(57)【要約】本発明は、「オンライン」または「リアルタイム」代謝フラックス分析を用いた、新規および改変された表現型の全細胞操作のための方法を提供する。本発明は、細胞の遺伝子構成を改変し、前記改変された細胞を培養して複数の改変細胞を生成させ、リアルタイムで前記細胞培養物をモニターすることにより前記細胞の少なくとも一つの代謝パラメータを測定することによる、オンライン」または「リアルタイム」代謝フラックス解析を用いた、新規および改変された表現型の全細胞操作のための方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法を実行するための、機械実行可能な命令を含む機械読み取り可能な媒体およびシステムを含む物品、例えば、コンピューターシステムを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リアルタイム代謝フラックス分析を用いた新規又は改変表現型の全細胞操作の方法であって、
(a)細胞の遺伝子構成を改変することによって、改変細胞を作成する工程；
(b)前記改変細胞を培養して、複数の改変細胞を生成する工程；
(c)工程(b)の細胞培養をリアルタイムでモニタリングすることによって、前記細胞の代謝パラメータの少なくとも一つを測定する工程；及び
(d)工程(c)のデータを分析して、測定したパラメータと同様な条件下の非改変細胞における比較可能な測定値とが異なるかどうかを決定することによって、リアルタイム代謝フラックス分析を用いて前記細胞における操作された表現型を同定する工程；
を含む前記方法。
【請求項２】
細胞の遺伝子構成が、細胞に対する核酸の付加を含む方法によって改変される、請求項１の方法。
【請求項３】
核酸が、細胞に対して異種の核酸を含む、請求項２の方法。
【請求項４】
同種核酸が改変同種核酸を含む、請求項３の方法。
【請求項５】
新たに操作された表現型を含んでいる細胞を選択する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項６】
選択した細胞を培養することによって、新たに操作された表現型を含んでいる新しい細胞株を生成する工程をさらに含む、請求項５の方法。
【請求項７】
新たに操作された表現型が、ポリペプチドの発現又は量の増加又は減少、mRNA転写物量の増加又は減少、遺伝子発現の増加又は減少、毒素に対する耐性又は感受性の増加又は減少、代謝産物の耐性使用又は生産の増加又は減少、細胞による化合物摂取の増加又は減少、代謝率の増加又は減少、及び成長率の増加又は減少からなる群より選択される、請求項５の方法。
【請求項８】
新たに操作された表現型を含んでいる細胞を単離する工程を更に含む、請求項１の方法。
【請求項９】
新たに操作された表現型が安定な表現型である、請求項１の方法。
【請求項１０】
工程(a)の異種遺伝子が配列改変された同種遺伝子を含み、
(e)細胞の同種遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程；
(f)各々が鋳型ポリヌクレオチドに対して相同な配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを提供し、それによって、鋳型ポリヌクレオチドの特定配列、及び同種遺伝子の変異体配列を標的化する工程；
(g)工程(f)のオリゴヌクレオチドを用いて工程(e)の鋳型ポリヌクレオチドを複製することにより、非確率的な配列バリエーションを含む子孫ポリヌクレオチドを生成し、それによって同種遺伝子配列バリエーションを含むポリヌクレオチドが生成される工程；
を含む方法によって前記配列改変がなされる、請求項１の方法。
【請求項１１】
工程(a)の異種遺伝子が配列改変同種遺伝子を含み、
(e)同種遺伝子をコードしている配列を含む鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程；
(f)所定の配列において鋳型ポリヌクレオチドと交差再構成するように設計されている複数の基本構築単位ポリヌクレオチドを提供する工程であって、基本構築単位ポリヌクレオチドが、同種遺伝子変異体配列、及び前記変異体配列にフランキングな鋳型ポリヌクレオチドに対して相同な配列を含む前記工程；
(g)基本構築単位ポリヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドと交差再構成するように基本構築単位ポリヌクレオチドと鋳型ポリヌクレオチドとを組合せて、同種遺伝子配列バリエーションを含むポリヌクレオチドを生成する工程；
を含む方法によって前記配列改変がなされる、請求項１の方法。
【請求項１２】
測定される代謝パラメータがポリペプチド発現の変化を含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
ポリペプチド発現の変化が、一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、タンデム型質量分析法、RIA、ELISA、免疫沈降及びウエスタンブロットからなる群より選択される方法によって測定される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
測定される代謝パラメータが二次代謝産物の増加又は減少を含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
測定される代謝パラメータが、組成物の摂取の増加又は減少を含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
組成物が代謝産物である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
代謝産物が、単糖、二糖、多糖、脂質、核酸、アミノ酸及びポリペプチドからなる群より選択される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
リアルタイムモニタリングが複数の代謝パラメータを同時に測定する、請求項１の方法。
【請求項１９】
リアルタイム同時モニタリングが、細胞密度、グルコースの摂取；アセテート、ブチラート、スクシナート、オキサロアセテート、フマレート、α-ケトグルタレート、フォスフェート若しくはこれらの組合せのレベル；細胞内の天然アミノ酸のレベル；又はこれらの組合せを測定する、請求項１８の方法。
【請求項２０】
長期にわたり測定される代謝パラメータの変化をリアルタイムモニタリングするコンピュータ実装プログラムの使用を更に含む、請求項１８の方法。
【請求項２１】
コンピュータ実装プログラムが図１に示すようなコンピュータ実装法を含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
コンピュータ実装法が代謝ネットワーク方程式を含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
コンピュータ実装法が経路分析を含む、請求項２１の方法。
【請求項２４】
コンピュータ実装プログラムが、代謝フラックス分析の前に測定についてのエラーを除外する前処理ユニットを含む、請求項２１の方法。
【請求項２５】
(a)制御可能な細胞環境で細胞を培養する工程；
(b)培養中に少なくとも一つの代謝パラメータを測定して、少なくとも二つの異なる測定値をリアルタイムで得る工程；
(c)培養中に前記二つの異なる測定値を処理して、代謝パラメータの変化率をリアルタイムで決定する工程；及び
(d)培養中に前記細胞の既知の代謝ネットワークにおける変化率を用いて、前記細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を決定する工程；
を含む方法。
【請求項２６】
培養中に、制御可能な細胞環境の操作パラメータを決定されたリアルタイム代謝フラックス分布に基いて調整し、前記代謝フラックス分布を改変させるために培養条件を変化させることを更に含む、請求項２５の方法。
【請求項２７】
遺伝子改変が、初期の細胞又は細胞培養物におけるリアルタイム代謝フラックス分布から得られた情報に基いており、
前記リアルタイム代謝フラックス分布が、
前記初期の細胞又は細胞培養物の培養中に、１つの初期細胞の選択された代謝パラメータを測定して、少なくとも２つの異なる測定値をリアルタイムで得ること；
前記２つの異なる測定値を処理して、選択された代謝パラメータの変化率をリアルタイムで決定すること；及び
前記初期の細胞又は細胞培養物に対する既知の初期代謝ネットワークに前記変化率を用いて、前記初期の細胞又は細胞培養物におけるリアルタイム代謝フラックス分布を決定すること；によって得られ、
工程(a)の培養に先立って細胞培養物の一つ以上の初期細胞の遺伝子構成を改変する工程をさらに含む、請求項２５の方法。
【請求項２８】
機械実行可能な指令を含んでいる機械読取り可能な媒体を含む物品であって、
前記指令が働いて、機械に：
制御可能な細胞環境に連結された複数の測定装置と電子的にインターフェイスし、前記環境内で培養している細胞の複数の代謝パラメータ又は状況を示している電子データをリアルタイムで得ること；
前記電子データをリアルタイムで処理して、前記制御可能な細胞環境内で培養された細胞のリアルタイム代謝特性を示している選択された代謝パラメータ又は状況のセットに対する値を出すこと；
前記培養された細胞について、代謝ネットワークのデータを含む少なくとも一つのデータベースから情報を検索すること；及び
前記代謝ネットワークと、選択された代謝パラメータ又は状況の前記セットに対する値とを用いて、前記培養された細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を決定すること；
を行わせる前記物品。
【請求項２９】
細胞が原核細胞であり、
指令が働いて、機械に、電子装置から前記原核細胞に関する代謝ネットワーク情報を検索させ、前記情報を用いて電子データを処理させる、請求項２８の物品。
【請求項３０】
(h) 細胞を培養するための操作条件が制御コマンドに応答して制御可能である、細胞を培養するための制御可能な細胞環境；
(i) 前記制御可能な細胞環境に連結されて、前記制御可能な細胞環境内の前記細胞の培養に関連する測定値を前記培養中にリアルタイムで得る、検出サブシステム；及び
(j)前記測定値を前記培養中にリアルタイムで受取るように前記検出サブシステムに連結され、且つ前記測定値を処理して、前記培養細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を呈示するために動作可能なシステムコントローラー；
を含むシステム。
【請求項３１】
細胞の培養についての操作条件が、培養された細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布に基いている、請求項３０のシステム。
【請求項３２】
工程(j)のリアルタイム代謝フラックス分布を用いて、工程(h)の細胞の培養についての操作条件を決定することを更に含む、請求項３１のシステム。
【請求項３３】
検出サブシステムが、ガス、有機酸、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、多糖、脂質又はこれらの組合せのレベルを検出及び決定する装置を含む、請求項３０のシステム。
【請求項３４】
システムコントローラーが、
測定値を表しているデータを伝送するように検出サブシステムに連結されている、一つ以上の電子インターフェイス；及び
前記データを受取るように前記電子インターフェイスに連結されており、且つ前記データを処理して、培養細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を呈示するようにプログラムされている、コンピュータ；
を含む請求項３０のシステム。
【請求項３５】
コンピュータが、リアルタイムでデータを処理して、制御可能な細胞環境内で培養された細胞のリアルタイム代謝特性を示している選択されたパラメータのセットに対する値を呈示するようにプログラムされている、請求項３４のシステム。
【請求項３６】
コンピュータが、培養された細胞に対して、代謝ネットワークのデータを含む少なくとも一つのデータベースから情報を検索するようにプログラムされている、請求項３５のシステム。
【請求項３７】
培養された細胞についての代謝ネットワークのデータが、バイオインフォマティクス、化学量論、ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、微生物学及び生化学的経路、並びに酵素反応速度論知識からなる群の少なくとも一つから得られる、請求項３６のシステム。
【請求項３８】
コンピュータが、代謝ネットワークデータと培養された細胞のリアルタイム代謝特性を示している選択されたパラメータのセットに対する値とを用いて、前記培養された細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を決定するようにプログラムされている、請求項３６のシステム。
【請求項３９】
コンピュータが：
細胞培養中に少なくとも二つの異なる測定値をリアルタイムで得ること；
培養中に前記二つの測定値を処理して、代謝パラメータにおける変化率をリアルタイムで決定すること；
培養中に前記変化率を代謝ネットワークに用いて、選択された細胞におけるリアルタイム代謝分布を決定すること；
を行うように更にプログラムされている、請求項３４のシステム。
【請求項４０】
培養される細胞において所望の生成物又は所望の表現型を生み出すのに最適な培養条件を決定する方法であって、
制御可能な細胞環境で細胞を培養する工程；
培養中に少なくとも一つの代謝パラメータを測定して、少なくとも二つの異なる測定値をリアルタイムで得る工程；
培養中に前記二つの異なる測定値を処理して、代謝パラメータにおける変化率をリアルタイムで決定する工程；
培養中に前記変化率を前記細胞の代謝の特徴付けについての化学量論方程式のセットに当てはめて、前記細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を決定する工程；及び
決定されたリアルタイム代謝フラックス分布に従って前記制御可能な細胞環境の操作パラメータを調整し、前記代謝フラックス分布を改変するように培養条件を変えて、これによって所望の生成物又は所望の表現型を生み出すための培養条件を最適化する工程；
を含む前記方法。
【請求項４１】
代謝フラックス分析についての情報を得ること、及び前記の得られた情報を測定値の処理に用いることを更に含む、請求項４０の方法。
【請求項４２】
培養下の細胞に対してオンライン代謝フラックス分析をリアルタイムで行わせるコンピュータ制御の方法であって、
選択された細胞の代謝フラックス分布を決定するために、培養下の選択された細胞に対して適切な代謝ネットワークモデルの情報にアクセスすることを、コンピュータに指令すること；
前記代謝フラックス分布を決定するために、データを受け取ることをコンピュータに指令すること；
受け取ったデータを用いることによって、比速度を算出すること；
前記比速度に代謝ネットワークモデルを当てはめて、前記代謝フラックス分布を決定すること；
保存のためのデータファイルと表示のためのコンピュータディスプレイ装置とに、前記代謝フラックス分布のデータを送ること；
入力データが変更される場合は、新しい代謝フラックス分布を呈示すること；及び
前記入力データが変更されない場合は、データの新しいセットに対応する新しい代謝フラックス分布を決定するために、データの新しいセットを待つことをコンピュータに指令すること；
を含む前記方法。
【請求項４３】
(a)細胞の遺伝子構成を改変することによって、改変細胞を作製する工程；
(b)前記改変細胞を培養して、複数の改変細胞を生成する工程；
(c)工程(b)の細胞培養物をモニタリングすることによって、前記細胞の少なくとも一つの代謝パラメータをリアルタイムで測定する工程；及び
(d)工程(c)のデータを分析して、測定されたパラメータが同様な条件下の非改変細胞の比較可能な測定値と異なるかを決定し、これによってリアルタイム代謝フラックス分析を用いた前記細胞における操作された表現型を同定する工程；
を含む方法によって作製された細胞。
【請求項４４】
所望の生成物又は所望の表現型を生み出すのに最適な培養条件を有する培養細胞システムであって、
制御可能な細胞環境で細胞を培養する工程；
培養中に少なくとも一つの代謝パラメータを測定して、少なくとも二つの異なる測定値をリアルタイムで得る工程；
培養中に前記二つの異なる測定値を処理して、前記代謝パラメータの変化率をリアルタイムで決定する工程；
培養中に前記変化率を前記細胞の代謝の特徴付けについての化学量論方程式のセットに当てはめて、リアルタイム代謝フラックス分布を決定する工程；及び
決定したリアルタイム代謝フラックス分布に従って前記制御可能な細胞環境の操作パラメータを調整して、前記代謝フラックス分布を改変するように培養条件を変えて、これによって所望の生成物又は所望の表現型を生み出すための培養条件を最適化する工程；
を含む方法によって作られた前記システム。
【請求項４５】
ペプチドの示差的標識化によってタンパク質を同定する方法であって、
(a)ポリペプチドを含んでいるサンプルを提供する工程；
(b)分子量は異なるが同一又はほぼ同一又は類似のクロマトグラフィー保持特性を有し、質量分光分析において同一又はほぼ同一又は類似のイオン化特性及び検出特性を有し、且つ分子量の差異が質量分光分析によって識別可能な、複数の標識化試薬を提供する工程；
(c)酵素消化又は非酵素的断片化によって、ポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程；
(d)工程(b)の標識化試薬を工程(c)のペプチド断片と接触させることによって、示差的な前記標識化試薬で前記ペプチドを標識する工程；
(e)クロマトグラフィーによって前記ペプチドを分離して、溶出液を生成する工程；
(f)工程（e）の溶出液を質量分析計へ供給し、前記質量分析計の使用により、各ペプチド量の定量化及び各ペプチド配列の生成を行う工程；
(g)入力配列とポリペプチド配列のデータベースとを比較するコンピュータプログラム製品に前記の生成された配列を入力して、前記配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドを同定する工程；
を含む前記方法。
【請求項４６】
工程（b）の標識化試薬が、ペプチドのＣ-末端及び/又はAsp側鎖をエステル化するためのＺAOH及びＺBOH；ペプチドのＣ-末端及び/又はGlu及びAsp側鎖とアミド結合を形成するためのＺANH2及びＺBNH2；並びに、ペプチドのＮ-末端及び/又はLys及びArg側鎖とアミド結合を形成するためのＺACO2H及びＺBCO2H；からなる群より選択される一般式を含む、請求項４５の方法。
（式中、
ＺA及びＺBは互いに独立であって、一般式Ｒ-Ｚ1-Ａ1-Ｚ2-Ａ2-Ｚ3-Ａ3-Ｚ4-Ａ4-を含み；
Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は互いに独立であって、存在しない、O、OC(O)、OC(S)、OC(O)O、OC(O)NR、OC(S)NR、OSiRR1、S、SC(O)、SC(S)、SS、S(O)、S(O2)、NR、NRR1+、C(O)、C(O)O、C(S)、C(S)O、C(O)S、C(O)NR、C(S)NR、SiRR1、(Si(RR1)O)n、SnRR1、Sn(RR1)O、BR(OR1)、BRR1、B(OR)(OR1)、OBR(OR1)、OBRR1及びOB(OR)(OR1)からなる群より選択され、且つR及びR1がアルキル基であり；
Ａ1、Ａ2、Ａ3及びＡ4は互いに独立であって、存在しないか又は(CRR1)nからなる群より選択され；
R、R1は、Ｚ1からＺ4において他のR及びR1から独立であって、またＡ1からＡ4において他のR及びR1から独立であって、水素原子、ハロゲン原子及びアルキル基からなる群より選択され；
Ｚ1からＺ4におけるnは、Ａ1からＡ4におけるnから独立であって、0-約51、0-約41、0-約31、0-約21、0-約11及び0-約6からなる群より選択される値を有する整数である。）
【請求項４７】
与えられた細胞状態に関連して発現されるタンパク質を規定する方法であって、
（a）細胞を所望の細胞状態で含んでいるサンプルを提供する工程；
（b）分子量で異なるがクロマトグラフィー保持特性で異ならず、質量分光分析におけるイオン化特性及び検出特性で異ならず、且つ分子量の差異が質量分光分析によって識別可能な、複数の標識化試薬を提供する工程；
（c）酵素消化又は非酵素的断片化によって、前記細胞由来のポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程；
（d）工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片と接触させることによって、示差的な前記標識化試薬で前記ペプチドを標識する工程；
（e）クロマトグラフィーによって前記ペプチドを分離して、溶出液を生成する工程；
（f）工程（e）の溶出液を質量分析計へ供給し、前記質量分析計の使用によって、各ペプチド量の定量化及び各ペプチド配列の生成を行う工程；
（g）入力配列とポリペプチド配列のデータベースとを比較して前記配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドを同定するコンピュータプログラム製品に前記の生成した配列を入力して、これによって前記細胞状態に関連して発現されるタンパク質を規定する工程；
を含む前記方法。
【請求項４８】
少なくとも二つの細胞状態の間におけるタンパク質発現の変化を定量化する方法であって、
(a)所望の細胞状態で細胞を含む少なくとも二つのサンプルを提供する工程；
(b) 分子量で異なるがクロマトグラフィー保持特性では異ならず、質量分光分析におけるイオン化特性及び検出特性で異ならず、且つ分子量の差異が質量分光分析によって識別可能な、複数の標識化試薬を提供する工程；
(c) 酵素消化又は非酵素的断片化によって、前記細胞由来のポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程；
(d) 工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片と接触させることによって、示差的な前記標識化試薬で前記ペプチドを標識する工程；
(e) クロマトグラフィーによって前記ペプチドを分離して、溶出液を生成する工程；
(f) 工程（e）の溶出液を質量分析計へ供給し、前記質量分析計の使用によって、各ペプチド量の定量化及び各ペプチド配列の生成を行う工程；
(g)各ペプチドがどのサンプルに由来したかを同定し、入力配列とポリペプチド配列のデータベースとを比較して配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドを同定し、各サンプルにおける各ポリペプチドの量を比較するコンピュータプログラム製品に、前記生成した配列を入力し、これによって少なくとも二つの細胞状態の間におけるタンパク質発現の変化を定量化する工程；
を含む前記方法。
【請求項４９】
ペプチドの液体クロマトグラフ（LC）分離のための三次元（3-D）マイクロキャピラリーカラムを含み、且つ逆相（RP1）クロマトグラフ、強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフ及び逆相（RP2）樹脂クロマトグラフを含んでいる構成を含む、多次元マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）システム。
【請求項５０】
システムが、逆相（RP1）クロマトグラフ、続いて強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフ、続いて逆相（RP2）樹脂クロマトグラフという順序のシステム構成要素で構成されている、請求項４９の多次元マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）システム。
【請求項５１】
ペプチドを分離する方法であって、
(a) ペプチドの液体クロマトグラフ（LC）分離のための三次元（3-D）マイクロキャピラリーカラムを含み、且つ逆相（RP1）クロマトグラフカラム、強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフカラム及び逆相（RP2）樹脂クロマトグラフカラムを含んでいる構成を含む、多次元マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）システムを提供する工程；
(b)ペプチドの混合物を提供する工程；及び
(c)前記ペプチドを前記多次元マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）システムに装荷して、前記システムを通り抜けさせる工程；
を含む前記方法。
【請求項５２】
システムが、逆相（RP1）クロマトグラフカラム、続いて強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフカラム、続いて逆相（RP2）樹脂クロマトグラフカラムという順序であるシステムの構成要素を用いて構成されている、請求項５１の方法。
【請求項５３】
吸収されたペプチドの離散的画分が、逆相グラジエントＸｎ−Ｘｎ＋1％を用いて逆相（RP2）樹脂から強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフカラムへ置換えられる、請求項５１の方法。
【請求項５４】
置換えられたペプチド画分が、強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフカラム上に保持され、次に塩の段階グラジエントを用いて、強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフカラムから逆相（RP2）樹脂カラム上に細分画され、
前記ペプチドの一部が、混入している塩及び緩衝液が洗い流される間に、溶出され逆相（RP1）クロマトグラフカラム上に保持される、請求項５３の方法。
【請求項５５】
細分画されたペプチドが、次に同じ逆相グラジエントＸｎ−Ｘｎ＋1％を用いてRP1カラム上で分離される、請求項５３の方法。
【請求項５６】
分離及び溶出されたペプチドの質量及び配列が、タンデム型質量分析計によって直接決定される、請求項５５の方法。
【請求項５７】
各段階に続くSCXカラムから更なる細画分を逆相グラジエントによって置換えるために、処理が、増加した塩濃度を用いて繰り返される、請求項５５の方法。
【請求項５８】
塩段階の全配列が完成したら、より高い逆相グラジエント（Ｘn＋1−Ｘｎ＋2％、Ｘｎ＋2＞Ｘｎ＋1、ｎ＝0,1,2,3..、Ｘ1＝0）を用いて前記の処理が繰り返される、請求項５５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に全細胞操作、細胞生物学、および分子生物学の各分野に関するするものである。特に、この発明は、代謝フラックス分析を利用した、新規および改変表現型の全細胞操作(whole cell engineering)で用いるための方法およびシステムに関するものである。また、本発明は、この発明の方法を実施するための機械実行可能な命令およびシステム（コンピュータ システムなど）を含む機械読取可能な媒体を含む装置も提供する。
【背景技術】
【０００２】
全細胞代謝フラックス分析は、生物体の代謝、または「メタボローム」を研究するための「水平的な」あるいは「全体論的な」アプローチである。全細胞の「水平的な」メタボロームアプローチでは、一つの生物体にある全ての遺伝子の発現および機能を同時に研究する。細胞の代謝を研究するために、この全細胞アプローチを使用することで、全細胞のトランスクリプトーム（発現した転写物、つまりmRNAメッセージ）およびプロテオーム（発現したポリペプチド）の完全なスナップショットを得ることが可能となる。ところが、こうしたスナップショットは、細胞の生理機能および代謝の一面についての静的な実態である。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、部分的に、細胞培養における数多くの異なるパラメータを動的にモニタリングするための手段を開発すれば、新規および改変細胞表現型ならびにその他の特性や細胞増殖条件の検出において、単なる静的データよりもずっと効果的となるという認識に基づくものである。したがって、本発明は、数ある中で、リアルタイム代謝フラックス分析を利用した新規または改変表現型の全細胞操作の方法を提供する。この発明のシステムおよび方法を使用して、任意の表現型を追加したり、それを変更することができる。また、この発明では、この発明の方法を実施するための機械実行可能な命令およびシステム（コンピュータ システムなど）を含む機械読取可能な媒体から構成される装置も提供している。
一面において、この方法は、（a）細胞の遺伝子構成を改変することにより改変された細胞を作成する工程、（b）改変された細胞を培養し、複数の改変された細胞を生成する工程、（c）工程（b）の細胞培養物をリアルタイムでモニタリングすることで細胞の少なくとも1つの代謝パラメータを測定する工程、そして（d）工程（c）のデータを分析し、測定したパラメータが類似した条件下での未改変細胞における比較可能な測定値と異なるかどうかを判断し、それにより、リアルタイム代謝フラックス分析を用いて細胞における操作された表現型を同定する工程を含む。
【０００４】
一面において、細胞の遺伝子構成は、細胞への核酸の付加を含む方法により改変される。1つまたは複数の核酸を同時に、または連続して付加できる。細胞の遺伝子構成は、細胞に対して異種、または細胞に対して同種の核酸を付加することで改変できる。同種核酸には、改変同種遺伝子のような改変同種核酸が含まれうる。遺伝子のコード配列または転写制御配列は改変が可能である。別の方法として、細胞の遺伝子構成は、細胞における配列の欠失または配列の改変を含む方法で改変できる。細胞の遺伝子構成は、遺伝子の発現の改変またはノックアウトを含む方法で改変できる。
どのような表現型も付加または改変することができる。細胞のゲノム、プロテオーム、および/またはメタボロームは、この発明のシステムおよび方法を用いて改変することができる。どの表現型も、変化または付加に対して、特異的に標的とすることができる。
例えば、特定の異種遺伝子を挿入したり、または特定の同種遺伝子を確率論的にもしくは非確率論的に改変することもできる。例えば、新たに改変された表現型としては、例えば、ポリペプチドの発現や量の増減、mRNA転写物の量の増減、遺伝子の発現の増減、毒素への耐性や感度の増減、代謝生成物の耐性の使用や生成の増減、細胞による化合物の摂取の増減、代謝率の増減、成長率の増減などが挙げられる。
【０００５】
一面において、この方法は、さらに配列が未決定の生物体からの遺伝子発現の分析を含む。例えば、この分析は、MEGASORTTMやLEADTMなどの技術の助けを借りることで達成できる。
付加や変更が可能な例示的な表現型には、抗生物質（エリスロマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ペニシリン、等）の増加または新たな（de novo）生成、酢酸の増加または新規の生成、耐溶剤性の増大またはその新規の出現、等々がある。この発明の方法によって「改良」されたある例示的な株は遊離酢酸を生成する。ここにおいて、この株には、酢酸除去に使用される溶剤に対する耐性がある。
上述のとおり、一面において、配列未決定の生物体からの遺伝子発現が分析される。これらの技法により、2個のcDNAサンプルの超大規模ハイブリッド形成が可能となる。また、これらの技法により、2個のサンプル間で示差的に発現したcDNAの種の分類または分析が可能となる。その後、示差的に発現した遺伝子のクローニングや配列分析を実施できる。発明のこの局面において得た情報は、GENESPRINGTMソフトウェアなどのソフトウェアによりクラスター分析ができる。発明のこの局面で得た情報は、適切なデータベースに中継され、さらに比較または分析がされ得る。この技術は、現時点での遺伝子チップによるアプローチでは不可能な、少量のmRNA 種の示差的な発現の研究を目的とした用途にも関連する。
【０００６】
一面において、この発明は、酢酸除去に使用される溶剤に対する耐性を有する遊離酢酸を生成する菌種を提供している。耐溶剤性または酢酸の生成を向上させる突然変異は、この発明のシステムおよび方法を用いて細胞培養内で引き起こされモニタリングされる。両方の望ましい特性を併せ持つ株が産出されるようにするために、この発明の方法を用いた遺伝子発現分析は、耐溶剤性および/または酢酸の生成についての遺伝子発現パターンと相互関連性のあるものとすることができる。これは、酢酸の生成と耐溶剤性の両方が改善された株を作り出すための、標的化された遺伝子学的アプローチである。
【０００７】
新たに操作された表現型は、安定した表現型とすることができる。別の面では、過渡的なまたは誘導性の表現型とすることもできる。一面において、細胞の遺伝子構成の改変には、細胞への構築物の挿入が含まれ、ここにおいて、この構築物には、構成的に活性なプロモーターに、操作できるかたちで結合された核酸が含まれている。別の方法として、細胞の遺伝子構成の改変には、細胞への構築物の挿入が含まれ、ここにおいて、この構築物は、誘導性プロモーターに操作できるかたちで結合された核酸を含む。細胞に付加される核酸は、細胞のゲノムに安定して挿入できる。別の方法として、細胞に付加する核酸は、細胞内のエピソームとして増殖させることができる。
【０００８】
一面において、細胞に付加された核酸は、ペプチドまたはポリペプチドをコードできる。ポリペプチドには、改変された同種ポリペプチドのような、同種ポリペプチドが含まれうる。別の方法として、ポリペプチドには、異種ポリペプチドが含まれうる。細胞に付加された核酸は、相同転写物に対するアンチセンス配列を含む転写物をコードすることができる。一面において、細胞の遺伝子構成の改変には、mRNA転写物の発現の増減が含まれうる。細胞の遺伝子構成の改変には、ポリペプチド、脂質、単糖類や多糖類、または核酸の発現の増減が含まれうる。
【０００９】
一面において、同種遺伝子の改変には、同種遺伝子の発現のノックアウトが含まれうる。同種遺伝子の改変には、同種遺伝子の発現の増大が含まれうる。遺伝子の改変は、無作為（つまり確率論的）、または非無作為（標的をもって、すなわち非確率論的）とすることができる。
例示的非確率的遺伝子改変では、表現型を変更するために細胞に挿入する遺伝子は、異種遺伝子または配列を改変した同種遺伝子とすることができるが、ここにおいて、配列改変は、以下の工程が含まれる方法で実施される。すなわち、（a）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記鋳型ポリヌクレオチドには、細胞の同種遺伝子（これは改変したい異種遺伝子でもよい）が含まれる。（b）複数のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここにおいて、各オリゴヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドに対して相同な配列（それにより、鋳型ポリヌクレオチドの特定の配列を標的化する）、および同種遺伝子の変異体を含む。（c）工程（a）の鋳型ポリヌクレオチドを工程（b）のオリゴヌクレオチドを用いて複製することにより、非確率的配列変異体を含む子孫ポリヌクレオチドを生成し、同種遺伝子配列変異体を含むポリヌクレオチドを生成する。この方法の変形の1つが「遺伝子部位飽和型変異誘発」「部位飽和型変異誘発」「飽和変異誘発」または単に「GSSM」などと呼ばれてきたもので、下記にさらに詳細に説明する。これは、その他の突然変異誘発過程と組み合わせて使用することができる。米国特許第6,171,820号、第6,238,884号などを参照。
【００１０】
別の例示的非確率的遺伝子組換プロセスは、2つ以上の関連性のあるポリヌクレオチドの適した宿主細胞へ導入することを含み、ハイブリッドポリヌクレオチドは組換および還元的再構成により生成(reductive reassortment)される。例えば、改変される遺伝子（異種遺伝子または同種遺伝子など）の配列改変は、以下の工程を含む方法で実施される。（a）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記鋳型ポリヌクレオチドには、同種遺伝子をコードする配列が含まれる。（b）複数の基本構築単位(building block)ポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記基本構築単位ポリヌクレオチドは、所定の配列で鋳型ポリヌクレオチドと交差再構成(cross-over reassemble)するよう設計され、また基本構築単位ポリヌクレオチドは、同種遺伝子の変異体である配列と、変異体配列に隣接する（側方に位置する）鋳型ポリヌクレオチドに対して相同な配列とを含む。（c）基本構築単位ポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドと、基本構築単位ポリヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドと交差再構成して同種遺伝子配列変異体が含まれるポリヌクレオチドが生成されるように、組合わせる工程。この方法の変形の1つが「合成連結再構成」または単に「SLR」と呼ばれてきたもので、下記にさらに詳細に説明する。これは、その他の突然変異誘発過程と組合わせて使用することができる。米国特許第6,171,820号などを参照。
【００１１】
