(57)【要約】本発明は、液体媒体中に少なくとも１つの分析物を検出しそして／又は定量するための方法に関し、そして検出されそして／又は評価される分析物に対し特異的な少なくとも１のリガンドと、表面にて官能化されたコロイド状磁気粒子を使用すること、及びそれが、分析される前記媒体と前記粒子を接触させる工程、前記磁気粒子を鎖状に構成させるに十分な強度にて前記媒体に磁場を印加する工程、鎖の2つの隣接する粒子上に、それぞれ存在する少なくとも２つの特異的リガンドと関連した分析物の対又は組み合わせができるに十分な時間にわたり前記磁場を保持する工程、その磁場を除去させる工程、及び前記分析物の存在及び／又は非存在を、在場合により前記磁気粒子の永続した鎖の存在及び／又は非存在を介しその濃度を決定する工程、を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体媒体中にて少なくとも1つの分析物を検出しそして／又は定量するための方法において、検出されそして／又は評価される分析物に対し特異的な少なくとも１つのリガンドと、表面にて官能化されたコロイド状磁気粒子を使用すること、及び：
1．前記粒子を分析される前記媒体と接触させるようにする工程、
2．前記磁気粒子を鎖形状に構成させるために十分な強度にて、前記媒体に磁場をかける工程、
3．鎖の2つ連続して隣接する粒子にそれぞれ存在する少なくとも２つの特異的リガンドと、関連する分析物の結合又は組み合わせができるに十分な期間にわたり前記磁場を保持する工程、
4．磁場をとり除く工程、並びに
5．前記分析物の存在及び／又は不存在の決定、そして適切な場合、コロイド状磁気粒子の永続的 (permanent) 鎖の存在及び／又は不存在における濃度の決定の工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記粒子がコロイド状超常磁性粒子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記コロイド状超常磁性粒子が、水溶性の鉄流動体と重合体との共沈殿により、又は有機相中で鉄流動体との乳化により得られることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
コロイド状磁気粒子におけるサイズが、5と10,000との間、そしてより好ましくは100と500nmとの間であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
特定リガンドが、吸収相互作用、共有結合による相互作用、及び／又は高親和性相互作用により粒子の表面にて固定化されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか1項記載方法。
【請求項６】
固定化されるリガンドが、高親和性結合対２つの一方であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
そのリガンドは、(ポリ)カルボハイドレイト/エレクチン、ビオチン又はブオチン化化合物/アビジン又はストレプトアビジン、タンパク質受容体及びその特定リガンド、及びハプテン/抗体などの結合対の双方の一方から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
固定されるリガンドは、ペプチド、遊離又は複合形状の糖タンパク質、リポタンパク質及び他の類似又は誘導される構造体を含むタンパク質、DNA又はRNA及びこれらの相同体、単糖又は2糖、オリゴ糖、及び多糖などの糖類、脂質、ホルモン、受容体、代謝産物又は他の生物的物質から選択される化合物であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
標的とされる分析物が、抗原、抗体及び核酸及び／又はタンパク質であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
分析される媒体が、分析物をその特異的リガンドの１の少なくとも２分子に対する反応性が求められるようにするため、前もって予備処理されることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
上記予備処理は、高親和性結合対の相手側の１と、分析物の官能化を含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ウイルス、細菌又は原虫及び他の感染物などの病原体に特異的抗体、腫瘍に対する抗体、アレルゲンに対する抗体、又は自己抗体などの分析物を検出し、そして／又は定量するための請求項１乃至１１の何れか１項記載の方法。
【請求項１３】
