(57)【要約】脂質エタノール混合液に、生物活性物質の水溶液又はエタノール溶液を、前記脂質の脂質成分のうちの少なくとも１つの相転移よりも低い温度で浸出させるステップを含む、リポソームの生物活性物質を調製する方法と、前記本発明の方法により作製される組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質エタノール混合液に、生物活性物質の水溶液又はエタノール溶液を、前記脂質の脂質成分のうちの少なくとも１つの相転移よりも低い温度で浸出させるステップを含む、リポソーム化生物活性物質を調製する方法。
【請求項２】
前記生物活性物質が抗菌剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗菌剤がアミノグリコシドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アミノグリコシドがアミカシンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗菌剤がキノリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノグリコシドがテトラサイクリンである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
生物活性物質対脂質の比率がほぼ3:1未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
生物活性物質対脂質の比率がほぼ2.5:1未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記温度がほぼ摂氏４０度未満である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１０】
前記温度がほぼ摂氏３０度未満である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１１】
脂質−エタノール溶液の濃度がほぼ50mg/mL未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
生物活性物質をリポソーム又は脂質複合体中に封入する方法であって、
ａ）前記生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液を調製するステップと、
ｂ）脂質−エタノール溶液を調製するステップと、
ｃ）前記脂質−エタノール溶液を、前記生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液に浸出させて生成物を作製するステップであって、前記浸出させるステップが、前記脂質−エタノール溶液の脂質成分のうちの少なくとも１つの相転移より低い温度で行われる、ステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
前記生成物を洗浄するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生成物を洗浄するステップが透析又はダイアフィルトレーションを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂質−エタノール溶液の濃度がほぼ50mg/mL未満である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂質−エタノール溶液の濃度がほぼ30mg/mL未満である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質−エタノール溶液を、生物活性物質を含有する前記水溶液又はエタノール溶液に浸出させるステップが、生物活性物質を含有する前記水溶液又はエタノール溶液の表面の上方で行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記透析がNaClの存在下で行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記透析がNa２SO４の存在下で行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記Na２SO４が、ほぼ1.5% w/v乃至3.0% w/vの間の濃度を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物活性物質が抗菌剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗菌剤がアミノグリコシドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗菌剤がアミカシンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗菌剤がゲンタマイシンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗菌剤がシプロフロキサシンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物活性物質を含有する前記水溶液又はエタノール溶液が緩衝剤をさらに含有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
