(57)【要約】特殊な特性を有する細胞の単離された集団を含むマイクロ器官培養物が記載される。本発明のマイクロ器官培養物の顕著な特徴としては、比較的長時間、培養中で維持される能力、ならびに例えば、供給源の器官に存在する器官微小構造と類似の細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用を容易にする器官微小構造の保存が挙げられる。本発明のマイクロ器官培養物はレシピエント被検体に遺伝子産物を送達する方法において、細胞増殖及び細胞分化剤を同定する方法において、及び前駆体及び幹細胞を同定して単離する方法において用いられることができる。加えて、本発明のマイクロ器官培養物は細胞増殖、細胞分化及びウイルス感染性の阻害剤を同定する方法において用いられることができる。他の実施態様において、マイクロ器官培養物は移植のために用いられることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体であって、前記マイクロ器官外植体が細胞の集団を含み、前記マイクロ器官外植体がそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性とマイクロ器官外植体中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有しており、マイクロ器官外植体の細胞の前記集団の細胞の少なくともいくつかが少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項２】
前記少なくとも一種の組換え遺伝子産物が組換えタンパク質及び組換え機能的ＲＮＡ分子からなる群から選択される請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項３】
前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常生産されるものである請求項２に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項４】
前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常は生産されないものである請求項２に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項５】
前記組換えタンパク質がマーカータンパク質である請求項２に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項６】
前記組換えタンパク質がインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、チトクロームｐ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ、血清胸腺因子、胸腺体液因子、サイモポイエチン、サイモシンα１，増殖ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球新生因子（ヘパトポエチン）、肝細胞増殖因子、インターロイキン、負の増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子−βファミリー、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ及び転写因子からなる群から選択されたものである請求項２に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項７】
培養物中で少なくとも２４時間の間維持可能である請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項８】
式１／ｘ＋１／ａ＞１．５ｍｍ−１により特徴付けられる表面積−容積指数（式中、ｘはミリメートルでの組織の厚さであり、ａはミリメートルでの前記組織の幅である）を有する請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項９】
前記器官がリンパ器官、膵臓、肝臓、胆嚢、腎臓、消化管器官、呼吸管器官、生殖器官、皮膚、尿道管器官、血液関連の器官、胸腺及び脾臓からなる群から選択されたものである請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１０】
外植体が得られた器官の微小構造に類似する微小構造に配列された上皮及び結合組織細胞を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１１】
器官が膵臓であり、細胞の集団がランゲルハンス島を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１２】
器官が皮膚であり、外植体が少なくとも一つの毛包及び腺を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１３】
器官が病気の皮膚であり、外植体が病気の皮膚からの過剰増殖性の又は新生増殖性の細胞の集団を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１４】
外植体が最小培地中で維持可能である請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１５】
外植体の保持された微小構造が、外植体が単離された器官の二つ以上の組織の間の一つ以上の細胞−細胞及び細胞−マトリックス配向を含む請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１６】
細胞の集団の少なくとも一部分が前記組換え遺伝子産物をコードする組換え遺伝子を担持する組換えウイルスに感染されている請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１７】
前記組換えウイルスが組換え肝炎ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えパピローマウイルス、組換えヘルペスウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えサイトメガロウイルス及び組換えシミアンウイルス（ＳＶ）からなる群から選択された組換えウイルスである請求項１６に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１８】
細胞の集団の少なくとも一部分がリン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入及びレセプター媒介取り込みからなる群から選択される形質転換法を介して外因性核酸配列で形質転換されたものである請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体。
【請求項１９】
請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体によってならされかつ前記組換え遺伝子産物を含む馴化培地。
【請求項２０】
請求項１に記載の遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体を含む医薬製剤。
【請求項２１】
以下のステップを含む、少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現するマイクロ器官外植体の生産方法：
（ａ）動物から細胞の集団を含む器官の一部分を単離し（ただし、前記器官の一部分はそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性と前記器官の一部分中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有している）；そして
（ｂ）前記器官の一部分の細胞の集団の細胞の少なくともいくつかを組換え遺伝子で遺伝的に改変して少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現させる。
【請求項２２】
前記少なくとも一種の組換え遺伝子産物が組換えタンパク質及び組換え機能的ＲＮＡ分子からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常生産されるものである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常は生産されないものである請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えタンパク質がマーカータンパク質である請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記組換えタンパク質がインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、チトクロームｐ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ、血清胸腺因子、胸腺体液因子、サイモポイエチン、サイモシンα１，増殖ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球新生因子（ヘパトポエチン）、肝細胞増殖因子、インターロイキン、負の増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子−βファミリー、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ及び転写因子からなる群から選択されたものである請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が培養物中で少なくとも２４時間の間維持可能である請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が式１／ｘ＋１／ａ＞１．５ｍｍ−１により特徴付けられる表面積−容積指数（式中、ｘはミリメートルでの組織の厚さであり、ａはミリメートルでの前記組織の幅である）を有する請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記器官がリンパ器官、膵臓、肝臓、胆嚢、腎臓、消化管器官、呼吸管器官、生殖器官、皮膚、尿道管器官、血液関連の器官、胸腺及び脾臓からなる群から選択されたものである請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が、外植体が得られた器官の微小構造に類似する微小構造に配列された上皮及び結合組織細胞を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
器官が膵臓であり、細胞の集団がランゲルハンス島を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
器官が皮膚であり、外植体が少なくとも一つの毛包及び腺を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
器官が病気の皮膚であり、外植体が病気の皮膚からの過剰増殖性の又は新生増殖性の細胞の集団を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
外植体が最小培地中で維持可能である請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
外植体の保持された微小構造が、外植体が単離された器官の二つ以上の組織の間の一つ以上の細胞−細胞及び細胞−マトリックス配向を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
細胞の集団の少なくとも一部分が前記組換え遺伝子産物をコードする組換え遺伝子を担持する組換えウイルスに感染される請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記組換えウイルスが組換え肝炎ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えパピローマウイルス、組換えヘルペスウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えサイトメガロウイルス及び組換えシミアンウイルス（ＳＶ）からなる群から選択された組換えウイルスである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞の集団の少なくとも一部分がリン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入及びレセプター媒介取り込みからなる群から選択される形質転換法を介して外因性核酸配列で形質転換される請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
以下のステップを含む、遺伝子産物をレシピエントに送達する方法：
（ａ）少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現するマイクロ器官外植体であって、前記マイクロ器官外植体が細胞の集団を含み、前記マイクロ器官外植体がそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性とマイクロ器官外植体中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有しており、マイクロ器官外植体の細胞の前記集団の細胞の少なくともいくつかが少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現するマイクロ器官外植体を準備し；そして
（ｂ）マイクロ器官外植体をレシピエントに移植する。
【請求項４０】
前記マイクロ器官外植体がレシピエントから由来する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記マイクロ器官外植体がドナーから由来する請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記マイクロ器官外植体がヒトから由来する請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記マイクロ器官外植体が非ヒト動物から由来する請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
レシピエントがヒトである請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
レシピエントが非ヒト動物である請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも一種の組換え遺伝子産物が組換えタンパク質及び組換え機能的ＲＮＡ分子からなる群から選択される請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常生産されるものである請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組換えタンパク質が、マイクロ器官外植体が由来する器官によって通常は生産されないものである請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記組換えタンパク質がマーカータンパク質である請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記組換えタンパク質がインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、チトクロームｐ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ、血清胸腺因子、胸腺体液因子、サイモポイエチン、サイモシンα１，増殖ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球新生因子（ヘパトポエチン）、肝細胞増殖因子、インターロイキン、負の増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子−βファミリー、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ及び転写因子からなる群から選択されたものである請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が培養物中で少なくとも２４時間の間維持可能である請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が式１／ｘ＋１／ａ＞１．５ｍｍ−１により特徴付けられる表面積−容積指数（式中、ｘはミリメートルでの組織の厚さであり、ａはミリメートルでの前記組織の幅である）を有する請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記器官がリンパ器官、膵臓、肝臓、胆嚢、腎臓、消化管器官、呼吸管器官、生殖器官、皮膚、尿道管器官、血液関連の器官、胸腺及び脾臓からなる群から選択されたものである請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体が、外植体が得られた器官の微小構造に類似する微小構造に配列された上皮及び結合組織細胞を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
器官が膵臓であり、細胞の集団がランゲルハンス島を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
器官が皮膚であり、外植体が少なくとも一つの毛包及び腺を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
器官が病気の皮膚であり、外植体が病気の皮膚からの過剰増殖性の又は新生増殖性の細胞の集団を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
外植体が最小培地中で維持可能である請求項３９に記載の方法。
【請求項５９】
外植体の保持された微小構造が、外植体が単離された器官の二つ以上の組織の間の一つ以上の細胞−細胞及び細胞−マトリックス配向を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項６０】
細胞の集団の少なくとも一部分が前記組換え遺伝子産物をコードする組換え遺伝子を担持する組換えウイルスに感染されている請求項３９に記載の方法。
【請求項６１】
前記組換えウイルスが組換え肝炎ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えパピローマウイルス、組換えヘルペスウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えサイトメガロウイルス及び組換えシミアンウイルス（ＳＶ）からなる群から選択された組換えウイルスである請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
細胞の集団の少なくとも一部分がリン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入及びレセプター媒介取り込みからなる群から選択される形質転換法を介して外因性核酸配列で形質転換されたものである請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
前記ステップ（ｃ）に先立って前記遺伝的に改変されたマイクロ器官培養物をカプセル化するステップをさらに含む請求項３９に記載の方法。
【請求項６４】
ステップ（ａ）が以下のステップにより行われる請求項３９に記載の方法：
（ｉ）動物から細胞の集団を含む器官の一部分を単離し（ただし、前記器官の一部分はそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性と前記器官の一部分中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有している）；そして
（ｉｉ）前記器官の一部分の細胞の集団の細胞の少なくともいくつかを組換え遺伝子で遺伝的に改変して少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現させる。
【請求項６５】
前記ステップ（ａ）が前記組換え遺伝子産物を発現するトランスジェニック動物の器官から前記マイクロ器官外植体を得ることによって行われる前記請求項３９に記載の方法。
【請求項６６】
トランスジェニック動物から細胞の集団を含む器官の一部分を単離するステップを含む、少なくとも一種の遺伝子産物を発現するマイクロ器官外植体の生産方法であって、前記器官の一部分がそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性と前記器官の一部分中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有しており、器官の一部分の細胞の前記集団の細胞の少なくともいくつかが少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する方法。
【請求項６７】
少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する遺伝的に改変されたマイクロ器官外植体をカプセル化したポリマーデバイスを含む医療デバイスであって、前記マイクロ器官外植体が細胞の集団を含み、前記マイクロ器官外植体がそれが由来する器官の微小構造を維持しており、同時に、マイクロ器官外植体中の細胞に十分な栄養物とガスを拡散させ、かつ細胞廃棄物をマイクロ器官外植体から拡散させて、細胞毒性とマイクロ器官外植体中の廃棄物の蓄積及び不十分な栄養物が原因で付随して起こる死とを最小限にするように選択された寸法を有しており、マイクロ器官外植体の細胞の前記集団の細胞の少なくともいくつかが少なくとも一種の組換え遺伝子産物を発現する医療デバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
真核生物細胞培養は、１９５０年代初頭に初めて達成された。それ以来、広範な形質転換細胞および初代細胞が、広範な種々の培地および規定された補充物、例えば、増殖因子およびホルモン、ならびに規定されていない補充物、例えば、血清および他の身体の抽出物を用いて培養されている。例えば、動物の皮膚から得られた線維芽細胞は、多くの細胞継代を通じて、核型で二倍体細胞としてまたは不定性で樹立された細胞株として、慣用的に培養されている。しかし上皮細胞は、線維芽細胞とは異なる形態学的特性および増殖特性を有しており、培養することがさらに困難である。さらに、上皮細胞および線維芽細胞を同じ培養物中で培養する場合、上皮細胞は一般に線維芽細胞によって過剰増殖される。
【０００２】
２次元での細胞の増殖は、培養中で細胞を調製、観察および研究するために便利な方法であって、高速の細胞増殖を可能にするが、インビボにおける組織全体の細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用の特徴を欠く。
