(57)【要約】  本発明のいくつかの実施形態において、転写活性を質問するための方法が提供される。この方法は、細胞区画中のＲＮＡに由来する核酸と、膨大な数のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを使用する。  この方法は、細胞区画からポリＡ＋ＲＮＡサンプルを得る工程、オリゴヌクレオチドプローブアレイと、ポリＡ＋ＲＮＡまたはＲＮＡ由来の核酸をハイブリダイズさせる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブアレイは、少なくとも１０，０００完全一致（ＰＭ）プローブを含み、ここで、該完全一致プローブの各々は、ゲノムの領域由来の種々の転写物配列を標的化する工程、およびゲノム配列に対する該プローブが標的とハイブリダイズされる場合、該ゲノム配列が転写されることを決定する工程、を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム転写活性を決定するための方法であって、該方法は：
細胞区画からポリＡ＋ＲＮＡサンプルを得る工程；
オリゴヌクレオチドプローブアレイと、ポリＡ＋ＲＮＡまたはＲＮＡ由来の核酸をハイブリダイズさせる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブアレイは、少なくとも１０，０００完全一致（ＰＭ）プローブを含み、ここで、該完全一致プローブの各々は、ゲノムの領域由来の異なる転写物配列を標的化する、工程；および
ゲノム配列に対する該プローブが標的とハイブリダイズされる場合、該ゲノム配列が転写されることを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ゲノムの領域が少なくとも２０ＭＢである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲノムの領域が少なくとも５０ＭＢである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノムの領域が染色体中のＤＮＡ配列の２５％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノムの領域が染色体中のＤＮＡ配列の５０％である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲノムの領域が染色体由来のＤＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ゲノムの領域が全ゲノム由来のＤＮＡ配列である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プローブが、少なくとも１００ｂｐの分解能で前記ゲノム由来の転写物配列を標的化する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブが、少なくとも３０ｂｐの分解能で前記ゲノム由来の転写物配列を標的化する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記プローブが、少なくとも１０ｂｐの分解能でゲノム由来の転写物配列を標的化する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブが、１ｂｐの分解能で前記ゲノム由来の転写物配列を標的化する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞区画が核である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞区画が細胞質である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドプローブアレイが、少なくとも１００，０００のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該オリゴヌクレオチドプローブの各々は、ゲノムの異なる領域由来の転写物配列を標的化する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドプローブアレイが、少なくとも５００，０００のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該オリゴヌクレオチドプローブの各々は、ゲノムの異なる領域由来の転写物配列を標的化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドプローブアレイが、少なくとも８００，０００のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該オリゴヌクレオチドプローブの各々は、ゲノムの異なる領域由来の転写物配列を標的化する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドアレイが、ミスマッチ（ＭＭ）プローブをさらに含み、ここで、該ミスマッチプローブの各々が、完全一致プローブから一塩基異なる、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ミスマッチプローブの各々が、中間位置で前記完全一致プローブから異なる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記完全一致プローブが、前記ゲノムの非繰り返し配列由来の転写物を標的化する、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＭのＭＭに対する比（Ｒ）が閾値に到達する場合、ＲＮＡ標的の検出がなされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＭとＭＭとの差（Ｄ）が閾値に到達する場合、ＲＮＡ標的の検出がなされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＭのＭＭに対する比（Ｒ）が閾値に到達し、そしてＰＭとＭＭとの差（Ｄ）が閾値に到達する場合、ＲＮＡ標的の検出がなされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｒが１．１〜１．５の範囲にあり、そしてＤが４Ｑ〜１２Ｑの範囲にあり、ここで、該Ｑがノイズ推定値である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｑが、前記プローブアレイに対するプローブ強度の第２の百分位数の値に属する特徴内のピクセルバリエーションである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出が、隣接プローブのハイブリダイゼーション挙動を考慮する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ランの長さが、最大でプローブ間の最大のギャップである場合、ポジティブプローブの間のネガティブプローブのランが、ポジティブとして再分類される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記最大のギャップが５である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ミニラン塩基未満の長さのポジティブプローブのランが、偽ポジティブとして再分類される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ミニラン塩基が２０である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
２つの生物学的サンプルの転写活性を比較するための方法であって、該方法は：
第１のサンプルの細胞区画から第１のポリＡ＋ＲＮＡサンプルを得る工程；
第２のサンプルの細胞区画から第２のポリＡ＋ＲＮＡサンプルを得る工程；
オリゴヌクレオチドプローブアレイと、該第１および第２のポリＡ＋ＲＮＡまたは該第１および第２のポリＡ＋ＲＮＡ由来の核酸をハイブリダイズさせる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドプローブアレイは、少なくとも１０，０００完全一致（ＰＭ）プローブを含み、ここで、該完全一致プローブの各々は、ゲノムの領域由来の異なる転写物配列を標的化する、工程；および
ゲノム配列に対する該プローブが標的とハイブリダイズされる場合、該第１および第２のサンプルの各々について、ゲノム配列が転写されることを決定する工程；ならびに
該第１のサンプルと第２のサンプルとの間の転写配列を比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記第１および第２のポリＡ＋ＲＮＡ、または該第１および第２のポリＡ＋ＲＮＡに由来する核酸は、差示的に標識されている、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記ハイブリダイズする工程は、前記第１および第２のポリＡ＋ＲＮＡ、または該第１および第２のポリＡ＋ＲＮＡに由来する核酸を、同じ型の２つのオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズする工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記ゲノムの領域は、少なくとも２０ＭＢである、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記ゲノムの領域は、少なくとも５０ＭＢである、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記ゲノムの領域は、染色体におけるＤＮＡ配列の２５％である、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記ゲノムの領域は、染色体におけるＤＮＡ配列の５０％である、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記ゲノムの領域は、染色体由来のＤＮＡである、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、前記ゲノムの領域は、ゲノム全体に由来するＤＮＡ配列である、方法。
【請求項３９】
請求項３２に記載の方法であって、前記プローブは、少なくとも１００ｂｐの分解能で、前記ゲノム由来の転写物配列を標的化する、方法。
【請求項４０】
請求項３２に記載の方法であって、前記プローブは、少なくとも３０ｂｐの分解能で、前記ゲノム由来の転写物配列を標的化する、方法。
【請求項４１】
請求項３２に記載の方法であって、前記プローブは、少なくとも１０ｂｐの分解能で、前記ゲノム由来の転写物配列を標的化する、方法。
【請求項４２】
請求項３２に記載の方法であって、前記プローブは、１ｂｐの分解能で、前記ゲノム由来の転写物配列を標的化する、方法。
【請求項４３】
請求項３２に記載の方法であって、前記細胞区画は核である、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記細胞区画は細胞質である、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブアレイは、少なくとも１００，０００個のオリゴヌクレオチドプローブを含み、その各々は、ゲノムの異なる領域に由来する転写物配列を標的化する、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブアレイは、少なくとも５００，０００個のオリゴヌクレオチドプローブを含み、その各々は、ゲノムの異なる領域に由来する転写物配列を標的化する、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブアレイは、少なくとも８００，０００個のオリゴヌクレオチドプローブを含み、その各々は、ゲノムの異なる領域に由来する転写物配列を標的化する、方法。
【請求項４８】
請求項３２に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドアレイは、ミスマッチ（ＭＭ）プローブをさらに含み、ここで、該ミスマッチプローブの各々は、完全一致プローブから一塩基異なる、方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、前記ミスマッチプローブの各々は、完全一致プローブから、中間位置が異なる、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記完全一致プローブは、前記ゲノムの非反復配列に由来する転写物を標的化する、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、ＲＮＡの検出は、ＰＭのＭＭに対する比（Ｒ）が、閾値に達する場合になされる、方法。
【請求項５２】
請求項５０に記載の方法であって、ＲＮＡの検出は、ＰＭとＭＭとの差異（Ｄ）が、閾値に達する場合になされる、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、ＲＮＡの検出は、ＰＭのＭＭに対する比（Ｒ）が、閾値に達し、かつＰＭとＭＭとの差異（Ｄ）が、閾値に達する場合になされる、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、前記Ｒは、１．１〜１．５の範囲にあり、Ｄは、４Ｑ〜１２Ｑの範囲にあり、ここでＱは、ノイズ推定値である、方法。
