(57)【要約】該開示は、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＦＧＦ１４の役割を研究しＣＮＳ疾患の治療用として見込みのある医薬品を試験するために有用である独特な動物モデルについて記述している。この動物モデルを提供するために、Ｆｇｆ１４遺伝子は、β−ガラクトシダーゼで第２及び第３のエキソンを置換することにより、マウスの体内で分断される。Ｆｇｆ１４欠損マウスが、分断された線条体黒質及び線条体淡蒼球経路を有しその結果皮質に対する興奮性入力を増大させることを示す神経薬理学的研究が開示されている。Ｆｇｆ１４欠損マウスにおける発作性多動性障害は、往々にして被核の機能不全に付随する疾病である筋緊張異常の１形態を表現型模写する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｇｆ１４遺伝子内の導入されたヌル突然変異を含むゲノムをもつ非ヒト脊椎動物であって、運動失調及び発作性運動異常を示す前記動物。
【請求項２】
ＦＧＦ１４タンパク質発現が欠如した非ヒト脊椎動物細胞系統。
【請求項３】
Ｆｇｆ１４遺伝子内の導入されたヌル突然変異を含むゲノムをもつトランスジェニックノックアウトマウスであって、発作性多動症運動異常を示す前記マウス。
【請求項４】
ＦＧＦ１４のインビボ活性が、ＦＧＦ１４発現を止めＦＧＦ１４の第１のエキソンとβ−ガラクトシダーゼの間の融合タンパク質ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌを生成するＦｇｆ１４Ｎ−βＧａｌ対立遺伝子での相同的導入によって分断されるトランスジェニックノックアウトマウス。
【請求項５】
ＦＧＦ１４欠損脊椎動物又は細胞系統を作る方法であって、相同的組換えによって前記脊椎動物又は細胞系統中のＦｇｆ１４遺伝子を分断する段階を含む、前記方法。
【請求項６】
Ｆｇｆ１４Ｎ−βＧａｌ対立遺伝子を内部に相同的に導入することによってＦｇｆ１４遺伝子が分断される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡがエキソン２内にインフレーム挿入される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
分断されたＦｇｆ１４遺伝子を含むゲノムをもつ同型接合のトランスジェニックノックアウトマウスを作る方法であって：
（Ａ）  Ｆｇｆ１４遺伝子の第２及び第３エキソンを欠失させ、マウス胚幹細胞内の相同的組換えによりβ−ガラクトシダーゼと交換する段階；
（Ｂ）  マウス胚盤胞内に前記胚幹細胞を導入し、前記胚盤胞を偽妊娠マウス体内に移植する段階；
（Ｃ）  前記胚盤胞をキメラマウスへと発達させる段階；
（Ｄ）  前記キメラマウスを繁殖させて子孫を産生する段階；
（Ｅ）  Ｆｇｆ１４遺伝子の第２及び第３のエキソンの欠失を含むゲノムをもつ同型接合トランスジェニックノックアウトマウスを同定するべく前記子孫をスクリーニングする段階であって、前記マウスが運動失調及び発作性多動症運動異常を示している段階、
を含む、前記方法。
【請求項９】
請求項３〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニックノックアウトマウスに対して前記テスト化合物を投与し、ＣＮＳ機能の改善について前記マウスを検定する段階を含む、ＣＮＳ疾患に向かうテスト化合物の活性についてスクリーニングする方法。
【請求項１０】
ＣＮＳ疾患が運動障害である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＮＳ疾患が運動失調である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＮＳ疾患が発作性運動異常である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
テスト化合物が経口又は非経口投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記テスト化合物での処置に応答したＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌの亜細胞局在化について前記細胞系統を検定する段階を含む、Ｆｇｆ１４欠損細胞に向かうテスト化合物の活性についてスクリーニングするための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年８月２日出願の特許出願第６０／３０７，６８７号の利益を請求する。
発明の分野
本発明は、線維芽細胞成長因子関連分子の分野、より特定的には線維芽細胞成長因子１４（ＦＧＦ１４）及び中枢神経系（ＣＮＳ）内でのＦＧＦ１４の役割を研究しＣＮＳ疾患の治療用として見込みのある医薬品を試験するための動物モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）は、哺乳動物の発育、創傷の治ゆそして不適切に発現された場合には癌にとっての、必須分子である。複数のＦＧＦ及びＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）をコードする遺伝子内の工学処理された突然変異は、結果として発育異常及び／又は胎生致死をもたらす。さらに、ＦＧＦＲ１、２、及び３をコードする遺伝子内の点突然変異は結果としてヒト遺伝性頭蓋顔面及び骨格形成異常をもたらす。
【０００３】
１９７０年代に発見され現在ＦＧＦ２として知られている最初にわかったＦＧＦは、３Ｔ３繊維芽細胞の増殖を刺激する活性を有していた。その後ＦＧＦ系統群は大きくなり、構造的に関連したタンパク質を約２２成員内含するようになった。
【０００４】
遺伝子ノックアウト（例えばマウスにおける）の生成は、異常を発生させ次に表現型に対するその効果を観察するための手段を提供している。例えば、米国特許第６，１３６，０４０号に記述されているように、Ｆｇｆ．９遺伝子内の導入されたヌル突然変異を含むゲノムをもつトランスジェニックノックアウトマウスが、発育不足の肺を示しかつ１４、５日目の古い肺の中で心房を膨張させた。
【０００５】
ＦＧＦ１４は、これまでに既知の機能をもつＦＧＦ系統群の全く異なる１分岐に属する。ＦＧＦ１４は、発生中の中枢神経系及び成人の脳の中で広く発現される。Wang, McEwen及びOrnitz, Mech. Develop., 第９０巻ｐ２８３〜２８７、（２０００）によって記述されているように、最初の最高７０個のＮ末端アミノ酸においてのみ異なるＦＧＦ１４の２つのイソ型、すなわちＦＧＦ１４−１ａ及びＦＧＦ１４−１ｂがクローニングされた。米国特許第５，７７３，２５２号及び６，０１３，４７７号には、ＦＧＦ１４−１ｂの全２５２アミノ酸の配列が記述されているが、これらの特許の中でこれは誤ってＦＧＦ１５と呼称されている。ＦＧＦ１４−１ａの全２４７アミノ酸配列は、Smallwood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第９３巻、ｐ９８５０〜９８５７、（１９９６）によって記述されている。
【０００６】
特に、ＦＧＦ１４は、既知のＦＧＦの独特の亜系統群に属している。この亜系統群は、従来繊維芽細胞成長因子相同性因子１−４（ＦＨＦ１−４）（Ｒｅｆ．４７，５３）と呼ばれていたＦＧＦ１１〜１４で構成されている。これらは、その他のＦＧＦと３０％未満のアミノ酸同一性しか共有していないが、エキソン２及び３の中でコア保存されたアミノ酸残基を保持する。これらは、見かけ上既知の４つのＦＧＦ受容体のいずれにも結合していないという点で、その他のＦＧＦと異なっている。これまで、それらの生物学的機能については理解しがたいままであった。ＦＧＦ１１−１４は、５８〜７１％のアミノ酸配列同一性を共有し、分泌シグナルペプチド（Ｒｅｆ．５３）が欠如している。第１のエキソンのみが異なっているＦＧＦ１１−１４の多数のスプライス形態が同定されてきた。代替的な第１のエキソンは、異なる亜細胞区画にタンパク質をターゲティングするのに充分かつ必要な優性タンパク質トライックシグナルをコードするように思われる（Ｒｅｆｓ．４２，５３，６３，７１）。ＦＧＦ１４の２形態、ＦＧＦ１４−１ａ及びＦＧＦ１４−１ｂは、それぞれ核及び細胞質の中に局在化されている（Ｒｅｆ．６３）。
【０００７】
古典的ＦＧＦの活性は一部には、細胞の局在化及び移出によって調節される。ＦＧＦ系統群の数多くの成員が細胞外空間内に効率良く分泌され、膜内外ＦＧＦ受容体を通して機能する。ただし、ＦＧＦ１及び２は、分泌のためのコンセンサスシグナルペプチドが欠如しているが、それでも正常な細胞の細胞外基質内に発見され得る。ＦＧＦ１及びＦＧＦ２は同様に、細胞に応力が加わった場合にも放出されうる、ということが示されてきた（Ｒｅｆ．３７，１２）。さらにＦＧＦ１及びＦＧＦ２は、或る種の細胞型の核の中に局在化され得、一部の研究では、ＦＧＦ受容体とは独立してＤＮＡ合成を開始させるにはＦＧＦ１の核局在化で充分である、ということが示唆されている（Ｒｅｆ．３１，３７）。ニューロン内では、外因性ＦＧＦ２が、受容体依存的に軸索に沿って順行的に輸送可能である（Ｒｅｆ．１５）。
【０００８】
Ｆｇｆ１４は、マウス体内の発生中の中枢神経系内で発現される。Ｅ１２．５では、第３及び第４の心室の腹側内層、視核上及び中核部域及び脊髄の中にＦｇｆ１４が局在化されている（Ｒｅｆ．６３）。この段階で、Ｆｇｆ１４は神経上皮から排除され、脳室下帯内に局在化されている。底板を含む発生中の脊髄の腹側３分の２の中にＦｇｆ１４が局在化される。Ｆｇｆ１４は同様に、胸腺原基及び主要動脈を含む複数の非ニューロン組織内でも発現される。成体マウスにおいては、Ｆｇｆ１４の細胞質局在化形態（Ｆｇｆ１４−１６）が、脳内で発現される優勢な形態である（Ｒｅｆ．４３，６２，７１）。Ｆｇｆ１４の発現パターンは、ニューロンの発達及び成体の脳の生理学の両方におけるその役割を調査することの目的を示唆している。
【０００９】
Ｆｇｆｓ１１−１４は、重複するものの同一でない発現パターンを有し、このことは、機能的冗長性を示唆している（Ｒｅｆ．５３）。例えばＦｇｆ１１、１２、１３、及び１４は全て、Ｅ１２．５−Ｅ１３．５で、発生中の脊髄中で高レベルで発現されている。Ｆｇｆ１４の腹側発現パターンとは対照的に、Ｆｇｆ１２は、背側から腹側に勾配が増大していきながら、脊髄全体を通して発現されており、Ｆｇｆ１３は、運動性細胞柱の外側腹側角内及び背側根部神経節内で発現されている（Ｒｅｆ．２５，６３）。成体の脳内では、Ｆｇｆｓ１１−１４が皮質、海馬及び小脳内で広く発現されている（Ｒｅｆ．５３）。
【発明の開示】
【００１０】
発明の簡単な説明
本発明に従うと、中枢神経系内のＦＧＦ１４の役割を研究し、ＣＮＳ疾患治療用として見込みのある医薬品を試験するための独特の非ヒト脊椎動物モデルが提供される。好ましい動物モデルを提供するために、マウスＦｇｆ１４遺伝子内のヌル突然変異が工学処理された。このトランスジェニックノックアウトマウスは、第２及び第３のエキソンをβ−ガラクトシダーゼｃＤＮＡで置換することによりＦｇｆ１４遺伝子を分断することによって産生された。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態においては、Ｆｇｆ１４遺伝子は、Ｆｇｆ１４Ｎ−βＧａｌ対立遺伝子の相同的導入によって分断された。この対立遺伝子は、ＦＧＦ１４の発現を止め、ＦＧＦ１４の第１のエキソンとβ−ガラクトシダーゼの間の融合タンパク質（ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌ）を生成した。ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌは、脳幹神経節及び小脳、つまり、運動の学習及び協調を調節する脳の領域の中で局在化された。
【００１２】
すばらしいことに、ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌは、ニューロンプロセスへと効率良くトライックされた。驚くべきことに、予想外にも、同型接合のＦＧＦ１４欠損マウスは、生存可能、繁殖可能かつ解剖学的に正常であったが、生後３週間目に始まる運動失調及び発作性多動症運動異常を示した。これらの運動性異常は、脳幹神経節系の機能不全と結びつけられ、複数のヒト筋緊張異常症候群と類似している。従って、本書で記述するノックアウトマウスは、特に運動失調及び多発性運動異常といったヒトＣＮＳ疾患におけるＦＧＦ１４活性の役割を研究するための独特の動物モデルを提供する。
【００１３】
本書では、Ｆｇｆ１４欠損マウスがドーパミンアゴニストに対して低い行動的及び転写的応答を有することを実証する神経薬理学的研究が記述されている。これらは、分断された線条体黒質及び線条体淡蒼球経路を有しその結果皮質に対する興奮性入力を増大させる。Ｆｇｆ１４欠損マウスにおける発作性多動性運動障害は、往々にして被核の機能不全に付随する疾病である筋緊張異常の１形態を表現型模写する。
【００１４】
これらの研究に従うと、Ｆｇｆ１４は、ニューロンシグナリングにとって重要な分子であることが示されている。かくしてＦＧＦ１４は、（ａ）シナプス後シグナリング及び脳幹神経節内のドーパミン受容体の下流側の機能及び（ｂ）シナプス前シグナリング及び軸索トライック又は神経伝達物質の放出の調節にとって重要であると考えられている。
【００１５】
ＦＧＦ１４は、ＪＩＰ２／ＩＢ２と呼ばれる足場型分子に結合し、この分子がＭＡＰＫカスケードの成員と結合できるようにする（Ｒｅｆ．５１）。ＩＢ１及びＩＢ２は、キネシンに対し結合するものとして、さらに記述されてきた（Ｒｅｆ．５９）。これらの公表された発見事実は、軸索輸送系又はシナプスでの生化学活性におけるＦＧＦ１４の役割を裏づけている。
【００１６】
本発明に従うと、軸索トライックのための代替的経路が提供されており、これにより、非相同タンパク質（β−ガラクトシダーゼ）の発現を軸索にターゲティングするのに、ＦＧＦ１４（ＦＧＦ１４−ＧＦＢ）の１ｂアミノ末端だけで充分になる。すなわち、ＦＧＦ−１ｂのアミノ末端がβ−ガラクトシダーゼに融合された時点で、ＦＧＦ−Ｎ−β−ｇａｌタンパク質は、インビボで軸索内を下へ効率良くトラフイックされる。かくして、ＦＧＦ１４−１ｂのアミノ末端はそれ自体軸索ターゲティングに充分なものであり、潜在的にＪＩＰ１／ＩＢ２及びキネシンとの相互作用とは独立して作用する。
【００１７】
軸索輸送系内のＦＧＦ１４の役割をさらに裏づけるものとして、Neuro２ａ細胞が、ＦＧＦ１４−ＧＦＢでトランスフェクションされ、該タンパク質が細胞質ゾル及び神経突起内に存在し、シナプス小脳マーカーＳＶ２と同時局在化できるということを示した。これらの結果は、ＦＧＦ１４が軸索内に効率良くトライックされるということを示している。
