(57)【要約】ウイルス、細菌、酵母、カビ、マイコプラズマ、プリオンおよび寄生生物のような活性な生物学的汚染物のレベルを低下させるためにモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線に感受性であるモノクローナル免疫グロブリンの製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）モノクローナル免疫グロブリンの製剤を前記放射線から保護するのに有効なレベルまで、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤の残留溶媒含有量を低下させる工程と、
（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合で、好適な放射線により照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
放射線に感受性であるモノクローナル免疫グロブリンの製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を前記放射線から保護するのに有効な量で、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤に少なくとも１種の安定剤を添加する工程と、
（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合で、好適な放射線により照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
放射線に感受性であるモノクローナル免疫グロブリンの製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）モノクローナル免疫グロブリンの製剤を前記放射線から保護するのに有効な量で、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤に少なくとも１種の安定剤を添加する工程と、
（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を殺菌するのに有効な時間の間、低い割合で好適な放射線により照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
放射線に感受性であるモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）モノクローナル免疫グロブリンの製剤を前記放射線から保護するのに有効なレベルまで、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤の残留溶媒含有量を低下させる工程と、
（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を、好適な放射線によりモノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を殺菌するのに有効な時間の間、低い割合で照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
放射線に感受性であるモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）モノクローナル免疫グロブリンの製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまで、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤の残留溶媒含有量を低下させる工程と、
（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を放射線から保護するのに有効な量で、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤に少なくとも１種の安定剤を添加する工程と、
（ｉｉｉ）モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を、好適な放射線によりモノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合で照射する工程と
を含み、工程（ｉ）および（ｉｉ）は逆の順番で行なわれてもよいことを特徴とする方法。
【請求項６】
放射線に感受性であるモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）モノクローナル免疫グロブリンの製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまで、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤の残留溶媒含有量を低下させる工程と、
（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を前記放射線から保護するのに有効な量で、モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤に少なくとも１種の安定剤を添加する工程と、
（ｉｉｉ）モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を好適な放射線によりモノクローナル免疫グロブリンの前記製剤を殺菌するのに有効な時間の間、低い割合で照射する工程と
を含み、工程（ｉ）および（ｉｉ）は逆の順番で行なわれてもよいことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記溶媒は水であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記溶媒は水であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒は水であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶媒は水であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記残留水含有量を有機溶媒の添加によって低下させることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記残留水含有量を有機溶媒の添加によって低下させることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記残留水含有量を有機溶媒の添加によって低下することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記残留水含有量を有機溶媒の添加によって低下させることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶媒は有機溶媒であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶媒は有機溶媒であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶媒は有機溶媒であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶媒は有機溶媒であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項２３】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項２４】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項２６】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項２７】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２９】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項３０】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項３３】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤が、前記残留溶媒含有量の低下の後、有機溶媒中に懸濁されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
前記モノクローナル免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ならびにその断片、誘導体および代謝産物；ＩｇＭ、ならびにその断片、誘導体および代謝産物；ＩｇＡ、ならびにその断片、誘導体および代謝産物；ＩｇＤ、ならびにその断片、誘導体および代謝産物；ＩｇＥ、ならびにその断片、誘導体および代謝産物；ならびにそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記モノクローナル免疫グロブリンは、ＩｇＧ、またはその断片、もしくは誘導体もしくは代謝産物であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記モノクローナル免疫グロブリンは、ＩｇＭ、またはその断片もしくは誘導体もしくは代謝産物であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記モノクローナル免疫グロブリンは、ＩｇＡ、またはその断片もしくは誘導体もしくは代謝産物であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記モノクローナル免疫グロブリンは、ＩｇＤ、またはその断片もしくは誘導体もしくは代謝産物であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記モノクローナル免疫グロブリンは、ＩｇＥ、またはその断片もしくは誘導体もしくは代謝産物であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記モノクローナル免疫グロブリンは、Ｆ（ａｂ）’2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆａｃｂ、ｐＦｃ’およびＦｄ、またはその代謝産物もしくは誘導体からなる群から選択される免疫グロブリンフラグメントを含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記有効な割合は約３．０ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記有効な割合は約２．０ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記有効な割合は約１．０ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記有効な割合は約０．３ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記有効な割合は約３．０ｋＧｙ／時間を超えることを特徴とする請求項１、２または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記有効な割合は少なくとも約６．０ｋＧｙ／時間であることを特徴とする請求項１、２または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記有効な割合は少なくとも約１８．０ｋＧｙ／時間であることを特徴とする請求項１、２または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記有効な割合は少なくとも約４５ｋＧｙ／時間であることを特徴とする請求項１、２または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤は低酸素雰囲気中で保持されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤はアルゴン雰囲気中で保持されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤は真空中で保持されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記残留溶媒含有量は、凍結乾燥、乾燥、濃縮、溶質の添加、蒸発、化学的抽出、噴霧乾燥およびガラス化からなる群から選択される方法により低下されることを特徴とする請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記残留溶媒含有量は約１０％未満であることを特徴とする請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記残留溶媒含有量は約５％未満であることを特徴とする請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記残留溶媒含有量は約２％未満であることを特徴とする請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記残留溶媒含有量は約１％未満であることを特徴とする請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記残留溶媒含有量は約０．５％未満であることを特徴とする請求項１、４、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤に照射する前記工程の前に、少なくとも１種の増感剤がモノクローナル免疫グロブリンの前記製剤に添加されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤は生物学的汚染物として少なくとも１種のプリオンを含有することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤は生物学的汚染物として少なくとも１種のウイルスを含有することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤に照射する前記工程の前に、少なくとも１種の安定剤がモノクローナル免疫グロブリンの前記製剤に添加されることを特徴とする請求項１または４に記載の方法。
【請求項６３】