【請求項５５】
請求項５３に記載の方法であって、Ｑは、プローブアレイについてのプローブ強度の第２の百分位数の値に属する特徴内のピクセルバリエーションである、方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、前記検出は、隣接プローブのハイブリダイゼーション挙動を考慮する、方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、ポジティブプローブの間のネガティブプローブのランは、該ランの長さが、最大でプローブ間の最大ギャップである場合にポジティブとして再分類される、方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、前記最大ギャップは５である、方法。
【請求項５９】
請求項５８に記載の方法であって、ミニラン塩基より短い長さのポジティブプローブのランは、偽陽性として再分類される、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記ミニラン塩基は、２０である、方法。
【請求項６１】
転写活性を質問するためのオリゴヌクレオチドプローブアレイであって、該アレイは、以下：
基材；
該基材上に固定化される少なくとも１００，０００個の異なるオリゴヌクレオチドプローブであって、ここで各プローブは、ゲノム由来の転写物を標的化する、プローブ、
を含む、オリゴヌクレオチドプローブアレイ。
【請求項６２】
請求項６１に記載のオリゴヌクレオチドプローブアレイであって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、１００ｂｐの分解能で、ゲノム由来の転写物を標的化する、オリゴヌクレオチドプローブアレイ。
【請求項６３】
請求項６１に記載のオリゴヌクレオチドプローブアレイであって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、３０ｂｐの分解能で、ゲノム由来の転写物を標的化する、オリゴヌクレオチドプローブアレイ。
【請求項６４】
請求項６１に記載のオリゴヌクレオチドプローブアレイであって、前記オリゴヌクレオチドプローブアレイは、１ｂｐの分解能で、ゲノム由来の転写物を標的化する、オリゴヌクレオチドプローブアレイ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００１年１２月１１日に出願された米国仮出願番号６０／３３９，６５５に対する優先権を主張する。上記の出願の全体の技術は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、生物学的アッセイ、マイクロアレイおよび生命情報科学に関する。
【０００３】
ＲＮＡへのＤＮＡの転写は、細胞が、その増殖、機能および代謝を媒介することによる基本的メカニズムである。このため、転写活性を理解することは、ゲノムの機能を明らかにするために重要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明の１つの局面において、方法および組成物は、オリゴヌクレオチドプローブを使用するゲノムの転写活性を調べるために提供される。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、高い密度のオリゴヌクレオチドプローブ配列を形成するために固定化される。
【０００５】
本発明のいくつかの例示的方法は、ヒト第２１染色体および第２２染色体の転写活性を調べるために使用されている（Ｋａｐｒａｎｏｖら、「Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ２１  ａｎｄ  ２２」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：９１６−９１９（２００２）、それは本明細書中で参考として援用されている）。ヒト第２１染色体および第２２染色体の配列は、約７７０の十分特徴づけられまた、予測された遺伝子が存在することを示す。これらの遺伝子は、ＲＮＡに翻訳される配列情報のほんの一部を表す。引用される刊行物（Ｋａｐｒａｎｏｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：９１６−９１９（２００２））において示されるように、それらの染色体の転写的に活性な領域の実験的に得られたマップは、種々の発育途中の器官の１１のヒト細胞株から得られた細胞質ゾルのポリＡ＋ＲＮＡを使用して構成された。他のマップは、核についてのポリＡ＋ＲＮＡならびに、核および細胞質についての総ＲＮＡを使用して構成された。これらのマップは、高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用して構成され、これらによって、染色体に沿って平均３０塩基対毎の間隔で配置される２５ヌクレオチド長のプローブを使用して、繰り返しのないゲノム配列の３５００万塩基対を調べた。これらの結果は、それら２つの染色体について利用可能な配列注釈上にオーバーレイされる場合、予測および特徴付けられるエキソンによって予測されるものよりも９倍以上のゲノム配列が、転写のために使用されることを明らかにする。これらの転写物は、以前に注釈されるマップにおいて説明されなかった隠されたトランスクリプトームを示す。
【０００６】
上記の例は、ゲノムの生物学的機能を理解することにおける本発明の方法の能力を示しまた、転写活性の大規模な調査のための必要性を強調する。本発明の方法および組成物は、革新的な生物学的調査、臨床的診断、ポストゲノム時代の薬物開発のためのツールを提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、転写活性を調査するための方法は、１つ、２つ、またはそれ以上の細胞区画（例えば、核、細胞質など）から全ＲＮＡサンプルまたはポリＡ＋ＲＮＡサンプルを得る工程；ポリＡ＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡ、あるいはＲＮＡ由来の核酸をオリゴヌクレオチドプローブアレイとハイブリダイズする工程であって、ここで、オリゴヌクレオチドプローブアレイは、完全一致（ＰＭ）プローブであるように設計された少なくとも１０，０００のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、各々の完全一致プローブは、ゲノム領域から異なる転写物配列を標的化する、工程；およびゲノム配列に対するプローブが、標的にハイブリダイズされる場合、ゲノム配列が転写されることを決定する工程、を含む。
【０００８】
本発明の方法が、あらゆるサイズのゲノム領域において、転写活性を調べるために使用され得る一方、本方法は、大きなゲノム領域（例えば、少なくとも２０ＭＢ、５０ＭＢおよびそれ以上、あるいは染色体またはゲノム全体におけるＤＮＡ配列の２５％、５０％または１００％）の調査のために特に有用である。いくつかの実施形態において、全ゲノム由来のＤＮＡ配列は、１、２、５、１０、５０または１００のプローブアレイにおいて、調査される。
【０００９】
プローブは、少なくとも１０００ｂｐ、５００ｂｐ、１００ｂｐ、３０ｂｐ、１０ｂｐまたは１ｂｐの分解能で、ゲノム由来の転写物配列を標的化し得る。
【００１０】
異なる細胞分画（例えば、細胞質または核）由来のＲＮＡは、本発明の方法を使用して検出され得る。
【００１１】
代表的には、オリゴヌクレオチドプローブアレイの各々は、少なくとも１００，０００、５００，０００または８００，０００のオリゴヌクレオチドプローブを含み、ゲノムの異なる領域由来の転写物配列を、各々標的化する。オリゴヌクレオチドは、２０、１５、１４、１０、８、５、２、１、または０．５ミクロンよりも小さい特徴（プローブを含むように設計された各領域が、特徴である）サイズで、固定化される。
【００１２】
完全一致プローブに加えて、オリゴヌクレオチドアレイはまた、ミスマッチ（ＭＭ）プローブであるよう設計されたオリゴヌクレオチドを含み得る。ミスマッチプローブの各々は、１つ以上の塩基で、完全一致プローブと異なる。好ましい実施形態において、一致しないプローブは、中間位置で、完全一致プローブと異なる。他のコントロールプローブがまた、含まれ得る。
【００１３】
完全一致プローブは、代表的にはゲノム配列および所望の調査分解能に従って選択される。好ましい実施形態において、ゲノムの繰り返し配列は、ふるいにかけられ、調査領域として使用されない。しかし、これらの配列の調査が有用であるいくつかの実施形態がある。
【００１４】
転写活性プロフィールは、異なる条件下（例えば、細胞分化／発達の過程の間、通常状態  対  罹患した、異なる生理学的および病理学的状態、種々の化学処理）で得られ得る。これらのプロフィールは、発達的状態、生理学的状態、病理学的状態または毒物学的状態に関連し得る転写活性を明らかにするために比較され得る。
【００１５】
転写活性プロフィールは、新規の転写物の確認および単離（クローニング）を導くために使用され得る。これらのプロフィールはまた、調節機構を解明するために使用され得る。加えて、転写活性プロフィールは、臨床的診断、毒性試験（例えば、薬剤候補物について）、および薬物開発のために使用され得る。
【００１６】
本発明の以下および他の目的、特徴および利点は、添付の図面に示されるような本発明の好ましい実施形態の、以下のより具体的な記載から明らかであり、これらの図面において、同じ参照記号は、異なる図の全てにおいて同じ部分をいう。これらの図面は、一定の縮尺である必要はなく、その代わり、本発明の原理を例示する際に強調される。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態の記載が以下に続く。
【００１８】
本発明は、多くの好ましい実施形態を有し、そして多くの特許、出願および当業者に公知の詳細についての他の参考文献に依存する。従って、特許、出願および他の参考文献が、以下に引用されるかまたは繰り返し出現する場合、その全体が、全ての目的および引用される事柄について、参考として援用されることが理解されるべきである。
【００１９】
（Ｉ．一般）
本願において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数形の言及を含む。例えば、用語「薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」は、複数の試薬（これらの混合物を含む）を含む。
【００２０】
個体は、ヒトに限定されないが、他の生物（哺乳動物、植物、細菌または上記のいずれか由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。
【００２１】
この開示を通じて、本発明の種々の局面が、範囲形式で示され得る。範囲形式での記載は、単に簡便さおよび簡潔さのためであることが、理解されるべきであり、本発明の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきではない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された全ての可能な小範囲ならびにその範囲内の個々の数的値を有するとみなされるべきである。例えば、範囲の記載（例えば、１〜６）は、具体的に開示された小範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびにその範囲内の個々の数的値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有するとみなされるべきである。これは、範囲の広さに関わらず適用される。
【００２２】
本発明の実施は、他に示されない限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術および説明（これらは、当業者の技術範囲内である）を使用し得る。このような従来技術としては、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。適切な技術の具体的例示は、以下の本明細書中の実施例を参照してなされ得る。しかし、他の等価な従来の手順もまた、当然使用され得る。このような従来技術および説明は、以下のような標準的な実験室マニュアル中に見出され得る：Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｉ〜ＩＶ巻），Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＭａｎｕａｌおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから），Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｇａｉｔ，「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」１９８４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ（２０００），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹおよびＢｅｒｇら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（これらは全て、全目的のために、参考としてその全体が本明細書中で援用される）。
【００２３】
