(57)【要約】本発明は、一般に、それ自体で又は１つ以上の他のアミノ酸との相互作用の後にカラー助長性を示す、１つ以上のアミノ酸又は１つ以上のアミノ酸配列を有するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、及びそれをコードする核酸分子に関する。このようなペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は本明細書において“カラー助長分子”又は“CFMs”と呼ぶ。本発明はさらに、真核又は原核細胞及び特に真核細胞組織を遺伝的に修飾してその視覚的特徴を変化させるために、すなわち、外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に視覚的特徴を示す能力を変化させるために用いられる遺伝的構造体を提供する。したがって、本発明は、CMFsを生成するように遺伝的に修飾され、それにより外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に変化した視覚的特徴を示す真核又は原核細胞及び特に真核細胞組織に拡張される。ある特別な実施形態では、CMFsは植物の視覚的特徴を、さらに具体的には花の色を変えるために用いられる。別の実施形態では、本発明は、CMFsを含むバイオマトリクスという形のゲルやコーティングその他同様のバイオマテリアルであって、紫外線吸収体（UV sink）として、日焼け止めに、化粧品に使用されるもの、発現マーカー又はその他のリポーター分子として用いられるもの、又は光強度を強める光子トラップとして使用されるもの、を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において、単独で又は１つ以上の他の分子といっしょに、外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に視覚化されるときに前記細胞に変化した視覚的特徴を付与するカラー助長分子（CFM）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２】
該CFMが、Anemonia majano, Anemonia sulucata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp, (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera とAcropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea spから由来することを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
該CFMが、SVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸配列をそのN-末端に含むことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
該CFMが、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）、を含むリストから選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
該CFMが、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202を含むリストから選択されるアミノ酸配列を含む（ただし、前記アミノ酸配列が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない）、又は上記配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項３又は請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
カラー助長分子（CFM）をコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列がSEQ ID NOs:19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 及び201、又は上記配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するヌクレオチド配列、又は上記配列の１つ又はその相補的形態と低ストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズすることができる配列、を含むリストから選択されることを特徴とする請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
該細胞が原核細胞であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
該細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
該真核細胞が哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
該真核細胞が非哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
該真核細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
該植物細胞が植物カルス又は完全な植物の部分であることを特徴とする請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
該完全な植物が観賞植物又は顕花植物又はその一部であることを特徴とする請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
該植物の部分が花、根、葉、茎、種子、果実、又は繊維であることを特徴とする請求項１３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
該植物がバラ、カーネーション、リシアンサス、ペチュニア、ユリ、チューリップ、パンジー、ガーベラ、又はキクから選択されることを特徴とする請求項１３に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
該CFMがGFP又はその誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１７】
該GFPの相同体が非蛍光GFPであることを特徴とする請求項１６に記載の単離された核酸分子。
【請求項１８】
細胞において、単独で又は１つ以上の他の分子といっしょに、外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に視覚化されるときに前記細胞に変化した視覚的特徴を付与するポリペプチドを含む単離されたカラー助長分子（CFM）。
【請求項１９】
該CFMが、Anemonia majano, Anemonia sulucata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp, (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera とAcropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea spから由来することを特徴とする請求項１８に記載の単離されたCFM。
【請求項２０】
該CFMが、SVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸配列をそのN-末端に含むことを特徴とする請求項１９に記載の単離されたCFM。
【請求項２１】
該CFMが、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）、を含むリストから選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２０に記載の単離されたCFM。
【請求項２２】
該CFMが、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202を含むリストから選択されるアミノ酸配列（ただし、前記アミノ酸配列が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない）、又は上であげた配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項２１に記載の単離されたCFM。
【請求項２３】
該細胞が原核細胞であることを特徴とする請求項１８に記載の単離されたCFM。
【請求項２４】
該細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項１８に記載の単離されたCFM。
【請求項２５】
該真核細胞が哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求項２４に記載の単離されたCFM。
【請求項２６】
該真核細胞が非哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求項２４に記載の単離されたCFM。
【請求項２７】
該非哺乳類動物細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の単離されたCFM。
【請求項２８】
該植物細胞が植物カルス又は完全な植物の部分であることを特徴とする請求項２７に記載の単離されたCFM。
【請求項２９】
該完全な植物が観賞植物又は顕花植物又はその一部であることを特徴とする請求項２８に記載の単離されたCFM。
【請求項３０】
該植物の部分が花、根、葉、茎、種子、果実、又は繊維であることを特徴とする請求項２９に記載の単離されたCFM。
【請求項３１】
該植物がバラ、カーネーション、リシアンサス、ペチュニア、ユリ、チューリップ、パンジー、ガーベラ、又はキクから選択されることを特徴とする請求項２９に記載の単離されたCFM。
【請求項３２】
該CFMがGFP又はその誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項１８乃至３１のいずれか１項に記載の単離されたCFM。
【請求項３３】
該GFPの相同体が非蛍光GFPであることを特徴とする請求項３２に記載の単離されたCFM。
【請求項３４】
単離された細胞であって、単独で又は１つ以上の他の分子といっしょに外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に視覚化されるときに前記細胞に変化した視覚的特徴を付与するカラー助長分子（CFM）を産生できるように前記細胞又は親細胞が遺伝的に修飾されていることを特徴とする単離された細胞。
【請求項３５】
該CFMが、Anemonia majano, Anemonia sulucata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp, (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera とAcropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea spから由来することを特徴とする請求項３４に記載の単離された細胞。
【請求項３６】
該CFMが、SVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸配列をそのN-末端に含むことを特徴とする請求項３５に記載の単離された細胞。
【請求項３７】
該CFMが、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）、を含むリストから選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項３６に記載の単離された細胞。
【請求項３８】
該CFMが、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202を含むリストから選択されるアミノ酸配列（ただし、前記アミノ酸配列が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない）、又は上であげた配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項３６又は３７に記載の単離された細胞。
【請求項３９】
該細胞が原核細胞であることを特徴とする請求項３４に記載の単離された細胞。
【請求項４０】
該細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項３４に記載の単離された細胞。
【請求項４１】
該真核細胞が、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、ラマ、ウシ）又はその部分（例えば、羊毛、レザー）などからの哺乳類細胞であることを特徴とする請求項４０に記載の単離された細胞。
【請求項４２】
該真核細胞が、非哺乳類動物細胞（例えば、ダチョウ、エミュ、アヒル、ニワトリ、七面鳥、などの鳥類）であることを特徴とする請求項４０に記載の単離された細胞。
【請求項４３】
該真核細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項４０に記載の単離された細胞。
【請求項４４】
該細胞が植物カルス又は完全な植物の部分であることを特徴とする請求項４３に記載の単離された植物細胞。
【請求項４５】
該完全な植物が観賞植物又は顕花植物又はその一部であることを特徴とする請求項４４に記載の単離された植物細胞。
【請求項４６】
該植物の部分が花、根、葉、茎、種子、果実、又は繊維であることを特徴とする請求項４５に記載の単離された植物細胞。
【請求項４７】
該植物がバラ、カーネーション、リシアンサス、ペチュニア、ユリ、チューリップ、パンジー、ガーベラ、又はキクから選択されることを特徴とする請求項４５に記載の単離された植物細胞。
【請求項４８】
該CFMがGFP又はその誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項３４に記載の単離された細胞。
【請求項４９】
該GFPの相同体が非蛍光GFP相同体であることを特徴とする請求項４８に記載の単離された細胞。
【請求項５０】
植物又は植物の部分であって、該植物又は植物の部分が、単独で又は１つ以上の他の分子といっしょに外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に視覚化されるときに細胞に変化した視覚的特徴を付与するCFMを産生できるように遺伝的に修飾された細胞を含むことを特徴とする植物又は植物の部分。
【請求項５１】
該CFMが、Anemonia majano, Anemonia sulucata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp, (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera とAcropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea spから由来することを特徴とする請求項５０に記載の植物又は植物の部分。
【請求項５２】
該CFMが、SVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸配列をそのN-末端に含むことを特徴とする請求項５１に記載の植物又は植物の部分。
【請求項５３】
該CFMが、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）、を含むリストから選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５１に記載の植物又は植物の部分。
【請求項５４】
該CFMが、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202を含むリストから選択されるアミノ酸配列（ただし、前記アミノ酸配列が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない）、又は上であげた配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５３に記載の植物又は植物の部分。
【請求項５５】
該完全な植物が観賞植物又は顕花植物又はその一部であることを特徴とする請求項５０に記載の植物又は植物の部分。
【請求項５６】
該植物の部分が花、根、葉、茎、種子、果実、又は繊維であることを特徴とする請求項５５に記載の植物又は植物の部分。
【請求項５７】
該植物がバラ、カーネーション、リシアンサス、ペチュニア、ユリ、チューリップ、パンジー、ガーベラ、又はキクから選択されることを特徴とする請求項５５に記載の植物又は植物の部分。
【請求項５８】
該CFMがGFP又はその誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項５０に記載の植物又は植物の部分。
【請求項５９】
該GFPの相同体が非蛍光GFPであることを特徴とする請求項５８に記載の植物又は植物の部分。
【請求項６０】
請求項５０乃至５９のいずれか１項に記載の植物からの切り花。
【請求項６１】
請求項５０乃至５９のいずれか１項に記載の植物又は植物の部分からの抽出物。
【請求項６２】
該抽出物が、芳香剤又は食品添加物、飲料又はジュース、又は着色剤であることを特徴とする請求項６１に記載の抽出物。
【請求項６３】
請求項５０乃至５４、５８又は５９のいずれか１項に記載の植物からの分離されたアサ材料。  
【請求項６４】
請求項５０乃至５４、５８又は５９のいずれか１項に記載の植物からの木綿。
【請求項６５】
請求項１８乃至３３のいずれか１項に記載のCFMを含む組成物。
【請求項６６】
遺伝子導入植物又は植物の部分を生成する方法であって、前記植物又は植物の部分が、単独で又は１つ以上の他の分子と組み合わされて、外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に視覚化されたときに細胞に変化した視覚的特徴を付与するCFMを産生できるように遺伝的に修飾された細胞を含み、前記方法が、SEQ ID NOs:19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 1456, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 及び201を含むリストから選択されるヌクレオチド配列、又は上記配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するヌクレオチド配列、又は上記配列又はその相補的な形態の１つと低ストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、を含む単離された核酸分子を前記細胞に導入するステップ、及びそれから遺伝子導入植物を再生するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項６７】
該CFMが、Anemonia majano, Anemonia sulucata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp, (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera とAcropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea spから由来することを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
該CFMが、SVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸配列をそのN-末端に含むことを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
該CFMが、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）、を含むリストから選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
該CFMが、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202を含むリストから選択されるアミノ酸配列（ただし、前記アミノ酸配列が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない）、又は上記配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するアミノ酸配列、を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
該植物部分が植物カルスであることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
該植物部分が花、根、葉、茎、種子、果実、又は繊維であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
該植物が観賞植物又は顕花植物又はその一部であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
該植物がバラ、カーネーション、リシアンサス、ペチュニア、ユリ、チューリップ、パンジー、ガーベラ、又はキクから選択されることを特徴とする請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
該CFMがGFP又はその誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項７６】
該GFPの相同体が非蛍光GFPであることを特徴とする請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
あるCFMに対して特異的である単離された抗体であって、前記CFMがSVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸配列をそのN-末端に含むことを特徴とする単離された抗体。
【請求項７８】
該CFMが、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及び／又はSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）、を含むリストから選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項７７に記載の単離された抗体。
【請求項７９】
該CFMが、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び／又は202を含むリストから選択されるアミノ酸配列、又は上であげた配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するアミノ酸配列、を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項７７又は７８に記載の単離された抗体。
【請求項８０】
あるCFMを含むバイオマトリックスであって、前記CFMが、細胞において、単独で又は１つ以上の他の分子といっしょに、外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に視覚化されるときに前記細胞に変化した視覚的特徴を付与するポリペプチドを含むことを特徴とするバイオマトリックス。
【請求項８１】
該CFMが、Anemonia majano, Anemonia sulucata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp, (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera とAcropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea spから由来することを特徴とする請求項８０に記載のバイオマトリックス。
【請求項８２】
該CFMが、SVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸配列をそのN-末端に含むことを特徴とする請求項８１に記載のバイオマトリックス。
【請求項８３】
該CFMが、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）、を含むリストから選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項８２に記載のバイオマトリックス。
【請求項８４】
該CFMが、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202を含むリストから選択されるアミノ酸配列（ただし、前記アミノ酸配列が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない）、又は上であげた配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するアミノ酸配列、を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項８３に記載のバイオマトリックス。
【請求項８５】
該細胞が原核細胞であることを特徴とする請求項８０に記載のバイオマトリックス。
【請求項８６】
該細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項８０に記載のバイオマトリックス。
【請求項８７】
該真核細胞が哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求項８６に記載のバイオマトリックス。
【請求項８８】
該真核細胞が非哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求項８６に記載のバイオマトリックス。
【請求項８９】
該非哺乳類動物細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項８８に記載のバイオマトリックス。
【請求項９０】
該植物細胞が植物カルス又は完全な植物の部分であることを特徴とする請求項８９に記載のバイオマトリックス。
【請求項９１】
該完全な植物が観賞植物又は顕花植物又はその一部であることを特徴とする請求項９０に記載のバイオマトリックス。
【請求項９２】
該植物部分が花、根、葉、茎、種子、果実、又は繊維であることを特徴とする請求項９１に記載のバイオマトリックス。
【請求項９３】
該植物がバラ、カーネーション、リシアンサス、ペチュニア、ユリ、チューリップ、パンジー、ガーベラ、又はキクから選択されることを特徴とする請求項９１に記載のバイオマトリックス。
【請求項９４】
該CFMがGFP又はその誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項８０乃至９３のいずれか１項に記載のバイオマトリックス。
【請求項９５】
該GFPの相同体が非蛍光GFP相同体であることを特徴とする請求項９４に記載のバイオマトリックス。
【請求項９６】
前記バイオマトリックスが日焼け止めであることを特徴とする請求項８０乃至９５のいずれか１項に記載のバイオマトリックス。
【請求項９７】
前記バイオマトリックスが化粧品であることを特徴とする請求項８０乃至９５のいずれか１項に記載のバイオマトリックス。
【請求項９８】
前記バイオマトリックスが光フィルター組成物であることを特徴とする請求項８０乃至９５のいずれか１項に記載のバイオマトリックス。
【請求項９９】
前記バイオマトリックスが光子トラップであることを特徴とする請求項８０乃至９５のいずれか１項に記載のバイオマトリックス。
【請求項１００】
前記バイオマトリックスがレポーター分子であることを特徴とする請求項８０乃至９５のいずれか１項に記載のバイオマトリックス。
【請求項１０１】
CFMの存在をスクリーニングするステップを含む診断的分析法であって、前記CFMをコードする核酸分子が細胞で発現されることを特徴とする診断的分析法。
【請求項１０２】
前記核酸分子が、SVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸配列をそのN-末端に有するポリペプチドを含むCFMをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１０１に記載の診断的分析法。
【請求項１０３】
前記核酸分子が、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）を含むリストから選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むCFMをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１０２に記載の診断的分析法。
【請求項１０４】
前記核酸分子が、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202を含むリストから選択されるアミノ酸配列（ただし、前記アミノ酸配列が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない）、又は上であげた配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するアミノ酸配列、を有するポリペプチドを含むCFMをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１０３に記載の診断的分析法。
【請求項１０５】
前記核酸分子が、SEQ ID NOs:19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 1456, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 及び201を含むリストから選択されるヌクレオチド配列、又は上記配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するヌクレオチド配列、又は上記配列又はその相補的な形態の１つと低ストリンジェンシー条件の下でハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、を含むことを特徴とする請求項１０１乃至１０４のいずれか１項に記載の診断的分析法。
【請求項１０６】
該CFMが、SVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸配列をそのN-末端に含むことを特徴とする請求項１０１に記載の診断的分析法。
【請求項１０７】
該CFMが、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）を含むリストから選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１０１に記載の診断的分析法。
【請求項１０８】
該CFMが、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202を含むリストから選択されるアミノ酸配列（ただし、前記アミノ酸配列が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない）、又は上記配列の１つ以上と少なくとも60%の類似度を有するアミノ酸配列、を含むことを特徴とする請求項１０７に記載の診断的分析法。
【請求項１０９】
細胞において、単独で又は１つ以上の他の分子と一緒に、外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に視覚化されるときに前記細胞に変化した視覚的特徴を付与するCFMをコードする核酸分子の、前記CFMを産生する細胞の製造における利用。
【請求項１１０】
該細胞が原核細胞であることを特徴とする請求項１０９に記載のCFMの利用。
【請求項１１１】
該細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項１０９に記載のCFMの利用。
【請求項１１２】
該真核細胞が哺乳類動物細胞であることを特徴とする請求項１１１に記載のCFMの利用。
【請求項１１３】
該真核細胞が非哺乳類細胞であることを特徴とする請求項１１１に記載のCFMの利用。
【請求項１１４】
該非哺乳類細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項１１３に記載のCFMの利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、それ自体で又は１つ以上の他のアミノ酸との相互作用の後にカラー助長性を示す、１つ以上のアミノ酸又は１つ以上のアミノ酸配列を有するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、及びそれをコードする核酸分子に関する。このようなペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は本明細書において“カラー助長分子”又は“CFMs”と呼ぶ。本発明はさらに、真核又は原核細胞及び特に真核細胞組織を遺伝的に修飾してその視覚的特徴を変化させる、すなわち、外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼にそれを示す能力を変化させるのに用いられる遺伝的構造体を提供する。したがって、本発明は、CMFsを生成するように遺伝的に修飾され、それによって外部からの非白色光又は粒子放出による励起の不在下でヒトの肉眼に変化した視覚的特徴を示す真核又は原核細胞及び特に真核細胞組織に拡張される。ある特別な実施形態では、CMFsは植物の視覚的特徴を、そしてさらに具体的には花の色を変えるために用いられる。別の実施形態では、本発明は、CMFs を含むバイオマトリクスという形のゲルやコーティングその他同様のバイオマテリアルであって、紫外線吸収体（UV sink）として、日焼け止めに、化粧品に使用されるもの、発現マーカー又はその他のリポーター分子として用いられるもの、又は光強度を強める光子トラップとして使用されるもの、を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における何らかの従来技術への言及は、この従来技術がオーストラリア又は他の国で普通の一般的な知識の一部になっていることを認めたり、何らかの形で示唆したりするものではなく、そのように解釈してはならない。
【０００３】
全タンパク質発色基（色素）はCnidaria門（腔腸動物とも呼ばれる）から単離された。この門は次の４つの綱：すなわち、Scyphozoa、Cubozoa、Anthozoa、及びHydrozoa、を含む。単離された最初の全タンパク質発色基、Green Fluorescent Protein (GFP)、は、普通にクラゲと呼ばれるHydrozoa, Aequorea victoria, のcDNAからクローニングされ配列が決定された。
【０００４】
同様の全タンパク質発色基は、Anthozoansから単離されている。Matz et al. (Nature Biotechnol. 17: 969-973,1999)は、Aequorea victoria GFPヌクレオチド配列に基づく退化したプライマーを用いてAnthozoaの５つの目のうち４つ：Stolonifera, Actiniaria, Zoanthidea, 及びCorallimorphariaから単離されたcDNAをPCR増幅した。Lukyanov et al. (Journal of Biological Chemistry 275: 25879-25882, 2000)は、同じ方法を用いてActiniariaから非蛍光全タンパク質発色基を単離した。しかし、使用された方法は５番目の目、Scleractinia、から全タンパク質発色基を単離することができなかった。
【０００５】
Scleractiniaはサンゴ礁の構造を形成するサンゴである。これは別に“真の”又は“礁形成”サンゴとして知られている。国際特許No. WO 00/46233及びDove et al. (Coral Reefs 19: 197-204, 2000)は、どちらも、サンゴ組織からのScleractinia色素から得られる全タンパク質発色基の単離に関する（PPCT）。
【０００６】
これまでに単離された全タンパク質発色基は、特定の環境において見かけの色を発現する一連のスペクトル性質を示す。色は、分子の吸収及び／又は蛍光性質ならびに入射光の質によって決定される。スペクトル性質は、吸収、励起及び発光エネルギー、モル吸光係数、量子収率、及び成熟パラメータを含む。多くの場合、単純なアミノ酸置換がポリペプチドのスペクトル・パラメータに劇的な効果を生ずる（例えば、Tsien, Ann. Rev. Biochem. 67: 509, 1998; Lukyanov et al., 2000, 前出）。しかし、ある特定分子の有用な修飾は限られており、全タンパク質発色基の定方向及びランダム突然変異では所望のスペクトル特徴を生成することができていない（Tsien, 1998, 前出）。その結果、異なる源から単離された全タンパク質発色基が特定の応用範囲を見出す形になっている。
【０００７】
最初は分子マーカーとして用いられた１つの全タンパク質発色基はGFPである。このタンパク質はUV又は青色光で励起されると（最大は396 nm 又は475 nmにある）、緑色の蛍光を放出する（最大は500 nm にある）[Heim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12501-12504, 1994]。 最大励起又は放出特性が変化したGFP変異体がランダム突然変異によって生成されている（Crameri et al., Nature Biotechnology 14: 315-319, 1996）。その他に溶解度や蛍光を増強したGFP変異体が生成されている（Davis and Vierstra, Arabidopsis thalianaに使用される緑色蛍光タンパク質（GFP）の可溶誘導体、Weed of the World, International Electronic Arabidopsis Newsletter ISBN 1358-6912,(Ed. Mary Anderson) vol 3ii,1996）。GFP とその変異体の蛍光は、研究のための植物やその他の生物の生物学的サンプルの非侵襲的な分析とモニターのために利用されている（Haseloff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2122-2127, 1997; Hu and Cheng, FEBS Letters 369: 331-334, 1995; Wang and Hazelrigg, Nature 369: 400-403, 1994）。これらの蛍光GFPs、特定の波長の光で励起されると見えるようになる蛍光マーカー色素としての変異体や相同体、の利用は広く文書で公開されている（例えば、米国特許Nos. 6,027,881 and 5,958, 713; 日本特許No. 11266883; 国際特許No. WO 97/11094; 米国特許No. 5,625,048; 国際特許出願No. PCT/US99/29472; 及び国際特許No. PCT/AU00/00056）。
【０００８】
他の蛍光タンパク質と異なり、GFPの蛍光は分子内でのアミノ酸の相互作用、一般に折り畳まれた後の相互作用、による。Ser-Tyr-Glyという隣接する蛍光体を規定するアミノ酸配列は折り畳まれると変性して伸ばされた芳香族システムを生成し、それが成熟したタンパク質に特徴的な緑色の蛍光を付与する（Cody et al., Biochemistry 32: 1212-1218, 1993; Ormoe et al., Science 273: 1392-1395, 1996; Yang et al., Nature Biotechnol. 14: 1246-1251, 1996）。上述したように、非生物発光Anthozoa種でGFP様の分子が同定されており（Matz et al., 1999, 前出）、GFP様タンパク質が必ずしも生物発光システムの成分ではないが、動物における蛍光着色を決定するという証拠を提供している（Lukyanov et al., 2000, 前出）。その他の弱い蛍光のGFP相同体がAcropora formosa及びAcropora digitiferaから同定されている（Dove et al., Biol. Bull. 189: 288-297, 1995; Hoegh-Guldberg and Dove, 2000, 前出; Saligh et al., Nature 408: 850-853, 2000）。
【０００９】
全タンパク質発色基は現在、生化学、分子及び細胞生物学の分野でポリペプチドの発現と局在化をモニターするための分子マーカーとして応用されている。
【００１０】
本発明は、以下で、新しい全タンパク質発色基（又はCFMs）とその新しい有益な応用を記述する。
【００１１】
例えば、花卉産業は、顕花植物の新しい異なる変種を、特に花の色の操作によって開発しようと努力している。ほとんどの商業的な花の品種で古典的な育種方法を用いて広範な色彩を生み出すことである程度の成功が収められているが、このアプローチにはある特定種の遺伝子プールの制約による限界がある。このため、ある単一の種の色彩品種が全スペクトルにわたることは稀である。例えば、バラ、キク、チューリップ、ユリ、カーネーション、及びガーベラなどの主要な切花品種の青色変種の開発は困難であり、それができれば切り花市場や観賞植物市場における大きな好機となる。
