(57)【要約】本発明は、一般式(Ｉ)：【化１】2005525327.tif 000010[式中、Ｒ１は所望により置換されているベンゾチアゾリル、ピリミジン−４−イル、イミダゾール−２−イル、オキサゾール−２−イル、またはチアゾール−２−イルであり；Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、またはＣ１−６アルコキシであり；そしてＲ３は、水素、またはＣ１−６アルキルである(詳細は明細書を参照のこと)]のＮ−置換インドール−３−酢酸誘導体、および呼吸器疾患、例えば喘息、鼻炎、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、およびプロスタグランジン Ｄ２(ＰＧＤ２)が介在する別の疾患の処置におけるその使用に関する。
2005525327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
喘息およびＣＯＰＤの処置における、式(Ｉ)：
式(Ｉ)：
2005525327.tif 000007
[式中、
Ｒ１は、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシによって、所望により置換されている１,３−ベンゾチアゾール、または式(Ａ)：
【化１】
2005525327.tif 000008
｛式中、Ｒ４とＲ５は、独立に、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フェノキシ(ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシによって、所望により置換されている)である｝の基、または式(Ｂ)：
【化２】
2005525327.tif 000009
｛式中、ＸおよびＹの一方が、窒素であり、他方が、窒素、酸素、または硫黄であり；
そしてＲ６は、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシによって所望により置換されているフェニルである｝の基であり；
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシであり；そして
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキルである]の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２】
Ｒ１が１,３−ベンゾチアゾールである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｒ１が式(Ａ)の基である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ｒ４とＲ５が、共にプロポキシ、クロロ、またはフェノキシである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ２がメチルまたはメトキシである、請求項１から４の何れか１項に記載の使用。
【請求項６】
式(Ｉ)の化合物が、
[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(２,６−ジイソプロポキシピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[５−メトキシ−２−メチル−１−(６−メチル−２−フェニルピリミジン−４−イル)−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(２,６−ジクロロピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(１,３−ベンゾチアゾール−２−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
およびそれらの薬学的に許容される塩から選択される、請求項１から５の何れか１項に記載の使用。
【請求項７】
治療に使用するための、請求項１から６の何れか１項に記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項８】
プロスタグランジン Ｄ２が介在する疾患を処置する方法であって、請求項１から６で定義した通りの式(Ｉ)の化合物 またはその薬学的に許容される塩を、治療上効果的な量で患者に投与することを含む方法。
【請求項９】
呼吸器疾患に罹患している もしくはそのリスクがある患者において、呼吸器疾患(例えば喘息、鼻炎)を処置する方法であって、請求項１から６で定義した通りの式(Ｉ)の化合物 またはその薬学的に許容される塩 もしくは溶媒和物を、治療上効果的な量で、該患者に投与することを含む方法。
【請求項１０】
式(Ｉ)の新規化合物。
【請求項１１】
[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(２,６−ジイソプロポキシピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[５−メトキシ−２−メチル−１−(６−メチル−２−フェニルピリミジン−４−イル)−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸,
[１−(２,６−ジクロロピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(１,３−ベンゾチアゾール−２−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
