(57)【要約】本発明は、マイクロアレイの品質を評価するための方法および組成物に関する。特に本発明は、逐次合成でモノマーごとにマイクロアレイ上で合成される品質管理プローブの使用に関する。品質管理プローブからのシグナルの程度を評価し、予想されるシグナル強度からの乖離を決定することによって、マイクロアレイ合成の品質を確認できる。更に本発明は、マイクロアレイの保存または処理中に発生する欠陥を検出する方法に関する。更に本発明は、合成、保存または処理中の1つまたは複数の欠陥を生じたマイクロアレイを識別するために、コンピュータを使用する方法に関する。
2005531315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる生体高分子プローブが付着している基板を含む、位置的にアドレス可能なアレイであり、前記複数の前記異なる生体高分子プローブは、前記表面上の異なる位置にあって、前記基板上での前記生体高分子プローブの逐次合成の産物であり、前記複数の異なる結合性プローブは複数の品質管理プローブを含み、前記複数の各品質管理プローブは、(i)同一の所定の結合性配列、または(ii)同一の結合特異性を有する異なる所定の結合性配列を含み、前記各品質管理プローブ中の前記所定の結合性配列の合成が、順次合成サイクルにおける前記逐次合成の間に開始されたものである、アレイ。
【請求項２】
前記複数の前記各品質管理プローブの配列は、前記所定の結合性配列からなる請求項1に記載のアレイ。
【請求項３】
前記複数の品質管理プローブは、前記所定の結合性配列と隣接する化学構造からなる第2の配列を含み、前記品質管理プローブの少なくとも幾つかは、前記品質管理プローブの他のものと前記化学構造の長さが異なる、請求項1に記載のアレイ。
【請求項４】
前記化学構造は、前記所定の結合性配列と隣接する0〜N個のモノマーの配列であり、Nは1以上の整数である、請求項3に記載のアレイ。
【請求項５】
位置的にアドレス可能な生体高分子アレイが、合成欠陥を有するか否かを判定する方法であって、記載の順に以下の工程:
a) 請求項1から2のいずれかに記載のアレイを、前記所定の結合性配列と結合する結合性相手を含む試料と接触させる工程、
b) 前記品質管理プローブの2個以上と試料中の前記結合性相手との結合を検出または測定する工程、および
c) 前記品質管理プローブの前記2個以上の結合を比較する工程であって、前記結合が類似の場合、前記アレイの前記順次合成サイクルの間に、合成欠陥のないことが示される工程
を含む方法。
【請求項６】
位置的にアドレス可能な生体高分子アレイが、合成欠陥を有するか否かを判定する方法であって、記載の順に以下の工程:
a) 請求項3に記載のアレイを、前記所定の結合性配列と結合する結合性相手を含む試料と接触させる工程、
b)  (i)前記モノマーの数が異なる、前記品質管理プローブの2個以上と、(ii)試料中の前記結合性相手との間の結合を検出または測定する工程、および
c) 前記品質管理プローブの前記2個以上の結合を比較する工程であって、前記結合が類似の場合、前記2個以上の品質管理プローブを合成するために用いた前記順次合成サイクルの間に、合成欠陥のないことが示される工程
を含む方法。
【請求項７】
前記比較工程が、前記2個以上の品質管理プローブ中の2個の結合比を決定することを含み、前記結合比は、前記2個の品質管理プローブ中の第1プローブの前記結合性相手との結合量を、前記2個の品質管理プローブ中の第2プローブの前記結合性相手との結合量で割った値であり、0.5〜2.0の間の前記結合比が前記合成欠陥のないことを示す請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記比較工程が、前記2個以上の品質管理プローブ中の2個の結合比を決定することを含み、前記結合比は、前記2個の品質管理プローブ中の第1プローブの前記結合性相手との結合量を、前記2個の品質管理プローブ中の第2プローブの前記結合性相手との結合量で割った値であり、0.5〜2.0の間の前記結合比が前記合成欠陥のないことを示す請求項6に記載の方法。
【請求項９】
工程(a)の前に、前記アレイを合成する工程を更に含む、請求項5または6に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、(i)1つまたは複数の細胞からの全細胞RNAまたはmRNA、あるいはそれに由来する複数の核酸と、(ii)前記細胞によって発現されない前記結合性相手とを含む、請求項5または6に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体高分子プローブが核酸である、請求項2、3または4に記載のアレイ。
【請求項１２】
前記所定の結合性配列は、長さがヌクレオチド10〜40個の範囲にある、請求項11に記載のアレイ。
【請求項１３】
前記生体高分子プローブは、ヌクレオチド20〜100個の範囲の配列からなる、請求項11に記載のアレイ。
【請求項１４】
前記所定の結合性配列は、長さがヌクレオチド25個である、請求項12に記載のアレイ。
【請求項１５】
前記所定の結合性配列は、配列番号1またはその相補体である、請求項14に記載のアレイ。
【請求項１６】
前記生体高分子プローブがタンパク質である、請求項2、3または4に記載のアレイ。
【請求項１７】
前記タンパク質が抗体である、請求項16に記載のアレイ。
【請求項１８】
前記品質管理生体高分子プローブの前記所定の結合性配列は、前記品質管理プローブではないアレイ上の生体高分子プローブの長さに対し、10〜75%の間の長さにある、請求項2に記載のアレイ。
【請求項１９】
前記所定の結合性配列は、モノマー25個からなり、前記品質管理プローブではないアレイ上の前記生体高分子プローブは、モノマー60個からなる、請求項18に記載のアレイ。
【請求項２０】
Nは、前記品質管理生体高分子プローブではないアレイ上の前記生体高分子プローブ中のモノマー数から、前記所定の結合性配列中のモノマー数を差し引いた数以下である、請求項4に記載のアレイ。
【請求項２１】
Nは、前記品質管理生体高分子プローブではないアレイ上の前記生体高分子プローブ中のモノマー数から、前記所定の結合性配列中のモノマー数を差し引いた数より大きい、請求項4に記載のアレイ。
【請求項２２】
Nが異なる前記品質管理プローブを3個含む、請求項4に記載のアレイ。
【請求項２３】
異なる品質管理プローブに対して、Nがそれぞれ0、20および35である、請求項22に記載のアレイ。
【請求項２４】
複数の異なる生体高分子プローブの、位置的にアドレス可能なアレイを作製する方法であって、前記複数の異なる生体高分子プローブを、逐次合成を用いてモノマーから基板上で合成する工程であって、前記異なる生体高分子プローブの各々が前記基板上の異なる位置で前記基板に付着する工程を含む方法であり、前記複数の異なる結合性プローブは複数の品質管理プローブを含み、前記複数の各品質管理プローブは、同一の所定の結合性配列を含んでおり、かつ、前記各品質管理プローブ中の前記所定の結合性配列の合成が、順次合成サイクルにおける前記逐次合成の間に開始される方法。
【請求項２５】
前記複数の前記各品質管理プローブの配列は、前記所定の結合性配列からなる請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数の品質管理プローブは、前記所定の結合性配列と隣接するモノマー0〜N個の第2の配列を含み、前記品質管理プローブの少なくとも幾つかは、前記品質管理プローブの他のものと前記モノマーの数が異なり、Nは1以上の整数である、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の品質管理プローブは、
(i) 配列が前記所定の配列からなる品質管理プローブ、および
(ii) 前記所定の結合性配列と隣接するモノマー0〜N個の第2の配列を含み、品質管理プローブの少なくとも幾つかは、前記品質管理プローブの他のものと前記モノマーの数が異なり、Nは1以上の整数である、前記品質管理プローブ
を含む、請求項1に記載のアレイ。
【請求項２８】
前記生体高分子プローブはオリゴヌクレオチドであり、前記所定の配列はヌクレオチド25個からなり、前記品質管理プローブではない前記生体高分子プローブは、ヌクレオチド60個からなる、請求項27に記載のアレイ。
【請求項２９】
配列番号1もしくは配列番号2のヌクレオチド配列、またはその相補体を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
複数の異なる生体高分子プローブが付着している基板を含む、位置的にアドレス可能なアレイであって、前記複数の前記異なる生体高分子プローブは、前記表面上の異なる位置にあって、前記基板上での前記生体高分子プローブへのモノマーの逐次付加の産物であり、前記複数の異なる生体高分子プローブは複数の品質管理プローブを含み、前記複数の各品質管理プローブは少なくとも1つの標識モノマーを含み、前記品質管理プローブへの前記標識モノマーの付加が、順次合成サイクルにおける前記逐次合成の間に開始されたものである、アレイ。
【請求項３１】
請求項30に記載の位置的にアドレス可能な生体高分子アレイが、合成欠陥を有するか否かを判定する方法であって、前記品質管理プローブの2個以上の前記少なくとも1つの標識モノマーからのシグナルを比較することを含み、前記シグナルが類似の場合、前記アレイの前記順次合成サイクルの間に、合成欠陥のないことが示される方法。
【請求項３２】
前記の比較が、前記2個以上の品質管理プローブ中の2個の結合比を決定することを含み、前記シグナル比は、前記2個の品質管理プローブ中の第1プローブから発するシグナル量を、前記2個の品質管理プローブ中の第2プローブから発するシグナル量で割った値であり、0.5〜2.0の間の前記シグナル比が前記合成欠陥のないことを示す請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記生体高分子プローブが核酸である、請求項30に記載のアレイ。
【請求項３４】
前記生体高分子プローブがヌクレオチド20〜100個の範囲の配列からなる、請求項33に記載のアレイ。
【請求項３５】
前記生体高分子プローブがタンパク質である、請求項30に記載のアレイ。
【請求項３６】
前記タンパク質が抗体である、請求項35に記載のアレイ。
【請求項３７】
前記合成欠陥がノズルの故障である、請求項5、6、31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記アレイが、周期Pで配列された前記品質管理プローブの少なくとも一部を含み、前記アレイは、ノズルP個のインクジェット・プリントヘッドを用いた逐次合成によって合成され、Pは1以上の整数である、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
Pが20に等しい、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
請求項1または2に記載の位置的にアドレス可能なアレイを用いて、ノズルの故障を検出する方法であって、記載の順に以下の工程:
a) 請求項1または2のいずれかに記載のアレイを、前記所定の結合性配列と結合する結合性相手を含む試料と接触させる工程であって、前記複数の品質管理プローブの少なくとも一部が、周期Pで配列され、前記アレイは、ノズルP個のインクジェット・プリントヘッドを用いた逐次合成によって合成され、Pは1以上の整数である工程、
b) 前記品質管理プローブの2個以上と試料中の前記結合性相手との結合を検出または測定する工程、および
c) 周期Pの前記品質管理プローブの前記2個以上の結合を比較する工程であって、前記結合が類似の場合、ノズル欠陥のないことが示される工程
を含む方法。
【請求項４１】
請求項30に記載の位置的にアドレス可能なアレイを用いて、ノズルの故障を検出する方法であって、周期Pである前記品質管理プローブの2個以上の、前記少なくとも1つの標識モノマーからのシグナルを比較することを含み、前記複数の品質管理プローブの少なくとも一部が、周期Pで配列され、前記アレイは、ノズルP個のインクジェット・プリントヘッドを用いた逐次合成によって合成され、前記シグナルが類似の場合、ノズル欠陥のないことが示され、Pは1以上の整数である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイ合成の品質を評価するための方法および組成物に関する。更に本発明は、マイクロアレイの保存または処理中に発生する欠陥を検出する方法に関する。特に本発明は、マイクロアレイの品質を評価するために、マイクロアレイ上で合成される品質管理プローブの使用に関する。更に本発明は、例えば合成、保存または処理中に発生する1つまたは複数の欠陥を有するマイクロアレイを識別するために、コンピュータを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、参照によりその全体を本明細書に組み込んである、2002年6月28日に出願した米国仮特許出願第60/392629号に対する優先権を請求するものである。
【０００３】
DNAアレイ技術によって、特に、多数の遺伝子転写物の発現レベルを任意の同時期に監視することが可能となった(例えば、Schena et al., 1995, Science 270:467-470; Lockhart et al., 1996, Nature BioTechnology 14:1675-1680; Blanchard et al., 1996, Nature BioTechnology 14:1649; 2000年11月28日に出願されたShoemaker他、米国特許出願第09/724538号 を参照されたい)。DNAアレイ技術は、遺伝子の発見、例えば遺伝子のエキソン構造の識別にも応用された(例えば、2000年11月28日に出願されたShoemaker他、米国特許出願第09/724538号; Meltzer, 2001, Curr. Opin. Genet. Dev. 11(3):258-63; Andrews et al., 2000, Genome Res. 10(12):2030-43; Abdellatif, 2000, Circ. Res. 86(9): 919-20; Lennon, 2000, Drug Discov. Today 5(2):59-66; Zweiger, 1999, Trends Biotechnol. 17(11):429-36 を参照されたい)。
【０００４】
数万個の遺伝子を同時に監視することによって、マイクロアレイ技術により、特に、細胞もしくは細胞型または任意の生物試料中でmRNA発現の全ゲノム規模の分析が可能となった。工夫を凝らしたデータ管理と分析の各方法論との助けを得て、細胞または細胞型の転写状態、ならびに薬物撹乱に限らないがそれも含めた外部撹乱に応じた該転写状態の変化を、mRNAレベルで特定することができる(例えば、米国特許第6203987号; Stoughton他、国際公開第00/24936号(2000年5月4日公開); Stoughton他、国際公開第00/39336号(2000年7月6日公開); Friend他、国際公開第00/24936号(2000年5月4日公開)を参照されたい)。このような技術の応用には、例えば、様々な生理状態、特に病的状態において上方調節または下方調節されている遺伝子の識別が含まれる。DNAアレイの追加の例示的用途には、シグナル伝達経路の構成物質の分析および様々な薬物に対する標的の識別が含まれる。例えば、Friend and Hartwell、国際公開第98/38329号(1998年9月3日公開); Friend and Stoughton、国際公開第99/59037号(1999年11月18日公開);米国特許第6132969号、第5965352号、第6218122号を参照されたい。
【０００５】
マイクロアレイは、支持体上の位置的にアドレス可能な結合(例えばハイブリダイゼーションによる)部位のアレイである。このような結合部位は各々、支持体上の所定領域に結合したプローブの生体高分子の複数の分子を含んでいる。マイクロアレイは、予備合成したプローブの支持体上への固定化や、プローブの支持体上でのその場合成を含む幾つかの方法で作製できる。例えば、予備合成プローブの固定化は、DeRisi他(1997, Science 278(5338):680-6)に記載のようにロボット利用で、またはインクジェットで行うことができる。その場合成は、インクジェット技術の使用を含む様々な手段、または光活性化合成によって実現できる(Holmes et al., 1995, Biopolymers 37(3):199-211; Jacobs et al., 1994, Trends Biotechnol. 12(1):19-26; Fodor et al., 1991, Science 251(4995)767-73)。その場合成のいずれの場合でも、化学反応は、生体高分子に1つまたは複数のモノマーを付加する場である支持体上で行われる。しかし、生体高分子鎖が成長するときに、合成サイクル中の1つまたは複数のサイクルが失敗に終わり(部分的か完全に)、そのため意図したモノマーの1つまたは複数が欠けたプローブを生成し得る危険性がある。合成効率は、試薬純度、反応時間、インクジェット・ヘッドの正しい位置合わせ等を含む多数の要因に依存する。これらの工程のいずれかに欠陥があると、成長中の生体高分子鎖に1つまたは複数のモノマーを非効率に付加することになり得る。
【０００６】
