(57)【要約】本発明は、サンプル中の標的分子、特にタンパク質標的分子の存在を検出する方法に関する。特に本発明は、サンプルをディテクタータンパク質と接触させることを含む、サンプル中の標的分子の存在を検出する方法を提供する。このディテクタータンパク質は、標的分子の結合パートナーであり、２つの蛍光レポーター基で誘導体化され、レポーター基の間でのエネルギーの移動は、標的分子とディテクタータンパク質が結合したときに検出可能な変化を受ける。さらにディテクタータンパク質分子は標的分子に対する結合部位を有し、それに共有結合された２つの蛍光レポーター基を有しており、このレポーター基間のエネルギー移動は、標的分子とディテクタータンパク質が結合したとき検出可能な変化を受ける。ディテクタータンパク質は組合せタンパク質を含むか、または組合せタンパク質から成る。
2005504261.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを、
（ａ）標的分子に対する結合パートナーであり；
（ｂ）２つの蛍光レポーター基によって誘導体化され；さらに
（ｃ）組合せタンパク質を含む、
ディテクタータンパク質と接触させ、標的分子とディテクタータンパク質との結合時にレポーター基間のエネルギー移動が検出可能な変化を受ける工程を含む、サンプル中の標的分子の存在を検出する方法。
【請求項２】
２つのレポーター基の蛍光発光比の変化がサンプル中に存在する標的分子の量に依存し、サンプル中の標的に関する量的情報の入手を可能にする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛍光レポーター基が非タンパク質基である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ディテクタータンパク質がただ１つの結合ドメインを含み、このドメインが２つの蛍光レポーター基によって誘導体化され、さらにこのドメインが標的分子の結合パートナーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ディテクタータンパク質が、ブドウ球菌のプロテインＡに由来する組合せタンパク質を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ディテクタータンパク質が、ブドウ球菌のプロテインＡのＢドメインに由来する組合せタンパク質を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ディテクタータンパク質が、位置特異的態様で蛍光レポーター基によって修飾されている請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
蛍光レポーター基のうちただ１つの基がディテクタータンパク質のＮまたはＣ末端に位置する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
蛍光レポーター基の１つがディテクタータンパク質のＮまたはＣ末端に位置する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
レポーター基の１つが、結合ドメインの内部アミノ酸残基のただ１つのアミノ酸残基と共有結合できる請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
アミノ酸残基がシステイン残基である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ディテクタータンパク質が、標的分子と結合したとき配座の変化を受ける請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
標的分子が、タンパク質、タンパク質誘導体もしくはフラグメント、ポリペプチドまたはペプチドである請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）標的分子と結合することができる組合せ結合タンパク質を選別し；
（ｂ）工程（ａ）で同定したタンパク質に、蛍光レポーター基によって誘導体化することができる１つまたは２つ以上のアミノ酸残基を場合によって導入し；さらに
（ｃ）この結合タンパク質を２つの蛍光レポーター基で同時にまたは連続して標識する工程、
を含む、サンプル中の標的分子の検出に用いるディテクタータンパク質の製造方法。
【請求項１５】
標的分子のための結合部位を有し、さらに２つの蛍光レポーター基が共有結合したディテクタータンパク質分子であって、ここでレポーター基間のエネルギーの移動が、標的分子とディテクタータンパク質との結合時に検出可能な変化を受ける、組合せタンパク質を含むディテクタータンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はサンプル中の標的分子、特にタンパク質標的分子の存在を検出する方法に関する。より具体的には、本発明は、標的分子と結合パートナーとの間の結合を基にする検出方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
近年、ＤＮＡマイクロアレイ技術の大きな進歩によって遺伝子発現の高処理平行分析が促進された。このタイプの実験によって多くの貴重なデータが得られたが、それにもかかわらず前記方法の明らかな欠点が示されている。細胞状態の重要な変化、例えば健常状態から病的状態への変化を一番よく示す特徴は、必ずしもｍＲＮＡレベルにおける変化ではないことは明らかである。細胞のタンパク質の豊富さと対応するｍＲＮＡレベルとの相関性は低いこと、およびタンパク質の活性はその発現レベルの変化よりはむしろ翻訳後修飾によってしばしば調節されることが示された。もし再現性がある鋭敏な方法が利用できるならば、多くの事例においてタンパク質レベルで生物学的サンプルを分析することが好ましいであろう。
【０００３】
タンパク質の特異的検出はタンパク質研究の重要な分野であり、現在用いられている技術はいずれも適用の可能性に限界があるという問題を抱えている。質量分光分析技術は、二次元ゲルから溶出したタンパク質またはチップに結合したタンパク質の分析および同定を目的に開発された。前記方法は高度に鋭敏で非常に少量のタンパク質を検出できることが示された。しかしながら、質量分光分析法は定量的な技術ではなく、定量分析を可能にするプローブでタンパク質を標識しないかぎり、サンプル中に存在する種々のタンパク質の相対量を決定することはできない。直接的な情報の読み出しのために分析前にサンプル中のタンパク質集団を標識することを必要とする蛍光法は、類似しないタンパク質が様々な程度で標識され、種々のタンパク質のために極めて変動するシグナルを生じ、定量的測定での前記方法の使用が制限されるという欠点を有する。さらに、標識およびタンパク質サンプルの調製は時間を要し、回避するのが好ましい工程である。
【０００４】
遺伝子発現の分析に用いられるＤＮＡマイクロアレイに類似するタンパク質アレイの調製は、いくつかの技術的な困難を伴なう。ＲＴ−ＰＣＲによって増幅され、さらにＤＮＡレベルで間接的に分析することができるｍＲＮＡとは対照的に、タンパク質は公知のいずれの方法によっても増幅することが不可能で、したがって高度に鋭敏な検出方法が要求される。蛍光または放射能測定技術は典型的には高い感度を有する。しかしながら、オリゴヌクレオチドは蛍光または放射能活性を有するヌクレオチドの結合によって容易に標識されるが、一方、タンパク質集団の均質で再現性のある標識は容易ではない。別の問題は分析されるべきタンパク質の捕捉である。なぜならば、特異的で高い親和性を有する結合物質は細胞内に存在するタンパク質のほんの一部に対してのみ利用可能である。
【０００５】