【０００３】
このような機能的相互作用および形態学的相互作用を研究するため、少数の研究者が以下のような３次元の基質の使用を探究している：コラーゲンゲル（Ｄｏｕｇｌａｓら（１９８０）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １６：３０６〜３１２；Ｙａｎｇら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：３４０１；Ｙａｎｇら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：２０８８〜２０９２；Ｙａｎｇら（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１：１０２１〜１０２７）；セルローススポンジ単独（Ｌｅｉｇｈｔｏｎら（１９５１）Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１２：５４５〜５６１）、またはコーティングされたコラーゲン（Ｌｅｉｇｈｔｏｎら、（１９６８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２８：２８６〜２９６）；ゼラチンスポンジ、Ｇｅｌｆｏａｍ（Ｓｏｒｏｕｒら（１９７５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．４３：７４２〜７４９）。
【０００４】
クローンコンピテントな方式で上皮細胞を増殖するために、種々の培養条件が使用されている。例えば、上皮細胞および詳細には皮膚上皮細胞（ケラチノサイト）は、以下の上で培養される：致死的に照射した線維芽細胞の支持細胞層（Ｒｈｅｉｎｈａｒｄｔら（１９７５）Ｃｅｌｌ  ６：３３１〜３４３）および半合成コラーゲンマトリックス（米国特許第５２８２８５９号；欧州特許出願第０３６１９５７号）。いくつかの場合に、このような細胞を増殖させるために用いられる培地は、下垂体抽出物および血清、ならびに増殖補充物、例えば、上皮増殖因子およびインスリンを含む生物学的抽出物を添加することによって操作される（Ｂｏｉｓｓｅａｕら（１９９２）Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ３（２）：１１１〜１２０；米国特許第５２９２６５５号）。
【０００５】
インビトロにおいて皮膚増殖の際に多くの試みが行なわれている。これらの試みは代表的には、真皮の線維芽細胞および脂肪細胞から表皮のケラチノサイトを分離する工程を包含する。分離後、ケラチノサイトは一般に、層化された表皮の形成を可能にする方式で増殖される。しかし、この方式で調製された表皮は、毛包および汗腺を欠く。さらに、このような培養物においては、表皮と真皮との間の自然な関係は保存されていない。生存不能な線維芽細胞におけるケラチノサイトの増殖を含む培養方法（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄら（１９７５）Ｃｅｌｌ  ６：３３１〜３４３）、または合成であるか、もしくは表皮の真皮基質由来の別の供給源に由来する、コラーゲンおよび線維芽細胞の真皮基質上へのケラチノサイトの配置（Ｓｕｇｉｈａｒａら（１９９１）Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１４２〜１４６；Ｐａｒｅｎｔｅａｕら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５（３）：２４５−２５１）も行なわれている。しかし、いくつかの場合、ケラチノサイトの分離は、実施されておらず、そして器官全体が培養中に置かれる。インビトロにおける培養器官に対する試みは、血清含有培地における器官のインキュベートに限定されている（Ｌｉら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８（５）：１０８〜１１２）。
【０００６】
表皮の既存のインビトロモデルのほとんどは、毛包、汗腺および皮脂腺を欠く（表皮細胞培養の概説については、Ｃｏｕｌｏｍｂら（１９９２）Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ  ４０（２）：１３９〜１４６を参照のこと）。例外としては、２×５ｍｍ２の寸法および２．０ｍｍの厚みを有する皮膚外植体が血清含有培地の存在下で数日間生存したままである、Ｌｉらのゲル支持皮膚モデルが挙げられる（（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ８９：８７６４〜８７６８）。
【０００７】
細胞損傷の欠点に加えて、哺乳動物細胞を培養するバイオリアクターおよび他の方法はまた、インタクトな生物体における実際の組織の空間的な三次元形態をシミュレートする、細胞が組織に構築される条件を提供する能力において極めて限定されている。従来の組織培養プロセスは、同様の理由のせいで、哺乳動物細胞の分化、ならびに研究および薬学的な目的の専門的な生物学的に活性な分子の分泌に重要であると考えられる、高度に機能的に特殊化されたかまたは分化された状態を培養された組織が表現する能力を、制限する。微生物と異なり、哺乳動物のような高等生物の細胞はそれ自体が、高次の多細胞組織を形成する。この自己構築の正確な機構は未知であるが、今までに研究された状況では、細胞の組織への発達は、細胞のお互い（同じかまたは異なるタイプの細胞）に対する位置関係、または他の固着基質、および／またはホルモンのような特定の物質（因子）の有無、自己分泌、またはパラ分泌に依存していることが見出されている。要するに従来は、インビボの組織構造の優れたモデリングを可能にするのに十分な低い剪断応力、十分な３次元の空間自由度、および十分に長い期間の臨界の細胞相互作用（お互いとまたは基質との相互作用）を同時に達成することが可能である培養プロセスは、なかった。
【０００８】
従って、細胞培養が長期間にわたってその天然の細胞間の関係を保存する、培養中で器官の一部を生成しかつ維持するインビトロ方法が必要である。有効な組織および器官のモデルであって、細胞分化、細胞増殖および細胞機能がインビボにおいて組織全体で見出されるものを模倣するモデルは、器官が健常状態で維持され、結果としてどのようにして異常な事象が逆転され得るかという機構を理解するのに有用である。
【０００９】
発明の要約
本発明は、上述の必要性に取り組むインビトロのマイクロ器官（ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎ）培養物を提供する。本発明のマイクロ器官培養物の顕著な特徴としては、比較的長時間、例えば少なくとも約２４時間、好ましくは少なくとも７日間以上、培養中で維持される能力、ならびに例えば、供給源の器官に存在する細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用と類似の細胞間および細胞−マトリックス間の相互作用を容易にする器官微小構造の保存が挙げられる。
【００１０】
代表的には、マイクロ器官培養物の細胞の集団の少なくとも１つの細胞は、増殖する能力を有する。マイクロ器官培養物における細胞の集団は全体として平衡の状態にあってもよい。すなわち細胞の集団において細胞の損失に対する細胞増殖の比率が約１であるか、またはマイクロ器官培養物における細胞は、それらが損失されるよりも大きい速度で増殖され得、結果として細胞の集団における細胞損失に対する細胞増殖の比率は、例えば、新生物組織から得られた細胞の集団、または例えば、外植体中で増殖するように誘導された前駆体細胞集団におけるように、１より大きくなる。
【００１１】
マイクロ器官培養物の細胞を単離することができる好ましい器官としては、以下が挙げられる：リンパ器官、例えば、胸腺および脾臓；消化器官、例えば、腸、肝臓、膵臓、胆嚢および胆管；肺；生殖器官、例えば、前立腺および子宮；乳房、例えば、乳腺；皮膚；尿路器官、例えば、膀胱および腎臓；角膜；および骨髄のような血液関連器官。マイクロ器官増殖の単離された細胞集団は、特定の実施形態において、例えば、被験体への細胞または細胞産物（例えば遺伝子産物）の送達のために、高分子デバイス内に封入されてもよい。本発明はまた、本発明のマイクロ器官培養物から単離された馴化培地に関する。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、マイクロ器官培養物は、器官の一部である細胞の集団を含む。好ましくは、このマイクロ器官外植体は、上皮および結合組織細胞を含む。本発明の１つの実施形態において、器官外植体は、膵臓から得られ、例えば、細胞集団の微小構造は実質的に、この外植体が由来する、もとの膵臓の微小構造と同じであり、膵臓の上皮細胞、例えば、島細胞および膵臓結合組織細胞を含む。
【００１３】
本発明の別の実施形態において、マイクロ器官外植体は、皮膚から得られ、例えば、集団細胞の微小構造は、インビボにおける皮膚の微小構造と実質的に同じであり、そして皮膚上皮、例えば、表皮細胞および皮膚結合組織細胞、例えば、真皮細胞を含む。皮膚外植体から得られるマイクロ器官培養物はまた、表皮細胞を支持する基底膜、真皮細胞を含む細胞外マトリックス、および少なくとも１つの陥入、例えば、少なくとも１つの毛包または腺を備えてもよい。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、マイクロ器官培養物は、肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎、またはヒトパピローマ（乳頭腫）ウイルス（ＨＰＶ）、例えばＨＰＶ−６、ＨＰＶ−８もしくはＨＰＶ−３３のようなウイルスに感染された細胞の単離された集団を含む。ウイルスに感染された場合、マイクロ器官培養物は、ウイルス感染力のインヒビターを特定するための方法において用いることができる。この方法は、本発明の方法によってマイクロ器官外植体を単離する工程を包含するが、この外植体は、ウイルス感染された器官由来であるか、または引き続きインビトロでウイルスに感染されて、この移植体においてウイルス感染した細胞の集団を生じる。次いでこの外植体は、例えば、抗ウイルス活性について試験されている因子である、候補の因子と接触されてもよく、そしてこの候補因子の存在下における感染性のレベル（例えば、ウイルス負荷、新感染性など）が測定されて、候補因子の非存在下におけるこのウイルスによる感染性のレベルに対して比較される。候補因子の存在下におけるこのウイルスの感染性のレベルの低下は、ウイルス感染性のインヒビターの指標である。
【００１５】
本発明はまた、マイクロ器官培養物を生成するための方法に関する。この方法は、哺乳動物のドナー被験体から、最小培地中で少なくとも約２４時間維持可能な細胞の単離された集団を提供する寸法を有する、マイクロ器官外植体を単離する工程を包含する。次いで、このマイクロ器官外植体を培養中に置く。代表的にはこの外植体は、この外植体が単離される器官の微小構造を有する細胞の単離された集団を含む。本発明の１つの実施形態において、この外植体の少なくとも１つの細胞は、増殖する能力を有する。被験体のマイクロ器官培養物の細胞は、平衡の状態であってもよく、すなわち、細胞の集団における細胞損失に対する細胞増殖の比率は１であるか、またはマイクロ器官培養物における細胞は、それらが損失されるよりも大きい速度で増殖することが可能であって、結果として細胞の集団において、細胞損失の集団における細胞の損失に対する細胞増殖の比率は１より大きくなり、例えば、マイクロ器官外植体は、新生物組織から得られた細胞の集団を含む。
【００１６】
マイクロ器官培養物の細胞を単離することができる好ましい器官としては、リンパ器官、例えば、胸腺および脾臓；消化管器官、例えば、腸、肝臓、膵臓、胆嚢および胆管；肺；生殖器官、例えば、前立腺および子宮；乳房；皮膚；尿管器官、例えば、膀胱；腎臓；角膜；および骨髄のような血液関連器官が挙げられる。これらの各々の例において、器官の微小構造は、培養された外植体によって維持される。マイクロ器官培養物は、組織切片、例えば、β島細胞を含む膵臓組織切片、例えば、表皮細胞および真皮細胞および他の皮膚特異的構造特徴、例えば毛包を備える皮膚組織切片であってもよい。
【００１７】
マイクロ器官外植体における細胞はまた、組み換えタンパク質を発現するように改変されてもよい。このタンパク質は、この外植体が由来する器官によって通常発現されてもされなくてもよい。例えば、膵臓によって通常生成され、本発明のトランスジェニック方法によって増大され得る、例えば、欠乏症を補正するための遺伝子産物としては、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、およびアミラーゼが挙げられる；同様に、肝臓によって通常生成され、遺伝子補充療法によって補完され得る遺伝子産物としては、血液凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、およびチトクロームｐ４５０酵素が挙げられる；胸腺によって通常生成される遺伝子産物としては、血清胸腺因子、胸腺ホルモン因子、サイモポイエチンおよびサイモシンα１が挙げられる。
【００１８】
本発明のマイクロ器官培養物は、レシピエント被験体に対して遺伝子産物を送達するための方法において用いることができる。この方法は、ドナー被験体から単離された細胞の集団を提供する工程を包含する。この細胞の集団は、この細胞が単離される組織または器官の微小構造、および少なくとも約２４時間、最小培地中で維持可能な細胞の単離された集団を提供する表面積対容積を有する。次いで、所望の遺伝子産物をコードしかつ発現を指向する組み換え核酸を細胞の集団に導入して、マイクロ器官外植体、例えば、トランスジェニック外植体においてトランスジェニック細胞の集団を生成することができる。トランスジェニック外植体はレシピエント被験体に投与されてもよい。ドナー被験体およびレシピエント被験体は、同じ種の被験体であっても、異なる種の被験体であってもよい。
【００１９】
本発明のマイクロ器官培養物はまた、前駆細胞を含む、所定の器官の細胞の増殖を誘導する因子を同定するための方法において用いることができる。この方法は、本発明によるマイクロ器官外植体培養を生成する工程を包含するが、この外植体は、増殖する能力を有する少なくとも１つの細胞を含む。培養物に入れられた後、この外植体は、候補化合物、例えば、細胞増殖能について試験されるべき化合物と接触され、そしてこの候補化合物の存在下での細胞増殖のレベルが測定される。次いで、この候補化合物の存在下での細胞増殖の測定されたレベルを、候補化合物の非存在下での細胞増殖のレベルと比較する。候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルの増大は、細胞増殖因子の指標である。細胞増殖のインヒビターは、同様の方法を用いて同定することができる。詳細には、候補化合物の存在下で測定された細胞増殖のレベルが、上記の方法を用いて決定される場合、候補化合物の非存在下での細胞増殖のレベルに対してこれを比較することができる。候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルの減少は、細胞増殖のインヒビターの指標である。
【００２０】
本発明のマイクロ器官培養物を、所定の器官における１つ以上の細胞タイプの分化を誘導もしくは阻害する因子、または特定の分化した状態を維持する（脱分化を防止する）因子を同定するための方法において用いることができる。この方法は、目的の器官からマイクロ器官外植体生成する工程を包含する。この外植体を構成する細胞の集団は、本明細書において以下に記載されるように、その器官の微小構造、少なくとも約１．５ｍｍ−１のアレフを有し、そして分化する能力を有するか、または分化されて脱分化する能力を有する少なくとも１つの細胞を含む。一旦培養されれば、細胞の集団は、候補化合物と接触されて、この化合物の存在下での細胞分化のレベルが測定される。候補化合物の存在下における細胞分化の測定されたレベルは、候補化合物の非存在下における細胞分化のレベルと比較される。候補化合物の存在下における細胞分化のレベルの増大は、細胞分化因子の指標である。細胞分化のインヒビターは、同様の方法を用いて同定することができる。詳細には、候補化合物の存在下における細胞分化の測定されたレベルを、上記の方法を用いて決定する場合、これを候補化合物の非存在下における細胞分化のレベルに対して比較することができる。候補化合物の存在下における細胞分化のレベルの低下は、細胞分化のインヒビターの指標である。
【００２１】
本発明のなお別の局面は、器官から幹細胞または前駆体細胞集団を同定および単離するための方法を提供する。この方法は一般に、器官由来の細胞の集団の外植体を培養中で単離する工程を提供する。本明細書において記載されるとおり、この外植体は、以下によって特徴付けられる：（ｉ）この外植体が由来する器官の微小構造をこの培養中で維持すること、（ｉｉ）少なくとも約１．５５ｍｍ−１の表面積対容積指数（アレフ）、および（ｉｉｉ）増殖する能力を有する少なくとも１つの前駆細胞または幹細胞。この外植体は、この外植体において細胞の別個の集団を増殖するために、前駆体または幹細胞の増殖を誘導する因子、例えば、増殖因子または他のマイトジェンと接触させられる。引き続き、この増殖された前駆細胞は、外植体から単離されてもよい。この外植体のこのような亜集団は、それらの増殖応答のおかげで同定することができる。他の実施形態では、前駆体／幹細胞は、外因性の因子の追加がなくても培養中で同時に増殖する。他の実施形態では、例えば、この外植体の残りから新たに出現する芽の直接の機械的分離によって、またはこの外植体の全てもしくは一部の分離および増幅された細胞集団の引き続く単離によって、この因子に応答して増殖する外植体から、前駆体または幹細胞を単離することができる。
【００２２】
本発明のマイクロ器官培養物を用いることができるさらに別の方法は、レシピエント被験体において創傷治癒を促進するための方法において用いることができる。この方法は、少なくとも約１．５ｍｍ−１のアレフを有する細胞の集団であるドナー被験体から単離する工程、およびレシピエント被験体の創傷に対して細胞の集団を付加する工程を包含する。このドナー被験体およびレシピエント被験体は、同じ種の被験体であっても異なる種の被験体であってもよい。１つの実施形態においては、細胞を単離した組織は皮膚であり、そしてレシピエント被験体の創傷は潰瘍、例えば、糖尿病関連の潰瘍である。
【００２３】
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献中に詳細に説明される。例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓによる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４６８３１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）。
【００２４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明白である。
図面の簡単な記述
図１は、アレフ（Ａｌｅｐｈ）を決定する寸法を描写するマイクロ器官の図表示であり、ここでｘ＝組織の厚みであり、ａ＝組織の幅である。
図２は、異なる時間のインキュベーション後のＢｒｄＵ標識によって決定される、モルモットのマイクロ器官培養物における細胞増殖を示す棒グラフである。
図３は、１〜８日間の培養物のインキュベーション後のＢｒｄＵ標識によって決定される、ヒトのバックスキンのマイクロ器官培養物における細胞増殖を示す棒グラフである。
図４Ａ〜４Ｄは、マウス皮膚（倍率５０×）（図４Ａ）、モルモット皮膚（倍率７５×）（図４Ｂ）、ヒト包皮（倍率５０×）（図４Ｃ）およびヒト包皮（倍率７５×）（図４Ｄ）の複製している細胞に対応する免疫蛍光を示す顕微鏡写真である。
図５Ａ〜５Ｃは、ヒト表皮マイクロ器官外植体の横断面（倍率７５×）であって、培養の０日目（図５Ａ）、３日目（図５Ｂ）、および６日目（図６Ｄ）の組織構造を示す。
図６は、ＢｒｄＵ取り込みを用いて、モルモット皮膚のマイクロ器官培養物の種々の厚み（×）の表皮増殖に対する影響を実証する棒グラフであり、ここで（ａ）は、４ｍｍで一定に保たれている。
図７Ａ〜７Ｂは、膵臓由来のマイクロ培養物における増殖中の細胞に対応する免疫蛍光を示す顕微鏡写真である（倍率７５×）。
図８は、成体ブタの膵臓マイクロ器官培養物によって放出されたインスリンの量を示す棒グラフである。
図９は、培養の３日目、４日目、および６日目の結腸、肝臓、腎臓、十二指腸および食道のマイクロ器官培養物における増殖中の細胞への３Ｈチミジン取り込みを示す棒グラフである。
図１０Ａ〜１０Ｃは、免疫蛍光によって決定されたマイクロ器官培養物における毛包の活性な増殖を示す顕微鏡写真である。倍率は４０×（図１０Ａ）、４０×（図１０Ｂ）、および７５×（図１０Ｃ）である。
図１１は、マイクロ培養の開始および終了の時点での毛幹のサイズ分布を示す棒グラフである。
図１２は、モルモット皮膚培養物において、２．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下でのマイクロ器官培養物における有糸分裂誘発の阻害を示す棒グラフである。
図１３は、慢性皮膚潰瘍の処置のためのマイクロ器官外植体の図表示であって、インビボで容易に操作可能な構造を維持するような組織切片の不完全な切り出しを示す。
図１４は、マイクロ器官培養物による正常な皮膚の切片の置き換え後のマウスの表面の写真である；治癒、このインプラントにおける新しい毛幹の発生、および正常なマウス皮膚へのこのインプラントの組み込みを観察することができる（倍率１０×）。
図１５は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドを用いた培養物のトランスフェクション後のモルモット皮膚マイクロ器官培養物におけるルシフェラーゼレポーターの発現のグラフ表示である。
図１６は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドを用いた培養物のカチオン性脂質媒介トランスフェクション後のラット肺および胸腺のマイクロ器官培養物におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現のグラフ表示である。
図１７は、本発明のマイクロ器官培養物におけるＦＧＦでの処置の際のテロゲン毛包の活性化のグラフ表示である。
図１８は、本発明のマイクロ器官外植体におけるトランスジェニックルシフェラーゼ遺伝子の発現のグラフ表示である。
【００２５】
発明の詳細な記述
本発明は、３次元の器官外植体培養システムに関する。この培養システムは、インビボにおいて器官全体において見出される環境に密接に近似する環境における、インビトロでのマイクロ器官外植体の長期増殖のために用いることができる。本明細書において記載される培養システムは、インビボにおいて器官の対応物に対して類似の構造を維持するように増殖および適切な細胞成熟を提供する。
【００２６】
本発明のマイクロ器官培養物は、インビトロ培養システムを提供するが、ここでは組織または器官切片を長期間、維持し、そしてそれらの機能を保存することができる。これらの培養システムは、インビトロモデルを提供するが、ここでは細胞分化、細胞増殖、細胞機能、ならびにこのような細胞の特徴および機能を変更する方法を便利にかつ正確に試験することができる。得られた培養物は、インビボにおける移植から、インビトロにおける細胞傷害性化合物および薬学的化合物をスクリーニングすること、「バイオリアクター」における生物学的に活性な分子の産生、ならびに組織からの前駆体細胞の単離、までにおよぶ種々の用途を有する。
