(57)【要約】本発明は、皮膚／毛髪等価物、とりわけ再構成真皮（偽真皮；ＰＤ）中に再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）を有する毛髪モデル、その製造、並びにとりわけ医療／製薬目的および化粧品産業における用途のためのその使用に関する。
2005525088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）再構成真皮（偽真皮；ＰＤ）または偽真皮調剤を供給する工程、
（ｂ）培養乳頭細胞、好ましくは真皮乳頭細胞（毛乳頭細胞）を含む再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）を、適当なキャリヤ上および／または適当なマトリックス、とりわけゲルマトリックス中に供給するか、あるいは培養乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞を含むそのような再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）の対応する前駆体を、マトリックス、とりわけゲルマトリックスを形成することができる適当なマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPP中に、インサイチューで、とりわけ再構成真皮（偽真皮；ＰＤ）中で供給する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で供給された再構成乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体を、工程（ａ）で供給された偽真皮（ＰＤ）また偽真皮調剤中に導入または挿入する工程、
（ｄ）任意に、再構成表皮（偽表皮；ＰＥ）または再構成周皮（偽周皮；ＰＩ）を偽真皮（ＰＤ）に適用する工程
を含む、皮膚／毛髪等価物、とりわけ再構成真皮（偽真皮；ＰＤ）中に再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）を有する皮膚／毛髪モデルの製造方法。
【請求項２】
偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤が、培養収縮細胞を適当なマトリックス中に含み、該マトリックスが、コラーゲン、とりわけ I 型および／または III 型コラーゲン、および任意に他の成分をベースとするマトリックスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
線維芽細胞、とりわけ真皮線維芽細胞を、偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤のための収縮細胞として使用することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
真皮線維芽細胞をヒトまたは動物の皮膚から単離し、培養後に収縮細胞を得られた単層培養物から、とりわけ穏やかなトリプシン処理によって回収することにより、偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤のための培養収縮細胞を得ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
収縮細胞、とりわけ線維芽細胞、好ましくは真皮線維芽細胞を、適当な栄養培地中で、とりわけ最小必須培地ＭＥＭを栄養培地として使用して培養することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
単層培養物から回収され、任意に適当な栄養培地中に存在する収縮細胞と、少なくとも１種のマトリックス形成剤ＭＦPD、とりわけゲル形成剤を含有する偽真皮（ＰＤ）のためのマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPDおよび任意に他の成分とを混合することにより、偽真皮調剤を得ることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
偽真皮調剤が、マトリックス、好ましくはゲルを形成し、とりわけ、もしあるなら栄養培地を放出して、偽真皮（ＰＤ）に収縮することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
マトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPDが、少なくとも１種のコラーゲン、とりわけ I 型および／または III 型コラーゲン、および任意に他の成分、とりわけ真皮の細胞外マトリックスの成分、好ましくはマトリックスおよび／または硬タンパク質、例えばラミニンを、マトリックス形成剤ＭＦPD、とりわけゲル形成剤として含むことを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
適当な栄養培地、とりわけ最小必須培地ＭＥＭ、および任意に他の成分を、偽真皮（ＰＤ）に適用することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
偽乳頭（ＰＰ）が、培養乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞を、適当なマトリックス中に含み、該マトリックスが、特に、コラーゲン、とりわけ IV 型コラーゲンおよび任意に他の成分をベースとするマトリックスであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
真皮乳頭細胞をヒトまたは動物の皮膚の毛包から単離し、培養後に真皮乳頭細胞を、得られた単層培養物から、とりわけ穏やかなトリプシン処理によって回収することにより、培養真皮乳頭細胞を得ることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
真皮乳頭細胞を、適当な栄養培地中で、とりわけ最小必須培地（ＭＥＭ）、特にＤＭＥＭおよび／またはＲＰＭＩ培地および／またはチャング(Chang)培地を栄養培地として、任意に他の成分、とりわけウシ胎児血清（ＦＣＳ）、コラーゲン、とりわけ I 型コラーゲンなどと一緒に使用して培養することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞を適当なキャリヤ上で成長させることにより、偽乳頭（ＰＰ）を得ることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
キャリヤが、約５０〜２,０００μｍの範囲、好ましくは１００〜１,０００μｍの範囲、より好ましくは約１００〜５００μｍの範囲の寸法を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
キャリヤ物質を、好ましくは架橋されている、多糖類またはポリペプチド、とりわけゼラチンまたはデキストランから選択することを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
単層培養物から回収され、任意に適当な栄養培地中に存在する乳頭細胞と、少なくとも１種のマトリックス形成剤ＭＦPP、とりわけゲル形成剤を含有する偽乳頭（ＰＰ）のためのマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPPおよび任意に他の成分とを混合し、得られた混合物が、マトリックス、好ましくはゲルを形成し、とりわけ、もしあるなら栄養培地を放出して収縮することにより、偽乳頭（ＰＰ）を得ることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
マトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPPが、マトリックス形成剤ＭＦPP、とりわけゲル形成剤として、少なくとも１種のコラーゲン、とりわけ IV 型コラーゲン、並びに任意に、マトリックスおよび／または硬タンパク質、とりわけラミニン、ゼラチン、キトサン、グルコサミン、グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、硫酸化糖タンパク質、例えばナイドジェン（とりわけエンタクチン）、および成長因子、例えば組織成長因子-ベータ（ＴＧＦ-β）、線維芽細胞成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および Engelbreth-Holm-Swarm 腫瘍（ＥＨＳ腫瘍）および／またはヒト胎盤からの他の成長因子、および上記成分の混合物の群から特に選ばれる他の成分を含有することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
収縮したマトリックス、とりわけゲルおよび／または偽乳頭（ＰＰ）を、インサイチューで、偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中で形成することを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
偽乳頭（ＰＰ）を、マトリックス、とりわけゲルから形成し、偽乳頭（ＰＰ）の形成／造形を、工程（ｃ）における偽乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体の導入または挿入前またはその後のいずれかで行うことを特徴とする請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
