(57)【要約】本発明は、試料の画像を作り出すために、画像処理ソフトウェアに接続された２ｋ×２ｋ画素領域のスロースキャンの冷却型電荷結合素子カメラを装備した透過型電子顕微鏡に関する。サンプル中の金粒子の区分けが、試料構造および背景ノイズからの分離によって達成される。粒子タイプの識別と分類が、検出された粒子または粒子対の形状とサイズに従って実行され、最後に、金粒子の分布が、画像内における数の表示とともに、擬似色彩をオーバーレイした画像の生成によって可視化される。
2005534912.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料分析において複数の粒子を多重標識して検出および評価するための方法であって、
ｉ）少なくとも１つの画像を単一の色調で収集する工程と、
ｉｉ）色の閾値を使用して前記複数の粒子を分離する工程と、
ｉｉｉ）前記複数の粒子を１つまたは複数の粒子タイプに識別して分類し、粒子を多様なクラスに分ける工程と、
ｉｖ）前記複数の粒子の位置を可視化する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
スロースキャンの冷却型電荷結合素子カメラによってコントラストのある画像を収集する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記画像が少なくとも１４ビットの画像である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の粒子の前記分離が、内在の背景画像を参照して実行される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の粒子の前記分離が試料の構造を参照して実行される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数の粒子タイプの前記識別と分類が前記粒子タイプの形状によって行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数の粒子タイプの前記識別と分類が前記粒子タイプのサイズによって行われる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記画像が少なくとも１６ビットを使用して処理される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記画像が複数の画像のモンタージュ写真である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の粒子の前記位置の前記可視化が前記複数の粒子の擬似着色によって実行される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
粒子クラス毎に異なる擬似色彩が使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
オーバーレイ画像の作成工程をさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
粒子の分析のための装置であって
・粒子を備えた試料の単色画像を捕捉するための画像捕捉装置と、
・画像強調装置と、
・画像識別分類装置と、
・粒子を備えた前記試料を可視化するための表示装置と、
を有する装置。
【請求項１４】
前記画像捕捉装置が電子顕微鏡に接続されたカメラである、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記カメラがスロースキャンの電荷結合素子である、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記画像識別分類装置が前記粒子のサイズに基づいて前記粒子を分類する、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記画像識別分類装置が前記粒子の形状に基づいて前記粒子を分類する、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１８】
前記表示装置が擬似色彩で前記粒子を可視化する、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡の使用者が生物学的および医学的顕微鏡試料内の粒子の分布を自動的に検出および定量化することを可能にする装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の抗体−抗原複合体の場所を可視化しかつ識別するために、研究者は公知の方法を使用している。