【００２７】
例えば、限定はしないが、本発明の特定の実施形態としては、以下が挙げられる：（ｉ）化学療法処置の間に破壊された骨髄を置換するために用いられたマイクロ器官骨髄培養物インプラント；（ｉｉ）肝硬変患者において肝臓機能を増強するために用いられるマイクロ器官肝臓インプラント；（ｉｉｉ）被験体のマイクロ器官培養物において増殖した遺伝子的に変化した細胞（例えば、インスリンをコードする組み換え遺伝子を発現する膵臓のマイクロ器官）；および（ｉｖ）口腔粘膜のマイクロ器官培養物に結合された歯科補綴物。
【００２８】
なお他の例示的な非限定的実施形態において、本発明のマイクロ器官培養物は、広範な種々の化合物、例えば、細胞傷害性化合物、増殖因子／調節因子、薬学的因子などをスクリーニングするためにインビトロで用いることができる。この目的を達成するために、マイクロ器官培養物をインビトロで維持して、試験されるべき化合物に曝露する。細胞傷害性化合物の活性を、例えば、それがこの外植体中の細胞を損傷するかまたは殺傷する能力によって測定することができる。
【００２９】
これは、生体染色技術によって容易に評価することができる。増殖因子／調節因子の効果は、例えば総細胞含量および異なる細胞含量によって、この外植体の細胞含量を解析することにより、評価することができる。これは、タイプ特異的な細胞抗原を規定する抗体を使用して免疫細胞科学技術の使用を含む、標準的な細胞学的技術および／または組織化学的技術を用いて達成することができる。三次元システムにおいて、培養された正常な細胞に対する種々の薬物の効果を評価することができる。例えば、赤血球形成を増大する薬物は、骨髄マイクロ器官培養物に対して試験することができる。例えば、コレステロール産生を低下させることによってコレステロール代謝に影響する薬物は、肝臓マイクロ器官に対して試験することができる。過剰増殖障害または新生増殖障害の研究を容易にするなどのためにも異常な組織のマイクロ器官培養物を用いることができる。例えば、増殖した腫瘍細胞に侵入された器官のマイクロ器官外植体は、例えば、抗腫瘍因子の有効性を試験するためにモデルシステムとして用いることができる。
【００３０】
便宜のために、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用した特定の用語を、ここに収集する。
【００３１】
「外植体」という用語は、身体から採取され人工的な培地中で増殖された、ある器官由来の細胞の集合をいう。間質性成分および上皮成分の両方を有する器官由来の外植体をいう場合、この用語は一般に、その器官由来の単一の外植体において両方の成分を含む外植体をいう。
【００３２】
「組織」という用語は、一緒になって特定の専門的な機能を実施する類似の特殊化された細胞の群または層をいう。
【００３３】
「器官」という用語は、組織の２つ以上の隣接する層であって、この組織の層が細胞間および／または細胞−マトリックスの相互作用のいくつかの形態を維持して、微小構造を生成する層をいう。本発明において、マイクロ器官培養物は、例えば、哺乳動物の皮膚、哺乳動物の膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、食道、膀胱、角膜、前立腺、骨髄、胸腺および脾臓のような器官から調製した。
【００３４】
「間質」という用語は、器官の支持組織またはマトリックスをいう。
【００３５】
「マイクロ器官培養物（ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、細胞の単離された集団、例えば、細胞が単離される器官または組織の微小構造を有する外植体をいう。すなわち、単離された細胞は一緒になって、空間的相互作用、例えば、細胞間、細胞−マトリックスおよび細胞−間質の相互作用、ならびにこの外植体が由来した現実の組織およびインタクトな生物体の配向をシミュレート／保持する三次元構造を形成する。従って、間質層と上皮層との間のこのような相互作用は、外植された組織において保存され、その結果、臨界の細胞相互作用が、例えば、自己分泌およびパラ分泌因子、ならびにこの外植体の生物学的機能を維持する他の細胞外刺激を提供し、そして十分な栄養および廃棄物輸送がそのサンプル全体にわたって生じる条件下で長期の生存を提供する。
【００３６】
本発明のマイクロ器官培養物は、細胞または組織外植体が単離される器官または組織の微小構造を有する。本明細書において用いる場合、「微小構造（ｍｉｃｒｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）」という用語は、細胞または組織の外植体の単離された集団であって、ここでこの細胞の集団の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％以上が、インビトロにおいて、少なくとも１つの細胞または非細胞性物質とのそれらの物理的および／または機能的な接触を維持しており、この物質とそれらの細胞は、インビボで物理的および／または機能的に接触しており、そして少なくとも約１つ、より好ましくは少なくとも約５つ、そして最も好ましくは少なくとも約１０以上の層の細胞培養物を形成する、集団をいう。好ましくは、この外植体の細胞は、それが単離される器官または組織の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【００３７】
「単離された」という用語は、本明細書において用いる場合、生物体におけるその天然の環境から分離された外植体をいう。この用語は、その天然の環境からの全体的な物理的分離、例えば、ドナー動物、例えばヒトまたはミニブタのような哺乳動物からの取り出しを包含する。例えば、「単離された」という用語は、外植体である細胞の集団、外植体の一部として培養されている細胞の集団、または外植体の形態で移植されている細胞の集団をいう。細胞の集団について言及するために用いられる場合、「単離された」という用語は、本発明のマイクロ器官培養物における細胞の増殖から生じる細胞の集団を包含する。
【００３８】
「外胚葉」という用語は、胚の３つの原始胚層の最外側をいう；表皮および表皮組織、例えば、爪、髪、および皮膚の汗腺、神経系、外的感覚器官、ならびに口および肛門の粘膜は、それに由来する。
【００３９】
「上皮」および「上皮組織」という用語は、身体の内面および外面の細胞被覆（皮膚、粘膜、および漿液）をいい、これには、それに由来する腺および他の構造、例えば、角膜、食道、表皮および毛包上皮細胞が含まれる。他の例示的な上皮組織としては、以下が挙げられる：鼻腔の嗅部を裏打ちし、臭いの感覚のためのレセプターを含む偽重層上皮である嗅上皮；腺上皮（これは、分泌細胞から構成される上皮組織をいう）；扁平上皮（これは、扁平な板状細胞から構成される上皮組織をいう）。上皮組織という用語はまた、移行性の上皮をいうこともあるが、これは、収縮および膨張に起因する大きな機械的変化にさらされる中空の器官、例えば、層化した扁平上皮と円柱上皮との間の移行を示す組織を裏打ちすることが特徴的に見出されている。「上皮形成」という用語は、剥皮された表面を覆う上皮組織の増殖による治癒をいう。
【００４０】
「皮膚（ｓｋｉｎ）」という用語は、真皮および上皮から構成される身体の外側の防御的被覆をいい、そして汗腺および脂腺、ならびに毛包構造を含むことが理解される。本出願を通じて、付加的な「皮膚の（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」を用いてもよく、それらが用いられる状況に応じて、一般に皮膚の属性をいうと理解されるべきである。
【００４１】
「表皮」という用語は、胚期の外胚葉由来の皮膚の最外層および導管のない層をいい、これは０．０７〜１．４ｍｍの厚みに及ぶ。手の平および足の裏の表面において、これは、外側から以下の５つの層を含む：垂直に配列された円柱状細胞から構成される基底層；短突起または針を有する平坦な多角形の細胞から構成される有棘細胞または突起のある層；平坦な顆粒細胞から構成される顆粒層；核が不明瞭であるかまたは存在しない、いくつかの層の透明な透過的な細胞から構成される透明な層；および平坦な角化された非有核細胞から構成される角層。全身の体表の表皮において、透明な層は通常存在しない。「類表皮」は、表皮を模倣する細胞または組織であるがまた、非皮膚反応部位において生じる任意の腫瘍をいうために用いてもよく、そして表皮エレメントの封入によって形成されてもよい。
【００４２】
「真皮（ｃｏｒｉｕｍまたはｄｅｒｍｉｓ）」とは、脈管の結合組織の濃密な層からなり、かつ感覚の神経および末端器官を含む、表皮に対して真下の深部の皮膚の層をいう。毛根、ならびに皮脂腺および汗腺は表皮の構造であって、真皮に深く包埋されている。
【００４３】
「腺」という用語は、細胞の普通の代謝要件に関連しない物質を分泌または排泄するように特殊化された細胞の集合をいう。例えば「皮脂腺」は、脂性の物質および皮脂を分泌する真皮のホロクリン腺である。「汗腺」という用語は、汗を分泌する腺であって、真皮または皮下組織に位置し、体表上の管によって開口している腺をいう。通常の汗腺またはエクリン汗腺は、ほとんどの体表にわたって分布しており、そして分泌物の蒸発による冷却を促進する；アポクリン汗腺は、皮膚上に直接ではなく、毛包の上部に入り、そして肛門周囲および腋下のような特定の身体領域にのみ見出される。
【００４４】
「毛（髪）」（または「線毛」）という用語は、糸状の構造であって、特に特殊化した表皮構造をいう。これは、ケラチンからなり、真皮に落ち込んだ乳頭から発達しており、哺乳動物によってのみ生成されて、その群の動物の特徴である。この用語はまたこのような毛（髪）の集合をいう。「毛包」とは、毛（髪）を内包している表皮の管状の陥入であって、これから毛（髪）が成長する管状の陥入の１つをいう；そして「毛包上皮細胞」とは、毛包において真皮によって囲まれている上皮細胞、例えば、幹細胞、外毛根鞘細胞、マトリックス細胞および内毛根鞘細胞をいう。このような細胞は、正常な非悪性細胞であってもよいし、または形質転換細胞／不死化細胞であってもよい。
【００４５】
「脱毛症」という用語は、一般に禿頭、例えば、通常は毛（髪）が存在する皮膚領域から毛（髪）がなくなることをいう。種々の形態の脱毛症が当該分野で知られている。例えば、円形脱毛症は、はっきりと規定された領域の、通常は可逆性の毛（髪）の喪失をいうが、これは通常、あごひげまたは頭髪を含む；薬物性脱毛症とは、薬物の摂取に起因する毛（髪）の喪失をいう；そして男性型脱毛症、または男性型禿頭とは、遺伝的に決定されたアンドロゲン依存性の頭髪の喪失をいい、これは一般に前頭部の後退で開始して、対称的に進行して、最終的には、まばらな周辺の縁の毛（髪）のみが残る。
【００４６】
本出願を通じて、「増殖性皮膚障害」という用語は、皮膚組織の無用であるかまたは異常な増殖によって特徴付けられる皮膚の任意の疾患／障害をいう。これらの状態は代表的には、表皮細胞増殖または不完全な細胞分化によって特徴づけられ、そしてこれらの状態としては例えば、Ｘ連鎖型魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、表皮剥離性角質増殖症および脂漏性皮膚炎が挙げられる。例えば、表皮異形成は、表皮の不完全な発育の形態、例えば、「疣贅状表皮発育異常症」であり、これは尋常性疣贅のウイルスと同一のウイルスまたは密接に関連するウイルスに起因する状態である。別の例は、「表皮剥離」であって、これは自然にまたは外傷の部位のいずれかで水疱の形成を伴う表皮の弛緩した状態をいう。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「乾癬」という用語は、皮膚の調節機構を変更する過剰増殖性皮膚障害をいう。詳細には、表皮増殖における一時的変更および二次的変更、皮膚の炎症性応答、ならびにリンホカインおよび炎症性因子のような調節分子の発現を含む病変が形成される。乾癬皮膚は、表皮細胞の代謝回転の増大、肥厚した表皮、異常な角質化、真皮層への炎症性細胞浸潤、および表皮層への多形核白血球浸潤（基底細胞周期の増大を生じる）によって形態学的に特徴付けられる。さらに、角化性細胞およびパラ角化細胞が存在する。
【００４８】
本明細書において用いる場合、「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇおよびｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」とは、有糸分裂を受けている細胞をいう。
【００４９】
「前駆細胞」という用語は、増殖可能であり、かつ多数の母細胞（次に分化するかまたは分化可能である娘細胞を生じ得る）を生じる能力を有するより多くの前駆細胞を生じることが可能な未分化の細胞をいう。本明細書において用いる場合、「前駆細胞」という用語はまた、当該分野で時に「幹細胞」と呼ばれる細胞を包含することを意図する。好ましい実施形態において、「前駆細胞」という用語は、一般化された母細胞であって、その子孫がしばしば、分化によって、例えば、胚細胞および組織の進行性の多様化において生じるような、完全に個々の特徴を獲得することによって、異なる方向に特殊化する母細胞をいう。例えば、「造血前駆細胞」（または幹細胞）とは、骨髄および他の血液関連器官において生じ、そして例えば、赤血球、リンパ球および他の血液細胞のような分化した子孫を生じる前駆細胞をいう。
【００５０】
本明細書において用いる場合、「形質転換細胞」とは、無制限の増殖の状態に自然に変換した細胞をいい、すなわちそれらは、培養において無限な回数の分裂にわたって増殖する能力を獲得している。形質転換細胞は、増殖制御の喪失に関して、新生物、未分化、および／または過形成のような用語で特徴付けることができる。
【００５１】
本明細書において用いる場合、「不死化した細胞（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌｓ）」とは、細胞が培養において無限の回数の分裂によって増殖する能力を有するように、化学的および／または組み換え方法を介して変更された細胞をいう。
【００５２】
「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤し、かつ転移を生じる傾向である上皮細胞から構成される悪性の新増殖をいう。代表的な癌腫としては、「基底細胞癌腫」が挙げられる。これは、皮膚の上皮腫瘍であって、ただしほとんど転移はせず、局所的な浸潤および破壊の可能性を有する；「扁平上皮細胞癌」とは、扁平上皮から生じ、かつ立方体細胞を有する癌腫をいう；「癌肉腫」は、癌および肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む；「腺細胞癌腫（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」は、乳腺および唾液腺、ならびに呼吸器管の粘液腺に存在する小上皮細胞の巣または索によって分離されるかまたは囲まれる硝子質または粘液性間質の円柱または帯によって印される癌腫である；「類表皮癌」は、表皮の方法と同じ方法で分化する傾向である癌細胞をいう；すなわち、それらは有棘細胞を形成し、角質化を受ける傾向である；「鼻咽頭癌」は、鼻の後ろの空間の上皮裏打ちにおいて生じる悪性腫瘍をいう；そして「腎細胞癌腫」は、種々の配列の管状細胞からなる腎柔組織の癌腫に関する。別の癌腫上皮増殖は、「乳頭腫」であり、これは、上皮に由来し、かつ原因因子としてパピローマウイルス（乳頭腫ウイルス）を有する良性腫瘍をいう；そして「類表皮腫」は、中央の溝の閉鎖の時点で外胚葉性エレメントの封入によって形成された脳腫瘍または髄膜の腫瘍をいう。
【００５３】
本明細書において用いる場合、「トランスジェニック動物」は、任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳動物、鳥または両生類であって、ここで動物の１つ以上の細胞は、人間の介入、例えば当該分野で周知のトランスジェニック技術によって誘導された異種核酸を含む。この核酸は、慎重な遺伝子操作の方法による、細胞の前駆体への導入によって、例えば、組み換えウイルスを用いたマイクロインジェクション、または感染などによって、直接または間接的に細胞に導入される。遺伝子操作という用語は、古典的な交差育種もインビトロの受精も含まず、むしろ組み換えＤＮＡ分子の導入に関する。この分子は、染色体の中に組み込まれてもよいし、または染色体外でＤＮＡを置換してもよい。この用語はまた、例えば、当該分野で記載されたＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性構築物などの、組み換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物を包含する。トランスジェニック動物はまた、構成的な「ノックアウト」動物および条件的な「ノックアウト」動物の両方を含む。本発明の「非ヒト動物（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ａｎｉｍａｌｓ）」としては、げっ歯類、非ヒト霊長類、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などのような脊椎動物が挙げられる。好ましい非ヒト動物は、ミニブタであるか、またはラットおよびマウス、最も好ましくはマウスを含むげっ歯類のファミリーから選択される。「キメラ動物（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｉｍａｌ）」という用語は本明細書において、組み換え遺伝子が見出される動物か、または組み換え体がその動物の全ての細胞ではないがいくつかの細胞で発現される動物をいうために用いられる。
【００５４】
Ｉ．マイクロ器官培養の確立
本発明のマイクロ器官培養の顕著な特徴および方法は、本発明によれば、特定の組織についてインビボで見出される細胞の微小環境を保存する能力である。本発明は、規定された環境下において、器官外植体の異なる組織層、例えば、間充織層および上皮層における細胞の増殖が、培養中で増殖しかつ成熟するように活性化され得るという発見に部分的には基づく。さらに、外植体自体において提供された細胞間の相互作用および細胞−マトリックス間の相互作用は、細胞のホメオスタシス、例えば、外植体培養における細胞の成熟、分化および分離を支持し、それによって組織の微小構造および機能を長期間維持するのに十分である。
【００５５】
細胞と非細胞基質（マトリックス）との間の物理的な接触の例は、上皮細胞とその基底膜との間の物理的な接触である。細胞と別の細胞との間の物理的な接触の例としては、例えば、ギャップ結合および密着結合のような細胞間の細胞結合によって維持される、実際の物理的な接触が挙げられる。１つの細胞と別の細胞との間の機能的な接触の例としては、細胞の間の電気的または化学的な連絡が挙げられる。例えば、心筋細胞は、電気的なインパルスを介して他の心筋細胞と連絡する。さらに、多くの細胞が化学的なメッセージ、例えば、局所的に拡散するか（パラクリンシグナル伝達および自己分泌シグナル伝達）または脈管系によってさらに遠隔の位置に輸送される（内分泌シグナル伝達）かのいずれかであるホルモンを介して他の細胞と連絡する。細胞の間のパラクリンシグナル伝達の例は、消化管の種々の細胞（腸内分泌細胞として公知）、例えば、幽門Ｄ細胞（ソマトスタチンを分泌し、これが次に近傍の幽門胃（Ｇ）細胞によってガストリンの放出を阻害する）によって生成されたメッセージである。
【００５６】
いかなる特定の理論によって拘束されることも望まないが、この微小構造は、例えば、血清も増殖因子もその外因性の供給源なしに、最小培地における外植体の維持のために極度に重要であり得る。なぜならこの組織は、外植体内の特定の細胞相互作用から生じるパラクリンおよび自己分泌因子によって、このような最小培地中で維持され得るからである。
【００５７】
さらに、「インビトロにおいて、それらの物理的接触および／または機能的接触を維持する」という句は、細胞の単離された集団であって、少なくとも１つの細胞が少なくとも１つの細胞または非細胞物質と物理的接触および／または機能的接触を発達させ、この物質とそれらの細胞は、インビボで物理的および／または機能的に接触していない、細胞の単離された集団を排除することを意図しない。このような発達の例は、単離された細胞集団の少なくとも１つの細胞の増殖である。
【００５８】
好ましい実施形態において、外植体を構成する細胞の集団は、外植体に異なる細胞が存在する場合、例えば、この異なる細胞の層を保存するために、１つの細胞の別の細胞に対する天然の親和性を保存する方式で器官から単離される。例えば、皮膚のマイクロ器官培養において、表皮のケラチノサイトは、間質と会合したままであり、そして毛包および腺を含む正常な組織機構は、保存されている。この基礎的な構造は、例えば、上皮成分を含む全ての器官に共通である。さらに、このような会合によって細胞間の連絡が容易になる。多くのタイプの連絡が動物の細胞の間で生じる。これは、分化している細胞においては特に重要である。この分化している細胞では、誘導は、応答している細胞が分化の方向の変化を受ける結果として、１つの（誘導している）組織または細胞と別の（応答している）組織または細胞との間の相互作用として規定される。さらに、誘導性の相互作用は、胚細胞および成体細胞において生じ、そして形態形成的パターンを確立しかつ維持し、そして分化を誘導するように作用し得る（Ｇｕｒｄｏｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１８５〜１９９）。
【００５９】
さらに、本発明によって調製されたマイクロ器官培養物は、長期間培養された場合でさえ、正常な組織構造を保存する。これは、インビトロにおける皮膚マイクロ器官の毛包、汗腺および脂腺であって、インビボにおけるその正常な出現に従うもの（実施例ＶＩＩＩおよび図１０Ａ〜１０Ｃを参照のこと）、または膵臓におけるランゲルハンス島であって、インビボにおけるその正常な出現に従うもの（実施例ＩＶ、ＶおよびＶＩを参照のこと）の維持を含む。これらの培養物は、管理されかつ均一な条件、およびさらにインビボにおいて密接に類似した組織で維持することが可能であるので、それらによって、天然の現象ならびに疾患、加齢または外傷から生じる天然の現象の摂動を観察、測定および制御するための固有の機会が提供される。さらに、この培養物上の同定された部位において個々の細胞を研究するための技術は直ちに利用可能であるので、組織の個々の成分の機能がお互いにそして組織全体と相互作用する場合、この組織の個々の成分に対する洞察が提供される。
【００６０】
本発明によって調製されたマイクロ器官培養物の例は、添付の実施例に記載されており、そして１つの細胞の別の細胞に対する天然の親和性を保存するように複数の層を含み得る方式で分類された細胞の集団を含み得る。個々の細胞または細胞群の増殖は、オートラジオグラフィーまたは免疫蛍光によって観察し追跡することができる。
【００６１】
単にさらなる例示であるが、この添付の実施例によって、被験体の培養システムが、インビトロにおいて、生理学的な条件に匹敵するシステムにおいて、上皮および間質要素の複製を提供することが実証される。重要なことに、このシステムで複製する細胞は、適切に分離して、形態学的にかつ組織学的に正常な表皮および真皮成分を形成する。
