(57)【要約】Fasを無能にする環外ペプチド模倣体を開発した。Fas受容体-リガンド複合体の三次元モデルを構築し、受容体のリガンドとの結合に関連する構造上予測された領域を用いて固定化ペプチド模倣体を作成した。Fas受容体-リガンド相互作用をブロックし、in vitroとin vivoの両方でFasの生物活性を調節する環外抗Fasペプチド模倣体を同定した。この模倣体は、例えばFas関連症状の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
FasLと相互作用するFas表面ドメインのアミノ酸配列を有する環外ペプチドを含むFas模倣体。
【請求項２】
前記表面ドメインが表面ループドメインである、請求項1に記載の模倣体。
【請求項３】
前記表面ドメインが、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、および配列番号20からなる群から選択される、請求項1に記載の模倣体。
【請求項４】
式(I)で表されるFas模倣体
【化１】
2005534641.tif 000005
(式中、B1およびB9は、それぞれ独立に少なくとも1つが疎水性アミノ酸である1〜6個のアミノ酸からなるペプチドであり、前記アミノ酸のうち、芳香族部分または複素環式芳香族部分であり、
Z2は、B1、X3、およびZ8と共有結合を形成することが可能な部分であり、
Z8は、B9、X7、およびZ2と共有結合を形成することが可能な部分であり、
X3は、親水性アミノ酸または結合であり、
X4は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
X5は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
X6は、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、またはグルタミンからなる群から選択され、
X7は、芳香族または複素環式芳香族部分であり、
「--」はアミド、置換アミド、またはそれらのアミドのアイソスターを含む共有結合であり、
「==」は共有結合である)
またはその薬剤として許容される塩、代謝産物、もしくはプロドラッグ。
【請求項５】
Z2およびZ8がシステイン残基である、請求項4に記載の模倣体。
【請求項６】
X3が結合である、請求項4または5に記載の模倣体。
【請求項７】
X4がアスパラギン酸であり、X5がグルタミン酸である、請求項4から6のいずれかに記載の模倣体。
【請求項８】
X7がフェニルアラニンである、請求項4から7のいずれかに記載の模倣体。
【請求項９】
B1が-R1-R2であり、R1がZ1と結合した芳香族アミノ酸であり、R2が1〜5個のアミノ酸からなるペプチドである、請求項4から8のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１０】
B9が-R3-R4であり、R3がZ8と結合した芳香族アミノ酸であり、R4が1〜5個のアミノ酸からなるペプチドである、請求項4から9のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１１】
B9が-R3-R4であり、R3がZ8と結合した芳香族アミノ酸であり、R4が1〜5個のアミノ酸からなるペプチドである、請求項4から10のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１２】
B1またはB9が芳香族アミノ酸である、請求項4から11のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１３】
B1とB9のそれぞれが芳香族アミノ酸である、請求項4から12のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１４】
B1またはB9がチロシンである、請求項4から13のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１５】
B1とB9のそれぞれがチロシンである、請求項4から14のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１６】
FasLに関するKDが10-4M以下である、請求項4から15のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１７】
FasLに関するKDが10-5M以下である、請求項4から15のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１８】
FasLに関するkoffが10-3 s-1以下である、請求項4から17のいずれかに記載の模倣体。
【請求項１９】
FasLに関するkoffが10-4 s-1以下である、請求項4から17のいずれかに記載の模倣体。
【請求項２０】
YCDEGHLCY(配列番号1);
YCDEGLCY(配列番号2);
YCDEGYFCY(配列番号3);
YCDEGEYCY(配列番号4);
YCDEHFCY(配列番号5);
YCDEHGLCY(配列番号6);
YCDEHGQCY(配列番号7);
YCDEKFCY(配列番号8);および
YCDEQFCY(配列番号9)
からなる群から選択される配列を含む、請求項4から19のいずれかに記載の模倣体。
【請求項２１】
YCDEHFCY(配列番号5);
YCDEKFCY(配列番号8);および
YCDEQFCY(配列番号9)
からなる群から選択される配列を含む、請求項4から19のいずれかに記載の模倣体。
【請求項２２】
YCDEGHLCY(配列番号1);
YCDEGLCY(配列番号2);
YCDEGYFCY(配列番号3);
YCDEGEYCY(配列番号4);
YCDEHFCY(配列番号5);
YCDEHGLCY(配列番号6);
YCDEHGQCY(配列番号7);
YCDEKFCY(配列番号8);および
YCDEQFCY(配列番号9)
からなる群から選択される配列からなる、請求項4に記載の模倣体。
【請求項２３】
YCDEHFCY(配列番号5);
YCDEKFCY(配列番号8);および
YCDEQFCY(配列番号9)
からなる群から選択される配列からなる、請求項22に記載の模倣体。
【請求項２４】
配列YCDEHFCY(配列番号5)からなる、請求項23に記載の模倣体。
【請求項２５】
YCNSTVCY(配列番号10)、YCDKAEHFCY(配列番号11)、YCNTRTQNTCY(配列番号12)、YCQEKEYCY(配列番号13)、およびYCQERKEYCY(配列番号14)からなる群から選択される配列を含むFas模倣体。
【請求項２６】
請求項1から25のいずれかに記載の模倣体および薬剤用賦形剤を含む薬剤組成物。
【請求項２７】
前記賦形剤が希釈剤、緩衝剤、担体、安定化剤、および防腐剤からなる群から選択されるメンバーである、請求項26に記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
FAS関連症状に罹患した哺乳動物に、治療有効量の請求項1から25のいずれかに記載の模倣体あるいは請求項26または27に記載の薬剤組成物を投与することを含む、FAS関連症状の治療方法。
【請求項２９】
前記FAS関連症状が自己免疫性症状である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記FAS関連症状がリウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、肝炎、眼球障害、腎損傷、炎症、老化、移植片拒絶、およびHIV感染からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
前記FAS関連症状が肝炎および眼球障害からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記FAS関連症状が黄斑変性症である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項28から32のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記模倣体を薬剤として許容される組成物として投与する、請求項28から33のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記模倣体を経口、非経口、鼻腔内、舌下、直腸、または呼吸器の経路を介して、あるいは吸入剤、経皮パッチ、または凍結乾燥組成物により投与する、請求項28から34のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記模倣体を約0.01〜約25mg/kg/日の量で投与する、請求項28から35のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記模倣体を約0.1〜約10mg/kg/日の量で投与する、請求項28から36のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記模倣体を約0.2〜約5mg/kg/日の量で投与する、請求項28から37のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記模倣体を1日当たり合計約25〜約1,000mgの用量で投与する、請求項28から38のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記模倣体を1日当たり合計約150〜約500mgの用量で投与する、請求項28から39のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記模倣体を1日当たり合計約350mgの用量で投与する、請求項28から39のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
FasまたはFas Lを有効量の請求項1から25のいずれかに記載の模倣体に曝露して相互作用を阻害することを含む、Fas受容体-Fasリガンド相互作用の阻害方法。
【請求項４３】
FAS受容体が細胞の表面上に存在する、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
前記曝露をin vitroで行う、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
前記曝露をin vivoで行う、請求項42に記載の方法。
【請求項４６】
前記模倣体を、細胞表面上にFAS受容体を有する細胞を含む哺乳動物に投与することを含む、請求項42から45のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項46に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面受容体によるシグナル伝達を乱すまたは阻害することによって作用する治療剤に関する。より詳細には、本発明は、Fas受容体によるシグナル伝達を阻害するペプチド模倣体、およびFas関連症状を治療するためにこのようなペプチド模倣体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許法第119条(e)項の下、いずれもその全体を本明細書中に組み込まれている2002年5月23日出願の米国仮特許出願第60/383,309号および2003年4月28日出願の第60/465,943号の優先権が主張されている。
【０００３】
本発明に至った研究は、国立がん研究所から授与された助成金第PO1 CA89480号および第RO1 89481号に少なくとも部分的に支援された。これらの助成金の条件に基づいて米国政府が本発明に一定の権利を有し得る。
【０００４】
Fas(CD95/APO-1)およびその特異的なリガンド(FasL/CD95L)は、それぞれ腫瘍壊死因子(TNF)受容体およびTNFタンパク質ファミリーのメンバーである。(Nagata,S.他、Science、267、1449〜1456、(1995)。FasとFasLとの間の相互作用は細胞下の現象のカスケードを引き起こし、Fasを発現する標的において定義可能な細胞死プロセスが生じる。Fasとは、脾臓、リンパ節、肝臓、肺、腎臓および卵巣を含めた様々な組織内で構成的に発現される45kDaのI型膜タンパク質である。(Leithauser,F.他、Lab Invest、69、415〜429、(1993);Watanabe-Fukunaga,R.他、J Immunol、148、1274〜1279、(1992))。FasLとは40kDaのII型膜タンパク質であり、その発現はリンパ系器官および場合によっては特定の免疫特権組織に主に限定されている。(Suda,T.他、Cell、75、1169〜1178、(1993);Suda,T.他、J Immunol、154、3806〜3813、(1995))。ヒトでは、FasLはメタロプロテイナーゼに媒介されるタンパク質分解性の脱粒によって放出される膜に結合した形態または17kDaの可溶性の形態のいずれかとしてFas発現細胞の細胞溶解を誘発することができる。(Kayagaki,N.他、J Exp Med、182、1777〜1783、(1995);Mariani,S.M.他、Eur J Immunol、25、2303〜2307、(1995))。
【０００５】
FasL/Fas系は、免疫応答および炎症、感染に対する応答、新形成、およびいつくかの器官における実質細胞の死滅を制御していると示唆されている。(Nagata他、上記;Biancone,L.他、J Exp Med、186、147〜152、(1997);Krammer,P.H.、Adv Immunol、71、163〜210、(1999);Seino,K.他、J Immunol、161、4484〜4488、(1998))。FasL/Fas系の欠陥によりリンパ球アポトーシスが制限され、リンパ球増殖および自己免疫がもたらされる可能性がある。リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、ウイルス性肝炎、腎損傷、炎症、老化、移植片拒絶、HIV感染および多数の他の疾病の病因におけるFasL-Fasの役割が提案されている。(Famularo,G.他、Med Hypotheses、53、50〜62、(1999))。Fasに媒介されるアポトーシスは、Fas-FasL受容体系の結合によって誘発されることが示されている肝臓損傷などの組織特異的の臓器損傷の重要な構成要素である。(Kakinuma,C.他、Toxicol Pathol、27、412〜420、(1999);Famularo他、上記;Martinez,O.M.他、Int Rev Immunol、18、527〜546、(1999);Kataoka,Y.他、Immunology、103、310〜318、(2001);Chung,C.S.他、Surgery、130、339〜345、(2001);Doughty,L.他、Pediatr Res、52、922〜927、(2002))。したがって、FasL-Fas経路は治療行為の重要な一般的な標的を表す。
【０００６】
