(57)【要約】本発明は、虚血症状（ischemic events）、特に中枢神経系の限局性虚血からの回復を促進または増強するため、ならびに、慢性的変性による変化を予防または軽減させるためのNarp阻害物質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ-タイポキシンおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２】
神経系への損傷を治療するのに有効な量のγ-タイポキシンおよび担体を含む、組成物。
【請求項３】
担体が薬学的に許容される担体である、請求項2記載の組成物。
【請求項４】
中枢神経系に対する損傷を受けた患者を治療する方法であって、回復が促進され、それによって患者が治療されるように、該患者に請求項3記載の医薬組成物の適用量を投与する段階を含む方法。
【請求項５】
投与が定期的である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
損傷が虚血のエピソードである、請求項4記載の方法。
【請求項７】
虚血のエピソードが全体性の脳のエピソードである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
虚血のエピソードが限局性の脳のエピソードである、請求項6記載の方法。
【請求項９】
損傷が脳卒中を含む、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
医薬の調製におけるγ-タイポキシンの使用。
【請求項１１】
中枢神経系に対する損傷を受けた患者を治療するための医薬の調製におけるγ-タイポキシンの使用。
【請求項１２】
損傷が脳卒中を含む、請求項11記載の使用。
【請求項１３】
以下の段階を含む、Narpとγ-タイポキシンとの間の結合を調節する物質種を同定する方法：
a）Narpを、結合条件下でγ-タイポキシンと接触させる段階；
b）段階a）の条件下で、Narp、γ-タイポキシン、および試験される物質種を接触させる段階；ならびに
c）段階a）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルを、段階b）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルと比較する段階であって、ここで、結合のレベルが変化することにより、Narpとγ-タイポキシンとの間の結合を調節する当該物質種の能力が示される段階。
【請求項１４】
物質種が化合物である、請求項3記載の方法。
【請求項１５】
方法によって同定される物質種がNarpとγ-タイポキシンとの間の結合を増強する、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
以下の段階を含む、γ-タイポキシンの結合活性を有する物質種を同定する方法：
a）Narpを、結合条件下でγ-タイポキシンと接触させる段階；
b）段階a）の条件下で、Narp、γ-タイポキシン、および試験される物質種を接触させる段階；ならびに
c）段階a）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルを、段階b）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルと比較する段階であって、ここで、段階b）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルがより低いことにより、当該物質種がγ-タイポキシン様結合活性を有することが示される段階。
【請求項１７】
物質種が化合物である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
以下の段階を含む、γ-タイポキシンとの結合活性を有する物質種を同定する方法：
a）Narpを発現する細胞を、試験される物質種と接触させる段階；
b）正常なNarp発現を欠く細胞を、段階a）の物質種と接触させる段階；ならびに
c）段階a）および段階b）の細胞中の物質種の存在をアッセイする段階であって、ここで、段階b）の細胞における物質種のレベルと比較した場合に、段階a）の細胞における物質種のレベルがより高いことにより、当該物質種がγ-タイポキシン様結合活性を有することが示される段階。
【請求項１９】
物質種が化合物である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、γ-タイポキシンの結合活性を有する物質種を同定する方法：
a）Narpを発現する細胞を、結合条件下で、試験される物質種と接触させる段階；
b）Narpを発現する細胞を、段階a）の条件下で、γ-タイポキシンおよび試験される物質種と接触させる段階；ならびに
c）段階a）および段階b）の細胞中の物質種の存在をアッセイする段階であって、ここで、段階a）の細胞における物質種のレベルと比較した場合に、段階b）の細胞における物質種のレベルがより低いことにより、当該物質種がγ-タイポキシン様結合活性を有することが示される段階。
【請求項２１】
物質種が化合物である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
以下の段階を含む、γ-タイポキシンの結合活性を有する物質種を同定する方法：
a）Narpを発現する細胞を、結合条件下で、γ-タイポキシンと接触させる段階；
b）Narpを発現する細胞を、段階a）の条件下で、γ-タイポキシンおよび試験される物質種と接触させる段階；ならびに
c）段階a）および段階b）の細胞中のγ-タイポキシンの存在をアッセイする段階であって、ここで、段階b）の細胞におけるγ-タイポキシンのレベルがより低いことにより、当該物質種がγ-タイポキシン様結合活性を有する種であることが示される段階。
【請求項２３】
物質種が化合物である、請求項22記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2002年2月21日に出願した米国仮出願第60/359,061号の一部継続出願であり、この恩典を主張する。この仮出願の内容は、本明細書によって参照として本願に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、虚血症状（ischemic event）、特に中枢神経系の虚血からの回復を促進または増強するための、ならびに、中枢神経系の慢性的な変性による変化を抑止または軽減させるためのNarp阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
効率的なシナプス伝達には、伝達物質放出部位に並置するシナプス後膜上における受容体の濃縮（enrichment）および特異的な局在化が必要とされる。中枢神経系（CNS）において、イオンチャネル型のグルタミン酸受容体は主要な興奮性神経伝達物質受容体であるが、分子的および薬理学的な判断基準に基づいて、3つの広範なクラス（AMPA型受容体、NMDA型受容体、およびカイニン酸型受容体と呼ばれる）に分けられている。通常の迅速な興奮性シナプス伝達における優勢な電荷担体は、AMPA型受容体である。機能的なAMPA受容体は、グルタミン酸受容体サブユニット1〜4（GluR１〜GluR４）と呼ばれるサブユニットから構成される。
【０００４】
種々の神経疾患とAMPA受容体の構造的構成との間の関連は、多くの最近の研究における焦点となってきている。さらに、この型の受容体の調節におけるある種の増殖因子の役割が推定されてきた。例えば、O'Brienら（Neuron, 23, 193, 1999）は、Narp（神経活性制御ペントラキシン）がAMPA受容体のクラスター化を誘導し得ることを開示した。Narpポリペプチドは、神経細胞ペントラキシンII（NP2, neuronal pentraxin II）とも呼ばれるが、元々は、ラット海馬における癲癇の発作により誘導される新規な最初期遺伝子（IEG, immediate-early gene）として、Tsuiら（J. Neurosci 16, 2463, 1996）によってクローニングされた。NARPは、モルモット精子先体タンパク質p50/アペキシン（p50/apexin）として別個に同定されてきた（Noland, T.D.ら（1994）J. Biol. Chem. 269, 32607; Reid, M.S.およびBlobel, C.P.（1994）J. Biol. Chem. 269, 32619 ）。O'Brienはさらに、Narpが多量体を形成し、引き続いてAMPA受容体、特にGluR１〜３サブユニットに直接的に作用してそれらのクラスター化を誘導する証拠を提供した。Narpは前シナプス性および後シナプス性の両方の供給源に由来するようである。まとめると、これらのデータから、Narpは新規な興奮性シナプスの形成を容易にするように機能し得ることが示唆される。Narpはシナプス活性によって制御される最初期遺伝子（IEG）であるため、そのダイナミックな発現は、活性依存型のシナプス発生およびシナプス可塑性に関する新規なメカニズムを提供する。
【０００５】
米国特許第5,762,552号が、そのアミノ酸配列を含む、精製したNarpポリペプチドを開示しているのに対して、国際公開公報第97/39133号はまた、Narpポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、上記のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびこのベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供している。Narpが樹状神経突起の成長の誘導ならびに神経移動（neural migration）の促進にとって有用であるという事実に基づいて、この特許は、Narpを患者へ投与することを利用した神経疾患を有する患者の治療法を開示している。
【０００６】
欧州特許出願第1,101,820A1号は、ヒト神経細胞ペントラキシン受容体（NPR, neuronal pentraxin receptor）およびペントラキシンI（NP1, pentraxin I）の両方をコードする核酸配列を開示しているが、その出願はペントラキシンIを対象としている。NarpであるペントラキシンIIについては、手短に言及しているのみである。
【０００７】
国際公開公報第00/75661号は、AMPA受容体の凝集体の形成に影響を与える化合物を同定するための方法を提供している。国際公開公報第00/75661号は、Narpの機能／発現を増大または阻害する薬剤を、それぞれ患者に投与することにより、Narpの機能／発現の増加または減少のいずれかと関連する障害を有する患者を治療するための方法を開示している。国際公開公報第00/75661号では、虚血性損傷を含む、脳卒中または脳もしくは脊髄の損傷障害を含む神経細胞障害を、治療するためのNARP発現または活性の刺激が開示されている。
【０００８】
脳の虚血
外傷（trauma）および脳卒中（stroke）のような脳損傷(brain injury)は、西欧において死亡および身体障害の主要な原因である。
【０００９】
外傷性脳損傷（TBI, traumatic brain injury）は、現代社会において入院および身体障害の最も深刻な原因の1つである。臨床的な経験から、TBIが、損傷後すぐに発生する一次損傷、および損傷後数日の間に発生する二次損傷に分類され得ることが示唆される。現在のTBI療法は、外科的であるか、そうでなければ主に対症療法的であるかのいずれかである。
【００１０】
脳血管疾患は、主として人生の中年期および後年期において発症する。これらは、米国で毎年約200,000人の死亡例ならびに顕著な神経的身体障害を引き起こす。脳卒中の発生率は年齢と共に増加し、急速に増加している人口層である高齢者の多くに影響を与える。これらの疾患は虚血性梗塞（ischemia-infarction）または頭蓋内出血(intracranial hemorrhage)のいずれかを引き起こす。
【００１１】
脳卒中は、血液供給が妨害された結果として起こる急性の神経性損傷であり、脳に傷害を生じる。多くの脳血管疾患は、限局性の神経性欠損（focal neurologic deficit）として突発的に発症する。この欠損は回復されないまま残っていて、改善されたり進行性に悪化したりするかもしれないが、通常は、虚血性病巣の中心部分で不可逆的な神経損傷を引き起こす。一方、境界域（penumbra）における神経性機能障害は、治療可能であるか、または可逆的であり得る。虚血の期間が長引けば、明白な組織の壊死を生じる。脳水腫が続いて起こり、次の2〜4日間にわたって進行する。梗塞の領域が大きい場合、水腫は、それに伴う影響すべてを含め、顕著な腫瘤効果を引き起こすことがある。
【００１２】
神経保護薬物は、境界域（penumbra）における神経細胞を死滅からレスキューする試みにおいて開発されているが、現在のところ、いずれも有効であることが証明されていない。
【００１３】
神経細胞組織に対する損傷は、深刻な身体障害および死亡につながることがある。損傷の程度は、主として、損傷を受けた組織の位置および程度によって影響される。急性傷害に応答して活性化された内因性カスケードは、機能上の結果(functional outcome)における役割を担っている。損傷を最小化、制限、および／または逆転させるための労力には、臨床上の結果を緩和する大きな潜在的可能性が存在する。
【００１４】
タイポキシン
