(57)【要約】一般式（Ｉ）で表される二官能化メタロセン。式中、Ｍｅは遷移金属であり、Ｙ及びＺは同一の場合は−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択され、又はＹが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−でありＺが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−であり、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔはそれぞれ３と６、１と４、０と２、０と２、２と５、３と６の間の整数であり、R及びR’は水素原子又はオリゴヌクレオチド及びペプチドの合成に使用される保護基を表し、少なくともR又はR’のうち一つが前記保護基である。
2005517709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2005517709.tif 000026
[式中、
−Ｍｅは遷移金属を表し、好ましくはＦｅ、Ｒｕ、及びＯｓから選択され、
−Ｙ及びＺは同一であり、−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される、又は
−Ｙが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−であり、
−ｎは３と６の間の整数であり、
−ｐは１と４の間の整数であり、
−ｑは０と２の間の整数であり、
−ｒは０と２の間の整数であり、
−ｓは２と５の間の整数であり、
−ｔは３と６の間の整数であり、
−R及びR’は水素原子又はオリゴヌクレオチド及びペプチドの合成に使用される保護基を表し、少なくともR又はR’のうち一つがオリゴヌクレオチド及びペプチドの合成に使用される保護基であり、そしてR及びR’は以下のように定義されると解される：
（i）Z及びYが−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される場合、R及びR’はオリゴヌクレオチドの合成に使用される保護基であり、Rが脱保護の後遊離ヒドロキシル基を維持することが可能な基であり、好ましくは感光基、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、tert−ブチルジメチルシリル、アセチル又はトリフロロアセチルであり、そしてR’が遊離ヒドロキシル基と反応可能なリン基であり、好ましくはホスホジエステル、ホスホルアミダイト又はH-ホスホナート基であり、
(ii)Ｙが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−である場合、Rはペプチドの合成に使用される保護基であってアミンの保護基を表し、好ましくは９−フルオレニルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル又はベンジルオキシカルボニルであり、そしてR’は水素原子を表す。]
で表される二官能化メタロセン。
【請求項２】
Meが鉄であることを特徴とする請求項１に記載のメタロセン。
【請求項３】
Ｙ及びＺが、−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載のメタロセン。
【請求項４】
Y及びZがそれぞれ−（CH2）n−O−であり、ｎが３であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のメタロセン。
【請求項５】
Y及びZがそれぞれ−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−であり、ｐが２であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のメタロセン。
【請求項６】
Ｙが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−であることを特徴とする請求項１又は２に記載のメタロセン。
【請求項７】
ｓが３であり、ｔが４であることを特徴とする請求項６に記載のメタロセン。
【請求項８】
−一般式（II）：
【化２】
2005517709.tif 000027
[式中、Meは前述した請求項において定義されるとおりであり、Y’及びZ’は同一であり、−（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p’−（ＣＨ2）2−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−から選択され、ｎ、ｑ、ｒは前述の請求項において定義されるとおりであり、ｐ’は０と３の間の整数である]
の化合物のヒドロキシル基の一つを、、脱保護の後遊離ヒドロキシル基を維持することが可能な基、好ましくは感光基、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、tert−ブチルジメチルシリル、アセチル及びトリフルオロアセチルから選択される基を結合することによって保護する工程、及び
−遊離状態の他方のヒドロキシル基に、遊離ヒドロキシル基と反応可能なリン基、好ましくはホスホジエステル、ホスホルアミダイト及びH−ホスホナート基から選択される基を結合させる工程
を含むことを特徴とする、請求項３乃至５のいずれか一項に記載の式（I）のメタロセンの製造方法。
【請求項９】
−一般式（III）：
【化３】
2005517709.tif 000028
[式中、
−Meは前記請求項のいずれかに定義されているとおりであり、
−Y’’は−（CH2）s−であり、
−Z’’は−（CH2）t−であり、
−ｓ及びｔは前記請求項のいずれかに定義されるとおりである。]
の化合物のNH2基を、脱保護の後遊離アミン官能基を維持することが可能な基、好ましくは９−フロルオレニルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル及びベンジルオキシカルボニルから選択される基を結合することによって保護する工程と含むことを特徴とする請求項６又は７に記載の一般式（I)のメタロセンの製造方法。
【請求項１０】
一般式（II）：
【化４】
2005517709.tif 000029
[式中、
−Ｍｅは遷移金属を表し、好ましくはＦｅ、Ｒｕ、及びＯｓから選択され、
−Ｙ’及びＺ’は同一であり、−（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p’−（ＣＨ2）2−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−から選択され、
−ｎは３と６の間の整数であり、
−ｐ’は０と３の間の整数であり、
−ｑは０と２の間の整数であり、
−ｒは０と２の間の整数であり、
−MeがFe又はRuでありY’及びZ’が−（ＣＨ2）n−である場合、ｎは５であり、MeがFeでありY’及びZ’が−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p’−（ＣＨ2）2−である場合、p’は０であると解される。]
のビス（ヒドロキシ）メタロセン。
【請求項１１】
Meが鉄であることを特徴とする請求項１０に記載のビス（ヒドロキシ）メタロセン。
【請求項１２】
Y’及びZ’がそれぞれ−（ＣＨ2）n−であり、ｎが３であることを特徴とする請求項１０に記載のビス（ヒドロキシ）メタロセン。
【請求項１３】
Y’及びZ’がそれぞれ−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p’−（ＣＨ2）2−であり、p’が０であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載のビス（ヒドロキシ）メタロセン。
【請求項１４】
