(57)【要約】腸の薬剤吸収を増進するための組成物及び方法。本製剤は、薬剤と生体接着性化合物を含んでなる第１集団の担体粒子及び浸透増進剤を含んでなる第２集団の担体粒子を含んでなる。この生体接着剤は、薬剤の保持時間を延ばし、そしてその生体接着剤によって透過性にされた腸粘膜の部分からのその吸収能力を高める。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性な高分子を粘膜表面に送逹するための製剤で
あって：
（ａ）前記薬剤と生体接着性化合物とを含んでなる第１集団の担体粒子；及び
（ｂ）浸透増進剤を含んでなる第２集団の担体粒子
を含んでなる製剤。
【請求項２】
請求項１の製剤であって、前記薬剤が、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチドホルモン、抗生物質、抗菌剤、血管収縮薬、心臓血管薬、血管拡張薬、酵素、骨代謝制御剤、ステロイドホルモン、抗高血圧剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、去痰薬、化学療法剤、鎮静剤、抗鬱薬、β遮断薬、鎮痛薬、及びアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤からなる群から選択される製剤。
【請求項３】
請求項２の製剤であって、前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである製剤。
【請求項４】
請求項２の製剤であって、該浸透増進剤が、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、及び非キレート非表面活性剤からなる群から選択される製剤。
【請求項５】
請求項４の製剤であって、前記脂肪酸が、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル・１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、及び薬学的に許容できるそれらの塩からなる群から選択される製剤。
【請求項６】
請求項４の製剤であって、前記胆汁酸が、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ナトリウム・タウロ−２４，２５−ジヒドロフシデート、ナトリウム・グリコジヒドロフシデート、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及び薬学的に許容できるそれらの塩からなる群から選択される製剤。
【請求項７】
請求項４の製剤であって、前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチレート、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレト−９、βジケトンのＮ−アミノアシル誘導体、及びそれらの混合物からなる群から選択される製剤。
【請求項８】
請求項４の製剤であって、前記非キレート非表面活性剤が、不飽和環状尿素、１−アルキルアルカノン、１−アルケニルアザシクロアルカノン、ステロイド系抗炎症剤、及びそれらの混合物からなる群から選択される製剤。
【請求項９】
請求項１の製剤であって、前記製剤が、カプセル剤、錠剤、圧縮コーテッド錠剤又は２層錠剤である製剤。
【請求項１０】
請求項１の製剤であって、前記生体接着剤が、ポリアクリルポリマー、ポリ（アクリル酸）、トラガカント、セルロース、ポリエチレンオキシドセルロース誘導体、カルヤガム、スターチ、ゼラチン、ペクチン、ラテックス、キトサン、アルギン酸ナトリウム、ポリ無水物、及びレセプター結合性ペプチドからなる群から選択される製剤。
【請求項１１】
請求項１の製剤であって、前記セルロース誘導体が、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、及びナトリウム・カルボキシメチルセルロース（ＮａＣＭＣ）からなる群から選択される製剤。
【請求項１２】
請求項１の製剤であって、前記第１集団の担体粒子及び／又は前記第２集団の担体粒子が、更にラブリカントを含んでなる製剤。
【請求項１３】
請求項１の製剤であって、前記第１集団の担体粒子及び／又は前記第２集団の担体粒子が、腸溶性コーティングされている製剤。
【請求項１４】
請求項１の製剤であって、前記担体粒子が経口剤形の中に取り込まれている製剤。
【請求項１５】
請求項１４の製剤であって、前記経口剤形が、錠剤、カプセル剤、及びゲルキャップ剤からなる群から選択される製剤。
【請求項１６】
請求項１の製剤であって、前記生物活性な高分子が約１，０００を越える分子量を有する製剤。
【請求項１７】
請求項１の製剤であって、前記担体粒子が、鼻内、経肺、膣内、及び直腸内投与に適する剤形の中に取り込まれている製剤。
【請求項１８】
生物活性な高分子の哺乳動物における粘膜吸収を増進させる方法であって、前記哺乳動物に請求項１の製剤を粘膜投与することを含んでなる方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法であって、前記哺乳動物がヒトである方法。
【請求項２０】
請求項１８の方法であって、前記第１集団の担体粒子及び前記第２集団の担体粒子が別々に投与される方法。
【請求項２１】
請求項１８の方法であって、前記第１集団の担体粒子及び前記第２集団の担体粒子が単一剤形で投与される方法。
【請求項２２】
請求項１８の方法であって、前記生物活性な高分子が、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、ペプチドホルモン、抗生物質、抗菌剤、血管収縮薬、心臓血管薬、血管拡張薬、酵素、骨代謝制御剤、ステロイドホルモン、抗高血圧剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、去痰薬、化学療法剤、鎮静剤、抗鬱薬、β遮断薬、鎮痛薬、及びアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤からなる群から選択される方法。
【請求項２３】
請求項１８の方法であって、前記浸透増進剤が、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、及び非キレート非表面活性剤からなる群から選択される方法。
【請求項２４】
請求項１８の方法であって、前記生体接着剤が、ポリアクリルポリマー、ポリ（アクリル酸）、トラガカント、セルロース、ポリエチレンオキシドセルロース誘導体、カルヤガム、スターチ、ゼラチン、ペクチン、ラテックス、キトサン、アルギン酸ナトリウム、ポリ無水物、及びレセプター結合性ペプチドからなる群から選択される方法。
【請求項２５】
請求項２２の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、薬剤、特にオリゴヌクレオチドの粘膜吸収性を増進させる組成物及び方法に関する。より特定すると、本発明は、増進された粘膜送逹のための医薬製剤であって、薬剤、生体接着性化合物、及び、粘膜、好ましくは腸管粘膜の領域にわたってその薬剤の吸収能力を最大にするための浸透増進剤を含んでなる製剤に関し、その粘膜はその浸透増進剤によって透過性にされる。
【発明の背景】
【０００２】
バイオテクノロジーの分野の進歩は、従来は処置が難しかった癌、遺伝子疾患、関節炎及びＡＩＤＳのような疾患の処置に有意な進歩をもたらしている。多くのそのような進歩は、対象、特にヒト対象にオリゴヌクレオチド及び他の核酸の投与を包含する。腸管外経路を介するそのような分子の投与は、疾患及び／又は障害の処置のために有効であることが示されてきた。例えば、哺乳動物の眼の硝子体液へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの直接投与のための手段として硝子体内注射を開示している Draper et al., １９９７年１月２１日発行の米国特許第 5,595,978号を参照のこと。Robertson, Nature Biotechnology, 1997, 15, 209 及び Genetic Engineering News, 1997, 15, 1 も参照のこと。これら各々は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの静脈内灌流を介するクローン病の処置を議論している。
【０００３】
オリゴヌクレオチド及び他の核酸を包含する薬剤の経口投与は、簡単で容易で傷を付けない投与の可能性を、無菌操作及びそれに付随する費用、例えば、入院費及び／又は医師に支払う出費を必要としないで与える。しかしながら、経口投与された薬剤の吸収性は、しばしば乏しいものである。経口投与された薬剤の吸収性を増進させるための１つのアプローチは、遅延放出コーティングの使用によって単一製剤から複数用量の薬剤が放出されるパルス放出製剤である（米国特許第 5,508,040, 6,117,450, 5,840,329, 5,814,336 及び 5,686,105 号；これらの全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００４】
浸透増進剤は、粘膜表面、特に腸管粘膜を通過するオリゴヌクレオチド及び他の薬剤の吸収を促進する。それらの作用の具体的なメカニズムは未知であるが、浸透増進剤は、同時に又はその後に投与される薬剤に対して胃腸管粘膜をより透過性にすることが知られている。事実、そのような薬剤は、選択された浸透増進剤を徐々にしみ込ませた後１時間までは殆ど同等の吸収速度で投与されることができる。しかし、浸透増進剤の存在下で吸収される薬剤の量は常に満足できる訳ではない。
【０００５】
かくして、薬剤、特にオリゴヌクレオチドの、経口、鼻内、経肺、膣内及び直腸内を包含する投与経路によって粘膜表面を通る吸収及びバイオアベイラビリティを増進させるための組成物及び方法を提供する必要性が存在している。
【発明の要旨】
【０００６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤の粘膜送逹の利点の故に、本発明の組成物及び方法は、本明細書でより詳細に説明されるように、治療方法に使用されることができる。本明細書に提供される組成物及び方法は、動物発育に必須のものを包含する、動物における種々のタンパク質及び遺伝子の機能を検査するためにも使用されることができる。この発明の方法は、例えば、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患、又は過度の細胞増殖のような、経口医薬活性化合物で処置可能なあらゆる疾患を患うことが知られている動物の処置に使用されることができる。
【０００７】
本発明の１つの態様は、薬剤の増進された腸管吸収のための経口製剤であって：（ａ）該薬剤と生体接着性化合物とを含んでなる第１集団の担体粒子；及び（ｂ）浸透増進剤を含んでなる第２集団の担体粒子を含んでなる経口製剤である。この好ましい態様の１つの側面では、その薬剤は、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、ペプチドホルモン、抗生物質、抗菌剤、血管収縮薬、心臓血管薬、血管拡張薬、酵素、骨代謝制御剤、ステロイドホルモン、抗高血圧剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、去痰薬、化学療法剤、鎮静剤、抗鬱薬、β遮断薬、鎮痛薬又はアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤である。オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドであるのが有利である。好ましくは、浸透増進剤は、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、非キレート非表面活性剤又は短鎖ホスファチド（Ｃ４〜Ｃ１２）である。この好ましい態様の１つの側面では、脂肪酸は、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル・１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、又は薬学的に許容できるそれらの塩がである。この好ましい態様の別の側面では、胆汁酸は、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ナトリウム・タウロ−２４，２５−ジヒドロフシデート、ナトリウム・グリコジヒドロフシデート、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル又は薬学的に許容できるそれらの塩である。キレート剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチレート、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレト−９ (laureth-9) 、βジケトンのＮ−アミノアシル誘導体又はそれらの混合物からなる群から選択されるのが有利である。好ましくは、非キレート非表面活性剤は、不飽和環状尿素、１−アルキルアルカノン、１−アルケニルアザシクロアルカノン、ステロイド系抗炎症剤又はそれらの混合物からなる群から選択される。この好ましい態様の別の側面では、本製剤は、カプセル剤、錠剤、圧縮コーテッド錠剤又は２層錠剤である。生体接着剤は、ポリアクリルポリマー、ポリ（アクリル酸）、トラガカント、セルロース、ポリエチレンオキシドセルロース誘導体、カルヤガム (karya gum)、スターチ、ゼラチン、ペクチン、ラテックス、キトサン、アルギン酸ナトリウム又はレセプター結合性ペプチドであるのが有利である。好ましくは、セルロース誘導体は、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）又はナトリウム・カルボキシメチルセルロース（ＮａＣＰＣ）である。この好ましい態様の１つの側面では、第１集団の担体粒子及び／又は第２集団の担体粒子は、更にラブリカントを含んでなる。第１及び／又は第２集団の担体粒子は、���溶性コーティングされているのが有利である。好ましくは、担体粒子は、経口剤形中に取り込まれる。この好ましい態様の１つの側面では、経口剤形は、錠剤、カプセル剤又はゲルキャップ剤 (gel cap) である。
【０００８】
本発明は、動物において薬剤の吸収を増進させるための方法であって、該動物に上記の製剤を投与することを含んでなる方法も提供する。好ましくは、動物は哺乳動物である。より好ましくは、哺乳動物はヒトである。第１及び第２集団の担体粒子は、別々に投与されるのが有利である。また、第１及び第２集団の担体粒子は、単一剤形で投与されてもよい。好ましくは、薬剤は、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、モノクローナル抗体、ペプチドホスモン、抗生物質、抗菌剤、血管収縮薬、心臓血管薬、血管拡張薬、酵素、骨代謝制御剤、ステロイドホルモン、抗高血圧剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、去痰薬、化学療法剤、鎮静剤、抗鬱薬、β遮断薬、鎮痛薬又はアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤である。浸透増進剤は、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、又はキレート非表面活性剤であるのが有利である。好ましくは、生体接着剤は、ポリアクリルポリマー、ポリ（アクリル酸）、トラガカント、セルロース、ポリエチレンオキシドセルロース誘導体、カルヤガム、スターチ、ゼラチンペクチン、ラテックス、キトサン、アルギン酸ナトリウム又はレセプター結合性ペプチドである。この好ましい態様の１つの側面では、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
本発明は、生物活性物質の増進された粘膜吸収、特に腸管吸収をもたらす経口医薬組成物を提供する。特に、本発明は、薬剤、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド及び他の核酸の腸管吸収性を増進させる組成物及び方法を提供することにより、静脈内及び他の非経口経路の投与に付随し得る厄介さと出費を回避する。この増進は、担体粒子の少なくとも２つの集団を封入することによって得られる。第１集団の担体粒子は、生物活性物質（薬剤）と１又はそれを越える生体接着剤を含んでなり、そして、第２集団の（任意に追加的な）担体粒子は、浸透増進剤を含んでなる。
【００１０】
生物活性物質の増進されたバイオアベイラビリティは、本発明の組成物及び方法の粘膜投与を介して達成される。“粘膜”という用語は、口内、腸管内、鼻内、肺内、直腸内、及び膣内を包含するあらゆる粘膜表面のことを言う。“バイオアベイラビリティ”という用語は、動物内に薬剤を導入するために非腸管外様式の投与が使用されたときに、投与された薬剤のどれくらいが循環系に到達したかの測定値のことを言う。この用語は、たとえ薬剤の究極作用部位が細胞内であっても、達成された血中濃度に関係するその薬剤の効力について使用される（van Berge-Henegouwen et al., Gastroenterol., 1977, 73, 300）。伝統的に、バイオアベイラビリティ研究では、経口投与後の薬剤の末梢血中レベルの変化を測定することによってその薬剤の腸管吸収の程度が決定される（DiSanto, Chapter 76 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, pages 1451-1458）。その曲線下の面積（ＡＵＣo）が、静脈内（i.v.）投与後の曲線下の面積（ＡＵＣｉｖ）によって除され、その商が吸収された薬剤の画分を計算するために使用される。しかしながら、このアプローチは、大きな“第１パスクリアランス”を有する化合物、即ち、肝臓取り込みが急速であるために吸収された物質の一部分だけが末梢血に入る化合物では使用されることができない。そのような化合物については、絶対的なバイオアベイラビリティを決定するのに他の方法が使用されなければならない（van Berge-Henegouwen et al., Gastroenterol., 1977, 73, 300）。オリゴヌクレオチドに関して、それらは、i.v.投与後に血漿から急速に排除されて、主として肝臓及び腎臓に蓄積する（Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177）。
【００１１】
経口投与された薬剤に適用される別の“第１パス効果”は、胃酸及び種々の消化酵素の作用に起因する分解である。更に、多くの高分子量活性物質（例えば、ペプチド、タンパク質及びオリゴヌクレオチド）及び幾つかの慣用的な及び／又は低分子量の薬剤（例えば、インスリン、バソプレッシン、ロイシン、エンケファリン等）が粘膜経路（例えば、経口、経肺、舌下、直腸内、経皮、膣内及び眼内）で血流へ入るのは、上皮細胞通過性の乏しさ及び輸送中に併行する代謝によって頻繁に妨害される。このタイプの分解的代謝が、オリゴヌクレオチド及び核酸について知られている。例えば、ホスホジエステラーゼが、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル連結、並びに合成オリゴヌクレオチド及び核酸中に存在する多くの他の修飾された連結を開裂することが知られている。
【００１２】
第１パスクリアランス効果を改善する１つの手段は、投与される薬剤の量を増やすことによって、第１パスクリアランスへの薬剤損失の割合を補償することである。これは、例えば、動物により多くの薬剤を単に提供するだけで、i.v.投与で容易に達成し得るが、他の要因が、非腸管外手段を介して投与される薬剤のバイオアベイラビリティに影響を与える。例えば、薬剤は、消化管若しくは血流内で酵素的若しくは化学的に分解されたり、及び／又は種々の粘膜に対し非透過性若しくは半透過性であったりし得る。
【００１３】
