(57)【要約】ヒトβ−アミロイドペプチドに結合する新規タンパク質、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらのタンパク質を作製する方法が提供される。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いる診断、治療、およびスクリーニング法も提供される。トランスジェニック動物およびノックアウト動物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列の内在変種または当該内在変種の縮重変種を含んでいるポリヌクレオチド。
【請求項２】
スプライス変種をさらに含んでいる、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
アミノ酸２３７にて始まるＰＸＤＧＳモチーフを含んでいるβ−アミロイドペプチド結合（ＢＢＰ）タンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸を含んでいるタンパク質。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸６８〜アミノ酸２６９のアミノ酸を含んでいるタンパク質。
【請求項６】
受入番号ＡＴＣＣ９８６１７下に寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列を含んでいるタンパク質。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸１８５〜アミノ酸２１７のアミノ酸配列を含んでいるタンパク質。
【請求項８】
異種構造タンパク質またはペプチド配列に結合したＢＢＰ１を含んでいる融合タンパク質。
【請求項９】
ＢＢＰ１が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
サンプル中のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードしているポリヌクレオチドを測定するための方法であって、
（ａ）サンプルへ、当該ポリヌクレオチドに特異的なプローブを、当該プローブが当該ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下でハイブリダイズさせる工程；および、
（ｂ）サンプル中のポリヌクレオチドに対する当該プローブのハイブリダイゼーションを測定する工程
を含み、ここで、当該プローブは配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である２０個またはそれ以上の塩基対の領域を有する核酸配列を含む方法。
【請求項１１】
サンプル中のβ−アミロイドペプチド−結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードしているポリヌクレオチドを測定するための方法であって、
（ａ）当該ポリヌクレオチドに特異的なプローブをサンプルへと、当該プローブが当該ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件下にハイブリダイズさせる工程；および、
（ｂ）サンプル中での当該プローブのポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを測定する工程
を含み、ここで、当該プローブはＡＴＣＣ９８６１７またはＡＴＣＣ９８３９９のｃＤＮＡインサートのポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一である２０個またはそれ以上の塩基対の領域を有する核酸配列を含む方法。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
ＡＴＣＣ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１４】
ＢＢＰの細胞外領域に結合する抗体。
【請求項１５】
細胞外領域がＰＸＤＧＳモチーフを含む、請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
サンプル中の、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の領域を含んでいるポリペプチドを検出するための方法であって、
（ａ）サンプルと共に、当該ポリペプチドに特異的に結合する試薬を、特異的結合に効果的な条件下でインキュベートすること；および、
（ｂ）サンプル中での当該試薬の当該ポリペプチドへの結合を測定すること、
を含む方法。
【請求項１７】
サンプル中の、ＡＴＣＣ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列に対して配列が少なくとも９０％同一である領域を含んでいるポリペプチドを検出するための方法であって、
（ａ）サンプルと共に、当該ポリペプチドに特異的に結合する試薬を、特異的結合に効果的な条件下でインキュベートすること；および、
（ｂ）サンプル中での、該試薬の該ポリペプチドに対する結合を測定すること、
を含む方法。
【請求項１８】
ヒトβ−アミロイドペプチド（ＢＡＰ）の異常な発現により特徴づけられる疾患を診断する方法であって、
（ａ）ヒトβ−アミロイドペプチドの異常な発現を暗示するサンプルを、配列番号２のアミノ酸配列と少なくも９０％同一である領域を含んでいるポリペプチドを含む試薬と、該ヒトβ−アミロイドペプチドに対する該試薬の特異的結合に効果的な条件下でインキュベートすること、および、
（ｂ）サンプル中での、該試薬の該ヒトβ−アミロイドペプチドに対する結合を測定すること、
を含む方法。
【請求項１９】
ヒトβ−アミロイドペプチドの異常な発現により特徴づけられる疾患を診断する方法であって、
（ａ）ヒトβ−アミロイドペプチドの異常な発現を暗示するサンプルを、ＡＴＣＣ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列と少なくも９０％同一である領域を含んでいるポリペプチドを含む試薬と、該ヒトβ−アミロイドペプチドに対する該試薬の特異的結合に効果的な条件下でインキュベートすること、および、
（ｂ）サンプル中での、該試薬の該ヒトβ−アミロイドペプチドに対する結合を測定すること、
を含む方法。
【請求項２０】
宿主由来のサンプル中の請求項１記載のポリヌクレオチドの存在を分析することを含む診断方法。
【請求項２１】
β−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）試験化合物を含んでいる試験培地中にヒトβ−アミロイドペプチドを含んでいるサンプルと、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の領域を含んでいるポリペプチドを含む試薬を、ヒトβ−アミロイドペプチドに対する当該試薬の特異的結合に有効な条件下でインキュベートすること；
（ｂ）サンプル中の当該ペプチドに対する当該試薬の、当該試験化合物の存在および不在下での結合を比較すること；および、
（ｃ）工程（ｂ）における、β−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する試験化合物に対する結合間の差を関連づけること、
を含む方法。
【請求項２２】
β−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する化合物を同定するための方法であって、
（ａ）試験化合物およびＡＴＣＣ９８６１７のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の領域を含んでいるポリペプチドを含む試薬を含んでいる試験培地中にヒトβ−アミロイドペプチドを含んでいるサンプルを、ヒトβ−アミロイドペプチドに対する当該試薬の特異的結合に効果的な条件下でインキュベートすること；
（ｂ）サンプル中の当該ペプチドに対する当該試薬の、当該試験化合物の存在および不在下での結合を比較すること；および、
（ｃ）工程（ｂ）における、β−アミロイドペプチド結合タンパク質の活性を調節する試験化合物に対する結合間の差を関連づけること、
を含む方法。
【請求項２３】
脳におけるβ−アミロイドペプチドの蓄積を阻害する必要を有する患者の治療のための、ＢＢＰ１の治療有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項２４】
治療の必要を有する患者の治療のための、ＢＢＰ１の細胞外部分に結合する抗体の治療有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項２５】
配列番号１のポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドの縮重変種を含む、トランスジェニックまたはキメラ非ヒト動物。
【請求項２６】
トランスジーンが調節可能な発現システムのコントロール下にある、請求項２５記載の動物。
【請求項２７】
ＢＢＰ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子が機能的に破壊されている、ノックアウト非ヒト動物。
【請求項２８】
ＢＢＰ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子がＣｒｅ遺伝子の導入により機能的に破壊され得るノックアウト非ヒト動物。
【請求項２９】
Ｃｒｅ遺伝子が組織特異的プロモーターのコントロール下にある、請求項２８記載のノックアウト非ヒト動物。
【請求項３０】
Ｃｒｅ遺伝子が発生特異的プロモーターのコントロール下にある、請求項２８記載のノックアウト非ヒト動物。
【請求項３１】
Ｃｒｅ遺伝子が誘導性プロモーターのコントロール下にある、請求項２８記載のノックアウト非ヒト動物。
【請求項３２】
ＢＢＰ１遺伝子の部分に相補的な二本鎖の、約６００塩基対を含むリボ核酸を細胞に提供することを含む、ＢＢＰ１遺伝子の発現を阻害する方法。
【請求項３３】
細胞におけるＢＢＰ１遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞にアンチセンス核酸を提供することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９８年１０月１４日に出願された米国出願番号第０９／１７２９９０、１９９８年４月１５日に出願された米国出願番号第０９／０６０６０９号、今や放棄された、１９９７年４月１６日に出願された米国仮出願６０／０６４５８３号、１９９９年１０月１３日に出願された係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２１６２１、および１９９８年１０月１３日に出願された米国仮出願第６０／１０４１０４号に部分的に継続するものであり、これらの内容は出典明示により本出願中に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新規ポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびタンパク質に関する治療、診断、および研究上の利用性に関する。特に、本発明は、ポリヌクレオチド、およびアルツハイマー病に関連するアミロイド沈着の主成分の一つ、β−アミロイドペプチドに結合するこのようなポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に関する。
【０００３】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳の構造異常のシリーズにより特徴づけられる老人の進行性痴呆性疾患である。中枢神経系（ＣＮＳ）の複数の領域におけるニューロンが機能不全となり、そして死亡し、シナプスの入力の変異を生じる。これらの脆弱なニューロンの細胞体および隣接樹状突起は、一対の螺旋状フラグメント（その主成分は、タウと呼ばれるリン酸化された微小管結合タンパク質である）から成る神経原繊維変化を含む。疾患の顕著な特徴の一つは、老人性（神経炎性）プラークと呼ばれる脳内沈積物を含んでいるアミロイドの蓄積である。アミロイドプラークの主成分は、ＡＤの進行中に密な集塊を形成するβ−アミロイドペプチド（以下「ＢＡＰ」と、さらに文献中ではＡβ、βＡＰなどとも呼ばれる）である。
【０００４】
ＢＡＰは、アミロイドプレカーサータンパク質（以下、「ＡＰＰ」）のタンパク質分解により誘導され、およびＡＰＰの膜貫通ドメインおよび内腔／細胞外ドメインの部分から成る３９−４３個のアミノ酸ペプチドである。４２個のアミノ酸から成るＢＡＰペプチド（ＢＡＰ４２）は、潜在的にヒトにおいてより毒性の凝集形態であると考えられる。ＡＰＰはいくつかのＢＡＰ含有異性体として生じる。主な形態は、６９５個、７５１個、および７７０個のアミノ酸から成り、後者の２つのＡＰＰはクニッツセリンプロテアーゼインヒビターと構造および機能上の相同性を有するドメインを含む。正常な個人においては、ＢＡＰは蓄積せず、循環している体液から迅速に除去される。しかし、ペプチドはジストロフィーの樹状突起および軸索、神経膠細胞、および反応性星状細胞の表面においてプラークを形成し得る。神経炎性プラークにおけるＢＡＰの凝集および蓄積は、ＡＤのイニシエーション現象の１つと仮定される。ＢＡＰの発現および因果関係に通ずる現象、およびＡＤにおけるその個々の役割に関する研究に、神経科学研究の主要な焦点があてられている。特に、ＢＡＰに結合するタンパク質の発見は、疾患の病因の理解を深めるのに、および新規な治療標的を潜在的に導くのに重要である。
本発明以前においては、ヒトＢＡＰと結合する、およびＡＤにおけるＢＡＰの生物学的効果に関与する可能性のあるタンパク質およびそのフラグメントは同定されていない。
【０００５】
発明の概要
本発明により、ヒトβ−アミロイドペプチド（ＢＡＰ）アミノ酸配列に選択的に結合する、遺伝子産物をコードする新規単離ポリヌクレオチドが提供される。
１つの具体例において、本発明により、以下の群から選択される単離ポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）受入番号ＡＴＣＣ９８６１７の下に寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
【０００６】
（ｃ）受入番号ＡＴＣＣ９８６１７の下に寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードしているポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列ヌクレオチド２０２〜ヌクレオチド８０７を含んでいるポリヌクレオチド；
（ｅ）受入番号ＡＴＣＣ９８３９９の下に寄託されたクローンｐＥＫ１９６のβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
【０００７】
（ｆ）受入番号ＡＴＣＣ９８３９９の下に寄託されたクローンｐＥＫ１９６のｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードしているポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列を含んでいるタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；
【０００８】
（ｈ）ヒトβ−アミロイドペプチド結合活性を有する配列番号２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでいるタンパク質をコードしているポリヌクレオチド、ここで該フラグメントは配列番号２のアミノ酸６８〜アミノ酸２６９のアミノ酸配列を含んでいる；
（ｉ）前記（ａ）−（ｆ）のポリヌクレオチドの対立変種であるポリヌクレオチド；
【０００９】
（ｊ）前記（ｇ）−（ｉ）のタンパク質の種相同物をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）（ａ）−（ｈ）に指定されるポリヌクレオチドのいずれか１つにストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド。
【００１０】
好ましくは、そのようなポリヌクレオチドは配列番号１のヌクレオチド配列；受入番号ＡＴＣＣ９８６１７下に寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのβ−アミロイドペプチド−結合タンパク質（ＢＢＰ）のヌクレオチド配列；または受入番号ＡＴＣＣ９８６１７下に寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるβ−アミロイドペプチド−結合タンパク質（ＢＢＰ）をコードしているポリヌクレオチドを含む。他の具体例により、配列番号１のｃＤＮＡ配列に対応している遺伝子が提供される。
【００１１】
他の具体例において、本発明により、タンパク質を含んでいる組成物が提供されるが、ここで、該タンパク質は、以下の（ａ）〜（ｄ）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列アミノ酸６８〜アミノ酸２６９；
（ｃ）受入番号ＡＴＣＣ９８６１７の下に寄託されたクローンＢＢＰ１−ｆｌのｃＤＮＡインサートによりコードされるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列アミノ酸１８５〜アミノ酸２１７を含む配列番号２のアミノ酸配列のフラグメント。
【００１２】
好ましくは、そのようなタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列アミノ酸６８〜アミノ酸２６９を含む。融合タンパク質も本発明において権利主張される。
所定の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは発現コントロール配列に作用的に結合している。本発明により、そのようなポリヌクレオチド組成物で形質転換された細菌、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞を含んでいる宿主細胞も提供される。
【００１３】
（ａ）適当な培養培地にて請求項３記載の培養宿主細胞を増殖させること；および（ｂ）培養培地からタンパク質を精製することを含む、ＢＢＰを製造するための方法も提供される。
そのようなＢＢＰと特異的に反応する抗体を含む組成物も、本発明により提供される。
ヒトのＢＡＰの異常な発現により特徴づけられる疾患を検出するための方法および診断方法、ならびに、ＢＢＰの活性を調節する化合物を同定するための方法が提供される。
【００１４】
本発明の他の具体例には、発現コントロール配列に作用的に結合したＢＢＰをコードしているポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物が含まれる。
本発明のさらなる具体例により、ＢＢＰ１遺伝子が機能的に破壊されたノックアウト動物が提供される。本発明はさらに、ＢＢＰ１遺伝子が一時的または組織特異的様式で破壊された、またはＢＢＰ１の破壊を外部刺激により誘導することができるコンディショナルノックアウト動物に関する。
【００１５】
図面の簡単な記載
以下の図は、本発明の所定の具体例を示す。それらは単なる例示であって、それ以外の本明細書中に開示される発明を制限するものではない。
図１は、酵母２−ハイブリッドスクリーン設計を示す。ＢＡＰ４２（ＢＡＰＢＤ；ＴＲＰ１マーカーを含んでいるプラスミド）および非融合ＢＡＰ４２（ＢＡＰ；ＵＲＡ３マーカーを含んでいるプラスミド）に融合したＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを発現しているＹ２Ｈ宿主細胞を、Ｇａｌ４活性化ドメイン融合タンパク質（非公知ＡＤ）を発現しているＹ２Ｈヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（ＬＥＵ２マーカーを含んでいるプラスミド）で記載のごとく形質転換した。従って、株は、指定のタンパク質を発現している、円で示した３つのエピソームプラスミドを含んだ。ポジティブなタンパク質−タンパク質相互作用により、上流の活性化配列（ＧＡＬＵＡＳ）にてＧａｌ４活性が再構成され、それにより、レポーター遺伝子ＨＩＳ３の転写が誘導される。
【００１６】
図２は、ｐＢＢＰでの細胞のトランスフェクションにより、Ａβでの処置に際しての増加した細胞のロスを生じることを示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ベクターまたはｐＢＢＰでトランスフェクトした。サンプルを４８時間１０Ｍの成熟Ａβで処置し、次いで非処置の対照サンプルと比較した細胞の生存率を評価した。値は、３つの別個の実験の標準エラーを有する平均を示す。星はＰ＜０．０１（ｔ−試験）を示す。
【００１７】
図３は、ｐＢＢＰでトランスフェクトされた細胞におけるＡβ−誘導性のアポトーシスがＧタンパク質により変換されることを示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ｐＥＧＦＰ＋ｐＢＢＰまたはｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅ発現プラスミドでトランスフェクトした。サンプルを１０ＭのＡβにて処理し、核の形態を、テキストに記載のごとくトランスフェクトした（ＥＧＦＰ＋）細胞において評価した。１つのｐＢＢＰサンプルを１００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒（ＰＴＸ）で同時に処置し、標識づけたｐＢＢＰ＋ＰＴＸの値を得た。値は、＞１００ＥＧＦＰ＋細胞の２倍サンプルの標準偏差を有する平均である。星は、ベクターに対するｐＢＢＰの有意な（Ｐ＜０．０１；Yates Ｇ−試験）の効果を示す。
【００１８】
図４は、Ａβに対するＢＢＰ−媒介性の反応がカスパーゼ依存性であることを示す。Ｎｔ２幹細胞をｐＥＧＦＰ＋ベクターまたはｐＢＢＰでトランスフェクトし、次いで１０ＭのＡβで処置した。二倍のｐＢＢＰサンプルをさらに、２５ＭのＢＯＡ−Ａｓｐ（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン（ＢＡＦ）、非特異的カスパーゼインヒビターで処理した。
【００１９】
図５は、Ａβに対するＢＢＰ−特異的アポトーシス反応が、成熟（即ち、集合した）ヒトペプチドに関して選択的であることを示す。Ｎｔ２幹細胞をｐＥＧＦＰ＋ベクターまたはｐＢＢＰでトランスフェクトした。サンプルを４８時間１０Ｍの指定のペプチドで処置し、核の形態を試験した。
【００２０】