偽真皮（ＰＤ）のためのマトリックス形成剤ＭＦPDおよび／または偽乳頭（ＰＰ）のためのマトリックス形成剤ＭＦPPが、加熱により、とりわけ２０℃〜４０℃の温度でゲル化し、とりわけ該方法において重合し、細胞の成長および分化を促進することができることを特徴とする請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
偽真皮（ＰＤ）のマトリックスおよび／または偽乳頭（ＰＰ）のマトリックスが、三次元構造を形成することを特徴とする請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
マトリックス、とりわけゲルの形成が、可逆または不可逆であることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
偽乳頭（ＰＰ）を適応させるために適当な空洞を偽真皮（ＰＤ）中に、とりわけパンチングまたはプリッキングにより形成し、次いで培養乳頭細胞を含有し、その寸法が偽真皮（ＰＤ）中に形成された空洞に対応する偽乳頭（ＰＰ）を、それらの空洞に導入、挿入または移植することにより、あるいは培養真皮乳頭細胞および少なくとも１種のマトリックス形成剤ＭＦPPの混合物の形態の偽乳頭（ＰＰ）またはそのような偽乳頭（ＰＰ）の対応する前駆体を、導入または挿入し、次いで偽乳頭（ＰＰ）の前駆体が、インサイチューで偽真皮（ＰＤ）中で、とりわけゲル化によってマトリックスを形成することにより、工程（ｃ）における偽乳頭（ＰＰ）の導入または挿入を行うことを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
パンチングまたはプリッキングを、とりわけ直径０.５〜４ｍｍ、好ましくは約２ｍｍのパンチ、ボタンカニューレまたは通常のカニューレで行うことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
偽乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体の導入の前に空洞を、少なくとも１種のコラーゲン、とりわけ IV 型コラーゲンおよび／または他のマトリックスタンパク質、とりわけ基底膜タンパク質、例えばラミニンで裏打ちすることを特徴とする請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
予備成形偽乳頭（ＰＰ）または偽乳頭（ＰＰ）の前駆体を、偽真皮（ＰＤ）中、またはとりわけ偽真皮調剤中に直接導入または挿入することを特徴とする請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｃ）において偽乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体を偽真皮（ＰＤ）中に導入または挿入する角度が、偽真皮（ＰＤ）面を基準に３０°〜９０°、とりわけ４０°〜６０°であることを特徴とする請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
任意に工程（ｄ）で行われる再構成表皮（偽表皮；ＰＥ）または再構成周皮（偽周皮；ＰＩ）の適用を、工程（ｃ）における偽乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体の導入または挿入の前またはその後に行うことを特徴とする請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
偽表皮（ＰＥ）または偽周皮（ＰＩ）が、培養ケラチノサイト、とりわけ毛包ケラチノサイト（ＯＲＳおよび／またはマトリックスケラチノサイト）および／または表皮ケラチノサイト、および任意にメラノサイトさえ、とりわけ外毛根鞘メラノサイト（ＯＲＳメラノサイト）および／または表皮メラノサイト、および任意に他の成分を含有することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ケラチノサイトおよびメラノサイトを、個々に別の単層若しくは多層中、または一緒に単層若しくは多層としての混合物中で、偽真皮（ＰＤ）に適用することを特徴とする請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれかに記載の方法により得ることができる、毛髪／皮膚等価物、とりわけ偽真皮（ＰＤ）中に再構成乳頭（ＰＰ）を有する毛髪モデル。
【請求項３２】
製薬、医療または化粧品およびボディケア分野における、請求項３１に記載の皮膚／毛髪等価物の使用。
【請求項３３】
とりわけ適合性および／または有効性について薬剤または化粧品を発見、研究および／または試験するための、請求項３２に記載の皮膚／毛髪等価物の使用。
【請求項３４】
毛包に関する、とりわけ毛髪の着色、毛髪の成長、毛髪の構造、毛髪の色などに関する有効性および／または適合性について薬剤または化粧品を発見、研究および／または試験するための、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
薬剤または化粧品の開発のための、請求項３１に記載の皮膚／毛髪等価物の使用。
【請求項３６】
好ましくは自動スクリーニング法において、とりわけ薬剤または化粧品を発見、研究および／または試験するための、請求項３１に記載の皮膚／毛髪等価物の使用。
【請求項３７】
とりわけ薬剤または化粧品による毛包、毛髪の着色、毛髪の成長、毛髪の構造、毛髪の色などの影響をインビトロで評価するための、請求項３１に記載の皮膚／毛髪等価物の使用。
【請求項３８】
請求項３１に記載の皮膚／毛髪等価物を含む系、とりわけ試験系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚／毛髪等価物、とりわけ再構成真皮（偽真皮；ＰＤ）中に再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）を有する皮膚／毛髪モデル、その製造、並びにとりわけ医療、製薬および化粧分野におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば毛包に対する生物学的効果を有し、毛髪の着色、毛髪の成長および毛髪の構造に影響を及ぼし得るような活性物質を見出すには、あらゆるそのような効果を評価することができる適当なインビトロ試験系が必要である。これらの試験系は、理想的には、比較的に多数の物質のスクリーニングを可能にし、標準化可能(standardizable)で安価であり、インビトロ系の場合は、インビボ状況をシミュレートすべきである。
【０００３】
毛髪の研究において、現在、例えば毛髪の成長、毛髪の着色および毛髪の構造を研究するために適当なインビトロモデルは無い。存在する方法の要約およびこれら系の欠点の実例は、例えば Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol. 1999年; 12: 第154-157頁中の K.S. Stenn “Laboratory Assessment of Hair Follicle Growth”において見出すことができる。これらの系は、単層細胞培養物から動物モデルおよびエクスビボ(ex-vivo)系を介してインビトロ系に及ぶ。
【０００４】
毛包細胞の単層培養物は、それらの複雑な三次元構造物から取り出されたときに細胞が、全体として器官内の場合とは異なって振舞うという欠点を有する。このために、単層として培養した毛包細胞に対する物質の効果についての情報は、インビボ状況とはほとんど関連しない。化粧品に対するガイドライン下において動物モデルは、化粧製品の開発のために使用することができない。従ってインビトロ法と動物に対するインビボ法とを組み合わせるエクスビボモデルも問題外である。物質の有用性および標準化可能性(standardizability)について同様の問題が、毛髪を有する皮膚外植体を培養で使用することに含まれる。ヒトに対するインビボ研究は、効果をスクリーニングするために行われるが、それらは、効力のある活性物質であると発見されて配合物に組み込まれるまでは、勧める価値は無い。なぜならそのような研究は、それ相応に高価で複雑だからである。毛髪の色に影響を及ぼす物質のスクリーニングのために適当なインビトロ試験系も存在しない。
【０００５】
メラノサイトのメラニン製造に影響を及ぼすことにより毛髪の着色を修正するためのインビトロ試験も、主として単細胞培養で行われる。表皮メラノサイトまたはＢ１６メラノーマ細胞が、しばしばこの目的のために使用され、この細胞種により得られる結果は、毛髪メラノサイトに外挿される。なぜなら毛髪メラノサイトは、単離および培養することが困難だからである。さらにメラノサイトと毛包との複雑な相互作用は、これらの系には無く、そうして毛包に対するインビボでの該状況との関連性は、疑いを差しはさまなければならない。同じことは、（表皮）メラノサイトを含有する再構成毛髪モデルにあてはまる。毛髪の着色に対する効果を有する物質のために評判のよい試験モデルでもある動物モデルは、物質が化粧製品のために使用される場合、化粧品についてのガイドライン下において禁止される。ヒトに対するインビボ研究は、面倒で費用がかかり、従って効力のある活性物質を見出した後にのみ勧める価値がある。
【０００６】
組織工学の技術において様々な細胞種が、組織、例えば皮膚組織から単離され、細胞培養においていわゆる単層として増殖される。次いで該組織は、単細胞から再構成される。皮膚の場合、例えば線維芽細胞を、コラーゲンゲルまたは他のマトリックスに「播種」することができ、そうしてそれらは増殖し、偽真皮を形成する。表皮ケラチノサイトを、そうして形成された偽真皮に適用することができ、そこでは、それらはまた増殖し、偽表皮を形成する。培養物を空気中（気／液界面）に引き上げることにより、細胞は、分化を始め、角質層を形成し始める。
【０００７】
