(57)【要約】精子特異的（ＣａｔＳｐｅｒ２）であるカチオンチャネルに関して核酸とタンパク質配列が開示される。上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質は、精子において特異的に発現されるものが示される。上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子に関する核酸、ベクター、形質転換細胞、トランスジェニック動物、ポリペプチド、抗体が開示されている。また提供されているのは、媒介障害に関するビジネスを実施する諸方法とともに、インビトロ受精と避妊の諸方法、ＣａｔＳｐｅｒ２活性のモジュレータを同定する諸方法、ＣａｔＳｐｅｒ２に対する対象者の遺伝子型を判定する諸方法、不妊症を含むＣａｔＳｐｅｒ２媒介紹介を診断しまた治療する諸方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列識別番号：１の少なくとも１０連続ヌクレオチドと、
（ｂ）配列識別番号：１の少なくとも１２連続ヌクレオチドと、
（ｃ）配列識別番号：１の少なくとも１４連続ヌクレオチドと、
（ｄ）配列識別番号：１の少なくとも１６連続ヌクレオチドと、
（ｅ）配列識別番号：１の少なくとも１８連続ヌクレオチドと、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の前記配列のいずれか一つに相補的な一つの配列と、
から成る、グループから選択されたヌクレオチド配列を有する分離核酸。
【請求項２】
ａ）配列識別番号：３の少なくとも１０連続ヌクレオチドと、
（ｂ）配列識別番号：３の少なくとも１２連続ヌクレオチドと、
（ｃ）配列識別番号：３の少なくとも１４連続ヌクレオチドと、
（ｄ）配列識別番号：３の少なくとも１６連続ヌクレオチドと、
（ｅ）配列識別番号：３の少なくとも１８連続ヌクレオチドと、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の前記配列のいずれか一つに相補的な一つの配列と、
から成る、グループから選択されたヌクレオチド配列を有する分離核酸。
【請求項３】
ａ）配列識別番号：５の少なくとも１０連続ヌクレオチドと、
（ｂ）配列識別番号：５の少なくとも１２連続ヌクレオチドと、
（ｃ）配列識別番号：５の少なくとも１４連続ヌクレオチドと、
（ｄ）配列識別番号：５の少なくとも１６連続ヌクレオチドと、
（ｅ）配列識別番号：５の少なくとも１８連続ヌクレオチドと、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の前記配列のいずれか一つに相補的な一つの配列と、
から成る、グループから選択されたヌクレオチド配列を有する分離核酸。
【請求項４】
ａ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコードする一つの配列と、
（ｂ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの膜貫通ドメインをコードする一つの配列と、
（ｃ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの細胞外ループをコードする一つの配列と、
（ｄ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのポア領域をコードする一つの配列と、
（ｅ）高予測抗原性を有するＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのエピトープをコードする一つの配列と、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の前記配列のいずれか一つに相補的な一つの配列と、
から成る、グループから選択されたヌクレオチド配列を有する分離核酸。
【請求項５】
（ａ）配列識別番号：２をコードする一つの配列と、
（ｂ）配列識別番号：４をコードする一つの配列と、
（ｃ）配列識別番号：６をコードする一つの配列と、
（ｄ）配列識別番号：２の残基１０４−１２６と，１４６−１６６と，１７６−１９５と，２０６−２２８と，２４１−２６２と，３１６−３４０とから成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｅ）配列識別番号：４の残基１０４−１２６と，１４６−１６６と，１７６−１９５と，２０６−２２８と，２４１−２６２と，３１６−３４０とから成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｆ）配列識別番号：６の残基１０２−１２４と，１４４−１６４と，１７４−１９３と，２０４−２２７と，２３９−２６０と，３１４−３２８とから成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｇ）配列識別番号：２の残基１２７−１４５と，１９６−２０５と，２６３−３１５とから成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｈ）配列識別番号：４の残基１２７−１４５と，１９６−２０５と，２６３−３１５とから成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｉ）配列識別番号：６の残基１２５−１４３と，１９４−２０３と，２６１−３１３とから成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｊ）配列識別番号：２の残基２８０−３０３から成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｋ）配列識別番号：４の残基２８０−３０３から成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｌ）配列識別番号：６の残基２７８−３０１から成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｍ）配列識別番号：２の残基２６６−２７５と，３８６−４００と４４７−４５８と，４８２−４９４から成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｎ）配列識別番号：４の残基６６−９９と，２６６−２７５と３９４−４１４と，から成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｏ）配列識別番号：６の残基６４−８９と，２６２−２７５と５６２−５８８と，から成る一つのペプチドをコードする一つの配列と、
（ｐ）（ａ）〜（ｏ）の前記配列のいずれか一つに相補的な一つの配列と、
から成る、グループから選択された請求項４３に記載されているヌクレオチド配列を有する分離核酸。
【請求項６】
ａ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質と、
（ｂ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの細胞外ループと、
（ｄ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのポア領域と、
から成る、グループから選択された一つのペプチドと少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する一つのペプチドをコードする分離核酸。
【請求項７】
ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質と、と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有し、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を発現させることができる一つの細胞におけるＣａｔＳｐｅｒ２活性を有する一つのペプチドをコードする分離核酸。
【請求項８】
６５℃にて１．０ｘＳＳＣという洗浄ステップを含む条件下で配列識別番号：１，配列識別番号：３または配列識別番号：５の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズされるヌクレオチド配列から成る分離核酸。
【請求項９】
前記核酸がＣａｔＳｐｅｒ２活性を有するボリペプチドをコードすることを特徴とする請求項８に記載されている分離核酸。
【請求項１０】
核酸であって、
（ｉ）ＣａｔＳｐｅｒ２活性を有する一つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記核酸は、６５℃にて１．０ｘＳＳＣという洗浄ステップを含む条件下で配列識別番号：１，配列識別番号：３または配列識別番号：５の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズされる前記ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）前記配列が発現されるように前記配列に操作可能に結合される異種制御領域と、
から成る前記核酸。
【請求項１１】
核酸であって、
（ｉ）配列識別番号：２，配列識別番号：４，あるいは配列識別番号：６のアミノ酸配列と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する一つのペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）前記配列が発現されるように前記配列に操作可能に結合される異種制御領域と、
から成る前記核酸。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一つの分離核酸と、前期分離拡散を検出する手段とから成るＣａｔＳｐｅｒ２核酸の少なくとも一部を検出するキット。
【請求項１３】
前記分離核酸を検出するための前記手段はそれに結合している検出可能な標識から成ることを特徴とする請求項１２に記載されているキット。
【請求項１４】
前記分離核酸を検出するための手段は前記分離核酸に特異的にハイブリダイズされる標識化二次核酸から成ることを特徴とする請求項１２に記載されているキット。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一つの分離核酸から成るベクター。
【請求項１６】
請求項４〜１１のいずれか一つの核酸を発現させる遺伝子構築物から成るベクター。
【請求項１７】
前記核酸は外因性制御領域に操作可能に結合されることを特徴とする請求項１６に記載されているベクター。
【請求項１８】
前記核酸は融合ベクターを形成するために異種コード配列に操作可能に結合されることを特徴とする請求項１６に記載されているベクター。
【請求項１９】
請求項４〜１１のいずれか一つの分離核酸から成るベクター。
【請求項２０】
リポーター遺伝子に操作可能に結合される請求項４〜１１のいずれか一つの分離核酸から成るベクター。
【請求項２１】
請求項４〜１１のいずれか一つの核酸により形質転換された細胞。
【請求項２２】
請求項４〜１１のいずれか一つの核酸を発現させることができる遺伝子構築物により形質転換される細胞。
【請求項２３】
前記核酸は融合タンパク質をコードするために異種コード配列に操作可能に前記核酸は結合されることを特徴とする請求項２２に記載されている細胞。
【請求項２４】
前記細胞が細菌細胞、酵母菌細胞、昆虫細胞、線形動物細胞、両生類動物細胞、げっ歯類動物細胞、ヒト細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２２に記載されている細胞。
【請求項２５】
前記細胞が哺乳動物体細胞、胎性細胞、胚性幹細胞、接合体、生殖体、生殖系細胞、トランスジェニック動物細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２２に記載されている細胞。
【請求項２６】
遺伝子構築物が前記動物またはその祖先のゲノムの中に修飾を導入したことを特徴とし、また、前記修飾がＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの断片をコードする核酸の挿入と、内因性ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の不活性化と、ＣａｔＳｐｅｒ２制御エレメントに操作可能に結合されているリポーター遺伝子の相同性組み換えによる挿入とから成るグループから選択されることを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２７】
前記修飾はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質と、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの膜貫通ドメインと、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの細胞外ループと、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのポア領域と、高予測抗原性を有するＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのエピトープと、から成るグループから選択される一つのポリペプチドをコードする核酸の挿入であることを特徴とする請求項３６に記載されている動物。
【請求項２８】
前記動物がラットと、マウスと、ハムスターと、モルモットと、ウサギと、イヌと、ネコと、ヤギと、ヒツジと、ブタと、非ヒト霊長類とから成るグループから選択されることを特徴とする請求項２６に記載されている動物。
【請求項２９】
実質的に純粋なタンパク質調製剤であって、
ａ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質と、
（ｂ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの細胞外ループと、
（ｄ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのポア領域と、
（ｅ）高予測抗原性を有するＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのエピトープと、
から成るグループから選択された一つポリペプチドから成る前記実質的に純粋なタンパク質調製剤。
【請求項３０】
実質的に純粋なタンパク質調製剤であって、前記ポペプチドは、
（ａ）配列識別番号：２と、
（ｂ）配列識別番号：４と、
（ｃ）配列識別番号：６と、
（ｄ）配列識別番号：２の残基１０４−１２６と，１４６−１６６と，１７６−１９５と，２０６−２２８と，２４１−２６２と，３１６−３４０と、
（ｅ）配列識別番号：４の残基１０４−１２６と，１４６−１６６と，１７６−１９５と，２０６−２２８と，２４１−２６２と，３１６−３４０と、
（ｆ）配列識別番号：６の残基１０２−１２４と，１４４−１６４と，１７４−１９３と，２０４−２２７と，２３９−２６０と，３１４−３２８と、
（ｇ）配列識別番号：２の残基１２７−１４５と，１９６−２０５と，２６３−３１５と、
（ｈ）配列識別番号：４の残基１２７−１４５と，１９６−２０５と，２６３−３１５と、
（ｉ）配列識別番号：６の残基１２５−１４３と，１９４−２０３と，２６１−３１３と、
（ｊ）配列識別番号：２の残基２８０−３０３と、
（ｋ）配列識別番号：４の残基２８０−３０３と、
（ｌ）配列識別番号：６の残基２７８−３０１と、
（ｍ）配列識別番号：２の残基２６６−２７５と，３８６−４００と４４７−４５８と，４８２−４９４と、
（ｎ）配列識別番号：４の残基６６−９９と，２６６−２７５と３９４−４１４と、
（ｏ）配列識別番号：６の残基６４−８９と，２６２−２７５と５６２−５８８と、
から成る、グループから選択されることを特徴とする請求項２９に記載されている前記実質的に純粋なタンパク質調製剤。
【請求項３１】
ａ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質と、
（ｂ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの細胞外ループと、
（ｄ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのポア領域と、
から成る、グループから選択された一つのペプチドと少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有する一つのペプチドから成る実質的に純粋なタンパク質調製剤。
【請求項３２】
ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質と、と少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有し、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を発現させることができる一つの細胞におけるＣａｔＳｐｅｒ２活性を有する一つのペプチドから成る実質的に純粋なタンパク質調製剤。
【請求項３３】
ＣａｔＳｐｅｒ２エピトープに対して立ち上げた一つの抗体から成る実質的に純粋な抗体調製剤。
【請求項３４】
前記エピトープが高予測抗原性を有することを特徴とする請求項３３に記載されている実質的に純粋な抗体調製剤。
【請求項３５】
前記エピトープは配列識別番号：２の残基２６６−２７５と，３８６−４００と４４７−４５８と，４８２−４９４と、配列識別番号：４の残基６６−９９と，２６６−２７５と３９４−４１４と、配列識別番号：６の残基６４−８９と，２６２−２７５と５６２−５８８と、
から成る、グループから選択されるアミノ酸配列内にあるアミノ酸配列から成ることを特徴とする請求項３３に記載されている実質的に純粋な抗体調製剤。
【請求項３６】
前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３３〜３５のいずれか一つに記載されている実質的に純粋な抗体調製剤。
【請求項３７】
前記抗体がＦａｂ断片と、Ｆ（ａｂ’）2断片と、Ｆｖ断片と、一本鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖ）とから成るグループから選択される抗体断片であることを特徴とする請求項３３〜３５のいずれか一つに記載されている実質的に純粋な抗体調製剤。
【請求項３８】
請求項３３〜３７のいずれか一つの抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体と前記抗体を検出するための手段とから成るＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのエピトープを検出するためのキット。
【請求項３９】
前記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体を検出するための前記手段はそれに結合される検出可能な標識から成ることを特徴とする請求項３８に記載されているキット。
【請求項４０】
前記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体を検出するための前記手段は前記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体に特異的に結合する標識化二次抗体から成ることを特徴とする請求項３８に記載されているキット。
【請求項４１】
ＣａｔＳｐｅｒ２活性の潜在的なモジュレーターを同定する方法であって、
ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を発現させる細胞と一つの候補化合物を接触させるステップと、
前記細胞におけるＣａｔＳｐｅｒ２活性の指標を測定するステップと、
前記候補化合物が基準値に関する前記指標における増加または減少を引き起こすかどうかを判定するステップと、
前記化合物が前記指標における増加または減少を引き起こす場合は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性の潜在的なモジュレータとして前記候補化合物を同定するステップと、
から成る前記方法。
【請求項４２】
前記指標が前記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの値の指標であることを特徴とする請求項４１に記載されている方法。
【請求項４３】
前記指標がＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の値の指標であることを特徴とする請求項４１に記載されている方法。
【請求項４４】
前記指標が前記細胞の膜全体にわたるカチオンフラックスの指標であることを特徴とする請求項４１に記載されている方法。
【請求項４５】
前記指標が前記細胞の全細胞またはチャネル電流の指標であることを特徴とする請求項４１に記載されている方法。
【請求項４６】
前記細胞がＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を発現させる遺伝子構築物により形質転換されたことを特徴とする請求項４１〜４５のいずれか一つに記載されている方法。
【請求項４７】
前記細胞が成熟精細胞であり、また、前記指標が精子の運動性の測定値であることを特徴とする請求項４１に記載されている方法。
【請求項４８】
ＣａｔＳｐｅｒ２活性の潜在的なモジュレータを同定する方法であって、
ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの構造ドメインから成るＣａｔＳｐｅｒ２部分と、生理学的条件下で一つの候補化合物を接触させるステップと、
何らかのものがあれば、前記候補化合物と前記ＣａｔＳｐｅｒ２部分との間の結合を測定するステップと、
前記候補化合物が前記ＣａｔＳｐｅｒ２部分に結合している場合に、ＣａｔＳｐｅｒ２活性の潜在的なモジュレータとして前記候補化合物を同定するステップと、
から成る前記方法。
【請求項４９】
一つの方法であって、前記ＣａｔＳｐｅｒ２部分が、
（ａ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質と、
（ｂ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの膜貫通ドメインと、
（ｃ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの細胞外ループと、
（ｄ）ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのポア領域と、
から成る、グループから選択された一つのペプチドであることを特徴とする請求項４８に記載されている前記方法。
【請求項５０】
ＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる一つの化合物を前記雄（男性）に投与するステップ、
から成る雄（男性）対象者の不妊症を減少させる方法。
【請求項５１】
ＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる一つの化合物を前記雄（男性）に投与するステップ、
から成る雄（男性）対象者における可逆的な避妊を引き起こす方法。
【請求項５２】
ＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる一つの化合物を前記雄（男性）に投与するステップ、
から成る避妊の方法。
【請求項５３】
ＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる一つの化合物を前記雌（女性）に投与するステップ、
から成る避妊の方法
【請求項５４】
前記化合物が注射と、経皮的パッチと、生物学的腐食可能なインプラントと、潤滑剤と、湿潤剤と、発泡剤と、ゼリーと、スポンジとから成るグループから選択される製剤形態にあることを特徴とする請求項５０〜５３のいずれか一つに記載されている方法。
【請求項５５】
前記雌（女性）対象者が哺乳動物であって、また、前記化合物が前記雌（女性）の膣、子宮、輸卵管の少なくとも一つの中に投与されることを特徴とする請求項５３に記載されている避妊の方法。
【請求項５６】
前記化合物がＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の少なくとも一部に対するアンチセンスである核酸とＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対する一つの抗体とから成るグループから選択されることを特徴とする請求項５０〜５３のいずれか一つに記載されている方法。
【請求項５７】
前記化合物が、Ｆａｂ断片と、Ｆ（ａｂ’）2断片と、Ｆｖ断片と、ｓｃＦｖ断片とから成るグループから選択されることを特徴とする請求項５６に記載されている方法。
【請求項５８】
前記対象者が哺乳動物であることを特徴とする請求項５０〜５３のいずれか一つに記載されている方法。
【請求項５９】
前記哺乳動物がヒトと、イヌと、ネコと、ウシと、ヒツジと、ウマと、マウスと、ラットと、アライグマと、ホリネズミとから成るグループから選択されることであることを特徴とする請求項５８に記載されている方法。
【請求項６０】
前記対象がサカナと、両生類動物と、昆虫とから成るグループから選択されることであることを特徴とする請求項５８に記載されている方法。
【請求項６１】
雄（男性）対象（者）の繁殖力を減少させるための医薬品の調製剤におけるＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる化合物の使用法。
【請求項６２】
雄（男性）対象（者）における繁殖力を可逆的に不妊を引き起こすための医薬品の調製剤におけるＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる化合物の使用法。
【請求項６３】
雄（男性）対象（者）に対して投与するための避妊薬の調製剤においてＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる化合物の使用法。
【請求項６４】
雌（女性）対象（者）に対して投与するための避妊薬の調製剤においてＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる化合物の使用法。
【請求項６５】
前記化合物が注射と、経皮的パッチと、生物学的浸透可能なインプラントと、潤滑剤と、湿潤剤と、発泡剤と、ゼリーと、スポンジとから成るグループから選択される製剤形態にあることを特徴とする請求項６１〜６４のいずれか一つに記載されている使用法。
【請求項６６】
前記雌（女性）対象者が哺乳動物であって、また、前記化合物が前記雌（女性）の膣、子宮、輸卵管の少なくとも一つの中に投与されることを特徴とする請求項５３に記載されている避妊の方法。
【請求項６７】
前記化合物がＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の少なくとも一部に対するアンチセンスである核酸とＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対する一つの抗体とから成るグループから選択されることを特徴とする請求項６１〜６４のいずれか一つに記載されている使用法。
【請求項６８】
前記化合物が、Ｆａｂ断片と、Ｆ（ａｂ’）2断片と、Ｆｖ断片と、ｓｃＦｖ断片とから成るグループから選択されることを特徴とする請求項６７に記載されている使用法。
【請求項６９】
前記対象（者）が哺乳動物であることを特徴とする請求項６１〜６４のいずれか一つに記載されている使用法。
【請求項７０】
前記哺乳動物がヒトと、イヌと、ネコと、ウシと、ヒツジと、ウマと、マウスと、ラットと、アライグマと、ホリネズミとから成るグループから選択されることであることを特徴とする請求項６９に記載されている使用法。
【請求項７１】
前記対象が魚類と、両生類動物と、昆虫とから成るグループから選択されることであることを特徴とする請求項６９に記載されている使用法。
【請求項７２】
ＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる化合物から成る避妊調製剤の使用法。
【請求項７３】
前記化合物がＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスである核酸とＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対する抗体とから成るグループから選択されることを特徴とする請求項７２に記載されている調製剤。
【請求項７４】
前記化合物が注射と、経皮的パッチと、生物学的腐食可能なインプラントと、潤滑剤と、湿潤剤と、発泡剤と、ゼリーと、スポンジとから成るグループから選択される製剤形態にあることを特徴とする請求項７２に記載されている調製剤。
【請求項７５】
ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子における変異の有無を判定するステップから成る哺乳動物におけるＣａｔＳｐｅｒ２関連障害を診断する方法。
【請求項７６】
ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子配列の少なくとも一部を決定するステップと、参考配列に対して前記決定された配列を比較するステップと、
から成る前記方法であって、
前記決定された配列と前期基準配列との間の差異の有無が、前記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子における変異の有無を示すことを特徴とする請求項７５に記載されている前記方法。
【請求項７７】
ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子における変異の有無を判定するステップから成るＣａｔＳｐｅｒ２関連障害を診断する方法。
【請求項７８】
ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子配列の少なくとも一部を決定するステップと、参考配列に対して前記決定された配列を比較するステップと、
から成る前記方法であって、
前記決定された配列と前期基準配列との間の差異の有無が、前記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子における変異の有無を示すことを特徴とする請求項７７に記載されている前記方法。
【請求項７９】
前記判定が、前記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの断片を、一つの変異が有無が公知のものであるＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に結合することが公知の抗体と接触させるステップと、前記抗体と前記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の前記断片との間の結合を検出するステップとから成ることを特徴とする請求項７８に記載されている方法。
【請求項８０】
前記細胞におけるＣａｔＳｐｅｒ２活性の指標を測定するステップと、
