(57)【要約】薬物開発において自動化された細胞スクリーニングを実施するためのシステムは、自動化顕微鏡（１００）と、高速オートフォーカスデバイスと、デジタル画像化システム（５００）とを備える。プロセスは、ユーザーの操作が最小限であって関連の細胞物質が区分され、かつ数量化されるソフトウェアにおいて実施される。以下の領域における改良：画像処理の公知の方法を、自動化セグメント化を達成するような方法で実施する；既知の測定値の設定（画素カウントなど）を、信頼できる方式で生物学的態様を実施する方法として実行する；多様なサンプルの自動的な位置づけ、集束、画像化及び処理のための構成要素を、システムとして組み込んで、その中にセグメント化及び測定方法を組み込んでもよい；さらに高度に自動化されさらに迅速な細胞スクリーニングを得るシステムに、構成要素及び方法を適合させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子カメラと、上記カメラのための焦点画像を与える光学サブシステムと、複数の容器中の検体を光学サブシステムのレンジ内の位置に配置する位置決めサブシステムと、上記カメラ及び上記サブシステムを制御するコンピューターと、細胞の同化の解析のための一般制御プロセスを総合的に規定する一組の選択可能なサブプログラムを含むコンピュータープログラムを実行するコンピューターとを備える、細胞同化作用の自動的解析のためのオプトメカニカルシステム。
【請求項２】
実験装置に対するインターフェースをさらに備える、請求項１記載のシステム。
【請求項３】
前記制御サブプログラムが、神経突起同化作用を解析するための一般的自動化制御プロセスを総合的に規定する、請求項１又は請求項２記載のシステム。
【請求項４】
前記制御サブプログラムが、細胞内の顆粒物質を解析するための一般的自動化制御プロセスを総合的に規定する、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のシステム。
【請求項５】
前記制御サブプログラムが、顆粒細胞下区画と非顆粒細胞下区画との間の物質の移行に関連する顆粒物質の特徴及び分布を解析するための一般的自動化制御プロセスを総合的に規定する、請求項４記載のシステム。
【請求項６】
前記制御サブプログラムが、非顆粒細胞下区画の間の物質の移行を解析するための一般的自動化制御プロセスを総合的に規定する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載のシステム。
【請求項７】
前記制御サブプログラムが、核と細胞質細胞下区画との間の物質の移行を解析するための一般的自動化制御プロセスを総合的に規定する、請求項６記載のシステム。
【請求項８】
前記制御サブプログラムが、形態学的に別個の細胞の同化作用における物質の区画化を解析するための一般的自動化制御プロセスを総合的に規定する、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載のシステム。
【請求項９】
前記制御サブプログラムが、以下の解析プロセス：
高強度ピークの非線形抑制；
適応ノイズ平滑化（ガウシアン）；
非線形拡散フィルタリングによる適応ノイズ平滑化及び特徴強化；
最適ヒストグラム二分割による閾値化；
シード化領域拡張；
テクスチャ変換；
検出された特徴の形態学的リファイニング；
局所コントラストによる数量化；
分布特徴解析；
顆粒細部の周波数領域検出；
境界マッピング；
バックグラウンド補正；及び
ふるい分け；
のうちの少なくともあるサブグループを達成する、
請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載のシステム
【請求項１０】
前記制御サブプログラムが、前記容器の表面に対して固定されていない位置にある細胞に使用し得るソフトウェアオートフォーカスアルゴリズムを含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のシステムであって、
参照として位置オートフォーカスによって達成される最高の焦点位置を用いる工程と、
試料容器中に固定距離移動する工程と、
距離間隔で多数の画像をとる工程と、
これらの画像からの最高の焦点を算出する工程と、
を含む、システム。
【請求項１１】
前記制御サブプログラムが、単一焦点面を超えて延在する試料に適合したソフトウェアオートフォーカスアルゴリズムを含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載のシステムであって、
参照として位置オートフォーカスによって達成される最高の焦点位置を用いる工程と、
試料容器中に固定距離移動する工程と、
該試料を包含する十分大きな距離範囲で一組の画像を取得する工程と、
該得られた画像を該試料の細い光学的切片を最もよく示す単一の画像に合わせる工程と、
を含むシステム。
【請求項１２】
前記制御サブプログラムが、単一焦点面を超えて延在する試料に適合したソフトウェアオートフォーカスアルゴリズムを含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載のシステムであって、
参照として位置オートフォーカスによって達成される最高の焦点位置を用いる工程と、
試料容器中に固定距離移動する工程と、
該試料を包含する十分大きな距離範囲で一組の画像を取得する工程と、
該得られた画像の組で画像逆重畳を実施して、該試料の細い光学的切片を最もよく示す単一の画像を作成する工程と、
を含むシステム。
【請求項１３】
前記光学切片が前記試料の厚みの実質的に全体である、請求項１２又は請求項１３記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は該して、薬物発見における自動的な細胞スクリーニングに関し、具体的には、かかるスクリーニングを実施するためのシステムであって、自動的顕微鏡と、高速オートフォーカスデバイスと、デジタル画像化システムと、ユーザーの操作が最小限であって関連の細胞物質が区分されかつ数量化されるソフトウェアにおいて実行されるプロセスとを備えるシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
有望な新薬は、化合物を標的に対して試験することによって発見され、このプロセスはスクリーニングと呼ばれる。従来、スクリーニングは比較的時間のかかるプロセスであり、大規模製薬会社で１週間でスクリーニングできるのは数百又は数千の化合物である。利用可能な化合物及び生物学的標的の数はかなり限られているので、これは容認できる数といえる。
【０００３】
化合物合成（例えば、コンビナトリアルケミストリー）及び（ゲノミクス、プロテオミクスその他の分野からの）生物学的標的の同定における近年の進歩は、スクリーニングの性質に変化をもたらした。化合物の数が増え、標的の数も急速に増大すると予想される。その増大の程度は、現在の薬物が、推定５００００の潜在的遺伝子産物（その各々が標的となる可能性がある）のうち約４５０を標的としていることを考慮すれば、理解できよう。遺伝子産物（タンパク質）の研究から利用できるであろう標的についてはいうまでもない。従って、実施できるはずの試験の数は極めて多くなり、今後も増え続けるであろう。医薬品スクリーニング部門は試験速度の向上が見込まれる技術を実施している。その論理は、単位時間当たりに実施される試験の数が多いほど、有望な新薬が発見される可能性が高くなるというものである。
【０００４】
高速スクリーニングは、「ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）」と呼ばれ、１日当たり数千又は何千もの試験を行なうプロセスとして規定され得る。ＨＴＳにはハイスループットに適合した装置及びロボット工学が必要であり、この目的のためのシステムは開示されている（例えば、Ｒａｍｍ他の米国特許出願公開第２００１／００２８５１０号）。
【０００５】
大抵、ＨＴＳに用いられる装置及びロボット工学は組織には適合しない。これらは化合物及び単離された標的に適応される。目的の化合物（化合物と呼ばれる）は、化合物とその標的との間の分子相互作用を反映する標的の取込み又は幾つかの他の特性を用いて、標的（別の化合物、レセプター分子、タンパク質など）に対して試験される。標的に対する化合物のハイスループット試験は、「一次スクリーニング」と呼ばれる。一次スクリーニングが１日当たり何千もの試験を行い、それらの試験でさらに検討する価値のある化合物（「ヒット」、通常、スクリーニングの０．５％未満）がある割合で得らるとすれば、一次スクリーニングで得られたヒットは、今までにない速度で蓄積されている。これらのヒットはポスト一次スクリーニング段階で評価されて、このヒット化合物の有効性、毒性及び特異性を特徴づけられなければならない。特徴づけされたこれらの要因を用いて、少数の最適ヒット「リード」を、極めて費用のかさみ時間を浪費する前臨床試験及び臨床試験に持ち込むことができる。
【０００６】
残念なことに、ポスト一次試験はさらに複雑で一次試験よりもかなり遅い。その試験は、化合物と単離された標的分子との間の分子相互作用を簡単に検出するには十分ではない。そうではなく、化合物は組織との相互作用について試験されなければならない。従って、ヒットの蓄積はいまや、薬物開発のパイプライン内の主なボトルネックであり、昔可能であったよりも高速でリードを検証し得るポスト一次試験が必要である。
【０００７】
このボトルネックは、ポスト一次試験が生物学において化合物の相互作用を実証するのに有効である場合に緩和され得る。見込みのある経路の１つは、細胞においてポスト一次アッセイを実施することである。細胞は、単純な化合物の混合物から得られるよりも生物学的に関連性のある試験を提供し得る。同時に、細胞アッセイは費用が少なく、実施がかなり素早く、高等生物（例えば、げっ歯類）において実施されるアッセイよりも社会的に受容可能である。細胞ベースのアッセイの重要性は増し続けることが予測される。なぜなら生体応答についての細胞モデルは発展かつ改善し続けているからである。
【０００８】
細胞アッセイに伴う潜在的な問題は、比較的低レベルの処理能力であることが最も証拠付けられる。例えば、「代謝速度」法は、Ｄａｗｅｓ（１９７２）によって開示されており、「プール量」法が、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）によって記載されている。これらのタイプの低処理能力の技術は、画像化又は検出の他の高処理能力法の使用なしに細胞集団を解析するために用いられる代表的な技術である。
【０００９】
高速の処理能力を達成するために、画像ベースの測定を細胞集団で用いてもよく（例えば、Ｍａｌａｙ他，１９８９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＮｅａｇｌｅ，１９９６；Ｒａｍｍ，１９９９）、細胞サンプルを取り扱う、画像化する、解析するプロセスを自動化及び最適化するための種々の方法と組み合わせてもよい。これらの開示では、測定の実体は、マイクロウェルプレートにおける複数のウェルの各々の中の細胞の集団である。細胞又は細胞下の細部は解明されない。
【００１０】
細胞集団応答の検出は、集団における別個の細胞内に存在する効果の検出のための要件と対比され得る。この場合、細胞又は細胞下の解明が必要であり、顕微鏡的細胞スクリーニングのための多数のシステム及び方法が開発されている。集団のスクリーニングと同様に、重要なのは、細胞サンプルを取り扱い、画像化し、解析するプロセスを自動化して最適化するシステム及び方法を構築することである。本発明を用いて、自動化された細胞スクリーニングを単一の細胞及び細胞下解明によって実施することができる。
【００１１】
イメージサイトメトリー