一般に、かくして、該動物モデルは、運動失調、肥満、不安症／うつ病（局在化のみに基づく）、海馬興奮性亢進、発作性疾患、双極性障害、片頭痛、（統合失調症、ＡＤＨＤ、ＡＤを含む）認知障害、コカイン誘発性発作感受性の増大、長期増強作用の増大、薬物乱用、運動障害、パーキンソン病、ハンチントン病、筋緊張異常／運動異常、ＡＬＳ（細胞トライックに関連するもの）及び神経筋肉障害といったようなＣＮＳ疾患及び障害のための見込みのある医薬品の活性を試験するために有用である。
【００１８】
テスト化合物は、検定においてＦＧＦ１４欠損マウスを利用すること又は、テスト化合物で直接Ｆｇｆ１４欠損マウスを処理し該マウスのＣＮＳ機能の改善が存在するか否かを見極めること、又はこれらのマウスからＦｇｆ１４欠損細胞系統を発達させ、テスト化合物に応答したＦＧＦ１４N-βgalの亜細胞局在化を検定することによって、疾病についての従来のインビボエンドポイント法により、ＣＮＳ疾患に対する活性についてスクリーニングできる。
【００１９】
動物モデル及び神経細胞成分を利用することによるＣＮＳ疾患及び障害に対する活性についてのテスト化合物のスクリーニングは、当業者による周知の手順に従って実施可能である。例えば、傾眠、興奮性亢進、運動失調及び発作といったマウス体内の行動的及び電気生理学的効果の試験；神経毒性についての標準的回転棒（rotorod）手順；麻痺した通気済みモルモットのＥＥＧに対する効果；ペンチレンテトラゾル（ＰＴＺ）により誘発された発作に対する効果；及びインキュベートした海馬スライスの電気的活性に対する効果、といったような、マウス、モルモット及び海馬スライス内のテスト化合物のスクリーニングについては、米国特許第４，７０７，４９１号及びKlunk et al., 分子薬理学、第２２巻ｐ４３８〜４４３（１９８２）を参照のこと。
【００２０】
培養したラットの海馬ニューロン内でのＧＡＢＡと記された塩素電流に対する効果を検査することによりガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）応答を改変させるためのテスト化合物のスクリーニングについては、米国特許第５，２０６，４１５号及びRodgers-Neame, et al.,「分子薬理学」第４２巻、ｐ９５２〜９５７（１９９２）も参照のこと。ＧＡＢＡは、脊椎動物のＣＮＳの中で神経伝達される重要な阻害物質であると考えられている。
【００２１】
ＣＮＳ疾患及び障害についての突然変異体マウス内での表現型分析の戦略は、Lisa M. Gold「精神薬理学」第１４６巻、ｐ２〜４（１９９９）により、最近再考されている。本発明のＦｇｆ１４欠損マウスで使用できる該著者によって記述された複数の従来のスクリーニング方法は、例えば以下のようなものである：
・  分析には、特定の系の機能パターンについての情報を提供するべく、単純反射（阻害及び出現）の監視が含まれる可能性がある。
・  不安症を評定するためには、ストレッサー及び新規性／探査に対する脳底反応性を十字迷路、白／黒ボックス及び明暗出現パラダイムの中で特徴づけすることができる。
・  基礎生理学パラメータ、例えば食料／水摂取及び体重増加の監視は、スクリーニングプログラミングの重要な面である。
・  運動性活性は、脳機能不全、前庭の問題、全身的筋肉衰弱及びカタレプシーについての監視及び回転棒による平衡化によって評定可能である。
・  認知障害は、動機づけ、知覚、学習、記憶及び／又は運動プロセスの統合を必要とする行動タスクの中で検査できる。
・  知覚閾値、例えば痛覚閾値は、正常な刺激に対する及び薬物条件下での感受性を評定するために有用でありうる。
【００２２】
パーキンソン病、ハンチントン病及び筋緊張異常といったようなヒトの運動障害は、２つの経路間の平衡を実際に分断する脳の病変によってひき起こされる。すなわち、脳幹神経節視床皮質回路の現行モデルにおいては、尾状核−被核（ＣＰｕ）は、皮質から入力を受理し、２つの経路を通して、黒質網状部（ＳＮｒ）及び淡蒼球（Ｇｐｉ）の内部セグメントまで突出する（Ｒｅｆ．５７）（本書図１０Ａ）。直接経路は、Ｇｐｉ／ＳＮｒに直接突出する線条体ニューロンから成る。これらのニューロンＤ１は、Ｄ１クラスのドーパミン受容体（Ｄ１Ｒ）を発現し、Ｇｐｉ／ＳＮｒに対し阻害入力を提供する。Ｄ２クラスのドーパミン受容体（Ｄ２Ｒ）を主として発現する線条体ニューロンは、淡蒼球（Ｇｐｅ）及び視床腹部核（ＳＴＮ）の外部セグメントに対する阻害性突起を介してＧｐｉ／ＳＮｒに対し正味刺激性入力を提供する。この経路は、かくして、間接的経路と呼ばれる。Ｇｐｉ／ＳＮｒは、直接及び間接経路からの入力を統合し、阻害シグナルを視床に対し提供する。直接及び間接経路からの正味入力の平衡は、運動の計画、開始及び実行にとってきわめて重要である（Ｒｅｆ．５７，６１，４６，６５）。
【００２３】
ハンチントン病といったような神経変性障害は、Yamamoto et al., Cell. 第１１巻、ｐ５７〜６６（２０００）により記述されているような神経タンパク質集合又はCarter et al., J. Neuroscience, 第１９巻ｐ３２４８〜３２５７（１９９９）で記述されているようにさまざまな前後肢協調、平衡及び感覚運動ゲートで観察される運動不足といったような症候によっても特徴づけされ得る。パーキンソン病は同様に、Stolzc et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 第７０巻ｐ２８９〜２９７（２００１）によって記述されているような比較用歩行分析、又はMontgomery et al., 運動障害、第１５巻、ｐ５１１〜５１５（２０００）により記述された通りの運動性開始及び実行によっても特徴づけされ得る。
【００２４】
前肢及び後肢間代性けいれん、慢性発作及び飛躍縦揺れ発作に対する潜時も同様に、Golden et al., 神経精神薬理学、第２４巻、ｐ２９１−２９９（２００１）により記述されているように、コカインによって誘発された行動発作に対する罹病性をテストするための有利なエンドポイントである。ＰＴＺ（ペンチレンテトラゾル）で誘発されたけいれんの重症度に対する効果は、Mazarati et al., J. Newroscience, 第２０巻ｐ６２７６〜６２８１（２０００）によって記述されているように、発作分析のための共通のエンドポイントである。
【００２５】
以上のＣＮＳ疾患及び障害におけるＦＧＦ１４の役割を研究しその治療用として見込みのある医薬品をテストするための開示された動物モデルの有用性は、本書に記述されている神経薬理学的研究から明白である。
【００２６】
以下の例示的な特定的作用例において、発明人らは、ＦＧＦ１４欠損マウスに関して、以下の試験についての詳細な方法及び結果を記述している：
−  感覚運動試験；
−  ドーパミン及び代謝産物測定、
−  コカインで誘発された発作の活性；
−  ペンチレンテトラゾル（ＰＴＺ）誘発された発作の活性；
−  脳幹神経節視床皮質回路；
−  学習／記憶試験；
−  シナプス局在化試験、及び
−  脳波検査。
【００２７】
感覚運動試験の結果は、運動失調及び多発性運動異常を標示していた。
ドーパミン及び代謝産物の測定は、対照マウスに匹敵するレベルを実証したが、Ｆｇｆ１４欠損マウスは、ドーパミンアゴニストに対して異常な応答を示し、コカインにより誘発された発作に対する閾値は低減した。
【００２８】
Ｆｇｆ１４欠損マウスにおける脳幹神経節視床皮質回路は、直接（Ｄ１Ｒ）及び間接（Ｄ２Ｒ）シグナリング経路間の平衡失調を示した。上述のように、パーキンソン病、ハンチントン病及び筋緊張異常といったようなヒト運動障害は、これらの経路の間の平衡を効果的に分断する脳の病変によってひき起こされる。
【００２９】
学習／記憶試験では、Ｆｇｆ１４欠損マウスは、対照マウスに比べて有意なほどに大きい静止行動を示した。
【００３０】
シナプス局在化試験では、Ｆｇｆ１４欠損マウスは海馬歯状回の中で高い興奮性をひき起こすことが示された。
【００３１】
本書では、特定のスクリーニング及びエンドポイント検定方法が記述されているが、本発明はこれらの特定の方法に制限されるわけではないということがわかるだろう。当業者は、ＣＮＳ疾患のためのエンドポイント検定方法についての周知の教本、学術論文及び科学的刊行物を参照することができる。特に、Crawley et Paylor,「ホルモンと行動」、第３１巻、ｐ１９７−２１１（１９９７）は、トランスジェニック及びノックアウトマウスの行動的表現型を調査するべく特定のパラダイムの一群及びテスト一式についてのすばらしい記述を提供している。著者らは、突然変異体マウスにおける行動異常についての第１のスクリーンとして有効に使用される一連の従来の神経学的及び神経心理学的試験、及び学習と記憶、摂食行動、痛覚／痛覚脱失、攻撃性、生殖、不安症うつ病、統合失調症及び薬物乱用モデルを含めた一連の特定的パラダイムについて記述している。行動パラダイムの各々についての方法の広範な記述を伴う周知の公表済み参考文献のリストが、前記著者らによって提供されている。これらの従来のエンドポイント検定のうちの任意のものを、本書に記述されているようなＦｇｆ１４欠損マウスについて使用することができる。
【００３２】
本発明のＦｇｆ１４欠損動物又は細胞系統は、相同的組換えによりＦｇｆ１４遺伝子を分断することによって作ることができる。Ｆｇｆ１４遺伝子は、好ましくは、前記遺伝子内のＦｇｆ１４Ｎ−βＧａｌ対立遺伝子の相同的導入によって分断される。これは、β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡをエキソン２内部にインフレーム挿入することによって行なうことができる。
【００３３】
本発明の、同型接合のトランスジェニックノックアウトマウスを作る好ましい方法は、
（Ａ）  Ｆｇｆ１４遺伝子の第２及び第３エキソンを欠失させ、マウス胚幹細胞内の相同的組換えによりβ−ガラクトシダーゼと交換する段階；
（Ｂ）  マウス胚盤胞内に前記胚幹細胞を導入し、前記胚盤胞を偽妊娠マウス体内に移植する段階；
（Ｃ）  前記胚盤胞をキメラマウスへと発達させる段階；
（Ｄ）  前記キメラマウスを繁殖させて子孫を産生する段階；
（Ｅ）  Ｆｇｆ１４遺伝子の第２及び第３のエキソンの欠失を含むゲノムをもつ同型接合トランスジェニックノックアウトマウスを同定するべく前記子孫をスクリーニングする段階であって、前記マウスが運動失調及び発作性多動症運動異常を示している段階、
を含んで成る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
明細書は、発明を形成するものとみなされる内容を指摘し弁別的にそれを請求するクレームで完結するものの、本発明は、添付図面と併わせて以下の好ましい実施形態を取上げることにより、さらによく理解できるだろう。
【００３５】
本発明をより詳細に例示するために、以下の特定の実験室例を実施した。本書ではこのように特定例を例示したが、本発明がこれらの特定的な例又はその中の詳細に制限されるものでないということがわかるだろう。
【実施例】
【００３６】
実施例Ｉ
Ｆｇｆ１４欠損マウスの調製及び神経薬理学的試験
この例１では、ＦＧＦ１４のインビボ活性は、ＦＧＦ１４の発現を止め、ＦＧＦ１４の第１のエキソンとβ−ガラクトシダーゼの間で融合タンパク質（ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌ）を生成したＦｇｆ１４Ｎ−βＧａｌ対立遺伝子の相同的導入によって分断された。Ｆｇｆ１４Ｎ−βＧａｌは、運動行動を調節する脳の領域である、脳幹神経節及び小脳の中に局在化されていた。著しいことに、ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌキメラタンパク質は、ニューロンプロセスへと効率良くトライックされた。Ｆｇｆ１４欠損マウスは生存可能で繁殖力をもち、解剖学的に正常であったが、運動失調及び発作性多動性運動障害を発症していた。
【００３７】
この例での神経薬理学的研究から、Ｆｇｆ１４欠損マウスが、線条体−黒質及び線条体淡蒼球経路を分断し、皮質に対する興奮性入力の増加を結果としてもたらしたことがわかった。Ｆｇｆ１４欠損マウス内の発作性多動性運動障害は、被核の機能不全に往々にして付随する疾患である筋緊張異常の１形態を表現型模写する。
【００３８】
方法
遺伝子ターゲティング及びＦｇｆ１４欠損マウスの生成
ターゲティングベクター（図１Ａ）は、エキソン２（第５コドンの後）、エキソン３全体及びエキソン２とエキソン３の間の３ｋｂのイシトロンを欠失させるように設計された。β−ガラクトシダーゼ遺伝子をエキソン２の第５コドンと共にインフレーム挿入した。ターゲティングベクターは、欠失にフランキングする２．７ｋｂの３´相同ゲノミックＤＮＡと４．５ｋｂの５´相同ゲノミックＤＮＡを含んでいる。挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の下流側でＮｅｏ選択カセットをクローニングし、これはｃｒｅ媒介切除のために使用できる２つのｌｏｘＰ部位によりフランキングされている。ターゲティングベクターは、同じく２つのＴＫ遺伝子によってフランキングされた。プラスミドをＳｆｉｌで線形化し、ＳＭ１胚幹（ＥＳ）細胞内へと電気穿孔し、Ｇ４１８及びＦＩＡＵで選択した。ゲノミックＤＮＡをＥＳ細胞から単離し、ＥｃｏＲＩで消化させて、５´外部プローブ（４００ｂｐのＰＣＲフラグメント）でハイブリッド形成させる（図１Ｂ）か又はＥｃｏＲＶで消化させて、３´外部プローブにハイブリッド形成させた（７００ｂｐ−ＸｂａＩフラグメント）。２つの適正にターゲティングされたクローンを、Ｇ４１８及びＦＩＡＵでの選択に生きのびた２００のＥＳ細胞コロニーの中から同定した。これらのクローンを、Ｃ５７ＢＪ／６マウスから誘導された胚盤胞内に個別に注入した。両方のクローン共、ターゲティングされた対立遺伝子を生殖細胞系列内に伝達するキメラマウスを発生させた。
【００３９】
後代の遺伝子型特定は、尾部組織ＤＮＡのＰＣＲ分析か又はサザンブロット法（上述の通り）によるものであった。５´プライマ、ＱＷ１２７（５´−ＣＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＣＣＣＴＡＴＴＴＣ−３´）［配列番号１］は、５´の相同領域に対しハイブリッド形成する。３´プライマは、野生型対立遺伝子についてはＦｇｆ１４エキソン２に対し、ハイブリッド形成するＱＷ１２８（５´−ＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＣＡＡＴＡＴＡＡＣＣＴＧＧＴＣＡＣ−３´）［配列番号２］そしてβ−ガラクトシダーゼ、ｃＤＮＡａ５´領域に対しハイブリッド形成するＱＷ１２９（５´−ＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧ−３´）［配列番号３］であった。ＰＣＲ条件は、３０サイクル（３０秒間９５℃、１分間５５℃、１分間７２℃）とそれに続く７２℃で３分間であった。ＰＣＲ検定は、野生型対立遺伝子については２５５ｂｐのフラグメントを、又Ｆｇｆ１４Ｎ−βｇａｌ対立遺伝子については３５０ｂｐのフラグメントを生成した（図１Ｃ）。
