(57)【要約】動物における移植により軟骨の修復のための移植可能な物品。上記移植可能な物品は、支持体マトリックス、及び当該支持体マトリックスの縁に接着した軟骨細胞及び生物適合性接着剤を含み、指示体マトリックスは動物により吸収可能である。支持体マトリックスはコラーゲンのような生物適合性材料であり、そして接着剤は自己のフィブリンである。
2005504576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物内への移植による軟骨の修復のための移植可能な物品であって、支持体マトリックス、及び軟骨細胞及び支持体マトリックスの縁に接着した生物適合性接着剤を含み、但し支持体マトリックスは動物により吸収可能である、物品。
【請求項２】
支持体マトリックスが、軟骨細胞の生育を持続させることができ、且つ上記の移植可能な物品の物理的完全性を提供することによりその操作を用意にできる、シート様部材である、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項３】
支持体マトリックスがポリペプチド又は蛋白質を含む、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項４】
支持体マトリックスがコラーゲンである、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項５】
コラーゲンがウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ及びチキンのコラーゲンからなる群から選択される、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項６】
支持体マトリックスが固形である、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項７】
支持体マトリックスがゲル様である、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項８】
コラーゲンがコラーゲンタイプＩである、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項９】
コラーゲンがコラーゲンタイプＩＩである、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項１０】
移植可能な物品が可逆的に変形可能である、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項１１】
支持体マトリックスが粗い側面を有する、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項１２】
粗い側面が孔性である、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項１３】
支持体マトリックスが滑らかな側面を有する、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項１４】
支持体マトリックスが粗い側面及び滑らかな側面を有する、請求項１記載の移植可能な物品。
【請求項１５】
軟骨細胞及び生物適合可能な接着剤が混合物中にある、請求項１記載の移植可能な物品。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、軟骨細胞移植、骨及び軟骨の移植片、治療、関節の矯正及び関節炎の病状の予防の分野に関する。特に、移植部位の用意のための方法、そのような用意及び用意された移植部位への細胞の自己移植のための装置である。
【０００２】
発明の背景
５００，０００を超える関節塑造（arthroplastic）処置及び全関節置換が米国において実施されている。ほぼ同数の類似の手法が欧州において実施されている。これらの数字には、欧州における１年あたりの約９０，０００の全膝置換及び膝の欠損を修復する約５０，０００の処置が含まれる。処置の数は本質的に米国と同じである（Ｐｒａｅｍｅｒ，Ａ．，Ｆｕｒｎｅｒ  Ｓ．，Ｒｉｃｅ，Ｄ．Ｐ．，米国における骨格筋の症状、整形外科医のアメリカンアカデミー、パークリッジ、Ｉ１１．，１９９２，１２５中）。軟骨の再生処置の方法はもっとも有用なはずで、且つ関節の損傷の初期段階において実施することができるから、即ち、人工関節置換の外科手術を必要とする患者の数を減少させる。そのような予防的処置法により、骨関節症を発症する患者の数も低下するはずである。
【０００３】
関節において軟骨構造を再度蘇らせる（resurfacing）のに使用される技術は、主に、軟骨下の穴開け（subchondral drilling）、研摩（abrasion）及び他の方法を用いて軟骨の修復を誘導するために企てられ、それにより患部の軟骨及び軟骨下の骨が切除されて、血管新生した海面状の骨が露出される（Ｉｎｓａｌｌ，Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．１９７４，１０１，６１；Ｆｉｃａｔ  Ｒ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ．１９７９；１４４，７４；Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｌ．Ｌ．，：手術における関節鏡検査法、ＭｃＧｉｎｔｙ  Ｊ．Ｂ．，編纂Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク、１９９１，３４１中）。
【０００４】
Ｃｏｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｈｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６６，１５３，１１１６）は、チキンの胚体節からの軟骨合成細胞の培養技術を記載した。後に、Ｃａｈｎ  ａｎｄ  Ｌａｓｈｅｒ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １９６７，５８，１１３１）は、軟骨の分化のための先行必要条件としてＤＮＡ合成の関与の分析のための系を用いた。軟骨細胞は成長によりＥＦＧ及びＦＧＦの両方に応答する（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｍｅｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １９７７，９３，１１７）が、最終的にはそれらの分化機能を失う（Ｂｅｎｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  １９７８，１５，１３１３）。軟骨細胞を成長させる方法は記述されており、主に、Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９４，３３１，８８９）によりマイナーな修正と共に使用されている。これらの方法を用いて成長した細胞は、患者の膝の関節の自己移植に使用された。さらに、Ｋｏｌｅｔｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，１０８，１９９１）は、軟骨特異的分子、例えばコラーゲン及びプロテオグリカンの、延期された細胞培養下における発現を試験した。彼らは、単層培養の培養の間の形態上の変化にも拘わらず（Ａｕｌｔｈｏｕｓｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９８９，２５，６５９；Ａｒｃｈｅｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９０，９７，３６１；Ｈａｎｓｅｌｍａｎｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９４，１０７，１７；Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９４，２１２，９７）、様々な化学者により試験された、アガロースゲル上又はアルギン酸ビーズ上で成長させたか或いは回転培養物（spinner cultures）（丸い細胞の形態を保持する）として成長させた懸濁液の培養に比較した場合に、軟骨発現マーカー、例えばタイプＩＩ及びＩＸコラーゲンを変化させなかったし、そして大きな凝集プロテオグリカン、アグリカン、ベルシカン及び結合蛋白質は変化しなかったことを見いだした（Ｋｏｌｅｔｔａｓ，ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，１０８，１９９１）。