本発明の方法により、原核細胞や真核細胞など、どんな細胞でも操作することができる。細菌、古細菌、菌類、酵母、植物細胞、昆虫の細胞、ヒト細胞を含めた哺乳類の細胞などを、これに限定されることなく、この発明の方法により操作することができる。さらに、免疫不全ウイルス（HIVなど）、オンコウイルス、コバクテリウム、原生動物（アルゼンチントリパソノーマなどのトリパノソーマ類）、プラズモディウム（熱帯熱マラリア原虫など）、トキソプラスマ症（Toxoplasma gondii等）、リューシュマニア属、その他などの、細胞内寄生体、細菌、ウイルスも、この発明の方法による真核細胞の培養・モニタリングにより「間接的に」操作することができる。
この方法には、さらに、新たに操作された表現型を含む細胞の選択が含まれうる。選択した細胞は、単離したものとすることができる。この方法には、さらに、選択したまたは単離した細胞の培養を含んでもよく、それによって新たに作成された表現型を含む新しい菌株または細胞株が生成される。この方法には、さらに、新たに作成された表現型を含む細胞の単離が含まれうる。
【００１２】
この発明の方法の実施において、任意の代謝パラメータを測定できる。一面において、いくつかの異なる代謝パラメータが、細胞培養物において評価される。代謝パラメータは、同時にまたは連続的に測定ができる。1つの例示的な代謝パラメータは、細胞増殖速度で、これは、細胞培養の光学濃度の変化などにより測定できる。測定される別の例示的な代謝パラメータは、ポリペプチドの発現の変化を含む。ポリペプチドの発現の変化は、一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、タンデム型質量分析法、RIA、ELISA、免疫沈降およびウエスタンブロットなど、任意の方法で測定できる。
一面において、測定される代謝パラメータは、少なくとも1つの転写物の発現の変化、または、新しく導入された遺伝子の転写物の発現の変化を含む。転写物の発現の変化は、ハイブリッド形成、定量的増幅、ノーザン分析、その他により測定できる。転写発現は、細胞の転写物または細胞の転写物を表す核酸もしくは細胞の転写物に対して相補的な核酸を含むサンプルのハイブリダイゼーションにより、即ちこのサンプルとアレイ上に固定化された核酸をハイブリダイゼーションすることにより測定できる。
一面において、測定される代謝パラメータは、第1および第2の代謝物質を含めた代謝生成物の測定値を含む。例えば、測定される代謝パラメータは、一次または二次代謝産物の増減を含みうる。二次代謝産物は、グリセロールおよびメタノールのグループから選択することができる。測定される代謝パラメータは、アセテート、ブチラート、スクシナート、オキサロアセテート、フマレート、α-ケトグルタラート、またはフォスフェートなどの有機酸の増減を含んでいていてよい。
【００１３】
一面において、測定される代謝パラメータは、細胞内pHの増減、または、培地における細胞外のpHの増減を含む。細胞内pHの増減は細胞内での染料の使用により測定でき、染料の蛍光性の変化は時間経過とともに測定できる。一面において、実測代謝パラメータはガス交換率測定値を含む。
一面において、測定される代謝パラメータは、時間経過に伴うDNAまたはRNAの合成の増減を含む。時間経過に伴うDNAまたはRNAの合成、または蓄積、または減衰の増減は、細胞内での染料の使用により測定でき、染料の蛍光性の変化は時間経過にともない測定できる。
一面において、測定される代謝パラメータは、組成物の摂取の増減を含む。組成物は、単糖、二糖、多糖類、脂質、核酸、アミノ酸、およびポリペプチドなどの代謝生成物等が考えられる。糖類、二糖または多糖類は、ブドウ糖または蔗糖を含み得る。また、組成物は、抗生物質、金属、ステロイドおよび抗体であってもよい。
【００１４】
一面において、測定される代謝パラメータは、副産物の分泌の増減または細胞の分泌組成物の増減を含む。副産物または分泌組成物は、毒素、リンホカイン、多糖類、脂質、核酸、アミノ酸、ポリペプチドおよび抗体を含む。
この方法の一面において、リアルタイム モニタリングにより、複数の代謝パラメータが同時に測定される。複数の代謝パラメータのリアルタイム モニタリングには、細胞増殖モニター装置の使用が含まれうる。細胞増殖モニター装置としては、Wedgewood Technology, Inc.の細胞増殖モニター652型、またはこれに類似したモデルまたはその変形物等が挙げられる。一面において、リアルタイム同時モニタリングでは、基質の摂取、細胞内の有機酸レベルおよび細胞内アミノ酸レベル等が測定される。リアルタイム同時モニタリングでは、ブドウ糖摂取のほか、アセテート、ブチラート、スクシナート、オキサロアセテート、フマレート、α-ケトグルタラート、フォスフェート等のレベル、細胞内の天然アミノ酸のレベルを測定できる。
【００１５】
一面において、この方法には、さらに、時間経過に伴い実測代謝パラメータをリアルタイムでモニタリングするコンピュータを導入したプログラムの使用を含みうる。コンピュータを導入したプログラムには、コンピュータを導入した方法を含みうる。コンピュータを導入した方法には、代謝ネットワーク方程式を含みうる。また、これらのコンピュータを導入した方法には、経路分析、加重最小自乗解等のエラー解析、およびフラックス推定も含みうる。コンピュータを導入した方法には、さらに、代謝フラックス分析の前の測定値についてのエラーを除外するための前処理ユニットも含みうる。
【００１６】
本発明は、制御可能な細胞環境内で細胞を培養すること、培養中に少なくとも1つの代謝パラメータを測定して少なくとも2つの異なる測定値をリアルタイムで獲得すること、前記2つの異なる測定値を処理して培養中の代謝パラメータの変化率をリアルタイムで決定すること、および、培養中の細胞における既知の代謝ネットワークの変化率を使用してリアルタイム代謝フラックス分布を決定すること、を含む方法を提供する。
一面において、制御可能な細胞環境には、発酵槽またはバイオリアクターが含まれる。制御可能な細胞環境には、フラスコ、プレート、毛細管、試験管、バイオマトリックス、人工臓器のいずれかが含まれうる。制御可能な細胞環境には、寄生システム（寄生生物）、共生生物、細胞培養または人工臓器における支持細胞層、その他が含まれうる。一面において、制御可能な細胞環境には、48〜96セットのマイクロバイオリアクターがマイクロタイタープレート様に配置されるなど、複数のマイクロバイオリアクターが含まれる。
一面において、測定代謝パラメータには、酸素、メタノール、水素、エタノール、またはその組合せ等のガスまたは揮発性組成物が含まれる。ガスはオンライン質量分析計により測定することができる。
【００１７】
一面において、測定代謝パラメータには、基質、代謝生成物、またはブドウ糖等の糖類といった小さな化合物が含まれる。基質、代謝生成物、またはブドウ糖等小さな化合物は、オンライン質量分析計またはバイオアナライザーで測定することができる。
一面において、測定代謝パラメータには、アセテート、ブチラート、スクシナート、オキサロアセテート、フマレート、α-ケトグルタラート、フォスフェート、またはその組合せ等の有機酸が含まれる。有機酸は、オンラインHPLC、質量分析器、赤外分光器、または同等の装置により測定することができる。
【００１８】
この方法には、さらに、培養中に代謝フラックス分布を変更するために、細胞または細胞培養の培養状態を変化させる、所定のリアルタイム代謝フラックス分布に基く制御可能な細胞環境の操作パラメータの調節が含まれうる。一面において、操作パラメータは、代謝フラックス分布が望ましい分布に向うように調節される。操作パラメータには、制御可能な細胞環境への基質の供給が含まれうる。代謝パラメータまたは操作パラメータには、制御可能な細胞環境の温度、制御可能な細胞環境内での細胞内pH値、培養中に発生する１つまたは複数のガスについての制御可能な細胞環境内でのガス交換率、制御可能な細胞環境への栄養素の供給、制御可能な細胞環境における細胞密度、その他が含まれうる。制御可能な細胞環境における細胞密度は、細胞増殖モニター装置によりモニタリングができる。一面において、細胞は、液体培地内で培養され、細胞密度は、細胞培養の光学濃度を測定することによりモニタリングされる。
【００１９】
この方法には、さらに、培養に先立ち、細胞培養物において1つまたは複数の初期細胞の遺伝子構成を改変することを含み得る。遺伝子改変は、初期細胞または細胞培養物におけるリアルタイム代謝フラックス分布から得た情報に基くことができ、ここにおいて、リアルタイム代謝フラックス分布は、初期細胞または細胞培養物の培養中に1つの初期細胞の選択した代謝パラメータを測定し、少なくとも2つの異なる測定値をリアルタイムで得、前記2つの異なる測定値を処理して選択した代謝パラメータの変化率をリアルタイムで決定し、さらに、その変化率を初期的な細胞または細胞培養についての既知の初期的な代謝ネットワークにおいて使用して初期細胞または細胞培養物におけるリアルタイム代謝フラックス分布を決定すること、により得られる。
【００２０】
一面において、遺伝子構成の改変には、初期細胞または細胞培養物への核酸の付加が含まれる。遺伝子構成の改変には、初期細胞または細胞培養物の核酸の改変が含まれうる。遺伝子構成の改変には、進化したキメラ配列を生成するための最適化された定方向(directed)進化システムの利用が含まれうる。遺伝子構成の改変には、選択した遺伝子の発現のノックアウトが含まれうる。
一面において、遺伝子構成の改変には、さらに、ゲノム、プロテオミクス、メタボロミクス（代謝学）、バイオインフォマティクス（生命情報科学）、化学量論、微生物学、および生化学工学の知識、その他などからの情報を用いることによる、細胞または細胞培養物についての既知の代謝ネットワークの確立が含まれる。この方法には、さらに、選択した細胞のトランスクリプトームおよびプロテオーム データからの情報の獲得、ならびに、代謝工学プロセスの設計のためにその情報と選択した細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布とを組合わせる過程が含まれる。
【００２１】
本方法には、さらに、2つの異なる測定値をリアルタイムで処理し、選択した細胞の培養中のリアルタイム代謝フラックス分布を決定するためのコンピュータの提供が含まれる。この方法には、さらに、選択した細胞に対する既知の代謝ネットワークを確立するにあたり、バイオインフォマティクス（生命情報科学）、化学量論、微生物学、および生化学工学の知識で構成される群のうち少なくとも1つから情報を取り出す目的でのコンピュータの使用が含まれる。プラスミド、プリオン、ファージ、ウイルス粒子（DNAウイルスおよびRNAウイルス）等のほか、すべての原核細胞、真核細胞、古細菌細胞、たとえば、細菌の細胞、昆虫の細胞、植物細胞、酵母菌および哺乳類の細胞等のように、任意の生物学的再生システムは細胞とみなされ、それが使用できる。
【００２２】
本発明は、機械実行可能な命令を含む機械読取可能な媒体が含まれる装置が規定され、この命令は、複数の代謝パラメータまたは細胞培養内部の状態を示す電子データを得るために、制御可能な細胞環境に連結された複数の測定装置とのリアルタイムでの電子的なインターフェイスをとる；選択した代謝パラメータまたは、制御可能な細胞環境において培養した細胞のリアルタイムでの代謝特性を示す状態についての値を生成するために、リアルタイムで電子データを処理する；培養した細胞についての代謝ネットワークに関するデータを含む少なくとも1つのデータベースからの情報を取り出す；並びに、培養した細胞でのリアルタイム代謝フラックス分布を決定するために、選択された代謝パラメータまたは状況のセットについての代謝ネットワークおよび値を使用するために機械を操作するものである。プラスミド、プリオン、ファージ、ウイルス粒子（DNAウイルスおよびRNAウイルス）等のほか、すべての原核細胞、真核細胞、古細菌細胞、たとえば、細菌の細胞、昆虫の細胞、植物細胞、酵母菌および哺乳類の細胞等のように、任意の生物学的再生システムは細胞とみなされ、それが使用できる。
【００２３】
一面において、培養した細胞についての代謝ネットワークに関するデータには、培養した細胞についての化学量論マトリックスが含まれる。化学量論マトリックスには、培養した細胞の代謝ネットワークの表示が含まれうる。化学量論マトリックスは、既知の細胞代謝系路全てを含め、1つまたは複数の代謝経路の関連性の有無を定義することができる。化学量論マトリックスは、化学量論係数Aで表すことができ、ここにおいてA ・ x = rで、rは代謝パラメータのオンラインでのリアルタイムによる測定値を表す測定ベクトルで、xは、単位mmol/hour乾燥細胞重量（dry cell weight, DCW）を有するフラックスベクトルである。
一面において、測定ベクトルであるrは、培養した細胞の代謝経路における酵素の特定の入力および出力の率を表示する。培養した細胞についての代謝ネットワークに関するデータとしては、バイオインフォマティクス（生命情報科学）、化学量論、ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス（代謝学）、微生物学、ならびに生化学経路および酵素反応速度論の知識、その他などが考えられる。選択された細胞についての代謝ネットワークには、選択した細胞における代謝生成物についての1セットの化学量論方程式が含まれうる。
【００２４】
一面において、命令は、さらに、選択した細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を、機械に連結されたディスプレイ装置に表示するために機械を操作するものである。この命令は、さらに、リアルタイム代謝フラックス分布をディスプレイ装置にグラフ形状で表示するために機械を操作することができる。ディスプレイ装置のグラフ形状は、選択した細胞において関連性のある代謝系路のマップ上に内部の代謝フラックスを表示できる。この命令は、さらに、リアルタイム代謝フラックス分布をディスプレイ装置にグラフ形状で表示するために機械を操作することができる。一面において、この命令は、WindowsTM、UNIXTM、Linux、およびMacOSのグループから選択した少なくとも1つのオペレーティングシステムで動作可能なものである。一面において、この命令は、さらに、培養中に少なくとも2つの異なる測定値をリアルタイムで獲得すること、前記2つの異なる測定値を処理して培養中にリアルタイムで代謝パラメータの変化率を決定すること、および、代謝ネットワークの変化率を使用して培養した細胞中のリアルタイム代謝フラックス分布を決定すること、を機械に行わせることができる。
【００２５】
本発明は、以下を含むシステム（コンピュータを備えたシステム等）を提供する。すなわち、（a）細胞培養のための制御可能な細胞環境。ここにおいて、細胞培養の操作条件(operating condition)は、制御コマンドに呼応して制御可能である。（b）制御可能な細胞環境での細胞の培養と関連した測定値を、培養中にリアルタイムで獲得するための、制御可能な細胞環境に連結された検出サブシステム(sensing subsystem)。および、（c）測定値を培養中にリアルタイムで受取り、培養した細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を生成するために測定値を処理するために動作可能な、検出サブシステムに連結されたシステム コントローラ。一面において、細胞の培養についての操作条件は、培養細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布に基く。
【００２６】
このシステムには、さらに、細胞の培養についての操作条件を決定するために、工程（c）のリアルタイム代謝フラックス分布の使用が含まれる。このシステムの制御可能な細胞環境には、発酵槽またはバイオリアクター、フラスコ、プレート、毛細管、試験管、バイオマトリックス、または人工臓器が含まれうる。このシステムの制御可能な細胞環境には、複数のマイクロバイオリアクターが含まれうる。
一面において、制御可能な細胞環境には、細胞増殖モニター装置が含まれる。細胞増殖モニター装置は、液体培地における細胞密度等、細胞密度の測定ができる。一面において、細胞は、液体培地内で培養され、細胞密度は、細胞培養の光学濃度のオンライン測定によりモニタリングされる。
一面において、検出サブシステムには、mRNA転写物を検出する装置が含まれる。この装置は、ノーザン分析、定量的増幅反応、アレイに対するハイブリッド形成、その他に基き動作するよう設定ができる。別の面で、検出サブシステムには、ガス、有機酸、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、多糖類、脂質、またはその組合せを検出し、そのレベルを決定する装置が含まれる。この装置には、核磁気共鳴（NMR）装置、分光光度計、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）装置、薄層クロマトグラフィー装置、高拡散クロマトグラフィー装置、その他が含まれうる。この装置は、免疫学的な方法に基き動作するよう設定ができる。
【００２７】
一面において、この検出サブシステムにより検出および/または測定が可能な有機酸は、アセテート、ブチラート、スクシナート、オキサロアセテート、フマレート、α-ケトグルタラート、フォスフェート、またはその組合せである。一面において、この検出サブシステムにより検出および/または測定が可能なガスまたは揮発性組成物は、酸素、メタノール、水素、エタノール、またはその組合せである。
一面において、検出サブシステムには、一次代謝産物、二次代謝産物、またはその組合せのモニタリングをする装置が含まれる。一次代謝産物または二次代謝産物としては、エタノール、メタノール、ブドウ糖、またはその組合せを挙げることができる。
一面において、検出サブシステムには、制御可能な細胞環境での細胞内pH値を検出する装置が含まれる。一面において、検出サブシステムには、表現型を検出し特定する装置が含まれる。一面において、検出サブシステムには、選択した細胞内の組成をモニタリングするために動作可能なキャピラリーアレイが含まれる。また、検出サブシステムには、制御可能な細胞環境から液体サンプルを取り出し、液体サンプルの化学成分を測定する装置も含まれうる。また、検出サブシステムには、制御可能な細胞環境からガス サンプルを取り出し、ガス サンプルの化学成分を測定する装置が含まれる。
【００２８】
一面において、システム コントローラには、測定値を表すデータを取り出す検出サブシステムに連結された1つまたは複数の電子インタフェース、およびデータを受取るための電子インタフェースに連結されたコンピュータが含まれ、ここにおいて、コンピュータは、データを処理し、培養した細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布が生成されるようにプログラムされる。
一面において、このコンピュータは、データをリアルタイムで処理し、制御可能な細胞環境において培養した細胞のリアルタイムでの代謝特性を表示する選択したパラメータの値を生成するようにプログラムされる。このコンピュータは、培養した細胞についての代謝ネットワークに関するデータを含む少なくとも1つのデータベースから情報を取り出すようにプログラムできる。培養した細胞についての代謝ネットワークに関するデータとしては、バイオインフォマティクス（生命情報科学）、化学量論、ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス（代謝学）、微生物学、および生化学経路および酵素反応速度論の知識等からのほか、ならびにそうした情報を含むデータベースからのものが考えられる。一面において、コンピュータは、培養した細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を決定するために、代謝ネットワークデータおよび培養した細胞のリアルタイムでの代謝特性を表示する一連の選択したパラメータについての値を使用するようにプログラムされる。コンピュータは、代謝フラックス分析のための情報が保存されたローカルまたはリモートの電子装置に接続し、そうした情報を取り出してデータ処理をすることができる。こうした電子装置は、別のコンピュータにある記憶装置でも、コンピュータ ネットワークにあるサーバーでもよく、インターネットを介して確立される通信リンクを経由して接続することもできる。システム コントローラは、オンライン ゲノム データベースを含めた各種の遺伝情報および生化学的情報データベースの情報にアクセスしうる。
【００２９】
このコンピュータは、さらに、細胞培養中に少なくとも2つの異なる測定値をリアルタイムで獲得する、培養中にリアルタイムで2つの異なる測定値を処理して代謝パラメータの変化率を決定する、また代謝ネットワークの変化率を使用して培養中に選択した細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を決定する、またはそのいずれか、またはその任意の組合せをするようにプログラムできる。このコンピュータは、WindowsTM、UNIXTM、LinuxまたはMacOS等のうち、少なくとも1つのオペレーティングシステムで動作するように設定できる。
一面において、システム コントローラには、さらに、コンピュータに連結されたディスプレイ装置が含まれる。このシステムには、さらに、リアルタイム オンライン データ、計算結果（代謝フラックス分析[Metabolic Flux Analysis, MFA]等）、リアルタイム代謝フラックス分布、化学量論マトリックス、その他をユーザーが表示できるようにしたユーザーインタフェースが含まれる。コンピュータは、さらに、リアルタイム代謝フラックス分布をディスプレイ装置にグラフ形状で表示するようにプログラムすることができる。コンピュータは、さらに、選択した細胞において関連性のある代謝系路のマップ上に内部の代謝フラックスがグラフ形状で表示されるようにプログラムすることができる。
【００３０】
このシステムには、さらに、システム コントローラにより生成されるリアルタイム代謝フラックス分布に呼応して、制御可能な細胞環境にある細胞における遺伝子構成を組換えるために動作する細胞改変サブシステムを含みうる。培養した細胞についての代謝ネットワークに関するデータには、培養した細胞についての化学量論マトリックスが含まれうる。化学量論マトリックスには、培養した細胞の代謝ネットワークの説明が含まれうる。化学量論マトリックスは、代謝経路の関連性の有無を定義することができる。化学量論マトリックスは、化学量論係数Aで表すことができ、ここにおいてA・x = rで、rは代謝パラメータのオンラインでのリアルタイムによる測定値を表す測定ベクトルで、xは、単位mmol/hour乾燥細胞重量（DCW）を有するフラックスベクトルである。一面において、測定ベクトルであるrは、培養した細胞の代謝経路における酵素の特定の入力および出力の率を表示する。
【００３１】
本発明は、培養した細胞において所望の生成物または所望の表現型を生成するための最適な培養条件を決定するための方法を提供し、これには、制御可能な細胞環境における細胞培養、少なくとも2つの異なる測定値を培養中にリアルタイムで獲得するための少なくとも1つの代謝パラメータの測定、代謝パラメータの変化率を培養中にリアルタイムで決定する2つの異なる測定値の処理、培養中の細胞におけるリアルタイム代謝フラックス分布を決定するための細胞の既知の代謝ネットワークの変化率の使用、および、培養中に代謝フラックス分布を変更するために、培養状態を変化させる、確固たるリアルタイム代謝フラックス分布に基く制御可能な細胞環境の操作パラメータの調節が含まれ、それにより、所望の生成物または所望の表現型の生成のための培養条件が最適化される。
【００３２】
また別の一面で、この発明は、培養下の細胞についてのオンライン代謝フラックス分析をリアルタイムで実施するために、コンピュータを制御する方法を規定している。まず、コンピュータには、選択した細胞の代謝フラックス分布を決定するために、培養下で選択した細胞について適切な代謝ネットワーク モデル上にある情報にアクセスせよとの指令が出される。次に、コンピュータには、代謝フラックス分布を決定するためのデータを受取るようにとの指令が出される。次に、受取られたデータは、選択した細胞の比速度の計算に使用される。その後、代謝ネットワーク モデルでは、その比速度が適用され、代謝フラックス分布が決定される。代謝フラックス分布についてのデータは、データ ファイルに送信されて保存され、またコンピュータ ディスプレイ装置に送信されて表示される。入力データが変化すると、新しい代謝フラックス分布が作成される。変化がない場合には、コンピュータには、データの新しいセットに対応した新しい代謝フラックス分布を決定するためのデータの新しいセットを待機せよとの指令が出される。
【００３３】
本発明には、ペプチドの示差的標識化によりタンパク質を識別する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む。すなわち、（a）ポリペプチドが含まれるサンプルを供給する工程。（b）分子量は異なるが、クロマトグラフィーによる保持特性、ならびに質量分析法による分析におけるイオン化および検出特性には違いのない複数の標識化試薬を供給する工程。ここにおいて、分子量の違いは、質量分析法による分析により区別される。（c）酵素による消化または非酵素的断片化によりポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程。（d）工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片に接触させ、それにより、ペプチドを異なる標識化試薬で標識化する工程。（e）ペプチドをクロマトグラフィーにより分離して溶出液を生成する工程。（f）工程（e）の溶出液を質量分析計に供給し、その質量分析計を使用して各ペプチドの量を定量化し、各ペプチドの配列を生成する工程。（g）配列をコンピュータ プログラム製品に入力し、その入力した配列がポリペプチド配列データベースに対して比較され、配列が決定された元になるペプチドからポリペプチドが識別される工程。
【００３４】
一面において、工程（a）のサンプルには、細胞または細胞抽出物が含まれる。この方法には、ポリペプチドを含む2つ以上のサンプルを用意することも含まれうる。サンプルのうち1つまたは複数は、野生型細胞由来とすることができ、1つのサンプルは、異常細胞または改変された細胞由来とすることができる。異常な細胞は、ガン細胞でもよい。改変細胞としては、化学薬品、生理学的要因、若しくは他の生物体（真核生物体、原核生物の生物体、ウイルス、ベクター、プリオン、またはその一部等）の存在により突然変異誘発されたおよび/または処理された細胞、および/または環境的要因、環境的変化もしくは物理的な力（音、光、熱、超音波処理、および放射線等）に曝露された細胞が考えられる。改変としては、遺伝子の変化（例えば、DNAまたはRNAの配列や内容の変化等）またはその他が考えられうる。
【００３５】
一面において、この方法には、さらに、工程（c）の断片化の前、ポリペプチドの精製または分画が含まれうる。この方法には、さらに、工程（d）の標識化の前に、ポリペプチドの精製または分画が含まれうる。この方法には、さらに、工程（e）のクロマトグラフィーの前に、標識化されたペプチドの精製または分画が含まれうる。別の面で、精製または分画には、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLC、およびアフィニティー精製のグループから選択した方法が含まれる。一面において、この方法には、さらに、工程（c）の断片化の前に、ポリペプチドを工程（b）の標識化試薬と接触させる工程が含まれる。
一面において、工程（b）の標識化試薬は、ペプチドC-末端および/またはGluおよびAsp側鎖をエステル化するためのZAOHおよびZBOH、ペプチドC-末端および/またはGluおよびAsp側鎖とアミド結合を形成するためのZANH2およびZBNH2、ならびにペプチドN-末端および/またはLysおよびArg側鎖とアミド結合を形成するZACO2HおよびZBCO2Hのグループから選択した一般式を有する。ここにおいて、ZAおよびZBは、互いに独立するもので、一般式 R-Z1-A1-Z2-A2-Z3-A3-Z4-A4-を有し、Z1、Z2、Z3、およびZ4は、互いに独立であり、何も無いか、O、OC(O)、OC(S)、OC(O)O、OC(O)NR、OC(S)NR、OSiRR1、S、SC(O)、SC(S)、SS、S(O)、S(O2)、NR、NRR1+、C(O)、C(O)O、C(S)、C(S)O、C(O)S、C(O)NR、C(S)NR、SiRR1、(Si(RR1)O)n、SnRR1、Sn(RR1)O、BR(OR1)、BRR1、B(OR)(OR1)、OBR(OR1)、OBRR1、およびOB(OR)(OR1)からなる群から選択され、またRおよびR1はアルキル基であり、A1、A2、A3、およびA4 は、互いに独立であり、何も無いかまたは(CRR1)nのいずれかから選択されたものである。ここにおいて、R、R1は、Z1〜Z4における他のRおよびR1とも、A1〜A4における他のRおよびR1とも独立であり、水素原子、ハロゲン原子およびアルキル基からなる群より選択され、Z1〜Z4における「n」は、A1〜A4におけるnとは独立するもので、0〜約51、0〜約41、0〜約31、0〜約21、0〜約11、および0〜約6からなる群より選ばれる値を持つ整数である。
【００３６】
一面において、アルキル基（下記の定義を参照）は、アルケニル、アルキニル、およびアリール基からなる群より選択される。(CRR1)nにある1つまたは複数のC-C結合は、二重結合または三重結合と置換が可能で、こうして、別の面で、RまたはR1基は欠失される。(CRR1)nは、o-アリーレン、m-アリーレン、およびp-アリーレンからなる群より選択でき、ここにおいて、各基は0個または最高6個の置換基を有する。(CRR1)nは、炭素環式、二環式、および三環式の断片(fragment)からなる群より選択され、ここにおいて、前記断片は環中に最高8個の原子を有し、ヘテロ原子を有していないか、又は、O原子、N原子、およびS原子からなる群より選択されるヘテロ原子を有している。
一面において、2つ以上の標識化試薬は、同一構造であるが、同位体の組成は異なる。例えば、一面において、ZAは、ZBと同一構造であるが、ZAは、ZBとは同位体の組成が異なる。別の面で、同位体は、ホウ素10Bおよび11B、炭素12Cおよび13C、窒素14Nおよび15N、ならびに硫黄32Sおよび34Sである。一面において、ここで質量の小さい同位体をx、質量の大きい同位体をyとし、またxおよびyは整数であり、xはyよりも大きい。
別の面で、xとyは、1〜約11の間、1〜約21の間、1〜約31の間、1〜約41の間、または1〜約51の間のいずれかである。
【００３７】
一面において、工程（b）の標識化試薬は、ペプチドC-末端をエステル化するためのCD3(CD2)nOH/CH3(CH2)nOH（この式でn = 0、1、2またはy）、ペプチドC-末端とのアミド結合を形成するためのCD3(CD2)nNH2/CH3(CH2)nNH2（この式でn = 0、1、2またはy）、およびペプチドN-末端とのアミド結合を形成するためのD(CD2)nCO2H/H(CH2)nCO2H（この式でn = 0、1、2またはy）からなる群より選ばれる一般式を有する。ここにおいて、Dは重水素原子であり、またyは、約51、約41、約31、約21、約11、約6および約5〜51からなる群より選択される整数である。
一面において、工程（b）の標識化試薬は、ペプチドC-末端をエステル化するためのZAOH および ZBOH、ペプチドC-末端とのアミド結合を形成するためのZANH2/ZBNH2、および、ペプチドN-末端とのアミド結合を形成するためのZACO2H/ZBCO2Hからなる群より選ばれる一般式を有しうる。ここにおいてZAおよびZBは、一般式R-Z1-A1-Z2-A2-Z3-A3-Z4-A4-を有し、Z1、Z2、Z3、およびZ4は、互いに独立であり、何も無いか、O、OC(O)、OC(S)、OC(O)O、OC(O)NR、OC(S)NR、OSiRR1、S、SC(O)、SC(S)、SS、S(O)、S(O2)、NR、NRR1+、C(O)、C(O)O、C(S)、C(S)O、C(O)S、C(O)NR、C(S)NR、SiRR1、Si(RR1)O)n、SnRR1、Sn(RR1)O、BR(OR1)、BRR1、B(OR)(OR1)、OBR(OR1)、OBRR1、およびOB(OR)(OR1)からなる群より選択され、A1、A2、A3、およびA4は、互いに独立であり、何も無いか、一般式(CRR1)nから選択され、またRおよびR1はアルキル基である。
【００３８】
一面において、(CRR1)n基にある一重C-C結合は、二重結合または三重結合と置換される。こうして、RおよびR1は不在でもよい。(CRR1)nには、o-アリーレン、m-アリーレン、およびp-アリーレンからなる群より選択でされた部分を含めることができ、各基は0個または最高6個の置換基を有する。この基には、最高8個の原子を有する炭素環式、二環式、または三環系の断片が含まれ、ヘテロ原子を含まないか、またはO原子、N原子、およびS原子からなる群より選択されるヘテロ原子を含む。一面において、R、R1は、Z1〜Z4における他のRおよびR1とも、A1〜A4における他のRおよびR1とも独立であり、水素原子、ハロゲン、およびアルキル基からなる群より選択される。アルキル基（下記の定義を参照）は、アルケニル、アルキニルまたは、アリール基を含み得る。
【００３９】
一面において、Z1〜Z4における「n」は、A1〜A4におけるnとは独立であり、約51、約41、約31、約21、約11および約6からなる群より選択される整数である。一面において、ZAはZBと同一構造であるが、ZAは、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx個の-CH2-断片を有しうる。ここにおいてxは整数である。一面において、ZAはZBと同一構造であるが、ZAは、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx個の-CF2-断片を有しうる。ここにおいてxは整数である。一面において、ZAには、x個のプロトンがあり、ZBには、プロトンの位置にy個のハロゲンがある。ここにおいてxおよびyは整数である。一面において、ZAには、x個のプロトンがあり、ZBには、y個のハロゲンがあり、1つまたは複数のA1〜A4断片にx-y個のプロトンが残っている。ここにおいてxおよびyは整数である。一面において、ZAには、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx個の-O-断片がある。ここにおいてxは整数である。一面において、ZAには、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx個の-S-断片がある。ここにおいてxは整数である。一面において、ZAには、さらにx個の-O-断片があり、またZBには、さらに-O-断片の位置にy個の-S-断片がある。ここにおいてxおよびyは整数である。一面において、ZAには、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx-y個の-O-断片がある。ここにおいてxおよびyは整数である。
【００４０】
別の面で、xおよびyは、1〜約51の間、1〜約41の間、1〜約31の間、1〜約21の間、1〜約11の間、および1〜約6の間からなる群より選択される整数である。ここにおいて、xはyよりも大きい。
一面において、工程（b）の標識化試薬は、ペプチドC-末端をエステル化するためのCH3(CH2)nOH/CH3(CH2)n+mOH（この式でn = 0、1、2、・・・、y、m = 1、2、・・・、y）、ペプチドC-末端とのアミド結合を形成するためのCH3(CH2)n NH2/CH3(CH2)n+mNH2（この式でn = 0、1、2、・・・、y、m = 1、2、・・・、y）、およびペプチドN-末端とのアミド結合を形成するためのH(CH2)nCO2H/H(CH2)n+mCO2H（この式でn = 0、1、2、・・・、y、m = 1、2、・・・、y）からなる群より選ばれる一般式を有する。ここにおいて、n、mおよびyは整数である。一面において、n、mおよびyは、約51、約41、約31、約21、約11、約6、および約5〜51からなる群より選択される整数である。
【００４１】
一面において、工程（e）の分離には、多次元的液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー クロマトグラフィー システム等の液体クロマトグラフィー システムを含む。
一面において、質量分析計には、タンデム型質量分析装置がある。一面において、この方法には、さらに、各ポリペプチドまたは各ペプチドの量の定量が含まれる。
【００４２】
本発明は、所定の細胞の状態に関連する発現したタンパク質を同定する方法を提供しており、この方法は以下の工程を含む。（a）望ましい細胞の状態にある細胞を含むサンプルを提供する工程。（b）分子量は異なるが、クロマトグラフィーによる保持特性、ならびに質量分析法による分析におけるイオン化および検出特性には違いのない複数の標識化試薬を供給する工程。ここにおいて、分子量の違いは、質量分析法による分析により識別される。（c）酵素による消化または非酵素的断片化により、細胞に由来するポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程。（d）工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片に接触させ、それにより、ペプチドを異なる標識化試薬で標識化する工程。（e）ペプチドをクロマトグラフィーにより分離して溶出液を生成する工程。（f）工程（e）の溶出液を質量分析計に供給し、その質量分析計を使用して各ペプチドの量を定量化し、各ペプチドの配列を生成する工程。（g）配列をコンピュータ プログラム製品に入力し、その入力した配列がポリペプチド配列データベースに対して比較され、配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドが同定される工程。これにより、細胞の状態に関連して発現されたタンパク質が規定される。
