(57)【要約】本発明は、シリカベースの支持物質（特に、粘土物質、砂、および粘土物質−砂混合物）を用いる、核酸抽出および核酸精製のための多価カチオンおよびキレート剤の使用に関する。従って、任意の量の各種核酸含有物質から核酸を精製するための汎用的方法が、提供される。本発明は、核酸の単離および／または精製のための方法を開示する。この方法は、ａ）核酸含有物質（サンプル）を、核酸の吸着のために、多価カチオンの塩の存在下で支持物質と接触させる工程；ｂ）該支持物質を、少なくとも１回洗浄する工程；ならびにｃ）該カチオンに適切なキレート剤水溶液を、該核酸の脱離のために該支持体に添加すること、および該支持物質から該核酸含有水溶液を分離することによって、該核酸を単離する工程；を包含する。
2005525819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の単離および／または精製のための方法であって、
ａ）核酸含有物質（サンプル）を、核酸の吸着のために、多価カチオンの塩の存在下で支持物質と接触させる工程；
ｂ）該支持物質を、少なくとも１回洗浄する工程；ならびに
ｃ）該カチオンに適切なキレート剤水溶液を、該核酸の脱離のために該支持体に添加すること、および該支持物質から該核酸含有水溶液を分離することによって、該核酸を単離する工程；
を特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
工程（ｂ）の前に、前記支持物質と前記サンプルとを互いに分離する工程（工程ａ’）
を特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記支持物質は、粘土鉱物、砂、または粘土鉱物と砂との混合物であることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記粘土鉱物は、粘土鉱物の混合物であることを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法であって、前記粘土鉱物は、１：１粘土鉱物および／または２：１粘土鉱物であることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、前記粘土鉱物は、カオリナイトおよび／またはモンモリロナイト（ベントナイト）であることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の方法であって、前記核酸含有物質は、ウイルス、バクテリオファージ、インタクトな細胞、細胞フラグメント、原核生物、酵母、下等真菌および高等真菌、植物物質、無脊椎動物、ヒトおよび動物由来の血液および組織、ヒト細胞培養物、動物細胞培養物および植物細胞培養物、尿、糞便、食糧、法医学標本物質、土壌、核酸含有アガロースゲルまたはＰＣＲ反応混合物からなる群より選択されることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の方法であって、工程（ａ）において、１種の多価カチオンの数種の塩または数種の多価カチオンの数種の塩を使用することを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法であって、前記塩は、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、および／またはＡｌＣｌ３であることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の方法であって、工程（ｃ）において、数種のキレート剤を使用することを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の方法であって、前記支持物質を、適切な緩衝剤中の懸濁物の形態で提供することを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載の方法であって、前記支持物質を、スピンカラムの形態で提供することを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記スピンカラムに前記核酸含有物質（サンプル）を適用しそして遠心分離を実行することによって、工程（ａ）および（ａ’）を実行することを特徴とする、方法。
【請求項１４】
請求項１２および１３に記載の方法であって、前記スピンカラムに洗浄溶液を適用しそして遠心分離を実行し、そして必要に応じて異なる洗浄溶液を用いてこの工程を数回反復することによって、工程（ｂ）を実行することを特徴とする、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、洗浄のためにアルコールをさらに含有するＥＤＴＡ含有緩衝溶液を使用して、工程（ｂ）を数回実行することを特徴とする、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、まずアルコール緩衝溶液を用い、その後、アルコールを含有するＥＤＴＡ含有緩衝液を用いて、洗浄を実行することを特徴とする、方法。
【請求項１７】
請求項１５および１６に記載の方法であって、前記アルコールは、エタノール、プロパノール、および／またはイソプロパノールであることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１３に記載の方法であって、１種以上のＲＮアーゼまたはＤＮアーゼでの処理を、工程（ａ）の前または工程（ａ）もしくは（ａ’）の後でかつ工程（ｃ）の前に、実行することを特徴とする、方法。
【請求項１９】
核酸含有物質から核酸を単離するため、および／または核酸を精製するための、粘土鉱物の使用。
【請求項２０】
請求項１９に記載の使用であって、前記粘土鉱物は、異なる粘土鉱物の混合物であることを特徴とする、使用。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の使用であって、前記粘土鉱物は、１：１粘土鉱物および／または２：１粘土鉱物であることを特徴とする、使用。
【請求項２２】
請求項２１に記載の使用であって、前記粘土鉱物は、カオリナイトおよび／またはモンモリロナイト（ベントナイト）であることを特徴とする、使用。
【請求項２３】
請求項１９または２２に記載の使用であって、前記核酸含有物質は、ウイルス、バクテリオファージ、インタクトな細胞、細胞フラグメント、原核生物、酵母、下等真菌および高等真菌、植物物質、無脊椎動物、ヒトおよび動物由来の血液および組織、ヒト細胞培養物、動物細胞培養物および植物細胞培養物、尿、糞便、食糧、法医学標本物質、土壌、核酸含有アガロースゲルまたはＰＣＲ反応混合物からなる群より選択されることを特徴とする、使用。
【請求項２４】
核酸をシリカベースの支持物質に結合するための、１種以上の多価カチオンの塩を含む緩衝液の使用。
【請求項２５】
請求項２４に記載の使用であって、前記カチオンは、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、および／またはＡｌ３＋であることを特徴とする、使用。
【請求項２６】