本発明の生体接着性経口医薬製剤は、担体粒子の少なくとも２の集団を含んでなる。第１集団の担体粒子は、生物活性物質（薬剤）と１又はそれを越える生体接着性化合物とを含んでなり、そして、第２集団の（任意に追加的な）担体粒子は、吸収増進剤としても知られる１又はそれを越える浸透増進剤を含んでなる。これらは、粘膜表面及び他の上皮細胞膜、特に腸粘膜、を通る生物活性物質の輸送を促進する物質である。薬剤を生体接着性化合物と配合することによって、その薬剤はある程度の接着性を獲得してその滞留時間が延び、結果として、浸透増進剤によって透過性にされた粘膜領域での吸収性を獲得する。生物活性高分子、特に１，０００ｋＤ又はそれ以上の分子量を有する生物活性高分子のバイオアベイラビリティは、粘膜を介する投与、特に経口投与を介して非常に制限を受ける。当業者は、（消化管内での滞留時間を増やすための）生体接着特性の効果と（粘膜壁を透過させるための）浸透増進剤の使用とを組み合わせることによって、より高いバイオアベイラビリティが得られることが分かるであろう。
【００１４】
第１及び第２集団の担体粒子は、別々に配合されても、好ましくは同じ医薬製剤中に取り込まれてもよい。好ましい態様では、薬剤及び生体接着性化合物は、錠剤又は多粒子製剤（例えば、ミクロ粒子、ミニ粒子、ミニ錠剤）に配合される。好ましい態様では、浸透増進剤は、錠剤、多粒子剤、乳剤、マイクロエマルジョン、又は自己乳化系に配合される。次いで、それら２つのタイプの担体粒子は、別々に、又は相手の接着特性又は放出特性を害さないやり方で、一緒に、錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ剤、浣腸剤、ネブライザー、鼻内スプレー、坐剤等のような粘膜投与製剤に配合される。好ましい態様では、本経口投与製剤は、いずれかの製剤が胃内で放出されないよう、腸溶性コーティングされる。腸内で解離すると、浸透増進剤が放出されてその腸に降りると同時にその粘膜上に作用する。同時進行的に、薬剤−生体接着性成分がその粘膜に接着し、浸透増進剤で活性化された粘膜に直接に、及びそこからも薬剤が吸収されるところの内腔液内に薬剤を放出する。こうして、薬剤の到達前に組織が活性化され、その薬剤が活性化された組織の最大面積を通って通過する。これは、浸透増進剤に先んじて薬剤が通過する可能性、引いては、薬剤が吸収されてはならない未活性化組織からの通過の可能性を最小にする。
【００１５】
生物活性物質は、in vitro 及び／又は in vivo で生物学的効果を発揮するあらゆる分子又は分子の混合物又は複合体のことを言い、医薬品、薬剤、ペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体、ビタミン、ステロイド、サイトカイン、成長因子、ポリアニオン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等が含まれる。好ましい態様では、生物活性物質は、約１０００、２５００又は５０００より大きな分子量を有する。特に好ましい態様では、生物活性物質は１，０００より大きな分子量を有する。というのは、これら分子量を有する分子は、それより低い分子量を有するものよりも粘膜経路を介して送逹され難いからである。
【００１６】
薬剤とは、動物、特にヒトにおける疾患の予防、診断、軽癒、処置、又は治癒に使用される治療剤又は予防剤のことを言う。治療的に有用なオリゴヌクレオチド及びポリペプチドは、薬剤についてのこの定義の範囲内である。
【００１７】
浸透増進剤には、表面活性剤、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、及び非キレート非表面活性剤のような分子クラスのメンバーである（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92）。担体は、生物学的に利用可能な薬剤のレベルの減少をもたらすプロセスに干渉するために、本発明の組成物中に含まれることができる不活性分子である。
【００１８】
本発明に関連し、表面活性剤とは、水溶液中に溶解させたときにその溶液の表面張力又はその水溶液とある液体の間の界面張力を少なくする結果、消化管粘膜及び他の上皮膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収を増進する化学的存在物である。胆汁酸及び脂肪酸に加えて、表面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）；及びＦＣ−４３のようなペルフルオロケミカルエマルジョン（Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252）が含まれる。
【００１９】
浸透増進剤として作用する脂肪酸及びそれらの誘導体は、本発明の組成物中に使用されることができ、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル・１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン及びそれらのモノ及びジグリセリド、及び／又は薬学的に許容できるそれらの塩（即ち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリシチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノレン酸塩等）が含まれる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651）。
【００２０】
種々の胆汁酸も、薬剤の取り込みとバイオアベイラビリティを促進するために浸透増進剤として機能する。胆汁酸の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミン類の分散と吸収の促進が含まれる（Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, NY, 1996, pages 934-935）。種々の天然の胆汁酸塩及びそれらの合成誘導体は、浸透増進剤として作用する。かくして、“胆汁酸塩”という用語には、胆汁酸の天然成分並びにそれらのあらゆる合成誘導体が含まれる。本発明の胆汁酸塩には、例えば、コール酸（又は薬学的に許容できるそのナトリウム塩、即ち、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ，ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579）。
【００２１】
特定の態様では、本発明で有用な浸透増進剤は浸透増進性化合物の混合物である。例えば、特に好ましい浸透増進剤は、ＵＤＣＡ（及び／又はＣＤＣＡ）とカプリン酸及び／又はラウリン酸又はそれらの塩、例えばナトリウム塩、との混合物である。そのような混合物は、生物活性物質の粘膜を通過する送逹、特に腸管粘膜を通過する送逹を増進するのに有用である。好ましい浸透増進剤混合物は、約５〜９５％の胆汁酸又はその塩であるＵＤＣＡ及び／又はＣＤＣＡと５〜９５％のカプリン酸及び／又はラウリン酸とを含んでなる。特に好ましいのは、ＵＤＣＡ、カプリン酸及びラウリン酸のナトリウム塩の約１：２：２の比率の混合物である。
【００２２】
本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンと複合体を形成することによって溶液からそれを除く化合物であって、その結果、消化管及び他の粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収を増進する化合物であると定義できる。本発明における浸透増進剤としてのそれらの使用に関して、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても役立つという追加の利点を有する。というのは、殆どの特性決定されたＤＮＡヌクレアーゼは触媒のために二価金属イオンを必要とするためにキレート剤によって阻害されるからである（Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315）。本発明のキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９（laureth-9）及びβ−ジケトン類のＮ−アミノアシル誘導体（エナミン類）（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43）が含まれるが、それらに限定されない。
【００２３】
本明細書で使用される“非キレート非表面活性剤”浸透増進剤は、キレート剤としても表面活性剤としても不十分な活性しか示さないにも拘らず、消化管及び他の粘膜からのオリゴヌクレオチドの吸収を増進させる化合物として定義できる（Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1）。このクラスの浸透増進剤には、不飽和環状尿素、１−アルキル及び１−アルケニルアザシクロアルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92）；及び、ジクロフェナック・ナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンのようなステロイド系抗炎症剤が含まれるが、それらに限定されない（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621）。
【００２４】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込みを増進させる物質が、本発明の医薬組成物及び他の組成物に加えられてもよい。例えば、リポフェクチンのようなカチオン性脂質（Junichi et al, 米国特許第 5,705,188号）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリシンのような多カチオン性分子（Lollo et al., WO 97/30731）が使用されてもよい。
【００２５】
担体粒子の集団がその中に取り込まれる本経口医薬製剤は、例えば、カプセル剤、錠剤、圧縮コーテッド錠剤又は２層錠剤であることができる。好ましい態様では、これら製剤は、胃内での分解に抵抗し腸管内で溶解する腸溶性外殻コーティングを含んでなる。好ましい態様では、本製剤は、胃の極限的ｐＨから核酸を保護するのに、又は特定の粘膜部位への核酸の送逹を最適化するために時間をかけてそれを放出するのに効果的な腸溶性材料を含んでなる。
【００２６】
酸抵抗性錠剤、カプセル剤及びキャプレット（caplet）のための腸溶性材料は、当該技術分野で知られており、典型的には、アセテートフタレート、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、セルロースアセテートトリメリテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、メタクリレート、キトサン、グアーガム、ペクチン、ローカストビーンガム、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。１つの特に有用なタイプのメタクリレートは、ＥＵＤＲＡＧＩＴＳTMである。これらは、低ｐＨで水非混和性であるが、腸のｐＨではイオン化されて溶解性になるアニオン性ポリマーである。ＥＵＤＲＡＧＩＴＳTMＬ１００及びＳ１００は、メタクリル酸とメタクリル酸メチルのコポリマーである。
【００２７】
腸溶性材料は、剤形内に取り込まれても、錠剤、カプセル剤又はキャプレットの全表面を実質的に覆うコーティングであってもよい。腸溶性材料は、例えば、錠剤硬化又は熟成中の割れに抵抗性にするために、柔軟弾力性を付与する可塑剤を伴ってもよい。可塑剤は、当該技術分野剤で知られており、典型的には、フタル酸ジエチル（ＤＥＰ）、トリアセチン、セバシン酸ジブチル（ＤＢＳ）、フタル酸ジブチル（ＤＢＰ）及びクエン酸トリエチル（ＴＥＣ）が含まれる。
【００２８】
本発明の製剤の“薬学的に許容できる”成分は、賦形剤、希釈剤、安定剤、保存剤及び他の成分と一緒に使用されたときに、製剤の性質、組成及び投与様式に適切である成分である。従って、薬剤、特にオリゴヌクレオチドの活性に干渉せず、かつ、その薬剤が、毒性、刺激又はアレルギー反応のような許容できない副作用なしに動物の体内に導入され得るやり方で、その薬剤の取り込みを促進する浸透増進剤を選択することが望まれる。
【００２９】
“担体粒子”は、本明細書では、顆粒、ビーズ、マイクロ粒子、ミニ粒子、ナノ粒子、又は上記の経口医薬製剤中に取り込まれ得る他のあらゆる固体剤形として定義される。
好ましい担体粒子形成物質には、ポリアミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、デンドリマー（dendrimer）、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、スターチ、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＤＥＡＥ誘導化ポリイミン、プルラン及びセルロースが含まれる。
【００３０】
他の好ましい態様では、担体粒子形成物質には、キトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、パラアミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン、及びＤＥＡＥ−デキストランが含まれる。別の好ましい態様では、担体粒子形成物質は、アルギネートと複合化したポリ−Ｌ−リシンである。
【００３１】
別の態様では、担体粒子形成物質は、非多カチオン性のものである、即ち、ポリアクリレート、例えば、ポリアルキルアクリレート（例えば、メチル、ヘキシル）、ポリオキシエタン、ポリ（ＤＬ−乳酸−co−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びポリエチレングリコールのような全般的に中性又は陰性電荷を有するものである。
【００３２】
別の態様では、本発明の医薬製剤は、更に、粘膜に担体粒子を接着させるのに役立つ生体接着性材料を含んでなる。担体粒子は、ＰＬＬアルギネート担体粒子の場合のように、それ自体が生体接着性であっても、生体接着性材料でコートされていてもよい。そのような材料は、製剤分野では周知である。その例は、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる WO85/02092 Eur. J. Pharm. Biopharm. 44:15-23, 1997, 米国特許第 6,375,963 号、米国特許出願第 6,316,011 号、及び米国特許出願第 6,280,770 号に記載されている。好ましい生体接着性材料には、ポリアクリルポリマー（例えば、カーボマー及びその誘導体）、ポリ無水物（例えば、Gantrez）、ポリ（アクリル酸）、トラガカント、セルロース、ポリエチレンオキシドセルロース誘導体（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びナトリウム・カルボキシメチルセルロース（ＮａＣＰＣ））、カルヤガム、スターチ、ゼラチン、ペクチン、ラテックス、キトサン、アルギン酸ナトリウム、及びレクチンのようなレセプター結合性ペプチドが含まれる。
【００３３】
本発明の製剤は、更に、通過される粘膜の部位においてムチンを部分的に又は完全に分解又は浸蝕するのに役立つ粘膜分解性物質を含んでなることができる。粘膜分解性物質は製剤分野で周知であり、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオスレイトール、ペプシン、ピロカルピン、グアイフェネシン、グリセロールグアイアコレート、テルピン水和物、塩化アンモニウム、グアテネシン、アンブロキソール、ブロムヘキシン、カルボシステイン、ドミオドール、レトステイン、メシステイン、メスナ、ソブレロール、ステプロニン、チオプロニン、及びチロキサポールが含まれる。
【００３４】
薬剤は、その薬剤及び担体粒子並びに担体粒子を調製する方法に依存して、静電気的（例えば、イオン、極性、Van der Waals）、共有結合的又は機械的（非静電気的、非共有結合的）相互作用によってその担体粒子と結着することができる。例えば、オリゴヌクレオチドのようなアニオン性の薬剤は、イオン性相互作用によってカチオン性担体に結合することができる。
【００３５】
担体粒子は、賦形剤を含んでなることができる。典型的な医薬賦形剤には、結合剤（例えば、予備ゼラチン化トウモロコシスターチ、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトース及び他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウム等）；ラブリカント（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、スターチ、スターチグリコール酸ナトリウム、EXPLOTAB）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
好ましい態様では、第２集団の担体粒子（浸透増進剤を含んでなる）は、更に、遅延放出コーティング又はマトリックスを含まないところの第１集団の担体粒子から薬剤及び浸透増進剤が放出された箇所から腸管下流の箇所に到達するまでの溶解を遅らせるための腸内遅延放出コーティング又はマトリックスを含んでなる。この遅延放出コーティング又はマトリックスは、薬剤と浸透増進剤の組合せが第１集団の担体粒子から放出された後に浸透増進剤の放出を起こさせる上記の医薬製剤（例えば、カプセル剤又は錠剤）上の遅延放出コーティングとは異なるか又は異なる厚さを有する。好ましい態様では、第２集団の担体粒子上のコーティングはｐＨ非依存性である。
【００３７】
医薬製剤が経口投与後に腸管（小腸又は結腸）内を標的にすることができる３つの実用的メカニズムが存在する：結腸細菌性酵素による活性化又はその微生物相によって作り出される環境を少なくすること、ｐＨ依存性コーティング及び時間依存性コーティング（コーティングの厚さ）。
【００３８】
製剤上のコーティングが溶解した後の第２集団の担体粒子からの浸透増進剤の放出を促進するために、１又はそれを越えるこれらメカニズムを使用してもよい。例えば、腸管のｐＨを材料が通過するにつれて上昇させる。かくして、製剤上のコーティングは、第２集団の担体粒子からの浸透増進剤の放出に先んじて第１及び第２集団の担体粒子の放出を促進するために、第２集団の担体粒子上のコーティングよりも低いｐＨで溶解するコーティングであることができる。
【００３９】
別の態様では、製剤上及び第２集団の担体粒子上の生分解性コーティングの厚さ及び／又は性質は異なる。コーティングの溶解時間は、厚さが増加するにつれて長くなる。かくして、１つの態様では、製剤上のコーティングの厚さは第２集団の担体粒子上のコーティングの厚さよりも大きいので、第２集団の担体粒子からの浸透増進剤の放出に先んじて担体粒子の放出を促進する。コーティングの性質も、異なるコーティングは異なる速度で溶解するので考慮すべき事柄である。
【００４０】
遅延放出コーティング及びその溶解性に影響する特性は、当該技術分野で周知であり、例えば、Bauer et al., Coated Pharmaceutical Dosage Forms, Medpharm Scientific Publishers, CRC Press, New York, 1998 and by Watts et al., Drug Devel, Industr. Pharm. 23:893-913, 1997 に記載されている。これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４１】
本発明の組成物は、医薬組成物において慣用的に見出される他のアジュバント成分をその確立された使用レベルで含んでなることができる。かくして、本組成物は、例えば、痒み止め、収斂剤、局所麻酔剤又は抗炎症剤のような追加の適合性の医薬活性材料を含有することも、染料、フレーバー付与剤、保存剤、抗酸化剤、混濁化剤、増粘剤及び安定剤のような、本発明の組成物の種々の剤形を物理的に配合するのに有用な追加の材料を含有することもできる。しかしながら、そのような材料が加えられるときは、本発明の組成物の成分の生物活性に過度に干渉してはならない。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、ペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体及びそのフラグメント、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び小分子を包含する薬剤を送逹するのに使用される。本発明の医薬組成物に使用するのに適する薬剤のタイプには、ペプチドホルモン、抗生物質及び抗菌剤、血管収縮薬、心臓血管薬、血管拡張薬、酵素、骨代謝制御剤、ステロイドホルモン、抗高血圧剤、非ステロイド系抗炎症剤、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、去痰薬、化学療法剤、鎮静剤、抗鬱薬、β遮断薬、及びアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
