(57)【要約】本発明はアルツハイマー病患者の特定の脳領域におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現の差を開示する。この知見に基づき、本発明は、被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断するかまたは予測診断するための、または被験者がそのような疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定するための方法を提供する。さらに、本発明は、ＡＢＣＡ１遺伝子およびその対応する遺伝子産物を用いて、アルツハイマー病および関連する神経変性疾患を治療するかまたは予防するための、治療的または予防的方法を提供する。神経変性疾患の調節物質をスクリーニングする方法もまた開示される。
2005522222.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において神経変性疾患を診断または予測診断する、または被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する方法であって、
前記被験者由来の試料中の
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体
のレベルおよび／または活性を測定し、前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記被験者において前記神経変性疾患を診断または予測診断すること、または前記被験者が前記神経変性疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定すること
：を含む方法。
【請求項２】
被験者における神経変性疾患の進行を監視する方法であって、
前記被験者由来の試料中の
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体
のレベルおよび／または活性を測定し、前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記被験者において前記神経変性疾患の進行を監視すること
：を含む方法。
【請求項３】
神経変性疾患のための治療を評価する方法であって、
前記疾患について治療を受けている被験者由来の試料中の
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の
のレベルおよび／または活性を測定し、前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記神経変性疾患のための前記治療を評価すること
：を含む方法。
【請求項４】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記試料が細胞、または組織、または体液、特に脳脊髄液または血液を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記参照値が前記神経変性疾患に罹患していない被験者に由来する試料中の
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体
のレベルおよび／または活性の値である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
既知の健康状態を表す参照値に対する、前記被験者に由来する試料細胞、または組織、または体液、特に脳脊髄液中の、ＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の転写産物および／またはＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の翻訳産物および／またはその断片、または誘導体、または変異体のレベルおよび／または活性の変化が、前記被験者におけるアルツハイマー病の診断、または予測診断、または高リスクを示す、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
被験者において神経変性疾患、特に アルツハイマー病を診断または予測診断する、または被験者のそのような疾患を発症する傾向または素因を判定するためのキットであって、
（ａ）（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬および（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、から成る群から選択される少なくとも１つの試薬；ならびに
（ｂ）（ｉ）前記被験者に由来する試料中の、ＡＢＣＡ１遺伝子の前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出すること；および（ｉｉ）神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断するかまたは予測診断する、またはそのような疾患を発症する傾向または素因を判定することによる、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を診断するかまたは予測診断する、またはそのような疾患を発症する傾向または素因を判定するための指示であって、既知の健康状態を表す参照値と比較した前記転写産物および／または前記翻訳産物の、変化したレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方；または既知の健康状態を表す参照値と同様であるかまたは等しい、前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の診断または予測診断、またはそのような疾患を発症する高い傾向または素因を示す
：ことを含む前記キット。
【請求項９】
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
の活性および／またはレベルに直接的にまたは間接的に影響を及ぼす、治療的にまたは予防的に有効な量の一または複数の物質の前記被験者への投与を含む、被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療または予防する方法。
【請求項１０】
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択される少なくとも１つの物質の活性および／またはレベルの調節因子。
【請求項１１】
ＡＢＣＡ１またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする非天然遺伝子配列を含む組み換え非ヒト動物であって、
（ｉ）前記遺伝子配列および選択可能なマーカー配列を含む遺伝子ターゲッティング構築物を提供すること、および
（ｉｉ）前記ターゲッティング構築物を非ヒト動物の幹細胞へ導入すること、および
（ｉｉｉ）前記非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚へ導入すること、および
（ｉｖ）前記胚を偽妊娠非ヒト動物へ移植すること、および
（ｖ）前記胚を満期まで発生させること、および
（ｖｉ）ゲノムが両方の対立遺伝子に前記遺伝子配列の修飾を含む遺伝子改変非ヒト動物を特定すること、および
（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子改変非ヒト動物を繁殖させて、ゲノムが前記内因性遺伝子の修飾を含む遺伝子改変非ヒト動物を得ること(ただし、前記破壊は結果として神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因を示す前記非ヒト動物を与える)
：によって得ることができる前記動物。
【請求項１２】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬および治療薬の開発において、化合物，物質、および調節因子を、スクリーニング、試験、および評価するための、請求項１１に記載の組み換え非ヒト動物の使用。
【請求項１３】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）細胞を被験化合物と接触させること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）前記被験化合物と接触させていない対照細胞中の、（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；および
（ｄ）段階（ｂ）と（ｃ）の細胞中の物質のレベルおよび／または活性を比較すること(但し、接触させた細胞中の物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示す)
：を含む前記方法。
【請求項１４】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）神経変性疾患または（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質について関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している被験動物に被験化合物を投与すること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）神経変性疾患または（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質について関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症しており、かつそのような被験化合物が投与されていない、一致した対照動物において、（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の活性および／またはレベルを測定すること；
（ｄ）段階（ｂ）と（ｃ）の動物における物質の活性および／またはレベルを比較すること(但し、被験動物における物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示す)
：を含む前記方法。
【請求項１５】
前記被験動物および／または前記対照動物が、天然のＡＢＣＡ１遺伝子転写調節配列ではない転写調節配列の調節下において、ＡＢＣＡ１、またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする遺伝子を発現する組み換え非ヒト動物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リガンドと、ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体との間の結合の阻害について、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法であって、
（ｉ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える；
（ｉｉ）前記阻害についてスクリーニングされるべき、一または複数の化合物を前記複数の容器に加える；
（ｉｉｉ）検出可能なリガンド、好ましくは蛍光標識リガンドを前記容器に加える；
（ｉｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記一または複数の化合物、および前記検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドをインキュベートする；
（ｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物に、またはその前記断片、または誘導体、または変異体に付随する検出可能なリガンドまたは蛍光の量を測定する；および
（ｖｉ）前記リガンドの、前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への結合の、一種類以上の前記化合物による阻害の程度を測定する
：段階を含む前記測定法。
【請求項１７】
ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体との前記化合物の結合の程度を測定する、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法であって、
（ｉ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える；
（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングされるべき、一つの検出可能な化合物、好ましくは複数の検出可能な化合物、特に一つの蛍光標識化合物または複数の蛍光標識化合物を前記複数の容器に加える；
（ｉｉｉ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記検出可能な、好ましくは前記一または複数の蛍光標識化合物をインキュベートする；
（ｉｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物と、またはその前記断片、または誘導体、または変異体に付随する検出可能な化合物または蛍光の量を測定する；および
（ｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への、一種類以上の前記化合物による結合の程度を測定する
：段階を含む前記測定法。
【請求項１８】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断標的として用いられるための、配列番号１に示されるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体。
【請求項１９】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防する、または治療する、または改善する試薬または化合物についてのスクリーニング標的として用いられるための、配列番号１に示されるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体。
【請求項２０】
被験者由来の試料中の細胞の病理状態を検出するための、免疫原と特異的に免疫反応性である抗体の使用であって、前記免疫原が配列番号１に示されるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体であり、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学染色を含む (但し、既知の健康状態を表す細胞と比較した前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化が、前記細胞の病理状態を示す) 使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者における神経変性疾患の進行を診断、予測、および監視する方法に関する。さらに、神経変性疾患の調節物質の治療コントロールおよびスクリーニングの方法を提供する。本発明はまた、医薬組成物、キット、および組み換え動物モデルも開示する。