【００４３】
本発明は、少なくとも2つの細胞の状態間でのタンパク質発現の変化を定量化する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む。（a）所望の細胞状態にある細胞を含む少なくとも2つのサンプルを供給する工程。（b）分子量は異なるが、クロマトグラフィーによる保持特性、ならびに質量分析法による分析におけるイオン化および検出特性には違いのない複数の標識化試薬を供給する工程で、ここにおいて、分子量の違いは、質量分析法による分析により識別される。（c）酵素による消化または非酵素的断片化により、細胞に由来するポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程。（d）工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片に接触させ、それにより、ペプチドを異なる標識化試薬で標識化する工程。ここにおいて、一方のサンプルに使用されている標識は、他方のサンプルに使用されている標識とは異なる。（e）ペプチドをクロマトグラフィーにより分離して溶出液を生成する工程。（f）工程（e）の溶出液を質量分析計に供給し、その質量分析計を使用して各ペプチドの量を定量化し、各ペプチドの配列を生成する工程。（g）各ペプチドがどのサンプルに由来するかを特定するコンピュータ プログラム製品に配列を入力し、その入力した配列がポリペプチド配列データベースに対して比較され、配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドが同定され、また各サンプルにおける各ポリペプチドの量が比較される工程で、これにより、少なくとも2つの細胞の状態間でのタンパク質発現の変化が定量化される。
【００４４】
本発明は、ペプチドの示差的標識化によりタンパク質を同定する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む。（a）ポリペプチドが含まれるサンプルを提供する工程。（b）分子量は異なるが、クロマトグラフィーによる保持特性、ならびに質量分析法による分析におけるイオン化および検出特性には違いのない複数の標識化試薬を供給する工程。ここにおいて、分子量の違いは、質量分析法による分析により識別される。（c）酵素による消化または非酵素的断片化によりポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程。（d）工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片に接触させ、それにより、ペプチドを異なる標識化試薬で標識化する工程。（e）多次元的液体クロマトグラフィーによりペプチドを分離し、溶出液を生成する工程。（f）工程（e）の溶出液をタンデム型質量分析計に供給し、質量分析計を使用して、ペプチドの量を定量化し、各ペプチドの配列を生成する工程。（g）配列をコンピュータ プログラム製品に入力し、その入力した配列がポリペプチド配列データベースに対して比較され、配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドが同定される工程。
【００４５】
本発明は、（a）ビオチンが含まれる第1の領域と、（b）アミノ酸との共有結合的な結合能力のある反応性の基が含まれる第2の領域、とを含むキメラ標識化試薬を提供する。ここにおいて、キメラ標識化試薬には、少なくとも1つの同位体が含まれる。同位体があるのは、第1の領域でも、第2の領域でもよい。例えば、同位体は、ビオチン内でもよい。
別の面で、同位体は、重水素同位体、ホウ素同位体10Bもしくは11B、炭素同位体12Cもしくは13C、窒素同位体14Nもしくは15N、または硫黄同位体32Sもしくは34Sであってよい。キメラ標識化試薬には、2つ以上の同位体が含まれうる。キメラ標識化試薬のアミノ酸との共有結合的な結合能力のある反応性の基は、スクシミド基（succimide group）、イソチオシアネート基、またはイソシアネート基等としうる。アミノ酸と共有結合的に結合する能力のある反応性の基は、リジンまたはシステインと結合する。
キメラ標識化試薬には、さらに、ビオチン基および反応性の基と連結するリンカー部分が含まれうる。リンカー部分には、少なくとも1つの同位体が含まれうる。一面において、リンカーは、切断可能な部分で、酵素による消化、または還元等により切断が可能である。
【００４６】
本発明は、以下の工程のあるサンプル内の相対タンパク質濃度を比較する方法を提供する。すなわち、（a）複数の示差的小分子タグを提供する工程であって、前記小分子タグは、構造的には同一であるが、その同位体の組成が異なり、その小分子には、システインまたはリジン残基またはその両方と共有結合的に結合された反応性の基が含まれる。（b）ポリペプチドが含まれる少なくとも2つのサンプルを提供する工程。（c）示差的小分子タグをポリペプチドのアミノ酸に共有結合的に付着させる工程。（d）タンデム型質量分析計内の各サンプルのタンパク質濃度を決定する工程。および（d）各サンプルの相対タンパク質濃度を比較する工程。一面において、サンプルには、完全なまたは分画化された細胞サンプルが含まれる。
【００４７】
この方法の一面において、示差的小分子タグは、（a）ビオチンが含まれる第1の領域、および（b）アミノ酸に共有結合的に結合する能力のある反応性の基が含まれる第2の領域を含むキメラ標識化試薬が含まれるが、ここにおいて、このキメラ標識化試薬には、少なくとも1つの同位体が含まれる。同位体としては、重水素同位体、ホウ素同位体10Bもしくは11B、炭素同位体12Cもしくは13C、窒素同位体14Nもしくは15N、または硫黄同位体32Sもしくは34Sが考えられる。キメラ標識化試薬には、2つ以上の同位体が含まれうる。アミノ酸と共有結合的に結合する能力のある反応性の基は、スクシミド基、イソチオシアネート基、またはイソシアネートから選択される。
【００４８】
本発明は、以下を含むサンプル内の相対タンパク質濃度を比較する方法を提供する。すなわち（a）複数の示差的小分子タグを供給する工程。ここにおいて、示差的小分子タグには、(i)ビオチンが含まれる第1の領域、および(ii)アミノ酸に共有結合的に結合する能力のある反応性の基が含まれる第2の領域があるキメラ標識化試薬が含まれる。ここにおいて、キメラ標識化試薬には、少なくとも1つの同位体が含まれる。（b）ポリペプチドが含まれる少なくとも2つのサンプルを供給する工程。（c）示差的小分子タグをポリペプチドのアミノ酸に共有結合的に結合する工程。（d）タグ付ポリペプチドをカラムに結合し、カラムから非結合物質を洗い流し、カラムからタグ付ポリペプチドを溶出させることにより、ビオチン結合カラム上のタグ付ポリペプチドを単離する工程。（e）タンデム型質量分析計内の各サンプルのタンパク質濃度を決定する工程。および（f）各サンプルの相対タンパク質濃度を比較する工程。
【００４９】
ペプチドの示差的標識化によりタンパク質を同定する方法があるが、この方法は以下の工程を含む。（a）ポリペプチドが含まれるサンプルを提供する工程。（b）分子量が異なるが、全く同一またはほぼ同一または類似したクロマトグラフィーによる保持特性があり、質量分析法による分析において全く同一またはほぼ同一または類似したイオン化および検出特性のある複数の標識化試薬を供給する工程。ここにおいて、分子量の違いは、質量分析法による分析により識別される。（c）酵素による消化または非酵素的断片化によりポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程。（d）工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片に接触させ、それにより、ペプチドを異なる標識化試薬で標識化する工程。（e）ペプチドをクロマトグラフィーにより分離して溶出液を生成する工程。（f）工程（e）の溶出液を質量分析計に供給し、その質量分析計を使用して各ペプチドの量を定量化し、各ペプチドの配列を生成する工程。（g）配列をコンピュータ プログラム製品に入力し、その入力した配列がポリペプチド配列データベースに対して比較され、配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドが同定される工程。一面において、工程（a）のサンプルには、細胞または細胞抽出物が含まれる。
【００５０】
この方法には、さらに、ポリペプチドを含む2つ以上のサンプルを用意することも含まれうる。一面において、1つのサンプルは野生型細胞に由来し、また1つのサンプルは異常細胞または改変細胞に由来する。一面において、異常細胞はガン細胞である。
この方法には、さらに、工程（c）の断片化の前、ポリペプチドの精製または分画が含まれうる。この方法には、さらに、工程（d）の標識化の前に、ポリペプチドの精製または分画が含まれうる。この方法には、さらに、工程（e）のクロマトグラフィーの前に、標識化されたペプチドの精製または分画が含まれうる。一面において、精製または分画には、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、HPLC、逆相HPLCおよび親和性精製からなる群より選ばれる方法が含まれる。この方法には、さらに、工程（c）の断片化の前に、ポリペプチドを工程（b）の標識化試薬と接触させる工程が含まれうる。
【００５１】
一面において、工程（b）の標識化試薬は、ペプチドC-末端および/またはGluおよびAsp側鎖をエステル化するためのZAOHおよびZBOH、ペプチドC-末端および/またはGluおよびAsp側鎖とアミド結合を形成するためのZANH2およびZBNH2、ならびに、ペプチドN-末端および/またはLysおよびArg側鎖とアミド結合を形成するためのZACO2HおよびZBCO2Hからなる群より選択される一般式を有する。ここにおいてZAおよびZBは、互いに独立であり、一般式R-Z1-A1-Z2-A2-Z3-A3-Z4-A4-を有し、Z1、Z2、Z3、およびZ4は、互いに独立であり、何も含んでいないか、O、OC(O)、OC(S)、OC(O)O、OC(O)NR、OC(S)NR、OSiRR1、S、SC(O)、SC(S)、SS、S(O)、S(O2)、NR、NRR1+、C(O)、C(O)O、C(S)、C(S)O、C(O)S、C(O)NR、C(S)NR、SiRR1、(Si(RR1)O)n、SnRR1、Sn(RR1)O、BR(OR1)、BRR1、B(OR)(OR1)、OBR(OR1)、OBRR1、およびOB(OR)(OR1)からなる群より選択され、またRおよびR1は、アルキル基であり、A1、A2、A3、およびA4は、互いに独立であり、何も含んでいないか、または(CRR1)nから選ばれる。ここにおいて、R、R1は、Z1〜Z4における他のRおよびR1とも、A1〜A4における他のRおよびR1とも独立であり、Z1〜Z4における他のRおよびR1とも、A1〜A4における他のRおよびR1とも独立であり、Z1〜Z4におけるnは、A1〜A4におけるnとは独立であり、0〜約51、0〜約41、0〜約31、0〜約21、0〜約11、および0〜約6からなる群より選択される値を持つ整数である。
【００５２】
一面において、アルキル基は、アルケニル、アルキニル、およびアリール基からなる群より選ばれる。一面において、(CRR1)nにある1つまたは複数のC-C結合は、二重結合または三重結合で置換が可能である。一面において、RまたはR1基は欠失する。一面において、(CRR1)nは、o-アリーレン、m-アリーレン、およびp-アリーレンからなる群より選択され、ここにおいて、各基は0個または最高6個の置換基を有する。一面において、(CRR1)nは、炭素環式、二環式、および三環式の断片からなる群より選択され、ここにおいて、前記断片には環中に最高8個の原子があり、ヘテロ原子を含まないか又はO原子、N原子 、およびS原子からなる群より選択されるヘテロ原子を有する。
【００５３】
一面において、2つ以上の標識化試薬は、同一構造であるが、同位体の組成は異なる。一面において、ZAは、ZBと同一構造であるが、ZAは、ZBとは同位体の組成が異なる。一面において、同位体がホウ素10Bおよび11Bであるか、または、同位体が炭素12Cおよび13Cであるか、または、同位体が窒素14Nおよび15Nであるか、または、同位体が硫黄32Sおよび34Sである。一面において、質量の小さい同位体をx、質量の大きい同位体をyとし、xおよびyは整数であり、xはyよりも大きい。
一面において、xとyは、1〜約11の間、1〜約21の間、1〜約31の間、1〜約41の間、または1〜約51の間のいずれかである。
一面において、工程（b）の標識化試薬は、ペプチドC-末端をエステル化するためのCD3(CD2)nOH/CH3(CH2)nOH（この式でn = 0、1、2またはy）、ii.ペプチドC-末端とのアミド結合を形成するためのCD3(CD2)nNH2/CH3(CH2)nNH2（この式でn = 0、1、2またはy）、およびペプチドN-末端とのアミド結合を形成するためのD(CD2)nCO2H/ H(CH2)nCO2H（この式でn = 0、1、2またはy）からなる群より選ばれる一般式を有する。ここにおいて、Dは、重水素原子であり、またyは、約51、約41、約31、約21、約11、約6および約5〜51からなる群より選ばれる整数である。
【００５４】
一面において、工程（b）の標識化試薬は、ペプチドC-末端をエステル化するためのZAOH and ZBOH、ペプチドC-末端とのアミド結合を形成するためのZANH2/ZBNH2、およびペプチドN-末端とのアミド結合を形成するためのZACO2H/ZBCO2Hからなる群より選択される一般式を有する。ここにおいて、ZAおよびZBは、一般式 R-Z1-A1-Z2-A2-Z3-A3-Z4-A4-を有し、Z1、Z2、Z3、およびZ4は、互いに独立であり、何も含んでいないか、O、OC(O)、OC(S)、OC(O)O、OC(O)NR、OC(S)NR、OSiRR1、S、SC(O)、SC(S)、SS、S(O)、S(O2)、NR、NRR1+、C(O)、C(O)O、C(S)、C(S)O、C(O)S、C(O)NR、C(S)NR、SiRR1、(Si(RR1)O)n、SnRR1、Sn(RR1)O、BR(OR1)、BRR1、B(OR)(OR1)、OBR(OR1)、OBRR1、およびOB(OR)(OR1)からなる群より選択され、A1、A2、A3、およびA4は、互いに独立であり、何も含んでいないか一般式(CRR1)nから選択され、またRおよびR1はアルキル基である。
【００５５】
一面において、(CRR1)n基にある一重C-C結合は、二重結合または三重結合と置換される。一面において、RおよびR1は不在である。一面において、(CRR1)nには、o-アリーレン、m-アリーレン、およびp-アリーレンからなる群より選択された部分を含めることができ、各基は0個または最高6個の置換基を有する。一面において、この基には、環に最高8個の原子のある炭素環式、二環式、または三環系の断片が含まれ、ヘテロ原子を含まないか、又はO原子、N原子、およびS原子からなる群より選択されるヘテロ原子を含む。一面において、R、R1は、Z1〜Z4における他のRおよびR1とも、A1〜A4における他のRおよびR1とも独立であり、水素原子、ハロゲン、およびアルキル基からなる群より選択される。一面において、アルキル基は、アルケニル、アルキニル、およびアリール基からなる群より選択される。一面において、Z1〜Z4は、A1〜A4におけるnとは独立であり、約51、約41、約31、約21、約11および約6からなる群より選択される整数である。一面において、ZAはZBと同一構造であるが、ZAには、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx個の-CH2-断片を有する。ここにおいてxは整数である。一面において、ZAはZBと同一構造であるが、ZAには、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx個の-CF2-断片を有する。ここにおいてxは整数である。一面において、ZAには、x個のプロトンがあり、ZBには、プロトンの位置にy個のハロゲンがある。ここにおいてxおよびyは整数である。一面において、ZAには、x個のプロトンがあり、ZBには、y個のハロゲンがあり、1つまたは複数のA1〜A4断片にx-y個のプロトンが残っている。ここにおいてxおよびyは整数である。一面において、ZAには、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx個の-O-断片がある。ここにおいてxは整数である。一面において、ZAには、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx個の-S-断片がある。ここにおいてxは整数である。一面において、ZAには、さらにx個の-O-断片があり、またZBには、さらに-O-断片の位置にy個の-S-断片がある。ここにおいてxおよびyは整数である。一面において、ZAには、さらに、1つまたは複数のA1〜A4断片にx-y個の-O-断片がある。ここにおいてxおよびyは整数である。一面において、xおよびyは、1〜約51の間、1〜約41の間、1〜約31の間、1〜約21の間、1〜約11の間および1〜約6の間からなる群より選択される整数である。ここにおいて、xはyよりも大きい。
【００５６】
一面において、工程（b）の標識化試薬は、ペプチドC-末端をエステル化するためのCH3(CH2)nOH/CH3(CH2)n+mOH（この式でn = 0、1、2、・・・、y、m = 1、2、・・・、y）、ペプチドC-末端とのアミド結合を形成するためのCH3(CH2)nNH2/CH3(CH2)n+mNH2（この式でn = 0、1、2、・・・、y、m = 1、2、・・・、y）、ペプチドN-末端とのアミド結合を形成するためのH(CH2)nCO2H/H(CH2)n+mCO2H（この式でn = 0、1、2、・・・、y、m = 1、2、・・・、y）からなる群より選択される一般式を有する。ここにおいて、n、mおよびyは整数である。
一面において、n、mおよびyは、約51、約41、約31、約21、約11、約6、および約5〜51からなる群より選択される整数である。一面において、工程（e）の分離には、液体クロマトグラフィー システムが含まれる。
一面において、液体クロマトグラフィーシステムには、多次元的液体クロマトグラフィーが含まれる。一面において、質量分析計は、タンデム型質量分析装置が含まれる。
この方法には、さらに、各ポリペプチドの量の定量化が含まれうる。この方法には、さらに各ペプチドの量の定量化が含まれうる。
【００５７】
本発明は、所定の細胞の状態に関連する発現したタンパク質を規定する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：（a）所望の細胞状態にある細胞を含むサンプルを提供する工程。（b）分子量は異なるが、クロマトグラフィーによる保持特性、ならびに質量分析法による分析におけるイオン化および検出特性には違いのない複数の標識化試薬を供給する工程。ここにおいて、分子量の違いは、質量分析法による分析により区別される。（c）酵素による消化または非酵素的断片化により、細胞に由来するポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程。（d）工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片に接触させ、それにより、ペプチドを異なる標識化試薬で標識化する工程。（e）ペプチドをクロマトグラフィーにより分離して溶出液を生成する工程。（f）工程（e）の溶出液を質量分析計に供給し、その質量分析計を使用して各ペプチドの量を定量化し、各ペプチドの配列を生成する工程。（g）配列をコンピュータ プログラム製品に入力し、その入力した配列がポリペプチド配列データベースに対して比較され、配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドが同定される工程で、これにより、細胞の状態に関連する発現したタンパク質が規定される。
【００５８】
本発明は、少なくとも2つの細胞状態間でのタンパク質発現の変化を定量化する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。（a）所望の細胞状態にある細胞を含む少なくとも2つのサンプルを提供する工程。（b）分子量は異なるが、クロマトグラフィーによる保持特性、ならびに質量分析法による分析におけるイオン化および検出特性には違いのない複数の標識化試薬を供給する工程。ここにおいて、分子量の違いは、質量分析法による分析により区別される。（c）酵素による消化または非酵素的断片化により、細胞に由来するポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程。（d）工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片に接触させ、それにより、ペプチドを異なる標識化試薬で標識化する工程。ここにおいて、一方のサンプルに使用されている標識は、他方のサンプルに使用されている標識とは異なる。（e）ペプチドをクロマトグラフィーにより分離して溶出液を生成する工程。（f）工程（e）の溶出液を質量分析計に供給し、その質量分析計を使用して各ペプチドの量を定量化し、各ペプチドの配列を生成する工程。（g）各ペプチドがどのサンプルに由来するかを同定するコンピュータ プログラム製品に配列を入力し、その入力した配列がポリペプチド配列データベースに対して比較され、配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドが同定され、また各サンプルにおける各ポリペプチドの量が比較される工程で、これにより、少なくとも2つの細胞状態間でのタンパク質発現の変化が定量化される。
【００５９】
この発明では、ペプチドの示差的標識化によりタンパク質を同定する方法を規定している。この方法は以下の工程を含む。（a）ポリペプチドが含まれるサンプルを提供する工程。（b）分子量は異なるが、クロマトグラフィーによる保持特性、ならびに質量分析法による分析におけるイオン化および検出特性には違いのない複数の標識化試薬を提供する工程。ここにおいて、分子量の違いは、質量分析法による分析により区別される。（c）酵素による消化または非酵素的断片化によりポリペプチドをペプチド断片に断片化する工程。（d）工程（b）の標識化試薬を工程（c）のペプチド断片に接触させ、それにより、ペプチドを異なる標識化試薬で標識する工程。（e）多次元液体クロマトグラフィーによりペプチドを分離し、溶出液を生成する工程。（f）工程（e）の溶出液をタンデム型質量分析計に供給し、質量分析計を使用して、ペプチドの量を定量化し、各ペプチドの配列を生成する工程。（g）配列をコンピュータ プログラム製品に入力し、その入力した配列がポリペプチド配列データベースに対して比較され、配列決定されたペプチドの起源であるポリペプチドが同定される工程。
【００６０】
本発明は、（a）ビオチンが含まれる第1の領域、および（b）アミノ酸に共有結合的に結合する能力のある反応性の基が含まれる第2の領域、を含むキメラ標識化試薬を提供する。ここにおいて、キメラ標識化試薬には、少なくとも1つの同位体が含まれる。一面において、同位体は、第1の領域にある。一面において、同位体は、ビオチン内にある。一面において、同位体は、第2の領域にある。一面において、同位体は、重水素同位体、ホウ素同位体10Bまたは11B、炭素同位体12Cまたは13C、窒素同位体14Nまたは15N、および硫黄同位体32Sまたは34Sからなる群より選択される。一面において、標識化試薬には、2つ以上の同位体が含まれる。
一面において、アミノ酸との共有結合的な結合能力のある反応性の基は、スクシミド基、イソチオシアネート基、またはイソシアネート基からなる群より選択される。一面において、アミノ酸との共有結合的な結合能力のある反応性の基は、リジンまたはシステインと結合する。キメラ標識化試薬には、さらに、ビオチン基および反応性の基と連結するリンカー部分が含まれる。リンカー部分には、少なくとも1つの同位体が含まれる。一面において、リンカーは、切断可能な部分である。一面において、リンカーは、酵素による消化により切断できる。一面において、リンカーは、還元により切断できる。
【００６１】
本発明は、以下を含むサンプル内の相対タンパク質濃度を比較する方法を提供する。すなわち（a）複数の示差的小分子タグを提供する工程。ここにおいて、小分子タグは、構造的には同一であるが、その同位体の組成が異なり、その小分子には、システインまたはリジン残基またはその両方と共有結合的に結合された反応性の基が含まれる。（b）ポリペプチドが含まれる少なくとも2つのサンプルを提供する工程。（c）示差的小分子タグをポリペプチドのアミノ酸に共有結合的に結合させる工程。（d）タンデム型質量分析計内の各サンプルのタンパク質濃度を決定する工程。および（d）各サンプルの相対タンパク質濃度を比較する工程。一面において、サンプルには、完全なまたは分画化された細胞サンプルが含まれる。一面において、示差的小分子タグには、（a）ビオチンが含まれる第1の領域、および（b）アミノ酸に共有結合的に結合する能力のある反応性の基が含まれる第2の領域、を含むキメラ標識化試薬が含まれ、ここにおいてキメラ標識化試薬には、少なくとも1つの同位体が含まれる。一面において、同位体は、重水素同位体、ホウ素同位体10Bまたは11B、炭素同位体12Cまたは13C、窒素同位体14Nまたは15N、および硫黄同位体32Sまたは34Sからなる群より選択される。一面において、キメラ標識化試薬には、2つ以上の同位体が含まれうる。一面において、アミノ酸との共有結合的な結合能力のある反応性の基は、スクシミド基、イソチオシアネート基、またはイソシアネート基からなる群より選択される。
【００６２】
本発明は、以下を含むサンプル内の相対タンパク質濃度を比較する方法を提供する：すなわち、（a）複数の示差的小分子タグを提供する工程。ここにおいて、示差的小分子タグには、(i)ビオチンが含まれる第1の領域、および(ii)アミノ酸に共有結合的に結合する能力のある反応性の基が含まれる第2の領域、を含むキメラ標識化試薬が含まれる。ここにおいて、このキメラ標識化試薬には、少なくとも1つの同位体が含まれる。（b）ポリペプチドが含まれる少なくとも2つのサンプルを供給する工程。（c）示差的小分子タグをポリペプチドのアミノ酸に共有結合的に結合させる工程。（d）タグ付ポリペプチドをカラムに結合し、カラムから非結合物質を洗い流し、カラムからタグ付ポリペプチドを溶出させることにより、ビオチン結合カラム上のタグ付ポリペプチドを単離する工程。（e）タンデム型質量分析計内の各サンプルのタンパク質濃度を決定する工程。および（f）各サンプルの相対タンパク質濃度を比較する工程。
【００６３】
本発明は、逆相（RP1）クロマトグラフ、強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフ、および逆相（RP2）樹脂クロマトグラフを含む構成を含み、ペプチドの液体クロマトグラフ（LC）分離のための三次元（の）(3-D)ミクロキャピラリー カラムが含まれる多次元的マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）システムを提供する。多次元的マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）システムの一面において、システムは、以下の順序のシステムのコンポーネントで配置される：逆相（RP1）クロマトグラフ、その後に、強力な陽イオン交換（SCX）クロマトグラフ、その後に、逆相（RP2）樹脂クロマトグラフ。
【００６４】
この発明の1つまたは複数についての詳細は、下記の添付図面および明細書本文で述べる。その他の発明の特徴、目的、および利点は、明細書本文および図面から、ならびに請求項から明らかである。
あらゆる目的において、本書で引用した全ての出版物、GenBank Accession参考データ（シーケンス）、米国菌培養収集所（The American Type Culture Collection、ATCC）寄託、特許および特許出願は、ここに、明示的に参照により本書に組込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
この発明は、数ある中で、「オンライン」または「リアルタイム」代謝フラックス分析を用いた、新規および改変した表現型の全細胞操作についての新しい方法およびシステムを提供するものである。図1に、この発明の方法を実施するための一態様を示す。最初の工程として、細胞の遺伝子構成を変化させて、細胞を改変する。本書に説明するとおり、この改変は、無作為つまり確率論的方法、または非確率的方法をとりうる。特定の遺伝子または特定の代謝系路を組換えの標的としうる。
【００６６】
この実施態様によれば、この発明の方法の第2の工程は、改変細胞を培養し、複数の改変細胞を生成することを含む。この細胞培養は、オペレーターによって、または電子的またはその他の制御機構によって制御することのできる、制御可能な細胞環境内で実施することができる。一般に、細胞は、例えば、組織培養等の細胞培養中で、発酵または組織培養反応器により、または細胞増殖モニター装置内等、どんな手段でも培養できる。
この方法の次の工程は、細胞の少なくとも1つの代謝パラメータをリアルタイムで測定することを含む。一面において、複数のメタボローム パラメータは、同時に測定される。こうして、1つまたは複数の装置を、代謝パラメータのモニタリングおよび測定に使用することができる。こうした装置は、測定値を得るために制御可能な細胞環境と相互作用させるために連結されてもよく、そのようにして、この発明の細胞システムにおける検出サブシステムを構成してもよい。例えば、細胞増殖モニター装置では、培養内にある細胞の複数の代謝パラメータをリアルタイムで測定できる。一例としては、下記に記載するWedgewood Technology, Inc.（San Carlos, CA）、細胞増殖モニター652TMモデルがある。
【００６７】
さらに、この方法には、それらのデータを分析し、測定されたパラメータが同様の条件下にある未改変細胞（または別様に改変した細胞）における比較可能な測定値と異なるかどうか、または時間経過と共に変化が見られたかを決定し、それにより、リアルタイム代謝フラックス分析を用いた細胞の操作された表現型を同定することが含まれる。例えば、パラメータは、野生型細胞もしくは他のかたちで改変されていない細胞や細胞培養よりも高いか、小さいか、または異なる率で変化しうる。細胞の遺伝子構成の改変による表現型変化があるかどうか、そして／あるいは、それはどんなものかを確認するために未改変の細胞または細胞培養をリアルタイムで同時にモニタリングする必要はない。既知のデータおよび情報は、基準として使用できる。上記のプロセスは、1つまたは複数の所望の特性により改変された細胞または細胞培養物が生成されるまで、繰り返すことができる。
【００６８】
また、本発明は、測定した細胞および細胞培養の代謝パラメータの時間経過に伴う変化のリアルタイムモニタリングのための方法を提供する。この発明の一面において、本方法には、測定代謝パラメータの時間経過に伴う変化をリアルタイムでモニタリングするためのコンピュータ実装プログラムの使用が含まれる。一面において、この方法およびプログラムには、結果的な処理済のデータの分析および表示も含まれる。1つの例示的なコンピュータ実装プログラムには、図2に記載したコンピュータ実装法が含まれる。使用可能なこの方法や他のコンピュータ実装法において、この例示的パラダイムには、代謝ネットワーク方程式、代謝経路分析、エラー解析（フラックス推定のための加重最小自乗法等）、その他の使用が含まれる。
【００６９】
図2A〜2Eには、さらに、本発明の多様な面および例を示す。図2Aは、本発明が適用されうるシステム生物学枠組みの全体的構造を示す。図2Bは、仮説的細胞の代謝ネットワーク方程式の例を図示するもので、方程式の根拠になる物理的プロセスを例示する。図2Cは、代謝フラックス分析の例示的な適用を図示する。図2Dは、代謝フラックス分析の手順の一例を示す。図2Eは、代謝フラックス収支分析（FBA）における制約の一例である。発明のこれらの特徴については、本出願書の明細書全体を通してさらに説明・図示している。
図2のコンピュータ実装法には、以下の主な動作が含まれうる。まず、特定の細胞についての代謝ネットワーク方程式が、その細胞についての既知の遺伝的および生化学的特性から確立される。そのような特性は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）データベース、化学量論データベース、ゲノミクス、またはプロテオミクス データベース、微生物学データベース、生化学工学データベース、その他等、一定の既知のデータベースから獲得することができる。これらのデータベースやその他のデータベースは、インターネットを含めた各種コンピュータ ネットワーク等、適切な通信リンクまたはチャネルを経由してアクセスができる。
【００７０】
特定の細胞または細胞培養に関するそうした情報から由来しうる代謝ネットワーク方程式は、細胞の異なる節の部位での異なる代謝フラックスにおいて過渡的に物質の総質量が保存されるという仮定に基くことができる。細胞の代謝フラックスが、定常状態に達すると、代謝ネットワーク方程式は、一次行列式AX=rで表現することができ、この式で、Aは、所定の細胞または細胞培養の化学量論係数および変数を表す行列、Xは、細胞または細胞培養の全ての代謝フラックスを表すベクトル、およびrは、測定される代謝パラメータの比速度を表すベクトルである。代謝パラメータ、つまりrは、各種の手段によりリアルタイムで測定できる。よって、細胞の所定のAについて、リアルタイムでの測定値または事前の測定値から、ベクトルrにおける比速度がいったん決定されると、代謝フラックス（X）が決定されうる。
測定される代謝パラメータは、ブドウ糖、グリセロール、エタノールまたはメタノール等の二次代謝産物の増減を含み得る。測定される代謝パラメータは、アセテート、ブチラート、スクシナート、オキサロアセテート、フマレート、α-ケトグルタラートまたはフォスフェート等の有機酸の増減を含み得る。測定される代謝パラメータは、細胞内または培養のpHの増減を含み得る。測定される代謝パラメータは、酸素、メタノール、その他などのガスの入力または出力の増減含み得る。
【００７１】
一面において、コンピュータ プログラムは、Xの計算を高速で実行し、計算時間が比較的短くなり、その間の培養下での細胞の改変が小さくなるように、適切なコンピュータ ハードウェアに実装される。つまり、完全な代謝フラックス分析（MFA）の処理速度は、培養下の細胞の成長率よりも早い。この意味で、コンピュータ実装代謝フラックス分析はリアルタイム（その間、細胞培養が同時に進行中）であるとみなされる。
図2に示すとおり、コンピュータを導入した方法のこの実施態様には、行列式AX=rにおけるデータ ベクトルrについてのオンライン メタボローム データを得るためのプロセスを含めることもできる。このデータは、生データベクトルrを形成するために使用される。生データベクトルを、さらにエラー解析プロセスにより処理し、実際のMFA計算のための修正データ ベクトルｒを生成してもよい。オンライン メタボローム データの情報源は、細胞増殖環境に連結されているオンライン検出サブシステムでもよい。この配置において、オンライン検出サブシステムの演算速度は、検出サブシステムによる全測定時間およびコンピュータによる全てのMFA計算にかかる時間がリアルタイムとなる程度に比較的短くなるように、培養下の細胞の成長率よりも早くなるべきである。別の方法として、オンライン メタボローム データの情報源は、目的の細胞についての事前の測定値またはメタボローム データ ファイルが保存されている電子データファイルまたはデータベースからとしてもよい。培養下の細胞の代謝フラックスをモニタリングするためのオンラインMFAとは異なり、こうした非リアルタイムのメタボローム データは、選択した細胞の代謝フラックスの予測にも使用することができ、こうして、細胞選択プロセスまたは細胞培養条件の設計において利用することもできる。
【００７２】
コンピュータを導入したMFA計算は、所望の速度および計算の精度を達成するために、各種の適切な計算技術のどれか一つまたはその組合せにより達成ができる。計算精度を向上させるための1つの技術は、例えば、図2に示す加重最小自乗法の使用である。Xの計算が終われば、細胞内の代謝フラックス経路を分析して、表現型の決定、経路利用の分析、および特定の細胞の細胞特性の調査をすることもできる。
上述のコンピュータを導入したMFAは、新しい細胞増殖、またはリアルタイムのMFA能力のある操作システムを提供するために、適したハードウェア システムに導入することができる。以下の部分では、発明のこの面を例示するために、そうしたシステムの実施態様を例として説明する。
図3は、制御可能な細胞環境310での細胞増殖をリアルタイムでモニタリングするためのオンライン検出サブシステム320、測定値をリアルタイムで処理するためのオンライン データ処理機構330、および細胞増殖の状態を制御するための制御機構340（その制御はリアルタイムの測定値に呼応してなしうる）を備えた細胞増殖システム300の一態様を図示する。細胞環境310は、各種の制御可能または変更可能な配置で導入することができ、その例としては、発酵槽、バイオリアクター、細胞培養フラスコ、および細胞培養プレート等があるが、これに限定されない。検出サブシステム320には、測定用の細胞環境310に連結された1つまたは複数の検出装置が含まれうる。検出サブシステム320における検出装置の例には、培養下の細胞の特性を測定するための検出装置（光学濃度測定値を根拠とした生物量モニター等）、細胞環境の検出装置（OUR、CER、およびRQの測定用の質量分析計等）、ならびに代謝生成物の特性の測定用の検出装置（オンライン バイオアナライザー等）があるが、これに限定されない。
