(57)【要約】本発明は、高血圧症の治療又は予防に有用な抗高血圧治療型の活性を有する薬品の調製における、ＡＣＥ阻害活性を備え、約６０μＭ又はそれ以下のＩＣ５０値である、下記のアミノ酸配列、Thr-Val-Tyr（配列識別番号１）、Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys（配列識別番号２）、Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr（配列識別番号３）、Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr（配列識別番号４）、Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys（配列識別番号５）、Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro（配列識別番号６）、Phe-Ala-Leu-Pro（配列識別番号７）、を備えるペプチドのグループから選択される１又は２以上のペプチドの使用方法に関する。本発明は、又、活性成分として、有効量の前記１又は２以上のペプチドを、薬剤的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含む薬用組成物にも関する。本発明は、更に、有効成分として有効量の前記１又は２以上のペプチドを、食物担体（food supports）、特に、タンパク質、脂質、炭水化物、と組み合わせて含み、高血圧症の傾向がある、又は、その発症を防止することを望む人間の食事療法を補助するために特に適した食品に関する。そのような食品は、また、下記のアミノ酸配列、Ala-Leu-Asn-Glu-Ile-Asn-Gln-Phe-Tyr-Gln-Lys（配列識別番号８）、Ala-Leu-Asn-Glu-Ile-Asn-Gln-Phe-Tyr（配列識別番号９）、Tyr-Leu（配列識別番号１０）を備えるペプチドの少なくとも1つを包含することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高血圧症の治療又は予防に有用な抗高血圧治療型の活性を有する医薬品の調製における、約６０μＭ又はそれ以下のＩＣ５０値である、ＡＣＥ阻害活性を備え、下記のアミノ酸配列、
Thr-Val-Tyr（配列識別番号１）、
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys（配列識別番号２）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr（配列識別番号３）、
Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr（配列識別番号４）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys（配列識別番号５）、
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro（配列識別番号６）、
Phe-Ala-Leu-Pro（配列識別番号７）、
を備えるペプチドのグループから選択される１又は２以上のペプチドの使用方法。
【請求項２】
活性成分として、約６０μＭ又はそれ以下のＩＣ５０値である、ＡＣＥ阻害活性を備え、下記のアミノ酸配列
Thr-Val-Tyr（配列識別番号１）、
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys（配列識別番号２）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr（配列識別番号３）、
Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr（配列識別番号４）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys（配列識別番号５）、
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro（配列識別番号６）、
Phe-Ala-Leu-Pro（配列識別番号７）
を備えるペプチドのグループから選択される１又は２以上のペプチドの有効量を、薬剤的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含む薬用組成物。
【請求項３】
高血圧症を患う又はその発症を予防することを望む対象体の食事療法を補助するのに特に有用な食品であって、約６０μＭ又はそれ以下のＩＣ５０値である、ＡＣＥ阻害活性を備え、下記のアミノ酸配列、
Thr-Val-Tyr（配列識別番号１）、
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys（配列識別番号２）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr（配列識別番号３）、
Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr（配列識別番号４）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys（配列識別番号５）、
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro（配列識別番号６）、
Phe-Ala-Leu-Pro（配列識別番号７）
を備えるペプチドのグループから選択される１又は２以上のペプチドを有効量、食物担体（food supports）、特に、タンパク質、脂質、炭水化物、と組み合わせて含む食品。
【請求項４】
請求項３に記載の食品であって、下記のアミノ酸配列、
Thr-Val-Tyr（配列識別番号１）、
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys（配列識別番号２）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr（配列識別番号３）、
Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr（配列識別番号４）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys（配列識別番号５）、
