(57)【要約】下記式（Ｉ）の化合物が開示される。【化１】2005534738.tif 000023式中、Ｄはアクリドン及びキナクリドン色素から選択される蛍光色素であり、Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基を含み、ＭはＦへの結合に適合した基であり、Ｘは水素又は式−Ｌ２−Ｂの基（式中、Ｂは親和性標識である。）から選択され、Ｌ１及びＬ２は各々独立に炭素原子から選択される１〜４０の連結原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含んでいてもよい。本発明は、合成又は組換えペプチド又はタンパク質及びそれらの誘導体のＮ末端又はＣ末端のいずれかにアクリドン又はキナクリドン色素を部位特異的に直接結合させる方法であって、得られる標識分子の精製と組合わせた方法も提供する。ペプチド標識における部位特異的タンパク質は、天然の化学結合に関して１，２−アミノチオール基とのチオエステル基の反応に関与する。
2005534738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボン酸チオエステル基又はチオエステルとの共有結合反応に適した基から選択される１以上の標的結合基を含むアクリドン及びキナクリドン色素から選択される化合物であって、当該化合物がそれに共有結合した親和性標識を適宜含む化合物。
【請求項２】
次の式（Ｉ）を有する、請求項１記載の化合物。
【化１】
2005534738.tif 000015
式中、
Ｄはアクリドン及びキナクリドン色素から選択される蛍光色素であり、
Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基を含み、
ＭはＦとの結合に適した基であり、
Ｘは水素又は次式の基から選択され、
−Ｌ２−Ｂ
（式中、Ｂは親和性標識である。）
Ｌ１及びＬ２は各々独立に、炭素原子から選択される１〜４０の連結原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含んでいてもよい。
【請求項３】
Ｘが次式の基である、請求項２記載の化合物。
−Ｌ２−Ｂ
式中、Ｂ及びＬ２は既に定義した通りである。
【請求項４】
Ｌ１及びＬ２が各々２〜３０個の原子を含む、請求項２又は請求項３記載の化合物。
【請求項５】
Ｌ１及びＬ２が独立に次式の基から選択される、請求項２又は請求項３記載の化合物。
−｛（ＣＨＲ′）ｐ−Ｑ−（ＣＨＲ′）ｒ｝ｓ−
式中、Ｑは−ＣＨＲ′−、ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ａｒ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｐは０〜５であり、ｒは１〜５であり、ｓは１又は２である。
【請求項６】
ＱがＣＨＲ′−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′が既に定義した通りである、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
前記親和性標識がビオチン及びデスチオビオチンから選択される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
前記親和性標識が、ｈｉｓ−タグ、イミノ二酢酸及びニトリロ三酢酸から選択される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
標的結合基Ｆが次式のカルボン酸チオエステルである、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の化合物。
【化２】
2005534738.tif 000016
式中、Ｌ′は単結合であるか、或いは炭素原子及び適宜−ＮＨ−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択される１以上の基から選択される１〜３０の連結原子を含む基であり、Ｒ″は適宜スルホネートで置換し得るＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール又はＣ７〜Ｃ１５アラルキルであるか、或いは−(ＣＨ２)２−ＣＯＮＨ２である。
【請求項１０】
標的結合基Ｆが次式の１，２−アミノチオール基である、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の化合物。
【化３】
2005534738.tif 000017
式中、Ｌ′は既に定義した通りである。
【請求項１１】
当該化合物が式（II）のアクリドン色素である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の化合物。
【化４】
2005534738.tif 000018
式中、
基Ｒ２及びＲ３はＺ１環構造に結合し、基Ｒ４及びＲ５はＺ２環構造に結合しており、
式中、
Ｚ１及びＺ２は独立に１つの環又は２つの縮合環の芳香族又は複素環式芳香族環系を完成するのに必要な原子であり、各環は炭素原子から選択される５又は６個の原子と適宜酸素、窒素及びイオウから選択される２以下の原子を有しており、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの１以上は次式の基Ｗであり、
【化５】
2005534738.tif 000019
（式中、Ｆ、Ｍ、Ｘ及びＬ１は既に定義した通りである。）
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５基のいずれかが上記のＷ基でない場合には、その残りの基Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立に水素、ハロゲン、アミド、シアノ、モノ又はジ−Ｃ１〜Ｃ４アルキル置換アミノ、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第四アンモニウム及び基−（ＣＨ２）ｎ−Ｙから選択され、
基Ｒ１が上記のＷ基でない場合には、そのＲ１基は水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アラルキル及び基−（ＣＨ２）ｎ−Ｙから選択され、
Ｙはスルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であるが、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの１以上が水溶性基であることを条件とする。
【請求項１２】
当該化合物が式（III）のキナクリドン色素である、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の化合物。
【化６】
2005534738.tif 000020
式中、
