(57)【要約】本発明は、２３００〜２５００ＭＨｚの周波数で、６００〜９００ワットの出力をもち、そして５〜１２０秒にわたる期間の連続した短時間のマイクロ波照射を使用した、単純で、効率的で、促進的な、酵素触媒によるインビトロでの核酸の修飾および合成方法；そしてさらに上記方法を使用するための装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続した、短時間のマイクロ波照射を使用した、酵素触媒されるインビトロでの核酸の修飾および合成のための単純で、効率的で、かつ、促進的な方法であって、以下のステップ： 
（ａ）小さなエッペンドルフ・チューブ中またはパラフィルム小片上に、以下の（ｉ）制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼから成る群から選ばれる酵素、（ｉｉ）上記の選ばれた酵素の基質として作用する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドから選ばれる生体分子、（ｉｉｉ）特定の酵素に好適なバッファー、ならびに（ｉｖ）他の成分、を含む反応混合物を提供し、
（ｂ）上記反応混合物を添加した上記エッペンドルフ・チューブまたはパラフィルム片を電子レンジ内に移し、
（ｃ）上記エッペンドルフ・チューブまたはパラフィルム片に、２３００〜２５００ＭＨｚの周波数で６００〜９００ワットの出力をもつマイクロ波を連続的に照射し、
（ｄ）５〜１２０秒間、
（ｅ）エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を加えることによって、および／または７５℃で３〜１５分間水浴中で加熱することによって反応を終わらせ、その後にゲル添加染料の添加が続き、そして
（ｆ）上記反応産物を、アガロースゲル電気泳動法、オートラジオグラフィー、放射能のカウント、および伝統的な手順で使用される他の技術によって分析する、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記使用される他の成分が、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣＨ3ＣＯＯＨ、エチレンジアミンテトラアセテート、ジチオスレイトール、スペルミジン、ＢＳＡ、トリトンｘ−１００、ヌクレオチド、鋳型ＤＮＡ、鋳型ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチド・プライマーを含む群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＢｓｔＥＩＩ、およびＢｓｔＮＩから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記使用されるリガーゼがＴ４ＤＮＡリガーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記使用されるキナーゼがＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（ＴＰＮＫ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記使用されるホスファターゼが仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記使用される逆転写酵素がトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記使用されるＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、λファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、バキュロウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、および哺乳動物のＤＮＡを含む群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
２種類以上の制限エンドヌクレアーゼが、核酸の二重消化に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記使用される制限エンドヌクレアーゼが、二重消化のためのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロ波照射を、マイクロ波を発生させることができるあらゆる装置またはチャンバー内で行うことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、特別に設計された装置によって部分的に、または完全に自動化されうる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
連続した、短時間のマイクロ波照射を使用した、酵素触媒されるインビトロでの核酸の修飾および合成を効率的に実施するのに好適な装置であって、以下の：
（ａ）マグネトロン、排気ファン、光ファイバーの温度計、冷却系、および回転式反応台から成る反応チャンバー、
（ｂ）好適なハードウェアとソフトウェアにより異なる反応を実施するためのあらかじめプログラムされたコマンドを与えるためのマイクロプロセッサ・ベースの演算手段、
を含む前記装置。
【請求項１６】
前記マグネトロンが、約２４５０ＭＨｚの周波数、１００ワット〜８００ワットの出力で作動するマイクロ波供給源である、請求項１５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２３００〜２５００ＭＨｚの周波数で、６００〜９００ワットの出力をもち、そして５〜１２０秒にわたる期間の連続した短時間のマイクロ波照射を使用した、単純で、効率的で、促進的な、酵素触媒によるインビトロでの核酸の修飾および合成方法；そしてさらに上記方法を使用するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の酵素反応は、分子生物学者の生命線である。分子生物学において最も一般に使用される酵素反応は、部位特異的切断、ライゲーション、脱リン酸化、リン酸化（カイネーション）、およびインビトロでのＤＮＡおよびＲＮＡ合成反応である。これらの反応は、異なる酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼによって行われる。これらの反応産物は分子生物学での広範囲な用途をもつ。
【０００３】
いくつかの制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥＮｓ）の発見が、近代バイオテクノロジーの誕生をもたらした。これらの酵素は、向かい側の鎖のニッキングによる２本鎖ＤＮＡの配列特異的加水分解切断を触媒する。
【０００４】
リガーゼは、もう１つの重要な酵素であり、２本鎖ＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの１本鎖ニックの２つの適合末端の間のホスホジエステル結合の形成により核酸の修飾を可能にする。［Engler, M. J. およびRichardson, C. C. (1982)、The Enzymes (Boyer, P. D, ed) Vol. 5, p. 3, Academic Press, San Diego中］。ＤＮＡリガーゼ触媒反応による産物は、クローニングおよび遺伝子操作のために必要とされる。
【０００５】
ホスファターゼは、核酸の末端のリン酸基の除去を触媒し［Sambrook, J., Fritsch, E. F.およびManiatis, T. (1989) Molecular cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York］、そしてクローニングおよび［γ32Ｐ］ＡＴＰによる末端標識におけるベクター・バックグラウンドの減少のために必要である。
【０００６】
ポリヌクレオチド・キナーゼは、ポリヌクレオチド（２本鎖および１本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ）、およびヌクレオシド３’一リン酸のガンマ位のＡＴＰから５’ヒドロキシル末端へとリン酸基を転移するか、または交換することによって核酸を修飾する［Sambrook, J., Fritsch, E. F. およびManiatis, (1989) Molecular cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York］。
【０００７】
それぞれのポリメラーゼによって触媒される鋳型に対するＤＮＡおよびＲＮＡの合成は、組み換えＤＮＡの探索においてごく普通に行われる。ＤＮＡ鋳型に対するＤＮＡ合成は、ニック・トランスレーションによる放射標識ハイブリダイゼーション・プローブの準備［Rigbyら(1977), J. Biol. Chem. 113:237］、ＤＮＡ断片のライゲーションおよび標識のための末端埋め合わせ反応、第二鎖ｃＤＮＡ合成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡ塩基配列決定法などに使用される。
【０００８】
逆転写酵素によって触媒されるＲＮＡ鋳型に対するＤＮＡ合成は、ｃＤＮＡの合成およびＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子の増幅のために必要とされる。ＤＮＡ鋳型に対するＲＮＡ合成（転写）は、ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーターの同定、連動した転写反応と翻訳反応、および高度に標識されたＲＮＡプローブの製造などのために利用される。
【０００９】
伝統的に、前記反応は、酵素が最大の活性を示す最適温度に維持された水浴中でインキュベートすることによって行われる。個々の酵素および基質、ならびにそれらの濃度に依存して、インキュベーション時間は数分から数時間まで変化する。これらの反応のほとんどが、ある反応の産物が他の反応の基質であるように、個々の目的を達成するために連続して行われることがしばしば必要とされる。たとえこれらの反応のほとんどが数分〜数時間しかかからないとしても、反応の個々のセットを完了するために消費される全体的な時間は非常に長い。反応の完成を確実にするためにより長い反応時間を与えることが一般に望ましい。
