(57)【要約】本発明は、末梢脈管疾患の治療および／または予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。本発明はさらに、四肢切断の予防のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢脈管疾患の治療および／または予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用。
【請求項２】
末梢脈管疾患が末梢動脈疾患である請求項１記載の使用。
【請求項３】
末梢脈管疾患が下肢の末梢脈管疾患である請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
跛行の治療および／または予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用。
【請求項５】
末梢脈管疾患がバーガー病（閉塞性血栓血管炎）である請求項１、２、３または４記載の使用。
【請求項６】
末梢脈管疾患が末梢虚血である請求項１、２、３、４または５記載の使用。
【請求項７】
四肢虚血が重篤な四肢虚血である請求項６記載の使用。
【請求項８】
壊疽および／または潰瘍の治療および／または予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用。
【請求項９】
四肢切断の予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用。
【請求項１０】
ＩＬ−１８阻害剤が、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）阻害剤、ＩＬ−１８に対する抗体、ＩＬ−１８受容体サブユニットのいずれかに対する抗体、ＩＬ−１８シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と競争し、かつＩＬ−１８受容体を遮断するＩＬ−１８のアンタゴニスト、およびＩＬ−１８結合タンパク質、またはＩＬ−１８の生物学的活性を阻害する、そのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは循環置換誘導体から選択される請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の使用。
【請求項１１】
ＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８に対する抗体である請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
ＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８受容体αに対する抗体である請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
ＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８受容体βに対する抗体である請求項１０記載の使用。
【請求項１４】
ＩＬ−１８抗体がヒト化またはヒト抗体である請求項１０、１１、１２または１３記載の使用。
【請求項１５】
ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８結合タンパク質、またはＩＬ−１８の生物学的活性を阻害するそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは循環置換誘導体である請求項１０記載の使用。
【請求項１６】
ＩＬ−１８阻害剤が１つ以上の部位でグリコシル化されている請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載の使用。
【請求項１７】
融合タンパク質が免疫グロブリン（Ｉｇ）融合を含む請求項１０記載の使用。
【請求項１８】
機能的誘導体が、アミノ酸残基上の１つ以上の側鎖として存在する１つ以上の官能基に結合される少なくとも１つの部分を含有する請求項１０記載の使用。
【請求項１９】
部分がポリエチレン部分である請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
末梢脈管疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤のコード配列を含有する発現ベクターの使用。
【請求項２１】
末梢脈管疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における、細胞でのＩＬ−１８阻害剤の内因性産生を誘導および／または促進させるための発現ベクターの使用。
【請求項２２】
末梢脈管疾患の治療方法であって、それを必要とする患者に有効阻害量のＩＬ−１８阻害剤を投与することからなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脈管疾患の分野にある。より具体的には、本発明は末梢脈管疾患の治療および／または予防のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。本発明はさらに、切断の予防のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインであるインターロイキン１８（ＩＬ−１８）は、当初はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）誘導因子として記載された（ナカムラ（Nakamura）ら、１９８９年）。それは、Ｔ−リンパ球ヘルパー細胞１型（ＴＨ１）応答の発生における初期シグナルである。ＩＬ−１８はＩＬ−１２、ＩＬ−２、抗原、マイトジェンおよびことによると別の因子と一緒に作用し、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。ＩＬ−１８はまた、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２の産生を促進し、抗−ＣＤ３誘導性Ｔ細胞増殖を増強し、そしてナチュラルキラー細胞のＦａｓ−媒介性細胞死を増加させる。
【０００３】
成熟ＩＬ−１８は、ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ、カスパーゼ−１）によりその前駆体から産生される。
【０００４】
ＩＬ−１８受容体は、リガンドの結合において共作用する、少なくとも２つの成分、ＩＬ−１８ＲαおよびＩＬ−１８Ｒβからなる。ＩＬ−１８に対する高親和性および低親和性の結合部位がマウスＩＬ−１２刺激Ｔ細胞において見出されたことにより（ヨシモト（Yoshimoto）ら、１９９８年）、多重鎖受容体複合体（multiple chain receptor complex）であることが示唆された。これまでに同定された２つの受容体サブユニットは、どちらもＩＬ−１受容体ファミリーに属している（パルネット（Parnet）ら、１９９６年；キム（Kim）ら、２００１年）。ＩＬ−１８のシグナル伝達はＮＦ−κＢの活性化に関与する（ディドネート（DiDonato）ら、１９９７年）。ＩＬ−１８受容体複合体は、２つの受容体鎖：ＩＬ−１８Ｒα鎖と呼ばれるリガンド結合鎖およびＩＬ−１８Ｒβ鎖と呼ばれるシグナル伝達鎖とで構成される。ＩＬ−１８Ｒα鎖は当初、放射線標識化ＩＬ−１８に結合する細胞表面タンパク質として単離された。そのタンパク質は精製され、そのアミノ酸配列が、ＩＬ−１Ｒ関連タンパク質（ＩＬ−１Ｒｒｐ）と呼ばれる以前に報告されていた孤立受容体と同一であることが明らかになった（トリゴエ（Torigoe）ら、１９９７年）。
【０００５】
近年、ＩＬ−１８に高い親和性を有する可溶性タンパク質がヒトの尿から単離され、ヒトおよびマウスのｃＤＮＡならびにヒト遺伝子がクローニングされた（ノービック（Novick）ら、１９９９年；国際公開第９９／０９０６３号パンフレット）。そのタンパク質はＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）と呼ばれている。
【０００６】
ＩＬ−１８ＢＰは、既知のＩＬ−１８受容体の１つの細胞外ドメインではないが、分泌され、通常循環しているタンパク質である。ＩＬ−１８ＢＰは、分泌タンパク質の新しいファミリーに属し、さらに、そのファミリーはポックスウイルスにコードされるいくつかのタンパク質を含む（ノービックら、１９９９年）。尿のＩＬ−１８ＢＰならびに組換えＩＬ−１８ＢＰは、特異的に高い親和性でＩＬ−１８に結合し、ＩＬ−１８の生物学的活性を調節する。
【０００７】
ＩＬ−１８ＢＰの遺伝子はヒト染色体の１１ｑ１３に位置し、８．３ｋｂのゲノム配列中には膜貫通ドメインをコードするエクソンは見出されなかった。択一的ｍＲＮＡスプライシングにより産生される４つのスプライス変異体、すなわちＩＬ−１８ＢＰのアイソフォームがこれまでにヒトで見つかっている。それらはＩＬ−１８ＢＰａ、ｂ、ｃおよびｄと名付けられ、すべて共通のＮ末端を有し、Ｃ末端は異なっている（ノービックら、１９９９年）。これらのアイソフォームは、ＩＬ−１８を結合する能力の点で異なる。４つのうち、ｈＩＬ−１８ＢＰアイソフォームａおよびｃは、ＩＬ−１８の中和能力を有することが知られている。ヒトＩＬ−１８ＢＰアイソフォームは、マウスＩＬ−１８に結合する。
【０００８】
末梢脈管疾患には、動脈疾患（閉塞性または機能性）、静脈疾患、複合動静脈疾患（combined arteriovenous）（たとえば、動静脈瘻）、またはリンパ管疾患が含まれ得る。閉塞性動脈疾患には、末梢動脈閉塞やバーガー病（閉塞性血栓血管炎とも呼ばれる）があげられる。機能性動脈障害は、血管痙攣（レーノー現象およびレーノー病、先端チアノーゼ）または血管拡張（先端紅痛症）であり得る。それらは血管の局所的欠陥または交感神経系活動の妨害（disturbances）に続発するか、または器質的脈管疾患に付随して生じ得る。静脈疾患には静脈血栓症や拡張蛇行静脈があげられ、複合動静脈疾患には動静脈瘻があげられ、そしてリンパ性疾患にはリンパ浮腫および脂肪浮腫があげられる。
【０００９】
末梢動脈閉塞とは、一般にアテローム性動脈硬化プラーク（アテローム）、血栓または塞栓症による四肢（extremities）への血液供給の閉塞を意味する。
【００１０】