モノクローナル抗FasL抗体および組換え可溶性Fasタンパク質は、臨床研究におけるよく認識されている潜在的な拮抗剤の候補である。(Hashimoto,H.他、Arthritis and Rheumatism、41、657〜662、(1998);Kanda,Y.他、Bone Marrow Transplantation、22、751〜754、(1998);Kato,K.他、British Journal of Haematology、103、1164〜1166、(1998);Maggi,C.A.、Pharmacological Research、38、1〜34、(1998))。FasLを抗体で中和する試みが、様々な動物モデルで調査されている。(Okuda,Y.他、Biochem Biophys Res Commun、275、164〜168、(2000))。抗体は半減期が長く特性が高いが、これらは、(i)商業規模の製造は困難であるか費用がかかり得ること、(ii)体液の環境次第でコンフォメーションの安定性が変動し得ること、(iii)血液/脳関門を越えられないことが原因で抗体が特定の区画、例えば脳から遮断され得ること、および(iv)これらは中和抗体の発生をもたらし得ること、などの重要な制限も有する。(Cho,M.J.他、Trends Biotechnol、14、153〜158、(1996))。
【０００７】
大きな巨大分子の多くの不利点は、表面受容体またはそのリガンドを標的とする小分子の阻害剤を作製することによって克服することができる。標的タンパク質の二次構造特徴を表すよう構築されたペプチド模倣体は、巨大分子の制限を一部克服するための手法を表しており、抗体(Park,B.W.他、Nat Biotechnol、18、194〜198、(2000))および可溶性受容体などの大分子の阻害性特徴を模倣することができる。(Takasaki,W.他、Nat Biotechnol、15、1266〜1270、(1997))。最近では、リガンド-受容体結合を阻害し、強力な生物学的効果を媒介するいくつかのペプチド模倣体について記載されている。(Park他、上記;Takasaki他、上記)。このようなペプチドは、天然の拮抗剤に匹敵するまたはそれと同等の効力で作用できる新規の小分子ツールを表す。(Takasaki他、上記;Wrighton,N.C.他、Nat Biotechnol、15、1261〜1265、(1997))。
【０００８】
いくつかの研究により、眼内にFasLが存在することが、炎症細胞(Griffith,T.S.他、Science、270、1189〜92、(1995);Gao,Y.他、J Exp Med.、188、887〜96、(1998))および新しい血管の発生(Kaplan,H.J.他、Nat Med.、5、292〜97、(1999))のいずれにおいても障害になっていることが示唆されている。炎症の制御は、眼の免疫特権の構成要素であることが知られている(Griffith他、1995、上記;Griffith,T.S.他、Immunity、5、7〜16、(1996);Greil,R.,A.他、Leukemia & Lymphoma、31、477、(1998);Oconnell,J.他、Molecular Medicine、3、294〜300、(1997))。眼組織におけるFasLの発現は、ウイルス感染や角膜移植に応答して眼に浸潤するFas+リンパ球のアポトーシスを誘発させる(Griffith,T.S.他、1995、上記;Stuart,P.M.他、J Clin Invest、99、396〜402、(1997);Chen,J.J.他、Science、282、1714〜1717、(1998);Mohan,R.R.他、Experimental Eye Research、65、575〜589、(1997))。網膜におけるFasLの発現は、Fas抗原を発現することが知られている血管内皮細胞でアポトーシスを誘発させることによって、網膜の下の血管の成長を阻害する(Kaplan他、上記)。この領域におけるFasL発現の損失は老化関連の黄斑変性症の素因であり得、これによりブラーフ膜を透過した後に網膜の下に血管が局在する。このプロセスは網膜剥離および失明をもたらし得る。
【０００９】
FasLは角膜でも発現される。機能的FasL(gld)を発現しなかった角膜は、正常な角膜よりも有意に高い新血管新生を示した。さらに、in vitroで成長している血管にFasが結合することにより血管伸張が予防される。これらの結果は、成長している血管にFasを結合させてFas+血管内皮細胞のアポトーシスを誘発させることによって、FasLが新血管新生を調節することを示唆している。Fas/FasLの相互作用も、ネズミ腎癌を治療する場合にIL-12およびIL-2の抗血管形成効果に必要である(Wigginton,J.M.他、J Clin Invest.、108、51〜62、(2001))。
【００１０】
角膜の新血管新生はいくつかの抗血管形成因子とFasとの間の複雑な相互作用が原因であり得る。これは、gldおよびlprマウスは自然発生の新血管新生が低い傾向にあるが、眼の正常な発生に影響がないことから明らかである。これは、FasLが他の阻害剤と協力して炎症の拡大を制御するのに働く、眼の免疫特権で見られた観察と類似している(Stuart,P.M.他、Invest Ophthalmol Vis Sci.、44、93〜98、(2003))。FasLの役割は、炎症を誘発した薬剤(Griffith他、1995、上記;Kaplan他、上記)もしくはFGF、HGFなどの成長因子(Stuart他、上記)で誘発または刺激された場合に重要であると考えられる。
【００１１】
最近、眼区画の無血管性の原因である阻害剤が角膜内で色素上皮由来因子(PEDF)として同定された(Dawson,D.W.他、Science、285、245〜48、(1999))。このタンパク質は神経栄養性の活性を有していることが示されているが(Tombran-Tink,J.他、J Neurosci、15、4992〜5003、(1995);Taniwaki,T.他、J Neurochem、68、26〜32、(1997))、現在では強力な抗血管形成分子として知られている(Gettins,P.G.他、Biol Chem、383、1677〜82、(2002);Simonovic,M.他、Proc Natl Acad Sci USA、98、11131〜35、(2001))。これは眼区画の構成的な構成要素であると考えられ、その活性を中和することにより新しい血管が角膜中央へと成長することが可能になる(Dawson他、上記)。内皮細胞におけるアポトーシスはPEDFの活性に関連づけられている(Stellmach,V.他、Proc Natl Acad Sci USA、98、2593〜2597、(2001);Volpert,O.V.他、Nat Med、8、349〜357、(2002))。自然発生の新血管新生を阻害するためおよび血管形成の誘発を制限するために、PEDF阻害機能が角膜におけるFasの上方調節(Volpert,O.V.他、上記)によって調整されていることが示されている。
【特許文献１】米国仮特許出願第60/383,309号
【特許文献２】米国仮特許出願第60/465,943号
【非特許文献１】Nagata,S.他、Science、267、1449〜1456、(1995)
【非特許文献２】Leithauser,F.他、Lab Invest、69、415〜429、(1993)
【非特許文献３】Watanabe-Fukunaga,R.他、J Immunol、148、1274〜1279、(1992)
【非特許文献４】Suda,T.他、Cell、75、1169〜1178、(1993)
【非特許文献５】Suda,T.他、J Immunol、154、3806〜3813、(1995)
【非特許文献６】Kayagaki,N.他、J Exp Med、182、1777〜1783、(1995)
【非特許文献７】Mariani,S.M.他、Eur J Immunol、25、2303〜2307、(1995)
【非特許文献８】Biancone,L.他、J Exp Med、186、147〜152、(1997)
【非特許文献９】Krammer,P.H.、Adv Immunol、71、163〜210、(1999)
【非特許文献１０】Seino,K.他、J Immunol、161、4484〜4488、(1998)
【非特許文献１１】Famularo,G.他、Med Hypotheses、53、50〜62、(1999)
【非特許文献１２】Kakinuma,C.他、Toxicol Pathol、27、412〜420、(1999)
【非特許文献１３】Martinez,O.M.他、Int Rev Immunol、18、527〜546、(1999)
【非特許文献１４】Kataoka,Y.他、Immunology、103、310〜318、(2001)
【非特許文献１５】Chung,C.S.他、Surgery、130、339〜345、(2001)
【非特許文献１６】Doughty,L.他、Pediatr Res、52、922〜927、(2002)
【非特許文献１７】Hashimoto,H.他、Arthritis and Rheumatism、41、657〜662、(1998)
【非特許文献１８】Kanda,Y.他、Bone Marrow Transplantation、22、751〜754、(1998)
【非特許文献１９】Kato,K.他、British Journal of Haematology、103、1164〜1166、(1998)
【非特許文献２０】Maggi,C.A.、Pharmacological Research、38、1〜34、(1998)
【非特許文献２１】Okuda,Y.他、Biochem Biophys Res Commun、275、164〜168、(2000)
【非特許文献２２】Cho,M.J.他、Trends Biotechnol、14、153〜158、(1996)
【非特許文献２３】Park,B.W.他、Nat Biotechnol、18、194〜198、(2000)
【非特許文献２４】Takasaki,W.他、Nat Biotechnol、15、1266〜1270、(1997)
【非特許文献２５】Wrighton,N.C.他、Nat Biotechnol、15、1261〜1265、(1997)
【非特許文献２６】Griffith,T.S.他、Science、270、1189〜92、(1995)
【非特許文献２７】Gao,Y.他、J Exp Med.、188、887〜96、(1998)
【非特許文献２８】Kaplan,H.J.他、Nat Med.、5、292〜97、(1999)
【非特許文献２９】Griffith,T.S.他、Immunity、5、7〜16、(1996)
【非特許文献３０】Greil,R.,A.他、Leukemia & Lymphoma、31、477、(1998)
【非特許文献３１】Oconnell,J.他、Molecular Medicine、3、294〜300、(1997)
【非特許文献３２】Stuart,P.M.他、J Clin Invest、99、396〜402、(1997)
【非特許文献３３】Chen,J.J.他、Science、282、1714〜1717、(1998)
【非特許文献３４】Mohan,R.R.他、Experimental Eye Research、65、575〜589、(1997)
【非特許文献３５】Wigginton,J.M.他、J Clin Invest.、108、51〜62、(2001)
【非特許文献３６】Stuart,P.M.他、Invest Ophthalmol Vis Sci.、44、93〜98、(2003)
【非特許文献３７】Dawson,D.W.他、Science、285、245〜48、(1999)
【非特許文献３８】Tombran-Tink,J.他、J Neurosci、15、4992〜5003、(1995)
【非特許文献３９】Taniwaki,T.他、J Neurochem、68、26〜32、(1997)
【非特許文献４０】Gettins,P.G.他、Biol Chem、383、1677〜82、(2002)
【非特許文献４１】Simonovic,M.他、Proc Natl Acad Sci USA、98、11131〜35、(2001)
【非特許文献４２】Stellmach,V.他、Proc Natl Acad Sci USA、98、2593〜2597、(2001)
【非特許文献４３】Volpert,O.V.他、Nat Med、8、349〜357、(2002)
【非特許文献４４】Mathews & van Holde、「Biochemistry」、第2版(Benjamin/Cumings Publishing Company,Inc.、ニューヨーク)、131頁
【特許文献３】米国特許第6,265,535号
【非特許文献４５】Benkirane,N.他、J.Biol.Chem.、271:33218〜33224、(1996)
【特許文献４】米国特許第5,637,677号
【非特許文献４６】Jones他、J.Mol.Biol.、272:121〜132、(1997)
【非特許文献４７】Samanta,U.他、Prot.Eng.、15:659〜667、(2002)
【非特許文献４８】「The Pharmacological Basis of Therapeutics、第9版」、McGraw-Hill、(1996)、11〜17頁
【非特許文献４９】Hansen他、J.Immunol.Methods、199、203〜210、(1989)
【非特許文献５０】Tiegs,G.他、J Clin Invest、90、196〜203、(1992)
【非特許文献５１】Mizuhara,H.他、J Exp Med、179、1529〜1537、(1994)
【非特許文献５２】Seino,K.他、Gastroenterology、113、1315〜1322、(1997)
【非特許文献５３】Tagawa,Y.他、Eur J Immunol、28、4105〜4113、(1998)
【非特許文献５４】Tagawa,Y.他、J Immunol、159、1418〜1428、(1997)
【非特許文献５５】Watanabe,Y.他、Hepatology、24、702〜710、(1996)
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
眼におけるFas Lの発現パターンおよび眼組織においてFasLの発現を改変した場合に得られた結果により、Fasの機能を強化することが様々な眼関連症状に有用であり得ることが示唆される。眼におけるFasの機能を変更することは、例えば角膜の新血管形成を阻害するために有用な戦略であり得る。
【００１３】
本発明者らは、Fas-FasL相互作用の構造解析を行った。本発明者らはコンピューター支援モデリングによって開発したFasLとFasとの相互作用モデルを構築し、Fasの推定二次構造特徴に基づいてペプチド模倣体を設計した。Fas-FasLの認識特徴を原子レベルで理解することにより、本発明者らは、Fasのシグナル伝達機能を変調し、したがってFas症状の治療に使用できる模倣体を設計した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明者らは、Fasの機能を変更し、したがってFasに媒介される病状に対して治療的用途を有するペプチド模倣体を同定かつ開発した。この模倣体はβ-FGFに誘発される角膜の新血管新生をin vivoで阻害するのに有効であり、これによりFasLの相互作用が新しい血管の角膜への伸張の調節に顕著な役割を果たすことが実証され、また、Fasが眼関連症状の治療標的であることが示された。模倣体のin vivoにおける生物学的活性も、Fas依存性のCon Aに誘発された肝炎損傷のネズミモデルで確認された。したがって、模倣体は劇症肝炎の治療法としても有用である。
【００１５】