【０００２】
神経変性疾患、特に アルツハイマー病 （ＡＤ）は、患者の生活を強く衰弱させる影響を与える。さらに、これらの疾患は、甚大な健康上の、社会的な、および経済的な負担を構成する。ＡＤ は最も一般的な神経変性疾患であり、痴呆の症例全体の約７０%を占め、６５歳超の人口の約１０%および８５歳超の最大４５%が罹患する、おそらく最も破壊的な加齢関連神経変性症状である（最近の総説はＶｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０００， ６０； １３９−１６５を参照）。現在、これは米国、欧州、および日本において推定約１２００万例に達する。この状況は、発展途上国における高齢者数の人口統計上の増加（「ベビーブーマーの高齢化」）に伴い不可避的に悪化する。ＡＤを有する人の脳に生じる神経病理学的な顕著な特徴は、アミロイド−β タンパク質で構成される老人斑、および異常な線維状構造の出現および神経原線維変化の形成と一致して現れる著しい細胞骨格変化である。
【０００３】
アミロイド−β（Ａβ）タンパク質は、さまざまな種類のプロテアーゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の開裂から生じる。β／γ−セクレターゼによる開裂はさまざまな長さのＡβペプチドの形成に繋がり、典型的には、４０アミノ酸から構成される短くより可溶性が高く凝集が遅いペプチド、および細胞外で迅速に凝集し特徴的なアミロイド斑を形成する、より長い４２アミノ酸ペプチドである（Ｓｅｌｋｏｅ， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ ２００１， ８１； ７４１−６６； Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０００， ５； Ｄ７２−８３）。二つの型の斑、すなわちびまん性老人斑と老人斑を、ＡＤ患者の脳に検出することができ、後者は古典的で最も一般的な型である。それらは主に大脳皮質および海馬に見出される。老人斑は直径５０μｍないし２００μｍで、不溶性原線維アミロイド、死滅した神経細胞、神経細胞、小膠細胞、および星状細胞の断片、および、神経伝達物質、アポリポタンパク質Ｅ、グリコサミノグリカン、α１−抗キモトリプシンなどといったその他の構成成分から成る。脳における毒性のＡ(沈着物の生成は、ＡＤの経過のごく早期に開始し、ＡＤの病理に繋がるその後の破壊過程の中心的存在であると論じられている。ＡＤの他の病理学的な顕著な特徴は、神経原線維変化（ＮＦＴｓ）および、ニューピル・スレッドと表現される異常な神経突起である（Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １９９１， ８２； ２３９−２５９）。ＮＦＴｓは神経細胞の内部に出現し、互いに絡まり合う対のらせん状線維を形成する、化学的に変化したタウタンパク質から成る。ＮＦＴｓの形成と共に、神経細胞の喪失を観察することができる。前記の神経細胞喪失は、微小管関連輸送系の損傷が原因である可能性があると議論されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １９９６， １； ３８−５８； Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｒｔｉｇａｎ， Ｊ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ Ｄｉｓ １９９９， １； ３２９−３５１）。神経原線維変化の出現およびその数の増加は、ＡＤの臨床的重症度とよく相関する（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０００， ５５； ３７０−３７６）。
【０００４】
ＡＤは進行性疾患であり、初期の記憶形成の障害を伴い、最終的にはより高次の認知機能の完全な衰退に繋がる。認知障害には、とりわけ、記憶障害、失語症、失認症、および実行機能の喪失がある。ＡＤの病因の特徴的性質は、脳の特定の領域および神経細胞の部分集団の、変性過程に対する選択的な不安定性である。具体的には、側頭葉領域および海馬は、疾患の経過中に早期におよびより重度に冒される。一方、前頭皮質、後頭皮質、および小脳内の神経細胞は大体は損なわれないままであり、神経変性から守られている（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１， １０； １８４−９２）。
【０００５】
ＡＤの発症年齢は５０年の範囲内でさまざまであり、６５歳未満の人で起こる早発型ＡＤ、６５歳超の人で起こる遅発型ＡＤがある。ＡＤの全症例のうち約１０%が早発型 ＡＤに罹患し、１〜２%だけが家族性の遺伝例である。
【０００６】
現在、ＡＤに治癒は無く、ＡＤの進行を止めるか、または高確率で死亡前にＡＤを診断するためさえ、有効な方法は無い。個人がＡＤを発症する素因となるいくつかのリスク因子が特定されており、中でも非常に重要なのは、アポリポタンパク質Ｅ遺伝子（ＡｐｏＥ）の既存の３つの異なる対立遺伝子（イプシロン２、３、および４）のイプシロン４対立遺伝子である（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３， ９０； １９７７−８１； Ｒｏｓｅｓ， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９８， ８５５； ７３８−４３）。他の感受性遺伝子および疾患関連多型を検出する努力は、ヒト第１０および第１２染色体上の特定の領域および遺伝子が遅発型ＡＤと関連している可能性があるという仮定に繋がる（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００， ２９０； ２３０４−５； Ｂｅｒｔｒａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００， ２９０； ２３０３； Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２０００， ６６； ９２２−３２）。
【０００７】
第２１染色体上のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、第１４染色体上のプレセニリン−１、および第１染色体上のプレセニリン−２の遺伝子の遺伝的欠陥によるとされる早発型ＡＤの稀な例が存在するが、遅発型散発性ＡＤの一般的な型は、これまでのところ病因的起源は不明である。現在までに見出された突然変異は、家族性ＡＤの症例の半分しか説明せず、それは全ＡＤ患者の２%に満たない。神経変性疾患の遅い発症および複雑な病因は、治療用および診断用薬の開発に困難な問題をもたらす。医薬標的および診断マーカーの候補のプールを拡大することが極めて重大である。したがって、神経疾患の病因に関する洞察を与えること、およびこれらの疾患の治療の診断および開発に特に適した方法、材料、物質、組成物、および動物モデルを提供することは、本発明の目的である。この目的は、独立した請求項の条項によって解決される。従属項は、本発明の好ましい実施形態を定義する。
【０００８】
ＡＤの病因に関するいくつかの研究は、本疾患を発症する高いリスクを伴う、コレステロールレベルの調節障害の役割を指摘している。これはＡＤを、コレステロール生合成（たとえばスミス・レムリ・オピッツ症候群およびデスモステロール沈着症）またはコレステロールの細胞内輸送（ニーマン・ピック病Ｃ型）のどちらかにおける独特の遺伝子欠陥によって引き起こされる他の神経変性疾患の状況に置く。しかし、後者の症候群および疾患が一つの特定の遺伝子だけの欠陥によって引き起こされる常染色体劣性疾患である一方（総説はＮｗｏｋｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． Ｍｅｔａｂ． ２００１， ７４； １０５−１１９）、ＡＤの遅発型は、浸透度は低いが有病率は高い、広く行き渡った多型によって引き起こされる複雑で遺伝的に不均一な疾患と考えられている（Ｔａｎｚｉ ａｎｄ Ｂｅｒｔｒａｍ， Ｎｅｕｒｏｎ ２００１， ３２； １８１−１８４）。
【０００９】
ＡＤに関しては、初期の顕著な特徴である知見は、ＡｐｏＥアポリポタンパク質の特定の遺伝子、すなわちイプシロン４対立遺伝子が、ＡＤのリスク増大および早期発症と関連していることであった（Ｃｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３， ２６１； ９２１−９２３）。ＡｐｏＥは、血漿および脳の両方で高レベルで見られるリポタンパク質である。末梢組織では（すなわち肝臓の外で）、それはコレステロールにおよびトリグリセリドに富む低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子の分解に関与する。ＡｐｏＥはＬＤＬ受容体と結合することができ、動脈硬化症およびＡＤにおいて異なる対立遺伝子ＡｐｏＥ型の役割を決定するのはこの受容体への結合の親和性である、すなわち、イプシロン２対立遺伝子は血漿中の一定のコレステロール低下効果を有しＡＤのリスク低下と関連する一方、イプシロン４対立遺伝子は血漿コレステロールレベル上昇およびＡＤのリスク上昇と関連する（総説はＧｏｌｄｅ ａｎｄ Ｅｃｋｍａｎ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００１， ６； １０４９−１０５５）。しかし、８５%を超える血漿コレステロールの変動は、キャリアーのＡｐｏＥ遺伝子型とは無関係である（Ｂｒｅｓｌｏｗ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２０００， ３４； ２３３−２５４）。さらに、脳のコレステロールの大部分がｉｎ ｓｉｔｕで合成され（Ｄｉｅｔｓｃｈｙ ａｎｄ Ｔｕｒｌｅｙ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｌｉｐｉｄｏｌ． ２００１， １２； １０５−１１２）、したがって、ＡｐｏＥが脳で果たしている役割は、局地的なコレステロール再分配およびＡＰＰ由来Ａベータ４０／Ａベータ４２−ペプチドの凝集に対する潜在的な直接的効果（Ｍａｈｌｅｙ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８， ２４０； ６２２−６３１； Ｃａｓｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９９５， ３０６； ５９９−６０４）に限られる可能性が高いことが、広く認められている。
【００１０】
近年、膜中のコレステロールレベルおよび／またはコレステロールエステルに対する遊離コレステロールの細胞比が膜流動性に直接的に影響を及ぼし、および、アミロイド前駆体タンパク質の処理に、アルファおよびベータ／ガンマセクレターゼに対抗することによって間接的に影響することが認められている。細胞からのコレステロール減少は、アミロイド形成性ベータ−／ガンマ−セクレターゼ依存性経路を損なう一方、非アミロイド形成性アルファ−セクレターゼ依存性経路に有利に働くことが実証された（Ｇｏｌｄｅ ａｎｄ Ｅｃｋｍａｎ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００１， ６； １０４９−１０５５； Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００１， ５７； １０８９−１０９３； Ｗｏｌｏｚｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２００１， ９８； ５３７１−５３７３； Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２００１， ３； ９０５−９１２）。総合すると、現れる図は、細胞における細胞コレステロールレベルの全体の低下はＡＤの発症に関して有益であるということである。これは、脳を含む全身におけるコレステロールのｄｅ ｎｏｖｏ合成を遮断する薬剤を用いた疫学的研究によって、さらにそしてより強力に支持されている。そのような処置は調査集団におけるＡＤの発生率を著しく低下させた（Ｗｏｌｏｚｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２０００， ５７； １４３９−１４４３； Ｊｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ２０００， ３５６； １６２７−１６３１）。コレステロール降下薬の同じ有益な影響が、ＡＤの実験動物モデルで観察された（Ｒｅｆｏｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｄｉｓ． ２０００， ７； ３２１−３３１； Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ． ２００１， ９８； ５８５６−５８６１）。
【００１１】
脳のコレステロールはｉｎ ｓｉｔｕで合成されるとすると、胆汁酸産生および分泌のための、コレステロールの脳から肝臓への逆輸送の恒常的な機構が必要である。現在の見解は、逆輸送の主要経路は２４−ヒドロキシコレステロール（「セレブロステロール」）の酵素的形成、細胞膜および血液脳関門を越えたその拡散、および抽出、修飾、分泌のための、肝臓への循環を介したその後の輸送を含むということである（Ｄｉｅｔｓｃｈｙ ａｎｄ Ｔｕｒｌｅｙ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｌｉｐｉｄｏｌ． ２００１， １２； １０５−１１２）。 興味深いことに、ＣＹＰ４６は、２４−ヒドロキシコレステロールの形成を触媒する酵素であるが、ほぼ脳組織に限定されて見出され、したがってこの経路の特化した恒常的機能という考えを裏付ける（Ｌuｔｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９６， ９３； ９７９９−９８０４； Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １９９９， ９６； ７２３８−７２４３）。実際、２４−ヒドロキシコレステロールの血漿レベルは、ＡＤを含む神経疾患の重症度マーカーとして示唆されてきている（Ｐａｐａｓｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ２０００， １１； １９５９−６２； Ｂｒｅｔｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． ２０００， ２９３； ８７−９０； Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． ２００１， ３１４； ４５−４８）。