基準値に対して前記測定された指標を比較するステップと、
前記指標が増加するかまたは減少する場合は、ＣａｔＳｐｅｒ２関連障害を診断するステップと、
から成る哺乳動物におけるＣａｔＳｐｅｒ２関連障害を診断する方法。
【請求項８１】
前記指標が前記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの値の指標であることを特徴とする請求項８０に記載されている方法。
【請求項８２】
前記指標がＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の値の指標であることを特徴とする請求項８０に記載されている方法。
【請求項８３】
前記指標が前記細胞の膜全体にわたるカチオンフラックスの指標であることを特徴とする請求項８０に記載されている方法。
【請求項８４】
前記指標が前記細胞の全細胞またはチャネル電流の指標であることを特徴とする請求項８０に記載されている方法。
【請求項８５】
前記障害がＣａｔＳｐｅｒ２関連不妊症であることを特徴とする請求項７５〜８４のいずれか一つに記載されている方法。
【請求項８６】
ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子配列の少なくとも一部を決定するステップと、参考配列に対して前記決定された配列を比較するステップと、
から成り、
前記決定された配列と前記基準配列との間の差異の有無が、前記基準配列に対応する遺伝子型の有無を示すことを特徴とするＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子に対して一つの対象（者）の遺伝子型を判定する方法。
【請求項８７】
ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質配列の少なくとも一部を決定するステップと、参考配列に対して前記決定された配列を比較するステップと、
から成り、
前記決定された配列と前記基準配列との間の差異の有無が、前記基準配列に対応する遺伝子型の有無を示すことを特徴とするＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子に対して一つの対象（者）の遺伝子型を判定する方法。
【請求項８８】
前記判定が、前記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの断片を、一つの変異が有無が公知のものであるＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に結合することが公知の抗体と接触させるステップと、前記抗体と前記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の前記断片との間の結合を検出するステップとから成ることを特徴とする請求項８７に記載されている方法。
【請求項８９】
透明帯を少なくとも一つの卵子から取り除くステップと、
前記卵子を前記精子の少なくとも一つと接触させるステップと、
前記精子が前記卵子を受精させることを可能にするステップと、
から成るＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させた精子によるインビトロでの受精の方法。
【請求項９０】
透明帯を少なくとも一つの卵子から取り除くステップと、
前記卵子を前記精子の少なくとも一つと接触させるステップと、
前記精子が前記卵子を受精させることを可能にするステップと、
から成る運動性を減少させた精子によるインビトロでの受精の方法。
【請求項９１】
透明帯を少なくとも一つの卵子から取り除くステップと、
前記卵子を前記精子の少なくとも一つと接触させるステップと、
前記精子が前記卵子を受精させることを可能にするステップと、
から成る透明帯を貫通する能力を減少させた精子によるインビトロでの受精の方法。
【請求項９２】
前記対象（者）の精子または精子前駆体を、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を発現させることができる遺伝子構築物により形質転換させるステップと、
卵子を受精させるために前記対象（者）の形質転換した精子を使用するステップと、
から成る減少ＣａｔＳｐｅｒ２活性のために避妊により特徴付けられる対象（者）を治療する方法。
【請求項９３】
前記対象（者）の精子または精子前駆体に対してＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を投与するステップと、
卵子を受精させるために前記対象（者）の形質転換した精子を使用するステップと、
から成る減少ＣａｔＳｐｅｒ２活性のために避妊により特徴付けられる対象（者）を治療する方法。
【請求項９４】
雌（女性）の尿生殖路に存在する抗体のサンプルを得るステップと、
抗体の前記サンプルを、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの断片と接触させるステップと、
抗体の前記サンプルと、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の前記断片との間の結合を検出するステップと、
ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の抗体の前記サンプルと前記断片との間で結合が検出される場合は、抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体媒介不妊症を診断するステップと、
から成る雌（女性）尿生殖路に存在している抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体により引き起こされる抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体媒介不妊症を診断する方法。
【請求項９５】
前記ＣａｔＳｐｅｒ２断片は高予測抗原性を有する前記エピトープから成ることを特徴とする請求項９４に記載されている方法。
【請求項９６】
前記エピトープは配列識別番号：２の残基２６６−２７５と，３８６−４００と４４７−４５８と，４８２−４９４と、配列識別番号：４の残基６６−９９と，２６６−２７５と３９４−４１４と、配列識別番号：６の残基６４−８９と，２６２−２７５と５６２−５８８と、
から成る、グループから選択される配列内に含められていることを特徴とする請求項９５に記載されている方法。
【請求項９７】
前記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体と前記尿生殖路にある精子上に存在しているＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質との間の結合を阻害するために効果的な用量における前記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体に特異的に結合する薬剤を前記尿生殖路の中に投与するステップから成る雌（女性）の中に存在する抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体により引き起こされる抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体媒介不妊症を治療する方法。
【請求項９８】
前記薬剤が高予測抗原性を有する前記エピトープを含むＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも断片から成ることを特徴とする請求項９７に記載されている方法。
【請求項９９】
前記エピトープは配列識別番号：２の残基２６６−２７５と，３８６−４００と４４７−４５８と，４８２−４９４と、配列識別番号：４の残基６６−９９と，２６６−２７５と３９４−４１４と、配列識別番号：６の残基６４−８９と，２６２−２７５と５６２−５８８と、
から成る、グループから選択される配列内に含められていることを特徴とする請求項９８に記載されている方法。
【請求項１００】
前記薬剤は前記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体に対抗する抗イディオタイプ抗体から成ることを特徴とする請求項９８に記載されている方法。
【請求項１０１】
（ａ）ＣａｔＳｐｅｒ２活性をアンタゴナイズする一つまたはそれ以上の薬剤を請求項４１のアッセイにより同定するステップと。
（ｂ）ステップ（ａ）において同定された薬剤、あるいはその類似体が精子の運動性または卵貫通性の少なくとも一つを阻害するかどうかを判定するステップと、
（ｃ）一つまたはそれ以上の動物モデルにおける効き目と毒性に関して、ステップ（ｂ）において一つの阻害剤として同定された薬剤の治療上のプロフィール作成を実施するステップと、
（ｄ）受け入れ可能な治療上のプロフィールを有するものとしてステップ（ｃ）において同定される一つまたはそれ以上の薬剤を含む製薬調製剤を製剤化するステップと、
から成る薬物ディスカバリービジネスを実施するための方法。
【請求項１０２】
販売のために製薬調製剤を配布するためのシステムを確立するステップと、任意には前記製薬調製剤を市場調査するための販売グループを確立するステップをさらに含める、請求項１０１に記載されている前記方法。
【請求項１０３】
（ａ）ＣａｔＳｐｅｒ２活性をアゴナイズする一つまたはそれ以上の薬剤を請求項４１のアッセイにより同定するステップと。
（ｂ）ステップ（ａ）において同定された薬剤、あるいはその類似体が精子の運動性または卵貫通性の少なくとも一つを阻害するかどうかを判定するステップと、
（ｃ）一つまたはそれ以上の動物モデルにおける効き目と毒性に関して、ステップ（ｂ）において一つのアゴニストとして同定された薬剤の治療上のプロフィール作成を実施するステップと、
（ｄ）受け入れ可能な治療上のプロフィールを有するとしてステップ（ｃ）において同定される一つまたはそれ以上の薬剤を含む製薬調製剤を製剤化するステップと、
から成る薬物ディスカバリービジネスを実施するための方法。
【請求項１０４】
販売のために製薬調製剤を配布するためのシステムを確立するステップと、任意には前記製薬調製剤を市場調査するための販売グループを確立するステップをさらに含める、請求項１０１に記載されている前記方法。
【請求項１０５】
ステップ（ａ）は野生型ＣａｔＳｐｅｒ２の活性をアゴナイズする一つまたはそれ以上の薬剤を同定することから成ることを特徴とする請求項１０３に記載されている前記方法。
【請求項１０６】
ステップ（ａ）は一つまたはそれ以上の変異を含むＣａｔＳｐｅｒ２の活性をアゴナイズする一つまたはそれ以上の薬剤を同定することから成ることを特徴とする請求項１０３に記載されている前記方法。
【請求項１０７】
（ａ）男性患者から採取された精子サンプルを調べるステップであって、そこでは前記患者は受精の問題を体験している、前記ステップと、
（ｂ）前記精子が運動性における減少あるいは卵貫通性の減少の少なくとも一つにより特徴付けられるかどうかを判定するステップと、
（ｃ）精子の運動性または卵貫通性の少なくとも一つを増加させる際に、ＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストの効き目を判定するためにインビトロ分析を実施するステップと、
（ｄ）前記男性における精子の運動性または卵貫通性の少なくとも一つを増加させるために効果的なＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストの用量を投与することから成る治療処方を確立するステップと、
から成る生殖医学ビジネスを実施する方法。
【請求項１０８】
さらに、受精における改善を評価するために医師により前記男性がモニターされることを特徴とするステップを含む、請求項１０７に記載されている前記方法。
【請求項１０９】
さらに、前記患者または上記患者の保健ケア供給者に請求書を作成するステップを含む、請求項１０７に記載されている前記方法。
【請求項１１０】
（ａ）請求項４１のアッセイにより発見された製薬調製剤を提供するステップであって、そこでは前記調製剤がＣａｔＳｐｅｒ２の活性を阻害する前記ステップと、
（ｂ）ＣａｔＳｐｅｒ２の活性を阻害するために効果的な前記製薬調製剤の用量の投与に関して医師と保健ケア供給者に指示を供給し、そこでは前記好適な用量は妊娠を予防するのに十分であるが、前記ステップと、
から成る避妊医学ビジネスを実施する方法。
【請求項１１１】
さらに、販売のために製薬調製剤を配布するためのシステムを確立するステップを含め、また任意には前記製薬調製剤を市場調査するための販売グループを確立するステップをさらに含める、請求項１１０に記載されている前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野および再生技術に関する。特に、本発明は、精細胞において特異的に発現されるカチオンチャネルタンパク質と、上記タンパク質をコード化する核酸と、上記タンパク質を発現させるよう設計された細胞と、上記タンパク質の活動を効果的なものにする化合物に対する評価分析と、不妊症の治療あるいは因果関係におけるこうした化合物の使用法、あるいは避妊あるいは動物対照の手段としてのこうした化合物の使用法に関する。
（政府支援）
本発明はＮＩＨ助成金ＨＤ３６０２２からの支援により一部作成された。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
（関連出願）
本出願は、２００１年１０月２２日に出願した米国仮特許出願第６０／３４５，３２４号の優先権の特典を主張する。
【背景技術】
【０００２】
精子と卵子は脊椎動物の受精において相互に作用する（Ｗａｓｓａｒｍａｎら（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：Ｅ５９−Ｅ６４；Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ（１９９４）、ＫｎｏｂｉｌとＮｅｉｌｌ編“Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ社刊，ニューヨーク市），ｐｐ．１８９−３１５）。受精の部位に達するために、精子は比較的長い距離を移動しなければならず、受精能獲得ならびにその他のプロセスにより上記卵子の受精のために準備がなされる。精子が卵子の表面にいったん辿り着くと、精子は透明帯タンパク質を含む卵子外細胞マトリックス糖タンパク質と相互作用する。精子は先体反応の間、また、Ｃａ2+チャネルの開口とＣａ2+の精子頭部への流入をおそらく含む情報伝達事象の間酸性物質を放出する（Ｏ’Ｔｏｏｌｅら、（２０００）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：１５７１−８４）。そのＴＲＰＣ２タンパク質、推定上のＣａ2+浸透性チャネルは上記先体反応において最近その潜在的な重要性が示されているものである（Ｊｕｎｇｎｉｃｋｅｌら（２００１），Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：４９９−５０２）。上記卵子の厚い外側層を通って精子が貫通するのは、卵子膜の化学的溶解および／精子の機械的な運動により達成される（Ｂｅｄｆｏｒｄ（１９９８），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５９：１２７５−８７）。卵子透明帯膜の浸潤の後に、精子膜は卵子の膜と融合する。融合の後には、卵子の中でのＣａ2+振動で始まる受精プロセスの活性化が続く（Ｗａｓｓａｒｍａｎら、（２００１），同上、；Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ（１９９４）、ＫｎｏｂｉｌとＮｅｉｌｌ編“Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ社刊，ニューヨーク市），ｐｐ．１８９−３１５）。
【０００３】
Ｃａ2+と環状ヌクレオチドは精子の運動性を制御する（Ｔａｓｈ（１９９０），Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｏｆ  Ｓｐｅｒｍ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ：Ｇａｇｎｏｎ編“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ”，（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社刊，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ市），ｐｐ．２２９−２４０；Ｄａｒｓｚｏｎら（１９９９），Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７９：４８１−５１０；ＨｙｎｅとＧａｒｂｅｒｓ（１９７９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：５６９９−７０３）、またいくつかの電圧依存性Ｃａ2+チャネル（ＣａV）ｍＲＮＡと環状ヌクレオチドゲート（ＣＮＧ）チャネルタンパク質は精細胞前駆体の中で検出されている（Ｄａｒｓｚｏｎら（１９９９），Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７９：４８１−５１０；Ｓｅｒｒａｎｏら（１９９９），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６２：１７１−６；Ｗｅｙａｎｄら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８；８５９−６３；Ｗｉｅｓｎｅｒら（１９９８），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４２：４７３−８４）。さらに、低電圧活性化でヒドロピリジン感受性「Ｔ型」チャネル（Ｓａｎｔｉら（１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｃ１５８３−９３；Ａｒｎｏｕｌｔら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１３００４−９）と、薬理学的に定義されたＮ−とＲ−型電流が、精子形成細胞の中で測定されている（Ｗｎｎｅｍｕｔｈら（２０００），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２１２１０−７）。しかしながら、精子形成細胞における、あるいは成熟精子機能におけるこれらチャネルの役割は知られていない。
【０００４】
最近、マウスの正常な受精のために必要とされている電圧ゲートチャネル（ＣａｒＳｐｅｒ１）が発見されている（Ｒｅｎら（２００１），Ｎａｔｕｒｅ４１３：６０３−９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一つの側面において、本発明は、一つのＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の全部あるいは一部から成る分離核酸を提供する。いくつかの実施態様では、上記分離核酸には、配列識別番号；１あるいは配列識別番号：３あるいは配列識別番号：５あるいはそれらに対して相補的な配列の少なくとも１０、１２、１４、１６あるいは１８の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列が含まれる。他の実施態様では、上記核酸には、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも膜貫通ドメイン、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも細胞外ループ、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくともポア領域、高予測率の抗原性を有するＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくともエピトープあるいはそれらに対して相補的な配列が含まれる。特定の実施態様では、上記核酸には、配列識別番号：１の配列と；配列識別番号：３の配列と；配列識別番号：５の配列と；配列識別番号：２の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：６の近接残基１０２−１２４、１４４−１６４、１７４−１９３、２０４−２２７、２３９−２６０、３１４−３３８から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：２の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６３−３１５から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６３−３１５から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：６の近接残基１２５−１４３、１９４−２０３、２６１−３１３から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：２の近接残基２８０−３０３から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基２８０−３０３から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：６の近接残基２７８−３０１から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：２の近接残基２６６−２７５、３８６−４００、４４７−４５８、４８２−４９４から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基６６−９９、２６６−２７５、３９４−４１４から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：６の近接残基６４−８９、２６２−２７５、５６２−５８８から成るポリペプチドをコード化する配列と；それらに対して相補的な配列とが含まれる。いくつかの実施態様では、本発明は、配列識別番号：２の近接残基２６６−２７５、３８６−４００、４４７−４５８、４８２−４９４と；配列識別番号：４の近接残基６６−９９、２６６−２７５、３９４−４１４と；配列識別番号：６の近接残基６４−８９、２６４−２７５、５６２−５８８と；それらに対して相補的な配列とから主に構成されるポリペプチドをコード化する配列から成る核酸を提供する。
【０００６】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドをコード化する分離核酸；ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも膜貫通ドメイン、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも細胞外ループ、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくともポア領域を提供する。いくつかの実施態様では、分離核酸はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドと、ＣａｔＳｐｅｒ２活性化を発現させることができる細胞中でのＣａｔＳｐｅｒ２活性を有するポリペプチドをコードする。
【０００７】
もう一つの側面では、本発明は、６５℃で１．０ｘＳＳＣという洗浄ステップ、０．５ｘＳＳＣという洗浄ステップ、０．２ｘＳＳＣという洗浄ステップ、あるいは０．１ｘＳＳＣという洗浄ステップを含む条件下で配列識別番号：１あるいは配列識別番号：３あるいは配列識別番号：５の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズされる分離核酸を提供する。いくつかの実施態様では、上記分離核酸はＣａｔＳｐｅｒ２活性化を有するポリペプチドをコード化する。
【０００８】
もう一つの側面では、本発明は、６５℃で１．０ｘＳＳＣという洗浄ステップ、０．５ｘＳＳＣという洗浄ステップ、０．２ｘＳＳＣという洗浄ステップ、あるいは０．１ｘＳＳＣという洗浄ステップを含む条件下で、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列から成る核酸を、また配列識別番号：１あるいは配列識別番号：３あるいは配列識別番号：５の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズされる分離核酸を、また上記配列が発現されるように異種制御領域に操作可能に結合される核酸を提供する。もう一つの実施態様では、本発明は配列識別番号：２あるいは配列識別番号：４あるいは配列識別番号：６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列から成る核酸を、提供し、また、上記配列が発現されるように異種制御領域に操作可能に結合される。
【０００９】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２核酸の少なくとも一部を検出するためのキットを提供する。上記キットには、本発明の上記分離核酸と、上記単離分離核酸を検出するための手段のいずれかを含めることができる。いくつかの実施態様では、上記分離核酸を検出するための手段には、それに結合される検出可能なレベルが含まれ、また、いくつかの実施態様では、上記手段には、上記第一単離核酸に特異的にハイブリダイズされる標識化第二次核酸が含まれる。
【００１０】
もう一つの側面では、本発明は、本発明の上記分離核酸のいずれかを含む媒体を提供する。いくつかの実施態様では、上記媒体には、本発明の上記核酸を発現させることができる遺伝子構築物が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の上記核酸は、外因性制御領域に操作可能に結合され、また、いくつかの実施態様では、上記核酸は融合媒体を形成するために異種コード配列に操作可能に結合される。いくつかの実施態様では、上記媒体には、ＣａｔＳｐｅｒ２制御領域が含まれ、また、いくつかの実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２制御領域は、異種コード配列に操作可能に結合される。
【００１１】
もう一つの側面では、本発明は本発明の上記核酸により形質転換された細胞あるいは本発明の核酸を発現させることができる遺伝子構築物を提供する。いくつかの実施態様では、本発明の上記核酸は融合タンパク質をコード化するために異種コード配列に操作可能に結合される。いくつかの実施態様では、上記細胞は細菌細胞、酵母菌細胞、昆虫細胞、線形動物細胞、両生類動物細胞、げっ歯類あるいはヒト細胞である。いくつかの実施態様では、上記細胞は哺乳動物体細胞、胎性細胞、胚性幹細胞、接合体、配偶子、生殖系統細胞、トランスジェニック動物細胞である。
【００１２】
もう一つの側面では、本発明は非ヒトトランスジェニック動物を提供する。これらの側面では、一つの遺伝子構築物が上記動物あるいは上記動物の祖先のゲノムの中に修飾を導入しており、また、上記修飾にはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも断片をコード化する核酸の挿入、内因性ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の不活性化、あるいはＣａｔＳｐｅｒ２制御エレメントに操作可能に結合されるレポータ遺伝子の同種組み換えによる挿入が含まれる。いくつかの実施態様では、上記修飾はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコード化する核酸の挿入、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも膜貫通ドメインと、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも細胞外ループ、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくともポア領域、あるいは高予測抗原性を有するＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質のエピトープである。いくつかの実施態様では、上記動物はラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、非ヒト霊長類である。
【００１３】
もう一つの側面では、本発明は、一つのＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質；ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも膜貫通ドメイン；ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも細胞外ループ；ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくともポア領域、高予測率の抗原性を有するＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくともエピトープから選択されるポリペプチドを含む実質的に純粋なタンパク質作成物を提供する。特定の実施態様では、上記ポリペプチドは、配列識別番号：２；配列識別番号：４；配列識別番号：６；配列識別番号：２の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：６の近接残基１０２−１２４、１４４−１６４、１７４−１９３、２０４−２２７、２３９−２６０、３１４−３３８から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：２の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６３−３１５から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６５−３１５から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：６の近接残基１２５−１４３、１９４−２０３、２６１−３１３から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：２の近接残基２８０−３０３から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基２８０−３０３から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：６の近接残基２７８−３０１から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：２の近接残基２６６−２７５、３８６−４００、４４７−４５８、４８２−４９４から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基６６−９９、２６６−２７５、３９４−４１４から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：６の近接残基６４−８９、２６２−２７５、５６２−５８８から成るポリペプチドをコード化する配列と；から選択される。いくつかの実施態様では、本発明は、配列識別番号：２の近接残基２６６−２７５、３８６−４００、４４７−４５８、４８２−４９４から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基６６−９９、２６６−２７５、３９４−４１４から成るポリペプチドをコードする配列と；配列識別番号：６の近接残基６４−８９、２６２−２７５、５６２−５８８から主に構成されるポリペプチドをコード化する配列と；から選択されるポリペプチドを含む実質的に純粋なタンパク質作成物を提供する。