【０００３】
光学顕微鏡で作業をするとき、抗体を蛍光マーカーと結合させ、正しく照明をして、所望の複合体の位置を明らかにすることが可能である。残念なことに、抗体−抗原複合体が位置する場所の詳細な識別を可能にするには光学顕微鏡の最大解像度は充分ではない。
【０００４】
さらに多くの情報を得るために、研究者は最大で数ナノメートル（１０−９ｍ）のサイズまで詳細に画像を明らかにすることが可能な電子顕微鏡（ＥＭ）を使用する必要がある。しかしながら、電子顕微鏡はカラー画像を提示することが不可能であり、なぜならばそれらはフォトンではなく電子を使用するからである。それゆえに、抗体−抗原複合体を可視化するために、研究者は光学顕微鏡で使用される蛍光マーカーを高電子密度の粒子で置き換えなければならない。最も一般的に使用されるそのような高電子密度粒子は金粒子である。しかしながら、ＥＭで高電子密度の粒子を使用し、かつグレー・スケールの画像を観察することを必要とするという事実は、金粒子のコントラストが背景構造のそれに極めて近いことが理由で問題になる。言い換えると、人間の眼にとってしばしば殆ど同じグレー・スケール値を呈する背景と金粒子とを識別することは極めて困難である。
【０００５】
多重標識を観察しようとするとき、この問題はなおさら複雑化される。光学顕微鏡では、異なる色彩を示す蛍光マーカーを使用して多様な抗体−抗原複合体を識別することは容易である。同じ画像内で、蛍光マーカーのいくつかの位置を極めて明確に見ることが可能である。電子顕微鏡画像の中でこれを為すことは容易ではない。金粒子で作業するとき、研究者は多様な粒子サイズを使用する可能性がある。小さい粒子がクラスタを形成し、それが電子顕微鏡の操作者の人間によって大きな粒子と混同されかねないということがしばしば生じる。マーカーを使用する目的の１つは多重標識実験の中でそのような成分の数と位置を比較評価することであるので、粒子の間違った識別または識別の欠如は完全に間違った結論につながるであろう。さらなる複雑化は、例えば直径３、６、１０ｎｍといった極めて小さい粒子を見るためには、さらに高い倍率を使用することが必要となり、顕微鏡の視野がサンプルの極めて小さい領域に限定されることによって進行する。
【０００６】
このような訳で、広い視野にわたって粒子の正確な識別を可能にし得る新たな方法および技術を研究者は探している。この可能性はスロースキャンの冷却型電荷結合素子（ＣＣＤ）といった高品質デジタル・カメラの開発で現実となった。これら新型のデジタル・カメラを使用すれば、顕微鏡画像を詳細に見ること、および以前は観察不可能であった極めてわずかのコントラストの差異でも識別することが可能である。デジタル顕微鏡の開発は制御された視野の移動および方向付けされた方式での画像配列の収集を可能にする。これらの画像の配列は、画像モンタージュの作成を可能とし、これによって拡大された視野と高い解像度が同時に提供される。
【０００７】
以前の試みは、電子顕微鏡で自動化された金粒子の検出の方法を確立するために為されてきた。開発された先行技術のツールは、それらが信頼性に欠け、多数の場所を特定をすることが不可能であったためか、失敗に終わっていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、高速かつ信頼性のある粒子検出、計数、および擬似色彩のオーバーレイのための装置および方法を研究者に提供することが本発明の目的である。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、３／１０ｎｍ、６／１５ｎｍおよび１０／２５ｎｍからなる金粒子の対の一重および二重のいずれの抗原検出にも適した多目的モジュールを提供することであり、それにより、すべての対の小さい方の粒子タイプを単一粒子および粒子のクラスタの両方として識別できるようにすることにある。
【００１０】