遊離抗原などの抗原類、たとえば血液タンパク質及び血塊因子、代謝産物、ホルモン又は媒体などの因子、又は支持体に結合される抗原、たとえば微生物の表面抗原、膜結合受容体、血液群の抗原、及び主要組織適合系による抗原などを検出し、そして／又は定量するための請求項１乃至１１の何れか１項記載方法。
【請求項１４】
さらにコロイド状磁気粒子が、第二標識を移送することを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１項記載の方法。
【請求項１５】
本標識が、視覚的で、所望により機械的又は電気的に特徴付けられることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
本標識が、色彩の顔料及び蛍光剤又はリン蛍光剤から選択されることを特徴とする請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
検出される種々の分析物に対し特異的な少なくとも１つのリガンドと、それぞれ官能化されたコロイド状磁気粒子の幾つかの集団とが、使用されることを特徴とする請求項１乃至１６の何れか１項記載の方法。
【請求項１８】
磁場が連続性であることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
連続磁場が、5乃至500mT、好ましくは10乃至100mTであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
磁場が交番することを特徴とする請求項１乃至１９の何れか１項記載の方法。
【請求項２１】
その鎖の特徴付けが、顕微鏡下で視覚により直接行はれるか、そして／又は適切な場合に何らかの光学的、機械的、又は電気的な方法により間接的に行はれることを特徴とする請求項１乃至２０の何れか1項記載の方法。
【請求項２２】
この鎖の特徴付けが、測光法又は比濁分析法により行はれることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
この鎖の特徴付けが、画像処理により行はれることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
CCDカメラが、画像捕捉装置として使用されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
レザーを光源として使用することを特徴とする請求項２１乃至２４の何れか1項記載の方法。
【請求項２６】
液体媒体中に分析物を検出するための試薬キットにおいて、標的分析物に対し特異的な少なくとも１つのリガンドと、表面にて官能化された少なくともコロイド状磁気粒子を含むことを特徴とする試薬キット。
【請求項２７】
微量流動系において、少なくとも１つの分析物を検出しそして／又は定量するための、請求項１乃至２５の何れか１項記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体、生物的又は合成した試料の少なくとも1つの分析種の検出に有益で、そして凝集反応試薬に類似する試薬及びこの種の結合(coupling)を含む方法に関する。
今日まで多くの「凝集」方法が、これまで提案されてきた。これらは、主に診断目的として抗原及び／又は抗体の検出に適用されている。特にこれらの方法は、バイオアッセイ(妊娠試験,血塊(clotting)試験)又は感染性疾患の診断として適用される。しかしながらこうした方法は、通常感受性に制限される。実際にこれらの試験の一般的原理は、分析物が存在するゲル状コロイド粒子の形性体を検出することである。この種の試験において分析物を、２つのコロイド粒子に結合させる必要があり、そのコロイド粒子の表面を、極めて広くセンス(sense)し分析物を認識する分子で被覆する必要がある。
より詳細には本発明は、コロイド状凝集反応試薬として磁気粒子の使用を基盤としている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
その磁気粒子は、生物的な分離技術又は診断技術(WO 94/09368;EP 180 384;WO 98/51435)にてすでに使用されている。磁気による分離では、操作を速く簡単に行うことができ、そして必要な装置も単純であることが見出された。捕捉される分析物を認識する分子にて被覆された磁気粒子を使用すると、磁力の効果により複合混合物から問題とする分析物を分離することができる。この方法は、たとえば「ELISA」法(酵素結合免疫法)に使用するには適切である。
【０００３】
使用される磁気粒子は、たとえばマグネタイト、フェライト、酸化クロム、酸化ニッケルなどの磁性材料をマトリックスにして通常天然の有機物質に組み入れる。これらは、分離される活性種と、反応する抗原、ハプテン又は特定型の抗体の反応基により、その表面にて官能化される。