請求項２４に記載の使用であって、前記塩は、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、および／またはＡｌＣｌ３であることを特徴とする、使用。
【請求項２７】
請求項２４〜２６に記載の使用であって、前記支持物質は、粘土鉱物、砂、または粘土鉱物と砂との混合物であることを特徴とする、使用。
【請求項２８】
請求項１〜１８に記載の方法を実行するための、キット。
【請求項２９】
請求項２８に記載のキットであって、該キットは、適切な緩衝剤中に支持物質の懸濁物を含むことを特徴とする、キット。
【請求項３０】
請求項２９に記載のキットであって、前記支持物質は、粘土鉱物、砂、または粘土鉱物と砂との混合物であることを特徴とする、キット。
【請求項３１】
請求項２９に記載のキットであって、該キットは、砂と粘土鉱物との混合物を充填されたスピンカラムを含むことを特徴とする、キット。
【請求項３２】
請求項２８〜３１に記載のキットであって、該キットは、細胞溶解用薬剤、洗浄溶液（洗浄緩衝液）および／または前記方法を実行するために有用な他の装置、手段、もしくは試薬をさらに含むことを特徴とする、キット。
【請求項３３】
請求項３２に記載のキットであって、該キットは、以下の緩衝液および溶液：
（ａ）塩化マグネシウム含有緩衝液、塩化カルシウム含有緩衝液、塩化マンガン含有緩衝液、および／または塩化アルミニウム含有緩衝液；
（ｂ）ＥＤＴＡ含有緩衝液またはＥＧＴＡ含有緩衝液；
（ｃ）エタノール含有緩衝液またはイソプロパノール含有緩衝液；ならびに
（ｄ）ＤＮアーゼＩもしくはＲＮアーゼＡまたは他のヌクレアーゼおよび／あるいはプロテアーゼを含む、溶液
を含むことを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカベースの支持物質（支持体）、特に、粘土鉱物、砂および粘土鉱物／砂混合物を用いて核酸抽出および核酸精製するための多価陽イオンおよびキレート剤の使用に関する。従って、任意の量の各種の核酸含有物質から核酸を精製するための汎用法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
古典的に、当該分野の状態では、核酸は、強力な変性剤および還元剤（加水分解酵素（例えば、プロテアーゼ、リゾチーム、リチカーゼ（ｌｉｔｉｃａｓｅ））を含む）によって、細胞および組織から放出され、その後クロロホルムとフェノールとの混合物を用いて実質的に抽出されそして精製される。核酸は、最終的には、エタノール沈降によって水相から得られるか、または透析によって濃化（ｎａｒｒｏｗ  ｄｏｗｎ）される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０００３】
これらの「古典的」方法は、特に、時間がかかり（ときおり、４８時間までかかる）、かなりの量の装置および比較的多量の生物学的物質を必要とし、さらにかなりの健康上のリスク（とりわけ、クロロホルムおよびフェノールの使用に起因するもの）を伴う。
【０００４】
ここ数年、簡素化および健康上のリスクの軽減を目的とした代替の抽出および精製法が開発されている。これらは、ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＧｉｌｌｅｓｐｉｅの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７６，１９７９，６１５−６１９）に基づき、この方法は、初めて、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの分取的かつ分析的な抽出のために開発された。この方法によると、アガロースのＤＮＡ含有片を溶解し、そしてＤＮＡが、高濃度のカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）塩（ヨウ化ナトリウムまたはグアニジン塩）の存在下で、シリカまたはシリケート（ガラスビーズまたはガラスミルク）に可逆的に結合する。さらなる精製方法において、シリカマトリクスを、緩衝溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ；２ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ；５０％  エタノール）で洗浄し、そして最後に、ＤＮＡを、水または希釈緩衝溶液（例えば、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で溶出する。
【０００５】
この方法に基づく改変方法が、種々の物質から核酸を（とりわけ、細菌溶解物からプラスミドＤＮＡを、ならびに血液、動物もしくはヒトまたは植物の組織および細胞培養物からゲノムＤＮＡおよび総ＲＮＡを）抽出および精製するために使用された（Ｍａｒｋｏ，Ｍ．Ａ．，Ｃｈｉｐｐｅｒｆｉｅｌｄ，Ｒ．，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１，１９８２，３８２−３８７）。
【０００６】
これらの方法は、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，ＤＥ）またはＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（Ｄｕｒｅｎ，ＤＥ）からキットの形態で販売されているが、この方法は、核酸が、高イオン強度、特に、カオトロピック塩の存在下で、鉱物支持体に結合するという原理に基づく。微細に粉砕されたガラス粉末（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ；ＭｏＢｉｏｌ）、珪藻土（Ｓｉｇｍａ）またはシリカゲル（Ｑｉａｇｅｎ）は、化学的に改変された物質（例えば、炭化ケイ素（米国特許第６，２９１，２４８号））もまた使用され得る首尾良い支持物質として実証されている。
【０００７】
米国特許第５，２３４，８０９号は、種々の物質（血液、血清、糞便、尿および細胞培養物）から核酸を精製するための方法を開示し、この方法は、首尾良いことが証明されている。この方法において、カオトロピック剤（例えば、高濃度の界面活性剤およびグアニジン塩）を含む緩衝液が、細胞溶解のために使用され、そして同時に、固体支持体（例えば、シリカ、ポリスチレンボール、ニトロセルロース紙）への核酸の結合のためにも使用される。エタノール含有溶液またはイソプロパノール含有溶液を用いる十分に公知の洗浄工程が、溶解した不純物を支持体から除去するために使用される。水または１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＴｒｉｓもしくはＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ，１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）のような低塩緩衝液での溶出は、最終的に、支持物質からの核酸の脱離をもたらす。
【０００８】