【００１２】
花の色は、主に３つのタイプの色素；フラボノイド、カロチノイド、及びベタレイン（betalain）、による。この３つのうち、フラボノイドが最も普通に見られ、黄色から赤そして青までの一連の色の原因になっている。花の色の主要な原因になっているフラボノイド分子はアントシアニンであり、これはシアニジン、デルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジン、及びペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であり、液胞に局在する。カロチノイドは、花と果物に黄色、オレンジ及び赤色を付与する天然色素である。植物では、これらの色素は、花、葉、果実、及び根の有色体に局在する。
【００１３】
観賞植物及び顕花植物の種における新しい色はアントシアニン経路を変更させて新しいアントシアニンやオーロンを生成すること（Davies et al., Plant Journal 13: 259-266, 1998）及びアントシアニンと補色素の比率を変えること（Holton et al., Plant Journal 4: 1003-1010, 1993）によって生み出される。あるいはまた、カロチノイドの生合成経路を変更させて新しい花の色を生み出すこともできる（Mann et al., Nature Biotech. 18: 888-892, 2000）。また、アントシアニン産生レベルを、非相同アントシアニン経路調節因子の発現によって増加させることもできる（例えば、Borevitz et al., Plant Cell 12: 2383-2393, 2000, を見よ）。
【００１４】
これらのアプローチを用いてある程度の成功を収めているが、それは限定されたものであり、別の新しいアプローチが常に探求されている。
【００１５】
本発明に導いた研究で、本発明者らは、特に、新しいカラー助長分子（CFMs）を同定し、それを用いて真核細胞又は原核細胞に、外部の非白色光又は粒子放出による励起なしにヒトの眼に見える色を付与するCFMsをコードする遺伝物質を導入することによって真核生物又は原核生物の視覚的特徴を修飾しようと試みた。ある好ましい実施の形態では、CFMsはGFPsなどのタンパク質又はその同類、例えば非蛍光GFP-相同体、である。CFMsを用いて植物の色又は花や種子などの植物の部分の色を変化させることは、変化した色彩特性を有する植物品種を開発するための新しいアプローチである。CFMsに関してここで考えている他の用途としては、発現マーカーとして、又は一般的なリポーター分子としての利用、光子トラップ、紫外線吸収体、としての利用、日焼け止め又は化粧品における利用が考えられ、あるいはゲル・マトリックスに埋め込んで見えにくい光をもっと見やすい波長に変換するために用いることもできる。このような組成物はすべて“バイオマトリックス”という用語に包含される。
【発明の開示】
【００１６】
発明の要約
本明細書の全体にわたって、文脈によって別に規定される場合を除き、“含む”という語、又はそのバリエーションである“含んで成る”、はある明記された要素又は整数、又は要素又は整数のグループ、を包含することを意味するが、他の要素又は整数、又は要素又は整数のグループ、を排除することを意味しないと理解される。
【００１７】
ヌクレオチドとアミノ酸配列は配列同定ナンバー（SEQ ID NO:）によって呼ばれる。SEQ ID NO:は数値的に配列識別子（identifier）〈400〉1, 〈400〉2, 等に対応する。配列リストは特許請求の範囲の後に示される。
【００１８】
本発明は、それ自体で又は１つ以上の他のアミノ酸との相互作用の後にカラー助長性を示す１つ以上のアミノ酸又は１つ以上のアミノ酸配列を有するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、ならびにそれをコードする核酸分子、を提供する。好ましくは、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質、又はそれらの核酸分子は、Anemonia majano, Anemonia sulucata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp, (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera and Acropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea spの１つ以上から誘導されるものである。これらのペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、“カラー助長分子（CFMs）”と呼ばれ、単離された形であっても、細胞内又は上で生成されても、又はバイオマトリックスの一部を成していてもよい。
【００１９】
したがって、本発明のある様態では、細胞内で、単独で又は１つ以上の他の分子と一緒に、外部の非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されるときの前記細胞の視覚的特徴を変化させるカラー助長分子（CFM）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が提供される。
【００２０】
本発明は、また、細胞内で、単独で又は１つ以上の他の分子と一緒に、外部の非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されるときの前記細胞の視覚的特徴を変化させるポリペプチドを含む単離されたCFMを提供する。
【００２１】
好ましいCFMは、SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 又は9に示されたポリペプチドのアミノ末端を含む。
【００２２】
特に好ましいCFMsは、SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 又は18から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
さらに好ましくは、CFM は、SEQ ID NOs: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 及び201 のいずれかに示されたヌクレオチド配列によって、又は上記配列の１つ又は低ストリンジェンシー条件でのその相補形態とハイブリダイズできるヌクレオチド配列、又は上記配列のいずれかと少なくとも約60% の類似性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２４】
上記ヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列は、SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202、ならびに上記配列のいずれかと少なくとも約60% の類似性を有するアミノ酸配列に対応する。
【００２５】
CFMは単離された形であってもバイオマトリックスの一部であってもよく、バイオマトリックスには細胞、固体支持体、ゲル、又はバイオインストルメント（bioinstrument）が含まれる。CFMsは、変化した視覚的特徴を示す真核細胞又は原核細胞を生成するのに、また日焼け止め、紫外線トラップ、光子トラップ、及び発光増強体の形のバイオマスを生成するのに特に有用である。
【００２６】
特に好ましい実施の形態では、本発明は、変化した視覚的特徴を示す遺伝子導入植物及び花、根、葉、茎、果実、及び繊維を含むその部分を提供する。
【００２７】
本明細書の全体にわたって用いられる配列識別子のまとめを表１に示す。
【００２８】
表１
配列識別子のまとめ
【００２９】
【表１】
2005518182.tif 000002
【００３０】
【表２】
2005518182.tif 000003
【００３１】
【表３】
2005518182.tif 000004
【００３２】
【表４】
2005518182.tif 000005
【００３３】
【表５】
2005518182.tif 000006
【００３４】
【表６】
2005518182.tif 000007
【００３５】
【表７】
2005518182.tif 000008
【００３６】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、それ自体で又は１つ以上の他のアミノ酸との相互作用の後にカラー助長性を示す１つ以上のアミノ酸又は１つ以上のアミノ酸配列を有するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、及びそれをコードする核酸分子、の同定に基づいている。このようなペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は本明細書において“カラー助長分子”又は“CFMs”と呼ぶ。本発明は、CFMsの一連の利用を、カラー表現マーカー及びカラー増強剤としての利用、ならびに光子トラップとしてのゲル状調合物の形、及び局所塗布される日焼け止めなどの光フィルタ調合物としての利用、を意図している。
【００３７】
本発明はさらに、CFMsをコードする遺伝物質の利用も意図しており、CFMsの存在下で、外部からの非白色光又は粒子放出によるCFMsの励起なしでヒトの眼に対する視覚的特徴が変化した真核細胞又は原核細胞又は真核又は原核細胞組織を生成することを意図している。
【００３８】
このような変化した視覚的特徴は、また、裸の、助けなしの眼に対して変化したとも言われる。“裸の”又は“助けなしの”という言及は、眼が眼鏡や拡大鏡などの形の拡大補助を必要としないということを意味しない。外部からの光又は粒子放出への言及は、紫外（UV）光、青いレーザー光、プラズマ照射、γ-照射、粒子照射、340 nm, 382 nm, 396 nm, 405 nm, 475 nm, 490 nm, 575 nmなどの単一波長光、又はその他の形の放出又は粒子による打撃、などを含む。それは白色光を含まない。
【００３９】
したがって、本発明の１つの様態で本発明は、細胞内で、外部からの非白色光又は粒子放出によるCFMsの励起なしでヒトの眼に視覚化されるときに細胞に変化した視覚的特徴を与えるカラー助長分子（CFM）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【００４０】
好ましくは、この核酸分子はAnemonia majano, Anemonia sulcata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera and Acropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea sp から導出される。
【００４１】
ある好ましい実施の形態では、この核酸分子は、SVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されたアミノ酸をN-末端領域にもつCFMをコードする。もっと具体的に言うと、CFMは、SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)（ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい）、から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００４２】
ある特別な実施の形態では、本発明は、CFM又はその断片、変異体又は誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、前記単離された核酸分子がSEQ ID NOs:19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 1456, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 及び201,又は生物学的に活性なこれらの断片又は誘導体、から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
特に好ましい核酸分子は、SEQ ID NOs:189, 191, 193, 195, 197, 199 及び201で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
核酸分子は遺伝物質と考えられ、一般にCFMをコードするコーディング領域を任意に単一又は複数のプロモーターと効果的に結合された形で含む。ある実施の形態では、核酸分子は単一プロモーターのコントロール下にある（すなわち、それと効果的に結合した）遺伝的構造体（genetic construct）である。別の実施の形態では、この遺伝的構造体は、CFMをコードする遺伝子とレポーター分子をコードするものなど他の遺伝子を任意に含む２−シストロン、３−シストロン、又は多シストロン構造体である。
【００４５】
本明細書で用いる場合、“遺伝物質”を含む“核酸分子”という用語は、少なくとも、特にDNA（cDNA又はゲノムDNA）、RNA、mRNA、又はtRNA、を含むデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸などの一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。このような分子と合成手段又は天然の源から生ずる非ヌクレオチド置換基との組合せも本発明によって考えられる。遺伝物質は、また、特定のホスト細胞におけるコドンの発現のために最適化された配列も含む。
【００４６】
本発明は核酸分子の誘導体にも拡張され、そのような誘導体としては、本明細書において何らかの実施の形態に係わって記載されるような遺伝配列から誘導される少なくとも10,好ましくは少なくとも20,の隣接するヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる。誘導体は、一部、断片、部分、又は類似体を含む。誘導体は、また、CFMsをコードする２つ以上の遺伝配列の融合分子も含む。
【００４７】
本発明は、また、核酸分子の類似体を含む。“類似体”とは、本明細書において何らかの実施の形態に係わって記載されるような本発明の核酸分子又はその相補的なヌクレオチド配列と実質的に同じである単離された核酸分子を意味し、前記単離された核酸分子に通常存在しない非ヌクレオチド成分、例えば炭化水素、放射性核種を含む放射性物質、リポーター分子、例えば、それだけに限定されないが、特にアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、などが見られても実質的に同じであればよい。“相同体”とは、異なる種又は系統からの機能的に同様な分子を意味する。
【００４８】
一般に、本発明の核酸分子の類似体や誘導体は、合成手段によって生成されるか、又は天然に見られる源から得られる。例えば、本発明のヌクレオチド配列から、突然変異によって単一の又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、及び／又は挿入を生ずることができる。誘導体は、ある特定の細胞におけるコドンの利用を最適化するため又は増強するために修飾されたヌクレオチド配列を包含する。
【００４９】
本発明の遺伝的配列は、以下の１つ以上を含むヌクレオチド配列を含む又はそれと相補的であってもよい：すなわち、プロモーター配列、5'非コーディング領域、cis-調節領域、例えば、転写調節タンパク質又は翻訳調節タンパク質の機能的結合部位、上流アクチベーター配列、エンハンサー・エレメント、サイレンサー・エレメント、TATAボックス・モチーフ、CCAATボックス・モチーフ、上流オープン・リーディング・フレーム、転写開始部位、翻訳開始部位、及び／又はリーダー配列をコードするヌクレオチド配列。遺伝的配列はまた、CFMもコードする。
【００５０】
用語“5'-非コーディング領域” は、本明細書ではその最も広い意味で用いられ、ある発現可能な遺伝子の上流領域から得られるヌクレオチド配列であって、前記遺伝子のポリペプチド産物を含むアミノ酸残基をコードする配列以外の全てのヌクレオチド配列を含み、5'-非コーディング領域はその遺伝子の発現を可能にする又は活性化する又はその他の仕方で助長する。
【００５１】
核酸分子はまた、遺伝子と見られる。“遺伝子”という用語は、その最も広い意味で用いられ、その遺伝子に対応するゲノムDNA領域、ならびにエクソンに対応するcDNA配列、又はある産物の機能的形態をコードする様に組み換えられた分子、を含む。“遺伝子”という用語は、その最も広い意味で用いられ、ある遺伝子のエクソンに対応するcDNAを含む。したがって、本明細書における“遺伝子” への言及は以下のものを含むと解すべきである：
（ｉ）古典的なゲノム遺伝子、転写及び／又は翻訳調節配列及び／又はコーディング領域及び／又は非翻訳配列（すなわち、イントロン、5'-及び3'-非翻訳配列）、又は
（ii）遺伝子のコーディング領域（すなわち、エクソン）及び5'-及び3'-非翻訳配列に対応するmRNA又はcDNA。
【００５２】
“遺伝子”という用語は、また、ある機能的産物の全部又は一部をコードする合成又は融合分子を記述するためにも用いられる。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、“cis-作用配列”又は“cis-調節領域”又は同様の用語は、発現可能な遺伝的配列から導出されるヌクレオチド配列であって、最初の遺伝的配列の発現が、少なくとも部分的に、前記ヌクレオチド配列によって調節されるもの、を意味すると解される。cis-調節領域が、構造遺伝子配列の発現レベル及び／又は細胞タイプ特異性及び／又は発生特異性を、活性化、サイレンス、エンハンス、抑制、その他何らかの仕方で変化させることができることは当業者には公知であろう。
【００５４】
本明細書における“プロモーター”への言及はその最も広い意味で理解するべきであり、発生及び／又は環境刺激に応じて、又は組織特異的又は細胞特異的な仕方で遺伝子発現を変化させる、CCAATボックス配列及び付加的な調節エレメント（すなわち、上流の活性化配列、エンハンサー、及びサイレンサー）を含む又は含まない、正確な転写開始のために必要なTATAボックスを含む、古典的なゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。プロモーターは、通常、必ずではないが、その発現を調節しているある構造遺伝子の上流側又は5'-側に位置している。さらに、プロモーターを含む調節エレメントは、通常、その遺伝子の転写の開始部位から2 kb以内に位置している。
【００５５】
本明細書では、“プロモーター”という用語は、また、植物細胞におけるある構造遺伝子又はその他の核酸分子の発現を可能にする、活性化する、又は増強する合成又は融合分子又は誘導体を記述するためにも用いられる。本発明による好ましいプロモーターは、ある細胞における発現をさらに増強するための、及び／又は操作的に結合されている構造遺伝子の発現の時期を変えるための１つ以上の特異的調節エレメントの付加的コピーを含む。
【００５６】
ある好ましい実施の形態では、核酸分子はある細胞で発現される。細胞は真核細胞又は原核細胞である。真核細胞への言及は、哺乳類動物細胞、非哺乳類動物細胞、又は植物細胞を含む。真核細胞が植物細胞である場合、その植物細胞は植物カルスの一部であるか、又は完全な植物である。“植物”への言及は、観賞植物又は顕花植物又はそれらの部分、例えば、花、根、葉、茎、種子、果実又は繊維を含む。特に好ましい植物細胞は、バラ、カーネーション、lisianthus、ペチュニア、ユリ、チューリップ、パンジー、ガーベラ、又はキクから選択されるものである。
【００５７】
CFMは、好ましくは、GFP 又はその誘導体又は相同体、例えば、非蛍光GFP相同体である。
【００５８】
本発明の別の様態は、細胞において、単独で又は１つ以上の他の分子と一緒に、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されたときにその細胞に変化した視覚的特徴を付与する単離されたカラー助長分子（CFM）を提供する。
【００５９】
本発明のCFMは、好ましくは、アミノ酸のある配列を含むタンパク質であって、折り畳まれたときに、その配列が単独で、又は同じ分子内部又は別の分子、例えばダイマー、トリマー、又はオリゴマー、の１つ以上の他のアミノ酸との相互作用の後に発色基又は蛍光基の性質を示すものである。特に有用なタンパク質は、隣接するアミノ酸配列Gln-Tyr-Gly (QYG)を含む。さらに好ましくは、タンパク質はGFP 又はその相同体又は誘導体である。GFPの相同体の一例は非蛍光GFP相同体である。GFPの誘導体又は非蛍光GFP相同体の一例は、励起又は放出ピークの比を変化させるように修飾されたGFPである。このような修飾は、蛍光を強めたり、蛍光の変化や弱められた蛍光を生ずる。
【００６０】
任意の数のGFP又は非蛍光GFP相同体又は他の誘導体を、本発明にしたがってCFMsとして用いることができる。そのような分子の例は、Anemonia majano, Anemonia sulcata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera and Acropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea sp からのものである。
【００６１】
本発明のCFMsを構成する特に好ましいタンパク質配列は、ポリペプチドのアミノ末端に次のアミノ酸配列のいずれかを含む：“SVIAK” (SEQ ID NO:5)、“(M)SVIAT” (SEQ ID NO:6)、“SGIAT” (SEQ ID NO:7)、“SVIVT” (SEQ ID NO:8)、又は“SVSAT” (SEQ ID NO:9)。
【００６２】
そのような好ましいタンパク質配列の例は以下のものから成る群から選択できる：
SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10)
SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11)
SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12)
SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13)
SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14)
SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15)
SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16)
SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及び
SVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)、
ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい。
【００６３】
したがって、本発明の別の様態では、単離されたポリペプチド、又は生物的に活性なその断片、又はそれらの変異体又は誘導体であって、前記ポリペプチドがSEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むものが提供される、ただし、SEQ ID NO:18の単離されたポリペプチド、又は生物的に活性なその断片、又はそれらの変異体又は誘導体において、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない。
【００６４】
特に適当な分子は、SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６５】
したがって、本発明の好ましい実施の形態は、単離されたポリペプチド、又は生物的に活性なその断片、又はそれらの変異体又は誘導体であって、前記ポリペプチドがSEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むものを提供する、ただし前記生物的に活性なその断片、又はそれらの変異体又は誘導体が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない。
【００６６】
そのような単離されたポリペプチドは、真核細胞又は原核細胞又は植物組織又は植物カルスの形の植物細胞などの真核細胞又は原核細胞のグループに存在するとき、単独で又は１つ以上の他の分子と一緒に、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されたときにその細胞に変化した視覚的特徴を付与する。
【００６７】
したがって、本発明の別の様態は、真核細胞又は原核細胞又は組織の形の真核細胞又は原核細胞のグループであって、前記細胞又は細胞のグループ又はそれらの親細胞が、単独で又は１つ以上の他の分子と一緒に、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されたときにその細胞又は細胞グループに変化した視覚的特徴を付与するカラー助長分子（CFM）の産生が可能となるように遺伝的に修飾されているものを提供する。
【００６８】
CFMはここで定義されるようなものであり、好ましい実施の形態では、SEQ ID NO:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202を含むリストから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ただし、そのアミノ酸配列が配列SVIAK QMTY X1X2YX3 SGTを含む場合、X1はリシンでなく、X2はバリンでなく、X3はメチオニンでない。
【００６９】
“真核”細胞とは、“原核”細胞として表されない細胞と考えられる。特に有用な真核細胞は、植物細胞、及びカビと酵母である。しかし、その他の真核細胞も、例えば哺乳類細胞や非哺乳類動物細胞、例えば昆虫細胞、も植物細胞と同様に考えられる。“植物”とは単子葉又は双子葉植物と考えられ、観賞植物及び作物植物を含む。“組織”への言及は植物カルスを含む。“原核細胞”とは一般に核膜に囲まれていない核を含む細胞であり、バクテリア及び微生物細胞を含む。そのような原核細胞としては、特に、Pseudomonas sp., E. coli, Enterobacter sp., Salmonella sp., Klebsiella sp., Acetobacter sp., Staphylocous sp., Streptococcus sp., 又はBacillus sp.が含まれる。
【００７０】
ある好ましい実施の形態では、本発明は植物細胞又は植物組織又は植物カルスの形の植物細胞のグループであって、前記植物細胞又は植物細胞のグループ又はそれらの親細胞が遺伝的に修飾されて、単独で又は１つ以上の他の分子と一緒に、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されたときにその細胞又は細胞グループに変化した視覚的特徴を付与するCFMの産生が可能となっているものを提供する。
【００７１】
特に好ましい植物は観賞植物と顕花植物である。本発明が考えている特に有用な植物はバラ、カーネーション、lisianthus、ペチュニア、ユリ、チューリップ、パンジー、ガーベラ、又はキクなどであるが、それだけに限定されない。
【００７２】
本明細書において“植物”への言及は植物の部分を含む。同様に、本明細書において“植物組織”への言及は植物の部分を含む。そのような植物部分の例は、花、根、葉、茎、種子、果実又は繊維などを含むが、それだけに限定されない。“花”という語は花の部分、例えば花弁、柄、花頭、及び蕾、を含む。植物組織はまた、カルス物質、ならびに胚芽又は非胚芽物質も含む。“繊維”という語は木綿及び大麻繊維を含む。
【００７３】
したがって、本発明の別の様態は、植物、又は花、根、葉、茎、種子、果実又は繊維、又は前記植物の生殖部分、又は前記植物の細胞などの植物の部分、であって、前記植物又は植物の部分が遺伝的に修飾された細胞を含み、単独で又は１つ以上の他の分子と一緒に、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されたときにその細胞又は細胞グループに変化した視覚的特徴を付与するCFMの産生が可能となっているもの、に向けられている。  “遺伝的に修飾される”という用語はその最も広い意味で用いられており、細胞に遺伝子を導入すること、細胞の遺伝子を突然変異させること、及び細胞における遺伝子の調節を変更又は変化させることを含む。
【００７４】
植物の“部分”とは、花（例えば、切り花や裂かれた花）、花弁、茎、葉、及び木綿などの繊維、切り穂、花粉、種子、及びカルスなどの成長、蔓延、生殖物質を含む。
【００７５】
変化した視覚的特徴は、植物の全ての細胞、又はいくつかの組織又は植物部分、例えば花、根、葉、茎、種子、果実又は繊維、が示してもよい。したがって、CFMの産生は組織特異的又は組織選択的であってもよい。さらに、CFMの産生は発生に依存したり、決定されたり、影響されたり、又はその他の仕方で調節されたりしてもよい。
【００７６】
CFMは、カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35Sプロモーターなどの、CFMをコードする遺伝子その他の核酸分子に操作的に結合又は操作的に連結された構成性プロモーターを用いて植物全体に生成させることができる。あるいはまた、この分子は、例えば花弁組織、花弁の表皮細胞層、又は細胞内のいろいろな小器官に局限することもできる。
【００７７】
ある種の遺伝子プロモーター（例えば、35S）を用いると形質転換された細胞の細胞質にCFMを蓄積させて植物組織に眼に見えるカラーを与えることができる。CFMは、植物細胞内のいろいろな小器官をターゲットにして生成して、白色光の照明の下で補助なしの裸眼に見えるような組織の色の変化を付与することができる。CFMは、彩色タンパク質のcDNA配列とin-frameで融合された葉緑体トランジット・ペプチドを用いて色素体をターゲットにして生成できる。使用できる色素体トランジット・ペプチドの一例は、リブロース-1,5-ビスホスフェート・カルボキシラーゼの小さなサブユニットのトランジット・ペプチドである（例えば、InCheol et al., Molecular Breeding 5: 453-461, 1999）。CFMを色素体をターゲットにして生成すると、蓄積されるタンパク質の総量が劇的に増加し（InCheol et al., 1999, 前出）、カラーの強度を増加させることができる。
【００７８】
有色体は、ある種の花の花弁、葉、及び果実に多くある。タンパク質cDNAとin-frame融合された有色体特異的なトランジット・ペプチドを用いて、構成性プロモーターと葉緑体トランジット・ペプチドを用いてターゲットにCFMを生成した場合に生ずるような植物全体の光合成活動への妨害の可能性をずっと小さくして花やその他の組織の色を変えることができる。有色体トランジット・ペプチドと花特異的なプロモーターの使用は花の色を変えるのに最適であろう。
【００７９】
形質転換された細胞又は植物への有害な影響を避けるために全てのCFMを液胞又は小胞体をターゲットにして生成するのが有益である。使用できる小胞体をターゲットにするペプチド配列は、アミノ酸配列HDELである（Haseloff et al., 1997, 前出）。CFMは、細胞壁をターゲットにして生成してもよい。
【００８０】
本明細書で用いられる“操作的に結合された”又は“操作的に連結された”という用語は、構造遺伝子（例えば、CFMをコードする核酸分子）をあるプロモーターの調節制御の下に置くことを意味し、そうするとこのプロモーターがその遺伝子の発現を制御する。プロモーターなどは、一般に、それが制御する遺伝子に対して5'（上流）側に位置している。非相同プロモーター／構造遺伝子の組合せを構成する場合、一般に遺伝的配列又はプロモーターを遺伝子転写開始部位からある距離のところに配置することが好ましく、この距離は遺伝的配列又はプロモーターと自然の状況においてそれが制御する遺伝子、すなわち、その遺伝的配列又はプロモーターが得られた遺伝子、との距離とほぼ同じである。当業者には公知のように、この距離のある程度の変動には機能の低下なしに適応することができる。同様に、調節配列エレメントの制御の下に置かれる非相同遺伝子に対する調節配列エレメントの好ましい位置も、自然の状況におけるそのエレメントの位置によって、すなわち、それが得られた遺伝子によって定められる。
【００８１】
CFMの産生を可能にするように遺伝的に修飾された細胞は、遺伝物質が導入された細胞であるか、又は遺伝的に修飾された親細胞の子孫である。
【００８２】
したがって、本発明は遺伝子導入植物又は植物の部分を生成する方法であって、前記植物又は植物の部分は、単独で又は１つ以上の他の分子との組合せで外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されたときに細胞に変化した視覚的特徴を付与するCFMの産生が可能となるように遺伝的に修飾された細胞を含み、前記方法は前記CFMをコードする単離された核酸分子を前記細胞に導入するステップを含むものである。
【００８３】
好ましくは、CFMは、Anemonia majano, Anemonia sulcata, Clavularia sp, Zoanthus sp, Discosoma sp (例えば、Discosoma striata), Aequorea sp (例えば、Aequorea victoria), Anthozoa sp, Cassiopea sp, (例えば、Cassiopea xamachana), Millepora sp, Acropora sp (例えば、Acropora aspera and Acropora nobilis), Montipora sp, Porites murrayensis, Pocillopora damicormis, Pavona descussaca, Acanthastrea sp, Platygyra sp 又はCaulastrea sp から得られる。
【００８４】
さらに好ましくは、CFMはそのN-末端にSVIAK (SEQ ID NO:5)、(M)SVIAT (SEQ ID NO:6)、SGIAT (SEQ ID NO:7)、SVIVT (SEQ ID NO:8)、又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８５】
さらに好ましくは、CFMは次のリストから選択されるアミノ酸配列を含む：SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)、ただし、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい。
【００８６】
最も好ましくは、CFMは次のリストから選択されるヌクレオチド配列によってコードされる：SEQ ID NOs:19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 及び201。
【００８７】
本発明の別の様態は、遺伝子導入植物を提供するものであり、前記植物又はその部分、例えば花、葉、根、茎、種子、果実、又は繊維などが外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に変化した視覚的特徴を示し、前記遺伝子導入植物又は親植物の細胞がCFMの産生が可能になるように遺伝的に修飾されている遺伝子導入植物を提供する。
【００８８】
上述したように、本発明は、植物細胞と同様に遺伝的に修飾された哺乳類細胞、非哺乳類動物細胞に拡張される。
【００８９】
農業者は、従来の育種技術を用いて市場向けの動物及び動物製品の新しい色を、例えば着色したウール及びレザーや皮革を開発している。現在、これらの製品に着色して新しい色を得る主な方法は、天然の色の製品に染料や着色剤やペイントや色素を使用することである。しかし、本発明のCFMsを使用して新しい色を示す遺伝子導入動物、例えば青色又は赤色の羊毛のヒツジ、赤色の皮のウシ、を生み出すことができる。
【００９０】
具体的に言うと、CFMを一連の農業的に重要な動物、例えば、それだけに限定されないが、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラマ、サカナ、ダチョウ、エミュ、アヒル、及びニワトリに使用することができる。したがって、本発明の別の様態では、遺伝子導入哺乳類又は非哺乳類動物細胞又は前記細胞を含むヒト以外の遺伝子導入哺乳類又は非哺乳類動物が提供され、前記細胞は外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしにヒトの眼に変化した視覚的特徴を示し、前記遺伝子導入植物、哺乳類、又は動物の細胞、又は粗の植物細胞は、CFMの産生を可能にするように遺伝的に修飾されている。
【００９１】
CFMはここで定義されているようなものである。CFMの産生は、構成的又は発生的であるか、又はストレスを含む内部又は外部の刺激に応じて誘発される。
【００９２】
本明細書における“カラー助長分子”、“CFM”、“タンパク質”、“GFP”、又は“非蛍光GFP相同体”への言及はそれらの断片、誘導体、変異体、及び相同体を含む。誘導体の例は、コレラの分子の突然変異体、部分、断片及び部分を含み、単数又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は分子への付加を含む。誘導体は、また、２つ以上のCFMs又はCFMと別の分子、例えばリーダー配列、ターゲット配列、発現促進配列、及び／又は識別可能な信号を発生できるレポーター分子など、との融合分子も含む。
【００９３】
上述したように、誘導体はまた、変化した比の励起又は放出スペクトルを与える修飾された形態を含む。励起又は放出スペクトルの比が変化した結果として、修飾されたGFP又はその相同体は修飾されない分子に比べてカラー生成能が強くなることがある。
【００９４】
さらに、細胞の特徴を変えるために他のタンパク質をCFMと一緒に用いることもできる。他のタンパク質の例としては、Saccharomyces cerevisiae (Hasset et al., Journal of Biological Chemistry 273: 23274-23282, 1998)からのFet3タンパク質に見られるような１つ以上のタイプ１（CuII）を含む銅含有タンパク質、及びラッカーゼ、セルロプラスミン、及びアスコルベート・オキシダーゼなどの多核銅フェロキシダーゼ酵素(Messerschmidt and Huber et al., Eur. J. Biochem. 187: 341-352, 1990)などがあげられる。同様に、プラストシアニン、アズリン、シュードアズリン、プランタシアニン、ルスチシアニン、アミシアニン、オーラシアニン、及びハロシアニンなどの単核ブルー又はタイプ１銅タンパク質（cuproprotein）があげられる(Nerisissian et al., Protein Science 5: 2184-2192, 1996)。これらのタンパク質は天然の色素沈着とは結びつけられていなかった。しかし、これらのタンパク質が濃縮されると、強いブルーの色がはっきりと見られる（Hasset et al., 1998, 前出；Messerschmidt and Huber, 1990, 前出）。正しい折り畳みとCuイオンの取り込みを可能にする条件の下での花その他の植物組織にタイプ１（CuII）含有タンパク質が過剰発現すると白色光の下で補助なしの裸眼に見える色を変化させたり付与したりできる。“一緒に”という表現は、CFMと別のタンパク質、例えばcuproprotein、の間の融合タンパク質、ならびにCFMと少なくとも１つの他のタンパク質をコードする多シストロン形態のヌクレオチド配列の発現を含む。
【００９５】
本発明の別の様態では、真核細胞又は原核細胞又は組織の形の真核細胞又は原核細胞のグループが提供され、前記細胞又は細胞のグループ又はそれらの親細胞は遺伝的に修飾されて、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されるときに前記細胞に変化した視覚的特徴を付与するGFP又はその誘導体又は相同体、例えば非蛍光GFP相同体を生成する。
【００９６】
好ましくは、真核細胞は植物細胞又は植物組織である。しかし、真核細胞は哺乳類細胞又は非哺乳類動物細胞であってもよい。“植物組織”への言及は“カルス”を含む。
【００９７】
したがって、本発明の別の様態は、植物、又は花、根、葉、茎、種子、果実、又は繊維などの植物の部分、又は前記植物の生殖部分、又は前記植物の細胞、に向けられており、前記植物又は植物の部分は遺伝的に修飾された細胞を含み、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしにヒトの眼に視覚化されるときに前記細胞に変化した視覚的特徴を付与するGFP又はその誘導体又は相同体、例えば非蛍光GFP相同体、の産生が可能になっている。
【００９８】
