(57)【要約】アリール基に電子求引基を持ちリン酸基にアミノ酸置換基を持つｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体を投与することによりＡＤＶ感染及びＨＩＶ／ＡＤＶ重感染を治療するための方法及び組成物が記述される。ｄ４Ｔの好適なアリールホスフェート誘導体はｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]及びｄ４Ｔ-５'-[ｐ-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中でのアデノウイルス感染の作用をインビトロ又はインビボで阻害するための医薬の調製における、式Ｉ：
2005534666.tif 000019
（上式中、Ｒ１は電子求引基で置換したアリール基又はＨであり、
Ｒ２はアミノ酸残基又はアミノ酸残基エステルである）
の化合物又は医薬的に許容可能な塩の使用。
【請求項２】
Ｒ１は電子求引基で置換したアリール基である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
アリール基はフェニル、ナフチル又はアントリルである請求項２に記載の使用。
【請求項４】
アリール基はフェニルである請求項２に記載の使用。
【請求項５】
電子求引基がハロである請求項２に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ１がパラ-ブロモフェニルである請求項２に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ１がパラ-クロロモフェニルである請求項２に記載の使用。
【請求項８】
Ｒ２がα-アミノ酸又はそのエステルである請求項１に記載の使用。
【請求項９】
Ｒ２が-ＮＨＣＨ(ＣＨ３)ＣＯＯＣＨ３である請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ１がパラ-ブロモフェニルであり、Ｒ２が-ＮＨＣＨ(ＣＨ３)ＣＯＯＣＨ３である請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
Ｒ１がパラ-クロロフェニルであり、Ｒ２が-ＮＨＣＨ(ＣＨ３)ＣＯＯＣＨ３である請求項２に記載の使用。
【請求項１２】
化合物が式ＩＶ：
2005534666.tif 000020
（上式中、Ｒ２はアミノ酸残基又はアミノ酸残基エステルである）の化合物である請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
上記医薬が動物に投与される請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
上記医薬が約１ｍｇ／ｋｇ体重から約５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
上記医薬が約１０ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
上記阻害がアデノウイルス感染の一又は複数の徴候を減じることを含む請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
上記阻害がアデノウイルス感染の一又は複数の徴候の発症を防止又は遅延させることを含む請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
上記阻害がＨＩＶ感染とアデノウイルス感染の両方を防止又は遅延させることを含む請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
この出願は２００２年６月１２日に出願された米国出願第６０／３８８４７０；２００２年１０月２１日に出願された米国出願第６０／４２０２６０；及び２００２年１０月２５日に出願された米国出願第１０／２８１３９９に対して優先権を主張し米国を除く全ての国を指定して２００３年６月１１日に米国に国籍と住所を有する法人であるパーカーヒュージインスティチュート名義でＰＣＴ国際特許出願として出願されたものである。
【０００２】
［発明の背景］
アデノウイルス（ＡＤＶ）感染は免疫応答及び免疫抑制宿主の双方において著しい罹患率及び死亡率を示す。アデノウイルスはＡＩＤＳ蔓延の開始以来、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)陽性患者から回収されている(Khoo等 J. Infect. Dis, 1996,172:629-637)。ＨＩＶ感染者のような免疫抑制患者において、アデノウイルスは、免疫抑制患者の肺炎、肝炎、脳炎、出血性膀胱炎、腎炎及び胃腸炎を含む高い死亡率を伴う広範囲の臨床疾患の原因である。(Bhanthumkosol, J. C.,J Med.Assoc.Thai., 1998, 81: 214-222; Carrigan等, Am. J. Med., 1997, 102: 71-74; De Jong等, J. Clin. Microbiol., 1999,37:3940-0945; Dombrowski等, Virchows Arch, 1997,431:469-472; Ghez 等, Am. J. Hematol., 2000,63:32-34; Green等, Clin. Infect. Dis, 1994,172:629-637; Khoo等, J. Infect. Dis. 1995,172:629-637; Maslo等, Am.J Respir. Crit. Care Med, 1997,156:1263-1264)。
【０００３】
アデノウイルス大腸炎はＨＩＶ感染患者における下痢の一般的な原因であり、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)での腸内感染を容易にする可能性がある(Thomas等, HIVMed., 1999,1:19-24)。胃腸アデノウイルス分泌はＨＩＶ疾患のかなり進行した段階で生じる(Sabin等, J Med Virol., 1999,58:280-285)。アデノウイルス陽性の下痢のＨＩＶ感染患者の平均生存期間はアデノウイルスを持たない患者の２．４年と比較して１年ある(Sabin等, J Med ViroL, 1999,58:280-285)。この差はグループ間のＣＤ４数の差を考慮後も有意なままであり、アデノウイルスがこの集団における死亡率に寄与していることを示唆している(Sabin等, J. Med.Virol, 1999, 58:280-285)。
【０００４】
殆どのヌクレオシド類似体は広スペクトル範囲の抗ウイルス活性を示す(Allen等, J. Med. Chem., 1978,21:742-746; De Clercq, E., Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg, 1978,58:19-47)。２',３'-ジデオキシヌクレシオド５'-トリホスフェート及び３'-フルオロ-２'-デオキシチミジン(ＦＴｄＲ)を含む幾つかのヌクレオシド類似体がアデノウイルスに対して抗ウイルス活性を有していることが発見されている。これらのヌクレオシド類似体はアデノウイルス感染細胞でのアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ媒介ＤＮＡ複製を阻害する(Mentel等, Med. Mircobiol. Immunol., 2000,189:91-95; Mental等, Antiviral Res., 1997,34:113-119; Mul等, Nucleic Acid Res., 1989,12:8917-8929; Vand der Vliet and Kwant, Biochemistry, 1981,20:2628-2632)。
【０００５】
現在利用できる抗ＨＩＶ剤の中では、抗ＡＤＶ活性を持つものは報告されていない。更に、リバビリンのような抗ＡＤＶ剤は、貧血や深刻な血液学的毒性のような付随する副作用のためにＨＩＶ感染患者に長期にわたって投与することはできない(De Clercq, E., Verh. K. Acad.Geneeskd.Belg, 1996,58:19-47; Reefschlager等, Antiviral Res, 1982, 2:41-52)。従って、利用可能なヌクレオシド類似体よりも一層好ましい安全性特性を持つ選択的抗ＡＤＶ剤並びに抗ＡＤＶ活性を持つ二重機能性抗ＨＩＶ剤に対する緊急の必要性が存在する。
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、宿主細胞において抗ＡＤＶ活性を、又はＡＤＶとＨＩＶに重感染した宿主において抗ＡＤＶ及び抗ＨＩＶ活性を有する２',３'-ジデヒドロ-２',３'-ジデオキシチミジン（以下、「ｄ４Ｔ」）のアリールホスフェート誘導体に関する。
【０００７】
本発明の一態様は、式Ｉ：
2005534666.tif 000002
（上式中、Ｒ１は電子求引基で置換したアリール基であり、Ｒ２はアミノ酸残基又はアミノ酸残基エステルである）のようなアリール基に電子求引置換基を、ホスフェート基にアミノ酸置換基を有するｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体を投与することにより、ＡＤＶ感染又はＡＤＶ／ＨＩＶ重感染を治療する方法を提供する。式Ｉの一実施態様では、Ｒ１は電子求引基で置換したフェニルであり、Ｒ２はα-アミノ酸のエステルである。好ましくは、式Ｉは、Ｒ１がパラ位をブロモに置換したフェニル基でＲ２がアラニンのメチルエステルであるｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]であるか、又は式Ｉは、Ｒ１がパラ位をクロロに置換したフェニル基でＲ２がアラニンのメチルエステルであるｄ４Ｔ-５'-[ｐ-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]である。
【０００８】
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]又はｄ４Ｔ-５'-[ｐ-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の経口又は静脈投与により、二種の重要な代謝物が生成される：アラニニル-ｄ４Ｔ-モノホスフェート（Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ）及びｄ４Ｔである。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]又はｄ４Ｔ-５'-[ｐ-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の投与により、等モル用量の何れかの代謝物の投与よりもＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ並びにｄ４Ｔへのより長期の全身性暴露が得られる。各代謝物は、直接投与される場合よりも、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]又はｄ４Ｔ-５'-[ｐ-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の投与から生成される場合に有意に長い排出半減期を持っている。
【０００９】
本発明の他の態様は、有効量の式ＩＶ：
2005534666.tif 000003
（上式中、Ｒ２はアミノ酸又はアミノ酸エステル残基である）の化合物を投与することを含むＡＤＶ感染又はＡＤＶ／ＨＩＶ重感染を治療するための方法を提供する。一実施態様では、Ｒ２はアラニンのメチルエステルである。
【００１０】
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]及び１２の構造的に類似するｄ４Ｔ誘導体はｄ４ＴよりもＡＤＶに対して実質的により強力であり、ナノモルＩＣ５０値でＡＤＶ誘導プラーク生成を阻害した。フェニル環にハロ置換を持つ化合物並びに未置換化合物６０７は、メトキシ、メチル又はシアノ置換基を持つ化合物よりＡＤＶに対してより強力であった。
【００１１】
４-Ｂｒ置換を有するｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の化合物１１３と、４-Ｃｌ置換を有するｄ４Ｔ-５'-[ｐ-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]が最も強力なリードＡＤＶ剤として同定された。双方の化合物が細胞毒性なしにナノモル濃度で皮膚線維芽細胞においてＡＤＶ誘導プラーク生成を阻害した。リード化合物１１３及び６０９は強力なＨＩＶ活性を示したが、何れの化合物もＩ型又はＩＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ-１、ＨＳＶ-２）、エンテロウイルスＥＣＨＯ３０、又は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含む非ＨＩＶウイルスに対して抗ウイルス活性を示さなかった。
【００１２】
これらの結果は、強力で選択的な抗ＡＤＶ活性を持つ新しいクラスの重感染抗ＨＩＶ剤として２',３'-ジデヒドロ-２',３'-ジデオキシチミジンのアリールホスフェート誘導体を確立する。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の化合物１１３と、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の化合物６０９の抗ＡＤＶ能が、同時感染した宿主においてＡＤＶとＨＩＶの両方を阻害可能な効果的なＡＤＶ治療策の設計ベースを提供する。
【００１３】
［発明の詳細な記載］
ここで使用される場合、次の用語と語句は以下に示した定義を持つ。