【００１２】
本発明は、ＡＤ脳のさまざまな領域の、大きなよく研究されたファミリーのＡＴＰ結合性カセット輸送体の一員であるが、年齢を合わせた健常対照者の脳には無い、ＡＢＣＡ１の発現の差を開示する。ＡＢＣＡ１は第９染色体上のＡＢＣＡ１遺伝子によってコードされる２２６１アミノ酸のタンパク質である（Ｓａｎｔａｍａｒｉｎａ−Ｆｏｊｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２０００， ９７； ７９８７−７９９２； ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２７５９４８）。ＡＴＰ結合性カセット輸送体は、ＡＴＰ加水分解のエネルギーを利用して、イオン、代謝産物、タンパク質断片、その他といった積荷分子の方向性の膜通過輸送を達成する、膜埋め込み輸送タンパク質のファミリーを構成する。このファミリーのよく知られたメンバーは、ＭＤＲ１、ＴＡＰ、およびＣＦＴＲ輸送体であり、それぞれ多剤耐性、ＭＨＣクラスＩ分子によるペプチド提示、および嚢胞性線維症に関与する（最近の総説は、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ２００１， １１； １１５６−１１６６）。
【００１３】
ＡＢＣＡ１はマクロファージでエネルギー依存性逆コレステロールおよびリン脂質輸送体として作用することが示されている（総説は、Ｏｒａｍ ａｎｄ Ｌａｗｎ， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ． Ｒｅｓ． ２００１， ４２； １１７３−１１７９）。 ＡＢＣＡ１ ｍＲＮＡは下記の組織で見つかった；肝臓、腸、胎盤、脂肪、副腎、マクロファージ、および脾臓（Ｌａｎｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １９９９， ２５７； ２９−３３； Ｃｈａｗｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１， ２９４； １８６６−１８７０）。ＡＢＣＡ１ 遺伝子における突然変異は、タンジール病および家族性高密度リポタンパク質欠損症に繋がる（Ｂｒｏｏｋｓ−Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １９９９， ２２； ３３６−３４５； Ｂｏｄｚｉｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １９９９， ２２； ３４７−３５１； Ｒｕｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １９９９， ２２； ３５２−３５５； Ｏｒａｍ ａｎｄ Ｌａｗｎ， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ． Ｒｅｓ． ２００１， ４２； １１７３−１１７９）。動脈硬化症、冠状動脈疾患、および脂質異常についての、ＡＢＣＡ１の診断マーカーおよび治療標的としての可能性は認められている（ＷＯ００／５５３１８、ＷＯ００／７８９７１、ＷＯ００／７８９７２、ＷＯ００／１８９１２、ＷＯ０１／１５６７６、ＷＯ０１／７０８１０）。しかし、前記神経変性疾患の病理表現型と関連するＡＢＣＡ１遺伝子における突然変異は見つかっておらず、また、現在まで、ＡＢＣＡ１遺伝子発現の調節障害と神経変性疾患、特にＡＤの病因との間の関係を実証することが記載された実験は無い。そのような結びつきは、本発明で開示される通り、特に前記疾患の診断および治療のための新しい方法を提供する。
【００１４】
ここでおよび請求項で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈でそうでないと示されない限り、複数への言及を含む。たとえば、「ａ細胞（一つの細胞）」は複数の細胞をも意味する、など。本明細書および請求項で用いられる「および／または」の語句は、この語句の前および後の語句が選択肢としてまたは組み合わせて考えられるべきであることを示す。たとえば、「レベルおよび／または活性の測定」という言い回しは、レベルだけ、または活性だけ、またはレベルおよび活性の両方が測定されることを意味する。ここで用いられる「レベル」の語は、転写産物、たとえばｍＲＮＡ、または翻訳産物、たとえばタンパク質またはポリペプチドの、量または濃度の尺度または指標を含むことを意図する。ここで用いられる「活性」の語は、転写産物または翻訳産物が生物学的効果を生じる能力についての指標、または、生物学的に活性な分子のレベルの指標と理解すべきである。「活性」の語はまた、酵素活性もいう。ここで用いられる「レベル」および／または「活性」の語はさらに、遺伝子発現レベルまたは遺伝子活性をいう。遺伝子発現は、遺伝子産物の産生に繋がる、転写および翻訳による、遺伝子に含まれる情報の利用と定義される。「調節障害」は遺伝子発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを意味することとする。遺伝子産物はＲＮＡまたはタンパク質のどちらかを含み、遺伝子の発現の結果である。遺伝子産物の量は、遺伝子がどの程度活性であるかを測定するのに用いることができる。本明細書および請求項で用いられる「遺伝子」は、コード領域（エクソン）および非コード領域（たとえばプロモーターまたはエンハンサー、イントロン、リーダーおよびトレーラー配列といった非コード調節配列）の両方を含む。「ＯＲＦ」の語は「オープン・リーディング・フレーム」の頭文字であり、少なくとも１つの読み枠に終止コドンを持たずしたがって潜在的にアミノ酸の配列に翻訳されうる核酸配列をいう。「調節配列」は、遺伝子発現を推進し調節する、誘導性および非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、およびその他の配列を含む。ここで用いられる「断片」の語は、たとえば択一的にスプライシングされ、または短縮され、またはさもなければ切断された転写産物または翻訳産物を含むことを意図する。ここで用いられる「誘導体」の語は、突然変異体、またはＲＮＡ改変された、または化学的に修飾された、または別の方法で改変を受けた翻訳産物をいう。たとえば、「誘導体」は、変化したリン酸化、またはグリコシル化、またはアセチル化、または脂質化といった過程によって、または変化したシグナルペプチド開裂またはその他の型の成熟開裂によって生じうる。これらの過程は翻訳後に起こりうる。本発明および請求項で用いられる「調節因子」の語は、遺伝子、または遺伝子の転写産物、または遺伝子の翻訳産物のレベルおよび／または活性を変化または改変することができる分子をいう。好ましくは、「調節因子」は、遺伝子の転写産物または翻訳産物の生物学的活性を変化または改変することができる。前記の調節は、たとえば、酵素活性の上昇または低下、結合特性の変化、または遺伝子の前記翻訳産物の生物学的、機能的、または免疫学的性質の何らかのその他の変化または改変でありうる。「物質」、「試薬」、または「化合物」の語は、細胞、組織、体液に対して、または任意の生物学的系または被験分析系の背景内で、正または負の生物学的効果を有する任意の物質、化学物質、組成物または抽出物をいう。それらは標的の作用因子、拮抗因子、部分的作用因子または逆作用因子であることができる。そのような物質、試薬、または化合物は、核酸、天然または合成ペプチドまたはタンパク質複合体、または融合タンパク質でありうる。それらはまた、抗体、有機または無機分子または組成物、小分子、薬物、および上の前記物質のうち任意のものの任意の組み合わせでありうる。それらは診断のまたは治療の目的のための試験に用いることができる。「オリゴヌクレオチドプライマー」または「プライマー」の語は、相補的塩基対のハイブリダイゼーションによって、与えられた標的ポリヌクレオチドとアニーリングすることができ、ポリメラーゼによって伸長することができる、短い核酸配列をいう。それらは特定の配列に対して特異的であるように選択することができ、または任意に選択することができ、たとえばそれらはある混合物中のすべての可能な配列のプライマーとなることができる。ここで用いられるプライマーの長さは１０ヌクレオチドから８０ヌクレオチドまで変動しうる。「プローブ」はここで記載および開示される核酸配列の短い核酸配列またはそれと相補的である配列である。それらは完全長配列、または断片、誘導体、アイソフォーム、または任意の配列の変異体を含むことができる。プローブと分析試料との間のハイブリダイゼーションの同定は、試料内の他の類似配列の存在の検出を可能にする。ここで用いられる「ホモログまたはホモロジー」は、ヌクレオチドまたはペプチド配列の別のもう一つのヌクレオチドまたはペプチド配列との関係性を表す本分野の語であり、比較される前記配列間の同一性および／または類似性の程度によって測定される。ここで用いられる「変異体」の語は、本発明で開示されたポリペプチドおよびタンパク質に関して、Ｎ末端および／またはＣ末端に、および／または本発明の天然のポリペプチドまたはタンパク質の天然のアミノ酸配列中に１個以上のアミノ酸が付加されたおよび／または置換されたおよび／または欠失したおよび／または挿入された、任意のポリペプチドまたはタンパク質をいう。さらに、「変異体」の語は、ポリペプチドまたはタンパク質の任意のより短いかまたはより長い形を含む。「変異体」はまた、ＡＢＣＡ１遺伝子のアミノ酸配列と少なくとも約８０%配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０%配列同一性、および非常に好ましくは少なくとも約９５%配列同一性を有する配列も含む。タンパク質分子の「変異体」は、たとえば、高度に保存された領域に保存されたアミノ酸置換を有するタンパク質を含む。本発明の「タンパク質およびポリペプチド」は、ＡＢＣＡ１のアミノ酸配列を構成するタンパク質の変異体、断片、および化学的誘導体を含む。それらは、天然から単離することができるかまたは、組み換えおよび／または合成の方法によって製造することができるタンパク質およびポリペプチドを含む。天然タンパク質またはポリペプチドは、天然に存在する短縮型または分泌型、天然に存在する変異型（たとえばスプライス変異体）および天然に存在する対立遺伝子変異体をいう。ここで用いられる「単離された」の語は、天然の環境から取り出された、すなわち通常存在する細胞からまたは生体から単離され、そして天然で付随して見出される共存成分から分離されたかまたは本質的に精製された分子をいうと考えられる。この概念はさらに、そのような分子をコードする配列を人間の手で、自然状態では結合していないポリヌクレオチドと結合させることができること、そしてそのような分子を組み換えおよび／または合成の方法によって製造することができることを意味する。前記の目的のためにそれらの配列が、当業者に既知である方法によって生体または死んだ生物に導入されても、そしてそれらの配列が前記生物中にまだ存在していても、それらはなお単離されていると考えられる。本発明では、「リスク」、「感受性」、および「素因」の語は同等であり、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を発症する確率に関して用いられる。
【００１５】
「ＡＤ」の語はアルツハイマー病を意味する。ここで用いられる「ＡＤ型神経病理」は、本発明に記載されている通りの、および最先端の文献から一般に既知である通りの、神経病理学的、神経生理学的、組織病理学的、および臨床的な顕著な特徴をいう（Ｉｑｂａｌ， Ｓｗａａｂ， Ｗｉｎｂｌａｄ ａｎｄ Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ， 『アルツハイマー病と関連疾患（疫学、病因論および治療薬）』（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ （Ｅｔｉｏｌｏｇｙ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ））， Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， １９９９； Ｓｃｉｎｔｏ ａｎｄ Ｄａｆｆｎｅｒ， 『アルツハイマー病の早期診断』（Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ２０００； Ｍａｙｅｕｘ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎ， 『アルツハイマー病の疫学：遺伝子から予防まで』（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ； Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９； Ｙｏｕｎｋｉｎ， Ｔａｎｚｉ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎ， 『プレインスリンとアルツハイマー病』（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎｓ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ`ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９８を参照）。
【００１６】
本発明に記載の神経変性疾患または障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病、前頭側頭性痴呆症、進行性核麻痺、大脳皮質基底核変性症、脳血管性痴呆症、多系統変性症、嗜銀性顆粒痴呆症およびその他のタウオパシー、および軽度の認知障害を含む。神経変性過程を含むその他の症状は、たとえば、加齢黄斑変性、ナルコレプシー、運動神経細胞疾患、プリオン病、外傷性神経損傷および修復、および多発性硬化症である。
【００１７】
一態様では、本発明は、被験者において神経変性疾患を診断または予測診断する、または被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する方法に関する。その方法は；前記被験者由来の試料中の（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定すること、および、前記レベル、および／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記被験者において前記神経変性疾患を診断または予測診断すること、または前記被験者がを発症する高いリスクがあるかどうかを判定することを含む。
【００１８】