【００１４】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有しかつポリペプチド；ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも膜貫通ドメイン、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも細胞外ループ、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくともポア領域を提供する。いくつかの実施態様では、上記実質的に純粋なタンパク質作成物には、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドと、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を発現させることができる細胞におけるＣａｔＳｐｅｒ２活性を有するポリペプチドが含まれる。
【００１５】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２エピトープに対して立ち上げた抗体を含む実質的に純粋な抗体作成物を提供する。いくつかの実施態様では、上記エピトープは高予測抗原性を有する。いくつかの実施態様では、上記エピトープには、配列識別番号：２の近接残基２６６−２７５、３８６−４００、４４７−４５８、４８２−４９４から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：４の近接残基６６−９９、２６６−２７５、３９４−４１４から成るポリペプチドをコード化する配列と；配列識別番号：６の近接残基６４−８９、２６２−２７５、５６２−５８８の内から選択されるアミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施態様では、上記抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、上記抗体はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、あるいは一本鎖Ｆｖ断片である（ＳｃＦｖ）。
【００１６】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくともエピトープを検出するためのキットを提供する。上記キットには、本発明の抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体と上記抗体を検出するための手段が含まれる。ある種実施態様では、上記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体を検出するための上記手段には、それに結合される検出可能な標識が含まれ、また、いくつかの実施態様では、上記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体を検出するための上記手段には、上記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体に特異的に結合する標識化二次性抗体が含まれる。
【００１７】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２活性の潜在的なモジュレータを同定する諸方法を提供する。こうした諸方法にはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を発現させる細胞と候補化合物を接触させるステップ；上記細胞におけるＣａｔＳｐｅｒ２活性の指標を測定するステップ；上記候補化合物が参考基準に関する上記指標における増加あるいは減少の原因となったかどうかを判定するステップ：上記化合物が上記指標における増加あるいは減少の原因となった場合は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性の潜在的なモジュレータとして上記候補化合物を同定するステップが含まれる。いくつかの実施態様では、上記指標とは、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコード化するｍＲＮＡの値の指標、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の値の指標であり、上記細胞の膜にわたるカチオン流出の指標であり、あるいは上記細胞の全細胞あるいはチャネル電流の指標である。いくつかの実施態様では、上記細胞は、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を発現させることができる遺伝子構築物により形質転換されている。いくつかの実施態様では、上記細胞は成熟精細胞であって、また、上記指標は精運動性の測定値である。
【００１８】
もう一つの側面では、本発明は、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも構造ドメインと候補化合物を接触させるステップと、もしあれば、上記候補化合物と上記ＣａｔＳｐｅｒ２部分の間にある結合を測定するステップと、上記結合が有意なものである場合は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性の潜在的なモジュレータとして上記候補化合物を同定するステップとから成るＣａｔＳｐｅｒ２の潜在的なモジュレータを同定する諸方法を提供する。いくつかの実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２部分はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質であり、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも膜貫通ドメインであり、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも細胞外ループどてあり、あるいはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくともポア領域である。
【００１９】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させている対象に対して一つの化合物を投与することにより男性対象の受精能を減少させる一つの方法を提供する。もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させている対象に対して一つの化合物を投与することにより男性対象者における可逆的な避妊を起こす一つの方法を提供する。もう一つの側面では、本発明は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる化合物が男性あるいは女性対象者に投与される避妊の一つの方法を提供する。上記実施態様のそれぞれにおいて、上記化合物は注射、経皮的パッチ、生物学的に腐食可能なインプラント、注油、加湿器、発泡剤、ゼリー、あるいはスポンジの形態で可能である。対象者が女性である場合は、上記化合物は膣、子宮、あるいは卵管の少なくとも一つの中に投与することができる。上記実施態様のそれぞれにおいて、上記化合物はＣａｔＳｐｅｒ２遺伝の少なくとも一部に対してアンチセンスであるか、あるいはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆｖ断片、あるいはｓｃＦｖ断片を含むＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対する抗体である核酸でありうる。いくつかの実施態様では、上記対象者は哺乳動物である。いくつかの実施態様では、上記対象者はヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、ラット、アライグマ、ホリネズミである。他の実施態様では、上記対象者は魚、両生類動物、あるいは昆虫である。関連した側面では、本発明は男性対象者の上記受精能を減少させる、あるいは男性対象者における可逆的な避妊を起こすための薬物の調製において、あるいは男性あるいは女性に対して投与するための避妊薬の調製において、ＣａｔＳｐｅｒ２を減少される一つの化合物の使用を用意している。このように、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスであり、またＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対する抗体である核酸を含むＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させる化合物を含む避妊薬調製を提供する。
【００２０】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子における変異の存在あるいは欠如を判定することにより哺乳動物におけるＣａｔＳｐｅｒ２関連障害を診断する諸方法を提供する。いくつかの実施態様では、判定された核酸あるいはアミノ酸配列と参考配列の間の差異の存在あいはる欠如は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子における変異の存在あるいは欠如を示す。いくつかの実施態様では、上記方法には、変異が、存在するかあるいは欠如しているかどうかが知られているＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対して結合することが知られている交代と、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも断片を接触させるステップと、上記抗体と上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質との間の結合を検出するステップと、が含まれる。他の実施態様では、上記方法には、一つの細胞におけるＣａｔＳｐｅｒ２活性の指標を測定するステップと、一つの参考値に上記測定した指標とを比較するステップと、が含まれる。上記指標はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの値の指標であり、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の値の指標であり、上記細胞の膜にわたっているカチオンフラックスの指標であり、あるいは上記細胞の全細胞あるいはチャネル電流の指標である。いくつかの実施態様では、上記障害はＣａｔＳｐｅｒ２関連不妊である。もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子に関して対象者の遺伝子型を調べる諸方法を提供する。
【００２１】
もう一つの側面では、本発明は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を減少させ、運動性を減少させ、透明帯を貫通する能力を減少させた精子によるインビトロにて受精能に関する一つの方法、あるいは透明帯が少なくとも一つの卵子から取り除かれ、また上記卵子を少なくとも一つの精子と接触させる一つの方法を提供する。
【００２２】
もう一つの側面では、減少させたＣａｔＳｐｅｒ２活性による不妊により特徴付けられる対象者を治療する方法が提供される。上記方法には、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を発現させることができる遺伝子構築物により上記対象者の精子あるいは精子プロジェニターを形質転換するステップと、卵子を受精させるために上記対象者の形質転換された精子を使用するステップとが含まれる。代替的には、本方法には対象者の精子あるいは精子プロジェニターに対してＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を投与するステップが含まれる。
【００２３】
もう一つの側面では、本発明は女性尿生殖路の中に存在する抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体により起こる抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体媒介不妊症を診断する諸方法を提供する。もう一つの側面では、女性尿生殖路の中に存在している抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体により起こる抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体媒介不妊症を治療する諸方法が提供される。
【００２４】
もう一つの側面では、（ａ）ＣａｔＳｐｅｒ２活性をアンタゴナイズする一つあるいはそれ以上の薬剤を本発明の分析により、同定するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において同定された薬剤あるいはその類似体が、精子運動性あるいは卵貫通性の少なくとも一つを阻害するかどうかを判定するステップと、（ｃ）一つあるいはそれ以上の動物モデルにおける効果および毒性に対するステップ（ｂ）における阻害剤としてどいて異された薬剤の治療プロファイル作成を実施するステップと、（ｄ）受け入れ可能な治療プロファイル作成を有するように上記ステップ（ｃ）において同定された一つあるいはそれ以上の薬剤を含む製薬調製剤を調合するステップを含む薬剤発掘ビジネスを行う諸方法を提供する。いくつかの実施態様では、上記方法にはさらに、販売のための製薬調製剤を配布するためのシステムが含まれ、また、任意には上記製薬調製剤をマーケティングするための販売グループを確立することを含む確立するステップが含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、精子の運動性と卵子を受精させるその能力において有意な役割を果たしている、テストされた他の組織においてではなく、男性の生殖細胞において発現される新規な電圧ゲートイオンチャネル（ＣａｔＳｐｅｒ２）の同定と、分離と、特徴付けに部分的に依存している。上記タンパク質はそれが同定される精子特異的なものである第二カチオンチャネルであることを示すようにＣａｔＳｐｅｒ２と名付けられている。上記推定上のチャネルには、６つの膜貫通セグメント、上記電圧ゲートカリウムチャネルにさらに類似している構造が含まれているが、そのイオン選択ポアはそれがカルシウムチャネルであることを示している。上記ｍＲＮＡは精子形成の減数分裂あるいは後減数分裂期の間に発現され、また、上記タンパク質は上記精子鞭毛に位置付けられており、精子運動性の制御におけるその役割と一致している。したがって、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の活性のインヒビターは、男性と女性の避妊薬として使用することができる。
【００２６】
本発明がなされたときに同業者には入手可能であった知識を本明細書においてはっきりと明示するために上記特許、科学および医学的公表物は参照されている。本明細書において引用されている発行された米国特許、公表され、また係属中の特許出願、また、その他の参考文献の全体的な開示が参考文献として本明細書に組み込まれている。特に、２００１年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／３４５，３２４号の全体的な開示は本明細書において参考文献として組み込まれている。
（定義）
本明細書において使用されている技術的および科学的用語は、以下に別に定義されているのでなければ、同業者により通常的に理解されるのと同じ意味を有することが意図されており、本明細書の中で採用されている技術は、同業者には明らかなものであると考えられる、そうした技術の変更例、あるいは等価な技術の代替物を含む同業者には通常的に理解されている技術を言うことが意図されている。本発明のものである手段をさらに明確にまた正確に記述するために、以下の定義が、本明細書において用いられているある種の用語が用意されている。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「ＣａｔＳｐｅｒ２」という用語は、配列識別番号：２および配列識別番号：４に開示されているヒトＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質、上記開示されているＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質のヒト対立遺伝子およびスプライス変異体、これらヒトＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の非ヒト哺乳動物相同体（例えば、配列識別番号：６）、および機能的にそれらと等価なものなどの精子特異的カチオンチャネルを意味する。ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質という用語は、精子から分離された自然発生的なタンパク質、ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子により形質転換された細胞から組み換えにより産生されたタンパク質、およびＣａｔＳｐｅｒ２配列が、Ｎ末端あるいはＣ末端ポリペプチドに融合される融合タンパク質を言う。「ＣａｔＳｐｅｒ２断片」という用語は、構造ドメインとエピトープなどのＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の断片を言う。ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の断片は少なくとも６つのアミノ酸残基から成る。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子」という用語は、配列識別番号：２および配列識別番号：４に開示されているヒトＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質、上記開示されているＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質のヒト対立遺伝子およびスプライス変異体、これらヒトＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の非ヒト哺乳動物相同体（例えば、配列識別番号：６）、および機能的にそれらと等価なものを含むＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコードする遺伝子を意味する。ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子という用語は、ゲノムから分離された自然発生的な遺伝子、およびＣａｔＳｐｅｒ２コード領域が、イントロン配列によりあるいはイントロン配列なしで、および、ＣａｔＳｐｅｒ２融合タンパク質を形成するために異種（すなわち、非ＣａｔＳｐｅｒ２）配列をコード化することができる５’あるいは３’フランキング配列により、あるいは上記フランキング配列なしで、内因性あるいは外因性制御エレメントかのいずれかに操作可能に結合される組み換えにより産生される遺伝子を言う。遺伝子により形質転換された細胞から組み換えにより産生されたタンパク質、およびＣａｔＳｐｅｒ２配列が、Ｎ末端あるいはＣ末端ポリペプチドに融合される融合タンパク質を言う。「ＣａｔＳｐｅｒ２断片」という用語は、構造ドメインとエピトープなどのＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の断片を言う。ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子には、最小限で、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に翻訳することができるｍＲＮＡに対する上記コード領域の転写を可能にする制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）に操作可能に結合される上記タンパク質をコード化するコード領域が含まれる。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、「ＣａｔＳｐｅｒ２」活性という用語は、ＣａｔＳｐｅｒ２が正常に発現される細胞あるいは細胞型の中で発現される場合に、また、ＣａｔＳｐｅｒ２が正常に発現される条件下で野生型ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質のいずれかの正常な生物学的活性を意味する。こうした活性には、イオン電流の誘導と、ｃＡＭＰ誘導Ｃａ2+流入の媒介と、ＣａｔＳｐｅｒ２−／−精子において発現されるときに精子運動性の回復と、および／またはＣａｔＳｐｅｒ２−／−精子が発現されるときに卵を貫通する能力の回復とを含めることができる。ＣａｔＳｐｅｒ２活性は、精細胞あるいは精母細胞において測定することができ、あるいはいずれかの必要なアクセサリー因子が存在するその他の細胞の中で測定することができる。
【００３０】
核酸およびアミノ酸配列に関して本明細書において使用されるとき、「同定」という用語は、同定を最大のものとし、また、それが同一のヌクレオチドあるいは残基の数の関数であり、また、総ヌクレオチドあるいは残基の数であり、また、上記配列整列におけるギャップの存在および長さである、上記配列の整列に基づいて2つの配列の類似の程度を測定することを意味する。さまざまなアルゴリズムとコンピュータプログラムは、標準的なパラメータを用いて配列同一性を測定するのに有用である。例えば、ギャップを付けたＢＬＡＳＴあるいはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）と、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈら（１９８１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）である。本明細書で使用されるとき、パーセント同一性は上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムに対するデフォルト値に基づいたものである。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「相同性」という用語は、また、参照タンパク質との実質的、保存構造および機能的な類似に対して進化的に関連し、また、それを分かち合っているタンパク質であるが、しかし、異なる種（例えば、ヒト、ラットおよび昆虫ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質は互いに相同体である）において天然に存在するタンパク質を意味する。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「変異」という用語は、ある種の参考配列に関して、対応しているコードタンパク質配列における変化として発現されるかどうか、核酸配列における変化を言う。上記参考配列は「野生型」配列（すなわち、「正常」表現型に対応している一つの集団における一つあるいはそれ以上の高頻度配列）あるいはいずれかの他の配列でありうる。本明細書で使用されるとき、変異という用語は、遺伝子多型という用語と同意語であることが意図されており、また、したがって、いずれかの2つの非同一配列の間の差異は変異とみなすことができる。変異という用語は、参考配列に関する一つあるいはそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換を含むように意図されている。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「外因性」あるいは「異種性」という用語は、2つあるいはそれ以上の遺伝子配列に関して、遺伝子配列が、天然においては互いに同一の物理的関係においては起こらない、および／または同一のゲノム内では天然においては起こらないことを言う。例えば、遺伝子構築物には、一つあるいはそれ以上の制御エレメントに操作可能に結合されるコード領域を含めることができ、また、そうした配列は、天然においては操作可能に結合されていない場合、および／またはそれらが天然においては同一のゲノムの中では見つからない場合は、異種性のものであるとみなされる。同様に、一つの細胞に導入される遺伝子構築物は、その細胞の中で見つからない遺伝子配列をそれが含んでいる程度にその細胞に対して異種性があると考えられる。さらに、天然発生配列に基づいている合成により産生された遺伝子配列は、その配列が改変された程度に即して、また、上記合成配列が天然においては存在しないその程度に即して上記天然に発生する配列に対して異種性があるものとなる。一つの種の一つの配列の対立遺伝子変異体は互いに異種性のものであるとはみなされない。
【００３４】
本明細書において使用されるとき、「操作可能に結合された」という用語は、上記制御エレメントの一つあるいはそれ以上に結合することができるＲＮＡポリメラーゼにより上記コード領域がｍＲＮＡの中に転写させることができる遺伝子制御エレメントと遺伝子コード領域の共有結合および機能的なリンケージを言う。したがって、制御エレメントを含む制御領域は、上記制御領域内にある一つのプロモーターへの結合が許容される条件下で、また、ｍＲＮＡの中への上記コード領域の転写を引き起こすことが許容される条件下でＲＮＡポリメラーゼが可能であるときにコード領域に操作可能に結合される。この文脈においては、許容される条件には、インビトロ転写システムに関しては同業者には公知のものであるように、構成プロモーターのための標準的な細胞内条件、標準的な条件、およびリプレッサーの欠如、あるいは抑圧可能／誘導可能なプロモーターのための誘導物質の存在、適当なインビトロ条件が含まれる。
本明細書において使用されるとき、「発現」という用語は、一つの遺伝子の一つのコード配列が、一次ｍＲＮＡ転写の中に転写され、上記一次ｍＲＮＡ転写が成熟ｍＲＮＡの中に処理して入れ、また、上記成熟ｍＲＮＡは一つのタンパク質の中に翻訳されるそのプロセスを言う。発現にはその結果生じるポリペプチドの翻訳後修飾が任意には含めることができる。
【００３５】
本明細書において使用されるとき、「ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコード化する遺伝子構築物」という慣用句は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の上記アミノ酸配列をコード化する遺伝子配列、あるいはそれをコードする遺伝子配列に相補的なものであり、あるいは、それをコード化する遺伝子配列に相補的なものであり、また、上記構築物により形質転換された一つの細胞の中で発現されることが可能である遺伝子配列を含む組み換えＤＮＡ，ＲＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいは核酸類似体分子を意味する。上記構築物は一過性に上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を発現することができ、あるいは、上記細胞の上記ゲノムの中に安定的に組み込むことができ、また、条件にのっとって、あるいは構成的に上記タンパク質を発現させることができる。
【００３６】
本明細書において使用されるとき、「ベクター」という用語は、細胞間で遺伝子配列を移動することができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン、その他などのいずれかの遺伝子構築物を意味する。ベクターは複製、発現および挿入あるいは組み込みの一つあるいはそれ以上を行うことができるが、それらの能力の一つ一つを全て所持する必要はない。このように、この用語には、クローニング、発現、相同性組み換え、およびノックアウトベクターが含まれる。
【００３７】
本明細書において使用されるとき、遺伝子工学に関して、「形質転換」という用語は、その細胞あるいは組織の中で発現されるポリペプチド配列をコードし、および／または一つの遺伝子座の発現を実施するようにその細胞あるいは組織のゲノムの中に組み込まれるその細胞あるいは組織内で複製する外因性核酸あるいは核酸類似体を細胞あるいは組織の中に導入することを意味する。「形質転換」という用語は、形質転換、トランスフェクション、形質導入、電気穿孔法、弾道的注入などとして同業者には言われている諸方法に限定手されるわけではないが、それらを含む、核酸、あるいは核酸類似体などを導入するさまざまな方法の全てを包括するのに使用される。
【００３８】
本明細書において使用されるとき、「核酸類似体」という用語は、相補的な核酸の配列特異的順方向および逆転写を指示し、また、生体細胞内にあるコード化されたポリペプチドの配列特異的翻訳を指示する核酸に対する十分な構造的および機能的類似性を有する分子を意味する。本明細書において使用されるとき、「核酸」という用語が使用されるときはいつでも、その用語は、こうした類似体が使用するという文脈において有用である、あるいは適当であると考えられるときに、核酸類似体を包括することが意図されている。
【００３９】
本明細書において使用されるとき、「リポーター遺伝子」という用語は、発現されるとき、検出可能である生化学あるいは表現型効果を有するいずれかの遺伝子配列を意味する。リポーター遺伝子はまた、「マーカー」遺伝子として同業者には公知のものである。
【００４０】
本明細書において使用されるとき、「抗体」という用語は、天然において産生される抗体、組み換えにより産生される抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)を包括することが意図されている。
【００４１】
本明細書において使用されるとき、アゴニスト、あるいはアンタゴニスト、あるいはエンハンサー、あるいはリプレッサーの「効果的な用量」という用語は、検出可能な生化学的あるいは表現型の特性の統計的に有意な変化を起こすのに十分なものである組成の活性化成分の総量を意味する。胆道で投与される個々の活性化成分に適用されるとき、その用語はその単独成分を言う。一つの組み合わせに適用されるとき、上記用語は組み合わせて投与されるか、連続してか、あるいは同時にか投与されるかどうか、その効果を結果的に生じる上記活性成分の組み合わせた用量を言う。