生物活性物質をリポソーム又は脂質複合体中に封入する方法であって、
ａ）前記生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液を調製するステップと、
ｂ）小単層膜ベシクルを調製するステップと、
ｃ）前記生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液を前記小単層膜ベシクルと混合して生成溶液を作製するステップと、
ｄ）エタノールに前記生成溶液を浸出させて生成物を作製するステップであって、前記浸出させるステップが、前記脂質−エタノール溶液の脂質成分のうちの少なくとも１つの相転移より低い温度で行われる、ステップと
を含む、方法。
【請求項２８】
前記生成物を洗浄するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生成物を洗浄するステップが透析又はダイアフィルトレーションを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
エタノールを前記生成溶液に浸出させるステップが、前記生成溶液の表面より上方で行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記透析がNaClの存在下で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記透析がNa２SO４の存在下で行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記Na２SO４が、ほぼ1.5% w/v乃至3.0% w/vの間の濃度を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物活性物質が抗菌剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗菌剤がアミノグリコシドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗菌剤がアミカシンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗菌剤がゲンタマイシンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗菌剤がシプロフロキサシンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物活性物質を含有する前記水溶液又はエタノール溶液が緩衝剤をさらに含有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１に記載のプロセスにより作製されたリポソーム化生物活性物質を含む、静脈内投与用に適合された組成物。
【請求項４１】
請求項１に記載のプロセスにより作製されたリポソーム化生物活性物質を含む、吸入による投与用に適合された組成物。
【請求項４２】
請求項１２に記載のプロセスにより作製されたリポソーム化生物活性物質を含む、静脈内投与用に適合された組成物。
【請求項４３】
請求項１２に記載のプロセスにより作製されたリポソーム化生物活性物質を含む、吸入による投与用に適合された組成物。
【請求項４４】
請求項２７に記載のプロセスにより作製されたリポソーム化生物活性物質を含む、静脈内投与用に適合された組成物。
【請求項４５】
請求項２７に記載のプロセスにより作製されたリポソーム化生物活性物質を含む、吸入による投与用に適合された組成物。
【請求項４６】
前記脂質-エタノール溶液が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、コレステロール及びジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項４７】
DPPC：DOPC：コレステロール：DOPGのモル比が59:5:30:6である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記脂質-エタノール溶液が、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、コレステロール及びジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)を含み、前記生物活性物質がゲンタマイシンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項４９】