末梢動脈閉塞は、結果として急性または慢性の虚血を引き起こし得る。急性虚血は、破裂した近位の動脈硬化プラークにより、先在するアテローム硬化症にもとづく急性血栓症により、心臓、大動脈もしくは他の大型の管由来の塞栓により、または解離した動脈瘤により引き起こされる。慢性虚血は、アテロームプラークのゆっくりとした拡大により引き起こされる。
【００１１】
持続的な高濃度血中ホモシステインは、内皮細胞を損傷することにより、大動脈およびその分枝、末梢動脈、大脳動脈、ならびにことによると冠状動脈の早発性アテローム性動脈硬化症の素因となる。ホモシステイン濃度は通常ほかの危険因子と関連して上昇するが、それらは食事やビタミンＢ補給により修正され得る。
【００１２】
動脈閉塞の臨床的諸症状は、罹患血管、閉塞の程度、閉塞の進行の速さ、および側副の流れが充分かどうかにより決まる。
【００１３】
急性閉塞は、四肢に突然起こる激痛、寒気、痺れ、および蒼白などの病歴を有する。四肢は冷たく紫になり、閉塞の遠位では拍動がなくなる。急性閉塞は、感覚および運動の失調、そして最終的には（６〜８時間後）触診で圧痛を示す筋肉の硬化により明らかとされる重篤な虚血を引き起こし得る。
【００１４】
慢性閉塞においては、症状は組織虚血の潜行性の発生に関係している。初期症状は間欠性の跛行である。跛行の症状は、歩行時に現れる痛み、うずき（ache）、痙攣または疲労感である。これらの症状はふくらはぎに最も多く見られるが、足（foot）、大腿部、股関節部または臀部にも現れ得る。
【００１５】
最終的には、虚血性の痛みは安静時に起こることもあり、深刻な場合四肢の最も遠位の部分で始まり、挙げること（elevation）により悪化する容赦ない痛みで、そしてしばしば睡眠を妨げる。
【００１６】
動脈閉塞のレベルと間欠性跛行の位置との間には密接な相関関係がある（たとえば、大動脈腸骨動脈疾患は、臀部、股関節部およびふくらはぎに跛行を引き起こすことが多く、そして大腿部の脈拍は減弱しているかまたはなくなる）。大腿膝窩動脈疾患では、跛行は通常ふくらはぎに起こり、大腿から下位のすべての脈がなくなる。小管疾患（たとえば、閉塞性血栓血管炎、真性糖尿病）の患者では、大腿膝窩動脈の脈拍は存在し得るが、足の脈はない。１〜２分足を挙げた後の罹患した足の蒼白、その後の足を下ろした際（on dependency）の発赤が、動脈の機能不全を確認するのを助ける。挙げた後、足を下ろした際の静脈の充満時間は、正常な限界である１５秒よりも長い。跛行の症候が良好な末梢の脈で現れた場合は、脊髄の狭窄が鑑別診断において考慮されるべきである。
【００１７】
高度な虚血状態の足は、痛く、冷たくまたしばしば痺れる。慢性の場合、皮膚が乾燥し、鱗片を伴い、爪や髪の毛の成長が乏しくなり得る。虚血がさらに悪化すると、特に局所的外傷の後、潰瘍形成がみられる（典型的には、つま先またはかかとに、時には脚（leg）に）。患者が痛みの軽減のために脚を従属する位置に維持しないかぎり、浮腫は通常現れないが、高度な虚血状態の脚は萎縮することがある。より広範囲な閉塞が組織の生存を危うくし、壊死または壊疽を引き起こす。発赤、痛み、下垂した足の腫脹を伴う虚血は、蜂巣炎または静脈不全に似た症状を呈する。動脈の非侵襲性テストにより診断を明確にすることができる。
【００１８】
末梢脈管疾患のなかで、バーガー病（閉塞性血栓血管炎）は、小型および中型動脈ならびに静脈の炎症性の変化によって特徴付けられる閉塞性疾患である。
【００１９】
バーガー病は、紙巻きたばこ（cigarette）喫煙者に発生し、主に２０〜４０代の男性に起こる。女性の発症患者は約５％のみである。この診断の頻度は近年劇的に減少している。これは、閉塞性動脈硬化症に対して、この疾患の臨床および血管造影特性がより良く理解されているためである。
【００２０】
原因は不明であるが、バーガー病は、非喫煙者では報告されておらず、おそらく、遅延型過敏症または毒性血管炎のように、第一の原因因子として巻きたばこ喫煙が関係している。閉塞性血栓血管炎は、この疾患の患者にＨＬＡ−Ａ９およびＨＬＡ−Ｂ５の人が非常に多いことから、特定の表現型を有する人でのタバコに対する反応であるか、または血管の構成成分であるＩ型およびIII型ヒトコラーゲンに対する細胞性過敏症による自己免疫疾患である可能性がある。
【００２１】
アテローム性動脈硬化症と異なり、バーガー病は冠状動脈とは関係していない。
【００２２】
その疾患は、分節パターンにおける四肢の小型および中型動脈、ならびにしばしば表在性静脈と関連している。まれに、進行した疾患においては、体のほかの部分の血管が罹患する。病理学的所見は、罹患血管の血栓を伴う、非化膿性の汎動脈炎または汎静脈炎の所見である。内皮細胞の増殖と内膜層へのリンパ球の浸潤が、急性の病変に生じるが、内弾性板は正常である。血栓は器質化し、その後不完全に再疎通する。中膜はよく保存されるが、線維芽細胞に浸潤され得る。外膜は通常より広範囲に線維芽細胞により浸潤されるので、古い病変ほど動脈周囲の線維化を示す。その線維化は、近接する静脈と神経も巻き込み得る。
【００２３】
その症状と徴候は、動脈虚血と表在性血栓静脈炎のものである。発症は緩やかで、上肢および下肢（lower extremities）の最も遠位の血管に始まり、近位に進行し、最終的に遠位の壊疽となる。患者は、疾患の客観的な徴候があらわれる前に、冷感、痺れ、疼き（tingling）または灼熱痛（burning）を訴えることがある。レーノー現象がよく見られる。間欠性跛行は罹患した四肢にあらわれる（通常足または脚の痛み、まれに手、腕または大腿）。痛みはより重度の虚血、たとえば壊疽の前段階、潰瘍または壊疽で持続する。しばしば、交感神経の働き過ぎが、冷感、多汗、および罹患した四肢のチアノーゼとして明らかにされ、おそらく重度の持続する痛みによる。
【００２４】
虚血性潰瘍および壊疽（通常１つ以上の指の壊疽）は、疾患の初期に現れるが急性ではない。非侵襲性の検査は、罹患したつま先、足、および手の指の血流と血圧のひどい減少を示す。疾患は近位に進行する。
【００２５】
もう１つの末梢脈管疾患は、下肢末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の患者が、進行して重篤な虚血の徴候のある四肢（limb-threatening ischemia）になり得る、末梢動脈疾患である。虚血性休息痛、非癒合潰瘍形成および壊疽は、不幸な結果のすべての前兆である。これらの患者は、四肢を失う高い危険がある。重篤な四肢虚血の迅速な決断と評価とそれに続く効果的な血管再生（revascularization）は、四肢の救出および全体的な健康の維持のために必要である。
【００２６】
慢性の重篤な四肢虚血は、動脈閉塞症（最も一般的にはアテローム性動脈硬化症）の最終的な結果である。高血圧、高コレステロール血症、紙巻たばこの喫煙および糖尿病と共同して、アテローム性動脈硬化症に加えて、慢性の重篤な四肢虚血の原因は、バーガー病または閉塞性血栓血管炎、および動脈のいくつかの形態などである。
【００２７】
慢性の重篤な四肢虚血の発症は、通常、組織への血流が大幅に減少する複数部位の動脈閉塞を必要とする。重篤な組織虚血は、臨床的には休息痛、非癒合創傷（創傷の治癒には代謝の増加が必要なので）または組織壊死（壊疽）として明らかにされる。
【００２８】
虚血性休息痛は、患者が床についている夜に悪化し、母指球およびつま先の焼けるような痛みとして古典的には説明されている。虚血性休息痛は、組織が心臓から最も遠く、動脈閉塞遠位である足に局在化する。非癒合創傷は、通常、合っていない靴や怪我による足の外傷の領域で見られる。創傷は一般的に、通常の包帯の取替え、外傷の回避、感染の治療および壊死組織の切除などの保存療法を４週間から１２週間試して反応がない場合に非癒合であるとみなされる。
【００２９】
壊疽は、通常つま先に見られる。それは、血液供給が低過ぎて、最も灌流の乏しい組織で自然発生的に壊死が生じる場合に発症する。
【００３０】
注意深く計画された保存的療法は、重篤な四肢虚血の多くの患者に有益なものであるが、それらの疾患の深刻性によっては、手術介入が検討される。外科的介入には血管再生や切断があげられる。患者が血管再生を受けることを望む場合や、許容可能な手術候補者（acceptable operative candidate）である場合、しばしば、さらなる評価のため、そして血管再生の計画のため動脈造影が行なわれる。いくつかのセンターでは、造影剤（dye）暴露の危険を最小限に抑えるために動脈造影法に代わるものとしてまたは補完するものとして磁気共鳴血管造影法が使用される。血管再生による四肢保存は費用効率が高く、ほとんどの患者に質の高い生活をもたらし、手術時の疾病率および死亡率が切断よりも低い。四肢保存は、慢性の重篤な四肢虚血のほとんどの患者の目標のはずである。
【００３１】
血管再生が実行できるかどうかは、動脈造影の所見、ならびにバイパス導管（conduit）の有効性によって決まる。血管形成またはステント留置、またはその両方は、跛行の患者にみられるような、短く、近位の損傷で最も成功しているが、重篤な四肢虚血の場合には、動脈閉塞疾患の多重性により、必要とされる最良の治療法である可能性は低い。理想的なバイパス導管は大伏在静脈であるが、他の導管としては、小伏在静脈、腕静脈または人工導管があげられる。最も外科的な系において、ふくらはぎ動脈の３年のバイパス開存性率は、人工バイパスでの４０パーセントから大伏在静脈バイパスでの８５パーセントまで変動する。相対的に、保存的治療の研究では、非癒合創傷で２５から４９パーセントの成功率、そして虚血性休息痛において５０から８０パーセントの改善率を証明した。
【００３２】
一次切断術は、広範囲の組織壊死、命にかかわる感染または血管再生に適合しない外傷の患者などの特定の患者に示され得る。注意深い待機と保存的取扱いで患者の状態をモニターするという決定、または血管再生もしくは切断を行なうという決定は、保存的取扱いと比較して手術に付随する危険と利点との念入りな評価によって決まる。
【００３３】
より重要なことには、それは、利用可能な選択肢の侵襲性または適合性についての患者の解釈にかかっている。病状により歩けない患者でさえ、切断は不適当であると考え得るし、すべての患者が切断後のリハビリテーションに必要な作業をする気になるわけではない。切断する決断がなされる場合、切断のレベルは、機能的リハビリテーションの最大の機会を患者に与える一方、一番回復の見込みのあるものとすべきである。
【００３４】