【００４０】
ノーザンブロットハイブリダイゼーション
ＲＮeasyキット（Qiagen）を用いて、生後２１日のマウスの小脳についてＲＮＡを単離した。６．４１μｇの全ＲＮＡを、０．６６Ｍのホルムアルデヒドを含有する１％のアガロースゲルを通した（４Ｖ／ｃｍ）での電気泳動により分離し、これを毛管溶出によりＮ−Hykond膜（Amersham）に移した。エキソン２、エキソン３及びエキソン４の一部から誘導された３１５ｂｐのＦｇｆ１４プローブを、ランダムプライミング方法により３２Ｐ−２ＳＣＴＰで標識づけした。フィルタを、高緊縮性条件下でハイブリッド形成及び洗浄し、Ｘ線フィルムに露呈した。ヒト脳ノーザンブロットをClonetech Incから購入し、３１５ｂｐのマウスＦｇｆ１４プローブを用いてハイブリッド形成した。マウス及びヒトｃＤＮＡは、この領域内で９５％を上回る同一性を共有する。バンド強度を、ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いた走査式デンシトメトリにより定量化した。
【００４１】
インサイチュハイブリダイゼーション
脳組織を、４％のパラホルムアルデヒドで灌流させた生後３０日のマウスから収獲した。凍結切片を１５分間室温でアセチル化し（０．１トリエタノールアミン、ｐＨ８．０、０．２５％−無水酢酸）、一晩５５℃でハイブリッド形成した（１×１０６ｃｐｍ／ｍｌのリボプローブ、５０％のホルムアミド、４×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、５０ｍＭのＤＴＴ、５００μｇ／ｍｌの酵母ｔ−ＲＮＡ、及び３００μｇ／ｍｌの変性ニシン精子ＤＮＡ）。ハイブリダイゼーションの後、切片を洗浄し、前述のようにＲnase Ａで消化させた（Ｒｅｆ．４３）。切片を脱水し、空気乾燥させた。ＮＴＢエマルジョン（Kodak）対水の比を１：１としてオートラジオグラフィを実施した。５分間、Kodak高速定着液を用いて、Ｄ−１０現像液中で切片を現像した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。
【００４２】
β−ガラクトシダーゼ活性のための染色
ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌ及びβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）での染色により、インサイチュで局在化させた。生後３ヵ月のマウスを２％のパラホルムアルデヒドで灌流させた。脳を収獲し、ＯＣＴ化合物中に包埋し、クリオスタットで−２０℃で切り出しした。その後、切片を、ｐＨ＝７．０の０．１Ｍのリン酸ナトリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６、０．０１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．０２％のＮＰ−４０、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ及び１ｍｇ／ｍｌのＸｇａｌ中で、一晩３７℃で染色した。次にスライドを、ヌクレアファストレッドで対比染色した。
【００４３】
組織学及び免疫組織化学
深麻酔したマウスを４％のパラホルムアルデヒドで灌流し、段階的脱水を通して処理しパラフィン内に包埋した。（Ｒｅｆ．５２１に従ってニッスル、ルクソールファストブルー、及び銀染色を実施した。
【００４４】
免疫組織化学については、４％のパラホルムアルデヒドで灌流したマウスから脳を取り出し、次に１２時間４％のパラホルムアルデヒド内で後定着した。組織を一晩３０％のスクロース内浸漬により凍結保護し、その後Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（Tissue-Tek）中に包埋させ、ドライアイス上に置いた。凍結した切片を４０μｍでカットし、使用するまで４℃でＰＢＳ／アジド溶液中に保管した。切片を室温で３０分間、ＰＢＳ中の０．３％のＨ２Ｏ２の中でインキュベートした。３０分間ＰＢＳ中の３％の正常なヤギ血清内での遮断の後、切片を遮断溶液中で抗−Ｃ−ｆｏｓ抗体（１：30,000, Oncogene Science, Inc）又は抗−チロシンヒドロキシラーゼ抗体（１：1000, Chemicon International, Inc）と共にインキュベートした。その後切片を、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされた適切な２次的抗体と共にインキュベートした。ベクタスタインＡＢＣキット（Vector Laboratories）を用いてペルオキシダーゼ染色を視覚化した。
【００４５】
感覚運動試験
感覚運動試験一式は、傾斜したスクリーン、プラットフォーム、棚を内含し、Schaefer et al.（Ｒｅｆ．５０）により記述された通りに歩行開始試験が実施された。
【００４６】
傾斜及び倒置スクリーン試験。各マウスを６０°傾斜した高架（床から４７ｃｍ上）ワイヤメッシュ格子（１０ｃｍあたり１６個の正方形）の上に置いた。ワイヤメッシュ格子を、１５×５２ｃｍであった木製フレームを横断して伸長させた。マウスが器具の裏面まで回ってよじ登るのを防ぐため周囲に沿ってテープを設置した。各動物を、頭を下に向けた状態でスクリーンの中央に置き、それがどれほどの時間スクリーン上にとどまったか及びスクリーンの上部までよじ登るのにどれほどかかったかについて計時した。倒置スクリーン試験のためには、マウスを以上の通りに設置し、次にスクリーンを１８０°まで倒置させた。動物が落下しない場合、６０秒の最高評点が与えられた。
【００４７】
プラットフォーム試験。高架（床から上４７ｃｍ）円形プラットフォーム（厚み１．０ｃｍ；直径３．０ｃｍ）上にどれほど長くとどまっていたかについて、各マウスを計時した。最大時間量の間マウスがプラットフォーム上にとどまっていた場合又はプラットフォームを支持していたひじょうに薄いポール上を落下することなく伝い降りることができた場合、６０秒という最高の評点が割当てられた。
【００４８】
棚試験。各マウスは、落下することなくプレキシグラスの幅０．７５ｃｍの棚の上でその平衡をどれほど長く保つことができたかについて、計時された。マウスがプレクシグラムの棚の全長（５１ｃｍ）を横断し、落下することなく６０秒未満で出発場所に戻った場合、同様に６０秒の評点が割当てられた。
【００４９】
歩行開始試験。大きいテーブル表面の平滑な黒色表面上に白色の布テープ（２１×２１ｃｍ）により輪郭どりされた１つの正方形の中央に、各々のマウスを置いた。各マウスが正方形を離れる（４本の足全てをテープの外側に置く）のに要した時間を記録した。許容最高時間は６０秒であった。
【００５０】
回転棒試験。運動協調及び平衡を測定するために、回転棒器具（Columlus Instrument）を使用した。訓練期間中、各マウスを静止した回転棒上に置き、次に、一定速度（２．５ｒｐｍ）で回転する回転棒上に置いた。各マウスは、連続３回の試行時に１分間平衡を保つことができた場合、次の訓練段階に進んだ。訓練がうまく完了した後、各マウスを加速する回転棒上で（０〜１８０秒にわたり５〜２０ｒｐｍ）連続５日間、１日３回の試行でテストした。回転棒から落ちる平均潜時を記録した。
【００５１】
自発運動。自発運動実験のために、全てのマウスを、連続２日間、１時間にわたり活動ケージ（長さ２８ｃｍ×幅１７ｃｍ×高さ１２．５ｃｍ）に順応させた。各々の薬物実験のために、腹腔内注射（塩酸コカイン（Sigma）１０ｍｇ／ｋｇ又はＳＫＦ３８３９３ ２０ｍｇ／ｋｇ（ＲＢＩ、Natik、ＭＡ））又は皮下注射（ｄ−硫酸アンフェタミン（Sigma）２．０又は４．０ｍｇ／ｋｇ又はキシピロール２．０ｍｇ／ｋｇ（ＲＢＩ、Natik、ＭＡ））を受ける前に、３０分間、動物を活動ケージ内に入れ、５５分間再び活動ケージ内に戻した。一日おきにマウスをテストし、薬物治療の順序を、遺伝子型グループ内で全日数にわたり釣り合わせた。活動ケージの長さに沿って１０ｃｍ及び１９ｃｍのところに置かれた赤色光線２本により、５分毎に自発運動を記録した。
【００５２】
統計的分析。１つの対象間変数（遺伝子型）及び１つの対象内変数（例えば試行又は試験セッション）を標準的に含む分散分析（ＡＮＯＶＡ）モデルを用いて、行動データを分析した。主要効果を評価するため、その後の一方向ＡＮＯＶＡを使用した。自発運動に対する薬物効果に関する実験からのデータを、上述のモデルに１つの対象間変数（薬物）を付加した２方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。個々のグループの事後比較が関与するフィッシャーの保護付き最小二乗差をこれらのデータについて使用した。全ての分析についてアルファをｐ＜０．０５に設定した。
【００５３】
ドーパミン及びその代謝産物の測定
ドーパミン及びドーパミン代謝産物（ＤＯＰＡＣ及びＨＶＡ）の組織濃度を前述のような電気化学検出（Ｒｅｆ．４）と結合させたＨＰＬＣによって測定した。側座核及び背側線条体を含む各々のマウスの脳の２ｍｍの冠状スライスをかみそりの刃で単離させた。側座核を、パンチ除去用の探り針を収納した１．６ｍｍの低温ステンレス鋼管で細かく切開した。左右の側座核からのパンチ、１．５ｍｌ入りポリプロピレン管の中で組合せ、ドライアイス上に置き、検定される前で−８０℃で保管した。ＥＳＡCoulochem ＩＩ検出器に結合させたＥＳＡ７０１３ ２重電極解剖セル及びＥＳＡ５０２０ガードセルを用いたＨＰＬＣにより、ドーパミンＤＯＰＡＣ及びＨＶＡを検出した。コンピュータデータ分析プログラム（Bechmann Syotem Gold）を用いてＤＡ、ＤＯＰＡＣ及びＨＶＡについての標準曲線から、全ての値を導出し分析した。
【００５４】
ペンチレンテトラゾル処理及びＥＲＫ活性化分析
ペンチレンテトラゾル（Sigma）を食塩水中で溶解させ（１０ｍｇ／ｍｌ）、７５又は１００ｍｇ／ｋｇいずれかの用量で腹腔内注射した。強直−間代性てんかん発作の開始までの時間を記録した。第１の実験（図９）において、平均年齢は生後８２日であり、性別比は雌雄５０％であった。第２の実験では、平均年齢は、生後３５４日で、全ての動物が雌であった。
【００５５】
ＥＲＫ活性化のためには、成体（生後６〜２３週）のＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal及び野生型雌マウスに７５ｍｇ／ｋｇのＰＴＺ又はＰＢＳを腹腔内注射した。実験日前の３日間毎日、各々のマウスに腹腔内に２回ＰＢＳを注射して、動物を取扱い及び注射に慣れさせた。実験的注射から９０秒後に（又はてんかん重積症状態の開始時点で）、動物を屠殺した。大脳半球及び小脳を取り出し、５００μｌの沸とうする溶解緩衝液（１％のＳＤＳ；２０μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害物質カクテル溶液（Sigma P8340）；及び１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム）中で均質化させた。上清中のタンパク質レベルを、タンパク質検定キット（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いてブラッドフォード法によって決定した。２０μｇのタンパク質を含有する各標本のアリュートを、成形済みの１２％のトリス−ＨＣｌポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）上で電気泳動に付した。ポリクローナルウサギ抗−ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）抗体（１：1000 ; Cell Signaling, Beverly, MA）又はポリクローナル抗−ｐ４４／４２ＥＲＫ（１：1000 ; Cell Signaling）を用いて、タンパク質を視覚化させた。画像を走査し（ＡＧＦＡ Duo Scan）、Quantity Oneソフトウェア（Bio-Rad）を用いてデンシトメトリデータを分析した。
【００５６】
脳波検査
ハロタン麻酔下でマウスを定位固定枠内に位置づけた状態で、頭がい骨スクリュー電極を外科的に移植した。無菌技術を用いて、頭皮を正中線で切開し、頭がい骨を含まないよう荷に骨膜を削り取った。硬膜外スクリュー電極を設置するために、高速ドリルを用いて、３つのバーホールをあけた。ブレグマの後方約１ｍｍのところで左右の前頭皮質上に２つの活性電極を設置した。前頭洞上の領域内に基準電極を移植した。電極及びリード線は、歯科用セメントで頭がい骨に安定させた。記録する前にマウスを３日間回復させた。左右の前頭部からの基準ＥＥＧ記録を、それぞれ１００ＨＺ及びＬＨＺの高及び低周波数フィルタ設定値をもつGrass Ｐ５シリーズＡＣ増幅器を用いて実施した。増幅器の出力を、アナログ−デジタル変換器及びAxoscopeソフトウェアを用いてデジタル化し記憶した。
【００５７】
結果
Ｆｇｆ１４ 遺伝子ターゲティング
Ｆｇｆ１４ 遺伝子内にβ−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）−Ｎｅｏカセットを挿入するように、Ｆｇｆ１４遺伝子ターゲティングベクター（図１Ａ）を設計した。この設計により、β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡはエキソン２の最初の５つのコドンと共にインフレームに置かれ、β−ガラクトシダーゼ（ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌ）に融合されたＦＧＦ１４の交互にスプライシングされた最初のエキソンを含む融合タンパク質が生成された。こうして、全てのＦＧＦに共通のコア保存アミノ酸をコードするエキソン２及び３の欠失が結果としてもたらされた（Ｒｅｆ．６３）。ターゲティング構成体を、胚幹細胞内に電気穿孔させた。２００のクローンをスクリーニングすることにより、相同的組換えによってＦｇｆ１４が分断された２つの独立したクローンが同定された（図１Ｂ）。両方のクローン共、キメラマウスを産生するべく胚盤胞内に注入され、両方共生殖細胞系列内に伝達された（図１Ｃ）。結果として得られた異型接合マウス（Ｆｇｆ１４Ｎ−βＣａｌ／＋又は＋／−）は、野生型同腹子（ｗｔ又は＋／＋）と区別不能であった。同型接合マウス（Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGal又は−／−）は、生存可能で繁殖力を有していた。エキソン２及び３をコードする配列から誘導されたプローブを用いて、全小脳ＲＮＡのノーザンブロット法によってＦＧＦ１４ｍＲＮＡ発現を評定した（図１Ｄ）。Ｆｇｆ１４ｍＲＮＡは、野生型マウスにおいて検出され、異型接合マウスでは低減したレベルで検出されたが、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスでは存在しなかった。