DPPC：DOPC：コレステロール：DOPG のモル比が59:5:30:6である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記脂質-エタノール溶液がジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)及びコレステロールを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項５１】
DPPC：コレステロールのモル比が1:1である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記脂質-エタノール溶液がジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)及びコレステロールを含み、前記生物活性物質がアミカシンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項５３】
DPPC：コレステロールのモル比が1:1である、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本出願は、その開示を、その全文をここに記載した場合と同様に引用をもってここに援用することとする２００２年３月５日提出の米国仮特許出願60/361,809号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は生物活性物質をリポソーム又は脂質複合体内に封入する方法に関する。
【０００３】
生物活性物質のリポソーム又は脂質複合体内への封入は、最高溶融点を持つ当該脂質成分の相転移よりも高い温度で行われねばならないことが当業で公知である。本発明は、脂質成分のうちの少なくとも１つの相転移よりも低い温度でリポソーム又は脂質複合体内に生物活性物質を封入する方法を包含するものである。驚くべきことに、この方法は、生物活性物質の封入に成功し、高い封入率を達成することが実証されている。
【０００４】
リポソーム化抗菌剤を製造する公知の方法の障害の１つは、このプロセスが水不混和性又は毒性の溶媒を用いることである。加えて、その結果得られるベシクルの大きさは調節が難しい。1ミクロンを越えるリポソームを作製するためのよく確立された方法があり、また、それらを0.03ミクロン未満に均質化する方法もある。中間の範囲の作製はより難しい。
【０００５】
本発明の製造法では、水不混和性又は毒性のいずれの溶媒も用いない。本プロセスは簡便であり、また一定の割合での製造が可能である。小単層膜ベシクル又は脂質を、無菌的な加工のために滅菌濾過することができる。形成されるベシクルの大きさは、脂質の組成、脂質の濃度、医薬品添加物、温度、及び剪断力を変更することにより、押出を行うことなく調節することができる。さらに、ベシクルの大きさは、他のプロセスで製造されるベシクルの大きさにとって概して好ましい中間の大きさである。
【０００６】
発明の簡単な説明
本発明は、脂質混合物の脂質成分のうちの少なくとも１つの相転移よりも低い温度で、脂質−エタノール混合物に生物活性物質を浸出させるステップを含む、生物活性物質をリポソーム又は脂質複合体内に封入する方法に関する。
【０００７】
ある実施態様では、生物活性物質をリポソーム又は脂質複合体内に封入する本方法は：
ａ）生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液を調製するステップと、
ｂ）脂質−エタノール溶液を調製するステップと、
ｃ）前記脂質−エタノール溶液を、前記生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液に浸出させて、製品を作製するステップと
を含む。前記浸出させるステップは、脂質−エタノール溶液の脂質成分のうちの少なくとも１つの相転移よりも低い温度で行われる。当該温度は、摂氏４０度未満、摂氏３５度未満、又は摂氏２０度未満であることが好ましいであろう。さらに、本方法には、製品を、好ましくは透析又はダイアフィルトレーションにより、洗浄するステップを含めることができる。
【０００８】
脂質−エタノール溶液の濃度は、好ましくはほぼ50mg/mL未満であるが、より好ましくはほぼ30mg/mL未満である。
【０００９】
脂質−エタノール溶液を、生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液に浸出させるステップは、前記生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液の表面より上方で行うことも、又は、下方で行うこともできる。好ましくはこのステップを、該溶液の表面より上方で行うとよい。
【００１０】
透析は、好ましくはほぼ1.5% w/v及び3.0% w/vの濃度のNaCl 又はNa２SO４の存在下で行われるとよい。
【００１１】
生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液には緩衝剤を含めることができる。
【００１２】
別の実施態様では、生物活性物質をリポソーム又は脂質複合体内に封入する本方法は、
