(57)【要約】  複数のアレルゲンに対する全免疫グロブリンＥと特異的抗体レベルを定量的に決定する均質免疫分析方法及びシステムであって、比較的少量の血液のサンプリングしか必要とされない（図２）。本方法は、免疫計測サンドイッチ手順を用い、好ましくはビオチン−ストレプトアビジン信号増幅方法とＲ−フィコエリスリン蛍光ラベルを用いる。
2005512091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプル中の２〜約１００のアレルゲンに対する特異的免疫グロビン抗体レベルを同時に測定する方法であって：
（ａ）個体から約１０〜約１００μＬの血液サンプルを採取するステップ；
（ｂ）該血液サンプル又はその一部について均質免疫分析を行うステップ、ここで該免疫分析は２〜約１００のアレルゲンに対する特異的免疫グロビン抗体レベルを決定することができる；及び
（ｃ）前記特異的免疫グロビン抗体レベルを決定するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
血液サンプル中の２〜約１００のアレルゲンに対する特異的免疫グロビン抗体レベルを同時に測定する方法であって：
（ａ）個体から約１０〜約１００μＬの血液サンプルを採取するステップ；
（ｂ）該血液サンプル又はその一部について均質免疫分析を行うステップ、ここで該免疫分析は２〜約１００のアレルゲンに対する特異的免疫グロビン抗体レベルを決定することができる；及び
（ｃ）前記特異的免疫グロビン抗体レベルを決定するステップ；
を含む方法。
【請求項３】
血液サンプル中のアレルゲンに対する特異的免疫グロブリン抗体レベルの定量的な測定装置であって：
（ａ）複数のアレルゲンに結合した複数の粒子、該粒子は約１〜約５０μＬの水性媒質に懸濁し、粒子と特異的アレルゲンとの各組み合わせは粒子と他のアレルゲンとの組み合わせから区別可能である；
（ｂ）特異的結合ペアの第一のメンバーに接合した抗ヒトＩｇＥ又はＩｇＧ抗体を含む第一の接合体、前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅する能力を有し、該第一の接合体は１分子の抗ヒト抗体に１０〜３０分子の第一の結合ペア・メンバーが接合している；
（ｃ）第一の特異的結合ペア・メンバーに結合する第二の特異的結合ペア・メンバーを含む第二の接合体、該第二のメンバーは蛍光体部分と結合している；を含み、
（ｄ）第一の接合体の第二の接合体に対するモル比は約１：１〜約１：５である；
ことを特徴とする前記装置。
【請求項４】
該複数の粒子が約５〜約１００のアレルゲンを含むことを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
該複数の粒子が約１０〜約４０のアレルゲンを含むことを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
該特異的抗体が免疫グロブリンＥであることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項７】
該特異的抗体が免疫グロブリンＧ及びそのサブクラスを含むことを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項８】
該抗ヒト抗体が抗ヒトＩｇＥであることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項９】
該抗ヒト抗体が免疫グロブリンＥと特異的に結合する抗ヒトＩｇＥ断片であることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項１０】
該抗ヒト抗体が免疫グロブリンＥと特異的に結合するモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項１１】
該抗ヒト抗体が抗ヒトＩｇＧであることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項１２】
該抗ヒト抗体が免疫グロブリンＧと特異的に結合する抗ヒトＩｇＧ断片であることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項１３】
該抗ヒト抗体が免疫グロブリンＧと特異的に結合するモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項１４】
該蛍光体がフィコビリン・タンパク質であることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項１５】
該フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリン、フィコシアニン、及びアロフィコシアニンから選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
該フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリンであることを特徴とする、請求項１４に記載の装置。
【請求項１７】
該フィコエリスリンがＲ−フィコエリスリンであることを特徴とする、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
該第二の接合体が４００，０００から約１，０００，０００ダルトンまでの間の分子量を有することを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項１９】
該第一の特異的結合ペア・メンバーがビオチン及びジゴキシンから選択されることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項２０】
該第一の特異的結合ペア・メンバーがビオチンであることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項２１】
該ビオチンが抗ヒト抗体に約１０：１〜約３０：１のモル比で接合していることを特徴とする、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
該ビオチンが抗ヒト抗体に約１５：１〜２５：１のモル比で接合していることを特徴とする、請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
該ビオチンが抗ヒト抗体に２０：１のモル比で接合していることを特徴とする、請求項２０に記載の装置。
【請求項２４】
該第二の特異的結合ペア・メンバーがアビジン、ストレプトアビジン、及び抗ジゴキシンから選択されることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項２５】
該第二の特異的結合ペア・メンバーがストレプトアビジンであることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項２６】
該粒子の懸濁液が約１〜１０μＬの体積を有することを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項２７】
さらに、約１〜約５μＬの体積を有するテストされる血液サンプルを含む、請求項３に記載の装置。
【請求項２８】
血液サンプル中の複数のアレルゲンに対する特異的免疫グロブリン抗体レベルを同時に検出し、定量化する均質免疫分析方法であって：
（ａ）約１〜約２５μＬの体積の血液サンプルを複数のアレルゲンと結合した複数の粒子に接触させるステップ、該粒子は約１〜約５０μＬの水性媒質に懸濁されており、粒子と特異的アレルゲンとの各組み合わせは、１つ以上のアレルゲンに特異的に結合する血液サンプル中に存在する免疫グロブリン抗体が該粒子に結合している状態で、粒子と他のアレルゲンとの組み合わせから区別可能である；
（ｂ）その後、ステップ（ａ）からの物質を、特異的結合ペアの第一のメンバーに接合した抗ヒトＩｇＥ又はＩｇＧ抗体を含む第一の接合体と接触させるステップ、前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅させる能力を有する；
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの物質を、該第一の特異的結合ペア・メンバーと結合する第二の特異的結合ペア・メンバーに結合した蛍光体部分を含む第二の接合体と接触させるステップ；及び
（ｄ）その後、ステップ（ｃ）からの物質における特異的免疫グロブリン抗体のレベルを、粒子サブセットの蛍光放出信号を決定し、同時に蛍光体部分の蛍光放出信号を測定することによって決定するステップ；
を含む前記方法。
【請求項２９】
ステップ（ａ）が該サンプルを約５〜約１００の特異的アレルゲンと結合した複数の粒子と接触させることによって行われることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ａ）がサンプルを約１０〜約４０の特異的アレルゲンと結合した複数の粒子と接触させることによって行われることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
該抗体が特異的免疫グロブリンＥを含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
該抗体が特異的免疫グロブリンＧとそのサブクラスを含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
該第一の接合体がビオチン又はジゴキシンと結合した抗ヒト抗体を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
該第一の接合体における抗ヒト抗体のビオチン又はジゴキシンに対するモル比が約１：１０〜約１：３０であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該第一の接合体における抗ヒト抗体のビオチン又はジゴキシンに対するモル比が約１：１５〜約１：２５であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
該第一の接合体における抗ヒト抗体のビオチン又はジゴキシンに対するモル比が１：２０であることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
該第二の接合体の蛍光体部分がフィコビリン・タンパク質であることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
該フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリン、フィコシアニン、及びアロフィコシアニンから選択されることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリンであることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
該フィコビリン・タンパク質がＲ−フィコエリスリンであることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