タイポキシンは、オーストラリアタイパンヘビ（Oxyuranus s. scutellatus）の毒に含まれるシナプス前性毒素である。Fohlman J. (1976) Eur J Biochem 68 457-69。タイポキシンの完全な複合体分子は、α、β、および  サブユニットからなる。γ-タイポキシンは、133個のアミノ酸からなり、そして14.6Kdaの分子量を有する。これは、タイポキシンにおいては、Nグリコシル化およびシアル化されている唯一のサブユニットである。タイポキシンは、Narpと結合することが知られている；実際、Narpは、タイポキシンのアフィニティーカラムで最初精製され（Kirkpatrickら（2000）「Biochemical Interactions of the Neuronal Pentraxins.」 The Journal of Biological Chemistry, 275, 23: 17786-17792）タイポキシンとの相互作用を通して同定された。さらに、NarpおよびNarp受容体（NPR）は、タイポキシンがシナプスへと移行するインターナリゼーション（internalization）経路に関与していることが示唆されてきた（Doddsら、「Neuronal Pentraxin Receptor, a novel Putative Integral Membrane Pentraxin that Interacts with Neuronal Pentraxin I and II and Taipoxin-associated Calcium-binding Protein 49.」 The Journal of Biological Chemistry 272 (34): 21488-21494, 1997）。国際公開公報第01/63293号は、とりわけ、神経ペントラキシンI (Neural pentraxin I) を介した活性にさらされた細胞のタイポキシンへの感受性に基づく統合失調症の治療に有効な薬剤のスクリーニング方法について述べている。米国特許第4,341,762号は、神経障害および関連する障害の治療のための、ヘビ毒から単離された異なる型の毒素（タイポキシンを含む）の組み合わせを使用する可能性に関する。タイポキシンの3つの別個のサブユニットのうち、αサブユニットで最も高い毒性が見い出された（LD50=300μg/Kg−European Journal of Biochemistry (1979) 94, 531-540）のに対して、サブユニットの毒性の証拠は（非毒性とあるものから中程度の毒性とあるものまで）定まっていない。タイポキシン全体の毒性は2μg/Kgである。αまたはα+βサブユニットの毒性は、γを付加することによって著しく増大し、このことは、γが細胞表面の特定のタンパク質との相互作用に関与することを示唆している。この相互作用は、おそらくγサブユニットの炭水化物部分を含む。βサブユニット（β1およびβ2）は非毒性かつ有糸分裂促進性であることが見い出され（Lipps（2000）Toxicon 38 1845-1854）、そして、細胞増殖因子として、および創傷の治療のために提案されてきた（米国特許第6,316,602号および同第6,307,031号）。
【００１５】
米国特許第6,316,602号は、細胞増殖因子としてのβタイポキシンの使用に関する。この特許は、主として、他のサブユニットからβタイポキシンを分離するための方法を指向している。
【００１６】
PCT公開番号 国際公開公報第01/63293号は、多数のタンパク質およびタンパク質アイソフォームの同定、ならびにスクリーニング、診断および統合失調症の治療のためのこれらのタンパク質および核酸の使用、を指向している。神経細胞をタイポキシン活性に感受性とするためにペントラキシンIを使用した、統合失調症の治療のためのスクリーニング方法が開示されている。
【００１７】
上記の刊行物のいずれもが、虚血とのからみでNarpを阻害することを教示も示唆もしておらず、確かに上記の刊行物のいずれもが、脳卒中、TBI、または他の虚血状態との関連において、タイポキシンのγサブユニットによるNarp阻害の有益な効果を開示していない。
【発明の開示】
【００１８】
発明の概要
本発明は、組織の外傷から生じるか、または慢性的変性による変化から生じるかに関わらず、損傷を受けた神経細胞組織に関連する症状および徴候を緩和または軽減させるための組成物および方法を提供する。本発明の目的は、記載のようなCNSに対する急性の損傷に起因するか、または他の傷害に起因する組織損傷または変性を軽減するか、または完全に減少させるための医薬組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、外傷性の虚血症状（ischemic events）（外傷性脳損傷（TBI）または脳卒中を含むがこれらに限定されない）の後で機能的改善をもたらす方法を提供することである。これらの効果は、Narp分子と相互作用する薬剤を投与することによって、結果として、AMPA型グルタミン酸受容体に対するNarpの効果が阻害されることによって達成されるだろう。
【００１９】
本明細書に記載される好ましい方法、材料、および実施例は単に例示であって、限定を意図するものではない；ここで記載されるものと同様または等価な材料および方法は、本発明の実施または試験において使用され得る。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるだろう。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、組織の外傷性障害から生じるか、または慢性的変性による変化から生じるかに関わらず、損傷を受けた神経細胞組織に関連する症状および徴候を緩和または軽減させるためのポリペプチド、組成物および方法を提供する。本発明の目的は、組織損傷または変性を軽減させるか、または完全にまで減少させるための医薬組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、外傷性の虚血症状（ischemic events）後に機能的改善をもたらす方法を提供することである。これらの効果は、Narp分子と相互作用する薬剤を投与し、その結果として、Narpの効果が阻害されることによって達成されるだろう。
【００２１】
Narp（神経細胞活性制御ペントラキシン（neuronal activity regulated pentraxin）または神経細胞ペントラキシンII (neuronal pentraxin II)とも呼ばれる）は分泌タンパク質であり、そのメッセンジャーRNA（mRNA）は、生理的なシナプス活動によって海馬および皮質のニューロンにおいて迅速に誘導される最初期遺伝子（IEG, immediate-early gene）から転写される。これは、C反応性タンパク質（CRP, C-reactive protein）および血清アミロイドP（SAP, serum amyloid P）成分を含む分泌性レクチンのペントラキシンファミリーののメンバーに対して相同性を有する。Narpは環状五量体構造および放射状対称性によって特徴付けられる。5つの相同な24kDaプロトマーは206個のアミノ酸からなり、そして非共有結合的に連結されている。NarpがGluR1 AMPA受容体サブユニットとカルシウム依存性様式で結合すること、ならびに、その示唆される機能が神経突起成長促進活性（興奮性シナプス形成における役割）とAMPA受容体のための細胞外凝集因子であることを仮定すると、Narpを標的とすることで、虚血症状（ischemic events）の初期段階においてAMPA受容体によって媒介される「興奮毒性」損傷を軽減させる可能性がある。
【００２２】
本発明は、とりわけ、虚血（脳卒中）モデルである、中大脳動脈閉塞（MCAO）に供された動物において、Narp RNAレベルが、虚血症状（ischemic events）の発症後に（対照と比較して）有意に発現上昇するという本発明者らによる知見に基づいている。
【００２３】
本発明は、Narpに結合し、それによってNarpの生物活性を阻害するポリペプチド、抗体、または低分子化合物を利用する。
【００２４】
本発明の好ましい態様に従って、神経活性制御ペントラキシンペプチド（neural activity-regulated pentraxin peptide）またはその免疫反応性断片に対する抗体が提供される。
【００２５】
本発明の別の好ましい態様に従って、神経活性制御ペントラキシンペプチド（neural activity-regulated pentraxin peptide）またはその断片に結合するポリペプチドが提供される。
【００２６】
本発明の別の好ましい態様に従って、神経活性制御ペントラキシンポリペプチド（neural activity-regulated pentraxin peptide）またはその断片に結合する低分子化合物が提供される。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「Narp」という用語は、Narp（神経活性制御ペントラキシン, neural activity-regulated pentraxin）ポリペプチドを意味し、任意の生物、好ましくはヒトまたはマウス由来の「神経活性化ペントラキシン(neural activated pentraxin)」（またはペンタキシン(pentaxin)）、「ペントラキシンII(pentrrraxin II)」「ペンタキシンII (pentaxin II)」および「NP2」、または、同様の生物活性を有するそれらの相同体、好ましくは、Narpポリペプチドに対して70％、80％、90％、または、さらに95％の相同性を有する相同体を含むものとして理解される。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件下（これは、当技術分野において周知である（例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), 1995および1998改訂版））、Narp遺伝子に結合する核酸配列にコードされるポリペプチドもまた、この用語に含まれる。
【００２８】
「Narpの生物学的効果」または「Narp生物学的活性」とは、AMPA型グルタミン酸受容体におけるNarpの効果を意味し、その効果は直接的なことも間接的なこともあるが、理論に束縛されることなく、神経突起成長促進活性、およびAMPA受容体に対する細胞外凝集因子としての機能を含んでいる。その細胞外凝集因子としての機能には、Narpが細胞の表面上のAMPA受容体のクラスター化を引き起こす場所における阻害効果も含まれる。グルタミン酸受容体は、好ましくは、神経細胞の表面に存在する；間接的効果としては、Narpがシグナル伝達カスケードに関与するいくつかの分子の1つに対して結合するか効果を及ぼしてAMPA型グルタミン酸受容体に効果をもたらすことが含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
「Narp阻害物質」とは、ポリペプチド、抗体、または低分子化合物とにかかわらず、上記に列挙したような、Narpの生物学的効果を遮断または減少させるような任意の分子を意味する。Narp阻害物質はまた、特に、アンチセンスRNA分子、ドミナントネガティブペプチドのようなNarpプロモーターの阻害物質であり得る（例えば、以下を参照されたい：O'Brienら、「Synaptically Targeted Narp Plays an Essential Role in the Aggregation of AMPA Receptors at Excitatory Synapses in Cultures Spinal Neurons」、Journal of Neuroscience 22 (11): 4487-4498, 2002、これは、Narp活性を阻害するNarpドミナントネガティブ変異体を開示する）。好ましいNarp阻害物質はγ-タイポキシンである。
【００３０】
本発明において使用される場合、「抗体」という用語は、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の完全長な抗体、ならびに、Fab、F(ab')２、Fvなどのエピトープ決定基（epitopic determinant）に結合し得るそれらの断片を意味する。これらの抗体断片は、その抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持しており、そしてとりわけ、以下のようなものが例示される。
（1）Fab：抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片であり、軽鎖と重鎖の一部を生成するために、抗体全体を酵素パパインを用いて消化することによって産生される。
（2）F(ab')２：抗体全体を酵素ペプシンで処理し、次の還元処理を行わないことによって得ることができる抗体の断片；F(ab')２は2本のジスルフィド結合によって結合されている2つのFab断片の二量体である。
（3）Fv：2本鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された断片として定義される。
（4）単鎖抗体（SCA）：遺伝子融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって結合された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子として定義される。
全タイプの抗体を調製する方法の詳細は、以下の実施例8に提供する。
【００３１】
本発明において使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープ性決定基（epitopic determinants）は、通常、例えば、アミノ酸または糖側鎖のような化学的に活性な表面分子のグルーピング(chemically active surface groupings of molecules) ）からなり、そして通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。
【００３２】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸からなる分子を意味し、そしてこの用語は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびペプチド模倣物(peptidomimetics)を含む。
【００３３】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在する20種のアミノ酸のいずれか、化学修飾されたアミノ酸（以下を参照されたい）、または合成アミノ酸からなる分子を意味する。
【００３４】
「化合物(chemical compound)」、「低分子(small molecule)」、「化学分子(chemical molecule)」、「低分子化学分子(small chemical molecule)」および「低分子化合物(small chemical compound)」という用語は、本明細書中では言い換え可能なように使用されており、任意の特定の型の化学的部分を意味することと理解される。その任意の特定の型の化学的部分は、合成的に製造されるかもしれないし、または天然の供給源から得られるかもしれないが、典型的には、2000ダルトン未満の分子量、より好ましくは1000ダルトン未満、またはさらに600ダルトン未満の分子量を有するものである。  
【００３５】
本発明において使用される場合、「相同体／相同性（homolog/homology）」とは、少なくとも約70％、好ましくは少なくとも約75％の相同性、有利には少なくとも約80％の相同性、より有利には少なくとも約90％の相同性、なおさらに有利には少なくとも約95％の相同性、例えば、少なくとも約97％、約98％、約99％、またはさらに約100％の相同性さえ意味する。本発明はまた、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、本明細書中のまたは前述のポリヌクレオチドおよびポリペプチドと同様の様式で使用され得ることを含む。