【００６２】
もともとの組織の細胞間、細胞−マトリックス間および細胞−間質の構造を保持する外植体の単離に加えて、この外植体の寸法は、例えば、マイクロ器官培養物が長期間、例えば７〜２１日間以上の間、維持されることを意図する場所における、細胞の生存度に重要である。従って、組織外植体の寸法は、十分な栄養物およびガス、例えばＯ２を３次元マイクロ器官におけるあらゆる細胞に拡散するように、そしてマイクロ器官における廃棄物の局在化に起因する細胞毒性および付随する死亡を最小限にするためにこの外植体の外側に細胞の廃棄物を拡散するように選択される。従って、この外植体のサイズは、特殊化された送達構造または合成基質の非存在下において各々の細胞に対する最小レベルの接近可能性についての要件によって決定される。本明細書に記載されるように、この外植体の厚みおよび幅から算出される指数であるアレフが少なくとも約１．５ｍｍ−１より大きい場合、この接近可能性が維持され得るということが発見されている。
【００６３】
本明細書において用いる場合、「アレフ」とは、式１／ｘ＋１／ａ≧１．５ｍｍ−１によって与えられる、表面積対容積比をいう；ここでｘ＝組織の厚みであり、そしてａ＝組織の幅（ミリメートル）である。好ましい実施形態において、外植体のアレフは、１．５〜２５ｍｍ−１の範囲、より好ましくは１．５〜１５ｍｍ−１の範囲、そしてなおより好ましくは１．５〜１０ｍｍ−１の範囲であるが、１．５〜６．６７ｍｍ−１の範囲、１．５〜３．３３ｍｍ−１の範囲のアレフが意図される。
【００６４】
従って、本発明によって、組織外植体の表面積対容積指数は、選択された範囲内に維持される。この表面積対容積の指数の選択された範囲によって、単層における細胞と類似の様式で拡散によって、栄養物に対しておよび廃棄物廃棄の通路に対する細胞の接近が得られる。このレベルの接近可能性は、本明細書において「アレフまたはアレフ指数」として規定された、表面積対容積の指数が少なくとも約１．５ｍｍ−１である場合、達成しかつ維持することができる。３次元は表面積対容積指数を決定するのには無視された。なぜなら、３次元におけるバラツキは、容積および表面積の両方に放射測定のバラツキを生じるからである。しかし、アレフを決定する場合、ａおよびｘは、組織切片の最小の二次元として規定されるべきである。
【００６５】
アレフの例は、表Ｉに提供されており、ここでは例えば、０．１ｍｍの厚み（ｘ）および１ｍｍの幅（ａ）を有する組織が、１１のアレフ指数を有する。実施例Ｉにおいて、この組織はｘ＝０．３ｍｍおよびａ＝４ｍｍを有し、その結果アレフ＝３．４８である。実施例ＩＩＩにおいて、ｘは、変化して、ａは４ｍｍで一定である。図６に例示されるように、増殖性活性は、外植体の厚みの増大につれて実質的に低下される。従って、９００μｍの厚みでは、マイクロ器官培養物中の増殖している細胞の数は、３００μｍの厚みを有する同様の供給源由来の組織における数の約１０分の１である。９００μｍの厚みを有する組織のアレフ指数は、本明細書に記載された最小より下の１．３６ｍｍ−１であるが、３００μｍの厚みを有する組織のアレフ指数は、本明細書に記載された範囲の十分内側である３．５８ｍｍ−１である。
【表１】
2005506084.tif 000002
【００６６】
ここでも、いかなる特定の理論によって拘束されることも望まないが、この３次元培養システムによって提供される多数の要因が、その成功に寄与し得る：
（ａ）例えば、上記のアレフ計算の使用による外植体サイズの適切な選択によって、３次元マトリックスは、外植体の全ての細胞に対する栄養物の適切な拡散のための、およびこの外植体中の全ての細胞からの細胞性廃棄物の十分な拡散のための適切な表面積対容積比を提供する。
（ｂ）マトリックスの３次元性のおかげで、種々の細胞は、単層培養の細胞と対称的に活発に増殖を続ける。単層培養の細胞は、コンフルエンスまで増殖して接触阻害を示し、増殖および分裂を停止する。外植体の細胞を複製することによる、増殖および調節因子の同化作用は部分的に、培養中の細胞の増殖を刺激しかつ分化を調節することを、例えば、全体的容積に関して静止しているマイクロ器官培養についてさえ担う。
（ｃ）３次元マトリックスは、細胞性エレメントの空間的分布を保持しているがこれは、インビボにおける対応する組織において見出されるものに密接に近似する。
（ｄ）細胞間の相互作用および細胞−マトリックス間の相互作用によって、細胞成熟に対して誘導性の局所的な微小環境の確立が可能になり得る。分化した細胞表現型の維持には、増殖／分化因子が必要なだけでなく、適切な細胞相互作用も必要であることが認識されている。本発明は組織の微小環境を効率的に模倣する。
【００６７】
以下の例示的な実施例に記載されるように、動物（ヒトを含む）由来のマイクロ器官培養物、例えば、皮膚、膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、食道、膀胱、骨髄、胸腺または脾臓由来の培養物を単離して、培養物中で２１日間にわたって増殖させた。しかし、２１日を上回って長期間培養物を維持することも、本発明の範囲内である。
【００６８】
ＩＩ．マイクロ器官培養のための外植体の供給源
本発明のマイクロ器官培養物は、例えば以下から単離された外植体を用いて誘導されてもよい：皮膚および粘膜（口腔粘膜、胃腸粘膜、鼻道、呼吸管、子宮頸部および角膜を含む）；膵臓；肝臓；膀胱；胆管；肺；前立腺；子宮；乳腺；膀胱組織；ならびに胸腺、脾臓および骨髄のような血液関連器官。従って、このような器官のインビトロ培養の等価物が生成され得る。外植体を形成する組織は、病的であっても正常（例えば、健常組織）であってもよい。例えば、本発明のマイクロ器官外植体を単離する器官は、以下によって影響され得る：過剰増殖性障害、例えば、乾癬または角化症；ウイルス感染した細胞、例えば、肝炎に感染したまたはパピローマウイルス感染した細胞の増殖；新生増殖性障害、例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、肉腫またはウィルムス腫瘍；あるいは線維性組織、例えば、硬変した肝臓または膵炎を被っている膵臓。
【００６９】
本発明の細胞が単離され得る動物の例としては、ヒトおよび他の霊長類、ブタ、例えば、完全にまたは部分的に近交系のブタ（例えば、ミニブタおよびトランスジェニックブタ）、げっ歯類などが挙げられる。
【００７０】
ＩＩＩ．増殖培地
動物由来の細胞を培養するために存在する多数の組織培養培地がある。これらのいくつかは複雑であり、いくつかは単純である。マイクロ器官培養物は、複雑な培地中で増殖し得ることが期待されているが、その培養物は、ダルベッコの最小必須培地のような単純な培地中で維持され得ることが本明細書において示されている。さらに、この培養物は血清または下垂体抽出物のような他の生物学的抽出物を含む培地において増殖され得るが、血清も任意の他の生物学的抽出物も必要ではないことが本明細書において示されている。さらに、器官培養物は長期間、血清の非存在下で維持され得る。本発明の好ましい実施形態において、増殖因子は、インビトロにおける培養物の維持の間この培地中に含まれない。
【００７１】
最小培地における増殖に関するポイントは重要である。現在、哺乳動物細胞の長期増殖のためのほとんどの培地またはシステムは、不明確なタンパク質を組み込んでいるか、または支持細胞を用いて、このような増殖を維持するのに必要なタンパク質を提供する。このような不明確なタンパク質の存在は、本発明のマイクロ器官培養物の意図された最終用途を邪魔し得るので、不明確なタンパク質の存在を最小限にする条件下でこの外植体を培養することが一般に所望され得る。
【００７２】
本明細書において用いる場合、「最小培地」という言葉は、細胞が培養中で生存しかつ増殖するために必要である栄養物のみを含む、化学的に規定された培地をいう。代表的には、最小培地は生物学的抽出物、例えば増殖因子、血清、下垂体抽出物、または培養物における細胞集団の生存および増殖を支持するために必要でない他の物質を含まない。例えば、最小培地は一般に少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも１つのビタミン、少なくとも１つの塩、少なくとも１つの抗生物質、少なくとも１つの指示薬、例えばフェノールレッド（水素イオン濃度を決定するために用いられる）、グルコース、ならびに細胞の生存および増殖のために必要な他の雑多な成分を含む。最小培地は血清を含まない。種々の最小培地が、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから最小必須培地として市販されている。
【００７３】
しかし、増殖因子および調節因子は、培地に添加される必要は無いが、このような因子の添加、または他の特殊化した細胞の接種を用いて、培養物中の増殖および細胞成熟を増強、変更または調節することができる。培養物中の細胞の増殖および活性は、インスリン、増殖ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球新生因子（ヘパトポエチン）および肝細胞増殖因子のような種々の増殖因子によって影響され得る。増殖および／または分化を調節する他の因子としては、プロスタグランジン、インターロイキンおよび天然に存在する負の増殖因子、線維芽細胞増殖因子、およびトランスフォーミング成長因子−βファミリーのメンバーが挙げられる。
【００７４】
マイクロ器官培養物は、２４ウェルまたは９６ウェルのマイクロプレートのような任意の適切な培養容器中で維持されてもよく、そして５％ＣＯ２中で、３７℃で維持されてもよい。この培養物は、通気を改良するために振盪されてもよく、振盪の速度は例えば１２ｒｐｍである。
【００７５】
本発明のマイクロ器官培養物が（必要に応じて）（その中にまたは上に）提供される培養容器に関して、好ましい実施形態においてはこのような容器は一般に、任意の材料および／または形状の容器であってもよいことに注意すべきである。多数の異なる材料が容器を形成するために用いられ得、これらとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（例えば、ポリビニルクロライド）、ポリカーボネート（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ；テフロン）、サーマノックス（ｔｈｅｒｍａｎｏｘ）（ＴＰＸ）、ニトロセルロース、綿、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ネコ腸縫合糸、セルロース、ゼラチン、デキストランなど。これらの材料のいずれをメッシュに織ってもよい。マイクロ器官培養物がそれ自体、インビボで移植すべき場合、例えば、ポリグリコール酸、ネコ腸縫合糸材料、またはゼラチンのような生分解性マトリックスを使用することが好ましいかもしれない。この培養物を長期間維持するかまたは凍結保存すべき場合、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、テフロン、綿などのような非分解性の材料が好ましいかもしれない。本発明によって用いることができる従来のナイロンメッシュは、Ｎｉｔｅｘであり、これは平均孔径２１０μｍおよび平均ナイロン繊維直径９０μｍを有するナイロンろ過メッシュである（＃３−２１０／３６、Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）。なお他の実施形態を以下に考察する。
【００７６】
例示的な実施形態において、ランゲルハンス島を含む膵臓のマイクロ器官は、本発明の培養物として調製される。次いで、この培養物は、免疫拒絶を回避するためにカプセル化形態で提供される。カプセル化のための３つの一般的（例示的）アプローチが用いられ得る。第一に、管状膜はマイクロ器官外植体を含むハウジング中に巻かれる。この膜はポリマー移植片に接続されて、このポリマー移植片が次にこのデバイスを血管に接続する。膜を通る前後のグルコースおよびインスリンの自由な拡散を可能にし、さらに抗体およびリンパ球の通過をブロックするため、膜透過性の操作によって、このデバイスで処置された膵臓摘出動物において正常血糖を維持することができる（Ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：７１８）。
【００７７】
第二のアプローチでは、膵臓外植体を含む中空のファイバーを（必要に応じて）アルギン酸ポリサッカライド中で固定する。このデバイスが糖尿病動物に腹腔内に入れられる場合、血糖値を、低くすることが可能で、そして良好な組織適合性が観察できる（Ｌａｃｅｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１７８２；また、実施例ＶＩも参照のこと）。従って、線維を予めスピンして引き続きマイクロ器官外植体とともに装填してもよい（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、米国特許第４８９２５３８号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、米国特許第５１０６６２７号；Ｈｏｆｆｍａｎら（１９９０）Ｅｘｐｔ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１０：３９〜４４；Ｊａｅｇｅｒら、（１９９０）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８２：４１〜４６；ならびにＡｅｂｉｓｃｈｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ  Ｅｎｇ．１１３：１７８〜１８３）。
【００７８】
第三に、マイクロ器官の島外植体は、アルギン酸またはポリアクリレートからなるマイクロカプセルに入れられてもよい（例えば、以下を参照のこと：Ｌｉｍら（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１０：９０８；Ｏ’Ｓｈｅａら（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｃｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８４０：１３３；Ｓｕｇａｍｏｒｉら、（１９８９）Ｔｒａｎｓ  Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ  ３５：７９１；Ｌｅｖｅｓｑｕｅら（１９９２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：６４４；およびＬｉｍら（１９９２）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５３：１１８０）。
【００７９】
最終的に、本発明のマイクロ器官培養物が維持される培養培地は、馴化培地の供給源として収集され得ることが注目される。「馴化培地」という用語は、例えば、培養された細胞／組織を含まない上清であって、培養細胞との接触のある時間後に生じ、その結果この培地が、細胞によって産生され、この培養物中に分泌された特定のパラクリン因子および／または自己分泌因子を含むように変更されている上清をいう。このような産物の例は、インスリン、種々の増殖因子、およびホルモンである。この馴化培地は、他のタイプの細胞培養および組織培養のための培養培地として用いられ得る。あるいは、この馴化培地は、増殖因子のような新規な細胞産物の供給源として使用されてもよい。このような産物は、この馴化培地から分画して精製または実質的に精製することができる。
【００８０】
ＩＶ．マイクロ器官培養物の生物学的特性の測定
正常な組織に由来する本発明のマイクロ器官培養物は、組織の全体的な増殖なしに構成細胞の増殖を伴いホメオスタシスの状態を維持することが示されている。
【００８１】
細胞増殖を測定する方法は当該分野で周知であり、そして最も通常には、細胞複製のＤＮＡ合成特徴を決定する工程を包含する。ＤＮＡ合成を測定するための多くの方法が当該分野に存在しており、そのいずれかが本発明に従って用いられ得る。本発明の実施形態において、免疫蛍光による検出のために放射性標識（３Ｈ−チミジン）または標識されたヌクレオチド類似体（ＢｒｄＵ）を用いてＤＮＡ合成が決定された。
【００８２】
マイクロ器官培養物は、成熟細胞の増殖によってだけでなく、前駆体細胞（ある場合には胚性細胞を含む）の能動的な関与によっても形成されかつ維持され得る。マイクロ器官培養物は、これらの前駆体細胞の天然の進化を保存し、特定し、単離し、そして促進するために適切な環境を提示することが示されている。例えば、基底層の未成熟の細胞は、皮膚のマイクロ器官培養において成熟ケラチノサイトになることが観察されている。同様に、胚性膵臓細胞は、マイクロ器官培養物において成熟膵臓上皮を提供し得る。前駆体細胞の成熟および成体細胞としてのそれらの引き続く機能化は、表皮細胞における特定のケラチン、ならびに膵臓上皮におけるインスリン、Ｇｌｕｔ２およびグルカゴン、ならびに肝臓マイクロ器官培養物におけるアルブミンおよび第ＶＩＩＩ因子のような特殊化した産物の分泌を測定することによって、モニターすることができる。
【００８３】
本発明に従って調製されたマイクロ器官培養物は、インビボに存在する正常な組織構造を保存する。上述のように、これは、インビボにおいて、ならびに膵臓マイクロ器官におけるインスリンおよびグルカゴン分泌細胞の正常な出現に従う、インビトロでの皮膚マイクロ器官における毛包、汗腺および皮脂腺の維持を含む。これらの培養物は管理条件および均一な条件で維持されてもよく、さらにそれらはインビボにおいて器官の微小構造を密接に近似するので、それらによって、天然の現象ならびに疾患、加齢または外傷から生じる天然の現象の摂動を観察し、測定し、そして管理する固有の機会が得られる。さらに、この培養物上の特定の部位において個々の細胞を研究するための技術の入手し易さによって、この器官の個々の成分の機能化、およびそれらのお互いに対する相互作用ならびに器官全体についての洞察が得られる。
【００８４】
さらに、本発明のマイクロ器官培養物は、培養中で、長期間維持可能である。好ましくは、マイクロ器官培養物は、少なくとも約２４時間、より好ましくは少なくとも約２日間、さらにより好ましくは少なくとも約５日間、なおより好ましくは少なくとも約７日間、なおさらに好ましくは少なくとも約２週間以上、培養中で維持可能である。本発明のマイクロ器官培養物は代表的には、培養中で少なくとも７日間、維持される。例示するために、ヒト、マウス、モルモットおよびラットの皮膚由来の皮膚マイクロ器官培養物を、少なくとも約２１日間、培養中で維持している。
【００８５】
本明細書において用いる場合、「培養中で維持可能」という言葉は、組織外植体の細胞の集団であって、その細胞の少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは９５％以上が、特定の期間後に培養中で生存可能である細胞の集団をいう。
【００８６】
好ましい実施形態において、マイクロ器官培養物における細胞の、例えば死亡または抜け落ちによる、細胞損失に対する細胞増殖の比は１に等しく、すなわち増殖した細胞の数は、損失した細胞の数に等しい。本発明の別の実施形態において、マイクロ器官培養物における細胞の細胞損失に対する細胞増殖の比は１より大きく、すなわち細胞が損失するよりも大きい率で細胞が増殖している。後者の場合には、マイクロ器官培養物は、増幅している細胞の集団を含むことが理解される。
【００８７】
Ｖ．マイクロ器官培養物の適用
本発明のマイクロ器官培養物の例示的な適用としては以下が挙げられる：
（ａ）組織および器官の正常なホメオスタシスに関与する因子の特定；
（ｂ）栄養物の変化および潜在的に毒性の因子の存在を含む環境の変化に関する、器官の組織および細胞の正常なホメオスタシスに対する影響を研究すること；
（ｃ）病因または外傷の開始およびその間に誘発される、器官の組織および細胞における変化の経路を理解すること；
（ｄ）病因または外傷に関連する環境の変化における有害な影響を逆転する修復機構の特定；
（ｅ）組織の正常なホメオスタシスの間に分化する細胞の発達調節。
（ｆ）毛包のような器官内の特殊化した構造の発達調節；
（ｇ）慢性の皮膚潰瘍、種々の形態の糖尿病または慢性肝不全を有する患者に生じるような、個々の器官の一部が残っているが損傷をうけた組織を置換または再生するには不十分である器官の補充／移植；
（ｈ）薬物スクリーニングおよび細胞毒性研究のための組織／器官等価物として；
（ｉ）増殖障害のための診断アッセイとして；
（ｊ）新規な増殖因子の供給源として；
（ｋ）幹細胞／前駆体細胞の供給源として；
（ｌ）分子を誘導する供給源として；
（ｍ）分子を誘導するためのスクリーニングとして；
さらなる例示のために、本発明の方法は、マイクロ器官培養物の形態で皮膚等価物を生成するために用いることができる。背景として、創傷処置の目的で、詳細には火傷の処置において、ヒト皮膚を模倣するような方式で上皮細胞を増殖するための多くの試みが記載されていることが注目される。皮膚は２つのタイプの組織からなる。以下が存在する：（１）高密度コラーゲンマトリックス内にまばらに分散される線維芽細胞、ならびに神経、血管および脂肪細胞を含む、間質または真皮；（２）密接に密集した、活発に増殖している未成熟の上皮細胞の表皮基底層を含む表皮。基底層の細胞が複製するにつれ、若い細胞のいくつかは、基底層に残り、一方その他は外側に遊走してサイズが増大し、最終的に界面活性剤および還元剤に対するエンベロープ耐性を発達させる。ヒトにおいては、基底層における細胞の誕生には、末端または外側の層に達するまで約２週間要し、その後、細胞は死んで剥がれ落ちる。皮膚は種々の構造を含むが、これには毛包、皮脂腺および汗腺が挙げられる。毛包は、表皮の高密度に並ぶ陥入である、分化しているケラチノサイトから形成される。このような陥入から形成された開口式の小胞は、分泌されたケラチンを収集して濃縮し、そして毛（髪）の長線維が生じる。あるいは、陥入を裏打ちする表皮細胞は、液体（汗腺）または皮脂（皮脂腺）を分泌し得る。これらの構造の形成および増殖の調節は未知である。健常な皮膚の一定の更新は、新しい細胞が生成されており、そして加齢した細胞が死ぬという平衡プロセスによって達成される。加齢において、そしてまた平衡を破壊する疾患および外傷を通じて生じる、異常な事象を相殺するために、この正確な調節が行なわれる方法を理解する必要がある。
【００８８】
本発明の１つの実施形態において、マイクロ器官培養物の微小構造は、インビボにおける皮膚の微小構造を模倣するかまたは実質的にそれと同じである。例えば、その微小構造は、上皮組織／結合組織の構造を有する。例えば、皮膚のマイクロ器官培養物において、表皮のケラチノサイトは、結合組織と会合したままであり、そして毛包を含む正常な組織構造は保存されている。皮膚組織切片から得られるマイクロ器官培養物はまた、表皮細胞を支持する基底層、真皮細胞を含む細胞外マトリックス、および少なくとも１つの陥入、例えば、少なくとも１つの毛包を含み得る。皮膚上皮組織と皮膚結合組織との間の会合によって、細胞間連絡が容易になる。さらに、完全な厚みの皮膚を、種々の方法で増殖させて、これによって空気との接触面を可能にすることができる。空気に対するこの外植体のケラチノサイトの曝露によって、ケラチノサイトのより急速な分化、およびケラチン層のさらに過剰な分泌が促進されるが、これは皮膚浸透研究において非常に重要であるかもしれない。
【００８９】