蛍光技術は感度が高いことおよび広範囲の蛍光プローブが利用可能であることから、蛍光法は生化学および細胞生物学で広く用いられている。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の概念をベースにする多数の方法が開発されてきた（蛍光共鳴エネルギー移動は、励起されたドナーの蛍光発光団から近傍にあるアクセプター分子へのエネルギー移動に関する非放射性誘起双極子−誘起双極子メカニズムである（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ， １９４８））。本明細書の“エネルギー移動”とはＦＲＥＴを意味する。ＦＲＥＴの理論はＦｏｅｒｓｔｅｒによって初めて記載された。Ｆｏｅｒｓｔｅｒは、エネルギー移動効率Ｅは、２つの基の距離Ｒに強く依存することを示した。ＦＲＥＴは１０から１００Åの距離にわたって生じるので、分子内の距離の測定および細胞規模での処理に特に有用である。
【０００６】
最近、ＦＲＥＴの原理をベースにした配座依存バイオセンサーが、例えば、細胞内Ｃａ２＋濃度を分析するために（Ｍｉｙａｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、Ｃｒｋ−ＩＩアダプタータンパク質のリン酸化を測定するために（Ｃｏｔｔｏｎ ＆ Ｍｕｉｒ， ２０００）、およびＧＴＰ結合タンパク質Ｃｄｃ４２とそのエフェクタータンパク質との相互作用を検出するために（Ｎｏｍａｎｂｈｏｙ ＆ Ｃｅｒｉｏｎｅ， １９９９）開発された。抗体と抗原との特異的な相互反応を検出する均質なＦＲＥＴをベースにするイムノアッセイも報告された（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ． およびＡｒａｉ ｅｔ ａｌ．に記載されたアッセイでは、異なる蛍光で標識されたＶＨおよびＶＬフラグメントとの間で形成された複合体は抗原の結合で安定化され、この結合が、標識されたこの抗体の半分のフラグメントの間でのエネルギー移動効率の増加によってモニターされる。タンパク質の標識は、アミン基を介した蛍光発光団の結合によって、または２つの異なる蛍光レポータータンパク質との遺伝子融合によって達成された。
【０００７】
これまでに報告されたこれらの系の多くで、蛍光レポータードメインを含む多数の異なるドメインを含む複雑な融合タンパク質が生成される。例えば、Ｍｉｙａｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．は、Ｃａ２＋結合カルモジュリンドメインと融合させた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の変異体対の使用を記載している。もっと単純で小型の分子を生成できたなら好ましいであろう。理由は特に、融合レポータータンパク質の使用は標的分子の結合を妨げる可能性があるからである。Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．は、小型の蛍光発色団（フルオレセインおよびテトラメチルローダミン）を用いる系を記載しているが、一方で異なるサブユニットを含む複雑な融合タンパク質を構築している。ある種の従来技術の系では典型的には２つの分子が必要とされ、これらの分子は個々に標識されて初めてそれら両者を第三の分子と結合させるＦＲＥＴを実施することができる。
また別の方法では逆の様式で蛍光検出を利用することができるが、この場合は結合タンパク質−標的複合体の生成はＦＲＥＴの効率低下をもたらす。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明にしたがえば、非標識タンパク質を検出する新規なアプローチが提供され、本アプローチはタンパク質のマイクロアレイの製造を容易にする。蛍光共鳴エネルギー移動に適した蛍光ドナー／アクセプター対を用いて共有結合標識されたプロテインＡ由来結合タンパク質によって仲介されるタンパク質−タンパク質相互作用の検出が調べられた。ドナーおよびアクセプター基が互いに極めて接近している場合、励起されたドナー基のエネルギーはアクセプター基に移動するが、このタンパク質がその標的タンパク質と結合している場合、蛍光シグナルは変化する（図１を参照されたい）。結合タンパク質のみを蛍光発光団で誘導体化するので、分析されるサンプルの標識は不要である。
【０００９】
したがって、１つの態様によれば、本発明は、サンプル中の標的分子の存在を検出する方法であって、標的分子のための結合パートナーであり、さらに２つの蛍光レポーター基で誘導体化されているサンプルをディテクタータンパク質と接触させる方法を提供し、ここで、レポーター基間のエネルギー移動は、標的分子とディテクタータンパク質との結合時に検出可能な変化を受ける。
検出は、典型的には蛍光レポーター基の一方または両方の発光を測定することを必要とする。したがって、発光における変化を検出することによって、標的分子の存在が示唆される。
【００１０】
レポーター基は、好ましくは非タンパク質であり、したがって（例えばＧＦＰ誘導体の場合のように）レポータードメインとしてディテクタータンパク質に取り込まれることを必要としないが、それらは標識として付加されてディテクタータンパク質を生成することができる小分子である。適切なレポーター基は蛍光発光団、例えばフルオレセイン、ローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、ナフタレン、ピレン、ピリジルオキサゾール、ベンゾオキサジアゾールおよびスルホインドシアニンの誘導体である。タンパク質との効率的な共役のために、蛍光発光団は好ましくは、アミンまたはチオール反応性試薬、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、アルデヒド、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化アルキル、ハロアセトアミド、マレイミド、アジリジン、またはエポキシドの形態を有する。適当な例には、ローダミンＢスルホニルクロリドおよびフルオレセインマレイミド、Ｎ−ヨードアセチル−Ｎ′−（５−スルホ−１−ナフチル）エチル−エンジアミン（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）またはヨードアセトアミドおよびスクシンイミジル６−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノエート（ＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ）、（ジエチルアミノ）クマリン（ＤＥＡＣ）またはＮ−メチル−アントラニロイルデオキシグアニンヌクレオチド（例えばＭａｎｔｄＧＤＰまたはＭａｎｔｄＧＴＰ）および“ＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ”としても知られているｓＮＢＤ（スクシンイミジル６−［（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノエート）が含まれる。
【００１１】
結合タンパク質の配座の変化を誘発することができるいずれの標的分子も本明細書に記載した方法にしたがって分析することができる。好ましくは、標的分子はタンパク質分子またはその誘導体もしくはフラグメント、ポリペプチドまたはペプチドである。典型的には、前記標的分子は長さが１０から１０００アミノ酸、例えば２０から５００であろう。
結合タンパク質ライブラリーを作製し、ある標的分子との結合の適切性について、そのライブラリーをスクリーニングすることができる。いったん選択できたら、その結合タンパク質を用い、蛍光レポーター基で標識し、場合によってはその結合タンパク質の一次構造を改変し、レポーター基を結合させることができるアミノ酸を取り込ませる追加工程を実施することによってディテクタータンパク質を生成することができる。
【００１２】
