(57)【要約】本発明はサッカライドを硫酸化する方法に関するものであり、更に詳細にはグリコサミノグリカン類由来の低分子量のサッカライド類を硫酸化する方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカライドを硫酸化するための方法であって、当該方法が以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）ナトリウム塩またはアンモニウム塩の形態である原料サッカライドを調製する工程で、当該原料サッカライドが、単糖類、二糖類および／またはオリゴサッカライドの異種又は同種の集合物から成り、８５％を越える部分が最大で８の糖残基から成ること、
（ｂ）前記原料サッカライド塩を、ピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳ）から成るグループより選択された非プロトン型極性溶媒に溶解することで原料サッカライド塩と溶媒との混合物を調製すること、及び
（ｃ）前記原料サッカライド塩と溶媒との混合物を、硫酸化反応試薬と反応させて硫酸化サッカライドを生成すること
を含むことを特徴とするサッカライドの硫酸化方法。
【請求項２】
前記の原料サッカライド塩が、グリコサミノグリカンの解重合によって調製されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリコサミノグリカンがヘパリンまたはヘパリン硫酸であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の原料サッカライドの内、少なくとも約２５％が二糖類であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記の原料サッカライドの少なくとも約１５％を占めるサッカライドが４個以上の糖残基を有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
サッカライドを硫酸化するための方法であって、当該方法が以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）ナトリウム塩またはアンモニウム塩の形態である原料サッカライドを調製するためにグリコサミノグリカンを解重合させる工程で、当該原料サッカライドが、単糖類、二糖類および／またはオリゴサッカライドの異種又は同種の集合物から成り、９５％を越える部分が最大で８の糖残基から成ること、
（ｂ）前記原料サッカライド塩を、ピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳ）から成るグループより選択された非プロトン型極性溶媒に溶解することで原料サッカライド塩と溶媒との混合物を調製すること、及び
（ｃ）前記原料サッカライド塩と溶媒との混合物を、硫酸化反応試薬と反応させて硫酸化サッカライドを生成すること
を含むことを特徴とするサッカライドの硫酸化方法。
【請求項７】
前記の原料サッカライドの内、少なくとも約２５％が二糖類であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記の原料サッカライドの少なくとも約１５％を占めるサッカライドが４個を越える糖残基を有していることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記解重合工程が、前記グリコサミノグリカンを亜硝酸で処理しその後水素化ホウ素ナトリウムで処理することを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記の硫酸化されたサッカライド混合物から硫酸化された二糖類を分離する工程を更に含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記の分離工程がサイズ排除クロマトグラフ法を用いて実施されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
二糖類を硫酸化するための方法であって、当該方法が以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）単糖類、二糖類、およびオリゴサッカライドを含むサッカライド混合物を、グリコサミノグリカンの解重合によって調製し、
（ｂ）前記サッカライド混合物からナトリウム塩あるいはアンモニウム塩の形態である二糖類フラクションを分離して、
（ｃ）前記の二糖類フラクションを、ピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳ）から成るグループより選択された非プロトン型極性溶媒に溶解して、二糖類の塩と溶媒との混合物を調製し、そして
（ｄ）前記の二糖類の塩と溶媒との混合物を、硫酸化反応試薬と反応させて硫酸化された二糖類を生成すること
を含むことを特徴とする二糖類の硫酸化方法。
【請求項１３】
前記の解重合工程が、前記グリコサミノグリカンを亜硝酸で処理しその後水素化ホウ素ナトリウムで処理することを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記のグリコサミノグリカンが、ヘパリンまたはヘパリン硫酸であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
二糖類を硫酸化するための方法であって、当該方法が以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）単糖類、二糖類、およびオリゴサッカライドを含むサッカライド混合物をグリコサミノグリカンの解重合によって調製し、