本発明のまたさらなる目的は、画像をモンタージュとして提供し、視野の広い画像において粒子の分析を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は二重金標識および広範囲視野画像のための方法および装置を開示する。図１はＰｒｏｓｃａｎの２ｋ×２ｋ画素アレイのスロースキャン式冷却型電荷結合素子カメラ（Ｐｒｏｓｃａｎ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｓｃｈｅ  Ｓｙｓｔｅｍｅ，Ｓｃｈｅｕｒｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙによって供給されるＳＣＣ−ＣＣＤカメラであって、図１では「ＳＳＣ−カメラ」と略されている）を備えた電子顕微鏡ＬＥＯ  ＥＭ９１２  Ｏｍｅｇａ（ＬＥＯ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を示している。この電子顕微鏡は本発明によって処理される画像を得るために使用される。本発明のモジュールはＰＣ（５１２ＭＢ  ＲＡＭを備えたＰｅｎｔｉｕｍ  ＩＩＩ）上のａｎａｌｙｓｉｓ  ３．１  ＰＲＯソフトウェア（ＳＩＳ−Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に組み込まれた。この画像化機器の使用により、画像は試料の領域を広い視野で描出されるように配列され、高い解像度と高いダイナミック・レンジの画像を得ることが可能になる。画像収集および広い視野の画像の形成の後に、使用者によって制御される金粒子の区分け、およびその結果生じる他の試料構造からの分離が行なわれた。それに続く画像の２値化、粒子タイプの識別および分類は、本発明に従って本発明のモジュールによる形状とサイズの比較を通じて達成される。その後、擬似色彩が各々の粒子グループまたはサイズのクラスへと割り当てられた。
【００１２】
ここに記載した方法はいくつかの利点を示した。ＳＳＣ  ＣＣＤ画像の高いダイナミック・レンジはコントラストに関係なく背景からの金粒子の信頼性のある分離を可能にする。形状とサイズのパラメータによる検出、および多様な金粒子対に関する評価は本発明を使用すると可能である。高倍率画像の多数の画像を配列した後の広視野フレームの採用により、使用者は鳥瞰的な粒子分布を選択して表示することができるようになる。最後に、分類用モジュールは単一またはクラスタ形成しているかどちらかである粒子の識別を可能にする。「クラスタ形成」とは、複数の単一粒子が極めて近接して会合または凝集していることを意味する。これにより、研究過程の中、高速で信頼性のある粒子検出および結果の評価がもたらされる。粒子分布の評価は関心領域（ＲＯＩ）の選択によって実施できる。さらに、広視野画像内の粒子対の可視化および評価がおこなえる。最後に、追加的な高倍率化処理を必要とせず、高い空間解像度での免疫細胞化学的試料の完全細胞および組織領域の分析が可能となる。
【００１３】
異なるサイズの金粒子または金粒子対はマイクロチップ製造会社がナノワイヤを作製する努力をするために極めて興味深いので、本発明はその分野の用途に対して有用な可能性がある。免疫細胞化学にさらに近い分野では、現在ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、抗体適用によって仲介される抗原の検出、あるいは高速スクリーニングのためのマイクロアレイ（および金粒子の適用）に従事している研究者は同様に本方法を使用することが可能である。概して、本発明による方法は、特定のコントラストおよび規定のサイズの構造を、当該ターゲット構造と部分的に同等なコントラストを示す異種の背景から識別するための助けとなる。本発明は既に存在するソフトウェア・パッケージにアドオン方式で導入することが可能である。結果として、利用可能なソフトウェアを完全に変更する必要はなく、本発明によるモジュールを含むように拡張するだけでよい。
【００１４】
以下、顕微鏡観察のためのサンプルの調製について、図２および３を参照しながら説明する。
【００１５】
顕微鏡用切片の調製
３６時間増殖させた細胞を遠心分離（１５００ｒｐｍ／１０ｍｉｎ）し、０．１％グルタルアルデヒド（５０％溶液、１級、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、４％パラホルムアルデヒド、４％スクロース、０．１％ピクリン酸、５ｍＭ塩化カルシウムを含有するＰＥＭバッファ（０．１Ｍのピペス、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、ｐＨ６．８（Ｏｇｂａｄｏｙｉら、２０００年））溶液を用い、ペレットを洗浄せずに室温で２時間（または、別法として４℃で一晩）直接固定した。