(57)【要約】【課題】哺乳動物の悪性細胞および形質転換細胞に対する選択的致死性ペプチドを提供する。【解決手段】ヒトｐ５３蛋白質のアミノ酸残基１２−２６のすべてまたは一部に対応するペプチドのカルボキシ末端に膜貫通型リーダー配列を融合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜貫通型リーダー配列に融合し且つ悪性細胞または形質転換細胞に対して選択的致死性である、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６個の隣接するアミノ酸からなることを特徴とするペプチドまたはその類似体もしくは誘導体。
【請求項２】
アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）を含む請求項１記載のペプチドまたはその類似体もしくは誘導体。
【請求項３】
アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）を含む請求項１記載のペプチドまたはその類似体もしくは誘導体。
【請求項４】
アミノ酸配列：ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を含む請求項１記載のペプチドまたはその類似体もしくは誘導体。
【請求項５】
リーダー配列が、ペプチド、その類似体または誘導体のカルボキシル末端に位置する請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、その類似体または誘導体。
【請求項６】
リーダー配列が、ペプチド、その類似体または誘導体のアミノ末端に位置する請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、その類似体または誘導体。
【請求項７】
リーダー配列が主として正電荷のアミノ酸残基を含む請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、その類似体または誘導体。
【請求項８】
リーダー配列が、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、Ａｒｇ８、ＨＩＶ１のＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｒ−ＴＡＴ、ＳＶ４０−ＮＬＳ、ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ、ＨＩＶ  ＲＥＶ、ＦＨＶコート、ＢＭＶ  ＧＡＧ、ＨＴＬＶ−ＩＩ（ＲＥＸ）、ＣＣＭＶ  ＧＡＧ、Ｐ２２Ｎ、ラムダＮ、デルタＮ、酵母ＰＲＰ６、ヒトＵ２ＡＦ、ヒトＣ−ＦＯＳ、ヒトＣ−ＪＵＮ、酵母ＧＣＮ４またはｐ−ｖｅｃの少なくとも１つである、請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、その類似体または誘導体。
【請求項９】
ペネトラチンリーダー配列がアミノ酸配列：ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）を有する請求項８記載のペプチド、その類似体または誘導体。
【請求項１０】
製薬的に許容し得る担体と混合された請求項１〜４に記載の少なくとも一つのペプチドまたはそれらの類似体もしくは誘導体からなる医薬組成物。
【請求項１１】
製薬的に許容し得る担体と混合された請求項５に記載の少なくとも一つのペプチドまたはそれらの類似体もしくは誘導体からなる医薬組成物。
【請求項１２】
製薬的に許容し得る担体と混合された請求項６に記載の少なくとも一つのペプチドまたはそれらの類似体もしくは誘導体からなる医薬組成物。
【請求項１３】
製薬的に許容し得る担体と混合された請求項７に記載の少なくとも一つのペプチドまたはそれらの類似体もしくは誘導体からなる医薬組成物。
【請求項１４】
製薬的に許容し得る担体と混合された請求項８に記載の少なくとも一つのペプチドまたはそれらの類似体もしくは誘導体からなる医薬組成物。
【請求項１５】
製薬的許容し得る担体と混合された請求項９に記載の少なくとも一つのペプチドまたはそれらの類似体もしくは誘導体からなる医薬組成物。
【請求項１６】
アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６個の隣接するアミノ酸をもつ該ペプチドまたはその類似体もしくは誘導体のカルボキシ末端に膜貫通型リーダー配列が融合している、該ペプチドまたはその類似体もしくは誘導体の治療有効量を患者に投与することからなる、患者の悪性細胞または腫瘍細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１７】
請求項２、３または４に記載の少なくとも一つのペプチドまたはその類似体もしくは誘導体のカルボキシ末端に膜貫通型リーダー配列が融合している、治療有効量の該ペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を患者に投与することからなる、患者の悪性細胞または腫瘍細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１８】
請求項７に記載の少なくとも一つのペプチドまたはその類似体もしくは誘導体のカルボキシ末端に膜貫通型リーダー配列が融合している、治療有効量の該ペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を患者に投与することからなる、患者の悪性細胞または腫瘍細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１９】
