(57)【要約】本発明は、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子であって、その表面に目的とする細胞又はその断片を含むこと、及び微小粒子の埋め込みの際に前記細胞又はその環境に対して少なくとも１つの作用物質の分子を含み、前記分子は、微小粒子によって、持続して、かつ制御されて放出されることを特徴とする微小粒子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性物質を担持する、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子であって、その表面に目的とする細胞又はその断片を含むこと、及び微小粒子の埋め込みの際に前記細胞又はその環境に対して少なくとも１つの作用物質の分子を含み、前記分子は、微小粒子によって、持続して、かつ制御されて放出されることを特徴とする微小粒子。
【請求項２】
少なくとも１つの作用物質の分子が、表面にあり、かつ／又は微小粒子中に取り込まれることを特徴とする請求項１に記載の微小粒子。
【請求項３】
生体適合性かつ生分解性材料は、ポリマー又はコポリマーであることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項４】
ポリマー又はコポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、例えばポリラクチド、ポリラクチドｃｏ−グリコリド、ポリエステル、例えばポリε−カプロラクトン（ｐｏｌｙ  ε−ｃｏｐｒｏｌａｃｔｏｎｅｓ）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスホゼン）（ｐｏｌｙ（ｐｈｏｓｐｈｏｚｅｎｅｓ））、ＰＬＧＡ及びそれらの混合物を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項５】
約１〜５００μｍ、かつ好適には１０〜５００μｍの直径を有することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項６】
生体適合性かつ生分解性材料は、目的とする細胞又はその断片の付着を可能にするか、又は細胞の付着を可能にする化合物でコーティングされ、前記化合物は、その上前記細胞又はその断片に対して場合により活性であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項７】
微小粒子表面の、目的とする細胞は：成人細胞、胚性細胞、形質転換された、又はされない細胞系統、幹細胞、遺伝子操作細胞、欠損組み換えウイルスを、それらの複製のために生成する細胞、肝細胞、ランゲルハンス島、神経細胞、筋細胞、造血細胞、骨細胞を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項８】
微小粒子中に取り込まれた分子は、免疫調節物質、細胞の生存を促進する因子、細胞の毒剤、免疫反応及び拒絶を減少させて、又は血管形成を増加させ、組み込みを促進して組織環境に作用する因子、遺伝子操作細胞中に存在する遺伝子の発現を制御する因子を含む群から選択される少なくとも１つの作用物質のそれであることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項９】
微小粒子中に取り込まれた分子は、成長因子、ホルモン、サイトカインを含む群から選択される少なくとも１つの作用物質のそれであることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項１０】
微小粒子表面の目的とする細胞は、抗原源として患者の腫瘍の初代培養から得られる自己腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項１１】
微小粒子表面の細胞断片は、腫瘍の初代培養から得られるアポトーシス体又は膜小胞であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項１２】
微小粒子中に取り込まれる分子は、炎症誘発性サイトカイン又はアジュバントを含む群から選択される少なくとも１つの作用物質のそれであることを特徴とする請求項１０又は１１のいずれかに記載の微小粒子。
【請求項１３】
組織修復又は遺伝子導入のための医薬品組成物を調製するための、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子の使用であって、前記微小粒子は、その表面に目的とする細胞を含み、かつ微小粒子の埋め込みの際に前記細胞又はその環境に対して少なくとも１つの作用物質の分子を含み、前記分子は、微小粒子によって、持続して、かつ制御されて放出される使用。
【請求項１４】
ワクチン、特には抗腫瘍医薬品組成物を調製するための、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子の使用であって、前記微小粒子は、その表面に目的とする細胞又はその断片を含み、かつ微小粒子の埋め込みの際に前記細胞又はその環境に対して少なくとも１つの作用物質の分子を含み、前記分子は、微小粒子によって、持続して、かつ制御されて放出される使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織修復又は遺伝子導入、あるいは予防接種のための細胞治療の範囲で有用な細胞の調製及び移植の分野に関する。特には、本発明は、目的とする細胞又はその断片、及び成長因子又はサイトカイン因子を含む、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