図６は、一時トランスフェクションアッセイを示し、ＢＢＰ−Ｒ＞Ｅ変種がドミナントネガティブ式に作用して野生型タンパク質の活性を抑制することを示す。Ｎｔ２幹細胞を指定のＤＮＡ混合物でトランスフェクトして、トータルのＤＮＡ濃度を一定に（１．６５μｇ）に維持した。２倍のサンプルを１０ＭのＡβにて処置し、アポトーシス核に関してスコアした。ｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅの不在下でのｐＢＢＰのトランスフェクションにより、ベクターコントロールに対して有意な（Ｐ＜０．０１）アポトーシスの誘導を生じた。二重トランスフェクトサンプルにおいて、ｐＢＢＰ単独に対するｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅの一定（Ｎ＝５）および有意な（Ｐ＜０．０１）ドミナントネガティブな効果があった。ｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅ単独に対するｐＢＢＰ＋ｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅ二重トランスフェクションの中間値は統計学的に有意ではなかった（Ｐ＞０・０５；Yates G-試験）。
【００２１】
図７は、ＢＢＰ／ＢＬＰ翻訳産物の配列比較を示す。ヒト、マウス、およびドロソフィラ メラノガスター（ハエ）のアミノ酸配列、ＢＢＰ、ＢＬＰ１およびＢＬＰ２タンパク質をＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを用いて整列化した。ハエのＢＬＰ２タンパク質を、アーモンドエックス(almondexamx)(amx;受入ＡＦ２１７７９７）として試験的に同定した。ダッシュにより示すＧａｐを導入して整列を最適化した。サブタイプ内で共通するアミノ酸を影にする。全タンパク質に不変のアミノ酸を矢印により示す。予測される膜貫通ドメイン（ｔｍ１およびｔｍ２）を示す。星は翻訳終結を示す。
【００２２】
図８は、７−ｔｍドメインＧタンパク結合レセプターとのＢＢＰタンパク質の予測されるトポロジーの比較を示す。ＢＢＰの２つのｔｍドメインは、ＧＰＣＲのｔｍドメイン３および４に対応する。
【００２３】
図９は、スプライス変異を有するＢＢＰ１アンプリコンならびにアミノ酸２１７からストップコドンの部分配列を示す。
図１０は、ＢＢＰ１ＰＸＤＧＳモチーフにおけるアスパラギン酸の変異がプロ−および抗−アポトーシス活性を分かつことの分析を示す。ＳＹ５Ｙ（トップパネル）またはＮｔ２幹細胞（ボトムパネル）を指定の発現プラスミドでトランスフェクトし、Ａ[ＢＥＴＡ]にて４８時間（左のパネル）またはスタウロスポリン（ＳＴＳ）にて３時間（右のパネル）で処置した。２倍のサンプルを固定し、核色素Hoechst33342にて染色した。トランスフェクトした細胞の核の形態を蛍光顕微鏡により盲検的にスコアした。各値は標準偏差を有する平均を示す。各カウントは、少なくとも１００個の細胞から成った。
【００２４】
図１１は、指定される個々のエキソン開始および停止部位を有するＢＢＰ１遺伝子のゲノム構造を示す。
図１２は、内在ネズミ遺伝子ＢＢＰ１遺伝子、ＢＢＰ１ターゲッティング構築物、および内在ＢＢＰ１遺伝子とＢＢＰ１ターゲッティング構築物の間の相同組換えにより作製される変異ＢＢＰ１対立遺伝子を図示したものである。
図１３は、挿入後のコンディショナルノックアウト構築物の図を示す。アスタリスクは、除去されるべきエキソンを示し、三角は挿入されたLox部位を示す。
【００２５】
発明の詳細な記載
本発明は、ヒトβ−アミロイドペプチド結合タンパク質（ＢＢＰ１）の単離およびクローニングに関する。ＢＢＰ１は、融合タンパク質として酵母２ハイブリッドアッセイにおいて、ＢＡＰ、特にＢＡＰの４２アミノ酸フラグメント（ＢＡＰ４２）に対して結合しているとして特徴づけられている。ＢＢＰ１の発現はヒト組織において、および特定の脳領域において示されている。重要なことに、ＢＢＰ１はヒトＢＡＰに選択的に結合することが酵母２ハイブリッドシステムにおいて齧歯動物のＢＡＰと比較して立証された。これらの所見は、本発明のＢＢＰ１をアルツハイマー病の診断および治療に用い得るという仮定を支持する。
【００２６】
ＢＢＰ１コーディング配列
最初のヒトＢＢＰ１クローン（指定クローン１４）は、ＢＡＰの潜在的により毒性の形態であるヒトＢＡＰ４２と相互作用するタンパク質を同定するべく開発された酵母２−ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）遺伝子スクリーンを用いることにより得られた。ＢＡＰ４２は酵母Ｇａｌ４ＤＮＡ−結合ドメインに融合して発現され、および遊離ペプチドとしても発現された（図１）。この株をヒトの胎児脳ｃＤＮＡＹ２Ｈライブラリーで形質転換した。約１０６個の独立の形質変換体からの単一クローン、指定＃１４は、一定のレポーター遺伝子の活性化を生じ、ＧＡＬ４ドメインのものに続く実質的なオープンリーディングフレームを含んだ。ｃＤＮＡインサートは９８４塩基対から成り、ポリ−Ａ領域にて終結する。この配列は、細胞膜を貫通するのに十分な長さおよび疎水性の２つの領域を有する２０１個のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸６８〜アミノ酸２６９）をコードした。潜在的アスパラギン結合グルコシル化部位も存在する。クローン１４は指定クローンＰＥＫ１９６であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209に１９９７年４月９日に寄託され、受入番号98399号として指定された。全寄託は本明細書中、ＡＴＣＣにおける寄託を意味し、全てのそのような寄託は特許手続上微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の約定下、および本出願から授与されるいずれかの特許の発行日現在、公にそれらを入手可能なものとする条件下に維持される。
【００２７】
ライブラリー由来のプラスミドをクローン１４から単離し、Ｙ２Ｈアッセイ株を再構築するのに用いた。これらの株の試験により、ＢＡＰ融合タンパク質がクローン１４タンパク質と、反応は弱いが、特異的に相互作用することが示された。膜貫通領域などの強い疎水性のタンパク質ドメインはＹ２Ｈ反応を阻害するので、クローン１４インサートを切断して（ＢＢＰ１Δｔｍ；更なる記載に関する以下の表２を参照されたい）、強い疎水性の領域を除去し、ＢＡＰとの相互作用に関して再度試験した。よりいっそう強いＹ２Ｈ反応が、ＢＢＰ１Δｔｍを用いて認められ、欠失された配列が潜在的な膜貫通（「ｔｍ」）アンカーをコードするという所見を指示する。クローン１４により、融合タンパク質の形態の新規なＢＡＰ結合タンパク質が同定される。
【００２８】
クローン１４に含まれるＢＢＰ１ｃＤＮＡ配列は、潜在的な開始メチオニンコドンが存在しないので、タンパク質コーディング領域の５’末端を欠くとして同定された。標準的なリバース−トランスクリプターゼのみを用いる常套の５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）での複数回の試みにより、２７個のヌクレオチドの付加を生じた。つまり、以下の実施例２に記載するゲノムクローニングアプローチを用いて、５’末端を単離した。
【００２９】
５’コーディング配列末端はゲノムライブラリーから得たので、この領域がイントロンを含む可能性があった。この可能性を、以下の実施例２に記載する２つの方法により調べた。生じたデータにより、（ゲノムおよびｃＤＮＡ配列両方から）上流配列およびこの領域におけるイントロンの欠如が確認された。全長のＢＢＰ１タンパク質コーディング領域をコードしているｃＤＮＡインサートを含んでいるプラスミドＢＢＰ１−ｆｌを、１９９７年１２月１１日に受入番号９８６１７にてアメリカ タイプ カルチャー コレクションに寄託した。全コーディング領域および推定タンパク質配列を、配列番号１および２に示す。３’非翻訳ヌクレオチド配列が、元のクローン１４（ｐＥＫ１９６）に含まれる。
【００３０】
本発明に従い、ＢＢＰ１、そのフラグメント、融合タンパク質、または機能同等物をコードするヌクレオチド配列を用いて、ＢＢＰ１または機能活性ペプチドの発現を指向する組換えＤＮＡ分子を適当な宿主細胞中で作製し得る。別法として、ＢＢＰ１配列の部分にハイブリダイズするヌクレオチド配列を核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロットアッセイなどに用いてよい。
【００３１】
本発明はさらに、本明細書中に開示するポリヌクレオチドの配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを含む。
本発明はさらに、低いストリンジェンシー条件下、より好ましくはスリンジェント条件下、および最も好ましくは高ストリンジェント条件下で、本明細書中に記載するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む。
【００３２】
ストリンジェンシー条件の例を、以下の表に示す：高ストリンジェント条件は、例えば条件Ａ−Ｆと少なくとも同程度にストリンジェントであるもの；ストリンジェント条件は、例えば、条件Ｇ−Ｌと少なくとも同程度にストリンジェントである；および低ストリンジェント条件は、例えば、条件Ｍ−Ｒと少なくとも同程度にストリンジェントである。
【００３３】
【表１】
2005506831.tif 000002
【００３４】
(bp)'：ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドのハイブリダイズ領域に対して予想されたものである。未知の配列の標的ポリヌクレオチドに対してポリヌクレオチドをハイブリダイズする場合、ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドの長さと仮定される。公知の配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは、ポリヌクレオチドの配列を並べ、ついで最適の配列相補性の領域（複数も）を同定することにより決定することができる。
バッファーＨ：ハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーにおいて、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）をＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）に置きかえることができる。洗浄はハイブリダイゼーション完了後１５分間行う。
ＴＢ＊〜ＴＲ＊：５０塩基対長未満であると予想されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点（Ｔｍ）より５−１０ＥＣ低く、ここで、Ｔｍは以下の等式に従い決定される。１８塩基対長未満のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（ＥＣ）＝２（＃Ａ＋Ｔ塩基）＋４（＃Ｇ＋Ｃ塩基）。１８〜４９塩基対長のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（ＥＣ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０[Ｎａ＋]）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここでＮはハイブリッド中の塩基の数であり、および[Ｎａ＋]は、ハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣに対する[Ｎａ＋]＝０．１６５Ｍ）。
【００３５】
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件のさらなる例は、出典明示により以下に組み込むSambrook et モレキュラークローニング(Molecular Cloning):  研究室マニュアル(A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, チャプター 9 および 11、およびAusubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, eds., John Wiley & Sons, Inc., セクション 2.10 および 6.3-6.4に提供される。
【００３６】
好ましくは、それぞれのそのようなハイブリダイズしているポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズするところの本発明のポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、および最も好ましくは少なくとも７５％）の長さを有し、それがハイブリダイズするところの本発明のポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９０％、または９５％の同一性）を有する。ここで配列同一性は、オーバーラップを最大にし、一方で配列のギャップを最小にするように並べた場合に、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドの配列を比較することにより決定する。
【００３７】
ＢＢＰ１の発現
本発明の単離ポリヌクレオチドは、Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991)に開示されているｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターなどの発現コントロール配列に、タンパク質を組換え産生するために作用的に結合されてよい。多くの適当な発現コントロール配列が当該分野で公知である。組換えタンパク質を発現させる一般的な方法も公知であり、R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990)に例示されている。本明細書中に規定される「作用的に結合する」は、本発明の単離ポリヌクレオチドおよび発現コントロール配列が、ライゲートポリヌクレオチド／発現コントロール配列で形質転換した（トランスフェクトした）宿主細胞により発現されるように、ベクターまたは細胞内に位置づけられていることを意味する。
【００３８】
多くの細胞のタイプが、タンパク質の発現のための適当な宿主細胞として働き得る。哺乳動物の宿主細胞には、例えば、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトcolo２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養物から誘導された細胞株、一次エクスプラント、ヒーラー細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはジャーカット細胞が含まれる。
【００３９】
別法として、酵母などの下等真核生物、または細菌などの原核生物においてタンパク質を産生させることも可能であり得る。潜在的に適当な酵母宿主には、サッカロマイセス セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロマイセス株(Kluyveromyces strain)、カンジダ(Candida)、または異種構造タンパク質を発現することができるあらゆる酵母株が含まれる。潜在的に適当な細菌株には、エシェリキア コリ(Escherichia coli)、バチラス サブチリス(Bacillus subtilis)、サルモネラ チフィムリアム(Salmonella typhimurium)、または異種構造タンパク質を発現することができるあらゆる細菌株が含まれる。タンパク質が酵母または細菌中で作製される場合、その中で作製されるタンパク質を、機能タンパク質を得るために例えば、適当な部位のリン酸化またはグリコシル化により変更することが必要となり得る。そのような共有結合は、公知の化学または酵素法を用いて達成されてよい。
【００４０】
タンパク質は、１またはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適当なコントロール配列に本発明の単離ポリヌクレオチドを作用的に結合させることにより、および昆虫発現システムを用いることにより作製されてもよい。バキュロウイルス／昆虫細胞発現システムに関する材料および方法は、例えばInvitrogen, San Diego, California, U.S.A.からのキット形態(MaxBac7キット）にて市場入手可能であり、そのような方法は、本明細書中に出典明示により組み込むSummers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)に記載されているごとく、当該分野で周知である。本明細書中に用いられるように、本発明のポリヌクレオチドを発現することができる昆虫細胞は、「形質転換」される。
【００４１】
本発明のタンパク質は、組換えタンパク質を発現するのに適した培養条件下に形質転換宿主細胞を培養することにより調製されてよい。生じた発現タンパク質を次いでそのような培養物から（即ち、培養培地または細胞抽出物）から、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーなどの公知の精製方法を用いて精製してよい。タンパク質の精製には、タンパク質に結合する試薬を含んでいるアフィニティカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール７またはチバクロムブルー３ＧＡセファロース７などのアフィニティ樹脂などのに対する１またはそれ以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルなどの樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーが関与する１またはそれ以上の工程；または免疫アフィニティクロマトグラフィーも含まれてよい。
【００４２】
別法として、本発明のタンパク質は、精製を促進する形態で発現されてもよい。例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）の融合タンパク質のように、融合タンパク質として発現されてもよい。そのような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、New England BioLab (Beverly, MA)、Pharmacia (Piscataway, NJ)およびInVitrogenからそれぞれ市場入手可能である。タンパク質は、エピトープでタグ付けされ、次いでそのようなエピトープに対して指向される特異的抗体を用いることにより精製することもできる。１つのそのようなエピトープ（「フラッグ」）が、Kodak (New Haven, CT)より市場入手可能である。
【００４３】
最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる逆相高処理液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いてタンパク質をさらに精製することができる。前記精製工程のいくつかまたは全てを組み合わせて用いて、実質上均一の単離組換えタンパク質を提供することもできる。こうして精製されたタンパク質は実質上他の哺乳動物タンパク質から遊離しており、「単離タンパク質」として本発明に従い規定される。
【００４４】
本発明のタンパク質は、トランスジェニック動物の産物として、例えばタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる体細胞または生殖細胞により特徴づけられるトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジのミルクの成分として発現されてもよい。本発明の実施例１３は、ヒトＢＢＰ１がニューロンにて発現されるトランスジェニックマウスの作製を記載する。
【００４５】
タンパク質は公知の常套の化学合成により作製されてもよい。合成手段により本発明のタンパク質を構築するための方法は、当業者に公知である。合成により構築されたタンパク質配列は、タンパク質と一次、二次、または三次構造および／または構造特徴を共有することにより、それと共通の、タンパク質活性を含む生物学的特性を有してよい。つまり、それらは、治療化合物のスクリーニングに、および抗体の開発のための免疫学的方法において、天然の精製タンパク質に対して生物活性のあるまたは免疫学的な置換物として用いられてもよい。
【００４６】
本明細書中に提供されるタンパク質には、精製タンパク質のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列により特徴付けられるが、それに対する変更が天然になされもしくは意図的に操作されたタンパク質も含まれる。例えば、ペプチドまたはＤＮＡ配列における変更は、当業者により公知の方法を用いてなされ得る。タンパク質配列における重要な変更には、コーディング配列における選択されたアミノ酸残基の変更、置換、置き換え、挿入または欠失が含まれてよい。例えば、システイン残基の１つまたはそれ以上を欠失させ、または他のアミノ酸と置き換えて、分子の配置を変更してよい。そのような変更、置換、置き換え、挿入または欠失のための方法は、当業者に周知である（例えば、USP No. 4,518,584を参照されたい）。好ましくは、そのようは変更、置換、置き換え、挿入または欠失は、タンパク質の所望の活性を維持する。
【００４７】
全体的または部分的にタンパク質活性を維持していることが予想され、従って、スクリーニングまたは他の免疫学的方法に有用であり得るタンパク質配列の他のフラグメントおよび誘導体が、本明細書中の開示が与えられる場合に当業者により容易に作製され得る。そのような変更は、本発明により包含されると考えられる。
【００４８】
ＢＢＰ１の発現の阻害
前記のＢＢＰ１タンパク質をコードしている核酸分子に加えて、本発明の他の側面は、それに対してアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードしている「センス」核酸に相補的な、例えば二本鎖ｃＤＮＡのコーディング鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列が含まれる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、全ＢＢＰ１コーディング鎖に、またはそのフラグメントのみに相補的であり得る。１つの具体例において、アンチセンス核酸分子はＢＢＰ１タンパク質をコードしているヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」に対してアンチセンスである。「コーディング領域」なる用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでいるヌクレオチド配列の領域を意味する。他の具体例において、アンチセンス核酸分子は、ＢＢＰ１タンパク質をコードしているヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」に対してアンチセンスである。「非コーディング領域」なる用語は、アミノ酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する５’および３’配列を意味する（即ち、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