「サイトメトリー」は、個々の細胞からの特徴の測定である。「イメージサイトメトリー」は、サイトメトリー測定を実施するための画像化システムの使用である。サイトメトリック測定には、細胞下の細部は必要であってもなくてもよい。別個の細胞を低解像度で画像化する場合、各々の細胞は、少数の画像画素を占め、均一な測定ポイントとして処理される（例えば、Ｍｉｒａｇｌｉａ他，１９９９）。本発明者らは、これらを「ポイント細胞アッセイ」と呼ぶ。細胞の解剖学はまた、各々が多数の画素を占める細胞の一部で、高い解像度で解明され得る。細胞下の解像度のレベルは、最も大きい構造のみの可視化（例えば、Ｇａｌｂｒａｉｔｈ他，１９９１）から細胞下オルガネラ（当該分野に関する物質のほとんど）の解像に及ぶ。サイトメトリー測定の共通のクラスとしては、以下が挙げられる：
形態計測−細胞、核及びオルガネラのサイズ、形状及び外見、例えば：
・神経突起成長は、神経発達又は再生の指標として用いられる（Ｍａｓｓｅｒｏｌｉ他，１９９３；Ｓｉｋｌｏｓ他，１９９３；Ｍａｌｇｒａｎｇｅ他，１９９４；Ｍｅｚｉｎ他，１９９４；Ｔｕｒｎｅｒ他，１９９４；ｄｅ  Ｍｅｄｉｎａｃｅｌｉ他，１９９５；Ｐａｕｗｅｌｓ他，１９９５；Ｖｅｎｔｉｍｉｇｌｉａ他，１９９５；Ｓｔａｈｌｈｕｔ他，１９９７；Ｉｓａａｃｓ他，１９９８；Ｂｉｌｓｌａｎｄ他，１９９９；Ｐｏｌｌａｃｋ他，１９９９；Ｒｏｎｎ他，２０００）。
【００１２】
・核のサイズ、形状及びクロマチンの分布における変化は、細胞周期を通じた進行と（例えば、Ｄｅ  Ｌｅ  Ｔｏｒｒｅ及びＮａｖａｒｒｅｔｅ，１９７４；Ｓａｗｉｃｋｉ他，１９７４；Ｇｉｒｏｕｄ，１９８２）、又は増殖傾向の分類（例えば、Ｃｒｉｓｓｍａｎ他，１９９０；Ｍａｒｔｉｎ他，１９８４；Ｓｍｉｔｈ他，１９８９；Ｓｏｕｃｈｉｅｒ他，１９９５）と関連し得る。
【００１３】
形態計測は通常、診断的な画像サイトメーターに基づいて実施される。これらは、自動化されたデバイスであって、臨床スクリーニングのための専用の構成要素及びソフトウェア方法を組み込んでいる（例えば、Ｌｅｅ他，１９９２；Ｗｉｅｄ他，１９８７；米国特許第５２８１５１７号；同第５２８７２７２号；同第５６２７９０８号；同第５７４１６４８号；同第５９７８４９８号；同第６２７１０３６号；同第６２５２９７９号に開示される通り）。
【００１４】
機能的な解析−細胞下区画の物質の量又は物質（単数又は複数）の比較した量を測定すること、及び細胞機能の指標としてその測定値を用いることが通常である。
【００１５】
・イオンチャネル  細胞の電位の変化は、イオンチャネルの操作を反映する。細胞内標識の局在化は、イオンチャネルの操作を検討するために、電気生理学に対する代替として用いられ得る（例えば、Ｔａｙｌｏｒ他，２００１；Ｏｍａｌｌｅｙ，１９９４における概説））。
【００１６】
・移行（細胞下画分の間のタンパク質の移動）タンパク質は、２つのタイプの細胞下区画に局在する。それらは、膜に包埋されるか会合してもよく（例えば、細胞膜を装飾するレセプター）、又はそれらは水相であってもよい（核質又は細胞質）。多くの細胞機能が、これらの区画の間のタンパク質移行に関連する。機能的な画像化を、特定の細胞内レセプター区画に対する局在化（例えば、Ｌｕｂｙ−Ｐｈｅｌｐｓ他，１９８５）又は細胞の区画の間のレセプターの輸送を検査するために用いることができる。例えば、Ｇｅｏｒｇｅｔ他（１９９８）、並びにＴｒａｐｍａｎ及びＢｒｉｎｋｍａｎｎ（１９９３）は、核／細胞質比の画像化数量化を用いるレセプター局在化の解析を開示している。蛍光がレセプターを標識し、蛍光の動きが、核と細胞質との間のレセプター分子の位置の変化を反映する。
【００１７】
・局在化（細胞及び細胞下画分内のタンパク質の量）細胞下画分（例えば、核及び細胞質）における任意の（例えば、構造）タンパク質の量を機能の（例えば、Ｋａｗａｍｏｔｏ他，１９９７におけるような増殖の傾向の）指標として用いることができる。
【００１８】
形態計測及び機能的解析のためのサイトメトリーのシステムは、多くの商業的業者から上市されているタイプの画像解析装置を中心として構築され得る。かかるシステムの幾つかは、研究室における適用のために設計され（研究システム）、その機能を実施するには頻繁なオペレーターの操作を必要とする。従って、これらのシステムは、所定の時間で少数の試料を検討する。かかるシステムの例は、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．のＭＣＩＤ画像アナライザーである。他のかかるシステムは産業上の薬物開発（工業的システム）、又は細胞診断（診断システム）における適用のために設計されており、それらは、頻繁なオペレーターの操作なしに機能し（自動化）、所定の期間で比較的多数の試料を検討する（「ハイスループット」と呼ばれる）。産業上のハイスループットシステムの例は、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．のＡｕｔｏＬｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．のＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＩＩである。細胞診断システムの例は、ＣｏｍｐｕＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．のＬＳＣである。
【００１９】
研究システムを用いて得られた多くの刊行物によって、細胞における形態計測及び機能的測定を行うための方法が記載されている。かかる測定の周知の例としては、核と細胞質との間のサイズもしくは標識の強度の比、又は複数の波長で励起された、蛍光の相対強度（標準的蛍光方法又は空間依存性の方法、例えば、蛍光共鳴エネルギー伝達によって得られた）が挙げられる。
【００２０】
研究システムは、診断及びスクリーニングに対する理論的な適用を有する。すなわち、それらは、任意の細胞検出方法を実行するようにプログラムされかつ操作され得る（例えば、Ｓｅｒｒａ，１９８２がしばしば引用される）。ほとんどの産業上及び診断上のシステムは、画像中の細胞の検出を増強する検索システムでも実行される、公知の画像処理方法を用いる。
【００２１】
しかし、検索システムは、産業上の薬物の発見又は臨床診断に有用となる、自動化及び処理能力を欠いている。最も通常には、オペレーターは、このシステムを頻繁に操作しなければならない。例えば、Ｂａｃｕｓ（米国特許第５０１８２０９号）は、かかるオペレーター補助診断システムを開示しているが、このシステムは少数のサンプルでは有用であるが、ハイスループットの環境では有用ではない。
【００２２】
サイトメトリック画像化システムにおいて使用される方法
プレセグメント化
特徴の検出性を増強するためには画像を前処理することが通常である。例えば、特定の重畳フィルタ、例えば、Ｐｒｅｗｉｔｔ（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ他，１９８５）及びＨｕｅｃｋｅｌ（Ｈｕｅｃｋｅｌ，１９７１）はときどき、フィルタリングされていない画像よりも細胞周囲を良好に示す。かかる方法は、引き続くセグメント化の精度を改善して、セグメント化画素をオペレーターが編集する必要性を減じることができる。
【００２３】
収集光学及び照射野内での不均質性を正すために、局所（例えば、米国特許第５０７２３８２号に開示される）又は全体的（多くの市販の画像化システムに通常適用される）なバックグラウンドの変動を正すために、他の周知の補正が適用される。これに関して、空欄の画像を取得すること、高周波数の強度変動を除去する幾つかの方法でこの画像を処理すること、処理された画像における各々の位置で参照画素値から逸脱を算出すること、及び逸脱要因のマトリックスを補正マトリックスとして確保すること（例えば、Ｉｍａｇｉｎｇ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＭＣＩＤシステムにおける実施に対して例えられたように）が一般的である。この補正マトリックスは引き続く画像におけるバックグラウンドの均質性を改善するために用いられる。
【００２４】
セグメント化
測定が行なわれ得る前に、関連の画像特徴をバックグラウンドから識別しなければならない。この識別は、画像のセグメント化のための周知の方法を用いて行なわれる（多くの市販品、例えば、Ｍｅｄｉａ  ＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓのソフトウェアＩｍａｇｅＰｒｏにおける実施に例えられた）。セグメント化は、画像をその成分又はオブジェクトに小分割するプロセスとして規定される。トレーシング及び閾値化は、セグメント化のための公知の方法である（他の方法もある）。理想的には、単純な染色プロセスによって細胞又は細胞成分のあいまいな検出が得られ、ここでは各々の染色されたオブジェクトが目的の特徴をマークし、他の画像成分は染色されない。この目標は、このオブジェクトが単純な強度規準で検出されるのに十分明るいか又は暗いことである。実際には、この目標はめったに達成されない。
【００２５】
トレーシング
最も簡単な手技によるセグメント化方法は、ヒトのオペレーターが細胞及び細胞下の細部をトレースすることである。次いでこのシステムは、このトレース内の画素を用いて目的のパラメーターを報告する（例えば、Ｄｅｌｉｇｄｉｓｃｈ他，１９９３；Ｇｉｌ他，１９８６）。
【００２６】
閾値化
最も簡単な自動的セグメント化方法である強度閾値化は、グレースケール（濃淡階調）又はカラー画像を入力とし、強度周波数をヒストグラムにし、単一の識別値（閾値）に基づく二値画像を出力する。単一の強度又は色の閾値化は、セグメント化画素の幾つかが妥当なだけであり、セグメント化画像がオペレーターの編集を要するという点で産業上の適用にはめったに適さない。例えば、Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８６）は、単一の強度閾値化は、フローサイトメトリーによって得られるよりも細胞検出について正確性が低かったということを報告している。多くの問題が存在しており、これには、単一の画像又は画像の組における位置から位置へ変化する細胞及びバックグラウンドの強度が挙げられる。
【００２７】
標的領域
一旦、画像画素が妥当である可能性があるとしてセグメント化されれば、それらは目的の特徴（領域又は標的と呼ばれる）に適合するように分類されなければならない。そのポイントは、均一性の規準に従って別個の領域に対する画素に分類することである。均一性規準は、公知の種々の方法に由来し得る幾つかのパラメーター（例えば、検出された画素を分離する距離）に基づく。ｒｅｇｉｏｎ抽出のための技術のなかでも最も複雑でない方法としては、マニュアル又は半自動的抽出が挙げられる。このプロセスでは、人々は、領域に対してセグメント化画素の割り当てを確認するか又は同定する。
【００２８】
「領域拡張」とは、分離されセグメント化画素を領域へ融合させるプロセスである。領域拡張のためには多くの規準が用いられ得る（例えば、Ｃｈａｓｓｅｒｙ及びＧａｒｂａｙ，１９８４；Ｇａｒｂａｙ  １９８６；Ｏｎｇ他，１９９３；Ｓｍｅｕｌｄｅｒｓ他，１９７９）。例えば、幾何学的特徴（例えば、別の領域からの距離、サイズ、形状、テクスチャ、度数分布、フラクタル次元、局所湾曲）又は統計的特徴（例えば、分散、モード、歪度、とがり、エントロピー）は、領域に対する画素の分類の部分として用いられ得る。領域拡張はまた、形態学的技術に基づいてもよい。例えば、Ｓｅｎｉｕｋ他，１９９１及び米国特許第５９７８４９８号は、核及び細胞質区画を識別するための強度ベースのマスク、続いて浸食（清浄な核を抽出するため）及び拡大（清浄な細胞質領域を抽出するため）を用いる一連の工程における形態学の使用を開示している。
【００２９】
次いで、拡張領域は種々のさらに高レベルのプロセスへ渡されてもよい。例えば、複雑な画素統計学（例えば、米国特許第６３０７９５７号に開示されるマルチスケール・ウェーブレット最大値（ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ  ｗａｖｅｌｅｔ  ｍａｘｉｍａ）が領域において測定値を得るために適用され得る。同様に、細胞分類のための方法に基づく知識は、領域を入力としてとらえ、その出力として判断を下す。これらのシステムは専門的なシステム及び／又は神経網を組み込んでもよい（例えば、米国特許第５２８７２７２号；Ｒｅｆｅｎｅｓ他，１９９０；Ｓｔｏｔｚｋａ他，１９９５）。