慢性の重篤な四肢虚血の診断は、明らかな休息痛、非癒合創傷および壊疽などである。虚血性休息痛は、典型的には、土踏まずまたは足先（distal foot）の灼熱痛として説明される。その痛みは、患者が横になっているときに現れ、患者が足を下ろした位置に戻ると和らぐ。重篤な四肢虚血の診断を裏付ける客観的な血行動態パラメーターは、くるぶし−上腕指数０．４以下、くるぶし最大血圧５０ｍｍＨｇ以下、またはつま先最大血圧３０ｍｍＨｇ以下である。介入は、保存的療法、血管再生または切断であり得る。進行性壊疽、急速に広がった創傷または持続的な虚血性休息痛は、四肢への治療を意味し、ひどく高い手術の危険性なく患者における血管再生の必要性を示唆する。重篤な四肢虚血では、動脈狭窄の多重性および末端性のため、バイパス移植術が通常必要とされる。糖尿病の患者は、他の患者より、バイパス移植術があまり適さない末端の疾患にかかる可能性が高い。切断と比較した場合、血管再生はより費用効果が高く、より良い手術に際する疾病率および死亡率を示す。四肢の保存は、ほとんどの重篤な四肢虚血の患者における目標のはずである。
【００３５】
現在、末梢脈管疾患の主な治療は、四肢切断と同様に新生血管形成などの侵襲性治療である。アテローム性動脈硬化プラークの発達を増加させることなく末梢新生血管形成を刺激する薬物の同定は、この医学分野における主要で治療上重要なものである。
【発明の開示】
【００３６】
本発明は、ＩＬ−１８阻害剤が、実験的動物モデルにおいて、末梢虚血の誘導ののちの新生血管形成を刺激するという知見に基づく。新生血管形成はＶＥＧＦ／Ａｋｔシグナルの活性化に関連して生じ、骨髄内皮前駆細胞の移動と分化の増加を伴う。
【００３７】
これらの結果に基づき、新生血管形成または血管再生を必要とする末梢脈管疾患を治療または予防するための新規な治療アプローチが提供される。
【００３８】
本発明は、したがって、末梢脈管疾患、とりわけ末梢虚血の治療および／または予防のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００３９】
本発明はさらに、跛行および壊疽の治療および／または予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００４０】
さらに、本発明は切断、とくに四肢切断の予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００４１】
ＩＬ−１８阻害剤のコード配列を含有する発現ベクターの使用、ならびに末梢脈管疾患の治療または予防のための、細胞でのＩＬ−１８阻害剤の内因性産生を誘導および／または促進するための発現ベクターの使用も本発明の範囲内である。
【００４２】
本発明はさらに、末梢脈管疾患の治療方法であって、それを必要とする患者（host）に有効阻害量のＩＬ−１８阻害剤を投与することからなる方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明は、ＩＬ−１８阻害剤が、インビボマウス疾患モデルにおいて、非虚血肢の血管密度に影響を与えることなく、四肢虚血後の、虚血後脈管形成を有意に増加させるという知見にもとづく。したがって、本発明は、組織灌流の促進を必要とする末梢脈管疾患の治療または予防のための新規な治療アプローチを提供する。
【００４４】
本発明はしたがって、末梢脈管疾患の治療および／または予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００４５】
本明細書の文脈内において、用語「予防」は、ある作用の完全な予防のみならず、疾患の前または疾患の発症初期での任意の部分的なまたは実質的な作用の予防、減衰（attenuation）、減退（reduction）、減少（decrease）または縮小すること（diminishing）を意味する。
【００４６】
本明細書の文脈内において、用語「治療」は、疾患の発症後の病的な状態の発展の減衰、減退、減少または縮小などの、病気の進行に対する任意の有益な作用を意味する。
【００４７】
本明細書において使用される、用語「末梢脈管疾患」は、四肢の動脈、静脈およびリンパ管に影響を及ぼす疾患または障害を意味する。末梢脈管障害は、動脈障害（閉塞性または機能性）、静脈障害、複合動静脈障害（たとえば、動静脈瘻）、またはリンパ管障害であり得る。閉塞性動脈疾患には、末梢動脈閉塞症や閉塞性血栓血管炎があげられる。機能性動脈障害は、血管痙攣（レーノー現象およびレーノー病、先端チアノーゼ）または血管拡張（先端紅痛症）であり得る。それらは血管の局所的欠陥または交感神経活動の妨害に続発するか、または有機的な脈管疾患に付随して生じ得る。静脈疾患には静脈血栓症や拡張蛇行静脈があげられ、複合動静脈疾患には動静脈瘻があげられ、そしてリンパ性疾患にはリンパ浮腫および脂肪浮腫があげられる。
【００４８】
末梢脈管疾患は、前記の「発明の背景」に記載されたすべての医学的徴候、疾患、障害または症状を包含することを意味している。
【００４９】
本明細書の文脈内において、用語「ＩＬ−１８阻害剤」は、ＩＬ−１８産生および／または作用を、ＩＬ−１８産生および／または作用が減衰され、減退され、または部分的に、実質的にもしくは完全に妨げられ、または遮断されるように調節する任意の分子を意味する。
【００５０】
産生阻害剤は、ＩＬ−１８の合成、プロセッシングまたは成熟に否定的に影響する任意の分子であり得る。本発明において考慮される阻害剤は、たとえば、インターロイキンＩＬ−１８の遺伝子発現のサプレッサー、ＩＬ−１８ｍＲＮＡの転写を減じるかもしくは妨げるか、または結果としてｍＲＮＡの分解をもたらすアンチセンスｍＲＮＡ、正しい折り畳みを阻害する、または部分的にもしくは実質的にＩＬ−１８の分泌を妨げるタンパク質、いったん合成されたＩＬ−１８を分解するプロテアーゼ、プロ−ＩＬ−１８を切断し成熟ＩＬ−１８を産生するカスパーゼ−１の阻害剤などのプロテアーゼの阻害剤などである。
【００５１】
ＩＬ−１８作用の阻害剤は、たとえばＩＬ−１８アンタゴニストであり得る。アンタゴニストは、ＩＬ−１８分子自身に充分な親和性と特異性で結合するかまたはＩＬ−１８分子自身を充分な親和性と特異性で隔離するかのいずれかにより、ＩＬ−１８またはそのリガンド（たとえば、その受容体に）へのＩＬ−１８結合を担うＩＬ−１８結合部位を部分的にもしくは実質的に中和させ得る。アンタゴニストはまた、ＩＬ−１８受容体結合へのＩＬ−１８結合の際に細胞内において活性されるＩＬ−１８シグナル伝達経路を阻害し得る。
【００５２】
ＩＬ−１８作用の阻害剤はまた、可溶性ＩＬ−１８受容体もしくはその受容体擬似分子、またはＩＬ−１８受容体遮断剤、またはポリクローナルもしくはモノクローナル抗体などのＩＬ−１８抗体、またはＩＬ−１８のその標的への結合を妨げ、よって、ＩＬ−１８によって媒介される細胞内もしくは細胞外反応の誘発を減少もしくは妨げる任意の他の物質もしくは分子であり得る。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様において、末梢脈管疾患は末梢動脈疾患である。
【００５４】
「末梢動脈疾患」は、腕から脚の大動脈および動脈までの任意の動脈の狭窄を伴う障害である。発症は、突然または緩やかであり得、通常結果として虚血（酸素の血管供給領域への送達の減少）になる。
【００５５】
好ましくは、本発明にしたがって、末梢動脈疾患は下肢に関する。末梢動脈疾患または末梢動脈閉塞は慢性または急性であり得る。末梢動脈疾患はしばしば跛行を伴う。
【００５６】
したがって、本発明はさらに、跛行の治療および／または予防のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。跛行は、脚、特にふくらはぎの痛みであり、それが移り変わり跛行（limping）を生じる。典型的には、跛行は歩行中に感じ、静止中には鎮まる。したがって、一般的に間欠性跛行と呼ばれる。通常、跛行の痛みの間欠性は、脚の筋肉への酸素の一時的な供給不足が原因である。その酸素供給不足は、脚に血液を供給する動脈の狭窄または閉塞の結果である。これは、酸素の脚筋肉への供給を制限し、特にこれらの筋肉の酸素要求が運動や歩行により上昇する際に感じられる。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様において、末梢脈管疾患は、閉塞性血栓血管炎（バーガー病）である。「バーガー病」は、小型動脈および中型動脈ならびに静脈における炎症性の変化によって特徴付けられる閉塞性疾患であり、しばしば紙巻タバコ喫煙者に、主に２０〜４０歳の男性に起こる。
【００５８】
その疾患は、分節パターンにおける四肢の小型および中型動脈、ならびにしばしば表在性静脈と関連している。
【００５９】
さらなる好ましい実施態様において、末梢脈管疾患は、末梢虚血、特に四肢虚血である。「虚血」は血液供給の欠陥であり、通常、血管の閉塞または外傷による。「末梢虚血」は特に四肢（すなわち腕または脚）の虚血を意味し、結果として対応する肢組織の酸素供給の欠乏をもたらす。
【００６０】
本発明のさらになお好ましい態様において、四肢虚血は重篤な四肢虚血である。「重篤な四肢虚血」とは、その肢への血液供給がその生存を脅かすほど乏しい状態である。休息痛、潰瘍形成または壊疽の存在は、重篤な四肢虚血を示唆している。壊疽は死んだ組織を説明するために使用される専門用語であり、しばしば四肢虚血の結果、または四肢虚血と供に生じる。虚血性潰瘍は不充分な血液供給により引き起こされる。
【００６１】
壊疽または潰瘍などの重篤な四肢虚血は、その肢の切断を防ぐために血管再生を必要とする。したがって、本発明はまた、壊疽および潰瘍の治療および／または予防のためのＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００６２】
末梢脈管疾患、特に末梢虚血の最終的な結果は、罹患した肢、特に罹患した下肢または足（foot）の切断であり得る。血管再生は、罹患した組織の再灌流をもたらし、したがって、治癒過程を助けるであろう。
【００６３】
