(57)【要約】組換えＮ−グリコシル化標的タンパク質の産生のためのシステムおよび方法。該システムは、原核生物（例えば大腸菌）を含み、原核生物には標的タンパク質の要求されるＮ−グリコシル化を行うことができる代謝装置をコードする遺伝情報が導入される。該原核生物はまた、１または複数の組換え標的タンパク質の発現に必要な遺伝情報も含む。代謝装置は好ましくは、オリゴ糖を脂質キャリア上に集合させる特定のグリコシルトランスフェラーゼおよびこのオリゴ糖を所望のタンパク質の特定の残基に共有結合させるＯＴａｓｅを含む。
2005518806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＮ−グリコシル化標的タンパク質の産生のためのシステムであって、標的タンパク質に要求されるＮ−グリコシル化を行うことができる代謝装置をコードする遺伝情報が導入された原核生物を含み、該原核生物が１または複数の組換え標的タンパク質の発現に必要な遺伝情報を含むものであるシステム。
【請求項２】
代謝装置が脂質キャリア上へのオリゴ糖の集合のための特定のグリコシルトランスフェラーゼおよびこのオリゴ糖を所望の標的タンパク質の特定の残基へと共有結合させるＯＴａｓｅを含む請求項１のシステム。
【請求項３】
原核生物が大腸菌である請求項１または２のシステム。
【請求項４】
原核生物が特定のグリコシルトランスフェラーゼのタイプによって規定される特定の構造を有するＮ−グリカンを産生する請求項２または３のシステム。
【請求項５】
組換えＮ−グリコシル化標的タンパク質の産生方法であって、標的タンパク質に要求されるＮ−グリコシル化を行うことができる代謝装置をコードする遺伝情報を原核生物に導入することを含み、該原核生物には１または複数の組換え標的タンパク質の発現に必要な遺伝情報もまた導入される方法。
【請求項６】
代謝装置が脂質キャリア上へのオリゴ糖の集合のための特定のグリコシルトランスフェラーゼおよびこのオリゴ糖を所望の標的タンパク質の特定の残基へと共有結合させるＯＴａｓｅを含む請求項５の方法。
【請求項７】
原核生物が大腸菌である請求項５または６の方法。
【請求項８】
特定のグリコシルトランスフェラーゼの選択によって、原核生物が特定のグリコシルトランスフェラーゼのタイプによって規定される特定の構造を有するＮ−グリカンを産生する請求項６または７の方法。
【請求項９】
ヒトまたは動物または植物の治療のための薬物の開発または薬物の製造のための標的タンパク質の産生のための請求項１〜４のいずれかのシステムまたは請求項５〜８のいずれかの方法の利用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかのシステムまたは請求項５〜８のいずれかの方法によって産生される栄養用途および／または医薬用途のタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかのシステムまたは請求項５〜８のいずれかの方法によって産生されるヒトまたは動物または植物のためのワクチン、サイトカインなどの薬物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかのシステムまたは請求項５〜８のいずれかの方法によって産生されるタンパク質を含む工業用酵素、機能性食品、化粧品、包装材料または繊維製品。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかのシステムまたは請求項５〜８のいずれかの方法によって産生される薬物のヒトまたは動物または植物の疾患の治療のための利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、組換えヒトおよび／または動物および／または植物および／または原核生物および／または真菌糖タンパク質の産生のための発現システムおよび方法に関する。かかる糖タンパク質は、上記のような生物において通常産生される糖タンパク質と同一の構造を有するためにヒトまたは動物または植物のための栄養または医薬として役立つ。
【背景技術】
【０００２】
（技術的背景）
