(57)【要約】本発明は、2つの異なる導体に核酸分子を付着させるための方法であって、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが第2導体には結合させない付着化学反応により、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブが付着される方法に関する。次いで、第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。本発明によりまた、マスキング剤を用いて導体に核酸分子を付着させるための方法およびオリゴヌクレオチドプローブが導体に化学的に結合されるよう静電引力により導体に核酸分子を付着させるための方法が提供される。本発明によりまた、試料中の標的核酸分子を検出するための方法および装置が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、伝導性表面に核酸分子を付着させる方法：
第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製された、相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体を提供する段階；
第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが、第2導体には結合させない付着化学反応により、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる段階；および
第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる段階。
【請求項２】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
前記の第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる段階の後であり且つ前記の第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる段階の前に、ブロッキング分子を第1セットのオリゴヌクレオチドプローブにより占有されなかった全ての部位で、第1導体に付着させる段階。
【請求項３】
以下の段階をさらに含む、請求項2記載の方法：
前記のブロッキング分子を付着させる段階の後であり且つ前記の第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる段階の前に、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブが第2導体に付着されることを可能とするため、第2導体の表面を官能化する段階。
【請求項４】
第2導体の表面が水酸基で官能化される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
第1のタイプの導体物質が金であり、第2のタイプの導体物質がアルミニウムであり、第1導体に対する付着化学反応がメルカプト基であり、およびブロッキング分子が第1導体に付着するチオール基を有する、請求項2記載の方法。
【請求項６】
第2導体の表面をシリコン処理し、シロキサン基で第2導体のシリコン処理表面に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを連結することにより、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを第2導体に付着させる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
第1導体および第2導体が基板上に固定されている、請求項1記載の方法。
【請求項８】
基板がガラス、石英、シリコン、およびポリマー物質からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
以下の段階を含む、伝導性表面に核酸分子を付着させる方法：
第2導体がマスキング剤で被覆された、相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体を提供する段階；
第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる付着化学反応により第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させる段階；
マスキング剤を第2導体から除去する段階；および
第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させる付着化学反応により第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる段階。
【請求項１０】
以下の段階をさらに含む、請求項9記載の方法：
前記の第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる段階の後、または前記の第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる段階の後、第1または第2セットのオリゴヌクレオチドプローブにより占有されなかった全ての部位で、ブロッキング分子を第1導体または第2導体に付着させる段階。
【請求項１１】
第1導体および第2導体がマスキング剤で被覆される、以下の段階をさらに含む、請求項9記載の方法：
前記の第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる段階の前に、マスキング剤を第1導体から除去するが、第2導体からは除去しない段階。
【請求項１２】
マスキング剤がフォトレジストであり、該マスキング剤を第1導体または第2導体から除去する段階が以下を含む段階により行われる、請求項11記載の方法：
第1導体または第2導体に相当する位置にあるフォトレジストに放射線を照射する段階；および
その照射されたフォトレジストを除去する段階。
【請求項１３】
第1導体および第2導体が同じタイプの物質で作製された、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
第1導体および第2導体が金で作製され、第1導体および第2導体に対する付着化学反応がメルカプト基であり、並びにブロッキング分子が第1導体および第2導体に付着するチオール基を有する、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
第1導体および第2導体が基板上に固定されている、請求項9記載の方法。
【請求項１６】
基板がガラス、石英、シリコン、およびポリマー物質からなる群より選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
以下の段階を含む、伝導性表面に複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を付着させる方法：
相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体を提供する段階；
第1導体の表面をシリコン処理し、シロキサン基でシリコン処理表面に金属粒子を連結することにより、第1導体に金属粒子を付着させる段階；および
第1導体に付着した金属粒子に複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を付着させる段階。
【請求項１８】
以下の段階をさらに含む、請求項17記載の方法：
第2導体の表面をシリコン処理し、シロキサン基でシリコン処理表面に金属粒子を連結することにより、第2導体に金属粒子を付着させる段階；および
第2導体に付着した金属粒子に複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を付着させる段階。
【請求項１９】
第1導体がアルミニウム製であり、金属粒子が金製である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、伝導性表面に核酸分子を付着させる方法：
相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体を提供する段階であって、前記導体に電源が連結されている段階；および
第2導体に対して第1導体をよりプラスに帯電させることにより、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを第1導体の方へ引きつける段階であって、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブが第1導体に化学的に結合する段階。
【請求項２１】
以下の段階をさらに含む、請求項20記載の方法：
第1導体に対して第2導体をよりプラスに帯電させることにより、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを第2導体の方へ引きつける段階であって、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブが第2導体に化学的に結合する段階。
【請求項２２】
前記の第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを引きつける段階の間に第1導体がプラスに帯電され且つ第2導体がマイナスに帯電され、前記の第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを引きつける段階の間に第2導体がプラスに帯電され且つ第1導体がマイナスに帯電される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
以下の段階をさらに含む、請求項20記載の方法：
第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させた後、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブにより占有されなかった全ての部位で、ブロッキング分子を第1導体に付着させる段階。
【請求項２４】
以下の段階をさらに含む、請求項20記載の方法：
前記の第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを引きつける段階の前に、第1導体を特定の金属で電気メッキする段階。
【請求項２５】
以下の段階をさらに含む、請求項21記載の方法：
前記の第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを引きつける段階の前に、第2導体を特定の金属で電気メッキする段階。
【請求項２６】
第1導体および第2導体が同じタイプの物質で作製された、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
以下を含む、試料中の標的核酸分子を検出するための装置：
第1導体および第2導体のそれぞれが、相互に接触することなく250ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する検出部位を有し、第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製された、第1導体および第2導体；
第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが第2導体には結合させない付着化学反応により第1導体の検出部位に付着された第1セットのオリゴヌクレオチドプローブ；ならびに
第2導体の検出部位に付着された、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２８】
検出部位が100ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する、請求項27記載の装置。
【請求項２９】
検出部位が10ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する、請求項27記載の装置。
【請求項３０】
第1セットのオリゴヌクレオチドプローブにより占有されなかった全ての部位でブロッキング分子を第1導体に付着させる、請求項27記載の装置。
【請求項３１】
第1のタイプの導体物質が金であり、第2のタイプの導体物質がアルミニウムであり、第1のタイプの導体物質に対する付着化学反応がメルカプト基であり、ブロッキング分子が第1導体に付着するチオール基を有する、請求項30記載の装置。
【請求項３２】
第2導体の表面をシリコン処理しシロキサン基で第2導体のシリコン処理表面に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを連結することにより、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを第2導体に付着させる、請求項27記載の装置。
【請求項３３】
第1導体および第2導体が基板上に固定されている、請求項27記載の装置。
【請求項３４】
基板がガラス、石英、シリコン、およびポリマー物質からなる群より選択される、請求項33記載の装置。
【請求項３５】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸分子を検出するための方法：
以下を含む装置を提供する段階：
第1導体および第2導体のそれぞれが、相互に接触することなく250ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する検出部位を有し、第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製された、第1導体および第2導体；
第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが第2導体には結合させない付着化学反応により第1導体の検出部位に付着された第1セットのオリゴヌクレオチドプローブ；および
第2導体の検出部位に付着され、且つギャップによって第1セットのオリゴヌクレオチドプローブから離すようにして一定間隔で配置された第2セットのオリゴヌクレオチドプローブ；