したがってさらに別の態様で、本発明は、サンプル中の標的分子の検出に使用されるディテクタータンパク質の製造方法を提供し、本方法は以下の工程を含む：
（ａ）分子ライブラリーを作製して、標的分子と結合することができる結合タンパク質を選別し；
（ｂ）工程（ａ）で同定したタンパク質に、蛍光レポーター基によって誘導体化されることができる１つまたは２つ以上のアミノ酸残基を場合によって導入し（これは好ましくは、工程（ａ）で同定したタンパク質をコードする核酸の位置特異的突然変異誘発によって達成されるであろう）；さらに
（ｃ）２つの蛍光レポーター基で同時にまたは好ましくは連続してその結合タンパク質を標識する。
【００１３】
導入されるアミノ酸は好ましくは内部に存在し、すなわちＮまたはＣ末端には存在せず、さらにこのアミノ酸は、典型的にはそのタイプの結合タンパク質において唯一のもの、ただ１つしか存在しないアミノ酸であろう。
ディテクタータンパク質は好ましくは単一ドメイン結合タンパク質であるか、または単一ドメイン結合タンパク質を含む。この結合タンパク質は、標的分子と結合し、さらにその単一ドメイン結合タンパク質が保有する２つの蛍光レポーター基との間のエネルギー移動で測定可能な増減を生じる配座の変化を受けることができる。この単純な単一ドメイン結合タンパク質は、したがって２箇所で誘導体化されて標的への結合を表示し、さらにそれ自体が標的との結合に必要である。これは、従来技術のマルチドメイン（融合タンパク質）構造よりもはるかに単純な組合せである（マルチドメイン構造では、１つのドメインは表示または結合に必要であるが、両方の機能に必要なわけではない）。
【００１４】
本発明のまた別の実施態様では、ディテクタータンパク質は２つまたはそれ以上、好ましくは２つの異なるドメインを含むことができ、このドメインは標的タンパク質上の重なり合わないエピトープと結合する。したがって、各ドメインはさらに２つの役割、標的認識と結合の役割、および各ドメインは蛍光レポーター基を保有するので表示の役割を果たす。この２つのドメインの両方が標的分子上の対応するそれぞれのエピトープと結合しなければＦＲＥＴが生じないように（またはＦＲＥＴが低レベルであるように）、可撓性リンカーを用いてこのドメインを分離させることができる。
【００１５】
本発明のさらに別の特徴を提供する、このような系の変形例では、抗イディオタイプタンパク質結合ドメイン（アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アフィボディはその可変領域を介して互いに結合する）対が生成された。典型的には、この対の一方は標的特異的アフィボディであり、これに対して第二のアフィボディが生成され、この第二のアフィボディは第一のアフィボディの結合表面と結合することができる。競合型の系では、標的分子はこの２つのドメインを互いに分離させ、典型的には顕著なＦＲＥＴの低下をもたらす。したがって抗イディオタイプアフィボディは各々蛍光レポーター基で標識され、それらは単一タンパク質内で連結されてあるか、または遊離ドメインとして用いることができる。さらに別の特徴では、標的がホモダイマーである場合には、２つの同一または少なくとも機能的に同等な標識ドメインを用いることができ、顕著なＦＲＥＴの低下は、この２つのドメインが標的と結合したときにのみ生じる。
ドメインとはタンパク質分子の容易に同定することができる単位であり、その二次および／または三次構造によってそのドメインはタンパク質分子の他の部分と区別され、すなわちドメインは構造的に独立している。
【００１６】
二重に誘導体化された結合ドメイン（完全なディテクタータンパク質を構成していてもいなくてもよい）は、典型的には長さが約２００アミノ酸を越えず、例えば５０から１５０アミノ酸の長さである。この結合ドメインは、好ましくは長さが少なくとも２５アミノ酸である。本発明にしたがって使用されるいずれの結合ドメインも好ましくは折り畳まれてあり、これは標的分子に対するより高い潜在的親和性（熱力学的効果、結合によるエントロピーロスの少なさ）、タンパク分解に対する安定性および構造的一体性／レジリエンスという利点を有する。このことは、固相に結合させるかまたは他のドメインと融合させたとき、非折り畳みドメインよりも活性を維持し易いことを意味する。
【００１７】
好ましくは、ディテクタータンパク質は組合せタンパク質（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むか、または組合せタンパク質から成る。組合せタンパク質は、天然には存在しないが、標的タンパク質の一次配列にランダムな変更を導入することによって生成されるタンパク質と定義することができる。これらの変更は典型的には核酸レベルで導入される。このような組合せタンパク質および種々の組合せタンパク質のライブラリーは、結合官能性または他の官能性について容易にスクリーニングすることができる。組合せタンパク質工学技術およびこれらのタンパク質のスクリーニング方法は当分野で周知である。好ましい組合せディテクタータンパク質は、ブドウ球菌プロテインＡ、特にそのＢドメインに由来するものである。ディテクタータンパク質が２つ以上のドメインから作製される場合、ドメインの１つまたはそれ以上、例えば全部が組合せタンパク質ドメインであってもよい。
【００１８】
【課題を解決する手段】
“結合パートナー”とは、ディテクタータンパク質が特異的態様で標的分子と結合することができることを意味する。換言すれば、一般的な静電気結合または同様な結合とは別の結合が存在する。これら２つの部分間の関係は、標的分子が２つ以上のタイプのディテクタータンパク質と結合できるという意味で排他的である必要はない。ディテクタータンパク質は２つ以上の標的分子と結合する能力を有することができるが、好ましくは被検サンプル中の他のいずれの分子よりも標的分子に対してはるかに強い親和性（例えば少なくとも６倍、好ましくは少なくとも１０倍強い親和性）を有する。標識されたディテクタータンパク質は、標的分子の認識において、それ自体が標的によって認識される受動的パートナーというよりはむしろ“能動的に”関与すると考えることができる。
【００１９】
被検“サンプル”は、興味のある標的分子を含む可能性のある任意のサンプルであってよい。サンプルは、生物学的サンプル（植物またはヒトまたは動物の身体から得られたもので、典型的には体液に由来するもの、例えば血液もしくは尿）でも、または環境的サンプル（例えば水、土壌または食物）でもよい。さらに、サンプルはまた、細胞もしくは組織材料または培養液から得ることもでき、これには、全細胞分画、細胞内分画、核分画、ペリプラズム分画、膜分画および細胞内小器官分画が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
レポーター基間のエネルギー移動（ＦＲＥＴ）は増加してもよく、これはアクセプター基によるより強い発光をもたらすであろう。またはエネルギー移動は減少してもよく、これは典型的にはドナー基によるより強い発光をもたらすであろう。
【００２０】
したがって、結合タンパク質は、分子の限定した位置においてドナーおよびアクセプターレポーター基で誘導体化され、完全な標的物質の存在によって影響を受ける。これは、単一ドメイン結合タンパク質を制御下で位置特異的二重標識することによって達成された。好ましくは、レポーター基の少なくとも１つは、ディテクタータンパク質のＮまたはＣ末端（実際のＮもしくはＣ末端残基またはそれらと隣接する残基）に位置しないが、内部アミノ酸と結合している。したがって、“内部”残基はＮまたはＣ末端残基のすぐ隣ではなく、好ましくは結合ドメインのどちらかの末端に存在する３残基の１つではなく、より好ましくはそのどちらかの末端の５残基の１つではない。少なくとも１つの内部残基を使用するのが好ましい。なぜならば、２つのレポーター部分が二量体を形成することは意図されず、その代わりにレポーター部分が、より直接的に物理的結合することなく、ＦＲＥＴにより“連絡”することが好ましいからである。下記で考察するように、レポーター基を結合させる内部のアミノ酸は、好ましくはその分子内で唯一のアミノ酸であり（さらに天然の分子に例えば位置特異的突然変異誘発によって導入されてあってもよい）、それによって、結合に適した部位がただ１つしか存在しないことから、レポーター基の正確な位置を担保することができる。