（ｂ）前記のサッカライド混合物からナトリウム塩あるいはアンモニウム塩の形態である二糖類フラクションを分離して、
（ｃ）前記の二糖類フラクションを、ピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳ）から成るグループより選択された非プロトン型極性溶媒に溶解して、二糖類の塩と溶媒との混合物を調製し、
（ｄ）前記の二糖類の塩と溶媒との混合物を、硫酸化反応試薬と反応させて硫酸化された二糖類を生成し、そして
（ｅ）前記の二糖類の塩と溶媒との混合物を分離して、ナトリウム塩あるいはアンモニウム塩の形態である硫酸化された二糖類のフラクションを得ること
を含むことを特徴とする二糖類の硫酸化方法。
【請求項１６】
前記の解重合工程が、前記グリコサミノグリカンを亜硝酸で処理しその後水素化ホウ素ナトリウムで処理することを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記のグルコサミノクリカンが、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、およびヒアルロン酸から成るグループより選ばれた物質であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記のグルコサミノクリカンが、ヘパリンまたはヘパリン硫酸であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記原料サッカライドを構成する前記二糖類が、多くとも７個の硫酸化可能な反応部位を有していることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記原料サッカライドを構成する前記二糖類が、多くとも６個の硫酸化可能な反応部位を有していることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔発明の背景〕
〔発明の分野〕
本発明はサッカライドを硫酸化する方法に関するものであり、更に詳細には低分子量のオリゴサッカライドを硫酸化する方法に関するものである。
【０００２】
〔発明の背景〕
ポリサッカライドの硫酸エステルは多岐にわたる重要な生物学的活性を示す。例えば、Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃ他はＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，３７：１９（１９９８）にデキストラン硫酸が凝集防止効果や高脂血症防止効果を示すこと、Ｂａｂａ他はＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３２，１７４２（１９８８）にポリサッカライドの硫酸エステル群が種々のエンベロープウイルスに対する選択的で高活性な阻害薬として作用することを開示している。
【０００３】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）はヘキソサミンとアルドウロン酸の二種の残基が交互に配列してなる各種のポリサッカライドの総称である。天然に存在し、生物学的活性を有するグリコサミノグリカン類にはヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、およびヒアルロン酸がある。グリコサミノグリカン類の低分子量断片や人工的に合成されたオリゴサッカライドの硫酸エステル類も生物学的活性を示す。ＰｅｔｉｔｏｕおよびＣｈｏａｙ、米国特許第５，０１３，７２４号には抗血栓効果、低脂血化作用、およびフィブリン（繊維素）溶解効果を示すヘパリン由来断片成分に関する開示がある。Ａｈｍｅｄ他、米国特許５，６９０，９１０号はヘパリン由来の超低分子量（＜３，０００  Ｄａ）断片が喘息の治療に有効であるとしている。Ｃｏｎｒａｄ他、米国特許第５，３８０，７１６およびＨｏｓａｎｇ他、米国特許第５，４４７，９１９号は、高度に硫酸化した三糖体ないし八糖体のサッカライド類が平滑筋細胞の増殖を抑制する活性を有することを開示している。
【０００４】
これら多糖類中の硫酸基の含量がこのようなオリゴサッカライドないしはポリサッカライドの類が示す生物学的活性に関して重要な役割を果たしている。特に、天然に生成されるグリコサミノグリカン類に認められる硫酸化度よりも高い度合いに硫酸化することが有利であるといえる。Ｐｅｔｉｔｏｕ他、米国特許第５，０１３，７２４号はグリコサミノグリカン類の硫酸化方法を記述しているがそこに記されたプロセスにおいては当該グリコサミノグリカンを一旦有機アミンの塩に変換することが必要であるとしている。このようなことから、サッカライドの硫酸化をもっと効率良く行えるプロセスを開発する必要性の高いことが理解できる。
【０００５】
〔発明の簡単な概要〕
本発明は低分子量オリゴサッカライドを硫酸化するいくつかの方法を提供する。これらの方法によると従来法による場合に比べてより高い収率ならびに効率を達成できる。
【０００６】
本発明の一つの実施態様においては、サッカライドのナトリウム塩あるいはアンモニウム塩を硫酸化するプロセスを提供する。好ましくは、単糖類、二糖類、および／またはオリゴサッカライド類のそれぞれのナトリウム塩またはアンモニウム塩から選んだ一種ないし多種の混合物で当該原料であるサッカライドを構成する。本実施態様に属する好ましい実施例のいくつかにおいては前記の原料サッカライドの８５％を超える部分が糖鎖を形成する糖残基の数において最大で８のサッカライド類で占められている。
【０００７】