【０００５】
関節の軟骨は、軟骨中に独占的に見いだされる、特殊化された間葉由来細胞である。軟骨は軟骨細胞により生じた細胞外マトリックスにその物理的特性が依存する無血管組織である。軟骨の骨化の間、軟骨は成熟を経て細胞肥大を導くが、タイプＸコラーゲンの発現の開始により特徴付けられる（Ｕｐｈｏｌｔ，Ｗ．Ｂ．ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，Ｒ．Ｒ．，Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ（Ｈａｌｌ，Ｂ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ，Ｓ，編纂）ＣＲＣ  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  １９９１，４３；Ｒｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９１，１４８，５６２；Ｋｉｒｓｃｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，１９９２，５２，８９；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１９９３，１０３，１１１１中）。
【０００６】
関節中の外層又は関節表面のタイプＩＩコラーゲンの過剰な分解は骨関節炎によっても引き起こされる。コラーゲンのネットワークは従って弱まり、そして次に繊維性攣縮を発症して、それによりプロテオグリカンのようなマトリックス物質が失われて結局は完全に置き換わる。弱まった骨関節炎性軟骨のそのような繊維性攣縮は、石灰化された軟骨へ、そして軟骨下の（subchondral）骨へと達し得る（Ｋｅｍｐｓｏｎ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９７６，４２８，７４１；Ｒｏｔｈ，Ｖ．ａｎｄ  Ｍｏｗ，Ｖ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｙ，１９８０，６２Ａ，１１０２；Ｗｏｏ，Ｓ．Ｌ．−Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，バイオエンジニアリングハンドブック（Ｒ．Ｓｋａｌａｋ  ａｎｄ  Ｓ．Ｃｈｉｅｎ編纂）マグロウヒル、ニューヨーク、１９８７，ｐ．４．１−４．４４中）。
【０００７】
骨、軟骨及び他の結合組織の基本的な発生、組織学及び顕微鏡による解剖的調査の記載は、例えば、Ｗｈｅａｔｅｒ，Ｂｕｒｋｉｔｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，第２版、（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，ロンドン、１９８７、第４章）に見いだされ得る。骨、軟骨及び他の結合組織中の欠損の基本的な組織学解剖的調査の記載は、例えば、Ｗｈｅａｔｅｒ，Ｂｕｒｋｉｔｔ，Ｓｔｅｖｅｎｓ  ａｎｄ  Ｌｏｖｅ，Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，ロンドン、１９８５、第２１章）に見いだされ得る。
【０００８】
軟骨細胞を培養すること及び骨及び軟骨を操作することにおける前進にも拘わらず、損傷した組織化表面の修復のために軟骨又は軟骨細胞を移植する試みによる大きな成功は、なされていない。本発明の教示は、軟骨及び／又は軟骨細胞の、組織化関節又は他の軟骨で覆われた骨表面の欠損への移植を促進させる有効且つ効率の良い手段を提供し、それにより欠損を固定するように軟骨が再生される。本発明は、移植部位を用意するようにデザインされる外科手術用装置も提供することにより、移植された材料の移植部位への有効な融和を促進させる。
【０００９】
発明の簡単な概要
本発明は、適切なマトリックス中の軟骨細胞の処理される表面への移植により関節表面の軟骨を組織化する有効な処置方法を提供するが、止血バリアー及び細胞を含まないカバーリングパッチを用い、最初に処理される表面の近位に止血バリアーを置き、止血バリアーの遠位に処理される表面の上に適切なマトリックス中の軟骨細胞を入れ、処理される表面を細胞を含まないカバーリングパッチで覆うことを含む。以下にさらに詳細に記載されるとおり、止血バリアーは血管新生細胞及び組織の移植された材料への侵入を阻害するバリアーである。特定すれば、本発明は、バリアーを通しての血管の侵入を阻害するか又は予防する、再吸収可能で且つ半透性の材料である止血バリアーを提供する。一つの態様において、止血バリアーはコラーゲンを含む。細胞を含まないとは当業界で使用されるとおりに本明細書で使用されて、さらなる細胞分割、普及（promulgation）及び生物活性が可能な完全細胞は実質上無い材料を意味する。好ましい態様において、細胞を含まない材料は全部の完全な有核細胞が無い。一つの態様において、本方法は、半透性コラーゲンマトリックスを含む細胞不含カバーリングパッチの使用を包含する。当該方法の一つの好ましい態様において、細胞不含カバーリングパッチの孔性表面は移植材料に向けられる。
【００１０】
本発明は、さらに、移植部位へのコラーゲン又は軟骨細胞の自己移植を提供するが、但し、当該移植部位は移植された材料を良好に受容するように外科操作により最初に用意される。一つの態様において、移植された材料が移植部位内に置かれて移植部位の壁に接触するように伸長した（expanded）場合に全移植物の移植部位からの除去又は排除に対して耐性を提供するような起伏様式にて移植部位の壁が輪郭を示すように、移植部位を作成する（sculpted）。本発明は、さらに、発明の方法により教示されたとおりに移植部位を作成するようにデザインされた外科手術装置を提供する。
【００１１】
本発明は、さらに、関節の接合点の表面上に軟骨及び／又は軟骨細胞を移植するためのキットを提供し、当該キットは止血バリアー、細胞不含半透性カバーリングパッチ、及び有機接着剤を含む。さらなる態様において、上記キットは、任意に、さらに、本発明の方法に従い、移植部位を作成するのに使用することができる一つ又は複数の外科手術装置を提供し得る。
【００１２】
本発明は、さらに、動物における軟骨修復のための移植物を提供する。当該移植物は、１）支持体マトリックス、２）軟骨細胞、及び３）支持体マトリックスの縁に接着された生物適合性接着剤である。一つの態様において、支持体は動物により吸収され得る。
【００１３】
発明の詳細な説明
この発明は、管性組織（vascular tissue）の形成を阻害する特定の生成物の使用に関し、例えば、軟骨内の欠損への軟骨細胞の自己移植のプロセスの間に、軟骨へ突き出る毛細管ループが確立される。下にある骨からの管系組織の形成は、形成される新しい軟骨に突き出る傾向があり、所望の間葉性の特殊化された軟骨細胞意外の細胞の出現を導く。
【００１４】
血管新生により導入された混在細胞は、軟骨への侵食及び過剰成長が移植された軟骨細胞により形成されるかもしれない。この発明に使用できる市販の製品の種類の一つはＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）（Ｅｔｈｉｃｏｎ社、英国）であり、７−１４日後に吸収され得る。本発明の方法におけるこの材料の使用は、止血装置、例えばＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）のＥｔｈｉｃｏｎ社からのパッケージに記載されたような通常の使用とは相容れない。