【００５８】
誕生後最初の２週間は、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalの子はその野生の同腹子と区別不能であった。３週目及び４週目において、純粋な１２９／ＳＶＪの遺伝的背景上でのＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの成長は、野生型同腹子の成長に遅れを取っていたが、その後は平行な曲線を維持した。成体のＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、同腹子の対照よりも最高３０％小さい状態にとどまった（遺伝子型１つにつきｎ＝９、ｐ＜０．０１）（図１Ｅ）。Ｆｇｆ１４Ｎ−βＧａｌ／＋マウスを、Ｃ５７Ｂ６／Ｊの遺伝的背景上で５世代戻し交配させた（Ｇ５：Ｃ５７Ｂ６／Ｊ）。Ｇ５：Ｃ５７Ｂ６／Ｊの遺伝的背景上で、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスのサイズは、離乳まで野生型同腹子のものと類似していた。しかしながら、成体Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、正常な体重に達することができず、その同腹子に比べ１５％小さい状態にとどまった（遺伝子型１つにつきｎ＝７、ｐ＜０．０５）（図１Ｆ）。
【００５９】
ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌを小脳及び脳幹神経節内で発現させ、軸索内に効率良くトライックさせる。
Ｆｇｆ１４Ｎ−βＧａｌ発現がＦｇｆ１４の発現を発生反復するか否かを見極めるために、成体野生型及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalの脳由来の連続冠状切片上でＦｇｆ１４及びβ−ｇａｌｃＤＮＡプローブの両方を用いて、インサイチュハイブリダイゼーションを実施した。この分析から、Ｆｇｆ１４の写しが海馬及び小脳顆粒細胞内に局在化され、大脳皮質及び線条体（尾状核−被核、ＣＰｕ）内で拡散的に発現されるということが明らかになった（図２Ａ−Ｃ）。Ｆｇｆ１４の写しは、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGal組織内では検出されず（図２Ｄ−Ｆ）、これはノーザンブロットデータ（図１Ｄ）と一貫していた。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGal組織内でのβ−ガラクトシダーゼインサイチュｍＲＮＡ発現パターン（図２Ｇ−Ｌ）は、野生型組織内のＦｇｆ１４のものと基本的に同じであり、これはエキソン２とエキソン３の間の３ｋｂのイントロンの欠失がＦｇｆ１４の発現を制御する調節要素を分断しないということを示唆していた。さらに、ヒトの成体脳の中のＦＧＦ１４局所発現のノーザンブロット分析は、小脳の中で最高レベルを、海馬、小脳扁桃、大脳皮質、線条体、及び視床内で中乃至高レベルを示し、これは、成体マウス組織上のインサイチュデータと一貫性をもっていた。脳梁及び黒質は、有意な発現を全く示さなかった。これらのデータは、Ｆｇｆ１４の発現パターンが種全体を通して保存されていることを実証した。
【００６０】
ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌタンパク質の発現パターンを評定するために、Ｘ−ｇａｌ染色により、インサイチュでβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を局在化した。ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌは小脳及び線条体内で強く発現され、背側大脳皮質、海馬及び視床下部で穏かに発現された（図３Ａ−Ｃ）。インサイチュハイブリダイゼーション及びノーザンブロット法により決定されたＦｇｆ１４写し分布パターン（図２）と包括的に一貫していたものの、Ｘ−ｇａｌ染色は、著しい差異を顕示した。驚くべきことに、ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌは、軸索内に効率良く局在化され、ニューロン細胞体内ではほとんど検出できなかった。例えば、小脳内では（図３Ｄ及び３Ｅ）、ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌ染色は、顆粒細胞の軸索が拡張し線維束収縮する分子層（ＭＬ）内で最も強く、一方、Ｆｇｆ１４Ｎ−βＧａｌ及びＦｇｆ１４ｍＲＮＡは、顆粒細胞の細胞体を含む内部顆粒細胞層（ＩＧＬ）の中で局在化されている。海馬内では（データは示さず）、ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌは、歯状顆粒細胞の軸索を含む門部領域に大部分が局在化され、一方Ｆｇｆ１４ｍＲＮＡは顆粒細胞層に局在化されていた。さらに著しいことに、繊維収集物のみを含む領域である脳梁は、Ｘ−ｇａｌで強く染色された（図３Ｂ，Ｃ）。これとは対照的に、インサイチュハイブリダイゼーション及びノーザンブロットは共に、脳梁内でのＦｇｆ１４ｍＲＮＡの発現を全く示さなかった。ＧＡＢＡ受容体α６サブユニット調節要素の制御下で顆粒細胞内でβ−ガラクトシダーゼを発現する対照トランスジェニックマウスは（Bahn et al., 1997; Jones et al., 1997）、主としてＩＧＬ内にそしてＭＬ内に拡散的に分布したβ−ガラクトシダーゼ活性を示す（図３Ｆ）。合わせて考慮した場合、これらのデータは、ＦＧＦ１４の最初のエキソンが、軸索内にβ−ガラクトシダーゼを導くのに充分であることを実証しており、又、ＦＧＦ１４がそれ自体ニューロンプロセス内にトライックされうるということを示唆している。
【００６１】
ＦＧＦ１４は、ニューロンの発達にとって不可欠ではない。
Ｆｇｆ１４は、胚の発育中に中枢神経系の中で広く発現されることから、我々は、ＦＧＦ１４の喪失がニューロンの形成異常を結果としてもたらし得るという仮説を立てた。しかしながら、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、生存可能でかつ繁殖力を有し、２０ヵ月の期間にわたり死亡率を増大させなかった（Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGal：ｎ＝１６；ｗｔ：ｎ＝１２）。３つの異なる組織学的染色液を用いた脳構造の検査は、生後３〜４ヵ月のＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて細胞体が正常に器質化していること（ニッスル染色液、図示せず）；脱髄の証拠が全くないこと、（luxal fast blue、図４Ａ−Ｄ）、そして軸索の変性が全くないこと（銀染色液、図４Ｅ−Ｈ）を明らかにした。Ｆｇｆ１４は、移動するニューロンを含む領域である発育中のＣＮＳの脳室下帯ゾーン内で最も強く発現されていることから（Wang et al., 2000a）、我々はＢｒｄＵ誕生日決定によりニューロンの移動を検査した（Chae et al., 1997）。妊娠したマウスに、妊娠１３日目にＢｒｄＵを注射した。野生型及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスから生後１ヵ月で調製した冠状切片を、移動後のニューロンの場所を同定するためにＢｒｄＵについて染色した。前海馬レベルの切片は、大部分のＢｒｄＵ標識づけされたニューロンがＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス（図４Ｉ）及び野生型同腹子（図４Ｊ）の両方において皮層ＩＶ及びＶ内に局在化されている、ということを同定した。かくして、ニューロン移動又は脳の組織学のいずれも、Ｆｇｆ１４の欠如したマウスにおいては分断されているように思われなかった。
【００６２】
Ｆｇｆ１４が欠如したマウスにおける運動失調及び多発性運動異常
野生型マウスは、尻尾で吊るされていることの応答としてその後肢及び指を拡張する。これとは対照的に、６０％の成体Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス（Ｇ５；Ｃ５７Ｂ６／Ｊ背景、ｎ＝１０）は、尻尾で吊るされたとき、その後足をひっ込めその指をにぎり締めた。この行動の原因は、線条体（Yamamoto et al., 2000）及び小脳（Lalonde, 1987）の両方に帰属させられ、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスがこれらの領域に神経学的欠損を有する可能性があることを示唆していた。さらに、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、引きずった足跡パターン、広くなったスタンス、そして前足−後足の対応の欠如を伴う運動失調の歩行を示した（図５Ａ）。運動を協調させるＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの能力を評定するには、加速する回転棒が用いられた（図５Ｂ）。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスとの関係において対照マウスが全体として優れた能力を示すことに留意されたい。対照マウスは、連続した試行全体にわたり著しい能力の改善を示した。これとは対照的に、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、加速する棒上に数秒しかとどまることができず、その能力は、試行回数が増加しても改善しなかった（図５Ｂ）。
【００６３】
回転棒タスクについての成績は、協調、平衡、強度又はさまざまな体性感覚能力といったような複数の技能によって左右され得ることから、マウスを、４つの感覚運動試験の１セットでテストした（Wozniak et al., 1996）。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス及び同腹子対照の傾斜（６０°）スクリーン試験での成績は、図５Ｃに示されている。これらのデータは、両方のグループが、全６０秒の試行期間中スクリーン上にとどまることができたものの、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、傾斜したスクリーンの上部までよじ登るのにはるかに長い時間がかかった、ということを示している。試行全体にわたりスクリーン上にとどまるＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの能力は、それらが筋肉強度においてひどく損われていなかったことを示唆している。ただし、これは、相対的に鈍感な強度尺度である（Brosnan-Watters et al., 1996）。
【００６４】
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスが、傾斜したスクリーンの上部までよじ登るのに対照よりも長い時間かかったという発見事実は、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスが協調及び／又は強度の欠損を有し得るということを示唆しているが、成績の差の主たる原因であるのがどの機能であるかを知ることはむずかしい。これらの発見事実に関連しているのは、より慣習的な握力試験であるとみなされている倒置スクリーン試験（図５Ｃ）である。この試験では、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスはひどく損われており、対照マウスが試行全体にわたりスクリーン上にとどまったのに対し、倒置スクリーン上数秒しかにとどまることができなかった。これらの結果は、協調の混乱がその成績の低さに貢献した可能性があるものの、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの握力が損われていたことを示唆している。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは同様に、対照マウスに比べて著しく短かい時間しかプラットフォーム及び棚上でその平衡を保つことができなかったという点で、棚及びプラットフォーム試験（図５Ｄ＆Ｅ）でも機能が損なわれていた。同様にして、運動失調によりこれらの結果の説明がつくものの、これらの能力不足に対する平衡、協調及び／又は強度の潜在的混乱の相対的寄与を知ることは困難である。
【００６５】
歩行開始試験でも又、集団遂行行動の差が観察され、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、輪郭どりされた正方形の外への運動（移動）の開始の著しい遅れを示した（図５Ｆ）。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGal及び対照マウスが、１時間の試験セッション中自発運動に関して異なるとは思われなかったことから、これは、興味深い発見である。歩行開始データは、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスが運動開始の遅れを示すことを示唆しているものの、マウスにおける以前の薬物研究は、情動反応性によっても移動の遅れの説明がつくということを示唆している（例えばBrosnan-Watters et al., 1996）。棚及びプラットフォーム試験でのＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの成績の低さは運動失調で説明できるとしても、寄与因子として筋肉強度の穏かな欠損を度外視することはできない。
【００６６】