【００４２】
本明細書において使用されるとき、「実質的に純粋な」という用語は、その他の意図的に含められた化合物の重量を除く興味の対象となっている上記タンパク質の少なくとも６０%(乾燥重量で)を含む調製剤を意味する。いくつかの実施態様では、上記調製剤はその他の意図的に含められた化合物の重量を除く興味の対象となっている少なくとも７５％、少なくとも９０%あるいは少なくとも９９％タンパク質である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気穿孔法、アミノ酸組成分析あるいはＨＰＬＣ分析などのいずれかの適当な方法により測定することができる。一つの調製剤には意図的に、本発明の二つあるいはそれ以上の異なるタンパク質が含まれており、「実質的に純粋な」調製剤は、その他の意図的に含まれている化合物の重量を除外して、総乾燥重量の少なくとも６０%である。本発明の2つあるいはそれ以上のタンパク質を含有する調製剤に関しては、本発明のタンパク質の総重量は、その他の乾燥重量の少なくとも７５%、少なくとも９０％，あるいは少なくとも９９%となるはずである。したがって、本発明の上記タンパク質が投与、安定性、保存、などの目的で一つあるいはそれ以上のその他の化合物と混合される場合(例えば、希釈剤、安定剤、洗浄剤、賦形剤、塩、砂糖、脂質)、こうしたその他の化合物の重量は上記調製剤の純度の計算においては無視される。
【００４３】
本明細書において使用されるとき、「調節する」あるいは「影響を及ぼす」という用語は増加するかあるいは減少するかのいずれかを意味する。本明細書において使用されるとき、「増加」あるいは「減少」という用語はそれぞれ統計的に有意に増加する(すなわち、ｐ＞０．１)、また統計的に有意に減少する(すなわち、ｐ＜０．１)ことを意味する。
【００４４】
本明細書において使用されるとき、「ＡをＢと接触させる」という語句におけるように「接触される」という用語は、溶液の中でＡとＢを一緒に混合することにより、あるいは基板の上でＡの溶液をＢの上に注ぐことにより、分子レベルで相互作用するように十分な物理的近位にＡとＢはもってこられることを意味する。本明細書において使用されるとき、「ＡをＢと接触させる」という語句は、「ＢをＡと接触させる」と等価であることが意図されており、また、いずれかのエレメントがその他に対して相対的に固定されているか、あるいはその他に対して相対的に移動されることを暗に言うことを意図されている。
（数的範囲）
本明細書において使用されるとき、変数に対する数的範囲の詳説は、本発明がその範囲内にある値のいずれかに等しい変数で実施することが可能であるということを伝えることを意図されている。したがって、固有に離散している変数に関しては、その範囲のエンドポイントを含めて、数的な範囲のそれぞれの整数値に等しくすることができる。同様に、固有に連続のものである変数に関して、上記変数は、その範囲のエンドポイントを含めて、数的範囲のそれぞれの実数に等しくすることができる。例として、０と２の間の値を有するものとして説明される変数は、固有に離散している変数に関しては０．１あるいは２でありうるし、また、０．０、０．１、０．０１、０．００１あるいは固有に連続している変数に関して２≦のいずれかのその他の実数値でありうる。
（または）
本明細書において使用されるとき、特にそのように示されていない限りは、「または」という言葉は、「および／または」の「包括」感覚であって、「いずれか／または」の「排除」感覚ではない場合に使用される。
(一般的な考察)
本発明は、精細胞において発現されるカチオンチャネルタンパク質の同定、分離および特徴付けに部分的に依存しており、本発明は、テストされた他の組織においてではなく、精子の運動性と卵子を受精させるその能力において有意な役割を果たしている。上記タンパク質はそれが同定される精子特異的なものである第二カチオンチャネルであることを示すようにＣａｔＳｐｅｒ２と名付けられている。上記タンパク質は上記精子鞭毛上に存在しており、精子運動性の制御におけるその役割と一致している。したがって、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の活性の阻害剤は、一時的な、可逆的な避妊を生じる男性および／または女性による精子阻害避妊薬として使用することができる。
【００４５】
予測ＣａｔＳｐｅｒ２  ＯＲＦは、６つの膜貫通セグメントにより一つのタンパク質をコードする（図1（Ａ），配列識別番号：1、配列識別番号：３、配列識別番号：５）。上記配列は上記電圧ゲートカルシウムチャネルファミリー(ＣａV)に対する類似性を示し、また、運動性と正常受精にとって重要であることが最近見出されたもう一つの精細胞特異的推定カチオンチャネルであるＣａｔＳｐｅｒ１にもっとも類似している（図１（Ｂ））（Ｒｅｎら（２００１）、同上）。したがって、ＣａｔＳｐｅｒ２とＣａｔＳｐｅｒ1はイオンチャネルの新しいファミリーを定義している（Ｓａｉｅｒ（２０００），Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１７５：１６５−８０；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ（２０００），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６：5２１−５５）。このファミリーの特徴には、セグメント全体にわたっている6つの膜を有する単一膜貫通領域と、見掛けのＳ４電圧センサ、電圧ゲートカルシウムとナトリウムチャネルにおける４つの膜貫通反復を有する予測カルシウム選択ポア領域と膜貫通領域の全体的な配列類似性とを組み合わせたＫVとＨＣＮチャネルにより共有されている特性の存在が含まれる。
（ＣａｔＳｐｅｒ2核酸）
一つの側面では、本発明は、上記ＣａｔＳｐｅｒ2タンパク質あるいはその有用な断片をコード化する核酸分子あるいは核酸類似体を提供する。上記ヒトＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の２つのＤＮＡが同定され、また、互いの見掛けのスプライス変異体となる。これら配列は、配列識別番号：1と配列識別番号：3として、また、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ４１１８１７とＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ４１１８１９としてそれぞれ開示されている。マウス類似体のその完全長ｃＤＮＡ配列は配列識別番号：５として、また、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ４１１８１６として開示されている。
【００４６】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子あるいはハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ分子でありうる。本発明の上記核酸類似体は、インビトロ翻訳あるいはアンチセンス技術において有用なものである、修飾塩基（例えば、２’−ハロゲノ−２’−デオキシヌクレオチド）を含めたペプチド核酸、類似体および／または修飾インターヌクレオチドリンケージ（例えば、ホスホロチオエートリンケージ）を含めた類似体などの同業者には公知のものであるそうしたもののいずれかでありうる。上記核酸はＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子配列の全部あるいは一部に相当するセンス分子でありうるものであり、あるいは上記核酸はＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子配列の全部あるいは部分に対して相補的なものであるアンチセンス分子でありうる。上記核酸はゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡにから誘導することが可能であり、あるいはそれに相当する、あるいは上記核酸は、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質配列と上記遺伝子コード（例えば、発現系で使用されている宿主細胞においてコドン使用好適性を反映している合成核酸）に基づく合成分子でありうる。
【００４７】
いくつかの実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２核酸は、ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の全コード領域から成る（例えば、配列識別番号：１，配列識別番号：３あるいは配列識別番号：５）。こうした核酸は、細胞の形質転換のための遺伝子構築物を産生するのに、インビトロ転写および翻訳系のための遺伝子構築物を産生するのに使用することができる。こうした核酸はまた、その他の核酸のサンプルにおいてＣａｔＳｐｅｒ２配列を検出するためにハイブリダイゼーション分析におけるプローブとして使用することもできる。
【００４８】
他の実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２核酸配列のサブセットは、核酸増幅反応のためにプライマーとして、他の核酸のサンプルにおけるＣａｔＳｐｅｒ２配列を検出するためにハイブリダイゼーション分析におけるプローブとして、あるいは、異常あるいは変異体配列から正常あるいは野生型配列を識別するためにプローブとして使用されるように用意される。これら実施態様では、本発明の上記核酸は配列識別番号：１などのＣａｔＳｐｅｒ２配列から選択される少なくとも１０，１２，１４，１６，１８連続ヌクレオチドから成る。適用の性質により、一意的な標的を有することになる、あるいは探索されるあるいは増幅されるサンプル内で、一意的な標的を有することが予測されるＣａｔＳｐｅｒ２配列を選択することが好ましいものとなりうる。したがって、例えば、より長い配列および高頻度反復エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含まない配列がいずれかの所定のサンプル内で一意的に呈示される可能性が高い。増幅反応のためのプライマーを選択する目的で、少なくとも１５ヌクレオチドの配列、また典型的には１８−２５ヌクレオチドの配列が使用される。
【００４９】
いくつかの実施態様では、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の構造ドメインをコード化し、あるいは抗体の産生のためにエピトープとして役に立たせることができる上記タンパク質の断片をコード化する核酸が提供される。したがって、例えば、有用な核酸には、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の膜貫通ドメインをコード化するもの（すなわち、配列識別番号：２の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０と；配列識別番号：４の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０と；配列識別番号：６の近接残基１０２−１２４、１４４−１６４、１７４−１９３、２０４−２２７、２３９−２６０、３１４−３３８と、それらの対立遺伝子変異体と類似体）、膜貫通ドメイン間にある細胞外ループをコード化するもの（すなわち、；配列識別番号：４の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６５−３１５、；配列識別番号：６の近接残基１２５−１４３、１９４−２０３、２６１−３１３、それらの対立遺伝子変異体と類似）、あるいはポア領域をコード化するもの（すなわち、配列識別番号：２の近接残基２８０−３０３と、配列識別番号：４の近接残基２８０−３０３と、配列識別番号：６の近接残基２７８−３０１と、それらの対立遺伝子変異体と類似）が含まれる。その他の有用な核酸には、以下で説明されている標準的な配列分析技術により同定されるような、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の潜在的なエピトープをコード化するものが含まれる。したがって、例えば、有用な核酸には、以下のヒトＣａｔＳｐｅｒ２配列をコード化するもの、すなわち、配列識別番号：２の近接残基２６６−２７５、３８６−４００、４４７−４５８、４８２−４９４、配列識別番号：４の近接残基６６−９９、２６６−２７５、３９４−４１４、配列識別番号：６の近接残基６４−８９、２６２−２７５、５６２−５８８が含まれる。その他の有用なエピトープには、こうしたエピトープの対立遺伝子と非ヒト哺乳動物類似体が含まれる。
【００５０】
いくつかの実施態様では、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも構造ドメインに対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドをコード化する核酸が提供される。いくつかの実施態様では、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の膜貫通ドメインに対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドをコード化する核酸が提供される（例えば、すなわち、配列識別番号：２の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０；配列識別番号：４の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０；配列識別番号：６の近接残基１０２−１２４、１４４−１６４、１７４−１９３、２０４−２２７、２３９−２６０、３１４−３３８と、それらの対立遺伝子変異体と類似体）、膜貫通ドメイン間にある細胞外ループをコードするもの（すなわち、；配列識別番号：４の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６５−３１５と、；配列識別番号：６の近接残基１２５−１４３、１９４−２０３、２６１−３１３と、それらの対立遺伝子変異体と類似）、あるいはポア領域をコードするもの（すなわち、配列識別番号：２の近接残基２８０−３０３と、配列識別番号：４の近接残基２８０−３０３と、配列識別番号：６の近接残基２７８−３０１と、それらの対立遺伝子変異体と類似）が提供される。いくつかの実施態様では、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有し、また、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を有するポリペプチドをコードする核酸が提供される。ＣａｔＳｐｅｒ２活性を示すタンパク質の能力は、ＣａｔＳｐｅｒ２−／−変異体（例えば、ＣａｔＳｐｅｒ２ノックアウト変異体）を補足し、また、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を発現させることがそうでなければできる細胞内のＣａｔＳｐｅｒ２+／+表現型（例えば、精子の運動性を回復させるため）を回復させる能力により測定することができる（例えば、上記ＣａｔＳｐｅｒ２−／−変異体から得られる精細胞）。
【００５１】
他の実施態様では、厳密な条件下でＣａｔＳｐｅｒ２コード配列（例えば、配列識別番号：１あるいは配列識別番号：３あるいは配列識別番号：５）の少なくとも一部にハイブリダイズされる分離核酸が提供される。こうした条件には、６５℃で１．０ｘＳＳＣという洗浄ステップとそれに等価のものが含まれる。さらに緊縮条件には、０．５ｘＳＳＣという洗浄ステップ、０．２ｘＳＳＣという洗浄ステップ、あるいは０．１ｘＳＳＣという洗浄ステップを含めることができる。その他の等価な緊縮条件が同業者には周知のものとなっている。これについては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８９）“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社刊、ニューヨーク市を参照のこと。いくつかの実施態様では、上記核酸は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を有するポリペプチドをコード化する。
【００５２】
もう一つの側面では、本発明は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を有するポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列が、上記ＣａｔＳｐｅｒ２配列が発現されるような異種制御領域に操作可能に結合される、細胞内で分離あるいはその中に存在しているかのいずれかである核酸を提供する。したがって、いくつかの実施態様では、異種制御領域は、それが内因性ＣａｔＳｐｅｒ２配列に操作可能に結合される染色体の中に挿入することができる。ある種の実施態様では、上記ポリペプチドは、配列識別番号：２あるいは配列識別番号：４あるいは配列識別番号：６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有する。他の実施態様では、上記ポリペプチドをコード化する上記核酸は６５℃で１．０ｘＳＳＣ、０．５ｘＳＳＣ、０．２ｘＳＳＣ、あるいは０．１ｘＳＳＣという洗浄ステップを含む条件下で、配列識別番号：１あるいは配列識別番号：３あるいは配列識別番号：５の核酸の少なくとも一部にハイブリダイズされる。
【００５３】
いくつかの実施態様では、本発明の上記核酸は、長さにして少なくとも５０アミノ酸残基、あるいは長さにして少なくとも１００，２００，あるいは３００アミノ酸残基のＣａｔＳｐｅｒ２配列を含むポリペプチドをコード化する。これらポペプチドには少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの細胞外ループドメイン、少なくともポア領域あるいはそれらを組み合わせたものを含むＣａｔＳｐｅｒ２配列が含まれ得る。いくつかの実施態様では、上記ポリペプチドはＣａｔＳｐｅｒ２活性を有する。こうした活性にはイオン電流の誘導、ｃＡＭＰ誘導Ｃａ2+流入、ＣａｔＳｐｅｒ２−／−精子において発現される場合の精子運動性の回復、および／またはＣａｔＳｐｅｒ２−／−精子において発現される場合に卵を受精する能力の回復が含まれ得る。
【００５４】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２核酸（すなわち、ＣａｔＳｐｅｒ２ゲノムＤＮＡ，ｍＲＮＡ，ｃＤＮＡあるいはそれらの増幅産物）の少なくとも一部を検出するためのキットを提供する。上記キットには、一つのプローブとして本発明の分離核酸と、上記プローブを検出するための手段とが含まれる。上記プローブを検出するための上記手段は、上記第一プローブを検出するための上記プローブあるいは二次核酸プローブに結合された検出可能な標識でありうる（例えば、上記分離核酸に特異的にハイブリダイズされる標識化二次核酸）。
（遺伝子構築物）
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２遺伝から選択された配列から成る遺伝子構築物を提供する。いくつかの実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子配列が上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子のコード領域から選択され、また、他の実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子配列は、転写開始コドンの５’末端からおよそ１，０００塩基伸長している上記ＣａｔＳｐｅｒ２制御領域、および上記終止コドンの３’からおよそ１，０００塩基伸長している上記ＣａｔＳｐｅｒ２制御領域から選択することができる。
【００５５】
実施態様の一つのシリーズにおいては、ＣａｔＳｐｅｒ２コード（例えば、全コード領域、構造ドメインをコード化する配列、潜在的エピトープをコード化する配列、あるいは有用なプライマー、あるいはプローブをコード化する配列）は、一つの発現構築物を形成するために内因性あるいは外因性制御領域に操作可能に結合される。こうした目的のために有用な制御領域には、上記内因性ＣａｔＳｐｅｒ２制御領域、構成プロモーター配列（例えば、ＣＭＶ，ＳＶ４０，ＥＦ２）、誘導可能なプロモーター配列（例えば、ｌａｃＺ，ｔｅｔ）が含まれる。多くの有用なベクター系は商業的に入手可能である。例えば、有用な細菌ベクターには、ｐＱＥ７０，ｐＱＥ６０，ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ市）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ  ＩＩTM（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社，カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ市）、およびｐＴＲＣ９９ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｍａｃｉａ社、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ市）、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８），Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９９０），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９）に限定されるわけではないが、それらが含まれる。酵母菌における発現のためのベクターの実施例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７），ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４），ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎら（１９８２），Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３），ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｓら（１９８７），Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３），およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ市）が含まれる。上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質もまたｐＡｃベクター（Ｓｍｉｔｈら（１９８３），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬベクター（Ｌｕｃｋｌｏｗら（１９８９），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９）に限定されるわけではないが、それらを含むバキュロウイルス発現ベクターを用いる昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）において発現させることができる。哺乳動物発現ベクターの実施例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７），ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）に限定されるわけではないが、それらが含まれる。その他の有用な真核細胞ベクターには、ｐＸＴ２，ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ市）およびｐＳＶＫ３，ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ，ＰＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ市）に限定されるわけではなく、それらが含まれる。したがって、形質転換される宿主細胞に対する適当なベクター系を選択することが同業者にはできる。
【００５６】
他の実施態様では、上記ベクターは、「ノックアウト」ベクターにおける欠損あるいは部分ＣａｔＳｐｅｒ２配列から成る。こうしたベクターは同業者には周知のものであり、内因性遺伝子が上記内因性配列内での変異を導入する部分的に相同性外因性配列により組み合わせることにより「ノックアウト」されるトランスジェニック生体組織を産生するのに使用することができる。典型的には、上記ベクターは、興味の対象となっている遺伝子の全部あるいは部分でありうる内因性標的配列に方向付けられる。上記ベクターには、上記標的の上記５’および３’末端に対して相同性のある５’および３’フランキング配列が含まれる。上記５’および３’フランキング配列との間には上記変異を含む配列がある。上記変異は終結変異、フレームシフト変異、大きな欠失、あるいは上記内因性遺伝子を破壊し、また、成功裏に相同性組み換え体を同定するためにマーカーとして働くという両方で役に立つ新しいコード配列の導入でもありうる。ノックアウトベクターはさらに以下で論議される。
【００５７】
もう一つの実施態様のシリーズでは、上記ＣａｔＳｐｅｒ２コード配列は、融合タンパク質をコード化する遺伝子構築物あるいは融合ベクターを形成するために制御領域と外因コード配列に結合させることができる。いくつかの実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２コード配列は、上記融合タンパク質に対して新しいまた有用な特性を付与する外因性コード配列に結合させることができる。例えば、融合ベクターと融合タンパク質は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の発現を増加させるのに、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の溶解度を増加させるのに、あるいは上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の精製において補助するのに有用なものとすることができる（例えば、親和性精製のためのリガンド配列を提供することより）。上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を上記融合部分から容易に分離することができるようにタンパク分解性切断部位は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２と上記非ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質配列の接合点で導入することができる。典型的な融合発現ベクターには、上記標的組み換えタンパク質に対してグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ），マルトースＥ結合タンパク質、あるいはタンパク質Ａを融合するｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら（１９８８），Ｇｅｎｅ６７：３１−４０），ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ市）およびｐＲＩＴ５（Ｐａｒｍａｃｉａ社、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ市）が含まれる。
【００５８】
もう一つの実施態様のシリーズでは、リポーター遺伝子からの上記コード領域はＣａｔＳｐｅ２遺伝子の上記制御領域に操作可能に結合される遺伝子構築物が産生される。こうした遺伝子構築物は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の転写を促進するかあるいは退行させることによりＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子発現を促進するかあるいは退行させる化合物を同定するあるいは特徴付けるためにアッセイにおいて有用である。広範なさまざまの適当なリポーター遺伝子は同業者には公知のものであり、また、商業的に入手可能である。実施例には、上記ｌａｃＺ、ルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子に限定されるわけではないが、それらが含まれる。
【００５９】
有用なＣａｔＳｐｅｒ２制御エレメントには、５’直後１，０００ヌクレオチドから上記ＣａｔＳｐｅｒ２転写開始部位までで選択された少なくとも１００−１，０００，２００−８００，あるいは３００−７００連続ヌクレオチドに対して少なくとも８０％ヌクレオチド同一性を有する配列が含まれる。有用な制御エレメントは、ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子が発現される哺乳動物細胞の中のエレメントに操作可能に結合されるコード配列の転写を促進する能力を保持している。特に、有用な制御エレメントは、上記エレメントが誘導された上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子が発現される、あるいはそのＣａｔｓｐｅｒ２遺伝子の類似体が発現される細胞における転写を促進する能力を保持している。
（形質転換細胞系統）
もう一つの側面では、本発明は本発明の上記核酸分子により形質転換された細胞系統を提供する。こうした細胞系統は単にこれら核酸を増殖することができ（例えば、クローニングベクターにより形質転換されるとき）あるいはこれら核酸によりコード化される上記ポリペプチドを発現することができる（例えば、発現ベクターにより形質転換されるとき）。こうした形質転換細胞系統は、本発明の上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質とＣａｔＳｐｅｒｅ２断片を産生するのに使用することができ、あるいは、ＣａｔＳｐｅｒ２発現あるいは活性を促進する、退行させる、アゴナイズする、あるいはアンタゴナイズする化合物に関してスクリーニングするのにアッセイにおいて使用することができる。
【００６０】
上記形質転換細胞は、その細胞において発現されるポリペプチド配列をコードする、および／または、遺伝子座の発現に影響を及ぼすようにその細胞のゲノムの中に組み込まれる、その細胞内で複製する外因性核酸あるいは核酸類似体を一つの細胞の中に導入することにより産生することができる。上記形質転換は、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔法、軌道式注入などとして、同業者には言及されている標準的な諸方法のいずれかにより達成することができる。形質転換の上記方法は、形質転換されている細胞の型と上記細胞の中に導入される上記遺伝子構築物の性質に適当なものであるように選択される。
【００６１】