試料中の任意の標的核酸分子を一定間隔で離れて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの双方とハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、プローブを標的核酸分子が含まれている可能性のある試料と接触させる段階であって、もし含まれている場合、これによりギャップが架橋され、ハイブリダイズした標的核酸分子によりオリゴヌクレオチドプローブ対が電気的に連結される段階；
電気的に連結されたオリゴヌクレオチドプローブ対およびハイブリダイズした標的核酸分子を充てん用の核酸配列で充てんする段階であって、充てん用の核酸配列は、標的核酸分子に相補的であって、オリゴヌクレオチドプローブ対の間を伸張する段階；並びに
プローブ間に電流が流れるかどうかを決定する段階であって、プローブ間を流れる電流がある場合には、試料中にそのプローブに相補的な配列を有する標的核酸分子が存在していることが示される段階。
【請求項３６】
標的核酸分子がDNAである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
標的核酸分子がRNAである、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
以下の段階をさらに含む、請求項35記載の方法：
オリゴヌクレオチドプローブおよび任意の標的核酸分子を導体物質で被覆する段階。
【請求項３９】
導体物質が銀である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
導体物質が金である、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
以下の段階をさらに含む、請求項35記載の方法：
プローブと結合させた後、標的核酸分子をヌクレアーゼと接触させる段階。
【請求項４２】
標的核酸分子とハイブリダイズする場合、第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブが連結点で相互に隣接する、請求項35記載の方法であって、以下の段階をさらに含む方法：
前記の充てんする段階の後、標的核酸分子をリガーゼと接触させる段階；および
プローブから標的核酸分子が変性されるのに十分高い温度まで装置を加熱する段階。
【請求項４３】
プローブが病原菌の遺伝物質に相補的である、請求項35記載の方法。
【請求項４４】
病原菌が生物戦争の媒介物である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
病原菌が食品媒介性の病原体である、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
プローブがウイルスの遺伝物質に相補的である、請求項35記載の方法。
【請求項４７】
プローブがヒトの遺伝物質に相補的である、請求項35記載の方法。
【請求項４８】
プローブが多型性を含む配列に相補的な配列を有する、請求項35記載の方法。
【請求項４９】
複数個の各オリゴヌクレオチドプローブ対が提供される、請求項35記載の方法であって、以下の段階をさらに含む方法：
試料中に存在する標的核酸分子の量を定量化するため、その間を電流が通過する同一なオリゴヌクレオチドプローブ対の数を同定する段階。
【請求項５０】
オリゴヌクレオチドプローブ対が、20〜75℃の温度で標的核酸分子とハイブリダイズするように設定されている、請求項35記載の方法。
【請求項５１】
以下の段階をさらに含む、請求項35記載の方法：
前記の接触させる段階の後、オリゴヌクレオチドプローブ対とハイブリダイズしない一部の標的核酸分子をヌクレアーゼにより除去する段階。
【請求項５２】
第1導体および第2導体が基板上に固定されている、請求項35記載の方法。
【請求項５３】
基板がガラス、石英、シリコン、およびポリマー物質からなる群より選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
試料が唾液、全血、末梢血リンパ球、皮膚、髪、または精液である、請求項35記載の方法。
【請求項５５】
感染物質を検出するために使用される、請求項35記載の方法。
【請求項５６】
核酸塩基配列決定のために使用される、請求項35記載の方法。
【請求項５７】
検出部位が100ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する、請求項35記載の方法。
【請求項５８】
検出部位が10ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する、請求項35記載の方法。
【請求項５９】
ブロッキング分子を第1セットのオリゴヌクレオチドプローブにより占有されなかった全ての部位で第1導体に付着させる、請求項35記載の方法。
【請求項６０】
第1のタイプの導体が金であり、第2のタイプの導体がアルミニウムであり、第1のタイプの導体に対する付着化学反応がメルカプト基であり、ブロッキング分子が第1のタイプの導体に付着するチオール基を有する、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
第2導体の表面をシリコン処理しシロキサン基でそのシリコン処理表面に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを連結することにより、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを第2導体に付着させる、請求項35記載の方法。
【請求項６２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸分子を検出するための方法：
以下を含む装置を提供する段階：
第1導体および第2導体のそれぞれが、相互に接触することなく250ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する検出部位を有し、第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製された、第1導体および第2導体；
第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが第2導体には結合させない付着化学反応により第1導体の検出部位に付着された第1セットのオリゴヌクレオチドプローブ；および
第2導体の検出部位に付着され、且つギャップによって第1セットのオリゴヌクレオチドプローブから離れて一定間隔で配置された、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブ；
試料中の任意の標的核酸分子を、一定間隔で離れて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの双方とハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、プローブを標的核酸分子が含まれている可能性のある試料と接触させる段階であって、もし含まれている場合、これによりギャップが架橋され、ハイブリダイズした標的核酸分子によりオリゴヌクレオチドプローブ対が電気的に連結される段階；
電気的に連結されたオリゴヌクレオチドプローブ対およびハイブリダイズした標的核酸分子の上に導体物質を塗布する段階；並びに
プローブ間に電流が流れるかどうかを決定する段階であって、プローブ間を流れる電流がある場合には、試料中にそのプローブに相補的な配列を有する標的核酸分子が存在していることが示される段階。
【請求項６３】
標的核酸分子がDNAである、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
標的核酸分子がRNAである、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
導体物質が銀である、請求項62記載の方法。
【請求項６６】
導体物質が金である、請求項62記載の方法。
【請求項６７】
以下の段階をさらに含む、請求項62記載の方法：
プローブと結合させた後、標的核酸分子をヌクレアーゼと接触させる段階。
【請求項６８】
標的核酸分子とハイブリダイズする場合、第1および第2オリゴヌクレオチドプローブが連結点で相互に隣接する、請求項62記載の方法であって、以下の段階をさらに含む方法：
前記の充てんする段階の後、標的核酸分子をリガーゼと接触させる段階；および
プローブから標的核酸分子を変性させるのに十分高い温度まで装置を加熱する段階。
【請求項６９】
プローブが病原菌の遺伝物質に相補的である、請求項62記載の方法。
【請求項７０】
病原菌が生物戦争の媒介物である、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
病原菌が食品媒介性の病原体である、請求項69記載の方法。
【請求項７２】
プローブがウイルスの遺伝物質に相補的である、請求項62記載の方法。
【請求項７３】
プローブがヒトの遺伝物質に相補的である、請求項62記載の方法。
【請求項７４】
プローブが多型性を含む配列に相補的な配列を有する、請求項62記載の方法。
【請求項７５】
複数個の各オリゴヌクレオチドプローブ対が提供される、請求項62記載の方法であって、以下の段階をさらに含む方法：
試料中に存在する標的核酸分子の量を定量化するため、その間を電流が通過する同一なオリゴヌクレオチドプローブ対の数を同定する段階。
【請求項７６】
オリゴヌクレオチドプローブ対が、20〜75℃の温度で標的核酸分子とハイブリダイズするように設定されている、請求項62記載の方法。
【請求項７７】
以下の段階をさらに含む、請求項62記載の方法：
前記の接触させる段階の後、オリゴヌクレオチドプローブ対とハイブリダイズしない一部の標的核酸分子をヌクレアーゼにより除去する段階。
【請求項７８】
第1導体および第2導体が基板上に固定されている、請求項62記載の方法。
【請求項７９】
基板がガラス、石英、シリコン、およびポリマー物質からなる群より選択される、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
試料が唾液、全血、末梢血リンパ球、皮膚、髪または精液である、請求項62記載の方法。
【請求項８１】
感染物質を検出するために使用される、請求項62記載の方法。
【請求項８２】
核酸塩基配列決定のために使用される、請求項62記載の方法。
【請求項８３】
検出部位が100ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する、請求項62記載の方法。
【請求項８４】
検出部位が10ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する、請求項62記載の方法。
【請求項８５】
ブロッキング分子を第1セットのオリゴヌクレオチドプローブにより占有されなかった全ての部位で、第1導体に付着させる、請求項62記載の方法。
【請求項８６】
第1のタイプの導体が金であり、第2のタイプの導体がアルミニウムであり、第1のタイプの導体に対する付着化学反応がメルカプト基であり、ブロッキング分子が第1のタイプの導体に付着するチオール基を有する、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
第2導体の表面をシリコン処理し、シロキサン基でそのシリコン処理表面に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを連結することにより、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを第2のタイプの導体に付着させる、請求項62記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年8月8日付で出願した米国特許仮出願第60/310,937号の恩典を主張するものであり、これらの全てが参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、液体試料からの、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)のような核酸の収集、精製および遺伝学的特徴付けのための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
臨床的または法医学的用途に向けた検体として、DNAまたはRNAのような核酸への関心が高まってきている。強力な新しい分子生物学技術により、先天性疾患または感染症を検出することが可能となる。これらの同一技術により、父親認知訴訟および刑事訴追のような訴訟手続きにおける事実に関する問題を解決する際に、DNAを使用することが特徴付けられる。
【０００４】
核酸分子の分析および試験のためには、少量の核酸分子を増幅すること、増幅された核酸断片を単離すること、および他の手順が必要とされる。少量のDNAを増幅する技術は急速に進歩し、現在ではいくつかの方法が存在する。これらの方法には、連結型線形増幅法(linked linear amplification)、ライゲーションに基づく増幅法(ligation-based amplification)、転写に基づく増幅法(transcription-based amplification)および線形等温増幅法(linear isothermal amplification)が含まれる。連結型線形増幅法については、Wallaceらが米国特許第6,027,923号の中で詳細に説明している。ライゲーションに基づく増幅法には、Wuら, Genomics, 4:560 (1989)の中で詳細に説明されているライゲーション増幅反応(LAR)と欧州特許第0320308B1号中で説明されているリガーゼ連鎖反応が含まれる。転写に基づく増幅法は、米国特許第5,766,849号および米国特許第5,654,142号、Kwohら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173 (1989)、並びにGinergerasらのPCT出願国際公開公報第88/10315号の中で詳細に説明されている。線形等温増幅法というもっと最近の方法については、Kurnらが米国特許第6,251,639号の中で説明している。
【０００５】