本発明は、固体基板（いくつかの好ましい実施形態において、アレイを含む）を利用し得る。ポリマー（タンパク質を含む）アレイ合成に適用可能な方法および技術は、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ  ０９／５３６，８４１、ＷＯ  ００／５８５１６、米国特許第５，１４３，８５４号、同５，２４２，９７４号、同５，２５２，７４３号、同５，３２４，６３３号、同５，３８４，２６１号、同５，４０５，７８３号、同５，４２４，１８６号、同５，４５１，６８３号、同５，４８２，８６７号、同５，４９１，０７４号、同５，５２７，６８１号、同５，５５０，２１５号、同５，５７１，６３９号、同５，５７８，８３２号、同５，５９３，８３９号、同５，５９９，６９５号、同５，６２４，７１１号、同５，６３１，７３４号、同５，７９５，７１６号、同５，８３１，０７０号、同５，８３７，８３２号、同５，８５６，１０１号、同５，８５８，６５９号、同５，９３６，３２４号、同５，９６８，７４０号、同５，９７４，１６４号、同５，９８１，１８５号、同５，９８１，９５６号、同６，０２５，６０１号、同６，０３３，８６０号、同６，０４０，１９３号、同６，０９０，５５５号、同６，１３６，２６９号、同６，２６９，８４６号、および同６，４２８，７５２号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／００７３０（国際公開番号ＷＯ  ９９／３６７６０）およびＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５において記載され、これらはすべての目的のために、その全体が、参考として本明細書中に全て援用される。
【００２４】
特定の実施形態における合成技術を記載した特許としては、米国特許第５，４１２，０８７号、同６，１４７，２０５号、同６，２６２，２１６号、同６，３１０，１８９号、同５，８８９，１６５号および同５，９５９，０９８号が挙げられる。核酸アレイは、多くの上記の特許において記載されるが、同様の技術は、これもまた記載されるポリペプチドアレイに適用される。
【００２５】
本発明で有用な核酸アレイとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）より、商品名ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）で市販される核酸アレイが挙げられる。例に挙げたアレイは、ウェブサイト上のａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ．で示される。本発明はまた、固体基材に付着したポリマーのための多くの使用もまた意図する。これらの使用としては、遺伝子発現モニタリング、プロファイリング、ライブラリースクリーニング、遺伝子型決定および診断学が挙げられる。遺伝子発現モニタリングおよびプロファイリング法は、米国特許第５，８００，９９２号、同６，０１３，４４９号、同６，０２０，１３５号、同６，０３３，８６０号、同６，０４０，１３８号、同６，１７７，２４８号および同６，３０９，８２２号に示される。従って、遺伝子型決定および使用は、ＵＳＳＮ  ６０／３１９，２５３、同１０／０１３，５９８、および米国特許第５，８５６，０９２号、同６，３００，０６３号、同５，８５８，６５９号、同６，２８４，４６０号、同６，３６１，９４７号、同６，３６８，７９９号および同６，３３３，１７９号において示される。他の使用は、米国特許第５，８７１，９２８号、第５，９０２，７２３号、第６，０４５，９９６号、第５，５４１，０６１号および第６，１９７，５０６号において具体化される。
【００２６】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態におけるサンプル調製法を意図する。遺伝子型決定より前、または遺伝子型決定と同時に、ゲノムサンプルは、様々な機構により増幅され得る。ここで、これらの機構のいくつかは、ＰＣＲを利用し得る。例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １，１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら，編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号、同４，６８３，１９５号、同４，８００，１５９号、同４，９６５，１８８号および同５，３３３，６７５号を参照のこと。そして、これら各々は、すべての目的のために、その全体が、参考として本明細書中に援用される。サンプルは、アレイ上で増幅され得る。例えば、米国特許第６，３００，０７０号および米国特許出願０９／５１３，３００を参照のこと。ここで、これらは参考として本明細書中に援用される。
【００２７】
他の適した増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７（１９８８）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ  ８９：１１７（１９９０））、転写増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３（１９８９）およびＷ０８８／１０３１５）、自己持続性配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）およびＷＯ９０／０６９９５）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列ポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、アービトラリリーポリメラーゼ連鎖反応（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、同５，８６１，２４５号）および核酸ベースの配列増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＢＳＡ）が挙げられる。（米国特許第５，４０９，８１８号、同５，５５４，５１７号および同６，０６３，６０３号を参照のこと、これら各々は、本明細書中に参考として援用される）。使用され得る他の増幅法は、米国特許第５，２４２，７９４号、同５，４９４，８１０号、同４，９８８，６１７号、およびＵＳＳＮ  ０９／８５４，３１７において記載され、これら各々は本明細書中に参考として援用される。
【００２８】
サンプル調製のさらなる方法および核酸サンプルの複雑性を減少させる技術が、Ｄｏｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１，１４１８（２００１）、米国特許第６，３６１，９４７号、同６，３９１，５９２号ならびに米国特許出願番号０９／９１６，１３５、同０９／９２０，４９１、同０９／９１０，２９２および同１０／０１３，５９８において記載され、これらは全ての目的のために参考として援用される。
【００２９】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを行うための方法は、当該分野において十分開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、用途により変化し、そして、以下に言及される方法を包含することが公知の一般的な結合方法に従って選択される：Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，１９８９）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９８７）；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓｍ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）。ハイブリダイゼーション反応を反復してかつ調節して行うための方法および装置は、米国特許第５，８７１，９２８号、同５，８７４，２１９号、同６，０４５，９９６号および同６，３８６，７４９号、同６，３９１，６２３において記載され、これらの各々は、参考として本明細書中に援用される。
【００３０】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態におけるリガンド間のハイブリダイゼーションのシグナル検出を企図する。米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，５７８，８３２号；同第５，６３１，７３４号；同第５，８３４，７５８号；同第５，９３６，３２４号；同第５，９８１，９５６号；同第６，０２５，６０１号；同第６，１４１，０９６号；同第６，１８５，０３０号；同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号、米国特許出願６０／３６４，７３１およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として公開済み）（これらの各々はまた、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００３１】
シグナル検出のためのおよび強度データの処置のための方法および装置は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，５４７，８３９号；同第５，５７８，８３２号；同第５，６３１，７３４号；同第５，８００，９９２号；同第５，８３４，７５８号；同第５，８５６，０９２号；同第５，９０２，７２３号、同第５，９３６，３２４号；同第５，９８１，９５６号；同第６，０２５，６０１号；同第６，０９０，５５５号；同第６，１４１，０９６号；同第６，１８５，０３０号；同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号、米国特許出願６０／３６４，７３１およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ９９／４７９６４として公開済み）（これらの各々はまた、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される）に開示される。
【００３２】
本発明の実施はまた、従来の生物学の方法、ソフトウェア、およびシステムを使用し得る。本発明のコンピューターソフトウェア製品は、代表的には、本発明の方法の論理工程を実施するためのコンピューターにより実行可能な指示を含むコンピューター読出し可能な媒体を含む。適切なコンピューター読出し可能な媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが挙げられる。コンピューターにより実行可能な指示は、適切なコンピューター言語またはいくつかの言語の組み合わせにて記載され得る。基本的コンピューター生物学方法は、例えば、ＳｅｔｕｂａｌおよびＭｅｉｄａｎｉｓら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓｅａｒｌｅｓ，Ｋａｓｉｆ編、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）；ＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００）、ならびにＯｕｅｌｅｔｔｅおよびＢｚｅｖａｎｉｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，第２版、２００１）に記載される。
【００３３】
本発明はまた、種々の目的（例えば、プローブ設計、データ管理、分析、および器具操作）のために、種々のコンピュータープログラム製品およびソフトウェアを使用し得る。米国特許第５，５９３，８３９号；同第５，７９５，７１６号；同第５，７３３，７２９号；同第５，９７４，１６４号；同第６，０６６，４５４号；同第６，０９０，５５５号；同第６，１８５，５６１号；同第６，１８８，７８３号；同第６，２２３，１２７号；同第６，２２９，９１１号および同第６，３０８，１７０号（これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００３４】
さらに、本発明は、ネットワーク（例えば、米国特許出願１０／０６３，５５９、同６０／３４９，５４６、同６０／３７６，００３、同６０／３９４，５７４、同６０／４０３，３８１に示されるようなインターネット）を渡って遺伝子情報を提供するための方法を包含する、好ましい実施形態を有し得る。
【００３５】
（ＩＩ．用語）
以下の用語は、本明細書中で使用される以下の一般的意味を有することが意図される。
【００３６】
本発明による核酸は、ピリミジン塩基およびプリン塩基（好ましくは、それぞれ、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、およびアデニン（Ａ）、およびグアニン（Ｇ））の任意のポリマーまたはオリゴマーを包含し得る。Ａｌｂｅｒｔ  Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，７９３〜８００（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂ．１９８２）を参照のこと。実際、本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはペプチド核酸成分、およびその任意の化学改変体（例えば、これらの塩基のメチル化形態、ヒドロキシメチル形態またはグリコシル化形態など）を企図する。このポリマーまたはオリゴマーは、組成が不均質であっても均質であっても良く、そして天然に存在する供給源から単離され得るし、または人工生成もしくは合成により生成され得る。さらに、この核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはその混合物であり得、そして永久にかまたは一過的に、一本鎖形態または二本鎖形態（ホモ二重鎖状態、ヘテロ二重鎖状態、およびハイブリッド状態を含む）で存在し得る。