ａ）生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液を調製するステップと、
ｂ）小単層膜ベシクルを調製するステップと、
ｃ）前記生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液を前記小単層膜に混合して、その結果の生成溶液を作製するステップと、
ｄ）エタノールに前記生成溶液を浸出させて製品を作製するステップと
を含む。前記浸出させるステップは、脂質−エタノール溶液の脂質成分のうちの少なくとも１つの相転移よりも低い温度で行われる。前記ステップを摂氏ほぼ１０度と摂氏ほぼ４０度の間の温度で行ってもよい。本方法には、さらに、透析又はダイアフィルトレーションで行ってもよい製品の洗浄ステップを含めることもできる。
【００１３】
さらに本発明は、本発明のプロセスにより作製されたリポソームの生物活性物質を含む、静脈内投与用又は吸入用に適合された組成物に関する。
【００１４】
発明の詳細な説明
用語「生物活性物質」又は「薬剤」は、本明細書全体を通じて、生物活性を持つ化合物又は組成物を言うために用いられている。本発明の生物活性物質には、数多くの治療領域の状態の治療又は予防に用いることのできる薬剤が包含される。これらの治療領域には、感染性疾患（抗菌性、抗カビ性及び抗ウィルス性の活性、ワクチン）、（関節炎及び高血圧を含む）炎症性疾患、新生物性疾患、糖尿病、骨粗鬆症、疼痛管理、一般的な心臓血管疾患及び肺疾患、がある。肺疾患には、喘息、気腫、肺癌、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、気管支炎、インフルエンザ、肺炎、結核、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、乳幼児急死症候群（SDK）、呼吸系発疹ウィルス（RSV）、AIDS関連肺疾患（例えばニューモシスティスカリニ肺炎、マイコバクテリウム−アビウム症候群、カビ感染等）、サルコイドーシス、睡眠無呼吸、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、気管支拡張症、細気管支炎、気管支肺異形成、コクシジオイデス症、ハンタウィルス肺症候群、ヒストプラズマ症、百日咳及び肺高血圧症、がある。限定はしないが、細菌、酵母、ウィルス、原虫又は寄生生物を含むいくつかの他の有害又は病原性の生物を致死又はその成長を阻害する働きをすると共に、生きた生物、特に哺乳動物、特にヒトなどの動物、に投与することのできる生物活性物質。用語「生物活性物質」には、さらに、遺伝子治療及び撮像で用いられる化合物又は組成物も含まれる。
【００１５】
本発明の方法を用いて封入することのできる生物活性物質のいくつかの具体的な例には、スルホンアミド、例えばスルホンアミド、スルファメトキサゾール及びスルフアセトアミド；トリメトプリン、特にスルファメトキサゾールと組み合わせたもの；ノルフロキサシン及びシプロフロキサシンなどのキノリン；ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、アンピシリン、アモキシシリン、及びピペラシリンなどのペニシリン、及びピペラシリン、セファロスポリンＣなどのセファロスポリン、セファロシン、セフォキシチン及びセフタジジンを含むベータ−ラクタム化合物、イミペネム及びアズトレオナムなどの他のベータ−ラクタム抗菌剤；クラブラン酸などのベータ・ラクタマーゼ阻害剤；ゲンタマイシン、アミカシン、エルシロマイシン、トブラマイシン、ネオマイシン、カナマイシン及びネチルミシンなどのアミノグリコシド；クロルテトラサイクリン及びドキシサイクリンなどのテトラサイクリン；クロラムフェニコール；エリスロマイシンなどのマクロライド；又は、クリンダマイシン、ポリマイキシンや抗菌剤用、そしてときには抗カビ用、感染用のバシトラシンなど、種々の抗菌剤；アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、及びハミシンなどのポリエン抗菌剤；フルシトシン；ケトコナゾール、ミコナゾール、イトラコナゾール及びフルコナゾールなどのイミダゾール又はトリアゾール；例えばアスペルギルス症、カンジダ症又はヒストプラズマ症などの抗カビ疾患用のグリセオフルビン；ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスリジン、トリフルリジン、インターフェロン（例えばインターフェロンアルファ-2a又はインターフェロンアルファ-2b）及び抗ウィルス性疾患用のリバビリン；アスピリン、フェニルブタゾン、フェナセチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、インドメタシン、スリンダック、ピロキシカム；ジクロフェナック；関節炎などの炎症性疾患用のゴールド及びステロイド系抗炎症剤；カプトプリル、エナラプリル、及びリジノプリルなどのACE阻害剤；亜硝酸アミル、ニトログリセリン及びイソソルビドジニトレートなどの有機硝酸塩；ジルチアゼム、ニフェジピン及びベラパミルなどのカルシウム・チャネル遮断剤；心臓血