本発明はまた、本発明に開示される通り、核酸配列、またはその断片、または変異体に独自のプライマーおよびプローブの構築および使用に関する。そのオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、蛍光、生物発光、磁性、または放射性物質で特異的に標識することができる。本発明はさらに、適当な組み合わせの前記特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いた、前記核酸配列、またはその断片および／または変異体の検出および製造に関する。ＰＣＲ分析は、当業者によく知られた方法であるが、核酸を含む試料から前記遺伝子特異的核酸配列を増幅するために、前記プライマーの組み合わせを用いて実施することができる。そのような試料は、健常者または患者のどちらかから得ることができる。増幅の結果として特定の核酸産物を生じるかどうか、および異なる長さの断片を得ることができるかどうかは、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を示しうる。このように、本発明は、調べる核酸配列を含む任意の試料中の、神経変性疾患、特にアルツハイマー病と関連している可能性がある、遺伝子突然変異および一塩基多型の検出に有用な、少なくとも長さ１０塩基、最大でコードおよび遺伝子配列全体の、核酸配列、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを提供する。この機能は、好ましくはまたキットの形式である、ＤＮＡに基づく迅速診断検査を開発するために有用である。
【００１９】
別の一態様では、本発明は被験者における神経変性疾患の進行を監視する方法に関する。前記被験者由来の試料中の（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定する。前記レベル、および／または前記活性を既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較する。それによって前記被験者において前記神経変性疾患の進行を監視する。
【００２０】
さらに別の一態様では、本発明は、前記疾患について治療されている被験者由来の試料中の（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を測定することを含む、神経変性疾患の治療を評価する方法に関する。前記レベル、または前記活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記神経変性疾患の治療を評価する。
【００２１】
ここで請求される本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、分析法、および使用の好ましい一実施形態では、ＡＢＣＡ１をコードする前記遺伝子は、ＡＴＰ結合性カセット１、ＡＢＣ輸送体１（ＡＢＣ−１）またはコレステロール排出制御タンパク質（ＣＥＲＰ）ともいう、ヒトＡＴＰ結合性カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）をコードする遺伝子であり、配列番号１で表される（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｏ９５４７７；ｍＲＮＡＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２８５１６７、ＡＦ２８５１６７の前記ｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２７５９４８およびＧｅｎＢａｎｋデータベースからのＥＳＴｓに従って訂正されている）。
【００２２】
ここで請求される本発明の方法、キット、組み換え動物、分子、分析法、および使用の別の好ましい一実施形態では、前記神経変性疾患または障害はアルツハイマー病であり、前記被験者はアルツハイマー病患者である。
【００２３】
本発明は、ＡＤ患者の特定の脳領域におけるＡＢＣＡ１遺伝子の検出および発現の差および調節を開示する。結果として、ＡＢＣＡ１遺伝子およびその対応する転写および／または翻訳産物は、ＡＤで典型的に観察される局所性選択的神経細胞変性の原因的な役割を有する可能性がある。あるいは、ＡＢＣＡ１は残りの生存神経細胞に神経保護機能を与える可能性がある。これらの開示に基づき、本発明は、診断評価および予測診断のために、および神経変性疾患、特にＡＤの素因の検出に有用である。さらに、本発明は、そのような疾患のための治療を受けている患者の診断的監視のための方法を提供する。
【００２４】
分析および測定する前記試料は、脳組織、またはその他の組織、器官、または体細胞を含む群から選択されるのが特に好ましい。試料はまた、脳脊髄液または、唾液、尿、血液、血清、血漿、または粘液を含むその他の体液を含むことができる。好ましくは、本発明に記載の神経変性疾患の診断、予測診断、進行の監視、または治療の評価は、体外で実施することができ、そしてそのような方法は好ましくは、たとえば、被験者または患者から摘出、採取、または単離された体液または細胞といった試料に関する。
【００２５】
さらに好ましい実施形態では、前記参照値は、前記神経変性疾患に罹患していない被験者由来の試料中の（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方の値である。
【００２６】
好ましい実施形態では、既知の健康状態を表す参照値に対する、前記被験者に由来する試料細胞または組織中のＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物の、および／またはＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物の、および／またはその断片、または誘導体、または変異体のレベルおよび／または活性の変化が、神経変性疾患、特にＡＤに罹患する診断、または予測診断、または高リスクを示す。
【００２７】
好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物のレベルの測定は、被験者の試料から抽出されたＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡに由来する前記遺伝子特異的配列を増幅するために、プライマーの組み合わせを用いた定量的ＰＣＲ分析を使用して、被験者由来の試料で実施される。前記遺伝子に特異的なプローブを用いたノーザンブロットもまた適用することができる。チップを基礎とするマイクロアレイ技術によって転写産物を測定することがさらに好ましい。これらの手法は当業者に既知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， 『分子クローニング：実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１； Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．， 『マイクロアレイバイオチップ技術』（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ， ２０００を参照）。免疫測定法の一例は、特許出願ＷＯ０２／１４５４３に開示され記載される通り、酵素活性の検出および測定である。
【００２８】
さらに、ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物のおよび／または前記翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベルおよび／または活性、および／または、前記翻訳産物および／またはその断片、または誘導体、または変異体の活性のレベルは、免疫測定法、活性測定法、および／または結合測定法によって検出することができる。これらの測定法は、前記タンパク質分子と抗タンパク質抗体との間の結合の量を、抗タンパク質抗体かまたはその抗タンパク質抗体と結合する二次抗体のどちらかに結合した、酵素、色力学、放射性、磁性、または発光標識を用いることによって測定することができる。加えて、他の高親和性リガンドを用いることができる。使用することができる免疫測定法は、たとえばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および当業者に既知のその他の技術を含む（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， 『抗体：実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９およびＥｄｗａｒｄｓ Ｒ， 『免疫診断：実際的手法』（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ； Ｅｎｇｌａｎｄ， １９９９を参照）。これらの検出方法すべてはまた、マイクロアレイ，タンパク質アレイ，抗体マイクロアレイ，組織マイクロアレイ，電子バイオチップ、またはタンパク質チップを基礎とする技術の形式で使用することができる（Ｓｃｈｅｎａ Ｍ．， 『マイクロアレイバイオチップ技術』（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ， ２０００）。
【００２９】
好ましい一実施形態では、前記疾患の進行を監視するため、ある期間にわたって前記被験者から採取された一連の試料中の（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物の、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物の、および／または（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体のレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が比較される。さらに好ましい実施形態では、前記被験者は前記試料収集の１回以上の前に治療を受ける。さらに別の好ましい一実施形態では、前記レベルおよび／または活性は、前記被験者の前記治療の前および後に測定される。
【００３０】
別の一態様では、本発明は被験者において神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、または神経変性疾患、特にＡＤを発症する傾向または素因を判定するためのキットを扱い、前記キットは下記を含む；
（ａ）（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬、から成る群から選択された少なくとも１つの試薬；および
（ｂ）
−前記被験者に由来する試料中の、ＡＢＣＡ１遺伝子の前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出すること；および
−神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、またはそのような疾患を発症する傾向または素因を判定すること
による、神経変性疾患、特にＡＤを診断するかまたは予測診断する、またはそのような疾患を発症する傾向または素因を判定するための指示
であって、既知の健康状態を表す参照値と比較した前記転写産物および／または前記翻訳産物の、変化したレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方；または既知の健康状態を表す参照値と同様であるかまたは等しい、前記転写産物および／または前記翻訳産物の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方が、神経変性疾患、特にＡＤの診断または予測診断、またはそのような疾患を発症する高い傾向または素因を示す。本発明に記載のキットは、神経変性疾患、特にＡＤを発症するリスクがある人の特定に特に有用である可能性がある。結果として、本発明に記載のキットは、疾患経過の不可逆的損傷が与えられる前に、特定された人を疾患の発症前の早期予防処置または治療的介入の対象とする方法となりうる。さらに、好ましい実施形態では、本発明で扱うキットは、被験者において神経変性疾患、特にＡＤの進行を監視、および前記被験者のそのような疾患について治療的処置の成功または失敗を監視するのに有用である。
【００３１】
別の一態様では、本発明は、（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方に直接的にまたは間接的に影響を及ぼす、治療的にまたは予防的に有効な量の一または複数の物質の前記被験者への投与を含む、被験者において神経変性疾患、特にＡＤを治療または予防する方法に関する。前記物質は小分子を含むことができ、またはペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドを含むこともできる。前記ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドは、ＡＢＣＡ１、またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする遺伝子の翻訳産物のアミノ酸配列を含むことができる。本発明に記載の、神経変性疾患、特にＡＤを治療するかまたは予防するための物質はまた、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドから成ることができる。前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ＡＢＣＡ１をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を、センス方向かまたはアンチセンス方向のどちらかで含むことができる。
【００３２】
好ましい実施形態では、本方法は前記の一または複数の物質を投与するための遺伝子治療および／またはアンチセンス核酸技術の本質的に既知である方法の応用を含む。一般的に、遺伝子治療はいくつかの手法を含む；変異遺伝子の分子的置換、治療用タンパク質の合成を結果として生じる新しい遺伝子の付加、および組み換え発現方法によるかまたは薬剤による内因性細胞遺伝子発現の調節。遺伝子導入法は詳細に記載されており（たとえばＢｅｈｒ， Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １９９３， ２６； ２７４−２７８およびＭｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３， ２６０； ９２６−９３１を参照）、機械的マイクロインジェクションといった直接的遺伝子導入法、および生物ベクター（組み換えウイルス、特にレトロウイルスのような）またはモデルリポソームを用いる間接的方法、またはＤＮＡのポリカチオンとの共沈を用いた遺伝子導入に基づく方法、化学的（溶媒、界面活性剤、ポリマー、酵素）または物理的手段（機械的、浸透圧、熱、電気ショック）による細胞膜の不安定化を含む。出生後の中枢神経系への遺伝子導入は詳細に記載されている（たとえば Ｗｏｌｆｆ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９３， ３； ７４３−７４８を参照）。
【００３３】