【００２１】
抗体よりもさらに単純な構造の骨格をベースにした結合タンパク質は、選択的カップリング化学反応に適切な固有の部位（例えばシステイン残基）を導入するその潜在能力のために、位置特異的標識の好ましい候補物質である。このような種類の結合タンパク質は、アフィボディと称され、システイン残基を欠き、頑強な５８残基の３らせん束構造である単一ドメイン免疫グロブリン（Ｆｃ）結合ブドウ球菌プロテインＡ類似体Ｚをベースとする。この親ドメインを組合せタンパク質作製のための骨格として利用し、天然のＦｃ結合パートナー以外の多様な標的タンパク質を選択的に認識することができる新規なアフィニティータンパク質を得た（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。Ｚドメインの骨格をベースにしたこれらタンパク質の証明された高い安定性（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００）は、タンパク質表面の界面の変性およびタンパク質分解が潜在的な問題であるタンパク質アレイの製造に有利であろう。
【００２２】
標的を認識する能力を有するいずれのタンパク質も誘導体化および本発明の使用に有用であろう。これには抗体およびそのフラグメントが含まれ、天然の供給源から入手するか、または組み換え手段によって製造される。結合特異性の創出およびそれに続く蛍光発光団の標識に適した他のドメインの例は、例えばレセプチンと称される細菌のレセプター構造内のドメインに見出すことができる（Ｋｒｏｎｖａｌｌ ｅｔ ａｌ．）。
【００２３】
本発明の原理を説明するために、結合タンパク質を２つの蛍光レポーター基で化学的に誘導体化する方法を述べる。この蛍光基は、標的タンパク質が結合したときに、この特異的標的タンパク質の存在を定量的に決定するために用いることができる用量依存性の発光比におけるシフトを示す。この蛍光基はドナー／アクセプター対を構成し、二重標識されたタンパク質中のこのドナー／アクセプター対は、ドナーの蛍光発光団の最大励起で励起されたとき蛍光共鳴エネルギー移動を受けると考えられる。ドナー基とアクセプター基との間のエネルギー移動は、ドナーの蛍光発光の低下、ドナーの励起状態の寿命の減少またはアクセプターの蛍光発光の増加によって実験的に検出することができる。蛍光の検出方法は当分野で周知であり、その例は本明細書に引用した文献で見つけることができる。本実験では、ドナー／アクセプター標識タンパク質の酵素消化は、蛍光発光スペクトルをドナーの発光に有利なように劇的にシフトさせ、このことは、蛍光共鳴エネルギー伝達は完全な標識タンパク質において発生し、ドナーの発光の減少およびアクセプターの発光の増加をもたらすことを強く示唆している。
【００２４】
標的タンパク質のドナー／アクセプター標識結合タンパク質への添加は、ドナーの蛍光の増加およびアクセプターの蛍光の減少をもたらす。これは、タンパク質−タンパク質複合体中で励起されたドナーの蛍光発光団からアクセプター蛍光団へのエネルギー移動が障害されたことによるものであろう。２つの蛍光レポーター基間の距離を標的タンパク質の存在下で増加させることができる。これは、標的タンパク質の体積が、未結合の状態ではおそらくフレキシブルである蛍光発光団の運動に立体的に干渉するためであるか、または結合状態のタンパク質では配座が変化するためである。ドナー／アクセプター対の２つの基の間の距離の変化はエネルギー移動効率に大きく影響を及ぼすことが知られている。感度は、フェルスター（ｆｏｅｒｓｔｅｒ）の距離Ｒ０に近い距離で最大となる。Ｒ０は蛍光発光団対に特有であり、さらにドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルのオーバーラップ、ドナーの量子効率、媒体の屈折率、および２つの相互作用する双極子の相対的な向きに依存する。Ｂドメインの結合表面の端から端までの概算距離は約３０Åであり、Ｒ０値は典型的には２０−６０Åの範囲にあることから、この場合にはさらに小さな距離の変化がエネルギー移動効率におそらく影響を与えるであろう。蛍光発光比のシフトもまた、蛍光発光団の局所環境における変化の作用であり、これは蛍光発光団の量子収率の変化をもたらすであろう。
【００２５】
標的タンパク質Ｆｃ３（１）および非結合性コントロールタンパク質Ｆｃ３の添加による蛍光発光比に対する本明細書で述べる異なる効果は、そのメカニズムに関わらず、発光比におけるシフトは、標識タンパク質と特異的に結合するタンパク質の存在下でのみ生じることを示している。蛍光発光比は標的タンパク質の濃度の増加とともに増加するので、本アッセイを用いてサンプル中のタンパク質の量を定量することができる。この均質アッセイでは、Ｆｃ３（１）の検出に対する感度は、ＺドメインとＩｇＧのＦｃ領域間の相互作用について決定された解離定数（ＫＤは約７０ｎＭ）と同じ濃度範囲にある。チップ表面上で少量のサンプルを濃縮することによって（チップ上でタンパク質の分析物が周囲の媒体から捕捉される）、アッセイの感度をさらに高めることができる（Ｓｉｌｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。タンパク質−タンパク質複合体の生成および蛍光シグナルの発達は十分に迅速で、この方法を高処理タンパク質分析に応用することが可能であるはずである。この方法では標識および被検サンプルの調製が不要であるので、多数のタンパク質の平行分析に本方法は特に適しているであろう。
【００２６】
モデル系として、プロテインＡのＢドメインおよびＩｇＧのＦｃ領域間の相互作用を調べた。しかしながら、本発明は、他の結合タンパク質とそれらの対応する標的タンパク質との間の相互作用の検出に用いることができる一般的概念に関する。広範囲のタンパク質に対する特異的な結合物質は、合成Ｚドメイン（Ｂドメインの合成類似体である（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７））の骨格をベースにした組合せタンパク質ライブラリーから選択した。これらの結合物質（いわゆるアフィボディ）は小型でコンパクトなタンパク質であり、天然に存在するシステイン残基を欠き、さらに細菌で容易に発現される。アフィボディはＺドメインの全体的な三次元の折り畳みを保有し（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、したがってこれらアフィボディは本明細書で開発された手法で使用するために適切であることがＣＤ分光分析によって示された。
【００２７】
本明細書の実施例では、ＡＢＤ（アルブミン結合ドメイン）をアフィニティータグとして用い、タンパク質の精製を促進させた。ＡＢＤはシステイン残基を全く含まず、したがってそれ自体は標識されない。そのようなタグは構築物に含ませる必要はなく、また標識の前に切り離すことができる。
既にアフィボディの選択が成功している標的タンパク質が多様であれば、他の標的タンパク質に対する結合物質を選択することも同様に可能である。高い親和性を有する結合物質を作製する効率的な方法と、結合タンパク質とその標的タンパク質間の相互作用を標識無しで検出する方法との組合せは、タンパク質の包括的分析のためのマイクロアレイを製造するために開発された新規なアプローチの基礎となっている。
【００２８】
標的分子に対する結合部位を有し、さらにそれ自身に２つの蛍光レポーター基を共有結合させたディテクタータンパク質分子が提供される本発明のさらに別の特徴によると、レポーター基間のエネルギー移動は、標的分子がディテクタータンパク質に結合したとき検出可能な変化を受ける。本ディテクタータンパク質の好ましい特色は、上記の本発明の検出方法の中で考察されている。
