変異誘発を、標的コドン又は領域及び所望する活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされた発現化合物で実施することができる。
【００３９】
タンパク質又はペプチドライブラリーのファージディスプレイは、向上した親和性、改変された特異性、又は向上した安定性をもつ化合物の選択のための他の方法論を与える（Smith, Curr. Opin. Biotechnol. 2:668-673(1991)）。Ｍ１３遺伝子IIIコートタンパク質との融合として一価法で提示された高親和性タンパク質（Clackson等, Trends Biotechnol. 12:173-183(1994)）は、多数回の結合選択の後に、ファージミド粒子に詰め込まれている相当ＤＮＡをクローニング及び配列決定することによって同定することができる。
他のペプチドは、免疫原性ポリペプチド、例えば、βラクタマーゼ又は大腸菌Ｔｒｐ遺伝子座によってコードされる酵素のような細菌性ポリペプチド又は酵母タンパク質の、ここで記載されるペプチドのＮ又はＣ末端への融合物、及び1989年4月6日に公開されたＷＯ89/02922に記載されるような免疫グロブリン定常領域又は他の免疫グロブリン領域、アルブミン、あるいはフェリチン等の長い半減期を有するタンパク質とのＣ末端融合物を含む。更に、アミノ酸残基の側鎖にあるフリーの官能基はまた、アミド化、アシル化又は例えば活性に影響を与えずにペプチドの溶解性を変えることができる他の置換によって修飾することができる。
以下の説明は、一般的な組換え技術の例示である。
【００４０】
精製ＩＧＦ及びそのアミノ酸配列から、例えば、ＩＧＦのペプチジル突然変異であるＩＧＦアンタゴニストは組換えＤＮＡ技術を用いて作成してもよい。これらの技術は、単純化した形態において、天然又は合成のいずれかで、ペプチドをコードする遺伝子を取り出す；遺伝子を適切なベクターへ挿入する；ベクターを適切な宿主細胞へ挿入する；遺伝子発現の為に宿主細胞を培養する；その結果得られたペプチドを回収又は単離することが考えられる。好ましくは、回収されたペプチドは、その後、適当な程度まで精製される。
幾分より詳しくは、ペプチジルＩＧＦアンタゴニストをコード化するＤＮＡ配列は、適した宿主で発現されうるように、クローン化及び操作される。親ポリペプチドをコード化するＤＮＡは、ゲノムライブラリーから、ペプチドを発現する細胞由来のｍＲＮＡから誘導されるｃＤＮＡから、あるいは合成的に構築されたＤＮＡ配列によって、得ることが可能である（Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed.) (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989)）。
次いで、親ＤＮＡは、宿主細胞の形質転換に使用される適切なプラスミド又はベクターへ挿入される。一般には、宿主との関連において、宿主細胞と適合する種由来の複製及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが使用される。ベクターは、通常、形質転換細胞の形質選択を提供できるタンパク質又はペプチドをコードする配列並びに複製部位を持つ。
例えば、大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミド、ｐＢＲ３２２を使用することによって形質転換することができる（Mandel等., J. Mol. Biol. 53: 154(1970)）。プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むため、選択が容易な方法を提供する。他のベクターは、発現にしばしば重要な異なったプロモーター等の、異なった特徴を含む。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０、及びｐＰＬ−λは、ｔａｃ、ｔｒｐ、又はＰＬプロモーターを有する現在入手可能な発現ベクターである（Pharmacia Biotechnology）。
【００４１】
好ましいベクターはｐＢ０４７５である。このベクターは、このような宿主の間を往復することを可能にするファージ及び大腸菌の為の複製開始点を有し、それによって突然変異誘発及び発現の両方を促進する（Cunningham等., Science, 243: 1330-1336(1989); U.S.Pat. No. 5,580,723）。他の好ましいベクターは、ｐＲ１Ｔ５及びｐＲ１Ｔ２Ｔである（Pharmacia Biotechnology）。これらのベクターは、ベクターに挿入された遺伝子が融合タンパク質として発現されるように、適切なプロモーターに続くプロテインＡのＺドメインを含む。
他の好ましいベクターは、前記したベクターの適切な特徴を組み合わせることによる、標準的技術を用いた構築が可能である。適切な特徴とは、プロモーター、リボゾーム結合部位、デコルシン(decorsin)又はオルナチン(ornatin)遺伝子、或いは遺伝子融合（プロテインＡのＺドメイン及びデコルシン又はオルナチンとそのリンカー）、抗生物質耐性マーカー、及び適切な複製開始点を含む。
宿主細胞は、原核生物のものでも真核生物のものでもよい。原核生物は、ＤＮＡ配列をクローニング及び発現させ、親ＩＧＦ−１ポリペプチド、セグメント置換ペプチド、残基置換ペプチド、及びペプチド変異体を作成する為に好ましい。例えば、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１４４６）は、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１５３７）、及び大腸菌ｃ６００及びｃ６００ｈｆｌ、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ-、γ-、原栄養性／ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３２５）、枯草菌のような桿菌、ネズミチフス菌又はセラチア・マルセッセンス菌のような腸内細菌、及び様々なシュードモナス属も同様に使用される。好ましい原核生物は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生物によって発現された場合、ペプチドは通常、Ｎ末端メチオニン又はホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。融合タンパク質の場合、Ｎ末端メチオニン又はホルミルメチオニンは融合タンパク質のアミノ末端、又は融合タンパク質のシグナル配列に存在する。これらの例は言うまでもなく、限定ではなく例示を意図するものである。
【００４２】
原核生物に加えて、酵母培養菌、又は多細胞生物由来の細胞のような真核生物を使用することができる。基本的には、そのような全ての細胞培養が実施可能である。しかし、脊椎動物細胞にもっとも大きな関心があり、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は再現性のある方法になっている。Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors(1973)。そのような有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｗ１３８,２９３，ＢＨＫ、ＣＯＳ-７、及びＭＤＣＫ細胞株である。
前記方法の変形として、所望するペプチドをコード化する遺伝子が、ベクター中で、他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコード化する遺伝子と関連している場合には、遺伝子融合の使用が考慮される。これは、所望するペプチドが他のタンパク質又はペプチドと融合体として宿主細胞で生産されることになる。「他の」タンパク質又はペプチドとは、多くの場合、細胞からの分泌が可能なタンパク質又はペプチドであり、所望するペプチドの培養液からの単離及び精製を可能にし、所望するペプチドが細胞内に残っている場合に生じる宿主細胞破壊の必要性がない。あるいは、融合タンパク質を、細胞内に発現させることも可能である。高度に発現される融合タンパク質の使用が有用である。
【００４３】
遺伝子融合の使用は、必須ではないが、大腸菌における異種ペプチドの発現並びに後のこれら遺伝子産物の精製を容易にしうる。Harris, Genetic Engineering, Williamson, R., Ed.(Academic Press, London, Vol.4, 1983), p.127; Ljunquist等., Eur. J. Biochem., 186: 557-561(1989)及びLjungquist等., Eur. J. Biochem., 186: 563-569(1989)。プロテインＡ融合は、プロテインＡの結合、より具体的にはプロテインＡのＺドメインのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製の為の「親和性ハンドル」を提供することから頻繁に使用される。Nilsson等, Protein Engineering, 1: 107-113 (1987)。また、多くの異種タンパク質が大腸菌内で直接に発現されると分解されることが知られているが、融合タンパク質として発現された場合は安定である。Marston, Biochem J., 240: 1(1986)。
発現又は分泌の後、例えば大腸菌から、融合タンパク質を切断して遊離ペプチドを作成し、反応混合物から精製することができる。切断は、臭化シアンのような化学薬品の使用によって実施され、メチオニン、又はヒドロキシルアミンで切断され、Ａｓｎ及びＧｌｙ残基間を切断する。標準的な組換えＤＮＡ技術を使用することにより、これらのアミノ酸をコード化するヌクレオチド塩基対を、所望のペプチドをコード化する遺伝子の５'末端の直前に挿入することができる。
あるいは、融合タンパク質のタンパク質分解による切断を用いることができる（Carter, Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, Ladisch等., eds.(American Chemical Society Symposium Series No.427,1990), Ch13, page 181-193; Varadarajan等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5681-5684 (1985); Castellanos-Serra等, FEBS Letters, 378: 171-176 (1996); Nilsson等, J. Biotechnol., 48:241-250 (1996)）。
【００４４】
第Ｘａ因子、トロンビン、サブチリシン又はトリプシン、又はその変異体、及び他の多数のプロテアーゼが、融合タンパク質の切断に成功裏に使用されている。ペプチドＺドメイン融合体がプロテアーゼにより切断されやすいことが分かっているので、トリプシンが好ましい。トリプシンをプロテアーゼとして使用するための詳細な方法はSmith, Methods in Mol. Biol., 32: 289-196 (1994)で見られる。典型的には、プロテアーゼによる切断を受けやすいペプチドリンカーは、「他の」のタンパク質（例えばプロテインＡのＺドメイン）と所望するペプチドとの間に挿入される。組換えＤＮＡ技術を使用すると、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対は、他のタンパク質をコード化する遺伝子又は遺伝子断片の間に挿入される。次いで、タンパク質分解による正確なリンカーを含む部分精製融合タンパク質の切断を、天然融合タンパク質、あるいは還元型又は変性融合タンパク質で実施することができる。
融合タンパク質として発現した場合、ペプチドは、適切に折り畳まれたり、折り畳まれなかったりする。さらに、切断部位を含有する特定のペプチドリンカーは、プロテアーゼへ接触可能であったり、なかったりする。これらの要因は、融合タンパク質を変性及び再折り畳みするべきか否か、もしそうならば、これらの手段を切断の前又は後のいずれに用いるかを決定する。