【００３０】
細胞スクリーニングシステム
細胞内のプローブのレベルを測定するための公知の方法の集合を使用する研究システムは広範に開示されている（例えば、Ｍａｃａｕｌａｙ及びＰａｌｃｉｃ，１９９０；Ｍｉｚｅ他，１９８８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他，１９９０；Ｚｏｌｉ他，１９９０）。同様に、産業上の細胞スクリーニングシステムは、プレセグメント化、セグメント化及び標的分類のための公知の方法を実施する（例えば、ＣｅｌｌｏｍｉｃｓのＡｒｒａｙＳｃａｎシステム、及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＩｎＣｅｌｌシステムにおいてのように）。研究及び産業上のシステムをお互いから識別されるものは、産業上のシステムが、オペレーターの操作が最小で（自動的に）機能しながら、さらに高速の処理能力を提供するということである。研究の適用は、ほとんどの任意の画像解析システムにおいて達成され得る。自動化及び処理能力は、専門的なソフトウェア及びハードウェアを組み込むシステム内でのみ達成できる。
【００３１】
例えば、広範に適用される原理は、容易に検出される細胞下成分をマークすることで、細胞位置及びこのマークされた成分に隣接する細胞下成分の引き続く検出を改善するということである。通常は、このマークされた成分は核である（例えば、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ他，１９８９；Ｌｏｃｋｅｔｔ他，１９９１；Ａｎｄｅｒｓｏｎ他，１９９２；Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ他，１９９２に開示されるように）。産業上の適用では（例えば、米国特許第５９８９８３５号に開示される、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．のＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＩＩで供給される）、マークされた核の周囲の細胞質は、別の細胞質（この細胞質は環を超えて存在する）に対する一方の細胞質の進入を最小化するようにこの環によって（自動的に）限定され得る。同じ環の方法は、検索システムで実行され得るが、ユーザーの相互作用が最小でかつ高い処理能力で操作するように、この顕微鏡システム及びソフトウェアの自動化はない。詳細には、Ｓｅｎｉｕｋ他（１９９１）は、ＤＮＡ特異的蛍光プローブを用いて細胞核をマークして、次いで細胞質プローブ含量の画像ベースの測定のために核からある距離（この場合、１μｍの距離を用いた）で環を作成する方法を開示している。
【００３２】
細胞成分のマーキング及び他の成分を局在化するためのこれらの成分の使用は公知の方法である。しかし、工業的な細胞スクリーニングシステムにおいて有効なシステム及び方法への公知の方法の構築によって、これらのシステム及び方法が先行技術において利用可能であるよりも優れた自動化及び処理能力を生みだすという新規性が得られる。かかる自動化され、かつ高い処理能力のシステムを作成する困難性は、過小評価されるべきではなく、かかるシステム（開示されているか又は実施することが例えられている）の極めて少数によってしか実証されない（例えば、Ｐｒｏｆｆｉｔ他，１９９６；Ｒａｍｍ他，２００１，２００２；米国特許第５９８９８３５号；同第６１０３４７９号）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明は、以下の領域における改善を達成するシステム及びプロセスを提供する：
・（プレセグメント化及びセグメント化）画像処理のための公知の方法は、自動的なセグメント化が達成されるような方法で実行される（例えば、Ｒａｍｍ他，米国特許出願公開第２００１／００２８５１０号に開示されるように）。
・（測定）公知の測定の組（画素カウントなど）を、生物学的な局面を信頼できる方式で示す方法として実行する（例えば、Ｒａｍｍ他，２００１／００２８５１０に開示されるように）。
・（光学、機械及び電子機器）多様なサンプルの自動的な位置決め、集束、画像化及び処理のための構成要素を、システムとして組み込んで、その中にセグメント化及び測定方法を組み込んでもよい。
さらに高度に自動化され、かつさらに迅速な細胞スクリーニングを得るシステムに、構成要素及び方法を適合させる。
【００３４】
本発明の１つの態様によれば、ユーザーの相互作用が最小であって自動的な解析を実施する方法へ構築される、アッセイ処理手順のライブラリが提供される。このライブラリのメンバーは、以下である：
・高強度ピークの非線形抑制、
・適応ノイズ平滑化（ガウシアン）、
・非線形拡散フィルタリングによる適応ノイズ平滑化及び特徴強化、
・最適ヒストグラム二分割による閾値化、
・シード化領域拡張、
・テクスチャ変換、
・検出された特徴の形態学的リファイニング、
・局所コントラストによる数量化、
・分布特徴解析、
・顆粒細部の周波数領域検出、
・境界マッピング、
・バックグラウンド補正、
・ふるい分け。
【００３５】
開示された方法としては、神経突起アッセイ、顆粒移行アッセイ、核移行アッセイ、及びメンブレンラッフリングアッセイが挙げられる。
【００３６】
本発明の別の態様によれば、この方法は、複数の容器中に試料を配置し、集束して、自動化実験装置とインターフェースする自動化されたオプトメカニカルシステム内に組み込まれる。
【００３７】
さらなる態様によれば、本発明は画像を取得しかつ記録するために、ソフトウェアを収納するために用いられる電子カメラ及びコンピューターが包含される。
【００３８】
前述の簡単な説明、並びに本発明のさらなる目的、特徴及び利点は、現在好ましい以下の詳細な説明からさらに完全に理解されるが、それにもかかわらず、本発明に従う例示的な実施形態には、参考として以下の図面を添付している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本明細書に用いた語句の意味及び略号を表１に規定する。
【００４０】
ここで図面の説明を振り返れば、図１は、本発明のシステムの光学的、機械的及び電気的構成要素を図示する模式的なブロック図である。倒立顕微鏡スタンド１００は、蛍光エピイルミネーター１０１及びタングステンハロゲントランスイルミネーター１０２を装備される。対物タレット１０３に装着されるのは、好ましくは圧電性の種類の高速モータードライブ１０４である。モーター１０４は、対物レンズ２００をＺ次元（垂直に）動かして最高の焦点位置に達するようにする。最高の焦点位置は、デジタルコンピューター６００によってモニターされる通り、共焦点オートフォーカスデバイス３００によって規定される。オートフォーカスソフトウェアが選択される場合、顕微鏡Ｚ焦点ドライブ１０７はまた、対物レンズ２００をＺ次元で動かすように用いられてもよい。フィルタチェンジャー１０８は、イルミネーター１０１の照射通路にフィルタを存在させて、それによって狭い照射励起帯を選択するように配置される。必要に応じて、コンピューター制御下に光学的な狭い励起帯を選択するように、フィルタチェンジャー１０９が、顕微鏡１００の発光通路に装着されてもよい。シャッター１１０は、コンピューター制御下にイルミネーター１０２からの光を透過する。モーターを装着されたステージ４００は、対物レンズ２００に対して各々の複数のウェルが存在するようにマルチウェルプレート４１０を運ぶ。ＣＣＤカメラ５００は、プレート４１０に細胞の画像を取得するように装着される。デジタルコンピューター６００は、この構成要素（フィルタチェンジャー１０８／１０９、シャッター１１０、焦点部品１０４、３００、１０７、ステージ４００、カメラ５００）を制御して、解析を行なうソフトウェアを備える。
【００４１】
顕微鏡１００は好ましくは、落射蛍光光学及び透過光照射通路を備えられた倒立スタンドである。モーターを取り付けられたコンピューター制御のステージ４００が、試料容器を顕微鏡光学にまたがって動かすように顕微鏡に装着される。好ましくは、ステージ４００は、マルチウェルプレート４１０のためのホルダーを装備され、このホルダーは、Ｚｙｍａｒｃ  ＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓのＴｗｉｓｔｅｒ２のような標準的な実験ロボットによるプレートの挿入及び除去を可能にするように構築される。デジタルカメラ５００は、好ましくは、冷却型で低ノイズのＣＣＤカメラであり、この顕微鏡に装着されて試料の画像を取得する。システム制御及び画像記録は、デジタルコンピューター６００によって行なわれる。
【００４２】
【表１】
2005525550.tif 000002
【００４３】
図２は、高速オートフォーカスデバイスを図示する模式的なブロック図である。レーザーダイオード１００から放射された光は、ビームスプリッター１０３′によって導入された収差を補償するように計算された、透過ウインドウ１０１′を通過する。この補償は、補償する収差を導入するためにこのウインドウを傾けることによって達せられる。ビームスプリッター１０３′は収差を誘導せず（例えば、極めて細いビームスプリッターの場合のように）、ガラスウインドウ１０１′からの補正が必要ないタイプのものでなければならない。
【００４４】
ウインドウ１０１′をそのままにすれば、次にレーザービームは、ビームの幅を制限する開口部１０２′を通過して、その結果、そのレーザービームはその後、顕微鏡の対物レンズ２００の後レンズを満たす。直径１５〜２０ｍｍの後レンズを有する対物レンズでの操作のために、この開口部を直径２．４ｍｍに構成する。
【００４５】
ビームスプリッター１０３′は、レーザー強度制限デバイスとして機能する。これは、吸収表面１０４′上の側面に対して入射レーザービームの９５％より多くを反射するように構築される。優先的に、この吸光度は、逆反射（他の構成要素に対して投射されることによって測定感度を悪化させ得る）を最小にするような程度に、大きい（１００％に近い）。ビームスプリッター１０３′からの側方反射は、吸収表面１０４′に向かって進行するので、広範に発散するように算出され、検出器６００′に向かって戻る集束された反射の侵入は最小限である。
【００４６】
このシステムは、レーザービームの残りのわずかな割合の使用において効率的であるように設計される。このレーザービームの低出力及びこのデバイスの効率性によって、オートフォーカスを比較的非制限的なカテゴリー内で認証することが可能になる（クラス１）。レーザービームのさらに大部分が鋭敏な操作に必要であった場合、この認証カテゴリーはさらに制限的であって、このデバイスの費用及び複雑性の両方ともかなり大きくなる。
【００４７】
別の光通路は、ビームスプリッター１０３′を通して透過されて、ミラー１０５′へ通過し、これは、最終のビームの焦点を維持するために高い平面度（λ／４）であり、レーザーを放射する近赤外線及び赤外線の波長における効率性を最大にするために高い反射性である。ミラーコーティングは金であって、関連の波長を効率的に反射する特性を有する。
【００４８】
ミラー１０５′からの光は、光を平行にして、光検知器ピンホール５００′の開口部（絞り）を最もよく満たすような焦点距離の収斂レンズ１０６に反射される。好ましくは、レンズ１０６′は、動作波長λに対して限定された回折である。
【００４９】
次いで、平行にされたビームは、フィルタ１０８′を備える別のミラー１０７′に通過する。かかるミラーの例は、λ／２の平面度を有し、７５０ｎｍ未満の波長を透過し、７５０ｎｍを越える波長を反射する特性を備える、高品質ダイクロイックアセンブリである。ミラー１０７′は、対物レンズ２００の後レンズに向かって所望の波長を最も効率的に反射するような角度に傾けられる。好ましい実施形態において、ミラー１０７′の後面は、望ましくない反射を最小限にするように抗反射コーティングである。
【００５０】
