(57)【要約】非特異的薬物結合（ＮＢＳ）を低下させるための希釈剤の使用は、バイオアッセイの結果がｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの化合物の挙動をより正確に予測できるように、化学物質（たとえば薬物、薬物候補、および他の小分子）のＮＳＢを低下させる、単純で柔軟な生体適合性のある方法を提供する。さらに、化学物質希釈剤としての希釈剤の使用により、高スループット薬物アッセイ、たとえばＣａｃｏ−２薬物輸送アッセイ、血漿タンパク質薬物結合アッセイ、ＰＡＭＰＡアッセイ、透過性アッセイ、および薬物溶解性アッセイから生じるデータの予測的な性質を高める。この希釈剤は、選択した血漿を、３０ｋＤの、好ましくは約１０ｋＤ以下の公称排除限界分子量を有する限外濾過膜で濾過すること、または非特異的結合に寄与しない血漿または血清の個々の成分を選択的に加えることのいずれかによって作成する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０ｋＤ未満の公称分子量を有し、および５０ｋＤの公称排除限界分子量を有する膜で濾過した、血漿、血清およびそれらの混合物、または血漿、血清およびそれらの混合物の個々の成分の緩衝生理食塩溶液中の混合物からなる群から選択された材料源から形成される希釈剤を含む、細胞増殖用の生体適合希釈剤。
【請求項２】
血漿、血清、およびその混合物からなる群から選択される材料源を選択するステップと、材料源を約５０ｋＤの公称排除限界分子量を有する限外濾過膜で濾過するステップと、濾過ステップから濾液を回収するステップとを含む、希釈剤を形成する方法。
【請求項３】
材料源が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ヒト、およびそれらの混合物からなる群から選択された源に由来する請求項１に記載の希釈剤。
【請求項４】
材料源が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ヒト、およびそれらの混合物からなる群から選択された源に由来する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
材料源がウシ胎児血清である請求項１に記載の希釈剤。
【請求項６】
材料源がウシ胎児血清である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
材料源がヒト血漿である請求項１に記載の希釈剤。
【請求項８】
材料源がヒト血漿である請求項２に記載の方法。
【請求項９】
希釈剤が３０ｋＤ未満の公称分子量を有する請求項１に記載の希釈剤。
【請求項１０】
希釈剤が１０ｋＤ未満の公称分子量を有する請求項１に記載の希釈剤。
【請求項１１】
限外濾過膜が約３０ｋＤの公称排除限界分子量を有する請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
限外濾過膜が約１０ｋＤの公称排除限界分子量を有する請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
希釈剤が５ｋＤ未満の公称分子量を有する請求項１に記載の希釈剤。
【請求項１４】
材料源が、タンパク質を含まない血清製品およびタンパク質を含まない非動物性の血清製品からなる群から選択される請求項１に記載の希釈剤。
【請求項１５】
材料源が、タンパク質を含まない血清製品およびタンパク質を含まない非動物性の血清製品からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
試験する化学物質を選択すること、１個または複数のウェルを有する試験装置を選択すること、希釈剤を用いて化学物質を所望の濃度に希釈し、希釈した化学物質を試験装置の１個または複数のウェルに施用すること、および材料を回収して分析することを含み、前記希釈剤は、血漿、血清、その混合物からなる群から選択される材料源から形成され、材料源を約５０ｋＤより小さい公称排除限界分子量を有するフィルターで濾過することからなる群から選択されるプロセスによって、または緩衝生理食塩溶液中で約５０ｋＤより小さい公称分子量を有する材料源の個々の成分を混ぜ合わせることによって形成される、化学物質の非特異的結合を低下させた化学物質を試験する方法。
【請求項１７】