DNAを増幅する最も一般的な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)によるものであり、Mullisら, Cold Spring Harbor Quant. Biol., 51:263〜273 (1986)、Mullisの欧州特許第201,184号、Mullisらの米国特許第4,582,788号、Erlichらの欧州特許第50,424号、欧州特許第84,796号、欧州特許第258017号および欧州特許第237362号、並びにSaikiらの米国特許第4,683,194号により詳細に説明されている。PCR反応は、複数サイクルの、ハイブリダイゼーションと核酸合成と変性に基づいている。この反応で、非常に少量の核酸分子または断片が数桁のオーダーで増幅され、検出可能となる量の物質が得られる。当業者であれば、PCR増幅の有効性と再現性が部分的には、鋳型DNAの純度とその量に依存していることは周知である。核酸の生物源に存在するある種の分子が、PCR増幅を停止または阻害することが知られている(Belecら, Muscle and Nerve, 21(8):1064 (1998); Wiedbraukら, Journal of Clinical Microbiology, 33(10):2643〜6 (1995); DeneerおよびKnight, Clinical Chemistry, 40(1):171〜2 (1994))。例えば、全血中では、ヘモグロビン、ラクトフェリン、および免疫グロブリンGが、PCR反応を行うのに使用されるいくつかのDNAポリメラーゼを阻害することが知られている(Al-SoudおよびRadstrom, Journal of Clinical Microbiology, 39(2):485〜493 (2001); Al-Soudら, Journal of Clinical Microbiology, 38(1):345〜50 (2000))。これらの阻害作用は、特定のタンパク質剤を添加することで幾分、克服され得るが、PCR反応を行うのに既に使用されている多数の成分とは別に、そのタンパク質剤を添加する必要がある。従って、そのような阻害因子の除去または不活化は、選択試料からDNAを増幅する上での重要な要素である。
【０００６】
一方、混合物中の特定の核酸分子の単離および検出には、ゲル電気泳動法と蛍光検出法が組み合わされた、核酸配列決定装置および断片解析装置が必要となる。あいにく、電気泳動法は、試料数または試験項目が増えると、非常に大きな労働力を必要とするようになる。
【０００７】
この理由のため、DNAオリゴヌクレオチドプローブを用いた、より単純な分析法が盛んになっている。VLSIPS(登録商標)と呼ばれる新技術により、親指の爪よりも小さいチップ(各チップには、数十万以上の異なる分子プローブが含まれる)の作製が可能となった。これらの技術は、Pirrungらの米国特許第 5,143,854号、PCT出願国際公開公報第92/10092号、およびPCT出願国際公開公報第90/15070号の中で説明されている。これらの生物学的チップでは、各プローブ集団が特定の位置に割り当てられるように、分子プローブがアレイ中に配置されている。これらの分子アレイチップは、チップ中の各プローブの位置を、中心間の距離がミクロンスケールで測定されるようにして、作製されている。これらのアレイタイプのチップを使用することは、ごく少量の試料が必要とされるだけであるということと、多様な数多くのプローブ配列を同時に使用できるという利点がある。アレイチップは、遺伝子発現レベルの測定、一塩基多型の同定、並びにPirrungらが米国特許第5,143,854号の中で説明しているような分子診断および塩基配列決定を含む、数多くの異なる種類の科学的用途において役立っている。
【０００８】
プローブが核酸分子であるアレイチップは、特定のDNA配列の存在を検出する上でますます有益となっている。アレイチップに関するほとんどの技術には、本質的には構造的かまたは伝導性とできる基板に既知配列のプローブを結合させることが含まれる。構造タイプのアレイチップには通常、プローブ分子を一塩基づつ構築できるプラットフォームを提供するか完成した分子を共有結合させることが含まれる。典型的なアレイチップには、標的核酸の増幅に続いて、標的核酸分子がチップ上のオリゴヌクレオチドプローブのうちのいずれかとハイブリダイズするかどうかを決定するための蛍光標識による検出が含まれる。選択した試験条件の下で、標的核酸分子を含む試料にアレイをさらした後、スキャニング装置によりアレイ中の各位置とその位置にあるハイブリダイズした物質の量を定量化することができる。または、伝導タイプのアレイチップには、金属のような導体物質に結合したプローブ配列が含まれる。標的核酸のハイブリダイゼーションによって通常、導体電極に運ばれ次いで分析される電気信号が誘発される。
【０００９】
基板上に配列を形成させるための技術は、周知である。例えば、Pirrungらの米国特許第5,143,854号、PCT出願国際公開公報第92/10092号、またはHubbellらの米国特許第5,571,639号中に開示されている技術に従って、配列を形成させてもよい。ガラス(http://www.piercenet.com/Technical/default.cfm?tmp1=.. /Lib/ViewDoc.cfm&doc=3483; McGovernら, Langmuir, 10:3607〜3614 (1994))または酸化ケイ素(McGovernらの米国特許第6,159,695号の実施例4〜6)のような電気絶縁表面への生物学的に有用な分子の付着に関する参考文献がいくつかあるが、金(Bainら, Langmuir, 5:723〜727 (1989))および銀(Xiaら, Langmuir, 22:269, (1998))以外の伝導性表面に効果的に分子を付着させる例はほとんどない。一般的に、基板の表面に生物学的に活性な分子を付着させる問題は、それが金属導体であれまたはガラスのような電気絶縁体であれ、生物分子上の反応基と基板上の相補反応基との単純な化学反応よりもずっと困難なことである。例えば、金属導体は原則的に、反応部位が金属表面に付随的にまたは意図的に配置されているものを除いて、反応部位がない。従って、非常に少量の標的核酸分子を検出する効果的な手段を提供するため、異なる導体への異なるプローブの付着を制御する方法を持つことが望ましい。
【００１０】
本発明は、これらの目的を達成することを目的とする。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、伝導性表面に核酸分子を付着させる方法に関する。その方法には、第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、そして第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製された、相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体を提供する段階が含まれる。次に、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが、第2導体には結合させない付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。次いで、第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。
【００１２】
本発明のもう一つの局面は、伝導性表面に核酸分子を付着させる方法に関する。その方法には、第2導体がマスキング剤で被覆された、相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体を提供する段階が含まれる。次に、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させる付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。次いで、マスキング剤を第2導体から除去する。最後に、第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させる付着化学反応(attachment chemistry)により、第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの局面は、伝導性表面に複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を付着させる方法に関する。その方法には、相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体を提供する段階が含まれる。次に、第1導体の表面をシリコン処理し、そしてシロキサン基でシリコン処理表面に金属粒子を連結することにより、第1導体に金属粒子を付着させる。次いで、第1導体に付着した金属粒子に複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を付着させる。
【００１４】
本発明はまた、伝導性表面に核酸分子を付着させる方法に関する。その方法には、相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体であって、前記導体に電源が連結された第1導体および第2導体を提供する段階が含まれる。次に、第2導体に対して第1導体をよりプラスに帯電させることにより、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブ分子を第1導体の方へ引きつけ、そこで第1セットのオリゴヌクレオチドプローブが第1導体に化学的に結合する。
【００１５】
本発明はまた、試料中の標的核酸分子を検出するための装置に関する。その装置は、第1導体および第2導体のそれぞれが、相互に接触することなく250ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する検出部位を有するように含む。第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、そして第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製される。装置にはまた、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが、第2導体には結合させない付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体の検出部位に付着された、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。最後に、装置には、第2導体の検出部位に付着された、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。
【００１６】
本発明のもう一つの局面は、試料中の標的核酸分子を検出するための方法に関する。その方法にはまず、第1導体および第2導体のそれぞれが、相互に接触することなく250ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する検出部位を有するように含む装置を提供する段階が含まれる。第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、そして第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製される。装置にはまた、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが、第2導体には結合させない付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体の検出部位に付着された、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。最後に、装置には、第2導体の検出部位に付着され、且つギャップによって第1セットのオリゴヌクレオチドプローブから離すようにして一定間隔で配置された、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。次に、プローブを標的核酸分子が含まれている可能性のある試料と、もし含まれている場合、ギャップを架橋させるため、一定間隔で離れて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの双方に試料中の任意の標的核酸分子をハイブリダイズさせ、オリゴヌクレオチドプローブ対をハイブリダイズした標的核酸分子で電気的に連結させることを可能とする効果的な条件の下で、接触させる。次いで、電気的に連結された、オリゴヌクレオチドプローブ対およびハイブリダイズした標的核酸分子は、充てん用の核酸配列で充てんされるが、ここで充てん用の核酸配列は、標的核酸分子に相補的であって、オリゴヌクレオチドプローブ対の間を伸張する。最終的には、プローブ間に電流が流れるかどうかが決定され、プローブ間を流れる電流がある場合には、試料中にそのプローブに相補的な配列を有する標的核酸分子が存在していることが示される。
【００１７】
本発明のさらにもう一つの局面は、試料中の標的核酸分子を検出するための方法に関する。その方法にはまず、第1導体および第2導体のそれぞれが、相互に接触することなく250ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する検出部位を有するように含む装置を提供する段階が含まれる。第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、そして第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製される。装置にはまた、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが、第2導体には結合させない付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体の検出部位に付着された、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。最後に、装置には、第2導体の検出部位に付着され、且つギャップによって第1セットのオリゴヌクレオチドプローブから離すようにして一定間隔で配置された、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。次に、プローブを標的核酸分子が含まれている可能性のある試料と、もし含まれている場合、ギャップを架橋させるため、一定間隔で離れて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの双方に試料中の任意の標的核酸分子をハイブリダイズさせ、オリゴヌクレオチドプローブ対をハイブリダイズした標的核酸分子で電気的に連結させることを可能とする効果的な条件の下で、接触させる。次いで、電気的に連結された、オリゴヌクレオチドプローブ対およびハイブリダイズした標的核酸分子の一面に導体物質を塗布する。最終的には、プローブ間に電流が流れるかどうかが決定され、プローブ間を流れる電流がある場合には、試料中にそのプローブに相補的な配列を有する標的核酸分子が存在していることが示される。