前記安定剤の少なくとも１種は酸化防止剤であることを特徴とする請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記安定剤の少なくとも１種はフリーラジカルスカベンジャーであることを特徴とする請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記安定剤の少なくとも１種は、反応性酸素種による損傷を低減することを特徴とする請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記安定剤の少なくとも１種は、アスコルビン酸またはその塩もしくはエステル；グルタチオン；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；尿酸またはその塩もしくはエステル；メチオニン；ヒスチジン；Ｎ−アセチルシステイン；リポ酸；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；没食子酸またはその誘導体；没食子酸プロピル、および前記安定剤の２種以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記安定剤の２種以上の前記混合物は、アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと尿酸またはその塩もしくはエステルの混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと、尿酸またはその塩もしくはエステルと、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；尿酸またはその塩もしくはエステルの混合物；尿酸またはその塩もしくはエステル；リポ酸；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；没食子酸またはその誘導体；没食子酸プロピル；ならびに、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記安定剤の少なくとも１種は、ジペプチドのグリシン−グリシンを含むことを特徴とする請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記安定剤の少なくとも１種は、ジオスミンを含むことを特徴とする請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記安定剤の少なくとも１種は、シリマリンを含むことを特徴とする請求項２、３、５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記放射線は、粒子線または電磁放射線またはその混合物であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記電磁放射線は、電波、マイクロ波、可視光線および不可視光線、紫外線、Ｘ線、γ線、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記放射線はγ線であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記放射線は電子ビームであることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記放射線は可視光線であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記放射線は紫外線であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記放射線はＸ線であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記放射線は、多色可視光線であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記放射線は、可視光線および紫外線の１種または複数種の波長の組み合わせであることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記照射は、周囲温度で行なわれることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記照射は、周囲温度より低い温度で行なわれることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記照射は、モノクローナル免疫グロブリンの凝固点より下で行なわれることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記照射は、モノクローナル免疫グロブリンの共融点より下で行なわれることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤のｐＨは７未満であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤のｐＨは６未満であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤のｐＨは５未満であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤のｐＨは４未満であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
モノクローナル免疫グロブリンの前記製剤のｐＨは３未満であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
少なくとも１種のモノクローナル免疫グロブリンと、アスコルビン酸またはその塩もしくはエステル；グルタチオン；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；尿酸またはその塩もしくはエステル；メチオニン；ヒスチジン；Ｎ−アセチルシステイン；ジペプチドグリシン−グリシン；ジオスミン；シリマリン；リポ酸；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；没食子酸またはその誘導体；没食子酸プロピル；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと尿酸またはその塩もしくはエステルの混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと、尿酸またはその塩もしくはエステルと、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；尿酸またはその塩もしくはエステルと、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物からなる群から選択される少なくとも１種の安定剤を含み、前記の少なくとも１種の安定剤は、放射線による組成物の滅菌後、その企図する使用のために前記モノクローナル免疫グロブリンを保存するのに有効な量で存在することを特徴とする組成物。
【請求項９０】
放射線による組成物の滅菌後、その企図する使用のために、照射による滅菌中、前記モノクローナル免疫グロブリンを保存するのに十分に少量である残留溶媒含有量を有することを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
約１０％未満の残留溶媒含有量を有していることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項９２】
約５％未満の残留溶媒含有量を有していることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項９３】
約２％未満の残留溶媒含有量を有していることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項９４】
約１％未満の残留溶媒含有量を有していることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項９５】
約０．５％未満の残留溶媒含有量を有していることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項９６】
ｐＨ値は７未満であることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項９７】
ｐＨ値は６未満であることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項９８】
ｐＨ値は５未満であることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項９９】
ｐＨ値は４未満であることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【請求項１００】
ｐＨ値は３未満であることを特徴とする請求項８９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌し、その中に存在するウイルス、細菌、酵母、カビ、マイコプラズマ、プリオンおよび／または寄生生物のような活性な生物学的汚染物のレベルを低下させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機体は、身体が脅威ととらえる異物へ曝露されると抗体を産生する。抗体（あるいは、免疫グロブリン（Ｉｇ）と総称される）は、Ｂ細胞またプラズマ細胞として知られている免疫系の細胞によって分泌されるタンパク質である。免疫グロブリンの構造は複雑であるが、十分に特徴づけられる。簡単に説明すると、各免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖として知られているタンパク質鎖の複合体からなる。各重鎖は、ジスルフィド結合を介して一本鎖の軽鎖に結合する。得られた複合体は、さらなるジスルフィド結合によって、順次同一の重鎖軽鎖複合体に結合する。重鎖の構造と数を変化させることによって、この基本ユニットが細胞により数種類の特定形態へ組み立てられる。異なる重鎖構造は、免疫グロブリンの「クラス」として知られている、異なる分子を産生する。また、これらのクラスは、上に記載した基本ユニットの数が異なっている。
【０００３】
免疫グロブリン分子のこれらの様々な物理的形態の産生は、逐次的方法により起こる。この方法の間、単一分子または抗原に対する分子の特異性は変化しないままである。その理由は、上述の変化はすべて、特定免疫グロブリン分子の特異性の決定に関与しない免疫グロブリン分子の一部分に生じるからである。この「超可変領域」は、Ｂ細胞の成熟中に、異常に高度の組み換え現象を受ける。これらの組み換え現象が生じた後、細胞による第１の免疫グロブリン分子が産生される。結果として、身体は、比較的少数の可変部領域遺伝子から、異なる特異性を持つ多数の潜在的免疫グロブリン分子を生成することになる。
【０００４】
一度、Ｂ細胞が、その細胞自身の免疫グロブリン分子が結合する分子（「抗原」）に遭遇し、免疫系の他の細胞からシグナルを受け取ると、まず、Ｂ細胞は多数の同一の細胞に増幅し（クローンと総称される）、次いで、免疫グロブリン分泌プラズマ細胞に分化する。このように、産生され得る非常に多くの潜在的免疫グロブリン分子は、身体が応答する必要がある抗原を認識する分子のみに限定される。
【０００５】
産生される免疫グロブリンの膨大な多様な特異性により、身体が過去に免疫グロブリンを作ったそれらの有機体の感染に対して身体の保護が継続することになる。要約すると、結果として、一人のドナー由来の血漿中に含まれている免疫グロブリンは、何百万もの有用な免疫グロブリン特異性を有し得るということである。したがって、血漿由来の免疫グロブリン製剤は、身体中のすべてのプラズマ細胞クローンによって産生された免疫グロブリン分子を含んでいるので、ポリクローナル免疫グロブリン製剤と称される。
【０００６】
ポリクローナル免疫グロブリンは、Ｉｇを産生する能力がないか、あるいは損なわれているヒトの疾病を治療するのに特に有用である。すべてのプラズマ細胞クローンは影響を受けるので、血漿で発見されたすべての免疫グロブリン特異性の組み合わせは前記の不全を治すのに必要とされている。対照的に、極端な程度の特異性が必要である場合、あるいは単一の明確化された治療目標が要求される場合、ポリクローナル免疫グロブリンは最良の溶液ではない。代わりに、所望の特異性を有する単クローンによって産生された免疫グロブリン分子からなる免疫グロブリン製剤が最も的確で最も予測可能な溶液である。かかる製剤は、モノクローナル免疫グロブリンとして知られている。
【０００７】
モノクローナル免疫グロブリンは、ポリクローナル免疫グロブリンと比較して多くの違いがある。検出試薬として使用する場合、モノクローナル免疫グロブリンの単一特異性により、検出は非常に正確になる。治療の場合、望まない特異性の免疫グロブリンが患者に導入されるといったような、ポリクローナル免疫グロブリン製剤により生じる混在の副作用または危険な副作用がモノクローナル免疫グロブリンにはない。また、これらの物理的特性も相違し得る。各モノクローナル免疫グロブリンは特有かつ不変の構造を有するので、安定性、分解、凝集、温度感受性および他の特性のその可能性は、特有かつ不変である。一度、好適なモノクローナル免疫グロブリンが産生のために選択されたならば、その特性は不変である。したがって、モノクローナル免疫グロブリンは、優れた一貫性で、その性能と保存特性を保証しつつ製造することができる。また、要求生産量に生産量を調整する能力により、モノクローナル免疫グロブリンは、ポリクローナル免疫グロブリンの非常に望ましい代替物となる。
【０００８】
モノクローナル免疫グロブリン製剤は、３通りある一般的な方法の１つによって製造される。第１の方法には細胞培養系での産生が含まれ、第２の方法は、モノクローナル免疫グロブリンの産生に一時的バイオリアクターとして動物を使用する。第３の方法は、連続的にそれを回収することができる（遺伝子組み換えによる産生）ように、動物の液体または組織へモノクローナル免疫グロブリンの連続的産生を誘導する方法で、動物に所望のモノクローナル免疫グロブリンの遺伝子を挿入することが含まれる。
【０００９】
これらの各方法は、その製剤が病原体によって汚染される可能性がある。第１の方法では、モノクローナル免疫グロブリンを産生する細胞に、培養系で産生され得る、検出されなかったウイルスが潜伏しているかもしれない。また、細菌、酵母またはカビによる培養系の汚染が生じるかもしれない。
【００１０】
残りの２つの方法には、モノクローナル免疫グロブリン産生細胞の宿主としての、あるいは、モノクローナル免疫グロブリン産生物をそれ自身で製造するバイオリアクターとしての役割を果たす動物の利用が含まれる。明らかに、これらの製品は、宿主動物に感染、または潜伏している病原体による汚染の危険にさらされている。かかる病原体としては、特に、ウイルス、細菌、酵母、カビ、マイコプラズマ、および寄生生物などが挙げられる。
【００１１】
したがって、モノクローナル免疫グロブリン製品中の任意の生物学的活性汚染物を、その製品を使用する前に不活性化することが最も重要である。患者にその製品を直接投与することになっている場合、これは特に重大である。さらに、これは、様々な種類の血漿を含有し、かつマイコプラズマまたは他のウイルスの汚染物の影響を受ける可能性がある培地で調製される、様々なモノクローナル免疫グロブリン製品にとって重要なことである。
【００１２】
これまで、ほとんどの方法は、製品から汚染物を除去または不活性化するのではなく、むしろ製品を特定の汚染物についてスクリーニングまたは試験する方法である。汚染物について陽性の試験結果が出る製品は単に使用しない。スクリーニングの手順の例としては、献血者から得られたヒト血液中の特定のウイルスについて試験することが含まれる。しかしながら、かかる手順には必ずしも信頼性があるとは限らず、非常に数が少ないウイルスの存在を検出することはできない。このことは、偽陰性結果に関連する結果を考慮すれば、試験の評価または確実性を下げる。偽陰性の結果は、ある場合、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の場合には、生命にかかわり得る。さらに、一部の事例では、製品が汚染されているか否かを検出するのに、数か月ではないにしても、数週間かかることがある。