【００４９】
以下に開示するＢＢＰ１タンパク質をコードしているコーディング鎖配列（例えば、配列番号１）を用いて、本発明のアンチセンス核酸を、ワトソンおよびクリックの塩基対形成の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＢＢＰ１ｍＲＮＡの全コーディング領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ＢＢＰ１ｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域のフラグメントのみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＢＰ１ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成および酵素ライゲーション反応を用いて、当該分野で公知の方法を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に生じるヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増すために、またはアンチセンスおよびセンス核酸の間で形成された二本鎖の物理的安定性を増すために設計された種々の変更ヌクレオチド、例えばホスホロチオエート誘導体を用いて化学合成することができ、アクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を作製するために用いることができる変更されたヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、 5-ブロモウラシル、 5-クロロウラシル、 5-ヨードウラシル、 ヒポキサンチン、 キサンチン、 4-アセチルシトシン、 5-(カルボキシヒドロキシルメチル) ウラシル、 5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、 5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、 ジヒドロウラシル、 ベータ-D-ガラクトシルクエオシン、 イノシン、 N6-イソペンテニルアデニン、 I-メチルグアニン、 I-メチルイノシン、 2,2-ジメチルグアニン、 2-メチルアデニン、 2-メチルグアニン、 3-メチルシトシン、 5-メチルシトシン、 N6-アデニン、 7-メチルグアニン、 5-メチルアミノメチルウラシル、 5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、 ベータ-D-マンノシルクエオシン、 5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、 5-メトキシウラシル、 2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、 ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、 イブトキソシン、 擬似ウラシル、 クエオシン、 2-チオシトシン、 5-メチル-2-チオウラシル、 2-チオウラシル、 4-チオウラシル、 5-メチルウラシル、 ウラシル-5-オキシ酢酸 メチルエステル、 ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、 5-メチル-2-チオウラシル、 3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル) ウラシル、 (acp3)w、 および 2、6-ジアミノプリンが含まれる。別法として、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配置でサブクローンされている発現ベクターを用いて生物学的に製造することができる（即ち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下のサブセクションにさらに記載する目的の標的核酸に対してアンチセンス配向である）。
【００５１】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、ＢＢＰ１タンパク質をコードしている細胞内ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合して、それにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害するように、対象に投与されるか、またはインサイチュで作製される。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成するための、または例えば、二本鎖ヘリックスの主溝における特異的相互作用によりＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、おきまりのヌクレオチド相補性によるものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位における直接注入が含まれる。別法として、アンチセンス核酸分子は、選択される細胞を標的し、次いで全身に投与されるように変更することができる。例えば、全身投与のためには、アンチセンス分子は、例えばアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に結合させることにより、選択される細胞の表面上に発現されるレセプターまたは抗原にそれが特異的に結合するように、変更されることができる。アンチセンス核酸分子は、以下に記載するベクターを用いて細胞へ送達することもできる。
【００５２】
さらに他の具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。μ−アノマー核酸分子は、通常のγ−ユニットと違って鎖が互いにパラレルに走っている、相補的ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultier et al., 1987 Nucleic Acids.  Res. 15:6625-6641)。アンチセンス核酸分子は、さらに、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド (Inoue et al., 1987 (a) Nucleic Acids Res. 15:6131- 6148)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(Inoue et al., 1987(b) FEBS Lett. 215:327-330)を含み得る。
【００５３】
さらに他の具体例では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補性領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。つまり、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff および Gerlach, (1988) Nature 334:585-591に記載されている））は、ＢＢＰ１ｍＲＮＡ転写産物を触媒切断し、それによりＢＢＰ１ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ＢＢＰエンコーディング核酸に対して特異性を有するリボザイムを、以下に開示するＢＢＰ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（即ち、配列番号１）に基き指定することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＢＢＰ−エンコーディングｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列と相補的であるテトラヒメナＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。共に出典明示により組み込むCech et al. U.S. 特許第 4,987,071号およびCech et al. U.S. 特許第 5,116,742号を参照されたい。別法として、ＢＢＰ１ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる。例えば、Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【００５４】
別法として、ＢＢＰ１遺伝子発現は、ＢＢＰ１遺伝子の調節領域（例えば、ＢＢＰ１遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的して、標的細胞におけるＢＢＰ１遺伝子の転写を妨げる三重螺旋構造を形成することにより、阻害することができる。一般に、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N. Y Acad Sci. 660:27- 36; and Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15を参照されたい。
【００５５】
ＢＢＰ１遺伝子発現は、ＲＮＡインターフィアランス（ＲＮＡｉ）を用いて阻害することもできる。これは、同種の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）で標的遺伝子の活性を特異的に破壊する転写後遺伝子スプライシング法である。ＲＮＡｉは多くの側面において、植物におけるＰＴＧＳに類似し、トリパノゾーマ、ヒドラ、プラナリア、線虫、およびミバエ（ドロソフィラ メラングノスター(Drosophila melangnoster)を含む多くの非脊椎動物において検出されている。それは、転移因子の移動および抗ウイルス状態の形成の調節に関与する可能性がある。哺乳動物のシステムにおけるＲＮＡｉは、その全容を以下に出典明示により組み込む国際出願第WO00/63364号に開示されている。基本的に、標的に対して相同な、少なくとも約６００個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡを細胞に導入し、配列特異的な遺伝子の活性の低下が認められる。
【００５６】
酵母２ハイブリッドアッセイ
Ｙ２Ｈアッセイにより、ＢＡＰのＢＢＰ１融合タンパク質との結合が特異的であることが立証された。ＢＡＰとのＢＢＰ１の結合により、ＢＢＰ１の活性がアルツハイマー病の病因につき確かな役割を有する可能性があることが示唆される。
【００５７】
ＢＢＰ１配列を、基本的な位置整列検索ツール（BLAST; Altschul et al., 1990)を用いてGenbankに対して比較した。ＢＢＰ１タンパク質および入手可能は発現配列タグの翻訳物を並べ、保存されたセグメントに対して検索し、そしてMoSTタンパク質モチーフ検索アルゴリズム(Tatusov, R., Altschul, S., and Koonin, E. (1994) タンパク質中の保存されたセグメントの検出：アライメントブロックでの配列データベースの反復スキャニング．Proc Natl Acad Sci USA 91, 12091-12095)により評価した。これらの分析により、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）ファミリーに対する潜在的な進化上の関連性が明らかになった。特に、これらの分析は、ＢＢＰ１がＧタンパク質−結合レセプターの膜貫通(ｔｍ)ドメイン３および４と等価な２つの潜在的ｔｍドメインを含むことを示した。間にある親水性ループは、このレセプターファミリーのほとんど全てのメンバーにおいて保存されており、そしてＧタンパク質活性化の分子トリガーとして役立つことが示されている(Acharya, S., および Karnik, S. (1996). リョードプシンにおける保存されたGlu134-Arg135配列によるトランスデューシンからのGDPの放出の調節(Modulation of GDP release from transducin by the conserved Glu134-Arg135 sequence in rhodopsin). J Biol Chem 271, 25406-25411)、十分に特徴づけられた３つのアミノ酸モチーフ、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸、それに続くアルギニン（Ｒ）および芳香族残基（ＹまたはＦ）（一般にＤＲＹ配列とも呼ばれる）を含む。
【００５８】
Ｙ２Ｈアッセイからのデータにより、新規タンパク質がＧタンパク質−結合レセプタースーパーファミリーのメンバーと共通する機能モジュールを潜在的に含んでいることが示される。特に、ＢＢＰ１は、２つの予測されたｔｍドメインの間に重要なＤＲＦ配列（配列番号２のアミノ酸１９９〜アミノ酸２０１）を保持し、Ｇタンパク質調節性のシグナリング経路に連結する潜在性を有し得る。
【００５９】
ＡＰＰは、Ｇαｏと機能的に結合することが示されている。アルツハイマーアミロイドタンパク質プレカーサーは、脳ＧＴＰ結合タンパク質Ｇｏと複合体を形成する。家族性アルツハイマー疾患の、ＡＰＰおよびＢＢＰ１の疾患関連変異体により誘導される、Ｇタンパク質媒介性ニューロンＤＮＡの断片は、関連するＧタンパク質結合レセプターにおいてＧαタンパク質活性化配列であることが公知の構造モチーフを含む。さらに、ＢＢＰ１ｔｍドメインの予測される位置および配向に基く仮説は、ＢＡＰと相互作用するタンパク質の領域が、ＡＰＰにおいてＢＡＰと同じ位置に、局所解剖学的に拘束されることを示唆する。
【００６０】
【表２】
2005506831.tif 000003
【００６１】
ＢＢＰ１のさらなる分析を、Ｙ２Ｈアッセイを用いて得た。ＢＢＰ１Δｔｍクローンに含まれるＢＢＰ１配列の２つのオーバーラッピング部分を増幅し、Ｙ２ＨベクターｐＡＣＴ２（発現プラスミドｐＥＫ２１６およびｐＥＫ２１９、表２）にクローン化し、そしてタンパク質ＢＢＰ１ΔＮおよびＢＢＰ１ΔＣに対応した。ΔＣ構築物は、両ｔｍドメインを欠き、ΔＮ構築物は第一のｔｍドメインおよび先行する５２アミノ酸をコードした。これらの融合タンパク質をＢＡＰ融合タンパク質を用いてアッセイし、反応をより大きなＢＢＰ１Δｔｍタンパク質を発現している株の反応と比較した。ＢＢＰ１ΔＣタンパク質は、弱いＹ２Ｈ反応を誘導した（ＢＢＰ１ΔＣをベクターに対して比較する、図４）が、第１ｔｍドメインおよび隣接するアミノ隣接配列を含んでいるＢＢＰ１ΔＮタンパク質は、ＢＢＰ１Δｔｍに関して観察されるものよりもわずかに弱い反応のみを生じた。これらの結果は、ＢＡＰとの結合のための主要な決定因子が、野生型ＡＰＰタンパク質においてＢＰＡと局所解剖学的に類似することが予想されるＢＢＰ１領域内に含まれることを示す。
【００６２】
Ｙ２Ｈシステムを用いて、齧歯動物のＢＡＰと比較したヒトＢＡＰに対するＢＢＰ１の選択性および特異性を立証した。齧歯動物のＢＡＰ配列には、ヒト配列と比較して３つのアミノ酸置換（Ｇ５Ｒ、Ｆ１０Ｙ、およびＲ１３Ｈ）が存在する。Ｙ２Ｈシステムでは、ＢＢＰ１との齧歯動物のＢＡＰの結合を評価することが重要であった。ｐＥＫ１６２におけるヒトＢＡＰの配列をＰＣＲによるオリゴヌクレオチド指向性の突然変異形成により齧歯動物のペプチドをコードするべく変更した。生じたプラスミド、ｐＥＫ２４０は、齧歯動物のペプチド配列に対してアミノ酸置換を生じる３つのコドンを除き、この報告を通じて利用したヒトＢＡＰ融合タンパク質発現プラスミドと同一である。ＢＢＰ１融合タンパク質と齧歯動物およびヒトＢＡＰ融合タンパク質の間の相互作用をＹ２Ｈバイオアッセイにより比較した。ＢＢＰ１および齧歯動物のＢＡＰを発現している株は、増殖反応を生じなかった。これらの所見は、ＢＢＰ１がＢＡＰの神経毒効果の特定のメディエーターとして作用し、齧歯動物のＢＡＰの低下した神経毒を説明するメカニズムを提供するという結論を支持する。興味深いことに、これらのデータをさらに用いて、３つのアミノ酸の置換は結合を完全に排除するのに十分であったので、Ｙ２Ｈアッセイにおいて高程度のＢＢＰ１/ＢＡＰの相互作用の特異性が説明される。
【００６３】
Ｇタンパク質結合レセプタースーパーファミリーに対するＢＢＰの関連性
ＢＢＰタンパク質、および入手可能なＥＳＴの翻訳物を合わせ、並べ、保存されたセグメントに関して検索し、MoSTタンパク質モチーフ検索アルゴリズムにより評価した。まず、これらの分析により、ヒトおよびマウスのデータベースの両方においてＥＳＴの別個のセットが明らかになり、ＢＢＰが構造上関連するタンパク質ファミリーの１つのメンバーであることが示される（本明細書中にそのッ全内容を出典明示により組み込むＰＣＴ公開ＷＯ00/22125に開示されている）。次いで、哺乳動物のＢＢＰおよびＢＢＰ-様タンパク質（「ＢＬＰ」）に対してオーソロガスな配列をディ．メラノガスター(D.Merlanogaster)およびシー．エレガンス(C.elegans)ゲノムにおいて同定した。ヒトＢＬＰ１およびＢＬＰ２、およびマウスおよびハエのＢＢＰｃＤＮＡを、プライマー設計を導くためのＥＳＴおよびゲノムＤＮＡ情報を用いて逆転写-ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）法により単離した。マウスおよびハエのＢＬＰ１およびＢＬＰ２タンパク質をコードしているｃＤＮＡ配列をＥＳＴおよびゲノムＤＮＡコンセンサス測定から誘導した。ヒトタンパク質のクラスターＷアライメントを図７に示す。タンパク質は、潜在的なＮ第一末端分析シグナルを含む。シグナルペプチダーゼの分裂(cleavage)（図７にて矢印により示す）がＢＢＰ１において生じることが示された。加えて、ＢＢＰ１はグルコシル化されていることが示された。潜在的なアスパラギン−結合炭水化物はダイアモンドで示す。重要なことには、全３つのタンパク質はＧタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーの第３および第４ドメインに類似する一次配列を共有する保存セグメントを含む。７−ｔｍドメインＧＰＣＲにおいて、モチーフＤＲ（ＹまたはＦ）におけるアルギニンが、アゴニストの結合に際してのＧタンパク質の活性化の特異的トリガーであることが示された。ＢＢＰタンパク質もこのモチーフを有し、それらがヘテロトリマーＧタンパク質シグナル伝達を調節することを示唆する。
【００６４】
いくつかのＧＰＣＲメンバーのｔｍ３〜ｔｍ４セグメントに対する＞２５％の同一性である一般的な類似性に加えて、他の非常に高度に保存されたアミノ酸は、ｔｍ３（ＢＢＰｔｍ１）の直前のシステインおよびｔｍ４（ＢＢＰｔｍ２）の開始を示しているリジンを含む。ＧＰＣＲの〜９５％のｔｍ４において見出されるトリプトファンは、ＢＬＰ１およびＢＬＰ２サブタイプにおいて同等の位置に存在している。ｔｍドメインに先行して、保存されたシグナル結合ドメインを共有しているレセプターファミリーの共通の態様である、ＢＢＰ／ＢＬＰサブタイプ間にほとんどホモロジーがなく、保存性の少ない外部ドメインにより決定されるユニークな活性を有した。各タンパク質はアミノ末端分泌シグナルを示すものである、強い疎水性領域をアミノ末端付近に有する。ＢＢＰにおけるアミノ末端シグナル配列に関して立証された官能性を用いて、およびＧＰＣＲトポロジーに対するホモロジーと合わせて、タンパク質が、図８に示すように末端を内腔または細胞外に位置づけて、細胞膜を貫通することが予測される。プロトタイプの７−ｔｍドメインＧタンパク質結合レセプターに関するごとく、ＢＢＰ／ＢＬＰタンパク質は２つのｔｍドメインの間におよそ位置する、第１のｔｍドメインに並列する重要なＤＲＦモチーフを含む。これにより、タンパク質がヘテロトリマーＧタンパク質調節経路を調節し得ることが示唆される。
【００６５】
ＢＢＰタンパク質は共通の構造を有するが、ＢＢＰ１サブタイプだけがＡβに結合する。全３つのサブタイプを、Ａβとの酵母２−ハイブリッド相互作用に関して試験した。ＢＢＰ１タンパク質のみがポジティブな反応を示した。
ＢＢＰ１サブタイプに関するＡβの特異性をさらに、ＢＢＰ発現プラスミドでトランスフェクトしたヒトNtera-2幹細胞にて評価した。１０Ｍの集合させたＡβで４８時間処置することにより、対照サンプルにおいては、わずかな（最高のアポトーシスの２０％）反応が誘導された。これに対して、ＢＢＰ１発現プラスミドでトランスフェクトした細胞は、アポトーシスの実質上および有意な増加を示した。ＢＬＰ１またはＢＬＰ２トランスフェクションでは、増加は検出されなかった。
【００６６】
ヒトＢＢＰ１遺伝子の構造
ＢＢＰ１遺伝子は、ＤＮＡコンティグ＃021923.1上に位置する７つのエキソンを含む。ＢＢＰは配列は、コンティグの塩基155,044〜199,466に及ぶ。ヒト染色体１の上端から測定して、ＢＢＰｍＲＮＡ配列は塩基対67,000,000付近から始まり、塩基対66,965,000付近で終わる。コーディング領域を配列番号１に示す。ＢＢＰ１の遺伝子構造を図１１に示す。
【００６７】
ＢＢＰホモログ
開示のポリヌクレオチドおよびタンパク質の種ホモログも、本発明により提供される（図７を参照されたい）。本明細書中に用いられるように、種ホモログは所定のタンパク質またはポリヌクレオチドのものとは異なる起源種を有するが、進化上の関連性の指標である、所定のタンパク質またはポリヌクレオチドと類似する有意な配列類似性を有するタンパク質またはポリヌクレオチドである。例えば、ヒト対マウスのＢＢＰは、タンパク質レベルで８４％同一であり、ＤＮＡレベル（タンパク質コーディング領域において）で８５％同一である。ドロフソフィラ(Drosophila)またはシー．エレガンス(C.elegans)などの無脊椎動物との比較により、低い全体的な同一性を得る（ヒト対ハエＢＢＰタンパク質は、３８％同一である）。ＢＢＰタンパク質のコア領域（２−ｔｍドメインＧＰＣＲ様領域）は、図７に示すものとかなり大きな配列類似性を示す。例えば、ヒトおよびハエＢＢＰ１のこの領域の６７個のアミノ酸は５８％同一である。
【００６８】