一つ又は複数のヌクレオチドシントンの、一つ又は複数の前記式（I）のメタロセンによる置換を含み、R及びR’はオリゴヌクレオチドの合成に使用される保護基であることを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドの合成サイクルにおける、請求項3乃至５のいずれか一項に記載の式（I）の二官能化メタロセンによるオリゴヌクレオチドの標識方法。
【請求項１５】
最初の又は最後のヌクレオチドの置換の際、置換が３’−又は５’−位置でそれぞれ行われることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
一つ又は複数のアミノ酸シントンの、一つ又は複数の前記式（I）のメタロセンによる置換を含み、Rはアミンに対する保護基を表し、R’は水素原子を表すことを特徴とする、前記ペプチドの合成サイクルにおける、請求項6又は７に記載の式（I）の二官能化メタロセンによるペプチドの標識方法。
【請求項１７】
最初の又は最後のアミノ酸の置換の際、置換がC−末端又はN−末端で行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも二つの連続する置換が行われることを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項14又は15に記載の標識方法で得られることができることを特徴とする標識オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項10乃至13のいずれか一項に記載の一般式（II）のビス（ヒドロキシ）メタロセンによって、構成するヌクレオシドの少なくとも一つが置換されたことを特徴とする標識オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
３’−又は５’−位置に少なくとも一つの一般式（I）のビス（ヒドロキシ）メタロセンを含むことを特徴とする請求項19又は20に記載の標識オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項16乃至18のいずれか一項に記載の方法によって得られることができることを特徴とする標識ペプチド。
【請求項２３】
請求項9において定義される式（III）の二官能化メタロセンによって、構成するアミノ酸の少なくとも一つが置換されたことを特徴とする標識ペプチド。
【請求項２４】
C−末端又はN−末端に少なくとも一つの式（III）の二官能化メタロセンを含むことを特徴とする請求項22又は23に記載のペプチド。
【請求項２５】
請求項1乃至7のいずれか一項に記載の式（I）のメタロセンが少なくとも一つが、その官能化末端の一つの共有結合反応によって支持体に接合されていることを特徴とする、オリゴヌクレオチド合成用支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識の分野、特にはオリゴヌクレオチドやペプチドなど対象となる生物学的分子の標識の分野に関する。より具体的は、本発明の主題は新規な二官能化メタロセン、その製造方法、オリゴヌクレオチド又はペプチドの標識における二官能化メタロセンの使用、及びそれによって得られた標識されたオリゴヌクレオチド又はペプチド、そして支持された合成のための、少なくとも一つの本発明のメタロセンによって官能化された支持体である。
【背景技術】
【０００２】
メタロセンはオリゴヌクレオチドのための標識として知られ、具体的にはDNA又はRNA片の検出のための標識として知られている。
【０００３】
したがって、例えば、米国特許６２１１３５６号は、カップリングした後、DNA及び／又はRNAについての信号を示し、そしてこの信号は電子顕微鏡を用いて検出されるためのホスホルアミダイト官能基を有する単一官能性メタロセンの使用について開示している。オリゴヌクレオチドへのメタロセンの付加は手動で、そして鎖の末端においてのみ行われる。
【０００４】
米国特許６２３２０６２号は、ハイブリダイゼーションを検出するための電気化学的プローブとしてのオリゴヌクレオチド−フェロセン接合体を開示している。前記接合体は、フェロセンによって変性されたウリジンをシントンとして使用することから始まる、支持された合成によって得られる。述べられている二つのシントンは、５−位置にフェロセンを有するウリジン３’−ホスホルアミダイト及び２’−位置にフェロセンを有する３’−ホスホルアミダイトである。この技術を使用した、フェロセンによって標識されたオリゴヌクレオチドの製造は、シントン（合成に相互性のあるモノマー）としてフェロセンによって変性されたヌクレオシドを使用するため、コストがかかり、これは調製するのが複雑であるという不都合がある。
【０００５】
リボースの２’−位置のフェロセン置換を含む、化学的に変性されたホスホルアミダイトがC.J.Yu他の研究から知られている（J.  Org.  Chem.、２００１年、６６巻、p.２９３７−２９４２参照）。これらのホスホルアミダイトは様々な位置にフェロセンを含むオリゴヌクレオチドの合成を可能にするが、これらのホスホルアミダイトの合成は複素環のアミン官能基及びその他の遊離OH官能基の保護及び脱保護の合成技術を含み、そして置換の選択性を維持することができるような条件下で合成を行うことを必要とする。
【０００６】
特許WO  ００/３１７５０及びWO  ０１／８１４４６は、観察可能な電気化学的プローブとしての二官能化フェロセンを開示し、フェロセンは一方ではポリピロールに、他方ではオリゴヌクレオチドに接合される。フェロセンのオリゴヌクレオチドへのカップリングはフェロセンの活性化されたエステル（N−ヒドロキシフタルイミド）と事前合成されたオリゴヌクレオチドのNH2末端との間で行われる。このカップリングは自動化されたオリゴヌクレオチド合成とは相互性がなく、そして選択性を欠く（塩基のアミンの副反応）という不都合がある。
【０００７】
メタロセン／オリゴヌクレオチド又はメタロセン／ペプチド接合体の支持された合成を従来技術で使用されたメタロセンで行うことは、フェロセンによって変性されたヌクレオシドの合成、そして対応するホスホルアミダイトシントンの合成を必要とするため冗長となる。さらに、メタロセンのオリゴヌクレオチド又はペプチドへのカップリングは必ずしも選択的ではなく、そのためこの方法は現在の商業的合成装置において自動化することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本出願人は、従来技術のメタロセンの欠点を克服することができる新規な二官能化メタロセンを発見し、すなわちそれは：
−メタロセン／オリゴヌクレオチド又はメタロセン／ペプチド接合体の自動化合成、
−メタロセンとオリゴヌクレオチド又はメタロセンとペプチドの間の選択的カップリング、及び
−使用されるシントンは、メタロセンによって変性されたヌクレオシドの形態ではなくメタロセンそのままであるので、前記接合体の製造コストの向上
を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明の主題は、式（I）：
【００１０】
【化１】
2005517709.tif 000003
【００１１】
のメタロセンであって、式中、
−Ｍｅは遷移金属を表し、好ましくはＦｅ、Ｒｕ、及びＯｓから選択され、
−Ｙ及びＺは同一であり、−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される、又は
−Ｙが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−であり、
−ｎは３と６の間の整数であり、
−ｐは１と４の間の整数であり、
−ｑは０と２の間の整数であり、
−ｒは０と２の間の整数であり、
−ｓは２と５の間の整数であり、
−ｔは３と６の間の整数であり、
−R及びR’は水素原子又はオリゴヌクレオチド及びペプチドの合成に使用される保護基を表し、少なくともR又はR’のうち一つがオリゴヌクレオチド又はペプチドの合成に使用される保護基であり、そして以下のように定義されると解される：