請求項８に記載の少なくとも一つのペプチドまたはその類似体もしくは誘導体のカルボキシ末端に貫通型リーダー配列が融合している、治療有効量の該ペプチドを患者に投与することからなる、患者の悪性細胞または腫瘍細胞を選択的に殺す方法。
【請求項２０】
請求項９に記載の少なくとも一つのペプチドまたはその類似体もしくは誘導体のカルボキシ末端に膜貫通型リーダー配列が融合している、治療有効量の該ペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を患者に投与することからなる、患者の悪性細胞または腫瘍細胞を選択的に殺す方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍性疾患を治療するための治療様式に関する。さらに具体的には、本発明は、悪性細胞および形質転換細胞を選択的に破壊する合成ペプチド、ならびにそれらに基づく腫瘍性疾患の治療法を含む。
【背景技術】
【０００２】
ｐ５３蛋白質は、細胞周期の生体調節物質である。それは、一部は有糸分裂を誘導する蛋白質の転写を阻害することおよび有糸分裂を阻害する蛋白質の転写を誘導し、アポトーシスを促進することによって、有糸分裂を誘導する多数の腫瘍遺伝子蛋白の腫瘍形成作用を阻害する。ｐ５３蛋白質の不在は、細胞形質転換および悪性疾患と関連する。（非特許文献１）
【非特許文献１】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ  ＆  Ｏｒｅｎ，Ｍ（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０
【０００３】
ｐ５３蛋白質分子は、３９３のアミノ酸から成る。それは、残基９３−３１３から成るＤＮＡ結合ドメイン内のＤＮＡの特異的配列に結合するドメインを含む。この領域の結晶構造は、Ｘ線結晶学によって決定されている。残基３１２−３９３は、ｐ５３蛋白質のホモテトラマーの形成に関わる。残基１−９３は、ｐ５３蛋白質の活性および半減期の調節に関わる。
【０００４】
ｐ５３蛋白質は、もう一つの重要な調節蛋白質、ＭＤＭ−２蛋白質、に結合する。ＭＤＭ−２蛋白質をコードしているＭＤＭ遺伝子は、公知の腫瘍遺伝子である。ＭＤＭ−２蛋白質は、ｐ５３蛋白質と複合体を形成し、その結果、偏在性経路によるｐ５３蛋白質の分解が生じる。ｐ５３蛋白質は、不変であるｐ５３蛋白質の残基１４−２２を含むアミノ酸配列を使用して、ＭＤＭ−２蛋白質に結合する。ｐ５３蛋白質の全ＭＤＭ−２蛋白質結合ドメインは、残基１２−２６にわたる。（非特許文献２）
【非特許文献２】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ  ＆  Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０。
【０００５】
ＭＤＭ−２蛋白質が公知の腫瘍遺伝子の発現産物であることを考えると、ＭＤＭ−２蛋白質が、非常に重要な調節蛋白質であることは、驚くべきことではない。さらに、ＭＤＭ−２蛋白質の過発現または増幅は、ヒト乳腺腫瘍の５０％を含む、ヒト悪性病変の４０〜６０％において認められた。それは、ｐ５３蛋白質とＭＤＭ−２蛋白質との間で複合体が形成された結果的、ｐ５３蛋白質の転写活性が阻害されること、従って、ｐ５３蛋白質の活性化ドメインまたはその中のＤＮＡ結合部位の遮断により、その分子の抗腫瘍作用が生じることを示唆していた。さらに一般的には、これらおよび他の実験的観察は、ｐ５３蛋白質の抗腫瘍作用がｐ５３蛋白質へのＭＤＭ−２蛋白質の結合に干渉することができるペプチドによって強化されうることを示唆していると、解釈されている。実際、多数の研究者が、ＭＤＭ−２／ｐ５３複合体は合理的な創薬のためのターゲットとなりうると提案している。例えば、（非特許文献３）（特許文献１）参照。
【非特許文献３】Ｃｈｉｓｔｉｎｅ  Ｗａｓｙｌｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，“ｐ５３  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅａｔｈ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＭＤＭ２  ｂｙ  ａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＭＤＭ２  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐ５３”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８，１９２１−３４（１９９９）
【特許文献１】米国特許第５，７７０，３７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）のうちの少なくとも約６個の隣接するアミノ酸を含むペプチドまたはその類似体もしくは誘導体であり、膜貫通型リーダー配列（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に融合し、且つ悪性細胞または形質転換細胞に対して選択的致死性であるペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そうしたペプチドの例には、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）またはその類似体もしくは誘導体、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）またはその類似体もしくは誘導体、およびＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）またはその類似体もしくは誘導体が挙げられる。