好ましい態様では、本医薬製剤は、そのモジュレーションが望まれるタンパク質をコードするＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の機能のアンチセンスモジュレーションに使用するためのオリゴヌクレオチドを送達するために使用され、究極的にそのようなタンパク質の量を調節するために使用される。アンチセンスオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡ標的とのハイブリダイゼーションは、そのｍＲＮＡの正常な役割に干渉するので、細胞内でのその機能のモジュレーションを引き起こす。干渉されるｍＲＮＡの機能には、タンパク質翻訳のための部位へのそのＲＮＡの移動、そのＲＮＡからのタンパク質の現実の翻訳、１又はそれを越えるｍＲＮＡ種を生み出すためのそのＲＮＡのスプライシング、ｍＲＮＡのターンオーバー又は分解が含まれ、そのＲＮＡによって連動され得る独立の触媒活性すら含まれ得る。ｍＲＮＡ機能へのそのような干渉の全体的効果は、タンパク質発現のモジュレーションである。ここで、“モジュレーション”とは、タンパク質発現の増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明の文脈では、阻害は、遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形態である。
【００４４】
本発明の文脈では、“オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のオリゴマー又はポリマーのことを言う。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖及び糖間（主鎖）共有連結から構成されるオリゴヌクレオチド、並びに同じように機能する天然に存在しない部分を有する修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、増進された細胞取り込み、増進された標的への結合性及びヌクレアーゼ存在下での向上した安定性のような望ましい特性の故に、しばしば天然形態よりも好ましい。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾された連結、修飾された核酸塩基又は修飾された糖を有する核酸であっても、キメラ核酸であってもよい。
オリゴヌクレオチド及び他の核酸の多くの生物学的同等物が本発明に従って用いられてもよい。従って、本発明は、オリゴヌクレオチド及び核酸のプロドラッグ、オリゴヌクレオチドの欠失誘導体、オリゴヌクレオチドの接合体、アプタマー、及びリボザイムのような、しかしそれらに限定されない、オリゴヌクレオチド及び核酸の生物学的同等物をも包含する。
【００４６】
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドとして広く知られる繰り返し単位のポリマーである。未修飾（天然に存在する）ヌクレオチドは３つの成分を有する：（１）窒素性塩基であってその窒素原子の１つによって連結している塩基、（２）５つの炭素の環化糖、及び（３）該糖の炭素５にエステル化したリン酸。オリゴヌクレオチド鎖に取り込まれると、第１ヌクレオチドのリン酸は、隣接する第２ヌクレオチドの糖の炭素３にエステル化される。未修飾オリゴヌクレオチドの“主鎖”は（２）及び（３）からなる；即ち、糖は、第１ヌクレオチドの糖の炭素５（５’）位と、隣接する第２ヌクレオチドの炭素３（３’）位との間のホスホジエステル連結によって一緒に連結している。“クレオシド”は、（１）核酸塩基と（２）（３）のリン酸エステル部分が存在しない糖の組合せである（Kornberg, A., DNA Replication, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pages 4-7）。オリゴヌクレオチドの主鎖は、特定の順序で一連の塩基を位置付けし、慣用的に５’から３’への順序で記載されるこの一連の塩基の表記はヌクレオチド配列として知られる。
【００４７】
オリゴヌクレオチドは、特定の核酸との特異的ハイブリダイゼーションを行うのに十分な同一性と数のヌクレオチド配列を含んでなることができる。遺伝子のセンス鎖の一部分に特異的にハイブリダイズするそのようなオリゴヌクレオチドは、広く“アンチセンス”として記載される。本発明の文脈では、“ハイブリダイゼーション”は、相補的ヌクレオチド間の、Watson-Crick、Hoogsteen 又は逆 Hoogsteen 水素結合であってもよい水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成によって対になる相補的核酸塩基である。本明細書で使用される“相補的”という用語は、２つのヌクレオチド間で正確に対合する能力のことを言う。例えば、オリゴヌクレオチドの一定の位置におけるヌクレオチドが、別のＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置におけるヌクレオチドと水素結合できるなら、そのオリゴヌクレオチドとそのＤＮＡ又はＲＮＡとは、その位置において相互に相補的であると考えられる。それらオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡは、各々の分子内において十分な数の対応する位置が相互に水素結合できるヌクレオチドによって占められるとき、相互に相補的である。かくして、“特異的にハイブリダイズする”及び“相補的な”は、安定で特異的な結合がそれらオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡ標的との間で起こるような十分な程度の相補性又は正確な対合を示すために使用される。当該技術分野では、オリゴヌクレオチドがその標的ＤＮＡ配列に特異的ハイブリダイズ可能であるために１００％相補性を必要とすることはないと理解されている。オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子への結合が、その標的ＤＮＡ又はＲＮＡの正常な機能に干渉して機能の低下又は亡失を起こし、そして、特異的結合が望まれる条件下で、即ち、in vivo アッセイ若しくは治療的処置の場合又は in vitro アッセイの場合の生理学的条件下で、つまり、それらアッセイが行われる条件下で、そのオリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を避けるだけの十分な程度の相補性が存在しているとき、特異的にハイブリダイズしている。
【００４８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、研究試薬、診断助剤、及び治療剤として広く使用される。例えば、優れた特異性で遺伝子発現を阻害できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、特定の遺伝子の機能を解明するために、例えば、生理学的経路の種々のメンバーの機能を区別するために、当業者により使用される。従って、この特異的阻害効果は、研究用途のために当業者によって利用されてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一定の疾患状態に存在するＤＮＡ又はｍＲＮＡへのそれらの特異的な結合又はハイブリダイゼーションに基づいて、そして幾つかのポリメラーゼ連鎖反応を利用するハイブリダイゼーションベースのアッセイ及び増幅アッセイが与える高い度合いの感度に起因して、診断助剤としても使用されてきた。このオリゴヌクレオチドの特異性及び感度は、治療用途においても当業者によって利用されてきた。例えば、次の米国特許は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する一時抑えの治療方法又は他の方法を示している。米国特許第５，１３５，９１７号は、ヒトインターロイキン−１レセプター発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第５，０９８，８９０号は、ｃ−ｍｙｂ発癌遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド及び一定の癌状態のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド療法に向けられている。米国特許第５，０８７，６１７号は、アンチセンスオリゴヌクレオチドで癌患者を処置する方法を提供している。米国特許第５，１６６，１９５号は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供している。米国特許第５，００４，８１０号は、単純ヘルペスＶｍｗ６５ｍＲＮＡにハイブリダイズして複製を阻害できるオリゴマーを提供している。米国特許第５，１９４，４２８号は、インフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第４，８０６，４６３号は、ＨＴＬ Ｖ−III 複製を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びそれらを使用する方法を提供している。米国特許第５，２８６，７１７号は、発癌遺伝子の一部分に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第５，２７６，０１９号及び米国特許第５，２６４，４２３号は、細胞内の外来核酸の複製を阻止するために使用されるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体に向けられている。米国特許第４，６８９，３２０号は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的な抗ウイルス剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドに向けられている。米国特許第５，０９８，８９０号は、ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の少なくとも一部分に相補的なオリゴヌクレオチドを提供している。米国特許第５，２４２，９０６号は、潜伏性エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染の処置に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例が本明細書に提供される。
【００４９】
更に、本発明の組成物に使用されるオリゴヌクレオチドは、白血球の他の細胞タイプへの接着を調節するタンパク質の合成に関与するｍＲＮＡ又はＤＮＡの作用を修飾することに向けられ得る。白血球の血管内皮への接着は、in toto でないなら、５種の細胞接着分子、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１及びＧＭＰ−１４０によって部分的に媒介されると考えられる。Dustin and Springer, J. Cell. Biol. 1987, 107, 321。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，５１４，７８８号（Bennett et al., １９９６年５月７日）及び米国特許第５，５９１，６２３号（Bennett et al., １９９７年１月７日）、及び係属中の米国特許出願第０８／４４０，７４０号（１９９５年５月１２日出願）及び第０９／０６２，４１６号（１９９８年４月１７日出願）に開示されているように、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、内皮白血球接着分子−１（ＥＬＡＭ−１、又はＥ−選択）、及び血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）をコードするｍＲＮＡ又は選択されたＤＮＡ部分のいずれかにハイブリダイズするようにデザインされている。これらオリゴヌクレオチドは、標的にされたｍＲＮＡの活性をモジュレートして、特異的な細胞接着分子の合成と代謝をモジュレートし、それによって、一時的緩和及び治療的効果をもたらすことが見出されている。ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１及び／又はＥＬＡＭ−１発現の阻害は、炎症性疾患、炎症要素を有する疾患、同種異系移植片拒絶反応、乾癬及び他の皮膚疾患、炎症性腸疾患、癌及びそれらの転移、及びウイルス感染の処置に有用であると期待される。細胞接着をモジュレートする方法であって、動物を本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させることを含んでなる方法が提供される。
【００５０】
例示的アンチセンス化合物には、次のものが含まれる：
ISIS2302は、ホスホロチオエート主鎖及び配列 5'-GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA-3' (SEQ ID NO:1) を有する２’−デオキシリボヌクレオチドである。ISIS 2302 は、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子の 3'-未翻訳領域 (3'-UTR) を標的としている。ISIS 2302 は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,514,788 及び 5,591,623号に記載されている。
【００５１】
ISIS 15839 は、構造 5'-GCC-CAA-GCT-GGC-ATC-CGT-CA-3' (SEQ ID NO:1) を有する ISIS 2302 のホスホロチオエートイソ配列“ヘミマー”誘導体である。下線が付されていない“Ｃ”残基は５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）塩基を有し、下線が付された残基は更に２’−メトキシエトキシ修飾（他の残基は２’−デオキシ）を含んでなる。ISIS 15839 は、参照により本明細書に組み込まれる１９９８年４月１７日に出願された同時係属の米国特許出願第 09/062,416号に記載されている。
【００５２】
ISIS 1939 は、ホスホロチオエート主鎖及び配列 5'-CCC-CCA-CCA-CTT-CCC-CTC-TC-3' (SEQ ID NO:2) を有する２’−オリゴデオキシヌクレオチドである。ISIS 1939 は、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子の 3'-未翻訳領域 (3'-UTR) を標的としている。ISIS 1939 は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,514,788 及び 5,591,623号に記載されている。
【００５３】
ISIS 2302 (SEQ ID NO: 1) は、ヒト臍静脈細胞、ヒト肺癌細胞 (A549)、ヒト表皮癌細胞 (A431)、及びヒトケラチノサイトにおける ICAM-1 発現を阻害することが見出されている。ISIS 2302 は、その標的 ICAM-1 からHLA-A 及び HLA-B のような他の潜在的核酸標的にわたっても特異性を示す。ISIS 1939 (SEQ ID NO:2) 及び ISIS 2302 は、ｍＲＮＡレベルを測定するためのノーザンブロット分析により検出すると、C8161 ヒトメラノーマ細胞における ICAM-1 発現を顕著に減少させた。実験的転移アッセイにおいて、ISIS 2302 は、C8161 細胞の転移能力を低下させ、そしてTNF-α 処置からもたらされる C8161 細胞の増進された転移能力を排除した。ISIS 2302 は、炎症性疾患の動物モデルにおいて有意な生物活性も示す。動物実験かからのデータで、クローン病、慢性関節リウマチ、乾癬、潰瘍性大腸炎、及び腎臓移植拒絶反応を包含する多くの炎症性疾患において ISIS 2302 の強い抗炎症性効果が明らかになった。ヒトで試験すると、ISIS 2302 は、クローン病に対して良好な安全性と活性を示した。更に、ISIS 2302 は、処置された対象への満足で有意なステロイド要らずの効果を示し、５カ月後でも処置後の対象はステロイドから離れたままでありかつ疾患が軽減されたままであった。これは、ISIS 2302 の効果の驚くべき有意な発見である。
【００５４】
本発明の組成物に使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは約８〜３０ヌクレオチド含んでなる。そのようなオリゴヌクレオチドが約１０〜約２５ヌクレオチドを含んでなるのがより好ましい。
【００５５】
本発明の組成物に用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物の種々の遺伝子要素の、性質、機能、及び正常又は異常な身体状態への潜在的関係を確認するのにも使用できる。これまで、遺伝子の機能は、動物中の遺伝子に機能欠損突然変異（例えば、ノックアウト突然変異）を構築することにより主として検査されてきた（例えば、トランスジェニック動物）。そのような作業は難しくて時間がかかり、かつ、動物発育に必須の遺伝子については、“ノックアウト”突然変異は、致命的な表現型を生み出すので行うことはできない。更には、機能欠損表現型は、動物のライフサイクル又は疾患状態の特定期間の間に一時的に導入することができない。即ち、“ノックアウト”突然変異は常に存在する。“アンチセンスノックアウト”の使用、即ち、直接の遺伝子操作によってではないアンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の選択的モジュレーションはこれら制限を乗り越える（例えば、Albert et al., Trends in Pharmacological Sciences, 1994, 15, 250 を参照のこと）。加えて、幾つかの遺伝子は、択一的スプライシングのようなプロセスの結果として種々のｍＲＮＡ転写産物を産生するが、“ノックアウト”突然変異は、典型的には、そのような遺伝子から産生されたｍＲＮＡ転写産物の全ての形態を除くので、特定のｍＲＮＡ転写産物の生物学的役割を検査するのに使用することができない。オリゴヌクレオチド及び他の核酸を包含する薬剤の簡単な経口送逹のための組成物及び方法を提供することによって、本発明はこれら及び他の欠点を乗り越える。
【００５６】
本発明の組成物に使用するために考えられる幾つかの好ましい修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾された主鎖又は非天然糖間連結を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。この明細書で定義される様に、修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドには、主鎖中にリン原子を残したもの及び主鎖中にリンとは異なる原子（又は原子の集団）を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。この明細書の目的のためには、及び当該技術分野でときどき言及されるように、それらの糖間主鎖内にリンを持たない、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を包含する修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドであると考えられる。
【００５７】
具体的なオリゴヌクレオチド化学修飾が以下に記載される。所与化合物中の全ての位置が均一に修飾されることを要さず、事実、１を越える以下の修飾が、単一のアンチセンス化合物に取り入れられても、その単一の残基に、例えば、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオチドに取り入れられてもよい。