このセクションおよび本明細書全体における参考文献の引用および/または記述は、このような参考文献が本発明の従来技術であることを是認していると解釈されるべきでない。
【００１６】
ある実施形態では、本発明は、FasLと相互作用するFas表面ドメインのアミノ酸配列を有する環外ペプチドを提供する。
【００１７】
ある実施形態では、本発明は、式(I)で表されるFas模倣体、またはその薬剤として許容される塩、代謝産物、もしくはプロドラッグを提供する。
【化１】
2005534641.tif 000002
式中、B1およびB9はそれぞれ独立に1〜6個のアミノ酸からなるペプチドであり、前記アミノ酸のうち少なくとも1つは疎水性アミノ酸、芳香族部分、または複素環式芳香族部分であり、
Z2は、B1、X3、およびZ8と共有結合を形成することが可能な部分であり、
Z8は、B9、X7、およびZ2と共有結合を形成することが可能な部分であり、
X3は、疎水性アミノ酸または結合であり、
X4は、アスパラギン酸またはグルタミン酸から選択されるアミノ酸であり、
X5は、アスパラギン酸またはグルタミン酸から選択されるアミノ酸であり、
X6は、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、またはグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
X7は、芳香族部分または複素環式芳香族部分であり、
「--」はアミド、置換アミド、またはそのアミドのアイソスターを含む共有結合であり、
「==」は共有結合である。
【００１８】
好ましくは、式(I)の模倣体は、YCDEGHLCY(配列番号1)、YCDEGLCY(配列番号2)、YCDEGYFCY(配列番号3)、YCDEGEYCY(配列番号4)、YCDEHFCY(配列番号5)、YCDEHGLCY(配列番号6)、YCDEHGQCY(配列番号7)、YCDEKFCY(配列番号8)、およびYCDEQFCY(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ配列を含むペプチドであり、前記ペプチドのシステイン残基が共有結合により結合して環状ペプチドを形成することが好ましい。より好ましくは、式(I)の模倣体は、YCDEHFCY(配列番号5)、YCDEKFCY(配列番号8)、およびYCDEQFCY(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ配列を含むペプチドであり、前記ペプチドのシステイン残基が共有結合により結合して環状ペプチドを形成することが好ましい。
【００１９】
他の実施形態では、本発明は、YCNSTVCY(配列番号10)、YCDKAEHFCY(配列番号11)、YCNTRTQNTCY(配列番号12)、YCQEKEYCY(配列番号13)、およびYCQERKEYCY(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む模倣体を提供する。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、FAS関連症状に罹患した哺乳動物(例えばヒト)に、治療有効量の前記模倣体を投与することを含む、FAS関連症状の予防または治療方法を対象とする。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は、FAS関連症状の予防または治療用の薬物の調製における前記模倣体の使用を提供し、前記薬物は前記FAS関連症状に罹患した哺乳動物(例えばヒト)に、治療有効量の前記模倣体を投与するのに用いられる。
【００２２】
本発明はまた、前記模倣体を含む薬剤組成物を提供する。
【００２３】
他の実施形態では、本発明は、FasまたはFasLを有効量の前記模倣体に曝露して相互作用を阻害することを含む、Fas受容体-Fasリガンド相互作用の阻害方法を対象とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、Fas受容体(Fas)-Fasリガンド(FasL)シグナル伝達系の拮抗剤である模倣体およびこのような模倣体を使用する方法に関する。本発明は、FasLの結合に機能するFas上の部位がTNF受容体と比較することによって同定できること、またFas上で同定された部位のペプチド模倣体が、FasLがFasに結合することを阻害するよう作用してFasの機能を阻害する、すなわち、模倣体はFasLの結合ならびにFasシグナル伝達および機能の拮抗剤であることに、部分的に基づいている。したがって、模倣体はFas関連症状の治療に有用である。
【００２５】
したがって、本発明は、FasLと相互作用するFasの表面ドメインのアミノ酸配列を含む、またはFasLと相互作用するFasの表面ドメインのアミノ酸配列由来である環外ペプチド模倣体を提供する。
【００２６】
本発明は、式(I)で表されるFas模倣体
【００２７】
【化２】
2005534641.tif 000003
【００２８】
(式中、
B1およびB9は、それぞれ独立に少なくとも1つが疎水性アミノ酸である1〜6個のアミノ酸からなるペプチド、芳香族部分または複素環式芳香族部分であり、
Z2は、B1、X3およびZ8と共有結合を形成することが可能な部分であり、
Z8は、B9、X7およびZ2と共有結合を形成することが可能な部分であり、
X3は、親水性アミノ酸または結合であり、
X4は、アスパラギン酸またはグルタミン酸から選択されるアミノ酸であり、
X5は、アスパラギン酸またはグルタミン酸から選択されるアミノ酸であり、
X6は、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギンまたはグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
X7は、芳香族部分または複素環式芳香族部分であり、
「--」は、アミド、置換アミドまたはそれらのアミドのアイソスターを含む結合であり、
「==」は、共有結合である)
または薬剤として許容される塩、代謝産物もしくはそのプロドラッグを提供する。
【００２９】
B1およびB9は、それぞれ独立に、例えば環外アミノ酸残基からなる、式(I)の模倣体の環外部分である。Z2、X3、X4、X5、X6、X7およびZ8は式(I)の模倣体の環状部分を含む。Z2およびZ8はさらなる結合部分、好ましくは結合アミノ酸である。
【００３０】
好ましくは、本発明のFas模倣体はコンフォメーションが拘束されたペプチドである。最も好ましくは、このようなコンフォメーションが拘束されたペプチドは、環状部分、1つまたは複数の環外領域、1つまたは複数の結合部分および活性領域を含む環状ペプチドである。
【００３１】
式Iの独立した好ましい部分は以下の通りである:Z2はシステインであり、Z8はシステインであり、X3は結合であり、X4はアスパラギン酸であり、X5はグルタミン酸であり、X7はフェニルアラニンであり、X7は芳香族アミノ酸である。
【００３２】
以下もそれぞれ独立に好ましい:B1はチロシンであり、B9はチロシンであり、B1およびB9はどちらもチロシンであり、B1は-R1-R2であり(式中、R1はZ2に結合した芳香族アミノ酸であり、R2は1〜5個のアミノ酸からなるペプチドである)、B9は-R3-R4であり(式中、R3はZ8に結合した芳香族の酸であり、R4は1〜5個のアミノ酸からなるペプチドである)。
【００３３】
同様に、YCDEGHLCY(配列番号1)、YCDEGLCY(配列番号2)、YCDEGYFCY(配列番号3)、YCDEGEYCY(配列番号4)、YCDEHFCY(配列番号5)、YCDEHGLCY(配列番号6)、YCDEHGQCY(配列番号7)、YCDEKFCY(配列番号8)およびYCDEQFCY(配列番号9)(式中、前記アミノ酸配列のシステイン残基は共有結合によって結合されて環状ペプチドを形成する)からなる群から選択されるアミノ配列を含む式(I)の模倣体が好ましい。より好ましくは、式(I)の模倣体は、YCDEHFCY(配列番号5)、YCDEKFCY(配列番号8)およびYCDEQFCY(配列番号9)(式中、前記アミノ酸配列のシステイン残基は共有結合によって結合されて環状ペプチドを形成する)からなる群から選択されるアミノ配列を含む。
【００３４】
同様に、YCNSTVCY(配列番号10)、YCDKAEHFCY(配列番号11)、YCNTRTQNTCY(配列番号12)、YCQEKEYCY(配列番号13)、およびYCQERKEYCY(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む模倣体が、本発明で使用するために提供される。
【００３５】
本発明中で提供するさらに好ましい模倣体は、長さが約5〜約100個の範囲のアミノ酸である。本発明中で提供するさらに好ましい模倣体は、長さが約5〜約50個の範囲のアミノ酸、または長さが約10〜約50個の範囲のアミノ酸である。本発明中で提供するさらに好ましい模倣体は、長さが約5〜約40個の範囲のアミノ酸、または長さが約10〜約40個の範囲のアミノ酸である。本発明中で提供するさらに好ましい模倣体は、長さが約5〜約30個の範囲のアミノ酸、または長さが約10〜約30個の範囲のアミノ酸である。本発明中で提供するさらに好ましい模倣体は、長さが約5〜約20個の範囲のアミノ酸、または長さが約10〜約20個の範囲のアミノ酸である。本発明中で提供する最も好ましい模倣体は、長さが約5〜約10個の範囲のアミノ酸である。
【００３６】
定義:
本発明中で使用するアミノ酸残基は、その完全な名称によって列挙するか、3文字または1文字のアミノ酸コード(例えば、Mathews & van Holde、「Biochemistry」、第2版(Benjamin/Cumings Publishing Company,Inc.、ニューヨーク)、131頁の表5.1参照)のどちらかで呼ぶことによって列挙し得る。本発明の範囲に包含される模倣体は、指定されたクラスのアミノ酸残基の点から部分的に定義する。アミノ酸は一般に、主にアミノ酸側鎖の特徴に応じて3つの主要なクラス、すなわち親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸およびシステイン様アミノ酸に分類し得る。これらの主要なクラスをさらにサブクラスに分類し得る。親水性アミノ酸には、酸性、塩基性または極性の側鎖を有するアミノ酸が含まれる。疎水性アミノ酸には、芳香族または無極性の側鎖を有するアミノ酸が含まれる。無極性のアミノ酸はさらに、とりわけ脂肪族アミノ酸を含むよう分類し得る。本明細書中で使用するアミノ酸クラスの定義は以下の通りである。
【００３７】
用語「疎水性アミノ酸」とは、生理的なpHで無荷電であり、水溶液にはじかれる側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝子にコードされている疎水性アミノ酸の例にはIle、LeuおよびValが含まれる。遺伝子にコードされていない疎水性アミノ酸の例にはt-BuAが含まれる。
【００３８】
用語「芳香族アミノ酸」とは、π電子系が結合した少なくとも1つの環(芳香族基)を含む側鎖を有する疎水性アミノ酸をいう。芳香族基はさらに、とりわけアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヒドロキシル基、スルファニル基、ニトロ基およびアミノ基などの置換基で置換されていてもよい。遺伝子にコードされている芳香族アミノ酸の例には、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが含まれる。よく見かける遺伝子にコードされていない芳香族アミノ酸には、フェニルグリシン、2-ナフチルアラニン、β-2-チエニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、4-クロロフェニルアラニン、2-フルオロフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニンおよび4-フルオロフェニルアラニンが含まれる。
【００３９】
用語「親水性アミノ酸」とは、水溶液中の溶媒分子に結合することができる側鎖を有するアミノ酸をいう。遺伝子にコードされている親水性アミノ酸の例にはSerおよびLysが含まれる。遺伝子にコードされていない親水性アミノ酸の例にはCitおよびhCysが含まれる。
【００４０】
用語「複素環式芳香族部分」とは、環の炭素原子の1つまたは複数が、例えば窒素、酸素または硫黄などの別の原子に置き換わっている芳香族部分をいう。典型的な複素環式芳香族部分には、それだけには限定されないが、ピラン、ピラゾール、ピリジン、ピロール、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、セレノフェン、チオフェア、テルロフェン、キサンテンなどが含まれる。
【００４１】
アミノ酸および関連化合物のさらなる例は米国特許第6,265,535号に出ている。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「模倣体」とは、ペプチドの活性を模倣する化合物をいう。模倣体自体がペプチドであってよい。模倣体はまた、非ペプチドであるか、かつ/または非ペプチド結合、例えば、それだけに限定されないが、ψ結合によって結合されたアミノ酸を含んでいてよい(例えば、Benkirane,N.他、J.Biol.Chem.、271:33218〜33224、(1996)参照)。米国特許第5,637,677号およびその親出願は模倣体を生成する詳細な手引きを含む。好ましい模倣体は「コンフォメーションが束縛された」ペプチドである。環状の模倣体も同様に好ましい。少なくとも1つの環外ドメイン、結合部分(例えば結合アミノ酸)および活性領域を含む環状の模倣体がさらに好ましい。
【００４３】
本明細書中で使用する用語「束縛されたペプチド」および「コンフォメーションが束縛されたペプチド」は互換性があるように使用され、例えば分子内結合によってコンフォメーションが安定であり、拘束されたコンフォメーションに保たれるペプチドをいうことを意味する。
【００４４】
本明細書中で使用する用語「環外アミノ酸残基」とは、環状ペプチドに直接または間接的に結合されているが、環状構造を構成するペプチドの部分内にはないアミノ酸残基をいうことを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用する用語「環外部分」とは、環状ペプチドに結合されているが、環状構造を構成するペプチドの部分にはない1つまたは複数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列をいうことを意味する。
【００４６】
本明細書中で使用する用語「結合部分」とは、3つのアミノ酸と結合を形成できる分子状構成要素または官能基をいうことを意味する。
【００４７】
本明細書中で使用する用語「結合アミノ酸残基」とは、結合部分であるアミノ酸残基をいうことを意味する。
【００４８】
本明細書中で使用する用語「活性領域」とは、受容体または受容体リガンドと直接相互作用する模倣体の部分のアミノ酸配列をいうことを意味し、相互作用は模倣体の活性領域と受容体または受容体リガンドとの間の親和性によって特徴づけられる。
【００４９】
用語「Fas模倣体」とは、Fasペプチド由来のペプチド模倣体をいう、すなわち、本発明のFas模倣体はFasペプチド(Fas由来のペプチド)を模倣する化合物である。好ましいFas模倣体は、Fasの表面ドメイン由来のおよび/またはそれに対応するペプチドの模倣体である。Fas表面ループドメイン由来のおよび/またはそれに対応するペプチドの模倣体であるFas模倣体がさらに好ましい。例示的なFasペプチドを、以下の表1で提供する。本発明の特に好ましいFas模倣体は、FasのKp7表面ドメインペプチドの模倣体である。