光は、顕微鏡の対物レンズ２００を通って試料容器３００′の底面に透過する。対物レンズ２００は、容器３００′に対して垂直な次元で動かされて、容器３００′の底面よりも大きい距離にまたがるのに十分太く、ウェル３／０の含量の一部を含む検出容積を通じてレーザービームを掃引する。
【００５１】
容器３００′の透明な表面と空気（底面３０１）と液体（内面３０２）との間の境界からの反射を、対物レンズ２００によって収集して、フィルタ／ミラー１０７′／１０８′に送る。ミラー１０７′／１０８′は、レーザー波長を優先的に通過して、容器３００′及び試料媒体３０３からの他の発光をブロックする。この反射された光は、レンズ１０６′、ミラー１０５′及びビームスプリッター１０３′（光検知器６００′に光の一部を戻す）を通して戻る。
【００５２】
光検知器６００′は、対物レンズ２００がサンプル容積３１０をアドレスするように動かされるにつれて、ビームをモニターする。正反射によって生じた光の量は、以下のように算出できる：
【００５３】
【数１】
2005525550.tif 000003
【００５４】
式中、Ｎは、光が通過する第一の媒体の反射指数であり、Ｎ′は、光が通過する第二の媒体の反射指数である。Ｉの値は、Ｎ及びＮ′の反射指数が異なる場合に最大化される。従って、空気から試料容器３１０の底への第一の遷移３０３は、この試料容器の材料から水気のある液体への遷移３０２よりも大きい反射を生じる。コンピューター６００におけるソフトウェアアルゴリズムは、光検知器によって生じる波形の形状をリアルタイムでモニターして、遷移３０２を突き止める。
【００５５】
操作中、本発明の位置的オートフォーカスは、レーザービームを、顕微鏡の対物レンズを通って試料容器３００′へ伝達する。急速な焦点ドライブ（これは、圧電性アクチュエータであってもよい）は、顕微鏡の対物レンズ２００をｚ面（深度）でプレート底３０１に対して動かして、サンプリング容積を確立する。サンプリング容積における各々のポイントで、逆反射は、共焦点光検知器６００′に伝達される。この光検知器は、反射強度をモニターして、その強度をデジタルコンピューターへ伝達され得る電圧に変換する。コンピューターのソフトウェアは、照射ビームが資料容器の表面にわたって推移するにつれて生じる強度特徴に基づいて最高の焦点位置を算出する。このデバイスの構成要素及び構成は、共焦点光学通路の周知の実施形態と同様である（米国特許第４８８１８０８号、同第６１３０７４５号、国際公開第９２／１５０３４号、同第９５／２２０５８号、同第９８／４４３７５号、同第００／３７９８４号に開示された通り）。これらのシステムの幾つかはまた、細胞が存在する基板に対応する焦点面を検出し、次いでこの基板を超える幾つかの固定された距離で細胞の焦点を確立する。
【００５６】
本発明のオートフォーカスの特徴であるのは、これがソフトウェアオートフォーカスアルゴリズムを組み込んでおり、その結果、これが、容器の表面に対して固定されていない位置（例えば、５〜１５ｕｍを上回る範囲内）に存在する細胞とともに用いられ得るということである。この方法は、次の工程を含む：ａ）参考として位置オートフォーカスによって達成される最高の焦点位置を用いる；ｂ）試料容器中に固定距離動かす；ｃ）ｚ面中の間隔で多数の画像をとり、これらの画像から最高の焦点を算出する（図３）。当業者は、ソフトウェアオートフォーカスが、単独で用いられる場合、多数の画像をとらなければならないために、遅いということを認識する。しかし、試料容器によって規定される位置に至るための現在のハードウェアの使用、及びその後にその容器に対して参照されるポイントで制限された組の画像取得を開始することで、本発明のシステムは、単独で用いられるソフトウェアオートフォーカスよりも迅速に機能することが可能になる。
【００５７】
本発明のシステムの特徴は、このシステムが厚みのある試料を焦点するために用いられ得るということである。例えば、ゼブラフィッシュの１細胞胚へのドーパミントランスポータープロモーター−ＧＦＰ構築物の注入後、ドーパミン作動性ニューロンにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の一過性の発現が観察されている。これらの胚は、トランスジェニック魚のホモ接合性ストックを確立するために成体まで成長される。次いで、トランスジェニック株の胚は、マイクロウェルプレートに胚を置き、化合物を投与することによって、スクリーニング方式で研究することができる。これらの胚は、標準的な顕微鏡の対物レンズの焦点の深さよりも厚みがある。本発明のシステムは、単一焦点面を超えて延在する試料を収容する。この方法は、次の工程を含む：ａ）参照として位置オートフォーカスによって達成される最高の焦点位置を用いる；ｂ）試料容器中に固定距離動かす；ｃ）試料を含むのに十分大きい距離にまたがって、ｚ面中で一組の画像をとる、ｄ）公知の画像組み合わせアルゴリズムを用いてこの試料の全体の厚みを最高に示す単一の画像にこの画像を合わせる。
【００５８】
別の態様では、同じ焦点駆動システムを用いて、蛍光Ｚ面画像のスタックを作製することが可能で、これからデジタル逆重畳について公知の方法を用いて、単一の最高の焦点の画像が算出される。この場合、公知のアルゴリズムを用いる画像逆重畳は、上記のように画像組み合わせに置き換えられる。
【００５９】
図３は、フローチャートであって、これは図４〜図９にさらに詳細である通り、神経突起解析のための一般的な手順を示す。もとの画像１１０′は、画像前処理、二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング、細胞及び神経突起の分類、並びに境界マッピングを含む一組の手順に供される。
【００６０】
図４は、自動化された神経突起解析のための方法内で用いられる画像前処理手順を示すフローチャートである。もとの画像１１０′は、判定ポイント１１１に送られる。画像１１０′が蛍光標識される場合、これは、非線形抑制１１４に直接進行する（プロセス１−このプロセス及び全ての他の番号付けされたプロセスは、以下にさらに詳細に記載される）。もとの画像１１０′が未標識の場合、これは、テクスチャ変換１１２（プロセス６）に供されて、画像１１３を作成し、これが次いで、非線形抑制１１４（プロセス１）に供される。画像１１５は、抑制１１４からの出力である。
【００６１】
画像１１５は、適応ノイズ平滑化１１６（プロセス２）に供されて、前処理された神経突起画像１１７として出力される。
【００６２】
図５ａは、微分干渉コントラスト顕微鏡を用いて画像化された未染色の細胞画像を示しており、エネルギーテクスチャ変換は、図５ｂの画像を生じ、ここでは、神経突起が他の画像成分に対して強調されている。この図の目的は、本発明の方法のエネルギーテクスチャ変換によって、神経突起が自動的な手順によって容易にセグメント化される画像が得られることを示すことである。
【００６３】
図６は、神経突起解析方法の二値化手順を図示するフローチャートである。１２０で、画像１１７が入力される。１２１では、前処理された神経突起画像１１７がヒストグラム二分割によって二値化される（プロセス４）。二値画像１２２が出力される。１２３では、画像１２２が、ＳＲＧ手順のためのシードとして働く（プロセス５）。領域画像１２４が出力される。１２５で、領域画像１２４は、小さいホール及び平滑な境界線を除くために形態学的画像リファイニング（プロセス７）に供される。二値神経突起画像１２６が、図７に示されるように出力される。
【００６４】
図７ａは、もとの画像（蛍光顕微鏡を用いて得られた）を示しており、図７ｂは、二値神経突起画像１２６を示しており、ここでは、神経突起及び細胞本体の両方が本発明によって正確に二値化されている。この図の目的は、本発明の方法の二値化プロセスによって、神経突起及び細胞本体の正確なセグメント化がもたらされることを示すことである。
【００６５】
図８は、本発明の方法の細胞及び神経突起の分類手順を図示するフローチャートである。１２７では、画像１２６が出力される。１２８では、画像１２６がマルチ規準プロセスによってふるい分けられる（プロセス１３）。ふるい１２８は、神経突起又は細胞の特徴でない形状及び領域を有するオブジェクトを除く。ふるい１２８は、細胞及び神経突起の両方を含む画像１２９を出力する。１３０では、画像１２９は、形態学的開口プロセスに供される。前駆画像１３１が出力される。
【００６６】
１３２では、サイズによるふるい（プロセス１３）が画像１３１に適用される。ふるい１３２の出力は、二値細胞画像１３３であり、これは最小細胞サイズよりも大きいオブジェクトのみを含む。
【００６７】
１３４では、前駆画像１３１が、細胞及び神経突起画像１２９から論理的に除外される。これによって神経突起のみを含む画像１３５が得られる。１３６では、画像１３５を、サイズ、形状及び近似を含むマルチ規準プロセスによってふるい分けして（プロセス１３）、二値神経突起画像１３７を作成する。画像１３７では、神経突起の形状及びサイズを有し、かつ細胞本体に近位である（画像１３３に図示されるように）オブジェクトのみが存在する。
【００６８】
図９は、本発明の方法の境界マッピング手順を図示するフローチャートである。１３８では、二値化神経突起画像１３７が骨組みにされて、骨組みにされた神経突起画像１３９が作成される。
【００６９】
１４０では、テセレーション手順を二値細胞画像１３３に適用して、細胞本体の影響のゾーンからなるテセレーション処理細胞画像１４１を作成する（図１０を参照のこと）。これらの影響のゾーンは、各々の細胞の周囲の幾何的に規定された領域であり、この中で神経突起がもとの細胞に割り当てられ得る。
【００７０】
１４２では、神経突起及び神経突起の形状の細部（終点、分岐点、結合点など）が、骨組みにされた神経突起画像１３９において決定される。細胞画像１３３及びテセレーション処理画像１４１を用いて、神経突起及び神経突起の細部は、もとの細胞に割り当てられ得る。
【００７１】
図１０は、神経突起及び神経突起の形状の細部が割り当てられる影響のゾーンを図示する。「Ｃ」の表示は、細胞本体を意味する。「Ｎ」の表示は、神経突起の骨格を規定する。「Ｚ」の表示は、影響ゾーンの境界線を意味する。「ｄ」の表示は、神経突起形状の細部を意味する。この図の目的は、本発明の境界マッピングが、お互いの細胞の周囲のゾーンを作成すること、並びに神経突起及びその形状の特徴の起源を突き止めることの両方に有効であるということを示すことである。各々の細胞のゾーン内で、示される神経突起及びその特徴が、そのゾーンについてのもとの細胞に関連付けられ得る。
【００７２】
図１１は左側に、顆粒移行アッセイの解析の顆粒セグメント化のためのフローチャートを示す。もとの画像２１０を、画像前処理、二値化及び数量化を含む一組の手順に供する。
【００７３】
図１１は右側に顆粒移行アッセイの解析の細胞本体セグメント化についてのフローチャートを示す。もとの画像２００を、画像前処理、二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング、ふるい分け及び数量化を含む一組の手順に供する。
【００７４】
図１２は、顆粒移行アッセイの解析のための方法の細胞本体セグメント化の画像処理を図示するフローチャートである。もとの画像２００を、非線形抑制２２０（プロセス１）に供する。次いで、出力画像２０１を判定ポイント２２１に送る。出力画像２０１がノイズが多い場合、これを適応ノイズ平滑化２２２（プロセス２）、又は非線形拡散フィルタリング２２３（プロセス３）に供して、画像２０２を作成する。好ましくはフィルタリング２２３は、ＳＧＭＤ処理及びＡＥＥＤ処理の相互作用によって達成される。画像２０１がノイズが多くない場合、これをプロセス２２４に直接進める。２２４において、画像２０１又は２０２がバックグラウンド補正２２５に供されるべきか否かの決定を行なう（プロセス１２）。前処理された細胞画像２０３を作成する。
【００７５】