（i）Z及びYが−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される場合、Rが脱保護の後遊離ヒドロキシル基を維持することが可能な基であり、好ましくは感光基、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、tert−ブチルジメチルシリル、アセチル又はトリフルオロアセチルであり、そしてR’が遊離ヒドロキシル基と反応可能なリン基であり、好ましくはホスホジエステル、ホスホルアミダイト又はH−ホスホナート塩基であり、
(ii)Ｙが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−である場合、Rはアミンの保護基を表し、好ましくは９−フルオレニルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル又はベンジルオキシカルボニルであり、そしてR’は水素原子を表す。
【００１２】
本発明の別の主題は、本発明のメタロセンの製造方法であり、以下の工程を含むことを特徴とする：
（i）Z及びYが−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される場合：
−一般式（II）
【００１３】
【化２】
2005517709.tif 000004
【００１４】
[式中、Meは上記で定義される通りであり、Y’及びZ’は同一であり−（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p’−（ＣＨ2）2−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−から選択され、ｎ、ｑ、ｒは上記において定義されるとおりであり、ｐ’は０と３の間の整数である]
の化合物のヒドロキシル基の一つを、脱保護の後遊離ヒドロキシル基を維持することが可能な基、好ましくは感光基、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、tert−ブチルジメチルシリル、アセチル及びトリフロロアセチルから選択される基を結合することによって保護する工程、そして
−遊離状態の他方のヒドロキシル基に、遊離ヒドロキシル基と反応可能なリン基、好ましくはホスホジエステル、ホスホルアミダイト及びH−ホスホナート基から選択される基を結合させる工程；及び
(ii)Ｙが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−である場合：
−一般式（III）：
【００１５】
【化３】
2005517709.tif 000005
【００１６】
[式中、
−Meは上記に定義されているとおりであり、
−Y’’は−（CH2）s−であり
−Z’’は−（CH2）t−であり、
−ｓ及びｔは上記に定義されるとおりである。]
の化合物のNH2基を、脱保護の後遊離アミン官能基を維持することが可能な基、好ましくは９−フルオレニルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル及びベンジルオキシカルボニルから選択される基を結合することによって保護する工程。
【００１７】
本発明の別の主題は、上述の一般式（II）の（ビス）−ヒドロキシメタロセンである。
【００１８】
本発明の別の主題は、
−式（I）の二官能化メタロセン[ここで、Y及びZは同一であり−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される]によってオリゴヌクレオチドを標識する方法であり、前記オリゴヌクレオチドの合成サイクルにおいて一つ以上のヌクレオシドシントンを一つ以上の前記式（I）のメタロセンで置換することを含み、
−式（I）の二官能化メタロセン[ここで、Ｙは−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚは−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−である]でペプチドを標識する方法であり、前記ペプチドの合成サイクルにおいて一つ以上のアミノ酸シントンを一つ以上の前記式（I）のメタロセンで置換することを含み、
そしてそのようにして標識されたオリゴヌクレオチド及びペプチドである。
【００１９】
本発明の別の主題は、少なくとも一つの式（Ｉ）のメタロセンによってそれぞれ表面において官能化された、オリゴヌクレオチド又はペプチドの合成のための支持体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明を詳細に説明する前に、本明細書及び請求項において使用されるいくつかの語句が以下で定義される。
【００２１】
「オリゴヌクレオチド」という語句は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも部分的に相補性のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能な、少なくとも二つの天然又は変性されたヌクレオチド（デオキシキリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、あるいは両方）を意味する。「ヌクレオシド」という語句は、モノサッカリド（リボース又はデオキシリボース）に結合されたプリン又はピリミジン塩基からなる有機化合物を意味すると理解される。「ヌクレオチド」という語句は、モノサッカリド（リボース又はデオキシリボース）及びホスフェート基に結合されたプリン又はピリミジン塩基からなる有機可能物を意味すると理解される。「変性ヌクレオチド」という語句は、例えば、変性塩基及び／又はヌクレオチド間結合及び／又はバックボーンでの変性を含むヌクレオチドを意味すると理解される。変性塩基の例として、イノシン、５−メチルデオキシシチジン、５−（ジメチルアミノ）デオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン及び５−ブロモデオキシウリジンを挙げることができる。ヌクレオチド間結合の変性を説明するため、ホスホロチオエート、Ｎ−アルキルホスホラミデート、アルキルホスホネート及びアルキル−ホスホトリエステル結合を挙げることができる。特許文献ＦＲ−Ａ−２  ６０７  ５０７に開示されているようなアルファ−オリゴヌクレオチド、及びＭ．Ｅｇｈｏｌｍ他著、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９２年、１１４号、ｐ.１８９５−１８９７の主題であるＰＮＡｓは、変性バックボーンを有するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの例である。
【００２２】
「ペプチド」という語句は、具体的には少なくとも二つのアミノ酸のいずれかの配列であり、例えばタンパク質、タンパク質断片又はオリゴペプチドであり、それは化学的合成によって、若しくは組換え生物における発現によって得られるペプチドのように、抽出、分離、単離又は合成されたものである。また、Ｌ型の一つ以上のアミノ酸がＤ型の一つ以上のアミノ酸によって置換されている、若しくはその逆の場合のいずれかのペプチド；少なくとも一つのＣＯ−ＮＨ結合がＮＨ−ＣＯ結合によって置換されているいずれかのペプチド；少なくとも一つのＣＯ−ＮＨ結合がＮＨ−ＣＯ結合によって置換されており、一つ以上の前記ＣＯ−ＮＨ結合に含まれる又は含まれない各アミノアシル残基のキラル性が、レファレンスペプチド（又はイムノレトロイド）を成すアミノアシル残基に対して固定されている、又は転化されているいずれかのペプチド；及びいずれかのミモトープもペプチドという語句には含まれている。
【００２３】