【００３７】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、またはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物の範囲の核酸である。本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の配列を含み、これらは、天然供給源から単離され得、組換え生成または人工生成され得、そしてその模倣物であり得る。本発明のポリヌクレオチドのさらなる例は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７〜１５００（１９９１）、Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７１〜７５（１９９９）に記載されるような、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結されている、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。本発明はまた、非伝統的塩基対形成（例えば、特定のｔＲＮＡ分子において同定され三重ヘリックスの状態で存在すると推定されている、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成）が存在する状態を包含する。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本出願において互換可能に使用される。
【００３８】
「アレイ」とは、合成または生合成のいずれかにより調製され得る、意図的に作製された分子集合である。そのアレイ中の分子は、互いに同定であっても異なっていてもよい。このアレイは、種々の形態（例えば、可溶性分子のライブラリー；樹脂ビーズに結合された化合物のライブラリー、シリカチップ、または他の固体支持体）を呈し得る。
【００３９】
核酸ライブラリーまたは核酸アレイは、種々の異なる形態（例えば、可溶性分子のライブラリー；樹脂ビーズに結合されたオリゴヌクレオチドのライブラリー、シリカチップ、または他の固体支持体）にて合成または生合成のいずれかにより調製され得る、意図的に作製された核酸集合である。さらに、用語「アレイ」とは、基材上に本質的に任意の長さ（例えば、１ヌクレオチド分子長〜約１０００ヌクレオチド分子長）の核酸をスポットすることより調製され得る、核酸ライブラリーを包含することになっている。用語「核酸」とは、本明細書中で使用される場合、任意の長さのヌクレオチド（プリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然ヌクレオチド塩基、化学的に改変されたヌクレオチド塩基もしくは生化学的に改変されたヌクレオチド塩基、非天然塩基、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含む、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）（例えば、本明細書中に参考として援用される米国特許第６，１５６，５０１号を参照のこと）のいずれか）のポリマー形態を指す。このポリヌクレオチドの骨格は、代表的にＲＮＡまたはＤＮＡにおいて見出され得るような、糖およびリン酸基を含み得るか、または改変もしくは置換された糖およびリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得る。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により割り込まれ得る。従って、用語ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドは、一般的には、本明細書中に記載されるようなアナログを包含する。これらのアナログは、天然に存在するヌクレオシドまたは天然に存在するヌクレオチドと共通するいくつかの構造的特徴を有し、その結果、核酸配列またはオリゴヌクレオチド配列中に組み込まれた場合に溶液中の天然に存在する核酸配列とハイブリダイズ可能である、分子である。代表的には、これらのアナログは、天然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオチドから、塩基部分、リボース部分、またはホスホジエステル部分を置換および／または改変することによって誘導される。この変化は、望ましいように相補的核酸配列とのハイブリッド形成を安定化もしくは不安定化するため、または望ましいように相補的核酸配列とのハイブリダイゼーション特異性を増強するために、条件に合わせて調整され得る。
【００４０】
「固体支持体」、「支持体」および「基材」は、互換可能に使用され、そしてこれらは、剛性または半剛性の表面を有する材料または材料群を指す。多くの実施形態において、この固体支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であるが、いくつかの実施形態において、異なる化合物のための合成領域を、例えば、ウェル、隆起領域、ピン、エッチングした溝などを用いて物理的に分離することが、望ましくあり得る。他の実施形態に従って、その固体支持体は、ビーズ形態、樹脂形態、ゲル形態、ミクロスフェア形態、または他の幾何学的形状をとる。
【００４１】
コンビナトリアル合成ストラテジー：コンビナトリアル合成ストラテジーは、反応物マトリックスおよびスイッチマトリックス（その生成物は、生成物マトリックスである）により示され得る試薬の連続添加による、多岐のポリマー配列の並行合成のための順序つけられたストラテジーである。反応物マトリックスは、添加されるべき構築ブロックの１行×ｍ列のマトリックスである。スイッチマトリックスは、二進数のすべてまたは部分集合であり、好ましくは、行の状態で整列された１とｍとの間に順序付けられている。「二進法ストラテジー」は、少なくとも２つの連続する工程が基材上の目的領域の一部（しばしば、半分）を照射する、ストラテジーである。二進法合成ストラテジーにおいて、順序付けられた反応物の組から形成され得る全ての可能な化合物が、形成される。最も好ましい実施形態において、二進法合成は、以前の添加工程を因数分解するストラテジーを指す。例えば、マスキングストラテジーのためのスイッチマトリックスが、以前に照射された領域を半分にするストラテジーであり、以前に照射された領域のほぼ半分を照射し、残り半分を保護する（同時にまた、以前に保護された領域のほぼ半分を保護し、以前に保護された領域のほぼ半分を照射する）。二進法ラウンドは、非二進法ラウンドにより分散され得ること、および基材の一部のみが二進法スキームに供され得ることが、認識される。コンビナトリアル「マスキング」ストラテジーは、他の物質（例えば、アミノ酸）の添加のために材料から保護基を除去するために、光または他の空間的に選択的な脱保護因子もしくは空間的に選択的な活性化因子を使用する合成である。例えば、米国特許第５，１４３，８５４号を参照のこと。
【００４２】
モノマーとは、オリゴマーまたはポリマーを形成するために一緒に結合され得る分子のセットの任意のメンバーのことをいう。本発明において有用なモノマーのセットとしては、（ポリ）ペプチド合成の例について、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸または合成アミノ酸のセットが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、「モノマー」とは、オリゴマーの合成についての基本セットの任意のメンバーのことをいう。例えば、Ｌ−アミノ酸のダイマーは、ポリペプチドの合成についての４００個の「モノマー」の基本セットを形成する。異なるモノマー基本セットは、ポリマーの合成において連続的な工程において使用され得る。用語「モノマー」とはまた、いずれかのサブユニット単独よりも大きい化合物を形成する異なる化学サブユニットと組み合わされ得る化学サブユニットのことをいう。
【００４３】
バイオポリマーまたは生物学的なポリマーは、生物学的または化学的部分の繰り返し単位を意味することが意図される。代表的なバイオポリマーとしては、核酸、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴ糖、脂質、糖脂質、リポポリ多糖類、リン脂質、前記の合成アナログ（逆向きヌクレオチド、ペプチド核酸、メタＤＮＡおよび上記の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。「バイオポリマー合成」は、バイオポリマーの有機的および無機的の両方の合成産物を含むことが意図される。
【００４４】
バイオポリマーの単一の単位またはバイオポリマーの部分ではない単一の単位を意味することが意図される「バイオモノマー」は、バイオポリマーに関する。従って、例えば、ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドバイオポリマー内のバイオモノマーであり、アミノ酸は、タンパク質バイオポリマーまたはペプチドバイオポリマー内のバイオモノマーである；例えば、アビジン、ビオチン、抗体、抗体フラグメントなどもまたバイオモノマーである。開始バイオモノマー（Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｍｏｎｏｍｅｒ）：または「イニシエーターバイオモノマー（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｂｉｏｍｏｎｏｍｅｒ）」は、ポリマーの表面に反応性求核剤を介して共有結合した第１のバイオモノマー、またはポリマーに結合したリンカーまたはスペーサーアームに結合した第１のバイオモノマー（このリンカーまたはスペーサーアームは、反応性求核剤を介してポリマーに結合している）を示すことになっている。
【００４５】
「相補的」とは、ヌクレオチド間または核酸間（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２本の鎖の間またはオリゴヌクレオチドプライマーと配列決定もしくは増幅される一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間）のハイブリダイゼーションまたは塩基対形成のことをいう。相補的なヌクレオチドは、一般的にＡとＴ（またはＡとＵ）またはＣとＧである。２つの一本鎖ＲＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子は、一方の鎖のヌクレオチドが、適切なヌクレオチドの挿入または欠失により最適に整列および比較され、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常少なくとも約９０〜９５％、より好ましくは約９８〜１００％と対合する場合、相補的であるといわれる。あるいは、ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖がその相補体に選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合、相補性が存在する。代表的に、少なくとも１４〜２５ヌクレオチド一帯にわたって少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性が存在する場合、選択的なハイブリダイゼーションが生じる。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）（これは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００４６】
用語「ハイブリダイゼーション」とは、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが、安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するように非共有結合的に結合するプロセスのことをいう。用語「ハイブリダイゼーション」とは、三本鎖ハイブリダイゼーションのこともまたいう。その結果生じた（通常）二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」である。安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチドの集団の割合は、「ハイブリダイゼーションの程度」と本明細書中でいわれる。
【００４７】