図１３は、顆粒移行アッセイの解析のための方法の細胞本体セグメント化の二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング及びふるい分け手順を示すフローチャートである。２２５′において、前処理された細胞画像２０３が入力される。２２６では、画像２０３はＯＨＢによって二値化されて（プロセス４）二値シード画像２０４が得られる。２２７では、画像２０４は、ＳＲＧに供されて（プロセス５）、領域画像２０５が得られる。２２８では、領域画像２０５が形態学的リファイニングに供されて（プロセス７）、リファイニングされた前駆細胞画像２０６が出力される。２２９では、リファイニングされた細胞画像２０６が、サイズによるふるいに供されて（プロセス１３）、これが二値細胞画像２０７を生じる。細胞画像２０７は、最小細胞サイズよりも小さいオブジェクトを含まない。
【００７６】
図１４は、顆粒移行アッセイの解析のための方法の顆粒セグメント化手順を示すフローチャートである。二値細胞画像２０７は、非線形拡散フィルタリング２３０（プロセス３）に供されて、出力画像２０８が得られる。好ましくは、拡散フィルタリングは、ＳＰＥＤ処理による。画像２０８における強調された強度ピークは、小胞に相当し、２３１で局所最大として検出されて、二値顆粒画像２０９を生じる。
【００７７】
図１５は、顆粒移行アッセイの解析のための方法の数量化手順を図示するフローチャートである。２３２において、二値顆粒画像２０９及び二値細胞画像２０７を用いて、もとの画像２００において、細胞質及び小胞（細胞質内の顆粒）の成分が突き止められる。画像２００の位置付けられた成分から、任意の形態の強度又は空間に基づく解析が実行され得る。好ましくは、局所コントラスト（プロセス８）及び／又は分布特徴の解析（プロセス９）及び／又は周波数領域解析（プロセス１０、図１６）による数量化が、数量化２３３で行なわれる。
【００７８】
図１６は、数量化２３３の周波数領域解析（プロセス１０）を図示しており、これは処理された細胞における顆粒の変化の識別を示している。細胞内顆粒物質における相違は、細胞画像のフーリエスペクトルから検出される。コントロール細胞のエネルギースペクトルは、ドットによって示される（下側の曲線）が、３用量の薬物で処理した、漸増する量及びサイズの顆粒を含む細胞のスペクトルが、それぞれ対応して丸、四角及びバツで示される。この図は、生物学的に関連する効果が本発明の空間的領域解析によって識別され得ることを示す。
【００７９】
図１７は、核移行の解析のためのプロセスを実証するフローチャートである。もとの画像３００は、幾何学的位置づけ補助として核を最もよく示す画像である。もとの画像３０１は、目的の標識された分子を最もよく示す画像であり、これは、標識された分子の局所濃度に相当する蛍光強度を有する。好ましくは、画像３００及び画像３０１における核及び非核細胞区画の示差的な可視化は、顕微鏡での励起及び発光フィルタリングの異なる条件によって達成される。
【００８０】
画像３００（図１７の左側）は、核を区分する一組の手順に供される。これらの手順は、画像の前処理、二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング、ふるい分け及び数量化を含む。
【００８１】
画像３０１（図１７の右側）は、細胞質を区分する一組の手順に供される。これらの手順は、画像の前処理、二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング、ふるい分け及び数量化を含む。
【００８２】
図１８は、核移行アッセイの解析に用いられる核セグメント化の前処理段階を図示するフローチャートである。もとの画像３００を、３３０で入力させる。３３１において、画像３００を、非線形抑制（プロセス１）に供して、画像３０２を出力する。画像３０２を判定ポイント３３２に送る。画像３０２がノイズが多い場合、これを適応ノイズ平滑化３３３（プロセス２）、又は非線形拡散フィルタリング３３４（プロセス３）に供する。好ましくは、フィルタリング３３４は、ＳＧＭＤ及びＡＥＥＤ処理の相互作用によって達成される。画像３０３が出力される。画像３０３は、判定ポイント３３５に送られる。バックグラウンドの補正が所望される場合、画像３０３は、バックグラウンド補正３３６に供される（プロセス１２）。前処理された核の画像３０４が作成される。
【００８３】
図１９は、核移行アッセイの解析のために用いられた核セグメント化の二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング及びふるい分け手順を示す。３３７では、画像３０４が入力される。３３８では、画像３０４は、最も可能性の高い画素の値よりも暗い核画像の画素が、最も可能性の高い画素の値に設定されるプロセスに供される。画像３０５が出力される。３３９では、画像３０５はＯＨＢによって二値化されて（プロセス４）、画像３０６が出力される。３４０では、画像３０６は、ＳＲＧに供されて（プロセス５）、領域画像３０７が得られる。３４１では、領域画像３０７は、画像３０５で行なわれるＯＨＢの第二の繰り返し（プロセス４）のための画素を規定するためのマスクとして用いられる。二値画像３０８が出力されて、領域画像３０７よりも核境界線のさらに正確な定義が提供される。３４２では、画像３０８が形態学的リファイニングに供される（プロセス７）。画像３０９が出力される。３４３では、画像３０９は、ふるい分けされる（プロセス１３）。ふるい３４３は、最小の核サイズよりも小さいオブジェクト（このオブジェクトは除去されなければ核と混同される）を除く。二値の核画像３１０が出力される。
【００８４】
図２０は、核移行アッセイの解析に用いられる細胞質セグメント化手順の前処理を図示するフローチャートである。３４４において、細胞質画像３０１が入力される。画像３０１を、３４５で非線形抑制（プロセス１）に供する。画像３１１が出力される。画像３１１が判定ポイント３４６に送られる。画像３１１がノイズが多い場合、これを適応ノイズ平滑化３４７（プロセス２）、又は非線形拡散フィルタリング３４８（プロセス３）に供する。好ましくは、フィルタリング３４８は、ＳＧＭＤ及びＡＥＥＤ処理の相互作用によって達成される。画像３１２が出力される。画像３１２は、判定ポイント３４９に送られる。バックグラウンドの補正が所望される場合、画像３１２は、バックグラウンド補正３５０に供される（プロセス１２）。前処理された細胞質の画像３／３が作成される。
【００８５】
図２１は、核移行アッセイの解析のための方法において用いられる細胞質セグメント化の二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング及びふるい分けのプロセスを示すフローチャートである。３５１では、画像３１３が入力される。３５２では、画像３１３は、最も可能性の高い画素の値よりも暗い核画像の画素が、最も可能性の高い画素の値に設定されるプロセスに供される。画像３１４が出力される。３５３では、画像３１４はＯＨＢによって二値化されて（プロセス４）、シード画像３１５が出力される。３５４では、画像３１５は、ＳＲＧに供されて（プロセス５）、領域画像３１６が得られる。３５５では、領域画像３１６は、画像３１４で行なわれるＯＨＢの第二の繰り返し（プロセス４）のための画素を規定するためのマスクとして用いられる。二値画像３１７が出力されて、領域画像３１６よりも核境界線（核除外のため）のさらに正確な定義が提供される。３５６では、画像３１７が形態学的リファイニングに供される（プロセス７）。画像３１８が出力される。３５７では、画像３１８は、ふるい分けされる（プロセス１３）。ふるい３５７は、最小の細胞サイズよりも小さいオブジェクト（このオブジェクトは除去されなければ核と混同される）を除く。二値の細胞質画像３１９が出力される。
【００８６】
図２２は、核移行アッセイの解析のための方法に用いられる数量化手順を図示するフローチャートである。１つの態様では、数量化は、起源としてセグメント化核を用いる。次いで、強度データがもとの細胞質画像３０１から、核に対して近位で規定される固定位置で読みとられる（例えば、カラーは核から２画素で開始して、核から６画素まで延在する）。
【００８７】
３５８では、二値核画像３１０が入力される。好ましくは、３５９で、画像３１０は、形態学的拡張演算（Ｒｕｓｓ  １９９９，ｐ４６０、及びＰａｒｋｅｒ  １９９７，ｐ６８に開示される）に供されて、拡張された二値核画像３２０が得られる。好ましくは、この拡張は、環状構造要素で行なわれる（Ｐａｒｋｅｒ  １９９７、ｐ７３に開示される通り）。画像３２０は、二値核画像３１０の核成分及びこの拡張プロセスによって生まれる核周囲成分の両方から構成される。
【００８８】
３６０では、画像３１０が画像３２０から排除されて、核周囲成分のみを含む画像３２１が残る。
【００８９】
３６１では、画像３１０は、細胞質画像３０１における核画素を同定するためのマスクとして機能し、画像３２１は、細胞質画像３０１における核周囲画素を同定するためのマスクとして機能する。
【００９０】
好ましくは、３６２で、核周囲標識強度及び核標識強度の比から移行が数量化される（プロセス８）。別の好ましい態様では、３６３において、数量化は、比３６２の分布特徴解析（プロセス９）を含む。
【００９１】
別の態様では、３６４で、二値細胞質画像３１９を用いて、細胞質画像３０１における細胞質画素を同定し、細胞質画素強度は、これらの同定された画素から算出される。３６４で、二値核画像３１０は、細胞質画像３０１内の核領域を同定するためのマスクとして機能し、核画素強度は、これらの同定された画素から算出される。好ましくは、３６５で、核の内側及び、その細胞のできるだけ多くの細胞質を含む領域における細胞質標識強度の比から数量化される（プロセス８）。別の態様では、数量化は、比３６５の分布特徴解析３６６（プロセス９）をふくんでいてもよい。
【００９２】
図２３は、ラッフル移行の解析を図示するフローチャートである。もとの画像４００は、幾何学的位置づけ補助として核を最もよく示す画像である。もとの画像４０１は、目的の標識された分子を最もよく示す画像であり、これは、標識された分子の局所濃度に相当する蛍光強度を有する。好ましくは、画像４００及び画像４０１における核及び非核細胞区画の示差的な可視化は、顕微鏡での励起及び発光フィルタリングの異なる条件によって達成される。
【００９３】
画像４００（図２３の左側）は、核を区分する一組の手順に供される。これらの手順は、画像の前処理、二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング、及びふるい分けを含む。
【００９４】
画像４０１（図２３の右側）は、ラッフルを含む、細胞質を区分する一組の手順に供される。これらの手順は、画像の前処理、二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング、及びふるい分けを含む。
【００９５】
図２４は、ラッフル移行アッセイの解析のための方法に用いられる核セグメント化の前処理段階を図示するフローチャートである。もとの画像４００は、４３０で入力される。４３１において、画像４００を、非線形抑制（プロセス１）に供して、画像４０２を出力する。画像４０２を判定ポイント４３２に送る。画像４０２がノイズが多い場合、これを適応ノイズ平滑化４３３（プロセス２）、又は非線形拡散フィルタリング４３４（プロセス３）に供する。好ましくは、フィルタリング４３４は、ＳＧＭＤ及びＡＥＥＤ処理の相互作用によって達成される。画像４０３が出力される。画像４０３は、判定ポイント４３５に送られる。バックグラウンドの補正が所望される場合、画像４０３は、バックグラウンド補正４３６に供される（プロセス１２）。前処理された核の画像４０４が作成される。
【００９６】
図２５は、ラッフル移行の解析のための方法に用いられる核セグメント化の二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング及びふるい分けのプロセスを図示するフローチャートである。４３７では、画像４０４が入力される。４３８では、画像４０４は、最も可能性の高い画素の値よりも暗い核画像の画素が、最も可能性の高い画素の値に設定されるプロセスに供される。画像４０５が出力される。４３９では、画像４０５はＯＨＢによって二値化されて（プロセス４）、画像４０６が出力される。４４０では、画像４０６は、ＳＲＧに供されて（プロセス５）、領域画像４０７が得られる。４４１では、領域画像４０７は、画像４０５で行なわれるＯＨＢの第二の繰り返し（プロセス４）のための画素を規定するためのマスクとして用いられる。二値画像４０８が出力されて、領域画像４０７よりも核境界線のさらに正確な定義が提供される。４４２では、画像４０８が形態学的リファイニングに供される（プロセス７）。画像４０９が出力される。４４３では、画像４０９は、ふるい分けされる（プロセス１３）。ふるい４４３は、最小の核サイズよりも小さいオブジェクト（このオブジェクトは除去されなければ核と混同される）を除く。二値の核画像４１０が出力される。