を備えるペプチドの少なくとも１つを含むαＳ２カゼインのトリプシン加水分解物のフラクションを包含することを特徴とする食品。
【請求項５】
請求項３に記載の食品であって、下記のアミノ酸配列、
Thr-Val-Tyr（配列識別番号１）、
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys（配列識別番号２）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr（配列識別番号３）、
Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr（配列識別番号４）、
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys（配列識別番号５）、
を備える５つのペプチドを含むαＳ２カゼインの全トリプシン加水分解物を包含することを特徴とする食品。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか一項に記載の食品であって、下記のアミノ酸配列、
Ala-Leu-Asn-Glu-Ile-Asn-Gln-Phe-Tyr-Gln-Lys（配列識別番号８）、
Ala-Leu-Asn-Glu-Ile-Asn-Gln-Phe-Tyr（配列識別番号９）、
Tyr-Leu（配列識別番号１０）
を備えるペプチドの少なくとも１つのペプチドを包含することを特徴とする食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗高血圧活性を有する薬品、食品、及び食品サプリメントの調製における、アンジオテンシンＩ変換酵素に対する阻害活性を備えるウシαＳ２カゼインの１又は２以上のペプチドの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全カゼインは、例えば、グロスクロード（Grosclaude）（１）、スウェイスグッド（Swaisgood）（２）、そしてグラッピン（Grappin）とリバドー−デュマ（Ribadeau-Dumas）（３）等によって既に詳細に研究されている乳タンパク質群である。ジエチルアミノエチル−セルロース（ＤＥＡＥ−セルロース）上でのクロマトグラフィーによって、全カゼインから、下記のカゼイン：γ、κ、β、αＳ１及びαＳ２、を分離することが可能となる。カゼインのアミノ酸配列は、周知であり［アイゲル（Eigel）他（４），ホールト（Holt）及びソーヤー（Sawyer）（５）］、特に、αＳ２カゼインの配列は、ブリニョン（Brignon）他（６）とスチュアート（Stewart）他（７）とによって決定されている。
【０００３】
これらの種々のカゼインのある種のペプチドフラグメントが様々な生物活性を有していることは既に知られている［クレア（Clare）とスウェイスグッド（Swaisgood）（８）、マイセル（Meisel）（９）]。αＳ２カゼインに関し、ペプチドＣＮαＳ２−（ｆ１６５−２０３）［ズーフト（Zucht）他（１０）］、ＣＮαＳ２−（ｆ１８３−１０７）、及びＣＮαＳ２−（ｆ１６４−１７９）［レシオ（Recio）及びヴィッサー（Visser）（１１）］は、抗菌活性を示し、ペプチドＣＮαＳ２−（ｆ１８９−１９３）、ＣＮαＳ２−（ｆ１９０−１９７）、及びＣＮαＳ２−（ｆ１９８−２０２）は、アンジオテンシンＩ変換酵素を阻害し[コーヴォル（Corvol）他（１２）]、そのＩＣ５０値、即ち、５０％の酵素作用を阻害するのに必要なペプチドの量は、それぞれ、５８０μＭ、３００μＭ、４００μＭである［マエノ（Maeno）他（１３）］。しかしながら、それらのペプチドは、自然発症高血圧であるラットの系において、ラットのキログラム（ｋｇ）当たり１ミリグラム（ｍｇ）用量の合成ペプチドの経口投与後６時間では、イン・ヴィヴォで大きな抗高血圧作用を示さない［マエノ（Maeno）他（１３）］。
【０００４】
アンジオテンシンＩ変換酵素、以下ＡＣＥという、は、イン・ヴィヴォで動脈圧の調節に重要な役割を有する［ウェバー（Weber）（１４）]。ＡＣＥ阻害物質（カプトプロイル（captoproil）、ベナゼプリル、エナラプリル、リシノプリル（lisinopril）....）［パイポ（Piepho）（１５）］は、高血圧症と戦うために使用される主要なクラスの分子の1つである。それらは、特に、糖尿病患者と、心臓又は腎臓不全用に適している［WHO（１６），J.N.C.（１７）］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本出願人によれば、αＳ２の上述した三種類のペプチドよりも遥かに低いＩＣ５０値を提示するＡＣＥ阻害物質を利用可能とすることが重要である。値は、約６０μＭまたはそれ以下である場合に「遥かに低い」とみなされる。但し、作動条件の関数として得られる前記値に関しては或る程度の不正確さが残るので、前記値を測定する際には後述する条件について言及することが適切である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願人は、イン・ヴィトロテストにおいて、αＳ２カゼインのある種のペプチドが、約６０μＭ以下の値で、ＡＣＥに対してまだ記載されていない阻害活性を提示することを見出した。これらのペプチドは、αＳ２カゼインのトリプシン加水分解によって得ることが可能な、下記の五種類のペプチド、即ち、ＣＮαＳ２−（ｆ２５−３２）、ＣＮαＳ２−（ｆ９２−９８）、 ＣＮαＳ２−（ｆ１７４−１７９）、ＣＮαＳ２−（ｆ１７４−１８１）、ＣＮαＳ２−（ｆ１８２−１８４）と、化学合成によって得られる他の二種類のペプチド、即ち、ＣＮαＳ２−（ｆ２５−３０）とＣＮαＳ２−（ｆ１７４−１７７）である。
【０００７】
従って、本発明は、高血圧症の治療又は予防に有効な抗高血症活性を有する医薬品の調製における、６０マイクロモーラー（μＭ）又はそれ以下のＩＣ５０値を有するＡＣＥ阻害活性を備え、下記のアミノ酸配列を有するペプチドのグループから選択される１又は２以上のペプチドの使用方法を提供する、
Thr-Val-Tyr
1
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys
1                    5