これまでの細胞培養物、例えば外毛根鞘のケラチノサイト（ＯＲＳケラチノサイト、ＯＲＳ＝outer root sheath(外毛根鞘)）、真皮乳頭細胞などは、主として毛髪の研究に使用されている。しかしながら、三次元モデルとして毛包または毛包部分を、例えばコラーゲンゲル中に培養すること、または異なる毛包細胞を組み合わせることにより全毛包を再構成することも繰り返し試みられている。
【０００８】
In Vitro Cell. Dev. Biol.  Animal 35: 第318-326頁, 1999年6月中に公表された“Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair”において M. Michel らは、初めて、侵入の研究において使用するための再構成毛髪モデルへの毛包の挿入を報告している。ここで著者は、全毛包を使用し、これは、毛髪で覆われた皮膚から前もって調製しなければならなかった。該物質の限られた入手可能性とは別に、調製した毛髪が使用される場合には標準化可能性は乏しい。なぜなら生物学的変動が無視できないからである。
【０００９】
EP 0 285 471 A1 および EP 0 285 474 A1 も、収縮細胞（線維芽細胞）の真皮層および細胞外マトリックス成分からなり、その中に全毛包または小胞セグメントが挿入される、人口皮膚の製造を記載している。次いで真皮層は、さらにケラチノサイトで被覆され、これは、表皮層を形成する。この場合の欠点は、乳頭が再構成されず、その代わりに乳頭を有さない毛包の部分だけが使用されることである。
【００１０】
毛髪発育の初期段階で日本の研究者グループにより使用されたモデル（M. Inamatsu ら“Hair Follicle Development in Organotypic Culture”, Third Intercontinental Meeting of Hair Research Societies(第３回国際毛髪学会) (要約), 東京, 2001年）は、ラットのひげから単離したての真皮乳頭からなり、これは、線維芽細胞を含有するコラーゲンゲルとラットケラチノサイトの表皮層の間に挿入される。この器官型培養物は、気／液界面で培養される。７日後に表皮は、真皮乳頭付近で厚くなると述べられている。ここで第１にヒト細胞または乳頭は使用されておらず、第２に乳頭は、再構成乳頭ではなく、毛包から単離された全乳頭であり、第３に乳頭は、表皮に挿入（例えば注入または移植）されず、真皮および表皮層の間に置かれる。単離乳頭の使用は、単離毛包を使用する場合と同じ入手可能性および標準化可能性の問題を含む。
【００１１】
同じことが、S.A.J. Watson らの研究 British Journal of Dermatology (1994年) 131, 第827-835頁中の“Sheep vibrissa dermal papillae induce hair follicle formation in heterotypic skin equivalents”にあてはまる。ここでコラーゲンゲル中で培養された真皮乳頭または乳頭細胞は、毛包の発育のためのモデルを得るために、皮膚等価物の真皮および表皮の間に置かれる。しかしながらこれらの条件下で真皮乳頭細胞は、真皮マトリックス中に移動し、それ自身を乳頭に形づくらず、そうして該モデルは、乳頭または乳頭細胞を真皮基質に適用して変性する必要があり、そしてこれは、次いで胎児マウス表皮により被覆され、無毛マウスに移植される。
【００１２】
１９９３年に A.B. Jahoda らは、J. Invest. Dermatol. 101: 33S-38S, 1993年中の“Dermal-Epidermal Interactions  Follicle-Derived Cell Populations in the Study of Hair-Growth Mechanisms”で、まずラットのひげの小胞コラーゲンカプセル中で外毛根鞘細胞（ＯＲＳ細胞）を培養し、次いで異なる毛包細胞−真皮乳頭細胞、真皮有鞘細胞およびマトリックス細胞の混合物を添加することにより、毛細胞の組合せから小胞様構造物を製造することに成功した。しかしながらそれらは、構造を安定化させるためにラットのひげの安定なコラーゲンカプセルを必要とした。
【００１３】
A. Limat らも、Cell Tissue Res. (1994年) 275: 第169-176頁中の“Outer Root Sheath (ORS) cells organize into epidermoid cyst-like spheroids when cultured inside Matrigel(商標): a light-microscopic and immunohistological comparison between human ORS cells and interfollicular keratinocytes”で、様々な毛包細胞および皮膚細胞を一緒に、それらの相互作用を研究するために三次元構造に適合させている。それらは、ベースとしてコラーゲン（I）ゲルを使用し、その上に Matrigel(商標)の層、または様々な細胞若しくは細胞混合物を含有する基底膜成分の混合物を積み重ねる。Matrigel(商標)中で表皮またはＯＲＳケラチノサイト（＝外毛根鞘ケラチノサイト）は、球状であるが非小胞構造を形成する。ここで様々な細胞を含有する層は、その上に次々と置かれる。しかしながら新しい構造は、真皮乳頭のようなこれらの層中で構築されない。Limat らは、ＯＲＳケラチノサイトが、内部で角形に変化する嚢形構造物を形成し得ることを報告しているが、この場合それは、毛幹形成の生理的性質の問題ではなく、むしろ嚢形に配列したケラチノサイトによる分化および角質層形成の問題である。しかしながら毛幹は、通常、真皮乳頭上にあるマトリックス細胞により形成される。
【００１４】
特開平10-136977号公報（東洋紡績株式会社、日本）は、人口組織およびその再構成物を記載し、これは、毛幹様構造をコラーゲン層中の線維芽細胞層と毛乳頭細胞を含有するコラーゲン層との間の境界で含む。このモデルは、活性物質および化粧品の適合性および有効性を測定するための試験系として機能すると述べられている。ここで、A. Limat らによる論文と同じことがあてはまる：このモデルにおいて、毛包の三次元構造を共有する真皮乳頭は、再構成されず、その代わりに細胞は、層中でその上に次々と配列し、新しい構造は形成されない。メラノサイトは、記載されたモデルのいずれにも明らかに使用されない。有効性試験は、該モデルのための潜在的な用途として言及されている。しかしながらその終点が該モデルに対して評価されること、即ち活性物質の適用が再構成モデルの構造にいかに作用するか、およびこの物質の毛髪の成長および毛髪の構造に対する効果に関して何をこれに読み込むことができるかの指摘はない。
【００１５】
単離毛包が培養中で９日間維持される「フィルポットモデル(Philpott Model)」（M.P. Philpott “Human hair growth in vitro”, J. Cell. Sci. 97, 第463-471頁, 1990年）は、一方で、個々の小胞間におけるかなりの変動、これゆえ乏しい標準化可能性という欠点、および他方で毛包の乏しい入手可能性という欠点を有する。このために非常に限られた量の活性物質しか、一定の期間内で評価することができない。さらに培地中に溶解する物質および配合物だけは適用することができるが、水不溶性物質または配合物、例えばクリームはできない。
【００１６】
フィルポットモデルを実質的にさらに開発したものにおいて、単離毛包セグメントを再構成皮膚モデルに挿入することも試みられた（M. Inamatsu ら、および M. Michel ら参照）。それにより小胞、小胞セグメントまたは真皮乳頭は真皮と接触し、これは、他の既知のモデルよりもインビボ状況に近づくが、それらが活性物質の研究のために使用される場合のこれら系の欠点は、フィルポットモデルに伴うものと類似する（毛包の乏しい入手可能性、標準化可能性がない、高コストなど）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って本発明が取り組む課題は、皮膚／毛髪等価物（「皮膚モデル」）、とりわけ再構成真皮中に再構成乳頭を有する毛髪／皮膚モデルを提供することであり、これは、少なくとも部分的に先行技術の上記欠点を回避する。
【００１８】
本発明が取り組む別の課題は、インビトロモデル系として、とりわけ活性物質を、とりわけ毛包に対して試験および／または評価するために適当な皮膚／毛髪等価物またはモデルを見出すことまたは提供することであった。そのようなモデルは、薬剤／医療および化粧品の有効成分を発見および試験するために特に適している。それは、そのような有効成分の毛包、毛髪の成長、毛髪の着色、毛髪の構造などに対する効果のインビトロ評価も可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って本発明は、以下の工程：
（ａ）適当な再構成真皮（偽真皮；ＰＤ）または偽真皮調剤を供給する工程、
（ｂ）培養乳頭細胞、好ましくは真皮乳頭細胞（毛乳頭細胞）を含む再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）を、適当なマトリックス、とりわけゲルマトリックス中に供給するか、または培養乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞（毛乳頭細胞）を含むそのような再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）の対応する前駆体を、マトリックス、とりわけゲルマトリックスを形成することができる適当なマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPP中に、インサイチューで、とりわけ再構成真皮（偽真皮；ＰＤ）中で供給する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で供給された再構成乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体を、工程（ａ）で供給された偽真皮（ＰＤ）また偽真皮調剤中に導入または挿入する工程、