およそ生後１ヵ月で、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、後肢が過伸展した状態で発作性前肢慢性けい縮を発生させる。症候は一日に数度起こり、７〜１２分間持続する。時々、症状の発現が１５〜２０分間持続することが観察された。若い成体（生後１〜３０日）では、症状の発現は、立上がり時の平衡喪失及び前肢の震元をひき起こす。これらの症候は、より月齢の高いマウス（３ヵ月以上）においてはさほど重症でない。これらの症候発現は発作に似ていたため、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、脳波検査（ＥＥＧ）によって監視された。多動症運動の症候発現と相関関係のある表面てんかん様ＥＥＧパターンは全く見られず（４匹の異なるＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス内でｎ＝８の症候発現）。これらの症候発現が発作でなかったことを示唆していた。
【００６７】
発作性運動誘発型コレオアテトーシス及び発作性筋緊張異常を含めたマウス及びヒトの両方における複数のタイプの多発性運動異常が立証されてきた（Bhatia, 1999; Vidailhet, 2000）。多動症及び減動症の両方の運動障害共、脳幹神経節内の病変によってひき起こされる可能性があるということが示唆されてきた。発作性筋緊張異常のげっ歯類モデルを研究することで、脳幹神経節系内の機能的混乱が神経病理学の主たる病因でありうるということがわかった（Gerrert et al., 2000; Nobrega et al., 1996; Rehders et al., 2000）。脳幹神経節系内のＦｇｆ１４の卓越した発現及び筋緊張異常症候発現中のてんかん様活動の欠如からみて、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおける自然発生的神経学表現型は、発作ではなく筋緊張異常の１形態と、より一貫性をもつものであると思われる。
【００６８】
線条体黒質経路内での黒質線条体ニューロンの無欠性及びＦＧＦ１４Ｎ−βＧａｌの発現。
脳幹神経節系は、ドーパミン作動性ニューロン及びＧＡＢＡ作動性線条体黒質及び線条体淡蒼球ニューロンを含むフィードバック回路を含んでいる。神経伝達物質ドーパミンの生物学的作用は、２クラスの受容体つまりＤ１（Ｄ１及びＤ５）クラスとＤ２（Ｄ２、Ｄ３及びＤ４）クラスによって媒介される。Ｄ１及びＤ２受容体は、成体の脳の中の最も豊富なドーパミン受容体である（Missale et al., 1998）。刺激性Ｄ１受容体は、線条体黒質ニューロン上で発現され、阻害性Ｄ２受容体は、シナプス前に黒質線条体上ニューロンで、又シナプス後に線条体淡蒼球ニューロン上で発現される（Gerfen, 1992）。
【００６９】
パーキンソン病といったような神経筋肉疾患には、往々にして、黒質緻密部（ＳＮｃ）から線条体まで突出するドーパミン作動性黒質線条体ニューロンの変性が関与している（Dawson, 2000; Smith and Kieval, 2000）。ドーパミン合成中の速度制限酵素であるチロシンヒドロキシラーゼのための免疫染色は、生後２．５ヵ月でのＳＮｃ及び腹側被蓋部域（ＶＴＡ）内にドーパミン作動性ニューロンが正常に現われることを顕示しており（図６Ａ及びＢ）、これはドーパミン作動性ニューロンの変性が全くないことを示唆している。線条体内の正常なＴＨ染色強度は、線条体に対するドーパミン作動性ニューロンの軸索方向突起も又無傷であることを示唆している（図６Ｄ及びＥ）。腹側線条体は自発運動の調節に関与している（Swanson et al., 1997）。ドーパミン及びその代謝産物である３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモパニリン酸（ＨＶＡ）のこの領域内でのレベルの検査は、生後８ヵ月のＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス及び対照における比較可能なレベルを立証した（図６Ｆ）。正常なＴＨ染色及びＤＡレベルは、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて、ドーパミン作動性ニューロンが構造的に正常であり正常量のドーパミンを産生することを表わしている。このことは、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおける欠損が、ドーパミン作動性ニューロンの下流側にあることを示唆している。
【００７０】
ノーザンブロット（ヒトの脳）及びインサイチュハイブリダイゼーション（マウスの脳）の両方共が、黒質内におけるＦｇｆ１４（又はβｇａｌ）ｍＲＮＡの発現を検出することができなかった（図２）。これとは対照的に、ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌタンパク質についての染色は、線条体、淡蒼球及び黒質内で強い活性を示した。匹敵する黒質の切片内でのＴＨ及びＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌ染色パターンの比較（図６Ａ−Ｃ）は、黒質網状部内に存在するＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌタンパク質及びＳＮｃ内のＴＨとの相互に排他的な発現を示した。これらのデータを合わせて考慮すると、Ｆｇｆ１４Ｎ−βＧａｌがドーパミン作動性ニューロンによって発現されず、線条体淡蒼球（Ｄ２Ｒ）又は線条体黒質（Ｄ１Ｒ）経路のいずれか又は両方の軸索内で発現されるということがわかる。
【００７１】
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、ドーパミンアゴニストに対する異常応答を示す
脳幹神経節系内のＦＧＦ１４の卓越した発現及び運動調節における脳のこの部分の重要性は、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスがドーパミン作動性アゴニストに対し異常な応答を有し得ることを示唆した。ドーパミン作動性経路は、精神刺激薬例えばコカイン及びアンフェタミンにより活性化され得る。両方の薬物共シナプスドーパミンレベルを増加させ、マウス、ラット及びヒトにおける活発性過度を結果としてもたらす。コカインは、ドーパミン輸送体の機能を遮断しかくしてドーパミンの再摂取を阻害することによりシナプスドーパミンレベルを増大させる。アンフェタミンは、再接種を阻害することに加えてシナプス前神経末端からのドーパミンの放出をひき起こす（Jones et al., 1998）。
【００７２】
脳幹神経節系の機能的無欠性を検査するため、コカイン、アンフェタミン及び特異的ドーパミン受容体アゴニストでの抗原誘発を受けたＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの中での自発運動を監視した。１０ｍｇ／ｋｇの用量で、コカインは、野生型同腹子では有意な活動過剰応答をひき起こす一方で生後９〜１２ヵ月の雄のＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて自発運動過剰を誘発することができなかった（図７Ａ）。２及び４ｍｇ／ｋｇの用量でのアンフェタミンに対する活動過剰応答は、野生型同腹子の場合に比べＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて著しく低いものであった（ｐ＜０．０１）（図７Ａ）。
【００７３】
ドーパミンＤ１受容体のシグナリングは、精神刺激薬で処置されたマウスの活動過剰応答において重要な役割を果たす。ドーパミンＤ１受容体欠損マウスには、コカインに対する運動応答が完全に欠如している（Xu et al., 1994）。さらに、ドーパミンＤ１受容体欠損マウスは２ｍｇ／ｋｇのアンフェタミンに対し応答せず、５ｍｇ／ｋｇのアンフェタミンに対する応答は減少している（Xu et al., 2000b）。アンフェタミンは、細胞外ドーパミン濃度を増加させる上でコカインよりも効力が高いと思われる。２ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇで、アンフェタミンは、ＤＡの流出を基線より上にそれぞれ３５０％又は７５０％だけ上昇させる（Butcher et al., 1988）。これとは対照的に、２０ｍｇ／ｋｇのコカインは、シナプスドーパミンを基線より上にわずか１２０％しか増大させなかった（Akimoto et al., 1990）。コカイン及びアンフェタミンに対する応答差は、線条体内で放出されるＤＡの量を反映する確率が高く、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスがコカインにより誘発された細胞外ドーパミンのわずかな増加に対し応答せずアンフェタミンによって誘発されたドーパミンの高い濃度に対し（比較的程度は低いが）応答することができるということを示している。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGal及びＤ１Ｒ−／−マウスにおける精神刺激薬に対する応答の減少は、刺激性ドーパミンＤ１受容体含有ニューロン（線条体黒質経路）を通したシグナリングの減少を反映していると思われる。この仮説は、野生型マウスのものに比べＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいてＤ１受容体特異的アゴニストＳＫＦ３８３９３により誘発される活動過剰応答がわずかに減少すること（ｐ＝０．１２）によってさらに裏づけされる（図７Ｂ）。
【００７４】
Ｄ１及びＤ２は、異なるニューロン個体群において大部分が分離されていると思われ、ニューロンのわずか２０〜２５％しか両方の受容体を発現しない（Surmeier et al., 1998）。シナプス前Ｄ２受容体の活性化は、ＤＡ放出の減少ひいては自発運動の減少を結果としてもたらし、一方、シナプス後のＤ２受容体の活性化（線条体淡蒼球経路）の活性化は、自発運動のわずかな増加を結果としてもたらす。キンピロールは、ラットにおける自発運動に対し二相性効果をもつ可能性のあるＤ２−クラスの受容体アゴニストである（Frantz及びVan Hartesneldt, 1999）。マウスにおいては、０．５ｍｇ／ｋｇの用量が自発運動を減少させることが示された（Geter-Douglass et al., 1997）。これらの結果と一貫して、キンピロールは、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、野生型マウスにおいて自発運動を９分の２に減少させた（図７Ｂ）。これとは対照的に、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、キンピロールに対する有意な応答を全く示さなかった（ｐ＜０．００１）（図７Ｂ）。
【００７５】
キンピロールに対する応答の欠如は、Ｄ２受容体媒介シグナリングがＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて損われていることを示唆している。
【００７６】
Ｆｇｆ１４欠損マウスにおけるコカイン誘発されたｃ−ｆｏｓ活性化の減少
自発行動に対するその急性効果に加えて、コカインは、線条体内の遺伝子発現に対し強力な効果をもつ（Graybiel et al., 1990）。活性化されたドーパミン受容体は、ｃ−ｆｏｓといったような前初期遺伝子の発現及び活性化を結果としてもたらす一連の第２メッセンジャカスケードを開始させる。ｃ−ｆｏｓ発現の誘発は、コカイン注射から３０〜４０分後に起こり、２時間でピークになる（Moratalla et al., 1996a）。Ｄ１及びＤ２受容体は、ｃ−ｆｏｓ誘発において異なる役割をもつ（Alonso et al., 1999; Le Moine et al., 1997; Robertson and Jian, 1995）。Ｄ１受容体の活性化は、線条体におけるｃ−ｆｏｓ発現をアップレギュレートする。Ｄ２受容体の活性化は、線条体内のｃ−ｆｏｓの基底発現をダウンレギュレートするが、逆説的に、淡蒼球内でのｃ−ｆｏｓ発現を増大させる。マウスにおけるｃ−ｆｏｓ誘発のためのコカインの最適用量は４０ｍｇ／ｋｇである（Moratella et al., 1996b）。この用量でコカインは、２時間後に野生型マウスの線条体内でｃ−ｆｏｓ発現を確実に誘発した（図８Ａ，Ｃ及びＥ）。これとは対照的に、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスでは、強直性発作が開始されたにせよ、線条体ｃ−ｆｏｓ誘発は劇的に減少した（図８Ｂ，Ｄ及びＥ）。野生型及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの間のｃ−ｆｏｓ誘発の違いは、発作から海馬、嗅球及び小脳を含めた多数の脳領域内でのｃ−ｆｏｓ発現を誘発することから、発作活動の帰結であるとは考えにくい。同様に、線条体内でコカインにより誘発されたｃ−ｆｏｓ発現は、発作の始まりと大方独立している（Clark et al., 1992）。これらのデータは、ＦＧＦ１４の欠如が、線条体ニューロン内のコカインに応答した前初期遺伝子誘発を特異的に損なうことを示唆している。
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、コカイン及びＰＴＺによって誘発された発作に対する低減された閾値を有する。
【００７７】
高い用量のコカインは一般に、てんかん性発作を結果としてもたらす。コカインで誘発された発作に対する感受性は、遺伝子因子により大きく影響される。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＤＢＡ／２マウスよりもコカインにより誘発された発作に対しより感受性が高い（Hain et al., 2000）。ドーパミン受容体の活性化は、コカイン誘発された発作の開始において主要な役割を果たす。ドーパミンＤ１受容体は、けいれん促進効果をもち、一方Ｄ２受容体はけいれん防止効果をもつ（Ushijima et al., 1995; Waddington, 1993）。野生型マウスにおいては（ｎ＝１０）、コカインの注入（４０ｍｇ／ｋｇ）は発作を誘発しなかった。これとは対照的に、４０ｍｇ／ｋｇのコカインをＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスに注射すると、ほとんどが後肢における短かい強直性運動とそれに続く不動期間が結果としてもたらされた（テスト対象マウス９匹中ｎ＝９）。ＥＥＧ記録は、発作様の症候に付随するけいれん様活動（緩慢なリズム及び小さなスパイク）を示した（図９Ａ−Ｄ）、（ｎ＝３１  遺伝子型）。８０ｍｇ／ｋｇのコカインで、野生型マウス（ｎ＝２）とＦｇｆ１４欠損マウス（ｎ＝２）の両方共が、そのＥＥＧ記録の中に付随するけいれん様スパイクを伴う強直−間代性発作を発生させた（図９Ｅ及びＦ）。コカイン４０ｍｇ／ｋｇでのＥＥＧ変化は、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの大脳皮質が興奮性亢進状態にあることを示している。