特に、本発明は、アンチセンス核酸治療、すなわちある種の重要な細胞へのアンチセンス核酸またはその誘導体の導入による、不適切に発現されたかまたは欠陥のある遺伝子のダウンレギュレーションを用いた、神経変性疾患を治療するかまたは予防する方法に関する（たとえばＧｉｌｌｅｓｐｉｅ， ＤＮ&Ｐ １９９２， ５； ３８９−３９５； Ａｇｒａｗａｌ ａｎｄ Ａｋｈｔａｒ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９５， １３； １９７−１９９； Ｃｒｏｏｋｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２， １０； ８８２−６を参照）。ハイブリダイゼーション戦略以外に、リボザイム、すなわち酵素として作用するＲＮＡ分子の、疾患のメッセージを運ぶＲＮＡを破壊する適用もまた記載されている（たとえば Ｂａｒｉｎａｇａ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３， ２６２； １５１２−１５１４を参照）。好ましい実施形態では、治療される被験者はヒトであり、治療的アンチセンス核酸またはその誘導体はＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の転写産物に対して向けられる。被験者の中枢神経系、好ましくは脳の細胞は、そのような方法で治療されるのが好ましい。細胞透過は、アンチセンス核酸およびその誘導体のキャリアー粒子へのカップリング、または上記の方法といった既知の戦略によって実施することができる。標的化した治療用オリゴデオキシヌクレオチドを投与するための戦略は当業者に既知である（たとえばＷｉｃｋｓｔｒｏｍ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９２， １０； ２８１−２８７を参照）。一部の場合では、輸送は単なる局所投与によって実施することができる。別の手法はアンチセンスＲＮＡの細胞内発現を指示する。この戦略では、細胞は標的核酸の領域と相補的であるＲＮＡの合成を指示する組み換え遺伝子を用いてｅｘ ｖｉｖｏで形質転換される。細胞内で発現されたアンチセンスＲＮＡの治療的使用は、手続的に遺伝子治療と同様である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としてさまざまに知られる、二本鎖ＲＮＡを用いて遺伝子の細胞内発現を調節する近年開発された方法は、核酸治療のもう一つの有効な手法である可能性がある（Ｈａｎｎｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２００２， ４１８； ２４４−２５１）。
【００３４】
さらに好ましい実施形態では、本方法は前記被験者の中枢神経系、好ましくは脳に、ドナー細胞、または好ましくは移植片拒絶を最小化または低減するように処理されたドナー細胞を移植することを含み、前記ドナー細胞は前記一または複数の物質をコードする少なくとも１つの導入遺伝子の挿入によって遺伝子組み換えされている。前記導入遺伝子は、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって運ばれうる。導入遺伝子は、導入遺伝子をコードするＤＮＡの非ウイルス物理的遺伝子導入によって、特にマイクロインジェクションによってドナー細胞へ挿入することができる。導入遺伝子の挿入はまた、エレクトロポレーション、化学的媒介遺伝子導入、特にリン酸カルシウム遺伝子導入またはリポソーム媒介遺伝子導入によっても実施することができる（Ｍｃ Ｃｅｌｌａｎｄ ａｎｄ Ｐａｒｄｅｅ， 『発現遺伝学：迅速および高処理量法』（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ； Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ａｎｄ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ）， Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ， １９９９を参照）。
【００３５】
好ましい実施形態では、神経変性疾患、特にＡＤを治療または予防するための前記物質は、対象細胞を前記被験者に導入し、ここで前記対象細胞は前記治療用タンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで処理されており、前記対象細胞がｉｎ ｖｉｖｏで前記被験者において治療的に有効な量の前記治療用タンパク質を発現することを含む過程によって、前記被験者、好ましくはヒトに投与することができる治療用タンパク質である。前記ＤＮＡ断片は、前記細胞へｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって挿入することができる。
【００３６】
本発明に記載の、治療の方法は、前記の細胞治療的および遺伝子治療的方法の任意のものと組み合わせた、治療的クローニング、移植、および胚性幹細胞または胚性生殖細胞および神経細胞性成体幹細胞を用いた幹細胞治療の適用を含む。幹細胞は全能性または多能性でありうる。それらはまた器官特異性でもありうる。罹患および／または損傷した脳細胞または組織を修復する戦略は、（ｉ）ドナー細胞を成体組織から採取することを含む。これらの細胞の核は、遺伝物質が除去されている未受精卵細胞に移植される。胚性幹細胞は、体細胞核移植を受けた細胞の胚盤胞期から単離される。その時、分化因子の使用は、特化した細胞型、好ましくは神経細胞への幹細胞の分化誘導に繋がる（Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９９， ９； ９７５−９７７）、または（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大およびその後の移植のために、中枢神経系、または骨髄（間葉性幹細胞）から単離された成体幹細胞を精製する、または（ｉｉｉ）内因性神経幹細胞を直接、増殖、移動、および機能する神経細胞へ分化するように誘導する（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＤＡ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００２， ２； ３４−４２）。成体脳の胚中心は神経細胞損傷または機能障害が存在しないように、成体神経幹細胞は、損傷したかまたは罹患した脳組織を修復する大きな可能性がある（Ｃｏｌｍａｎ Ａ， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｌｄ ２００１， ７； ６６−７１）。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明に記載の治療または予防の被験者は、ヒト、実験動物、たとえばマウスまたはラット、家畜、または非ヒト霊長類であることができる。実験動物は、神経変性疾患の動物モデル、たとえばＡＤ型神経病理を有する遺伝子導入マウスおよび／またはノックアウトマウスであることができる。
【００３８】
別の一態様では、本発明は、（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも１つの物質の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方の調節因子に関する。
【００３９】
別の一態様では、本発明は、前記 調節因子 および好ましくは医薬キャリアーを含む医薬組成物に関する。前記 キャリアーは、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または調節因子と共に投与する媒体に関する。
【００４０】
別の一態様では、本発明は、医薬組成物における使用のための（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも１つの物質の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方の調節因子に関する。
【００４１】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特に ＡＤを治療するかまたは予防するための薬剤の調製のための（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される少なくとも１つの物質の、レベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方の調節因子の使用を提供する。
【００４２】
一態様では、本発明はまた、治療的にまたは予防的に有効な量の前記医薬組成物を詰めた一種類以上の容器を含むキットを提供する。
【００４３】
別の一態様では、本発明はＡＢＣＡ１またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする非天然遺伝子配列を含む組み換え非ヒト動物に関する。前記組み換え非ヒト動物の作製は、（ｉ）前記遺伝子配列および選択可能なマーカー配列を含む遺伝子ターゲッティング構築物を提供すること、および（ｉｉ）前記ターゲッティング構築物を非ヒト動物の幹細胞へ導入すること、および（ｉｉｉ）前記非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚へ導入すること、および（ｉｖ）前記胚を偽妊娠非ヒト動物へ移植すること、および（ｖ）前記胚を満期まで発生させること、および（ｖｉ）ゲノムが両方の対立遺伝子に前記遺伝子配列の修飾を含む遺伝子改変非ヒト動物を特定すること、および（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子改変非ヒト動物を繁殖させて、ゲノムが前記内因性遺伝子の修飾を含み、前記遺伝子が発現していない、または低発現である、または過剰発現である、および前記破壊または改変の結果として神経変性疾患、特にＡＤと類似した神経病理の症状を発症する素因を示す遺伝子改変非ヒト動物を得ることを含む。そのような動物の作製および構築は当業者に既知である（たとえばＣａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８９， ２４４； １２８８−１２９２ ａｎｄ Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， 『マウス胚操作：実験の手引き』（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ａｂｂｏｔｔ，『マウス遺伝学および遺伝子組み換え：実践的手法』（Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， １９９９を参照）。そのような組み換え非ヒト動物を、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を調べるための動物モデルとして利用することが好ましい。そのような動物は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬および治療薬の開発において、化合物，物質、および調節因子を、スクリーニング、試験、および評価するのに有用である可能性がある。
【００４４】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤの調節因子、または（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される一種類以上の物質の、関連する疾患および異常のスクリーニングのための測定法に関する。このスクリーニング方法は下記を含む、（ａ）細胞を被験化合物と接触させること、および（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性、またはレベル、または活性およびレベルの両方を測定すること、および（ｃ）前記被験化合物と接触させていない対照細胞中の前記物質の、活性、またはレベル、または活性およびレベルの両方を測定すること、および（ｄ）段階（ｂ）と（ｃ）の細胞中の物質のレベルを比較するが、接触させた細胞中の前記物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患および障害の調節因子であることを示す。
【００４５】
別の一態様では、本発明は、神経変性疾患、特にＡＤの調節因子、または（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体から成る群から選択される一種類以上の物質の、関連する疾患および異常のスクリーニング測定法を扱い、下記を含む：（ａ）神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している被験動物に被験化合物を投与すること、および（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること、および（ｃ）等しく前記疾患の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している、そのような被験化合物が投与されていない、一致した対照動物における前記物質の活性および／またはレベルを測定すること、および（ｄ）段階（ｂ）と（ｃ）の動物における物質の活性および／またはレベルを比較するが、被験動物における物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患および障害の調節因子であることを示す。
【００４６】
好ましい一実施形態では、前記被験動物および／または前記対照動物は、ＡＢＣＡ１、またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする、天然のＡＢＣＡ１遺伝子転写調節配列ではない転写調節配列の調節下にある遺伝子を発現する組み換え非ヒト動物である。
【００４７】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述のスクリーニング測定の方法によって神経変性疾患の調節因子を特定する、および（ｉｉ）調節因子を医薬キャリアーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記調節因子はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定することができる。
【００４８】