【００５０】
Fas模倣体はヒトまたはマウスのFas由来であることが好ましい。より好ましくは、Fas模倣体はヒトFas由来のもの、例えば、それだけに限定されないがヒトFasである。最も好ましくは、模倣体は、以下の成熟アミノ酸配列を有するヒトFas由来である。
RLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKAHFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCTKCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKTCRKHRKENQGSHESPTLNPETVAINLSDVDLSKYITTIAGVMTLSQVKGFVRKNGVNEAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKKANLCTLAEKIQTIILKDITSDSENSNFRNEIQSLV(配列番号15)
【００５１】
本発明の好ましいFas模倣体は、Fas、FasLのどちらかまたはFasおよびFasLのどちらもと相互作用する(例えばそれに結合する)ことができる。したがって、Fas模倣体は、例えば拮抗剤、作用剤、または逆作用剤としてFasの活性(具体的にはFas に媒介されるシグナル伝達)を変調し得る。例えば、特定の実施形態では、本発明のFas模倣体はFasLのFasへの結合を阻害し、したがってFas活性を阻害し得る。他の実施形態(好ましくはFasLを存在させずにまたは非常に低濃度で実施する)では、本発明のFas模倣体はFasに結合してこれを活性化させ得る。
【００５２】
本明細書中で使用する用語「表面ドメイン」とは、1つまたは複数の溶媒が接近できるアミノ酸を含むタンパク質のドメインをいう。表面ドメインは、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の溶媒が接近できるアミノ酸を含み得る。表面ドメインはまた、20個より多くの溶媒が接近できるアミノ酸を含み得る。好ましくは、表面ドメイン内のそれぞれのアミノ酸が、溶媒が接近できるアミノ酸である。溶媒が接近できるアミノ酸、およびそれ故に表面ドメインは、当分野で周知の方法を用いて同定し得る(例えば、Jones他、J.Mol.Biol.、272:121〜132、(1997)およびSamanta,U.他、Prot.Eng.、15:659〜667、(2002)参照)。
【００５３】
アミノ酸の溶媒接近性は、0.0(埋まっている)から1.0の完全に接近可能の値で表す。好ましくは、表面ドメインは、少なくとも約0.3の溶媒接近性を有する少なくとも1つのアミノ酸を含む。より好ましくは、表面ドメインは、少なくとも約0.4、0.5、0.6または0.7の溶媒接近性を有する少なくとも1つのアミノ酸を含む。より好ましくは、表面ドメインは、少なくとも約0.8、0.9または0.95の溶媒接近性を有する少なくとも1つのアミノ酸を含む。表面ドメインは、少なくとも0.3の溶媒接近性を有する約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸を含む、または少なくとも約0.3の溶媒接近性を有する少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸を含むことがさらに好ましい。表面ドメインは、少なくとも約0.4、0.5、0.6、もしくは0.7の溶媒接近性を有する約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸を含む、または少なくとも約0.4、0.5、0.6、もしくは0.7の溶媒接近性を有する少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸を含むことがさらに好ましい。表面ドメインは、少なくとも約0.8、0.9、もしくは0.95の溶媒接近性を有する約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸を含む、または少なくとも約0.8、0.9、もしくは0.95の溶媒接近性を有する少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸を含むことがさらに好ましい。
【００５４】
表面ドメインは、少なくとも約0.3の溶媒接近性を有する約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸からなる、または少なくとも約0.3の溶媒接近性を有する少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸からなることがさらに好ましい。表面ドメインは、少なくとも約0.4、0.5、0.6、もしくは0.7の溶媒接近性を有する約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸からなる、または少なくとも約0.4、0.5、0.6、もしくは0.7の溶媒接近性を有する少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸からなることがさらに好ましい。表面ドメインは、少なくとも約0.8、0.9、もしくは0.95の溶媒接近性を有する約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸からなる、または少なくとも約0.8、0.9、もしくは0.95の溶媒接近性を有する少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸からなることがさらに好ましい。
【００５５】
本明細書中で使用する用語「治療」とは、既存の状態の重篤度または再発の可能性を低下させるために活性剤を投与することをいう。したがって、「治療」には、例えば、それだけに限定されないが、状態に関連する少なくとも1つの症状を寛解すること、または状態の発生率もしくは再発率を低下させることが包含される。
【００５６】
本明細書中で使用する用語「予防する」とは、状態が発生する可能性を低下させることをいう。
【００５７】
本明細書中で使用する「治療を要する対象」または状態を「罹患している対象」とは、状態の少なくとも1つの症状を表しているまたは治療する特定の状態を発生もしくは再発する危険性にある哺乳動物(例えばヒト)である。
【００５８】
本明細書中で使用する薬剤の「治療有効量」とは、病理学的状態、異常状態もしくは他の様式で望ましくない状態に関連する少なくとも1つの症状を寛解するのに十分な量、このような状態が発生もしくは再発することを予防するもしくはその確率を低下させるのに十分な量、またはこのような状態の悪化を遅延させるのに十分な量である。
【００５９】
本明細書中で使用する「Fas関連症状」とは、Fasの活性(すなわちシグナル伝達)を増大または低減させることによって治療することができる病理学的状態である。「Fas関連症状」は、Fas活性の拮抗剤で治療することが好ましい。より好ましくは、前記拮抗剤はFasまたはFasLの一方または双方に結合してFas活性させる。あるいは、特定の実施形態では、「Fas関連症状」をFas活性の作用剤で治療し得る。「Fas関連症状」の例には、それだけに限定されないが、異常なリンパ球増殖および自己免疫をもたらすリンパ球のアポトーシスに関連する症状が含まれる。さらなる例には、それだけに限定されないが、(例えば皮膚および他の臓器における)老化および細胞死、失明、リウマチ様関節炎、シェーグレン症候群、複数、ウイルス性肝炎、腎損傷、HIV感染、および血管形成が含まれる。Famularo他、上記も参照されたい。FasLおよびFasの抗原相互作用の阻害も、移植拒絶を予防するために使用されてきた。FasとFasLとの結合を阻害する本発明の模倣体は、特定の設定において免疫応答を増大させるのに使用し得る。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明の模倣体を用いて失明または同時発生の新血管新生を伴ったもしくは伴わない他の眼球障害を治療する。好ましい実施形態では、本発明の模倣体を用いて失明または同時発生の新血管新生を伴った他の眼球障害を治療する。眼球障害の例には、それだけに限定されないが、黄斑変性症、例えば老化関連の黄斑変性症が含まれる。
【００６１】
本明細書中に開示する化合物の「代謝産物」とは、化合物が代謝された際に形成される、化合物の誘導体である。用語「活性代謝産物」とは、化合物が代謝された際に形成される、化合物の生物学的に活性のある誘導体をいう。用語「代謝された」とは、生体内で特定の物質が変化するプロセスを合わせたものをいう。要約すると、体内に存在するすべての化合物は、エネルギーを得るためおよび/またはエネルギーを体内から除去するために、体内の酵素に操作されている。特異的な酵素は化合物に特異的な構造の変更を与える。例えば、チトクロームP450は様々な酸化および還元反応を触媒し、ウリジン二リン酸グルクロン酸転移酵素は活性グルクロン酸分子の芳香族アルコール、脂肪族アルコール、カルボン酸、アミンおよび遊離スルフヒドリル基への転移を触媒する。代謝に関するさらなる情報は、「The Pharmacological Basis of Therapeutics、第9版」、McGraw-Hill、(1996)、11〜17頁から得ることができる。
【００６２】
本明細書中に開示する化合物の代謝産物は、化合物を宿主に投与してその宿主由来の組織試料を解析すること、または化合物を肝細胞と共にin vitroでインキュベートし、生じた化合物を解析することのいずれかによって同定することができる。どちらの方法も当分野で周知である。
【００６３】
本明細書中に開示する化合物の「プロドラッグ」とは、哺乳動物に投与した場合にin vivoで開示する化合物の活性型に変換される不活性物質である。
【００６４】
本発明の化合物は、すべての鏡像異性体、ジアステレオマー、結晶形、水和物、溶媒和物またはそれらの薬剤として許容される塩、ならびに同種の活性を有するこれらの模倣体の活性代謝産物を含めた上記開示の模倣体に関連している。
【００６５】
Fasの拮抗剤とは、リガンド(作用剤)の効果を減少または消失させる物質であり、典型的にはFas受容体、例えばFasLを活性化させる。拮抗剤は、例えば、化学的拮抗剤、薬物動態学的拮抗剤、受容体の遮断による拮抗剤、非競合的拮抗剤または生理的拮抗剤であり得る。好ましい実施形態では、拮抗剤は化学的拮抗剤または受容体の遮断による拮抗剤である。拮抗剤はFas模倣体であることが好ましい。拮抗剤はFasペプチドのKp1、Kp2、Kp3、Kp4、またはKp7の模倣体であることがさらに好ましい。
【００６６】
化学的拮抗剤とは、リガンドの効果が失われるように拮抗剤が溶液中のリガンドに結合する物質である。薬物動態学的拮抗剤とは、例えば活性リガンドの代謝的分解速度を増加させることによってリガンドの濃度をその作用部位で有効に低下させる拮抗剤である。受容体の遮断による拮抗作用は、2つの重要な機構、すなわち可逆的な競合的拮抗作用および不可逆的、または非平衡の競合的拮抗作用を含む。可逆的な競合的拮抗作用は、拮抗剤分子の解離速度が、リガンドを加えた際に化学的拮抗剤分子が受容体から有効に追放されるほどに十分高い場合に起こる。もちろん、リガンドは結合した拮抗剤分子を立ち退かせることはできず、逆もそうである。不可逆的または非平衡の競合的拮抗作用は、拮抗剤が受容体から非常にゆっくり解離する、またはまったく解離しない場合に起こり、その結果、リガンドを施用した場合に拮抗剤の占有において変化が起こらない。したがって、拮抗作用は打ち勝つことができない。非競合的拮抗作用とは、拮抗剤がシグナル伝達経路のある時点でその遮断作用を発揮し、リガンドによる応答を生じさせる状況を記載している。
【００６７】
本発明の模倣体は、Fasの拮抗剤であることが好ましい。より好ましくは、本発明中で使用する模倣体は、Fasの選択的拮抗剤である。Fasの選択的拮抗剤とは、Fasを拮抗するが、TNF受容体ファミリーの他の受容体を弱くしか拮抗しないまたは実質的に拮抗しない拮抗剤である。最も好ましい模倣体拮抗剤は、低濃度でFas受容体を選択的に拮抗するもの、例えば1000mM以下の濃度で50%以上の拮抗作用レベルを引き起こすものである。したがって、選択的Fas模倣体拮抗剤は、典型的には他のTNF受容体よりもFasに対して少なくとも10倍、好ましくは100倍、最も好ましくは1000倍高い活性を示す。
【００６８】
好ましい実施形態:
本発明のFas模倣体は、以下の特性を1つまたは複数有することが好ましい。
【００６９】
(1)FasLのFasへの結合の有意な阻害:
模倣体は、1nM〜500mMの拮抗効力(IC50として測定)を示すことが好ましい。以下にさらに詳細に述べる本発明の開示を制限することなしに、効力は、模倣体の拮抗活性をin vivoまたは細胞抽出物または抽出物の画分を含めたin vitroで決定することによって測定し得る。阻害効力も、非限定的な例としてネイティブもしくは組換えFas、および/または可溶性Fasを用いて決定し得る。Fas結合は、ELISAやMTTによる増殖などの当業者に周知の方法(Hansen他、J.Immunol.Methods、199、203〜210、(1989))によって決定し得る。
【００７０】
(2)選択性:
好ましい模倣体は、他のTNF受容体と比較してFasに対して少なくとも約10倍高い拮抗効力を示す。他のTNF受容体と比較してFasに対して少なくとも約100倍高い拮抗を示す化合物がより好ましい。他のTNF受容体と比較してFasに対して少なくとも約1000倍高い拮抗を示す化合物が最も好ましい。
【００７１】
(3)FasLへの結合:
模倣体は、FasLに結合してFasLとFasとの相互作用を阻害することが好ましい。模倣体のFasLに対する結合親和性は、様々なパラメータ、例えば、kon、koffおよびKD。によって記述することができる。好ましい実施形態では、模倣体は、10M-1s-1より高いkon値、10-3s-1未満のkoff値または10-4M未満のKD値によって表されるFasLに対する親和性を有する。より好ましくは、模倣体は、102M-1s-1より高いkon値、10-4s-1未満のkoff値または10-5M未満のKD値によって表されるFasLに対する親和性を有する。最も好ましくは、模倣体は、103M-1s-1より高いkon値、10-5s-1未満のkoff値または10-6M未満のKD値によって表されるFasLに対する親和性を有する。
【００７２】
したがって、これらの特性を1つまたは複数有する模倣体は、哺乳動物、特にヒトにおけるFas関連症状を治療するために使用する候補である。
【００７３】
上記特性を1つまたは複数有する模倣体をさらに、in vitroまたはin vivoでFasの機能を測定するアッセイを用いて、生物学的活性について試験することができる。
【００７４】
模倣体の生物学的活性の測定は、例えばそれぞれ以下の実施例4および5に記載のように、Fas-Lに誘発される細胞毒性の阻害を測定することによって、またはFas-Lに誘発される細胞培養物におけるアポトーシスを阻害することによってin vitroで決定することができる。あるいは、模倣体の生物学的活性はまた、カスパーゼ活性、NF-κBの活性化、および/またはFasシグナル伝達の他の下流メディエーターなどの、Fas活性のシグナル伝達の側面を直接または間接的に測定することによって測定し得る。