この方法の利点は、カオトロピック塩が、不可逆的な変性を保証し、従ってヌクレアーゼの不活性化を保証する点である。この方法の決定的な欠点は、ある程度のカオトロピック塩の濃度が、使用される物質によって確実に調節される必要があり、そして生物学的物質（例えば、真菌組織または植物組織）の溶解は、時々非常に非効率的であることである。さらに、精製方法における、酵素（プロテイナーゼ、ＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ））の頻繁な選択された使用のために、カオトロピック剤の濃度は、ヌクレアーゼの不活性化をもたらす値未満に低下させなければならない。
【０００９】
さらに、カオトロピック塩の使用を包含しないシリカに基づく代替技術が、開示される（例えば、ＤＥ１９８  ５６  ０６４  Ａ１）。この市販の方法の利点は、非常に少量の核酸成分しか有さない材料からさえも、核酸が、汎用のプロトコルで抽出され得る点である。欠点は、核酸調製物が、必要な品質基準（光度測定を含む）を例外なくは満たさず、それにより、２６０ｎｍ／２８０ｎｍ  で１．７０未満である吸光度を有する点である。
【００１０】
さらなる方法は、交換樹脂（米国特許第５，０５７，４２６号）による、核酸のクロマトグラフィー精製に基づく。この方法において、細胞溶解物中の核酸は、樹脂の正に荷電した基に結合し、そして種々の洗浄工程の後で、高濃度のアニオンにより、マトリックスから溶出される。この方法は、大量の生物学的物質からの核酸の抽出および精製のために、特に使用される。一般的な市販のアプリケーションは、純度の高い核酸を送達する、重力式通下流カラムを使用する。このシステムの欠点は、この方法が、非常に時間がかかり（染色体ＤＮＡの場合には１６時間以上）、核酸は脱塩され、そして溶出後に沈殿される必要があるので、その後、水または低塩緩衝液（例えば、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）または  １０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ，  １ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）に溶解される必要があることである。さらに、このマトリックスは、細胞外高分子物質（例えば、粘液）の存在によって閉塞され得、その結果、核酸を得られないか、または少量の核酸もしくは質の低い核酸のみが得られ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、純度の高いＤＮＡおよび純度の高い全ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡおよびｈｎＲＮＡを含む）が調製され得る方法を利用可能にすることであり、この方法は、核酸含有供給源物質に対して普遍的に適用可能であり、そして取り扱いが迅速かつ単純である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に従って、この物体を、多価カチオンを含有する緩衝液の使用により溶解する。
【００１３】
本発明は、それゆえ、これらの支持物質のための（２）新規緩衝液の存在下で、（１）シリカベースの支持体を使用する核酸の抽出および精製に関連する。ここで、（１）シリカベースの支持体は、特に鉱物支持物質であり、その鉱物支持物質は、現在まで核酸の単離のための支持物質として提案および／または使用されておらず、（２）新規緩衝液は核酸の上記の支持体（特に、鉱物支持体）への結合を特異的に生じさせ、そしてこの支持体からの夾雑物質の除去およびこの支持体からの核酸の溶出をもたらす。
【００１４】
（１）に関して：
本発明に従う方法において、例えば、異なる粒子の大きさのガラス繊維、不織布（フリース）またはケイ素化合物のようなシリカベースの支持体は、支持物質として使用され得る。
【００１５】
特に好ましくは、使用は、粘土鉱物、砂または粘土鉱物と砂との混合物（粘土鉱物−砂の混合物）から作製され、核酸精製のために現在まで使用されているシリカ物質から、それらの続成作用、鉱物学および物理化学的特性において明確に異なる。
【００１６】
粘土鉱物は、主としてフィロシリケートに属すが、ある場合においてはシリケート（例えば、パリゴルスカイト（アッタプルガイト）およびセピオライト（海泡石）にもまた属し、シリケートは粘土および粘土石の主要な鉱物貯蔵物を形成し、そして沈泥および沈泥石、粘板岩および砂ならびに砂岩においてもまた生ずる。粘土鉱物（一続きの１テトラへドロンおよび１オクタヘドロン層からなる）は、二層粘土鉱物または１：１鉱物、あるいはまた、間隔をあけた後の７Å粘土物質とも呼ばれ、テトラヘドロン層のベース間隔として専門用語に参照される；これらとしては、例えば、カロリナイト、ディッカイトおよびナクライトが挙げられる。１オクタヘドロンと２テトラヘドロンの層の形成からの粘土鉱物は、三層鉱物または１０Å鉱物あるいは２：１鉱物と呼ばれる；これらは、イライト、スメクタイト（モントモリロナイトは、スメクタイトグループの主要な代表物であり、そしてベントナイトの主要な組成物である。実際には、ベントナイト、スメクタイトおよびモントモリロナイトは、供給源として使用され得る多層シリケートの同義語として使用される）、海緑石および蛭石が挙げられる。さらなる独立したオクタヘドロン層が三層形成間に組み込まれる場合、四層鉱物または１４Å鉱物が産生される；例として、緑泥石がある。特別な粘土鉱物グループは、層間鉱物により表される。これらの層のパッケージ（それらは互いに対して比較的容易に移動し得、そして、多くの粘土物質に典型的であってそれらの完全な切断性をもまた表す、層状に貼り合わせた構造を産生する）の間で、イオンおよび水分子は、例えば、包埋されるようになり得る；このことは、例えば、スメクタイトの場合において層間隔の拡張（膨張）を導き得る。
【００１７】
本発明の好ましい目的は、それゆえ核酸含有物質からの核酸の単離のための、粘土物質の使用および／または核酸の精製のための使用であり、ここで粘土物質は本発明の意味において、個々の粘土物質または異なる粘土物質（好ましくは１：１および／または２：１の粘土物質）の混合物である。特定の実施形態に従って、カロリナイトおよび／またはモントモリロナイト（ベントナイト）が、使用される。言及が、以下、「粘土物質」についてなされる場合には、この用語はまた、上記の混合物を含むようにもまた意図される。
【００１８】
地質学的に、砂は、小さなほぼ球形のフラグメント／粒子の混合物であり、これらは、石の風化の間に作られる。粒子の直径は、０．０５と２ｍｍの間である。砂は、主に石英からなり、さらに他の鉱物（例えば、シルト（非常に微細な砂、直径０．００２〜０．０６ｍｍ）、雲母、長石、セライト（ＣａＣＯ３）、磁鉄鉱、粘土鉱物および重鉱物）を含む。
【００１９】
従って、本発明の目的はまた、核酸含有物質からの核酸の単離および／または核酸の精製のための砂の使用である。本発明の意味において、これは、異なる起源の砂を含み、そして砂と鉱物の人工的な混合物もまた含み得る。
【００２０】
特定の実施形態によると、使用は、酸処理して溶融温度以下で加熱した（ｃａｌｃｉｎａｔｅ）海砂（Ｍｅｒｃｋ）または上記の海砂と粘土鉱物、特に、カオリナイトおよび／またはモンモリロナイト（ベントナイト）の混合物（例えば、海砂および粘土鉱物（１００：１の割合）で作られる。以下に「砂」という言及がなされるときは、この用語はまた、上記混合物を含むことが意図される。