「投与する」という用語は、一般的な非毒性の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又はビヒクルを含む投薬単位製剤として、及び他の既知の態様の薬物送達によって、経口的、非経口的（皮下注射、静脈的、筋肉内、胸骨内又は注入技術を含む）、吸入噴霧、局所的、粘膜を通しての吸収、直腸的を含む任意の形で哺乳動物に提供することを意味する。
【００１４】
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸の任意のもの並びにその反対のエナンチオマー又は両エナンチオマーのラセミ混合物、合成類似体及びその誘導体を意味する。その用語には、例えばα-、β-、γ-、δ-及びω-アミノ酸が含まれる。好適な天然に生じるアミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、スレオニン、セリン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びヒスチジンが含まれる。合成又は非天然アミノ酸、例えばトリフルオロロイシン、ｐ-フルオロフェニルアラニン及び３-トリエチルアラニンを使用することができる。アミノ酸という用語にはアミノ酸のエステルが含まれる。エステルには、アルキル基が１から７の炭素原子、好ましくは１から４の炭素原子を有するもの、例えばメチル、エチル、プロピル及びブチルである低級アルキルエステルが含まれる。アミノ酸又はそのエステルのアミノ酸群は式Ｉのホスフェート基に結合する。
【００１５】
「動物」という用語は限定されるものではないがヒトのような哺乳動物を含む。
「アリール」という用語は、フェニル、ナフチル及びアントリルのような芳香族基を含む。
「電子求引基」という用語は、ハロ（-ＮＯ２、-ＣＮ、-ＳＯ３Ｈ、-ＣＯＯＨ、-ＣＨＯ、-ＣＯＲ（ここでＲは（Ｃ１からＣ４）アルキルである）等々の基を含む。
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）及びヨウ素（Ｉ）の群から選択される原子を記述するのに使用される。
【００１６】
「保護する」又は「防止する」という用語は、可能な又は恐らくの感染に対して進んだ手段をとり、疾患を引き起こす薬剤に通常伴う罹患率及び死亡率を防止することを意味する。
本発明の意味における「宿主」という用語は、哺乳動物、つまり乳腺から分泌される乳で自身の乳児を育てる任意のクラスの高等脊椎動物を意味する。
【００１７】
この発明における「細胞」という用語は、一又は複数の核、細胞質、及び半透過性膜によって全てが囲まれた様々な細胞小器官からなる、独立の機能が可能な生物体の最も小さい構造単位を意味する。
この発明における「重感染」という用語はＡＤＶとＨＩＶの双方に同時に感染した宿主を意味する。
この発明におけるＡＤＶ活性の阻害とは、ＡＤＶ複製の阻害、ＡＤＶ誘導プラーク生成の阻害、ＡＤＶ死滅又はＡＤＶ ＤＮＡポリメラーゼの阻害を意味する。
この発明におけるＨＩＶ活性の阻害はＨＩＶ複製の阻害、ＨＩＶ死滅又はＨＩＶ逆転写酵素の阻害を意味する。
【００１８】
本発明の方法に有用な化合物
細胞中でのアデノウイルス感染の作用をインビトロ又はインビボで阻害するための２',３'-ジデヒドロ-２',３'-ジデオキシチミジンのアリールホスフェート誘導体（ｄ４Ｔの誘導体）を使用する方法に関する。より詳細には、本発明は、式Ｉ：
2005534666.tif 000004
（上式中、Ｒ１は電子求引基で置換したアリール基であり、Ｒ２はアミノ酸残基又はアミノ酸残基エステルである）のように、アリール基に電子求引置換基を、ホスフェート基にアミノ酸置換基を有するｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体を投与することにより、哺乳動物における細胞中のアデノウイルス感染の作用を阻害する卯を提供する。
【００１９】
式Ｉの化合物はまた医薬的に許容可能な塩の形態でありうる。医薬的に許容可能な塩は有機及び無機酸によって生成される。式Ｉの化合物のアミノ酸又はアミノ酸エステル残基のアミノ基との塩生成に適した酸の例には、限定するものではないが、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、蓚酸、マロン酸、サリチル酸、リンゴ酸、グルコン酸、フマル酸、コハク酸、ソルビン酸、マレイン酸、メタンスルホン酸等々が含まれる。塩は、十分な量の所望の酸に遊離塩基形態を接触させて通常の形で一又は二塩等の塩をつくることによって調製される。式Ｉの化合物のアミノ酸残基のカルボン酸基との塩の生成に適した塩基には、例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム及び炭酸水素カリウムが含まれる。
【００２０】
式Ｉの一実施態様では、式ＩＩ：
2005534666.tif 000005
に示されているように、Ｒ１が電子求引基で置換したアリール基であり、Ｒ２がα-アミノ酸又はそのエステルである。式ＩＩにおいて、Ｘは電子求引基、例えばハロ-ＮＯ２、-ＣＮ、-ＳＯ３Ｈ、-ＣＯＯＨ、-ＣＨＯ、-ＣＯＲ（ここでＲは（Ｃ１からＣ４）アルキルである）等々の基である。Ｒ３は、水素又は１から７の炭素原子のアルキル、好ましくは１から４の炭素原子のアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、及びブチルである。Ｒ４は水素（例えばグリシンにおけるように）、アルキル（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンにおけるように）、置換アルキル（例えばスレオニン、セリン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、及びリジンにおけるように）、アリールアルキル（例えばフェニルアラニン及びトリプトファンにおけるように）、置換アリールアルキル（例えばチロシンにおけるように）、又はヘテロアルキル（例えばヒスチジンにおけるように）である。
【００２１】
一実施態様では、式ＩＩの化合物は、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]）（ここでＸはフェニル基のパラ位に結合したブロモであり、Ｒ４はメチルであり、Ｒ３はメチルである）である。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の構造を式ＩＩＩに示す：
2005534666.tif 000006
【００２２】
薬物動態学
過去のインビトロ研究は、フェニル基のパラ位の電子求引基が加水分解速度を増加させて、未置換アリールホスフェート誘導体に対して重要な代謝物アラニニル-ｄ４Ｔ-モノホスフェート（Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ）の産生を増大させる(Venkatachalam等, Bioorg Med. Chef. Lett., 8,3121 (1998); Vig等, Antiviral Chem. Chemnother., 9, 445 (1998);及び米国特許第６０３０９５７号(Uckun等))。
【００２３】
抗ウイルス剤ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]（以下のスキーム１ではＨＩ-１１３と呼ぶ）はインビボで速やかに代謝されて、二種の代謝物：２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（ｄ４Ｔ）及びアラニニル-ｄ４Ｔ-モノホスフェート（Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ）を生成する。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰはまた更に代謝されてｄ４Ｔを生じうる。代謝物ｄ４Ｔは先の細胞でのインビトロ研究では見出されていなかった。
2005534666.tif 000007
【００２４】
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート] は血漿又は全血中の何れかで直ぐに代謝してＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及び少量のｄ４Ｔを生成する（図２参照）。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰは血漿中と全血中の双方で安定している。これらの結果は、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ又はｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の何れかの加水分解によってｄ４Ｔを生成するのに他の酵素（例えば肝臓酵素）が必要であることを示している。この仮説は、肝臓ホモジェネートと共にｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]をインキュベーションした後の有意な量のｄ４Ｔの生成と一致している（図４参照）。
【００２５】
コリンエステラーゼとカルボキシルエステラーゼ双方のインヒビターであるパラオクソン(Augustinsson, Ann. N. Y. Acad.Sci., 94,884 (1961); McCracken等, Biochem. Pharmacol., 46,1125 (1993); Madhu等, J. Pharm. Sci., 86,971 (1997))は、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]のＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔへの加水分解を有意に防止したが、コリンエステラーゼとカルボキシルエステラーゼ双方がｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の代謝に重要であることを示唆している（図３Ａ参照）。コリンエステラーゼのインヒビターであるフィゾスチグミンはｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の加水分解を部分的に防止したが、これはｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の加水分解におけるコリンエステラーゼの重要性を更に裏付けている（図３Ｂ参照）。アリールエステラーゼのインヒビターであるＥＤＴＡはｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の加水分解に影響を及ぼさなかったが、これはアリールエステラーゼがおそらくはｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の加水分解に関与していないことを示している（図３Ｃ参照）。
【００２６】
排出半減期
静脈内投与ｄ４Ｔの排出半減期は、以下の実施例に示されるように、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの静脈内投与後に生成されたｄ４Ｔの排出半減期にかなり類似している（３０．３分対３４．０分のｔ１／２）。これに対して、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の静脈内投与後に生成されたｄ４Ｔの排出半減期は有意に長くなった（１１４．８のｔ１／２）。同様に、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]から生成されたＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの排出半減期は、静脈内投与されたＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰに対するｔ１／２より有意に長かった（１２９．２分対２８．５分のｔ１／２）。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の静脈内投与は、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]誘導代謝物の明らかに長い排出半減期のためにＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ又はｄ４Ｔの等モル用量の投与と比較してＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔの双方への長期の全身性暴露をもたらす。
【００２７】
静脈内投与後に、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の排出半減期（ｔ１／２）は３．５分で、１６０．９ｍｌ／分／ｋｇの全身クリアランス（ＣＬ）であった。全身クリアランス（ＣＬ）値の異なった推定値が、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の２種のジアステレオマー（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]Ａは２０８．２ｍｌ／分／ｋｇでありｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]Ｂは１２３．９ｍｌ／分／ｋｇである）に対して得られたが、双方とも３０分以内に完全に代謝した。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は活性代謝物Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ（２３％）及びｄ４Ｔ（２４％）に転換した。静脈内投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]から生成されたＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔのｔｍａｘ値はそれぞれ５．９分及び１８．７分であった。