関係する様々なクラスのペプチドを説明するため、副腎皮質刺激ホルモン又はその断片、アンジオテンシン類似体及びその阻害剤、ナトリウム排泄増加性ペプチド、ブラジキニン及びそのペプチド誘導体、走化性ペプチド、ジノルフィン及びその誘導体、エンドルフィン及びその誘導体、エンケファリン及びその誘導体、酵素阻害剤、フィブロネクチン断片及びその誘導体、胃腸ペプチド、オピオイドペプチド、オキシトシン、バソプレシン、バソトーシン及びこれらの誘導体、又はプロテインキナーゼが挙げられる。
【００２４】
本発明のメタロセンはハプテン誘導体又は他のいずれかの合成可能な分子の調製のためのシントンとして有用である。
【００２５】
具体的には、本発明のメタロセンはオリゴヌクレオチド及びペプチドの支持された合成において有用である。本発明のメタロセンは、それらが有する二つの特定の官能基、すなわちオリゴヌクレオチドの支持された合成には式（ＩＩ）において示されているような二つのヒドロキシル官能基、若しくはペプチドの支持された合成には式（ＩＩＩ）において示されているようなアミン官能基と酸官能基の結果、非常に選択的方法で合成されたオリゴヌクレオチド又はペプチドの標識を可能とする。
【００２６】
支持されたオリゴヌクレオチドの合成の場合、式（Ｉ）において示されている官能化されたスペーサーアームＹ及びＺはそれぞれオキシ官能基を有し脱保護の後ヒドロキシ官能基を生成し、そしてＹ及びＺは−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される。
【００２７】
本発明の一実施態様では、Ｙ及びＺはそれぞれ−（ＣＨ2）n−Ｏ−であり、ｎは３である。
【００２８】
別の実施態様によると、Ｙ及びＺはそれぞれ−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−であり、ｐは２である。
【００２９】
ペプチドの支持された合成の場合、式（Ｉ）に示されている官能化されたスペーサーアームＹ及びＺは、アミド官能基を有し脱保護の後アミン官能基を生成する、若しくは酸官能基であり−（ＣＨ2）s−ＮＨ−及び−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−から選択され、Ｙ及びＺが同一であることはできないと理解される。
【００３０】
本発明の一実施態様によると、ｓは３でありｔは４である。
【００３１】
本発明の式（Ｉ）のメタロセンで使用される遷移金属Ｍｅは如何なる遷移金属であってもよい。好ましくは、それはＦｅ、Ｒｕ、及びＯｓから選択される。
【００３２】
本発明の一実施態様によると、Ｍｅは鉄である。
【００３３】
オリゴヌクレオチド及びペプチドの合成に使用される保護基は、当業者に周知の如何なる基であってもよい。例えば、Ｓｔｅｖｅｎ  Ａ．  ＫａｔｅｓとＦｅｒｎａｎｄｏ  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ著、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、２０００年、Ｍａｒａｌ  Ｄｅｋｋｅｒ出版の中にそれらは述べられている。
【００３４】
オリゴヌクレオチドの合成においてのシントンとしての使用する場合の本発明のメタロセンは、保護基の一つが、本発明のメタロセンがヌクレオチドの後に配置される限り、先行するヌクレオチドの５’−又は３’−位置の遊離ヒドロキシルと、若しくはオリゴヌクレオチドがいくつかのメタロセンを連続して含む限り、先行するメタロセンの脱保護されたヒドロキシルと、若しくは例えば、ポリ（エチレンオキシド）などスペーサーアームとして作用することができるほかの化合物の遊離ヒドロキシルと反応することが可能であるリン基でなければならない。そのようなリン保護基の例は、ホスホジエステル、ホスホルアミダイト及びＨ−ホスホナート基、及びこれらの誘導体を含む。
【００３５】
メタロセンの他方の保護基は、メタロセンがヌクレオチドの前に配される限りは、続くヌクレオチドの反応性リン（ホスホジエステル、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホナート）と、若しくは少なくとも二つのメタロセンが続く限りは次のメタロセンの反応性リンと反応するために、脱保護の後遊離ヒドロキシル基を維持することができなければならない。この種類の保護基の例として、感光基、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、tert−ブチルジメチルシリル、アセチル及びトリフロロアセチルを挙げることができる。
【００３６】
感光基の例として、６−ニトロベラトリル、６−ニトロピペロニル、メチル−６−ニトロベラトリル、ニトロベラトリルカルボニル、メチル−６−ニトロ−ピペロニル、ニトロベンジル、ニトロベンジルオキシカルボニル、ジメチルジメトキシベンジル、ジメチルジメトキシベンジルオキシカルボニル、５−ブロモ−７−ニトロインドリニル、ヒドロキシ−α−メチルシンナモイル、２−（オキシメチレン）アントラキノニル又はピレニルメトキシカルボニルを挙げることができる。
【００３７】
アミンの保護基の例は９−フルオレニルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル及びベンジルオキシカルボニルを含む。
【００３８】
一般式（Ｉ）
【００３９】
【化４】
2005517709.tif 000006
【００４０】
[式中、
−Ｍｅは遷移金属を表し、好ましくはＦｅ、Ｒｕ、及びＯｓから選択され、
−Ｙ及びＺは同一であり、−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される、又は
−Ｙが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−であり、
−ｎは３と６の間の整数であり、
−ｐは１と４の間の整数であり、
−ｑは０と２の間の整数であり、
−ｒは０と２の間の整数であり、
−ｓは２と５の間の整数であり、
−ｔは３と６の間の整数であり、
−R及びR’は水素原子又はオリゴヌクレオチド及びペプチドの合成に使用される保護基を表し、少なくともR又はR’のうち一つがオリゴヌクレオチドペプチドの及び合成に使用される保護基であり、そしてR及びR’は以下のように定義されると解される：
（i）Z及びYが−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される場合、R及びR’はオリゴヌクレオチドの合成に使用される保護基であり、Rが脱保護の後遊離ヒドロキシル基を維持することが可能な基であり、好ましくは感光基、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、tertブチルジメチルシリル、アセチル又はトリフロロアセチルであり、そしてR’が遊離ヒドロキシル基と反応可能なリン基であり、好ましくはホスホジエステル、ホスホルアミダイト又はH−ホスホナート基であり、
(ii)Ｙが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−である場合、Rはペプチドの合成に使用される保護基であってアミンの保護基を表し、好ましくは９−フルオレニルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル又はベンジルオキシカルボニルであり、そしてR’は水素原子を表す。]
の二官能化メタロセンが本発明の好ましい態様をなす。
【００４１】
本発明のメタロセンは官能化された適切なスペーサーアームに所望の保護基を得ることを可能にする一つ又は二つの工程を必要とする方法によって製造される。
【００４２】
すなわち、本発明の別の主題は本発明のメタロセンの製造方法であり、以下の工程を含むことを特徴とする：
（i）Z及びYが−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される場合：
−一般式（II）
【００４３】
【化５】
2005517709.tif 000007
【００４４】