【００３６】
あるいは、またはそれに加えて、「相同性」とは、配列に関して、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在する位置の数を2つの配列のうち短い方の配列中のヌクレオチド数またはアミノ酸残基数で割ったものを意味しており、ここで、2つの配列のアラインメントは、例えば、20ヌクレオチドのウィンドウサイズ、4ヌクレオチドのワード長、および4のギャップペナルティーを使用することにより、WilburおよびLipmanアルゴリズム（the Wilbur and Lipman algorithm,（1983）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726）に従って決定することができる。そしてコンピューターを使った分析およびアラインメントを含む配列データの解釈は、市販のプログラム（例えば、Intelligenetics（商標）Suite、Intelligenetics Inc., CA）を使用して首尾よく実施することができる。RNA配列が類似であるか、またはDNA配列と一定の配列同一性または配列相同性を有すると言われる場合は、DNA配列中のチミジン（T）はRNA配列中のウラシル（U）と等しいものとみなしている。本発明の範囲内のRNA配列は、DNA配列またはそれらの相補配列から、そのDNA配列中のチミジン（T）をウラシル（U）に置換することによって得ることができる。
【００３７】
それに加えて、あるいは、アミノ酸配列の類似性または相同性は、例えば、BlastPプログラム（Altschulら、Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402およびNCBIにて利用可能）を使用して決定してもよい。以下の参考文献は、2つのポリペプチドのアミノ酸残基の相対的な同一性または相同性を比較するためのアルゴリズムを提供している。それに加えて、あるいは、前述に関しては、これらの参考文献における開示は相同性パーセントを決定するために使用できる：Smithら（1981）Adv. Appl. Math. 2: 482-489；Smithら（1983）Nucl. Acids Res. 11: 2205-2220；Devereuxら（1984）Nucl. Acids Res. 12: 387-395；Fengら（1987）J. Molec. Evol. 25: 351-360；Higginsら（1989）CABIOS 5: 151-153；およびThompsonら（1994）Nucl. Acids Res. 22: 4673-4680。
【００３８】
本発明は、とりわけ、脳卒中または他の虚血性および低酸素性症状(hypoxic events)のモデルとなっている大脳動脈の閉塞が、対照群(control)と比較したNarp RNAの発現レベルによって決定されるNarp転写の有意な上昇を誘導するという本発明者らによる観察、ならびに、NarpがAMPA受容体のあるサブユニットと相互作用し、続いてそれらのクラスター化を引き起こすという事実に基づいている。
【００３９】
本発明は、初めて、Narp阻害の有用性および抗Narp抗体、Narp阻害物質の利用、Narp機能の阻害のためのγ-タイポキシン、低分子、アンチセンスRNA、またはリボザイムの使用を開示する。従って、理論に束縛されることなく、本発明者らは、Narp抗体または他のペプチド性Narp阻害物質または低分子のNarp阻害物質が、グルタミン酸受容体におけるNarpの効果（おそらくグルタミン酸受容体のクラスター化）を阻害し、それによって、脳虚血後または組織外傷後の臨床上の結果および回復結果を改善することを示唆する。
【００４０】
ある種の神経疾患、例えば、脳虚血または脳卒中においては、血液脳関門（BBB）が健常人のそれと比較して相対的に開いており、従って、抗体を含む高分子のような大きな分子さえも脳へと透過させ、続いてシナプス後領域においてそのような高分子がNarpと相互作用することが可能となることは当技術分野において公知である。脳への送達についてのさらなる情報は本明細書中、ここでは以下の実施例6に提供する。
【００４１】
理論に束縛されることなく、本発明者らは、脳におけるシナプス後末端中のグルタミン酸受容体のクラスター化におけるNARPの作用ならびに脳卒中後のその発現上昇制御が有害であることを示唆する。本発明者らはさらに、シナプス後末端中のNARPとグルタミン酸受容体との間の相互作用が阻害されることによって、シナプスにおけるAMPA受容体のクラスター化が阻害され、かつAPMA受容体によって駆動される興奮毒性が阻害および／または減少させられることを示唆する。
【００４２】
理論に束縛されることなく、γ-タイポキシンや抗Narp抗体とは別に、Narpのその他の阻害物質が、グルタミン酸受容体におけるNarpの効果を阻害（妨害）し得るかもしれない。このような阻害物質としては、特に、NARPの効果を阻害できるようなポリペプチド（クラスター化を阻害するドミナントネガティブペプチドおよび／または細胞外ポリペプチドの両方−例えば、Miら、「Differing Mechanisms for Glutamate Receptor Aggregation on Dendritic Spines and Shafts in Cultures Hippocampal Neurons.」 The Journal of Neuroscience, 22(17): 7606-7616, 2002を参照されたい）、および、ペプチドアンタゴニスト、合成低分子アンタゴニスト、アンチセンスRNA、またはリボザイムのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。
【００４３】
本発明のアプローチは、好ましい効果や有益な効果を維持しながらより長期に渡る治療効果を有する点を含めて、これまでに利用可能であったか示唆されていたいかなる治療をも超えるいくつかの明瞭な利点を有している。
【００４４】
本発明の1つの局面は、Narpに結合するポリペプチドを提供することである。このポリペプチドは、抗体または毒素の一部であり得るがこれに限定されない。
【００４５】
上記ポリペプチドのNarpへの結合は、特異的結合部位またはエピトープを通して起こり得る。この結合部位は、Narpに、Narpに起因するいかなる活性をも発揮させる可能性をもたらし得るという事実によって特徴づけられ、そのNarpに起因する活性としては、神経突起成長促進活性やAMPA受容体のための細胞外凝集因子としての機能が含まれるがこれらに限定されない。この結合部位はさらに、本発明のポリペプチドのこの結合部位を介したNarpへの結合が、Narpの生物学的活性（神経突起成長促進活性およびAMPA受容体に対する細胞外凝集因子としての機能を含むがこれらに限定されない）を妨害または減少させるという事実によって特徴づけられる。
【００４６】
本発明の1つの実施態様において、特許請求されるポリペプチドは、好ましくは同じ結合部位を通してNarpへのマウス抗体の結合を阻害する抗体である。この阻害は、当業者に公知の方法によって試験され得る。
【００４７】
本発明の別の局面は、Narp阻害物質、好ましくはポリペプチド、好ましくは抗体もしくは毒素の一部、好ましくはタイポキシンを含む医薬組成物を提供する。本発明の1つの実施態様において、この医薬組成物は、組織の外傷から生じるか慢性的変性による変化から生じるかに関わらず、損傷を受けた神経細胞組織に関連する症状および徴候を緩和または軽減させるために使用される。
【００４８】
Narp阻害物質はいくつかの経路、好ましくは結合を通して、Narp生物学的活性の阻害を引き起こし得る。結合したNarpは、（例えば、低分子化合物や毒素の一部が阻害物質である場合にそうした可能性があるように）、Narp活性に決定的である部位やエピトープが不活性化されるためにNarp活性を保持しないかもしれず、あるいは、また（例えば、阻害物質が抗体または毒素の一部である場合にその可能性があるように、）結合した阻害物質によって引き起こされる立体障害に起因してNarp活性が保持されないかもしれない。、Narp阻害物質のNarpへの結合の結果として、Narpは、もはやNarpの生物活性を有する可能性がないかもしれない。このNarpの生物活性としては、神経突起成長促進活性およびAMPA受容体のための細胞外凝集因子としての機能が含まれ得るがこれらに限定されない。その細胞外凝集因子としての機能には、Narpが細胞の表面上のAMPA受容体のクラスター化を引き起こす場所での阻害効果も含まれる。このNarpの生物活性を阻害することは、損傷が組織の外傷から生じるか慢性的変性による変化から生じるかに関わらず、その損傷を受けた神経細胞組織に関連する症状および徴候を緩和または軽減させるうえで、助けとなり得る。
【００４９】
「毒素の一部」とは、Narpを結合する能力を有する完全なサブユニットまたはその断片を意味し、好ましくはタイポキシン毒素由来、最も好ましくはγ-タイポキシン由来であるものを意味している。
【００５０】
特許請求した発明の1つの局面において、毒素の一部は、Narp阻害物質（上記の毒素の一部）を活性成分として含み、さらに薬学的に許容され得る希釈剤または担体を含む医薬組成物において使用される。好ましくは、上記毒素はタイポキシンである。
【００５１】
本発明の好ましい実施態様は、神経細胞損傷と関連する症状および徴候の緩和または減少のための、Narp阻害物質を活性成分として含み、さらに薬学的に許容され得る希釈剤または担体を含む医薬組成物における、Narp阻害物質としての、γ-タイポキシンまたはその断片の使用である。γ-タイポキシンは、以下、実施例3に詳述するように、本発明の発明者らによって非毒性であることが見い出された。
【００５２】
本発明に記載の医薬組成物は、希釈剤または担体をさらに含み得る。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「γ-タイポキシン」という用語は、タイポキシンポリペプチドのγサブユニット、結合活性を保持しているその断片、およびその相同体を意味し、好ましくは、それに対して少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％または95％の相同性を有する。この用語は、γ-タイポキシンコード配列におけるマイナーな変化（例えば、とりわけ、得られたポリペプチドと天然に存在するγ-タイポキシンとの間で数個のアミノ酸の違いを生じ得る、点変異、欠失、および挿入等）から生じるポリペプチドを含むことが理解される。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション（highly stringent hybridization）の条件下（これは、当技術分野において周知である（例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), 1995および1998改訂版））、γ-タイポキシンのコード配列またはゲノム配列に結合する核酸配列にコードされるポリペプチドもまた、この用語に含まれる。化学修飾されたγ-タイポキシンまたはγ-タイポキシンの化学修飾された断片もまた、結合活性が保持される限りはこの用語に含まれる。γ-タイポキシンのポリペプチド配列は図5（配列番号：7）に示される。γ-タイポキシンポリペプチドの特定の断片には、配列番号：7の1〜20位、21〜40位、41〜60位、61〜80位、81〜100位、101〜120位、および121〜133位のアミノ酸が含まれる。γ-タイポキシンポリペプチドのさらなる特定の断片には、配列番号：7の10〜30位、31〜50位、51〜70位、71〜90位、91〜110位、および111〜133位のアミノ酸が含まれる。
【００５４】
γ-タイポキシンと関連して本明細書において使用される場合、「結合活性（binding activity）」という用語は、γ-タイポキシンのNarpに対する結合活性を意味する。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様は、中枢神経系に損傷を受けた患者において、中枢神経系への損傷を緩和または減少するための方法に関するものであり、損傷を緩和または減少するために十分な用量で、Narp阻害物質を活性成分として含み、さらに薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物を、患者に投与することを含む。
【００５６】
本発明の別の好ましい実施態様は、中枢神経系に損傷を受けた患者において、回復を促進または増強するための方法に関するものであり、この方法は、回復を促進または増強するために十分な用量で、Narp阻害物質を活性成分として含み、さらに薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物を、患者に投与することを含む。
【００５７】
本発明の1つの局面において、上記の医薬組成物が緩和または軽減を目的としており、あるいは、当該医薬組成物が回復の促進または増強を目的としている中枢神経系に対する損傷とは、虚血のエピソード（ischemic episode）であり、全体性(global)または局限性（focal）の脳のエピソードである場合があるが、それらに限定されない。
【００５８】
「虚血のエピソード（ischemic episode）」とは、組織への血液供給の不足をもたらす任意の状況を意味する。大脳の虚血のエピソード（ischemic episode）は、脳への血液供給の不足から生じる。同様に中枢神経系の一部である脊髄は、血流の減少から生じる虚血に対して等しく感受性である。虚血のエピソード（ischemic episode）は、高血圧、高血圧性の脳血管疾患、動脈瘤の破裂、血栓もしくは塞栓の場合において起こるような血管の狭窄もしくは閉塞、血管腫、血液疾患(blood dyscrasias)、心停止もしくは心不全を含むいかなる型の心機能低下、全身性低血圧、心停止、心臓性ショック、敗血症性ショック、脊髄損傷、頭部損傷、てんかん発作、腫瘍由来の出血、または他の血液の損失によって引き起こされ得る。本発明はまた、機械的な力（例えば、頭部または脊椎への打撃）によって引き起こされる中枢神経系への損傷を治療するために有用であることが予想される。外傷は、擦過傷、切開、挫傷、穿刺、圧縮等のような組織傷害を含み得る。これらは、頭部、頸部、または脊柱の任意の部位またはそれらに付随する部位と、外来性物体との外傷性の接触から生じ得る。他の型の外傷性損傷は、体液の不適切な蓄積（例えば、正常な脳脊髄液もしくは硝子体液の産生の遮断もしくは機能不全、ターンオーバー、または体積調節、または硬膜下もしくは頭蓋内の血腫もしくは水腫）によるCNS組織の圧縮または圧迫から生じ得る。
【００５９】
同様に、外傷的圧縮または圧迫は、異常な組織（例えば、転移性または原発性腫瘍）の塊が存在することにより生じ得る。