管疾患用のプロプラノロールなどのベータ・アドレナリン作動性アンタゴニスト；チアジドなどの利尿薬；例えばベンゾチアジアジン又はループ利尿薬、例えばフロセミド；メチルドーパ、クロニジン、グナベンズ、グアナエチジン及びレセルピンなどの交感神経遮断薬；ヒダラジン及びミノキシジルなどの血管拡張剤；ベラパミルなどのカルシウム・チャネル遮断剤；高血圧治療用のカプトプリルなどのACE阻害剤；心臓不整脈の治療用のキニジン、プロカインアミド、リドカイン、エンカイニド、プロプラノロール、エスモロール、ブレチリウム、ベラピミル及びジルチアゼム；低脂血症の治療用のロボスタチン、リピトール、クロフィブレート、コレストリアミン、プロブコール、及びニコチン酸；ドキソルビシン、ダウノルビシン及びイダルビシンなどのアントラサイクリン；共有結合型DNA結合化合物、共有結合型DNA結合化合物及びプラチナ化合物、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；葉酸アンタゴニスト、例えばメトトレキセート及びトリメトレキセート；抗代謝産物及びピリミジンアンタゴニスト、例えばフルオロウラシル、5-フルオロウラシル及びフルオロデオキシウリジン；抗代謝産物及びプリンアンタゴニスト、例えばメルカプトプリン、6-メルカプトプリン及びチオグアニン；抗代謝産物及び糖修飾類似体、例えばシタラビン及びフルダラビン；抗代謝産物及びリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、例えばヒドロキシウレア；共有結合型DNA結合化合物及びナイトロジェンマスタード化合物、例えばシクロホスファミド及びイフォスファミド；共有結合型DNA結合化合物及びアルカンスルホネート、例えばブスルファン；カルムスチンなどのニトロソウレア；共有結合型DNA結合化合物及びメチル化剤、例えばプロカルバジン；共有結合型DNA結合化合物及びアジリジン、例えばミトマイシン；非共有結合型DNA結合化合物；非共有結合型DNA結合化合物、例えばミトキサントロン及びブレオマイシン；クロマチン機能の阻害剤及びトポイソメラーゼ阻害剤、例えばエトポシド、テニポシド、カンプトテシン及びトポテカン；クロマチン機能阻害剤及び微小管阻害剤、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンジシン、及びパクリタキセル、タキソテル又は他のタキサンを含むビンカアルカロイド；内分泌機能に影響する化合物、例えばプレドニゾン、プレドニゾロン、タモキシフェン、ロイプロリド、エチニルエストラジオール、ハーセプチンなどの抗体；遺伝子、例えばp-53遺伝子、p 16遺伝子、MIT遺伝子、及び遺伝子E-カドヘリン；サイトカイン、例えばインターロイキン、特にIL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8 及びIL- 12、腫瘍壊死因子、例えば腫瘍壊死因子-アルファ及び腫瘍壊死因子-ベータ、コロニ刺激因子、例えば顆粒球コロニ刺激因子(G-CSF)、マクロファージコロニ刺激因子 (M-CSF）、及び顆粒球マクロファージコロニ刺激因子 (GM-CSF)、インターフェロン、例えばインターフェロン-アルファ、インターフェロン-ベータ1、インターフェロン-ベータ2、及びインターフェロン-ガンマ；癌治療用のすべてのtransレチノイン酸又は他のレチノイド；免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、免疫グロブリン、及びスルファサジン、メトクサレン及びサリドイミド；糖尿病用のインシュリン及びグルコゴン；骨粗鬆症、高カルシウム血症及びパジェット病の治療用のカルシトニン及びナトリウムアレンドロネート；モルヒネ及び関連するオピオイド；メペリジン又はコンジナー；メタドン又はコンジナー；ナロルフィンなどのオピオイドアンタゴニスト；デキストロメトロファンなどの中枢作用性鎮咳薬；疼痛管理用のテトラヒドロカンナビノール又はマリノール、リドカイン及びブピビカイン；クロロプロマジン、プロクロルペラジン；カンナビノイド、例えばテトラヒドロカンナビノール、ドロペリドールなどのブチルフェノン；吐き気及び嘔吐の治療用のメトクロプラミドなどのベンザミド；抗凝固剤、抗血栓剤又は抗血小板剤としてのヘパリン、クマリン、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベータ因子(t-PA)；炎症性腸疾患の治療用のヘパリン、スルファサラジン、ニコチン及び副腎皮質ステロイド及び腫瘍壊死因子アルファ；喫煙中毒の治療用のニコチン；ホルモン治療用の成長ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、及びソマトロピ���；並びに全身アナフィラキシー用のアドレナリン、がある。
【００１６】
用語「リポソーム化」は本出願全体を通じて、リポソーム又は脂質複合体内に封入された、又は、リポソーム又は脂質複合体に結合した、物質を言うために用いられている。脂質複合体とは、一種以上の脂質に結合した物質である。