広範囲の種ホモログが本明細書中に開示されるが、更なる種ホモログを、本明細書中に提供される配列から適当なプローブまたはプライマーを作製することにより、所望の種から適当な核酸源をスクリーニングすることにより単離および同定してよい。好ましいさらなる種ホモログは、遺伝子地図が作製されており、１つの種の遺伝子のゲノム組成と他の種における関連遺伝子のゲノム組成の間の相同関連性の同定が可能となっている(O'Brien および Seuanez, 1988, Ann. Rev. Genet. 22: 323-351; O'Brien et al., 1993, Nature Genetics 3:103-112; Johansson et al., 1995, Genomics 25: 682-690; Lyons et al., 1997, Nature Genetics 15: 47-56; O'Brien et al., 1997, Trends in Genetics 13(10): 393-399; Carver および Stubbs, 1997, Genome Research 7:1123-1137; これら全ては、本明細書中に出典明示により組み込まれる。)、例えば、全類人猿(Pan troglodytes)、ゴリラ(Gorilla gorilla)、オランウータン(Pongo pygmaeus)、クロテナガザル(Hylobates concolor)、アカゲザル(Macaca mulatta)、ヒヒ(Papio papio)、マントヒヒ(Papio hamadryas)、サバンナザル(Cercopithecus aethiops)、ノドジロオマモザル(Cebus capucinus)、ヨザル(Aotus trivigatus)、サングイヌス エディプス(Sanguinus oedipus)、グレイネズミレムール(Microcebus murinus)、ドブネズミ(Rattus norvegicus)、キヌゲネズミ(Cricetulus griseus)、イエネコ(Felis catus)、アメリカミンク(Mustela vison)、イエイヌ(Canis familiaris)、カイウサギ(Oryctolagus cuniculus)、ウシ(Bos taurus)、ヒツジ(Ovis aries)、イノシシ(Sus scrofa)、およびウマ(Equus caballus)などの所定の哺乳動物種から単離されるものである。
【００６９】
本発明はさらに、開示されるポリヌクレオチドまたはタンパク質の変種；すなわち、開示されるポリヌクレオチドによりコードされるものと同一の、またはかなり類似する配列を有するタンパク質をさらにコードする単離ポリヌクレオチドの天然に生じる別形態を包含する。好ましくは、対立変種は所定のポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７５％の同一性；最も好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有し、ここで、配列同一性は、オーバーラップを最大にし、配列ギャップを最少にするように並べた場合にポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を比較することにより決定される。変種は、本明細書中に提供される配列から適当なプローブまたはプライマーを作製することにより、および適当な種の個人から適当な核酸源をスクリーニングすることにより単離および同定されてよい。
【００７０】
本発明はさらに、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドならびに開示されるタンパク質をコードするが、遺伝子コードの縮重の結果として開示される配列とは異なるポリヌクレオチドと配列相補性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００７１】
トランスジェニック動物
本発明のトランスジェニック動物は、好ましくは胎児幹細胞（ＥＳ）細胞にベクターを標的する導入により好ましくは作製される。ＥＳ細胞は、プレ−インプランテーション胎児をインビトロで適当な条件下に培養することにより得られる(Evans, et al. (1981) Nature 292:154-156; Bradley, et al. (1984) Nature 309:255-258; Gossler, et al. (1986) Proc. Acad. Sci. USA 83:9065-9069;および Robertson, et al. (1986) Nature 322:445-448)。トランスジーンは、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム共沈、プロトプラストまたはスフェロプラスト融合、リポフェクション、およびＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクションを含む当該分野で公知の種々の方法を用いるＤＮＡトランスフェクションによりＥＳ細胞へと効果的に導入することができる。トランスジーンは、レトロウイルス媒介トランスダクションにより、またはマイクロ−インジェクションによりＥＳ細胞へと導入されてよい。そのようなトランスフェクトされたＥＳ細胞はその後、胚盤胞段階の胎児の胞胚腔へのその導入後に胎児を形成することができ、生じるキメラ動物の生殖系統を生じることができる。レビューとしては、Jaenisch, (1988) Science 240:1468-1474を参照されたい。トランスジーンがそのような選択のための手段を提供する場合には、胞胚腔へのトランスフェクトされたＥＳ細胞の導入前に、トランスフェクトされたＥＳ細胞をトランスジーンを統合したＥＳ細胞を豊富化するための種々の選択プロトコルに供してよい。別法として、ポリメラーゼ鎖反応を用いて、トランスジーンを統合したＥＳ細胞をスクリーンしてよい。この方法では、胞胚腔への移入前に適当な選択条件下にトランスフェクトＥＳ細胞を増殖させる必要が回避される。
【００７２】
変更されたＢＢＰ１遺伝子を含んでいるトランスジェニック動物の作製のための別法は当該分野で公知である。例えば、種々の発生段階にある胎児細胞を用いて、トランスジェニック動物の作製のためのトランスジーンを導入することができる。胎児細胞の発生段階により、種々の方法を用いる。接合子はマイクロインジェクションの最良の標的である。マウスにおいて、オスの生殖核は、１−２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ溶液の再現性ある注入を可能とする直径約２０マイクロメートルのサイズに達する。接合子の遺伝子輸送の標的としての使用は、ほとんどの場合に、注入されたＤＮＡが最初の切断前に宿主遺伝子へと組み込まれるという点に主要な利点を有する(Brinster, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442)。結果として、トランスジェニック非ヒト動物の全細胞は、組み込まれたトランスジーンを有する。これは、一般に、５０％の生殖細胞がトランスジーンを有するので、ファンダーの子孫へのトランスジーンの効果的な伝達にも反映される。接合子のマイクロインジェクションは、本発明を実施することにおいてトランスジーンを組み込むのに好ましい方法である。Ｕ．Ｓ．特許第4,873,191号は、接合子のマイクロインジェクションのための方法を開示し、この特許の開示を、その全容を本明細書中に組み込む。
【００７３】
レトロウイルス感染を用いて、非ヒト動物へとトランスジーンを導入することもできる。発生している非ヒト胎児をインビトロで培養して、胚盤胞段階へと培養することができる。この時間中、割球が、レトロウイルスの感染のための標的であり得る（Janenich (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260-1264)。割球の有効な感染は、透明帯を除去するための酵素処置により得られる(マウス胎児の操作(Manipulating the Mouse Embryo)におけるHogan et al. (1986) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)。トランスジーンを導入するのに用いられるウイルスベクターシステムは、典型的にはトランスジーンを有している複製欠損レトロウイルスである(Jahner, D. et al. (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:6927-6931; Van der Putten, et al. (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:6148-6152)。トランスフェクションは、割球をウイルス産生細胞の単層にて培養することにより容易かつ効果的に得られる(Van der Putten, 既出; Stewart, et al. (1987) EMBO J. 6:383-388)。別法として、感染は、後期段階にて行うことができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を胞胚腔へと注入することができる(Jahner, D. et al. (1982) Nature 298:623-628)。導入はトランスジェニック動物を形成する細胞のサブセットにおいてのみ生じるので、ファウンダーのほとんどは、トランスジーンに関してモザイクである。さらに、ファウンダーは、ゲノム中の異なる位置にトランスジーンの種々のレトロウイスル挿入を含んでよく、これは子孫では一般に分離する。加えて、低い効率ではあっても、妊娠中期の胎児の子宮内レトロウイルス感染により、生殖系統へとトランスジーンを導入することもできる(Jahner, D. et al. (1982) 既出)。トランスジェニック動物を作製するための当該分野で公知のレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを用いるさらなる手段には、受精卵の卵囲卵腔または初期胚へのレトロウイルス粒子またはレトロウイルス産生マイトマイシンＣ処置細胞のマイクロインジェクションが含まれる(PCT 国際出願WO 90/08832号 (1990) および Haskell および Bowen (1995) Mol. Reprod. Dev. 40:386)。
【００７４】
WO99/31969号（本明細書中に出典明示によりその全容を組み込む）に記載されているようなコンディショナルまたはコントロール可能なトランスジェニック動物も本発明に包含される。そのような動物において、挿入される遺伝子は調節可能なプロモーターまたは他の発現コントロールシステムの制御下にある。
【００７５】
ノックアウト動物
本発明はさらに、内在ベータアミロイド結合タンパク質サブタイプ１（ＢＢＰ１）遺伝子の少なくとも１つの、およびより好ましくは両方の対立遺伝子の機能破壊を有する体細胞および生殖細胞を有する非ヒト動物をも含む。従って、本発明により、変異したＢＢＰ１遺伝子を有する、およびＢＢＰ１活性を欠く生存能力のある動物が提供される。これらの動物は、野生型対照動物において正常量のＢＢＰ１を生じる刺激に反応して、実質上低下した量のＢＢＰ１を生じる。本発明の動物は、例えば、ＢＢＰ１インヒビターを評価するための標準的な対照として、ヒトＢＢＰ１インヒビターをインビボでスクリーニングするためのモデルシステムを作製するための正常ヒトＢＢＰ１遺伝子のレシピエントとして、およびＢＢＰ１インヒビターでの治療のために疾患状態を同定するために有用である。動物はまた、β−アミロイドおよびアミロイドプレカーサータンパク質におけるＢＢＰ１の効果を研究するための対照として有用である。本発明のトランスジェニック非ヒト動物では、ＢＢＰ１遺伝子を、好ましくは、内在する対立および変異ＢＢＰ１遺伝子、または動物の胎児幹細胞プレカーサーへ導入されたその部分の間の相同組換えにより破壊する。胎児幹細胞プレカーサーを次いで発生させ、機能的に破壊されたＢＢＰ１遺伝子を有する動物を得る。動物は、機能的に破壊された１つのＢＢＰ対立遺伝子を有してよく（即ち、動物は変異に関してヘテロ接合体であってよい）、またはより好ましくは、動物は、機能的に破壊された両方のＢＢＰ１対立遺伝子を有する（即ち、動物は変異に関してホモ接合体であり得る）。本発明の１つの具体例において、両方のＢＢＰ１対立遺伝子の機能的破壊により、動物の細胞におけるＢＢＰ１遺伝子産物の発現が非変異動物と比較して実質上存在しない動物を生じる。他の具体例において、ＢＢＰ１対立遺伝子は、変更された（即ち、変異）ＢＢＰ１遺伝子産物が動物の細胞において作製されるように破壊することができる。機能的に破壊されたＢＢＰ１遺伝子を有する本発明の好ましい非ヒト動物はマウスである。
【００７６】
本発明のホモ接合体動物におけるＢＢＰ１機能の実質上完全な不活性化および本発明のヘテロ接合体動物におけるＢＢＰ１機能の約５０％の阻害が得られる場合、これらの動物は、ＢＢＰ１インヒビターの有効性を評価するポジティブなコントロールとして有用である。例えば、通常ＢＢＰ１の産生を誘導する刺激を試験されるべきＢＢＰ１インヒビターの存在下に野生型動物（即ち、非変異ＢＢＰ１遺伝子を有する動物）に与える、そして動物によるＢＢＰ１の産生を測定することができる。野生型動物におけるＢＢＰ１の反応を、同様にＢＢＰ１刺激を与えた本発明のヘテロ接合体およびホモ接合体ＢＢＰ１変異動物におけるＢＢＰ１の反応と比較して、試験インヒビターの最大のＢＢＰ１阻害の割合を決定することができる。もちろん、ＢＢＰ１ホモ接合体の変異体は、１００％の阻害を示す。
【００７７】
本発明の動物は、特定の疾患状態にＢＢＰ１の活性が関与するか、そして従って、ＢＢＰ１インヒビターにより治療することができるかどうかを決定するために有用である。例えば、機能的に破壊されたＢＢＰ１遺伝子を有する本発明の動物において疾患状態を誘導する試みをなすことができる。その後、疾患状態に対する動物の罹病性または抵抗性を決定することができる。ＢＢＰ１インヒビターで治療することができる疾患状態は、疾患状態に対する本発明の（ＢＢＰ１を欠いている）動物の抵抗性に基いて同定することができる。
【００７８】
本発明の他の側面は、機能破壊された内在ＢＢＰ１遺伝子を有するが、しかし異種構造ＢＢＰ１（即ち、他の種からのＢＢＰ１）をコードしているトランスジーンをそのゲノムに有し、そしてそれを発現するトランスジェニック非ヒト動物に関する。好ましくは、動物はマウスであり、異種構造ＢＢＰ１はヒトＢＢＰ１である。ヒトＢＢＰ１で再構築された本発明の動物を用いて、インビボでヒトＢＢＰ１を阻害する試薬を同定することができる。例えば、ＢＢＰ１の産生を誘導する刺激を、試験されるべき試薬の存在および不在下に動物に与えることができ、そして動物におけるＢＢＰ１の反応を測定することができる。インビボでヒトＢＢＰ１を阻害する試薬は、試薬の不在下でのＢＢＰ１反応と比較して試薬の存在下で低下したＢＢＰ１反応に基いて同定することができる。
【００７９】
本発明のさらに他の態様は、宿主細胞においてＢＢＰ１遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物に関する。核酸構築物は、以下を含む：ａ）非相同置換部分；ｂ）非相同置換部分の上流に位置する第１相同領域、ここで第１相同領域は第１ＢＢＰ１遺伝子配列と実質上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する；およびｃ）非相同置換部分の下流に位置する第２相同領域、ここで第２相同領域は、第２のＢＢＰ１遺伝子配列と実質上の同一性を有するヌクレオチド配列を有し、第２ＢＢＰ１遺伝子配列は、天然に存在している内在ＢＢＰ１遺伝子において第１ＢＢＰ１遺伝子配列の下流の位置を有する。加えて、第１および第２相同領域は、核酸分子を宿主細胞へ導入した場合の、宿主細胞における核酸構築物と内在ＢＢＰ１遺伝子の間の相同組換えに足る長さである。好ましい具体例において、非相同置換部分は、好ましくは調節エレメント（複数も）に作用的に結合したネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むポジティブ選択発現カセットを含む。他の好ましい具体例では、核酸構築物は、上流または下流いずれかの相同領域に対して遠位にるネガティブ選択発現カセットをさらに含む。好ましいネガティブ選択カセットは、調節エレメント（複数も）に作用的に結合した単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を含む。
【００８０】
本発明の他の態様は、本発明の核酸構築物が組み込まれた組換えベクターに関する。本発明のさらに他の態様は、本発明の核酸構築物が導入されて、核酸構築物と宿主細胞の内在ＢＢＰ遺伝子の間で相同組換えがなされ、内在ＢＢＰ１遺伝子の機能破壊を生じる宿主細胞に関する。宿主細胞は、ＢＢＰ１を正常に発現する哺乳動物細胞、ヒトニューロンなど、または多能性細胞、マウス胎児幹細胞などであり得る。核酸構築物を導入して内在ＢＢＰ１遺伝子と相同組換えされた胎児幹細胞をさらに発生させて、胎児幹細胞からの子孫であり、その遺伝子にＢＢＰ１遺伝子破壊を有する細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物が生じる。その生殖系にＢＢＰ１遺伝子破壊を有する動物を次いで選択し、繁殖させて、全体細胞および生殖細胞においてＢＢＰ１遺伝子破壊を有する動物を得ることができる。そのようなマウスを次いで、ＢＢＰ１遺伝子に関するホモ接合体と繁殖させることができる。
【００８１】
本発明は、さらに、ＢＢＰ１遺伝子が常套的にノックアウトされた非ヒト動物に関する。そのような動物においては、Cre/Loxシステム（本明細書中にその全容を出典明示により組み込むUS特許第4,959,317号を参照されたい）を用いて、ノックアウトされるべき遺伝子の部分がLox部位（これは組換えるべく、そしてそれゆえそれが包囲するエキソンを除去するべく導入されることができる）に隣接する構築物を作製することができる（図１２）。このような動物は、胎児の致死性および発生上の代償の問題を回避するのに有用である。組織およびまたは一次（発生学的に）特異的なコンディショナル変異体も、本発明により包含され、Cre/Ioxシステムを活性化するための標準的な方法を用いて、公知の組織またはプロモーターなどの発生特異的調節エレメントを用いて作製することができる。
【００８２】
適用
本発明のＢＢＰ１タンパク質は、本開示に基いて、当業者にとって常套の種々の適用において用いることができる。特に、ＢＢＰを免疫原として用いて、クローン化したポリペプチドに特異的な抗体を増すことができる。当該分野で公知の種々の方法を、ＢＢＰ１タンパク質に対する抗体の産生のために用いてよい。そのような抗体には、制限されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーが含まれる。抗体の産生のためには、制限するものではなくウサギ、マウス、およびラットを含む種々の宿主動物にＢＢＰを注入する。１つの具体例において、特定の免疫活性能力のあるポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントを、免疫原性キャリアに結合させる。アジュバントをポリペプチドと共に投与して、宿主動物の免疫原性反応を増してよい。用いられてよいアジュバントの例には、制限されるものではないが、完全および不完全フロイント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性剤が含まれる。
【００８３】
本発明のＢＢＰタンパク質に対するモノクローナル抗体を、培養継代細胞株による抗体の産生を提供するいずれかの方法を用いて調製することができる。そのような方法は、当業者に周知であり、制限されるものではないが、ハイブリドーマ法、Kosbor et al.  (Immunology Today 1983, 4, 72)により開示されるヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、およびCole et al. (モノクローナル抗体および癌治療, Alan R. Liss, Inc., pp 77-96)に開示されるＥＢＶ−ハイブリドーマ法が含まれる。本発明による抗体は、実施例９に記載のごとく製造した。
【００８４】
本発明のポリペプチドに免疫反応性のある抗体を次いで用いて、生物サンプルにおける同様のポリペプチドの存在および亜細胞における分布を調べることができる。加えて、本発明のＢＢＰ１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を治療として用いることができる。
本発明による抗体を治療上用いて、そのような治療を必要とする哺乳動物を治療し得る。詳しくは、抗体を用いて、ＢＢＰ１タンパク質の細胞外ドメインに対する細胞外分子の結合を阻害してよい。治療抗体は、ＢＢＰ１のβ−アミロイドとの相互作用を阻害するものであってもよい。
【００８５】
ＢＢＰタンパク質は、請求項に係るペプチドと免疫反応する抗体の存在を測定する固相アッセイに有用な抗原としても作用し得る。固相競合アッセイを用いて、生物サンプルにおけるクローン１４関連抗原の免疫学的な量を測定することができる。この測定は、本発明のポリペプチドの細胞機能（複数も）の完全な特定を容易にするのに有用であるのみならず、これらのタンパク質の異常な量を有する患者を同定するのにも有用であり得る。
【００８６】
本発明のＢＢＰ１タンパク質は、ＡＤのマーカーとしてのＢＡＰおよびＢＡＰ集合物の検出のためのアフィニティクロマトグラフィーにおいて捕捉試薬として用いることもできる。
加えて、これらのＢＢＰ１はＢＡＰとクローン化タンパク質の相互作用に影響を及ぼす候補分子を同定するためのアッセイにおける試薬として有用である。この結合を特異的にブロックする化合物が、ＡＤの治療または予防に有用であり得る。
【００８７】
これらのＢＢＰ１は、これらのβ−アミロイドペプチド結合タンパク質のＢＡＰまたはＢＡＰ集合物に対する結合における化合物による変化を測定する無細胞インビトロ結合アッセイにおいても有用である。無細胞アッセイは、これらのアッセイは経済的に優れており、かつ生きている細胞を用いるアッセイよりも容易に行えるので、かなりの数の化合物をスクリーニングするのに非常に有用である。本発明のポリペプチドの開示に際して、これらのアッセイの開発は当業者には常套的なものであろう。そのようなアッセイでは、ＢＢＰ１またはＢＡＰいずれかを標識する。そのような標識には、制限されるものではないが、放射能標識、抗体、および蛍光または紫外線タグが含まれる。ＢＢＰ１のＢＡＰまたはＢＡＰ集合物への結合をまず、いずれの試験化合物も存在しない条件下で決定する。試験されるべき化合物を次いでアッセイに添加し、そのような化合物がこの相互作用を変化させるかどうかを決定する。インビトロ結合アッセイにおける１例を実施例７に詳細に示す。
【００８８】
実施例
本発明をさらに以下の実施例により記載する。実施例は、本発明を特定の具体例に対する引用により、説明のためにのみ提供するものである。これらの例は、本発明の所定の特定の態様を示しているが、本発明を制限するものでも、本発明を限定するものでもない。
酵母の２つのハイブリッドシステム（以下「Ｙ２Ｈ」）：Ｙ２Ｈ発現プラスミドをｐＡＳ２およびｐＡＣＴ２およびｐＣＵＰにて構築した。酵母株ＣＹ７７０は全Ｙ２Ｈアッセイのための宿主として役立つ。
【００８９】