【００９７】
図２６は、ラッフル移行アッセイの解析に用いられる細胞質セグメント化手順の前処理段階を図示するフローチャートである。４４４において、細胞質画像４０１が入力される。４４５で、ラッフルのサイズ特徴付けの細部を強調するさらに有利な特性を有するバックグラウンド補正に画像４０１を供する（プロセス１２）。画像４１１が出力される。画像４１１は４４６で非線形拡散フィルタリング（プロセス３）に供される。好ましくは、フィルタリング４４６は、ＳＧＭＤ処理及びＡＥＥＤ処理の相互作用によって達成される。前処理されたラッフル画像４１２が得られる。
【００９８】
図２７は、ラッフル移行アッセイの解析のための方法において用いられるラッフルセグメント化の二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング及びふるい分けのプロセスを示すフローチャートである。４４７では、前処理されたラッフル画像４１２が入力される。４４８では、画像４１２は、最も可能性の高い画素の値よりも暗いラッフル画像の画素が、最も可能性の高い画素の値に設定されるプロセスに供される。画像４１３が出力される。４４９では、画像４１３はＯＨＢによって二値化されて（プロセス４）、画像４１４が出力される。４５０では、画像４１４は、ＳＲＧに供されて（プロセス５）、領域画像４１５が得られる。４５１では、領域画像４１５は、画像４１３で行なわれるＯＨＢの第二の繰り返し（プロセス４）のための画素を規定するためのマスクとして用いられる。二値画像４１６が出力されて、領域画像４１５よりもラッフルのさらに正確な定義が提供される。４５２では、画像４１６が形態学的リファイニングに供される（プロセス７）。画像４１７が出力される。４５３では、画像４１７は、サイズによってふるい分けされて（プロセス１３）、ラッフルと混同されるオブジェクトが除かれる。二値のラッフル画像４１８が出力される。
【００９９】
好ましくは、４５４で、二値核画像４１０が、二値ラッフル画像４１８から論理的に除外されて、リファイニングされた二値ラッフル画像４１９が得られるが、ここではラッフルは核にわたって局在できない。
【０１００】
図２８は、ラッフル移行アッセイの解析に用いられる数量化手順を図示するフローチャートである。４５５では、二値ラッフル画像４１８又はリファイニングされた二値ラッフル画像４１９が、細胞質画像４０１からのラッフル強度の算出のためのマスクとして機能する。好ましくは、４５６で、数量化は、局所コントラストによって達成される（プロセス８）。別の態様では、数量化は、ラッフルのサイズ及び近似に基づいた分布特徴解析４５７（プロセス９）を含んでいてもよい。
【０１０１】
本発明の方法で用いられる関数
この方法のアルゴリズム的工程は、通常用いられる細胞アッセイの特徴に最も適するように考案されている。この方法は、以下に記載されるライブラリーからの関数を組み込むことによって各々の特定のアッセイに構築される。本発明の方法において用いられる関数の一般的性質は以下に示すが、これらの関数のいずれも、画像における特徴を必要に応じて強調、選択、さもなければ影響するようにパラメーター化できるということが理解されるべきである。
【０１０２】
プロセス１）高強度ピークの非線形抑制
高い強度ピークから生じるアーチファクトは、特徴的なグレーレベルの統計上の所望されない変動を誘発し、適応閾値及び領域拡張の手順を混乱させ得る。ピーク抑制法は、ヒストグラム補正の公知の技術の変法である。本発明において実行される通り、このプロセスは、入力としてグレーレベル参照画像をとり、最高のグレーレベルを有する画素に非線形抑制を適用して、ダイナミックレンジの静止内の画素に対する変換を同定する。この出力画像は、さらに明るいオブジェクトを超える強度変動の減少を示すが、明るさの劣るオブジェクトを超える強度変動の低下は示さない。これは、下記のような引き続く画像処理の能力を改善するという点で利点を有する。
【０１０３】
プロセス２）適応ノイズ平滑化
適応ノイズ平滑化手順は、検出可能特徴を改善するのに有益であり得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他，１９９５に開示されるように、当業者に明白である）。本発明の好ましい態様において、優れた細部特徴を損なうことなく画像のシグナル対ノイズ比を増大する手順が用いられる。もとの画像及びガウシアン平滑化画像（それぞれ、Ｕ及びＵσ）を、式２．１に示されるようにあわせる：
【０１０４】
【数２】
2005525550.tif 000004
【０１０５】
式中、（Ｒ）は、得られた画像であり、Ｗ＝Ｗ（｜▽σＵ｜）は、もとの画像のガウシアン勾配｜▽σＵ｜のモジュラスに依存性の加重関数であり、σは、平滑化に用いられるガウシアン関数の標準偏差である。
【０１０６】
加重関数Ｗの使用は、得られた画像Ｒの画素が、高い勾配の大きさの領域におけるもとの画像Ｕの値に近く、かつ低い勾配の大きさを有する領域における平滑化された画像Ｕσの値に近い値を示すという利点を有する。低勾配の大きさの領域は、さらに大きい割合の画像ノイズを含む傾向であり、それによって相対的な振幅が低下する。
【０１０７】
適応ノイズ平滑化は、出力画像におけるノイズが、別個に取得された一組の画像を横切る画像から画像の同じ振幅を有するというさらに望ましい特性を有する。この利点は、ノイズのこの振幅均一性によって引き続くセグメント化手順演算がさらに一貫性にされるということである。
【０１０８】
プロセス３）非線形拡散フィルタリングによる適応ノイズ平滑化及び特徴強調
非線形拡散フィルタリング（ＮＤＦ）法は、画像フィルタリングのためのスケールスペース技術の仲間のうちの１つである。ＮＤＦ法（例えば、Ｗｅｉｃｋｅｒｔ  １９９７に開示される）は、有用であって、ここではノイズ（高周波数の空間的変調として規定される）が除去され、より低い空間的周波数をともなう特徴が保存されることが望ましい。
【０１０９】
本発明は、関連の画像特徴をそれらの形状及びサイズに依存性の様式で強調したままで、画像ノイズを除去するためにＮＤＦ法を適用する。画像は、非線形拡散演算子の反復性適用によって処理される。ＮＤＦ演算子の正確な性質は、所望の特徴的な特性に従って変化し、かかる演算子の一般的な型を式３．１として示す。
【０１１０】
【数３】
2005525550.tif 000005
【０１１１】
式中、Ｕ＝Ｕ（ｘ，ｙ）は、座標依存性の画像強度であり、
【０１１２】
【数４】
2005525550.tif 000006
【０１１３】
は、拡散率テンソル（成分ｂxx（n）、ｂxy（n）、ｂyx（n）、ｂyy（n）を用いる）であり、ｄｔは、「タイムステップ」パラメーターであり、これは画像展開の速度を制御する。添字の指数は、ＮＤＦプロセスの反復回数を示す。
【０１１４】
好ましい態様では、本発明は、Ｗｅｉｃｋｅｒｔ  １９９７に開示されるような、ＮＤＦについての３つの公知の方法のうちの１つ以上を組み込む。
【０１１５】
・スカラー「勾配係数」誘導拡散（ＳＧＭＤ）
・異方性エッジ強調拡散
・異方性コヒーレンス強調拡散
【０１１６】
入力画像は、グレースケール参照画像である。３．１は、ＳＧＭＤ、ＡＥＥＤ又はＡＣＥＤにおいて特定される通り拡散率テンソルとともに適用される。このプロセスは、何度も繰り返されてもよい。ＳＧＭＥ，ＡＥＥＤ又はＡＣＥＤの選択は、強調されるか又は抑制される特徴の形態学に基づいて行なわれる。
【０１１７】
好ましい態様では、ＳＧＭＤ及び／又はＡＥＥＤを、エッジ保存が重要である特徴とともに用いる。ＡＥＣＤをファイバー様の細部とともに用いる。ファイバーもエッジも両方の保存が必要である場合、３つ全ての方法を用いてもよい。
【０１１８】
隔離された強度ピークを保存しなければならない場合、本発明は、本発明者らが、スカラーピーク強調拡散（ＳＰＥＤ）と称しているさらなる変換を適用する。
【０１１９】
本発明のＳＰＥＤプロセスの利点は、ＮＤＦが隔離された強度ピークについて、例えば細胞の内側の顆粒物質と関連したピークについて最適化され得るということである。ＳＰＥＤ反復を実施するのにおいて、ＳＧＭＤ反復の出力は、ピーク形状のマスクでかき乱され、ここで、画素のグレーレベル値は、このマスク中心から指数関数的な距離で減少する。マスクのサイズは、強調されるべきピーク様画像細部の特徴的なサイズに適合するように予め設定される。この手順を、反復の数回の事前設定について反復して、ノイズを抑制したままで先鋭な強度ピークを強調する。
【０１２０】
プロセス４）最適のヒストグラム二分割による閾値化
好ましくは、本発明はセグメント化のための最適ヒストグラム二分割（ＯＨＢ）に当てはまる。これは、生物学的画像に存在する広範な動的範囲に適合するＯＨＢ法の特徴である。
【０１２１】
ＯＨＢ手順の入力は、上記の工程１〜３を用いて必要に応じて処理されたグレースケール画像である。この出力は二値画像であり、ここではセグメント化画素が目的の細胞特徴に相当する。
【０１２２】
種々のＯＨＢ法が公知であり（例えば、Ｐａｒｋｅｒ  １９９７，Ｐａｕｌｕｓ  １９９５）、ＯＨＢ法の１つ又は別の使用から生じる閾値選択においてはバイアスの可能性がある。従って、複数のＯＨＢ方法によって算出される幾つかの閾値の幾つかの特性（例えば、４つ全ての平均、昇順でソートされた中間の２つの値の平均、最小又は最大）を用いて閾値を算出することが本発明の利点である。この統計的閾値は、ＯＨＢ法のいずれか１つによって誘導されるバイアスを被る可能性は低い。
【０１２３】
好ましい態様において、４つのＯＨＢ法を用いて閾値を生成する。
【０１２４】
・二値化のためのエントロピー測定を最大化するグレーレベル値（Ｐａｕｌｕｓ  １９９５，２７８〜２８１頁）。
【０１２５】
・二値化のための平均平方離隔測定を最大化するグレーレベル値（Ｐａｕｌｕｓ  １９９５，２７８〜２８１頁）。
【０１２６】
・ファジー集合としてとった画像のＳｈａｎｎｏｎ測定を最小化するグレーレベル値（Ｐａｒｋｅｒ  １９９７，１２５頁）。
【０１２７】
・ファジー集合としてとった画像のＹａｇｅｒ測定を最小化するグレーレベル値（Ｐａｒｋｅｒ  １９９７，１２５頁）。
【０１２８】
プロセス５）シード化領域拡張
領域拡張に対する入力は、グレースケール参照画像及び二値画像であり、これは工程４に記載されるようなプロセスによる参照画像から作成される。参照画像における目的の特徴を示す二値画素がその参照画像におけるその特徴に正確に対応しないということが最初の二値画像の不利な点である。従って、最終の二値画像が参照画像においてより良好な特徴を示すことができるように領域拡張を用いる。シード化領域拡張法がそのシード画像として最初の二値画像を用いることは本発明の１態様である。次いで、整調可能な反復手順（例えば、Ｒｕｓｓ，１９９１、８７〜８９頁に記載されるものなど）を用いて領域に二値画像を加える。整調（チューニング）は、候補画素を選択するために、拡張するオブジェクト、その近傍及びバックグラウンドの統計的な特性を用いることであると規定され、この１実施形態は、式５．１に示される。統計的パラメーターは、反復して再算出され、その手順は目的の領域に対する画素の最適の割り当てが得られるまで続けられる。
【０１２９】
【数５】
2005525550.tif 000007
【０１３０】
式中、ＴNは、現在の反復のために用いた閾値であり、Ｍｅａｎ［Ｕ｜ＢN］及びＳｔｄ［Ｕ｜ＢN］は、二値画素のアンサンブルによって算出される平均及び標準偏差であり、Ｍｅａｎ［Ｕ｜ＢｃｋN］及びＳｔｄ［Ｕ｜ＢｃｋN］は、バックグラウンド画素のアンサンブルによって算出される平均及び標準偏差であり（すなわち、画素はオブジェクトＯNにも境界ＢNにも含まれない）、ｋB及びｋBckは、１に近い値で係数を制御している。