したがって、本発明はさらに、四肢、特に下肢、足またはつま先の切断の予防のための医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の使用に関する。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）阻害剤、ＩＬ−１８に対する抗体、ＩＬ−１８受容体サブユニットのいずれかに対する抗体、ＩＬ−１８シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と競争し、かつＩＬ−１８受容体を遮断するＩＬ−１８のアンタゴニスト、およびＩＬ−１８結合タンパク質、ＩＬ−１８の生物学的活性を阻害するそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、循環置換誘導体（circularly permutated derivatives）から選択される。
【００６５】
「ＩＬ−１８結合タンパク質類」という用語は、本明細書において、「ＩＬ−１８結合タンパク質」または「ＩＬ１８ＢＰ」と同義で使用される。それは、国際公開第９９／０９０６３号パンフレットまたはノービックら、１９９９年に記載されているようなＩＬ−１８結合タンパク質を含み、キムら、２０００年に記載されているようなＩＬ−１８に結合するＩＬ−１８結合タンパク質のスプライス変異体および／またはアイソフォームを含む。特に、ＩＬ−１８ＢＰのヒトアイソフォームａおよびｃは本発明において有用である。本発明による有用なタンパク質は、グリコシル化されていてもまたはグリコシル化されていなくても良く、それらは尿などの天然源由来であっても良く、またはそれらは、好ましくは組換えにより生産されていても良い。組換え体発現は、大腸菌などの原核生物発現系で実施されても良く、または真核生物、好ましくは哺乳類の発現系で実施されても良い。哺乳類タンパク質の発現に特に良く適している細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「ムテイン」という用語は、ＩＬ−１８ＢＰの類似体またはウイルス性ＩＬ−１８の類似体を意味し、該類似体においては、野生型ＩＬ−１８ＢＰもしくはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰと比較して得られる産物の活性を目立って変化させることなく、天然ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの１つ以上のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基で置換されているか、もしくは欠失されているか、または１つ以上のアミノ酸残基がＩＬ−１８ＢＰもしくはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの生来の配列に付加されている。これらのムテインは、既知の合成法によっておよび／または位置指定突然変異誘発技術、またはそれに好適な任意の他の既知の技術によって製造される。
【００６７】
本発明によるムテインは、ＩＬ−１８ＢＰをコードするかまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡに、ストリンジェントな条件下で国際公開公報第９９／０９０６３号パンフレットに記載されたように、ハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされたタンパク質を含む。「ストリンジェントな条件」という用語は、当業者が従来から「ストリンジェント」と呼ぶ、ハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を意味する。アスベル（Ausubel）ら、カレント  プロトコール  イン  モレキュラー  バイオロジー、スープラ、インターサイエンス、ニューヨーク（Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y.）、§§6.3および6.4（１９８７年、１９９２年）、およびサンブロック（Sambrook）ら、スープラ（supra）参照。制限なく、ストリンジェントな条件の例は、試験下のハイブリッドの推定Ｔｍの１２〜２０℃低い洗浄条件など、たとえば２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳを５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを１５分間；０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳを３７℃で３０〜６０分間、ついで０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳを６８℃で３０〜６０分間である。当業者であれば、ストリンジェントな条件がＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（たとえば１０〜４０塩基）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することは理解される。もし混合プローブを用いる場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を用いることが好ましい。アスベル上記参照。
【００６８】
任意のこのようなムテインは、好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰに相当する活性を有するほど、ＩＬ−１８ＢＰの配列に充分に重複する、またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰに充分に重複するアミノ酸配列を有する。ＩＬ−１８ＢＰの１つの活性は、ＩＬ−１８を結合するその能力である。ムテインがＩＬ−１８に実質的な結合活性を有する限り、ＩＬ−１８の精製において（たとえば、アフィニティクロマトグラフィーの手段など）使用することができ、そのため、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に同様の活性を有するとみなされる。したがって、任意の所定のムテインが、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に同じ活性を有するかどうかは、適切に標識されたＩＬ−１８に結合するか否かを決定するための、たとえば、単純なサンドイッチ阻害アッセイ（たとえば、放射免疫アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイ）に、そのようなムテインを供することからなるルーチンの実験方法によって決定され得る。
【００６９】
好ましい態様において、任意のこのようなムテインは、国際公開第９９／０９０６３号パンフレットに記載されているように、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルスにコードされたＩＬ−１８ＢＰ相同物のいずれかの配列と少なくとも４０％同一性または相同性を有する。より好ましくは、それは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは少なくとも９０％同一性または相同性を有する。
【００７０】
本発明により使用され得るＩＬ−１８ＢＰポリペプチドのムテインまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのムテイン、あるいはそれをコードする核酸は、本明細書中で示された教示および指導に基づいて、過度の実験をすることなく、当業者によってルーチンな手順で得られる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドと実質的に一致する配列の有限の一群を含む。
【００７１】
本発明によるムテインの好ましい変更は、「保存的（な）（conservative）」置換として公知である。ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドもしくはタンパク質またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの保存的なアミノ酸置換とは、充分に類似した物理化学的な特性を有する群の範囲内の同義アミノ酸を含み得るものであり、その群のメンバー間における置換は分子の生物学的機能を保存するものであろう（Grantham, 1974）。とくに挿入または欠失が、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のわずかなアミノ酸を含むものであり、たとえばシステイン残基など機能的配座に重要なアミノ酸の除去または入れ替えをしない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を変化させることなく前記配列内でなされることは明らかである。このような欠失および／または挿入によって産生されるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲内である。
【００７２】
好ましくは、同義のアミノ酸群は、表１に規定される群である。より好ましくは、同義のアミノ酸群は、表２に規定される群である。そして、最も好ましくは、同義のアミノ酸群は、表３に規定される群である。
【００７３】
【表１】
2005520852.tif 000002
【００７４】
【表２】
2005520852.tif 000003
【００７５】
【表３】
2005520852.tif 000004
【００７６】
本発明における使用のための、ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドもしくはタンパク質のムテイン、またはウイルスＩＬ−１８ＢＰのムテインを得るために使用され得るタンパク質のアミノ酸置換の製造例としては、マーク（Mark）らによる米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書；コース（Koths）らによる同第５，１１６，９４３号明細書、ナーメン（Namen）らによる同第４，９６５，１９５号明細書、コング（Chong）らによる同第４，８７９，１１１号明細書、リー（Lee）らによる同第５，０１７，６９１号明細書などにおいて示された周知の方法手順；および米国特許第４，９０４，５８４号明細書（ショウ（Shaw）ら）に示されたリジン置換タンパク質を含む。
【００７７】