[式中、Meは上記で定義される通りであり、Y’及びZ’は同一であり−（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p’−（ＣＨ2）2−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−から選択され、ｎ、ｑ、ｒは上記において定義されるとおりであり、ｐ’は０と３の間の整数である]
の化合物のヒドロキシル基の一つを、脱保護の後遊離ヒドロキシル基を維持することが可能な基、好ましくは感光基、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、tert−ブチルジメチルシリル、アセチル及びトリフルオロアセチルから選択される基を結合することによって保護する工程、及び
−遊離状態の他方のヒドロキシル基に、遊離ヒドロキシル基と反応可能なリン基、好ましくはホスホジエステル、ホスホルアミダイト及びH−ホスホナート基から選択される基を結合させる工程；そして
(ii)Ｙが−（ＣＨ2）s−ＮＨ−であり、Ｚが−（ＣＨ2）t−ＣＯＯ−である場合：
−一般式（III）：
【００４５】
【化６】
2005517709.tif 000008
【００４６】
[式中、
−Meは上記に定義されているとおりであり、
−Y’’は−（CH2）s−であり
−Z’’は−（CH2）t−であり、
−ｓ及びｔは上記に定義されるとおりである。]
の化合物のNH2基を、脱保護の後遊離アミン官能基を維持することが可能な基、好ましくは９−フルオレニルオキシカルボニル、tert−ブトキシカルボニル及びベンジルオキシカルボニルから選択される基を結合することによって保護する工程。
【００４７】
一般式（ＩＩ）の化合物のヒドロキシル基の一つを、感光基、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、tert−ブチルジメチルシリル、アセチル及びトリフロロアセチルなどの脱保護の後遊離ヒドロキシル基を維持することができる保護基によって保護する工程は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９９年、第一巻、ＮＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．出版中に述べられているような、当業者に周知の条件下によって行われる。
【００４８】
同様に、式（ＩＩ）の化合物の維持されたもう一方の遊離ヒドロキシル基へ、ホスホジエステル、ホスホルアミダイト又はＨ−ホスホナート基などのリン保護基の結合工程が、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９９年、第一巻、ＮＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．出版、及び“Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”、Ｓｕｄｈｉｒ  Ａｇｒａｗａｌ編集「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９３年、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ出版中に述べられているような、当業者に周知の条件下において行われる。
【００４９】
以下に定義される式（ＩＩ）の特定の化合物は本発明の別の主題である新規な化合物である。それらは、一般式（ＩＩ）：
【００５０】
【化７】
2005517709.tif 000009
【００５１】
[式中、
−Ｍｅは遷移金属を表し、好ましくはＦｅ、Ｒｕ、及びＯｓから選択され、
−Ｙ’及びＺ’は同一であり、−（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p’−（ＣＨ2）2−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−から選択され、
−ｎは３と６の間の整数であり、
−ｐ’は０と３の間の整数であり、
−ｑは０と２の間の整数であり、
−ｒは０と２の間の整数であり、
−MeがFe又はRuでありY’及びZ’が−（ＣＨ2）n−である場合、ｎは５であり、MeがFeでありY’及びZ’が−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p’−（ＣＨ2）2−である場合、p’は０であると解される。]
のビス−（ヒドロキシ）メタロセンから選択される。
【００５２】
好ましい実施態様によると、式（ＩＩ）の化合物は少なくとも一つの以下の性質を有する：
−Ｍｅは鉄であり、そして
−Ｙ’及びＺ’はそれぞれ−（ＣＨ2）n−であり、ｎは３である、若しくはＹ’及びＺ’はそれぞれ−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p’−（ＣＨ2）2−であり、ｐ’は０である。
【００５３】
式（ＩＩ）の化合物はスペーサーアームＹ’及びＺ’の性質によって異なる方法で得ることができる。
【００５４】
−（ＣＨ2）n−をスペーサーアームとするメタロセンを得るためには、アルデヒド官能基がメタロセンにグラフトされ、そして得られた化合物が適切なエチルジエチルホスホノアルキレートと反応され、１,１’−ビス[（２−エチルオキシカルボニル）アルケニル]メタロセンを得、以下に示されるように、まず最初に二重結合を還元するために、次いで第一級アルコールを放出するために、二つの還元工程が行われる：
【００５５】
【化８】
2005517709.tif 000010
【００５６】
ここで、Ｅｔはエチルであり、ｎ’は２から４の間である。
【００５７】
−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p-1−（ＣＨ2）2−をスペーサーアームとするメタロセンを得るためには、ＮａＯＨなどの塩基の存在下で、ビス−（ヒドロキシメチル）メタロセンのヒドロキシル基が適切な２−クロロエチル（ポリ（エチレンオキシド））基に官能化され、そしてクロロラジカルがヨードラジカルに、次いでヒドロキシルラジカルに、以下に示されるように変換される：
【００５８】
【化９】
2005517709.tif 000011
【００５９】
ここで、Ｔｓはトシルであり、ｐ’は０から３の間の整数である。
【００６０】
−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−をスペーサーアームとするメタロセンを得るためには、特許出願ＷＯ  ０１／８１４４６に開示されている方法によって得られる適切な１,１’−（Ｎ−ヒドロキシフタルイミド−カルボニルアルキル）メタロセンが、適切なトリフルオロアセトキシアルキルアミンで処理され、次いでトリフルオロアセトキシラジカルが以下に示されるようにヒドロキシルラジカルに変換される：
【００６１】
【化１０】
2005517709.tif 000012
【００６２】
ここで、ｑ及びｒは上記で定義されるとおりである。
【００６３】
化合物（ＩＩＩ）は以下の方法によって製造することができる：
【００６４】
適切な１−tert−ブトキシカルボニルアミノアルキル−１’−ヨードメタロセン１が有機金属ヨウ化物２と反応され、次いで処理の最後に、酸官能基が放出され化合物（ＩＩＩ）が下記に示されるように生成される：
【００６５】
【化１１】
2005517709.tif 000013
【００６６】
ここで、ｓ及びｔは上記で述べtertおりである。
【００６７】
化合物２自体が下記の合成によって得ることができる：
【００６８】
【化１２】
2005517709.tif 000014
【００６９】
化合物１は１，１’−ヨードメタロセン３と有機金属ヨウ化物４の反応によって以下のように得ることができる：
【００７０】
【化１３】
2005517709.tif 000015
【００７１】
これは、
ａ）Ｂａｒｒｙ  Ｍ．  Ｔｒｏｓｔ及びＩａｎ  Ｆｌｅｍｉｎｇ著、“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、第３巻、