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr
1                    5
Phe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr
1                    5
Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys
1                    5
Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro
1                    5
Phe-Ala-Leu-Pro
1
【０００８】
本発明は、更に、有効成分として、有効量の前記少なくとも１のペプチドを、薬剤的に許容可能な賦形剤（vehicle）と組み合わせて含む薬用組成物をも提供する。
【０００９】
本発明は、更に、有効成分として、前記１又は２以上のペプチドの少なくとも１つ、又は、前記ペプチドの少なくとも１つを含む全トリプシン加水分解物質、又は、前記ペプチドの少なくとも１つを含む前記加水分解物質のフラクションを、食物担体（food supports）、特に、タンパク質、脂質、炭水化物、と組み合わせて含む食品を提供する。そのような食物サプリメントは、特に、高血圧症を患う人々の食事療法を補助するため、又は、その発症を予防するために、適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の前記ペプチドグループにおいて、  
分子量３８１．４の前記ペプチドThr-Val-Tyr，［TVY（配列識別番号１）］は、αＳ２カゼインの１８２−１８４ペプチドに対応し、
分子量８４７．０の前記ペプチド, Asn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro-Ser-Lys［NMAINPSK（配列識別番号２）］は、αＳ２カゼインの２５−３２ペプチドに対応し、
分子量７３７．９の前記ペプチドPhe-Ala-Leu-Pro-Gln-Try，［FALPQY（配列識別番号３）］は、αＳ２カゼインの１７４−１７９ペプチドに対応し、
分子量９５８．１の前記ペプチドPhe-Pro-Gln-Tyr-Leu-Gln-Tyr，［FPQYLQY（配列識別番号４）］は、αＳ２カゼインの９２−９８ペプチドに対応し、
分子量９７９．２の前記ペプチドPhe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys，［FALPQYLK（配列識別番号５）］は、αＳ２カゼインの１７４−１８１ペプチドに対応し、
分子量６５８．８の前記ペプチドAsn-Met-Ala-Ile-Asn-Pro，［NMAINP（配列識別番号６）］は、αＳ２カゼインの２５−３０ペプチドに対応し、
分子量４４６．６の前記ペプチドPhe-Ala-Leu-Pro，［FALP（配列識別番号７）］は、αＳ２カゼインの１７４−１７７ペプチドに対応する。
【００１１】
これらのペプチドのうちのいくつかは、酵素加水分解、好ましくは、トリプシンの補助による、酵素加水分解によって得ることができる。次に、それらは、逆相の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）によって、又は、その他のクロマトグラフ法（ゲル濾過、イオン交換、等）を使用して、又は、遠心分離（膜上）によって、或いは、その他の膜分離技術（マイクロ濾過、限外瀘過、等）を使用して濃縮又は単離することができる。
【００１２】
これらのペプチドは、又、例えばマーリフィールド（Merrifield）（１８）によって記載されているもののような、当業者に周知の方法を使用する化学合成によっても得ることができる。
【００１３】
全カゼインは、周知の方法の、酸沈殿とアルカリを使用する中和によって乳から得られる。例えば、ニッチュマン（Nitschmann）とレーマン（Lehmann）（１９）の方法を使用することが好ましい。
【００１４】
本発明によって前記グループから選択されるペプチドを得るための出発物質として使用されるαＳ２カゼインは、乳、全カゼイン、カゼイネート（caseinate）、及び乳の全タンパク質濃縮物から出発する当業者に周知の従来方法、例えば、トムソン（Thomson）（２０）とモーボイス（Maubois）（２１）によって記載されている方法を使用して、得ることができる。
【００１５】
例えば、サノゴ（Sanogo）他（２２）によって記載されている方法を適用するとによってαＳ２カゼインを調製することが可能である。この方法は、溶出剤としての塩化カルシウムの非連続グラジェントを使用してＤＥＡＥ−セルロース上で分画する方法である。これによってすべてのカゼインを迅速に分画することが可能である。これは、アニオン交換担体として、乾燥樹脂である、ＤＥＡＥ−セルロース ＤＥ２３［Whatman, Maidstone, UKによって販売］、を使用して実施すると有利である。この工程後、他の微量のタンパク質をすべて除去するために、ＴＳＫｇｅｌ  ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷカラム［TosoHaas, Stuttgart，ドイツ］に対して次第に減少するグラジェントのリン酸ナトリウムを適用することによって、疎水性相互作用クロマトグラフィーの追加工程を行ってもよい。
【００１６】
前記αＳ２カゼインの全トリプシン加水分解物は、例えば、後述する条件下におけるトリプシンのαＳ２カゼインに対する作用によって得られる。
【００１７】
本発明によって前記グループから選択される前記第１、第２、第３、第４及び第５のペプチド［配列識別番号１，２，３，４，５］は、アセトニトリルのグラジェントを使用して逆相ＨＰＬＣによって前記全トリプシン加水分解物から直接精製される。これら５つのペプチドに対応する収集されたペプチドのピークのそれぞれを、凍結乾燥する。
【００１８】
これらの５つのペプチドのそれぞれを、単体で、又は、混合物として、或いは、これら５つのペプチドの少なくとも１つを含む前記全トリプシン加水分解物のフラクション、あるいは、すべての５つのペプチドを含む全トリプシン加水分解物を、有効成分として、食物担体（例えば、タンパク質、脂質、又は炭水化物）と組み合わせた食品サプリメントに、あるいは、特定の食事療法のため食品に使用することができる。