ハイブリダイゼーション条件は、代表的に約１Ｍ未満、より通常には約５００ｍＭ未満および約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度に低くあり得るが、代表的には２２℃より高く、より代表的には約３０℃より高く、そして好ましくは約３７℃を越える。ハイブリダイゼーションは、通常ストリンジェントな条件下（すなわち、プローブが、その標的部分配列にハイブリダイズする条件下）で実施される。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、そして異なる状況において異なる。より長いフラグメントは、特異的なハイブリダイゼーションのために、より高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。他の因子（相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在ならびに塩基不一致の程度を含む）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るので、パラメーターの組み合わせが、いずれか１つの絶対的な基準よりも重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定の配列について熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。このＴｍは、（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸組成下で）標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列に平衡状態でハイブリダイズする温度である。
【００４８】
代表的に、ストリンジェントな条件は、ｐＨが７．０〜８．３かつ少なくとも２５℃の温度において、少なくとも０．０１Ｍから１Ｍ以下までのＮａイオン濃度（または他の塩）の塩濃度を含む。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸Ｎａ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）および２５〜３０℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適切である。ストリンジェントな条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈｅおよびＭａｎｉａｔｉｓ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」第１版、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９９）を参照のこと。これらは、本明細書により上記のすべての目的のためにその全体を参考として援用される。
【００４９】
ハイブリダイゼーションプローブは、核酸の相補鎖に塩基特異的様式において結合し得る核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）である。このようなプローブは、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）、Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７１−７５（１９９９）に記載されるようなペプチド核酸、ならびに他の核酸アナログおよび核酸模倣物を含む。米国特許第６，１５６，５０１号を参照のこと。
【００５０】
プローブ：プローブは、特定の標的により認識され得る分子である。いくつかの実施形態において、プローブは、固定された表面であり得る。本発明により調査され得るプローブの例としては、細胞膜レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピオイドペプチド、ステロイドなど）、ホルモンレセプター、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質ならびにモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
標的：所定のプローブに対する親和性を有する分子。標的は、天然に生じ得るかまたは合成分子であり得る。標的はまた、不変状態においてかまたは他の種との凝集体として使用され得る。標的は、共有結合的にかまたは非共有結合的に、直接的にかまたは特異的な結合物質を介して、結合部剤（ｍｅｍｂｅｒ）に結合され得る。本発明に使用され得る標的の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗体、細胞膜レセプター、（例えば、ウイルス、細胞または他の物質上の）特異的な抗原性決定基に反応性のモノクローナル抗体および抗血清、薬物、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖、ポリサッカリド、細胞、細胞膜ならびにオルガネラ。標的は時折、当該分野において抗プローブと言われる。標的という用語が本明細書中で使用される場合、意味の違いは意図されない。「プローブ標的対」は、２つの高分子が分子認識を介して組合され、複合体を形成する場合に、形成される。
【００５２】
リガンド：リガンドとは、特定のレセプターによって認識される分子である。レセプターに結合されるかまたはレセプターと反応する物質は、「リガンド」と呼ばれ、この用語は、その対となるレセプターに関してのみ定義的に意味がある。用語「リガンド」は、問題の物質がレセプターに結合し得るかまたはさもなくばレセプターと相互作用し得るという性質以外の、任意の特定の分子サイズまたは他の構造的または成分的な性質を意味しない。また、リガンドは、レセプターが結合するための天然リガンドとしてか、またはアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用し得る機能的アナログとしてのいずれかで、役立ち得る。本発明によって研究され得るリガンドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞膜レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニスト、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイドなど）、ホルモンレセプター、ペプチド、酵素、酵素基質、基質アナログ、遷移状態アナログ、補助因子、薬物、タンパク質ならびに抗体。
【００５３】
レセプター：所定のリガンドに対する親和性を有する分子。レセプターは、天然に生じ得るか、または合成分子であり得る。また、レセプターは、不変状態においてかまたは他の種との凝集体として使用され得る。レセプターは、共有結合的にかまたは非共有結合的に、直接的にかまたは特異的な結合物質を介して、結合部剤に結合され得る。本発明に使用され得るレセプターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗体、細胞膜レセプター、（例えば、ウイルス、細胞または他の物質上の）特異的な抗原性決定基に反応性のモノクローナル抗体および抗血清、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補助因子、レクチン、糖、ポリサッカリド、細胞、細胞膜ならびにオルガネラ。レセプターは時折、当該分野において抗リガンドと言われる。レセプターという用語が本明細書中で使用される場合、意味の違いは意図されない。「リガンドレセプター対」は、２つの高分子が分子認識を介して組合され、複合体を形成する場合に、形成される。本発明によって研究され得るレセプターの他の例としては、米国特許第５，１４３，８５４号（これは全体が本明細書中に参考として援用される）に見られる分子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
「有効量」とは、所望の結果を誘導するのに十分な量のことをいう。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写物としては、プレｍＲＮＡ転写物、転写プロセシング中間体、翻訳および遺伝子の転写のために準備される成熟ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ転写物由来の核酸が挙げられるが、これらに限定されない。転写プロセスは、スプライシング、編集および分解が挙げられ得る。本明細書中で使用される場合、ｍＲＮＡ転写物由来の核酸とは、その合成のために、ｍＲＮＡ転写物またはその部分配列が最終的にテンプレートとして働く核酸のことをいう。従って、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、このｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、このｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、この増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは、全てｍＲＮＡ転写物から得られ、そのように得られた産物の検出は、サンプル中の本来の転写物の存在および／または存在量を示す。従って、サンプルから得られたｍＲＮＡとしては、遺伝子のｍＲＮＡ転写物、このｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、このｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどが挙げられるが，これらに限定されない。
【００５６】
フラグメント、セグメントまたはＤＮＡセグメントとは、大型のＤＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡの一部のことをいう。例えば、ポリヌクレオチドは、破壊され得るか、または複数のセグメントに切断され得る。核酸を切断する種々の方法は、当該分野で周知である。例えば、これらの方法は、本質的に化学的あっても物理的であってもよい。化学的な切断としては、ＤＮａｓｅによる部分的な分解；酸による部分的な脱プリン化；制限酵素の使用；イントロンコードされたエンドヌクレアーゼ；ＤＮＡベースの切断方法（例えば、核酸分子内の特異的な位置に切断薬剤を局在化させるための核酸セグメントの特異的なハイブリダイゼーションに依存する、三重鎖形成方法およびハイブリッド形成方法）；または既知の位置または未知の位置でＤＮＡを切断する他の酵素または化合物が挙げられ得る。物理的な切断方法は、ＤＮＡを高剪断速度に供する工程を包含し得る。例えば、高剪断速度は、穿または釘でチャンバーまたはチャネルを介してＤＮＡを移動させることまたは制限された大きさの流路（例えば、ミクロンまたはサブミクロン規模の断面積を有する開口部）にＤＮＡサンプルを通すことによって生成され得る。他の物理的方法としては、超音波処理および噴霧化が挙げられる。物理的切断方法と化学的切断方法との組み合わせは、同様に、例えば熱およびイオン媒介性加水分解による切断を使用し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）（これは、すべての目的のために本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。これらの方法は、核酸を選択された大きさの範囲のフラグメントに消化させるように最適化され得る。有用な大きさの範囲は、１００、２００、４００、７００または１０００塩基対から５００、８００、１５００、２０００、４０００または１０，０００塩基対までであり得る。しかし、より大きい大きさの範囲（例えば、４０００、１０，０００または２０，０００塩基対から１０，０００、２０，０００または５００，０００塩基対）もまた有用であり得る。例えば、Ｄｏｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１，１４１８（２００１）ならびに米国特許第６，３６１，９４７号および同第６，３９１，５９２号（これらは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００５７】
プライマーは、適切な条件（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合のための薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下における緩衝液および温度）下でテンプレート特異的ＤＮＡ合成に対する開始点として作用し得る一本鎖オリゴヌクレオチドである。所定の任意の場合において、プライマーの長さは、例えば、プライマーの意図される用途に依存し、そして一般的には１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、一般的に、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのに十分により低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、そのようなテンプレートとハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。プライマー部位は、プライマーがハイブリダイズするテンプレートの領域である。プライマー対は、増幅される配列の５’末端とハイブリダイズする５’上流プライマーと増幅される配列の３’末端の相補体とハイブリダイズする３’下流プライマーとを含むプライマーのセットである。
【００５８】