その上、インクジェット合成のマイクロアレイの場合、インクジェット・ヘッドのノズル中の一個が適切に試薬を吐出できないときにも(例えば、当のノズルが一時的または恒久的に塞がった場合)、合成欠陥が起こり得る。ノズルの故障とは、個々のインクジェット・ノズルの何らかの機能的故障を指す。ノズルが生体高分子への添加に必要な所望の溶液を吐出できない場合、それが「詰まって」いると呼ぶこともある。ノズルの故障は、マイクロアレイ合成の何時の時点でも起こり得る。合成開始時の故障は、ノズルからの新しい試薬の注入が不十分なためのこともある。ノズルの故障は、1組のマイクロアレイの印刷が始まった後でも、例えば気泡や粒子が捕捉されると起こり得る。ノズルの故障は、マイクロアレイの合成前に検出し、修正することができる。各合成バッチの開始前および各合成バッチの終了時に、プリントヘッド上の各ノズルが適切に機能しているか確かめるために、試験することができる。この試験は、各ノズルから少量の液体を強制的に押出す前に、ヘッド・アセンブリの頂部に清浄な基板を置くことによってなすことができる。全てのノズルが適切に機能していれば、各ノズルに対応する液滴が生じるであろう。しかし、1個または複数のノズルの機能が故障すれば、そのノズルに対応する液滴は生じない。液滴が小さいために、ノズルの故障を人的誤りにより時には見過ごすことがあり、それでノズルの故障の証拠を示すアレイが合成されることになろう。現状では、合成が失敗したか否か、もしそうならばマイクロアレイ合成の過程中のどこで、いつ起こったかを決定するために、信頼性のより高い方法が必要とされている。予備合成プローブの品質管理はDNAの通常の配列決定、質量分析法または他の手段により実施可能であるが、その場合成されるプローブの品質を評価する方法は未だない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願では、マイクロアレイ合成の品質を評価するために設計した方法について説明する。本明細書で開示する発明では、マイクロアレイ上での品質管理プローブの設計および製造方法と、マイクロアレイ処理から得られる情報であって、全体的な合成品質の判定ならびに欠陥のあった可能性が最も高い合成サイクルの同定を可能とする情報の分析方法とを説明する。本発明は、マイクロアレイ上での品質管理プローブの位置と同定に関する情報を含んだデータベースも含んでいる。
【０００８】
本明細書で参考文献を引用または考察する場合、そのような文献が本発明の先行技術であると認めたものと見なすものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、生体高分子プローブが逐次合成でモノマーごとにアレイ基板上で合成されるマイクロアレイの品質を評価するための方法および組成物に関する。特に、マイクロアレイの個々の合成サイクルの蓄積における失敗や非効率が、マイクロアレイ上に品質管理プローブを含めることにより検出される。品質管理プローブは、他の生体高分子プローブと同時にマイクロアレイ基板上で合成され、したがって発生し得る合成上の失敗や非効率の対象となりうる。品質管理プローブからのシグナルの程度を評価し、予想されるシグナル強度からの乖離を決定することによって、マイクロアレイ合成の品質を確認できる。
【００１０】
一実施形態では、品質管理プローブの各群は同じ所定の結合性配列を含み、それに対する結合性相手が、分析のためにマイクロアレイと接触するように試料中に存在するか、または導入される。各品質管理プローブ中の所定の結合性配列の合成は、合成の順次サイクルにおける逐次合成中に開始される。品質管理プローブ中の所定の結合性配列に結合できる生体高分子の結合度を評価することによって、マイクロアレイ合成の品質を判定できる。他の実施形態では、品質管理プローブは所定の結合性配列を含んでいない。検知可能なシグナルは、所定の結合性配列に結合する標識された結合性相手ではなく、品質管理プローブ自体によって発生される。これは、例えば、1つまたは複数の標識モノマーを品質管理プローブ中に組み込み、品質管理プローブを蛍光色素などで染色することにより実現できる。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明はオリゴヌクレオチド・マイクロアレイ上の合成の失敗を検出する方法に関する。より好ましい実施形態では、本発明は、インクジェットによるオリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中における、ノズル故障を含む合成欠陥を検出する方法に関する。合成の失敗以外に、マイクロアレイ品質に影響する他の欠陥、例えばマイクロアレイの保存または処理中におけるプローブの分解による欠陥も検出できる。
【００１２】
本発明は、複数の異なる生体高分子プローブが付着した基板を含む、位置的にアドレス可能なアレイであって、前記複数の前記異なる生体高分子プローブが、前記表面上の異なる位置にあって、前記基板上の前記生体高分子プローブの逐次合成の生成物であり、前記複数の異なる結合プローブは複数の品質管理プローブを含み、かつ、前記複数の品質管理プローブの合成が、順次合成サイクルにおける前記逐次合成中に開始されたものである、前記アレイを提供する。所定の結合性配列を含む前記複数の各品質管理プローブは、好ましくは同じ所定の結合性配列を含むか、あるいは異なる所定の結合性配列であるが、同じ結合特異性または類似の結合特性を有する配列を含む(例えば、同じ結合条件下で類似の強度でそれぞれの結合性相手と結合する)。一実施形態では、異なる長さの所定の結合性配列が使用できる(例えば、25merや24mer)。
【００１３】
アレイの特定の一実施形態では、前記複数の前記各品質管理プローブの配列は、前記所定の結合性配列からなる。
【００１４】
特定の他の実施形態では、該複数の品質管理プローブは、前記所定の結合性配列に隣接した化学構造からなる第2の配列であって、品質管理プローブの少なくとも一部はその他の品質管理プローブと前記化学構造の長さが異なるものである、第2の配列を含む。特定の一実施形態では、該化学構造は、前記所定の結合性配列に隣接したモノマー数0からNで、Nが1以上の整数の配列である。特定の一実施形態では、該生体高分子プローブはオリゴヌクレオチドであり、前記所定の結合性配列は25ヌクレオチドからなり、前記品質管理プローブでない前記生体高分子プローブは60ヌクレオチドからなる。特定の一実施形態では、Nは、前記品質管理生体高分子プローブでないアレイ上の前記生体高分子プローブ中のモノマー数から、前記所定の結合性配列中のモノマー数を差し引いた数より大きくない。特定の他の実施形態では、品質管理プローブは、前記品質管理生体高分子プローブでないアレイ上の前記生体高分子プローブより多数のモノマーを含む。特定の更なる実施形態では、アレイはNが異なる前記品質管理プローブの3, 10, 30, 60またはもっと多数の個数を含んでいる。特定の実施形態では、異なる品質管理プローブに対して、Nがそれぞれ0、20および35である。
【００１５】
特定の更に他の実施形態では、該複数の品質管理プローブは、
(i) 配列が前記所定の配列からなる品質管理プローブ、および
(ii) 前記所定の結合性配列に隣接したモノマー数0からNの第2の配列を含む品質管理プローブであって、前記品質管理プローブの少なくとも一部はその他の前記品質管理プローブと前記モノマー数が異なり、Nが1以上の整数の配列である前記品質管理プローブ
を含む。
【００１６】
特定の様々な実施形態では、生体高分子プローブは核酸、タンパク質または抗体である。所定の結合性配列は、好ましくは長さが10〜40ヌクレオチドの範囲にあり、更に好ましくは長さが25ヌクレオチドである。特定の実施形態では、所定の結合性配列は、配列番号1もしくは配列番号2またはそれらの相補体である。
【００１７】
一実施形態では、生体高分子プローブは20〜100ヌクレオチドの範囲の配列からなる。
【００１８】
好ましくは、品質管理生体高分子プローブの所定の結合性配列は、品質管理プローブではないアレイ上の生体高分子プローブの長さに対し、10〜75%の間の長さにある。
【００１９】
特定の実施形態では、該所定の結合性配列は25モノマーからなり、品質管理プローブではないアレイ上の生体高分子プローブは60モノマーからなる。
【００２０】
本発明は、位置的にアドレス可能な生体高分子アレイが合成欠陥を有しているか否かを判定する、以下のステップ:
a) 前記所定の結合性配列と結合する結合性相手を含む試料と、本発明のアレイを接触させるステップ、
b) 前記品質管理プローブの2種以上と試料中の前記結合性相手との結合を検出または測定するステップ、および
c) 前記品質管理プローブの前記2種以上の結合を比較するステップであって、前記結合が類似であれば、前記アレイの前記順次結合サイクルの間に合成欠陥がないことを示すステップ
を順に含む方法も提供する。
【００２１】
本発明は、位置的にアドレス可能な生体高分子アレイが合成欠陥を有しているか否かを判定する、以下のステップ:
a) 前記所定の結合性配列と結合する結合性相手を含む試料と、モノマー数0からNの隣接配列を含む品質管理プローブを含んだ上記アレイを接触させるステップ、
b)  (i)前記モノマー数が異なる前記品質管理プローブの2種以上と、(ii)試料中の前記結合性相手との結合を検出または測定するステップ、および
c) 前記品質管理プローブの前記2種以上の結合を比較するステップであって、前記結合が類似であれば、前記2種以上の品質管理プローブを合成するために用いた、前記順次合成サイクルの間に合成欠陥がないことを示すステップ
を順に含む方法を更に提供する。
【００２２】
本発明は、位置的にアドレス可能な生体高分子アレイがノズル故障で起こる合成欠陥を有しているか否かを判定する、以下のステップ:
a) 前記所定の結合性配列と結合する結合性相手を含む試料と、本発明のアレイを接触させるステップであって、前記複数の品質管理プローブの少なくとも一部は周期Pで配置されており、前記アレイはノズルP個を有するインクジェット用プリントヘッドを用いて逐次合成で合成され、Pが1以上の整数であるステップ、
b) 前記品質管理プローブの2種以上と、試料中の前記結合性相手との結合を検出または測定するステップ、および
c) 周期Pをなす前記品質管理プローブの前記2種以上の結合を比較するステップであって、前記結合が類似であれば、ノズル欠陥がないことを示すステップ
を順に含む方法を更に提供する。
【００２３】
前記方法において、比較ステップは、前記2種以上の品質管理プローブ中の2種の結合比を決定することを含むことができ、前記結合比は、前記2種の品質管理プローブのうち第1プローブの前記結合性相手との結合量を、前記2種の品質管理プローブの第2プローブの前記結合性相手との結合量で割ったものであり、前記結合比が0.5と2.0の間であることが前記合成欠陥のないことを示す。
【００２４】
特定の実施形態では、前記方法は、ステップ(a)の前に前記アレイを合成するステップを更に含む。
【００２５】
特定の実施形態では、該試料は、(i)1つまたは複数の細胞からの全細胞RNAもしくはmRNA、またはそれから誘導される複数の核酸、および(ii)前記細胞によって発現されない前記結合性相手を含む。
【００２６】
また、本発明は、複数の異なる生体高分子プローブの位置的にアドレス可能なアレイを作製する方法であって、前記複数の異なる生体高分子プローブを逐次合成を用いてモノマーから基板上で合成し、前記異なる生体高分子プローブの各々が前記基板上の異なる位置で前記基板に付着することを含む方法であり、前記複数の異なる生体高分子プローブは複数の品質管理プローブを含み、前記複数の各品質管理プローブは同じ所定の結合性配列を含んでおり、かつ、前記品質管理プローブの各々における前記所定の結合性配列の合成が、順次合成サイクルにおける前記逐次合成中に開始される方法を提供する。こうして作製したアレイは、上記の特性を有することができる。
【００２７】
本発明は、更に、配列番号1もしくは配列番号2またはそれらの相補体のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の目的は、生体高分子プローブが逐次合成でモノマーごとにアレイ基板上で合成されるアレイに対して、マイクロアレイ合成の品質を評価することである。本目的は、評価対象のマイクロアレイ上での品質管理プローブの合成により実現される。品質管理プローブは、マイクロアレイ上の他の生体高分子プローブと同様に、かつそのようなプローブと共に合成される。
【００２９】
品質管理プローブは所定の結合性配列を含んでいてもよい。この所定の結合性配列は、マイクロアレイ処理中に該所定の結合性配列の存在を検出するために用いることのできる結合性相手を有する。一部の実施形態では、品質管理プローブは、所定の結合性配列と隣接した化学構造も含む(このような化学構造をここでは「スペーサー」と称する)。スペーサーは、好ましくは、所定の結合性配列に付着した(と隣接した)追加のモノマーからなるポリマー(例えば配列)である。マイクロアレイ合成が完了すると、品質管理プローブは標識した結合性相手と結合することにより検出される。結合度は各品質管理プローブについて定量され、他の品質管理プローブの結合強度と比較される。類似の結合強度であれば、合成を通して合成が同等に効率的であったことを示す。
【００３０】
特定の他の実施形態では、品質管理プローブは所定の結合性配列を含まない。このような実施形態では、この種の品質管理プローブに認められるシグナルは、1) 品質管理プローブを構成するモノマーにより直接、または2) 品質管理プローブを構成するモノマーと相互作用または付着する標識(例えば色素)により発せられる。予想した結合強度からの乖離は、アレイ中の欠陥、例えば合成欠陥または保存もしくは処理中の分解を示す。
【００３１】
全般的に1群の品質管理プローブを使用して本発明を説明するが、異なる群の品質管理プローブも単一のアレイ上で使用できることは理解されよう。異なる群の品質管理プローブは、異なる所定の結合性配列を有してもよいし、あるいは所定の結合性配列を有する品質管理プローブと有していないものとの混合物であってもよい。また、品質管理プローブは長さの異なる混合物であってもよい(例えば、25merまたは24merの所定の結合性配列を含む品質管理プローブの混合物)。
【００３２】
5.1所定の結合性配列を有する品質管理プローブ
5.1.1所定の結合性配列
所定の結合性配列を有する品質管理プローブは、所定の結合性配列を含み、意図するマイクロアレイ処理の結果を妨害しない生体高分子である。結合における交差反応性を避けるために、アッセイ試料の生体高分子は、マイクロアレイ上の品質管理プローブと結合すべきではない。また、品質管理プローブと結合し、それを検出するために用いる所定の結合性配列の逆相補体は、マイクロアレイ上の試験プローブ(即ち、試料の生体高分子と結合するように設計したマイクロアレイ上のプローブ)と結合すべきではない。本発明の方法では、品質管理プローブは、合成すべきマイクロアレイ上で分析する試料の由来、調製および処理の組合せ要件に従って作製される。マイクロアレイ上で分析する試料が天然の核酸またはタンパク質を含む場合、品質管理プローブの所定の結合性配列は、各々、天然の核酸中に存在しないか、または存在していることが知られていないか、あるいは天然のタンパク質をコードすることが知られていないことが好ましい。他の実施形態では、品質管理プローブの所定の結合性配列は、試料中に存在しないか、または存在していることが知られていない。これは、所定の結合性配列が交差反応性を示す可能性を減らすためになされる。交差反応性は、ある生体高分子がマイクロアレイ処理中に存在する複数の他の生体高分子と相互作用する(例えば、ハイブリダイゼーションするか、結合する)能力を有することを示す。例えばオリゴヌクレオチド・マイクロアレイの処理中に、所定の結合性配列が、生物試料中のそれと相補的な核酸ならびに異なる配列とハイブリダイゼーションするならば、該プローブは交差反応性を示すと言われる。試料処理で観察されるシグナル強度を変え、マイクロアレイ合成品質の評価に影響するので、プローブの交差反応性は好ましくない。
【００３３】
一実施形態では、所定の結合性配列を構成するモノマーからなる潜在的配列が、ランダム合成した配列のプールから同定できる。次いで、このような潜在的な所定の結合性配列は、処理すべき生物試料との、または処理中の生物試料にある天然配列を検出するために設計したプローブとの交差反応性について、アッセイをすることができる。好ましくは、試料中に含まれるアッセイ中の生体高分子と実質的には交差反応性を示さない所定の結合性配列が、品質管理プローブ中に使用される。したがって、マイクロアレイ合成時には、品質管理プローブの配列は、その配列が当初ランダム合成の生成物であったためにランダムであるとしても、既知となっている。ランダム配列は、実際に生成する配列に関して特定の設計を予め計画せずに生成する生体高分子残基(例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の残基)であり、即ち、モノマー(例えば、ヌクレオチド、アミノ酸)がランダムと言うとき、どんなモノマーがその残基に現れるか予測がつかない。ランダム配列は、考え得る各残基が生体高分子中の各位置に組み込まれる等しい可能性を有するような、偏向のない合成方式によって合成できる。あるいは、ランダム配列は、生体高分子中の一定の位置が残基の一方を他方より優先するという可能性が高い、偏向した合成方式によって合成できる。その上、いずれであれ1種の生体高分子を合成するために、偏向のない合成方法と偏向した合成方法とを併用できる。一実施形態では、末端のいずれか一方または内部位置にある配列を、標準的な生物学的分子操作を促進するために、所定の結合性配列に付加してもよい。一旦生成すると、ランダムに生成しても、品質管理プローブの配列は決定される。次いで、該配列の交差反応性を試験し、今後の使用のために記録を取ることが好ましい。次いで、各マイクロアレイに対して、交差反応性がないと実験的に判定した所定の結合性配列の1種または複数を、マイクロアレイ上で合成し、合成品質やアレイ中の合成以外の他の欠陥を今後評価するのに備える。
【００３４】
他の実施形態では、所定の結合性配列は、マイクロアレイ上で処理する予定の試料にとって内因性でない天然配列であってもよい。例えば試料が真核生物に由来するなら、細菌の配列(またはその断片)を所定の結合性配列として使用できる。交差反応性は念のため評価でる。
【００３５】
したがって、品質管理プローブの所定の結合性配列に対する結合性相手が、マイクロアレイに結合させるためのアッセイ対象の試料中に内因的に存在しない場合、品質管理プローブ中の所定の結合性配列に対する結合性相手は、試料をマイクロアレイと接触させる前、またはその最中の任意の時に試料中に導入される。一実施形態では、結合性相手は試料の処理中に試料に添加される。より好ましい実施形態では、結合性相手は、試料をマイクロアレイと接触させる直前に試料に添加される。