本発明の前記実施態様に属する実施例のいくつかにおいては、当該原料であるサッカライドとしてグルクロン酸残基、またはイズロン酸残基どちらか一方のみの多糖類でなるサッカライド類が用いられる。また、前記の実施例のいくつかにおいては、多くとも７箇所しか硫酸化できる部位を保有しない二糖類で当該原料サッカライドが構成される。あるいは前記の実施例の別のいくつかにおいては、硫酸化できる部位を多くとも６箇所しか保有しない二糖類で当該原料サッカライドが構成される。
【０００８】
本発明の前述の実施態様におけるプロセスにおいては、原料サッカライドの塩は極性非プロトン性溶媒、望ましくはピリジン、ピリジン−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびピリジン−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなる溶媒グループから選ばれる溶媒に溶解され、硫酸化反応試薬との反応に供される。
【０００９】
本発明の第二の実施態様においては、グリコサミノグリカン類の一種類から得られるサッカライドを原料としそれを硫酸化するプロセスが提供される。前記の第二の実施態様において提供されるプロセスでは、最初に、一糖類、二糖類、ならびにオリゴサッカライド類が混合物として生成されるような反応条件下でグリコサミノグリカンの糖鎖を切断する。前記の第二の実施態様に基づく好ましい実施例のいくつかにおいては、原料サッカライド類はその８５％を超える部分がその糖鎖形成をする残基の数が最大で８であるサッカライド類で構成されている。
【００１０】
当該実施例のいくつかにおいては、当該原料サッカライドはグルクロン酸の残基あるいはイズロン酸の残基のいずれかのみをその繰り返し残基とする。前記の実施例のいくつかにおいては、多くとも７箇所しか硫酸化できる部位を保有しない二糖体類で当該原料サッカライドが構成される。あるいは前記の実施例の別のいくつかにおいては、硫酸化できる部位を多くとも６箇所しか保有しない二糖体で当該原料サッカライドが構成される。
【００１１】
前記原料サッカライドはナトリウムあるいはアンモニュウムの塩として存在しており、前述した第一の実施態様におけると同様に、非プロトン性極性溶媒に溶解され硫酸化反応試薬との反応に供される。ここで、実施例のひとつにおいては、この非プロトン性極性溶媒をピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳＯからなる溶媒グループから選ばれた何れかの溶媒である。
【００１２】
本発明の第三の実施態様においては、グリコサミノグリカン類の一種類から得られるサッカライドを原料としそれを硫酸化するプロセスが提供される。前記の第三の実施態様において提供されるプロセスでは、最初に、一糖類、二糖類、ならびにオリゴサッカライド類が混合物として生成されるような反応条件下でグリコサミノグリカンの糖鎖を切断し、生成される当該サッカライド混合物から二糖類フラクションを、望ましくはそのナトリウムまたはアンモニウムの塩として分離入手する。
【００１３】
いくつかの実施例では、前記二糖類はグルクロン酸の残基あるいはイズロン酸の残基のいずれかのみをその繰り返し残基とする。前記の実施例のいくつかでは、前記の二糖類は多くとも７箇所しか硫酸化できる部位を保有しない。あるいは前記の実施例の別のいくつかにおいては、前記の二糖類は硫酸化できる部位を多くとも６箇所しか保有しない。
【００１４】
前記二糖類フラクションは、次いで、上述の第一ならびに第二の実施態様におけると同様に非プロトン性極性溶媒に溶解し硫酸化反応試薬との反応に供される。ここで、実施例のひとつにおいてはこの非プロトン性極性溶媒をピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳＯからなる溶媒グループから選ばれた何れかの溶媒とする。
【００１５】
〔発明の詳細な説明〕
本発明はサッカライドを硫酸化する方法に関するものであり、より詳細には低分子量オリゴサッカライドを硫酸化する方法に関するものである。更に詳細には、本発明はグリコサミノグリカン類由来の低分子量オリゴサッカライド類を硫酸化する方法を提供するものである。
【００１６】
ここに参照文献として記載する特許ないし科学関連の文献は当該技術分野に通じた技術者の知るところとなっている知識がいかなるものかを示すためのものである。また、ここに、本願明細書に引用する発行済特許、出願公開特許ならびにこれら以外の参照文献は、そのそれぞれについて、詳細に、あるいは同引用箇所を個々に特定して示すことをしないものの、そうした場合と同様の意味において、本明細書による引用事項であることと認識するものである。これら文献との間に矛盾が存在する場合は、本明細書における記載を優先する。
【００１７】
本発明に関して、次の通りの定義を採用する。
【００１８】
ここで使用されている「グリコサミノグリカン」または「ＧＡＧ」なる語は、実質的にヘキソサミンとアルドウロン酸各々の残基を交互に繰り返すことでなる構造をもつ何らかのポリサッカライド、ならびに前記のポリサッカライド類の特定フラクション、断片、および塩のいずれをも包含する意味で用いるものとする。この定義により、「ＧＡＧ」なる語が天然のＧＡＧのみを指すにとどまらないものとなる。
【００１９】
ここで使用されている「硫酸化度」なる語は、結合する硫酸基（−ＯＳＯ３グループ）の数を二糖類１単位当りに換算し表現するものである。
【００２０】
「硫酸化部位」の語は硫酸化され得る性質をもつ反応基を意味する。前記の反応基は、好ましくは水酸基あるいはアミノ基である。また本文面で使用される「硫酸化部位」は、硫酸化の対象となりえる前記反応基（遊離反応基）のみにとどまらず、既に硫酸化され、硫酸基が接続した前記反応基をも含むものである。
【００２１】