遺伝子スクリーン：ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、ＢＡＰをコードしている配列を増幅および変更した。オリゴヌクレオチド＃１(5' - CC ATG GAT GCA GAA TTC CGA C)および＃３(5' - AAGCTTGTCGAC TTA CGC TATGAC AAC ACC GC) を用いて、変更されたヒトＡＰＰクローン、ｐＣＬＬ６２１を鋳型として用いて(Jacobsen, et al. 1994)、ＢＡＰを増幅した。アルツハイマー病βアミロイドペプチドの放出は、ホルボール処置により低下する。増幅されたＤＮＡは、以下の変更を有するＡＰＰプレカーサータンパク質のコドン３８９〜４３０（ＢＡＰ４２をコードする）から成る。センス鎖プライマーは、同じ翻訳リーディングフレームにｐＡＳ２中のNcol部位として５’Ncol制限部位を付加した。アンチセンス鎖プライマーは、クローニングのためのストップコドンおよびHind IIIおよびSalI部位を付加した。この増幅からの産物をＴＡクローニングシステム(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)にライゲートし、次いでNcoIおよびSalIでの消化により切り出した。このフラグメントをNcoIおよびSalIで切断したｐＡＳ２へとクローン化した。生じたプラスミド、ｐＥＫ１６２を、ＧＡＬ４/ＢＡＰジャンクションを経るＤＮＡ配列決定により確認した。ｐＥＫ１６２から発現されたタンパク質（ＢＡＰＢＤ；図１）は、酵母転写活性化タンパク質Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（機能活性配列を欠いている）を、カルボキシ末端にＢＡＰの４２個のアミノ酸を追加して含む融合タンパク質から成った。変更されていないＢＡＰ４２の発現を媒介する発現プラスミドを開発した。オリゴ＃２(5' - AAGCTTAAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA C)を前記のとごくＰＣＲにおいてオリゴ＃３と対にした。この増幅の産物は、５’Hind III部位およびサッカロマイセス セレビジアエ(Saccharomuces cerevisiae)における発現のために最適化された翻訳開始シグナルを含む。再び、ＤＮＡフラグメントをＴＡシステムにクローン化した。それを次いでHincIIフラグメントに関して単離し、Hind IIIにて切断したｐＣＵＰにクローン化した。生じたプラスミド、ｐＥＫ１４９におけるＢＡＰ遺伝子の配向（ＢＡＰ；図１）をＤＮＡ配列決定により確認した。ＢＡＰ発現プラスミドｐＥＫ１４９（これは選択マーカーとしてＵＲＡ３を用いた）およびｐＥＫ１６２（これは選択マーカーとしてＴＲＰ１を用いた）を酵母宿主ＣＹ７７０にトランスフォームした。両プラスミドを含んでいる株をＣＹ２０９１と指定した。宿主２-ハイブリッド発現ベクターｐＡＣＴ２（これは選択マーカーとしてＬＥＵ２を用いた）にクローン化したヒト胎児脳から単離したｃＤＮＡフラグメントから成るプラスミドライブラリーは、Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)から購入した。ライブラリー由来のタンパク質を、図１において未知ＡＤとして示す。このライブラリーを用いてＣＹ２０９１を形質転換した。サンプルをウラシル、トリプトファン、およびロイシンを欠いている合成完全（ＳＣ）酵母増殖培地に蒔き、３つのプラスミドを含んでいる細胞を選択した。培地はヒスチジンも欠き、酵母ＨＩＳ３遺伝子の産物のインヒビターである３-アミノ-トリアゾールを２５ｍＭの濃度で含んだ。３-アミノ-トリアゾールを用いて、ＨＩＳ３レポーター遺伝子の低レベルの構造発現から、活性を低下させた。プレートを３０℃にて１２日間インキュベートした���増加したヒスチジンプロトトロフィーを示している２４個のコロニーを単離した。トランスフォーメーション対照は、スクリーニングにより１０６個の個々のクローンがアッセイされることを示した。ＰＣＲアプローチを用いて、ポジティブクローンの含量を迅速に決定した。トータルのＤＮＡを標準的な方法により、各ポジティブ株から単離した。この材料をＰＣＲのための鋳型としてライブラリーベクターｐＡＣＴ２のクローニング領域の側面に位置するオリゴ＃４(5' - TTTAATACCA CTACAATGGA T)および＃５(5' - TTTTCAGTAT CTACGATTCA T)を用いて、用いた。ＤＮＡフラグメントをＴＡシステムにライゲートし、ＤＮＡ配列決定により試験した。＃１４に（前記のごとく）含まれるライブラリープラスミドを、イー．コリに、シャトルにより単離した。ヒトｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を決定し、最初のＰＣＲ産物の配列を確認した。
【００９０】
バイオアッセイ：株を一晩、ロイシンおよびトリプトファンを欠く２ｍｌのＳＣ培地中に１ｍｌ当たり約７×１０７細胞の密度へと増殖させた。細胞をカウントし、滅菌水１ｍｌ当たり１０４〜１０８個細胞の１０倍連続希釈を作製した。これらのサンプルを、ロイシン、トリプトファン、およびヒスチジンを欠き、そして２５ｍＭの３−アミノ−トリアゾールを含んでいるＳＣ培地の５μｌ部分にスポットした。プレートを３０℃にて２〜３日間インキュベートした。ポジティブなタンパク質／タンパク質相互作用を、Ｇａｌ４ＤＮＡ−結合ドメイン融合タンパク質および不適切な転写活性化ドメイン融合タンパク質を発現している（または挿入配列を含まないｐＡＣＴベクターを含んでいるだけの）対照株と比較して増加したプロトトロフィー増殖により同定した。このアッセイ法は非常に再現性があり、標的タンパク質間の特異的相互作用により媒介される増殖のわずかな誘導が検出される。もとのＢＢＰ１クローン（ｐＥＫ１９６として指定され、ＡＴＣＣ９８３９９として寄託される；本明細書中ではクローン１４と呼ぶ）をＰＣＲの鋳型として用いて、タンパク質産物を先端切除し、ＢＢＰ１Δｔｍを発現させた。センスプライマー＃６(5'-TTTAATACCA CTACAATGGA T)は、ｐＡＣＴ２においてＧＡＬ４配列とアニールした。アンチセンスプライマー＃７(5'-CTCGAG TTA AAA TCG ATC TGC TCC CAA CC)を、３’ストップコドンとＢＢＰ１のＤＲＦモチーフをコードしている配列のすぐ３’のＸｈｏＩ部位に挿入した。ＰＣＲ産物をＴＡクローニングベクターにライゲートし、次いでＥｃｏＲＩ＋ＸｈｏＩで消化し、ｐＡＣＴ２へとクローン化した。このプラスミド（ｐＥＫ１９８）から発現されるハイブリッド産物をＢＢＰ１Δｔｍと指定した。同様に、プライマー＃７をプライマー＃８(5'-GAATT CCA AAA ATA AAT GAC GCT ACG)と対にして、ＢＢＰ１ΔＮ発現プラスミドｐＥＫ２１６を操作した。再び、ＰＣＲ産物をＴＡシステムにライゲートし、生じたプラスミドをＥｃｏＲＩ＋ＸｈｏＩで消化して、ＢＢＰ１フラグメント（コドン１２３−２０２）を同じ酵素で消化したｐＡＣＴ２へと最終的にライゲートした。ＢＢＰ１ΔＣをｐＡＣＴ２−特異的オリゴ＃６をアンチセンスオリゴ＃９(5'-CTCGAG TCA AGA TAT GGG CTT GAA AAA AC)と共に用いて作製した。ＴＡクローニング、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントの単離およびｐＡＣＴ２へのクローニングの後、生じたプラスミドｐＥＫ２１９は残基６８〜１７５のＢＢＰ１を発現した。ＢＢＰ１細胞内ループをコードしている配列を、オリゴヌクレオチド＃１０（5'-CCTTCC ATG GAA GTG GCA GTC GCA TTG TCT）および＃１１（5'-AACACTCGAG TCA AAA CCC TAC AGT GCA AAA C）を用いて増幅した。ＢＢＰ１コドン１８５〜２１７を含んでいるこの産物をＮｃｏＩ＋ＸｈｏＩで消化し、ＮｃｏＩ＋ＳａｌＩで切断したｐＡＳ２へとクローン化して、ｐＯＺ３３９を作製した。全Ｇαタンパク質発現プラスミドの構築は、ｐＡＣＴ２における融合部位として各ラットのｃＤＮＡ配列の中心近くのＢａｍＨＩ部位を利用した(Kang, Y.-S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J., および Tipper, D. (1990) Mol Cell Biol 10, 2582-2590)。センスプライマーは、ＢａｍＨＩ部位の配列５’へとアニールし、アンチセンスプライマーは、ストプコドンの配列３’へとアニールし、SalI制限部位を含んだ。���ライマーは、Ｇαｏ、センス（＃１７）＝5'-GTGGATCCAC TGCTTCGAGG AT、アンチセンス（＃１８）＝5'-GTCGACGGTT GCTATACAGG ACAAGAGG; Gas、センス（＃１９）＝5'-GTGGATCCAG TGCTTCAATG AT、アンチセンス（＃２０）＝5'-GTCGACTAAA TTTGGGCGTT CCCTTCTT；Ｇａｉ２、センス（＃２１）＝5'-GTGGATCCAC TGCTTTGAGG GT、アンチセンス（＃２２）＝5'-GTCGACGGTC TTCTTGCCCC CATCTTCCであった。ＰＣＲ産物をＴＡベクターにクローン化した。Ｇα配列をBamHI-SalIフラグメントとして単離し、BamHI＋SalIで消化したｐＡＣＴ２へとクローン化した。プラスミドの指定に関する表２を参照されたい。最終的にオリゴヌクレオチド＃２３を、ヒトＢＡＰの齧歯動物の配列への変換のために合成した。このプライマーは、配列5'-ATATGGCCATG GAT GCA GAA TTC GGA CAT GAC TCA GGA TTT GAA GTT CGTを有する。３つ組はＢＡＰの最初の１３個のコドンを示し、齧歯動物の配列を作製するべく変化させた３つのヌクレオチドに下線を引く。オリゴ＃２３を、ｐＥＫ１６２を鋳型として用いるＰＣＲにおいてクローニング部位の３’であるＹ２Ｈベクターの領域へアニールする＃２４(5'-TGACCTACAG GAAAGAGTTA)と対にした。生成物をNcolI＋SalIで切断し、ｐＡＳ２へとライゲートしてｐＥＫ２４０を作製した。齧歯動物のＢＡＰをコードしているセグメントのヌクレオチド配列を確認した。
【００９１】
ゲノムクローニング：ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）：ａ２．０×１０６ｐｆｕｓに対応しているヒトゲノムラムダライブラリー(Stratagene)をヌクレオチド１８７−６００に対応しているランダムにプライムしたＥｃｏＲＩ/ＣｌａＩフラグメントプローブでスクリーンした。プローブをＴ７QuickPrimerキットを製造業者(Pharmacia)のプロトコルに従い用いて[３２Ｐ]−ＣＴＰにて標識した。フィルターを高ストリンジェンシー：５０％ホルムアミド中４０℃、０．１２Ｍ ＮａＨＰＯ４、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、７％ＳＤＳおよび２５ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ下にハイブリダイズさせ、６５℃にてドデシル硫酸ナトリウムを含む０．１％の０．１×ＳＳＣ中で洗浄し、Kodak BioMax MSフィルムへ暴露した。プローブにハイブリダイズしているラムダファージクローンを連続プレーティングおよび再スクリーニングによりプラーク精製した。１０個のポジティブなクローンを精製し、オリジナルなｃＤＮＡクローンから公知のほとんどの５’配列に対して指向された４５ｎｔのオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせることによりさらなる分析に供した。このオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド１５７−２０１の逆相補物であり、配列5'-CCAGGCGGCC GCCATCTTGG AGACCGACAC TTTCTCGCCA CTTCCを有する。ラムダファージＤＮＡを標準的な分子生物学的方法により単離し、ABI373シークエンサーにて蛍光ダイデオキシサイクル配列決定を用いる直接配列決定に供した。
【００９２】
ＲＡＣＥ：第１鎖ＤＮＡ合成を、ｒＴｔｈ熱安定ポリメラーゼシステム(Perkin Elmer)を用いて行った。以下の試薬を１．５ｍＬのチューブに合わせ、１０マイクロリットルの体積を得た：１×逆転写バッファー、１ｍＭのＭｎＣｌ２、１．６ｍＭのｄＮＴＰミックス、２．５ＵのｒＴｔｈポリメラーゼ、１００ｎｇのヒト海馬ポリＡ＋ＲＮＡ(Clontech)、１０ｍＭのオリゴヌクレオチド(ｎｔ４２９−４５２；5'-GTTATGTTGG GTGCTGGAAA ACAG）。反応物を７０℃にて１５分間インキュベートし、すぐに氷上に置いた。Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ合成キット(Clontech)を第２鎖ｃＤＮＡの作製のために用いた。第１鎖反応物からの全１０μｌを以下の試薬と合わせた：１×第２鎖バッファー、０．８ｍＭ ｄＮＴＰミックス、４×第２鎖カクテル（イー．コリ ＤＮＡポリメラーゼＩ、イー．コリＤＮＡリガーゼ、イー．コリＲＮａｓｅＨ）、および８０μｌの体積までｄＨ２Ｏ。チューブを１６℃にて１．５時間インキュベートし、その後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ）を添加し、さらに４５分間１６℃にてインキュベートした。反応を終結させるために、４μｌの２０×ＥＤＴＡ／グリコーゲン(0.2M EDTA/2mg/ml グリコーゲン）を反応混合液に添加し、その後フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出を行い、酵素および他の不純物を除去した。ＤＮＡを０．１×容積の３Ｍ ＮａアセテートｐＨ５．２および２．５×容積の試薬グレードのＥｔＯＨを添加することにより沈殿させ、−７０℃に置いた。ＤＮＡを７０％のＥｔＯＨで１回洗浄し、乾燥させ、次いで１０μｌのｄＨ２Ｏに再懸濁した。ＤＮＡの半分を、Clontechのプロトコルに従い以下のごとくその後のＲＡＣＥ ＰＣＲ反応に用いられるべきMarathonアダプターライゲーションのために用いた：５μｌのｃＤＮＡを、２μｌ（１０ｍＭ）のMarathon(5'- CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT)、１×ＤＮＡライゲーションバッファー、および１μｌ（１Ｕ）のＴ４ＤＮＡリガーゼに添加した。反応混合液を一晩１６℃にてインキュベートした。混合液を最初のＲＡＣＥ反応のために１：５０希釈し、以下のものと共に０．２ｍＬのＰＣＲチューブに合わせた：４０μｌのｄＨ２Ｏ、１μｌの１０×Klentaq ＤＮＡポリメラーゼ(Clontech)、１μｌ（１０ｍＭ）のＡＰ１プライマー（5'-CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC）、１μｌ（１０ｍＭ）のＢＢＰ１−特異的プライマー（ヌクレオチド１８７−２０９に対応している；5'-CCAGACGGCCA GGCGGCCGCC AT）、５μｌの１０×Klentaqポリメラーゼバッファー、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰミックス、前記反応からの１μｌの希釈ｃＤＮＡ。以下のサイクリング条件を、Perkin Elmer GeneAmp PCRシステム2400熱サイクラーを用いて行った：変性サイクル９４℃１分間の後、３０”９４℃、３’７２℃にての５サイクル、３０”９４℃、３’７０℃にての５サイクルの後、３０”９４℃、３’６８℃の２５サイクル、最終的な７２℃にて延長７’。この後、ネスティッドRACE PCR反応を以下のように行なった：４０μｌのｄＨ２Ｏ、１μｌ(１Ｕ）の１０×AmplitaqGold DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer)、１μｌ（１０ｍＭ）ＡＰ２プライマー（5'-CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC）、１μｌ（１０ｍＭ）のＢＢＰ１−特異的プライマー（ヌクレオチド１７２−１９４に対応している；5'-CCAGACGGCCA GGCGGCCGCC AT）、５μｌの１０×Amplitaqポリメラーゼバッファー、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、１μｌの一次ＲＡＣＥ産物。ＰＣＲサイクリング条件は以下のようであった：９’９４℃にての最初の変性サイクル、３０”９４℃、３０”６８℃、２’７２℃にての２５サイクルの後、７２℃にて７’の延長。ＰＣＲ産物を１×ＴＢＥバッファー中１％のアガロースゲルに流した。生じた３５０塩基対産物をゲル精製し、ＴＡクローニングキット（Invitrogen)を用いて直接クローン化した。ライゲーション混合物をワンショットセル(Invitrogen)にトランスフォームし、Ｘ−galを含んでいるＬＢ−アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）寒天プレートに蒔いた。ミニ−プレップＤＮＡを得、ABI373シークエンサーにて蛍光ダイデオキシサイクル配列決定により試験した。
【００９３】
ノーザン分析：ヒトの複数の組織および複数の脳組織のｍＲＮＡノーザンブロットをClontech(Palo Alto, CA)より得た。オリジナルな融合ジャンクションからポリＡ領域まで伸長しているＢＢＰ１配列を、ｐＥＫ１９６からのＴＡクローンからＥｃｏＲＩフラグメントにて単離した。β−アクチンＤＮＡは、製造業者により提供された。放射能標識したプローブを、３２Ｐ−ｄＣＴＰ（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を組み込むためのランダムプライミング法を用いてこれらのＤＮＡから作製した。ハイブリダイゼーションをExpress Hyb溶液中６８℃にて製造業者(Clontech)の指示に従い行った。ブロットを２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）、０．０５％ＳＤＳ中室温にて洗浄した後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて２回洗浄した。ハイブリダイゼーションシグナルをKodak BioMaxフィルムに露出することにより視覚化した。
【００９４】
インサイチュハイブリダイゼーション：リボプローブ合成のためのＤＮＡの鋳型を、全長のヒトＢＢＰｃＤＮＡを含んでいるプラスミドクローンを用いてＰＣＲにより調製した。ｃＤＮＡの３’ＵＴＲに標的される単一のリボプローブを用いた。プローブの配列をGenBankデータベースに対してチェックし、それらが全寄託配列中の適当な標的のみを認識することを確認した。ＢＢＰ１のためのリボプローブを作製するために、オリゴヌクレオチドプライマーの対を設計し、ＢＢＰ１ｃＤＮＡの３’ＵＴＲから２７５塩基対領域を増幅し、加えて、Ｔ７（センス）およびＴ３（アンチセンス）ポリメラーゼのためのプロモーター配列を追加した。これらのプライマーは以下の配列を含んだ：5'-TAATACGACT CACTATAGGG TTAGAAGAAA CAGATTTGAG（フォーワード）；5'-ATTAACCCTC ACTAAAGGGA CAAGTGGCAA CTTGCCTTTG（リバース）。ＰＣＲ産物を１．５％の低融アガロースゲルにてゲル精製し、産物を含んでいるバンドを切り出し、フェノールおよびフェノールクロロホルム抽出し、次いでエタノール沈殿させた。ペレットを乾燥させ、１×ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。ＡＰＰリボプローブの鋳型は、Jacobsen et al. (Jacobsen, J, Muenkel, H, Blume, A, および Vitek, M (1991)により記載されているように、タンパク質コーディング領域からのDdel-XhoIフラグメントから成る。１５ｎｇのＤＮＡの鋳型を、（３５Ｓ）−ＣＴＰ（New England Nuclear, Boston, MA）およびリボプローブGeminiＴＭ システム (Promega, Madison, WI)を用いる転写反応のために用いた。
【００９５】
死後のヒト海馬のセクションを用いるインサイチュハイブリダイゼーションヒストケミストリーを、すでに記載されているように行った(Rhodes K., Monaghan M., Barrezueta N., Nawoschik S., Bekele-Arcuri Z., Matos M., Nakahira K., Schechter L., および Trimmer J. (1996))。電圧−ゲートＫ＋チャネルβサブユニット：成人ラットの脳におけるＫｖベータ１およびＫｖベータ２の発現および分布．J Neurosci 16, 4846-4860)。セクションをHacker-Brightsクリオスタット上で１０μｍに切断し、次いでVectabond試薬（Vector Labs, Burlingame, CA）でコートされた凍結（−２０℃）スライド上で溶解−固定した。全溶液は、０．１％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカルボネートで処理し、次いでオートクレーブしたｄＨ２Ｏにて調製した。セクションをＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）にての浸漬により固定し、次いで２×ＳＳＣ、ｄＨ２Ｏ、および０．１Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ８．０にて連続浸漬した。セクションを次いで、０．２５％（ｖ／ｖ）の無水酢酸を含んでいる０．１Ｍのトリエタノールアミンにての浸漬によりアセチル化し、０．２×ＳＳＣにて洗浄し、５０、７０、および９０％エタノールにて脱水し、そしてすぐに乾燥させた。０．９ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５×デンハルト、０．２５ｍｇ／ｍｌの一本鎖ニシン精子ＤＮＡ（GIBCO/BRL, Gaithersberg, MD）、５０％脱イオン化ホルムアミド（EM Sciences, Gibbstown, NJ）を１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）中に含んでいる１ｍｌの前ハイブリダイゼーション溶液を各スライド上にピペットし、スライドを３時間、５０℃にて湿った箱の中でインキュベートした。セクションを次いで５０、７０、および９０％のエタノール中での浸漬により脱水し、次いで空気乾燥した。標識したリボプローブを０．９ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１×デンハルト、０．１ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｍｌの一本鎖サケ精子ＤＮＡ、硫酸デキストラン（１０％）、０．０８％ＢＳＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）、および５０％の脱イオン化ホルムアミドを１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）中に含んでいるハイブリダイゼーション溶液へと５０，０００ｃｐｍ／μｌの最終濃度にて添加した。プローブを次いで９５℃にて変性し（１分）、氷上に置き（５分）、次いでセクションにピペットし、一晩５５℃にて湿ったチャンバーの中でハイブリダイズさせた。セクションを次いで１×４５分間３７℃にて１０ｍＭのＤＴＴを含んでいる２×ＳＳＣにて洗浄した後、５０％ホルムアミドを含んでいる１×ＳＳＣ中で１×３０分３７℃にて次いで２×ＳＳＣ中３７℃にて１×３０分間続けて洗浄した。一本鎖の、および非特異的にハイブリダイズしたリボプローブを、ウシ脾臓ＲＮＡｓｅＡ（Boehringer Mannheim; 40 mg/ml）、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含んでいる１０ｍＭのトリスｐＨ８．０中での浸漬により消化した。セクションを２×ＳＳＣ中で１時間６０℃にて洗浄した後、０．５％（ｗ／ｖ）のチオ硫酸ナトリウムを含んでいる０．１×ＳＳＣにて２時間６０℃にて洗浄した。セクションを次いで、０．３Ｍの酢酸アンモニウムを含んでいる５０、７０、９０％のエタノールにて脱水し、ついで乾燥させた。スライドをＸ−線カセット上にのせ、Hyperfilm b-Max(Amersham)に対して１４−���０日間向かわせた。満足のいく露出が得られたら、スライドを核−トラックエマルジョン（NTB-2; Kodak）でコートし、７−２１日間４℃にて露出した。エマルジョンオートラジオグラフを展開し、製造業者の指示に従い固定し、次いで下にある組織セクションをヘマトキシリンで染色した。非特異的な標識を評価するために、対照プローブをRiboprobe GeminiＴＭ System kit (Promega)にて提供される鋳型から作製した。このベクターをScalを用いて線形にし、Ｔ３ポリメラーゼを用いて転写した。生じる転写反応により２つの生成物、ベクター配列のみを含んでいる２５０塩基および１５２５塩基のリボプローブを得た。この対照プローブ混合物を前記のごとく標識し、５０，０００ｃｐｍ／μｌの最終濃度にてハイブリダイゼーション溶液へと添加した。特異的ハイブリダイゼーションは対照セクションでは観察されず、すなわち、これらのセクションは神経解剖学的ランドマーク（データは示していない）に従わない非常に弱い均一のハイブリダイゼーションシグナルを生じた。