該第二の接合体の該第二の特異的結合ペア・メンバーがアビジン、ストレプトアビジン、及び抗ジゴキシンから選択されることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
該第二の接合体の該第二の特異的結合ペア・メンバーがストレプトアビジンであることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
該第二の接合体が４００，０００と約１，０００，０００ダルトンの間の分子量を有することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
該第一の接合体の該第二の接合体に対するモル比が１：１〜約１：５であることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
該複数の粒子が約１〜約１０μＬの体積を有することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
該血液サンプルが約１〜約５μＬの体積を有することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
該アレルゲン特異的抗体が該血液サンプルを希釈することなしに決定されることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
該血液サンプルが、この方法で使用するための血液サンプルを得ることを可能にするように血液採取キットを用意し、皮膚を刺して血液を取り、前記血液のサンプルを採取し、この方法で使用するためにサンプルを提出することによって得られることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
血液サンプルにおける全免疫グロブリンＥレベルを定量的に決定するための装置であって：
（ａ）抗ヒトＩｇＥ抗体に結合した複数の粒子、該粒子は約１〜約５０μＬの水性媒質に懸濁している；
（ｂ）抗ヒト抗体と特異的結合ペアの第一のメンバーを含む第一の接合体、前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅する能力を有する；
（ｃ）フィコビリン・タンパク質と、該第一の特異的結合ペア・メンバーに特異的に結合し蛍光信号出力を増幅する第二の特異的結合ペア・メンバーとを含む第二の接合体；を含み
（ｄ）該第一の接合体の該第二の接合体に対するモル比が約１：１〜約１：５であることを特徴とする装置。
【請求項５０】
粒子と結合した抗体がポリクローナル抗ヒトＩｇＥから選択されることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項５１】
粒子と結合した抗体が免疫グロブリンＥと特異的に結合する抗ヒトＩｇＥ断片であることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項５２】
粒子と結合した抗体が免疫グロブリンＥと特異的に結合するモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項５３】
該抗ヒト抗体が抗ヒトＩｇＥであることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項５４】
該抗ヒト抗体が免疫グロブリンＥと特異的に結合する抗ヒトＩｇＥ断片であることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項５５】
該抗ヒト抗体が免疫グロブリンＥと特異的に結合するモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項５６】
該フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリン、フィコシアニン、、及びアロフィコシアニンから選択されることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項５７】
該フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリンであることを特徴とする、請求項５６に記載の装置。
【請求項５８】
該フィコエリスリンがＲ−フィコエリスリンであることを特徴とする、請求項５７に記載の装置。
【請求項５９】
該第二の接合体が４００，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有することを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項６０】
該第一の特異的結合ペア・メンバーがビオチン及びジゴキシンから選択されることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項６１】
該第一の特異的結合ペア・メンバーがビオチンであることを特徴とする、請求項６０に記載の装置。
【請求項６２】
該ビオチンは抗ヒト抗体に約１０：１〜約３０：１のモル比で接合していることを特徴とする、請求項６１に記載の装置。
【請求項６３】
該ビオチンは抗ヒト抗体に約１５：１〜２５：１のモル比で接合していることを特徴とする、請求項６１に記載の装置。
【請求項６４】
該ビオチンは抗ヒト抗体に２０：１のモル比で接合していることを特徴とする、請求項６１に記載の装置。
【請求項６５】
該第二の特異的結合ペア・メンバーがアビジン、ストレプトアビジン、及び抗ジゴキシンから選択されることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項６６】
該第二の特異的結合ペア・メンバーがストレプトアビジンであることを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項６７】
該粒子の懸濁液が約１〜２５μＬの体積を有することを特徴とする、請求項４９に記載の装置。
【請求項６８】
さらに、約１〜約２μＬの体積を有するテストされる血液サンプルを含む、請求項４９に記載の装置。
【請求項６９】
血液サンプル中の全免疫グロブリンＥ抗体を検出し定量化するための均質免疫分析方法であって：
（ａ）約０．５〜約１０μＬの体積を有する血液サンプルを抗ヒト免疫グロブリンＥと結合した複数の粒子と接触させるステップ、該粒子は約１〜約５０μＬの水性媒質に懸濁されている；
（ｂ）その後、ステップ（ａ）からの物質を、特異的結合ペアの第一のメンバーに接合された抗ヒトＩｇＥ抗体を含む第一の接合体と接触させるステップ、前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅する能力を有する；
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの物質を、該第一の特異的結合ペア・メンバーと結合する第二の特異的結合ペア・メンバーに結合した蛍光体部分を含む第二の接合体と接触させるステップ；及び
（ｄ）その後、ステップ（ｃ）からの物質中の特異的免疫グロブリン抗体のレベルを、該粒子の蛍光放出信号を決定し、同時に該粒子に結合した蛍光体部分の蛍光放出信号を測定することによって決定するステップ；
を含む前記方法。
【請求項７０】
該第一の接合体がビオチン又はジゴキシンと結合した抗ヒトＩｇＥ抗体を含むことを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
該第一の接合体における抗ヒトＩｇＥ抗体の第一の結合ペア・メンバーに対するモル比が約１：１０〜約１：３０であることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
該第一の接合体における抗ヒトＩｇＥ抗体の第一の結合ペア・メンバーに対するモル比が約１：１５〜約１：２５であることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
該第一の接合体における抗ヒトＩｇＥ抗体の第一の結合ペア・メンバーに対するモル比が１：２０であることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
該第二の接合体の蛍光体がフィコビリン・タンパク質であることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
該フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリン、フィコシアニン、及びアロフィコシアニンから選択されることを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
該フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリンであることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
該フィコビリン・タンパク質がＲ−フィコエリスリンであることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
該第二の接合体の第二の特異的結合ペア・メンバーがアビジン、ストレプトアビジン、又は抗ジゴキシンを含むことを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７９】
該第二の接合体の第二の特異的結合ペア・メンバーがストレプトアビジンであることを特徴とする、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
該第二の接合体が４００，０００〜約１，０００，０００ダルトンまでの間の分子量を有することを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
該第一の接合体の該第二の接合体に対するモル比が１：１〜約１：５であることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
該粒子が約１〜約２５の体積を有することを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項８３】
該血液サンプルが１〜約５μＬの体積を有することを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項８４】
全ＩｇＥ濃度がサンプルを希釈することなく決定されることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項８５】
前記方法で使用する血液サンプルを得ることを可能にするように血液採取キットを用意し、皮膚を刺して血液を取り、前記血液のサンプルを採取し、前記方法で使用するためにサンプルを提出することによって該血液サンプルが得られることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項８６】
サンプル中のアレルゲンに対する特異的抗体の存在又は全ＩｇＥに関するテストの実施及び提供方法であって：