「ヘパリン」ならびに「ヘパリン硫酸」なる語は一般に、凝集防止剤用としてのヘパリン生成のための従来法に基づく一般的な方法により哺乳動物の細胞から分離され得られるヘパリン製剤ならびに前記のヘパリン製剤のみならず、別の調製法によるか化学合成された、前記哺乳動物細胞由来のヘパリン製剤に同等な製剤を意味する。このようにして得られるヘパリン製剤は、Ｄ−グルコサミンとＬ−イズロン酸が交互に接続するか、またはＤ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸が交互に接続するかのいずれかの構造をもつ。これら種々の処方で生成されるヘパリン製剤は互いにそのヘパリンとしての糖鎖の大きさ、糖鎖の詳細に関わる性状特性および硫酸化度の点でそれぞれ異なるが、「ヘパリン」及び「ヘパリン硫酸」なる語はこれら処方の異なるヘパリン製剤のすべてを含むものである。
【００２２】
ここでで使用されている「アンモニウム塩」なる語は、種々のＮＨ４＋塩を指すものとし、有機アミン類から生成される塩、例えばテトラブチルアンモニウム塩のようなアンモニウム塩は、敢えて含めないものとする。
【００２３】
この明細書において、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を伴って示される単数形表現の名詞であっても文脈からそうでない旨が明確に判る場合を除き、前記の名詞が複数形表現の場合に持つ意味をも含意するものとする。例えば、「ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ」の語は複数種のオリゴサッカライドの混合物をも含めて種々のオリゴサッカライドを意味し、「ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ」は複数種の二糖類の混合物をも含めて種々の二糖類を意味するものとする。
【００２４】
この明細書において、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」なる語は、それが説明目的の文章内の語句として使用されるか請求項の文に使用されるかに関わらず、制約のない意味として理解されるべきものとする。すなわち、これらの語は「少なくとも〜を持つ」、あるいは「少なくとも〜を含む」との意味に理解されるべきものとする。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の語がプロセスに関係する内容を表現するために使用される場合においては、少なくとも当該工程が前記のプロセスに含まれることを意味するものであると共に前記の当該工程以外の工程も併せて含む可能性を否定しないものとする。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の語が化合物、または組成物の内容を示すために使用される場合においては、少なくとも当該分子的特質あるいは組成成分が前記の化合物または前記の組成物に含まれることを意味するもので、前記の分子的特質あるいは前記の組成成分以外の分子的特質あるいは組成成分も併せ含む可能性を除外しないものとする。
【００２５】
本発明の一つの実施態様においては、ある種のサッカライドのナトリウム塩、またはアンモニウム塩の硫酸化のプロセスを提供するものである。ここで使用する原料サッカライドは、望ましくはナトリウム塩とアンモニウム塩のいずれかであって、かつ一糖類、二糖類およびオリゴサッカライドの内いずれかの単一化合物あるいはそれらの混合物からなる。本実施態様においては、原料サッカライド塩を非プロトン型極性溶媒、望ましくはピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳＯからなる溶媒グループから選ばれた何れかの溶媒に溶解し、それを硫酸化反応試薬との反応に供するものである。
【００２６】
好ましい実施例のいくつかにおいては、原料サッカライドは炭水化物合成法として既知である化学的合成方法により生成される。これら以外の好ましい実施例のいくつかにおいては、原料サッカライドは何らかのポリサッカライドの糖鎖切断によって生成される。種々のポリサッカライドの糖鎖切断方法は先行技術として既知であり、より具体的には以下に記す通りである。好ましくは当該原料生成のためのポリサッカライドとして、グリコサミドグリカン、より好ましくは天然に産し高い生物活性を示すグリコサミドグリカンを用いる。前記のポリサッカライドの例としては、採用できるものをこれらに限定するものではないが、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン類、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸およびヒアルロン酸が挙げられる。特に好ましい実施例のいくつかにおいては、前記のポリサッカライドをヘパリンあるいはヘパリン硫酸としている。
【００２７】
実施例のいくつかにおいては、原料サッカライドとしてグルクロン酸、またはイズロン酸の残基をその糖鎖に有するサッカライドを採用している。また実施例のいくつかにおいては、硫酸化できる部位を多くとも７箇所しか有しない二糖類を当該原料サッカライドとして採用している。あるいは前記の実施例の別のいくつかにおいては、硫酸化できる部位を多くとも６箇所しか有しない二糖類を当該原料サッカライドとして採用している。
【００２８】
好ましい実施例のある種のものいくつかにおいては、当該原料サッカライドを構成するサッカライドの内、その８５％、９０％、あるいは９５％を超える部分を最大で８個の糖残基からなる糖鎖のサッカライドが占めている。原料サッカライドの鎖長に関して、糖残基数が４を超えるサッカライドの混在比率が約２５％未満であることが好ましく、更に好ましくは約２０％未満であること、更には約１５％未満であることが好ましい。好ましい実施例のある種のものいくつかにおいては、当該原料サッカライドを構成するサッカライドの内、その少なくとも約２０％、好ましくは約２５％、より好ましくは約３０％、更には約３５％を二糖類が占めるのが好ましい。