用語「融合タンパク質」は、たとえば体液内において長期の滞留時間を有する他のタンパク質と融合された、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰまたはそのムテインもしくは断片からなるポリペプチドを意味する。ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰは、このようにたとえば免疫グロブリンまたはその断片といった他のタンパク質、ポリペプチドなどと融合され得る。
【００７８】
本明細書中で用いられる「機能的誘導体」は、本技術分野において周知の方法で、残基の側鎖またはＮ末もしくはＣ末基として存在する官能基から製造され得るＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの誘導体、ならびに、そのムテインおよび融合タンパク質を含み、薬学的に許容し得るかぎり、すなわちＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの活性と実質的に類似しているタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。
【００７９】
これらの誘導体としては、たとえば、ポリエチレングリコール側鎖を含むことができ、該側鎖は、抗原部位を覆い、かつＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−ＢＰの体液中での滞留を拡大し得る。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級アミンもしくは二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえば、アルカノイル基または炭素環式アロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、あるいはアシル部分と形成される遊離ヒドロキシル基（たとえば、セリル基またはトレオニル基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体があげられる。
【００８０】
ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰ、ムテインおよび融合タンパク質の活性画分がＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似した活性を有する場合、本発明では、該「活性画分」として、タンパク質分子のポリペプチド鎖の断片または前駆体単独、またはそれと結合する関連分子または残基（たとえば糖またはリン酸塩残基、またはタンパク質分子または糖残基自身の集合体）を伴うタンパク質分子のポリペプチド鎖の断片または前駆体を含む。
【００８１】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、ＩＬ−１８に対する抗体、またはその受容体であるＩＬ−１８Ｒに対する抗体である。ＩＬ−１８Ｒαおよびβと呼ばれる任意のＩＬ−１８Ｒサブユニットに対する抗体が、本発明にしたがって使用され得る。
【００８２】
本発明による抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、キメラ、ヒト化した、または完全にヒトのものであり得る。組換え抗体およびその断片は、インビボにおけるＩＬ−１８またはＩＬ−１８Ｒと結合する高い親和性、および低毒性によって特徴付けられる。本発明において用いることができる抗体は、病的な状態またはあらゆる症状または病的な状態に関連する症状群を極めて軽減または緩和するために充分な期間、患者を治療することができる能力、および低毒性によって特徴付けられる。
【００８３】
中和抗体は、ＩＬ−１８またはＩＬ−１８Ｒαもしくはβで免疫されたウサギ、ヤギまたはマウスなどの動物によって容易に作出することができる。免疫されたマウスはとくに、ハイブリドーマを製造するためのＢ細胞の供給源を提供するのに有効であり、次には、ハイブリドーマは大量の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体を産生するために培養される。
【００８４】
キメラ抗体は、異なる動物種由来の２つ以上の断片または部分によって特徴づけられる免疫グロブリン分子である。一般的に、キメラ抗体の可変領域は、マウスモノクローナル抗体のようなヒトではない哺乳動物の抗体由来であり、免疫グロブリンの定常領域はヒトの免疫グロブリン分子由来である。好ましくは、両方の領域およびその組み合わせは、決まりきった手順によって決定されるように低い免疫原性を有する（エリオット（Elliott）ら、１９９４年）。ヒト化抗体は、マウスの定常領域をマウスの抗原結合領域は残したままヒトの対応物で置き換えるという、遺伝子工学技術によって創出された免疫グロブリン分子である。得られるマウス−ヒトキメラ抗体は、ヒトにおいて、好ましくは免疫原性が減少し、薬物動態が改善される（ナイト（Knight）ら、１９９３年）。
【００８５】
したがって、さらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８またはＩＬ−１８Ｒ抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗ＩＬ−１８抗体の好ましい例は、たとえば欧州特許出願第０９７４６００号明細書に記載されている。
【００８６】
さらになお好ましい実施態様において、抗体は完全にヒトのものである。ヒト抗体を産生する技術は、たとえば国際公開第００／７６３１０号パンフレット、国際公開第９９／５３０４９号パンフレット、米国特許第６，１６２，９６３号明細書またはオーストラリア特許第５３３６１００号明細書に詳細に記載されている。
【００８７】
完全なヒト抗体の１つの製造方法は、マウス体液免疫系の「ヒト化」、すなわちヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の、内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスへの導入による、ヒトＩｇを産生できるマウス株（キセノマウス）の産生から構成されている。Ｉｇ遺伝子座は、それらの物理的構造および遺伝子再整列ならびに最終的に広い免疫応答を産生するために必要とされる発現過程の両方の点から複雑である。抗体の多様性は、Ｉｇ遺伝子座に存在する異なるＶ、ＤおよびＪ遺伝子のあいだの主にコンビナトリアル再整列により産生される。これらの遺伝子座も、抗体の発現、対立遺伝子の排除（allelic exclusion）、クラススイッチ、および親和性の成熟を制御する、点在した制御要素を含む。再整列されていないヒトＩｇ導入遺伝子のマウスへの導入は、マウスの組換え機構がヒト遺伝子に適合することを証明した。さらに、様々なアイソタイプの抗原特異ｈｕ−ｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマを、抗原によるキセノマウス免疫により得ることができる。
【００８８】
完全なヒト抗体とそれらの産生方法は、本技術分野において既知である（メンデズ（Mendez）ら、（１９９７年）；ブゲマン（Buggemann）ら、（１９９１年）；トミヅカ（Tomizuka）ら、（２０００年）、特許、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット）。
【００８９】
本発明の非常に好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、ＩＬ−１８ＢＰまたはそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分もしくは循環置換誘導体である。それらアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質または機能的誘導体は、とくにＩＬ−１８と結合するというＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性を保持し、好ましくは、本質的には少なくともＩＬ−１８ＢＰと類似した活性を有する。理想的には、そのようなタンパク質は、非修飾のＩＬ−１８ＢＰと比較して増大した生物学的活性を有する。好ましい活性画分は、ＩＬ−１８ＢＰの活性よりも優れた活性を有するか、もしくはより優れた安定性またはより低い毒性もしくは免疫原性などのさらなる利点を有し、または大量に産生することがより容易であるか、もしくは精製がより容易である。
【００９０】
ＩＬ−１８ＢＰおよびそのスプライス変異体／アイソフォームの配列は、キムら、２０００年によるものだけでなく、国際公開第９９／０９０６３号パンフレットまたはノービックら、１９９９年によって提供される。
【００９１】
ＩＬ−１８ＢＰの機能的誘導体は、安定性、半減期、バイオアベイラビリティー、人体による寛容または免疫原性などのタンパク質の性質を改善するために、ポリマーと結合されてもよい。これらの目標を達成するために、ＩＬ−１８ＢＰは、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合しても良い。ポリエチレングリコール化（PEGylation）は、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されている周知の方法によって行なわれ得る。
【００９２】
したがって、本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤および特にはＩＬ−１８ＢＰはポリエチレングリコール化される。
【００９３】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は免疫グロブリン融合物である。すなわち、ＩＬ−１８阻害剤は、免疫グロブリンの全てまたは一部に融合したＩＬ−１８結合タンパク質の全てまたは一部からなる融合タンパク質である。免疫グロブリン融合タンパク質を作製する方法は、たとえば国際公開第０１／０３７３７号パンフレットに記載されたもののように、当技術分野において公知である。当業者であれば、本発明の得られる融合タンパク質が、特にＩＬ−１８への結合といったＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性を保持することを理解するであろう。融合は、直接、または１から３アミノ酸残基長の短いリンカーペプチド、もしくはより長いたとえば１３から２０アミノ酸残基長のリンカーペプチドを介してなるものであってよい。該リンカーは、たとえば配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、またはＩＬ−１８ＢＰ配列と免疫グロブリン配列とのあいだに導入されるＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔからなる１３アミノ酸リンカー配列であり得る。得られる融合タンパク質は、体液内での長い滞留時間（半減期）、増大した特異的な活性、上昇した発現レベルまたは融合タンパク質の精製が容易になるなどの改善された性質を有する。