別の一態様では、本発明は、リガンドと、ＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体との間の結合の阻害について、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法を提供する。前記スクリーニング測定法は、（ｉ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える、および（ｉｉ）前記阻害についてスクリーニングする一または複数の化合物を前記複数の容器に加える、および（ｉｉｉ）検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドを前記容器に加える、および（ｉｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記一または複数の化合物、および前記検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドをインキュベートする、および（ｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物に、またはその前記断片、または誘導体、または変異体に結合した蛍光の量を測定する、および（ｖｉ）前記リガンドの、前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への結合の、一種類以上の前記化合物による阻害の程度を測定する段階を含む。リガンドと前記ＡＢＣＡ１翻訳産物との間の結合の阻害を測定するためには、前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体を、人工リポソーム中に再構成し、対応するプロテオリポソームを作製するのが好ましい可能性がある。界面活性剤からリポソームへのＡＴＰ結合性カセット輸送体の再構成の方法は当業者に既知である（Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９９， ２６５； ２８１−２８９； Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０００， ２７５； ２０３９９−２０４０５）。蛍光標識リガンドを利用する代わりに、一部の態様では、当業者に既知である任意のその他の検出可能な標識、たとえば放射性標識を用い、それをしかるべく検出するのが好ましい可能性がある。前記方法は、新規化合物の同定に、およびＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体へのリガンドの結合を阻害する能力が改良されたかまたはそうでなければ最適化された化合物を評価するために有用である可能性がある。キャリアー粒子の使用を基礎としたこの場合の蛍光結合測定法の一例は、特許出願ＷＯ００／５２４５１に開示され記載されている。別の一例は、特許ＷＯ０２／０１２２６に記載された競合測定法である。本発明のスクリーニング測定法のために好ましいシグナル検出方法は、下記の特許出願に記載されている；ＷＯ９６／１３７４４、ＷＯ９８／１６８１４、ＷＯ９８／２３９４２、ＷＯ９９／１７０８６、ＷＯ９９／３４１９５、ＷＯ００／６６９８５、ＷＯ０１／５９４３６、ＷＯ０１／５９４１６。
【００４９】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述の阻害結合測定法によって、化合物を、リガンドとＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の遺伝子産物との間の結合の阻害因子として特定する、および（ｉｉ）その化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、前記化合物はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定できる可能性がある。
【００５０】
別の一態様では、本発明は、ＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体との前記化合物の結合の程度を測定する、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法に関する。前記スクリーニング測定法は、（ｉ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える、および（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングする一または複数の化合物を前記複数の容器に加える、および（ｉｉｉ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記一または複数の蛍光標識化合物をインキュベートする、および（ｉｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物と、またはその前記断片、または誘導体、または変異体と結合した蛍光の量を測定する、および（ｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への、一種類以上の前記化合物による結合の程度を測定する段階を含む。この型の測定では、蛍光標識を用いるのが好ましい。しかし、任意の他の種類の検出可能な標識もまた使用することができる。またこの型の測定法では、ＡＢＣＡ１翻訳産物またはその断片、または誘導体、または変異体を、本発明に記載の通りの人工リポソーム中に再構成するのが好ましい可能性がある。前記測定方法は、新規化合物の同定に、およびＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体へ結合する能力が改良されたかまたはそうでなければ最適化された化合物を評価するために有用である可能性がある。
【００５１】
別の一実施形態では、本発明は、（ｉ）前述の結合測定法によって、ＡＢＣＡ１遺伝子の遺伝子産物への結合因子として化合物を特定する、および（ｉｉ）その化合物を医薬キャリヤーと混合する段階を含む、薬剤を製造する方法を提供する。しかし、しかし、前記化合物はまた、他の種類のスクリーニング測定法によっても特定できる可能性がある。
【００５２】
別の一実施形態では、本発明は、ここで請求するスクリーニング測定法に記載の方法のうち任意のものによって得ることができる薬剤を提供する。別の一実施形態では、本発明は、ここで請求するスクリーニング測定法に記載の方法のうち任意のものによって得られた薬剤を提供する。
【００５３】
本発明は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断標的としての使用のための、配列番号１に示されるタンパク質分子、ＡＴＰ結合性カセット輸送体ＡＢＣＡ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする遺伝子の翻訳産物である前記タンパク質分子に関する。
【００５４】
本発明はさらに、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防、または治療、または改善する試薬または化合物についてのスクリーニング標的としての使用のための、配列番号１に示されるタンパク質分子、ＡＴＰ結合性カセット輸送体ＡＢＣＡ１タンパク質、またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする遺伝子の翻訳産物である前記タンパク質分子に関する。
【００５５】
本発明は、免疫原と特異的に免疫反応する抗体を扱い、ここで前記免疫原は配列番号１に示されるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体である。その免疫原は、配列番号１の免疫原性または抗原性のエピトープまたは部分を含むことができ、ここで前記免疫原性または抗原性部分はポリペプチドであり、および前記ポリペプチドは抗体反応を動物において導き、前記ポリペプチドは前記抗体によって免疫特異的に結合している。抗体を作製する方法は当該分野でよく知られている（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， 『抗体−実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８を参照）。本発明で使用される「抗体」の語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、組み換え、抗イディオタイプ、ヒト化、または一本鎖抗体、およびその断片といった、当該分野で既知のすべての型の抗体を包含する（Ｄｕｂｅｌ ａｎｄ Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，『組み換え抗体』（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９９９を参照）。本発明の抗体は、たとえば（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，『抗体利用：実験の手引き』（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９９およびＥｄｗａｒｄｓ Ｒ．，『免疫診断法：実践的手法』（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， １９９９を参照）、酵素免疫測定法（たとえば酵素結合免疫吸収測定法、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、化学発光免疫測定法、ウェスタンブロット、免疫沈降法、および抗体マイクロアレイといった、最先端の方法を基礎とするさまざまな診断および治療方法で有用である。これらの方法は、ＡＢＣＡ１遺伝子、またはその断片、または誘導体、または変異体の翻訳産物の検出を含む。
【００５６】
本発明の好ましい一実施形態では、前記抗体は被験者に由来する試料中の細胞の病理状態を検出するのに用いることができ、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学染色を含み、ここで既知の健康状態を表す細胞と比較した前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化は、前記細胞の病理状態を示す。好ましくは、その病理状態は神経変性疾患、特にＡＤに関係する。細胞の免疫細胞化学染色は、当該分野でよく知られたいくつかの異なる実験法によって実施することができる。しかし、抗体結合の検出には自動化法を適用するのが好ましく、ここで、細胞の染色の程度の判定、または細胞の細胞染色または細胞成分染色のパターンの判定、または細胞表面上または細胞内のオルガネラおよびその他の細胞下構造の間の抗原のトポロジカルな分布は、米国特許第６１５０１７３号に記載の方法に従って実施される。
【００５７】
本発明のその他の特性および利点は、例証に過ぎずいかなる方法でも開示の残りを制限しないことを意図する下記の図および実施例の説明から明らかになる。
【００５８】
図１は、ＡＤにおける神経細胞の喪失および変性に対する選択的不安定性を有する脳領域を表す。主に、下側頭葉、嗅内皮質、海馬、および小脳扁桃の中の神経細胞が、ＡＤにおいて変性過程を受ける（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １９８１， １０；１８４−１９２）。これらの脳領域は大部分が学習および記憶機能の処理に関与する。対照的に、前頭皮質、後頭皮質、および小脳の中の神経細胞は概ね無傷で、ＡＤにおいて神経変性過程から保護されたままである。ＡＤ患者および同年齢の対照健常者の前頭皮質（Ｆ）、側頭皮質（Ｔ）、および海馬（Ｈ）に由来する脳組織を、ここで開示する実施例に使用した。例示目的で、Ｓｔｒａｎｇｅによる発表から正常健康脳の画像を取った（Ｂｒａｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９９２， ｐ．４）。
【００５９】
図２および３は、ＡＤ脳組織におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現の差を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって実証する。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取したＲＮＡ試料（図２ａ）、およびＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および海馬（Ｈ）に由来する試料（図３ａ）からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量を、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）迅速熱サイクル法によって実施した。同様に、同年齢の対照健常者の試料を比較した（図２ｂは前頭皮質および側頭皮質、図３ｂは前頭皮質および海馬）。データは、遺伝子発現レベルに有意差を示さなかった標準遺伝子の組の平均値の組み合わせについて正規化した。前記標準遺伝子の組は、シクロフィリンＢ、リボソームタンパク質Ｓ９、トランスフェリン受容体、ＧＡＰＤＨ、およびベータアクチンの遺伝子から成った。図は、蛍光によって標識された増幅された物質の量に対してサイクル数をプロットすることによって、増幅の動力学を示す。反応の指数期の間、対照健常者の前頭皮質および側頭皮質、および対照健常者の前頭皮質および海馬、のそれぞれ両方に由来するＡＢＣＡ１ｃＤＮＡの増幅動力学は並列しており（図２ｂおよび３ｂ、矢印）、一方、アルツハイマー病では（図２ａおよび３ａ、矢印）対応する曲線の有意な分離があり、分析した脳領域のそれぞれでＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の発現の差を示していることに注意する。
【００６０】
図４は、ここで使用したＲＴ−ＰＣＲプライマー配列の、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２８５１６７、ＡＦ２８５１６７の前記配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２７５９４８およびＧｅｎＢａｎｋデータベースからの対応するＥＳＴｓに従って訂正されている）のヌクレオチド配列との図式的整列を図示する。例示目的で、エクソン１およびエクソン５０だけが描かれている；ポリＡ；ポリアデニル化部位；プライマーは矢印および位置番号付けによって示される
【００６１】
図５は、ＡＢＣＡ１プライマー対の、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のヌクレオチドに対する正確なヌクレオチド配列整列の概略を示す（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２８５１６７、ＡＦ２８５１６７の前記配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２７５９４８およびＧｅｎＢａｎｋデータベースからの対応するＥＳＴｓに従って訂正されている）。
【００６２】
図６は、配列番号１、すなわち２２６１アミノ酸を含むヒトＡＢＣＡ１のポリペプチド配列を開示する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｏ９５４７７）。[図１]
【００６３】