【００１０】
伝統的な手順の主な欠点は長い反応時間であり、そして分子生物学者たちは、これらの酵素を用いて時間がかかる実験を遂行するために彼らの貴重な時間の多くを浪費しなくてはならない。酵素触媒反応をより速くする方法の１つが、酵素または基質のいずれか、あるいはその両方を活性化することである。通常、有機反応は、加熱によって加速される。それはそれらのほとんどが熱不活化に弱い酵素である場合には必ずしも可能なわけではない。化学的または生物学的な反応を加速する代わりの方法の１つが、エネルギー源としてマイクロ波を使うことである。実際、有機反応の速度を加速するためのマイクロ波の使用は長い間知られていた。
【００１１】
１９８６年に、Ｇｅｄｂｙｅら、およびＧｉｇｕｅｒｅらは、多くの有機反応がマイクロ波照射によって非常に速く行われうることを証明した［Gedye, R. N.ら、Tetrahedron Lett. (1986) 26, 279; Giguere, R. Jら、Tetrahedron Lett. (1986), 27, 4945-4948］。それ以来、「マイクロ波誘導有機反応増強」（ＭＯＲＥ）化学の汎用性が、多くの著者によって種々の有機反応、例えば接触水素添加、ディールス・アルダー反応、フリー・ラジカル反応、アシル化、脱アシル化などによって証明された［Bose. A. K, ら、Res. Chem. Intermed. (1994) 20, 1-11; Bose. A. Kら、J. Org. Chem. (1991) 56, 6968-6970; Nahar, P. Tetrahedron Lett. (1997) 38, 7253-7254］。実際には、これらの全ての反応が、２４５０ＭＨｚの周波数で作動し、そして最大出力が約７００ワットである国産の電子レンジで実施された。通常、これらのオーブンは異なる出力に対応する１０の異なるレベルをもち、レベル１０が最大または最高の出力を有するのに対し、レベル１は電子レンジの最低の出力を有する。時間の大幅な削減がマイクロ波反応の主な利点であるが、同様に反応の選択性または特異性が報告された［Nahar, P. Tetrahedron Lett. (1997) 38, 7253-7254］。
【００１２】
同様に、マイクロ波エネルギーは、タンパク質分析［Akins, Jr. ら;米国特許第5,403,747号および同第5,478,748号］、および免疫組織化学［Boon, M. E.ら; Am. J. Clin.Pathol. (1989), Boon, M. E.ら; In Microwave Cookbook of Pathology: The art of Microscopic Visualisation］のために首尾よく使われた。同様に、マイクロ波照射によるアデノシン三リン酸の加水分解が研究された［Jahngen, E. G .E.ら、J. Org. Chem. (1990) 55, 3406-3409］。
【００１３】
生体高分子、特に酵素とＤＮＡに対するマイクロ波照射の効果は、数人の研究者によって研究された。しかし、生体分子に対するマイクロ波照射の効果に関する矛盾する報告があった。いくつかのケースで、マイクロ波が、実験小動物の脳の酵素を不活化するのに使用された［Galli ClaudioおよびRacagni Giogio, Methods in enzymology, (1982) 86, 636-642］。しかし、Ｂｙｕｓ，Ｃ．Ｖ．らは、マイクロ波エネルギーを使った培養細胞においてオルニチン・デカルボキシラーゼ活性の増加が見られた［Byusら、Cancer Res. (1988) 48, 4222-4226］。同様に、細胞の酵素活性の増強、ならびに抑制が観察された報告もある［Dutta, S. K.およびVerma, M. Current Scince (1989) 58, 58-63; Dutta, S. K.およびVerma, M. Current Scince (1988) 57, 779-786］。Ｍａｌｅｅｖ、Ｖ．Ｙａらは、ＤＮＡによる高いマイクロ波吸収に関するどんな効果も見つけることができなかった（Maleev, V. Yaら、Biopolymers (1987) 26, 1965-1970）。しかし、Ｎａｒａｓｉｍｈａｎらによると、マイクロ波にさらされた場合、ＤＮＡ分子は、１本鎖の破損、二本鎖の破損、局所的な鎖の分離などを示す可能性がある［Narasimhan, V. およびHuh, W. K.; Biochem. International (1991) 25, 363-370］。
【００１４】
マイクロ波による核酸合成および修飾のための酵素反応の増強は、これまで報告されないが、制限酵素による核酸消化は、Ｊｈｉｎｇａｎによって報告された（米国特許第５，３５０，６８６号）。著者は、標準的な電子レンジの７００ワットの出力の１０％である最も低い出力レベルのマイクロ波エネルギーを使って制限酵素を用いてＤＮＡを消化した。著者は、反応中にマイクロ波出力を反応混合物に適用しない一連の間隔を同様にとった。この方法における酵素の大部分による消化反応の総反応時間は６〜１５分だった。しかし、３７℃でインキュベートされる時、プラスミドＤＮＡの対照サンプルのいくつかは、ほぼ完璧な消化された産物を示した。この実験から、反応時間のほとんどで酵素が適切なマイクロ波を得なかった時に、どれくらいのマイクロ波照射が上述の酵素反応の原因となったか明らかではない。これらのケースにおいてマイクロ波より時が主要な役割を担っているように思われる。
【００１５】
高分子のマイクロ波を介した酵素触媒による修飾のための方法（米国特許第５，３５０，６８６号）は、いくつかの欠点、例えば（１）時間短縮は魅力的でなかった。３７℃で同時に電子レンジ外での制限酵素消化反応のいくつかに関して同程度の結果を得ることが可能であるかもしれない。（２）上記手順は、マイクロ波出力が反応混合物に適用されない一連の間隔を必要とする、（３）酵素反応のための同一の条件が存在しなかった。ほとんどのケースで、著者は制限酵素を使った消化反応に関して異なるマイクロ波照射時間を使った、そして（４）手順の自動化は、（ａ）より長い反応時間と（ｂ）反応条件の不同一性のためにあまり有効ではない、があった。
【００１６】
本発明における適用は、上述の欠点の全てを克服した。あらゆる反応のために最適な条件が必要とされる。最適な熱エネルギーが酵素反応を加速し、穏やかな条件（最適条件を下回る）で、反応が減速するのに対して、ドラスチックな条件（最適条件を上回る）で、酵素は非活性化する。同じことは、マイクロ波エネルギーを使用した反応についても当てはまる。最適な条件が維持されなければ、酵素反応が台無しになるか、または不完全な反応産物を与えるかもしれない。本発明において、その多くが報告された方法に反する、先行技術で知られていない適当な条件を発見した。
【００１７】
その上、マイクロ波による酵素反応は、酵素と基質を除く反応混合物の組成に大きく依存する。バッファー、そのｐＨ、塩濃度、および他の成分が、より特にマイクロ波によってされる時、酵素反応の主要な役割を担っている。我々は、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む希釈バッファー中、短期間（１５秒以上）でさえ、高出力の連続的なマイクロ波にさらされた場合、制限酵素は不活化されたのに対し、３７℃の伝統的な反応においてそれは活性を維持することを発明した。必要な場合、高濃度酵素を希釈するために希釈バッファーが製造業者によって推奨される。
【００１８】
Ｊｈｉｎｇａｎによって報告された研究（米国特許第５，３５０，６８６号）に反して、我々は、生物学的高分子の酵素的修飾が、２４５０ＭＨｚの周波数および７００ワットの出力で作動する電子レンジの最も高い出力設定で行われうることをここで発明した。その上、この場合もやはり上述の研究に反して、マイクロ波が介在する酵素反応中にあらゆる中断を必要としないことを我々は同様に発見した。
【発明の開示】
【００１９】
本発明の目的
本発明の主な目的は、分子生物学および組換えＤＮＡ技術、そして他の技術分野における遺伝子の分析および操作に不可欠であるこれらの酵素触媒反応の特異的産物を製造するための迅速で、効率的な酵素的反応の方法を提供することである。
本発明の他の目的は、単純で、再現性のある、そして追加の専門的知識または高価な装置を必要としない方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる他の目的は、単独の器具によってバイオテクノロジーまたは分子生物学において使用される酵素反応のほとんどを実施するための単純な方法によって自動化されることができる方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、酵素に不都合な効果をもたらさない照射を伴った方法を開発することである。
【００２１】
本発明の概要
本発明は、２３００〜２５００ＭＨｚにわたる周波数で、６００〜９００ワットにわたる出力で、かつ、５〜１２０秒にわたる期間の連続した、短時間のマイクロ波照射を使用した、単純で、効率的で、促進的な酵素触媒されたインビトロでの核酸の修飾および合成方法；そしてさらに、上記方法を使用した装置に関する。
【００２２】
本発明の詳細な説明
それ故に、本発明は、連続した、短時間のマイクロ波照射を使用した、単純で、効率的で、促進的な、酵素触媒されるインビトロでの核酸の修飾および合成方法に関する。
【００２３】
本発明の態様において、小さいエッペンドルフ・チューブ中、またはパラフィルムの小片上に、以下の（ｉ）制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼから成る群から選ばれる酵素、（ｉｉ）上記選ばれた酵素の基質として作用する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドから選ばれる生体分子、（ｉｉｉ）特異的酵素のための好適なバッファー、そして（ｉｖ）他の成分を含む反応混合物を提供する。
【００２４】
本発明の他の態様において、反応混合物を添加した前記エッペンドルフ・チューブまたはパラフィルム片を電子レンジ内に置いた。