本発明のさらに別の関連する特徴にしたがえば、単一蛍光発光団の蛍光発光におけるシフトを、標的分子とディテクタータンパク質との結合によって誘発された単一蛍光発光団の局所環境の変化の結果としてモニターすることができる。したがって、単一蛍光レポーター基で誘導体化された結合ドメインは、モニターすることができる蛍光発光団からの量子収率の変化によりディテクタータンパク質として機能することができる。
本明細書では“単一ドメイン”結合タンパク質と呼ぶことがある。このタンパク質は、検出に必要であり、さらにレポーター基をもつ部分が単一ドメインであるが、アッセイで実際に用いられる完全なタンパク質は、もう１つの別のドメインまたは検出には直接必要とされないドメインとの融合タンパク質であってもよい。
【００２９】
【実施例】
実施例１
実験方法
株およびプラスミド：
クローニングおよび突然変異誘発には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＲＲ１ΔＭ１５（Ｒｕｅｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８２）を用い、さらに可溶性タンパク質の発現には大腸菌株ＲＶ３０８（Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８０）を用いた。ＯｍｐＡリーダーペプチド、Ｚドメインの４４−５８残基およびアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）をコードするファージミドベクターｐＫＮ１（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５）をクローニングに用いた。
【００３０】
位置特異的突然変異誘発：
ブドウ球菌プロテインＡ由来のＢドメインのヘリックス１と２の間のループに、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９８９）によってＡｓｎ２３Ｃｙｓ点変異を導入した。ＰＣＲは以下を用いて実施した：ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）、オーバーラッププライマー（５′−ＧＴＴＴＣＧＴＴＧＴＴＣＴＴＣＧＣＡＴＡＡＧＴＴＡＧＧＴＡＡＡＴＧＴＡＡＧＡＴＣ−３′および５′−ＧＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＡＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＡＡＧＴＴＴＡ−３′）、およびＺＬＩＢ３／ＺＬＩＢ５プライマーセット（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。融合ＰＣＲ生成物はゲル精製し、ＮｈｅＩ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ， Ｖｉｌｎｉｕｓ， Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）およびＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）で消化し、続いてＮｈｅＩ／ＢａｍＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）消化ｐＫＮ１ベクターにＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて連結させた。この連結プラスミドで大腸菌ＲＲ１ΔＭ１５を形質転換し、突然変異は、シークェンシングプライマーとしてＮＯＫＡ２およびＲＩＴ２７（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５）、並びにＭｅｇａＢＡＣＥ１０００ＤＮＡシークェンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ／Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いＤＮＡ配列決定によって実証した。
【００３１】
タンパク質の発現および精製：
プラスミドをタンパク質の産生のために大腸菌宿主株ＲＶ３０８に導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１０ｍＬのトリプティックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ， ＴＢＳ）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧｇＡ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に単一コロニーを接種し、３７℃で一晩振盪した。この培養物を５００ｍＬのＴＳＢ培養（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｆｏｕｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｍａｉｓｏｎｓ−Ａｌｆｏｒｔ， Ｆｒａｎｃｅ）を補充）で１：１００に希釈し、３７℃のシェーカーでＯＤ６００＝１になるまで増殖させた。タンパク質の発現は１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘発し、さらに培養物を室温で２２時間振盪した。４０００ｘｇ、４℃で１５分遠心分離によって細胞を採集し、ペレットをＴＳＴ緩衝液（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｗ）のＴｗｅｅｎ２０）に再懸濁させた。ペリプラズムのタンパク質を３回の凍結融解で遊離させ、さらに、１７０００ｘｇ、４℃、２０分の遠心分離とそれに続く上清の０．４５μｍフィルターによるろ過によって清澄な分画を得た。ＡＢＤ融合タンパク質は、記載にしたがって（Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８）ＨＳＡ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、タンパク質の純度は、ファストシステム（Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー染色によってチェックした。
【００３２】
タンパク質の修飾：
標識の前に、タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。タンパク質濃度は、吸光指数０．３７９ｍＬ／ｍｇ・ｃｍを用いてＯＤ２８０を測定することによって概算した後１ｍｇ／ｍＬに調節した。分子間ジスルフィド結合を還元するために、タンパク質を２０ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに室温で３時間インキュベートした。脱気したＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対してそのタンパク質を透析することによってＤＴＴを除去した。透析には３５００Ｄａのカットオフを有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ）を用いた。前記還元されたタンパク質をＮ−ヨードアセチル−Ｎ′−（５−スルホ−１−ナフチル）エチル−エンジアミン（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）またはヨードアセトアミド（両試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）で標識した。ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中の２５ｍｇ／ｍＬのストック溶液から１００倍モル過剰のチオール反応性プローブを前記透析したタンパク質に添加し、光から防護しながら室温で３時間攪拌した。β−メルカプトエタノール（Ｍｅｒｃｋ）をプローブに対して２０倍モル過剰で添加して反応を停止させた。続いて、ＰＤ１０セファデックスＧ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（５ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ５．５）で平衡化）を用いたゲルろ過により、標識タンパク質を過剰プローブおよびβ−メルカプトエタノールから分離し、続いて凍結乾燥した。第二の標識の導入のために、凍結乾燥タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．０）に最初のタンパク質測定を基準にして１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ＤＭＳＯ中の２ｍｇ／ｍＬのストック溶液から１０倍モル過剰のスクシンイミジル６−（Ｎ−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノエート（ＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ， ＵＳＡ）から購入）を添加し、溶液を光から防護しながら室温で１５分攪拌した。１５０ｍＭのヒドロキシルアミンを溶液に添加し、さらに３０分攪拌を継続した。標識タンパク質は上記に記載したようにゲルろ過で精製し、続いて凍結乾燥させた。
【００３３】
標識タンパク質の精製と分析：
標識タンパク質は、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ポリスチレン／ジビニルベンゼンマトリックスおよび５μｍの粒子サイズを有する４．６×１５０ｍｍカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの精製には溶媒Ａ（０．１％のＴＦＡ−Ｈ２Ｏ）および溶媒Ｂ（０．１％のＴＦＡ−ＣＨ３ＣＮ）を用い、流速は１ｍＬ／分で溶出グラディエントは２０分でＢが３５−４０％であった。同じ条件をＮＢＤ−Ｘおよびヨードアセトアミドでブロックされたチオールを用いて標識したタンパク質の精製に用いた。精製分画は凍結乾燥し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。全ての精製分画を２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥファスト（Ｐｈａｓｔ）分析によって調べ、タンパク質の純度を実証し、さらに濃度を概算した。この分画を蛍光分光分析によって分析し（下記参照）、蛍光発色団が存在することを決定した。精製した二重標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤをさらに質量分析およびアミノ酸分析によって調べた。分子量はＭＡＬＤＩ−ＭＳによって決定し、タンパク質標識の程度を概算した。アミノ酸分析を用いてタンパク質の縮合を決定し、続いてこれを用いて結合親和性を計算した。
【００３４】
標的タンパク質：
記載（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）にしたがって、Ｆｃ３（１）およびＦｃ３を製造し、さらに精製した。凍結乾燥タンパク質を６Ｍの塩酸グアニジニン−ＰＢＳに溶解し、続いて一晩４℃でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に透析することによって再折り畳みを実施した。
【００３５】
結合分析：
標識タンパク質とその対応する標的タンパク質との結合の保有は、装置ＢＩＡｃｏｒ（登録商標）２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてバイオセンサー分析によって実証した。Ｆｃ３（１）およびＦｃ３は、スクシンイミド仲介カップリングによってＣＭ５センサーチップのカルボキシル化デキストラン層に供給元の推奨にしたがって固定した。結合親和性に対する突然変異と蛍光標識の結合作用を決定するために、標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤ変異体の解離定数をリファレンスとして野生型Ｚ−ＡＢＤを用いて測定した。結合分析は、流速５μＬ／分、サンプル容積２０μＬで２５℃で実施した。ＨＢＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡおよび０．００５％のサーファクタントＰ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ））を泳動緩衝液として用いた。チップは５０ｍＭのＨＣｌの注入によって再生させた。結合曲線は５０ｎＭから１．８μＭの濃度のタンパク質を注入して得た。結合相互反応の解離定数は、ＢＩＡ検定ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて決定した。
【００３６】
蛍光分光分析：
蛍光スペクトルは、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のＬＳ５０Ｂ蛍光測定装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）を用いて記録した。励起波長は３３６ｎｍで、蛍光発光は４００ｎｍから６００ｎｍの間でスキャンした。１０ｎｍのスリット幅を励起と発光の両方に用いた。測定は、１０×４ｍｍの光路を有するセミミクロ蛍光セル（Ｈｅｌｌｍａ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．， Ｍｕｅｌｌｈｅｉｍ／Ｂａｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。全てのスペクトルはＰＢＳ（７．４）中で記録した。結合アッセイでは、標識結合タンパク質の濃度は２７０ｎＭで一定に保持し、１０ｎＭから１μＭの標的タンパク質濃度を定量した。タンパク分解実験は、タンパク質分解の前後にＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のタンパク質溶液の蛍光発光スペクトルを記録することによって実施した。タンパク質の分解消化は、２５μｇのプロテイナーゼＫをキュベットに添加し、続いて３７℃で３０分インキュベートして実施した。経時変化観察実験は、標的タンパク質を最終濃度５００ｎＭから２７０ｎＭの標識タンパク質溶液に添加し、１０分間にわたって４８０ｎｍおよび５２５ｎｍで蛍光発光を測定することによって実施した。
【００３７】
結果
標識タンパク質の調製と性状決定：