最終的に、最近の研究で、皮膚は免疫系の不可欠かつ能動的な要素であることが示されていることに注目のこと（Ｃｏｏｐｅｒら（１９８７）Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｏｂｕｌｌｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第３版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，ＮＹ（６１０〜６２６頁））。種々の免疫活性を担う皮膚の主な細胞型の１つはランゲルハンス細胞である。これらの細胞は、新鮮な皮膚サンプルから調製されて、３次元の皮膚培養物に添加されて、免疫学的に完全な組織系を生じる。培養中で長期間のこれらの細胞の増殖は、従来の組織培養手順によっては困難である。３次元システムにおいてこれらの細胞を増殖させる能力は、移植、細胞傷害性および疾患の機構を含む研究の全ての局面において重要性が大きいものである。このタイプの皮膚培養システムは、直接または間接的な皮膚反応の関与を有する自己免疫障害（紅斑性狼瘡、水疱性類天疱瘡など）に関する研究において最大の影響を有する。従って、本発明のマイクロ器官培養物は、疾患の免疫学的局面が最小化される条件下で増殖／分化の障害を研究するために用いることができる。過形成上皮細胞の増殖を阻害し得る因子を同定するために、乾癬の皮膚外植体を用いる例示的な薬物スクリーニングアッセイが誘導され得る。
【００９０】
皮膚は、間質性組織によって支持される上皮組織を有するマイクロ器官培養物として増殖され得る組織の単なる例である。上皮組織を含む他の組織は、本発明のマイクロ器官培養物として増殖されてもよい。上皮組織は、器官と環境との間の接触面が生じる、身体のあらゆる部分において見出される。上皮細胞の周期は、無傷の身体において連続的であり、そして皮膚を含む身体の全ての自由な表面について被覆組織を形成する。ある場合には、膵臓においてのように、上皮細胞は、多くの陥入を並べ、そして空間に酵素を分泌して、器官が機能することを可能にする。肺は、高度に陥入した器官の別の例であり、肺における各々の陥入は、上皮細胞にそって並べられ、これを通じて環境から身体中へ空気が拡散する。ここでもやはり、これらの上皮細胞は、特徴的な特性を有する。腸の裏打ちはまた、障壁を形成するだけでなく、食物を選択的に胃吸収するための特殊化した構造も含む、特殊化した上皮細胞からなる。上皮の全てが結合組織によって支持される。さらに、重要な細胞−間質の相互作用を含む別の器官は骨髄である。
【００９１】
従って、本発明の別の実施形態において、マイクロ器官の膵臓培養物の微小構造は、インビボにおける供給源の膵臓の微小構造を模倣するかまたはそれと実質的に同じであり、例えば、その微小構造は、上皮組織／結合組織の構造を有する。例えば、膵臓のマイクロ器官培養物は、膵臓上皮細胞、例えば、島細胞を含み、膵臓の結合組織と会合したままである。従って、膵臓のマイクロ器官培養物において、正常な組織構造は保存され、そして正常な膵臓上皮細胞産物、例えば、インスリンおよびグルカゴンが産生される。
【００９２】
別の実施形態において、本発明によって、骨髄に由来するマイクロ器官培養物の生成が得られるが、この培養物はインビボにおける器官の微小構造を保存している。実施例ＸＶに記載されるように、骨髄マイクロ器官は、生理学的条件に匹敵するシステムを誘導させるように培養中で単離されている。
【００９３】
本発明の骨髄培養物は、健常な骨髄細胞を破壊するかまたはその機能的能力を抑制する疾患または状態を処置するために用いることができる。本発明のマイクロ器官の移植は、骨髄に関与する、血液学的悪性度および他の新生物形成の処置において有効であり得る。本発明の局面はまた、骨髄が環境因子（例えば、放射線、毒素など）によって有害に影響されている患者を処置するのに有効である。患者自身の骨髄に由来する外植体の再移植が一般に好ましいが、このような外植体は、同種、例えば、同じ種の別のメンバー由来であっても、または異種、例えば、別の生物体由来であってもよいことに注意のこと。例示的な異種インプラントは、ヒトにおける移植のためのミニブタ由来のマイクロ器官培養物であり得る。
【００９４】
さらに、もしヒト造血前駆体が必要な間質由来増殖／調節因子とともに提供される場合、ヒト造血前駆体の長期成長が可能である。このような相互作用は、本発明のマイクロ器官によって提供され、これらの外植体を幹細胞および前駆体細胞の供給源とさせる。一般に、骨髄の造血前駆細胞は、骨髄マイクロ器官の間質性マトリックス中で形成された天然のパケットをコロニー形成（「播種」）する。骨髄間質細胞の増殖における主な律速因子は、骨髄の間質細胞の間に含まれる線維芽細胞の比較的低い分裂指数である。従って、これらの細胞の増殖および細胞外マトリックス成分のそれらの素因が強化されることが望ましい場合、この外植体は、ヒドロコルチゾンまたは他の線維芽細胞増殖因子のような因子と接触させられてもよい。
【００９５】
転移性疾患または血液学的悪性腫瘍を有する特定の患者を処置するために骨髄を培養すべき場合、患者から得られた骨髄は、培養の前に物理的手段または化学療法によって、異常に増殖している細胞を「除去される」べきである。
【００９６】
本発明の骨髄マイクロ器官培養からの馴化培地は、新規のまたは公知のリンホカインの供給源として、例えばインターロイキンの供給源として用いられてもよい。
【００９７】
本発明は、１つの局面において、生物体における移植のための本発明のマイクロ器官培養の使用を意図する。本明細書において用いる場合、「投与する」、「導入する」および「移植する」という用語は、互換可能に用いられて、所望の部位への細胞の局在化を生じる方法または経路による、被験体、例えば、同種被験体または異種被験体への本発明の細胞集団の配置をいう。細胞集団は、細胞の少なくとも一部が生存したままで、被験体における所望の位置への細胞の送達を生じる、任意の適切な経路によって被験体に投与され得る。少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、なおさらに好ましくは少なくとも約３０％、なおさらに好ましくは少なくとも約４０％、そして最も好ましくは少なくとも約５０％以上の細胞が被験体への投与の後に生存したままであることが好ましい。被験体への投与後の細胞の生存の期間は、数時間程度の短さから、例えば２４時間から２〜３日間、さらに２〜３週間から２〜３ヶ月程度の長さであってもよい。本発明の細胞の集団を投与する方法としては、内蔵または壁側腹膜へ、例えば、網の嚢への細胞の移植、レシピエント被験体の器官、例えば、膵臓、肝臓、脾臓、皮膚への細胞の移植が挙げられる。本発明のマイクロ器官はまた、例えば、腎臓カプセルとして、移植によって被験体に投与され得る。
【００９８】
本明細書において用いる場合、「被験体」という用語は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトをいう。「異種被験体」とは、本明細書において用いる場合、別の種の細胞が導入されるかまたは導入されることになる被験体である。「同種被験体」とは、同じ種の細胞が導入されるかまたは導入されることになる被験体である。ドナー被験体とは、培養物中に配置されることになるか、および／またはレシピエント被験体に移植されることになる、細胞、組織または器官を提供する被験体である。レシピエント被験体は、異種被験体であっても、または同種被験体であってもよい。ドナー被験体はまた、それら自体への再導入のため、すなわち自家移植のための細胞、組織または器官を提供し得る。
【００９９】
宿主による免疫学的攻撃に対して供され得る細胞集団の移植（例えば、ブタ−ヒトの移植のような異種移植を用いる場合）を容易にするため、マイクロ器官を、再充填可能かまたは生分解性のデバイスに挿入するかまたはカプセル化して、次いでレシピエント被験体に移植してもよい。次いで、このような細胞によって生成される遺伝子産物は、例えば、徐放性の化合物、例えば、タンパク質性の生物製剤を含む薬物のために設計されたポリマー性デバイスを介して送達され得る。生分解性ポリマーおよび非分解性ポリマーの両方を含む、種々の生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）を用いて、特定の標的部位における本発明の細胞集団の遺伝子産物の徐放性の放出のためのインプラントを形成することができる。このようなインプラントの生成は一般に、当該分野で公知である。例えば、以下を参照のこと：Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｄｅｎｔａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ編（ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９０）；Ｓａｂｅｌら、米国特許第４８８３６６６号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、米国特許第４８９２５３８号；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、米国特許第５１０６６２７号；Ｌｉｍ、米国特許第４３９１９０９号；およびＳｅｆｔｏｎ米国特許第４３５３８８８号。本発明の細胞集団は、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤、例えば、滅菌生理食塩水および水性緩衝液中で投与されてもよい。このようなキャリアおよび希釈剤の使用は当該分野で周知である。
【０１００】
１つの実施形態において、本発明のマイクロ器官培養物は、創傷治癒のために使用することができる。皮膚病変の修復は、高度に複雑な過程であって、一次的な上皮細胞遊走、および基礎にある結合組織からの分子シグナルに応答する表皮細胞の複製を含む過程であることが公知である。皮膚マイクロ器官培養物は、創傷治癒のためのモデルとして本明細書に記載されている。管理された培養条件下で、治癒を制御する因子は、注意深くモニターされ得る。さらに、マイクロ器官培養物は、天然の血液供給から隔離されているので、治癒プロセスの解析は、血液由来因子または細胞のさらなる複雑性なしに行なうことができる。正常な表皮は、２００〜３００時間ごとの細胞周期を有する低い有糸分裂活性を有する。表皮が傷つけられる場合、有糸分裂活性のバーストが生じ、その結果細胞は、創傷の状態および重篤度に依存して１０倍まで早く分裂する（Ｐｉｎｋｕｓ  Ｈ．（１９５１）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１６：３８３〜３８６）。
【０１０１】
実施例ＩＩにおいて実証されたように、皮膚マイクロ器官培養物は、数日間で１０倍までの増殖の増大を示す。この実施例では、創傷の縁は、マイクロ器官培養物に匹敵する。この増殖の増大は、創傷に関連している事象を模倣して、創傷治癒の過程を研究するための固有の機会を提供する。さらに、添付の実施例によって、本発明の表皮外植体を慢性の創傷に適用することが可能であり（実施例ＩＸ）、そして毛（髪）を増殖し得る生存可能なインプラントを形成することが可能である（実施例ＸＩ）ことがインビボで実証される。
【０１０２】
さらに、被験体の表皮マイクロ器官は、火傷患者の処置に用いることができる。火傷患者には皮膚交換の必要性が証明されている。米国および欧州のいくつかの施設では、火傷の創傷および慢性潰瘍を永続的に被覆するため、培養されたヒトケラチノサイトの同種移植片および異種移植片が利用された（Ｅｉｓｉｎｇｅｒら（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：２８７〜２９３；Ｇｒｅｅｎら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：５６６５〜５６６８；Ｃｕｏｎｏら（１９８７）Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８０：６２６〜６３５）。これらの方法はしばしば失敗しており、近年の研究では、移植された表皮層のもとで形成された１つ以上の結合組織成分における異常のために、治癒した移植片に水疱形成および／または皮膚脆弱性が存在し得ることが示されている（Ｗｏｏｄｌｅｙら（１９８８）ＪＡＭＡ  ６：２５６６〜２５７１）。本発明の皮膚培養システムは、表皮および真皮の両方の皮膚等価物を提供し、そして現在用いられる培養されたケラチノサイト移植片の特徴的な問題を克服するはずである。
【０１０３】
なお別の実施形態において、本発明のマイクロ器官培養システムは、遺伝子治療における使用のためにインビボで遺伝子または遺伝子産物を誘導するためのビヒクルを産出し得る。例えば、組み換えＤＮＡ技術を用いて、患者が欠いている遺伝子を、ウイルスまたは組織特異的なプロモーターの制御下に置くことができる。組み換えＤＮＡ構築物を用いて、本発明のマイクロ器官培養システムにおける全ての細胞または特定の細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができる。活性な遺伝子産物を発現するマイクロ器官培養物を、その産物を欠く個体に移植することができる。
【０１０４】
遺伝子治療における本発明のマイクロ器官培養物の使用は、多数の利点を有する。第一に、培養物は真核生物細胞を含むので、遺伝子産物は、培養物中で適切に発現されてプロセシングされ、活性な産物を形成する。第二に、遺伝子治療技術は、トランスフェクトされた細胞の数が、臨床的な値、妥当性および有用性なものであるように実質的に増強され得る場合にのみ有用である；本発明の培養物によって、トランスフェクトされた細胞の数の増大および増幅が可能になる。
【０１０５】
本発明のさらなる実施形態において、トランスジェニックマイクロ器官培養物を用いて、遺伝子導入を容易にすることができる。例えば、限定はしないが、組み換えウイルス発現ベクターを含むマイクロ器官培養物は、例えば、移植によって、この培養物と接触させられた細胞に組み換えウイルスを移入して、これによってインビボにおけるウイルス伝達をシミュレートするために用いることができる。従って、このシステムは、ＤＮＡトランスフェクションのための現在の技術よりも遺伝子導入を達成するさらに有効な方法であり得る。
【０１０６】
従って、本発明のマイクロ器官培養物の細胞は、遺伝子産物を発現するために改変され得る。本明細書において用いる場合、「遺伝子産物」という句は、タンパク質、ペプチドおよび機能的なＲＮＡ分子をいう。一般に、核酸分子によってコードされる遺伝子産物は、被験体に供給されることが所望される遺伝子産物である。このような遺伝子産物の例としては、レシピエント被験体の器官によって正常に生成されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質およびリポタンパク質が挙げられる。例えば、膵臓における欠損器官に対して遺伝子置換の方法で供給され得る遺伝子産物としては、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、およびアミラーゼが挙げられる；肝臓によって通常生成される遺伝子産物としては、血液凝固第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子のような血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、およびチトクロームｐ４５０酵素、ならびにアデノシンデアミナーゼ（血清アデノシンのプロセシングまたは低密度リポタンパク質のエンドサイトーシスのため）が挙げられる；胸腺によって生成される遺伝子産物としては、血清胸腺因子、胸腺ホルモン因子、サイモポエチンおよびサイモシンα１が挙げられる；消化管細胞によって生成される遺伝子産物としては、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチンおよびサブスタンスＰが挙げられる。あるいは、コードされた遺伝子産物は、細胞による所望の遺伝子産物の発現を誘導するものである（例えば、導入された遺伝子材料は、被験体に供給されるべき遺伝子産物の転写を誘導する転写因子をコードする）。なお別の実施形態において、組み換え遺伝子は、異種タンパク質（例えば、そのタンパク質が発現される細胞に対してネイティブでない）を提供し得る。例えば、種々のヒトＭＨＣ成分が、ヒトレシピエントにおける移植を支持する非ヒトマイクロ器官に提供されてもよい。あるいは、導入遺伝子は、マイクロ器官外植体において正常に発現されるドナーＭＨＣ遺伝子産物の発現または作用を阻害するものである。
【０１０７】
細胞に導入された核酸分子は、核酸によってコードされる遺伝子産物の細胞における発現に適切な形態である。従って、核酸分子は、遺伝子（またはその一部）の転写のために必要なコード配列および調節配列を含み、そして遺伝子産物がタンパク質またはペプチドである場合、核酸分子の翻訳は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナル、ならびにコードされたタンパク質またはペプチドの輸送に必要な配列、例えば、細胞の表面へのタンパク質もしくはペプチドの輸送、または分泌のためのＮ末端シグナル配列を含む。
【０１０８】
遺伝子産物の発現を調節するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列およびエンハンサー配列）は、この遺伝子産物が発現されるべき細胞のタイプ、およびこの遺伝子産物の発現の所望のレベルに基づいて選択される。例えば、そのプロモーターに連結された遺伝子の細胞型特異的な発現を付与することが公知のプロモーターを用いてもよい。筋芽細胞遺伝子発現に特異的なプロモーターは、目的の遺伝子に連結されて、その遺伝子産物の筋特異的な発現を付与することができる。当該分野で公知の筋特異的な調節エレメントとしては、ジストロフィン遺伝子の上流の領域（Ｋｌａｍｕｔら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２３９６）、クレアチンキナーゼ遺伝子の上流の領域（ＢｕｓｋｉｎおよびＨａｕｓｃｈｋａ，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２６２７）およびトロポニン遺伝子の上流の領域（ＭａｒおよびＯｒｄａｈｌ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：６４０４）、転写抑制を媒介するケラチン遺伝子における負の応答エレメント（Ｊｈｏ  Ｓｈら（２００１）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）が挙げられる。他の細胞型に特異的な調節エレメントが当該分野で公知である（例えば、肝臓特異的発現のためのアルブミンエンハンサー；膵島細胞特異的発現のためのインスリン調節性エレメント；神経ジストロフィン、神経エノラーゼおよびＡ４アミロイドプロモーターを含む、種々の神経細胞特異的調節エレメント）。あるいは、ウイルス調節エレメントのような、種々の異なる細胞型において遺伝子の構成的な発現を指向し得る調節エレメントを用いてもよい。遺伝子発現を駆動するために通常用いられるウイルスプロモーターの例としては、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来のプロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲが挙げられる。あるいは、調節エレメントであって、そこに連結された遺伝子の誘導性の発現を提供する調節エレメントを用いてもよい。誘導性調節エレメント（例えば、誘導性プロモーター）の使用によって、細胞における遺伝子産物の産生の調節が可能になる。真核生物細胞における使用のために潜在的に有用な誘導性調節システムの例としては、以下が挙げられる：ホルモン調節エレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．およびＷｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３〜５６０７を参照のこと）、合成のリガンド調節性エレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９〜１０２４を参照のこと）、およびイオン化放射線調節性エレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０６０７〜１０６１３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０１４〜１０１５３を参照のこと）。さらなる組織特異的または誘導性の調節システムが開発され得、これが本発明に従って用いられてもよい。
【０１０９】
本発明の細胞を改変するために適用することができる、細胞への遺伝物質を導入するための当該分野で公知の多数の技術が存在する。１つの実施形態において核酸は、裸の核酸分子の形態である。この状況では、改変されるべき細胞に導入された核酸分子は、遺伝子産物をコードする核酸および必要な調節エレメントのみからなる。あるいは、遺伝子産物をコードする核酸（必要な調節エレメントを含む）は、プラスミドベクター内に含まれる。プラスミド発現ベクターの例としては、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７〜１９５）が挙げられる。別の実施形態では、細胞に導入される核酸分子は、ウイルスベクター内に含まれる。この状況では、遺伝子産物をコードする核酸は、ウイルスゲノム（または部分的なウイルスゲノム）に挿入される。遺伝子産物の発現を指向する調節エレメントは、ウイルスゲノム内に挿入された核酸内に含まれ（すなわち、ウイルスゲノムに挿入された遺伝子に連結され）てもよいし、またはウイルスゲノム自体によって提供されてもよい。
【０１１０】
裸の核酸は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入、およびレセプター媒介取り込みを用いて細胞に導入されてもよい。
【０１１１】
裸の核酸、例えば、ＤＮＡは、核酸およびリン酸カルシウムを含有する沈殿物を形成することによって細胞に導入されてもよい。例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水溶液は、沈殿を形成するために、塩化カルシウムおよび核酸を含有する溶液とともに混合されてもよく、次いでこの沈殿物が細胞とともにインキュベートされる。グリセロールまたはジメチルスルホキシドショック工程を加えて、特定の細胞に取り込まれる核酸の量を増大することができる。ＣａＰＯ４媒介トランスフェクションは、安定に（または一過性に）細胞をトランスフェクトするために用いることができ、そして細胞のインビトロ改変にのみ適用可能である。ＣａＰＯ４媒介トランスフェクションのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），第９．１節、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９），第１６．３２節〜第１６．４０節、または他の標準的な実験室マニュアルから見つけることができる。
【０１１２】