本発明のさらに他の態様において、前記エッペンドルフ・チューブまたはパラフィルムに、２３００〜２５００ＭＨｚにわたる周波数で６００〜９００ワットにわたる出力をもつマイクロ波を連続的に照射する。
本発明のさらに他の態様において、前記期間は５〜１２０秒にわたる。
本発明のさらに他の態様において、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を加えること、および／または７５℃で３〜１５分間水浴中で加熱することによって反応を終わらせて、その後ゲル添加染料を加える。
【００２５】
本発明のさらに他の態様において、アガロースゲル電気泳動法、オートラジオグラフィー、放射能のカウント、および伝統的な手順において使用される他の技術によって反応産物を分析する。
本発明のさらに他の態様において、前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドから選ばれる。
本発明のさらに他の態様において、前記使用される他の成分は、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＮａＣｌ、ＫＣＩ、ＣＨ3ＣＯＯＫ、エチレンジアミンテトラアセテート、ジチオスレイトール、スペルミジン、ＢＳＡ、トリトンｘ−１００、ヌクレオチド、鋳型ＤＮＡ、鋳型ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチド・プライマーを含む群から選ばれる。
【００２６】
本発明のさらに他の態様において、制限エンドヌクレアーゼが、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＢｓｔＥＩＩ、およびＢｓｔＮＩから選ばれる。
本発明のさらに他の態様において、前記使用されるリガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼである。
本発明のさらに他の態様において、前記使用されるキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（ＴＰＮＫ）である。
本発明のさらに他の態様において、前記使用されるホスファターゼは、仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）である。
【００２７】
本発明のさらに他の態様において、前記ポリメラーゼが、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから成る群から選ばれる。
本発明のさらに他の態様において、前記使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）である。
本発明のさらに他の態様において、前記使用されるＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、λファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、バキュロウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、および哺乳動物ＤＮＡを含む群から選ばれる。
本発明のさらに他の態様において、前記２以上の制限エンドヌクレアーゼが核酸の二重消化に使用される。
【００２８】
本発明のさらに他の態様において、前記使用される制限エンドヌクレアーゼは、二重消化のためのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩである。
本発明のさらに他の態様において、前記マイクロ波照射は、マイクロ波を発生しうるあらゆる装置またはチャンバーでも行われることができる。
本発明のさらに他の態様において、前記方法は、特別に設計された装置によって部分的にまたは完全に自動化される。
【００２９】
本発明のさらに他の態様において、先に記載の酵素反応を実施するのに好適な装置。
本発明のさらに他の態様において、マグネトロン、排気ファン、光ファイバー温度計、冷却系統、および回転式反応台から成るチャンバー。
本発明のさらに他の態様において、好適なハードウェアとソフトウェアによって異なる反応を実施するためのあらかじめプログラムされた命令を出すためのマイクロプロセッサ・ベースの計算手段。
本発明のさらに他の態様において、前記マグネトロンは、約２４５０ＭＨｚの周波数で作動し、１００ワット〜８００ワットにわたる出力をもつマイクロ波の供給源である。
【００３０】
本発明のさらに他の態様において、本願発明は、生物学的な分子の部位特異的切断、修飾、および合成の迅速で、効率的な方法に関する。より特に、短時間の、連続したマイクロ波照射を使用した、酵素触媒反応による設計された生体分子の製造を説明する。本発明の手順は、バイオテクノロジーに、より特に分子生物学に、酵素ベースの生産加工、および下水処理に適応可能であって、そして同様に、関連分野における自動化に好適である。
【００３１】
本発明のさらに他の態様において、特に本願発明は、マイクロ波により促進された酵素反応による部位特異的切断、修飾、およびインビトロでの生体分子の合成のための迅速で、効率的な方法に関する。特に本願発明は、あらゆる中断なしに短時間で、連続したマイクロ波放射により酵素触媒される核酸の部位特異的切断、修飾、およびインビトロでの合成を実施するための迅速で、効率的な手順に関する。好ましいマイクロ波周波数は、２０００〜２８００のＭＨｚであり、５００〜９００ワットの出力をもつ。好ましいマイクロ波照射時間は、５〜１２０秒である。核酸の切断、修飾、および合成は、より特に制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応によって得られる。これらの酵素触媒反応の特定の産物は、分子生物学における分析と遺伝子操作および組換えＤＮＡ技術に不可欠である。
【００３２】
本発明のさらに他の態様において、本願発明は、酵素触媒反応産物の製造のための迅速な方法に関する。特に本願発明は、酵素により触媒される核酸の部位特異的切断、修飾、およびインビトロでの合成を実施するための速くて、効率的な手順に関する。核酸の合成、修飾、および切断は、より特に制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ＤＭＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼによって触媒される反応によって得られる。これは、部位特異的切断、ライゲーション、脱リン酸化、リン酸化（カイネーション）、およびインビトロでのＤＮＡおよびＲＮＡ合成反応を実施する非常に迅速な方法である。これらの酵素触媒反応による特定の産物は、分子生物学における分析と遺伝子の操作および組換えＤＮＡ技術に不可欠である。
【００３３】
本発明のさらに他の態様において、本発明の目的を達成し、かつ、酵素反応の既知の方法の問題点を克服することを期待して、迅速で、効率的な方法が、マイクロ波を介した酵素反応による核酸の部位特異的切断、修飾、およびインビトロでの合成のために提供される。分子生物学で使用される酵素反応、すなわち部位特異的切断、ライゲーション、脱リン酸化、リン酸化（カイネーション）、インビトロでのＤＮＡ合成、およびインビトロでのＲＮＡ合成が本発明により実施された。
【００３４】
本発明のさらに他の態様において、本発明は以下のステップ：（ａ）酵素、基質、好適なバッファー、および（実施例に記載の）他の成分を含む反応混合物を、あらゆる中断なく、短期間、電子レンジの最高出力（７００ワット）で電子レンジによるマイクロ波照射にさらす、
を含む。
【００３５】
本発明のさらに他の態様において、手順は、５〜１２０秒で核酸の部位特異的切断、修飾、およびインビトロでの合成をもたらす。
本発明の手順によって実施された酵素反応は、上記手順に汎用性をもたらす再現性のある結果を示した。酵素−基質反応混合物への短期間の、連続したマイクロ波照射による、１４０秒未満の、高分子、より特に核酸の切断、修飾、および合成のためのこの新しい発見が開示される。
【００３６】
本発明のさらに他の態様において、これは、酵素により触媒される核酸の部位特異的切断、修飾、およびインビトロでの合成のためにこれまでに知られる非常に迅速な方法である。本発明の手順におけるインビトロでの合成は、ＤＮＡ鋳型に対するＤＮＡとＲＮＡの合成、そしてＲＮＡ鋳型に対するＤＮＡの合成（逆転写）を含んでいる。前記方法には自動化の可能性がある。
本発明のさらに他の態様において、本発明の新規性は、反応のほとんどが５〜１５０秒以内に完了することであり、マイクロ波の効果が時間効果に対してはっきりと証明される。
【００３７】
本発明のさらに他の態様において、本発明の他の新規性は、短時間であっても高出力マイクロ波エネルギーにさらされた場合、５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む希釈バッファー中の制限酵素がその酵素特性を喪失することの発見である。
本発明のさらに他の態様において、本発明の他の新規性は、あらゆる中断なしに、短時間（少なくとも１４０秒間）、高出力（７００ワット）のマイクロ波エネルギーにさらされた場合、消化バッファー中の制限酵素が活性を維持していたことである。
本発明のさらに他の態様において、本発明の他の新規性は、大部分のケースで異なる制限酵素によるＤＮＡ消化が異なる反応条件を必要とする報告された方法に反して、反応条件がより同一なことである。
【００３８】
本発明のさらに他の態様において、本発明の他の新規性は、分子生物学において一般に使用されるほとんど全ての酵素反応本発明の方法によって行われうることである。
本発明のさらに他の態様において、本発明の他の新規性は、本発明は単独の器具により分子生物学で使用される酵素反応のほとんどを実施するために単純な方法によって自動化されうることである。
【００３９】
本発明のさらに他の態様において、本発明は、マイクロ波により誘発される酵素反応、すなわち部位特異的切断、ライゲーション、脱リン酸化、リン酸化（カイネーション）、インビトロでのＤＮＡ合成、およびインビトロでのＲＮＡ合成により核酸の部位特異的切断、修飾、およびインビトロでの合成のための迅速で、効率的な方法を提供する。前記手順は、酵素を含む反応混合物を、あらゆる中断なしに、短期間、最も高い出力レベルで電子レンジによるマイクロ波照射にさらすステップを含む。酵素反応は、不適当な条件が結果を妨げることがあるデリケートな方法である。