【００２８】
Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの静脈内投与はｄ４Ｔの生成を生じる（１５％）。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰはまたｄ４Ｔプロドラッグとして使用することができる。本発明は、式ＩＶ：
2005534666.tif 000008
（上式中、Ｒ２はアミノ酸又はそのエステル化物である）
の有効量の化合物を投与することによってインビトロ又はインビボで細胞中のアデノウイルス感染の作用を阻害する方法を提供する。
【００２９】
塩
式ＩからＩＶの化合物はまた医薬的に許容可能な塩の形態とすることもできる。医薬的に許容可能な塩は有機及び無機酸を用いて生成することができる。式ＩＶのアミノ酸又はアミノ酸エステル残基のアミノ基との塩生成に適した酸の例には、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、蓚酸、マロン酸、サリチル酸、リンゴ酸、グルコン酸、フマル酸、コハク酸、ソルビン酸、マレイン酸、メタンスルホン酸等々が含まれる。塩は、十分な量の所望の酸に遊離塩基形態を接触させて通常の形で一又は二塩等の塩をつくることによって調製される。式ＩＶのアミノ酸残基のカルボン酸基との塩の生成に適した塩基には、例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム及び炭酸水素カリウムが含まれる。
【００３０】
生物学的利用能
経口投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]はまたＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔを主要代謝物として生成した。親のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は経口投与後の血液中には検出できなかった。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は胃液中で安定で、胃に吸収されうるが、血液中で速やかに加水分解しうる。他方、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は腸液中で即座に分解してＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰを生成する。この代謝物は腸に吸収され得、その後更に代謝されて血液中にｄ４Ｔを生じる。マウスでのｄ４Ｔに対するｔｍａｘ及びｔ１／２値は、経口投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]から誘導された場合、経口投与されたｄ４Ｔからのものより長かった（それぞれ５分及び１８分）。静脈内投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]と比較して経口投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]に対してｔｍａｘ値は高いがｔ１／２値は低い。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の経口投与後では、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔの推定生物学的利用能はそれぞれおよそ１２％及び４８％であった。しかしながら、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]から代謝されたｄ４Ｔの生物学的利用能（４８％）は経口投与されたＤ４Ｔのもの（９８％）よりも低かった。
【００３１】
齧歯類種におけるｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]のインビボでの薬物動態学、代謝、毒性及び抗レトロウイルス活性は研究されている(Uckun等, ArzneimittelforschuraglDrug Research, 2002,(印刷中))。マウス及びラットでは、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は、５００ｍｇ／ｋｇと高い単一の腹腔内又は経口大量瞬時投与用量レベルで検出可能な急性又は亜急性毒性なしに非常に良好な許容性を示した(Uckun等, 2002,(上掲))。顕著なことに、連続８週間までのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の毎日の腹腔内又は経口投与には、６．４ｇ／ｋｇと高い累積用量レベルでマウス又はラットにおいて如何なる検出可能な毒性も伴っていなかった(Uckun等, 2002, (上掲))。齧歯類種でのその安全性特性に従って、２５ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]を含む硬ゼラチンカプセルの毎日２回の投与を含む４週のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]処置過程は、８．４ｇ／ｋｇと高い累積用量でイヌ及びネコによって非常によく許容された(Uckun等, Antimicrob. Agents Chemother. (2002年提出))。
【００３２】
投与方法
式ＩからＩＶの化合物は医薬組成物として製剤化でき、選択された投与経路に適合させられた様々な形態でヒト患者を含む哺乳動物宿主に投与できる。組成物は典型的には医薬的に許容可能な担体と組み合わせて投与され、ターゲティング抗体又はサイトカインを含む特定の送達剤と組み合わせることができる。
【００３３】
有用な用量
アデノウイルス感染の作用を阻害するためにインビボで使用される場合、投与される用量は、アデノウイルスの一又は複数の徴候を低減し又は除去するのに十分なもののような、所望の効果を持つのに効果的なものである。適切な量は、本明細書と実施例に提供したインビボでの動物モデルデータから、既知の方法及び関係を使用して推定して、当業者により決定されうる。
一般に、生存時間の増大のようなアデノウイルス感染の徴候又は作用の低減を含むアデノウイルス感染の治療的処置を達成するのに効果的なｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体の用量は、約１−５００ｍｇ／ｋｇ体重／用量、好ましくは約１０−１００ｍｇ／ｋｇ体重／用量のおよその範囲、及び週当たりおよそ８００−１０００ｍｇ／ｋｇ体重の累積用量である。
【００３４】
投与される有効用量は各患者に特定の条件によって変わる。一般に、ウイルス負荷、宿主年齢、代謝、疾病、薬物への前の暴露等々のような要因は薬剤の予想された効能に寄与する。当業者であれば、実施例に提供されたデータから推定して、標準的な手順と患者の分析法を使用して適切な用量を計算できる。一般に、約１−１００ｍｇ／ｋｇ体重を送達する用量が効果的であると予想されるが、より多いものも少ないものも有用であろう。
また、本発明の組成物は他の治療法と組み合わせて投与されうる。そのような併用療法では、化合物の投与用量は単一の薬剤療法に対するものよりも少なくてもよい。
【００３５】
化合物は、一般的な非毒性の医薬的に許容可能な担体、アジュバント又はビヒクルを含む投薬単位製剤として、経口的、非経口的（皮下注射、静脈的、筋肉内、胸骨内又は注入技術を含む）、吸入噴霧、局所的、粘膜を通しての吸収、又は直腸的に投与され得る。本発明の医薬組成物は、経口投与に好適な懸濁液又は錠剤、点鼻薬、クリーム、滅菌注射可能製剤、例えば滅菌性の注射可能な水性又は油脂性懸濁液又は座薬の形態とできる。
懸濁液としての経口投与のためには、組成物は医薬製剤化分野でよく知られた技術に従って調製することができる。組成物は、嵩を賦与するためにマイクロクリスタリンセルロース、懸濁剤としてアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、粘度増加剤としてメチルセルロース及び甘味料又は香味料を含みうる。速やかな放出錠剤としては、組成物は当該分野で既知のマイクロクリスタリンセルロース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム及びラクトース又は他の賦形剤、バインダー、増量剤、錠剤分解物質、希釈剤及び潤滑剤を含みうる。
【００３６】
吸入噴霧又はエアロゾルによる投与に対しては、組成物は医薬製剤の分野でよく知られた技術に従って調製することができる。組成物は、生理食塩水の溶液として、ベンジルアルコール又は他の好適な保存料、生物学的利用能を増大させる吸収促進剤、過フッ化炭化水素又は当該分野で一般的に知られている他の可溶化又は分散剤を使用して調製することができる。
注射可能な溶液又は懸濁液としての投与に対しては、組成物は、好適な分散又は湿潤及び懸濁剤、例えば限定するものではないが合成モノ-又はジグリセリド、オレイン酸を含む脂肪酸を含む滅菌油を使用して、当該分野においてよく知られた技術に従って製剤化できる。
【００３７】
座薬としての直腸投与に対しては、組成物は、室温で固体であるが直腸腔内で液化又は溶解して薬剤を放出する好適な非刺激性賦形剤、例えばココアバター、合成グリセリドエステル又はポリエチレングリコールと混合する既知の方法によって調製することができる。
組成物の溶液又は懸濁液は水、等張性生理食塩水（ＰＢＳ）等中で縫製することができ、場合によっては非毒性界面活性剤と混合することができる。分散液はまた例えばグリセロール、液状ポリエチレン、グリコール、ＤＮＡ、植物油、トリアセチン及びその混合物中で既知の方法によって調製することができる。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、例えば微生物の成長を防止するために保存料を含みうる。
【００３８】
注射又は注入に適した医薬投薬形態は、滅菌水溶液又は分散液、滅菌注射可能又は注入可能溶液又は分散液の即時調製に適した活性成分を含有する滅菌パウダー等々を含みうる。全ての場合、最終的な投薬形態は滅菌性、流体で製造及び保存条件下で安定であることが好ましい。液状担体又はビヒクルは、例えば水、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、又は液状ポリエチレングリコール等々、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びその好適な混合物を含む溶媒又は液体分散体媒質でありうる。例えば、リポソームの生成、分散液の場合には要求された粒子サイズの維持、又は非毒性の界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等々によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、緩衝液、又は塩化ナトリウムを含ませるのが望ましい。注射可能組成物の長期にわたる吸収は、組成物中に吸収遅延剤−例えばモノステアリン酸アルミニウムヒドロゲル及びゼラチンを含有させることによってもたらすことができる。
【００３９】
滅菌性注射可能溶液は、上に挙げた様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要な量のコンジュゲートを導入し、必要に応じて濾過殺菌することによって調製される。滅菌性注射可能溶液の調製用の滅菌パウダーの場合には、好適な調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥法であり、これは活性成分とそれまでに滅菌濾過された溶液中に存在する任意の付加的な所望成分のパウダーを生じる。
【実施例】
【００４０】
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔを調製するための合成手順は過去に詳細に記載されている(Venkatachalam等, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8,3121 (1998); Vig等, Antiviral Chena. Chemother., 9,445, (1998))。式ＩからＩＩＩの化合物はまた出典明示によりここに取り込まれる米国特許第６０３０９５７号(Uckun et al. )に記載されたようにして合成することができる。
【００４１】
実施例１
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]とその代謝産物の検出のための定量的ＨＰＬＣ
これらの実験に用いたＨＰＬＣシステムは４基一組のポンプ、自動サンプラー、自動電子脱ガス装置、自動サーモスタットカラム室、ダイオードアレイディテクター、Chemstationデータ分析ソフトを備えたコンピュータを具備したヒューレットパッカード(Palo Alto, CA)シリーズ１１００機器であった(Chen等, JChromatogr. B., 724,157 (1999); Chen等, J. Chromatogr. B., 727,205 (1999);及びChen等, J Liq. Chromatogr., 22,1771(1999))。使用した分析カラムはガードカラム(Hewlett Packard, Inc.)に付設したＺｏｂａｘ ＳＢ-フェニル(５μｍ, Hewlett Packard, Inc.)カラムであった。カラムはデータ収集前に平衡化した。線形勾配の移動相(流量＝１．０ｍＬ／分)は、０分での１００％Ａ／０％Ｂ、２０分での８８％Ａ／１２％Ｂ、３０分での８％Ａ／９２％Ｂであった(Ａ：１０ｍＭリン酸アンモニウムバッファー、ｐＨ３．７；Ｂ：アセトニトリル)。検出波長は２６８ｎｍ、ピーク幅は０．０３分未満、応答時間は０．５秒、スリットは４ｎｍであった。
【００４２】