ｂ）Ｊｕｉｏ  Ｔｓｕｊｉ著、“Ｐａｌｌａｄｉｕｍ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ”、１９９５年、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ出版
中に述べられているとおりである。
【００７２】
有機金属ヨウ化物４自体は以下のようにアルキルアミンヨウ化物から２工程によって得ることができる：
【００７３】
【化１４】
2005517709.tif 000016
【００７４】
ここで、ｓは上記で述べられているとおりであり、これはＧｒｅｅｎｅ＆Ｗｕｔｓ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ中に述べられているとおりである。
【００７５】
最後に、１,１’−ヨードメタロセン  ３  自体は以下の方法によって、Ｄ．Ｇｕｉｌｌａｎｅｕｘ及びＨ．Ｂ．Ｋａｇａｎによる論文（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、６０号、ｐ.２５０２−２５０５）中に述べられているように得ることができる。
【００７６】
【化１５】
2005517709.tif 000017
【００７７】
このようにして得られた式（Ｉ）のメタロセンは、具体的には、対象となるオリゴヌクレオチドやペプチドなどの生物学的分子の支持された合成の際に標識するために使用することができるようになる。
【００７８】
すなわち、本発明の別の主題はオリゴヌクレオチド又はペプチドを本発明の式（Ｉ）の二官能化メタロセンで標識する方法であり、この方法は一つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸シントンを一つ又は複数の前記式（Ｉ）のメタロセンで、前記オリゴヌクレオチド又は前記ペプチドの合成サイクル中に置換することを含む。
【００７９】
オリゴヌクレオチドの合成の場合、一つまたは複数の式（Ｉ）のメタロセンが使用され、式中Ｙ及びＺは同一で、−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択される。
【００８０】
ペプチドの合成の場合、一つまたは複数の式（Ｉ）のメタロセンが使用され、式中Ｙが−（ＣＨ2）s−NH−であり、Zが−（ＣＨ2）t−COOH−である。
【００８１】
ヌクレオチド又はアミノ酸シントンの本発明のメタロセンによる置換は現在の合成機において製造ラインの如何なる位置でも行うことができる。本発明の一実施態様によれば、置換は以下の条件の少なくとも一つを満たす：
−オリゴヌクレオチドの場合は３’−又は５’−位置で、若しくはペプチドの場合はC−末端又はN−末端において行われ、そして
−少なくとも二つの連続する置換がある。
【００８２】
置換はヌクレオチド又はアミノ酸を本発明のメタロセンによって置換するだけなので、当業者によって簡単に行うことができる。
【００８３】
すなわち、例えば、下記のスキーム１に示されるようにホスホルアミダイトカップリングサイクルの場合、この製造ラインのいずれか一つ、又はいくつかのヌクレオチドが一つ又は複数の式（I）のメタロセンで置換されることができ、ここでメタロセンの保護基R又はR’の一つはホスホルアミダイトである。
【００８４】
【化１６】
2005517709.tif 000018
【００８５】
別の例によれば、下記のスキーム２に示されるように“H−ホスホナート”シリーズサイクルの場合、このサイクルのいずれか一つ又はいくつかのヌクレオチドが本発明の式（I）のメタロセンで置換されることができ、ここでメタロセンの保護基R又はR’の一つはH−ホスホナートである。
【００８６】
【化１７】
2005517709.tif 000019
【００８７】
同様に、別の例によると、下記に示されるように“ホスホトリエステル”カップリングサイクルの場合、このサイクルのいずれかヌクレオチドの一つ又はいくつかが一つまたは複数の式（I）のメタロセンで置換され、ここで保護基R又はR’の一つはホスホジエステルである。
【００８８】
【化１８】
2005517709.tif 000020
【００８９】
同様に、BOC（tert−ブトキシカルボニル）又はFMOC（９−フルオレニルオキシカルボニル）化学による合成のように、周知のペプチドの合成の際、当業者は簡単に一つ又は複数の本発明のメタロセンで一つ又は複数のアミノ酸を置換することができる。
【００９０】
本発明のメタロセンによって標識されたオリゴヌクレオチド及びペプチドは新規であり、本発明のまた別の主題である。
【００９１】
上記のように、式（I）のメタロセンから得られる一つ又は複数のメタロセンでオリゴヌクレオチドは標識され、式中Y及びZは、それぞれ独立して−（ＣＨ2）n−Ｏ−、−（ＣＨ2）−Ｏ−[（ＣＨ2）2−Ｏ]p−及び−（ＣＨ2）q−ＣＯＮＨ−（ＣＨ2）r−Ｏ−から選択され、そしてペプチドは式（I）のメタロセンから得られる一つ又は複数のメタロセンで標識され、式中Yが−（ＣＨ2）s−NH−でありZが−（ＣＨ2）t−COOH−である。本発明の式（II）のメタロセンは、化学的な観点から、オリゴヌクレオチド配列のヌクレオシドを置換してオリゴヌクレオチド配列に組み込まれる。同様に、式（II）のメタロセンは、化学的な観点から、ペプチド配列のアミノ酸を置換してペプチド配列に組み込まれる。
【００９２】
好ましい実施態様によると、本発明のオリゴヌクレオチド又はペプチドは少なくとも一つの本発明のメタロセンを、それぞれ、３’−又は５’−位置若しくはC−末端又はN−末端に含む。
【００９３】
３’−位置に標識されたオリゴヌクレオチドを得ることが目的の場合、少なくとも一つの本発明のメタロセンがその官能化された末端の一つの共有結合反応でグラフトされた固体の支持体を使用することができる。この支持体−メタロセン複合体は本発明のまた別の主題である。
【００９４】
支持体として、下記の支持体LCAA−CPG（長鎖アルキルアミン制御有孔ガラス）を使用することができ、これは従来よりオリゴヌクレオチド合成に使用されている。
【００９５】
【化１９】
2005517709.tif 000021
【００９６】
本発明のメタロセンの支持体へのグラフトは、例えば、以下の方法に従って行うことができる：
【００９７】
【化２０】
2005517709.tif 000022
【００９８】
ここで、Matteucci＆Caruthers著、J.  Am.  Chem.  Soc.、１９８１年、１０３号、p.３１８５−３１９１中に述べられているように、Dmtrはジメトキシトリチル、DMAPはジメチルアミノピリジンそしてDCCはジシクロヘキシル−カルボジイミドである。
【００９９】
本発明は以下の実施例によってより理解され、これらは付随する図１を参照とし、図中、本発明のフェロセンを３’−位置に呈する本発明のオリゴヌクレオチドのHPLCトレースが示されており、そして実施例は純粋に説明のために与えられており本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１００】
＜例１：１−[３−O−ジメトキシトリチルプロピル]−１’−[３’−O−（２−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジチル）プロピル]フェロセン６の合成＞
【０１０１】
【化２１】
2005517709.tif 000023
【０１０２】
（１．１：１,１’−ビスホルミルフェロセン１の合成）
１２ｍｌの無水エチルエーテルに溶解した１ｇ（５．３７mmol）のフェロセンが７．２ｍｌ（１１．５６mmol）のｎ−BuLi（ヘキサン中の１．６M溶液）及び１．７４ｍｌ（１１．５６mmol）のN,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミンの添加によって処理された。反応物はアルゴン下で、そして常温で２０時間攪拌された。１．３３ｍｌ（１７．２０mmol）のDMFが−７８℃で加えられた。−７８℃で２時間攪拌された後、反応混合物は加水分解（１５ｍｌの水）された。ジクロロメタン（３ｘ１５ｍｌ）で水相が抽出された。得られた有機相はMgSO4上で乾燥され、そして濃縮された。残留物はシリカゲル上でペンタン／酢酸エチル（５０：５０）混合物で精製された。