（ｄ）任意に、再構成表皮（偽表皮；ＰＥ）または再構成周皮（偽周皮；ＰＩ）を偽真皮（ＰＤ）に適用する工程
を含む、皮膚／毛髪等価物、とりわけ再構成真皮（偽真皮；ＰＤ）中に再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）を有する皮膚／毛髪モデルの製造方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
即ち、本発明の方法の工程（ａ）は、再構成真皮、偽真皮または偽真皮調剤を提供することを含む。本発明により、先行技術から知られているあらゆる偽真皮を、それが本発明の方法のために適当であること、即ち、特にそれが、本発明の皮膚／毛髪等価物の他の成分と適合性であることを条件として、使用することができる。特に、本発明に従い使用される偽真皮（ＰＤ）は、培養収縮細胞、とりわけ線維芽細胞、好ましくは真皮線維芽細胞を適当なマトリックス中に含む。マトリックスは、特にコラーゲン、好ましくは I 型および／または III 型コラーゲン、並びに任意に他の成分をベースとするマトリックスであり得る。偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤のための培養収縮細胞を、既知の方法において、例えばヒトまたは動物の皮膚から真皮線維芽細胞を単離し、培養後に得られた単層培養物から（例えば穏やかなトリプシン処理によって）収縮細胞を回収することにより得ることができる。特に収縮細胞と適合性であるべき適当な栄養培地が、それらの細胞を培養するために使用される。本発明にとって適当な栄養培地の一例は、最小必須培地ＭＥＭ（Modified Eagle Medium(変性イーグル培地)）である。
【００２１】
次いで、単層培養物から回収され、任意に適当な栄養培地中に存在する収縮細胞と、少なくとも１種のマトリックス形成剤ＭＦPD、とりわけゲル形成剤を含有するマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPDおよび任意に他の成分とを混合することにより、偽真皮（ＰＤ）を得ることができる。
【００２２】
本発明において得られた混合物を、偽真皮調剤と称する。マトリックス形成培地の濃度に応じて、偽真皮調剤は、マトリックス、好ましくはゲルマトリックスを、比較的急速に（高濃度のマトリックス形成培地）または比較的ゆっくりと（低濃度）形成し、最後に、任意に存在するあらゆる栄養培地を放出することにより、偽真皮（ＰＤ）に収縮する。マトリックス形成プロセスおよび収縮プロセスのあらゆる段階および状態は、用語「偽真皮調製」により包含される。従って偽真皮は、偽真皮調製のマトリックス形成および収縮が完了すると得られる。
【００２３】
マトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPDのマトリックス形成剤ＭＦPD、とりわけゲル形成剤は、特に、コラーゲン、好ましくは I 型および／または III 型コラーゲン、および任意に他の成分（例えば真皮の細胞外マトリックスの成分、好ましくはマトリックスおよび／または硬タンパク質、例えばラミニン）をベースとするマトリックス形成剤であり得る。
そうして供給または発生させた偽真皮（ＰＤ）に、適当な栄養培地、とりわけ最小必須培地ＭＥＭ、および任意に他の成分を、所望により適用することができる。
【００２４】
工程（ｂ）で供給された偽乳頭（ＰＰ）は、培養乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞（毛乳頭細胞）を、適当なキャリヤ上および／または適当なマトリックス中に含む。該マトリックスは、特に、コラーゲン、とりわけ IV 型コラーゲンおよび任意に他の成分をベースとするマトリックスであり得る。培養真皮乳頭細胞（毛乳頭細胞）を、既知の方法で、例えば真皮乳頭細胞（毛乳頭細胞）をヒトまたは動物の皮膚の毛包から単離し、培養後に真皮乳頭細胞を、得られた単層培養物から、とりわけ穏やかなトリプシン処理によって回収することにより、製造することができる。継代数は少なくあるべきであり、真皮乳頭のための継代数は、一般に１〜１０の間、好ましくは１〜３の間である。真皮乳頭細胞は、適当な栄養培地中で培養され、使用する栄養培地は、特に最小必須培地ＭＥＭ、例えばＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium(ダルベッコ変性イーグル培地)）および／またはＲＰＭＩ培地（Roswell Park Memorial Institute により開発された培地）および／またはチャング(Chang)培地であり、これは、任意に他の成分、例えばウシ胎児血清（ＦＣＳ）、コラーゲン、とりわけ I 型コラーゲンなどと一緒にされる。本発明に従い真皮乳頭細胞を培養するために適当な栄養培地の例は、あらゆるＲＰＭＩ-またはＤＭＥＭ-ベースの細胞培地、例えば RPMI 1640 (Sigma)(ＦＣＳ２０％含有)、チャング培地 (Irvine Scientific)(ＦＣＳ１０％含有)などである。
【００２５】
次いで、単層培養物から回収され、任意に適当な栄養培地中に存在する乳頭細胞と、少なくとも１種のマトリックス形成剤ＭＦPP、とりわけゲル形成剤を含有するマトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPPおよび任意に他の成分とを混合することにより、偽乳頭（ＰＰ）が得られる。得られる混合物は、マトリックス、好ましくはゲルを形成し、次いで、もしあるなら栄養培地を放出して収縮する。次いで偽乳頭（ＰＰ）を、収縮したマトリックスまたは収縮したゲルから（例えばパンチングまたは切り抜きにより）形成することができる。
【００２６】
特に好ましい実施態様において偽乳頭（ＰＰ）は、乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞を適当なキャリヤ上で成長させることにより製造される。既に相互作用している細胞群を、このように乳頭に類似の方法で、有利に製造することができる。
キャリヤは、多孔質および無孔質の両方であり得、孔を有さないか、または少しの若しくは多くの孔を有し得る。多孔質表面が好ましく、それにより乳頭細胞は、自然な三次元凝集体を良好に模倣することができる。膨潤性キャリヤ物質（例えば多糖類またはポリペプチドをベースとするもの）または非膨潤性キャリヤ物質（例えばポリマー）も、使用することができる。
【００２７】
キャリヤ寸法（または粒度、即ち直径または一次元における最大の大きさ）は、好ましくは約５０〜２,０００μｍの範囲、より好ましくは１００〜１,０００μｍの範囲である。約１００〜５００μｍの粒度が特に好ましい。なぜなら、一方で偽真皮の製造における取扱い性と、他方で実際の毛乳頭に対して充分に高い類似性とが、保証されるからである。適当なキャリヤは、特に、その上で細胞が三次元配置で成長する、いわゆるマイクロキャリヤ、小さな球状粒子である。
【００２８】
あらゆる三次元形状のキャリヤを使用することができる。球形、円錐形、円筒形および多面形、丸形または楕円的に平らな、または多角形（例えば六角形）キャリヤが適当であり、球形キャリヤが特に好ましい。なぜならそれらは、乳頭の形状を特に良好に模倣し得るからである。
キャリヤは、無機および／または有機物質からなることができ、これらは、その表面で変性されていても良く、未変性でも良い。
【００２９】
表面変性は、本質的に物理的であり得、例えばそれは、粒子、例えばスチール粒子またはポリマー（とりわけバイオポリマー、好ましくはポリペプチドおよび／または多糖類）の接着を防ぐためのキャリヤの被覆であり得る。マトリックス形成タンパク質、とりわけコラーゲン、好ましくは I、III および IV 型コラーゲン、およびマトリックスおよび／または硬タンパク質（好ましくはラミニン、ゼラチン、キトサン、グルコサミン、グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、硫酸化糖タンパク質、例えばナイドジェン（とりわけエンタクチン）、組織プラスミノーゲン活性化因子、Matrigel(商標)並びに上記成分の混合物による表面変性が挙げられる。
【００３０】
しかしながらまた、表面を化学変性により変性することができる。例えば表面がキャリヤ物質自体からもはや帯電されていない場合に、様々な表面電荷を得ることができる。Ｎ,Ｎ-ジエチルアミノエチル基を有する架橋デキストランマトリックスの表面変性により正に帯電したキャリヤが、例として挙げられる。
ガラス、シリコーンまたはポリマーマトリックス、例えばポリスチレンなどが適当である。多糖類、例えばデキストラン、またはポリペプチド、例えばゼラチンのマトリックスが特に適当である。架橋ポリマー、例えば架橋ゼラチン（特に高架橋ゼラチン、例えば Cultisphere(商標), Percell）または架橋デキストランも、特に適している。
【００３１】
単純にキャリヤを乳頭細胞培養物に添加することにより、偽乳頭を製造することができる。細胞成長密度に応じて、１日から数日、または数週間までものインキュベーション時間が適当であり得る。完全ではあるが、過度に強すぎない培地の混合が、キャリヤ表面上での最適な細胞成長を確保するために好ましい。例えば穏やかな攪拌若しくは振とう、または流動床若しくは攪拌反応器若しくはスピナー瓶中でさえの培養が適当である。
次いで乳頭細胞で被覆されたキャリヤから形成された偽乳頭を、調製した偽真皮または偽真皮調剤に埋め込むことができる。
【００３２】