細胞膜を越えて輸送し、悪性細胞または形質転換細胞を選択的に殺すために、上記リーダー配列は、好ましくは、上記ペプチド、その類似体または誘導体のカルボキシル末端に位置する。好ましくは、上記リーダー配列は、主として正電荷のアミノ酸残基を含む。本発明に従って使用することができるリーダー配列の例には、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）、Ａｒｇ８、ＨＩＶ１のＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｒ−ＴＡＴ、ＳＶ４０−ＮＬＳ、ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ−ＮＬＳ）、ＨＩＶ  ＲＥＶ（３４−５０）、ＦＨＶコート（ＦＨＶ  ｃｏａｔ）（３５−４９）、ＢＭＶ  ＧＡＧ（７−２５）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  ＲＥＸ（４−１６）、ＣＣＭＶ  ＧＡＧ（７−２５）、Ｐ２２Ｎ（１４−３０）、ラムダＮ（Ｌａｍｂｄａ  Ｎ）（１−２２）、デルタＮ（Ｄｅｌｔａ  Ｎ）（１２−２９）、酵母ＰＲＰ６（ｙｅａｓｔ  ＰＲＰ６）、ヒトＵ２ＡＦ（ｈｕｍａｎ  Ｕ２ＡＦ）、ヒトＣ−ＦＯＳ（ｈｕｍａｎ  Ｃ−ＦＯＳ）（１３９−１６４）、ヒトＣ−ＪＵＮ（ｈｕｍａｎ  Ｃ−ＪＵＮ）（２５２−２７９）、酵母ＧＣＮ４（ｙｅａｓｔ  ＧＣＮ４）およびｐ−ｖｅｃが挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、上記リーダー配列は、アミノ酸配列ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）を有するアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）蛋白質からのペネトラチン配列である。
【０００８】
製薬的に許容され得る担体と混合された少なくとも一つの対象ペプチドを含む医薬組成物も提供する。加えて、患者の腫瘍性疾患を治療する方法、すなわち、患者の悪性細胞または腫瘍細胞を選択的に殺す方法を提供する。一つの実施形態において、本発明の方法は、アミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６個の隣接するアミノ酸を含むペプチドまたはその類似体もしくは誘導体であり、そのカルボキシ末端において膜貫通型リーダー配列に融合し、且つ悪性細胞または形質転換細胞を選択的に殺すペプチドまたはその類似体もしくは誘導体の治療有効量を患者に投与することを含む。もう一つの実施形態において、本発明の方法は、そのカルボキシ末端に膜貫通型リーダー配列が融合している、配列番号１、配列番号２または配列番号３で示される配列を有する少なくとも一つのペプチドまたはその類似体もしくは誘導体の治療有効量を被験者に投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に従って、悪性細胞および形質転換細胞が、ｐ５３蛋白質内のアミノ酸配列および一本の連続するポリペプチド鎖としてのリーダー配列を含む合成ペプチドの投与により選択的に破壊されることを発見した。作用のメカニズムは、ｐ５３ペプチドがｐ５３蛋白質を全く生産しない形質転換細胞を選択的に殺すので、ＭＤＭ−２蛋白質へのｐ５３細胞の結合には依存しないようである。ｐ５３ペプチドは、正常な細胞を殺すことなく、正常または高レベルのｐ５３蛋白質を発現する悪性細胞および形質転換細胞をまた選択的に殺す。
【００１０】
本発明に従って、ヒトｐ５３のアミノ酸残基１２−２６のすべてまたは一部に対応するペプチドを含む組成物が提供される。この領域は、ｍｄｍ−２蛋白質と接触することが知られており、ｍｄｍ−２と結合するとαへリックス配座をとる。対象ペプチドは、そのカルボキシ末端上で膜貫通型リーダー配列と融合した時、ヒト悪性細胞および形質転換細胞を選択的に殺す。
【００１１】
本発明の第一の側面において、次のアミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）の少なくとも約６個の隣接するアミノ酸を含むペプチドであり、リーダー配列と融合している、少なくとも約６個の隣接するアミノ酸を含むペプチドを提供する。好ましくは、上記ペプチドは、少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸残基を含む。好ましい実施形態において、配列番号１で示される配列のうちの少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸を含むペプチドは、次のアミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号１）を有する。もう一つの好ましい実施形態において、配列番号１で示される配列のうちの少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸を含むペプチドは、次のアミノ酸配列：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号２）を有する。さらにもう一つの好ましい実施形態において、配列番号１で示される配列のうちの少なくとも約８から少なくとも約１５のアミノ酸を含むペプチドは、次のアミノ酸配列：ＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号３）を有する。
【００１２】