【００６０】
中枢神経系に関連して本明細書において使用される場合、「限局性虚血（focal ischemia）」とは、脳または脊髄への血液を供給する単一の動脈が遮断されることから生じる状態を意味し、その動脈によって供給される領域では、すべての細胞要素の死（全壊死（pan-nevrosis））がもたらされる。
【００６１】
中枢神経系に関連して本明細書において使用される場合、「全体性虚血(global ischemia)」とは、脳全体、前脳、または脊髄への血流の全面的な減少から生じる状態を意味し、これは、これらの組織を通じて選択的に脆弱な領域において神経細胞の死を引き起こす。これらの各症例における病理は、臨床的な相関がそうであるように、全く異なっている。限局性虚血のモデルは、限局性の大脳の梗塞形成を有する患者にあてはまるのに対して、全体性虚血のモデルは心停止および他の原因による全身性低血圧に類似している。
【００６２】
本発明の別の局面において、さらなる薬学的に有効な化合物は、上述の医薬組成物と併用して投与される。
【００６３】
「併用して（in conjunction with）」とは、さらなる薬学的に有効な化合物が、Narp阻害物質の投与の前に、同時に、またはその後に投与されることを意味する。
【００６４】
特許請求する発明の1つの態様は、Narp阻害物質を使用して、中枢神経系に損傷を受けた患者の治療のための医薬の調製を提供する。Narp阻害物質は、本明細書に記載されるもののいずれかであってもよく、好ましくはポリペプチドである。
【００６５】
本発明に従う治療計画は、虚血のエピソードまたは中枢神経系の損傷における有害な結果からの患者の機能の回復が改善されるように；すなわち、患者の運動技能（例えば、姿勢、平衡性、把持、または歩行）、認知技能、話す能力、および／または知覚（視覚能力、味覚、嗅覚、および固有感覚を含む）が本発明に従う抗体投与の結果として改善するように、投与の様式、投与のタイミング、および投薬量の観点から実施される。
【００６６】
本発明に従う抗体またはポリペプチドまたは低分子化合物の投与は、静脈内、動脈内、皮下、または脳内を含む、任意の公知の投与経路によって実施され得る。特殊な製剤、特に抗Narp抗体の活性断片を使用する場合においては、これらを経口的にまたは吸入を介して投与することもまた可能であり得る。抗体をその必要がある個体に投与するための適切な用量および治療計画については、以下に詳細に論じる。
【００６７】
本発明は、様々な状態のいずれかから生じる中枢神経系の損傷の有害な結果を治療するために使用できる。血栓、塞栓、および全身性低血圧は、脳の虚血のエピソード（ischemic episode）の最も一般的な原因に挙げられる。他の損傷は、高血圧、高血圧性脳血管疾患、動脈瘤の破裂、血管腫、血液疾患、心不全、心停止、心臓性ショック、敗血症性ショック、頭部損傷、脊髄損傷、てんかん発作、腫瘍由来の出血、または他の血液の損失によって引き起こされ得る。
【００６８】
虚血が脳卒中と関連する場合、以下に定義するように、その虚血は、全体性または限局性のいずれかであり得る。本発明に従う抗体の投与は、損傷後かなりの時間が経った後で投与が行われた場合においても、有効であると考えられている。
【００６９】
本発明の好ましい態様は、γ-タイポキシンおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００７０】
さらなる態様において、神経系に対する損傷を治療するのに有効な量のγ-タイポキシンを含む組成物および担体が提供される。この担体は薬学的に許容される担体であってもよく；さらに、この組成物は、回復を促進し治療するために十分な用量でその医薬組成物を投与することによって、全体性もしくは限局性であり得る虚血のエピソードまたは脳卒中等の損傷を中枢神経系に受けた患者を治療するために使用することができる。その医薬組成物の投与は、定期的であってもよい。医薬組成物の投与という文脈においては、および本明細書において使用される場合においては、「定期的」とは、一定の間隔で、一定の回数だけ、本発明の医薬組成物を投与することを意味する。このような間隔は、1時間または数時間に1回から、1日に1回または数日間に1回またはさらに1週間に1回までの範囲であり得る。投薬量および投与計画についてのさらなる情報は、以下の実施例5に提供する。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、とりわけ脳卒中のような中枢神経系に損傷を受けた患者を治療するために使用され得る医薬の調製におけるγ-タイポキシンの使用に関する。
【００７２】
本発明の別の態様は、Narpとγ-タイポキシンとの間の結合を調節する物質種（species）を同定する方法（process）に関連しており、この方法は、
a）Narpを、結合条件下でγ-タイポキシンと接触させる段階；
b）段階a）の条件下で、Narp、γ-タイポキシン、および試験されるべき物質種（species）を接触させる段階；ならびに
c）段階a）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルを、段階b）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルと比較する段階であって、ここで、結合のレベルが変化することにより、Narpとγ-タイポキシンとの間の結合を調節する当該物質種（species）の能力が示される段階を含む。
【００７３】
このように同定された物質種（species）は、Narpとγ-タイポキシンとの間の結合を増強するかもしれない。
【００７４】
一般的に、「物質種（species）」という用語は、とりわけ、低分子化学分子、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスDNAまたはRNA分子、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチド模倣物（peptido-mimetics）を含むペプチド、発現ベクター、脂質、炭水化物、および天然に存在する分子と相互作用し得る任意の他の分子を含む。
【００７５】
さらなる態様において、本発明は、γ-タイポキシンの結合活性を有する物質種（species）を同定する方法を提供するが、この方法は、
a）Narpを、結合条件下でγ-タイポキシンと接触させる段階；
b）段階a）の条件下で、Narp、γ-タイポキシン、および試験される物質種（species）を接触させる段階；ならびに
c）段階a）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルを、段階b）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルと比較する段階であって、ここで、段階b）におけるNarpとγ-タイポキシンとの間の結合のレベルがより低いこと（すなわち、当該物質種（species）の存在下における結合が、当該物質種（species）の非存在下における結合と比較して、減少すること）により、当該物質種（species）がγ-タイポキシン様結合活性を有することが示される段階を含む。
【００７６】
本発明のさらなる局面は、γ-タイポキシンの結合活性を有する物質種（species）を同定する方法を含み、この方法は、
a）Narpを発現する細胞を、試験されるべき物質種（species）と接触させる段階；
b）正常なNarpの発現を欠く細胞を、段階a）の物質種（species）と接触させる段階；ならびに
c）段階a）および段階b）の細胞中の物質種（species）の存在をアッセイする段階であって、ここで、段階a）の細胞における物質種（species）のレベルが段階b）の細胞における物質種（species）のレベルと比較して、より高いことにより、当該物質種（species）がγ-タイポキシン様結合活性を有することが示される段階を含む。
【００７７】
さらなる局面において、本発明は、γ-タイポキシンの結合活性を有する物質種（species）を同定する方法を提供し、この方法は、
a）Narpを発現する細胞を、結合条件下で、試験されるべき物質種（species）と接触させる段階；
b）段階a）の条件下で、Narpを発現する細胞を、γ-タイポキシンおよび試験されるべき物質種（species）と接触させる段階；ならびに
c）段階a）および段階b）の細胞中の物質種（species）の存在をアッセイする段階であって、ここで、段階b）の細胞における物質種（species）のレベルが段階a）の細胞における物質種（species）のレベルと比較してより低いことにより、当該物質種（species）がγ-タイポキシン様結合活性を有することが示される段階を含む。
【００７８】
本発明のさらなる態様は、γ-タイポキシンの結合活性を有する物質種（species）を同定する方法に関し、この方法は、
a）Narpを発現する細胞を、結合条件下で、γ-タイポキシンと接触させる段階；
b）段階a）の条件下で、Narpを発現する細胞を、γ-タイポキシンおよび試験されるべき物質種（species）と接触させる段階；ならびに
c）段階a）および段階b）の細胞中のγ-タイポキシンの存在をアッセイする段階であって、ここで、段階b）の細胞におけるγ-タイポキシンのレベルがより低いことにより、当該物質種（species）がγ-タイポキシン様結合活性を有する種であることが示される段階を含む。
【００７９】
先の方法のいずれか1つに従って同定される物質種（species）は化合物であり得る。
【００８０】
Narpとγ-タイポキシンとの間の結合の検出は、当技術分野における公知の方法に従って行うことができる；1つの好ましい方法は、本発明のスクリーニング方法を、免疫蛍光検出系（immuno-fluoresent detection system）を用いて実施することである。スクリーニングアッセイ法についてのさらなる詳細については、以下の実施例7を参照されたい。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、実質的に純粋な無毒性のγ-タイポキシンの調製物を産生する方法に関しており、この方法は、
a）α、β、およびγサブユニットを含む、粗タイポキシン（crude taipoxin）を得る段階；
b）γサブユニットを、ゲルクロマトグラフィーによって分離する段階；ならびに
c）段階bから得られた調製物についてイオン交換を行うことによってγサブユニットを精製する段階を含む。
【００８２】
本発明の方法はいくつかの利点を有する。第1に、抗体、ポリペプチド、または低分子化合物については、中枢神経系に対する損傷後に、数時間後、数日後、または数週間後であっても、投与が可能である。このような損傷がいつ起こるかを予測する方法はないので、このことは有利である。上記に論じたような虚血または外傷を引き起こすすべての事象は、予測不可能である。第2に、この治療計画は有害な副作用を伴うことなく機能的な性能を改善する。
【００８３】
「保存的置換（Conservative substitution）」という用語は、あるクラスのアミノ酸が、同じクラスのアミノ酸によって置換されることを意味する。ここで、クラスとは、物理化学的にアミノ酸側鎖の特性が共通であること、および、自然界において見い出される相同タンパク質における置換頻度が高いことによって定義されるが、その置換頻度は、例えば、標準的なDayhoff頻度交換マトリックス(Dayhoff frequency exchange matrix)またはBLOSUMマトリックス(BLOSUM matrix)によって決定される。  6つの概略的なクラスのアミノ酸側鎖が分類されてきており、以下を含む：クラスI（Cys）；クラスII（Ser、Thr、Pro、Ala、Gly）；クラスIII（Asn、Asp、Gln、Glu）；クラスIV（His、Arg、Lys）；クラスV（Ile、Leu、Val、Met）；およびクラスVI（Phe、Tyr、Trp）。例えば、AspからクラスIIIの別の残基、例えばAsn、Gln、またはGluへの置換は保存的置換である。
【００８４】
「非保存的置換（Non-conservative substitution）」という用語は、あるクラスのアミノ酸から別のクラスのアミノ酸への置換を意味する；例えば、クラスIIの残基AlaからクラスIIIの残基、例えば、Asp、Asn、Gln、またはGluへの置換がある。
【００８５】
「化学修飾された」とは、本発明の生成物を指す場合、少なくとも1つのそのアミノ酸残基が、プロセシングもしくは他の翻訳後修飾などの天然の過程または当技術分野で周知である化学修飾技術のいずれかによって修飾されている、生成物（ポリペプチド）を意味する。多数の公知の修飾の中で、典型的ではあるが限定でない例として、以下のものが含まれる：アセチル化、アシル化、アミド化、ADPリボシル化（ADP-ribosylation）、グリコシル化、GPIアンカー形成（GPI anchor formation）、脂質または脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリスチル化、ペグ化（pegylation）、プレニル化（prenylation）、リン酸化、ユビキチン化（ubiqutination）、または任意の同様の過程。
【００８６】
「発現ベクター」という用語は、外来性の細胞に異種DNAを組み込みかつこれを発現する能力を有するベクターを意味する。多くの原核細胞性および真核細胞性発現ベクターが公知であり、および／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００８７】
「欠失（Deletion）」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸分子のいずれかの配列における変化であって、1つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基がそれぞれ欠けているものである。
【００８８】
「挿入（Insertion）」または「付加（addition）」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸分子の配列における変化であって、天然に存在する分子と比較して、1つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加をそれぞれ生じているもののことである。
【００８９】
「置換（Substitution）」という用語は、それぞれ、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による、1つまたはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置き換えを意味する。アミノ酸配列に関しては、置換は保存的または非保存的であり得る。
【００９０】