しかしながら以下に記載するように偽乳頭（ＰＰ）を、インサイチューで、とりわけ偽真皮（ＰＤ）中でも形成することができる。マトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPPは、マトリックス形成剤ＭＦPP、とりわけゲル形成剤として少なくとも１種のコラーゲン、とりわけ IV 型コラーゲン、並びに任意に、マトリックスおよび／または硬タンパク質、とりわけラミニン、ゼラチン、キトサン、グルコサミン、グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、硫酸化糖タンパク質、例えばナイドジェン（とりわけエンタクチン）、組織プラスミノーゲン活性化因子、および成長因子、例えば組織成長因子-ベータ（ＴＧＦ-β）、線維芽細胞成長因子、および Engelbreth-Holm-Swarm 腫瘍（ＥＨＳ腫瘍）および／またはヒト胎盤からの他の成長因子および上記成分の混合物の群から特に選ばれる他の成分を含有する。本発明にとって例えば以下の物質が、偽乳頭（ＰＰ）を形成するために適当なマトリックス物質である：Matrigel(商標) Basement Membrane Matrix(基底膜マトリックス)(Matrigel(商標))、コラーゲン、ゼラチン、コラーゲン／キトサン／ＧＡＧ（ＧＡＧ＝グルコサミノグリカン）、グルコサミンまたはあらゆる他の種類のマトリックス、およびこれら物質の混合物。コラーゲン、Matrigel(商標) およびこれらの混合物が特に好ましい。Matrigel(商標) および（コラーゲン：Matrigel(商標)）比０.１：１〜１０：１の混合物が、最も好ましい。
【００３３】
上記のように偽乳頭（ＰＰ）を、マトリックス、とりわけゲルから形成することができ、偽乳頭（ＰＰ）の形成／造形を、工程（ｃ）における偽乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体の導入または挿入の前またはその後のいずれかで行うことができる。適当なキャリヤ上で乳頭細胞を成長させることにより形成された偽乳頭（これにより各キャリヤ粒子を偽乳頭とみなすことができる。）を、そのようなマトリックス中でこの方法で、肉眼的偽乳頭を製造するために使用することもできる。
【００３４】
偽真皮（ＰＤ）を形成するためのマトリックス形成剤ＭＦPDおよび偽乳頭（ＰＰ）を形成するためのマトリックス形成剤ＭＦPPの両方は、加熱により、とりわけ２０℃〜４０℃の温度でゲル化し、例えば該方法において重合し、細胞の成長および分化を促進することができるべきである。偽真皮（ＰＤ）のマトリックスおよび偽乳頭（ＰＰ）のマトリックスは、一般に三次元構造に形成される。マトリックス、とりわけゲルの形成は、可逆または不可逆であり得るが、それは好ましくは不可逆である。
【００３５】
工程（ｃ）における偽乳頭（ＰＰ）の導入または挿入を、様々な様式で行うことができる：
１つの実施態様において、偽乳頭（ＰＰ）を適応させるために適当な空洞を、まず、好ましくは既に収縮した偽真皮（ＰＤ）中に、とりわけパンチングまたはプリッキングにより形成し、次いで培養乳頭細胞を含有し、その寸法が偽真皮中に形成された空洞に対応するように造形される偽乳頭が、それらの空洞に（例えば移植により）導入または挿入される。偽真皮（ＰＤ）のパンチングまたは偽真皮（ＰＤ）のプリッキングを、例えばパンチ（例えば直径０.５〜４ｍｍ、好ましくは約２ｍｍ）、ボタンカニューレまたは通常のカニューレで行うことができる。
【００３６】
偽乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体の導入前に、偽真皮（ＰＤ）のパンチングまたはプリッキングにより形成された空洞を、とりわけ少なくとも１種のコラーゲン、好ましくは IV 型コラーゲンおよび／または他のマトリックスタンパク質、とりわけ基底膜タンパク質、例えばラミニンで（例えば噴霧により）裏打ちすることができる。空洞は、好ましくは２種またはそれ以上の記載成分、とりわけ Matrigel(商標) の混合物で裏打ちされる。この手順が採用される場合、偽乳頭（ＰＰ）は、好ましくは偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中に、１〜５０個／ｃｍ2偽真皮（ＰＤ）、とりわけ３〜７個／ｃｍ2偽真皮（ＰＤ）の数または密度で導入または挿入される。
【００３７】
別の実施態様において、培養真皮乳頭細胞を適当なキャリヤ上および／またはマトリックス、とりわけゲルマトリックス中に含有する偽乳頭（ＰＰ）を偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中に直接注入または挿入することにより、工程（ｃ）における偽乳頭（ＰＰ）の導入または挿入を行うことができる。１つの特定の実施態様において偽乳頭の偽真皮調剤中への導入は、偽真皮への収縮が完了する前に行われる。特に好ましい実施態様において、偽真皮調剤がマトリックス（またはゲル）を形成する直後、または好ましくは収縮段階の前若しくはその開始時に、偽乳頭の導入または挿入、好ましくは注入を行うことができる。
【００３８】
この手順が採用される場合（乳頭細胞で被覆されたキャリヤにより形成された偽乳頭を使用する場合を除く）、偽乳頭（ＰＰ）は、再び好ましくは偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中に、１〜５０個／ｃｍ2偽真皮（ＰＤ）、とりわけ３〜７個／ｃｍ2偽真皮（ＰＤ）の数または密度で導入または挿入される。
適当なキャリヤ上で成長し、個々の偽乳頭を表す乳頭細胞の注入において、好ましくは１００〜１００,０００個の偽乳頭が、偽真皮１ｃｍ3あたりに導入される。
【００３９】
代わりにそのような偽乳頭（ＰＰ）の前駆体も、偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中に注入または挿入することができる。これらの前駆体は、培養真皮乳頭細胞、および少なくとも１種の上記のようなマトリックス形成剤ＭＦPPの混合物からなり、そうしてこれらの混合物は、次いでマトリックスを、よって偽乳頭（ＰＰ）をインサイチューで偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中で、とりわけゲル化により形成する。即ち、この実施態様において偽乳頭は、インサイチューで偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中で形成される。
【００４０】
別の特に好ましい実施態様において工程（ｃ）における偽乳頭（ＰＰ）の導入または埋込みを、培養真皮乳頭細胞をキャリヤ上に含有する偽乳頭（ＰＰ）と、収縮細胞と、少なくとも１種のマトリックス形成剤ＭＦPD、とりわけゲル形成剤を含有する、マトリックス形成培地、とりわけゲル形成培地ＭＦＭPDと、任意に他の成分とを、偽真皮の調製中に直接混合することにより行うことができる。この偽乳頭と偽真皮調剤との初期混合は、均一な皮膚／毛髪等価物を導く。キャリヤ上で成長する乳頭細胞により形成された偽乳頭を、偽真皮（ＰＤ）中に、５,０００〜１,０００,０００ＰＰ／ｃｍ3偽真皮（ＰＤ）の密度、とりわけ１０,０００〜８０,０００偽乳頭（キャリヤ粒子）／ｃｍ3偽真皮（ＰＤ）の密度で導入または挿入することができる。キャリヤ上で成長する乳頭細胞により形成された偽乳頭を、偽真皮調剤中に、１,０００〜１００,０００ＰＰ／ｃｍ3偽真皮調剤（ＰＤ）の密度、とりわけ１,５００〜６０,０００偽乳頭（キャリヤ粒子）／ｃｍ3偽真皮調剤（ＰＤ）の密度で導入または挿入することができる。
【００４１】
実際的にインビボ系を調節するために、とりわけパンチが挿入され、偽乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体が偽真皮（ＰＤ）中に挿入される場合に、工程（ｃ）における導入または挿入は、偽真皮（ＰＤ）面を基準に３０°〜９０°、とりわけ４０°〜６０°の角度で行われる。
偽乳頭（ＰＰ）の偽真皮（ＰＤ）中への導入または挿入を、規則的な間隔で行うことができる。
【００４２】
工程（ｃ）における偽乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体の導入または挿入の前またはその後に、再構成表皮（偽表皮；ＰＥ）または再構成周皮（偽周皮；ＰＩ）を、任意に工程（ｄ）で偽真皮（ＰＤ）に適用することができる。偽表皮は、好ましくは、工程（ｃ）における偽乳頭（ＰＰ）またはそれらの前駆体の導入または挿入後に適用される。偽表皮（ＰＥ）または偽周皮（ＰＩ）は、培養ケラチノサイト、毛包ケラチノサイト（ＯＲＳおよび／またはマトリックスケラチノサイト）、とりわけ外毛根鞘ケラチノサイト（ＯＲＳケラチノサイト）および／または表皮ケラチノサイト、および任意にメラノサイト、とりわけ外毛根鞘メラノサイト（ＯＲＳメラノサイト）および／または表皮メラノサイト、および任意に他の成分からなることができる。もしあるならケラチノサイトおよびメラノサイトを、個々に別の単層若しくは多層中、または一緒に単層若しくは多層としての混合物中で、偽真皮（ＰＤ）に適用することができる。使用する培地に応じて、外毛根鞘ケラチノサイト（ＯＲＳケラチノサイト）は、特に偽周皮（ＰＩ）を形成することができる。周皮様構造を有する偽周皮は、胚胞形態形成における状態に対応する。このように、自然の状態、とりわけ三次元配置で観察される直接および間接の細胞／細胞および／または細胞／マトリックス相互作用を調査または左右することができるという利点を、これは有する。
【００４３】
本発明の方法の１つの実施態様を、以下のように行うことができる。