【００１８】
本発明により、DNA検出装置内の2つの異なる導体に2つの異なる核酸分子を付着させる方法が提供されるだけでなく、感度の良いDNA検出装置をより低価格で製造することも可能になる。
【００１９】
発明の詳細な説明  
本発明は、試料から標的核酸分子を検出する装置の製造およびその利用に関する。本発明を大局的に見るため、本装置およびその利用法が図1A〜1Bに示されている。図1Aによれば、一定間隔を空けて配置された伝導フィンガ(conductive fingers)100に付着されたオリゴヌクレオチドプローブ102は物理的に、それらが相互に接触することがない十分な距離で設置されている。図1Bに示されているように、核酸分子の混合物(すなわち、M1〜M6)を含む試験試料を伝導フィンガ(conductive fingers)100が固定されている組立装置と接触させる。2つのオリゴヌクレオチドプローブに結合できる標的核酸分子(すなわち、M1)が試料中に存在している場合、標的核酸分子はその2つのプローブ分子に結合するであろう。結合すると、その核酸分子により、2つの電極間のギャップが架橋され、電気的に接続される。ハイブリダイズしない核酸分子(すなわち、M2〜M6)はすべて、プローブにより捕捉されることなく、洗浄除去される。ここで、電気信号の伝達は、核酸分子の伝導率に依存する。Hans-Werner FinkおよびChristian Schoenenbergerは、Nature, 398:407〜410 (1999)(これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)のなかで、DNAは半導体のように電気を伝導すると報告していた。この電流は、単純なスイッチを構築するのに十分であり、これにより、標的核酸が試料内に存在しているか否かが示されるであろう。標的核酸分子が存在すると、スイッチ「オン」として検出されるが、プローブ対が標的核酸により連結されなければ、スイッチ「オフ」となるであろう。情報は、スイッチの状態を特定の標的の存在と相関させる、デジタルコンピュータにより処理できる。ユーザは、その情報により、生物学的物質、生物、突然変異、または関心がある他の標的が存在することが示されると、またはそれらが存在しないことが示されると迅速に識別することができる。選択的に、標的分子の各生物学的プローブ対とのハイブリダイゼーション後、その標的分子を金属のような導体でコーティングできる。次いで、コーティングされた標的分子が、プローブ対の間のギャップを越えて電気を流すことを可能とし、これにより標的分子の存在を示す検出可能な信号が発生する。
【００２０】
本発明の一つの局面は、伝導性表面に核酸分子を付着させる方法に関する。その方法には、第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、そして第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製された、相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体を提供する段階が含まれる。次に、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが、第2導体には結合させない付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。次いで、第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。
【００２１】
図2には本発明のこの局面が描かれており、ここで第1導体200と第2導体202は、導体にオリゴヌクレオチドプローブを結合させるための異なる付着化学反応(attachment chemistries)を有する。第1オリゴヌクレオチドプローブ206は、第1オリゴヌクレオチドプローブ206のメルカプト末端と第1導体200の表面との間の配位結合(矢印で示されている)により第1導体200に付着される。第2オリゴヌクレオチドプローブ208は、第2導体202の表面に対するシロキサン結合により第2導体202に付着される。第1導体および第2導体は、基板204上に固定されている。有用な基板材料の例には、ガラス、石英およびシリコンのほか、プラスチックのようなポリマー物質が含まれる。
【００２２】
図3A〜Fには、一方の導体にある種類のオリゴヌクレオチドプローブを付着させ、さらに他方の導体に別の種類のオリゴヌクレオチドプローブを付着させるために必要なステップの順序であって、その2つの導体が異なる付着化学反応(attachment chemistries)を有するものについて図解されている。図3Aには、第1導体300への第1オリゴヌクレオチドプローブ306の付着が示されている。上述のように、この付着は、導体をオリゴヌクレオチドプローブが適当な溶媒で溶解された溶液に浸すことにより達成される。第1オリゴヌクレオチドプローブ306は、第2導体が適当な付着化学反応(attachment chemistries)を有していないため、第2導体302には付着しない。図3Bでは、第1導体300上の全ての残存部位が、ジグザグ線で示されたブロッキング分子310の溶液中にその導体を浸すことにより、ブロッキングされている。図3Cには、表面をN-[3-(トリメトキシシリル)プロピル]エチレンジアミンでシリコン処理した後の、第2導体302の表面が示されている。図3Dには、リンカー分子312がシロキサンに結合した第2導体302が示されている。図3Eには、第2導体302と結合したリンカー分子312への第2オリゴヌクレオチドプローブ308の結合が示されている。
【００２３】
本発明のこの局面の一つの態様として、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させた後、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる前に、ブロッキング分子を第1セットのオリゴヌクレオチドプローブにより占有されなかった全ての部位で、第1導体に付着させる。ブロッキング分子により、非特異的なDNA結合が阻止されるほか、それ以上にオリゴヌクレオチドプローブが結合することが阻止されるであろう。ブロッキング分子の例は、ドデカンチオールであり、金または銀の表面をドデカンチオールの自己組織化単層膜(SAM)で被覆するのに非常に有効な試薬である。この試薬の有効性は、金の表面から伸びるぎっしりつまった炭化水素鎖のファンデルワールス相互作用からなる余剰の結合エネルギーに基づいている。機構が何であるにせよ、第1導体の表面をブロッキング分子で処理することにより、オリゴヌクレオチドプローブのさらなる結合が阻止される。
【００２４】
もう一つの態様として、ブロッキング分子を付着させた後、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる前に、第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブが付着されることを可能とするため、第2導体の表面を官能化する。第2導体の表面を水酸基で官能化することができる。例えば、新たにスパッタされたアルミニウムの表面は、うまく水で濡れない。すなわち、一滴の純水によって形成される接触角が高く、すると水は、アルミニウム表面に広がってそれを被覆するのではなく、アルミニウム表面で玉状になってそこから流出してしまう。これは表面に水酸基が殆どないことを示している。付着化学反応(attachment chemistry)の反応部位となるアルミニウム表面の水酸基の数を増やすため、その表面を30%過酸化水素水10部に高濃度のアンモニアを約1部〜4部加えた混合液中に沈めることにより、アルミニウム導体を清浄化できる。アルミニウムを混合液中、室温で15分〜30分間インキュベート後、純水で数回洗浄し、さらに乾燥させる。少滴の水を用いた検査により、水が表面に広がりそれを濡らすことが示されれば、水酸基の数が増加したことになる。これらの水酸基により、オリゴヌクレオチドプローブを付着させるための反応部位が与えられる。
【００２５】
本発明のもう一つの態様として、第1のタイプの導体物質が金であり、第2のタイプの導体物質がアルミニウムであり、第1導体に対する付着化学反応(attachment chemistry)がメルカプト基であり、およびブロッキング分子が第1導体に付着するチオール基を有する。
【００２６】
金製またはアルミニウム製の導体について説明してきたが、その他の物質も同様にして使用することが可能である。例えば、チタン、タンタル、クロム、銅、および亜鉛のような金属を導体として使用することができる。最も伝導性の導体は、金属元素が単一でまたは組み合わされ構成されているが、他の非金属性の導体物質を使用することも可能である。例えば、インジウムスズ酸化物(ITO)は、携帯用コンピュータモニターのような装置中の透明導体としてよく使用されている。シリコンは、そのものだけでは半導体であるが、これに金属、例えばボロンをドープして、導体として使用するのに十分な伝導性を与えることができる。
【００２７】
金(Bainら, Langmuir, 5:723〜727 (1989), これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)および銀(Xiaら, Langmuir, 22:269, (1998), これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)以外の伝導性表面に効果的に分子を付着させる例はほとんどない。金導体へのメルカプト末端オリゴヌクレオチドプローブの付着は、単に、そのオリゴヌクレオチドプローブ分子を適当な溶媒、例えば水またはジメチルスルホキシドに溶解した溶液中にその金導体を、約1分〜5分間浸し、続けてその同一溶媒で洗浄することにより達成することができる。硫黄と金原子との間の配位結合の形成により、結合が生じる。
【００２８】
もう一つの態様として、第2導体の表面をシリコン処理し、そしてシロキサン基で第2導体のシリコン処理表面に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを連結することにより、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを第2導体に付着させる。これは、アルミニウム導体の場合、そのアルミニウム表面を過酸化水素水と水酸化アンモニウムの混合液で清浄化することにより達成することができる。次いで、清浄化され、水酸化されたアルミニウム導体をトリアルコキシシランのトルエン溶液で処理する。Z-6094(Dow Corning Company, Midland, Michigan)として販売されているN-[3-(トリメトキシシリル)プロピル]エチレンジアミンが、約トルエン10,000部あたり1部〜トルエン100部あたり1部の濃度で、および好ましくは約トルエン1000部あたり1部の濃度でトルエンに溶解されたものが好ましい。トルエン溶液は、アルミニウム表面を室温で15分間浸すために使用される。それから、アルミニウムをトルエンで洗浄し、風乾させる。
【００２９】
次に、シリコン処理したアルミニウム表面を、リンカー分子がメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミドのような両性の非プロトン性溶媒に溶解された溶液中に浸すことができる。リンカー分子は、第一級アミンに対する反応基を一端とし、且つチオールに対する反応基を他端としている。そのようなリンカー分子の例としては、N-(α-マレイミドアセトキシル)スクシンイミドエステル、N-(β-マレイミドプロピルオキシ)スクシンイミドエステル、N-(γ-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミドカプロエート)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、N-スクシンイミジルヨードアセテートおよびN-スクシンイミジル-(4-ビニルスルホニル)ベンゾエートが挙げられ、全てPierce Company (Rockford, Illinois)から販売されている。リンカー分子は、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミド中、約0.1%(重量で)〜約10%の濃度で、より好ましくは、約1%の濃度で使用することができる。シリコン処理したアルミニウム導体の表面をリンカー溶液中に、約1分〜60分間、より好ましくは、約10分〜20分間浸す。次いで、導体をその同一溶媒で洗浄後、続けて水洗し、さらに風乾させる。
【００３０】
最後に、リンカーのマレイミド末端をメルカプト基と反応させて、オリゴヌクレオチドプローブとリンカーとの間のチオエーテル共有結合を形成させるため、導体をコーティングするまたは沈めるのに、メルカプト基を3’末端または5’末端としたオリゴヌクレオチドプローブの水溶液または水性緩衝溶液(例えば0.1Mリン酸ナトリウム水溶液)を使用することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、約1μlあたり1pg〜約1μlあたり1μgの濃度で使用する。オリゴヌクレオチドプローブを溶解させるのに、水の代わりにジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミドのような両性の非プロトン性溶媒を使用してもよい。そのプローブ溶液を使用して、導体を約1分〜60分間、より好ましくは、約10分〜20分間浸す。次いで、導体をその同一溶媒で洗浄後、続けて水洗し、さらに風乾させる。それ以降は、その導体は、いつでも標的核酸分子とハイブリダイゼーションさせる状態にある。
【００３１】