【００２１】
（２）に関して:
本発明によると、緩衝液は、上記シリカベースの支持体（特に、粘土鉱物および／または砂）上での、核酸の結合、精製および溶出をもたらすように使用される。本発明の方法について、低濃度（０．２モル／ｌ以下）で、単価ではなく多価のカチオンの存在は、鉱物支持体への核酸の結合に十分である。本発明の意味において、核酸の精製および溶出について、精製のためにキレート剤（アルコール）を含む緩衝液の使用が必須である。
【００２２】
従って、本発明の目的は、シリカベースの支持体（特に、粘土鉱物、砂または粘土鉱物／砂の混合物）への核酸の結合のための、１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の多価のカチオンの塩を含む緩衝液の使用である。
【００２３】
本発明は、特に、核酸の単離および／または精製のための方法またはプロセスに関し、ここで、以下：
（ａ）核酸含有鉱物（サンプル）は、多価カチオンの塩の存在下で、核酸と上記支持体との吸着のための接触をもたらし、好ましい実施形態によると、この支持体は、粘土鉱物、砂または粘土鉱物−砂混合物である、
（ｂ）この支持体は、１回以上（すなわち、少なくとも１回）洗浄され、ここで、少なくとも１つの工程は、キレート剤およびアルコールを含む緩衝液の使用を含む、そして
（ｃ）カチオンに適切なキレート剤水溶液を、核酸の脱離のためにこの支持体に添加すること、およびこの支持体から核酸含有水溶液を分離することによって、この核酸は単離される。
【００２４】
必要に応じて、工程（ｂ）の前に、この支持体およびサンプルは互いから分離される（工程ａ’）。
【００２５】
この方法において、段階（ａ）において、多価カチオンまたはいくつかの多価カチオンのいくつかの塩が使用され得る。これらのカチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、および／またはＡｌ３＋であり、そして塩は、特に、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、および／またはＡｌＣｌ３である。対応して、工程（ｂ）および（ｃ）において、いくつかのキレート剤が同時に使用され得る。
【００２６】
本方法は、適切な緩衝液中において懸濁物の形態の支持体を生成することによって実施され得る。あるいは、本方法は、スピンカラムの形態で実施され得、これは、支持物質（好ましくは、砂または砂と粘土物質との混合物）により充填される（そして、好ましくは、緩衝溶液もまた、これに加えられる）。
【００２７】
最後に言及した本方法のスピンカラムの改変法において、工程（ａ）および（ａ’）は、核酸含有物質（サンプル）をスピンカラムに適用し、遠心分離を実行することによって実行され得る。
【００２８】
工程（ｂ）は、洗浄溶液をスピンカラムに適用し、遠心分離を実行し、可能であれば、この工程を数回繰返し、可能であれば、異なる洗浄溶液を用いることで実行され得る。特定の実施形態によると、工程（ｂ）は、ＥＤＴＡ含有緩衝溶液（この溶液はさらにアルコールを含む）を使用して数回実行される。しかし、まずアルコール性緩衝液、次いで、アルコールを含むＥＤＴＡ含有緩衝液により洗浄することもまた可能である。使用されるアルコールは、好ましくは、エタノール、プロパノールおよび／またはイソプロパノールである。
【００２９】
本発明はさらに、本方法の改変法に関し、ここで、１つ以上のＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）またはＤＮＡアーゼ（ＤＮａｓｅ）による処理は、工程（ａ）の前、または工程（ａ）もしくは（ａ’）の後、そして工程（ｃ）の前に実行される。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、本方法または本発明に従う上記方法の改変法を実行するためのキットである。このキットは、好ましくは、適切な緩衝液中の粘土物質の懸濁物または砂もしくは砂と粘土物質との混合物により充填されたスピンカラムのいずれかを含む。このキットがまた、細胞溶解のための薬剤、洗浄溶液（洗浄緩衝液）および／または本方法を実行するのに必要な他の装置、手段もしくは試薬を含む場合、このキットがさらに有利である。特定の実施形態によると、このキットは、以下の緩衝液および溶液を含む：
ＲＳ（１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ，５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ８．０），ＣＨ（５ｍｏｌ／ｌ  グアニジン−イソチオシアネート，５％  Ｔｗｅｅｎ−２０），ＡＢ（０．３  ｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２，０．３ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ９．５，２０％  イソプロパノール），ＡＬ１（０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ，１％  ＳＤＳ），ＡＬ２（０．２ｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２，０．８ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５），ＷＢ（０．２ｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ，５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５，４０％  イソプロパノール），ＴＥ（ｌ０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）。
【００３１】
驚くべきことに、本発明の特定の実施形態によると、最高品質の核酸（ＤＮＡおよび全ＲＮＡ）が、以下を含有する細胞溶解剤を使用して、核酸含有物質から単離され得ることが見出された：
−化合物中で低濃度（０．２ｍｏｌ／ｌ以下）の一価ではなく多価のカチオン（０．６ｍｏｌ／ｌ）の塩の存在下での、支持物質、特に、粘土物質の緩衝された懸濁液、
−洗浄工程および引き続くアルコール含有溶液（例えば、エタノールまたはイソプロパノール）による公知の洗浄工程におけるキレート剤、
−および、水または希釈緩衝液（例えば、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０）とともにケイ酸塩支持体を使用する他の精製方法における、支持物質からの核酸の脱着のためのキレート剤であるが、当該分野の状態からは公知でないキレート剤。
【００３２】