【００５８】
Ａ．修飾連結：  好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、及び３’−アルキレンホスホネートやキラルホスホネートを包含する他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミダイトやアミノアルキルホスホルアミダイトを包含するホスホルアミダイト、チオノホスホルアミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートであって、正常な 3'-5' 連結、これらの 2'-5' 連結類似体を有するもの、及び隣接するヌクレオチド単位の対が 3'-5' から 5'-3' へ又は 2'-5' から 5'-2' へ連結している逆の極性を有するものが含まれる。種々の塩、混合された塩、及びフリーの酸形態も含まれる。
【００５９】
上記のリン原子含有連結の調製を教示する代表的米国特許には、その一定のものが本願と共通して所有され、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるところの、米国特許第 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050 及び 5,697,248号が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
その中にリン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖（即ち、オリゴヌクレオシド）は、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間連結、混合ヘテロ原子とアルキル又はシクロアルキル糖間連結、又は１若しくはそれを越える短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環糖間連結によって形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ連結（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；及び、混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ2部分を有する他の主鎖が含まれる。
【００６１】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的米国特許には、その一定のものが本願と共通して所有され、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるところの、米国特許第 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437 及び 5,677,439号が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
他の好ましいオリゴヌクレオシド擬似体では、ヌクレオチド単位の糖及び糖間連結の両方、即ち、主鎖が、新たな基で置き換えられている。その塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。１つのそのようなオリゴマー化合物である優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド擬似体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と言われる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖に置き換えられている。核酸塩基は維持されており、その主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的米国特許には、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるところの、米国特許第 5,539,082; 5,714,331 及び 5,719,262号が含まれるがこれらに限定されない。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497 に見出される。
【００６３】
本発明の幾つかの好ましい態様は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオチド、特に上で引用された米国特許第 5,489,677号の -CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2- [メチレン（メチレンイミノ）又はＭＭＩ主鎖として知られる]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 及び -O-N(CH3)-CH2-CH2- [天然のホスホジエステル主鎖が -O-P-O-CH2- と表される]、及び上で引用された米国特許第 5,602,240号のアミド主鎖を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。やはり好ましいのは、上で引用された米国特許第 5,034,506号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【００６４】
Ｂ．修飾核酸塩基：  本発明の組成物に用いられるオリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当該技術分野ではしばしば単に“塩基”と言われる）修飾又は置換を追加的に又は択一的に含むことができる。本明細書で使用される“未修飾”又は“天然”の核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシ及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンのような他の合成及び天然核酸塩基が含まれる。更なる核酸塩基には、米国特許第 3,687,808号に開示されたもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990 に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613 によって開示されたもの、及び Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993 によって開示されたものが含まれる。これら核酸塩基の一定のものは、本発明のオリゴヌクレオチド化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを包含する、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃だけ核酸二重鎖安定性を高める（上掲文献, 276-278 頁）ので、現時点で好ましい塩基置換であり、２’−メトキシエチル糖修飾と組み合わせたときにより好ましいことが示されている。
【００６５】
一定の上記修飾核酸塩基並びに他の修飾核酸塩基の調製を教示する代表的米国特許には、上記の米国特許第3,687,808号、並びに米国特許第 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617号; 及び 5,681,941号が含まれるが、これらに限定されない。これら特許の一定のものは共通して所有されており、各々が参照により本明細書に組み込まれ、そして、1996年１２月１０日に出願された共通して所有される米国特許出願第 08/762,488号も、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
Ｃ．糖修飾：  本発明の組成物に用いられるオリゴヌクレオチドは、更に又は別に１又はそれを越える置換された糖部分を含んでなる。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位で次のうちの１つを含んでなる：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；又はＯ−、Ｓ−又はＮ−アルキニルであって、それらアルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換若しくは未置換のＣ1〜Ｃ10アルキル若しくはＣ2〜Ｃ10アルケニル及びアルキニルであってもよい。特に好ましいのは、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及び O(CH2)nON[(CH2)nCH3]]2であり、ここでｎ及びｍは１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位で次のうちの１つを有する：Ｃ1〜Ｃ10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善する基、及び類似の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ [2'-O-CH2CH2OCH3； 2'-O-(2-メトキシエチル) 又は 2'-MOE としても知られている] (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486)、即ち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。更に好ましい修飾には、１９９８年１月３０日に出願された共通に所有される米国特許出願第09/016,520号に記載されている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、2'-DMAOE としても知られている O(CH2)2ON(CH3)2基が含まれ、この特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
他の好ましい修飾には、2'-メトキシ (2'-O-CH3)、2'-アミノプロポキシ (2'-OCH2CH2CH2NH2) 及び 2'-フルオロ (2'-F) が含まれる。類似の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に 3' 末端ヌクレオチド上の糖の 3'位に又は 2'-5' 連結オリゴヌクレオチドにおいて及び 5' 末端ヌクレオチドの 5' 位に行われてもよい。オリゴヌクレオチドは、そのペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬似体を有することもできる。そのような修飾糖構造体の調製を教示する代表的米国特許には、米国特許第 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053l 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633号; 及び 5,700,920号が含まれるがこれらに限定されず、これらの一定のものは共通して所有されており、各々が参照により本明細書に組み込まれ、そして、１９９５年６月５日に出願された共通して所有される米国特許出願第 08/468,037号も含まれ、これも参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
Ｄ．他の修飾：  追加の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に 3'末端ヌクレオチド上の糖の 3'位及び 5' 末端ヌクレオチドの 5' 位に行われてもよい。例えば、本発明の組成物で用いられるオリゴヌクレオチドの１つの追加修飾は、そのオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを高める１又はそれを越える部分又は接合基をそのオリゴヌクレオチドに化学的に連結することを包含してもよい。そのような部分には、コレステロール部分のような脂質部分 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553)、コール酸 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053)、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765)、チオコレステロール (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム・1,2−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969)、又はアダマンタン酢酸 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651)、パルミチル部分 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229)、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923) が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
そのようなオリゴヌクレオチド接合体の調製を教示する代表的米国特許に、米国特許出願第 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928号 及び 5,688,941号が含まれるが、これらに限定されず、これらの一定のものは共通して所有されており、そして、各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
消化管中でのオリゴヌクレオチドの向上した吸収を付与する好ましい接合基は葉酸である。従って、オリゴヌクレオチドと担体とを含んでなる経口投与のための組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが葉酸に接合している組成物が提供される。葉酸（葉酸基）は、オリゴヌクレオチドの 3'又は 5' 末端に、核酸塩基に、又は鎖内のいずれかの糖残基の 2'位に接合してもよい。接合は、オリゴヌクレオチド及び葉酸基上の官能基を利用するあらゆる適する化学リンカーを介することができる。オリゴヌクレオチド−葉酸基接合体及び調製する際の方法は、いずれも参照により本明細書に組み込まれる係属中の米国特許出願第 09/098,166号 (１９９８年６月１６日出願) 及び 09/275,505号 (１９９９年３月２４日出願) に記載されている。
【００７１】
Ｅ．キメラオリゴヌクレオチド：  本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を用いる組成物を包含する。本発明の文脈では、“キメラな”アンチセンス化合物又は“キメラ体”は、２又はそれを越える化学的に異なる領域であって、各々が少なくとも１つのモノマー単位、即ち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド、からできた領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらオリゴヌクレオチドは、典型的には、それらオリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取込み、及び／又は標的核酸についての増加した結合親和性を与えるために、修飾された少なくとも１つの領域を含有する。そのオリゴヌクレオチドの追加の領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂できる酵素についての基質として役立ってもよい。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞性エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮアーゼＨの活性化が、ＲＮＡ標的の開裂をもたらすことによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効力を大きく高める。結論として、キメラオリゴヌクレオチドが使用されると、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴヌクレオチドで匹敵する結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の開裂は、ゲル電気泳動によって日常的に検出されることができ、必要なら当該技術分野で知られた核酸ハイブリダイゼーション技術と併せてもよい。ＲＮアーゼＨ媒介標的開裂は、リボザイムを使用して核酸を開裂するのとは異なる。
【００７２】
例えば、そのような“キメラ体”は、“ギャプマー”、即ち、オリゴヌクレオチドであって、そのオリゴヌクレオチドの中央部分（ギャップ）が、例えば、ＲＮアーゼＨについての基質として役立ち、そしてその 5' 及び 3' 部分（ウィング）が標的ＲＮＡ分子と二重鎖になったときにそれへのより大きな親和性もしくは安定性を有するようなやり方で修飾されているが、ヌクレアーゼ活性をサポートできないオリゴヌクレオチド（例えば、2'−フルオロ−又は 2'−メトキシエトキシ−置換されたもの）であることができる。他のキメラ体には、“ヘミマー”、即ち、オリゴヌクレオチドであって、そのオリゴヌクレオチドのその 5' 部分が、例えば、ＲＮアーゼについての基質として役立つのに反して、その 3'部分が標的ＲＮＡ分子と二重鎖になったときにそれへのより大きな親和性若しくは安定性を有するようなやり方で修飾されているが、ヌクレアーゼ活性をサポートできないオリゴヌクレオチド（例えば、2'−フルオロ−又は 2'−メトキシエトキシ−置換されたもの）又はその逆のオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００７３】
より大きなオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖安定性を与えるオリゴヌクレオチドへの多くの化学修飾が、Freier et al. (Nucl. Acids Res., 1997, 25, 4429) によって記載されている。そのような修飾は、キメラオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨ不応部分のために好ましく、そしてアンチセンス化合物の標的ＲＮＡについての親和性を高めるために広く使用されることができる。
【００７４】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２又はそれを越えるオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又は上記のオリゴヌクレオチド擬似体の複合構造体として形成されてもよい。そのような化合物は、当該技術分野で、ハイブリッド又はギャプマーとも言われる。そのようなハイブリッド構造体の調製を教示する代表的米国特許には、米国特許第 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356号; 及び 5,700,922号が含まれるがこれらに限定されず、これらの一定のものは共通して所有されており、そしてこれらの各々は参照によりが本明細書に組み込まれ、そして、１９９５年６月６日に出願されて許可され、やはり参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第 08/465,880号も含まれる。
【００７５】
本発明は、オリゴヌクレオチド内の特定の位置に関して実質的にキラル的に純粋であるオリゴヌクレオチドを用いる組成物をも包含する。実質的にキラル的に純粋なオリゴヌクレオチドの例には、少なくとも７５％Ｓｐ又はＲｐであるホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオシド (Cook et al., 米国特許第 5,587,361号) 及び実質的にキラル的に純粋な（Ｓｐ又はＲｐ）アルキルホスホネート、ホスホルアミデート又はホスホトリエステル連結 (Cook, 米国特許第 5,212,295号及び 5,521,302号) が含まれるがこれらに限定されない。
【００７６】