各ウェルが多孔性構造体によって閉じられた底を有し、各ウェルが、受けプレートの１個または複数のウェルが試験装置の１個または複数のウェルと位置が合うように、試験装置の下方に配置された受けプレートをさらに備え、試験装置の１個または複数のウェルからの濾液を受けプレートの１個または複数のウェルで受けるため受けプレートの上方に試験装置を配置すること、試験装置の濾液を受けプレートの１個または複数のウェルで捕捉すること、および濾液を回収し分析することを含む請求項１６に記載の化学物質の非特異的結合を低下させる方法。
【請求項１８】
各ウェルが多孔性構造体によって閉じられた底を有し、各ウェルが、試験装置の１個または複数のウェルと、試験装置の１個または複数のウェルと位置を合わせた、試験装置の下方に配置した受けプレートの１個または複数のウェルとの、内側の多孔性構造体上に形成した、化学物質を試験する細胞株をさらに備え、試験装置の１個または複数のウェルからの濾液を受けプレートの１個または複数のウェルで受けるため受けプレートの上方に試験装置を配置すること、試験装置の濾液を受けプレートの１個または複数のウェルで捕捉すること、および濾液を回収し分析することを含む請求項１１に記載の化学物質の非特異的結合を低下させる方法。
【請求項１９】
試験が、Ｃａｃｏ−２薬物輸送アッセイ、血漿タンパク質薬物結合アッセイ、ＰＡＭＰＡアッセイ、透過性アッセイ、薬物溶解性アッセイからなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
血漿、血清、およびその混合物からなる群から選択された材料源に由来し、材料源を約５０ｋＤより小さい公称排除限界分子量を有するフィルターで濾過することからなる群から選択された方法によって、または緩衝生理食塩溶液中で約５０ｋＤより小さい公称分子量を有する材料源の個々の成分を混ぜ合わせること、希釈剤を化学物質に加えてｉｎ  ｖｉｖｏ希釈剤を得ること、および希釈した化学物質を試験アッセイに施用することによって形成される希釈剤の使用を含む、化学物質の非特異的結合を低下させる方法。
【請求項２１】
希釈剤が、５０ｋＤ未満の公称分子量を有し、血漿、血清、およびその混合物からなる群から選択させた材料源から形成され、材料源を約５０ｋＤより小さい公称排除限界分子量を有するフィルターで濾過することからなる群から選択された方法によって、または約５０ｋＤより小さい公称分子量を有する材料源の個々の成分を混ぜ合わせることによって形成され、希釈剤が生体適合性であり、薬物または小分子の溶解性および生体利用特性を維持する、希釈剤を含む生物試験システム内で化学物質の非特異的結合を低下させるための希釈剤。
【請求項２２】
血漿、血清の個々の成分およびその混合物からなる群から選択された材料源を選択するステップと、個々の成分を緩衝生理食塩溶液中で混合して希釈剤を形成するステップとを含む、希釈剤を形成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合希釈剤ならびにその製造方法および使用に関する。より詳細には、本発明はｉｎ  ｖｉｖｏの化学物質試験における小分子の非特異的結合を防ぐ希釈剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高スループットのスクリーニングアッセイ（たとえばＣａｃｏ−２薬物輸送、並行人工膜透過性アッセイ（Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、ＰＡＭＰＡ）、血漿タンパク質薬物結合、溶解性試験など）は、１２〜１５３６個のうち任意の数の分離した複数のウェルからなる装置内で実施する。これらは、ある程度の製薬的用途がある、またはあると考えられている、様々な低分子量有機分子（化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）すなわち「ＣＥ」）を同定し特徴付けるのに使用される。一般的にＣＥは、有効となる可能性がある薬物候補であるかどうかを判断するために、創薬（ｄｒａｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）手順において調査される。
【０００３】