この実験ではＨＰＬＣ級試薬及び脱イオン化蒸留水を使用した。アセトニトリルはBurdick & Jackson (Allied Signal Inc., Muskegon, MI)から購入した。酢酸はFisher Chemicals (Fair Lawn, NJ)から購入した。リン酸アンモニウム及びリン酸はSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から購入した。
血漿試料(２００μＬ)はアセトン(８００μＬ)と１：４で混合し、少なくとも３０秒ボルテックスした。遠心分離後、上清をきれいな試験管に移し、窒素下で乾燥させた。２００ｍＭのＨＣｌ中５０％のメタノールの溶液５０μＬを用いて抽出残渣を再構成し、４０μＬをＨＰＬＣ中に注入した。
【００４３】
試薬を添加した試料中のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]とその代謝産物に対して測定されたクロマトグラフィー滞留時間(ＲＴ)は２８．７±０．０２分（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]Ａ；ｎ＝１３；図１Ｂ）、２８．９±０．０２分（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]Ｂ；ｎ＝１３；図１Ｃ）、１５．３±０．２分（Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ；ｎ＝３０）及び１８．５±０．１分（ｄ４Ｔ；ｎ＝３０）であった。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]Ａ及びｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]Ｂはｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]のジアステレオマーである。これらの滞留時間では、ブランク血漿からは有意な干渉ピークは観察されなかった（図１Ａ及び１Ｂ）。
【００４４】
再構成された溶液の塩酸成分はｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]及びその代謝産物；酸プロトン化Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰのクロマトグラフィーにおいて所定の役割を果たしていた。再構成された溶液中に塩酸がないと、この代謝産物のクロマトグラムにはピークが現れなかった。酸性溶液はしかしＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの安定性を減少させた。従って、抽出試料の全てを再構成の直後に分析した。
【００４５】
実施例２
全血及び血漿中でのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]及びＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの安定性
全血及び血漿試料にｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]及びＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰを添加(スパイク)してそれぞれ２５０μＭのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]及び１００μＭのＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの最終濃度にした。全血試料を３７℃の水浴に入れる一方、血漿試料を−２０℃に保存した。予め決められた時間に、スパイクした全血又は血漿の一定分量（１００μｌ）を、上述のように、タンパク質の沈殿を誘導するために４００μｌのアセトンを添加することによって抽出した。絶対ピーク面積をｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]及びＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの安定性を評価するために使用した。
【００４６】
図２Ａ及び２Ｂに示された結果は、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]が血漿中及び全血中において非常に不安定であることを示している。血漿と共にインキュベーションされた後、９５％を越えるｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]が５分後に分解した。全血試料では、６８％、８７％及び９２％のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]がそれぞれ５分、１０分及び１５分に取られた試料中で分解した。血漿及び全血試料双方において、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の分解は３０分以内に完了した（血漿データについては表１参照）。よって、試料は試料取得直後に抽出した。これに対して、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰは全血及び血漿中で１日間安定であった。
【００４７】
実施例３
選択的エステラーゼインヒビターの存在下での血漿中におけるｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の安定性
血漿試料をエステラーゼインヒビターであるパラオクソン（０．１ｍＭの最終濃度）、フィゾスチグミン（１Ｍの最終濃度）及びＥＤＴＡ（１Ｍの最終濃度）と共に３７℃で３０分間、プレインキュベートした。ついで、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]を添加して２５０μＭの最終濃度にした。予め決められた時間に、スパイクした血漿の一定分量（１００μｌ）を、上述のように、タンパク質の沈殿を誘導するために４００μｌのアセトンを添加することによって抽出した。血漿中のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の分解はパラオクソンによって有意に阻害され、フィゾスチグミンによって部分的に阻害されたが、ＥＤＴＡによっては影響を受けなかった（図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ並びに表１参照）。表１に示されたデータは二回の実験の加水分解平均割合をとって計算した。
【００４８】
2005534666.tif 000009
【００４９】
実施例４
マウス肝臓ホモジェネート中でのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の安定性
新鮮なマウスの肝臓をＢａｌｂ／ｃマウスから取得し、ポリトロン(Polytron (RT-MR2000))ホモジェナイザー(Kinematical AG, Littau, Switzerland)を使用して１ｘＰＢＳ中でホモジェナイズした（１：１、Ｗ／Ｖ）。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]を肝臓ホモジェネートに添加して１００μＭの最終濃度にした。
予め決められた時間に、スパイクした肝臓ホモジェネートの一定分量（１００μｌ）を、上述のように、タンパク質の沈殿を誘導するために４００μｌのアセトンを添加することによって抽出した。
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]化合物は、血漿で得られたデータと同様に、肝臓ホモジェネートとのインキュベーション後に３０分以内に分解した。しかし、血漿中とは異なり、肝臓ホモジェネートとのインキュベーション後に有意な量のｄ４Ｔが検出された。
【００５０】
実施例５
胃腸液中でのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]及びＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの安定性
シミュレートされた胃及び腸液を、合衆国薬局方の方法に従って調製し、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]及びＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰをスパイクして各化合物１００μＭの最終濃度の溶液を得た。ついでスパイクした液を３７℃の水浴中に入れた。予め決められた時間に、スパイクした胃又は腸液の１００μｌの一定分量を、上述のように、４００μｌのアセトンを添加することによって抽出した。
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は胃液中で８時間の間、比較的安定であるが、腸液中では安定ではない（図５Ａ及び５Ｂ）。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は速やかに分解して腸液中にＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰを生じた（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]のおよそ９４％が２時間以内に分解した）。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰは腸液中で安定であった；ほんの微量のｄ４Ｔが腸液中で検出されただけであった。
【００５１】
実施例６
マウスでの薬物動態研究
Ｔａｃｏｎｉｃ(Germantown, NY)からの雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＵＳＤＡによって完全に公認された制御環境中（１２時間の光／１２時間の暗所、２２±１℃、６０±１０％の相対湿度）に収容した。全ての齧歯類は、オートクレーブ床を含むマイクロアイソレーター（Lab Products, Inc., NJ）に収容した。実験中マウスはオートクレーブのペレット状食物や水道水に自由に接近できるようにした。動物飼育手順は全てGuide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, National Academy Press, Washington DC 1996)に準拠した。
ＤＭＳＯ中に溶解させたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]（１００ｍｇ／ｋｇ）の溶液（５０μｌ）を尾の静脈を経て静脈内投与した。この容量のＤＭＳＯは、迅速な静脈内又は血管外注射によって投与するとマウスに良好に許容される(Rosenkrantz等, Cancer Chemother.Rep.,31,7 (1963); Wilson等, Toxicol. Appl. Pharmacol., 7,104(1965))。血液試料(〜５００μＬ)は静脈内注射の０、２、５、１０、１５、３０、４５、６０、１２０、２４０及び３６０分後に逆軌道静脈穿刺(retro-orbital venipuncture)によって眼の静脈叢から取得した。これらの化合物の全身性投与後のＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔの薬物動態学を研究するために、マウスに、それぞれ７５ｍｇ／ｋｇのＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及び４０ｍｇ／ｋｇのｄ４Ｔを注射した（これらの用量は１００ｍｇ／ｋｇのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]に等モルである）。
【００５２】
経口投与後のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の薬物動態学を決定するために、１２時間絶食させたマウスに、＃２１のステンレス鋼ボール付き給餌針を使用してチューブによる栄養補給によって１００ｍｇ／ｋｇのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]を大量瞬時投与量与えた。サンプリング時点はチューブによる栄養補給後０、２、５、１０、１５、３０、４５、６０、１２０、２４０及び３６０分の時点であった。
全ての収集した血液試料をヘパリン処理し、５分間７０００ｘｇで遠心分離して、全血から血漿画分を分離した。ついで血漿思料を、上述の抽出手順を用いて即座に処理した。
【００５３】
薬物動態学モデル化及びパラメータの計算はＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌバージョン３．０(Pharsight,Inc., Mountain, CA)薬物動態学ソフトウェア(Chen等, Pharm.Res., 16, 1003 (1999); Chen等, Pharm.Res., 16,117 (1999); Chen等, J. Clin. Pharmacol., 39,1248 (1999); Uckun等, Clin. CancerRes., 5,2954 (1999);及びUckun等, J. PharmacoL Exp.Ther., 291,1301 (1999))を用いて実施した。適切なモデルは、加重残差最小二乗和、最小シュワルツ基準（ＳＣ）、最小赤池情報量基準（ＡＩＣ）値、適合パラメータの最小標準誤差、及び残差の分散に基づいて選択した。排出半減期は血漿濃度-時間特性の終末過程の線形回帰分析によって推定した。濃度-時間曲線下の面積（ＡＵＣ）は最初のサンプリング時（０時間）と最後のサンプリング時プラスＣ／ｋ（ここで、Ｃは最後のサンプリング濃度、ｋは排出速度定数）の間の線形台形則に従って計算した。漸進性クリアランス（ＣＬ）は用量をＡＵＣで割って決定した。親薬物の代謝クリアランス、代謝産物の生成クリアランス、代謝産物の分配クリアランスは、微分方程式の系として特定された薬物動態モデルに時間曲線の関数として親薬物及び代謝産物の濃度を同時に適合させることによって推定した(Gabrielsson & Weiner,Phamacokinetic/Phamacodynamic Data Analysis: Concepts and Applications, Swedish Pharmaceutical Press (1997))。代謝産物に転換したｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の割合（ｆｍ）は、等モル用量の代謝産物の投与後のＡＵＣ[(ＡＵＣｍ)ｍ]に対する親薬物の投与後の代謝産物のＡＵＣ[(ＡＵＣｍ)ｐ]の比として計算した(Gibaldi及びPerrier,1982)：ｆｍ＝[ (ＡＵＣm)ｐ ／Ｄｐ]ｘ[Ｄｍ／(ＡＵＣｍ)ｍ]＝(ＡＵＣｍ)ｐ・ＣＬｍ／Ｄｐ