【００７３】
オンライン データ処理機構330には、一般に、適切な情報源から適切な遺伝情報および生化学的情報を取り出し、MFA計算を実行し、MFA結果をグラフまたはテキスト表示で提示するようにプログラムされたコンピュータが含まれる。コンピュータは、リアルタイムの測定値を受取るために、検出サブシステム320にある装置との電子的なインタフェースがとられる。こうした電子インタフェースには、測定値をコンピュータ読み取り可能なデジタルデータに変換するアナログ・デジタル変換器（ADC）が含まれる。こうしたADCは、検出装置の信号出力機構または検出サブシステム320に組込むか、コンピュータと検出サブシステム320との間に接続される別個の装置とすることもできる。コンピュータは、各種の目的の細胞についての一定の遺伝情報および生化学的情報、ならびにMFAプロセスに必要なその他のデータを取り出すために、他の外部電子情報源350にリンクすることもできる。電子情報源350の例としては、電子記憶装置、別のコンピュータまたはサーバー、ローカルエリアネットワークやワイドエリアネットワークやインターネット等のコンピュータ ネットワークがあるが、これに限定されない。
【００７４】
制御機構340では、細胞培養条件（温度等）を変更、または細胞環境310の物質（pH値等）を変更するための、細胞環境310への入力が提供される。入力は、システム アナライザー330により生成されたリアルタイムの細胞代謝フラックス分布（MFD）に呼応して変更できる。制御は、操作者が行うか、または電子的およびその他の自動制御機構により自動的に行うことができる。図4は、図3に示したシステム300を使用することにより達成しうる一例示的細胞エンジニアリングプロセスを示す。
図5に、部分的に図3に示したシステム300に基く細胞増殖およびエンジニアリング システム500の一つのインプリメンテーションを図示する。ここで、細胞改変サブシステム540は、発酵槽やバイオリアクター等の制御可能な細胞環境510における培養下でのリアルタイムでの細胞の測定に従い、細胞を改変または操作するために使用される。このシステムにおいて、検出サブシステム520には、MFA計算のためにシステム コンピュータ530にそれぞれ接続された、質量分析計、生物量モニター、およびオンライン バイオアナライザーを含めて図示している。発酵槽またはバイオリアクター510のコントローラ540は、細胞改変サブシステム540およびシステム コンピュータ530からの入力制御信号を受取るように接続されている。MFA計算に基くコントローラ540への制御信号は、コンピュータ利用のインテリジェンスを経由して、または操作者によって、コントローラ540に自動的に供給することができる。また、システム コンピュータ530からのMFA結果は、細胞を改変する目的で、電子インターフェースを経由して、または操作者によって、細胞改変サブシステムに送信することもできる。
図6は、図5のシステム500に使用しうる細胞改変サブシステムの一例を示す。図7は、図5のシステム500で実施しうる動作を示す。
【００７５】
これ以降の部分において、この発明の様々な面、特徴、インプリメンテーションについて説明する。
本発明の一面において、変更された表現型の原因となるある核酸（または、特定の核酸）が同定され、再び単離され、（確率論的または非確率論的に）再び改変され、細胞に再び挿入され、リアルタイム代謝フラックス分析プロセスが反復して実施される。この処理プロセスは、希望の表現型が作り出されるまで、反復して実施しうる。例えば、植物細胞および植物細胞培養には、例えば、成長力、栄養価、昆虫や干ばつへの耐性の強化、またはそれらの特性の全てか一部等、所望の新しい表現型を有する新しい植物細胞が作られるまで、この発明の方法が反復繰り返しされる。病原微生物には、病原性がなくなるまで、この発明の方法が反復繰り返しされうる。微生物を、ある昆虫等、他の生物体に対して致命的なものとなるように、または、各種の抗生物質またはその他の成分を生成するように操作することができる。微生物には、望ましい生成物の生成の増加、望ましくない共同代謝物(co-metabolite)の除去、廉価な炭素・窒素源の利用改善、発酵槽/バイオリアクターの培養条件への適応、一次代謝産物の生成の増加、二次代謝産物の生成の増加、酸性の状態に対する耐性の増大、塩基性の状態に対する耐性の増大、有機溶剤に対する耐性の増大、高塩分状態に対する耐性の増大および、高温または低温に対する耐性の増大などを操作するために、この発明の方法が反復繰り返しされうる。
【００７６】
細胞に生合成経路全体を挿入することができる。この発明の方法を利用して、非限定的に、細胞の任意の表現型を変更したり、任意の表現型を細胞に追加することができる。この発明は、代謝系路の挿入やスクリーニングのその他の方法と組合わせて実施することができるが、これについては、多量体タンパク質の組み合わせ代謝ライブラリの生成およびスクリーニングについて記載した米国特許第6,268,140号、あるいは、ポリケチド合成酵素をコードし、次に各種のポリケチドの生成の触媒作用を及ぼすベクターについて記載した米国特許第5,712,146号を参照のこと。
【００７７】
定義
他に定義していない限り、本書で使用した全ての技術的・科学的用語は、この発明の属する技術分野の熟練者により共通して理解される意味を有する。ここで使用されているように、以下の用語には、他で指定されていない限り、それに与えられた意味を有する。
本明細書において「アレイ」もしくは「マイクロアレイ」または「バイオチップ」もしくは「チップ」という用語は、複数の標的の要素のことで、標的の各要素には、基質表面の定義された領域に固定化されている定義された量の1つまたは複数のポリペプチドまたは核酸が含まれ、下記にさらに詳細に記載するとおりである。
本明細書において、「コンピュータ」および「プロセッサ」という用語は、その最も広範な一般的な状況において使用され、下記に詳細に記載する全ての装置が含まれる。
【００７８】
「飽和変異誘発」または「GSSM」という用語には、点突然変異をポリヌクレオチドに導入するための縮重オリゴヌクレチド プライマーを使用した方法が含まれ、下記に詳細に記載するとおりである。
「最適化された定方向進化システム」または「最適化された定方向進化」という用語には、関連性のある核酸配列の断片（関連性のある遺伝子等）を再構成するための方法も含まれ、下記に詳細に説明するとおりである。
「合成連結再構成」または「SLR」という用語には、オリゴヌクレオチド断片を非確率論的な方法で連結する方法が含まれ、下記に詳細に説明するとおりである。
「抗体」という用語には、抗原またはエピトープ（抗原決定基）を特異的に結合する能力のある免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子もしくはその断片に由来する、それをモデルにした、またはそれにより実質的にコードされたペプチドまたはポリペプチドが含まれる。Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, 編纂, Raven Press, N.Y.（1993年）、Wilson（1994年）J. Immunol. Methods 175:267-73、Yarmush（1992年）J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97等を参照。抗体という用語には、抗原結合部分、つまり、抗原を結合する能力を保有する「抗原結合部位」、（断片、部分列、補完性決定領域（complementarity determining regions, CDR）等）が含まれ、これには、（i）VL、VH、CLおよびCH1領域からなる一価の断片であるFab断片、（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によりリンクされた2個のFab断片を含む二価の断片であるF(ab')2断片、（iii）VHおよびCH1領域を含むFd断片、（iv）抗体の単一腕のVLおよびVH領域からなるFv断片、（v）VH領域から成るdAb断片（Ward et al.,（1989年）Nature 341:544-546）、ならびに（vi）単離した補完性決定領域（CDR）等がある。また、単鎖抗体も、「抗体」という用語に含まれる。
【００７９】
制御可能な細胞環境における増殖のための「細胞」または「細胞培養」という用語は、その最も広範な意味で使用され、全ての自己複製生体系がこれに含まれ、これには、プラスミド、プリオン、ファージ、ウイルス粒子（DNAおよびRNAウイルス等）、その他がある。この用語には、全ての細胞が含まれ、これには、細菌の細胞、昆虫の細胞、植物細胞、酵母菌および哺乳類の細胞等、全ての原核細胞、真核細胞、古細菌細胞がある。この発明の方法および構成（システム、プログラム等）は、これらのあらゆる自己複製生体系について、MFA、および最適な培養条件をリアルタイムで決定するために使用できる。
【００８０】
核酸の生成および操作
本発明の方法には、異種核酸の細胞への付加、または細胞内での同種遺伝子の改変による、細胞の遺伝子構成の改変が含まれる。核酸には、細胞から単離したもの、組換的に生成したもの、合成により作製したもの等が含まれうる。配列は、cDNAライブラリのクローン化や発現、メッセージの増幅、またはPCRによるゲノムDNA、その他などにより単離されうる。本発明の方法の実施において、同種遺伝子は、本明細書に説明するとおり、鋳型核酸の操作により改変できる。この発明は、この技術分野で知られる任意の方法またはプロトコルまたは装置と組み合わせて実施でき、これらについては科学文献や特許文献に詳しく説明されている。
【００８１】
一般的技法
この発明を実施するために使用される核酸は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルスまたはその混成体のいずれであるかによらず、多様な原料から単離したもの、遺伝子操作したもの、増幅したもの、および発現／組換的に生成したもの、またはそのいずれかとしうる。これらの核酸から生成した組換ポリペプチドは、単離またはクローン化し、希望の活性について試験することができる。細菌性、哺乳類、酵母、昆虫または植物細胞の発現システム等を含め、任意の組換体の発現システムが使用できる。
別の方法として、これらの核酸は、例えば、Adams（1983年）J. Am. Chem. Soc. 105:661、Belousov（1997年）Nucleic Acids Res. 25:3440-3444、Frenkel（1995年）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380、Blommers（1994年）Biochemistry 33:7886-7896、Narang（1979年）Meth. Enzymol. 68:90、Brown（1979年）Meth. Enzymol. 68:109、Beaucage（1981年）Tetra. Lett. 22:1859、米国特許第4,458,066号等に記載されている、よく知られた化学合成技法により生体外で合成できる。
例えば、サブクローニング、標識化プローブ（Klenowポリメラーゼ使用の無作為なプライマー標識化、ニックトランスレーション、増幅等）、配列決定、ハイブリダイゼーション、その他などの核酸の操作の技法については、科学文献や特許文献に詳しい説明がある。Sambrook, 編纂, Molecular Cloning: a Laboratory Manual（第2版）、Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory,（1989年）、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 編纂John Wiley & Sons, Inc., New York（1997年）、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, 編纂Elsevier, N.Y.（1993年）等を参照。
【００８２】
核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチド、その他は、この技術分野の熟練者によく知られた多数の一般的手段のうち任意の手段により、分析および定量化ができる。これには、NMR等の分析的生化学的方法、分光測光法、X線撮影、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、および高拡散クロマトグラフィーのほか、流体またはゲル沈降反応、免疫拡散法、免疫電気泳動法、放射免疫アッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）、免疫蛍光試験法、サザン分析、ノーザン分析、ドット ブロット分析、ゲル電気泳動（SDS-PAGE等）、核酸・標的・信号の増幅方法、放射標識、シンチレーション計数、およびアフィニティー クロマトグラフィー等の各種免疫学的な方法等がある。
この発明の方法を実施するために使用される核酸を獲得・操作する別の有用な手段は、ゲノムサンプルからクローニングを行い、所望であれば、例えばゲノムのクローンやcDNAクローンから単離または増幅した挿入物のスクリーニングおよび再クローニングを行う方法である。この発明の方法で使用されている核酸の原料には、例えば、哺乳類人工染色体（MAC）（米国特許第5,721,118号、第6,025,155号等を参照）、ヒト人工染色体（Rosenfeld（1997年）Nat. Genet. 15:333-335等を参照）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、P1人工染色体（Woon（1998年）Genomics 50:306-316等を参照）、P1由来のベクター（PAC）（Kern（1997年）Biotechniques 23:120-124等を参照）のほか、コスミド、組換体ウイルス、ファージまたはプラスミド等に含まれているゲノム ライブラリまたはcDNAライブラリ等がある。
【００８３】
核酸の増幅
この発明の方法の実施において、異種もしくは同種の、または改変核酸をコードする核酸は、増幅等による複製ができる。また、増幅反応は、サンプル内の核酸の量（細胞サンプル内のメッセージの量等）の定量化、核酸の標識化（アレイやブロットに適用するためなど）、核酸の検出、またはサンプル内にある特定の核酸の量の定量化等にも使用できる。この発明の一面において、細胞またはcDNAライブラリから単離したメッセージの増幅ができる。熟練者であれば、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーの選択・設計ができる。また、増幅方法は、この技術分野でよく知られており、これには、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, 編纂 Innis, Academic Press, N.Y.（1990年）およびPCR STRATEGIES（1995年）、編纂Innis, Academic Press, Inc., N.Y.等を参照）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（Wu（1989年）Genomics 4:560、Landegren（1988年）Science 241:1077、Barringer（1990年）遺伝子 89:117等を参照）、転写増幅（Kwoh（1989年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173等を参照）のほか、自律的配列複製（Guatelli（1990年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874等を参照）、Qβレプリカーゼ増幅（Smith（1997年）J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491等を参照）、自動Q-βレプリカーゼ増幅試験法（Burg（1996年）Mol. Cell. Probes 10:257-271等を参照）、またその他のRNAポリメラーゼを仲介とする方法（NASBA、Cangene、Mississauga、Ontario等）、さらに、Berger（1987年）Methods Enzymol. 152:307-316、Sambrook、Ausubel、米国特許第4,683,195号および第4,683,202号、Sooknanan（1995年）Biotechnology 13:563-564等も参照。
【００８４】
核酸の改変
本発明の方法の実施において、細胞の遺伝子構成は、例えば、ex vivoで同種遺伝子を改変した後、それを細胞へ再挿入する等の方法により改変される。同種遺伝子、異種遺伝子、またはこの発明の方法により選択された遺伝子は、どんな手段でも改変でき、例えば、無作為つまり確率論的方法、または非確率論的、つまり「定方向進化」によって改変できる。
遺伝子へのランダム変異導入の方法は、この技術分野でよく知られているが、これについては、米国特許第5,830,696号等を参照。例えば、突然変異原を使用して、遺伝子を無作為に突然変異させることができる。突然変異原には、例えば、紫外線またはガンマ線照射、またはマイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレン等の化学的突然変異誘発要因（単独または組合せで）があり、組換による修復を受けることになるDNAの切断を誘発する。その他の化学的突然変異誘発要因には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、またはギ酸等がある。その他の突然変異原は、ヌクレオチド前駆物質の類似化合物であり、これには、例えば、ニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、またはアクリジン等がある。これらの物質を、ヌクレオチド前駆物質の代わりにPCR反応に添加することができ、それにより、配列が突然変異を起こす。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリン、その他の挿入剤を使用することもできる。
【００８５】
分子生物学における技法も使用することができ、例えば、ランダムPCR突然変異誘発（Rice（1992年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471等を参照）や、コンビナトリアルマルチカセット突然変異生成（Crameri（1995年）Biotechniques 18:194-196等を参照）である。別の方法として、遺伝子等の核酸は、無作為な、つまり「確率論的な」断片化の後で再構成させることができ、これについては、米国特許第6,291,242号、第6,287,862号、第6,287,861号、第5,955,358号、第5,830,721号、第5,824,514号、第5,811,238号、第5,605,793号等を参照。
【００８６】
非確率論的、つまり「定方向進化」による方法には、飽和変異誘発（GSSM）、合成連結再構成（SLR）、またはその組合せ等がある。本発明の一面において、核酸は、リアルタイム代謝フラックス分析を利用して、新しいまたは改変された表現型を細胞に授けるために選択され、単離、組換、細胞への再挿入がなされ、この発明の方法の工程を繰り返す。単離および/または組換をした核酸によりコードされるポリペプチドは、キャピラリーアレイ プラットホームを使用するなどにより、細胞への再挿入の前に、ある活性についてスクリーニングができる。米国特許第6,280,926号、第5,939,250号等を参照。
【００８７】
飽和変異誘発（別称、GSSM）
この発明の一面において、「定方向進化過程」である非確率的遺伝子改変を、細胞に挿入する遺伝子を改変して表現型を追加または変更するために使用することができる。この方法を変形したものは、「遺伝子部位飽和型変異誘発」、「部位飽和型変異誘発」、「飽和変異誘発」または単に「GSSM」などと呼ばれてきた。これは、その他の突然変異誘発過程と組合わせて使用することができる。米国特許第6,171,820号、第6,238,884号等を参照。一面において、GSSMには、鋳型ポリヌクレオチドおよび複数のオリゴヌクレオチドを用意することが含まれるが、ここにおいて、各オリゴヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドに対して相同的な配列（それにより、鋳型ポリヌクレオチドの特定の配列を標的化する）、および同種遺伝子の変異体である配列を含み、鋳型ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに置換されることで非確率的配列変異体を含む子孫ポリヌクレオチドが生成され、それにより、同種遺伝子配列変異体を含むポリヌクレオチドが生成される。
【００８８】
一面において、縮重N,N,G/T配列を含むコドンプライマーは、改変の標的となる酵素活性部位のアミノ酸残基やリガンド結合部位といった各アミノ酸位置において全範囲の単一アミノ酸置換が生成される子孫ポリペプチドが生成されるように、ポリヌクレオチドに点突然変異を導入するために使用される。これらのオリゴヌクレオチドには、隣接する第1の相同的な配列、縮重N,N,G/T配列、さらに任意選択的に第2の相同的な配列が含まれうる。そうしたオリゴヌクレオチドを使用することに起因する下流の子孫翻訳生成物には、ポリペプチドに沿った各アミノ酸部位で考えられるあらゆるアミノ酸の改変が含まれるが、これは、N,N,G/T配列の縮重には、全20種のアミノ酸についてのコドンが含まれるためである。
N,N,G/Tカセットは、この発明での例証の目的で（限定的なものではなく）使用されており、よって、さらにN,N,G/Tカセットのほかに、所定のコドン位置に全20種の酸をすべて導入する目的で、32倍縮重N,N,G/Cカセットまたは48倍縮重N,N,C/G/Tや48倍縮重N,N,A,C/Gカセットなど、その他のカセットを使用しうることが理解され、また、この発明では、この発明の別の面で、N,N,G/Tの代わりに、これらのカセットを使用しうることを特に規定している。そのうえ、この発明では、全ての縮重カセットおよび非縮重カセットを、ポリヌクレオチド配列の改変に使用しうる（コード領域または非コード領域のいずれでも）と規定している。例えば、コード領域の場合には、コードされるアミノ酸へのコドンの割合は、1:1でも、1:1を超えてもよい。こうして、コドンの縮重：コードアミノ酸の数の比がちょうど1:1の場合には、コドン位置に対して考えられる全19個の改変を導入するために、19倍縮重カセットを使用しうる。
【００８９】
一面において、このような縮重オリゴヌクレチド（1つの縮重N,N,G/Tカセットからなるものなど）の一つは、親ポリヌクレオチド鋳型にあるそれぞれの元のコドンを全範囲のコドン置換の対象とするために使用される。別の面で、親ポリヌクレオチド鋳型にある少なくとも2つの元のコドンを全部範囲のコドン置換の対象とするために少なくとも2つの縮重カセット（同一のオリゴヌクレオチド中またはそうでない）が使用される。例えば、1つ以上のN,N,G/T配列を1つのオリゴヌクレオチドに含めて、アミノ酸突然変異を1つ以上の部位に導入することができる。この複数個のN,N,G/T配列は、直接的に隣接するか、または別個の、1つまたは複数の追加ヌクレオチド配列としうる。別の面で、付加および欠失の導入に役立つオリゴヌクレオチドは、単独で、またはN,N,G/T配列を含むコドンとの組合わせで使用して、任意の組合せまたは順列のアミノ酸 付加、欠失、および置換（あるいはそのいずれか）を導入できる。
【００９０】
一面において、2つ以上の隣接アミノ酸位置の同時突然変異誘発は、隣接するN,N,G/Tトリプレット、つまり縮重(N,N,G/T)n配列を含むオリゴヌクレオチドを使用して実施することができる。別の面で、N,N,G/T配列よりも縮重度の小さい縮重カセットが使用できる。例えば、一部の例（オリゴヌクレオチドにおいてなど）では、唯一のNを含む縮重トリプレット配列を使用することが望ましいこともあり、ここでこのNは、トリプレットの第1、第2または第3のどの位置でもよい。その任意の組合せおよび順列を含むその他の任意の塩基をトリプレットの残りの2つの位置に使用することができる。別の方法として、一部の例（オリゴにおいてなど）では、縮重N,N,Nトリプレット配列が望ましいこともある。
一面において、縮重トリプレット（N,N,G/Tトリプレットなど）の使用によって、考えられる全部の天然アミノ酸（合計20種のアミノ酸について）を、ポリペプチドにある各アミノ酸位置に、体系的かつ簡単に生成することができるようになる。（別の面で、この方法には、アミノ酸残基の、つまりコドンの位置について考えられる全ての置換よりも生成数が少ない場合も含まれる）。例えば、100個のアミノ酸ポリペプチドについて、識別性のある2000種（つまり、位置ごとに考えられる20種のアミノ酸×100個のアミノ酸位置）が生成できる。縮重N,N,G/Tトリプレットを含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの構成を使用することにより、32個の別個の配列を考えられる全20種の天然アミノ酸をコードできる。こうして、その内部で親ポリヌクレオチド配列が少なくとも1つのこうしたオリゴヌクレオチドを使用した飽和変異誘発の対象となる反応槽において、20種の識別性のあるポリペプチドをコードする32個の識別性のある子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、部位特異的変異誘発において非縮重オリゴヌクレオチドを使用することで、反応容器あたり唯一の子孫ポリペプチドの生成につながる。非縮重オリゴヌクレオチドを、開示した縮重プライマーとの組合せで任意選択的に使用できる。例えば、非縮重オリゴヌクレオチドを使用して、機能しているポリヌクレオチドにおいて特異的な点突然変異を生成することができる。これによって、特異的なサイレント点突然変異、対応するアミノ酸の変化につながる点突然変異、終止コドン生成や、対応するポリペプチド断片の発現の原因となる点突然変異などを生成する一手段が提供される。
【００９１】
一面において、各飽和変異誘発反応容器には、全20種の天然アミノ酸が親ポリヌクレオチドにおいて突然変異を起こさせるコドン位置に対応した特定の1つのアミノ酸位置に提示されるように、少なくとも20個の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドが含まれる（他の面では、全20種の天然の組合せより少ないものを使用）。各飽和変異誘発反応容器で生成された32倍縮重子孫ポリペプチドは、クローン増幅（例えば、発現ベクター等を使用した大腸菌宿主等の適切な宿主へのクローン化）の対象となり、また発現スクリーニングの対象としうる。スクリーニングによって、（親ポリペプチドと比較したとき）個別の子孫ポリペプチドが好ましい特性の変化（例えば、抗原に対する親和性や結合活性の増加）を示すことが明らかにされた場合、それに含まれる好ましい対応したアミノ酸置換を識別するために配列決定することができる。
【００９２】
一面において、本書で開示した飽和変異誘発を用いて、親ポリペプチドにおいて各々のアミノ酸位置が突然変異誘発されると、好ましいアミノ酸の変化は、1つ以上のアミノ酸位置で同定されることもある。これらの好ましいアミノ酸置換の全部または一部の組合せを含む1つまたは複数の新しい子孫分子を生成することもできる。例えば、ポリペプチドの3つのアミノ酸位置で、それぞれ2つの特定の好ましいアミノ酸の変化が明らかにされると、順列には、各位置について3通りの可能性（原型アミノ酸への変化なしもの、および好ましい変化のあるもの2通り）があり、また3つの位置がある。こうして、3x3x3、つまり合計27通りの可能性があるが、7つはこれまでに検査済みである―単一点突然変異6通り（つまり3位置それぞれについて2通り）およびどの位置にも改変のないものもこれに含まれる。
別の面で、部位飽和型変異誘発は、配列を変化させるために、合成連結再構成（下記参照）、シャフリング、キメラ化、改変およびその他の突然変異誘発過程や突然変異誘発剤など、別の確率論的または非確率論的な手段と共に使用することができる。この発明では、反復的な方法での、飽和変異誘発を含む任意の突然変異誘発過程の使用が規定されている。
【００９３】
合成連結再構成（SLR）
細胞に挿入される遺伝子を改変して、表現型を追加または改変するために、本発明の方法で使用可能な「定方向進化過程」である別の非確率的遺伝子改変は、「合成連結再構成」（「synthetic ligation reassembly」）、または単に「SLR」と呼ばれてきた。SLRは、オリゴヌクレオチド断片をまとめて非確率論的に連結する方法である。この方法は、核酸基本構築単位がランダムに混合（シャフリング）、鎖状連結、またはキメラ化されない点で確率論的なオリゴヌクレオチド シャフリングとは異なり、むしろ非確率論的に構成される。1999年6月14日出願の「定方向進化における合成連結再構成（Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution）」という名称の米国特許出願(USSN)第09/332,835号等を参照（「USSN 09/332,835」とする）。一面において、SLRは以下の工程を含む。すなわち、（a）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記鋳型ポリヌクレオチドは、同種遺伝子をコードする配列を含む。（b）複数の基本構築単位ポリヌクレオチドを提供する工程であって、前記基本構築単位ポリヌクレオチドは、所定の配列で鋳型ポリヌクレオチドと交差再構成するよう設計され、また前記基本構築単位ポリヌクレオチドは、同種遺伝子の変異体である配列と、変異体配列に隣接する（側方に位置する）鋳型ポリヌクレオチドに対して相同的な配列を含む。（c）基本構築単位ポリヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドと交差再構成して、同種遺伝子配列変異体を含むポリヌクレオチドが生成されるように、基本構築単位ポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドと組合わせる工程。
【００９４】
SLRは、再編成されるポリヌクレオチド間に高いレベルの相同性かあるかどうかには依存しない。こうして、この方法は、10100個を超える異なるキメラを含む子孫分子のライブラリ（または構成）を非確率論的に生成するために使用できる。SLRは、101000個を超える異なる子孫キメラを含むライブラリの生成に使用できる。こうして、本発明の各面には、設計により選択された全体的な構成順序を削り取る、完成したキメラ核酸分子の構成を生成する非確率的方法が含まれる。この方法には、互換性のある有用な連結可能な末端を有し、設計された全体的な構成順序が実現されるように、これらの核酸基本構築単位を構成させる、複数の特異的な核酸基本構築単位を設計により生成する工程が含まれる。
【００９５】
構成される核酸基本構築単位の互換性のある連結可能な末端は、それらが、基本構築単位を所定の順序で結合させうる場合に、この順序だったタイプの構成にとって「有用」であると考えられる。こうして、核酸基本構築単位を結合しうる全体的な構成順序は、連結可能な末端の設計により指定される。2つ以上の構成工程が使用される場合にも、核酸基本構築単位を結合しうる全体的な構成順序は、構成工程の連続的な順序により指定することができる。一面において、アニーリングを施した組立部品は、リガーゼ（T4 DNAリガーゼ等）などの酵素で処理し、基本構築単位の共有結合が実現される。
一面において、オリゴヌクレオチド基本構築単位の設計は、完成したキメラ ポリヌクレオチド分子の子孫構成を生成する基礎としての役目を果す前駆核酸配列の鋳型の構成を分析して獲得できる。これらの親オリゴヌクレオチド鋳型は、こうして突然変異を起こさせる核酸基本構築単位の設計に役立つ配列情報源としての役目を果す。キメラ化や混合等の突然変異を起こさせる核酸基本構築単位の設計に役立つ。
【００９６】
この方法の一面において、複数の親の核酸鋳型の配列は、1つまたは複数の境界点を選択するためにアラインメントされる。境界点は、相同性のある領域に位置することが考えられ、また1つまたは複数のヌクレオチドが含まれる。これらの境界点は、少なくとも2つの前駆体の鋳型が共有していることが好ましい。それにより、境界点を、親ポリヌクレオチドを再編成する目的で、生成されるオリゴヌクレオチド基本構築単位の境界線を描くために使用できる。前駆分子において同定・選択された境界点は、最終的キメラ子孫分子の構成において、潜在的なキメラ化の点としての役目を果す。境界点は、少なくとも2つの親ポリヌクレオチド配列が共有している相同性のある領域（少なくとも1つの相同ヌクレオチド塩基を含む）としうる。別の方法として、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも半数が共有している相同性のある領域とすることも、また、少なくとも3分の2の親ポリヌクレオチド配列が共有している相同性のある領域とすることもできる。有用な境界点は、少なくとも4分の3の親ポリヌクレオチド配列が共有するか、または、ほぼ全ての親ポリヌクレオチド配列が共有しうる相同性のある領域であることがさらに好ましい。一面において、境界点は、全ての親ポリヌクレオチド配列が共有する相同性のある領域である。
【００９７】
一面において、連結再構成過程は、子孫キメラ ポリヌクレオチドの網羅的なライブラリを生成する目的で、徹底的に実施される。言い換えれば、核酸基本構築単位の考えられる全ての順序のある組合せは、完成したキメラ核酸分子の構成で表現される。同時に、別の態様では、各組合せにおける構成順序（つまり、それぞれについて完成した各キメラ核酸の5'から3の配列での各基本構築単位の構成順序）は、上述のとおり（非確率論的な）設計によるものである。この発明は、本質的に非確率論的なものであるため、望ましくない副産物の可能性は、大幅に低減される。
別の面で、連結再構成法は、体系的に実施される。例えば、この方法は、体系的に（一区画ごとなど）スクリーニングの可能な区画のある、系統的に区画化された子孫分子ライブラリを生成するために実施できる。言い換えれば、この発明では、特定の核酸基本構築単位の選択的かつ賢明な使用と、連続的な階段状の構成反応の選択的かつ賢明な使用との組合せによって、設計が実現でき、そこにおいて複数ある各反応槽において特定の子孫生成物の構成が生成されるとしている。これによって、系統的な試験およびスクリーニング手続きの実施が可能となる。こうして、これらの方法により、少数の組で体系的に検査される潜在的な非常に多数の子孫分子が可能となる。
【００９８】
非常に柔軟性がありながらも、同時に徹底的かつ体系的な方法によりキメラ化を実施する能力があるために、特に、前駆分子内での相同性のレベルが低い時に、これらの方法は、多数の子孫分子を含むライブラリ（またはそのセット）の生成を提供する。この即時連結反応再構成の発明は、本質的に非確率論的であることから、生成される子孫分子には、設計により選択された全体的な構成順序を有する完成したキメラ核酸分子のライブラリが含まれることが好ましい。
飽和変異誘発および最適化された定方向進化の方法も、異なる子孫分子種のこれらの量の生成に使用できる。
この発明では、境界点の選択、核酸基本構築単位の規模および数、ならびに共役の規模および設計に関しては、選択・制御の自由が提供されていることが理解される。さらに、分子間相同性の要件は、この発明の実施可能性については、かなり緩和されていることが理解される。事実、境界点は、ほとんど、または全く分子間相同性のない領域に選択することさえもできる。例えば、コドン、つまりコドンの縮重にはゆらぎがあるため、本来対応する前駆鋳型にコードされているアミノ酸を変化させることなく、ヌクレオチド置換を核酸基本構築単位に導入することができる。別の方法として、コドンを、変化させて、本来のアミノ酸についてのコードを変化させることもできる。この発明では、分子間の相同的な境界点の発生率を増大させる目的で、こうした置換を核酸基本構築単位に導入しうるとしており、こうして、基本構築単位内に実現される共役の数の増加が可能となり、また、より多くの数の子孫キメラ分子の生成も可能となる。
【００９９】
別の面で、基本構築単位が生成される工程は、本質的に合成的であることから、後から、生体外プロセス（突然変異誘発など）またはin vivoプロセス（宿主生物体のもつ遺伝子スプライシング能力の利用など）での任意選択的な除去が可能なヌクレオチド（コドンやインロロン等の1つまたは複数のヌクレオチド、または制御配列）の設計および導入が可能となる。多くの例においても、これらのヌクレオチドを導入することは、有用な境界点を作り出すという潜在的な利点に加え、数多くの理由から好ましい。
こうして、別の面によれば、核酸基本構築単位は、イントロンの導入にも使用できる。こうして、機能性イントロンを、本書で説明した方法に従い製造した人工遺伝子に導入することもできる。人工的に導入されたイントロンは、天然に発生するイントロンが遺伝子スプライシングにおいて機能的に役割を果たすのとかなり同じ方法で、遺伝子スプライシングについて宿主細胞において機能的でありうる。
【０１００】
最適化された定方向進化システム
この発明の方法の実施において、最適化された定方向進化システムを含む方法により、核酸を改変することができる。最適化された定方向進化は、改変による核酸の定方向の分子進化を可能にするための還元的再構成、改変および選択の繰り返しサイクルの使用が指示される。最適化された定方向進化により、大規模な集団の進化したキメラ配列の生成が可能となり、ここにおいて、生成された集団は、予め定めた数の交差事象を有する配列をきわめて豊富に含むものである。