自己又は非自己細胞の移植による細胞治療は、今日、本質的に血液生物学（ｈｅｍａｔｏｂｉｏｌｏｇｉｅ）で開発されているが、幹細胞及びそれらを筋肉から中枢神経系までの、大部分の組織中で識別することに関して得られた知識のために、他の専門に応用されるべき主要な治療ツールを構成している。サイトカイン及び成長因子の増大する識別及び特徴付けにより、これらの細胞の増殖及び分化を、試験管内及び／又は生体内で制御すること、及びそれらの組織環境（免疫拒絶現象、血管形成）を調節することの可能性を検討できるようになる。これらの細胞生物学の前進にもかかわらず、細胞移植の臨床学的発達は現在のところ、採集、保存、形質転換及び投与手順、又は（同種及び異種移植での）免疫拒絶、更には宿主組織中での組み込み欠如による、非特異的死亡率（壊死又はアポトーシスによる細胞死）に関連し得る、埋め込まれた細胞の低い生存率を特に理由として、限られたままである。
【０００３】
この細胞死亡率を減少させるために、細胞が付着し、従って輸送体又は「マイクロキャリア」として役立つ非生分解性マイクロビード（ｍｉｃｒｏｂｉｌｌｅｓ）の使用が提案された。肝細胞の生存及び働きは、これらの細胞が、ガラス又はデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標））のマイクロビードに付着して移植された時に、例えば改善された（デメトリウ（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ）ら、１９８６年；テ・ヴェルデ（Ｔｅ  Ｖｅｌｄｅ）ら、１９９２年）。この戦略は、マイクロカプセル化肝細胞によるよりも、興味深い結果を得ることを可能にした。より最近、これらの同種のマイクロビードが、ヌードマウスにおいて皮膚カバーを復元するために、ヒトケラチノサイトを培養し、かつ移植するために使用された（フォイクト（Ｖｏｉｇｔ）ら、１９９９年）。このアプローチは、パーキンソン病のマウスモデル中に神経クロム親和細胞又はドーパミン作動性胚性細胞を移植するためにも使用された。このモデルにおいて、線条体中に移植された細胞の生存率は、細胞がガラス又はデキストラン微小粒子に予め付着される時に非常に増加し、かつ動物の行動改善を可能にする（チャースキ（Ｃｈｅｒｓｋｅｙ）ら、１９９６年；サポータ（Ｓａｐｏｒｔａ）ら、１９９７年、ボーロンガン（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ）ら、１９９８年）。同様に、デキストランマイクロビードに付着されたヒト胎児細胞が、免疫抑制処理なしに少なくとも３ヶ月生存し、他方で微小粒子なしではこれらの細胞が急速に拒絶されることが観察された（サポータ（Ｓａｐｏｒｔａ）ら、１９９７年）。
【０００４】
より最近の、移植細胞の生存率を増大させることを可能にする、もう一つのアプローチは、成長因子の、移植と組み合わせた投与である。細胞の増殖、分化、活性化及び生存率に作用し得るこれらのタンパク質は、細胞移植の主要な提供物を構成する。ヒト組み換え成長因子を使うことは、今や可能であるが、これらのタンパク質が短い半減期を有し、かつある種の生物学的障壁をうまく横切らないので、その投与は困難さを示している。その上、それらは望ましくない副作用の効果の原因となり得る多面作用を有する。現在開発された投与方法のいずれも、完全に満足のゆくものでなく、かつ臨床に急速に応用できない。
【０００５】
提案された第１の投与方法の一つは、成長因子を含む懸濁液中に細胞を移植することからなった。このアプローチは簡単であるとしても、細胞に長期間作用することを可能にしない。第２の投与方法は、選択された成長因子を生成するために識別された組織を同時移植することからなり、例えば末梢神経−クロム親和細胞同時移植（ダテ（Ｄａｔｅ）ら、１９９６年）、又は肝細胞−ランゲルハンス島同時移植（クネーザー（Ｋｎｅｓｅｒ）ら、１９９９年）である。これらの同時移植の時折限られる生存率、及び成長因子の分量を制御することが不可能であることは、この戦略を著しく制限する。分子生物学の進歩は、成長因子を生成し、かつ同時移植で、又はいわゆる移植片として使用され得る遺伝子操作細胞を得ることを今や可能にしている（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９８年；ウッド（Ｗｏｏｄ）及びプライアー（Ｐｒｉｏｒ）、２００１年）。しかしながら、このアプローチは、倫理的問題、生物学的危険、及び放出分量の制御によって制限されたままである。このように、神経内分泌細胞ＰＣ１２（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９８９年；ドゥオー（Ｄｅｈａｕｔ）ら、１９９３年）、又は正常なシュワン、若しくは神経栄養因子を生成するために遺伝子操作された細胞（モントゥロ・ムネー（Ｍｏｎｔｅｒｏ−Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９２年；ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９８年）のような神経細胞の移植が報告された。
【０００６】
持続して、かつ制御されて向神経活性分子を放出する生分解性微小粒子が、同様に記載された（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９７年；ブノワ（Ｂｅｎｏｉｔ）ら、１９９９年）。これらのマイクロスフェアは、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）タイプのバイオポリマーから構成される。それらは、神経組織による生分解性であり、かつ数ヶ月で完全に分解される（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９３年；１９９４年ｂ；ヴェジエ（Ｖｅｚｉｅｒｓ）ら、２０００年）。それらの数十ミクロンの大きさは、細胞埋め込みと同じ微量注射器を使用して、薬理学的標的のレベルで、脳内での定位埋め込みを可能にする（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９４年ａ）。それらは、脳腫瘍の組織内化学療法のための第Ｉ相臨床試験で成功裡に使用された（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９９年）。