図７は、抗ＡＢＣＡ１ウサギ（赤色シグナル）および抗ＡＢＣＡ１ヤギ（緑色シグナル）ポリクローナル抗体を用いて二重標識したヒト大脳皮質を示す。ＡＢＣＡ１の免疫反応性は中心前皮質（ＣＴ）および白質（ＷＭ）の両方で検出された（図７ａ、低倍率）。皮質では、ＡＢＣＡ１免疫反応性は神経細胞体およびグリア細胞体、および内皮細胞に観察された。ＡＢＣＡ１免疫反応性は細胞質中におよび原形質膜に結合して存在することが見出された（図７ｂ、高倍率）。使用した抗体の両方が高度に重複したシグナルを示し、重複する免疫特異性を示唆した。青色シグナルはＤＡＰＩで染色した核を示す。
【００６４】
表１は、内部参照番号Ｐ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１７、Ｐ０１９（１．１８ないし２．９９倍）で特定されるアルツハイマー病患者７名、および内部参照番号Ｃ００５、Ｃ００８、Ｃ０１１、Ｃ０１２、Ｃ０１４（０．８１ないし１．４９倍）で特定される同年齢の対照健常者５名における、前頭皮質と比較しての側頭皮質でのＡＢＣＡ１遺伝子の遺伝子発現レベルを列記する。散布図は、それぞれ対照試料（点）およびＡＤ患者試料（三角）における、前頭皮質に対する側頭皮質の調節比を視覚化する。
【００６５】
表２は、内部参照番号Ｐ０１０、Ｐ０１１、Ｐ０１２、Ｐ０１４、Ｐ０１６、Ｐ０１９（１．９６ないし５．８３倍）で特定されるアルツハイマー病患者６名、および内部参照番号Ｃ００４、Ｃ００５、Ｃ００８（１．１８ないし３．２２倍）で特定される同年齢の対照健常者３名における、前頭皮質と比較しての海馬でのＡＢＣＡ１遺伝子の遺伝子発現レベルを列記する。散布図は、それぞれ対照試料（点）およびＡＤ患者試料（三角）における、前頭皮質に対する海馬の調節比を視覚化する。
【００６６】
実施例１
（ｉ）ＡＤ患者由来の脳組織解剖；
ＡＤ患者および同年齢の対照被験者由来の脳組織を死後６時間以内に採取し、直ちにドライアイス上で凍結した。診断の組織病理的確認のため、各組織からの試料切片はパラホルムアルデヒドで固定した。発現差の分析のための脳の部分を特定し（図１参照）、ＲＮＡ抽出を実施するまで−８０℃にて保存した。
【００６７】
（ｉｉ）総ｍＲＮＡの単離；
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を取扱説明書に従って使用することによって、死後脳組織から抽出した。正確なＲＮＡ濃度およびＲＮＡ品質は、ＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）系を用いてアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザー（アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して測定した。調製したＲＮＡの追加の品質試験、すなわち部分分解の排除およびＤＮＡ混入に関する試験のために、特に設計したイントロンＧＡＰＤＨオリゴヌクレオチドおよび参照対照としてゲノムＤＮＡを使用して、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）技術を取扱説明書（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））に従って用いて融解曲線を作成した。
【００６８】
（ｉｉｉ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析；
前頭皮質に対して側頭皮質におけるヒトＡＢＣＡ１遺伝子の発現レベルを、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）技術（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて分析した。この手法はポリメラーゼ連鎖反応の迅速熱サイクリングおよび増幅中の蛍光シグナルのリアルタイム測定を特色とし、したがって、終点計測値でなく動力学を用いることによってＲＴ−ＰＣＲ産物の高度に正確な定量が可能である。側頭皮質および前頭皮質由来の、ならびに海馬および前頭皮質由来の、ＡＢＣＡ１ ｃＤＮＡの比をそれぞれ測定した（相対的定量）。
最初に、ヒトＡＢＣＡ１をコードする遺伝子に特異的なプライマー；
５'−ＴＧＴＴＧＣＡＴＣＣＣＣＣＴＴＡＧＡＡＴＧＴ−３'および
５'−ＧＡＧＧＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧ−３'
を用いたＰＣＲの効率を測定するため、標準曲線を作成した。
【００６９】
ＰＣＲ増幅（９５℃で１秒間，５６℃で５秒間、および７２℃で５秒間）は、ライトサイクラー・ファストスタートＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ）混合物（ファストスタートＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含むｄＮＴＰ混合物、ＳＹＢＲグリーンＩ色素、および１ｍＭ ＭｇＣｌ2；ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、０．５μＭのプライマー、２μｌのｃＤＮＡ希釈系列（ヒト脳総ｃＤＮＡ終濃度４０、２０、１０、５、１、０．５ｎｇ；クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および、使用したプライマーに応じて追加の３ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む、体積２０μｌで実施した。融解曲線分析は約 ７９℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ 産物の品質および大きさはＤＮＡラブチップ（ＬａｂＣｈｉｐ）系を用いて測定した （アジレント２１００バイオアナライザー、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。試料の電気泳動図で、ＡＢＣＡ１の予測サイズ１１４ｂｐに単一ピークが観察された。
【００７０】
同様の方法で、ＰＣＲ手順を適用して、定量用の参照標準として選択された参照遺伝子の組のＰＣＲ効率を測定した。本発明では、５種類のそのような参照遺伝子の平均値を測定した；（１）シクロフィリンＢ、特異的プライマー５'−ＡＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＧＣＣＴＧ−３'および５'−ＡＧＣＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＣＣ−３'を用いＭｇＣｌ2を省いて（別に１ｍＭを３ｍＭの代わりに加えた）。融解曲線分析は約８７℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（６２ ｂｐ）の単一バンド一本を示した。（２）リボソームタンパク質Ｓ９（ＲＰＳ９）、特異的プライマー５'−ＧＧＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡ−３'および５'− ＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣ−３'を用いて （例外；別に１ ｍＭ ＭｇＣｌ2を３ｍＭの代わりに加えた）。融解曲線分析は約８５℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（６２ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（３）ベータアクチン、特異的プライマー５'−ＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡ−３'および５'−ＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３'を用いて。融解曲線分析は約８７℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（１４２ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（４）ＧＡＰＤＨ、特異的プライマー５'−ＣＧＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧ−３'および５'−ＧＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧ−３'を用いて。融解曲線分析は約８３℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（８１ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。（５）トランスフェリン受容体ＴＲＲ、特異的プライマー５'−ＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＴＴ−３'および５'−ＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣ−３'を用いて。融解曲線分析は約８３℃に単一ピークを示し、プライマー二量体は見られなかった。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、予想サイズ（８０ｂｐ）を有する単一バンド一本を示した。
【００７１】
値の計算のために、まずｃＤＮＡ濃度の対数を、ＡＢＣＡ１をコードする遺伝子および５種類の参照標準遺伝子についてのサイクル数閾値Ｃtに対してプロットした。標準曲線の傾きおよび切片（すなわち直線回帰）をすべての遺伝子について計算した。次の段階で、側頭皮質および前頭皮質由来の、ならびに海馬および前頭皮質由来のｃＤＮＡをそれぞれ平行して分析しシクロフィリンＢに対して正規化した。Ｃt値を測定し、対応する標準曲線を用いてｍｇ総脳ｃＤＮＡに変換した；
【数１】
2005522222.tif 000003
【００７２】
前頭 および側頭 皮質ＡＢＣＡ１のｃＤＮＡについての値、および海馬および前頭 皮質 ＡＢＣＡ１ ｃＤＮＡについての値はそれぞれ、シクロフィリン Ｂに対して正規化し、比を下記の式に従って計算した；
【数２】
2005522222.tif 000004
【数３】
2005522222.tif 000005
【００７３】
三番目の段階で、参照標準遺伝子の組を平行して分析し、個別の脳試料それぞれについて参照標準遺伝子の発現レベルの前頭対側頭比の、および前頭対海馬比の平均値をそれぞれ決定した。シクロフィリンＢを段階２および段階３で分析し、また、一つの遺伝子から別の遺伝子への比は別々の分析で一定のままであったため、ＡＢＣＡ１についての値を、単一の遺伝子だけに対してでなく、参照標準遺伝子の組の平均値に対して正規化することが可能であった。計算は、上記に示すそれぞれの比を、すべてのハウスキーピング遺伝子の平均値からのシクロフィリンＢの偏差で割ることによって行った。ＡＢＣＡ１遺伝子についてのそのような定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を図２および図３に示す。
【００７４】
（ｉｖ）免疫組織化学；
ヒト脳におけるＡＢＣＡ１の免疫蛍光染色のために、一名の提供者の死後中心前頭回（pre-central gyrus）から凍結切片を調製し（クリオスタット・ライカＣＭ３０５０Ｓ）、アセトン中で１０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、切片をブロッキング緩衝液（１０%正常ヤギ血清、０．２%トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ）で３０分間プレインキュベートし、その後、抗ＡＢＣＡ１ウサギポリクローナル抗体（ブロッキング緩衝液で１；５０希釈；アブカム（Ａｂｃａｍ）、バートナウハイム（ＢａｄＮａｕｈｅｉｍ））および抗ＡＢＣＡ１ヤギポリクローナル抗体 （Ｎ−１５、ブロッキング緩衝液で１；２０希釈； サンタクルス・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ））の両方と一夜４℃にてインキュベートした。０．１%トリトンＸ−１００／ＰＢＳで３回洗浄後、切片をＣｙ３結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（１%ＢＳＡ／ＰＢＳで１；６００希釈）およびＦＩＴＣ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（１%ＢＳＡ／ＰＢＳで１；１５０希釈）と共に２時間室温にてインキュベートし、その後再びＰＢＳで洗浄した。核の染色は、５μＭＤＡＰＩを含むＰＢＳとの３分間の切片のインキュベートによって実施した（青色シグナル）。ヒト脳中のリポフスチンの自己蛍光をブロックするため、切片を１%スダンブラックＢを含む７０%エタノールで２〜１０分間室温にて処理し、連続して７０%エタノール、蒸留水、およびＰＢＳに浸した。切片は、「ベクトラシールド（Ｖｅｃｔｒａｓｈｉｅｌｄ）封入剤」（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ））によってカバーガラスを掛け、倒立顕微鏡（ＩＸ８１、オリンパス光学）下で観察した。デジタル画像は適当なソフトウェア（ＡｎａｌｙＳｉＳ、オリンパス光学）を用いて取り込んだ。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ＡＤにおける神経細胞の喪失および変性に対する選択的不安定性を有する脳領域を表す。
【図２】図２は、ＡＤ脳組織におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現の差を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって実証する。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および側頭皮質（Ｔ）から採取したＲＮＡ試料（図２ａ）からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量を、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）迅速熱サイクル法によって実施した。同様に、同年齢の対照健常者の試料を比較した（図２ｂは前頭皮質および側頭皮質）。
【図３】図３は、ＡＤ脳組織におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現の差を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によって実証する。ＡＤ患者の前頭皮質（Ｆ）および海馬（Ｈ）に由来する試料（図３ａ）からのＲＴ−ＰＣＲ産物の定量を、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）迅速熱サイクル法によって実施した。同様に、同年齢の対照健常者の試料を比較した（図３ｂは前頭皮質および海馬）。