【００９４】
好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰはＩｇ分子の定常領域に融合される。好ましくは、それは、たとえばヒトのＩｇＧ１またはＩｇＧ２のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような重鎖領域に融合される。ＩＬ−１８ＢＰおよび免疫グロブリンの部分を含む特異的な融合タンパク質の産生は、たとえば国際公開第９９／０９０６３号パンフレットの実施例１１に記載されている。ＩｇＧ2もしくはＩｇＧ4、またはたとえばＩｇＭもしくはＩｇＡのような他のＩｇクラスのアイソフォームなど、Ｉｇ分子の他のアイソフォームもまた、本発明における融合タンパク質の産生に適する。融合タンパク質は、モノマーまたはマルチマー、ヘテロもしくはホモのマルチマーであり得る。
【００９５】
本発明のなおさらなる実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、本発明の臨床状態にかかわる１つ以上の分子、たとえば血管拡張薬、Ｃａブロッカー、アスピリン、ベータ−ブロッカーなどとの組み合せで使用される。ＴＮＦアンタゴニストもまた本発明にもとづきＩＬ−１８阻害剤と組み合せて使用され得る。ＴＮＦアンタゴニストは、いくつかの方法でその活性を発揮する。まず、アンタゴニストはＴＮＦ分子自体に充分な親和性と特異性で結合するか、またはＴＮＦ分子を隔離し、ＴＮＦ受容体結合を担うＴＮＦエピトープを部分的または実質的に中和することができる（以下「隔離アンタゴニスト」という）。隔離アンタゴニストは、たとえばＴＮＦに対する抗体であり得る。
【００９６】
あるいは、ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ結合の後に細胞表面の受容体によって活性化されるＴＮＦシグナル伝達経路を阻害することができる（以下、「シグナル伝達アンタゴニスト」という）。両群のアンタゴニストは、末梢脈管疾患の治療または予防において、ＩＬ−１８阻害剤と組み合わせて、単独または一緒のいずれでも有用である。
【００９７】
ＴＮＦアンタゴニストは、候補を、インビボで、たとえば、ＴＮＦが増殖と免疫グロブリンの分泌を引き起こすヒトＢ細胞などの感受性細胞株における天然ＴＮＦの活性に対するそれらの効果について、ルーチンスクリーニングすることにより容易に同定および評価される。このアッセイは、候補アンタゴニストの希釈を、そのアッセイに用いるＴＮＦのモル量の０．１倍〜１００倍まで変化させた場合のＴＮＦ処方およびＴＮＦなしまたはアンタゴニストのみの対照を含む（トゥシ（Tucci）ら、１９９２年）。
【００９８】
隔離アンタゴニストが本発明にしたがって使用される好ましいＴＮＦアンタゴニストである。隔離アンタゴニストの中でも、ＴＮＦに高い親和性で結合し、低い免疫原性を有するポリペプチドが好ましい。可溶性ＴＮＦ受容体分子およびＴＮＦの中和抗体が特に好ましい。たとえば、可溶性ＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲIIが本発明において有用である。これら受容体の切断型は、受容体の細胞外ドメインまたはその機能部分からなり、本発明のより特に好ましいアンタゴニストである。切断型可溶性ＴＮＦＩ型受容体およびII型受容体は、たとえば欧州特許出願第９１４４３１号明細書に記載されている。
【００９９】
ＴＮＦ受容体の切断型は可溶性であり、尿および血清中に３０ｋＤａおよび４０ｋＤａのＴＮＦ阻害結合タンパク質として検出されており、それぞれＴＢＰＩおよびＴＢＰIIと呼ばれている（エンゲルマン（Engelmann）ら、１９９０年）。ＩＬ−１８阻害剤とＴＮＦアンタゴニストとの同時、連続または個別使用は、本発明により好ましい。
【０１００】
さらに好ましい実施態様において、ヒト可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（ＴＢＰＩ）が本発明により使用されるＴＮＦアンタゴニストである。天然のおよび組換えの可溶性ＴＮＦ受容体分子とそれらの産生方法は、欧州特許出願第３０８３７８号明細書、同第３９８３２７号明細書および同４３３９００号明細書に記載されている。
【０１０１】
受容体分子の誘導体、断片、領域および生物学的活性部分は機能的に受容体分子と似ており、本発明において使用することができる。そのような受容体分子の生物学的に活性な等価物または誘導体は、充分な大きさで、膜結合ＴＮＦ受容体との相互作用が阻害または遮断されるような親和性でＴＮＦに結合できる、ポリペプチドの部分、または受容体分子をコードする配列の部分を意味する。
【０１０２】
ＩＬ−１８阻害剤は、ＴＮＦ阻害剤と同時に、連続的または別々に使用され得る。
【０１０３】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、または約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約２〜５ｍｇ／ｋｇ体重の量で使用される。
【０１０４】
本発明のＩＬ−１８阻害剤は、好ましくは全身的に、好ましくは皮下または筋肉内に投与される。それは毎日または隔日に投与される。徐放処方により、たとえば１週間に１回などの低い頻度での投与が可能となる。
【０１０５】
本発明はさらに、末梢脈管疾患の予防および／または治療のための医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤のコード配列を含有する発現ベクターの使用に関する。したがって、遺伝子治療的アプローチが、ＩＬ−１８阻害剤をそれが必要とされる部位へ送達するために考慮される。末梢脈管疾患を治療および／または予防するために、ＩＬ−１８阻害剤の配列を含む遺伝子治療ベクターは、直接、たとえば患部組織に注射され得る。これにより、ベクターの希釈、標的細胞または組織への到達およびターゲッティングならびに副作用などの遺伝子治療ベクターの全身性投与に関わる問題を回避できる。
【０１０６】
通常ＩＬ−１８阻害剤が発現されていない細胞、または阻害剤の発現量が充分ではない細胞において、ＩＬ−１８阻害剤の内因的な産生を誘導および／または増強するためのベクターの使用もまた、本発明より検討される。そのベクターは、ＩＬ−１８阻害剤を発現することが所望される細胞において機能する調節配列を含む。そのような調節配列は、たとえばプロモーターまたはエンハンサーであり得る。その調節配列は、そののち相同組換えによってゲノムの適当な座に導入され得、したがって作動可能に調節配列と遺伝子とを連結させることにより必要とされる発現が誘導または増強される。その技術は、通常「内因性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、たとえば国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【０１０７】
同じ技術を用いて、ＩＬ−１８阻害剤を使用せずに直接ＩＬ−１８の発現を抑えることが可能であることは、当業者によって理解されるであろう。そのようにするためには、たとえばサイレンシング因子のような負の調節因子をＩＬ−１８の遺伝子座に導入することによって、ＩＬ−１８発現のダウンレギュレーションまたは予防を導くことができる。そのようなＩＬ−１８発現のダウンレギュレーションまたはサイレンシングが、疾患を予防および／または治療するためのＩＬ−１８阻害剤の使用と同じ効果を有することは、当業者に理解されるであろう。
【０１０８】
本発明はさらに、末梢脈管疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤を産生するために遺伝子的に改変された細胞の使用に関する。
【０１０９】
本発明にしたがって使用されるＩＬ−１８阻害剤は、任意に治療的有効量のＴＮＦ阻害剤または末梢脈管疾患の治療もしくは予防にかかわる他の薬物と組み合せて、医薬組成物として好ましく投与され得る。
【０１１０】
ＩＬ−１８ＢＰおよびそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分または循環置換誘導体は、前記したように、医薬組成物の好ましい活性成分である。
【０１１１】
「薬学的に許容し得る」という定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、投与される患者に有害でない任意の担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与に対しては、活性タンパク質は、注射剤のため、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液などのビヒクルの中で単位投与量形態に処方され得る。
【０１１２】
本発明の医薬組成物の活性成分は、多様な方法で個体に投与することができる。投与経路は、皮内、経皮（たとえば、徐放製剤で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所および鼻腔内経路である。任意のほかの治療的に有効な投与経路、たとえば、上皮もしくは内皮組織を通した吸収、または活性薬剤をコードするＤＮＡ分子を患者に投与し（たとえば、ベクターを介し）、インビボで該活性薬剤が発現および分泌するようにした遺伝子治療などが使用できる。さらに、本発明のタンパク質は、薬学的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどのほかの生物学的に活性な薬剤成分と一緒に投与することができる。