交差事象は、ある親変異体から別の親変異体へ配列のシフトが生じる、キメラ配列内の一つの点である。このような点は、通常、2つの親からのオリゴヌクレオチドが連結され単一の配列を形成する接続部である。この方法によって、オリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算が可能となり、最終的なキメラ配列の集団には、選択した数の交差事象が豊富となる。これにより、予め定めた数の交差事象を有するキメラ変異体の選択に対して、より適切な制御なされるようになる。
さらに、この方法は、他のシステムと比較して、莫大な量の考えられるタンパク質変異体の空間を調査するための便利な手段を提供している。例えば、前もって、反応中に1013個のキメラ分子を生成した場合には、そうした多数のキメラ変異体を特定の活性について試験することは極端に困難となる。その上、子孫集団のかなりの部分は、非常に多数の交差事象があることになり、これにより、特定の活性のレベルを高める可能性のあまりないタンパク質ができる。これらの方法を使用して、キメラ分子の集団を、特定数の交差事象を有する変異体に対して濃縮することができる。こうして、なおも反応中に1013個のキメラ分子を生成できるが、さらに分析するために選んだ各分子は、例えば3つの交差事象だけなどを有する可能性が最も高くなる。得られる子孫集団は、所定数の交差事象を有するように偏向させることができるため、キメラ分子間の機能的な変種の境界は低減される。これにより、本来の親ポリヌクレオチドからのどのオリゴヌクレオチドが特定の特性への影響を引き起こしうるかを計算する、より管理可能な数の変数が提供される。
【０１０１】
キメラ子孫ポリヌクレオチド配列を生成するための1つの方法は、各々の親配列の断片または部分に対応するオリゴヌクレオチドを生成することである。各オリゴヌクレオチドには、固有の重複領域があることが好ましく、オリゴヌクレオチドをまとめて混合することで、その結果、それぞれのオリゴヌクレオチド断片が正しい順序で構成した新しい変異体ができるようになる。また、追加情報は、USSN 09/332,835に求めることができる。各々の親変異体について生成されるオリゴヌクレオチドの数は、最終的に生成されるキメラ分子にある結果的な交差の総数との関係に影響する。例えば、3つの親のヌクレオチド配列の変異体は、例えば高温での活性が増大するキメラ変異体を探す目的で、連結反応が起こるようにすることもできる。一例として、50個のオリゴヌクレオチド配列のセットを、各々の親変異体の各部分に対応して生成することもできる。したがって、連結再構成過程中に、各キメラ配列内に最高50個の交差事象がありうる。生成された各々のキメラ ポリヌクレオチドが、各々の親変異体からの別の順序でのオリゴヌクレオチドを有する確率は、非常に低い。同一モル量での連結反応に、各オリゴヌクレオチド断片が存在する場合、一部の位置において、同一の親のポリヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドは、隣接して連結される可能性が高く、こうして交差事象は起こらない。各々の親からの各オリゴヌクレオチドの濃度が、この例での任意の連結工程中に一定に保たれる場合は、同一の親変異体からのオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で連結し、交差を生成しない確率は、1/3（3つの親と仮定）である。
【０１０２】
したがって、親変異体の構成数、各変異体に対応するオリゴヌクレオチドの数、および連結反応の各工程における各変異体の濃度が定められると、連結反応の各工程において発生する可能性の高い交差事象の構成を予測する確率密度関数（PDF）を決定することができる。PDF決定の背景となる統計学および数学については、下記に説明する。これらの方法を利用することで、その確率密度関数を計算でき、こうしてキメラ子孫個体群に、特定の連結反応から得られる予め定めた数の交差事象が豊富に含まれるようにすることができる。その上、交差事象の目標数を予め定めることができ、次に、連結反応の各段階における各親のオリゴヌクレオチドの開始時の数量が計算されるようにシステムをプログラムすることができ、その結果、予め定めた数の交差事象を中心とする確率密度関数が得られる。
これらの方法では、最適化された定方向進化は、改変によるポリペプチドをコードする核酸の定方向分子進化を可能にするための還元的再構成、改変および選択の繰り返しサイクルの使用が指示される。このシステムにより、大規模な進化したキメラ配列の構成の生成が可能となり、ここにおいて、生成された構成は、予め定めた数の交差事象を有する配列をかなり豊富に含むものである。交差事象は、ある親変異体から別の親変異体へ配列中のシフトが生じる、キメラ配列内の一つの点である。このような点は、通常、2つの親からのオリゴヌクレオチドが連結され単一の配列を形成する接続部である。この方法によって、オリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算が可能となり、最終的なキメラ配列の集団には、選択した数の交差事象が豊富となる。これにより、予め定めた数の交差事象を有するキメラ変異体の選択に対して、より適切な制御なされるようになる。
【０１０３】
さらに、この方法は、他のシステムと比較して、莫大な量の考えられるタンパク質変異体の空間を調査するための便利な手段が提供されている。本書で説明した方法を使用して、キメラ分子の集団を、特定数の交差事象を有する変異体の豊富なものとするができる。こうして、なおも反応中に1013個のキメラ分子を生成できるが、さらに分析するために選んだ各分子は、例えば3つの交差事象のみなどを有する可能性が最も高くなる。結果的な子孫集団は、予め定めた数の交差事象を持つように見せかけることができるため、キメラ分子間の機能的な変種の境界は減少する。これにより、本来の親ポリヌクレオチドからのどのオリゴヌクレオチドが特定の特性への影響を引き起こしうるかを計算する、より管理可能な数の変数が提供される。
一面において、この方法により、各々の親配列の断片または部分に対応するオリゴヌクレオチドが生成されることで、キメラ子孫ポリヌクレオチド配列が生成される。各オリゴヌクレオチドには、固有の重複領域があることが好ましく、オリゴヌクレオチドをまとめて混合することで、その結果、それぞれのオリゴヌクレオチド断片が正しい順序で構成した新しい変異体ができるようになる。また、USSN 09/332,835も参照。
【０１０４】
各々の親変異体について生成されるオリゴヌクレオチドの数は、最終的に生成されるキメラ分子にある、得られる交差の総数との関係に影響する。例えば、3つの親のヌクレオチド配列の変異体は、例えば高温での活性が増大するキメラ変異体を探す目的で、連結反応が起こるようにすることもできる。一例として、50個のオリゴヌクレオチド配列のセットを、各々の親変異体の各部分に対応して生成することができる。したがって、連結再構成過程中には、各キメラ配列内に最高50個の交差事象がありうる。生成された各々のキメラ ポリヌクレオチドが、各々の親変異体からの別の順序でのオリゴヌクレオチドを有する確率は非常に低い。同一モル量での連結反応に、各オリゴヌクレオチド断片が存在する場合、一部の位置において、同一の親のポリヌクレオチドからのオリゴヌクレオチドは、隣接して連結される可能性が高く、こうして交差事象は起こらない。各々の親からの各オリゴヌクレオチドの濃度が、この例での任意の連結工程中に一定に保たれる場合は、同一の親変異体からのオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で連結し、交差を生成しない確率は、1/3（3つの親と仮定）である。
【０１０５】
したがって、親変異体の構成数、各変異体に対応するオリゴヌクレオチドの数、および連結反応の各工程における各変異体の濃度が定めされると、連結反応の各工程において発生する可能性の高い交差事象の構成を予測する確率密度関数（PDF）を決定することができる。PDF決定の背景となる統計学および数学については、下記に説明する。そのような確率密度関数を計算することができ、こうしてキメラ子孫個体群について、特定の連結反応から得られる予め定めた数の交差事象が豊富に含まれるようにすることができる。その上、交差事象の目標数を、予め定めることができ、次に、連結反応の各段階における各親のオリゴヌクレオチドの開始時の数量が計算されるようにシステムをプログラムすることができ、その結果、予め定めた数の交差事象を中心とする確率密度関数が得られる。
【０１０６】
交差事象の決定
本発明の実施態様には、所望の交差確率密度関数（PDF）、再編成される親遺伝子の数、および入力としての再編成の断片数を受取るシステムおよびソフトウェアが含まれる。このプログラムの出力は、再編成された遺伝子を生成するための製法、およびそれらの遺伝子の予想交差PDFを決定するために使用可能な「断片PDF」である。本書で説明した処理は、技術計算用のプログラム言語および開発環境であるMATLABR（The Mathworks, Natick, Massachusetts）で実施できる。
【０１０７】
繰り返しプロセス
この発明の方法の実施において、この処理プロセスは、反復して実施しうる。例えば、改変表現型の原因となる核酸（メッセージ、遺伝子、オペロンおよび生合成経路の一部か全部、またはそのいずれか）が、同定され、再び単離され、再び改変され、細胞に再び挿入され、リアルタイム代謝フラックス分析プロセスが反復して実施される。この処理プロセスは、希望の表現型が作り出されるまで、反復繰り返しされうる。例えば、生化学経路全体を操作して細胞に組込むことができる。この発明の方法を利用して、非限定的に、細胞の任意の表現型を改変したり、任意の表現型を細胞に追加することができる。
核酸は、確率論的または非確率的方法のいずれでも改変が可能である。様々な面において、この方法により、キメラ核酸およびタンパク質分子の構成を生成し、その後で、細胞への挿入・培養の後、希望の表現型の変更または追加など特定の活性についてのリアルタイム代謝フラックス分析を使用したスクリーニングが行われる。この発明は、一回だけのスクリーニングには限定されない。この決定に基き、望ましい性質を持つか、希望の表現型を受ける子孫のために質を高める、2回目の再構成を起こすことができる。
同様に、特定のオリゴヌクレオチドに所望の特性（新しい表現型など）に対する影響が全くないと判断された場合には、除去される配列が含まれる大きな親オリゴヌクレオチドを合成することにより、変数としてのそのオリゴヌクレオチドは除去可能である。配列をより大きな配列内に組込むことにより、一切の交差事象が回避されるため、子孫ポリヌクレオチドには、この配列の変形は一切存在しなくなる。どのオリゴヌクレオチドが最も望ましい特性に関連し、どれが関連していないかを判断する、この反復による実施法によって、特定の特性または活性を与えている可能性のある、考えられる全てのタンパク質変異体を、より効率よく調査することができるようになる。
【０１０８】
反応の自動制御
この発明の方法の任意の反応を生じさせるプロセスは、自動化装置やロボット機器を用いて自動化しうる。例えば、一面において、Wedgewood Technology, Inc.製の細胞増殖モニター652型等の細胞増殖モニター装置を、リアルタイム代謝フラックス分析に使用することができる。下記に記すとおり、この装置はコンピュータ システムにリンクすることができる。別の例示的な装置は、Tecan Corporation（Hombrechtikon, Switzerland）製のTECAN GENESISTMプログラマブル ロボットで、各オリゴヌクレオチド断片の数量を決定し、結果PDFを作成するコンピュータとのインタフェースをとることができる。自動化されたロボットに対する各オリゴヌクレオチドの適切な量を判断するコンピュータ システムをリンクすることで、完全な連結再編成システムができあがる。シリアルインタフェースやその他のインターフェイスによるデータ リンクによって、連結再編成の計算により生成されたデータ ファイルが、ロボット システム用に適切な形式で転送され、反応管への各オリゴヌクレオチド断片の適切な量の配分が自動的に開始される。
【０１０９】
自動システムには、一連の核酸配列変異体に由来する多数のオリゴヌクレオチド断片を含めることができ、ここにおいて、この断片は、固有のオーバーハングにおいて相互に結合するように構成されている。また、システムには、各変異体配列について目標数の交差事象を蓄えるように設定されたデータ入力フィールドもある。システム内には、断片を混合することにより、目標数に対応した交差事象が豊富な子孫分子の構成ができるように、混ぜ合わせる各断片の量を決定するように設定された予測モジュールもある。また、システムには、決定した量の断片を自動的に混合するために、通信インタフェースにより予測モジュールにリンクされたロボット腕もある。
【０１１０】
変異オリゴヌクレオチド
最適化された定方向進化の方法では、親のポリヌクレオチド配列に対して100%の忠実度を有するオリゴヌクレオチドをすることもできるが、このレベルの忠実度は必要ではない。例えば、親ポリヌクレオチドに関連した3つのセットを選択して、新しい表現型などの作成の目的で連結再編成を起こす場合には、固有の重複領域を有するオリゴヌクレオチドのセットを従来の方法で合成することができる。しかしながら、変異オリゴヌクレオチドのセットを合成することもできる。これらの変異オリゴヌクレオチドは、サイレントな、保存性、または非保存性のアミノ酸をコードするように設計されることが好ましい。
サイレント変異に入るための選択をして、例えば、ヌクレオチド相同性のある2つの断片の領域を付加するが、最終的な翻訳タンパク質には影響のないようにすることもできる。非保存的置換または保存的置換が、得られるポリペプチドの機能をこうした変化がどう変えるかを判断するためになされる。これは、例えば、ある特定のオリゴヌクレオチド断片における突然変異によって、ペプチドの活性の増加が引き起こされる場合に、実施することができる。突然変異を起こさせるオリゴヌクレオチド（親とは異なるヌクレオチド配列を有するものなど）を合成することで、ペプチドやタンパク質配列への結果的な改変がペプチドやポリペプチドの活性にどのように影響するかを、制御された方法で調査することができる。
【０１１１】
変異断片を用いて核酸配列の変異体を生成するための別の方法には、まず、複数の核酸配列をアラインメントし、その変異体の大部分で保存されるが、その変異体の全てにおいては保存されるとは限らない変異体内の境界部位を決定することが含まれる。次に、保存される核酸配列の断片の第1のセット中の配列断片が生成される。この断片は境界部位でお互いに結合される。次に、保存されない核酸配列の断片の第2のセットが、核酸合成機などにより生成される。しかしながら、保存されない配列は、第2の断片が境界部位において第1の断片と同一のヌクレオチド配列を有するように、その境界部位で突然変異が起こるように生成される。これによって、前記保存されない配列は、他の親配列への連結反応の際に、なおハイブリダイゼーションすることが可能となる。断片がいったん生成されると、各変異体について所望の数の交差事象を選択できる。次に、第1および第2の断片の計算した数量間での連結/培養反応によって、所望の数の交差事象を有する子孫分子が生じるように、第1および第2の各断片の数が計算される。
【０１１２】
インシリコ モデル、すなわちコンピュータ モデル
本発明の方法の実施において、改変されたまたは新規の核酸を設計して、新しい表現型が生成されるよう細胞を改変するために、インシリコ、すなわちコンピュータ プログラムを導入したパラダイムを使用することができる。また、本発明には、本発明のこれらインシリコ、すなわちコンピュータ プログラムを導入した方法を実施するためのコンピュータ システム等の機械実行可能な命令およびシステムを含む機械読取可能な媒体を含む装置を規定している。
【０１１３】
この発明の方法の実施において、新しい表現型の生成のための人工のポリヌクレオチド配列の生成用に使用可能な、1つの例示的なインシリコの方法では、複数の鋳型ポリヌクレオチド間での共通の領域が検出される。これは、鋳型ポリヌクレオチドをアラインメントさせ、約75%〜95%の配列同一性など、全ての鋳型ポリヌクレオチド間で共通である一定の率の相同性を有する全ての配列文字列を同定することによる。これにより、鋳型ポリヌクレオチド間での共通の領域が検出される。次に、領域の配列を、対応する領域の配列のある1つの鋳型ポリヌクレオチドから切換える。これが、全ての領域が別の鋳型ポリヌクレオチドにある対応する領域に切換わるまで繰り返され、それにより、鋳型ポリヌクレオチドのセットからの人工ポリヌクレオチド配列のインシリコのライブラリが生成される。
またこの発明の方法の実施において、インシリコ、すなわちコンピュータ プログラムを導入した方法を、代謝フラックスデータの分析に使用することができる。これについては、Covert（2001年）Trends Biochem. Sci. 26(3):179-186、Jamshidi（2001年）Bioinformatics 17(3):286-287等を参照。例えば、（細菌、アセテートまたはスクシナート等について）一次炭素源摂取率、酸素摂取率、および最大細胞成長率の間の定量的関連性をインシリコでモデル化し、この発明の「リアルタイム」または「オンライン」モニタリングに相補的に使用することができる。Edwards（2001年）Nat. Biotechnol. 19(2):125-130等を参照。中央代謝経路における遺伝子欠失の効果を、インシリコでモデル化して、この発明の「リアルタイム」または「オンライン」モニタリングに相補的にし使用することができる。Edwards（2000年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10):5528-5533等を参照。
【０１１４】
代謝パラメータの測定
本発明の方法には、新しい表現型を有する新しい細胞株の開発のための、細胞の全細胞進化、つまり全細胞操作が関連する。新しい表現型を検出するために、改変細胞の少なくとも1つの代謝パラメータが、細胞内で、「リアルタイム」または「オンライン」の時間枠内でモニタリングされる。一面において、細胞培養物のような複数個の細胞が、「リアルタイム」または「オンライン」でモニタリングされる。一面において、複数の代謝パラメータが「リアルタイム」または「オンライン」でモニタリングされる。
代謝フラックス分析（MFA）は、既知の生化学の枠組みに基く。線形独立の代謝行列は、質量保存の法則および細胞内代謝生成物に関する擬似安定状態仮説（PSSH）に基き構築される。この発明の方法の実施において、以下に挙げる項目を含む代謝ネットワークが確立される。
【０１１５】
・ 全ての経路基質、生成物、および中間代謝物のアイデンティティ
・ 経路代謝生成物を相互変換する全ての化学反応のアイデンティティ、経路反応の化学量論
・ 反応の触媒作用を及ぼす全ての酵素のアイデンティティ、酵素反応速度論
・ アロステリック相互作用、酵素間の相互作用等の、経路構成要素間の制御相互作用
・ 酵素の細胞内区画化、または、その他の、酵素の一切の超分子的構成
・ 代謝生成物、酵素、またはエフェクター分子の濃度勾配、またはその移動に対する拡散障壁の存在
【０１１６】
所定の株についての代謝ネットワークが形成されると、オンライン メタボローム データが利用できるならば、細胞内代謝フラックスを評価するために、行列の概念による数学的表現が導入可能である。
代謝の表現型は、細胞内の代謝ネットワーク全体の変化に依存する。代謝の表現型は、環境条件、遺伝的調節、開発状況、および遺伝形質等に関する経路利用の変化に依存する。この発明の方法の一面において、オンラインMFA計算の後、細胞の動的挙動、その表現型およびその他の特性が、経路利用の調査により分析される。例えば、酵母の発酵中に、ブドウ糖の供給が増大し、酸素が減少した場合は、呼吸性経路の利用は、減少および/または停止し、発酵経路の利用が支配的となる。細胞培養の生理学的状態の制御は、経路分析の後に可能となる。本発明の方法は、基質の供給、温度、誘導物質の使用等の変更方法を決定して、細胞の生理学的状態が望ましい方向に移動するように制御することにより、発酵を操作する方法を決定するのに役立ちうる。本発明の方法の実施において、MFA結果は、代謝工学または遺伝子シャフリング等のための実験やプロトコルを設計するために、トランスクリプトーム データやプロテオーム データと比較することができる。
本発明の方法の実施において、細胞の新しいまたは改善済みの特性を含めて、任意の変更されたまたは新しい表現型を与えたり、検出することができる。代謝または成長のいかなる側面もモニタリング可能である。
【０１１７】
mRNA転写物の発現のモニタリング
この発明の一面において、操作された表現型には、mRNA転写物の発現の増減、または細胞内での新しい転写物の生成が含まれる。mRNA転写物、つまりメッセージは、ノーザン分析、定量的増幅反応、アレイへのハイブリダイゼーション等、この技術分野で知られている任意の方法により検出・定量化ができる。定量的増幅反応には、定量的PCR（定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、つまりRT-PCRなどを含む）、定量的リアルタイムRT-PCR、または「リアルタイム動態RT-PCR」（Kreuzer（2001年）Br. J. Haematol. 114:313-318; Xia（2001年）Transplantation 72:907-914等を参照）などがある。
本発明の一面において、操作された表現型は、同種遺伝子の発現のノックアウトにより生成される。プロモーター、エンハンサー等、遺伝子のコード配列または1つまたは複数の転写制御要素をノックアウトできる。こうして、転写物の発現を、完全に除去するか、または単に低減しうる。
【０１１８】
本発明の一面において、操作された表現型には、同種遺伝子の発現の増加が含まれる。これは、負の対照要素のノックアウトにより効果が生じうるもので、シス（cis）やトランス（trans）に作用する転写制御要素、または正の対照要素の突然変異誘発などを含む。
下記に詳しく記載するとおり、細胞の1つ以上または全ての転写物が、細胞の転写物を含むサンプルのハイブリダイゼーションで測定でき、また、細胞の転写物の代理である核酸、またはそれに相補的な核酸は、アレイ上に固定化された核酸のハイブリダイゼーションで測定できる。
【０１１９】
ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸の発現のモニタリング
この発明の一面において、操作された表現型には、ポリペプチドの発現の増減、または細胞内での新しいポリペプチドの生成が含まれる。ポリペプチド、ペプチド、およびアミノ酸は、核磁気共鳴（NMR）、分光測光法、X線撮影（タンパク質放射標識化）、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高拡散クロマトグラフィーのほか、免疫沈降、免疫拡散法、免疫電気泳動法、放射免疫アッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）、免疫蛍光試験法、ゲル電気泳動（SDS-PAGE等）、抗体を用いた染色、蛍光細胞選別機（FACS）、熱分解質量分析法、フーリエ変換赤外線分光測定、ラマン分光法、GC-MS、およびLCエレクトロスプレーやキャップLCタンデム-エレクトロスプレー質量分析法などの各種免疫学的方法等の、この技術分野で知られている任意の方法により検出・定量化ができる。新しい生理活性も、方法、またはそれを変形したものを使用してスクリーニングが可能で、これについては、米国特許第6,057,103号に説明がある。さらに、下記に詳しく記載したとおり、細胞にある1つ以上または全てのポリペプチドは、タンパク質アレイを使用して測定ができる。
【０１２０】
タンパク質原性アミノ酸の生合成方向分別的13C標識化は、13Cで標識化された炭素源化合物と標識化されていない炭素源化合物の均一な混合体を生物反応ネットワークに供給することでモニタリングできる。結果としての標識化パターンの分析により、ネットワーク トポロジーの総合的な特性付けと、アミノ酸の代謝フラックス比の決定の両方が可能となる。Szyperski（1999年）Metab. Eng. 1:189-197等を参照。
【０１２１】
代謝生成物および生合成経路の発現のモニタリング
一面において、一次および二次の代謝物は、測定代謝パラメータである。関連性のある任意の一次および二次の代謝産物は、リアルタイムでのモニタリングができる。例えば、測定代謝パラメータには、一次または二次代謝産物の増減が含まれうる。代謝生成物には、例えば、ブドウ糖、グリセロール、メタノールが含まれる。測定代謝パラメータは、アセテート、ブチラート、スクシナート、オキサロアセテート、フマレート、α-ケトグルタラート、またはフォスフェート等の有機酸の増減を含み得る。一面において、測定される代謝パラメータには、酸素、メタノール、水素等、ガスの増減が含まれる。
【０１２２】
「オンライン」または「リアルタイム」でモニタリングする代謝生成物または代謝経路や生合成経路の選択は、どの表現型の追加または変更を望むかによる。例えば、ゲラニルピロリン酸のリモネンや他の下流の代謝物質は、米国特許第6,291,745号にあるように、「オンライン」または「リアルタイム」でモニタリングが可能で、これは植物における昆虫防除のための手段を作り出すためにモニタリングされる (例えば、以下を参照...)。枯草菌（Bacillus subtilis）の上澄における代謝生成物/抗生物質は、効果的な殺虫剤、抗真菌剤、および抗菌剤についてモニタリングできる。米国特許第6,291,426号等を参照。この発明の方法は、トリカルボン酸回路および解糖の代謝生成物のモニタリングにも使用することができるが、これはSauer（1997年）Nat. Biotechnol. 15:448-452（この著者は断片的13C-標識化および二次元核磁気共鳴分光法も使用している）による枯草菌（バチリスサブチリス）菌株での場合のとおりである。Penicillium chrysogenum等のペニシリンの生合成経路が、リアルタイムでモニタリングできる。Nielsen（1995年）Biotechnol. Prog. 11(3):299-305、Jorgensen（1995年）Appl. Microbiol. Biotechnol. 43(1):123-130等を参照。アスパラギン リンク（N-リンク）のグリコシル化を、リアルタイムで研究できる。Nyberg（1999年）Biotechnol. Bioeng. 62(3):336-347等を参照。加水分解物追加媒体内で成長した細胞培養のペプチドから解放されたアミノ酸の量は、リアルタイムで研究できる。Nyberg（1999年）Biotechnol. Bioeng. 62(3):324-335等を参照。この著者は、複合的な（加水分解物含有）媒体内で成長したチャイニーズハムスターの卵巣細胞内の経路フラックスを研究している。この発明の方法は、ミトコンドリア内でATP生産を最大にするために、フラックス分布のモニタリングにも使用でき、これには、ブドウ糖、乳酸塩、およびパルミチン酸塩についてのATP収量などがある。Ramakrishna（2001年）Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 280(3):R695-704等を参照。細菌では、この発明の方法は、ブドウ糖最小培地などのブドウ糖媒体内での成長について7つの本質的な反応を、中央代謝経路、解糖、ペントースリン酸経路、トリカルボン酸回路で、モニタリングするために使用できる。遺伝子改変については、これらの酵素をコードする7つの遺伝子は、（1）ペントースリン酸経路遺伝子、（2）三炭素解糖遺伝子、および（3）トリカルボン酸回路遺伝子の3つのカテゴリーに分類できる。Edwards（2000年）Biotechnol. Prog. 16(6):927-939等を参照。
【０１２３】
細胞内pHのモニタリング
一面において、細胞内pHの増減は、「オンライン」または「リアルタイムで」測定される。細胞内pHの変化は、細胞内に色素を適用することにより測定できる。色素の蛍光の変化を経時的に測定できる。
細胞内pHの決定には、任意のシステムを使用できる。一つの例示的方法で、色素が使用された場合には、全フィールド時間領域蛍光寿命イメージング（FLIM）を使用できる。FLIMは、混合された蛍光団の濃度比の定量的画像化、および蛍光団環境の揺らぎの定量的画像化に使用できる。またFLIMでは、像コントラストは、二次元画像内の各点での蛍光寿命から得られる（Cole（2001年）J. Microsc. 203(Pt 3):246-257等を参照）。近視野走査型光学顕微鏡法（NSOM）は、同時進行的な光学的画像および組織分布的画像を得るために使用され、0.1ナノメートルの空間分解能のある高解像度走査プローブ技術の1つである（Kwak（2001年）Anal. Chem. 73(14):3257-3262等を参照）。周波数領域蛍光性寿命画像顕微鏡（FLIM）により、三次元のナノ秒蛍光性寿命画像の測定および再構成が可能となる（Squire（1999年）J. Microsc. 193( Pt 1):36-49等を参照）。
ガス発生のモニタリング
一面において、測定代謝パラメータは、ガス交換率測定値を含む。酸素、一酸化炭素、二酸化炭素、窒素等の任意のガスをモニタリングできる。Follstad（1999年）Biotechnol. Bioeng. 63(6):675-683等を参照。
【０１２４】
スクリーニング方法および「オンライン」モニタリング装置
この発明の方法の実施において、リアルタイム代謝フラックス分析を用いて細胞内の人工的表現型を識別するために、「リアルタイム」または「オンライン」細胞モニタリング装置が使用される。任意のスクリーニング方法をこれらの「リアルタイム」または「オンライン」細胞モニタリング装置と共に使用できる。
【０１２５】
細胞増殖モニター装置
一面において、複数の代謝パラメータのリアルタイム モニタリングは、細胞増殖モニター装置を用いて実施される。この1つの例示的な装置は、Wedgewood Technology, Inc. (San Carlos, CA)製の細胞増殖モニター652型で、ブドウ糖などの基質の摂取、アセテート、ブチラート、スクシナート、オキサロアセテート、フマレート、α-ケトグルタラート、フォスフェートといった有機酸などの細胞内中間体のレベル、およびアミノ酸のレベルなどを含む、多様な代謝パラメータの「リアルタイム」または「オンライン」モニタリングができる。いずれの細胞増殖モニター装置も使用でき、またこれらの装置は、これに限定されることなくいずれのパラメータのセットをも測定できるように修正することができる。細胞増殖モニター装置は、他のいずれの測定用またはモニタリング用の装置と共に使用することができる。全細胞レベルでの代謝生成物の高速分析にはいくつかあるが、熱分解質量分析法、フーリエ変換赤外線分光測定、ラマン分光法、GC-MS、およびLCエレクトロスプレーやキャップLCタンデム-エレクトロスプレー質量分析法などの方法を用いたものがある。
【０１２６】
キャピラリーアレイ
ポリペプチド、核酸、代謝生成物、副産物、抗生物質、金属等（これに限定されない）の各種の成分をスクリーニングまたはモニタリングするため、「バイオチップ」アレイ（下記参照）に加えて、GIGAMATRIXTM（Diversa Corporation, San Diego, CA）などのキャピラリーアレイを使用できる。キャピラリーアレイには、サンプルの保持およびスクリーニング用に別のシステムも用意されている。例えば、サンプル スクリーニング器具には、複数の毛細管が隣接する毛細管のアレイとして形成されたものが含まれうる。ここにおいて、各毛細管は、サンプルを保持するための内腔を規定する少なくとも1つの壁が含まれる。この装置には、さらに、アレイ内の隣接する毛細管に配置された間隙材料、および間隙材料内に形成された1つまたは複数の指標も含まれる。サンプルのスクリーニング用の毛細管は（この毛細管は毛細管のアレイ内に結合されるように適応されている）、サンプルの保持用の内腔を規定する第1の壁と、サンプルを励起するために内腔に供給されるフィルタ励起エネルギー用のフィルタ材料から形成される第2の壁が含まれうる。
【０１２７】
リガンドなどのポリペプチドまたは核酸を、最初の成分に、少なくともキャピラリーアレイの毛細管の一部に導入することができる。キャピラリーアレイの各毛細管には、第1の成分を保持するための内腔を規定し、気泡を第1の成分の背後の毛細管に導入するための少なくとも1つの壁が含まれる。第2の成分を毛細管に導入することができるが、第2の成分は第1の成分とは気泡によって分離される。目的のサンプルを、検出可能な粒子で標識化された第1の液体としてキャピラリーアレイの毛細管に導入することができるが、キャピラリーアレイの各毛細管は、前記第1の液体および検出可能な粒子を保持するための内腔を規定する少なくとも1つの壁を含み、さらに、前記少なくとも1つの壁は、検出可能な粒子を少なくとも1つの壁に結合する結合材料で覆われている。この方法は、さらに、毛細管からの最初の液体の除去を含んでもよく、結合された検出可能な粒子は毛細管内に保持され、第2の液体が毛細管に導入される。
【０１２８】
キャピラリーアレイは、内腔を規定する少なくとも1つの外壁のある複数の個別の毛細管を含みうる。毛細管の外壁は、互いに融合された1つまたは複数の壁であってよい。同様に、壁が液体またはサンプルの維持のための内腔を形成している限り、円柱形、正方形、六角形、またはその他任意の幾何学的形状を有する内腔を壁によって規定することができる。キャピラリーアレイの毛細管は、近接して平面構造を形成するようにまとめて保持できる。毛細管は、融合（毛細管がガラス製の場合）、接着、ボンド付け、または並べてクランプ留めにより、まとめて結合できる。キャピラリーアレイは、任意の数の、例えば、100〜4,000,000本の範囲の個別の毛細管から形成することができる。キャピラリーアレイは、まとめて結合された約100,000本を超える個別の毛細管を持つマイクロタイタープレートを形成することができる。
【０１２９】
アレイ、または、「バイオチップ」
本発明の一面において、モニタリングするパラメータは、転写発現である。細胞の1つ以上または全ての転写物は、細胞の転写物、細胞の転写物を表す核酸、またはそれに相補的な核酸を含むサンプルのハイブリダイゼーションにより、アレイ、すなわち「バイオチップ」上に固定化された核酸へのハイブリダイゼーションにより測定できる。マイクロチップ上の核酸の「アレイ」を使用することにより、細胞の一部または全部の転写物が、同時に定量化できる。本発明の方法により生成された新しく操作された株の遺伝形質決定のために、ゲノム核酸を含むアレイを使用することもできる。複数のタンパク質を同時進行的に定量化するために、「ポリペプチドアレイ」を使用することもできる。
【０１３０】
本発明は、「マイクロアレイ」、「核酸アレイ」、「ポリペプチド アレイ」、「抗体アレイ」、「バイオチップ」とも呼ばれる任意の既知の「アレイ」、またはその変形物を用いて実施できる。アレイは、一般的には複数の「点」または「標的要素」であり、各標的要素は、所定量の1つまたは複数の生体分子、例えばmRNA転写物などのサンプル分子に特異的な結合をするために基質表面の定義された領域上に固定化されたオリゴヌクレオチドを含む。
本発明の方法の実施において、既知のアレイおよびアレイの作成方法および使用方法としては、例えば、米国特許第6,277,628号、第6,277,489号、第6,261,776号、第6,258,606号、第6,054,270号、第6,048,695号、第6,045,996号、第6,022,963号、第6,013,440号、第5,965,452号、第5,959,098号、第5,856,174号、第5,830,645号、第5,770,456号、第5,632,957号、第5,556,752号、第5,143,854号、第5,807,522号、第5,800,992号、第5,744,305号、第5,700,637号、第5,556,752号、第5,434,049号等の記載内容の全文またはその一部、またはそれを変形したものを取り入れることができる。また、国際公開公報（WO）第99/51773号、第99/09217号、第97/46313号、第96/17958号等も参照。また、Johnston（1998年）Curr. Biol. 8:R171-R174、Schummer（1997年）Biotechniques 23:1087-1092、Kern（1997年）Biotechniques 23:120-124、Solinas-Toldo（1997年）Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407、Bowtell（1999年）Nature Genetics Supp. 21:25-32なども参照。公開済みの米国特許出願第20010018642号、第20010019827号、第20010016322号、第20010014449号、第20010014448号、第20010012537号、第20010008765号も参照。本発明では、GeneChipsTM（Affymetrix, Santa Clara, CA）、SpectralChipTM Human BAC Arrays（Spectral Genomics, Houston, Texas）等を、同封のメーカーによる取扱説明書とともに、任意の既知のアレイを使用できる。
【０１３１】
抗体および免疫ブロット