【００９６】
実施例１：ＢＡＰ−結合タンパク質（ＢＢＰ１）のクローニングおよび単離
酵母２−ハイブリッド遺伝子スクリーンを進めて、潜在的にＢＡＰのより毒性の集合形態であると考えられるＡＡＰの４２アミノ酸タンパク質分解フラグメントであるヒトＢＡＰ４２と相互作用するタンパク質を同定した。ＢＡＰ４２は、酵母Ｇａｌ４ＤＮＡ−結合ドメインに融合して発現され、そしてまた、遊離タンパク質としても発現された（図１）。この株をヒト胎児脳ｃＤＮＡＹ２Ｈライブラリーで形質転換した。約１０６個の独立の形質転換体からの単一クローン、前記指定クローン１４は、一貫したレポーター遺伝子の活性化を生じ、ＧＡＬ４ドメインのものに連続する実質的なオープンリーディングフレームを含んだ。ｃＤＮＡインサートは９８４個の塩基対を含み、ポリ−Ａ領域にて終結した。この配列は、細胞膜を貫通するのに十分な長さおよび疎水性の２つの領域を有する２０１個のアミノ酸（配列番号２：アミノ酸残基６８〜２６９）をコードした。
【００９７】
ライブラリー由来のプラスミドをクローン１４から単離し、Ｙ２Ｈアッセイ株を再構築するのに用いた。これらの株の試験により、ＢＡＰ融合タンパク質が、反応はわずかであるが、クローン１４タンパク質と特異的に相互作用することが立証された。膜貫通領域などの強い疎水性のタンパク質ドメインはＹ２Ｈの反応を阻害するので、クローン１４インサートを先端切除して（以下、ＢＢＰ１Δｔｍ）、最も強い疎水性領域を切りだし、ＢＡＰとの相互作用に関して再試験した。よりいっそう強いＹ２Ｈ反応がＢＢＰΔｔｍを用いて観察され、欠失された配列が潜在的な膜貫通（「ｔｍ」）アンカーをコードするという所見を指示した。クローン１４のヌクレオチド配列をGenBankに対して検索し、こうして同定されたＢＡＰ結合タンパク質（ＢＢＰ１）が新規であることが見出された。
【００９８】
実施例２：ＢＢＰ１の５’末端の単離および確認
前記実施例１に記載するクローン１４に含まれるＢＢＰ１ｃＤＮＡ配列は、ポテンシャルな開始メチオニンコドンが存在しないのでタンパク質コーディング領域の５’末端を欠く。標準的な逆転写酵素を用いる常套の５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）を複数回行い、２７個のヌクレオチドの付加のみを得た。これらの配列はＡＴＧを含んだが同じ翻訳リーディングフレーム中に上流のストップコドンは含まず、これが開始コドンであることが確信された。遺伝子クローニングアプローチを行い、ＢＢＰ１遺伝子の５’末端を単離した。
【００９９】
クローン１４の５’配列の４００塩基対（ｂｐｓ）に対応しているランダムにプライムされたプローブとのヒトゲノムラムダライブラリーのハイブリダイゼーションにより、１０個のポジティブなクローンが同定された。クローン１４の最も上流のＢＢＰ１配列に対して指向される（および４００塩基対の５’上流配列に対応している）４５塩基のオリゴヌクレオチドプローブを用いるこれらのクローンのさらなる特定により、１０個のクローンの６個が、すでに同定された配列中に含まれる末端５’配列を含むことを明らかになった。他の４つのラムダクローンは、もとの４００塩基対ランダムプライムｃＤＮＡ由来プローブ内に含まれる他のエキソンを示した（データは示していない）。ＢＢＰ１の５’末端に対応している個々のクローンからのラムダファージＤＮＡの直接サイクル配列決定により、クローン１４に関して公知の配列の上流の、そしてそれとオーバーラップしている５００ヌクレオチドが明らかにされた。このさらなる配列は、インフレームのストップコドンが先行するＭＥＴに達する前に特定されるＭＥＴの上流の６２個のさらなるアミノ酸を潜在的にコードする。最も上流のＭＥＴから下流に、２つのＭＥＴ残基が存在したが、標準的な常套法により、ヒトＢＢＰ１遺伝子のアミノ末端の配列がインフレームストップコドンに続く最初の５’ＭＥＴを含むことが試験的に規定された。全コーディング領域および推定されるタンパク質配列を配列番号１および２に示す。このアミノ酸配列を含んでいるプラスミド（ＢＢＰ１−ｆｌと指定される）は、アメリカン タイプ カルチャー コレクションに寄託してあり、受入番号９８６１７を有する。
【０１００】
５’コーディング配列はゲノムライブラリーから得たので、この領域がイントロンを含む可能性があった。この可能性を２つの方法により調べた。１つめは、もとのクローン１４内にて５’ＭＥＴの領域に対して指向されるフォーワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、脳ｃＤＮＡならびにゲノムＤＮＡから配列を増幅した。同じサイズの産物が両方のサンプルから生じ、この領域内にイントロンが無いことが示され、もとの配列との上流配列の関連性が確認された。２番目に、ゲノムクローンから得られたものと同一のｃＤＮＡ配列を、変更５’ＲＡＣＥ実験（前記材料および方法を参照されたい）にて単離した。これらの所見により、上流配列が（ゲノムおよびｃＤＮＡ配列の両方から）確認され、この領域におけるイントロンの欠如が確認された。
【０１０１】
実施例３：ＢＢＰ１の特定
ＢＢＰ１を基本的なローカルアライメント検索ツール(BLAST; Altschul, S., Gish, W., Miller, W., Myers, E., and Lipman, D. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410)を用いてBenbankに対して比較した。２匹の線虫(Caenorhabditis elegans)および１匹のショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)ゲノム配列および多数のヒト、マウス、および他の哺乳動物発現配列タグを同定した。しかし、完全なｃＤＮＡ配列は得られず、遺伝子に帰属する機能データも得られなかった。ＢＢＰ棚Ｐ句質および入手可能な発現配列タグの翻訳物を並べ、保存されたセグメントに関して検索し、MoSTタンパク質モチーフ検索アルゴリズムにより評価した。これらの分析により、Ｇタンパク質結合レセプターファミリーに対する潜在的な進化上の関連性が明らかになった。詳細には、これらの分析により、ＢＢＰ１がＧタンパク質結合レセプターのｔｍドメイン３および４と等価の２つの潜在的な膜貫通（ｔｍ）ドメインを含むことが示された。間にある親水性ループは、このレセプターファミリーのほとんど全てのメンバーにおいて保存されており、そしてＧタンパク質活性化の分子トリガーとして役立つことが示されている(Acharya, S., および Karnik, S. (1996))、十分に特徴づけられた３つのアミノ酸モチーフ、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸、それに続くアルギニン（Ｒ）および芳香族残基（ＹまたはＦ）（一般にＤＲＹ配列とも呼ばれる）を含む。これらのデータにより、新規タンパク質がＧタンパク質−結合レセプタースーパーファミリーのメンバーと共通する機能モジュールを潜在的に含んでいることが示される。ＢＢＰ１は、２つの予測されたｔｍドメインの間に重要なＤＲＦ配列を保持し、Ｇタンパク質調節性のシグナリング経路に結合する潜在性を有し得る。
【０１０２】
ＢＢＰ１の構造分析により、それが、関連するＧタンパク質結合レセプターにおいてＧαタンパク質活性化配列であることが公知の構造モチーフを含むことが示唆された。ＢＢＰ１の、Ｇタンパク質カプレッドとの種々のメンバーとの相互作用を立証するＹ２Ｈアッセイを行った。ＢＢＰ１の予測される細胞内ドメインは、Ｇａｌ４活性化ドメイン融合タンパク質として発現されるラットのＧαｓ、Ｇαｏ、またはＧαｉ２の部分を有するＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインとして発現された。各株の２つの独立に導入されたクローンのＹ２Ｈ反応を、Ｇタンパク質成分（ベクター）を欠いている細胞の反応と比較した。構造予測に基き、ＢＢＰ１は、両方の末端を内腔区画に有して、膜を２回横切っていることが示される。他の配置を完全に除外することはできない。前記の潜在的なタンパク質相互作用をＹ２Ｈアッセイにて調べた。ＢＢＰ１Δｔｍクローンに含まれるＢＢＰ１配列の２つのオーバーラップしている部分を増幅し、Ｙ２ＨベクターｐＡＣＴ２（発現プラスミドｐＥＫ２１６およびｐＥＫ２１９、表２）にクローン化し、そしてタンパク質ＢＢＰ１ΔＮおよびＢＢＰ１ΔＣに対応した。ΔＣ構築物は、両ｔｍドメインを欠き、ΔＮ構築物は第一のｔｍドメインおよび先行する５２アミノ酸をコードした。これらの融合タンパク質をＢＡＰ融合タンパク質を用いてアッセイし、反応をより大きなＢＢＰ１Δｔｍタンパク質を発現している株の反応と比較した。これらの結果は、ＢＡＰとの結合のための主要な決定因子が、野生型ＡＰＰタンパク質においてＢＰＡと局所解剖学的に類似することが予想されるＢＢＰ１領域内に含まれることを示す。
【０１０３】
実施例４：ヒトＢＢＰ１発現の組織分布
ＢＢＰ１ｍＲＮＡの発現を、遺伝子の活性およびその産物の解明における初期工程として評価した。指定の組織から単離された、２μｇのサイズに断片化されたポリ−Ａ ＲＮＡでブロットしたナイロン膜を、CLONTECHから得た。これらを放射能標識したＢＢＰ１ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ブロットを除去し、ローディングおよびＲＮＡインテグリティコントロールとしてβ−アクチンで再プローブした；全レーンは、同等のシグナルを示した。
【０１０４】
１．２５ｋｇの主要な転写が全組織において認められた。心臓において高レベルの発現があった。脳は中レベルの発現を示した。別の脳領域由来のサンプルは全て、ＢＢＰ１の発現を示した。興味深いことに、大脳辺縁系は相対的に大量のＢＢＰ１ ｍＲＮＡを含んだ。ＢＡＰの集合およびそれに伴う神経毒が初期に生じる脳領域が存在する。高分子量の転写産物は異核ＲＮＡに対応することが考えられ、ＢＢＰ１遺伝子はいくつかのイントロンを含む。２つの異なる患者から得られたＢＢＰ１特異的リボプローブおよび死後の標本を用いて得られたインサイチュハイブリダイゼーションオートラジオグラムの分析により、ヒトの海馬および内網膜皮質において、ＢＢ１ｍＲＮＡが中〜大細胞において、神経膠細胞とは異なりニューロンにおける発現と一致するパターンで発現されることが示された。さらに、ＢＢＰ１ｍＲＮＡは、実質上全海馬および内網膜ニューロンで発現され、ハイブリダイゼーションシグナルの強度に関して、真のもしくは層状の差は全くないようである。ＢＢＰ１発現のパターンは、アミロイドプレカーサータンパク質ＡＰＰのｍＲＮＡに対して指向されるリボプローブを用いて認められるパターンと類似していた。まとめて、ＢＢＰ１ｍＲＮＡは、試験した全組織および全脳領域において認められた。ＢＢｐ１ｍＲＮＡの発現のインサイチュ分析も、海馬領域において強い発現を示した。
【０１０５】
実施例５：ＢＢＰ１発現の細胞株分布
ＢＢＰ１の発現を、多くの細胞株においてさらに調べ、データを、バイオテクノロジー情報に関する国際センターからの発現配列タグのコレクションであるｄｂＥＳＴから抽出した。逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて、組換えタンパク質発現のために一般に用いられる細胞株ならびに種々の癌細胞株におけるＢＢＰ１ｍＲＮＡの発現を定量評価した。ＢＢＰ１は、ハムスターＣＨＯおよびヒトＨＥＫ２９３細胞において観察された。シグナルは、胎児幹細胞株Ntera-2および神経芽細胞腫ＩＭＲ３２およびＳＫ−Ｎ−ＳＨにて観察された。ＢＢＰ１の発現は、以下の組織起源を示す癌細胞株において観察された：結腸(Cx-1、 Colo205、 MIP101、 SW948、 CaCo、 SW620、 LS174T）、卵巣（A2780S、 A2780DDP）、乳房（MCF-7、 SKBr-3、 T47-D、 B7474）、肺（Lx-1、 A5439）、黒色腫（Lox、 Skmel30）、白血病（HL60、 CEM）、前立腺（LNCAP、 Du145, PC-3）。以下の癌細胞株から単離されたｍＲＮＡをプローブしているノーザンブロットは、全サンプルにおいてＢＢＰ１の発現を示した：前骨髄球性白血病（ＨＬ−６０）、癌（ヒーラーＳ３）、慢性骨髄性白血病（Ｋ−５６２）、リンパ芽球性白血病（ＭＯＬＴ−４）、バーキットリンパ腫（Raji)、結腸直腸腺癌(SW 480)、肺癌(A549)、および黒色腫(G361)。
【０１０６】
実施例６：ＢＢＰ１のヒトＢＡＰ対齧歯動物ＢＡＰとの選択的相互作用
ヒトの配列と比較して、齧歯動物のＢＡＰ配列では、３つのアミノ酸が置換している（Ｇ５Ｒ、Ｆ１０Ｙ、およびＲ１３Ｈ）。齧歯動物のペプチドは低下した神経毒およびヒト脳ホモジェネートに対する結合の不在を示した。標識されたアミロイドペプチドの沈積によるアルツハイマー疾患β−アミロイドプラークのインビトロでの増殖は排除され得る。それゆえ、Ｙ２Ｈシステムにて、齧歯動物のＢＡＰのＢＢＰ１との結合を評価した。ｐＥＫ１６２におけるヒトＢＡＰの配列を、前記のようにＰＣＲによりオリゴヌクレオチド指向突然変異生成により変更して、齧歯動物のペプチドをコードするようにした。生じたプラスミド、ｐＥＫ２４０は、齧歯動物のペプチド配列に関してアミノ酸置換を生じる３つのコドン以外は本発明を通じて用いられるヒトＢＡＰ融合タンパク質発現プラスミドと同一であった。ＢＡＰ１タンパク質と齧歯動物およびヒトのＢＡＰ融合タンパク質の間の相互作用を、Ｙ２Ｈバイオアッセイにより比較した。ＢＢＰ１および齧歯動物のＢＡＰを発現している株は、増殖反応を生じなかった。この所見は、ＢＢＰ１がＢＡＰの神経毒効果の特定のメディエーターとして作用し、齧歯動物のＢＡＰの低下した神経毒性を説明するメカニズムを提供するという結論をサポートする。これらのデータをさらに用いて、ＢＡＰにおける３つのアミノ酸の置換は結合を完全に破壊するのに十分であったので、Ｙ２ＨアッセイにおいてＢＢＰ１／ＢＡＰの相互作用の高程度の特異性が説明される。
【０１０７】
実施例７：放射能標識したベータ−アミロイドタンパク質のＢＢＰ１タンパク質に対するインビトロ結合
まず、胎児脳ライブラリーから融合タンパク質として発現される新規な遺伝子産物は、酵母２ハイブリッドシステムにより融合タンパク質として発現されるベータ−アミロイドタンパク質（ＢＡＰ）と相互作用することが示された。これらの所見を確認するためにベータ−アミロイドタンパク質の全長のＢＢＰ１タンパク質に対する潜在的な結合を、インビトロラジオリガンド結合アッセイにおいて調べた。詳細には、ヒトベータ−アミロイドタンパク質（１−４２）は、タグ付けされたＢＢＰ１タンパク質とベータアミロイドタンパク質を共沈させることができる能力により明らかなように、インビトロで合成されたmyc-タグＢＢＰ１タンパク質と結合することが示された。ラジオリガンド結合アッセイの詳細を以下に示す。
【０１０８】
タンパク質Ａアガロースビーズ＋二次抗体の複合体が、２．５μＬのImmunoPurePlus免疫化タンパク質Ａ（Pierce, Rockford, IL）を１０ｍｇのAffiniPureウサギ マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA）と５０ｍＬの冷塩結合バッファー（５０ｍＭのトリスｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ １％ＩＧＥＰＡＬ、およびプロテアーゼインヒビター（５μｇ／ｍＬのロイペプチン、５μｇ／ｍＬのアプロチニン、２μｇ／ｍＬのペプスタチンＡ、０．２５ｍＭのＰＭＳＦ）中で一晩４℃にて回転させながらインキュベートすることにより生じた。ビーズを４回１ｍＬの結合バッファーで洗浄し、１．２５ｍＬの結合バッファーに再懸濁して、５０％のスラリーを得た。いくつかの具体例において、このスラリーの２５０ｍＬの部分をSuperblock(Pierce)にて、一晩４℃で回転させながらインキュベートした。ビーズを４回１ｍＬのSuperblockで洗浄し、１２５μｌのSuperblockに再懸濁した。
【０１０９】
Kozakコンセンサス配列、およびＢＢＰ１コーディング領域の第一メチオニンのすぐ上流の、mycエピトープをコードしている配列、ＥＱＫＬＳＥＥＤＬを含むＢＢＰ１タンパク質のインビトロ転写／翻訳のためのＤＮＡ鋳型を、ｐＳＰ６４ポリＡベクター（Promega, Madison, WI）のBamHI/EcoRI部位に挿入した。ＤＮＡ鋳型は、フォーワードプライマー、5' GCAGGATCCCCACCATGGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGCATATTTTAAAAGGGTCTCCCAATGTGA 3'およびリバースプライマー5' TCACGGCCTCCGGAGCAGACGG 3'、およびＰＦＵポリメラーゼを製造業者の条件（Stratagene, La Jolla, CA）に従い用いてＰＣＲ作製した。ＰＣＲサイクリング条件は、９５℃３分間の最初の変性工程、９４℃３０秒間の変性、６５℃にて３０秒間のアニーリング、７２℃にて１分３０秒間の伸長の３０サイクルの後、７２℃にて５分間の最終的な伸長を行うものであった。アンプリコンをBamHI＋NotIにて消化し、ＢＢＰ１の３’末端にライゲートし、組換え発現カセットから予めゲル精製したNotI/EcoRIフラグメントに関して挿入した。
【０１１０】
約２．５μＣｉの構成単位に分けたヒト[１２５Ｉ]−Tyr-Ab(1-42)(American Radiolabeled Chemicals, Inc., St. Louis, MO)を５−１０ｍｌのＮ−末端ｃ-mycタグ付ヒトＢＢＰ１（ＴＮＴ ＳＰ６ Coupled Reticulcyte Lysateシステム[Promega, Madison, WI]を用いて得た１／５−１／１０の反応体積）と共に、回転させながら〜６時間４℃にて１ｍＬの冷低塩結合バッファー（前記を参照されたい）の最終体積中にてインキュベートした。２−マイクログラムのマウスのａ−ｍｙｃおよび２５ｍＬのアガロースタンパク質Ａ／ウサギａ−マウスＩｇＧ複合体（前記を参照されたい）を反応チューブに添加し、４℃にて一晩回転させながらインキュベートした。免疫複合体を４回１ｍＬの結合バッファーで洗浄し、５％のｂ−メルカプトエタノールを含んでいる２５ｍＬの２×トリシンローディング色素（Novex, San Diego, CA）に再懸濁した。サンプルを５分間煮沸し、すぐに氷上に１５分間置いた。チューブを簡単に２５００×ｇにてスパンし、上清を１６％のトリシンポリアクリルアミドゲル（Novex, San Diego, CA）にロードし、これは５０mAにて９０分間流した。ゲルを１５分間、２０％の酢酸／１０％のメタノールから成る乾燥溶液中に浸し、８０℃にて１時間真空下に乾燥させた。乾燥ゲルを一晩、分析のためにStormホスホイメージャー（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）でスキャンするホスホイメージャースクリーンに供した。
【０１１１】
放射能標識ＢＡＰをｍｙｃ−タグＢＢＰ１と共−免疫沈降させることを試みる最初の実験により、アガロースタンパク質Ａ／二次抗体複合体を低塩結合バッファー中に調製した場合、ＢＢＰ１を欠いているサンプルにおいてさえ、ＢＡＰの非特異的結合を生じた。これらの非特異的相互作用を減らすために、アガロースタンパク質Ａ／ウサギa-マウスＩｇＧを結合前に前記のようなブロッキング試薬にてインキュベート／洗浄した。ブロッキング工程により、全免疫沈降成分が入手可能である場合、ｍｙｃ−タグ付ＢＢＰを除き、０近くまで非特異的Ａｂ結合が低下した。放射能標識したヒトのＢＡＰ（１−４２）は、Ａｂとサイズが一致するバンドにより認められるように、抗−ｍｙｃでｍｙｃ−タグ付されたＢＢＰ１を免疫沈殿させた後にインビトロで転写／翻訳されたｍｙｃ−タグ付ヒトＢＢＰ１と複合体を形成することができた。これらのデータは、インビトロにおけるｍｙｃ−タグ付ヒトＢＢＰ１に対するヒトＢＡＰ結合と一致し、ＢＡＰがＢＢＰ１と相互作用するという酵母２−ハイブリッドシステムにての最初の観察をサポートする。
【０１１２】
実施例８：組換えＢＢＰ１の発現により、β−アミロイドペプチドに対してＮＴＥＲＡ２幹細胞が感作される。