【図４】図４は、ここで使用したＲＴ−ＰＣＲプライマー配列の、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のヌクレオチド配列との図式的整列を図示する。例示目的で、エクソン１およびエクソン５０だけが描かれている；ポリＡ；ポリアデニル化部位；プライマーは矢印および位置番号付けによって示される
【図５】図５は、ＡＢＣＡ１プライマー対の、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のヌクレオチドに対する正確なヌクレオチド配列整列の概略を示す。
【図６】図６は、配列番号１、すなわち２２６１アミノ酸を含むヒトＡＢＣＡ１のポリペプチド配列を開示する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｏ９５４７７）。
【図７】図７は、抗ＡＢＣＡ１ウサギ（赤色シグナル）および抗ＡＢＣＡ１ヤギ（緑色シグナル）ポリクローナル抗体を用いて二重標識したヒト大脳皮質を示す。
【図８】図８の散布図は、それぞれ対照試料（点）およびＡＤ患者試料（三角）における、前頭皮質に対する側頭皮質の調節比を視覚化する。
【図９】図９の散布図は、それぞれ対照試料（点）およびＡＤ患者試料（三角）における、前頭皮質に対する海馬の調節比を視覚化する。
【図１】
2005522222.tif 000006
【図２】
2005522222.tif 000007
【図３】
2005522222.tif 000008
【図４】
2005522222.tif 000009
【図５】
2005522222.tif 000010
【図６】
2005522222.tif 000011
【図７】
2005522222.tif 000012
【図８】
2005522222.tif 000013
【図９】
2005522222.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月6日(2004.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者において神経変性疾患を診断または予測診断する、または被験者が前記疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定する方法であって、
前記被験者由来の試料中の
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体
のレベルおよび／または活性を測定し、前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記被験者において前記神経変性疾患を診断または予測診断すること、または前記被験者が前記神経変性疾患を発症する高いリスクがあるかどうかを判定すること
：を含む方法。
【請求項２】
被験者における神経変性疾患の進行を監視する方法であって、
前記被験者由来の試料中の
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体
のレベルおよび／または活性を測定し、前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記被験者において前記神経変性疾患の進行を監視すること
：を含む方法。
【請求項３】
神経変性疾患のための治療を評価する方法であって、
前記疾患について治療を受けている被験者由来の試料中の
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体
のレベルおよび／または活性を測定し、前記レベルおよび／または前記活性を、既知の疾患または健康状態を表す参照値と比較し、それによって前記神経変性疾患のための前記治療を評価すること
：を含む方法。
【請求項４】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記試料が細胞、または組織、または体液、特に脳脊髄液または血液を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記参照値が前記神経変性疾患に罹患していない被験者に由来する試料中の
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｉｉ）前記転写または翻訳産物の断片、または誘導体、または変異体
のレベルおよび／または活性の値である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
既知の健康状態を表す参照値に対する、前記被験者に由来する試料細胞、または組織、または体液、特に脳脊髄液中の、ＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の転写産物および／またはＡＢＣＡ１をコードする遺伝子の翻訳産物および／またはその断片、または誘導体、または変異体のレベルおよび／または活性の変化が、前記被験者におけるアルツハイマー病の診断、または予測診断、または高リスクを示す、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
被験者に由来する試料中の、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物および／または翻訳産物の、既知の健康状態を表す参照値と比較した、変化したレベル、または活性、または前記レベルおよび前記活性の両方を検出することにより、被験者において神経変性疾患、特に アルツハイマー病を診断または予測診断する、または被験者のそのような疾患を発症する傾向または素因を判定するためのキットであって、
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物を選択的に検出する試薬および
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物を選択的に検出する試薬
を含む前記キット。
【請求項９】
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
の活性および／またはレベルに直接的にまたは間接的に影響を及ぼす、治療的にまたは予防的に有効な量の一または複数の物質の前記被験者への投与を含む、被験者において神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療または予防する方法。
【請求項１０】
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択される少なくとも１つの物質の活性および／またはレベルの調節因子。
【請求項１１】
ＡＢＣＡ１またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする非天然遺伝子配列を含む組み換え非ヒト動物であって、
（ｉ）前記遺伝子配列および選択可能なマーカー配列を含む遺伝子ターゲッティング構築物を提供すること、および
（ｉｉ）前記ターゲッティング構築物を非ヒト動物の幹細胞へ導入すること、および
（ｉｉｉ）前記非ヒト動物幹細胞を非ヒト胚へ導入すること、および
（ｉｖ）前記胚を偽妊娠非ヒト動物へ移植すること、および
（ｖ）前記胚を満期まで発生させること、および
（ｖｉ）ゲノムが両方の対立遺伝子に前記遺伝子配列の修飾を含む遺伝子改変非ヒト動物を特定すること、および
（ｖｉｉ）段階（ｖｉ）の遺伝子改変非ヒト動物を繁殖させて、ゲノムが前記内因性遺伝子の修飾を含む遺伝子改変非ヒト動物を得ること(ただし、前記破壊は結果として神経変性疾患または関連する疾患または障害の症状を発症する素因を示す前記非ヒト動物を与える)
：によって得ることができる前記動物。
【請求項１２】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための診断薬および治療薬の開発において、化合物，物質、および調節因子を、スクリーニング、試験、および評価するための、請求項１１に記載の組み換え非ヒト動物の使用。
【請求項１３】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）細胞を被験化合物と接触させること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）前記被験化合物と接触させていない対照細胞中の、（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；および
（ｄ）段階（ｂ）と（ｃ）の細胞中の物質のレベルおよび／または活性を比較すること(但し、接触させた細胞中の物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示す)
：を含む前記方法。
【請求項１４】
神経変性疾患、特にアルツハイマー病、または関連する疾患または障害の調節因子についての、
（ｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子、および／または
（ｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の転写産物、および／または
（ｉｉｉ）ＡＢＣＡ１遺伝子の翻訳産物、および／または
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）の断片、または誘導体、または変異体
から成る群から選択された一種類以上の物質のスクリーニングのための測定法であって、
（ａ）神経変性疾患または（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質について関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症している被験動物に被験化合物を投与すること；
（ｂ）（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の、活性および／またはレベルを測定すること；
（ｃ）神経変性疾患または（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質について関連する疾患または障害の症状を発症する素因があるかまたは既に発症しており、かつそのような被験化合物が投与されていない、一致した対照動物において、（ｉ）から（ｉｖ）で列挙された一種類以上の物質の活性および／またはレベルを測定すること；
（ｄ）段階（ｂ）と（ｃ）の動物における物質の活性および／またはレベルを比較すること(但し、被験動物における物質の活性および／またはレベルの変化は被験化合物が前記疾患または障害の調節因子であることを示す)
：を含む前記方法。
【請求項１５】
前記被験動物および／または前記対照動物が、天然のＡＢＣＡ１遺伝子転写調節配列ではない転写調節配列の調節下において、ＡＢＣＡ１、またはその断片、または誘導体、または変異体をコードする遺伝子を発現する組み換え非ヒト動物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リガンドと、ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体との間の結合の阻害について、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法であって、
（ｉ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える；
（ｉｉ）前記阻害についてスクリーニングされるべき、一または複数の化合物を前記複数の容器に加える；
（ｉｉｉ）検出可能なリガンド、好ましくは蛍光標識リガンドを前記容器に加える；
（ｉｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記一または複数の化合物、および前記検出可能な、好ましくは蛍光標識リガンドをインキュベートする；
（ｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物に、またはその前記断片、または誘導体、または変異体に付随する検出可能なリガンドまたは蛍光の量を測定する；および
（ｖｉ）前記リガンドの、前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への結合の、一種類以上の前記化合物による阻害の程度を測定する
：段階を含む前記測定法。
【請求項１７】
ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体との前記化合物の結合の程度を測定する、化合物を試験するための、好ましくは複数の化合物をスクリーニングするための測定法であって、
（ｉ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその断片、または誘導体、または変異体の懸濁液を複数の容器に加える；
（ｉｉ）前記結合についてスクリーニングされるべき、一つの検出可能な化合物、好ましくは複数の検出可能な化合物、特に一つの蛍光標識化合物または複数の蛍光標識化合物を前記複数の容器に加える；
（ｉｉｉ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体、および前記検出可能な、好ましくは前記一または複数の蛍光標識化合物をインキュベートする；
（ｉｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物と、またはその前記断片、または誘導体、または変異体に付随する検出可能な化合物または蛍光の量を測定する；および
（ｖ）前記ＡＢＣＡ１翻訳産物、またはその前記断片、または誘導体、または変異体への、一種類以上の前記化合物による結合の程度を測定する
：段階を含む前記測定法。
【請求項１８】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を検出するための診断標的として用いられるための、配列番号１に示されるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体。
【請求項１９】
神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を予防する、または治療する、または改善する試薬または化合物についてのスクリーニング標的として用いられるための、配列番号１に示されるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体。
【請求項２０】
被験者由来の試料中の細胞の病理状態を検出するための、免疫原と特異的に免疫反応性である抗体の使用であって、前記免疫原が配列番号１に示されるタンパク質分子、またはその断片、または誘導体、または変異体であり、前記抗体を用いた前記細胞の免疫細胞化学染色を含む (但し、既知の健康状態を表す細胞と比較した前記細胞における染色の程度の変化、または染色パターンの変化が、前記細胞の病理状態を示す) 使用。


【国際調査報告】
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