【００３６】
所定の結合性配列は、任意の種類の生体高分子で作製することができる。好ましくは、品質管理プローブの分子的性質は、マイクロアレイ上の他の生体高分子プローブと一致するものである。所定の結合性配列は、例えばヌクレオチド(即ちDNAやRNA)、アミノ酸、グリカン、糖類または有機低分子で構成できる。
【００３７】
一実施形態では、所定の結合性配列は核酸、好ましくはオリゴヌクレオチドであり、核酸マイクロアレイは、ハイブリダイゼーション実行可能な条件で所定の結合性配列に相補的な配列を含む核酸を含んだ試料と接触させ、品質管理プローブへのハイブリダイゼーション量を比較する。
【００３８】
他の実施形態では、所定の結合性配列はタンパク質(ポリペプチドやペプチド)であり、タンパク質マイクロアレイは、結合可能な条件で前記タンパク質に対する結合性相手を含む試料と接触させ、品質管理プローブへの結合量を比較する。一実施形態では、結合部分は抗体、好ましくはモノクローナル抗体により認識されるエピトープである。好ましくは、エピトープは、所定の結合性配列をなすエピトープに対する抗体の、検出中における試料エピトープとの交差反応性を最小限とするために、特異なものである(即ち、試料にタンパク質材料を提供する細胞や組織中で内因的に発現しない)。
【００３９】
所定の結合性配列の長さは、アッセイ対象の試料中で結合性相手を検出するために使用する、マイクロアレイ上の他の生体高分子プローブの長さに応じて変化し得る。所定の結合性配列は、通常、マイクロアレイ上の他の生体高分子プローブより少数のモノマーで構成される。このため、所定の結合性配列は、マイクロアレイ上の他の生体高分子プローブを構成する全モノマーの部分集合に過ぎないことになる。したがって、完全長の各生体高分子プローブを表すためには、所定の結合性配列が複数必要となる。このため、所定の結合性配列を合成するためにどの合成サイクルが使用されたのかに応じて、異なる品質管理プローブが探す対象となる合成サイクルが異なることになる。完全長の生体高分子プローブの異なる部分に関する情報を確かめるためには、異なる所定の結合性配列間で結合強度を比較することができる。所定の結合性配列は、マイクロアレイ上の他の生体高分子プローブの長さの5〜95%、10〜75%、、25〜65%、35〜60%、40〜55%または41〜48%の間であることが好ましい。他の実施形態では、マイクロアレイ上の他のプローブが生体高分子残基60個の長さであるとき、所定の結合性配列は生体高分子残基15個である。他の実施形態では、所定の結合性配列は、マイクロアレイ上のその他のプローブの長さが生体高分子残基60個のとき、生体高分子残基25個である。品質管理プローブ以外のマイクロアレイ上の生体高分子プローブの長さは、核酸の場合、好ましくはヌクレオチド10〜500個、より好ましくはヌクレオチド10〜250、20〜100、40〜80、50〜70または60個である。
【００４０】
5.1.1.1意図的な欠失を有する所定の結合性配列
一部の実施形態では、所定の結合性配列は、マイクロアレイ処理中に品質管理プローブの検出に使用する結合性相手と結合する配列に対して、1個または複数のモノマーを意図的に欠失している。したがって特定の実施形態では、所定の結合性配列は、ハイブリダイゼーションによる品質管理プローブの検出に使用する核酸に完全に相補的な配列に対して、ヌクレオチドを内部に欠失している。このために不完全な結合対によりシグナル強度が確かに減少するが、それでもシグナルを観察することができる。マイクロアレイ合成中の故障により欠失が更に追加されれば、所定の結合性配列と結合性相手との差異が激化し、したがってマイクロアレイ処理中に観察されるシグナルが激減するように作用するであろう。一実施形態では、オリゴマイクロアレイ上で、所定の結合性配列は24mer(即ち、1個のモノマーが意図的に欠失している)で結合配列は25merである。
【００４１】
一実施形態では、マイクロアレイ上の各品質管理プローブは、このような意図的な欠失を1個または複数含む所定の結合性配列を含んでいる。他の実施形態では、マイクロアレイ上の品質管理プローブは、このような意図的な欠失を1個または複数含む所定の結合性配列を含んだものと、意図的な欠失を含まない所定の結合性配列を含んだものとの混合物である。
【００４２】
5.1.2スペーサー
一部の実施形態では、品質管理プローブは所定の結合性配列と隣接する化学構造を含む。この化学構造をここではスペーサーと称する。スペーサーは、0〜N個のモノマー(例えば、ヌクレオチドやアミノ酸の残基)で構成されるのが好ましい（Nは1以上の整数である）。好ましくは、付加されるスペーサーが、品質管理プローブの全配列の75%未満、50%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満または1%未満である。スペーサーは、所定の結合性配列の片側にあっても、両側にあってもよい。核酸プローブの場合、スペーサーは所定の結合性配列の5'または3'、あるいは5'と3'の両方であってもよい。一実施形態では、スペーサーは所定の結合性配列の3'だけである。タンパク質プローブの場合、スペーサーは所定の結合性配列のアミノ末端'またはカルボキシ末端、あるいはアミノ末端とカルボキシ末端の両方であってもよい。特定の実施形態では、スペーサーはヌクレオチドまたはタンパク質の配列である。
【００４３】
一実施形態では、Nの上限値は、マイクロアレイ上で合成される品質管理プローブ以外の生体高分子プローブ(即ち、所定の結合性配列を含まないもの)の長さによって決定される。品質管理プローブの全長は、好ましくはマイクロアレイ上の他の生体高分子プローブの全長以下である。したがって特定の実施形態では、Nと所定の結合性配列中のモノマー数との和は、アレイ上の品質管理プローブ以外の生体高分子プローブにある全モノマー数と等しくなるべきである。
【００４４】
他の実施形態では、Nの値は、品質管理プローブ以外のマイクロアレイ上で合成される生体高分子プローブ(即ち、所定の結合性配列を含まないもの)の長さに規制されない。この実施形態では、品質管理プローブは、マイクロアレイ上の他の生体高分子プローブより短くても長くてもよい。
【００４５】
スペーサーは、試料中のアッセイされている生体高分子と交差反応性を示さないことが好ましい。マイクロアレイの処理中には、スペーサーからのシグナルが検出されないことが好ましい。その上、スペーサーは、マイクロアレイの処理中に、結合性相手と結合している所定の結合性配列から発生するシグナルを妨害すべきではない。一実施形態では、スペーサーを構成する化学構造は、スペーサーが結合性相手と結合できないように改変されるために、このようなシグナルの妨害が防止される。例えば、ハイブリッドを形成する能力のない改変核酸は、スペーサーに使用でき、交差反応性を示さないであろうが、そのような核酸は、例えば非塩基性ヌクレオチドである(即ち、ヌクレオチド塩基を欠いているが、糖部およびリン酸エステル部を有する部分)(米国特許第6248878号; Takeshita et al, 1987, J. Biol. Chem. 262:10171; 非塩基性ヌクレオチドがGlen Research in Sterling, Virginiaから市販されている、ことを全般的に参照されたい)。他の実施形態では、スペーサーは、品質管理用でないマイクロアレイ上の他の生体高分子プローブに存在するモノマー、および/または所定の結合性配列を構成するモノマーとは異なる化学的部分から作製できる。例えば、ヌクレオチドマイクロアレイでは、スペーサーはポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ポリ炭化水素の化合物などの非ヌクレオチド部分から作製できる。具体的な例には、Seela and Kaiser, 1990, Nucleic Acids Res. 18:6353; Seela and Kaiser, 1987, Nucleic Acids Res. 1987, 15:3113; Cload and Scheparts, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:6324; Richardson and Scheparts, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113;5109; Ma et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21:2585; Ma et al., 1993, Biochemistry 32:1751; Durand et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18:6353; McCurdy et al., 1991, Nucleosides & Nucleotides 10:287; Jaschke et al., 1993, Tetrahedron Lett. 34:301; Ono et al., 1991, Biochemistry 30:9914; Ferentz and Verdine, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:4000; 米国特許第6362323号; 国際公開第89/02439号に記載のものが含まれる。
【００４６】
一旦生成したら、品質管理プローブの配列全体を決定し、交差反応性について試験し、今後の使用のために記録することが好ましい。
【００４７】
5.2所定の結合性配列を有しない品質管理プローブ
一部の実施形態では、品質管理プローブは、所定の結合性配列を有しておらず、専らスペーサーから作製されている。この種の品質管理プローブで認めるシグナルは、1) 品質管理プローブを構成する化学構造(例えばモノマー)から直接的に、または2) 品質管理プローブを構成する化学構造(例えばモノマー)と相互作用する標識色素の使用により間接的に、発せられる。この種の品質管理プローブは、標識した結合性相手を使用せずにシグナルを発することができる。
【００４８】
したがって一実施形態では、品質管理プローブは標識モノマーで合成される。標識モノマーは、例えば蛍光標識(例えば、Cy3やCy5)ヌクレオチドまたは蛍光標識アミノ酸となり得る。使用し得る他の標識には、それだけに限らないが、電子豊富な分子や放射性同位体が挙げられる。各品質管理プローブは、合成中にひとつまたは複数の標識モノマーを組み込む。
【００４９】
特定の実施形態では、標識モノマーを品質管理プローブ中に組み込む合成サイクルは、各品質管理プローブにより変動する。各合成サイクルは、その合成サイクルにおいてモノマー中の標識を入れた品質管理プローブの少なくともひとつ、好ましくは複数で占められる。もし合成欠陥が発生すれば、標識モノマーは組み込まれず、その欠陥を検出できる。好ましい態様では、各品質管理プローブの長さが同じである。
【００５０】
他の特定の実施形態では、品質管理プローブは、マイクロアレイ上の試験プローブ(即ち、品質管理プローブではないマイクロアレイ上のプローブ)を構成するのと同数のモノマーから作製され、そのモノマーのひとつが標識されている。
【００５１】
他の特定の実施形態では、品質管理プローブは、各合成サイクルで終了する品質管理プローブが少なくともひとつ、好ましくは複数あるように長さが変動する。このような品質管理プローブでは、各品質管理プローブの最後のモノマーは標識モノマーである。
【００５２】
他の実施形態では、品質管理プローブは、所定の結合性配列なしに未標識のモノマーを用いて合成される。発生するシグナルは、シグナルを発生する、例えば蛍光を発するモノマーの固有の能力に依存している。長さが様々の核酸の品質管理プローブを合成することができ、マイクロアレイを標識プローブとハイブリダイゼーションすることによって、処理前に走査できる。観察される蛍光の程度は、長いプローブほどモノマー(ヌクレオチド)数が増加するために、品質管理プローブの長さと相関するはずである。
【００５３】
他の実施形態では、品質管理プローブのモノマーに直接結合する標識色素が、検出可能なシグナルを発生するために使用できる。例えば、核酸マイクロアレイについては、POPO, SYBR Green I, SYBR Green II, SYTO 59, SYTO 61 (Molecular Probes, Inc. in Eugene, ORから入手可能)などの様々な核酸蛍光染色剤を使用できる。マイクロアレイの合成効率を評価した後、マイクロアレイの試験試料とのインキュベーションの前に、色素を除去できる。
【００５４】
5.3マイクロアレイ上での品質管理プローブ合成
マイクロアレイ基板上への生体高分子プローブの逐次合成中に、マイクロアレイ上の1区域または複数の区域で合成サイクルの1回または複数回に誤ったモノマー付加が起こり得る。このような合成過誤が起こったか否かを認識するために、本発明の品質管理プローブがマイクロアレイ上の異なる場所で合成され、異なる品質管理プローブのシグナルが比較される。予想したシグナルからの有意な乖離は合成欠陥を示す(5.4節を参照されたい)。
【００５５】
5.3.1垂直的配置
一実施形態では、所定の結合性配列に結合するか、または標識モノマーを組み込むことによって、検出可能なシグナルを発生する品質管理プローブは、全合成サイクルの効率を評価するために、相互に垂直的に置き換えることができる。一実施形態では、所定の結合性配列の合成は、異なる合成サイクルの逐次的モノマー付加中に開始される。したがって、1群の品質管理プローブについて各所定の結合性配列は同一であるが、マイクロアレイ上で該所定の結合性配列を創出する合成サイクルは、相互に垂直的に置き換えられる。一実施形態では、標識モノマーを品質管理プローブ中に組み込む合成サイクルは、各合成サイクルが少なくとも1つの品質管理プローブ中に標識モノマーを組み込み終えるように変更される。これらの方法は、誤ったモノマー付加を受けた合成サイクルを正確に指示するために使用できる。
【００５６】
一実施形態では、この垂直的置き換えはスペーサーの使用により実現される。例えば、スペーサー中のモノマー数を変えることによって、所定の結合性配列の合成が始まるマイクロアレイの合成サイクルも変化しよう。その結果、このために、各所定の結合性配列は、合成中の異なるサイクルで発生するモノマー付加の欠陥を受け易くなる。マイクロアレイの合成中に合成欠陥がないとすれば、所定の結合性配列の結合性相手は、全ての品質管理プローブ上において所定の結合性配列に同等に(即ち、同様に)結合するであろう。異なる品質管理プローブ上の所定の結合性配列の結合性相手が、同様に結合しているか否かを判定する際には、品質管理プローブがスペーサーを含むとき、結合の差異に関して、所定の結合性配列のマイクロアレイからの距離がその原因の一部となり得ることを認識しなければならない(5.4節を参照されたい)。したがって、スペーサーの長さの違いによりこのように予想される結合差は、異なる品質管理プローブが「同様に」結合しているか否かを判定する際、無視するのが好ましい。
【００５７】
特定の実施形態では、ある群の品質管理プローブは、全て同一の所定の結合性配列を含んでいるが、スペーサーを構成するモノマー数が異なるために、品質管理プローブ中のモノマー総数が異なっている。
【００５８】
特定の実施形態では、この垂直的置き換えは、標識モノマーを品質管理プローブ中に組み込むマイクロアレイの合成サイクルを変えることによって、実現される。その結果、このために、各標識モノマーの付加は、合成中の異なるサイクルで発生するモノマー付加の欠陥を受け易くなる。マイクロアレイの合成中に合成欠陥がないとすれば、各品質管理プローブは、同数の標識モノマーを組み込んだであろうし、したがって同等のシグナルを発するであろう。
【００５９】
他の実施形態では、この垂直的置き換えは、時差開始の合成で実現される。上記のように、各所定の結合性配列は、モノマー付加の1回または複数回の順次サイクルだけ相互に合成の開始がずらされる。一実施形態では、この置き換えを実現するためにスペーサーが使用される。より好ましい実施形態では、この置き換えを実現するためにスペーサーが使用されない。むしろ、所定の結合性配列の合成を開始しようとするサイクルにマイクロアレイ合成が到達するまで、所定の結合性配列が占めるマイクロアレイ上の位置でモノマー付加が遅延される。この実施形態では、全ての品質管理プローブは同数のモノマーを含んでいるが、マイクロアレイ上の(品質管理プローブに対応する)異なる位置でこれらのモノマーを使用する合成が時間的に隔てられている。
【００６０】
5.3.2水平的配置
本発明の品質管理プローブは、幾つかの異なるパターンを構成するために、マイクロアレイ上の幾つかの異なる場所で合成できる。これらのパターンは、マイクロアレイ合成の欠陥区域を特定すること、ならびに処理中のマイクロアレイに位置情報をもたらすことのために使用できる。マイクロアレイ上の品質管理プローブ数は、マイクロアレイ全体の合成を十分に表現するに足るものとなるべきである。品質管理プローブであるマイクロアレイ上のプローブ数は、マイクロアレイ上の全プローブ数の約0.5%以上、1%以上、2%以上、3%以上、5%以上、10%以上、20%以上となるべきである。
【００６１】
一実施形態では、1横列または複数の横列の品質管理プローブ(グリッド線と呼ぶ)が、マイクロアレイ全体の異なる位置で合成できる。マイクロアレイの各区画は、全区画での適切な合成が評価されたことを保証するために、グリッド線を含むことができる。一実施形態では、生体高分子プローブ合成がマイクロアレイの縁部で完全であることが、外側(周囲)グリッド線、例えば品質管理プローブの1〜5本の境界線(図17A)の使用により監視できる。縁部近辺または縁部のマイクロアレイの区画は、欠陥があれば検出できるように品質管理プローブに割り当てることができる。他の実施形態では、生体高分子プローブ合成がマイクロアレイの中心部で完全であることが、対角グリッド線の使用により監視できる(図17B)。品質管理プローブは、アレイを対角線状に横切り、したがってマイクロアレイの代表的区画を横切る位置で合成できる。好ましい実施形態では、グリッド線パターンはスペーサーを含む品質管理プローブで構成される。