残留磁気に対する問題を回避するためには、通常超常磁性材料は従来の強磁性材料より好ましい。強く磁化し且つ飽和磁化(100mTより大きい）を有し、そして外部磁場がない状態で何ら残留磁気を示さない鉄の流体は、コロイド状超常磁性材料の調製方法に組み入れるには極めて良好な候補である。
【０００４】
本発明に関しては、磁場の効果により特異的な構造の構成に適合するよう、コロイド状磁性体が示す性能としての利点を得ることが、目的である。
本例において、磁場により誘導される凝集体は、分離されている「鎖」又は「クラスター」と称する鎖の群を、容積当たりのコロイド物の画分に依存して作りだされる。以後鎖又はクラスターを、同一なものとして鎖と称することにする。これらの構造や形成に関する詳細な文献は、多くの刊行物から見出だすことができるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
換言すると磁場がないと粒子が分散した形状となる。磁場が存在すればこうした粒子が配向され、水溶液中に粒子の鎖を形成する。もちろんこれら鎖の形成は可逆的であり、そして磁場が除去されると熱振動の影響下で急に鎖の形成をなくする。都合の良いことにこうした粒子サイズが有意に小さく、そのためブラウン運動及び分極可能であれば、これらの鎖が、印加された磁場の軸に沿ってそして重力に影響されず直ちに形成される。この現象を、図1Aに概略的に示している。図1Bは、磁場におけるこうした粒子にて形成される鎖の顕微鏡写真を示す。
【０００６】
液体媒体中で特定種を検出しそして／又は定量することを目的として、磁場の効果により迅速に粒子鎖状を構成すると言うコロイド状磁気粒子の性能を、本発明者が明示的に実証したことは驚くべきことである。
【０００７】
本例においてこれらコロイド状磁気粒子が、特定リガンドによりその表面に被覆され、そして分散される連続相には、少なくとも2つの特異的リガンドと反応できる種が含まれる時、その磁場が、磁場により誘導される鎖において、2の相違し且つ隣接する粒子に対し、関係する種の結合を触媒することになる。磁場が除去された後、種に結合した粒子が永続的な鎖状の構成を存続し、そのため分析される媒体中で標的種の存在が示される。
【０００８】
より具体的には、本発明の第一の目的は、液体媒体中に少なくとも1つの分析物を検出しそして／又は定量するための方法であり、それは検出されそして／又は評価される分析物に特異的な少なくとも１つのリガンドと、その表面にて官能化されたコロイド状磁気粒子を使用し：
1.前記媒体と接触させるよう前記粒子を誘導する工程、
2.前記磁気粒子が鎖の形状を構成するに十分な強さで、前記媒体に磁場を印加する工程、
3.鎖の2の隣接する粒子上にそれぞれ存在する少なくとも2つの特異的リガンドと、関係分析物の結合又は組み合わせができるに十分な時間にわたりこの磁場を保持する工程、
4.磁場を除去する工程、そして
5.前記分析物の存在及び／又は不存在を決定し、そして適切な場合前記液体媒体中にコロイド状磁気粒子における永続的な鎖の存在及び／又は不存在によりその濃度を決定する工程、
を含むことが特徴である。
【０００９】
なお留意することは、一覧として記載されているこれらの工程の順序が、本発明の好ましい例に対応するが、本発明の内容から違った順序にて行うことも可能であり、たとえば分析される媒体を導入する前に、磁場を活性化することにより行うことができる。
本発明に関しては、検出され、評価され又は置き換えられると考えられる分析物により結合されたコロイド状磁気粒子を、収集することも可能である。
【００１０】
本発明の記載内容において、さらに極めて多様な磁場をそして勾配形状の磁場を、さらには極めて多様な「凝集セル」の形状を使用することもできる。これらの多様性は、迅速なリガンド-受容体の結合、及び永続的な鎖の検出の両方を、その場合により最適化し易くそれが、その条件により長さ及び厚みを有意に変動させることができる。特に本発明は、チャンネル幅又は高さが100μmより小さい微量流動装置を含む。チャンネルの軸に直角又は並行に配位された磁場を使用することができる。都合のよい事にこの方法は、分析装置などの診断ツールにて実施される。自動分析装置が特に好ましい。
【００１１】
永続的な鎖のより具体的特徴付けに関し、それが、分析される媒体が簡単な顕微鏡試験により行はれるという利点がある。しかしながら特に自動分析装置を使用する場合には、その鎖の存在を光学的に検出することが好ましい。そのため光の散乱を測定することにより、たとえば光度計又は濁度計にて測定することにより、鎖の存在を検出することができる。別の変更では、たとえばCCDカメラにより捕捉された画像を処理するという構成である。この変更は、微細な鎖のサイズを分析することができるという利点を有する。何か適切な光源、好ましくはレザーが、これら検出の変更として使用することができる。
【００１２】