【００４０】
本発明のさらに他の態様において、本発明者らは、５〜１２０秒にわたる短期間、電子レンジの最も高い出力レベル（７００ワット）でのマイクロ波照射後に酵素活性を見出した。我々の発見は、ずっと低い出力レベルのマイクロ波照射後に酵素の失活が見られた報告（米国特許第５，３５０，６８６号）に反している。これは、先行技術が異なる数の間隔をもつ１５〜３１分におよぶより長い照射時間を使ったという事実によるかもしれない。本発明者らは、あらゆる中断のない短期間の最も高い出力レベルのマイクロ波照射によって酵素反応を実施した。
【００４１】
【表１】
2005531324.tif 000002
【００４２】
【表２】
2005531324.tif 000003
【００４３】
【表３】
2005531324.tif 000004
【００４４】
本発明のさらに他の態様において、本発明はマイクロ波により誘発される酵素反応による核酸の部位特異的切断、修飾、およびインビトロでの合成、すなわち制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、脱リン酸化、リン酸化（カイネーション）、インビトロでのＤＮＡ合成、逆転写、およびインビトロでのＲＮＡ合成のための迅速で、効率的な方法を含む。前記手順は、酵素を含む反応混合物と基質を、あらゆる中断なしに短期間、その最高出力で、電子レンジによるマイクロ波照射にさらすことを含む。
【００４５】
本発明のさらに他の態様において、前記手順は、５〜１２０秒で核酸の高度に選択的な特異的分裂、修飾、および合成をもたらす。全ての反応は、最善の反応時間を見つけるためにマイクロ波照射時間の異なる継続時間で実施される。それらの反応混合物のマイクロ波照射によるそれぞれの酵素によって産生された産物は、最適温度（３７℃以下）３０分〜数時間実施された伝統的な手順によって産生されたものと同じだった。（マイクロ波介在反応で使われているように）同じ時間電子レンジの外側で実施された対照反応は、所望の反応産物を生じさせるのに失敗した。酵素のありまたはなしでの非特異的ＤＮＡバンドの欠如は、考え出された反応条件によって、マイクロ波が非特異的ヌクレアーゼ活性を誘発せず、そしてＤＮＡの断片化を引き起こしていないことを示した。
【００４６】
本発明のさらに他の態様において、最高出力レベル（７００ワット）での０〜１３０秒間のマイクロ波照射によるＨｉｎｄＩＩＩの安定性が研究された。５０％グリセロール（ｖ／ｖ）を含むその希釈バッファー中のＨｉｎｄＩＩＩが、７００ワットで０〜１３０秒間照射された時、その活性を失うと発見したことを観察した。
【００４７】
本発明のさらに他の態様において、対照的に、その消化バッファー（反応混合物の全体のグリセロール含量は６．２５％のｖ／ｖだった）中の同じ酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）は、７００ワットで０〜１３０秒間マイクロ波にさらされた時に安定していることが判明した（実施例１、図１）。
【００４８】
本発明のさらに他の態様において、我々は、制限エンドヌクレアーゼ消化が最高出力レベルでのあらゆる中断のない短時間、反応混合物に連続的なマイクロ波照射によって実施されうることが分かった。これは、酵素が高出力レベルでその活性を失うことが分かった報告された方法に反する。
【００４９】
本発明のさらに他の態様において、前記手順は、かなりの短時間内で、高い特異性（消化されたＤＮＡが再度ライゲートされうる）を有する核酸の高度に選択的な消化をもたらす。基質ＤＮＡ、酵素、および適合バッファーを含む反応混合物が最高出力レベルのマイクロ波にさらされた時、制限酵素、例えばＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、およびＢｓｔＥＩＩのエンドヌクレアーゼ活性が高められた。典型的な実験において、２０μｌの反応容量中、１μｇのλＤＮＡは、３０〜７０秒間マイクロ波にさらされる時、（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓによって規定される）５〜２０単位の各々の制限酵素によって完全に消化された（実施例２、図２）。２つの酵素、例えばＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩによる基質ＤＮＡの二重の消化が、同様に同じ時間内マイクロ波にさらされる時、完成されることが判明した。本発明の手順による制限エンドヌクレアーゼ消化の他の利点は、上記方法が広範囲の制限エンドヌクレアーゼ、ならびに基質ＤＮＡにわたって全く同一であることである。基質ＤＮＡは、λファージ、バキュロウイルス、プラスミド、植物および哺乳動物であることを含む。本発明の手順による制限酵素による基質ＤＮＡの部位特異的切断が、本発明のおよび伝統的な手順によって実施されたライゲーションによって確認された。
【００５０】
本発明のさらに他の態様において、ＨｉｎｄＩＩＩによって産生された突出切断（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｃｕｔ）ＤＮＡ断片、およびＨａｅＩＩＩによって産生された平滑末端ＤＮＡ断片を、マイクロ波照射による１０〜１５秒以内のＴ４ＤＮＡリガーゼによる完全にライゲートされた。対照実験は、伝統的な手順のとおりの１６℃で８時間行われる。
【００５１】
本発明のさらに他の態様において、（伝統的な、および本発明の手順によって産生された）制限エンドヌクレアーゼ産生ＤＮＡ断片が、ライゲーション反応のための基質として使われて、そしてライゲーションされたＤＮＡが再度同じ酵素による制限エンドヌクレアーゼ消化を受ける時に同じ特異的断片を生じた（実施例３、図３）。
【００５２】
本発明のさらに他の態様において、修飾された核酸、すなわち、脱リン酸化された、リン酸化された、ライゲーションされたＤＮＡは分子生物学の重要な道具である。これら全ての産物が、反応混合物の１０〜６０秒以内のマイクロ波照射で、十分な分量で得られた。伝統的な手順と比較して反応時間の顕著な減少が得られた。よって、制限エンドヌクレアーゼ産生ＤＮＡ断片の末端リン酸基の脱リン酸化が、２０〜５０秒間の範囲の異なる継続時間、電子レンジ内で仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）を使って実施した。それがＴ４ＤＮＡリガーゼでのライゲートに失敗したが、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼによりリン酸化されうる時、マイクロ波介在反応産物（脱リン酸化ＤＮＡ）が確認された（実施例４）。脱リン酸化された制限エンドヌクレアーゼ切断ＤＮＡ断片は、１０〜５０秒以内に電子レンジによってＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（ＴＰＮＫ）および［γ32Ｐ］ＡＴＰによってリン酸化された。ＤＮＡのリン酸化は、トリクロロ酢酸沈澱性カウントとオートラジオグラフィーの両方で評価される。３０秒のマイクロ波反応により得られるリン酸化の程度は、３７℃で２０分間実施された伝統的な反応により得られたものと等しい（実施例５）。
【００５３】
本発明のさらに他の態様において、同様に合成オリゴヌクレオチドが電子レンジによるカイネーション反応、そしてその後の脱リン酸化反応の基質として使用される。両反応が、核酸の場合に同じ効率で生じると判明した（実施例５ｂ、図４）。
本発明のさらに他の態様において、本発明の手順における酵素によって触媒されるインビトロでの合成は、ＤＮＡ鋳型に対するＤＮＡおよびＲＮＡ合成、とＲＮＡ鋳型に対するＤＮＡ合成（逆転写）を含む。
【００５４】
本発明のさらに他の態様において、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩによって触媒されるＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成が、ニック付きＤＮＡ鋳型（ニック・トランスレーション）と、鋳型として３’凹型末端をもつ突出切断制限エンドヌクレアーゼ断片を使用して、マイクロ波放射によって実施された。ニック・トランスレーション反応が異なる継続時間、電子レンジ内で実施された。ＤＮＡ合成は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈澱性カウントへの［α32Ｐ］ｄＣＴＰの取り込みによって観察される。４５秒間のマイクロ波反応における１μｇのニック付きＤＮＡあたりのＴＣＡ沈澱性カウントが、１６℃で６０分間実施される伝統的な反応のそれと同じであることが判明した。しかし、３０秒間のマイクロ波反応によって得られたものがより少ないことが判明した一方で、６０秒間のマイクロ波反応によって伝統的な反応よりも良好な結果が得られた（実施例６）。
【００５５】
本発明のさらに他の態様において、本発明の手順によるニック・トランスレーション反応でのＤＮＡ合成の忠実度を、鋳型DNA（ニックなし）を用いたサザンブロット法によってさらに確認した。Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片と３’突出末端をもつＤＮＡ鋳型を含む反応混合物をマイクロ波にさらした場合、平滑末端ＤＮＡを２０秒で産生した。２０秒間のマイクロ波照射によるＤＮＡ合成の程度が、３７℃で３０分間実施された対照実験によるのと同じであることが判明した。より短時間のマイクロ波照射が不完全な結果を示す一方で、より長時間では同じかまたはわずかに良好な結果を示す。マイクロ波の下で合成されたＤＮＡは、（ｉ）［α32Ｐ］ｄＣＴＰの取り込み、（ｉｉ）オートラジオグラフィー、および（ｉｉｉ）平滑末端ベクターＤＮＡへのライゲーションによって確認された（実施例７；図５、レーン１）。
【００５６】