しばしば、これらのプレートたとえばＣａｃｏ−２  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）プレートのウェルの底は、スクリーニングアッセイの一部の面を助長または可能にするために、膜やフィルターを有する。フィルターまたは膜を有する底のプレートを使用する場合は、複数ウェルのプレートの下にはめる受け皿を用いることもでき、この中に試料を濾過させるまたはフィルタープレートの内容物を拡散させることができる。ＣＥはこれらプレート内に非常に低い濃度（＜＜１マイクロモル濃度）で導入され、あるいは最終的に受けプレートボリューム中で非常に低い濃度（＜＜１マイクロモル濃度）となる可能性がある。これら希釈液中のＣＥの絶対濃度が測定可能であることは決定的に重要であり、プラスチック表面、膜、および試験液の他の成分たとえばタンパク質にＣＥが非特異的結合することによる損失があると、これら装置の有用性が潜在的に制限される可能性がある。
【０００４】
溶液中に低濃度（＜＜１μＭ）で存在することに加えて、多くのＣＥは親油性なので、プラスチック表面、たとえば複数ウェルプレート、膜、受けプレート、あるいはタンパク質など試験液の他の成分に非特異的に吸着または結合（より一般的には非特異的薬物結合と呼ばれる、以降「ＮＳＢ」）する傾向があり、試験液から消失するように見える。このＣＥの消失は、アッセイの成果や解釈に有意な影響を及ぼす可能性があり、不正確な誤解を招く結果をもたらす。表面積と体積の比が増大し、濃度が低下するにつれて、ＮＳＢ問題が起こる可能性が高くなる。
【０００５】
ＮＳＢを減少させるためにいくつかの試みがなされてきた。
【０００６】
一般的に、ＮＳＢを抑制するには、受けプレートに使用するプラスチックの選択が重要であると考えられている。ＮＳＢをなくす手段として、プラスチック表面を覆う様々な種類の機構が試されてきた。
【０００７】
比較的少量の有機溶媒（たとえばＤＭＳＯ、メタノール、ＤＭＦ、ＴＨＦなど）の添加により、一部の場合でＣＥのＮＳＢレベルが有意に低下することが見出されたが、これらの溶媒は、血漿タンパク質に対するこれらＣＥの結合の挙動を変化させる潜在的可能性があり、またその明らかな透過性により一般的に受け入れられない。
【０００８】
受けプレートに対するＮＢＳを低下させる別の方法は、プラスチックをブロック剤でプレコートすることである。ＢＳＡなどのタンパク質が一部のＣＥに有効であることが見出されたが、これらがＣＥと結合してアッセイ系から取り除き、間違った結果をもたらす危険性がある。
【０００９】
ＮＳＢを最小限にする別の解決法は、少量のＰＴＦＥまたは他の低ＮＳＢポリマーと混合したポリオレフィンを使用することであった。このような受けプレートの１つは、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）フィルター装置と一緒に使用されるＰＴＦＥ／ポリプロピレン受けプレートであり、これらはいずれもマサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である。２０００年３月３１１日出願の米国特許出願第０９／５４０，０３０号および２０００年７月１４日出願の米国特許出願第０９／６１６，５９７号参照。
【００１０】
この受けプレートは大部分のＣＥおよび薬物に効果があり、従来技術の受けプレートに比べて大幅な改善を示す。しかし、溶解性が低いまたは親油性のＣＥでは、この受けプレートでも、多数の低溶解性ＣＥおよび／または親油性ＣＥで有意なレベルのＮＳＢがあることが示された。
【００１１】
あるいは、ＮＳＢを低下させるために親水性ポリマーでプレコートしたプラスチック受けプレートを使用することもできる。この解決法は基本的に信頼できるように思えるが、これには少なくとも２つの重大な制限がある。第１には、これらの表面処理した受けプレートは、少なくとも現在供給されている状態では、深刻な寸法の制約がある。受けプレートは、いくつかの変数、たとえばトッププレートの設計や形式、行う試験、個々の製造者の設計および優先事項などに応じて、大きさおよび形式が異なる。したがって、これらは、ロボット式の実験室装置によって処理することができず、自動高スループットスクリーニング技術に適合していない。第２には、これらのコーティングした受けプレートでは、装置内の他の表面上（たとえばトッププレート、膜、フローダイレクター（ｆｌｏｗ  ｄｉｒｅｃｔｏｒ）など）または試験溶液自体のＮＳＢに対する保護が全く提供されない。
【００１２】
これらのタイプのアッセイを、ｉｎ  ｖｉｖｏ挙動をより予測可能なものにするために、ＮＢＳを防ぐまたは低下させる、より普遍的な方法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