およびそれらの薬学的に許容される塩から選択される、式(Ｉ)の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のインドール酢酸の新規医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
EP A 1,170,594 は、プロスタグランジン Ｄ２、すなわちオーファン受容体 ＣＲＴＨ２のリガンドが介在する疾病状態の処置に有用な化合物の同定方法を開示している。GB 1,356,834 は、抗炎症、鎮痛、解熱活性を有すると言われる一連の化合物を開示している。驚くべきことに、GB 1,356,834 の範囲内の特定の化合物が、ＣＲＴＨ２受容体に活性であり、結果として、喘息やＣＯＰＤを含む 様々な呼吸器疾患の処置に有用である可能性があると予測されることが見出された。
【発明の開示】
【０００３】
第１の態様において、本発明は、従って、喘息およびＣＯＰＤの処置における、式(Ｉ)：
【化１】
2005525327.tif 000003
[式中、Ｒ１は、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシによって、所望により置換されている１,３−ベンゾチアゾール、または式(Ａ)：
【化２】
2005525327.tif 000004
｛式中、Ｒ４とＲ５は、独立に、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、フェノキシ(ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシによって所望により置換されている)である｝の基、または式(Ｂ)：
【化３】
2005525327.tif 000005
｛式中、ＸおよびＹの一方が、窒素であり、他方が、窒素、酸素、または硫黄であり；
そしてＲ６は、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシによって、所望により置換されているフェニルである｝の基であり；
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシであり；そして
Ｒ３は、水素、Ｃ１−６アルキルである]の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【０００４】
“アルキル”という用語は、単独であると別の基の一部であるとを問わず、直鎖および分枝鎖のアルキル基を含む。
好ましくは、Ｒ１は、１,３−ベンゾチアゾール、または式(Ａ)の基である。Ｒ４とＲ５は、同一または異なり得る。好ましくは、Ｒ４とＲ５は、共にプロポキシ、クロロまたはフェノキシである。
好ましくは、Ｒ２は、メチルまたはメトキシである。
【０００５】
本発明の望ましい化合物は、
[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(２,６−ジイソプロポキシピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[５−メトキシ−２−メチル−１−(６−メチル−２−フェニルピリミジン−４−イル)−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(２,６−ジクロロピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
[１−(１,３−ベンゾチアゾール−２−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸；
およびそれらの薬学的に許容される塩を含む。
【０００６】
特定の式(Ｉ)の化合物は、立体異性体の形態で存在し得る。本発明は、式(Ｉ)の化合物の全ての幾何異性体および光学異性体、およびラセミ体を含むそれらの混合物を含むと解される。互変異性体およびその混合物もまた、本発明の態様を形成する。
【０００７】
特定の式(Ｉ)の化合物は、新規であり、本発明のさらなる態様を形成する。
上記の式(Ｉ)の化合物は、その薬学的に許容される塩 もしくは溶媒和物、好ましくは塩基付加塩(例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、ベンザチン塩、クロロプロカイン塩、コリン塩、ジエタノールアミン塩、エタノールアミン塩、エチルジアミン塩、メグルミン塩、トロメタミン塩、またはプロカイン塩)、または酸付加塩(例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、またはｐ−トルエンスルホン酸塩に変換され得る。
【０００８】
式(Ｉ)の化合物は、医薬として、特にＣＲＴｈ２受容体活性のモジュレーターとして活性を有し、ヒトおよびヒト以外の動物において、ＰＧＤ２およびその代謝物の過剰生産もしくは制御されない生産によって増悪する もしくは引き起こされる状態／疾患の処置(治療もしくは予防)に使用され得る。
【０００９】
このような状態／疾患の例は、
(１)[呼吸管]
以下を含む閉塞性気道疾患：
喘息(例えば気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、および塵埃喘息、特に慢性または難治性喘息(例えば遅発性喘息 および気道過剰応答))；
慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)(例えば不可逆性ＣＯＰＤ)；
気管支炎(好酸球性気管支炎を含む)；