【００６２】
他の実施形態では、品質管理プローブのクラスターが、合成品質を評価するためにマイクロアレイの区画中で合成できる。一実施形態では、品質管理プローブは、アレイ中央部全体のランダムな位置で合成される(図17C)。他の実施形態では、品質管理プローブは、マイクロアレイの隅部で合成できる(図17D)。
【００６３】
他の実施形態では、マイクロアレイがインクジェット技術で合成されるとき、品質管理プローブは、特定のノズル(1個か複数)の故障を検出できるようにマイクロアレイ上に配列できる。品質管理プローブにおいて、特定のノズルによる印刷と合致する周期性のあるシグナル強度の低下は、そのノズルに繰り返し欠陥があったことを示し得る。インクジェット・ヘッドにN個のノズルがあるとき、品質管理プローブ強度のN周期を有する低下は、ノズルの詰まりや故障を示す(Nが1以上の整数の場合)。一実施形態では、Nは20である。更なる実施形態では、対角グリッド線(図17B)はノズルの詰まりや故障を評価するために使用される。
【００６４】
他の実施形態では、品質管理プローブのパターンは、マイクロアレイに関する位置情報をもたらすために使用できる。マイクロアレイの合成中に品質管理プローブが合成される部位は既知なので、処理中のマイクロアレイを位置合わせするためにプローブを使用できる。
【００６５】
5.4マイクロアレイ上の欠陥の検出
同じ所定の結合性配列を含む品質管理プローブは、すべて同様に結合性相手に結合すべきである。しかし、多くの実例で本発明者等は、マイクロアレイからの所定の結合性配列の距離を増やすスペーサーが、所与の結合配列の結合時に、マイクロアレイに直結した同一の所与の結合配列から観察するシグナルと比較して、シグナル強度を実際に増加させることを見出した。特定の機構に拘泥するわけではないが、シグナル強度の増加は、所定の結合性配列がマイクロアレイから遠ざかることにより(例えば、マイクロアレイに直結したスペーサーの、所定の結合性配列に隣接するモノマー数を増やすことにより)、結合性相手に接近し易くなることから起こると思われる。所定の結合性配列がマイクロアレイから異なる距離だけ離れていることによる予想値より大きな、異なる品質管理プローブと結合性相手との結合量の乖離は、マイクロアレイ品質の問題を示し得るものである。マイクロアレイ品質の欠陥は、全般的な場合(即ち、欠陥がマイクロアレイ全体に影響する)も、局部的な場合(即ち、欠陥がマイクロアレイの1区域や複数の区域に影響するが、その他の区域には影響しない)もあり得る。
【００６６】
特定の実施形態では、本発明の品質管理プローブの使用によって、マイクロアレイ合成の欠陥を検出できる(例えば、フローセル中の気泡や他の問題で、一部の合成サイクル中に試薬がマイクロアレイに均一に行き渡らないというフローセル勾配)。しかし、マイクロアレイ品質に影響する他種の欠陥も、本発明の品質管理プローブの使用によって検出できる。マイクロアレイ中の欠陥は、合成欠陥以外の事象によることもある。品質管理プローブは、この種の欠陥を検出するためにも使用できる。一実施形態では、本発明の方法で検出できるマイクロアレイの欠陥は、マイクロアレイの保存中に発生する。最適でない条件(例えば、不適当な温度や湿度のレベル)のために、マイクロアレイ品質は劣化することがある。本発明の方法で検出できるマイクロアレイの他の欠陥には、それだけに限らないが、マイクロアレイ上で局所的欠陥を起こす摩損が含まれる。このような摩損はマイクロアレイの保存または処理中に起こり得る。マイクロアレイの処理中に起こり得る欠陥もある。このような欠陥は、マイクロアレイ全体のシグナル強度を比較することで検出できるシグナルの不均一性を起こし得る。結合強度の比較は幾つかの方法で実現できる。
【００６７】
一実施形態では、各組の品質管理プローブに対する結合比を計算できる。所定の結合性配列を含み、スペーサーを含まない品質管理プローブについては、特定の品質管理プローブに対してマイクロアレイ処理中に発生するシグナルは、異なる別の品質管理プローブに対して発生するシグナルと等しくなるべきである。その2つのシグナルの比は1に近くなるべきである。1から乖離することは、計算に用いた2つの品質管理プローブの一方が結合性相手への結合を減少させたことを示す。このようなことは、合成欠陥のために品質管理プローブ中の所定の結合性配列に欠陥があり、したがって普通のレベルで結合性相手に結合できない場合に起こると思われる。所定の結合性配列とスペーサーを共に含む品質管理プローブについては、特定の品質管理プローブに対してマイクロアレイ処理中に発生するシグナルは、マイクロアレイからの距離が異なるために、異なる別の品質管理プローブに対して発生するシグナルと等しいことも、等しくないこともある。マイクロアレイから同様の距離だけ離れている、各所定の結合性配列(例えば、各所定の結合性配列の合成が相互に3合成サイクル以内に開始された)からの2つのシグナルの比は、1に近くなるべきである。しかし、マイクロアレイから異なる距離だけ離れている、各所定の結合性配列(例えば、各所定の結合性配列の合成が相互に3合成サイクルを超えて開始された)からの2つのシグナルの比は、1から乖離することになろう。この例では、予想される比は、欠陥のないことが知られているマイクロアレイからのデータを用いて決定できる。このようなマイクロアレイは、例えば、複数のアレイ(好ましくは、少なくとも5個)を作製し、欠陥のないものを特定するためにその結果を比較することによって、特定できる。次いで、決定したこの予想比からの乖離をマイクロアレイ中の欠陥を検出するために使用できる。
【００６８】
各種のマイクロアレイ(例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク質など)について、欠陥のないことを示す結合比の値の範囲が実験的に決定できる。例えば、欠陥のないことが知られている様々な所定の結合性配列を結合性相手に結合させ、シグナルを記録することができる。これは、予想結合比を決定するために用いる基準値として使用できる。マイクロアレイ上の品質管理プローブの水平および垂直配置を変化させることによって、許容できる比の範囲を決定できる。実験的に決定したこのような比からの乖離は欠陥マイクロアレイを示す。特定の実施形態では、マイクロアレイがオリゴヌクレオチド・マイクロアレイのとき、0.25〜2.25、0.5〜2.0または0.75〜1.25の間の結合比は合成欠陥のないことを示す。
【００６９】
特定の実施形態では、マイクロアレイの処理中に品質管理プローブを検出するために用いる結合性相手と結合する配列に対して、1個または複数の意図的な欠失を含む所定の結合性配列を含んだものと、意図的な欠失をもたない所定の結合性配列を含んだものとの混合物を品質管理プローブに用いたマイクロアレイについては、マイクロアレイ品質を評価するために結合比を計算し、使用できる。各タイプの所定の結合性配列(即ち、意図的な欠失をもつか、またはもたない)に標識結合性相手を結合することにより発生するシグナルは、当然ながら異なるものとなろう。欠陥のないことが知られているマイクロアレイから決定した結合強度が、予想結合比を計算するために使用できる。このようなマイクロアレイは、例えば、複数のアレイ(好ましくは、少なくとも5個)を作製し、欠陥のないものを特定するためにその結果を比較することによって、特定できる。その予想比からの乖離は欠陥を示す。
【００７０】
他の実施形態では、結合強度の比較は統計分析により実現できる。1群の品質管理プローブに対する平均結合強度は、各該プローブで観察したシグナル(例えば蛍光)の値を平均することにより計算できる。次いで、個別の各品質管理プローブに対して観察したシグナル量は、その群の平均値と比較できる。一実施形態では、平均値から2つの標準偏差内にある品質管理プローブは、マイクロアレイ中に品質欠陥がないこと、例えば、合成中に欠陥がなかったか、または処理、貯蔵などの間に欠陥を受けなかったことを示す。より好ましい実施形態では、平均値から1つの標準偏差内にある品質管理プローブは、欠陥がないことを示す。
【００７１】
他の実施形態では、所定の結合性配列に結合する結合性相手を標識するために、複数の蛍光色素を使用できる。例えば、結合性相手のある部分組をCy3で標識し、ある部分組をCy5で標識できる。使用した各蛍光体種について、単一の品質管理プローブから検出したシグナルの比を決定できる。マイクロアレイ上の品質管理プローブの水平および垂直配置を変化させることによって、許容できる比の範囲を決定できる。実験的に決定したこの比からの乖離はマイクロアレイ欠陥を示す。
【００７２】
所定の結合性配列がなく、標識モノマーで合成した品質管理プローブを使用するマイクロアレイに対して、欠陥を検出するために同様の方法を使用できる。シグナルは、所定の結合性配列の標識結合性相手に由来する代わりに、マイクロアレイに付着した品質管理プローブ自体から発せられよう。比と平均シグナルからの標準偏差とを、マイクロアレイの完全性を評価するために使用できる。
【００７３】
所定の結合性配列または標識モノマーがない品質管理プローブを使用するマイクロアレイに対して、品質欠陥を検出するために同様の方法を使用できる。しかし、このようなマイクロアレイでは、検出可能なシグナルは品質管理プローブの長さに比例する。したがって、長さの異なる各品質管理プローブに対して、シグナル強度は同じはずがない。むしろ、品質管理プローブが長くなると、シグナル強度は大きくなると予想される。プローブ間で認められると予想した差異からの乖離は、マイクロアレイの欠陥を示す。
【００７４】
一実施形態では、品質管理プローブの混合物を使用するとき、予想される結合比またはシグナル強度は実験的に決定できる。欠陥のないことが知られているマイクロアレイは、結合性相手に結合する所定の結合性配列に対する基準値、または異種の品質管理プローブの各々に対するシグナル強度を得るために使用できる。このデータから比を決定でき、それを予想比として使用できる。これらの比からの乖離は欠陥マイクロアレイを示す。
【００７５】
5.5マイクロアレイの合成と処理
マイクロアレイ上のプローブは、幾つもの異なる生体高分子、例えばDNA, RNA、ペプチド核酸(PNA)(例えば、Egholm et al., 1993, Nature 363:566-568; 米国特許第5539083号を参照されたい)またはタンパク質のいずれか1つであってよい。本発明のマイクロアレイは、固体支持体上へのモノマーの逐次付加により合成される。このような各モノマーは、1合成サイクル中に付加される生体高分子の1構成単位である。一実施形態では、1合成サイクル当たり付加される生体高分子の構成単位は、それ自体、せいぜい1つの基本的な生体高分子の構成単位(例えば、ヌクレオチド、アミノ酸など)で構成されている。他の実施形態では、1合成サイクル当たり付加される生体高分子の構成単位は、複数の基本的な生体高分子の構成単位(例えば、ジヌクレオチド、ジペプチド、他の部分に共有結合したヌクレオチドやアミノ酸など)からなる。他の実施形態では、1合成サイクル当たり付加される生体高分子の構成単位は、合成サイクルが異なると共に変化する。
【００７６】
5.5.1ヌクレオチドのマイクロアレイ
本発明の好ましい実施形態では、試料処理はヌクレオチド・マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを経てなされる。より好ましい実施形態では、マイクロアレイはオリゴヌクレオチド・アレイである。最も好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド・アレイは、インクジェット合成オリゴヌクレオチド・マイクロアレイである。好ましくは、マイクロアレイは20〜50000個の範囲の核酸プローブを含む。プローブは様々なパターンに配置できる。例えば、プローブは横列と縦列に、多角形(例えば、六角形)または円形パターンなどに配置できる。
【００７７】
ハイブリダイゼーションのレベルは、ポリヌクレオチド・プローブのアレイまたはマイクロアレイを用いて測定するのが好ましい。ポリヌクレオチド・アレイ上では、関心のある配列を含むポリヌクレオチド・プローブが、支持体、例えば固体支持体の表面に固定化されている。例えば、プローブはDNA配列、RNA配列、またはDNAとRNAのコポリマー配列を含み得る。プローブのポリヌクレオチド配列は、DNAおよび/またはRNA類似体(例えば、ペプチド核酸)、あるいはその組合せも含み得る。例えば、プローブのポリヌクレオチド配列は、細胞由来のゲノムDNAまたはmRNAの完全配列または部分配列であってもよく、あるいはそれから誘導されるcDNAまたはcRNAの配列であってもよい。
【００７８】
本発明の方法で用いる1つまたは複数のプローブは、好ましくは、多孔性または無孔性でもよい固体支持体または表面に固定化される。例えば、本発明のプローブは、ニトロセルロースまたはナイロンの膜やフィルターに付着されたポリヌクレオチド配列となり得る。このようなハイブリダイゼーションプローブは当分野で周知である(例えば、Sambrook et al., Eds., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)。あるいは、固体支持体または表面はガラスまたはプラスチック表面であってもよい。
【００７９】
5.5.1.1マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションアッセイ
マイクロアレイは、支持体上の位置的にアドレス可能な結合(例えば、ハイブリダイゼーション)部位からなるアレイである。このような結合部位の各々は、支持体上の所定領域に結合したプローブの複数のポリヌクレオチド分子を含む。マイクロアレイは幾つもの方法で作製でき、その中の幾つかはここで以下に説明する(例えば、Meltzer, 2001, Curr. Opin. Genet. Dev. 11(3):258-63; Andrews et al., 2000, Genome Res. 10(12):2030-43; Abdellatif, 2000, Circ. Res. 86(9)919-20; Lennon, 2000, Drug Discov. Today 5(2):59-66; Zweiger, 1999, Trends Biotechnol. 17(11):429-36を参照されたい)。どのように作製したにせよ、マイクロアレイは一定の特性を共有している。アレイは再現可能であることが好ましく、それにより、所与のアレイの多数のコピーを作製し、相互に容易に比較できる。好ましくは、マイクロアレイは、結合(例えば、核酸のハイブリダイゼーション)条件下で安定な材料から作製される。マイクロアレイは、好ましくは1〜25cm2の間、好ましくは約10〜15cm2である。しかし、大きめのアレイも小さめの(例えば、0.5 cm2以下)アレイも、やはり企図しており、例えば、非常に多数の異なるプローブを同時に評価するために、好ましいものとなり得る。
【００８０】
特に好ましい実施形態では、DNAまたはDNA模倣体の集団、あるいはRNAまたはRNA模倣体の集団などのポリヌクレオチドの集団を、その表面に固定化した固相からなるプローブのマイクロアレイに対して、ハイブリダイゼーションレベルが測定される。その固相は無孔性、または場合によりゲルなどの多孔性であってもよい。マイクロアレイは、例えば、関心ある薬物の濃度勾配または関心ある生物学的経路に対する撹乱勾配に曝した細胞の転写状態などの、細胞の転写状態を分析するために使用できる。マイクロアレイは、例えば、特定の標的ポリヌクレオチドに対する各プローブの感度および特異性を評価するために、複数の異なるプローブを同時にスクリーニングするのに使用できる。
【００８１】
好ましくは、マイクロアレイ上の所与の結合部位または特異な1組の結合部位は、細胞または生物からの単一遺伝子の産物または遺伝子転写物に(例えば、それに由来する特異的mRNAや特異的cDNAに)特異的に結合する(例えば、ハイブリダイゼーションする)であろう。しかし、他の関連または類似配列は、一般に所与の結合部位と交差してハイブリダイゼーションする場合もある。
【００８２】
本発明の方法に使用するマイクロアレイ、および組成物は、1つまたは複数の試験プローブを含み、その各々が検出対象のRNAまたはDNAの配列に相補的なポリヌクレオチド配列を有している。各プローブは異なる核酸配列を有するのが好ましく、アレイの固体表面上の各プローブの位置は既知であることが好ましい。実際のところ、マイクロアレイはアドレス可能なアレイであることが好ましく、位置的にアドレス可能なアレイであることがより好ましい。より具体的には、アレイの各プローブが固体支持体上の既知の所定位置に配置されることにより、各プローブのアイデンティティ(即ち、配列)がアレイ上（即ち、支持体上または表面上）の位置から決定できることが好ましい。
【００８３】
好ましくは、マイクロアレイ上のプローブの密度は、1cm2当たり異なる(即ち、不同の)プローブが約100個以上である。より好ましくは、本発明の方法に用いるマイクロアレイは、1cm2当たり少なくとも550個のプローブ、1cm2当たり少なくとも1000個のプローブ、1cm2当たり少なくとも1500個のプローブ、または1cm2当たり少なくとも2000個のプローブを有するであろう。特に好ましい実施形態では、該マイクロアレイは高密度アレイで、好ましくは1cm2当たり異なるプローブが少なくとも約2500個の密度を有する。したがって好ましくは、本発明に用いるマイクロアレイは、少なくとも2500個、少なくとも5000個、少なくとも10000個、少なくとも15000個、少なくとも20000個、少なくとも25000個、少なくとも50000個、または少なくとも55000個の異なる(即ち、不同の)プローブを含む。これらプローブの1つの部分組は、試料に付加された場合の打ち込み(spike-in)タグに対応するであろう。
【００８４】