変性及び再折り畳みが必要な場合、ペプチドは通常、塩酸グアニジンのようなカオトロピック剤で処理され、その後、例えばペプチドが天然構造へと再折り畳むような適切な割合、ｐＨ、及び温度において、還元及び酸化型ジチオスレイトール又はグルタチオンを含有する酸化還元緩衝液によって処理される。
【００４５】
組換え法と同様に、本発明のペプチドは、一般的に、固相ペプチド合成法（Merrifield, J. Am.Chem. Soc., 85: 2149(1964); Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5132 (1985)）を用いて調製することもできるが、当該分野で周知の他の同等な化学合成法も使用可能である。固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適切な樹脂と結合させることによってペプチドのＣ末端から開始される。そのような開始物質は、クロロメチル化樹脂又はヒドロキシメチル樹脂にエステル結合させることにより、あるいはＢＨＡ樹脂又はＭＢＨＡ樹脂にアミド結合させることにより、αアミノ基保護アミノ酸を付着させて調製することができる。ヒドロキシメチル化樹脂の調製は、Bodansky等., Chem. Ind. (London), 38: 1597-1598 (1966)に記載されている。クロロメチル化樹脂は、BioRad Laboratories, Richmond, CA 及び Lab. Systems, Inc.から市販されている。そのような樹脂の調製は、Stewart等., Sold Phase Peptide Synthesis (Freeman & Co., San Francisco 1969), 第１章, pp.1-6 に記載されている。ＢＨＡ及びＭＢＨＡ樹脂担体は市販されており、一般的には、合成された所望のポリペプチドがＣ末端に置換されていないアミドを有している場合のみ使用される。
【００４６】
アミノ酸は、ペプチド結合の形成に関する当分野で周知の技術を用いてペプチド鎖と連結される。一つの方法は、カルボキシル基がペプチド断片の遊離Ｎ末端アミノ基との反応をさらに受けやすくしうる誘導体へとアミノ酸を変換することを含む。例えば、アミノ酸は、保護されたアミノ酸とクロロギ酸エチル、クロロギ酸フェニル、ｓｅｃ-クロロギ酸ブチル、クロロギ酸イソブチル、塩化ピバロイル、又は類似の酸塩化物との反応によって混合無水物への変換が可能である。あるいは、アミノ酸を、２,４,５-トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ-ニトロフェニルエステル、Ｎ-ヒドロキシスクシニミドエステル、又は１-ヒドロキシベンゾトリアゾールから形成されるエステルなどの活性型エステルへ変換することができる。
その他のカップリング法は、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はＮ,Ｎ'-ジイソプロピルカルボジイミドなどの適したカップリング剤の使用を含む。他の適したカップリング剤で、当分野の技術者に明らかなものは、E.Gross & J.Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol.I: Major Methods of Peptide Bond Formation(Academic Press, New York, 1979)に記載されている。
【００４７】
ペプチド合成に使用される各アミノ酸のαアミノ基は、それらの活性αアミノ基に関する副反応を防ぐ為に、カップリング反応中は保護されるべきことが認識されるべきである。また、ある種のアミノ酸は反応性の側鎖官能基（例えば、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル、及びヒドロキシル）を有し、そのような官能基もまた、適した保護基によって化学反応から保護し、初期段階及びそれに続くカップリング段階の間に化学反応がその部位で生じることを防止しなければならないことも認識すべきである。当分野で周知の適した保護基は、Gross and .Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol.3:" Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis"(Academic Press, New York, 1981)に記載されている。
ペプチド合成に使用される特定の側鎖保護基の選択では、次の一般的規則が順守される。α-アミノ保護基は、（ａ）カップリング反応に用いられる条件下では、α-アミノ機能を不活性にしなければならない、（ｂ）カップリング反応後には、側鎖保護基を除去せずペプチド断片の構造を改変しない条件下で容易に除去できなければならない、さらに（ｃ）カップリング直前の活性化に当たってはラセミ化の可能性を除去しなければならない。側鎖保護基は、（ａ）カップリング反応に用いられる条件下においては、側鎖官能基を不活性にしなければならない、（ｂ）α-アミノ保護基の除去に用いられる条件下では安定でなければならない、さらに（ｃ）所望のアミノ酸ペプチドが完成した際には、ペプチド鎖の構造を改変しない反応条件下で容易に除去できなければならない。
【００４８】
当業者には、ペプチド合成に有用なことが知られた保護基が、それらの除去に用いる試薬との反応性において変化することは明らかであろう。例えば、トリフェニルメチル及び２-(ｐ-ビフェニリル)イソプロピルオキシカルボニルのようなある種の保護基は非常に不安定で、温和な酸性条件下で切断できる。他の保護基、例えばｔ-ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ-アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びｐ-メトキシベンジルオキシカルボニルは不安定性が低く、それらの除去のために、酢酸中のトリフルオロホウ素、塩酸、三フッ化ホウ素などの中程度に強い酸を必要とする。さらに他の保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ又はＺ）、ハロベンジルオキシカルボニル、ｐ-ニトロベンジルオキシカルボニルシクロアルキルオキシカルボニル、及びイソプロピルオキシカルボニルは、不安定性が更に低く、それらの除去には、トリフルオロ酢酸中のフッ化水素、臭化水素、又はトリフルオロ酢酸ホウ素といった更に強い酸を必要とする。有用なアミノ酸保護基のクラスの中には以下のものが含まれる：
（１）α-アミノ基については、（ａ）芳香族ウレタン型保護基、例えばフルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）ＣＢＺ、及び置換されたＣＢＺ、例えばｐ-クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ-６-ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ-ブロモベンジルオキシカルボニル及びｐ-メトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ-クロロベンジルオキシカルボニル、２,４-ジクロロベンジルオキシカルボニル、２,６-ジクロロベンジルオキシカルボニルなど；（ｂ）脂肪族ウレタン型保護基、例えばＢＯＣ、ｔ-アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２-(ｐ-ビフェニリル)-イソプロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなど；（ｃ）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びシクロへキシルオキシカルボニル；及び（ｄ）アリルオキシカルボニル。好ましいα-アミノ保護基はＢＯＣ又はＦＭＯＣである。
（２）Ｌｙｓに存在する側鎖アミノ基については、保護は、ＢＯＣ、ｐ-クロロベンジルオキシカルボニル等といった上記（１）に述べた任意の基によってなされる。
（３）Ａｒｇのグアニジド基については、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、アダマンチルオキシカルボニル、２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-スルホニル、２,３,６-トリメチル-４-メトキシフェニルスルホニル、又はＢＯＣによってなされる。
（４）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒのヒドロキシル基については、保護は、例えば、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、例えばｔ-ブチル；ベンジル（ＢＺＬ）；置換ＢＺＬ、例えばｐ-メトキシベンジル、ｐ-ニトロベンジル、ｐ-クロロベンジル、ｏ-クロロベンジル、及び２,６-ジクロロベンジルによってなされる。
（５）Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシル基については、保護は、例えば、ＢＺＬ、ｔ-ブチル、シクロへキシル、シクロペンチルなどの基を用いたエステル化によってなされる。
（６）Ｈｉｓのイミダゾール窒素については、トシル部が好ましく使用される。
（７）Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基については、テトラヒドロピラニル、tert-ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４-ブロモベンジル、又は２,６-ジクロロベンジルなどの保護基が好ましく使用される。好ましい保護基は２,６-ジクロロベンジルである。
（８）Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖アミノ基については、キサンチル（Ｘａｎ）が好ましく用いられる。
（９）Ｍｅｔについては、アミノ酸は好ましくは保護せずに残す。
（１０）Ｃｙｓのチオ基については、ｐ-メトキシベンジルが典型的に用いられる。
【００４９】
Ｃ末端アミノ酸、例えばＬｙｓは、Ｎ-アミノ位置において適切に選択された保護基、Ｌｙｓの場合はＢＯＣによって保護される。ＢＯＣ-Ｌｙｓ-ＯＨは、最初にベンジルヒドリルアミン又はクロロメチル化樹脂に、Horiki等, Chemistry Letters, 165-168 (1978)に記載された方法に従って、又はイソプロピルカルボジイミドを用いて約２５℃で２時間攪拌しながら結合させる。ＢＯＣ保護アミノ酸の樹脂担体への結合に続いて、α-アミノ保護基を、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はＴＦＡ単品を用いるなどして除去する。脱保護は、約０℃から室温までの温度で実施する。他の標準的な切断試薬、例えばジオキサン中のＨＣｌ、及び特定のα-アミノ保護基の除去条件は文献に記載されている。
α-アミノ保護基の除去の後、残ったα-アミノ及び側鎖保護アミノ酸を所望の順序で段階的に結合させる。合成において各アミノ酸を別々に添加する代わりに、固相合成機に添加する前に互いに結合させてよい場合もある。適したカップリング試薬の選択は当業者の技量の範囲内である。カップリング試薬として特に適したものは、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミドである。
各保護アミノ酸又はアミノ酸配列を固相反応器に過剰に導入し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はＣＨ２Ｃｌ２又はそれらの混合物の媒体中でカップリングを適切に実施させる。不完全なカップリングが生じた場合、次のアミノ酸のカップリング前になされるＮ-アミノ保護基の除去以前にカップリング法を繰り返す。合成の各段階でのカップリング反応の成功を監視してもよい。合成を監視する好ましい方法は、Kaiser等, Anal. Biochem., 34: 595 (1970)に記載されたニンヒドリン反応によるものである。カップリング反応は、周知の方法、例えばBIOSEARCH 9500(商品名)ペプチド合成機を使用して自動的に実施できる。