裸の核酸は、核酸およびＤＥＡＥデキストランの混合物を形成すること、ならびにこの混合物と細胞とをインキュベートすることによって細胞に導入されてもよい。核酸取り込みの量を増大するためにジメチルスルホキシドまたはクロロキンショック工程を加えてもよい。ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションは、細胞のインビトロ改変のためにのみ適用可能であり、そしてＤＮＡを一時的に細胞に導入するために用いることはできるが安定にトランスフェクトされた細胞を作製するのには好ましくない。従ってこの方法は、遺伝子産物の短時間産生のためには用いることが可能であるが、遺伝子産物の長期間産生のためには選り抜きの方法ではない。ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），第９．２節、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９），第１６．４１節〜第１６．４６節、または他の標準的な実験室マニュアルから見つけることができる。
【０１１３】
裸の核酸はまた、細胞および核酸を一緒に適切な緩衝液中でインキュベートすること、およびこの細胞を高電圧の電気パルスに供することによって、細胞中に導入することができる。核酸がエレクトロポレーションによって細胞に導入される効率は、印加された電場の強度、電気パルスの長さ、温度、ＤＮＡの構成および濃度、ならびに培地のイオン組成によって影響される。エレクトロポレーションは、広範な種々の細胞型を安定に（または一過性に）トランスフェクトするために用いることができる。細胞をエレクトロポレートするためのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９），第９．３節、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９），第１６．５４〜１６．５５節、または他の標準的な実験室マニュアルから見出すことができる。
【０１１４】
裸の核酸を細胞に導入することができる別の方法としては、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクチン）が挙げられる。核酸を、カチオン性脂質を含有するリポソーム懸濁液と混合する。次いで、ＤＮＡ／リポソーム複合体を細胞とインキュベートする。リポソーム媒介トランスフェクションを用いて、インビトロにおいて培養中の細胞を安定に（または一過性に）トランスフェクトすることができる。プロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），第９．４節、および他の標準的な実験室マニュアルにおいて見出すことができる。さらに、インビボにおける遺伝子送達は、リポソームを用いて達成されている。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７〜１７６；ＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１〜７８５５；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）Ａｍ．Ｊ  Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８；ならびにＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅら（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８４：４２９〜４３８を参照のこと。
【０１１５】
裸の核酸はまた、核酸を細胞に直接注入することによって細胞に導入されてもよい。細胞のインビトロ培養のために、マイクロインジェクションによってＤＮＡを導入してもよい。各々の細胞を、個々にマイクロインジェクションするので、このアプローチは、多数の細胞を改変する場合に非常に労働集約的である。しかし、マイクロインジェクションが選り抜きの方法である条件は、トランスジェニック動物の産生においてである（以下に詳細に考察される）。この状況では、ＤＮＡは、受精した卵母細胞に安定に導入され、これが次に動物へと発達させられる。得られた動物は、卵母細胞に導入されたＤＮＡを担持する細胞を含む。直接注入はインビボにおいて細胞に裸のＤＮＡを導入するためにも用いられている（例えば、Ａｃｓａｄｉら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：８１５〜８１８；Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５〜１４６８を参照のこと）。インビボにおける細胞へのＤＮＡの注入のための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）を用いてもよい。このような装置は（例えば、ＢｉｏＲａｄから）市販されている。
【０１１６】
裸の核酸を、ポリリジンのような陽イオンと複合して、これを細胞表面レセプターのリガンドに結合させて、レセプター媒介性エンドサイトーシスによって取り込ませることができる（例えば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；ならびに米国特許第５１６６３２０号を参照のこと）。レセプターに対する核酸リガンド複合体の結合によって、レセプター媒介性エンドサイトーシスによるＤＮＡの取り込みが容易になる。ＤＮＡリガンド複合体が標的とするレセプターとしては、トランスフェリンレセプターおよびアシアロ糖タンパク質レセプターが挙げられる。エンドソームを天然に破壊し、これによって細胞質中に材料を放出する、アデノウイルスキャプシドに連結されたＤＮＡ−リガンド複合体を用いて、細胞内リソソームによるこの複合体の分解を回避することができる（例えば、Ｃｕｒｉｅｌら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２１２２〜２１２６を参照のこと）。レセプター媒介ＤＮＡ取り込みを用いて、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞にＤＮＡを導入することができる。そしてさらに、このレセプター媒介ＤＮＡ取り込みは、目的の標的細胞上で選択的に発現されるレセプターに対して結合するリガンドの使用によって、ＤＮＡが特定の細胞型に選択的に標的され得るというさらなる特徴を有する。
【０１１７】
一般に、裸のＤＮＡを培養中の細胞に（例えば、上記のトランスフェクション技術の１つによって）導入する場合、細胞のわずかな画分（約１０５分の１）が代表的には、トランスフェクトされたＤＮＡをそのゲノム中に組み込む（すなわち、このＤＮＡは細胞中でエピソームとして維持される）。従って、外因性ＤＮＡを取り込んでいる細胞を特定するためには、選択マーカーをコードする核酸を、目的の核酸とともに細胞にトランスフェクトすることが有利である。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与するマーカーが挙げられる。選択マーカーは、目的の遺伝子と同じプラスミド上に導入されてもよいし、または別のプラスミドに導入されてもよい。
【０１１８】
遺伝子産物をコードする核酸を細胞中に導入するための好ましいアプローチは、この遺伝子産物をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を含有するウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターを用いた細胞の感染では、大きい割合の細胞が核酸を受容し、これによって、核酸を受容している細胞の選択の必要性を排除することができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクター内でコードされた分子、例えば、ウイルスベクター内に含まれたｃＤＮＡは、ウイルスベクター核酸を取り込んでおり、そしてウイルスベクター系をインビトロまたはインビボのいずれかで用いることができる細胞中で、効率的に発現される。
【０１１９】
欠損レトロウイルスは、遺伝子治療の目的の遺伝子移入における使用のために十分に特徴付けられる（概説については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１を参照のこと）。組み換えレトロウイルスであって、このレトロウイルスゲノムに挿入された目的の遺伝子産物をコードする核酸を有するレトロウイルスを構築してもよい。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去してこのレトロウイルスを複製欠損にさせてもよい。次いでこの複製欠損レトロウイルスをビリオン中にパッケージングし、これを用いて、標準的な技術によってヘルパーウイルスの使用を通じて標的細胞を感染させることができる。組み換えレトロウイルスを生成するためのプロトコール、およびこのようなウイルスを用いてインビトロまたはインビボにおいて細胞を感染させるためのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），第９．１０節〜第９．１４節、および他の標準的なマニュアルにおいて見出すことができる。適切なレトロウイルスの例としては、当業者に周知であるｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。適切なパッケージングウイルス株の例としては、ψＣｒｉｐ、ψ２およびψＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボにおいて、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む、多くの異なる細胞型へ種々の遺伝子を導入するために用いられている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５〜１３９８；Ｄａｎｏｓａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０〜６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：３０１４〜３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１〜６１４５；Ｈｕｂｅｒら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９〜８０４３；Ｆｅｒｉら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７〜８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２〜１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：７６４０〜７６４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１〜６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２〜１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４〜４１１５；米国特許第４８６８１１６号；米国特許第４９８０２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノム（そして外来核酸がそこに挿入される）が宿主ゲノム中に組み込まれて細胞に核酸を安定に導入するためには標的細胞の分���を必要とする。従って、標的細胞の複製を刺激することが必要であるかもしれない。
【０１２０】
アデノウイルスのゲノムを、それが目的の遺伝子産物をコードしかつ発現するが、それが正常な細胞溶解性のウイルスのライフサイクルにおいて複製する能力に関しては不活化されているように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３〜１５５を参照のこと。アデノウイルスの株であるＡｄ５型ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターが、当業者に周知である。組み換えアデノウイルスは、それらが有効な遺伝子送達ビヒクルであるために細胞の分裂の必要がなく、気道上皮（前に引用した、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２））、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２〜６４８６）、肝細胞（Ｈｅｒｚ、およびＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２〜２８１６）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１〜２５８４）を含む広範な種々の細胞型を感染させるために用いることができるという点で有利である。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそれを含む外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれないが、エピソームを残しており、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）に組み込まれる状況で挿入突然変異の結果として生じ得る潜在的な問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡがアデノウイルスゲノムを担持する能力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（８キロベースにおよぶ）（前に引用した、Ｂｅｒｋｎｅｒら；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ５７：２６７）。現在使用されているほとんどの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全てまたは一部を欠いているが、アデノウイルス遺伝子材料の８０％程度を保持している。
【０１２１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および増殖のライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような別のウイルスを要する、天然に存在する欠損ウイルスである（概説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７〜１２９を参照のこと）。これはまた、そのＤＮＡを分裂していない細胞に組み込み得る、数少ないウイルスのうちの１つであって、高い頻度の安定な組み込みを示す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９〜３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３〜１９７３を参照のこと）。３００塩基対程度の少ないＡＡＶを含むベクターをパッケージングすることが可能であり、組み込むことが可能である。内因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限定される。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０に記載されるようなＡＡＶベクターを用いて、細胞にＤＮＡを導入することができる。ＡＡＶベクターを用いて、種々の核酸を異なる細胞型に導入した（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６〜６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９；およびＦｌｏｔｔｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０を参照のこと）。
【０１２２】
細胞に核酸を導入する特定の発現ベクター系および方法の効率は、当該分野で慣用的に用いられる標準的なアプローチによって評価することができる。例えば、細胞に導入されたＤＮＡは、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロッティング）によって決定することができる。そして導入されたＤＮＡの転写によって生成されたＲＮＡは、例えばノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護または逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出することができる。遺伝子産物は、適切なアッセイによって、例えば、生成されたタンパク質の免疫学的検出によって、例えば特定の抗体を用いて、またはこの遺伝子産物の機能的な活性を検出するための機能的なアッセイ、例えば酵素アッセイによって検出することができる。細胞によって発現されるべき、目的となる重要な遺伝子産物が容易にアッセイできない場合、用いられるべき調節エレメントおよびベクターに連結されたレポーター遺伝子を用いて、発現系を最初に最適化することができる。このレポーター遺伝子は、容易に検出可能であり、従って、このシステムの有効性を評価するために用いることができる遺伝子産物をコードする。当該分野で用いられる標準的なレポーター遺伝子としては、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ／ＥＧＦＰおよびヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１２３】
細胞の集団に核酸を導入するために用いられる方法によって、細胞の大部分の改変および、この細胞による遺伝子産物の効率的な発現が生じる場合（例えば、ウイルス発現ベクターを用いる場合によくあるように）、細胞の改変された集団は、この集団内の個々の細胞のさらなる単離またはサブクローニングなしに用いることができる。すなわち、細胞の集団による遺伝子産物の十分な産生が存在し得、その結果さらなる細胞の単離が不要である。あるいは、単一の改変された細胞由来の、同一に改変された細胞の均一な集団を増殖させて、この遺伝子産物を効率的に発現する細胞を単離することが所望され得る。このような均一な細胞の集団は、限界希釈クローニングによって改変した単一の細胞を単離すること、続いて、標準的な技術により、この単一の細胞を培養中で細胞のクローン集団に増殖させることによって調製され得る。
【０１２４】
本明細書において用いる場合、「トランスジェニック細胞」という句は、細胞であって、部分的にまたは完全に異種の、すなわち外来の核酸配列がその細胞に挿入されるか導入されている細胞をいう。トランスジェニック細胞はまた、細胞であって、その細胞の内因性遺伝子に対して同種である核酸がそこに挿入されている細胞であってもよい。しかし、この場合、相同な核酸は、それが挿入される細胞のゲノムを変更するような方式で、その細胞のゲノムへ挿入されるように設計されるかまたは挿入される。例えば、同種の核酸は、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるか、または同種の核酸の挿入は、特定の表現型のノックアウトを生じる。細胞に挿入された核酸は、選択された核酸の至適の発現に必要であり得る、１つ以上の転写調節配列、およびイントロンのような任意の他の核酸を含んでもよい。
【０１２５】
本発明のなお別の局面において、被験体マイクロ器官培養物は、悪性腫瘍および疾患の診断および処置において補助するために用いることができる。例えば、器官（例えば、皮膚、腎臓、肝臓など）の生検は、過剰増殖障害または新生増殖障害を有することが疑われる患者から採取してもよい。生検の外植体が、本発明の方法によって培養される場合、この外植体の増殖性細胞は、培養の間にクローン培養される。これによって、このような障害を検出する機会が増大し、従って診断の正確度が増大する。さらに、患者のマイクロ器官培養物をインビトロで用いて、細胞傷害性化合物および／または薬学的化合物をスクリーニングし、最も有効である化合物（すなわち、悪性の細胞または疾患状態の細胞を殺傷するが正常な細胞に害を与えない化合物）を特定することができる。これらの作用剤を患者の治療的処置に使用することができる。
【０１２６】
本発明のさらなる局面は、広範な種々の化合物、例えば、細胞傷害性化合物増殖因子／調節因子、薬学的因子などをスクリーニングするために本発明のマイクロ器官培養物を用いる方法に関する。例えば、潜在的に毒性の性質の化合物の徹底的な試験の必要性が一般に認識されており、そして薬物、化粧品、食品添加物および殺虫剤の評価のための鋭敏でかつ再現性の短時間のインビトロアッセイを開発する必要が明らかである。本明細書において記載されるマイクロ器官培養物によって、アッセイ基質としての組織等価物の使用が可能になり、そしてインビボ状態を厳密に模倣するシステムにおける正常な細胞相互作用という利点が得られる。
【０１２７】
この目的を達成するために、培養物をインビトロで維持して、試験されるべき化合物に曝露する。細胞傷害性化合物の活性は、それが外植体における細胞の表現型を調節する（殺傷を含む）能力によって測定することができる。これは、生体染色技術、マーカーの発現などによって容易に評価され得る。例えば、増殖因子／調節因子の効果は、例えば、総細胞カウントおよび異なる細胞カウントによって、培養物の細胞含量を分析することによって評価できる。これは、型特異的な細胞抗原を規定する抗体を使用する免疫細胞科学技術の使用を含む、標準的な細胞学的技術および／または組織学的技術を用いて達成することができる。本発明のシステムにおいて培養された正常な細胞に対する種々の薬物の効果を評価することができる。例えば、乾癬組織の増殖を減少させる薬物を特定することができる。
【０１２８】
本発明の方法の例示的な実施形態において、外植体における細胞の増殖を刺激する因子を検出するために誘導されたこの方法は、被験体から組織外植体を単離する工程を包含する。ここで外植体の細胞の集団は、この外植体が単離された器官または組織の微小構造を保持し、例えば、この外植体は、少なくとも約１．５ｍｍ−１のアレフによって特徴付けられ、そして増殖する能力を有する少なくとも１つの細胞を含む。この外植体は、候補化合物とともに培養されて接触されてもよい。次いで、候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルを測定して、候補化合物の非存在下における細胞増殖のレベルと比較する。候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルの実質的に有意な増大は、細胞増殖因子の指標である。
【０１２９】
本明細書において用いる場合、「候補化合物」または「候補因子」という句は、増殖活性、抗増殖活性、分化活性、抗分化活性、または抗ウイルス活性について試験されるか、試験されるべき因子をいう。このような因子は、例えば、有機低分子、生物学的抽出物、および組み換え産物または組成物であってもよい。
【０１３０】
細胞増殖を測定する方法は、当該分野で周知であり、そしてほとんど共通して細胞複製のＤＮＡ合成特徴を決定する工程を包含する。ＤＮＡ合成を測定するためには当該分野には多くの方法が存在しており、そのいずれも本発明に従って用いることができる。本発明の１つの実施形態において、ＤＮＡ合成は、免疫蛍光による検出のために放射性標識（３Ｈチミジン）または標識されたヌクレオチド類似体（ＢｒｄＵ）を用いて決定されている。