（ａ）皮膚を刺して血液を吸引し、前記血液のサンプルを採取し、該方法で使用するために前記サンプルを提出することにより、該方法で使用する血液サンプルを個体が提供できるようにする血液採取キットを用意するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）からのサンプルにおける特異的アレルゲンに対する抗体の存在又は全ＩｇＥを検出する均質免疫分析を行うステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）からの免疫分析の結果をデータベースに入力するステップ；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）のデータベース内の免疫分析の結果へのアクセスをグローバル・コンピュータ・システムのウエブサイト又はウエブページによって該個体に提供するステップ；
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロス・レファレンス
本出願は、２００１年１２月６日に出願した米国出願第１０／００６，４８３号の一部継続出願である。
発明の背景
１．  発明の属する技術分野
[０１]  本発明は、アレルギー診断のために血液サンプルからの多数のアレルゲンに対する特異抗体レベルを決定するための、又は血液サンプルにおける全免疫グロブリンＥのレベルを決定するための均質免疫分析方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
２．  背景及び従来技術
[０２]  「アレルギー」とは、アトピー又は過敏症と同義語であって、アレルゲンと呼ばれるいろいろな抗原物質に対して免疫的に誘発される個体の反応を指す。アレルギーがある人は、吸入又は嚥下される花粉、かび、ふけ、又は食品からの通常は無害な物質、への曝露に応答してアレルゲン特異的な免疫グロブリン、ＩｇＥとＩｇＧ、を生成する。生成された抗体は放出されて血液中で循環し、ときには組織の特定細胞に固着する。アレルゲンへの曝露は、一般に即時的な反応又は遅延した反応を生じ、それはいくつかのよく見られる症状、例えば、くしゃみ、目の刺激、鼻水、及び肺や鼻の気道の炎症として発現する。「アレルギー」という用語はまた、一般に、枯草熱、鼻炎、湿疹、じんま疹、と同義であり、喘息の発現と結びつけられる。アレルギーの診断には、患者の病歴の検討、理学的検査、そして患者の症状がアレルギーに起因するかどうかを決定する確認的な診断テストを行うことが必要になる。症状の原因がアレルギーである場合、原因になっているアレルゲンを同定しなければならない。アトピー又はアレルギー疾患がある患者は１つのアレルゲンに対してだけ感受性がある場合もある；しかし、複数のアレルゲンに対して感作があるというのがもっと普通である。アレルゲンに対する人の反応は、不快（annoying）程度から、深刻、さらには致死的なものにまで及ぶ。したがって、ある人にアレルギーがあるかどうかということだけではなく、アレルギーがあるとしたら、どんなアレルゲンに対してどれほど深刻なアレルギーがあるかを決定し、薬物治療又は免疫治療の方法によって曝露を回避したり、最小にしたり、軽減したりできることが望ましい。
【０００３】
[０３]  確認診断テストは、in vivo皮膚テスト、in vivo誘発テスト、又は血液サンプルからの循環するアレルゲン特異的抗体の存在を調べるin vitroテストによって行うことができる。可能な攻撃的アレルゲンの直接吸入又は嚥下による直接誘発テストは不快であり、危険である可能性もあり、多数のアレルゲンについて同時に行うことはできない。
【０００４】
[０４]  皮膚テスト（皮膚乱刺（prick）テスト又は引っかきテストともいう）は、アレルゲン・サンプルを、もっと一般的には多数のアレルゲンを、皮膚を小さな針で引っかくことによって患者の前腕部又は背中に塗布し、塗布された皮膚の場所における炎症反応のサイズを測定するというin vivoテスト方法である。皮膚乱刺（prick）テストは、広く用いられ、最適な条件下では信頼性が高いが、苦痛を与えることがあり、技能や解釈によって大きな差異が生じ、ある種の薬を服用している患者や皮膚に問題がある患者には用いることができない。さらに、誘発テスト及び皮膚乱刺in vivo診断方法はどちらも、新しいアレルゲンに対して患者を敏感にし、極端な場合は攻撃的なアレルゲンへの直接曝露によって生命の危険があるアナフィラキシー反応を誘発する可能性がある。
【０００５】
[０５]  in vitro診断テスト方法は、患者から得られる血液サンプルで、アレルゲン特異的抗体の血中レベルを直接測定する。この方法は一般に、再現性が高く、その感度と特異性に関しては良く行われた皮膚乱刺テストと同等であり、２つのin vivoテストのいずれかの使用を妨げる因子によっても影響されることがなく、アナフィラキシー反応を誘発しない免疫分析法である。単一のアレルゲンに対する特異抗体レベルを測定できる免疫分析法はずっと前から用いられている（Johansson, S.G.O, and Yman, L., In vitro assay for immunoglobulin E, Coin. Rev. Allergy 6, 93-109, 1988）。それと異なり、複数のアレルゲンに対するアレルゲン特異的なレベルを測定する方法は、例えば、米国特許第４，４５９，３６０号、同第５，０８２，７６８号に記載されているように、アレルギーをスクリーニングする有用な方法になっている。米国特許第６，０８７，１８８号は、サンプル中の抗体を常磁性粒子とアビジン又はストレプトアビジンに結合した化学発光アクリジニウム化合物を用いて検出する方法を記載している。この特許に記載されている方法はアレルゲンの検出に有用であると述べられている。しかし、この方法は、あるサンプルにおける単一アレルゲンの検出に限定される。
【０００６】
[０６]  臨床診断の分野では、拡大しつつあるリストに載っている臨床的に関連ある分析物について判定するためにいろいろなカテゴリーの方法が利用できる。そのようなカテゴリーの１つが免疫分析法であり、現在、生物サンプルにおけるいろいろな分析物の存在や濃度を好適にかつ高い信頼性で決定するために用いられている（The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, M., Stockton Press, 1994）。免疫分析は、流体中の標的分析物に対する特異結合因子を利用するものであり、一般にそのような結合因子の少なくとも１つが、放射性同位元素、酵素、及び蛍光又は化学発光化合物、など、放射性崩壊、酵素で誘発される色を生ずる物質、蛍光の発生又は抑制、化学発光出力、によって測定できるいろいろな化合物で標識される。このような特異結合因子は、普通、分析物特異的な抗体（免疫グロブリン）及び抗体断片、レセプター、レクチン、及び遺伝子工学又は化学的に設計された人工的抗体を含む。注目すべき免疫分析法としては、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＺＡ）（Enzyme Immunoassay, Edward T. Maggio, CRC Press, 1980）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、及び化学発光分析法（ＣＬＡ）（Luminescent Assays, Perspective in Endocrinology and Clinical Chemistry, Vol. 1, Mario Serio and Mario Pazzagli, Raven Press, 1982）、（Bioluminescennce and Chemiluminescence, Basic Chemistry and Analytical Applications, Marlene, A. DeLuca and William D. McElroy, Academic Press, 1981）、（Journal of Bioluminescence, Vol. 4, M. Pazzagli, et al., Proceedings of the Vth International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence, Wiley, 1989）、etc. これらの分析法を実行するための方法のバリエーションや装置が多数あって、当業者には公知であり、科学文献や特許文献で見出される。
【０００７】
[０７]  免疫分析は、不均質であるか又は均質である。不均質免疫分析は、分子量が小さい分析物にも大きい分析物にも応用され、（検出又は決定すべき）結合した物質を（測定の妨害になることがある）自由な物質から分離する必要がある。不均質免疫分析は、プラスチックのマイクロタイタ・プレート、ビーズ、チューブなどの固体表面又はガラス、ナイロン、セルロースなどの膜シート、チップ、ピースに固定される抗原又は抗体を含む（Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptide, Howard H. Weetal, Marcel Dekker, Inc., 1975）。不均質免疫分析では、固体相に結合した抗原−抗体錯体が、溶液中の未反応の、非特異的な分析物から一般に遠心分離、濾過、沈殿、磁気的分離、又は固体相からの流体の吸い上げなどによって分離され、その後固体相に結合した抗原−抗体錯体が繰り返し洗浄される。特に興味深いのは、免疫計測「サンドイッチ」分析法である（Immunochemistry of Solid Phase Immunoassay, John E. Butler, CRC Press）。これはまず、固定された抗原又は抗体を生物サンプルからの標的分析物と結合させる必要がある。固定されたペアを分離し、その後繰り返し洗浄した後、その分析物に特異的な二次結合物質が導入される。この二次結合物質は、通常、放射性同位元素、酵素、蛍光又は科学発光ラベル（標識）と化学的に結合している。典型的な二次結合物質は、免疫グロブリン抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、又は組み換え抗体である。分析物は、最初の抗原又は抗体と標識された二次結合物質の間に「サンドイッチ」される。未結合の標識された二次結合物質を除去するために、その後の分離と洗浄が必要である。次に、標識さ結合した固定された錯体の直接測定又は基質を用いた間接測定が行われる。固体相の免疫分析の実行に精通している人であれば、この方法が厄介であり、時間がかかり、固定された結合物質及び分析物を分離するために特別な設備や装置が必要であることを理解するであろう。
【０００８】
[０８]  均質分析は、一般に、液層での分析方法であり、固体物質に固定された抗原又は抗体を用いない。この方法は、蛍光標識された抗原又は抗体を使用することが多く、これらが標的の分析物と結合すると、結合したペアが空間的に近接しているために、励起されて蛍光を放出したり蛍光の放出が停止したりする。均質分析方法は、普通、ハプテン、薬、ホルモン、ペプチドなどの小さな分子を検出するために開発されてきた。巨大分子の分析物、例えば、分子量が５０００を超えるタンパク質やペプチドは、通常、分析感度が低すぎるので均質方法によって測定されない。タンパク質の検出のための均質方法は米国特許第５，８０７，６７５号で報告されたが、両方の結合物質に化学的な修飾が必要であり、しかも単一の分析物の検出に限定される。