ＰＥＭバッファで洗浄した後、エタノール濃度を３０％から１００％に上げることで細胞を脱水し、親水性樹脂ＬＲ−Ｗｈｉｔｅ（ハードグレード、Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、流通元Ｐｌａｎｏ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に包埋した。ＬＲ−Ｗｈｉｔｅブロックの重合を４℃にて４８時間、ＵＶ光照射下で実施した。Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｅ（Ｌｅｉｃａ，Ｍｉｋｒｏｓｙｓｔｅｍｅ，Ｂｅｎｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）超ミクロトームを使用して切片を作製し（工程３００、３１０）、ニッケル・グリッド上に集めた（工程２１０）。
【００１６】
免疫学的局在決定に使用した抗体は商業関係者から入手可能である。一次抗体は蛍光顕微鏡で検査した。これらは、１：１０００に希釈して用いたマウス由来のモノクローナル抗ａ−チューブリン、クローンＢ５．１．２、ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎｏ．Ｔ５１６８）、および１：１００に希釈して用いたマウスの抗アクチン、クローンＪＬＡ２０、ＩｇＭ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ，Ｎｏ．ＣＰ０１）であった。金結合二次抗体は、各種粒子サイズ（このケースでは６および１５ｎｍ）を備えたＡｕｒｉｏｎ（流通元Ｂｉｏｔｒｅｎｄ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のヤギの抗マウスＩｇＧ（６ｎｍ）およびヤギの抗マウスＩｇＭ（１５ｎｍ）であり、両方共に１：４０に希釈して用いた。１０ｎｍ／２５ｎｍの実験については、以下の複合体、すなわちヤギの抗マウスＩｇＧ／金２５ｎｍおよびヤギの抗マウスＩｇＭ／１０ｎｍ（１：４０に希釈）を用いた。免疫学的局在決定は供給元（Ａｕｒｉｏｎ）の指示に従っていくつかの改造を伴なって為された。簡単に述べると、切片３１０をＰＢＳ中の５０ｍＭのグリシンで１５分間インキュベートし、非特異的結合は５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋１％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中で３０分間のインキュベートすることにより阻止した。切片３１０を、ＢＳＡ−ｃバッファ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、ｐ０：１％ＢＳＡ−ｃ、Ａｕｒｉｏｎ、流通元Ｂｉｏｔｒｅｎｄ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で３回洗浄した後、３２０に見られ得るように、一次抗体（２つの抗体の混合物を含む）中で室温にて１〜２時間インキュベートした（工程２２０）。その後、切片３２０をＢＳＡ−ｃで洗浄し（３〜１０分）、３３０に見られ得るように二次抗体（やはり両方の金結合粒子の混合物、室温）で１時間インキュベートした（工程２３０）。このインキュベーションの後、切片３３０をＢＳＡ−ｃバッファで十分に洗浄した。切片（工程３３０）を酢酸ウラニルの水溶液（５％）で１０分間コントラストを付し、その後、グリッドを蒸留水中に浸漬することによって洗浄した。クエン酸鉛の使用は省略した。
【００１７】
その後、Ｐｒｏｓｃａｎのスロースキャンの冷却型電荷結合素子カメラ（ＳＣＣ−ＣＣＤカメラ）を備えた電子顕微鏡３４０を使用してサンプルを画像化した（工程２４０）。工程２５０で、画像収集および広視野画像の生成を実行した。使用者制御による金粒子の区分け３６０、およびその結果としての他の試料構造からの分離を実施した（工程２６０）。画像２値化（工程２６０）の後、粒子タイプの識別および分類３７０を、本発明による形状とサイズの比較を通じて達成する（工程２７０）。その後、擬似色彩を各々の粒子グループまたはサイズのクラスへと割り当て（工程２８０）、オーバーレイ３８０として加えた。
【００１８】
本発明を実施するために使用するソフトウェアは、手順の中で前の工程がいったん完了されると自動的に別のウィンドウが開くように設計されている。以下、画像処理についてさらに詳述する。
【００１９】
画像を入手した後、電子顕微鏡の操作者は関心領域を選択する。