本発明のペプチドを細胞に輸送するように機能するリーダー配列は、様々な供給源から誘導することができる。正電荷のリーダー配列は、対象ペプチドのαへリックスを安定させるので、好ましくは、リーダー配列は、主として正電荷のアミノ酸残基を含む。本発明のペプチドと連結させることができるリーダー配列の例は、（非特許文献４）に記載されており、次の膜貫通型リーダー配列が挙げられるが、それらに限定されない（蛋白質のリーダー配列を構成するアミノ酸残基の番号付けは、多くの場合、蛋白質名のすぐ後に挿入する形で示す）：
【非特許文献４】Ｅｕｔａｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２００１），Ａｒｇｉｎｉｎｅ−Ｒｉｃｈ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６；５８３６−５８４０
【００１３】
【化１】
2005520866.tif 000002
【００１４】
他の膜貫通型リーダー配列も使用することができる。そうした配列は、幅広く利用可能であり、例えば、（非特許文献５）および（非特許文献６）に記載されている。
【非特許文献５】Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６０４３−６０４９
【非特許文献６】Ｅｌｍｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６９：２３７−２２４
【００１５】
好ましくは、アンテナペディア蛋白質のペネトラチンリーダー配列の正電荷のリーダー配列を使用する。このリーダー配列は、次のアミノ酸配列を有する：ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）。好ましくは、リーダー配列をＰ５３ペプチドのカルボキシ末端に結合させて、上記合成ペプチドが形質転換細胞および悪性細胞を殺すことができるようにする。
【００１６】
本発明を実施する際、構造的に関連したアミノ酸配列を、配列番号１、２、３または４で示される開示配列の代わりに使用してもよい。配列番号４で示される配列を含む（しかし、これに限定されない）リーダー配列と連結した時の、配列番号１、２または３で示される一切の配列（それらの類似体または誘導体を含む）を、本願明細書では、「合成ペプチド（単数または複数のいずれか）」と呼ぶことにする。これらの合成ペプチドの三次元構造を模倣する剛性分子はペプチド模倣体と呼び、それらも本発明の範囲に包含される。ｐ５３ペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端のいずれかまたは両方においてαヘリックス安定化アミノ酸残基を付加させて、ＭＤＭ−２蛋白質と結合した時のｐ５３蛋白質のこの領域の配座であることが知られているαヘリックス配座を安定させることができる。αヘリックス安定化アミノ酸の例には、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ（特に、そのヘリックスのアミノ末端上のもの）、ＭｅｔおよびＰｈｅが挙げられる。
【００１７】
本発明のペプチドのアミノ酸挿入誘導体には、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合体ならびに一つまたは複数のアミノ酸の配列内挿入体が挙げられる。挿入アミノ酸配列変異体は、一つ以上のアミノ酸残基が、対象ペプチドの所定の部位に導入されているものであるが、得られる産物の適切なスクリーニングで、ランダム挿入も可能である。欠失変異体は、対象ペプチドの配列から一つ以上のアミノ酸を除去することにより作ることができる。置換アミノ酸変異体は、その配列内の少なくとも一つの残基が除去されて、異なる残基がその場所に挿入されているものである。典型的な置換は、下記表１に従って成される：
【００１８】
【表１】
2005520866.tif 000003
【００１９】
合成ペプチドをアミノ酸置換によって誘導する時、そのアミノ酸は、疎水性、親水性、電気陰性、バルキーな副鎖およびこれらに類するものなどの特性が類似している他のアミノ酸によって、一般に、置換される。本願明細書中で用いられる場合、用語「誘導体」、「類似体」、「フラグメント」、「部分」および「同類分子」は、上記誘導体、類似体、フラグメント、部分、または同類分子が、形質転換細胞または腫瘍細胞に侵入され、選択的に殺す能力を維持している限り、アミノ酸の置換、挿入、付加または欠失を有する配列番号１、２、３または４で示されるアミノ酸配列を有する対象ペプチドを指す。
【００２０】
本発明の合成ペプチドは、多数の公知技術によって合成することができる。例えば、本ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄが（非特許文献７）に最初に記載した固相法を使用して調製することができる。他のペプチド合成技術は、（非特許文献８）および当業者が容易に利用できる他の参考文献において見出すことができる。ポリペプチド合成技術の要約は、（非特許文献９）において見出すことができる。ペプチドは、（非特許文献１０）に記載されているような溶液法によって合成することもできる。異なるペプチド合成における使用に適する保護基は、上に挙げたテキストならびに（非特許文献１１）に記載されている。本発明のペプチドは、ｐ５３蛋白質のより大きな部分または完全長のｐ５３蛋白質からの化学的または酵素的分解によって調製することもできる。同様に、本発明の合成ペプチドにおいて使用するためのリーダー配列は、そうしたリーダー配列が誘導される蛋白質のより大きな部分または完全長の蛋白質からの化学的または酵素的分解によって調製することができる。