形質転換のために有用な細胞系統には、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、酵母菌（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｓｃｈｎｃｉｄｅｒ細胞）、線形動物細胞（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、両生類動物細胞（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｏｏｃｙｔｅｓ）、げっ歯類動物細胞（例えば、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（例えば、マウス３Ｔ３線維芽細胞）、Ｒａｔｔｕｓ  ｒａｔｔｕｓ，チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１））、およびヒト細胞（例えば、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト胎児性腎細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞））が含まれる。これらとその他の多くの細胞の型が上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を産生する目的で形質転換することができるが、予備的な研究では、ＣＨＯ−Ｋ１とＨＥＫ−２９３細胞の形質転換は、チャネル電流のパッチクランプ測定により測定されるようには、検出可能なＣａｔＳｐｅｒ２活性を生じるという結果にはならないことが分かった。これら後者の細胞はＣａｔＳｐｅｒ２活性に必要とされる精子の中には存在しているコファクターあるいはアクセサリータンパク質、機能的チャネル組織のためには必要なものとされる構造的属性、あるいは必要とされるＣａｔＳｐｅｒ２翻訳後処理、あるいは局在化機構を欠いているようにみえる。酵母菌２ハイブリッドアプローチ法と共免疫沈降のアプローチは、ＣａｔＳｐｅｒ２活性のモジュレータを含むＣａｔＳｐｅｒ２アクセサリー、会合あるいは相互作用タンパク質を同定するためにライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。
【００６２】
適当な細胞を、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の融合タンパク質、あるいはＣａｔＳｐｅｒ２制御領域の制御下にあるマーカータンパク質を含むＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を産生するために上述の遺伝子構築物のいずれかにより形質転換することができる。
【００６３】
上記細胞は、形質転換されている上記細胞の型に適当なものであることが同業者には公知のものであるいずれかの方法により形質転換することができる。適当な諸方法には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ刊、ニューヨーク；とＤａｖｉｓら（１９８６），Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社刊が含まれる。特定の諸方法には、カルシウムリン酸共沈降法（Ｇｒａｈａｍら（１９７３），Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−４６７），培養細胞への直接マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｉ（１９８０），Ｃｅｌｌ２２：４７９−４８８），電気穿孔法（Ｓｈｉｇｅｋａｗａら（１９８８），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：７４２−７５１），リポソーム媒介遺伝子移入、（Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６８２−６９０），脂質媒介形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１７），核酸デリバリー高速微粒子銃（Ｋｅｉｎら（１９８７），Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０−７３）が含まれる。
（トランスジェニック動物）
本発明はまた野生型、対立遺伝子変異体、キメラあるいはアンチセンスＣａｔＳｐｅｒ２配列が発現される、あるいは、ＣａｔＳｐｅｒ２配列が不活性化あるいは欠失した（例えば、「ノックアウト」構築物）あるいは、リポーターあるいはマーカー遺伝子（例えば、「ノックインリホーター」構築物）トランスジェニック非ヒト動物モデルの生産が用意されている。上記ＣａｔＳｐｅｒ２配列は上記トランスジェニック動物に対して同種のもの（例えば、トランスジェニックマウスにおけるマウス配列）あるいは上記トランスジェニック動物に対して異種のものでありうる。こうしたトランスジェニック動物では、上記トランスジェニック配列は誘導可能に、構成的にまた、異所性に発現させることができる。発現は組織特異的なものかあるいは広範な組織的なものでありうる。ＣａｔＳｐｅ２遺伝子産物を正常には含有していない組織および細胞におけるＣａｔＳｐｅ２配列の遺伝子工学的な発現は、カチオン流入の新規な改変を引き起こすことができ、また、新規な細胞あるいは組織表現型につなげることができる。ＣａｔＳｐｅｒ２配列の発現の異所性あるいは改変レベルは細胞、組織および／または発生上の表現型を改変することができる。トランスジェニック動物は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性における欠陥から生じる障害のモデルとして有用である。
【００６４】
トランスジェニック動物はまた、ＣａｔＳｐｅｒ２活性に対するその効果に関して化合物をスクリーニングするためには有用である。リポーター構築物により形質転換されたトランスジェニック動物は、ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子およびインビボにおけるタンパク質の発現に対する小さな分子あるいは薬物あるいは物理的動揺の転写効果を測定するのに使用することができる。本発明の上記トランスジェニック動物は治療的有効性に関するこうした化合物をスクリーニングするのに使用することができる。
【００６５】
本発明の上記動物モデルに使用されるのに適当なものである動物種には、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、および非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル、チンパンジー）に限定されるわけではないが、それらが含まれる。初期の研究に関しては、トランスジェニックげっ歯（例えば、マウス）は、維持が比較的容易であり、また寿命が短いため、使用することができる。
【００６６】
本明細書の中で開示され、そうでない場合は有用なものとされる上記核酸を使用して、一つのトランスジェニック動物を作り出すいくつかの実施態様がある。このように有用な動物モデルには、（１）ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の少なくとも一つの機能的断片をコードする配列が、外因性かあるいは内因性プロモーターエレメントかのいずれかの制御下で、付加的な遺伝子として、また、ミニ遺伝子（すなわち、取り除いたイントロンによるｃＤＮＡに基づいた上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の遺伝子構築物）あるいは大きなゲノム断片として上記動物のゲノムの中に組み換え工学的に導入されている動物、（２）ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の少なくとも一つの機能的断片をコードする配列が相同性組み換えあるいは遺伝子標的により、上記動物の内因性ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の一つあるいは両方のコピーに組み換え工学的に置換されている動物、（３）上記動物の相同性ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝の一つの一つあるいは両方のコピーが相同性組み換えあるいは遺伝子標的により上記ヒト相同体をコードする配列の上記部分的置換により組み換え工学的に「ヒト化」されている動物、（４）リポーター遺伝子をコードする配列により相同性組み換えにより上記内因性ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子が置換されている動物、（５）上記動物のＣａｔＳｐｅｒ２配列の一つあるいは両方のコピーが、相同性組み換えにより一つあるいはそれ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、あるいは置換により部分的にあるいは完全に不活性化されている「ノックアウト」動物が含まれる。本発明のこうしたまたその他のトランスジェニック動物は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子および／またはタンパク質における欠陥から生じる不妊あるいはその他の障害のモデルとして有用である。こうした動物はまた、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子および／またはタンパク質に対するその効果に関して化合物をスクリーニングするために有用である。
【００６７】
動物モデル（例えば、トランスジェニックマウス）を産生するには、野生型あるいは対立遺伝子変異体ＣａｔＳｐｅｒ２配列あるいは野生型あるいはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つの機能的断片をコードする組み換え核酸の対立遺伝子変異体は、卵母細胞あるいは胚性幹細胞マイクロインジェクションあるいはこうした細胞の形質転換のその他の諸方法といった標準的な技術を使用して生殖系統あるいは幹細胞の中に挿入することができる。代替的には、成体（成人）から採取した他の細胞を用いることができる。こうしたあるいは同様のプロセスにより産生された動物はトランスジェニックと呼ばれる。同様に、それが、内因性ＣａｔＳｐｅｒ２配列をタ活性化するあるいは置換することが所望されている場合は、卵母細胞、胚性幹、あるいはその他の細胞を用いて相同性組み換えを用いることができる。こうしたあるいは土曜のプロセスにより産生された動物は、「ノックアウト」（不活性化）あるいは「ノックイン」（置換）モデルと呼ばれる。
【００６８】
卵母細胞インジェクションに関しては、本発明の上記組み換えＤＮＡ構築物の一つあるいはそれ以上のコピーを、ちょうど受精された卵母細胞の前核の中に挿入することができる。この卵母細胞はその後に偽妊娠育成母の中に再び移植される。生きて生まれた動物は、標準的なＤＮＡ／ｍＲＮＡ分析法（例えば、子孫マウスの尾部静脈から採取）を使用して、上記挿入された組み換えトランスジェニック配列の存在に関して構成要素に関してスクリーニングされる。上記導入遺伝子は、酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）の一部として、上記内因性プロモーターあるいは異種プロモーターかのいずれかによるｃＤＮＡとして、あるいは、最適な発現のために必要とされることが分かっている上記コード領域とその他のエレメントの全部を含むミニ遺伝子として、宿主の中に導入された完全なゲノム配列か、あるいはその他の染色体ＤＮＡ断片かのいずれかでありうる。
【００６９】
導入遺伝子を作り出すために、興味の対象となっている上記標的配列（例えば、ＣａｔＳｐｅｒ２配列の野生型あるいは対立遺伝子変異）は典型的には上記配列から採られたＲＮＡの発現を制御するようになるプロモーターの下流に位置しているクローニング部位の中に結合される。上記コード配列の下流では、典型的にはポリアデニル化配列がある。導入遺伝子を作り出す一つの代替的なアプローチは、上記導入遺伝子の発現を駆動するために外因性プロモーターおよび制御配列を使用することである。最終的には、その適当な制御配列とともに、所望される全体の遺伝子を含むＹＡＣなどの大きなゲノムＤＮＡ断片を使用して導入遺伝子を作り出すことが可能である。
【００７０】
動物モデルは、相同性組み換えに関して内因性ＣａｔＳｐｅｒ２配列を標的にすることにより作り出すことができる。こうした標的出来事はヒトの疾患あるいはそうでない場合は一つの異常な配列（例えば、下の動物配列よりもさらにヒト配列に似ている配列）（ノックイン動物モデル）と関連しているアミノ酸変化を作り出すために、内因性配列（ノックアウト）を取り除く、あるいは上記内因性配列を改変する効果を有することができる。非常に多くのベクターが、こうした変化を達成することが有用であり、また、マウスおよびその他の動物に関するゲノムＤＮＡの適当な資源とその他の動物は商業的に入手可能である（例えば、ＧｅｎｏｍｅＳｙｓｔｅｍ社、ミズーリ州セントルイス市）。
【００７１】
これら標的ベクター構築物の典型的な特徴はゲノムＤＮＡの２〜４ｋｂが５’末端で選択可能なマーカー（例えば、「ネオマイシンカセット」と呼ばれるそれ自体のプロモーターエレメントの下にある細菌ネオマイシン耐性遺伝子）に結合される。興味の対象となっている遺伝子から得られた第二ＤＮＡ断片はその後に、上記ネオマイシンカセットの下流、第二選択可能なマーカー（例えば、チミジンキナーゼ）の上流で結合される。上記ベクターの中に含められた配列のいずれか一つにより内因性配列の相同性置換により変異配列が上記標的動物の生殖系統の中に導入することが可能になるよう上記ＤＮＡ断片が選択される。代替的には、上記配列は、上記ネオマイシンカセットを取り囲む上記ベクターの左と右腕の間に正常であれば存在すると考えられる配列の欠失を引き起こすように選択することができる。前者はノックインとして公知のものであり、また、後者はノックアウトとして公知のものである。
【００７２】
初期胚もまた、本発明の上記組み換えＤＮＡ構築物を挿入するために感染させることができる。この方法では、上記導入遺伝子（例えば、ＣａｔＳｐｅｒ２配列の野生型あるいは対立遺伝子変異体）は、部分的にトランスジェニック動物を生成するために発生の初期段階の間に直接胚を感染させるのに使用されるウイルスあるいはレトロウイルスベクターの中に挿入される。上記部分的にトランスジェニック動物のある種のものは、生殖系統細胞の中に上記導入遺伝子を産出し、また、完全にトランスジェニック動物を産生するように育てることができる。
【００７３】
代替的には、幹細胞の集団を使用した相同性組み換えにより、成功裏に形質転換体に関して上記集団のスクリーニングを準備する。一旦同定されると、こうしたものは線維芽細胞の中に注入することができ、また、上記結果的に生まれた動物の割合は、上記導入遺伝子の生殖系統伝達を示すものとなる。これらの部分的なトランスジェニック動物は、完全なトランスジェニック動物を産生するために育てることができる。
【００７４】
相同性組み換えあるいは遺伝子標的のための技術だけではなくトランスジェニック動物の技術を生成する技術はいまでは広範に受け入れられ、また実施されている。上記マウス胚のマニュピレーションについての実験室マニュアルは例えば、トランスジェニックマウスの産生に関する標準的な実験室技術を詳細しているものであり、入手可能である（Ｈｏｇａｎら（１９８６），Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社刊，ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ市）。
（ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質とポリペプチド）
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の実質的に純粋な作成物を提供する。上記タンパク質は、本発明の抗体により免疫親和性生成などの標準的な技術を使用して、精細胞から分離することができ（以下を参照）、あるいは、そのタンパク質はさらに高いレベルで発現することができる、任意には、さらに容易に分離され、および／または生成される融合タンパク質として、本発明の上記形質転換された細胞から分離することができる。
【００７５】
いくつかの実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２コード領域の全翻訳配列から成る。こうした完全長ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の実施例には、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の対立遺伝子および非ヒト相同体とそれらの機能的等価物とともに、配列識別番号：2と配列識別番号：4として開示されている上記ヒトＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質と、配列識別番号：6として開示されている上記マウス相同体が含まれる。
【００７６】
他の実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質はＣａｔＳｐｅｒ２断片である。こうした断片には、上記タンパク質の上記膜貫通、ループとポア形成領域を含む、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の構造ドメインが含まれる。有用な構造ドメインには、それらの対立遺伝子変異体と非ヒト相同体とともに、上記ヒトＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の上記膜貫通ドメイン（すなわち、配列識別番号：２の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０；配列識別番号：４の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０；配列識別番号：６の近接残基１０２−１２４、１４４−１６４、１７４−１９３、２０４−２２７、２３９−２６０、３１４−３３８）、膜貫通ドメインの間にある細胞外ループ（すなわち、配列識別番号：２の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６３−３１５；配列識別番号：４の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６３−３１５；配列識別番号：６の近接残基１２５−１４３、１９４−２０３、２６１−３１３）、ポア領域（すなわち、配列識別番号：２の近接残基２８０−３０３；配列識別番号：４の近接残基２８０−３０３；配列識別番号：６の近接残基２７８−３０１）が含まれる。その他のＣａｔＳｐｅｒ２断片には、標準的な配列分析技術により同定されるように、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の潜在的に有用なエピトープが含まれる。したがって、例えば、有用なＣａｔＳｐｅｒ２断片には、以下のヒトＣａｔＳｐｅｒ２配列が含まれる。すなわち、配列識別番号：２の近接残基２６６−２７５、３８６−４００、４４７−４５８、４８２−４９４；配列識別番号：４の近接残基６６−９９、２６６−２７５、３９４−４１４；配列識別番号：６の近接残基６４−８９、２６４−２７５、５６２−５８８；である。
いくつかの実施態様では、ポリペプチドはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも構造ドメインに対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有する。このように、いくつかの実施態様では、ポリペプチドはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも膜貫通ドメインに対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有する（例えば、配列識別番号：２の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０；配列識別番号：４の近接残基１０４−１２６、１４６−１６６、１７６−１９５、２０６−２２８、２４１−２６２、３１６−３４０；配列識別番号：６の近接残基１０２−１２４、１４４−１６４、１７４−１９３、２０４−２２７、２３９−２６０、３１４−３３８とそれらの対立遺伝子変異体と相同体）、膜貫通ドメインの間にある細胞外ループ（例えば、配列識別番号：２の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６３−３１５；配列識別番号：４の近接残基１２７−１４５、１９６−２０５、２６３−３１５；配列識別番号：６の近接残基１２５−１４３、１９４−２０３、２６１−３１３とそれらの対立遺伝子変異体と相同体）、ポア領域（例えば、配列識別番号：２の近接残基２８０−３０３；配列識別番号：４の近接残基２８０−３０３；配列識別番号：６の近接残基２７８−３０１とそれらの対立遺伝子変異体と相同体）が含まれる。いくつかの実施態様では、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対して少なくとも８０％，８５％，９０％，あるいは９５％アミノ酸配列の同一性を有し、また、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を有するポリペプチドが提供される。ＣａｔＳｐｅｒ２活性を示すタンパク質の能力は、ＣａｔＳｐｅｒ２−／−変異体（例えば、ＣａｔＳｐｅｒ２ノックアウト変異体）を補足し、また、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を発現させることがそうでなければできる細胞内のＣａｔＳｐｅｒ２+／+表現型（例えば、精子の運動性を回復させるため）を回復させるその能力により測定することができる（例えば、上記ＣａｔＳｐｅｒ２−／−変異体から得られる精細胞）。
【００７７】
いくつかの実施態様では、本発明の上記ポリペプチドは、長さにして少なくとも５０アミノ酸残基、あるいは長さにして少なくとも１００，２００，あるいは３００アミノ酸残基のＣａｔＳｐｅｒ２配列が含まれる。これらポペプチドには少なくとも一つの膜貫通ドメイン、少なくとも一つの細胞外ループドメイン、少なくともポア領域あるいはそれらを組み合わせたものを含むＣａｔＳｐｅｒ２配列が含まれうる。いくつかの実施態様では、上記ポリペプチドはＣａｔＳｐｅｒ２活性を有する。こうした活性には細胞（例えば、卵母細胞）の中で発現される場合にイオン電流の誘導、ｃＡＭＰ誘導Ｃａ2+流入、ＣａｔＳｐｅｒ２−／−精子の中で発現される場合の精子運動性の回復、および／またはＣａｔＳｐｅｒ２−／−精子の中で発現される場合に卵を受精する能力の回復が含まれうる。
（ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質とポリペプチドに対する抗体）
もう一つの側面では、本発明は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対する抗体の実質的に純粋な作成物およびこうした抗体を作成する諸方法を提供する。上記抗体はポリクローナルあるいはモノクローナルでありうるものであり、また、同業者には周知のものである諸方法により作成することができる。特に、本発明は高い予測抗原性を有するＣａｔＳｐｅｒ２エピトープに対して立ち上げた抗体であって、したがってそれはそれによって、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の野生型および／または変異体形態を分離するかあるいは同定するために選択的に結合する抗体を提供する。
【００７８】
上記抗体は、上記完全長ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対して、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の断片に対して、あるいは上記タンパク質の特性であり、また、実質的に他のタンパク質からそれらを区別しているいずれかのＣａｔＳｐｅｒ２エピトープを用いて立ち上げることができる。いくつかの実施態様では、上記抗体は配列識別番号：２の近接残基２６６−２７５、３８６−４００、４４７−４５８、４８２−４９４；配列識別番号：４の近接残基６６−９９、２６６−２７５、３９４−４１４、配列識別番号：６の近接残基６４−８９、２６２−２７５、５６２−５８８、に限定されるわけではないが、それらが含まれる。他の有用なエピトープには、それらエピトープの対立遺伝子および非ヒト相同体が含まれる。高い予測抗原性を有するエピトープは、ＧＣＧとＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ市）を含む標準的プログラムを使用して疎水性、表面確率と、抗原指標を予測することにより同定された。
【００７９】
ＣａｔＳｐｅｒ２免疫原作成物は粗抽出物（例えば、上記タンパク質を発現させる細胞のミクロソーム分画）から、天然であるいは組み換え的にそれを発現する細胞から実質的に精製されたタンパク質失あるいはペプチドから、あるいは小さな免疫原に関しては、化学的ペプチド合成により作り出すことができる。上記ＣａｔＳｐｅｒ２免疫原はまた、上記非ＣａｔＳｐｅｒ２部分は、精製を容易にする（例えば、ポリヒスチジン）そのアジュバント特性および／またはその能力に対して選択される融合タンパク質の形態にすることが可能である。
【００８０】
本発明の上記抗体はポリクローナルあるいはモノクローナル、あるいは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、および一本鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖ）を含む抗体断片でありうる。さらに、本発明の本方法により有用な抗体を同定した後、組み換え抗体は、非ヒト抗体から上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に基づくキメラおよび／またはヒト化抗体だけではなく、上記に挙げられている抗体断片のいずれかを含む組み換え抗体を生成することができる。ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質だけではなく、本明細書で可能なものとなっているその他のＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の特徴付けの本開示に照らして、同業者であれば、さまざまな標準的な手段のいずれかより上述されている抗体を作り出すことができる。抗体技術の総見については、Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ編“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，第2版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ刊，Ｏｘｆｏｒｄ市（１９５５）を参照。
【００８１】
一般的な事柄として、モノクローナル抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体はまずマウス、ウサギ、ヤギあるいはその他の適当な動物に適当なキャリアーあるいは希釈剤に入れたＣａｔＳｐｅｒ２免疫原を注射することにより作り出すことができる。キャリアータンパク質あるいはアジュバントを使用することができ、また、追加免疫注入（例えば、8〜10週にわたって週2あるいは3回投与）を必要である場合は用いることができる。体液性の反応の現像を用意した後、上記動物が犠牲にされてその脾臓が取り出され、また、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）の中に懸濁される。上記脾臓細胞は、リンパ球の一つの資源として役立たせて、そのうちのあるもので上記適当な特異性を有する抗体を作り出すことになる。これら細胞はその後固定細胞系統（例えば、ミエローマ）と融合され、また、上記融合の産物は選択性薬物（例えば、ＨＡＴ）の存在下で組織培養ウェルの中に置かれる。上記ウェルは連続的にスクリーニングされ、また、再度置きなおされ、その度に有用な抗体を作る細胞を選択する。典型的には、いくつかのスクリーニングと再戴置手順が上記ウェルが抗体産生に対して肯定的である単クローンを含むようになるまで実施される。こうしたクローンにより産生されたモノクローナル抗体は、イオン交換クロマトグラフィにより、あるいはこれら技術のさまざまなものおよびそれら技術の組み合わせにより、タンパク質Ａセファロースを使用して親和性クロマトグラフィなどの標準的諸方法により精製することができる。
【００８２】
本発明の上記抗体はさまざまな適用において使用することができる。例えば、抗体は、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の存在あるいは値を検出するのにアッセイの中でＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に関して、あるいは形質転換細胞（例えば、ＣａｔＳｐｅｒ２発現の制御因子に対するアッセイの中で、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を発現させる細胞を同定するウェスタンブロット法の中で、あるいはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の細胞あるいは細胞外位置を確定する免疫細胞化学あるいは免疫蛍光技術の中で）におけるＣａｔＳｐｅｒ２発現の存在あるいは値を測定するアッセイの中で精製プロセスにおいて使用することができる（例えば、免疫親和性精製）。
【００８３】
本発明の上記抗体は診断および／または治療的使用方法について、その他の化合物あるいは材料に結合される、あるいは共役させることができる。例えば、それらは、放射性核種、蛍光化合物（例えば、ローダミン）あるいは画像診断あるいは治療のための酵素などの標識に結合させることができる。上記標識は上記抗体に対して共有結合的に、あるいは非競合結合的に結合させることができる。
【００８４】
もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも一つのエピトープを検出するためのキットを提供する。上記キットには、一つの抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体と上記抗体を検出するための一つの手段が含まれる。上記抗体を検出するための上記手段は、上記抗体かあるいは上記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体を検出するための二次抗体かに結合される検出可能な標識でありうる（例えば、ウサギ抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体を検出するための二次抗体としての標識化ヤギ抗ウサギＩｇ抗体）。