本発明の方法の実施において、特定のポリペプチドまたは多糖類の単離、識別、または定量化のために抗体を使用することができる。抗体は、免疫沈降、染色（FACS等）、免疫親和性カラム等で使用できる。所望であれば、免疫化した後、ポリペプチドまたは核酸を分離、増幅、またはクローン化し、本発明のアレイ上にポリペプチドを固定化することにより、特定の抗原をコードする核酸配列を生成できる。別の方法として、本発明の方法は、改変すべき細胞によって生成される抗体の構造を改変するために使用することもでき、例えば、抗体の親和性を増減できる。さらに、抗体を作成または改変する能力は、この発明の方法により細胞へ操作される表現型でありうる。
抗体（多クローン性および単クローン性）の免疫化、生成、分離の方法は、この技術分野の熟練者に知られており、科学文献や特許文献に記載がある。例えば、Coligan「免疫学における現行のプロトコル（CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY）」Wiley/Greene, NY（1991年）、Stites（eds.）「基礎的・臨床的免疫学第七版（BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY（7th ed.））」Lange Medical Publications, Los Altos, CA（「Stites」）、Goding「単クローン抗体：原理と実践（第二版）（MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE（2d ed.））」Academic Press, New York, NY（1986年）、Kohler（1975）Nature 256:495、Harlow（1988年）「抗体、研究室マニュアル（ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL）」Cold Spring Harbor Publications, New York等を参照。抗体は、動物を使用した従来的なin vivoの方法に加えて、組換え抗体結合部位を発現したファージディスプレイライブラリーを使用して、in vitroで生成することもできる。Hoogenboom（1997年）Trends Biotechnol. 15:62-70、Katz（1997年）Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45等を参照。
【０１３２】
有機酸およびアミノ酸のモニタリング用の装置
本発明の方法の実施において、有機酸およびアミノ酸のモニタリングができるオンライン装置も使用できる。例えば、一面において、BIO+ ON-LINETM（Lachat Instruments, Milwaukee, WI）により、発酵プロセスおよび哺乳類の細胞培養プロセスの近リアルタイム モニタリングが提供される。この装置は、生産収量を最大化するために重要な情報を提供できる。カートに乗せて、この装置は発酵バンクまで移動させて流路選択バルブを介して接続できる。そこからは、イオン排除クロマトグラフィーを用いて、化学成分のモニタリングが、アンモニア、ブドウ糖、グルタミン酸塩、グルタミン、グリセロール、乳酸塩およびフォスフェートについては個別に、有機酸についてはプロファイルとして、自動的に起こる。BIO+ ON-LINETMは、FLOWNAMICSRフィルタ プローブと組合せたポンプシステムを使用し、この問題に対して実際の解決策を与えてくれる総合的サンプリング システムで、定位置滅菌、材料を容器内に再循環するバイパス フィルタの除去による無リスク サンプリング、滅菌無細胞サンプリング、あらゆるサイズの容器の収容、一貫性があり精度の高いサンプリングの確保かつ水洗い時間の短縮のための最小限のデッド ボリューム、バイオプロセス環境につきものの温度・圧力・粘度・せん断力および化学成分に持ちこたえる耐久性のある設計・構造といった利点が示される。
【０１３３】
BIO+オンラインTMでは、フローインジェクション分析を用いて、最高4個の被検体を同時に決定できる。反応モジュールは、取外しおよび他のモジュールとの置換が可能である。こうして、利用者は、異なる発酵/バイオプロセスの要件に合わせて装置をカスタム化できる。さらに、その他の液体クロマトグラフィー（LC）にニーズに合わせて、イオン・クロマトグラフィー チャネルのカスタム化ができる。伝導率の検出がデフォルトの検出器であるが、利用者は、UV、RI、またはその他の検出器および独自のカラムを装置に接続し、カスタム化されたLC分離のニーズを満たすことができる。このシステム、またはその変形は、好気性菌液および嫌気性菌液のほか、酵母、菌類、藻類、昆虫および哺乳類の細胞培養液にも適用できる。
本発明の実施に使用可能なその他の関連する装置には、QUIKCHEMTM 8000（Lachat Instruments, Milwaukee, WI）があり、高いサンプル処理量が得られることに加え、単純で迅速な方法切換ができ、ppb（10億分の1）以下から濃度パーセントまで、多様なサンプル行列におけるイオン種の決定での生産性が最大化される。
【０１３４】
細胞の供給源および細胞の培養
本発明は、リアルタイム代謝フラックス分析を用いることによる、新規な表現型の全細胞操作のための方法を提供する。酵母、菌類、昆虫および植物の細胞を含む、どのような細胞も操作することができる。本発明の方法の一面において、細胞は、異種核酸を細胞に付加することで改変される。異種核酸は、細菌性、哺乳類、酵母、昆虫または植物の細胞などの任意の供給源からの核酸から単離、クローン化、複製ができる。
一面において、細胞は、患者などの個人から採取した組織または体液からのものでもよい。細胞は、同種細胞、例えば患者から採取したヒト細胞であってよく、または異種細胞、例えば、個人の胃腸管から採取した細菌や酵母菌でもよい。細胞は、リンパ管またはリンパ節サンプル、血清、血液、臍帯血、CSF（脳脊椎液）または骨髄吸引、糞便サンプル、唾液、涙、組織からのもの、また外科生検、針生検やパンチ生検等によるものであってよい。
細胞の成長または維持には、バイオリアクターまたは発酵槽等の任意の装置が使用できる。米国特許第6,242,248号、第6,228,607号、第6,218,182号、第6,174,720号、第6,168,949号、第6,133,022号、第6,133,021号、第6,048,721号、第5,660,977号、第5,075,234号等を参照。
【０１３５】
リアルタイム代謝フラックス分析
本発明の方法では、細胞の少なくとも1つの代謝パラメータがリアルタイムで、つまりリアルタイムまたは「オンライン」のフラックス分析によりモニタリングされる。別の面で、培養下の細胞の数多くのパラメータが、リアルタイムで同時進行的にモニタリングされる。基質はリアルタイムで配給されるため、通常の分析手段では、代替の代謝系路間での中間生成物や生成物は入手できない。本発明では、MFA方法と「オンライン」または「リアルタイム」メタボローム データが組み合わされている。したがって、計算により、発酵中の代謝フラックス分布が定量化できる。流量の定量化および遺伝子発現分析と、高性能の実験技術とを組合わせて、細胞の機能や調節の解明に向けて、生理学的データおよびゲノム/プロテオーム データにある情報の内容をアップグレードすることができる。これにより、生物体の挙動を理解するうえで非常に望ましく必要とされる代謝系路についての洞察が得られる。
【０１３６】
代謝フラックス分析（MFA）は、代謝工学のための分析技術の1つである。この技術は、細胞の代謝の研究と関連して使用されてきたもので、その目的は、基質からできるだけ多くの炭素を生物量および生成物に送ることであった。下記の例1で、この発明の方法に使用可能な例示的な代謝フラックス分析（MFA）を一般的に説明している。
「メタボロミクス」は、比較的に未開拓の分野であり、全ての細胞代謝物の分析が包含されうる。メタボロミクスでは、機能的生物学に対する洞察を得るための強力な新しいツールが用意されており、また細胞内の数多くの小規模な分子の各レベルのスナップショットが、また条件が変化するとそれらの各レベルがどう変化するかについて提供されてきた。これらの研究は、遺伝子およびポリペプチドの発現の研究（ゲノミクスおよびプロテオミクス）に対して極めて相補的なもので、これが感染症、生成、モデル生物体だけでなく、ヒト細胞や植物の研究にも積極的に適用されている。本発明では、リアルタイム代謝フラックス分析を使用することによる新規または変更済み表現型の全細胞操作の方法を規定することにより、「メタボロミクス」研究の方法論が改善されている。
【０１３７】
本発明の方法の実施において、細胞の制御を階層的に異なるレベル、ゲノムのレベル、トランスクリプトームのレベル、プロテオームのレベル、メタボロームのレベルで研究することができる。細胞のゲノム全体の分析での現時点での大きな関心は、転写レベル（「トランスクリプトーム」を定義）および翻訳レベル（「プロテオーム」を定義）にあるが、第3のレベルの分析である「メタボローム」のレベルが、面白いことに現在まで未開拓であった。「メタボローム」という用語は、目的の細胞懸濁液（またはその他のサンプル）内にあるわずかな分子量の代謝生成物全体の補体全体を意味する。異なる生理学的状態でのメタボロームの測定により、特にこの発明の方法を使用すると、実際に、機能ゲノミクスの目的に対して、ずっと識別性の高いものとなる可能性がある。
【０１３８】
ゲノム（細胞内の全遺伝物質）によって、生物体の反応の全レパートリーが特定される。今では、いくつかの生物体のゲノムが完全に配列決定され、その他いくつかが完成間近またはかなり進行している（複数の寄生体を含む）。体系的なゲノム配列決定プログラムによりこれまでに配列決定された遺伝子のうち、信頼性をもって機能が知られた遺伝子は半数に満たない。今や、技術の進歩により、開発の特定段階の、または特定の生理学的状態における遺伝子発現が分析できるようになった。このような分析は、転写レベルではノーザン分析を用いるか、さらに効率的には、異なる条件の組においてどの遺伝子が発現しているのかを決定するハイブリダイゼーションアレイ技術を用いるか、つまり「トランスクリプトーム」をもちいるかのいずれかにより遂行しうる。類似した分析を翻訳レベルで行って、細胞の全タンパク質相補物である「プロテオーム」を同定するために遂行できる。先進の画像分析のための二次元電気泳動法およびコンピュータ ソフトウェアの改良により、1〜2x103個のタンパク質を単一の20x20cmのプレート上に分解でき、また、質量分析法とデータベース検索の組合せにより、迅速なタンパク質識別の方法が提供される。トランスクリプトームの変化は、変更する細胞の初期的な反応を表す一方、プロテオームの変化は、高分子のレベルでの最終的な反応を表す。分析の第3のレベル、そしてこの発明の方法により分析できるのが「メタボローム」のレベルであり、これには、特定の生理学的または発生段階にある細胞内に存在する全ての低分子量の分子の定量的補集合が含まれる。
【０１３９】
代謝生成物の各レベルは本発明の別の面においてモニタリングされるが、こうして、代謝生成物の各レベルは細胞機能の定量分析における測定のために選択する変数となる。代謝生成物は、トランスクリプトームまたはプロテオームで発生する変化の下流での増幅を表す。その上、代謝生成物はフィードバック経路のネットワークを介して遺伝子発現を調節し、代謝生成物が発現を促進し、ゲノムと代謝との間のリンクとして機能する。メタボロームにおける代謝生成物の数も少なく、トランスクリプトームやプロテオーム内の遺伝子生成物の数に比較して約１桁少ない（例示的な真核細胞には、約105個の遺伝子と104個の異なる発現のタンパク質があるが、異なる既知の代謝生成物は、約103個しかない）。したがって、中間的な代謝を理解し、この知識を利用するためには、メタボロームの変化は関連性がずっと高く、トランスクリプトームまたはプロテオームのいずれにおける変化に比べても、検出と利用のどちらもずっと簡単となる。
本発明の方法は、本来に備わっている科学的な関心に加え、メタボロームによる特異的な代謝障害の部位を同定することで、潜在的な新しい医薬品または農薬の細胞全体における標的の検出につながる。本発明の方法は、機能的検査の設計にも使用できる。この結果をもとに、特定の高処理量の機械的アッセイのために、標的代謝生成物のみを研究すればよい非常に単純性の高いアッセイの設計が可能となる。
【０１４０】
本発明のメタボローム分析には、オンライン非侵襲的技術であるという利点がある。静的メタボローム分析には、多くの生物体で、代謝生成物の数は、遺伝子やタンパク質の数よりもかなり少なかったために、トランスクリプトームおよびプロテオームの分析よりもいくらかの利点があった。ところが、静的メタボローム分析には、本質的にある不利な点もあった。これは、生化学によって代謝系路についての情報を生成することができる一方、代謝生成物と遺伝子との間に直接的なリンクがないということである。また、これらは、濃度の分析にける問題点、または一定の代謝生成物の存在自体についての分析における問題点ですらあった。赤外線分光測定法、質量分析法、核磁気共鳴分光法等の現在の識別技術では、いくらかの情報が生成されたが、その用途は限定的なもので、生きた細胞の適切な分析はできなかった。この発明の方法では、「オンライン」または「リアルタイム」の非侵襲的技術を提供することで、この問題が解決された。旧来の技術に欠けていた、この発明の方法の「オンライン」または「リアルタイム」という時間領域は、生きた細胞を分析する能力のある方法における1つの重要な要因である。
【０１４１】
代謝フラックス分析（MFA）は、摂取/排泄率、成長率、生成物や生物量の収量等の観察による細胞外の現象と、細胞内炭素フラックスおよびエネルギー分布とを組合せることのできる強力な分析ツールである。この発明の「オンライン」または「リアルタイム」MFAは、大腸菌、出芽型酵母菌、およびハイブリドーマの生理機能の調査（Keasling（1998年）Biotechnol. Bioeng. 5;58(2-3):231-239、Pramanik（1998年）Biotechnol. Bioeng. 60(2):230-238、Nissen et al., 1997年、Schulze et al., 1996年、Follstad et al., 1999年等を参照）、リジン生成および突然変異のコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）への影響（Vallino（2000年）Biotechnol. Bioeng. 67(6):872-885、Vallino and Stephanopoulos, 1993年, 1994年、Park et al., 1997年、Dominguez（1998年）Eur. J. Biochem. 254(1):96-102等を参照）、枯草菌（バチリスサブチリス）におけるリボフラビン生成（Sauer et al., 1996年, 1998年、Sauer（1997年）Nat. Biotechnol. 15:448-452等を参照）、 Penicillium chrysogenumにおけるペニシリン生成（Nielsen（1995年）Biotechnol. Prog. 11(3):299-305、Jorgensen（1995年）Appl. Microbiol. Biotechnol. 43(1):123-130）、およびチャイニーズハムスターの卵巣（CHO）細胞におけるペプチド アミノ酸代謝（Nyberg（1999年）Biotechnol. Bioeng. 62(3):324-335、Nyberg（1999年）Biotechnol. Bioeng. 62(3):336-347等を参照）に使用できる。
【０１４２】
その上、本発明の「オンライン」または「リアルタイム」MFAは、NMR、MS、およびGCMS、またはそのいずれかと組合わせて、無益回路、反応の可逆性の度合、活動性のある経路に関する得がたい情報を得るために使用できる。これについては、Szyperski（1999年）Metab. Eng. 1:189-197、Szyperski（1998年）Q Rev. Biophys. 31:41-106、Szyperski（1995年）Eur. J. Biochem. 232(2):433-448、Szyperski et al., 1997年、Schmidt et al., 1998年、Klapa（1999年）Biotechnol. Bioeng. 62(4):375-391、Mollney et al., 1999年、Park et al., 1999年、Wiechert et al., 1999年、Wittmann and Heinzle, 1999年等を参照。Schilling、Edwards、およびPalssonは、MFAの用途をゲノム データや細胞ネットワークの構造的特性の分析（Schilling（2000年-2001年）Biotechnol. Bioeng. 71(4):286-306、Edwards and Palsson, 1998年、Schilling et al., 1999年a,b等を参照）、複数の微生物の補充ノード（anaplerotic node）におけるC(3)-C(4)代謝生成物の相互転換のモニタリング（Petersen（2000年）J. Biol. Chem. 275(46):35932-35941等を参照）も含まれるように拡張した。
【０１４３】
MFAでは、全ての主な細胞内の反応について化学量論モデルを用い、細胞内代謝生成物の周囲の質量収支を適用することにより細胞内フラックスが計算される。この計算への入力として、測定したフラックスの組、一般には、基質の取込速度および代謝生成物の分泌速度が使用される。
本発明の新しい「リアルタイム」または「オンライン」代謝フラックス分析により、所定の環境条件下や遺伝的調節のある生物系により合成された全部の代謝生成物に関するデータを得ることができる。この発明の「リアルタイム」または「オンライン」MFA方法により、極めて複雑なメタボローム データセットを得ることができる。この発明のMFA方法により、複雑な生体系の全身的な反応を描写するために獲得したデータの取扱い、保存、正規化、および評価を行うための適切なツールが得られる。図2は、実際の細胞培養や発酵期間中に研究されている株に新しい表現型、経路の利用、および細胞応答を決定するために、この発明のMFAの新しい用途を例示する図式である。結果は、発酵後分析または代謝の即時的な制御のいずれかに使用できる。また、この発明の「オンライン」または「リアルタイム」の方法はHPLCおよびGC/MS等の他の分析装置に組込むこともでき、実験的測定値から代謝ネットワーク（我々の生化学的知識およびゲノム/プロテオーム情報データベースとともに構築）におけるフラックス分布を見積もることができる。これらの装置を用いて、研究中の生物系の「スナップショット」を、研究する代謝パラメータの数および使用する装置数に応じて、約1分、5分、10分、15分、20分、25分、30分おきなど、定期的に獲得することができる。
【０１４４】
メタボローム データについてのベクトルr
本発明のオンラインMFAでは、「変化率」データ、つまり現在の代謝測定値と前回の測定値の差が使用される。この差は計算され、エラー解析用の「未加工の測定値」ベクトルに保存されて、使用できるようになる。こうして、一面において、「前処理ユニット」は、代謝フラックス分析の前の測定についてエラーを除去し、品質の高いデータの使用を確保するために使用される。下記の例1を参照。
【０１４５】
コンピュータ システム
一面において、本発明の方法では、時間経過にともなう測定代謝パラメータの変化をリアルタイムでモニタリングするために、コンピュータを導入した方法/プログラムが使用される。本発明の方法は、任意のプログラム言語またはコンピュータ/プロセッサを使用して、また任意の既知のソフトウェアまたは方法論とともに実施することができる。例えば、MATHEMATICA 4.1TMや、その変形など、MATHEMATICATM（Wolfram Research, Inc., Champaign, IL）と呼ばれるプログラムの1つを使用できる。これについては、下記の例1を参照。また、Jamshidi（2001年）Bioinformatics 17(3):286-287、Wilson （2001年）Biophys. Chem. 91(3):281-304、Torrecilla（2001年）J. Neurochem. 76(5):1291-1307なども参照。
本発明の方法を実施するために使用するコンピュータ/プロセッサとしては、マイクロプロセッサ、機械読取可能なメモリーユニット、およびデータ転送バス等の各種コンピュータ装置のほか、図形コントローラ、ならびに1つまたは複数のCRTモニターやLCDモニター等のディスプレイ装置などを含むパーソナル ワークステーションまたは携帯型コンピュータなどの従来的な汎用デジタルコンピュータを使用でき、さらに、コンピュータには、リアルタイムの測定データを受取るための検出サブシステム付のデータ収集インタフェースや、コンピュータで生成された制御コマンドを直接的またはその他のなんらかの制御装置を経由して間接的に制御可能な細胞環境または細胞改変サブシステムに送出す制御インタフェースも含めることができる。記憶装置の例としては、ダイナミックRAM、フラッシュメモリー等の任意の形態の記憶素子、磁気ディスクメモリーや光ディスクドライブなどの大容量記憶装置などがある。コンピュータ ソフトウェアを、少なくともその一部を1つまたは複数の適切な記憶装置に保存することもできる。
【０１４６】
例えば、Intel製マイクロプロセッサを搭載し、Windowsオペレーティングシステムを実行するものなど、従来的なパーソナルコンピュータが使用できる。この発明の方法の実施には、任意のハードウェアまたはソフトウェアの構成が使用できる。例えば、その他のよく知られたマイクロプロセッサを搭載し、UNIXTM、Linux、MacOS、その他のオペレーティングシステムソフトウェアを実行するコンピュータが意図される。
【０１４７】
細胞操作、タンパク質発現プロファイリング、ペプチドの示差的標識化のための改良された方法、およびそのための新しい試薬
本発明は、生体分子の複雑な混合物で個々のタンパク質を識別し、同時にそれらのタンパク質の発現レベルの量を測定する方法、例えばプロテオーム分析を提供する。この方法では、タンパク質の2つ以上のサンプルが比較され、そのうちの1つは標準サンプルとされ、他のすべては研究中のサンプルとされ得る。標準のそして研究されるサンプルの中のタンパク質は、例えば、タンパク質分解の消化および/またはその他の酵素反応、あるいは物理的な断片化方法によって、一連の化学改変、つまり示差的化学的標識化、および断片化のそれぞれの対象となる。化学改変は、ペプチドへのポリペプチドの断片化／消化の前あるいはその後に、あるいはその前後に行ってもよい。
【０１４８】
標準のそして研究されるサンプルより抽出されたペプチドは、異なる質量の残留化学物質で標識化されるが、両方のサンプルと同じ配列のあるペプチドのような類似する特性のあるものは、分離法でともに溶出され、質量分析に関するそのイオン化および検出特性は非常に類似している。示差的な化学標識化は、タンパク質およびペプチドのカルボキシ-および/もしくはアミノ-末端のいくつかもしくは全部、および/または選択されたアミノ酸側鎖における反応性官能基上で行われ得る。化学的標識化、タンパク質分解の消化およびその他の酵素反応工程、物理的な断片化および/または分画の組合せによって、種々の残基へのアクセスを一般に異なる特異的標識化ペプチドに提供し、方法の全体的な選択性が増強され得る。
標準的且つ研究されたサンプルが組合わされ、多次元的クロマトグラフィーによる分離の対象となり、質量分析方法によって分析される。質量分析データは、ペプチドとタンパク質の識別および定量化を考慮に入れる特定のソフトウェアによって処理される。
【０１４９】
タンパク質サンプルの複雑性や組成によって、1つ以上の化学改変工程、タンパク質分解の消化あるいはその他の酵素反応工程、または物理的な断片化工程の前に、サイズ排除、イオン交換、逆相あるいは、その他の親和性精製法のような方法を使用して、タンパク質分画を実行するのが望ましい、あるいは必要である場合がある。
ペプチドの結合混合物は、タンデム型質量分析装置のような連結質量分析装置に送り込まれる前に、多次元液体クロマトグラフィー、システムのようなクロマトグラフィー法によって最初に分離される。多次元液体クロマトグラフィーおよびタンデム型質量分析の組み合わせは「LC-LC-MS/MS」と呼ばれる。LC-LC-MS/MSは、例えばLink (1999年) Nature Biotechnology 17:676-682; Link (1999年) Electrophoresis 18:1314-1334に記述されるように、Link A. and Yates J. Rによって最初に開発された。
【０１５０】
本発明の方法を実施する際に、タンパク質を、対象の生体サンプルから大幅にあるいは部分的に最初に分離することができる。ポリペプチドは選択的に示差的標準化する前に処理されうる。例えば、それらは変性、還元することができ、組織標本を脱塩することなどができる。タンパク質のサンプルの、示差的に標識化されたペプチド混合物への転換には、予備的な側基および／または末端の化学的および/または酵素的改変；タンパク質分解的消化あるいは断片化；側基および/または末端の消化後または断片化後の化学的および/または酵素的改変が含まれうる。
示差的に改変されたポリペプチドおよびペプチドがその後、1つ以上のペプチド混合物に組合わされる。望ましいあるいは必要である場合は、溶剤あるいはその他の試薬を取り除くか、中和する、あるいは薄めることができる。バッファーを改変するか、あるいは、「MudPIT」（以下を参照）ローディングバッファーのような1つ以上の異なるバッファーにペプチドを再溶解することができる。その後、ペプチド混合物は、液体クロマトグラフィーカラム、2Dキャピラリーカラムあるいは多次元的クロマトグラフカラムのようなクロマトグラフィーカラムに負荷され、溶出液が生成される。
【０１５１】
溶出液がタンデム型質量分析器のような質量分析器に送り込まれる。一面において、LC ESI MSおよびMS/MSの分析が完了する。最後に、データベース探索およびデータ分析を使用して、データ出力が適切なソフトウェアによって処理される。
本発明の方法を実行する際に、大量のペプチドが質量分析法による分析のために生成することができる。2つ以上のサンプルが各サンプルの選択的標識化により示差的標識化されることができる。ペプチド改変、つまり、標識化は安定している。異なる質量あるいは反応性の基がある試薬を反応性の基および示差的標識化されたサンプルの数を最大限にするために選ぶことができ、それにより、サンプル、ポリペプチドおよびペプチドの多重分析が可能になる。一面において、ここに説明するとおり、「MudPIT」プロトコルがペプチド分析のために使用される。本発明の方法は完全に自動化することができ、本質的にサンプルのすべてのタンパク質を分析することができる。
【０１５２】
他の方法で定義していない限り、ここで使用した全ての技術的・科学的用語は、この発明に属する技術分野の熟練者により、共通して理解される意味を有する。ここで使用されている以下の用語には、他の方法で指定されていない限り、それ等に与えられた意味を有する。
本明細書において用いられる用語「アルキル基」は、分枝または分枝でない飽和または不飽和の一価の炭化水素基を含んでいる化合物の属を参照するために使用され、前記化合物の置換誘導体およびその等価物を含む。一面において、炭化水素は、約1から約100の炭素、約1から約50の炭素か約1から約30の炭素、約1から約20の炭素、約1から約10の炭素を持っている。アルキル基に約1から6の炭素原子がある場合、それは「低級アルキル」として参照される。適切なアルキル基には、例えば、非環式および/または環式の形状に配置された1つ以上のメチレン基、メチン（methine）基および/またはメチン（methyne）基を含む構造などが含まれる。分枝構造には、イソプロピル、第三ブチルイソブチル、2-エチルプロピルなどに類似する分岐モチーフがある。ここで使用されているように、その用語は「置換アルキル」を含む。「置換アルキル」は、低級アルキル基、アリール基、アシル、ハロゲン（つまりアルキルハロ、例えばCF3）、水酸基、アミノ、アルコキシル基、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールアミノ、アリールオキシアルキル、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和あるいは不飽和の環状炭化水素、ヘテロ環のような1つ以上の官能基を含む上述のアルキルを指す。これらの基はアルキル部分の炭素に結合される場合がある。さらに、これらの基はアルキル鎖から飛び出ているか、あるいは統合されている。
【０１５３】
用語「アルコキシル」は、ここではCOR基を指すために使用され、式中、Rは低級アルキル、置換の低級アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキルまたは置換アリールアルキルを示し、アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキルおよび置換アリールアルキル基は本明細書に記載されるようなものである。適切なアルコキシル基には、例えば、メトキシ、エトキシル、フェノキシ、置換フェノキシ、ベンジルオキシ フェネチルオキシ、第三ブトキシなどが含まれる。
用語「アリール」は、共に融解する、電子対を共有して結合するかメチレンあるいはエチレン部分のような共通基に結合する単一の芳香環、あるいは複数の芳香環を指すためにここでは使用される。共通の結合基はベンゾフェノンでのようなカルボニルである場合もある。芳香環にはフェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチルおよびベンゾフェノンが特に含まれる場合がある。用語「アリール」には「アリールアルキル」が含まれる。「置換アリール」は、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例えばCF3）、水酸基、アミノ、アルコキシル、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、フェノキシ、メルカプトのような1つ以上の官能基を含む上述のアリール、および芳香環に融合する、共有的に結合する、またはメチレンあるいはエチレン部分のような共通の基に共有結合する、飽和あるいは不飽和の両方の環状炭化水素を指す。結合基は、シクロヘキシルフェニルケトンのカルボニルである場合もある。用語「置換アリール」は「置換アリールアルキル」を含む。
【０１５４】
用語「アリールアルキル」は、ここに定義するように、アリール基がアルキル基にさらに結合する、「アリール」の部分集合を指すためにここで使用される。
用語「ビオチン」は、ここで使用しているように、この技術分野でよく知られる天然あるいは合成ビオチンあるいはその変異体を指す。ビオチンのリガンドおよびリガンドに対するビオチンの親和性を改変する方法もこの技術分野でよく知られている。米国特許第6,242,610号、第6,150,123号、第6,096,508号、第6,083,712号、第6,022,688号、第5,998,155号、第5,487,975号などを参照。
「質量分析法による分析でイオン化および検出の性質が異ならない・・・標識化試薬」という表現は、標識化試薬の量および/または質量配列(mass sequence)が、同じ質量分析法の条件および検出装置を使用して検出されうることを意味する。
【０１５５】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の合成、非天然のアナログから完全に組成される天然および合成のポリペプチド、あるいはミメティクスを含むか、あるいは部分的に天然のペプチドアミノ酸やアミノ酸の部分的に非天然のアナログのキメラ分子でありえる。ここで使用されているように、用語「ポリペプチド」には、すべてのサイズのタンパク質およびペプチドが含まれる。
用語「サンプル」には、ここで使用されているように、天然資源からのサンプルあるいは完全に合成のサンプルを含む、ポリペプチドを含むサンプルが含まれる。
用語「カラム」は、ここで使用されているように、ビーズ、フィラメント、アレイ、チューブなどのものを含む基質表面を意味する。
句「クロマトグラフィーによる保持特性において異ならない」は、ここで使用されているように、液体クロマトグラフのようなクロマトグラフにおいて、全く同じである必要はないが、本質的に、2つの成分に同じ保持特性があることを意味する。例えば、2つの成分が共に溶出する場合、それらはクロマトグラフィーによる保持特性において異ならない。つまり、それらは、この技術の熟練者が同じ溶出画分と考えるものを溶出する。
【０１５６】
ペプチドとポリペプチドの示差的標識化
本発明の方法を実行する際に、タンパク質とペプチドは、一連の化学改変つまり示差的化学標識化を行われる。化学改変は、ポリペプチドのペプチドへの断片化／消化の前、その後、あるいはその前後に行うことができる。示差的標識化試薬は、同位体の組成の点で異なっており（すなわち同位体試薬)、構造的構成の点で異なっており（すなわち相同的試薬）、しかし、上述の特性を変更しないやや小さな断片によっては異ならない。すなわち、標識化試薬は分子の質量において異なるが、クロマトグラフィーによる保持特性において異ならず、また質量分析法による分析におけるイオン化および検出の性質においても異ならず、分子の質量の差を質量分析法による分析によって識別することができる。
本発明の一面において、「標準」タンパク質サンプルおよび「研究される」タンパク質サンプルのポリペプチドおよび/またはペプチドの混合物は、示差的試薬で別々に標識化されるか、あるいは、1つのサンプルは標識化され、他のサンプルは標識化されない。上述されるように、これらの示差的試薬は分子の質量において異なるが、使用される（例えばクロマトグラフィー）分離方法に関する保持特性においては異ならない。また、使用される質量分析方法は異なるイオン化および検出特性を検出しない。したがって、これらの示差的試薬はその同位体の組成において異なるか（つまり、それらは同位体的試薬である）、あるいは上述の特性を変更しないやや小さな断片によって構造上異なる（つまり、それらは相同的試薬である）。
【０１５７】
示差的化学標識化は、C-末端のエステル化、C-末端のアミド化および/またはN-末端のアシル化を含みうる。エステル化は、アミノ酸側鎖のペプチドおよびカルボン酸基のC-末端を標的とする。アミド化は、アミノ酸側鎖のペプチドおよびカルボン酸基のC-末端を標的とする。アミド化は、アミン基の保護を最初に必要とする場合がある。アシル化は、アミノ酸側鎖のペプチドおよびアミノと水酸基のN-末端を標的とする。アシル化は、カルボキシ基の保護を最初に必要とする場合がある。
この技術の熟練者は、本発明の方法を実行するために使用されるペプチドおよびポリペプチド（例えばエステル化、アミド化およびアシル化）の化学合成および示差的化学標識化が、科学および特許の文献に詳しく説明されている様々な手段および方法論によって行うことができることを認識するだろう。例えばその文献は、Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds), John Wiley & Sons, Inc., NY; Venuti (1989年) Pharm. Res. 6: 867-873; the Beilstein Handbook of Organic Chemistry (Beilstein Institut fuer Literatur der Organischen Chemie, Frankfurt, Germany); 入手可能なBeilstein オンラインデータベースおよび参照、「Organic Chemistry」、Morrison & Boyd, 7th edition, 1999年, Prentice-Hall, Upper Saddle River, NJ。本発明は、科学、特許の文献に詳しく記述されている技術分野で知られる方法あるいはプロトコルに関連して実行することができる。例えば、エステル化、アミド化およびアシル化反応は、次のような、先行技術で既に記述のある他のタイプの反応に類似する方法でペプチドの混合物に実行される場合がある：
【０１５８】
2005506840.tif 000002
【０１５９】
別の面では、試薬には次の一般式が含まれる：
ｉ．ペプチドC-末端および/またはGluおよびAsp側鎖をエステル化するZAOHおよびZBOH、
ii.ペプチドC-末端およびGluおよび/またはAsp側鎖とアミド結合を形成するZANH2 / ZBNH2、あるいは、
iii.ペプチドN-末端および/またはLysおよびArgの側鎖とアミド結合を形成するZACO2H / ZBCO2H、
ここにおいて、ZAおよびZBは、互いに独立するもので、R-Z1-A1-Z2-A2-Z3-A3-Z4-A4-でありえ、そしてZ1、Z2、 Z3、およびZ4は、互いに独立するもので、O、OC(O)、OC(S)、OC(O)O、OC(O)NR、OC(S)NR、OSiRR1、 S、SC(O)、SC(S)、SS、S(O)、S(O2)、NR, NRR1+、C(O)、C(O)O、C(S)、C(S)O、C(O)S、C(O)NR、C(S)NR、SiRR1、(Si(RR1)O)n、SnRR1、Sn(RR1)O、BR(OR1)、BRR1、B(OR)(OR1)、OBR(OR1)、OBRR1、OB(OR)(OR1)から選ぶことができ、あるいは、Z1、Z2、Z3およびZ4は、互いに独立するもので、存在しなくてもよく、そしてRがアルキル基である。そして、