【００１３】
ウイルスを不活性化する技術の可能性を判定する実験を行う場合、関係がある実際のウイルスはほとんど利用されない。これは、試験を行う研究者に対する安全性への配慮と、封じ込めの設備および廃棄物処理に関連する困難性と経費が主因である。それらのかわりに、同一のファミリーおよびクラスのモデルウイルスを使用する。
【００１４】
一般に、不活性化するのが最も困難なウイルスは、タンパク質からできている外部シェルをもつものであり、しかも、それらの中で、不活性化するのが最も困難なものは、最小サイズのものであることが認められている。このことは、それらウイルスの小型サイズが、これらの小さなゲノムに起因しているので、γ線照射および他のほとんどの照射の形態において真実であることが明らかとなっている。分子に対する放射線の直接的効果の規模は、分子のサイズに正比例し、標的分子が大きくなるほど、効果が大きくなる。推論のとおり、γ線照射は、ウイルスゲノムが小さいほど、ウイルスを不活性化するのに必要な放射線量は高くなることが明らかとなった。
【００１５】
ヒトおよび動物に由来する生物製剤について懸念すべきウイルスのうち、最小の重要なウイルスは、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のファミリーと、わずかに大きいタンパク質被覆肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）に属するものである。ヒトにおいては、パルボウイルスＢ１９とＡ型肝炎は重要な病原体である。ブタ由来の製品および組織では、対応する最小のウイルスはブタパルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）である。このウイルスはヒトに無害であるので、ヒトＢ１９パルボウイルスとＡ型肝炎のモデルウイルスとして選択されることが多い。このモデルパルボウイルスの不活性化の実証が、用いられている方法がヒトＢ１９ウイルスとＡ型肝炎を死滅させる適切な証拠となり、さらに、拡大解釈すると、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎などの大型で、それほど耐久性がないウイルスを死滅させる適切な証拠となると考えられる。
【００１６】
より最近の研究では、製剤中の汚染物を除去または不活性化する方法に的が絞られてきた。かかる方法には、熱処理、濾過、ならびに製剤への化学不活性化剤または化学増感剤の添加が挙げられる。熱処理には、感受性のある製剤に損傷を与えることができる、約６０℃まで約７０時間その製品を加熱することが必要である。熱不活性化により、製剤の５０％以上の生物活性を無効化する可能性がある。濾過には、物理的に汚染物を除去するために製剤を濾過することが含まれる。残念ながら、またこの方法により、高分子量を有する製剤が除去されるかもしれない。さらに、ある場合には、製剤が大きな分子構造であるので、小型ウイルスはフィルタによって除去されないかもしれない。化学増感の方法には、ウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡに結合する有害な薬剤、および、ＵＶまたは放射線のいずれかによって活性化されて、ＤＮＡ／ＲＮＡに結合するか、またはウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡバックボーン中の化学結合を切断するか、またはウイルスがもはや自己複製することができないようにこれを架橋結合若しくは複合体化する、反応性中間体および／または遊離基を生じる有害な薬剤の添加が含まれる。この手順では、増感剤が有毒であり、変異原性または発癌性でなくとも、患者に投与することができないので、製剤から未結合の増感剤を洗浄する必要がある。
【００１７】
製剤へのγ線照射は、製剤を殺菌する別の方法である。γ線は、高い総線量で照射した場合、ウイルスと細菌を死滅させるのに有効である（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。しかしながら、この分野の刊行された文献には、γ線が、血液、血液製剤、タンパク質およびタンパク質含有製剤などの紫外線感受性製剤に損傷を与え得ることが報告されている。特に、高放射線量が赤血球、血小板および顆粒球にとって有害であることが示されている（非特許文献２）。特許文献１には、タンパク質製剤は、タンパク質製剤の効力（viability）を保持するためには、照射前に凍結しなければならないことを開示している。この特許は、「もしタンパク質材料が、例えば、周囲温度である間に、γ線が照射された場合、その材料は完全に損なわれ、すなわち、材料の活性が実質的には効果がないほど低くなる」と推断している。このことは、当然、タンパク質であるモノクローナル免疫グロブリンにも同様に当てはまる。しかし、残念ながら、もし、照射目的で凍結し、次いで患者への投与前に解凍させたならば、感受性生物学的製剤（モノクローナル抗体（Ｍａｂ）など）の多くは効力と活性を失う。
【００１８】
上で論じた問題から、モノクローナル免疫グロブリンに悪効果を及ぼすことなく、活性な生物学的汚染物のレベルを低下させるために有効なモノクローナル免疫グロブリンの殺菌方法が求められている。
【００１９】
【特許文献１】米国特許第４，６２０，９０８号
【非特許文献１】Keathly et al., "Is There Life After Irradiation? Part 2," BioPharm July-August, 1993
【非特許文献２】Leitman, "Use of Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post Transfusion Graft-vs-Host Disease," Transfusion Science 10: 219-239 (1989)
【非特許文献３】Meyer and Boyd, Analytical Chem., 31, 215-219, 1959
【非特許文献４】May, et al., J. Biol. Standardization, 10, 249-259, 1982
【非特許文献５】Centers for Biologics Evaluation and Research, FDA, Docket No.89D-0140,. 83-93 ; 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明の目的は、モノクローナル免疫グロブリンに悪効果を及ぼすことなく活性な生物学的汚染物のレベルを低下させることによって、モノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌する方法を提供することである。本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な記述に記載されており、一部は、その記載から明白になるか、あるいは本発明の実施により理解することができる。本発明のこれらの目的および利点は、記載した記述において特に指摘した組成物と方法、ならびにこれについての特許請求の範囲によって実現され達成される。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
これらの目的および他の目的に従って、本発明の第１の実施形態は、（ｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線から保護するために、モノクローナル免疫グロブリン製剤の残留溶媒含有量を有効レベルまで低下させることと、（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を好適な放射線によりモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性のモノクローナル免疫グロブリンの製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００２２】
本発明の第２の実施形態は、（ｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線から保護するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を、モノクローナル免疫グロブリン製剤に添加することと、（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を好適な放射線によりモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性のモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００２３】
本発明の第３の実施形態は、（ｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線から保護するために、モノクローナル免疫グロブリン製剤の残留溶媒含有量を有効レベルまで低下させることと、（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線から保護するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を、モノクローナル免疫グロブリン製剤に添加することと、（ｉｉｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を好適な放射線によりモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射し、こととを含む、放射線感受性のモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌する方法に向けられる。本実施形態によれば、ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）は逆であってもよい。
【００２４】
また、本発明は、少なくとも１種のモノクローナル免疫グロブリンと、アスコルビン酸またはその塩もしくはエステル；グルタチオン；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；尿酸またはその塩もしくはエステル；メチオニン；ヒスチジン；Ｎ−アセチルシステイン；ジペプチドグリシン−グリシン；ジオスミン；シリマリン；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと尿酸またはその塩もしくはエステルの混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと、尿酸またはその塩もしくはエステルと、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；尿酸またはその塩もしくはエステルと、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物からな群から選択される少なくとも１種の安定剤を含み、前記の少なくとも１種の安定剤が、放射線による組成物の滅菌後、それの企図する使用のために前記モノクローナル免疫グロブリンを保存するのに有効な量で存在する組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
Ａ．定義
他に特に定めがない限り、本明細書において用いられているすべての技術的および科学用語は、当該技術分野の技術者によって一般に理解されているのと同一の意味を有することを意図している。本明細書に記載されているすべての特許および刊行物は、引用により本明細書に特に組み込む。
【００２６】
本明細書では、単数形を示す「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には、文脈に他に特段の明らかな指示がない限り、複数の言及を含んでいる。
【００２７】
本明細書では、「免疫グロブリン」という用語は、「抗体」という用語と同義的に使用し、かつ、これに限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含めた免疫グロブリンのすべてのクラスと、細胞またはヒトを含めた動物で発見または産生されているＩｇＧサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のような免疫グロブリンのすべてのサブクラスを包含する。「免疫グロブリン」という用語には、膜型免疫グロブリンと分泌型免疫グロブリンの両方が含まれる。膜型免疫グロブリンはＢ細胞の膜内外タンパク質であり、Ｂ細胞の抗原レセプターとして働く。分泌型免疫グロブリンは、膜型免疫グロブリンのＣ末端のアミノ酸の膜内外領域を欠如していることを除いては、それらの膜相当物と構造上同一である。分泌型免疫グロブリンは細胞外液と分泌物に存在する。
【００２８】
また、「免疫グロブリン」という用語には、これに限定されるものではないが、フラグメントＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆａｃｂ、ｐＦｃ’およびＦｄを含めた免疫グロブリンのフラグメント、ならびに、当該技術分野で知られている免疫グロブリン誘導体および代謝産物が含まれる。免疫グロブリンの代謝産物は、生体による免疫グロブリンの代謝に起因する産物である。当技術分野で知られている種々の免疫グロブリン誘導体は、既知の方法によって調製することができる。この方法には、通常、免疫グロブリン中のペプチドまたはジスルフィド結合を切断することが含まれる。また、免疫グロブリンを誘導体化し、修飾アミノ酸または合成アミノ酸または非天然アミノ酸を含めることができる。また、免疫グロブリンの誘導体には、毒素（例えば、ジフテリア毒素、リシン）、標識化分子（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド）、治療用途または診断用途の放射性原子または分子（例えば、125Ｉ）、酵素（例えば、アビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）のような部分に結合した免疫グロブリンが含まれる。免疫グロブリンには、燐酸化、グリコシル化、ミリスチル化、プレニル化、ＡＤＰリボシル化、メチル化、アセチル化、ヒドロキシル化、カルボキシル化および酸化還元などの翻訳後修飾が含まれていてもよく、あるいは、免疫グロブリンをカチオン化またはアニオン化して、免疫グロブリンの全電荷を改変することもできる。
【００２９】