グリコシル化は真核細胞におけるすべての翻訳後タンパク質修飾のなかでもっとも重要なものの１つを構成し、特定のタンパク質の機能、構造、物理的性質および標的化に対して様々な作用を有する。一般に、炭水化物部分はタンパク質の構造と物理化学的特性の両方に重要な作用を有すると考えられており、その酵素活性、抗原性または熱安定性に影響を及ぼす。糖はアスパラギンのε−アミン基を介して（Ｎ−グリコシド結合）またはセリンまたはスレオニン残基のヒドロキシル基を介して（Ｏ−グリコシド結合）結合できる。
【０００３】
Ｎ−結合型タンパク質グリコシル化は明らかに真核生物においてみられるもっとも一般的なタンパク質修飾である。複雑なグリコシル化工程は小胞体（ＥＲ）の細胞質側から開始し、脂質キャリアであるドリチルピロホスフェート（dolichylpyrophosphate）の上にオリゴ糖が集合する[Burda、P. and Aebi、M. (1999) The dolichol pathway of N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta、1426、239-257]:２つのＮ−アセチルグルコサミンおよび５つのマンノース残基がこの脂質に段階的に結合する。脂質結合オリゴ糖（ＬＬＯ）は次いでＥＲのルーメンへフリップし、そこで４つのマンノースおよび３つのグルコース残基の付加により全長ＬＬＯが得られる。この工程の中心となる反応において、このオリゴ糖が新たに合成されたポリペプチドの選択されたアスパラギン残基に転移する。この反応はＥＲのルーメンのオリゴサッカリル（oligosaccharyl）トランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）によって触媒される。ＯＴａｓｅは少なくとも８つのサブユニットの複合体であり、この酵素によってＮ−グリコシド結合が形成する。ＥＲ中において、３つのグルコースおよび１つのマンノース残基が糖タンパク質のオリゴ糖から迅速に除去される。糖タンパク質は次いでゴルジ体へと輸送され、ゴルジ体においてさらに糖部分のトリミングと付加が起こり、その後、最終的な目的地へと標的化される[Varki、A.、Cummings、R.、Esko、J.、Freeze、H.、Hart、G. and Marth、J. (1999) Essentials of Glycobiology. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York]。ＬＬＯ合成は真核細胞において高度に保存されている工程であるが、ゴルジ体における修飾は種特異的であるだけでなく細胞型特異的であり、Ｎ−結合型オリゴ糖の構造に関して高度な多様性が導かれる。
【０００４】
（従来技術）
様々な異種発現システムでのヒトタンパク質の産生は研究目的および医薬用途の組換えタンパク質を作成するための重要な技術となっている。一般に、産生に利用できる普遍的な発現システムは存在しないと考えられている。さらに異種タンパク質の発現のための細胞型の選択は多くの因子に依存する。かかる因子には多くの基準が含まれ、例えば細胞増殖特性、発現レベル、細胞内または細胞外発現、および目的タンパク質の生物活性ならびにその使用意図が挙げられる。しかしもっとも重要な基準の１つはあるタンパク質がその施用のためにグリコシル化を必要とするか否かであると考えられる。多くのヒト治療薬は糖タンパク質であり、ポリペプチドの所定のオリゴ糖による翻訳後修飾の重要性が、その多くの生理現象への関与によって考察されている。
【０００５】
哺乳類の糖タンパク質では、Ｎ−グリカンの大部分が複雑型である。即ち、Ｎ−グリカンは２つのＮ−アセチルグルコサミンと３つのマンノース残基からなる五糖コアを含む。このコアは元々ドリチルピロホスフェートからタンパク質へと転移したオリゴ糖の残っている構造である。ゴルジ体においてそれはさらに、さらなるＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸およびしばしばフコース残基を含むアンテナにより修飾される。非常に複雑なオリゴ糖構造の幅広い多様性はこのようにして可能となる。複雑なＮ−グリカンの重要性およびこれら構造の必須の役割が、このような複雑型Ｎ−グリカンを合成することができないノックアウトマウスを用いた実験において示されている。こららのマウスは出生前に死亡する。最近、グリコシル化の先天性障害（ＣＤＧ）がヒトにおいて報告されている。これは一群の先天性多システム疾患であり、Ｎ−グリカンの生成の欠損によって特徴付けられる。かかる傷害は広範な臨床特性、例えば神経系発達の傷害、精神運動遅延、異形症特性、低圧、凝固傷害および免疫欠損などによって明らかとなる。この広範な特性は胚発生、分化、および細胞機能維持におけるＮ−糖タンパク質の重要な役割を反映しており、正しいオリゴ糖構造が重要であることが強調される。