【００１７】
用語「処理」又は「処理する」とは、医学的状態を予防、改善、治療又は向上させるために、哺乳動物又はヒトなどの動物に組成物を投与することを意味する。
【００１８】
リポソームの生物活性物質は、持続的な治療効果又は低い毒性を有することで、投与回数を減らし、治療指数が高くなるようにデザインすることができる。リポソームは、所望の医薬を封入する二重層から構成される。これらを、異なる層の脂質の中か、又は、層間の水性空間内のいずれかに医薬が封入された状態の、同心円的な二重層の多重膜ベシクルとして構成することができる。
【００１９】
本発明の組成物中に用いられる脂質は、リン脂質、トコフェロール、ステロイド、脂肪酸、アルブミンなどの糖タンパク質、負の電荷を持つ脂質、及び陽イオン性の脂質を含め、合成でも、半合成でも、又は天然で生じる脂質でもよい。リン脂質には、卵ホスファチジルコリン（EPC）、卵ホスファチジルグリセロール（EPG）、卵ホスファチジルイノシトール（EPI）、卵ホスファチジルセリン（EPS）、ホスファチジルエタノールアミン（EPE）、及び卵ホスファチジン酸（EPA）；大豆相当物、大豆ホスファチジルコリン (SPC)；SPG、SPS、SPI、SPE、及びSPA；水素化した卵及び大豆相当物（例えばHEPC、HSPC)、コリン、グリセロール、イノシトール、セリン、エタノールアミンを含め、12個乃至26個の炭素原子の鎖を含有するグリセロールの2及び3位の脂肪酸のエステル結合と、グリセロールの１位に様々な先頭基を持つ他のリン脂質や対応するホスファチジン酸、がある。これらの脂肪酸上の鎖は飽和していても、又は不飽和でもよく、そして該ホスホリピドは、様々な鎖長及び様々な不飽和の程度の脂肪酸から成っていてもよい。具体的には、本調合物の組成には、天然で生じる肺表面活性物質の主要構成成分であるジパルミトイルホスファチジルコリン (DPPC)や、ジオレオイルホスファチジルコリン (DOPC)及びジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）を含めることができる。他の例には、ジミリストイルホスファチジルコリン (DMPC) 及びジミリストイルホスファチジルグリセロール (DMPG) ジパルミトイルホスファチドコリン (DPPC) 及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール (DPPG) ジステアロイルホスファチジルコリン (DSPC) 及び ジステアロイルホスファチジルグリセロール (DSPG)、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE) 及びパルミトイルステアロイルホスファチジルコリン (PSPC) 及びパルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール (PSPG)のような混合ホスホリピド、並びにモノ-オレイル-ホスファチジルエタノールアミン (MOPE)のような単一アシル化ホスホリピド、がある。
【００２０】
好適な実施態様では、用いる脂質は、DPPCなど、よく定義された相転移を持つ飽和ホスファチジルコリンである。
【００２１】
用いる脂質−エタノール溶液は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、コレステロール及びジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）を含むことができる。DPPC：DOPC：コレステロール：DOPGのモル比は59:5:30:6であってよい。脂質−エタノール溶液は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）及びコレステロールを1:1のモル比で含んでいてもよい。
【００２２】
封入率は、DOPCの量が30% DOPCを越えて増えると減少する。同様な傾向はこれらのリポソームの生物活性でも観察される。光学顕微鏡で観察されるように、シートの形成は約80%DPPCを越えたときに起きる。
【００２３】
当該のプロセスを公知のプロセスに比較すると、脂質対生物活性物質のモル対モル比の減少が示される。より具体的には、本発明のプロセスを用いた脂質対生物活性物質の比は、5対1未満である。より好ましくは、本発明のプロセスを用いた脂質対生物活性物質の比率は、3対1未満であるとよい。さらにより好ましくは、脂質対生物活性物質の比率は、 2.5対1未満である。
【００２４】
本発明の製造プロセスの一実施態様を図１に示す。小単層膜ベシクル（SUV）の形のリポソーム（1)を、封入しようとする生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液（2)と混合する。エタノールをこの混合液に浸出させる。この混合液は、すぐに脂質（3)の拡がったシートか、又は、多重膜ベシクル（MLV）を形成する。(5)。脂質の拡がったシートは、スパージングか、あるいは遠心分離、透析又はダイアフィルトレーションなどの方法で洗浄を行うことでエタノールを除去するとMLVを形成するであろう。このMLVは、直径でほぼ0.1乃至ほぼ3.0μmの範囲になるであろう。