本発明は、更にリボザイムを用いる組成物を含む。高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を触媒する合成ＲＮＡ分子とその誘導体は、リボザイムとして知られている（一般的には、米国特許第 5,543,508号及び 5,545,729号を参照のこと）。その開裂反応は、ＲＮＡ分子自身によって触媒される。天然に存在するＲＮＡ分子では、自己触媒開裂の部位は、ＲＮＡ第二構造の高度に保存された領域内に局在している (Buzayan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 8859; Forster et al., Cell, 1987, 50, 9)。天然に存在する自己触媒性ＲＮＡ分子は、高い度合いの特異性で特定の細胞又は病因性ＲＮＡ分子を標的にすることができるリボザイムを生成するように修飾されてきた。かくして、リボザイムは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして同じ一般的目的（即ち、特異的遺伝子の発現のモジュレーション）に役立ち、そして、オリゴヌクレオチドのように、一本鎖性の有意な部分を所有する核酸である。即ち、リボザイムは、オリゴヌクレオチドと実質的な化学的及び機能的同一性を有するので、本発明の目的のためには同等と考えられる。
【００７７】
他の生物活性なオリゴヌクレオチドが本発明の組成物中に形成され、そして、本発明の方法に従って、治療、一時緩和又は予防目的のために使用されてもよい。そのような他の生物活性なオリゴヌクレオチドには、中でもアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＰＮＡ及びリボザイム（上記のもの）及びＥＧＳ、並びにアプタマー及び分子オトリ（下記のもの）を含むアンチセンス化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
ＲＮアーゼＰを強める配列は、External Guide Sequences なので、略号“ＥＧＳ”として知られている。ＥＧＳは、内因性ヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＰ）を標的核酸へ向かわせるアンチセンス化合物である (Forster et al., Science, 1990, 249, 783; Guerrier-Takada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 8468)。
【００７９】
アンチセンス化合物は、内因性ヌクレアーゼの強化に頼る代わりに、択一的に又は追加的に別のアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドに共有結合したヌクレアーゼ活性を有する合成部分を含んでなることができる。ヌクレアーゼ活性を有する合成部分には、酵素性ＲＮＡ（リボザイム中におけるようなもの）、ランタニドイオン複合体等 (Haseloff et al., Nature, 1988, 334, 585; Baker et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 8749) が含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
アプタマーは、Watson-Crick 塩基対合より他のメカニズムを介して特異的リガンドに結合する一本鎖オリゴヌクレオチドである。アプタマーは、典型的には、例えば、タンパク質を標的にするが核酸に結合するようにはデザインされていない (Ellington et al., Nature, 1990, 346, 818)。
【００８１】
分子オトリは、タンパク質のような因子がそれに結合する核酸上の部位を擬似する短い二本鎖核酸（それら自身上に“折り畳み返される”ようにデザインされた一本鎖核酸を含む）である。そのようなオトリは、因子である分子が過剰のオトリと結合し、そのオトリに対応する細胞部位に結合する因子の濃度が低下して、治療、一時緩和又は予防効果をもたらすので、その因子を競合的に阻害することが期待される。核酸オトリ分子を同定し構築する方法は、例えば、米国特許第 5,716,780号に記載されている。
【００８２】
別のタイプの生物活性オリゴヌクレオチドは、内因性核酸の遺伝子変換を指揮することができるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子である (Cole-Strauss et al., Science, 1996, 273, 1386)。
【００８３】
本発明の製剤に用いられることができる特異的オリゴヌクレオチド及びそれらが阻害する標的遺伝子の例には：
【００８４】
【表１】
2005531487.tif 000002
【００８５】
が含まれる。ISIS-9605 は、最初の５連結及び最後の５連結において天然のホスホジエステル連結を取り込んでおり、残りはホスホロチオエート連結である。
Ｆ．合成：  本発明の組成物に使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成法の周知の技術によって慣用的に及び日常的に作られることができる。そのような合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems (Foster City, CA) を含む幾つかの業者によって販売されている。当該技術分野で知られているそのような合成のどのような他の手段も、追加的に又は択一的に用いられることができる。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを調製する類似の技術も知られている。
【００８６】
１．オリゴヌクレオチドの合成：  特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する技術は、各々が本願と共通して譲渡されている次の米国特許又は係属中の出願に見い出されることができる：ポリアミン接合化オリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第 5,138,045 及び 5,218,105号；キラルなリン連結を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのモノマーに向けられた米国特許第 5,212,295号；修飾された主鎖を有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第 5,378,825 及び 5,541,307号；主鎖修飾オリゴヌクレオチド及び還元的カップリングを介するその調製に向けられた米国特許第 5,386,023号；3-デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基及びその合成方法に向けられた米国特許第 5,457,191号；N-2 置換プリンに基づく修飾核酸塩基に向けられた米国特許第 5,459,255号；キラルなリン連結を有するオリゴヌクレオチドを調製するための方法に向けられた米国特許第 5,521,302号；ペプチド核酸に向けられた米国特許第 5,539,082号；β-ラクタム主鎖を有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第 5,554,746号；オリゴヌクレオチドの合成のための方法及び材料に向けられた米国特許第 5,571,902号；アルキルチオ基を有するヌクレオシドであって、そのような基がそのヌクレオシドの種々の位置のいずれかに結合した他の部分へのリンカーとして使用され得るヌクレオシドに向けられた米国特許第 5,578,718号；高いキラル純度のホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第 5,587,361 及び 5,599,797号；2,6-ジアミノプリン化合物を包含する 2'-O-アルキルグアノシン及び関連化合物の調製方法に向けられた米国特許第 5,506,351号；N-2 置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第 5,587,469号；3-デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに向けられた米国特許第 5,587,470号；接合化 4'-デスメチルヌクレオシド類似体に向けられた１９９３年６月２９日に発行された米国特許第 5,223,168号、及び米国特許第 5,608,046号；主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体に向けられた米国特許第 5,602,240号及び 5,610,289号；及び、特に 2'-フルオロオリゴヌクレオチドを合成する方法に向けられた１９９５年２月３日に出願された米国特許出願第 08/383,666号、及び米国特許第 5,459,255号。
【００８７】
２．生物学的同等物：  本発明の組成物は、ヒトを包含する動物に投与すると生物活性なその代謝産物又は残基を（直接に又は間接に）提供することができるあらゆる薬学的に許容できる化合物を包含する。従って、例えば、この開示は、本発明のアンチセンス化合物及び他の生物学的同等物の“プロドラッグ”及び“薬学的に許容できる塩”にも向けられている。
【００８８】
Ａ．オリゴヌクレオチドプロドラッグ：  本発明の組成物に用いられるオリゴヌクレオチド及び核酸化合物は、追加的に又は択一的に“プロドラッグ”形態で送達されるように調製され得る。“プロドラッグ”という用語は、内因性酵素又は他の化学物質の作用及び／又は条件によって体内で又はその細胞内で活性形態（即ち、薬剤）に変換される不活性形態で調製される治療剤を意味する。特に、アンチセンス化合物のプロドラッグ型は、WO 93/24510 (Gosselin et al., １９９３年１２月９日公開) に開示された方法に従うＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製されることができる。
【００８９】
Ｂ．薬学的に許容できる塩：  “薬学的に許容できる塩”という用語は、本発明の組成物に用いられるオリゴヌクレオチド及び核酸化合物の生理学的及び生物学的に許容できる塩（即ち、親化合物の望まれる生物活性を維持するが望まれない毒性学的な作用をそれに付与しない塩）のことを言う。
【００９０】
薬学的に許容できる塩基付加塩は、アルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミンのような金属又はアミンで形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、スペルミン及びスペルミジンのような多価アミンである。適するアミンの例は、クロロプロカイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインである（例えば、Berge et al., “Pharmaceutical Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66:1）。酸性化合物の塩基付加塩は、そのフリーの酸形態を十分な量の望まれる塩基と接触させて慣用的なやり方で塩を生成させることによって調製される。フリーの酸形態は、その塩形態を酸と接触させてそのフリーの酸を慣用的なやり方で単離することによって生じさせることができる。フリーの酸形態は、それらそれぞれの塩形態と、極性溶媒中での溶解性のような一定の物理的特性において幾分異なるが、本発明の目的のためにはそれらそれぞれのフリーの酸と同等である。
【００９１】
オリゴヌクレオチド合成のプロセスの間、ヌクレオシドモノマーは、ヌクレオシドモノマーカップリング、酸化、キャッピング及び脱トリチル化のような反復される一連の化学反応において、一回に１つが鎖に付けられる。各々のヌクレオシド付加についての工程毎の収率は９９％を上回る。それは、不完全なカップリング後に不完全なキャッピング、脱トリチル化及び酸化が起こる全体の結果として、各々の工程において、ヌクレオシドモノマー付加から配列鎖を発生するのに１％未満だけが失敗することを意味する (Smith, Anal. Chem., 1988, 60, 381A)。（ｎ−１）、（ｎ−２）等から１マー（ヌクレオシド）に及ぶ全ての短いオリゴヌクレオチドは、ｎマーのオリゴヌクレオチド生成物中に不純物として存在する。それら不純物の中で、（ｎ−２）マー及びより短いオリゴヌクレオチドは、非常に少ない量でしか存在しないので、クロマトグラフィー精製によって容易に除くことができる (Warren et al., Chapter 9 In: Methods in Molecular Biology, Vol. 26: Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Agrawal, S., Ed., 1994, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pages 233-264)。しかしながら、クロマトグラフィー選択性の欠如及び生成物収率のために、幾つかの（ｎ−１）マー不純物が精製過程の後でも完全長（即ち、ｎマー）オリゴヌクレオチド生成物中に依然として存在する。その（ｎ−１）部分は、ｎマー親オリゴヌクレオチドと比較して全てのあり得る１塩基欠失の配列の混合物からなる。そのような（ｎ−１）不純物は、欠けている塩基の位置（即ち、５’若しくは３’末端又は内部のいずれか）に依存して、末端欠失又は内部欠失配列として分類されることができる。１塩基欠失配列不純物を含有するオリゴヌクレオチドが薬剤として使用されるとき (Crooke, Hematologic Pathology, 1995, 9, 59) は、末端欠失配列不純物は、僅かに低い親和性ではあるが完全長配列と同じ標的ｍＲＮＡに結合するであろう。かくして、ある程度までは、そのような不純物は活性薬剤成分の一部として考えることができるので、本発明の目的のためには生物学的同等物であると考えられる。
【００９２】
核酸と有害な反応を起こさないところの経口投与に適する薬学的に許容できる有機又は無機の担体物質も、本発明の組成物を配合するのに使用されることができる。適する薬学的に許容できる担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。本製剤は滅菌されても、望ましければ、その製剤の核酸と有害な反応を起こさない補助剤、例えば、ラブリカント、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色剤、フレーバー付与剤及び／又は芳香物質等と混合されてもよい。
【００９３】
本発明は、動物に薬剤を経口送逹するために組成物及び方法を提供する。本発明の目的のために、“動物”という用語は、ヒト並びに他の哺乳動物、並びに爬虫類、魚類、両生類及び鳥類を包含することが意味される。本発明の組成物は、エマルジョンとして調製及び製剤されていてもよい。エマルジョンは、典型的には、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形態で別のものの中に分散した１つの液体の不均一系である (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 2, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 335; Higuchi et al., in “Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301)。エマルジョンは、よく混合されかつ互いに分散した２つの非混和性液相から構成される二相系であることが多い。一般に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水相が嵩い油相中に小さな液滴として微細に分割されているとき、得られる組成物は油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。また、油相が嵩い水相中に小さな液滴として微細に分割されているとき、得られる組成物は水中油（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。
【００９４】
エマルジョンは、分散相及び活性薬物に加えて、水相、油相又はそれ自体が別々の相のいずれかである溶液として存在することができる追加成分を含有してもよい。乳化剤、安定化剤、染料、及び抗酸化剤のような製剤上の賦形剤も、必要に応じてエマルジョン中に存在することができる。製剤上のエマルジョンは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のような２を越える相から形成される多エマルジョンであることもできる。そのような複合製剤は、簡単な二相エマルジョンが提供できない一定の利点を提供することが多い。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を包む多エマルジョンがｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油の連続相中に安定化された水の小球中に包まれた油滴の系がｏ／ｗ／ｏエマルジョンを提供する。
【００９５】
エマルジョンは、熱力学的安定性が殆ど又は全く無いことによって特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散相又は不連続相は、外部相又は連続相中に十分に分散され、乳化剤又はその製剤の粘度によってその形態に維持される。エマルジョンのいずれかの相は、エマルジョンスタイルの軟膏ベースやクリーム剤の場合のように、半固体又は固体であってもよい。エマルジョンを安定化させる他の手段は、そのエマルジョンのいずれかの相に取り込まれてもよい乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、４つのカテゴリーに大きく分類される：合成表面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収ベース (absorption base)、及び微分散固体 (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 199)。
【００９６】
表面活性剤としても知られる合成表面活性剤は、エマルジョンの配合に広い用途があるので、文献に纏められている (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285;  Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 199)。表面活性剤は典型的には両性であり、親水性部分と疎水性部分とを含んでなる。表面活性剤の親水性の疎水性に対する比率は、親水体／親油体バランス（ＨＬＢ）と名付けられ、製剤の調製において表面活性剤をカテゴリーに分けそして選択する価値あるツールである。表面活性剤は、親水性の性質に基づいて異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性 (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285)。
【００９７】
エマルジョン製剤に使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜ろう、ホスファチド、レシチン及びアラビアゴムが含まれる。吸収ベースは親水性特性を有するので、それらは水を吸収してｗ／ｏエマルジョンを形成しても依然としてそれらの無水ラノリン及び親水性ペトロラタムのような半固体コンシステンシーを保持する。微粉砕された固体も、特に表面活性剤と組合わせて粘稠な製剤において良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物のような極性の無機固体、ベントナイト、アタッパルガイト (attapulgite)、ヘクトライト (hectorite)、カオリン、モントモリロナイト (montmorillonite)、コロイド状アルミニウムシリケート及びコロイド状マグネシウムアルミニウムシリケートのような非膨潤性粘土、炭素又はトリステアリン酸グリセリルのような顔料及び非極性固体が含まれる。
【００９８】