ゲノムは、生物体の全ての遺伝物質である。いくつかの場合において、用語ゲノムは、染色体ＤＮＡを表し得る。ゲノムは、多染色体性であり得、その結果、ＤＮＡは、複数の個々の染色体の間で、細胞質に分配される。例えば、ヒトにおいて、２２対の染色体と性に関連するＸＸ対またはＸＹ対がある。特定の生物体の染色体中の遺伝物質に由来するＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。用語ゲノムはまた、染色体構造を有さない生物体からの遺伝物質を表し得る。加えて、用語ゲノムは、ミトコンドリアＤＮＡを表し得る。ゲノムライブラリーは、全てのまたは一部のゲノムを表すＤＮＡフラグメントの集合である。しばしば、ゲノムライブラリーは、無作為に生じたセットから作製されたクローンの集合であり、時々生物体の全ゲノムまたはゲノムの一部を表すＤＮＡフラグメントにオーバーラップする。
【００５９】
対立遺伝子は、細胞内の、または母集団内の遺伝子配列（例えば、遺伝子）の１つの特定の形態をいい、この特定の形態は、遺伝子の配列内の少なくとも１つの、しばしば１つより多い、改変体部分の配列中の同じ遺伝子の他の形態と異なる。異なる対立遺伝子間で異なるこれらの改変体部位での配列は、「変化」「多型」、または「変異」と呼ばれる。各常染色体特異的染色体位置または「遺伝子座」において、個体は、２つの対立遺伝子（１つは父親から受け継ぎ、１つは母親から受け継ぐ）を有する。個体は、遺伝子座で２つの異なる対立遺伝子を有する場合、その遺伝子座で「ヘテロ接合」である。個体は、遺伝子座で２つの同一の対立遺伝子を有する場合、その遺伝子座で「ホモ接合」である。
【００６０】
多型は、母集団中の２つ以上の遺伝的に決定された代替配列または対立遺伝子の発生をいう。多型マーカーまたは多型部位は、発散が起こる遺伝子座である。好ましいマーカーは、少なくとも２つの対立遺伝子を有し、各々が、選択された母集団の１％より大きな頻度で発生し、より好ましくは１０％または２０％より大きな頻度で発生する。多型は、１つ以上の、塩基変化、挿入、繰り返し、または欠失を含み得る。多型遺伝子座は、１つの塩基対と同じくらい小さくあり得る。多型マーカーとしては、制限フラグメント長の多型、可変数の縦列反復（ＶＮＴＲ’ｓ）、超可変領域、微小付随体、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復、および挿入エレメント（例えば、Ａｌｕ）が挙げられる。最初に同定された対立遺伝子形態は、参照の形態として恣意的に示され、そして他の対立遺伝子の形態は、代替の対立遺伝子または改変体対立遺伝子として示される。選択された母集団中に最も頻繁に生じる対立遺伝子の形態は、時々野生型形態と呼ばれる。二倍体生物体は、対立遺伝子の形態に対してホモ接合またはヘテロ接合であり得る。二対立遺伝子多型は、２つの形態を有する。三対立遺伝子多型は、３つの形態を有する。一ヌクレオチド多型（ＳＮＰs）は、多型に含まれる。
【００６１】
一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）は、２つの代替の塩基が、ヒト母集団中適切な頻度（＞１％）で起こる位置であり、ヒト遺伝子変異の最も一般的な型である。この部位は、通常、高度に保存された対立遺伝子の配列（例えば、母集団の１／１００メンバーまたは１／１０００メンバーより小さい変動の配列）によって先行され、そしてそれが後に続く。一ヌクレオチド多型は、通常、多型部位にて１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに代わる置換に起因して発生する。転位は、１つのプリンの別のプリンによる置換または１つのピリミジンの別のピリミジンによる置換である。転換は、プリンのピリミジンによる置換またはその逆である。一ヌクレオチド多型はまた、参照の対立遺伝子に関するヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。
【００６２】
遺伝子型分類は、個体がゲノム中の１つ以上の位置にて所有する遺伝子情報の決定をいう。例えば、遺伝子型分類は、個体が１つのＳＮＰについて所有する１つもしくは複数の対立遺伝子の決定、または個体が複数のＳＮＰについて所有する１つもしくは複数の対立遺伝子の決定を包含し得る。遺伝子型は、１つ以上の多型部位にて個体中で存在する対立遺伝子の同定であり得る。
【００６３】
結合不均衡または対立遺伝子結合は、母集団中の任意の特定の対立遺伝子出現率について偶然予測されるよりもより頻繁に、染色体位置の近くに特異的な対立遺伝子または遺伝子マーカーを持つ、特定の対立遺伝子または遺伝子マーカーの優先的な結合を意味する。例えば、遺伝子座Ｘが、同じ頻度で生じる対立遺伝子ａおよびｂを有し、結合した遺伝子座Ｙが、同じ頻度で生じる対立遺伝子ｃおよびｄを有する場合、組み合わせａｃは、０．２５の頻度で生じると予測される。次いで、ａｃがより頻繁に生じる場合、対立遺伝子ａおよびｃは、結合不均衡である。結合不均衡は、対立遺伝子の特定の組み合わせの自然な選択から生じ得るか、または対立遺伝子が、母集団にあまりに最近導入され、結合した対立遺伝子との平衡に達していないので生じ得る。結合不均衡におけるマーカーは、マーカーが疾患を引き起こさないにもかかわらず、疾患（または他の表現型）への感受性を検出するのに特に有用であり得る。例えば、マーカー（Ｘ）は、それ自体疾患の原因となる要素ではないが、（調節配列を含む）遺伝子（Ｙ）との結合不均衡において、表現型の原因となる要素であり、このマーカー（Ｘ）は、遺伝子Ｙが、同定され得ないか、またはすぐに検出され得ない環境において、検出され、疾患への感受性を示し得る。
【００６４】
（ＩＩＩ．転写活性を決定する方法）
本発明の１つの局面において、方法は、オリゴヌクレオチドプローブを用いるゲノムの転写活性を調べるために提供される。実施例が示すように、本発明の方法は、ゲノムの転写活性を明らかにする強力な道具であり、そしてゲノムの機能に関する価値のある情報を提供する。これらの方法は、生物学、医学、環境科学、産業生物工学、製薬産業および多くの他の分野において多くの実用的な適用を有する。
【００６５】
本発明の例示的な方法は、ヒト第２１染色体および第２２染色体の隠された転写活性を明らかにするために、首尾よく用いられてきた（Ｋａｐｒａｎｏｖ，ｐ．ら 、Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ２１  ａｎｄ  ２２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６：９１６−９１９（２００２）、本明細書中に参考として援用される）。多くの明らかになった転写は、伝統的なノーザンブロッティング／ハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲを含むいくつかの異なる技術を用いて証明されてきた。
【００６６】
ヒトゲノムの転写活性は、ゲノム配列に対するｃＤＮＡ配列のアライメントと、コード領域を予想するためのゲノム配列の解釈の組合せに基づいてマッピングされている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ／；Ｒｕｂｉｎ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，２０１２（２０００）；Ｃａｒｏｎ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，１２８９（２００１）；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｆ．Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，１（２００１））。他のアプローチと比較して、本願で提供されるアプローチは、以下を含むいくつかの利点を有する：以前の実験または配列分析によって以前に観察されていなかった転写の新たな領域の同定、コード能力をほとんどまたは全く有さないＲＮＡ転写物の検出、および／または以前に注釈を付けられた遺伝子の代替のＲＮＡアイソフォームの同定。
【００６７】
いくつかの実施形態において、転写活性を質問するための方法は、以下：１つ、２つまたはそれ以上の細胞区画（例えば、核、細胞質）からポリＡ＋ＲＮＡ（または総ＲＮＡ）を得る工程；このポリＡ＋ＲＮＡまたはこのＲＮＡ由来の核酸を、オリゴヌクレオチドプローブアレイにハイブリダイズする工程であって、ここでこのオリゴヌクレオチドプローブアレイは、少なくとも１０，０００個、５０，０００個、１００，０００個、５００，０００個または１，０００，０００個の完全に一致した（ＰＭ）プローブを含み、この完全に一致したプローブは、ゲノムの領域とは異なる転写配列を標的化する、工程；およびこのゲノム配列の対するプローブが、標的にハイブリダイズする場合、ゲノム配列が転写されたことを決定する工程、を包含する。
【００６８】
このアプローチにおいて、ＲＮＡサンプルは、最初に、核および細胞質細胞区画を分離し、次いで、ＲＮＡ転写物を全またはポリＡ＋含有ＲＮＡに画分化することによって、調製される。核および細胞質細胞区画を分離し、そしてＲＮＡおよびポリＡ＋含有ＲＮＡを単離するための方法は、当該分野で周知であり、そして例示的な方法は、以下の実施例に記載される。
【００６９】
細胞質に特異的に輸送され、そしてＲＮＡの最も成熟したプロセシング形態について富化されたＲＮＡ部分集団に焦点を当てることによって、これらの方法は、希釈効果に起因してこのＲＮＡプールでは以前には観察されなかった稀な潜在的に興味が持たれるＲＮＡ転写物の検出および同定を可能にする。しかし、本発明の方法は、細胞質ポリＡ＋ＲＮＡのための使用に限定されない。例えば、一例において、核由来のポリＡ＋ＲＮＡを、高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイを使用して、問い合わせした。核由来の転写物プロフィールを、細胞質ＲＮＡ由来のプロフィールと比較して、目的の差異を明らかにし、そしてこのプロフィールは、特定の生物学的機能と関連し得る（データは示さず）。
【００７０】
ポリＡ＋ＲＮＡを高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイに直接ハイブリダイズすることが可能であるが、その代わりに誘導核酸を使用することが、しばしば好ましい。誘導核酸は、サンプルＲＮＡをテンプレートとして使用して得られる。誘導核酸は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｃＲＮＡ）、あるいはそれらのアナログまたは模倣物であり得る。ランダムプライマーを使用するｃＤＮＡ合成を含む多くの方法が、誘導核酸を作製するために使用され得る（例示的なプロトコールについての実施例を参照のこと）。ｃＲＮＡは、ｃＤＮＡをテンプレートと使用して、インビボ転写反応において作製され得る。核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、鎖置換増幅、インビトロ転写など）が、例えば、検出感度を増加するために用いられ得る。
【００７１】
誘導核酸を作製するプロセスの間、誘導核酸を作製するために使用された方法に依存して、５’または３’末端配列に向かう特定の偏りが生じ得ることに注意することが重要である。いくつかの実施形態において、偏向なしの方法またはわずかに偏向された方法が好ましくあり得る。他の実施形態において、５’末端に向かって偏向される方法および３’末端に向かって偏向される方法が、転写物の５’末端および３’末端の両方を質問するために組み合わせて使用され得る。
【００７２】
代表的には、核酸は、検出を容易にするために標識される。核酸標識技術は、当該分野で周知であり、本明細書中で参考として援用される多くの特許／特許出願中に記載される。１つの好ましい標識方法は、以下の実施例の章に記載される。当業者は、本発明の方法の多くの実施形態が、特定の標識方法に依存しないことを理解する。実際、標識を使用しないこれらの方法はまた、核酸検出技術と共に使用され得る。
【００７３】
本発明の方法は、任意のサイズのゲノム領域中の転写活性を質問するために使用され得るが、この方法は、大きいゲノム領域（例えば、少なくとも２０ＭＢ、５０ＭＢもしくはそれより大きい領域、または染色体中のＤＮＡ配列の２５％、５０％、もしくは１００％）の質問に特に有用である。いくつかの実施形態において、総ゲノム由来のＤＮＡ配列は、１、２、５、１０、５０、または１００のプローブアレイのセット中で質問される。
【００７４】
これらのプローブは、少なくとも１００ｂｐ、３０ｂｐ、１０ｂｐ、または１ｂｐの分解能でゲノム由来の転写配列を標的し得る。
【００７５】
代表的には、オリゴヌクレオチドプローブアレイの各々は、少なくとも１００，０００、５００，０００、または８００，０００のオリゴヌクレオチドプローブを含み、その各々は、ゲノムの異なる領域由来の転写配列を標的化する。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、１５塩基長、２０塩基長、２５塩基長、３０塩基長、３５塩基長、４０塩基長、４５塩基長、５０塩基長、５５塩基長、または６０塩基長であり得る。これらは、例えば、光指向性合成を使用して、基質上で合成され得る。あるいは、これらは、予備合成され、そして基質上にスポットされて、マイクロアレイを形成し得る。しかし、好ましい実施形態において、これらのオリゴヌクレオチドプローブは、２５マーであり、そして光指向性合成を使用して合成される。これらのオリゴヌクレオチドは、２０、１５、１４、１０、８、５、２、または１ミクロンよりも小さい特徴的な（プローブを含むように設計される各領域が特徴である）サイズで固定化される。
【００７６】
完全に一致したプローブに加えて、これらのオリゴヌクレオチドアレイはまた、ミスマッチプローブ（ＭＭ）であるように設計された１つ以上のオリゴヌクレオチドを含み得る。これらのミスマッチプローブの各々は、１つの塩基において、完全に一致したプローブと異なる。好ましい実施形態において、ミスマッチプローブは、中間位置で完全に整合するプローブと異なる。他のコントロールプローブもまた、含まれ得る。