【００７５】
Fas活性をin vivoで測定するために有用な動物モデルは、実施例6に記載のCon A誘発性肝炎モデルである。このアッセイは、ヒト自己免疫肝炎のネズミモデルである。(Tiegs,G.他、J Clin Invest、90、196〜203、(1992))。成熟T細胞が欠損している重症複合型免疫不全(SCID)マウスおよび無胸腺症のヌードマウスがCon Aに誘発された損傷に耐性を持っていたので、Con A誘発性肝炎のプロセスにおいてT細胞の活性化が重要な役割を果たす。(Tiegs他、上記;Mizuhara,H.他、J Exp Med、179、1529〜1537、(1994)。肝損傷は、Fas-FasL(Seino,K.他、Gastroenterology、113、1315〜1322、(1997);Tagawa,Y.他、Eur J Immunol、28、4105〜4113、(1998);Tagawa,Y.他、J Immunol、159、1418〜1428、(1997))、パーフォリン-グランザイム系(Watanabe,Y.他、Hepatology、24、702〜710、(1996))、IFN-γ(Tagawa他、上記;Kusters,S.他、Gastroenterology、111、462〜471、(1996))およびTNF-αに媒介される細胞毒性(Mizuhara他、上記;Toyabe,S.他、J Immunol、159、1537〜1542、(1997);Gantner,F.他、Exp Cell Res、229、137〜146、(1996);Gantner,F.他、Hepatology、21、190〜198、(1995);Kusters,S.他、Eur J Immunol、27、2870〜2905、(1997);Ksontini,R.他、J Immunol、160、4082〜4089、(1998))に関与するものなどのいくつかの異なる機構によって誘発されていると考えられる。(Mizuhara,H.他、J Exp Med、179、1529〜1537、(1994)。FasL欠陥のgld/gldマウスまたはFas欠陥lpr/lprマウスがCon A治療によって誘発された肝臓損傷に耐性を持っていたので、肝臓損傷は主にFas-FasL系に依存している。(Tagawa他、上記;Tagawa他、上記)。
【００７６】
模倣体の設計:
好ましい実施形態によれば、FASの既知の領域に基づいて模倣体を設計する。好ましい実施形態では、模倣体はFasの細胞外ドメイン、より好ましくはFasのシスチンノット領域を模倣する。最も好ましくは、模倣体はFasのKp7ドメインに基づく。
【００７７】
模倣体の基礎とするFasペプチドの同定は、コンピュータモデリングおよび構造解析を用いて行うことができる。例えば、下記の実施例1は、FasLおよびFasの相互作用モデルをコンピューター支援モデリングによって作製し、Fasの推定二次構造特徴に基づいてペプチド模倣体を設計するために使用した一実施形態を記述している。このような実施形態では、当業者は利用可能な生物学的データまたは構造的な表面相補性のどちらかと一致したFas表面の最適な相互作用を定義し得る。その後、ペプチド模倣体を、典型的には約5個の模倣体化合物に対応するこのような相互作用に関与しているすべての二次構造について設計かつ合成することができる。それぞれの化合物を、例えば米国特許第6,100,377号および第6,265,535号に記載のように修飾し得る。その後、このようにして得られた模倣体化合物を、例えば本出願中に記載の方法を使用して、Fas作用剤または拮抗剤としてのその活性について試験することができる。
【００７８】
巨大分子を同様の機能を有する小分子へと小さくすることは、一般の化学的な問題である。機能単位を適切な骨格上に移植することによって小タンパク質を設計する試み(Vita他、Biopolymers、47、93〜100、(1998))および抗体を単鎖抗体へと極小化する試み(Magliani他、Nature Biotechnol.、15、155〜158、(1997))がいくらかなされている。
【００７９】
現在では、コンフォメーションが束縛されたペプチドは束縛されていないペプチドよりも生物活性が高いことが確立している。近年、固相合成および他の方法によるペプチド環状化の化学反応が劇的に改善されており(Burgess他、(1996)、「Solid phase syntheses of peptidomimetics、(American Chemical Society、ワシントンDC)、ORGN-157頁;Goodman & Shao、Pure Appl.Chem.、68、1303〜1308、(1996);Hanessian他、Tetrahedron、53、12789〜12854、(1997);Koskinen & Hassila、Acta Chem.Scand.、50、323〜327、(1996);Kuhn他、Tetrahedron、53、12497〜12504、(1997);Waid他、Tetrahedron Lett.、37、4091〜4094、(1996);Zuckermann、Curr.Opin.Struct.Biol.、3、580〜584、(1993))、ペプチドをペプチド模倣体へと開発する機会がより多く提供されている。
【００８０】
環状ペプチド模倣体を作製する一般原理が採用され、一部の場合では(エプチフィチミド(eptifitimide)(Integrilin)糖タンパク質11b 111a阻害剤(COR Therapeutics)など)臨床利用が可能になっている。芳香族残基を環が束縛された小ペプチドの末端に配置すると、模倣体の活性が増大される(Takasaki他、Nat.Biotechnol.、15、1266〜1270、(1997);Zhang他、Nature Biotechnol.、14、472〜475、(1996))。このような改変を採用することにより、CDRに基づいた抗体模倣体の親和性が高い模倣体(Park他、Nature Biotechnol.、18、194〜198、(2000))、CD4(Zhang他、Nature Biotechnol.、15、150〜154、(1997))、IL4受容体ループ模倣体、抗CD3抗体模倣体、およびその受容体へのTNFαの結合に影響を与えるTNFシスチンノット模倣体(Takasaki他、Nature Biotechnol.、15、1266〜1270、(1997))の作製が可能となった。
【００８１】
化学合成:
本発明の模倣体は、ペプチドおよびペプチド類似体を調製するための、当分野で知られている事実上任意の技術を用いて調製し得る。例えば、ペプチドは、慣用の溶液または固相ペプチド合成を用いて直鎖状または非環状形態で調製し、標準の化学反応を用いて環状化し得る。好ましくは、ペプチドを環状化するために使用した化学反応は、ペプチドが実質上分解されるのを避けるために十分穏やかである。本明細書中に記載のペプチドを合成するための適切な手順、ならびにペプチドを環状化するための適切な化学反応は、当分野で周知である。
【００８２】
所望する場合は、ジスルフィド結合の形成は一般に穏やかな酸化剤の存在下で実施する。化学的、酵素的または光分解性の酸化剤を使用し得る。例えばTam,J.P.他、1979、Synthesis、955〜957;Stewart他、1984、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版、Pierce Chemical Company、イリノイ州Rockford;Ahmed他、1975、J.Biol.Chem.、250:8477〜8482;ならびにPennington他、1991 Peptides、1990、164〜166、GiraltおよびAndreu編、ESCOM Leiden、オランダに記載のものを含めた様々な方法が当分野で周知である。さらなる代替方法は、Kamber他、1980、Helv Chim Acta、63:899〜915に記載されている。固体支持体上で実施する方法は、Albericio、1985、Int.J.Peptide Protein Res.、26:92〜97に記載されている。本発明のペプチドにおいてジスルフィド結合を形成させるために、これらの方法のうち任意のものを使用し得る。
【００８３】
組換え合成:
ペプチドの全体が遺伝子にコードされているアミノ酸のみで構成されている場合、またはその一部分がそのように構成されている場合は、このペプチドまたは当該部分は、慣用の組換え遺伝子操作技術を用いても合成し得る。その後、単離したペプチドまたはそのセグメントをすでに記載のように縮合し、酸化して環状ペプチドを得る。
【００８４】
組換えによる産生には、ペプチドの直鎖型をコードしているポリヌクレオチド配列を適切な発現ベヒクル、すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素、またはRNAウイルスベクターの場合は複製および翻訳に必要な要素を含むベクター内に挿入する。その後、発現ベヒクルを、環状ペプチドの直鎖型を発現する適切な標的細胞内に形質移入させる。使用した発現系に応じて、その後発現されたペプチドを当分野でよく確立されている手順によって単離する。組換えタンパク質およびペプチドの産生方法は当分野で周知である(例えば、Maniatis他、1989、「Molecular Cloning A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク;およびAusubel他、1989、「Current Protocols in Molecular Biology」、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、ニューヨーク参照)。
【００８５】
本明細書中に記載のペプチドを発現させるために様々な宿主-発現ベクター系を利用し得る。これらには、それだけには限定されないが、適切なコード配列を含む組換えバクテリオファージDNAまたはプラスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌などの微生物、適切なコード配列を含む組換え酵母もしくは真菌発現ベクターで形質転換させた酵母または糸状菌、適切なコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系、適切なコード配列を組換えウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルス)を感染させたまたは適切なコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換させた植物細胞系、あるいは動物細胞系が含まれる。
【００８６】
発現系の発現要素は、その強度および特異性が異なる。利用する宿主/ベクター系に応じて、構成的および誘導プロモーターを含めたいくつかの適切な転写および翻訳要素のうち任意のものを発現ベクターで使用し得る。例えば、細菌系内にクローニングする場合は、バクテリオファージX、plac、ptrp、ptac等のpL(ptrp-lacハイブリッドプロモーター)などの誘導プロモーターを使用し得る。昆虫細胞系内にクローニングする場合は、バキュロウイルス多角体プロモーターなどのプロモーターを使用し得る。植物細胞系内にクローニングする場合は、植物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば熱ショックプロモーター、RUBISCOの小サブユニットのプロモーター、クロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーター)または植物ウイルス由来のプロモーター(例えばCaMVの35S RNAプロモーター、TMVの外被タンパク質プロモーター)を使用し得る。哺乳動物細胞系内にクローニングする場合は、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルスの7.5Kプロモーター)を使用し得る。複数の発現産物のコピーを含む細胞系を作製する場合は、SV40、BPVおよびEBVに基づいたベクターを適切な選択マーカーと共に使用し得る。
【００８７】
植物発現ベクターを使用する場合は、本発明のペプチドをコードしている配列は、いくつかのプロモーターのうち任意のものによって駆動され得る。例えば、CaMVの35S RNAおよび19S RNAプロモーターなどのウイルスプロモーター(Brisson他、1984、Nature、310:511〜514)、またはTMVの外被タンパク質プロモーター(Takamatsu他、1987、EMBO J.、6:307〜311)を使用し得る。あるいは、RUBISCOの小サブユニット(Coruzzi他、1984、EMBO J.、3:1671〜1680;Broglie他、1984、Science、224:838〜843)または熱ショックプロモーター、例えばダイズhsp17.5-Eもしくはhsp17.3-B(Gurley他、1986、Mol.Cell.Biol.、6:559〜565)などの植物プロモーターを使用し得る。これらの構築体を、Tiプラスミド、Riプラスミド、植物ウイルスベクター、直接のDNAの形質転換、微量注入、電気穿孔などを用いて植物細胞内に導入することができる。このような技術の概説には、例えば、Weissbach & Weissbach、1988、「Methods for Plant Molecular Biology」、Academic Press、ニューヨーク、セクションVIII、421〜463頁;およびGrierson & Corey、1988、「Plant Molecular Biology」、第2版、Blackie、ロンドン、第7〜9章を参照されたい。
【００８８】
本発明のペプチドの産生に使用し得る1つの昆虫発現系では、オートグラファカリフォルニア(Autographa californica)核多汗症ウイルス(AcNPV)を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用する。ウイルスはスポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞内で増殖する。コード配列をウイルスの非必須領域(例えば多面性遺伝子)内にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば多角体プロモーター)の制御下に置き得る。コード配列の挿入が成功した場合は、多角体遺伝子の不活性化および非閉塞性組換えウイルス(すなわち多角体遺伝子にコードされているタンパク質外被を欠いているウイルス)の産生がもたらされる。その後、これらの組換えウイルスを使用して、挿入した遺伝子がその中で発現されるスポドプテラフルギペルダ細胞を感染させる。(例えば、Smith他、1983、J.Virol.、46:584;Smith、米国特許第4,215,051号参照)。この発現系のさらなる例は、「Current Protocols in Molecular Biology」、第2巻、Ausubel他編、Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscienceに出ている。