【０１０３】
０．６２ｇ（２．５６mmol、４８％）の化合物１が茶色のペースト状で得られた。
【０１０４】
1H  NMR  (CDCl3)：４．６２（ｄ、J＝９Hz、４H、H2H3−H2’H3’）、４．８３（ｄ、J＝８．７Hz、４H、H1H4−H1’H4’）、９．８９（ｍ、２H、２CHO）。
13C  NMR  (CDCl3)：７０．９（C2H5）、７４．２０（C3C4）、８０．４（C1）、１９２．９（C6）。
MS：１８５（６０）、２４３（M・＋、９５）。
【０１０５】
（１．２：１,１’−ビス[（２−エチルオキシカルボニル）エテニル]−フェロセン２の合成）
０．０９４ｇ（４．０８mmol）のナトリウムと２５ｍｌの無水エタノールが、還流冷却器を備え、アルゴン下の５０ｍｌ三首丸底フラスコに加えられた。ナトリウムが完全に消費された後、溶液は０℃に冷却され、そして０．８０９ｍｌ（４．０８mmol）のエチルジエチルホスホノアセテート及び事前に１０ｍｌの無水エタノールに溶解された０．４７０ｇ（１．９４mmol）のフェロセン−１,１’−カルボキサルデヒド１が加えられた。
【０１０６】
常温に戻し蒸発の後、残留物がシリカゲル上でシクロヘキサン／酢酸エチル（９５：５）混合物によって精製された。
【０１０７】
０．５６０ｇ（１．４６mmol、７５％）の化合物２が赤い結晶状で得られた。
【０１０８】
1H  NMR  (CDCl3)：１．２６（ｔ、J＝７．１５とJ＝７．１２Hz、６H、H9H10H11−H9’H10’H11’）、４．１５（ｑ、J=７．１４とJ=７．１１Hz、４H、H7H8−H7’H8’）、４．３１（ｍ、４H、H2H3−H2’H3’）、４．３８（ｍ、４H、H1H4−H1’H4’）、５．９１（ｄ、J＝１５．８０Hz、２H、H6−H6’）、７．３３（ｄ、J＝１５．７９Hz、２H、H5−H5’）。
13C  NMR  (CDCl3)：１４．２（C10）、６０．１（C9）、６９．７（C2H5）、７２．２（C3C4）、７９．９（C1）、１１６．２（C7）、１４３．７（C6）、１６６．９（C8）。
MS：３８２（M・＋、８５）。
【０１０９】
（１．３：１,１’−ビス[（２−エチルオキシカルボニル）エチル]−フェロセン３の合成）
０．４００ｇ（１．０５mmol）の化合物２、０．１００ｇ（０．９４mmol）の炭に担持されたパラジウム（１０％Pd／C）及び４０ｍｌの酢酸エチルが１００ｍｌ丸底フラスコに加えられた。溶液はアルゴンのストリームで泡立てることによって慎重にガス抜きされた（約３０分）。バルーンの中にある水素が溶液が飽和するまで泡として加えられた。水素のバルーンはその集合体の上方に配置された。反応混合物はそして４８から７２時間の間激しく攪拌された。
【０１１０】
ろ過と濃縮の後、０．４００ｇ（１．０３mmol、９９％）の化合物３が黄色の油状に得られた。
【０１１１】
1H  NMR  (CDCl3)：１．１９（ｔ、J＝７．１５とJ＝７．１２Hz、６H、H11H12H13−H11’H12’H13’）、２．４３（ｍ、４H、H7H8−H7’H8’）、２．５７（ｍ、４H、H5H6−H5’H6’）、３．６４（ｓ、８H、H1H2H3H4−H1’H2’H3’H4’）、４．０６（ｑ、J＝７．１３とJ＝７．１５Hz、４H、H9H10−H9’H10’）。
【０１１２】
（１．４：１,１’−ビス（３−ヒドロキシプロピル）フェロセン４の合成）
０．１４０ｇ（３．７０mmol）のLiAlH4が攪拌されながらアルゴン下で、還流冷却器を備えた三首丸底フラスコに加えられた。シリンジを使用して７ｍｌの無水エチルエーテルが加えられた。９．５ｍｌの無水エチルエーテルに溶解された１．４３ｇ（３．７０mmol）のエステル３が一滴ずつ一定の還流を保つように加えられた。混合物は粘性の外観を有し、１５ｍｌの完全に無水のTHFの添加を化合物の溶解を促進するために必要とした。反応はTLC（溶出：シクロヘキサン／酢酸エチル（８０：２０））によってモニターされた。40分間攪拌した後、過剰なリチウム化合物が攪拌を続けながら水（１５ｍｌ）をゆっくりと加えることによって分解された。白い水酸化リチウムの沈殿物の形成が観察された。ろ過の後、水相がエチルエーテル（２ｘ２５ｍｌ）で抽出された。有機相は一緒にされ、MgSO4上で乾燥され、そして濃縮された。
【０１１３】
０．８１０ｇ（２．６８mmol、７２％）の化合物４が黄色い油状で回収された。
【０１１４】
1H  NMR  (CDCl3)：１．５４（ｍ、４H、H7H8−H7’H8’）、２．１２（ｔ、J＝７．８１とJ＝７．０８Hz、４H、H5H6−H5’H6’）、３．４３（ｔ、J=６．１２Hz、H9H10−H9’H10’）、３．８９（ｍ、８H、H1H2H3H4−H1’H2’H3’H4’）。
13C  NMR  (CDCl3)：２５．７（C6）、３４．１（C7）、６２．３（C8）、６９．０（C2H5）、６４．４（C3C4）、７０．３（C1’C2’C3’C4’C5’）、８９．１（C1）。
MS：１６１（２１）、１７９（４０）、３０２（M・＋、１００）。
【０１１５】
（１．５：１−[３−O−ジメトキシトリチルプロピル]−１’−[３’−ヒドロキシプロピル]フェロセン５の合成）
２００ｍｇ（０．６６２mmol）の１,１’−ジヒドロキシプロピルフェロセン４及び１６ｍｇ（０．１３２ｍｇ）のDMAPが連続して２５ｍｌ丸底フラスコに加えられた。５ｍｌの無水ピリジンによる２回の連続した共蒸発の後、得られた油が５ｍｌの無水ピリジンに採取された。２４７ｍｇ（０．７２８mmol）の４,４’−塩化ジメトキシトリチル及び１１５μｌ（０．６６２mmol）N,N−ジイソプロピルエチルアミンが加えられた。反応混合物は常温で攪拌されたまま窒素のストリームの下に置かれた。反応の進行はTLC（溶出：ジクロロメタン／メタノール／TEA  ８９／１０／１）によってモニターされた。溶出の後、プレートは系統的にエタノール／硫酸混合物の中で可視化された。常温で４時間攪拌された後、２ｍｌのメタノールが反応していない４,４’−塩化ジメトキシトリチルを中性化するために加えられた。半分に濃縮した後、残留物はジクロロメタン（２５ｍｌ）に採取され、そして溶液は飽和水性NaHCO3溶液で、次いで水（５ｘ２５ｍｌ）で洗浄された。MgSO4上で乾燥し濃縮した後、粗反応物は２ｘ１０ｍｌのトルエンと共蒸発され、そして真空下に一晩置かれた。混合物はシリカゲル（TEAで事前に中性化された）上で増加極性のジクロロメタン／メタノール混合物で精製された。
【０１１６】
３０４ｍｇ（７６％）のモノトリチル化化合物５が単離された。それはオレンジ色の油状である。
【０１１７】
1H  NMR  (d6−アセトン)：１．６４−１．７２（ｍ、２H、H7’H8’）、１．７５−１．８６（ｍ、２H、H7H8）、２．３８−２．５３（ｍ、４H、H5H6−H5’H6’）、３．０８−３．１４（ｔ、２H、H9H10）、３．５２−３．５８（ｔ、２H、H9’H10’）、３．７８と３．７９（２ｓ、６H、−OCH3）、３．９５−３．９８（ｍ、８H、H1H2H3H4−H1’H2’H3’H4’）、６．８２−７．６８（ｍ、１３H、Ar）。
【０１１８】
（１．６：１−[３−O−ジメトキシトリチルプロピル]−１’−[３’−O−（２−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミジチル）プロピル]フェロセン６の合成）