本発明のさらに他の態様において、同様に、ＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素の触媒活性がマイクロ波の影響下で促進されることも判明した。よって、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）によって触媒されたＲＮＡに対するＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成は、さまざまな時間のマイクロ波照射によって、２つの鋳型ＲＮＡおよび鋳型特異的プライマーを用いて実施された。最適な照射時間は、４８℃４５分間の伝統的な手順によって実施される対照反応によるのと同量の合成を得る、５０秒間であることが分かった。反応の相当な量は、１０秒間のマイクロ波照射でさえ生じた。ｃＤＮＡの合成は、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）におけるＴｆｌポリメラーゼによる増幅後に観察された（実施例８、図６および実施例９、図７）。
【００５７】
本発明のさらに他の態様において、ＤＮＡに対するＲＮＡ合成（転写）は、転写に着手するためにＲＮＡポリメラーゼが鋳型ＤＮＡに結合するための特異的ＤＮＡ塩基配列（プロモーター）を必要とする。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって触媒されるＲＮＡのインビトロでの合成は、それぞれｐＳＰＴ１８、およびｐＳＰＴ１９−ｎｅｏＤＮＡ鋳型（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ  Ｎｏ．９９９６４４）を使って実施された。５〜２０秒間の範囲のさまざまな時間の反応混合物のマイクロ波照射によって得られた産物は、［α32Ｐ］ＵＴＰ取り込みと、特異的サイズの転写物の合成によってアッセイされた。５秒間のマイクロ波反応で得られたトリクロロ酢酸沈澱性カウントは、３７℃２０分間実施された伝統的な反応によって得られたそれとほとんど等しいと判明した。
【００５８】
本発明のさらに他の態様において、全ての反応は、約２４５０ＭＨｚの周波数で作動して約７００ｗの最大出力をもつ国産電子レンジ（ＢＰＬ、インド）により実施された。全ての反応が、最高出力設定（レベル１０）で電子レンジ内によって行われ、それは７００ワットの出力の１００％のマグネトロン・デューティー・サイクルを意味する。
【００５９】
本発明のさらに他の態様において、反応は、伝統的なプロトコールに従って規定の容量でバッファー、基質、および酵素を続けて混合することによって設定された。本発明のさらに他の態様において、これらの酵素触媒反応の全ては、伝統的な反応で使用されるｐＨおよびイオン環境で実施された。反応混合物をエッペンドルフ・チューブに入れ、電子レンジの回転円板の中心に置いた。反応混合物を好ましくは５〜１２０秒の期間マイクロ波にさらした。マイクロ波照射中に、前記エッペンドルフ・チューブを、ふたがされていない状態に保持した。エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えることによって、および／または７５℃で３〜１５分間加熱することによって、マイクロ波照射後に反応を直ちに終了させた。反応産物を、伝統的な手順、例えばアガロースゲル電気泳動法、オートラジオグラフィー、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈澱性カウント、ライゲーション、カイネーション、ハイブリダイゼーション、および形質転換によって分析した。本発明の手順によって行われた全ての反応の結果を、酵素の最適温度を維持した水浴中で反応混合物をインキュベートすることによって実施された伝統的な反応により得られたものと比較した。
【００６０】
本発明は、これまでに知られている既存の方法を上回る核酸の部位特異的切断、修飾および合成の改良の明確な事例である。
以下の実施例は、本発明の詳細について述べて、説明のためだけに作製されるので、本発明の範囲を制限するように解釈されるべきでない。以下に請求の範囲に記載される本発明は、その範囲内の様々な修飾を対象とすることを意図している。
【実施例】
【００６１】
実施例−１
７００ワットのマイクロ波にさらされた後のその消化バッファー中のＨｉｎｄＩＩＩの安定性
５μｌ（１００ユニット）のＨｉｎｄＩＩＩを、１６μｌの１０×ＨｉｎｄＩＩＩ消化バッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．９、５００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ）、と１０７μｌの水の混合物を用いて１４４μlに希釈した後に、ＨｉｎｄＩＩＩの１６μlのアリコートを、エッペンドルフ・チューブに入れた。各々のアリコートを、７００ワット（出力レベル１０）のマイクロ波にさまざまな時間：０、３０、５０、７０、９０、１１０、および１３０秒間さらした。各々の照射酵素を、伝統的反応、およびマイクロ波介在反応によるλＤＮＡの消化によってアッセイした。
【００６２】
前記照射酵素による消化は、各々のチューブ中に４ｕｌ（２．０μｇ）のλＤＮＡを加えた後に実施された。それらの内容物の半分をエッペンドルフ・チューブに取り、伝統的な手順のように３７℃で４時間インキュベートした。
【００６３】
マイクロ波介在反応において、残りの半分を１片のパラフィルム上にスポットし、それを電子レンジの中心に置いて、５０秒間、７００ワットでマイクロ波を照射した。
全ての反応産物を１．０％のアガロースゲルで泳動した、ここで１．０μｇの消化されたＤＮＡを各ウェル内に添加した（図１）。
【００６４】
実施例−２
７００ワットのマイクロ波照射によるＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化
パラフィルム上に反応混合物をスポットすることにより、５０秒間電子レンジ内で、全ての消化を一度に実施した。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩによるλＤＮＡの消化、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＨＩＩによるλＤＮＡの二重消化、そしてＰｓｔＩによるＰＵＣ１９ベクターのＰｓｔＩサイトでのエンドウマメ・レクチンｃＤＮＡクローンの消化を、２０．０μｌの反応容量中、２．０μｇのＤＮＡ、それらのそれぞれの消化バッファー中の１．０μｌの各々の酵素を使って実施した。ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩによる二重消化を、ＥｃｏＲＩ消化バッファー中で実施した。対照反応において、酵素を含まない２０．０μｌのＨｉｎｄＩＩＩ消化バッファー中、２．０μｇのλＤＮＡを使用した。各々の１μｌの酵素は、２０．０ユニット（ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ）、または１０．０ユニット（ＢａｍＨＩとＰｓｔＩ）を含む。１．０％のアガロースゲルの各々のレーンに、１．０μｇのＤＮＡを添加した（図２）。
【００６５】
実施例−３
ＨｉｎｄＩＩＩによるλＤＮＡの消化とそれに続くマイクロ波照射によるＴ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応
ライゲーション反応のためのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、１．５ｍｌ容エッペンドルフ・チューブの中に５．０μｌ（１００ユニット）のＨｉｎｄＩＩＩと１６．０μｌの１０×ＨｉｎｄＩＩＩ消化バッファーを含む１６０．０μｌの反応容量中、８．０μｇのＤＮＡを電子レンジにより５０秒間消化することによって準備した。
【００６６】
６．０μｌのＨｉｎｄＩＩＩ断片、２．０μｌの１０×ライゲーション・バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＤＴ、１ｍＭのＡＴＰ、および２５μｇ／ｍｌのＢＳＡ）、ならびに２０粘着ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ．Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を含む２０．０μｌのライゲーション反応混合物を、１０．０μｌのアリコートで２本の０．５ｍｌ容エッペンドルフ・チューブに入れた。反応混合物を含むチューブの１本を、２０秒間マイクロ波にさらして、他のチューブを４５分間３７℃に保った。５分間６５℃で加熱することによって反応を終わらせた。先に記載のように、各々のエッペンドルフ・チューブからのＤＮＡの半分（１．５μｇ）をマイクロ波照射によるＨｉｎｄＩＩＩでの再切断のために使用した。残りの半分をアガロースゲル電気泳動法によるライゲートされた断片の発生を確認するために使用した。
【００６７】
対照実験において、もしあれば、非特異的切断を見付け出すために、切断されていないλＤＮＡ（１．０μｇ）に、ＨｉｎｄＩＩＩ消化バッファー中、７００ワットで５０秒間マイクロ波を照射した（図３）。
【００６８】
実施例−４
アルカリホスファターゼによる脱リン酸化反応
１．０μｇのＤＮＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＤＴＴを含む２０μｌの反応容量中、５ユニットの仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、電子レンジ中で、λＥｃｏＲＩ断片の５’リン酸基の脱リン酸化を実施した。３０秒間のマイクロ波照射後に、２μｌの０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）添加し、続く７５℃で１５分間インキュベーションによって反応を終わらせた。フェノール−クロロホルム抽出によってＤＮＡを脱タンパク質処理し、そして最後にエタノールで沈殿させた。このようにして得られたホスファターゼ処理したＤＮＡ断片は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって連結することができないと分かったが、しかし３０秒の脱リン酸化反応の効率を確認するポリヌクレオチド・キナーゼによって効率よくリン酸化された。
【００６９】
実施例−５
Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼによるカイネーション反応
ａ）ＥｃｏＲｌによるλＤＮＡの断片化を、実施例２に記載のとおり５０秒でマイクロ波照射によって行った。
【００７０】
先に記載のとおり１．０μｇのＤＮＡと１．０ユニットのＣＩＰを使用して、電子レンジにより３０秒間、１．５ｍｌ容エッペンドルフ・チューブの中、２０．０μｌの反応容量で、ＣＩＰによる脱リン酸化反応を実施した。
【００７１】
０．５μｇのλＤＮＡの脱リン酸化ＥｃｏＲＩ断片の５’ヒドロキシル基のリン酸化を、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（Ｂａｎｇａｌｏｒｅ  Ｇｅｎｅｉ）、７０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのＤＴＴ、および２０μＣｉ［γ32Ｐ］ＡＴＰ（Ｓｐ．活性＞４０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を含む２０μｌの反応混合物をパラフィルム上にスポットし、そしてそれを２０秒間マイクロ波にさらすことで実施された。ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を５ｍＭ（終濃度）まで添加し、続いて６５℃で１０分間加熱することによって前記反応を終わらせた。取り込まれなかった放射能を、スピン−カラムＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０ゲル濾過によって取り除いた。ＤＮＡ断片のリン酸化を、０．１μｌに相当する反応容量を添加することによってオートラジオグラフィーによって確認される。
【００７２】
ｂ）Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼによる０．１μｇの６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ−３’）の５’ヒドロキシル基のリン酸化を、上記のとおりさまざまな時間（０、５０、３０、および２０秒間）のマイクロ波照射によって実施した（図４）。
【００７３】
実施例−６
Ｅ．コリ・ポリメラーゼＩによるＤＮＡ合成
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩによって触媒されるＤＮＡ合成反応を、１μｇのニック入りλDNAまたはオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ鋳型（５ｆｇのＤｎａｓｅＩにより処理した）、５ユニットのＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ（ＮＥＢ）、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ｐｅｎｔａｘ、フラクションＶ）、非標識ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ（各１ｎＭ）、１００μＣｉ［α32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ｓｐ．活性＞４０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を含む５０μｌの反応容量で、さまざまな継続時間電子レンジにより実施した。マイクロ波にさらした後に、０．２５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を４μｌ加えることによって前記反応を止めた。各々のＤＮＡ鋳型を用いたＤＮＡ合成を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０の小カラムによる遠心分離による取り込まれていない放射性ヌクレオチドの除去後に、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿アッセイによって計測した。４５秒のマイクロ波反応で合成されたＤＮＡの量は、１６℃で６０分間実施された伝統的な反応で合成されたそれに等しかった。本発明の手順によって合成された標識ＤＮＡは、鋳型ＤＮＡの非標識制限エンドヌクレアーゼ消化産物と効率よくハイブリダイズした。
【００７４】
実施例７
クレノー断片Ｅ．コリ・ポリメラーゼＩによるＤＮＡ合成
クレノー断片Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩによって触媒されるＤＮＡ合成反応を、１μｌのλファージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ断片（実施例１に記載のとおりマイクロ波照射によって準備した）、１μｌ（８ユニット）のＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、４ｐ  ｍｏｌｅｓの［α32Ｐ］ｄＣＰＴ（Ｓｐ．活性＞４０００μＣｉ／ｍｍｏｌｅ）、および２ｎ  ｍｏｌｅｓの各ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰを含む２０μｌの反応容量で、電子レンジによって行われた。前記反応混合物をパラフィルム上にスポットし、そして２０秒間マイクロ波にさらして、その後０．２５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４μｌを加えることによってその反応を止めた。放射性ヌクレオチドを使用した場合、取り込まれていないヌクレオチドをＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０スピンカラムで取り除く。ＤＮＡ合成による鋳型ＤＮＡの３’凹型末端の埋め合わせを、ＴＣＡ沈澱性カウントによって計測し、そしてＤＮＡ合成の特異性を、オートラジオグラフィーと、平滑末端ベクターＤＮＡへのライゲーションによって確認した。本発明のマイクロ波反応によって合成されたＤＮＡの程度は、３７℃で３０分間の従来法によって得られるそれに等しかった（図５、レーン１）。
【００７５】
実施例−８
マイクロ波が介在する、ＡＭＶ−ＲＴａｓｅによるＥ−セレクチンｍＲＮＡ鋳型に対するｃＤＮＡ合成
反応混合物をそれぞれ１０、３０、および５０秒間マイクロ波にさらすことによって、特異的なフォワード・プライマーによるＥ−セレクチン［Tucker et al., (1991 )J. Biol. Chem., 266, 2466-2473］を使用したトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−Ｒｔａｓｅ）により触媒されたｃＤＮＡの合成に関する３つのそれぞれ異なった実験を作製した。特異的なサイズのｃＤＮＡを、鋳型特異的なリバース・プライマー及びフォワード・プライマーと、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼの追加に続いて、第一鎖ｃＤＮＡ反応産物の増幅後のアガロースゲル電気泳動法によって確認した。Ｅ−セレクチンｍＲＮＡ鋳型に使用したフォワードおよびリバース・プライマーは、それぞれ５’−ＧＡＧＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＧＡＡＴＧＡＴＧ−３’、そして３’−ＧＧＴＣＴＣＧＧＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＧＡ−５’であった。ＡＭＶ逆転写酵素の不活化（９４℃で２分間）後に第二鎖ｃＤＮＡ合成とＰＣＲ増幅を、４０サイクル（９４℃で３０秒間／変性、６０℃で１分間／アニーリング、６８℃で２分間／伸長）で行った。５０μｌの反応容量中のＲＴ−ＰＣＲ反応の組成は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭの（各）ｄＮＴＰ、１μＭのフォアード・プライマー、１μＭのリバース・プライマー、１ｍＭのＭｇＳＯ4、５ユニットのＡＭＶ−Ｒｔａｓｅ、および５ユニットのＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼであった。反応をＲＮＡの追加によって開始させた。Ｅ−セレクチンｍＲＮＡおよびそのプライマーを除く全てのＲＴ−ＰＣＲ反応成分は、Ｐｒｏｍｅｇａから調達した。
【００７６】
本発明の反応および伝統的な反応の両方でのＥ−セレクチンｍＲＮＡ鋳型による特定のサイズ、すなわち５０１ｂｐの増幅産物の形成は、上記ｍＲＮＡを用いた特異的な第一鎖ｃＤＮＡの合成を確認した。５０秒間に合成された増幅ｃＤＮＡの量は、伝統的な反応により得られたものより多かった（図６）。
【００７７】
実施例−９
ＡＭＶ−ＲＴａｓｅによるマイクロ波介在合成ｍＲＮＡ鋳型に対するｃＤＮＡの合成
それぞれ１０、３０、および５０秒間反応混合物をマイクロ波にさらすことによる特異的なフォワード・プライマーを用いた合成ｍＲＮＡ鋳型（Ｐｒｏｍｅｇａ製の１１５１ｎｔのインビトロ合成ＲＮＡ）を使った、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−Ｒｔａｓｅ）によって触媒されるｃＤＮＡの合成に関して、３つのそれぞれ異なる実験を作製した。特異的サイズのｃＤＮＡを、鋳型特異的なリバースおよびフォワード・プライマーと、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼの追加に続く、第一鎖ｃＤＮＡ反応産物の増幅後のアガロースゲル電気泳動法によって確認する。合成ｍＲＮＡ鋳型のために使用されるフォワードおよびリバース・プライマーは、それぞれ５’−ＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＴＣＧＴＣ−３’および３’−ＧＡＣＴＧＡＡＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡ−５’であった。本発明の反応および伝統的な反応の両方における合成ｍＲＮＡ鋳型を用いた特定のサイズ、すなわち３２３ｂｐの増幅産物の形成は、上記ｍＲＮＡを用いた特異的な第一鎖ｃＤＮＡの合成を確認した。５０秒間で合成された増幅ｃＤＮＡの量は、伝統的な反応によって得られたそれに等しかった。