【０００６】
治療に関連するタンパク質の大多数はその天然形態においてグリコシル化されているため、正しい生物活性を有させるためにはそれらは組換えタンパク質の場合もグリコシル化される必要がある。したがって、生成物の安全性、有効性および一貫性を保証するために組換えタンパク質の質制御においてグリコシル化パターンをモニターすることが益々重要になっている。グリコシル化タンパク質の発現システムが開発されてきた。もっとも一般的に用いられているのは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系[Grabenhorst、E.、Schlenke、P.、Pohl、S.、Nimtz、M. and Conradt、H.S. (1999) Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the glycosylation pathway in mammalian host cells. Glycoconjugate Journal、16、81-97]、昆虫細胞 [Altmann、F.、Staudacher、E.、Wilson、I.B. and Marz、L. (1999) Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycoconjugate Journal、16、109-123]または真菌細胞[Malissard、M.、Zeng、S. and Berger、E.G. (1999) The yeast expression system for recombinant glycosyltransferase. Glycoconjugate Journal、16、125-139. またはMaras、M.、van Die、I.、Contreras、R. and van den Hondel、C.A. (1999) Filamentous fungi as production orgamism for glycoproteins of bio-medical interest. Glycoconjugate Journal、16、99-107]である。これら細胞系はすべてタンパク質をグリコシル化する能力を有するが、組換え糖タンパク質の産生において重要な相違を示す。前述のように、ＬＬＯの合成およびオリゴ糖のポリペプチドへの転移はすべての真核生物において高度に保存された機構であるが、ゴルジ体におけるＮ−グリカンのさらなるプロセシングおよびトリミングは生物および細胞型によって異なっている。それゆえ組換え糖タンパク質の最終的な構造は使用した産生細胞によって決まる。ＣＨＯ細胞は組換え糖タンパク質の発現に一般的に用いられている哺乳類の細胞系である。ＣＨＯ細胞は複雑型Ｎ−グリカンを合成することができるが、ヒト組織特異的末端糖残基のいくつかはかかる細胞によっては合成することができない。というのはＣＨＯ細胞は適切なグリコシルトランスフェラーゼを発現していないからである。それゆえ宿主細胞系をかかるグリコシルトランスフェラーゼの導入による遺伝子操作によって改変しなければならない。
【０００７】
昆虫細胞[国際特許出願第ＷＯ００／５２１３５号も参照されたい]も組換えタンパク質の産生に広く用いられている。というのは昆虫細胞は強力なバキュロウイルスベースの遺伝子発現ベクターを用いて感染させると目的のタンパク質を大量に合成することができ、哺乳類の細胞によるものと類似の翻訳後修飾を行うことができるからである。そのＮ−グリコシル化経路は哺乳類の経路とコア五糖の形成までは類似している。しかし通常は昆虫細胞はゴルジ体においてさらなるトランスフェラーゼを発現せず、それゆえ産生されるＮ−グリカンは切形型(マンノシド欠乏（paucimannosidic)）であって、哺乳類の細胞においてみられるような複雑型ではない。
【０００８】