基Ｒ１３及びＲ１４はＺ１環構造に結合し、基Ｒ１５及びＲ１６はＺ２環構造に結合しており、
Ｚ１及びＺ２は独立に１つの環又は２つの縮合環の芳香族又は複素環式芳香族環系を完成するのに必要な原子であり、各環は炭素原子から選択される５又は６個の原子と適宜酸素、窒素及びイオウから選択される２以下の原子を有しており、
基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８のうちの１以上は次式の基Ｔである。
【化７】
2005534738.tif 000021
（式中、Ｆ、Ｍ、Ｘ及びＬ１は既に定義した通りである。）
Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８基のいずれかが上記のＴ基でない場合には、その残りの基Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８は独立に水素、ハロゲン、アミド、シアノ、モノ又はジ−Ｃ１〜Ｃ４アルキル置換アミノ、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第四アンモニウム及び基−（ＣＨ２）ｎ−Ｙから選択され、
基Ｒ１１及びＲ１２が上記のＴ基でない場合には、その基は水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アラルキル及び基−（ＣＨ２）ｎ−Ｙから選択され、
Ｙはスルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であるが、基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８のうちの１以上が水溶性基であることを条件とする。
【請求項１３】
Ｚ１及びＺ２が独立にフェニル、ピリジニル、ナフチル、キノリニル及びインドリル部分からなる群から選択される、請求項１１又は請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
Ｚ１及びＺ２がフェニル及びナフチル部分から選択される、請求項１１又は請求項１２記載の化合物。
【請求項１５】
Ｎ末端システインを含むか、又はＮ末端システインを含むように誘導体化された目的タンパク質を標識する方法であって、
ｉ）上記タンパク質を含む液体に次の式（Ｉ）の化合物を添加し、
【化８】
2005534738.tif 000022
（式中、
Ｄはアクリドン及びキナクリドン色素から選択される蛍光色素であり、
Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基を含み、
ＭはＦとの結合に適した基であり、
Ｘは水素又は次式の基から選択され、
−Ｌ２−Ｂ
（式中、Ｂは親和性標識である。）
Ｌ１及びＬ２は各々独立に、炭素原子から選択される１〜４０の連結原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含んでいてもよい。）、
ii）上記タンパク質を標識するのに適した条件下で上記化合物をタンパク質と共にインキュベートする
ことを含んでなる方法。
【請求項１６】
Ｌ１及びＬ１が各々２〜３０の原子を含む、請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
Ｌ１及びＬ２が独立に次式の基から選択される、請求項１５記載の方法。
−｛（ＣＨＲ′）ｐ−Ｑ−（ＣＨＲ′）ｒ｝ｓ−
式中、Ｑは−ＣＨＲ′−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ａｒ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｐは０〜５であり、ｒは１〜５であり、ｓは１又は２である。
【請求項１８】
Ｑが−ＣＨＲ′−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′が既に定義した通りである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
Ｘが次式の基であり
−Ｌ２−Ｂ
（式中、Ｂ及びＬ２は既に定義した通りである。）、当該方法が、アフィニティークロマトグラフィーによって目的タンパク質の色素標識タンパク質を分離及び／又は精製することをさらに含む、請求項１５乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
目的タンパク質が、抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、微生物材料、細胞及び細胞膜から選択される、請求項１５乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクリドン及びキナクリドン系色素を用いたタンパク質の部位特異的標識のための試薬及び方法に関する。具体的には、本発明は、チオエステル活性化基を含み、チオエステル反応性部分を含むか或いは含むように誘導体化された標的分子との反応性基を含む新規なアクリドン及びキナクリドン色素誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子の標識及び検出用の蛍光標識について関心及び需要が増大している。アクリドン及びキナクリドンは高度に蛍光性の分子であって、特徴的な蛍光寿命を有する新しいアクリドン及びキナクリドン系色素誘導体について標的物質の標識としての使用が記載されている。アクリドン及びキナクリドン系色素の蛍光寿命は一般に、他の蛍光標識、並びに天然に存在する蛍光物質、例えばタンパク質及びポリヌクレオチドの寿命よりも長い。蛍光標識としての蛍光アクリドン及びキナクリドン系色素の使用によって、かかる色素を利用するアッセイにおけるバッググラウンド蛍光からの容易な識別が可能になる。
【０００３】
多くの用途では、蛍光標識色素とタンパク質のような標的分子との間に、共有結合の形態で恒久的な結合を形成する必要がある。ペプチド及びタンパク質標識の化学は文献に十分に記載されており、現在広範な試薬がペプチドの化学的修飾用に市販されている。蛍光標識試薬を用いるタンパク質標識の総説及び事例については、“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、及び“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ”，Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，１９９２を参照されたい。
【０００４】