【００５０】
所望のペプチド配列が完成したら、保護ペプチドを樹脂担体から切断し、全ての保護基を除去しなければならない。切断反応及び保護基の除去は、同時に又は段階的に適切になされる。樹脂担体がクロロメチル化ポリスチレン樹脂である場合、ペプチドを樹脂に固定している結合は、Ｃ末端残基の遊離カルボキシル基と樹脂マトリクス上に存在する多数のクロロメチル基の一つとの間のエステル結合である。固定している結合は、エステル結合を破壊でき樹脂マトリクスを透過できることが知られている試薬によって切断できることは理解されるであろう。
一つの特に便利な方法は、液体無水フッ化水素での処理によるものである。この試薬はペプチドを樹脂から切断するだけでなく、全ての保護基を除去しうる。従って、この試薬の使用は、完全に脱保護されたペプチドを直接に生じうる。クロロメチル化樹脂を使用した場合、フッ化水素処理は遊離のペプチド酸の形成をもたらす。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用した場合、フッ化水素処理により直接遊離のペプチドアミンを生じる。アニソール及びジメチルスルフィドの存在下での０℃、１時間のフッ化水素との反応は、同時に側鎖保護基を除去し、樹脂からペプチドを遊離する。
【００５１】
保護基を除去することなくペプチドを切断することが望まれる場合、保護ペプチド−樹脂にメタノール分解を施して、Ｃ末端カルボキシル基がメチル化された保護ペプチドを生成させることができる。次いで、このメチルエステルを穏やかなアルカリ条件下で加水分解してフリーのＣ末端カルボキシル基を与える。次いで、ペプチド鎖上の保護基を液体フッ化水素などの強酸で処理することにより除去する。メタノール分解についての特に有用な技術は、Moore等, Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., M. Goodman及びJ. Meienhofer, 編, (John Wiley, N.Y., 1977), p. 518-521のものであり、そこでは保護ペプチド−樹脂をクラウンエーテルの存在下でメタノール及びシアン化カリウムで処理する。
クロロメチル化樹脂を使用した場合に保護ペプチドを樹脂から切断する他の方法は、加アンモニア分解又はヒドラジンでの処理によるものである。必要ならば、得られたＣ末端アミド又はヒドラジドをフリーのＣ末端カルボキシル部に加水分解することができ、保護基は従来法で除去することができる。
【００５２】
また、Ｎ末端αアミノ基に存在する保護基は、保護ペプチドが支持体から切断される前又は後に優先的に除去してよいということも認識されるであろう。
本発明のポリペプチドの精製は、典型的には従来の手法、例えば調製用の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（逆相ＨＰＬＣを含む）又は他の周知のクロマトグラフィー技術、例えばゲル浸透、イオン交換、分配クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ（モノクローナル抗体カラムを含む）、又は向流分配によって達成される。
本発明のペプチドは、重合によって安定化させてもよい。これは、モノマー鎖を多官能性架橋試薬で直接的に、又は多官能性ポリマーを介して間接的に架橋させることにより達成される。通常は、二官能性架橋試薬を用いて、２つの実質的に同一のポリペプチドを、それらのＣ又はＮ末端において架橋させる。試薬は、末端アミノ及び／又はカルボキシル基を架橋するために使用される。一般に、両方の末端カルボキシル基又は両方の末端アミノ基が互いに架橋するが、適切な架橋試薬を選択することにより、一方のポリペプチドのαアミノ基が他方のポリペプチドの末端カルボキシル基と架橋する。好ましくは、ポリペプチドはそれらのＣ-末端でシステインと置換される。当分野で良く知られた条件下では、末端システイン間でジスルフィド結合が形成され、それによりポリペプチド鎖が架橋する。例えば、ジスルフィド架橋は、フリーのシステインの金属触媒酸化により又は適切に修飾されたシステイン残基の求核置換により簡便に形成される。架橋試薬の選択は、ポリペプチドに存在するアミノ酸の反応性側鎖のアイデンティティに依存するであろう。例えば、ジスルフィド架橋は、システインがポリペプチドのＣ-末端以外のさらなる部位に存在する場合には好ましくないであろう。また、この範囲には、メチレン架橋で架橋したペプチドも包含される。
【００５３】
Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシル基以外の、ペプチド上の好適な架橋部位は、リジン残基上に見られるεアミノ基、並びにペプチドの内部残基又はフランキング配列に導入された残基の側鎖に位置するアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル及びヒドロキシル基を含む。外部から添加された架橋試薬を介する架橋は、例えば、当業者に馴染み深いたくさんの試薬の任意のものを用いて、例えば、ポリペプチドのカルボジイミド処理を介して適当に達成される。好適な多官能性（通常は二官能性）架橋試薬の他の例は文献に見られる。
また、本発明のペプチドは、環化によって立体配置的に安定化させてもよい。ペプチドは通常、１つのペプチドのＮ及びＣ末端ドメインを本発明の他のペプチドの対応ドメインに共有結合させることにより環化され、２又はそれ以上の反復ペプチド配列を含むシクロオリゴマーを形成し、各反復ペプチドは実質的に同じ配列を有する。さらに、環化ペプチド（シクロオリゴマー又はシクロモノマーのいずれか）は、架橋して１−３の環状構造を形成し、そこには２から６のペプチドが含まれる。ペプチドは、好ましくはαアミノ基及び主鎖カルボキシル基（頭部から尾部）を介して共有結合せず、Ｎ及びＣ末端ドメインにある残基の側鎖を介して架橋する。従って、結合部位は一般に、残基の側鎖間になるであろう。
ここで考慮されるようなモノ又はポリ環化ペプチドを調製するために、それ自体、多くの好適な方法が知られている。Ｌｙｓ／Ａｓｐ環化は、Ｌｙｓ／ＡｓｐについてＦｍｏｃ／９-フルオレニルメチル（ＯＦｍ）側鎖保護を持つ固相担体上でＮａ-ＢＯＣ-アミノ酸を用いて達成され；この方法は、ピペリジン処理後の環化によって完了する。
【００５４】
Ｇｌｕ及びＬｙｓ側鎖も、環状又は二環ペプチドの調製において架橋され；ペプチドはｐ-メチルベンズヒドリルアミン樹脂上での固相化学法によって合成される。ペプチドは樹脂から切断されて脱保護される。環状ペプチドは、希釈メチルホルムアミド中のジフェニルホスホリルアジドを用いて形成される。これに代わる方法については、Schiller等, Peptide Protein Res., 25: 171-177 (1985)を参照のこと。また、米国特許第4,547,489号も参照のこと。
ジスルフィド架橋した又は環化されたペプチドは従来の方法により生成される。Pelton等（J. Med. Chem., 29: 2370-2375 (1986)）の方法は、シクロモノマーの作成について上掲のPelton等に記載された希釈反応混合物よりも濃厚な溶液中で反応を実施することにより高い割合でシクロオリゴマーが生成されることを除いては、適している。同様の化学法が、二量体又はシクロオリゴマー又はシクロモノマーの合成に有用である。また有用なのはチオメチレン架橋である。Lebl及びHruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067-2068 (1984)。また、Cody等, J. Med. Chem., 28: 583 (1985)参照。
望ましい環状又は重合ペプチドは、ゲル濾過の後にＨＰＬＣ又は他の従来の手法により精製される。ペプチドは滅菌濾過され、従来からの薬理学的に許容される媒体中に処方される。
ここに記載するプロセスに必要とされる出発材料は文献で知られているか、又は周知の方法を用いて周知の出発材料から調製することができる。
【００５５】
作成されたペプチドにおいて４つの異なる置換基に結合した炭素原子が不斉である場合、化合物はジアステレオイソマー、エナンチオマー又はそれらの混合物として存在しうる。上記の合成は、出発材料又は中間体としてラセミ化合物、エナンチオマー又はジアステレオマーを用いてもよい。そのような合成から得られるジアステレオマー産物は、クロマトグラフィー又は結晶化法によって分離されうる。同様に、エナンチオマー生成混合物は、同様の技術又はこの分野で既知の他の技術を用いて分離してもよい。各不斉炭素原子は、存在している場合、２つの立体配置（Ｒ又はＳ）の一方でよく、共に本発明の範囲内である。
本発明に記載されるペプチドは、遊離の酸又は塩基として単離されても、あるいは様々な無機及び有機の酸及び塩基の塩に変えられてもよい。このような塩は本発明の範囲内である。このような塩の例にはアンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム等の金属塩；ジシクロヘキシルアミン、Ｎ-メチル-Ｄ-グルカミン等の有機塩基との塩；及びアルギニン又はリジン等のアミノ酸との塩を含む。無機及び有機酸との塩は、同様に、例えば塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸等を用いて調製される。非毒性及び生理学的に適合性の塩が特に有用であるが、他の望ましくない塩は単離及び精製の過程での用途を有しうる。
上記の塩の調製に多数の方法が利用でき、当業者に周知である。例には、塩が不溶性である溶剤又は溶剤の混合物における；又は蒸発、蒸留又は凍結乾燥により溶剤が除去された後の水などの溶剤における、ペプチドの遊離酸又は遊離塩基形態と所望の酸の一以上の分子等価物との反応を含む。あるいは、生成物の遊離酸又は塩基の形態をイオン交換樹脂を通して所望の塩を形成しても、あるいは同様の一般的な方法を用いて生成物のある塩の形態を他のものと変えてもよい。
【００５６】
ペプチドの使用
ここでのペプチドは、例えば、特定の細胞、組織、又は血清におけるＩＧＦ−１の発現を検出するための診断アッセイにおいても有用である。
診断的応用においては、ペプチドは典型的に検出可能な部分で標識される。一般的に以下の範疇に分類される多数の標識が利用可能である：
（ａ）放射性同位体、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ等。ペプチドは、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen等編集, (Wiley-Interscience, New York, 1991)に記載された技術を用いて放射性同位体で標識され、放射性はシンチレーションカウンティングにより測定できる。
（ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、リサミン(Lissamine)、フィコエリトリン及びテキサスレッド等が使用できる。蛍光標識は、例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いてペプチドに結合させることができる。蛍光は蛍光定量計によって定量できる。
（ｃ）種々の酵素−基質標識が利用でき、米国特許第4,275,149号は、それらの幾つかの概説を提供している。酵素は一般に種々の技術を用いて測定可能な色素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒し、それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させうる。蛍光変化を定量化する技術は上述している。化学発光基質は化学反応によって電子的に励起され、ついで（例えば化学発光計を用いて）測定可能な光を放出するか、又は蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が含まれる。酵素を抗体に結合させる技術は、O'Sullivan等, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (編集J. Langone & H. Van Vunakis）, 73: 147-166 (Academic Press, New York, 1981)に記載されている。