本発明の特に好ましい実施の形態は、植物、又は花、根、葉、茎、種子、果実、又は繊維などの植物の部分、又は前記植物の生殖部分、又は前記植物の細胞、に向けられ、前記植物又は植物の部分は、SEQ ID NOs:19, 21 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 及び201, のいずれかで示されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又はこれらのいずれかの誘導体又は相同体、を含むように遺伝的に修飾された細胞を含み、それにより、単独で又は１つ以上の多の分子と組み合わされて、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしにヒトの眼に視覚化されるときに前記細胞又は細胞のグループに変化した視覚的特徴を付与するCFMの産生が可能になっている。
【００９９】
本発明は特に、ある好ましい実施の形態で、遺伝的に修飾されない植物と比べて変化した花の色を示す遺伝的に修飾された植物ならびにそのような植物からの切り花を提供する。本明細書における“遺伝的に修飾された植物”への言及は、遺伝的に修飾された植物の子孫、ならびに遺伝的に修飾された植物のハイブリッド及び派生物、を含む。
【０１００】
植物細胞などの真核細胞の着色の変化は、観賞植物の市場に有益であるだけでなく、商品タグ（proprietary tag）としても、例えば、種子、根株、花、作物、及び完全な植物及び植物の部分、の商品タグとしても有用である。これは特に，遺伝子導入と非遺伝子導入作物、植物、及びその他の園芸製品を識別するために重要である。さらに、木綿繊維や大麻の眼に見える色の修飾は、彩色繊維製造における染色工程の毒性を減らす手段として有用である。可食及び／又は観賞菌種における眼に見える色の修飾は、市場性の区別と強化のために利用できる。
【０１０１】
果物と野菜の眼に見える色の修飾を用いて市場性を区別し強化することができる。適当な遺伝子プロモーターを用いてCFMの発現をコントロールして、例えば、花や種子などの植物の部分を収穫することも含めて作物植物を収穫する最適な時期を知らせるようにすることができる。さらに、ストレスで誘発されるプロモーターを用いて水や病原ストレスについて早めの警告を出せるようにして、栽培者が早めに介入してその後の経済的な損失を減らすことができる。
【０１０２】
本発明のCFMのその他の用途としては、例えば、新しい着色植物からの抽出物の生産があげられ、抽出物としては、例えば、着香又は食品添加剤、健康製品、飲料、ジュース、又は着色剤、などがあげられる。飲料としては、ワイン、酒精、ビール、茶、コーヒー、ミルク及び酪製品があげられるが、それだけに限定されない。
【０１０３】
CFMは、多くの製品、例えば、それだけに限定されないが、食品（例えば、パン及びイースト製品、菓子類）、飲料（上を見よ）又は目新しい品（例えば、玩具）、の色を変えるのに利用できる。
【０１０４】
本発明の別の様態では、CFM又はその機能的誘導体又は相同体を含む、又は産生できる、形質移入又は形質転換された細胞、組織、器官、又は非細胞物質が提供される。好ましくは、CFMはGFP又は非蛍光GFP相同体などのタンパク質である。
【０１０５】
本発明の遺伝的構造体（genetic constructs）は当業者に公知のいろいろな方法で細胞に導入することができる。用いられる方法は、その特定生物について成功することが知られている方法によって異なる。
【０１０６】
組み換えDNAを細胞に導入する方法としては、それだけに限定されないが、次のようなものがある：CaCl2を用いる形質転換及びその変型、プロトプラストへのDNAの直接取り込み、PEGによるプロトプラストへの取り込み、微粒子撃ち込み、電気穿孔法、DNAのマイクロインジェクション、組織外植片又は細胞への微粒子撃ち込み、核酸による組織浸潤、及びAgrobacteriumから植物組織へのT-DNA-による移動。
【０１０７】
細胞への微粒子撃ち込みでは、微粒子が細胞に撃ち込まれて形質転換された細胞を生ずる。どんな適当な砲撃による細胞形質転換の方法及び装置でも、本発明の実施のために使用できる。装置と手順の例はStomp et al. (U.S. Patent No. 5,122,466)及びSanford and Wolf (U.S. Patent No. 4,945,050)に開示されている。撃ち込みによる形質転換の方法を用いる場合、遺伝的構造体は形質転換される細胞内で複製が可能なプラスミドを組み込むことができる。
【０１０８】
このようなシステムで使用するのに適した微粒子の例としては0.1 乃至10 μm、もっと具体的に10.5乃至5 μm、のタングステン又は金の球があげられる。DNA構造体を沈着などの適当な方法で微粒子に付着させることができる。
【０１０９】
植物組織などの細胞に導入された後、CFMの発現は一過性発現システムで分析されるか、又は、例えば植物ゲノム内への安定な統合に選択された後にそれが決定される。したがって、本発明のCFMは発現マーカーとして利用できる。例えば、本発明のCFMをコードする遺伝物質は、任意に単数又は複数のプロモーターに操作的に連結して、オプションでポリペプチドをコードする１つ以上の他の核酸配列又は調節ヌクレオチド配列と融合させた蛍光“タグ”として細胞に導入することができる。このように、別のポリペプチドと融合されたCFMは、融合体の細胞内の局在化を評価するのに、あるいはまた、あるホスト細胞における調節ヌクレオチド配列の活性を評価する発現マーカーとして利用できる。
【０１１０】
ホスト細胞は原核細胞、例えばバクテリア、であっても、又は真核細胞、例えば酵母、植物、及びヒトを含む動物細胞であってもよい。好ましいホスト細胞はバクテリア又は植物である。
【０１１１】
その後のクローン増殖が、器官発生によってであれ胚発生によってであれ可能な植物組織を、本発明の遺伝的構造体で形質転換させて、完全な植物をそこから発生させることができる。選ばれる特定組織は、形質転換させようとしている特定の種で利用できる、最も適したクローン増殖システムによって異なる。ターゲット組織の例としては、葉のディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、大形配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、及び根分裂組織）、及び誘導された分裂組織（例えば、子葉分裂組織及び拝辞区分裂組織）などがあげられる。
【０１１２】
再生された形質転換された植物は、クローン増殖や古典的な育種方法などいろいろな手段で増殖させることができる。例えば、第１世代（すなわち、T1）形質転換植物を自己増殖させて同型接合の第２世代（すなわち、T2）形質転換株を生成し、T2植物をさらに古典的な育種方法で増殖させることができる。
【０１１３】
GFP又はその相同体又は他のCFMが、細胞又は細胞のグループに、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしにヒトの眼に変化した視覚的特徴を付与する限り、任意の数のGFP又は非蛍光GFP相同体を用いることができる。ここで考えられるCFMsの例としては、それだけに限定されないが、非蛍光GFP相同体、例えばasFP595 (Lukyanov et al., 2000, 前出)及びt7SP6BASPOC3とT7SP6BASPOC4 (Hoegh-Guldberg and Dove, 2000, 前出)でコードされるもの、及び蛍光GFP変異体と相同体、例えばDavies and Vierstra, 1996, 前出；Haseloff et al., 1997, 前出；Lukyanov et al., 1999, 前出；Matz et al., 1999, 前出；Fradkov et al., FEBS Letters 479: 127-130, 2000)に記載されているもの、があげられる。
【０１１４】
したがって、本発明の別の様態は、次のものを含むように遺伝的に修飾された真核又は原核細胞、又は真核又は原核細胞のグループを提供する：
（ｉ）SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201で示されるヌクレオチド配列；
（ii）最適整列の後に、SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201 と少なくとも約60%の類似性を有するヌクレオチド配列；
（iii ）低ストリンジェンシー条件の下で、SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列；
（iv）SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201に示される、アミノ酸配列をコードできるヌクレオチド配列；
（ｖ）最適整列の後に、SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201と少なくとも約60%の類似性を有する、アミノ酸配列をコードできるヌクレオチド配列；
（vi）低ストリンジェンシー条件の下で（iv）又は（ｖ）の配列、又はその相補的な形とハイブリダイズできるヌクレオチド配列；
ただし、前記ヌクレオチド配列は外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしにヒトの眼に変化した視覚的特徴を前記細胞又は細胞のグループに付与するCFMをコードする。
【０１１５】
特に、本発明は次のものを含むように遺伝的に修飾された真核又は原核細胞又は真核又は原核細胞のグループを提供する：
（ｉ）SEQ ID NO:189又はSEQ ID NO:191又はSEQ ID NO:193又はSEQ ID NO:195又はSEQ ID NO:197又はSEQ ID NO:199又はSEQ ID NO:201に示されるヌクレオチド配列；
（ii）最適整列の後にSEQ ID NO:189又はSEQ ID NO:191又はSEQ ID NO:193又はSEQ ID NO:195又はSEQ ID NO:197又はSEQ ID NO:199又はSEQ ID NO:201と少なくとも約60%の類似性を有するヌクレオチド配列；
（iii ）低ストリンジェンシー条件の下でSEQ ID NO:189又はSEQ ID NO:191又はSEQ ID NO:193又はSEQ ID NO:195又はSEQ ID NO:197又はSEQ ID NO:199又はSEQ ID NO:201又はその相補的な形とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列；
（iv）SEQ ID NO:190又はSEQ ID NO:192又はSEQ ID NO:194又はSEQ ID NO:196又はSEQ ID NO:198又はSEQ ID NO:200又はSEQ ID NO:202に示されるアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列；
（ｖ）最適整列の後にSEQ ID NO:190又はSEQ ID NO:192又はSEQ ID NO:194又はSEQ ID NO:196又はSEQ ID NO:198又はSEQ ID NO:200又はSEQ ID NO:202と少なくとも約60%の類似性を有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列；
（vi）低ストリンジェンシー条件の下で（iv）又は（ｖ）のヌクレオチド配列、又はその相補的な形とハイブリダイズできるヌクレオチド配列；
ただし、前記ヌクレオチド配列は外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしにヒトの眼に変化した視覚的特徴を前記細胞又は細胞のグループに付与するCFMをコードする。
【０１１６】
好ましくは、真核細胞は植物細胞である。
【０１１７】
したがって、本発明の別の様態では、植物又は植物の細胞又は植物の部分又は植物の子孫が提供され、前記植物は以下のものを含む細胞を含む：
（ｉ）SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201で示されるヌクレオチド配列；
（ii）最適整列の後に、SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201 と少なくとも約60%の類似性を有するヌクレオチド配列；
（iii ）低ストリンジェンシー条件の下で、SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列；
（iv）SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201に示される、アミノ酸配列をコードできるヌクレオチド配列；
（ｖ）最適整列の後に、SEQ ID NO:19 又はSEQ ID NO:21 又はSEQ ID NO:23 又はSEQ ID NO:25 又はSEQ ID NO:27 又はSEQ ID NO:29 又はSEQ ID NO:31 又はSEQ ID NO:33 又はSEQ ID NO:35 又はSEQ ID NO:37 又はSEQ ID NO:39 又はSEQ ID NO:41 又はSEQ ID NO:43 又はSEQ ID NO:45 又はSEQ ID NO:47 又はSEQ ID NO:49 又はSEQ ID NO:51 又はSEQ ID NO:53 又はSEQ ID NO:55 又はSEQ ID NO:57 又はSEQ ID NO:59 又はSEQ ID NO:61 又はSEQ ID NO:63 又はSEQ ID NO:65 又はSEQ ID NO:67 又はSEQ ID NO:69 又はSEQ ID NO:71 又はSEQ ID NO:73 又はSEQ ID NO:75 又はSEQ ID NO:77 又はSEQ ID NO:79 又はSEQ ID NO:81 又はSEQ ID NO:83 又はSEQ ID NO:85 又はSEQ ID NO:87 又はSEQ ID NO:89 又はSEQ ID NO:91 又はSEQ ID NO:93 又はSEQ ID NO:95 又はSEQ ID NO:97 又はSEQ ID NO:99 又はSEQ ID NO:101 又はSEQ ID NO:103 又はSEQ ID NO:105 又はSEQ ID NO:107 又はSEQ ID NO:109 又はSEQ ID NO:111 又はSEQ ID NO:113 又はSEQ ID NO:115 又はSEQ ID NO:117 又はSEQ ID NO:119 又はSEQ ID NO:121 又はSEQ ID NO:123 又はSEQ ID NO:125 又はSEQ ID NO:127 又はSEQ ID NO:129 又はSEQ ID NO:131 又はSEQ ID NO:133 又はSEQ ID NO:135 又はSEQ ID NO:137 又はSEQ ID NO:139 又はSEQ ID NO:141 又はSEQ ID NO:143 又はSEQ ID NO:145 又はSEQ ID NO:147 又はSEQ ID NO:149 又はSEQ ID NO:151 又はSEQ ID NO:153 又はSEQ ID NO:155 又はSEQ ID NO:157 又はSEQ ID NO:159 又はSEQ ID NO:161 又はSEQ ID NO:163 又はSEQ ID NO:165 又はSEQ ID NO:167 又はSEQ ID NO:169 又はSEQ ID NO:171 又はSEQ ID NO:173 又はSEQ ID NO:175 又はSEQ ID NO:177 又はSEQ ID NO:179 又はSEQ ID NO:189 又はSEQ ID NO:191 又はSEQ ID NO:193 又はSEQ ID NO:195 又はSEQ ID NO: 197 又はSEQ ID NO:199 又は201と少なくとも約60%の類似性を有する、アミノ酸配列をコードできるヌクレオチド配列；
（vi）低ストリンジェンシー条件の下で（iv）又は（ｖ）の配列、又はその相補的な形とハイブリダイズできるヌクレオチド配列；
ただし、前記ヌクレオチド配列は外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしにヒトの眼に変化した視覚的特徴を前記細胞又は細胞のグループに付与するCFMをコードする。
【０１１８】
特に、植物又は植物の細胞又は植物の部分又は植物の子孫が提供され、前記植物は以下のものを含む細胞を含む：
（ｉ）SEQ ID NO:189又はSEQ ID NO:191又はSEQ ID NO:193又はSEQ ID NO:195又はSEQ ID NO:197又はSEQ ID NO:199又はSEQ ID NO:201に示されるヌクレオチド配列；
（ii）最適整列の後にSEQ ID NO:189又はSEQ ID NO:191又はSEQ ID NO:193又はSEQ ID NO:195又はSEQ ID NO:197又はSEQ ID NO:199又はSEQ ID NO:201と少なくとも約60%の類似性を有するヌクレオチド配列；
（iii ）低ストリンジェンシー条件の下でSEQ ID NO:189又はSEQ ID NO:191又はSEQ ID NO:193又はSEQ ID NO:195又はSEQ ID NO:197又はSEQ ID NO:199又はSEQ ID NO:201又はその相補的な形とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列；
（iv）SEQ ID NO:190又はSEQ ID NO:192又はSEQ ID NO:194又はSEQ ID NO:196又はSEQ ID NO:198又はSEQ ID NO:200又はSEQ ID NO:202に示されるアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列；
（ｖ）最適整列の後にSEQ ID NO:190又はSEQ ID NO:192又はSEQ ID NO:194又はSEQ ID NO:196又はSEQ ID NO:198又はSEQ ID NO:200又はSEQ ID NO:202と少なくとも約60%の類似性を有するアミノ酸配列をコードすることができるヌクレオチド配列；
（vi）低ストリンジェンシー条件の下で（iv）又は（ｖ）のヌクレオチド配列、又はその相補的な形とハイブリダイズできるヌクレオチド配列；
ただし、前記ヌクレオチド配列は外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしにヒトの眼に変化した視覚的特徴を前記細胞又は細胞のグループに付与するCFMをコードする。
【０１１９】
特に好ましいある実施の形態では、CFMの利用、例えば、それだけに限定されないが植物の製造において、外部からの非白色光又は粒子放出なしにヒトの眼に変化した視覚的特徴を前記植物の全部又は一部又は前記植物の細胞に付与するGFP又は非蛍光GFP相同体の利用、などを提供する。
【０１２０】
本明細書における外部からの光への言及は、白色光又は背景照射を包含すると解してはならない。変化した視覚的特徴は、白色光、例えば60 Wの電灯や昼日光、の存在下で視覚化される。白色光とは可視スペクトルの全ての波長を含む光であり、例えば太陽光である。
【０１２１】
本明細書で用いる場合、“類似性”という用語は、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルで比較される配列の間の正確な同一性を含む。ヌクレオチド・レベルで同一でない場合、“類似性”とは、配列の間の差であって、それにも関わらず構造、機能、生化学及び／又はコンフォメーションのレベルで互いに関連する異なるアミノ酸を生ずるものを含む。アミノ酸レベルで同一でない場合、“類似性”とは、それにも関わらず構造、機能、生化学及び／又はコンフォメーションのレベルで互いに関連するアミノ酸を含む。ある特に好ましい実施の形態では、ヌクレオチドと配列の比較は類似性ではなく同一性のレベルでなされる。
【０１２２】
２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の配列関係を記述するために用いられる用語として、“基準配列”、“比較ウインドー”、“配列類似性”、“配列同一性”、“実質的に同様”、及び“実質的同一性”などがある。“基準配列”は、長さがヌクレオチド及びアミノ酸残基で、少なくとも12、多くの場合15乃至18、しばしば少なくとも25以上、例えば30 モノマー・ユニットである。２つのポリヌクレオチドは、各々、（１）２つのポリヌクレオチドの間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分だけ）、及び（２）２つのポリヌクレオチドの間で離反する配列、を含むので、２つ（以上）のポリヌクレオチドの間の配列の比較は普通、配列類似性の局所領域を同定して比較するために２つのポリヌクレオチドの配列をある“比較ウインドー”にわたって比較することによって行われる。“比較ウインドー”は、普通12の隣接する残基から成る概念的セグメントを指し、それが基準配列と比較される。２つの配列の最適整列のために、比較ウインドーは、基準配列（これは付加も欠失も含まない）に比べて約20%以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウインドーを整列させるための配列の整列は、アルゴリズムのコンピュータによる実施で（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 の GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA）、又は選択されるいろいろな方法のいずれかによって生成される検査と最良整列（すなわち、比較ウインドーで最高のパーセンテージの相同性を生ずるもの）によって行われる。また、BLAST系統のプログラム、例えばAltschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389, 1997)によって開示されたもの、を参照することもできる。配列分析の詳しい議論は、Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15)のUnit 19.3に見られる。
【０１２３】
本明細書で用いる用語“配列類似性”及び“配列同一性”は、２つの配列が比較ウインドーにわたって、ヌクレオチド同士で又はアミノ酸同士で、同一である度合い又は機能的又は構造的に類似している度合い、を指す。したがって、例えば、“配列同一性のパーセンテージ”は、２つの最適整列された配列を比較ウインドーで比較し、同一の核酸塩基（例えば、A, T, C, G, I）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys, 及びMet）が両方の配列で起こる位置の数を決定してマッチする位置の数を出し、マッチする位置の数を比較ウインドーの位置の総数（すなわち、ウインドー・サイズ）で割り、結果に100をかけて配列同一性のパーセンテージを得る。本発明の目的には、“配列同一性”は、DNASISコンピュータ・プログラム（Version 2.5 for Windows; Hitachi Software Engineering Co. Ltd., South San Francisco, California, USA, から入手できる）によって、ソフトウエアに添付された参照マニュアルで用いられている標準のデフォルトを用いて計算された“マッチ・パーセンテージ”を意味するものと理解される。同様のコメントが配列類似性にもあてはまる。
【０１２４】
本明細書における低ストリンジェンシーへの言及は、ハイブリダイゼーションでは少なくとも約0乃至少なくとも約15% v/vのホルムアミド及び少なくとも約1 M乃至少なくとも約2 Mの塩、そして洗浄条件としては少なくとも約1 M乃至少なくとも約2 Mの塩、を含み包含する。一般に、低ストリンジェンシーは、約25-30 ℃乃至約42 ℃である。温度は変更でき、もっと高い温度を用いてホルムアミドに代えたり、及び／又は別のストリンジェンシー条件にしたりすることができる。必要な場合、別のストリンジェンシー条件を用いることができる。それは、例えば中間ストリンジェンシー、すなわち、ハイブリダイゼーションでは少なくとも約16% v/v乃至少なくとも約30% v/vのホルムアミド及び少なくとも約0.5 M乃至少なくとも約0.9 Mの塩、そして洗浄条件としては少なくとも約0.5 M乃至少なくとも約0.9 Mの塩、又は高ストリンジェンシー、すなわち、ハイブリダイゼーションでは少なくとも約31% v/v乃至少なくとも約50% v/vのホルムアミド及び少なくとも約0.01 M乃至少なくとも約0.15 Mの塩、そして洗浄条件としては少なくとも約0.01 M乃至少なくとも約0.15 Mの塩、である。一般に、洗浄はTm = 69.3 + 0.41 (G + C)% である（Marmur and Doty, J. Mol. Biol. 5: 109, 1962）。しかし、二重鎖DNAのTmはミスマッチ塩基対の数の1%の増加あたり1 ℃減少する（Bonner and Laskey, Eur. J. Biochem. 46: 83, 1974）。これらのハイブリダイゼーション条件でホルムアミドはオプションである。したがって、特に好ましいストリンジェンシーのレベルは次のように定義される：低ストリンジェンシーは、6×SSCバッファー、0.1% w/v SDS, at 25-42 ℃; 中間ストリンジェンシーは、2×SSCバッファー、0.1% w/v SDS, at 温度範囲20 ℃乃至65 ℃; 高ストリンジェンシーは、0.1×SSCバッファー、0.1% w/v SDS, at 温度は少なくとも65 ℃。
【０１２５】
タバコ・リボソームDNAのスペーサー・エレメントを用いて、遺伝子導入Arabidopsis、カーネーション、バラ、その他の植物種におけるCFMs 又は彩色タンパク質の発現を増強させることができる。タバコ・リボソームDNAのスペーサー・エレメントを用いて、植物における導入遺伝子のコピー数と発現レベルを高めることができる（Borisjuk et al., Nat. Biotechnol. 18: 1303-1306, 2000）。タバコ・リボソームDNAのスペーサー・エレメントは、植物でCFMsや彩色タンパク質を発現させるために用いられるpCGP2772, pCGP2785, pCGP3259又はその他の構造体（construct）に挿入することができる。
【０１２６】
Arabidopsis, Caenorhabditis, 及びDrosophilaにおけるコドンの使用と遺伝子発現レベルの間にははっきりとした相関がある（Duret and Mouchiroud, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4482-4487, 1999）。
【０１２７】
CFM又は彩色タンパク質のオープン・リーディング・フレーム内のコドン使用を変えて、遺伝子導入Arabidopsis、カーネーション、バラ、その他の植物種におけるCFMs 又は彩色タンパク質のレベルを高めることができる。
【０１２８】
Stevens et al. (Plant physiology 173-182, 2000)の最近の研究は、タンパク質のグリコシル化パタンを変えることによって遺伝子導入植物における組み換えタンパク質の安定性を高められる可能性を示している。
【０１２９】
植物における外来遺伝子の高レベル遺伝子発現のために植物ウイルス遺伝子ベクターを用い琉ことができる（Scholthoff and Scholthoff, Annu. Rev. of Phytopathol. 34: 299-323, 1996; Chapman et al., Plant Journal 2: 549-557, 1992）。
【０１３０】
植物ウイルス発現システムを利用して、遺伝子導入Arabidopsis、カーネーション、バラ、その他の植物種におけるCFMs 又は彩色タンパク質のレベルを高めることができる。適当なウイルス・タイプ又は系統の選択によって、特定の組織又はパタンでのCFMs又は彩色タンパク質の発現で新しい表現型を生み出すことが可能になる。例えば、FMs又は彩色タンパク質遺伝子をチューリップ斑入りウイルス又はチューリップchlorotic blotchポチウイルスのゲノムに組み込むことによってチューリップその他の花に、彩色セクターを生ずることができる。
【０１３１】
本発明の単離されたCFMsが利用できるようになると、さらに、これらの単離された配列又はその誘導体又は相同体のいずれか又は全てに対する抗体を、モノクローナルであれポリクローナルであれ、生成できる可能性が生まれる。
【０１３２】
抗体の生成、精製、及び使用に関する周知の手順は、例えば、Coligan et al. (Current Protocol in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y., 1991-94)の第２章、及びHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, に見られる。これらはどちらも参照によって本明細書に取り入れられる。
【０１３３】
一般に、本発明の抗体は、ポリペプチド、その断片、変異体、又は誘導体に結合又は接合する。例えば、抗体はポリクローナル抗体を含むことができる。そのような抗体は、あるポリペプチド、その断片、変異体、又は誘導体を、マウスやウサギなどの生産種に注射してポリクローナル抗血清を得ることによって調製できる。ポリクローナル抗体の生産方法は当業者には周知である。その手順の例は、Coligan et al., 1991-94, 前出、及びharlow and Lane, 1988, 前出、に記載されている。
【０１３４】
生産種で得られるポリクローナル抗血清でなく、モノクローナル抗体をKohler & Milstein (European Journal of Immunology 6: 511-519, 1976)に記載されているような標準的な方法によって、又はそのもっと最近の変型、例えばColigan et al. (1991-94, 前出)に記載されているような変型によって、１つ以上の本発明のポリペプチド、その断片、変異体、又は誘導体を接種された生産種から得られる脾臓やその他の抗体産生細胞を不死化することによって生成される。
【０１３５】
本発明はまた、上述のポリクローナル又はモノクローナル抗体のFc又はFab断片を含む抗体も考えている。あるいはまた、抗体は、本発明のペプチドに対する単鎖Fv抗体（scFvs）を含むものでもよい。このようなscFvsは、例えば、U.S. Patent No. 5,091,513, 欧州特許No. 239,400又はWinter and Milstein (Nature 349: 293, 1991)にそれぞれ記載されているような方法によって調製することができる。
【０１３６】
本発明にしたがって生成された抗体をアフィニティー・クロマトグラフィーで天然又は組み換え色素ポリペプチドを単離するために用いることができる。適当な手順については、Coligan et al. (1991-94, 前出)に記載されている免疫アフィニティー・クロマトグラフィー手順を参照できる。
【０１３７】
したがって、本発明はCFMに特異的な抗体を提供し、前記CFMはそのN-末端にSVIAK (SEQ ID NO:5), (M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 又はSVSAT (SEQ ID NO:9)から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
好ましくは、単離された抗体は次のリストから選択されたアミノ酸配列を含むCFMに対して特異的である：SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10), SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11), SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12), SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13), SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14), SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15), SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16), SVIAK QMTY KVYM SDT (SEQ ID NO:17) 及びSVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18)、ただし、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい。
【０１３９】
最も好ましくは、抗体は次のリストから選択されるアミノ酸配列を含むCFMに対して特異的である：SEQ ID NOs:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 及び202。
【０１４０】
いったん抗体が生成されたら、１つ以上の本発明のポリペプチドをそれに接合し、好ましくは抗体染色錯体の一部としての二次抗体に接合し、それによって顕微鏡やその他の関連手法に置いて蛍光マーカーとして有用なものにすることができる。あるいはまた、又はさらに、本発明のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を二次抗体と融合した組み換えポリペプチドとして発現させることもできる。これらの抗体は、in situ標識手法や、その他の関連手法、例えば蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）などで有用である。
【０１４１】
既に上で述べたように、当業者に周知の融合パートナーはGFPである。この融合パートナーは“蛍光タグ”として役立ち、それに融合したポリペプチドを蛍光顕微鏡又はフロー・サイトメトリーによって同定及び／又は局在化するのを助ける。蛍光活性化セル・ソーティング（FACS）などのフロー・サイトメトリー法はこの点で特に有用である。
【０１４２】
研究及び医療で利用するための、放射性同位元素よりもむしろルミネッセンス、蛍光、又は可視光を用いた高感度の生化学分析には変わらない関心がある。可視光検出システムによる分析への関心は、それによって高価なルミネッセンス、蛍光、又は同位元素検出システムが不要になるので高まっている。
【０１４３】
したがって、本発明はさらに、CFMの存在をスクリーニングするステップを含み、前記CFMをコードする核酸分子が細胞で発現されることを特徴とする診断分析法を提供する。
【０１４４】
紫外領域を包含する（320-700 nm）入射光を吸収できるCFMsの能力は、CFMsを局所塗布できる日焼け止め調合物の成分に含めるための有力な候補にしている。日焼け止めの目的は過剰な紫外線が皮膚に影響を及ぼさないようにブロックすることである。日焼け止め調合物は、皮膚に焼けと焦げを生ずる入射光を曲げたり散乱させたり、又はこの光を吸収することによって働く。日焼け止めを注意深く選定することによって皮膚が保護され、放射によって皮膚が黒くなり損傷することが減少する。
【０１４５】
このような調合物は、例えば、効果的な量の１つ以上の本発明のCFMsを含み、製薬的に受容されるビヒクル、例えば皮膚に害のないキャリア又は賦形剤が任意に混合されている。“キャリア”という用語は、固体又は液体の充填剤、希釈剤、又は局所塗布に安全に使用できる物質を意味する。これらのキャリアは、粉末吸収剤、クリームオイル、合成オイル、リン酸緩衝液、乳化剤、及び皮膚軟化剤、噴射剤、溶剤、湿潤薬、増粘剤、等張食塩水、及び発熱物質を含まない水、を含む群から選択される。この日焼け止め調合物はまた、当業者に周知の他の日焼け止め、例えばプロピル・ヒドロキシベンゾエート、ジメチルアミノベンゾエート（PABA）、フェニル・サリチル酸、及び／又はメトキシシンナメート、などを含んでもよい。これらの調合物は、ローション、クリーム、軟膏、及びエアロゾル製品など従来の製品形態で皮膚への局所塗布のために調製することができる。有用な日焼け止め調合物及びそのためのエマルジョンを調製する方法は、国際特許No. WO 00/46233に実施例４で提供されている。
【０１４６】
したがって、本発明はCFMを含むバイオマトリックスを提供し、前記CFMは、単独で又は１つ以上の他の分子と一緒に、外部からの非白色光又は粒子放出による励起なしでヒトの眼に視覚化されるときに前記細胞に変化した視覚的特徴を付与する。
【０１４７】
“バイオマトリックス”への言及は、細胞、日焼け止め、などのCFMを含む任意の組成物、CFMの精製された調製物、又はCFMが固定される任意の固形サポートを含む。バイオマトリックスへの言及は生物測定器を含む。
【０１４８】
本発明のさらに別の様態は、化粧品又は光フィルター組成物におけるCFMの利用を意図している。化粧品は、外観又は色を変えるために顔や体に塗布できるいろいろな製品を含む。新しい成分の組合せによって環境ストレス、例えば太陽への露出、に対して保護する化粧組成物が得られる。化粧品にCFMを使用して美的に望ましい、眼に見える彩色が得られる、及び／又は、例えば日焼け止めで得られるような光を濾過する性能が得られる。
【０１４９】
光フィルター組成物は、また、紫外線や全スペクトル内のいろいろな波長の光を遮断又はブロックするために用いられる。本発明による化粧又は光フィルター組成物は、また、化粧として又は製薬的に共用可能なキャリア、保存剤、乳化剤、増粘剤、芳香、カラー、ならびに皮膚に有益な性質を有する他の物質、中でも例えば、保水剤、皮膚軟化剤、老化防止剤、などを含むことができる。
【０１５０】
本発明のCFMsの別の応用も考えられる。CFMsはいろいろな種類の入射する光／放射が処理され検出されるしかた及び度合いに影響を及ぼすことができる活性を有するので、例えば、画像を変換又は増強することに応用できる可能性がある。例えば、紫外線などの眼に見えにくい波長の光をもっと見えやすい波長に変換できれば有益であろう。CFMを含むゲルや同様の物質を膜又は選択的バリアの背後に配置して光ファイバー・プローブ、例えばオプトードやミクロ電極、と組み合わせることができる。プローブが挿入された物理的及び化学的環境の変化を、蛍光強度及び／又は蛍光半減期の変化に換算して、酸素濃度やpHなどの微小スケールでの測定が可能になる。蛍光強度及び／又は半減期蛍光イメージング法を用いる同様の応用にも本発明のCFMを組み込むことができる。
【０１５１】
上述のように、本発明のCFMとその相同体の各々は、はっきり区別される励起及び放出特性を有する。それらを蛍光で結合して、捕捉された光子を複数のCFMsの間で、例えば６つものCFMsの間で、順次受け渡すようにすることができる。これによって、CFMsを含む物質内部での光子の経路の長さと光子が過ごす時間の量が増大し、それによりこの環境内部での光の強度がかなり増加する。このような光増強効果は、成分の光システムと光子の相互作用の可能性を増大させることによって、瀬頂する光合成生物、例えば植物、藻類、及び／又はサンゴにより多くの光を供給するのに役立つであろう。
【０１５２】
また、本発明のこの実施形態は、ある媒質中における光強度を入射光よりも高めるために用いられる光エンハンサーを作り出すために役立つだろう。
【０１５３】
さらに、ゲル・マトリックスやその他の物質に埋め込まれたCFMは、光のスペクトルが歪むような状況、例えば光がスペクトルの青い方にずれている水中などで画像の質を改善することができる。水溶性にしたCFMは、一連の異なるタイプの液体中で使用できるであろう。あるいはまた、又はそれに加えて、本発明のポリペプチドの誘導体又は相同体を、アミノ酸の置換によって、又はN-又はC-末端タグを付加することによってその不溶性を高めるように合成して、極性が低い環境でもっと有用なものにすることもできる。この実施形態では、CFM又はアミノ酸の包含や置換によってもっと疎水性になるように修飾されたCFMなど、を水溶性又は非水溶性のエマルジョンと組み合わせて、紫外線によって損傷する物質、例えば、プラスチックや車の布張りをコーティングするために用いることができる。
【０１５４】
以下、本発明を非限定的な実施例によってさらに説明する。
【０１５５】
実施例１
一般的方法
用いた方法は、一般に、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989)に記述されているようなものであった。
【０１５６】
クローニング・ベクターpBluescriptとPCR scriptはStratageneから入手した。pCR7 2.1 はInvitrogenから入手した。
【０１５７】
バクテリア発現ベクターpQE-30はQiagenから入手した。
E. coli 形質転換
使用したEscherichia coliの株は次のものであった：
DH5α
supE44, Δ(lacZYA-ArgF)U169, (φ80lacZΔM15), hsdR17(rk-, mk+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, deoR. (Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557 1983)
XL1-Blue
supE44, hsdR17(rk-, mk+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1,
lac-, [F'proAB, lacIq, lacZΔM15, Tn10(tetR)] (Bullock et al., Biotechniques 5: 376, 1987).
BL21-CodonPlus-RIL 株
ompT hsdS(rB-mB-) dcm+ Tetr gal endA Hte [argU ileY leuW Camr]
M15 E. coliはE. coli K12から導出され表現型はNaIS, StrS, RifS, Thi-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+.