タンパク質又はペプチドへの蛍光標識の部位特異的導入は、ある種の生化学及び生物物理学的研究、例えば蛍光共鳴エネルギー移動並びにタンパク質の構造及び機能の研究で多大な利益をもたらす可能性がある。標的ポリペプチドにレポーター基を部位特異的に結合するための一方法は、天然の化学的連結反応を利用する。この方法では、Ｎ−末端システイン残基を含む非保護ペプチド断片とα−チオエステル基を含む第二のレポーター標識ペプチド断片とを生理的ｐＨで化学選択的に連結することによって、それらの一次配列にかかわりなく、連結部位にアミド結合が生成される。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），６，Ｒ２４７−２６０、Ｇｉｒｉａｔ，Ｉ．，Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（２００１），２３，１７１−１９９、及びＭｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｓｙｎ．Ｌｅｔｔ．，（２００１），６，７３３−７４０の総説を参照されたい。
【０００５】
Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｃ−Ｈ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，（２００２），４１，２１７１−２１７４）には、フルオレセイン及びビオチンチオエステル誘導体の製造並びにこれらとＮ−末端システイン含有組換えタンパク質との反応を記載している。Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ  Ｐａｎｎｅｌｌ，Ｌ．Ｋ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２年７月１８日にオンラインで出版）には、Ｃｙ５（商標）のベンジルチオエステルの製造及びその後のＮ−末端システイン残基含有合成ポリペプチドとの反応が報告されている。
【０００６】
しかし、アクリドン及びキナクリドン系色素のような蛍光寿命レポーター分子のチオエステル誘導体について記載された報文はないし、蛍光寿命レポーターを親和性標識にさらに共有結合させた報文もない。こうしたレポーターの利点として、それらの特徴的な蛍光寿命の兆候によって、かかる色素で標識された標的分子をバックグラウンドの蛍光から識別することができることである。さらに、アクリドン及びキナクリドン系の色素は互いに識別可能な所定範囲の蛍光寿命をもつように操作することができ、多重検出が必要とされる用途が可能となる。
【非特許文献１】“Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７
【非特許文献２】“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ”，Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，１９９２
【非特許文献３】Ｃｏｔｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），６，Ｒ２４７−２６０
【非特許文献４】Ｇｉｒｉａｔ，Ｉ．，Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（２００１），２３，１７１−１９９
【非特許文献５】Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｓｙｎ．Ｌｅｔｔ．，（２００１），６，７３３−７４０
【非特許文献６】Ｔｏｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，Ｃ−Ｈ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，（２００２），４１，２１７１−２１７４
【非特許文献７】Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ  Ｐａｎｎｅｌｌ，Ｌ．Ｋ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２年７月１８日にオンラインで出版
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、合成又は組換えペプチド又はタンパク質及びそれらの誘導体のＮ末端又はＣ末端のいずれかに蛍光アクリドン又はキナクリドン色素を部位特異的に直接結合させる試薬及び方法であって、得られる標識分子の精製と組合わせた試薬及び方法を提供する。
【０００８】
本発明の一態様では、カルボン酸チオエステル基又はチオエステルとの共有結合反応に適した基から選択される１以上の標的結合基を含むアクリドン及びキナクリドン系色素から選択される化合物であって、当該化合物がそれに共有結合した親和性標識を適宜含んでいてもよい化合物を提供する。
【０００９】
好適には、本化合物は次の式（Ｉ）の化合物である。
【００１０】
【化１】
2005534738.tif 000003
【００１１】
式中、
Ｄはアクリドン及びキナクリドン系色素から選択される蛍光色素であり、
Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基を含み、
ＭはＦとの結合に適した基であり、
Ｘは水素又は次式の基から選択され、
−Ｌ２−Ｂ
（式中、Ｂは親和性標識である。）
Ｌ１及びＬ２は各々独立に、炭素原子から選択される１〜４０の連結原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含んでいてもよい。
【００１２】
好適には、Ｌ１及びＬ２の各々には２〜３０個の原子、好ましくは６〜２０個の原子が存在する。
【００１３】
好ましくは、Ｌ１及びＬ２は次式の基から独立に選択される。
【００１４】
−｛（ＣＨＲ′）ｐ−Ｑ−（ＣＨＲ′）ｒ｝ｓ−
式中、Ｑは−ＣＨＲ′−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ａｒ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｐは０〜５であり、ｒは１〜５であり、ｓは１又は２である。
【００１５】
特に好ましいＱは、−ＣＨＲ′−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択されるが、Ｒ′は既に定義した通りである。
【００１６】
好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物の基Ｘは次式の基である、
−Ｌ２−Ｂ