【０１１３】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内など）投与については、活性タンパク質は、薬学的に許容し得る非経口ビヒクル（たとえば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）および等張性を維持する添加物（たとえばマンニトール）または化学安定性を維持する添加物（たとえば防腐剤および緩衝液）と共同して、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末として製剤化され得る。製剤は、一般的に使用される技術により滅菌される。
【０１１４】
本発明の活性タンパク質のバイオアベイラビリティーも、人体において分子の半減期を増加させる共役前駆体を使用すること、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されているように分子をポリエチレングリコールに連結することなどにより改善することができる。
【０１１５】
活性タンパク質の治療的有効量は、アンタゴニストのタイプ、アンタゴニストのＩＬ−１８に対する親和性、アンタゴニストによって示される任意の残留細胞毒性活性、投与経路、患者の臨床状態（内因性ＩＬ−１８活性の非毒性レベルの維持の望ましさなど）などを含む多くの変数の関数となるであろう。
【０１１６】
「治療的有効量」は、投与した際に、ＩＬ−１８阻害剤が結果としてＩＬ−１８の生物学的活性の阻害を生じるようなものである。単回または複数回投与量として個体に投与される服用量は、ＩＬ−１８阻害剤の薬物動態特性、投与経路、患者の状態や特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、同時治療、治療の頻度ならびに望ましい効果などの多様な因子に依存して変化する。確立される服用量の範囲の調整や操作は、個体におけるＩＬ−１８の阻害のインビトロおよびインビボ測定法と同様に、当業者の能力の範囲内である。
【０１１７】
本発明によれば、ＩＬ−１８阻害剤は、体重の約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇまたは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または体重の約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、または体重の約１〜３ｍｇ／ｋｇ、または体重の約２ｍｇ／ｋｇで使用される。
【０１１８】
本発明によって好ましい投与経路は、皮下経路による投与である。筋肉内投与は、本発明によればさらに好ましい。ＩＬ−１８阻害剤を直接的にその作用箇所に投与するために、それを局所的に投与することもまた好ましい。
【０１１９】
さらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は毎日または隔日に投与される。
【０１２０】
１日用量は、通常、所望の結果を得るために有効な分割用量または徐放形態で投与される。２回目以降の投与は、個体に投与された開始または事前の用量と同じか、それより少ないかまたはそれより多い服用量で行われ得る。２回目以降の投与は、疾患の発症中またはそれより以前に投与され得る。
【０１２１】
本発明によれば、ＩＬ−１８阻害剤は、ほかの治療法または治療剤、特にＴＮＦ阻害剤および／またはほか脈管保護剤に先んじて、同時にまたは連続して（多剤療法）、治療的有効量で、予防的にまたは治療的に個体に投与され得る。ほかの治療的薬剤と同時に投与される活性薬剤は、同一または異なる組成物で投与することができる。
【０１２２】
本発明はさらに、有効量のＩＬ−１８阻害剤および／またはＴＮＦアンタゴニストを薬学的に許容し得る担体と混合することからなる医薬組成物の製造方法に関する。
【０１２３】
本発明はさらに、末梢脈管疾患の治療方法であって、それを必要とする患者に医薬的有効量のＩＬ−１８阻害剤を（任意には医薬的有効量のＴＮＦアンタゴニストと組み合せて）投与することからなる方法に関する。
【０１２４】
ここまで本発明を充分に説明してきたので、同様のことが等しいパラメーター、濃度および条件の範囲内で、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、また過度の実験をすることなく行なうことができるということは当業者によって充分理解されるであろう。
【０１２５】
本発明は、その特定の実施態様に関連して説明されているが、さらなる変更が可能であるということは理解されるであろう。この出願は、概して本発明の原理を受けて本発明の任意の変化、用途、適応を保護することを意図しており、本発明の属する技術分野の既知のまたは一般的な手法の範囲内となる本開示からの逸脱および下記の通り添付のクレームの範囲で前記の本質的な特徴にあてはまるような本発明からの逸脱も含む。
【０１２６】
本明細書において引用される、雑誌の論文もしくは要旨、公開もしくは非公開の米国もしくは外国特許出願、公布された米国もしくは外国特許または任意のほかの参考文献などのすべての参考文献は、引用される参考文献に示されたすべてのデータ、表、図および文章を含めて、本明細書において言及することにより完全に組み込まれる。さらに、本明細書において引用される参考文献中で引用される参考文献の全内容も、言及することにより完全に組み込まれる。
【０１２７】
既知の方法手段、常套的な方法手段、既知の方法または常套的な方法への言及は、本発明のあらゆる局面、記載または実施態様が関連技術において開示、教示または示唆されるものであると認めるものではない。
【０１２８】
特定の実施態様の先行する記載は、第三者が、当業者の知識（本明細書で引用された参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験をすることなく、本発明の全体的な概念から逸脱することなく、特定の実施態様などのさまざまな適用のために、容易に修飾および／または適応させることができるほど、本発明の全体的な性質を充分に示すものであろう。したがって、本明細書で紹介された教示および手引きに基づく、そのような適応および修飾は、開示された実施態様と同等の範囲の意味であると意図される。本明細書の表現または専門用語は、本明細書で紹介された教示および手引きによる見地と当業者の知識とを組み合わせて、当業者に理解されるものであるため、本明細書での表現または専門用語は、説明を目的とするものであって限定するためのものではない。
【実施例１】
【０１２９】
ＩＬ−１８の阻害が末梢虚血を軽減する
方法：
後足虚血の導入
雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（イファ  クレド（Iffa Creddo）、リヨン、フランス）に、片側の後足虚血を導入するために外科手術を施した。動物にイソフルレン吸入により麻酔をかけた。結紮を右大腿動脈上、伏在動脈および膝窩動脈の分岐から０．５ｃｍ近位に行なった。つぎにマウス（１群当たり７匹）を、特定の無菌条件下で３日または２８日間収容した。虚血誘導脈管形成におけるＩＬ−１８ＢＰの役割を調べるため、１群のマウスに６０μｇのマウスＩＬ−１８ＢＰ発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ３−ｍＩＬ−１８ＢＰを両脛骨上方筋（tibial cranial muscles）に、既に説明されているように注射した（マラット（Mallat）ら、２００１年）。対照マウスには同じ用量の対照空プラスミドを注射した。経皮電気パルス（２００Ｖ／ｃｍの８方形波電気パルス、２Ｈｚで２０ｍｓ持続時間）は、ステンレススチールプレート電極を用いるＰＳ−１５電気パルセーター（ジェネトロニクス（genetronics））（脚の両脇に４．２〜５．３ｍｍ離して設置）により送達された。この方法は、ＩＬ−１８ＢＰ血漿濃度を増加し、血漿ＩＬ−１８活性を減少し、アテローム性動脈硬化プラークの発達および進行を阻害するということが既に示されているので使用した（マラットら、２００１年）。
【０１３０】
脈管形成の定量化
細血管造影法
治療期間の終わりに高解像度細血管造影法により血管密度を、既に説明されているように評価した（シルベスター（Silvestre）ら、２０００年；シルベスターら、２００１年）。簡単に説明すると、マウスに麻酔をかけ（イソフルラン吸入）、造影培地（硫酸バリウム  １ｇ／ｍｌ）を腹大動脈に導入したカテーテルを通して注入した。デジタルＸ線変換器により得た画像（動物（animals）につき３つ）を、後足の完全な図を得るためにアセンブルした。血管の密度は、定量化領域における血管で占められた画像あたりの画素の割合として表わした。定量化区域は、大腿動脈の結紮場所、膝、大腿部の端および脚の外側の境界で線引きした。
【０１３１】
毛細管密度
細血管造影分析は、既に説明されているように、虚血および非虚血筋肉における毛細管密度の評価により完了した（シルベスターら、２０００年；シルベスターら、２００１年）。凍結組織切片（７μｍ）をＣＤ３１に対するラットのモノクローナル抗体（２０μｇ／ｍｌ、ファーミンゲン（Pharmingen））と供にインキュベートし、毛細管を同定した。免疫染色は、アビジン−ビオチン  ホースラディッシュペルオキシダーゼ可視化システム（ベクタステイン  ＡＢＣ  キット  エリート（Vectastain ABC kit elite）、ベクター  ラボラトリーズ（Vector Laboratories））を使用して可視化した。規定された領域の無作為に選択されたフィールドで、ヒストラブ  ソフトウェア（Histolab software）（マイクロビジョン（Microvision））を用いて毛細管密度を計算した。
【０１３２】
レーザードップラー灌流イメージング
脈管新生の虚血誘導変化に対する機能的証拠を提供するために、レーザードップラー灌流イメージング実験を、既に説明されているように行なった（シルベスターら、２０００年；シルベスターら、２００１年）。簡単に説明すると、イメージングの前に脱毛クリームで四肢から過剰な毛を除去し、温度変化をできるだけ少なくするために、マウスを３７℃の加熱プレートに置いた。それでもなお、周囲の光と温度などの変数を説明するために、計算された灌流は虚血脚と非虚血脚との比率として表わした。
【０１３３】
統計的分析
結果は平均±ＳＥＭとして表わした。各パラメーターを比較するために一方向分散分析ＡＮＯＶＡを使用した。この後に、どの群の差異が有意な全ＡＮＯＶＡの原因であるかを同定するためにボンフェローニのｔ検定（Bonferonni's t test）比較を行なった。ｐ＜０．０５の値を統計的に有意であるとみなした。