E. coli株の形質転換はInoue et al., (Gene 96: 23-28, 1990)の方法によって行われた。
Agrobacterium tumefaciens 株と形質転換
使用した防備を撤去したAgrobacterium tumefaciens 株はAGL0 (Lazo et al., Bio/technology 9: 963-967, 1991)であった。
【０１５８】
プラスミドDNAは、Agrobacterium tumefaciens 株AGL0に、50 mL LB培養に接種して28℃で振動させながら１６時間培養して調製された100 μLのコンピテントAGL0細胞に5 μgのプラスミドDNAを加えることによって導入された。次に、細胞をペレットにして、0.5 mLの85% v/v 100mM CaCl2/15% v/v) グリセリンに再懸濁させた。DNA-Agrobacterium 混合物は液体N2に2分間インキュベートして凍結させ、その後5分間37℃でインキュベートして解凍させた。次にDNA／バクテリア混合物はさらに10分間氷の上に置かれた。次に、細胞を1 mLのLB (Sambrook et al., 1989 前出)媒質と混合し、28℃で16時間振動させながらインキュベートした。プラスミドを含むA. tumefaciens細胞は、50 μg/mLのテトラサイクリンを含むLB寒天平板上で選択された。A. tumefaciensにおけるプラスミドの確認はテトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析によって行われた。
Sacchromyces cerevisiae 株と形質転換
使用した酵母発現ベクターはpYE22m (Tanaka et al., J. Biochem. 103: 954-961, 1988)であった。
【０１５９】
酵母株G-1315 (Matα, trpl)(Ashikari et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 515-520, 1989)がIto et al., (J. Bacteriol. 153: 163-168, 1983)に従ってプラスミドDNAで形質転換された。形質転換体はトリプトファン・プロトトロフィーでG-1315回復できる能力によって選択された。
DNA 結紮
DNA結紮はAmersham Ligation Kitを用いて、メーカーが勧告する手順に従って行われた。
DNA断片の単離と精製
断片は一般に1% w/v 寒天ゲルに単離され、QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いて精製された。
制限消化の後の張り出している末端の修復
張り出している5'末端は、DNAポリメラーゼ(Klenow fragment)を用いて標準的な手順(Sambrook et al., 1989, 前出)に従って修復された。張り出している3'末端は、T4 DNAポリメラーゼを用いて標準的な手順(Sambrook et al., 1989, 前出)に従って修復された。
核酸からのホスホリル基の除去
通常、シュリンプ・アルカリ・ホスファターゼ(SAP)(USB)をメーカーの勧告に従って用いてクローニング・ベクターからホスホリル基を除去して再環状化を防止した。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
別に断らない限り、プラスミドDNAをもちいるPCRの条件は、2 ngのプラスミド、各100 ngのプライマー、2μl 10 mMのdNTPミックス、5 μl 10 x PfuTurbo(登録商標)DNAポリメラーゼ・バッファー(Stratagene), 0.5 μl PfuTurbo(登録商標)DNAポリメラーゼ(2.5 units/μL)(Stratagene)を全体積50 μLで用いるというものであった。サイクリング条件は、最初の変性ステップが94℃で5分、その後に94℃で20秒、50℃で30秒、そして72℃で1分が35サイクル、最後の処理が72℃で10分、そして最後に4℃で貯蔵、であった。
【０１６０】
PCRはPerkin Elmer GeneAmp PCR System 9600で行われた。
DNAの32P-ラベリング
DNA断片が,Gigaprime kit (Geneworks)を用いて50 μCiの[α-32P]-dCTPで放射性元素によって標識された。取り込まれなかった[α-32P]-dCTPはSephadex G-50 (Fine)カラムでクロマトグラフィーによって除去された。
プラスミド単離
個々のコロニーを、適当な抗生物質セレクション（例えば、バイナリー・ベクター構造体に対して100 μg/mLのアンピシリン、又は10乃至50 μg/mLのテトラサイクリン）と共にLB肉汁中で培養することによりインサートについて分析した（Sambrook et al., 1989, 前出）。プラスミドDNAは、アルカリ溶解手順（Sambrook et al., 1989, 前出）を用いて、又はWizardPlus SV minipreps DNA 精製システム（Promega）又はQiagen Plasmid Mini Kit (Qiagen)を用いて精製された。インサートの存在が決定された後、もっと多量のプラスミドDNAがQIAfilter Plasmid Midi Kit (Qiagen)を用いて50 mLオーバーナイト培養で調製された。
DNA配列分析
DNA配列決定はApplied BiosystemsからのPRISM(商標)Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencing Kitsを用いて行われた。メーカーから提供された手順に従った。サイクル配列決定反応は、Perkin Elmer PCR machine (GeneAmp PCR System 9600)を用いて行われた。配列決定実験はWalter and Eliza Hall Institute of Medical Research (Melbourne, Australia)のAustralian Genome Research Facilityで行われた。
【０１６１】
Genbank, SWISS-PROT 及びEMBLデータベースに対する相同性サーチは、FASTA及びTFASTAプログラム(Pearson and Lipman, 1988)又はBLASTプログラム(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990)を用いて行われた。配列類似性パーセンテージは、LALIGNプログラム(Huang and Miller, Adv. Appl. Math. 12: 373-381,1991)で、デフォルト設定を用いて得られた。
【０１６２】
多重の配列整列はClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994)を用いて生成された。
ペチュニアの形質転換
（a）植物材料
成熟した植物P. hybrida cv Mitchell (又はBa 20又はBrl 40w)からの葉組織が1.88% w/v 次亜塩素酸ナトリウムで2分間処理され、無菌の水で3回水洗された。次に葉組織を25-50 mm2の正方形に切り分け、MS培地（Murashige and Skoog, Physiol. Plant 15: 73-97,1962）に1.0 mg/Lのα-ベンジルアミノプリン（BAP）と0.1 mg/Lのα-酢酸ナフタレン（NAA）を補ったもので24時間白色蛍光灯の下で前培養された。
（b）Agrobacterium とペチュニアの共培養
バイナリー・ベクターを含むA. tumefaciens 株AGL0が50 μg/mLのテトラサイクリンを含むLB寒天平板で4℃に保たれた。単一コロニーが一晩40 μg/mLのテトラサイクリンを含む液体LB培地で培養された。翌朝、一晩おいた培養1-2 mL が25 mL液体LB培地の新しいバッチに加えられ、37 ℃で振動させながら、650 nmでの吸光度（A650）の読取値が0.4乃至0.8に達するまで培養された。最終濃度5×108 細胞／mLは、50 μMアセトシリンゴンと3% w/v スクロースB5ビタミンを含む液体MS培地での希釈によって調製された（Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151-158, 1968）。葉ディスクは2分間接種源に浸され、たたいて乾かして5日間共培養培地に載置された。共培養培地は、SH培地（Schenk and Hildebrandt, Can. J. Bot. 50: 199-204, 1972）を0.05 mg/Lのキネチンと1.0 mg/Lの2,4-Dで補ったものであった。
（c）遺伝子導入ペチュニアの回収
共培養の後、葉ディスクは選択培地（MS培地に3% w/v スクロース、3 mg/LのBAP, 0.2 mg/LのIAA, 1 μg/Lのクロルスルフロン、300 mg/Lのチメンチン、及び0.3% w/v Gelrite Gellan Gum (Schweizerhall)をおぎなったもの）に移された。2週間後、再生している外植片は新しい選択培地に移された。  クロルスルフロン選択を生き延びた不定シュートは、単離されて1 mg/Lのクロルスルフロンと300 mg/Lのチメンチンを含むBPMにうつされて根が誘導される。全ての培養は16時間の光周期（60 μmol.m-2s-1の冷白色蛍光灯）で23±2℃に保たれる。根が2-3 cmの長さに達すると、遺伝子導入ペチュニアはオートクレーブに入れた8 cmチューブのDebco51410/2鉢植えミックスに移される。4週間後、植物は15 cmの鉢に、同じ鉢植えミックスを用いて植えかえられ、14時間の光周期（300 μmol.m-2s-1の水銀ハロゲン灯）で23℃に保たれる。
Abidopsisの形質転換
Abidopsis thalianaエコタイプWS-2は、メルボルン大学、Parkville, Melbourne, Australiaから入手された。
【０１６３】
A. thalianaの植物生育条件と形質転換は、本質的にClough and Bent (Plant J., 16: 735-743,1998)に記載されているようなものであったが、形質転換プロセスで、SuRB選択マーカー遺伝子を含むバイナリー・ベクターを用いる場合、形質転換植物の種子は100 μg/mLのクロルスルフロンで選択されたことだけが異なる。
【０１６４】
実施例２
Heron Island サンゴからの新しい彩色タンパク質配列の単離
サンゴのサンプルはHeron Island Reefフラット、Queensland, Australia,から採取された。これらのサンプルは、ここで記述しているように、蛍光顕微鏡の下で生きた組織と認められた。
蛍光性質の評価
表２はCnidaria門から単離されたGFPの分類学的な関係、及び本発明のあるアミノ酸配列（Aams2-pep; SEQ ID NO:88）との比較を示す。蛍光性質は、Olympus蛍光顕微鏡（BH2-RFL）を用いて、表３に示されているようなフィルターの組合せで分析された。表４と５は、AnthozoaとHydrazoaのいろいろな種の生物に関する色の蛍光性質を示す。
全RNA単離
プレート・サンゴは乳鉢とすりこぎで砕かれ、枝サンゴは歯ブラシでこすって直接、Chomczynski and Sacchi, 1987, 前出、に記載されているような冷溶液Dにされた。溶液Dを含む組織はガラス・ホモジナイザーを用いて均質化され、1.5 mlのeppendorfミクロ遠心分離チューブに移された。フェノール・クロロフォルム抽出の前に10% w/v 2M 酢酸ナトリウム（pH 4）溶液が加えられ、抽出された物質はイソプロパノール中に一晩-20℃で沈澱された。ペレットは溶液Dに再懸濁され、再びイソプロパノール中に沈澱された。得られたペレットは3 mMのEDTAと50 mMの酢酸ナトリウム（pH 5）中に溶解され、最終的にエタノール中に-20℃で沈澱され貯蔵された。
cDNAの構成
採取されたサンゴ組織から単離されたRNAを用いてcDNAが作成された。cDNAは、本明細書に参照によって取り込まれるClontech Laboratories (Palo Alto, CA, USA)からの指向性cDNA合成キットを用いて構成された。
PCR増幅用の5'順方向プライマー
SEQ ID NO:1        POC FOR
TCC GTT ATC GCT AAA CAG ATG ACC TAC AAA
SEQ ID NO:2        POC 220 
GGC GAC CAC AGG TTT GCG TGT
SEQ ID NO:3        MSVIAT(FOR)
ATG AGT GTG ATC GCT ACA CAA
SEQ ID NO:1は、サンゴ色素タンパク質をコードする核酸のPCR増幅のためののための5'（すなわち、順方向プライマー）として以前に設計された。SEQ ID NO:1は、アミノ酸、SVIAK (SEQ ID NO:5)を含むポリペプチドをコードする核酸にアニールすることが示された。Dove et al., (2001; 前出)及び国際特許No. WO 00/46233を参照。
【０１６５】
SEQ ID NO:2は、元来、WO 00/46233で開示されたようなサンゴ色素ポリペプチドをコードする核酸のPCR増幅のためののための3'（すなわち、逆方向プライマー）として設計された。意図した核酸の3'領域にアニールする他に、SEQ ID NO:2は、また、ここで開示されるAcropora asperaからのポシロポリンの5' UTR領域にアニールする。
【０１６６】
SEQ ID NO:3は、SEQ ID NO:1とSEQ ID NO:2を用いたPCR増幅生成物からの配列情報に基づいて新しく設計され合成されたものである。増幅された生成物は、国際特許No. WO 00/46233に開示されたポリペプチドに類似した、しかしそれと異なるポリペプチドの新しいアミノ末端をコードする配列を含む5'UTR 配列を含む。この新しいポリペプチドは、アミノ酸(M)SVIAT (SEQ ID NO:6; 図３)を含むアミノ末端を有する。したがって、SEQ ID NO:3は、(M)SVIAT (SEQ ID NO:6)を含むペプチドをコードする核酸にアニールする。ペプチド配列SVIAK (SEQ ID NO:5)と(M)SVIAT (SEQ ID NO:6)はただ１つのアミノ酸が異なるだけであるが、対応する核酸は67%の同一性しか共有していない（18のうち12の核酸）。特に、SEQ ID NO:1は、N-末端ペプチド(M)SVIAT (SEQ ID NO:6)で始まる配列を増幅するのに使用できず、SEQ ID NO:3はSVIAK (SEQ ID NO:5)ペプチドで始まる配列を増幅するのに使用できない。
PCR増幅用の3'逆方向プライマー
SEQ ID NO:4        POC 231  
TTT GTG CCT TGA TTT GAC TCT
SEQ ID NO:2は、また、3'逆方向プライマーとしても用いられた。これは上述されている。SEQ ID NO:4は、以前に単離されたAcropora asperaからのポシロポリンの3'末端にアニールするように設計された（Dove et al., [2001; 前出]及び国際特許No. WO 00/46233）。
PCR増幅
PCR増幅は、上記のSEQ ID NOsの組合せを用いて以下で詳しく述べるように行われた。Hybaid PCR express (Hybaid PCR Express, Integrated Sciences, Australia)が、そこで提供されている指示に従って用いられた。増幅の生成物は1.5% w/v 寒天ゲルでゲル電気泳動によって分離され、所望の核酸を含む核酸バンドが標準的な方法によって視覚化された。所望の核酸を含む寒天ゲルはゲル精製され、ゲル精製された核酸は結紮によってpGemT-ベクター（Promega, Madison, WI, USA）に挿入され、組み換えベクターを生成した。
【０１６７】
挿入された核酸は、T7及びSP6プライマーを用い、それが挿入された核酸に横付けされて配列決定された（配列決定サービスはAGRF; University of Queensland, Australiaから提供された）。インサートの配列決定は少なくとも２回、順方向と逆方向で、曖昧さが解消されるまで行われた。１つの方向で以下の配列が決定された：Ce61-7sv-rep (SEQ ID NO:37); Ce61- 5sv -rep (SEQ ID NO:35); PM1Csv-rep (SEQ ID NO:57); PM1Asv-rep (SEQ ID NO:55); Mi68Dms (SEQ ID NO:119); Acams-3 (SEQ ID NO:101)。
【０１６８】
表６は、アミノ末端にアミノ酸配列SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), SVSAT (SEQ ID NO:9)又は(M)SVIAT (SEQ ID NO:6)を含む本発明のポリペプチドの可能なスペクトル・バリアントをコードする蛍光基から5オングストローム以内のアミノ酸配列を示す。これらのアミノ酸配列は、5'プライマーを用いてPCRによって得られた核酸配列：SEQ ID NO:2 (5'UTR)とSEQ ID NO:3[(M)SVIAT];及び3'プライマーを用いて得られた核酸配列：SEQ ID NO:2とSEQ ID NO:4;から翻訳された。
【０１６９】
表７は、アミノ末端にアミノ酸配列：SVIAK (SEQ ID NO:5)を含む本発明のポリペプチドの可能なスペクトル・バリアントをコードする蛍光基から5オングストローム以内のアミノ酸配列を示す。これらのアミノ酸配列は、5'プライマーを用いてPCRによって得られた核酸配列SEQ ID NO:1 及び3'プライマーを用いて得られた核酸配列SEQ ID NO:2及び3'SEQ ID NO:3から翻訳された。
ポリペプチドのモデル化
ポリペプチドの３次元モデルを用いて蛍光基“QYG”から5オングストローム以内にあるアミノ酸を予測した。これらのアミノ酸はスペクトル性質に影響を及ぼす可能性があり（Tsien, 1998, 前出、及びDove et al., 2001, 前出）、表６と７に示されている。蛍光基から5オングストローム以内にあると予測されるアミノ酸は、アミノ酸残基37, 39, 56-65 (蛍光基QYGを含むもの)、86, 88, 90, 104, 106, 115, 139, 141, 143, 156, 158, 171, 192, 194, 208, 209, 及び210に対応する。アミノ酸残基ナンバーは、アミノ末端アミノ酸S-V-Iをそれぞれ残基1, 2, 及び3として始まるナンバー付けを指す。
【０１７０】
蛍光基から5オングストローム以内にあるアミノ酸残基及び国際特許No. WO 00/46233の表４に開示されているポリペプチドの原子接触の詳細に関する情報は本発明のポリペプチドに関して重要である。表６と７で、“タイプ”は、蛍光基から5オングストローム以内にある共通のアミノ酸のグループ又はクラスを指し、“＊”は内部終止コドンを示す。“ネーム”は多重反復配列からのコンセンサス配列ネームを指す。
【０１７１】
図９は、本発明の色素ポリペプチドの多くをリストし、ポリペプチドの蛍光基領域から5オングストローム以内にあるアミノ酸残基を示している。さらに、いろいろなポリペプチド全体にわたってバリエーションが見られたアミノ酸残基の位置が示されている。ポリペプチド全体にわたって示されている変化するアミノ酸は、ポリペプチドの折り畳みに干渉するので重要かもしれない。
アミノ酸及びヌクレオチド配列の比較
図１と３は、アミノ末端SVIAK (SEQ ID NO:5; 図１)を含むポリペプチド及びアミノ末端又は近くに(M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 及びSVSAt (SEQ ID NO:9)を含むポリペプチド（図３）のアミノ酸配列を示す。Aams-2.pep (SEQ ID NO:88)とAams-4.pep (SEQ ID NO:90)はアミノ末端に別のアミノ酸を含むことが示される。図１と３に示されるアミノ酸配列の対応するヌクレオチド配列の整列は図２と４に、それぞれ、示されている。
【０１７２】
したがって、５つの共有されるアミノ酸配列SVIAK (SEQ ID NO:5)、(M)SVIAT (SEQ ID NO:6), SGIAT (SEQ ID NO:7), SVIVT (SEQ ID NO:8), 及びSVSAt (SEQ ID NO:9)を含むポリペプチドはグループ分けできる。上記のアミノ酸に直接に隣接する別の共通アミノ酸を下に示す：
SVIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:10);
SVIAT QMTY KVYM PGT (SEQ ID NO:11);
SVIAT QVTY KVYM SGT (SEQ ID NO:12);
SGIAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:13);
SVIVT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:14);
SVSAT QMTY KVYM SGT (SEQ ID NO:15);
SVIAK QMTY KVNM SGT (SEQ ID NO:16);
SVIAK QMTY KVNM SDT (SEQ ID NO:17); 及び
SVIAK QMTY X1X2YX3 SGT (SEQ ID NO:18),
ここで、X1、X2、及びX3は、X1がKでなく、X2がVでなく、X3がMでない限りどんなアミノ酸であってもよい。
【０１７３】
図５は、アミノ末端にSVIAK (SEQ ID NO:5)を含み、対応するアミノ酸残基14にストップ又は終止コドンを含むアミノ酸配列の整列を示す。終止コドンは２つの核酸残基の付加から生ずる。得られるポリペプチドは、この終止コドンを欠いているポリペプチドと比較すると大きく異なる。対応する核酸配列の整列は図６に示されている。これらの核酸は終止コドンを欠いているものより約40ヌクレオチド塩基長い（図６）。差異は、図７を参照するともっと分かり易い。この図は、終止コドンを含むある核酸配列（SEQ ID NO:169）と終止コドンを欠いている核酸配列（SEQ ID NO:19）の整列を示す。
【０１７４】
以前に開示されたSVIAK (SEQ ID NO:5)を含むタンパク質Aapat-1 (SEQ ID NO:181)とAapat-2 (SEQ ID NO:182)も、図８に本発明のSVIAK (SEQ ID NO:5)を含むポリペプチドの多くと共に、アミノ酸配列整列で含まれている。影をつけたアミノ酸残基は、SEQ ID NO:181 及び／又はSEQ ID NO:182にユニークナアミノ酸を示す。
【０１７５】
実施例３
Melbourne サンゴからの新しい彩色タンパク質配列の単離
サンゴからの彩色タンパク質の抽出と視覚化
いろいろなサンゴと藻類のサンプルは、Water World Aquarium (Melbourne, Australia)とCoburg Aquarium (Melbourne, Australia)から購入した。それらは、Goniopora sp. (“フラワーポット・サンゴ”)[褐色の触毛と紅緑色の水中センター]、緑色のAcropora sp.サンゴ（“エダミドリイシ”）、褐色／ライトブルーPorites sp. サンゴ（“フィンガー”）、Sinularia sp.及びTubastrea sp. サンゴ、ならびにディープブルーと明るいオレンジのCorallimorphs (Discosoma sp.)。
【０１７６】
各サンゴの小さなサンプルが、1 M リン酸ナトリウム緩衝液pH 7.5で4℃でインキュベートされた。死んだサンゴ（普通、生きている岩として売られている）に生育していた“紅藻”のサンプルも緩衝液に集められた。48時間後、Acropora sp.抽出物は黄褐色に見え、Porites sp. 抽出物はオレンジ色に見え、紅藻の抽出物は透明なピンクの色に見えた。
【０１７７】
抽出物を紫外線にさらすと、Acropora sp.抽出物はオレンジとブルーの分画を含み、Porites sp. 抽出物はピンクの分画を含み、“紅藻”の抽出物は明るいオレンジ色であった。
【０１７８】
Goniopora sp.サンゴのチップは1 M リン酸ナトリウム緩衝液pH 7.5で抽出された。4℃で一晩インキュベートした後、抽出物は自然光の下でオレンジ−ピンク色に見え、紫外線の下でオレンジ色に見えた。蛍光の緑色の分画も、固相で紫外光の下で見られた。
【０１７９】
上述の粗抽出物の10 μLサンプルがプレキャストSDS PAGEゲル（12% w/v resolvingゲル、4% w/v stackingゲル）（Ready Gels, Biorad）を通して25 mM Tris-HCl, pH8.3, 192 mM グリシン、0.1% w/v SDSを流動緩衝液として100 Vで75分間電気泳動させた。粗タンパク質抽出物は、10% v/v グリセリン、3% w/v SDS, 3% β-メルカプトエタノール、0.025% w/v ブロムフェノール・ブルー中で煮沸して変性されるか、又は生の状態で5% w/v グリセリン、0.04% w/v ブロムフェノール・ブルーにロードされた。標準は、予備染色されたLow Orangeマーカー（Biorad）を含み、それは116 kDa, 80 kDa, 51.8 kDa, 及び34.7 kDaの標準タンパク質サンプルを含んでいた。
【０１８０】
Coomassie blue (0.25% (w/v)Coomassie Brilliant Blue, 45%(v/v) メタノール、10%(v/v)酢酸)で染色する前に、PAGEゲルは手持ちのUVトランスイルミネーター（BLAK-RAY, 長波紫外線ランプ、モデルB100AP, UVP Inc.）の下で検査された。Goniopora sp.からの変性されない粗タンパク質抽出物は、オレンジの帯（116 kDa マーカー・タンパク質よりも高い位置）と青緑色の帯（51.8 kDa と80 kDaのタンパク質マーカーの間）を含んでいた。Porites sp.からの変性されない粗タンパク質抽出物は、UV光の下で２つのオレンジの帯をGoniopora sp.からのものとほぼ同じ位置に（すなわち、116 kDa マーカー・タンパク質よりも高い位置）含んでいた。Acropora sp.からの変性されない粗タンパク質抽出物は、UV光の下でGoniopora sp.の帯とほぼ同じ位置（すなわち、116 kDa マーカー・タンパク質よりも高い位置）に単一のオレンジの帯を、さらに緑色の帯を（80 kDa と116 kDaのタンパク質マーカーの間に）含んでいた。
【０１８１】
これらの蛍光の帯は変性された粗タンパク質抽出物のいずれにも見られなかった。Coomasie blue染色前には自然光の下で何もタンパク質の帯は見られなかった。
サンゴからのRNAの単離とcDNAの合成
全RNAがAnthozoans Acropora sp. Sinularia sp. 及びTubastrea sp.から、RNeasy Plant mini kit (Qiagen)を用いて、又はTurpen and Griffith (Biotechniques 4: 11-15, 1986)の方法によって単離された。
【０１８２】
相補DNAは、1 μgの全RNA, 1 μL DNase RQ1 RNase free (Promega), 1μL 10×緩衝液（最終濃度：40 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 10 mM CaCl2）を用いて合成された。反応物は、37℃で10分間、次に65℃で10分間インキュベートされた。１マイクロリットル（1 μg）のプライマーdT(17)Ad2Ad1 (SEQ ID NO:183)が加えられ、反応物は5分間煮沸され、次に氷の上で5分間インキュベートされた。4 μLの5 x RT緩衝液、2 μL 0.1 M DTT, 1 μL 10 mM dNTPS,及び1 μL RNasin (Promega)が加えられ、反応物は50℃で2分間インキュベートされた。次に、1 μL (200 U)Superscript II逆転写酵素（Gibco BRL）が加えられ、反応物は50℃で1.5時間インキュベートされた。cDNAは、QIAquick PCR 精製キット（Qiagen）を用いて精製された。
彩色タンパク質の配列のPCR
オリゴヌクレオチド・プライマー“vispro-F1” (SEQ ID NO:184)と“vispro-R1” (SEQ ID NO:185)は、それぞれ、T7SP6BASPOC3とT7SP6BASPOC4配列の5'及び3'末端とハイブリダイズするように設計された（国際特許出願No. PCT/AU00/00056）。プライマー“vispro-F1” (SEQ ID NO:184) は、バクテリア発現ベクターpQE-30 (Qiagen)にクローニングするためのBamHI部位とバイナリー・ベクターにクローニングするための翻訳開始コドンを含むAscI部位を含んでいた。プライマー“vispro-R1” (SEQ ID NO:185)は、バクテリア発現ベクターpQE-30 にクローニングするためのPstI部位とバイナリー・ベクターにクローニングするための翻訳開始コドンを含むPacI部位を含んでいる。
【０１８３】
【化１】
2005518182.tif 000009
【０１８４】
ポリメラーゼ連鎖反応は、20 pmole vispro-F1 (SEQ ID NO:184)及び20 pmole vispro-R1 (SEQ ID NO:185)プライマーを用い、テンプレートとしてサンゴから合成された5 μL cDNA, 2.5ユニットのHotStarTaq (商標)DNAポリメラーゼ（Qiagen）, 200 μM dTNPミックス、及び1 X PCR バッファー（Qiagen）、を50 μL 反応物で用いてセットされた。
【０１８５】
PCR条件は、変性ステップが95℃で15分間、その後94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で1分間、を35サイクル、そして最終処理が72℃で10分間行われた後に4℃で貯蔵するというものであった。
【０１８６】
PCR産物は、1% w/v 寒天ゲルを通して電気泳動された。QIAEX II ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて~700 bpの生成物がゲルから切り出され、精製された。精製されたDNAは、BamHI及びPstI制限酵素によって消化され、QIAquick PCR精製キット（Qiagen）を用いて再精製された。精製されたDNAは、バクテリア発現ベクターpQE-30（Qiagen）のBamHI/PstI末端に結紮された。結紮されたDNAは、Escherichia coli BL21-RIL, M15 （pREP4（Qiagen））、又はXL1-blueコンピテント細胞に形質転換され、100 μg/mLのアンピシリンを含むLuria Broth(LB)寒天平板に植えられた。一晩37℃でインキュベートした後、ナイロン膜（DuPont/KEN）上のコロニーを取り出し、コロニー側を上にして100 μg/mLのアンピシリンと1 mM IPTG を含むLB寒天に載せられた。プレートは37℃で一晩、又は室温で二晩インキュベートされた。自然光の下で眼に見えるブルー及び深紅の色のコロニーがAcropora sp., Discosoma sp., Sinularia sp., 及びTubastrea sp.に由来する生成物から得られた。
【０１８７】
深紅及びブルーのコロニーの培養が37℃で開始され一晩インキュベートされた。プラスミドDNAが単離され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析された。深紅のコロニーから単離されたDNAは、pCGP2915 (Acropora sp.からのA10クローン)、pCGP2916 (Acropora sp.からのA11クローン)、pCGP2917 (Acropora sp.からのA12クローン)、pCGP2918 (Acropora sp.からのA8クローン)、pCGP2920 (Discosoma sp.からのD10クローン)、pCGP2922 (Tubastrea sp.からのT3クローン)、pCGP2924 (Sinularia sp.からのS3クローン)、を含んでいた。
【０１８８】
ブルーのコロニーから単離されたプラスミドDNAは、pCGP2919 (Discosoma sp.からのD1クローン)、pCGP2921 (Tubastrea sp.からのT1クローン)、pCGP2923 (Sinularia sp.からのS1クローン)、を含んでいた。
【０１８９】
上記のプラスミドの全ての設計図については図１０を見よ。
cDNAクローンの配列分析
pQE-30に含まれるcDNAクローンの完全な配列分析は、pQEprom (Qiagen)(SEQ ID NO:186), pQErev (Qiagen)(SEQ ID NO:187), Coral-R1 (SEQ ID NO:188), vispro-F1 (SEQ ID NO:184), 及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185),を配列決定プライマーとして用いて得られた。
SEQ ID NO:186      pQEprom
CCCGAA AAG TGC CAC CTG
SEQ ID NO:187      pQErev
GTT CTG AGG TCA TTA CTG G
SEQ ID NO:188      Coral-R1
TCA GGG TAC TTG GTG AAT GG
完全なヌクレオチド配列は以下から生成された：−
pCGP2918 (SEQ ID NO:189)に含まれるAcropora sp.からのA8 cDNA
pCGP2920 (SEQ ID NO:191)に含まれるDiscosoma sp.からのD10 cDNA
pCGP2924 (SEQ ID NO:193)に含まれるSinularia sp.からのS3 cDNA
pCGP2922 (SEQ ID NO:195)に含まれるTubastrea sp.からのT3 cDNA
pCGP2919 (SEQ ID NO:197)に含まれるDiscosoma sp.からのD1 cDNA
pCGP2923 (SEQ ID NO:199)に含まれるSinularia sp.からのS1 cDNA
pCGP2921 (SEQ ID NO:201)に含まれるTubastrea sp.からのT1 cDNA。
【０１９０】
A8ヌクレオチド配列は、推定される223のアミノ酸（SEQ ID NO:190）のポリペプチドをコードする、推定される669塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。
【０１９１】
D10ヌクレオチド配列は、推定される223のアミノ酸（SEQ ID NO:192）のポリペプチドをコードする、推定される669塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。
【０１９２】
S3ヌクレオチド配列は、推定される223のアミノ酸（SEQ ID NO:194）のポリペプチドをコードする、推定される669塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。
【０１９３】
T3ヌクレオチド配列は、推定される223のアミノ酸（SEQ ID NO:196）のポリペプチドをコードする、推定される669塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。
【０１９４】
D1ヌクレオチド配列は、推定される223のアミノ酸（SEQ ID NO:198）のポリペプチドをコードする、推定される669塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。
【０１９５】
S1ヌクレオチド配列は、推定される223のアミノ酸（SEQ ID NO:200）のポリペプチドをコードする、推定される669塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。
【０１９６】
T1ヌクレオチド配列は、推定される223のアミノ酸（SEQ ID NO:202）のポリペプチドをコードする、推定される669塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでいた。
【０１９７】
ヌクレオチドとアミノ酸の配列の類似性はLALIGN (Huang and Miller, 1991, 前出)を用いて決定された。サンゴの４つの種から単離された配列は、核酸及びアミノ酸の配列の高い類似性を共有している（表８と表９）。
【０１９８】
実施例４
Heron Island サンゴcDNAsからの彩色タンパク質の発現
バクテリアにおける発現のために、CFMsをコードするヌクレオチド配列が、NotI制限結合部位、リボソーム結合部位、スペーサー及びタンパク質のN-末端をコードする15 塩基から成る順方向オリゴヌクレオチド・プライマー及びH6-タグ（POC220-H6; POC220はSEQ ID NO:2）をコードする逆方向オリゴヌクレオチド・プライマーを用いてpGEM-Tクローニング・ベクターから取り出された。PCR産物は、ゲル精製され希釈されて（x 10）からPCRII-TOPOにクローニングされ、Top 10 細胞（Invitrogen）に形質転換された。細胞は0.5 mM IPTGによって誘導され、タンパク質は、PBS pH 6.0中50 mM, 200 mM, 350 mM及び500 mM Imidazoleで溶出するNi-カラム（Pro-Bond, Invitrogen）で精製した後, 50 mM リン酸カリウム pH 6.65で一晩透析された。
タイプ１ペプチドの例の発現
バクテリアにおけるタイプ１の（表６と７及び図９に定義されているような）配列の発現の結果は表１０に示されている。非同一配列だけが示されている。いくつかの他の配列は、表に示されているものと同一であり、表のトップに示されている（すなわち、Acasv-D = PavsvB, etc.）。配列の整列は国際特許No. WO 00/46233 とDove et al. (2001; 前出)。アミノ酸配列の上の水平のバーは、GFP構造からのβ−鎖を表す。発色基“QYG”は黒いバックグラウンド上の白いタイプで示されている。配列中のアミノ酸の差異は灰色の影で示されている。
【０１９９】
タイプ１の配列の多数はディープ・ブルーでλmaxが589 nmから593 nmまでの範囲にある。Acasv-D (SEQ ID NO:30)と比べてRTms5 (SEQ ID NO:166)に見られるような、天然に見られるアミノ酸置換L161Pは透明なバクテリアに導き、それはもはや520 nm - 600 nmの範囲で吸収しない。P161Lの逆置換は、この範囲における吸収を回復する。整列は、タンパク質の色に影響するように見えるアミノ酸とそうでないアミノ酸を示している。
【０２００】
発現されたタイプ１の配列の例に関する吸収のスキャンが図１１に示されている。この図及びその後の図１２と１３に示されているように、λmaxでの吸光係数はタンパク質の検出のためのWhitaker and Granum (1980, 前出)の方法に基づいている。吸光係数のばらつきは一部はタンパク質の成熟の状態による；同様のばらつきはDsRedについても示されている（Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11984-11989）。