【０００７】
タンパク質を放出するマイクロスフェア、特に成長因子及びサイトカインも、同様に開発された。「神経成長因子」（ＮＧＦ）は、以前に特徴を有する中で、興味深い物質である。このように、少なくとも２ヶ月間、ＮＧＦを放出し得るマイクロスフェアが記載された（ペアン（Ｐｅａｎ）ら、１９９８年；ペアン（Ｐｅａｎ）ら、１９９９年）。その治療的有用性は、神経変性病の２匹の動物モデル：アルツハイマー病のマウスモデル（ペアン（Ｐｅａｎ）ら、２０００年）及びハンチントン舞踏病のマウスモデル（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、２０００年）に対して証明された。
【０００８】
腫瘍の範囲において、腫瘍内移植後の免疫刺激サイトカインを放出することが可能なＰＬＧＡのマイクロスフェアが作成された（マララッド（Ｍｕｌｌｅｒａｄ）ら、２０００年；ペティット（Ｐｅｔｔｉｔ）ら、１９９７年）。抗腫瘍ワクチンの範囲内でサイトカインを放出するための、生分解性マイクロスフェアの使用は、このようにして提案された（ゴランベック（Ｇｏｌｕｍｂｅｋ）ら、１９９３年）が、この研究において、マイクロスフェアは、注射直前に細胞に単に混合される。同様に、細菌性抗原又は膜小胞で被覆されたマイクロスフェアで構成されるワクチンの調製は、すでに提案されたが、マイクロスフェアは、免疫刺激分子を放出できなかった（メッシャー（Ｍｅｓｃｈｅｒ）及びロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）、１９９６年、メッシャー（Ｍｅｓｈｅｒ）及びサヴェリエヴァ（Ｓａｖｅｌｉｅｖａ）、１９９７年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、細胞治療の細胞移植又は予防接種のために、同じ微小粒子のレベルで、細胞（又は細胞分画）、及び成長因子又はサイトカインのような、細胞に対する作用物質の組み合わせを今、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らの能力により、成長因子を持続して、かつ制御されて放出する、以下で「ＭＰＡ」とも指し示す、薬理活性マイクロキャリアを開発することができた。直径数十ミクロンのこれらの微小粒子は、ポリマーの固有の特性、又は生物活性であり得るコーティングのために、細胞又は細胞断片の付着を可能にする生分解性かつ生体適合性ポリマーから構成される。ＭＰＡは、生物学的危険を有さず、かつ以下の理由で注目すべきである：
−それらは、細胞（又はその断片）の培養用担体として役立ち得る。移植する細胞の微小粒子に対する好ましい付着により、それらを採集するために、明白な、衛生上の安全の理由で勧められない動物由来のタンパク質分解酵素を使用せずに、それらの調製、更にはそれらの試験管内形質転換が可能になる。
−それらは、移植細胞（又は細胞分画）への担体として役立ち、かつ埋め込み後に毒性なしに分解し得、移植細胞（又はその断片）の組み込みに干渉しない。
−それらは、プログラムされた期間に、かつ一定の分量で１つ又は幾つかの成長因子又はサイトカインを放出し得る。
−それらは、移植細胞の生存率及び分化を促進し、その微小環境、並びに宿主組織中へのそれらの組み込みを変更し得る。
【００１１】
従って、本発明は、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子であって、その表面に目的とする細胞又はその断片を含むこと、及び微小粒子の埋め込みの際に前記細胞又はその環境に対して少なくとも１つの作用物質の分子を含み、前記分子は、微小粒子によって、持続して、かつ制御されて放出されることを特徴とする微小粒子を対象とする。
【００１２】
本発明は、少なくとも１つの作用物質の分子が、表面にあるか、かつ／又は微小粒子中に取り込まれるかに応じて、幾つかの実施態様を可能にする。
【００１３】
活性分子の取り込みは、カプセル化プロセスの際に、及び／又は粒子形成後に行われ得る。操作条件に応じて、マトリックスは、多かれ少なかれ球状の形状を有し、多かれ少なかれ多孔質であり得る。
【００１４】
微小粒子は、生体適合性かつ生分解性ポリマー又はコポリマーから構成される。かかるポリマー又はコポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、例えばポリラクチド、ポリラクチドｃｏ−グリコリド、ポリエステル、例えばポリε−カプロラクトン（ｐｏｌｙ  ε−ｃｏｐｒｏｌａｃｔｏｎｅｓ）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ホスホゼン）（ｐｏｌｙ（ｐｈｏｓｐｈｏｚｅｎｅｓ））、ＰＬＧＡ及びそれらの混合物を含む群から例えば選択される。本発明の好適な実施態様では、ポリマーはポリラクチドから選択される。
【００１５】
微小粒子は、１〜５００μｍ、かつ好適には１０〜５００μｍの直径を有する。実際、ＭＰＡは、付着される細胞に応じて微小粒子の大きさを適応させ得るという利点を有する。
【００１６】
微小粒子に対する細胞の付着は、ポリマーの固有の特質によって、又は細胞の付着を可能にし、かつ生物活性であり得る化合物又は化合物の混合物によるコーティングによって可能にされる。このようにして、本発明は、分子に対してＲＧＤ配列又はリジンが移植される、その物理化学特性によって細胞の付着を可能にする合成ポリマー、又は合成コポリマーの使用を検討する（ヴァラニ（Ｖａｒａｎｉ）ら、１９９３年）。細胞の付着を可能にする微小粒子のコーティング化合物の例として、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリオルニチン、ポリエチレンアミン、又はその他のあらゆる合成、又は細胞外マトリックスに属さない分子、例えばフィブロネクチン様、又はそれらの混合物を含む群から選択されたものを挙げることができる。