もちろん、従来の凝集化と比較できる鎖の形成には、第一に分析される媒体中の分析物の濃度に、そして第二に粒子の濃度に依存する。概要的には、前記媒体中に存在する分析物が有意的に多くなれば、鎖の長さが有意に長くなり、そして粒子の濃度が有意に濃くなれば、形成する鎖の厚みが有意に厚くなり、そして凝集化により有意に比較可能であると考えることができる。本発明の内容にから永続的な鎖状に形成された磁気粒子の密度を定量することにより、分析物の濃度を決定できることが分る。この密度の測定は、従来技術により行うことができる。従って校正基準は、所定の分析物に対し予め確立することができる。従って液体媒体中で低濃度の分析物を検出するには好適であることが分る。
【００１３】
以下の例に示すように、その鎖は、同一のリガンドと受容体の結合対(ビオチン-ストレプトアビジン)にて行われる従来の凝集反応法では10-5mol/lであるのに対し、抗原の本例において、10-9mol/lの桁の分析物の濃度を持続する。適切な利点としては本濃度の閾値が、同一の抗原と抗体の対で、そして磁場のない状態にて行はれた従来の凝集反応法にて期待されるゲルの凝集又は生成を持続するに必要な濃度閾値より低い。
そのためクレームされた本方法は、従来の凝集反応法から取り換え可能であり、そして評価の感受性を有意に増大させるという利点がある。
【００１４】
本発明の目的として、用語「コロイド状」の意味は、粒子の大きさが、5と10,000nmとの間、より好ましくは100と500nmとの間にあることを意味する。それには、できるだけ小さい粒子を使用すると同時に十分な磁気感受性を保証し、磁気双極子力及びブラウン運動の結合作用により直ちに凝集できることが、特に適切な利点である。一般にこの調整は、通常包含される酸化鉄である、磁気材料の量が最大である場合、数ミクロン以下の粒径に向けそして、好ましくは約0.1から0.5ミクロンにて達成される。
上記理由のため、コロイド状超常磁性粒子を使用することが好ましい。本発明に必要な品質を有するコロイド状超常磁性粒子を作成するため、幾つか異なる種類の技術が存在する。これらには、たとえば水溶性鉄流動体と天然又は合成ポリマー材料とを共沈殿させる技術、又は有機相中に鉄流動体を乳化させる技術がある。
【００１５】
制御された方法において、この種のコロイド材料を得るための好ましい技術は、乳化後の重合及びグラフト処理方法の原理に基づいている。特にこれらの乳化物が、有機の鉄流動体と界面活性剤の豊富な水溶相から成る混合液を共有することにより生成することができる。鉄流動体の有機相が水溶相にわずかに溶けるように、鉄流動体が選択される。本例において、各小滴を、球状に凝集化した極微小な(ナノメータ状)粒子に、関係磁気材料を、好ましくは各小滴に約60容量%の酸化鉄酸を有する磁性鉄酸化物(マグヘマイト(maghemite))に変換される。
【００１６】
従って得られる粒子は、その反応が小滴中にて起こるように、スチレンなどの疎水性モノマーを導入することにより重合される。重合体の端部に水溶性官能モノマーを導入することにより、官能化した表面が得られる。
こうした2つの処理、すなわち乳化及び重合化を合わせることにより、非常に酸化鉄の富んだ、そして重合化及び官能化された層により被覆された球状の粒子と成る。この乳化物を調製するため、特に文献では、J.Bibette in J.and Magn.Mat.V.122,p.37(1993) and in WO 97/38787 and FR 2800836にて公開された方法で行はれる。
【００１７】
都合のよいことに、組み入れられた磁気材料は、酸化鉄類、酸化コバルト類、又は最終分裂し、安定化した金属から選択され、そして好ましくはマグヘマイト(maghemite)である。粒子に組み入れられのは、40容量%の率で、好ましくは60容量%である。
本発明の好ましい変更例によれば、基本的な磁気材料は鉄の流動体である。
したがって得られたコロイド状磁気粒子が、従来の工業方法により大量のリガンドにて、これらの表面における固定化に適合できるかぎり、とくに有利なもである。
【００１８】
都合の良いことに、これらは、本発明に記載されている免疫測定法、及び凝集反応法として特に使用される試薬に変換できるよう、極めて多様な特異的リガンドと組合せることができる。
リガンドと称する分子を、吸収性相互作用、共有結合性相互作用、及び／又は高親和性相互作用により、コロイド状磁気粒子の表面にて固定化することができる。
たとえば共有結合(coupling)は、粒子の表面に存在する化学反応基を用いて行うことができる。
【００１９】
これらの反応基の明示により、記載の基が、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、及びエポキシ基からより特異的に作成することができる。特徴付されると考えられる分析物が、反応性化学種である場合、これらの反応基自体が、標的分析物に対する特異的リガンドの役割を果すことができる。