Ｂ及びＬ２は既に定義した通りである。この実施形態では、Ｌ２は適宜開裂可能なリンカー基であり、さらに基Ｐを含んでいてもよく、Ｐ基は化学的に開裂可能な基、酵素で開裂可能な基又は光化学的に開裂可能な基から好適に選択し得る。好適な化学開裂性基としては、いずれも塩基性条件下で開裂されるカルバミン酸エステル及びカルボン酸エステルがある。好適な酵素開裂性基は、エステル基、アミド基及びホスホジエステル基のような基から選択できる。かかる基はプロテアーゼ、エステラーゼ及びホスホジエステラーゼのような加水分解酵素の基質であり、かかる加水分解酵素で加水分解される。式（Ｉ）の化合物での使用に適した光開裂性基Ｐは、４，５−ジアルコキシ−２−ニトロベンジルアルコールリンカー（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｇ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９９５），６０，２３１８−２３１９）又はフェナシルリンカー（Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９７６），４１，３２５８−３２６１）を含んでいてもよい。これらの基は３００ｎｍの光照射で効率的に光反応を起こし、親和性標識からの色素分子又は色素標識タンパク質の急速な開裂をもたらす。
【００１７】
好適には、Ｍ基は標的結合基Ｆの結合に適した任意の官能基でよい。好ましくはＭは以下のものから選択される
【００１８】
【化２】
2005534738.tif 000004
【００１９】
式中、Ｒ′は既に定義した通りである。
【００２０】
適当な親和性標識は、ビオチン、デスチオビオチン及び金属キレートリガンド、例えば、ｈｉｓ−タグ及びイミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸などから選択できる。好ましい親和性標識はビオチン及びデスチオビオチンから選択される。
【００２１】
本発明の一実施形態では、標的結合基Ｆは次式のカルボン酸チオエステルである。
【００２２】
【化３】
2005534738.tif 000005
【００２３】
式中、Ｌ′は単結合であるか、或いは炭素原子及び適宜−ＮＨ−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択される１以上の基から選択される１〜３０の連結原子を含む基であり、Ｒ″は適宜スルホネートで置換し得るＣ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール又はＣ７〜Ｃ１５アラルキルであるか、或いは−(ＣＨ２)２−ＣＯＮＨ２である。Ｌ′が単結合である場合、標的結合基Ｆは基Ｍに直接結合する。
【００２４】
別の実施形態では、標的結合基Ｆは次式の１，２−アミノチオール基である。
【００２５】
【化４】
2005534738.tif 000006
【００２６】
式中、Ｌ′は既に定義した通りである。
【００２７】
従って、本発明は、標的結合基と適宜親和性標識を分子に導入した修飾アクリドン色素又はキナクリドン色素を含む蛍光標識試薬を提供する。標的結合基はカルボン酸チオエステル基又は１，２−アミノチオール基から選択し得るが、チオエステル基は標的分子（好適にはタンパク質もしくはペプチド又はその誘導体）の１，２−アミノチオール基と選択的に反応する。別法では、アクリドン又はキナクリドン系色素は、標的のチオエステル基との反応のための１，２−アミノチオール基を含んでいてもよい。レポーター基の化学構造中に反応性チオエステル又は１，２−アミノチオール官能基を導入することによって、簡便な一段階プロセスで標的分子を直接標識することが可能となる。本発明の方法によれば、ペプチド及びタンパク質の標識は、一次配列の組成にかかわらず、部位特異的である。Ｎ末端システイン又はチオエステル官能基のいずれかを有する標的一次配列を生成することによって、標的を適当なアクリドン又はキナクリドン系色素の誘導体（それぞれ、αチオエステル及び１，２−アミノチオール誘導体）と共にインキュベートすることで部位特異的標識を直接達成することができる。標的試薬中に親和性標識が含まれているので、引き続いて蛍光色素標識タンパク質又はペプチドを精製することが可能となる。
【００２８】
第一の態様に係る一実施形態では、本化合物は式（II）のアクリドン色素である。
【００２９】
【化５】
2005534738.tif 000007
【００３０】
式中、
基Ｒ２及びＲ３はＺ１環構造に結合し、基Ｒ４及びＲ５はＺ２環構造に結合しており、
Ｚ１及びＺ２は独立に１つの環又は２つの縮合環の芳香族又は複素環式芳香族環系を完成するのに必要な原子であり、各環は炭素原子から選択される５又は６個の原子と適宜酸素、窒素及びイオウから選択される２以下の原子を有しており、
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの１以上は次式の基Ｗである。
【００３１】
【化６】
2005534738.tif 000008
【００３２】
式中、Ｆ、Ｍ、Ｘ及びＬ１は既に定義した通りである。
【００３３】
基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のいずれかが上記のＷ基でない場合には、その残りの基Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は独立に水素、ハロゲン、アミド、シアノ、モノ又はジ−Ｃ１〜Ｃ４アルキル置換アミノ、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第四アンモニウム及び基−（ＣＨ２）ｎ−Ｙから選択され、
基Ｒ１が上記のＷ基でない場合には、そのＲ１基は水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アラルキル及び基−（ＣＨ２）ｎ−Ｙから選択され、
Ｙはスルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であるが、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちの１以上が水溶性基であることを条件とする。
【００３４】
第一の態様に係る第二の実施形態では、本化合物は式（III）のキナクリドン色素である。
【００３５】
【化７】
2005534738.tif 000009
【００３６】
式中、
基Ｒ１３及びＲ１４はＺ１環構造に結合し、基Ｒ１５及びＲ１６はＺ２環構造に結合しており、
Ｚ１及びＺ２は独立に１つの環又は２つの縮合環の芳香族又は複素環式芳香族環系を完成するのに必要な原子であり、各環は炭素原子から選択される５又は６個の原子と適宜酸素、窒素及びイオウから選択される２以下の原子を有しており、
基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８のうちの１以上は次式の基Ｔである。
【００３７】
【化８】
2005534738.tif 000010
【００３８】
式中、Ｆ、Ｍ、Ｘ及びＬ１は既に定義した通りである。
【００３９】
基Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８のいずれかが上記のＴ基でない場合には、その残りの基Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８は独立に水素、ハロゲン、アミド、シアノ、モノ又はジ−Ｃ１〜Ｃ４アルキル置換アミノ、カルボニル、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アクリレート、ビニル、スチリル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アラルキル、スルホネート、スルホン酸、第四アンモニウム及び基−（ＣＨ２）ｎ−Ｙから選択され、