【００２０】
選択された関心領域の保存画像内の画像の不完全性、例えば斑のある背景は、前に保存された背景画像から元の画像を減算することによって修正する。この減算機能は２つの異なる基準画像、すなわち利得画像とオフセット画像を使用する。減算はフレーム毎に実行される。この機能は３．１ＰＲＯソフトウェア・パッケージの中に見出される。
【００２１】
その後、コントラストを向上させる工程を実行する。これは、元の画像のコントラストと輝度がデジタルで高められることを確実化するために為される。保存される画像はコントラストのヒストグラムを使用し、これが「引き延ばされる（stretched）」。この機能は３．１ＰＲＯソフトウェア・パッケージ内で利用可能である。
【００２２】
ここで操作者は関心対象物（すなわち金粒子）を表わすグレー・スケールの範囲を対話形式で識別することが可能となり、それらを他の背景構造から分離する。入力される画像は２１４（１４ビット）のグレー・スケールを表わす。操作者は、どのグレー・スケールが金粒子のコントラストを表わすかをコンピュータに教えなければならない。これを行なうために、ヒストグラムの下側および上側の閾値を調節してコントラスト・ウィンドウを得ることが必要である。コントラスト・ウィンドウを使用することで、操作者はどの範囲のグレー・スケール値に金粒子が含まれるかをコンピュータに教えることができる。閾値ウィンドウは、画像のグレー・スケール値すべて、および金粒子を識別するために操作者が選択したコントラスト・ウィンドウを限定する上側と下側のグレー・スケール値の閾値を表わす２本の縦線を備えたヒストグラムを表わす。
【００２３】
操作者によって実行されるコントラスト・ウィンドウの規定の変更を追尾することはコンピュータ画面上で可能である。コンピュータはコンピュータ画面上に表示される２値画像を作成し、そこでは閾値の間のコントラスト値を有する関心対象物（金粒子）は白色の値を割り当てられ、背景または他の非関心対象物（すなわち金粒子以外）は黒色の値を割り当てられるであろう。
【００２４】
こうして、元の画像は２つの部分、すなわち結果の画像で白色に見える関心対象物、および黒色に見える背景と他の対象物へと区分けされる。操作者は、コントラスト・ウィンドウを移動させること、および選択された閾値に応じて白色で現れるかまたは消滅する画像内のターゲット構造を眺めることが可能である。ターゲット構造（金粒子）だけが白色ドットとして視認可能となるようにウィンドウが設定されると、区分けが完了され、それに続く工程が実行された。この区分けは、金粒子の検出と計数の信頼性のある評価を確実化するために必要である。区分け工程はａｎａｌｙｓｉｓ３．１ＰＲＯソフトウェア・パッケージ（ＳＩＳ−Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供され、図３のブロック３６０として示されている。
【００２５】
ここで粒子の形状が規定される。これは粒子の最小測定直径に対する最大測定直径の比に関する以下の定義を使用して為される。
球体＝最大直径／最小直径≧０．７
クラスタ＝最大直径／最小直径＜０．７
【００２６】
この段階で、コンピュータは粒子の形状を分析することになる。金粒子は普通、実質的に球に近い形状で生産され、単独の金粒子は最小直径に対する最大直径の比で約１を呈することになる。粒子のクラスタは不規則な形状を示すことになる。
【００２７】
その後、粒子のサイズを識別する工程が実行される。これについては、６および１５ｎｍの粒子対を用いて行った例を参照して説明する。
【００２８】
本方法によって金粒子として識別されるべき粒子の表面積を規定しなければならない。本発明に先行して実行された測定に従い、この例に関して粒子の断面積の境界は、
小さい粒子（６ｎｍ）：１０ｎｍ２＜面積＜６０ｎｍ２
大きい粒子（１５ｎｍ）：４０ｎｍ２＜面積＜９０ｎｍ２
に設定することとした。
【００２９】
表１は、この例のために開発された粒子分類のスキームを示す。
【００３０】
【表１】
2005534912.tif 000003
【００３１】
単一粒子または６ｎｍ直径の標本は１０から６０ｎｍ２の範囲の断面積を有し得たので、クラスの範囲は４０ｎｍ２で開始して各々の異なるクラスに５０ｎｍ２の増分を使用して定められた。もしも特定の対象物が４５ｎｍ２の面積を示せば、それは１つの単一粒子、または２つの小さい単一粒子のクラスタである可能性がある。本方法は形状に基づいて対象物を正確に識別することになる。