【００２９】
原料サッカライド塩の硫酸化には水酸基の硫酸化反応方法として既知となっている方法を用いる。好適な硫酸化反応試薬の例としては三酸化硫黄の複合物がある。前記の三酸化硫黄の複合物とは、例えばＳＯ３−ピリジン、ＳＯ３−トリメチルアミン、ＳＯ３−トリエチルアミン、ＳＯ３−ジオキサンおよびＳＯ３−ジメチルホルムアミドがある。これら以外の好適な硫酸化反応試薬の例としては、これらに限定するものではないが、塩素化スルホン酸、塩素化スルホン酸と硫酸の混合物、およびＮ−硫酸ピペリジンが挙げられる。
【００３０】
硫酸化反応は、好ましくは非プロトン型極性溶媒中で実行されるものである。ピリジンは当該サッカライドナトリウム塩、あるいはサッカライドアンモニウム塩の溶解度を向上させる作用を有するものであり、このために当該混合溶媒処方の中に含めることが望ましい。好ましい溶媒の例としては、これらに限定する主旨ではなく、ピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳＯが挙げられる。
【００３１】
当該反応は室温あるいはいくらか昇温された温度、すなわち１５〜１００℃において進行させることができる。前記の反応温度は好ましくは、最低約２０℃、より好ましくは約２５℃、更に好ましくは約３０℃である。前記の反応温度は約９０℃を超えないことが望ましく、より好ましくは８０℃、更に好ましくは約７０℃を超えないことである。いくつかの好適な実施例では、前記の反応混合物は５０〜６０℃程度に加熱昇温される。
【００３２】
また、反応混合物の攪拌や硫酸化サッカライドの分離生成は既知の方法によって実施される。溶媒の除去においては望ましくは減圧下で行うものとし、その残存物を水に溶解し、そのｐＨを中性に調整し、そして凍結乾燥するものである。得られた粗製硫酸化サッカライドは例えばサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）のようなクロマトグラフ法で精製するのが好ましい。炭酸水素アンモニウムを用いた溶出を実施した場合には溶出液の凍結乾燥によってアンモニウム塩の形で硫酸化サッカライドを生成する。もし、別の塩、すなわちナトリウム塩として生成することを望む場合は、本アンモニウム塩を陽イオン交換樹脂に通すことでナトリウム塩にできる。
【００３３】
本発明の第二の実施態様においては、グリコサミノグリカンから生成されるサッカライドの硫酸化のプロセスを提供するものである。本発明の実施様態におけるプロセスにおいては、前記グリコサミノグリカンは、最初にそれを一糖体、二糖体および種々オリゴサッカライドの混合物からなる原料サッカライドを生成するような条件下で解重合される。このような解重合工程は、既知のいずれの技術に基づいて行うことができる。ヘパリンをその限定する意味ではない例とするグリコサミノグリカン類を含むポリサッカライドの解重合を進行させるための試薬としては、これらに限定するものではないが、例えば、亜硝酸、過ヨウ素酸、およびヘパリナーゼがある。代表的な切断方法としては、亜硝酸ナトリウムを含ませた溶液を酸性にすることで前記の溶液中に亜硝酸を生成する方法である。反応条件を調整することで解重合の程度を変更することができる。
【００３４】
望ましくは、当該解重合によって得られる反応生成混合物中のサッカライドには繰り返し糖残基数を８以下とする分子形状のサッカライド群の含量が８５％、９０％、あるいは９５％を越えることである。原料サッカライドの糖鎖長に関して、糖残基数が４を越えるサッカライドの前記混合物中での混在比率が約２５％未満であることが好ましく、更に好ましくは約２０％未満であること、約１５％未満であれば更に好ましい。好ましい実施例においては前記混合物中の少なくとも約２０％、好ましくは約２５％、より好ましくは約３０％、更に好ましくは約３５％を二糖類が占めることである。
【００３５】
本発明の好ましい実施例においては、亜硝酸は、濃度として約０．２Ｍ〜０．５Ｍという大幅な過剰量で使用する。当該反応性混合物のｐＨは望ましくは約１〜４、より望ましくは約１〜３、更に望ましくは約１．５〜２に維持される。反応温度としては、常温程度が望ましいがそれよりも少し低かったり高かったりすることは許容される。本発明の趣旨から「常温」なる語は一般的な室内温度を意味するものであり、当該反応が進行している時のその場所での温度がそうであることを意味する。この意味で常温とは代表的には約１５℃〜３０℃の温度域にあることをいう。
【００３６】
好ましいいくつかの実施例においては、前記の解重合工程に当該切断反応で生成される混合物を更に還元反応剤で処理することをも含めるものとする。この方法による場合は、前記解重合が所定の程度までに糖鎖の切断を完了した時点でアルカリ性の試薬、望ましくは水酸化ナトリウムを当該切断反応完了時の混合物中に加え、前記の混合物をアルカリ性にし、続いて水素化ホウ素ナトリウムをその好適な例とする還元反応剤で処理される。望ましくは、その後前記の反応混合物を中和し凍結乾燥によって当該原料サッカライドを分離調製する。好ましい実施例のひとつにおいては、この反応生成混合物のｐＨを調整するのにも水酸化ナトリウムを使用するものであり、この結果、当該原料サッカライドをナトリウム塩の形で得ることになる。
【００３７】
いくつかの実施例においては、前記原料サッカライドはグルクロン酸、またはイズロン酸のいずれかの残基で構成される糖鎖をもっている。いくつかの実施例では、原料サッカライドを構成する二糖類は多くとも７個の硫酸化可能反応部位しか有さず、またいくつかの実施例においては、原料サッカライドを構成する二糖類は多くとも６個の硫酸化可能反応部位しか有さない。