【０００９】
[０９]  アレルギー診断のためには、全免疫グロブリンＥレベルの測定が有用であるが、さらに重要なのは、１つ以上のアレルゲンがアレルギー症状の発現の原因になっている場合に、一連のアレルゲンに対する特異的免疫グロブリン抗体レベルを同時に測定できる好適で信頼性の高い免疫分析方法が必要であるということである。さらに、免疫分析手順が容易に実行でき、自動化に適合していることが望ましい。現在利用できるin vitroでの方法は不均質免疫分析方法を用いるものであり、分離と洗浄を必要とし、そのため手間と時間がかかり、自動化することが難しい。固体相不均質分析方法の汎用性と感度を均質プロトコルの容易さと組み合わせることが有利になるであろう。さらに、一連のアレルゲンに対するin vitroアレルギー試験を行うためには患者の静脈血から相当な量のサンプル、一般に３−５ミリリットルのサンプルを採取する必要がある。実際、患者は血液サンプルを採取してもらうという目的だけのために検査室又は病院に行かなければならない。
【００１０】
[１０]  免疫分析の最近の進歩は、小さな固体相を用い必要なサンプルの量も少ないマイクロ技術を導入した。一例は、米国特許第５，９８１，１８０号に記載されている、複数の生体分子の分析と検出を行うためのマイクロ免疫分析法である。この汎用タイプの装置はLuminex CorporationによってFlow Matrix （商標）という商品名で市販されている。このテクノロジーは、フロー・サイトメトリーの手法を組み込み、小さな５．６ミクロンのポリスチレン・ビーズ・セットを用い、各セットは内部蛍光シグナチャー（signature）を含み、複数の分析物の検出を可能にしている。抗体の特異的レベルが循環する血液中で低い場合のin vitroアレルギー・テストでは、ミリリットルあたりナノグラム以下、又はピコグラムというレベルにある抗体の検出を可能にするためには希釈されない血液又は血清が必要である。現在まで、既存のin vitroアレルギー・テスト方法では均質免疫分析法ではなく不均質免疫分析方法が用いられている。それは、希釈されない血液又は血清は多くの場合マイクログラム・レベルの自由な又は非特異的（全）抗体を含み、それが均質分析による測定を妨げるからである。
【００１１】
[１１]   希釈されない血液又は血清を用いてミリリットルあたりナノグラム以下、又はピコグラムというレベルの抗体を測定する均質分析方法では、希釈されない血清における自由な又は非特異的な抗体レベルがミリリットルあたりマイクログラムという領域にある場合にサンプル中の特異的抗体のレベルが誤って低く、又は誤って検出不可能なレベルにあると示されるということが知られている。このような誤った結果は、「フック（hook）効果」と呼ばれている。フック効果は、Robard, D.によって（Radioisotopes: 37, (10), 1988）、Immunoassay Handbook (David Wild, M 編、Stockton Press, 1994)において、またAmerican Society for Microbiologyが刊行したManual of Clinical Laboratory Immunology（4th ed., Rose et al. Editors） (Chapter 2, page 5)、に記載されている。これには、量−応答曲線の高い方の端における分析物の量の予期しない低下が関わっており、そのために分析物が大きく過小評価される結果になる。フック効果は、生の血清又は血液サンプル中の高濃度の自由な、すなわち結合しない分析物が二次結合物質に結合し、そのために固体相と結合した分析物が利用できる二次結合物質が不足することによって起こり、その結果誤った低い信号が生じ、分析物の濃度が誤って低く示される。不均質分析方法は、具体的には免疫計測サンドイッチ分析法は、一般にその手順に内在している分離と洗浄ステップによってこの妨害を回避する。
【００１２】
[１２]  上記の参照文献は、検査室がこのフック効果に対処するいくつかの方法をあげている。あげられた戦略の１つは、この問題に関するスクリーンとして全ての患者サンプルを２つの希釈度で試験するということである。より希釈されたサンプルが著しく高い分析物レベルを示した場合、検査室はフック効果の可能性を疑わなければならない。その場合いろいろな希釈度で試験を行って、サンプル中に存在する分析物の量を正確に決定することができる。このやり方では、もちろん、ある患者からのサンプルについて試験を行うための作業が重複し、時間が長くかかり、コストも増加する。あるいはまた、結合した及び結合していない特異的及び非特異的分析物抗体の両方と結合するのに十分なほど大量に過剰な二次結合物質を用いるというやり方もある。しかし、このやり方は、希釈されない血液中の結合していない特異的及び非特異的分析物抗体の濃度が大きくなり、in vitroアレルギー・テストを行うのに普通必要な血清又は血液の量が比較的大きくなり、使用する二次結合物質のコストが高くなるので実用的でないことが分かった。
【００１３】
[１３]  多数のアレルゲンに対する特異的抗体の存在を一回のテストで同時に検出するための、又は血液サンプル中の全ＩｇＥ抗体の量を決定するための均質分析方法であって、フック効果が発生しにくい方法を提供することは有益であろう。また、アレルギーの患者からの血液サンプルをテストする方法であって、患者が検査室や病院に行く必要がなく、またこのテストのためにかなり多量の血液を採取する必要もない方法を提供することは有益であろう。ここに記載される発明は、そのような利点、ならびに以下の記載から明らかになるその他の利点を提供するものである。
【発明の開示】
【００１４】
発明の要約
[１４]  きわめて一般的に言うと、本発明は、アレルギーを診断するために非常に少量の血液サンプリングを用いて複数のアレルゲンに対する特異的免疫グロブリン抗体のレベルを同時に検出し定量化する方法及びシステムを提供する。本発明はまた、そのように少量の血液サンプリングによって全免疫グロブリンＥのレベルを検出し定量化する方法及びシステムを提供する。
【００１５】
[１５]  一般に、本発明の方法は、血液サンプル中の２乃至役１００のアレルゲンに対する特異的免疫グロブリン抗体レベルを同時に測定するものであって、この方法は：
(a) 個体から約１０乃至約１００μＬの血液サンプルを採取するステップ；
(b) その血液サンプル又はその一部に対して均質免疫分析を行うステップ、ここで免疫分析は２乃至約１００のアレルゲンに対する免疫グロブリン抗体レベルを決定することができる；及び
(c) 前記特異的免疫グロブリン抗体レベルを決定するステップ、
を含む。本発明のシステムは、均質免疫分析を用いて複数の特異的免疫グロブリン抗体レベルを同時に測定するシステムであって、前記システムは：
(a) ２乃至約１００のアレルゲンと結合する複数の粒子；
(b) 特異的結合ペアの第一のメンバーに接合した（conjugated）抗ヒトＩｇＥ又はＩｇＧ抗体を含む第一の接合体（conjugate）；及び
(c) 第一の特異的結合ペア・メンバーに結合した第二の特異的結合ペア・メンバーを含む第二の接合体；
を含み、システムは均質免疫分析によって２乃至約１００のアレルゲンに対する特異免疫グロブリン抗体レベルの同時定量的決定を行うことができる。
【００１６】
[１６]  このシステム及び方法は、このように比較的少量の血液サンプルで複数の（２乃至約１００の）アレルゲンの同時決定を行うことを、初めて、可能にする。
【００１７】
[１７]  １つの好ましい方法は、血液サンプルにおける複数のアレルゲンに対する特異的免疫グロブリン抗体を同時に検出し決定するための免疫分析を含み：
[１８](a) 約１乃至約２５μＬ、好ましくは１−１０μＬ、さらに好ましくは１−５μＬ、の体積の血液サンプルを複数のアレルゲンと結合した複数の粒子と接触させるステップ；該粒子は約１乃至約５０μＬ、好ましくは約１乃至約１０μＬ、の水性媒質に懸濁し、粒子と特異的アレルゲンとの各組み合わせは、血液サンプル中に存在するアレルゲン特異的な免疫グロブリン抗体が粒子に結合した１つ以上のアレルゲンに特異的に結合している状態で、粒子と他のアレルゲンの組み合わせから区別できる；
[１９] (b) その後ステップ(a)からの物質を、特異的結合ペアの第一のメンバーに接合した抗ヒトＩｇＥ又はＩｇＧ抗体を含む第一の接合体（conjugate）と接触させるステップ、抗ヒト抗体が免疫グロブリン抗体と結合している状態で前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅する能力を有する；
[２０] (c) その後、ステップ(b)からの物質を特異的結合ペアの第二のメンバーと結合した蛍光体部分を含む第二の接合体と、該特異的結合ペアの第二のメンバーがペアの第一のメンバーと結合する条件の下で、接触させるステップ；及び
[２１] (d) その後ステップ(c)の生成物から放出される蛍光を測定するステップ、を含む。
【００１８】
[２２]  第二の方法は、血液サンプルの全免疫グロブリンＥのレベルを検出し定量化する均質免疫分析を含み、その方法は：
[２３] (a) 約０．５乃至約１０μＬ、好ましくは約１乃至約５μＬ、さらに好ましくは約１乃至約２μＬ、の体積を有する血液サンプルを、抗ヒト免疫グロブリンＥと結合した複数の粒子と接触させるステップ、粒子は約１乃至約５０μＬの水性媒質に懸濁している；
[２４] (b) その後、ステップ(a)からの物質を、特異的結合ペアの第一のメンバーに接合した抗ヒトＩｇＥ抗体を含む第一の接合体と接触させるステップ、前記特異的結合ペアは抗ヒト抗体が抗ヒト免疫グロブリンＥに結合している状態で蛍光信号出力を増幅する能力を有する；
[２５] (c) その後、ステップ(b)からの物質を、該特異的結合ペアの第二のメンバーと、該特異的結合の第二のメンバーがペアの第一のメンバーに結合する条件の下で接触させるステップ；及び
[２６] (d) その後、ステップ(c)の生成物から放出される蛍光を測定するステップ、を含む。
【００１９】
[２７]  同様に、本発明の１つのシステムは血液サンプルにおけるアレルゲンに対する特異的免疫グロブリン（ＩｇＥ又はＩｇＧ）の定量的決定のためのシステムを含み、該システムは：
[２８] (a) 複数のアレルゲンに結合した複数の粒子、該粒子は約１乃至約５０μＬの水性媒質に懸濁し、粒子と特異的アレルゲンとの各組み合わせは、粒子と他のアレルゲンとの組み合わせから区別できる；
[２９] (b) 特異的結合ペアの第一のメンバーに接合した抗ヒトＩｇＥ又はＩｇＧ抗体を含む第一の接合体、前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅する能力を有し、該第一の接合体は抗ヒト抗体の１分子に接合した１０乃至３０分子、好ましくは１５乃至２５分子の第一の結合ペア・メンバーを有する；
[３０] (c) 該特異的結合ペアの第一のメンバーに特異的に結合した第二のメンバーを含む第二の接合体、第二の接合体は蛍光体部分と結合している；を含み