【００３２】
これらの分類は、実際には粒子は割り当てられた直径に近いサイズの範囲で生産されるが、しかし表１に規定されて示されるように差異を備えているので必要とされる。粒子の全範囲は表１に規定されたこの分類によってグループ分けされる。この分類は、金粒子、特に小さい粒子がサンプル切片上で常に単一粒子として配置されるわけではなく、１つまたは複数の隣り合う金粒子に密接に会合して配置され、それにより、金粒子に似たコントラストを備えているが球状の形状を備えていない小粒子のクラスタが見出される可能性があったので必要とされる。これらを無視せず、そのようなクラスタ内の金粒子の数を計数することが可能となるように、本方法はこれらのクラスタを単一粒子（分けない場合にはクラスタ内に隠されている）へと分けることが可能となる方式で設計される必要があった。これは、やはりグループ２（クラス２）、３（クラス３）またはさらに小さい金粒子を網羅する多様な断面積を規定することによって行った。同時に、小粒子のクラスタの全体的形状が球状ではない可能性があったので、単一の小さい金粒子の形状パラメータとは異なる形状パラメータを規定する必要があった。したがって、形状パラメータの規定はクラス１からクラス２、およびさらに高いクラスへと変化させる必要があった（クラス１で形状＞０．７、形状＜０．７、表１参照）。
【００３３】
最後の工程では、本方法は小粒子を単一粒子または小粒子のクラスタのいずれかとして大粒子から識別する。同じ試料内の大粒子は互いにクラスタにならないことが観察された。したがってこのケースでは、大粒子は、それらの断面積に従って、かつ球体に近い形状を有することで充分に識別された（クラス２１）。６および１５ｎｍ粒子の区別のためのクラスの数、このケースでは２１、は金粒子の取り扱い時に為された観察および経験に従って決定された。この金粒子の対（６／１５ｎｍ）の区別に関しては、この例では、上述したようなパラメータを使用して２１クラスの粒子を規定することで充分であった。
【００３４】
粒子の識別、および小粒子のクラスタからの単一粒子の分離、および大粒子からの小粒子の分離の後、本システムは所定の領域内の粒子の合計数を計数することが可能である。これは、単一粒子に合致しなかった各々のクラスについて補正因子を規定することによって為される。金に似たコントラストを備えた領域を作り出すが不規則な形状を備えた粒子のクラスタ（すなわちクラス２から２０）は最初に単一の領域として識別されたので、補正因子を規定する必要があった。不規則な形状の領域の中では或る数の金粒子が隠されているであろうから、補正が為される必要があった。隠れた金粒子の数は断面積のサイズに応じて決まる。したがって、粒子の合計数は以下のとおり与えられる。
ＮＴ＝ＮＳ＋ＮＣ２−２０×ＣＦ２−２０。
ＮＴ＝粒子の合計数。
ＮＳ＝単一粒子の合計数。
ＮＣ２−２０＝クラス２から２０に由来するクラスタの合計数。
ＣＦ２−２０＝対応するクラスタのクラスに適用される補正因子。
ＣＦ２−２０＝クラスタ評価のための補正因子。
【００３５】
上述の方法によって分離された粒子は着色され、元の画像フレームと着色粒子とを備えた最終画像が図３のブロック３８０に示されるようにコンピュータ画面上で操作者に対して表示される。異なる粒子サイズに対して異なる色彩が使用される。画像処理ソフトウェアによって擬似色彩が特定のグレー・スケール値に割り当てられる。これらの色彩はグラフィック平面内で粒子の上にオーバーレイされるもので、画像に永久的に加えられるわけではない。これによりグレー・スケールの画像からの粒子の着色がなされる。
【００３６】
所定の関心領域内における特定のサイズの単一およびクラスタの粒子数を集約することが可能である。言い換えると、本システムは、選択された関心領域に応じて、多様なサイズの粒子の合計数、ならびにその関心領域内で観察された単一粒子の数及びクラスタ粒子の数を表示するようにもできる。クラスタ内の粒子の合計数は以下に記述されるように、
粒子の合計数＝クラスタの面積／単一粒子の面積
すなわち、粒子の単一の面積で除算したクラスタの合計面積によって規定してもよい。
【００３７】
図４は本発明のさらなる実施形態を示しており、それはモンタージュ写真のように、互いに隣り合った複数の単一高倍率電子顕微鏡画像４１０から広視野の画像４２０を構成することを可能にする。画像モンタージュを実行する選択肢はソフトウェア分析パッケージ３．１ＰＲＯの機能である。擬似色彩のオーバーレイ描写に結果的につながる上述したような同じ粒子分析を実行することができる。組み立てられた画像４２０は元の画像４２０の品質と空間解像度を依然として有している。