【００５４】
実施例７
静脈内投与後のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の代謝及び薬物動態性状
静脈内投与後に、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]（１００ｍｇ／ｋｇ）が代謝されてｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ｍ１（ＲＴ＝１５．３分）及びｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ｍ２（ＲＴ＝１８．５分）を生成した（図１Ｃ）。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ｍ１はＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰと同じ滞留時間を有している一方、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ｍ２はｄ４Ｔと同じ滞留時間を有していた（図１Ｂ及び１Ｃ）。これら二種の代謝産物のＵＶスペクトルはそれぞれＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔのものと同一であった。
１００ｍｇ／ｋｇのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の静脈内投与後に、時間の関数としてのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の血漿中濃度を一室モデルによって記述した（図６Ａ）。薬物動態パラメータ推定値を表２に示す。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は２２４．２μＭのＣｍａｘと１１４２．０μＭ・分のＡＵＣを有していた。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の全身性クリアランスは適度に速く、１６０．９ｍＬ／分／ｋｇのＣＬであり、これは腎臓又は肝臓への血流速のおよそ２倍である(Davies等, Pharm. Res., 10,1093 (1993))。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は中程度の分散サイズ容積を有していて、８１９．９ｍｌ／ｋｇのＶｓｓであり、これは体内の水の全容積にほぼ等しい。しかし、その速やかな代謝のため、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は短い排出半減期を有していた（ｔ１／２＝３．５分）。
【００５５】
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]のジアステレオマーを、上述のＨＰＬＣ条件下で分離した（滞留時間は２８．７及び２８．９分であった）。ジアステレオマーの一つ（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ａ、滞留時間＝２８．７分）は他方（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ｂ、滞留時間＝２８．９分；図１Ｃ）よりも速やかに代謝された。これらの２種のジアステレオマーの薬物動態特性を表２にまとめる。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ｂはｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ａより、高いＡＵＣ（７４１．２対４４１．５μＭ・分）とＣｍａｘ（１２５．７対１０７．９μＭ）を有していた。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ｂはまたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ａより、僅かに長い排出半減期（４．１分対２．８分）を有しており、これはｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ａのクリアランスがｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-Ｂのクリアランスより速いためであろう（２０８．２対１２３．９ｍｌ／分／ｋｇ）。しかしながら、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]ジアステレオマーは双方共３０分以内に完全に代謝された。
【００５６】
静脈内注射の後、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は速やかに代謝されて、表２に示されるようにＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ（ｔｍａｘ＝５．９分；Ｃｍａｘ＝６７．４μＭ；ｔ１／２＝１２９．２分）とｄ４Ｔ（ｔｍａｘ＝１８．７分；Ｃｍａｘ＝１５．７μＭ；ｔ１／２＝１１４．８分）を生じた。
2005534666.tif 000010
Ｂａｌｂ／ｃマウスでの薬物動態パラメータ（各時点当たりＮ＝４マウス）を、プールされたデータの複合血漿濃度-時間曲線から推定された平均値として表した。平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ(平均値標準誤差)値は括弧中に示す。ＮＤは値が検出されたかったことを意味する。
【００５７】
図７Ａ及び７Ｂに示されたモデルはｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の静脈内注射後のＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰとｄ４Ｔの代謝産物薬物動態を記述する。このモデルによれば、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は生体内変換されてＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ（ＣＬｍ１）とｄ４Ｔ（ＣＬｍ２）をそれぞれ生成する。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]から誘導されたＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰは更に代謝されてｄ４Ｔ（ＣＬｍ３）を生成し、又は血管外区画に分散される（ＣＬｍｉｄ）。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]又はＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰから生成されたｄ４Ｔは最終的には体から除かれる（ＣＬｍｅ２）。これらの２種の代謝産物に対して推定された薬物動態パラメータを表３にまとめる。
【００５８】
2005534666.tif 000011
括弧内の値はモデリングのＣ.Ｖ.である。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の代謝クリアランスと代謝産物の生成クリアランスは、それぞれＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰに対して８３．９ｍｌ／分／ｋｇ、ｄ４Ｔに対して８７．４ｍｌ／分／ｋｇであった。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの代謝クリアランスとその代謝産物ｄ４Ｔの生成クリアランスは３６．１ｍｌ／分／ｋｇであり、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの少しの部分が４７．１ｍｌ／分／ｋｇのＣＬｍ１ｄで血管外区画に分散せしめられた。最後に、ｄ４Ｔは６２．０ｍｌ／分／ｋｇのＣＬｍｅ２で排除された。
【００５９】
実施例８
Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの静脈内注射（７５ｍｇ／ｋｇ、上で検討したｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の１００ｍｇ／ｋｇ用量と等モル用量）後、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰは速やかに代謝されて、ｄ４Ｔ（ｔｍａｘ＝４．４分；ｔ１／２＝３４．０分）を生じた（図８Ａ及び８Ｂ、表４）。時間の関数としてのＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの濃度は二区画モデルを用いて記述することができる一方、一区画モデルが時間の関数としてその代謝産物ｄ４Ｔに最も良好に適合する（図８Ｂ）。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰとｄ４Ｔに対するＣｍａｘ値はそれぞれ１２０６．６μＭ、３５．２μＭであった。ＡＵＣはＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰに対して１１６４８．７μＭ・分、ｄ４Ｔに対して１８８８．０μＭ・分であった。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの全身性クリアランスは僅か１５．８ｍＬ／分／ｋｇ（表４）であり、これは腎臓又は肝臓に対する血流よりも更に少ない（Davies等, Pharm.Res., 10,1093 (1993)）。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰはまた体内の水の全容積よりも少ない小容積の分散性(Ｖｓｓ＝２７５．５ｍｌ／ｋｇ)を有していた。にもかかわらず、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの排出半減期はその速やかな代謝のために短かった（ｔ１／２＝２８．５分）。
【００６０】
2005534666.tif 000012
Ｂａｌｂ／ｃマウスでの薬物動態パラメータ（各時点当たりＮ＝５マウス）を、プールされたデータの複合血漿濃度-時間曲線から推定された平均値として表した。平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ(平均値標準誤差)値は括弧中に示す。ＮＤは値が検出されたかったことを意味する。
【００６１】
図８Ａに示されたモデルはＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの静脈内注射後の代謝産物薬物動態を最もよく記述している。このモデルによれば、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰは代謝されてｄ４Ｔ（ＣＬｍ１）を生成するか、又は血管外区画に分散されうる（ＣＬｐｄ）。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰから誘導されたｄ４Ｔは体から除かれる（ＣＬｍｅ）。記述されたモデルに対して時間の関数としてＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰとｄ４Ｔの濃度値を同時に適合させることにより、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの代謝クリアランスとｄ４Ｔの生成クリアランス（ＣＬｍ１）は表５に示されるように１５．６ｍｌ／分／ｋｇと推定された。
【００６２】
2005534666.tif 000013
括弧内の値はモデリングのＣ.Ｖ.である。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの少しの部分が４．７ｍｌ／分／ｋｇのＣＬｐｄで血管外区画に分散せしめられ、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰから誘導されたｄ４Ｔは８８．４ｍｌ／分／ｋｇの相対的に高いＣＬｍｅで最終的に排除された。１５．６ｍｌ／分／ｋｇのＣＬｍ１は全身性クリアランス（ＣＬ＝１５．８ｍｌ／分／ｋｇ）の９９％を占め（表４参照）、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの殆どが生体内変換されてｄ４Ｔを生成することを示している。
【００６３】
実施例９
静脈内投与後のｄ４Ｔの薬物動態特性