【００１５】
驚くことに、我々は、あなたが軟骨への再血管新生を阻害することを願う状況において、止血材料がゲル様の人工の凝固物（coagulate）のように作用することを見いだした。赤血球細胞がそのような止血バリアーにより上を覆われた関節の軟骨の完全厚の欠損内に存在するべきであるなら、これらの血球細胞は化学的にヘマチンに変換されて、即ち、血管の成長を誘導できなくさせることになる。即ち、例えばＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）のような繊維状接着剤を用いるか又は用いずに再血管新生阻害バリアーとして使用された止血生成物は、本発明により教示されたような想像された方法に有効である。この発明の別の部分は、細胞不含成分の使用であり、即ち、移植のために自己軟骨細胞を用いて培養された軟骨細胞／軟骨が移植される接合点の欠損エリアを覆うパッチとして使用される。発明の方法は、軟骨の欠損の矯正のための適切な自己軟骨細胞又は異種個体の軟骨細胞の使用も意図する。
【００１６】
即ち、本発明は、関節の接合点の骨表面の軟骨の欠損を有効に矯正するか又は処置するための方法を教示し、矯正される軟骨部位への血管の侵入をブロックするための薬剤又は装置を投与し、そしてまた矯正部位を単離して移植された細胞を適所に保持する細胞不含バリアーを提供することも含む。本発明は、矯正される部位への血管新生の有効な阻害が存在するように、矯正される部位への挿入のための止血バリアー成分を含むキットも提供する；そして移植される軟骨細胞が矯正される部位へ配置されたなら、移植された軟骨細胞が適所に保持されるが栄養に対する接近は可能なように、細胞を含まない半透性のバリアーで矯正部位を覆う。
【００１７】
発明の特定の側面は、血管組織の形成を阻害する特定の生成物又は複数の特定の生成物の組み合わせに接触させた場合に、軟骨細胞の挙動を研究するためのインビトロ系を用いて例示されてきた。このインビトロ試験は、軟骨内の欠損への軟骨細胞の自己移植のプロセスの間に毛細管ループの軟骨への突出が確立されるようにインビボにて生じるように、特定の試験された材料が血管新生を阻害する能力を予測する。
【００１８】
適切な止血生成物は、発生している軟骨への、血管組織、骨細胞、繊維芽細胞当の成長又は侵入を阻害する能力を有することにより特徴付けされることになる。適切な止血材料は、軟骨の形成を最適化して、関節の軟骨のあらゆる欠損の完全厚の矯正を達成するために、発生中の軟骨への血管及び細胞の侵入が阻害されるべきであるということにおいて、本発明の方法の到達点を達成することになる。理想的には、止血バリアーは完全な軟骨の矯正を許容するのに十分な延長された時間安定であり、そして再吸収されるか又はさもなくば時間をかけて分解され得る。適切であることがわかった一つの材料は、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）Ｗ１９１２（酸化された再生滅菌セルロースを含む吸収可能な止血鉗子（hemostat）；ロットＧＧ３ＤＨ，Ｅｔｈｉｃｏｎ社、英国）である。適切な材料の別の例は、ＢｉｏＧｅｌ（登録商標）（市販のタイプＩコラーゲンマトリックスパッド；Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ，スイス）である。
【００１９】
適切な有機接着剤の材料は、例えばＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）又はＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（フィブリンベースの接着剤；Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧ，オーストリア）、アドヒーシブプロテイン（Adhesive Protein）（カタログ番号＃Ａ−２７０７，シグマ  ケミカルズ、米国）及びダウコーニングメディカルアドヒーシブ（Dow Corning Medical Adhesive）（カタログ番号＃８９５−３，ダウコーニング、米国）のような市販物に見いだされ得る。
【００２０】
本発明により意図される外科手術装置は、単一使用の使い捨てか又は複数使用の再使用可能な外科手術装置を作成するのに適した金属及び／又はプラスチックから製造することができる。切断装置は、完全に丸いか又は平坦か又はその中間の切断歯を含んでよい。軟骨が相対的に柔らかい材料であるので、骨を損傷し得ることなく軟骨を作成することができる硬化プラスチックの刃先を製造することが有利かもしれない。そのような切断装置は、液体の投与のための開口、切断残渣及び液体の吸引除去、及び欠損部位の照明及び可視化のための繊維性光学糸を組込むように製造され得る。
【００２１】
別の態様において、本発明は、細胞２１及び接着剤２２を、（１）接着剤２２と細胞２１の混合物としてか又は（２）支持体マトリックス１８上で細胞２１と接着剤２２の一つ又は複数の交互の層として組み合わされて含む。
【００２２】
そのような一つの態様においては、細胞２１は欠損２３へ移植される自己軟骨細胞である。軟骨細胞２１は、均質か又は非均質に、支持体マトリックス１８への軟骨細胞／接着剤混合物の塗布の前に適切な接着剤２２により混合される。好ましくは、接着剤２２と軟骨細胞２１は、接着剤２２と細胞２１の支持体マトリックス１８への塗布、及び接着剤２２、細胞２１及び支持体マトリックス１８の組み合わせの欠損２３への移植の直前に（即ち、手術場面において）混合する。或いは、細胞２１と接着剤２２を別々に支持体マトリックス１８に一つ又は複数の層にて塗布する。一つの態様において、接着剤２２は生物適合性接着剤、例えばフィブリン接着剤であり、そしてより特定すれば自己のフィブリン接着剤又は非自己のフィブリン接着剤である。好ましくは、自己フィブリン接着剤を使用する。
【００２３】
軟骨細胞２１を支持体マトリックス２３上で接着剤２２と混合する場合、接着剤／軟骨細胞／支持体マトリックスの組み合わせを、欠損２３中へ、止血バリアー（本明細書に記載されたとおり）を骨１４と接着剤／軟骨細胞／支持体マトリックスの組み合わせの間に存在させるか又は存在させずに移植する。一つの態様においては、図２に示すとおり、処置された欠損２３は、骨１４と接着剤／軟骨細胞／支持体マトリックスの組み合わせの間に止血バリアーを含まない。
【００２４】
一つの態様においては、図７に示すとおり、本発明に従う同様な欠損２３の処置は、接着剤／軟骨細胞／支持体マトリックスの組み合わせと欠損２３の基部の間の止血バリアーの使用を伴わずに達成される。
【００２５】
付加的に、図７に示す態様においては、接着剤２２と軟骨細胞２１の組み合わせが支持体マトリックス１８の一部のみの上に存在する。例えば、接着剤２２と軟骨細胞２１は、好ましくは、支持体マトリックス１８の孔性の縁上のみである。或いは、軟骨細胞２１及び／又は接着剤２２は支持体マトリックス１８の孔性側面の外部の縁に、所望のレベル、例えば支持体マトリックス１８の深さの２から５０％まで浸透する。典型的には、支持体マトリックス１８の孔度は、粗い側面、即ち細胞２１と接着剤２２が被覆される側面に近似して最大であり、そして支持体マトリックス１８の反対の側面上のもっとも小さい孔度である。図７においてさらに示されるとおり、支持体マトリックス１８の孔度は陰で示され、暗い影は低い孔度を示し、そして明るい陰は大きな孔度を示す。
【００２６】
さらに別の態様において、軟骨細胞２１は、支持体マトリックス１８に塗布されて、次に、適切な生物適合性接着剤２２の層により覆われる。支持体マトリックス１８上の軟骨細胞２１の単層及び軟骨細胞２１上を覆って位置する接着剤２２の単層は欠損の有効な処置のために十分であるが、接着剤２２と軟骨細胞２１の１より多い交互の層を使用することができる。或いは、生物適合性接着剤２２の層を最初に支持体マトリックス１８上に被覆して、次に、接着剤２２上に軟骨細胞１の層を被覆することができる。
【００２７】