多様な非乳化性材料もエマルジョン製剤中に含められてそのエマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂肪、油、ろう、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が含まれる (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 335; Idson, Id., p. 199)。
【００９９】
親水性コロイド又はハイドロコロイドには、多糖類（例えば、アラビアガム、寒天、アルギン酸、カラジーナン、グアーガム、カラヤガム、及びトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カーボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）のような天然に存在するガム及び合成ポリマーが含まれる。これらは、水中で分散又は膨潤して、分散相の液滴の周囲に強い界面膜を形成することにより及び外部相の粘度を高めることによりエマルジョンを安定化させる。
【０１００】
エマルジョンは、細菌の増殖を容易に支援することができる、炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドのような多くの成分を含有するので、これら製剤は保存剤を取り込むことが多い。エマルジョン製剤中に含まれる普通に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が含まれる。抗酸化剤も、エマルジョン製剤の劣化を阻止するためにその製剤に普通に添加される。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンのようなフリーラジカルスカベンジャー、アスコルビン酸及びメタ亜硫酸ナトリウムのような還元剤、及びクエン酸、酒石酸及びレシチンのような抗酸化剤相乗剤であることができる。
【０１０１】
経皮、経口及び非経口ルートを介するエマルジョン製剤の適用及びそれらの製造方法は文献に纏められている (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 199)。経口送逹のためのエマルジョン製剤は、製剤化の容易性、吸収からの効力及びバイオアベイラビリティ観点の故に非常に広く使用されている (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 245; Idson, Id., p. 199)。中でも、鉱油ベースの下剤、油溶性ビタミン、及び高脂肪栄養製剤は、ｏ／ｗエマルジョンとして広く経口投与されてきたものである。
【０１０２】
本発明の１つの態様では、オリゴヌクレオチド及び核酸の組成物がマイクロエマルジョンとして製剤される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な溶液である、水、油及び両親媒体の系として定義されることができる (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 245)。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を表面活性剤溶液中に分散させてから、一般的には中鎖アルコールである十分な量の第４成分を添加して透明系を形成させることによって調製される系である。従って、マイクロエマルジョンは、熱力学的に安定で等方的に澄明な、表面活性分子の界面膜によって安定化された２つの非混和性液体の分散液として説明されることができる (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215)。マイクロエマルジョンは、普通、油、水、表面活性剤、補助表面活性剤及び電解質を含む３〜５成分の組み合わせを介して調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）タイプであるか又は水中油（ｏ／ｗ）タイプであるかは、使用される油及び表面活性剤の特性並びにその表面活性剤分子の極性ヘッドと炭化水素テールの構造と幾何学的詰まり具合に依存する (Schott, in “Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271)。
【０１０３】
相ダイヤグラムを用いる現象学的アプローチが幅広く検討され、マイクロエマルジョンの製剤の仕方の包括的理解を当業者にもたらした (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 245; Block, Id., p. 335)。慣用的なエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定な液滴の形成に際して、非水溶性薬剤を可溶化させる利点を与える。
【０１０４】
マイクロエマルジョンの調製に使用される表面活性剤には、イオン性表面活性剤、非イオン性表面活性剤、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート (ML310)、テトラグリセロールモノオレート (MO310)、ヘキサグリセロールモノオレート (PO310)、ヘキサグリセロールペンタオレート (PO500)、デカグリセロールモノカプレート (MCA750)、デカグリセロールモノオレート (MO750)、デカグリセロールセクイオレート (sequioleate) (SO750)、デカグリセロールデカオレート (DAO750) が、単独又は補助表面活性剤と組み合わせで含まれるが、これらに限定されない。通常はエタノール、１−プロパノール及び１−ブタノールのような短鎖アルコールである補助表面活性剤は、表面活性剤膜内に浸透して、その結果、表面活性剤分子の間に生成する空隙スペースの故に障害のある膜を作り上げることによって、界面の流動性を高めるのに役立つ。しかしながら、マイクロエマルジョンは、補助表面活性剤を使用なくても調製されることができ、無アルコール自己乳化性マイクロエマルジョン系が当該技術分野で知られている。その水相は、典型的には、水；薬剤、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体の水溶液であり得るが、これらに限定されない。油相には、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル、中鎖 (C8-C12) モノ、ジ及びトリグリセリド、ポリオキシエチレン化脂肪酸グリセリルエステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化 (C8-C10) グリセリド、植物油及びシリコーン油が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
マイクロエマルジョンは、薬剤安定化及び薬剤の高い吸収性の観点から特に興味深い。脂質をベースとしたマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）が、ペプチドを含む薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めることが提唱されている (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205)。マイクロエマルジョンは、向上した薬剤安定化、酵素的加水分解からの薬剤の保護、表面活性剤が誘発する膜流動性及び透過性の変化に起因する薬剤吸収のあり得る促進、製剤の容易性、固体剤形に勝った経口投与の容易性、向上した臨床的強力さ、及び低下した毒性という利点を与える (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138)。しばしば、マイクロエマルジョンは、それらの成分が周囲温度で一緒にされたときに自発的に形成される。このことは、熱不安定性薬剤、ペプチド又はオリゴヌクレオチドを製剤するときに特に有益であり得る。マイクロエマルジョンは、化粧品及び医薬品の両方の適用で活性成分を経皮送達するのにも有効である。本発明のマイクロエマルジョン組成物及び製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチド及び核酸の全身吸収を促進し、並びに胃腸管内でのオリゴヌクレオチド及び核酸の局所的細胞取り込みを向上させることが期待される。
【０１０６】
本発明のマイクロエマルジョンは、その製剤の特性を向上させるため、及び本発明のオリゴヌクレオチド及び核酸の吸収を増進させるために、ソルビタンモノステアレート (Grill 3)、ラブラゾール、及び浸透増進剤のような追加成分又は添加剤も含有することができる。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透増進剤は、１〜５の広いカテゴリーに属するように分類されることができる：表面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート非表面活性剤 (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92)。これらクラスの各々は上で説明した。
【０１０７】
マイクロエマルジョンの他にも、薬剤の製剤のために検討され使用されてきた多くの組織化された表面活性剤構造体が存在する。これらには、単分子層、ミセル、二分子層 (bilayer)、及び小胞が含まれる。リポソームのような小胞は、それらの特異性及びそれらが与える作用期間の故に、薬剤送逹の観点から大きな興味を抱かせてきた。更なる利点は、天然のリン脂質から得られるリポソームは生体適合性でありかつ生分解性である点、リポソームは広範な水溶性及び脂溶性薬剤を取り込むことができる点、リポソームはそれらの内部に包まれた薬剤を代謝及び分解から保護できる点である (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 245)。リポソーム製剤の調製に際し考慮すべき重要な事柄は、脂質表面電荷、小胞サイズ、及びリポソームの水容量である。リポソームは、経口でもエアゾールでも局所適用でも投与されることができる。
【０１０８】
表面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）及びリポソームのような製剤において広い用途がある。天然及び合成両方の多くの異なるタイプの表面活性剤の特性を分類しかつ等級付けする最も普通のやり方は、親水体／親油体バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水基（“ヘッド”としても知られる）の性質が、製剤に使用される異なる表面活性剤をカテゴリーに分類する最も有用な手段を提供する (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285)。
【０１０９】
表面活性剤分子がイオン化されないなら、それは非イオン性表面活性剤として分類される。非イオン性表面活性剤は医薬品及び化粧品に広い用途があり、広い範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、ＨＬＢ値はそれらの構造に依存して２〜約１８の範囲である。非イオン性表面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルのような非イオン性エステルが含まれる。非イオン性アルカノールアミド、及び脂肪アルコールエトキシル化物、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーのような非イオン性アルカノールエーテルもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン表面活性剤が、非イオン性表面活性剤クラスの最も典型的なメンバーである。
【０１１０】
表面活性剤分子が水中に溶解又は分散したときに負電荷を持つなら、その表面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性表面活性剤には、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミドのようなカルボキシレート；硫酸アルキル及びエトキシル化硫酸アルキルのような硫酸のエステル；アルキルベンゼンスルホン酸、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシル及びスルホスクシネートのようなスルホネート、及びホスフェートが含まれる。アニオン性表面活性剤クラスの最も重要なメンバーは硫酸アルキル及び石鹸である。
【０１１１】
表面活性分子が水中に溶解又は分散したときに陽電荷を持つなら、その表面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性表面活性剤には、４級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが含まれる。４級アンモニウム塩は、このクラスの最も多く使用されるメンバーである。
【０１１２】
表面活性分子が陽又は負電荷のいずれかをも持つ能力を有するなら、その表面活性剤は両性として分類される。両性表面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドが含まれる。
【０１１３】
薬剤製品、製剤及びエマルジョンでの表面活性剤の使用は纏められている (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Vol. 1, Lieberman, Rieger and Banker, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285)。
【０１１４】
本発明の好ましい態様では、１又はそれを越える核酸が経口送逹を介して投与される。
経口投与のための組成物には、散剤又は顆粒剤、水若しくは非水系媒質中の懸濁液剤又は溶液剤、カプセル剤、サシェ剤、トローチ剤、錠剤又はＳＥＣ（軟弾性カプセル剤若しくは“カプレット”）が含まれる。増粘剤、フレーバー付与剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、担体物質又は結合剤もそのような製剤に望ましくは添加されることができる。錠剤は、任意に１又はそれを越える補助成分とともに圧縮又は成形によって作られることができる。
【０１１５】
圧縮された錠剤は、適する機械で、粉末又は顆粒のような自由に流動する形態の活性成分であって、結合剤（ＰＶＰ、又はトラガカント、アラビアゴム、カラジーナンのようなガム）、ラブリカント（例えば、ステアリン酸マグネシウムのようなステアレート）、グライダント（タルク、コロイド状二酸化ケイ素）、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤又は分散剤と混合されてもよい活性成分、を圧縮することにより調製されることができる。好ましい結合剤／崩壊剤には、EMDEX (デキストレート)、PRECIROL (トリグリセリド)、PEG、及び AVICEL (セルロース) が含まれる。成形された錠剤は、適する機械で、粉末化され湿った化合物と不活性液体希釈剤との混合物を成形することにより作られることができる。錠剤は、コートされても切込みが入れられても、そして活性成分の遅延又は制御された放出を提供できるように製剤されてもよい。
【０１１６】
消化管送逹のための製剤を製造する種々の方法が当該技術分野で周知である。一般的には、Nairn, Chapter 83; Block, Chapter 87; Rudnic et al., Chapter 89; Porter, Chapter 90; and Longer et al., Chapter 91 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990 を参照のこと。この発明の組成物は、不活性で無毒の薬学的に適する賦形剤又は溶剤を使用して、錠剤、コーテッド錠剤、ピル剤、顆粒剤、カプセル剤、エアゾール剤、シロップ剤、エマルジョン、懸濁液剤及び溶液剤のような通例の製剤に公知のやり方で変換されることができる。治療的に活性な化合物は、全混合物の約０．５〜約９５重量％の濃度で、即ち、記述される用量範囲を達成するのに十分である量で存在する。組成物は、適切な場合には、追加の薬学的に許容できる担体又は賦形剤を使用して慣用的なやり方で製剤されることができる。かくして、本組成物は、結合剤（例えば、予備ゼラチン化トウモロコシスターチ、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素カルシウム）；ラブリカント（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、スターチ又はスターチグリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような担体又は賦形剤と共に、慣用的な手段で調製されることができる。錠剤は、当該技術分野で周知の方法によってコートされてもよい。その製剤は、適切な場合には、フレーバー付与剤、着色剤、及び／又は甘味剤を含有することもできる。
【０１１７】
経口投与のために使用されるカプセル剤には、当該技術分野で周知である製剤が含まれ得る。更に、Digenis et al., 米国特許第 5,672,359号によって記載された制御放出特性を有する多区画ハードカプセル、及び Amidon et al., 米国特許第 5,674,530号により記載された多段階薬剤送逹系を有する水浸透性カプセル剤も、本発明の組成物を製剤するのに使用されることができる。
【０１１８】
医薬組成物の製剤及びその後のそれらの投与は、当該技術分野の熟練の範囲内であると考えられる。本発明に関する具体的なコメントが以下に示される。
一般に、治療用途のためには、疾患又は障害を有するか又はそれに罹り易い患者（即ち、ヒトを含む動物）が、本発明に従って、薬学的に許容できる担体中の１又はそれを越える薬剤、好ましくはオリゴヌクレオチドを含む核酸は、その患者の年齢及び処置される疾患又は障害の重さに依存して体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの用量で投与される。更に、その処方は、特定の疾患又は障害の性質、その重さ及び患者の全般的状態に依存して変動する期間にわたって続けることができ、そして毎日１回から２０年毎に１回まで及ぶことができる。本発明の文脈では、“処方”という用語は、治療、一時緩和及び予防目的を包含するよう意図される。処置後、患者は、彼／彼女の状態の変化及び障害又は疾患状態の症状の軽癒について追跡される。薬剤の用量は、患者がその時点の用量レベルに有意に応答しないなら増加され、障害又は疾患状態の症状の軽癒が観察されるか、又は障害又は疾患状態が無くなるなら減少されることができる。
【０１１９】
用量は、数日から数カ月まで続く処置の途中での又は治癒が得られるか又は疾患状態の減衰が達成されるまでの処置されるべき疾患状態の重さ及び応答性に依存する。最適な用量スケジュールは、患者の体内に蓄積した薬剤の測定から計算されることができる。当業者は、容易に最適用量、投与方法及び反復率を決めることができる。最適用量は、個々の薬剤の相対的強度に依存して変動するので、一般に、in vitro 又は in vivo 動物モデルで効果的であることが見出されたＥＣ50値に基づいて見積もられることができる。一般に、用量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇであり、そして、毎日、毎週、毎月若しくは毎年１回若しくはそれを越える回数、又は２〜２０年毎に１回投与されることができる。最適な用量スケジュールが、投与される治療有効量の薬剤を特定の投与様式を介して送達するために使用される。
【０１２０】
本発明の目的のため“治療有効量”という用語は、望ましくない副作用（毒性、刺激又はアレルギー反応）なしに意図される目的を達成するのに有効である薬剤含有製剤の量のことを意味する。個々の必要量は変動し得るとはいえ、有効量の製剤の最適範囲は当業者によって容易に決められることができる。ヒトの用量は、動物での検討から推測することができる (Katocs et al., Chapter 27 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990)。一般に、当業者によって調節され得る有効量の製剤を提供するのに要求される用量は、受容者の年齢、健康、身体的状態、体重、疾患若しくは障害のタイプ及び程度、処置の頻度、併行する療法（もしあれば）、及び望まれる効果の性質と範囲に依存して変動する (Nies et al., Chapter 3 In: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, NY, 1996)。