「モノクローナル免疫グロブリン」という用語は、単一のクローンによって産生された均質の免疫グロブリンを言い、ポリクローナル免疫グロブリンと対比されるものである。モノクローナル免疫グロブリンは、通常、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、免疫化したマウスまたはネズミの脾臓細胞を非分泌型ミエローマと融合させることによって調製されているハイブリドーマから作成される。その融合混合物は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有するＨＡＴ培地で平板培養する。アミノプテリンは、ヒポキサンチンとチミジンが存在する場合、迂回が可能な代謝経路をブロックする。ミエローマ細胞はこの迂回路を欠き、したがって、ＨＡＴ培地中で死滅する。脾臓細胞は、通常、１週間または２週間後に培養中で死滅するが、融合細胞は、ミエローマの不死性を有し、脾臓細胞の代謝迂回路を有するので残存する。融合細胞のうちの一部は抗体を分泌し、その上清を特異的アッセイにて試験する。次いで、所望の抗体を産生するウェルをクローン化する。また、モノクローナル免疫グロブリンは、遺伝子工学の当業者によく知られている種々の技術によって産生することができる。前記技術は、単一免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子の単一のセットの誘導性発現または構成的発現を引き起こすか、または、単一免疫グロブリンをコードする遺伝子の得られた単一のセットの誘導性発現または構成的発現が生じるような方法で、細胞または有機体に遺伝子のセットまたはセットの一部分を付加することを含む。
【００３０】
モノクローナル免疫グロブリンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞培養物（例えば、腹水培養物）を併用した上記技術を使用して、あるいは遺伝子導入（transgenesis）の技術によって産生することができる。遺伝子導入には、宿主有機体へ１個または複数個の遺伝子を挿入することが含まれる。次いで、宿主有機体は、構成的にもしくは誘導に続いて、これらの遺伝子のタンパク質産物を産生し、かつ、前記産物を取り込むか、または組織（卵を含む）もしくは液体（血液、汗、乳もしくは尿を含む）へ分泌する。次いで、得られた組織または液体を回収し、所望のモノクローナル免疫グロブリンをそれから精製する。
【００３１】
本明細書では、「モノクローナル免疫グロブリン製剤」という用語には、これに限定されるものではないが、以下のもの、すなわち、
（１）モノクローナル免疫グロブリン（単一特異性のモノクローナル免疫グロブリン、または異なる特異性および／または異なるクラスのモノクローナル免疫グロブリンの組み合わせなど）のみからなる組成物であって、不純物（モノクローナル抗体が遺伝子組み換え手段によって産生される組織または液体の、天然に存在する成分を含む）を含有していてもよい組成物、（２）モノクローナル免疫グロブリン、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、アジュバント、リポソーム、および他の治療薬などで、当技術分野で公知のものを含む組成物、（３）モノクローナル免疫グロブリンの部分的に精製された製造過程の中間体製剤、および、（４）モノクローナル免疫グロブリンを含有する物品、または製品上に固定化されているか、またはその上に付着されているモノクローナル免疫グロブリンを有する物品が含まれる。好ましい「モノクローナル免疫グロブリン製剤」は以下に記載する。
【００３２】
治療用途では、モノクローナル免疫グロブリンは、典型的には、当技術分野で知られているようなバッファーまたは食塩水と併用する。また、モノクローナル免疫グロブリンは、別の治療薬と併用することもできる。例えば、血小板が凝集するのを防止する抗血小板モノクローナル免疫グロブリンは、血栓の形成を予防する長期療法で評価されている。この用途では、抗血小板モノクローナル免疫グロブリンはアスピリンとともに投与される。モノクローナル免疫グロブリンと他の治療薬は、例えば、静脈注射による投与用に同時包装されてもよい。これは、一つの外部包装中に簡易な包有物の形態を取ってもよく、あるいは、１つの容器中にこれらを供給してもよい。さらに進んだ包装形態の例は、リポソーム製剤にモノクローナル免疫グロブリンを使用することであろう。一般には、所望の細胞上または組織上で、あるいは所望の細胞中または組織中で、構造に結合することにより標的薬剤として作用し得る、少なくともリポソームの外層に免疫グロブリンを包埋する。次いで、薬剤（リポソーム内に含有されている薬剤）はその特異的部位で遊離され、通常の全身性の療法によって達成可能な治療係数より高い治療指数の高濃縮薬物治療を提供する。
【００３３】
治療用途においては、モノクローナル免疫グロブリンは、典型的には、液体、凍結、または、窒素もしくは真空下でパックされたフリーズドライ（凍結乾燥）形態で提供される。次いで、モノクローナル免疫グロブリンは、通常、滅菌水で元に戻し（所望の場合、あるいは必要に応じて解凍）、直接的に、あるいは点滴用バッグの設置に続いて、筋肉注射または静脈注射のような適当な経路によって投与される。本発明によれば、モノクローナル免疫グロブリン製剤は、これに限定されるものではないが、ばら包装あるいは単回用量または多回用量の包装中、包装の前後、投与のための稀釈後、あるいは点滴用バッグまたは他の送達ビヒクル自体中の、原材料、精製もしくは部分的に精製された製造過程の中間物を含めたいかなる段階でも照射されうる。照射は、調剤に有害な効果を及ぼさない、いずれの都合のよい温度においても実施することができる。なお、前記温度は、製剤の凝固点または共融点より高くても、あるいは低くてもよい。表１に示すとおり、モノクローナル免疫グロブリンの種々の製剤は、治療用途に利用可能である。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
また、モノクローナル免疫グロブリン製剤は、研究ツールとしての用途が見出され、莫大な数が診断目的で、特に血液の研究において用いられる。モノクローナル免疫グロブリンに関する代表的な研究ツールと診断試験には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、磁気ビーズに基づくアッセイおよび分離キット、ならびに、蛍光活性化細胞分析および／または選別等が含まれる。かかる診断ツールは、それらを保存するため、および、それらが実験技術者によって取り扱われるので安全性のために、殺菌されることが望ましい。診断目的に用いられるモノクローナル免疫グロブリン製剤は、共有結合化学、乾燥、または他の既知の手段によって、担体上または担体中に固定化されたモノクローナル免疫グロブリンを有する、ディップスティックまたはプラスチックプレートのような固相担体を含むことが多い。本発明によれば、完全な市販のパッケージまたはキットであって、固体単体とこれに付着されたモノクローナル免疫グロブリン、説明書、試薬の容器（例えば、標準曲線を生成するための参考試料）などを含むものは、本発明に従って殺菌することができる。表２に、多数の市販されている診断用モノクローナル免疫グロブリン製品を示す。
【００３６】
【表２】
2005517631.tif 000003
【００３７】
本明細書では、「殺菌する」という用語は、本発明に従って処理されているモノクローナル免疫グロブリン製剤で見出された、少なくとも１種の活性な生物学的汚染物のレベルを低下させることを意味することを意図する。
【００３８】
本明細書では、「生物学的汚染物」という用語は、モノクローナル免疫グロブリン製剤と直接的にまたは間接的に接触した際に、モノクローナル免疫グロブリン製剤、またはその宿主に悪効果を及ぼし得る汚染物を意味することを意図する。かかる生物学的汚染物には、一般に、モノクローナル免疫グロブリン製剤中で発見されるか、あるいは前記製剤を感染させることが当業者に知られている様々なウイルス、細菌および寄生生物が含まれる。生物学的汚染物の例としては、これに限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルスおよび他のレトロウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、フィロウイルス、シルコウイルス、パラミクソウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス（Ｂ型肝炎とＣ型肝炎を含む）、ポックスウイルス、トーガウイルス、エプスタインバーウイルスおよびパルボウイルスのようなウイルス；エシェリヒア属、バチルス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属およびスタヒロコッカス属のような細菌；トリパノゾーマ属とマラリア原虫（プラズモディウム種を含む）のような寄生生物；酵母；カビ；マイコプラズマ；およびプリオンが挙げられる。本明細書では、「活性な生物学的汚染物」という用語は、悪効果を及ぼす可能性がある生物学的汚染物を意味することを意図する。
【００３９】
本明細書では、「生物学的適合溶液」とは、モノクローナル免疫グロブリンが、例えば、懸濁または溶解されることによって暴露され、かつ、生存可能に維持されている、すなわち、それらの本質的な生物学的および生理学的特性を保持する溶液を意味することを意図する。
【００４０】
本明細書では、「生物学的適合緩衝溶液」という用語は、モノクローナル免疫グロブリンの完全性を維持するのに適切なｐＨ特性および浸透圧特性（例えば、張性、オスモル濃度および／またはコロイド浸透圧）を有する生物学的適合溶液を意味することを意図する。好適な生物学的適合緩衝溶液は、一般に、４から８．５のｐＨ値を有しており、等張性であるか、あるいは、わずかに適度に低張性または高張性である。生物学的適合緩衝溶液は知られており、当業者によって容易に利用され得る。
【００４１】
本明細書では、「安定剤」という用語は、照射されるモノクローナル免疫グロブリン製剤への損傷を、モノクローナル免疫グロブリン製剤の安全性と有効な利用を妨げるのには不十分なレベルまで低下させる化合物または材料を意味することを意図する。安定剤の説明に役立つ例としては、これに限定されるものではないが、以下の物が含まれる：アスコルビン酸とトコフェロールのような酸化防止剤；エタノールのようなフリーラジカルスカベンジャーが挙げられる。安定剤の好ましい例としては、これに限定されるものではないが、６，８−ジメルカプトオクタン酸（リポ酸）およびその誘導体および類似体（アルファ、ベータ、ジヒドロ、ビソノルおよびテトラノルリポ酸）、チオクト酸、６，８−ジメルカプトオクタン酸、ジヒドロロポエート（ＤＬ−６，８−ジチオールオクタン酸メチルエステル）、リポアミド、ビソノルメチルエステルおよびテトラノルジヒドロリポ酸、フラン脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、およびそれらの塩類および誘導体を含めた脂肪酸；ケルセチン、ルチンおよびその誘導体類、アピゲニン、アミノフラボン、カテキン、ヘスペリジン、およびナリンギンのような、フラボノイド、フェニルプロパノイドおよびフラベノール；βカロチンを含めたカロチン；Ｃｏ−Ｑ１０；キサントフィル；グリセロール、マンニトールのような多価アルコール；キシロース、グルコース、リボース、マンノース、フルクトースおよびトレハロースのような糖；ヒスチジン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、グルタミン酸、トリプトファン、ナトリウムカプリルＮ−アセチルトリプトファン、およびメチオニンのようなアミノ酸；アジ化ナトリウムなどのアジ化物；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼのような酵素；１，３−ジメチル尿酸およびジメチルチオ尿素のような尿酸およびその誘導体；アロプリノール；グルタチオンおよび還元グルタチオンおよびシステインのようなチオール；セレンのような微量元素；ビタミンＡ、ビタミンＣ（アスコルビン酸ナトリウムおよびパルミトイルアスコルビン酸のようなその誘導体および塩類を含む）、ならびにビタミンＥ（および酢酸トコフェロールとα−トコトリエノールのようなその誘導体および塩類）のようなビタミン；クロマノール−アルファ−Ｃ６；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマ−２  カルボン酸（トロロクス）および誘導体；ゼラチンとアルブミンのような外来タンパク質；トリス−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（ＭＣＩ−１８６）；シチオロン；プエルセチン；クリシン；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）；イミダゾール；メトキシプソラレン（ＭＯＰＳ）；１，２−ジチアン−４，５−ジオール；ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような還元物質；コレステロール；プロブコール；インドール誘導体；チメロサール；ラザロイドおよびチリラザドメシレート（tirilazad mesylate）；プロアンテノール；プロアントシアニジン；硫酸アンモニウム；ペゴルゴテイン（ＰＥＧ−ＳＯＤ）；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−アルファ−フェニルニトロン（ＰＥＮ）；４−ニドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（Ｔｅｍｐｏｌ）；アスコルベート、尿酸塩およびトロロクスＣの混合物（Ａｓｃ／ｕｒａｔｅ／Ｔｒｏｌｏｘ  Ｃ）；タンパク質、ペプチドおよびジペプチド；グリシンホモジペプチドグリシングリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）；還元グルタチオン；ジオスミン；ププロガリン（ｐｕｐｕｒｏｇａｌｉｎ）；これに限定されるものではないが、没食子酸プロピルを含めた没食子酸とその誘導体；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムおよびシリマリン。
【００４２】
本明細書では、「残留溶媒含有量」という用語は、モノクローナル免疫グロブリン製剤中の遊離している液体の量または割合を意味することを意図する。遊離している液体（freely available liquid）は、モノクローナル免疫グロブリン製剤の１種または複数種の非液体成分と結合しないかもしくは複合体を形成しない、モノクローナル免疫グロブリン製剤中に存在する、水または有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール、ポリエチレングリコールなど）のような液体を意味する。遊離している液体には細胞内水が含まれる。本明細書で記載されている水のような関連のある残留溶媒含有量は、ＦＤＡ承認の変法カールフィッシャー法（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）によって検出されたレベルを意味する。他の溶媒の残留レベルの定量は、どの溶媒を使用するかに応じて、当技術分野でよく知られている手段によって検出することができる。また、溶質と残留溶媒の比率は、溶媒内の溶質の濃度を反映したものであると考えることができる。そのように表現されている場合、溶質の濃度が高いほど、残留溶媒の量は低い。
【００４３】