【００１９】
本発明によって前記グループから選択される前記７つのペプチドの少なくとも１つを使用して調製される高血圧症の治療に有用な薬剤は、経口投与することができる。
【００２０】
経口投与のために、薬用組成物は、錠剤（ピル）、カプセル、粉末、顆粒、又は、経口投与に適したその他の形態にする必要がある。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を、下記の非限定的具体例によって更に詳細に説明する。
【００２２】
Ａ−αＳ２カゼインの調製
５グラム（ｇ）のカゼイネートアンモニア（ammonium caseinate）を、ｐＨ６．６で、３．５Ｍの尿素と、３５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と、０．１％の２−メルカプトエタノールと、を含有する２００ミリリットル（ｍＬ）の２０ｍＭの酢酸緩衝液中に溶解させ、次に、１５０ｍＬの同じ緩衝液中で平衡させた２０ｇのＤＥＡＥ−セルロースＤＥ２３を添加した。これによって得られた混合物を、２５℃で１５分間（ｍｉｎ）攪拌し、その後、Ｎｏ．４１フィルター［Whatman］上で濾過した。保留物（retentate）を、２５０ｍＬの２−メルカプトエタノール中の酢酸−尿素−ＥＤＴＡ緩衝液で二回、溶出させた。三つの濾液を組み合わせた。この最初の攪拌−濾過サイクルは、分画Ｆ０を除去するためのものであった。その後のカゼイン分画（Ｆ１及びＦ２）を、同じ手順を使用して、前記緩衝液に３０ｍＭのＣａＣｌ２と７０ｍＭのＣａＣｌ２とをそれぞれ添加して溶出させた。これら分画に、ＥＤＴＡを、分画Ｆ１に対しては１５ｍＭ、分画Ｆ１に対しては４５ｍＭ、分画Ｆ２に対しては８５ｍＭ、の量、添加した。前記濾液Ｆ０，Ｆ１，Ｆ２を、超純水に対して透析し、次に、凍結乾燥させた。その後、それらを、分画を明らかにするために、ポリアクリルアミド−尿素  ゲルを使用した電気泳動にかけた。前記分画Ｆ１は、αＳ２カゼインを含有していた。
【００２３】
前記αＳ２カゼインの精製は、１５０ミリメートル（ｍｍ）  ｘ  ３２．５ｍｍの寸法を有するＴＳＫｇｅｌ  ｐｈｅｎｙｌ  ５ＰＷカラム［TosoHaas, Stuttgart，ドイツ］上での疎水性相互作用クロマトグラフィーによって終了させた。前記分画Ｆ１（ミリリットル当たり１ミリグラム（ｍｇ．ｍＬ−１））を、２．５Ｍの尿素を含有するｐＨ６．４の０．４８Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の溶液に、０．１％の２−メルカプトエタノールの存在下で導入し、次に、０．４５マイクロメーター（μｍ）のＰＶＤＦフィルター［Pall Corporation，アンアーバー、ミシガン州、米国］上で濾過した。２０ｍｇのタンパク質溶液を、注入した。ｐＨ６．４で２．５Ｍの尿素を含有するリン酸ナトリウムを０．４８Ｍから０．０３７Ｍの非リニアグラジェントで、下記のように毎分６．０ミリリットル（ｍＬ．ｍｉｎ−１）の流速で使用した、即ち、４８０ｍＭから１２６ｍＭ（１８分）、１２６ｍＭ（３分）、１２６ｍＭから１０３ｍＭ（３分）、１０３ｍＭ（３分）、１０３ｍＭから７２ｍＭ（５分）、７２ｍＭ（５分）、７２ｍＭから３７ｍＭ（４分）、３７ｍＭ（１７分）。収集されたウシαＳ２カゼインを透析、凍結乾燥し、＋４℃にて真空下で保存した。
【００２４】
Ｂ−αＳ２カゼインのトリプシン加水分解物の調製
前記αＳ２カゼインを、ｐＨ８．１で、０．０２％の窒化ナトリウムを含有する１００ｍＬの６７ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で溶液に投入した。ｍＬ当たり０．２ユニットのＮα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエーテル（ＢＡＥＥ）を得るために、前の緩衝液中での洗浄と、複数回の濾過後、前記αＳ２カゼイン溶液に、アガロースビーズ上に固定され、ＴＰＣＫ（Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン）［Sigman，セントルイス、ミズーリ州、米国］によって処理されたウシ膵臓トリプシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．４）を添加した。加水分解は、３７℃で２４時間行われた。その反応を、前記混合物を、０．２％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する４％アセトニトリルを使用して二回希釈し、次に、０．４５μｍのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター上で濾過することによって停止させた。加水分解物は、−３０℃で保存された。
【００２５】
Ｃ−アセトニトリルのグラジェントでの逆相ＨＰＬＣによる加水分解物の分画
前記加水分解物を、２５０ｍｍ  ｘ  ４．６ｍｍの寸法を有し、３７℃に温度調節されたＣ１８  ＸＴｅｒｒａＴＭカラム［Waters，ミルフォード、マサチューセッツ州、米国］上で分画した。５００μＬのサンプル（０．２５ｍｇ．ｍＬ−１）を注入した。溶出プロファイルは、水中の１．６％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡの存在下）での３分間のアイソクラティックな相を有し、その後、リニアグラジェントによって、１ｍＬ．ｍｉｎ．−１の速度で８７分にて４０％のアセトニトリルに達した。
【００２６】
前記ペプチドプロファイルを図１に示す。ここで、２１５ナノメートル（ｎｍ）での吸収度が縦座標に沿ってプロットされ、溶出時間が横座標に沿ってプロットされている。
【００２７】
本発明によって前記グループから選択される前記７つのペプチドのうちの５つは、図１中において１−４で示されているペプチドピークに対応する。これらのペプチドを選別し、凍結乾燥を２回行った。それらを、それらのアミノ酸組成を、ハミルトン（Hamilton）（２３）ニンヒドリン法と、前記ＨＰＬＣ，ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳ（「エレクトロスプレーイオン化法」に組み合わせた質量分析法、又は、ＭＳ／ＭＳ，質量分析法とのタンデム型、によって決定することによって同定した。