急性、アレルギー性、萎縮性鼻炎、または慢性鼻炎(例えば乾酪性鼻炎、肥厚性鼻炎、化膿性鼻炎、乾燥性鼻炎)、薬物性鼻炎、
膜性鼻炎(クループ性鼻炎、フィブリン性鼻炎、および偽膜性鼻炎)、腺病性鼻炎、
永年性アレルギー性鼻炎、季節性鼻炎(神経性鼻炎(枯草熱)および血管運動神経性鼻炎を含む)；
鼻のポリープ症；
サルコイドーシス；
農夫肺および関連疾患；
類繊維肺(fibroid lung)；
特発性間質性肺炎；
嚢胞性線維症；
鎮咳活性；炎症を伴う または医原性の慢性咳の処置；
【００１０】
(２)[骨および関節]
リウマチ性、感染性、自己免疫性、血清反応陰性脊椎関節症を含む関節炎(例えば強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、およびライター病)、
ベーチェット病、シェーグレン症候群、および全身性硬化症；
(３)[皮膚および眼]
乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、他の湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、
扁平苔癬、天疱瘡、水疱性天疱瘡、表皮水疱症、
蕁麻疹、皮膚脈管炎(angiodermas)、脈管炎、紅斑、
皮膚好酸球増加症、慢性皮膚潰瘍、ブドウ膜炎、円形脱毛症、
角膜潰瘍、および春季結膜炎;
【００１１】
(４)[胃腸管]
セリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、
クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸疾患；
腸から離れた部位に発現する食物関連アレルギー(例えば偏頭痛、鼻炎、および湿疹)；
(５)[中枢および末梢神経系]
神経変性疾患および痴呆疾患｛例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症および他の運動神経疾患、クロイツフェルト−ヤコブ病および他のプリオン疾患、ＨＩＶ脳症(ＡＩＤＳ性痴呆合併症)、ハンチントン病、前頭側頭骨性痴呆、レヴィー小体痴呆および血管性痴呆｝、
多発神経障害(例えばギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害、多巣性運動神経障害)、
神経叢障害、
ＣＮＳ脱髄(例えば多発性硬化症、急性汎発性／出血性脳脊髄炎、および亜急性硬化性全脳炎)、
神経筋疾患(例えば重症筋無力症およびランバート−イートン症候群)、
脊髄疾患(例えば熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群)、
新生物随伴症候群(例えば小脳変性および脳脊髄炎)、ＣＮＳ外傷、偏頭痛、および卒中；
【００１２】
(６)[その他の組織および全身性疾患]
アテローム硬化症、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、エリテマトーデス；
全身性エリテマトーデス；
橋本甲状腺炎、タイプＩ型糖尿病、ネフローゼ症候群、好酸球性筋膜炎、
過剰ＩｇＥ症候群、らい腫性らい、特発性血小板減少性紫斑；
手術後癒着、心臓、脳、末端肢における 敗血症および虚血／再灌流障害、
肝炎(アルコール性肝炎、脂肪性肝炎、および慢性ウイルス性肝炎)、
糸球体腎炎、腎機能障害、慢性腎不全、および他の器官の機能不全；
(７)[同種移植片拒絶反応]
例えば、腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、皮膚および角膜移植後の急性および慢性の拒絶反応；および
慢性移植片対宿主病；
(８)ＰＧＤ２もしくはその代謝物のレベル上昇を伴う疾患；
を含む。
【００１３】
従って、本発明は、治療に使用するための、上記で定義した通りの式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を提供する。
【００１４】
好ましくは、本発明の化合物は、ケモカイン受容体がＣＲＴｈ２受容体サブファミリーに属する疾患を処置するために使用される。
本発明の化合物で処置され得る特定の状態は、喘息、鼻炎、および ＰＧＤ２またはその代謝物のレベルが上昇する他の疾患である。本発明の化合物は、喘息を処置するために用いられることが望ましい。
【００１５】
式(Ｉ)の新規化合物は、本発明のさらなる態様を形成する。望ましい化合物は、上記で命名された化合物および本明細書中で例示された化合物である。
さらなる態様において、本発明は、治療に使用するための医薬の製造における、上記で定義した通りの式(Ｉ)の化合物 またはその薬学的に許容される塩 もしくは溶媒和物の使用を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、喘息や鼻炎を処置するために用いられる薬物(例えば吸入ステロイド、経口ステロイド、吸入β２−受容体アゴニスト、および経口ロイコトリエン受容体アンタゴニスト)と組み合わせて、治療に使用するための医薬の製造における、上記で定義した通りの式(Ｉ)の化合物 またはその薬学的に許容される塩 もしくは溶媒和物の使用を提供する。
【００１７】
本発明は、さらに、プロスタグランジン Ｄ２が介在する疾患を処置する方法であって、上記で定義した通りの式(Ｉ)の化合物 またはその薬学的に許容される塩 もしくは溶媒和物を、治療上効果的な量で患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、呼吸器疾患に罹患している もしくはそのリスクがある患者において、呼吸器疾患、例えば喘息や鼻炎、特に喘息を処置する方法であって、上記で定義した通りの式(Ｉ)の化合物 またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を、治療上効果的な量で患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