モデルを製造するために偽真皮（ＰＤ）が、まずコラーゲンマトリックス中の表皮線維芽細胞から調製される。次いで「穴」を、偽真皮（ＰＤ）中に一定の角度（例えば３０〜９０°）であけることができ、次いで任意に基底膜タンパク質（例えばラミニン、コラーゲン IV など）または例えば Matrigel(商標)、基底膜タンパク質の混合物、または Matrigel とコラーゲン（とりわけ I 型コラーゲン）との混合物で裏打ちすることができる。次いで再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）が、「穴」に挿入される。これらの再構成乳頭を、毛包乳頭から培養された真皮乳頭細胞と、ゲル、例えば Matrigel(商標) 若しくはコラーゲン（特に I 型コラーゲン）またはこれらの混合物とを混合し、少ない継代数で該混合物をゲル化させることにより得ることができる。ゲル化の後、偽乳頭（ＰＰ）を、ゲルから打ち抜き、偽真皮（ＰＤ）に挿入することができる。しかしながらゲル化を、インサイチューで偽真皮への導入後に行うこともできる。しかしながら代わりに、Matrigel(商標) 中に埋め込まれた真皮乳頭細胞を、あらかじめ「穴」があけられていない偽真皮（ＰＤ）に直接注入することもでき、または Matrigel(商標) 中に埋め込まれた真皮乳頭細胞が、プリッキングチャネルを介して偽真皮（ＰＤ）に導入される。
最後に毛包メラノサイトおよび／または毛包ケラチノサイト（ＯＲＳおよび／またはマトリックスケラチノサイト）の細胞層を、偽真皮（ＰＤ）に適用することができる。
【００４４】
その結果、本発明の方法において乳頭が、偽真皮調剤または偽真皮（ＰＤ）中への導入または挿入（例えば注入、移植など）により、培養真皮乳頭細胞から適当なキャリヤおよび／または適当なゲル形成剤（例えば Matrigel(商標)）上で再構成される。所望によりこれを、周囲環境からの或る形状の分界により行うこともできる。再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）は、適当なゲル形成剤（例えば Matrigel(商標)）および培養真皮乳頭細胞を含有する組合せを含む。本発明により乳頭が、例えば毛包の三次元構造を共有するいわゆる偽乳頭プラグを偽真皮（ＰＤ）に挿入することにより、例えば Matrigel(商標) に埋め込まれた真皮乳頭細胞を例えば再構成真皮の区画に直接注入することにより再構成される。
【００４５】
好ましい実施態様において偽真皮を、乳頭細胞を適当なキャリヤ上で成長させることによっても再構成することができる。次いで乳頭細胞を、偽真皮中に予備成形した「穴」に挿入することができ、またはそれを単純に圧力によりその中に組み込むことができ、またはそれを収縮細胞およびゲル形成剤（または偽真皮調剤）と偽真皮の製造中に直接混合することができる。
【００４６】
偽乳頭（ＰＰ）は、任意に重なるケラチノサイトの偽表皮（ＰＥ）または偽周皮（ＰＩ）、および任意にメラノサイトの構造に影響を及ぼす。毛包様構造が、これらの条件下で形成される。このようにして製造されるモデルを、例えば毛髪の成長および毛髪の構造について物質（薬剤、化粧品など）を研究するため、および毛髪の着色に対する物質の効果を研究するために使用することができる。
【００４７】
図１は、本発明の方法の１つの特定実施態様の図解である。I 型コラーゲンのマトリックス中の線維芽細胞をベースとする偽真皮（ＰＤ）が（１）に示される。（２）では、培養真皮乳頭細胞および少なくとも１種のマトリックス形成剤ＭＦPPの混合物からなる偽乳頭の前駆体が示され、それから次に実際の偽乳頭（ＰＰ）を、例えば直接注入により形成することができ、そうして次にこの混合物が、マトリックスを、よって偽乳頭（ＰＰ）をインサイチューで偽真皮（ＰＤ）中で、とりわけゲル化により形成する。（３）で示される再構成乳頭モデルが形成される。
【００４８】
図２は、本発明の方法の別の特定実施態様の図解である。（１）では、I 型コラーゲンのマトリックス中の線維芽細胞をベースとする偽真皮（ＰＤ）が示され、この中に偽乳頭（ＰＰ）を適応させるための空洞または開口部があけられており、空洞は、任意に IV 型コラーゲンまたは Matrigel(商標) で噴霧により裏打ちされる。ゼラチンをベースとするマイクロキャリヤおよびその上で成長させた真皮乳頭細胞からなる偽乳頭が、（２）で示される。（３）ではマイクロキャリヤから形成された偽乳頭（ＰＰ）が、偽真皮（ＰＤ）中に（例えば注入により）導入または挿入される。（４）で示される再構成乳頭モデルが形成される。
毛髪の形態形成の最早段階（形態形成段階 I〜III）を思い出させるもの、例えば周皮を含む小胞様または小胞状構造が、次いで（５）で、三次元毛髪／皮膚モデルに形づくられる。
【００４９】
本発明は、本発明の方法により得ることができる毛髪／皮膚等価物にも関する。
本発明の皮膚／毛髪等価物は、特に、毛髪の形態形成の最早段階、即ち、形態形成段階 I 〜III) を思い出させるものを含む小胞様または小胞状構造を有し、特に三次元的に形成され、場合により空間的に分画された再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）を有する皮膚／毛髪モデルであり、皮膚／毛髪等価物は、再構成真皮（偽真皮；ＰＤ）を含み、この中に偽乳頭（ＰＰ）が導入または挿入され、偽乳頭（ＰＰ）は、培養乳頭細胞、とりわけ真皮乳頭細胞（毛乳頭細胞）を適当なキャリヤ上および／または適当なマトリックス、とりわけゲルマトリックス中に含み、再構成表皮（偽表皮；ＰＥ）または偽周皮（ＰＩ）は、任意に真皮に適用される。
【００５０】
従って本発明の皮膚／毛髪等価物、とりわけ毛包モデルは、一般に偽真皮（ＰＤ）を含み、該偽真皮は、その中に再構成された真皮乳頭（偽乳頭；ＰＰ）を有する。それ自身を偽表皮（ＰＥ）または偽周皮（ＰＩ）に形づくる、または形づくったケラチノサイトの１つまたはそれ以上の層、および任意にメラノサイトの１つまたはそれ以上の層を、偽真皮（ＰＤ）上に適用することができる。このインビトロモデルは、例えば製薬、医療および化粧分野における有効性および適合性試験のために適している。毛髪の形態形成の最早段階（形態形成段階 I〜III）を思い出させるものを含む小胞様または小胞状構造は、本発明の三次元毛髪／皮膚モデルに形づくられる。
【００５１】
本発明は、請求項３２〜３７に記載するような本発明の皮膚／毛髪等価物の使用にも関する。加えて、さらなる詳細のために、本発明の方法および本発明の皮膚／毛髪等価物についての先の所見を参照することができ、従ってこれは、本発明の使用にもあてはまる。
本発明は、本発明の皮膚／毛髪等価物を含む系、とりわけ試験系（例えばスクリーニング系）にも関する。加えて、さらなる詳細のために、本発明の方法、本発明の皮膚／毛髪等価物、および本発明の使用についての先の所見を参照することができ、従ってこれは、本発明の系にもあてはまる。
【００５２】
本発明は、多くの利点を与える：
本発明の皮膚／毛髪等価物は、単離された毛包よりも標準化可能な再構成モデルである。それは、毛包の需要を減少させ、そして単層系よりもインビボ状況に近い。さらにそれは、動物試験に代わるものである。
本発明の再構成モデルは、複雑な三次元構造モデルであり、これは、その構造およびその組織組成においてインビボでの毛包を擬態し、その結果、活性物質（化粧品、薬剤など）の有効性および適合性に対して提供される情報について高度の関連性がある。
【００５３】
とりわけ以下の終点を、毛髪構造の改良および毛髪成長の影響に関する物質の有効性についての情報を得るために評価または測定することができる；偽乳頭を介するケラチノサイトの増殖／細胞消滅；偽乳頭を介するケラチノサイトの構造および配列；表皮の構造；角質層の構造；真皮乳頭の体積および構造；或る毛髪特異タンパク質（とりわけ毛髪特異ケラチン）の分析；サイトカイン、ケモキネシス、とりわけ真皮乳頭により形成されるあらゆる種類のメッセンジャー物質の分析；毛髪の配列分析、プロテオームまたは発現分析など。
【００５４】
本発明の再構成毛包モデルは、毛髪の着色についての影響（例えばアメラノサイティック(amelanocytic)ＯＲＳメラノサイトの着色；メラニン合成；メラニン顆粒；メラノサイトの配列；メラノサイトの移動；メラノサイトマーカー、例えば TRP-1、TRP-2、NKI/beteb などの変性；メラニンのケラチノサイトへの放出）を測定することができる唯一の再構成毛包モデルである。それは、例えば毛髪の配列分析のために使用することもできる。
【００５５】
本発明の毛髪／皮膚モデルは、医療、製薬および化粧分野における様々な用途のために（例えば化粧品などの開発のためのスクリーニング法において、インビトロ試験系で毛髪の着色、毛髪の成長および毛髪の構造に影響を及ぼすことにより、毛包に対して生物学的効果を有する活性物質を発見するために）適している。本発明のモデルまたは等価物は、毛包細胞に対する物質の効果についてインビボ関連性のある情報を提供する。本発明のモデルまたは等価物は、三次元モデルでの毛包または毛包部分を提供する。単離された毛包とは対照的に、再構成乳頭（偽乳頭；ＰＰ）は、いつでも入手することができ、標準化することができる。毛包の三次元構造を共有する真皮乳頭が再構成される。このようにして、適用される活性物質が、再構成三次元モデルの構造にいかに作用し、これら物質の毛包に対する効果（例えば毛髪の成長、毛髪の構造、毛髪の着色など）に関して何をこれに読み込むことができるかを評価することができる。
【００５６】
本発明の他の実施態様、変形および変法は、本明細書を読むことで専門家にとって容易に明らかになり、それらは、本発明の範囲から外れることなく実施することができる。
以下の実施例は、決して本発明を限定するものではなく、本発明を説明することが意図される。
【実施例】
【００５７】
偽真皮（ＰＤ）中に埋め込まれた、または挿入された再構成真皮乳頭（偽乳頭；ＰＰ）を有する皮膚／毛髪モデルの製造を、以下に記載する。この目的のために真皮乳頭細胞を、偽真皮（ＰＤ）中に注入するか、または偽真皮（ＰＤ）中のパンチにより配置する。代わりに適当なキャリヤ上で成長させた真皮乳頭細胞を、偽真皮調剤と混合することにより埋め込むことができる。次いで偽真皮（ＰＤ）を、偽表皮（ＰＥ）または偽周皮（ＰＩ）を表す表皮または毛包ケラチノサイトの層、および任意にメラノサイトで被覆することができる。