図4には、一方のプローブが他方のプローブよりも多集団である場合、好適に使用される導体配置の上面図が示されている。このように、より幅の広い第2導体402が、より薄い中央の第1導体400の両側面に位置している。導体は、絶縁基板404上に置かれている。黒の太線は、装置の動作領域の境界406の概略を示している。電気接点用の導体パッド408は、縦の長方形として示されている。第1導体400上にはより多くのプローブ分子が存在しているので、標的核酸分子のハイブリダイゼーションは、第1導体400上で最初に起こる可能性が高い。従って、標的核酸分子の一端が第1導体400につながれるので、標的核酸分子の他方の自由端は、第2プローブが付着されている第2導体402のより広い面積を比較的長時間にわたって逃すことなく探ることが可能となり、第2プローブとハイブリダイズする可能性が増す。
【００３２】
または、両導体を同じタイプの物質で構築することも好ましいかもしれない。この場合は、マスキング剤を使用することで達成することができる。従って、本発明のもう一つの局面は、伝導性表面に核酸分子を付着させる方法に関する。その方法には、第2導体がマスキング剤で被覆された、第1導体および第2導体を提供する段階が含まれる。次に、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させる付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。次いで、マスキング剤を第2導体から除去する。最後に、第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させる付着化学反応(attachment chemistry)により、第2導体に第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる。
【００３３】
図5A〜Fには、同一物質で作製された2つの別個の導体に、マスキング剤を使用して、2つの異なるオリゴヌクレオチドプローブ分子を付着させるためのステップの順序が図解されている。図5Aには、マスキング剤512の層で被覆された、同一金属製の第1導体500および第2導体502が示されている。フォトリソグラフマスク516を通して、第1導体500に紫外線514(矢印で示されている)を照射する。照射後、現像液によりマスキング剤512の照射領域を除去する。その結果が図5Bに示されている。次いで、照射された第1導体500を、メルカプト基を末端とした太線の第1オリゴヌクレオチドプローブ506の溶液中に浸すと、図5Cに示されるように、結果的にプローブが付着する。次に、第1導体500をジグザグ線で示されたブロッキング分子510のブロッキング溶液中に浸し、図5Dに示されているように、照射された第1導体500上の任意の残存部位を覆う。次いで、図5Eに示されるように、残りのマスキング剤512をアセトンで除去する。次いで、図5Fに示されるように、第2導体502を破線で示された第2オリゴヌクレオチドプローブ508の溶液中に浸すことにより、第2オリゴヌクレオチドプローブ508を付着させる。第1導体および第2導体は、基板504上に固定されている。
【００３４】
本発明のこの局面の一つの態様として、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させた後、または第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させた後、ドデカンチオールのようなブロッキング分子を第1または第2セットのオリゴヌクレオチドプローブにより占有されなかった全ての部位で、第1導体または第2導体に付着させることができる。
【００３５】
もう一つの態様として、第1導体および第2導体はマスキング剤で被覆され、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させる前に、マスキング剤を第1導体から除去するが、第2導体からは除去しない。マスキング剤は、フォトレジストのようなポリマーの層としてもよく、または導体を被覆することができ、且つ他方の導体上の核酸を妨害することなく選択的に除去可能であるならば、別の金属もしくはその他の任意の物質としてもよい。マスキング剤がフォトレジストである場合、第1導体または第2導体に相当する位置にあるフォトレジストに放射線を照射し、その照射されたフォトレジストを除去することにより、フォトレジストを第1導体または第2導体から除去することができる。
【００３６】
もう一つの態様として、第1導体および第2導体が金で作製され、第1導体および第2導体に対する付着化学反応(attachment chemistry)がメルカプト基であり、並びにブロッキング分子が第1導体および第2導体に付着するチオール基を有する。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの局面は、伝導性表面に複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を付着させる方法に関する。その方法には、相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体および第2導体を提供する段階が含まれる。次に、第1導体の表面をシリコン処理し、そしてシロキサン基でシリコン処理表面に金属粒子を連結することにより、第1導体に金属粒子を付着させる。次いで、第1導体に付着した金属粒子に複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を付着させる。シリコン処理表面にオリゴヌクレオチドプローブを付着させる以前の方法では、シロキサンに単一プローブ分子を結合させる二官能性リンカーが使用されていた。その一方、本発明ではリンカーとして金属粒子(これにより、シロキサン1分子につき複数のプローブ分子が付着可能となる)を使用することにより、導体に付着されるプローブ分子の密度と数が増加する。プローブ分子をより高密度に備えた検出装置により、標的分子を捕捉する可能性と割合がより高くなるであろう。
【００３８】
図6A〜Dには、第1導体がアルミニウム製であり、金属粒子が金製である、本発明のこの局面の一つの態様が示されている。以前公表された方法の中で説明されているように、種々の所望の大きさの金粒子を作製することができる。
例えば、クエン酸ナトリウムを含有する1%塩化金溶液の還元により、20nm球状金粒子が生成する。図6A〜6Bに図解されているように、金粒子600は、メルカプト-シロキサン(mercapto-siloxane)で被覆された、アルミニウム導体602により供与されるチオール基に結合することができる。続いて、図6C〜6Dに図解されているように、オリゴヌクレオチドプローブ分子604は、自身のチオール部位を介して金粒子600に結合する。
【００３９】
本発明はまた、導体がオリゴヌクレオチドプローブを静電気的に引きつけるように、導体上に電荷が蓄積される、伝導性表面に核酸分子を付着させる方法に関する。その方法には、図7Aに示されるように、相互に近接して位置するが接触はしていない第1導体700および第2導体702であって、その導体に電源710が連結された第1導体700および第2導体702を提供する段階が含まれる。次に、図7Bに図解されているように、第2導体702に対して第1導体700をよりプラスに帯電させることにより、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブ706を第1導体700の方へ引きつけ、そこで第1セットのオリゴヌクレオチドプローブ706が第1導体700に化学的に結合する。
【００４０】
図7Cに図解されているように、第1導体700に対して第2導体702をよりプラスに帯電させることにより、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブ708を第2導体702の方へ引きつけ、そこで第2セットのオリゴヌクレオチドプローブ708が第2導体702に化学的に結合する。
【００４１】
もう一つの態様として、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを引きつける際には、第1導体がプラスに帯電され且つ第2導体がマイナスに帯電されるが、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブを引きつける際には、第2導体がプラスに帯電され且つ第1導体がマイナスに帯電される。
【００４２】
第1導体および第2導体は、同じタイプの物質で作製することができる。
【００４３】
さらにもう一つの態様として、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させた後、ブロッキング分子を第1セットのオリゴヌクレオチドプローブにより占有されなかった全ての部位で、第1導体に付着させることができる。
【００４４】
図8A〜Fには、本発明のもう一つの態様が図解されており、これは導体を特定の金属で順番に電気メッキし、さらに特定の導体にチオールプローブ分子を標的化することにより、異なる導体に異なるプローブ分子を方向づけるのに効果的な方法である。最初に、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを付着させるステップの前に、図8A〜8Bに示されているように、第1導体800上に特定の金属804を電気メッキするため、装置を電気メッキ溶液中に入れ、そして導体越しに電位を印加することにより、第1導体800を特定の金属804で電気メッキする。次に、図8Cに示されているように、マイナスに帯電している第1セットのオリゴヌクレオチドプローブ806は、プラスに帯電している電気メッキした第1導体800の方に引きつけられる。次いで、図8Dに示されているように、ブロッキング分子810を第1セットのオリゴヌクレオチドプローブ806により占有されなかった全ての部位で、第1導体800に付着させる。このステップには電位は必要とされない。次に、図8E〜8Fに示されているように、装置を電気メッキ溶液中に再び入れ、そして第2導体802を特定の金属804で電気メッキするため、前に印加した導体の反対側の導体に電位を印化する。次いで、図8Gに示されているように、マイナスに帯電している第2セットのオリゴヌクレオチドプローブ808は、プラスに帯電している電気メッキした第2導体802の方に引きつけられる。第1導体800上の電気メッキはブロッキング剤812によりふさがれ且つ電荷の偏りは、第2導体802周辺の第2セットのオリゴヌクレオチドプローブ808に集中すると思われるので、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブ808の結合は、第2導体802に特異的である。次いで、図8Hに示されているように、DNAまたはRNAの非特異的結合を阻止するため、ブロッキング分子812を第2導体802に付着させる。異なるオリゴヌクレオチドプローブ分子を検出装置内の対向導体に特異的に結合させることで、標的核酸分子の2つの相補領域が同一導体上のオリゴヌクレオチドプローブに意味なく結合することが減少するか解消されると思われ、これにより検出装置の感度が増大する。
【００４５】
本発明はまた、試料中の標的核酸分子を検出するための装置に関する。その装置は、第1導体および第2導体のそれぞれが、相互に接触することなく250ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する検出部位を有するように含む。第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、そして第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製される。装置にはまた、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが、第2導体には結合させない付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体の検出部位に付着された、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。最後に、装置には、第2導体の検出部位に付着された、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。
【００４６】
第1導体および第2導体は、基板上に固定されている。有用な基板材料の例には、ガラス、石英およびシリコンのほか、ポリマー基板、例えばプラスチックが含まれる。導体基板または半導体基板の場合、一般的に基板上に絶縁層が含まれることが望ましいであろう。しかし、非導体表面を有する任意の固体支持体を使用して装置を構築してもよい。支持体表面は、平坦である必要はない。実際に、支持体は、チップ中のチャンバー壁としてもよい。
【００４７】
チップ製造技術は向上しており、チップ上の2つの導体の検出部位間の距離を縮めることが可能となった。従って、本発明の一つの態様として、検出部位が100ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する。もう一つの態様として、検出部位が10ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する。
【００４８】
オリゴヌクレオチド、ペプチドおよびその他のポリマー配列からなる大きなアレイを最小数の合成ステップで形成する改良法が知られている。Pirrungらの米国特許第5,143,854号(PCT出願国際公開公報第90/15070号も参照されたい)およびFodorらのPCT出願国際公開公報第92/10092号を参照されたく、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。それらには、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよびその他の分子からなる莫大なアレイを、例えば光直接合成(light-directed synthesis)技術を用いて形成する方法が開示されている。また、Fodorら, Science, 251:767〜77 (1991)も参照されたく、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。ポリマーアレイを合成するためのこれらの方法は、現在ではVLSIPS(登録商標)法と呼ばれている。