【００７７】
これらの完全に一致したプローブは、代表的には、ゲノム配列または所望の質問分解能に従って選択される。好ましい実施形態において、代表的なゲノム配列は、フィルタをかけられ、そして質問領域としては使用されない。
【００７８】
本発明の別の局面において、プローブ対がＲＮＡ標的を検出するか否かを決定する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ポジティブな検出が、ＭＭ測定値に対するＰＭの比（Ｒ）に対する閾値範囲およびＰＭ−ＭＭ値の差（Ｄ）に対する閾値範囲を使用してなされる。バックグラウンドが差し引かれた完全に一致した強度ＰＭおよびミスマッチ強度ＭＭを有するプローブ対は、ＰＭ／ＭＭの比がいくつかの比の閾値Ｒを超える場合、およびＰＭ−ＭＭの差異が差の閾値Ｄを超える場合にポジティブと呼ばれ、そうでない場合は、ネガティブと呼ばれる。閾値を変化させることによって、異なるレベルの選択性および特異性を得る。１．１〜１．５の範囲のＲ、４Ｑ〜１２Ｑの範囲のＤ（ここで、Ｑは、チップに対するプローブ強度の第２の百分位数値に沿った特徴の範囲内のピクセル変化である）を使用して作製され得る転写マップは、ノイズの変動の推定値である。
【００７９】
いくつかの実施形態において、特に、高い分解能の検出（例えば、１ｂｐの分解能）の場合において、隣接するプローブもまた、Ｒ閾値およびＤ閾値を超える値を有したか否かを尋ねることによって、各プローブ対によって作成されるコールの信頼度を増加させることが望ましい。隣接するプローブの最小数（ミニラン）および隣接プローブ間の最大ギャップ（マキシギャップ）を設定することによって、ＲＮＡの連続（コンティグ）ランを有するマップを作成し得る。マップは、ヒューリスティックな２工程プロセスでの局所プローブ挙動を考慮することによって改善され得る。例えば、第１のパスにおいて、ポジティブプローブ対間のネガティブプローブ対のランは、ランの長さが、最大ギャップ塩基長であった場合、ポジティブとして再分類され得る。第２パスにおいて、ミニラン塩基より短い長さのポジティブプローブ対のランは、ネガティブとして再分類され得る。工程の効果は、偽ネガティブおよび偽ポジティブの割合を減少させることである。マキシギャップおよびミニランの例示的な値は、それぞれ、５および２０であり得る。
【００８０】
コンピューターソフトウェアおよびコンピューターシステムを使用して、データ分析を実行する。コンピューターソフトウェアは、データ分析の方法を実行する（例えば、プローブ対がＲＮＡを検出するか否かを決定する）コンピューターソフトウェアコードを含み得る。コンピュータープログラムのコードは、代表的に、適切なコンピューター読み取り可能媒体（例えば、ハードドライブ、ＣＤ−Ｒｏｍ、ＤＶＤロムなど）に保存される。データ分析のためのコンピューターシステムは、本発明のデータ分析を実行するためのコンピューター（コンピュータネットワークを含む）である。
【００８１】
本発明の別の局面において、スパイクされたＲＮＡ転写物を、コントロールとして使用し得る。例えば、ヒト転写物についてのアッセイにおいて、特定の配列欠失を含む細菌性ＲＮＡ転写物は、各ポリＡ＋ＲＮＡサンプル内に配置され得る。細菌性転写物は、感受性および偽陽性の割合を評価するために使用され得る（以下の実施例を参照のこと）。
【００８２】
転写活性プロフィールは、異なる条件下（例えば、正常  対  疾患、異なる生理学的除隊および病理学的状態、種々の化学処置）で得られ得る。これらのプロフィールは、生理学的状態、病理学的状態、毒物学的状態に関連し得る転写活性を明らかにするために比較され得る（例えば、米国特許第６，０３３，８６０号を参照のこと）。
【００８３】
本発明の１つの局面において、転写活性プロフィールは、コンピュータデータベース（例えば、関連データベース）に保存され得る。プロフィールは、種々の方法で検索され、要約され、そして分析され得る。
【００８４】
転写活性プロフィールは、新規な転写物の確認および単離（クローニング）をガイドするために使用され得る。例えば、ゲノムの領域が転写されることが検出される場合、プライマーは、転写された配列を確認および単離するためのＲＴ−ＰＣＲを実施するために設計され得る（例えば、実施例を参照のこと）。単離されたｃＤＮＡは、その機能について研究され得る。
【００８５】
本発明の別の局面において、本発明の方法を使用する転写活性プロファイリングは、臨床診断のために使用され得る。このような適用において、患者サンプルから得られる転写活性プロフィールは、転写活性パターンと参照プロフィールとの類似性を検出するために、１つ以上の参照プロフィール（疾患または正常）と比較され得る。参照プロフィールは、本発明の方法を使用して、転写活性について疾患組織および正常組織を質問することによって得られ得る。
【００８６】
転写活性プロファイリングはまた、インビトロ毒性試験のために使用され得る。このような適用において、化合物を使用して、細胞培養物を処理する。細胞の転写活性が、問い合わされ得る。転写活性のプロフィールは、その化合物が毒性の影響を有し得るか否かを検出するために、参照プロフィールと比較され得る。参照プロフィールは、毒性転写活性プロフィールおよび非毒性転写活性プロフィールのために公知の毒性化合物および非毒性化合物を試験することによって、作成され得る。
【００８７】
同様に、転写活性プロファイリングは、薬物候補を試験するために使用され得る。このような適用において、薬物候補は、細胞培養物において試験され得、その薬物候補が、所望の転写活性を誘導するか否かを決定し得る。
【００８８】
本発明のなお別の局面において、本発明の方法を使用して発見される転写活性は、遺伝子発現モニタリングのためにマイクロアレイ設計するために使用され得る。例えば、転写マップは、新規な転写物を同定するために使用され得る。新規な転写物を標的化するプローブは、基材上に設計され、そして固定化されて、新規な転写物の発現をモニターするために使用され得るマイクロアレイを形成し得る。
【００８９】
本発明の質問アレイはまた、ＤＮＡタンパク質結合部位、複製起点、および他のゲノム活性の大スケール（例えば、ゲノムスケール）検出のために使用され得る。ゲノムを質問するアレイから得られる情報の組合せは、ゲノムにおける生物学的機能を理解するための強力なツールである。
【００９０】
（ＩＶ．実施例−第２１染色体および第２２染色体におけるヒトゲノムの大スケール転写活性）
以下の実施例は、本発明の種々の局面を示す。
【００９１】
本発明の方法の能力を実証するために、この方法を使用して、ヌクレオドレベルにおけるヒトゲノムの転写活性領域の経験的マップを開発し、このマップを、他のアプローチから誘導される配列注釈（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）と相関させる。
【００９２】
（オリゴヌクレオチドプローブアレイ）
全ての塩基または平均３０塩基対（ｂｐ）毎のいずれかで質問する均一な間隔のプローブを使用して、体系的な様式で、ヒト第２１染色体および第２２染色体の配列を質問するオリゴヌクレオチドプローブを有するアレイを作製した。このアプローチの利点は、以下を含むいくらかがある：先の実験または配列分析によって先に観察されていない転写の新たな領域の同定、ほとんどまたは全くコード能力を有さないＲＮＡ転写物の検出、および先に注釈された遺伝子の代替のＲＮＡアイソフォームの同定。
【００９３】
（サンプル調製）
第２１染色体および第２２染色体の転写活性領域を同定するこの実験的試みの１つの重要な局面は、マッピングされる標的細胞性ＲＮＡ転写物の調製であった。ＲＮＡサンプルは、核区画および細胞質ゾル細胞性区画を最初に分離し、次いで、ＲＮＡ転写物を全ＲＮＡまたはポリＡ＋含有ＲＮＡ内に分画することによって、調製された。このサンプル調製アプローチは、この分析が、細胞質に特異的に輸送され、そしてＲＮＡの最も成熟しプロセスされた形態のＲＮＡについて濃縮されたＲＮＡ部分集団に焦点を当てることによって、第２１染色体および第２２染色体の転写活性領域の検索における公平な（ｕｎｂｉａｓｅｄ）ストラテジーを補完する。次いで、これは、希釈の効果に起因して、このＲＮＡプールにおいて先に観察されなかった、稀な潜在的に興味深いＲＮＡ転写物の検出および同定を可能にする。
【００９４】
（実験設計および誤差推定）
全部で１１の以下の種々の発達起源の異なる細胞株を使用し、ＲＮＡを得た：Ａ−３７５（黒色腫、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６１９）；ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（急性リンパ芽球性白血病；Ｔリンパ芽球）；ＣＯＬＯ２０５（結腸直腸腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２２）；ＦＨｓ７３８Ｌｕ（正常胎児胚線維芽細胞、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１５７）；ＨｅｐＧ２（肝芽細胞腫、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）；Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病）；ＮＣＣＩＴ（奇形癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２０７３）；ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３（卵巣腺癌、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１６１）；ＰＣ３（前立腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４３５）；ＳＫ−Ｎ−ＡＳ（神経芽細胞腫、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１３７）；Ｕ−８７ＭＧ（神経膠星状細胞腫、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１４）。ＪｕｒｋａｔおよびＣＣＲＦ−ＣＥＭを、Ｄｒ．Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｃｏｒｂｅｉｌ（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から得た。各細胞株を、核および細胞質画分を分離することによって調製し、各々に存在するＲＮＡを分画し、ポリＡ＋含有部分画分を得た。全細胞質ＲＮＡおよびそのポリＡ＋分画を、製造業者の指示書に従って、ＲＮｅａｓｙキットおよびＯｌｉｇｏｔｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。ｍＲＮＡを、ランダムヘキサマー（８３．３ｎｇ／ｍＲＮＡの１μｇ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および細菌コントロール転写物（以下を参照のこと）と混合し、ＰＥ  ＧｅｎｅＡｍｐ９６００  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて、以下のサイクル条件に供した：５×Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＴＴおよび４種のｄＮＴＰを、以下の１×の最終濃度（それぞれ、１０ｍＭおよび０．５ｍＭ）まで添加した後、７０℃１０分および２５℃への１０分の傾斜、その後、２５℃での１０分のインキュベーション。ここで、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴａｓｅ（２００単位／ｍＲＮＡの１μｇ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、続いて、４２℃への１０分の傾斜および４２℃での６０分のインキュベーションを行う。
【００９５】
第１鎖ｃＤＮＡ合成反応の容積は、全ての３μｇのｍＲＮＡ当たり２０μｌであった。７０℃で１５分間のＲＴａｓｅの不活性化の後、第１鎖ｃＤＮＡを、２０μｌのアリコートに分割し、ｃＤＮＡ合成マニュアル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）についてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍに記載される条件を使用し第２鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用した。第２鎖合成反応の後、ｍＲＮＡテンプレートを、ＲＮＡｓｅＡ／Ｔｌカクテル（Ａｍｂｉｏｎ）およびＲＮＡｓｅＨ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の組み合わせを使用して分解した。各細胞株由来の第２鎖合成反応を、プールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、エタノール沈殿し、そして限定ＤＮＡｓｅＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）消化に供し、５０−１００ｂｐのフラグメントを生じた。ｃＤＮＡを、７０μｌ中で、１００単位のターミナルトランスフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）および７１．４μＭのＢｉｏｔｉｎ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰを使用して、３７℃で２時間標識し、その後、それを、以下の混合物中でハイブリダイゼーションのために直接使用した：３０ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ−２９３３）；７４ｍＭ  ＭＥＳ・Ｎａ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ−３０５８）；３Ｍ  テトラメチルアンモニウムクロリド（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−３４１１）；０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１×Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、０．０５ｎＭコントロールビオチン化オリゴ９４８または２１３（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。代表的には、１ハイブリダイゼーション当たり、１〜２μｇの二本鎖標識ｃＤＮＡを使用した。