【００１７】
これらの微小粒子は、細胞、又は移植の際のこれらの細胞の環境に対する、少なくとも１つの作用物質の分子を含む。これらの分子のカプセル化方法は、多様であり、二重乳剤による方法、又はその他のあらゆる物理化学的、機械的又は化学的方法を挙げることができる。微小粒子表面に前記分子を固定するように、前記分子により微小粒子を簡単に吸収することであっても良い。微小粒子は、この物質の分子を持続して、かつ制御されて放出する。
【００１８】
本発明の第１の実施形状によれば、ＭＰＡは、組織修復又は遺伝子導入のための細胞治療に有用な医薬組成物の調製に有用である。
【００１９】
微小粒子表面に固定された目的とする細胞は、所望の移植片のタイプに応じて多様であり得、例えば成人自己細胞、胚性細胞、形質転換された、又はされない細胞系統、又は幹細胞であっても良い。これらの細胞は、細胞治療を必要とする様々な疾患に使用され得る。例えば、肝細胞及びランゲルハンス島移植が当てはまる。神経移植の場合、ドーパミンを分泌し、かつＮＧＦのために「交感神経様」ニューロンに分化することが可能な細胞系統ＰＣ１２のことであっても良い。例として、肝臓、心筋層、中枢神経系の修復のための細胞移植、糖尿病治療のためのランゲルハンス島、血友病における骨髄細胞、成人細胞、胚性細胞、形質転換された、又はされない細胞系統、幹細胞、遺伝子操作細胞、欠損組み換えウイルスを、それらの複製のために生成する細胞、肝細胞、ランゲルハンス島、神経細胞、筋細胞、造血細胞、骨細胞の移植を更に挙げることができる。従って、隣接宿主細胞を感染させる、欠損組み換えウイルスをそれらの複製のために生成する細胞の、導入遺伝子を含む細胞のように、生体内の遺伝子導入を可能にする細胞のことであっても良い。これらの細胞は、多くの場合動物系統から生じ、かつ異種免疫反応は、それらの生存、及びそれ故にそれらの機能を長期間妨げる。免疫調節剤及び／又はこれらの細胞の生存を促進する因子を放出するＭＰＡの使用は、期間中にその機能を長引かせることを可能にする。逆に、ＭＰＡは、輸送された細胞の毒性分子を選択した時間に放出することができ、このようにしてその死及び除去をプログラムする。
【００２０】
取り込まれた、又はＭＰＡ表面の物質の分子は、その場合好適には、成長因子、サイトカイン、ホルモン、輸送細胞に対する作用又は組織環境のために知られている細胞外マトリックス又は付着分子である。例として、成長因子、サイトカイン、免疫調節物質又は細胞分化に作用する因子、特にニュートロフィン、例えばＮＧＦ、ＢＮＤＦ、ＮＴ−３等、ＴＧＦβ、ＧＤＮＦファミリー、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、インターロイキン例えばＩｌ−１、Ｉｌ−２、ケモカイン、レチノイン酸、エリスロポイエチン等、又はそれらの混合物を含む群から選択されるものが挙げられる。
【００２１】
単独の、又は細胞を付着するためのコーティング化合物と組み合わされた微小粒子により放出される分子は、細胞の生存、その機能を促進するか、又は幹細胞の分化を一定の表現型に向ける。それらは、免疫反応及び拒絶を減少させて、又は血管形成を増加させ、組み込みを促進して、組織環境を変更することもできる。これらの分子は、これらの分子に応答するプロモーターの制御下にありかつ、遺伝子操作細胞中に存在する遺伝子の発現を制御することに役立つことさえも可能である。
【００２２】
従って本発明は、組織修復又は遺伝子導入のための医薬品組成物を調製するための、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子の使用であって、前記微小粒子は、その表面に目的とする細胞を含み、かつ微小粒子の埋め込みの際に前記細胞又はその環境に対して少なくとも１つの作用物質の分子を含み、前記分子は、微小粒子によって、持続して、かつ制御されて放出される使用も対象とする。
【００２３】
本発明の第２の実施形状によれば、ＭＰＡは、ワクチン調製、及び特には抗腫瘍予防接種にも有用である。がん治療におけるこの新規アプローチは、抗原源として患者の腫瘍の初代培養（ｐｒｉｍｏｃｕｌｔｕｒｅ）から得られる自己腫瘍細胞を使用する。これらの細胞は、炎症誘発性サイトカインを放出するために遺伝子操作され得る。ＭＰＡは、手順を引き延ばすトランスフェクション及び選択段階を通らずに、この役割を果たすことができる。
【００２４】
しかし、ＭＰＡの特殊な有用性は、その表面特性により、細胞だけでなく、好ましくは細胞質膜又はタンパク質抽出物で被覆された細胞断片も、又はｍＲＮＡ若しくはＤＮＡも輸送することも可能であることである。本発明は、かかる断片の例として、腫瘍の初代培養から得られるアポトーシス体、エキソソーム又は膜小胞を検討する。アポトーシス体は、酪酸ナトリウムの作用、細胞の熱処理とそれに続く紫外線Ｂの放射によって容易に得られる。膜小胞は、細胞断片化、次に二相系中での遠心分離による分離によって得られる。アポトーシス体、又は膜小胞の有用性は、腫瘍試料から多量に生成され得ることであり、他方で自己細胞は、治療を著しく遅らせる培養及び膨張段階を必要とする。
【００２５】
この予防接種のための応用において、ＭＰＡは、樹状細胞の作用及びＴ抗腫瘍反応を刺激する、１つ又は幾つかの炎症誘発性サイトカイン又はアジュバントの分子をその表面に含むか、取り込む。かかる物質の例として、フロイントアジュバント、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１２、ＩＬ４又はＩＬ１８を含む群から選択されるものを挙げることができる。