【００８９】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスに基づいた発現系を利用し得る。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合は、コード配列をアデノウイルスの転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび3つ組のリーダー配列にライゲートさせ得る。その後、このキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivoの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば領域E1またはE3)内に挿入することにより、生存可能であり、かつ感染した宿主内でペプチドを発現することができる組換えウイルスが生じる。(例えば、Logan他、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:3655〜3659参照)。あるいは、ワクシニア7.5Kプロモーターを使用し得る、(例えば、Mackett他、1982、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79:7415〜7419;Mackett他、1984、J.Virol.、49:857〜864;Panicali他、1982、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79:4927〜4931参照)。
【００９０】
環状本発明のペプチドの直鎖状または環状でない形態を産生させるための他の発現系は、当業者には明らかであろう。
【００９１】
ペプチドおよびペプチド類似体の精製:
本発明のペプチドおよびペプチド類似体は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーなどの当分野で知られている技術によって精製することができる。特定のペプチドまたは類似体を精製するために使用する実際の条件は、実効電荷、疎水性、親水性などの要因に部分的に依存し、当業者には明らかであろう。
【００９２】
アフィニティークロマトグラフィーによる精製では、ペプチドまたはペプチド類似体に特異的に結合する任意の抗体を使用し得る。抗体の産生には、それだけには限定されないがウサギ、マウス、ラットなどを含めた様々な宿主動物に直鎖状または環状ペプチドを注射することによって免疫化し得る。ペプチドは、側鎖官能基または側鎖官能基に結合したリンカーによってBSAなどの適切な担体に結合させ得る。免疫学的応答を増大させるために、宿主の種に応じて、それだけには限定されないが、フロイントアジュバント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびBCG(桿菌カルメット-ゲラン)やコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントを含めた様々なアジュバントを使用し得る。
【００９３】
ペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系による抗体分子の産生をもたらす任意の技術を用いて調製し得る。これらには、それだけには限定されないが、最初にKoehler and Milstein、1975、Nature、256:495〜497に記載されているハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、Kosbor他、1983、Immunology Today、4:72;Cote他、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80:2026〜2030およびEBV-ハイブリドーマ技術(Cole他、1985、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、77〜96、(1985))が含まれる。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」産生のために開発された技術(Morrison他、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:6851〜6855;Neuberger他、1984、Nature、312:604〜608;Takeda他、1985、Nature、314:452〜454)を用いることができる。あるいは、単鎖抗体の産生について記載されている技術(米国特許第4,946,778号)を、環状ペプチドに特異的な単鎖抗体が産生されるように適応させることができる。
【００９４】
特定の結合部位の欠失を含む抗体断片を既知の技術によって作製し得る。例えば、このような断片には、それだけには限定されないが、抗体分子のペプシン消化によって生成することができるF(ab')2断片、およびF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することで作製することができるFab断片が含まれる。あるいは、目的の環状ペプチドに対して所望する特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、Fab発現ライブラリを構築し得る(Huse他、1989、Science、246:1275〜1281)。
【００９５】
所望の環状ペプチドに特異的な抗体または抗体断片を、例えばアガロースに結合させることができ、この抗体-アガロース複合体を免疫クロマトグラフィーで使用して本発明の環状ペプチドを精製する。Scopes、1984、Protein Purification:Principles and Practice、Springer-Verlag New York,Inc.、ニューヨーク、Livingstone、1974、Methods Enzymology:Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723〜731を参照されたい。
【００９６】
配合および投与経路:
本発明の化合物は、それ自体でまたは薬剤組成物の形態で対象に投与し得る。本発明の化合物を含む薬剤組成物は、慣用の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル封入、混入または凍結乾燥プロセスによって製造し得る。薬剤組成物は、活性ペプチドもしくはペプチド類似体を製薬で使用できる調製物へと加工することを容易にする1つまたは複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して、慣用の方法で配合し得る。適切な配合は、選択された投与経路に依存する。
【００９７】
局所投与用には、本発明の化合物を、当分野で周知のように溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液などとして配合し得る。
【００９８】
全身用の配合物には、注射、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内または腹腔内注射による投与用に設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、経口または経肺投与用に設計されたものが含まれる。
【００９９】
注射用には、本発明の化合物を水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液などの生理的に適合性のある緩衝剤中で配合し得る。溶液は、懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの配合剤を含み得る。
【０１００】
あるいは、化合物は、使用前に適切なベヒクル、例えば無菌的な発熱物質を含まない水で再構成する散剤形態であり得る。
【０１０１】
経粘膜投与には、透過する関門に適した浸透剤を配合物中で使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１０２】
経口投与には、化合物は、活性ペプチドまたはペプチド類似体を当分野で周知の薬剤として許容される担体と合わせることによって容易に配合することができる。このような担体により、本発明の化合物が、治療する患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして配合されることが可能となる。例えば散剤、カプセルおよび錠剤などの経口固体配合物では、適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖などの充填剤、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、イモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)などのセルロース調製物、顆粒化剤、および結合剤が含まれる。所望する場合は、架橋結合させたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウム等のその塩などの崩壊剤を加え得る。
【０１０３】
所望する場合は、標準の技術を用いて固体剤形に糖衣または腸溶コーティングを行い得る。
【０１０４】
経口液剤調製物、例えば懸濁液、エリキシルおよび溶液において、適切な担体、賦形剤または希釈剤には水、グリコール、油、アルコールなどが含まれる。さらに、香味料、防腐剤、着色料などを加え得る。
【０１０５】
舌下投与には、化合物は、慣用の方法で配合した錠剤、ロゼンジなどの形態をとり得る。
【０１０６】
吸入による投与には、本発明に従って使用する化合物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で便利に送達する。加圧エアロゾルの場合は、単位用量は、計量された量を送達するために弁を設けることによって決定し得る。吸入器または吹入器で使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の散剤混合物およびラクトースやデンプンなどの適切な粉末基剤を含むよう配合し得る。
【０１０７】
化合物はまた、例えばカカオ脂や他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤を含む坐薬や保留浣腸などの直腸または膣用組成物中にも配合し得る。
【０１０８】
すでに記載した配合物に加えて、化合物をデポー調製物としても配合し得る。このような長時間作用型の配合物は、埋め込み(例えば皮下もしくは筋肉内)または筋肉内注射によって投与し得る。したがって、例えば、化合物を適切なポリマーもしくは疎水性物質(例えば許容される油中の乳剤として)またはイオン交換樹脂と共に配合するか、あるいはやや溶けにくい誘導体として、例えばやや溶けにくい塩として配合し得る。
【０１０９】
あるいは、他の製薬上の送達系を採用し得る。リポソームおよび乳剤は、本発明のペプチドおよびペプチド類似体を送達するのに使用し得る送達ベヒクルの周知の例である。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒も使用し得るが、通常は毒性がより高くなるという犠牲が伴う。さらに、治療剤を含む固体ポリマーの半透過性マトリックスなどの徐放性の系を使用して化合物を送達し得る。様々な徐放性物質が確立されており、当業者には周知である。徐放性カプセルでは、その化学的性質に応じて、化合物が数週間から100日を越える間放出され得る。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質を安定化するさらなる戦略を採用し得る。
【０１１０】
本発明の模倣体は帯電した側鎖または末端を有し得るので、これらを上述の配合物のうち任意のものに遊離酸もしくは塩基または薬剤として許容される塩として含め得る。薬剤として許容される塩とは、遊離塩基の抗微生物活性を実質的に保っており、無機酸との反応によって調製する塩である。製薬用の塩は、対応する遊離塩基の形態よりも水性溶媒および他のプロトン性溶媒への可溶性が高い傾向にある。
【０１１１】
有効な用量:
本発明の化合物は一般に、意図する目的を実現するのに有効な量で使用する。FAS関連症状を治療または予防するための使用では、本発明の化合物またはその薬剤組成物を、治療有効量で投与または塗布する。治療有効量とは、症状を寛解もしくは予防すること、または治療する患者の生存を延長することに有効な量を意味する。治療有効量を決定することは十分に当業者の能力範囲内にある。
【０１１２】
全身投与には、治療有効用量は、最初にin vitroアッセイから推定することができる。例えば、動物モデル内で、細胞培養物で決定されたIC50(すなわちFas:Fas-L結合相互作用の50%を阻害する試験化合物の濃度)を含む循環濃度範囲に達するように用量を配合することができる。このような情報を使用してヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【０１１３】
最初の用量はin vivoデータから、例えば動物モデルで、当分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０１１４】
用量および間隔は、治療効果の維持に十分な化合物の血漿レベルをもたらすために個別に調節し得る。注射による投与のための通常の患者の用量は、約0.01〜約25mg/kg/日、好ましくは約0.1〜約10mg/kg/日、より好ましくは約0.5〜約5mg/kg/日の範囲である。1日あたり約25〜約1000mg、好ましくは1日あたり約100〜約750mg、より好ましくは1日あたり約250〜500mgの1日総用量も好ましい。治療上有効な血清レベルは、毎日複数用量を投与することによって達成し得る。
【０１１５】
局所投与または選択的な取り込みの場合は、化合物の有効な局所濃度は血漿濃度と無関係であるかもしれない。当業者は、過剰な実験なしに治療上有効な局所用量を最適化することができるであろう。
【０１１６】
投与する化合物はもちろん、治療する対象、対象の重量、病気の重篤度、投与様式、および処方する医療専門家の判断に依存する。
【０１１７】
治療は、症状が検出可能である間、および症状が検出可能でない場合でも、断続的に繰り返してよい。治療は、単独でまたは他の薬物と組み合わせて提供し得る。Fas関連症状の場合、本発明の模倣体と組み合わせて使用し得る薬物には、それだけには限定されないが、抗炎症剤、ステロイドおよび抗代謝剤(例えばメトトレキサート)が含まれる。
【０１１８】
「組み合わせて」使用する薬物は、所定の症状を治療する一般的な方法の一部として投与する。組み合わせて使用する薬物は、同一または別個の剤形で投与し得る。個別の剤形は、同時にまたは異なる時に投与し得る。
【０１１９】
毒性:
本明細書中に記載の化合物の治療有効用量は、実質的な毒性を引き起こさずに治療上の利点をもたらすことが好ましい。
【０１２０】
本明細書中に記載の化合物の毒性は、細胞培養物または実験動物における標準の製薬手順によって、例えばLD50(集団の50%に致命的な用量)またはLD100(集団の100%に致命的な用量)を決定することによって、決定することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指標である。高い治療指標を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータを使用して、ヒトにおける使用に毒性でない用量範囲を形成することができる。本明細書中に記載の化合物の用量は、毒性が少ししかないまたはまったくない有効な用量を含む循環濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、採用する剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。正確な配合、投与経路および用量は、患者の状態を考慮してそれぞれの医師が選択することができる。(例えば、Fingl他、1975、「Pharmacological Basis of Therapeutics」、第1章、1頁参照)。