一つの態様において、支持体マトリックス１８は、軟骨細胞２１の生育を持続させることができ、且つその操作を促進するように移植可能な物品に物理的完全性を提供することができるシート状の部材である。一つの態様において、支持体マトリックス１８は、コラーゲンのようなポリペプチド又は蛋白質を含む。特定すれば、支持体又は１８は、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ及びチキンのコラーゲンを含む。付加的に、コラーゲンはタイプＩ又はタイプＩＩのコラーゲンのいずれかであり得る。適切なコラーゲン支持体マトリックス１８の例は、ＣｈｏｎｄｒａＧｉｄｅ（登録商標）及びＢｉｏＧｉｄｅ（登録商標）（市販のタイプＩコラーゲンマトリックスパッド；Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ，スイスより利用可能）である。付加的に、支持体マトリックス１８は可逆的に変形可能であって、上記のとおり孔性の粗い側面又は滑らかな側面又は２つの粗い側面のいずれかである。何れかの側面が孔性であり得るが、上記の一つの態様においては、粗い側面は滑らかな側面に比較して大きな孔度を有する。その上に配置される支持体マトリックス１８と細胞２１は、追加の生物適合性接着剤２２及び／又は一つ又は複数の生物適合性の吸収可能なピンにより欠損中の適所に任意に維持されることができ、図７に示すとおりである。
【００２８】
一つの態様において、支持体マトリックス１８の一つまたは複数の位置は固形であるか又はゲル様の特徴の何れかである。
本発明の特定の側面は、例示のためであって限定的することを意図しない以下の実施例により例示されるとおりに良好に認識される。
実施例１
自己移植軟骨又は軟骨細胞への血管の発生を予防するために本発明によりＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）が使用されるために、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を最初に固定剤、例えばアルデヒドにより処理した。簡単に言えば、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を０．６％のグルタルアルデヒドにより１分間処理し、そして数回洗浄することにより組織に毒性であるかもしれない残余のグルタルアルデヒドを除去した。或いは、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を、実施例２において記載された、グルタルアルデヒドによる処理の前に、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）と呼ばれるフィブリン接着剤により処理した。例えばグルタルアルデヒドのような固定剤により固定されて、滅菌生理食塩水（０．９％）により洗浄され、そして冷凍庫において保存されたＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は、１から２カ月溶解しないことがわかった。通常、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は７から１４日の間の期間で再吸収した（resorbed）。この時間はあまりに短いが、何故ならば移植された軟骨細胞が固形軟骨内に成長してその栄養要求性を隣の軟骨から得るよりも前に、それ自体骨構造から移植された軟骨内への血管の発生又は血管新生を阻害するのには長い時間が必要だからである。換言すれば、血管新生の十分な阻害は長時間、例えば１カ月を必要とする。よって、生成物はその時間の前に顕著に吸収されるべきではない。反して、再吸収が結局要求される。よって、阻害バリアーとして使用される有機材料はこれらの能力を有するであろうし、且つこの様式にて処理されたＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）はその機能を提供することがわかった。
実施例２
Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は、有機接着剤によってもコートされ、この実施例においては、接着剤がＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）であったが、その他も使用できる。他の如何なる止血バリアー又は血管阻害バリアーも使用できた。Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）を以下に記載のとおりに混合した。Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を次に、吸収される（soaked）までＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）材料をスプレーすることにより、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）でコートした。Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）（フィブリン接着剤）を次に室温において固形化させた。完全に固形化する直前に、コートされたＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を次に０．６％グルタルアルデヒド中に１分間入れて、次に滅菌生理（０．９％）食塩水により洗浄した。ｐＨを次にＰＢＳ及び／またはＮａＯＨにより、ｐＨが７．２から７．４にて安定化するまで調節した。のちに、そのようにして処理されたＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）を次に組織培養媒体、例えば必須最少媒体／Ｆ１２プラス１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファーにより洗浄した。
【００２９】
この実施例において前記のとおり、我々は、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）をフィブリン接着剤として使用してＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）をコートした。さらに、フィブリン接着剤（adhesive）又は接着剤（glue）も、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）がコートされる骨に対して損傷の底に直接塗布してよい。インビトロ試験の代りに使用されたインビトロ系は、細胞調査作業のためのＮＵＮＣＬＯＮ（商標）デルタ６−ウエル滅菌使い捨てプレート（ＮＵＮＣ，ＩｎｔｅｒＭｅｄ，Ｐｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）からなった。各ウエルの測定値は直径約４ｃｍである。
【００３０】
本発明においては、フィブリン接着剤を、ヒトに寛容であり得る接着剤を生じるフィブリン成分と共に如何なる接着剤でもあり得る（Ｉｈａｒａ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｒｎｓ  Ｉｎｃｌ．Ｔｈｅｒｍ．Ｉｎｊ．，１９８４，１０，３９６）。本発明は、フィブリン接着剤に代り使用可能な如何なる他の接着剤成分も予測する。この発明において、我々は、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）又はＴｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧ，Ｖｉｅｎｎａ，オーストリア）を使用した。Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）キットは以下の成分からなる：
−Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）、凍結乾燥され、ウイルス不活性化されたシーラー、その凝結可能蛋白質を含む；フィブリノーゲン、血漿フィブロネクチン（ＣＩＧ）及び因子ＸＩＩＩ、及びプラスミノーゲン；