このようなポリヌクレオチドは、好ましくは15〜200塩基の長さ、より好ましくは20〜100塩基の長さ、最も好ましくは40〜60塩基である。各プローブ配列は、標的配列に相補的な配列以外に、リンカー(例えば、スペーサー)も含んでいることが理解されよう。ここで使用する場合、リンカーとは標的配列に相補的な配列と表面との間の化学構造を指す。リンカーはヌクレオチド配列である必要はない。例えば、リンカーは、ヌクレオチド配列、またはペプチド核酸、炭化水素鎖などで構成できる。
【００８５】
一実施形態では、マイクロアレイは、各位置が遺伝子でコードされた転写物に対する(例えば、それに由来するmRNAやcDNAに対する)個別の結合部位を表すアレイ(即ち、マトリックス)である。例えば、様々な実施形態で、本発明のマイクロアレイは、ある生物のゲノム中の遺伝子の50%未満でコードされる産物に対する結合部位を含むことができる。あるいは、本発明のマイクロアレイは、ある生物のゲノム中の遺伝子の少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは100%、または少なくとも50, 100, 500, 1000もしくは10000個でコードされる産物に対する結合部位を有することができる。他の実施形態では、本発明のマイクロアレイは、ある生物の細胞によって発現される遺伝子の50%未満、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%でコードされる産物に対する結合部位を有することができる。結合部位は、特定のRNAが特異的にハイブリダイゼーションをすることのできる、DNAまたはDNA類似体とし得る。DNAまたはDNA類似体は、例えば合成オリゴマー、または例えばエキソンに対応する遺伝子断片とし得る。
【００８６】
好ましくは、本発明に用いるマイクロアレイは、関心ある薬物の作用または関心ある生物学的経路に関わる1つまたは複数の遺伝子のために、遺伝子の組のための結合部位(即ち、プローブ)を有する。上で考察したように、「遺伝子」は、RNAポリメラーゼによって転写されるDNAの一部であり、5'非翻訳領域(UTR)、イントロン、エキソンおよび3'UTRを含み得るものとして特定される。ゲノム中の遺伝子数は、細胞または生物により発現されるmRNA分子の数から、またはゲノム中の特性決定が良くなされた部分の外挿によって推定できる。関心がある生物のゲノムの配列が決定されてしまうと、オープン・リーディング・フレーム(ORF)の数が決定でき、mRNAコード領域がDNA配列の分析で同定できる。例えば、Saccharomyces cerevisiaeのゲノムの配列は完全に決定されてしまい、長さが99アミノ酸残基より長い配列をコードする約6275個のORFを有すると報告されている。このようなORFの分析で、タンパク質産物をコードしていそうなORFが5885個あることが示されている(Goffeau et al., 1996, Science 274:546-567)。それとは対照的に、ヒトのゲノムは約30000〜130000個の遺伝子を含んでいると推定される(Crollius et al., 2000, Nature Genetics 25:235-238; Ewing et al., 2000, Nature Genetics 25:232-234)。それだけに限らないが、Drosophila, C. elegans、植物、例えばイネおよびArabidopsis、ならびに哺乳類、例えばマウスおよびヒトを含む他の生物のゲノム配列も、完了しているか、またはほぼ完了している。したがって、本発明の好ましい実施形態では、ある生物のゲノム中の全遺伝子に対するプローブを含むアレイ・セットが提供される。
【００８７】
標的核酸分子、例えば細胞のRNAに相補的なcDNAの試料を作製し、適当なハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイとハイブリダイゼーションするとき、アレイ中のその部位とハイブリダイゼーションするレベルは試料中の対応する相補配列の普遍性を反映することは認識されよう。例えば、検出可能に標識した(例えば、蛍光体で)cDNAがマイクロアレイとハイブリダイゼーションするとき、試料中にないヌクレオチド配列に対応するアレイ上の部位は殆どか、全くシグナル(例えば、蛍光シグナル)を示さず、試料中に普遍的なヌクレオチド配列はかなり強いシグナルを示すであろう。試料中の異なるヌクレオチド配列の相対存在量は、マイクロアレイ上のプローブのシグナル強度パターンで決定し得る。
【００８８】
異なる2条件を受けた異なる2細胞からの試料の核酸は、2色プロトコルを用いてマイクロアレイの結合部位とハイブリダイゼーションできる。薬物応答の場合、一方の細胞試料を薬物に曝し、同型の他方の細胞試料は薬物に曝さない。2つの細胞型の各々に由来するcDNAに、識別できるように異なった標識(例えば、Cy3とCy5で)を付ける。一実施形態では、例えば、薬物で処理した(または、変異もしくは疾患などを有する)細胞からのcDNAをフルオレッセイン標識dNTPを用いて合成し、薬物に曝していない第2の細胞からのcDNAをローダミン標識dNTPを用いて合成する。2種のcDNA分子を混合し、マイクロアレイとハイブリダイゼーションするとき、cDNAの各組からの相対的シグナル強度をアレイ上の各部位に対して決定し、特定遺伝子の相対存在量の差を検出する。
【００８９】
上記の例では、薬物処理細胞からの核酸は、蛍光体が刺激されると緑色の蛍光を発し、未処理細胞からの核酸は赤色の蛍光を発するであろう。その結果、薬物処理が、細胞中の特定遺伝子の転写に対して直接的にも間接的にも作用しないとき、発現パターンは両細胞で識別できず、逆転写したとき、赤色標識と緑色標識の核酸は同等な普遍性を示すであろう。マイクロアレイとハイブリダイゼーションするとき、その核酸種に対する結合部位は両蛍光体に特有の波長を発するであろう。それと対照的に、薬物曝露細胞が、細胞中の特定遺伝子の転写を直接的または間接的に変化させる薬物で処理されるとき、各結合部位に対する緑色対赤色蛍光の比で表される発現パターンは変化するであろう。薬物があるmRNAの普遍性を増加させると、そのmRNAの各結合部位に対する比が増加するが、薬物があるmRNAの普遍性を減少させると、そのmRNAの各結合部位に対する比は減少するであろう。
【００９０】
遺伝子発現の変化を規定するための2色蛍光標識および検出方式の使用は、例えば、Shena et al., 1995, Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray, Science 270:467-470に、mRNAの検出に関して記載されている。2種の蛍光体で標識したcDNAを使用する利点は、2つの細胞状態にある配列した各遺伝子に対応するmRNAまたはエキソンの発現レベルを直接、内部で対照しながら比較でき、実験条件(例えば、ハイブリダイゼーション条件)の小さな差による変化は、その後の分析に影響しないと思われることである。しかし、単一細胞からのcDNAを使用し、例えば、薬物処理または経路撹乱細胞と未処理細胞との、例えば、特定エキソンの絶対量を比較することも可能であることは、認識されよう。更にまた、3種以上の色による標識も、本発明では企図されている。本発明の一部の実施形態では、色の異なる少なくとも5, 10, 20または100種の色素を標識に使用できる。このような標識により、識別可能に標識したcDNA集団を同じアレイに同時にハイブリダイゼーションでき、したがって3種以上の試料に由来するmRNA分子の発現量を測定し、場合により比較することができる。使用できる色素には、それだけに限らないが、フルオレッセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、テキサス赤、5'カルボキシ-フルオレッセイン(FMA)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシ-フルオレッセイン(JOE)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシ-ローダミン(TAMRA)、6'-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、HEX、TET、IRD40およびIRD41、それだけに限らないがCy3、Cy3.5およびCy5を含むシアミン色素; それだけに限らないがBODIPY-FL、BODIPY-TR、BODIPY-TMR、BODIPY-630/650およびBODIPY-650/670を含むBODIPY色素; それと、それだけに限らないがALEXA-488、ALEXA-532、ALEXA-546、ALEXA-568およびALEXA-594を含むALEXA色素;ならびに当分野の技術者に公知と思われる他の蛍光色素が挙げられる。
【００９１】
5.5.1.2マイクロアレイ用プローブの調製
上記のように、特定のポリヌクレオチド分子が特異的にハイブリダイゼーションするプローブは、相補ポリヌクレオチド配列である。マイクロアレイ上の各プローブは、通常20〜600塩基の間、普通は30〜200塩基の間になろう。
【００９２】
マイクロアレイのポリヌクレオチド・プローブを生成する手段は、例えば、N-ホスホネートまたはホスホロアミダイト薬品(Froehler et al., 1986, Nucleic Acid Res. 14:5399-5407; McBride et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24:246-248)を用いた合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成による。合成配列は、通常長さが約15〜約600塩基の間、より通常には約20〜約100塩基の間、最も好ましくは長さが約40〜約70塩基の間にある。
【００９３】
マイクロアレイ上のプローブは、マイクロアレイの固体支持体に付着した高分子である。本発明では、プローブは好ましくは核酸配列(またはその断片)である。
【００９４】
5.5.1.3プローブの固体表面への付着
本発明の方法は、アレイを形成するために支持体上で直接合成したポリヌクレオチド・プローブを利用する。プローブは固体支持体または表面に付着するが、それは、例えばガラス、プラスチック(例えばポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ゲル、または他の多孔性もしくは無孔性材料で作製し得る。
【００９５】
マイクロアレイを作製する方法は、高密度オリゴヌクレオチド・アレイを作製することによりなされる。表面上の規定の箇所に、規定の配列に相補的な数千のオリゴヌクレオチドを含むアレイを作製するために、多様な技術が知られている。例えば、その場合成のための光平板技術(Fodor et al., 1991, Science 251:767-773; Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:5022-5026; Lockhart et al., 1996, Nature BioTechnology 14:1675; 米国特許第5489678号; 第5578832号; 第5556752号; 第5510270号; 第6197506号; および第6346413号を参照されたい)や、規定のオリゴヌクレオチドを迅速に合成し、堆積する他の方法(Blanchard et al., Biosensor & Bioelectronics 11:687-690)が使用し得る。
【００９６】
マイクロアレイを作製する他の方法、例えばマスキング法(Maskos and Southern, 1992, Nucl. Acids. Res. 20:1679-1684)も用い得る。原理的に、また上記のように、任意のタイプのアレイ、例えば、ナイロン製ハイブリダイゼーション膜(上記のSambrook等を参照されたい)上のドット・ブロットが使用できる。しかし、当分野の技術者には認識されるように、ハイブリダイゼーション体積が減少するので、非常に小さなアレイが多くの場合好まれよう。
【００９７】
特に好ましい実施形態では、本発明のマイクロアレイは、オリゴヌクレオチド合成用のインクジェット印刷装置によって、例えば、1998年9月24日に公開された国際特許公開第98/41531号のBlanchard; Blanchard et al., 1996, Biosensors and Bioelectronics 11:687-690; Blanchard, 1998, in Synthetic DNA Arrays in Genetic Engineering, Vol. 20, J. K. Setlow, Ed., Plenum Press, New York at pages 111-123; Hughes et al., 2001, Nature BioTechnology 19:342-347; およびBlanchardに授与された米国特許第6028189号に記載の方法およびシステムを用いて製造される。具体的には、このようなマイクロアレイ中のオリゴヌクレオチド・プローブは、プロピレンカーボネートなどの高表面張力溶媒の微小滴中で個々のヌクレオチド塩基を連続的に堆積することにより、アレイ中、例えばスライド・ガラス上で合成するのが好ましい。微小滴は小さな体積(例えば、100pL未満、より好ましくは50pL未満)を有し、マイクロアレイ上で(例えば、疎水性ドメインにより)相互に隔てられることにより、アレイ要素(即ち、異なるプローブ)の位置を画定する円形表面張力ウェルを形成する。ポリヌクレオチド・プローブは、ポリヌクレオチドの3'末端で表面に共有結合で付着する。
【００９８】
このような方法を用いると、配列既知のオリゴヌクレオチド(例えば、60mer)がスライド・ガラス誘導体などの表面上に直接合成される。作製したアレイは、1遺伝子当たりオリゴヌクレオチドが数分子に重複することがある。
【００９９】
5.5.1.4標的ポリヌクレオチド分子
標的ポリヌクレオチドは、マイクロアレイ上で処理している生物試料のポリヌクレオチドである。標的ポリヌクレオチドは、それだけに決して限らないが、メッセンジャーRNA(mRNA)分子、リボソームRNA(rRNA)分子、cRNA分子(即ち、in vitroで転写されるcDNA分子から調製されるRNA分子)およびその断片などのRNA分子とし得る。その上、標的ポリヌクレオチドは、それだけに限らないが、ゲノムDNA分子、cDNA分子、およびオリゴヌクレオチド、EST、STSなどのその断片などのDNA分子であってもよい。特定の実施形態では、試料は、異なるヌクレオチド配列の核酸分子を1000、5000, 10000, 50000, 100000, 250000または1000000個超含んでいる。
【０１００】
標的ポリヌクレオチドの由来はいずれであってもよい、例えば、標的ポリヌクレオチド分子は、生物から単離したゲノムまたはゲノム外DNA分子、あるいは生物から単離したmRNA分子などのRNA分子のような天然核酸分子であってもよい。あるいは、該ポリヌクレオチド分子は、例えば、PCRで合成したcDNA分子またはポリヌクレオチド分子、in vitro転写などで合成したRNA分子のような、in vivoまたはin vitroで酵素的に合成した核酸分子を含めて、合成してもよい。標的ポリヌクレオチドの試料は、例えば、DNA、RNAまたはDNAとRNAのコポリマーの分子を含み得る。好ましい実施形態では、本発明の標的ポリヌクレオチドは、特定の遺伝子または特定の遺伝子転写物に(例えば、細胞中に発現する特定のmRNA配列、またはこのようなmRNA配列に由来する特定のcDNA配列に)対応するであろう。しかし、多くの実施形態、特に、ポリヌクレオチド分子が哺乳類細胞に由来する実施形態では、標的ポリヌクレオチドが遺伝子転写物の特定の断片に対応することがある。例えば、該ポリヌクレオチド分子は、例えば、同一遺伝子の異なるスプライシング変異体を検出および/または分析するために、当該遺伝子の異なるエキソンに対応し得る。
【０１０１】
好ましい実施形態では、分析対象の標的ポリヌクレオチドは、細胞から抽出した核酸からin vitroで調製される。例えば、一実施形態では、RNAが細胞(例えば、全細胞RNA、ポリ(A)+メッセンジャーRNA、その断片)から抽出され、mRNAが全抽出RNAから精製される。全RNAおよびポリ(A)+RNAを調製する方法は当分野で周知であり、例えば上記のSambrook他に全般的に記載されている。一実施形態では、RNAは、チオシアン酸グァニジウムによる溶解の後、CsCl遠心およびオリゴdT精製を用いて(Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299)、本発明において関心のある様々な型の細胞から抽出される。他の実施形態では、全RNAは、チオシアン酸グァニジウムによる溶解の後、RNeasyカラム(Qiagen)上での精製を用いて、細胞から抽出される。次いで、cDNAを精製mRNAから、例えばオリゴ-dTまたはランダム・プライマーを用いて合成する。好ましい実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、精製mRNAから、または細胞から抽出した全RNAから調製したcDNAから調製したcRNAである。本明細書で使用する場合、cRNAは試料RNAと相補的(アンチセンス)であるか、または同一配列(センス)のいずれかである。抽出RNA分子は、RNAポリメラーゼ・プロモーターに連結したプライマーを用いて、2本鎖cDNA分子が同じRNA分子から合成される方法を使用して増幅される。その結果、RNAポリメラーゼ・プロモーターはcDNAの一方または両方の鎖中に組み込むことができる。cDNA分子の第1の鎖上にあるRNAポリメラーゼ・プロモーターを用いて、同じRNAと同一配列のcRNAを合成できる。同じRNAと相補的なcRNAを合成するためには、2本鎖cDNA分子の第2の鎖上にあるRNAポリメラーゼ・プロモーターから、RNAポリメラーゼを用いて転写を開始できる(例えば、米国特許第5891636号、第5716785号、第5545522号および第6132997号を参照されたい。また、米国特許第6271002号およびZiman他により2000年11月28日に出願された米国仮特許出願第60/253641号も参照されたい)。RNAポリメラーゼ・プロモーターまたはその相補体を含んだオリゴ-dTプライマー(米国特許第5545522号および第6132997号)、ランダム・プライマー(Ziman他により2000年11月28日に出願された米国仮特許出願第60/253641号)のいずれも使用できる。好ましくは、標的ポリヌクレオチドは、細胞の元の核酸集団を代表する短鎖および/または断片化ポリヌクレオチド分子である。一実施形態では、全RNAがcRNA合成の投入物として使用される。T7 RNAポリメラーゼ・プロモーター配列を含んだオリゴ-dTプライマーは、第1鎖のcDNA合成を開始するために使用できる。第2鎖の合成が所望のときは、逆転写酵素による第2鎖のcDNA合成を開始するために、ランダム六量体を使用できる。この反応は、3'末端にT7 RNAポリメラーゼ・プロモーターを含む2本鎖cDNAを産生する。次いで、2本鎖cDNAをT7 RNAポリメラーゼによりcRNAに転写できる。