タイプ２と１４のペプチドの例の発現
バクテリアにおけるタイプ２の配列の発現の結果は表１１に示されている。やはり、非同一の配列だけが示されている。他の配列、表に示されているものと同一な配列、は表のトップに示されている（すなわち、PMms-B = PMms-E = PPd57-4ms, etc.）。タイプ２の配列の多数はピンキーパープルで、λmaxが579 nmから580 nmまでの範囲にある。天然に見られるアミノ酸置換P15Sは透明なバクテリアに導き、それはもはや520 nm - 600 nmの範囲内で吸収しない。整列は、タンパク質の色に影響を及ぼさないアミノ酸を示しているが、これらのタンパク質のあるものは、他のものよりも集合して沈澱する傾向が大きい。
【０２０１】
バクテリアにおけるタイプ１４の配列の発現を追跡した同様の結果が表１２に示されている。非同一の配列だけが示されている。表の型式は表１０及び１１と同じである。タイプ１４の配列の多数はピンキーパープルで、λmaxが579 nmから579.5 nmまでの範囲にある。整列は、タンパク質の色に影響を及ぼさないアミノ酸を示している。しかし、MisvFとMisvAは、AA147 = Fで、他のものより高い濃度で溶けやすかった。
【０２０２】
タイプ２とタイプ１４の配列のスペクトル性質は似ている。これは、AA61に原因があるのかもしれない。AA61は、この両方の場合にSerであるが、タイプ１ではCysであり、タイプ６の配列ではではThrである。図１２AとBは、発現されたタイプ２とタイプ１４の配列の例に関する吸収スキャンを示している。タイプ１の配列について上で述べたように、観測される吸光係数のばらつきは一部はタンパク質成熟の状態による。
タイプ６のペプチドの例の発現
タイプ６配列の例も同様にバクテリアで発現された。やはり、非同一の配列だけが示されている。この場合、配列の多数はブルーパープルであり、λmaxは583.5 nmから585.5 nmまでの範囲にある。整列は、天然に見られるアミノ酸置換V8M及び／又はT182Pが、G238のように、無色のバクテリアに導くこと、及びAA101とAA147における置換はλmaxにわずかな影響を及ぼすことを示している。結果は表１３に示されている（上を見よ）。型式は表１０，１１，及び１２と同じである。
【０２０３】
図１３は、発現されたタイプ６の配列の例に関する吸収スキャンを示している。既に上で述べたように、観測される吸光係数のばらつきは一部はタンパク質成熟の状態によるものであり、同様なばらつきはDsRedについても示されている（Baird et al., 2000）。
他のタイプのペプチドの例の発現
主なタイプ１，２，６及び１４以外の配列タイプのバクテリアにおける発現の結果が表１４に示されている（上を見よ）。ブルーパープル又はピンクを発現できなかった配列の多くは、これが存在している主要なGFPでなかったcDNAから単離された。
【０２０４】
実施例５
彩色タンパク質に関する全可溶タンパク質の量の推定
Acropora aspera の２つのカラー・モルフ（ダーク・ブルー色素モルフとクリーム・モルフ）の生リン酸緩衝液抽出物を用いて全可溶タンパク質に対する彩色タンパク質の比率を決定した。２つの別々の推定が行われた−吸収分光による推定とゲル濾過による推定である（各ケース、n = 5; 95%信頼区間）。結果は図１４A/Bに示されている。
【０２０５】
図１４Aは、２つのAcropora aspera のモルフの吸収スキャンを示す。サンゴ組織の表面積あたりのブルーパープル・ポシロポリン濃度の推定（Dove et al., 1995, 前出；Dove et al., 2001, 前出）は、50,000 - 100,000 M-1cm-1という吸光係数範囲に基づく。図１４Bは、ゲル濾過タンパク質溶出のクロマトグラムの結果を示す。これは、235 nmと280 nmクロマトグラムから、（235 nm - 280 nm）/2.51という式を適用して決定されたものである（Whitaker and Granum, 1980, 前出）。グラフの下の総面積は全可溶タンパク質の尺度を与える。ブルーパープル・ポシロポリン濃度は、ポシロポリン溶出の範囲（24 - 26.5 min）におけるブルーのグラフとクリームのグラフの下の面積の差に基づく。注目されることは、ブルーパープル・ポシロポリン濃度を求める独立な方法が同様の結果を与えるということである。
【０２０６】
実施例６
Melbourne サンゴcDNAからの彩色タンパク質の発現
Discosoma sp. (D2, pCGP2925 (色はブルー))、Sinularia sp. (S1, pCGP2923)、及びTubastrea sp. (T1, pCGP2921, T3pCGP2922)からのサンゴcDNAクローンのコロニーが一晩、振動させながら、37℃で100 μg/mLのアンピシリンを含む2 mL のLB培地中で培養された。一晩培養されたもの1 mLを用いて、100 μg/mLのアンピシリンを含む25 mL のLB培地に接種した。この培養は次に、振動させながらOD600が約0.5になるまで37℃でインキュベートされた。IPTG が最終濃度1 mMになるまで加えられ、培養は一晩37℃で振動させながら育成された。インキュベートされた培養の細胞（10 mL）が、2000 rpmで10分間の遠心分離によってペレットにされた。自然光の下で、バクテリアのペレットとD2(pCGP2925), S1(pCGP2923), 及びT1(pCGP2921)の上澄みはブルー、T3(pCGP2922)の上澄みは深紅だった。バクテリア・ペレットは-20℃で貯蔵された。
【０２０７】
培養の上澄みに含まれるタンパク質が、Centricon 30 スピン・カラム（Amicon）をメーカーの指示に従って用いて濃縮された。各濃縮されたタンパク質抽出物の最終体積は~200 μLであった。
【０２０８】
培養の上澄みから得られた濃縮タンパク質のアリクオット（8 μL）が、プレキャストSDS PAGE ゲル（12% w/v resolving, 4% w/v stacking ゲル）（Ready Gels, BIORAD）を通して、25 mM Tris-HCl, Ph 8.3, 192 mMグリシン、0.1% w/v SDSから成る走行緩衝液で、100 Vで75分間電気泳動された。標準はBiorad 染色広域マーカーで、206 kDa, 119 kDa, 91 kDa, 51.4 kDa, 34.7 kDa, 28.1 kDa, 20.4 kDa, 及び7.2 kDaの標準タンパク質サンプルを含んでいた。
【０２０９】
サンプルは、10% v/v グリセリン、3% w/v SDS, 3% β-メルカプトエタノール（β-ME）、0.025% w/v ブロモフェノールブルー中で煮沸することによって変性されるか、又は10% v/v グリセリン、3% w/v SDS, 0.025% w/v ブロモフェノールブルー中で煮沸することによって変性されるか、又はそのままの状態で5% w/v グリセリン、0.04% w/v ブロモフェノールブルーに装荷された。
【０２１０】
Coomassie blueによって染色する前に、タンパク質のバンドは手持ち式紫外線ランプの下で検査された。いずれのサンプル似も、紫外光の下で蛍光バンドは見えなかった。しかし、自然光の下では、28 kDaのタンパク質標準と同じ位置にある青色のバンドが、D2上澄みからの濃縮タンパク質サンプルに見られた。T1とS1上澄みからの非変性濃縮タンパク質サンプルでは、自然光の下で28 kDa と51 kDaのタンパク質標準の間に拡がる青いにじみが見られた。S3上澄みからの非変性濃縮タンパク質サンプルでは、自然光の下で28 kDa と51 kDaのタンパク質標準の間に拡がる深紅のにじみが見られた。煮沸によって変性されたサンプルでは自然光の下でどんなバンドも見られなかった。ゲルをCoomassie blue で染色すると、生成されたタンパク質が25 kDaのタンパク質マーカー（Biorad Precision Broadrange Prestained marker）と一緒に移動することが示された。
【０２１１】
Discosoma sp. からの(pCGP2919のD1)、Sinularia sp.からの(pCGP2923のS1)、及びTubastrea sp.からの(pCGP2921のT1とpCGP2922のT3)サンゴcDNAクローンの、一晩37℃で生育した培養(E. coli, XL1-blue) が、100 μg/mLのアンピシリンを含むLB培地に接種され、振動させながら37℃でさらに、OD600が~0.5になるまでインキュベートされた。IPTGが、最終濃度で1 mMになるまで加えられ、培養は振動させながら37℃で一晩生育された。Tubastrea sp.クローン(T1とT3)が発現したタンパク質が、Ni-NTA Superflow 樹脂（Qiagen; QIAexpressionist 03/97）をメーカーの勧告に従って用いて原生条件で精製された。溶出バッファーは、Sephadex G-25カラム(NAP10; Pharmacia)をメーカーの指示に従って用いて20 mM Tris-HCl pH 8.0に交換された。Discosoma sp.クローンD1とSinularia sp.クローンS1によって発現されたタンパク質は、Ni-NTA法（Qiagen; QIA expressionist 03/97）を用いて原生条件で精製されたが、タンパク質が透明のバクテリア溶出物から65% イソプロパノールを用いて沈澱され、10,000 rpm、4℃で10分間遠心分離された点が異なっていた。彩色ペレットは20 mM Tris-HCl pH 8.0 に再懸濁された。
【０２１２】
pCGP2918のAcropora sp. A8クローン、pCGP2920のDiscosoma sp. D10クローン、pCGP2924のSinularia sp. S3クローン、及びpCGP2922のTubastrea sp. T3クローンによってコードされるタンパク質は、濃縮したとき、深紅色であった（Royal Horticultural Society Color Chart (RHSCC) 88A）。Tubastrea sp. T3クローンとSinularia sp. S3クローンからのタンパク質は約580 nmに吸光度ピークを有していた。
【０２１３】
pCGP2918のDiscosoma sp. D1クローンとpCGP2921のTubastrea sp. T1クローンによってコードされるタンパク質は、濃縮したとき、青色(RHSCC 102A)で、吸光度ピークは約595 nmにあった。pCGP2923のSinularia sp. S1クローンによってコードされるタンパク質は、濃縮したとき、ブルーパープル色(RHSCC 90A)で、吸光度ピークは約590 nmにあった。
アミノ酸配列の整列
コードされるアミノ酸配列T1 (SEQ ID NO:202), D1 (SEQ ID NO:198), S1 (SEQ ID NO:200), A8 (SEQ ID NO:190), T3 (SEQ ID NO:196), D10 (SEQ ID NO:192), 及びS3 (SEQ ID NO:194)の多重整列は、Mac VectorのClustal W(1,4)プログラム（6.5.3; Oxford Molecular Group Plc, 1999）(図１５)を用いて作成された。コードされるアミノ酸の多重整列から、青色、ブルーパープル、及び深紅色を示すタンパク質の間で異なっていたアミノ酸位置は16しかないことが示された。この整列から、タンパク質の色に影響する可能性があるアミノ酸位置は８つあるように見える（表１５）。
【０２１４】
S1によってコードされるタンパク質(SEQ ID NO:200)は、ブルーと深紅色のタンパク質の中間の色を有する。アミノ酸配列の整列（図１５）は、S1アミノ酸配列がブルーのタンパク質に特徴的な４つのアミノ酸をアミノ末端の方向に含み、深紅色のタンパク質に特徴的な４つのアミノ酸をカルボキシ末端の方向に含無ことを示した（表１５）。表１５にリストされた１つ以上のアミノ酸の置換は、タンパク質の眼に見えるカラー特徴に影響を及ぼす可能性がある。
Melbourne 及びHeron Island サンゴのタンパク質配列の整列
上記の７つのポリペプチド（SEQ ID NOs:190, 192, 194, 196, 198, 200 及び202）のアミノ酸配列が、図１に示されているような他のSVIAK (SEQ ID NO:5)含有ポリペプチドと比較された。得られた整列が図１６に示されている。
【０２１５】
実施例７
真核生物Saccharomyces cerevisiae における彩色タンパク質の発現
彩色タンパク質配列が真核細胞において色を生ずることができるかどうかを調べるために、彩色タンパク質cDNAクローンT1 (SEQ ID NO:201)とA8 (SEQ ID NO:189)が酵母発現ベクター(pYE22m)に導入され（Tanaka et al., 1988, 前出）、Saccharomyces cerevisiae株G1315に形質転換された。
pCGP3269とpCGP3270の構成（pYE22mにおけるT1又はA8）
プラスミドpCGP3269 （図１７）とpCGP3270 （図１８）が、それぞれ、T1又はA8 cDNAクローンをpYE22mの酵母グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ・プロモーターの後方にセンス方向でクローニングすることによって構成された（Tanaka et al., 1988, 前出）。
【０２１６】
順方向プライマー（Kpn.6His.F; SEQ ID NO:203）は、6 x HistidineタグがN-末端で彩色タンパク質とin-frameで融合し、5'末端でKpnI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を生ずる彩色タンパク質配列を増幅するように設計された。逆方向プライマー（T1/A8.Sal.R; SEQ ID NO:204）は3'末端にSalI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいた。
【０２１７】
【化２】
2005518182.tif 000010
【０２１８】
T1(SEQ ID NO:201)とA8(SEQ ID NO:189)のコーディング領域は、プライマーKpn.6His.F(SEQ ID NO:203)とT1/A8.Sal.R(SEQ ID NO:204)及びプラスミドDNA  pCGP2921(T1)（図１０）とpCGP2918(A8) （図１０）をテンプレートとして用いてPCRによって増幅された。~700 bp のPCR産物は、QIA quick PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製され、次に制限エンドヌクレアーゼKpnIとSalIによって消化された。KpnI/SalIで消化された生成物は最後にQIA quick PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製され、その後、DNA 結紮キット(Amersham)をメーカーの勧告に従って用いて、pYE22m酵母発現ベクター（Tanaka et al., 1988 前出）のKpnI/SalI末端に結紮された。酵母発現ベクターへのT1又はA8 cDNAクローンの正しい挿入は、トリプトファン・プロトトロフィー（prototrophy）に対してG-1315を回復する能力によって選択された形質転換体の色を眼で見て確認された。酵母発現ベクターpYE22mにおけるT1クローン（pCGP3269と呼ばれる）は酵母株G1315に導入されると青い色のコロニーを生じた（RHSCC 101C）。酵母発現ベクターpYE22mにおけるA8クローン（pCGP3270と呼ばれる）は酵母株G1315に導入されると深紅色のコロニーを生じた（RHSCC 82B）。
【０２１９】
実施例８
バクテリアと酵母培養によって生成される彩色タンパク質の量の推定
Saccharomyces cerevisiaeにおける彩色タンパク質発現の定量化
pCGP293269（図１７）又はpCGP3270（図１８）を収容している酵母細胞の純粋培養が、100 mLのYEPD 液体肉汁（1% 酵母エキス、2% bacto-pepton, 2% w/v グルコース、pH 5.0）で、48時間、27℃で生育された。培養は、2000 rpmで15 分間遠心分離された。得られたペレットは青色（pCGP3270）と深紅色（pCGP3269）であった。His-タグをもつ彩色タンパク質は、原生条件の下で、まずペレットを4 mL lysis バッファ（50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール、5 mg/mL 酵母溶解酵素(IBN)）に再懸濁させて抽出され、30℃で1 時間インキュベートされた。溶液は、氷上で10秒間10回、間に15秒間の冷却をはさんで超音波処理された。次に、溶解産物は10,000 rpmで10分間遠心分離され、上澄み（粗抽出物）が集められた。His-タグをもつ彩色タンパク質は、ニッケル−ニトリロトリ酢酸金属アフィニティー・クロマトグラフィー（Qiagen）をメーカーの勧告に従って用いて精製された。
【０２２０】
粗抽出物のタンパク質含有量と精製された彩色タンパク質は、Bio-Rad Protein Assayと1, 3, 及び5 μLアリクオットの抽出物をメーカーの指示に従って用いて測定された（Bio-rad Microassay Procedure）。595 nmにおける吸光度を、ウシ血清アルブミン（BSA）標準カーブ（0-10 μg/mL）と比較してタンパク質濃度を推定した。
【０２２１】
粗抽出物のサンプルと既知量の精製されたHis-タグ付き彩色タンパク質の希釈シリーズが、実施例３で述べたように、プレキャストSDS PAGE ゲル（12% w/v resolving, 4% w/v stackingゲル）（Ready Gels, Biorad）を通して電気泳動された。次に、ゲルはCoomassie blue (0.25% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 45% (v/v) メタノール, 10% (v/v) 酢酸)で染色され、粗抽出物中の彩色タンパク質の量は、染色されたバンドの強度を精製されたHis-タグ付き彩色タンパク質の希釈シリーズと比較して推定された。これにより、酵母における彩色タンパク質の発現を全可溶タンパク質のパーセンテージで推定することができた（表１６）。
Escherichia coliにおける彩色タンパク質発現の定量化
プラスミドpCGP2921 (T1)（図１０）（実施例３）を収容しているEscherichia coli XL1blue の一晩おいた培養1 mLを用いて、（50 μg/mLのアンピシリンを含む）100 mLのLB肉汁に接種し、200 rpm で振動させながらOD600が0.5-0.7の間になるまでインキュベートした。IPTGを1 mMまで加えてタンパク質の生成を誘導し、200 rpmで振動させながら一晩29℃でインキュベートした。細胞は2000 rpmで15 分間遠心分離してペレットにした。得られたペレットは青色であった。ペレットは、4 mL lysis バッファ（50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール）に再懸濁させ、氷上で10秒間6回、間に15秒間の冷却をはさんで超音波処理した。溶液は、10,000 rpmで10分間遠心分離され、（粗抽出物）上澄みが集められた。His-タグ付き彩色タンパク質（T1）は、原生条件の下で、ニッケル−ニトリロトリ酢酸金属アフィニティー・クロマトグラフィー（Qiagen）をメーカーの勧告に従って用いて抽出された。
【０２２２】
粗抽出物のタンパク質含有量と精製された彩色タンパク質は、Bio-Rad Protein Assayと1, 3, 及び5 μLアリクオットの抽出物を用いて、メーカーの指示に従って測定された（Bio-rad Microassay Procedure）。595 nmにおける吸光度を、BSA標準カーブ（0-10 μg/mL）と比較してタンパク質濃度を推定した。
【０２２３】
粗抽出物のサンプルと既知量の精製されたHis-タグ付き彩色タンパク質の希釈シリーズが、（上述のように）酵母培養からの粗抽出物と同様に、SDS PAGE ゲル（12% w/v resolving, 4% w/v stackingゲル）（Ready Gels, Biorad）を通して電気泳動された。粗抽出物中の彩色タンパク質の量は、染色されたバンドの強度を精製されたHis-タグ付き彩色タンパク質の希釈シリーズの強度と比較して推定された。これにより、E. coliにおける彩色タンパク質の発現を全可溶タンパク質のパーセンテージで推定することができた（表１６）。
【０２２４】
実施例９
構成性プロモーターの制御の下での彩色タンパク質の発現
pCGP2756(35S: MCS: 35S発現カセット)の構成
プラスミドpCGP2756（図１９）は、pNEB193 (New England Biolabs)から（稀少な制限エンドヌクレアーゼ部位PacIとAscIを含む）多重クローニング部位（MCS）をpRTppoptcAFPのCaMV358発現カセットにクローニングして構成された（Wnendt et al., Curr. Genet. 25: 510-523, 1994）。プラスミドpRTppoptcAFPは、EcoRIとXbaIによって消化されて、300 bp AFP (抗菌タンパク質)インサートとCaMV 35S発現カセットを含む3.3 kbベクターを放出する。プラスミドpNEB193は、EcoRIとXbaIによって消化されて、多重クローニング部位を含む40 bpの断片を放出する。pNEB193からの40 bpのEcoRI/ XbaI断片とpRTppoptcAFP からのCaMV 35S発現カセットを含む3.3 kbベクター は、QIAEX II ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、結紮された。結紮は、Amersham 結紮キットを用いて行われた。pCGP2756への断片の正しい挿入は、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（SalI, KpnI, BamHI, XbaI, AscI, PacI, HindIII/BamHI）によって確認された。
pCGP2757 (35S: MCS: 35S バイナリー・ベクター)の構成
プラスミドpCGP2757（図２０）は、pCGP2756（上述）のCaMV発現カセットをバイナリー・ベクターpWTT2132(DNAP)にクローニングすることによって構成された。プラスミドpCGP2756はPstIで消化されてpNEB193から多重クローニング部位を含む0.7 kbのCaMV発現カセットを放出する。この0.7 kbの断片はQIAEX II ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pWTT2132バイナリー・ベクターのPstI末端に結紮された。pWTT2132のCaMV35S: surB カセットへのタンデム（tandem）方向での断片の正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（KpnI, PacI/AscI, EcoRI, XbaI, PstI）によって確認された。
【０２２５】
プライマーvispro-F1(SEQ ID NO:184)及びvispro-R1(SEQ ID NO:185)を用いて、又はAscI及びPacI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むプライマーを用いて得られたCFMs又は彩色タンパク質のPCR産物は、AscI及びPacIによって消化することができ、pCGP2757のAscI/PacI末端に結紮することができる。
pCGP2765(35S: A8: 35Sバイナリー)の構成
プラスミドpCGP2765（図１）は、Acropora sp.から増幅されたA8 PCRクローンをpCGP2757(上述)のバイナリー・ベクターに含まれるCaMV35S発現カセットにクローニングすることによって構成された。vispro-F1(SEQ ID NO:184)及びvispro-R1(SEQ ID NO:185)プライマーを用い、Acropora sp.全RNAから合成されたcDNAをテンプレートとして用いて生成されたA8 PCR産物（実施例１を見よ）が、AscI及びPacIによって消化された。~0.7 kbの断片がQIAEX II ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP2757バイナリー・ベクターのAscI/PacI末端と結紮された。CaMV 35Sプロモーターの後方のセンス方向への断片の正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（EcoRI, PstI, BstXI）によって確認された。
pCGP2769(35S: D1: 35Sバイナリー)の構成（図２２）
プラスミドpCGP2769（図２２）は、Discosoma sp.から増幅されたD1 PCRクローンをpCGP2757(上述)のバイナリー・ベクターに含まれるCaMV35S発現カセットにクローニングすることによって構成された。プライマーvispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1(SEQ ID NO:185)を用い、テンプレートpCGP2919(D1 cDNA クローンを含む)を用いて生成されたPCR産物がAscI及びPacIによって消化された。PCRは、200 μM dNTPs, 20 pmol vispro-F1 (SEQ ID NO:184), 20 pmol vispro-R1 (SEQ ID NO:185), 1 x Pfu バッファ（Stratagene）, 2.5 ユニットPfu trubo DNA ポリメラーゼ(Stratagene), 及びテンプレートとしての~2 ng pCGP2919 プラスミドDNA, による50 μL反応で行われた。~0.7 kbの断片がQIAEX II ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP2757バイナリー・ベクターのAscI/PacI末端と結紮された。CaMV35Sプロモーターの後方のセンス方向での断片の正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（EcoRI, PstI, BstXI, BamHI）によって確認された。
pCGP2770(35S: S1: 35Sバイナリー)の構成(図２３)
プラスミドpCGP2770（図２３）は、Sinularia sp.から増幅されたS1 PCRクローンをpCGP2757(上述)のバイナリー・ベクターに含まれるCaMV35S発現カセットにクローニングすることによって構成された。プライマーvispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185)を用い、テンプレートとして（S1 cDNAクローンを含む）pCGP2923を用いて生成されたPCR産物が、AscI及びPacIによって消化された。PCRは、200 μM dNTPs, 20 pmol vispro-F1 (SEQ ID NO:184), 20 pmol vispro-R1 (SEQ ID NO:185), 1 x Pfu バッファ（Stratagene）, 2.5 ユニットPfu trubo DNA ポリメラーゼ(Stratagene), 及びテンプレートとしての~2 ng pCGP2923 プラスミドDNA, による50 μL反応で行われた。~0.7 kbの断片がQIAEX II ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP2757バイナリー・ベクターのAscI/PacI末端と結紮された。CaMV35Sプロモーターの後方のセンス方向での断片の正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（EcoRI, PstI, BstXI, BamHI）によって確認された。
pCGP2772 (35S: T1: 35Sバイナリー)の構成（図２４）
プラスミドpCGP2772（図２４）は、Tubastrea sp.から増幅されたT1 PCRクローンをpCGP2757(上述)のバイナリー・ベクターに含まれるCaMV35S発現カセットにクローニングすることによって構成された。プライマーvispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185)を用い、テンプレートとして（T1 cDNAクローンを含む）pCGP2921を用いて生成されたPCR産物が、AscI及びPacIによって消化された。PCRは、200 μM dNTPs, 20 pmol vispro-F1 (SEQ ID NO:184), 20 pmol vispro-R1 (SEQ ID NO:185), 1 x Pfu バッファ（Stratagene）, 2.5 ユニットPfu trubo DNA ポリメラーゼ(Stratagene), 及びテンプレートとしての~2 ng pCGP2921プラスミドDNA, による50 μL反応で行われた。~0.7 kbの断片がQIAEX II ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP2757バイナリー・ベクターのAscI/PacI末端と結紮された。CaMV35Sプロモーターの後方のセンス方向での断片の正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（EcoRI, PstI, BstXI, BamHI）によって確認された。
pCGP2926 (35S: His T1: 35Sバイナリー)の構成
T1のヒスチジン・タグ付きバージョンもCaMV35S遺伝子発現カセットで発現するために生成された。このT1の修飾バージョンの発現は、発現されたT1タンパク質を容易に濃縮して植物で生成されている量を計算する方法を可能にする。
【０２２６】
RGS-His エピトープが２つの相補的プライマーTICS-His-FWD (SEQ ID NO:227)とTICS-His-REV (SEQ ID NO:228)の結紮によって作り出された。この結紮によって、原核リボソーム結合部位(RBS)、翻訳開始コンセンサス配列(TICS)（植物における最適翻訳のため）、RGS-Hisエピトープ（アミノ酸RGSHHHHHHをコードする配列から成る）及び張り出しているAscI（5'末端）とBamHI（3'末端）への配列を含む断片を生じた。このAscI/BamHI断片がプラスミドpCGP2781（図３２）のAscI/BamHI末端に結紮された。pCGP2781へのインサートの正しい結紮は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析によって確認された。このプラスミドはpCGP2926と名づけられた（図４４）。
【０２２７】
【化３】
2005518182.tif 000011
【０２２８】
A. tumefaciens の形質転換
プラスミドpCGP2772とpCGP2765がAgrobacterium tumefaciens株AGL0に、50 mL LB培地に接種され、28℃で16時間、振動させながら培養して調製された100 μLのコンピーテントAGL0細胞に5 μgのプラスミドDNAを加えることによって導入された。次に、細胞をペレットにして、0.5 mLの85% v/v 100 mM CaCl2/15% v/v)グリセリンに再懸濁させた。DNA-Agrobacterium混合物は液体N2に2分間インキュベートして凍らせ、37℃で5分間インキュベートして解凍させた。次に、DNA/バクテリア混合物はさらに氷上に10分間載置された。その後、細胞は1 mLのLB培地（Sambrook et al., 1989, 前出）に混合され、28℃で16時間、振動させながらインキュベートされた。pCGP2772とpCGP2765 を含むA. tumefaciens細胞は50 μg/mLのテトラサイクリンを含む寒天平板で選択された。pCGP2772とpCGP2765の存在は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析によって確認された。
【０２２９】
実施例１０
植物における彩色タンパク質の空間的及び時間的な発現
CaMV35Sなどの構成性プロモーターは、植物全体にわたるCFM又は彩色タンパク質の発現を導くために利用でき、全体植物に関して新しい表現型が求められる場合に有用である。しかし、場合によっては、新しい色が、花、種子、葉、繊維（例えば、木綿繊維）、茎、根、花粉、など特定の組織について求められる。このような場合、組織特異的なプロモーターを用いて特定組織をターゲットにしてCFM又は彩色タンパク質を発現させることができる。空間的及び時間的な発現を誘導するプロモーターの利用が記載されているケースは文献に数多くある。プロモーターとしては、種子特異的プロモーター（Song et al., Journal of Cotton Science 4: 217-223, 2000）、葉及び葉緑素含有組織特異的プロモーター（Song et al., 2000, 前出）、及び塊茎特異的プロモーター（Rocha-Sosa et al., EMBO J 8: 23-29, 1989）などの例があるが、それだけに限定されない。
バラCHSプロモーターの単離
バラ・ゲノムDNAライブラリーが、Rosa hybrida cv.Kardinalから作成された。
【０２３０】
このバラ・ライブラリーがバラCHS cDNAクローンでスクリーニングされた。  翻訳開始部位の上流にある6.6 kbの断片がpBluescript KS(-) (Stratagene)にクローニングされ、そのプラスミドがpCGP1114と名づけられた。
【０２３１】
プラスミドpCGP1114は、HindIIとEcoRVで消化されて~2.7-3.0 kbの断片を放出し、それがBresaclean kit (Geneworks)を用いて精製され、pUC19 (New England Biolabs)のHindIII/SmaI末端と結紮された。バラCHSプロモーター断片の正しい挿入は、アンピシリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析によって確認された。得られたプラスミドはpCGP1116と名づけられた（図２５）。
pCGP3255(バラCHS 5': 35S 3' プレバイナリー)の構成
プラスミドpCGP3255（図２６）は、バイナリー・ベクターpCGP2757のCaMV35SプロモーターをpCGP1116からのバラCHSプロモーター断片で置き換えることによって構成された。プラスミドpCGP1116は最初にHindIIIによって消化された。張り出している5'末端はDNAポリメラーゼ(Klenow 断片) (Promega)をメーカーの勧告に従って用いて埋め込まれた。次に、線形化されたベクターがAsp718で消化されて~2.7 kbのバラCHSプロモーター断片を放出した。プラスミドpCGP2757は最初にSalIで消化された。張り出している5'末端はDNAポリメラーゼ(Klenow 断片) (Promega)をメーカーの勧告に従って用いて埋め込まれた。SalIで消化されたプラスミドpCGP2757は次にAsp718で消化されて~19 kbのバイナリー・ベクター断片とCaMV 35S断片を放出した。SalI(埋込)/Asp718 ~19 kbベクター断片は、QIAEX II ゲル抽出キット（Qiagen）を用いて精製され、バラCHSプロモーター断片のHindIII(埋込)/Asp718末端と結紮された。バラCHSプロモーターの正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（BgtII, EcoRI, PstI, HindIII, XbaI, EcoRV）によって確認された。
【０２３２】
プライマーvispro-F1(SEQ ID NO:184)及びvispro-R1(SEQ ID NO:185)を用いて、又はAscI及びPacI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むプライマーを用いて得られたCFMs又は彩色タンパク質のPCR産物は、AscI及びPacIによって消化し、pCGP3255のAscI/PacI末端に結紮することができる。
pCGP2782(バラCHS: T1: 35S3'バイナリー)の構成
プラスミドpCGP2782（図２７）は、pCGP2921に含まれるT1サンゴ・タンパク質（実施例１）のcDNAをpCGP3255に含まれるバラCHSプロモーターの後方に挿入することによって構成される。
【０２３３】
プライマーvispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185)を用い、テンプレートとして（T1 cDNAクローンを含む）pCGP2921を用いて生成されたPCR産物が、AscI及びPacIによって消化された。PCRは、200 μM dNTPs, 20 pmol vispro-F1 (SEQ ID NO:184), 20 pmol vispro-R1 (SEQ ID NO:185), 1 x Pfu バッファ（Stratagene）, 2.5 ユニットPfu trubo DNA ポリメラーゼ(Stratagene), 及びテンプレートとしての~2 ng pCGP2921プラスミドDNA, による50 μL反応で行われた。得られた生成物はQIAquick Gel Extraction （Qiagen）を用いて精製され、pCGP3255のAscI/PacI末端に結紮された。バラCHSプロモーターの後方へのT1コーディング領域の正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体の制限エンドヌクレアーゼ消化(HindIII, EcoRI, PstI, XbaI, BstXI)によって確認された。
pCGP2773(バラCHS: D1: 35S 3'バイナリー)の構成
プラスミドpCGP2773（図２８）は、pCGP2919に含まれるD1サンゴ・タンパク質（実施例１）のcDNAをpCGP3255に含まれるバラCHSプロモーターの後方に挿入することによって構成される。
【０２３４】
プライマーvispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185)を用い、テンプレートとして（D1 cDNAクローンを含む）pCGP2919を用いて生成されたPCR産物が、AscI及びPacIによって消化された。プライマーvispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185)を用い、テンプレートとして（D1 cDNAクローンを含む）pCGP2919を用いて生成されたPCR産物が、AscI及びPacIによって消化された。PCRは、200 μM dNTPs, 20 pmol vispro-F1 (SEQ ID NO:184), 20 pmol vispro-R1 (SEQ ID NO:185), 1 x Pfu バッファ（Stratagene）, 2.5 ユニットPfu trubo DNA ポリメラーゼ(Stratagene), 及びテンプレートとしての~2 ng pCGP2919プラスミドDNA, による50 μL反応で行われた。得られた断片はQIAquick Gel Extraction （Qiagen）を用いて精製され、pCGP3255のAscI/PacI末端に結紮された。バラCHSプロモーターの後方へのD1コーディング領域の正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体の制限エンドヌクレアーゼ消化(HindIII, EcoRI, PstI, XbaI)によって確認された。