−アプロチニン溶液（ウシ）；
−トロンビン４（ウシ）；
−トロンビン５００（ウシ）；及び
−塩化カルシウム溶液。
【００３１】
Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）キットはＤＵＰＬＯＪＥＣＴ（登録商標）アプリケーションシステムを含む。フィブリン接着剤又はＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）キットを用いる２成分密封剤は、Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧプロダクト挿入シートに従った次の様式において組み合わされる。
実施例３
軟骨細胞を、ＨＡＭ  Ｆ１２及びＦ１５  Ｈｅｐｅｓバッファー及び５から７．５％の自己血清を含む最少必須培養培地中で、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において生育させ、そしてＶｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ／Ｓ，Ｓｙｍｂｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ，コペンハーゲン、デンマークのクラス１００研究所において操作した。培養培地の他の組成物を軟骨細胞を培養するために使用してよい。細胞はトリプシンＥＤＴＡを用いて５から１０分間トリプシン処理し、そしてＢｕｒｌｅｒ−Ｔｕｒｋチャンバー中のトリパンブルー生存可能性染色を用いてカウントした。細胞のカウントをｍｌあたり７．５ｘ１０５細胞に調節した。一つのＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）プレートは、クラス１００研究所中でふたをとった（uncovered）。
【００３２】
Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）止血バリアーを、ＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）組織培養トレー中のウエルの底に適合する適当なサイズに切った。この場合に、約４ｃｍのサイズの円（しかし、あらゆる可能なサイズになり得た）を、細胞調査作業のためにＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）デルタ６−ウエル滅菌使い捨てプレート（ＮＵＮＣ，ＩｎｔｅｒＭｅｄ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）中のウエルの底に無菌状態で置いた。当該ウエルの底に入れられる止血バリアーは実施例１に記載される。この処理はＳｕｒｇｉｃｅｌの吸収を顕著に遅延させる。この止血バリアーを次に蒸留水中で数回洗浄して、続いて未反応のグルタルアルデヒドが洗い流されるまで数回洗浄した。血清を含む少量の細胞培養培地を止血培地内に吸収されるように塗布して、同時にウエルの底の止血培地をウエットに保った。
【００３３】
１ｍｌ培養培地中の約１０６細胞を直接止血培地の上部に置き、前記のとおりに０．４％のグルタルアルデヒドで予め処理した止血培地の表面に分散させた。当該プレートを次にＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて６０分間置いた。５から７．５％の血清を含む２から５ｍｌの量の組織培養培地を注意深く細胞を含むウエルに加え、培地を放出する際にウエルの側面にピペットのチップがわずかに触れるように支えることにより細胞を撒き散らした。培地のｐＨはとても低かった（ｐＨ〜６．８）。ｐＨを次に７．４から７．５に調節した。翌日、軟骨細胞を止血バリアー上で生育させ、密集して整列された。いくつかの細胞はｐＨ調節の前の低いｐＨへの暴露のために死んだ。プレートを、３から７日間、３日目に培地を代えてインキュベートした。
【００３４】
インキュベーション期間の終わりに、培地をデカントして、ジメチルアルシン酸の０．１Ｍナトリウム塩を含む冷たく凍らせた２．５％のグルタルアルデヒド（カコジル酸ナトリウムとも呼ばれ、ｐＨをＨＣｌにより７．４に合わせた）を、電子顕微鏡ののちの用意のため、細胞とサポーター（止血バリアー）の用意のための固定剤として加えた。
実施例４
軟骨細胞を、ＨＡＭ  Ｆ１２及び１５ｍＭのＨｅｐｅｓバッファー及び５から７．５％の自己血清を含む最少必須培養培地中でＣＯ２インキュベーターにて３７℃において生育させ、そしてＶｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ／Ｓ，Ｓｙｍｂｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ，コペンハーゲン、デンマークのクラス１００研究所において操作した。培養培地の他の組成物を軟骨細胞を培養するために使用してよい。細胞はトリプシンＥＤＴＡを用いて５から１０分間トリプシン処理し、そしてＢｕｒｌｅｒ−Ｔｕｒｋチャンバー中のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ生存可能性染色を用いてカウントした。細胞のカウントをｍｌあたり７．５ｘ１０５細胞に調節した。一つのＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）プレートは、クラス１００研究所中でふたをとった（uncovered）。
【００３５】
Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）（止血バリアーとしての使用のため）を０．６％のグルタルアルデヒドにより１分間、実施例１に記載されたとおりに処理し、そして０．９％滅菌塩化ナトリウム溶液又は好ましくはバッファー、例えばＰＢＳバッファー又は培養培地、例えばＭＥＭ／１２で洗浄したが、何故ならば、グルタルアルデヒド処理後のｐＨは６．８であり、好ましくは７．０から７．５であるべきだからである。Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）をＤＵＰＬＯＪＥＣＴ（登録商標）システムを用いてＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）の両側に塗布し、即ち、使用することが意図されるパッチ、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）の両側をフィブリン接着剤でコートした。接着剤は無菌状態下で少なくとも３から５分間放置する。「コートされた」止血バリアーを細胞調査作業のためにＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）デルタ６−ウエル滅菌使い捨てプレート（ＮＵＮＣ，ＩｎｔｅｒＭｅｄ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）中のウエルの底に置いた。血清を含む少量の組織培養培地を塗布して止血バリアーに吸収させた。１ｍｌ培養培地中の約１０６細胞を直接Ｈｅｍｏｓｔａｔの上部に置き、止血バリアーの表面全体を被覆した。プレートを次にＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて６０分間置いた。５から７．５％の血清を含む２から５ｍｌの量の組織培養培地を注意深く細胞を含むウエルに加え、培地を放出する際にウエルの側面にピペットのチップがわずかに触れるように支えることにより細胞を撒き散らした。３から６日後、顕微鏡検査は、細胞が満足の行く様式にてＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）に接着してその中へ生育したことを示したことから、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）は軟骨細胞に対して毒性を示さず、そして軟骨細胞は満足の行く様式にてＳｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）内に生育したことを示唆する。