これまで本発明を例示的な様式で記載してきたが、そこで使用されている用語については、意味を限定することよりは、むしろ説明をすることを言葉の性質において意図していることが理解されるべきである。
【００９１】
明白に、本発明については、多くの改良および変更が上記の開示に照らして可能である。それゆえに、添付の特許請求の範囲の範囲内において、本発明は、具体的に記載されたのとは別のやり方で実施され得るものであることが理解されるべきである。
【００９２】
本願を通して、米国特許を含む種々の刊行物は、著者および発行年によって参照され、そして特許は番号によって参照されている。これらの刊行物ならびに特許および特許出願の開示は、本発明が属する当技術分野の状況をより十分に記載するために、その全体が本明細書によって参照として本願に組み入れられる。
【００９３】
実施例
さらなる苦労を伴うことなく、当業者は、先の記載を使用して、その全体に及んで本発明を利用し得ることが考えられている。従って、以下の好ましい特定の実施態様は、単に例示とみなされるべきであり、いかなる方法においても特許請求する発明を限定するものとみなされるべきではない。
【００９４】
本明細書中に詳細には記載されない当技術分野で公知の標準的な分子生物学プロトコールは、一般的に、Sambrookら、「Molecular cloning: A laboratory manual」、Cold Spring Harbor Laboratory, New-York (1989, 1992) およびAusubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988) に本質的に従う。
【００９５】
本明細書中に詳細には記載されない当技術分野で公知の標準的な有機合成プロトコールは、一般的に、Organic syntheses: 第1巻-79巻、編集者は異なる、J. Wiley, New York, (1941-2003); Gewartら、「Organic synthesis workbook」、Wiley-VCH, Weinheim (2000); Smith & March, 「Advanced Organic Chemistry」、Wiley-Intersciences; 第5版 (2001) に本質的に従う。
【００９６】
本明細書中に詳細には記載されない当技術分野で公知の標準的な医薬化学的な方法は、一般的に、Pergamon Pressから出版され、様々な著者および編集者による、「Comprehensive Medicinal Chemistry」のシリーズに本質的に従う。
【００９７】
実施例1
脳卒中症状（stroke event）に関与する鍵となる遺伝子の同定および調製
新規な薬物発見への第1の段階として、以下の方法によって提供されるように、脳卒中症状（stroke event）に関与する鍵となる遺伝子を同定した。
【００９８】
cDNAマイクロアレイ構築の概要
Narpをコードするポリヌクレオチドを、マイクロアレイに基づく差次的な遺伝子発現(differential gene expression)によって見い出し、インビボ(in vivo)モデルとインビトロ(in vitro)モデルの両方によって評価した。
【００９９】
cDNAマイクロアレイは、脳卒中特異的遺伝子について濃縮されたサブトラクションライブラリーを含むcDNAライブラリーを組み合わせることによって構築した（表1）。結果として、この脳卒中チップ（Stroke chip）は、重複度の低い脳卒中特異的クローンから構成されている。このマイクロアレイは10,000個のcDNAクローンを含む。このチップ上にプリントされたライブラリーは、表1に記載されるようなものであった。
【０１００】
（表１）脳卒中チップの設計：ライブラリーの型およびcDNAの供給源
2005518443.tif 000002
各ライブラリーを、Lで示しかつ番号付けにより示す。中大脳動脈閉塞（MCAO）をSDラットに施した。そして、初代ニューロン細胞はラット皮質初代ニューロン細胞である。正常酸素（Normoxia）は、通常の酸素濃度を示す。SDGIは、配列依存性遺伝子同定（sequence-dependent gene identification）である。
【０１０１】
FK506（タクロリムス）は、ストレプトマイセス・ツクバエシス（Streptomyces tsukubaesis）によって産生される公知の免疫抑制剤である。FK506は、低酸素症によって誘導される神経細胞の死滅を遅延または阻止することによって、神経保護活性を有する。さらに、それは、損傷した神経細胞の再成長を引き起こし得る。FK506の神経保護活性の根底にある具体的な分子機構は大部分は未知であるが、カルシニューリンおよび一酸化窒素合成酵素（nitric oxide synthase）の活性を抑制し、ならびに、脳卒中によって誘導されるセラミドの生成およびFasシグナル伝達を阻害しているとの指摘がある。本発明においては、虚血により誘導される損傷によって調節されているだけではなく、FK506を添加することによっても調節されている遺伝子を突き止めるためにFK506が供される。
【０１０２】
遺伝子発現の差次的プロファイリングは、脳卒中のインビトロ（in vitro）モデルとインビボ（in vivo）モデルの両方において実施された。インビボ（in vivo）では、中大脳動脈閉塞（MCAO）は、FK506で処理するかまたは処理しないかのいずれかのラット、および偽手術ラットにおいて、中大脳動脈（MCA）を電気的に凝血させて行った。使用したインビトロ（in vitro）モデルは、FK506処理を伴うかまたは伴わない、通常の酸素濃度または低酸素のいずれかにさらした、ラット初代皮質ニューロン細胞培養物であった。
【０１０３】
従って、本発明は、神経毒性ストレスに曝された神経細胞においてその発現が調節されているNARPポリペプチドの阻害物質を指向している。
【０１０４】
遺伝子発見の技術
脳卒中の応答に関与する遺伝子、および／またはFK506によって調節される遺伝子を同定するために3種の異なる技術が使用され、そしてこれらの手段によってNarpが同定された。第1の技術は、「脳卒中チップ（Stroke Chip）」として知られているものであり、そのチップ上に脳卒中特異的と考えられている遺伝子に対応するcDNA断片がインプリントされている。これらのクローンは、MCAOに供されたラットの脳組織およびインビトロ（in vitro）で低酸素条件に曝された初代神経細胞から得られた。
【０１０５】
脳卒中チップ（Stroke Chip）の製造において、cDNAマイクロアレイは、様々な種類のライブラリーを組み合わせることによって構築された。虚血（脳卒中）モデルは、SDおよびSHRラットにおいて永久的な中大脳動脈閉塞（MCAO）を施すことによって構築した。同じ系統の対照ラットを、偽手術（Sham）に供した。各グループの半数のラットは、0時間の時点で、FK506処理を与えた。サブトラクションライブラリー（Subtraction libraries）は、MCAOラットにおいては発現しているが偽手術ラットにおいては発現していない遺伝子（MCAO−Sham）、及び、FK506で処理したMCAOラット（FK506処理後3時間および6時間の時点で採取された）においては発現しているがMCAO処理したラット（これは、FK506の存在下でMCAO処理に供されたものではない））には発現していない遺伝子（［MCAO+FK506］-［MCAO］）によって構成された。脳卒中チップ（Stroke Chip）に含まれるもうひとつのライブラリーは、7日齢仔ラットの小脳からの初代ニューロン細胞をインビトロ（in vitro）処理したものに由来した。その細胞は、低酸素状態（0.5％ O２）に16時間曝された。低酸素下の細胞および通常の酸素濃度（正常酸素）下の対照細胞を、0時間の時点においてFK506（100ng/ml）で処理し、16時間後にそのcDNAを抽出した。サブトラクションライブラリー（subtraction library）を、低酸素下でFK506処理した細胞においては発現しているが正常酸素下でFK506処理した細胞においては発現していないcDNA断片（［低酸素状態+FK506］-［正常酸素+FK506］）から作製した。
【０１０６】
さらなるライブラリーは、配列依存性遺伝子同定（SDGI, sequence-dependent gene identification）によって生成された。この技術は、共同で譲渡されたPCT出願番号PCT/US01/09392号に記載されている。SDGIライブラリーは、MCAOに供したラット、FK506で処理後3時間および6時間のMCAOラット、およびFK506で処理後3時間および6時間の偽手術ラットの脳組織から調製した。SDGIライブラリーは、インビトロ(in vitro)実験において16時間低酸素状態に曝した初代ニューロン細胞と、FK506で前処理後16時間低酸素状態に曝した初代ニューロン細胞から調製した。
【０１０７】
チップは、ディファレンシャルハイブリダイゼーション実験（differential hybridization experiments）のために使用された。こうして、細胞は、インビボ（in vivo）またはインビトロ（in vitro）のいずれかにおいて、それに応答して遺伝子を活性化させたり抑制させたりするような発生的事象、生理学的事象、薬理学的事象、または他の手がかりとなる事象に供された。この遺伝子発現アレイ技術は、例えば、米国特許第5,807,522号に開示された。
【０１０８】
ハイブリダイゼーション
22例のハイブリダイゼーションを、表2に要約される以下のスキームに従って実施した。
【０１０９】
（表２）脳卒中チップにおけるハイブリダイゼーションのために使用されたプローブ
2005518443.tif 000003
これらのプローブに加えて、Cy3で標識した共通する対照プローブを各ハイブリダイゼーションに加えた（プローブA）。共通する対照プローブは、SDラットの全脳から抽出したポリA RNA（poly-A RNA）の混合物であった。各ハイブリダイゼーションにおいて、プローブAおよびプローブBの混合物を使用した。
【０１１０】
インサイチュー分析（In situ analysis）のための組織の調製
冠状の切片を、偽手術ラット脳およびMCAOに供した脳のパラフィンブロックから調製した。
【０１１１】
このモデルを特徴付けるために、対照のインサイチューハイブリダイゼーション（in situ hybridization）および免疫染色を実施した。切片は、脳卒中で影響を受けることが知られているc-fosやp21等の遺伝子に特異的プローブとハイブリダイズさせた。2種の抗体を免疫染色のために使用した：神経細胞の細胞骨格の完全性の指標となる神経細胞の細胞体（neuronal cell body）と樹状突起を染色する微小管関連タンパク質２（microtubule associated protein 2）に対するモノクローナル抗体；およびGFAP（グリア神経線維酸性タンパク質, glial fibrillary acidic protein）に対するポリクローナル抗体；この染色は、アストロサイト（astrocytes）およびオリゴデンドロサイト（oligodendrocytes）に特異的であり、グリア細胞の細胞骨格の完全性を示す。これらのハイブリダイゼーションの結果は、以前に報告された結果と一致していた。従って、得られたパラフィンブロックはインサイチューハイブリダイゼーション研究に適し、かつモデルは本研究に適していることが実証された。
【０１１２】
結果の要約
CRPは、ホスホリルコリン（phosphorylcholine）、フィブロネクチン、クロマチン、ヒストン、およびリボヌクレオタンパク質（ribonucleoprotein）のような広範な基質に、カルシウム依存性の様式で結合する。それは、食作用を有する白血球上に存在する特異的受容体に対するリガンドであり、単球およびマクロファージ上での活性化反応を媒介し、そして補体を活性化する。血漿CRP（plasma CRP）は古典的な急性期タンパク質であり、感染、虚血、外傷、熱傷、および感染性状態に応答して1,000倍に増加する。
【０１１３】
ヒトNarpポリヌクレオチド（cDNA）およびポリペプチドのそれぞれヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図1（それぞれ配列番号：1および2）に示す。ラットNarp cDNAのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図2（それぞれ配列番号：3および4）に示す。塩基番号は左側のマージンに示されている。さらに、ラット、マウス、およびヒト（nptx2と呼ばれる）のNarp間のヌクレオチド配列比較もまた、図3に示す（それぞれ配列番号：3、5、および1）。ラット配列のラインの下の＊は、ラットに対し、マウスおよびヒトの塩基が相同であることを表す。ラット、マウス、およびヒトのNarpの推定アミノ酸配列間の比較を図4に示す（それぞれ、配列番号：4、2、および6）。符号＊は図3と同じ意味を有する。ヒトNarpのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以前に米国特許第6,436,673号において提供されている。ラットNarpのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以前に米国特許第5,767,252号において提供されている。
【０１１４】
Narpは、海馬および脊髄のいずれのニューロン上の興奮性シナプスにおいても選択的に濃縮されており、組換えNARPの過剰発現は、培養された脊髄ニューロン（cultured spinal neurons）における興奮性シナプスの数を増加させるが抑制性シナプスの数は増加させない。Narpはいくつかの機能を有することが示唆されている：
１）約40ng/mlの濃度での神経突起成長促進活性。これは、既知のペプチド性増殖因子と同様の効力を示しており、興奮性シナプス形成において鍵となる役割を果たすことが示唆されてきた。
2）虚血に応答して強力に発現上昇され、分泌され、そしてカルシウム依存性の様式でGluR1 AMPAサブユニットに結合する。
3）アセチルコリン受容体に対するアグリン（agrin）と同様に、AMPA受容体に対する細胞外凝集因子である。
4）NarpがPI3K活性を増大させるCRP様の能力を有するか否かは分かっていない。
【０１１５】
上記に言及したプロトコールに従って脳卒中チップ（stroke chip）に対して実施したハイブリダイゼーションから、NAPAは、皮質および同側の大脳半球（ipsilateral hemisphere）の両方において、MCAOに供せられた動物由来のRNAプローブで発現上昇されていることが見い出された。この発現上昇は、1.5〜24時間の範囲で即時的であった。この発現上昇のピークは6時間から12時間の間であった。脳卒中モデルにおいて有益な効果を有することが知られているFK506は、NARP RNAの発現上昇の程度を50％減少させる。