【００３８】
前記原料サッカライドは、それがナトリウム塩であってもアンモニウム塩であっても、前述した本発明第一の実施態様の場合と同様に非プロトン型極性溶媒に溶解され、硫酸化反応試薬と反応させられる。前記非プロトン型極性溶媒は、好ましくはピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳＯからなるグループより選択される。
【００３９】
本発明の第三の実施態様においては、グリコサミノグリカンから生成される二糖類の硫酸化のプロセスが提供される。本実施様態に基づくプロセスにおいては、前記グリコサミノグリカンは、最初にそれを一糖類、二糖類各種オリゴサッカライドの混合物からなる原料サッカライドを生成するような条件下において解重合され、生成したサッカライド混合物から二糖類のみからなるフラクションを分離し採り出される。前記の分離工程は、好ましくはクロマトグラフによる方法、より好ましくはサイズ排除クロマトグラフィで実施される。フラクションの分離は、好ましくは炭酸水素アンモニウム溶液で溶出する方法で実施される。得られた二糖類を含有するフラクションは互いに寄せ集めて凍結乾燥し、二糖類のみからなるサッカライド・フラクションとなる。ここでの二糖類はアンモニウム塩の形で存在する。この二糖類フラクションは次いで硫酸化され、更にクロマトグラフ的手法、好ましくはサイズ排除クロマトグラフ法によって分離される。フラクションは好ましくは炭酸水素アンモニウム溶液により溶出処理される。前記の塩は、必要により前記の固体を凍結乾燥工程に廻す以前に、例えば陽イオン交換樹脂に暴露することによって別の塩、例えばナトリウム塩に変換できる。
【００４０】
実施例のいくつかにおいては、前記原料サッカライドはグルクロン酸、またはイズロン酸のいずれかの残基で構成される糖鎖を有する。いくつかの実施例では、原料サッカライドを構成する二糖類は多くとも７個の硫酸化可能反応部位しか持たず、またいくつかの実施例においては、原料サッカライドを構成する二糖類は多くとも６個の硫酸化可能反応部位しか持たない。
【００４１】
前記二糖類フラクションは、上述した本発明の第一および第二の実施態様の場合と同様に非プロトン型極性溶媒に溶解し硫酸化反応試薬と反応させられる。ここに記した非プロトン型極性溶媒は好ましくはピリジン、ピリジン−ＤＭＦ、およびピリジン−ＤＭＳＯからなるグループから選ばれる。この様にして生成された、高度に硫酸化された二糖類は回収され、再度分離される。前記の分離工程は好ましくはクロマトグラによる方法、より好ましくはサイズ排除クロマトグラフ法によって実施される。フラクションの分離は、好ましくは炭酸水素アンモニウム溶液で溶出する方法で実施される。得られた二糖類からなるフラクションは互いに集めて凍結乾燥し二糖類のみからなるサッカライド・フラクションとなる。ここでの二糖類はアンモニウム塩の形で存在する。必要ならば、前記の塩は、前記の固体を凍結乾燥する工程に廻す前に、例えば陽イオン交換樹脂に暴露することによって別の塩、例えばナトリウム塩に変換できる。
【００４２】
次に記載するいくつかの実施例は本発明の好ましい実施例の一部について追加的に説明を加えるものであるが、発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
オリゴサッカライド混合物（オリゴミックス）の高度硫酸化
工程１：  オリゴミックスの調製
ヘパリンナトリウムＵＳＰ（２５ｇ）（米国、オハイオ州フランクリン市、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ社製）を室温において精製水（１２５ｍｌ）をいれたガラス製ビーカーに静かに加えた。前記の混合物を機械的攪拌具にて５０分攪拌し完全に溶解させた。前記の溶液に濃塩酸（ＨＣｌ）をその溶液のｐＨが約１．５となるまで滴下した。前記の酸性にした溶液に５分間かけてＮａＮＯ２（２．６ｇ）（米国、ニュージャージー州フィリップスバーグ市、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）を加え１時間攪拌した。前記の反応混合物のｐＨは濃塩酸を添加することで１．５に維持した。
【００４４】
上記の溶液に水酸化ナトリウムの溶液を滴下し、前記の溶液のｐＨを１０．０に調整した。水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）（０．２５ｇ）（米国、ワイオミング州ミルウォーキー市、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，製）を前記のアルカリ性の反応溶液に添加し室温にて一晩攪拌を継続した。その後前記の反応溶液に濃塩酸を加えｐＨを３．０として前記の溶液中で進行中の反応を終了させ、更に約１０分間攪拌を続けた。その後前記の溶液のｐＨを水酸化ナトリウム溶液で約６．７にまで上昇させた。中性にした前記溶液を凍結乾燥し、オリゴサッカライド混合物のナトリウム塩（オリゴミックス）（２２．５ｇ）を得た。
【００４５】
工程２：  オリゴミックスのナトリウム塩の高度硫酸化
アルゴンガス雰囲気下において、無水ピリジン（５０ｍｌ）にヘパリン由来のオリゴミックスナトリウム塩（５ｇ）とピリジン−三酸化硫黄複合物（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（１４．０５ｇ））を入れ攪拌し分散液の状態に維持しながら、前記の分散液に無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）を加えた。この反応混合液をオイルバスで６０℃に加温し前記の温度で１８時間攪拌を続けた。