基Ｒ１１及びＲ１２のいずれかが上記のＴ基でない場合には、その基は水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、アラルキル及び基−（ＣＨ２）ｎ−Ｙから選択され、
Ｙはスルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数であるが、ただし基Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８のうちの１以上が水溶性基であることを条件とする。
【００４０】
好適には、式（II）及び（III）の化合物において、Ｚ１及びＺ２は独立にフェニル、ピリジニル、ナフチル、アントラニル、インデニル、フルオレニル、キノリニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル及びベンズイミダゾリル部分からなる群から選択できる。追加の１又は２つの縮合環系は当業者には自明である。好ましくは、Ｚ１及びＺ２は、フェニル、ピリジニル、ナフチル、キノリニル及びインドリル部分からなる群から選択される。好ましいＺ１及びＺ２はフェニル及びナフチル部分である。
【００４１】
好適には、式（II）及び（III）の色素のＲ基の１以上は、この化合物に親水特性を与えるために水溶性の基である。可溶化基、例えば、スルホネート、スルホン酸及び第四アンモニウムは、式（Ｉ）及び（II）の化合物の芳香族環構造Ｚ１及び／又はＺ２に直接結合していてもよい。或いは、可溶化基はＣ１〜Ｃ６アルキルリンカー鎖で芳香族環構造に結合していてもよく、基−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ（式中、Ｙはスルホネート、サルフェート、ホスホネート、ホスフェート、第四アンモニウム及びカルボキシルから選択され、ｎは１〜６の整数である。）から選択できる。別の可溶化基としては、炭水化物残基（例えば、単糖類）又はポリエチレングリコール誘導体がある。水溶性成分の例としては、Ｃ１〜Ｃ６アルキルスルホネート、例えば−（ＣＨ２）３−ＳＯ３−及び−（ＣＨ２）４−ＳＯ３−が挙げられる。ただし、式（II）又は（III）の色素の芳香族環構造に１以上のスルホネート又はスルホン酸基が直接結合しているのが特に好ましい。水溶性であると、タンパク質を標識する際に有利である。
【００４２】
第一の態様に係る実施形態では：
ｉ）アリールは、炭素原子数６〜１０の１又は２つの縮合芳香族環（例えばフェニル又はナフチル）を含む芳香族置換基であり、適宜１以上の置換基（例えば、ハロゲン、炭素原子数１〜１０の直鎖又は枝分れアルキル基、アラルキル及びアルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びｎ−ブトキシ））で独立に置換され、
ii）ヘテロアリールは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択し得る１〜３個のヘテロ原子を含む単環式又は二環式五〜十員芳香環系であり、適宜１以上の置換基（例えば、ハロゲン、炭素原子数１〜１０の直鎖又は枝分れアルキル基、アラルキル及びアルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ及びｎ−ブトキシ））で独立に置換され、
iii）アラルキルは、アリール又はヘテロアリール基で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル基であり、
iv）ハロゲン及びハロ基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択される。
【００４３】
標的結合基Ｆのおかげで、本発明に係る化合物は、生物学的検出系での用途のため、標的生体物質を部位特異的に共有結合で標識するのに有用である。適当な標的物質には、タンパク質、翻訳後修飾タンパク質、ペプチド、抗体、抗原及びタンパク質−核酸（ＰＮＡ）がある。リポーター部分は、細胞（生細胞又は死細胞）内でのリポーターの経路を指示し得る化学種、或いは細胞への出入りを助ける化学種、例えば、親油性膜の透過を可能にする長鎖アルキル残基、或いは二本鎖ＤＮＡを含む核又は他の細胞領域にリポーターを局在させるための挿入化学種に結合することもできる。
【００４４】
第二の態様では、Ｎ末端システインを含むか、又はＮ末端システインを含むように誘導体化された目的タンパク質を標識する方法であって、
ｉ）上記タンパク質を含む液体に次の式（Ｉ）の化合物を添加し、
【００４５】
【化９】
2005534738.tif 000011
【００４６】
（式中、
Ｄはアクリドン及びキナクリドン系色素から選択される蛍光色素であり、
Ｆはカルボン酸チオエステル基及び１，２−アミノチオール基から選択される標的結合基を含み；
ＭはＦとの結合に適した基であり、
Ｘは水素又は次式の基から選択され、
−Ｌ２−Ｂ
（式中、Ｂは親和性標識である。）
Ｌ１及びＬ２は各々独立に、炭素原子から選択される１〜４０の連結原子を含む基であって、適宜−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯ−ＮＨ−及びフェニレニル基（式中、Ｒ′は水素及びＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。）から選択される１以上の基を含んでいてもよい。）、
ii）上記タンパク質を標識するのに適した条件下で上記化合物をタンパク質と共にインキュベートする
ことを含んでなる方法を提供する。
【００４７】
好適には、Ｌ１及びＬ１の各々に２〜３０個の原子、好ましくは６〜２０個の原子が存在する。
【００４８】
好ましくは、Ｌ１及びＬ２は独立に次式の基から選択される。
【００４９】
−｛（ＣＨＲ′）ｐ−Ｑ−（ＣＨＲ′）ｒ｝ｓ−
式中、Ｑは−ＣＨＲ′−、−ＮＲ′−、−Ｏ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ａｒ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′は水素又はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｐは０〜５であり、ｒは１〜５であり、ｓは１又は２である。
【００５０】
特に好ましいＱは、−ＣＨＲ′−、−Ｏ−及び−ＣＯ−ＮＨ−から選択され、Ｒ′は既に定義した通りである。
【００５１】
好ましくは、Ｍは以下のものから選択される。
【００５２】
【化１０】
2005534738.tif 000012
【００５３】
Ｒ′は既に定義した通りである。