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の１００ｍｇ／ｋｇ用量と等モル用量である４０ｍｇ／ｋｇの静脈内注射後に、時間の関数としてｄ４Ｔの濃度を一区画モデルを使用して記述した（図９）。薬物動態パラメータの推定値は表６に示す。Ｄ４Ｔの推定Ｃｍａｘ及びＡＵＣ値はそれぞれ２７９．５μＭ、１２２２７．１μＭ・分であった。Ｄ４Ｔは短い排出半減期（３０．３分）を有していた。ｄ４Ｔの全身性クリアランスはＣＬが僅かに１５．０ｍｌ／分／ｋｇと遅く、これは腎臓又は肝臓への血流よりも更に低い（Davies等, Pharm.Res., 10,1093 (1993)）。Ｄ４Ｔは体内の水の容積にほぼ等しい中程度に大なる容積の分散性(Ｖｓｓ＝６５７．８ｍｌ／ｋｇ)を有していた。
【００６４】
2005534666.tif 000014
Ｂａｌｂ／ｃマウスでの薬物動態パラメータ（各時点当たりＮ＝５マウス）を、プールされたデータの複合血漿濃度-時間曲線から推定された平均値として表した。平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ(平均値標準誤差)値は括弧中に示す。
【００６５】
実施例１０
経口投与後のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の薬物動態特性
経口投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]（１００ｍｇ／ｋｇ）の薬物動態学的挙動をまた調べた。両方の代謝産物（Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰとｄ４Ｔ）が検出されたが、親ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の濃度は検出限界（０．５μＭ）以下であった。ｔｍａｘ値はＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰでは１０．３分、ｄ４Ｔでは４２．４分であった。一区画薬物動態モデルを用いて時間の関数としてＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔ双方の濃度変化を記述した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。薬物動態パラメータの推定値は表７に示す。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びＤ４Ｔの最大濃度（Ｃｍａｘ）はそれぞれ１２．７μＭ、３０．７μＭであった。排出半減期はＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔに対してそれぞれ６６．４分及び９９．０分であった。
【００６６】
2005534666.tif 000015
Ｂａｌｂ／ｃマウスでの薬物動態パラメータ（各時点当たりＮ＝４マウス）を、プールされたデータの複合血漿濃度-時間曲線から推定された平均値として表した。平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ(平均値標準誤差)値は括弧中に示す。
【００６７】
実施例１１
スタブジン誘導体の合成と特徴付け
全ての化学薬品はＡｌｄｒｉｃｈ(Milwaukee, WI)から購入した。全ての合成は窒素雰囲気下で行った。ＣＤＣｌ３又はＤＭＳＯ-ｄ６中で室温にてバリアンマーキュリー３００機器を使用して１Ｈ、１３Ｃ、１９Ｆ及び３１Ｐ ＮＭＲを得た。化学シフトは内部基準としてテトラメチルシラン（δ＝０ｐｐｍ）からダウンフィールドした百万分率（ｐｐｍ）でのδ値として報告した。スプリットパターンは次のように表示する：ｓ，一重項；ｄ，二重項；ｔ，三重項；ｍ，多重項；ｂｒ，ブロードピーク。ＦＴ-ＩＲスペクトルはニコレットプロテージ(Nicolet Proteege)４６０分光計で記録した。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトルはＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴ９５システムを使用して得た。ＵＶスペクトルは、セルパス長１ｃｍのベックマンＵＶ-ＶＩＳ分光光度計（モデル３ＤＵ７４０００）を使用して記録した。
【００６８】
ＨＰＬＣ精製は逆相Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒカラム（２５０ｘ４ｍｍ、ヒューレットパッカード、ＲＰ-１８、カタログ番号７９９２５）と水（７０％）とアセトニトリル（３０％）からなる定組成(isocratic)流（１ｍｌ／分）を使用して達成した。融点はメルト・ジョン装置を用いて決定し、修正していない。カラムクロマトグラフィーはベイカー(Baker)社から得たシルカゲルを使用して実施した。オクタノール／水分配係数は振盪フラスコ法によって決定した。ホスホラミダイト類似体をガラスバイアル中、２ｍｌの水及び２ｍｌのオクタノールに添加した。混合物を室温で４時間振盪した。二相を注意して分離しミリポアフィルターで濾過し、ＨＰＬＣで分析した。分配係数は、オクタノールと水のそれぞれに対する曲線下の面積の比を用いて計算した。
【００６９】
抗ウイルス薬。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の調製のための合成手順はVig等, 1992 Antiviral Chem. andClzemother., 9: 445-447に過去に詳細に記載されている。ジドブジンはトロント・リサーチ・ケミカルズ社Missassagua, Ontario, Canadaから得た。ｄ４ＴはMansuri等, 1989J. Med. Chem. 32,461の方法に従ってチミジンから調製した。適切に置換されたフェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデートはまたMcGuigan等, 1992 AntiviralRes.,17, 311によって報告された方法に従って調製した。化合物は以下のスキーム２に概略を示したようにして合成した。
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【００７０】
スキーム２。フェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデートを無水ＴＨＦ中のｄ４Ｔ及び１-メチルイミダゾール溶液に添加し、混合物を室温で５−６時間攪拌した。反応混合物をまとめると、必要な誘導体が良好な収量で得られた。カラムクロマトグラフィーにかけて化合物を精製した。
合成された化合物の物理データは、流量１ｍｌ／分で水／アセトニトリル７０：３０で溶出させたＣ１８の４ｘ２５０ｍｍ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒカラムを使用して実施したＨＰＬＣによって測定した。次の化合物の純度はＨＰＬＣで９６％を越えていた。星印で標識した１３Ｃ ＮＭＲピークはジアステレオマーのために分かれていた。
【００７１】
合成された化合物の物理化学的性質は次の通りであった：
２', ３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（ｄ４Ｔ）：収率：５７％；融点１６５−１６６℃；ＵＶ(ＭｅＯＨ)λｍａｘ２０４，２５７ｎｍ；ＩＲ(ＫＢｒ)：３４６３，３１５９，３０３３，１６９１，１４６９，１１１６，１０９３Ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ６)δ１１．２９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．６３（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）；６．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），５．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝ｌ．  ｌ，４．７Ｈｚ），５．０１（ｍ，１Ｈ），４．７６（ｓ，１Ｈ），３．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８，３．６Ｈｚ），１．７１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝１．２Ｈｚ），１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ-ｄ６）δ１６４．４，１５１．３，１３７．２，１３５．４，１２６．４，１０９．３，８９．２，８７．６，６２．４，１２．２；算定質量：２２４，実測値：２２５（Ｍ＋１）；ＨＰＬＣ滞留時間（ｔＲ）：８．７分。
【００７２】
５'-[４-ブロモフェニルメトキシルアニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'0デオキシチミジン（化合物１１３）：収率：８３％；ＵＶ(ＭｅＯＨ)ｍａｘ：２０９，２１８及び２６６ｎｍ；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２０３，３０７０，２９５４，２８８７，２２４８，１７４３，１６９３，１４８５，１２２１，１１５３，１０３８，９１２，８３５，７３３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．６０−９．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４５−７．４２（ｍ， ２Ｈ），７．３０−７．０９（ｍ， ４Ｈ），６．３７−６．２７（ｍ， １Ｈ），５．９３−５．８８（ｍ，１Ｈ），５．０４−５．０１（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），４．３５−４．３３（ｍ，２Ｈ），４．２７−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．７１−３．７０  （ｓ，３Ｈ），１．８５−１．８１（ｓ，３Ｈ），１．３７−１．３１（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．７，１６３．８，１５０．８，１４９．７−１４９．６，１３５．６−１３５．４，１３３．１−１３２．５，１２７．４−１２７．３，１２１．９−１２１．７，１１８．０，１１１．２−１１１．１，８９．７−８９．４，８４．４−８４．３，６７．８−６６．４，５２．５，５０．０−４９．９，２０．７，及び１２．３；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．４１，２．７８；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ算定質量（Ｍ＋Ｎａ）５６７．２，実測値５６７．１；ＨＰＬＣｔＲ：１２．０４及び１２．７２分。
【００７３】
５'-[４-メトキシフェニルメトキシルアニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物５９８）：収率：２５％；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２２３，２２９及び２７０ｎｍ；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２２３，３０７２，２９９９，２９５３，２８３７，１７４３，１６９３，１５０６，１４４３，１２０７，１１５３，１１１１，１０３４，９３７，８３７及び７５６ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．４０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３０−７．００（ｍ，５Ｈ），６．８３−６．８１（ｍ，１Ｈ），６．３７−６．２７（ｍ，１Ｈ），５．９１−５．８６（ｍ，１Ｈ），５．００（ｂｒ ｍ，１Ｈ）、４．４０−４．３０（ｍ，２Ｈ），４．２０−４．１０（ｍ，２Ｈ），３．９５−３．９３（ｓ，３Ｈ），３．８２−３．８０（ｓ，３Ｈ），１．８５−１．８１（ｓ，３Ｈ）及び１．３９−１．２９（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７４．０，１６３．９，１５６．６，１５０．８，１４３．５，１３５．８−１３５．５，１３３．３−１３２．９，１２７．４−１２７．２，１２１．２−１２０．９，１１４．５，１１１．２，８９．７−８９．４，８４．５，６６．９−６６．３，５５．５，５２．５，５０．６−４９．９，２０．９及び１２．３；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．８２，３．２０；ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ算定質量（Ｍ＋Ｎａ）５１８．２，実測値５１８．２；ＨＰＬＣｔＲ：５．８３及び６．２６分。
【００７４】
５'-[３-ジメチルアミノフェニルメトキシルアニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物５９９）：収率：１８％；融点６１−６２℃；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２０３，２０６，２１１及び２５８ｎｍ；ＩＲ：３４４８，３０５０，２９５２，１６９１，１５０６，１４５０，１２４７，１１４３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．９３（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｍ，１Ｈ），７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９７（ｍ，１Ｈ），６．４４（ｑ，３Ｈ），６．２４（ｍ，１Ｈ），５．８１（ｔ，１Ｈ）、４．９４（ｔ，１Ｈ），４．２４（ｓ，２Ｈ），４．０３（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｍ，１Ｈ），３．６４＊（ｄ，３Ｈ），２．８６（ｓ，６Ｈ），１．７７＊（ｄ，３Ｈ），１．２８＊（ｔ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．７（ｄ），１６３．９（ｄ），１５１．３（ｔ），１５０．８（ｔ），１３５．５（ｄ），１３２．９（ｄ），１２９．５（ｄ），１２６．９（ｄ），１１１．０（ｄ），１０８．８（ｄ），１０７．２（ｑ），１０３．７（ｑ），８９．３（ｄ），８４．４（ｑ），６６．７（ｄ），６６．１（ｄ），５２．３（ｄ），４９．９（ｄ），４０．２，２０．７（ｔ），１２．２；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．３２，２．７０；ＨＰＬＣｔＲ：３．３６分。