高親和性相互作用から起こる固定化に関しては、 (ポリ)カルボハイドレイト/イレクチン(electin)、ビオチン又はビオチン化された化合物/アビジン又はストレプトアビジン、タンパク質受容体及びその特異的リガンド、ハプテン/抗体などの２つの相対する高親和性対により通常媒介される。
最後に粒子の表面にリガンドを結合させることは、直接か、又はさらに「リンカー」又は「スペーサー」という語句を用いて言及されるスペーサー要素を使用するかのいずれかにて行うことがでいる。
【００２０】
これら共有結合又は高親和性の相互作用により、天然又は合成リガンドを固定化することができ、その天然又は合成リガンドには、ペプチド、たとえば糖タンパク質、脂質タンパク質、及び他の類似した又は誘導された構造体にて遊離又は複合形状のタンパク質、免疫グロブリン、DNA又はRNA及びこれらの相同体などの核酸、単糖又は2糖、オリゴ糖、及び多糖類などの糖類、脂質、ホルモン、受容体、代謝物又は他の生化学物質などがあげられる。
クレームされる方法により検出できそして／又は評価できる分析物は、本発明の官能化された粒子により、特異的でそして高い親和性相互作用の可能な物質が好ましい。従ってこれらは、免疫反応により決定できる抗原及び抗体、又はハイブリット反応により検出できる核酸、及びより一般的にあらゆる種類のタンパク質にて可能である。
好ましくは、その分析物が、分析される媒体中で前記粒子の核酸係数に少なくとも等しい核酸係数を有する。
【００２１】
同定される分析物が、それが天然の形状にて、2つの異なるリガンドと、たとえば共通的に幾つかの結合部位を提供する抗原及び抗体の同じ方法にて、反応することができる。
対照的な例において、分析物が、その特異的リガンドの１の少なくとも2分子に対し反応を求めるようにするため、分析される媒体を、クレームされる方法を行う前に予備処理する。特にこうした種類の予備処理は、上記「高親和性」対となる１方の相手の少なくとも1分子により分析物を官能化させることから成る。この種の予備処理を行うことは、競合する当業者の技術的範囲内である。
【００２２】
本発明の第一の例は、液体試料中で抗体種の分析物を検出しそして／又は定量することに関し、その抗体類には、たとえばウイルス、バクテリア又はプロトーザ及び他の感染剤などの病原体に対する抗体、腫瘍に対する抗体、アレルゲンに対する抗体、自己免疫に対する抗体などが含まれる。
本発明の第二の例は、遊離抗原などの抗原を検出しそして／又は定量することに関し、その抗原類としては、遊離抗原などの抗原、たとえば血液タンパク質、及び血塊因子、代謝物、ホルモン、媒体などの因子類、又は支持体に結合する抗原、たとえば微生物の表面抗原、膜結合受容体に結合する抗原、血液群の抗原及び主要組織適応系の抗原が含まれる。
【００２３】
さらにクレームされる方法は、たとえば天然又は人工による薬品などの非生物的分子を検出しそして／又は定量することに使用でき、問題の薬品が直接リガンドに2重の親和性を有すると理解されている。
これが例にないとしても、予備処理は、会合により指定されたリガンドに対して、この種の分析物を2価にする必要がある。本発明は、特に分析化学、及び微小分析化学に特に有意な利点となる。
本発明の特定の変更によれば、幾つかの種類のコロイド状磁気粒子を、凝集反応試薬と同様の方法にて使用することができる。これは、分析物が2種類のリガンドに容易に反応させる場合適切である。さらに本発明により用いられるコロイド状粒子は、第二の標識を移送することができる。
【００２４】
この標識化処理は、顕微鏡による検出形態と第二の検出形態とを組み合わせることができるか、又は単に顕微鏡による検出の改良が可能である限り、有意な利点である。特にこの補足標識(supplementary label)は、視覚的、光学的、機械的及び／又は電気的に特徴付けすることができる。本発明のこの変更による鎖の特徴付けは、顕微鏡下での視覚により直接的に、及び選択される標識の特性による光学的、機械的及び／又は電気的な方法により間接的に行うことができる。本発明に適した標識を明示するために記載されていることでは、特に着色剤、蛍光剤又はリン蛍光剤から生成することができる。
【００２５】
分析される液体媒体は、たとえば生物流体物などの合成、あるいは天然のもので良い。  特にこれらは、身体内の体液、たとえば血液(全体又は画分化して)、血清、血漿、唾液、尿又は脳脊髄液などにて良く、希釈又は希釈されない状態にて使用される。
磁場に関しては、それは、当業者周知の種々の手段、たとえばヘルムホルツ・コイル(Helmholtz coils)、電磁体又は永久磁石などにより作り出される。
印加される連続的磁場は、通常1と500mTとの間、好ましくは1から100mTの間である。
こうした磁場を作りだす簡単な手段は、永久磁石又は電磁石の北極及び南極のそれぞれ２極を、「凝集」帯域のいずれかの側に配置することである。別の手段では、電流発生装置にて磁化されるヘルムホルツ・コイル(Helmholtz coil)にて、特に円形にて同心円である軸によりチャンネルを構成したものである。