（ＣａｔＳｐｅｒ２発現あるいは活性のモジュレータに対するアッセイ）
もう一つの側面では、本発明は、ＣａｔＳｐｅｒ２発現あるいは活性のモジュレータに対するアッセイを提供する。上記モジュレータは上記転写、翻訳、翻訳後処理、局在化、あるいは、ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子および／またはタンパク質の活性に影響を及ぼすことができる。
【００８５】
このようにして、実施態様の一つのシリーズにおいて、本発明の上記形質転換細胞は一つの候補化合物と接触させ、また、ＣａｔＳｐｅｒ２の発現あるいは活性に対する上記化合物の効果が測定される。一般的な事柄として、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質を発現させる細胞と候補化合物を接触されるステップと、上記細胞においてＣａｔＳｐｅｒ２活性の指標を測定するステップを上記分析は必要としている。上記指標は転写（例えば、ｍＲＮＡ値）、翻訳（例えば、タンパク質の値）、翻訳後処理（例えば、特異的グリコシル化）、局在化（例えば、免疫組織化学）あるいは活性（例えば、ナトリウムあるいはその他の一価イオンフラックス;カルシウムあるいはその他の二価イオンフラックス）の指標でありうるものである。上記指標測定はその後に上記候補化合物は指標における増減の原因となったかどうかを測定するために一つの基準値に比較される。上記基準値は外因性(例えば、所定のベースライン値)、あるいは内因性(例えば、上記候補化合物と接触させるより前に行った同じ細胞の測定値)のものでありうる。増あるいは減が有意なものである場合は(一つあるいはそれ以上の細胞から単回かあるいは複数回読み込む)、上記候補化合物は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性の潜在的なモジュレータとして同定される。ＣａｔＳｐｅｒ２活性における変化に対する分析には、その他の遺伝子に関して、同業者であれば、日常的に使用されているそうしたもののうちいずれかのものを含めることができる。例えば、ＣａｔＳｐｅｒ２  ｍＲＮＡあるいはタンパク質の存在あるいは値における変化は、ＣａｔＳｐｅｒ２発現のエンハンサー、リプレッサーを同定するために検出することができる。代替的には、本発明のリポーター遺伝子構築物を使用する際には、上記リポーターの上記生化学、あるいは表現型変化特性が、上記候補化合物がリポーター遺伝子発現を促進するあるいは抑制する指標として使用することができる。他の実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の活性における変化は、例えば、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質により媒介されたカチオンの上記フラックスを測定することにより、あるいは全細胞、あるいはチャネル電流を測定することにより、検出することができる。イオンフラックスの測定は、特異的イオンの集中により、色を変化させる発色団を使用することにより容易なものとすることができる。成熟精細胞に対する候補化合物の効果は、本発明の上記形質転換において得られた結果を確定するあるいは評価するためにテストを実施することができる。
【００８６】
ＣａｔＳｐｅｒ２に結合する化合物は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を調節するための候補となる。したがって、実施態様のもう一つのシリーズでは、化合物のライブラリーは、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質、あるいはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも構造ドメインにより候補化合物と接触させることによりＣａｔＳｐｅｒ２活性を調節するために候補を同定するために、ＣａｔＳｐｅｒ２に結合する化合物を同定するために、スクリーニングすることができる。これら諸方法において使用することができるＣａｔＳｐｅｒ２構造ドメインには、膜貫通ドメイン、特に細胞外ループと、ポア領域が含まれる。こうした方法においては、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質あるいはＣａｔＳｐｅｒ２構造ドメインは固定することができ（例えば、カラムあるいは微粒子）、上記候補化合物の溶液は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２部分と接触させることができる。代替的には、いくつかの実施態様では、上記候補化合物も上記ＣａｔＳｐｅｒ２部分も固定されることはないが、しかしそれよりも、両方は溶液中に入れ、結合は、例えば、上記結合パートナーを帯びている粒子の凝集により検出される。結合は同業者には周知のものである諸方法により検出することができる（例えば、上記潜在的な結合対の一つの成分の放射性あるいは蛍光標識；結合のプラズモン共鳴検出；凝集分析における混濁度）。生理学的条件（例えば、精巣、精巣上体内あるいは膣、子宮、輸卵管内）下でのＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質に対する有意な結合（例えば、Ｋ4・１０μＭ）を示す化合物はＣａｔＳｐｅｒ２活性の潜在的なモジュレータである。
（受精を調節する諸方法）
上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子とタンパク質は潜在的な避妊薬剤として理想的な標的となっている。上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質は精子の鞭毛において発現されるため、ＣａｔＳｐｅｒ２の特異的なブロッカーにより、精子の運動性を阻害することができ、またしたがって、いずれの性によっても使用する際に避妊薬として効果的なものとなりうる。精子および精子形成細胞へのＣａｔＳｐｅｒ２の局在化が制限されているということは、特異的なブロッカーはその他の組織には影響を及ぼすべきものではなく、またしたがって、副作用は低いものあるいは存在しないものであるべきであるという意味である。最終的には、新規な構造を上記チャネルが提示するため、それは新しいチャネルアゴニストあるいはアンタゴニストにとっては非常に良好な標的となりうる。
したがって、もう一つの側面では、本発明はＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子あるいはタンパク質の発現あるいは活性を減少させることにより、受精を減少させる諸方法を提供する。発現あるいは活性におけるこうした減少は、ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の発現を抑圧する小さな分子という手段により、ＣａｔＳｐｅｒ２  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンス分子という手段により、ＣａｔＳｐｅｒ２翻訳あるいは翻訳後処理に干渉する小さな分子という手段により、ＣａｔＳｐｅｒ２局在化に干渉する小さな分子という手段により、イオンチャネルとしてＣａｔＳｐｅｒ２活性をブロックする分子という手段により、あるいはＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の発現を減少させる、あるいはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質壊変を促進するその他の分子により達成することができる。ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質あるいはポリペプチドに特異的に結合するＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）2あるいはＦｖ断片および一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）断片を含む抗体もまた、上記タンパク質の細胞外ドメインに結合することにより、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を阻害するのに使用することができ、またそれによってその活性をブロックすることができる。
【００８７】
ＣａｔＳｐｅｒ２発現あるいは活性のリプレッサーあるいはアンタゴニストは、可逆的なものであるか、あるいは単に成熟精子のみに影響を及ぼすかであるため、受精に対するこうした化合物の効果は、上記分子は長時間が経過すると体から一掃され、また、新しい精子が常に賛成されるので、可逆的なものである。したがって、ＣａｔＳｐｅｒ２発現あるいは活性のリプレッサーあるいはアンタゴニストは、それらが可逆的に避妊を引き起こすことができるため、ヒトの避妊薬として使用することができる。こうした避妊薬は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性を効果的に阻害し、それによって精子の運動性あるいは上記ＺＰを貫通する精子の能力を減少するためにそれらが膣、子宮、あるいは輸卵管で十分な濃度に達すれば、経口的に、あるいは非経口的に女性により摂取することができる。同様に、こうした避妊薬は、それらが精巣あるいは精液においてＣａｔＳｐｅｒ２発現あるいは活性を効果的に阻害するように十分な濃度に達すれば男性により経口的に、あるいは非経口的に摂取することができ、またそれによって精子の運動性あるいは上記ＺＰを貫通する精子の能力を減少させることができる。代替的には、こうした化合物は、予防薬、頚部キャップ、あるいは避妊膣スポンジ、発泡剤、あるいはゼリーとともに使用するため潤滑剤、加湿剤、発泡剤、あるいはゼリーに製剤化することができる。
【００８８】
実施態様のもう一つのシリーズでは、ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子とタンパク質のリプレーサーあるいはアンタゴニストは、非ヒト哺乳動物を治療するため避妊薬として使用することができる。こうした実施態様は上記に記載されているものと同様である。こうした避妊薬はペットとして保有されている家畜化動物に対して、商業的に価値のある家畜化動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ウマ）に対して、あるいは、有害動物（例えば、マウス、ラット、アライグマ、ホリネズミ）に対して使用することができる。いくつかの実施態様では、上記避妊薬は経口的に有用であり、また、上記動物に関して食物資源の中に混合することができる。他の実施態様では、上記避妊薬は、非経口的に投与することができる（例えば、注入、経皮的パッチ、あるいは生物学的に腐食可能なインプラント）。
【００８９】
上記哺乳動物ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子とタンパク質と、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子とタンパク質の魚、両生類と昆虫相同体が実質的な配列同一性を共有する程度まで、哺乳動物ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子とタンパク質のリプレッサーあるいはアンタゴニストもまた魚、両生類および有害昆虫（例えば、カ）の制御に使用することができる。さらに、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子の上記非哺乳動物相同体とタンパク質は、こうした相同体に対してさらに特異的であるかあるいは効果的である付加的なリプレッサーとアンタゴニストを同定するのに使用することができる。
（ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子型決定およびＣａｔＳｐｅｒ２関連障害を診断する諸方法）
もう一つの側面では、本発明は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子に関して対象者の遺伝子型を判定し、また、不妊などのＣａｔＳｐｅｒ２関連障害を診断するための方法を提供する。したがって、例えば、対象者の上記ＣａｔＳｐｅｒ２核酸（あるいはその部分）は、対象者のＣａｔＳｐｅｒ２遺伝型に野生型に関して上記配列にある何らかの変異が含まれているかどうかを確かめるためにテストすることができる。特定の有意性のものについては、機能的ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の産生を予防する終結あるいはフレームシフト変異を導入する変異であると考えられる。しかし、減少ＣａｔＳｐｅｒ２活性を引き起こす点変異もまた同定することができる。同様に、本発明の上記抗体はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の存在あるいは値を測定するために対象者の精子をテストするのに使用することができる。特定の注意点については、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の値において存在しないあるいは有意に減少していることであると考えられる。しかし、点変異はまた、不妊を引き起こすことができ
また、上記変異配列を含めるかあるいはそれら変異配列により影響を受けるエピトープに対して特異的なものである抗体により検出することができる。対象者のＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子型の測定は遺伝子あるいは生殖カウンセリングを行うために、ＣａｔＳｐｅｒ２欠陥から結果的に生じる不妊を診断するために使用することができる。
【００９０】
対象者のＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子型を測定するために、あるいはＣａｔＳｐｅｒ２関連障害を診断するために、本発明の上記核酸は、上記対象者のＤＮＡ／ｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、アンカーＰＣＲあるいはＲＡＣＥ  ＰＣＲ），あるいはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅においてプライマーとして使用することができる。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号と、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０；Ｎａｋａｚａｗａら（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３６０−３６４；Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照されたい。本発明の上記核酸を使用して対象者のＤＮＡ／ｍＲＮＡを増幅するためのその他の有用な諸方法には、自己持続性配列複製（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１７３−１１７７）、およびＱ−β複製をベースにした系（例えば、Ｌｉｚａｒｄら（１９８８），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１１９７）が含まれる。上記結果的に生じた増幅産物の有無あるいは大きさ（例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６２３０；Ｇｉｂｂｓら（１９８９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７；２４３７−２４４８；Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３），Ｔｉｂｔｅｃｈ１１：２３８；Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ６：１；Ｂａｒａｎｙ（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８９），上記増幅産物の直接配列（例えば、ＭａｘｉｍとＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５６０；Ｓａｎｇｅｒ（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３）とその他の標準的な分析技術は、ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子型を判定するために用いることができる。上記増幅産物はまた、以下に説明した技術の多くにおいて使用することができる。
【００９１】
本発明の上記核酸もまた、対象者において相補的であり、あるいは不完全に相補的な配列を同定するためにハイブリダイゼーションおよび／またはコンホメーションをベースにしたアッセイにおいてプローブとして使用することができる。
【００９２】
例えば、いくつかの実施態様では、変異は固定化された対照核酸にサンプル核酸が選択的にハイブリダイズされることにより同定することができる。上記対照はフィルターあるいはカラムに吸収させることができ、あるいは数百あるいは数千というオリゴヌクレオチドプローブを含む高い密度オーダーのアレイの中に配置することができる（例えば、Ｃｒｏｎｉら（１９９６），Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２：７５３−７５９）。
【００９３】
他の実施態様では、酵素あるいは化学的切断は不適性塩基でサンプルと対照配列の二重鎖を切断するあるいは制限するのに用いることができる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１２４２）。例えば、ＲＮＡ／ＤＡＮ二重鎖は、ＲＮＡｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）により処理することができ；ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは不適性塩基で二重鎖を消化するようにＳ１ヌクレアーゼにより処理することができ；Ｇ／Ｔミスマッチは上記ヒトチミジンＤＮＡグリコシル化によりＴで切断される（例えば、Ｈｓｕら（１９９４），Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１５：１６５７−１６６２を参照のこと）。ミスマッチの化学的切断は、例えば、ヒドロキシルアミン、四酸化オスミウムおよび／またはピペラジンを使用して用いることができる。一般的には、例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５；および米国特許第５，４５９，０３９号を参照されたい。
【００９４】
他の実施態様では、変異は制限酵素あるいはリボザイムに対する切断点として役に立つ特異的配列を作り出すあるいは破壊することができる。したがって、（増幅）サンプルＤＮＡが少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼにより消化される制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析を用いることができ、また、その結果生じた断片の長さが部席され、制限断片の長さのパターンに影響を与える変異の有無を判定するために対照と比較される。同様に、配列特異的リボザイムは、リボザイム切断部位を作り出すあるいは破壊する変異を同定するのに使用することができる。これについては、米国特許第５，４９８，５３１号を参照されたい。
【００９５】
他の実施態様では、変異は、一本鎖核酸としてあるいは二本鎖としてかのいずれかで、配列の電気泳動的な運動性に対するその効果により検出することができる。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）分析（Ｏｒｉｔａら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３），Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２），Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９；Ｋｅｅｎら（１９９１），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５），変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓら（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ３１３：４９５），温度勾配ゲル電気泳動（ＲｏｓｅｎｂａｕｍとＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７），Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３）は用いることができる。
【００９６】
上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子とタンパク質における変異を検出するこれらと他の諸方法は、本明細書において開示された上記核酸とタンパク質配列に基づいて同業者には明らかなものとなる。
（インビトロ受精）
もう一つの側面では、本発明は、減少させたＣａｔＳｐｅｒ２発現あるいは活性により特徴付けられた精子により卵子のインビトロ受精の方法を提供する。鞭毛におけるＣａｔＳｐｅｒ２の役割のため、ＣａｔＳｐｅｒ２欠損性精子は、その運動性が損なわれ、またしたがって、卵子を受精させる能力もまた損なわれる。特に、適当な鞭毛機能は、受精のために透明帯（ＺＰ）を貫通するのに精子には必要とされるものである（Ｒｅｎら（２００１），同上）。したがって、本発明は、こうした男性の精子が上記ＣａｔＳｐｅｒ２欠損を克服するために治療される、あるいは上記ＺＰが取り除かれた卵子と接触させられるＣａｔＳｐｅｒ２欠陥男性のためのインビトロ受精の一つの方法を提供する。他の遺伝子欠損は上記ＺＰを貫通することが不可能である精子を結果的に生じることができるため、この方法は、精子の運動性あるいはＺＰ貫通に影響を及ぼす遺伝子欠損を有する、あるいは無傷のＺＰによりインビトロ受精を以前に成功させた他の男性に敷衍することができる。
（ＣａｔＳｐｅｒ２媒介不妊を治療する諸方法）
もう一つの側面では、本発明は、ＣａｔＳｐｅｒ２発現のエンハンサー、あるいはＣａｔＳｐｅｒ２活性のアゴニストが上記対象者に投与される、ＣａｔＳｐｅｒ２欠損男性において不妊を治療する諸方法を提供する。他の実施態様では、遺伝子あるいはタンパク質治療が、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子あるいはタンパク質において欠損される精子（あるいは精子前駆体）に上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子あるいはタンパク質を提供するために用いることができる。遺伝子治療に関しては、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質をコードする遺伝子構築物は、上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子あるいはタンパク質において欠損している精子あるいは精子前駆体の中にあるＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の発現を引き起こすために用いることができる。交尾対（例えば、ヒトのカップル）の不妊症は上記男性の精子上に存在している抗原に対して上記女性により生成された抗体から結果的に生じさせることができる。いくつかのケースでは、上記抗体はＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質のエピトープに対して方向付けることができる。したがって、本発明はまた、女性尿生殖路の中に存在している抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体により引き起こされる抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体媒介不妊を診断する諸方法を提供する。上記諸方法には、上記女性に存在している抗体のサンプルを得るステップと、ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質あるいはＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の断片に上記抗体を接触させるステップとが含まれる。いくつかの実施態様では、上記ＣａｔＳｐｅｒ２断片は、高い予測抗原性を有する上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質のエピトープである（例えば、配列識別番号：２の近接残基２６６−２７５、３８６−４００、４４７−４５８、４８２−４９４；配列識別番号：４の近接残基６６−９９、２６６−２７５、３９４−４１４；配列識別番号：６の近接残基６４−８９、２６４−２７５、５６２−５８８；およびそれらの対立遺伝子と哺乳動物相同体）。これら諸方法において、上記女性の抗体あるいは上記ＣａｔＳｐｅ２タンパク質／断片は任意には、固定することができ、また、上記女性の抗体あるいは上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質／断片は任意には上記抗体と上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質／断片の間にある結合の検出を容易にするために検出可能に標識化することが可能である。
【００９７】
これらのケースでは、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質のあるいは当該エピトープを含む上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質の少なくとも断片の過剰量を投与することは、上記女性の尿生殖路に存在している上記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体の結合部位を飽和することができ、またそれによって上記抗体媒介不妊を阻害あるいは減少させる。代替的には、抗イディオタイプ抗体（すなわち、定義された特異性を備えた別の抗体の可変領域に特異的に結合する抗体）を用いることができる。すなわち、抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体に特異的に結合する抗体は、上記女性の尿生殖路の中に存在している上記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体を阻害するのに用いることができ、またそれによって上記抗体媒介不妊を阻害するあるいは減少させる。同業者であれば、こうした女性の交代により認識される当該ＣａｔＳｐｅｒ２エピトープを容易に同定することができ、また、標準的な手段により当該エピトープあるいは抗イディオタイプ抗体の実質的に純粋な作成物を産生することができる。したがって、本発明はまた、女性の尿生殖路の中に存在している抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体により引き起こされる抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体媒介不妊症を処理するための諸方法を提供する。上記諸方法には、当該ＣａｔＳｐｅｒ２エピトープの分量、あるいは上記抗ＣａｔＳｐｅｒ２抗体を阻害するのに効果的な抗イディオタイプ抗体の分量を上記女性の尿生殖路の中に投与するステップが含まれ、またそれによって上記抗体媒介不妊症を阻害するあるいは減少させる。
（ＣａｔＳｐｅｒ２に関するビジネスの諸方法）
もう一つの側面では、本発明は本発明の上記分析により、ＣａｔＳｐｅｒ２活性をアンタゴナイズする一つあるいはそれ以上の薬剤を同定するステップと、こうした分析で同定された薬剤あるいはこうした薬剤の類似体が精子運動性あるいは卵の貫通性の少なくとも一つを阻害するかどうかを判定するステップと、一つあるいはそれ以上の動物モデルにおける効果および毒性に関してアンタゴニストとして同定された薬剤の治療的プロフィールを実施するステップと、受け入れ可能な治療上のプロフィールを有するように同定された一つあるいはそれ以上のアンタゴニスト薬剤を含む製薬調製剤を製剤化するステップと、からなる薬剤ディスカバリービジネスを実施する一つの方法を提供する。
【００９８】
一つの実施態様では、上記薬剤ディスカバリービジネスにはさらに、販売のために上記製薬調製剤を配布するための一つのシステムを確立するステップが含まれ、また、上記製薬調製剤の市場調査を行うための販売グループを確立することを任意に含めることができる。
【００９９】
もう一つの側面では、本発明は、ＣａｔＳｐｅｒ２活性をアゴナイズする一つあるいはそれ以上の薬剤を上記対象者分析により同定するステップと、こうした分析あるいはこうした薬剤の類似体の中で同定した薬剤が精子の運動性あるいは卵貫通性の少なくともひとつを増加させるかどうかを判定するステップと、一つあるいはそれ以上の動物モデルにおける効果および毒性に関して一つのアゴニストとして同定される薬剤の治療上のプロフィールを実施するステップと、受け入れ可能な治療上のプロフィールを有するように同定された一つあるいはそれ以上の薬剤を含む製薬調製剤を製剤化するステップと、から成る薬剤ディスカバリービジネスを実施する一つの方法を提供する。
【０１００】
特定の実施態様では、上記薬剤ディスカバリービジネスにはさらに販売のために上記製薬調製剤を配布するための一つのシステムを確立するステップが含まれ、また、任意には、上記製薬調製剤の市場調査を行うための販売グループを確立するステップを含めることができる。
【０１０１】
特定の実施態様では、ＣａｔＳｐｅｒ２活性をアゴナイズする薬剤を同定するための上記分析が野生型ＣａｔＳｐｅｒ２を使用して実施される。もう一つの実施態様では、ＣａｔＳｐｅｒ２活性をアゴナイズする薬剤を同定するための上記分析が変異ＣａｔＳｐｅｒ２を使用して実施される。「変異体ＣａｔＳｐｅｒ２」は、一つあるいはそれ以上のアミノ酸挿片、欠失片、あるいは置換片を含むＣａｔＳｐｅｒ２ポリペプチドを意味しそこでは、上記挿入片、欠失片、あるいは置換片が野生型ＣａｔＳｐｅｒ２に比較して上記変異体ＣａｔＳｐｅｒ２の上記アミノ酸配列と活性を変化させる。活性におけるこうした変化には運動性、卵貫通性、あるいはカチオン輸送における変化に限定されるわけではないが、それらが含まれる。活性における変化にはまた、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質あるいはｍＲＮＡの適当な局在化あるいは発現における変化が含まれる。
【０１０２】