【００５４】
本発明の化合物を用いる共有結合標識は、既に規定した１以上のカルボン酸チオエステル基又は１，２−アミノチオール基を有する標的を用いて達成し得る。標的は、標的物質の相補的基と共有結合し得る上述のＦ基を１以上有する本発明の化合物と共にインキュベートすればよい。標的物質と本発明の化合物は、標的物質を本発明の化合物に共有結合させるのに十分な条件下で十分な時間インキュベートされる。例えば、チオエステル基Ｆは、１，２−アミノチオール基を含むか、又は１，２−アミノチオール基を含むように誘導体化された標的物質と反応して共有結合を形成し得る。これらの方法及びそれで得られる生成物（例えばリポーター標識生体分子）も、本発明の追加の態様として想定されている。
【００５５】
好適には、目的タンパク質は抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、微生物材料、細胞及び細胞膜からなる群から選択できる。
【００５６】
第二の態様に係る一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーによって目的色素標識タンパク質を分離及び／又は精製する方法が提供される。この実施形態では、本発明の化合物は次式の基を含む。
【００５７】
−Ｌ２−Ｂ
（式中、Ｂ及びＬ２は既に定義した通りである。）。この方法は、支持体に結合した固定化リガンド（又は特異結合パートナー）に対する親和性標識部分の親和性を利用する。アフィニティークロマトグラフィーは、生理的条件下で標識と非標識タンパク質分子とを分離できる迅速・簡便な方法を提供する。親和性標識で標識したタンパク質はアフィニティーカラムに選択的に結合させることができ、未反応タンパク質はカラムを洗浄することで除去できる。適当な特異的結合部分としては、アビジン又はストレプトアビジン（ビオチン標識に対して）があり、固定化金属イオン（Ｈｉｓ標識又はイミノ二酢酸に対して）、例えばＣｕ（II）、Ｎｉ（II）、Ｆｅ（II）及びＦｅ（III）がある。タンパク質のアフィニティー精製法は当業者に周知であり、例えば、Ｏｓｔｒｏｖｅ，Ｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９９０），Ｖｏｌ  １８２，ｐａｇｅ  ３５７を参照されたい。
【００５８】
典型的な標識法では、Ｎ末端システイン残基を含む標的ペプチド又はタンパク質を、過剰のアクリドン又はキナクリドン系色素チオエステル誘導体（例えば、９−オキソ−１０−｛６−オキソ−６−［２−スルホエチル）チオ］ヘキシル｝−９，１０−ジヒドロアクリジン−２−スルホン酸（Ａｃｅ−ＭＥＳＮＡ）を含む緩衝液（通例、約１．５％のＭＥＳＮＡを含む２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  リン酸ナトリウム）と約ｐＨ７．３〜７．４）で撹拌する。標識反応における標的ポリペプチドの濃度は概して１００μＭ〜１０ｍＭであり、Ａｃｅ−ＭＥＳＮＡは概して過剰（例えば１．５〜３倍モル過剰）存在する。標的ポリペプチド濃度が比較的低い場合、Ａｃｅ−ＭＥＳＮＡの濃度は通常１ｍＭ以上に維持される。一般に、低分子ペプチドの標識には、Ａｃｅ−ＭＥＳＮＡ及びＭＥＳＮＡ補因子の溶液を、凍結乾燥した標識に直接添加する。
【００５９】
通例、本発明の試薬を用いたタンパク質及び高分子ポリペプチドの部位特異的標識には、まず、標識反応に影響を及ぼさないことが知られている適当な緩衝液中に標的を移す。次いで、ライゲーション緩衝液中のＡｃｅ−ＭＥＳＮＡ及びＭＥＳＮＡチオール補因子の等容積の溶液を、タンパク質に添加して、反応体を所望の最終濃度とする。反応混合物を室温で一晩撹拌する。反応時間は、反応体濃度が高い場合には１時間未満に短縮でき、標的ポリペプチドの安定性が問題となる場合には、標識反応を４℃で効率的に実施できる。標的反応が完了したら、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を約５０〜２５０ｍＭの最終濃度で添加して、所望の物質をクロマトグラフィー法で単離する。
【００６０】
天然の化学結合反応を行って発現タンパク質の連結反応を実施する場合には、ペプチドフラグメントの連結の促進及び／又は反応体又は生成物の安定化のため、様々な変性剤、有機溶剤及び界面活性剤を反応緩衝液に添加してもよい。かかる試薬は、必要に応じて、生成物の収率を高めるため標識反応で利用してもよい。その例には、特に限定されないが、塩化グアニジニウム、尿素、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、トリトンＸ−１００、オクチルグルコシド、１，６−ヘキサンジオール及びグリセロールがある。
【００６１】
本発明では、適宜、誘導体化アクリドン又はキナクリドン系色素を用いた連結反応を、ｐＨ７．０〜８．０及び温度４〜３７℃で実施してもよい。かかる範囲の条件は、本明細書に記載した部位特異的標識反応に適合していると思料される。
【００６２】
本方法の利点は、タンパク質系基質中に外来の標識を位置選択的かつ特異的に導入することを可能にし、かくして、タンパク質の生物学的機能に標識が与えかねない悪影響を最小限に抑制できることである。色素の過剰添加が生物活性を妨げる可能性がある場合には、標識の化学量論を制御することが重要である。さらに、こうした標識の化学量論の制御が内部部位ではなく単一の末端部位に関するものであれば、これは標識種の生物学的有効性をさらに維持するという利益をもたらす可能性がある。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例を参照して本発明をさらに詳しく説明する。
【００６４】
実験
１．  ９−オキソ−１０−｛６−オキソ−６−［２−スルホエチル）チオ］ヘキシル｝−９，１０−ジチオドロアクリジン−２−スルホン酸（Ａｃｅ−ＭＥＳＮＡ）
【００６５】
【化１１】
2005534738.tif 000013
【００６６】