例えば、ＥＤＴＡ（０．２ｍｏｌ／ｌ）およびアルコール（例えば、４０％イソプロパノール）を含む緩衝液を用いる洗浄が、精製および引き続く溶出に必須である。他方、溶出のために、低いＥＤＴＡ濃度を有する緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）が必要とされる（１〜１００ｍｍｏｌ／ｌ）。溶出のために、いくつかの適用において、加熱緩衝液（例えば、７０℃）および／または増加したｐＨ値を有する緩衝液（例えば、１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５）の使用は、増加した核酸収率に有利であることが証明されている。
【００３３】
高い濃度でのカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）塩（例えば、グアジニン塩）の存在は、本発明の意味において、支持体への核酸の生じる結合について必須ではない。さらに、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＫ−アセテート）、カオトロピック塩（例えば、グアニジン塩酸塩またはグアニジンイソチオシアネート）、他のカオトロピック剤（例えば、界面活性剤）の濃度、低濃度のキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸、ＥＤＴＡ；ビス−アミノエチルグリコエーテル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ＥＧＴＡ）、および／またはタンパク質崩壊酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）は、本発明の意味において、支持物質上への核酸の吸着を妨害しない。
【００３４】
現在の技術におけるガラスおよびシリカ材料を使用する方法とは対照的に、本発明の意味において、鉱物支持体への核酸の結合は、粘土鉱物および砂の特定の実施形態において、核酸含有溶液のｐＨ値とは独立していることもまた、驚くべきことである。
【００３５】
核酸含有溶液は、核酸含有材料の溶解緩衝液とのインキュベーションによって得られ、これは、（１）グアジニン塩のようなカオトロピック塩、（２）ＮａＯＨのようなアルカリ化合物、（３）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴＷＥＥＮ−２０またはヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドＣＴＡＢのような中性、アニオン性またはカチオン性界面活性剤、あるいは（４）細菌中のリゾチーム、酵母中のリチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）、真菌中のキチナーゼ、または組織中のプロテアーゼのいずれかを含む。
【００３６】
以下は、例えば、核酸または核酸フラグメントを抽出するために、核酸含有溶液の作製のための核酸含有材料として使用され得る：ウイルス、バクテリオファージ、プラスミドおよびベクターの抽出のための細胞材料（特に、例えば、細菌の細胞分解由来の細胞フラグメント）（コスミド、ファージミド、「細菌人工染色体」［ＢＡＣ］、「酵母人工染色体」［ＹＡＣ］、「Ｐ１誘導体化人工染色体」［ＰＡＣ］）、原核生物（真正細菌、古細菌（ａｒｃｈａｅａ））、酵母、低級真菌（ｌｏｗｅｒ  ｆｕｎｇｉ）および高級真菌（ｈｉｇｈｅｒ  ｆｕｎｇｉ）、植物材料（果実、葉および幹を含む）、無脊椎動物（例えば、巻貝）、ヒトおよび動物の血液および組織、ヒト、動物および植物の細胞培養物、尿、糞便、食品（魚、ミルク、ソーセージ、保存食を含む）、法医学試料材料、土（土壌）および材料（例えば、核酸含有アガロースゲルまたはＰＣＲ反応混合物）。
【００３７】
以下の用語「核酸」は、ＤＮＡおよび／または全ＲＮＡを意味するために意図される。用語「全ＲＮＡ」は、細胞に存在するＲＮＡ種（ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡおよびｈｎＲＮＡを含む）を網羅する。
【００３８】
核酸が上述のシリカベースの支持物質、特に粘土鉱物および砂と結合するためには、低濃度の多価カチオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、またはＡｌ３＋の塩、好ましくは、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、および／またはＡｌＣｌ３）（例えば、ＭｇＣｌ２＜０．０８ｍｏｌ／ｌ）で既に十分である。これらは、例えば、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マンガンおよび／または塩化アルミニウムを含有する緩衝液であり得る。
【００３９】
さらに、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを含有する溶液が、例えば、キレート剤を含有する洗浄溶液として考慮され得る。
【００４０】
好ましい粘土鉱物は、「二層粘土鉱物」（１：１粘土鉱物としても公知）、および「三層粘土鉱物」（２：１粘土鉱物としても公知）（例えば、カオリナイトおよび／またはモンモリロナイト（ベントナイト））である。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態に従って、上述の支持物質、特に粘土鉱物および砂への核酸の結合およびその後の精製方法を最適化するために、アルコール性成分（例えば、イソプロパノールまたはエタノールおよび／あるいはそれらの混合物）もまた添加される。
【００４２】
溶解物の支持物質との短時間の接触／インキュベーションの後で、この溶解物は、例えば、短い遠心分離工程を介して、支持体から分離される。さらなる精製方法において、さらにアルコール性成分（例えば、４０％（ｖ／ｖ）エタノールまたは４０％イソプロパノール）を含有するＥＤＴＡ含有洗浄緩衝液で、この核酸を保持する支持体を洗浄する。その後、公知の様式で７０％アルコールを用いて洗浄を行う。支持物質を乾燥させ、そして、吸着された核酸をキレート剤含有緩衝液で溶解させる。ＤＮＡまたは全ＲＮＡが単離されるべきか否かに依存して、ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ  Ａ）またはＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）の使用による酵素（反応）工程を挿入する可能性がある。これを行うために、支持体からの溶解物の分離の後で、最初にアルコール含有溶液（例えば、７０％エタノール）を用いて洗浄が行われ、その後、酵素消化が行われる。その後、ＥＤＴＡおよびアルコールを含有する洗浄緩衝液を用いて洗浄が行われ、そして、この方法が上述のように続く。
【００４３】
驚くべきことに、本発明の枠組みの範囲内において、核酸を脱離させるために、カチオン（または、それぞれ、そのキレート化）に適した低濃度のキレート剤、すなわち、キレート化合物（例えば、ＥＤＴＡ）が、必要であることが明らかになった。例えば、１〜１００ｎｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡが適している。対照的に、通常、ガラス支持物質またはシリカ支持物質から核酸を溶解させるために使用される蒸留水または緩衝溶液（例えば、１０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ）は、支持物質に結合した核酸を少ししか脱離させないか、または全く脱離させなかった。