さらにもう一つの側面では、本発明は、男性患者から採取した精子サンプルを調べるステップであって、前記患者は受精問題を経験していることを特徴とし、上記精子は、運動性における減少あるいは卵の貫通性における減少のうちの少なくとも一つにより特徴付けられるかどうかを判定するステップと、精子の運動性あるいは卵の貫通性のうちの少なくともひとつを増加させる際にＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストの効果を判定するためにインビトロ分析を実施するステップと、精子の運動性あるいは卵の貫通性のうちの少なくとも一つを上記男性から採取した精子により増加させるために効果的なＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストの用量を投与するステップから成る治療処方を確立するステップと、から成る生殖医学ビジネスを実施する一つの方法を提供する。
【０１０３】
特定の実施態様では、上記方法にはさらに、上記男性の患者が、受精能力における改善を評価するために医師によりモニターされるステップが含まれる。こうした評価には、精子の運動性あるいは卵の貫通性の一つあるいはそれ以上における改善を測定するために治療の開始の後に定間隔で精子の検査を含めることができる。上記治療している医師によるフォローアップ評価の頻度は、上記医師あるいは訓練を受けた保健ケア供給者により決定される。考慮しなければならない因子は、男性の患者が子孫をもうけることを試みている場合のその切迫度だけではなく、上記患者のスケジュールや快適さのレベルである。代表的なフォローアップのアポイントメントは、週単位で、週の半分の単位で、あるいは月単位で実施することができる。もう一つの実施態様では、上記方法にはさらに、上記患者に課金するあるいは上記患者の保険供給者に課金するステップが含められる。上記患者の健康保険が上記受精治療の全部あるいは一部に対して支払われている場合には、上記健康保険供給者の政策がフォローアップのアポイントメントの頻度に影響を及ぼす可能性がある。
【０１０４】
さらにもう一つの側面では、本発明は、薬剤ディスカバリービジネスの上記諸方法により発見された製薬調製剤を提供するステップであって、上記調製剤は、ＣａｔＳｐｅｒ２の活性を阻害するが、上記ステップと、ＣａｔＳｐｅｒ２の活性を阻害するために効果的な上記製薬調製剤の用量の投与を関する医師および健康保険供給者に指示を供給するステップであって、上記効果的な用量が妊娠を防ぐために十分なものである上記ステップと、から成る避妊医療ビジネスを実施するための一つの方法を提供する。
【０１０５】
一つの実施態様では、上記方法にはさらに、販売のために上記製薬調製剤を配布するための一つのシステムを確立するステップと、上記製薬調製剤の市場調査を実施するために販売グループを確立するステップが任意には含まれる。
【０１０６】
ＣａｔＳｐｅｒ２はカチオンチャネルをコード化する。カチオンチャネルの非常に多くの型が、心臓機能の制御を含む細胞プロセス（例えば、カルシウムチャネル）では非常に重要な役割を果たす。したがって、カチオンチャネルの活性を増加させるかあるいは減少させるかのいずれかを行う薬剤の投与法を採用する諸方法の非常なる限定により、こうした諸方法には実質的な副作用を有する可能性がある。しかしながら、本明細書において供給された結果は精子の中でＣａｔＳｐｅｒ２が特異的に発現されることを示している。したがって、ＣａｔＳｐｅｒ２の活性を選択的に増加させるかあるいは減少させる薬剤は、一般的なカチオンチャネルアンタゴニストおよびアゴニストか、あるいは上記体の中で広範にさらに発現されるカチオンチャネルのアンタゴニストおよびアゴニストかのいずれかに関連している副作用を引き起こさずに、患者に投与するこができる。
【０１０７】
薬剤ディスカバリービジネスにより、ＣａｔＳｐｅｒ２の活性をアンタゴナイズすることができる一つあるいはそれ以上の薬剤を同定することができる。上記活性をアンタゴナイズすることにより、ＣａｔＳｐｅｒ２の活性を全体的にあるいは部分的に減少させるという意味である。活性におけるこうした減少は、精子の運動性、卵の貫通性、あるいはカチオンの輸送のうちの少なくとも一つを検査することにより測定することができる。減少させるという用語とアンタゴナイズという用語は、相互交換可能に使用されることになる。
【０１０８】
特定の実施態様では、当初に同定されたＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストあるいはアンタゴニストは、例えば、効力と活性が維持されるが、しかし、溶解度、浸透度、バイオアベイラビリティ（生物学的利用能）、毒性、変異原性、薬理動態（例えば、吸収、分布、代謝、排出）を含む重量な薬理学的特性とのバランスをとるために、鉛化合物の構造をさらに精製するよう、さらに鉛の最適化を受けさせることができる。構造的な修飾はこうした薬理学的なパラメータに関する問題と取り組むために鉛化合物に対して行われる。しかし、こうした修飾は上記分子の効力と活性に対する考えうる効果を考慮に入れなければならない。例えば、一つの鉛化合物の溶解度が貧弱である場合は、変化は溶解度を改善する努力の中で上記分子に対して行うことができる。すなわち、これら修飾はしかしながら、上記分子の効力と活性にマイナスに影響を与えることができる。構造−活性関係（ＳＡＲ）データはその後に効力と活性における変更の効果を測定するために使用される。構造的修飾とＳＡＲ（構造−活性関係）データの反復性プロセスを用いて、バランスはこれら薬理学的パラメータと、上記化合物の上記効力と活性との間で作り出される。
【０１０９】
候補アンタゴニストあるいはそれらを組み合わせたものはその後に、動物モデルにおいて効果と毒性に関してテストしなければならない。こうした治療上のプロフィール作成は製薬業界では一般的に用いられている。ヒトにおける実験的な薬剤をテストする前に、敷衍的な治療用プロフィール作成（例えば、前臨床試験）は、安全性と効果に関して初期パラメータ確立を完了しなければならない。前臨床試験はインビトロにて（すなわち、試験管、ビーカー、ペトリ皿、その他において）行われた研究調査により薬剤、その生物学的利用能、吸収、分布、代謝および排出に関する作用の機構を確立する。動物による研究調査は、所望された結果を上記薬剤が提供するかどうかを評価するのに使用される。上記実験的な薬剤のさまざまな投与量のものが上記薬剤の効果をテストするために、起こりうる有害な副作用を同定し、また、毒性を評価するために投与される。
【０１１０】
手短に言うと、一つの薬剤をベースとしたスクリーニングにおいてＣａｔＳｐｅｒ２活性をアンタゴナイズする一つの候補薬剤の同定は、一つの避妊薬として有用な製薬調製剤を開発する際の第１ステップである。成功裏に妊娠を防ぐのに（すなわち、有用な避妊薬剤として作用するように）効果的な上記製薬調製剤の用量の投与は安全でありかつ効果的であるという両方でなければならない。製薬業界では日常的に用いられる初期段階の薬剤治験は潜在的な製薬の安全性と効き目という問題に取り組む手助けをする。ＣａｔＳｐｅｒ２アンタゴニストの特定のケースでは、上記製薬調製剤の効き目は、マウスあるいはラットモデルにおいて容易に評価することができる。手短に言うと、雄マウスにはさまざまな時間スケジュール上で上記製薬調製剤のさまざまな投与量を投与することができる。対照雄マウスはプラセボを投与することができる（例えば、キャリアーあるいは賦形剤単独で）。上記雄マウスはその後に雌マウスと一緒に上記雄マウスをケージに入れることにより自由に交尾させることができ、時間に対する受精の割合を測定することができる。受胎調節の現在入手可能な形態の効き目が与えられるとすると、効果的な避妊は妊娠を防ぐのに少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，９９％あるいは９９％以上効果があって然るべきである。
【０１１１】
一つの実施態様では、治療用プロフィール作成という上記ステップには細胞培養培地と動物において化合物の毒性テスト、薬理動態の分析と上記候補薬剤の代謝、疾患の動物モデルにおける効き目の測定が含まれる。ある特定の例では、上記方法には効き目、安全性と薬理動態プロフィールをベースにしたＳＡＲ（構造−活性関係）分析と、鉛構造最適化とを含めることができる。こうしたステップの目標は米国ＦＤＡ（食品医薬品局）に関する調査段階新薬（“ＩＮＤ”）適用、および／またはヒト臨床治:験前に同様の規制関係機関に関する同様の適用の申請につながる前臨床研究調査に対する薬剤候補の選択である。
【０１１２】
鉛最適化と治療用プロフィール作成との間にあって、上記対象とする方法の一つの目標は、最小限の副作用を有するＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストあるはいアンタゴニストを開発することである。アンタゴニストの場合は、上記鉛化合物は血管拡張（すなわち、眩暈、低血圧、頭痛、のぼせ、浮腫、その他）、心筋虚血、低血圧、頻脈、一過性不全収縮期、心不全の増悪、心室不全、ＳＡ結節あるいは房室伝導障害あるいはプラズマジゴキシン値に対する臨床的に受け入れ可能な効果を有することになる。
【０１１３】
「毒性プロフィール作成」により、効果的な製薬調製剤が投与されるときに起こりうる潜在的に有害な副作用の評価が意図される。副作用は有害であるものもそうではないものもあり、また、一つの製薬調製剤に関する副作用が受け入れることが可能な副作用であるかどうかの判定は、規制承認プロセス時に行われる。受け入れ可能な副作用は（ａ）治療されている症状の重篤度、および（ｂ）これら他の治療法の有用性とこれらの他の治療法と現在関連している副作用を含む因子のため、さまざまに変化する。例えば、癌という用語は、間違って制御された細胞成長、増殖、および分化に関連している疾患の諸症状の複合的なファミリーを包摂している。癌の多くの形態は特に激しい疼痛、治療が実施された組織の機能の喪失、そして死を引き起こす荒廃した疾患である。化学療法薬剤は癌の多くの形態にとって標準的な治療法の一つの重要な部分となっている。化学療法自体は脱毛、激しい悪心、体重減少、生殖不能を含む深刻な副作用を有する可能があるが、こうした副作用は、それらが治療しようとしている上記疾患の重篤度が分かっている場合は受け入れ可能なものであると考えられる。
【０１１４】
しかしながら、これに対して、受胎調節のもっとも現在有用な形態は有意な副作用を有してはいない。したがって、ＣａｔＳｐｅｒ２アンタゴニストの製薬調製剤は、最小限の毒性と副作用を有するべきである。毒性試験は効果試験と平行して実施することができ、また、上記製薬調製剤の効果的な投与量を投与された雄マウスは上記調製剤に対する有害な反応（副作用）に関してモニターすることができる。潜在的な副作用には、性的衝動の喪失や行動上の変化が含まれることがある。処置されたマウスから採取された血液、尿、糞便サンプルはまた、免疫、腎臓、あるいは肝臓機能における何らかの潜在的な副作用による変化を検出するためにモニターすることができる。さらに、ＣａｔＳｐｅｒ２はカチオンチャネルであり、上記製薬調製剤を受けたマウスはまた、他のカチオンチャネルとの上記ＣａｔＳｐｅｒ２アンタゴニストの交差反応性を示す心臓機能における何らかの変化に関してモニターするべきである。
【０１１５】
ＣａｔＳｐｅｒ２活性をアンタゴナイズし、また、動物研究調査においては安全でかつ効果的であると証明されている薬剤は、一つの製薬調製剤に製薬化することができる。こうした製薬調製剤はその後に避妊薬として市場調査、配布および販売することができる。
【０１１６】
ＣａｔＳｐｅｒ２活性および受精の喪失の間の関連性がはっきりすると、雄の受精問題を治療するためにＣａｔＳｐｅｒ２の活性を増加する薬剤でそれが実質的に有用なものとなる。不妊症の多くの例には、上記男性に関連している問題が含まれている。こうした男性不妊症問題には、低精子数、貧弱な精子の運動性および異常な精子の形態が含まれる。現在、男性関連不妊症に対する効果的な治療法はほとんどない。
【０１１７】
男性不妊症に対する潜在的に成功裏に実施される治療法を開発する際の第一ステップは、ＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストの同定である。ＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストはＣａｔＳｐｅｒ２の活性を増加させる一つあるいはそれ以上の薬剤である。ＣａｔＳｐｅｒ２アンタゴニストに関して上に詳細に概要されているように、上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質のアゴニストはその他のカチオンチャネルアゴニストよりも非常に少ない潜在的な副作用を有することが予想される。
【０１１８】
ＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストとして作用する薬剤を同定するための諸方法は、ＣａｔＳｐｅｒ２アンタゴニストに関して詳細に述べられているように主として行われる。しかしながら、有用なＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストは、精子の運動性あるいは卵の貫通性の一つあるいはそれ以上を増加させることになる。さらに、ＣａｔＳｐｅ２アゴニストを同定するときに、こうした薬剤は野生型ＣａｔＳｐｅｒ２の活性をアゴナイズすることができる。さらに、あるいは代替的には、こうした薬剤は、変異体ＣａｔＳｐｅｒ２の活性をアゴナイズすることができる。上記に詳細に概略されているように
こうした諸方法により同定された一つあるいはそれ以上のアゴニストはその後に安全性および効き目に関してテストすることができる。動物研究調査において安全かつ効果的なものであることが示されている薬剤は製薬調製剤に製薬化される。
【０１１９】
ＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストは全ての男性受精の問題を治療するために効果的なものではあるとは考えられない。しかし、男性の不妊症の問題のある一定の不定のパーセンテージは、ＣａｔＳｐｅｒ２機能のアゴニストを使用する治療法に対して適用可能である。例えば、貧弱な精子の運動性という結果を生じる男性不妊症のある一定のパーセンテージはＣａｔＳｐｅｒ２における変異が原因となっている可能性が高い。ＣａｔＳｐｅｒ２が、精子において特異的に発現される場合は、こうした変異を有する男性は、ほとんどあるいは付加的な医学的な問題を有することは考えられず、また、これにより、なぜ健康な男性で不妊症がよく発見されるのかが説明される。さらに、ＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストは、精子の運動性を全体に改善することができ、また、したがって、他の関連性の無い原因により貧弱な精子の運動性に対して補完する手助けをする。
（生殖医学ビジネスを実施する）
野生型の活性あるいは変異体ＣａｔＳｐｅｒ２をアゴナイズする一つあるいはそれ以上の薬剤を含む製薬調製剤は不妊の困難性を体験した候補男性患者に対する治療法を提供する生殖医学ビジネスを確立するのに有用なものとなりうる。男性患者により提供された精子サンプルは、上記製薬調製剤による治療に上記男性患者の不妊症が受け入れられるかどうかを判定するために調べられる。精子の運動性あるいは卵貫通性のうちの少なくとも一つを減少させたとして特徴付けられる精子の患者は治療を受けるのには適当な状態とすることができる。治療の前に、上記男性患者により提供された精子サンプルは上記男性は治療に適当であるかどうかをさらに評価するために上記製薬調製剤に関してインビトロにてテストされる。インビトロ試験というこの付加的なステップは上記ＣａＰＳｐｅｒ２アゴニストによりその不妊症が改善される可能性がある男性において行われる不必要な治療を軽減する手助けを行う。
【０１２０】
インビトロにて精子の運動性かあるいは卵貫通性を増加させることを示す精子の男性患者は一つあるいはそれ以上のＣａｔＳｐｅｒ２アゴニストを含む製薬調製剤を含む受精治療には適当である。正確な治療処方は患者によってさまざまであり、また、経験を積んだ医療関係者には容易に決めることができるものである。しかしながら、上記治療処方には、上記治療を受けた男性における精子の運動性あるいは卵貫通性の少なくとも一つを増加させるのに効果的である上記製薬調製剤の用量を投与することが含まれる。ある特定の実施態様では、精子の運動性あるいは卵貫通性における増加は受精率の増加という結果をもたらすことになる。
（製薬調製剤）
もう一つの側面では、本発明は一つあるいはそれ以上の製薬的に受け入れ可能なキャリアー（添加剤）および／または希釈剤と一緒に製薬化された、上述されている一つあるいはそれ以上の同定された薬剤（すなわち、アンタゴニストあるいはアゴニスト）の治療上効果的な用量から成る製薬的に受け入れ可能な調製剤を提供する。以下に詳細に説明されているように、本発明の上記製薬成分は、以下のものに適合されるそうしたものを含む固形あるいは液体の形態でと用するために特に製薬化することができる。すなわち、（１）経口投与、例えば、舌に対して塗布するための水薬（水性あるいは非水性溶液あるいは懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト；（２）非経口投与、例えば、皮下、筋内あるいは静脈内注射によるもの、滅菌溶液あるいは懸濁液として；（３）局所的な適用、例えば、皮膚に塗布されるクリーム、軟膏、スプレーとして；あるいは（４）例えば、ペッサリー、クリームあるいは発泡剤として、膣内あるいは直腸内に。しかしながら、特定の実施態様では、上記主な化合物は単に滅菌水の中に溶解するあるいは懸濁することができる。
【０１２１】
本明細書において使用されるとき、「治療上効果的な用量」という慣用句は、何らかの医学的治療に適用可能な理にかなった恩恵／危険性の比率で、いくつかの所望される治療上の効果を産生するために効果的である薬剤あるいは組成の用量を意味する。
【０１２２】
「製薬的に受け入れ可能な」という慣用句は健全な医学的判断の範囲内にあって、理にかなった恩恵／危険性の比率に見合っていて、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー性反応、あるいはその他の問題あるいは合併症は無しにヒトと動物の組織と接触して使用するのに適当であるそうした化合物、材料、組成および／または投与形態に言及するために本明細書では用いられている。
【０１２３】
本明細書において使用されるとき、「製薬的に受け入れ可能なキャリアー」という慣用句は、一つの器官、あるいは身体の一部からもう一つの臓器あるいは身体の一部にその目的のアンタゴニストを担体するあるいは輸送するのに関わっている液体、あるいは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、あるいはカプセル材料などの製薬的に受け入れ可能な材料、組成あるいはビーイクルを意味する。各キャリアーは、そのほかの成分と適合性があり、上記患者に対して傷害性がないという意味で「受け入れ可能」であらねばならない。製薬的に受け入れ可能なキャリアーとして役に立つことができる材料のいくつかの実施例には、（１）ラクトース、ブドウ糖およびショ糖などの糖類；（２）コーンスターチおよびポテトスターチなどの澱粉；（３）カルキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどセルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゲラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツオイル、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブオイル、コーン油などのオイル類；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類；（１２）オレイン酸エチル、ラウリル酸エチルなどのエステル類；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝薬剤；（１５）アルギン酸；（１６）非発熱性の水；（１７）等張性生理食塩水；(１８)リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；および（２１）製剤化において用いられるその他の非毒性適合性物質が挙げられる。特定の実施態様では、上記製薬調製剤は非発熱性のものであり、すなわち、患者の体温を上昇させないものである。
【０１２４】
この点では「製薬的に受け入れ可能な塩」という慣用句は、本発明の化合物の比較的非毒性、無機および有機酸添加塩を言う。これら塩は、本発明の化合物の最終的な分離と精製時にインサイチューにて調製することができ、あるいは本発明の化合物の精製化合物を適当な有機あるいは無機酸と、その遊離塩基形態で個別に反応させ、また、そのように形成された上記塩を分離することにより調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸、ラウリル酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート]、クエン酸、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシラート、グルコペプト酸塩｛ｇｌｕｃｏｈｅｐｔａｎａｔｅ？｝、ラウリルスルフォネート塩などが挙げられる。(これについてはＢｅｒｇｅら（１９７７），Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい)
上記目的とする主要な薬剤の上記製薬的に受け入れ可能な塩には、例えば、非毒性有機あるいは無機酸から得られる通常の非毒性塩あるいは第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、こうした通常の非毒性塩には塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、亜硫酸塩、スルファミン酸塩、リン酸塩、硝酸塩などの無機塩から取られたもの、また、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、グリコール酸塩、ステアリン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、パルミチン酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸塩、グルタミン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、スルファニル酸塩、２−アセトキシ安息香酸塩、フマル酸塩、トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタン二スルホン酸塩、シュウ酸塩、イソチオン酸塩などの有機酸から作成された塩が含まれる。
【０１２５】
その他のケースでは、本発明の上記薬剤には、一つあるいはそれ以上の酸性官能基を含有することができ、またしたがって、製薬的に受け入れ可能な塩基により製薬的に受け入れ可能な塩を形成することが可能である。これらの例の中にみられる「製薬的に受け入れ可能な塩」という慣用句は、本発明の化合物の比較的非毒性、無機および有機の塩基添加塩を言う。これら塩は同様に、上記薬剤の最終的な分離と精製時にインサイチューにて調製することができ、製薬的に受け入れ可能な金属カチオンの酸化水素酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、適当な塩基と、アンモニア、製薬的に受け入れ可能な有機第一級、第二級、第三級アミンと、精製薬剤を、その遊離塩基形態で個別に反応させ、また、そのように形成された上記塩を分離することにより調製することができる。代表的なアルカリあるいはアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが含まれる。塩基添加塩の形成に有用な代表的な有機アミンにはエチルアミン、字エチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅら（１９７７），同上）。
【０１２６】
着色剤、剥離剤、塗布剤、甘味料、調味料、芳香剤、保存剤、抗酸化剤だけではなくラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤、潤滑剤もまた上記組成の中に存在させることができる。
【０１２７】
製薬的に受け入れ可能な抗酸化剤の実施例には、（１）アスコルビン酸、塩化水素酸システイン、二硫酸ナトリウム、メタ二硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；（３）クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤、が挙げられる。
【０１２８】
本発明の製剤形態には、口腔、鼻腔、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に適当なそうしたものが挙げられる。上記製剤形態は、単位投与形態で都合よく表示することができ、また、薬局の同業者には周知のものであるいずれかの諸方法により調製することができる。単回投与形態を産生するためにキャリアー材料と組み合わせることができる活性成分の用量は治療される宿主、投与の特定の態様によりさまざまに変化する。単回投与形態を産生するためにキャリアー材料と組み合わせることができる活性成分の用量は一般的には治療上の効果を作り出す上記化合物の用量となる。一般的には、この用量は活性成分の約１％〜約９９％の範囲、約５％〜約７０％、あるいは約１０％〜約３０％の範囲になる。
【０１２９】
これら製剤形態あるいは組成を調製する諸方法には、本発明の一つあるいはそれ以上の薬剤をキャリアー、任意には、一つあるいはそれ以上のアクセサリー成分と会合させるステップが含まれる。一般的には、上記製剤形態は、本発明の一つあるいはそれ以上の薬剤を液体キャリアーあるいは微細に分割した固体キャリアーあるいはその両方と均一にまた密接に会合させることにより調製され、またその後にもし必要である場合は上記製品を形状化する。
【０１３０】
経口投与に適している本発明の製剤形態は、カプセル、カシェ剤、ピル剤、錠剤、舐剤（芳香剤をベースに使用して、通常はショ糖とアカシア、あるいはトラガカント）、粉末、顆粒の形態でありうるが、あるいは水性液あるいは非水性液の中に入れた溶液あるいは懸濁液として、あるいは水の中に油、あるいは油の中に水を入れた液体乳化剤として、あるいはエリキシル剤あるいはシロップとして、あるいは香錠（ゲラチンおよびグリセリンあるいはショ糖およびアカシアなどの多活性塩基を使用して）および／または口腔洗浄剤などとして使用することができ、それぞれ本発明の化合物の一定所定用量を含有する。本発明の一つの薬剤はまたボーラス、動物用舐剤あるいはペーストとして投与することもできる。
【０１３１】
経口投与に関する本発明の固体投与形態では（カプセル、錠剤、ピル剤、糖衣錠、粉末、顆粒など）、上記活性成分は、クエン酸ナトリウムあるいはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれかのものなどの一つあるいはそれ以上の製薬的に許容されうるキャリアーと混合される。すなわち、（１）澱粉、ラクトース、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤あるいは増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゲラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖および／またはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの軟釈剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ポテトあるいはタピオカスターチ、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの壊変剤；（５）パラフィンなどの溶液緩染剤；（６）第四級化合物などの吸収促進剤；（７）セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイトクレイなどの吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物などの潤滑剤；（１０）着色剤、である。カプセル剤、錠剤、ピル剤の場合は、上記製薬調製剤はまた、緩衝薬剤から成りうる。同様の型の固体組成もまた、高分子重量ポリエチレングリコールなどとともに、ラクトースあるいは乳糖などの賦形剤などを使用して柔軟および硬質充填ゲラチンカプセルの中に入れた充填剤として用いることができる。
【０１３２】
一つの錠剤は、一つあるいはそれ以上のアクセサリー成分を任意には加えて圧縮あるいは成形により作ることができる。圧縮錠剤は結合剤、（例えば、ゲラチンあるいはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、グリコール酸ナトリウムスターチ、あるいは交差カルボキシメチルセルロース）、表面活性あるいは拡散剤を使用して調製することができる。成形錠剤は適当な器械で不活性液体希釈剤により湿潤化させた粉末化合物の混合物を成形することにより作ることができる。
【０１３３】
糖衣錠、カプセル剤、ピル剤および顆粒剤などの本発明の上記製薬組成の上記錠剤とその他の固体投与形態は製薬化技術においては周知のものとなっている腸溶コーティングとその他のコーティングなどのコーティングおよびシェルにより切れ目を入れて、調製することが任意には可能である。それらはまた、所望される放出プロフィール、その他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを提供する割合をさまざまに変化させて、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用して、その中に上記活性成分の徐放性のものを提供するように製薬化することができる。それらは、例えば、細菌保持フィルターによるろ過によって、あるいは滅菌水の中に溶解されることができる滅菌固体組成の形態で滅菌薬剤、あるいは使用の直前に何らかの滅菌注入可能な媒体を組み込むことにより、滅菌することができる。これら組成はまた任意には不透明化剤を含有することができ、また、任意にはゆっくりとしたやり方で胃腸管のある一定の部分において上記活性成分（複数）のみをあるいは選択的に放出するそういった組成のものとすることができる。重合体物質およびワックスを含む包埋組成の実施例を使用することができる。上記活性成分はまた、適当なものであれば、一つあるいはそれ以上の叙述されている賦形剤を加えてミクロカプセル化形態のものにすることができる。
【０１３４】
本発明の上記化合物の経口投与のための液体投与形態には、製薬的に許容される乳化剤、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシル剤が挙げられる。上記活性成分に加えて、上記液体投与形態には、例えば、水あるいは、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル（特に綿実油、塊根植物、コーン、胚芽、オリーブ、トウゴマおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールとソルビタンの脂肪酸エステル、それらの混合物などのその他の溶媒、可溶化剤および乳化剤などの同業者であれば通常使用している不活性希釈剤が含まれている。