【０１３４】
結果：
細血管造影法
３日目では、各群において虚血／非虚血脚の血管造影スコア率は影響されなかった（図１）。対照的に、２８日目では、血管造影スコアは、対照と比較してＩＬ−１８ＢＰ処理マウスにおいて１．６倍の増加を示した（ｐ＜０．０１）。
【０１３５】
毛細管密度
細血管造影データは、ＣＤ３１染色後、毛細管密度分析によって確認された。２８日目では、対照マウスの虚血脚の毛細管密度は非虚血脚よりも低かった（４１５±３１ 対 ６８８±４２ 血管／ｍｍ2、ｐ＜０．０１）。しかしながら、ＩＬ−１８ＢＰ処置マウスの虚血脚の毛細管密度は対照マウスより有意に高く（１．４倍の増加）（それぞれ、５８８±４８ 対 ４１５±３１ 血管／ｍｍ2、ｐ＝０．０１）、非虚血脚で見られたレベルとは異なっていた。
【０１３６】
レーザードップラー灌流イメージング
細血管造影測定および毛細管密度測定は、血液灌流の変化と関連していた。後足の血流の回復は、処置および未処置の両方のマウスで起こった。しかしながら、ＩＬ−１８ＢＰ処置マウスでは、血流（足灌流）のより大きな増加が、対照動物と比較して２８日目までに明らかとなった（１．５倍、ｐ＜０．０１、図２）。
【実施例２】
【０１３７】
ＶＥＧＦ、ホスホ-ＡｋｔおよびｅＮＯＳタンパク質濃度の制御
方法
ＶＥＧＦ、ホスホ-ＡｋｔおよびｅＮＯＳ（内皮性一酸化窒素合成タンパク質）の発現を、虚血脚および非虚血脚におけるウエスタンブロットにより、既に説明されているように測定した（シルベスターら、２０００年；シルベスターら、２００１年）。
【０１３８】
結果
ＶＥＧＦ
３日目では、虚血脚および非虚血脚の各群のあいだでＶＥＧＦタンパク質濃度に変化は観測されなかった。２８日目では、対照マウスにおいて、ＶＥＧＦタンパク質含量が、非虚血脚と比較した場合、虚血脚で増加傾向にあったが、これは統計的有意には至らなかった。一方、虚血脚足のＶＥＧＦタンパク質濃度は、対照と比べてＩＬ−１８ＢＰ処置マウスで１２０％目に見えて上方調節された（ｐ＜０．０５）（図３）。
【０１３９】
ホスホ-Ａｋｔ
３日目では、ホスホ-Ａｋｔタンパク質濃度は、どの処置でも虚血後足および非虚血後足において変化はなかった。２８日目では、対照マウスにおいて、ホスホ-Ａｋｔタンパク質含量は、虚血後足において非虚血後足の含有量より６０％増加した（ｐ＜０．０１）。虚血脚のホスホ-Ａｋｔ含量のこの増加は、ＩＬ−１８ＢＰ処置マウスにおいて２倍であった（１１０％増加、対照マウスの虚血脚の増加と比較してｐ＜０．０５）（図４）。
【０１４０】
ｅＮＯＳ
３日目では、ｅＮＯＳタンパク質含量は、それぞれ、対照およびＩＬ−１８ＢＰ処置マウスについて虚血脚（１０７±８％ 対 １０３±２４％）および非虚血脚（１００±１２％ 対 ９４±２１％）で影響されなかった。２８日目では、対照マウスにおいて、ｅＮＯＳ濃度は、非虚血脚に対して虚血脚で５５％上昇した（それぞれ、１５５±８％ 対 １００±１１％、ｐ＜０．０５）。この増加はＩＬ−１８ＢＰ処置に影響されなかった（１６０±１２％、ｐ＝０．６１ 対 虚血対照）。
【実施例３】
【０１４１】
ＥＰＣｓ（内皮前駆細胞）に対するＩＬ−１８ＢＰの作用
方法
フローサイトメトリー分析
ＥＰＣｓ細胞は、Ｓｃａ−１陽性造血前駆細胞から誘導されると考えられる（タカハシ（Takahashi）ら、１９９９年）。次に、ＥＰＣｓマーカータンパク質、Ｓｃａ−１を発現する単核細胞の割合をフローサイトメトリーにより決定した。虚血の７日後、単核細胞を、空のｐｃＤＮＡ３プラスミドまたはｐｃＤＮＡ３−ｍＩＬ１８ＢＰプラスミドのいずれかで処置したマウス（各群ｎ＝５）の末梢血（３００μｌ）および骨髄から単離した。骨髄細胞は脛骨および大腿骨をフラッシングすることにより得た。低密度単核細胞は、フィコールを用いた密度勾配遠心分離により単離した。次に単核細胞をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合Ｓｃａ−１モノクローナル抗体（Ｄ７、ＢＤ  ファーミンゲン（Pharmingen））と供にインキュベートした。アイソタイプの同一抗体が対照として供された。
【０１４２】
ＥＰＣ分化分析
単離直後、５×１０6骨髄由来単核細胞も、ラット血漿ビトロネクチン（シグマ）とゼラチン（０．１％）をコートした３５ｍｍ細胞培養皿に置き、内皮基底培地（ＥＢＭ２、バイオ  ホイッタカー（Bio whittaker））に維持した。培養４日後、非接着性細胞を除去し、接着性細胞を免疫化学分析した。
【０１４３】
１，１’−オクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン標識アセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ−Ｄｉｌ）の取り込みを検出するために、細胞をＡｃＬＤＬ−Ｄｉｌ（Ｔｅｂｕ）と供に３７℃で１時間インキュベートした。次に細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、第１のポリクローナルウサギ抗体およびフォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）（ダコ（DAKO））と１時間インキュベートし、ＦＩＴＣ標識モノクローナル抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と３０分間インキュベートした（コールター（Coulter））。ＡｃＬＤＬ−ＤｉｌとｖＷＦの両方に陽性の二重染色細胞をＥＰＣｓであると判定し、それらをウェルごとに計測した。３人の独立した調査員がウェルごとのＥＰＣｓの数を３つの無作為に選択された高出力フィールドを計測することにより評価した。次に結果を単核細胞の総数の割合として表わした。
【０１４４】
結果
ＥＰＣｓは、Ｓｃａ−１陽性単核細胞から誘導されると考えられる（タカハシら、１９９９年）。末梢血におけるＳｃａ−１陽性単核細胞の割合は、ＩＬ−１８ＢＰ処置マウスでは対照動物と比較して不変のままであった（それぞれ、３１．５±１３％ 対 ２８．５±１３％）。同様に、骨髄から単離されたＳｃａ−１陽性単核細胞の全体の数は、ＩＬ−１８ＢＰ処置マウスと対照マウスとの間で相違しなかった（それぞれ、４．３５±０．９５％ 対 ５．８７±０．２２％）。さらに、ＩＬ−１８ＢＰ処置は、末梢血単核細胞または骨髄単核細胞の総数に影響しなかった（データは示さず）。
【０１４５】
ＥＰＣｓは骨髄単核細胞から単離、培養され、ＡｃＬＤＬ−ＤｉｌとｖＷＦとに陽性の二重染色細胞として特徴付けられた。二重陽性染色細胞の割合は、非虚血動物においてはほとんど検出不可能であった（＜５％、ｎ＝４）。虚血は、ＡｃＬＤＬ−ＤｉｌとｖＷＦとに対する二重陽性染色細胞の割合の目立った増加を誘導した（４８±３％、ｐ＜０．００１ 対 非虚血動物）。この効果はさらにＩＬ−１８ＢＰ処置によって拡大された（対照で４８±３％ 対 ＩＬ−１８ＢＰ処置マウスで８５±２％、ｐ＜０．００１）（図５）。したがって、ＩＬ−１８ＢＰ処置は、循環前駆細胞の数を増加させるというよりむしろ単核細胞のＥＰＣｓへの分化を刺激すると思われる。
【０１４６】
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【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】Ａ）は、マウスの大腿動脈閉塞後３日および２８日目の、右の虚血後足および左の非虚血後足の代表的な細血管造影を示す。Ｂ）は、３日間または２８日間の、ｐｃＤＮＡ３−ｍＩＬ１８ＢＰ処置マウス（ＩＬ−１８ＢＰ）または空のプラスミド処置マウス（対照）における、虚血／非虚血血管造影スコアを示す。値は平均±ＳＥＭで示し、各群  ｎ＝７である。**ｐ＜０．０１ 対 対照マウス。
【図２】Ａ）は、ｐｃＤＮＡ３−ｍＩＬ１８ＢＰ処置マウス（ＩＬ−１８ＢＰ）または空のプラスミド処置マウス（対照）において、インビボでレーザードップラー灌流イメージングによりモニターした後足血流の虚血誘導変化を示す。色分けした画像において、正常な灌流を赤で示し、虚血後足の著しい血流の減少を青で示す。Ｂ）は、非虚血肢の血流に対する虚血肢の血流の割合として表わされる血流の定量的評価を示す。値は平均±ＳＥＭで示し、各群  ｎ＝７である。**ｐ＜０．０１ 対 対照マウス。
【図３】Ａ）は、非虚血脚および虚血脚における、大腿動脈閉塞後２８日目のＶＥＧＦタンパク質含量の代表的なウエスタンブロットを示す。Ｂ）は、非虚血肢でのタンパク質含量に対する虚血肢でのタンパク質含量の割合として表わされるＶＥＧＦタンパク質濃度の定量的評価を示す。値は平均±ＳＥＭで示し、各群  ｎ＝７である。**ｐ＜０．０１ 対 非虚血対照、および†ｐ＜０．０５ 対 虚血対照。
【図４】Ａ）は、非虚血脚および虚血脚における、大腿動脈閉塞後２８日目のホスホ−Ａｋｔタンパク質含量の代表的なウエスタンブロットを示す。Ｂ）は、非虚血肢でのタンパク質含量に対する虚血肢でのタンパク質含量の割合として表わされるホスホ−Ａｋｔタンパク質濃度の定量的評価を示す。値は平均±ＳＥＭで示し、各群  ｎ＝７である。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１ 対 非虚血対照、および†ｐ＜０．０５ 対 虚血対照。
【図５】Ａ）は、大腿動脈の結紮なしのマウス（偽）の骨髄およびｐｃＤＮＡ３−ｍＩＬ１８ＢＰ処置マウス（ＩＬ−１８ＢＰ）または空のプラスミド処置マウス（対照）の骨髄から単離されるＥＰＣｓ（内皮前駆細胞）の代表的な画像を示す。ＥＰＣｓは、ＡｃＬＤＬ−Ｄｉｌおよびフォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）に対する二重陽性染色を有する接着性細胞として特徴付けられた。Ｂ）は、ｐｃＤＮＡ３−ｍＩＬ１８ＢＰ処置マウスまたは空のプラスミド処置マウスにおける二重陽性細胞の定量化を示す。値は平均±ＳＥＭで示し、各群  ｎ＝５である。***ｐ＜０．００１ 対 対照マウス、†††ｐ＜０．００１ 対 大腿動脈結紮をしていないマウス（偽）。
【図１】
2005520852.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005520852.tif 000009
【国際調査報告】
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