【００２８】
２５分に収集されたピーク１は、前記ペプチドTVY（配列識別番号１）を含有している。
【００２９】
２９分に収集されたピーク２は、前記ペプチドNMAINPSK（配列識別番号２）を含有している。
【００３０】
５７分に収集されたピーク３は、前記ペプチドFALPQY（配列識別番号３）を含有している。
【００３１】
６０分に収集されたピーク４は、前記ペプチドFPQYLQY（配列識別番号４）とFALPQYLK（配列識別番号５）とを含有している。
【００３２】
その他の二つのペプチド、NMAINP（配列識別番号６）とFALP（配列識別番号７）とは、従来方法を使用した化学合成によって得ることができる。同じことは、好ましくはαＳ２カゼインの前記全トリプシン加水分解物を分画することによって得られる前記５つのペプチドにも当てはまる。
【００３３】
Ｄ−前記ペプチドの、アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）の場合の酵素に対するイン・ヴィトロテスト
主実験は、潜在的阻害性のペプチドの存在下で、Hippurhyl-His-Leu-OHの合成基質上でＡＣＥの残効性を測定することによるものである［クッシュマン（Cushman）及びチェン（Cheung）（２４）］。遊離された馬尿酸を、ＨＰＬＣによってアッセイし、その量を、阻害物質を有さない対照と比較した。
【００３４】
インキュベーションを、ｐＨ８．３で、５ｍＭのHippurhyl-His-Leu-OHと、３５０ｍＭのＮａＣｌと、３．３３Ｕ．Ｌ−１のＡＣＥと５％のエタノールを含む５０ｍＭのＣＨＥＳ緩衝液中で行った。前記酵素無しでの１０分間の前インキュベーション後、前記混合物（最終容量：１５０μＬ）を、３７℃で６０分間インキュベートした。前記反応を、カプトプリル（５μＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）及びＴＦＡ（０．０６７％）によって停止させた。遊離した馬尿酸を、１５０ｍｍ  ｘ  ２．１ｍｍの寸法を有し、３７℃に温度調節されたＣ１８  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）カラム［Waters，ミルフォード、マサチューセッツ州、米国］を使用したＨＰＬＣによって定量化した。前記サンプルは、０．４５μｍ  ＰＶＤＦフィルター上で濾過され、４０μＬが注入された。水中でのアセトニトリルグラジェント（０．１％のＴＦＡの存在下）を、０．２５ｍＬ．ｍｉｎ−１の流量で適用した。溶出グラジェントは、７分間で１３％から５０％となり、その後、０．５分間で９９％に達し、１．５分間この値に維持された。
【００３５】
ＩＣ５０値を測定する方法の有効性を、カプトプリル（０．０２２μｍ）、公知のＡＣＥ阻害物質、について見出された値を、生物価（０．０２３μｍ［クッシュマン（Cushman）他（２５）］、０．０１８μｍ［ダンカン（Duncan）他（２６）］、０．００７μｍ［ピーラント−レッパラ（Pihlanto-Leppala）他（２７）］と比較することによって確認した。
【００３６】
前記αＳ２カゼインの前記トリプシン加水分解物から収集され、本発明によって前記グループから選択される前記５つのペプチドに対応する前記４つのクロマトグラフィーピーク（１から４）を、５０μＭ濃度の一級アミンで二回テストした。５〜７の番号のクロマトグラフィーピークも同じ条件下でテストした。
【００３７】
得られた結果を、図２に示す。ここで、阻害率が縦座標に沿ってプロットされ、クロマトグラフィーピーク番号が横座標に沿ってプロットされている。本発明によって前記グループから選択される前記ペプチドを含む前記ピーク１〜４は、４０％以上、ＡＣＥを阻害し、それらのピークのうち、ペプチドFPQYLQY（配列識別番号４）とFALPQYLK（配列識別番号５）とを含むピークＮｏ．４、ペプチドFALPQY（配列識別番号３）を含むピークＮｏ．３、そしてペプチドTVY（配列識別番号１）を含むピークＮｏ．１は、７０％以上ＡＣＥを阻害することがわかる。
【００３８】
これらの５つのペプチドのＩＣ５０値を正確に測定するために合成ペプチドを使用した。前記ペプチドを、それらのＩＣ５０値の推定値を得るために、最初に、０．１μＭおよび２５０μＭから５００μＭの範囲の濃度で二回テストし、その後、適当な濃度範囲で三回テストした。
【００３９】
得られた結果を、図３のグラフに示す。ここで、活性／阻害比の対数値が縦座標に沿ってプロットされ、ペプチド濃度の対数値が横座標に沿ってプロットされている。これによって阻害曲線を自由化し、直線等式を使用して、それらからＩＣ５０値を導くことが可能となる。これらのＩＣ５０値を表１にまとめている。
【００４０】
それらは、すべて、約６０μＭ又はそれ以下であり、ペプチドFALPQY（配列識別番号３）とFALPQYLK（配列識別番号５）が４．３μＭのＩＣ５０値で最も効率が高いことが判る。
【００４１】
本発明によって前記グループから選択される前記７つのペプチドは、αＳ２カゼイン：ＣＮαＳ２−（ｆ１９８−２０２），ＣＮαＳ２−（ｆ１９０−１９７）、及びＣＮαＳ２−（ｆ１８９−１９３）、を使用して得られたマエノ（Maeno）他（１３）によって報告されているものを含めて、過去に記載された［フィッツジェラルド（Fitzgerald）及びマイセル（Meisel）（２８）、ヤマモト（Yamamoto）及びタカノ（Takano）（２９）、ピーラント−レッパラ（Pihlanto-Leppala）（３０）、ナーミネン（Nurminen）（３１）、タカノ（Takano）（３２）］８つの阻害ペプチドと異なるアミノ酸配列を有する。上述したように、αＳ２カゼインのトリプシン加水分解物を分画することによって得られる、本発明によって前記グループから選択される二つのペプチドは５μＭ以下のＩＣ５０値を提供し、他の二つは２０μＭ以下のＩＣ５０値を提供し、これによって、それらは、乳タンパク質に対する単一−酵素処理によって得られる天然ペプチドのなかで最も活性なＡＣＥ阻害物質として分類されることになる。
【００４２】