非特異的薬物結合（ＮＢＳ）を低下させるための希釈剤の使用は、薬物および薬物候補（および他の小分子）の試験中などでのＣＥの非特異的結合（ＮＢＳ）を低下させて、バイオアッセイの結果がこれら化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ挙動をより正確に予測できるようにする、単純で、柔軟な生体適合性のある方法を提供する。さらに、これは、部品の１つだけではなく、試験装置の全体にわたりＮＳＢに対する利点を提供する。これは、ＮＳＢ問題の普遍的な解決法を提供し、所望する任意の試験で任意のプレート設計を用いることを可能にする。本発明が教示する血漿希釈剤、血清希釈剤、または合成希釈剤の、ＣＥ希釈剤としての使用は、高スループットＣＥアッセイ、たとえばＣａｃｏ−２薬物輸送アッセイ、血漿タンパク質薬物結合アッセイ、ＰＡＭＰＡアッセイ、透過性アッセイ、薬物溶解性アッセイから生じるデータの予測的な性質を高める。
【００１４】
本発明の目的は、５０ｋＤ、好ましくは３０ｋＤ以下の公称排除限界分子量を有する膜で血清または血漿を濾過することによって生成した希釈剤を利用する、細胞に基づくアッセイおよび細胞に基づかないアッセイを含めて様々な化学物質（ＣＥ）アッセイを実施するための生体適合希釈剤を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、血漿、血清の個々の成分およびその混合物からなる群から選択された材料源を選択するステップと、個々の成分を緩衝生理食塩溶液中で混合して希釈剤を形成するステップとを含む、希釈剤を形成する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、希釈剤が５０ｋＤ未満の公称分子量を有し、血漿、血清、またはその混合物からなる群から選択された材料源から形成され、材料源を約５０ｋＤ未満の公称分子量を有するフィルターで濾過することからなる群から選択された方法によって、または約５０ｋＤの公称分子量を有する材料源の個々の成分を緩衝生理食塩溶液中で混ぜ合わせることによって形成され、希釈剤が生体適合性であり、薬物または小分子の溶解性および生体利用特性を維持する、希釈剤を含む生物試験システム中の化学物質の非特異的結合を低下させるための希釈剤を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、１つまたは複数の血漿、血清、またはその混合物からなる材料源から選択するステップと、約３０ｋＤ、好ましくは約１０ｋＤの公称排除限界分子量を有する限外濾過膜で材料源を濾過するステップと、濾過ステップから濾液を回収するステップとを含む、希釈剤を形成する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、試験するＣＥおよびＣＥを試験する方法を選択すること、１個または複数のウェルを有する複数ウェルプレートを選択すること、複数ウェルプレートの１個または複数のウェルでアッセイを実施すること、非特異的ＣＥ結合が低い希釈剤を用いてＣＥを所望の濃度に希釈すること、複数ウェルプレートの１個または複数のウェルのプレートに希釈したＣＥを施用すること、および、ＣＥを回収して分析することを含む、化学物質（ＣＥ）の非特異的結合を低下させる方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、試験するＣＥを選択すること、各ウェルが多孔性構造体によって閉じられている底を有する、１個または複数のウェルを有する試験装置を選択すること、各ウェルが、試験装置の１個または複数のウェルから濾液を受けられるように、試験装置のウェルと位置を合わせた、開いた上部と閉じられた底を有する１個または複数のウェルからなる装置を回収装置の上方に置くこと、希釈剤でＣＥを所望の濃度に希釈し、希釈したＣＥを試験装置の１個または複数のウェルに施用すること、受け装置の１個または複数のウェルで試験装置の濾液を捕捉すること、および濾液を回収して薬物活性を分析することを含む、ＣＥたとえば薬物候補を試験するプロセスを提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、希釈剤が３０ｋＤ未満、好ましくは１０ｋＤ未満の公称分子量を有し、血漿、血清およびその混合物からなる群から選択された材料源から形成され、希釈剤が生体適合性であり、薬物または小分子の溶解性および生体利用特性を維持する、希釈剤を含む生物試験システム中のＣＥたとえば薬物や他の小分子の非特異的結合を低下させるための希釈剤を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、希釈剤が血漿および血清の個々の滅菌成分、およびその混合物から形成され、希釈剤が生体適合性であり、ＣＥの溶解性および生体利用特性を維持する、希釈剤を含む生物試験システム中のＣＥたとえば薬物や他の小分子の非特異的結合を低下させるための希釈剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、化学物質（ＣＥ）の希釈剤に関する。