【００５８】
次の表に定める定義が、以下で用いられる。
【表１】
2005525088.tif 000003
【００５９】
手順および方法：
単細胞培養物の調製
真皮線維芽細胞
真皮線維芽細胞をヒト包皮から単離する。該包皮の表皮および真皮を、サーモリシン（０.５ｍｇ／ｎｌ ＨＥＰＥＳ緩衝剤）で相互から酵素的に分離する。線維芽細胞を抽出するために真皮を、コラゲナーゼＨ（０.２Ｕ／ｍｌ、Boehringer Mannheim、マンハイム、ドイツ）で消化させる（３７℃で３〜４時間）。インキュベーション段階後に、細胞を希釈するために溶液を慎重に混合し、細胞ふるいを通して濾過し、細胞を遠心分離する。培養を、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で Glutamax I (Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン) およびピルビン酸ナトリウム、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ)(Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ）で強化された４,５００ｍｇＬ-1のグルコースおよびピリドキシン（Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ）、２５μｇ ｍＬ-1のゲンタマイシン（Sigma、タウフクリッヒェン(Taufkirchen)、ドイツ）および１００ＵＩ ｍＬ-1のペニシリンＧ (Sigma) [1] で行う。
【００６０】
表皮ケラチノサイト
真皮線維芽細胞をヒト包皮から単離する。該包皮の表皮および真皮を、サーモリシン（０.５ｍｇ／ｎｌ ＨＥＰＥＳ緩衝剤）で相互から酵素的に分離する。ケラチノサイトを抽出するために表皮を、トリプシン (Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ) で消化させる（３７℃で２０分）。インキュベーション段階後に、細胞を希釈するために溶液を慎重に混合し、細胞ふるいを通して濾過し、細胞を遠心分離する。培養を、ウシ新生児血清 (ＮＣＦ、fetal clone II、Hyclone)、表皮成長因子 (ＥＧＦ)(Sigma)、インシュリン (Sigma)、ヒドロコルチゾン (Sigma)、トリヨード-Ｌ-サイロニン (Sigma)、アデニン (Sigma)、コレラトキシン (Sigma) 並びに抗生物質で強化された DMEM Glutamax I および Ham's F 12 (Sigma)(３：１)の混合物 [1] 中で、フィーダー層（増殖を阻害するために６０グレイで照射した真皮線維芽細胞）上で行う。
【００６１】
外毛根鞘ケラチノサイト（ＯＲＳケラチノサイト）
ＯＲＳケラチノサイトを、後頭部から抜いたヒトの毛髪から単離する。ケラチノサイトを抽出するために、毛根の残りをまずメスで取り除き、小胞をトリプシン (プロテアーゼ、Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ) で消化させる（３７℃で４０分）。インキュベーション段階後に、細胞を希釈するために溶液を慎重に混合し、細胞ふるいを通して濾過し、細胞を遠心分離する。培養を、ウシ新生児血清 (ＮＣＦ、fetal clone II、Hyclone)、表皮成長因子 (ＥＧＦ)(Sigma)、インシュリン (Sigma)、ヒドロコルチゾン (Sigma)、トリヨード-Ｌ-サイロニン (Sigma)、アデニン (Sigma)、コレラトキシン (Sigma) および抗生物質で強化された DMEM Glutamax I および Ham's F 12 (Sigma)(３：１)の混合物 [1] 中で、フィーダー層（増殖を阻害するために６０グレイで照射した真皮線維芽細胞）上で行う。
ＯＲＳメラノサイトを、Tobin らの方法により単離する [3]。
【００６２】
真皮乳頭細胞
真皮乳頭細胞を、頭皮（側頭または後頭領域）から無傷毛包で単離する。この目的のために上真皮を取り出し、真皮乳頭と一緒の小胞を、時計工ピンセットを使用して真皮から引き抜く。真皮乳頭のさらなる単離を、ステレオ拡大鏡の下で行う。次いで真皮乳頭を、I 型コラーゲンで被覆した培養瓶にマイクロキャピラリーにより移す。培養を、２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ)(Gibco BRL、カールスルーエ、ドイツ）および抗生物質で強化されたグルタミン含有 RPMI 1640 培地 (Sigma) 中またはウシ胎児血清１０％含有チャング培地中のいずれかで行う。
【００６３】
偽真皮（ＰＤ）の製造
毛髪モデルを確立するために、まず偽真皮（ＰＤ）を発生させる。この目的のために、第４継代の真皮線維芽細胞を、ラットの尾の腱からの I 型コラーゲンと混合し、マルチウェルプレート中で播種する。この目的は、細胞数、培養時間、層の厚さ、真皮等価物（偽真皮；ＰＤ）の寸法を最適化することである。製造を、以下の実験計画にあわせて行う：１部のＨＢＳＳ緩衝剤（Gibco BRL）を、８部のコラーゲン溶液 (Becton Dickinson) と混合し、１Ｍの水酸化ナトリウムで中和する。必要量の細胞を、１部のウシ胎児血清（ＦＣＳ、Gibco BRL）中に添加する。得られた混合物（偽真皮調剤）を、細胞培養皿に注ぎ、インキュベーション室内で３７℃で１時間インキュベートする。コラーゲンの重合後にモデルを、１０％のＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンで補足されたＤＭＥＭで被覆する。培地を、１週間あたり３回、７日間にわたって変更する。
【００６４】
以下の調剤を試験した。
【表２】
2005525088.tif 000004
【００６５】
真皮乳頭細胞（ＤＰＣ）の単層培養の最適化
真皮乳頭細胞の単層培養を最適化するために２つの異なる培地を、一次培養物を調製するために使用する。
１.  ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＦＣＳ２０％含有 RPMI 1640 (Sigma)
２.  ＦＣＳ１０％含有チャング培地 (Irvine Scientific)
一方で一次培養物（Ｐ０）を、示した培地中で調製し、他方で培養を続けるために使用する培地が、細胞の増殖、形態および配列に対する効果を有するかどうかを測定するために試験を行う。
【００６６】
真皮乳頭細胞の増殖に対する Matrigel(商標) の影響
Matrigel(商標)(Becton Dickinson) を、偽真皮（ＰＤ）中に置かれた真皮乳頭細胞のための環境培地として使用することができる [4,5]。Matrigel(商標) は、マウスの Engelbreth-Holm-Swarm 腫瘍から得られ、主としてラミニン、IV 型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ナイドジェン（とりわけエンタクチン）、およびまたＴＧＦ-β、ＦＧＦ、およびＥＨＳ腫瘍の他の成長因子を含有する。ＤＰＣの増殖に対する Matrigel(商標) の影響を研究するために、ＤＰの一次培養を、Matrigel(商標) で被覆した細胞培養瓶内で行い、成長を観察する。比較のためにＤＰを、同時に、I 型コラーゲンで被覆した細胞培養瓶内で成長させる。
【００６７】
偽真皮（ＰＤ）中にＤＰＣを挿入するための注入チャネルの調製
注入チャネルを調製するために、ボタンカニューレ、通常のカニューレおよび２ｍｍのパンチを使用する。チャネルを際立たせるために、１％のアガロース溶液中１０％のベルリンブルーの溶液を調製し、ボタンカニューレおよび通常のカニューレを使用して真皮等価物中に注入する。パンチを使用する場合、生検パンチで調製したチャネルを、直ちにまたは２４時間後のいずれかに、ボタンカニューレを使用して充填する。チャネルを、ステレオ拡大鏡により調製する。凍結切片を調製するため、および組織検査のために、２４時間後にモデルを深冷凍結する。
【００６８】
偽真皮（ＰＤ）中へのパンチの挿入による再構成乳頭の製造
まず第２継代の真皮乳頭細胞を、２５０,０００細胞／ｍｌの濃度でラットの尾の腱からの I 型コラーゲンと混合し、マルチウェルプレート中で播種した。細胞数を、偽真皮（ＰＤ）の製造に従い選択した。
製造を、以下の実験計画にあわせて行った：１部のＨＢＳＳ緩衝剤（Gibco BRL）を、８部のコラーゲン溶液 (Becton Dickinson) と混合し、１Ｍの水酸化ナトリウムで中和した。必要量の細胞を、１部のウシ胎児血清（ＦＣＳ、Gibco BRL）中に添加した。得られた混合物（偽真皮調剤）を、細胞培養皿に注ぎ、インキュベーション室内で３７℃で１時間インキュベートした。コラーゲンの重合後にモデルを、１０％のＦＣＳで補足されたチャング培地で被覆した。培地を、１週間あたり３回、８日間にわたって変更した。
【００６９】
この培養期間後に穴を、２ｍｍのパンチで７日の偽真皮中にあけた。５μｌ量の Matrigel を注入し、重合コラーゲン／ＤＰＣ混合物からの３ｍｍの生検材料を、こうして形成した穴に挿入した。モデルを、１０％のＦＣＳで補足されたチャング培地で被覆し、培地を、１週間あたり３回、６日間にわたって変更した。次いでモデルを、組織学的および免疫組織化学的な評価に付した。
【００７０】
真皮乳頭中の I 型コラーゲンは毛包中に表れず、純粋 Matrigel(商標) に穴をあけることはできないので、別の実験において、真皮乳頭細胞のためにより生理的な環境を創り出すことを試みた。この目的のために第２継代の真皮乳頭細胞を、２５０,０００細胞／ｍｌの濃度で、ラットの尾の腱からの I 型コラーゲンおよび Matrigel(商標) の組合せと混合し、マルチウェルプレート中で播種した。その製造方法において、ゲルの調製に通常使用されるコラーゲンを、様々な比で混合されたコラーゲン／Matrigel(商標) により置き換えた。