上記の治療的使用において、用量は、用いられる化合物、投与方法、望ましい処置、および適応される疾患に伴って、当然に変化する。
【００２０】
式(Ｉ)の化合物、およびその薬学的に許容される塩 および溶媒和物は、それ自身で用いられ得るが、一般的には、式(Ｉ)の化合物／塩／溶媒和物(活性成分)を薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、または担体と組み合わせた、医薬組成物の形態で投与される。投与方法に依存して、医薬組成物は、好ましくは、０.０５から９９重量％(重量による百分率)、より好ましくは０.０５から８０重量％、いっそうより好ましくは０.１０から７０重量％、そしてさらにより好ましくは０.１０から５０重量％の活性成分を含む。全ての重量％は、全組成物の重量に基づく。
【００２１】
本発明はまた、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、または担体と組み合わせた、上記で定義した通りの式(Ｉ)の化合物 またはその薬学的に許容される塩 もしくは溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
医薬組成物は、溶液、懸濁液、ヘプタフルオロアルカン・エアゾール、および乾燥粉末製剤の形態で、局所に(例えば肺および／または気道へ、または皮膚へ)；錠剤、カプセル、シロップ、粉剤、または顆粒の形態で、経口投与によって、または溶液もしくは懸濁液の形態で非経腸投与によって、または皮下投与によって、または坐剤の形態で直腸の投与によって、または経皮で、全身に投与され得る。好ましくは、本発明の化合物は、経口で投与される。
【実施例】
【００２３】
＜実験の章＞
実施例１
[５−メトキシ−２−メチル−１−(６−メチル−２−フェニルピリミジン−４−イル)−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸の製造
段階(ａ)：[５−メトキシ−２−メチル−１−(６−メチル−２−フェニルピリミジン−４−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸エチルの製造
エタノール中の(５−メトキシ−２−メチル−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−３−イル)酢酸エチル(２.０ｇ)に、４−クロロ−６−メチル−２−フェニルピリミジン(１.７６ｇ)を加え、次に濃ＨＣｌ(０.５ml)を加え、反応物を２４時間還流した。溶媒を蒸発させ、水を加え、反応物をｐＨ ７に中和し、生成物を酢酸エチルで抽出した。これより、副題化合物を得た(３.４ｇ)。これをさらに精製することなく次の段階に用いた。
【００２４】
段階(ｂ)：[５−メトキシ−２−メチル−１−(６−メチル−２−フェニルピリミジン−４−イル)−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸エチルの製造
ジフェニル エーテル(４０ml)中の実施例１の段階(ａ)の生成物(４.７ｇ)に、１０％ Ｐｄ／Ｃ(２.３ｇ)を加え、反応物を５時間還流した。反応混合物をセライトで濾過した。溶媒を蒸発させ、フラッシュ・シリカ・クロマトグラフィーによって、濃度勾配溶出系(１０％ ジエチルエーテル／９０％ ヘキサンから４０％ ジエチルエーテル／６０％ヘキサン)を用いて精製し、副題化合物を得た(１.６ｇ)。
【００２５】
段階(ｃ)：[５−メトキシ−２−メチル−１−(６−メチル−２−フェニルピリミジン−４−イル)−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸の製造
エタノール(４０ml)中の実施例１の段階(ｂ)の生成物(１.６ｇ)に、ＮａＯＨ(０.５ｇ)を加え、３０分間還流した。溶媒を蒸発させ、水(５０ml)を加えた。次に溶液を希ＨＣｌでｐＨ ５まで酸性にした。得られた固体を濾過し、乾燥し、再結晶し(ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ)、表題生成物を固体として得た(０.９ｇ)。
融点：１６０〜１６２℃；
APCI+ (M+H) = 388.
【００２６】
実施例２
[１−(１,３−ベンゾチアゾール−２−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸の製造
実施例１と同様の方法で製造した。
融点：１５８〜１６０℃；
APCI+ (M+H) = 353.
【００２７】
実施例３
[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸の製造
段階(ａ)：２,４−ジクロロ−６−[１−(４−メトキシフェニル)ヒドラジノ]ピリミジン
水(２６０ml)中の無水酢酸ナトリウム(６３.１ｇ)の溶液に、ＥｔＯＨ(１２００ml)を加えた。これに、(４−メトキシフェニル)ヒドラジン(５９ｇ)と、２,４,６−トリクロロピリミジン(７８.５ｇ)を加えた。反応物を全て溶解するまで振盪した。反応物を２時間放置し、得られた固体を濾過し、ＥｔＯＨで洗浄し、真空で乾燥した。ＥｔＯＨ／ＣＨＣｌ３から再結晶し、副題化合物を得た(２０ｇ)。
融点：１５６〜１５８℃.