【００７８】
発作閾値の低減が、皮質の過敏性に対するより広範囲に及ぶ影響の結果と対比して、コカインに対する感受性の増大とに制限されているか否かを見極めるために、Ｆｇｆ１４欠損マウス及びその野生型同腹子を、ゲッ歯類において実験的発作を誘発するために一般に用いられている薬物であるペンチレンテトラゾル（ＰＴＺ）で処置した（Fisher, 1989）。７５ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇの両方において、Ｆｇｆ１４欠損マウスは、ＰＴＺで誘発した発作までの著しく短かい潜時を示した（図９Ｇ）。
【００７９】
Ｆｇｆ１４欠損マウスは、ＰＴＺ誘発された発作までの劇的に短縮した潜時のみならず、増大した致死時間をも示す。野生型マウスは、発作の始まりから１５〜２０秒以内で死に至る。驚くべきことに、Ｆｇｆ１４欠損マウスは、何時間も持続するけいれん重積状態に入る（図１３）。従ってＦｇｆ１４（−／−）マウスは、皮質興奮性亢進及び、皮質興奮性亢進に影響を及ぼす薬理学的作用物質を研究するための有用なモデルを提供する。
【００８０】
Ｆｇｆ１４欠損マウスにおけるＰＴＺ治療に応答したＥＲＫ活性化の上昇
Ｅｇｆ１４は、４つの関連する遺伝子、Ｆｇｆｓ１１−１４の亜系統群である。密に関係する系統群成員ＦＧＦ１２は、ＭＡＰキナーゼ骨格タンパク質、islet-brain-2（ＩＢ2）と相互作用する。興味深いことに、ＦＧＦ１２、ＩＢ2の不在下では、ＩＢ2は、テスト対象のいかなるＭＡＰキナーゼにも結合しないが、ＦＧＦ１２の存在下では、ＩＢ2は効率良くＰ３８Ｓと結合し、ＦＧＦ１２がＭＡＰキナーゼシグナリング経路を変調させる上で１つの役割を有することを示唆している（Schvorlemmer and Goldfarb, 2001）。結合実験は、ＦＧＦ１４が同じくＩＢ2とも相互作用することを実証し、ＦＧＦ１４が同様にＩＢ2と特異的ＭＡＰキナーゼの会合を調節できるということを示唆している。ＥＲＫ活性比レベルはＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて改変されるか否かを見極めるため、我々はＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス及びその野生型同腹子の脳内のＥＲＫ及びホスホ−ＥＲＫレベルを検査した。マウスには、ＰＢＳと７５ｍｇ／ｋｇのペンチルテトラゾル（ＰＴＺ）を腹腔内注射した。注射から９０秒後に、脳組織を収獲し、小脳及び皮質半球へと分割し、均質化した。免疫ブロット法により、ＥＲＫ及びホスホ−ＥＲＫを検出した。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス及び野生型同腹子は、小脳半球及び大脳半球の両方において、ＰＢＳ注射後類似のＥＲＫ及びホスホ−ＥＲＫレベルを示した（図９Ｈ）。これとは対照的に、ＰＴＺでの処置の後、ホスホ−ＥＲＫの相対的レベルは、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの大脳半球において２倍に上昇した（ｎ＝７、ｐ＝０．０３６）が、野生型マウスではそうではなかった（図９Ｉ）。ＰＴＺでの処置後小脳内ではＥＲＫ活性化のいかなる変化も観察されなかった。
【００８１】
発明人らは理論により束縛されないものの、上述の神経薬理学的結果は以下のように説明がつくと考えられている：すなわち、
ＦＧＦ１４は、発達中のＣＮＳ及び成体の脳の中で広く発現される。ＣＮＳ発達及び成体脳機能におけるＦＧＦ１４の役割を見極めるため、我々は、相同的組換えによりＦｇｆ１４遺伝子を分断し、エキソン２内にβ−ＧｃＤＮＡをインフレーム挿入した。Ｆｇｆ１４N-βGalｍＲＮＡは、脳の適正な領域内で発現されるものの、ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌタンパク質は、軸索プロセス内にトライックされ、かくしてｍＲＮＡが発現されない場所に存在している。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは生存可能で繁殖力があり、組織学的に正常であるものの、重度の運動失調及び多発性運動異常を発生させる。
【００８２】
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおける脳幹神経節の視床皮質回路
脳幹神経節回路の現行モデル（図１０Ａ）では、線条体（尾状核−被粒、ＣＰｕ）は大脳皮質からの入力を受けとり、２つの経路を通してＳＮｒ及び淡蒼球（Ｇｐｉ）の内部セグメントまで突出する（Todd及びPerlmutter, 1998）。線条体黒質経路内のニューロンは、Ｄ１クラスのドーパミン受容体（Ｄ１Ｒ）を発現し、阻害的入力をＧｐｉ／ＳＮｉに提供する。線条体淡蒼球ニューロンは、主としてＤ２クラスのドーパミン受容体（Ｄ２Ｒ）を発現し、淡蒼球（Ｇｐｅ）及び視床腹部核（ＳＴＮ）の外部セグメントに対する阻害性突起を介してＧｐｉ／ＳＮｒに正味興奮性入力を提供する。線条体黒質及び線条体淡蒼球経路の両方に突出するドーパミン作動性ニューロンは、ＤＡ放出を阻害するシナプス前Ｄ２受容体を発現する（Missale et al., 1998）。Ｇｐｉ／ＳＮｒは、これらの経路からの入力を統合し、視床に対し阻害シグナルを提供する。これら２つの経路からの正味入力の平衡は、運動の計画、開始及び実施にとってきわめて重要である（Obeso et al., 2000; Todd and Perlmutter, 1998; Vitek and giroux, 2000; Wichmann and Delong, 1996）。パーキンソン病、ハンチントン病及び筋緊張異常といったようなヒトの運動障害は、これらの経路間の平衡を実際に分断する脳の病変によってひき起こされる。
【００８３】
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいては線条体黒質及び線条体淡蒼球経路の両方が、影響を受けていると思われる。２組の一連の証拠が、線条体黒質経路の機能不全を示している。まず第１に、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、コカイン及びアンフェタミンによって誘発された高いシナプスドーパミンレベルに応答して、自発運動過剰を低減させた。野生型マウスにおいては、この活動過剰応答は、線条体淡蒼球（シナプス後Ｄ２Ｒ）活性と相乗作用する線条体黒質（Ｄ１Ｒ）活性により媒介される（図１０Ｂ）（Gershanik et al., 1983; Jackson and Westlind-Danielsson, 1994; Missole et al., 1998）。第２に、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、Ｄ１ＲアゴニストＳＫＦ３８３９３によって誘発される自発運動の最高３０％の低減を示す（図７Ｂ）。
【００８４】
薬理学的証拠は同様に、線条体淡蒼球（Ｄ２Ｒ）が媒介するシグナリングにおける機能不全をも実証している。投薬を受けたことのないマウスでは、キンピロールが、０．０３〜２．０ｍｇ／ｋｇの間の用量で自発運動の用量依存性減少を惹起する（Chen et al., 2000; Geter-Donglass et al., 1997; Jones et al., 1999; Wang et al., 2000b）。０．５ｍｇ／ｋｇのキンピロールは、野生マウスにいて自発運動を最高９分の２に減少させたが、０．５２は２ｍｇ／ｋｇのキンピロールは、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて自発運動機能低下をひき起こすことができなかった。キンピロールに応答した自発運動機能低下は、線条体経路内のシナプス前活性（シナプスドーパミンの減少）及び線条体淡蒼球経路内のシナプス後活性に対する卓越した効果により説明することができる（図１０Ａ）。正味自発運動はＳＮｒの統合機能に左右されることから、線条体淡蒼球経路はＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス内の線条体黒質経路よりも重大な影響を受けると思われる（図１０Ｂ）。
【００８５】
これらの実験は、Ｄ１受容体媒介線条体黒質経路及び線条体淡蒼球経路の両方における機能的欠陥を明確に示している。両方の経路におけるＤ１Ｒ及びＤ２Ｒ発現ニューロンは、主として、ＧＡＢＡ作動性である（Graybiel, 1990）。ＦＧＦ１４は、軸索内に局在化されている確率が最も高いことから、観察された表現型は実際、ＧＡＢＡにより媒介されたシナプス伝達における欠陥、又は小脳のトライックといったような軸索機能のいくつかの側面の結果としてもたらされる可能性がある。
【００８６】
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス内の皮質性興奮性亢進
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスには、発作性多動症の症候発現が見られる。線条体黒質及び線条体淡蒼球経路は、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて異なる度合で影響を受けることから、我々は、正味効果が、ＧＰｉ／ＳＮｒへの興奮刺激の低減、視床に対する阻害性入力のその後の減少及び運動皮質に対する興奮刺激の増大であると断定する（図１０Ｂ）。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおける皮質興奮性の増強は、コカイン誘発された発作に対する感受性の増大によって裏づけされる。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの皮質活動過剰は、ハンチントン病といったようなヒトの多動症運動障害、パーキンソン病におけるＬ−ｄｏｐａ誘発された運動異常及び筋緊張異常に似ている（Obeso et al., 2000; Vitek and Giroux, 2000; Wickmann and DeLong, 1996）。運動皮質への高い興奮性入力は多動症運動障害における一般的テーマであるものの、一次的病因は不均一なものである。ハンチントン病では（Wichmann and DeLong, 1996）。線条体淡蒼球経路中の線条体ニューロンの変性は、結果として、ＧＰｅに対するＤ２Ｒ媒介された阻害性入力の劇的な減少及びＧＰｉ／ＳＮｒに対する興奮性入力のその後の減少を結果としてもたらす。これとは対照的に、Ｌ−ｄｏｐａで誘発された運動異常の場合、Ｄ１Ｒで媒介されたシグナルの過剰活性化及びＧＰｅに対するＤ２Ｒ媒介阻害入力の減少が、病気の一次的原因であると考えられている（Obeso et al., 2000; Vitek及びGiroux, 2000）。
【００８７】
マウス、ラット及びヒトの間には種の差異が存在する。ラットにおいては、Ｄ２受容体特異的アゴニスト、キンピロールが、マウスでは見られない自発運動に対する二相性効果を有する（Geter-Douglass et al., 1997; Halberda et al., 1997）。ラットとヒトの間でも種の差異が立証されてきた。ラットの線条体内では、Ｄ１受容体のレベルは、Ｄ２受容体よりも高い；一方ヒトにおいては、ドーパミン受容体の２つの重要なタイプが類似のレベルで発現される（Hall et al., 1988）。従って、Ｆｇｆ１４の機能喪失の表現型に関する帰結は、これらの種の間で異なる可能性がある。
【００８８】
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスモデルの発作性筋緊張異常
筋緊張異常というのは、さまざまなニューロン経路に病因をもつ可能性のある不均一な症候群グループである。線条体黒質及び線条体淡蒼球経路の平衡失調はヒト及びゲッ歯類における筋緊張異常症候発現を開始させるのに充分であるが、脳のその他の部分の病理も同じく筋緊張異常をひき起こす可能性がある（Jarman and Warner, 1998; Richter and Loscher, 1998）。ＦＧＦ１４は小脳顆粒細胞内で卓越して発現されることから、小脳の機能不全も同様に筋緊張異常及び運動失調表現型の両方に影響を及ぼす可能がある。
【００８９】
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおける不随意の運動表現型の症候発現の性質は、一次的発作性筋緊張異常の唯一のゲッ歯類遺伝モデルである筋緊張異常ハムスタ（ｄｔsz）の表現型と類似している（Loscher et al., 1989）。ｄｔszハムスタにおける突然変異は、常染色体劣性であり、遺伝子は同定されたことがない。ｄｔszハムスタの場合と同様、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおける筋緊張異常症候発現前及びその間の両側性ＥＥＧ記録は、全身的運動関与にもかかわらず、いかなるけいれん様異常も明らかにしなかった。ｄｔszハムスタにおける筋緊張異常事象は、自然発生的に開始することもあるし又は穏やかなストレス刺激によって誘発される可能性もある。各事象の重症度は可変的であるが、６段階に分類することができる（Rehders et al., 2000）。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて最も頻繁に見られる表現型は、動物が過剰延伸した後肢、ねじれ運動及び平衡喪失を有するｄｔszハムスタにおける第３及び第４段階に対応している。ｄｔszハムスタの場合とは異なり、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおける筋緊張異常症候発現には往々にして前肢の震えが伴う。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスについて仮定されてきたものと同様に、増大した正味阻害性線条体出力（視床に対する阻害性シグナルの減少）が、ｄｔszハムスタにおける発作性筋緊張異常の原因として示唆されてきた（Nobrega et al., 1999; Nobrega et al., 1996; Rehders et al., 2000）。ｄｔszハムスタにおける筋緊張異常発作の潜時及び重症度は、ペンチレンテトラゾルの亜けいれん用量によって著しく低減され（Loscher et al., 1989）、ｄｔszハムスタの皮質が、より高レベルの興奮性にあることを示唆している。