【０１０２】
分析対象の標的ポリヌクレオチドは、検出可能に標識されるのが好ましい。例えば、cDNAは、例えばヌクレオチド類似体で直接的に、または例えば、第1鎖を鋳型に用いて第2の標識cDNA鎖を作製することにより、間接的に標識できる。あるいは、2本鎖cDNAをcRNAに転写した後、標識できる。
【０１０３】
好ましくは、検出可能な標識は、例えばヌクレオチド類似体の組み込みによる蛍光標識である。本発明の使用に適した他の標識には、それだけに限らないが、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン化合物、検出可能なポリペプチド、電子豊富な分子、基質に作用して検出可能なシグナルを発生できる酵素、および放射性同位体が挙げられる。好ましい放射性同位体は32P, 35S, 14C, 15Nおよび125Iを含む。本発明に適した蛍光分子には、それだけに限らないが、フルオレッセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、テキサス赤、5'カルボキシ-フルオレッセイン(FMA)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシ-フルオレッセイン(JOE)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシ-ローダミン(TAMRA)、6'-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、HEX、TET、IRD40およびIRD41が挙げられる。本発明に適した蛍光分子には、それだけに限らないがCy3、Cy3.5およびCy5を含むシアミン色素; それだけに限らないがBODIPY-FL、BODIPY-TR、BODIPY-TMR、BODIPY-630/650およびBODIPY-650/670を含むBODIPY色素; それと、それだけに限らないがALEXA-488、ALEXA-532、ALEXA-546、ALEXA-568およびALEXA-594を含むALEXA色素; ならびに当分野の技術者に公知と思われる他の蛍光色素が更に挙げられる。本発明に適した電子豊富な指示薬分子には、それだけに限らないが、フェリチン、ヘモシアニンおよび金コロイドが挙げられる。あるいは、好ましさがより小さい実施形態では、標的ポリヌクレオチドに第1グループを特異的に複合することによって、該ポリヌクレオチドを標識してもよい。指示薬分子に共有結合し、第1グループに親和性を有する第2グループは、標的ポリヌクレオチドを間接的に検出するために使用できる。このような実施形態では、第1グループとしての使用に適した化合物は、それだけに限らないが、ビオチンおよびイミノビオチンである。第2グループとしての使用に適した化合物は、それだけに限らないが、アビジンおよびストレプトアビジンである。
【０１０４】
品質管理プローブの所定の結合性配列の結合性相手は、マイクロアレイと接触させる前に標的分子に付加できる。一実施形態では、結合性相手は、標的分子の処理中に標的分子に付加できる。より好ましい実施形態では、結合性相手は、マイクロアレイと接触させる直前に標的分子に付加される。
【０１０５】
5.5.1.5マイクロアレイとのハイブリダイゼーション
上記のように、核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、分析対象のポリヌクレオチド分子(または標的ポリヌクレオチド分子)が、アレイの相補ポリヌクレオチド配列、好ましくは相補配列のある、1つまたは複数の特異的アレイ部位に、特異的に結合または特異的にハイブリダイゼーションするように選定される。
【０１０６】
2本鎖プローブDNAを配置して含むアレイは、好ましくは、標的ポリヌクレオチド分子と接触させる前に、該DNAを1本鎖にする変性条件を受ける。1本鎖プローブDNA(例えば、合成オリゴデオキシリボ核酸)を含むアレイは、標的ポリヌクレオチド分子と接触させる前に、例えば、自己の相補配列のために形成されるヘアピンまたは二量体を除くために、変性されることを必要とすることがある。
【０１０７】
最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブおよび標的核酸の長さ(例えば、オリゴマー対200塩基を超えるポリヌクレオチド)および種類(例えば、RNAまたはDNA)に依存するであろう。核酸についての特異的な(即ち、厳しい)ハイブリダイゼーション条件の一般的パラメーターは、Sambrook他(上記)およびAusubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New Yorkに記載されている。例えば、cDNAマイクロアレイを用いるとき、通常のハイブリダイゼーション条件は、5 X SSC + 0.2% SDSで65℃、4時間の後、条件の厳しくない洗浄緩衝液(1 X SSC + 0.2% SDS)中25℃で洗浄し、その後、より厳しい洗浄緩衝液(0.1 X SSC + 0.2% SDS)中25℃で10分でのハイブリダイゼーションである(Hughes et al., 2001, Nature BioTechnology 19:342-347)。有用なハイブリダイゼーション条件は、例えば、Tijessen, 1993, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers B.V.およびKricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, C.A.にも提供されている。
【０１０８】
本発明のスクリーニングおよび/またはシグナル発生のチップを使用するための、特に好ましいハイブリダイゼーション条件には、1M NaCl, 50mM MES緩衝液(pH 6.5), 0.5%サルコシンナトリウムおよび30%ホルムアミド中、プローブの平均融解温度またはそれに近い温度でのハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１０９】
5.5.1.6シグナル検出およびデータ分析
細胞のRNAに相補的な標的配列、例えばcDNAまたはcRNAが作製され、適当なハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイとハイブリダイゼーションするとき、特定遺伝子に対応するアレイ中の部位とのハイブリダイゼーションレベルは、その遺伝子からの転写物を含むmRNAまたはmRNA分子の細胞中での普遍性を反映するであろう。例えば、全細胞mRNAに相補的な検出可能に標識された(例えば、蛍光体で)cDNAが、マイクロアレイとハイブリダイゼーションするとき、細胞中の転写されない遺伝子に対応するアレイ上の(即ち、遺伝子発現の1つまたは複数の産物を特異的に結合することのできる)部位は、殆どか全くシグナル(例えば、蛍光シグナル)を示さず、また、転写物を発現する、コードされたmRNAが普遍的な対応遺伝子は、比較的強いシグナルを示すであろう。
【０１１０】
好ましい実施形態では、2種の細胞由来の標的配列、例えばcDNA分子またはcRNA分子が、マイクロアレイの結合部位とハイブリダイゼーションする。薬物応答の場合、1つの細胞試料は薬物に曝し、同種の他の細胞試料は薬物に曝さない。経路応答の場合、1つの細胞は経路撹乱に曝し、同種の他の細胞は経路撹乱に曝さない。2つの細胞型の各々に由来するcDNAまたはcRNAは、識別できるように異なる標識を付けられる。一実施形態では、例えば、薬物で処理された(そうでなければ、撹乱された)細胞からのcDNAは、フルオレッセイン標識dNTPを用いて合成され、薬物に曝していない第2の細胞からのcDNAは、ローダミン標識dNTPを用いて合成される。2種のcDNA分子を混合し、マイクロアレイとハイブリダイゼーションするとき、cDNAの各組からの相対的シグナル強度をアレイ上の各部位に対して決定し、特定の転写物の相対存在量の差を検出する。
【０１１１】
前の段落に前記した例では、薬物処理(そうでなければ、撹乱された)細胞からのcDNAは、蛍光体が刺激されると緑色の蛍光を発し、未処理細胞からのcDNAは赤色の蛍光を発するであろう。その結果、薬物処理が、細胞中の特定遺伝子の転写に対して直接的にも間接的にも作用しないとき、発現パターンは両細胞で識別できず、逆転写したとき、赤色標識と緑色標識のcDNAは同等な普遍性を示すであろう。マイクロアレイとハイブリダイゼーションするとき、そのRNA種に対する結合部位は両蛍光体に特有の波長を発するであろう。それと対照的に、薬物曝露細胞が、細胞中の特定遺伝子の転写スプライシングを直接的または間接的に変化させる薬物で処理されるとき、転写物の各結合部位に対する緑色対赤色蛍光の比で表される発現パターンは変化するであろう。薬物があるmRNAの普遍性を増加させると、そのmRNAに発現される各転写物断片に対する比が増加するが、薬物があるmRNAの普遍性を減少させると、そのmRNAに発現される各エキソンに対する比は減少するであろう。
【０１１２】
遺伝子発現の変化を規定するための2色蛍光標識および検出方式の使用は、例えば、Shena et al., 1995, Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray, Science 270:467-470に、mRNA分子の検出に関して記載されている。2種の蛍光体で標識した標的配列、例えはcDNA分子またはcRNA分子を使用する利点は、2つの細胞状態にある配列した各遺伝子に対応するmRNAの発現レベルを直接、内部で対照しながら比較でき、実験条件(例えば、ハイブリダイゼーション条件)の小さな差による変化は、その後の分析に影響しないと思われることである。しかし、単一細胞からのcDNAを使用し、例えば、薬物処理またはそうでなければ撹乱細胞と未処理細胞との、例えば、特定エキソンの絶対量を比較することも可能であることは、認識されよう。
【０１１３】
他の好ましい実施形態では、例えば1色蛍光標識を用いる単一チャンネル検出法が使用される(2001年2月12日に出願の米国特許出願第09/781814号を参照されたい)。この実施形態では、逆行相補体(RC)プローブを含むアレイが設計され、作製される。DNA配列の逆行相補体は、標的配列に相補的な対応する順行鎖(FS)と、様々な尺度（例えば、GC含量、GC傾向などの測定量は、逆行相補体の下では不変である）に関して等価な配列複雑度を有するので、RCプローブは、対応するFSプローブとの非特異的な交差ハイブリダイゼーションのレベルを決定するための対照プローブとして使用される。標的配列のFSプローブ強度の有意性は、各々の測定誤差と共に、FSプローブの実際の強度測定値とRCプローブの対応する実際の強度測定値との比較によって決定される。好ましい実施形態では、FSプローブと対応するRCプローブとの強度差が有意であれば、転写物は存在すると言う。より好ましくは、FSプローブ強度が更にバックグランド・レベルより有意に高いならば、転写物は存在すると言う。単一チャンネル検出法は、多色標識法と共に使用できる。一実施形態では、異なる色で各々標識された複数の異なる試料が、アレイとハイブリダイゼーションされる。各色でのFSプローブとRCプローブとの差は、対応する試料のハイブリダイゼーションレベルを決定するために使用される。
【０１１４】
蛍光標識プローブを用いるとき、転写物アレイの各部位における蛍光放出は、好ましくは共焦レーザー走査顕微鏡で検出できる。一実施形態では、使用する2種の蛍光体の各々に対して、適当な励起線を用いた個々の走査を実行する。あるいは、2種の蛍光体に特異な各波長で試料を同時に照射できるレーザーを使用でき、2種の蛍光体からの発光を同時に分析できる(Shalon et al., 1996, Genome Res. 6:639-645を参照されたい)。好ましい実施形態では、コンピュータ制御X-Yステージと顕微鏡対物レンズが付属したレーザー蛍光スキャナーでアレイを走査する。多重線混合ガス・レーザーで2種の蛍光体の逐次励起が得られ、放出された光を波長で分割し、2個の光電子増倍管で検出する。このようなレーザー蛍光走査装置は、例えば、Sehena et al., 1996, Genome Res. 6:639-645に記載されている。あるいは、Ferguson et al., 1996, Nature BioTechnology 14:1681-1684に記載の光ファイバー束を用いて、同時に多数の部位におけるmRNA存在量を監視してもよい。
【０１１５】
シグナルを記録し、好ましい実施形態では、例えば、12ビットまたは16ビットのA/D変換ボードを用いてコンピュータで分析する。一実施形態では、走査画像の斑点をグラフィックス・プログラム(例えば、Hijaak Graphics Suite)を用いて除去し、次いで、各部位における各波長での平均ハイブリダイゼーションのスプレッド・シートを創出する画像グリッド化プログラムを用いて分析する。必要があれば、2種の蛍光体に対するチャンネル間のクロストーク(またはオーバーラップ)について、実験的に補正してもよい。転写物アレイ上の任意の特定のハイブリダイゼーション部位に対して、2種の蛍光体の発光の比を計算できる。その比は、同族遺伝子の絶対発現量に依存しないが、薬物投与、遺伝子欠失、または試験対象のその他の事象で有意に発現が変調されている遺伝子に対して有用である。
【０１１６】
2種の細胞または細胞系でのあるmRNAの相対存在量に対し、撹乱あり(即ち、試験するmRNAの2つの起源で存在量が異なる)、または撹乱なし(即ち、相対存在量が同じ)と評点を付けるのが好ましい。本明細書で使用する場合、RNAの2つの起源間の差が、少なくとも約25%の率(即ち、一方の起源は他方の起源よりRNAが25%多い)、より普通には約50%、一層より頻繁には約2(即ち、2倍多い)、3(即ち、3倍多い)、または5(即ち、5倍多い)の率であることを、撹乱ありと評点を付けるのが好ましい。
【０１１７】
しかし、2種の細胞または細胞系で発現する、あるmRNAに対して、存在量の相対差の大きさを決定することも有利である。これは、上記のように、差次的標識に用いる2種の蛍光体の発光比の計算、または当分野の技術者には容易に明白と思われる類似の方法により実行できる。
【０１１８】
5.5.2タンパク質マイクロアレイ
本発明の一実施形態では、マイクロアレイはタンパク質マイクロアレイである。その結果、この実施形態での品質管理プローブはポリペプチドまたはペプチドである。タンパク質品質管理プローブは、該プローブと結合性相手との接触により、特異的で定量可能な結合ができるように利用できる対応する結合性相手を有することが好ましい。
【０１１９】
タンパク質マイクロアレイ上では、関心のあるタンパク質との結合能を有するタンパク質プローブは、基板、例えば固体支持体の表面に固定化される(例えば、Goffeau et al., 1996, Science 274:546-567; Aebersold et al., 1999, Nature BioTechnology 10:994-999; Haab et al., 2001, Genome Biology 2:RESEACH0004.1- RESEACH0004.13; 米国特許第6346413号を参照されたい)。例えばポリペプチド・プローブは、ペプチド合成の標準的固相技術を用いて調製し得る。一般に知られているように、ポリペプチドは、干渉基を封鎖し、反応すべきアミノ酸を保護し、結合し、脱保護し、未反応残基をキャッピングするために、製造業者の教示に従って、市販の装置および試薬を用いて調製できる。タンパク質プローブは、非ペプチド連結基および/または修飾もしくは非天然アミノ酸、例えばD-アミノ酸、α-アミノリン酸やβ-アミノリン酸などのアミノ酸のリン酸類似体を含んでもよい。
【０１２０】
本発明の方法で使用するプローブは、無孔性、多孔性のいずれかの固体の支持体または表面上で合成するのが好ましい。本発明のプローブは、ニトロセルロースやナイロンの膜またはフィルターに付着したポリペプチド配列であってもよい。あるいは、固体の支持体または表面は、ガラスまたはプラスチック表面であってもよい。
【０１２１】
タンパク質は、各タンパク質が固体支持体上の異なる位置にある複数のタンパク質をその基板に付着した、位置的にアドレス可能なアレイ上で合成できる。好ましくは、複数のタンパク質は、単一の生物試料中に発現する異なるポリペプチドを少なくとも10, 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 50000または100000個に加え、品質管理プローブを含んでいる。タンパク質プローブは、アミノ酸モノマーを用いた逐次合成で基板上に合成される。
【０１２２】