【０１２１】
うまく処置できた後、その患者にメンテナンス療法を受けさせて疾患状態の再発を予防することが望まれ、その際、核酸が体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲のメンテナンス用量で毎日１回又はそれを越える回数から２０年毎に１回まで投与される。例えば、自己免疫性又は炎症性状態であることが分かっているか又はそれに罹り易い個体の場合には、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の予防的用量を毎日１回又はそれを越える回数から２０年毎に１回まで投与することによって、予防効果が達成され得る。同じように、個体は、何らかの医療処置の結果として起こることが考えられる炎症性状態、例えば、個体内への細胞、組織又は臓器の移植からもたらされる移植片対宿主病、に罹り難くされ得る。
【０１２２】
経口投与のための製剤には、核酸の滅菌及び非滅菌水溶液剤、アルコールのような普通の溶剤中の非水溶液剤、又は液体若しくは固体油ベース中の溶液剤が含まれる。溶液剤は、緩衝剤、希釈剤及び他の適する添加剤を含有することもできる。水性懸濁液剤は、その懸濁液剤の粘度を増加させる、例えば、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む物質を含有することができる。懸濁液剤は安定剤も含有することができる。
【０１２３】
単位剤形中で好都合に存在できる医薬製剤は、医薬産業界において周知の慣用的な技術に従って調製されることができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体又は賦形剤に混合する工程を包含する。一般に、製剤は、活性成分を液体担体又は微粉砕された固体担体又はその両方に均一かつ親密に混合し、次いで、必要なら、その生成物に形状を与えることによって調製される。
【０１２４】
好ましい態様では、本発明は、生物活性を有するオリゴヌクレオチドのような核酸の動物への経口投与に向けられている。“生物活性を有する”により、核酸が、１又はそれを越える遺伝子の絶対的機能（リボザイム活性のようなもの）に反映されるか又はそのような遺伝子によってコードされるタンパク質の発現によって反映されるところの動物内でのその遺伝子の発現を、モジュレートするように機能することが意味される。本発明の文脈では、“モジュレートする”とは、遺伝子の発現の増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを行うことを意味する。そのようなモジュレーションは、例えば、転写阻止；ＲＮＡプロセシング（キャッピング、ポリアデニル化及びスプライシング）及び輸送への作用；標的核酸の細胞性分解の促進又は減退；及び翻訳阻止を含むがこれらに限定されない当該技術分野で知られた種々のメカニズムにより、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって達成されることができる (Crooke et al., Exp. Opin. Ther. Patents, 1996, 6, 1)。
【０１２５】
ヒトより他の動物では、本発明の組成物及び方法は、その動物内の１又はそれを越える遺伝子の機能を研究するために使用されることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、神経死におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパルテートレセプターの役割を研究するためにラットに全身投与され、タンパク質キナーゼＣ−ａの生物学的役割を研究するためにマウスに投与され、そして不安症における神経ペプチドＹ１レセプターの役割を検査するためにラットに投与されてきた (それぞれ、Wahlestedt et al., Nature, 1993, 363, 260; Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91, 11762; and Wahlestedt et al., Science, 1993, 259, 528)。関連するタンパク質の複雑なファミリーが研究される場合、“アンチセンスノックアウト”（即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全身投与による遺伝子の阻害）は、そのファミリーの特定のメンバーを検査するための最も精密な手段に該当する (一般的には、Albert et al., Trends Pharmacol. Sci., 1994, 15, 250 を参照のこと)。
【０１２６】
述べてきたように、本発明の組成物及び方法は、治療的に有用である、即ち、１又はそれを越える核酸で全体的に又は部分的に処置可能である疾患又は障害を有するか若しくはそれに罹っているか又は罹りつつあるヒトを含む動物に治療的、一時緩和的又は予防的安堵を提供するのに有用である。“疾患又は障害”という用語は、（１）あらゆる生物又はその一部の正常な生理学的機能を害する異常な状態、特に感染、先天的弱体性、環境的ストレスの結果としての状態を包含し；（２）妊娠自体を除くが妊娠に関連する自己免疫疾患及び他の疾患を包含し；そして（３）癌及び腫瘍を包含する。“有するか若しくはそれに罹っているか又は罹りつつある”という用語は、対象動物が本明細書で定義した特定の疾患又は障害を発症していることが確認されているか、又はその動物の大方の集団と比較してその疾患又は障害を発症する高いリスクがあることを示す。例えば、ある対象動物が、特定の疾患又は障害をしばしば起こすという個人的及び／又は家族的既往歴を有する場合である。別の例として、ある対象動物が、当該技術分野で知られた技術に従う遺伝子スクリーニングによって確認されたそのような易罹患性を有している場合である（例えば、U.S. Congress, Office of Technology Assessment, Chapter 5 In: Genetic Monitoring and Screening in the Workplace, OTA-BA-455, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C., 1990, pages 75-99 を参照のこと）。“１又はそれを越える核酸で全体的に又は部分的に処置可能である疾患又は障害”という用語は、（１）その管理、モジュレーション又は処置、及び／又は（２）それからの治療的、一時緩和的及び／又は予防的安堵が、より多くの核酸の投与を介して提供され得るところの、本明細書で定義された疾患又は障害のことを言う。好ましい態様では、そのような疾患又は障害は、アンチセンスオリゴヌクレオチドで全体的に又は部分的に処置可能である。
【実施例】
【０１２７】
次の実施例は、本発明を例示するものであって、限定を意図したものではない。当業者は、日常的実験を通して本明細書に記載された具体的な物質及び操作への多数の均等物を認識又は確認することができる。そのような均等物は、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１２８】
実施例１：オリゴヌクレオチドの調製
Ａ．一般的合成技術：  オリゴヌクレオチドが、ヨウ素を使用して酸化しながら、標準的なホスホロアミダイト化学を使用して自動ＤＮＡ合成装置で合成された。β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは、Applied Biosystems (Foster City, CA) から購入された。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、標準的な酸化びんが、ホスファイト連結の段階的チオ化のために、アセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液により置き換えられた。
【０１２９】
２’−Ｏ−メチル−（２’−メトキシ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、標準的なホスホロアミダイトを２’−Ｏ−メチル  β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト (Chemgenes, Needham, MA) に置き換え、そしてテトラゾールと塩基のパルス送り後の待ちサイクルを３６０秒に増加した上記の操作に従う。
【０１３０】
同じく、２’−Ｏ−プロピル−（即ち、２’−プロポキシ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、この操作に僅かに手を加えることにより、本質的に、１９９５年２月３日に出願され本願と同じ譲受人に譲渡された、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第 08/383,666号に開示された操作に従って調製される。
【０１３１】
本発明の２’−フルオロ−ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、５’−ジメトキシトリチル−３’−ホスホロアミダイトを使用して合成され、そして、いずれも本願と同じ譲受人に譲渡され参照により本明細書に組み込まれる１９９５年２月３日に出願された米国特許出願第 08/383,666号及び１９９６年１０月８日に発行された米国特許第 5,459,255号に開示された通りに調製される。この２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト化学及び僅かに手を加えた標準的なＤＮＡ合成プロトコルを使用して調製される（即ち、脱保護がメタノール性アンモニアを使用して室温で行われた）。
【０１３２】
ＰＮＡアンチセンス類似体が、本質的に、いずれも（１）１９９６年７月２３日に発行され（２）本願と同じ譲受人に譲渡され、そして（３）参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,539,082号及び 5,539,083号に記載された通りに調製される。
【０１３３】
２，６−ジアミノプリンを含んでなるオリゴヌクレオチドが、１９９６年４月９日に発行され、本願と同じ譲受人に譲渡され、そして参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,506,351号に記載された化合物、及び Gaffney et al. (Tetrahedron, 1984, 40, 3)、Chollet et al., (Nucl. Acids Res., 1988, 16, 305) 及び Prosnyak et al. (Genomics, 1994, 21, 490) により記載された材料及び方法を使用して調製される。２，６−ジアミノプリンを含んでなるオリゴヌクレオチドも、酵素的手段 (Bailly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996, 93, 13623) によって調製できる。
【０１３４】
本発明の２’−メトキシエトキシオリゴヌクレオチドが、本質的に Martin et al. (Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486) の方法に従って合成される。
Ｂ．オリゴヌクレオチド精製：  制御有孔ガラス（ＣＰＧ）カラム(Applied Biosystems) からの切り離し及び濃アンモニア水中での５５℃で１８時間の脱ブロックの後、そのオリゴヌクレオチドが、２．５容量のエタノールで０．５Ｍ  ＮａＣｌから２回析出させた後、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による更なる精製により精製された。分析的ゲル電気泳動が、２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素及び４５ｍＭトリスホウ酸緩衝液（ｐＨ７）で行われた。
【０１３５】
Ｃ．オリゴヌクレオチド標識：  アンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書に記載された in vivo 薬物動力学的研究の途中で採取されたサンプル中でのその存在を検出し及び／又はその品質を測定するために標識された。トリチウム交換による放射性標識は、そのような in vivo 研究のためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを標識する１つの好ましい手段であるが、種々の放射性的、化学的又は酵素的標識をオリゴヌクレオチド及び他の核酸に取り込むために種々の他の手段が利用可能である。
【０１３６】
１．トリチウム交換：  本質的に、Graham et al. (Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3737) の操作が、トリチウム交換によりオリゴヌクレオチドを標識するために使用された。具体的には、約２４ｍｇのオリゴヌクレオチドが、２００μＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、４００μＬの０．１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）及び２００μＬの脱イオン水の混合液中に溶解された。得られた混合液のｐＨが測定され、０．０９５ＮＮａＯＨを使用してｐＨ７．８に調節された。その混合液は、１．２５ｍＬのガスケット付きポリプロピレンバイヤル中で一晩凍結乾燥された。そのオリゴヌクレオチドは、フリーラジカルスカベンジャーとして働く８．２５μＬのβ−メルカプトエタノール (Graham et al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3737) 及び４００μＬのトリチエート化Ｈ2Ｏ（５Ｃｉ／ｇ）中に溶解された。その試験管に蓋がされ、９０℃の油浴中に攪拌しないで９時間入れられ、そしてその試験管の縁の内側からあらゆる濃縮物も除去するために短時間遠心分離された。（任意の分析的段階として、２つの１０μＬアリコート（１つはＨＰＬＣ分析用で１つはＰＡＧＥ分析用）が反応試験管から取り出され、各々のアリコートが別の４９０μＬの５０μＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を含有する１．５ｍＬの標準的マイクロ分離試験管に加えられた。）次いで、そのオリゴヌクレオチド混合液は液体窒素中で凍結され、そして凍結乾燥が高真空下で典型的に３時間行われる凍結乾燥装置に移される。次いで、    ｍＬの２回蒸留Ｈ2Ｏ中に再懸濁され、室温で１時間交換させた。インキュベーション後、その混合液は再度急速凍結されて一晩凍結乾燥された。（任意の分析段階として、約１ｍｇのオリゴヌクレオチド物質がＨＰＬＣ分析のために取り出される。）更に各々１ｍＬの２回蒸留Ｈ2Ｏで３回の凍結乾燥が行われ、あらゆる残存未取り込みトリチウムが確実に除去された。最終の再懸濁オリゴヌクレオチド溶液が清浄なポリプロピレンバイヤルに移されてアッセイされる。そのトリチウム標識オリゴヌクレオチドは約−７０℃で保存される。
【０１３７】
２．核酸を標識する他の手段：  当該技術分野で周知のように、オリゴヌクレオチド及び他の核酸を標識するのに及び標識された核酸から未取り込み標識を分離するのに種々の手段が利用可能である。例えば、二本鎖核酸は、ニックトランスレーション及びプライマー伸長によって放射性標識されることができ、そしてオリゴヌクレオチドを含む種々の核酸は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼのような酵素及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの使用によって末端が放射性標識されることができる（例えば、一般的には、Chapter 3 In: Short Protocols in Molecular Biology, 2d Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, New York, NY, pages 3-11 to 3-38; 及び Chapter 10 In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Sambrook et al., eds., pages 10.1 to 10.70 を参照のこと)。当該技術分野では、オリゴヌクレオチド及び他の核酸を、例えば、酵素、蛍光性基等のような非放射性標識で標識することも周知である (例えば、Beck, Methods in Enzymology, 1992, 216, 143; and Ruth, Chapter 6 In: Protocols for Oligonucleotide Conjugates (Methods in Molecular Biology, Volume 26) Agrawal, S., ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1994, pages 167-185 を参照のこと)。
【０１３８】
実施例２：オリゴヌクレオチド標的及び配列
本発明は、オリゴヌクレオチド又は核酸及び１又はそれを越える粘膜浸透増進剤を含んでなる組成物及び製剤、及びそのような製剤を使用する方法に向けられている。１つの態様では、そのような製剤は、ヒトより他の動物中の１又はそれを越える遺伝子の機能を研究するため使用される。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドは、ヒトを含む動物への治療的送逹のために意図された医薬組成物の中に配合される。オリゴヌクレオチドは、望ましければ本発明の組成物及び方法に従って経口投与されることができるところの局所又は全身治療的送逹のために意図される。そのような望まれるオリゴヌクレオチドには、細胞接着タンパク質 (例えば、ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1) の発現、細胞増殖 (例えば、c-myb, vEGF, c-raf キナーゼ) の速度をモジュレートするもの、又は雑多な障害（例えば、アルツハイマー病、β−タラセミア）及び真核病原菌（例えば、マラリア）、ＨＩＶを含むレトロウイルス及び非レトロウイルス（例えば、エプスタイン−バール、ＣＭＶ）からもたらされる疾患に対し治療活性を有するものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
本発明の組成物に配合されることができる追加のオリゴヌクレオチドには、例えば、リボザイム、アプタマー、分子オトリ、外部ガイド配列（External Guide Sequences；ＥＧＳ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