【００４４】
本発明はさらに、本発明に従う精製／単離方法を行うためのキットに関する。このキットは、溶液および／または試薬、ならびに核酸の精製のために必要とされる支持物質、特に粘土鉱物および／または砂（好ましくは、適した緩衝液にすでに懸濁させてある）を含む。このキットは、核酸含有物質を、記載される方法に供することを可能とする。
【００４５】
好ましくは、キットは、本発明に従う核酸の精製に必要とされる以下の溶液を含む：例えば（ａ）塩化マグネシウム含有緩衝液、塩化カルシウム含有緩衝液、塩化マンガン含有緩衝液、および／または塩化アルミニウム含有緩衝液、（ｂ）ＥＤＴＡ含有緩衝液またはＥＧＴＡ含有緩衝液、（ｃ）エタノール含有緩衝液またはイソプロパノール含有緩衝液、（ｄ）ＤＮアーゼＩもしくはＲＮアーゼＡまたは他のヌクレアーゼおよび／あるいはプロテアーゼを含む溶液。これら溶液は、既に、直ぐ使用可能な状態で利用可能であり得るか、もしくは必要である場合は、新たに調整され得る。
【００４６】
特定の実施形態に従って、キットは、核酸含有物質の溶解のための溶液および粘度鉱物または砂を伴う鉱物もしくは砂のみを、スピンカラムの１種として含み得る。
【００４７】
（概要  システムの利点）
本発明の枠組み内で、粘度鉱物および砂が、種々の核酸含有物質からの核酸の結合および精製のための支持物質として非常に適していることが初めて示されている。支持物質への核酸の結合のために、非常に低濃度（≦０．２ｍｏｌ／ｌ）の多価カチオンの塩のみが必要とされる。現在の技術と反して、低濃度の多価カチオンの塩中の吸着方法は、溶液のｐＨとは独立に行われる。上記された多価カチオンの緩衝剤と共に、他のシリカベースの支持物資欝を使用して、良い結果がまた達成され得る。
【００４８】
ガラスまたはシリカ物質での現在の技術（ＤＥ  １９８  ５６  ０６４  Ａ１）に反して、粘度鉱物への核酸の結合は、一価カチオンの塩（例えば、≦０．６ｍｏｌ／ｌ  Ｎａ＋またはＫ＋）の存在下では、達成されない。本発明の真意の範囲内および、現在の技術に反して、キレート剤含有緩衝剤の使用は、支持物質からの核酸の精製および溶離のために必要である。
【００４９】
本発明は、種々の核酸含有物質からの純粋な核酸の生成のために新しく、かつ広範に適用される方法が開発されたという利点を有する。
【００５０】
本方法は、支持物質への核酸の結合において負の影響を及ぼす高濃度のカオトロピック剤、キレート化学薬品、および溶液のｐＨ値といった、物質の溶解に対して均一なプロトコルを含む。従って、通常の溶解方法（例えば、高いｐＨ値、高い界面活性剤濃度およびグアニジン塩濃度でのアルカリの使用）は、直接、種々の核酸含有物質からの核酸の精製に対する本発明の方法につながり、さらに本システムの根底にある普遍性へとつながる。
【００５１】
本方法のさらなる利点は、本発明に従う条件下で、ＤＮＡとＲＮＡとの両方が吸着され得、再び溶解され得ることである。両方の核酸種の同時の精製および／またはＤＮＡもしくはＲＮＡの分別した精製は、一般的な方法でのＲＮアーゼ／ＤＮアーゼの使用により達成され得る。さらに、本発明に従った方法は、迅速および単純であり、さらにＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、切断、または連結のような引き続くプロセスに非常に適した高品質な核酸調整物を送達する。
本発明は、実施例を参照しながら以下で説明される。
【実施例】
【００５２】
（適用の実施例）
使用した緩衝液および溶液：ＲＳ（１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ，５０ｍｍｏｌ／l  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）、ＣＨ（５ｍｏｌ／l  グアニジン−イソチオシアネート，５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）、ＡＢ（０．３ｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２，０．３ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５，２０％イソプロパノール）、ＡＬ１（０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ）、ＡＬ２（０．２ｍｏｌ／l  ＭｇＣｌ２，０．８ｍｏｌ／l  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５），ＷＢ（０．２ｍｏｌ／l  ＥＤＴＡ，５０ｍｍｏｌ／l  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５，４０％  イソプロパノール）、ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／l  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ）。
【００５３】
(実施例１）
(微生物からのゲノムＤＮＡの単離）
Ａ）真正細菌および古細菌
細胞溶解：供給物質は、種々の細菌およびハロバクテリアの定常期液体培養物（１〜１．５ｍｌ）である。この細胞を得るために、細菌／ハロバクテリアの懸濁物を、遠心分離し、そして、その上清を定量的に取り出した。これらの細胞を、１０ｍｇ／ｍｌ（真正細菌の）リゾチームを必要に応じて含む５０μｌ  ＲＳ緩衝液中に再懸濁して、必要に応じて１５分間に亘って３７℃でインキュベートした。２５０μｌ  ＣＨを添加して、そして、短時間のボルテックスを行うことによって、細胞溶解を達成した。その溶解物を、ボルテックス処理によって、２００μｌ  ＡＢと混合し、そしてスピンカラム（例えば、ＡＨＮ（Ｎｏｒｄｈａｕｓｅｎ）製の市販のスピンカラム）中に直ちに配置した。ここで、スピンカラムは、砂・ベントナイト（ｓａｎｄ−ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）混合物（０．５ｇの砂、約５ｍｇのベントナイト）を含んだ。
【００５４】
洗浄工程：次いで、このカラムを、１５秒間に亘って、１６，０００×ｇ以上で、直ちに遠心分離した。次いで、このカラムを、０．５ｍｌ  ＷＢで洗浄し、次いで、各々の場合において、３０秒間の遠心分離によって０．５ｍｌの７０％（ｖ／ｖ）のＥｔＯＨを適用することにより２回、連続的に、洗浄した。
【００５５】
ＤＮＡ溶出：１００〜１５０μｌのＴＥを、洗浄したカラムに添加して、１５分間インキュベートした。このＤＮＡを、０．５〜１分間の遠心分離によって１．５ｍｌのポリプロピレン反応容器に移動した。
【００５６】
結果については、図１を参照のこと。
【００５７】
Ｂ）酵母