【非特許文献７】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）
【非特許文献８】Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２ｄ  Ｅｄ．，（１９７６）
【非特許文献９】Ｊ．Ｓｔｕｒａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，（１９８４）
【非特許文献１０】Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ，３ｄ  Ｅｄ．，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐｐ．１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）
【００２１】
加えて、本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ法によって調製することもできる。蛋白質の構築に使用される大部分のアミノ酸は、一つ以上のコーディングヌクレオチドトリプレット（コドン）が、特定のアミノ酸残基をコードすることができる。遺伝子コードのこの特性は、重複性として知られている。従って、多数の異なるヌクレオチド配列が、哺乳動物の悪性細胞または形質転換細胞に対して選択的致死性である特定の対象ペプチドをコードすることができる。本発明は、遺伝子コード、すなわち、本発明のペプチドを酵素的または化学的に分解することができる対象ペプチドまたはキメラペプチドを発現することができる遺伝子コードを規定するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子も考慮している。
【００２２】
培養で成長する細胞に適用するとき、合成ペプチドは悪性細胞または形質転換細胞に対して選択的致死性であり、その結果、細胞数の減少に依存する用量となる。その効果は、２または３時間、長くとも４８時間以内に、一般には観察できる。培養で成長させたラットの膵臓腺房細胞（ＢＭＲＰＡ．４３０）系統を、Ｋ−ｒａｓで形質転換した。正常細胞系統は、膵臓腺房細胞に典型的な構造を示し；形質転換細胞（ＴＵＣ−３）は、腺房細胞の分化形態を欠失しており、これは、典型的な膵臓癌細胞のように見える。配列番号４のリーダー配列に結合している配列番号１の一次構造を有する、用量５０μｇ／ｍＬの合成ペプチドで、ＢＭＲＰＡ．４３０細胞を処理した時、それらの細胞は、影響を受けなかった。しかし、配列番号４のリーダー配列に結合している配列番号１の一次構造を有する、用量１００μｇ／ｍＬのペプチドで、ＴＵＣ−３細胞を処理した時、それらは、３日から４日以内に死んだ。配列番号１を配列番号２または配列番号３に替えて同じ実験を行った時、同様の結果が得られた。加えて、配列番号４のリーダー配列に結合している配列番号１の一次構造を有する、用量１００μｇ／ｍＬの合成ペプチドで処理したヒト乳癌細胞系統ならびに黒色腫およびＨｅＬａ細胞において、形質転換細胞死および悪性細胞死が観察された。対照的に、同じ用量の同じ合成ペプチドが、悪性でないヒト乳癌または線維芽細胞系統および形質転換されていないヒト乳癌または線維芽細胞系統に対しては影響を及ぼさなかった。
【００２３】
配列番号４で示されるリーダー配列が、次のアミノ酸配列：ＭＰＦＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有する対照蛋白質であるＰＮＣ２９のカルボキシ末端に位置した時には、悪性細胞にも、正常細胞にも影響がなかった。
【００２４】
加えて、そのカルボキシ末端において配列番号４で示されるリーダーペプチドに融合している配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を有するペプチドは、成長因子の存在下で造血細胞系統に分化させるヒト幹細胞の能力に対して影響を及ぼさない。これは、このペプチドが、化学療法薬として投与された時、骨髄細胞に対して有害でないであろうことを示している。（非特許文献１２）参照。この開示は、あたかも完全に記載するがごとく、本明細書に参照として取り入れる。
【非特許文献１２】Ｋａｎｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２３，２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（２２）；１２４３８−１２４３３
【００２５】
リーダー配列が結合していない配列番号１の一次構造を有する、用量１００μｇ／ｍＬのペプチドで培養癌細胞を処理した時、それらの細胞は、影響を受けなかった。同様に、この場合好ましいリーダー配列である配列番号４のリーダー配列の同じ用量で培養癌細胞を処理した時も、それらの細胞は影響を受けなかった。これらの結果は、その合成ペプチドのリーダー配列によって、その合成ペプチドが、処理した細胞の細胞膜を越えることができること、およびその合成ペプチドの作用は、必然的に細胞内でのものであることを示唆している。
【００２６】
合成ペプチドが、ｐ５３蛋白質とＭＤＭ−２蛋白質の結合に干渉することにより作用するのかどうかを判定するために、合成ペプチドを、同型接合性欠失によりｐ５３蛋白質を作ることができないようにした形質転換結腸直腸腺癌細胞に対して試験した。驚くべきことに、それらの合成ペプチドは、形質転換細胞を選択的に殺したが、正常細胞には影響を及ぼさなかった。これらの結果は、作用のメカニズムは、ｐ５３ペプチドがｐ５３蛋白質を全く生産しない形質転換細胞を選択的に殺すので、ＭＤＭ−２蛋白質へのｐ５３細胞の結合には依存しないようであることを示している。これらの結果は、ＭＤＭ−２蛋白質に対するｐ５３蛋白質の結合への干渉が、合成ペプチドにより悪性細胞および形質転換細胞の選択的な死がもたらされるというメカニズムではありえないことを示している。本明細書において開示されている合成ペプチド、それらの誘導体、類似体およびペプチド模倣分子は、癌などの腫瘍性疾患の治療に有用であるのだが、形質転換細胞および悪性細胞に対する作用のメカニズムは、分かっていない。