種々の脂肪酸、それらの塩及びそれらの誘導体が、浸透増進剤として働く。これらには、例えば、オレイン酸、即ち、シス−９−オクタデカン酸（又は薬学的に許容できるその塩、例えば、オレイン酸ナトリウム又はオレイン酸カリウム）；カプリル酸、即ち、ｎ−オクタン酸（カプリレート）；カプリン酸、即ち、ｎ−デカン酸（カプレート）；ラウリン酸（ラウレート）；アシルカルニチン；アシルコリン；並びにモノ及びジグリセリドが含まれる (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92)。種々の天然胆汁酸及びそれらの合成誘導体が浸透増進剤として働く。胆汁酸の生理学的役割には、脂質及び脂肪可溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる (Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Goodman et al., eds., McGraw-Hill, New York, NY, 1996, pages 934-935)。胆汁酸塩誘導化浸透増進剤には、例えば、コール酸、コラリン酸又は３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸（又は薬学的に許容できるそのナトリウム塩）；デオキシコール酸、デスデオキシコール酸、５ｂ−コラン−２４−酸−３ａ，１２ａ−ジオール、７−デオキシコール酸又は３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸（ナトリウム・デオキシコール酸）；グリココール酸（Ｎ−〔３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル〕グリシン又は３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸  Ｎ−〔カルボキシメチル〕アミド又はグリココール酸ナトリウム）；グリコデオキシコール酸（５ｂ−コラン−２４−酸  Ｎ−〔カルボキシメチル〕アミド−３ａ，１２ａ−ジオール）、３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸  Ｎ−〔カルボキシメチル〕アミド、Ｎ−〔３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル〕グリシン又はグリコデスオキシコール酸（グリコデスオキシコール酸ナトリウム）；タウロコール酸、（５ｂ−コラン−２４−酸  Ｎ−〔２−スルホエチル〕アミド−３ａ，７ａ，１２ａ−トリオール）、３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸  Ｎ−〔２−スルホエチル〕アミド又は２−〔（３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−２４−オキソ−５ｂ−コラン−２４−イル）アミノ〕エタンスルホン酸（タウロコール酸ナトリウム）；タウロデオキシコール酸、（３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン−２−酸  Ｎ〔２−スルホエチル〕アミド、又は２−〔（３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−２４−オキソ−５ｂ−コラン−２４−イル）アミノ〕エタンスルホン酸、又はタウロデオキシコール酸ナトリウム）；ケノデオキシコール酸（ケノジオール、ケノデスオキシコール酸、５ｂ−コラン酸−３ａ，７ａ−ジオール、３ａ，７ａ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン酸、又はケノデオキシコール酸ナトリウム、又はＣＤＣＡ）；ウルソデオキシコール酸、（５ｂ−コラン−２４−酸−３ａ，７ａ−ジオール、７ｂ−ヒドロキシリトコール酸又は３ａ，７ａ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸、又はＵＤＣＡ）；ナトリウム・タウロジヒドロフシデート（ＳＴＤＨＦ）；及びナトリウム・グリコジヒドロフシデートが含まれる (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, pages 782-783)。
【０１４１】
未置換及び置換ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、ヨウ素を使用して酸化しながら、標準的なホスホロアミダイト化学を使用して自動ＤＮＡ合成装置で交互的に合成される (Applied Biosystems model 380B)。
【０１４２】
ホスホロチオエートは、標準的な酸化びんが、ホスファイト連結の段階的チオ化のために、アセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液により置き換えられたことを除いて、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの通りに合成される。チオ化の待ち段階は６８秒に増やされ、その後にキャッピングが行われた。ＣＰＧカラムからの切り離しと濃アンモニア水中での５５℃（１８時間）での脱ブロックを行った後、０．５ＭＮａＣｌ溶液から２．５容量のエタノールで２回析出させることによりオリゴヌクレオチドが精製された。
【０１４３】
ホスフィネートオリゴヌクレオチドが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許 5,508,270号に記載の通りに調製される。
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許 4,469,863号に記載の通りに調製される。
【０１４４】
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許 5,610,289号又は 5,625,050号に記載の通りに調製される。
ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許 5,256,775号 又は 5,366,878号に記載の通りに調製される。
アルキルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、PCT/US94/00902 及び PCT/US93/06976 (それぞれ、WO 94/17093 及び WO 94/02499 として公開)に記載の通りの調製される。
【０１４５】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミダイトオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許 5,476,925号に記載の通りに調製される。
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,023,243号に記載の通りに調製される。
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,130,302号及び 5,177,198号に記載の通りに調製される。
【０１４６】
ＭＭＩ連結オリゴヌクレオチドとしても特定されるメチレンメチルイミノ連結オリゴヌクレオチド、ＭＤＨ連結オリゴヌクレオチドとしても特定されるメチレンジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオチド、及びアミド−３−連結オリゴヌクレオチドとしても特定されるメチレンカルボニルアミノ連結オリゴヌクレオチド、及びアミド−４−連結オリゴヌクレオチドとしても特定されるメチレンアミノカルボニル連結オリゴヌクレオチド、並びに、例えば、交互ＭＭＩ及びＰＯ又はＰＳ連結を有する混合主鎖化合物が、全てが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,378,825；5,386,023；5,489,677；5,602,240号及び 5,610,289号に記載の通りの調製される。
【０１４７】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール連結オリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,264,562号及び 5,264,564号に記載の通りに調製される。
エチレンオキシド連結オリゴヌクレオチドは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,223,618号に記載の通りに合成される。
【０１４８】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5 で言及される種々の操作のいずれかに従って調製される。それらは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,539,082；5,700,922号 及び 5,719,262号に従っても調製できる。
【０１４９】
実施例３：生体接着性ビーズの調製
アンチセンスオリゴヌクレオチド及び生体接着性物質を含んでなるビーズ（粘着性ビーズ）が次のように配合された：オリゴヌクレオチド（５５重量％）が、標準的熱溶融操作を用いてポリエチレングリコール３５００（ＰＥＧ３５００，１５重量％）と混合されて、Ｏ−Ｐ顆粒が形成され、篩に通されて１２５〜４００μｍのサイズ範囲を有する粒子が集められた。そのＯＰ顆粒画分は、生体接着剤であるカーボポール (Carbopol) 934 NF (BF Goodrich, Cleveland, OH)（１５重量％）及び Methocel E4M (Dow Chemical, Midland, OH)（１５重量％）と、ラブリカントであるステアリン酸マグネシウム (Mallinckrodt) 及び／又はコロイド状二酸化ケイ素 (Cab-O-Sil, Cabot Corporation) と一緒に又はそれら無しに混合されてから、スラッグに圧縮された。それらスラッグは顆粒に潰され、篩に通されて２００〜６００μｍのサイズ範囲を有する粒子が集めら、粘着性ビーズができた。これらビーズは、それらの表面上に生体接着性物質が存在するために粘着性であった。ラブリカントは、顆粒が一緒に粘着するのを阻止するために幾つかのサンプルに加えられた。
【０１５０】
次の配合物が調製された（１２５を除いて全て２ロット）：
１２９Ａ−３０％生体接着性ポリマー，スラッグ中に２％［ステアリン酸マグネシウム／Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（４：１）］
１２９Ｂ−３０％生体接着性ポリマー，ラブリカント無し
１２９Ｃ−３０％生体接着性ポリマー，スラッグ中に２％Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ
１２９Ｄ−３０％生体接着性ポリマー，最終ビーズ上にコートされた２％［ステアリン酸マグネシウム／Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（４：１）］
１２５−２５％生体接着性ポリマー，最終ビーズ上にコートされた３％ステアリン酸マグネシウム
【０１５１】
実施例４：in vitro 溶解性検討
実施例３に記載の通りに作られた粘着性ビーズ（１０〜２０ｍｇ）が、１５ｍＬビーカー中に又は Franz セルの底の部分に入れられてから、５ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）が加えられた。この溶液は２秒間ゆっくり攪拌され、サンプル採取前に１５秒間攪拌された。溶液（１００μＬ）が３、６、１０、１５、２０、２５及び３０分で採取され、オリゴヌクレオチドの存在について、Sax ＨＰＬＣにより分析された。２重にサンプルが試験された。結果（図１）は、全てのサンプルが３０分までに１００％放出が観察されるというオリゴヌクレオチドの有意な放出性が示されたことを示している。
【０１５２】
この溶解性検討の終わりに、この溶液を更に３０分間攪拌してビーズが完全に溶解したことを確認した。その溶液はオリゴヌクレオチド含量について Sax ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーにより分析された。粘着性ビーズ中のオリゴヌクレオチドの重量％は次の通りであった：１２９Ａ−４０．４３及び３９．６８；１２９Ｂ−４２．９９及び３７．７９；１２９Ｃ−４３．３２及び４５．６７；１２９Ｄ−４２．７７及び４２．８２；及び１２５−４５．４１。
【０１５３】
実施例５：粘着性ビーズの調製
３ロットのビーズ：Ｑ０７４２−８８（０％生体接着性ポリマー）、Ｑ０７４２−９０（５０％生体接着性ポリマー）及びＱ０７４２−９１（２５％生体接着性ポリマー）が次のように調製された：
Ｑ０７４２−８８
Ａ−１  ９．２５ｇのオリゴヌクレオチド、０．７５ｇの Providone USP K-29/32 (ISP Technologies, Inc.) 及び３．２５ｍＬの水が混合された。
Ａ−２  得られた混合液はＮｏ．１２の篩に通され、そして顆粒が風乾された。
Ａ−３  それら顆粒がＮｏ．２０の篩に通された。
Ａ−４  ２５０〜８５０μｍの直径を有する顆粒が集められた。
Ｑ０７４２−９０
Ｂ−１  Ａ−２の顆粒がＮｏ．１２０の篩に通され、そして１２４〜４２５μｍの顆粒が集められた。
Ｂ−２  次の成分が一緒に混合された：Ｂ−１からの２ｇの顆粒、１ｇのカーボポール 934 NF、１ｇの Methocel E。
Ｂ−３  その混合物が１ｃｍ直径のスラッグに圧縮された。
Ｂ−４  そのスラッグが顆粒に潰された。
Ｂ−５  顆粒は篩にかけられて２５０〜８５０μｍのものが集められた。
Ｑ０７４２−９１
Ｃ−１  工程Ｂ−２の混合物の成分が、Ｂ−１からの３ｇの顆粒、０．５ｇのカーボポール 934 NF、０．５ｇの Methocel E に変えられたことを除いて、工程Ｂ−１からＢ−５までが繰り返された。
【０１５４】
In vitro 溶解性検討が実施例４に記載の通りに(二重で)行われた。結果を図２に示す。最大量の生体接着剤（５０％）を有するビーズが、３、６、１０及び１５分で最大量のオリゴヌクレオチドを放出した。２０分までに、放出は３ロットのビーズについてほぼ同じになった。これは、生体接着剤が溶液へのオリゴヌクレオチドの放出を遅らせることを示している。
【０１５５】
実施例６：Ex vivo 灌流検討
小腸のセグメント（約２５ｃｍ）が一晩絶食したラットから採取され、リン酸緩衝液で濯がれた。その小腸は縦に切断されて氷冷リン酸緩衝液中に漬けられた。その小腸はその管腔側を上向きにしてステンレス支持体上に伸ばされた。約１０ｍｇの試験ビーズがその小腸の上（上方端）に置かれ、ビーズが水和してから３０秒後に灌流検討を始めた。灌流溶液はｐＨ７．０のリン酸緩衝液であった。流速は、シリンジポンプによって１ｍＬ／分に制御された。溶出液（１分／試験管）が小腸セグメントの他端から採取され、サンプルがＨＰＬＣ Sax カラムクロマトグラフィーによって分析された。
【０１５６】
結果（図３）は、５０％の生体接着剤を含む顆粒から最も多くのオリゴヌクレオチドが急速に放出されたことを示す。対照的に、２５％の生体接着剤を含む顆粒からは、より早期の画分においてより少ないオリゴヌクレオチドが放出されたに過ぎなかった。このことは、生体接着剤が、顆粒と小腸壁との相互作用を長引かせることを示唆し、そして、オリゴヌクレオチドが小腸の管腔を通って輸送されることを示している。かくして、これら生体接着性薬剤は、浸透増進剤と一緒に提供されたときには、小腸の透過可能になった部分とのより長い相互作用に起因して、有意により多くの吸収を示す。
【０１５７】
実施例７：異なるタイプの生体接着性ポリマーの in vitro 生体接着試験
各々が約５〜６ｍｇ重量の２ｍｍの錠剤が、１回パンチ錠剤プレス機用の２ｍｍツーリングキットで手で１回パンチすることによって調製された。
【０１５８】
生体接着試験：（Int. J. Pharm. 134: 173-181, 1996 に記載されたアッセイに手を加えたもの）：簡単に説明すると、１％のムチンを含有する寒天−リン酸緩衝液ゲルでコートされた２０×２０ｃｍのガラスプレート上に数サンプルが置かれ、２０μＬのリン酸緩衝液で浸された。そのプレートは、水の入ったガラスＴＬＣチャンバー（１００％相対湿度で一定）内に水平に入れられた。各々のサンプルは、５００μＬのリン酸緩衝液（１０×５０μＬ）で濯がれて、追い出し率が測定された。
【０１５９】
２．５％のカーボポール（登録商標）（ポリアクリレート）を含有する次の配合物が２ｍｍ錠剤に作られ、そして上で概略を示した生体接着試験を使用して試験された。
【０１６０】
【表２】
2005531487.tif 000003
【０１６１】
次の追い出し率が記録された。
【０１６２】
【表３】
2005531487.tif 000004
【０１６３】
カーボポールの生体接着性の度合いは、次の通りである：
カーボポール 980> カーボポール 940> カーボポール 934P = カーボポール 974P。
１％の Gantrez（登録商標）（ポリ無水物，メチルビニルエーテルと無水マレイン酸とのコポリマーから構成される）を含有する次の配合物が２ｍｍ錠剤に作られ、そして上で概略を示した生体接着試験を使用して試験された。
【０１６４】
【表４】
2005531487.tif 000005
【０１６５】
次の追い出し率が記録された。
【０１６６】
【表５】
2005531487.tif 000006
【０１６７】
Gantrez AN シリーズの生体接着性の度合いは、次の通りであった：
Gantrez AN 169> Gantrez AN 139 ≫ Gantrez AN 119。
Gantrez MS-95、カーボポール 971P 及び Noveon AA-1 も試験され、その試験条件では無視し得る生体接着性を示したに過ぎなかった。
カーボポールが一次性のゲルを形成したのに反し、Gantrez 配合物はムチンとより強く相互作用した。
【０１６８】
実施例８：レオロジーによって測定したときの２種の異なるクラスの生体接着剤の生体接着性
レオロジー測定 (Bohlin rheometer) は、異なる濃度の生体接着剤を含有する１％ムチン緩衝化溶液（ｐＨ＝７）で行われた。微粉砕した粉末が１％ムチン溶液に加えられ、３７℃に設定された水浴中で２０分間混合された。次に、それらサンプルはレオメーターに移され、そして粘度が測定された。それら測定値は、ムチンに加えられた同濃度のＮａＣｌと比較された。
【０１６９】
結果が以下の表５に示される。
【０１７０】
【表６】
2005531487.tif 000007
【０１７１】
【表７】
2005531487.tif 000008
【０１７２】
【表８】
2005531487.tif 000009
【０１７３】
これら結果に基づけば、Gantrez AN シリーズの生体接着性は、胃腸管内の保護バリヤの所為で起こるムチンの自然の分子間及び分子内相互作用を破壊するであろう、ポリ無水物とムチンとの直接の相互作用に起因している。このポリ無水物とムチンとの相互作用は、そのムチンへの“接着”を助ける（先の実施例で示した通り）だけでなく、それを“流動化”することさえでき、その流動化は、投与された医薬品のバイオアベイラビリティの向上を支援するようである。一方、カーボポールは、水素結合により及び拡散を少なくするところの濃いゲルを促進することにより、ムチンと相互作用すると考えられる。
【０１７４】
カプリン酸ナトリウムは、ムチンの塑性粘度の減少にも降伏値の減少にも効果があることを示した。これは、腸又は他の粘膜表面における医薬品の透過を増進するのに決定的であるところのムチン保護層の流動化を支援する浸透増進剤としてのカプリン酸ナトリウムの作用を示すものである。
【０１７５】
当業者は、本発明の好ましい態様におびただしい変更及び修飾を行え、そのような変更及び修飾が本発明の精神から逸脱することなく行えることを理解するであろう。従って、添付の特許請求の範囲がそのような均等物を全て本発明の真の精神及び範囲内に入るものとして覆うことが意図される。
【０１７６】
この明細書に挙げられ又は言及された各々の特許、特許出願、印刷された公表物、及び他の公表された書類が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、生体接着剤を含んでなる顆粒からのオリゴヌクレオチドの経時放出を示すグラフである。１２９Ａ＝３０％生体接着性ポリマー，スラッグ中に２％［ステアリン酸Ｍｇ／Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（４：１）］；１２９Ｂ＝３０％生体接着性ポリマー，ラブリカントなし；１２９Ｃ＝３０％生体接着性ポリマー，最終ビーズ上にコートされた２％［ステアリン酸Ｍｇ／Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（４：１）］；１２５＝２５％生体接着性ポリマー，最終ビーズ上にコートされた３％ステアリン酸Ｍｇ。
【図２】図２は、０％、２５％又は５０％生体接着剤を含んでなる顆粒からのオリゴヌクレオチドの経時放出を示すグラフである。
【図３】図３は、２５％又は５０％生体接着剤を含んでなる顆粒からの、灌流ラット腸管セグメントを介してのオリゴヌクレオチドの経時放出を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
2005531487.tif 000013