[３１] (d) 第一の接合体の第二の接合体に対するモル比が約１：１乃至約１：５，好ましくは約１：１乃至約１：２である。
【００２０】
[３２]  本発明はさらに、血液サンプル中の全免疫グロブリンＥレベルを定量的に決定するためのシステムを含み、該システムは：
[３３] (a) 抗ヒトＩｇＥ抗体と結合した複数の粒子、該粒子は約１乃至約５０μＬの水性媒質に懸濁している；
[３４] (b) 特異的結合ペアの第一のメンバーに接合した抗ヒトＩｇＥ抗体を含む第一の接合体、該特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅する能力を有し、該第一の接合体は抗ヒト抗体の１分子に接合した１０乃至３０分子、好ましくは１５乃至２５分子の第一の結合ペア・メンバーを有する；
[３５] (c) フィコビリン・タンパク質と該第一の特異的結合ペア・メンバーに特異的に結合した第二の特異的結合ペア・メンバーを含む第二の接合体；を含み
[３６] (d) 第一の接合体の第二の接合体に対するモル比が約１：１乃至約１：５，好ましくは約１：１乃至約１：２である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
[３９]  本発明は、アレルギー診断のための、個体の血液サンプル中のアレルゲンに対する特異的抗体を検出し定量化する方法及びシステムに関する。これまで、アレルギーのin vitroテストでは、アレルゲンの組についてのテストを可能にするような静脈からの血液サンプル採取を必要とする免疫分析方法を用いている。普通、５つ以上のアレルゲンの組について特異的抗体のレベルを決定するために、現在の方法で必要なサンプルの量は血液で１乃至３ミリリットルになる。このような従来技術に比べて、本発明は必要なサンプルの体積を１０マイクロリットル以下に制限し、それを用いて２つ以上のアレルゲン、好ましくは１０，２０，４０以上のアレルゲン、をテストすることができる。必要なサンプルの量は十分に小さく、遠隔の場所で指に刺す針を用いて個人が採取できる程度である。本発明によって、医院、病院の検査室、又は臨床検査機関における静脈採血手順によって血液サンプルを採取する必要がなくなる。
【００２２】
[４０]  本発明のある好ましい実施の形態では、血液をテストすべき人に対して、血液サンプルを採取し、郵送その他の仕方で提出するためのキットが提供される。キットには、普通、指又は他の体部分の皮膚に針を刺してある量の血液を採取するための器具（例えば、「フィンガープリック」又は「フィンガースティック」装置）、針を刺す部分を清潔にするためのアルコールその他の消毒用綿棒、血液を入れて密封するバイアルその他の容器、そしてテストする検査機関に血液サンプルを郵送するための適当な容器、が含まれる。キットはまた、その他の品、例えば、傷を保護する接着剤、説明書、及び個人識別ナンバー付きのサンプル用ラベル（例えば、ＰＩＮ）、なども含めることができる。いずれにしても、このキットの形や内容の細かい点は、検査機関の希望に応じて変えることができ、本発明の一部を成すものではない。このようなキットのいろいろな成分は、いろいろな目的での血液の採取及び／又はテスト（例えば、家庭でのテスト）のために容易に入手できる。
【００２３】
[４１]  さらに、医院や検査機関へ行かずに個人が血液サンプルを提供できるということは、本発明を限定する特徴ではなく、単にその利点であるにすぎない。血液サンプルは、医院へ外来で来たときに採取し、検査機関に提出してテストすることもできる。このような場合にも、本発明の他の利点、例えば、希釈することなしに及び／又はテストの重複なしに少量のサンプルをテストできること、は生かされる。
【００２４】
[４２]  このように限られたサンプル量を用いることで、分析の際に大量の自由なＩｇＥが存在することが回避され、結果的にアレルギーのin vitroテストで均質分析の障害になっていたフック効果が回避される。アレルギーを診断するためのin vitroテスト方法では、これまで不均質免疫分析方法を用いており、もっと一般に、二点（two site）免疫計測サンドイッチ分析法を用いており、分離と洗浄のステップを実行する必要があった。また、この方法では、１０-9乃至１０-12というモル・レベル又はナノグラム／ｍＬ乃至ピコグラム／ｍＬという低い特異的抗体の血中循環レベルを測定するために必要な感度を達成するためには、生の（neat）血清、血漿、又は血液サンプルが必要である。アレルギーのある人の生の血液サンプルには一般に高レベルの特異的抗体及び非特異的抗体が存在し、これらの分析で高い量（high dose）でのフック効果が発生するために、均質分析はこれまで用いられなかった。本発明は、固体相サンドイッチ免疫分析法を均質分析形式と組み合わせた分析方法を提供し、物質の分離、洗浄、などの必要がなく、サンプル希釈の必要もない。
【００２５】
[４３]  この分析方法は、アレルギー診断で不可欠の、そして既知のアレルゲンに対するアレルギー応答の度合い又は強さの判定に関して本質的に重要な全ＩｇＥのレベル及び特異的抗体のレベルを定量化する。
【００２６】
[４４]  この方法を実行し、本発明で用いるシステムを構成するための予備ステップは、複数のアレルゲンと結合した複数の固体粒子を調製し寄せ集めて、例えば、ある個人のアレルギー症状が１つ以上の調べているアレルゲンによって起こっているかどうかを決定するためにテストすべきアレルゲンの組（panel）を用意することである。
【００２７】
[４５]  粒子と特異的アレルゲンの各組み合わせは、粒子と他のアレルゲンとの組み合わせから区別可能である。特異的アレルゲンは、抽出されたタンパク質、クロマトグラフィー法又はアフィニティー・クロマトグラフィー法によって精製されたタンパク質断片、組み換えタンパク質、又はそれらの組み合わせ、から成る。アレルゲンのミックス、例えば、２つ以上の草、木、又は食品、も利用できる。粒子といろいろなアレルゲンの組み合わせを区別する能力は異なるタイプの複数の粒子を用意することによって実現される。すなわち、粒子はサブセット（部分集合）に分けられ、各サブセットは特定の性質、特徴（単数又は複数）によって他のサブセットから区別できる。例えば、米国特許第５，９８１，１８０号に記載されているように、粒子はサブセットに分けられ、各サブセットは内部又は表面に組み込まれた蛍光体又は蛍光体の組み合わせによって得られる特定の色又は放出スペクトルによって区別できるようにすることができる。粒子の各サブセットは特異的アレルゲンと結合し、粒子と特異的アレルゲンの組み合わせは、問題の粒子又はビーズを用いられる他の粒子又はビーズから区別する具体的な特徴（単数又は複数）によって粒子と他のアレルゲンの組み合わせから区別できる。アレルゲンとビーズ又は粒子との結合は、当業者には周知であり特許や科学文献に記載されている共有結合又は吸着法によって達成される（例えば、Immunochemistry of Solid Phase Immunoassay, John E. Butler, CRC Press, 1991, 及びImmobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides, Ed. By Howard H. Weetal, Marcel Dekker, Inc., New York, 1975, を見よ）。
【００２８】
[４６]  粒子そのものは普通、球形であり（すなわち、「ビーズ又はマイクロスフェア」）、表面は粗い又はなめらかであり、当業者に公知の仕方で調製される。粒子は、いろいろな材料から作られるが、通常、非多孔質のガラス、ポリスチレン、ラテックス、又はその他の高分子材料から作られ、一般に直径が０．０５ミクロン乃至９０ミクロン、好ましくは直径が０．５ミクロン乃至１０ミクロン、であり、密度は約１乃至２ｇ／ｍＬの範囲にあり、好ましくは水の密度に近い。
【００２９】
[４７]  粒子／アレルゲンの組み合わせは、タンパク質安定剤と静菌剤を含む緩衝溶液に貯蔵して、必要に応じて使用することが好ましい。
[４８]  個々のアレルゲン／粒子組み合わせのサブセットを調製したら、そのサブセットを単独で使用することもできるし、一緒に混合して粒子と結合したアレルゲンの単一集合体を形成することもできる。これを分析を行う前に実行して、一般的に使用するために予め集められたアレルゲンの組として用意することもできるし、例えば、何人かの患者の地理的な場所や環境に合わせて１つ以上の分析を構成することが望ましい場合には、個々の分析の度毎に実行することもできる。粒子の濃度は従来の計数装置を用いて測定し調整することができ、分析のために所望の数の粒子を取り分ける（aliquot）ことができる。懸濁液中の粒子の数は限定された量で限定された体積にあることが、分析の感度、スピード、及び自動化された微量分析形式への適合性（自動化された分析を用いる場合）を確保するために好ましい。懸濁液中の粒子は、密度が水の密度に近く、分子運動及び分子接触を可能にし、かつ微量分析形式に適合するのに十分な体積の緩衝又は水性媒質に懸濁されなければならない。
【００３０】
[４９]  テストのための組は、全体で、少なくて２つ、好ましくは少なくて５つ、から約１００までの特異的アレルゲン又はアレルゲンの混合を含むことができる；しかし、１０から４０までのアレルゲンの組がよく用いられる。各テストでサンプルは、粒子と結合したアレルゲン又はアレルゲンの混合の各セットに約１０００乃至約４０００の粒子を、好ましくは小さな体積に、例えば、約１乃至約５０μＬという体積、好ましくは約５〜２５μＬという体積に含む懸濁液に加えられることが好ましい。したがって、例えば、１０のアレルゲンの組についてのテストは、５〜２０マイクロリットルの緩衝溶液に約１０，０００の粒子を含む。同様に、２０アレルゲンの組についてのテストは、５〜２０マイクロリットルの体積に約２０，０００の粒子を組み込むことになる。分析における粒子の数を増やすことは、粒子を同定し、読み取るために必要な時間を減少させる。
【００３１】
[５０]  こうして調製された粒子に、個人の血液サンプルを接触させる。血液サンプルは、体積が約１乃至約２５μＬ、好ましくは約１乃至約１０μＬ、最も好ましくは約１乃至約５μＬである。抗原又は抗体と分析物の結合はインキュベーション条件、例えば、時間、温度、ｐＨ、反応物質のイオン強度など、によって影響されることは当業者に認識されており、分析の条件は当業者に公知の仕方で、テストの感度と特異性を最適化するように、一般に手順を実行する容易さと自動化への適合性に合うように選択される。一般に、この条件は、約１８乃至３７℃の範囲の温度、好ましくは約１８乃至２５℃の範囲の周囲温度、及び約１５分乃至約２４時間、好ましくは１時間以下の時間を含む。最初のインキュベーション段階で、個人血液サンプルからの特異的抗体は粒子上の特異的アレルゲンと通常の抗原−抗体結合力によって結合する。懸濁液は自由な特異的抗体と自由な非特異的抗体の両方、並びに粒子に結合した特異的抗体を含む。
【００３２】
[５１]  血液サンプルにおける全免疫グロブリン抗体の決定では、粒子に結合した抗ヒト抗体に個人のサンプルを接触させる。サンプルは、体積が約０．５乃至約１０μＬ、好ましくは約１乃至約５μＬ、最も好ましくは約１乃至約２μＬ、である。インキュベーション時間及び条件は本明細書に記載されるように決定される。本発明のある実施の形態では、全免疫グロブリンのテストでは、４８００ｎｇ／ｍＬのレベルまでの全免疫グロブリンを測定できる。