【実施例】
【０１２１】
本発明を以下の実施例によっても説明する。しかし、これらの実施例または本明細書中のいかなる場所に現れる他の実施例は、例証としての説明に使用しているのみであり、本発明や例示されたいかなる用語の範囲と意味を、限定するものでは決してない。同様に本発明は、本明細書で説明された個々のいかなる好ましい実施形態に限定されるものではない。実際に、本発明の変更または変化例の多くは、当業者が本明細書を読めば明らかであろうし、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、施されてよいものである。したがって本発明は、添付の請求項の条件と、それらの請求項が権利を有するすべての均等物によりのみ、限定されるものである。
【０１２２】
(実施例1)
Fas受容体複合体の分子モデル
TNFスーパーファミリーのメンバーであるFasはTNF受容体と有意な構造相同性を共有している。TNF受容体構造は、特徴あるシステインノット繰返しドメインを備えている。(Naismith,J.H.他、Structure 4、1251〜1262、(1996))。最初の3ドメインのループ構造、ならびにタンパク質のβターンは、分子認識および結合で役割を果たすと考えられている。(Leszczynski,J.F.他、Science 234、849〜855、(1986))。システインノットのペプチド模倣体を開発するため、小分子により乱されるか影響を受ける可能性のある、タンパク質-タンパク質相互作用部位を同定した。
【０１２３】
本発明者らの方法論におけるTNF受容体複合体の結晶構造、ならびに他研究者によりすでに公開されているモデル(Watanabe-Fukunaga他、上記;Naismith,J.H.他、J Biol Chem 270、13303〜13307、(1995);Banner,D.W.他、Cell 73、431〜445、(1993);Bajorath,J.、J Comput Aided Mol Des 13、409〜418、(1999))を用い、FasおよびFasL複合体の分子モデル(図1a)を開発した。この受容体-リガンド相互作用の全体的な特徴は、TNF受容体-リガンド複合体の相互作用と大変よく似ているといえる。米国特許第6,265,535号を参照のこと。しかし、Fas受容体の細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと比較して、約10°回転しているようである。分子モデルから予測したFas-FasL接触部位は、変異解析データ(Beltinger,C.他、British Journal of Haematology 102、722〜728、(1998))と一致する。
【０１２４】
Fas-FasL構造モデルから、FasLがFasに結合する可能性のある表面としてKp1、Kp2、Kp3、Kp4、およびKp7と名付けた5つの表面(図1b)が示唆されたが、TNF受容体(Takasaki他、上記)で同定されたこのような表面部位は3つであった。ラマチャンドランプロット(Ramachandran,G.N.他、Biopolymers 6、1255〜1262、(1968);Ramachandran,G.N.他、Adv Protein Chem 23、283〜438、(1968))およびプロファイル解析(Zhang,K.Y.他、Protein Sci 3、687〜695、(1994))から判断すると、Kp1、2、3、4、および7のループのアミノ酸は、よく定義されたコンフォメーションを取っている(すなわち、統計的に許容されたコンフォメーションを取っている)。
【０１２５】
上記の種々のループ構造をもとに、ペプチド類似体を設計した。ループの結合コンフォメーションを模倣する能力、および、模倣体に固有な可動性を減少させるために重要であると判定した模倣体の環の大きさについて、各模倣体を最適化した。最適化した具体的な特徴には、ループ構造と模倣体間でコンフォメーションを模倣させること、模倣体の疎水性親水性指標値、解離速度(表面プラズモン共鳴により測定、下記実施例3参照)、安定性、および溶解度があった。生物学的検査のために選択した一連の模倣体を表1に示す。
【０１２６】
【表１】
2005534641.tif 000004
【０１２７】
(実施例2)
Fas受容体へのFasL結合の阻害
プラスチックプレート上に固定化したFas-Fc融合タンパク質に結合するFasL-Flag(100ng/ml)を測定する検査法により、Fas模倣体活性を評価した。最初に生成するKp1-1、2-2、3-2、4-2、および7-2を、FasがFasLに結合する異なった推定部位をもとに設計し、300μMのペプチドと20nMの可溶性Fas受容体を用いた結合阻害検査法を使用してスクリーニングした(図2A)。模倣体の設計には、Kp7ループがテンプレートとして好ましい表面であることが、この結果から示された。追加して生成するKp7ループ表面由来の環外ペプチドも設計した。FasLおよびFas間の相互作用、および異なる模倣体の生物学的活性の分析から、Kp7ループのアスパラギン酸およびグルタミン酸が、相互作用に最も関係している残基と予想される。しかし、各位置でどの特定のアミノ酸であるかは重要ではない。したがって例えば、アスパラギン酸かグルタミン酸がどちらの位置に存在してもよい。Kp7の他の残基を修飾すると、この一連のKp7模倣体について示すように(図2A)、阻害活性はある程度向上した。
【０１２８】
この一連のKp7ペプチドの阻害活性を比較するため、用量反応試験を行った。Kp7-6が最良の活性を示し、FasL-Flag分子の固定化Fas-Fcへの結合を、150μMで50%阻害した(図2B)。
【０１２９】
(実施例3)
Kp7模倣体の結合親和性および特異性
表面プラズモン共鳴(BIAcore(商標))解析を用い、FasLへの最良の阻害活性を示したKp7-6の結合動力学を実行した。FasL-Flagをセンサーチップ上に固定化し、異なる濃度のKp7-6を含む種々の溶液をその表面上に行き渡らせた。上記の異なるKp7-6濃度から得られたセンサーグラムの結果を、図3Aに示す。konおよびkoff速度定数は、それぞれ6.85×101M-1s-1および7.65×10-4s-1と推定され、この解離速度定数と結合速度定数の比から、1.12×10-5MのKD値を得た。このkoff値は、生物学的活性を備えた治療薬開発において、重要な指標であると考えられており(Benveniste,M.他、Br J Pharmacol 104、207〜221、(1991);Yiallouros,I.他、Biochem J 331、375〜379、(1998))、一般に、有効な生物学的効果と関連がある(Moosmayer,D.他、J Interferon Cytokine Res 16、471〜477、(1996))。このKp7-6-FasL相互作用のKDは、Fas-FasL相互作用について記録されたもの(Starling,G.C.他、J Exp Med 185、1487〜1492、(1997))より低い親和性を示したが、koff速度は、通常の抗原抗体相互作用と同程度であった。これはKp7-6が安定な受容体複合体を形成し、また実用性の点から有益である可能性を示唆している。(Berezov,A.他、J Med Chem 44、2565〜2574、(2001))。
【０１３０】
Kp7-6の結合相互作用の特異性を評価するため、Fas、FasL、およびTNFαをセンサーチップ上に固定化した。Kp7-6はFasLに結合したが、TNFαには結合せず、Kp7-6は特異的にFasLに結合したことを示した(図3B)。Kp7-6はFasにも結合した(図3B)。この観測事実は、リガンド不在時に逆平行ホモ二量体を形成すると報告されている可溶性TNF受容体I(p55)(Naismith,J.H.他、Structure 4、1251〜1262、(1996))を、思い起こさせるものである。これらの結果は、Fasも同様な逆平行二量体を形成し、Kp7が逆平行二量体の形成に寄与する可能性を示唆している。TNF-Rへの有意な結合は、検出されなかった。
【０１３１】
(実施例4)
FasL誘発細胞毒性の阻害
模倣体がFas介在の細胞毒性に与える影響を評価するため、種々の濃度の模倣体の存在下または不在下で、FasLに感受性のあるジャーカット細胞を、可溶性FasL-Flag融合タンパク質で刺激した。Fas介在の細胞毒性に対する模倣体の阻害効果は、上記FasL結合阻害の結果と一致した(図4)。Kp7-6は用量依存的な阻害活性を示した。1mM濃度のKp7-6は、Fas介在の細胞毒性から90%を超える細胞を保護した(図4)。Kp7-10も用量依存的な阻害活性を示した(図4)。試験した濃度範囲では、環状ペプチドは、ジャーカット細胞に対し細胞毒性を介在することはなかった(データ略)。信号雑音比を向上させるため、多用量Kp7-6をこの実験では用いた。他の結合部位由来の模倣体が相乗的に相互作用してKp7表面をブロックする可能性があるかどうかを判定するため、模倣体を組み合わせてKp7を使用した。Kp4模倣体のメンバーと組み合わせて使用したKp7-6またはKp7-10のどちらも、有意な相乗効果を示さなかった。これは、Kp7結合部位の阻害自体が、FasL活性と拮抗するに十分であることを示唆している(データは示さない)。
【０１３２】
(実施例5)
FasL誘発アポトーシスの阻害
Fas模倣体の生物学的活性を、Fas-L誘発アポトーシスに模倣体が与える影響を判定することにより、さらに評価した。細胞膜上でのホスファチジルセリン(PS)の外在化を、アネキシンVを用い判定することで、アポトーシスを測定した。PSが原形質膜の外側のリーフレットに転移することは、アポトーシスの一般的な特徴であり、アネキシンV-FITCの結合を用い定量的に測定できる早期現象である。FasL-Flag(200ng/ml)で3時間治療したジャーカット細胞は、未治療細胞と比較して、PS露出の著しい増加を示した(図5)。このジャーカット細胞アポトーシスの増加は、Kp7-6により用量依存的に阻害された(図5)。
【０１３３】
(実施例6)
Con A誘発損傷に対するマウスの保護
Kp7-6模倣体の生物学的活性をin vivoで測定した。FasL誘発アポトーシスは、ウイルス感染、薬物毒性、その他の損傷などの種々の条件下で、肝細胞がアポトーシスを起こす主要な、また大多数の場合の1つの経路である。(Kaminuma,C.他、Toxicol Pathol 27、412〜420、(1999);Famularo,G.他、Med Hypotheses 53、50〜62、(1999);Gantner他、上記)。いくつかの報告によると、RNA干渉またはオリゴヌクレオチドでFasシグナル伝達を遮断すると、肝臓傷害の程度が抑えられる。(Zhang,H.他、Nat Biotechnol 18、862〜867、(2000);Song,E.他、Nat Med(2003))。Kp7-6のin vivoでのアンタゴニスト効果を、Con Aで誘発した肝炎モデルで試験した。抗FasLモノクローナル抗体、Fas模倣体ペプチド、または生理食塩水を腹腔内(IP)投与し、C57BL/6マウスを前治療した。30分後、実験動物にCon Aまたは生理食塩水を静脈内投与した。Con A治療の12時間後に、アラニンアミノ基転移酵素(ALT)およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素(AST)の血清中活性を測定することにより、肝臓傷害および炎症性肝炎の誘発を評価した。どちらのアミノ基転移酵素活性も、Kp7-6で前治療したマウスで減少した(図6A〜B)。これは、in vivoでKp7-6がFas介在の肝炎損傷を阻止したことを示している。Kp1-1は、肝炎損傷を阻止しなかった(図6A〜B)。これらの結果は、(上記実施例に示した)in vitroでのデータと一致した。したがって、Fas受容体を効果的に不活性化することが可能な、合理的に設計された小分子は、in vivoで機能するといえる。
【０１３４】
抗FasLモノクローナル抗体で前治療したマウスでの疾患の抑制は、不完全であった。これは、同じCon A誘発肝炎モデルにおいて疾患の抑制が不完全であったことを同様に示した、Fas欠損lpr/lprマウスを使用した遺伝学的実験結果(Tagawa他、上記)と一致する。Fas-FasL系が介在する以外の機構も、この過程に関わっている可能性がある。
【０１３５】
(実施例7)
Fas模倣体は眼内血管形成を阻害する
Fas Kp7を局所的に使用し、マウス眼モデルにおける血管形成を治療した。眼内に放出されると血管成長を導く線維芽細胞成長因子(FGF)で覆われたペレットを移植することで、血管形成を誘発した。当技術分野で周知の通常の方法を用い、新たに形成された、すなわち血管新生した血管からのFITC-デキストランの拡散より、血管新生の程度を測定した。例えばDe Fouw他、Microvasc.Res.38、136〜147、(1989);Tiedeken & Rovainer、Microvasc.Res.41、376〜389、(1991);Rizzo他、Microvasc.Res.49、49〜63、(1995)を参照のこと。Fas Kp7模倣体(1mg/ml、1日3回7日間)の局所的投与により、新血管形成が事実上阻害された。TNF阻害剤を用いての対照治療は、ここでも影響を与えなかった。
【０１３６】
(実施例8)
ウェルナー症候群細胞系におけるFas模倣体のアゴニスト活性
本発明のFas模倣体で治療した細胞のアポトーシスを測定する検査法により、Fas模倣体活性をさらに調査した。2つの特定の細胞系でFas模倣体活性を調査した。不死化したEBV形質転換ヒトBリンパ芽球様細胞系であるN6803(Kataoka他、Differentiation 62、203〜211、(1997))、および、ウェルナー症候群患者由来のEBV形質転換Bリンパ芽球様細胞系であるWS10201(Okada他、Biol.Pharm.Bull.21、235〜239、(1998);Hanma他、Mutat.Res.520、15〜24、(2002)参照)である。ウェルナー症候群は劣勢遺伝病で、若年性老化の原因となり、稀な癌の危険性を増加させる(Goto他、Hum.Genet.105、301〜307、(1999)参照)。
【０１３７】
抗FasアゴニストIgM抗体の存在下、96ウェルプレート(1ウェル当たり105個の細胞)のウェルで16時間培養したリンパ球分離用培地により、生細胞を分離した。このような抗体は、例えばベックマンコールター社(カルフォルニア州、Fullerton)で市販されている。抗Fas IgM抗体のみか、もしくは、10、100、または1000ng/ml用量のKp7-6 Fas模倣体と共に、細胞をインキュベートした。対照群の細胞も同条件の下、培地のみで(すなわち、抗Fas IgM抗体もFas模倣体も含まず)インキュベートした。TUNEL法(Gavrieli他、J.Cell Biol.119、493〜501、(1992);Gorczyca他、Cancer Res.53、1945〜1951、(1993);また、Ausubel他(編集)、Current Protocols in Molecular Biology、14.13.15頁も参照のこと)によりアポトーシスを評価した。