【０１１６】
1.5時間目と3時間目の偽手術動物において、NARPのわずかばかりの発現上昇が見られるが、これは、6時間目では正常に戻る。
【０１１７】
（表３）Narpのハイブリダイゼーション結果
2005518443.tif 000004
表3の第1のカラムはプローブ名を示し、第2のカラムは差次的な挙動（differential behavior）を示し、そして第3のカラムは処理の説明を示す。差は正常な対照に関して標準化され、例えば5.1（FJ77）とは、特定のプローブを用いたときのNARP RNAの量が正常な対照における量よりも5.1倍大きかったことを意味する（差は1.7よりも大きい場合に有意であると見なされる）。
【０１１８】
MCAOの冠状切片において実施されるインサイチュー実験(in situ experiments)
NARP遺伝子に特異的な３５S標識プローブを、永久的な中大脳動脈閉塞（MCAO）後または偽手術後の異なる時点（1.5時間、3時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、および96時間）で固定されたラット脳の冠状切片にハイブリダイズさせた。このインサイチューハイブリダイゼーション研究（in situ hybridization study）の結果は、MCAOから生じる梗塞巣の中心に隣接する領域における皮質および皮質下のニューロンにおいてNARPの発現が上昇していることを明らかにした。NARPの発現の上昇は、MCAOの1.5時間から48時間までに渡って、梗塞巣周囲の領域（peri-infarct areas）において検出可能であった。しかしながら、72時間および96時間目の時点では、MCAOと同側な側でののハイブリダイゼーションシグナルは、対側の側でみられるレベルに戻った。DNAマイクロアレイに基づく実験の結果を、インサイチューハイブリダイゼーション研究によって確認した。
【０１１９】
実施例2
タイポキシンの調製
タイポキシン毒素の部分（断片またはサブユニット）は、いくつかの方法（例えば、以下の方法）を介して産生できる。
【０１２０】
1）合成的方法
合成ポリペプチドを、タイポキシンポリペプチドまたはその断片の既知配列を用いて、市販の機器を利用して作製し得る。
【０１２１】
2）組換え的方法
タイポキシンポリペプチド（好ましくは、α、β、およびγサブユニット）の好ましい作製方法は、タイポキシン遺伝子のcDNAの断片を発現ベクターにクローニングし、コードされるポリペプチドを発現させるためにそのベクターを有する細胞を培養し、次いで得られたポリペプチドを精製する。
【０１２２】
これらのすべては当技術分野で公知の方法を使用して実施される（Deutscher、Harris、およびAngalを参照されたい）。
【０１２３】
発現ベクターは、異種物質の転写を制御するためのプロモーターを含んでいてもよく、そしてそれは、選択的に転写させるための構成性または誘導性のいずれかのプロモーターであり得る。必要な転写レベルを得るために必要とされ得るエンハンサーは、選択的に含まれ得る。この発現ビヒクル（expression vehicle）はまた、選択遺伝子を含み得る。
【０１２４】
ベクターは当技術分野で公知である種々の方法のいずれか1つによって細胞または組織に導入され得る。このような方法は、以下の文献に一般的に記載されているのを見出すことができる：Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Vegaら、「Gene Targetting」、CRC Press, Ann Arbor, MI (1995)、「Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses」、Butterworths, Boston MA (1988) およびGiboaら（1986）。
【０１２５】
3）天然の供給源からの精製
タイポキシン毒素のサブユニットは、Lipps（2000）、「Isolation of subunits, α, β, and χ of the complex taipoxin from the venom of Australian taipan snake (Oxynuranus s. scutellatus): characterization of β taipoxin as a potent mitogen.」Toxicon 38: 1845-1854 において記載されるように、Tris-HCL緩衝液系を用いたイオン交換カラムを使用するHPLCでの分画によって、オーストラリアタイパンヘビ（Oxyuranus s. scutellatus）の毒から精製することができる。
【０１２６】
他のポリペプチドは、上記の実施例に従って、適切なポリペプチド配列または天然の供給源を使用して調製できることに留意する。
【０１２７】
γ-タイポキシンの調製
タイポキシンのγサブユニットの精製は、実質的に、Folhmanら、Eur. J. Biochem 1976, 68, 457-69に記載されるように実施し、続いて、以下の2つの独立した手順のいずれかにより実施した。
【０１２８】
a）陰イオン交換クロマトグラフィー
精製したタイポキシンγを1mlの50mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4 緩衝液中に溶解し、同じ緩衝液で平衡化したQAEセファロースファストフローカラムにかけた。未結合の画分を収集した。結合した画分を、同じ緩衝液中の0〜1M NaCl勾配で溶出した。（0.13〜0.25M NaCl）で溶出した画分を収集し、NH４HCO３に対して透析し、そして50μgのアリコート（aliquots）を凍結乾燥した。
【０１２９】
b）陽イオン交換クロマトグラフィー
精製したタイポキシンγを1mlの50mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0中に溶解し、同じ緩衝液で平衡化した1mlのSPセファロースファストフローカラム（SP-Sepharose fast flow column, Pharmacia）にかけた。主要な画分は未結合の画分にあった。これを収集し、NH４HCO３に対して透析し、そして50μgのアリコート（aliquots）を凍結乾燥した。結合した画分を、同じ緩衝液中の1M NaClで溶出した。
【０１３０】
さらなる詳細において、γ-タイポキシンを精製する1つの方法は以下のようにして実施した：α、β、およびγサブユニットを含む粗タイポキシン（crude taipoxin）を、Alomone Labs（Jerusalem）から購入した。粗タイポキシンの凍結乾燥粉末を脱イオン水中に溶解し、凍結乾燥させ、そして2mlの6M 塩酸グアニジンに溶解した。これを、6M 塩酸グアニジンで平衡化したセファクリルS-200カラム（Sephacryl S-200 column）にかけ、γサブユニットを、ゲルクロマトグラフィーによって、αサブユニットおよびβサブユニットから分離した（Fohlman, J.ら（1976）Eur. J. Biochem. 68, 457）。
【０１３１】
γサブユニットを含む画分をプールし、50mM NH４HCO３中で透析し、そして凍結乾燥した。凍結乾燥した画分を6M 塩酸グアニジンに再溶解し、6M 塩酸グアニジンで平衡化したセファクリルS-200カラム（Sephacryl S-200 column）に再びかけた。微量のαおよびβサブユニットを除去するために再度クロマトグラフィーを実施した。
【０１３２】
次いで、画分をプールし、50mM リン酸ナトリウム緩衝液pH7.0中で透析した。透析した画分をSPセファロースファストフローカラム（SP-Sepharose fast flow column, Pharmacia）（1ml）に適用した。γサブユニットは、これらの条件ではSPセファロースに結合しなかった。ある程度残留する不純物を含む結合物質は、50mM リン酸ナトリウム緩衝液pH7.0中の1M NaClで溶出した。これは、カラムにかけた物質の1％を超えなかった。γサブユニットを含むそのフロースルーを、50mM NH４HCO３中で透析し、そしてタンパク質含量を分光光度法により計算した。
【０１３３】
実施例3
毒性
タイポキシンのγサブユニットは、以下の手順に従って無毒性であることが証明された。
【０１３４】
A）γ-タイポキシンのインビトロ毒性（in vitro toxicity）
P19分化ニューロン細胞（P19 differentiated neurons）を、当技術分野で公知のプロトコールに従って調製した。分化の2週間後、γ-タイポキシンまたは粗タイポキシンを細胞に加え、そして細胞の生存度を、アラマーブルー（Alamar Blue）を使用して引き続き測定する。
【０１３５】
結果
0.1μg/mlの濃度のタイポキシンは、P19未分化細胞（P19 undifferentiated cells）の約60％、およびP19分化ニューロン細胞（P19 differentiated neurons）の約80％に細胞死を引き起こした。濃度範囲を選べば、タイポキシンは、一貫した挙動を示し、細胞の90％より多くを死滅させる。
【０１３６】
1μg/mlの濃度のγ-タイポキシンは、P19分化ニューロン細胞（P19 differentiated neurons）の約50％に細胞死を引き起こしたのに対して、P19未分化細胞（P19 undifferentiated cells）では、0.5μg/ml〜10μg/mlの試験濃度範囲ではγ-タイポキシンによる影響を受けなかった。
【０１３７】
従って、モル比を考慮に入れると、P19分化ニューロン細胞（P19 differentiated neurons）において、γ-タイポキシンは、粗タイポキシンよりも数百分の1の低い毒性である。
【０１３８】
さらなる実験において、異なる濃度のγ-タイポキシンまたは粗タイポキシンを培養皮質ニューロン細胞（cultured cortical neurons）に加え（96ウェルマイクロプレートの1ウェルあたり80000細胞）、37℃で一晩インキュベーションした後、生存細胞をアラマーブルーを用いて検出した。
【０１３９】
結果
粗タイポキシンは、試験したすべての濃度（最も低い濃度は62.5ng/mlであった）で毒性があった。対照的に、γ-タイポキシンの毒性は、非常に高い濃度（IC５０＞5μg/ml）でのみ検出された。より低い濃度のγ-タイポキシンはいかなる毒性も発揮しなかった。γ-タイポキシンの毒性は、粗タイポキシンの毒性の＜1％である。
【０１４０】
B）γ-タイポキシンのインビボ毒性（in vivo toxicity）
粗タイポキシンおよびγ-タイポキシンを別々にマウスに腹腔内投与した（IP-単回注射）。タイポキシンについては、0.5、1、および2μg/Kg（LD50）の3種の用量レベルで投与した。γ-タイポキシンについては、60、600、および1000μg/Kg（LD50濃度の1/2）の3種の用量レベルで投与した。生理食塩水を投与したさらなる群は、賦形剤（vehicle）の対照群として供した。
【０１４１】
結果
2μg/kgタイポキシンを与えられた2匹の動物（5匹のうち）を、立毛、重篤な呼吸困難、自発的運動活動の減退、およびるいそうの徴候が示された後に安楽死させた。
【０１４２】
臨床的徴候は、2μg/kgタイポキシンを与えた動物に限られた。主要なひどい病理学的な知見は、γ-タイポキシン処理動物または対照動物において見られなかった。
【０１４３】
上記の実験の結果に基づいて、0.5μg/kgを下回るタイポキシンの用量レベル、および1000μg/kgを下回るγ-タイポキシンの用量レベルは、副作用の観察されないレベル（NOEL, non-observed adverse effects levels）とみなされ得る。従って、タイポキシンのγサブユニットは無毒性である。
【０１４４】
実施例4
実験モデル
CNS損傷
CNS損傷を治療するための抗Narp抗体または他のNarp阻害物質の使用の可能性を動物モデルで評価する。このモデルは、対照動物と抗体処理動物との比較により、種々の複雑度のレベルを表す。このような治療の有効性は、臨床的結果、神経学的欠損、用量作用および治療濃度域の点から評価される。試験動物は、静脈注射または皮下注射によって、適切な緩衝液中で調製された抗Narp抗体または他のNarp阻害物質で処置される。対照動物は、緩衝液のみで処置される。使用されるモデルは以下のとおりである。
【０１４５】
１．閉鎖性頭部外傷（CHI）：実験的なTBIは、神経学的および神経代謝的なカスケード（これは、行動の欠損の度合いおよび範囲に関連する）を導く一連の事象をもたらす。CHIは、中前頭面において左脳半球を覆う頭蓋を露出させ、あらかじめ固定された高さ（Chenら、J. Neurotrauma 13, 557, 1996）から自由落下させることによって、麻酔下で誘導される。
【０１４６】
２．一過性の中大脳動脈閉塞（MCAO）：90〜120分間の一過性の限局性虚血（transient focal ischemia）を、成体の雄Spraque Dawleyラット（300〜370グラム）に施す。利用する方法は、管腔内縫合（intraluminal suture）によるMCAOである（Longaら、Stroke, 30, 84, 1989およびDoganら、J.Neurochem. 72, 765, 1999）。手短に述べると、ハロセン麻酔下で、ポリ-L-リジン（Poly-L-Lysine）コートした3-O-ナイロン縫合材料を、外頸動脈の穴を通して右内頸動脈（ICA）に挿入する。ナイロン糸を、ICAに入れ、右のMCAの起点（20〜23mm）にまで挿入する。90〜120分後、糸を引き出し、動物を縫合し、そして回復させる。
【０１４７】
３．永久の中大脳動脈閉塞（MCAO）：MCAの電気的凝固により、閉塞は永続的であり、片側性に誘導される。どちらの方法も、脳皮質の同側の側（ipsilateral side）に限局性の脳虚血（focal brain ischemia）をもたらすが、対側の側（contralateral side）は無傷のまま（対照）である。左側のMCAは、Tamura A.ら、J. Cereb. Blood Flow Metab. 1981; 1: 53-60におけるラットについての記載のように、一過性の頭蓋骨局部切除を介して露出される。MCAおよびそのレンズ核線状体枝（lenticulostriatal branch）は、微小二極性凝集(microbipolar coagulation)によって、嗅索の内側の縁に近接した部位で閉塞する。創傷を縫合し、そして動物を、26℃〜28℃に加温した室内のホームケージに戻す。動物の体温は、すべての時点において、自動サーモスタットを用いて維持される。
【０１４８】
評価法