【００４９】
所望のオリゴヌクレオチドプローブを合成する方法は、当業者に周知である。特に、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を合成する方法は、例えば、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait(編), IRI Press, Oxford (1984); Kuijpers, Nucleic Acids Research, 18(17):5197 (1994); Dueholm, J. Org. Chem., 59:5767〜5773 (1994); およびAgrawal (編), Methods in Molecular Biology, 20の中で見つけることができ、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。より短いオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸分子に対する特異性がより低くなる、即ち、そのオリゴヌクレオチドプローブに相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸分子が2個以上、天然に存在している可能性がある。一方、より長いオリゴヌクレオチドプローブは、2個以上の天然の標的核酸分子に相補的な配列を含む可能性が漸減的により小さくなる。さらに、より長いオリゴヌクレオチドプローブは、より短いオリゴヌクレオチドプローブよりもハイブリダイゼーションの時間がより長くなる。分析時間は、市販用装置の1つの要素であるので、標的核酸分子に対して十分に特異的な、可能な限り最も短いプローブが望ましい。標的核酸分子の一端に相補的なプローブが一方の導体に付着され、且つ標的核酸分子の他端に相補的なプローブが他方の導体に付着されていれば、オリゴヌクレオチドプローブに標的核酸分子を結合させる速度と特異性がともに増大され得る。この場合、ハイブリダイゼーション速度が速い、短いオリゴヌクレオチドプローブを使用しても、その2つのプローブに対する標的核酸分子の特異性は高い。2つの異なる分子プローブを使用する場合、標的核酸分子が導体のある部分からその同じ導体の別の部分にかけてハイブリダイゼーションするのを防ぐため、両プローブが同じ導体上に配置されていないことが重要である。これが起こると、信号はそのような付着から発生されず、分析感度が低下する。
【００５０】
本発明には、オリゴヌクレオチドプローブとして、化学的に改変された核酸分子またはオリゴヌクレオチド類似体が含まれる。「オリゴヌクレオチド類似体」は、2つまたはそれ以上の単量体サブユニットを有するポリマーを指し、ここでサブユニットは、天然に存在するオリゴヌクレオチドと同じような、何らかの構造的特性(これにより、天然に存在するオリゴヌクレオチドが溶液中で天然に存在する核酸とハイブリダイズすることが可能となる)を有する。例えば、オリゴヌクレオチドに組み込むことを目的に、構造基がヌクレオシドのリボースまたは塩基に、例えばリボース上の2’酸素(2'-O)位でのメチルもしくはアリール基、または2’酸素(2'-O)基から置き換わったフルオロ基、またはリボヌクレオシドの塩基上のブロモ基のように、選択的に付加される。オリゴヌクレオチド類似体のホスホジエステル結合、または「糖-リン酸骨格」が、例えばメチルホスホネートまたはO-メチルホスフェートを用いて置換または改変される。オリゴヌクレオチド類似体の別の例には、ポリアミド骨格に天然のまたは改変された核酸塩基が結合された「ペプチド核酸」が含まれる。オリゴヌクレオチド類似体には選択的に、天然に存在するヌクレオチドとヌクレオチド類似体の混合物が含まれる。オリゴヌクレオチド類似体から成るオリゴヌクレオチド類似体のアレイは、RNase Aのようなヌクレアーゼ酵素による加水分解または分解に抵抗性である。これには、アレイを酵素分解抵抗性にすることで、より長い寿命がアレイに与えられるという利点がある。例えば、2'-O-メチルオリゴリボヌクレオチドを含む類似体は、RNase Aに抵抗性である。
【００５１】
ヌクレオシドへの組み込みに適した、多くの改変されたヌクレオシド、ヌクレオチド、およびさまざまな塩基は、SIGMA chemical company (Saint Louis, Mo.), R&D systems (Minneapolis, Minn.), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, N.J.), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis.), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, Md.), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen, San Diego, Calif.およびApplied Biosystems (Foster City, Calif.)のほかに当業者に知られているその他の多くの販売元を含む、種々の製造元から市販されている。ヌクレオシドを形成させるために塩基を糖部分に結合させる方法が知られている。例えば、LukevicsおよびZablocka, 「Nucleoside Synthesis: Organosilicon Methods」,  Ellis Horwood Limited Chichester, West Sussex, England (1991)を参照されたく、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。ヌクレオチドを形成させるためにヌクレオシドをリン酸化する方法、およびオリゴヌクレオチドにヌクレオチドを組み込む方法も知られている。例えば、Agrawal(編), 「Protocols for Oligonucleotides and Analogues, Synthesis and Properties」, Methods in Molecular Biology, volume 20, Humana Press, Towota, N.J. (1993)を参照されたく、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００５２】
本発明の装置は、試料中の標的核酸分子を検出するために使用することができる。第1および第2オリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列を含む標的核酸分子が試料中に存在している場合、その標的核酸分子により、2つの導体間がヌクレオチドポリマーで連絡され、電気回路が完成する。従って、その回路を介する電気信号の伝導能により、標的核酸分子の存在が示される。標的核酸分子が存在していない場合、回路は完成されない。このように、標的核酸分子はスイッチとして機能する。核酸分子が存在すると、「オン」信号が電気回路に与えられるが、標的核酸分子が存在していなければ、「オフ」信号として解釈される。情報は、スイッチの状態を特定の標的の存在と相関させる、デジタルコンピュータにより処理できる。コンピュータはまた、結合の特異性と標的の濃度を決定するため、同じ標的に特異的ないくつかのスイッチからの結果を解析することもできる。
【００５３】
一つの態様として、電気信号の伝達は、核酸分子本来の伝導率に依存する。Finkら, 「Electrical Conduction through DNA Molecules」, Nature, 398:407〜410 (1999)(これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)によれば、DNAは半導体のように電気を伝導するとの報告があった。この電流は、単純なスイッチを構築するのに十分であり得る。従って、本発明のもう一つの局面は、試料中の標的核酸分子を検出するための方法に関する。その方法にはまず、第1導体および第2導体のそれぞれが、相互に接触することなく250ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する検出部位を有するように含む装置を提供する段階が含まれる。第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、そして第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製される。装置にはまた、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが、第2導体には結合させない付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体の検出部位に付着された、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。最後に、装置には、第2導体の検出部位に付着され、且つギャップによって第1セットのオリゴヌクレオチドプローブから離すようにして一定間隔で配置された、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。次に、プローブを標的核酸分子が含まれている可能性のある試料と、もし含まれている場合、ギャップを架橋させるため、一定間隔で離れて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの双方に試料中の任意の標的核酸分子をハイブリダイズさせ、オリゴヌクレオチドプローブ対をハイブリダイズした標的核酸分子で電気的に連結させることを可能とする効果的な条件の下で、接触させる。次いで、電気的に連結された、オリゴヌクレオチドプローブ対およびハイブリダイズした標的核酸分子は、充てん用の核酸配列で充てんされるが、ここで充てん用の核酸配列は、標的核酸分子に相補的であって、オリゴヌクレオチドプローブ対の間を伸張する。最終的には、プローブ間に電流が流れるかどうかが決定され、プローブ間を流れる電流がある場合には、試料中にそのプローブに相補的な配列を有する標的核酸分子が存在していることが示される。
【００５４】
または、米国特許出願第60/095,096号、または米国特許出願第60/099,506号(これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)の中で説明されているように、標的核酸分子のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズした標的核酸分子を金属のような導体物質でコーティングする。導体物質の例には、銀および金が含まれる。次いで、コーティングされた核酸分子は、プローブ対の間のギャップを越えて電気を流すことが可能となり、これにより標的核酸分子の存在を示す検出可能な信号が発生する。このように、本発明は、試料中の標的核酸分子を検出するための方法に関する。その方法にはまず、第1導体および第2導体のそれぞれが、相互に接触することなく250ミクロンより少ない範囲内で離れて位置する検出部位を有するように含む装置を提供する段階が含まれる。第1導体は第1のタイプの導体物質で作製され、そして第2導体は第1のタイプの導体物質とは異なる第2のタイプの導体物質で作製される。装置にはまた、第1導体に第1セットのオリゴヌクレオチドプローブを結合させるが、第2導体には結合させない付着化学反応(attachment chemistry)により、第1導体の検出部位に付着された、第1セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。最後に、装置には、第2導体の検出部位に付着され、且つギャップによって第1セットのオリゴヌクレオチドプローブから離すようにして一定間隔で配置された、第2セットのオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。次に、プローブを標的核酸分子が含まれている可能性のある試料と、もし含まれている場合、ギャップを架橋させるため、一定間隔で離れて配置されたオリゴヌクレオチドプローブの双方に試料中の任意の標的核酸分子をハイブリダイズさせ、オリゴヌクレオチドプローブ対をハイブリダイズした標的核酸分子で電気的に連結させることを可能とする効果的な条件の下で、接触させる。次いで、電気的に連結された、オリゴヌクレオチドプローブ対およびハイブリダイズした標的核酸分子の一面に導体物質を塗布する。最終的には、プローブ間に電流が流れるかどうかが決定され、プローブ間を流れる電流がある場合には、試料中にそのプローブに相補的な配列を有する標的核酸分子が存在していることが示される。
【００５５】
例えば、DNAリン酸基に対するナトリウム対イオンは、試料領域に多量の硝酸銀溶液を注ぐことで、銀イオンに置換することができる。過剰な硝酸銀を洗浄除去した後、ヒドロキノンのような現像液にその領域を浸すことで、銀イオンが電気伝導性の金属銀に還元される。Braunらは、銀がDNA分子に沿うようにして付着されることを証明した(Braunら, 「DNA-Templated Assembly and Electrode Attachment of a Conducting Silver Wire」, Nature, 391:775〜778 (1998)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。3ステップの処理工程が用いられている。最初に、Ag+/Na+イオン交換法により、銀をDNA分子に選択的に局在化させ(Barton, Bioinorganic Chemistry, Bertiniら(編), ch. 8, University Science Books, Mill Valley, (1994)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)、銀とDNA塩基との間で複合体を形成させる(Spiro(編), Nucleic Acid-Metal Ion Interactions, Wiley Interscience, New York (1980); Marzeilliら, J. Am. Chem. Soc., 99:2797 (1977); Eichorn(編), Inorganic Biochemistry, Vol. 2, ch 33〜34, Elsevier, Amsterdam, (1973)、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。イオン交換の処理工程は、標識されたDNAの蛍光シグナルの消失を追うことにより、監視することができる。次に、銀イオンに交換されたDNAを還元し、凝集体をDNA骨格に結合させて形成させる。銀凝集体を、写真化学で使用されている手法(Holgateら, J. Histochem. Cytochem., 31:938 (1983); Birellら, J. Histochem. Cytochem., 34:339 (1986)、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)のような標準的手法を用いて、さらに成長させる。