A1、A2、A3およびA4は、互いに独立するもので、(CRR1)n から選択され、Rがアルキル基にある。別の面では、(CRR1)nからのいくつかのC-C一重結合が二重または三重結合と置換えられる場合があり、その場合に、ある基RおよびR1は存在せず、(CRR1)nは6つまでの置換基のあるo-アリーレン、m-アリーレンあるいはp-アリーレン、ヘテロ原子（O, N, S）のある、あるいはそのヘテロ原子のない、そして置換基のある、あるいは置換基のない環に8つまでの原子のある、炭素環式、二環式、あるいは三環式の断片である、あるいはA1、A2、A3およびA4は、互いに独立するもので、存在しなくてもよい。Z1 - Z4のその他のRおよびR1から独立し、A1 - A4のその他のRおよびR1から独立するR、R1は、水素、ハロゲンあるいはアルケニル、アルキニルあるいはアリール基のようなアルキル基でありえる。Z1〜Z4におけるnは、A1〜A4におけるnとは独立するもので、0〜約51、0〜約41、0〜約31、0〜約21、0〜約11または0〜約6の値を持ちうる整数である。
【０１６０】
別の面では、ZAはZBと同一構造であるが、同位体の組成は異なる。どんな同位体を使用してもよい。別の面では、ZAがx個の陽子を含む場合、ZBは陽子の場所にy個の重陽子、また対応して、残りのx - y個の陽子を含む場合がある：そしてZAがx個のホウ素-10を含む場合、ZBはホウ素-10の場所にy個のホウ素-11、また対応して、残りのx - y個のホウ素-10を含む場合がある：そしてZAがx個の炭素-12を含む場合、ZBは炭素-12の場所にy個の炭素-13、また対応して、残りのx - y個の炭素-12を含む場合がある：そしてZAがx個の窒素-14を含む場合、ZBは窒素-14の場所にy個の窒素-15、また対応して、残りのx - y個の窒素-14を含む場合がある：そしてZAがx個の硫黄-32を含む場合、ZBは硫黄-32の場所にy個の硫黄-34、また対応して、残りのx - y個の硫黄-32を含む場合（または上記のいずれかの場合）がある。異なる安定した同位体を持っている場合のあるすべての要素にこれが当てはまる。xとyは整数で、xはyより大きい。一面において、xとyは1と約11の間、1と約21の間、1と約31の間、1と約41の間、1と約51の間にある。
【０１６１】
別の面では、試薬ペア／シリーズには次の一般式が含まれる：
ｉ．ペプチドC-末端をエステル化するCD3(CD2)nOH / CH3(CH2)nOH、n = 0, 1, 2, ・・・, y（デルタ質量= 3+2n）。
ii.ペプチドC-末端とアミド結合を形成するCD3(CD2)nNH2 / CH3(CH2)nNH2、n = 0, 1, 2, ・・・, y（デルタ質量= 3+2n）。
iii.ペプチドN-末端とアミド結合を形成するD(CD2)nCO2H / H(CH2)nCO2H、n = 0, 1, 2, ・・・, y（デルタ質量= 1+2n）。
ここにおいて、yは約51、約41、約31、約21、約11、約6、あるいは約5〜51という値を持ちうる整数である。
【０１６２】
一般式によってその他の例示的試薬が示される：
ｉ．ペプチドC-末端をエステル化するZAOHおよびZBOH。
ii.ペプチドC-末端とアミド結合を形成するZANH2／ZBNH2。
iii.ペプチドN-末端とアミド結合を形成するZACO2H／ZBCO2H。
ここにおいて、ZAおよびZBは、R-Z1-A1-Z2-A2-Z3-A3-Z4-A4-となり
また、互いに依存しないZ1、Z2、Z3およびZ4は、O、OC(O)、OC(S)、OC(O)O、OC(O)NR、OC(S)NR、OSiRR1、S、SC(O)、SC(S)、SS、S(O)、S(O2)、NR, NRR1+、C(O)、 C(O)O、C(S)、C(S)O、C(O)S、C(O)NR、C(S)NR、SiRR1、(Si(RR1)O)n、SnRR1、Sn(RR1)O、 BR(OR1)、BRR1、B(OR)(OR1)、OBR(OR1)、OBRR1、またはOB(OR)(OR1)から選択される。Z1、Z2、Z3およびZ4は、互いに独立するもので、存在しなくてもよく、および、Rがアルキル基である。
A1、A2、A3およびA4は、互いに独立するもので、一般式 (CRR1) nを含む部分でありえる。別の面では、ある(CRR1)n基中のC-C一重結合が、二重または三重結合に置換えられる場合があり、その場合には、ある基RおよびR1は存在しないか、あるいは(CRR1)nが6つまでの置換基のあるo-アリーレン、m-アリーレンあるいはp-アリーレン、あるいはヘテロ原子（例えば、O、N又はS原子）のある、あるいはそのヘテロ原子のない、そして置換基のある、あるいは置換基のない環に8つまでの原子のある、炭素環式、二環式、あるいは三環式の断片でありえ、あるいはA1-A4は、互いに独立するもので、存在しない場合がある。
【０１６３】
別の面では、Z1 - Z4のその他のRおよびR1から独立し、A1 - A4のその他のRおよびR1から独立するR、R1が、水素、ハロゲンあるいはアルケニル、アルキニルあるいはアリール基のようなアルキル基でありえる。
Z1〜Z4におけるnは、A1〜A4におけるnとは独立するもので、約51、約41、約31、約21、約11、および約6の値を持ちうる整数である。
【０１６４】
別の面では、ZAはZBと類似構造を持つが、ZAは1つ以上のA1 - A4断片に余分のCH2-断片をx有する、および/またはZAは1つ以上のA1 - A4断片に余分のCF2-断片をx有する。あるいは、ZAはx個の陽子を含み、ZBは陽子の代わりにy個のハロゲンを含みうる。あるいは、ZAがx個の陽子を含み且つZBがy個のハロゲンを含む場合に、1つ以上のA1 - A4断片に残りのx - y個の陽子が存在する；および/またはZAは1つ以上のA1 - A4断片に余分のO-断片をx有する；および/またはZAは1つ以上のA1 - A4断片に余分のS-断片をx有する；および/またはZAが1x個の-O-断片を含む場合に、ZBは-O-断片の代わりにy個の-S-断片を含み得る、且つ対応して1つ以上のA1 - A4断片に残りのx - y個の-O-断片を含み得る；などである。
【０１６５】
別の面では、xとyは、1と約51の間、1と約41の間、1と約31の間、1と約21の間、1と約11の間、１と約6の値を持ちうる整数であり、xはyより大きい。
例示的な相同試薬ペア／シリーズは以下の通りである：
ｉ．ペプチドC-末端をエステル化するCH3(CH2)nOH/CH3(CH2)n+mOH（この式でn = 0、1、2・・・y、でm = 1、2・・・y）、（デルタ質量=14m）
ii.ペプチドC-末端でアミド結合を形成するCH3(CH2)n NH2 / CH3(CH2)n+mNH2（この式でn = 0、1、2・・・y、でm = 1、2・・・y）（デルタ質量=14m）
iii.ペプチドN-末端でアミド結合を形成するH(CH2)nCO2H / H(CH2)n+mCO2H（この式でn = 0、1、2・・・y、でm = 1、2・・・y）（デルタ質量=14m）
ここにおいて、yは約51、約41、約31、約21、約11、約6、あるいは約5〜51という値を持ちうる整数である。
【０１６６】
ペプチド／タンパク質の分離および検出方法 
本発明の方法では、タグが付けられたポリペプチドおよびペプチドを分離するためにクロマトグラフィーの技術を使用する。一面において、液体クロマトグラフィー、例えば多次元液体クロマトグラフィーが使用される。クロマトグラム溶出液は、タンデム型質量分析装置（例えば「LC-LC-MS/MS」システム）のような質量分析計に結合される。任意のその変化および等価物は、ペプチドを分離、検出するために使用されることができる。LC-LC-MS/MSは、例えばLink (1999年) Nature Biotechnology 17:676-682; Link (2000年) Electrophoresis 18, 1314-1334に説明があるように、Link A.およびYates J. Rによって最初に開発された。一面において、LC-LC-MS/MS技術が使用され、 それは複合ペプチドの分離に有効であり、簡単に自動化される。LC-LC-MS/MSは、「Multi-dimensional Protein Identification Technique（多次元タンパク質識別技術）」の頭字語「MudPIT」で広く知られている。
本発明の方法で使用されるLC-LC-MS/MSの変化および等価物は、陽イオン交換カラムに結合される逆相カラムを含んでいる（例えば、Opiteck (1997年) Anal. Chem. 69:1518-1524を参照）か、サイズ排除カラム（例えば、Opiteck (1997年) Anal. Biochem. 258:349-361参照）を含む方法を包含する。一面において、LC-LC-MS/MS技術は、強力な陽イオン交換（SCX）および逆相（RPC）樹脂を含んでいる混合ベッドマイクロキャピラリー カラムを使用する。その他の例示的方法には、一次元LC-ESI MS/MSと組合わされたタンパク質分画、あるいはMALDI MS/MSと組合わされたペプチド分画が含まれる。
タンパク質サンプルの複雑性あるいは特性によって異なるが、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、あるいは可能な親和性精製のいずれかを含むタンパク質分画法が、標識化やタンパク質分解に先立って導入されることができる。状況に応じて、サンプルの全てのタンパク質あるいは特定のタンパク質を識別するために、異なる方法を使用する必要がある場合がある。
【０１６７】
配列の分析と定量
改変ペプチドが由来するタンパク質の量および配列識別の両方を「多段階質量分析法」（MS）のような質量分析装置で決定することができる。これは、キャピラリーカラムから溶出するペプチドの相対的な量の測定と選択したペプチドの配列情報の記録の間を連続的にスキャンする際に互い違いになる、デュアルモードの質量分析計のオペレーションによって行われることができる。ペプチドは、示差的にタグが付けられ、したがって、示差的標識化試薬内に質量示差的にコードされる質量において異なる同一配列のペプチドイオンのペアあるいはシリーズの相対的な信号強度、MSモードで測定することにより量が計測される。
ペプチドの配列情報は、例えばLink (1997年) Electrophoresis 18:1314-1334; Gygi (1999年) Nature Biotechnol. 17:994-999; Gygi (1999年) Cell Biol. 19:1720-1730に記述されるように、タンデム型MSモードで作動する質量分析計の衝突誘起解離（CID）の特定の質量対電荷数（m/z）比率のペプチドイオンを選択することにより、自動的に生成することができる。
結果として生じるタンデム型質量スペクトルを、一定の規則によって並べられたペプチドが作り出されたタンパク質を識別する配列データベースに関連させることができる。例示的な市販の利用できるソフトウェアにはカリフォルニア州サンホセThermo Finnigan のTURBO SEQUESTTM、Matrix ScienceのMASSSCOTTM、Proteometrics のSONAR MS/MSTMが含まれる。従来のソフトウェア修正が自動相対定量化に必要な場合がある。
【０１６８】
質量分析装置 
本発明の方法では、示差的標識化されたペプチドおよびポリペプチドを識別及び定量化するために、質量分析法を使用する。どんな質量分析システムでも使用することができる。発明の一面において、ペプチドの結合混合物が、タンデム型質量分析、あるいは、「LC-LC-MS/MS」に結合された多次元液体クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法によって分離される（Link (1999年) Biotechnology 17:676-682; Link (1999年) Electrophoresis 18:1314-1334などを参照）。例示的には、質量分析装置には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間計測（MALDI-TOF）質量分析を組込んだこれらのものを含む（Isola (2001年) Anal. Chem. 73:2126-2131; Van de Water (2000年) Methods Mol. Biol. 146:453-459; Griffin (2000年) Trends Biotechnol. 18:77-84; Ross (2000年) Biotechniques 29:620-626, 628-629などを参照）。MALDI-TOF MSに固有の高い分子量分解能は、正確な計量を実行するために高い特異性や優れたSN比を伝える。
MALDI-TOF MS、核酸のハイブリッド形成の検出や、核酸配列決定におけるその使用を含む、質量分析法の使用が、この技術分野においてよく知られている。米国特許第6,258,538号、第6,238,871号、第6,238,869号、第6,235,478号、第6,232,066号、第6,228,654号、第6,225,450号、第6,051,378号、第6,043,031号などを参照。
【０１６９】
断片化とタンパク質分解の消化 
本発明の方法を実行する際に、ポリペプチドが、例えば、タンパク質分解、つまり、酵素、消化および/または他の酵素反応、あるいは物理的な断片化方法によって断片化される。断片化は、本発明の方法で使用される標識化試薬でペプチド／ポリペプチドを反応させる前および/または後に行ってもよい。
ポリペプチドのタンパク質分解性による切断方法はこの技術分野においてよく知られている（例えば、酵素はトリプシン（米国特許第6,177,268号、第4,973,554号などを参照）、キモトリプシン（米国特許第4,695,458号、第5,252,463号などを参照）、エラスターゼ（米国特許4,071,410番などを参照）、そしてサブチリシン（米国特許第5,837,516号などを参照）、等々を含む）。
【０１７０】
一面において、発明のキメラ標識化試薬には、切断可能なリンカーが含まれる。例示的な切断可能なリンカー配列は、例えば、Factor Xaあるいはエンテロキナーゼ（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）を含む。金属キレート化ペプチドのようなその他の精製促進領域を使用することができる。それは例えば、固定した金属の精製を可能にするポリヒスチジン路およびヒスチジン−トリプトファン モジュール、固定した免疫グロブリンの精製を可能にするタンパク質A領域、そしてFLAGS拡張／親和性精製システム（Immunex Corp、ワシントン州シアトル）で利用される領域である。
【０１７１】
生体サンプル 
この方法は、タンパク質の2つ以上のサンプルの比較に基づき、そのうちの1つは、標準サンプルとされ、他のすべては研究中のサンプルとされる。例えば、一面において、本発明は、少なくとも2つの細胞状態：例えば、活性化細胞に対する休止細胞、正常細胞に対する癌細胞、幹細胞に対する分化細胞、損傷細胞または感染細胞に対する未損傷細胞または非感染性細胞、の間のタンパク質発現における変化を定量化する方法、または、所定の細胞状態に関連して発現されるタンパク質を規定する方法を提供する。
サンプルは、細胞を含む生体供給源、例えば細菌、昆虫、酵母、哺乳動物などから得ることができる。細胞は、体液または組織供給源から採取され得るか、またはin vitroの細胞株若しくは細胞培養であってもよい。
【０１７２】
検出装置と方法
本発明の装置と方法は、米国特許番号第6,197,503号、第6,197,498号、第6,150,147号、第6,083,763号、第6,066,448号、第6,045,996号、第6,025,601号、第5,599,695号、第5,981,956号、第5,698,089号、第5,578,832号、第5,632,957号などで記述されるような、検出装置の全体あるいは一部分の操作に組込まれてもよい。
【０１７３】
微生物の脂質のプロファイリング
本発明は、異なる微生物種の「フィンガープリント」プロセスとして、脂質種の示差的輪郭を提供する。この方法は、単一細菌の培養あるいは母集団の生理学的状態を評価するために使用することができる。本プロセスでは、多くの様々な生物体がその原形質膜の脂質組成に本質的な違いを持っているという事実を利用する。本発明のプロセスは、トリグリセリド内に含まれるコンビナトリアル情報を利用するが、これは細菌をタイピングするFAME（脂肪酸メチルエステル分析）のような以前に用いられている方法を大幅に進歩している。本発明のプロセスは、脂質特異抽出手続、進歩したスペクトルの一致するアルゴリズムで高解像度ナノスプレー質量分析法の組合わせを使用する。本発明は、細菌培養物をタイピングする迅速な手段、あるいは培養物の迅速な品質管理としての手段を提供する。標準的な16S配列決定方法に対するこの方法の利点は、速さである。ワークフローの自動化を使用すると、少なくとも100のサンプルを一つの道具で1時間以内に処理することができる。
【０１７４】
細菌の培養の類型化は一般的に、現在は旧式となったFAME分析と16S類型化を使用して実行される。16S類型化は一般的に、DNAのヌクレオチドの配列決定を行う前に、DNAの伸張を増幅するためにPCRを使用して実行される。選択16S標的の配列に対する細菌のDNAのハイブリッド形成のような別の方法も存在する。配列決定のみによって、系統学的関連性を決定するための情報が提供されるが、しかしながら、この方法は通常の分析方法としては時間がかかる。例えば、M. tuberculosis detection using fatty acid profiling, and Diagn Microbiol Infect Dis 2000年 Dec;38(4):213-221; Gut 2001年 Feb;48(2):198-205; Appl Environ Microbiol 2000年 Apr;66(4):1668-75; Int J Syst Bacteriol 1996年 Apr;46(2):466-9を記述する米国特許第5,776,723号を参照。
【０１７５】
本発明の方法は、脂質分子内に記録されるコンビナトリアル情報の利点、そして様々な細菌の種が異なる脂質組成を持っているという事実を利用している。更に、脂質の合成および改変は、細胞の代謝状態によって異なり、それにより、細胞の状態および代謝に関する補足情報を提供する。
特に、本発明の方法は、質量分析によって組成を決定する前に（付録を参照）、脂質抽出法を使用する（付録を参照）。データが記録され、「フィンガープリント」される。このフィンガープリントによって、重複する情報が削除され、特性およびユニークな脂質種の質量および存在度が保存される。このように、すべての新しい質量スペクトルは、種類型化のために特性フィンガープリントのデータベースに対して照合することができる。
【０１７６】
すべての脂質分子は酵素によって触媒された生化学的合成の結果である。脂質合成および修飾の代謝経路がよく理解されているために、既知の経路への質量分析法による分析によって識別された種を位置づけることができる。この相互関係によってもたらされた情報は、細胞の代謝状態の記述子として開発することができる。脂質プロフィールが細胞のストレス、栄養素の有効性および成長過程の影響を受けるために、これは特に有用である。
本発明の方法は、脂質の組合せの複雑性を保存するために、従来のFAME方法（脂肪酸メチルエステル分析）よりも優れている。FAMEは、脂肪酸の化学的誘導体を作成することによりリピドームの複雑性を縮小する。リン脂質あるいはトリグリセリドが頭部、そして2つあるいは3つの脂肪酸の尾から成り、頭部と脂肪アシルの種が異なるために、すべての脂質の合計はすべての脂肪酸の合計よりもその複雑性は大規模である。
【０１７７】
速い原子衝撃あるいは全体の細菌のMALDIに基づいた、その他の質量分析法に基づく方法とは異なり、本発明の方法は、より感度が高く、はるかに複雑なプロフィールを分析することができる。
本発明のこの面では、GC-MS（FAME ANALYSIS）あるいはelectrospray-MSと共に実行することができる。後者は、2つあるいは3つの脂肪酸部分から成る脂質を含む、損傷のない脂質を測定するために使用されている。損傷のない脂質が脂肪酸および頭部の連結スペースを確保するために、脂肪酸種だけよりも脂質種により多様性がある。本発明は、損傷のない脂質の「フィンガープリント」を測定する。この情報は、種の同一性および/または種の成長環境に関連づけることができる。この方法は、損傷のない脂質種のより詳細な測定とFAMEの概念を組合わせる。
本発明の方法を実行するための例示的な脂質抽出プロトコルは、下記の例5に記述される。
【０１７８】
全細胞操作におけるタンパク質プロフィールおよび活性における変化のモニタリング 
本発明は、複合タンパク質混合物を単純化し、量的に大幅に異なるタンパク質を識別するために単純化された混合物を定量分析する、斬新なプロテオミクス戦略を提供する。本発明は、さらに細胞母集団を改変する方法を提供する。本発明は、示差的なタンパク質レベルを測定し、タンパク質の配列決定によって示差的に発現したタンパク質を識別するために、連結する液体クロマトグラフィーおよび質量分析計プラットフォームを確立する。したがって、発明のある面では、示差的なタンパク質レベルを測定し、タンパク質の配列決定によって示差的に発現したタンパク質を識別するために、連結する液体クロマトグラフィーおよび質量分析計プラットフォームを含むシステムが含まれる。
【０１７９】
別の面では、この方法では、FPLCによる細胞の細分画、示差的ICAT標識化、および/またはペプチドを生成する酵素的消化を使用する。一面において、二次元HPLC分離および/またはES-MS/MSがこれに続く。この戦略は、複合タンパク質混合物の量的差違を識別し、かつ質量スペクトル配列決定によってペプチドおよび対応するタンパク質を識別する包括的なプラットフォームを提供する。
一面において、質量および配列情報がデータベース上にコードされる。したがって、この方法は、質量および配列情報を含むユーザーインターフェースをコンピュータプログラム製品に供給する。発明のデータベースは、もしあれば、対応する遺伝子を識別するためにデータベース探索のために公共のあるいは個人のゲノムデータベースに提出することができる。
【０１８０】
ゲノムの配列が知られていない場合、示差的に発現したタンパク質は、質量分析計に直接、一定の規則にしたがって並べられる。獲得したデータはすべて集められ、編集および後のデータマイニングに備えてデータベース構造で保存することができる。
これらの方法は全細胞最適化方法で使用される。したがって、本発明は、斬新な遺伝および生理学的特性で細胞を作るモニタリングおよび設計ツールの非常に精巧で相互に連結するネットワークを提供する。発明のシステムおよび方法は、プロセスあるいは環境での特定の有益な必要条件を満たすために、生物体を特別に設計するために使用される。
【０１８１】
全細胞システムから設計標的を得るために、すべての発現した遺伝子、突然変異体あるいは野生株で発現したすべてのタンパク質および代謝物質、あるいは異なる条件で成長した株菌のような「−オミクス」のレベルでの細胞の代表的な特徴が測定される。これらの細胞の基本構築単位は、特定の発現型に関連づけられる。本発明は、生物体がどのように環境あるいはタスクに適用するのか、また何が障害であるかといった本質的な情報を引き出すために、これらの相対的な測定を既存の情報の知識基盤と組合わせる。この情報は、障害を改善し、かつ望ましい功績を取り入れる、生物体の遺伝暗号に必要な調節および変更を加えるために使用される。新しい生物体は、分析中の、例えば、RNA発現輪郭化およびプロテオーム分析によって、望ましい特性をモニターすることにより評価される。最後に、新しい生物体は、産業条件下、例えば発酵で、生物体の適合性を検査することにより評価される。
【０１８２】
多次元マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）
本発明は、多次元マイクロ液体のクロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）の配置を含む方法およびシステムをさらに提供する。発明の多次元マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MSのシステムは、バイオインフォマティクス分析環境に連結することができる。μLCMS/MSのシステムは、高い処理能力、完全自動化方法でプロテオミクスに使用することができる。この技術はpIまたは分子量にかかわらずタンパク質の広い配列を識別するために使用することができる。さらに、従来の2Dゲル方法とは対照的に、このアプローチでは疎水性タンパク質および少量のタンパク質にアクセスすることができる。さらに、発明の3DμLC MS/MS技術は、高い感度でありえ、本質的なピーク容量があり、一面において、約10,000から1より大きなダイナミックレンジを提供することができる。例示的な多次元マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）の構成は、図15で例証される。
【０１８３】
発明の3DμLC MS/MSシステムの例示的な特徴は、液体クロマトグラフィーに使用される組織内に構築された三次元（3D）マイクロキャピラリーカラムである。図15は、例示的なマイクロキャピラリー カラムの図形を示し、3D分離を達成するためにカラムに圧縮される樹脂の配置を描写する。発明のシステムおよび方法は、逆相（RP1）、強力な陽イオン交換（SCX）および逆相（RP2）樹脂の構成を使用して、複雑なペプチド混合物のよい分離を提供する。
図15は、さらに最適のペプチド分離を達成するために様々な勾配溶出理論体系を使用することができることを示す。脱塩しない場合、ペプチド混合物の合計を直接3D マイクロキャピラリー カラム上に装荷することができる。吸収されたペプチドの離散的な画分は、逆相勾配（Xn-Xn+1%）を使用して、RP2からSCX区分まで置き換えることができる。前記ペプチド画分はSCX区分上に保持され、次に、塩の段階勾配を使用してSCXカラムからRPCカラム上に細分画され、前記ペプチドの一部は、混入している塩及びバッファーが洗い流される間に、RP1区分に溶出および保持される。細分画によって得られたペプチドは、同じ逆相勾配（Xn-Xn+1%）を使用して、RP1カラム上で分離することができる。タンデム型質量分析計によって、分離、溶出したペプチドの質量および配列を直接検出することができる。このプロセスは、逆相勾配による各段階に続くSCXカラムからの追加の細画分を置き換えるために増加する塩濃度を使用して繰り返すことができる。
【０１８４】
塩段階の全配列を完了すると、より高い逆相勾配（例えばXn+1-Xn+2%、Xn+2> Xn+1、n=0, 1, 2, 3・・・、X1=0）を使用してプロセスを繰り返すことができる。サイクルの各々は、ペプチドの複雑性によって異なるサイクルの総数で、反復するやり方で使用することができる。複合タンパク質混合物の処理に、6-12の塩勾配段階の前に、約3-6のアセトニトリル サイクルを含めることができる。断片のすべてのMS/MSのデータは、データベース探索により分析することができる。図15および図16は、この例示的な3D LCセットアップおよびプロセスを例示する。図16は、（ステップ1として）例示的な3Dカラム組織標本およびサンプル装荷、また（ステップ2として）発明の例示的な3-D μLC MS/MSシステムの3-D分離を例示する。
【０１８５】
初期段階の研究では、酵母プロテオームおよびストレプトマイセスプロテオームをプロファイリングするために例示的な3DμLC MS/MS技術を使用して行なわれた。このプロジェクトの目標は、複雑なペプチド内にできるだけ多くの酵母あるいはストレプトマイセス（S. diversa）のタンパク質を発見することだった。可溶性の膜付随性および膜複合的膜タンパク質抽出物が、各サンプルから調製された。抽出物は、尿素がある状態でヨードアセトアミドで縮小／アルキル化が実行された後で、Lys-Cおよびトリプシンで連続的に処理された。ペプチド混合物はその後、図2に詳細に記述されるように3DμLC MS/MSシステム上で分析された。この手順は、高いピーク容量および高分解能の分離に有効であることが分っている。3Dカラムを作るために2つの別個のカラムを使用した。第1RPおよびSCXは、180μmキャピラリーカラムに直列に詰められ、第2RPは250μmキャピラリーカラムに詰められた。これらの2つのカラムはともにミクロユニオンを用いて連結された。総ペプチド混合物は、RP2によって3Dカラムへ直接装荷された。RP2はその後、切り離され、反転されて、SCX+RP1に再結合された。全ペプチドゾーンはSCX領域に非常に近いはずである。
【０１８６】
タンパク質の識別は、酵母あるいはストレプトマイセス（S. diversa）のいずれかより予測されたタンパク質の配列に獲得したMS/MSスペクトルを一致させることにより達成された。1000を越えるタンパク質は、各3D LC MS/MSの実験から識別することができる。
ストレプトマイセス（S. diversa）における天然産物の生合成経路の異質発現が、本発明の方法を使用してさらに検出された。図17は、抗生物質ピューロマイシンの生合成経路を例示する。これらの実験については、S.diversaのDS10株菌が、新しい株菌DS10-ピューロマイシンを作成するピューロマイシン合成に必要な遺伝子をすべて含んでいるプラスミドで転換された。この研究の目標は、DS10ピューロマイシン株菌中のピューロマイシン生合成に必要な10の酵素のすべての少なくとも1つのペプチドを検出することだった。
可溶性の膜付随性および膜複合的膜タンパク質抽出物が、株菌DS10およびDS10-ピューロマイシンから調製された。抽出物は、尿素がある状態でヨードアセトアミドで縮小／アルキル化が実行された後で、Lys-Cおよびトリプシンで別々に処理された。
表1は、モデルペプチドに最適のエステル化条件を示す：
【０１８７】
表1：モデルペプチドに最適のエステル化条件
2005506840.tif 000003
【０１８８】
ペプチド混合物はその後、3DμLC MS/MSシステムで分析され、S.diversaとピューロマイシン生合成経路の成分の両方から予測されたタンパク質配列に、獲得したMS/MSスペクトルを一致させることにより、タンパク質の識別が達成された。DS10-ピューロマイシンの可溶の断片から抽出された抽出物で、ピューロマイシン経路からの10のユニークなタンパク質がすべてこの分析で識別された。図18は、ピューロマイシン経路から3つの酵素について検出された、代表的なペプチドを例示する。これらのタンパク質の明白な識別に結びつく経路から各酵素について多数のペプチドが検出されたことに注意のこと。
さらに、800を越える可溶タンパク質が、両方のS.diversa菌株で識別された。図18は、経路エンジニアリングの後に経路に関連するタンパク質の識別の例を例示する。プロテオーム分析によって検出されたペプチドが強調される。
【０１８９】
定量的プロテオミクス法のデータ分析面：
一面において、下記の1および2に述べられるように、示差的に標識化したペプチドから得たLC-MSあるいはLC-LC-MSデータは、次の例示的な分析の対象となる。分析1は分析2より一般的に正確である。しかしながら、両方の分析を定量的プロテオミクス分析で使用することができる。
１．次のサブステップからなる成分抽出物：
ａ．LC溶出の始めからのすべてのMSのスペクトルについては、局所ノイズバックグラウンド上にあり、主にC12同位体を含んでいる「重要な」イオンを選択する。
ｂ.すべての「重要な」イオンについては、近隣のMSスペクトルを使用して、「選択したイオンクロマトグラム」を生成する。領域の幅は少なくともペプチド溶出（D0）の予測される幅の2Xであるべきである。
ｃ．「選択したイオンクロマトグラム」に基づいてピーク位置、品質、面積およびベースラインレベルを決定する。
ｄ．LC溶出ピークに必要な品質を超え、且つ「重要な」イオンの溶出境界線内に位置する「有効な」成分を保存する。
ｅ．そのm/z（質量対電荷数の比率）値、および適切な許容度を考慮した溶出時間に基いて利用可能な場合は、前記成分をMS/MSのスペクトルにリンクさせる。
【０１９０】
２．同時に、ペプチドのMS/MSのスペクトルが得られる場合、前駆イオンの強度が下記のように抽出される：
ａ．複製されたMS/MSのスペクトルが次のアルゴリズムを使用して識別される：
ｉ．LC溶出の始めからのすべてのMS/MSのスペクトルについては、すべてのMS/MSのスペクトルと比較する。
ii．同位性が断言されたスペクトルとは、次の必要条件を満たすスペクトルペアである：
１．それらの前駆イオンのm/z値は所定の許容度内にある。
２．それらの溶出時間は所定の許容度内にある。
３．それらの「痕跡」のピークは、所定の一致度を達成した。
４．それらの前方および後方の「ドット積」は、所定のしきい値を超過する。
ｂ．複製されたスペクトルは、ピークのm/z位置に基づいてマージされる。最初の（T1）および最後の（T2）スペクトルの溶出時間は、マージされたスペクトルの記述の一部として保存される。
ｃ．前駆イオンの強度は、前駆イオンが検出される領域を統合することにより、MS1スペクトルから計算される。この領域は、D0が1.bで定義される（T1 - D0 / 2, T1 + D0 / 2）として定義される。
３．予測された質量差と組合わせ、予測可能な溶出の性質に基づいた、示差的標識化されたペプチドのシリーズを再建する。
【０１９１】
この上記の記述された例示的データ分析方法およびLC-MSあるいはLC-LC-MS定量的プロテオミクスデータの解釈は、図19A から図19Gで例証される。
例示的な方法では、LC-MSあるいはLC-LC-MSデータから効果的にペプチドに関する定量的情報を引き出すことができる。この「成分」のリストには、ノイズおよび人工物がほとんどない。スペクトル比較アルゴリズムは特に等価物スペクトルを識別することができる。それは、MSおよびMS/MSのスペクトルを含む質量スペクトルに当てはめることができる。本発明のシステムおよび方法を使用して、予測された溶出および質量値の組合わせを利用する示差的に標識化されたペプチドの再構成が、有効かつ包括的となりえる。
【０１９２】
蛍光色素によるタンパク質の示差的標識化
本発明は、蛍光色素でタンパク質を示差的標識化し、その後多次元液体クロマトグラフィーシステムを使用して配列分析を分離分類する方法を提供する。発明のこの面では、多次元のカラムシステムおよび蛍光検出システムの助けを借りて2つ以上の複合タンパク質サンプルを直接量的に比較することを可能にする。
一面において、本発明は、プラットフォームおよび蛍光色素を含むシステムを提供する。色素は、ペプチドおよびタンパク質でアミンと共有結合を形成することができる。本発明では、タンパク質の複雑な混合物を分離するために多次元液体クロマトグラフィーシステムを使用する。このシステムは、示差的標識化されたタンパク質の種を検出する蛍光検出器に連結することができる。一面において、このプラットフォームは小型化、完全自動化される。
【０１９３】
一面において、本発明は、多重タンパク質サンプルの直接比較や分類を可能にする液相クロマトグラフ法およびタンパク質標識の手段を提供する。一面において、3つまでの（あるいはより多くの）複合タンパク質サンプルが、色素、例えばCy染料（例えば、Cy2、Cy3およびCy5またはそのいずれか（Cy染料は、米国特許第5,268,486号、第5,569,587号、第5,627,027号等を参照））で示差的に標識化され、その後のいくつかの連続的集束法(focusing)およびクロマトグラフィーカラムで混合、分離される。3つのCy染料すべてに同一の電荷数および精製特性があるとすれば、これらの染料でタグを付けられたタンパク質は、同様の精製特性を示すべきである。標識化されたプロテオーム混合物は、順に結合されたいくつかのカラムで液体カラムクロマトグラフィーシステム上に適用される。可能な組合わせは、逆相に結合された強い陰イオン交換カラムが後続するIEFカラムとその他の混和性である組合わせである。例えば、集束法を行ったタンパク質画分は、イオン交換カラムに適用される。段階溶出は、これらの画分をさらに分離することができる逆相カラム上で実行することができる。この段階溶出／逆相の手順は、個々の等電点分離法について繰り返すことができる。タンパク質の溶出は蛍光検出器に経路を定めることができる。蛍光放射はすべてのCy染料波長でモニターすることができる。ソフトウェアは、溶出するピーク間の示差的濃度を検出し、示差的に発現したタンパク質ピークのフラクションコレクターを活性化する。検出技術に基づいた質量分析計によって、その後これらの画分がさらに分析される。別の面では、本発明は、多重カラムシステム、これらのシステムおよび方法の自動化および/または小型化を提供する。
【０１９４】
本発明のシステムおよび方法によって、示差的プロテオミクスの質、感度および処理能力が強化される。従来の電気泳動アプローチ、例えば2-D電気泳動（米国特許番号第6,136,173号、第6,127,134号（示差的2-D電気泳動）、第6,064,754号（示差的2-D電気泳動）などを参照）とは異なり、本発明の方法は複製が容易に可能で、全プロテオームを分析し、自動サンプル収集装置あるいはプロテオーム分析手段に連結することができる。本発明の方法は、液相内のすべての可溶化したタンパク質の分離を可能にし、例えば米国特許第6,013,165号（例えばPROTEINPROFILERTM分離）などに記述されるような、ある分離に一般的に関連する表面効果を回避することができる。
発明の多次元カラムシステムおよび対応する方法によって、非常に複雑なサンプルの分離が強化される。発明の蛍光標識化システムおよび対応する方法を使用することによって、示差的サンプルの貯蔵により直接的な比較ができる。蛍光検出が現在、検出形態における最も感度の高いものの1つであるために、本発明のシステムおよび方法は非常に感度が高い。
【０１９５】
本発明は、2つ以上のサンプルでタンパク質の濃度差を検出する。それは、タンパク質の示差的標識化を、既存のクロマトグラフィーによるタンパク質分離技術を使って、シアニン色素または同種のものと組合わせる。本発明の方法およびシステムには、示差的タンパク質の種を検出し、かつそれらを画分に分類する適切な蛍光検出器でFPLCシステムおよび/またはHPLCシステムの使用を含む。本発明は、示差的に発現したタンパク質サンプルの感度の高い前分画を提供する。この方法はICATの代わりに使用することができる。