１〜２ｍｌの定常期酵母培養物を、１６，０００×ｇ以上で、遠心分離し、沈降した（ｓｅｄｉｍｅｎｔｅｄ）細胞を、１ｍｌの１Ｍ  サッカロース、０．１ｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、１４ｍｍｏｌ／ｌ  β−メルカプトエタノールおよび１００Ｕのリチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）中に再懸濁し、そして、３０〜４５分間に亘って３０℃でインキュベートした。このスフェロプラスト（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ）を、１０，０００×ｇで１０分間に亘り遠心分離し、この上清を、デカンテーション（ｄｅｃａｎｔ）して、次いで、強いボルテックスで２５０μｌ  ＣＨ中で溶解し、その後、２００μｌ  ＡＢと混合した。スピンカラムを適用した後に、この方法を、１．Ａ）に従って続けた。
【００５８】
結果については、図１および図２を参照のこと。
【００５９】
(実施例２）
(植物およびカタツムリからのゲノムＤＮＡおよび総ＲＮＡの単離）
新鮮な植物材料（例えば、葉、種子、苗条）または数個の凍結保存したカタツムリの全体（殻を含む）を、液体窒素のもと重量を計って、そして、５０〜１００ｍｇの粉末を、１．５ｍｌのポリプロピレン反応容器に移した。
【００６０】
０．６ｍｌ  ＣＨの添加、および、長時間（１５〜３０秒間）のボルテックスの後に、インキュベーションを、１０分間の間隔でボルテックスしながら６５℃で３０分間に亘って実施した。その溶解物を、約１０，０００×ｇで５分間に亘って遠心分離し、そして、３００μｌの上清を、３００μｌのＡＢと混合した。さらなるプロトコルは、実施例１．Ａ）のプロトコルに対応する。
【００６１】
結果については、図３を参照のこと。
【００６２】
（実施例３）
（全血からのゲノムＤＮＡの単離）
０．１％  ＥＤＴＡを凝固インヒビターとして添加した１００μｌの全血を、約１８，０００×ｇにて３０秒間遠心分離し、そして血漿上清を除去した。細胞の溶解のために、沈降物を、ボルテックスすることにより２５０μｌ  ＣＨと混合し、次いで２００μｌ  ＡＢと混合した。スピンカラムに溶解産物を充填し、そして３０秒間遠心分離し、次いで０．５ｍｌ  ＷＢを充填し、そして１５分間インキュベートした。次いで、洗浄を、７０％  ＥｔＯＨを用いて２回実施した。溶出を、７０℃に加熱したＴＥを用いて行い、続いて１５分間インキュベートし、そして３０秒間遠心分離した。
【００６３】
結果については図４を参照のこと。
【００６４】
（実施例４）
（プラスミドＤＮＡの単離）
１．５ｍｌの定常期Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を約１８，０００×ｇにて３０秒間秒間遠心分離し、上清を定量的にデカントし、そして細胞沈降物を、１００μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａを含む３０μｌ  ＲＳ中に、ボルテックスにより再懸濁した。３０μｌ  ＡＬ１の添加後、溶解が生じるまで、ピペットのチップを用いて、混合を注意深く行った。次いで、３０μｌの氷冷ＡＬ２を、上記の通りの溶解産物と混合し、約１８，０００×ｇおよび４℃にて１５分間遠心分離し、そして上清を９０μｌ  ＡＢと混合した。次いで、溶解産物をスピンカラム中に配置し、そして１５分間インキュベートした。３０秒間の遠心分離後、この方法を、１．Ａ）「洗浄工程」および「ＤＮＡ溶出」の通りに続けた。
【００６５】
結果については図５を参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】種々の微生物の１〜２ｍｌの定常期培養物からのゲノムＤＮＡの単離のゲル電気泳動図（０．８％  ＴＡＥアガロースゲル、臭化エチジウムで染色）。サンプル１〜５（アプライしたＤＮＡ調製物の比率）：１：Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．（Ａｒｃｈａｅａ）（１／５０）２：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ（グラム陰性ユーバクテリウム）（１／７５）３：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（グラム陽性ユーバクテリウム）（１／５０）４：Ｓａｃｃｈａｒｏｙｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ（酵母）（１／１５０）５：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（真菌）（１／７５）
【図２】２ｍｌの酵母培養物（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｇｓ１１５）からのゲノムＤＮＡおよび総ＲＮＡの単離のゲル電気泳動図（０．８％  ＴＡＥアガロースゲル、臭化エチジウムで染色）；ＤＮＡ調製物の１／５０をアプライした。サンプル１〜８：種々の増殖相からの核酸の単離：１：２０時間；２．２２時間；３：２５時間，４：２７時間；５：２９時間；６：３１時間；７：４４時間，８：４６時間。Ｍ：分子サイズマーカー（λＤＮＡ、ＨｉｎｄＩＩＩで制限処理した）：２３．１ｋｂ；９．４ｋｂ；６．５ｋｂ；４．４ｋｂ；２．３ｋｂ；２．０ｋｂ；０．６ｋｂ（上から下に向かって）。
【図３】５０ｍｇの植物材料／カタツムリからのゲノムＤＮＡおよび総ＲＮＡの単離のゲル電気泳動図（０．８％  ＴＡＥアガロースゲル、臭化エチジウムで染色した）；調製物の１／１０をアプライした。サンプル１：ゴウダソウ（葉）（Ｌｕｎａｒｉａ  ａｎｎｕａ）サンプル２：セイヨウキヅタ（葉）（Ｈｅｄｅｒａ  ｈｅｌｉｘ）サンプル３：イエローアークエンジェル（Ｙｅｌｌｏｗ  ａｒｃｈａｎｇｅｌ）（葉）（Ｇａｌｅｏｂｄｏｌｏｎ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）サンプル４：カタツムリ（Ｃｅｐａｅａ  ｓｐ．）Ｍ：分子サイズマーカー（λＤＮＡ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで制限処理した）：２３．１ｋｂ；９．４ｋｂ；６．５ｋｂ；４．４ｋｂ；２．３ｋｂ；２．０ｋｂ；０．６ｋｂ（上から下に向かって）。
【図４】１００μｌの全血からの精製したゲノムＤＮＡのゲル電気泳動の図（０．８％  ＴＡＥアガロースゲル、臭化エチジウムで染色した）；ＤＮＡ調製物の１／１５をアプライした。サンプル１〜４：種々の健常個体から単離したＤＮＡ。Ａ〜Ｃ：反復試験。
【図５】２つの供給業者からの市販のキットと比較した、スピンカラムを用いる本発明の手順に従ったプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ１３）の単離（アガロースゲル電気泳動、０．８％ゲル、臭化エチジウムで染色した）；各々の場合、プラスミド−ＤＮＡ調製物の１／２０をアプライした。サンプル１〜２：２つの供給業者からの市販のプラスミドＤＮＡ抽出キットによるプラスミドＤＮＡ抽出。３：本発明に従う方法によるプラスミドＤＮＡ抽出。−／＋  ＥｃｏＲＩ消化なし／あり。Ｍ：分子サイズマーカー（λＤＮＡ，ＨｉｎｄＩＩＩで制限処理した）：２３．１ｋｂ；９．４ｋｂ；６．５ｋｂ；４．４ｋｂ；２．３ｋｂ；２．０ｋｂ；０．６ｋｂ（上から下に向かって）。