【００３６】
プレートを、３から７日間、３日目に培地を代えてインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、培地をデカントして、カコジル酸ナトリウムとも呼ばれ、ｐＨをＨＣｌにより７．４に合わせた、ジメチルアルシン酸の０．１Ｍナトリウム塩を含む、冷たく凍らせた２．５％のグルタルアルデヒドを、電子顕微鏡ののちの用意のため、細胞とサポーター（止血バリアー）の用意のための固定剤として加えた。
実施例５
軟骨細胞を、ＨＡＭ  Ｆ１２及びＦ１５  Ｈｅｐｅｓバッファー及び５から７５％の自己血清を含む最少必須培養培地中で、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において生育させ、そしてＶｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ／Ｓ，Ｓｙｍｂｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ，コペンハーゲン、デンマークのクラス１００研究所において操作した。細胞はトリプシンＥＤＴＡを用いて５から１０分間トリプシン処理し、そしてＢｕｒｌｅｒ−Ｔｕｒｋチャンバー中のトリパンブルー生存可能性染色を用いてカウントした。細胞のカウントをｍｌあたり７．５ｘ１０５から２ｘ１０６細胞に調節した。一つのＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）プレートは、クラス１００研究所中でふたをとった（uncovered）。
【００３７】
培養された軟骨細胞が移植された関節の欠損エリアを覆うパッチ又は包帯として並びに止血バリアーとして使用される吸収可能な２層膜として、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）が使用できることを発見した。Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）は、規格化されて制御された製造プロセスにより得られる純粋なコラーゲン膜である（Ｅ．Ｄ．Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ  ＡＧ，ＣＨ−６１１０  Ｗｏｌｈｕｓｅｎにより）。当該コラーゲンは、獣医により証明されたブタから抽出されて、抗原性反応を回避するために注意深く精製され、そしてガンマ照射により二重ブリスター中で滅菌されている。上記の膜は、さらなる架橋結合又は化学処理を行わずにコラーゲンタイプＩ及びタイプＩＩから作成される。上記のコラーゲンは２４週以内に再吸収される。上記の膜は濡れた場合にも構造上の完全性を保持し、そして縫い糸又は鋲により固定することができる。上記の膜は、フィブリン接着剤、例えばＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）を用いて、隣りの軟骨又は組織へ、縫い糸の代りか又は縫い糸と共に接着してもよい。
【００３８】
Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）はクラス１００研究所においてふたをとり、そして細胞調査作業のために、２層膜の孔性表面を上にするか又は密な表面を上にして、ＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）デルタ６−ウエル滅菌使い捨てプレート（ＮＵＮＣ，ＩｎｔｅｒＭｅｄ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，デンマーク）中のウエルの底に無菌状態で置いた。１ｍｌ培養培地中の約１０６細胞を直接止血培地の上部に置き、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）の孔性表面又は密な表面の何れかの上に分散させた。次に、プレートをＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて６０分間置いた。５から７．５％の血清を含む２から５ｍｌの量の組織培養培地を注意深く細胞を含むウエルに加え、培地を放出する際にウエルの側面にピペットのチップがわずかに触れるように支えることにより細胞を撒き散らした。
【００３９】
２日目に、軟骨細胞をＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）を含むウエルの中に入れ、Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡により細胞を検査した。いくつかの軟骨細胞がＢｉｏ−Ｇｉｄｅの縁に接着したことが注目された。この顕微鏡によりＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）自身を通して観察することは当然不可能であった。
【００４０】
上記プレートを３から７日間、３日目に培地を代えてインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、培地をデカントして、カコジル酸ナトリウムとも呼ばれ、ｐＨをＨＣｌにより７．４に合わせた、ジメチルアルシン酸の０．１Ｍナトリウム塩を含む冷たく凍らせた２．５％のグルタルアルデヒドを、孔性表面又は密な表面上での何れかで培養された、細胞と細胞を伴うＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）サポーターの用意のための固定剤として加えた。Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）パッチは、Ｈｅｒｌｅｖ病院、デンマークの病理部門における電子顕微鏡検査のために送られた。
【００４１】
電子顕微鏡検査は、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）の密な表面上で培養された軟骨細胞がＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）のコラーゲン構造内に生育せず、一方孔性表面上で培養された細胞がコラーゲン構造内に本当に生育したことを示し、そしてさらにプロテオグリカンの存在を示し、繊維芽細胞の構造を示さなかった。この結果は、例えばＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）パッチとしてのコラーゲンパッチを軟骨の欠損を覆うパッチとして縫い付けた場合に、孔性表面は、培養された軟骨細胞が注入されるように、欠損に対して表を下にするべきであることを示す。それらは、次に、コラーゲン内に浸透して、完全な表面と調和して滑らかな軟骨表面を生成することが可能になり、そしてこのエリアにおいてプロテオグリカンの滑らかな層を構築することになる。一方、上記コラーゲンの密な表面を欠損に対して表が下になるようにすると、移植される軟骨細胞はコラーゲンに組込まれず、そして細胞は上記と同じ滑らかな表面を生成しない。
実施例６
軟骨細胞を、ＨＡＭ  Ｆ１２及びＦ１５  Ｈｅｐｅｓバッファー及び５から７．５％の自己血清を含む最少必須培養培地中で、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において生育させ、そしてＶｅｒｉｇｅｎ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ａ／Ｓ，Ｓｙｍｂｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ，コペンハーゲン、デンマークのクラス１００研究所において操作した。細胞はトリプシンＥＤＴＡを用いて５から１０分間トリプシン処理し、そしてＢｕｒｌｅｒ−Ｔｕｒｋチャンバー中のトリパンブルー生存可能性染色を用いてカウントした。細胞のカウントをｍｌあたり７．５ｘ１０５から２ｘ１０６細胞に調節した。一つのＮＵＮＣＬＯＮ（登録商標）プレートは、クラス１００研究所中でふたをとった（uncovered）。