２５５ｍｇ（０．４２mmol）のODMT化合物５及び７ｍｇ（０．０５mmol）のDMAPが連続して２５ｍｌ丸底フラスコに加えられた。２ｘ２ｍｌの無水ピリジン及び２ｘ２ｍｌの無水THFでの連続した共蒸発の後、残留物が３ｍｌの無水THFに採取された。反応混合物は窒素のストリームの下に置かれ、そして１４７μｌ（０．８４mmol）のN,N−ジイソプロピルエチルアミンが一気に加えられた。１０４μｌ（０．４６mmol）の２−シアノエチル−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトがガラスシリンジを使用してゆっくりと加えられた（添加は約１０分間続く）。半分の添加の後、沈殿物の形成が観察された。常温で３時間３０分の攪拌の後、反応はTLC（溶出：ペンタン／酢酸エチル  ７０／３０）によってモニターされた。形成されたホスホルアミダイトの反応性が非常に高いため、従来使用された処理は行われない。粗生成物は半分に濃縮された。シリカを中性化するためのペンタン／TEA（０．５％）混合物と共にシリカカラム（かなり短い）が配置され、そして純ペンタンで洗浄された。粗生成物のすばやい添加の後、生成物のシリカとの接触を最低限に抑えるためにアルゴンによって移動を促進しながら、生成物はペンタン／酢酸エチル（８５／１５）混合物で溶出された。濃縮の後、１９０ｍｇ（５６％）の油が得られた。生成物は１２時間真空下に置かれ、そして−２０℃で保管された。
【０１１９】
この生成物の変性ODNの合成での使用の前に、リンNMRによって分解生成物の存在を確認することが好ましく、そして必要であれば生成物のすばやい精製を行うことが好ましい。
【０１２０】
31P  NMR  （CD3CN）：１４８．２５（P）。
【０１２１】
＜例２：２２マーのオリゴヌクレオチド３’Fc−C7−NH2７の合成＞
ODN７の配列は：３’  NH2−C7−Fc−TGG  AAT  ACT  CAG  GTT  CCT  TAT  G  ５’である。
【０１２２】
１７ｍｇの、５９μmol／ｇに官能化された支持体（（２−ジメトキシトリチルオキシメチル−６−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ−ヘキサン−１−スクシノイル）−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ  １０００）（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、米国）が合成カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、仏国）に加えられた。１００ｍｇの６（０．１２４ｍｍｏｌ）が１．２４ｍｌの無水アセトニトリル（ＡＢ、仏国）に溶解された。商業用ホスホルアミダイト（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）用のプロトコールに同じく従い、６の溶液はＡＢ３９４合成器の５つの位置で使用された。オリゴヌクレオチド７の合成はスタンダードな１μｍプログラムで実行され、そのホスホルアミダイトの結合のための工程は以下のように変更された：ホスホルアミダイト溶液の２回の３．５秒の回収（スタンダードプログラムでの１回の回収に代わって）が１５秒の間隔をあけて行われ、そして続いて２５秒の休憩があった。１サイクルにつき、全体の結合量は９７．５％であった。３０％水性アンモニアでのCPGの処理（１６時間の間５５℃で）の後、上澄み液がＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ．で濃縮された。生成物は１ｍｌのH2Oに吸収され、そして７が準備用カラム（Merck  LiChrospher  RP18E、１２μ、１００Å、３００ｘ７．５）で精製された。
【０１２３】
分留物がロータベーパー上で濃縮され、そしてエッペンドルフチューブ内で凍結乾燥の前にH2Oで４回共蒸発された。１５OD（２６０ｎｍでの吸収単位）の純生成物が得られた。
【０１２４】
生成物の純度はWaters  Deltapak  C18５μ３００Å（３．９ｘ１５０ｍｍ）カラムにおいて実行されたHPLC分析によって確認された。２６０ｎｍで得られたクロマトグラムが図１に示されている。
【０１２５】
質量分析（MALDI−TOF）、Voyager  DE（Perseptive  Biosystem）：
理論質量m／ｚ：７３５２．９、実測質量ｍ／ｚ：７３３８．３
【０１２６】
＜例３：オリゴヌクレオチドの合成のための支持体の製造＞
（３．１：１−[３−O−（p、p’−ジメトキシトリチル）プロピル]−１’−[３’−O−（スクシナート）−プロピル]フェロセン８のトリエチルアンモニウム塩の合成）
【０１２７】
【化２２】
2005517709.tif 000024
【０１２８】
１４９ｍｇ（２４７μmol、１当量）の１−[３−O−（p、p’−ジメトキシトリチル）プロピル]−１’−[３’−ヒドロキシプロピル]フェロセン、５．６７ｍｇ（６６７μmol、２．７当量）の無水コハク酸及び７ｍｇ（２５μmol、０．１当量.）の４−N,N−ジメチルアミノピリジン（DMAP）が、１８０ｍｌ（１．３mmol、５．３当量）のトリエチルアミンと２ｍｌの無水ジクロロメタン中で不活性雰囲気の下攪拌された。３時間後、反応混合物は水性重炭酸ナトリウム（３ｘ１０ｍｌ）とジクロロメタン（４０ｍｌ）の間で分画された。有機相は硫酸ナトリウム上で乾燥され、ろ過され、蒸発されてシリカゲルのカラム（CH2CL2中にMeOH勾配）で精製され１６０ｍｇ（１９８μmol、８０％）の所望の生成物を生成した。
【０１２９】
Rf（２％  MeOH／CH2CL2）＝０．８
1H  NMR：δ  ｐｐｍ(CDCl3)：＝７．３４（ｍ、９H、DMTｒ）、６．８２（ｍ、４H、DMTｒ）、４．１２（ｔ、２H、J＝６．３６Hz、−CH2OCOCH2−）、３．９６（ｍ、８H、フェロセン）、３．７９（ｓ、６H、２ｘOCH3）、３．０８（ｍ、８H、−CH2−O−DMTｒ）、２．６４（ｍ、４H、O−CO−CH2−CH2−COO‐）、２．４２（ｍ、４H、２ｘCH2−フェロセン）、１．８２（ｍ、４H、２ｘCH2CH2−CH2−）。
【０１３０】
（３．２：LCAA−CPG（長鎖アルキルアミン制御有孔ガラス）型の支持体への付着）
【０１３１】
【化２３】
2005517709.tif 000025
【０１３２】
上記で得られた４０．３ｍｇ（５０μmol）の１−[（p、p’−ジメトキシトリチル）プロパノール]−１’−（プロパノールスクシナート）フェロセンのトリエチルアンモニウム塩、５００ｍｇのLCAA−CPG（５００Å）支持体、６００ｍｇ（３mmol）のジチクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、４０ｍｇ（０．３２mmol）のジメチルアミノピリジン（DMAP）及び２１０μｌ（１．５mmol）のトリエチルアミンが機械的に３ｍｌのピリジン／ジクロロメタン（１／２）混合物中で４８時間攪拌された。シリカビーズが続いてろ過され、そしてピリジン、ジクロロメタン、メタノール、ジクロロメタン及びエーテル（各５０ｍｌ）で続けて洗浄された。
【０１３３】
残りのNH2官能基は、次に１ｍｌのピリジン及び２０ｍｇのDMAPの存在下で１ｍｌの無水酢酸をCPGビーズと２時間の間反応させることによってマスクされた。ビーズは続けてろ過され、そしてジクロロメタン、メタノール、ジクロロメタン及びエーテル（各２５ｍｌ）で連続して洗浄された。それらは真空でサンプルが一定重量に達するまで乾燥された。
【０１３４】
支持体の官能化は、支持体の一部を酸処理にさらした後放出されるジメトキシトリチル  カチオンを定量的に測定することによって評価された。０．１μmol／ｍｇの官能化が得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】本発明のフェロセンを３’−位置に呈する本発明のオリゴヌクレオチドのHPLCトレース。
【図１】
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【国際調査報告】
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