【００９０】
Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおけるコカインによるｃ−ｆｏｓ誘発の欠如
線条体内での前初期遺伝子発現は、コカイン及びアンフェタミンといったような精神刺激薬によって（Graybiel et al., 1990）、及び神経安定薬ハロペリドール及びナクロプリドによって（Robertson and Jian, 1995）誘発可能である。これらの医薬品は、自発運動に対し相反する効果をもち、ｃ−ｆｏｓ誘発が自発運動の増大に対し直接応答性をもたないことを示している。発作活動及び低酸素症といったようなさまざまな事象が、前初期遺伝子誘発を開始できる。増大した細胞代謝についての一般的マーカーとして、前初期遺伝子ｃ−ｆｏｓの誘発された発現を使用することができる（Kovacs, 1998において再考）。線条体内のｃ−ｆｏｓの発現は、Ｄ１受容体活性化によりアップレギュレートされる（Keefe and Gerfen, 1995）。Ｄ１Ｒ欠損マウスには精神刺激薬に応答したｃ−ｆｏｓ誘発が完全に欠如していることから、線条体黒質（Ｄ１Ｒ）活性化は、コカインに応答してのｃ−ｆｏｓ誘発にとって不可欠であると思われる（Moratalla et al., 1996b）。逆説的であるが、Ｄ１及びＤ２の両方の受容体の活性化は、ｃ−ｆｏｓ誘発に対し相乗効果をもつ（Keefe and Gerfen, 1995）。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス内の線条体内のｃ−ｆｏｓ誘発の喪失は、線条体黒質及び線条体淡蒼球経路の両方を通したシグナリングの減少及び場合によってはそれらの間の相乗作用の喪失を反映すると思われる。
【００９１】
ＦＧＦ１４の分子機能
この例Ｉ及びいくつかの最近の刊行物内で紹介されたデータは、ＦＧＦ１４が、軸索機能、シナプトソーム機能又は神経伝達のいずれかにとって重要であることを示唆している。ここでは、ＦＧＦ１４が欠如したマウスの神経的欠陥を実証する。我々は又、エキソン１ｂによりコードされた７０個のアミノ酸が、β−ガラクトシダーゼタンパク質を軸索突起内に効率良くターゲティングするのに充分であることをも示している。これらの観察事実は、ＦＧＦ１４に対するニューロン機能を立証しており、ＦＧＦ１４自体が軸索突起内に局在化されていることを示唆している。
Ｆｇｆ１４は、４つの関連した遺伝子、Ｆｇｆｓ１１−１４の亜系統群の成員である。密に関連した系統群の成員ＦＧＦ１２は、ＭＡＰキナーゼ骨格タンパク質islet-brain-2（ＩＢ2）と相互作用する（Schoorlemmer and Goldfarb, 2001）。興味深いことに、ＦＧＦ１２の不在下で、ＩＢ２は、テストされたいずれのＭＡＰキナーゼにも結合しないが、ＦＧＦ１２の存在下では、ｐ３８δに効率良く結合し、ＦＧＦ１２がＭＡＰキナーゼシグナリング経路を変調する上で１つの役割をもつことを示唆している。ＩＢ2を結合するＦＧＦ１２の領域はＦＧＦコアドメイン及び分子のカルボキシ末端を内含するが、アミノ末端は必要としない（Schoorlemmer and Goldfarb, 2001）。予備結合実験は、ＦＧＦ１４が同様にＩＢ2と相互作用するもののＩＢ1とは相互作用しないことを実証し、ＦＧＦ１４が、ＩＢ2と特異的マップキナーゼの会合をも調節しうるということを示唆している。第２の関連する観察により、ＩＢ2とキネシンのカルボキシ末端ドメインの間の相互作用が同定された（Verhey et al., 2001）。これらのデータは、ＩＢ2、ひいてはＦＧＦ１２及びＦＧＦ１４がキネシンモーターにより軸索を下方へと輸送されたキネシンカーゴでありうるということを示唆している。しかしながら、ＦＧＦ１４の軸索トライックシグナルであるアミノ末端ペプチド（エキソン１ｂ）は、ＩＢ2結合ドメインとは全く異なり、従ってＦＧＦ１４軸索トライックにおいて独特の役割を有し得る。
【００９２】
実施例ＩＩ
この例ＩＩでは、例Ｉのトランスジェニックノックアウトマウスは、学習／記憶試験において評価された。この試験は、マウスがショックを受けこのショックと組合わされた聴覚手掛かり（発信者又は白色雑音サウンドバースト）を受けるという状況に対するパブロフ型条件付けを評価する。
【００９３】
一連の薬物抗原誘発に付した後のＦＧＦ１４ＫＯ及びＷＴマウスを用いて、条件づけされた恐怖タスクについて試験を行なった。静止行動を自動的に定量化するためにコンピュータによるデジタル画像システムを使用する新たに獲得した条件づけされた恐怖システムの中で、マウスを走らせた。このシステムを用いると、状況から得られる手掛り試験について、ＦＧＦ１４ＫＯ及びＷＴマウスの間にきわめて大きな差が存在することがわかった（ｐ＜０．００００５）。
【００９４】
ＦＧＦ１４ＫＯマウスは、テストされた８分中５分についてＷＴマウスに比べ著しく少ない静止を示し、ここで差異は、残りの３分のうちの２分について、わずかに無視できるものであった。ＦＧＦ１４ＫＯマウスは同様に、聴覚手掛かり試験でテストされたとき、ＷＴマウスよりも少ない静止を示し（ｐ＝０．０５０）、この時間中、これらのマウスは、予めショックと組合わされたサウンドバーストが８分間連続してオンに切換えられた後テストされた８分中２分の間著しく低い静止を示した。
【００９５】
改変された状況基線に応答して又は発信音／ショック（Ｔ／Ｓ）組合せにさらされた基本トレーニングの間に示した静止量に関し、グループに差異が見られたという証拠は全くなかった。しかしながら、トレーニング中の差は、わずかに無視できるものであり、ＦＧＦ１４ＫＯマウスが、第２のＴ／Ｓ組合せに対し比較的少ない静止を示したという証拠がいくつか存在した。
【００９６】
試験セッションをビデオテープにも銀画して、人間のオブザーバが戻って、観察された静止の量を定量化できるようにした。この方法により、我々は、聴覚手掛かりがオンに切換えられた８分のうちの２分間にＫＯマウスが著しく少ない静止を示し１分間の差異がわずかに無視できるものであった聴覚手掛かり条件づけの時間中にＦＧＦ１４ＫＯマウスが著しく少ない静止を示すこと（ｐ＝０．００６）に関する発見事実を確認した。
【００９７】
しかしながら、改変された状況基線の最初の１分間にＦＧＦ１４ＫＯマウスが著しく少ない静止を示したといういくつかの証拠は存在していた。重要なことに、状況から得られる手掛り試験についての差異は、静止の判断に人間のオブサーバを用いた場合にわずかに無視できるものであった（ｐ＝０．０８８）。ＦＧＦ１４ＫＯマウスは、１分間隔８つのうち１つの間だけ有意に少ない静止を示すものと判断された。もう１つの間隔について、差異はわずかに無視できるものであった。トレーニング中、いかなる差異も観察されなかった。
【００９８】
要約すると、両方の方法共、ＦＧＦ１４ＫＯマウスがＷＴ対照に比べ聴覚手掛かり試験中有意に多い静止を示すということを確認した。
【００９９】
実施例ＩＩＩ
この例ＩＩＩでは、神経芽細胞腫（Neuro−２ａ）細胞内のＦＧＦ１４−１ｂのシナプス局在化が実証され、ＥＧＦ１４の欠如が、海馬歯状回内の高い興奮性をひき起こすことが示された。
【０１００】
海馬興奮性
ハロタン麻酔を施した上でマウスを断頭した。脳を急いで除去し、低温酸素化人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中に入れた。ビブラトームを用いて腹側脳表面から海馬と内側嗅皮質の組合せの水平方向スライス（厚み最高５００μｍ＝）を取り出した。少なくとも１時間、加湿した界面チャンバ内でスライスを室温にてインキュベートした。生理学的記録のためには、個々のスライスを界面チャンバに移し、ここでそれらを酸素化人工脳脊髄液及び加湿された気体（９５％Ｏ2、５％のＣＯ2）を用いて、３４〜３５℃で連続的に過融解した。ＡＣＳＦは、７．３〜７．４のｐＨで、次のものを含有していた（ｍＭで）：ＮａＣｌ １２４、ＮａＨＣＯ3 ２６、ＫＣｌ ２、ＫＨ2ＰＯ4 １．３、Ｃ2Ｃｌ2 ２、ＭｇＳＯ4 １．０又は２．０、グルコース１０。
【０１０１】
２ＭのＮａＣｌが満たされたシングルバレルガラスマイクロ電極を用いて歯状回顆粒細胞から、細胞外フィールド電位記録を記録した。穿孔経路を介してシナプス入力を開始させるため、内側嗅皮質内に双極金属刺激電極を設置した。
【０１０２】
ブリッジモードのAxoclamp−２Ａ増幅器で自発的活動を連続的に記録し、その後の分析のためAxoscopeソフトウェアにより１ｋＨｚのサンプリング周波数でデジタル化した。増大する刺激強度に対するシナプス後応答を１０ｋＨｚでサンプリングし、個体群スパイクを開始させるべく最低の強度の刺激により惹起された集合スパイクの数によりこれを定量化した。対照又はＦＧＦ−１４ノックアウトマウスにおける単一の又は多数の集合スパイクの観察頻度をカイ２乗分析によって比較した。
【０１０３】
結果は、図１１及び１２に示されている。
本発明の本質及び範囲から逸脱することなく、本開示を読んだ後当業者には、その他のさまざまな例が明らかになることだろう。このようなその他の例全てがこの開示及び添付のクレームの範囲内に内含されるように意図されている。
【０１０４】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【０１０５】
この特許のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面（単複）を伴うこの特許のコピーは、必要な手数料を合わせて請求することで特許商標局から入手できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、Ｆｇｆ１４のターゲティングされた分断とＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの成長を示す。（Ａ）  Ｆｇｆ１４ゲノミック遺伝子座（上）、ターゲティングベクター（中）及びターゲティングされた対立遺伝子（下）の構造。コーディングエキソンは、黒の四角によって表わされている。ＰｏｌＩＩ−Ｎｅｏ−ｌｏｘＰ 遺伝子（黒の棒線）及びβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子（白の棒線）の場所は、ターゲティングベクター及び突然変異体対立遺伝子の中で標示されている。サザンブロットプローブの場所が示されている。Ｅ，Ｅｃｏ  ＲＩ；  Ｘ，ＸｂａＩ；  Ｂ，ＢａｍＨＩ；  Ｒｖ，Ｅｃｏ  ＲＶ；  Ｓ，ＳａｌＩ。（Ｂ）  ５´プローブ及び３´ゲノミックプローブでハイブリッド形成されたターゲティングされたＥＳクローン（レーン１及び２）及び野生型ＥＳクローン（レーン３）由来のゲノミックＤＮＡのサザンブロット。５´の相同的組換えを検出するため、ゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化させた。野生型対立遺伝子は、９ｋｂのバンドを生成し、ターゲティングされた対立遺伝子は７．５ｋｂのバンドを生成する。３´の相同的組換えを検出するため、ゲノミックＤＮＡをＥｃｏＲＶで消化した。野生型対立遺伝子は９ｋｂのバンドを生成し、ターゲティングされた対立遺伝子は４．５ｋｂのバンドを生成する。（Ｃ）  野生型（＋／＋）、異型接合（＋／−）及び同型接合（−／−）Ｆｇｆ１４N-βgalマウスのＰＣＲ遺伝子型特定。２５５ｂｐ（プライマＱＷ１２７及びＱＷ１２８）及び３５０ｂｐ（プライマＱＷ１２７及びＱＷ１２９）ＰＣＲ産物は、野生型及びターゲティングされた対立遺伝子をそれぞれ表わしている。（Ｄ）  野生型（＋／＋）、異型接合（−／−）及び同型接合（＋／＋）マウスの小脳由来のＲＮＡのノーザンブロット分析。左の図版は、臭化エチジウムで染色されたゲルを示す；１８ｓ及び２８ｓのｒＲＮＡの位置は、矢印で示されている。右の図版は、32Ｐ−α８ＣＴＰで標識づけされたＦｇｆ１４ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションに続くオートラジオグラフィを示す。（Ｅ）  純粋１２９ＳＶ／Ｊ遺伝的背景内のＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス及び同腹子の代表的成長曲線。インサートは、生後４〜５ヵ月での体重を示す。（Ｆ）  Ｃ５７Ｂ６／Ｊ遺伝的背景上への５世代を横断した後のＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス及び同腹子の代表的成長曲線。インサートは、生後４〜５ヵ月での体重比較を示す。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【０１０７】
【図２】図２は、成体マウスの脳内のＦｇｆ１４及びＦｇｆ１４N-βgalの発現及びヒトの脳内のＦＧＦ１４の発現を示す。（Ａ−Ｌ）インサイチュハイブリダイゼーションの暗視野像は、野生型（Ａ−Ｃ及びＧ−Ｉ）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（Ｄ−Ｆ及びＪ−Ｌ）マウスの一連の冠状切片内のＦｇｆ１４（Ａ−Ｆ）及びＦｇｆ１４N-βgal（Ｇ−Ｌ）の発現を示す。前脳、（Ａ，Ｄ，Ｇ，Ｊ）、中脳（Ｂ，Ｅ，Ｈ，Ｋ）及び後脳（Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ）を通して、代表的断面が示されている。ＣＰｕ、尾状核−被核；ＣＴ、大脳皮質；ドーパミン作動性、歯状回；ＣＢ、小脳。（Ｍ）  ヒトの脳の異なる領域内のＦＧＦ１４の発現を示すノーザンブロット分析。バンド強度は、Phosphor Imager分析により定量化され、データは、全脳内の発現レベルに正規化された。
【０１０８】