【００４２】
インビトロにおいてこの特徴を試験するために、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）をＮＵＮＣＬＯＮ（商標名）プレートのウエルの底に塗布し、そして不完全に凝固するようにする。コラーゲンパッチ、例えばＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）を、次に、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）上に塗布し、そしてウエルの底に接着する。Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）とＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）のこの組み合わせは、軟骨細胞の移植エリアに血管が分化するか又は侵入するのを阻害又は予防する止血バリアーとなるようにデザインされる。このハイブリッドコラーゲンパッチは、今、損傷の底における止血バリアーとして（修復される表面にほとんど隣接）、並びに軟骨形成のための支持体のために使用することができるが、何故ならば遠位の表面はコラーゲンパッチの孔性側であることができ、即ち軟骨細胞と軟骨マトリックスの侵入を促進させるからである。即ち、このハイブリッドコラーゲンパッチは、移植された軟骨細胞及び上部を形成するバリアーに対して下に向けられたコラーゲン孔性表面により移植物の上部を覆うために使用することもできる。ハイブリッドコラーゲンパッチは、上昇したアプロチニン成分と共に、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）のような如何なる有機接着剤もなしに使用され、そして欠損内に直接置かれてよく、自然な力により接着する。即ち、コラーゲンパッチは、止血バリアーとして、及び修復／移植部位の細胞不含カバーリングの両方として使用することができ、パッチの孔性表面は移植された軟骨細胞／軟骨に対して配置される。別の変更は、タイプＩＩコラーゲンからなるコラーゲンパッチを使用する（即ち、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｓｏｈｎｅ  ＡＧ，ＣＨ−６１１０  Ｗｏｌｈｕｓｅｎ）。
【００４３】
即ち、本発明はハイブリッドコラーゲンパッチを提供するが、当該パッチは上昇したレベルのアプロチニン成分、好ましくは約２５，０００  ＫＩＵ／ｍｌを有機マトリックス接着剤と共に有するコラーゲンマトリックスであって、当該コラーゲン成分はＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）吸収可能２層材料又はタイプＩＩコラーゲンと類似しており、そして上記接着剤はＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）材料と類似している。別の態様において、上記ハイブリッドコラーゲンパッチは修復部位へ接着するのに如何なる有機接着剤も使用しない。
実施例７
骨関節炎症の軟骨の弱くなった構造のために、欠損した軟骨内の移植部位へ移植された培養された自己軟骨細胞の接着は阻害されるかもしれず、即ち、新たに移植された軟骨／軟骨細胞と周囲の確立された軟骨の間に境界的なゾーン（区分のゾーン）を創製する。この境界的ゾーンは、移植部位が直線様式にて切断されたまっすぐで滑らかな壁を創製することにより移植物のために移植部位が創製されるなら、もっとも明白になる。そのような境界的ゾーンを横切るような剪断力及び圧縮力（図３Ａに示されるような）は，移植部位が直線様式にて切断されるときに、移植物を無理に押しのけるような力を及ぼすことになる。この境界的ゾーン、及びこのゾーンに沿った材料の異なる動作（movement）は、移植された材料と周囲の材料の間の融合性の治癒を阻害することになる。多くの場合、移植材料は周囲の材料よりも柔らかいが、しかしながら、骨関節炎症疾患のいくつかの場合には、周囲の軟骨が事実移植された軟骨細胞／軟骨よりも柔らかくなるかもしれない。
【００４４】
従って、子の問題を解決するために、本発明の方法は、壁が非直線であるように移植部位の壁を作成するような外科手術装置の使用を教示し、即ち、起伏した表面を提供する。骨の表面に対して近位の部位の直径が骨の遠位の開口部よりも大きな直径であるように、そして軟骨の表面において移植部位を形成させることも可能である。しかしながら、好ましい態様は、ボルト又はねじを受けるねじを切った開口部と類似の様式にての移植部位の壁の形成を記載し（図３Ｂに示されるような）、即ち、「おねじ」及び「めねじ」のねじやまとして記載することのできる移植部位から移植された材料の圧縮及び又は放出に対する機械的耐性を提供する。
【００４５】
本発明により意図される外科手術装置は、一回使用の使い捨て又は複数回使用の再使用外科手術装置を作成するために適した金属及び／又はプラスチックから製造され得る。軟骨が相対的に柔らかい材料であるから、骨を損傷することなく軟骨を作成できる硬化プラスチックの刃（cutting edge）を製造することが有利かもしれない。そのような切断装置は、液体の投与（administration）、切断残渣及び液体の吸引除去、及び欠損部位の照明及び可視化のためのファイバー光学糸のための開口部を取り込むように製造することができる。上記装置の特定の態様において、装置の基部は移植部位内に装置を導いて配置させることを補助することになる、押し出し点（protruding point）又はピン様構造を有してよい。もちろん、そのようなピンは下にある骨に対する損傷を最少にするようにデザインされる。
【００４６】
上記装置の切断表面は単一のぎざぎざを付けるか又は複数のぎざぎざを付けるか又は金属部分にねじ穴を生じさせるように使用される金属タップにおけるもののように、ねじ様パターンであってよいが、切断装置に必要な特性は、移植部位の結果として作成された側面が起伏しており直線でないことである。例えば、特定の態様においては、装置の切断の縁を図４Ａ又は図４Ｂにおいて示されるようなものと類似なように成型することができる。刃は、平坦であるか、又は切断装置の直径をぐるりと巻きつけるような円形であってよい。移植された材料及び周囲の材料の上で、圧力及び剪断力に対して異なる反応に対する機械的耐性を提供する干渉を創製するよう、本発明の方法の目的を達成するように、多くの形態をデザインすることができる。
実施例８
４カ月齢の混血のヨークシャーブタを普通の麻酔に供してその背中に位置を決めた。ブタは、ハーリントン関節炎研究所センター、フェニックス、アリゾナにおいて、洗浄して、外科用スーツをかけた。全部の外科手術の処置は滅菌下で実施した。左後肢及び隣接の腹部及び鼠蹊部エリアをヨウ素により洗浄した。膝の関節を位置決定（localized）し、そして膝蓋を位置決定した。中央の切除を実施したが、膝蓋及びいくつかの皮下組織の後部、筋肉層及び靭帯の約３ｃｍを切除することにより、大腿部の関節丘に接近した。円形のカッターを用いることにより、中央の関節丘の中央部分の上の白色の軟骨中に損傷を入れ、関節丘（左関節丘、図６Ａ）の後部中央部分を覆う軟骨の縁に対して０．５から１ｃｍの境界を残した。０．５から１ｃｍの欠損を中央関節丘の尾部体重伝達部（weight bearing part）内に入れた。全外科手術処置は、左の大腿骨の止血帯なしに行った。別の層及び皮膚を適切に縫合した。
【００４７】