一実施形態では、品質管理プローブは抗体またはその断片である。他の実施形態では、品質管理プローブの結合性相手が抗体またはその断片である。好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはその断片(例えば、Fab断片)である(例えば、Zhu et al., 2001, Science 293:2101-2105; MacBeath et al., 2000, Science 289:1760-63; de Wildt et al., 2000, Nature BioTechnology 18:989-994を参照されたい)。
【０１２３】
タンパク質の試料が適切な条件下でタンパク質マイクロアレイに結合すると、アレイ中の特定部位の結合量は、試料中での対応する結合性相手の普遍性を反映することは認識されよう。マイクロアレイ上のポリペプチド品質管理プローブとタンパク質結合性相手との結合量は、シグナル発生化合物により指示されるのが好ましい。例えば、タンパク質試料がタンパク質マイクロアレイに結合すると、対応する結合性相手が試料中にないポリペプチドプローブに対応するアレイ上の部位は、殆どまたは全くシグナルを示さず、また、対応する結合性相手が試料中に普遍的なポリペプチドプローブは、相対的に強いシグナルを示すであろう。試料中の異なるタンパク質の相対存在量は、マイクロアレイ上のプローブのシグナル強度パターンにより決定し得る。一実施形態では、1種または複数のシグナル化合物(例えば、蛍光色素)が、品質管理プローブのタンパク質結合性相手に直結する。他の実施形態では、1種または複数のシグナル化合物が、品質管理プローブのタンパク質結合性相手に間接的に付着する(例えば、蛍光標識抗体の使用を介して)。
【０１２４】
5.6実行のシステムおよび方法
本発明の分析方法は、好ましくは、本節に記載のコンピュータ・システムなどのコンピュータ・システムを用いて、以下のプログラムおよび方法に従って実行できる。このようなコンピュータ・システムは、好ましくは、マイクロアレイ上の品質管理プローブの位置に関する位置情報の要約、ならびにそうしたプローブが合成された順次合成サイクルの情報(即ち、マイクロアレイ中の垂直配置)を含み、本発明の分析方法を実行する際にコンピュータ・システムによって使用できるデータベースを保存し、操作することもできる。したがって、このようなコンピュータ・システムも本発明の一部であるとみなされる。特定の実施形態では、品質管理位置情報はデータベース中にデジタル形式で保存される。
【０１２５】
特定の実施形態では、コンピュータ・システムは、1個または複数のプロセッサーと前記1個または複数のプロセッサーに接続した1個または複数のメモリーとを含む。前記1個または複数のメモリーは、前記1個または複数のプロセッサーに、本発明のアレイ上にある2個以上の品質管理プローブの結合性相手との結合を比較する工程を実行させる、1個または複数のプログラムを含む。その結果は、好ましくは品質管理プローブの結合比の出力である。特定の実施形態では、コンピュータ・プログラムは、前記1個または複数のプロセッサーに、
(a) 処理されたマイクロアレイ上の品質管理プローブの結合強度を含む、第1のデータ構造を受信する工程、および
(b) データベース中の複数のデータ構造（各テータ構造が前記マイクロアレイに結合した品質管理プローブに関する位置情報を含む）と前記第1のデータ構造とを比較し、合成の完全性を評価するために、比較すべきマイクロアレイ上における関連した位置を同定する工程、および
(c)  2個以上の品質管理プローブの結合を比較する工程
を実行させる。
【０１２６】
特定の実施形態では、コンピュータ・システムは、プロセッサーに、品質管理プローブの適当な結合強度を比較させ、それによりマイクロアレイが正しく合成されたか否かを判定させるプログラムを含む。
【０１２７】
他の実施形態では、コンピュータ・システムは試料の品質管理の1つまたは複数の態様を実行する。例えば、コンピュータは、マイクロアレイ走査像のTIFFファイル中に表現された生データから、直接マイクロアレイの品質管理プローブ強度を読み取り、適当な強度を比較し、さらにアレイ合成に欠陥があるか否かを判定し、その結果、疑わしいデータを示すことができる。もし合成欠陥が特定されれば、コンピュータは、不適合レポートを作成し、品質管理問題に更に対処するまで、マイクロアレイ処理データを含んだデータベースに、疑わしいデータを自動的に追加することを控えることができよう。一実施形態では、コンピュータは、品質管理プローブの結合比が0.5〜2.0の間にない場合、不適合レポートを作成するであろう。
【０１２８】
本発明の分析法を実行するのに適当な例示的なコンピュータ・システムは、外部構成要素に連結されている内部構成要素を含むのが好ましい。このコンピュータ・システムの内部構成要素は、主メモリーと相互接続されたプロセッサー素子を含んでいる。例えば、該コンピュータ・システムは、クロック速度が200MHZ以上で主メモリーが32MB以上のIntel Pentium(登録商標)ベースのプロセッサーとし得る。好ましい実施形態では、該コンピュータ・システムは、主「ノード」と同種の副「ノード」8個を含み、各ノードが中央処理装置(CPU)を有する複数のコンピュータのクラスターである。その上、該クラスターは、主ノード上に少なくとも128MBのランダム・アクセス・メモリー(RAM)、および8個の各副ノード上に少なくとも256MBのRAMを含む。したがって、本発明のコンピュータ・システムは、1つのメモリーまたは1つのプロセッサーからなるシステムに限らない。
【０１２９】
外部構成要素は大容量保存装置を含むことができる。この大容量保存装置は、プロセッサーおよびメモリーと共に通常パッケージとなっている1個または複数のハード・ディスクであってもよい。このようなハード・ディスクは、通常、保存容量が1GB以上であり、より好ましくは保存容量が少なくとも6GBを有する。例えば、好ましい実施形態では、前記のように本発明のコンピュータ・システムが幾つかのノードを含む場合、各ノードは独自のハード・ドライブを有することができる。主ノードは、好ましくは保存容量が少なくとも6GBのハード・ドライブを有し、同種の各副ノードは、好ましくは保存容量が少なくとも9GBのハード・ドライブを有する。本発明のコンピュータ・システムは、更に、例えば1個または複数のフロッピー（登録商標）・ドライブ、1個または複数のCD-ROMドライブ、1個または複数のDVDドライブまたは1個または複数のDATドライブを含む、他の大容量保存装置を含むことができる。
【０１３０】
他の外部構成要素には、最も普通には、「マウス」などのグラフィカル入力デバイスと共に、モニターおよびキーボードのユーザー・インターフェース・デバイスが挙げられる。該コンピュータ・システムは、普通ネットワーク・リンクにも連結されており、そのリンクは、例えば、他の構内コンピュータ・システムへの構内ネットワーク(LAN)の一部、および/または他の遠隔コンピュータ・システムに接続される、インターネットなどの広域ネットワーク(WAN)の一部となり得る。例えば、好ましい実施形態では、前記のように該コンピュータ・システムが複数のノードを含む場合、各ノードは、好ましくは、ネットワーク、好ましくはNFSネットワークに接続され、それにより、コンピュータ・システムのノードで、ネットワークで相互に、また場合により、他のコンピュータ・システムと通信を行い、その結果、相互にデータおよび処理作業を共有できる。
【０１３１】
このようなコンピュータ・システムの操作中のメモリーに、幾つかのソフトウェア構成要素がロードされる。ソフトウェア構成要素は、当分野で標準的なソフトウェア構成要素と、本発明の特別な構成要素との両方を含む。このようなソフトウェア構成要素は、通常ハード・ドライブなどの大容量保存装置に保存されるが、例えば1個または複数のフロッピー（登録商標）・ディスク、1個または複数のCD-ROM、1個または複数のDVDまたは1個または複数のDATを含む、他のコンピュータ可読媒体に保存することもできる。ソフトウェア構成要素は、コンピュータ・システムおよびそのネットワークとの相互接続の管理を担うオペレーティング・システムである。オペレーティング・システムは、例えば、Windows 95, Windows 98, Windows NT, Windows 2000などのMicrosoft Windows(商標)ファミリーのひとつであってもよい。あるいは、基本ソフトは、Macintoshオペレーティング・システム、UNIX（登録商標）オペレーティング・システムまたはLINUXオペレーティング・システムとしてもよい。ソフトウェア構成要素は、本発明に特有の方法を実行するプログラムを補助するために、システム中に存在することが好ましい共通の言語および機能を含む。本発明の分析法のプログラム作成に使用できる言語には、例えば、CおよびC++,FORTRAN,PERL,HTML,JAVA（登録商標）、およびCシェル・スクリプト言語などのUNIX（登録商標）またはLINUXのシェル・コマンド言語が挙げられる。本発明の方法は、数学ソフトウェア・パッケージ中でプログラムまたはモデルの作成をすることもでき、該パッケージにより、式の記号入力および使用すべき特定ののアルゴリズムを含む処理の高度な記述が可能となり、それによりユーザーは、個々の式やアルゴリズムのプログラム作成手順を取る必要から解放される。このようなパッケージには、例えば、Mathworks (Natick, MA)製のMatlab、Wolfram Research (Champaign, IL)製のMathematica、またはMathSoft (Seattle, WA)製のS-Plusが含まれる。
【０１３２】
該ソフトウェア構成要素は、好ましくは、言語や記号の手順パッケージ中にプログラムされた本発明の分析法を含む。例えば、ソフトウェア構成要素は、プロセッサーに、各マイクロアレイ上の各品質管理プローブに対する複数の位置データを受け入れる工程、およびメモリー中にデータを保存する工程を実行させるプログラムを含むのが好ましい。例えば、コンピュータ・システムは、ユーザーが手入力した(例えば、ユーザー・インターフェースにより)データを受け入れることができる。あるいはしかし、コンピュータ・システムは、プログラムにより、データベースから品質管理プローブの情報を引き出すことができる。このようなデータベースは、通常ハード・ドライブなどの大容量保存装置または他のコンピュータ可読媒体に保存し、コンピュータのメモリー中にロードすることができ、あるいは、そのデータベースに、ネットワークによってコンピュータ・システムがアクセスすることができる。
【０１３３】
一実施形態では、コンピュータ可読媒体は、
(a) マイクロアレイ上にある品質管理プローブの位置のデジタル表示、および
(b) 各品質管理プローブが合成された合成サイクルのデジタル表示
を含む暗号データ構造を含んでいる。
【０１３４】
他の実施形態では、意図的な欠陥のある対照マイクロアレイを処理でき、シグナル強度のパターンおよび比を保存できる。本発明は、試料用マイクロアレイからのシグナル強度(1個または複数)および/または得られる比を、既知のエラーの要約を含んだデータベースと比較する方法も包含している。もしデータベース中に一致するものがあれば、試料用マイクロアレイ中の欠陥を判定できる。
【０１３５】
本明細書に記載の例示的なプログラム構造およびコンピュータ・システムの他に、代替的な他のプログラム構造およびコンピュータ・システムは、技術者には容易に明らかとなろう。したがって、精神上、範囲上のいずれからも前記のコンピュータ・システムおよびプログラム構造から逸脱しない、このような代替的システムは、付随する請求の範囲内に含むことを意図している。
【０１３６】
以下の実施例は、本発明の例示のために提示しており、本発明を制限することを何ら意図していない。
【０１３７】
6.〔実施例１〕品質管理プローブを用いた品質管理
6.1合成過誤の明示
インクジェット・ライターは、2個のインクジェット・ヘッドを使用して、アレイのガラス基板上にホスホロアミダイトまたは活性化剤を配分する。各ヘッドにはノズル20個ずつ3組が含まれ、20ノズルの各組は、ホスホロアミダイト、活性化剤のいずれかを堆積させるために使用される。1組中のノズル20個は、10個ずつからなる交互縦列2列に配置されている(図1を参照されたい)。このパターンにより、各ノズルが1横列を担当するので、インクジェット・ヘッドの通過1回当たり20横列の塩基を堆積させることができる。各ノズルが特定の1横列を担当するので、目詰まりや他のノズルの機能的故障が起こると、20横列の周期で、横列の全体または一部が欠失するか、非効率に合成されること(当該の品質管理プローブでの強度低下により検出される)になり得る。図1では、ノズル3個が目詰まりを起こして(即ち、第4、第15および第20ノズル)合成した25000オリゴヌクレオチドのアレイが示されている。
【０１３８】
6.2合成欠陥の検出
沈泥となった品質管理プローブが、図2Aに概略的に描かれている。ヌクレオチド25個からなる所定の結合性配列(実線で描いた)は、マイクロアレイ上で直接(したがって、該配列は第1〜25合成サイクルで作製される)か、またはスペーサー(破線で描いた)上に合成されている。スペーサーは、20ヌクレオチド長(したがって、該配列は第21〜45合成サイクルで作製される)、35ヌクレオチド長(したがって、該配列は第36〜60合成サイクルで作製される)のいずれかであることが示されている。オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中にもし合成欠陥がなければ、所定の結合性配列の逆行相補体は、全品質管理プローブ上の所定の結合性配列に同等に良好なハイブリダイゼーションを起こし、同等のシグナルを示すであろう。
【０１３９】
図2Bには、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの第24合成サイクルでの合成欠陥(縞入り棒で描いた)が概略的に描かれている。所定の結合性配列がスペーサー上に存在しないか、または20ヌクレオチドのスペーサー上に存在するとき、合成欠陥のためにその配列が影響されるので、逆行相補体とのハイブリダイゼーションは、合成過誤の認められない結合レベルと比較して減少するであろう。しかし、35ヌクレオチドのスペーサー上での所定の結合性配列は、影響されない。したがって、その配列は、合成過誤のないときと同程度に、逆行相補体とハイブリダイゼーションするはずである。
【０１４０】
配列番号1の配列を有する品質管理プローブは、スペーサーなし(全長25ヌクレオチドになる)、20オリゴヌクレオチド・スペーサー(全長45ヌクレオチドになる)上、35オリゴヌクレオチド・スペーサー(全長60ヌクレオチドになる)上のいずれかで、インクジェット法オリゴヌクレオチド・マイクロアレイ上に合成した。
【０１４１】
5' ATCATCGTAGCTGGTCAGTGTATCC 3' (配列番号1)
配列番号1の蛍光標識した逆行相補体を、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイとハイブリダイゼーションするために用いた。オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に合成欠陥がなかったとき、全品質管理プローブは、逆行相補体と同等に良好なハイブリダイゼーションを生じた(図4)。このことは、マイクロアレイ処理後、蛍光標識した逆行相補ヌクレオチドと、同等レベルにハイブリダイゼーションしたことにより示された(図4A〜4Bを参照されたい)。各品質管理プローブの蛍光強度を定量するデータは、2個のマイクロアレイ上で2回繰り返したもので、表1に示してある。25merの平均蛍光強度と45merまたは60merの平均蛍光強度との比は、1に近く、全部が逆行相補体と同等に結合していることを示す。
【０１４２】
品質管理プローブの感度を確認するために、マイクロアレイ合成中の様々な合成サイクルに欠陥がある場合の同様な実験を行った。合成中に第1 (図5)、または第1および第2 (図6) 合成サイクルを省いたときは、蛍光標識した相補オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは25merだけに影響が出た(図5A〜5Bおよび6A〜6B)。表1中の両方の比は、合成サイクルを省かないときの比に比べて減少している。第36 (図7)、または第34および第35 (図8) 合成サイクルを省いたときは、蛍光標識した相補オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、45merと60merの両方に影響が出た(図7A〜7Bおよび8A〜8B)。表1中の両方の比は、合成サイクルを省かないときの比に比べて増加している。最初の22合成サイクル(図9)で合成が不十分であったとき、蛍光標識した相補オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは25merだけに重度の影響が出た(図9A〜9B)。表1中の両方の比は、合成サイクルを省かないか、または効率的なときに見られる比に比べて減少している。
【表１】
2005531315.tif 000003
【０１４３】
7.〔実施例２〕スペーサーのない品質管理プローブを用いた品質管理
7.1合成の失敗の検出
時差開始品質管理プローブが図3Aに概括的に描かれている。25ヌクレオチドからなる一連の所定の結合性配列(太線で描いた)が、個々のプローブの合成を合成サイクル毎(第1〜36合成サイクルから)に開始して、マイクロアレイ上に直接合成されている。前記の戦略と異なり、スペーサーは使用されず、全品質管理プローブが、25オリゴヌクレオチド長の所定の結合性配列だけで構成されている。品質管理プローブ間の唯一の差異は、合成開始のサイクルである(太線で品質管理プローブを描き、細線でモノマーを堆積させなかった合成サイクルを描いている)。各品質管理プローブを作製する合成サイクルは、図3A中の各プローブの上に列挙されている。オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中にもし合成欠陥がなければ、プローブ配列の逆行相補体は、全品質管理プローブに同等に良好なハイブリダイゼーションを生じ、同等なシグナルを示すであろう。