真菌、特にサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピチア・パストリス（Pichia pastoris）は、真核生物異種タンパク質の産生のための好適な宿主生物である。これらシステムは分子および遺伝子操作の周知の技術を組み合わせたものであり、細胞は容易に増殖し、タンパク質のグリコシル化などの複雑な翻訳後修飾を行う能力を有する。動物細胞と違って、真菌はゴルジ体においてさらにオリゴ糖を修飾するわけではないが、そのかわりに直接マンノース残基を付加することによって伸長し、２００ものマンノース単位を有するマンナンを形成する。糖タンパク質のなかにはかかる修飾を受けず、その成熟がより制限されており、１３までのマンノース残基を有するコアが短いタイプのオリゴ糖を生じるものもある。
【０００９】
真核生物におけるＮ−グリコシル化のこれら３つの例はＮ−グリカンの構造の相違を強調するものである。機能に対する影響は構造の正確な分析が必須であることを示す。炭水化物構造分析の顕著な発展が近年達成された。特に質量分析（オンラインＥＳＩ−ＭＳ、ナノスプレータンデム質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）および改良されたＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ技術）において、非常に感度の高いグリコシル化分析の計測手段が利用可能となっている。
【００１０】
（従来技術の問題点）
組換え糖タンパク質における高度に規定されたオリゴ糖構造の重要性にもかかわらず、現在用いられている糖タンパク質産生のバイオテクノロジーによる方法ではそれを達成することができない。これはタンパク質に結合するオリゴ糖の構造が用いられる細胞型によって直接決まってしまい、すべての真核生物産生システムがこの特異性を示すという事実による。所望のオリゴ糖構造が産生されるように真核生物産生細胞系を遺伝子操作することができる可能性もある。しかし、真核生物のゴルジ体区画において活性なグリコシルトランスフェラーゼが非常に多いためかかるアプローチは非常に困難である。真核生物発現システムの使用にともなうさらなる問題には以下のものがある:一般に、哺乳類の発現システムはウシ血清を含む培地の使用による欠点を有する。これによって牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の汚染の可能性により生体安全性に関する問題が生じる。さらに、ヒト細胞系培養は無菌に維持するのが非常に困難であり、これら細胞は増殖が遅く、高価な工程制御を必要とする。前述のように、合成された特定の糖タンパク質は直接、用いた細胞系または細胞型に依存する。言い換えると、組換え糖タンパク質は、異種システムがそのタンパク質の起源におけるＮ−グリコシル化経路の酵素と同じ酵素を発現している場合にのみその起源のＮ−グリカンにより修飾されうる。そうでない場合は宿主細胞をゴルジ体におけるグリコシル化経路の遺伝子操作によって改変しなければならず（図１Ｂ）、これは組換え糖タンパク質の発現におけるヒト細胞系の主な欠点である。
【００１１】
バキュロウイルス発現システムを用いる昆虫細胞での組換えタンパク質産生の難点には以下のものがある:バキュロウイルスは本質的に溶解性感染機序を有する。即ち、生成物を収集すると、宿主細胞の大部分が溶解し、分解性酵素が放出される。さらに、タンパク質合成は感染細胞が死ぬ時期の近くに最大になり、タンパク質の全体のプロセシングはその時点では最大以下である。特に細胞膜へ輸送されるタンパク質や分泌タンパク質は、分泌経路の翻訳後機構の成分がないことにより影響を受ける。さらに、大規模昆虫細胞培養は酸素消費量が多いことから科学者に負荷を与え、哺乳類の細胞と比較して細胞の剪断（shear）感受性が高い。哺乳類の細胞における場合と同様に、糖タンパク質の異種発現の主な欠点は前記のようなＮ−グリカン構造の相違にある。特に末端シアル酸残基がないことが欠点である。というのは、これらの糖は糖タンパク質の生物学において重要な役割を果たすからである。
【００１２】
要約すると、３つの主な真核生物発現システムでは所望の構造のグリカンを産生することができない。真核生物システムとは異なり、グラム陰性細菌である大腸菌（Escherichia coli)は異種タンパク質の産生に関していくつかの技術的利点をもたらす。それはもっとも昔から利用されてきたもっとも生産性の高いシステムである。しかし、大腸菌細胞がタンパク質の翻訳後修飾を行えないことはヒトタンパク質の産生の好ましい宿主としてのその使用に関する最大の欠点であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