【００２７】
本発明のペプチドは、生体内で腫瘍細胞に対して有効である。例えば、膵臓癌細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３を異物移植し、約３〜６ｍｍの大きさの腫瘍を発現しているマウスは、主題合成ペプチド、例えば、そのカルボキシ末端でリーダー配列に融合している配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を有するペプチド、の投与後、そうした腫瘍のサイズが激烈に低下した。
【００２８】
観察された本発明のペプチドの特性に一致して、対象ペプチドは、動物、優先的にはヒトにおいて、腫瘍細胞または悪性細胞、すなわち癌細胞、を選択的に殺すために使用することができる。それ故、本発明の合成ペプチドは、被験動物またはヒトにおける腫瘍細胞を殺すために有効な量で投与される。
【００２９】
本発明の合成ペプチドは、治療有効量の本発明の合成ペプチドの少なくとも一つを製薬的に許容し得る担体とともに含有する医薬組成物として、好ましくはヒトの患者に投与することができる。用語「治療有効量」または「製薬上有効な量」は、腫瘍細胞または悪性細胞、すなわち癌細胞、を選択的に殺すことを含む成長抑制を個体において生じるために必要な用量を意味する。
【００３０】
好ましくは、本発明の合成ペプチド一つ以上を含有する組成物は、腫瘍細胞を選択的に殺し、その結果、癌などの腫瘍性疾患または悪性疾患を治療するために、静脈内投与される。本発明のペプチドを一つ以上使用して有効に治療することができる別の癌の例には、乳癌、前立腺癌、肺癌、子宮頚癌、大腸癌、黒色腫、膵臓癌およびすべての充実性組織腫瘍（上皮細胞腫瘍）、ならびにリンパ腫および白血病を含む（しかし、これらに限定されない）血液の癌が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３１】
本発明の合成ペプチドの投与は、経口、静脈内、鼻腔内、坐剤、腹腔内、筋肉内、皮内もしくは皮下投与によるもの、または吸入もしくは移植によるものでありうる。そうした方法で投与する時、本発明の合成ペプチドは、担体および／またはアジュバントなどの他の成分と併用することができる。医薬適合性でなければならず、所期の投与について意図した効果を生じなければならず、組成物の有効成分の活性を低下させることがなく、且つ、細胞への主題ペプチドの輸送を妨げることがないことを除き、そうした他の成分の性質に対する制限はない。本ペプチド組成物は、好ましくは液体または半液体形で、経皮パッチに含浸させてもよいし、または皮下挿入物に入れてもよく、このパッチまたは挿入体が、治療に有効な量の一つ以上の対象合成ペプチドを限時放出する。
【００３２】
注射に適する剤形には、無菌水溶液または無菌水性分散液、および無菌注射用溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。すべての場合、最終的な溶液の形は、無菌であり、流動性でなければならない。典型的な担体には、例えば、緩衝水溶液（すなわち、生体適合性緩衝液）、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、それらの適する混合物、界面活性剤または植物油を含有する溶媒または分散媒体が挙げられる。滅菌は、濾過または抗菌剤もしくは抗真菌剤の添加を含む（しかし、これらに限定されない）当該技術分野において認知されているあらゆる技術を利用して達成することができる。そうした薬剤の例には、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールが挙げられる。糖または塩化ナトリウムなどの等張剤も主題組成物に組み込むことができる。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、「製薬的に許容し得る担体」には、いずれかの、また、すべての溶媒、分散媒体、コーチング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤およびこれらに類するものが挙げられる。そうした媒体および薬剤の使用は、当該技術分野ではよく知られている。
【００３４】
主題合成ペプチドを含有する無菌注射用溶液の生成は、適する溶媒中の必要な量の上に記載した主題合成ペプチド一つ以上を、上に挙げた様々な成分一つ以上と配合し、その後、滅菌、好ましくはフィルター滅菌することにより、達成される。無菌粉末を得るために、必要ならば上記溶液を真空乾燥または凍結乾燥する。
【００３５】
不活性希釈剤および／または同化可能な食用担体およびこれらに類するものは、本ペプチドを経口投与する時、医薬組成物の一部となりうる。そうした医薬組成物は、硬質または軟質殻ゼラチンカプセルであってもよく、錠剤に圧縮されていてもよく、またはエリキシル、懸濁液、シロップなどであってもよい。
【００３６】
従って、主題合成ペプチドは、適便、且つ、有効に投与するために、治療に有効な用量の適する医薬適合性の担体と、製薬上有効な量で配合される。製薬上有効な量の例には、少なくとも約２５ｕｇ／ｍＬから少なくとも約３００ｕｇ／ｍＬの範囲のペプチド濃度が挙げられる。
【００３７】