【０１３１】
領域拡張プロセスのＮ回の反復で、画素ＯNの拡張集合に隣接する（第一の反復で、Ｏ1は、シード画像と一致する）候補の境界画素ｐ（ｐ⊂ＢN）は、参照画像Ｕ上の対応するグレー値Ｕ（ｐ）がＴNの閾値を超える場合及び超える場合のみ、次の反復について画素ＯN＋1の拡張集合に含まれる。この閾値は、式Ｘの通り画像Ｕの全体的統計から算出される。
【０１３２】
この反復プロセスを、画素の拡張集合に隣接する候補画素がなくなるまで（Ｕ（ｐ）＞ＴNとして規定される）続ける。
【０１３３】
プロセス６）テクスチャ変換
未染色又は生きたまま染色された試料のセグメント化及び解析が可能であることが本発明の利点である。かかる試料は、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡、明視野顕微鏡又は他の非蛍光顕微鏡を用いて得られる。これらの方法は蛍光又は他の染色手順に耐えられない生存細胞を画像化するのに最も有用である。
【０１３４】
重要な態様では、本発明は特徴の検出可能性を増強するために、規定のテクスチャのタイプの強度波動を突き止める。このテクスチャ変換手順は、グレーレベル共起統計学に基づく（例えば、Ｐａｒｋｅｒ  １９９７，１５５頁に開示される通り）。これらの手順は、それらの入力としてグレーレベル参照画像をとり、それらの出力としてグレーレベル処理画像を作成し、ここでは適切なテクスチャの特徴は、他の特徴（が強調される）よりも明るい。次いで、この強調された特徴は、蛍光画像に用いられる手順と同様の手順を用いてセグメント化され得る。従って、同様のセグメント化手順のセットを用いて蛍光及び非蛍光物質を解析できるということがこのテクスチャ変換の重要な利点である。
【０１３５】
好ましい態様において、「エネルギー」テクスチャ変換（Ｐａｒｋｅｒ  １９９７，１６０頁に記載される）が用いられる。この変換は、試料の最小の形態学的スケール（ＭＭＳ）の値によってパラメーター化される。ＭＭＳは、意味のある画像細部の最小サイズとしてユーザーに規定される。
【０１３６】
テクスチャ変換は、セグメント化の前に非蛍光画像を強調するための好ましい方法であるが、他の変換が用いられ得ることが理解されるべきである。重要な態様は、出力画像における強度増大が参照画像における構造的な特徴的特性に依存する強調である。
【０１３７】
プロセス７）検出された特徴の形態学的リファイニング
特徴の境界における微細な突出、種々のサイズのホール又は他の不連続性は、セグメント化形状において所望されない変動を生じ得る。次に、これが数量化アルゴリズムの能力低下をもたらし得る。例えば、骨組み化アルゴリズムは、とがったオブジェクトの端では機能が劣る。形態学的平滑化及びサイズによるふるいわけ管理したホール充填を数量化の前に用いることが本発明の特徴である。ＭＭＳの値は、平滑化手順の閾値サイズとして働く。好ましい態様では、この手順は、ＭＭＳより小さいサイズの全ての画像細部を除き、これによって粗さを除く。
【０１３８】
プロセス８）局所コントラストによる数量化
概して、特徴は、周囲の細胞物質の強度に対するその強度によって規定される。特徴とその局所周囲との間の局所コントラストは、式８．１に規定される。
【０１３９】
【数６】
2005525550.tif 000008
【０１４０】
コントラスト値は、参照画像から、又は処理画像上で規定された位置から直接算出されて、参照画像に移されてもよい。
【０１４１】
プロセス９）分布特徴解析
幾つかの測定された特徴に基づく特徴の分布は、基礎にある生物学を反映し得る。通常は、基礎にある生物学を反映するために用いられる特徴サイズ又は強度の頻度ヒストグラムをみる。
【０１４２】
本発明は、細胞サンプルにおける変化の指標として混合された特徴分布を用いる。この特徴分布は、確率密度分布関数（ＰＤＤＦ）によってモデル化される。次いで、周波数分布がどうされるべきかという幾つかの予め決定されたモデルに対して仮説を試験する。単峰性の分布は、例えば細胞顆粒が単一の特徴サイズについて分布される場合に得られる。二峰性の分布は、より大きいか又は小さい顆粒の集団が出現する処理によって細胞顆粒がそのように変更される場合に生じる（ＮｏｒａｋのＴｒａｎｓｆｌｕｏｒアッセイと同様に）。この場合、観察されるＰＤＤＦが二峰性である程度に基づいて、特定の処理が有効である判定を行なってもよい。
【０１４３】
特徴χの二峰性分布という特定の場合に、混合ＰＤＤＦであるＰmix（χ）は、式９．１に示されるようなその２つの成分の別個のＰＤＤＦとして表される：
【０１４４】
【数７】
2005525550.tif 000009
【０１４５】
式中、部分的なＰＤＤＦであるＰ1（χ）、Ｐ2（χ）の両方とも有限な平均並びに分散μi及びσi（ｉ＝１，２）を有する。混合ＰＤＤＦの二峰性の提示（９．１）において、αは、二峰性モデルについての重みづけパラメーターである。２つの重みづけ係数α及び（１−α）は、混合ＰＤＤＦＰmix（χ）に対する、部分的ＰＤＤＦであるＰ1（χ）、Ｐ2（χ）の寄与の相対量を反映する。
【０１４６】
（９．１）に示される混合ＰＤＤＦの平均及び分散は、
【０１４７】
【数８】
2005525550.tif 000010
【０１４８】
であり、式中μmix及びσmixは、それぞれ混合サンプルの平均及び標準偏差である。重みづけパラメーターαの実験的推定値
【０１４９】
【数９】
2005525550.tif 000011
【０１５０】
は、９．３ａ及び９．３ｂに示されるように、式（９．２ａ）及び／又は（９．２ｂ）によってサンプルから算出され得る。
【０１５１】
【数１０】
2005525550.tif 000012
【０１５２】
式中、推定値
【０１５３】
【数１１】
2005525550.tif 000013
【０１５４】
は、部分的サンプル及び混合サンプルの平均及び標準偏差である。部分的サンプルを規定するために、混合サンプルを分けなければならない。これは、閾値二分割演算によって達成される。二分割閾値ｔは、任意の公知の方法（例えば、プロセス４のＯＨＢ方法）によって規定され得る。
【０１５５】
好ましい態様において、サンプルの分離は、式９．４において算出されるような２つの集団の平均の間の正規化された距離として表される。
【０１５６】
【数１２】
2005525550.tif 000014
【０１５７】
式中、ＳＳはサンプルセパレーションである。
【０１５８】
別の好ましい態様では、各々の部分分布が原因となる混合分布の割合は上記に示される通り
【０１５９】
【数１３】
2005525550.tif 000015
【０１６０】
である。
【０１６１】
ＳＳ及び
【０１６２】
【数１４】
2005525550.tif 000016
【０１６３】
は本発明の分布特徴解析のための好ましいパラメーターである。
【０１６４】
１０）顆粒細部の周波数領域検出
細胞本体内の顆粒構造（例えば、小胞）は、生物学を反映する方法でサイズ及び強度を増大又は減少させ得る。従って、顆粒構造解析が画像エネルギースペクトルを解析することによってなされ得ることが本発明の特徴である。エネルギースペクトルは、顆粒及び非顆粒特徴の両方を評価する解析表示によって記載される。
【０１６５】
エネルギースペクトルの一般式を式１０．１に示す。
【０１６６】
【数１５】
2005525550.tif 000017
【０１６７】
式中、Ｅ（ρ）はエネルギースペクトルであり、Ｆ（ρ，ψ）は、極座標で表されたもとの画像のフーリエ変換であり、＜…＞ψは角座標による平均を意味し、ρ及びψは、相応して、フーリエ空間における動径座標及び角座標である。
【０１６８】
公知の方法（例えば、Ｇｒａｎｌｕｎｄ他，１９９５）を用いて、顆粒をほぼ同じ幅の一組の散乱強度ピークとして処理する。好ましい態様では、顆粒の強度プロフィールは、ガウシアン関数によってモデル化される（式１０．２）。
【０１６９】
【数１６】
2005525550.tif 000018
【０１７０】
式中、ａは、顆粒の有効平均半径であり、
【０１７１】
【数１７】
2005525550.tif 000019
【０１７２】
は、顆粒の位置である。ｆ（ａ）は、顆粒の明るさがそのサイズに関する比例乗数である（ｆ（ａ）〜ａ3）。明るい顆粒（例えば蛍光）を用いれば、比例乗数ｆ（ａ）はサイズ測定を改善する。なぜなら顆粒の明るさはその容積に比例するからである。
【０１７３】
同じサイズの顆粒のエネルギースペクトルは、ガウシアン関数のフーリエ変換の係数の二乗として規定される（式１０．３）：
【０１７４】
【数１８】
2005525550.tif 000020
【０１７５】
非顆粒特徴によって式１０．４に示されるようなエネルギースペクトルにおける累乗項が得られることが公知である（Ｇｒａｎｌｕｎｄ他，１９９５）：
【０１７６】
【数１９】
2005525550.tif 000021
【０１７７】
従って、エネルギースペクトルのためのモデル式（式，１０．５）を、２つの主な成分（非顆粒及び顆粒）の寄与の加重和の式でとる：
【０１７８】
【数２０】
2005525550.tif 000022
【０１７９】
式中、Ａ1，Ａ2は０より大きい。
【０１８０】
生物学的条件の間の識別は、パワースペクトルの顆粒成分の寄与を反映する、２つのフィットしたパラメーター（式１０．５から得られる）であるａ（平均顆粒半径の見積もり）及び比（Ａ2／Ａ1）に基づいて行なわれる。
【０１８１】
この解析は、エネルギースペクトル構築、続いて数量化を通じて進行する。
【０１８２】
エネルギースペクトル構築
顆粒のフーリエスペクトルを公知の方法（Ｐｒｅｓｓ  １９９２，６８９頁に記載される通り）によって作成する。次いで、このスペクトルをフーリエ空間における角座標及び半径距離の打ち切りによる平均後に別個の一次元周波数依存に対して減らす。この手順は、半径距離ρj（ｊ＝１，．．．Ｎρ）の値の別個の組について規定された変換（１０．１）を行なう、ここでＮρは、半径距離の別個の値の数である。この演算の結果として、平均スペクトル強度＜Ｅ＞jを、ρjの各々の値について算出し、スペクトルの別個の表示が得られる｛ρj，＜Ｅ＞j｝。
【０１８３】
数量化（スペクトルフィッティング）
非線形フィッティングの公知の方法（Ｐｒｅｓｓ  １９９２，６８３頁，４０８頁）を用いて、エネルギースペクトルから３つのフィッティングパラメーターを得る−ａ（顆粒の有効平均半径）並びにモデル式（１０．５）からの振幅Ａ2及びＡ1。好ましい態様において、ａの値及び比（Ａ2／Ａ1）を画像数量化のために用いる。
【０１８４】
１１）境界マッピング
境界マッピングは、セグメント化画像で幾何学的解析を行なうために用いられる手順である。本発明は、神経突起起源周囲の幾何学的領域を突き止めるために境界マッピングを用いる（図１０）。最も代表的には、各々の細胞は、境界マッピングプロセスによって出力された、その周囲の境界設定領域を有する。
【０１８５】
境界マッピングの１つの態様として、セグメント化神経突起（下記のプロセスからの出力として）を骨組みにする（例えば、Ｒｕｓｓ  １９９１，４８３〜４８５頁に開示されたように）。この骨組み化された画像において、対応する細胞画像における神経突起、神経突起終端、神経突起分岐点、及び各々の神経突起についての起源の細胞（付着点）を見出すことができる。
・二値骨格の画素は、その３×３近傍において２つを超える非ゼロ画素が存在する場合、及びその場合のみ分岐点であると考えられる。
・二値骨格の画素は、その３×３近傍において１つだけ非ゼロ画素が存在する場合、及びその場合のみ終点であると考えられる。
・二値骨格の画素は、それが終点であり、細胞に対して近傍である場合、その細胞に対する神経突起の付着点であると想定される。
・神経突起は、その神経突起が、対応する細胞テセレーション処理画像にける細胞の境界設定領域内に存在する場合に、特定の細胞本体に起源すると考えられる。
【０１８６】
境界マッピングの第二の態様として、細胞テセレーション処理画像を作成する。テセレーションは、シードとして働く任意のセグメント化標的の無条件の領域拡張又は二値拡張の結果である（Ｐａｒｋｅｒ  １９９７，６９頁）。この場合、標的は最も代表的には細胞本体である。