（発明の要約）
大腸菌における組換え糖タンパク質の産生の問題を克服するために、タンパク質をグリコシル化することができる代謝機構をこの細菌に導入する。それゆえ本発明の目的は、組換えタンパク質、特にＮ−グリコシル化タンパク質が産生できる発現システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明のこの目的は、第１の態様によると、独立請求項１の特性の組み合わせによって達成され、ここで、組換えヒト、ヒト様、または動物、または植物、または真菌、または細菌Ｎ−グリコシル化標的タンパク質の産生システムが提案され、かかるシステムは標的タンパク質に要求されるＮ−グリコシル化を行うことができる代謝装置をコードする遺伝情報を導入した原核生物を含む。本発明によるシステムは該原核生物が１または複数の組換え標的タンパク質の発現に必要な遺伝情報も含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明のこの目的は、第２の態様によると、独立請求項５の特性の組み合わせによって達成され、ここで、組換えヒト、ヒト様、または動物、または植物、または真菌、または細菌Ｎ−グリコシル化標的タンパク質の産生方法が提案され、かかるシステムは標的タンパク質に要求されるＮ−グリコシル化を行うことができる代謝装置をコードする遺伝情報を導入した原核生物を含む。本発明による方法は該原核生物が１または複数の組換え標的タンパク質の発現に必要な遺伝情報も含むことを特徴とする。
【００１６】
さらなるそして発明的な特性は従属請求項から導かれる。
【００１７】
（従来技術に対する利点）
大腸菌は操作および培養が容易でその遺伝学は非常によく知られているので、ヒト、ヒト様、動物、または植物、または真菌、または細菌糖タンパク質の大腸菌における産生はバイオテクノロジーにおけるブレークスルーである。
【００１８】
前述のように、今日まで組換え糖タンパク質はあまり好適でない真核生物で産生しなければならなかった。しかしＮ−糖タンパク質の合成の第１段階はすべての生物において高度に保存されているが、さらなるトリミングおよびプロセシングは真核生物の間で非常に異なっている。それゆえ組換え糖タンパク質のＮ−グリカンは用いた発現システムに存在するグリコシル化遺伝子に依存する。
【００１９】
これによって元々のものと比べてＮ−グリカンの構造が異なる組換え糖タンパク質の産生が行われてきた。
【００２０】
対照的に、タンパク質に要求されるグリコシル化を行うことができる代謝装置をコードする遺伝情報、例えばオペロンの、通常はタンパク質をグリコシル化しない生物への導入によって、特定のグリコシルトランスフェラーゼの導入によりＮ−グリカンの構造を操作する機会が与えられる。
【００２１】
（図面の簡単な説明）
従来から知られている技術の問題および本発明による方法を模式図に参照してより詳細に説明する。これらの図は本発明の例示的態様であり、本発明の保護範囲を狭めるものではない。図において、
図１は真核生物における組換え糖タンパク質の発現であり、ここで、
図１Ａは標的糖タンパク質の発現を示し、そして、
図１Ｂはゴルジ体における既存のグリコシル化経路の遺伝子操作を示す。
図２は、本発明による組換え標的タンパク質を発現し、特定のグリコシル化経路を導入された大腸菌発現システムである。
図３は、図１および図２における糖タンパク質のオリゴ糖残基の個々の要素を表す符号の説明である。
【００２２】
（発明の説明）
図１は真核生物発現システムにおける組換え糖タンパク質の発現を示す。図１Ａは標的糖タンパク質の発現を示し、ここで脂質結合オリゴ糖（ＬＬＯ；工程Ｉ）の集合およびオリゴ糖のＯＴａｓｅによるタンパク質への転移（工程ＩＩ）は小胞体（ＥＲ）における高度に保存されたプロセスである。対照的にゴルジ体における修飾は細胞型特異的である（工程ＩＩＩ）。
【００２３】