本発明の方法をヒトに適用する際に使用される合成ペプチドの治療に有効な正確な量は、腫瘍の期の変動、腫瘍のサイズおよび攻撃性、転移の存在または程度などに起因して述べることができる。加えて、個人の体重、性別、および総合的な健康を考慮せねばならず、それらは、用量に影響するだろう。しかし、本発明の合成ペプチドは、用量あたり少なくとも約１０ｍｇの量で、さらに好ましくは用量あたり約１０００ｍｇ以下の用量で投与されると、一般には述べることができる。本発明のペプチド組成物は、最終的には血流から無くなるので、本医薬組成物の再投与が、必要であり、好ましい。
【００３８】
本発明の合成ペプチドは、その投薬調合物に合った方法で、且つ、治療に有効であるような量で投与することができる。全身性投薬量は、患者の年齢、体重および状態ならびに投与形路に依存する。成人への投与に適する用量の具体例は、体重１キログラムあたり約０．１から約２０ｍｇの範囲である。好ましくは、その用量は、体重１キログラムあたり約０．１から約１０ｍｇである。
【００３９】
本発明に従って、腫瘍性疾患の治療法も提供する。この方法は、治療有効量の上に記載した合成ペプチド（その類似体および類似体を含む）を、そうした治療が必要な患者に投与することを含む。従って、例えば、一つの実施形態において、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合している、配列番号１で示されるような少なくとも約６つの隣接するアミノ酸を含む有効な量のペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を、患者者に投与することができる。もう一つの実施形態において、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合している、配列番号１で示されるような少なくとも約８から少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含む有効な量のペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を、患者に投与することができる。例えば、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合している、配列番号１で示されるようなアミノ酸配列を有する有効な量のペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を、患者に投与することができる。そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合している、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列を有する有効な量のペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を、患者に投与することもできる。さらにもう一つの実施形態において、そのカルボキシ末端においてリーダー配列と融合している、配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を有する有効な量のペプチドまたはその類似体もしくは誘導体を、患者に投与することができる。治療の方法によっては、合成ペプチドの混合物を投与することができる。従って、例えば、有効な量で、上に記載したペプチドまたはそれらの類似体もしくは誘導体のうちの一つを投与することに加えて、二つ以上の上に記載したペプチドまたはそれらの類似体もしくは誘導体を被験者に投与することができる。
【００４０】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するものであり、本発明の範囲を制限する意味は持たない。
【実施例１】
【００４１】
以下の実験は、アミノ末端に結合しているリーダー配列を有する対象ペプチドの有効性と比較して行った。上に記載したように、カルボキシル末端にリーダー配列を有する、合成したペプチドは、ＭＤＭ−２に結合した時のこのペプチドのｐ５３部分の活性配座であるαヘリックスの形成をこのペプチドにおいて促進した。上に記載したように、配列番号１、２および３で示されるようなアミノ酸配列を有する対象ペプチドは、同型接合的にｐ５３遺伝子が欠失されたものを含む多種多様なヒト癌細胞に対して強い毒性である。配列番号１〜３で示される配列を有する各ペプチドについてのαヘリックス確度プロフィールは、一方は、蛋白質データベースからのヘリクス確率（ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ）を使用する（非特許文献１３）、他方は、へリックス核形成（σ）および成長（ｓ）に基づくイジング模型を使用する、二つの異なる方法を使用して行い、平衡定数は、２０の天然Ｌアミノ酸の各々についてのブロックコポリマーから実験により決定し、（非特許文献１４）および（非特許文献１５）に記載されているように、これらのパラメータに対する変化の影響を含めることにより修正した。確率プロフィールは、もしリーダー配列がアミノ末端上にあるならば、たとえペプチドが細胞膜を未だ横断するとしても、α−ヘリックス含量はずっと低いことを示す。
【非特許文献１３】Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４：８４６−８５６）
【非特許文献１４】Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２６：３５１−３７２
【非特許文献１５】Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２６：３７３−３９３
【００４２】