【０１３８】
N6803およびWS10201で測定したアポトーシスのレベルを、それぞれ図7Aおよび図7Bにグラフで示す。予想されたように、細胞系を抗Fas IgM抗体とインキュベートすると、培地のみでインキュベートした細胞と比較して、アポトーシスが増加した。抗Fas IgM抗体とFas模倣体の両方と共にインキュベートすると、N6803細胞系では、抗Fas IgM抗体のみとインキュベートした場合と比較して、アポトーシスは有意には変化しなかった(図7A)。しかしWS10201細胞系では、Fas模倣体は抗Fas IgM抗体と相乗効果を示し、Fas模倣体不在下で抗Fas IgM抗体と治療した場合と比較して、アポトーシスを大幅に増加させた(図7B)。
【０１３９】
これらのデータは、本発明のFas模倣体は、このような環境でアポトーシスを刺激することができることを示し、ある条件下でのアゴニスト効果を示唆するものである。特に、そしてどのような特別な理論または動作機構にも制限されずにだが、Fasのような受容体は、2つの状態で存在すると考えられている(Lef、Trends Pharmacol.Sci.16、89〜97、(1995)参照)。つまり、不活性単量体型と、シグナル伝達が可能な活性二量体型である。上記実験で用いた濃度のような低濃度では、Fas模倣体はシグナル伝達が可能なFasの二量体型に結合するものの、その受容体群を不活性単量体型に移行させない、と考えられる。このような条件下で、特にFasL不在下では、本発明のFas模倣体は少なくとも一時的にFas活性を刺激し、したがってアゴニスト効果を有するものと予想される。しかしより高濃度では、Fas模倣体はFasの平衡状態を、シグナル伝達が不可能な単量体型に移行させ、それによってFasシグナルを阻害し、アンタゴニスト効果を有するものと考えられる。このような「逆アゴニスト」の性質は当技術分野では知られており、CD4受容体など他の受容体のペプチド模倣体について、報告されている。例えば、Horie他、Exp.Mol.Pathol.73、93〜103、(2002)を参照のこと。
【０１４０】
(実施例9)
実験手順
材料。ヒト組換えTNFαはロシェダイアグノスティック社(インディアナ州、インディアナポリス)から入手した。Flag標識可溶性ヒトFasリガンド(FasL-Flag)、および、ヒトFas細胞外ドメイン-IgGFc融合タンパク質(Fas-Fc)は、カミヤバイオメディカル社(ワシントン州、シアトル)から購入した。ヒト組換えTNF受容体(I)細胞外ドメイン-IgGFc融合タンパク質(TNFRI-Fc)は、R&Dシステムズ社(ミネソタ州、ミネアポリス)から購入した。抗Flag-HRP抗体、過酸化水素水、3,3,'5,5'-テトラメチルベンジジン(TMBZ)、およびコンカナバリンAは、シグマバイオメディカル社(ミズーリ州、セントルイス)から購入した。
【０１４１】
細胞系。10%熱不活性化ウシ胎児血清、L-グルタミン(2mM)、ペニシリン(100U/ml)、およびストレプトマイシン(100μg/ml)を加えたRPMI1640培地で、37℃の加湿5%CO2雰囲気下、American Type Culture Collectionジャーカット細胞を培養した。
【０１４２】
マウス。生後8週のC57BL/6(B6)マウスを、CLEA JAPAN社(日本、東京)から購入した。すべてのマウスは、本発明者らの動物実験施設で特定病原体不在の条件下で管理した。
【０１４３】
分子モデリング。コンピュータモデリングおよび構造解析は、QUANTAおよびINSIGHT(モレキュラーシミュレーション社、カルファルニア州、サンディエゴ)を用いて行った。設計したペプチドモデルは、その配列およびCHARMMを用いた折りたたみから構築した。QUANTAに備えられたPonderのロータマー(Ponder,J.W.他、J Mol Biol 193、775〜791、(1987))データベースを使用し、先ずアミノ酸残基の側鎖を許容されたコンフォメーションに配置した。次に誘電率を80として、この折りたたまれたペプチドのエネルギー最小化を行い、収束させた。ヒトFas/FasLの分子モデルは、Modeller 3.0(Sali,A.他、J Mol Biol 212、403〜428、(1990);Sali,A.他、Trends in Biochem Sci 15、235〜240、(1990))を用い、Brookhavenデータベース(Bernstein,F.C.他、J Mol Biol 112、535〜542、(1977))より入手したTNF受容体結晶構造およびFas分子モデル(Bajorath上記)を使用し構築した。ループのコンフォメーションは、ループサーチアルゴリズムおよびCONGEN(Bruccoleri,R.E.他、Nature 335、564〜568、(1988))の両方を用いて構築した。ラマチャンドランプロット(ファイとプサイの逸脱検査のため)およびプロファイル解析(Zhang他、上記)を用い、モデルの質を評価した。XPLOR 3.1(Brunger,A.T.X-PLOR.Version 3.1.A System for X-ray Crystallography and NMR.(イェール大学出版、コネチカット州、New Haven、1992))、およびINSIGHTを使用する剛体エネルギー最小化によりFas/FasL複合体を最適化した。
【０１４４】
Fas-FasL相互作用の基本配列から、模倣体を設計した。表1に示すように、Kp1からKp7のループのコンフォメーションを模倣するため、Fasの約5ないし7アミノ酸の配列を使用した。
【０１４５】
ペプチド合成および環状化。ペプチドを固相法により合成し、脱保護し、無水HFを用いて樹脂から分離した。ペプチドを凍結乾燥し、C18カラムを用いたHPLCでさらに精製し、次いで再凍結乾燥した。HPLC分析および質量分析により、ペプチドは95%を超える純度であった。
【０１４６】
内部システインを有するペプチドは、既報(Takasaki他、上記)と同様に、再折りたたみを行い酸化した。簡単に説明すると、(NH4)2CO3でpH8.0に調節した蒸留水に、100μg/mlでペプチドを溶かし、分子内ジスルフィド結合が95%形成されたことをDTNB(シグマバイオメディカル社、ミズーリ州、セントルイス)で確認するまで、4℃で攪拌した。環状化ペプチドを凍結乾燥し、純度をHPLCで分析した。HPLC分析により、これらのペプチドは90%を超える純度であることが示された。
【０１４７】
固相リガンド結合検査法。PBSに希釈したFas-Fc融合タンパク質(250ng/ml)を、4℃で一晩インキュベートして、96ウェルELISAプレート(Costar社、英国、High Wycombe)に固定化した。1%脱脂乳を含むPBSで、4℃で一晩ブロックし、続いて0.05%Tween20を含むPBS(PBS-Tw)で洗浄した後、1%脱脂乳を含むPBSでプレインキュベートしたFlag標識可溶性FasL(100ng/ml)ペプチド溶液を、Fas-Fcでコートした上記ウェルに加えた。室温で2時間インキュベートした後、プレートをPBS-Twで洗浄し、1%脱脂乳を含むPBSに1:2500に希釈した抗FLAG(M2)-HRP抗体を加えた。室温で1時間インキュベートした後、プレートをPBS-Twで洗浄し、基質溶液(100μg/mlのTMBZおよび0.005%(v/v)のH2O2を含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝剤(pH5.0))を加え酵素反応を開始させ、2N H2SO4で停止させた。ELISA読み取り装置で、450nmでの吸光度を測定した。
【０１４８】
バイオセンサー解析。実験はすべてBIAcore3000解析装置(Biacore AG社、スウェーデン、ウプサラ)を用い25℃で行い、0.005%の界面活性剤P20(Biacore AG社)を含むpH7.4のPBSをランニング緩衝剤として使用した。標準の、N-エチル-N-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびN-ヒドロキシコハク酸イミドによる結合を用い、FasL-Flag、Fas-Fc、またはTNFRI-Fcを研究グレードのCM5センサーチップ(Biacore AG社)上に固定化した。固定化は10mMの酢酸ナトリウムで行い、FasL-FlagおよびFas-FcについてはpH4.5、TNFRI-FcについてはpH4.0であった。結合後、エタノールアミンを用い、過剰のN-ヒドロキシコハク酸イミドを不活性化した。結合実験のために、約1500共鳴ユニット(RU)のFasL-Flag、Fas-Fc、およびTNFRI-Fcをチップに結合した。表面プラズモン共鳴(SPR)を流速20mlmin-1で測定した。BIA evaluation 3.0ソフトウェア(Biacore AG社)を用いてデータを解析した。バックグラウンドを差し引くことにより、時間(秒)に対して、相対的レスポンス値が共鳴ユニット(RU)でセンサーグラムにより与えられる。結合過程注入時間は300秒であり、その後解離緩衝剤が続いた。
【０１４９】
細胞毒性検定。1×105細胞/mlのジャーカット細胞20μlを、96ウェルU底プレートに蒔いた。FasL-Flag(培養培地に120ng/ml)を同容量のペプチド試料と共に、37℃で1時間、PBSでプレインキュベートし、混合物20μlを各ウェルに加えた。24時間のインキュベーション後、1μCiの[3H]-チミジンで各培養を24時間同位体標識し、その後グラスファイバーフィルターで回収した。培養培地のみの場合、および30ng/mlのFasLが存在した場合での[3H]-チミジンの取り込みを、それぞれ100%および0%の生存率の対照として使用した。いくつかのペプチド用量に対する生存率(%)をグラフに描いた。放射性標識の取り込みは、液体シンチレーション計数法(Wallac社、フィンランド)により測定し、3つの培養について算術平均した1分当たりの計数値(cpm)として表した。
【０１５０】
アポトーシス測定のためのフローサイトメトリー検査法。アポトーシスの早期過程において細胞膜上に露出したホスファチジルセリン(PS)へのアネキシンV-FITCの結合を、ロシェ社(インディアナ州、インディアナポリス)より購入した市販キットを用い測定することにより、アポトーシス細胞を検出した。簡単に説明すると、1×105個のジャーカット細胞を、ペプチド試料の存在下または不在下で、FasL-Flag(250ng/ml)と共に3時間培養した。次いで細胞をPBSで洗浄し、最適濃度のカルシウム、FITC標識アネキシンV、およびヨウ化プロピジウム(PI)を含んだ100μlの結合緩衝剤に、室温で10分間再懸濁した。400μlの結合緩衝剤をさらに加えた後、FACScan(ベクトンディッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ社、カルフォルニア州、サンノゼ)により解析した。データ収集および解析には、CELLQuestソフトウェアプログラム(ベクトンディッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ社、カルフォルニア州、サンノゼ)を使用した。アネキシンVに対し陽性でありまたPIに対し陰性である細胞の割合として、早期アポトーシス細胞を表した。各条件で10,000個の細胞を解析した。
【０１５１】
Con A投与および血清中アミノ基転移酵素の測定。発熱物質を含まない生理食塩水に溶解させ、マウスに尾部静脈から投与させる1回用量0.5mgのCon Aを注射することにより、肝臓傷害を誘発した。抗FasLモノクローナル抗体(MFL-4;Kayagaki,N.他、Proc Natl Acad Sci USA 94、3914〜3917、(1997))またはFas模倣体ペプチド(Kp7-6またはKp1-1)を、発熱物質を含まない生理食塩水に希釈し、Con Aの30分前に、腹腔内に1回用量を注射した。
【０１５２】
Con A注射12時間後にマウスから血液試料を採取し、その血清を遠心分離により分離した。アラニンアミノ基転移酵素(ALT)およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素(AST)の血清中活性を、Lippi-Guidiの方法(Iatrozyme TA-LQ、ダイアヤトロン社、日本、東京)(Lippi,U.他、Clin Chim Acta 28、431〜437、(1970))により測定した。
【０１５３】
統計解析。結果を平均±SEとして表し、適当なところではスチューデントのt検定または分散分析(ANOVA)で解析した。シェフェ検定を使用し、ポストホック比較を行った。信頼区間95%を使用し、統計的に有意であると定義した。
【０１５４】
引用文献
本発明の説明では、特許、特許出願、および各種刊行物を含む数多くの参照文献を引用し、論じている。このような参照文献の引用、および/またはそれらに関する議論は、単に本発明の説明を明快にするために行うものであり、このような参照文献のいずれかが本明細書に記載の本発明の「先行技術」であることを承認するものではない。本明細書で引用、議論した参照文献はすべてそのまま参照により本明細書に組み込まれ、また同様に各参照文献は個々に参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】FasL/Fas複合体における結合部位の三次元構造を示す図である。(A)FasLダイマーとFasペプチド模倣体Kp1、Kp2、Kp3、Kp4、およびKp7の相互作用。(B)ペプチド模倣体Kp7-6の推定上の溶液構造。
【図２】結合アッセイにおける環外模倣体によるFas受容体に結合するFasLの阻害を示す図である。
【図３】固定化FasLに結合する模倣体の表面プラズモン共鳴(バイオセンサー)分析を示す図である。
【図４】アンタゴニストペプチドによるジャーカット細胞中でのFasL誘発性細胞溶解の阻害を示す図である。
【図５】ペプチド模倣体Kp7-6によるジャーカット細胞中でのFasL誘発性アポトーシスの阻害を示す図である。各パネルのバーより上側の数字はアポトーシス(annexin-V+)細胞の比率を示す。
【図６】(A)アラニンアミノトランスフェラーゼおよび(B)アスパルテートアミノトランスフェラーゼの血清活性により測定した、アンタゴニストFas模倣体ペプチドKp7-7によるCon A誘発性肝損傷に対するマウスの保護を示す図である。*対照と比較してP<0.0001;**Con Aで治療したマウスと比較してP<0.01。
【図７】抗Fas Igm抗体およびFas模倣体Kp7-6で治療した(A)N6803細胞および(B)WS10201細胞において測定したアポトーシスレベルを示す図である。
【０１５６】
［配列表］
2005534641.tif 000006
【図２】
2005534641.tif 000007
【図３】
2005534641.tif 000008
【図４】
2005534641.tif 000009
【図５】
2005534641.tif 000010
【図５】
2005534641.tif 000011
2005534641.tif 000012
【図７】
2005534641.tif 000013
【配列表】
2005534641000001.app
【国際調査報告】
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