【００３８】
本発明は、実行される二重標識実験のタイプに応じて多様なサイズの粒子対を計数およびオーバーレイするように設計された。６ｎｍと１５ｎｍの粒子に関して本発明を記述してきたが、しかし３／１０ｎｍ、および１０／２５ｎｍ粒子サイズの対を使用することもやはり可能である。一の標識対に属する粒子間のサイズの差異は少なくとも１００％を超える方がよい。なぜなら、コロイド金粒子のサイズには一層大きなばらつきがあるからである。表１から理解され得るように、平均直径６ｎｍの単一の小粒子の面積は確かに１０から６０ｎｍ２へと拡大する可能性がある。同様のサイズばらつきは一層大きな粒子に関して見出される可能性がある。単一粒子はサイズと形状の両方を考慮に入れてコンピュータによって識別された。
【００３９】
さらに、例示された具体例では、３０ｎｍ２の面積および球体もしくは殆ど球体の形状を備えた１つの粒子は本方法によって単一の小粒子として分類され、それに対して１２０ｎｍ２の面積、および丸型の形状の粒子は大きな単一粒子として識別されることになる。もしもこの具体例で対象物が９０ｎｍ２の面積を覆い、かつ区分け工程の後に不規則な形状を示せば、コンピュータはこの成分を粒子のクラスタとして識別し、それに対象物クラス２を割り当てることになる。
【００４０】
２つの粒子が一体にクラスタ化していれば、その形状は球状ではなく、対象物は２つの小粒子で構成されていると識別されることになる。
【００４１】
本発明はまた、試料が１つだけのタイプの標識を備えていても機能する。したがって、本方法は金粒子を基にした単一標識の検出についてもやはり有用である。
【００４２】
本発明はまた、電子顕微鏡でのあらゆる自動化された標識構造検出にも使用されることが可能である。これはエネルギーフィルタ型の透過型電子顕微鏡（ＥＦＴＥＭ）に基づいた標識化に有用である元素マーカーの広視野検出を含む。ＥＦＴＥＭは試料中の特定の化学元素の選択的描出を可能にする。もしも金粒子（球状）のように設計され、かつ規定の化学元素で構成される標識が利用可能であれば、金粒子の検出に関して本明細書に述べられたと同等に、これらの標識を本明細書に提示された方法によって分離し、かつ選択的に表示することが可能である。
【実施例】
【００４３】
明瞭化のために、ここでは、単一のサンプル画像を使用して本発明を記述した。以下の図５.1から５.6は本発明の実際のサンプルを示しており、そこではコンピュータ画面上で画像モンタージュが構築される。
【００４４】
図５.1は３つの選択肢を有する本発明を示している。画像の記憶装置またはギャラリから画像を処理する（標示Ｇ）、顕微鏡から画像を入手する（Ｌ）、または先ずいくつかの画像のモンタージュを作成し（Ｍ）、その後、分析を進める選択肢である。
【００４５】
図５.2はモンタージュ選択肢の中の第１の工程、すなわちいくつかの高解像度（２０４８平方の画素サイズ）で高ダイナミック・レンジ（１４ビット）の画像の収集および配列を示している。
【００４６】
図５.3では、モンタージュの自動的終結の後に、本方法は操作者が１つの関心領域（ＲＯＩ、画像フレームによって規定される）を規定することを可能にする。この例では全体画像が選択される。
【００４７】
図５.4では、コントラスト・ウィンドウが確立される。コントラスト・ウィンドウ内の細い線は画像内のヒストグラムの開始部分、すなわち初期平面領域（コントラスト・ウィンドウの左部分、左の黒いピークへの交点）に達しているに過ぎない。
【００４８】
図５.5は粒子サイズの選択および分類のモードを示している。この段階で、操作者は使用される粒子対のサイズ（３／１０ｎｍ、６／１５ｎｍ、または６／２５ｎｍ）を決定し、および検出が単一粒子、または単一クラスタの粒子検出に限定されるかどうかを決定する。後者のケースでは、コンピュータはクラスタに属する粒子の数を全クラスタ面積に依存して見積もるであろう。
【００４９】
図５.6では、粒子の数が計数され、オーバーレイ画像が作成される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の電子顕微鏡画像捕捉システムの概観を示す図である。
【図２ａ】サンプル調製の流れを示す図である。
【図２ｂ】サンプル調製の流れを示す図である。
【図３】サンプルの調製を示す図である。
【図４】モンタージュ写真の構築を示す図である。