９−オキソ−１０−｛６−カルボキシヘキシル｝−９，１０−ジヒドロアクリジン−２−スルホン酸（３８．９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及び２−メルカプトエチルスルホン酸の撹拌溶液に、ナトリウム塩（ＭＥＳＮＡ）（２５．２ｍｇ，０．１５３ｍｍｏｌ）を含む無水ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）を環境温度で添加して、ジメチルアミノピリジン（１３．４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を含む無水ジメチルホルムアミド（１．２５ｍｌ）の溶液、続いて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１７．９ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）を含む無水ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）の溶液を添加した。この混合物に固体として乾燥４Ａモレキュラーシーブ（約１ｇ，＜５ミクロン、活性化、粉末）を添加した。この混合物を乾燥窒素雰囲気下で３０分間撹拌して、続けてＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（１２６ｍｇ、１５５μｌ、１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を乾燥窒素雰囲気下で１５時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー解析（逆相Ｃ１８プレート、溶出水／アセトニトリル（７０：３０，０．１％  ＴＦＡを含有）によって、微量の出発物質（ｒｆ  ０．３４）も伴わない、主なＵＶ可視成分（ｒｆ  ０．４３）が示された。ガラス焼結漏斗（空隙率３）による濾過、ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）を用いた洗浄、冷ジエチルエーテル（３０ｍｌ）に注ぐこと、及び遠心分離すること（５〜１０℃，１００ｒｐｍ、１０分間）を行なった。エチルアセテート（２×２０ｍｌ）での倍散及び水（２５ｍｌ）へ分散固体を溶解した後に、４０分間にわたってＨＰＬＣ精製（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム、０〜６０％の水／アセトニトリル（０．１％  ＴＦＡを含有）の勾配溶出）を行なった。黄色固体として生成物を得た（２８．８ｍｇ、５６％）、ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）５１４，ＮＭＲδＨ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）１．４５（２Ｈ，ｍ），１．７２（４Ｈ，ｍ），２．５４（２Ｈ，ｔ，ＣＨ２−ＣＯ−Ｓ），３．１９（４Ｈ，ｍ，ＳＣＨ２ＣＨ２），４．２４（２Ｈ，ｔ，ＮＣＨ２），７．２３〜８．１５（６Ｈ，ｍ，芳香族Ｈ）及び８．５３（１Ｈ，ｓ，１−ＣＨ）。
【００６７】
２．  Ａｃｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２の合成
２．１．  Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｙ−リンクアミド樹脂
全体として装置の製造業者の推奨する手順に従って、ＦａｓｔＭｏｃ（商標）化学を用いる市販のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ自動ペプチドシンセサイザーを用いてＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｙ−リンクアミド樹脂を合成した。活性化剤としてＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を使用して０．２５ミリモルのスケールでこのペプチドを合成した。
【００６８】
２．２．  Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
【００６９】
【化１２】
2005534738.tif 000014
【００７０】
Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｙ−リンクアミド樹脂（１００ｍｇ、理論的ローディング０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）を脱保護して、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／２．５％トリイソプロピルシラン（ｔｒｉ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｃｅ）（ＴＩＳ）／２．５％水（３ｍｌ）中で室温で２時間固相から切断した。粗生成物を１０倍過剰な冷ジエチルエーテル中に沈殿させて、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離させて、エーテルをデカントした。粗ペプチドをさらにエーテルを用いて２回洗浄して、逆相高処理能力クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）［Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム，溶出Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶出Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、勾配：０〜７３％Ｂ  １ｍｌ／分で３０分にわたり、２１４ｎｍで検出］によって精製した。この生成物を単離して凍結乾燥し、無色のフワフワした（ｆｌｕｆｆｙ）固体（２１ｍｇ  ６０重量％）を得た。モノアイソトピック質量（カルボン酸塩として）：９０６．０９。実測質量（ＬＣ−ＭＳ）：ＭＨ＋＠９０７．３；Ｍ＋Ｎａ＠９２９．６；＠２１４ｎｍでＲＰ−ＨＰＬＣで判定して純度９５％を超える（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム，溶出Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶出Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、５〜５０％Ｂ  １ｍｌ／分で２５分にわたり、６５０ｎｍでＵＶ検出）。
【００７１】
２．３．  Ａｃｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
固体のＨ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（重量で３．２ｍｇ  ０．００３５ｍｍｏｌ）にＡｃｅ−ＭＥＳＮＡ（２．５ｍｇ，０．００４９ｍｍｏｌ，１．４等量）を含有する２００ｍＭリン酸塩／２００ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液ｐＨ７．２（１．５％２−メルカプトエタンスルホン酸、ナトリウム塩含有）の溶液（５００μｌ）を添加した。この反応混合物を暗野で室温において３０分間撹拌した。インキュベーションの間、沈殿物が形成され、これを手による撹拌で再度溶解した。
【００７２】