図１Ｂもまた標的糖タンパク質の発現を示し、ここで脂質結合オリゴ糖（ＬＬＯ；工程Ｉ）の集合およびオリゴ糖のＯＴａｓｅによるタンパク質への転移（工程ＩＩ）はＥＲにおける高度に保存されたプロセスである。さらに、ゴルジ体における既存のグリコシル化経路の遺伝子操作を行う試みを示す。真核細胞において特定の構造を有する組換えタンパク質を産生するには、宿主細胞はゴルジ体においてこのグリコシル化経路の遺伝子操作によって適応させなければならない。「Ｘ」印は望ましくない経路を排除するために必要とされる欠失を示す。「Ａｓｎ」はアスパラギンを示し、「ＰＰ」はピロリン酸、そして「ＳＯ４」は硫酸基を示す。
【００２４】
図１Ａおよび１ＢはともにＥＲの外側で行われる組換えタンパク質の発現（工程Ｉｂ）およびこの標的タンパク質のＥＲへの輸送（工程ＩＩｂ）を示す。オリゴ糖の個々の要素の印の説明については図３の説明を参照されたい。
【００２５】
真核細胞において特定のオリゴ糖構造を有する組換え糖タンパク質を得るには、非常に複雑かつ重要な経路の調整(tailoring)が必要であり、これによって産生細胞の生存が脅かされる可能性がある。これは大腸菌システムには当てはまらない。大腸菌システムでは、調整はグリコシル化機構の特定の要素の導入によって達成され、これによって所望の糖タンパク質が得られる（図２）。
【００２６】
大腸菌細胞内にはオリゴ糖の集合に必要なすべての基本要素(単糖類)が存在するので上記解決手段には以下のものの導入が必要である:
ａ）脂質キャリア上でのオリゴ糖の集合のための特定のグリコシルトランスフェラーゼ、および、
ｂ）このオリゴ糖を所望のタンパク質の特定の残基に共有結合させるＯＴａｓｅ。
【００２７】
この解決手段によって特定のグリコシルトランスフェラーゼの発現により、産生細胞の重要な機能に影響を与えずにオリゴ糖構造を設計する可能性が提供される。
【００２８】
図２は本発明による大腸菌発現システムを示し、まず組換え標的タンパク質が発現し（工程Ｉｂ）、これが次いで糖タンパク質合成に導入される（工程ＩＩｂ）。大腸菌において特定の糖タンパク質を得るために脂質結合オリゴ糖（ＬＬＯ”；工程Ｉ）の集合のための特定のグリコシルトランスフェラーゼが宿主に導入される。ＯＴａｓｅはこのオリゴ糖を所望のタンパク質の特定の残基に共有結合させる（工程ＩＩ）。
【００２９】
別の試みにおいて、図２に記載のように所望のタンパク質に結合したオリゴ糖を別のオリゴ糖をインビトロでの酵素反応の基質として用いて交換することができる。アルトロバクター・プロトフォルミアエ（Arthrobacter protophormiae）由来の固定化されたエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ａ）が、オリゴ糖を共有結合したＮ−アセチルグルコサミンを含むリボヌクレアーゼＢに転移させることができることが示された[Fujita、K.、Tanaka、N.、Sano、M.、Kato、I.、Asada、Y. and Takegawa、K. (2000) Synthesis of neoglycoenzymes with homgogenous N-linked oligosaccharides using immobilized endo-β-N-acetylglucosaminidase A. Biochemical and Biophysical Research Communications、267、134-138]。したがって本発明は大腸菌において糖タンパク質を産生する可能性を与え、そして第二の工程において、タンパク質に共有結合したオリゴ糖を、インビトロで固定化したＥｎｄｏ−Ａによって所定の構造の異なるオリゴ糖に交換することにより改変する可能性を与える。
【００３０】
本発明にはグリコシル化糖タンパク質の産生が含まれる。かかる標的タンパク質のグリコシル化により多くの利益が得られる。かかる利益には、それらに限定されるわけではないが、タンパク質のインビボ循環半減期の上昇;組換えタンパク質の収量の増加; タンパク質の生物活性（これらに限定されないが以下のものが含まれる、酵素活性、受容体活性、結合能力）の上昇;抗原性の変化;治療特性の向上;ワクチンまたは診断ツールとしての能力の上昇など。本発明によって産生することができ、ヒト、動物または植物用の薬物として役立ちうる哺乳類の糖タンパク質としては、これらに限定されないが、エリスロポエチン、トランスフェリン、インターフェロン、免疫グロブリン、インターロイキン、プラスミノーゲン、および甲状腺刺激ホルモンが挙げられる。本発明によって例えば、カンピロバクター・ジュジェニ（C. jejuni）および真菌由来の糖タンパク質などの原核生物および／または真菌の糖タンパク質も産生でき、ヒト、動物または植物用の薬物として役立ちうる。本発明によって産生される糖タンパク質のさらなる用途としては、これらに限定されないが、工業用酵素、機能性食品、化粧品、包装材料、および繊維製品などが挙げられる。