【００２６】
本発明の好ましい例によれば、振動(交番)磁場がかけられる。
磁場を振動(交番)により、評価される分析物が、2つの粒子上にそれぞれ存在し、隣接した状態の2つの特異的リガンドである確率を、増大させることができる
各磁場サイクルにて、すでに形成された鎖に影響することなく、鎖を形成又は伸張させるため、粒子を互いに会合させることができる。従ってこれは、官能化されたコロイド状磁気粒子のリガンドと、評価される分析物との間の反応を完了させることができることを意味する。
したがって、それは、低濃度の分析物を評価することができ、さらにその評価を有意な感受性にて得ることができる。
【００２７】
しかしながら、本発明を使用する幾つかには、不均一な磁場が必要な場合があることを留意すべきである。特に粒子を凝集化できる磁場、及び正確な位置に鎖を集中させる勾配のある磁場の使用が求められる場合がある。磁場とその勾配の両方を、同時に又は別々に操作することができる。したがって、分析物を最初に濃縮することができ、さらにそれらを十分なサイズの凝集体を形成することにより視覚化ができる。本発明の内容の1部である他の適用に、微量流動チャンネルに凝集化を行うことは、好ましいことになろう。それは、たとえば(E.M.Lawrenceら、Int.J.of Modern Phys.B,8,2765-2777,1994)にて周知であり、それがカラムの直径及び空間(spacing)、又は磁気粒子が富んだ鎖は、磁場及びセルの厚みに依存する。従って、予測される印加にもっとも適切な凝集条件を選択することができる。
【００２８】
分析される媒体を導入する手段は：
試料が、ゲル電気泳動「Electrophoresisi:theory,techniques and biochemical and clinical applications,A.T.Andrews,Oxford University Press,NY 1986」にて沈殿されている1又は複数のノッチ又は「ウエル」、
あるいは、毛細管式電気泳動(たとえば「Capillary Electrophoresis」P.D.Grossman,J.C.Colburn published by Academic Press,San Diego,CA,USA,1992を参照)における過剰圧力又は減圧系、
あるいは、液体静脈血を電気泳動にかけるような、細流試料を継続的に送り出す(runout)チャンネル、
あるいは、クロマドグラフィーに使用される試料を導入する方法(「Chromatography and supercritique」[Liquid chromatography and supercritical fluid chromatography],R.Rosset,M.Caude,A.Jardy,published by Masson,Paris 1991;「Practical High Performance Liquid Chromatography」,V.R.Meyer,published by John Wiley,Chichester,NY,USA;「Chromatography of polymers」、T.Prodver,published by ACS publ.,Washington DC,1993)の1つ、
あるいは、自動分析装置に従来使用されるキュベット又は他の容器、
から成る。
【００２９】
その最も簡単な方法において、実験は以下の手順に従って、そしてこれに基づいて行はれ、それが、多様な変更が容易に想像されることになろう。
上記特性を有するコロイド状粒子が、評価される抗原に特異的な抗体とグラフト結合される。自明性の関係にて、ストレプトアビジン-ビオチン、リガンド-受容体結合対が、この記載にて考慮される。ストレプトアビジンが、粒子上にてグラフト結合されることから、試料を介し検出される抗原は、ビオチン分子がその両端にてグラフト結合される小さなポリエチレングリコール重合体である。この十分な量の抗原が、粒子と1容量％以上の画分にて混合されると、従来の凝集化方法にて予測されるゲル状の凝集体が、数秒又は数分程度でも見ることができる。C*は、この値より低い従来の走査における凝集化が、もはや検知できない抗原濃度であると考えられる。
【００３０】
本発明による実験では、C*より極めて低く、そしてC*/xとして言及されるC濃度で抗原と、0.1 %桁(order)の容量当たりの画分にて粒子を混合し、その混合物を直角断面(厚み20乃至50μm)の毛細管に吸引し、そしてその毛細管の軸に対し並行な磁場を印加しする、ということから構成される。その磁場を、毛管のいずれかの側に配置された２つも磁石により印加することができる。その磁場は、試料に対し少なくとも500ガウスの強度にて２分間保持される。次に毛細管を顕微鏡により観察し、鎖又は凝集体の存在を検出する。