【００７５】
５'-[２，６-ジメトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６００）：収率：２３％；融点５１−５３℃；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２１０及び２６７ｎｍ；ＩＲ：３４３２，３０７２，２９５０，１６９１，１４８３，１２６１，１１１２，９３１ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．７８（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｍ，３Ｈ），６．４８（ｔ，２Ｈ），６．２９（ｍ，１Ｈ），５．８１（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｍ，３Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ）、３．７４（ｍ，６Ｈ），３．６３＊（ｔ，３Ｈ），１．７４＊（ｄ，３Ｈ），１．２９＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．７（ｄ），１６３．９（ｄ），１５１．７（ｔ），１５０．８（ｔ），１３５．７（ｄ），１３３．１（ｄ），１２８．４（ｄ），１２６．８（ｄ），１２５．０（ｄ），１１０．９（ｄ），１０４．８（ｔ），８９．２（ｄ），８４．６（ｄ），６６．８（ｔ），５５．８（ｄ），５２．２（ｔ），４９．７（ｄ），４９．４（ｄ），２１．０（ｄ），１１．８（ｄ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ４．９７，４．２８；ＨＰＬＣｔＲ：６．５５分。
【００７６】
５'-[４-シアノフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６０１）：収率：２０％；融点６２−６３℃；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２０７，２１３，２３３及び２６７ｎｍ；ＩＲ：３２１４，３０７０，２９５４，２２２９，１６９１，１５０２，１４６７，１２４５，１０３５，９２５ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．９２（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｍ，１Ｈ），６．９６（ｍ，１Ｈ），６．２８（ｍ，１Ｈ），５．８６（ｔ，１Ｈ），４．９９（ｍ，１Ｈ），４．３２（ｍ，３Ｈ），３．９２（ｍ，１Ｈ），３．６５＊（ｍ，３Ｈ），１．７５＊（ｍ，３Ｈ），１．２９＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．５（ｔ），１６３．７（ｄ），１５３．４（ｑ），１５０．７，１３５．３（ｄ），１３３．７（ｄ），１３２．６（ｄ），１２７．２（ｄ），１２１．０（ｑ），１１７．９，１１１．０（ｄ），１０８．６（ｄ），８９．５（ｄ），８４．２（ｄ），６７．３（ｔ），５２．５（ｄ），５０．０（ｄ），２０．６（ｔ），１２．３（ｄ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ４．１５，３．６２；ＨＰＬＣｔＲ：５．０２分。
【００７７】
５'-[３-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６０２）：収率：１５％；融点４７−４８℃；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２０８，２１３及び２６７ｎｍ；ＩＲ：３４３２，３０７０，２９５４，１６８５，１４７３，１２４７，９４１ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．６５（ｓ，１Ｈ），７．３４−７．１１（ｍ，５Ｈ），６．９７（ｍ，１Ｈ），６．２６（ｍ，１Ｈ），５．８７（ｔ，１Ｈ），４．９８（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，３Ｈ），３．９３（ｍ，１Ｈ），３．６７＊（ｍ，３Ｈ），１．７６＊（ｍ，３Ｈ），１．３２＊（ｔ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．５（ｄ），１６３．８（ｄ），１５０．６（ｄ），１３５．４（ｄ），１３２．８（ｄ），１３０．６（ｄ），１２８．０，１２７．３（ｄ），１２３．３（ｑ），１２２．３（ｄ），１１８．８（ｑ），１１１．ｌ（ｄ），８９．５（ｄ），８４．４（ｑ），６７．２（ｄ），５２．６，５０．０（ｄ），２０．７（ｔ），１２．３（ｄ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．３６，２．７４；ＨＰＬＣｔＲ：１０．３，１０．７分。
【００７８】
５'-[４-ブロモ-２-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６０３）：収率：１８％；融点５１−５２℃；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２１５及び２６７ｎｍ；ＩＲ：３４１５，３２２２，３０７２，２９５２，１６９１，１４７５，１２４５，１０８５，１０３５，９２５ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．５２（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｍ，１Ｈ），６．９９（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｍ，１Ｈ），５．９０（ｍ，１Ｈ），５．００（ｍ，１Ｈ），４．３３（ｍ，２Ｈ），４．１９（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），１．７９＊（ｍ，３Ｈ），１．３１＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．５（ｑ），１６３．８（ｄ），１５０．８（ｄ），１４５．５（ｔ），１３５．３（ｄ），１３２．８（ｄ），１３０．９（ｄ），１２７．３（ｄ），１２６．２（ｄ），１２２．７（ｄ），１１７．８（ｄ），１１３．３（ｄ），８９．６（ｄ），８４．３（ｄ），６７．５（ｄ），６７．１（ｄ），５２．６，５０．１，２０．８（ｔ），１２．３（ｄ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．１１，２．５４；ＨＰＬＣｔＲ：１８．６，２０．６分。
【００７９】
５'-[４-フルオロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６０４）：収率：４６％；融点４２−４４℃；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２１０及び２６６ｎｍ；ＩＲ：３４２３，３２４５，３０７２，２９５４，１６９１，１５０４，１２４７，１０８９，１０３７，９３９ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１０．０８（ｂｓ，１Ｈ），７．１６（ｍ，１Ｈ），７．０８（ｍ，２Ｈ），６．９１（ｍ，３Ｈ），６．２０（ｍ，１Ｈ），５．７９（ｔ，１Ｈ），４．９２（ｍ，１Ｈ），４．４２（ｔ，１Ｈ），４．２２（ｍ，２Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．５８＊（ｍ，３Ｈ），１．７０＊（ｍ，３Ｈ），１．２２＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．５（ｑ），１６３．８（ｄ），１６０．７，１５７．５，１５０．７（ｄ），１４５．７（ｑ），１３５．３（ｄ），１３２．７（ｄ），１２６．９（ｄ），１２１．３（ｔ），１１５．８（ｑ），１１０．８（ｄ），８９．２（ｄ），８４．２（ｄ），６６．８（ｔ），５２．２，４９．８（ｄ），２０．４（ｄ），１２．１（ｄ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．８０（ｄ），３．２２（ｄ）；１９Ｆ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ−４２．８（ｔ）；ＨＰＬＣｔＲ：６．３，６．６分。
【００８０】
５'-[２-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６０５）：収率：２０％；融点４５−４６℃；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２０７及び２６７ｎｍ；ＩＲ：３４３２，３０７２，２９５４，１６８５，１４７５，１２４５，１０８９，９３３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．５５（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），６．９９（ｍ，２Ｈ），６．２９（ｍ，１Ｈ），５．８８（ｔ，１Ｈ），５．００（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｔ，２Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ），１．８０＊（ｍ，３Ｈ），１．３０＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．６（ｔ），１６３．８（ｄ），１５０．８（ｄ），１４７．３（ｔ），１３５．４（ｄ），１３３．０（ｔ），１２８．５（ｄ），１２７．２（ｄ），１２６．１（ｄ），１２１．３（ｑ），１１４．４（ｄ），１１１．３（ｄ），８９．６（ｄ），８４．３（ｄ），６７．２（ｑ），５２．５，５０．１（ｄ），２９．６，２０．８（ｔ），１２．４；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ２．９８，２．３７；ＨＰＬＣｔＲ：８．４，９．２分。
【００８１】
５'-[２-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６０６）：収率：４７％；融点４３−４５℃；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２１４，２１５，２１９及び２６７ｎｍ；ＩＲ：３２０９，３０７０，２９５２，１６９１，１４８１，１２４５，１０３５，９３１ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．８０（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｔ，１Ｈ），７．２９（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｔ，１Ｈ），７．０１（ｔ，１Ｈ），６．９２（ｄ，１Ｈ），６．２４（ｍ，１Ｈ），５．８１（ｍ，１Ｈ），４．９４（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｍ，３Ｈ），３．９６（ｍ，１Ｈ），３．５９＊（ｍ，３Ｈ），１．７２＊（ｍ，３Ｈ），１．２５＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．５（ｔ），１６３．８（ｄ），１５０．８（ｄ），１４５．９（ｄ），１３５．３（ｄ），１３２．７（ｄ），１３０．０，１２７．５（ｄ），１２７．０（ｄ），１２４．８（ｑ），１２１．２（ｑ），１１１．０（ｄ），８９．３（ｄ），８４．３（ｄ），６６．９（ｄ），５２．３，４９．８（ｄ），２０．５（ｔ），１２．１（ｄ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．２３，２．６７；  ＨＰＬＣｔＲ：７．６，８．３分。
【００８２】
５'-[フェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６０７）：収率：４６％；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２１１及び２６３ｎｍ；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２２２，２９８５，２９５４，１７４３，１６９３，１５９３，１４９１，１４５６，１２１３，１１５３，１０３９，９３１，７６９ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．３０（ｂｒｓ，１Ｈ），７．３０−７．１０（ｍ，６Ｈ），６．８５−６．８２（ｍ，１Ｈ），６．３６−６．２６（ｍ，１Ｈ），５．９１−５．８５（ｍ，１Ｈ），５．００（ｂｒｍ，１Ｈ），４．１９−３．６８（ｍ，４Ｈ），３．７２，３．７１（ｓ，３Ｈ），１．８３，１．８０（ｄ，３Ｈ），１．３８−１．２５（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．９，１６３．７，１５０．７，１４９．７，１３５．７−１３５．４，１３３．２−１３２．９，１２９．６−１２９．４，１２７．３−１２７．２，１２５．０−１２４．４，１２０．０，１１１．１，８９．６−８９．４，８４．５−８４．４，６６．９−６６．３，５２．５−５２．３，５０．０−４９．６，２０．９及び１２．３；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ２．６６，３．２０；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ算定質量（Ｍ＋Ｎａ）４８８．０，実測値４８７．９；ＨＰＬＣｔＲ：５．５４，５．８５分。