【００７８】
ＡＭＶ逆転写酵素の不活化（９４℃で２分間）後の第二鎖ｃＤＮＡ合成とＰＣＲ増幅を、４０サイクル（９４℃で３０秒間／変性、６０℃で１分間／アニーリング、６８℃で２分間／伸長）で行った。５０μｌの反応容量中のＲＴ−ＰＣＲ反応物の組成は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣ１、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭの（各）ｄＮＴＰ、１μＭのフォワード・プライマー、１μＭのリバース・プライマー、１ｍＭのＭｇＳＯ4、５ユニットのＡＭＶ−Ｒｔａｓｅ、および５ユニットのＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼだった。前記反応をＲＮＡの追加によって開始させた。全てのＲＴ−ＰＣＲ反応成分は、Ｐｒｏｍｅｇａから調達した（図７）。
【００７９】
実施例−１０
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成
ＳＰ６とＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって触媒されるＲＮＡ合成を、  ２０μｌの反応容量中、それぞれＥｃｏＲＩ切断ｐＳＰＴ１８−ｎｅｏおよびｐＳＰＴ１９−ｎｅｏ  ＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。各々の反応混合物が、０．５μｇのＤＮＡ鋳型、各０．５ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴを含んでいた。標識合成のために、０．５ｍＭのＵＴＰを５０μＣｉの［α32Ｐ］ＵＴＰ（＞４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に置き換えた。前記反応混合物を２０秒間マイクロ波照射にさらし、その後、０．２５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２μｌを加えてその反応を終わらせた。ＲＮＡ合成を、ＴＣＡ沈澱性カウントによる［α32Ｐ］ＵＴＰの取り込みによって計測した。本発明の手順によって合成されたＴＣＡ沈澱性ＲＮＡが、３７℃で４５分間実施された伝統的な手順よりも多いことが分かった。非放射性ＮＴＰを使って合成されたＲＮＡのサイズを、ホルムアルデヒドアガロースゲルによって測定し、そして伝統的な反応によって得られたそれと同じであることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本願発明は、短期間で、連続したマイクロ波照射による酵素触媒反応によって産生された産物の迅速で、効率的な製造方法に有用である。本発明の手順は、バイオテクノロジー、より特に分子生物学、生産加工、および下水処理に適合させることができる。同様に、本発明の手順は、関連分野の自動化にも好適である。
【００８１】
本発明のマイクロ波に基づく手順は、迅速なＤＮＡの部位特異的切断、ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドの修飾、ならびに核酸のインビトロでの合成に特に有用である。前記反応は、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、脱リン酸化、カイネーション、および核酸のインビトロでの合成を含む。そこで得られた産物は、分子生物学に欠かせないものであり、ゲノムマッピング、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ塩基配列決定法、遺伝子発現、所望の産物の精製、所望の産物の分離、組換えＤＮＡ技術における遺伝子操作などに必要とされる。本発明は、分子生物学における自動化に好適である。
【００８２】
利点
１．部位特異的切断、ＤＮＡとオリゴヌクレオチドの修飾、および核酸の合成の反応時間の大幅な削減が、本発明の主な利点である。反応時間は、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、脱リン酸化、リン酸化（カイネーション）、逆転写、インビトロでのＤＮＡ合成、およびインビトロでのＲＮＡ合成に関して５〜７０秒に削減される。
【００８３】
２．分子生物学、ならびに他の分野で使用されるほとんど全ての酵素反応が、非常な短期間で、たくさんの貴重な時間の節約し、よってその手順を経済的、かつ、汎用的にする本発明の手順によってなされる。
３．反応条件は非常に単純で、あらゆる高価な装置を必要としない。
４．本発明の手順は、分子生物学の自動化のために使用されうる。
５．本発明の手順は、酵素反応を伴うバイオテクノロジー産業において使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】７００ワットでのマイクロ波照射に対するＨｉｎｄＩＩＩの安定性。
【００８５】
その消化バッファー中のＨｉｎｄＩＩＩを異なる時間：０秒間（レーン１）、３０秒間（レーン２）、５０秒間（レーン３）、７０秒間（レーン４）、９０秒間（レーン５）、１１０秒間（レーン６）、および１３０秒間（レーン７）マイクロ波にさらした。異なる時間照射されたＨｉｎｄＩＩＩを、５０秒間７００ワットのマイクロ波にそれらをさらすことによるλＤＮＡの消化によってアッセイした。１．０％のアガロースゲルの各々のレーン内に、１．０μｇの消化されたＤＮＡを添加した（実施例１）。
【図２】７００ワットでのマイクロ波照射によるＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化。
【００８６】
ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン２）、ＢａｍＨＩ（レーン３）、ＥｃｏＲＩ（レーン４）によるλＤＮＡ消化、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ（レーン５）によるλＤＮＡの二重消化、そしてＰｓｔＩ（レーン６）によるＰＵＣ１９ベクターのＰｓｔＩサイトでのエンドウマメ・レクチンｃＤＮＡクローンの消化を、２０．０μｌの反応容量中、２．０μｇのＤＮＡ、そのそれぞれの消化バッファー中の各々の酵素１．０μｌを使って実施した。ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩによる二重消化を、ＥｃｏＲＩ消化バッファー中で行った。対照反応（レーン１）において、２０．０μｌの酵素を含まないＨｉｎｄＩＩＩ消化バッファー中の２．０μｇのλＤＮＡを使用した。１．０％のアガロースゲルの各々のレーン中に、１．０μｇのＤＮＡを添加した（実施例２）。
【図３】電子レンジ内でのλＨｉｎｄＩＩＩ断片のＴ４ＤＮＡリガーゼが触媒するライゲーション、およびライゲートされたＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩによる断片化。
【００８７】
レーン１に、ＨｉｎｄＩＩＩ消化バッファー中、５０秒間マイクロ波にさらした切断なしのλＤＮＡ（１．０μｇ）を添加した。レーン２は、反応混合物を５０秒間マイクロ波にさらすことによって準備したＨｉｎｄＩＩＩ切断λＤＮＡ（１．０μｇ）を表す。レーン３に、３７℃で４５分間実施されたＨｉｎｄＩＩＩ切断λＤＮＡのライゲーション反応で得られた産物を添加する。レーン５に、２０秒間のマイクロ波照射によって実施されたＨｉｎｄＩＩＩ切断λＤＮＡのライゲーション反応で得られた産物を添加した。レーン３および５で得られるライゲートされたＤＮＡを５０秒間のマイクロ波照射によってＨｉｎｄＩＩＩにより再切断し、それぞれ１．０％のアガロースゲルのレーン４および６に添加した。これらのレーンの各々が１．５μｇのＤＮＡを含む（実施例３）。
【図４】Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼによる６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのカイネーション。
【００８８】
２０秒間（レーン１）、３０秒間（レーン２）、５０秒間（レーン３）、および０秒間（レーン４）マイクロ波にさらすことでの、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼによる６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ−３’）のカイネーション（実施例５ｂ）。
【図５】レーン１．クレノー断片Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩによるマイクロ波が介在するＤＮＡ合成。
【００８９】
λＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化、その後のＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩによる末端充填反応によって製造された産物に関する１％のアガロースゲルのオートラジオグラム。両反応を、それぞれ５０および２０秒間の７００ワットでのマイクロ波照射によって実施した（実施例７）。
【００９０】
レーン２．マイクロ波が介在する消化、脱リン酸化、およびカイネーション反応。
【００９１】
λＤＮＡのＣＩＰ脱リン酸化ＥｃｏＲＩ断片のＴＰＮＫ触媒カイネーション。  λＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化、その後のＣＩＰによるＥｃｏＲＩ断片の５’末端の脱リン酸化、およびＴＰＮＫによるＥｃｏＲＩ断片の脱リン酸化５’末端のカイネーションによって製造された産物に関する１％のアガロースゲルのオートラジオグラム（実施例５ａ）。
【図６】ＡＭＶ−ＲＴａｓｅによるマイクロ波が介在するＥ-セレクチンｍＲＮＡ鋳型に対するｃＤＮＡ合成。
【００９２】
１０秒間（レーン１）、３０秒間（レーン３）、および５０秒間（レーン４）のマイクロ波照射、および４８℃で４５分間（レーン２）によって得られたＡＭＶ−ＲＴａｓｅ触媒反応産物を、Ｔｆｌ１ＤＮＡポリメラーゼを使ってＰＣＲ増幅した時、５０１ｂｐの特異的ｃＤＮＡを得た。ＲＴ−ＰＣＲ反応産物を１．４％のアガロースゲルで分析した（例８）。