【００３１】
従って、ビオチン-ストレプトアビジン対の例では、磁場に基づく凝集による凝集体の検出が、最大C*/1000の桁の抗原濃度まで出来ることが、達成される。
クレームされる方法は、微量流動系における少なくとも1つの分析物を検出し、そして適切であれば定量するに特に良好な利点である。この特定の例において微量流動系の第一の帯域における磁気による凝集化、及び異なる領域における検出を行うことができる。この例は、凝集化を受けなかった粒子から、粒子の永続的な鎖を分離するために特に適切な利点がある。
【００３２】
本発明による方法の特に適切な適用では、同じ評価法において幾つかの分析物を同時に評価するため、複数基準の分析を構成している。
本例によれば、官能化されたコロイド状磁気粒子の幾つかの集団が用いられる。各集団の粒子を、検出される分析物の1に対し特異的な少なくとも1つのリガンドにて官能化される。
交番磁場を印加することにより、同じ集団の粒子から構成され、各分析物に特異的な鎖を順次生成する。
これらを識別しそして評価内容を読み出すことができるために、コロイド状磁気粒子の種々の集団が、検出される各分析物に特異的な２次標識を移送する。
【００３３】
さらに本発明の対象物は、液体媒体中に、好ましくは生物的な体液中に、少なくとも１つの分析物を検出する試薬キットで、少なくとも前記1つの分析物に特異的な少なくとも１のリガンドと、その表面にて官能化された少なくともコロイド状磁気粒子を含むことを特徴とする。
本発明は、以下の例によって、そして明示されている図に従いより明確に表示されることになる。
【実施例１】
【００３４】
コロイド状磁気粒子を使用し分析物を検出
本実施例は、アビジン/ストレプトアビジンの高い親和性の対から誘導される代表的分析物の検出を明示し、そして所定の分析物に対しクレームされる方法の感受性閾値を特徴付けることを目的としている。その分析物がビオチンから成り、そしてストレプトアビジンが、コロイド状粒子上にてグラフト結合される。
より詳細には、ビオチン化された分析物が、質量5000のポリエチレングリコール重合体より構成され、その上にビオチン分子がその両端にてグラフト結合される。これらの生成物を商業的に入手することができる(Shearwater USA)。
【００３５】
ストレプトアビジンにてグラフト結合されたコロイド状超常磁性粒子が、予め得られる。コロイド粒子が、J.Bibette in J.Magn. and Magn.Mat.V.122,P.37(1993) and F.Leal Calderon,T.Stora,O.Mondain-Monval,P.Poulin and J.Bibette,Phys.Rev.Lett.,72,2959(1994) により公開された手順により、又は T.Mason and J.Bibette,phys.Rev.Lett.77,3481(1996) and in WO 97/38787にて公開された手順に従い得られる。これら粒子の重合体を、ER 2800836出願の記載の方法により得ることができる。カルボキシ部位にストレプトアビジンをグラフト結合させることは、当業者に周知である。文献では、Molday RS,Dreyer WJ,Rembaum A,Yen SP,J Cell Biol 1975 Jan;64(1):75-88 1986,Jul;156(1):220-2を参照。磁場の下での凝集反応法は、「PEG-ビオチン」分析物とストレプトアビジン-グラフト結合のコロイド状磁気粒子とを混合させることである。所望による検出方法では、顕微鏡下にて直接観察される。
【００３６】
10-4乃至10-2桁の容量Φ当たり所定粒子の画分に対し、その評価法の感受性の限界を検出するように、分析物Cの濃度を種々変化させる。
各評価に対し関係混合物を、厚み50μのフラット毛細管に吸入し、それを２つのフラット磁石の間に置き、そこで生成磁場を約50mTより大きくし、毛細管の軸に対し並行にする。この磁場を、市販フラット磁石を用い生成する。それを約２分間にわたり印加し、そしてその毛細管を、磁場のない状態にて顕微鏡下で観察する。その方法は、鎖又は凝集体の存在が(図２を参照)、顕微鏡下にて見出される場合、可能(posotive)であり、そしてその粒子が、熱振動の作用下にて自然に再分散する場合、不可能(negative)である。
本例による本方法では分析物の濃度は、最大低さが10-9mol/lの桁まで可能(positive)である。比較として10-5mol/lより低いと従来の凝集反応法では、行うことは不可能である。
【００３７】
補足研究として、鎖の平均長さを、試験される分析物の濃度(ビオチン化されたBSA,8対12のビオチン/BSA)の関数として決定した。図3は、10mTの磁場にて30分後(実線)及び磁場をなくして24時間後(破線)の鎖の平均長さを、ビオチン化したBSAの濃度の関数として明示する。