抗Narp抗体または他のNarp阻害物質の有効性は、死亡率、体重増加、梗塞巣体積および生存動物における短期および長期に渡る臨床的および神経生理学的結果によって決定する。梗塞巣体積は組織学的に評価する（Knightら、Stroke, 25, 1252, 1994, およびMintorovitchら、Magn. Reson. Med. 18, 39, 1991）。階段テスト（Montoyaら、J. Neurosci. Methods 36, 219, 1991）またはBederson法に従う運動障害スケール（Bedersonら、Stroke, 17, 472, 1986）を使用して、MCAO後の機能的結果を評価する。動物は、様々な時点の間に渡って追跡し、最も長いものは2ヶ月に及ぶ。各時点（24時間、1週間、3週間、6週間、8週間）において、動物を屠殺し、そしてPBS中4％ホルムアルデヒドの心臓灌流を実施する。脳を取り出し、連続的な200mの冠状切片を、プロセシングおよびパラフィン包埋のために調製する。切片を、TCCのような適切な色素で染色する。梗塞領域を、コンピュータ化された画像分析機を使用してこれらの切片において測定する。
【０１４９】
上記の動物モデルにおいて例示されるような抗Narp抗体または他のNarp阻害物質処理の利用は、ヒト脳損傷の治療のための新しい可能性を提供する。
【０１５０】
実施例5
ラット脳卒中モデルにおけるγ-タイポキシンの神経保護効果
γ-タイポキシンの神経保護効果を、本明細書に記載の、永久的な限局性脳虚血（permanent focal cerebral ischemia）のラット脳卒中モデルにおいて評価した。
【０１５１】
永久的な限局性虚血は、日本エスエルシー株式会社(Hamamatsu, Japan) から購入した9週齢雄Sprague-Dawleyラットを使用して実施した。11匹の動物を、各処理群のために使用した。実施例2に記載したように調製した凍結乾燥γ-タイポキシンを、リン酸緩衝生理食塩水で溶解および希釈した。この薬物を、MCAOの24時間前から開始して24時間後まで、0.48、4.8、または48μg/頭/日の投薬用量で、Alzet浸透圧性ミニポンプ（ALZA、CA、USA）を使用して、側脳室領域に連続的に注入した。注入速度は1μL／時間であった。対照群においては、賦形剤（vehicle）のみを投与した。限局性虚血（focal ischemia）を、中大脳動脈の永続的凝固（permanent coagulation）によって誘導した。ラットは、手術の間、70％亜酸化窒素および30％酸素の混合気中、ハロタン（誘導のために4％、維持のために1.5％）で麻酔した。側頭下開頭で、左MCAを顕微手術的アプローチによって露出させ、MCAを二極性電気凝固（bipolar electrocoagulation）によって閉塞させた。MCAの閉塞後、側頭筋および皮膚を層状に閉じ、そして麻酔を中止した。ラットの直腸温度は、手術の間、加熱パッドを用いて37.0〜38.5℃に維持した。MCAOの24時間後、ラットを、ペントバルビタール（50mg/kg、i.p.）麻酔下で生理食塩水により灌流し、それらの脳を取り出した。脳はブレグマ（bregma）から+4〜-6mmの位置で、2mm厚の冠状に切片化し、次いで、6つの連続した切片を、2％の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）で、37℃、30分間染色した。6つの切片における虚血脳損傷の領域および大脳全体の領域を、コンピュータ化された画像分析システムを使用することによって計算した。脳損傷は、損傷を受けた脳の領域の合計の大脳全体の領域の合計に対する割合として表現し、そして虚血脳損傷の体積を計算した。賦形剤（vehicle）処理対照群とタイポキシンγ処理群との間の統計学的比較は、Dunnettの多重比較検定によって実施した。すべての結果を平均±S.E.M.で表現する。
【０１５２】
結果
タイポキシンγのi.c.v.注入を受けたラットは、実験の過程において、明白な異常な行動を示さなかった。左MCAの持続性閉塞は、MCAの領域内で、すなわち、側背皮質および線条で、虚血性脳損傷を生じた。賦形剤（vehicle）処理した対象群における、全体、皮質、および皮質下の虚血性脳損傷の体積は、それぞれ、255.00±15.14、170.43±13.39、および84.57±3.81mm３であった。従って、虚血性脳損傷のサイズは用量依存的である（表4）。0.48〜48μg／頭／日の用量範囲で脳内に注入されたタイポキシンγは、用量依存的に虚血性脳損傷のサイズを減少させ、48μg／頭／日の用量においては有意な効果であった。タイポキシンγは、大脳皮質において損傷を受けた領域を劇的に減少させたが、線条の梗塞にはごく最小に影響したのみであった。皮質の損傷は、0.48、4.8、および48μg／頭／日の用量で、それぞれ15.9％、18.9％、および26.6％減少した。
【０１５３】
（表４）ラットの限局性大脳虚血モデルにおけるタイポキシンの神経保護効果
2005518443.tif 000005
＊P<0.05；賦形剤（vehicle）処理した対照群と比較して統計学的に有意である（Dunnettの多重比較検定による）。11匹の動物を各処理群のために使用した。
【０１５４】
実施例6
薬理学および薬物送達
本発明の化合物は、良好な医学的実践（good medical practice）に従って、個々の患者の臨床的状態、治療される疾患、投与の部位および方法、投与の日程計画、患者の年齢、性別、体重、ならびに医師等に公知の他の要因を考慮に入れて、投与および投薬される。従って、ここで目的とする薬学的「有効量」は、当技術分野で公知であるようなことを熟慮して決定される。その量は、改善を達成するために有効であるべきであり、その改善には、生存率の改善やより迅速な回復や症状の改善もしくは消失や当業者によって適切な尺度として選択されるような他の指標が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
治療は一般に、疾患過程の長さ、および薬物の有効性、および治療される患者の種に比例した期間を有する。ヒトは一般に、本明細書において例示されるマウスまたは他の実験動物よりも長い期間に渡って治療されることに留意する。
【０１５６】
本発明の化合物は、従来からある投与経路のいずれかによって投与され得る。これは、化合物としてまたは薬学的に許容される塩として投与され得るし、かつ単独で、または薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤(excipients)、アジュバント、および賦形剤（vehicles）と組み合わせた活性成分として投与できることに留意するべきである。この化合物は、経口的、皮下、または非経口的（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、および鼻内投与、ならびにクモ膜下腔内および注入技術を含む）に投与され得る。化合物のインプラント（implants）もまた有用である。液体剤形は注射のために調製することができ、この用語は、皮下、経皮的、静脈内、筋肉内、クモ膜下腔内、および他の非経口的な投与の経路を含む。液体組成物は、有機共溶媒(organic cosolvents)を伴うかまたは伴わない水溶液、水性または油性懸濁液、食用油を伴う乳剤、ならびに同様な薬学的賦形剤（vehicles）を含む。さらに、特定の状況下では、本発明の新規な治療における使用のための組成物は、鼻内などの投与のためのエアロゾルとして形成してもよい。治療される患者は温血動物であり、特に、ヒトを含む哺乳動物である。薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤(excipients)、アジュバント、および賦形剤(vehicles)、ならびにインプラント担体（inplant carriers）とは、一般に、本発明の活性成分と反応しない不活性、無毒性の固体または液体充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を指す。
【０１５７】
本発明の化合物を非経口的に投与した場合、これは一般に、単位用量注射用剤形（溶液、懸濁液、乳剤）で処方される。注射のために適切な薬学的処方物は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液に再構築するための滅菌粉末を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（polyol）（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、および植物性オイルを含む、溶媒または分散媒体であり得る。
【０１５８】
適当な流動性は、例えば、レシチン（lecithin）のようなコート剤を使用することによって、分散の場合には必要とされる粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって、持続できる。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、ダイズ油、コーン油、ヒマワリ油、またはピーナッツ油、およびエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸等）のような非水性賦形剤(vehicles)もまた、化合物組成物のための溶媒系として使用できる。さらに、組成物の安定性、無菌性、および等張性を増強する種々の添加剤（抗微生物保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含む）が付加され得る。微生物の作用の妨害は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確保され得る。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい。注射用の薬学的剤形の吸収を延長させるには、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用してもよい。しかし、本発明に従って、使用される任意の媒質、希釈剤、または添加剤が本発明の化合物と適合可能でなくてなならない。滅菌注射用溶液は、所望されるように、他の種々の成分を有する必要量の適切な溶媒の中に、本発明の実施の際に利用される化合物を組み込むことによって調製され得る。
【０１５９】
本発明の薬理学的製剤は、任意の適合可能な担体、例えば、種々の賦形剤(vehicles)、アジュバント、添加剤、および希釈剤を含む注射用製剤で患者に投与してもよく；または、本発明において使用される化合物は、徐放性経皮性インプラントもしくは標的化送達系（targeted delivery systems）（例えば、モノクローナル抗体、ベクターによる送達、イオン注入(iontophoretic)、ポリマーマトリックス、リポソーム、およびミクロスフェア）の剤形で患者に非経口的に投与してもよい。本発明において有用な送達系の例は、米国特許第5,225,182号；同第5,169,383号；同第5,167,616号；同第4,959,217号；同第4,925,678号；同第4,487,603号；同第4,486,194号；同第4,447,233号；同第4,447,224号；同第4,439,196号；および同第4,475,196号を含む。多数の他のこのようなインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に周知である。
【０１６０】
本発明において使用される化合物の薬理学的製剤は、経口的に患者に投与してもよい。錠剤、懸濁液、溶液、乳剤、カプセル、粉末、シロップなどにおいて化合物を送達するような従来の方法が使用可能である。それを経口的または静脈内で送達し、かつ生物学的活性を保持する既知の技術が好ましい。1つの態様において、本発明の化合物は、血液レベルを適切なレベルにする静脈内注射によって最初に投与してもよい。次いで、患者のレベルを経口剤によって維持するが、患者の状態に依存しておよび上記に示したように、他の投与剤形が使用され得る。
【０１６１】
抗体は、典型的には数日間または数週間にわたって投与される。これは、静脈内または皮下に注射され得る。中枢神経系に作用する抗体はボーラスで、または脳血液関門が開いているすべての時間（通常、脳卒中またはTBIのいずれかの脳損傷後24時間）については注入により、投与され得る。
【０１６２】
抗体の投与の用量および経路は変動してもよく、医学的な病歴に従って、担当医によって決定される。1つの代表的な例において、ICAM-1に対する治療抗体は、実験動物に対して、中大脳動脈閉塞から2時間、3分間の間隔にわたって2mg/kgの用量で投与され、続いて、中大脳動脈閉塞から22時間後に、1mg/kgの二回目の投与が行われた（Zhang R.L.ら、Stroke, 26: 1438-1443, 1995）。
【０１６３】
一般に、ヒトについての活性用量は、1日あたり1ng/kgから約20〜100mg/kg体重の範囲、好ましくは1日あたり約0.01mg/kgから約2〜10mg/kg体重の範囲であり、それは、1〜2週間またはそれ以上の期間、好ましくは24〜48時間の間、1日あたり1回用量、または1日あたり2回もしくは3回またはそれ以上の回数での、あるいは、1〜2週間またはそれ以上の期間、連続的注入での投与計画においてである。
【０１６４】
本発明の医薬組成物の最も適切な投与は、治療される傷害または疾患の種類に依存することが理解されるであろう。従って、急性の事象を治療するには、傷害の誘導後比較的迅速に活性組成物の全身投与が必要である。他方、慢性的な変性による損傷の減少には、持続した投薬計画が必要とされ得る。
【０１６５】
脳内へのγ-タイポキシンの送達
脳への化合物の送達は、いくつかの方法、例えば、とりわけ、神経外科的インプラント、血液脳関門破壊、脂質媒介輸送、担体媒介流入もしくは流出、血漿タンパク質媒介輸送、受容体媒介経細胞輸送（receptor-mediated transcytosis）、吸収剤媒介経細胞輸送、血液脳関門における神経ペプチド輸送、および薬物ターゲティングのための遺伝子操作した「トロイの木馬（Trojan horses）」によって達成され得る。上記の方法は、本質的には、「Brain Drug Targeting: the future of brain drug development」、W. M. Pardridge, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2001) に記載されるように実施される。特に、γ-タイポキシンまたはその断片のようなポリペプチドの送達は、薬物ターゲティングのための遺伝子操作した「トロイの木馬（Trojan horses）」によって達成され得る。これは例えば、血液脳関門内因性受容体に対するリガンドであるペプチド模倣性モノクローナル抗体（peptidomimetic monoclonal antibodies）である。