【図１】
2005525819.tif 000003
【図２】
2005525819.tif 000004
【図３】
2005525819.tif 000005
【図４】
2005525819.tif 000006
【図５】
2005525819.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月18日(2004.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の単離および／または精製のための方法であって、
ａ）核酸含有物質（サンプル）を、核酸の吸着のために、多価カチオンの塩の存在下で支持物質と接触させる工程；
ｂ）該支持物質を、アルコールおよびキレート剤を含む緩衝液で少なくとも１回洗浄する工程；ならびに
ｃ）該カチオンに適切なキレート剤水溶液を、該核酸の脱離のために該支持物質に添加すること、および該支持物質から該核酸含有水溶液を分離することによって、該核酸を単離する工程；
を特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
工程（ｂ）の前に、前記支持物質と前記サンプルとを互いに分離する工程（工程ａ’）
を特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記支持物質は、粘土鉱物、砂、または粘土鉱物と砂との混合物であることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記粘土鉱物は、粘土鉱物の混合物であることを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法であって、前記粘土鉱物は、１：１粘土鉱物および／または２：１粘土鉱物であることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、前記粘土鉱物は、カオリナイトおよび／またはモンモリロナイト（ベントナイト）であることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の方法であって、前記核酸含有物質は、ウイルス、バクテリオファージ、インタクトな細胞、細胞フラグメント、原核生物、酵母、下等真菌および高等真菌、植物物質、無脊椎動物、ヒトおよび動物由来の血液および組織、ヒト細胞培養物、動物細胞培養物および植物細胞培養物、尿、糞便、食糧、法医学標本物質、土壌、核酸含有アガロースゲルまたはＰＣＲ反応混合物からなる群より選択されることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の方法であって、工程（ａ）において、１種の多価カチオンの数種の塩または数種の多価カチオンの数種の塩を使用することを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法であって、前記塩は、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、および／またはＡｌＣｌ３であることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の方法であって、工程（ｃ）において、数種のキレート剤を使用することを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の方法であって、前記支持物質を、適切な緩衝剤中の懸濁物の形態で提供することを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載の方法であって、前記支持物質を、スピンカラムの形態で提供することを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記スピンカラムに前記核酸含有物質（サンプル）を適用しそして遠心分離を実行することによって、工程（ａ）および（ａ’）を実行することを特徴とする、方法。
【請求項１４】
請求項１２および１３に記載の方法であって、前記スピンカラムに洗浄溶液を適用しそして遠心分離を実行し、そして必要に応じて異なる洗浄溶液を用いてこの工程を数回反復することによって、工程（ｂ）を実行することを特徴とする、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、洗浄のためにアルコールをさらに含有するＥＤＴＡ含有緩衝溶液を使用して、工程（ｂ）を数回実行することを特徴とする、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、まずアルコール緩衝溶液を用い、その後、アルコールを含有するＥＤＴＡ含有緩衝液を用いて、洗浄を実行することを特徴とする、方法。
【請求項１７】
請求項１５および１６に記載の方法であって、前記アルコールは、エタノール、プロパノール、および／またはイソプロパノールであることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１３に記載の方法であって、１種以上のＲＮアーゼまたはＤＮアーゼでの処理を、工程（ａ）の前または工程（ａ）もしくは（ａ’）の後でかつ工程（ｃ）の前に、実行することを特徴とする、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８に記載の方法を実行するための、キット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットであって、該キットは、適切な緩衝剤中に支持物質の懸濁物を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２１】
請求項２０に記載のキットであって、前記支持物質は、粘土鉱物、砂、または粘土鉱物と砂との混合物であることを特徴とする、キット。
【請求項２２】
請求項２０に記載のキットであって、該キットは、砂と粘土鉱物との混合物を充填されたスピンカラムを含むことを特徴とする、キット。
【請求項２３】
請求項１９〜２２に記載のキットであって、該キットは、細胞溶解用薬剤、洗浄溶液（洗浄緩衝液）および／または前記方法を実行するために有用な他の装置、手段、もしくは試薬をさらに含むことを特徴とする、キット。
【請求項２４】
請求項２３に記載のキットであって、該キットは、以下の緩衝液および溶液：
（ａ）塩化マグネシウム含有緩衝液、塩化カルシウム含有緩衝液、塩化マンガン含有緩衝液、および／または塩化アルミニウム含有緩衝液；
（ｂ）ＥＤＴＡ含有緩衝液またはＥＧＴＡ含有緩衝液；
（ｃ）エタノール含有緩衝液またはイソプロパノール含有緩衝液；ならびに
（ｄ）ＤＮアーゼＩもしくはＲＮアーゼＡまたは他のヌクレアーゼおよび／あるいはプロテアーゼを含む、溶液
を含むことを特徴とする、キット。
【国際調査報告】
2005525819.tif 000008
2005525819.tif 000009
2005525819.tif 000010
2005525819.tif 000011
2005525819.tif 000012