より詳細には、本発明は、この希釈剤に関し、ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの化合物の挙動に予測的なアッセイにおいて、試験装置表面に対する非特異的結合（ＮＢＳ）、および化合物の輸送、溶解性、吸着、拡散、結合および化学物質の他の化合物特性を測定するのに使用する流体に対するＮＳＢを低下しまたはなくすための、好ましい希釈剤としてのその使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
この希釈剤は、化学物質のＮＳＢに寄与しないか、あるいはＮＳＢをなくし、ＣＥの分析にほとんどまたは全く悪影響を与えず、このようなＣＥの決定および定量用の方法やアッセイを妨害しない、低分子量成分からなる水性溶液である。
【００２４】
この希釈剤は、血漿、血清などの自然源を選択的に濾過してＮＳＢを増大させる成分を取り除いて形成するか、または自然源の個々の成分を混合することによって作成することができる。
【００２５】
この希釈剤は通常、血漿または血清が化学物質（ＣＥ）の非特異的結合に寄与するタンパク質および他の成分をほとんど含まないように、１つまたは複数の濾過ステップ、主に限外濾過ステップにかけた血漿または血清から形成される。好ましくは、これは、実質的にすべての成分が約５０キロダルトン（ｋＤ）未満の公称分子量である流体であり、より好ましくは、これは、３０キロダルトン（ｋＤ）未満の公称分子量を有する成分を含み、さらに好ましくは、これは、１０キロダルトン（ｋＤ）未満の公称分子量を有する成分を含み、実質的にタンパク質を含まない。所望する場合は、より細かい範囲たとえば５ｋＤ以下の公称分子量の希釈剤を用いることもできる。しかし、大部分の用途では、３０ｋＤ未満の公称分子量を有する希釈剤が許容でき、期待されるすべての利点を提供する。
【００２６】
あるいは、血清または血漿の様々な低分子量成分、たとえば塩、トリグリセリド、コレステロール、糖など（５０未満のｋＤ、好ましくは３０ｋＤ未満、より好ましくは１０未満）を緩衝生理食塩溶液に混合して希釈剤を形成することによって、溶液を作成することができる。これらの成分は当分野でよく知られており、様々な市販源から入手することができ、また当分野の技術者によって実験室内で通常の技術および装置を用いて容易に分離することもできる（たとえば表１参照）。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
血漿、血清、または選択される個々の成分は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）たとえば蓄牛（ｃａｔｔｌｅ）や子ウシ胎児の血清、ヒツジ、ヤギ、ヒトの血漿および血清、タンパク質を含まない血清製品、タンパク質を含まない非動物性の（ａｎｉｍａｌ−ｆｒｅｅ）血清製品などを含むがそれだけには限定されない様々な源に由来するものでよい。これらは、様々な製造者たとえばＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｉｎｃ．、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である。
【００２９】
自然源の希釈剤は、１つまたは複数の血漿源や血清源であれ１つまたは複数の血漿、血清、または両方の混合物であれ、所望の材料源を選択すること、および、少なくとも１つのステップが約５０ｋＤ、３０ｋＤ、または１０ｋＤの公称排除限界分子量を有する限外濾過膜で材料源を濾過することである、１つまたは複数回の濾過ステップに所望の材料源をかけることによって作成する。特に普通なら限外濾過膜を詰まらせるまたは汚してしまう、血漿または血清が大量の大きな分子量の成分を有する場合に、この限外濾過ステップの前により粗いプレフィルターを使用してもよい。さらに、所望する場合は、特定の用途に望まれるまたは必要であるならば、より細かい生成物を作成するために追加の限外濾過ステップを用いることもできる。