【００５７】
酵素−基質の組み合わせの例は、例えば以下を含む：
(i)セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素で、過酸化水素が染料前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３,３',５,５'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））を酸化する；
(ii)アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート；及び
(iii)β-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ。
当業者には、数多くの他の酵素−基質の組み合わせが利用可能である。これらの一般的な概説は、米国特許第4,275,149号及び第4,318,980号を参照のこと。
標識はペプチドに間接的に結合される場合もある。当業者であれば、これを達成するための種々の技術を知っているであろう。例えば、ペプチドにビオチンを結合させ、上述した３つの広い範疇の標識の任意のものにアビジンを結合するか、又はその逆が可能である。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、よってこの間接的な方式でペプチドに標識を結合させることができる。あるいは、ペプチドとの標識の間接的な結合を達成するために、ペプチドに小さなハプテン（例えばジゴキシン）を結合させ、上述の異なるタイプの標識を抗-ハプテンペプチド（例えば抗ジゴキシン抗体）に結合させる。よって、ペプチドとの標識の間接的な結合を達成できる。
【００５８】
本発明の他の実施態様では、ペプチドを標識する必要はなく、その存在がペプチドに結合する標識抗体を用いて検出できる。
本発明のペプチドは任意の公知のアッセイ法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等で用いられうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
またペプチドはインビボ診断アッセイにも使用できる。一般に、ペプチドは放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５Ｓ等）で標識され、抗原又はそれを発現する細胞が免疫シンチオグラフィーによって局在化され得る。
本発明のペプチドは、ＩＧＦ−１に結合し、ＩＧＦ−１へのＩＧＦＢＰ−３及びＩＧＦＢＰ−１結合を阻害することが示される。本発明のペプチドを、哺乳動物、例えばペプチドの投与が有効でありうる疾患又は疾病に罹っている、或いは罹りやすい患者の治療に使用してもよいことが予期される。ＩＧＦにより引き起こされる多くの疾患があることは当業者に周知のことである。これらの疾患は上記される。
【００５９】
疾患がＩＧＦレセプターを有する腫瘍を含む癌である場合、治療の効果は、例えば腫瘍の大きさ又は腫瘍のＩＧＦレセプターへの結合に使用できるＩＧＦの量の減少を含む、臨床的な徴候又は症状の減少によって評価することができる。これらのプロトコールの例は、当分野でよく知られている。例えば、ペプチドはＩＧＦ依存性腫瘍を有する対象に投与することができ、腫瘍の大きさは腫瘍のタイプに応じてＭＲＩ、乳房Ｘ線撮影、又は超音波等の画像処理技術を用いて監視することができる。画像処理は、例えば月に２回実施される。また、ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰの血清レベルを、定期的に対象から得た血清試料から測定することができる。例えば、ＩＧＦに、好ましくはＩＧＦ上のＩＧＦＢＰ結合ドメインに特異的な抗体を用いて、治療した対象の血漿ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２のレベルを、放射免疫測定法で監視することができる。結合及び非結合ＩＧＦのレベルを評価するために、血漿ＩＧＦレベルをＩＧＦ及びＩＧＦＢＰの酸解離の有無において測定することができる。従って、酸解離の有無におけるＩＧＦレベルの比較によって、非結合ＩＧＦの量を測定することができる。酸解離後のＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の正常血清レベルは、通常、それぞれ約９０から３２０及び２８８−７４０μｇ／Ｌの範囲である。ここでのＩＧＦアンタゴニストペプチドの血漿レベルは、同様に、ＩＧＦアンタゴニストペプチドに特異的な高親和性モノクローナル抗体を用いて評価することができる。
【００６０】
本発明のペプチドは、例えば経口、脳室内、経皮、体外、非経口（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、気管内、又は皮下注射又は注入、或いは移植）、経鼻、肺、膣、直腸、舌下、又は局所的な投与経路を含む任意の適切な技術によって哺乳動物に投与することができ、各投与経路に適した投与形態に製剤化することができる。具体的な投与経路は、例えば、ペプチドを用いて認知された又は予測された副作用を含む患者の病歴、投与されるペプチドのタイプ、及び治すべき特定の疾患に依存しうる。より好ましくは、投与は、経口又は肺投与又は連続注入（例えば徐放装置又は浸透ポンプ等のミニポンプ又は皮膚パッチを用いる）、あるいは注射（例えば静脈内又は皮下的な手段を用いる）による。投与のための特定の方法は、米国特許第6,124,259号に見ることができる。
【００６１】
治療に使用されるペプチドは、治療される具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床症状（特に、ペプチドでの治療の副作用）、治療される疾患のタイプ及び状態、使用される具体的なペプチドのタイプ、ペプチドの送達部位、投与方法、投与計画、及び医者に既知のその他の因子を考慮に入れて、良好な医療行為に整合した形で製剤化され、調薬され、投与されるであろう。従って、ここでの目的のための投与されるべきペプチドの「有効量」は、そのような考慮により決定され、ここでの疾患を抑制、寛解、又は治療し、哺乳動物に薬剤の生物学的利用能及び所望の効果を生じるのに必要な最小量である。一般的なわりあいとして、用量につき非経口的に投与されるＩＧＦ−１アンタゴニストペプチドの製薬的に有効な総量は、用量反応曲線により測定することができる範囲にあるだろう。
疾患のタイプ及び重症度に応じて、例えば一以上の別々の投与によるか、あるいは連続注入によるかを問わず、１日に１回体重の約１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇのペプチドが患者への投与の候補的な初期用量である。典型的な毎日の投与量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であり、上記の要因に依存し、より好ましくは体重の約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇであり、皮下的に又は筋肉内に投与される場合、体重の約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである。この投与量範囲で必要な変形は、ここで教示を与える日常的な経験のみを用いて通常の当業者により決定されうる。Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, 編 (Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980)参照。数日又は長期にわたる頻回の投与については、状況に応じて、治療は症状の所望される抑制が起こるまで治療が続けられる。しかしながら、他の投薬計画を利用することもできる。この療法の進展状況は、従来技術及びアッセイにより容易に監視される。
【００６２】
ペプチドは、徐放系によって好ましく投与される。徐放性組成物の好ましい例は、成形物品、例えばフィルム、マイクロカプセルの形状の半透性ポリマーマトリクスを含む。徐放性マトリクスはポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP58,481）、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタメートとのコポリマー（Sidman等, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)（Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)）、エチレンビニルアセテート（Langer等, 上掲）又はポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸（EP133,988）を含む。徐放性組成物は、リポソーム捕捉されたペプチドも含む。ペプチドを包含するリポソームは、それ自体周知の方法によって調製される：DE3,218,121; Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang, 等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP52,322; EP36,676; EP88,046; EP143,949; EP142,641; 日本国特許出願83-118008; 米国特許第4,485,045号及び同4,544,545号; 及びEP102,324。通常、リポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単ラメラ型であり、脂質含有量は約３０モルパーセントコレステロールより大きいが、選択される比率は最も効果的な治療のために調節される。また、Langer, Nature, 392:5-10 (1998)のマイクロカプセル化技術を参照のこと。また、活性成分は、例えばコアセルべーション又は界面重合により、それぞれ例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに調製されるマイクロカプセル、コロイド薬剤供給系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマイクロエマルジョン中に捕捉されうる。このような技術は上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【００６３】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通して濾過されることにより容易に達成される。
より長い寿命を持つポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化されたペプチドも、例えば、1995年11月30日公開のWO95/32003に記載された抱合技術に基づいて使用することができる。
非経口投与について、一実施態様では、ここでのペプチドは一般に、それを所望の純度で単位投薬注射形態（溶液、懸濁液、又は乳化液）で、製薬的、又は非経口的に許容される担体、即ち、用いる用量及び濃度で受容者に無毒性であり製剤の他の成分と適合性であるものと混合することにより製剤化される。例えば、製剤は好ましくは酸化剤及びポリペプチドに有害であることが知られた他の化合物を含まない。
意図する投与法に応じて、本発明のペプチドは、例えばタブレット、坐薬、ピル、カプセル、粉末、液体、懸濁物等のような固形、反固形又は液体の投薬形態に、好ましくは正確な投与量の単一投与に適した単位投与量の形態の、医薬組成物であり得る。組成物は、上記の様に、有効量の選択されたアンタゴニストを製薬的に許容される担体と組み合わせて含み、さらに、他の薬物、医薬剤、担体、アジュバント、希釈剤等を含みうる。「製薬的に許容される」により、生物学的に又は別の望ましくないものではない物質を意味し、つまりそのような物質は、何の望まれない生物学的活性も引き起こさず、又はそれが含有される医薬組成物の他の成分の何れかと有害な形で相互作用しないで、選択されたアンタゴニストと共に個体に投与されうる。
【００６４】