αＳ２カゼインのトリプシン加水分解物を分画することによって直接に得られない前記２つのペプチドNMAINP（配列識別番号６）とFALP（配列識別番号７）は、第１に、これらはいくつかの他のＡＣＥ阻害ペプチド［マルヤマ（Maruyama）他（３３），コームラ（Kohmura）他（３４，３５，３６）、ナカムラ（Nakamura）他（３７）］と共通して、そのＣ末端にプロリル残基を有する点において、そして第２に、それらのアミノ酸配列が、そのような分画によって直接得られる他の二つのペプチドNMAINPSK（配列識別番号２）とFALPQY（配列識別番号３）とに完全に含まれていること、において特筆すべきである。従って、薬品又は食品サプリメントとしての前記第２の二つのペプチド（配列識別番号２及び３）の使用が、適当なペプチド結合を切断することによって、前記第１の二つのペプチド（配列識別番号６及び７）をイン・ヴィヴォで形成することが可能となる、と考えられる。
【００４３】
尚、本発明によって前記グループから選択される前記７つのペプチドの少なくとも１つを、薬品、食品、又は食物サプリメントを調製するために使用することが、ＡＣＥ阻害活性は有するが、６０μＭ以上のＩＣ５０値を有する他の１又は２以上のペプチドと組み合わせて行うことが出来ることが判るはずである。これは、αＳ２カゼインの全トリプシン加水分解物又は、前記グループの少なくとも１つのペプチドを含有するそのフラクションを実行する場合に起こるであろう。そのような組み合わせは、ＡＣＥに対するイン・ヴィヴォ阻害活性のために有利であろう。
【００４４】
この組み合わせは、好ましくは、下記のペプチドを使用する。
（配列識別番号８），ＣＮαＳ２−（ｆ８１−９１），ALNEINQFYQK，Ala-Leu-Asn-Glu-Ile-Asn-Gln-Phe-Tyr-Gln-Lys、５２分に溶出されるピーク５、
（配列識別番号９），ＣＮαＳ２−（ｆ８１−８９），ALNEINQFY，Ala-Leu-Asn-Glu-Ile-Asn-Gln-Phe-Tyr、５９分に溶出されるピーク６、
（配列識別番号１０），ＣＮαＳ２−（ｆ２０６−２０７），YL，Tyr-Leu、３１分に溶出されるピーク７、
これらは、又、αＳ２カゼインの前記トリプシン加水分解物を分画することによっても入手可能であり、５０μＭの一級アミン濃度で２５％〜３５％の範囲でＡＣＥを阻害するものである（図２）。
【００４５】
参考文献
（１）グロスクロード，エフ（GROSCLAUDE, F.），1988, Le polymorphisme des principales lactoproteines bovines（ウシ主要乳タンパク質の多型）, INRA Prod. Anim., 1, 5-17.
（２）スウェイスグッド，エイチ・イー（SWAISGOOD, H. E.），1992, Chemistry of the caseins in P. F.（Ｐ．Ｆ．におけるカゼインの化学） Fox: Advanced dairy chemistry, volume 1, Proteins, Blackie Academic & Professional, London, United Kingdom, 63-109.
（３）グラッピン，アール（GRAPPIN, R.）およびリバドー−デュマ，ビー（RIBADEAU-DUMAS, B.），1992, Analytical methods for milk proteins in P. F. （Ｐ．Ｆ．における乳タンパク質の分析方法）Fox: Advanced dairy chemistry, volume 1, Proteins, Blackie Academic & Professional, London, United Kingdom, 1-61.
（４）アイゲル，ダブリュ・エヌ（EIGEL, W. N.），バトラー，ジェイ・イー（BUTLER, J. E.），アーンストローム，シー・エイ（ERNSTROM, C. A.），ファレル，エイチ・エム（FARRELL, H. M.），ハーウォーカー，ヴィ・アール（HARWALKAR, V. R.），ジェネス，アール（JENNESS, R.）およびホイットニー，アール・マックル（WHITNEY, R. McL.），1984, Nomenclature of proteins of cow’s milk : fifth revision（乳タンパク質の命名: 第５改訂）, J. Dairy Sci., 67, 1599-1631.
（５）ホールト，シー（HOLT, C.）およびソーヤー，エル（SAWYER, L.），1988, Primary and predicted secondary structures of the caseins in relation to their biological functions（それらの生物学的機能と関連したカゼインの維一次および予測された二次構造）, Protein Eng., 2, 251-259.
（６）ブリニョン，ジー（BRIGNON, G.），リバドー−デュマ，ビー（RIBADEAU-DUMAS, B.），マーシエ，ジェイ・−シー（MERCIER, J. -C.），ペリッシエール，ジェイ・−ピー（PELISSIER, J. -P.）およびダス，ビー・シー（DAS, B. C.）, 1977, Complete amino acid sequence of bovine αS2-casein（ウシαS2カゼインの完全アミノ酸配列）, FEBS Lett., 76, 274-279.
（７）スチュアート，エイ・エフ（STEWART, A. F.），ボンシン，ジェイ（BONSING, J.），ベアッティ，シー・ダブリュ（BEATTIE, C. W.），シャー，エフ（SHAH, F.），ウィリス，アイ・エム（WILLIS, I. M.）およびマッキンレイ，エイ・ジー（MACKINLAY, A. G.），1987, Complete nucleotide sequence of bovine αS2 and β-casein cDNAs: comparisons with related sequences in other species（ウシαS2とβカゼインcDNAの完全ヌクレオチド配列: 他の種の関連配列との比較）, Mol. Biol. Evol., 4, 231-241.
（８）クレア，ディ・エイ（CLARE, D. A.）およびスウェイスグッド，エイチ・イー（SWAISGOOD, H. E.），2000, Bioactive milk peptides: a prospectus（生物学的活性な乳ペプチド: 趣意書）, J. Dairy Sci., 83, 1187-1195.