【００３０】
限外濾過ステップは、ステンレス鋼フィルターホルダーまたはＳＷＩＮＮＥＸ（登録商標）フィルターホルダーに収容した、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）遠心濾過装置内など通常のフローフィルター、ＰＬＧＣ  ＵＦ膜（１０ｋＤ  Ｎ．Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．）、ＹＭＴ１０膜（Ｎ．Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．の１０ｋＤ）、ＰＬＴＫ  ＵＦ膜（３０ｋＤ  Ｎ．Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．）などの限外濾過膜、攪拌セル、ＰＬＴＫまたはＰＬＧＣ  ＵＦ膜を収容したＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＵＦカセットなどの接線方向フローフィルター装置、あるいは米国特許第５，６２６，７５８号に示すような中空糸装置で行うことができる。どのシステムを選択するかはこの用途には重要でなく、それよりも濾過する材料源のスケール／体積および手近にある既存装置に関係する所が多い。
【００３１】
好ましい方法は、ウシ胎児血清を材料源として使用し、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＳｔｅｒｉｃｕｐ（登録商標）フィルター装置で浄化するものである。マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからいずれも入手可能なＵｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）ＰＬＧＣまたはＹＭＴ１０膜（１０ｋＤのＮ．Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．）をはめたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ攪拌セルを使用して、浄化した血清を分離して希釈剤を調製した。
【００３２】
ＣＥを薬物候補などとして調査および／または開発するために、いくつかの異なるアッセイが使用される。Ｃａｃｏ２細胞などの試験細胞の使用を用いて、ＣＥの腸管輸送特性を試験することができる。血漿タンパク質結合、溶解性試験、ＰＡＭＰＡ、他の「人工」膜輸送（または透過性）アッセイなど他の方法では細胞の使用が必要とされない。本発明は、いずれの試験タイプでも使用できる希釈剤を提供することを意図する。
【００３３】
典型的なアッセイは、図１に示す装置に類似した装置を使用することを含む。本実施形態は、細胞に基づくアッセイで使用することができる。細胞に基づかないアッセイでは、システム内に細胞を含まない同様のシステムを使用することができる。このシステムは、通常は１２、２４、４８、９６個であるがより少ないまたは多い数（たとえば３８４または１５３６個のウェル）を使用してもよい、一連のウェル４を有するトッププレートすなわち細胞プレート２を備える。
【００３４】
ウェルの上部６は開いており、底８は中実の底または多孔性構造体１０のいずれか、通常は微小孔性膜またはガラスフィルターによって閉じられている。多孔性構造体１０は、大きさが膜またはフィルターの最大孔より大きい細胞および／または添加成分、あるいは濾過の駆動力を欠く場合に表面張力によって保持される細胞および／または添加成分はウェル内に保持され、液体のみが拡散によってまたは圧力下で多孔性構造体１０を通るように、プレートウェルの底に密閉されている。多孔性構造体１０の上側表面上で細胞１２を増殖させて、多孔性構造体１０の上側表面全体にわたって一体の層Ｉを形成させる。
【００３５】
フィルタープレートの使用では、受けプレート１４を細胞プレート２の下方に配置する。受けプレート１４は、開いた上部１８と閉じられた底２０とを有する一連のウェル１６を有する。ウェルの数、大きさ、構成は、細胞プレート２のウェル４Ａを出るすべての液体が受けプレート１４の対応するウェル１６Ａに流れ込むように、細胞プレートのウェルの数、大きさ、構成と位置が合うように設計されている。細胞を用いないアッセイの一部では、受けプレートは必要ない。
【００３６】