固形組成物について、通常非毒性の固形担体は、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、カルボン酸マグネシウム等を含む。液体の製薬的に投与可能な組成物は、例えば、ここに記載されるようなペプチド及び適した製薬アジュバンドを例えば水、食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール、エタノール等のような賦形剤に溶解、分散すること等によって調製され、それによって溶液又は懸濁液を作ることができる。所望される場合には、投与される製薬組成物はまた、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、酢酸ナトリウムトリエタノールアミン、オレイン酸トリエタノールアミンなどのような少量の非毒性の補助的な物質を含んでいてもよい。このような投与形状を調製する実際の方法は既知であり、当業者には明らかであろう；例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 上掲参照。
経口投与について、微粉末又は顆粒は、賦形剤、分散剤及び／又は界面活性剤を含んでいてもよく、水又はシロップ中に、乾燥状態でカプセル又はパック(sachet)中に、あるいは懸濁薬剤が含まれうる懸濁液又は非水溶液中に、あるいは結合剤及び潤滑剤が含まれうるタブレットに、あるいは水又はシロップの懸濁液中に存在しうる。所望される場合又は必要な場合、香料、防腐剤、懸濁剤、増粘剤、又は乳化剤を含みうる。タブレット及び顆粒は好ましい経口投与形態であり、これらはコートされていてもよい。
非経口投与が用いられる場合、一般的には注射に特徴づけられる。注射可能なものは、溶液形態又は懸濁液、注射の前に溶液又は懸濁液にするのに適した固体形態、あるいは乳化液のような従来の形態に調製されうる。より最近改良された非経口投与の方法は、一定レベルの投与量を維持するような徐放性又は持効性系の使用を含む。
【００６５】
一般に、製剤は、ペプチドを液体担体又は微細に分けた固体担体又はその両方と均一かつ密に接触させることにより調製される。次いで、必要ならば、生成物を所望の製剤に成形する。好ましくは、担体は非経口用担体、より好ましくは患者の血液と等張の溶液である。このような担体媒体の例は、水、食塩水、リンゲル液、緩衝溶液、及びデキストロース溶液を含む。不揮発性オイル及びオレイン酸エチルなどの非水性媒体も、ここで有用である。
担体は、好ましくは等張性及び化学的安定性を向上させる物質等の少量の添加剤を含有する。このような物質は、用いる用量及び濃度で受容者に無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、及び他の有機酸又はその塩等のバッファー；アスコルビン酸等の酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、又はアルギニン等のアミノ酸；セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオン；ポリソルベート、ポロキサマー、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤；及び／又は中性塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２等である。
ペプチドは典型的にはこのような媒体中に、約４．５から８のｐＨで製剤化される。上記の賦形剤、担体、又は安定化剤の或るものを使用することがペプチドの塩の形成をもたらすことが理解されるであろう。最終的な調製物は安定な液体又は凍結乾燥固体であってよい。
【００６６】
治療用投与に使用されるペプチドは無菌でなければならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通す濾過により容易に達成される。治療用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内溶液バッグ又はバイアル内に配される。
ペプチドは通常、単位又は複数回用量の容器、例えば密封されたアンプル又はバイアルに、水溶液として又は凍結乾燥された再構成用製剤として保存される。凍結乾燥された製剤の例として、１０-ｍＬバイアルは、５ｍＬの滅菌濾過された１％(w/v)のペプチド水溶液が充填され、得られた混合物が凍結乾燥される。注入用溶液は、凍結乾燥されたペプチドを静菌性の注射用水を用いて再構成することにより調製される。
本発明の投与の好ましい経路はエアロゾル又は吸入形態である。本発明のペプチドは、分散剤(dispersing agent or dispersant)と組み合わせて、乾燥粉末として又は希釈液を用いた溶液又は懸濁液としてエアロゾル形態で投与することができる。
好ましい分散剤はこの分野で良く知られ、限定されないが、界面活性剤などを含む。例えば、液体エアロゾルを形成する溶液の噴霧によって生ずる、ペプチドの表面誘発性の凝固を抑制するためにこの分野で一般に使用される界面活性剤を使用できる。このような界面活性剤の非限定的な例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含む。使用される界面活性剤の量は変化するが、一般には製剤の０．００１〜４重量％の範囲である。特定の態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート又はソルビタントリオレエートである。好ましい界面活性剤はこの分野で知られており、特定の製剤、ペプチドの濃度、希釈剤（液体製剤における）又は粉末の形態（乾燥粉末製剤における）等に応じて、意図する特性に基づいて選択される。
【００６７】
さらに、ペプチドの選択、意図する治療効果、肺組織の質（例えば疾患又は健常な肺）、及び多くの他の要因に応じて、液体又は乾燥製剤は以下にさらに述べるような付加的成分を含有してもよい。
液体エアロゾル製剤は、一般に、生理学的に許容される希釈剤中に、ペプチド及び分散剤を含有する。本発明の乾燥粉末エアロゾル製剤は、微細に分割した固体形態のペプチド及び分散剤からなる。液体又は乾燥粉末エアロゾルのいずれかで、製剤はエアロゾル化される。即ち、エアロゾル化された投薬が実際に肺胞に到達することを確実にするために、液体又は固体粒子まで分解する必要がある。一般に、マス媒体の動力学的半径は、薬物粒子の肺胞への到達を確実にするために約５マイクロメートル以下とされる（Wearley, Crit. Rev. in Ther. Drug Carrier Systems 8: 333 (1991)）。エアロゾル粒子は、肺性投与に、即ち肺胞に到達するのに適した、液体又は固体粒子である。輸送装置の構成といった他の考慮では、製剤中の付加的な成分及び粒子の特性が重要である。この態様の薬剤の肺性投与は当業者に良く知られており、製剤の操作、エアロゾル化手段及び輸送装置の構成は、当分野の通常の技術者によるもっとも日常的な実験で必要なものである。
輸送装置の構成に関して、エアロゾル化のあらゆる形態がこの分野で知られており、限定されないが、液体製剤の噴霧、微粒化又はポンプエアロゾル化、及び乾燥粉末製剤のエアロゾル化を含み、本発明の実施に使用できる。固体製剤の投与に特に設計された輸送装置が考慮される。しばしば、液体又は乾燥粉末製剤のエアロゾル化は推進剤を必要とする。推進剤はこの分野で一般に使用される任意の推進剤でよい。これらの有用な推進剤の特定の非限定的な例は、クロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、又はトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１,１,１,２-テトラフルオロエタン又はこれらの混合物を含む炭化水素である。
【００６８】
本発明の好ましい態様では、エアロゾル化のための装置は、計量用量吸入器である。計量用量吸入器は、投与したときに投与に応じて変化する用量ではなく特定の用量を与える。このような計量用量吸入器は、液体又は乾燥粉末エアロゾル製剤の何れにも使用できる。計量用量吸入器はこの分野で良く知られている。
ペプチドがひとたび肺に到達すると、多くの用量依存的因子が薬剤吸収に影響する。ペプチドの循環レベルを要求する疾患又は障害の治療において、エアロゾル粒子サイズ、エアロゾル粒子形状、感染、肺疾患又は塞栓の有無などの因子がペプチドの吸収に影響しうることは理解されるであろう。ここに記載した各製剤について、ある種の滑剤、吸収促進剤、タンパク質安定化剤又は懸濁剤が適当であることもある。これらの付加的な薬剤の選択は、目的に応じて変化する。ペプチドの局部的輸送が望まれ意図されている場合、吸収促進などの変化はあまり重要ではなくなることは理解されるであろう。
本発明の液体エアロゾル製剤は、典型的には噴霧器で使用される。噴霧器は、圧縮空気又は超音波のいずれでもよい。当分野で周知のあらゆる噴霧器が、本発明と組み合わせて使用でき、限定するものではないが：ULTRAVENT(商品名)ネブライザー, Mallinckrodt, Inc. (St. Louis, MO); ACORN II(商品名)ネブライザー（Marquest Medical Products, Englewood CO）である。本発明と組み合わせて有用な他の噴霧器は、米国特許第4,624,251号；3,703,173号；3,561,444号；及び米国特許第4,635,627号に記載されている。
【００６９】
液体エアロゾル製剤は担体を含んでもよい。担体は、循環系に可溶で生理学的に許容される高分子であり、生理学的な許容とは、当業者が前記担体を治療計画の一部として患者に注入することを許容することを意味する。担体は、好ましくは循環系において比較的安定であり、クリアランスのための許容される血漿半減期を持つ。このような高分子は、限定されないが、ダイズレシチン、オレイン酸及びソルビタントリオレエートを含み、ソルビタントリオレエートが好ましい。
ここでの液体エアロゾル製剤は、タンパク質安定化又は浸透圧の調製のための他の薬剤を含んでもよい。この薬剤の例は、限定されないが、塩化ナトリウム、又は塩化カリウムなどの塩、及びグルコース、ガラクトース又はマンノースなどの炭水化物等を含む。
また、この製薬製剤は、微細に分割した粉末形態のペプチド及び分散剤を含む乾燥粉末吸入製剤として使用することも考慮される。ペプチドの形態は一般に、凍結乾燥された粉末である。ペプチドの凍結乾燥された形態は、標準的な技術を通して得られる。
他の実施態様では、乾燥粉末製剤は、本発明の一以上のペプチドを含む微細に分割された乾燥粉末、分散剤及びバルク剤も含有する。本発明の製剤と組み合わせて有用なバルク剤は、装置からの粉末の分散を促進する量のラクトース、ソルビトール、スクロース、又はマンニトールなどの薬剤を含む。
【００７０】
また、ここでの製剤は、治療される特定の症状に必要とされる複数の活性化合物、好ましくは互いに不利に影響しない補完的な活性を有するものを含んでいてもよい。従って、本出願は、ペプチドと、治療される具体的な症状によって決まる、一以上の他の治療薬とを組み合わせることが考慮される。薬剤はＧＨ、ＧＨＲＰ，ＧＨＲＨ、ＧＨ分泌促進物質、ＩＧＦＢＰ、ＡＬＳ、ＧＨＢＰと複合したＧＨのような内分泌薬であってもよいが、好ましくは、特に癌を治療するための細胞障害剤である。例えば、ペプチドは他のペプチド（あるいは多価抗体）、一価又は二価抗体（又は抗体）、化学療法剤（化学療法剤のカクテルを含む）、他の細胞障害剤、抗血管形成剤、サイトカイン、及び／又は成長阻害剤と共に同時投与されうる。ペプチドがアポトーシスを誘発する場合、アポトーシスをまた誘発する一又は複数の他の治療剤とペプチドを組み合わせることが特に望ましいであろう。例えば、ペプチドをＢ細胞表面抗原に対するプロアポトーシス抗体（例えば二価又は多価抗体）（例えばＲＩＴＵＸＡＮ(登録商標)、ＺＥＶＡＬＩＮ(登録商標)又はＢＥＸＸＡＲ(登録商標)抗ＣＤ２０抗体）と、及び／又は（１）プロアポトーシス抗体（例えばＴＮＦレセプタースーパーファミリーのレセプターに対する二価又は多価抗体、例えば抗ＤＲ４もしくは抗ＤＲ５抗体）又は（２）サイトカインのＴＮＦファミリーのサイトカイン（例えばＡｐｏ２Ｌ）と組み合わせることができる。同様に、ペプチドを抗ＥｒｂＢ抗体（例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）抗ＨＥＲ２抗体）単独と一緒に、又は（１）及び／又は（２）と組み合わせて投与することができる。別法として、又は付加的に、患者は併用放射線療法（例えば外的ビーム照射あるいは抗体のような放射標識剤での治療法）、卵巣切除、化学的又は外科的、又は骨髄移植又は末梢血幹細胞レスキュー併用高用量化学療法、あるいは移植を受けてもよい。上に言及したそのような併用療法には併用投与（２以上の薬剤が同一の又は別の製剤中に含まれる）、及び別個の投与が含まれ、その場合には、ペプチドの投与を補助療法又は療法群の投与の前及び／又は後に行うことができる。このような他の薬剤の有効量は、処方におけるペプチドの量、疾患治療のタイプ、及び上述の他の因子に依存する。これらは一般的に、上文で使用されるような投与経路によって同じ投与量で、あるいは従来用いられる投与量の約１〜９９％である。