【０１９６】
実施例
以下の例は例示のために提示されており、特許請求の範囲記載の発明を制限するものではない。
実施例１：代謝フラックス分析（MFA）
以下の例は、本発明の方法で細胞培養のリアルタイム分析に適用される例示的代謝フラックス分析（Metabolic Flux Analysis, MFA）の実行を記述する。図2は、コンピュータ プログラムによって実行されることのできる処理工程の一例を示す。
代謝フラックス分析（MFA）は代謝工学の重要な分析技術である。フラックスバランスは、様々な代謝生成物を相互に連結させる動的な質量バランス方程式を導く代謝システム内の各代謝生成物（yi）に対して書かれることができる。一般に、m化合物およびn代謝フラックスを含んでいる代謝ネットワークに対し、過渡的な物質バランスはすべて、単一のマトリックス方程式によって表すことができる：
【０１９７】
dY/dt=A X(t)-r(t)
各々の記号は次を示す
Y: 1細胞当たりの代謝生成物量のm次元ベクトル
X: n 代謝フラックス
A: 化学量論m x nマトリックス、そして
r: 測定による特定割合のベクトル
【０１９８】
代謝過渡現象を特徴づける時定数は、細胞の成長およびプロセス力学の時定数と比較して、典型的には非常に迅速であり、したがって、質量バランスは定常状態にある性質を単に考慮するためにのみ単純化することができる。派生収率を消去する：A X(t)=r(t)
m>=nでAが最大階数と仮定した場合の、上記方程式の加重最小自乗解は：X = (ATA)-1AT r。
溶液の感度を以下のマトリックスによって調査することができる：dX/dr = (ATA)-1AT。
上記のマトリックスの要素は、測定におけるエラーあるいは摂動に関して個々のフラックスの変化を決定するのに役立つ。
【０１９９】
入力
化学量論方程式
化学量論マトリックスは、分析で使用される化学方程式によって導き出される。マトリックスは、反応に含まれる化学種の係数から成る。行は種を表し、列は方程式を表す。例えば、細胞内のエネルギー生産の方程式を考慮する場合：
2 NADH + O2 + 6 ADP → 2 NAD + 2 H2O + 6 ATP
2 FADH + O2 + 4 ADP → 2 FAD + 2 H2O + 4 ATP
ATP → ADP
【０２００】
このシステムで、3つの列と全システムで考慮される種と同数の行を持つ化学量論マトリックスが導かれる。
【０２０１】
2005506840.tif 000004
【０２０２】
この場合、8つの種が考慮されるので、マトリックスは3x8である。
これらのテンプレートを使用すると、化学量論マトリックスは35x33となり、EXCEL 97TMのファイル「stoichiex.xls.」に見ることができる。これは上記に記述されたマトリックス「A」であり、下記の33の化学方程式より導かれる。
【０２０３】
1. 中央代謝経路
1) GLC + ATP + NAD → 2 PYR + ADP + NADH + H2O
2) PYR + NADH → LAC + NAD
3) PYR + NAD → ACCOA + CO2 + NADH
4) ACCOA + OAA + NAD + H2O → AKG + CO2 + NADH
5) AKG + NAD → SUCCOA + CO2 + NADH
6) SUCCOA + ADP + H2O + FAD → FUM + ATP + FADH
7) FUM + H2O → MAL
8) MAL + NAD → OAA + NADH
9) GLN + ADP → GLU + NH3 + ATP
10) GLU + NAD → AKG + NH3 + NADH
11) MAL → PYR + CO2
【０２０４】
2. 生物量合成：      C50.5％ H8.31％ O32.93％ N8.26％
12) 0.1016 GLC + 0.031 GLN + 0.008 ARG + 0.0003 ASN + 0.001 GLU + 0.0038 GLY + 0.0028 HIS +  0.0071 ILE + ).008 LEU + ).0043 LYS + 0.001 MET + 0.0152 THR + ).0051 VAL →  BIOMASS
【０２０５】
3. アミノ酸代謝
13) PYR + GLU → ALA + AKG
14) SER → PYR + NH3
15) GLY → SER
16) CYS → PYR + NH3
17) ASP + AKG → OAA + GLU
18) ASN → ASP + NH3
19) HIS → GLU + NH3
20) ARG + AKG → 2 GLU
21) PRO → GLU
22) ILE + AKG → SUCCOA + ACCOA + GLU
23) VAL + AKG → GLU + CO2 + SUCCOA
24) MET → SUCCOA
25) THR → SUCCOA + NH3
26) PHE → TYR
27) TYR + AKG → GLU + FUM + 2 ACCOA
28) LYS + 2 AKG → 2 GLU + 2 CO2 + 2 ACCOA
29) LEU + AKG → GLU + 3 ACCOA
【０２０６】
4. 抗体形成：
30) 1.05 ARG +1.98 ASN + 1.96 ASP + 1.42 GLU +1.31 GLY +1.59 ILE + 3.79 LEU + 1.97 LYS +0.67 MET + 0.95 PHE + 5.72 SER 1.32 THR 5.05 TYR +2.68 VAL → Ab
【０２０７】
5. エネルギー生産：
31) 2 NADH + O2 + 6 ADP → 2 NAD + 2 H2O + 6 ATP
32) 2 FADH + O2 + 4 ADP → 2 FAD + 2 H2O + 4 ATP
33) ATP → ADP
【０２０８】
他の数学ソフトウェアでこのマトリックスを使用するには、テキストファイルに変換されなければならない。数を含んでいるセルのみをハイライトし、編集メニューからコピーを選び、ノートパッド（あるいは単にテキストエディター）文書、例えば、Microsoft WindowsTM 3.11、95およびNTにある「ノートパッド」テキスト編集プログラムに貼り付ける。ファイルは、テキストファイル「*.txt」としてノートパッドに保存することができる。
【０２０９】
特定の摂取率
特定の摂取率は細胞培養リアクターのデータによって計算される。このデータは、適切な化学種、つまり上記の化学量論マトリックスの行に対応する割合ベクトルrとしてテキストファイルにもなければならない。提供されるテンプレートでは、特定の割合が、テキストファイル（Excelからエクスポートされる）「rate.txt」と同様にEXCEL 97TMファイル「ratex.xls」に列挙されている。
【０２１０】
MFA計算
希望の書式で入力すると、推測の内部フラックスを計算するための数学パッケージ ソフトを使用することができる。このソフトウェアで、マトリックス数学および微分方程式を扱うことができるはずである。テンプレートの1つはMATHEMATICATM 3.0で作成されており、「mfamath.nb」と名前が付けられている。次のセクションでは、MATHEMATICATM 3.0で計算が行われると仮定するが、一般的な手続きは適切なパッケージならばどれでも適用される。
【０２１１】
データの読み取り
最初に、デフォルト ディレクトリーがSetDirectoryコマンドを使用して設定される：
例：SetDirectory［“a：\mfa\”］
【０２１２】
次にデータがマトリックスで読み込まれ、Aマトリックス（化学量論マトリックスに）そしてrベクトル（特定の割合に）へ保存される。
例：A=ReadList［“stoichi.txt, Number, RecordLists --> True］
r = ReadList［“rate.txt, Number, RecordLists --> True］
【０２１３】
感度分析
次に、感度マトリックス（dX/dr）が(ATA)-1ATとして計算される。
例：sens = Inverse［Transpose[A].A］.Transpose[A]
【０２１４】
解およびエラー分析
フラックス分布の最小自乗推定xおよびエラーeが、方程式の過剰決定体系について計算される。
例：x = sens.r
e = r  A.x
【０２１５】
結果の出力
フラックス推定を計算した後に、結果をプレゼンテーション用テキストファイルに書きこまなければならない。提供されるテンプレートには、3つの結果テキストファイルが含まれる。これらのファイルは、エラーベクトルを保持するxベクトル「error.txt」および感度マトリックスを含む「sensitivity.txt」を含んでいる「flux.txt」である。これらのテキストファイルをMATHEMATICATMに作成するための例が下記に示される。
例：a1 = OpenWrite［“flux.txt”. FormatType -> OutputForm］；
Write［a1, TableForm［x, TableSpacing -> ｛0,1｝］］; Close［a1］
【０２１６】
MFA結果のプレゼンテーション
この分析の重大な点は、多数の推定されたフラックスを効率的かつ明確に示すことである。MATHEMATICATMからの出力テキストファイルをエクセルに取り込むことが出来、解答を図8に示されるようなコンピュータ ディスプレイ装置の棒グラフの集合として表示・計算することができる。
EXCEL 97TMファイル「mfaexc.xls」は、各フラックスのデータ表および棒グラフを示すために提供されたテンプレートである。さらにこれには、フラックスをともに表示・計算し、代謝経路によってグループ化した、混成の棒グラフが含まれる。
またデータを示す他の方法には、適切な代謝経路のマップ上に重なる内部フラックスをすべて示す方法がある。POWERPOINTTMテンプレートファイル「mfa.ppt」は、フラックスの大きさを示すための棒グラフ（ファイル「mfa.ppt」の前に開かれなければならないエクセルファイル「mfaexc.xls」にリンクされている）のある代謝マップを示す。エクセルファイルとPOWERPOINTTMプレゼンテーションの間にリンクが存在する。エクセルのデータが更新されると、プレゼンテーションのリンクが更新されるはずである。
【０２１７】
MATHEMATICATMおよびその他の市販ソフトウェアツールが、本発明のリアルタイム代謝フラックス分析の処理工程を簡単に実行するために使用される。その他のソフトウェアツールを代わりの実行に使用することもできる。良く知られる例の1つはLABVIEWTMソフトウェアで、様々な工学的および科学的用途のデータ収集、データ処理およびデータ発表で広く使用されている。
どんな風に実行されようとも、上記に記述されるようなMFA計算用の基本的な処理工程は本質的に同じである。図9は、図2の基本オペレーション プロセスに基づいた、リアルタイムのMFAに基づく細胞増殖と改変の処理工程の別の具体例である。MFAに対するこのオペレーション フローは、適切なプログラム言語に基く異なるソフトウェア ツールを使用することにより、コンピュータ プログラムで実行することができる。
【０２１８】
図9に関連し、プロセス910は、コンピュータがMFAのデータ収集、データ処理およびデータ出力オペレーションに必要な様々なデータファイルおよびインターフェースを初期化する、初期化プロセスである。例えば、時間および日付を設定し、コンピュータ ディスプレイを初期化することができる。別の例として、コンピュータは、さらに、システム オペレータによって選択される当該の指定細胞の細胞モデルを保存しているファイルのファイル名を要求することもできる。この工程は、コンピュータのローカル記憶装置でファイル パスを指定することにより、あるいは図3および図5に示されるMFAコンピュータに通信チャネルでリンクされた外部の電子情報源350からファイルを取得するようコンピュータにコマンドを出すことにより、遂行されることができる。プロセス910の初期化の別の例として、コンピュータは、MFDデータ、OUR/CERのためのデータ、および代謝濃度のようなMFAデータを受け取る出力ファイルの名前および位置を要求することもできる。そのような出力ファイルは、一般にローカル コンピュータにあるが、ローカル コンピュータにリンクされる別の記憶装置あるいはコンピュータにある場合もある。
【０２１９】
特に、初期化プロセス910は、リアルタイムの代謝測定を要求しない予測MFA用途でのように選択された細胞の前の代謝データを要求するようコンピュータに指示することができる。そのようなデータは、ローカル記憶装置のデータファイル、あるいは図3および図5の情報源350のような遠隔ソースからアクセスすることができる。あるいは、初期化プロセス910は、さらに図3および図5で例証されるような検出サブシステムの装置にコンピュータを相互連結させるインターフェース ボードを初期化するようにコンピュータに指示することができる。そのような初期化によって、コンピュータと検出サブシステム内の装置間に通信が確立され、その結果、コンピュータは検出サブシステムからデータを受け取る準備ができる。
次に、プロセス920は、データファイルに保存されている前のデータ、あるいはリアルタイムで得られた検出サブシステムからの測定データのどちらか一方のMFA計算のためのデータサンプルが準備ができているかどうかを決定する。データサンプルの準備ができている場合は、コンピュータは次の処理工程930に指示される。そうでない場合は、データサンプルの準備ができるまで、コンピュータは待つよう指示を受ける。ステップ920が完了すると、コンピュータはデータを取得し、取得したデータをステップ930の永久データファイルあるいは一時的データファイルのいずれかに保存する。更に、コンピュータはステップ940で、検出サブシステムあるいはデータファイルより取得したデータのいずれかに基づき、特定の割合を計算する。細胞モデルおよびステップ940の結果によって、コンピュータは、ステップ950に指示され、マトリックス方程式AX=rからの代謝フラックスの計算を実行する。その後、計算されたXがMDAデータファイルおよびコンピューター ディスプレイに送られる。
【０２２０】
代謝フラックスを予測する目的で、コンピュータは次に新しい予測のために入力を変更するべきかどうかオペレーターに尋ねるように指示される場合がある。オペレーターが入力の変更を行いたければ、コンピュータが変更された入力を要求し、変更された入力を受け取る際、新しいMFD結果を生産するためにステップ950および960を繰り返すように指示される。オペレーターが新しいMFD予測を必要としない場合は、コンピュータは戻ってステップ920で新しいデータを待機するように指示される。
図9のオペレーションは、異なるプログラム言語を使用して実行されることができる。図10A〜10Hは、LABVIEWTMソフトウェアを使用することにより、ユーザーのグラフプログラム形式で、図9のプログラムの実行を示している。図10Aおよび10Bは、図9ステップの910および920の例示的実行を示している。図10Cは、図9のステップ930の例示的実行を示している。図10D、10E、10F、10Gおよび10Hは、図9のステップ940、950、960、970および980の例示的実行をそれぞれ示している。図11は、図9のオペレーションからの出力用LABVIEWTMソフトウェアのディスプレイを示している。
【０２２１】
実施例2：出芽酵母菌の培養の代謝フラックス分析 
次の例は、本発明の方法を使用した酵母出芽酵母菌の培養の例示的代謝フラックス分析について記述する。
方法と材料：
株菌と培地：
酵母出芽酵母菌は、数値的生物学プロセス（例えば転写、翻訳、細胞周期、膜輸送など）に関する基本分子および遺伝子研究の最も詳細に調査された真核生物のモデルシステムであり、広く使用されるバイオテクノロジー生産生物体としての役目を果す。酵母出芽酵母菌を特に生物学研究に適したものにする特性には、急成長、分散型の細胞、レプリカ平板法および変異体単離の容易さ、十分な定義済みの遺伝子システム、そして最も重要な、高い可変性のDNA形質転換システムが含まれる。酵母出芽酵母菌の株菌ATCC S288Cが、この研究で使用された。SD培地（Sherman他、1986年）が実験で使用された。アミノ酸とヘキソース（BIO101）を含まない0.16%の酵母窒素ベース（YNB）と0.5%の硫酸アンモニウムに2%のグルコースが追加されて作られた。培養物は、すべて30℃で増殖された。例としてSherman, F., Fink, G. R., および J. B. Hicks（1986年年）著、酵母遺伝学の方法、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.を参照。
典型的バッチ実験については、SD培地を5ml含む15mlの滅菌試験管に、縞模様のYPDプレートからコロニーを植菌した。酵母培養を30℃で一晩、振盪培養器（250rpm）で増殖させた。第一のたね(seed)を、あらかじめ暖められたSD培地を250ml含む1リットルの三角振盪フラスコに移した。培養を、第二のたねとして使用する前に、同じ振盪培養器で約12時間増殖させた。第二のたねが5リットルのバイオリアクター（BIOFLOTM 3000、New Brunswick Scientific Co., Inc.、 Edison, New Jersey）に植菌するために使用された。
【０２２２】
発酵システム：
BIOFLO 3000TMには温度、pHおよび溶存酸素（DO）を管理するコントローラがある。出芽酵母菌培養プロセスは、コンピュータのインターフェース ボード：アナログ入力ボードAT-MIO-16E-10（National Instruments Corp.、Austin, TX）に装備されているPENTIUM IITM（233MHz、Windows 98）を使用して、自動的にモニター、コントロールされた。データ収集およびプロセス制御プログラムが、LabVIEW6.0（National Instruments Corp.、Austin, TX）に書き込まれた。pH、温度および溶存酸素濃度（DO）を含むバイオリアクター システムのデータは、AT-MIO-16E-10ボードを通して得られる。圧縮された空気はガス流量計を通してバイオリアクターに供給される。排気ガスはドライライトボトル（W.A. Hammons Drierite Co.、Xenia, Ohio）に管材料を入れることによりろ過され、次に、1440CO2およびCO2アナライザー（Servomex Co., Inc.、Norwood, MA）に接続される。アナライザーのアナログ出力は、データ収集ボードAT-MIO-16E-10に接続される。温度は、温度制御モジュールのある循環恒温槽（Haake、 Berlin, Germany）を使用して管理された。
【０２２３】
分析手順：
培養期間の間、オフライン分析に定期的にサンプルを取った。2mLの一部分の容量が、その環境への摂動を最小限にするよう発酵用容器から素早く取り出された。その後、サンプルは細胞、グルコース、エタノール、アセテートおよび有機酸濃度を決定するために使用された。細胞の増殖は、DU 7400分光光度計（Beckman Coulter Inc.、Fullerton, CA）を用いて600nmおよび660nmで光学濃度（OD）を測定することによりモニターされた。グルコースとエタノールの濃度は、YSI 2700 SELECT BIOCHEMISTRYTMアナライザー（YSI Inc.、Yellowstone, Ohio）を使用して決定された。培養培地の他の代謝生成物の濃度は、HPLC（Rainin Instruments Co. Inc.、Woburn, MA）によって決定された。Aminex HPX-87HTMイオン交換炭水化物−有機酸カラム（Bio-Rad Laboratories、Hercules, CA）は、65℃で、移動相およびUV検知として、脱気された5mMの硫酸と共に使用された。
【０２２４】
MFAの分析
Aを決定するために使用された酵母酵素の反応、化学量論マトリックスは以下のとおりである：
1) GLC + ATP > G6P + ADP
2) SCR + H2O > FRU
3) FRU + ATP > F6P + ADP
4) G6P = F6P
5) F6P + ATP > 2 GAP + ADP
6) GAP + ADP + NAD > NADH + G3P + ATP
7) G3P = PEP + H2O
8) PEP + ADP > ATP + PYR
9) PYR + NADH = LAC + NAD
10) PYR = PYRE
11) PYR + ATP + H2O + CO2 > ADP + OAA
12) PYR + COA + NAD > ACCOA + CO2 + NADH
13) ACCOA + OAA + H2O = CIT + COA
14) CIT + NAD = AKG + NADH + CO2
15) AKG + COA + NAD > SUCCOA + CO2 + NADH
16) SUCCOA + ADP = SUC + COA + ATP
17) SUC + H2O + FAD = MAL + FADH
18) MAL + NAD = OAA + NADH
19) PYR > ADH + CO2
20) ADH + NADH = ETH + NAD
21) AC + COA + 2 ATP + H2O > ACCOA + 2 ADP
22) AC = ACE
23) G6P + H2O + 2 NADP > RIBU5P + CO2 + 2 NADPH
24) RIBU5P = R5P
25) RIBU5P = X5P
26) X5P + R5P = S7P + GAP
27) S7P + GAP = F6P + E4P
28) X5P + E4P = F6P + GAP
29) 0.934 G6P +0.379 R5P +0.091 GAP +.650 G3P +0.5 PEP +1.756 PYR +0.951 OAA +1.019 AKG +2.489 ACCOA +11.418 NADPH + 1.572 NAD = BIOMAS + 1.572 NADH +1.271 CO2 +11.418 NADP
30) CIT = CITE
31) AKG = AKGE
32) SUC = SUCE
33) MAL = MALE
34) NADH + .5 O2 + 1.2 ADP > H2O + 1.2 ATP + NAD
35) FADH + .5 O2 + 1.2 ADP > H2O + 1.2 ATP + FAD
36) ATP + H2O > ADP
【０２２５】
Xを決定するために4、10、17および32時間の培養で得られたこれらの出芽酵母菌酵素反応の測定、代謝フラックス分布は以下のとおりである：
【０２２６】
2005506840.tif 000005
【０２２７】
行列テキストとして表示される4、10、17および32時間の測定値は以下のとおりである：
2005506840.tif 000006
【０２２８】
マトリックス測定は、図12、図12A（1ページ）、12B（2ページ）および12C（3ページ）に示される。
この出芽酵母菌システムの代謝フラックス分析の結果は、図13として表1に示される。
システムは次のように要約される
2.489 ACCOA + 11.418 NADPH + 1.572 NAD =
BIOMAS + 1.572 NADH + 1.271 + CO2 + 11.418 NADP
【０２２９】
実施例3：大腸菌培養物の代謝フラックス分析
本発明の方法およびシステムは、生物学システムの代謝フラックス分析を決定するために使用することができる。MFAの別の例示的決定は、大腸菌培養物を分析する。
Aを決定するための大腸菌酵素反応の測定、化学量論マトリックスは以下のとおりである：
【０２３０】
2005506840.tif 000007
【０２３１】
マトリックス測定は、図14、図14A（1ページ）、14B（2ページ）および14C（3ページ）に示される。
【０２３２】
実施例4：ペプチドの示差的標識化によるタンパク質の識別
ペプチドの示差的標識化によってタンパク質を識別する例示的方法が、以下に記述されるように、提供される。
最初に、変性、還元されたタンパク質混合物が、ペプチド断片を生成するためにトリプシンで消化される。混合物は、RPC樹脂（Rapid Prototyping Chemicals、Switzerland）の上流にスルホン化スチレン樹脂（例えばDionex Corporation、Sunnyvale, CA、からのようなSCX樹脂）を含み、且つタンデム質量分析法へ直接溶出するミクロキャピラリーカラムに装荷される。吸収されたペプチドの離散的な画分は、塩分の段階勾配を利用してSCXカラムからRPCカラムに置き換えられ、混入している塩及び緩衝液が洗い流される間にRPCカラムに前記ペプチドが保持される。ペプチドはその後、アセトニトリル勾配を利用してRPCカラムから溶出され、MS/MSによって分析される。このプロセスは、SCXカラムから追加のフラクションを置き換えるために増加する塩分濃度を使用して繰り返される。これは繰り返し適用される方法で、10〜20回、あるいは20回以上繰り返すことができる。
フラクションのすべてのMS/MSのデータは、例えばYates, J. R., III, 等 (1995年) Anal. Chem. 67, 1426-1436; Eng, J. 等 (1994年) J. Amer. Mass Spectrom. 5, 976-989に記述があるように、データベース探索により分析される。データは、初期のサンプルにあるタンパク質コンポーネントの全体的な状況をつかむ為に組み合わされる。MudPIT技術を完全自動システムで実行することができる。クロマトグラフィーによる分離のための2次元使用によっても、非常に複雑な混合物から識別することができるペプチドの数が大幅に増加する。
【０２３３】
実施例5：ペプチドの示差的標識化によるタンパク質の識別
示差的標識化試薬を合成する例示的方法が、以下に記述されるように、提供される。
本発明によって、ビオチンや、スクシミド、イソチオシアナート、イソシアナートのようなアミノ酸反応性部分を含む、キメラ標識化試薬が供給される。アミノ酸反応性部分は、ビオチン、あるいはそれに相当する物に直接あるいは間接的に（つまりリンカーによって）結合されることができる。
ビオチンは、6つまでの重水素原子あるいは6つの水素原子を含むことができる。ビオチン合成は、例えば、米国の特許第4,876,350号に記述されている。
別の方法として、上記に記述されるような13C、18Oのようなその他の同位体は、ビオチン部分、アミノ酸反応性部分あるいは交差結合部分のいずれかに組み込まれることができる。ビオチンは精製を促進し（例えばWO 00/11208を参照）、そして、少なくとも1つの同位体を含むことによって、同時に質量分析計で質量の区別を可能にする。活性化基によって、リジンまたはシステインのようなアミノ酸に共有結合することが可能になる。
使用することができるビオチンへの例示的前駆物質は以下のとおりである：
【０２３４】
2005506840.tif 000008
【０２３５】
グリニャール反応は次の化合物で実行される：XMg-(CD2)4-MgX,
Xは塩素または臭素を表す。反応は、規則的なビオチンの化学合成について記述する米国の特許第4,876,350号に記述されたものに類似している。
重水素置換された、および重水素置換されていないビオチンは、続いてそのペンタフルオロフェニルエステルに誘導体化され、その後、ヨード酢酸無水化物に、あるいはNHSエステルとして、あるいは他のアミノ酸反応性基として結合させることができる。例えば、
【０２３６】
2005506840.tif 000009
【０２３７】
この技術によって、2つの示差的プロテオームサンプル間の直接的な比較が可能になる。例えば、タンパク質サンプルは、本発明の同位体でコード化された親和性タグで示差的にタグが付けられる。これらのタグは、異なる同位体組成を持っていることによってのみ識別できる。同位体（例えば重水素）を含んでいる部分は、ビオチン、リンカーあるいはアミノ酸反応性基、あるいはその組み合わせである場合がある。ビオチン部分は、ペプチドの精製を促進する。同位体で「重い」そして同位体で「軽い」タグが付けられたペプチドは、変性された示差的タンパク質サンプルと別々に混合される。タグが付けられたタンパク質は、サンプルを混合する前に、あるいはその後に、プロテアーゼで消化される。タグが付けられたペプチドは、アビジン カラムで精製される。カラムは洗われ、タグが付けられたペプチドが溶出した。タグが付けられたペプチドが溶出した後に、ペプチド混合物がキャピラリー クロマトグラフィーを使用して分離され、ペプチドの質量が決定される。同位体タグと全く同じ示差のあるペプチド質量は同一のペプチド種に相当し、直接その量を比較することができる。
【０２３８】
実施例5：脂質抽出プロトコル
例示的な脂質抽出プロトコルがこの例に記述される
I. 酵母製法
１．酵母株菌からコロニーを取り、液体培地で24℃で一晩培養する。
２．三角酵母振盪フラスコを2個用意する。各フラスコに次を入れる： 50mLのYPD媒質と4 mLの酵母サンプル。
３．一方のフラスコを7時間24℃のシェーカーに置く。
４．もう一方のフラスコを2時間24℃のシェーカーに置き、次に、さらに5時間37℃のシェーカーに移す。
５． 両方のフラスコを取り外し（合計7時間後）、遠心分離機にかける。酵母ペレットからYPD培地を取り除く。使用準備ができるまで冷凍しておく（-20℃）。
【０２３９】
II. 脂質抽出
1.1mLのHPLCグレードの水で酵母ペレットを再び懸濁する。
2,ホウ珪酸ガラス培養チューブへ懸濁液を移す。
**すべてを氷で冷やす。ヒュームフードで作業する。
**すべてガラス容器を使用する（プラスチック禁止！）。すべてのガラス容器を使用する前に（例えば、目盛り付シリンダ）：まずメタノールx3で洗浄し、その後クロロホルムx3で洗浄する。
**HPLCグレードの溶媒を使用する場合、常に清潔なガラス容器に溶媒を注ぐ（ファルコンチューブに保管することができる水を除く）。
3. クロロホルム：メタノール溶液を1：2の割合で2 mL加える：
クロロホルムを1の割合、メタノールを2の割合。ガラスパスツールピペットを使用する。
4. パラフィルムでフタをし、1分間ボルテックスする。パラフィルムに溶媒が付かないようにする。層が離れるようにする。
5. 10分間2000rpmで遠心分離機にかける。
6. 新しい培養チューブへ一番下の層を抽出する。
7. HPLCグレードの水1mL、上記クロロホルムメタノール溶液1 mLを加える。
8. 前のようにボルテックスして遠心分離機にかける。
9. 新しい培養チューブへ一番下の層をもう一度抽出する。
10. 窒素の流れで脂質を完全に乾燥させる。
11. クロロホルムで再び懸濁させる。
【０２４０】
実施例6：アミノ酸反応性同位体でコード化された親和性タグ
本実施例は、示差的プロテオミクスで使用されるアミノ酸反応性同位体でコード化された親和性タグを作るための例示的プロセスについて記述する。一面において、この方法では、同時に質量を差別化するのを可能にする、例えば、質量分析計で、様々な質量のビオチンを使用する。別の面においては、本発明では、リンカーのないICAT試薬を使用する。
この面において、本発明のシステムおよび方法で、その同位体質量の異なる硫黄およびアミノ基反応性化合物のある、ペプチドおよびタンパク質に示差的に標識化する。このアプローチによって、質量分析計を利用して2つ以上のタンパク質サンプルの量を直接比較することができる。本発明のシステムおよび方法は、ペプチドとタンパク質にリジンおよびシステインで共有結合を形成することができる新しい一連の化合物を供給する。
本発明のシステムおよび方法は、リジン（システインの代わりに、例えば、WO 00/11208に記述されるような同位体でタグを付けた化合物）に結合することができる低分子量試薬を作るためのアプローチを供給する。
一面において、スクシンイミド、イソチオシアナート、イソシアナートあるいはON3のような活性化基が、2つ以上の、例えば、六つ（6）の重水素か、2つ以上の、例えば六つ（6）の水素のいずれかを有するビオチンに結合される。ビオチンは精製（例えばWO 00/11208に記述されるような）を促進し、同時に質量分析計での質量識別を可能にする。活性化基は、リジンまたはシステインのようなアミノ酸への共有結合を可能にする。一面において、本発明はリンカーのないICAT試薬を使用する。
【０２４１】
この技術分野の熟練者は、本発明が目的を実行し、かつその点で本質的なものと同様に言及された目的および利益を得るために、上手く採用されていることを容易に認識するだろう。ここに記述される方法は、例示的な面を現在表現するものであり、本発明の範囲を制限するものとしては意図されない。その点での変更および他の用途が、本発明の精神の範囲内に含まれ、請求の範囲によって定義されるこの技術分野の熟練者に見出される。
この特許または出願ファイルには、色刷りで作成された少なくとも1つの図面がある。色刷り図面付の本特許または特許出願公報の写しは、その要請および必要な手数料の支払いに応じて当局から入手できる。各図面において、同様の参照シンボルは、同様の要素であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図1に、リアルタイム代謝フラックス分析に基いた細胞操作の方法の一態様を示す。
【図２】図2に、コンピュータ実装代謝フラックス分析プロセスの一態様を示す。図2A〜2Eには、さらに、本発明の多様な面および例を示す。
【図３】図3に、細胞増殖をリアルタイムでモニタリングするためのオンライン検出サブシステム、測定値をリアルタイムで処理するためのオンライン データ処理機構、および細胞増殖の条件を制御するための制御機構（その制御はリアルタイムの測定値に呼応してなしうる）を備えた細胞増殖システムの一態様を図示する。
【図４】図4に、図3に示したシステムを使用して達成しうる一つの例示的細胞操作プロセスを示す。
【図５】図5に、部分的に図3に示したシステムに基く細胞増殖および操作システムの一実施例を図示する。ここで、細胞改変サブシステムは、発酵槽やバイオリアクター等の制御可能な細胞環境における培養下でのリアルタイムでの細胞の測定に従い、細胞を改変しまたは操作するために使用される。
【図６】図6に、さらに、図5のシステムに使用しうる細胞改変サブシステムの一態様を示す。
【図７】図7に、図5のシステムで実施しうる動作を示す。
【図８】図8に、コンピュータ ディスプレイのMFA結果を図解したものの一例を示す。
【図９】図9に、リアルタイムのMFAベースの細胞増殖の処理工程および図2の基本的動作プロセスに基く操作の、別の態様を示す。
【図１０】図10A〜10Hに、LABVIEWTMソフトウェアの使用による図9のプログラムの例示的な実行を示す。
【図１１】図11に、図9の動作からの出力についてのLABVIEWTMソフトウェアの表示を示す。
【図１２】図12は、下記の実施例2で詳細を説明するとおり、出芽酵母菌システムの代謝フラックスの計算におけるAの分析についての基質の測定値を表形式でまとめたものである（図12、図12A（1ページ）、12B（2ページ）および12C（3ページ））。
【図１３】図13は、下記の実施例2で詳細に説明するとおり、出芽酵母菌システムについての代謝フラックス分析の結果を表形式でまとめたものである。
【図１４】図14は、下記の実施例3で詳細に説明するとおり、大腸菌（E. coli）システムの代謝フラックスの計算におけるAの分析についての基質の測定値を表形式でまとめたものである（図14、図14A（1ページ）、14B（2ページ）および14C（3ページ））。
【図１５】図15に、本発明の例示的なシステムでの例示的な多次元的マイクロ液体クロマトグラフィーMS/MS（μLC-MS/MS）の構成を図示する。
【図１６】図16に、（工程1として）例示的な3-Dカラムの準備およびサンプル装填、また（工程2として）この発明の例示的な3-D μLC MS/MSシステムの3-D分離を図示する。
【図１７】図17に、抗菌性ピューロマイシンの生合成経路を図示する。
【図１８】図18に、経路操作後に、経路に関連したタンパク質を識別する例を図示する。プロテオーム分析により検出されたペプチドは、強調表示している。
【図１９】図19A〜19Gに、LC-MSまたはLC-LC-MS定量的プロテオミクス データの方法および説明を示す。
【図１】
2005506840.tif 000010
【図２−１】
2005506840.tif 000011
【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
2005506840.tif 000038
【図１６】
2005506840.tif 000039
【図１７】
2005506840.tif 000040
【図１８】
2005506840.tif 000041
【図１９−１】
2005506840.tif 000042
【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
2005506840.tif 000047
【図１９−７】
2005506840.tif 000048
【国際公開パンフレット】
2005506840.tif 000049
2005506840.tif 000050
2005506840.tif 000051
2005506840.tif 000052
2005506840.tif 000053
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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