【００２５】
二番目の実施態様を図２に示す。用いる脂質をエタノールに溶解させて脂質−エタノール溶液(6)を形成する。この脂質−エタノール溶液に、封入しようとする生物活性物質(7)の分子を含有する水溶液又はエタノール溶液を浸出させる。操作はすべて、最低溶融脂質の相転移の下方で行われる。この混合液は、すぐに、脂質の拡がったシート(8)又は多重膜ベシクル（MLV）(10)を形成する。この脂質の拡がったシートは、スパージングか、あるいは遠心分離、透析又はダイアフィルトレーションなどの方法で洗浄を行うことでエタノールを除去(9)するとMLVを形成するであろう。このMLVは、直径でほぼ0.1乃至ほぼ3.0μmの範囲になるであろう。
【００２６】
本発明の好適な実施態様では、脂質エタノール溶液の濃度は50mg/mL未満である。あるより好適な実施態様では、脂質−エタノール溶液の濃度は30mg/mL未満である。
【００２７】
別の好適な実施態様では、透析は、ほぼ0.5% w/v乃至ほぼ3.5% w/vの間の濃度のNaCl溶液を用いて行われる。より好適な実施態様では、透析は、ほぼ0.5% w/v乃至ほぼ3.5% w/vの間の濃度のNa２SO４溶液を用いて行われる。さらにより好適な実施態様では、透析は、ほぼ1.5% w/v乃至ほぼ3.0% w/vの間の濃度のNa２SO４溶液を用いて行われる。
【００２８】
ある好適な実施態様では、エタノールを、生物活性物質を含有する水溶液又はエタノール溶液に、この溶液の表面上方から浸出させる。
【００２９】
親油性分子の封入のためには、当該分子をまず、脂質と一緒にエタノールに溶解させ、この混合液を水相に浸出させる。
【００３０】
本プロセスは、大規模な無菌的製造に簡単に適合させることができる。最終的なリポソームのサイズは、脂質の組成、濃度、医薬品添加物及び加工パラメータを変更することにより、調節することができる。本出願の範囲を限定することなく、ベシクルがゆっくりと密封されることが、高レベルの封入率に関係しているだろうと考えられる。
【００３１】
表１では、本発明の封入法の実施態様の１つを公知の封入法と比較する。この表では、脂質対薬物の比率や、その結果できるベシクルのサイズを比較する。本発明の方法は、(E)低い脂質対薬物比や、より小型のベシクル・サイズを示す。
【００３２】
Ａ．  1mlのストック脂質−エタノール溶液を回転蒸発器上で乾燥させて30mgの脂質を生じさせた。3.23mLのストックのアミカシンを摂氏５０度で加えた。
【００３３】
Ｂ．  1mlのストック脂質−エタノール溶液を回転蒸発器上で乾燥させて30mgの脂質を生じさせた。3.23mLのストックのアミカシンを加えた。この溶液に、ドライアイス／エタノールを用いた凍結と、摂氏５０度の槽内での解凍とを５サイクル、行った。
【００３４】
Ｃ．  1mlのストック脂質−エタノール溶液を回転蒸発器上で乾燥させて30mgの脂質を生じさせた。0.646mLのMeCl２を加えた。3.23mLのアミカシン溶液を加えた。N２ガスを用いてMeCl２を取り除いた。
【００３５】
Ｄ．  1mLのストック脂質−エタノール溶液に摂氏５０度の3.23mLのアミカシン溶液を浸出させた。
【００３６】
Ｅ．  1mLのストック脂質−エタノール溶液に摂氏２５度の3.23mLのアミカシン溶液を浸出させた。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
実施例１：  アミカシンを封入するプロセス
7.47g DPPC 及び3.93g コレステロールを352.5 mL エタノールに５０℃の水槽内で直接、溶解させた。85.95gのアミカシンスルフェートを、1147.5 ML PBS緩衝液中に直接、溶解させた。次に57.3 mg/ml アミカシンスルフェート溶液を10M NaOH 又はKOH で滴定して、ｐＨをほぼ6.8にした。
【００３９】
352.5 mL の32.3 mg/ml エタノール／脂質溶液を1147.5 mL アミカシン／緩衝液に加えるか、又は浸出させて、当初の総体積を1.5Lとした。エタノール／脂質を、ぜん動性ポンプで30 mL/分（浸出速度とも呼ばれる）で、摂氏２５度の攪拌プレートに載せた反応容器内で150RPMで高速で攪拌中のアミカシン／緩衝液に送り込んだ。
【００４０】
その生成物を摂氏２５度で２０乃至３０分間、攪拌した。
【００４１】
該混合容器をぜん動ポンプ及びダイアフィルトレーション・カートリッジに取り付けた。該ダイアフィルトレーション・カートリッジは、分子量カットオフ値が500キロダルトンの中空膜繊維である。該生成物を反応容器からこのダイアフィルトレーション・カートリッジを通し、さらに摂氏２５度の該混合容器に戻るようにポンプした。ほぼ7psiの背圧がこのカートリッジで生じる。遊離アミカシン及びエタノールを該背圧によりこの中空繊維膜を強制的に通過させ、リポソームのアミカシン（生成物）を漉し取った。該生成物を８回、摂氏２５度で洗浄した。新鮮なPBS緩衝液をこの反応容器に（別のぜん動ポンプで）加えることで、透過残留物を補い、また生成物体積を一定に維持した。生成物を濃縮した。150mLのリポソームのアミカシンが生じた。