（９）マイセル，エイチ（MEISEL, H.），1997, Biochemical properties of regulatory peptides derived from milk proteins（乳タンパク質由来の調節ペプチドの生化学的特性）, Biopolymers, 43, 119-128.
（１０）ズーフト，エイチ・−ディ（ZUCHT, H. -D.），ライダ，エム（RAIDA, M.），アーダーマン，ケイ（ADERMANN, K），メーガート，エイチ・−ジェイ（MAEGERT, H. -J.）およびフォースマン，ダブリュ・−ジー（FORSSMANN, W. -G.），1995, Casocidin-I: a casein-αS2derived peptide exhibits antibacterial activity（Casocidin-I：カゼイン-αS2由来ペプチドが抗菌活性を示す）, FEBS Lett., 372, 185-188.
（１１）レシオ，アイ（RECIO, I.）およびヴィッサー，エス（VISSER, S.），1999, Identification of two distinct antibacterial domains within the sequence of bovine-αS2（ウシ−αS2の配列内の2つの異なった抗菌ドメインの同定），Biochim. Biophys. Acta, 1428, 314-326.
（１２）コーヴォル，ピー（CORVOL, P.），ウィリアムズ，ティ・エイ（WILLIAMS, T. A.），スーブリア，エフ（SOUBRIER, F.），1995, Peptidyl dipeptidase A: angiotensinI-converting enzyme（ペプチジル  ジペプチダーゼＡ: アンジオテンシンI−変換酵素）, Methods Enzymol., 248, 243-305.
（１３）マエノ，エム（MAENO, M.），ヤマモト，エヌ（YAMAMOTO, N.）およびタカノ，ティ（TAKANO, T.），1996, Identification of an antihypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticusCP790（Lactobacillus helveticus CP790由来のタンパク質加水分解酵素によって作り出されたカゼイン加水分解産物由来の抗高血圧症剤ペプチドの同定）, J. Dairy Sci., 79, 1316-1321.
（１４）ウェバー，エム・エイ（WEBER, M. A.），1999, Interrupting the renin-angiotensin system: the role of angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin II receptor antagonists in the treatment of hypertension（レニン・アンギオテンシン系の遮断: 高血圧の治療におけるアンジオテンシン阻害剤とアンジオテンシンIIレセプターアンタゴニストの役割）, 12, 189S-194S.
（１５）パイポ，アール・ダブリュ（PIEPHO, R. W.），2000, Overview of the angiotensin-converting-enzyme inhibitors（アンギオテンシン−変換酵素阻害剤の概観）, Am. J. Health-Syst. Pharm., 57, S3-S7.
（１６）Guidelines subcommittee, 1999, World Health Organization-International Society of Hypertension.  Guidelines for the management of hypertension（ガイドライン小委員会、１９９９年、世界保健機関−高血圧症国際会合−高血圧症管理のためのガイドライン）, J. Hypertens., 17, 151-183.
（１７）Joint National Committee, 1997, Detection and treatment of high blood pressure.  The sixth report of the joint national committee on prevention and treatment of high blood pressure （高血圧の検出と治療、高血圧の治療と予防における米国合同委員会の第６レポート）(JNC VI), Arch. Intern. Med., 157, 2413-2446.
（１８）マーリフィールド，アール・ビー（MERRIFIELD, R. B.），1963, Solid phase peptide synthesis I.  Synthesis of a tetrapeptide（固相ペプチド合成Ｉ、テトラペプチドの合成）, J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149-2154.
（１９）ニッチュマン，エイチ・エス（NITSCHMANN, H. S.）およびレーマン，ダブリュ（LEHMANN, W.），1947, Zum problem der labwirkung auf casein, Helv. Chim. Acta, 130, 804.
（２０）トムソン，エイ・アール（THOMSON, A. R.），1984, Recent developments in protein recovery and purification（タンパク質回収と精製における最近の進展）, J. Chem. Tech. Biotechnol., 34B, 190-198.
（２１）モーボイス，ジェイ・−エル（MAUBOIS, J. -L.），Separation, extraction and purification of milk protein components（乳タンパク質成分の分離、抽出、および、精製）, Lait, 64, 485-495.
（２２）サノゴ，ティ（SANOGO, T.），パケット，ディ（PAQUET, D.），オーベール，エフ（AUBERT, F.）およびリンデン，ジー（LINDEN, G.），1989.  Purification ofαS1-casein by fast protein liquid chromatography（高速液体クロマトグラフィーによるαS1−カゼインの精製）, J. Dairy Sci., 72, 2242-2246.
（２３）ハミルトン，ピー・ビー（HAMILTON, P. B.），1963, Ion exchange chromatography of amino acids.  A single column, high resolving, fully automatic procedure（アミノ酸のイオン交換クロマトグラフィー。シングルカラム、高解離、全自動手順）, Anal. Chem., 35, 2055-2063.
（２４）クッシュマン，ディ・ダブリュ（CUSHMAN, D. W.）およびチェン，エイチ・エス（CHEUNG, H. S.），1971, Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung（ウサギの肺のアンギオテンシン変換酵素の分光光度的分析評価と特性）, Biochem. Pharm., 20, 1637-1648.
（２５）クッシュマン，ディ・ダブリュ（CUSHMAN, D. W.），チェン，エイチ・エス（CHEUNG, H. S.），サボ，イー・エフ（SABO, E. F.）およびオンデッティ，エム・エイ（ONDETTI, M. A.），1977, Design of potent competitive inhibitors of angiotensin-converting enzyme.  Carboxyalkanoyland mercaptoalkanoyl amino acids（アンギオテンシン変換酵素の強力な拮抗阻害剤の設計、カルボキシアルカノイルおよびメルカプトアルカノイルアミノ酸）, Biochemistry, 16, 5484-5491.