【００２６】
ワクチンを調製するためのＭＰＡの有用性は、その免疫原性質が、膜抗原及びサイトカインの持続する放出の組み合わせだけでなく、微小粒子系に対する抗原の提示からも生じるという意味において注目すべきである。これは、樹状細胞による抗原認識のための理想的な提示方法である。この非特異的免疫刺激又は微小粒子のアジュバントの役割は、久しい以前から証明されている（ナカオカ（Ｎａｋａｏｋａ）ら、１９９５年、シャイヒャー（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ）ら、１９９５年ａ、１９９５年ｂ、ヴェンカタプラサド（Ｖｅｎｋａｔａｐｒａｓａｄ）ら、１９９９年）。
【００２７】
従って本発明は、ワクチン、特には抗腫瘍医薬品組成物を調製するための、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子の使用であって、前記微小粒子は、その表面に目的とする細胞又はその断片を含み、かつ微小粒子の埋め込みの際に前記細胞又はその環境に対して少なくとも１つの作用物質の分子を含み、前記分子は、微小粒子によって、持続して、かつ制御されて放出される使用も対象とする。
【００２８】
本発明のその他の利点及び特徴は、添付図面を参照する、神経移植の分野でのＭＰＡの調製及び使用に関する、これに続く例から現れるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
実施例１：細胞移植用のＭＰＡの一般的な提示
【００３０】
以下の実施例は、神経移植（中枢神経系内への神経細胞の移植）の分野に関する。直径６０μｍの生分解性かつ生体適合性ＭＰＡが、調製された。それらは、ＰＬＧＡから構成され、かつ合成付着分子（ポリ−Ｄ−リジン及び「フィブロネクチン様」）の薄層でコーティングされ、かつ連続して（少なくとも２週間）神経栄養因子、ＮＧＦを放出する。ドーパミンを分泌し、かつこの因子の影響下で「交感神経様」ニューロンに分化することが可能な、細胞系統ＰＣ１２のようなＮＧＦに応答する細胞が使用された。これらＭＰＡの有効性は、パーキンソン病の動物モデルを使用して、生体内で成功裡に評価された。
【００３１】
神経移植は、本質的にパーキンソン病の範囲で、８０年代に臨床医学でスタートした（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９１年ａ；１９９１年ｂ）。それは、臨床研究の形で現在続けられ、かつ移植する細胞（胚性細胞）の入手可能性、及び埋め込み後のこれらの細胞の低い生存率（５〜１０％）によって本質的に制限されたままである。最近の研究は、大部分のニューロンは、おそらく栄養担体、ニューロン接続の欠如、及び限定された血管新生のために、移植後の第１週で死ぬことを示している（エムガード（Ｅｍｇａｒｄ）ら、１９９９年；マハリク（Ｍａｈａｌｉｋ）ら、１９９４年；ザワダ（Ｚａｗａｄａ）ら、１９９８年）。移植細胞と並行して投与された神経栄養因子が、その生存率を改良し、その分化及びシナプス発達にも作用し、このようにしてその最良の組み込みに役立つことが証明された（マホーニー（Ｍａｈｏｎｅｙ）ら、１９９９年；ソーター（Ｓａｕｔｔｅｒ）ら、１９９８年；ユーレック（Ｙｕｒｅｋ）ら、１９９６年）。これらの因子は、炎症及び細胞反応を変更して、移植細胞の環境にも有利に作用することができる（ウェイ（Ｗｅｉ）ら、１９９９年）。
【００３２】
１）成長因子の選択
【００３３】
ＮＧＦが、神経移植の範囲で幾つかの有用性を有する栄養因子であるので、第１段階で選択された。それは、その神経栄養作用に加えて、移植細胞の早死率の原因である興奮毒性から非特異的に保護することができる（ストレイボス（Ｓｔｒｉｊｂｏｓ）及びロスウェル（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ）、１９９５年；カールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ）ら、１９９９年）。更にＮＧＰは、移植片拒絶の範囲で、潜在的な有用性を有する。それは、拒絶を妨げること、又は局所「免疫寛容」を確立することを可能にする、中枢神経系でのＴ細胞の活性化のための必須免疫分子の、小グリア細胞に対する発現を減少させる（ノイマン（Ｎｅｕｍａｎｎ）ら、１９９８年；ウェイ（Ｗｅｉ）及びジョナカイト（Ｊｏｎａｋａｉｔ）、１９９９年、アロワジ（Ａｌｏｉｓｉ）ら、２０００年）
【００３４】
２）細胞の選択
【００３５】
副腎髄質のクロム親和細胞は、伝統的にパーキンソン病の範囲で細胞移植に使用された。従って、培養することがかなり簡単である系統ＰＣ１２の細胞が使用された。実際、これらの細胞は，ドーパミンを合成し、かつ放出する。更に、ＮＧＦの作用で、それらは、増殖することをやめ、かつ「交感神経様」ニューロンに分化する。細胞ＰＣ１２は、天然の付着特性を有さず、かつ付着を促進する分子で被覆された表面にしか付着しないので、「マイクロキャリア」生成の条件を決定するための良好なモデルも構成する。
【００３６】
胚性細胞移植の臨床的発達は、倫理的問題によって制限されたままである。従って、神経幹細胞又は骨髄の間葉幹細胞（ＣＳＭ）のような他の細胞源を今からすでに検討せねばならない。これらは、ヒトにおいて容易に採取可能であり、骨芽細胞、軟骨細胞、ミオサイト、脂肪細胞又は神経幹細胞に、培養条件に従って、試験管内で分化することができる。このように、塩基性ＦＧＦによって神経幹細胞に分化したＣＳＭは、ＮＧＦの高親和性受容体（ｔｒｋＡ）を発現させ、本発明の範囲内で使用され得る。
【００３７】
３）ＭＰＡの選択
【００３８】
この応用での最適な大きさは、約６０μｍである。実際、小さい寸法は、許容できる数の細胞の付着を可能にするために不十分な面積を有する。しかしながら、マイクロスフェアは、過度の困難さなしに吸収され、かつ針を通して容易に投与され得るために、過度に大きな直径を有するべきでない。