本明細書では、「増感剤」という用語は、ウイルス性汚染物、細菌性汚染物、プリオン汚染物、および／または寄生生物汚染物を選択的に標的とし、放射線による不活性化に対するそれらの感受性をより高めるようにし、その結果、増感剤非含有の場合よりも、照射率もしくは線量を低くして使用するか、および／または、照射時間を短くして使用することができる物質を意味することを意図する。好適な増感剤を説明する例としては、これに限定されるものではないが、以下の物が含まれる：ソラレンおよびその誘導体および類似体（３−カルボエトキシソラレンを含む）；ハロゲン置換基および、第四級アンモニウムイオンまたはホスホニウムイオンのような水可溶化成分を含有するアンゲリシン、ケリンおよびクマリン；核酸結合化合物；臭素化ヘマトポルフィリン；フタロシアニン；プルプリン；ポルホリン；ジヘマトポルフィリンエステルのハロゲン化誘導体または金属原子置換された誘導体、ヘマトポルフィリン誘導体、ベンゾポルフィリン誘導体、ヒドロジベンゾポルフィリンジマレイミド、ヒドロジベンゾポルフィリン、ジシアノジスルホン、テトラカルボエトキシヒドロジベンゾポルフィリン、およびテトラカルボエトキシヒドロジベンゾポルフィリンジプロピオンアミド；ハロゲンまたは金属原子で修飾されていてもよいドキソルビシンおよびダウノマイシン；ネトロプシン；ＢＤペプチド、Ｓ２ペプチド；Ｓ−３０３（ＡＬＥ化合物）；ヒペリシン、メチレンブルー、エオシン、フルオレセイン（およびそれらの誘導体）、フラビン、メロシアニン５４０のような色素；ベルガプテンのような光活性化合物；ならびにＳＥペプチド。
【００４４】
本明細書では、「放射線」という用語は、照射されたモノクローナル免疫グロブリンの少なくとも数種類の成分を殺菌するのに十分なエネルギーの放射線を意味することを意図する。放射線の種類は、これに限定されるものではないが、以下のもの、すなわち、（ｉ）微粒子（ニュートロン、電子および／または陽子のような亜原子粒子の照射）；（ｉｉ）電磁気（電波、可視光線（単色および多色）および不可視光線、紫外線、Ｘ線、γ線、ならびにそれらが混ぜ合わさったもののような種々の電磁界から発生するもの）、が含まれる。かかる放射線は、γ線のようなイオン化（照射された材料中でイオンを生じうる）放射線として、および、可視光線のような非イオン化放射線として記載されていることが多い。かかる放射線源はいろいろであるが、一般に、十分な放射線が、滅菌を行うのに適切な時間かつ適切な割合で与えられる限り、特定の照射源には、本質的な相違はほとんどない。実際には、γ線は通常、コバルトまたはセシウムのアイソトープにより発生するが、一方、Ｘ線は、Ｘ線を放射する装置により発生し、さらに、電子は、機械による発生が含まれる「電子ビーム」照射として知られている方法により材料を殺菌するために用いられることが多い。
【００４５】
Ｂ．特に好ましい実施形態
本発明の第１の好ましい実施形態は、（ｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線から保護するために、モノクローナル免疫グロブリン製剤の残留溶媒含有量を有効レベルまで低下させるステップと、（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を好適な放射線により有効な時間、有効な割合で照射し、モノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌するステップと、を含む放射線感受性のモノクローナル免疫グロブリンの製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００４６】
本発明の第２の実施形態は、（ｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線から保護するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を、モノクローナル免疫グロブリン製剤に添加するステップと、（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線により有効な時間有効な割合で照射し、モノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌するステップと、を含む放射線感受性のモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００４７】
本発明の第３の実施形態は、（ｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線から保護するために、モノクローナル免疫グロブリン製剤の残留溶媒含有量を有効レベルまで低下させるステップと、（ｉｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線から保護するために、モノクローナル免疫グロブリン製剤に少なくとも１種の有効量の安定剤を添加するステップと、（ｉｉｉ）モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線により有効な時間有効な割合で照射し、モノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌するステップと、を含む放射線感受性のモノクローナル免疫グロブリン製剤を殺菌する方法に向けられる。所望の場合、ステップ（ｉ）とステップ（ｉｉ）の順序は、もちろん、逆にすることができる。
【００４８】
本発明の方法によれば、モノクローナル免疫グロブリン製剤の残留溶媒含有量は、放射線によるモノクローナル免疫グロブリン製剤の照射前に低下させることができる。残留溶媒含有量は、モノクローナル免疫グロブリン製剤を放射線から保護するのに有効レベルまで低下される。好適なレベルの残留溶媒含有量は、照射されているモノクローナル免疫グロブリンの特定の製剤の性質および特性に依存して変動し得、その含有量は、当業者によって経験的に決定することができる。好ましくは、溶媒が水である場合、残留溶媒含有量は約１０％未満、さらに好ましくは約２．０％未満、さらに好ましくは約１．０％未満、よりさらに好ましくは約０．５％未満、最も好ましくは約０．２％未満である。
【００４９】
本発明の方法によれば、殺菌されるモノクローナル抗体は、当業者によく知られている手段によって、固体表面上に固定化することができる。
【００５０】
本発明の方法によれば、照射率は、生成物回収と操作を完了するのに必要な時間との最も有利な組み合わせを得るために最適化することができる。低い割合（＜３ｋＧｙ／時間）および高い割合（＞３ｋＧｙ／時間）の両方が、本明細書に記載した方法の適切な適用によって達成することができる。
【００５１】
いかなる操作性の理論にも拘束されるものではないが、残留溶媒含有量を低下させることによって、モノクローナル免疫グロブリン製剤の自由度が低下し、その結果、前記製剤が放射線の効果から保護されると考えられる。したがって、モノクローナル免疫グロブリン製剤の温度をその共融点より下に、またはその凝固点より下に低下させることによって、あるいは、モノクローナル免疫グロブリン製剤の自由度を同じように低下させるガラス化によって、同様の結果が達成できる。これらの結果は、これら以外の場合に許容されるものよりも高い照射率を用いることを可能する。したがって、本明細書に記載されている本発明は、モノクローナル免疫グロブリンに損傷を与えないすべての温度で実施することができる。
【００５２】
モノクローナル免疫グロブリン製剤の残留溶媒含有量は、モノクローナル免疫グロブリン製剤から溶媒を低下させることについて当業者に知られているいずれの方法と技術によっても低下させることができる。かかる方法には、これに限定されるものではないが、蒸発、濃縮、遠心による濃縮、ガラス化および噴霧乾燥が挙げられる。モノクローナル免疫グロブリン製剤の残留溶媒含有量を低下させるための特に好ましい方法は、凍結乾燥である。本発明の特に好ましい実施形態によれば、凍結乾燥されたモノクローナル免疫グロブリン製剤は、照射前に、真空または不活性雰囲気（好ましくは、ヘリウムまたはアルゴンのような希ガス、さらに好ましくは、より高い分子量の希ガス、最も好ましくはアルゴン）下で保存される。
【００５３】
本発明で用いられる放射線は、処理しているモノクローナル免疫グロブリン製剤の１種または複数種の生物学的汚染物の不活性化に有効なすべての放射線であってよい。放射線は、電子ビーム放射線を含めた微粒子であってよい。好ましくは、放射線は、可視光線、紫外線、および様々な波長の電磁放射線の混合物を含めた電磁放射線であり、特に好ましい放射線の形態はγ線である。
【００５４】
本発明の方法によれば、モノクローナル免疫グロブリン製剤は、モノクローナル免疫グロブリン製剤の１種または複数種の生物学的汚染物の不活性化に有効線量率で放射線により照射される。好適な照射率は、放射線の特定の形態、ならびに照射されている特定のモノクローナル免疫グロブリン製剤と不活性化されている特定の生物学的汚染物の各性質および特性に依存して変動し得る。好適な照射率は、当業者によって経験的に決定されうる。照射率は、殺菌方法を行っている間、一定であるのが好ましい。一定であるのが実際的でない場合、変動照射または不連続照射を利用してもよい。
【００５５】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、照射率は、約３．０ｋＧｙ／時間以下、さらに好ましくは約０．１ｋＧｙ／時間から３．０ｋＧｙ／時間の間、よりさらに好ましくは訳０．２５ｋＧｙ／時間から２．０ｋＧｙ／時間の間、より一層好ましくは、約０．５ｋＧｙ／時間から１．５ｋＧｙ／時間の間、最も好ましくは、約０．５ｋＧｙ／時間から１．０ｋＧｙ／時間の間である。
【００５６】
本発明の別の特に好ましい実施形態によれば、照射率は、少なくとも約３．０ｋＧｙ／時間、さらに好ましくは、少なくとも約６ｋＧｙ／時間、さらにより好ましくは、少なくとも約１６ｋＧｙ／時間、より一層好ましくは、少なくとも３０ｋＧｙ／時間、最も好ましくは、少なくとも４５ｋＧｙ／時間以上である。
【００５７】
モノクローナル免疫グロブリン製剤は、モノクローナル免疫グロブリン製剤の１種または複数種の生物学的汚染物の不活性化に有効時間、放射線により照射される。照射率と組み合わせた適当な照射時間により、モノクローナル免疫グロブリンに用いられる適切な照射の線量が得られる。好適なイオン化時間は、放射線の特定の形態および照射率ならびに、照射されている特定のモノクローナル免疫グロブリン製剤および不活性化されている特定の生物学的汚染物の性質および特性に依存して変動し得る。好適な照射時間は、当業者によって経験的に決定することができる。
【００５８】
必要に応じて、本明細書に記載されている方法を使用して、モノクローナル免疫グロブリンへの照射の悪効果を最小限にしながら、照射前にモノクローナル免疫グロブリンに有効量の少なくとも１種の増感化合物を添加して照射の抗菌効果を高めることができる。好適な増感剤は、当業者に知られている。
【００５９】
本発明の方法によれば、モノクローナル免疫グロブリン製剤の照射は、処理されているモノクローナル免疫グロブリン製剤に有害でないすべての温度で実施することができる。好ましい実施形態によれば、モノクローナル免疫グロブリン製剤は、周囲温度にて照射される。代替の好ましい実施形態によれば、モノクローナル免疫グロブリン製剤は、低い温度で、好ましくは、モノクローナル免疫グロブリン製剤の凝固点または共融点で、あるいはそれよりも低い温度で照射される。
【００６０】
モノクローナル免疫グロブリンの凝集を避けるには、モノクローナル免疫グロブリン製剤は、７未満、好ましくは６未満、さらに好ましくは５未満、さらにより好ましくは４未満、最も好ましくは３未満のｐＨを有していてもよい。
【００６１】
本明細書に記載されている数種類の方法を組み合わせて用いることによって、照射方法の抗微生物特性の適切な有効性を保持しながら、照射によって引き起こされるモノクローナル免疫グロブリンに対する好ましくない効果をさらに最小限にすることができることが理解されよう。
【実施例】
【００６２】
次の実施例は本発明の具体例であるが、これに限定されるものではない。他の好適な修正および改変は、当業者が通常出会う種々の変更であり、それらは、完全に本発明の趣旨および範囲内である。特に記載がない限り、照射はすべて60Ｃｏ源を使用して行った。
【００６３】
（実施例１）
本実験では、４５ｋＧｙの低線量のγ線照射に暴露された凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンを用いて、ある安定剤の保護作用を評価した。試験した安定剤は、アスコルビン酸ナトリウム、メチオニンおよびリポ酸であった。
【００６４】
方法
２ｍｌのガラス製バイアル中で、目的の安定剤５０ｍＭを含有または非含有する、抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリン５０μｇおよびウシ血清アルブミン（１％）５ｍｇを含む総量０．５ｍｌの溶液を凍結乾燥した。真空下で試料に栓をした。試料をγ線で照射し（全線量４５ｋＧｙ、線量率１．８３ｋＧｙ／時間、温度４℃）、次いで、水で元に戻した。
【００６５】
個別の重複試料の免疫グロブリン結合活性を、標準ＥＬＩＳＡプロトコルによって検出した。すなわち、９６ウェルのマイクロタイタープレートを２．５μｇ／ｍｌのインシュリン抗原で一晩コートした。５μｇ／ｍｌから出発する抗インシュリンモノクローナル抗体試料の３倍段階稀釈液を用いた。ホスファターゼに結合させたヤギ抗マウスＩｇは、５０ｎｇ／ｍｌで用いた。Ｓｈｉｇｍａ１０４アルカリフォスファターゼ基質は、ＤＥＡバッファー中、１ｍｇ／ｍｌで用いた。結合活性は、４０５〜６２０ｎｍの吸光度により検出した。
【００６６】
相対保護は、未照射試料に対する最大吸光度シグナルの約５０％で未照射試料と比較した照射試料の滴定曲線におけるシフト（すなわち、同じ量の結合を観測するのに必要とされた免疫グロブリンの濃度）を評価することによって決定した。
【００６７】
結果
安定剤非含有の凍結乾燥試料は、４５ｋＧｙのγ線照射後、５０％の免疫グロブリン結合力を保持していた。これは、溶液に４５ｋＧｙのγ線を照射した場合、このγ線が全免疫グロブリンの活性を本質的に全て破壊した先の結果とは対照的である。したがって、凍結乾燥により残留水分含有量を低下したことが、そのことだけで、モノクローナル免疫グロブリンに有意な保護を与えたことは明らかである。
【００６８】
アスコルビン酸ナトリウムを添加することで、試料の照射後の、活性の完全な回復がもたらされた。メチオニンとリポ酸は両方とも、未照射試料と比較すると、照射後の活性の有意な回復（７６〜８３％）をもたらした。それらの結果を図１および図２に示す。また、同様の結果（活性の６５％回復）がププロガリン（ｐｕｐｕｒｏｇａｌｉｎ）についても見られた（データは示さず）。
【００６９】
（実施例２）
本実験では、４５ｋＧｙの低照射量γ線に暴露された凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンを用いて、ある安定剤の保護作用を評価した。試験した安定剤は、アスコルビン酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、ならびに、尿酸塩／トロロクスの混合物およびアスコルビン酸塩（ascorbate）／尿酸塩／トロロクスの混合物である。
【００７０】
方法