pCGP2774(バラCHS: S1: 35S 3'バイナリー)の構成
プラスミドpCGP2774（図２９）は、pCGP2923に含まれるS1サンゴ・タンパク質（実施例１）のcDNAをpCGP3255に含まれるバラCHSプロモーターの後方に挿入することによって構成される。
【０２３５】
プライマーvispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185)を用い、テンプレートとして（S1 cDNAクローンを含む）pCGP2923を用いて生成されたPCR産物が、AscI及びPacIによって消化された。プライマーvispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185)を用い、テンプレートとして（D1 cDNAクローンを含む）pCGP2919を用いて生成されたPCR産物が、AscI及びPacIによって消化された。PCRは、200 μM dNTPs, 20 pmol vispro-F1 (SEQ ID NO:184), 20 pmol vispro-R1 (SEQ ID NO:185), 1 x Pfu バッファ（Stratagene）, 2.5 ユニットPfu trubo DNA ポリメラーゼ(Stratagene), 及びテンプレートとしての~2 ng pCGP2923プラスミドDNA, による50 μL反応で行われた。得られた断片はQIAquick Gel Extraction （Qiagen）を用いて精製され、pCGP3255のAscI/PacI末端に結紮された。バラCHSプロモーターの後方へのS1コーディング領域の正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体の制限エンドヌクレアーゼ消化(HindIII, EcoRI, PstI, XbaI)によって確認された。
【０２３６】
実施例１１
植物における発現を増すための彩色タンパク質の標的設定
眼に見える色又は表現型に商業的価値を付与するためには細胞のシトゾルに産生されるCFMs又は彩色タンパク質のレベルを高める必要がある。CFMs又は彩色タンパク質の標的を遺伝子導入細胞内のいろいろな小器官に設定することによって、CFMs又は彩色タンパク質のレベルが著しく増大すると期待される。遺伝子導入産物の蓄積が小器官に標的を設定することで増大することは既に実証されている。例えば、表１７を見よ。
【０２３７】
また、Arabidopsis, カーネーション、バラ、その他の植物の色素体の形質転換は、CFMs又は彩色タンパク質のレベルを著しく増大させると予期される。色素体の形質転換による遺伝子導入産物の蓄積増大は既に実証されている。例えば、表１８を見よ。
タバコからの葉緑体／色素体トランジット・ペプチド配列のクローニング
CFMs又は彩色タンパク質は、N-末端色素体や葉緑体を標的にするペプチドを含めることで色素体に標的設定することができる。
【０２３８】
Nicotiana sylvestrisからのリブロース・バイホスフェート・カルボキシラーゼの小さなサブユニット（SSU）の57アミノ酸のトランジット・ペプチド（Pinck et al., Biochimie 66: 539-545: 1984）が、サンゴの彩色タンパク質を遺伝子導入Arabidopsis, カーネーション、バラ、その他の植物の色素体に標的設定するために選ばれた。
【０２３９】
プライマーTSSU-Fnew (SEQ ID NO:205)及びTSSU-R (SEQ ID NO:206)を用い、プラスミドpCGN5075(Calgene)をテンプレートとして用いてタバコ葉緑体トランジット・ペプチドのコーディング領域を増幅した。
【０２４０】
【化４】
2005518182.tif 000012
【０２４１】
TSSU-Fnew(SEQ ID NO:205)は、35S 及びバラCHS発現ベクターにクローニングするためのAscI部位、バクテリア発現のための原核細胞リボソーム結合部位（RBS)及び植物における翻訳の改善のための植物翻訳開始コンテキスト配列（TICS）を含む。TSSU-R (SEQ ID NO:206)は、vispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185)プライマーを用いて生成されるサンゴ彩色タンパク質配列とin frameでトランジット・ペプチドのクローニングを可能にするBamHI部位を含んでいる。
【０２４２】
PCR条件は、1 μL TSSU-Fnew (20 pmol/μL)(SEQ ID NO:205), 1 μL TSSU-R (20 pmol/μL)(SEQ ID NO:206), 5 μL 10 x pfu バッファ(Stratagene), テンプレートとしての~20 ng pCGN5075プラスミドDNA, 1 μL 10 mM dNTP mix, 0.5 μL pfu turboDNAポリメラーゼ(2.5 U/μL)(Stratagene)を50 μL反応で含んでいた。サイクリング条件は、94℃で5分間、続いて94℃で30分間、50℃で30分間、そして72℃で60分間、を35 サイクル、そして最後のインキュベーションが72℃で10分間であった。PCRが完了した後、生成物は4℃で貯蔵された。PCR産物はQIAquick PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製され、pUC18 SmaIベクター(Pharmacia/ Amersham)にクローニングされた。得られたプラスミドはpCGP2783と名づけられた。トランジット・ペプチド（TSSU）の配列は両鎖の配列決定によって確認された。
pCGP2780 (ユニークBamHI部位をもつ35S発現バイナリー)の構成
プラスミドpCGP2780（図３０）は、pCGP2757から~290 bp SalI断片を除去して構成される。プラスミド2757がSalIで消化されて~290 bp 断片と~19 kb バイナリー・ベクターを放出した。~19 kb バイナリー・ベクターは、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、Amersham Ligation Kitを用いて自己結紮された。SalI末端の正しい再結紮は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（PvuII, BamHI, SalI）によって確認された。
pCGP2784 (色素体トランジット・ペプチドを含む35S発現プレバイナリー)の構成
プラスミドpCGP2784（図３１）は、pCGP2783に含まれるタバコの葉緑体トランジット・ペプチドをバイナリー・ベクターpCGP2781に挿入することによって構成された。
【０２４３】
プラスミドpCGP2783はAscIとBamHIによって消化されて~0.2 kb TSSU断片を放出した。0.2 kb TSSU断片は、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP2781バイナリー・ベクターのAscI/BamHI末端に結紮された。トランジット・ペプチドのin frame及びT1コーディング配列の上流への正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（EcoRI, PstI, XbaI, AscI/PacI）によって確認された。
【０２４４】
プライマーvispro-F1 (SEQ ID NO:184)及びvispro-R1 (SEQ ID NO:185)を用いて、又はBamHIとPacI制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むプライマーを用いて得られたCFMs又は彩色タンパク質のPCR産物は、BamHI及びPacIで消化することができ、pCGP2784のBamHI/PacI末端に結紮することができる。その場合、CFMs又は彩色タンパク質のコーディング領域は色素体ターゲッティング・ペプチドとin frameになり、色素体又は葉緑体でのそのタンパク質の発現を可能にする。
pCGP2781 (35S: T1: ユニークなBamHI部位をもつ35Sバイナリー)の構成
プラスミドpCGP29（図３２）は、pCGP2772から~290 bp SalI断片を除去することによって構成された。プラスミドpCGP2772はSalIで消化されて~290 bp 断片と~19 kb バイナリー・ベクターを放出した。~19 kb バイナリー・ベクターは、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、Amersham Ligation Kitを用いて自己結紮された。SalI末端の正しい再結紮は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（PvuII, BamHI, SalI, XbaI）によって確認された。
pCGP2785 (35S: TSSU: T1: 35Sバイナリー)の構成
プラスミドpCGP2785（図３３）は、pCGP2783に含まれるタバコの葉緑体トランジット・ペプチドをバイナリー・ベクターpCGP2781に挿入することによって構成された。
【０２４５】
プラスミドpCGP2783はAscIとBamHIによって消化されて~0.2 kb TSSU断片を放出した。0.2 kb TSSU断片は、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP2781バイナリー・ベクターのAscI/BamHI末端に結紮された。トランジット・ペプチドのT1コーディング配列の上流へのin frameの正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析（EcoRI, PstI, XbaI, AscI/PacI）によって確認された。
pCGP2787 (バラCHS: TSSU: T1: 35Sバイナリー)
プラスミドpCGP2787（図３４）は、pCGP2783（実施例１１）に含まれるタバコの葉緑体トランジット・ペプチドをバイナリー・ベクターpCGP2782（図２７）に挿入することによって構成された。
【０２４６】
プラスミドpCGP2783はAscIとBamHIによって消化されて~0.2 kb TSSU断片を放出した。0.2 kb TSSU断片は、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP2782バイナリー・ベクターのAscI/BamHI末端に結紮された。トランジット・ペプチドのT1コーディング配列の上流へのin frameの正しい挿入はテトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限酵素分析によって確認された（図３４）。
小胞体へのCFMs又は彩色タンパク質のターゲッティング
CFMs又は彩色タンパク質は、N-末端小胞体（ER）ターゲッティング・ペプチドとC-末端ER保持信号を含めることによって小胞体を標的に設定される。
【０２４７】
CFMs及び彩色タンパク質をERを標的に設定するために、Arabidopsis thaliana 塩基性キチナーゼN-末端信号配列が単離された(Haseloff et al., 1997, 前出)。このタンパク質をERに保持するために、HDELペプチド配列が生成されてコーディング領域の3'末端にクローニングされた(Haseloff et al., 1997, 前出)。これらのERターゲッティング信号とER保持信号は、遺伝子導入Arabidopsis、カーネーション、バラ、その他の植物種におけるCFMs及び彩色タンパク質のレベルを高めるために用いられる。
【０２４８】
プラスミドpBIN35Sm-GFP4-ER (Haseloff et al., 1997, 前出) (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/GFP/mgfp4.html)  が、Arabidopsis thaliana塩基性キチナーゼN-末端信号配列とHDEL ER-保持信号の源として用いられた。
【０２４９】
PCRに基づく方法を用いてN-末端ERトランジット・ペプチド配列に横付けするAscI及びBamHI部位を作成した。プライマーAscI-ER.F (SEQ ID NO:207)とER-BamHI.R (SEQ ID NO:208)を用いてpBIN35Sm-GFP4-ERに含まれるN-末端ER配列を増幅した。
【０２５０】
プライマーAscI-ER.F (SEQ ID NO:207)は、35S及びバラCHS発現バイナリーにクローニングするためのAscI部位（実施例９と１０を見よ）、バクテリア発現を可能にする原核細胞リボソーム結合部位（RBS）、及び植物翻訳開始コンテキスト配列（TICS）を含む。
【０２５１】
【化５】
2005518182.tif 000013
【０２５２】
PCR条件は、1 ng プラスミドpBIN35Sm-GFP4-ERをテンプレートとして用い、各100 ng のプライマーAscI-ER.F (SEQ ID NO:207)とER-BamHI.R (SEQ ID NO:208), 2.5 μL 10 x pfu turbo バッファ(Stratagene), 1 μL pfu turbo (Stratagene)を全体積25 μLで用いるというものであった。サイクリング条件は、最初の変性ステップが94℃で5分間、続いて94℃で30秒、50℃で30秒、そして72℃で1分間、を35サイクル、そして最後の処理が72℃で5分間行われて最終的に4℃で貯蔵されるというものだった。
【０２５３】
予期された~100 bpの生成物が増幅され、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）をメーカーが勧告する手順で用いて精製された。次に、100 bpの断片はpCR2.1(Invitrogen)にクローニングされて、プラスミドはpCGP3256と名づけられた。N-末端ERトランジット・ペプチド断片の配列はM13リバース及びM13-20プライマーを用いた配列分析によって確認された。
pCGP3257(35S: ER:MCS:35Sプレバイナリー)の構成
N-末端ERトランジット・ペプチド断片は、プレバイナリーpCGP2780（図３０）に含まれる35Sプロモーターの下流にクローニングされてpCGP3257を生成した。プラスミドpCGP3256はAscIとBamHIで消化されて~100 bpのN-末端ERトランジット・ペプチド断片を放出した。断片はQIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP2780のAscI/BamHI末端に結紮された。N-末端ERトランジット・ペプチド断片の正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確認された。
【０２５４】
プライマーvispro F1 (SEQ ID NO:185)及びCP-HDEL-PacI.R（本実施例において以下で記述される）を用いて得られたCFMs又は彩色タンパク質のPCR産物は、BamHIとPacIで消化され、pCGP3257のBamHI/PacI末端に結紮される。CFMs又は彩色タンパク質のコーディング領域は、CaMV35Sプロモーターの制御下にあってERトランジット・ターゲッティング・ペプチドとin frameになり、タンパク質をERに標的設定することが可能になる。CFMs又は彩色タンパク質のコーディング領域は、また、C-末端にHDEL配列を含み、ERにタンパク質を保持することを可能にする。
pCGP3259 (35S: ER: T1.hdel: 35Sバイナリー)の構成
彩色タンパク質T1のコーディング配列が、プライマーvispro F1 (SEQ ID NO:184)及びCP-HDEL-PacI.R（SEQ ID NO:209）を用い、プラスミドpCGP2779をテンプレートとして用いてPCRによって増幅された。プライマーCP-HDEL-PacI.Rは、本明細書で記述されるバイナリー・ベクターにクローニングするための翻訳終止コドンを含むPacI部位、彩色タンパク質配列とin-frameのHDELペプチド配列、及びバクテリア発現ベクターpQE-30（Qiagen）にクローニングするためのPstI部位を含むように設計された。
【０２５５】
【化６】
2005518182.tif 000014
【０２５６】
PCR条件は、2 ng プラスミドpCGP2779をテンプレートとして用い、各100 ng のプライマーvispro F1 (SEQ ID NO:184)及びCP-HDEL-PacI.R（SEQ ID NO:209）, 2μL 10 mM dTNP mix, 5 μL 10 x PfuTurbo （登録商標）DNAポリメラーゼ・バッファ(Stratagene), 0.5 μL PfuTurbo（登録商標）DNAポリメラーゼ(2.5ユニット/μL)(Stratagene)を全体積50 μLで用いるというものであった。サイクリング条件は、最初の変性ステップが94℃で5分間、続いて94℃で20秒、50℃で30秒、そして72℃で1分間、を35サイクル、そして最後の処理が72℃で10分間行われて最終的に4℃で貯蔵されるというものだった。
【０２５７】
得られた~700 bpの生成物が、BamHIとPacIで消化され、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP3257のBamHI/PacI末端に結紮された。35Sプロモーターの制御の下でのT1コーディング領域とHDEL配列のERトランジット・ペプチド配列とin-frameな正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析(BamHI, EcoI, AscI, PacI)によって確認された。得られたプラスミドはpCGP3259と名づけられた（図３６）。
pCGP3262 (バラCHS: ER: MCS: 35Sプレバイナリー)の構成
N-末端ERトランジット・ペプチド断片がプレバイナリーpCGP3255（図３７）に含まれるバラCHSプロモーターの下流にクローニングされた。プラスミドpCGP3256がAscIとBamHIで消化されて~100 bpのN-末端ERトランジット・ペプチド断片を放出した。断片はQIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP3255のAscI/BamHI末端に結紮された。N-末端ERトランジット・ペプチド断片の正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析によって確認された。
【０２５８】
プライマーvispro F1 (SEQ ID NO:184)及びCP-HDEL-PacI.R（SEQ ID NO:209）を用いて得られたCFMs又は彩色タンパク質のPCR産物は、BamHIとPacIで消化され、pCGP3262のBamHI/PacI末端に結紮される。CFMs又は彩色タンパク質のコーディング領域は、ERトランジット・ターゲッティング・ペプチドとin frameでバラCHSプロモーターの制御下にあって、タンパク質をERに標的設定することが可能になる。CFMs又は彩色タンパク質のコーディング領域は、また、C-末端にHDEL配列を含み、花組織のERにタンパク質を保持することを可能にする。
pCGP3263 (バラCHS: ER: T1-HDEL: 35Sバイナリー)の構成
彩色タンパク質T1のコディング配列が、プライマーvispro F1 (SEQ ID NO:184)及びCP-HDEL-PacI.R（SEQ ID NO:209）を用い、プラスミドpCGP 2779をテンプレートとして用いてPCRによって増幅された。
【０２５９】
PCR条件はpCGP3259の構成に関して上述したようなものであった。
【０２６０】
得られた~700 bpの生成物が、BamHIとPacIで消化され、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP3262のBamHI/PacI末端に結紮された。バラCHSプロモーターの制御の下でのT1コーディング領域とHDEL配列のERトランジット・ペプチド配列とin-frameな正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析(BamHI, EcoI, AscI, PacI)によって確認された。得られたプラスミドはpCGP3263と名づけられた（図３８）。
【０２６１】
N-グリコシル化を予測する部位が彩色タンパク質T1内に同定された(‘NDS’ - アミノ酸107を囲む)(SEQ ID NO:202)。この部位は、彩色タンパク質クローンD1, D10, T1, T3, S3, 及びA8の間で保存され、深紅色と青色の両方の変種を含む。GenBankデータベースにおける他の彩色及び蛍光変種の配列（例えば、asCP562, asFP499, Clavularia FP484, Discosoma FP483, etc）でのこの領域の比較から、この位置には２つの配列−QDS又はNDI-のどちらかが存在することが示される。最初のものはアスパラギン残基（N）をグルタミン（Q）に変換する（どちらの残基も極性であることを考えると保守的な変化である）が、２番目のものはセリン（S）をイソロイシン（I）に変える（極性から非極性への非保守的な変化である）。タンパク質のこの領域に関して天然に見られる両方の配列選択は別々に行われた。すなわち、T1配列のNDSからQDSへの突然変異と、NDSからNDIへの別の突然変異、である。
【０２６２】
プラスミドpCGP2921（図１０）が、T1青色タンパク質のコーディング配列の源として用いた。pCGP2921からBamHI/HindIII断片が単離され、pBluescriptのBamHI/HindIII末端とクローニングされてpCGP3268が生成された。GeneEditor in vitro 部位指向突然変異キット(Promega)をメーカーの指示に従って、合わせてオリゴヌクレオチド（T1.N-Q N(AAT)＞Q(CAG)SEQ ID NO:230）及び（T1.S-I S(TCC)＞I(ATC)SEQ ID NO:231）に従って用いてpCGP3268に突然変異を導入した。
【０２６３】
【化７】
2005518182.tif 000015
【０２６４】
pBluescriptにおけるT1青色タンパク質の突然変異形態N107QとS109Iを含む得られたプラスミドpCGP3271とpCGP3272は、完全に配列が決定されて突然変異した配列の存在が確認された。
pCGP3273 (pQE30: T1(N107Q))とpCGP3274 (pQE30: T1(S109I))の構成
pCGP3271とpCGP3272におけるT1の突然変異形態をE. coliで発現させることが、発現されるタンパク質の色に突然変異が影響を及ぼすかどうかを決定するために必要だった。このため、pCGP3271とpCGP3272のBamHI/HindIII断片がpQE30のBamHI/HindIII末端とサブクローニングされた。得られたプラスミドはpCGP3273(T1-N107Q)とpCGP3274(T1-S109I)と名づけられ、前に述べたように（実施例３と６）E. coliで発現させて、発現されたタンパク質の色を決定した。pCGP3273でコードされた配列が発現するタンパク質はpCGP2921によって発現されるT1の元の色を保持することが見出されたが、他方pCGP3274によって発現されるタンパク質は無色だった。このことは、S109I突然変異がタンパク質の色に対して有害な影響を及ぼした可能性を示唆した。このタンパク質の研究は、彩色タンパク質の色形成に重要なアミノ酸についての情報を与えてくれるであろう。
pCGP3275 (35S: ER: T1(N107Q).HDEL:35Sバイナリー)とpCGP3276 (35S: ER: T1(S109I).HDEL:35Sバイナリー)の構成
彩色タンパク質T1(N107Q)のコーディング配列が、プライマーvispro F1 (SEQ ID NO:184)及びCP-HDEL-PacI.R（SEQ ID NO:207）を用い、プラスミドpCGP 3271（上述）とpCGP3272（上述）をテンプレートとして用いて、本質的にpCGP3259の構成（実施例１１）で述べたように、PCRによって増幅された。
【０２６５】
得られた~700 bpの生成物が、BamHIとPacIで消化され、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP3257（図３５）のBamHI/PacI末端に結紮された。CaMV 35Sプロモーターの制御の下でのT1(N107Q)とT1(S109I)のコーディング領域とHDEL配列の、ERトランジット・ペプチド配列とin-frameな正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析(BamHI, EcoRI, AscI, PacI, EcoRV)によって確認された。得られたプラスミドはpCGP3275及びpCGP3276と名づけられた。
pCGP3277 (バラCHS: ER: T1(N107Q).HDEL:35Sバイナリー)とpCGP3276 (バラCHS: ER: T1(S109I).HDEL:35Sバイナリー)の構成
彩色タンパク質T1(N107Q)のコーディング配列が、プライマーvispro F1 (SEQ ID NO:184)及びCP-HDEL-PacI.R（SEQ ID NO:207）を用い、プラスミドpCGP 3271とpCGP3272をテンプレートとして用いて、本質的にpCGP3259の構成（実施例１１）で述べたように、PCRによって増幅された。
【０２６６】
得られた~700 bpの生成物が、BamHIとPacIで消化され、QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen）を用いて単離、精製され、pCGP3262（図３７）のBamHI/PacI末端に結紮された。バラCHSプロモーターの制御の下でのT1(N107Q)とT1(S109I)のコーディング領域とHDEL配列の、ERトランジット・ペプチド配列とin-frameな正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析(BamHI, EcoRI, AscI, PacI, EcoRV)によって確認された。得られたプラスミドはpCGP3277及びpCGP3278と名づけられた。
【０２６７】
実施例１２
GFPとの融合タンパク質
pCGP3258 (35S: T1/mGFP4:35Sバイナリー)の構成
T1彩色タンパク質の発現と局在化を追跡する１つの方法として、T1コーディング領域がmGFP4のN-末端と融合された（Haseloff et al., PNAS 94: 2122-2127, 1997）。
【０２６８】
mGFP4コーディング領域が、プライマーPstI-mGFP4F (SEQ ID NO:210)とmGFP4-PacIR (SEQ ID NO:211)を用い、pBIN35SmGFP4ER (Haseloff et al., 1997)をテンプレートとして用いて増幅された。~700 bpの生成物はゲル精製された後に制限エンドヌクレアーゼPstIとPacIによって消化された。T1コーディング配列は、プライマーvisproF1-new (SEQ ID NO:212)とvisproR1 (SEQ ID NO:185)を用い、pCGP2779をテンプレートとして用いて増幅された。
【０２６９】
【化８】
2005518182.tif 000016
【０２７０】
~700 bpの生成物はゲル精製された後に制限エンドヌクレアーゼAscIとPstIによって消化された。
【０２７１】
PstI/PacI mGFP4断片はAscI/PstI T1断片と結紮された。得られた結紮された断片は、次にバイナリー・ベクターpCGP3257（図３５）のAscI/PacI末端と結紮されてpCGP3258（図３９）を生ずる。T1:mGFP4融合物の正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析(BstXI, EcoRI, NcoI, PstI)によって確認された。得られたプラスミドはpCGP3258と名づけられた（図３９）。
pCGP3261 (35S: ER: T1: GFP: 35Sバイナリー)の構成
CaMV 35Sプロモーターの制御の下でのpCGP3258におけるT1:mGFP4融合タンパク質のERに標的を合わせたバージョンも調製された。このプラスミドはpCGP3261（図４５）と名づけられた。
【０２７２】
T1:mGFP4融合物は、プライマーvispro F1 (SEQ ID NO:184)及びmGFP4-HDEL-PacR(SEQ ID NO:229）を用い、pCGP 3258をテンプレートとして用いて増幅された。~1.4 kbの生成物は、ゲル精製された後に制限エンドヌクレアーゼBamHIとPacIによって消化された。得られた断片は、バイナリー・ベクターpCGP3257（図３５）のBamHI/PacI末端と結紮されてpCGP3261（図４５）を生じた。T1:mGFP4融合物の正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析(BstXI, EcoRI, NcoI, PstI, AscI/PacI, XbaI)によって確認された。得られたプラスミドはpCGP3261と名づけられた（図４５）。
SEQ ID NO:229       mGFP4-HDEL-PacR(5'から3')
CTG ATT AAT TAA AGC TCA TCA TGT TTG TAT AGT TCA TCC ATG CCA TG
pCGP3260 (35S: ER: GFP: 35Sバイナリー)の構成
CaMV 35SプロモーターとCaMV 35Sターミネーターの制御下にあるpBIN35S mGFP4ER (Haseloff et al., 1997, 前出)におけるmFGP4のERをターゲットにしたバージョンが、バイナリーpCGP3258（図３９）とpCGP3261（図４５）に対するコントロールとして利用するために作成された。
【０２７３】
プラスミドpBIN35S mGFP4ER (Haseloff et al., 1997, 前出)が、最初に制限エンドヌクレアーゼSacIによって消化された。生じた張出しが修復され、線形化されたベクターが次にBamHIによって消化されてmGFP4コーディング配列を含む~0.7 kb断片を放出した。生じたSacI(blunt)/BamHI断片がゲル精製され、バイナリー・ベクターpCGP2780（図３０）のBamHI/PacI(blunt)末端に結紮された。mGFP4コーディング配列の正しい挿入は、テトラサイクリン耐性形質転換体から単離されたDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析(EcoRI, NcoI, PstI, BamHI, XbaI)によって確認された。得られたプラスミドはpCGP3260と名づけられた（図４６）。
【０２７４】
実施例１３
色の再構成
バラ花弁又は植物物質一般が彩色タンパク質を劣化させる可能性があるプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）を含むかどうかを決定するために、T1彩色タンパク質によるバラ花弁抽出物の再構成がセットアップされた。
【０２７５】
Rosa hybrida栽培品種Medeoの花弁は、一般に、白色乃至ペール・アプリコットである。白い花における彩色タンパク質の発現は、彩色タンパク質が花に発現したときに色の視覚化を可能にするはずである。
【０２７６】
Medeoバラ花弁の１グラム量が、乳鉢とすりこぎを用いて500 μLの水の中ですりつぶされた。得られたスラリーを1.5 mLの遠心分離チューブで14,000 rpmで5分間遠心分離した。上澄みを集め、100 μLの抽出物をマイクロタイタ・トレーのウエルに小分けした。~30 μgのHis-タグ精製T1タンパク質（実施例８で述べたように精製したもの）を含む10 μLアリクオットが、Medeo抽出物に加えられた。彩色タンパク質のいろがpHによって影響されるかどうかを決定するために、いくつかの再構成物のpHをNaOHを加えることによって変えて、最終のpHが7.0, 8.5, 又は10.0になるようにした。Medeo花弁抽出物だけのpHは、pH 4.5及び4.6だった。T1タンパク質を混合したMedeo花弁抽出物のpHは、pH 5.2, 5.8, 及び6.1であった。pH 5.2, 5.8, 及び6.1でT1タンパク質が混合されたMedeo花弁抽出物の再構成物の色はライトブルーだった（RHSCC 101C/RHSCC 115B）。しかし、pH 7.0 及び8.5での色は、ペール・ブルー−グリーン（RHSCC 122C）であり、pH 10.0では黄色であった。色は、室温で5時間のインキュベーションの後でも、室温で48 時間後でもはっきりとしており、花弁抽出物で彩色タンパク質が安定であることを示した。
【０２７７】
興味ある、予期せざる所見は、T1タンパク質の色が高いpHの溶液では黄色に変化したことであった。この高いpHでのこのタンパク質のコンフォメーションの分析から、T1その他の彩色タンパク質配列を標的にした突然変異の設計を可能にする情報、したがって、植物細胞に見られるような低いpH乃至中性のpHの環境で黄色を生み出すことを可能にする情報が得られる。あるいはまた、単離された厖大な数の選抜された彩色タンパク質配列を用いて、これらの突然変異したバージョンを、実施例３，４，６及び７で述べたようにE. coli又は酵母でランダム・シャッフリング（US Patent No. 6,132,970）が、発現されるタンパク質の色及び／又は輝度の変化又は改良を選択する手段になるであろう。
T1タンパク質とペチュニア花弁のインキュベーション
Petunia hybrida栽培品種Mitchellの花は白色である。 Mitchell 花弁切片をT1タンパク質と一緒にインキュベートして、彩色タンパク質が生成されたときに白い花弁に生ずるであろう色を決定した。花弁切片（管と葉身の一部を含む）が、200 μLのHis-タグ付き精製T1タンパク質（実施例８で述べたようなE. coli培養からのもの）（20 mM Tris HCl pH 8.0 中6 mg/mL）、及び His-タグ付き精製A8タンパク質（実施例８で述べたような酵母培養からのもの）（20 mM Tris HCl pH 8.0 中1 mg/mL）の中でインキュベートされた。どちらの場合にも、彩色タンパク質は花弁の切断面の着色に見られるように数分以内に花弁断片に取り込まれた。T1タンパク質溶液での白い花弁のインキュベーションは、薄いブルー（RHSCC 112D）の色の花弁を生じ、他方A8タンパク質溶液での白い花弁のインキュベーションは、薄い深紅色（RHSCC 112D）の花弁組織を生じた。この実験は、タンパク質が花弁組織の中で安定であり、生じた色は他の植物成分でマスクされたり消されたりしないということを示した。
【０２７８】
実施例１４
Arabidopsisにおける彩色タンパク質の発現
Arabidopsisの形質転換
pCGP960(35S: gus: ocs: バイナリー)の構成
植物の形質転換実験でコントロールとして用いるためにバイナリー・ベクターpCGP960が作成された。pKIW1101(Klee et al., Bio/Technology 3: 637-642, 1985)からCaMV 35S:GUS:ocs3'発現カセットが単離され、CaMV 35S:SurB選択マーカー遺伝子を含むpWTT2132(DNAP)バイナリー・ベクターに挿入された。
【０２７９】
バイナリー・ベクターpCGP2772（図２４）、pCGP2765（図２１）、pCGP3259（図３６）、pCGP2785（図３３）、pCGP3258（図３９）、pCGP2926（図４４）、pCGP3263（図３８）、pCGP2787（図３４）、pCGP2782（図２７）、pCGP960（上を見よ）、pCGP3261（図４５）、pCGP3260（図４６）、pBINmGFP4ER (Haseloff et al., 1997, 前出)、がAgrobacterium tumefaciens 株AGL0に実施例１で記述したように導入された。
【０２８０】
Arabidopsis thalianaエコタイプWS-2が、実施例１で述べたような花浸漬(floral dip)法によって上記の構成体で形質転換された。浸漬された植物の種子が選択されてプレーティングされ、遺伝子導入植物を花が開くまで生長させた。植物は自家受粉して種子を生成させることができる。T2種子は、次に選択（例えば、CaMV 35S:SurB選択マーカー遺伝子で形質転換されたものでは、100 μg/mLクロロスルフロン選択）して発芽させ、開花まで生育させることができる。いくつかのT2世代は、導入された遺伝子にかんして同型接合性であることが予期され、それらの植物は異型接合性の親系統に比べて彩色タンパク質遺伝子の発現とタンパク質産生が増加することが予期される。
ノーザン分析
構成体（pCGP2772, pCGP2765, pCGP3259, pCGP2785, pCGP3258, pCGP3261, pCGP960, pBIN35Smgfp4ER, pCGP3260）の各々につきランダムに選択した2事例からの葉を分析して、導入されたT1又はA8彩色タンパク質遺伝子の転写産物が存在するかどうかを調べた。Plant RNAeasy キット(QIAGEN)をメーカーが勧告している手順に従って用いて、これらの事例から全RNAが単離された。
【０２８１】
RNAサンプル(5 μg)は、40 mM モルフォリノプロパンスルホン酸(pH 7.0), 5 mM 酢酸ナトリウム, 0.1 mM EDTA (pH 8.0)を含むランニング・バッファを用い、2.2 Mホルムアルデヒド/1.2% w/v 寒天ゲルを通して電気泳動された。RNAは、Hybond-N フィルター(Amersham)に、メーカーが記載している仕方で移された。
【０２８２】
RNAブロットは、最初、pCGP2921(T1)（図１０）から単離されたBamHI/HindIII断片の32P-標識断片で検査された(108 cpm/μg, 2 × 106 cpm/mL)。膜のプレハイブリダイゼーション（42℃で1時間）とハイブリダイゼーション（42℃で16時間）は、50% v/v ホルムアルデヒド、1 M NaCl, 1% w/v SDS, 10% w/v デキストラン・スルフェート中で行われた。フィルターは、65℃の2 x SSC, 1% w/v SDS中で1乃至2時間、そして次に65℃の0.2 x SSC, 1% w/v SDS中で0.5乃至1時間、洗浄された。フィルターは増感スクリーンと共に-70℃で22時間、Kodak XARフィルムに露出された。
【０２８３】