【００５６】
配列を決定する標的核酸分子は通常、組織試料から単離される。標的核酸分子がゲノムである場合、試料はどの組織に由来していてもよい(赤血球のみ除く)。例えば、唾液、全血、末梢血リンパ球もしくはPBMC(末梢血単核球)、皮膚、髪または精液は、好都合な臨床試料の供給源である。これらの供給源は、標的がRNAである場合にもまた、適している。血液およびその他の体液はまた、ウイルス核酸を単離するにも好都合な供給源である。標的がmRNAである場合、試料は、そのmRNAが発現している組織から得られる。試料中のポリヌクレオチドがRNAである場合、それをDNAに逆転写してもよいが、本方法ではDNAに変換する必要はない。
【００５７】
完全な細胞、ウイルスまたはその他の組織試料が分析される態様に対しては、種々の試料調製操作を続ける前に、細胞またはウイルスから核酸を抽出することが通常、必要とされる。従って、サンプル収集に続いて、収集された細胞、ウイルス被膜などから核酸が粗抽出物に遊離され、続いて、続く操作、例えばコンタミ(DNA結合)タンパク質の変性、精製、濾過、脱塩などのために試料を調製する追加処理が付随する。
【００５８】
試料となる細胞またはウイルスからの核酸の遊離、およびDNA結合タンパク質の変性は一般的に、物理的または化学的方法により行うことができる。例えば、化学的方法では一般的に、細胞を破壊するために溶解剤を使用し、核酸を細胞から抽出した後、コンタミしているおよび妨害する可能性がある任意のタンパク質を変性させるため、その抽出物をグアニジウムイソチオシアネートまたは尿素のようなカオトロピック塩で処理する。一般的に、化学的な抽出および/または変性方法を利用する場合、適当な試薬を、抽出用のチャンバー内に、別個の連絡可能なチャンバー内に組み込んでもよく、または外部から導入してもよい。
【００５９】
または、核酸を抽出し、そしてDNA結合タンパク質を変性させるために物理的方法を利用してもよい。米国特許第5,304,487号(これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)には、マイクロチャネル内の物理的な突起物またはチャンバーもしくはチャネル内の先の鋭い小片を用いて、細胞膜を貫通させ、その内容物を抽出することが論じられている。例えば、試料が十分な流れ圧力を有するチャネルを通過する際に、細胞の溶解が引き起こされる、制限された横断面寸法を備えたチャネルを用いる、細胞抽出のより従来的な方法を使用してもよい。または、細胞抽出およびコンタミタンパク質の変性を、試料に交流電流を印加することによって行ってもよい。より具体的には、細胞試料が、微小管アレイを通して流され、ここで交流電流がその流体の流れを通して印加される。細胞の溶解/抽出を達成するため、例えば細胞を超音波撹拌にかけるか、または細胞に微小の幾何学的開口部を通過させることにより、破壊をもたらす高い剪断応力に細胞をさらすことを含む、種々の他の方法を本発明の装置内に利用してもよい。
【００６０】
抽出に続いて、核酸を粗抽出物の他の成分、例えば変性されたタンパク質、細胞膜粒子などから分離することが、通常、望ましいと思われる。粒状物質の除去は一般的に、ろ過、凝集などにより達成される。種々のフィルタータイプを、装置内に容易に導入することができる。さらに、化学的変性方法を使用する場合、次のステップに進む前に、試料を脱塩することが望ましいかもしれない。試料の脱塩および核酸の単離は一般的に、単一のステップ、例えば固相に核酸を結合させ、次いでコンタミしている塩を洗浄除去するか、または試料に対してゲル濾過クロマトグラフィーを行うことにより、実施することができる。核酸結合に適した固体支持体には、例えば珪藻土、シリカなどが含まれる。適当なゲル排除媒体もまた、当技術分野においてよく知られており、例えばPharmacia社およびSigma Chemical社から市販されている。この単離および/またはゲル濾過/脱塩は、追加のチャンバーで行ってもよく、または特定のクロマトグラフィー用媒体を、その後に続く反応チャンバーにつながるチャネル又は流体路に組み込んでもよい。
【００６１】
または、1つまたは複数の流体路またはチャンバーの内面自体を、所望の精製のために適した官能基、例えば荷電された基、親和性結合基などを供与するよう誘導体化してもよい。
【００６２】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、配列の変異をプローブの末端で特異的に認識するように設計してもよい。標的核酸分子がプローブに結合した後、プローブに結合していない分子末端を除去するため、その標的核酸分子をヌクレアーゼで処理する。直面する2つのプローブの末端が、標的核酸分子に相補的な配列を含む場合、リガーゼ処理により、直面するその2つのプローブの末端が連結されると思われる。次いで、プローブからライゲーションされていない標的核酸分子が変性されるまで、試験チャンバーを加熱する。その後、特異的な標的核酸分子を検出することができる。
【００６３】
本発明の好ましい態様として、配列中の一塩基の相違を特異的に同定するため、ライゲーション法を利用することができる。以前、プローブライゲーション法により、周知の標的配列を同定する方法が報告された(N. M. Whiteleyらの米国特許第4,883,750号; Wuら, Genomics, 4:560 (1989); Landegrenら, Science, 241:1077 (1988); およびWinn-Deenら, Clin. Chem., 37:1522 (1991)、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(「OLA」)として知られる、一つの手法では、関心のある標的領域に及ぶ、2つのプローブまたはプローブ要素を標的配列に対してハイブリダイズさせる。プローブ要素が隣接する標的塩基のところで塩基対形成する場合、直面するプローブ要素の末端をライゲーションにより、例えばリガーゼで処理することにより連結することができる。ライゲーションしたプローブ要素が測定されれば、標的配列が存在するという証拠となる。
【００６４】
相同的なヌクレオチド配列は、互いに選択的にハイブリダイズすることにより検出することができる。選択的にハイブリダイズすることとは、本明細書では、ストリンジェントまたはストリンジェントでない条件の下で、ある配列由来のDNAまたはRNAプローブの、その「相同的な」配列とのハイブリダイゼーション(Ausubelら(編), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I: 2.10.3, Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York (1989)、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる)を意味するものとして使用される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件もまた、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor, NY (1989)の中に例示されており、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００６５】
種々のハイブリダイゼーション緩衝液が、本発明のハイブリダイゼーションアッセイに有効である。イオン界面活性剤(例えば、N-ラウロイル-サルコシン)を少量添加することは、有効である。NaClよりもLiClが好ましい。ハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、以下: Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Bergerら, 「Guide to Molecular Cloning Techniques」, Methods in Enzymology, Volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1987);およびYoungら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:1194 (1983)を含む、いくつかの文献の中で提供されており、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。水性緩衝液のほか、非水性緩衝液を使用してもよい。特に、ハイブリダイゼーションを促進させるが、伝導率が低い非水性緩衝液が好ましい。
【００６６】
ハイブリダイゼーション混合物をアレイと接触するように入れて、インキュベートする。接触は、任意の適当な容器、例えばプローブがアレイに保持されるよう、且つアレイと接触させるため、セルへの流体の導入とセルからの流体の除去が可能となるよう特別に設計された、皿またはセルで行うことができる。一般的に、インキュベーションは、核酸のハイブリダイゼーションに通常使用される温度、例えば約20℃〜約75℃の間、例えば約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、または約65℃で行われるであろう。約14ヌクレオチドよりも長いプローブに対しては、37℃〜45℃が好ましい。より短いプローブに対しては、55℃〜65℃が好ましい。より具体的なハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイズする領域の融解点を決定するための式を用いて算出することができる。ハイブリダイゼーションは、融点温度でまたは融解温度以下10℃〜融解温度の間の温度で行うのが好ましい。ハイブリダイゼーションは、融点温度でまたは融解温度以下5℃〜融解温度の間の温度で行うのがより好ましい。標的とアレイ中の任意の相補的プローブとの間のハイブリダイゼーションの望ましいレベルを達成するのに十分な時間、標的をプローブアレイとインキュベートする。ハイブリダイゼーション混合物とのインキュベーション後、通常、アレイをハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄する。ハイブリダイゼーション緩衝液はまた、ハイブリダイゼーション最適化物質を含むこともできる。これらの物質は、ハイブリダイゼーションのステップに関して、同程度の量で含ませてもよいし、またはそれらを完全に除去してもよい。その後、標的がハイブリダイズしたプローブを同定するため、アレイを調べることができる。
【００６７】
標的核酸分子の濃度を決定するため、プローブの数を増やしてもよい。複数個の各オリゴヌクレオチドプローブ対が提供される場合、試料中に存在する標的核酸分子の量を定量化するため、同一性のオリゴヌクレオチドプローブ対(その間を電流が通過する)の数を識別するのに本発明の方法を使用することができる。例えば、検出装置内に、数千の連続したプローブを作製することができる。回路は、占有された部位の数を数えることができると思われる。標的核酸分子の濃度を決定するための計算は、入出力装置(unit)によって行うことができる。
【００６８】
本発明の方法は、病原体またはウイルスの検出のような、多数の用途に使用することができる。例えば、試料を飲料水または食品から単離し、病原菌の遺伝物質に相補的なプローブを用いて、感染性微生物に対する迅速スクリーニングを行ってもよい。最近では、汚染された食肉製品の大規模なリコールがいくつもあった。本発明の方法は、食品中の微生物を製造過程で検出し、続いて汚染物質を処分するのに使用することができる。これにより、食品安全性が著しく改善され、食品媒介性の疾患および死が未然に防がれ、並びに費用のかかるリコールを回避することが可能となろう。食品産業界での使用を目的として、サルモネラ菌(Salmonella)および大腸菌(E. coli.)のような、一般的な食品媒介性の病原体の遺伝物質に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを備えた検出装置を設計することが可能となろう。
【００６９】
さらにもう一つの態様として、本発明の方法は、生物戦争の媒介物(biowarfare agents)の遺伝物質に相補的なプローブを用いることにより、生物戦争の媒介物(biowarfare agents)を即時検出するのに使用することができる。生物兵器の戦場でのおよびテロ攻撃での使用という最近の関心事から、装置を戦闘兵のための個人用センサーに、または生物学的脅威を事前に警告するための遠隔センサーに組み込むことができる。その媒介物を特異的に識別するために使用可能な装置は、情報を別の場所に送るため、モデムと連結することができる。モバイル装置にはまた、場所と病原体情報の双方を提供するため、全地球測位システムが含まれていてもよい。
【００７０】
さらにもう一つの態様として、本発明を、ヒトの遺伝物質に相補的なプローブを用いて、個人を識別するために使用してもよい。装置内に、個人を高い信頼性で識別するために十分な数の一連のプローブを配置する。種々の多型性部位を使用する。好ましくは、装置は、その同一性を100万分の1よりも高い特異性で決定することができ、より好ましいものは特異性が10億分の1よりも高く、さらにより好ましいものは特異性が100億分の1よりも高い。本発明を、患者から単離された試料中の突然変異または多型性をスクリーニングするために使用してもよい。
【００７１】
本発明はまた、ハイブリダイゼーション技術を用いて、核酸を塩基配列決定するために使用してもよい。そのような方法は、米国特許第5,837,832号の中で説明されており、これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００７２】
実施例