【００３９】
細胞付着に関して、ＰＬＧＡの微小粒子は、「フィブロネクチン様」及びポリ−Ｄ−リジンによってコーティングされた。合成かつ動物由来でない分子の使用は、将来の臨床応用を検討し得るために必要不可欠である。これらのコーティングされたマイクロスフェアは、少なくとも２週間、ＮＧＦの連続放出を、試験管内で可能にする。薬理活性「マイクロキャリア」の効果を生体内で研究するために、それらは、神経毒による完全ドーパミン作動性除神経後に、ラットの線状体に埋め込まれた（パーキンソン病ラット）。埋め込み後、細胞ＰＣ１２は、（作用物質のない）白色、又はＮＧＦを放出する微小粒子に付着されたままになる。ＮＧＦを放出する「マイクロキャリア」によって治療された動物に対して、ＰＣ１２は、分化し、かつおそらくＮＧＦ放出に応答して、伸長部分を有した。この分化は、行動効果（回転テスト）を伴った。
【００４０】
細胞ＰＣ１２は、この研究で、ＭＰＡを開発するためにのみ使用されたが、他の細胞も用いられ得る。胚由来の細胞移植は、神経変性病の動物モデルにおいて非常に研究された。その上、これらの研究は、パーキンソン病及びハンチントン舞踏病での臨床試験の実施に至らせた。しかしながら、移植細胞の高い死亡率に結び付いた、これらの移植のささやかな効果は、方法論を再考するに至らせる（リンドヴァル（Ｌｉｎｄｖａｌｌ）、１９９７年）。パーキンソン病及びドーパミン作動性胚性ニューロンの移植の範囲で、研究により、これらの細胞をＧＤＮＦに露出すること（テーンクヴィスト（Ｔｏｒｎｑｖｉｓｔ）ら、２０００年）、又は「マイクロキャリア」の使用（サポータ（Ｓａｐｏｒｔａ）ら、１９９７年）が、その生存率を増加させることが示された。ＧＤＮＦを放出する微小粒子も、ドーパミン作動性胚性ニューロンの移植を促進し、かつラットにおけるその有効性を研究するために、調製され得る。
【００４１】
実施例２：ＭＰＡ  ＰＣ１２／ＮＧＰの調製
【００４２】
１）微小粒子の調製
【００４３】
微小粒子は、二重乳剤（Ｈ／Ｌ／Ｈ）溶剤蒸発／抽出方法によって得られる。
【００４４】
水相は、６０μｌのクエン酸緩衝液（１６ｍＭ、ｐＨ６）、２．５ｍｇのＨＳＡ、（又は界面活性力を有するその他の分子）９０μｌのＰＥＧ４００及び１００μｇのＮＧＦから構成される。５０ｍｇ〜１５０ｍｇのＰＬＧＡ３７．５／２５（ポリＤ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド、Ｍｗ  ２１０００Ｄａ、Ｉ＝１．７）又はその他の生分解性かつ生体適合性ポリマーが、７５％のジクロロメタン及び２５％のアセトンから構成される２ｍｌの有機溶液中に溶解する。初乳剤は、０〜４℃で音波処理（１５ｓ、５〜６Ｗ）によるこれら２つの相から作られる。この初乳剤は、１０％（Ｐ／Ｖ）のＮａＣｌを含み、０〜２％のジクロロメタンを含む、３０〜１５０ｍｌのポリビニルアルコール溶液（０．８〜４．５％、４〜８℃）に機械攪拌下で（２００ｔｐｍ）添加される。攪拌は、１〜７分間維持され、次に二次乳剤は、磁気攪拌下で（２５〜５０ｍｉｎ）１０％のＮａＣｌを有する４００ｍｌの水溶液中に注入される。抽出水相は、二次乳剤に部分的に添加され得る。次に微小粒子は、ろ過され、（０．４５μｍ、ＨＶＬＰ、ミリポア）、１００ｍｌの蒸留水で５回洗浄され、次に凍結乾燥され、かつ＋４℃で保存される。
【００４５】
カプセル化の収率は、約８５％であるが、製造条件により９７％に達し得る（ペアン（Ｐｅａｎ）ら、１９９８年）。
【００４６】
２）微小粒子のコーティング
【００４７】
ポリ−Ｄ−リジン（１２μｇ／ｍＬ）との「フィブロネクチン様」（１６μｇ／ｍＬ）の組み合わせによる微小粒子のコーティングは、細胞ＰＣ１２の付着性及び最適な分化を有することを可能にする条件を構成する。
【００４８】
微小粒子のコーティング条件（攪拌速度及び時間）は、「フィブロネクチン様」及びポリ−Ｄ−リジンの存在下で、マイクロスフェア懸濁液の攪拌によって完成された。様々な試験の後、我々は、毎分１５回転（ｔｐｍ）の攪拌速度及び３７℃で２時間のコーティング時間を選択した。
【００４９】
３）微小粒子に対する細胞の付着
【００５０】
「マイクロキャリア」に対する細胞の付着条件を完成させるために、微小粒子の存在下での様々な細胞攪拌速度及び時間が、テストされた。従って細胞ＰＣ１２の付着は、５％のＣＯ２を有するインキュベータ中、３７℃、４時間、３ｔｐｍでの攪拌に対して最大であった。
【００５１】
微小粒子に付着した細胞の細胞単独の分離テストは、１０秒間、１３５ｇで微小粒子／細胞懸濁液を遠心分離するに至らせた。この処理、並びに移植用に使用される、１０μＬのハミルトン注射器中をペレット（ｃｕｌｏｔ）が通過することは、表面に細胞を有する微小粒子の数の減少を生じさせない。これらの条件において、かつ微小粒子／細胞懸濁液の顕微鏡での計算後、表面に付着細胞を有する約９０％の微小粒子を得ることができた。平均して、「マイクロキャリア」当たり８から１０の細胞が見出される。逆に、マイクロスフェアがコーティングされていない時、その中の５％のみが、表面に密着した細胞を有する。従って、フィブロネクチン様及びポリ−Ｄ−リジンの組み合わせによる微小粒子のコーティングは、そこに付着する細胞にとっては、必要不可欠である。この付着は、走査型電子顕微鏡の写真によって確認された（図２）。
【００５２】
４）試験管内での特徴付け
【００５３】
コーティングは、原子間力顕微鏡を特徴とし、かつこのコーティングが、粒子に対して均質に堆積し、かつその表面の多孔性を減少させることを示している。前述のコーティング条件で、コーティングの厚さは、２０ｎｍである。凍結乾燥後、コーティングは元のままに留まり、かつ試験管内の付着テストで、その付着及び分化効率を維持する。
【００５４】
前述の付着条件で、１．５×１０５の細胞が、ＭＰＡの存在下に置かれる時、平均して５×１０４の細胞が、各ＭＰＡに対して付着する。