【００４２】
実施例1a
前記のプロセスを、20.0 mg/mL 脂質/エタノール溶液 及び35.2 mg/mL 脂質 エタノール溶液を用いて繰り返した。脂質対薬物の比率は、脂質溶液濃度が増すにつれ、増した。（図３）。
【００４３】
実施例1b
前記のプロセスを、様々な濃度のNaCl及びNa２SO４を透析に用いて繰り返した。脂質封入率は、ほぼ1.5% w/v Na２SO４ 乃至ほぼ3% w/v Na２SO４の間の濃度のときに最高である（図４）。
【００４４】
実施例１c
前記のプロセスを、21.3 mg/mL 脂質/エタノール溶液を用いて繰り返した。一番目の場合では、エタノールをアミカシン／緩衝液に上方から浸出させた。二番目の場合では、エタノールにアミカシン／緩衝液を当該溶液の表面の僅か下方から直接、浸出させた。 封入率は、エタノールに上方から浸出させた場合の方が良好だった。（表２）。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
実施例1d
規定された比率のDPPC及びDOPCの混合液をエタノールに溶解させる。脂質のストック溶液を各比率ごとに32.5 mg脂質/mlになるように作製する。封入しようとする分子は、75 mg/ml のストックを10 mM Hepes 緩衝液、pH 6.8、150 mM NaClに溶かしたアミカシンスルフェートである。1 ml のアミカシンストックに、室温の0.31 ml エタノール/脂質ストック溶液を浸出させる。結果を図５、６及び７に示す。
【００４７】
上述の通りに、DOPCの代わりにコレステロールを用いて行う。90%のDPPCを浸出させたときにシートが観察された。 80% のときは、シート及びベシクルの混合物が存在した。結果を図８、９及び１０に示す。
【００４８】
実施例２：  シプロフロキサシンを封入するプロセス
141.7 mg DPPC 及び8.3 mg コレステロールをクロロホルムに溶解させた後、回転蒸発させ、真空下に一晩放置して、クロロホルムを取り除いた。残った薄膜をpH5の1.5 mLのクエン酸緩衝液で水和化させて、100 mg/ml のMLV 溶液とした。次に、このMLV 溶液をSUVが形成されるまで音波破砕した（１時間）。16 mg/mlのストックシプロフロキサシン溶液をpH5のクエン酸緩衝液に溶かした溶液を調製した。これらを以下の通りに混合した。
【００４９】
摂氏２５度の0.764 mL SUV(100 mg/ml)を0.764(16 mg/ml シプロ・ストック）及び0.470 mL EtOH に加えて、2 mL の試料体積とした。次にこの試料をpH5のクエン酸緩衝液で透析した。
【００５０】
実施例３：  ゲンタマイシンを封入するプロセス
DPPC/DOPC/Chol./DOPG (59/5/30/6 モル比) をエタノールに溶解させて32.3 mg/mL 脂質-エタノール溶液を作製した。
【００５１】
75 mg/ml ゲンタマイシンスルフェート溶液を10M NaOH 又はKOHで滴定して、ｐＨをほぼ6.8にした。
【００５２】
35.3 mL の32.3 mg/mL エタノール-脂質溶液を114.7 mLゲンタマイシンスルフェートノ10 mM Hepes溶液に浸出させた。エタノール/脂質を、ぜん動ポンプで30 mL/分（浸出速度とも呼ばれる）で、摂氏２５度の攪拌プレート上に置かれた反応容器内で150RPMで高速攪拌中のゲンタマイシン／緩衝液に送り込んだ。
【００５３】
生成物を摂氏２５度で２０乃至３０分間、攪拌してから、NaClでダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションによる洗浄後の最終的な封入率は、脂質／薬物質量比が7.8だった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明の封入方法の好適な実施態様の図である。
【図２】図２は、本発明の封入方法の好適な実施態様の図である。
【図３】図３は、様々な脂質濃度に対して相対的な脂質／薬物の比率を示した図解である。
【図４】図４は、様々な透析中指の封入の図解による比較である。
【図５】図５は、DOPCの量に比較したときのアミカシン／脂質の比率の図解である。
【図６】図６は、DOPCの量に比較したときのベシクル・サイズの図解である。
【図７】図７は、DOPCの量に比較したときの致死面積の図解である。
【図８】図８は、コレステロールの量に比較したときのアミカシン／脂質の比率の図解である。
【図９】図９は、コレステロールの量に比較したときのベシクル・サイズの図解である。
【図１０】図１０は、コレステロールの量に比較したときの致死面積の図解である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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