配列番号３で示される配列を有するペプチドを、そのアミノ末端に結合させるリーダー配列を用いて固相合成により合成した。このペプチドは、下の表２の中でＰＮＣ２８’と標識されているものである。このＰＮＣ２８’を三つの異なる濃度、すなわち、２５、５０および１００μｇ／ｍＬで、形質転換膵臓癌（ＴＵＣ−３）細胞とともにインキュベートした。二週間のインキュベーションの後、ペプチドの最も高い用量では、細胞死がなく、また、細胞の約半分に腺房の形成が見られ、且つ、形質転換されていない形態学的表現型を示した。同じ現象が、５０μｇ／ｍＬで観察され、２５μｇ／ｍＬでは、有意に少ない細胞に復帰変異が見られた。対照的に、リーダー配列がペプチドのカルボキシ末端に結合している時（表２中のＰＮＣ２８）、５０および１００μｇ／ｍＬの用量では、約４日で１００％の細胞死が発生した。
【００４３】
これらの結果は、リーダー配列が、ｐ５３ペプチドのＭＤＭ−２蛋白質のカルボキシル末端に優先的に付加して、そのペプチドが細胞膜を越え、悪性細胞を特異的に殺すことを可能にすることを示している。表２におけるリーダー配列は、ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号４）である。
【００４４】
【表２】
2005520866.tif 000004
【００４５】
これらの結果は、対象ペプチドの独自性、すなわち、正電荷の残基のリーダーまたはクラスターが、癌細胞毒性のためのあらゆるエフェクターペプチドのカルボキシ末端に位置しなければならないことを示している。
【実施例２】
【００４６】
体重２０〜２２ｇのＮＵ／ＮＵマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ｎ＝１０）の左後脚領域に、生膵臓癌細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（細胞数１×１０６／マウス）を皮下異物移植した。腫瘍を発生させ、成長させた。毎日の実験を通して、すべてのマウスが、非常に類似した成長率で腫瘍を発現したことが観察された。
【００４７】
１２日後、腫瘍は、直径３から６ｍｍのサイズに達した。マウスを５匹ずつの２グループに分けた。各グループにＡｌｚｅｔ（登録商標）浸透圧ポンプを皮下移植して、濃度２０ｍｇ／マウスで、それぞれのペプチドを含有する０．０９５ｍＬ量の規定生理食塩水の全量を、定義された１４日間かけて、一定速度で送達した。一方のグループのマウスには、そのカルボキシ末端でペネトラチンリーダー配列（配列番号４）に融合しているＰＮＣ−２８（配列番号３で示されるアミノ酸を有するペプチド）を与え、他方のグループのマウスには、次のアミノ酸配列：ＭＰＲＳＴＧＫＲＩＭＬＧＥ（配列番号２５）を有する類似サイズの対照ペプチドであるＰＮＣ−２９を与えた。無菌条件下、製造業者のガイドラインに従って上記ポンプを満たした。そのポンプを、小さなポンプを挿入するポケットをマウスの皮膚の下に作ることにより、麻酔したマウスの左側腹部に皮下移植した。簡単な縫合で各ポケットを閉じた。それらのポンプは、内部チャンバから各マウスに、０．２５μＬ／時を継続的に送達した。動物用施設の隔離病棟に戻して、手術から回復するまでそれらのマウスを観察した。これらの動物は、Ｎｕ／Ｎｕマウスであり、従って、免疫無防備状態であったので、病原体にさらすと非常に影響されやすい。従って、手術ならびにすべての手術前および後の処理は、無菌フードの環境下で行った。
【００４８】
図１に明らかに示されているように、４８から７２時間以内のマウスへのＰＮＣ−２８の送達は、腫瘍成長を有効に停止させる。対照的に、対照ペプチドＰＮＣ−２９は、正常な細胞にも、腫瘍細胞にも、全く影響を及ぼさなかった。ＰＮＣ２９で治療したマウスにおいて、一定速度で成長する腫瘍は、結果的に、２週間の治療期間、およびポンプが停止してそれ以上ペプチド溶液を放出しない追従期間をかけて、直径１０から１６ｍｍの腫瘍になった。
【００４９】
両グループのマウスにおける腫瘍サイズの測定値の統計的解析によって、それらの間にｐ＜０．００１の有意性が生じた。
【実施例３】
【００５０】
実施例ＩＩと同じ方法論を使用して、生膵臓癌細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（細胞数１×１０６／マウス）をマウス（ｎ＝１０）に異物移植すると同時にポンプを始動させた。五匹のマウスには、ＰＮＣ２８を投与し、５匹のマウスは、全く治療しなかった（偽治療）。結果を下の表にする。
【００５１】
【表３】
2005520866.tif 000005
【実施例４】
【００５２】
実施例ＩＩと同じ方法論を使用して、生膵臓癌細胞ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ−３（細胞数１×１０６／マウス）を五匹のマウスの腹腔に移植した。腫瘍細胞の移植と同時に、ポンプを右肩領域に配置した。五匹すべてのマウスにおいて、三週間後、目に見える腫瘍はなかった。
【００５３】
上記明細書およびその中で報告した実験結果は、説明のためのものであり、本出願人の発明の範囲を制限するものではない。本出願人の発明から逸脱することなく、様々な変更を施すことができることは、当業者にはご理解いただけよう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】膵臓癌細胞を異種移植した同型接合ＮＵ／ＮＵマウスにおけるＰＮＣ−２８（そのカルボキシ末端において配列番号４に融合している配列番号３）の生体内腫瘍抑制効果を示すグラフである。星の矢印は、腫瘍成長期間中の１３（正確には１３．５）日目に皮下ポンプ移植をした時を示す。
【図１】
2005520866.tif 000006
【国際調査報告】
2005520866.tif 000007