【００３３】
[５２]  次に、特異的結合ペアの第一のメンバーと結合した、抗ヒトＩｇＥなど、特異的分析物に対する抗体を含む第一の接合体が、順次混合物に加えられる。反応媒質及びサンプルからの固体相粒子の分離は必要ない。特異的結合ペアは、互いに対する結合特異性がある分子のペアである。特異的結合ペアのタイプの例としては、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシン−抗ジゴキシン、ホモポリヌクレオチド・ポリ（ｄＡ）−（ｄＴ）（米国特許第６，２４５，５１３号に記載）などがあげられる。ビオチン−ストレプトアビジン特異的結合ペアは本発明の好ましい実施の形態である。ある好ましい実施の形態では、複数の特異的結合ペアの一方のメンバー（例えば、ビオチン）が抗体（例えば、抗ヒトＩｇＥ）に結合（接合）される。以下で述べるように、その特異的結合ペアの第二のメンバー、例えばストレプトアビジン、は蛍光ラベル又は蛍光体部分に結合される。抗体に接合された複数のビオチンとの第二の特異的結合ペア・メンバーの結合は蛍光信号を増幅して分析感度を高める。抗体のビオチン化は、当業者に周知の方法によって行うことができる。普通、商業的に入手した又は調製した抗体−ビオチン接合体は、１抗体分子あたり５乃至１０ビオチン分子を含む。この好ましい形態では、最適の分析感度は、１抗体分子あたり約１０乃至約３０ビオチン分子、好ましくは１抗体分子あたり約１５〜２５ビオチン分子、が結合したときに得られる。
【００３４】
[５３]  繰り返しになるが、抗原又は抗体と分析物の結合はインキュベーション条件、例えば、時間、温度、ｐＨ、反応物質のイオン強度など、によって影響されることは当業者に認識されており、分析の条件は当業者に公知の仕方で、テストの感度と特異性を最適化するように、一般に手順を実行する容易さと自動化への適合性に合わせて選択される。一般に、この条件は、約１８乃至３７℃の範囲の温度、好ましくは約１８乃至約２５℃の範囲の周囲温度、及び約１５分乃至約２４時間、好ましくは１時間以下の時間を含む。二次インキュベーション段階で、第二の結合物質は通常の抗原−抗体結合力によって分析物−粒子複合体に結合する。
【００３５】
[５４]  接合体の選択は、分析の性能と感度を高める目的で、１０-9乃至１０-12モル領域で蛍光の消滅とフック効果を引き起こさないように行われる。
【００３６】
[５５]  粒子及びサンプルと第一の接合体の混合物との適当なインキュベーション期間の後、蛍光体と接合された特異的結合ペアの第二のメンバーを含む第二の接合体がこの混合物に加えられる。第二の結合ペア・メンバーは、好ましくはアビジン又はストレプトアビジン、最も好ましくはストレプトアビジン、であるが、上述のように、抗ジゴキシン又は米国特許第６，２４５，５１３号に記載された物質であってもよい。アビジン又はストレプトアビジンへの蛍光ラベルの共有結合による付着は、特許及び科学文献にすでに記載されたいろいろな方法によって行うことができる（Haugland, R. P., Bhalagat, M. K., Preparation of avidin conjugates, Methods Mol. Biol. 1998; 80:185-96）。典型的な蛍光部分は、前出のManual of Clinical Laboratory Immunology, のChapter 3に記載されている。あるいは又、接合体は商業的な源から入手することもできる。蛍光染料、例えば、フルオレセイン、アリールスルフォネート・シアニン染料、フィコビリン・タンパク質染料、bodipy染料など、を用いてもよい。粒子サブセットが組み込まれた蛍光色素によって互いに区別される場合、接合体で用いる染料は、蛍光放出が粒子サブセットの放出スペクトルとはっきり異なっていてそれを妨害しないように選ばれる。好ましいタイプの蛍光物質は、フィコビリン・タンパク質として知られている化合物のクラス、具体的にはフィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、最も好ましくはフィコエリスリン、である。フィコエリスリン接合体は、対応するフルオロセイン接合体の感度よりも感度が５倍から１０倍高く、量子収量が０．９８に達し、吸光係数が２．４０百万（ｃｍ-1Ｍ-1）に達する。これらのうち最も好ましいのはＲ−フィコエリスリンである。第二の接合体で、第二の結合ペア・メンバーに対する蛍光染料のモル比は約１：１から約５強：１０までの範囲にあり、分子量は約３００，０００乃至約３，０００，０００ダルトン以上の範囲にある。第二の接合体の好ましい分子量は、一般に、約４００，０００乃至約１，０００，０００ダルトンである。
【００３７】
[５６]  物質は、結合ペア・メンバーが結合するのに好適な条件の下でインキュベートされる。当業者に知られているように、この条件は普通、約１８℃から約４５℃まで、好ましくは約１８℃から約２５℃まで、という温度、及び約１５分から約２４時間まで、好ましくは約１５分から約３時間まで、という時間を含む。
【００３８】
[５７]  このプロセス全体で、蛍光ラベルされた抗体は第一及び第二の結合パートナーによって、そして抗体の分析物抗原への結合によって粒子に結合する。選ばれた蛍光ラベルを励起させるように選択された波長を有する励起エネルギーを印加することによってそれらが検出、測定される。発生される放出スペクトルは粒子に組み込まれている放出スペクトルとは異なる。
【００３９】
[５８]  本発明の方法全体の重要な特徴は、サンプルの希釈なしに免疫分析を行うことができるということである。さらに、小さな体積のサンプルを使用できるようにしたことにより、固体相粒子による均質分析の形が、適当な分析範囲と感度で可能になった。
【００４０】
[５９]  特異免疫グロブリン分析と全免疫グロブリン分析の両方に適用される本発明のある実施の形態では、サンプルを提出した人又は彼又は彼女の許可によって行動する別の人は、インターネットによって、又は同様な全世界的なコンピューター・システムによって、例えば、ウエブ・サイトからウエブ・サーバーを介して、テスト結果にアクセスできる。
【００４１】
[６０]  本明細書で用いられる「ウエブ・サーバー」という用語は、あるウエブ・サーバーへの多数のリクエストを処理するために組織された複数のサーバー、すなわち、分布ウエブ・サーバー、も指す。「ウエブ・サイト」という用語は、しばしば、ある企業体又はその他の団体によって、自分たちの目的のために組織されたウエブ・サーバーの集まりを指す形で用いられる。ユーザーが、彼又は彼女のウエブ顧客に指示してあるサイトのウエブ・サーバーにリクエストさせ、その回答をユーザーに対して表示させるとき（ユーザーとウエブ顧客は実際に物理的に移動しなくても）、そのウエブ・サイトに「行く」又は「アクセスする」と言われる。ユーザーの認識では、ウエブ上にこのウエブ・サイトが存在する場所があるということであるが、「ウエブ・サイト」はしばしば、ウエブ顧客からのリクエストに応えるウエブ・サーバー（単数又は複数）を指している（たとえ、「サイト」が必ずしもウエブ・サーバーの物理的な場所を指していなくても）ことは言うまでもない。実際、多くの場合に、あるウエブ・サイトを運営するサーバーは、局所的な電力の停止やネットワーク・サービスの停止が起きたときにダウンすることを避けるために物理的に分布している。
【００４２】
[６１]  「ウエブ・サイト」という用語は、普通、ビジターに提示するために共通管理者が管理しているページの集まりを指し、その集まりが１つの物理的場所で１人の物理的サーバーによって管理されているか、多くの場所及び／又はサーバーに分布しているかどうかによらない。それらのページ（又は、ページをダイナミックに発生するために必要なデータ／プログラム・コード）は、ページの集まりの共通管理者によって作成される必要はない。このようなページの集まりの管理者は普通、ウエブ・サイト運営者と呼ばれる。
【００４３】
[６２]  「ウエブ・サイト」という用語は、また、イントラネット、無線アクセス・プロトコル（ＷＡＰ）ネットワーク、構内ネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、仮想閉域網（ＶＰＮ）、又はその他のネットワーク形態によってウエブ顧客に結合されたウエブ・サイトも含む。「ウエブ」は普通、「ワールド・ワイド・ウエブ」（又は単に「ＷＷＷ」）を指し、これはＨＴＴＰによってインターネットでアクセスできるハイパーリンクによる文書の集まりに与えられた名称である。本明細書で用いられる場合、「ウエブ」はワールド・ワイド・ウエブ、ワールド・ワイド・ウエブのサブセット、ハイパーリンクされたページの局地的な集まり、などを指すことができる。
【００４４】
[６３]  本発明のこの実施の形態では、サンプルの提出者（又は、提出者から許可を受けた他の誰か、例えば、親類、医師、またはその他の医療提供者）はウエブ・サイト、ウエブ・ページ、などでテスト結果に関する情報にアクセスすることができる。ウエブ・ページは、普通、ある情報から成っている。ウエブ・ページは、静的なページと動的なページを含む。静的なページとは、リクエストの前にはサーバー上に保管され、又はサーバーがアクセスできる保管場所にあり、そのページに対するリクエストに応えて保管場所から送られるページである。動的なページとは、リクエストを受けたときに生成されるページである。例えば、ページがデータベースからのデータの図である場合、サーバーはルール又はテンプレートとデータベースからのデータを用いてそのページを動的に生成することができ、使用される具体的なデータは出された具体的なリクエストによって決まる。
【００４５】
[６４]  ウエブ・ページ上の、又はテスト機関（例えば、試験所）によって、又はその代わりに、管理されているデータベース内の彼又は彼女のテスト結果へのアクセスを許可するパスワード又はコード（ＰＩＮ）を提出者に付与することができる。したがって、この実施形態では、提出者は医院へ行かなくてもテスト結果を受け取ることができ、その後、彼又は彼女が選んだ医師に、彼又は彼女の都合に合わせてその情報を提供することができる。
【００４６】
[６５]  このようなテスト結果を管理し、アクセスを提供するために用いられるコンピュータ・ソフトウエアは販売業者から入手できるものであり、本発明の一部を成すものではない。
[６６]  本明細書で記述される全ての実施例に関して次の分析手順が用いられた。
【００４７】
[６７]  ａ．抽出されたアレルゲン、普通は木、草、かび、食品、ふけ、などから抽出されたアレルゲンが、共有結合又は吸着法によってマイクロ粒子と結合される。各アレルゲン抽出物は、粒子のユニークなサブセットに結合され、各サブセットは組み込まれた蛍光放出又は粒子サイズによって、それらの異なる特性が適当な計測装置で認識できる場合には区別可能である。アレルゲンと結合した粒子サブセットは、個別に貯蔵されるか、複数のサブセットをアレルゲンの組としてタンパク質安定剤及び静菌剤と共に緩衝媒質中で一緒にする。例えば、１０のアレルゲンの組に対して特異ＩｇＥレベルを決定するためには、一緒にされた粒子サブセット１０μＬ、全体で１０，０００の粒子、各アレルゲン粒子サブセットを１，０００の粒子で代表させたものを微量遠心機のチューブ又はマイクロタイタ・ウエルに入れる。全免疫グロブリンを決定するためには、抗ヒトＩｇＥを共有結合又は吸着法によってマイクロ粒子と結合させて、各テストで１，０００の粒子を微量遠心機チューブ又はマイクロタイタ・ウエルに入れる。