【００７１】
任意には、ペプチドが哺乳動物に投与される前に、様々なマーカーのレベルを測定して疾患の状態を決定する。従って、癌のような疾患を予測、診断及び監視する尺度としてアッセイをＩＧＦレベル、特にＩＧＦ−１の測定に使用することができる。ＩＧＦ−１と乳癌又は前立腺癌の危険との間の強い一定のポジティブな関連性が、特にＩＧＦＢＰ−３の調整において観察されている。WO99/38011参照のこと。高レベルのＩＧＦ−１は前立腺癌の危険増大の予測性があるが、ＩＧＦＢＰは防御効果を有する。更に、ＩＧＦ又はＩＧＦ／ＩＧＦＢＰアッセイを、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の試験と組合せ、向上した性能によって患者の診断及び監視治療を予測することができる。該方法は、哺乳動物由来のボディサンプルにおけるＩＧＦ又はＩＧＦＢＰ−３及び／又はＰＳＡの濃度を測定することを含み、正常基準値と比較した場合のこのような成分の濃度の相違が前立腺癌の増大した危険を示す。
一実施態様では、治療の前にＩＧＦ−１の濃度を哺乳動物由来のボディサンプルにおいて測定し、その場合ＩＧＦ−１の基準範囲を超えるＩＧＦ−１濃度増大は前立腺癌の増大した危険を示す。
他の実施態様では、該方法は、個体からの検体におけるＩＧＦ−１及びＩＧＦＢＰの濃度を測定することを含み、その場合正常な基準範囲値に比較して増大したＩＧＦ−１及び減少したＩＧＦＢＰは前立腺癌の増大した危険を示す。
さらに他の実施態様では、該方法は、個体のＩＧＦ／ＰＳＡ状態を測定することを含む。高ＩＧＦ及びＰＳＡレベル及び／又は低ＩＧＦＢＰレベルは重症の前立腺癌の危険性がある個体又は悪い予後のある前立腺癌を有する個体を示す。
【００７２】
ＩＧＦＢＰ−３濃度に対するＩＧＦ−１濃度の多変量調整は、調整された正常な基準範囲値と比較することができる調整されたＩＧＦ−１レベルを提供する。統計分析の分野の技術者はアルゴリズムを設計することができ、それは使用者に、前立腺疾患の予測又は監視に使用するための調整されたＩＧＦレベル又はＩＧＦ状態の素速い計算を可能にする。上記の方法と同様にして作成された更なる患者のデータと共に、ＩＧＦ状態のパラメータの正常な基準範囲値をより正確に定義することが可能であり得る。アルゴリズム及び正常基準値を用いて、エンドユーザーがＩＧＦ、ＩＧＦＢＰを入力して個体のＩＧＦ状態又は危険指標を容易に測定することができる装置を作ることができる。同様に、個体のＩＧＦ／ＰＳＡ状態を示す装置を提供することができる。
ＩＧＦの状態はＩＧＦ及びＩＧＦＢＰのレベルで示される。例えば、高いＩＧＦ状態は、高いレベルのＩＧＦ及びＩＧＦ刺激物質の活性、並びに低レベルのＩＧＦ活性阻害物質、例えばＩＧＦＢＰにより示される。個体のＩＧＦ状態は、限定するわけではないが前立腺腺癌及び前立腺肥大症を含む、前立腺に関与する特定の症状で上昇又は下降の変化をすることが現在知られている。ＩＧＦ／ＰＳＡ状態はＩＧＦ状態とＰＳＡレベルの組合せである。高いＩＧＦ／ＰＳＡ状態を有する個体は進行した重症の前立腺癌の危険性がある。高いＩＧＦとＰＳＡのレベル及び低いＩＧＦＢＰレベルは高いＩＧＦ／ＰＳＡ状態を示す。
【００７３】
「前立腺疾患」とは、限定するものではないが前立腺癌又は前立腺肥大症を含む前立腺の病的な状態に関する疾患又は障害を含む。ここでの方法は、個々の進行した前立腺癌の危険を測定するために好ましく使用される。
哺乳動物から回収されたボディサンプルを、静脈穿刺又は毛細管穿刺、あるいは組織診を含むあらゆる方法によって得ることができ、検体を入れるのに適切な容器に検体を回収する。あるいは、検体は濾紙に置かれてもよい。
ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰ及び／又はＰＳＡは、免疫測定法、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、及び放射免疫測定法（ＲＩＡ）を含む、当業者によく知られた技術によって測定することができる。例えば、米国特許第5,935,775号；6,066,464号；及び5,747,273号；Zapp等, J. Clin. Invest., 68: 1321-1330 (1981)；及びEP700,994に記載されるアッセイがここでは特に適している。さらに、ＩＧＦ、ＩＧＦＢＰ、及び／又はＰＳＡの濃度は、例えばDiagnostic Systems Laboratories社、ウェブスター、テキサス州により供給される試験キットによって測定することもできる。好ましい実施態様では、総ＩＧＦ−１が測定されうる。場合によっては、総ＩＧＦ−１、結合ＩＧＦ−１及び／又は遊離ＩＧＦ−１を測定するのが有利である。例えば、ＩＧＦ−１（Khosravi等, Clin. Chem., 42: 1147-54 (1996)）、ＩＧＦＢＰ−３（Khosravi等, Clin. Chem., S6:234 (1996)）及びＩＧＦＢＰ−１（Khosravi等, Clin. Chem., S6:171 (1996)）の正確な測定に適切な高特異性の単純非競合ＥＬＩＳＡについて記載がある。これらの免疫測定法で取り込まれる高親和性抗体は、密接に関連するペプチド又は結合タンパク質による交差反応性又は干渉の欠損について選択されている。
【００７４】
循環ＩＧＦ−１の最も高い四分位値の男性は、最も低い四分位値の男性に比較して、前立腺癌の相対危険度４．３２（９５％信頼区間１．７６−１０．６）を有する。ＩＧＦ−１レベルでの１００ｎｇ／ｍｌ増加が危険性の倍増（ｐ＝０．００１）に関係するというように有意な直線傾向があった。さらに、この関係は、正常な、並びに上昇した基準ＰＳＡレベルを有する男性で明白である。これらの結果は、循環ＩＧＦ−１が前立腺癌の危険性の予測指標であることを示す。
さらに、本発明はＩＧＦアンタゴニストペプチドをコード化する核酸を用いて、哺乳動物を治療するための遺伝子治療の使用も考慮される。一般に、遺伝子治療は、哺乳動物のＩＧＦレベルの増加（又は過剰発現）に用いられる。ＩＧＦアンタゴニストペプチドをコード化する核酸をこの目的に使用することができる。一旦アミノ酸配列が既知となれば、遺伝子コードの縮重を用いて幾つかの核酸分子を作成することができ、遺伝子治療に使用するものを選択することができる。
遺伝子治療の目的で核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために、インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常はＩＧＦアンタゴニストペプチドが必要とされている部位で、患者に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する。米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかによって様々である。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【００７５】
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、DOTMA、DOPE、及びDC-Cholである）での形質移入を含む。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞にターゲティングする試薬、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられる。このようなタンパク質は、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はそのフラグメント、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質を含む。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、WO93/25673及びそこに引用された参考文献も参照。
【００７６】
製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を含む製造品又はキットが提供される。製造品は容器とラベル又は容器内に挿入されるか添付されるパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含み、好ましくはバイアルである。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、少なくともここでのペプチドを含む組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。挿入物は、癌等の特定の疾患を治療するための薬剤の使用方法を使用者に示す。任意には、キットは、細胞障害剤など、上記されるような更なる活性剤を含む組成物を含む第２の容器を具備していてもよい。別に、あるいは加えて、製造品は更に、製薬的に許容可能な希釈バッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）の容器を具備してもよい。製造品は、更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
本発明は、次の実施例の言及によりさらに十分に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定して解釈させるものではない。ここで挙げられた全ての引用文献及び特許の開示は、出典明示によって明示的に取り込まれる。
【００７７】
（実施例）
インビボ及びインビトロにおけるここでのペプチドの予測される作用に関する、モデル化合物におけるデータ（残基２４と３１にアミノ酸置換（Ｙ２４Ｌ、Ｙ３１Ａ）を有するＩＧＦ−１突然変異、また（Ｌｅｕ２４、Ａｌａ３１）ｈＩＧＦ−１又はＩＧＦ−Ｍとも称される）は、上掲のWO98/45427にも記載される。WO98/45427はまた、ヒトでの使用のための、ＩＧＦアンタゴニストの投与法も記載する。用いられるＩＧＦ−１の用量及び示されるＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の濃度から、活性内因性ＩＧＦレベルの減少のためにどの程度のＩＧＦアンタゴニストが与えられるべきか算出することは容易である。ＩＧＦ−１の分子サイズ、ＩＧＦ−１に対するＩＧＦアンタゴニストの親和性、及びその生物学的利用能は、ヒトの活性ＩＧＦを減少させる用量に達するように考慮される他の変数である。
【実施例１】
【００７８】
実験方法
多価未処置ペプチドライブラリーの構築
Sidhu等, Methods Enzymol.,328: 333-363 (2000)の方法を用いてライブラリーを構築し、そこではＩＰＴＧ誘発性Ｐｔａｃプロモーターを含むファージミドが用いられ、これは次の形態の融合タンパク質をコード化するオープンリーディングフレームの発現を誘導する：ＳＴＩＩ分泌シグナル（MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA；配列番号：８）その後のランダムペプチド（つまり未処置ペプチドライブラリーのメンバー）、その後のリンカー（GGGSGGG；配列番号：９）、その後のＭ１３遺伝子８主要コートタンパク質（AEGDDPAKAAFNSLQASATEYIGYAWAMVVVIVGATIGIKLFKKFTSKAS；配列番号：１０）。２２の異なるペプチドライブラリーを表１に示されるように構築した。未処置ライブラリーを提示するファージを、上掲のSidhu等に記載されるようにＰＥＧ／ＮａＣｌでの沈降によって精製し、−７０℃で凍結保存した。