【００７１】
さらなる実験において他のパンチモデルを、増加させた細胞濃度（５００,０００細胞／ｍｌ〜２×１０6細胞／ｍｌの間）で調製し、１部の Matrigel(商標) および２部の I 型コラーゲンの組合せが最適であることを見出した。完了後にモデルを、組織学的および免疫組織化学的な評価に付した。
【００７２】
真皮乳頭細胞の偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中への注入による再構成真皮の製造
非常に高い細胞密度を確立するために細胞を、まず必要な細胞濃度で Matrigel(商標) と混合し、次いで冷却遠心機（５分、１,０００ｒｐｍ、Ｔ＝１℃）で遠心分離した。次いで過剰の Matrigel(商標) を除去し、後に残った細胞ペレットをピペットで取り出し、偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中に直接注入した。こうして製造したモデルを、組織学的および免疫組織化学的な評価に付した。
【００７３】
真皮乳頭細胞で過成長させたマイクロキャリヤの偽真皮（ＰＤ）または偽真皮調剤中への埋込みによる再構成乳頭の製造
マイクロキャリヤの使用は、真皮乳頭細胞を再現性のある予定の三次元構造に培養することを可能にし、これは毛包における生理的配列を有効に擬態する。原則として適当なマイクロキャリヤは、その上で真皮乳頭細胞を培養し得るあらゆる種類の三次元キャリヤである。以下のキャリヤ物質を試験した：
【００７４】
【表３】
2005525088.tif 000005
【００７５】
マイクロキャリヤを偽真皮または偽真皮調剤に挿入する前に、それらを、真皮乳頭細胞でプレインキュベートし、それによりそれらは充分な密度で成長する。選択キャリヤに応じて培養を、攪拌若しくは流動床反応器（Eddy pro 10、Papaspyrou Biotechnologie）またはスピナー瓶内において振とうまたは攪拌培養で行うことができる。真皮乳頭細胞を、いつでもチャング培地中で数日間培養した。その時に細胞成長を、ニュートラルレッド着色、ＭＴＴ試験、細胞数の測定、および免疫組織化学的検出（例えばバーシカンの発現）により監視し、様々なキャリヤの適性をそうして確認した。
【００７６】
真皮乳頭細胞を含有する無孔質アルギン酸カルシウムビーズを製造することもできる。この目的のためにアルギン酸ナトリウム溶液は、真皮乳頭細胞と混合され、得られた混合物は、カニューレを通して塩化カルシウム溶液に滴下して導入される。ナトリウムイオンは、カルシウムイオンにより置き換えられ、その結果、アルギナートの重合が生じ、この中で乳頭細胞は、アルギナートに組み込まれる。
【００７７】
偽乳頭（ＰＤ）または偽乳頭調剤（とりわけ既に形成したマトリックスを有するもの）の注入チャネルに挿入する前に、キャリヤを部分的に Matrigel(商標) で被覆した。代わりに、またはこれに加えてマイクロキャリヤが挿入されたチャネルを、Matrigel(商標) で裏打ちすることもできる。
【００７８】
偽真皮または形成したマトリックスを有する偽真皮調剤中にマイクロキャリヤを挿入することのほかにも、真皮乳頭細胞で過成長させたキャリヤを、偽真皮中にその製造（即ち、偽真皮調製）の間に埋め込むことも、調べた。この目的のために、真皮乳頭細胞で過成長させた様々な体積のマイクロキャリヤを、真皮線維芽細胞および I 型コラーゲンと混合し、該モデルを７日間培養した。
【００７９】
表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）の偽真皮および表皮、または毛ケラチノサイト（ＯＲＳケラチノサイト）の偽周皮の皮膚モデルの製造（偽乳頭ありおよび偽乳頭無し）
再構成毛包モデルをさらに開発するために偽真皮を、５日の培養後に Snapwell Inserts (Corning Costar) に移し、まず表皮ケラチノサイト（５００,０００細胞／モデル）で被覆した。ケラチノサイト培地（ウシ新生児血清 (ＮＣＦ、fetal clone II、Hyclone)、表皮成長因子 (ＥＧＦ)(Sigma)、インシュリン (Sigma)、ヒドロコルチゾン (Sigma)、トリヨード-Ｌ-サイロニン (Sigma)、アデニン (Sigma)、コレラトキシン (Sigma)、アスコルビル-２-ホスフェート (Sigma) および抗生物質で強化された DMEM Glutamax I および Ham's F 12 (Sigma)(３：１) 中における１週間の液中培養後、モデルを気／液界面に移し、インシュリン (Sigma)、ヒドロコルチゾン (Sigma)、アスコルビル-２-ホスフェート (Sigma)、ウシ血清アルブミン (Sigma) および抗生物質で強化された DMEM Glutamax I および Ham's F 12 (Sigma)(３：１) 中でさらに２週間培養した。
別の実験において表皮ケラチノサイトを、毛包からのＯＲＳケラチノサイトにより置き換え、これを８００,０００細胞／モデルで播種した。培養（液中）を、ケラチノサイト培地で７日間行った。
【００８０】
結果
以下のパラメーターは、偽真皮（ＰＤ）を製造するための最適な条件を表すことが分かった：２.５×１０5細胞／ｍｌゲル調剤（偽真皮調剤）は、７日間、１２ウェルプレート中で培養される。播種時の層の厚みは１０ｍｍである。７日後にモデルは完全に収縮し、残りの層の厚みは３.３ｍｍであり、これは、約６７％の収縮に相当する。
ＤＰＣ一次培養物の調製における細胞増殖は、ＲＰＭＩ培地中よりもチャング培地中において良好であることが分かった。培養を続けたとき、細胞成長において２つの培地の間に違いはなかった。両方の培地を使用する場合、細胞は、一次培養および第１継代の両方において、典型的にクラスターに配列される。
【００８１】
Matrigel(商標) で被覆した培養瓶を使用した場合、細胞成長は、I 型コラーゲンで被覆した成長表面と比べて遅かった。これは、おそらく Matrigel(商標) 中におけるＥＣＭ分子の高含有量に帰すことができ、これが、遅い細胞成長の場合に細胞分化を促進する。
ボタンカニューレを注入チャネルを調製するために使用してもよい。なぜなら充分に大きなチャネルを、そのようなカニューレにより偽真皮（ＰＤ）を貫通することなく、調製することができるからである。パンチを使用することもでき、その場合にチャネルを、細胞／Matrigel(商標) 混合物で充填することができ、またはＤＰＣを有する Matrigel(商標) のパンチを、存在するチャネル中に置くことができる。
【００８２】
真皮乳頭細胞で過成長させたマイクロキャリヤを、注入またはゲル調剤（または偽真皮調剤）との混合によって埋め込むことによる偽乳頭の製造が、特に適している。流動床反応器中における Siran キャリヤでの培養、とりわけ Percell Cultispheres(商標) での振とう培養を、特に有利に行うことができる。その表面上で密な細胞成長が、数日で得られた。
ケラチノサイト培地中における偽真皮のＯＲＳケラチノサイトでの被覆（付録を参照）は偽真皮の形成を導くのに対して、表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）およびケラチノサイトでの気／液界面培地における被覆は、表皮の形成を導く。
【００８３】
付録 I：細胞培地の組成
【表４】
2005525088.tif 000006
【００８４】
【表５】
2005525088.tif 000007
【００８５】
【表６】
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【００８６】
【表７】
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【００８７】
【表８】
2005525088.tif 000010
【００８８】
【表９】
2005525088.tif 000011
【００８９】
付録 II：実施例中で引用した参考文献
[1]  K. Schlotmann ら, Cosmetic Efficacy Claims In Vitro Using a 3D Human Skin Model, Int. J. Cosmet. Sci. 23, 第310-319頁 (2001年)
[2]  R. Warren ら, Improved Method for the Isolation and Cultivation of Human Scalp Dermal Papilla Cells, J. Invest. Dermatol. 98, 第693-699頁 (1992年)
[3]  D.J. Tobin ら, Isolation and Long-Term Culture of Human Hair-Follicle Melanocytes, J. Invest. Dermatol. 104, 第86-89頁 (1995年)
[4]  A. Limat ら, Outer root sheath cells organize into epidermoid cyst-like spheroids when cultured in Matrigel(商標). Cell Tissue Res. 275, 第169-176頁 (1994年)
[5]  EP 0 218 065 A2
【図面の簡単な説明】
【００９０】
（原文に記載なし）
【図１】
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【図２】
2005525088.tif 000013
【国際調査報告】
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