【００４６】
前記の反応混合液を室温まで冷却し、減圧下に置いて溶媒を除去し固体の残存物を得た。前記の固体残存物を精製水に溶解しそのｐＨを水酸化ナトリウム溶液により６．８（±０．１）に調整した。
【００４７】
前記の中和後の溶液を凍結乾燥し、凝集物状の固体を得た。それを再度精製水（１００ｍｌ）に溶解し活性炭（３ｇ）を用いて脱色した。前記の脱色後の溶液をフィルターし、続いて凍結乾燥し、オフホワイト色の粗製高度硫酸化物を得た。
【００４８】
工程３：  サイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）による高度硫酸化二糖類の分離
前記粗製高度硫酸化オリゴノミックスをＢｉｏＲａｄ  Ｐ４  ＢｉｏＧｅｌ（１０Ｌ）（米国、カリフォルニア州ヘリキュール市、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｓ社製）を充填した１．５ｍ´９０ｃｍのカラムを有するサイズ排除クロマトグラフにより、０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液を溶出液として精製した。高度硫酸化二糖類のアンモニウム塩（２．３ｇ）を前記の該当フラクションを凍結乾燥することで得た。
【００４９】
前記の高度硫酸化二糖類のアンモニウム塩を水溶液にし陽イオン交換樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ  １２０ＰＬＵＳ（１５０ｇ）（米国、ミズリー州セントルイス市、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，製）を担持するカラムに通しナトリウム塩にイオン交換した。前記のイオン交換樹脂カラムからの流出液を凍結乾燥して生成物質である白色ないしオフ−ホワイト色の固体（２．３ｇ）を得た。
【００５０】
〔実施例２〕
二糖類の高度硫酸化
工程１：  二糖類の調製
実施例１において記述したのと同様にして調製したオリゴミックスのナトリウム塩（４０ｇ）をＢｉｏＲａｄ  Ｐ４  ＢｉｏＧｅｌ（１０Ｌ）を充填した１．５ｍ´９０ｃｍのカラムを持つサイズ排除クロマトグラフ法により、０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３で溶出し精製した。前記の溶出液流の然るべきフラクションを凍結乾燥することで二糖類のアンモニウム塩を得た（１０ｇ）。前記の二糖類のアンモニウム塩はそのまま高度硫酸化反応の条件にするか、前記の硫酸化反応に供する前にイオン交換クロマトグラフにかけて、実施例１の工程３に示したのと同様の方法にてナトリウム塩に交換した。
【００５１】
工程２：  二糖類の高度硫酸化
アルゴンガス雰囲気下において、無水ピリジン（４０ｍｌ）にヘパリン由来の二糖類のナトリウム塩（４ｇ）とピリジン−三酸化硫黄複合物（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（６．８ｇ））を入れ攪拌し分散液の状態に維持しながら、前記の分散液に無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）を加えた。この反応混合液をオイルバスで６５℃に加温し前記の温度で１８時間攪拌を続けた。
【００５２】
前記の反応混合液を室温にまで冷却し、減圧下に置いて溶媒を除去し固体の残存物を得た。前記の固体残存物を精製水に溶解しそのｐＨを水酸化ナトリウム溶液により６．９５（±０．１）に調整した。
【００５３】
前記の中和後の溶液を凍結乾燥し、凝集物状の固体を得た。それを再度精製水（１００ｍｌ）に溶解し活性炭（３ｇ）を用いて脱色した。前記の脱色後の溶液をフィルター後、凍結乾燥しオフ−ホワイト色の粗製高度硫酸化物質を得た。
【００５４】
工程３：  高度硫酸化二糖類の精製
前記粗製高度硫酸化二糖類をＢｉｏＲａｄ  Ｐ４  ＢｉｏＧｅｌ（１０Ｌ）を充填した１．５ｍ´９０ｃｍのカラムを有するサイズ排除クロマトグラフにより、０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液を溶出液として精製した。高度硫酸化二糖類のアンモニウム塩（４ｇ）を前記の該当フラクションを凍結乾燥することで得た。
【００５５】
前記の高度硫酸化二糖類のアンモニウム塩を水溶液にし陽イオン交換樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ  １２０ＰＬＵＳ（１５０ｇ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，製）を担持するカラムに通しナトリウム塩にイオン交換した。前記のイオン交換樹脂カラムからの流出液を凍結乾燥して生成物である白色ないしオフ−ホワイト色の固体（３．９５ｇ）を得た。
【００５６】
〔実施例３〕
二糖類の高度硫酸化
工程１：  二糖類の調製
ヘパリンナトリウムＵＳＰ（２５ｇ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ社製）を室温において精製水（１２５ｍｌ）をいれたガラス製ビーカーに静かにいれた。前記の混合物を機械的攪拌具により５０分攪拌し完全に溶解させた。ＮａＮＯ２（２．６ｇ）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）を加え溶解するまで攪拌した。次いで濃塩酸を前記の溶液に滴下し前記の溶液のｐＨを約１．５にし、前記の酸性にした溶液をその後約１時間攪拌した。
【００５７】
工程２：  ＮａＢＨ４  によるアルデヒドの還元