【００８３】
５'-[２,５-ジクロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６０８）：収率：３０％；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２１１，２１６，２２０及び２６８ｎｍ；ＩＲ：３４２３，３２０５，３０７２，２９５４，１６９１，１４７５，１２４５，１０９３，９４６ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．４３（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９９（ｑ，１Ｈ），６．３２（ｍ，１Ｈ），５．８８（ｍ，１Ｈ），４．９９（ｍ，１Ｈ），４．３２（ｍ，３Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），１．７７＊（ｍ，３Ｈ），１．３３＊（ｔ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．５（ｄ），１６３．８（ｄ），１５０．８（ｄ），１４６．４（ｄ），１３６．３，１３２．７（ｔ），１３０．７（ｄ），１２７．４，１２５．８，１２３．７（ｄ），１２１．７（ｑ），１１１．２（ｄ），８９．６（ｄ），８４．３（ｔ），６７．１（ｄ），５２．６，５０．１，２９．６，２０．７（ｔ），１２．３（ｄ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．２４，２．６０；ＨＰＬＣｔＲ：１３．２分。
【００８４】
５'-[４-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（化合物６０９）：収率：４０％；ＵＶ(ＭｅＯＨ)％λｍａｘ：２０２，２０４，２１２，２１９及び２６７ｎｍ；ＩＲ：３４２３，３２１４，３０６８，２９５２，１６９１，１４８８，１２４７，１０８９，９２９ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ９．４８（ｄ，１Ｈ），７．２５（ｄ，３Ｈ），７．１２（ｔ，１Ｈ），７．００（ｍ，１Ｈ），６．３０（ｍ，１Ｈ），５．８９（ｔ，１Ｈ），５．０１（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｍ，３Ｈ），４．０５（ｔ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．６９＊（ｄ，３Ｈ），１．８０＊（ｄ，３Ｈ），１．３２＊（ｄ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１７３．７（ｑ），１６３．７（ｄ），１５０．７，１４８．６（ｑ），１３５．５（ｄ），１３２．９（ｄ），１３０．３（ｄ），１２９．５（ｄ），１２７．３（ｄ），１２１．４（ｑ），１１１．  ２（ｄ），８９．５（ｄ），８４．４（ｄ），６７．２（ｄ），６６．５（ｄ），５２．６，５０．１（ｄ），２０．９（ｔ），１２．４（ｄ）；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．５７，２．８２；ＨＰＬＣｔＲ：７．６，８．３分。
【００８５】
実施例１２
スタブジン誘導体の抗ウイルス活性
ウイルスストック。  この実験に使用したＨＩＶ-１株はＨＴＬＶ-ＩＩＩＢ（Uckun等, 1998 Antimicro. Agents and Chemother., 42: 383-388）であった。本実験に含まれる非ＨＩＶウイルスはガンシクロビル感受性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）株ＡＤ１６９（ＡＴＣＣＶＲ-５３８）；アシクロビル感受性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）Ｉ型株ＨＦ（ＡＴＣＣ ＶＲ−２６０）；アシクロビル感受性ＨＳＶ ＩＩ型株Ｇ（ＡＴＣＣ ＶＲ-７３４）；アデノウイルス株５型、株アデノイド７５（ＡＴＣＣ ＶＲ-５）；エンテロウイルス株，ＥＣＨＯ３０、株Ｂａｓｔｉａｎｎｉ(ＡＴＣＣ ＶＲ-３２２)；及び呼吸器合胞体ウイルス(ＲＳＶ)，株ロング(ＡＴＣＣ ＶＲ-２６)であった。
【００８６】
抗ＨＩＶ-１活性のインビトロアッセイ。  ＨＩＶ-陰性のドナーからの正常なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を、加湿された５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で１時間の吸着期間の間、０．１の感染効率（ＭＯＩ）でＨＩＶ-１に曝す前に、２０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、３％のインターロイキン-２、２ｍＭのＬ-グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及び４μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニンを補填したＲＰＭＩ１６４０中で７２時間培養した。続いて、細胞を、様々な濃度の化合物１１３又は６０９の存在下で９６ウェルマイクロタイタープレート（１００μＬ、２ｘ１０６細胞／ｍＬ）中で培養した。培養物上清の一定分量を、過去に記載されているように、ｐ２４抗原アッセイのために感染７日後にウェルから取り除いた。適用したｐ２４酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）は、Ｃｏｕｌｔｅｒ社／Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社(Westbrooke, ME)から市販されている未修飾動態学アッセイであり、試験培養上清試料中に存在する抗原が結合するマイクロウェルストリップ上にコートされたＨＩＶコアタンパク質に対してマウスｍＡｂを利用する。ウイルス阻害パーセントは未処理の感染細胞（つまりウイルスコントロール）からのｐ２４値と比較することによって計算した。
【００８７】
プラーク形成アッセイ。  プラークアッセイ法を用いて非ＨＩＶウイルスに対する化合物の活性を調べた。皮膚の線維芽細胞株ＳＦ(ＡＴＣＣ ＣＲＬ-２０９７)をＡＤ１６９、アデノウイルス５型の標的として使用した。ＥＣＨＯ３０のＶＥＲＯ細胞株(ＡＴＣＣ ＣＣＬ-８１)をＨＳＶ ＨＦ及びＧの標的として用いた。ＨＥＰ-２細胞株(ＡＴＣＣ ＣＣＬ-２３)をＲＳＶロング株の標的として用いた。これらの細胞株は０．９％のメチルセルロース又は０．４％のSeaPlaqueアガロース半固形支持体を持つ２４ウェル（ＥＣＨＯ３０感染ＳＦ以外全て）又は６ウェル（ＥＣＨＯ３０感染ＳＦ）中で１ｘ１０５細胞／ウェルにて培養した。アール塩（Gibco）、Ｌ-グルタミン、非必須アミノ酸、２％の熱不活化ウシ胎仔血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、及び０．０５％のゲンタマイシンを含む最小必須培地（ＭＥＭ）を培養培地とした。インキュベーション時間はＨＧ、Ｇ、ＥＣＨＯ３０及びロングでは３日；ＡＤ１６９及びアデノウイルス５型では７日とした。プラークの計数は、ＡＤ１６９、５型、ＥＣＨＯ３０及びＲＳＶロングに対しては２０Ｘの解剖顕微鏡を、ＨＦとＧに対してはライトボックスを用いて実施した。固定剤は、メチレンブルーを使用したＣＭＶ株ＡＤ１６９を除き、全てのウイルスに対してクリスタルバイオレットであった。プラーク形成の阻害パーセントは、試験物質で処置した感染細胞からのプラーク数を、未処置の感染細胞（つまりウイルスコントロール）からのプラーク数と比較することによって計算した。ＩＣ５０値はＳｔａｔｖｉｅｗ統計プログラム(SAS Institute, Inc., Cary, NC)を使用して決定した。
【００８８】
統計的解析。  各薬剤を、０．０００１μＭから１００μＭの範囲の６−７の異なった濃度で試験した。各アッセイ法は３通りのウェルで設定し、１−３回繰り返した。線形化した等式の指数形態の非線形回帰モデリング（Statview, SAS Institute,Inc., Cary, NC）を使用して３通りのウェルの各セットからＩＣ５０値を計算した。加水分解速度はアルカリ条件下での化合物の消失に単一指数減衰方程式を適合させることによって決定した（全てのＲ２値は０．８５より大）。得られたＩＣ５０値を、線形モデルに適合させることにより(JMP Software, SAS Institute Inc., Cary, NC)、ｌｏｇ変換加水分解速度定数と相関させた。０．０５未満のＰ値は有意であると判断された。
【００８９】
ＡＤＶに対して強力で選択的な抗ウイルス活性を持つ二重機能性抗ＨＩＶ剤としての化合物１１３及び化合物６０９の同定。  ヒトアデノウイルス（ＡＤＶ株５型）に対するスタブジンと１３のアリールホスホラミダイト誘導体の抗ウイルス活性を最初に調べた。スタブジンは１２．３±０．３μＭのＩＣ５０値でＡＤＶの細胞変性作用を阻害した。１３のスタブジン誘導体は全てスタブジンよりも実質的に強力で、ナノモルのＩＣ５０値でＡＤＶ誘導プラーク形成を阻害した（表８）。
フェニル環にハロ置換を有する化合物並びに未置換化合物６０７はメトキシ、メチル、又はシアノ置換の化合物よりも強力であった。４-Ｂｒ置換の化合物１１３（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]）及び４-Ｃｌ置換の化合物６０９は最も強力なリード抗ＡＤＶ剤として特定された。化合物１１３は濃度依存的な形で皮膚の線維芽細胞におけるＡＤＶ誘導プラーク形成を阻害し、１００μＭでさえ細胞毒性の如何なる徴候も伴わないで０．０２２±０．００９μＭの平均（±ＳＥＭ）ＩＣ５０値を示した（表８）。同様に、化合物６０９はＡＤＶ誘導プラーク形成を阻害し、０．００２７±０．００３μＭのＩＣ５０値を示した（表８）。
スタブジンのアリールホスフェート誘導体の抗ＡＤＶ能は各化合物の親油性、溶解度、又はアルカリ加水分解速度からは予測できなかった。スタブジンのアリールホスフェート誘導体の親油性（Ｐ＝０．０８）、溶解度（Ｐ＝０．１６）、又はアルカリ加水分解速度（Ｐ＝０．４２）の何れからもＡＤＶに対するその生物活性を予測できなかった。類似又は同一の分配係数、溶解度、又は加水分解速度を持つ化合物は広範囲のＩＣ５０値を示した（表８）。
【００９０】
リード化合物１１３及び６０９はＡＤＶ及びＨＩＶを阻害したが、幾種かの他のウイルスを阻害しなかった。双方の化合物とも強力な抗ＨＩＶ活性を示したが、何れの化合物もＩ型又はＩＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ-１、ＨＳＶ-２）、エンテロウイルスＥＣＨＯ３０又は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対しては如何なる抗ウイルス活性も示さなかった（ＩＣ５０＞１００μＭ）（表９）。
リバビリン又はＨＰＭＣのような抗ＡＤＶ活性を持つ他のヌクレオシド類似体とは異なり、化合物１１３と化合物６０９はアデノウイルスに対してのみ選択的に活性であったが、これはこれらのヌクレオシド類似体に対するアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼの高い感受性を示唆している。選択的な抗ウイルス活性はヌクレオシド抗ウイルス薬では前例がないものではない。例えば、多くの新規な５-置換２'デオキシピリミジンヌクレオシドは単純ヘルペスウイルス１型及び２型株Ｖ３に対して抗ウイルス活性を示したが、アデノウイルスに対しては示さなかった(Reefschlager等, 1982 Antiviral Res.,2:41-52)。しかし、化合物１１３と化合物６０９は選択的抗ＡＤＶ活性を持つ二重の機能を備えた抗ＨＩＶ剤として特定された最初のヌクレオシド類似体である。
【００９１】
2005534666.tif 000017
【００９２】
2005534666.tif 000018
プラークアッセイ法を用いて非ＨＩＶウイルスに対する化合物１１３及び化合物６０９の活性を調べた。皮膚の線維芽細胞株ＳＦ(ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０９７)をＡＤ１６９、アデノウイルス５型及びＥＣＨＯ３０の標的として使用した；ＶＥＲＯ細胞株(ＡＴＣＣ ＣＣＬ-８１)をＨＦ及びＧの標的として使用した；ＨＥＰ-２細胞株(ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２３)をＲＳＶロング株の標的として用いた。結果はμＭで平均ＩＣ５０として表す。スタブジン（ＳＴＶ）をコントロールとして含めた。
【００９３】
本発明の詳細な説明を上に記載したが、本発明はそれに限定されるものではない。ここに記載した発明は、当業者には明らかなように、他の実施態様を含むように変更することができる。そのような他の実施態様も全て添付の特許請求の範囲に記載した発明の要旨と範囲内のものであること考えられなければならない。
本明細書は多くの文献及び特許文献を引用するが、そのそれぞれが、あらゆる目的のために完全に記載されているかの如く、出典明示によりここに取り込まれるものである。
【国際調査報告】
2005534666.tif 000021