【図３】図３は、成体Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGal脳組織内のＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌの局在化を示す。（Ａ）  生後３ヵ月のマウスからのＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalの脳の矢状方向ホールマウントＸ−ｇａｌ染色。ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌ活性は、基底前脳及び小脳に見られる。２つの黄色の矢印は、パネル（Ｂ）及び（Ｃ）に示された２つの冠状切片の相対的位置を示す。（Ｂ，Ｃ）  凍結した冠状切片のＸ−ｇａｌ染色は、脳染（ＣＣ）、尾状核−被核（ＣＰｕ）、淡蒼球（ＧＰ）、歯状回（ドーパミン作動性）及び黒質網状部（ＳＮｒ）内のＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌ活性を示している。（Ｄ−Ｆ）  小脳中のＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌの軸索トライック。（Ｄ）小脳の内部顆粒細胞層（ＩＧＬ）内のＦｇｆ１４（又はＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal）ｍＲＮＡ発現を示すインサイチュハイブリダイゼーション。（Ｅ）  分子層（Ｍ２）内のＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌ活性の局在化。（Ｆ）  細胞質β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡがＧＡＢＡＡ受容体α６遺伝子内に挿入された対照マウスの小脳内のβｇａｌ活性の局在化（Ｒｅｆ．２７）。βｇａｌ活性は、ＩＧＬ及びＭＬの両方の中に局在化され、プルキンエ細胞（ＰＣ）層から排除されているという点に留意されたい。
【０１０９】
【図４】図４は、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス内の正常な脳細胞構築。野生型（Ａ及びＥ）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（Ｂ及びＦ）マウスの線条体を通った、及び生後３ヵ月の野生型（Ｃ及びＧ）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（Ｄ及びＨ）マウスの小脳を通った冠状切片。断面（Ａ−Ｄ）は、軸索の髄鞘形成を示すべくLuxol Fastブルーで染色されている。断面（Ｅ−Ｈ）は、軸索路を示すよう銀で染色されている。（Ｉ，Ｊ）胚１３．５日目でＢｒｄＵで子宮内で標識づけされ、ＢｒｄＵを含有する細胞について生後１ヵ月で検査された野生型（Ｉ）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（Ｊ）マウスの誕生日決定。
【０１１０】
【図５】図５．Ｆｇｆ１４欠損マウスマウスの感覚運動評価（Ａ）  野生型（＋／＋）マウス内での前足／後足の対応及び、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス内での前足−後足対応の欠如を示す歩行分析。（Ｂ）  野生型（ｎ＝６）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス（ｎ＝１０）の回転棒評価（１２９ＳＶ／Ｊ／Ｃ５７Ｂ６／Ｊの混合遺伝的背景）。全てのマウスは、６０秒間一定速度の回転棒（５ｒｐｍ）上にとどまるように予め訓練された。その後、５日間（一日あたり３回の試行）全体にわたり加速する回転棒上にとどまる能力についてマウスを試験した。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、試行期間全体にわたり（ｐ＜０．００１）能力を改善できなかった。（Ｃ）  スクリーニングリップ試験。マウスを６０°傾斜したスクリーン上に置いた。黒の棒線は、スクリーン上の時間（最大６０秒）を表わす。黒の棒線は、スクリーンの上部までマウスがよじ登るのに経過した時間を表わしている。灰色棒線は、マウスが倒置スクリーン上にとどまることのできた経過時間（最大６０秒）を表わしている。野生型マウス（ｎ＝９）、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス（ｎ＝８）。（Ｄ）  プラットフォーム試験及び（Ｅ）  棚試験は、小さなプラットフォーム又は棚の上でマウスが平衡を保つ経過時間を測定する。（Ｆ）  歩行開始試験。この試験は、大きな平滑な表面の中心の２１ｃｍの正方形の部域の外側にマウスが移動するのに必要とされる時間量を測定する。（Ｄ−Ｆ）  白の棒線は、野生型（ｎ＝９）を表わし、黒の棒線はＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス（ｎ＝８）を表わす。データは全て平均±ＳＥＭとして表現されている。星印は、＋／＋及び−／−グループ間の有意な差を表わしている（スチューデントｔ試験）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。
【０１１１】
【図６】図６．黒質及び線条体内のドーパミン作動性ニューロンの無欠性及び腹側線条体内のドーパミン／ドーパミン代謝産物レベル（Ａ，Ｂ）  野生型（＋／＋）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（−／−）マウス内で類似する染色パターンを示す黒質緻密部（ＳＮｃ）及び腹側被蓋野内のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）染色。（Ｃ）  黒質網状部（ＳＮｒ）内のＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌの局在化を示すＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal脳断面のＸ−ｇａｌ染色。（Ｄ，Ｅ）  野生型（Ｄ）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（Ｅ）マウスにおける類似した染色パターンを示す尾状核−被核（ＣＰｕ）内のＴＨ染色。（Ｆ）  腹側線条体内のドーパミン（ＤＡ）及びドーパミン代謝産物、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）のレベル。
【０１１２】
【図７】図７．刺激性薬物及びドーパミン受容体アゴニストに対する自発運動活性（Ａ）  野生型（ｎ＝９、白の棒線）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（ｎ＝１４、黒の棒線）のコホートを食塩水、コカイン（１０ｍｇ／ｋｇ）又はアンフェタミン（２及び４ｍｇ／ｋｇ）で処置し、自発運動について検定した。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、１０ｍｇ／ｋｇのコカインに対する自発運動を全く示さず（＋／＋マウスに対してｐ＜．００６）、ｄ−アンフェタミンの両方の用量に対する自発運動応答は低減していた（＋／＋マウスに対してｐ＜０．０１）（Ｂ）  同じマウスコホートを食塩水、Ｄ１受容体アゴニストＳＫ３８３９３又はＤ２受容体アゴニスト、キンピロールで処置した。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスには、Ｄ２アゴニスト、キンピロールに対する低自発運動が欠如していた（＋／＋マウスに対してｐ＜０．０００２）。Ｄ１アゴニストＳＫＦ３８３９３の注射後のグループ間の有意な差異（ｐ＝．１２）に向かう傾向がわずかに存在していた。データは全て平均±ＳＥＭ、として表現されている。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１。
【０１１３】
【図８】図８．コカインに応答したＣ−ＦＯＳ核局在化の誘発。食塩水（Ａ，Ｂ）又はコカイン（４０ｍｇ／ｋｇ）（Ｃ，Ｄ）の腹腔内注入から２時間後の野生型（Ａ，Ｃ）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（Ｂ，Ｄ）脳組織内のｃ−ＦＯＳの免疫組織学的検出。コカイン注入後、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、対照マウスに比べて低減したｃ−ＦＯＳ発現レベルを示す。（Ｅ）背側線条体内のｃ−ＦＯＳ標識づけされた核の定量化。コカイン誘発の後、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGal線条体内のｃ−ＦＯＳ陽性核の数は、野生型対照のものよりも著しく低く、*ｐ＝０．０２である（ＰＢＳ又はコカインで処置された野生型について及びコカインで処置されたＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalについてはｎ＝３、ＰＢＳで処置されたＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalについてはｎ＝２）。データは平均±ＳＥＭとして表現されている。白の棒線は、野生型対照であり、黒の棒線はＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスである。ＣＣ、脳梁；Ｃｐｕ：尾状核−被核；ＣＴ、大脳皮質、Ｓ、中隔。
【０１１４】
【図９】図９．コカイン及びＰＴＺで誘発された発作活性（Ａ，Ｂ）  野生型及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスについての基線ＥＥＧ記録（Ｃ，Ｄ）  Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGal内のてんかん様活性を示す４０ｍｇ／ｋｇのコカイン注入後のＥＥＧ記録（Ｅ及びＦ）  野生型及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスの両方におけるてんかん様の活性を示す８０ｍｇ／ｋｇのコカインの注入後のＥＥＧ記録（Ｇ）  ＰＴＺ（１００ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注入後の強直−間代性てんかん発作までの潜時。データは平均±ＳＥＭとしてプロットされている。ｎ＝８、**ｐ＝０．００３。（Ｈ，Ｉ）  ＰＴＺでの処置に応答したＥＲＫ活性化。（Ｈ）ＰＴＺの腹腔内注入後の野生型（＋／＋）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（−／−）大脳半球内のｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）及びホスホーＥＲＫのウェスタンブロット検出。（Ｉ）（Ｈ）及び付加的なデータ内で示されたｐ−ＥＲＫ及び合計ＥＲＫのバンド強度の比率の定量化。野生型マウスにおける比率は恣意的に１に正規化された。ＥＲＫ活性化の有意な差異は、食塩水の注入を受けた野生型（白の棒線）及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGal（黒の棒線）マウス（各遺伝子型ｎ＝４）の大脳半球内で全く見られなかった。しかしながら、ＰＴＺでの処置の後、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、同腹子対照に比べ著しく高いｐ−ＥＰＫレベルを示した。データは平均±ＳＥＭとしてプロットされている（各遺伝子型ｎ＝７、*ｐ＜０．０４）。
【０１１５】
【図１０】図１０は、ａ：正常な条件下で及びＦｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス内での脳幹神経節視床皮質回路を示す概略図である。（Ａ）  野生型マウス内の脳幹神経節視床皮質回路。（Ｂ）  Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウス内の脳幹神経節視床皮質回路。Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスは、視床皮質出力の増大を結果としてもたらす線条体黒質（Ｄ１Ｒ）及び線条体淡蒼球（Ｄ２Ｒ）シグナリング経路間の平衡失調を有するように思われる。緑色ラインは、興奮性ニューロン突出を表わし、赤色ラインは阻害性突起を表わしている。ラインの幅は相対的シグナリング強度を表わす。白色矢印↑又は↓は、Ｆｇｆ１４N-βGal/N-βGalマウスにおいて、活動低下又は活動過剰状態のいずれかである経路を表わしている。略号は以下の通りである：ＣＰｕ：尾状核−被核：Ｇｐｉ、淡蒼球内部セグメント；ＧＰｅ、淡蒼球外部セグメント；ＰＰＮ、大脳脚橋核：ＳＴＮ、視床下核；ＳＮｃ、黒質緻密部；ＳＮｒ、黒質網状部；Ｔｈａｌ、視床。
【０１１６】
【図１１】ＦＧＦ１４−ＧＦＰでのNeuro−２ａ細胞のトランスフェクションを示す。図１１は、神経芽細胞（Neuro−２ａ）内のＦＧＦ１４−１ｂのシナプス局在化を示す。（Ａ）  Ｍｙｃでタグ付けされたＦＧＦ１４−１ｂは、Neuro−２ａ細胞内に過渡的にトランスフェクションされた。Ｍｙｃ（ＦＩＴＣ）に対する抗体を用いた免疫染色は、未分化Neuro−２ａ細胞の細胞質局在化を示す。（Ｂ）  トランスフェクションを受けたNeuro−２ａ細胞は、レチノイン酸処置から１〜２日後に分化しつつあった。ＦＧＦ１４−１ｂタンパク質は、拡張中の神経突起の中で局在化されている。（Ｃ）  完全に分化したNeuro−２ａ細胞内では、ＦＧＦ１４−１ｂは、神経突起に沿った軸索瘤内で濃縮されている。
【０１１７】
【図１２】ＦＧＦ１４−ＧＦＰでのNeuro−２ａ細胞のトランスフェクションを示す。図１２．海馬中のＦＧＦ１４の発現  図１２は、ＦＧＦ１４の欠如が、海馬歯状回内の高い興奮性をひき起こす、ということを示している。（Ａ）  ＦＧＦ１４Ｎ−βｇａｌタンパク質は歯状回の門部内に局在化されている。（Ｂ）  ＦＧＦ１４ｍＲＮＡの発現は、インサイチュハイブリダイゼーションにより歯状回顆粒細胞内と局在化されている。（Ｃ）  野生型マウス（上部図版）及びＦＧＦ１４欠損マウス（下部図版）からの海馬スライス内の代表的歯状顆粒細胞の記録。刺激時点で、Ｆｇｆ１４欠損マウス由来のスライス（１２スライス中８）は、対照スライス（１３スライス中２）に比べて多数のスパイクを示す（スチューデントｔ試験によりｐ＜０．０５）。
【０１１８】
【図１３】図１３．ＰＴＺ誘発された発作後の死に至るまでの時間を示す。ＰＴＺのＩＰ注入後野生型（ｎ＝８）及びＦＧＦ１４（−／−）マウス（ｎ＝８）が死に至るまでの時間を２つの実験において測定した。実験１においては、平均年齢は８２日であり、性別は５０％が雌であり、ＰＴＺ用量は１００ｍｇ／ｋｇであった。実験２においては、平均年齢は３５４日であり、性別は１００％が雌であり、ＰＴＺ用量は７５ｍｇ／ｋｇであった。図１３は、野生型マウスがほんの数秒で死亡した（各実験について左側にかろうじて見える黒い棒線）のに対し、ＦＧＦ１４（−／−）マウスは１時間以上生存した（約４２００及び５７００秒の平均持続時間、各実験について右側の網掛け棒線）ことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2005504528.tif 000181