【００７９】
未処置ペプチド−ファージライブラリーからのＩＧＦ−１結合ペプチドの単離
ＩＧＦ−１を米国特許第5,342,763号に記載されるようにして社内で入手した。
免疫吸着プレート（Nunc Maxisorp）を５μｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を含有する50mMの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）で１時間、室温でコートし、続いて０．２％のＢＳＡを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳ、０．０５％のＴＷＥＥＮ(登録商標)−２０洗浄剤で４回洗浄した。
２６の未処置ペプチドライブラリー由来のファージ（表１）をプールした。ＩＧＦ−１に特異的に結合するペプチド−ファージを選択するために、ライブラリーのプールを前記のＩＧＦ−１コートプレートに添加した。第１ラウンドの選択では、４．８ｍＬのファージ溶液（約１０１３ファージ／ｍＬ）を４８のコートしたウェルに添加した（１００μｌ／ウェル）。撹拌しながらの２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)−２０洗浄剤で１２回洗浄して、結合していないファージを取り除いた。次に、結合したファージを０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．０で５分間抽出し（１００μｌ／ウェル）、ファージ溶離液を１／６体積の１．０ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０を添加することにより中和した。抽出したファージを、Ｍ１３−ＶＣＳヘルパーファージを有する大腸菌ＸＬ−１ｂｌｕｅ細胞の増殖により増幅させ、更なるラウンドの結合選択を増幅したファージのプールで実施した。全体で、４回の結合選択を実施した。ラウンド３の手順は、ラウンド１で記載した通りであるが、ラウンド２とラウンド４はブロッキング溶液とファージカクテルがともにＢＳＡの代わりに０．２％のカゼインを使用している点のみ異なる。
各ラウンドから個々のペプチド提示ファージを単離し、ファージＥＬＩＳＡで、プレートに固定化されたＩＧＦ−１でペプチド−ファージを捕獲し、結合ファージを検出することによってＩＧＦ−１への結合を分析した（下記参照）。また、非特異的結合のコントロールとして、ＢＳＡでコートしたプレートを用いるファージＥＬＩＳＡで、ファージを分析した。プレートに固定されたＩＧＦ−１によるファージＥＬＩＳＡにおいて強いシグナルを示すが、コントロールＥＬＩＳＡでは示さないファージで、ＤＮＡ配列分析を実施した。ポジティブなファージクローンの配列決定の結果は表２ａに見られる。
【００８０】
ＩＧＦ−１結合ペプチドの第２世代の親和性成熟
表２ａに示されるＣＸ９Ｃクラス由来のＩＧＦ−１結合ペプチドを配列の相同性に基づいて２つの異なるファミリーに分類することができた。２つのファミリーにおける配列の保存に基づいて、高度に保存された残基を常に保持し、部分的なランダム化を与える縮重コドンによって中程度に保存された残基を示し、さらに２０全ての天然アミノ酸をコード化するコドン（ＮＮＫ）によって非保存性の残基を示す、４つの第２世代ライブラリーを作成した（表２ｂ）。ファージコートのＰ３に融合したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＮ末端でペプチドファージライブラリーを提示し、一価的に裏付けた（表２ｂ）。
ライブラリーからのファージをプールし、上記のような４ラウンドの結合選択を実施した。ラウンド１及び３は、捕獲標的として固定ＩＧＦ−１を使用してＩＧＦ−１に特異的に結合するファージを選択し；０．２％のＢＳＡをブロッキングバッファー及びファージカクテルに使用した。ラウンド２及び４は、捕獲標的として抗ｈＧＨモノクローナル抗体３Ｆ６.Ｂ１.４Ｂ１（Jin等, J. Mol. Biol., 226: 851-865 (1992)）を用いて、ｈＧＨをさらに提示するファージを選択し、従って、ｈＧＨ遺伝子が欠落しているクローンに対して選択し；０．２％のカゼインをブロッキングバッファー及びファージカクテルに用いた。
最後に、０．２％のＢＳＡを含む１．０ｎＭのビオチニル化ＩＧＦ−１（ｂｉｏ−ＩＧＦ）含有ＰＢＳとともに、回収したファージのプールを２時間インキュベートすることにより、第５ラウンドの選択を実施した。ファージ及びｂｉｏ−ＩＧＦ溶液を、前もってＢＳＡでブロックし、上記のようにして洗浄しておいたストレプトアビジン結合磁気ビーズに添加した。３０分後、磁気ビーズをＰＢＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)洗浄剤で１２回洗浄して、結合していないファージを取り除いた。残ったファージを１．０ＭのＨＣｌで抽出し、１／６体積の１．０ＭのＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０を添加することにより中和した。
ラウンド５からの個々のファージクローンを単離し、ファージＥＬＩＳＡで分析した。特異的に結合したファージクローンを、ＩＧＦ−１及び抗ｈＧＨの両方に結合するがＢＳＡには結合しないものと定義した。これらのポジティブクローンにはＤＮＡ配列分析を実施し、結果は表３に示される。
【００８１】
ファージＥＬＩＳＡ
ファージミドを有する大腸菌ＸＬ−１ｂｌｕｅを、２ＹＴ、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及びＭ１３−ＶＣＳヘルパーファージ（１０１０ファージ／ｍＬ）において３７℃で一晩増殖させた。ＰＥＧ／ＮａＣｌで２回沈殿させることにより培養液の上清からファージを回収し、リン酸緩衝食塩水、０．２％のＢＳＡ、０．１％のＴＷＥＥＮ(登録商標)−２０洗浄剤（ＢＳＡブロッキングバッファー）に再懸濁した。ファージの濃度を分光光度的に測定した（λ２６８＝１．２×１０８Ｍ−１ｃｍ−１）。
ＭＡＸＩＳＯＲＰ(商品名)イムノプレート（９６穴）を室温で２時間、捕獲標的タンパク質でコートした（５０ｍＭの炭酸バッファー中に５μｇ／ｍＬで１００μＬ、ｐＨ９．６）。次いで、０．２％のＢＳＡを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でプレートを１時間ブロックし、ＰＢＳ，０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)−２０洗浄剤で８回洗浄した。ファージ粒子をＢＳＡブロッキングバッファーに段階希釈し、１００μＬを、コートしたウェルに移した。１時間後、プレートをＰＢＳＤ、０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)−２０洗浄剤で８回洗浄し、３０分間１００μＬの１：３０００西洋わさびペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体コンジュゲートを含有するＢＳＡブロッキングバッファーとともにインキュベートし、次いで、ＰＢＳ、０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)−２０洗浄剤で８回、ＰＢＳで２回洗浄した。プレートをテトラメチルベンジジン基質（ＴＭＢ、Kirkegaard及びPerry, Gaithsesburg, MD）を用いて展開させ、１．０ＭのＨ３ＰＯ４で停止させ、分光光度的に４５０ｎｍでと読み取った。
【００８２】
一価ファージＥＬＩＳＡによる親和性測定
改変したファージＥＬＩＳＡを用いて、上掲のSidhu等及び上掲のClackson等に記載されるように一価形式で提示される選択された第２世代ＩＧＦ−１結合ペプチドの結合親和性を評価した。ＩＧＦ−１でコートしたプレートを用いて、ファージＥＬＩＳＡを上記のようにして実施した。ペプチド提示ファージを段階希釈し、結合を測定して、飽和で＜５０％のＥＬＩＳＡシグナルを与えるファージ濃度を決定した。
固定した亜飽和濃度のファージ−ペプチドを、ＩＧＦ−１の段階希釈と混合して１．０時間インキュベートし、次いでＩＧＦ−１でコートしたアッセイプレートに移した。３０分のインキュベーションの後にプレートを洗浄し、上記のように展開させた。ＩＧＦ−１に対するペプチドの結合親和性をＩＣ５０値として測定し、このＩＣ５０値は固定されたＩＧＦ−１に結合するペプチド−ファージの５０％を阻害するＩＧＦ−１濃度とした。結果を表４に示す。
【００８３】
ペプチド合成
ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学法を利用してＰＥＧポリスチレン樹脂（Bodansky及びBodansky, in The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, New York, 1984)）０．２ｍＭでの手動又は自動（Milligen 9050）固相合成によって合成される。精製は、Duvaquie及びLowman, Biochemistry, 38: 6386-6396 (1999)に記載されるものと同様である。合成したペプチドを表５に示す。
ＩＧＦ結合タンパク質に結合するファージＩＧＦ−１のペプチド阻害
ＩＧＦＢＰ−１及びＩＧＦＢＰ３の阻害について、上掲のDubaque及びLowmanに記載されているようにしてヒトＩＧＦ−１を提示するファージベクターｐＩＧＦ−ｇ３で新たに形質転換した大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Stratagene）を、５ｍｌの２ＹＴ培地で一晩増殖させた（Sambrook等, Molecular Cloning. A Labotratory Handbook (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)）。ＩＧＦ−１提示ファージを、合成ペプチド及び結合タンパク質基準物質の段階希釈とともに４５分間あらかじめインキュベーションした５００−１０００倍希釈のものについて、ＩＧＦｂｐ１及びｂｐ３に対して滴定した。免疫吸着プレートを、ＩＧＦ結合タンパク質でコートし、０．５％のＴＷＥＥＮ(登録商標)−２０洗浄剤及びＰＢＳでブロックし、上記のようにして洗浄した。試料を２０分間プレートに添加し、上記のようにして洗浄及び検出を行った。実験で得たＩＣ５０値を表５に示す。
【００８４】
ＩＧＦ−１結合ペプチド活性の細胞ベースインスリンＫＩＲＡアッセイ
ヒトインスリンレセプター（ｈＩＲ）のリン酸化を測定するためのキナーゼレセプター活性化アッセイ（ＫＩＲＡ）（Sadick等, J. Pharm. Biomed. Analysis, 19: 883-891 (1999)）は、ｈＩＲを形質移入したチャイニーズハムスター卵巣細胞を用いて展開した。（ＴＲＹ−ＩＲ５．３）細胞を、培地（ＰＳ／２０）とともに３７℃で一晩、９６穴プレートで増殖させた。上清をデカントし、何れかのペプチド試料（２５ｎｍのＩＧＦ−１とともに１時間インキュベートしたペプチド）、実験用コントロール（ＩＧＦ−１とともに１時間インキュベートしたＩＧＦ Ｂｐ１）、及び２５ｎｍのｒｈＩＧＦ−１基準物質を含有する刺激培地を添加した。３７℃での１５分の刺激後、刺激溶液を除去し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００(商品名)オクチルフェニルエチレンオキシド縮合物、１ｍＭのＡＥＢＳＦ、アプロチニン及び０．０５ｍＭのロイペプチン、及び２ｍＭの正バナジン酸塩を含有するバッファーで細胞を溶解した。ライセートをＥＬＩＳＡのために−７０℃で凍結させた。免疫吸着プレートを２マイクロｇ／ｍｌのインスリンレセプターＡｂ−２（クローン８３−７）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．０で一晩、４℃でコートした。プレートをブロックし、上記のようにして洗浄した。形質移入したｈＩＲを含有する細胞ライセートを捕獲ＥＬＩＳＡプレート上で２時間インキュベートした。洗浄によって結合していないレセプターを除去した後、ビオチニル化抗リン酸化チロシン４Ｇ１０（Upstate Biological社）を添加して、活性化したレセプターを検出した。２時間後、プレートを上記のようにしてＨＲＰ及びＴＭＢ基質にコンジュゲートしたストレプトアビジンで展開した。結果を表５に示す。