【０１３５】
不活性希釈剤の他に、上記経口組成にはまた、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、調味料、着色剤、芳香剤、および保存剤などのアジュバントが含まれうる。
【０１３６】
上記活性化合物に加えて、懸濁液には、例えば、エトキシイソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、微晶質セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガカント、およびそれらの混合物などの懸濁液が含まれうる。
【０１３７】
直腸あるいは膣投与に関する本発明の上記製薬組成の製剤形態は坐薬として提供することができ、それは、本発明の一つあるいはそれ以上の薬剤を、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックスあるいはサリチル酸塩から成る一つあるいはそれ以上の適当な非刺激性賦形剤あるいはキャリアーと混合することにより調製することができ、また、それは室温では固体であるが、体温では液体となり、したがって、直腸あるいは膣腔で溶け、また活性化合物を放出する。
【０１３８】
膣投与に適当なものである本発明の製剤形態にはまた、適当なものとするのに同業者であれば公知のものとなっているこうしたキャリアーを含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡剤あるいはスプレー製剤を含められる。
【０１３９】
本発明の一つあるいはそれ以上の薬剤の局所あるいは経皮敵投与に関する投与形態には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が含まれる。上記活性薬剤は滅菌条件下で製薬的に許容されるキャリアーと、また必要とされる場合はいずれかの保存剤、緩衝液、あるいは液体発泡剤と混合することができる。
【０１４０】
上記軟膏、ペースト、クリームおよびゲルには、本発明の活性化合物に加えて、動物性および植物性脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン樹脂、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛あるいはそれらの混合物などの賦形剤を含めることができる。
【０１４１】
粉末およびスプレーには、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアド粉末あるいはそうした物質の混合物などの賦形剤を含めることができる。スプレーは、ブタンおよびプロパンなどのクロロフルオロヒドロカーボンおよび揮発性未置換炭化水素などの通常の液体発泡剤を付加的に含めることができる。
【０１４２】
経皮的パッチは本発明の薬剤の制御されたデリバリーを身体に提供するというさらなる長所を有する。こうした投与形態は、適当な媒体における主な化合物を溶解し、あるいは分散させることにより作り出すことができる。吸収エンハンサーはまた、目的とする薬剤のその皮膚を越えるフラックスを増加させるのに使用することができる。こうしたフラックスの速度は、速度制御膜を供給することによるか、あるいは重合体マトリックスあるいはゲルの中に上記化合物を分散させることによるかのいずれかにより制御することができる。
【０１４３】
非経口投与のために適当なものである本発明の製薬組成は、使用直前に滅菌注入可能な溶液あるいは分散液の中に再構成することができ、上記製剤を意図されているレシピエントの血液あるいは懸濁剤あるいは増粘剤と等張性のものとする抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質を含めることができる一つあるいはそれ以上の製薬的に許容されている滅菌等張性の水性あるいは非水性溶液、分散液、懸濁液、乳化液、あるいは滅菌粉末本発明の一つあるいはそれ以上の化合物から成る。
【０１４４】
本発明の上記製薬組成の中で用いることができる適当な水性あるいは非水性キャリアーの実施例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）および適当なそれらの混合物、オリーブオイルなどの野菜油およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルを含められる。適当な流動性を、レシチンなどのコーティング材料を使用することにより、分散液の場合は必要とされる粒子サイズを維持することにより、また、界面活性剤を使用することにより、維持することができる。
【０１４５】
これらの組成にはまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含めることができる。微生物の作用を予防することは、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などのさまざまな抗菌剤、抗真菌剤を封入することにより確実なものとすることができる。これにはまた、糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を上記組成の中に含めることが望ましいこととなる。さらに、注入可能な製薬形態の長引かせた徐放性の吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゲラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の封入によりもたらすことができる。
【０１４６】
本発明の上記化合物はヒトや動物に対して製薬として投与される場合、それらはそれ自体のままでか、あるいは例えば、製薬的に許容されているキャリアーと組み合わせた活性剤の０．１〜９９．５％、あるいは０．５〜９０％を含有する製薬組成として与えることができる。
【本発明の最良の実施の態様】
【０１４７】
以下の実施例では、本発明を実施するいくつかの特定の態様を説明しているが、請求されている本発明の範囲を限定しようとすることは意図されていない。代替的な材料および方法を同様の結果を得るために使用することができる。
（実施例１）
（ｃＤＮＡライブラリーの作成）
マウス１２９Ｓｖ／Ｅｖ成体精巣から富化精細胞分画は、Ｂｅｌｌｖｅ（１９９３），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：８４−１１３というユニット重力沈降方法を使用して作成された。その作成物から得られたポリＡ+ＲＮＡは上記供給者のプロトコルにより二本鎖ｃＤＮＡを合成するために無作為プライマーにより逆転写された（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｃａｒｓｂａｄ市）。このｃＤＮＡ（２μｇ）は、脳、心臓、腸管、腎臓、肝臓、肺臓、骨格筋、脾臓および胃を含む9つの異なる富化組織から得られたポリＡ+ＲＮＡの等量の混合物から作成されたドライバーｃＤＮＡ（２μｇ）を使用して抑制減算ハイブリダイゼーション（ＰＣＲ  ＳｅｌｅｃｔTM，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ市）にかけられた。
（実施例２）
（シグナルペプチドトラップ）
Ａ．ベクター作成。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ遺伝子（シグナルペプチドと終止シグナルは無しでプロモーター、コード配列を含むＧｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００１１４１．１，ヌクレオチド３６４８４−３７３５７と３７４４８−３９４８３）がｐＲＢ５７６から得られたＥｃｏＲＩ／ＳａＩＩ断片として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ市）の中にサブクローン化されて入れられた。上記インベルターゼコード配列は細胞質酵素形態の開始メチオニンコドンを、アラニンと置換させるために部位特異的変異誘発（Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ市）により修飾され、また、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩクローニング部位を含む人工リンカーが上記インベルターゼコード配列の開始時にＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ部位の中に結合されて入れられた。この修飾インベルターゼ遺伝子はｐＳＰＴＩＢを産生するために上記ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ制限部位を使用して酵母菌シャトルベクターｐＹＥＵｒａ３（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ０２４５７）の中にサブクローン化されて入れられた。
【０１４８】
Ｂ．酵母形質転換と選択。シグナルペプチドトラップはＫｌｅｉｎら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７１０８−１３により記載されているように基本的に実施された。手短に言うと、上記酵母菌株ＹＴ４５５（ｓｕｃ２Δ９，ａｄｅ２−１０１，ｕｒａ３−５２）が、酢酸リチウムを使用して上記富化精細胞ｃＤＮＡライブラリーにより形質転換された。結果的に生じた形質転換体が、３０℃で三日間最少培地／−Ｕｒａドロップアウトプレート上で選択され、またその後に機能シグナルペプチドをコードしたｃＤＮＡに関して選択するためにＹＰＳプレート（唯一の炭素資源として２％ショ糖）上に戴置した。７日以上ショ糖上で成長したこうした酵母コロニーはｃＤＮＡ挿入片に関して分析された。
Ｃ．配列分析。プラスミドは、ＳＤＳとガラスビーズによる溶解により酵母ミニ培養培地から放出された（ＳｔｒａｔｈｅｒｎとＨｉｇｇｉｎｓ（１９９１），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：３１９−２９）。上記ｃＤＮＡ挿入片は上記クローニング部位に隣接しているベクター特異的プライマーを使用してＰＣＲにより増幅された。その結果生じたＰＣＲ産物は自動シークエンスにかけられ、その後に、上記Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）に対するＢＬＡＳＴ分析にかけた。
Ｄ．ＣａｔＳｐｅｒ２クローンの同定。富化精細胞ｃＤＮＡライブラリーは、酵母系シグナルペプチド選択法（Ｋｌｅｉｎら（１９９６），同上；Ｊａｃｏｂら（１９９７），Ｇｅｎｅ１９８：２８９−９６）を使用してスクリーニングされた。マウス精細胞ｃＤＮＡを含む１．２ｘ１０5コロニーがスクリーニングされた。ショ糖上での選択の後およそ３５０復帰細胞酵母菌コロニーが得られた。これら選択ｃＤＮＡクローンに関しては、上記技術の有効性を示す精子により特異的に発現された公知の膜／分泌タンパク質が同定された（例えば、ｓｐ５６，フェルチリンβ、ＡＤＡＭ２６，ＴＰＸ−１）。上記電圧ゲートカリウムチャネルと同様のものであるが、カルシウム選択性によりポアを含んでいる演繹位相幾何学によりタンパク質をコードする新規なｃＤＮＡ配列は同定され、またその結果として意図されていたＣａｔＳｐｅｒ２となった。
（実施例３）
（完全ＣａｔＳｐｅｒ２  ｃＤＮＡ配列の同定）
上記クローンの上記完全コード配列は５’と３’ＲＡＣＥ増幅に関してはｃＤＮＡ断片特異的アンチセンスとセンスプライマーそれそれを使用して測定された（Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ＭｏｕｓｅTM 精巣ｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ市）。無傷の完全長クローンは特異的５’と３’ＵＴＲプライマー対によりＰＣＲを使用して産生された。その結果生じたＰＣＲ産物はサブクローン化されてｐＣＲ２．１に中に入れられ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ市）、また、変異が無いことを証明するために配列決定が実施された。
【０１４９】
１９８６ｂｐを含む完全長ｃＤＮＡがＲＡＣＥを使用して分離された。上記予測ＯＲＦは6つの膜貫通セグメントを備えた５８８アミノ酸タンパク質をコードする（図１（Ａ））。第４膜貫通セグメントには、4番目の位置毎に間隔を置いて塩基性アミノ酸残基（Ｋ／Ｒ）、電圧ゲートイオンチャネルが含まれている。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースとのこの配列の比較では、上記電圧ゲートカルシウムチャネルファミリー（ＣａV）に対する類似性がこの配列ＢＬＡＳＴ比較により明らかにされたるそのＮａV，ＫV，環式ヌクレオチド−ゲート（ＣＮＧ），一過性受容体電位（ＴＲＰ）およびポリシスチンチャネルはさらに距離的に関連性があるように見えた。上記公知のタンパク質の間では、ＣａｔＳｐｅｒ２はもっともＣａｔＳｐｅｒ２に類似しており、もう一つの精子細胞特異的推定カチオンチャネルが最近運動性と正常な受精にとって重要であることがわかった（図１（Ｂ）；Ｒｅｎら（２００１），同上）。これら２つのタンパク質は上記膜貫通領域内で２１％同一性であり、４０％類似性のものである。イオンチャネルの選択性は５番目（Ｓ５）と６番目（Ｓ６）膜貫通セグメントの間に位置しているポア形成残基により測定されている。図１（Ｂ）に図示されているように、上記ポア（Ｐ）領域におけるいくつかのアミノ酸残基はＣａｔＳｐｅｒ２，ＣａｔＳｐｅｒ１，およびカルシウム選択性を定義している非常に重要なアスパラギン酸あるいはグルタミン酸残基を含むＣａチャネルとの間に保存されている（Ｖａｒａｄｉら（１９９９），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４：１８１−２１４）。上記膜貫通領域に続くＣａｔＳｐｅｒ２の上記細胞質部分には付加的な潜在的機能モチーフが含まれている。上記反復配列領域には、ＣａｔＳｐｅｒ２はマウスにおける受精能獲得時にリン酸化された上記タンパク質の一つを代表しうるものであると示唆している複数の候補チロシンリン酸化部位が含まれている（Ｖｉｓｃｏｎｔｉら（１９９５），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２１：１１２９−３７）。上記Ｃ末端細胞質領域にはまた、残基５４７−５６８から得られる通常みられないロイシンジッパーモチーフが含まれている（Ｍａｘら（２００１），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５３：６９９−７０８）。この領域は、実際のチャネルポア複合体を形成する、あるいは精細胞の中にあるＣａｔＳｐｅ２チャネル活性を調節するタンパク質−タンパク質の相互作用を媒介することがある。
【０１５０】
上記マウスＣａｔＳｐｅｒ２配列を使用して、ＣａｔＳｐｅｒ２と同様の予測位相幾何学を有するタンパク質をコードする３つの類似ｃＤＮＡ配列がヒト精巣からクローン化された。上記ヒトクローンによりコードされた上記タンパク質は、マウスＣａｔＳｐｅｒ２と全体として６３〜６７％同一性がある。上記ヒトクローンの２つは５２８（配列識別番号：２）と５３０アミノ酸の予測ＯＲＦをコードし、また、上記膜貫通領域後に２つのタンデム型セリン残基５４アミノ酸残基の存在によってのみ互いに異なっている（すなわち、２つのセリン残基は配列識別番号：２の残基３９２と３９３との間に挿入される）。上記第３ヒトクローンは上記ｃＤＮＡ配列にある２１１ヌクレオチドギャップがフレームシフトと初期終結を引き起こす、アミノ酸残基３９３まではその他のヒトクローンに対して同一である４１４アミノ酸の予測ＯＲＦ（配列識別番号：４）をコードする。３つのヒトタンパク質全ての上記膜貫通領域は同一Ｐ領域を含めて、マウスＣａｔＳｐｅｒ２に対して７７％同一である。上記膜貫通セグメントの前の上記細胞質領域とＣａｔＳｐｅｒ２の上記カルボキシ末端６３アミノ酸もまた上記二つのさらに長いヒト相同体の中に保存されており、それぞれ７３％と９０％同一となっている。
（実施例４）
（ノーザンブロット分析法）
いくつかのマウス組織から得た総ＲＮＡ（１５μｇ）とマウス、ラットおよびヒト精巣から得たポリＡ+ＲＮＡ（２μｇ）が１％アガロースＭＯＰＳ／ホルムアルデヒドゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９），同上）の上で分離された。正に荷電されたナイロン膜への移送後に、上記ブロットが、ＵＬＴＲＡｈｙｂTM（Ａｍｂｉｏｎ社、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ市）において１０6ｃｐｍ／ｍｌでｃＤＮＡ配列（マウス組織ブロット）のヌクレオチド１１３−５３１に対応する無作為初回刺激を受けた32Ｐプローブか、あるいはヌクレオチド９１９−１２９９（交差種ブロット；マウス、ラットおよびヒト）かのいずれかで４２℃にて一夜ハイブリダイズされた。上記ブロットは０．１ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ／０．１％ＮａＰＰｉ（１ｘ１５分間室温にて、３ｘ１５分６５℃にて）により洗浄され、また、フィルムに露出させた。
【０１５１】
ＣａｔＳｐｅｒ２ｃＤＮＡプローブによるノーザンブロット分析では、マウス精巣における一回２．１ｋｂ転写が検出された。感受性の高いＲＴ−ＰＣＲアッセイでもシグナルは調べられたその他の組織（脳、心臓、腸管、腎臓、肝臓、卵巣、骨格筋、脾臓、胃）では検出されなかった。この結果、上記推定開始メチオニンの上流にあるインフレーム停止コドンの存在にともなって、上記転写は完全長であることが示されている。ＣａｔＳｐｅｒ２ｍＲＮＡもまた、ラットとヒトの両方の精巣サンプルで２．０−２．１ｋｂ転写として同定された。
【０１５２】
精巣組織のインサイチューハイブリダイゼーションにより、減数分裂および減数分裂後細胞には、上記ＣａｔＳｐｅｒ２転写物を含んでいたことが示されている。パラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋マウス精巣切片は、35Ｓ標識化ＣａｔＳｐｅｒ２センスあるいはアンチセンスプローブ（ヌクレオチド１１３−５３１）により調べられ、また、明視野暗視野顕微鏡により調べられた。上記アンチセンスプローブは精母細胞と精細胞の両方のわたって精細管にハイブリダイズされた。その他の細胞においては正のシグナルはなかったし、また上記センスプローブもまたいずれかの精巣細胞型へのハイブリダイゼーションには失敗した。
（実施例５）
（インサイチューハイブリダイゼーション）
ヌクレオチド１１３−５３１に対応している上記領域がＰＣＲにより増幅され、また、ｐＣＲ４．０−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ市）の中にサブクローン化されて入れられた。放射性標識化（35Ｓ）ｃＲＮＡセンスとアンチセンスプローブが上記線形化プラスミド（ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔTM，Ａｍｂｉｏｎ社、テキサス州Ａｕｓｔｉｎ市）から転写された。成体マウス精巣切片のインサイチューハイブリダイゼーションがＳｈｅｌｔｏｎら（２０００），Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４１：５３２−７により実施された。
（実施例６）
（ペプチド抗体の産生）
抗体は、Ｎ末端に添付されたシステインにより、配列識別番号：６のアミノ酸残基６４−８９と残基５６２−５８８に対応する合成ペプチドに対して作られた。こうしたペプチドは製造業者のプロトコルによりマレイミド活性化ＫＬＨに共役された（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ市）。ウサギは免疫化され（筋内注射）、また、結果的に注射毎にＫＬＨペプチド共役体の１００μｇと定常の間隔で追加免疫された。抗ペプチド抗体はＧｅｎｔｌｅ  ＢｉｎｄｉｎｇとＥｌｕｔｉｏｎTM緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ市）対応しているペプチドクロマトグラフィカラム上で親和性に精製された（ＳｕｌｆｏｌｉｎｋTM，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ市）。
（実施例7）
（免疫沈降法および免疫ブロッティング法）
免疫沈降法に関しては、サンプルは１％ＴＸ−１００あるいは１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４を含むＴＢＳ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で少なくとも４時間、４℃にて抽出された。上記抽出物は３０分間１００，０００ｘｇで遠心分離にかけられ、また、その結果得られた上清溶液は２時間プロテインＡアガロースに共有結合で結合された前免疫ＩｇＧとインキュベートされた（Ｓｅｉｚｅ  ＸTM，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ市）。その非結合分画が回収され、また、ペプチド反応抗体（±１．５μＭペプチドプレインキュベーション）／プロテインＡアガロースと一夜遥動させながらインキュベートされた。その結果得られた免疫複合体は５回洗浄された。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法はＬａｅｍｍｌｉ（１９７０），Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−５により行われた。電気泳動法により分離されたサンプルはＴｏｗｂｉｎら（１９７９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：４２５０−４により５０Ｖで２時間４℃にてニトロセルロース膜に移動させた。免疫ブロットはＣａｔＳｐｅｒ２抗体（１：５０００）あるいはＣａｔＳｐｅｒ１（１：２０００）抗体によりＴＢＳＴ／２．５％無脂肪ミルクの中で探索された。一次抗体によるインキュベーション後に、上記ブロットはＴＢＳＴ／２．５％無脂肪ミルクで一度洗浄され、また、ＴＢＳＴ（30分間にわたって４回変えた）。ブロットはその後に１時間二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抱合体によりインキュベートされ、ＴＢＳＴ（３０分間に３回変えた）、ＴＢＳ（３回）により洗浄され、また、上記シグナルが化学発光により検出された（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ市）。
ＣａｔＳｐｅｒ２とＣａｔＳｐｅｒ１の両方とも、ＳＤＳではなく清浄剤が精巣上体の精子を抽出するのに使用される場合は、比較的不溶性になる。上記タンパク質は１％ＴＸ−１００あるいはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４かのいずれかで上記精巣からさらに容易に可溶化された。これら清浄剤抽出物の両方から上記Ｃ末端ペプチド抗体とともにＣａｔＳｐｅｒ２が免疫沈降され、ＣａｔＳｐｅｒ１は、可溶性分画の中に残った。ＣａｔＳｐｅｒ２とＣａｔＳｐｅｒ１はＣＨＡＰＳあるいはその他の清浄剤により可溶化することはできなかった。
（実施例８）
（免疫局在化（蛍光））
尾側精巣上体精細胞がガラススライド上に塗り付けられ、また、空気乾燥させた。上記細胞は固定され、また、氷冷メタノールを２分間浸透させた。上記スライドはエタノールの中で洗浄され、空気乾燥され、また、非特異的結合をブロックするために３０分間ＣＡＳ溶液中のＰＢＳ／１０％正常ヤギ血清でインキュベートされた（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ市）。上記スライドはその後ブロック溶液の中で希釈された一次抗体の中でインキュベートされた（Ｃ末端抗体（１：５０００）、ポリクローナル抗体（１：１０００））。一次抗体は特異的結合を評価するためにブロック溶液の中で希釈する前に２０μＭ競合ペプチドあるいはスクランブルドペプチドかのいずれかでプレインキュベートされた。上記一次抗体インキュベーションの後、上記スライドはＰＢＳ（３ｘ１０分間）で洗浄され、また、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８と１時間インキュベートされた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ市）。ＰＢＳ（３ｘ１０分間）により洗浄された後、上記スライドはＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ペンシルバニア州Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ市）により観察のため取り付けられた。
【０１５３】
２つのペプチド反応抗体は、上述されているように産生された。それぞれ親和性に精製されている抗体とともにマウス精巣のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動／免疫ブロットと、粗精子膜ＳＤＳ抽出物が上記ｃＤＮＡ配列から予測されるサイズに対応している６８，０００Ｍタンパク質と同定されている。同様に、６８，０００Ｍタンパク質が、ラット精巣上体精細胞膜に検出された。間接免疫蛍光法は、Ｃ末端ペプチド抗体で標識化されているメタノール固定浸透マウス精巣上体精細胞膜において実施された。結合抗体は、位相差および側面蛍光発光顕微鏡を用いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８共役二次抗体により検出された。上記ＣａｔＳｐｅｒ２タンパク質は鞭毛に局在化されていた。このシグナルは、スクランブルドバージョンのペプチドではなく競合ペプチドを用いたプレインキュベートによりブロックされた。
（実施例９）
（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）
マウスゲノムクローンは、配列識別番号：５のヌクレオチド１１３−５３1に対応するｃＤＮＡプローブを用いて同定された。上記ＢＡＣクローンはニックトランスレーションによりジゴキシゲニンｄＵＴＰにより標識化され、また、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および２ｘＳＳＣの中でマウス胎性線維芽細胞から得られた正常分裂中期染色体を探索するのに使用された。特異的ハイブリダイゼーションシグナルは、蛍光発光抗ジゴキシゲニン抗体とＤＰＩにより対比染色された上記染色体により検出された。合計８０の分裂中期細胞がそれぞれのケースで検出された特異的な標識により分析された（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ市）。
【０１５４】
上記ＣａｔＳｐｅｒ２遺伝子はマウス染色体２Ｅ６−Ｆ１上に位置付けられている。雄の不妊症に関連して報告された変異は上記マウスゲノムのこの領域では存在していない。ヒトでは、上記ヌクレオチド値にあるＣａｔＳｐｅｒ２に７０−７５％同一性を有する２つの遺伝子が、染色体１５ｑ１３のＣａｔＳｐｅｒ２の上記マウス染色体位置とシンテニーである領域上で同定された。上述されている３つ全てのヒト精巣クローンはこれら遺伝子のたった一つのみから転写されているようにみえる。
（実施例１０）
（電気生理学）
ＣａｔＳｐｅｒ２単独、あるいはＣａｔＳｐｅｒ１と一緒におよび／またはサイクリックヌクレオチドゲートチャネルサブユニット（ＣＮＧ４）は、ＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫ−２９３細胞の中にトランスフェクションされて入れられた。全細胞パッチクランプ記録が先に述べられているように実施された（Ｒｅｎら、（２００１），同上）。上記ピペット溶液には、ｐＨ７．４で１２０ｍＭＣｓ+，６０ｍＭグルタミン酸、２０ｍＭ  ＴＥＡ−Ｃｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，３ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ，１０ｍＭ  ＥＧＴＡ，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳと５ｍＭ  Ｄ−グルコースが含まれていた。上記水槽には、ｐＨ７．４で１３５ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ2，１０ｍＭ  Ｎａ−乳酸塩，１０ｍＭ  Ｎａ−ピルビン酸塩、１０ｍＭグルコースと３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳが含まれていた。
【０１５５】
それぞれのケースでは、電圧、ｐＨ、浸透圧、および／またはサイクリックヌクレオチド濃度において変化により導き出された対応付け電流は検出されず、ＣａｔＳｐｅｒ２単独ではこれらの細胞において機能的イオンチャネルを形成しないことを示している。同様に、ＣａｔＳｐｅｒ１の異種発現単独、あるいはＣＨＧチャネルβサブユニットとの組み合わせでは、機能的イオンチャネルを産生することに失敗した（Ｒｅｎら（２００１），同上）。ａｔＳｐｅｒ１とＣａｔＳｐｅｒ２は重複発現パターンを有するユニークなイオンチャネルファミリーのメンバーであり、機能的異種四量体チャネルを形成するように会合するその能力がテストされた。これら２つのタンパク質の共発現はまた機能的チャネルを産生することに失敗している。
（等価物）
それらの特定の実施態様に参照して本発明が特に図示されまた説明されてきたが、形態および詳細におけるさまざまな変更が、本発明の正射と範囲から逸脱することなく本明細書において行うことができることは同業者であれば理解されることであろう。同業者であれば、本明細書において特に説明されている本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物があることは、日常的な実験より以上のものを用いることなく、認識し、あるいは確認することができる。こうした等価物は本発明の範囲の中に包摂されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
以下の図面は本発明のいくつかの実施態様に関する説明的なものであるが、本発明の範囲を制限することが意図されているわけではない。
【図１】図１（Ａ）はマウスＣａｔＳｐｅｒ２のアミノ酸配列である。膜貫通セグメントと鉄選択Ｐ領域には下線が施されている。Ｓ４の基本的な残基は太字で強調されている。（Ｂ）ＣａｔＳｐｅｒ２の対様整列とＣａｔＳｐｅｒ１膜貫通領域である。上記Ｐ領域は四角で囲んである。
【図１】
2005512561.tif 000002
2005512561.tif 000003
【配列表】
2005512561000001.app
【国際調査報告】
2005512561.tif 000004