【００２８】
段階(ｂ)：[１−(２,６−ジクロロピリミジン−４−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸の製造
４−オキソペンタン酸(６５ml)中の実施例３の段階(ａ)の生成物(２０ｇ)の溶液に、ＨＣｌガスを通気した。５分後固体が溶液から沈殿した。反応物を２時間放置した。反応混合物を水(７５０ml)に注ぎ、４５分間勢いよく撹拌した。固体を濾過し、ＥｔＯＨから再結晶した。これより、副題化合物を固体として得た(１４.１ｇ)。
融点：２０１〜２０２℃.
【００２９】
段階(ｃ)：[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸の製造
１,２−ジメトキシエタン(３０ml)に溶解させたフェノール(０.８５ｇ)の溶液に、ナトリウム(０.２１ｇ)を加えた。反応物を、ナトリウムがそれ以上溶解しなくなるまで加熱した。次に、この反応物に、１,２−ジメトキシエタン(２５ml)に溶解させた実施例３の段階(ｂ)の生成物(１.１ｇ)を、１０分に渡って加えた。反応物を１時間撹拌し、次に１時間還流した。溶媒を蒸発させ、水(１００ml)と酢酸エチル(５０ml)を加えた。希ＨＣｌを、混合物がｐＨ ２になるまで加えた。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物を水で洗浄し、乾燥し(ＭｇＳＯ４)、真空で蒸発させた。トルエンを用いて再結晶し、表題化合物を固体として得た(０.７７ｇ)。
融点：１６８〜１７０℃；
APIC+ (M+H) = 482.
【００３０】
実施例４
[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸の製造
実施例３と同様の方法で製造した。
APIC+ (M+H) = 466.
【００３１】
実施例５
[１−(２,６−ジイソプロポキシピリミジン−４−イル)−５−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸の製造
実施例３と同様の方法で製造した。
APCI+ (M+H) = 398.
別の式(Ｉ)の化合物は、GB 1,356,834 で概略された手順に従って製造され得る。
【００３２】
薬理データ
細胞内カルシウム移動
ＣＲＴｈ２受容体とＧα１６ Ｇ−蛋白質(ＨＥＫ−ｈｒＣＲＴｈ２−Ｇα１６)を共にトランスフェクトさせたヒト胎児腎細胞を、通常の方法で、１０％(v:v)熱不活性化ウシ胎児血清(New Zealand sourced; Hyclone)、１％(v:v)非必須アミノ酸(Gibco BRL)、１％(v:v)ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco BRL)、２mM Ｌ−グルタミン(Gibco BRL)、を加えた、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM; Sigma)中で培養して単層とし、１mg/ml(v:v) ジェネテシン(Gibco BRL) 抗生物質選択下で成長させた。
【００３３】
アッセイの約２４時間前に、細胞を、１００μｌの成長培地中、１００,０００細胞／ウェルの接種密度で、黒色の壁を有する９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンをコートしたプレート(Becton Dickinson)に置く。このプレートは透明な底を有し、このために、それぞれのウェルの底部から、細胞の観察および蛍光測定を行うことが可能である。全ての培養物を、標準組織培養条件下(３７℃, ５％ ＣＯ２の加湿雰囲気下)に保つ。
【００３４】
ＨＥＫ−ｈｒＣＲＴｈ２−Ｇα１６細胞中で、細胞内カルシウム レベルの変化を、測定することを可能とするために、ｆｌｕｏ−３ＡＭを蛍光カルシウム・インジケーターとして利用する。最終濃度で、５μＭ Ｆｌｕｏ−３ＡＭ 蛍光細胞質内カルシウム・インジケーター色素(Tef Labs)、２.２μｌ/ml Pluronic F127 (Molecular Probes)[色素取り込みを促進するため]、および０.５mM brilliant black (Sigma)[平衡塩類溶液(ＢＳＳ；１２５mM ＮａＣｌ、５.４mM ＫＣｌ、１６.２mM ＮａＨＣＯ３、０.８mM ＭｇＣｌ２、１mM ＣａＣｌ２、２０mM ＨＥＰＥＳ、１mM ＮａＨ２ＰＯ４、５.５mM Ｄ−(＋)−グルコース、０.１％ ＢＳＡ、およびＮａＯＨでｐＨ ７.４)におけるバックグラウンドの蛍光を減少させるため]を含む色素負荷緩衝液を調製する。アッセイ日に、存在する成長培地を除去し、１００μｌの色素負荷緩衝液をそれぞれのウェルに添加することによって、細胞を、暗所で、３７℃で６０分間色素負荷する。