以下の実施例は、本発明の態様を例示するために与えられ、その範囲を限定することを決して意図するものではない。
【００７３】
実施例1−アルミニウム導体へのオリゴヌクレオチドプローブの付着
その表面上に300nmのスパッタアルミニウム層を有する、1平方cmのシリコンチップを、30%過酸化水素水1000μlに濃縮水酸化アンモニウム100μlを混合した溶液中に沈め、20分間、室温に静置する。次いで、チップを純水で洗浄し、風乾させる。次いで、チップをN-[3-(トリメトキシシリル)-プロピル]エチレンジアミン(Dow Corning Company (Midland, Mich.)から製品Z-6094として販売されている)1μlをトルエン10ml中に加えた溶液中に沈める。15分後、チップをトルエン中で洗浄し、風乾する。次に、チップを0.03% N-スクシンイミジル-(4-ビニルスルホニル)ベンゾエートの100mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=8)-ジメチルスルホキシド(100mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=8):ジメチルスルホキシド = 90 : 10)溶液中に沈め、30分間インキュベートする。次いで、チップをジメチルスルホキシド、水およびエタノールで洗浄し、風乾させる。次に、P32放射性標識オリゴヌクレオチドの100mM リン酸緩衝(pH = 7)溶液(5 pM/50 μl)をチップ上にのせ、30分間、静置した。次いで、チップを、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含有する100mM リン酸緩衝液(pH = 7)中で、チップを攪拌させることにより約1分間洗浄した。チップを水で洗浄後、シンチレーション溶液5mlの入ったシンチレーション用バイアルに入れた。シンチレーションカウンターにより25,000 CPMと記録されたことから、チップ上の各900平方nmあたり、平均して、オリゴヌクレオチド分子が1個存在することが示された。放射性シグナルは、SDSリン酸緩衝液中での洗浄を続けても取り除かれなかった。
【００７４】
実施例2−金導体へのオリゴヌクレオチドプローブの付着
その表面上に1nmのスパッタチタン層、さらにそのチタン上に、100nmのスパッタ金層を有する、1平方cmのシリコンチップを、30%過酸化水素水1000μlに氷酢酸100μlを混合した溶液中に沈め、20分間、室温に静置する。次いで、チップを純水で洗浄し、風乾させる。次に、P32放射性標識オリゴヌクレオチドの100mM リン酸緩衝(pH = 7)溶液(5 pM/50 μl)をチップ上にのせ、30分間、静置した。次いで、チップを、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含有する100mM リン酸緩衝液(pH = 7)中で、チップを攪拌させることにより約1分間洗浄した。チップを水で洗浄後、シンチレーション溶液5mlの入ったシンチレーション用バイアルに入れた。シンチレーションカウンターにより128,000 CPMと記録されたことから、チップ上の各84平方nmあたり、平均して、オリゴヌクレオチド分子が1個存在することが示された。放射性シグナルは、SDSリン酸緩衝液中での洗浄を続けても取り除かれなかった。
【００７５】
実施例3−金導体へのオリゴヌクレオチドプローブの付着
その表面上に1nmのスパッタチタン層、さらにそのチタン上に、100nmのスパッタ金層を有する、1平方cmのシリコンチップを、30%過酸化水素水1000μlに氷酢酸100μlを混合した溶液中に沈め、20分間、室温に静置する。次いで、チップを純水で洗浄し、風乾させる。次に、P32放射性標識オリゴヌクレオチドのジメチルスルホキシド-水(ジメチルスルホキシド:水 = 95:5)溶液(5 pM/50 μl)をチップ上にのせ、5分間、静置した。次いで、チップを、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含有する100mM リン酸緩衝液(pH = 7)中で、チップを攪拌させることにより約1分間洗浄した。チップを水で洗浄後、シンチレーション溶液5mlの入ったシンチレーション用バイアルに入れた。シンチレーションカウンターから記録されたカウントは、実施例2で得られたカウントに匹敵していた。放射性シグナルは、SDSリン酸緩衝液中での洗浄を続けても取り除かれなかった。
【００７６】
実施例4−金導体へのオリゴヌクレオチドプローブの付着
その表面上に1nmのスパッタチタン層、さらにそのチタン上に、100nmのスパッタ金層を有する、1平方cmのシリコンチップを、30%過酸化水素水1000μlに氷酢酸100μlを混合した溶液中に沈め、20分間、室温に静置する。次いで、チップを純水で洗浄し、風乾させる。次に、P32放射性標識オリゴヌクレオチドのジメチルスルホキシド-水(ジメチルスルホキシド:水 = 95:5)溶液(5 pM/50 μl)をチップ上にのせ、5分間、静置した。次いで、0.1%ドデカンチオールのジメチルスルホキシド溶液10μlをチップに添加し、1分間、静置した。次いで、チップを、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含有する100mM リン酸緩衝液(pH = 7)中で、チップを攪拌させることにより約1分間洗浄した。チップを水で洗浄後、シンチレーション溶液5mlの入ったシンチレーション用バイアルに入れた。シンチレーションカウンターから記録されたカウントは、実施例3で得られたカウントに匹敵していた。放射性シグナルは、SDSリン酸緩衝液中での洗浄を続けても取り除かれなかった。放射性プローブ溶液をさらに塗布しても、結合による放射性シンチレーションカウントはさらに増加しなかったことから、ドデカンチオールが金表面上の任意の活性部位を明らかにふさぎ且つ遮断しており、これによりさらなるオリゴヌクレオチドの結合が抑制されることになる。
【００７７】
実施例5−金導体へのPNAプローブの付着
その表面上に30nmのスパッタクロム層、さらにそのクロム上に、100nmのスパッタ金層を有する、1平方cmのシリコンチップを、30%過酸化水素水1000μlに濃縮水酸化アンモニウム100μlを混合した溶液中に沈め、20分間、室温に静置する。次いで、チップを純水で洗浄し、風乾させる。次に、アミノ酸のシステインが末端となったPNAプローブ(18残基, Applied Biosystems Company(Framingham, MA)により作製された)の0.1% SDS添加100mM リン酸緩衝(pH = 7.8)溶液(2 pM/50 μl)をチップ上にのせ、約15分間、静置した。次いで、チップを洗浄用緩衝液中で約1分間洗浄し、水中ですすぎ、それからPNAプローブに相補的な配列を含有する、5 pM P32放射性標識DNAの0.1% SDS添加100mM リン酸緩衝液(pH = 7.8)50 μlの溶液で覆った。溶液は７０℃で用いられ、チップを55℃とした。チップを55℃で約5分間保持し、それから室温まで約20分間にわたって徐々に冷却させた。次に、チップを洗浄用緩衝液中で約1分間洗浄し、水ですすぎ、それからシンチレーション溶液5mlの入ったシンチレーション用バイアルに入れた。シンチレーションカウンターで記録されたカウントは、実施例2で得られたカウントに匹敵していた。放射性シグナルは、洗浄用緩衝液で洗浄を続けても取り除かれなかったことから、PNAプローブが金表面に結合していることが示された。
【００７８】
実施例6−インジウムスズ酸化物(ITO)導体へのオリゴヌクレオチドプローブの付着
その表面上に500nmの伝導性ITO層を有する、1平方cmのポリエチレンテレフタラート支持体を、30%過酸化水素水1000μlに濃縮水酸化アンモニウム100μlを混合した溶液中に沈め、20分間、室温に静置する。次いで、チップを純水で洗浄し、風乾させる。次いで、チップをN-[3-(トリメトキシシリル)-プロピル]エチレンジアミン(Dow Corning Companyから製品Z6094として販売されている)1μlをトルエン10ml中に加えた溶液中に沈める。15分後、チップをトルエン中で洗浄し、風乾する。次に、チップを0.03% N-スクシンイミジル-(4-ビニルスルホニル)ベンゾエートの100mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=8)-ジメチルスルホキシド(100mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=8):ジメチルスルホキシド = 90:10)溶液中に沈め、30分間インキュベートする。次いで、チップをジメチルスルホキシド、水およびエタノールで洗浄し、風乾させる。次に、P32放射性標識オリゴヌクレオチド(36塩基, Sigma Genesis Company(The Woodlands, Texas)により作製された)の100mM リン酸緩衝(pH = 7)溶液(5 pM/50 μl)をチップ上にのせ、30分間、静置した。次いで、チップを、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有する100mM リン酸緩衝液(pH = 7) (本明細書では、「洗浄用緩衝液」と呼ばれる)中で、チップを攪拌させることにより約1分間洗浄した。チップを水中で洗浄後、シンチレーション溶液5mlの入ったシンチレーション用バイアルに入れた。シンチレーションカウンターで記録されたカウントは、実施例1で得られたカウントに匹敵していた。放射性シグナルは、洗浄用緩衝液で洗浄を続けても取り除かれなかったことから、PNAプローブが金表面に結合していることが示された。
【００７９】
実施例7−アモルファスシリコン導体へのオリゴヌクレオチドプローブの付着
その表面上に500nmの伝導性アモルファスシリコン層を有する、1平方cmのシリコン支持体を、30%過酸化水素水1000μlに濃縮水酸化アンモニウム100μlを混合した溶液中に沈め、20分間、室温に静置する。次いで、チップを純水で洗浄し、風乾させる。次いで、チップをN-[3-(トリメトキシシリル)-プロピル]エチレンジアミン(Dow Corning Companyから製品Z6094として販売されている)1μlをトルエン10ml中に加えた溶液中に沈める。15分後、チップをトルエン中で洗浄し、風乾する。次に、チップを0.03% N-スクシンイミジル-(4-ビニルスルホニル)ベンゾエートの100mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=8)-ジメチルスルホキシド(100mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH=8):ジメチルスルホキシド = 90:10)溶液中に沈め、30分間インキュベートする。次いで、チップをジメチルスルホキシド、水およびエタノールで洗浄し、風乾させる。次に、P32放射性標識オリゴヌクレオチド(36塩基, Sigma Genesis Company(The Woodlands, Texas)により作製された)の100mM リン酸緩衝(pH = 7)溶液(5 pM/50 μl)をチップ上にのせ、30分間、静置した。次いで、チップを、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有する100mM リン酸緩衝液(pH = 7) (本明細書では、「洗浄用緩衝液」と呼ばれる)中で、チップを攪拌させることにより約1分間洗浄した。チップを水中で洗浄後、シンチレーション溶液5mlの入ったシンチレーション用バイアルに入れた。シンチレーションカウンターで記録されたカウントは、実施例1で得られたカウントに匹敵していた。放射性シグナルは、洗浄用緩衝液で洗浄を続けても取り除かれなかったことから、PNAプローブが金表面に結合していることが示された。
【００８０】
本発明をその例示を目的として詳細に説明してきたが、その詳説はもっぱらその目的のためであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書において変形が可能であることが当業者により理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図1Aには、オリゴヌクレオチドプローブが、一定間隔を空けて配置された伝導フィンガ(conductive fingers)形式の導体に付着された、本発明の装置が描かれている。図1Bには、前記装置により、試料中に存在する標的核酸分子が検出される方法が示されている。
【図２】それぞれが異なる付着化学反応(attachment chemistry)を有する、異なるタイプの物質で作製された、2つの導体を備えた本発明の装置の側面図が描かれている。
【図３】一方の導体にある種類のオリゴヌクレオチドプローブを付着させ、さらに図1の他方の導体に別の種類のオリゴヌクレオチドプローブを付着させるために必要なステップの順序が描かれている。
【図４】異なるオリゴヌクレオチドプローブ群が異なる導体上に与えられる場合、好適に使用される導体配置の上面図が描かれている。
【図５】同一金属で作製された2つの別個の導体に2つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを付着させるために必要なステップの順序が描かれている。
【図６】導体に複数のオリゴヌクレオチドプローブを付着させるために必要なステップの順序が示されている。
【図７】オリゴヌクレオチドプローブを導体の方へ静電気的に引きつけることにより、その導体にプローブを付着させるために必要なステップの順序が描かれている。
【図８】導体を特定の金属で順番に電気メッキすることにより、その導体にオリゴヌクレオチドプローブを静電気的に付着させるために必要なステップの順序が示されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７Ａ】
2005517428.tif 000018
【図７Ｂ】
2005517428.tif 000019
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
2005517428.tif 000021
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【国際調査報告】
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