３ｍｌガラス製バイアル中で、目的の安定剤を含有または非含有する、抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリン１００μｇおよびウシ血清アルブミン（１％）１０ｍｇを含む総量１．０ｍｌの溶液を凍結乾燥した。真空下で試料に栓をした。試料にγ線を照射し（全線量４５ｋＧｙ、線量率１．８３ｋＧｙ／時間、温度４℃）、次いで、水１．０ｍｌで元に戻した。
【００７１】
個別の重複試料の免疫グロブリン結合活性は、標準ＥＬＩＳＡプロトコルによって決定した。すなわち、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを２．５μｇ／ｍｌのインシュリン抗原で一晩コートした。５μｇ／ｍｌから出発する抗インシュリンモノクローナル抗体試料の３倍段階稀釈液を用いた。ホスファターゼに結合させたヤギ抗マウスＩｇは、５０ｎｇ／ｍｌで用いた。結合活性は、４０５〜６２０ｎｍの吸光度により決定した。
【００７２】
相対保護は、平行線解析ソフトウェアパッケージ（Ｓｔｅｇｍａｎｎ  ＳｙｓｔｅｍｂｅｒａｔｕｎｇのＰＬＡ１．２）を用いて決定した。
【００７３】
結果
安定剤非含有の凍結乾燥試料は、４５ｋＧｙのγ線照射後、７０％の免疫グロブリン結合力を保持していた。これは、溶液に４５ｋＧｙのγ線を照射した場合、このγ線が免疫グロブリンの活性を本質的に全て破壊した先の結果とは対照的である。したがって、凍結乾燥により残留水分含有量を低下したことが、そのことだけで、タンパク質に有意な保護を与えたことは明らかである。
【００７４】
アスコルビン酸ナトリウムの存在によって、照射後、２０％まで回復が高まった。すなわち、照射後、回復された結合力は９０％であった）。また、残りの安定剤により、７７〜８４％の結合力の回復が生じた。それらの結果を図３Ａ〜図３Ｃに示す。
【００７５】
（実施例３）
本実験では、モノクローナル免疫グロブリンの放射線感受性について、１次凍結乾燥（製品中に比較的「高い水分」含有量を残す凍結乾燥）の保護作用と、１次凍結乾燥および２次凍結乾燥（比較的「低い水分」の製品が得られる）の両方の組み合わせの保護作用を検出した。
【００７６】
方法
３ｍｌガラス製バイアル中で、１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウムを含有または非含有する、抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリン１００μｇおよびウシ血清アルブミン（１％）１０ｍｇを含む総量１．０ｍｌの溶液を凍結乾燥した。真空下で試料に栓をした。試料にγ線を照射し（全線量４５ｋＧｙ、線量率２．０３から２．１３ｋＧｙ／時間の間、温度４℃）、次いで、水１．０ｍｌで元に戻した。
【００７７】
個別の重複試料の免疫グロブリン結合活性は、標準ＥＬＩＳＡプロトコルによって決定した。すなわち、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを２．５μｇ／ｍｌのインシュリン抗原で一晩コートした。５μｇ／ｍｌから出発する抗インシュリンモノクローナル抗体試料の３倍段階稀釈液を用いた。ホスファターゼに結合させたヤギ抗マウスＩｇは、５０ｎｇ／ｍｌで用いた。結合活性は、４０５〜６２０ｎｍの吸光度により決定した。
【００７８】
結果
安定剤非含有の場合、第２次の「低い水分」の乾燥サイクルを受けた試料での、照射後の抗インシュリン免疫グロブリンの回復は良好であった。すなわち、安定剤の非存在下で全水分含量が低いと回復が改善される。
【００７９】
しかし、安定剤が存在する場合、試料に第１次の「高い水分」の乾燥サイクルのみが行われたか、さらに第２次の「低い水分」の乾燥サイクルが行われたかどうかに関係なく、４５ｋＧｙを照射後、抗体活性の回復は非常に良好であった。
【００８０】
これらの実験結果を図４および図５に示す。
【００８１】
（実施例４）
本実験では、凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの活性に対する一定の安定剤の保護作用を測定した。試験した安定剤は、アスコルビン酸ナトリウム、トロロクス／尿酸塩／アスコルビン酸塩混合物、およびＮ−アセチルシステインであった。
【００８２】
方法
１％ヒト血清アルブミン（および、任意に、５％ショ糖）を補充した抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンを凍結乾燥し、真空下で栓をし、照射した（全線量４５ｋＧｙ、線量率１．８３と１．８８ｋＧｙ／時間の間）。免疫グロブリン結合活性は、上述の標準ＥＬＩＳＡプロトコルを用いて決定した。
【００８３】
結果
１％ＨＳＡを補充した凍結乾燥抗インシュリン免疫グロブリンを４５ｋＧｙの線量に照射すると、平均して約３３％の結合力の損失を起こした。しかし、次の安定剤を添加することにより、以下のように、回復が有意に改善された：２０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（１００％回復）、２００μＭトロロクス／１．５ｍＭ尿酸塩／２０ｍＭアスコルビン酸塩（８７％回復）、２０ｍＭＮ−アセチルシステイン（８２％回復）。４５ｋＧｙの線量に照射した場合、１％ＨＳＡを含有する凍結乾燥免疫グロブリンへ５％ショ糖を添加すると、平均して約３０％の結合力の損失を起こした。次の安定剤を添加することにより、以下のように、回復が有意に改善された：２０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（８８％回復）、２００μＭトロロクス／１．５ｍＭ尿酸塩／２０ｍＭアスコルビン酸塩（８４％回復）、２０ｍＭＮ−アセチルシステイン（７２％回復）。
【００８４】
これらの実験の結果を図６〜図１１に示す。
【００８５】
（実施例５）
本実験では、高線量率（３０ｋＧｙ／時間）で試料を照射した場合の、凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの活性における安定剤（アスコルビン酸塩）の保護作用を測定した。
【００８６】
方法
抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンを凍結乾燥し、３０ｋＧｙ／時間の線量率（全線量４５ｋＧｙ）で照射した。免疫グロブリン結合活性は、上述の標準ＥＬＩＳＡプロトコルを用いて検出した。
【００８７】
結果
４５ｋＧｙの線量に凍結乾燥抗インシュリン免疫グロブリンを照射すると、平均約３２％の活性の損失を起こした。２０ｍＭアスコルビン酸ナトリウムを添加することにより、未照射試料に比べて結合力が８５％回復した。その結果を図１２に示す。
【００８８】
（実施例６）
本実験では、安定剤の存在下または非存在下で、マウスＩｇＧ3に特異的なＩｇＭモノクローナル免疫グロブリンを低線量率にて照射した。
【００８９】
方法
ラット抗マウスＩｇＧ3モノクローナルＩｇＭの液体（１０ｍＭアジ化ナトリウムを含むＰＢＳバッファーに溶解、抗体濃度は６６６ｎｇ／μｌ）に全線量１０ｋＧｙまたは４５ｋＧｙを１．８ｋＧｙ／時間の割合で照射した。試料は、安定剤未含有であるか、２０ｍＭクエン酸塩、３００μＭ尿酸塩および２００ｍＭアスコルビン酸塩を含有する安定剤混合物を含んでいた。
【００９０】
免疫グロブリン活性は、コーティング用抗原としてのマウスＩｇＧ3とホスファターゼ結合抗ラットＩｇＭ検出抗体を用いて、標準ＥＬＩＳＡプロトコルにより分析した。
【００９１】
結果
安定剤を全く含まない液体試料は、１０ｋＧｙまたは４５ｋＧｙのγ線照射後、機能的な免疫グロブリン活性をすべて喪失した。しかし、安定剤混合物が存在した場合、１０ｋＧｙのγ線照射後では活性の完全な回復をもたらし、４５ｋＧｙのγ線照射後では活性の８８％の回復をもたらした。この実験結果は図１３のグラフに示す。
【００９２】
（実施例７）
本実験では、４５ｋＧｙの低線量率γ線に暴露された固定化抗ヒトインシュリンモノクローナル免疫グロブリンを用いて、ある安定剤の保護作用について評価した。試験した安定剤は、アスコルビン酸ナトリウム、還元型グルタチオン、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムおよびポリプロピレングリコールであった。
【００９３】
方法
４℃において一晩コーティングバッファー中で新しく調製した２μｇ／ｍｌの抗インシュリン免疫グロブリン１００μｌ／ウェルで２枚のプレートをコートした。そのプレートをＰＢＳで簡単に３回洗浄した。各安定剤の２倍段階希釈ＰＢＳ溶液を調製した。選択した安定剤溶液１００μｌを各ウェルに添加した。プレートをキャップマットでしっかりとカバーした。４℃にて、１枚のプレートに全量で４５ｋＧｙを１．９２ｋＧｙ／時間で照射した。対照のプレートは０ｋＧｙであり、４℃にて保存した。
【００９４】
免疫グロブリン結合活性は、標準ＥＬＩＳＡプロトコルによって測定した。前記２枚のプレートウェルを空にし、十分に満たされる量のＰＢＳで４回洗浄した。十分に満たされる量のブロッキングバッファー（約３８０μｌ）をすべてのウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴ（０．０５％ＴＷＥＥＮ２０を含むＴＢＳ（ｐＨ７．４））ですべてのウェルを４回洗浄した。５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識化インシュリンを含む結合バッファー１００μｌを各ウェルに添加した。プレートをプレートシーラーでカバーし、１．５時間振盪しながら（３にセットされたＬａｂＬｉｎｅタイタープレートシェーカー）、３７℃でインキュベートした。次いで、ＴＢＳＴでそのプレートを４回洗浄した。０．５μｇ／ｍｌのホスファターゼ標識化ストレプトアビジンの１００μｌ（結合バッファーに１：１０００で希釈されたストック）を各ウェルに添加した。そのプレートをプレートシーラーでカバーし、振盪しながら１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、ＴＢＳＴでそのプレートを４回洗浄した。１ｍｇ／ｍｌのＳｉｇｍａ１０４ホスファターゼ基質を含むＤＥＡバッファー溶液１００μｌを各ウェルに添加した。次いで、振盪しながら、３７℃でそのプレートをインキュベートした。吸光度は、５分間隔で４０５ｎｍ〜６２８ｎｍで測定した。
【００９５】
結果
図１４および図１５に示すように、アスコルビン酸ナトリウムは用量依存性の保護作用を示した。３１〜２５０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを含有する試料は、７３〜８１％を超える保持活性を示した。
【００９６】
グルタチオン含有試料は、約２５％高いモノクローナル免疫グロブリン活性の保持を示しており、それは約３１ｍＭのグルタチオン濃度まで用量依存性であった。
【００９７】
ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムで処理した試料は、３１ｍＭの安定剤濃度において、対照試料よりも約５０％高い保持活性を示した。
【００９８】
３種類のポリプロピレングリコール（すなわち、ポリプロピレンＰ４００（Ｆｌｕｋａ  ８１３５０）、ポリプロピレンＰ１２００（Ｆｌｕｋａ  ８１３７０）；ポリプロピレンＰ２０００（Ｆｌｕｋａ  ８１３８０））はすべて保護作用を示した。ポリプロピレングリコールで処理した試料は、対照試料に対し、約５０〜６０％増加した活性の保持を示した。
【００９９】
（実施例８）
本実験では、４５ｋＧｙのγ線照射から固定化抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンを保護するためのアスコルビン酸ナトリウムの最適濃度を決定した。さらに、４５ｋＧｙのγ線照射に暴露された固定化モノクローナル免疫グロブリンのアスコルビン酸塩の安定化作用について、１．５ｍＭ尿酸の存在がいずれかの効果を有するかどうかを測定した。
【０１００】
方法
４℃にて一晩、２．５μｇ／ｍｌの抗インシュリン免疫グロブリンを含むコーティングバッファー１００μｌで２枚のプレートをコートした。コーティング溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。４×アスコルビン酸塩溶液２５μｌを適切なウェルに添加した。水７５μｌを尿酸塩非含有ウェル（列ａ〜ｄ）に添加した。水２５μｌを尿酸塩含有ウェル（列ｅ〜ｈ）に添加した。１５μｌの３ｍＭ尿酸塩を尿酸塩含有ウェル（列ｅ〜ｈ）に添加した。プレートをキャップマットでカバーした。４℃にて、１枚のプレートを全量４５ｋＧｙに向けて１．９ｋＧｙ／時間でγ線照射した。別のプレートはトラベル（travel）対照として４℃にて保存した。
【０１０１】
免疫グロブリン結合活性は、以下のようにして標準ＥＬＩＳＡプロトコルによって測定した。ウェル内容物を除去し、十分に満たされる量のＰＢＳで２回洗浄した。十分に満たされる量のブロッキングバッファー（約３８０μｌ）をすべてのウェルに添加することによって非特異的結合部位をブロックし、３７℃で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴですべてのウェルを３回洗浄した。１０ｎｇ／ｍｌのインシュリン−ビオチンを含む結合バッファー１００μｌを各ウェルに添加した（結合バッファー中１：１０００に希釈されたストック）。そのプレートをプレートシーラーでカバーし、振盪しながら（３にセットしたＬａｂＬｉｎｅタイタープレートシェーカー）、３７℃で１時間インキュベートした。そのプレートは、ＴＢＳＴを用いて、各セット２回洗浄を４セット（通常、各セット間５分放置）により洗浄した。２５ｎｇ／ｍｌのホスファターゼ標識化ストレプトアビジン溶液（結合バッファーに１：１０００で希釈されたストック）１００μｌを各ウェルに添加した。そのプレートをプレートシーラーでカバーし、振盪しながら１時間３７℃でインキュベートした。そのプレートは、ＴＢＳＴを用いて、各セット２回洗浄を４セット（通常、各セット間５分放置）により洗浄した。１ｎｇ／ｍｌのＳｉｇｍａ１０４ホスファターゼ基質を含むＤＥＡバッファー溶液１００μｌを各ウェルに添加した。章動させながら外界温度でそのプレートをインキュベートした。吸光度は４０５ｎｍ〜６２０ｎｍで測定した。
【０１０２】
結果
水溶性環境（尿酸の非存在下）で固定化抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの最大保護をもたらすために必要なアスコルビン酸ナトリウムの最適濃度が約１５０ｍＭであることが決定された。約１５０ｍＭのアスコルビン酸塩の濃度で抗インシュリン結合活性の約５０％の回復が達成された。１．５ｍＭ尿酸を添加すると、アスコルビン酸塩線量曲線のわずかな左側へのシフト（〜５ｍＭ）が生じ、より低濃度のアスコルビン酸塩（〜３０ｍＭ）で活性の回復が最大になるように思われた。図１６Ａは完全なデータセットを示し、図１６Ｂは、これらの値を決定するために用いたデータの臨界領域を拡大したものである。
【０１０３】
（実施例９）
本実験では、固定化モノクローナル免疫グロブリンを４５ｋＧｙのγ線照射から保護するためのアスコルビン酸ナトリウムの最適濃度を測定した。さらに、２．２５Ｍ尿酸の存在がアスコルビン酸塩の安定化作用に効果を及ぼすかどうかについて測定した。
【０１０４】
方法