【図７】ＡＭＶ−ＲＴａｓｅによるマイクロ波が介在する合成ｍＲＮＡ鋳型に対するｃＤＮＡ合成。  ３０秒間（レーン５）および５０秒間（レーン６）のマイクロ波照射、ならびに４８℃４５分間（レーン３）によって得られたＡＭＶ−ＲＴａｓｅが触媒反応産物を、Ｔｆｌ１ＤＮＡポリメラーゼを使ってＰＣＲ増幅した時、３２３ｂｐの特異的ｃＤＮＡを得た。ＲＴ−ＰＣＲ反応産物を１．４％のアガロースゲルで分析した。対照反応において、レーン２（４８℃で４５分間）およびレーン４（５０秒間のマイクロ波照射）にＲＮＡ鋳型（Ｐｒｏｍｅｇａ製１１５１ｎｔのインビトロ合成ＲＮＡ）を加えなかった。レーン１に、ｐＢＲ３２２  ＢｓｔＮ１マーカーＤＮＡを添加した（実施例９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月30日(2004.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続した、短時間のマイクロ波照射を使用した、酵素触媒されるインビトロでの核酸の修飾および合成のための単純で、効率的で、かつ、促進的な方法であって、以下のステップ：
（ａ）小さなエッペンドルフ・チューブ中またはパラフィルム小片上に、以下の（ｉ）制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼから成る群から選ばれる酵素、（ｉｉ）上記の選ばれた酵素の基質として作用する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドから選ばれる生体分子、（ｉｉｉ）特定の酵素に好適なバッファー、ならびに（ｉｖ）他の成分、を含む反応混合物を提供し、
（ｂ）上記反応混合物を添加した上記エッペンドルフ・チューブまたはパラフィルム片を電子レンジ内に移し、
（ｃ）上記エッペンドルフ・チューブまたはパラフィルム片に、２３００〜２５００ＭＨｚの周波数で６００〜９００ワットの出力をもつマイクロ波を連続的に照射し、
（ｄ）５〜１２０秒間、
（ｅ）エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を加えることによって、および／または７５℃で３〜１５分間水浴中で加熱することによって反応を終わらせ、その後にゲル添加染料の添加が続き、そして
（ｆ）上記反応産物を、アガロースゲル電気泳動法、オートラジオグラフィー、放射能のカウント、および伝統的な手順で使用される他の技術によって分析する、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記使用される他の成分が、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣＨ3ＣＯＯＨ、エチレンジアミンテトラアセテート、ジチオスレイトール、スペルミジン、ＢＳＡ、トリトンｘ−１００、ヌクレオチド、鋳型ＤＮＡ、鋳型ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチド・プライマーを含む群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＢｓｔＥＩＩ、およびＢｓｔＮＩから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記使用されるリガーゼがＴ４ＤＮＡリガーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記使用されるキナーゼがＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（ＴＰＮＫ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記使用されるホスファターゼが仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記使用される逆転写酵素がトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記使用されるＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、λファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、バキュロウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、および哺乳動物のＤＮＡを含む群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
２種類以上の制限エンドヌクレアーゼが、核酸の二重消化に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記使用される制限エンドヌクレアーゼが、二重消化のためのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロ波照射を、マイクロ波を発生させることができるあらゆる装置またはチャンバー内で行うことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、特別に設計された装置によって部分的に、または完全に自動化されうる、請求項１に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月7日(2005.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続した、短時間のマイクロ波照射を使用した、酵素触媒されるインビトロでの核酸の修飾および合成のための単純で、効率的で、かつ、促進的な方法であって、以下のステップ：
（ａ）小さなエッペンドルフ・チューブ中またはパラフィルム小片上に、以下の（ｉ）制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼから成る群から選ばれる酵素、（ｉｉ）上記の選ばれた酵素の基質として作用する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドから選ばれる生体分子、（ｉｉｉ）特定の酵素に好適なバッファー、ならびに（ｉｖ）他の成分、を含む反応混合物を提供し、
（ｂ）上記反応混合物を添加した上記エッペンドルフ・チューブまたはパラフィルム片を電子レンジ内に移し、
（ｃ）上記エッペンドルフ・チューブまたはパラフィルム片に、２３００〜２５００ＭＨｚの周波数で６００〜９００ワットの出力をもつマイクロ波を連続的に照射し、
（ｄ）５〜１２０秒間、
（ｅ）エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を加えることによって、および／または７５℃で３〜１５分間水浴中で加熱することによって反応を終わらせ、その後にゲル添加染料の添加が続き、そして
（ｆ）上記反応産物を、アガロースゲル電気泳動法、オートラジオグラフィー、放射能のカウント、および伝統的な手順で使用される他の技術によって分析する、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記使用される他の成分が、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣＨ3ＣＯＯＫ、エチレンジアミンテトラアセテート、ジチオスレイトール、スペルミジン、ＢＳＡ、トリトンｘ−１００、ヌクレオチド、鋳型ＤＮＡ、鋳型ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチド・プライマーを含む群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＢｓｔＥＩＩ、およびＢｓｔＮＩから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記使用されるリガーゼがＴ４ＤＮＡリガーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記使用されるキナーゼがＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（ＴＰＮＫ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記使用されるホスファターゼが仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記使用される逆転写酵素がトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記使用されるＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ、λファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、バキュロウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、および哺乳動物のＤＮＡを含む群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
２種類以上の制限エンドヌクレアーゼが、核酸の二重消化に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記使用される制限エンドヌクレアーゼが、二重消化のためのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロ波照射を、マイクロ波を発生させることができるあらゆる装置またはチャンバー内で行うことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、特別に設計された装置によって部分的に、または完全に自動化されうる、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2005531324.tif 000012
2005531324.tif 000013
2005531324.tif 000014