タンパク質の位置特異的標識を容易にするために、Ｂドメインの２３位のアスパラギン残基を固有のシステイン残基で置換した（図２参照）。変異タンパク質は野生型タンパク質と同様なレベルで大腸菌で発現されることが判明した。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で二量体の存在が示され、ペリプラズマでの分子間ジスルフィド結合の形成と一致した。ドナーの蛍光発光団（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）と導入されたチオールとのカップリングは、極めて過剰のプローブを用いて実施され、標識度は、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって５０−１００％の間で変動することが示された。アクセプターの蛍光発光団（ＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ）のカップリングは１０倍過剰のプローブを用いて低ｐＨで実施され、選択的にＮ−末端αアミノ基（このアミノ基は上記タンパク質のリジン残基のαアミノ基よりも低いｐＫａを有する）を選択的に標識した。標識度を分析ＲＰ−ＨＰＬＣでモニターし、反応はヒドロキシルアミンを添加して停止させ、リジン残基の強度の標識を避けた。標識されたタンパク質を調製用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。蛍光スペクトルによって両蛍光発光団の存在が精製分画で確認され、質量分析によってタンパク質がただ１つのドナー分子およびただ１つのアクセプター分子で標識されているのが証明された。１つのドナー分子および１つのアクセプター分子で標識されたＢ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤタンパク質の計算による分子量は１４０８６Ｄａで、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって実験的に求めた分子量は１４０７４Ｄａであり、前記の値は装置の誤差範囲内である（±０．１％）。バイオセンサー結合分析によって、Ｆｃ３（１）に対する親和性は、標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤでは非標識野生型Ｚ−ＡＢＤの親和性（Ｋｄ＝９０ｎＭ）と比較してわずかに低かった（Ｋｄ＝２００ｎＭ）。
【００３８】
標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの蛍光分光分析：
標的タンパク質非存在下でのＥＤＡＮＳ／ＮＢＤ−Ｘ標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの蛍光発光スペクトルが図３ａ（実線）で示されている。３３６ｎｍでの励起によって、５２５ｎｍで最大となるアクセプターの主要発光ピークが、４９０ｎｍで最大となるドナー（ＥＤＡＮＳ）の発光の低い肩とともに生じる。スペクトル中のＮＢＤ−Ｘ発光ピークの存在については、蛍光発光団の３３６ｎｍでの直接励起またはドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動のどちらかによって説明することができる。種々のメカニズムの関与を調べるために、標識タンパク質を非特異的にプロテイナーゼＫで消化し、タンパク分解の前後で発光スペクトルを記録した（Ｅｐｅ ｅｔ ａｌ．， １９８３）。参考として、単標識タンパク質を調製し、同じ態様で処理した。図３ａでは、ＥＤＡＮＳ／ＮＢＤ−Ｘ標識タンパク質のタンパク分解前後のスペクトルが示されている。タンパク質の消化によって２つの蛍光発光団を空間的に分離させた後、分子内蛍光共鳴エネルギー移動がなくなり、その結果ドナーの蛍光が顕著に増加している。対照的に、ドナーの蛍光発光団のみで標識されたタンパク質のスペクトルは、タンパク質の分解後ドナーの蛍光はわずかに低下（約２０％低下）することを示している（図３ｂ参照）。ドナー分子は、完全なタンパク質に結合されているときと比較してタンパク分解後一層接近し易くなるので、蛍光が低くなるのは、おそらく水分子による消光の増加によって説明できるであろう。アクセプターの蛍光発光団だけで標識されたタンパク質のスペクトルは、遊離アクセプターの量子収率がタンパク質と結合しているときよりも劇的に低下（約８０％低下）することを示している（図３ｃ参照）。ＮＢＤ蛍光発光団は環境に対して鋭敏で、一般にタンパク質と結合しているときまたは非極性溶媒中にあるときは、水溶液中で遊離しているときよりも高い量子収率を有することが知られている（Ｋｅｎｎｅｒ ＆ Ａｂｏｄｅｒｉｎ， １９７１）。総合すれば、単標識および二重標識タンパク質を用いたタンパク質分解実験は、蛍光共鳴エネルギー移動はドナーとアクセプターの両方で標識されたタンパク質で生じることを示している。二重標識タンパク質のアクセプターの発光は、部分的にはアクセプターの蛍光発光団の直接励起によるものであろうが、しかしながら弱いドナーの発光は、エネルギーが励起ドナーからアクセプターへ移動されることもまた強く示唆している。
【００３９】
標的タンパク質の存在下および非存在下でのＥＤＡＮＳ／ＮＢＤ−Ｘ標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの蛍光スペクトルを記録し、どのように標的タンパク質の結合が蛍光シグナルに影響を与えるかを測定した（図４参照）。以前の実験では、プロテインＡはヒトＩｇＧサブクラス３のＦｃ領域に結合するがＩｇＧサブクラス１には結合しないことが示された（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。組み換えＦｃフラグメントを作製することによって、Ｆｃ３の２つのアミノ酸置換がＦｃ１のプロテインＡ結合能力の回復に十分であることが示された。本実験では、この作出Ｆｃ３（１）バージョンを標的タンパク質として用い、Ｆｃ３を非特異的作用の陰性コントロールとして用いた。標識タンパク質と特異的に結合するＦｃ３（１）の存在下では、４８０ｎｍでのドナーの発光は増加するが、アクセプターの５２５ｎｍでの発光は低下する。このことは、標的タンパク質の存在下ではドナー基とアクセプター基との間のＦＲＥＴは低下するということによって説明することができ、ＦＲＥＴの低下は、標的との結合時の標識タンパク質における配座の変化によって仲介されるのであろう。コントロール（非結合タンパク質Ｆｃ３）の存在下では、標識タンパク質のスペクトルは、４８０ｎｍおよび５２５ｎｍの両方で蛍光発光の小さな増加を示した。４８０ｎｍと５２５ｎｍでの蛍光発光の比を計算したとき、Ｆｃ３の存在下で得られた値と同じ値が標的タンパク質の非存在下で得られ、一方、Ｆｃ３（１）の存在下ではその比は増加する。Ｆｃ３（１）およびＦｃ３はただ２つの位置で相違があるだけであるので、蛍光発光に対する異なる作用は標識タンパク質とＦｃ３（１）との特異的結合によるもので、他の要因、例えば媒体の極性に対する異なる作用（これは異なる物理化学的特性を有する２つのタンパク質が用いられた場合には予想されることである）によるものではない。
【００４０】
Ｆｃ３（１）およびＦｃ３の濃度を増加させたＥＤＡＮＳ／ＮＢＤ−Ｘ標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの滴定は図５に示されている。蛍光発光４８０ｎｍ／５２５ｎｍ比はＦｃ３（１）の濃度が増加するにつれ増加し、一方、この比はＦｃ３の濃度の増加では一定である。これらの結果は、本方法を用いて未知のサンプルで特定の結合物質の存在を定量することができることを示している。シグナルの飽和は１０ｎＭから１μＭの濃度範囲では観察されない。
経時変化観察実験は、シグナルの発達は非常に迅速であること、さらに標識結合タンパク質と標的タンパク質との混合後３分未満で最大に達することを示した（図６参照）。シグナルの迅速な発達は、本結合アッセイを用いてサンプル中の標的タンパク質の存在を迅速に検定することを可能にする。
【００４１】
実施例２
株およびプラスミド：
ＰＣＲ増幅のための鋳型としてｐＫＮ１−ＺＩｇＡ（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）（ヒトＩｇＡと結合させるために選択されたＺ−アフィボディをコードする）を用いた。
位置特異的突然変異誘発：
ＺＩｇＡアフィボディの突然変異誘発のために、上記で概略したものと同じ手法を用いた。
タンパク質の発現と精製：
ＺＩｇＡ（Ｎ２３Ｃ）アフィボディの発現と精製のために、上記で概略したものと同じ手法を用いた。
タンパク質の修飾：