【０１３１】
なお別の実施形態によって、細胞増殖のインヒビターを特定するための方法が提供される。この方法は、上記のような組織外植体を提供する工程、その外植体を候補化合物と接触させる工程、およびこの候補化合物の存在下で細胞の増殖のレベルを測定する工程を包含する。候補化合物の存在下における細胞増殖のレベルの実質的に有意な低下は、細胞増殖のインヒビターの指標である。
【０１３２】
例示的な実施形態において、例えば、所望の効果に依存して毛（髪）成長を制御するために、細胞増殖の増強因子およびインヒビター（本明細書において、抗増殖因子をも呼ばれる）の両方を用いることができる。
【０１３３】
羊毛および毛（髪）のような硬性のケラチン繊維の成長は、真皮鞘細胞の増殖に依存する。鞘の毛包幹細胞は、高度に活性であり、そして急速な増殖および複雑な分化を通じて毛（髪）繊維を生じる。毛（髪）サイクルは、３つの明白な相を含む：発育期（成長する）、退行期（退行する）、および休止期（休止する）。毛包の表皮幹細胞は、後期休止期の間に皮膚乳頭によって活性化される。これは、「毛隆起部活性化」と命名される。さらに、このような幹細胞は、多能性幹細胞であると考えられ、毛（髪）および毛包構造を生じるだけでなく、脂腺および表皮も生じる。細胞増殖因子および細胞増殖のインヒビターは、例えば、毛包細胞、詳細には毛包の幹細胞の増殖の静止状態を誘導するような毛（髪）成長サイクルの動態を変更する手段を提供する。
【０１３４】
毛包細胞増殖のインヒビターは、切断、剃毛または脱毛によるヒトの毛（髪）の従来の除去に対して、ヒトの毛（髪）の成長を低下させる手段として使用することができる。例えば、本発明の方法を用いて同定された毛包細胞のインヒビターは、毛（髪）の異常に急速なまたは濃い成長によって特徴付けられる毛髪病、例えば多毛症の処置において用いることができる。例示的な実施形態において、このようなインヒビターを用いて、異常な毛深さによって特徴付けられる障害である多毛を管理することができる。このようなインヒビターの使用によってまた、脱毛の期間を延長するためのプロセスを提供することができる。
【０１３５】
毛包細胞増殖のインヒビターはまた、有効性のために細胞周期のＳ期への進行を要する細胞傷害性因子、例えば、放射線誘導性死から毛包細胞を保護するために用いることができる。このようなインヒビターを用いた処置は、例えば、Ｓ期に入ることから細胞を阻害することによって、毛包細胞を静止状態にさせることによって、そしてこれによって毛包細胞を有糸分裂の破局またはプログラムされた細胞死を受けることから防止することによって保護を提供する。例えば、毛包細胞増殖のインヒビターは、通常は毛（髪）の喪失を生じる、化学療法または放射線療法を受けている患者に用いることができる。このような治療の間の細胞周期の進行を阻害することによって、インヒビターでの処置は、毛包細胞を死亡（さもなければ細胞死プログラムの活性化から生じ得る）から防御することができる。治療が終了した後、インヒビター処置はまた、毛包細胞増殖の阻害の救済を伴って除去することができる。
【０１３６】
しかし、毛（髪）成長管理の基礎にある分子機構の特徴付けを開始し、そして潜在的な毛（髪）影響薬物を試験するためには、適切な毛（髪）成長のためのインビトロモデルが必要である。本発明の１つの局面において、本発明の方法を用いて、毛包の微小構造、例えば、毛包の毛包上皮層と間質成分（皮膚乳頭）との間の相互作用、例えば１つ以上の幹細胞、外毛根鞘細胞、マトリックス細胞および内毛根鞘細胞を保持する毛包マイクロ器官外植体を生成する。添付の実施例において実証されるとおり、毛（髪）成長は、血清なしでさえ、例えば、最小培地においてさえ、これらのマイクロ器官培養物において観察することができる。重要なことに、本発明はまた、例えば、休止している、実質的に休止期における毛包を提供する、毛包培養物を提供する。以下に実証されるように、休止期の毛包外植体は、インビトロ培養物において、そして特定の実施形態において同調した様式で、増殖発育毛包に活性化され得る。毛包の表皮幹細胞の初期の一過性の増殖は、毛包器官の種々の組織によって生成される、例えばパラクリン因子および／または自己分泌因子によって媒介される発育期の活性化を理解するための固有の機会を提供する。
【０１３７】
さらに、本発明のマイクロ器官培養物は、例えば、毛（髪）成長を促進または阻害し得る因子を特定するために、毛包の活性化または不活性化を調節する因子を同定するためのシステムを供給する。１つの実施形態において、以下の実施例ＸＶＩＩＩに記載されるような休止期（休止している）毛包外植体が、種々の試験因子と接触され、そして毛包の刺激のレベルが検出される。例えば、毛包幹細胞の休止期から発育期への移行は、この毛包の細胞の有糸分裂指数を観察すること、または増殖を検出するいくつかの他の類似の方法によってモニターできる。例示するために、図１７は、チミジン取り込みを用いて、試験化合物（この図ではＦＧＦ）の有無におけるこの外植体の幹細胞活性化の相対的レベルを測定することができることを示す。ここでは、毛髪成長促進活性を有する試験因子の増殖指標が増大している。
【０１３８】
リバースアッセイにおいて、発育期のマイクロ器官移植体を、例えば、添付の実施例に記載される活性化Ｓｅｎｃａｒ外植体、または成長因子で刺激された外植体（例えば、ＦＧＦ刺激された外植体）のような培養物に提供する。毛包幹細胞の増殖を阻害する試験因子は、例えば、未処理の発育期の外植体に比して、毛（髪）成長を妨げる休止期の因子としての使用についてさらに考慮されてもよい。
【０１３９】
なお他の実施形態において、本発明のアッセイによって特定された細胞増殖のインヒビターは、新生細胞または過形成性細胞の増殖、例えば腫瘍形成および増殖を阻害するために使用することができる。本発明の好ましい実施形態は、上皮腫瘍形成および増殖の阻害に関する。皮膚上皮腫瘍形成の詳細な説明については、１９９５年２月７日に出願された米国特許出願第０８／３８５１８５号を参照のこと。腫瘍形成は、浸潤および転移を生じる、細胞とその周囲との間の相互作用における細胞増殖および障害の制御の変更の結果として生じる。細胞分裂から生じる細胞数の増大と、分化または細胞死に起因する細胞周期からの脱落との間の関係の破壊によって、細胞増殖の制御の妨害がもたらされる。正常な組織においては、各々の幹細胞が幹細胞区画中の残りの２つの娘細胞のうちの１つだけを分裂するとき、他方は分化の経路に方向付けされるということを確実にすることによってホメオスタシスが維持される（Ｃａｉｒｎｓ，Ｊ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５５：１９７〜２００）。従って、細胞増殖の制御は、これらのプロセスに影響するシグナルの結果である。これらのシグナルは、陽性であっても陰性であってもよく、腫瘍形成能の獲得は、これらのコントロールポイントに影響する遺伝子変化から生じる。
【０１４０】
実施例ＩＸに記載され、そして図１２に図示されるように、本発明の皮膚マイクロ器官培養物は、細胞増殖因子および細胞増殖のインヒビターを特定するために用いられている。実施例ＩＸに記載されるように、ＴＧＦ−βを試験したところ、細胞増殖のインヒビターとして作用することが見出された。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質であるアクチビンはまた、表皮細胞の増殖を阻害することが示されている。これらの結果によって、上皮細胞の増殖を阻害するのに役割を果たすＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーが存在し得ることが示される。このデータによって、表皮ホメオスタシスの重要な調節因子として、そしてインビボでの上皮腫瘍形成および増殖の阻害における、ＴＧＦ−βファミリーでのタンパク質の役割が示唆される。
【０１４１】
本発明の別の局面は、細胞分化因子、すなわち細胞分化を生じる化合物を特定するための方法に関する。この方法は、被験体から細胞の集団を単離する工程を包含するが、この細胞の集団は、この細胞が単離される器官または組織の微小構造、少なくとも約１．５ｍｍ−１の表面積対容積指数を有し、そして分化する能力を有する少なくとも１つの細胞を含む。次いで、この細胞を少なくとも約２４時間培養中に配置して、候補化合物と接触させる。次いで、この候補化合物の存在における細胞分化のレベルを測定して、候補化合物の非存在下における細胞分化のレベルと比較する。候補化合物の存在下における細胞分化のレベルの実質的に有意な増大は、細胞分化因子の指標である。本明細書において用いる場合、分化とは、細胞がもともと保有している形態および／または機能とは異なるか、および／またはそれに加えて、獲得された形態および／または機能を有する細胞をいう。代表的には、これらの形態および機能は、成熟細胞に特徴的である。本発明の細胞の集団の分化は、特殊化した細胞産物の産生および／または分泌を測定することによってモニターすることができる。
【０１４２】
類似の方式で、本発明はまた細胞分化のインヒビターを特定するための方法に関する。上記と同じプロトコールに従って、候補化合物の存在における細胞分化のレベルを測定して、候補化合物の非存在下での細胞分化のレベルと比較する。候補化合物の存在下における細胞分化のレベルの実質的に有意な低下は、細胞分化のインヒビターの指標である。
【０１４３】
なお別の実施形態において、本発明の培養物によって、ウイルス感染のインビトロモデルの生成が可能になる。例えば、表皮または扁平上皮組織を単離して、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２；水疱瘡ウイルス；またはヒトパピローマウイルス、例えば、任意のヒトパピローマウイルス１−５８、例えば、ＨＰＶ−６、またはＨＰＶ−８のようなウイルスを用いて感染させてもよい。同様に、肝臓モデルが肝臓感染、例えば、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスに感染された外植体のために提供され得る。ウイルス感染した組織外植体を用いて、本発明の方法によってウイルス感染性のインヒビターを特定することができる。上記のように、特定のマイクロ器官培養物が提供され、そして（必要に応じて）細胞に感染してウイルス感染細胞の集団を生成するウイルスと接触される。次いで、このウイルス感染細胞は、候補化合物と接触させられて、候補化合物の存在下におけるウイルスの感染性のレベルが測定される。次いで、候補化合物の存在下におけるウイルス感染性の測定されたレベルを、候補化合物の非存在下におけるウイルス感染性のレベルと比較する。候補化合物の存在下におけるウイルスの感染性のレベルの実質的に有意な低下は、ウイルス感染性のインヒビターの指標である。
【０１４４】
ウイルス感染性を測定する方法は、当該分野で公知であり、そして用いられるウイルスのタイプに依存して変化する。例えば、ウイルスの感染性のレベルを測定するために用いられ得る方法の１つは、マイクロ器官培養物の感染された細胞中において、またはマイクロ器官培養物の培地において、試験されている特定のウイルスに特異的な遺伝子産物の産生のレベルを測定することによる。例えば、マイクロ器官培養物において細胞の肝炎ウイルス、例えばＢ型肝炎ウイルスの感染性のレベルを測定するために、肝炎ウイルスタンパク質産生および肝炎ウイルスＤＮＡを定量してもよい。概して、マイクロ器官培養物は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、ＥＬＩＳＡ上で、当該分野で公知の種々の方法によって分析される、選択されたウイルスタンパク質に対する抗体および免疫反応性タンパク質とともにインキュベートされてもよい。例えば、Ｂ型肝炎表面抗原の産生を測定するため、Ｂ型肝炎ウイルスと事前にインキュベートしたマイクロ器官由来のマイクロ器官培養物培地を、毎日サンプリングして、製造業者によって記載されるＥＬＩＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ）方法によって表面抗原についてアッセイしてもよい。この方法は、連続希釈した標準の表面抗原（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）を用いる定量のために改変され得る。培養培地におけるＢ型肝炎表面抗原の蓄積の実質的に有意な減少によって、試験された候補化合物は肝炎ウイルス感染性のインヒビターであることが示される。
【０１４５】
マイクロ器官培養培地におけるＨＢｓＡｇのレベルを測定することに加えて、マイクロ器官培養物由来の細胞抽出物からの新たに合成されたＢ型肝炎ウイルスＤＮＡは、ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、続いてプローブとしてＨＢＳプレＳ（ＨＢｓＡｇコード）領域中の標識されたプライマー対を用いるサザンブロット解析によって、検出しかつ定量することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，第二版，第２巻．ｐｐ１０．１４−１０．１５を参照のこと）。相対的定量は、デンシトメトリーによって得ることができ、そして対応するバンドのシンチレーションカウントによって確認することができる。新しく合成されたウイルスＤＮＡのレベルの低下によって、試験された候補化合物が肝炎ウイルス感染性のインヒビターであるということが示される。
【０１４６】
別の実施例において、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質産物をやはり、上記および当該分野で公知の他の標準的技術を用いて測定することができる。例えば、ＨＩＶに感染したマイクロ器官培養物の細胞におけるｐｏｌタンパク質発現は、細胞抽出物を抗ｐｏｌ抗体またはプールされたＡＩＤＳ患者血清とともにインキュベートすることによって測定することができ、そして免疫反応性タンパク質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で解析することができる。本発明のマイクロ器官培養物中で、ヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン／バーウイルス（ＥＢＶ）の感染性を測定するために、ＥＢＶ  ＤＮＡおよびＥＢＶ誘導性の核抗原産生を、本明細書に記載の方法を用いて解析することができる。
【０１４７】
本発明のマイクロ器官培養物はまた、被験体中の創傷治癒を促進するために用いることができる。従って、本発明はさらに、レシピエント被験体において創傷治癒を促進するための方法に関連する。この方法は、表面積対容積指数が少なくとも約１．５ｍｍ−１である細胞の集団をドナー被験体から単離する工程を包含する。代表的には、細胞の集団は、少なくとも約２４時間培養中におかれる。次いで、細胞の集団は、レシピエント被験体の創傷に付与され得る。１つの実施形態において、創傷または病変は、治癒が遅いかまたは慢性、例えば、糖尿病関連の創傷、例えば、火傷、例えば、潰瘍である。実施例ＸおよびＸＩに実証されるように、本発明の皮膚マイクロ器官培養物は、慢性の創傷に付与されるべきマイクロ外植体として用いられてもよく（実施例Ｘ）、そして毛（髪）を成長させ得る生存インプラントを形成し得る（実施例ＸＩ）。
【０１４８】
なお別の実施形態において、本発明のマイクロ器官外植体は、細胞傷害性についてまたは刺激性について試験するためのアッセイに提供される。例示的な実施形態において、本発明の方法は、眼または皮膚の刺激物のインビトロ試験のための技術を提供する。このプロセスは、上記とまったく同様であり、本発明のマイクロ器官培養物に対する液体、固体顆粒またはゲル様物質（例えば、化粧品）の局所適用、続いてこの培養物中で生じた効果の検出を包含する。
【０１４９】
現在、多くの化学物質、家庭の掃除用品、化粧品、塗料および他の物質の可能性のある眼および皮膚の刺激性を、動物およびヒトの被験体に対する直接適用を通じて評価する。しかし、ほとんどの産業において評価されるように、このようなアプローチは、多大な公的サポートは受けない。本発明の方法は、動物の屠殺も永久的な身体の損傷も必要としない別のアッセイを提供し、また客観的な方式でデータを提供する。例示的な実施形態において、皮膚マイクロ器官培養物は、本発明によって誘導される。培養された外植体は、試験因子、例えば、化粧品と接触されて、曝露後同じ時点で細胞生存度が評価される。好ましい実施形態において、ＭＴＴアッセイ（機能的なミトコンドリアによるテトラゾリウム色素の減少に基づく）を用いて生存度についてスコア付けする。
【０１５０】
本出願のマイクロ器官培養物はさらに、以下のために用いることができる：組織および細胞の正常なホメオスタシスに関与する因子を特定するために、栄養物の変化および潜在的な毒性因子の存在を含む細胞の環境の変化の組織および細胞の正常なホメオスタシスに対する影響を研究するために、病因または外傷の開始およびその間に誘発される組織および細胞における変化の経路を研究するために；病因または外傷に関連する変更された環境における有害な影響を逆転する修復機構を特定するために；組織の正常なホメオスタシスの間に分化する細胞の発達調節および組織内の特殊化した構造（例えば、毛包）の発達調節を研究するため；そして不十分な血液供給によって生じる治癒の不全を有する、慢性の皮膚潰瘍の患者において生じるような、または局所の皮膚がＩ型もしくはＩＩ型糖尿病として公知の状態においてのように治癒できない、個々の器官の小片が残っているが損傷された組織を修復または再生するには不十分である器官の補充のために。
【０１５１】
（例示）
本発明は、ここで一般的に記載されているが、これは以下の実施例を参照してさらに容易に理解され、以下の実施例は本発明の特定の局面および実施形態の単なる例示の目的で含まれており、本発明の限定を意図しない。
【０１５２】
成体ヒト皮膚、マウス、モルモットおよびラットの皮膚を含む動物由来のマイクロ器官培養物を単離して、培養物中で２１日間増殖させた。しかし、２１日を上回る期間、培養物を維持することは、本発明の範囲内である。
【０１５３】
さらに、広範な動物由来のマイクロ器官培養物を形成することは、本発明の範囲内である。この動物の範囲は単に例示されているだけであり、以下に提供されるサンプルには限定されない。
【０１５４】
添付の実施例において記載されているとおり、マイクロ器官培養物を皮膚から、そして哺乳動物の膵臓、肝臓、腎臓、十二指腸、食道および膀胱を含む器官からも調製した。同様に、哺乳動物の角膜、腎臓、乳房組織由来、ならびに食道に加えて種々の腸由来の組織、例えば腸および結腸由来の上皮のマイクロ器官培養物をまた、本発明の方法を用いて調製してもよい。実際、身体内の上皮／間質の構造を含む任意の部位由来のマイクロ器官培養物を単離および維持することは本発明の範囲内である。
【０１５５】
上記にかかわらず、本発明のマイクロ器官培養物の技術を用いて、上皮／間質の構造を有さない組織、例えば特定のリンパ組織、例えば胸腺および脾臓の外植体からの長期培養物中で組織外植体を保存している。
【実施例１】
【０１５６】
（上皮のマイクロ器官培養物の調製）
新鮮な皮膚を手術後に得て、基礎にある脂肪組織を除去して、０．４×５ｃｍの皮弁に切断し、次いでこれを滅菌条件下で、組織チョッパーまたは他の適切な切断方法を用いて、３００μｍの切片に横断して切り出し、それによって最終組織セグメントは、４ｍｍ幅および０．３ｍｍ厚みの寸法を有することとなった（図１を参照のこと）。これらのマイクロ器官を、１〜８日間１２ｒｐｍで続けて振盪しながら、５％ＣＯ２、３７℃のもとで、血清を含まない４００μｌのＤＭＥＭを含有する２４ウェルのマイクロプレート中に入れた。１ウェルごとに２０個のマイクロ外植体を増殖させた。
【実施例２】
【０１５７】
（マウス、モルモットおよびヒトの表皮マイクロ器官培養物の増殖の測定）
実施例Ｉに従ってマイクロ器官培養物を調製して、以下のようにＤＮＡ合成の量を解析することによって細胞の増殖を測定した。マウスの皮膚およびモルモットの皮膚を２日間増殖させて、ヒトの皮膚を４日間増殖させ、その後、３時間、最終濃度１００μＭに培地にＢｒｄＵを添加し、その後４％ホルムアミド中で細胞を固定した。固定後、培養物をヤギ抗ＢｒｄＵ抗体を用いて、続いて抗ヤギＦＩＣＴ標識したＩｇＧを用いて染色した。組織学的調製物を、その後４％ホルムアミド固定に包埋して、３μｍの切片に切断してメチレンブルーで染色した。
【０１５８】
インビトロにおいてＤＮＡを合成する細胞の画分は培養中で２〜４日間後、インビボで観察された値に比べて１０倍まで増大し、その後ＤＮＡ合成の速度は徐々に低下したが、培養の１０日までは高いままであったということが見出された（図２、３、および４Ａ〜４Ｄを参照のこと）。培養中での６日目でさえ、細胞は一定状態の増殖および分化を維持し、その結果組織構造は保存された（図５Ａ〜５Ｃ）。
【実施例３】
【０１５９】
（種々のサイズのマイクロ器官培養物における細胞の増殖）
モルモットマイクロ器官を、実施例Ｉのとおり調製した。４ｍｍ幅の全厚の皮膚ストリップを、種々の厚みの外植体に切り出した。これには３００、４５０、６００、７００、９００、１２００および３０００μｍの厚みの切片を含む。これらのスライスを２日間、血清なしの培地を含むウェル中に個々に入れた。最終濃度１００μＭでの終了の前に４時間ＢｒｄＵを添加した。次いで、この外植体を４％ホルムアミド中で固定して、ＢｒｄＵに対するヤギ抗体、続いて抗ヤギＩｇＧＦＩＴＣ標識二次抗体調製物を用いて染色した。この実験の結果を図６に図示する。細胞／単位組織の数の関数としてＢｒｄＵ取り込みの量は、外植体の厚みが増大するにつれて有意に減少した。
【実施例４】
【０１６０】
（膵臓マイクロ器官培養物の調製、および細胞増殖の測定）
モルモット膵臓を取り出して、次いで適切な組織チョッパーを用い、そして膵臓の微小構造が維持される方式で、３００μｍの厚み、４ｍｍの幅および２ｍｍの深さの切片に切断した。このマイクロ外植体を培養中で、２日〜１８日間におよぶいくつかの時間にわたって増殖させた。７つのマイクロ器官を、１２ｒｐｍで一定に振盪しながら５％ＣＯ２、３７℃のもとで、血清を含まない１５０μｌのＤＭＥＭを含有する９６ウェルのプレート中に各々入れた。最終濃度１００μＭでの終了の３時間前にＢｒｄＵを添加し、次いで、この外植体を４％ホルムアミド中で固定して、ＢｒｄＵに対するヤギ抗体、続いて抗ヤギＦＩＴＣ標識ＩｇＧを用いて染色した。図７Ａ〜７Ｂは、膵臓由来のマイクロ器官において細胞が活発に増殖されたことを図示する。
【実施例５】
【０１６１】
（膵臓のマイクロ器官培養物の調製、およびこの培養培地中へのインスリン分泌の測定）
成体ブタの膵臓マイクロ器官培養物を皮膚についての以前の実施例のとおり調製した。膵臓を取り出して、ハサミを用いてほぼ２ｍｍの厚みに切断して、４ｍｍの幅を有する３００μｍの厚みの切片に切り出した。このマイクロ培養物を無血清培地中で１４日間増殖させた。２日間ごとに培地を取り出して、新鮮な培地を添加した。標準的なラジオイムノアッセイ法を用いてインスリン含量について収集した培地をアッセイした。
【実施例６】
【０１６２】
（異種被験体へのブタ膵臓マイクロ器官の移植）