【００３５】
試験化合物を、ＤＭＳＯ中１０mMのストック濃度とする。評価される化合物を、描かれる阻害用量応答曲線における必要濃度まで、ＢＢＳ緩衝液で順に希釈することによって調製する。これらの希釈液を、第１添加プレートに入れる(このプレートは、アッセイの前に、前もって３７℃に温めておく)。ＰＧＤ２ (Cayman Chemical) Ｅ／[Ａ]曲線は、それぞれ独立のアッセイにおいて、アゴニスト濃度の増大に対する応答における細胞内カルシウム・フラックスを測定することによって作成する。これから、アゴニスト活性(ｐ[Ａ]５０)値を、ＨＥＫ−ｈｒＣＲＴｈ２−Ｇα１６細胞について任意の日に決定する。ＰＧＤ２についてのｐ[Ａ]５０を決定したら、２×ｐ[Ａ]５０のＰＧＤ２を含む別のアッセイ・プレートを、第２添加プレート(またはアゴニスト・プレート)として調製する。このＰＧＤ２プレートはまた、アッセイの前に、３７℃に前もって温める。得られた阻害曲線データを下記のようにフィットさせ、ＩＣ５０値(ＰＧＤ２に対する応答の５０％の阻害をもたらす試験化合物の濃度)を算出した。
【００３６】
次に、細胞内Ｃａ２＋([Ｃａ２＋]ｉ)の増大の測定を、96 well FLIPr を用いて行う。蛍光の変化を、それぞれの試験ＡＲ−Ｃ化合物の添加後に、それ自身(第１添加プレート)、または試験化合物(第１添加プレート)について、次に参照アゴニストであるＰＧＤ２(第２添加プレート)について測定する。
【００３７】
次に、細胞内Ｃａ２＋([Ｃａ２＋]ｉ)の増大の測定を、約１０,０００蛍光ユニットの基底値を得るのに適切なレベルにセットしたレーザー強度で行う。化合物活性を単独で評価するために、蛍光読み取りを５分間に渡って測定し(第１添加プレート)、次にアゴニストを添加し、そして化合物の競合活性をさらに２分間評価する。ＰＧＤ２によって得られる蛍光シグナルの最大値は、典型的には１５,０００ユニット以上であり、１５秒の添加で得られる。
【００３８】
アゴニスト分析
ＰＧＤ２ コントロール Ｅ／[Ａ] 曲線における絶対蛍光単位を、４変数ロジスティック曲線フィッティング・プログラムを用いて、Hill の式の形に従ってフィットさせる。
【数１】
2005525327.tif 000006
｛ここで、αおよびβは、それぞれ上の漸近線と下の漸近線であり；そして
[Ａ]５０およびｍは、それぞれ位置(location)および傾きの変数である｝
計算されたαの値を用いて、次に、絶対蛍光単位をこの値の％として表した。アゴニズムを示すＡＲ−Ｃ化合物において、ｐ[Ａ]５０を、本質的な活性(試験アゴニストのα／ＰＧＤ２のα)と同様に算出した。
【００３９】
アンタゴニスト分析：
アンタゴニスト親和性の値は、ｐＩＣ５０ Cheng-Prusoff 分析を用いて評価した。これの最後に、ＰＧＤ２のＥ／[Ａ]曲線を作成し(上記参照)、式１にフィットさせ、活性([Ａ]５０])と傾き(ｍ)を算出する。次に、試験化合物の効果を、２×ｐ[Ａ]５０ 参照アゴニスト ＰＧＤ２の濃度に対して評価した。得られた阻害曲線は、次に式１にフィットさせ、ＩＣ５０値(ＰＧＤ２に対する応答の５０％阻害が起こる試験化合物の濃度)を算出した。
【００４０】
式(Ｉ)の化合物は、１０μＭ未満(＜１０μＭ)のｐＡ２値を有する。特に、[１−(２,６−ジフェノキシピリミジン−４−イル)−２,５−ジメチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸は、ｐＡ２＝６.８を有し、[５−メトキシ−２−メチル−１−(６−メチル−２−フェニルピリミジン−４−イル)−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸は、ｐＡ２＝６.５を有し、そして[１−(１,３−ベンゾチアゾール−２−イル)−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル]酢酸は、ｐＡ２＝６.５を有する。
【国際調査報告】
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