T1プローブは、T1又はA8クローンを含む構成体で形質転換された遺伝子導入植物のRNAにおける予想されるサイズ（表２０を見よ）の転写産物（transcript）とハイブリダイズした（レーン1, 2, 5, 6, 7, 8, 13, 16, 及び17）（例えば、pCGP2772, pCGP2765, pCGP3259, pCGP2785, pCGP3258, pCGP3261 ）（図４１A）（表２０）。用いた条件の下で、非遺伝子導入対照植物（レーン9と10）又はT1を含まない構成体で形質転換された遺伝子導入植物（レーン3, 4, 11, 12, 14, 及び15）（例えば、pCGP960(GUS), pBIN35Smgfp4, pCGP3260(ER:mGFP4)）から単離された全RNAのノーザン分析ではハイブリダイズする転写産物は何も検出されなかった。
【０２８４】
次に、32P-標識T1 DNAプローブが、膜を100℃の0.1% SDSに浸し、65℃のオーブンで30分間インキュベートし、最終インキュベーション・ステップを室温で約30分間行うことによってRNAブロットからはぎ取られた。
【０２８５】
次に、RNAブロットは、pCGP1651 (SuRB)からの~0.8 kb HindIII断片の32P-標識断片で検査された（108 cpm/μg, 2 x 106 cpm/mL）。プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションは上述のように行われた。プラスミドpCGP1651は、バイナリー・プラスミド・ベクターpWTT2132(DNAP)に含まれるSuRBコーディング領域からの0.8 kb HindIII断片を含む。
【０２８６】
SuRBプローブは、CaMV 35S: SuRB導入遺伝子（図４１B）を含む構成体で形質転換された遺伝子導入植物における2.2 kbの転写産物とハイブリダイズした（レーン1から8まで、13から17まで）（例えば、pCGP2772, pCGP2765, pCGP3259, pCGP2785, pCGP3258, pCGP3261）（表２０）。用いた条件の下で、非遺伝子導入対照植物（レーン9と10）又はSuRBを含まない構成体で形質転換された遺伝子導入植物（レーン11 と12）（例えば、pBIN35Smgfp4ER）から単離された全RNAのノーザン分析ではハイブリダイズする転写産物は何も検出されなかった。
遺伝子導入Arabidopsisにおける彩色タンパク質の検出
T1タンパク質に対するポリクローナル・ウサギ抗体
T1タンパク質が、前に実施例６で述べたようにpCGP2921（図１０）を収容しているE. coliの培養から抽出された。
【０２８７】
T1タンパク質に対するポリクローナル・ウサギ抗体は、Institute of Medical and Veterinary Sciences, Veterinary Services Division, 101 Blacks Rd, Gilles Plains, South Australia 5086, Australia,によって作成された。300 μgの量のT1タンパク質が（Freunds 完全アジュバントと共に）最初に投与された。その後、300 μgの系列投与量が（Freunds 不完全アジュバントと共に）最初の投与の22日及び36日後に投与された。最初の採血（最初の投与の45日後に取られた）で集められた抗体が最初の例のウエスタン・ブロットを検査するために用いられた。
植物からのタンパク質抽出物
葉物質（20-120 mg）がArabidopsis植物から採取され、液体窒素で瞬間凍結され、乳鉢とすりこぎで細かい粉末に砕かれた。次に、等しい量（w/v）の抽出バッファ（100 mM Na2PO4 pH6.8, 150 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.3% Tween 20, 0.05% Triton X）が細かい粉末に加えられ、混合物はさらに乳鉢とすりこぎで砕かれた。得られたスラリーは10,000 rpm で10 分間遠心分離されて上澄みが集められた。
遺伝子導入Arabidopsisから抽出されたタンパク質のウエスタン・ブロット分析
タンパク質抽出物のアリクオット（8 μL）が2 μLの5 x SDSバッファ（10% v/v グリセリン, 3% w/v SDS, 3% β-メルカプトエタノール, 0.025% w/v ブロモフェノール・ブルー）と混合され、前に実施例６で述べたような条件で、プレキャストSDS PAGE ゲル（12% w/v resolving, 4% w/v stacking ゲル）(Ready Gels, Biorad)を通して100 Vで15分間、Min-Protean システム（Bio-Rad）で電気泳動された。次に、タンパク質は、Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad)をTowbin バッファ（25 mM Tris, 20% メタノール, 192 mM グリシン）で100 Vで1 時間用いて、Immun- Blot PVDF膜（Bio-Rad）に移された。PVDF膜は、ブロッキング・バッファ（5% 脱脂粉乳, 0.2% Tween-20, 75 mM NaPi pH 7.4, 68 mM NaCl）中、室温で1 時間インキュベートされた。膜は、次に、ウサギ抗T1抗体（ブロッキング・バッファで1/200 に希釈）と共に室温で2 時間インキュベートされ、洗浄バッファ（0.2% Tween, NaPi pH 7.4, 68 mM NaCl）で2 回、5 分間洗浄された。膜は、最終的に、ヤギ抗ウサギ-IgG-アルカリホスファターゼ複合体（Bio-Rad）(ブロッキング・バッファで1/300 に希釈) と共に室温で1時間インキュベートされ、その後洗浄バッファで4回、各10 分間洗浄された。比色検出は、Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase (Promega)によって行われた。
【０２８８】
ポリクローナルT1抗体は、Arabidopsis/2772の事例1.2、 Arabidopsis/3259の事例1.5、からの抽出物においてpCGP2921を収容しているE. coli培養から抽出されたT1タンパク質と同じ位置にあるタンパク質バンドを検出した。同じT1タンパク質バンドは、非遺伝子導入対照からの抽出物では検出されなかった。
【０２８９】
2 μLサンプルのタンパク質抽出物中のタンパク質の量が、Bio-Rad Protein Assayをメーカーの指示（Microassay Procedure）に従って用いて推定された。各抽出物の595 nmでの吸光度をBSA標準カーブ（0 - 10 μg/mL）と比較してタンパク質濃度を推定した。
【０２９０】
タンパク質抽出物のサンプルと既知量の精製His-タグ彩色タンパク質（T1）の希釈シリーズが、前述のように、SDS PAGE ゲルを通して電気泳動された。タンパク質は（上述のように）PVDF膜に移され、ウサギ抗T1 抗体で検査された。タンパク質抽出物中のT1彩色タンパク質の量は精製His-タグ彩色タンパク質希釈シリーズとの比較によって推定された。これによって、Arabidopsis 葉の彩色タンパク質の発現を全可溶タンパク質のパーセンテージとして推定することができた（表２１）。
【０２９１】
実施例１５
ペチュニアにおける彩色タンパク質の発現
ペチュニアの形質転換
Petunia hybrida栽培品種Mitchell葉、白い花を咲かせる。実施例１で述べたようにAgrobacteriumを介する形質転換によって、Mitchellはバイナリー構成体pCGP2772 （図２４）、pCGP2765 （図２１）、pCGP3259 （図３６）、pCGP2785 （図３３）、及びpCGP2926（図４４）で形質転換された。
ノーザン分析
pCGP2772とpCGP2765のT-DNAで形質転換された事例からランダムに選択された花に、導入されたT1又はA8彩色タンパク質の転写産物が存在するかどうか分析された。全RNAは、Plant RNAeasy kit（Qiagen）をメーカーが勧告する手順に従って用いて単離された。ノーザン分析は、Arabidopsis遺伝子導入プラントの分析に関して上で述べたように行われた。
【０２９２】
T1プローブは、T1又はA8クローンを含む構成体（図４０A）（それぞれ、pCGP2772(レーン7から12まで)とpCGP2765 (レーン1から6まで)）で形質転換された遺伝子導入Mitchellプラントの花弁RNAにおける約0.9 kbの転写産物とハイブリダイズした。用いた条件の下で、非遺伝子導入対照の花弁から単離されたRNAにはハイブリダイズする転写産物は検出されなかった（データ省略）。
【０２９３】
SuRBプローブは、CaMV 35S: SuRB導入遺伝子を含む構成体で形質転換された遺伝子導入植物における2.2 kbの転写産物とハイブリダイズした。
【０２９４】
用いた条件の下で、非遺伝子導入対照の花弁から単離されたRNAにはハイブリダイズする転写産物は検出されなかった（データ省略）。
遺伝子導入P. hybridaにおける彩色タンパク質の検出
遺伝子導入Petuniaから抽出されたタンパク質のウエスタン・ブロット分析
遺伝子導入及び非遺伝子導入P. hybrida cv, Mitchell プラントの葉及び花の物質（花弁チューブ、花弁拡大部、葯、雌しべ、柱頭、及び花柱）（100 - 300 mg）から、Arabidopsisに関して述べたように、タンパク質が抽出された。
【０２９５】
これらのタンパク質抽出物のウエスタン・ブロット分析が、Arabidopsisに関して述べたように、行われた。
【０２９６】
ポリクローナルT1抗体は、Petunia 資料24534(pCGP2765)とPetunia 資料24444(pCGP2772)からの抽出物においてpCGP2921を収容しているE. coli培養から抽出されたT1タンパク質と同じ位置にあるタンパク質バンドを検出した。同じT1タンパク質バンドは、非遺伝子導入対照からの抽出物では検出されなかった。
【０２９７】
Petuniaの葉と花弁における彩色タンパク質の発現を、全可溶タンパク質のパーセンテージとして推定することが、Arabidopsis 抽出物に関して上で述べたように行われた（表２２）。
【０２９８】
T1タンパク質は、Arabidopsisの葉（実施例１４）及びPetuniaの葉と花組織（実施例１５）に生成された。タンパク質蓄積の増加は、花及び葉組織により強い色を生ずると予期される。形質転換されたプラントの第１世代は自家受粉されて、T1タンパク質やその他のCFMがより高く蓄積されて強い色を生ずる同型接合の第２世代形質転換体を生ずる。
【０２９９】
あるいはまた、異なる遺伝子導入事例が交雑されて、T1タンパク質やその他のCFMがより高く蓄積されて強い色を生ずる同型接合の第２世代形質転換体を生ずる。形質転換されたプラントに蓄積するT1タンパク質やその他のCFMを増大させるために考えられる方法としては、タバコのリブロース−バイホスフェートの小さなサブユニットからのものなど、葉緑体トランジット・ペプチドを用いて葉緑体をターゲットにしてT1タンパク質やその他のCFMを生成するというやり方などがある（実施例１１又は表１７を見よ）。これらの葉緑体トランジット・ペプチドは、葉に豊富な葉緑体と花弁に豊富な有色体へのCFMsの移動と蓄積を容易にする。植物組織に高レベルのCFMsを生ずるために考えられる他の方法としては、かって組み換えタンパク質を全可溶タンパク質の46%に達するレベルで発現する植物を生み出すために用いられたことがある葉緑体／色素体転換法を用いる方法がある（De Cosa et al., Nat. Biotechnol. 19: 71-74, 2001; Daniell et al., Trends in Plant Sci. 7: 84-91, 2002, 実施例１１，表１８を見よ）。また、適当なシャペロニンを１つ以上のCFMsと一緒に同時発現させることによって、CFMsの安定な構造への効率的な折り畳みを可能にしてCFMsが通常予期されるよりも高いレベルで蓄積されるようにするというやり方も考えられる。また、酵母において示されたように、CFMsと植物のユビキチンとの融合体を生成すると、遺伝子導入植物において蓄積されるCFMsのレベルが高められるということも考えられる（Baker, Curr. Opinions in Biotech. 7: 541-546, 1996, 及びその中の参照文献）。また、T1その他のCFMを小胞体をターゲットにして生成すると（実施例１１を見よ）、植物組織に蓄積される組み換えタンパク質のレベルが高められると言うことも考えられる（Haseloff et al., 1997, 前出）。
植物抽出物における正しく折り畳まれたCFMsの検出
異種のシステムにおいて（例えば、花又はその他の植物組織で発現されるとき）正しく折り畳まれたCFMsは、特徴的な吸光度と対応する色を保持すると予期される（実施例１３を見よ）。CFMの生成又は蓄積のレベルが最初は低すぎて植物組織にはっきりした色の変化が生じないことがある。植物抽出物における低レベルの正しく折り畳まれたCFMsを検出する方法が、pCGP2772とpCGP2765で形質転換されたPetuniaからの葉物質に関して記載されているが、この方法は、Petuniaやバラやガーベラなど、それだけに限定されないが他の植物組織にも使用できる。
【０３００】
全可溶タンパク質が、Mitchell/pCGP2772及びMitchell/pCGP2765の遺伝子導入された葉から抽出された（実施例１５を見よ）。これらのサンプルは液体窒素で凍結され、乳鉢とすりこぎで砕かれた。サンプルに等量（w/v）の抽出バッファ（100 mM NaPO4 pH 6.8, 150 mM NaCl, 10 mM DTT, 0.3% Tween 20, 0.05% Triton x）が加えられ、さらに砕かれた。得られたスラリーが、10,000 rpmで10分間遠心分離され、上澄みが集められた。
【０３０１】
抽出物は希釈せずに、又は水で1:2に希釈して用い、その吸光特性が400 nmから700 nmまでの間でVarian Cary 50 BioUV-Visible Spectrometerを用いて決定された。吸光スペクトルは、非遺伝子導入対照組織及びT1又はT3 His-タグ精製タンパク質が加えられた非遺伝子導入対照組織からの抽出物のスペクトルと比較された（実施例８を見よ）。遺伝子導入植物組織からの抽出物では、非遺伝子導入対照組織では見られない約580-590 nmのピークの検出によって検出可能な色が観測された。
【０３０２】
タンパク質レベルを高めるために考えられる方法としては、上述したようなもの、又はBailey-Serres and Gailleによる方法（American Society of Plant Physiologists, Look beyond transcription, UCLA, USA, 1998）又はmRNA配列を修飾して5'及び3'非翻訳配列を最適化し、それによってメッセージ安定性及び／又は翻訳効率を改善する方法、導入される遺伝子のコドン使用を高度に発現される遺伝子（すなわち、高レベルのコードされたタンパク質合成を生ずる遺伝子）、特に標的作物の遺伝子、で見られるコドン使用にマッチするように最適化するという方法、例えば、ユビキチンなどの安定化配列を付着させることによるタンパク質安定性の増大、特定N-末端アミノ酸残基を変えてタンパク質のモノマー形態の凝集の仕方を変化させること、合成されるポリペプチドを細胞内の小器官又は部分により効果的に集中させること、導入される遺伝子の重複と増幅によってタンパク質の生合成のレベルを、例えば‘Gene Amplification Technology’(Borisjuk et al., Nature Biotechnology 18: 1303-1306, 2000)を用いて高めること、などがある。
【０３０３】
実施例１６
他の植物における彩色タンパク質の発現
園芸産業は、新しい性質、例えば、新しい色、芳香、増殖性、及び病害抵抗性、の生成に依存している。商業的に重要な植物系統、例えば、それだけに限定されないが、バラ、カーネーション、及びガーベラ、への彩色タンパク質配列の（遺伝子工学による）導入は、そのような色を欠いている花や植物に新しい色を生ずる手段となる。
【０３０４】
バラへの彩色タンパク質遺伝子の導入は、例えば、国際特許出願No. PCT/US91/04412に記載されている方法、又はRobinson and Firoozabadyによる方法（Scientia Horticulturae, 55: 83-99: 1993）、又はRout et al.（Scientia Horticulturae, 81: 201-238: 1999）による、又はMarchant et al.（Molecular Breeding 4: 187-194,1998）による方法、又は当業者に周知のその他の方法、などを用いて遂行される。
【０３０５】
カーネーションへの彩色タンパク質遺伝子の導入は、例えば、国際特許出願No. PCT/US92/02612に、又はLu et al. (Bio/Technology 9: 864-868, 1991)、Robinson and Firoozabady （1993, 前出）、に記載されている方法、又は当業者に周知のその他の方法、などを用いて遂行される。
【０３０６】
カーネーションへの彩色タンパク質遺伝子の導入は、例えば、Robinson and Firoozabady （1993, 前出）に記載されているような方法を用いて遂行される。
【０３０７】
木綿産業は、染められた木綿の生産に依存しているが、使用される染料は付随する有害な影響を環境に及ぼす。商業的に重要な木綿の系統への、又は（それだけに限定されないが、麻など）織物の生産を可能にする他の植物系統への、（遺伝子工学による）彩色タンパク質配列の導入は、例えば、国際特許出願公開No. WO 00/77230に記載されているような方法を用いて遂行される。
【０３０８】
実施例１７
形質転換された動物の生成
本発明のCFMsは、新しい色を示す遺伝子導入動物、例えば、特に、青い又は赤い毛のヒツジや、赤い皮のウシ、を生み出すのに用いられる。本発明の遺伝子導入動物は、当業者に公知のいくつかの方法で生成することができる。例えば、それだけに限定されないが、遺伝子導入動物はいくつかの方法、例えば、CFMヌクレオチド配列を含む構成体を受精した卵子の前核に注入するマイクロインジェクション法、あるいは胚への胚性幹（ES）細胞を注入する方法、によって生成される。
マイクロインジェクション法
受精後、単細胞の胚が動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ）から取り出される。特別な装備を有する顕微鏡に取り付けられたマイクロマニピュレーターを用いて胚をつかむ。微細な点にまで引き伸ばされたガラス・ピペットで胚を一方の側に固定する。反対側で、CFMヌクレオチド配列を含む構成体が、第２の細く引かれた注入針で胚の前核に注入される。注入後、胚は体液的に準備された又は偽妊娠のレシピエント雌又は養母に戻される。レシピエントは正常な妊娠の経過をたどって月が満ちると子を出産する。
胚性幹細胞の注入
ES細胞は、未分化胚芽細胞段階の胚（受精から約７日後）の内側細胞集団から寸理される。ES細胞は、実験室で何世代にもわたって生育され、完全な形の成体にまで成長できる同一の細胞を限りなく生み出す。これらのES細胞が、CFMヌクレオチド配列を含む構成体を注入することによって遺伝的に変えられる。
【０３０９】
遺伝子導入個体は、CFM構成体を含む胚性幹（ES）細胞を胚にマイクロインジェクションで注入して生成され、２つ以上の異なる細胞タイプから成る“ハイブリッド”胚が生成される。注入後、胚は体液的に準備された又は偽妊娠のレシピエント雌又は養母に戻される。レシピエントは正常な妊娠の経過をたどって月が満ちると子を出産する。
【０３１０】
実施例１８
遠赤蛍光単遺伝子性タンパク質の生成
クローニングと発現
彩色タンパク質Rtms-5 (SEQ ID NO:166)をコードするcDNAがMontipora  efflorescens (Scleratina Acropodiae)から単離された。昼日光照明の下ではMontipora  efflorescensはパープルな赤色であったが、青い照明の下では黄色、グリーンの照明の下では赤色の蛍光を示した。
【０３１１】
このタンパク質の特性をさらに明らかにするために、cDNAのC-末端にヘキサヒスチジンのタグを取り付け、Escherichia coliで高レベルで発現させた。バクテリアで発現させるために、Rtms-5.pep (SEQ ID NO:166)をコードするヌクレオチド配列が、NotI制限結合部位、リボソーム結合部位、スペーサー、及びタンパク質のN-末端をコードする15塩基（MSV-RBS, SEQ ID NO:213; SVIAK-RBS, SEQ ID NO:214）から成る順方向オリゴヌクレオチド・プライマーとH6-タグをコードする逆方向オリゴヌクレオチド・プライマー（POC220-H6,SEQ ID NO:215）を用いてpGEM-Tクローニング・ベクター（Promega）から取り出された。
SEQ ID NO:213         MSV-RBS
GGC TCT AGA AAG GAG ATA TAC AAG TGT GAT CGC TAC ACA AAT GA
SEQ ID NO:214         SVIAK-RBS
GGC TCT AGA AAG GAG ATA TAC AAT GTC CGT TAT CGC TAA ACA GAT
SEQ ID NO:215         POC220-H6
GGC AAG CTT TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GGC GAC CAC AGG TTT GCG TG
PCR産物はゲル精製され、希釈（x 10）されてから、pCRII-TOPO (Invitrogen)にクローニングされ、Top 10 cells(Invitogen)に形質転換された。細胞は0.5 mM IPTGで誘導され、タンパク質はPBS中50 mM, 200 mM, 350 mM, 及び500 mM Imidazole pH 6.0で溶出するNi-カラム（Pro-Bond, Invitrogen）で精製されてから、50 mM リン酸カリウム pH 6.65 で一晩透析された。
Rtms-5の蛍光特性
E. coliコロニーは、昼日光で青い色をしており、波長595 mmの光で励起されたときに弱い赤の蛍光を示した。
【０３１２】
Rtms-5のアミノ酸配列（SEQ ID NO:166）と他の蛍光タンパク質との整列が構成された（表１９）。Rtms-5（SEQ ID NO:166）は、他のよく分かっているタンパク質、dsRed583 (ここではdrFP583とも呼ばれる、SEQ ID NO:221)  及びGFP (SEQ ID NO:222)、における蛍光基を構成するものに対応する重要なアミノ酸（Tyr-66及びGly-67）を含んでいる。全体では、Rtms-5（SEQ ID NO:166）配列の67% 及び20%がdsRed583 (SEQ ID NO:221)及びGFP (SEQ ID NO:222)と、それぞれ、同一である。このタンパク質は、最近Anthozoa 種から単離されたいくつかの色素タンパク質と高度の同一性を有する（Gurskaya et al., FEBS Lett. 507: 16-20, 2001）。
【０３１３】
精製された“野生タイプ” Rtms-5（SEQ ID NO:166）について吸収及び励起放出スペクトルが測定された。このタンパク質は、主要な吸収ピークを592 nmで示し、その吸光度はきわめて変動が大きく（ε592 = 53,000 M-1cm-1 - 111,000 M-1cm-1 ）、かつショルダー・ピークを454 nmに有する（図４２）。吸光係数のばらつきはdrFP583（SEQ ID NO:221)に見られるものと同様であり、同様に、それは成熟の状態，ならびにタンパク質が発現される条件、に依存する(Baird et al., 2000, 前出)。
部位指定突然変異誘発
Rtms-5（SEQ ID NO:166）は、弱く蛍光を示すだけであった。これを増強するために、部位指定突然変異誘発が行われた。Rtms-5配列(SEQ ID NO:166) と他の配列との整列（表１９）から、位置142がヒスチン残基で占められていることが分かった。置換H142Sを含む変異体Rtms-5H142Sが、pCRII-TOPO:: RTms5-H142Sを生ずるpCRII-TOPO::RTms5の突然変異によって工学的に生成された。この単一の置換で、遠赤部蛍光の量子収率は170倍に増加し、0.02未満の量子収率になった。励起及び放出スペクトルと吸収スペクトルへの小さな影響が観測された（スペクトルの青い端の方舳の4 nmのシフト、図４２A, B, C参照）。
オリゴマー構造の分析
dsRed583 (SEQ ID NO:221)は、絶対的四量体であることが知られている。蛍光タンパク質によるオリゴマーの形成は、関心のある他のタンパク質と融合して発現される場合に重大な問題になりうる。したがって、Rtms-5（SEQ ID NO:166）のオリゴマー化の度合いを確立することが重要である。このタンパク質は、予測されるサイズが25,820 Da (H6を含む)である。還元条件の下でSDS PAGEにかけられたとき、精製されたRtms-5（SEQ ID NO:166）は、26,900というMrで移動した。しかし、非還元条件の下では、タンパク質の多数は114,000というMrで移動した。これらの結果は、原生のRtms-5（SEQ ID NO:166）は主に四量体であることを示唆した。
別の部位指定突然変異誘発及び構造の分析
CRII-TOPO::RTms5-H142Sに突然変異を誘発して変異体pCRII-TOP- RTms5- H142S-F158H (pCRii::Rtms-5v)を生成する第２ラウンドの部位指定突然変異誘発が行われた。この彩色ペプチドは別の置換F158HとR145Hを含み、Rtms-5v(SEQ ID NO:216)と呼ばれる。
【０３１４】
Rtms-5v(SEQ ID NO:216)がE. coliで発現され、精製されたsix His-タグ・タンパク質が分析的超遠心分離で調べられた。結果は、突然変異体が圧倒雨滴にモノマーとして沈降し（82%, 30,700 Da）、残りがダイマーとして沈降した（12%, 50,800 Da）ことを示した。彩色タンパク質は、遠赤領域で蛍光を示し（図４２Cを見よ）、酵母細胞及び哺乳類細胞で効果的に使用できる。
他の彩色タンパク質の部位指定突然変異誘発の効果
他の彩色タンパク質における残基H又はN 142からSへの部位指定突然変異誘発も、遠赤領域の蛍光の発生に導く。他の２つの彩色タンパク質、Aams-4(SEQ ID NO:90)-H142S、及びRtms-1 (SEQ ID NO:162)-N142S、の励起及び放出スペクトルが図４３に示されている。
【０３１５】
実施例１９
酵母、哺乳類における、及び融合タンパク質としての発現
本発明者たちは、本発明のCFMsが酵母及び哺乳類細胞で発現でき、融合タンパク質として細胞の遺伝的マーキングに利用できることを実証しようとした。
(a)  酵母における発現
酵母細胞における発現のために、dsRed 又はYGFP3（(酵母における発現に関して強化された変異体）をコードするBamHI/NotI DNA カセット、又は新しい蛍光タンパク質、Rtms-5v (SEQ ID NO:216)、をコードするBglI/NotIカセットが、それぞれ、オリゴヌクレオチド・プライマーの対、REPUPI (SEQ ID NO:234), /REPDOI (SEQ ID NO:235), YGFP3UP (SEQ ID NO:232), /YGFP3DO (SEQ ID NO:233),又はMSVIATUP (SEQ ID NO:236)/COFPDO (SEQ ID NO:237)を用い、テンプレートとしてベクターpYGFP3 (Cormack et al., Microbiology 143, 303-11, 1977), pDsRed-1 [Clontech Industries]又はcDNA for pCRII-TOPO::RTms-5vを用いて取り出された。YGFP3UPの場合、NotI部位は、pGEM-T (Promega)PCR産物を消化した後に取り出された。PCR産物は、マルチコピー酵母発現ベクターpAS1NBのBamHI/ NotI部位にクローニングされて、pASINB::dsRedL, pASINB::YEGFP3L 又はpASINB::Rtms-5vを生じ、そこから野生タイプGFPをコードするDNAカセットは除かれていたが、そのベクターの多重クローニング部位及びそのベクターのリンカー配列は保持している[Prescott et al., Febs Letts. 411: 97-101, 1997]。pASINBは、pASINの誘導体であり(Prescott et al., 1997, 前出)、そこではBamHI制限部位はPGKプロモーター領域から除かれている。この一連のベクターは、パートナー・タンパク質に融合していない蛍光タンパク質の発現を可能にする。
【０３１６】
【化９】
2005518182.tif 000017
【０３１７】
(b)  融合タンパク質としての発現
それぞれ、ATPシンターゼのサブユニットbとdに関する酵母遺伝子のセグメントATP4とATP7を包含するDNAカセットが、YRD15ゲノムDNAから、それぞれ、オリゴヌクレオチド・プライマー対ATP4PROMUP2 (SEQ ID NO:238)/ATP4DO2 (SEQ ID NO:239)、又はATP7TUP (SEQ ID NO:240)/ATP3TDO (SEQ ID NO:241)を用いて回収された。最初のもの、ATP4PO、はATP4のオープン・リーディング・フレームと、それぞれ、5'及び3'でBglIIとBamHI制限部位が横付けする開始コドンの上流の500 bpの配列を包含する。BamHI制限部位は、サブユニットbのC-末端と３つの蛍光タンパク質カセットの各々とのin frame融合を可能にする。第２のもの、ATP7T、は、5'及び3'末端でNotI及びSacIIの制限部位が、それぞれ横付けするATP7遺伝子のターミネーター領域を表す転写ターミネーター・カセットを包含する。これらの制限部位は、PCR産物をGEM-Tにクローニングして得られた。ATP4PO & ATP7T DNAカセットは、それぞれ、酵母発現ベクターpRS413のBamHI及びNotI/SacII部位に継起的にクローニングされて、pRS413::ATP4PO:ATP7Tと表される発現ベクター構造を生ずる。YGFP3LをコードするBglIIHI/NotI DNA 断片が、pASINB::YEGFP3Lから切り取られ、pRS413::ATP4PO:ATP7TのBglII/NotI部位にクローニングされて、25のアミノ酸のポリペプチド・リンカーでYEGFP3に融合されたサブユニットbをコードするベクター(pRS306 ::ATP4PO:YEGFP3L:ATP7T)を生じた。27のアミノ酸のポリペプチド・リンカーでRTms-5B又はdsRedと融合されたサブユニットbをコードするベクター(pRS413::ATP4PO:RTms-5:ATP7T又はpRS413::ATP4PO:dsRed:ATP7T)は、pRS306 ::ATP4PO:YEGFP3L:ATP7TからYEGFP3をコードするBamHI/NotI断片を、RTms-5v又はdsRedをコードする等価な断片で置き換えることによって得られた。
【０３１８】
【化１０】
2005518182.tif 000018
【０３１９】
(C)  結果は透明な原生ゲルを用いて視覚化された。
【０３２０】
これは本質的に以下で述べるように行われた。簡単に言うと、200 μg のミトコンドリア・タンパク質が100,000 gで5分間ペレット化された。酵母ミトコンドリアはスフェロプラストから単離された（Law et al., Methods in Enzymol. 260: 12-163, 1995）。ペレットをドデシルβ-マルトシドを含むバッファ（40 μl）で可溶化してモノマー形態又はジギトニン（20 g/g タンパク質）を分離し、ダイマー形態を分離し、氷上で20分間インキュベートし、100,000 gで30分間遠心分離した。上澄み（30 μl）は4-16% グラジエント・ゲル（13 cm x 10 cm x 0.075 cm）のウエルに入れられた。ラン（running）の後、まだガラス・プレートの間にあるうちに、Perkin-Elmer 多重波長イメージャーを‘エッジ照明モード’で用い、励起（GFP, 480±20 nm; dsRed and Rtms-5v, 540±25 nm）と放出（GFP, 535±20 nm; dsRed, 590±35 nm; Rtms-5v, 620±30 nm）に対する適当なフィルターを用いてゲルの蛍光を画像化した。
【０３２１】
３つの蛍光タンパク質の各々のN-末端に融合されたサブユニットbをコードするDNAカセットが、内生的なサブユニットbを発現しない酵母の株で発現された。各株の細胞が炭素源として非発酵性の基質エタノールを用いて成長することができたので、これらの株の各々におけるATPシンターゼは構築されて機能することが確認された。内生的なサブユニットbを欠いている酵母細胞は、機能的なmtATPaseを構築せず、エタノールを唯一の炭素源として用いて成長することができない。個々の融合タンパク質を発現する各株の酵母細胞は蛍光顕微鏡を用いて視覚化された。各株の細胞で、細胞内の蛍光の分布は同様であり、ミトコンドリアへの局在化と矛盾しなかった。
【０３２２】
ミトコンドリアが各株の細胞から分離され、抽出後、ATPシンターゼ複合体は透明原生ゲル電気泳動（CNGE）によって分析された。酵母から単離されたATPシンターゼは大きな膜結合複合体（モノマー形態で~800 kDa）であり、20の異なるタイプのサブユニットで構成され、そのうちのあるものは複合体の中に２つ以上のコピーで存在している。複合体は、ミトコンドリアの膜から複合体を抽出するのに用いる洗浄剤、ドデシルβ-マルトシド又はジギトニン、によってそれぞれ、モノマー又はダイマーとして分離できる。サブユニットbはモノマー内にシングル・コピーで存在する。この実験で、ATPシンターゼは、ミトコンドリアの各試料からモノマーの分離に有利な条件の下で抽出された。サブユニットbはモノマー内にシングル・コピーで存在する。サンプルはCNGEによって分析され、ゲルの蛍光は、各蛍光タンパク質に特有な照明及び光検出条件を用いて画像化された（図４７）。b-GFP融合タンパク質を含む複合体では構築されたモノマーATPシンターゼの位置に対応する単一の蛍光バンドが観測された（図４７，レーン1）。別のタンパク質と融合されないGFPの位置が示されている（図４７，レーン4）。融合タンパク質b-Rtms-5vを含む複合体で単一の蛍光バンドが見られた（図４７，レーン2）。しかし、b-dsRedを含むサンプルでは複数のバンドが認められた（図４７，レーン3）。各蛍光バンドは、移動度が減少する順に、モノマー、ダイマー、トリマー（３量体）、及びテトラマー（４量体）に対応しているという可能性がある。
(d)  哺乳類における発現
哺乳類細胞における発現のために、Rtms-5v (SEQ ID NO:216)をコードするSmaI/NotI断片がpAS1NB::RTms-5vから切り取られ、哺乳類発現ベクターpCI-Neo (Promega Corporation, Madison USA)の発現部位にクローニングされた。このベクターは、パートナー・タンパク質に融合されていないRtms-5vの発現を可能にする。
【０３２３】
蛍光タンパク質テクノロジーの大きな利点は、スペクトルが異なる変異体を用いて生きている細胞で２つ以上の事象（event）を同時にモニターできるということである。Rtms-5vのスペクトル性質から、同じ細胞で発現されるdsRedとRtms-5vの両方を画像化することが可能であると考えられる。これにより、Rtms-5vをdsRedの代わりにではなく、dsRedと組み合わせて用いることが可能になる。dsRedとRtms-5vの放出の最大は50 nm離れている。我々は、同じ細胞で発現したdsRed, Rtms-5v, 及びEGFPを画像化する可能性をテストした。ヒト3-オキソアシル-CoAチオラーゼの16アミノ酸のミトコンドリアをターゲットにする配列にN-末端で融合されたdsRed、Rab6のC-末端に融合されたEGFP、及び他のタンパク質に融合されていないRtms-5v、をコードする３つの個別DNAカセットが構築された。細胞は、Zeiss Meta共焦点レーザー走査顕微鏡（Zeiss）を用いて画像化された。Rtms-5v、dsRed、及びEGFP融合物の各々から生ずる蛍光の分布は予期された場所（それぞれ、シトゾル／核、ミトコンドリア、及びゴルジ）と矛盾しなかった。この結果は、Rtms-5vが、細胞質以外にミトコンドリアなど細胞の他のコンパートメントを蛍光的に標識できることを示す。非形質移入細胞、したがって、非蛍光細胞の位置は、透過光の画像で白い矢印で示され、Rtms-5vの集合は何も見られない。同様の結果は、酵母細胞でターゲットされなかったRtms-5vの発現でも観測された。複数の蛍光タンパク質が同じ細胞に共通して（例えば、GFP, dsRed, CFP）イメージされる。
【０３２４】
実施例２０
サンゴからのその他の彩色タンパク質
本発明者たちは、２つのサンゴ、Montipora efforescens, Pavona decussaca、から別の彩色タンパク質を探した。
(a)  Montipora efforescens
標準的な精製方法（Dove et al., 2001, 前出）を用いてM. efforescensのリン酸バッファからの赤い蛍光タンパク質を精製した。タンパク質は、ゲル濾過によって精製され、N-末端アミノ酸配列決定が行われた。F及びR残基を含む多型性が同定された。N-末端アミノ酸配列は次のように表される：
【０３２５】
【化１１】
2005518182.tif 000019
【０３２６】
多型性は大きな太字で示されている。
(b)  Pavona decussaca
上の(a)で述べたと同様な方法を用いて、P. decussacaからのグリーンの蛍光タンパク質を同定、精製した。ゲル電気泳動によってタンパク質は２つのバンドで現れることが示され、N-末端アミノ酸配列決定によって、下に大きな太字で示されるような多型性変異体が同定された：
トップ・バンド：
【０３２７】
【化１２】
2005518182.tif 000020
【０３２８】
下方バンド：
【０３２９】
【化１３】
2005518182.tif 000021
【０３３０】
これらのN-末端配列を生じたタンパク質分画は、吸収の最大が440 nmにあり、励起の最大は440 nm、放出は488 nmであった。
【０３３１】
オリゴヌクレオチド・プローブは、Acropora millepora (Scleractinian サンゴ)のZAP express cDNAライブラリーからのPCR増幅のために順方向と逆方向の両方で設計された。用いられたオリゴヌクレオチド・プライマーは次のようなものであった：
順方向
MEGIVNG-A     ATG GAA GGG ATA GTC GAT GG     SEQ ID NO:247
MEGIVNG-T     ATG GAA GGG ATT GTC GAT GG     SEQ ID NO:248
MEGIVNG-C     ATG GAA GGG ATC GTC GAT GG     SEQ ID NO:249
逆方向
REV-MEG-T    CCT CGA CAA TCC CTT CCA T       SEQ ID NO:250
REV-MEG-C    CCT CGA CGA TCC CTT CCA T       SEQ ID NO:251