【００８５】
ＭＣＦ−７細胞でのＩＧＦ−１の置換
合成されたペプチドによる細胞上レセプターに対する１２５Ｉ ＩＧＦ−１の阻害を検出するために、ＩＧＦレセプター並びにインスリンレセプターを発現するＭＣＦ７（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ、ベテスダ、メリーランド州）、乳癌細胞株（Grupe等, J. Biol. Chem., 270, 22085-22088 (1995)）を使用した。高グルコースＤＭＥＭ／ハムＦ１２の５０／５０混合物、１０％のウシ胎児血清及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２を含有する培地で細胞を毎週継代させた。細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２に維持して一晩増殖させた。ＩＧＦ−１のヨウ素化のために、５０μｇのＩＧＦ−１を２００μＬのＰＢＳに希釈し、１００μｇのＩＯＤＯＧＥＮ(登録商標)１,３,４,６-テトラクロロ-３α-６β-ジフェニルグリコウリル（Pierce Chemical Co.）でコートしたチューブに添加し、１ｍＣｉの１２５Ｉ−Ｎａｌ（１０μＬ）とともに室温で１０−１５分間インキュベートした。合成されたペプチド及び結合タンパク質コントロールを２ｎｍの１２５Ｉ ＩＧＦ−１とともに３７℃で４０分間プレインキュベートした。試料を３０分間細胞に添加した。細胞を培地で洗浄し、１ＮのＮａＯＨで溶解した。１５分後、計数し、結果を表５に示す。
【００８６】
細胞ベースＩＧＦ−１ ＫＩＲＡアッセイ
ヒト１型ＩＧＦ−１レセプターの活性化を測定するためのＫＩＲＡを、ヒトＭＣＦ−７細胞を用いて実施した（上記のように行う）。細胞を培地（５０：５０のＦ１２／ＤＭＥＭ、Gibco）とともに９６穴プレートで一晩増殖させた。上清をデカントし、コントロール（ＩＧＦ Ｂｐ１又はＢｐ３とともにプレインキュベートした２ｎＭのＩＧＦ−１）又は実験試料（２ｎｍのＩＧＦ−１とともに３０分間プレインキュベートしたペプチド）の何れかを含む刺激培地（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び０．２％のＢＳＡを含有する５０：５０のＦ１２／ＤＭＥＭ）を添加した。１５分の刺激後、細胞を溶解し、免疫吸着プレート上に一晩コートされたポリクローナル抗ＩＧＦ−１Ｒ（３Ｂ７ Santa Cruz Biotech）に添加した。検出ＥＬＩＳＡを上記のように実施した。結果は表５に見られる。
【００８７】
結果：
【表１】
2005504723.tif 000006
【００８８】
【表２ａ】
2005504723.tif 000007
【００８９】
【表２ｂ】
2005504723.tif 000008
【００９０】
【表３】
2005504723.tif 000009
【００９１】
【表４】
2005504723.tif 000010
【００９２】
【表５】
2005504723.tif 000011
【実施例２】
【００９３】
ＮＭＲによるＩＧＦ−Ｆ１−１の構造決定
純粋なＨ２Ｏ溶液（３０℃、ｐＨ５．１及び濃度５．０ミリモル）又は６％(v/v)ｄ６−ＤＭＳＯを含有するＨ２Ｏ（４０℃、ｐＨ５．２及び濃度６．７ミリモル）の何れかでペプチドＩＧＦ−Ｆ１−１の１Ｈ ＮＭＲデータを収集した。１次元スペクトルに加えて、２次元の２量子フィルターによる相関分光法（２ＱＦ−ＣＯＳＹ）、全相関スペクトル（ＴＯＣＳＹ）、及び回転座標系でのオーバーハウザー効果スペクトル（ＲＯＥＳＹ）を収集した。２ＱＦ−ＣＯＳＹでの干渉選択のためにパルスフィールド勾配を用い（van Zijl 等, J. Magn. Reason., 113: 265-270 (1995)）、ＴＯＣＳＹ及びＲＯＥＳＹ実験で水の共鳴を抑えるために励起スカルプティング(excitation sculpting)を用いた（Hawang及びShaka, J. Magn. Reson., 112A: 275-279(1995)）以外は、Cavanagh等 in Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice（Academic Press, San Diego; ISBN 0-12-164490-1, 1995）に記載されるようにして実験を記録した。凍結乾燥及びペプチドの２Ｈ２Ｏ溶解の後、２Ｄ ＲＯＥＳＹスペクトル（Cavanagh等, 上掲）及び３５°の混合パルスによるＣＯＳＹスペクトルを得た。完全な１Ｈ共鳴の割当を標準的な方法（Wuthrich, in NMR of proteins and nucleic acids (John Wiley & Sons, New York; ISBN 0-471-82893-9, 1986)）によってこれらのデータから獲得し、表６に記載する。
【００９４】
次のことから、ＩＧＦ−Ｆ１−１のはっきりとした３次元構造の確証を得た：
（１）アミドとαプロトンの間のスカラー結合定数（２ＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルから得た）は構造化されていないペプチドで得られる平均値と異なる。Ｇｌｕ５、Ｓｅｒ６、Ａｌａ８、Ａｌａ９、Ｌｅｕ１０、Ａｒｇ１１、Ａｒｇ１２、及びＣｙｓ１３についての６．０Ｈｚ未満の値は、これらの残基のへリックス構造を示している。Ｐｈｅ４について得られた８．３Ｈｚの値はこの残基の伸びた構造を示している。
（２）また、ＣＯＳＹ−３５スペクトルではα及びβプロトンの間でスカラー結合定数を測定した。これらのデータは、Ｃｙｓ３、Ｐｈｅ４、Ｓｅｒ６及びＣｙｓ１３の側鎖がχ−１の角度に固定され；つまりこれらの側鎖は、非構造化ペプチドにあるχ−１回転異性体の範囲をサンプルしていないということを示す。
（３）ＲＯＥＳＹスペクトルのピークは、１次配列において隣接していない残基間で多くのプロトン−プロトン接触（＜５Å）があることを示す。これらは、ペプチドが明確な構造に折り畳まれる場合に生じうる。一次配列の位置ｉ及びｉ＋３の残基の間の接触は、この領域のへリックスの存在と一致して、Ｖａｌ６及びＡｒｇ１２の間に渡っている。Ｐｈｅ４の芳香族側鎖とＶａｌ７、Ｌｅｕ１０、及びＭｅｔ１４のメチル基の間に多くの接触が観察され、へリックスの一つの面に沿う疎水性パッチの存在を示す。
【００９５】
ＮＭＲデータを用いて、ＩＧＦ−Ｆ１−１構造の３次元モデルの決定に使用できる拘束を導く。アミド−α及びα−βスカラー結合定数から、適切なカープラス関係によって二面角拘束を導く（Karplus, J. Phys. Chem., 30: 11-15 (1959)）。ＲＯＥＳＹスペクトルで空間を通した相互作用を示すプロトン間に距離の拘束を導入し；上限の大きさ、及びピークの重複又は共鳴の同義性のための上限の訂正は、Skelton等, Biochemistry,33: 13581-92 (1994)に記載されているようにした。これらの拘束は、プログラムＤＧＩＩ（Havel, Prog. Biophys. Mol. Biol., 56: 43-78 (1991)）を用いた構造ファミリーの作成に使用され、それらはＡＭＢＥＲの全原子力場を用いたプログラムＤｉｓｃｏｖｅｒ（ＭＳＩ、サンディエゴ）で拘束分子力学によって引き続き洗練される。８１のプロトン間距離拘束（非連続残基間で４５）及び１８の二面角拘束（１４φ及び４χ１）を最終的な計算に用いた。得られた構造を１つの全体的な折り畳み（それぞれ、残基３−１３の全ての主鎖又は重原子について０．４６±０．１６Å及び１．５１±０．１４Åの平均構造からの二乗平均偏差を意味する）に収束する。最適な２０の構造（入力拘束の最小バイオレーション）が入力データと非常に合致し（０．１３Åを超える距離拘束バイオレーションがなく、２．０°を超える二面角バイオレーションなし）、さらにプログラムPROCHECK（Laskowski等, J. Appl.Cryst., 26: 283-291）によって判断されるような良好な共有結合性幾何学を有していた。ＩＧＦ−Ｆ１−１について２０の構造の集合から平均座標を作成し；実験での拘束の影響下におけるこれら座標のエネルギー最小化から、図１に表される最小平均構造が作られた。最小平均の原子座標を表７に記載する。
【００９６】
PROCHECK（上掲）でのKabsch及びSanderの２次構造アルゴリズムに従うと、ＩＧＦ−Ｆ１−１は残基Ｃｙｓ３−Ｐｈｅ４のＩ型逆ターン及びＶａｌ７からＣｙｓ１３のαへリックスを含み；Ｓｅｒ６及びＭｅｔ１４は主へリックスの延長である。これらの表示と一致する水素原子の相互作用は、集合内のほとんどの構造で観察される。残基Ａｒｇ１、Ａｓｎ２、Ｔｙｒ１５、及びＧｌｙ１６はＮＭＲ拘束によって上手く定義されず、他の残基よりも溶液中でフレキシブルでありうる。Ｐｈｅ４、Ｖａｌ７、Ｌｅｕ１０、及びＭｅｔ１４の側鎖の間に広範な疎水性の接触がある。これらの残基はまた、ジスルフィド結合（残基Ｃｙｓ３及びＣｙｓ１３）の上部にまとまっている。へリックスのこの面に沿う非結合性の相互作用は、ペプチドの折り畳み高次構造の安定化に役立つと考えられる。
ファージで提示されるペプチドライブラリーからＩＧＦ−Ｆ１−１を選択した。選択はＩＧＦ−１に結合するペプチドの能力のみに基づいたが、また同定された配列は安定でコンパクトな構造に折り畳まれる。Ｃ末端へリックスを有する高次構造化されたペプチドは、多くの他のファージ誘導ペプチドの選択実験で観察されている（Dennis等, Nature, 404: 465-470 (2000); Lowman等, Biochemistry, 37: 8870-8878 (1998)）。これらの実験において、溶液中のペプチドについて観察された高次構造は、標的タンパク質に結合する場合に示すものと同様である。その標的への結合において有意な変化がない、溶液中で安定した折り畳みを有するペプチドの選択は、高次構造のエントロピーの喪失を引き起こさない関係なので、結合をエネルギー的に有利にする。これら２つの実施例において、ペプチドへリックスの１つの面にある疎水性残基は標的タンパク質に結合するための重要な接点を提供する。これらの先の発見に基づき、何れか１つの理論に限定されることなく、図１に表される前方の表面にある残基の疎水性パッチ（Ｐｈｅ４、Ｖａｌ７、Ｌｅｕ１０、Ｍｅｔ１４）は、ＩＧＦ−Ｆ１−１がＩＧＦ−１と結合又は相互作用するために使用する表面を示すようであると仮定される。従って、ＩＧＦ−Ｆ１−１の構造は、ＩＧＦ−１への結合に必要な原子の特定の配列に関する情報を含む。
【００９７】
【表６】
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ａ６％(v/v)ｄ６−ＤＭＳＯを含む４０℃、ｐＨ５．１のＨ２Ｏ溶液から得られたデータ。立体特異的に配されたプロキラル基を太字で示し；下線を引いた共鳴はｐｒｏＲ立体化学を示す。
＊は変性メチレン(メチル)共鳴を示す。
【００９８】
【表７】
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【００９９】
本発明は、やむを得ずある特定の方法及び材料を挙げることによってここに説明されている。これらの特定の方法及び材料の説明は、本発明の範囲のどんな限定も決して構成せずに、本発明の対象を達成するのに適したあらゆる全ての別の材料及び方法にまで及ぶことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】ＮＭＲデータから導かれた拘束を用いて計算された、溶液中のペプチドＩＧＦ−Ｆ１−１の３次元最小平均構造を示す。主鎖の折り畳みはリボン状に描かれ、全ての側鎖重原子を示し；幾つかの側鎖は標示をつけた。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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