（２６）ダンカン，エイ・シー（DUNCAN, A. C.），イェーガー，エイ・ケイ（JAEGER, A. K.）およびヴァン・スタデン，ジェイ（VAN STADEN, J.），1999, Screening of Zulu medicinal plants for angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors（アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤のためのZulu薬用植物のスクリーニング）, J. Ethnopharm., 68, 63-70.
（２７）ピーラント−レッパラ，エイ（PIHLANTO-LEPPALA, A.），ロッカ，ティ（ROKKA, T.）およびコルホネン，エイチ（KORHONEN, H.），1998, Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins（ウシ乳タンパク質由来のアンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチド）, Int. Dairy J., 8, 325-331.
（２８）フィッツジェラルド，アール・ジェイ（FITZGERALD, R. J.）および マイセル，エイチ（MEISEL, H.），2000, Milk protein-derived inhibitors of angiotensin-I-converting enzyme（アンジオテンシンI変換酵素の乳タンパク質由来阻害剤）, British J. Nutr., 84, S33-S37.
（２９）ヤマモト，エヌ（YAMAMOTO, N.）およびタカノ，ティ（TAKANO, T.），1999, Antihypertensive peptides derived from milk proteins（乳タンパク質由来の抗高血圧剤ペプチド）, Nahrung, 3, S159-S164.
（３０）ピーラント−レッパラ，エイ（PIHLANTO-LEPPALA, A.），2001, Bioactive peptides derived from bovine whey proteins: opioidand ace-inhibitory peptides（ウシ乳清タンパク質由来の生物的活性ペプチド：オピオイドとＡＣＥ阻害ペプチド）. Trends Food Sci. Tech., 11, 347-356.
（３１）ナーミネン，エム・−エル（NURMINEN, M. -L.），2000, Milk-derived peptides and blood pressure（乳由来ペプチドと血圧）, Bull. IDF, 353, 11-15.
（３２）タカノ，ティ（TAKANO, T.），1998, Milk derived peptides and hypertension-reduction（乳由来ペプチドと高血圧低減）, Int. Dairy J., 8, 375-381.
（３３）マルヤマ，エス（MARUYAMA, S.），ナカゴミ，ケイ（NAKAGOMI, K.），トミズカ，エヌ（TOMIZUKA, N.）およびスズキ，エイチ（SUZUKI, H.），1985, AngiotensinI-converting enzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysateof casein. II. Isolation and bradykinin-potentiatingactivity on the uterus and the ileum of rats（カゼインの酵素的分解産物由来のアンジオテンシンI−変換酵素阻害剤。 II．ラットの子宮と回腸における単離とブラジキニンの潜在的活性）, Agric. Biol. Chem., 49, 1404-1409.
（３４）コームラ，エム（KOHMURA, M.），ニオ，エヌ（NIO, N.），クボ，ケイ（KUBO, K.），ミノシマ，ワイ（MINOSHIMA, Y.），ムネカタ，イー（MUNEKATA, E.）およびアリヨシ，ワイ（ARIYOSHI, Y.），1989, Inhibition of angiotensin-converting enzyme by synthetic peptides of human β-casein（ヒトκ−カゼインの合成フラグメントによるアンギオテンシン変換酵素の阻害）, Agric. Biol. Chem., 53, 2107-2114.
（３５）コームラ，エム（KOHMURA, M.），ニオ，エヌ（NIO, N.）およびアリヨシ，ワイ（ARIYOSHI, Y.），1990a, Inhibition of angiotensin-converting enzyme by synthetic fragments of human κ-casein（ヒトκ−カゼインの合成フラグメントによるアンギオテンシン変換酵素の阻害）, Agric. Biol. Chem., 54, 835-836.
（３６）コームラ，エム（KOHMURA, M.），ニオ，エヌ（NIO, N. ）およびアリヨシ，ワイ（ARIYOSHI, Y.），1990b, Inhibition of angiotensin-converting enzyme by synthetic peptide fragments of various β-casein（様々のβカゼインの合成ペプチド断片によるアンギオテンシン変換酵素の阻害）, Agric. Biol. Chem., 54, 1101-1102.
（３７）ナカムラ，ワイ（NAKAMURA, Y.），ヤマモト，エヌ（YAMAMOTO, N.），サカイ，ケイ（SAKAI, K.）およびタカノ，ティ（TAKANO, T.），1995, Antihypertensive effect of sour milk and peptides isolated from it that are inhibitors to angiotensin I converting enzyme（酸性乳の抗高血圧効果とアンジオテンシンＩ変換酵素に対する阻害剤であるそれから単離されたペプチド）, J. Dairy Sci., 78, 1253.
【００４６】
【表１】
2005530851.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ウシαＳ２カゼインのトリプシン加水分解物のクロマトグラフィープロファイル
【図２】ウシαＳ２カゼイン由来のトリプシンペプチドのＡＣＥ阻害活性を示す図
【図３】図２から選択されたペプチドのＩＣ５０値の測定結果を示す図
【配列表】
2005530851.tif 000003
2005530851.tif 000004
【図１】
2005530851.tif 000005
【図２】
2005530851.tif 000006
【図３】
2005530851.tif 000007
【国際調査報告】
2005530851.tif 000008
2005530851.tif 000009
2005530851.tif 000010
2005530851.tif 000011
2005530851.tif 000012
2005530851.tif 000013