【００４８】
[６８]  ｂ．本明細書に記載されたようなフィンガースティック採取キットによって、又はその他の採取方法によって、個体から採取した血液、血漿、又は血清は、適当にラベルしたりバーコードをつけたりして識別できるようにする。アレルゲンの組に対して特異ＩｇＥレベルを決定するためには、採取した血液、血漿、又は血清の数滴で十分である。微量遠心機チューブ又はマイクロタイタ・ウエルに入っているアレルゲンと結合した粒子に５μＬのサンプルが加えられる。一緒にした混合物を、短時間攪拌し（微量遠心機チューブ）又は振とうし（マイクロタイタ・ウエル）、室温で１時間インキュベートする。全免疫グロブリンの決定では、各テストで１μＬのサンプルが、微量遠心機チューブ又はマイクロタイタ・ウエルに入っている抗ヒトＩｇＥと結合した粒子に加えられる。
【００４９】
[６９]  ｃ．次に、すでに述べたようなある体積の緩衝溶液中の抗体−ビオチン接合体が、上述のサンプルとアレルゲンが結合した粒子の混合物に加えられる。全体をもう一度、短時間攪拌又は振とうして、周囲温度で１時間そのままインキュベートする。
【００５０】
[７０]  ｄ．すでに述べたようなある体積の緩衝溶液中のストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン接合体が次に混合物（ｃ）に加えられ、得られた混合物をもう一度、短時間攪拌又は振とうして、周囲温度で１時間そのままインキュベートする。
【００５１】
[７１]  このインキュベーションの後、得られた混合物を適当なフロー・サイトメトリック測定装置、例えば、Luminex Corporation Luminex 100 System （商標） 又はBecton-Dickinson Immunosytometry FACSCAN （商標） などの装置によって読み取りを行う。この装置は、粒子に組み込まれた蛍光放出又は粒子サイズによって粒子サブセットを決定し、同時に、前述のように抗原−抗体及びビオチン−ストレプトアビジン結合によって粒子に付着したＲ−フィコエリスリンの放出スペクトルを測定する。アレルゲンに対する特異的抗体の濃度レベルを定量的に決定するために、世界保健機構の標準（例えば、ＷＨＯ  ＩｇＥ標準７５／５０２ＩＵ／ｍＬ）にまでさかのぼることができる既知の標準で測定して標準曲線を作成し、それによって各アレルゲンに対する患者のサンプルにおける特異的ＩｇＥの濃度を外挿し、記録し、報告する。アレルゲンに対する抗体の個々のレベルは、濃度単位で、例えば、ミリリットル当たりの単位（Unit）で、及び／又は、in vitroアレルギー診断に精通している人には認識できるように、等級レベルで、報告することができる。
【実施例】
【００５２】
[７２]  以下は本発明を説明するための実施例である。
ビオチン化抗体の調製
ビオチン化抗ヒトＩｇＥ
[７３]  ジメチルホルムアミド（Sigma）中２５ｍｇ／ｍＬのビオチン（ビオチン・アミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル）（Sigma, MO, USA）１５μＬに０．１ＭのＮａＨＣＯ3中で３．０ｍｇ／ｍＬのアフィニティー精製された抗ヒトＩｇＥ（Bethy Labs, TX, USA）０．４ｍＬを加える。反応物質溶液を２５℃で１時間攪拌する。０．１ＭのＮａＨＣＯ3中で２０ｍｇ／ｍＬのヒドロキシルアミン（Spectrum Quality Products, CA, USA）２０μＬを加え、溶液を短時間混合する。ビオチン化抗体溶液は、０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Sigma）、ｐＨ７．２、で平衡にされたSephadex G-25 (Pharmacia, Sweden) 脱塩カラムによって精製される。
【００５３】
粒子へのアレルゲンの共有結合−一般的手順
[７４]  カルボキシル化ポリスチレン微小球（Luminex Corporation, TX, USA）を８０μＬの０．１Ｍ  ＭＥＳバッファー（Fisher Scientific, PA, USA）ｐＨ６．１に懸濁させる。この懸濁液に、５０ｍｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド・ナトリウム塩（Pierce Chemicals, IL, USA）１０μＬと５ｍｇ／ｍＬの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド塩酸塩（Pierce Chemicals, IL, USA）１０μＬを加える。溶液を攪拌し、暗所に周囲温度で１５−２０分間放置する。活性化された微小球を５分間５０００ｇで遠心分離して上澄みを吸引する。次に、微小球を再び２５０μＬの０．１Ｍ  ＰＨＳ溶液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ）ｐＨ７．３に懸濁させる。混合物を攪拌し、活性化された微小球を前と同様に遠心分離して上澄みを吸引する。
【００５４】
[７５]  次に、活性化された微小球を再び２５０μＬのアレルゲン抽出物、精製タンパク質又は組み換えタンパク質、に懸濁させる。混合物を少なくとも１時間、周囲温度で（光から保護して）回転させ、５分間５０００ｇで遠心分離する。上澄みを吸引し、微小球を再び２５０μＬの、０．０１Ｍ  ＰＢＳと０．０２ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ／ＨＳＡバッファーｐＨ７．３（Sigma, MO, USA）に懸濁させ、攪拌して微小球から残留アレルゲン抽出物を洗浄する。上澄みを再び、前述のように遠心分離して吸引する。洗浄手順をさらに２回繰り返し、微小球を再び２５０μＬのＰＢＳ／ＨＳＡに懸濁させる。溶液中の微小球の濃度がヘモサイトメーター（Fishert Scientific, PA, USA）と顕微鏡（Nippon Kogaku, Japan）を用いた計数によって決定される。
【００５５】
実施例１：アレルゲンに対する特異ＩｇＥレベルの分析
[７６]  Luminex Corporationから入手した蛍光ラベルされた微小球のサブセットに、Alternariaかび、Bermuda grass、Timothy grass、ネコのふけ、Mountain Cedar（スギ）の木、卵白、コムギ、ミルク、Ragweed（オグルマ） 及びダニから抽出されたタンパク質を共有結合させた。アトピー及び非アトピーの人から入手した血清サンプルがこの１０のアレルゲンの組に対して分析された。５μＬのサンプルが、Ｖ−底部ポリプロピレン・マイクロタイター・ウエル（Evergreen Scientific, CA, USA）又は０．５ｍＬポリプロピレン微量遠心機チューブ（Evergreen Scientific, CA, USA）に入れられた１０μＬの懸濁されたアレルゲン結合微小球に加えられた。６点標準カーブを得るために５μＬの血清標準（ＷＨＯのＩｇＥ標準７５／５０２に対して校正された二次標準）が、それぞれ、マイクロタイター・ウエル中の１０μＬの抗原をコーティングされた微小球に加えられた。マイクロタイター・プレートはマイクロタイター・プレート・シェーカー（Fisher Scientific, PA, USA）に載せられ、１０−２０分間振とうされた。標準又はサンプルを加えた微小球は、上述のように、室温で１時間インキュベートされた。各ウエルの内容に４０μＬの体積の抗ヒトＩｇＥ−ビオチン接合体が直接加えられた；プレートが前のように短時間振とうされ、内容物は周囲温度で１時間インキュベートされた。その後、４０μＬの体積のストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン接合体（Advanced Biosystems, CA, USA）が各ウエルの内容物に加えられ、周囲温度で１時間インキュベートされた。次に、微小球はLuminex 100フローサイトメーターに直接導入され、計測器に吸引された。計測器は、サブセット粒子の放出信号と粒子上にあるＲ−フィコエリスリン蛍光ラベルを同時に同定する。４パラメータLorentizian累積非線形転移関数の式を用いて標準曲線が決定され、アレルゲンに対する特異ＩｇＥレベルが図１に示されるような標準曲線から内挿された。
[７７]  図１は、非アレルギーの２人と、１０のアレルゲンの組に対する特異ＩｇＥ応答が陽性であったアレルギーの３人からの結果を示す。各人からの５μＬの体積のサンプルが、微小球に結合した１０のアレルゲンに対する特異ＩｇＥレベルを同時に測定する３時間均質分析方法で用いられた。Luminex 100システムによる蛍光強度信号の測定を用いて、０．３５ＩＵ／ｍＬからの６点標準曲線から内挿された結果がＩＵ／ｍＬ又はクラス単位で報告された。得られたクラス・レベルに基づいて、応答の解釈は「ネガティブ」から「きわめて高い」までにわたる。
【００５６】
実施例２：全ＩｇＥ分析
[７８]  ヤギ抗ヒトＩｇＥ（Bethyl Laboratories, TX, USA）が、アレルゲンの結合に関して上で述べたと同じ手順に従って微小球粒子（Luminex Corporation, TX, USA）に結合された。血清サンプルは、上で述べた方法によって入手した個人たちから得られた。１．０μＬの体積の標準（ＷＨＯのＩｇＥ標準７５／５０２に対して校正された二次標準）又は個人サンプルがマイクロタイター・ウエル中の２５μＬの抗体と結合した微小球の懸濁液に加えられ、上で述べたように短時間振とうされ、１時間インキュベートされた。その後、４０μＬの体積の抗ヒトＩｇＥ−ビオチン接合体が各ウエルの内容物に加えられ、１時間インキュベートされた。その後、４０μＬの体積のストレプトアビジン−リフィコエリスリン接合体が各ウエルの内容物に加えられ、マイクロタイター・プレートは短時間振とうされ、混合物は１時間インキュベートされた。次に、微小球は直接Luminex 100フローサイトメーターに導入され、計測器に吸引された。計測器は、サブセット粒子の放出信号と粒子上にあるＲ−フィコエリスリン蛍光ラベルを同時に同定する。４パラメータLorentizian累積非線形転移関数の式を用いて標準曲線が決定され、サンプルの全ＩｇＥレベルが図２に示されるような標準曲線から内挿された。
【００５７】
[７９]  図２は、全ＩｇＥ標準曲線と１０人の全ＩｇＥの結果を示す。各人からの１μＬの体積のサンプルが３時間の均質分析手順で用いられた。抗ヒトＩｇＥが結合した微小球に結合した全ＩｇＥの量が、Luminex 100システムを用いて蛍光レポーター信号からの信号強度を測定して決定され、２〜２０００ＩＵ／ｍＬからの６点標準曲線から内挿された。サンプルについての予期された結果は、別の分析手順を用いるある基準検査所から提供されたものである。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１−１】本発明の実施例１に係わる１０のアレルゲンの組に対する特異的ＩｇＥ分析を表及びグラフによって示す図である。