本発明の希釈剤中で、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適切と考えられる濃度に化学物質を希釈する。通常、ＣＥは、アッセイおよび試験するＣＥに応じて、希釈剤中で約１０マイクロモル濃度（μＭ）〜約０．１ナノモル濃度（ｎＭ）のレベルに希釈する。
【００３７】
その後、希釈剤中のＣＥを、細胞プレートのウェル４の開いた上部に、好ましくは細胞を乱さないようにウェル４の側面に沿って加え、細胞と相互作用させる。好ましくは、受けプレート１４のウェル１６も（ＣＥを含まない）希釈剤で満たす。
【００３８】
一定時間後、通常は約１時間後に、２つのプレート２、１４を分離し、受けプレート１４のウェル１６中の液体を分析する。
【００３９】
この希釈剤は、あらゆる試験表面または流体に対する、ＣＥのどのようなＮＳＢの可能性も低減させる。さらに、これは自然の産物であり細胞を増殖させる液体と類似しているので、従来技術の他の方法たとえば溶媒の使用とは異なり、細胞やＣＥの挙動にわずかしか悪影響を与えない。また、試験システム全体から分かるように、これは、受けプレートウェルのみならず、細胞プレート２、希釈容器（図示せず）、施用具たとえばシリンジまたはピペット、多孔性構造体などにおけるＮＳＢも低下させる。本発明は、ガラスであれプラスチックであれ、あるいはプラスチックの混合物や親水性コーティングでコーティングしたプラスチックであれ、システムで使用する材料に関わらず機能し、低ＮＳＢプレートとみなされていたプレートでもＮＳＢを低下させることが分かった。最後に、この希釈剤は溶液中のＣＥと全く結合せず、これは、ＣＥの生体利用に全く悪影響を及ぼさないことを意味する。
【００４０】
本発明の発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境に最もよく似ているので、幅広いアッセイで使用される材料の好ましい希釈剤であることが見出された。本発明を緩衝液、培養基、または生物アッセイやバイオ予測的（ｂｉｏｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ）アッセイで化合物の挙動を評価するのに使用する様々な化合物の希釈剤として使用することができる。
【実施例】
【００４１】
放射標識した様々な薬物（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０ｎＭの濃度）のＮＳＢを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）の９６穴受けプレート（ＰＴＦＥ樹脂ポリプロピレン混合物により形成）に加え、６０分間プレート内に放置した。ＮＳＢで失われた薬物量を測定し、図２にまとめて示す。
【００４２】
様々なプラスチックから作成された他の９６ウェルプレートに対する薬物ＮＳＢ（リン酸緩衝液中１０ｎＭの薬物）も試験した。ＰＴＦＥを含めたこれらプレートのすべてで結合が有意であり、損失の程度は薬物の溶解性に関連していた（すなわち、薬物が親油性であるほど、ＮＳＢによる損失が大きかった）。実際、タキソールおよびテストステロンのＰＰおよびＰＴＦＥプレート上でのＬＣ−ＭＳを用いた時間経過研究では、薬物ＮＳＢはプレート材料に依存しないように思えた（データ示さず）。
【００４３】
本発明で請求する希釈剤中の薬物の希釈液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）９６穴受けプレート（ＰＴＦＥ樹脂／ポリプロピレン混合物）、ポリプロピレンから形成した９６ウェルプレート、およびＰＴＦＥ樹脂から形成した９６ウェルプレート中で様々な薬物を用いて試験し、すべてにおいてＮＢＳが有意に低下したことが示された。結果を図３に示す。
【００４４】
希釈剤中で希釈した結果として観察された薬物ＮＳＢの劇的な低下に加えて、この希釈剤はｉｎ  ｖｉｖｏ「移動相」に最もよく似ているので、幅広いアッセイにおける理想的な希釈剤であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の一実施形態で有用な装置の横断面を示す図である。
【図２】実施例のデータを示すグラフである。
【図３】実施例のデータを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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