【実施例１】
【００３１】
本発明は、グラム陰性細菌であるカンピロバクター・ジュジェニ（Campylobacter jejuni）が糖タンパク質を産生するという知見に基づいてなされた。公知の方法を利用して、本発明者らは、カンピロバクター・ジュジェニ（C. jejuni）のＡｃｒＡという糖タンパク質をコードする遺伝子を大腸菌に導入した。この結果、グリコシル化されていないＡｃｒＡタンパク質が発現した（図２、工程Ｉｂを参照）。次いでまた公知の方法を用いて、ａ）特定のグリコシルトランスフェラーゼおよびｂ）ＯＴａｓｅをコードするカンピロバクター・ジュジェニ（C. jejuni）のオペロンを大腸菌に導入した。この結果本発明による特異的にグリコシル化されたＡｃｒＡタンパク質が産生した（図２、工程ＩおよびＩＩ参照）。これは常に当業者に知られた方法を用いて、高度に特異的なレクチン及びグリコシル化特異的抗体の異種産生されたＡｃｒＡタンパク質に対する結合によって確認された[Michael Wacker et al. (2002) N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E.coli (SCIENCE、Vol 298: 1790-1793]。さらにＡｃｒＡに結合したオリゴ糖の構造を質量分析によって確認した。次ぎに、オリゴ糖がコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のいずれのアミノ酸でもよい）のなかにあるアスパラギンのε−アミノ基にのみ転移していたことが示された [Gavel、Y. and Von Heijne、G. (1990). Sequence diferrences between glycosylated and non- glycosylated Asn-X-Thr/Ser acceptor sites: implications for protein engineering. Protein Eng、3、433-442]。コンセンサス配列を突然変異させると、オリゴ糖はタンパク質に転移しなくなった。それゆえ、常に当業者に知られた方法を用いて、カンピロバクター・ジュジェニ（C. jejuni）のＯＴａｓｅは真核生物および古細菌のＯＴａｓｅと同じコンセンサス配列を認識し提案されている同じ機構によってオリゴ糖をタンパク質へと転移させることが確認された[Wacker、M.、Linton、D.、Hitchen、P.G.、Nita-Lazar、M.、Haslam、S.M.、North、S.J.、Panico、M.、Morris、H.R.、Dell、A.、Wren、B.W. and Aebi、M. (2002). N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E.coli. Science、298: 1790-1793]。
【００３２】
大腸菌の遺伝的改変に用いる特定のグリコシルトランスフェラーゼおよびオリゴサッカリルトランスフェラーゼは原核生物または真核生物のいずれの起源であってもよい。というのはグリコシルトランスフェラーゼは普遍的でありオリゴサッカリルトランスフェラーゼは古細菌から知られているからである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は真核生物における組換え糖タンパク質の発現であり、ここで、図１Ａは標的糖タンパク質の発現を示し、そして、図１Ｂはゴルジ体における既存のグリコシル化経路の遺伝子操作を示す。
【図２】図２は、本発明による組換え標的タンパク質を発現し、特定のグリコシル化経路を導入された大腸菌発現システムである。
【図３】図３は、図１および図２における糖タンパク質のオリゴ糖残基の個々の要素を表す符号の説明である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
2005518806.tif 000007
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