【図１−２】本発明の実施例１に係わる１０のアレルゲンの組に対する特異的ＩｇＥ分析を表及びグラフによって示す図である。
【図１−３】本発明の実施例１に係わる１０のアレルゲンの組に対する特異的ＩｇＥ分析を表及びグラフによって示す図である。
【図２】実施例２に係わる全ＩｇＥ分析を表及びグラフによって示す図である。
【図１−１】
2005512091.tif 000003
【図１−２】
2005512091.tif 000004
【図１−３】
2005512091.tif 000005
【図２】
2005512091.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月9日(2004.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプル中の２〜約１００のアレルゲンに対する特異的免疫グロビン抗体レベルを同時に測定する方法であって：
（ａ）個体から約１０〜約１００μＬの血液サンプルを採取するステップ；
（ｂ）該血液サンプル又はその一部について均質免疫分析を行うステップ、ここで該免疫分析は２〜約１００のアレルゲンに対する特異的免疫グロビン抗体レベルを決定することができる；及び
（ｃ）前記特異的免疫グロビン抗体レベルを決定するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
血液サンプル中の２〜約１００のアレルゲンに対する特異的免疫グロビン抗体レベルを同時に測定する装置であって：
（ａ）個体から約１０〜約１００μＬの血液サンプルを採取するステップ；
（ｂ）該血液サンプル又はその一部について均質免疫分析を行うステップ、ここで該免疫分析は２〜約１００のアレルゲンに対する特異的免疫グロビン抗体レベルを決定することができる；及び
（ｃ）前記特異的免疫グロビン抗体レベルを決定するステップ；
を含む前記装置。
【請求項３】
血液サンプル中のアレルゲンに対する特異的免疫グロブリン抗体レベルの定量的な測定装置であって：
（ａ）複数のアレルゲンに結合した複数の粒子、該粒子は約１〜約５０μＬの水性媒質に懸濁し、粒子と特異的アレルゲンとの各組み合わせは粒子と他のアレルゲンとの組み合わせから区別可能である；
（ｂ）特異的結合ペアの第一のメンバーに接合した抗ヒトＩｇＥ又はＩｇＧ抗体を含む第一の接合体、前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅する能力を有し、該第一の接合体は１分子の抗ヒト抗体に１０〜３０分子の第一の結合ペア・メンバーが接合している；
（ｃ）第一の特異的結合ペア・メンバーに結合する第二の特異的結合ペア・メンバーを含む第二の接合体、該第二のメンバーは蛍光体部分と結合している；を含み、
（ｄ）第一の接合体の第二の接合体に対するモル比は約１：１〜約１：５である；
前記装置。
【請求項４】
血液サンプル中の複数のアレルゲンに対する特異的免疫グロブリン抗体レベルを同時に検出し、定量化する均質免疫分析方法であって：
（ａ）約１〜約２５μＬの体積の血液サンプルを複数のアレルゲンと結合した複数の粒子に接触させるステップ、該粒子は約１〜約５０μＬの水性媒質に懸濁されており、粒子と特異的アレルゲンとの各組み合わせは、１つ以上のアレルゲンに特異的に結合する血液サンプル中に存在する免疫グロブリン抗体が該粒子に結合している状態で、粒子と他のアレルゲンとの組み合わせから区別可能である；
（ｂ）その後、ステップ（ａ）からの物質を、特異的結合ペアの第一のメンバーに接合した抗ヒトＩｇＥ又はＩｇＧ抗体を含む第一の接合体と接触させるステップ、前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅させる能力を有する；
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの物質を、該第一の特異的結合ペア・メンバーと結合する第二の特異的結合ペア・メンバーに結合した蛍光体部分を含む第二の接合体と接触させるステップ；及び
（ｄ）その後、ステップ（ｃ）からの物質における特異的免疫グロブリン抗体のレベルを、粒子サブセットの蛍光放出信号を決定し、同時に蛍光体部分の蛍光放出信号を測定することによって決定するステップ；
を含む前記方法。
【請求項５】
血液サンプルにおける全免疫グロブリンＥレベルを定量的に決定するための装置であって：
（ａ）抗ヒトＩｇＥ抗体に結合した複数の粒子、該粒子は約１〜約５０μＬの水性媒質に懸濁している；
（ｂ）抗ヒト抗体と特異的結合ペアの第一のメンバーを含む第一の接合体、前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅する能力を有する；
（ｃ）フィコビリン・タンパク質と、該第一の特異的結合ペア・メンバーに特異的に結合し蛍光信号出力を増幅する第二の特異的結合ペア・メンバーとを含む第二の接合体；を含み
（ｄ）該第一の接合体の該第二の接合体に対するモル比が約１：１〜約１：５である前記装置。
【請求項６】
血液サンプル中の全免疫グロブリンＥ抗体を検出し定量化するための均質免疫分析方法であって：
（ａ）約０．５〜約１０μＬの体積を有する血液サンプルを抗ヒト免疫グロブリンＥと結合した複数の粒子と接触させるステップ、該粒子は約１〜約５０μＬの水性媒質に懸濁されている；
（ｂ）その後、ステップ（ａ）からの物質を、特異的結合ペアの第一のメンバーに接合された抗ヒトＩｇＥ抗体を含む第一の接合体と接触させるステップ、前記特異的結合ペアは蛍光信号出力を増幅する能力を有する；
（ｃ）その後、ステップ（ｂ）からの物質を、該第一の特異的結合ペア・メンバーと結合する第二の特異的結合ペア・メンバーに結合した蛍光体部分を含む第二の接合体と接触させるステップ；及び
（ｄ）その後、ステップ（ｃ）からの物質中の特異的免疫グロブリン抗体のレベルを、該粒子の蛍光放出信号を決定し、同時に該粒子に結合した蛍光体部分の蛍光放出信号を測定することによって決定するステップ；
を含む前記方法。
【請求項７】
前記複数の粒子が、約１０〜４０アレルゲンを含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項８】
前記特異的抗体が、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、及び免疫グロブリンＧのサブクラスから選ばれる、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項９】
前記蛍光体がフィコビリン・タンパク質である、請求項３、４又は６に記載の方法又は装置。
【請求項１０】
前記フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリンである、請求項５に記載の装置。
【請求項１１】
前記フィコビリン・タンパク質がフィコエリスリンである、請求項９に記載の方法又は装置。
【請求項１２】
前記第二の接合体が４００，０００から約１，０００，０００ダルトンまでの間の分子量を有する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項１３】
前記第一の特異的結合ペア・メンバーがビオチン及びジゴキシンから選択される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項１４】
前記ビオチンが抗ヒト抗体に約１０：１〜約３０：１のモル比で接合している、請求項１３に記載の方法又は装置。
【請求項１５】
前記第二の接合体の第二の特異的結合ペア・メンバーがアビジン、ストレプトアビジン、及び抗ジゴキシンから選択される、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項１６】
前記第１の特異的結合ペア・メンバーがビオチンであり、そして前記第２の特異的結合ペア・メンバーがストレプトアビジンである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項１７】
約１〜約５μＬの容量をもつ、テストされるべき血液サンプルをさらに含む、請求項２、３又は５に記載の方法又は装置。
【請求項１８】
前記ステップ（ａ）が、サンプルを、約２〜約１００特異的アレルゲンに結合させた複数の粒子と、接触させることにより行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１コンジュゲート対第２コンジュゲートのモル比が、１：１〜約１：５である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項２０】
前記の粒子に結合された抗体が、ポリクローナル抗ヒトＩｇＥから選ばれる、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項２１】
前記の粒子に結合された抗体が、免疫グロブリンＥに特異的に結合する抗ヒトＩｇＥ断片である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項２２】
前記粒子に結合された抗体が、免疫グロブリンＥに特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法又は装置。
【請求項２３】
前記アレルゲン特異的抗体が、前記血液サンプルを希釈せずに測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法で使用する血液サンプルを得ることを可能にするように血液採取キットを用意し、皮膚を刺して血液を取り、前記血液のサンプルを採取し、前記方法で使用するためにサンプルを提出することによって前記血液サンプルが得られる、請求項１、４又は６に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１コンジュゲート内の抗ヒトＩｇＥ抗体対第１結合ペア・メンバーのモル比が、約１：１０〜約１：３０である、請求項６に記載の方法。
【請求項２６】
サンプル中のアレルゲンに対する特異的抗体の存在又は全ＩｇＥに関するテストの実施及び提供方法であって：
（ａ）皮膚を刺して血液を吸引し、前記血液のサンプルを採取し、該方法で使用するために前記サンプルを提出することにより、該方法で使用する血液サンプルを個体が提供できるようにする血液採取キットを用意するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）からのサンプルにおける特異的アレルゲンに対する抗体の存在又は全ＩｇＥを検出する均質免疫分析を行うステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）からの免疫分析の結果をデータベースに入力するステップ；及び
（ｄ）ステップ（ｃ）のデータベース内の免疫分析の結果へのアクセスをグローバル・コンピュータ・システムのウエブサイト又はウエブページによって該個体に提供するステップ；
を含む前記方法。
【国際調査報告】
2005512091.tif 000007