反応混合物の５０μｌのアリコートを取り出して、ここに２００ｍＭのリン酸塩緩衝液／２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）（２５０ｍＭ（最終）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有）（１００μｌ）を添加した。次いでこの粗反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ［２５０×４．６ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム，溶出Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶出Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、勾配；０〜５０％Ｂ  １ｍｌ／分で３５分にわたり、２２０ｎｍ及び４００ｎｍで検出］によって解析した。ＨＰＬＣによって、保持時間１８．９１分、２１．６０分及び２３．４２分で主な新しい４００ｎｍの可視ピークを用いて、９０％を超える色素の消費（保持時間．約１４．７分）が示された。次いで、２００ｍＭのリン酸塩緩衝液／２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）（２５０ｍＭ（最終）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）含有）（２００μｌ）の添加によって、残りの反応混合物を作製した。次いでこの粗反応混合物を３回の半分取的ＲＰ−ＨＰＬＣ泳動［２５０×１０ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム，溶出Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶出Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、勾配；０〜５０％Ｂ  ５ｍｌ／分で４０分にわたり、２２０ｎｍ及び４００ｎｍで検出］に供した。２番目の４つの４００ｎｍの可視ピーク（保持時間、約２６．５分）が、所望の生成物（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、モノアイソトピック質量、Ｃ５３Ｈ７８Ｎ１４Ｏ１７Ｓ３、は１２７７を要する、実測値ＭＨ＋１２７８）として同定された。三番目のＨＰＬＣ泳動からの生成物を単離して淡黄色固体として凍結乾燥した（重量で１．４ｍｇ；約５４．５％収率；４００ｎｍの波長でＲＰ−ＨＰＬＣで判定して９７％純度）。さらに同定を行なった：（ＬＣ−ＭＳ  ＥＳ＋単一成分によってＭＨ＋＠１２７８が得られる）。
【００７３】
２．４．  標識化ペプチドの特性決定
２．４．１．  Ａｃｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２の酵素消化
Ａｃｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（実験の節４．３由来の最初の２つの分取ＨＰＬＣ泳動から約７５０μｇ）を含む５０ｍＭ  ＴＲＩＳ  緩衝液ｐＨ７．９の溶液（５００μｌ）（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ含有）に、Ｅｎｄｏ  Ａｓｐ−Ｎ（２μｇ）を含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．９（１００μｌ）を添加した。この反応混合物を暗野の窒素雰囲気下で室温において一晩撹拌した。この反応混合物を２５０ｍＭ（最終）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．９（２００μｌ）を用いて３０分間処理した。次いでこの粗反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣ［２５０×４．６ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム，溶出Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶出Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、勾配；０〜５０％Ｂ  １ｍｌ／分で３５分にわたり、２２０ｎｍ及び４００ｎｍで検出］によって解析した。ＨＰＬＣによって、実質上完全な酵素消化が示され、これには保持時間２４．７１分での主な新しい４００ｎｍの可視ピーク、及び保持時間２３．０９分の微量の出発基質を伴っていた。次いでこの粗反応混合物を半分取的ＲＰ−ＨＰＬＣ泳動［２５０×１０ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム，溶出Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、溶出Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、勾配；０〜５０％Ｂ  ５ｍｌ／分で３５分にわたり、２２０ｎｍ及び４００ｎｍで検出］に供した。主な４００ｎｍの可視ピーク（保持時間、約３１．１８分）が、所望の生成物（９７％ピーク面積）（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、Ａｃｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ、モノアイソトピック質量、Ｃ３０Ｈ３７Ｎ４Ｏ９Ｓ２、は６６１．７８を要する、実測値Ｍ＋Ｈ＠６６３）として同定された。さらに粗反応混合物を解析した（ＬＣ−ＭＳ  ＥＳ＋，ダイオードアレイ検出）。必要な切断生成物Ａ（Ａｃｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）は６６２．７９を要し、実測ＭＨ＋６６３であった。必要な切断生成物Ｂ（Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）は６３４を要し、実測ＭＨ＋６３４であった。非特異的内部Ｃｙｓ残基標識に相当する化合物のピークについての証拠はなかった。非切断出発物質（Ａｃｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）がまたＭＨ２２＋６３９．６（ＭＨ＋＠１２７８．２）として観察され、このことは９１．８％のｅｎｄｏＡｓｐ  Ｎ酵素切断効率を示す。
【００７４】
２．４．２．  Ａｃｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ２のＭＳ配列解析
配列解析（ＭＳ／ＭＳイオン配列β及びγ配向）によって、Ｍ＋４７５．０６で観察された末端Ａｃｅ−Ｃｙｓ残基を有する構造との整合性が示される。内部Ｃｙｓ標識の証拠はこの配列では観察されなかった。
【国際調査報告】
2005534738.tif 000024
2005534738.tif 000025
2005534738.tif 000026
2005534738.tif 000027
2005534738.tif 000028