DNAは、ゲル電気泳動によって増幅、分離された。バンドは精製されて、pCRII-TOPOにクローニングされ、Top 10 cells (Invutrogen)に形質移入された。次に、プラスミドは精製され、ヌクレオチド配列決定が行われた。完全な配列は表２３に示されている。
【０３３２】
したがって、この実験ではP. decussacaから同定されたタンパク質を用いてAcropora milleporaからのクローンが同定された。
【０３３３】
ここで記述された発明は、具体的に記述された以外の変型や変更が可能であるということは当業者には理解されるであろう。本発明はそのような変型や変更をすべて含んでいることはいうまでもない。本発明はまた、ここで言及又は示唆された全てのステップ、特徴、組成物及び化合物を、単独で又は集団で含み、前記ステップ又は特徴の任意の２つ以上の組合せを含む。
【０３３４】
【表８】
2005518182.tif 000022
【０３３５】
【表９】
2005518182.tif 000023
【０３３６】
【表１０】
2005518182.tif 000024
【０３３７】
【表１１】
2005518182.tif 000025
【０３３８】
【表１２】
2005518182.tif 000026
【０３３９】
【表１３】
2005518182.tif 000027
【０３４０】
【表１４】
2005518182.tif 000028
【０３４１】
【表１５】
2005518182.tif 000029
【０３４２】
【表１６】
2005518182.tif 000030
【０３４３】
【表１７】
2005518182.tif 000031
【０３４４】
【表１８】
2005518182.tif 000032
【０３４５】
【表１９】
2005518182.tif 000033
【０３４６】
【表２０】
2005518182.tif 000034
【０３４７】
【表２１】
2005518182.tif 000035
【０３４８】
【表２２】
2005518182.tif 000036
【０３４９】
【表２３】
2005518182.tif 000037
【０３５０】
【表２４】
2005518182.tif 000038
【０３５１】
【表２５】
2005518182.tif 000039
【０３５２】
【表２６】
2005518182.tif 000040
【０３５３】
【表２７】
2005518182.tif 000041
【０３５４】
【表２８】
2005518182.tif 000042
【０３５５】
【表２９】
2005518182.tif 000043
【０３５６】
【表３０】
2005518182.tif 000044
【０３５７】
【表３１】
2005518182.tif 000045
【０３５８】
【表３２】
2005518182.tif 000046
【図面の簡単な説明】
【０３５９】
【図１】N-末端SVIAK (SEQ ID NO: 5)配列を含むポリペプチドを表すSEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 及び86のコードされたアミノ酸配列の多重配列（multiple alignment）の表現を示す。
【図２】図１に示されたポリペプチドをコードする、対応するSEQ ID NOs: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 及び85の核酸分子のヌクレオチド配列を示す。
【図３】N-末端(M)SVIAT (SEQ ID NO: 6),SGIAT (SEQ ID NO: 7), SVIVT (SEQ ID NO: 8), 及びSVSAT (SEQ ID NO: 9)配列を含むポリペプチドを表すSEQ ID NOs: 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 及び168のコードされたアミノ酸配列の多重配列の表現を示す。
【図４】図３A-３Dに示されたポリペプチドをコードする、対応するSEQ ID NOs: 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 及び167, の核酸分子のヌクレオチド配列を示す。
【図５】N-末端SVIAK (SEQ ID NO: 5)配列とアミノ酸残基14に対応するストップ・コドンを含むポリペプチドを表すSEQ ID NOs: 170, 172, 174, 176, 178, 及び180のアミノ酸配列の配列の表現を示す。
【図６】図５に示されたポリペプチドをコードする、対応するSEQ ID NOs: 169, 171, 173, 175, 177, 及び179の核酸分子のヌクレオチド配列を示す。
【図７】それぞれ、ストップ・コドンがない場合とある場合のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であるSEQ ID NO: 19とSEQ ID NO: 169のヌクレオチド配列である。
【図８】SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 及び86、ならびに国際特許No. WO 00/46233で開示された配列Aapat-1 (SEQ ID NO: 181)とAapat-2 (SEQ ID NO: 182) を含むN-末端SVIAK配列（SEQ ID NO: 5）を含むポリペプチドのアミノ酸配列の多重配列の表現を示す。
【図９】サンゴ組織からの色素ポリペプチドのアミノ酸配列をN-末端５アミノ酸配列によってグループ分けして示す。各ペプチドの名称とSEQ ID NO、ならびに“QYG”蛍光基（fluorophore）から５オングストローム以内にある29のアミノ酸の同定に基づいて与えられた“タイプ”、が記されている。これらの29の個々の非隣接アミノ酸残基も示され、ポリペプチド全体にわたって変化する個々の非隣接アミノ酸残基も示されている。
【図１０】pQE-30(Qiagen)に基づき、それに~0.7kb cDNAが挿入された一般的なバクテリア発現ベクターの模式図を示す；cDNAクローンの源に応じて各プラスミドは次のように呼ばれる：pCGP2915 - Acropora sp.からのA10クローン；pCGP2916 - Acropora sp.からのA11クローン；pCGP2917 - Acropora sp.からのA12クローン；pCGP2918 - Acropora sp.からのA8クローン(SEQ ID NO: 189)；pCGP2920 - Discosoma sp.からのD10クローン(SEQ ID NO: 191)；pCGP2922 - Tubastrea sp.からのT3クローン(SEQ ID NO: 195)；pCGP2924 - Sinularia sp.からのS3クローン(SEQ ID NO: 193)；pCGP2919 - Discosoma sp.からのD1クローン(SEQ ID NO: 197)； pCGP2921 - Tubastrea sp.からのD1クローン(SEQ ID NO: 201)； pCGP2923 - Sinularia sp.からのS1クローン(SEQ ID NO: 199)。略記は次の通りである：bla = β-lactamase遺伝子; ColE1ori = プラスミドの複製の起点。PstI, HindIII,及びBamHIの制限エンドヌクレアーゼ認識部位の場所もマークされている。詳細は実施例３を参照。
【図１１】５つの“タイプ１”（詳しくは実施例２のテキスト及び表６と７を参照）の彩色タンパク質の吸収スキャンの例を示すグラフであり、タンパク質濃度を計算するWhitaker とGranum,1980 (Anal. Biochem. 109: 156-159) の方法に基づいて吸光係数（ελmax）を示している。x-軸＝相対吸収；y-軸＝波長（nm）；(a)Rtms5.pep (SEQ ID NO: 166)、ここでε592＝111,000 M-1cm-1；(b)LGasv-C.pep (SEQ ID NO: 44)ここでε591＝53,000 M-1cm-1；(c)Ce61-7sv. pep (SEQ ID NO:38)ここでε591.5＝104,000 M-1cm-1；(d)PPd57-2ms.pep (SEQ ID NO: 140)ここでε593＝67,000 M-1cm-1；(e)Mims-C.pep (SEQ ID NO: 126)ここでε589＝48,000 M-1cm-1 。
【図１２】３つの“タイプ２”（A）と２つの“タイプ１２”（B）（詳しくは実施例２のテキスト及び表６と７を参照）の彩色タンパク質の吸収スキャンの例を示すグラフであり、タンパク質濃度を計算するWhitaker とGranum,1980 (Anal. Biochem. 109: 156-159) の方法に基づいて吸光係数（ελmax）を示している。x-軸＝相対吸収；y-軸＝波長（nm）；（A）(a) PMms-B.pep (SEQ ID NO: 130)ここでε579.5＝39,000 M-1cm-1；(b) LGAsv -D.pep (SEQ ID NO: 46)ここでε579＝72,400 M-1cm-1；(c)rtsv-2.pep (SEQ ID NO: 84)ここでε579.5＝75,000 M-1cm-1；（B）(d) Misv-F.pep (SEQ ID NO:54)ここでε579＝111,000 M-1cm-1；(e) Acasv-C.pep (SEQ ID NO: 78)ここでε579.5＝32,300 M-1cm-1 。
【図１３】２つの“タイプ６”（詳しくは実施例２のテキスト及び表６と７を参照）の彩色タンパク質の吸収スキャンの例を示すグラフであり、タンパク質濃度を計算するWhitaker とGranum,1980 (Anal. Biochem. 109: 156-159) の方法に基づいて吸光係数（ελmax）を示している。x-軸＝相対吸収；y-軸＝波長（nm）；(a)LGAms-5.pep (SEQ ID NO: 116)ここでε583.5＝71,000 M-1cm-1；(b)Rtms-1.pep (SEQ ID NO: 162)ここでε584＝44,000 M-1cm-1 。
【図１４】Acropora asperaの２つのカラー・モルフ（morph）（暗青色色素モルフ；クリーム・モルフ）の粗リン酸緩衝液抽出物に関する、（A）吸収スペクトルと（B）ゲル濾過タンパク質溶出のクロマトグラム、のグラフ表現であり、どちらもN=5での95%信頼区間を示している。（A）において、サンゴ組織の表面積あたりのブルー・パープルpocilloporin濃度の推定は吸光係数範囲50,000 - 100,000 M-1cm-1に基づいている。（B）において、ゲル濾過タンパク質溶出のクロマトグラムは、235 nmクロマトグラムと280 nmクロマトグラムから次式：235nm - 280 nm)/2.51（Whitaker and Granum, 1980, 前出）、を適用して決定される。グラフの下の全面積は、全可溶タンパク質を表す。ブルー・パープルpocilloporin濃度は、pocilloporin溶出の範囲（24-26.5 min）におけるブルーのグラフとクリームのグラフの下の面積の差に基づいている。
【図１５】T1 (SEQ ID NO:202), D1 (SEQ ID NO:198), S1 (SEQ ID NO: 200), T3 (SEQ ID NO:196), D10 (SEQ ID NO:192), S3(SEQ ID NO:194), 及びA8 (SEQ ID NO:190)からのコードされたアミノ酸配列の多重配列の表現である。
【図１６】SVIAK (SEQ ID NO:5)を含むペプチドT1 (SEQ ID NO:202), D1 (SEQ ID NO:198), S1 (SEQ ID NO: 200), T3 (SEQ ID NO:196), D10 (SEQ ID NO:192), S3(SEQ ID NO:194), 及びA8 (SEQ ID NO:190)と、図１に示されたSVIAK (SEQ ID NO: 5)を含むSEQ ID NO:20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 及び86のペプチド、からのコードされたアミノ酸配列の多重配列の表現である。
【図１７】イースト発現プラスミドpCGP3269の模式図である。T1 cDNA (SEQ ID NO:201)は、発現ベクターpYE22mにおけるイーストのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ・プロモーター（PGAP）の後方のセンス方向にクローニングされている。略記は次の通りである：TRP1 = Trp 1 遺伝子、TGAP = イーストのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からのターミネーター配列、IR1 = 2 μmプラスミドの反転リピート、pBR322 = E. coliからの複製起点。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例７を参照。
【図１８】イースト発現プラスミドpCGP3270の模式図である。A8 cDNA (SEQ ID NO: 189)は、発現ベクターpYE22mにおけるイーストのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ・プロモーター（PGAP）の後方のセンス方向にクローニングされている。略記は次の通りである：TRP1 = Trp 1 遺伝子、TGAP = イーストのグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からのターミネーター配列、IR1 = 2 μmプラスミドの反転リピート、pBR322 = E. coliからの複製起点。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例７を参照。
【図１９】イースト発現プラスミドpCGP2756の模式図である。これは、CaMV (カリフラワー・モザイク・ウイルス)35SプロモーターとCaMV35Sターミネーター配列の間にpNEB193 (New England Biolabs)からのクローニング部位を含む。略記は次の通りである：Amp = アンピシリン耐性遺伝子；p35S =  CaMV35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例９を参照。
【図２０】バイナリー・プラスミドpCGP2757の模式図であり、これはpCGP2756（図１９）のCaMV35S発現カセットとSuRB選択マーカー遺伝子を含む。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例９を参照。
【図２１】バイナリー・プラスミドpCGP2765の模式図であり、これはAcropora sp.のA8 cDNA (SEQ ID NO:189)をバイナリー・ベクター pCGP2757 (図２０)にクローニングしたものを含む。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV ）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；A8 = Acropora sp. からのcDNA (SEQ ID NO:189)。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例９を参照。
【図２２】バイナリー・プラスミドpCGP2769の模式図であり、これはDiscosoma sp.のD1 cDNA (SEQ ID NO:197)をバイナリー・ベクター pCGP2757 (図２０)にクローニングしたものを含む。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；D1 = Discosoma sp.からのcDNA (SEQ ID NO:197)。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例９を参照。
【図２３】バイナリー・プラスミドpCGP2770の模式図であり、これはSimularia sp.のS1 cDNA (SEQ ID NO:199)をバイナリー・ベクター pCGP2757 (図２０)にクローニングしたものを含む。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；S1 = Simularia sp.からのcDNA (SEQ ID NO:199)。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例９を参照。
【図２４】バイナリー・プラスミドpCGP2772の模式図であり、これはTubastrea sp.のT1 cDNA (SEQ ID NO:201)をバイナリー・ベクター pCGP2757 (図２０)にクローニングしたものを含む。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；T1 = Tubastrea sp.からのcDNA (SEQ ID NO:201)。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例９を参照。
【図２５】プラスミドpCGP1116の模式図であり、これはRosa hybrida cv. Kardinalのカルコン・シンターゼ（CHS）遺伝子からのプロモーター断片を含む。略記は次の通りである：Rose CHS = バラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片；ori = 複製の起点；Amp = アンピシリン耐性遺伝子。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１０を参照。
【図２６】バイナリー・プラスミドpCGP3255の模式図である。pCGP2757(図２０)の35S発現カセットのCaMV 35SプロモーターがpCGP1116(図２５)のバラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片で置き換えられている。略記は次の通りである：rCHS = バラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片；TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；T1 = Tubastrea sp.からのcDNA (SEQ ID NO:201)。詳しくは実施例10を参照。
【図２７】バイナリー・プラスミドpCGP2782の模式図である。Tubastrea sp.のT1 cDNA (SEQ ID NO:201)がバイナリー・ベクター pCGP3255 （図２６）にバラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片の後ろにクローニングされた。略記は次の通りである：rCHS = バラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片；TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；T1 = Tubastrea sp.からのcDNA (SEQ ID NO:201)。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１０を参照。
【図２８】バイナリー・プラスミドpCGP2773の模式図である。Discosoma sp.のD1 cDNA (SEQ ID NO:197)がバイナリー・ベクター pCGP3255 (図２６)にバラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片の後ろにクローニングされた。略記は次の通りである：rCHS = バラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片；TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；D1 = Discosoma sp.からのcDNA (SEQ ID NO:197)。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１０を参照。
【図２９】バイナリー・プラスミドpCGP2774の模式図である。Simularia sp.のS1 cDNA (SEQ ID NO:199)がバイナリー・ベクター pCGP3255 (図２６)にバラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片の後ろにクローニングされた。略記は次の通りである：rCHS = バラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片；TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；S1 = Simularia sp.からのcDNA (SEQ ID NO:199)。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１０を参照。
【図３０】バイナリー・プラスミドpCGP2780の模式図であり、これはプラスミドpCGP2757 （図２０）から~290 塩基対SalIを除去して唯一のBamHI制限エンドヌクレアーゼ部位を創出することを可能にしたものである。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン。一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１１を参照。
【図３１】バイナリー・プラスミドpCGP2784の模式図であり、これはNicotiana sylvestris のリブロース・ビスフォスフェート・カルボキシラーゼ遺伝子（RBCase）の小さなサブユニットからの~0.2 kb葉緑体トランジット・ペプチドを、図３０のpCGP2780の多重クローニング部位にクローニングしたものである。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；TSSU = Nicotiana sylvestris のRBCaseの小さなサブユニットからの~0.2 kb葉緑体トランジット・ペプチド。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１１を参照。
【図３２】バイナリー・プラスミドpCGP2781の模式図であり、これはプラスミドpCGP2772 （図２４）から~290 塩基対SalIを除去して唯一のBamHI制限エンドヌクレアーゼ部位を創出することを可能にしたものである。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；T1 = Tubastrea sp.からのT1 cDNA (SEQ ID NO:201)。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１１を参照。
【図３３】バイナリー・プラスミドpCGP2785の模式図であり、これはNicotiana sylvestris のリブロース・ビスフォスフェート・カルボキシラーゼ遺伝子（RBCase）の小さなサブユニットからの~0.2 kb葉緑体トランジット・ペプチドを、バイナリー・ベクターpCGP2781（図３２）のCaMV 35S 発現カセットに、T1 cDNA の上流に挿入したものである。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン。T1 = Tubastrea sp.からのT1 cDNA (SEQ ID NO:201)；TSSU = Nicotiana sylvestris のRBCaseの小さなサブユニットからの~0.2 kb葉緑体トランジット・ペプチド。  いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１１を参照。
【図３４】バイナリー・プラスミドpCGP2787の模式図であり、これはNicotiana sylvestris のリブロース・ビスフォスフェート・カルボキシラーゼ遺伝子（RBCase）の小さなサブユニットからの~0.2 kb葉緑体トランジット・ペプチドを、バイナリー・ベクターpCGP2782（図２７）のRose CHS発現カセットに、T1 cDNA の上流に挿入したものである。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；rCHS = バラのカルコン・シンターゼ・プロモーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン。T1 = Tubastrea sp.からのT1 cDNA (SEQ ID NO:201)；TSSU = Nicotiana sylvestris のRBCaseの小さなサブユニットからの~0.2 kb葉緑体トランジット・ペプチド。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１１を参照。
【図３５】バイナリー・プラスミドpCGP3257の模式図であり、これはArabidopsis thaliana の塩基性キチナーゼN-末端小胞体（ER）トランジット・ペプチド・シグナル配列を、バイナリー・ベクターpCGP2780（図３０）のCaMV 35S 発現カセットに、CaMV 35S プロモーターの下流に挿入したものである。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；ERT = Arabidopsis塩基性キチナーゼ遺伝子からのERトランジット・ペプチド・シグナル配列。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１１を参照。
【図３６】バイナリー・プラスミドpCGP3259の模式図である。３’末端にin-frameのHDELペプチド配列をもつTubastrea sp.のT1 cDNA (SEQ ID NO: 201)がバイナリー・ベクターpCGP3257（図３５）のCaMV 35S 発現カセットに、Arabidopsis thaliana からのERトランジット・シグナル配列の下流でクローニングされた。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；ERT : T1 : HDEL = 5'末端にArabidopsis塩基性キチナーゼ遺伝子からのin-frame ERトランジット・ペプチド配列を、3'末端にHDEL ER リテンション配列を有するTubastreaのT1 cDNA クローン(SEQ ID NO: 201)。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１１を参照。
【図３７】バイナリー・プラスミドpCGP3262の模式図であり、これはArabidopsis thaliana の塩基性キチナーゼN-末端小胞体（ER）トランジット・ペプチド・シグナル配列を、バイナリー・ベクターpCGP3255（図２６）のバラCHS 発現カセットに、バラCHS プロモーターの下流に挿入したものである。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；rCHS バラ・カルコン・シンターゼ・プロモーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；ERT = Arabidopsis塩基性キチナーゼ遺伝子からのERトランジット・ペプチド・シグナル配列。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１１を参照。
【図３８】バイナリー・プラスミドpCGP3263の模式図である。３’末端にin-frameのHDELペプチド配列をもつTubastrea sp.のT1 cDNA (SEQ ID NO: 201)がバイナリー・ベクターpCGP3262（図３７）のバラCHS 発現カセットに、Arabidopsis thaliana からのERトランジット・シグナル配列の下流でクローニングされた。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYCori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；ERT : T1 : HDEL = 5'末端にArabidopsis塩基性キチナーゼ遺伝子からのin-frame ERトランジット・ペプチド配列を、3'末端にHDEL ER リテンション配列を有するTubastreaのT1 cDNA クローン(SEQ ID NO: 201)；rCHS = バラ・カルコン・シンターゼ・プロモーター断片。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１１を参照。
【図３９】バイナリー・プラスミドpCGP3258の模式図である。T1コーディング配列(SEQ ID NO:201)とmgfp4配列のin-frame 融合がpCGP3257（図３５）のCaMV 35S 発現カセットにクローニングされた。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYC ori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；T1 : mgfp4 = mgfp4コーディング配列がin-frame融合されたTubastreaのT1 cDNA クローン(SEQ ID NO: 201)。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１２を参照。
【図４０】（A）pCGP2921（図１０）に含まれるT1クローンの0.7 kb BamHI/HindIII断片、及び（b）pCGP1651に含まれるSuRBの0.8kb HindIII という32P標識された断片でプローブされたRNAブロットのオートラジオグラフの図である。各レーンは、遺伝子導入植物P. hybridaの葉と花弁から単離された全RNAの5乃至10 μgサンプルを含んでいた。（C）RNA負荷レベルを示すために18SrRNAの臭化エチジウム染色を示す。レーン・ナンバーは1から12まで記されている。レーン・ナンバーの上の数字は、形質転換実験に用いられた構造体のpCGPナンバーである。詳しくは実施例１５を参照。
【図４１】（A）pCGP2921（図１０）に含まれるT1クローンの0.7 kb BamHI/HindIII断片、及び（b）pCGP1651に含まれるSuRBの0.8kb HindIII という32P標識された断片でプローブされたRNAブロットのオートラジオグラフの図である。各レーンは、非遺伝子導入及び遺伝子導入植物A. thalianaの葉から単離された全RNAの5 μgサンプルを含んでいた。（C）RNA負荷レベルを示すために25S rRNAの臭化エチジウム染色を示す。レーン・ナンバーは1から17まで記されている。レーン・ナンバーの上の数字は、NTG と35Smgfp4 を除き、形質転換実験に用いられた構造体のpCGPナンバーである。NTG = 非遺伝子導入；35Smgfp4 = pBIN35Smgfp4。詳しくは実施例１４を参照。
【図４２】Rtms-5 (SEQ ID NO:166)及びその変異体の吸収、励起、及び放出スペクトルを表すグラフである。（A）Rtms-5 (SEQ ID NO:166)の吸収スペクトル；（B）部位指向的突然変異によって生成された変異体：Rtms5-H142SとRtms-5v (SEQ ID NO:216)の吸収スペクトル；（C）Rtms5-H142SとRtms-5v (SEQ ID NO:216)の記された波長での励起（exc）及び放出（em）スペクトル。
【図４３】他の２つの彩色タンパク質の励起及び放出スペクトルの例を表すグラフであり、タンパク質濃度を計算するためのWhitaker and Granumの方法 (1980, 前出)に基づく吸光係数（ελmax）を示している。x-軸＝相対吸収；y-軸＝波長（nm）；（A）Aams-4 (SEQ ID NO:90)-H142S,及び（B）Rtms-1 (SEQ ID NO:162)-N142S；各スペクトルのλmaxは図に示されている。
【図４４】バイナリー・プラスミドpCGP2926の模式図である。プライマーTICS-His-FWD (SEQ ID NO:227)とTICS-His-REV (SEQ ID NO:228)を結紮して生成される（原核細胞リボソーム結合部位（RBS）、翻訳開始コンセンサス配列（TICS）及びRGSHHHHHHエピトープを含む~0.1 kb AscI/BamHI）断片がバイナリー・プラスミドpCGP2781（図３２）に導入された。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYC ori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；T1 = Tubastrea sp.のT1 cDNA クローン(SEQ ID NO: 201), His = RGSHHHHHH エピトープ。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例９を参照。
【図４５】バイナリー・プラスミドpCGP3261の模式図である。ERをターゲットとするT1:mGFP4融合がバイナリー・ベクターpCGP3257のCaMV 35S発現カセットにクローニングされた。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYC ori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；ERT:T1:mGFP4:HDEL = Tubastrea のT1 cDNA クローン(SEQ ID NO: 201) :mGFP4のin-frame融合で5'末端はArabidopsis塩基性キチナーゼ遺伝子からのin-frame ER トランジット・ペプチド配列、3'末端はHDEL ER 保持配列。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１２を参照。
【図４６】バイナリー・プラスミドpCGP3260の模式図である。ERをターゲットとするmGFP4コーディング領域ガバイナリー・ベクターpCGP2780のCaMV 35S 発現カセットにクローニングされた。略記は次の通りである：TetR = テトラサイクリン耐性遺伝子；LB = 左境界；RB = 右境界；SuRB = タバコのアセトラクテート・シンターゼ遺伝子のコーディング領域とターミネーター配列；p35S =  カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35S遺伝子からのプロモーター領域；t35S =  CaMV35S遺伝子からのターミネーター断片；pVS1 = Pseudomonas aeruginosaのプラスミドからの広いホスト領域の複製起点；pACYC ori = E. coliのpACYC184の修飾されたレプリコン；ERT:mGFP4:HDEL = mGFP4コーディング配列で5'末端はArabidopsis塩基性キチナーゼ遺伝子からのin-frame ER トランジット・ペプチド配列、3'末端はHDEL ER 保持配列。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ認識部位もマークされている。詳しくは実施例１２を参照。
【図４７】蛍光標識されたミトコンドリアATPシンターゼの分離を示す透明タイプのゲル電気泳動の写真である。1. b-gfp融合タンパク質；2. b-Rtms-5v融合タンパク質；3. b-dsRed融合タンパク質；4. 別のタンパク質に融合されないGFP。
【配列表】
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【図１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図５】
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【図６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図７−１】
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【図８】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１（ａ）】
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【図１１（ｂ）】
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【図１１（ｃ）】
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【図１１（ｄ）】
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【図１１（ｅ）】
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【図１２Ａ（ａ）】
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【図１２Ａ（ｂ）】
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【図１２Ａ（ｃ）】
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【図１２Ｂ（ｄ）】
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【図１２Ｂ（ｅ）】
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【図１３（ａ）】
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【図１３（ｂ）】
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【図１４（ａ）】
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【図１４（ｂ）】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２（ａ）】
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【図４２（ｂ）】
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【図４２（ｃ）】
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【図４３（ａ）】
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【図４３（ｂ）】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【国際調査報告】
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