成体ブタの膵臓マイクロ器官培養物を皮膚についての以前の実施例のとおり調製した。膵臓を取り出して、ハサミを用いてほぼ２ｍｍの厚みに切断して、４ｍｍの幅を有する３００μｍの厚みの切片に切り出した。このマイクロ培養物を無血清培地中で０〜５日間の種々の期間、増殖させ、培養後、膵臓のマイクロ器官を培養物から取り出して、ラット宿主の内臓および体壁中胚葉の両方へ移植した。このマイクロ器官は、インビボで少なくとも１ヶ月間生存し、そして十分に血管新生した。インビボにおいて３日、５日、７日および１４日後、過剰な細胞増殖が検出され得る。さらに、正のインスリン染色が、インビボにおいて移植の４日、７日および３０日後に観察された。
【実施例７】
【０１６３】
（肝臓、腎臓、十二指腸、食道および膀胱のマイクロ器官培養物の調製、ならびにこのマイクロ器官培養物における細胞増殖の測定）
いくつかの上皮組織を含む器官由来のモルモットマイクロ器官培養物を、皮膚についての以前の実施例のとおり調製した。器官を取り出して、ハサミを用いて、ほぼ２ｍｍの幅、３ｍｍの長さに切断して、３００μｍの厚みの切片に切り出した。このマイクロ培養物を無血清培地中で３日間、４日間および６日間インキュベートした。実験終了の１２時間前に、３Ｈチミジンを外植体の培養物に添加した。終了時、組織を固定して、数回リンスして、シンチレーションカウンターでカウントした。この実験の結果を図９に図示する。図９に示されるとおり、全ての組織が３Ｈチミジンの取り込みによって決定されるとおり６日間続く活性な増殖を示した。
【実施例８】
【０１６４】
（マイクロ器官培養物における毛包の増殖）
皮膚マイクロ器官培養物を実施例Ｉに従って調製して、２日間インキュベートした。ＢｒｄＵをインキュベーション終了の３時間前に添加した。細胞を４％ホルムアミド中に固定して、ヤギ抗ＢｒｄＵ抗体、続いて抗ヤギＦＩＴＣ標識ＩｇＧを用いて染色した。インビボでそれらの正常な環境で存在したインタクトな毛包は、血清また任意の他の内因性因子を添加する必要なしに、正確に制御された培養条件下で維持することができた。これらのマイクロ器官における毛包細胞は、ＢｒｄＵを取り込んだ多数の毛包細胞によって示されるように、本発明の方法の条件下で数日間活発に増殖することが見出された（図１０Ａ〜１０Ｃ）。マイクロ器官モルモット培養物の０時点および２週間後での毛幹のサイズ分布を図１１に示す。培地は２日ごとに交換した。毛幹のサイズは小、中、大として恣意的に分類された。培養中での９日間後、サイズ分布において、小の毛（髪）の割合が６４％〜２８％に低下するが、培養の開始の時点では存在しなかった大の毛幹が毛幹の集団の３０％を占めるような明確なシフトが存在した。
【実施例９】
【０１６５】
（細胞増殖に対する候補化合物の効果を測定するためのアッセイの準備）
実施例Ｉに記載したのと同様の増殖条件で、規定の培地中で培養物を調製して維持した。コントロールサンプルを免疫細胞化学によって解析して、インビボで生じるのと同様の方式でマイクロ器官培養物が維持されたことを確認した。
【０１６６】
皮膚マイクロ培養物の複製サンプルを、ＴＧＦ−βを２．５ｎｇ／ｍｌで用いて処理した。ＢｒｄＵ標識した細胞／外植体の数の定量解析を、実施例ＩＩに従って実施した。コントロールに比べて、ＴＧＦ−βの存在下で、ＤＮＡ合成の９０％より大きい阻害が観察された（図１２）。
【実施例１０】
【０１６７】
（慢性の非治癒皮膚潰瘍の治癒を促進する方法）
この方法によれば、正常な関与しない皮膚移植片の小領域を患者から取り出して、４ｍｍ幅でかつ０．３ｍｍ厚みの完全厚のマイクロ外植体を、実施例Ｉに記載のとおり調製する。しかしこの調製物は、０．３ｍｍの切片への断片化が、故意に不完全であり、その結果一連の切片が図１３に示されるように、角質層を含む上部表皮層と一緒に保持されるという点で実施例Ｉとは異なる。このインプラントの設計は、栄養物が全ての細胞に達することを可能にするが、ただし操作可能な様式で組織スライスを維持するように指向される。患者の創傷は、清浄化され、そして周囲の皮膚の末端が取り除かれる。次いで、皮膚を欠く領域は、マイクロ外植体によって注意深く被覆され、これが創傷上に置かれて、その結果切り出されていない末端は、外側に面して、対向する切り出された小片は、創傷内の液体に浮遊される。創傷領域を実質的に被覆するのに十分なマイクロ外植体を調製する。次いで、処置された領域を適切な包帯剤で被覆して、治癒させる。
【実施例１１】
【０１６８】
（インビボにおける毛包の増殖）
インビボにおける動物実験を実施したが、ここでは、上記のように皮膚領域全体の角質層がインタクトに残るように、皮膚の１ｃｍ２の面積をマウスから取り出して、不完全に顕微鏡用に切り出した。マイクロ器官をマウスにおけるそのもとの位置に再移植して、縫い合わせ、治癒させた。このインプラントは生存したままであり、動物組織中に組み込まれ、そして新しい毛幹が、培養物中で１〜２週間後このインプラントから成長した（図１４を参照のこと）。
【実施例１２】
【０１６９】
（ヒト乾癬皮膚マイクロ器官培養物）
８２歳の高齢の患者からの中間層乾癬皮膚を、検死解剖後にデルマトーム（採皮刀）を用いて得た。次いで皮膚を０．５×５ｃｍの皮弁に切り出して、次いで、これを組織チョッパーまたは他の適切な切断デバイスを用いて３００μｍの切片に横断して切り出した。これらのマイクロ器官切片を、一定に振盪しながら５％ＣＯ２、３７℃のもとで、血清を含まないＤＭＥＭを含有するマイクロプレート中に１〜１４日間入れた。いくつかの場合、増殖因子を培養培地に入れた。培地を２日毎に交換した。ヒト乾癬皮膚は、マイクロ器官培養物として広く増殖した。
【実施例１３】
【０１７０】
（肝炎ウイルスに感染した肝臓マイクロ器官培養物）
ヒト、ラット、マウスおよびモルモットの肝臓を切り出して、実施例ＶＩＩに記載のようにマイクロ器官培養物として培養した。これらのマイクロ器官培養物における活性な増殖を、本明細書に記載のようなＢｒｄＵ取り込みを用いて検出した。これらのマイクロ器官培養物における肝細胞は、培養物中で少なくとも１４日間後、尿素のアッセイ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，尿素検出キット）およびアルブミン産生（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合、機能的であることが確認された。
【０１７１】
上記のように調製したヒト肝臓マイクロ器官培養物を、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスに陽性の患者由来の血清とともにインキュベートした。２４時間後、培地を取り出して、１０％の正常なウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が有無の状態の新鮮なＤＭＥＭを添加した。２日毎に、培養培地を、ウイルスタンパク質ＨＢｓに対する抗体を用いてウイルス粒子について試験した新鮮な培地および馴化培地と交換した。ＦＣＳの存在下で培養されたマイクロ器官培養物中で４日後にウイルス粒子の数の有意な増大が検出された。
【実施例１４】
【０１７２】
（胸腺および脾臓のマイクロ器官培養物）
胸腺および脾臓からのマウスおよびラットのマイクロ器官培養物を本質的に、皮膚についての前の実施例のとおりに調製した。器官を取り出してハサミを用いてほぼ２ｍｍの幅および３ｍｍの長さに切断した。次いで、これらのサンプルを、適切な組織チョッパーを用いてこの器官の本質的な微小構造が保持される方式で、約３００μｍの厚みの外植体にスライスした。次いで、このマイクロ器官を無血清培地中で１日、３日、５日および１０日間インキュベートした。これらのマイクロ器官培養物における活性な増殖を、本明細書に記載のようにＢｒｄＵ取り込みを用いて検出した。
【実施例１５】
【０１７３】
（骨髄マイクロ器官培養物）
ラットおよびマウスの大腿骨からインタクトな骨髄を注意深く取り出すことによって、骨髄からマイクロ器官培養物を調製した。このような外植体における骨髄の直径は、約１〜２ｍｍしかないので、組織チョッパーを用いて３００μｍの厚みを有するマイクロ器官外植体へと骨髄を直接スライスした。この方法によって、骨髄の微小構造が保存されているが、同時に長期培養の影響を受けやすい表面／容積指数を保持していることが確実にされた。無血清培地中で３日間マイクロ器官をインキュベートした。これらのマイクロ器官培養物における骨髄細胞の活発な増殖を、本明細書に記載されるようなＢｒｄＵ取り込みを用いて検出した。
【実施例１６】
【０１７４】
（皮膚マイクロ器官培養物に対する遺伝子産物の送達）
本発明のマイクロ器官培養物に固有の高い表面積対容積比によって、種々の遺伝子移入技術のために組織に容易に接近することが可能になる。本実施例において、マイクロ器官培養物は、エレクトロポレーションおよびリポフェクチンを用いて外来遺伝子でトランスフェクトされる。このマイクロ器官培養物は、動物に移植されて、インビボで少なくとも約３０日間生存して、血管新生することができる。これによって、エキソビボにおける遺伝子治療プロトコールにおいて組織のＭＣ培養を用いることの実現可能性が実証される。ＭＣ培養物のさらなる利点は、ＭＣ培養物を身体の規定の位置に移植することが可能であり、その結果必要であれば、将来は容易に取り出すことができるということである。このことは、細胞が遊走可能であるかまたは正常な組織において「損失」され得る、身体への細胞懸濁物の移植とは対照的である。
【０１７５】
モルモットの皮膚を解剖して、２ｍｍの幅および３００μｍの厚みを有する切片にスライスした。製造業者の推奨する濃度でペニシリンおよびストレプトマイシンを有する無血清のダルベッコ最小基本培地中で、皮膚をマイクロ器官として培養した。３７℃および５％ＣＯ２での培養中で１日後、皮膚マイクロ器官培養物を、抗生物質なしのＤＭＥＭを用いてリンスして、氷上で５００μｌの培地を有する０．４ｃｍのギャップのディスポーザルエレクトロポレーションキュベットに添加した。
【０１７６】
示されたレポーター遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡの１０μｇを、示されたとおり添加した（各々のプラスミドが、βガラクトシダーゼ（コントロール）またはルシフェラーゼレポーター遺伝子のいずれかの発現を駆動するサイトメガロウイルスプロモーターを有した）。ルシフェラーゼプラスミド骨格は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子とインフレームで融合したｐＲＣ−ＣＭＶ（インビトロゲン）であった。
【０１７７】
このサンプルを２２０ｍＶで、そして図１５に示されるように変化させたキャパシタンスで（Ｈｉ＝９００μＦ、中＝５００μＦ、低＝２５０μＦ）、エレクトロポレーションした。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、２５０μＦでＢｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーションデバイスを用いて処置した。次いでこのサンプルをさらに、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミン酸を含有するＤＭＥＭを用いて、２日間２４ウェル培養プレート中でインキュベートした。培地を取り出して、このサンプルを約７００μｌの細胞培養物溶解剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に懸濁した。組織切片をホモジナイズして、次に２０μｌを１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）に添加して、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔを用いてルシフェラーゼを三連で検出した。陽性コントロールとして、７５ｃｍの培養フラスコからのＮＩＨ３Ｔ３細胞をトリプシン処理して、マイクロ器官培養物と同じく処理した。図１５に図示されるとおり、中（５００μＦ）および低（２５０μＦ）のキャパシタンス設定で、有意なルシフェラーゼ活性が検出された。比較のために、同様の量のＮＩＨ３Ｔ３不死の培養細胞を、２５０μＦで同じプラスミドを用いてエレクトロポレーションした。
【０１７８】
別の実験では、マイクロ器官移植体のトランスフェクションは、リポフェクションによって達成され、これは、エレクトロポレーションよりも効率的であることが観察された。詳細には、モルモット皮膚、新生仔マウス皮膚、およびラット肺由来のマイクロ器官培養物を、ルシフェラーゼレポーターを含有するプラスミドを用いてトランスフェクトした。要するに、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｌグルタミンを有するＤＭＥＮ中で５．５％ＣＯ２において３７℃で、マイクロ器官培養物をトランスフェクションの前に１日間増殖させた。外植体を、１ウェルあたり２０個の外植体を含み、かつ４００μｌの培地を含有する２４ウェルプレート上にプレートした。トランスフェクションのために、マイクロ器官培養物をＯｐｔｉｍｅｍで２回リンスし、そして１０μｌのリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）＋２μｇのＤＮＡ＋Ｏｐｔｉｍｅｍを、各々のウェルに添加して、最終容積を５００μｌとした。Ｏｐｔｉｍｅｍ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ／ＤＮＡ溶液は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの製造業者の指示に従って作製した。次いで、この培養物を５．５％ＣＯ２中で３７℃で５〜６時間インキュベートした。次いで、Ｏｐｔｉｍｅｍ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ／ＤＮＡ培地を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌグルタミンおよび１０％ＦＣＳを含有する４００μｌのＤＭＥＮと置換して、この培養物を５．５％ＣＯ２中で３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、マイクロ器官培養物を取り出して、１×ＰＢＳを用いて２回洗浄し、そして手動式のガラス組織グラインダー中で７５０μｌの１×細胞培養物溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で粉砕した。導入遺伝子からのルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、この結果を図１８に報告した。
【実施例１７】
【０１７９】
（マイクロ器官培養物への遺伝子産物の送達）
８週齢の雌性Ｌｅｗｉｓラット由来の肺および胸腺を解剖して、マイクロ器官のために処理して、実施例ＸＶに記載のとおり培養する。マイクロ器官培養物を培養ウェル中に入れて、カチオン性脂質／ルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ複合体を用いて、３７℃でインキュベートしながら、５〜６時間トランスフェクトした。カチオン性脂質／プラスミドＤＮＡ溶液を吸引し、次いで、この培養物を２日間、１０％血清を加えた培地中でインキュベートし、次いでルシフェラーゼレポーター遺伝子発現（恣意的な光強度で表現）についてアッセイした。この実験の結果を図１６に図示する。図１６において実証されるとおり、肺（ただし胸腺ではない）は、これらの条件下でトランスフェクトされたルシフェラーゼ遺伝子を発現する。予想どおり、陰性コントロールのβガラクトシダーゼでトランスフェクトした肺のマイクロ器官培養物（１０μｌのカチオン性脂質濃度）は、光産生について機械のバックグラウンドに近かった（２３光強度）。
【実施例１８】
【０１８０】
インビトロにおける毛幹成長
新生仔マウス皮膚を手術後に得て、基礎にある脂肪組織を排除して、０．４×５ｃｍの皮弁に切断し、次いで、これを組織チョッパーまたは他の適切な切断デバイスを用いて３００μｍの切片に横断して切り出した。このマイクロ器官を、一定に振盪しながら５％ＣＯ２、３７℃のもとで、血清を含まないＤＭＥＭを含有するマイクロプレート中に１〜１４日間入れた。特定のマイクロ器官外植体を、培養培地中に添加した、増殖因子、例えばＦＧＦと接触させた。この培地を２日毎に交換した。
【０１８１】
新生の「毛のない」皮膚を導入してＭＣ培養物中で成長させた場合毛幹を生じることができる。１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下で、３日間マイクロ器官培養物中で増殖させた、３０時間齢のマウス由来の皮膚の顕微鏡写真によって、培養期間の開始時には存在しなかった、この外植体における毛幹の発達が示された。
【０１８２】
実験の別の設定では、休止期の毛包の活性化が観察された。Ｓｅｎｃａｒマウスは、毛包活性化を研究するための有用なモデルを提供する。なぜなら、この毛包は、十分に同調されており、そして周期段階は十分特徴付けられているからである。Ｓｅｎｃａｒマウスは、発育期活性化のためのインビボモデルを提供する。休止期の毛包からの棍状毛（ｃｌｕｂ）の取り出しによって新しい毛の形成が誘導され得、その最初の兆候は、十分特徴付けられる。成体Ｓｅｎｃａｒマウス由来の皮膚を手術後に得て、基礎にある脂肪組織を排除して、０．４×５ｃｍの皮弁に切断し、次いで、これを組織チョッパーまたは他の適切な切断デバイスを用いて３００μｍの切片に横断して切り出した。このマイクロ器官を、一定に振盪しながら５％ＣＯ２、３７℃のもとで、血清を含まないＤＭＥＭを含有するマイクロプレート中に１〜１４日間入れた。休止期の毛包の活性化は、棍状毛除去または成長因子処置のいずれによって誘導されても、毛包幹細胞の増殖によって明らかになった。図１７は、チミジン取り込みによって検出される場合の休止期外植体の活性化を図示する。
【実施例１９】
【０１８３】
（移植のための膵島の調製）
種々の哺乳動物供給源から島細胞を大量に調製するために、いくつかの技術が発展されている。なぜなら、それらは、潜在的に移植可能なβ細胞塊であって、それを用いて樹立された１型糖尿病を処置するためのβ細胞塊を構成するからである。今までに、２つの主な欠点に遭遇されている。β細胞を調製する再現可能な確実な方法を得ることは困難であることが証明されている。第二にインビトロおよびインビボの両方においてこれらの細胞の生存度は、かなり変動する。一部は第一の理由に起因し、そして一部は、β細胞が正常な膵臓における島の基礎にある間質からの支持を必要とする可能性が高いという事実に起因する。エキソビボにおいて膵臓器官を維持する試みはいままで、成功していない。本明細書に記載されるＭＣ培養技術を用いて、インビトロにおいて規定された培養培地中でマウス、ラット、モルモットおよびブタの膵臓のマイクロ器官培養物を樹立することが達成されている。
【０１８４】
膵臓のマイクロ器官培養物はここで、１ヶ月におよぶ期間、インビトロで増殖されている。培養物内では、外植体は、その組織微小構造を維持し、そして特定の細胞小集団がＢｒｄＵ取り込みおよび標識によって決定されるように活発に増殖する。さらに、島細胞は、インビトロ培養の１ヶ月後でさえ培地中にインスリンを分泌する。
【０１８５】
ブタのマイクロ器官膵臓培養物が、ラット宿主の内蔵および体壁中胚葉の両方に移植されている移植実験を実施した。外植体は、インビボにおいて数日間から１ヶ月におよぶ種々の期間、維持された。この外植体は十分に血管新生されて、組織宿主中に組み込まれる。
【実施例２０】
【０１８６】
（ヒト乾癬皮膚マイクロ器官培養物の調製）
患者から中間層乾癬皮膚を、検死解剖後にデルマトーム（採皮刀）を用いて得た。この皮膚を０．４×５ｃｍの皮弁に切断し、次いで、これを組織チョッパーを用いて３００μｍの切片に横断して切り出した。これらのマイクロ器官外植体を、３７℃で５％ＣＯ２マイクロプレート中で、ＤＭＥＭ（血清なし）中において１〜１４日間培養した。種々の時点でのマイクロ器官外植体の検査によって、この外植体の細胞が生存したままであり、増殖が生じていたことが示された。
【０１８７】
上記で引用された全ての引用文献および刊行物は、本明細書において参考として援用される。
【０１８８】
（等価物）
当業者は、たんに慣用的な実験を用いて、本明細書において記載される特定のアッセイおよび試薬に対する多くの等価物を認識しまたは確認することができる。このような等価物は、本発明の範囲内であり、そして添付の特許請求の範囲に包含されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】アレフ（Ａｌｅｐｈ）を決定する寸法を描写するマイクロ器官の図表示である。
【図２】異なる時間のインキュベーション後のＢｒｄＵ標識によって決定される、モルモットのマイクロ器官培養物における細胞増殖を示す棒グラフである。
【図３】１〜８日間の培養物のインキュベーション後のＢｒｄＵ標識によって決定される、ヒトのバックスキンのマイクロ器官培養物における細胞増殖を示す棒グラフである。
【図４】マウス皮膚（図４Ａ）、モルモット皮膚（図４Ｂ）、ヒト包皮（図４Ｃ）およびヒト包皮（図４Ｄ）の複製している細胞に対応する免疫蛍光を示す顕微鏡写真である。
【図５】ヒト表皮マイクロ器官外植体の横断面である。
【図６】ＢｒｄＵ取り込みを用いて、モルモット皮膚のマイクロ器官培養物の種々の厚み（×）の表皮増殖に対する影響を実証する棒グラフである。
【図７】膵臓由来のマイクロ培養物における増殖中の細胞に対応する免疫蛍光を示す顕微鏡写真である。
【図８】成体ブタの膵臓マイクロ器官培養物によって放出されたインスリンの量を示す棒グラフである。
【図９】培養の３日目、４日目、および６日目の結腸、肝臓、腎臓、十二指腸および食道のマイクロ器官培養物における増殖中の細胞への３Ｈチミジン取り込みを示す棒グラフである。
【図１０】免疫蛍光によって決定されたマイクロ器官培養物における毛包の活性な増殖を示す顕微鏡写真である。
【図１１】マイクロ培養の開始および終了の時点での毛幹のサイズ分布を示す棒グラフである。
【図１２】モルモット皮膚培養物において、２．５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βの存在下でのマイクロ器官培養物における有糸分裂誘発の阻害を示す棒グラフである。
【図１３】慢性皮膚潰瘍の処置のためのマイクロ器官外植体の図表示である。
【図１４】マイクロ器官培養物による正常な皮膚の切片の置き換え後のマウスの表面の写真である。
【図１５】ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドを用いた培養物のトランスフェクション後のモルモット皮膚マイクロ器官培養物におけるルシフェラーゼレポーターの発現のグラフ表示である。
【図１６】ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドを用いた培養物のカチオン性脂質媒介トランスフェクション後のラット肺および胸腺のマイクロ器官培養物におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現のグラフ表示である。
【図１７】本発明のマイクロ器官培養物におけるＦＧＦでの処置の際のテロゲン毛包の活性化のグラフ表示である。
【図１８】本発明のマイクロ器官外植体におけるトランスジェニックルシフェラーゼ遺伝子の発現のグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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