【００５５】
実施例３：動物モデルに対するＭＰＡ  ＮＧＦ／ＰＣ１２の結果
【００５６】
ＭＰＡは、ＮＧＦを持続して、かつ制御されて放出する。実際、試験管内の放出の第１の動態結果は、カプセル化された２００μｇのＮＧＦに関して、１５％が、最初の２週間に連続して放出されることを示している。このように、０．５ｍｇのＭＰＡの埋め込みは、１日当たり５〜１０ｎｇのＮＧＦの放出に至らせ、これは、細胞に対するＮＧＦの作用に必要な量と一致する。
【００５７】
「パーキンソン病ラット」の除神経線条体中への埋め込み後、細胞ＰＣ１２は、微小粒子に対して良好に付着されたままでいる。輸送された細胞は、チロシンヒドロキシラーゼをなおも発現させ、かつそれ故にドーパミンを生成することが可能である。埋め込み後２週間で、微小粒子は、なおも分解されておらず、かつまだ細胞への担体として役立っている。実際、それらは、まだ球状であり、かつ液胞化の孔がなく、かなり平滑な外観を有している。一般的に、ＮＧＦを有する又は有さない微小粒子に付着した細胞は、線条体中で単独に移植された細胞に対して分化した外観を有する。これらの細胞を高倍率で観察すると、ＮＧＦを放出する微小粒子に対して、伸長部分は、より長く、細胞体の大きさのおよそ２〜３倍になることに気が付く（図２Ｂ）。行動レベルでは、アンフェタミンによって誘発される回転テストの第１の結果は、ＮＧＦを放出する微小粒子により細胞を受け取ったラットのみが、改善されたことを示している（図３）。結果の中で、ＮＧＦを放出しない微小粒子に付着した細胞ＰＣ１２は、増殖することを停止したように見える。
【００５８】
動物モデルに対する結果
【００５９】
「パーキンソン病」ラットの線状体中へのマイクロスフェアの埋め込みの２週間後に、ＮＧＦの活性部位を認識する抗体による免疫マーキングは、ＮＧＦが生物活性形状で、十分に放出されることを示している。２週間で、ＮＧＦはＭＰＡ中でなおも検出され、かつ周囲全体に、かつ少なくとも４０＿ｍの距離に対して均質的に放出される。ＮＧＦを放出するＰＡＭの周囲の幾つかの場所で、神経突起網が同じく観察され、細胞ＰＣ１２分化をこのように刺激する成長因子の放出を十分に証明している。
【００６０】
他の細胞系統のように細胞ＰＣ１２は、又は幹細胞さえも、埋め込み後に腫瘍を形成し得る。増殖マーカーは、ＰＡＭに付着した細胞ＰＣ１２の移植において、増殖する細胞数の減少があることを示している。この効果は、ＮＧＦを放出するＰＡＭにより、更に明らかである。
【００６１】
アポトーシスによる細胞死も、ＮＧＦを放出するか、放出しないＰＡＭに付着した細胞ＰＣ１２の移植において減少した。
【００６２】
行動レベルで、アンフェタミンによって誘発される回転テストは、ＮＧＦを放出するＰＡＭにより細胞を受けたラットのみが、改善され、このモデルでのＰＡＭの有効性を確認している。
【００６３】
実施例４：ドーパミン作動性胚性（Ｅ−ｄｏｐａ）細胞を輸送するＧＤＮＦを放出するＭＰＡの調製
【００６４】
最低１時間、毎分６回転の回転周期で、細胞による、ポリ−Ｄ−リジンによってコーティングされたＭＰＡのインキュベーション後に、Ｅ−ｄｏｐａ細胞は、７０％〜９０％のＭＰＡの表面に付着する。付着した細胞の数は、かなり可変であり、ＭＰＡ当たり５〜３０位の細胞である。
【００６５】
実施例５：抗腫瘍予防接種に関するＭＰＡの一般的な提示
【００６６】
抗腫瘍予防接種での我々の臨床実験並びに文献中で公にされた結果は、腫瘍細胞の培養は、このタイプのアプローチにおいて、限定的なステップであることを確認している。収率は低く、かつ必要な細胞数を得るための期間は、多くの場合腫瘍の進行速度と相容れない。自己細胞は現在、試験管内樹状細胞の装填用であろうと、皮下予防接種用であろうと、腫瘍特異抗原（ＡＳＴ）の最も適当な源のままであり、多数の腫瘍抗原及び樹状細胞へのアジュバントを有すること可能な、わずかな細胞から急速に調製され得る系を開発することは、有用である。
【００６７】
我々はそのために、薬理活性マイクロキャリア（ＭＰＡ）の概念に立脚し、ＩＮＳＥＲＭ  ＥＲＩＴ−Ｍ  ０１０４中で開発された生物人工粒子を作成する。（ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）又はＰＬＧＡのように）生体適合性かつ生分解性コポリマーから構成され、（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ１２又はＩＬ１８のような）炎症誘発性サイトカインのようにアジュバントを持続して、かつ制御されて放出し得る、直径（約）５〜３０μｍのマイクロスフェアのことである。その表面特性（合成細胞付着分子によるストリッピング）により、これらの微小粒子は、その表面に自己腫瘍細胞（膜小胞、アポトーシス体、エキソソーム、タンパク質抽出物、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）から調製された腫瘍抗原を担持し得る。
【００６８】
表面に腫瘍抗原を担持し、かつサイトカインのようにアジュバントを制御されて放出するこれらのＭＰＡは：
−（血液幹細胞から生じた樹状細胞による予防接種の範囲で）試験管内で樹状細胞と接触させられるためであるか、
−皮下、真皮内、又は筋肉内から患者の直接投与されるためである。
【００６９】
ＭＰＡの免疫原性質は、腫瘍抗原及びサイトカインの持続した放出の組み合わせのみにによるだけでなく、微小粒子系に対する抗原の提示にもよる。これは、樹状細胞による抗原の認識に理想的な提示方法である。この非特異的免疫刺激、又は微小粒子のアジュバントの役割は、久しい以前から証明されている、（メッシャー（Ｍｅｓｃｈｅｒ）及びロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）、１９９６年、メッシャー（Ｍｅｓｈｅｒ）及びサヴェリエヴァ（Ｓａｖｅｌｉｅｖａ）、１９９７年；ナカオカ（Ｎａｋａｏｋａ）ら、１９９５年、ロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）及びメッシャー（Ｍｅｓｃｈｅｒ）１９９２年、シャイヒャー（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ）ら、１９９５年ａ、１９９５年ｂ、ヴェンカタプラサド（Ｖｅｎｋａｔａｐｒａｓａｄ）ら、１９９９年）。