ＺＩｇＡ（Ｎ２３Ｃ）アフィボディの改変のために、上記で概略したものと同じ手法を用いた。
標識タンパク質の精製と分析：
ＺＩｇＡ（Ｎ２３Ｃ）アフィボディの精製と分析のために、上記で概略したものと同じ手法を用いた。
標的タンパク質：
ヒトポリクローナルＩｇＧはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ， Ｓｗｅｄｅｎ）から入手し、ヒトＩｇＡは正常ヒト血漿（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｓｗｅｄｅｎ）からアフィニティークロマトグラフィーで精製して得た。
蛍光分光分析：
ＺＩｇＡ（Ｎ２３Ｃ）のアフィボディの蛍光分光分析は上記で概略した手法にしたがって実施した。
【００４２】
組合せタンパク質工学を用いて開発され、ヒトＩｇＡとの選択的結合を示す第二のアフィニティタンパク質（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を、実施例１でＢ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤタンパク質について述べたものと同じ原理にしたがって調べた。ここでは、ヒトポリクローナルＩｇＧをコントロールとして用い、対応する変異をもつ二重標識結合タンパク質ＺＩｇＡ（Ｎ２３Ｃ）（これもまたＡＢＤ融合タンパク質として発現させた）をヒトＩｇＡの蛍光分光分析検出で調べた。結果（図８）は、ＩｇＧコントロールを用いた滴定では発光比４８０ｎｍ／５２５ｎｍは顕著には変化しないことを示した。対照的に、ヒトＩｇＡを用いた滴定では発光比４８０ｎｍ／５２５ｎｍは、より高い濃度の標的が用いられた場合、調べられている改変アフィボディに対応して増加することを示した。このことは、ここに記載した検出原理は、結合特異性を創出するために実施される組合せタンパク質工学によって開発されたタンパク質にもまた適用できることを示している。
【００４３】
参考文献
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Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ７−（ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏ）−４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉｚｏｌｅ ｔｏ ｂｏｖｉｎｅ ｔｙｐｓｉｎｏｇｅｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．
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Ｎｉｌｓｓｏｎ， Ｂ．， Ｍｏｋｓ， Ｔ．， Ｊａｎｓｓｏｎ， Ｂ．， Ａｂｒａｈｍｓｅｎ， Ｌ．， Ｅｌｍｂｌａｄ， Ａ．， Ｈｏｌｍｇｒｅｎ， Ｅ．， Ｈｅｎｒｉｃｈｓｏｎ， Ｃ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｔ． Ａ． ＆ Ｕｈｌｅｎ， Ｍ． （ｌ９８７） Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ． Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． １， １０７−１１２．
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【図面の簡単な説明】
【図１】
蛍光標識結合タンパク質とその標的タンパク質との相互作用の模式図である。
【図２ａ】
発現ベクターによってコードされた融合タンパク質である。
【図２ｂ】
ＳＹＢＹＬ６．６ソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いて作製した、Ｂドメインの三次元構造を土台にしたＢ（Ｎ２３Ｃ）変異体（Ｇｏｕｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９２）のモデルである。
【図３ａ】
プロテイナーゼＫによる消化前（実線）および消化後（点線）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＥＤＡＮＳ／ＮＢＤＸ標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの発光スペクトルを示す。
【図３ｂ】
プロテイナーゼＫによる消化前（実線）および消化後（点線）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＥＤＡＮＳ標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの発光スペクトルを示す。
【図３ｃ】
プロテイナーゼＫによる消化前（実線）および消化後（点線）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＮＢＤＸ標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの発光スペクトルを示す。
【図４】
標的タンパク質の非存在下、３００ｎＭのＦｃ３（１）の存在下、および３００ｎＭのＦｃ３の存在下におけるＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でのＥＤＡＮＳ／ＮＢＤＸ標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの発光スペクトルを示す。
【図５】
Ｆｃ３（１）およびＦｃ３の濃度を増加させＥＤＡＮＳ／ＮＢＤＸ標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの力価を測定することを目的とする４８０ｎｍ／５２５ｎｍ発光比を示す。
【図６】
最終濃度５００ｎＭでＦｃ３（１）を添加した後の、ＥＤＡＮＳ／ＮＢＤＸ標識Ｂ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの４８０ｎｍ／５２５ｎｍ発光比のシフトについての経時的変化を示す。
【図７】
ドナー基およびアクセプター基を示すＢ／Ｚ（Ｎ２３Ｃ）誘導体の二重標識を表示している。
【図８】
ヒトＩｇＡまたはヒトポリクローナルＩｇＧの濃度を上昇させＥＤＡＮＳ／ＮＢＤＸ標識ＺＩｇＡ（Ｎ２３Ｃ）−ＡＢＤの力価を測定することを目的とする４８０ｎｍ／５２５ｎｍ発光比を示すグラフである。
【図１】
2005504261.tif 000003
【図２ａ】
2005504261.tif 000004
【図２ｂ】
2005504261.tif 000005
【図３ａ】
2005504261.tif 000006
【図３ｂ】
2005504261.tif 000007
【図３ｃ】
2005504261.tif 000008
【図４】
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【図５】
2005504261.tif 000010
【図６】
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【図７】
2005504261.tif 000012
【図８】
2005504261.tif 000013
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504261.tif 000059
2005504261.tif 000060
【国際調査報告】
2005504261.tif 000061
2005504261.tif 000062
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