上記溶液に水酸化ナトリウムの溶液を滴下しそのｐＨを１０．０にした。前記のアルカリ性溶液にＮａＢＨ４（０．２５ｇ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，製）を加え室温にてその反応性混合物を一晩攪拌した。その後前記の反応混合物のｐＨを濃塩酸（ＨＣｌ）で３．０に調整し反応の進行を停止させその後約１０分間攪拌を続けた。その後、前記の溶液のｐＨを水酸化ナトリウムの溶液で約６．７に調整した。前記の中性になった溶液を凍結乾燥することでオリゴサッカライドの混合物のナトリウム塩（２２．５ｇ）を得た。
【００５８】
工程３：  ＳＥＣによる二糖類フラクションの分離（ＮＨ４＋塩の生成）
ＢｉｏＲａｄ  ＢｉｏＧｅｌレジン（Ｐ６、Ｐ４、またはＰ２）を充填し、０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液を溶出液としたサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）により、二糖類のＮＨ４＋塩を前記の該当フラクションを凍結乾燥することで得た。前記のアンモニウム塩はイオン交換樹脂としてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ１２０Ｐｌｕｓ（ナトリウム型）を用いて陽イオン交換することでナトリウム塩に交換できる。
【００５９】
（二糖類の塩からの）高度硫酸化方法
工程４：  無水ピリジン／ＤＭＦ混合溶媒系内での二糖類のＮａ＋（またはＮＨ４＋）塩のピリジン−ＳＯ３との反応
アルゴンガス雰囲気下において、無水ピリジン（５０ｍｌ）にヘパリン由来の二糖類ナトリウム（またはアンモニウム）塩（５ｇ）とピリジン−三酸化硫黄複合物（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，（１４．０５ｇ））を入れ攪拌し分散液の状態に維持しながら、前記の分散液に無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）を加えた。本反応混合液をオイルバスで６０℃に加温し前記の温度で１８時間攪拌を続けた。前記の反応混合液を室温にまで冷却し、減圧下において溶媒を除去し残存物を得た。
【００６０】
工程５：  高度硫酸化二糖類の抽出
反応系溶剤を除去した後の半固体状の前記の残存物を５％Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ混合溶媒（１００ｍｌ）に分散し２０〜３０分間室温で攪拌した。前記の分散液を濾過し、得られたフィルターケーキを再度前記の水メタノール混合溶媒に分散し室温で２０〜３０分攪拌した。前記の分散液は再度フィルターにかけ、得られた濾液を集めて減圧下で濃縮した。
【００６１】
この様にして得られた固形分残渣を精製水（５０ｍｌ）に溶解し、溶液のｐＨを水酸化ナトリウム溶液にて６．７（±０．１）に調整した。
【００６２】
活性炭（１０ｇ）を上記の中性化した溶液に入れ、できた分散液を２０分間、はげしく攪拌し珪藻土（セライト）を通してフィルターした。前記の脱色済の溶液を凍結乾燥することで固体形状の粗製高度硫酸化物を得た。
【００６３】
工程６：  固体状残渣の水溶液のＳＥＣによるＳｕｐｅｒ−Ｄｉ  ＮＨ４＋塩の生成
０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３溶液を溶出液とする、ＢｉｏＲａｄ  Ｐ４（またはＰ２）ＢｉｏＧｅｌ（１０Ｌ）を充填した１．５ｍ×９０ｃｍのカラムを有するサイズ排除クロマトグラフにより、高度硫酸化二糖類のアンモニウム塩（２．３ｇ）を前記の溶出液流の該当フラクションを凍結乾燥することで得た。
【００６４】
工程７：  アンモニウム塩の陽イオン交換によるナトリウム塩への変換
二糖類の高度硫酸化物のアンモニウム塩水溶液を陽イオン交換樹脂、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ  １２０ＰＬＵＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，製（１５０ｇ））を担持するカラムに通し、前記のアンモニウム塩をナトリウム塩にイオン交換した。前記のイオン交換樹脂カラムからの流出液を活性炭を用いて再度脱色し、その後、凍結乾燥を行い、生成物質である白色ないしオフ−ホワイト色の固体（２．３ｇ）を得た。
【００６５】
以上、本発明に関しある程度詳細に記述したがこれは内容の明確化と理解の助けとするためであって、これら記載の内容をもとに、当業者であれば本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更が理解できるであろう。
【国際公開パンフレット】
2005504067.tif 000002
2005504067.tif 000003
2005504067.tif 000004
2005504067.tif 000005
2005504067.tif 000006
2005504067.tif 000007
2005504067.tif 000008
2005504067.tif 000009
2005504067.tif 000010
2005504067.tif 000011
2005504067.tif 000012
2005504067.tif 000013
2005504067.tif 000014
2005504067.tif 000015
2005504067.tif 000016
2005504067.tif 000017
2005504067.tif 000018
2005504067.tif 000019
【国際調査報告】
2005504067.tif 000020