【００３８】
なを留意することは磁場の印加により、10-9mol/l以下の低い場合がある分析物の濃度では、その分析物を速く検知することができ、そのことは、現在販売されている評価法のものより感受性が有意に高いことを示している。
さらに留意することは、形成される鎖の平均長さは、分析物の濃度の関数として増大する。従って本発明の方法は、鎖の平均長さの決定により試験される分析物を定量的に検出することもできる。
【実施例２】
【００３９】
抗-vWF免疫グロブリンG(IgG)にてグラフト結合されたコロイド状磁気粒子の調製及びフォンビルブラント因子(von Willebrand factor)の評価法(assaying)
リン酸緩衝液(20mM,pH7.2)中で、1容量%のコロイド状磁気粒子(径206nm,Ademtech,Franceから入手)を含むコロイド粒子の溶液200μlを調製する。
その粒子を活性化させるために、1-メチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジ-イミド(EDAC) (0.01g/l)の200μl水溶液をその溶液に加え、そしてその混合物を、44℃にて20分間継続して攪拌する。次に過剰なEDACを、0.001%のTween20の水溶液にて洗浄し除去する。
【００４０】
次に活性化された粒子の400μlのコロイド溶液を、400μlのIgG溶液(水398μl中で20mg/mlのIgG溶液1.7μl)に加えることにより、IgGsがコロイド状粒子上にてグラフト結合される。その溶液を44℃にて20分間継続して攪拌し、さらに周囲温度にて10分間攪拌する。
次に過剰なIgG溶液を、飽和緩衝液(0.001%のTween20を含むグリシン-BSA緩衝液)にてすすぎ洗により除去する。従って得られたグラフト結合された粒子を、1.2μmフィルターを通しろ過することにより分離する。
【００４１】
このように調製され、グラフト結合された粒子は、調節された密度及び配向のグラフト結合した抗体を呈する。さらにそのグラフト処理は、その溶液中で表面活性剤又は他のタンパク質が存在する場合でさえ安定である。
フォンビルブラント因子アッセイに対し、200%(2国際単位)のフォンビルブラント因子を含むLiatest(商標)vVF較正血漿(calibration plasma)(STA(商標)vWF較正物(Calibrator)、Diagnostica  Stagoから入手)が使用され、そしてこの評価法を使用するために指示された手順は、グラフト結合された磁気粒子のコロイド状溶液を使用することを除いて、実質的にそれに従って行はれる。
【００４２】
フォンビルブラント因子を100%,1%,及び0.1%に希釈した血漿を、Owren-Koller緩衝液にて調製する。Owren-Koller緩衝液を、コントロール(0%)として使用する。
次に、2容量のグリシン緩衝液、及びグラフト結合された磁気粒子の3容量のコロイド溶液を、それぞれ1容量のこれら希釈液に加える。
【００４３】
次に得られた溶液を、断面が50μmの四角形の毛細管(square capillary)に入れる。その構成物を、70mTの強度の磁場に5分間置いた。その磁場を除去した後、その試料を、光学顕微鏡の支持台(platform)に置いた。図4A,B,C及びDは、試験された種々の希釈液に対する顕微鏡下の試料の外観を示す。特に留意すべきことは、さらに記載された方法により、コントロール(0%)から0.1%の試料を視覚的に識別することができる。この結果は、Liatest(商標)に対し明示された2%という検出された閾値より良好である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１：磁場の下にてコロイド状磁気粒子の形性ラインの原理による概要図、及び顕微鏡写真である。
【図２】図２：磁場が除去された後、グラフト結合されたコロイド状磁気粒子及びビオチン化されたBSAを含む溶液の顕微鏡写真である。
【図３】図３：磁場の存在下、及び磁場が除去された後の溶液中のビオチン化されたBSAの濃度の関数として線(lines)の平均長を示すグラフである。
【図４】図4Aは、実施例２による溶液の0％の(コントロール)の希釈に対する顕微鏡写真である。  図4Bは、実施例２による溶液の0.1％の希釈に対する顕微鏡写真である。  図4Cは、実施例２による溶液の1％の希釈に対する顕微鏡写真である。  図4Dは、実施例２による溶液の100％の希釈に対する顕微鏡写真である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【国際調査報告】
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