培養細胞株を利用して、ＢＡＰの毒性に対する細胞の感受性におけるＢＢＰ１の発現の効果を調べた。ヒトNtera-2（Nt2)幹細胞を誘導して、ニューロン様細胞へ分化させることができる(P. Andrews, Dev. Biol. 103:285-293, 1984)。この場合、細胞は、一次ニューロンにおいて観察されるものと同じ程度のＢＡＰに対する脆弱さを示す。ＢＡＰにより影響をうけたニューロンは、死ぬ前にアポトーシスと特徴を示す。アポトーシスの初期の指標、クロマチンの凝集をＢＡＰに対する細胞反応の指標として用いた。未分化の幹細胞は、これらの試験において用いられる実験条件下に有意な感受性を示さなかった。しかし、ＢＢＰ１発現プラスミドでトランスフェクトしたNt2幹細胞は、適用されるＢＡＰに対して懸著に感受性となり、ＢＢＰ１がβアミロイドペプチドの毒性効果のメディエーターとして作用し得るという仮定を支持する。実験の詳細は以下のようである。
【０１１３】
ＢＢＰｃＤＮＡを、ベクターｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)からの発現のためにポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により変更した。ＢＢＰ１ｃＤＮＡをｐＢＢＰ１−ｆから増幅して、クローニングのために５’ＥｃｏＲＩおよび３’ＳａｌＩ部位を付加した。ＰＣＲプライマーは、5' - TGGTGAATTC GAAAGTGTCG GTCTCCAAG ATG G（＋鎖）および5' - CTTCGTCGAC TTA TGG ATA TAA TTG CGT TTT TC（−鎖）であった。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ＋ＳａｌＩで消化して、ｐｃＤＮＡ３．１／ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩへとクローンして、ｐＯＸ３６３を作製した。ＢＢＰ１ｃＤＮＡの「ＤＲＦ」モチーフ内のアルギニンコドンの変異形成をQuickChange システム(Stratagene Co., La Jolla, CA)を用いて行った。オリゴヌクレオチドを合成し、Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, TX)により精製した。ｐＯＺ３６３中のＢＢＰ１のＲ１３８コドンを、オリゴヌクレオチド5' - GG TTG GGA GCA GAT GAA TTT TAC CTT GGA TAC CCおよびその正確な逆相補物を用いてグルタミン酸コドンへと変えた。
【０１１４】
ヒトNtera2(Nt2)幹細胞を、１０％子牛血清を追加したダルベッコの変更イーグル培地（高グルコース）中に維持した。レチノイン酸を用いて、P. Andrews (Dev. Biol. 103:285-293, 1984)により記載されているようにニューロン表現型へと細胞を分化させた。発現構築物をエレクトロポーレーションにより幹細胞へと導入した。細胞を最高の生存および効率の指数関数的増殖を確実にするために、エレクトロポーレーションの前日に１：２に分けた。エレクトロポーレーションの日、細胞をトリプシンで処理し、２回リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。それらを１０ｍＭのデキストロースおよび０．１ｍＭのジチオトリオトールを含むＲＰＭＩ１６４０中０．３ｍｌ当たり１．３×１０７細胞にて再懸濁した。ＤＮＡの量は、トランスフェクションをモニターするための２．５ｍｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ１（CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA）を含む７．５ｍｇの対象ＤＮＡであった。細胞を１０分間氷上にてＤＮＡと共に前−インキュベートし、１０分間氷上でポスト−インキュベートした。GenePulser(BioRad Corp., Hercules, CA)を０．４ｃｍのキュベットギャップ、０．２４ｋＢの電圧および９６０ｍＦのキャパシタンスにて用いた。細胞を標準的な２４−ウェルのプレートに蒔いた。トランスフェクションの約２４時間後、増殖培地を指定濃度のＢＡＰを含んでいる培地に置いた。４４〜４８時間のインキュベーション後、クロマチン特異的色素Hoechst33342(分子プローブ、Inc., Eugene, OR)を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。培地を１０分後に除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞を次いで、４％のパラホルムアルデヒドを含んでいるＰＢＳ中に浸漬により固定した。
【０１１５】
４０残基のβ−アミロイドペプチドを、AnaSpec, Inc., San Jose, CAから得た。ペプチドを１ｍｇ／ｍｌにてヘキサフルオロ−イソプロパノール中に溶解および保存した。ペプチドを窒素での浸透により凍結乾燥し、次いで１．１５５ｍｌの細胞増殖培地に再懸濁し、９６ウェルのプレート中、０．１３ｍｌの部分に分けた。プレートを次いで５００ｒｐｍにて４時間振とうした。サンプルを次いで合わせ、５０ｍＭの最終ＢＡＰ濃度へと規格化した。記載する実験に用いた凝集した（または成熟した）ＢＡＰの同じ調製物も、一次海馬ニューロンに対して毒性であることが示された。４２残基のβ−アミロイドペプチドをBachem Bioscience Incから得た。それを細胞増殖培地に直接溶解し、実験サンプルに添加した。この調製物は、分化したＮｔ２ニューロンにおいて懸著な効果を有しなかった。
【０１１６】
細胞を、二色性フィルターを以下のように備えたZeiss Axiovert蛍光顕微鏡にて視覚化した。Hoechst色素ヴィジュアライゼーションは、３３０ミクロンの励起、４５０のエミッションを用い、EGFPヴィジュアライゼーションは、４７５の励起、５３５のエミッションを用いた。最少６０個のトランスフェクト（ＥＧＦＰ＋）細胞をサンプル当たりにスコアした。β−アミロイドペプチドは、成熟後繊維状の凝集物を生じた後にのみ、培地中で実質上の神経毒性を示した。培地に新たに溶解されたペプチドは、低下した有効性を示した。ＢＡＰ−媒介性の毒性における潜在的なＢＢＰ１の効果を調べるために、Nt2幹細胞をｐＥＧＦＰまたはｐＥＧＦＰ＋ＢＢＰ１発現プラスミドｐＯＺ３６３にて記載のごとくトランスフェクトした。
【０１１７】
サンプルを、凝集Ａβペプチドで４８時間処理し、生存率を評価した。これらの実験条件下で、Ａβ処置は対照サンプルに対して有意な毒性効果を持たなかった。しかし、ｐＢＢＰでのトランスフェクションにより、Ａβに対する感受性が有意に増加し、トータルの細胞の平均２２％が損失し、ＢＢＰの発現がＡβに対する感受性を刺激することを示した。毒性の凝集Ａβに曝されたニューロンは、死ぬ前にアポトーシスの特性を示す。ＢＢＰ−特異的Ａβ毒性にアポトーシス現象が含まれるかどうかを決定するために、核形態アッセイを行った。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をｐＥＧＦＰ＋試験プラスミドで二重にトランスフェクトし、毒性Ａβで処置し、次いでトランスフェクト細胞の核形態をHoechstクロマチン色素で染色後、蛍光顕微鏡により評価した。これらの実験に含まれたのは、ＤＲＦモチーフ中アルギニンに対してグルタミン酸を置換するべく変異されたＢＢＰ発現プラスミドであった。対応しているＲ＞Ｅ置換は、７−ｔｍドメインＧＰＣＲの活性を排除することが示された。ｐＢＢＰでのトランスフェクションにより、萎縮核の実質上および有意な増加を生じ、そしてこの反応は、Ｒ＞Ｅ置換により妨げられた（図３）。細胞溶解物の抗−ＢＢＰ免疫ブロットにより、Ｒ＞Ｅ置換がタンパク質の発現を変化させないことが立証された。ｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅサンプルにおいて反応がないことは、ＢＢＰがヘテロ三量体Ｇタンパク質に結合することによりＡβの毒性を調節することを示唆した。この可能性をさらに調べるために、サンプルをＧｉ／ｏインヒビター百日咳毒にて処置した。この処置により、ＢＢＰによるＡβに対する細胞の感受性が排除された。同じ結果が、トランスフェクトＮｔ２幹細胞において観察された。さらに、ｐＢＢＰでトランスフェクトしたＮｔ２幹細胞を、非選択的カスパーゼインヒビターＢＯＣ−Ａｓｐ（Ｏｍｅ）−フルオロメチルケトン（ＢＡＦ）にて処理し、カスパーゼの関与を評価した。ＢＡＦでの処置により、ＢＢＰ−トランスフェクト細胞においてＡβにより媒介される核萎縮の誘導が排除された（図４）。これらのデータはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で反復された。これらの所見は、ＢＢＰがニューロンタイプの細胞において、Ｇタンパク質調節性カスパーゼ依存性シグナリング経路によりＡβ誘導性のアポトーシスを媒介することを示す。
【０１１８】
一次ニューロンにおいて実質上の毒性を導き出すのはヒトＡβの成熟（即ち、凝集）調製物のみであり、非凝集ヒトペプチドまたは凝集齧歯動物ペプチドは非常に低下した毒性しか与えない。ｐＢＢＰでトランスフェクトした細胞は、Ａβ調製物に関して同じ感受性を示し、非凝集Ａβ、成熟逆ペプチド、または齧歯動物の配列から成る成熟Ａβに関しては効果を示さなかった（図５）。齧歯動物の配列から成るＡβに対する反応がないことは、結合アッセイにおいてヒトＢＢＰがこのペプチドと相互作用することができないことと関連する。これらのデータは、細胞培養物における、ＢＢＰ／Ａβ毒性を導くペプチド状態およびタイプに関する選択性がニューロンにおけるＡβ毒性に関して要求されるものに匹敵することを示す。さらに注目すべきことに、ＢＬＰ１またはＢＬＰ２発現プラスミドでトランスフェクトした細胞では、Ａβに対するアポトーシス反応に変化がなかったので、Ａβの毒性はＢＢＰサブタイプにのみ特異的である。
【０１１９】
Ａβの分子標的としてＢＢＰを含めることに対して中心となるのは、ＢＢＰのシグナリング欠損変種がヒトＮｔ２ニューロンにおけるネイティブなＢＢＰの活性を遮断し、Ａβによるアポトーシスの誘導を阻害することができるという所見であった。これらのデータにより、ＢＢＰタンパク質により、Ａβにより開始されるニューロンアポトーシスが調節されることが強く示唆される。ＢＢＰの発見により、アルツハイマー疾患の複雑な病態生理において考慮されるべき重要な新規分子が提示され、新規な治療的アプローチの強い要求に有望な新規標的が提供される。
【０１２０】
実施例９：抗体作製、免疫ブロット
予測されたＢＢＰ外部ドメイン配列を、５つの非−オーバーラッピングペプチドとして合成した。ペプチドをプールし、販売者の指示(Pierce)に従い、活性化されたＫＬＨキャリアタンパク質と結合させた。ニワトリを、０．１ｍｇペプチド／ＫＬＨで各週４週間筋肉内注射した。卵を集め、ＥＬＩＳＡにより各ＢＢＰペプチドに対するＩｇＹ力価に関して試験した。希釈および硫酸アンモニウム沈降により卵黄からＩｇＹを部分精製した。このサンプルを、残基４２−８１から成るＢＢＰペプチドに対する固相アフィニティ結合によりさらに精製した。組換えＢＢＰタンパク質の発現を、チャイニーズハムスター卵巣細胞溶解物にて評価した。細胞を製造業者(Life Technologies)の指示に従いリポフェクトアミン−ＰＬＵＳによりｐＢＢＰでトランスフェクトした。細胞を低張バッファー（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２；１ｍＭ ＥＤＴＡ）＋プロテイナーゼインヒビター中に懸濁し、氷上に維持した。細胞をポリトロンを用いて破壊し、破片を遠心分離器中２，０００ｒｐｍにて遠心分離により除去した。可溶性および膜フラクションをＴＬ１００遠心分離器(Beckman Instruments)中４５Ｔｉローターを用いて２００，０００×の遠心分離により分離した。膜ペレットを１％のトライトンＸ−１００＋プロテイナーゼインヒビターを含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）に再度溶解した。界面活性剤および２−メルカプトエタノールを含むLaemmliバッファーを、５０μｇのタンパク質を含んでいる部分に添加し、サンプルを電気泳動前に５分間、４〜１０％トリス−グリシンNuPageゲル(NOVEX)中で煮沸した。サンプルを半乾燥法（BIORAD)によりＰＶＤＦ膜へと写した。ブロットを、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたウサギ抗−ＩｇＹ（Promega)を二次検出試薬として用いて、前記のニワトリ抗−ＢＢＰ抗体でプローブした。タンパク質を、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ試薬を用いた展開およびHyperfilm(Amersham)に対する露出により視覚化した。タンパク質の脱グリコシル化を、酵素ＰＮＧアーゼＦ、ＮＡＮアーゼＩＩ、およびＯ−グリコシダーゼＤＳを製造業者の指示に従い(BIORAD)に従い用いて達成した。
【０１２１】
実施例１０：内在ＢＢＰ活性の評価
ＢＢＰ−Ｒ＞Ｅ変種は、Ａβに対するアポトーシス反応を媒介することができない。一時的トランスフェクションアッセイを用いて、ＢＢＰ−Ｒ＞Ｅが、ドミナントネガティブなタンパク質として作用することができるかどうかを決定した（もしそうであるならばヒトニューロンにおける内在性のＢＢＰの活性を評価し得る）。Ｎｔ２幹細胞を、ベクター、ベクター＋ｐＢＢＰ、ベクター＋ｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅまたは両ｐＢＢＰ＋ｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅのいずれかから成るｐＥＧＦＰ＋等量の混合ＤＮＡでトランスフェクトした。これらのサンプルをＡβで攻撃し、形質転換体を核形態に関してスコアした。既に示されているように、ＢＢＰはＡβ媒介性のアポトーシスを刺激し、Ｒ＞Ｅ置換を含んでいるタンパク質は不活性であった。ｐＢＢＰ＋ｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅでトランスフェクトした細胞はネガティブな表現型を示し（図６）、ＢＢＰ−Ｒ＞Ｅ不活性変種が野生型タンパク質に対して表現型的にドミナントであることが立証された。
【０１２２】
Ｎｔ２幹細胞は、レチノイン酸での処置によりニューロンの形態学的、遺伝学的、および生理学的特性を有している細胞へと分化することができる。ＢＢＰ ｍＲＮＡのレベルをＮｔ２幹細胞およびニューロンにおいて評価し、＞２０倍のＢＢＰ遺伝子発現の増加が分化した細胞で認められた。幹細胞およびニューロンを、ｐＥＧＦＰ＋ベクター、ｐＢＢＰまたはｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅでトランスフェクトし、Ａβ−誘導性のアポトーシスに関して試験した。結果を表３に示す。Ｎｔ２細胞はニューロンへの分化かまたはｐＢＢＰでのトランスフェクションによるかのいずれかによりＡβに対して感受性となった。ｐＢＢＰでのニューロンのトランスフェクションは、さらなる影響を持たなかった。ｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅドミナントネガティブ変種でのニューロンのトランスフェクションにより、Ａβの暴露によるアポトーシスの誘導が、おそらくは内在ＢＢＰタンパク質の活性を阻害することにより実質上低下した。これらのデータは、ＢＢＰタンパク質がヒトのニューロンにおいてＡβ誘導性のアポトーシスにおいて主要な役割を果たすことを示唆する。
【０１２３】
【表３】
2005506831.tif 000004
【０１２４】
Nt2幹細胞および分化したニューロンにおけるＢＢＰ ｍＲＮＡレベル（任意ユニット）を、ＢＢＰタンパク質コーディング領域内に含まれる配列でプローブする定量ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。サンプルを１０μＭの成熟Ａβにて４８時間処理し、トランスフェクト細胞の核形態を本明細書中に記載されるように測定した。値は、標準エラーを有する３つの独立した実験の実験の平均を示す。ｐＢＢＰまたはｐＢＢＰ−Ｒ＞Ｅトランスフェクションサンプルの統計学的有意性（＊Ｐ＜０．０１；Yates G-試験）を、ベクターコントロールに対して試験することにより決定した。
【０１２５】
実施例１１：ヒトＢＢＰ１のスプライス変種は、ＡＬＵ反復エレメントを含む。
ＲＮＡにおけるリバース−トランスクリプターゼポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または市場入手可能なｃＤＮＡにおけるＰＣＲのいずれかを用いる種々のヒト組織におけるＢＢＰ１ ｍＲＮＡの発現に関する試験中、２つのアンプリコンが認められた。これらのアンプリコンのクローニングおよび配列決定により、２つのｍＲＮＡの存在が明らかになった：小さい方のアンプリコンは、すでに決定されたＢＢＰ１に対応するｃＤＮＡのセグメントを示し、一方、大きいほうのアンプリコンは、ＢＢＰ１配列とインフレームでその３’末端付近に挿入された、ＡＬＵ反復エレメント由来の追加の〜１２０ヌクレオチドを含んだ。GenbankにおけるＢＢＰ１の完全なゲノム配列の存在により、予測されたイントロン内の、および正規のアクセプターおよびドナーｍＲＮＡスプライス部位配列がそれぞれその５’末端および３’末端に隣接するこの正確な〜１２０ヌクレオチドのＡＬＵ反復エレメントの存在が示される。これらのデータは、別のスプライシングメカニズムにより作製される〜１２０ヌクレオチドのＡＬＵ由来の配列の存在または不在により異なる、ＢＢＰ１ ｍＲＮＡの２つの形態の遍在発現と一致する。
【０１２６】
リバース−トランスクリプターゼポリメラーゼ鎖反応：種々の組織からのヒトポリＡ＋ｍＲＮＡ(Clontech and Invitrogen)を、サーモスクリプトＲＴ−ＰＣＲシステムを製造業者のプロトコル（Life Technologies）に従い用いるランダムプライミングによりｃＤＮＡへと変換した。このｃＤＮＡまたは市場入手したｃＤＮＡ(Clontech)を、フォーワードおよびリバースプライマーの２つの異なるセットを用いるＰＣＲにより増幅した：１つのセットはフォーワードプライマー、ＪＢ４４、5' CGAGGAGTCGCTTAAGTGCGAGG 3'およびリバースプライマー、ＪＢ４５、5' CAGTCTTGTAAG TCTGGTTCCATAG 3'を用い、一方、第２のセットはフォーワードプライマー、ＪＢ５３、5' GGCACTTTCAGAGGACCGAGAAG 3'およびリバースプライマー、ＪＢ２５１、5' ATATCCCATACTG GATGGAGGCTG 3'を用いた。ＰＣＲを、エクスパンド ロング ポリメラーゼキットを製造業者の条件(Roche Biochemicals)に従い、９５℃にて３分間の初期変性工程、９４℃にて３０秒間の変性、６５℃にて３０秒間のアニーリング、６８℃にて１分３０秒間の伸長の３０−４０サイクルの後、６８℃にて５分間の最後の伸長を行うＰＣＲサイクリングを用いて行った。ＰＣＲ産物を次いで１％アガロースゲルに流した。いくつかの場合に、適当なバンドをゲルから切り出し、Quantum Prep Freeze'N Squeeze DNA抽出カラム(Bio-Rad)により精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター(Promega)にクローン化した。配列決定をABI3700を用いるBigDyeターミネーターダイデオキシ配列決定により行った。配列の分析を、DNAスターソフトウェアパッケージを用いて行った。
【０１２７】
発明者らは、ＢＢＰ１コーディング領域由来のプライマーを用いてｃＤＮＡにおいてＰＣＲを行うことにより、１６個の異なるヒト組織からのＢＢＰ１ ｍＲＮＡの発現を調べた。前立腺、精巣、卵巣、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格、腎臓、膵臓を含む１１個の組織が約１２０異なる２つのバンドを示した。上の方のおよび下の方のバンドを単離し、クローン化し、次いで配列決定した。小さい方の下の方のバンドは、すでにＢＢＰ１として同定されたものと同一のＰＣＲフォーワードおよびリバースプライマー（例えば、ＪＢ４４およびＪＢ４５）の間の配列を含んだ。脳および膵臓両方に関して大きい方の上の方のバンドは、追加の〜１２０ヌクレオチドのＡＬＵ由来の反復エレメントを有する対応するＢＢＰ１配列を含んだ（図９を参照されたい）。インフレームストップコドンに達する前のＡＬＵ配列の存在により、ＢＢＰ１由来であるが(ＢＢＰ１−由来配列に関して）アウトオブフレームの７つのアミノ酸が後に続く、追加のインフレームＡＬＵ由来の４４アミノ酸が翻訳されることが予想される。それゆえ、ＡＬＵを含んでいるｍＲＮＡは、非ＡＬＵ ＢＢＰ１ ｍＲＮＡに対して同一の５’末端を示しているが、異なる３’末端を含んでいるタンパク質を翻訳すること；詳細には、非−ＡＬＵ ＢＢＰ１ ｍＲＮＡからの３６個のアミノ酸と比較して追加の新たに誘導される４４個のアミノ酸を発現していることが予想される。これにより、より短い非−ＡＬＵ含有ＢＢＰ１タンパク質と比較した場合に、ＡＬＵ含有ＢＢＰ１タンパク質に関して１５個のアミノ酸または〜１．７Ｋｄの正味の増加を生じる。さらに、ＡＬＵ−を含んでいる種におけるＣ末端でのＢＢＰ１タンパク質の３６個のアミノ酸の不在は、アミノ酸２３７で始まって位置している「ＰＸＤＧＳ」ボックスの欠損と一致する。「ＰＸＤＧＳ」モチーフは、アポトーシス経路をコントロールするのに関与し、それゆえ、２つのｍＲＮＡ種の間のこの「ＰＸＤＧＳ」配列のディファレンシャル発現が、別の機能上の重要性を有する可能性がある。
【０１２８】
これらの所見を確証し、ＡＬＵを含んでいるＢＢＰ１ ｍＲＮＡが第１のＭＥＴからＡＬＵ配列へと伸長している野生型配列を含むということを確認するために、発明者らはＰＣＲアンプリコンを伸長し、ＡＬＵ配列の下方の５’非翻訳領域からの領域を組み込んだ。この目的のために、５’ＵＴ領域内に位置づけられるフォーワードプライマー、ＪＢ５３およびＡＬＵ配列内に位置づけられるリバースプライマー、ＪＢ２５１を、ランダムにプライムしたヒト脳ｍＲＮＡに関して行った。リバースプライマー、ＪＢ２５１はＡＬＵ配列に特異的であったので、ＡＬＵを含んでいるＢＢＰ１ ｍＲＮＡを増幅することのみが予測された。期待されるサイズのアンプリコンをクローン化し、配列決定し、すでにクローン化し、配列決定したＢＢＰ１と、３’末端の追加のＡＬＵ由来配列を除いて１００％同一であることが明らかにされた。ＢＢＰ１に対してその５’末端においてインフレームであるが、その３’末端においてはアウトオブフレームである〜１２０個のヌクレオチドのＡＬＵ由来配列の存在または不在によってのみ異なる２つのＢＢＰ１ ｍＲＮＡ種を複数の組織が含むと、発明者らは結論付ける。
【０１２９】