【０１６６】
実施例7
スクリーニングアッセイ法
Narp遺伝子は、脳卒中を阻止する化合物を同定および単離するためのスクリーニングアッセイ法において使用され得る。スクリーニングされる化合物としては、とりわけ、低分子化学分子（small chemical molecules）、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスDNA分子またはRNA分子、ポリペプチドおよびドミナントネガティブまたはドミナントポジティブペプチド（dominant negative or dominant positive peptides）、および発現ベクターのような物質が含まれる（合成アンチセンスオリゴヌクレオチド薬物は脳卒中症状（stroke event）に関与する遺伝子の遺伝子産物をコードするmRNAの翻訳を阻害し得る）。低分子化学分子（small chemical molecules）は、一般的に、2000ダルトン未満の分子量、より好ましくは1000ダルトン未満、またはさらに600ダルトン未満の分子量を有する。
【０１６７】
多くの種類のスクリーニングアッセイ法が当業者に公知である。選択される特定のアッセイは、候補遺伝子またはそれによって発現されるポリペプチドの活性に大きく依存する。従って、もし仮に候補遺伝子の発現産物が酵素活性を有することが公知であるならば、その時は酵素活性の阻害（または活性化）に基づくアッセイ法が使用され得る。Narpの場合におけるように、候補ポリペプチドがリガンドまたは他の相互作用分子と結合することが知られているならば、アッセイ法は、このような結合または相互作用の阻害に基づき得る。候補遺伝子が既知の遺伝子である場合には、その特性の多くもまた公知であり得るので、それらの特性は、最も良好なスクリーニングアッセイ法を決定するために使用できる。もし仮に候補遺伝子が新規である場合には、その候補遺伝子の活性の阻害物質を見い出すために使用される最も良好なアッセイ法を決定するためには、何らかの分析および／または実験をすることが妥当である。そうした分析には、その活性の解明に役立つ配列中のドメインを見い出すための配列分析を含み得る。
【０１６８】
当技術分野で周知のように、スクリーニングアッセイ法は細胞に基づいていてもよく、または細胞に基づいていなくてもよい。細胞に基づくアッセイ法は、HeLa細胞のような真核生物細胞を使用して行われる。このような細胞に基づくアッセイを実施する1つの方法では、テトラサイクリン誘導性（Tet誘導性）遺伝子発現が使用される。Tet誘導性遺伝子発現は当技術分野で周知である；例えば、Hofmannら、1996, Proc Natl Acad Sci 93(11): 5185-5190を参照されたい。
【０１６９】
Tet誘導性レトロウイルスは、3'Ltr エンハンサー／プロモーターレトロウイルス欠失変異体（3' Ltr enhancer/promoter retroviral deletion mutant）の自己不活性化（SIN）特徴を組み込むように設計されてきた。細胞中においてこのベクターの発現は、テトラサイクリンまたは他の活性類似体の存在下では事実上検出不可能である。しかしながら、Tetの非存在下では、発現が生じて、誘導性レトロウイルスを有する細胞集団全体での一様な発現上昇を伴い、誘導後48時間以内に最大に達する。これらのことは、感染した細胞集団内で発現が一様に制御されていることを示している。
【０１７０】
もし仮に候補遺伝子の遺伝子産物が特定の標的タンパク質をリン酸化する場合、特定のレポーター遺伝子構築物が設計され得る。その際、このレポーター遺伝子産物はリン酸化されて活性化するが、着色反応によってその活性化を追跡することが可能である。候補遺伝子は、上記に論じたTet誘導性の系を使用して特異的に誘導でき、そして誘導性遺伝子対非誘導性遺伝子の比較は、レポーター遺伝子活性化の尺度を提供する。
【０１７１】
同様の間接的なアッセイ法においては、レポーター系は、候補タンパク質のタンパク質−タンパク質間相互作用の変化に応答するように設計され得る。もし、レポーターが候補タンパク質との実際の相互作用に応答した場合、着色反応が発生する。
【０１７２】
特定の候補プロモーターまたは他の制御エレメントを介してその発現レベルを調節することによって、レポーター遺伝子活性の阻害または促進もまた評価することができる。候補遺伝子の活性を調節する特定のプロモーターまたは制御エレメントについては、当技術分野で周知の方法によって定義される。特定の候補遺伝子のプロモーターまたは制御エレメントによって調節されるレポーター遺伝子が構築される。実際のところ、その特定のプロモーターや制御因子を含むDNAは、レポーターをコードする遺伝子に連結されている。レポーター活性は、プロモーターまたは制御エレメントの特異的活性化に依存する。従って、レポーターの阻害または刺激は、レポーター遺伝子の刺激／阻害の直接的アッセイ法である；例えば、Komarovら（1999）Science 第285巻、1733-7、およびStorzら（1999）Analytical Biochemistry, 276, 97-104を参照されたい。
【０１７３】
細胞に基づかない種々のスクリーニングアッセイ法もまた、当業者に周知である。例えば、酵素活性が測定される場合、もし仮に候補タンパク質がキナーゼ活性を有するようなものである場合、標的タンパク質については限定可能であり、かつその標的の特異的リン酸化を追跡することが可能である。このアッセイ法は、標的のリン酸化の阻害、または標的のリン酸化の促進のいずれが関連していてもよく、両方の種類のアッセイ法が当技術分野で周知である（例えば、キナーゼ活性の測定については、Mohneyら（1988）J. Neuroscience 18, 5285およびTangら（1997）J Clin. Invest. 100, 1180を参照されたい）。既知の酵素活性が存在しない場合においては該当しないが、非酵素タンパク質は、ある種の酵素と相互作用してタンパク質−タンパク質間相互作用を通してその酵素活性を調節する可能性がある。
【０１７４】
候補ポリペプチドの、相互作用分子（interactors）とのインビトロ相互作用（in vitro interaction）もまた測定することができる。このスクリーニングにおいて、候補ポリペプチドは、ビーズに固定化されている。例えば、受容体リガンドのような相互作用分子が、放射能標識されて加えられる。これがビーズ上の候補ポリペプチドに結合する場合、（候補ポリペプチドとの相互作用に起因する）ビーズ上に保持された放射能の量が測定され得る。このアッセイ法では、ビーズ上の放射能の量を測定することによって相互作用の阻害が示される。
【０１７５】
本発明に従ういかなるスクリーニングアッセイ法においても、そのアッセイ法において陽性であることを試験する、（上記に記載するような）化合物を同定する段階を含んでいてもよく、そしてまた、そのようにして同定されたものを医薬として製造するさらなる段階を含んでいてもよい。このような化合物、またはその化学的類似体もしくはそれらの相同体を含む医薬は、本発明の一部であるとみなされる。脳卒中または他の虚血症状（ischemic events）の予防または治療のために同定された任意のそのような化合物の使用もまた、本発明の一部であると考慮される。
【０１７６】
Narpが利用され得る特定のスクリーニング系については、O'Brienら、「Synaptically Targeted Narp Plays an Essential Role in the Aggregation of AMPA Receptors at Excitatory Synapses in Cultures Spinal Neurons」、Journal of Neuroscience 22(11): 4487-4498, 2002、およびPCT出願公開公報第97/39133号に開示されている。
【０１７７】
実施例8
抗Narp抗体の調製
本発明のNarpポリペプチドに結合する抗体は、完全長のNarpポリペプチドまたはより小さなポリペプチドを免疫抗原として含有する断片を使用して調製し得る。例えば、NarpのN末端もしくはC末端または任意の他の適切なドメインに特異的に結合する抗体を産生することが望ましいかもしれない。動物を免疫するために使用されるポリペプチドは、翻訳されたcDNAまたは化学合成に由来していてもよく、これは、所望される場合、担体タンパク質に結合していてもよい。ポリペプチドに化学的にカップリングされるこのような一般に使用される担体には、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH, keyhole limpet hemocyanin）、サイログロブリン（thyroglobulin）、ウシ血清アルブミン（BSA）、および破傷風毒素が含まれる。次いで、カップリングしたポリペプチドを使用して動物を免疫する。
【０１７８】
所望される場合、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、それらの抗体を生じさせたポリペプチドまたはペプチドが結合しているマトリックスに結合させて、それから溶出させることによって、さらに精製することができる。当業者は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の精製および／または濃縮のための免疫学において一般的な種々の技術を周知している（Coliganら、第9章、「Current Protocols in Immunology」、Wiley Interscience, 1994, 参照として組み入れられる）。すべてのタイプの抗体（断片を含む）を作製する方法については当技術分野において公知である（例えば、HarlowおよびLane、「Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory」、New York (1988)（参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。免疫化の方法は、適切なアジュバント中の免疫原の調製、抗体結合の決定、抗体の単離、モノクローナル抗体を取得するための方法、およびモノクローナル抗体のヒト化のすべての必要な段階を含めて、同業者に公知である。
【０１７９】
この抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。抗体は、当技術分野で公知の種々の方法を使用してヒト化され得る。これらの方法には以下が含まれる：CDR移植（CDR-grafting）（欧州特許第239,400号；PCT国際公開公報第91/09967号；米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号、および同第5,585,089号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフィシング（resurfacing）（欧州特許第592,106号；同第519,596号；Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnickaら、Protein Engineering 7(6): 805-814 (1994)；Roguskaら、PNAS 91: 969-973(1994)）、およびチェーンシャッフリング（chain shuffling）（米国特許第5,565,332号）。
【０１８０】
規定したようにモノクローナル抗体には、1つの種（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ラット、ヒトなど）由来の抗体、ならびにキメラ抗体やヒト化抗体のような2つ（またはそれ以上）の種由来の抗体）が含まれる。
【０１８１】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療上の処置のために特に所望される。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の方法によって作成でき、これには、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用したファージディスプレイ法が含まれる。米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号；ならびにPCT国際公開公報第98/46645号、同第98/50433号、同第98/24893号、同第98/16654号、同第96/34096号、同第96/33735号および同第91/10741号もまた参照されたい；これらの各々はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１８２】
すべてのタイプの抗体に関するさらなる情報は、ヒト化抗体、ヒト抗体、および抗体断片を含めて、国際公開公報第01/05998号に見い出すことができ、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】ヒトNarpオープンリーディングフレーム（cDNA）および対応するポリペプチドへの翻訳を示す（それぞれ配列番号：1および配列番号：2）。
【図２】ラットNarpオープンリーディングフレーム（cDNA）および対応するポリペプチドへの翻訳を示す（それぞれ配列番号：3および配列番号：4）。
【図３】ラット、マウス、およびヒトのNarpのヌクレオチド配列間の相同性比較を示し；ラットおよびヒトのNarpヌクレオチド配列の配列番号は上記のとおりであり（それぞれ配列番号：3および1）；マウスヌクレオチド配列の配列番号は配列番号：5であり、対応するポリペプチドは配列番号：6である。
【図４】ラット、マウス、およびヒトのNarpのアミノ酸配列間の相同性比較を示す（それぞれ配列番号：4、6、および2）。
【図５】γ-タイポキシンのアミノ酸配列、配列番号：7を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
2005518443.tif 000008
【図２−２】
2005518443.tif 000009
【図３−１】
2005518443.tif 000010
【図３−２】
2005518443.tif 000011
【図３−３】
2005518443.tif 000012
【図３−４】
2005518443.tif 000013
【図３−５】
2005518443.tif 000014
【図４−１】
2005518443.tif 000015
【図４−２】
2005518443.tif 000016
【図５】
2005518443.tif 000017
【国際調査報告】
2005518443.tif 000018
2005518443.tif 000019
2005518443.tif 000020