【００７０】
ＰＬＧＡのマイクロスフェアは、免疫刺激及び／又は抗腫瘍サイトカインを放出し得るとしてすでに記載され（ゴランベック（Ｇｏｌｕｍｂｅｋ）ら、１９９３年；マララッド（Ｍｕｌｌｅｒａｄ）ら、２０００年；ペティット（Ｐｅｔｔｉｔ）ら、１９９７年）、かつ我々は、抗腫瘍剤又は組み換えタンパク質を放出するマイクロスフェアを開発する、実験室における我々の能力をすでに示した（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９６年、１９９９年、２０００年；ペアン（Ｐｅａｎ）ら、２０００年）。
【００７１】
実施例６：抗膠腫予防接種において血漿膜を担持するＭＰＡ
【００７２】
（活性化サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦ無しで、又は有りで）使用されたＰＬＧＡのマイクロスフェアは、前記のような溶剤蒸発技術によって製造された（ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、１９９３年、ムネー（Ｍｅｎｅｉ）ら、９６年；ペアン（Ｐｅａｎ）ら、２０００年）。ろ過により、小さい寸法（直径５〜３０μｍ）のマイクロスフェアを選択することが可能になった。
【００７３】
細胞ＧＳ−９Ｌの外膜の精製は、３０ゲージの注射器中で、約５０回の通過を行って低張性緩衝液（ＫＣｌ  ４２ｍＭ、Ｈｅｐｅｓ  １０ｍＭ  ｐＨ７、ＭｇＣｌ２  ４．５ｍＭ及び１％のプロテアーゼ抑制因子）中に、４℃で、１５分間、１．５×１０８の細胞をインキュベートして実施された。このように破断した細胞は、ペレットに集められた非溶解細胞及び核から、上清中の膜を分離するために遠心分離された（２５０ｇ；１０分；４℃）。その場合、膜は超遠心分離ステップ（１０００００ｇ；９０分；４℃）後に回収された。それらは、次に４８時間前に、安定したポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）／デキストランＴ５００二相系中に置かれ、遠心分離される（３０００ｇ；１５分；４℃）。外膜は、その場合、２つの相の親和力によって二相系の中間相に配置される。回収後、０．２５Ｍのショ糖、１ＭのトリスＨＣｌ緩衝液中で２回の洗浄が行われた（１０００００ｇ；３０分；４℃）。膜は、その使用まで−８０℃で、この同じ緩衝液中で保存された。テストされた吸着及び作成手順の中で、最も有効であるように見えるものは、ｐＨ６．８のトリス緩衝液中で予めのコーティングなしに膜及びマイクロスフェアを直面させている。その他のタンパク質分画、膜小胞、アポトーシス体及びエキソソームの最適吸着手順は、仕上げの最中である。これらの手順は、共焦点顕微鏡の膜マーカーの直接免疫蛍光法によるＩ１２５によるタンパク質分画の放射マーキング（ｒａｄｉｏｍａｒｑｕａｇｅ）、次に吸着された構造の酵素力の分析によって有効にされる。
【００７４】
ＰＬＧＡのマイクロスフェアに対する細胞ＧＳ−９Ｌの外膜の吸着例：精製された外膜の調製は、膜小胞の凝集体の大きさを減少させるために３０秒間音波処理を受けた。１０μｇの膜タンパク質当量が、その場合２００００のＰＬＧＡマイクロスフェアの存在下に置かれる。集合を、４℃で一晩中、回転（６０ｔｐｍ）させた。
回収された膜タンパク質の量を決定するために、ローリーテストを実施する分量決定が、行われた。（０．２〜１μｇ／μＬの）ＢＳＡの基準範囲を使用して、試料のタンパク質濃度を計算することができた。精製開始時に（溶解の直後に）採取され、かつ細胞のタンパク質の集合を含む、初期アリコート（Ａｉ）と呼ばれるアリコートは、７０００〜１００００μｇ／μＬのタンパク質濃度を示した。それに反して、濃縮終了時には、２００〜３００μｇ／μＬのタンパク質濃度が得られる。従って我々は、タンパク質全体の３％を回収した。
【００７５】
単離タンパク質のプロフィールは、細胞溶解物の可溶性及び不溶性分画プロフィールの中間移動プロフィールを示すポリアクリルアミドのゲルに対する移動によって分析された。膜タンパク質を大部分含むのは、不溶性分画である。ウェスタンブロットによるＦａｓリガンド（Ｆａｓ−ｌｉｇｕａｎｔ）及び５’−ヌクレオチダーゼの特異活性の分量決定は、これらの膜タンパク質を濃縮する方向に向けられ、濃縮材料の膜の性質を示す。
共焦点顕微鏡の膜マーカー（５’−ヌクレオチダーゼ、インテグリン、ＩＣＡＭ−１）の直接免疫蛍光法は、微小粒子に対する膜タンパク質の固定を確認する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明のＭＰＡの略図である。
【図２Ａ】光学顕微鏡によって観察された、ＭＰＡに付着した細胞ＰＣ１２を示す。
【図２Ｂ】走査型電子顕微鏡によって観察された、ＭＰＡに付着した細胞ＰＣ１２を示す。
【図３】（ＮＧＦを放出する）ＭＰＡとの細胞ＰＣ１２、（ＮＧＦを放出しない）白色微小粒子との細胞ＰＣ１２、細胞ＰＣ１２単独の埋め込み前及び後の、又は専ら培地の注射後の様々なグループのラットのアンフェタミンによって誘発される回転行動を表すヒストグラムである。
【図４】本発明による抗腫瘍予防接種用のＭＰＡの略図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2005525407.tif 000009
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