【０１４４】
図3Bには、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの第29合成サイクル中の合成欠陥(灰色棒で描いた)を概略的に描いている。配列の一部として第29合成サイクルを有する所定の結合性配列(即ち、第5〜29合成サイクルで開始する品質管理プローブ)は全て、合成欠陥のために影響されるので、逆行相補体とのハイブリダイゼーションは、合成過誤の認められない結合レベルと比較したとき、これらの品質管理プローブでは減少するであろう。しかし、第29合成サイクル中に堆積されるモノマーを含んでいない品質管理プローブ(即ち、第1〜4または第30〜35サイクルで合成を開始する品質管理プローブ)は、影響されず、したがって、そのようなプローブは、合成過誤のないときと同程度に、逆行相補体とハイブリダイゼーションするはずである。
【０１４５】
配列番号1の配列を有する品質管理プローブは、時差開始を用いて、インクジェット法オリゴヌクレオチド・マイクロアレイ上に合成した。品質管理配列は、マイクロアレイ合成中の第1〜35番の連続的合成サイクル毎に開始した。配列番号1の蛍光標識した逆行相補体を、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイとハイブリダイゼーションするために使用した。
【０１４６】
オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に、第1および第2合成サイクルの合成が不十分であったとき、最初の2個の時差開始品質管理プローブだけに影響があった(図10)。各合成サイクルにおける品質管理プローブの平均蛍光強度をプロットしたところ、マイクロアレイの第1および/または第2合成サイクルに、品質管理プローブ配列の一部を含んでいたプローブだけに強度の減少を認めた(図10B)。第2合成サイクルの後に合成を開始した品質管理プローブは全て、影響を受けず、逆行相補体と同等に良好なハイブリダイゼーションを起こした。オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に、最初の5合成サイクル(図11)、最初の8合成サイクル(図12)、または最後の15合成サイクル(図13)で合成が不十分であったとき、同様な結果を認めた。各例において、その配列の一部に寄与するモノマーが、マイクロアレイの影響のあった合成サイクルで堆積した品質管理プローブだけに対して、蛍光強度が減少した。
【０１４７】
8.〔実施例３〕品質管理プローブの感度増加
8.1欠失の使用
1つまたは複数の合成サイクルに障害のあるようなオリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中の合成の失敗により、品質管理プローブの蛍光標識した逆行相補オリゴヌクレオチドとの結合度が減少する(例えば、前記の6.2節および7.1節を参照されたい)。しかし、品質管理プローブが完全長より今僅かに短くなる(即ち、完全長の25merに対して24merまたは23mer)ような、ごく少数の合成サイクルだけに障害のある(即ち、1または2)場合、逆行相補オリゴヌクレオチドとの結合は尚かなり強固となり得る。合成の失敗の検出感度を増すために、単一の欠失を既に含んだ所定の結合性配列を有する品質管理プローブを、本発明の方法に用いた。このような品質管理プローブの所定の結合性配列が、配列番号1の第19残基(5'末端から)に欠失を有したまま合成された。マイクロアレイ合成中の失敗による欠失が更にあれば、欠陥が悪化し、完全長の25mer配列の逆行相補体と結合する能力の不足が増加するであろう。図14では、第34および第35合成サイクルに合成欠陥のある、マイクロアレイ上の単一欠失の品質管理プローブは、欠失のない品質管理プローブより高感度であることが示されている。
【０１４８】
5' ATCATCGTAGCTGGTCAGGTATCC 3' (配列番号2)
完全長25ヌクレオチドの所定の結合性配列に対する標識逆行相補体を、各マイクロアレイ上の品質管理プローブとハイブリダイゼーションするために用いた。各合成サイクルでの品質管理プローブの平均蛍光強度のプロットを、各マイクロアレイに対して決定した。完全長品質管理プローブは、第15合成サイクルで始まる合成欠陥を示している(図14A)。単一欠失品質管理プローブは、第11合成サイクルで始まる合成過誤を示している(図14B)。したがって、単一欠失品質管理プローブは、マイクロアレイ品質のより高感度の測定手段である。
【０１４９】
8.2相関性プロットとの比較
このような実験は、1個または複数の欠陥を含んだマイクロアレイの使用で、外観上は許容可能に見えるデータが得られることを示している。しかし、そのデータを欠陥のないマイクロアレイのデータと比較すると、問題が明白となる。相関性プロットで実験の再現性を調べることによって、データの品質を評価する(例えば、蛍光体反転対の分析の使用)。蛍光体反転対の間の相関性を、最初の22合成サイクルに欠陥のあったマイクロアレイ(図15A)、および欠陥のなかったマイクロアレイ(図15B)に対してプロットした。オリゴヌクレオチドを赤色、緑色のいずれかの蛍光色素で標識し、混合物を各マイクロアレイとハイブリダイゼーションするために用いた。複製チップについて、赤色対緑色の蛍光シグナル比のlog10を赤色対緑色の蛍光シグナル比のlog10に対してプロットした。最初の22合成サイクルを省いたマイクロアレイからのデータをそれ自体と比較したときは、何ら問題が検出されなかった(図15A)。同様に、欠陥のないマイクロアレイからのデータをそれ自体と比較したとき、何ら問題が検出されなかった(図15B)。しかし、最初の22合成サイクルを省いたマイクロアレイからのデータを、欠陥のないマイクロアレイからのデータと比較したとき、差異が生じている(図15C)。欠陥のあるマイクロアレイからも、データが生成するであろう。そのデータがどのようになるべきかは予知されないので、欠陥のあるマイクロアレイからのデータは、当初は許容可能に見えることもある。本発明による品質管理プローブの使用は、不十分な品質データから保護するためである。
【０１５０】
合成サイクルの第1(図16A)、第1および第2(図16B)、第36(図16C)、または第34および第35(図16D)が合成中に省かれたオリゴヌクレオチド・マイクロアレイで、同様な実験を行った。欠陥のあるマイクロアレイとのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションから得たデータを、欠陥のないマイクロアレイからのデータに対してプロットした。全てのプロットはやはり同様に見えており、合成欠陥は検出されなかったであろう。これは、相関性プロットを用いるマイクロアレイの分析が、欠陥のあるマイクロアレイを特定するほどの感度がないことを明示している。
【０１５１】
9.引用した参考文献
本明細書に引用した全ての参考文献は、個々の各刊行物または特許もしくは特許出願が、全ての目的のためにその全体の参照により組み込むように明確に、個別に指示された場合と同程度に、その全体の参照により、また全ての目的のためにここに組み込まれている。
【０１５２】
本発明の多くの改変および変更は、当分野の技術者であれば明らかなように、その精神および範囲から逸脱せずになし得るものである。ここに記載の特定の実施形態は、例示だけのために提示しているものであって、本発明は、添付した請求の範囲、ならびに、該請求の範囲に権利のある十分な範囲の等価物による以外では、制限されるべきものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】3個の機能的故障のノズルで合成したインクジェット法オリゴヌクレオチド・マイクロアレイを示す図である。ノズル4、15および20に対応する横列全てが、ノズルの機能的故障のために合成されなかった。
【図２Ａ】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、スペーサー付き品質管理プローブの使用を概略的に示す図である。(A)25ヌクレオチド長のプローブをマイクロアレイ上に直接合成するか、または長さが変化するスペーサー(即ち、20ヌクレオチドまたは35ヌクレオチド)に付着した。
【図２Ｂ】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、スペーサー付き品質管理プローブの使用を概略的に示す図である。(B)合成サイクル24での合成過誤が描かれており、したがって図示した最初の品質管理プローブ2個においてだけ、所定の結合性配列中のモノマー配列が影響を受けている。実線は品質管理プローブを描き、点線はスペーサーを描いている。
【図３Ａ】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、時差開始品質管理プローブの使用を概略的に示す図である。(A)25ヌクレオチドの一連の品質管理プローブを、合成サイクル1から始めて合成サイクル36までマイクロアレイ上に直接合成する。品質管理プローブ間の唯一の違いは、合成を始める合成サイクルである。
【図３Ｂ】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、時差開始品質管理プローブの使用を概略的に示す図である。(B)合成サイクル29での合成過誤が描かれており、したがって品質管理プローブの配列にモノマーを付加するために、合成サイクル29を実際に用いた品質管理プローブだけが影響を受けている(即ち、合成サイクル5〜29で合成を始める品質管理プローブ)。太線は品質管理プローブを描き、細線はモノマーが堆積しなかった合成サイクルを描いている。
【図４】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に合成欠陥が不明か検出できなかったときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、スペーサーを含む品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。(B)25mer、40merおよび60merの各位置を描いている(A)のマイクロアレイの高倍率像。
【図５】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に第1合成サイクルを意図的に省いたときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、スペーサーを含む品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。(B)25mer、40merおよび60merの各位置を描いている(A)のマイクロアレイの高倍率像。
【図６】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に第1および第2合成サイクルを意図的に省いたときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、スペーサーを含む品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。(B)25mer、40merおよび60merの各位置を描いている(A)のマイクロアレイの高倍率像。
【図７】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に第36合成サイクルを意図的に省いたときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、スペーサーを含む品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。(B)25mer、40merおよび60merの各位置を描いている(A)のマイクロアレイの高倍率像。
【図８】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に第34および第35合成サイクルを意図的に省いたときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、スペーサーを含む品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。(B)25mer、40merおよび60merの各位置を描いている(A)のマイクロアレイの高倍率像。
【図９】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に最初の22合成サイクルで非効率な合成をしたときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、スペーサーを含む品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。(B)25mer、40merおよび60merの各位置を描いている(A)のマイクロアレイの高倍率像。
【図１０】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に第1および第2合成サイクルで非効率な合成をしたときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、時差開始品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。 (B)各合成サイクルにおける品質管理プローブの平均蛍光強度のプロット。
【図１１】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に最初の5合成サイクルで非効率な合成をしたときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、時差開始品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。(B)各合成サイクルにおける品質管理プローブの平均蛍光強度のプロット。
【図１２】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に最初の8合成サイクルで非効率な合成をしたときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、時差開始品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。(B)各合成サイクルにおける品質管理プローブの平均蛍光強度のプロット。
【図１３】オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成中に第45〜第60合成サイクルで非効率な合成をしたときに、オリゴヌクレオチド・マイクロアレイの合成品質を判定するために、時差開始品質管理プローブの使用を示す図である。(A)品質管理プローブとハイブリダイゼーションする蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした後のマイクロアレイ像。(B)各合成サイクルにおける品質管理プローブの平均蛍光強度のプロット。
【図１４】単一欠失品質管理プローブの感度増加を示す図である。第34および第35合成サイクルで合成欠陥を有するマイクロアレイが、所定の結合性配列中に意図的な単一欠失がない(A)か、またはある(B)品質管理プローブで合成された。完全長25ヌクレオチドの所定の結合性配列の標識逆転相補体を用いて、各マイクロアレイとハイブリダイゼーションした。各合成サイクルにおける品質管理プローブの平均蛍光強度のプロットを、各マイクロアレイに対して決定した。
【図１５Ａ−Ｂ】合成中に最初の22合成サイクルを省いたマイクロアレイに対する(A);合成欠陥のなかったマイクロアレイに対する(B)蛍光体反転対の間の相関を示す図である。
【図１５Ｃ】合成中に最初の22合成サイクルを省いたマイクロアレイと合成欠陥のなかったマイクロアレイに対する(C)、蛍光体反転対の間の相関を示す図である。
【図１６】合成欠陥のなかったオリゴヌクレオチド・マイクロアレイと、合成中に、第1合成サイクル(A)、第1および第2合成サイクル(B)、第36合成サイクル(C)または第34および第35合成サイクル(D)を省いた各オリゴヌクレオチド・マイクロアレイとの間の相関を示す図である。
【図１７】品質管理プローブが基板に付着されたマイクロアレイを概略的に示す図である。(A)外側グリッド線。(B)対角グリッド線。(C)内部クラスター。(D)隅部クラスター。
【配列表】
2005531315.tif 000004
【図１】
2005531315.tif 000005
【図２Ａ】
2005531315.tif 000006
【図２Ｂ】
2005531315.tif 000007
【図３Ａ】
2005531315.tif 000008
【図３Ｂ】
2005531315.tif 000009
【図４】
2005531315.tif 000010
【図５】
2005531315.tif 000011
【図６】
2005531315.tif 000012
【図７】
2005531315.tif 000013
【図８】
2005531315.tif 000014
【図９】
2005531315.tif 000015
【図１０】
2005531315.tif 000016
【図１１】
2005531315.tif 000017
【図１２】
2005531315.tif 000018
【図１３】
2005531315.tif 000019
【図１４】
2005531315.tif 000020
【図１５Ａ−Ｂ】
2005531315.tif 000021
【図１５Ｃ】
2005531315.tif 000022
【図１６】
2005531315.tif 000023
【図１７】
2005531315.tif 000024
【国際調査報告】
2005531315.tif 000025
2005531315.tif 000026
2005531315.tif 000027