【図５．１】本発明のさらなる例を示す図である。
【図５．２】本発明のさらなる例を示す図である。
【図５．３】本発明のさらなる例を示す図である。
【図５．４】本発明のさらなる例を示す図である。
【図５．５】本発明のさらなる例を示す図である。
【図５．６】本発明のさらなる例を示す図である。
【図１】
2005534912.tif 000004
【図２ａ】
2005534912.tif 000005
【図２ｂ】
2005534912.tif 000006
【図３】
2005534912.tif 000007
【図４】
2005534912.tif 000008
【図５．１】
2005534912.tif 000009
【図５．２】
2005534912.tif 000010
【図５．３】
2005534912.tif 000011
【図５．４】
2005534912.tif 000012
【図５．５】
2005534912.tif 000013
【図５．６】
2005534912.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月30日(2005.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料分析において複数の粒子を多重標識して検出および評価するための方法であって、
ｉ）少なくとも１つの画像を単一の色調で収集する工程と、
ｉｉ）色の閾値を使用して前記複数の粒子を分離する工程と、
ｉｉｉ）前記複数の粒子のサイズ及び形状に基づいて前記複数の粒子を１つまたは複数の粒子タイプに識別して分類し、粒子を多様なクラスに分ける工程と、
ｉｖ）前記複数の粒子の位置を可視化する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
スロースキャンの冷却型電荷結合素子カメラによってコントラストのある画像を収集する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記画像が少なくとも１４ビットの画像である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の粒子の前記分離が、内在の背景画像を参照して実行される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の粒子の前記分離が試料の構造を参照して実行される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記画像が少なくとも１６ビットを使用して処理される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記画像が複数の画像のモンタージュ写真である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の粒子の前記位置の前記可視化が前記複数の粒子の擬似着色によって実行される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
粒子クラス毎に異なる擬似色彩が使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
オーバーレイ画像の作成工程をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
粒子の分析のための装置であって
・複数の粒子を備えた試料の単色画像を捕捉するための画像捕捉装置と、
・画像強調装置と、
・前記複数の粒子のサイズ及び形状に基づいて前記複数の粒子を分類する画像識別分類装置と、
・前記粒子を備えた前記試料を可視化するための表示装置と、
を有する装置。
【請求項１２】
前記画像捕捉装置が電子顕微鏡に接続されたカメラである、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記カメラがスロースキャンの電荷結合素子である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記表示装置が擬似色彩で前記粒子を可視化する、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の装置。
【国際調査報告】
2005534912.tif 000015
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