２つのｍＲＮＡ種の存在を説明し得る可能なメカニズムは、：（１）ＡＬＵエレメントを含んでいる１つの遺伝子を有する２つの別個の遺伝子、または（２）同じ遺伝子由来の、ＡＬＵを含むエキソンの別の利用に至る二者択一的なスプライシングのいずれかである。サザンブロットアプローチにより２つの別個のｍＲＮＡに関しての決定因子としての２つのＢＢＰ１遺伝子の存在を直接つきとめることができるが、発明者らはそのような分析を今日まで行わなかった。しかし、GenBankにおける近年のエントリー（受入番号#AC025691)の分析は、ＢＢＰ１の全コーディング領域を含んでいる大きなゲノム配列を示して、二者択一的なｍＲＮＡスプライシングの第２の提案されるメカニズムと一致する。詳細には、受入番号#AC025691からの109275と109404の間に位置して、前記のＲＴ−ＰＣＲ実験により見出されるものと同一のＡＬＵ配列が存在する。さらに、このＡＬＵ配列には、正規のＲＮＡスプライシングシグナル配列がそれぞれ、調整された５’および３’において隣接している（例えば、ＧＴおよびポリ（Py)ＡＧ）。ＡＬＵエレメントの３’であることが予測されるエキソン６は、このゲノム配列中のＡＬＵ配列の下流、106029-105919の間（ＤＮＡのこのゲノム片の逆配向に関して修正された場合）に見出される。合わせて、データは、ＲＮＡの３’末端にＡＬＵエレメントを含んでいるものである、二者択一的にスプライスされたＢＢＰ１ ｍＲＮＡの存在を示唆する。翻訳予測により、サイズが１．７Ｋｄまで異なり、Ｃ末端部分の配列が異なる２つのタンパク質が合成されると結論づけられる。
【０１３０】
実施例１２：ＡＰＰとのＢＢＰ１の物理学的結合
Ａβに対するＢＢＰ−１特異性アポトーシスは、百日咳毒により、またはＯＦＲモチーフにおけるアルギニンの置換により遮断され、ヘテロ三量体Ｇタンパク質に対する結合が示唆される。アミロイドプレカーサータンパク質（ＡＰＰ）はＧαｏタンパク質と物理的および機能的に結合して、アポトーシスを誘導する。それゆえ、ＢＢＰ１がＡＰＰと結合して、機能的Ｇタンパク質結合レセプターを形成すると仮定された。この仮説をまずＹ２Ｈアッセイにて、次いでトランスフェクト細胞からの共−免疫沈降により試験した。
【０１３１】
Ｙ２Ｈアッセイ株を増殖させて、ＡＰＰとＢＢＰタンパク質の外部ドメイン間の潜在的な結合に関して前記のごとく試験した。驚くべきことに、全３つのＢＢＰタンパク質は弱くポジティブにスコアされた。同様の実験をＡＰＰ−様タンパク質ＡＰＬＰ２を用いて行った。これらのアッセイでは、ＢＢＰ１サブタイプのみがＡＰＬＰ２に対する有意なＹ２Ｈ結合を示した。
【０１３２】
ＢＢＰ１ ｃＤＮＡを変更して、シグナルペプチダーゼ部位に対して４個アミノ酸Ｃ末端に位置する二重ｍｙｃエピトープを含めた。ｍｙｃ−ＢＢＰ１発現プラスミドをＣＨＯ細胞へとＡＰＰ発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。対照トランスフェクションは、ＢＢＰ１を欠いているか、またはＡＰＰを欠いているサンプルを含んだ。溶解物を抗−ｍｙｃ抗体で免疫沈降し、抗−ＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いるウェスタンブロッティングに供した。ＡＰＰに対応しているバンドが、ｍｙｃ−ＢＢＰ１＋ＡＰＰを含んでいるサンプルにおいてのみ観察された。これらのデータは、ＢＢＰ１とＡＰＰがインビボで物理的結合を形成し得ることを示唆する。
【０１３３】
Ｙ２Ｈ法は、前記のように記載したものであった。Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを生じるべく用いられるＡＰＰおよびＡＰＬＰ２セグメントはＮ−末端シグナル配列の近くで始まり、膜貫通領域へと伸長した。免疫沈降のために、ＣＨＯ細胞をｐＡＰＰ、ｐＢＢＰ１またはベクターの混合物を前記のように用いてトランスフェクトした。細胞をＩＰバッファー（５０ｍＭのトリスｐＨ７．２、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｎＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ−４０、０．５％のＮａデオキシデオキシコレートをプロテーアインヒビターと含む）中でトランスフェクション後２４時間溶解した。溶解物をタンパク質Ａ−アガロースの５０％ｖ／ｖスラリーにて安全性を予め保証した。抗−ｍｙｃ抗体（Ａ−１４、Santa Cruz Biotechnology)を適当な希釈で（経験的に試験した）添加し、サンプルを４℃にて振とうした。タンパク質Ａ−アガロースでのインキュベーション後、ビーズをスパンダウンし、ＩＰバッファー中で４回洗浄した。上清を完全に最終の洗浄物から吸引し、ペレットを５０μｌのLaemmliバッファー、５％２−ＭＥに再懸濁した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタン分析のためにＰＶＤＦ膜に写した。一次ウェスタン抗体は抗−ｍｙｃ（９Ｅ１０、CalBioChem)または抗−ＡＰＰ（２２Ｃ１１、Boehringer Mannheim)であった。ＨＲＰに結合させたヤギ抗−マウスＩｇＧは、高化学ルミネセンスによる二次検出のために役立てた。
【０１３４】
実施例１３：トランスジェニックマウス
ヒトＢＢＰ１の発現をマウスの脳ニューロンに対して標的するトランスジェニックマウスを、Ｔｈｙ１．２プロモーターシステムを用いて得た。ヒトＢＢＰ１のニューロンにおける発現により、アポトーシスにおけるヒトＡベータおよびヒトＢＢＰ１の相互作用に関する研究（インビトロおよびインビボ）が容易となる。ヒトＢＢＰ１における推定メチオニン翻訳開始部位が異なる２つのトランスジェニックマウス株が確立されている。２つのトランスジーン構築物（Ｍｅｔ３ＢＢＰおよびＢＢＰ８００）をＣ５７／ｂ胎児に挿入した。
【０１３５】
Ｍｅｔ３ＢＢＰおよびＢＢＰ８００株からのネクロプシーを得、ＲＮＡ発現のレベルをＲＮａｓｅプロテクションアッセイおよびインサイチュ分析を脳にて用いて分析した。ＲＰＡ分析により、ＢＢＰ１トランスジェニックｍＲＮＡがヒトの脳においてＢＢＰ１の内因レベルの５倍のレベルで発現された。ＢＢＰ８００からの発現はしかし、内因性ヒトレベルと同等にとどまった。発現レベルにおけるこれらの差は、また、ＲＰＡ実験において用いられる同じプローブを用いて、インサイチュセクションにおいてサジタルに認められた。ヒトＢＢＰ１トランスジーンｍＲＮＡに関する、強くかつ特異的なシグナルが、Ｍｅｔ３ＢＢＰトランスジェニック脳において観察された。この実験において、トランスジーンの位置は、各トランスジェニック株の皮質、海馬、および小脳において確認された。これらの領域の全３つは、ＡＤの病因につき重要である。
【０１３６】
実施例１４：ノックアウトマウス
ノックアウト（ＫＯ）ターゲッティングベクターを、マウスＢＢＰ１遺伝子のエキソン１におけるＭｅｔ３開始コドンの上流の５’短腕、およびＢＢＰ１遺伝子のエキソン４のちょうど３’で始まる長い３’腕を用いて設計およびクローン化し、エキソン５まで伸長させた（図１２）。マウスＢＢＰ１遺伝子のエキソン１〜４のネオマイシン選択可能マーカーでの置換により、エキソン１におけるｍｅｔ開始ならびにＤＲＦ保存ＧＰＣＲモチーフを含むエキソン４における重要な配列が欠失することにより、ＢＢＰ１ＫＯを生じる。ＢＢＰ１標的ベクターを１２９Ｒ１Ｅｓ細胞にエレクトロポーレートした。およそ１０００個のネオマイシン耐性クローンを得た。これらのクローンをＰＣＲおよびサザンブロットにより分析し、標的ベクターの挿入が成功したものを単離し、適当なクローンを前記のように胚盤胞へと微細注射した。
【０１３７】
ＥＳ細胞における遺伝子ターゲッティング
ＥＳ細胞を、以下の標準的なＥＳ細胞培養条件にて培養した：ＥＳ細胞培地（高グルコースＤＭＥＭ、２０％子牛血清、非−必須アミノ酸、１４μＭの２−メルカプト−エタノール、および１０７Ｕの白血球阻害因子）、分裂抑制（マイトマイシン処置）胎児繊維芽細胞のフィーダー層上３７℃、５％ＣＯ２および湿ったチャンバー中。
遺伝子ターゲッティングのために、Ｒ１ＥＳ細胞（Joyner AL., Skarnes WC., Rossant J., 胎児幹細胞における相同組換えによるマウスＥｎ−２遺伝子の変異形成(Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells). Nature. 338(6211):153-6, 1989）を５０μｇの線状標的ベクターでエレクトロポーレートし、エレクトロポーレーション後２４時間で始めて７−１０日間２００μｇ／ｍｌのＧ４１８にて選択した。Ｇ４１８耐性クローンをつつき、展開し、次いで凍結保存した。耐性クローンを、野生型を検出する５’アウトサイドプローブを用いるSphI（制限エンドヌクレアーゼ）ゲノミックサザン制限フラグメント多型長（ＲＦＰＬ）分析により相同組換えに関してスクリーニングし、６ｋｂおよび４．５ｋｂのフラグメントとしてのＢＢＰ１の対立遺伝子をそれぞれ標的した。遺伝子標的ＥＳ細胞クローンを溶解し、野生型を検出する３’アウトサイドプローブを用いてＳｐｈＩ遺伝子ＲＦＰＬ分析により拡張しながら特定し、次いで１５ｋｂおよび４．５ｋｂのフラグメントとしてＬＲＰ５の対立遺伝子をそれぞれ標的した。
【０１３８】
胚盤胞注入による遺伝子標的マウスの作製
キメラマウスを作製するために、遺伝子標的ＥＳ細胞クローンを溶解し、展開し、Ｃ５７ＢＬ／６株マウスの４日齢の宿主胚盤胞へと注入した。注入のために単一細胞懸濁液を細胞をトリプシンで溶解することにより調製し、次いでＥＳ培地＋ヘペスバッファーに再懸濁した。１０個〜１２個の細胞を胚盤胞へと注入し、注入された胚盤胞を次いで、擬似妊娠させたスイスウェブスターレシピエント雌マウスの子宮へと移し、出産予定日まで発生させた。この方法で作製されたキメラの雄をＣ５７ＢＬ／６および／または１２９ＳｖＥｖ雌と戻し交配し、ネオマイシン耐性遺伝子に特異的なプライマーでのＰＣＲゲノタイピングにより、標的対立遺伝子の伝達に関して試験した。
【０１３９】
コンディショナルノックアウトマウス
コンディショナルノックアウトマウスをCre/loxシステムを用いて作製する。「LoxP」または「lox」は、イー．コリバクテリオファージＰ１のCreリコンビナーゼにより認識される短い(３４ｂｐ）ＤＮＡ配列を意味する。ＤＮＡセグメントのいずれかのサイドにおける同じ配向の２つのloxP部位の配置により、Creリコンビナーゼの存在下で、間にあるＤＮＡセグメントが有効に切除され、loxP部位の単一コピーのみが残る。コンディショナルノックアウトをＥＳ細胞にCre遺伝子を、他の発現コントロールシステムの調節可能なプロモーターのコントロール下に導入することにより作製する。
【０１４０】
Ｃｒｅリコンビナーゼによるネオマイシン耐性カセットの削除
ネオマイシン耐性遺伝子を有しないＢＢＰ１ＫＯマウスを作製するために、ネオマイシン耐性カセットを、ＮＥＯ遺伝子付近にloxP部位を含んでいる構築物を用いて、およびCre発現プラスミド（２μｇ／ｍｌ）のＢＢＰ１ＫＯ前融合接合子の雄の生殖核へのマイクロインジェクションにより削除する。注入された接合子を次いで擬似妊娠させたスイスウェブスターレシピエント雌マウスの子宮へ移し、出産予定日まで発生させる。ＫＯカセットの削除をカセット挿入部位のＰＣＲ分析により確認する。マウス細胞株からのｎｅｏ遺伝子の部位特異的削除は、本明細書中にその全容を出典明示により組み込む米国特許第4,959,317号に記載されている。
【０１４１】
実施例１５：ＢＢＰ１ ＰＸＤＧＳモチーフにおけるアスパラギン酸の変異によりプロ−アポトーシスと抗−アポトーシス活性が分かれる。
ＢＢＰ１ ＰＸＤＧＳモチーフ配列は、全ＢＢＰタンパク質のＣ末端近くに位置する。ショウジョウバエ(Drosophila)からヒトに、および全３つのタンパク質サブタイプにそれは進化上保存させており、機能の重要性が示唆される。荷電したアスパラギン酸残基はタンパク質機能おける重要な効果を媒介することが多く、ゆえに、ヒトＢＢＰ１のこの残基をストップまたはアラニンに変異させ、アポトーシス活性を評価する。ＢＢＰ１−ｗｔ（ｐＦＬ１９）およびＤ＞ストップまたはＤ＞Ａ変異体発現プラスミドをＳＹ５ＹまたはＮｔ２幹細胞へとトランスフェクトした。サンプルを、発現されるＢＢＰ１タンパク質に特異的なＡβ反応性およびＳＴＳ感受性の両方に関して評価した。野生型タンパク質および変異体タンパク質の抗−アポトーシス効果は、２５０ｎＭのスタウロスポリンでの処置後に容易に観察された。ＢＢＰ１の抗アポトーシス効果の詳細に関しては、本明細書中にその全容を出典明示により組み込むＰＣＴ ＷＯ00/22125号を参照されたい。これに対して、Ｄ＞ストップおよびＤ＞Ａ置換の両方は、Ａβ感受性の喪失を生じた。これらの所見は、ＢＢＰタンパク質における不変のＰＸＤＧＳモチーフがプロ−アポトーシス活性に必要であり、異なる機能を付与している異なるタンパク質パートナーとのＢＢＰの潜在的な結合性が示唆される。
【０１４２】
実施例１６：ＢＢＰ１産生の阻害
本発明の組成物としてのＲＮＡ分子の設計
本実施例における全ＲＮＡ分子はおよそ６００ｎｔｓの長さであり、全ＲＮＡ分子を、機能性のＢＢＰ１タンパク質を製造することができないように設計する。分子は、キャップを持たず、ポリ−Ａ配列を持たない；ネイティブな開始コドンは存在せず、ＲＮＡは全長の産物をコードしない。
【０１４３】
以下のＲＮＡ分子を設計する：
（１）ＢＢＰ１ネズミメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の部分に相同な一本鎖（ｓｓ）センスＲＮＡポリヌクレオチド配列；
（２）ＢＢＰ１ネズミｍＲＮＡの部分に相補的なｓｓ抗−センスＲＮＡポリヌクレオチド配列、
（３）ＢＢＰ１ネズミｍＲＮＡポリヌクレオチド配列のセンスおよびアンチセンス部分の両方から成る二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ分子、
（４）ＢＢＰ１ネズミ異種構造ＲＮＡ（ｈｍＲＮＡ）の部分と相同なｓｓセンスＲＮＡポリヌクレオチド配列、
（５）ＢＢＰ１ネズミｈｎＲＮＡの部分に相補的なｓｓアンチセンスＲＮＡポリヌクレオチド配列、
（６）センスおよびアンチセンスＢＢＰ１ネズミｈｎＲＮＡポリヌクレオチド配列から成るｄｓＲＮＡ分子、
（７）ＢＢＰ１プロモーターの部分のトップ鎖に相同なｓｓネズミＲＮＡポリヌクレオチド配列、
（８）ＢＢＰ１プロモーターの部分のボトム鎖に相同なｓｓネズミＲＮＡポリヌクレオチド配列、
（９）ＢＢＰ１プロモーターのトップおよびボトム鎖に相同なネズミＲＮＡポリヌクレオチド配列から成るｄｓＲＮＡ分子。
【０１４４】
前記（１）−（９）の種々のＲＮＡ分子は、１つの末端にＴ７プロモーターを有するＰＣＲ産物のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写により作製されてよい。センスＲＮＡが所望される場合、Ｔ７プロモーターはフォーワードＰＣＲプライマーの５’末端に位置づけられる。アンチセンスＲＮＡが所望される場合、Ｔ７プロモーターはリバースＰＣＲプライマーの５’末端に位置づけられる。ｄｓＲＮＡが所望される場合、ＰＣＲ産物の両方のタイプがＴ７転写反応に含まれてよい。別法として、センスおよびアンチセンスＲＮＡは、転写後に混合されてもよい。
【０１４５】
ＲＮＡの折り返し型をコードしている発現プラスミドの構築
ＢＢＰ１遺伝子の部分の逆の繰り返しをコードしている発現プラスミドを、本出願にて開示される情報を用いて構築してよい。およそ少なくとも６００ヌクレオチド長の、互いに配列がほぼ一致する２つのＢＢＰ１遺伝子フラグメントを、ＰＣＲ増幅により調製し、そして反対の向きのＢＢＰ１フラグメントの転写に必要とされるエレメントを含むベクターの適当な制限部位に導入してよい。構築物でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、相補的標的遺伝子配列が二重らせんを形成するところの折り畳みＲＮＡのみを生じる。
【０１４６】
アッセイ
Ｂａｌｂ／ｃマウス（５マウス／群）に、前記のネズミＢＢＰ１鎖特異的ＲＮＡまたは対照を、１０μｇと５００μｇの範囲の投与量で、筋肉内、頭蓋内、または腹腔内注入してよい。血清をマウスから、４日ごとに３週間集め、本明細書中に記載する抗体を用いてＢＢＰ１レベルに関してアッセイする。
本発明に従い、ＢＢＰ１ｍＲＮＡ、ＢＢＰ１ｈｎＲＮＡ、およびＢＢＰ１プロモーターから誘導されたｄｓＲＮＡから得たｄｓＲＮＡ分子を施したマウスは、ＢＢＰ１産生の低下または阻害を示す。あるとしてもわずかな阻害効果が、ＲＮＡ分子がある程度の二本鎖を形成する可能性を有しない限り、一方鎖ＢＢＰ１由来のＲＮＡ分子を施されたマウスの血清において観察される。
【０１４７】
実施例１７：疾患の予防における本発明の方法
インビボアッセイ
ＢＢＰ１タンパク質を作製する能力を有しない実施例１６に記載するＢＢＰ１特異的ＲＮＡ分子および対照としてのＢＢＰ１特異的ＲＮＡ分子を用いて、マウスを、本発明の注入されたＢＢＰ１特異的ＲＮＡ分子の使用によるＢＢＰ１関連疾患からの保護に関して評価してよい。Ｂａｌｂ/ｃマウス（５マウス／群）を、記載のＲＮＡ分子で、１０〜５００μｇＲＮＡの範囲の投与量で、筋肉内、頭蓋内、または腹腔内注入により免疫化してよい。ＲＮＡ注入の後１、２、４、および７日で、マウスにおいてＢＢＰ１に関連する表現系の変化のサインを観察してよく、および／またはＢＢＰ１の発現に関してアッセイしてよい。
【０１４８】
本発明に従い、ＢＢＰ１配列を含む本発明のｄｓＲＮＡ分子を受けるマウスはＢＢＰ１関連疾患に対して保護されることが示される可能性がある。コントロールＲＮＡ分子を受けているマウスは保護されない可能性がある。ＢＢＰ１配列を含むｓｓＲＮＡ分子を受けているマウスは、これらの分子がインビボで少なくとも部分的に二本鎖となる可能性を有しない限り、あるとしても非常に程度が低いことが予想され得る。
本発明に従い、本発明のｄｓＲＮＡ分子はＢＢＰ１タンパク質を作製する能力を有しないので、動物へのＲＮＡ分子の送達により提供される保護は、遺伝子特異的である非免疫媒介メカニズムによる。
【０１４９】
実施例１８：チャイニーズハムスター培養細胞におけるＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉の効果を観察するために、天然にＢＢＰ１を発現しているいずれかの細胞株（実施例５を参照されたい）を同定し、そして用いることができ、またはＢＢＰ１をトランスジーンとして発現する細胞株を周知の方法により（および本明細書に概説するように）構築することができる。例として、ＣＨＯ細胞の使用を記載する。チャイニーズハムスター細胞をダルベッコの変更イーグル培地(Gibco BRL)中３７℃にて培養してよい。培地に１０％熱不活性化子牛血清(Mitsubishi Kasei)および抗生物質（１０ユニット／ｍｌのペニシリン(Meiji)ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン(Meiji)）を追加してよい。トランスフェクションおよびＲＮＡｉ活性アッセイ
【０１５０】
ＣＨＯ細胞を２４ウェルのプレートに３×１０５細胞／ｍｌにて接種する。１日後、リン酸カルシウム沈降法を用いて、細胞をＢＢＰ１ｄｓＲＮＡ（８０ｐｇ〜３μｇ）でトランスフェクトする。細胞をトランスフェクション後２０時間で回収し、ＢＢＰ１遺伝子の発現を測定してよい。
【０１５１】
実施例１９：脊椎動物細胞株におけるアンチセンス阻害
アンチセンスは、Sequitur Inc. (Natick, MA)のキットなどのキットの使用を含む標準的な方法を用いて行うことができる。以下の方法は、ホスホロチオエート オリゴデオキシヌクレオチドおよびカチオン脂質を用いる。オリゴマーを、翻訳開始部位が包含されるようにｍＲＮＡの５’末端に相補的となるように選択する。
【０１５２】
（１）細胞を蒔く前に、０．２％滅菌濾過ゼラインを３０分間インキュベートし、次いで一度ＰＢＳで洗浄することによりプレートの壁をゼラチンコートし、接着を増す。細胞を４０−８０％コンフルエンスへと増殖させる。ヒーラー細胞をポジティブ対照として用いることができる。
【０１５３】
（２）細胞を血清を含まない培地(例えば、Gibco-BRLからのOpti-MEMA)で洗浄する。
（３）適当なカチオン脂質（Sequitur, Inc. からのオリゴフェクションＡなど）を混合し、ポリスチレンチューブ中の抗生物質を含まない血清不含培地に添加する。脂質の濃度はその源により変化させることができる。血清不含培地／カチオン脂質を含むチューブにオリゴマーを１００μＭのストック（ｍｌ当たり２μｌ）から約２００ｎＭ（５０−４００ｎＭの範囲）の終濃度まで添加し、次いで振とうにより混合する。
（４）オリゴマー／培地／カチオン脂質溶液を細胞に添加し（２４ウェルのプレートの各ウェルに関して約０．５ｍｌ）および３７℃にて４時間インキュベートする。
（５）細胞を培地でゆっくりと洗浄し、完全増殖培地を添加する。細胞を２４時間増殖させる。所定の割合の細胞をプレートから取り、溶解する。
細胞を回収し、ＢＢＰ１遺伝子発現をモニターする。
【０１５４】
本発明は、前記の記載および実施例に詳細に記載されているものとは別に実施されてよい。本発明の多くの変更および変化は、前記教示を照らして可能であり、それゆえ、係属する請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、酵母２−ハイブリッドスクリーン設計を示す。
【図２】図２は、ｐＢＢＰでの細胞のトランスフェクションにより、Ａβでの処置に際しての増加した細胞のロスを生じることを示す。
【図３】図３は、ｐＢＢＰでトランスフェクトされた細胞におけるＡβ−誘導性のアポトーシスがＧタンパク質により変換されることを示す。
【図４】図４は、Ａβに対するＢＢＰ−媒介性の反応がカスパーゼ依存性であることを示す。
【図５】図５は、Ａβに対するＢＢＰ−特異的アポトーシス反応が、成熟（即ち、集合した）ヒトペプチドに関して選択的であることを示す。
【図６】図６は、一時トランスフェクションアッセイを示し、ＢＢＰ−Ｒ＞Ｅ変種がドミナントネガティブ式に作用して野生型タンパク質の活性を抑制することを示す。
【図７】図７は、ＢＢＰ／ＢＬＰ翻訳産物の配列比較を示す。
【図８】図８は、７−ｔｍドメインＧタンパク結合レセプターとのＢＢＰタンパク質の予測されるトポロジーの比較を示す。
【図９】図９は、スプライス変異を有するＢＢＰ１アンプリコンならびにアミノ酸２１７からストップコドンの部分配列を示す。
【図１０】図１０は、ＢＢＰ１ＰＸＤＧＳモチーフにおけるアスパラギン酸の変異がプロ−および抗−アポトーシス活性を分かつことの分析を示す。
【図１１】図１１は、指定される個々のエキソン開始および停止部位を有するＢＢＰ１遺伝子のゲノム構造を示す。
【図１２】図１２は、内在ネズミ遺伝子ＢＢＰ１遺伝子、ＢＢＰ１ターゲッティング構築物、および内在ＢＢＰ１遺伝子とＢＢＰ１ターゲッティング構築物の間の相同組換えにより作製される変異ＢＢＰ１対立遺伝子を図示したものである。
【図１３】図１３は、挿入後のコンディショナルノックアウト構築物の図を示す。アスタリスクは、除去されるべきエキソンを示し、三角は挿入されたLox部位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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