３日目に、動物を再び外科スーツに入れて、上記のとおりに手術用テーブル上に置いて、普通の麻酔を行った。上記のように、左後肢及び隣接の腹部及び鼠蹊部エリアをヨウ素により洗浄した。縫合を切って、エリアを開いた。膝の関節に中度の血腫が存在したことは注目すべきであった。血液クロットを除去して、欠損を調べた。欠損中に血液クロットが存在し、除去した。おねじの刃、損傷の周辺に相当するサイズ、又は損傷の周辺よりもわずかに大きなサイズにデザインされた滅菌外科手術装置を注意深く欠損にねじ込んだ。Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）パッドを欠損の底に等しいサイズに切った。Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａ−２７０７，シグマケミカルズ、米国）と呼ばれる、使用される第１の接着剤を形を整えた止血バリアーパッドの密な側面の上に塗布し、そしてパッドを密な側面が下になるように欠損の底に配置し、それを上記のとおりにバリアーとして使用した。この接着剤は極めて素早く乾燥しないらしいことがわかった。欠損の底からのわずかな出血が直後に止まった。第２のＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）を欠損の周囲よりもいくらか大きく切り、そして上記のとおりに密な側面を上にして配置した（即ち、孔性側面は移植物に対して下に）。
【００４８】
この非細胞カバーリングパッドを次に空洞上で縫合し、一方の縁が開くようにし、そこに移植される軟骨細胞が注射された。パッドの縁の周囲の部分は第２の接着剤、ダウコーニング医薬用接着剤Ｂ（カタログ番号８９５−３、ダウコーニング、米国）で覆った。第２の接着剤は第１の接着剤よりも早く乾燥してやや強力であった。この特別な処置の間、第１の接着剤は、キャップの縫合が試みられた場合に、所定の位置に止血バリアーを保持するのに十分なように乾燥しなかったことがわかった。即ち、移植部位の近位表面上に形成された主なバリアーは接着剤自身であった。
【００４９】
１ｍｌのシリンジ及び１６ゲージの針を用いることにより、軟骨細胞懸濁液（０．６ｍｌ）をシリンジの筒の中に吸引した。２３ゲージの短い針を上記の１６ゲージの針と代えて、細胞懸濁液を縫合カバーされたパッチの下で移植部位に注射した（約１０ｘ１０６細胞）。次に、キャップの開口部の縁を針を除去する前に接着し、そして針を注意深く抜いた。細胞の漏れは観察されなかった。創傷を縫合して、上記のとおり、止血帯を用いず、出欠は観察されなかった。最後の皮膚層を縫合した。縫合の後に皮膚の隆起は起こらず、血腫が存在しなかったことを示唆した。術後の回復も平穏無事であった。
【００５０】
予測されたとおり、移植された軟骨細胞は、試験したブタの膝の関節の人工の軟骨表面に作られた欠損を修復するのに十分な軟骨マトリックスを生じた。図６Ａはブタの膝のＭＲＩ画像であり、膝に創製された軟骨の欠損を示し（左の関節丘、中央の関節丘）、そして図６Ｂは欠損の修復を示す、処置の３カ月後の同じブタの膝のＭＲＩ画像を示す。
実施例９
本発明の方法を実施するために有用な成分を含むキットは、外科手術のセッティングにおいて発明の方法の便利な実施を可能にする。好ましい態様において、発明のキットは、外科手術の環境においての容易な使用に適した滅菌成分を含み、そして適切な止血バリアー、適切なカバーリングパッチ、及び必要ならば有機接着剤を提供する。発明のキットは、関節の接合点表面の欠損に移植されるべき自己軟骨細胞を保持するのに適した滅菌細胞不含マトリックス材料も提供してよい。一つの態様において、発明のキットは、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）止血バリアー及びＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）カバーリングパッチを含み、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）有機接着剤の適切なコーティングを伴い、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）とＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）は再吸収までの時間を増加させるための本発明の教示に従い処理されている。Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）が予めコートされる場合には、一つの態様において、Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）は再吸収までの時間を増加させるための追加のアプロチニンを追加される。
【００５１】
別の好ましい態様において、上記止血バリアーとカバーリングパッチは共に材料の再吸収までの時間を延長させるために処理された半透性のコラーゲンマトリックスである。あらゆる修復／移植処置が遭遇する固有の可変性及び唯一の状況のために要求されるとおりに適合される別の成分として増強された形態にてＴｉｓｓｅｅｌ（登録商標）接着剤を提供することもできる。
【００５２】
上記キットのさらなる態様は、上記実施例７において記載されたとおりの外科手術の装置を含むことになる。
当業者には、多くの変更及び／又は修飾が発明の精神及び範囲を逸脱すること無しに特定の態様において示された発明に対して広く記載されたものとしてなされてよいことを認識する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本発明は、本発明の特定の態様を例示する以下の図面を考察することにより、良好に理解されることになる。
【図１】図１Ａは、骨の典型的な組織化末端を示す図面である。典型的には、骨材料は、軟骨性キャップにより組織化表面上に覆われる（斜行並行線の陰影を付された）。
図１Ｂは、軟骨性キャップに対する欠損又は損傷が生じ（斜行並行線の陰影を付された）、そしてそのような欠損が直接処置されて、わずかに大きくなるか、又は処置前に外科処置により移植された材料を受容するように作成され得る例を示す。
図１Ｃは、止血バリアー（濃淡のない黒、１の番号を付された）が軟骨性キャップの欠損に置かれて、如何にして下にある骨から再生軟骨への血管化を阻害又は阻止するかを示す。欠損空洞に移植される軟骨細胞を、次に、止血バリアーの上部に重ねる。
【図２】図２は、欠損部位の全体にキャップ／パッチ又は包帯を形成するのに使用される細胞不含半透性材料（濃淡のない黒、２の番号を付された）により覆われた軟骨キャップ（斜行並行線の陰影を付されたエリア）中の処置された欠損（斜行並行線の陰影を付されたエリアの中のギャップ）を示す図面である。このキャップは適所に固定されるが、空洞の縁を健康な軟骨に抱合するか、さもなくば接着する（attached）。このキャップは、接着剤及び培養された軟骨細胞／軟骨移植物が置かれた接合点の欠損エリアを覆う。
【図３】図３Ａは、堅い軟骨及び柔らかい軟骨による圧力及び剪断力に対する異なる応答を境界の次のゾーンと共に示す一覧図である。
図３Ｂは、起伏する壁を有するように欠損が作成された後の移植部位を示す。
図３Ｃは、止血バリアー（１）、移植された材料（３）、及び細胞不含カバーリングパッチ（２）を関節の表面の軟骨内の適所に有する、作成された移植部位を例示する。
【図４】図４Ａは、切断歯（cutting teeth）（５）及び突き出し配置ピン（６）を示す、本発明の外科手術装置の一つの態様を示す。
図４Ｂは、本発明の外科手術装置の第２の態様を示す。
【図５】図５は、移植部位を作成した後の、堅い軟骨及び柔らかい軟骨による圧力及び剪断力に対する異なる応答を示す一覧図である。
【図６】図６Ａは、左の（中央）関節丘の軟骨の欠損を示すブタの膝のＭＲＩイメージである。
図６Ｂは、処置の３カ月後の同じブタの膝のＭＲＩイメージである。
【図７】図７は、孔性側面、軟骨性材料及び移植された材料の境界（３０）、軟骨（１０）、骨材料及び軟骨性材料境界（１２）、吸収可能なピン（２４）及び骨材料（１４）を有する支持体マトリックス（１８）上の移植細胞（２１）及び生物適合性接着剤（２２）の混合物を含む、止血バリアー無しの移植部位又は欠損（２３）を例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504576.tif 000035
2005504576.tif 000036
【国際調査報告】
2005504576.tif 000037