【０１８７】
従って、境界マッピングは２つの入力画像を有する。セグメント化神経突起画像は骨格化に入力される。セグメント化細胞画像はテセレーションに入力される。骨格化神経突起画像及びテセレーション処理細胞画像は、中間出力である。最終出力は、骨格化された画像からとった神経突起幾何学の測定値であり、テセレーション処理細胞画像からとった特定の細胞に対する神経突起起源の局在化である。
【０１８８】
１２）バックグラウンド補正
バックグラウンド補正は、照射又はもとの画像からの発光強度における空間不均一性を除去する。好ましい方法は、試料の細部が存在しないが低周波数バックグラウンド成分が存在している、高度に平滑化された画像を作製するために画像を処理することである。この高度に平滑化された画像は、もとの画像から差引きされるか、又はもとの画像に分割される。
【０１８９】
画像を平滑化するための種々の手順は当業者に明白である。例えば、ガウシアン平滑化、グレースケール開放、ペアワイズフィルタリング（開放後閉鎖又は閉鎖後開放）、又は可変縦続フィルタリング（Ｊａｈｎｅ  １９９９，６２７〜６８０頁）は、全てこのタイプの演算において用いられている。
【０１９０】
平滑化演算又はバックグラウンド補正の他の方法はまた、さらに大きい特徴を重視しないままで、所定のサイズの特徴を最適に選択するためにも用いることができるということが理解されるべきである。
【０１９１】
１３）ふるい分け
ふるい分けは、二値画像をフィルタリングして、目的の特徴に相当しない形状を有する、セグメント化標的を除去するプロセスである。例えば、画像は、サイズによってふるい分けされて、特定のサイズ範囲内におさまる特徴のみがふるい分けされた画像に残る。多くの他のタイプのふるいは、特徴の幾何的な特性に依存する。例えば、画像は、形状の記述子によってふるい分けされ得る（Ｒｕｓｓ  １９９９，５５３〜５５５に開示のように）。本発明の特徴は、ふるい分けが単一の規準（例えば、サイズ）又は複数の規準を用いて適用されるということである。複数規準のふるいの例としては、本発明の方法は、異なる規準（例えば、第一の画像では円形、第二では細長い）に従って２つの画像をふるい分け、次いでさらなるふるい分け工程を行う。２つ組のふるい分けでは、別の規準（例えば、丸いオブジェクトに近い細長いオブジェクト）を満たす特徴のみが保持される。
【０１９２】
神経突起アッセイのための方法
神経突起物質は構造的に複雑であり、画像は多くの潜在的に混同される特徴を含む。蛍光標識された試料及び未標識の試料を含む、広範な種々の試料内の神経突起の自動的かつ正確な検出を行なうことが本発明の特徴である。
【０１９３】
１つの態様では、この方法は、未染色の画像における引き続くセグメント化を改善するためにエネルギーテクスチャ変換を用いる。
【０１９４】
別の態様では、この方法は、非線形の拡散フィルタリング、最適のヒストグラム二分割、シード化領域拡張、ふるい分け、及び形態学的画像リファイニングのプロセスを使用することによって神経突起及び細胞本体の検出能を改善する。
【０１９５】
別の態様では、この方法は、テセレーション手順を用いて細胞本体についての影響のゾーンを境界設定する。これらのゾーンから、神経突起構造は、その起源の細胞本体に関連し得る。広範な種々の神経突起構造を同定して、起源の細胞本体に関連付けることができることが本発明の特徴である。
【０１９６】
神経突起解析のための詳細な手順は、図３〜１０に最もよく示される。
【０１９７】
顆粒移行アッセイのための方法
本発明は、Ｎｏｒａｋ  Ｉｎｃ．のＴｒａｎｓｆｌｕｏｒアッセイのような核移行アッセイにおいて共通して観察された顆粒物質の解析を行なう。これらのアッセイでは、予め決定されたサイズの細胞質顆粒は、セグメント化されかつ解析されなければならず、一方では、細胞質の外側の顆粒のアーチファクトは、無視されなければならない。弱く標識された細胞質の物質（次に、この中には顆粒が局在し得る）でさえ検出することが本発明の方法の特徴である。
【０１９８】
１つの態様では、この方法は、高強度ピークの非線形抑制、非線形拡散フィルタリング又は適応ノイズ平滑化、最適のヒストグラム二分割、シード化領域拡張、及び形態学的画像リファイニングのプロセスを使用することによって、顆粒及び細胞質の検出能を改善する。
【０１９９】
好ましい態様では、本発明は、顆粒強度又は幾何的特性における変更を報告するために分布的特徴解析を用いる。
【０２００】
顆粒移行アッセイのための手順の詳細を図１１〜１７に示す。
【０２０１】
核移行アッセイのための方法
核移行は、核及び細胞質に含まれる蛍光標識の相対的強度における変化によって通常数量化される。代表的には、２つの画像が得られる。１つの画像は、幾何的な位置づけ補助として、及び／又は生存度もしくは他の細胞機能態様を示すために、核を最もよく示す。第二の画像は細胞質を最もよく示し、ここでは目的の標識分子の局所濃度に相当する蛍光強度を伴う。
【０２０２】
本発明の１つの態様では、測定を行なうための核及び細胞質の領域を最もよく示すように、処理された細胞画像から移行が数量化される。好ましくは、核を示すための処理としては、高強度ピークの非線形抑制、非線形拡散フィルタリングによるノイズ抑制、バックグラウンド補正、最適のヒストグラム二分割、及び形態学的リファイニングが挙げられる。好ましくは、細胞質を示すための処理としては、高強度ピークの非線形抑制、適応ノイズ平滑化又は非線形拡散フィルタリングによるノイズ抑制、バックグラウンド補正、最適のヒストグラム二分割、及び形態学的リファイニングが挙げられる。
【０２０３】
１つの態様では、分布的特徴解析は、移行を数量化するために用いられ得る。この場合、さらに暗いさらに明るい核及び／又は細胞質の相対的な寄与が核又は細胞質の強度ヒストグラムの二峰性の性質から識別され得る。
【０２０４】
強度数量化プロセスから算出された任意の強度パラメーターを分布解析に供してもよい。例えば、核−細胞質比、核強度、及び細胞質強度は全て用いることができる。
【０２０５】
核移行アッセイの解析のための方法を図１８〜２３に示す。
【０２０６】
メンブレンラッフリングアッセイのための方法
幾つかの移行事象を細胞質の非断続領域内の標識の限局された分布によって特徴付ける。この分布は、形態学的に別個であるか又は隆線形の生成物であって、ここでは「ラッフル（ｒｕｆｆｌｅｓ）」と呼ばれる。ラッフルは、特定の断面サイズの強度識別特徴として規定される。この方法は、核移行アッセイのために用いた方法と同様であり、ラッフルオブジェクトをさらによく検出するための詳細なリファイニングをともなう。メンブレンラッフルの自動的な識別を提供する方法に組み入れられることが本発明の関数の特徴である（図２４〜２８）。
【０２０７】
本発明の好ましい実施形態は、例示的な目的のために開示されているが、当業者は、多くの付加、改変及び置換が本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく可能であるということを理解する。
【０２０８】
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【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】本発明のシステムの光学的、機械的及び電気的構成要素を図示する模式的なブロック図である；
【図２】高速オートフォーカスデバイスを図示する模式的なブロック図である。
【図３】神経突起解析のための一般的手順を示すフローチャートである。
【図４】自動的な神経突起解析のための方法において用いられる画像前処理手順を示すフローチャートである。
【図５】図５ａは、未染色の細胞画像を、微分干渉コントラスト顕微鏡を用いた画像として示しており、画像処理手順のエネルギーテクスチャ変換によって図５ｂの画像が得られ、ここでは、神経突起が強調され、自動的なシステムによってさらに容易に検出される。
【図６】神経突起解析方法の二値化手順を図示するフローチャートである。
【図７】図７ａは、もとの画像（蛍光顕微鏡を用いて得られた）を示しており、図７ｂは、神経突起の二値画像を示し、ここでは、神経突起及び細胞本体の両方が、本発明の二値化手順によって、正確にかつ自動的に二値化されている。
【図８】本発明の方法の細胞及び神経突起分類手順を図示するフローチャートである。
【図９】本発明の境界マッピング手順を図示するフローチャートである。
【図１０】特定の神経突起及びもとの細胞のその幾何的特性を突き止めるための自動的切りわけマッピング手順の間、その中に神経突起及び神経突起形状の細部が割り当てられている影響のゾーンを図示している。
【図１１】左側には、顆粒移行アッセイの解析の顆粒セグメント化のためのフローチャートを示す。右側には、顆粒移行アッセイの解析の細胞質セグメント化のためのフローチャートを示す。
【図１２】顆粒移行アッセイの解析のための方法の細胞本体セグメント化の画像処理を図示するフローチャートである。
【図１３】顆粒移行アッセイの解析のための方法の細胞本体セグメント化の二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング及びふるい分け手順を示すフローチャートである。
【図１４】顆粒移行アッセイの解析のための方法の顆粒セグメント化手順を示すフローチャートである。
【図１５】顆粒移行アッセイの解析のための方法の数量化手順を図示するフローチャートである。
【図１６】数量化の周波数領域解析方法からのデータを図示しており、これは処理された細胞における顆粒の変化の周波数領域識別が、顆粒物質の測定領域のような他の方法の実行可能な代替法であることを実証する。
【図１７】核移行の解析のためのプロセスを実証するフローチャートである。
【図１８】核移行アッセイの解析に用いられる核セグメント化の前処理段階を図示するフローチャートである。
【図１９】核移行の解析のための方法の核セグメント化の二値化、シード化領域拡張、及び形態学的リファイニングプロセスを図示するフローチャートである。
【図２０】核移行アッセイの解析に用いられる細胞質セグメント化の前処理を図示するフローチャートである。
【図２１】核移行アッセイの解析のための方法において用いられる細胞質セグメント化の二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング及びふるい分け手順を示すフローチャートである。
【図２２】核移行アッセイの解析に用いられる数量化手順を図示するフローチャートである。
【図２３】ラッフル移行の解析を図示するフローチャートである。
【図２４】ラッフル移行アッセイの解析のための方法において用いられる核セグメント化の前処理段階を図示するフローチャートである。
【図２５】ラッフル移行の解析のための方法において用いられる核セグメント化の二値化、シード化領域拡張、及び形態学的リファイニング、及びふるい分けのプロセスを図示するフローチャートである。
【図２６】ラッフル移行アッセイの解析に用いられる細胞質セグメント化の前処理段階を図示するフローチャートである。
【図２７】ラッフル移行アッセイの解析のための方法において用いられるラッフルセグメント化の二値化、シード化領域拡張、形態学的リファイニング及びふるい分けのプロセスを図示するフローチャートである。
【図２８】ラッフル移行アッセイの解析に用いられる数量化手順を図示するフローチャートである。
【図２】
2005525550.tif 000023
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2005525550.tif 000047
【図１】
2005525550.tif 000048
【図５】
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【図７】
2005525550.tif 000050
【国際調査報告】
2005525550.tif 000051
2005525550.tif 000052
2005525550.tif 000053