４℃にて一晩、２．５μｇ／ｍｌの抗インシュリン免疫グロブリンを含むコーティングバッファー１００μｌで２枚のプレートをコートした。コーティング溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。４×アスコルビン酸塩溶液２５μｌを適当なウェルに添加した。水７５μｌを尿酸塩非含有ウェル（列ａ〜ｄ）に添加した。７５μｌの３ｍＭ尿酸塩ストックを尿酸塩含有ウェル（列ｅ〜ｈ）に添加した（ｆ．ｃ．＝２．２５ｍＭ）。そのプレートを９６ウェルキャップマットでカバーした。４℃にて、１枚のプレートを全量４５ｋＧｙに向けて１．９ｋＧｙ／時間でγ線照射した。別のプレートはトラベル対照として４℃にて保存した。
【０１０５】
実施例８の記載のようにして、モノクローナル免疫グロブリン結合活性を測定した。
【０１０６】
結果
図１７Ａおよび図１７Ｂに示すとおり、水溶性環境（尿酸の非存在下）での固定化抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの最大保護を得るために必要なアスコルビン酸ナトリウムの最適濃度は約７０ｍＭであると決定された。これは、アスコルビン酸塩の最適濃度が約１５０ｍＭである、実施例８と対照的であった。実施例８では約５０％の回復であったのに対し、本実施例では、抗インシュリン結合活性の約１００％の回復が達成された。尿酸（２．２５ｍＭ）を添加すると、アスコルビン酸塩線量曲線にわずかな左側へのシフト（〜５ｍＭ）が生じ、低濃度のアスコルビン酸塩（〜２５ｍＭ）で活性の回復が最大になると思われた。尿酸非含有の照射試料には二相性の性質があることがわかった。回復は、０〜２０ｍＭアスコルビン酸塩の間で有意に改善され、２０〜５０ｍＭのアスコルビン酸塩からは水平になり、次いで、約７０ｍＭのアスコルビン酸塩で最大の回復が観測されるまで再上昇した。
【０１０７】
（実施例１０）
本実験では、γ線照射した、１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および５％ショ糖補充の凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンにおける種々の安定剤の保護作用について評価した。試験した安定剤は、アスコルビン酸塩（２０ｍＭ）；トロロクス（２００ｍＭ）、尿酸塩（１．５ｕＭ）およびアスコルビン酸塩（２０ｍＭ）の混合物；ｎ−アセチル−１−システイン（２０ｍＭ）；還元型グルタチオン（２０ｍＭ）；およびジペプチドのグリシン−グリシン（２０ｍＭ）であった。
【０１０８】
方法
約６４時間試料を凍結乾燥し、真空下で栓をし、アルミニウム製クリンプシールで密閉した。４℃にて、試料に全線量４５．１〜４６．２ｋＧｙまで１．８３〜１．８８ｋＧｙ／時間の線量率で照射した。
【０１０９】
モノクローナル免疫グロブリン活性は、標準ＥＬＩＳＡプロトコルによって測定した。４℃にて一晩、２．５μｇ／ｍｌのヒト組み換えインシュリンでＭａｘｉｓｏｒｐプレートをコートした。３７℃で２時間、そのプレートをブロッキングバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、２％ＢＳＡ）２００μｌでブロックし、次いで、洗浄バッファー（ＴＢＳ、ｐＨ７、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）で６回洗浄した。試料を高純水（１００ｎｇ／μｌ）５００μｌに再懸濁し、ブロッキングバッファーで一晩または２時間コートされた、３００μｌＵ底プレート中で５μｇ／ｍｌに希釈した。最終濃度０．００２２μｇ／ｍｌで３倍段階稀釈を行った。プレートを撹拌しながら３７℃にて１時間インキュベートし、次いで、洗浄バッファーで６回洗浄した。ホスファターゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を結合バッファーで５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルに１００μｌを添加した。そのプレートを撹拌しながら３７℃にて１時間インキュベートし、洗浄バッファーで６回洗浄した。各ウェルにＳｉｇｍａ１０４基質（ＤＥＡバッファー中１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを添加し、室温で反応させた。そのプレートを、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＣＣ／３４０を用いて、６２０ｎＭの吸光度を差し引いて、４０５ｎＭで測定した。
【０１１０】
結果
図１８Ａ〜図１８Ｈに示すように、４５ｋＧｙのγ線を照射した、１％ＨＳＡ補充の凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンは、平均１．５倍の活性低下（平均３３％の結合力の損失）が生じた。
【０１１１】
安定剤の存在下で４５ｋＧｙを照射された試料については、以下の種々の結果が得られた。
【０１１２】
２０ｍＭアスコルビン酸塩＝〜１００％の回復。
【０１１３】
２００μＭトロロクス、１．５ｍＭ尿酸塩、２０ｍＭアスコルビン酸塩＝〜８７％の回復。
【０１１４】
２０ｍＭ、ｎ−アセチル−１−システイン＝〜８２％の回復。
【０１１５】
２０ｍＭ還元型グルタチオン＝〜７６％の回復。
【０１１６】
２０ｍＭのグリシン−グリシン＝〜１００％の回復。
【０１１７】
１％ＨＳＡ含有の凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに５％のショ糖を添加した場合、４５ｋＧｙを照射した試料中の活性は、平均して７０％回復した（平均約１．５倍の活性損失、または約３０％の活性損失）。
【０１１８】
前述の安定剤の存在下で４５ｋＧｙを照射された試料は、５％ショ糖を添加した場合、以下のように活性を低下した。
【０１１９】
２０ｍＭアスコルビン酸塩＝〜８８％の回復。
【０１２０】
２００μＭトロロクス、１．５ｍＭ尿酸塩、２０ｍＭアスコルビン酸塩＝〜８４％の回復。
【０１２１】
２０ｍＭ、ｎ−アセチル−１−システイン＝〜７２％の回復。
【０１２２】
２０ｍＭ還元型グルタチオン＝〜６９％の回復。
【０１２３】
２０ｍＭのグリシン−グリシン＝〜７９％の回復。
【０１２４】
異なる特異性の別のモノクローナルＩｇＧ製剤（抗Ｉｇλ軽鎖）への、２０ｍＭアスコルビン酸塩、２０ｍＭのグリシン−グリシンの添加、またはアスコルビン酸塩およびグリシン−グリシン２０ｍＭの添加の場合にも同様の結果が得られた。
【０１２５】
（実施例１１）
本実験では、凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンにおけるアスコルビン酸塩（Ａｓｃ、２０ｍＭ）、アスコルビン酸塩（２０ｍＭ）／尿酸塩（１．５ｍＭ）／トロロクス（２００ｕＭ）混合物（ＡＵＴ）、ｎ−アセチルシステイン（中性型：ＮＡＣ−ｎ、酸性型：ＮＡＣ−ａ、ともに２０ｍＭ）、グリシン−グリシン（２０ｍＭ）、還元型グルタチオン（ＧＳＨ、２０ｍＭ）、ジオスミン（３９．３ｕＭ）およびシリマリン（２４６ｕＭ）の保護作用について評価した。
【０１２６】
方法
３ｍｌガラス製バイアル中で、目的の安定剤を含有または非含有する、１００μｇ抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンと１０ｍｇＢＳＡ（１％）を含む全量１．０ｍｌの溶液を凍結乾燥した。その試料にγ線を照射し（全線量４５ｋＧｙ、線量率１．８３ｋＧｙ／時間、温度４℃）、次いで、水１ｍｌで元に戻した。免疫グロブリン非含有の４つの重複試料について、カールフィッシャー水分分析を行った。
【０１２７】
個々の重複試料の免疫グロブリン結合活性は、標準ＥＬＩＳＡプロトコルによって決定した。すなわち、２．５μｇ／ｍｌインシュリン抗原でＭａｘｉｓｏｒｐプレートを一晩コートした。５μｇ／ｍｌからスタートする抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリン試料の３倍段階稀釈液を用いた。ヤギ抗マウスホスファターゼ複合体は５０ｍｇ／ｍｌで用いた。対応する未照射試料と比較した照射試料の相対的作用強度値は、平行線解析ソフトウェアパッケージ（Ｓｔｅｇｍａｎｎ  ＳｙｓｔｅｍｂｅｒａｔｕｎｇのＰＬＡ１．２）を用いて計算した。質量分析は、ペンシルベニア州、ウェストチェスターのＭ−ｓｃａｎ，Ｉｎｃ．によって行われた。
【０１２８】
結果
図１９Ａ〜図１９Ｆに示すとおり、１％ウシ血清アルブミン存在下で凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンへ照射すると、その固定化抗原に対する免疫グロブリンの結合力の約３０％が損失（未照射試料対比）した。アスコルビン酸塩を単独添加した場合、２０％まで回復が改善した。すなわち、照射後に約９０％の結合力の回復があった。アスコルビン酸塩／尿酸塩／トロロクス混合物、ジペプチドグリシン−グリシン、中性ｎ−アセチルシステイン、還元型グルタチオン、またはシリマリンを添加した場合、結合力は７７〜８４％回復した。
【０１２９】
異なる特異性を持つ別の２種類のモノクローナルＩｇＧ製剤（抗Ｉｇλ軽鎖および抗ＩｇＧ１）への、２００ｍＭアスコルビン酸塩、２００ｍＭのグリシン−グリシンの添加、またはアスコルビン酸塩およびグリシン−グリシン２００ｍＭの添加の場合にも同様の結果が得られた。
【０１３０】
（実施例１２）
本実験では、アスコルビン酸塩の存在下または非存在下における液状で照射された抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの安定性について評価した。
【０１３１】
方法
１ｍｇ／ｍｌまで抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンを希釈し、２００ｍＭアスコルビン酸塩の存在下または非存在下、４℃にて、全線量０、１５、または４５ｋＧｙのγ線を照射した。
【０１３２】
個別の重複試料の免疫グロブリン結合活性は、前の実施例で記載したように、通常、標準の直接的ＥＬＩＳＡプロトコルによって検出した。
【０１３３】
結果
図２０Ａおよび図２０Ｂに示したように、２００ｍＭアスコルビン酸塩を添加すると、１５ｋＧｙの放射線を照射した試料の免疫グロブリン結合活性は１００％回復し、４５ｋＧｙの放射線を放射した試料の結合力は、インハウスの稀釈対照ならびに０ｋＧｙ＋アスコルビン酸塩の対照と比較すると、それぞれ７１．７％と８０．４％の回復であった。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定した場合、抗インシュリン免疫グロブリンへ照射すること、および安定剤が非存在であることは、ポリアクリルアミドゲル上の高分子量バンドによって明らかなように、タンパク質の凝集を生じた。さらに、材料の有意な損失は明らかであった。２００ｍＭアスコルビン酸塩を添加すると、完全なＩｇＧ1バンド、ならびに重鎖バンドおよび軽鎖バンドの回復によって示されるように、１５ｋＧｙおよび４５ｋＧｙで照射された免疫グロブリンに対して保護作用があった。
【０１３４】
２００ｍＭアスコルビン酸塩＋１５ｋＧｙの重複試料を平均した場合、その抗原結合活性に稀釈対照の活性との有意な相違はなかった。対照的に、アスコルビン酸塩含有試料に４５ｋＧｙを照射した場合には、インハウスの稀釈対照およびストックの対照と比較すると、それぞれ、結合力が平均して２倍および２．５倍低下した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、アスコルビン酸塩の非存在下で、抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに照射すると、材料が有意に損失し、高分子量の凝集の生成が生じたことが示された。２００ｍＭアスコルビン酸塩を添加すると、凝集の形成が防止され、１５ｋＧｙと４５ｋＧｙの照射後に、それぞれ、免疫グロブリンに約８０％と約５０％の回復があった。
【０１３５】
（実施例１３）
本実験は、低ｐＨ（４．５）が、４５ｋＧｙのγ線を照射されたモノクローナル免疫グロブリンについてＬ−アスコルビン酸の安定化作用を低下させるかどうかを測定するために行った。
【０１３６】
方法
抗ヒトインシュリンモノクローナルＩｇ（抗ヒトインシュリンモノクローナル免疫グロブリン、精製クローン＃７Ｆ８；ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、＃Ｅ８６１０２Ｍ（ロット７ｌ２５０００））は、ｐＨ６．８およびｐＨ４．５にて、２００ｍＭのＬ−アスコルビン酸の存在下および非存在下、液体として全線量４５ｋＧｙに向けて１．７７４ｋＧｙ／時間（60Ｃｏ）の線量率で照射された。照射後、標的としてインシュリンをコートしたプレートを用いて、ＥＬＩＳＡアッセイにより、それらの抗原特異的結合能力について試料を検定した。Ｉｇの構造分析は、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、還元条件下と非還元条件下の両方で行った。
【０１３７】
結果
図２１Ａおよび図２１Ｂに示すように、ＥＬＩＳＡ機能アッセイの結果は、アスコルビン酸塩存在下でのモノクローナル免疫グロブリンの回復がｐＨ値に依存しないことを明確に示した。ｐＨ６．８とｐＨ４．５のグラフは、実質的には重ね合わすことができる。アスコルビン酸の添加時のｐＨ値および照射後の再度のｐＨ値の両方で活性のわずかな低下が確認された。しかし、この低下の度合いは、アスコルビン酸塩の非存在下で照射が行われた場合に見られる活性の完全な損失に比べると小さい。
【０１３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲルは、ｐＨ３．８およびｐＨ４．５の両ｐＨにおけるアスコルビン酸の非存在下での４５ｋＧｙで、免疫グロブリンが完全に破壊されることを示した。しかし、２００ｍＭアスコルビン酸を添加すると、照射時に見かけの構造が保持されていた。４．５のｐＨは、凝集を抑制することができる。
【０１３９】
これらの結果は、２００ｍＭアスコルビン酸の存在下では、ｐＨ６．７とｐＨ４．５の両値において、構造と活性を保持しながら、少なくとも４５ｋＧｙまでモノクローナルＩｇを照射することができることを示している。
【０１４０】
（実施例１４）
本実験では、４℃にて約１．８ｋＧｙ／時間の割合で60Ｃｏγ線を照射した、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）に感染した抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリン中のウイルスの不活性化レベルとモノクローナル免疫グロブリン活性保持レベルを評価した。
【０１４１】
方法
ヒト供給源の生物学的製剤に関連する最も困難なウイルスと考えられる非エンベロープウイルスであり、動物供給源の生物学的製剤に関連する最も困難なウイルスと考えられるパルボウイルスファミリーの他のメンバーの非常に近い類似体であるヒトパルボウイルスＢ１９のモデルウイルスとして、ＰＰＶを用いた。
【０１４２】
インシュリンに対するモノクローナル免疫グロブリン製剤に高力価のＰＰＶ保存物を加えた。保護剤（アスコルビン酸ナトリウム）を最終濃度２００ｍＭでいくつかの試料に添加した。
【０１４３】
照射する試料を４℃、約１．８ｋＧｙ／時間の割合で60Ｃｏ放射線に暴露した。
【０１４４】
いくつかの試料に照射した後、そのＰＰＶ添加試料のアリコートを取り出し、残存する感染性ウイルス粒子の量を滴定するために用いた。簡単に説明すると、細胞変性効果試験（ＣＰＥ）として知られているウイルスの検出バイオアッセイで試料を検定した。ＰＰＶウイルスによる感染が可能であり、かつそれによって溶菌される細胞系（ＰＫ−１３細胞としても知られているブタ腎臓細胞）を９６ウェルアッセイプレートに加え、細胞密度約７０％の単層を形成させた。限界希釈系列（５倍稀釈）でウェルに、試料の４つの重複したアリコートを添加した。次いで、７〜８日間プレートをインキュベートし、次いで、生細胞がウェルに残ったかどうかを決定するために試験した。得られたデータは、Ｋａｒｂｅｒによって記載されているような限界希釈法を用いて分析し、ウイルス力価を決定し、０．１ｍｌ当たりのＬｏｇ10ＴＣＩＤ50力価として添付の図面に示した。
【０１４５】
結果
下記の表４と図２２に示すように、γ線を適用することにより、用量依存的な方法で有効にウイルスが不活性化された。モノクローナル免疫グロブリンに２００ｍＭアスコルビン酸ナトリウムを添加すると、低放射線量でウイルスの不活性化が有意に低下したが、高放射線量ではこの作用は著しく小さかった。アスコルビン酸塩含有試料に４５ｋＧｙのγ線を適用した場合、ウイルスの不活性化の対数は４より大きかった。
【０１４６】
【表３】
2005517631.tif 000004
【０１４７】
（実施例１５）
本実験は、アスコルビン酸ナトリウムの存在下または非存在下で、液体および凍結乾燥の両形態のモノクローナル免疫グロブリンに電子ビーム線を照射した場合に達成された活性保持レベルを評価するために行った。
【０１４８】
方法
抗インシュリンＩｇＧ1は、液体と凍結乾燥後に試験した。試料は、液体および凍結乾燥状態において、２００ｍＭおよび２０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを用いて、および、アスコルビン酸ナトリウムを用いずにそれぞれ調製した。
【０１４９】
照射する試料（アスコルビン酸塩含有または非含有）は、試料華氏７７〜８８度にて、約４５ｋＧｙ／時間の割合で電子ビーム線に暴露した。電子ビームエネルギーは７ＭｅＶであり、全線量約４５ｋＧｙを照射した。対照試料は、照射場所との間を移動した、アスコルビン酸塩を含有する、および含有しない未照射試料と、照射場所へ移動しなかった基準対照試料とからなる。移送中、４℃に試料を保持した。下記の表５に試料を示す。
【０１５０】
【表４】
2005517631.tif 000005
【０１５１】
照射後、蒸留水で凍結乾燥試料を元に戻した。次いで、実施例１０に記載したようにして抗ヒトインスリンＥＬＩＳＡアッセイで全試料を試験した。抗原結合活性の回復の近似測定は、最大ＯＤの約５０％を産生するＩｇの濃度として手動で行った。
【０１５２】
結果
下記の表６に示すように、液状の場合、電子ビーム線の適用によりＩｇは完全に不活性化された。アスコルビン酸塩の存在下では、活性は明らかに回復したが、その規模は限定されていた。
【０１５３】
照射前にＩｇを凍結乾燥すると、液体にアスコルビン酸塩だけを添加した場合よりも活性の回復により大きな効果があった。アスコルビン酸塩非含有Ｉｇに照射した場合、抗原結合活性の約５０％が保持された。凍結乾燥前に２０ｍＭアスコルビン酸塩を追加すると、活性が完全に回復した。ＥＬＩＳＡの結果を図２３Ａと図２３Ｂに示す。
【０１５４】
【表５】
2005517631.tif 000006
【０１５５】
本発明は十分に記載されているが、本発明またはその任意の実施態様の範囲を逸脱することなく、広範囲かつ同等の条件、配合および他のパラメーターで本発明の方法を実施することができることは当技術分野の当業者には理解されよう。本明細書に引用されたすべての特許および刊行物は、ここにその全体を完全に援用する。任意の刊行物の引用は出願日前のその開示についてであり、先行する発明によって本発明がかかる刊行物に先行する権利が与えられないという自認として解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】４５ｋＧｙの低線量γ線に暴露された、凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図２】４５ｋＧｙの低線量γ線に暴露された、凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図３Ａ】４５ｋＧｙの低線量γ線に暴露された、凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図３Ｂ】４５ｋＧｙの低線量γ線に暴露された、凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図３Ｃ】４５ｋＧｙの低線量γ線に暴露された、凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図４】モノクローナル免疫グロブリンの感受性に対する１次凍結乾燥および２次凍結乾燥の保護作用を示すグラフである。
【図５】モノクローナル免疫グロブリンの感受性に対する１次凍結乾燥および２次凍結乾燥の保護作用を示すグラフである。
【図６】凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの活性に対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図７】凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの活性に対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図８】凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの活性に対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図９】凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの活性に対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図１０】凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの活性に対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図１１】凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの活性に対する一定の安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図１２】高線量率（３０ｋＧｙ／時間）で試料を照射した場合の、凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンの活性に対する安定剤の保護作用を示すグラフである。
【図１３】γ線照射後のＩｇＭ活性に対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１４】γ線照射後の固定化抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１５】γ線照射後の固定化抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１６Ａ】γ線照射後の固定化抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する種々の濃度のアスコルビン酸塩の効果を示すグラフである。
【図１６Ｂ】γ線照射後の固定化抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する種々の濃度のアスコルビン酸塩の効果を示すグラフである。
【図１７Ａ】γ線照射後の固定化抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する種々の濃度のアスコルビン酸塩の効果を示すグラフである。
【図１７Ｂ】γ線照射後の固定化抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する種々の濃度のアスコルビン酸塩の効果を示すグラフである。
【図１８Ａ】γ線照射後のヒト血清アルブミンまたはショ糖を補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１８Ｂ】γ線照射後のヒト血清アルブミンまたはショ糖を補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１８Ｃ】γ線照射後のヒト血清アルブミンまたはショ糖を補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１８Ｄ】γ線照射後のヒト血清アルブミンまたはショ糖を補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１８Ｅ】γ線照射後のヒト血清アルブミンまたはショ糖を補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１８Ｆ】γ線照射後のヒト血清アルブミンまたはショ糖を補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１８Ｇ】γ線照射後のヒト血清アルブミンまたはショ糖を補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１８Ｈ】γ線照射後のヒト血清アルブミンまたはショ糖を補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１９Ａ】γ線照射後のウシ血清アルブミンを補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１９Ｂ】γ線照射後のウシ血清アルブミンを補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１９Ｃ】γ線照射後のウシ血清アルブミンを補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１９Ｄ】γ線照射後のウシ血清アルブミンを補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１９Ｅ】γ線照射後のウシ血清アルブミンを補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図１９Ｆ】γ線照射後のウシ血清アルブミンを補充した凍結乾燥抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対する安定剤の効果を示すグラフである。
【図２０Ａ】アスコルビン酸塩含有または非含有の抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対するγ線の様々な線量の効果を示すグラフである。
【図２０Ｂ】アスコルビン酸塩含有または非含有の抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンに対するγ線の様々な線量の効果を示すグラフである。
【図２１Ａ】γ線４５ｋＧｙに照射されたモノクローナル免疫グロブリンに対するＬ−アスコルビン酸の安定化作用に対する低ｐＨ（４．５）の効果を示すグラフである。
【図２１Ｂ】γ線４５ｋＧｙに照射されたモノクローナル免疫グロブリンに対するＬ−アスコルビン酸の安定化作用に対する低ｐＨ（４．５）の効果を示すグラフである。
【図２２】ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）で汚染された抗インシュリンモノクローナル免疫グロブリンのγ線照射によるウイルスの不活性化レベルを示すグラフである。
【図２３Ａ】電子ビーム線を液体状および凍結乾燥状モノクローナル免疫グロブリンに照射した場合に実現される活性保持レベルに対するアスコルビン酸ナトリウムの存在または非存在の効果を示すグラフである。
【図２３Ｂ】電子ビーム線を液体状および凍結乾燥状モノクローナル免疫グロブリンに照射した場合に実現される活性保持レベルに対するアスコルビン酸ナトリウムの存在または非存在の効果を示すグラフである。
【図１】
2005517631.tif 000007
【図２】
2005517631.tif 000008
【図３Ａ】
2005517631.tif 000009
【図３Ｂ】
2005517631.tif 000010
【図３Ｃ】
2005517631.tif 000011
【図４】
2005517631.tif 000012
【図５】
2005517631.tif 000013
【図６】
2005517631.tif 000014
【図７】
2005517631.tif 000015
【図８】
2005517631.tif 000016
【図９】
2005517631.tif 000017
【図１０】
2005517631.tif 000018
【図１１】
2005517631.tif 000019
【図１２】
2005517631.tif 000020
【図１３】
2005517631.tif 000021
【図１４】
2005517631.tif 000022
【図１５】
2005517631.tif 000023
【図１６Ａ】
2005517631.tif 000024
【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
2005517631.tif 000026
【図１７Ｂ】
2005517631.tif 000027
【図１８Ａ】
2005517631.tif 000028
【図１８Ｂ】
2005517631.tif 000029
【図１８Ｃ】
2005517631.tif 000030
【図１８Ｄ】
2005517631.tif 000031
【図１８Ｅ】
2005517631.tif 000032
【図１８Ｆ】
2005517631.tif 000033
【図１８Ｇ】
2005517631.tif 000034
【図１８Ｈ】
2005517631.tif 000035
【図１９Ａ】
2005517631.tif 000036
【図１９Ｂ】
2005517631.tif 000037
【図１９Ｃ】
2005517631.tif 000038
【図１９Ｄ】
2005517631.tif 000039
【図１９Ｅ】
2005517631.tif 000040
【図１９Ｆ】
2005517631.tif 000041
【図２０Ａ】
2005517631.tif 000042
【図２０Ｂ】
2005517631.tif 000043
【図２１Ａ】
2005517631.tif 000044
【図２１Ｂ】
2005517631.tif 000045
【図２２】
2005517631.tif 000046
【図２３Ａ】
2005517631.tif 000047
【図２３Ｂ】
2005517631.tif 000048
【国際調査報告】
2005517631.tif 000049
2005517631.tif 000050