【００９６】
（ハイブリダイゼーションおよび検出）
転写活性を質問するためのオリゴヌクレオチドプローブアレイ（チップ）を、４５℃で１６〜１８時間ハイブリダイズした。洗浄を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌに記載されるように抗体増幅プロトコールを使用して実施した。チップを、最大ＰＭＴ設定および２μｍのピクセルを使用して、ＧｅｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）スキャナーでスキャンした。各サンプルを、三連でハイブリダイズした。
【００９７】
この部分分画のＲＮＡからのコピーされたｃＤＮＡを標識し、アレイのための標的として使用したので、このチップ上の可能なＤＮＡ汚染の除去を、注意を払って行った。ＮＣＣＩＴおよびＣＯＬＯ２０５細胞株由来の細胞質ポリＡ＋ＲＮＡを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム、１単位／μｌのＡＮＴＩ−ＲＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）の存在下で、３７℃で１時間、ＲＮａｓｅ非含有ＤＮＡｓｅＩ（２単位／ｍＲＮＡの１μｇ；Ｒｏｃｈｅ）で処理した。ＤＮＡｓｅＩ消化についてのコントロールとして、反応を、３つの細菌コントロールの各々由来の以下のセグメントを含むプラスミドに対応するコントロールＤＮＡ（１ｎｇ／μｇのｍＲＮＡ）でスパイクした：ＬＹＳ３２８−１３４４、ＰＨＥ２０１６−３３３１、ＴＨＲ２４７−２２３１（これらのコントロール遺伝子の完全な記載については、以下を参照のこと）。ＤＮＡｓｅＩ消化の後、ｍＲＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製し、上記されるように、ｃＤＮＡ合成ならびにＣｈｒｏｍ２１＿２２およびＤＧＣＲアレイへのハイブリダイゼーションのために使用した。公知のエキソン内および注釈をつけられた領域の外側にハイブリダイズするプローブの数を、計算し、対応する未処理サンプル由来のこれらのものとは有意に異ならないことを示した（データは示さず）。ゲノムＤＮＡ汚染に対するさらなるコントロールとして、全細胞質ＲＮＡおよびそのポリＡ＋画分を、ＤＮＡｓｅ非含有ＲＮＡｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて前処理し、その後、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。
【００９８】
さらに、核および細胞質に存在するＲＮＡの分離を、市販の高密度オリゴヌクレオチドアレイ（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＧ−Ｕ−９５プローブアレイ）を使用して評価した。各細胞株の細胞質または核分画由来の全ＲＮＡを、上記されるようにランダムプライマー、を使用して、一本鎖ｃＤＮＡに転換し、ＤＮＡｓｅＩでフラグメント化し、そしてターミナルトランスフェラーゼで末端標識し、第２鎖合成は行わなかった。ｃＤＮＡを、２連の実験で、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＧ＿Ｕ−９５Ａアレイにハイブリダイズした。ヒトＸｉｓｔ遺伝子の発現を、プローブセット３８４４６＿ａｔを使用して、モニターし、雌由来細胞株においてのみ核特異的であることが見出された。さらに、多くの未知機能のｃＤＮＡ（ＬＩＮＥ、ＨＥＲＶならびに他の型の反復および特有の領域を含む）を、核においてしばしば検出したが、種々の細胞株の細胞質画分では検出しなかった。
【００９９】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨＧＵ−９５Ａアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に存在する、Ｘ−染色体不活性化遺伝子（Ｘｉｓｔ）を質問するために選択されたオリゴヌクレオチドプローブのセットを、核／細胞質分離技術の品質を試験するために使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞株、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞株、Ａ３７５細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株、ＮＣＣＩＴ細胞株およびＦＨｓ  ７３８Ｌｕ細胞株由来の核画分および細胞質ＲＮＡ画分の分析は、Ｘｉｓｔ遺伝子の発現が、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞株、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞株およびＡ３７５細胞株由来の雌性核ＲＮＡ画分中にのみ検出されたことを示した。この遺伝子の発現は、雄性細胞株の核画分においても、任意の細胞株から得られた細胞質ＲＮＡにおいても検出されなかった（データは示さず）。さらに、核ＲＮＡ区画および細胞質ＲＮＡ区画の分離は、低コピー数のＲＮＡの富化を可能にした。
【０１００】
総遺伝子の約１０〜２０％の発現の検出における増加は、核および細胞質画分を伴ってＲＮＡ濃縮後に観察され得る。
【０１０１】
１１細胞株からの細胞質ポリＡ＋ＲＮＡ画分から作製される標識化ｃＤＮＡを、１４×１４ミクロンの個々の合成装置（ｆｅａｔｕｒｅ）内で作製される高密度オリゴヌクレオチド（２５マー）アレイにハイブリダイズさせた。これらのアレイは、約８００，０００の質問プローブを含む。このプローブ密度を用い、２つのアレイ設計が使用された。第１のアレイ設計は、各塩基について用意される、完全相補体（ＰＭ）およびミスマッチ（ＭＭ）相補体のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、第２２染色体の３６２，９０１連続ヌクレオチドを質問する。この単一塩基質問設計（ＤＧＣＲアレイ）を使用して、第２２番染色体（２２ｑ１１．２）のディジョージ症候群臨界領域（ＤＧＣＲ）に局在化するＲＮＡ転写物をマッピングする（Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，Ｄ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．５０，９２４（１９９２）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｆ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４３，６０５（１９８８）；Ｃａｒｙ，Ａ．Ｈ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５１，９６４（１９９２））。第２のアレイ設計は、３組のアレイセット上で合成される１，０１１，７６８プローブペアを使用して、３５００万の第２１染色体および第２２染色体の非反復性塩基対（Ｃｈｒｏｍ  ２１＿２２アレイ）を質問する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘで開発された経験に基づく原則を使用して、オリゴヌクレオチドプローブ配列を選択し、可能性のある全長ホモログまたは部分ホモログについて、Ｕｎｉｇｅｎｅ  ９５データベースならびに第２１染色体配列および第２２染色体配列に対して剪定した。Ｃｈｒｏｍ  ２１＿２２アレイ上の各プローブ対は、平均して３０塩基までの非反復ゲノム配列を質問した。これらの染色体の反復配列領域は、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＵＷＧＣ／ａｎａｌｙｓｉｓｔｏｏｌｓ／ｒｅｐｅａｔｍａｓｋ．ｈｔｍ）の使用によって同定された。
【０１０２】
データ分析
ＰＭ測定対ＭＭ測定の比（Ｒ）およびＰＭ値−ＭＭ値の差（Ｄ）に対する閾値の範囲を使用して、どのプローブ対がＲＮＡ標的を検出するか決定した。ＰＭ／ＭＭの比がある比閾値Ｒを超え、かつＰＭ−ＭＭの差が差閾値Ｄを超える場合、バックグラウンド減算した完全一致強度ＰＭおよびミスマッチ強度ＭＭを有するプローブ対は、ポジティブと称され、そうでなければ、ネガティブと称される。閾値を変化させることで、異なるレベルの感度および特異性を得る。１．１〜１．５の範囲のＲおよび４Ｑ〜１２Ｑの範囲のＤを使用してマップを作成し、ここで、Ｑ（チップに対するプローブ強度の第２の百分位数値に属する特性内のピクセル変動）は、ノイズ変動の推定値である。ＤＧＣＲアレイの設計に使用される質問プローブの重複により、隣接するプローブがまた、Ｒ閾値およびＤ閾値を越える値を有するか否かを尋ねることによって、各プローブ対がなすコール（ｃａｌｌ）の信頼度を増すことが可能となった。隣接するプローブの最小数（ミニラン（ｍｉｎｒｕｎ））および隣接するプローブ間の最大ギャップ（マキシギャップ（ｍａｘｇａｐ））を設定することによって、ＲＮＡの連続した（コンティグ）ランでマップを構築することが可能となった。マップは、発見的な２工程プロセスにおける局所プローブの挙動を考慮して改善された。第１のパスにおいて、ランの長さが最大でマキシギャップ塩基長であった場合、ポジティブプローブ対の間のネガティブプローブ対のランが、ポジティブとして再分類された。第２のパスにおいて、ミニラン塩基未満の長さのポジティブプローブ対のランは、ネガティブとして再分類された。この工程の効果は、偽ネガティブおよび偽ポジティブの割合を低下することである。使用したマキシギャップおよびミニランの値は、それぞれ５および２０であった。
【０１０３】
この設計において使用されたプローブ間の距離に起因して、ｃｈｒｏｍ  ２１＿２２アレイデータについてコンティグは構築されなかった。任意の細胞株実験についてのＲ閾値およびＤ閾値を固定することで、偽ポジティブの割合、特異性の割合および感受性の割合を計算することが可能となった。特定の配列欠損を含む細菌のＲＮＡ転写物は、各ポリＡ＋ＲＮＡサンプルと置換された。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの遺伝子／オペロンを使用して、ＦＰ比を推定した：ｌｙｓ（ＬＹＳ，１６１２ｂｐ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ１７０１３）；ｓｐｏ０Ｂ，ｏｂｇ，ｐｈｅＢ，ｐｈｅＡ（ＰＨＥ，３３６０ｂｐ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２４５３７），ｔｈｒＣ，ｔｈｒＢ（ＴＨＲ，２４００ｂｐ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ０４６０３）；ｊｏｊＣ−ｂｉｒＡ（ＤＡＰ，６５４０ｂｐ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｌ３８４２４）；ｔｒｐオペロン（ＴＲＰ，２５２５ｂｐ，Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｋ０１３９１：ｂｐ．１８８３〜４４０４）。これらの遺伝子座の全配列は、ＤＧＣＲチップ上に並べられた（ｔｉｌｅ）。Ｃｈｒｏｍ  ２１＿２２アレイに関して、残りのゲノム配列について、同一なプローブの選択原則を使用して、使用される各遺伝子／遺伝子座の以下の領域から約３０ｂｐ毎にプローブを選んだ：ＬＹＳ  ３２８〜１３４４；ＰＨＥ  ２０１６〜３３３１；ＴＨＲ  ２４７〜２２３１；ＤＡＰ  １３５７〜３１９６；ＴＲＰ  １〜２５１７。５つの遺伝子座の各々のより小さな部分に対応するポリアデニル化転写物が作製され、アッセイの感度が評価される一方、ＦＰ比の決定にスパイク領域の外側の細菌領域が使用された。スパイク転写物に対応する各遺伝子／遺伝子座の領域としては、以下である：ＬＹＳ  ８１７−１３４４；ＰＨＥ  ２８５２〜３３３１；ＴＨＲ  １２２１〜２２３１；ＤＡＰ  １３５７〜２４９３；ＴＲＰ  １〜１２６１。コントロール細菌転写物が、ｃＤＮＡ合成手順の前に、以下の濃度（コピー／細胞）（ＬＹＳおよびＰＨＥ−３；ＴＨＲおよびＤＡＰ−１０およびＴＲＰ−３０）でヒトポリＡ＋調製物内にスパイクされ、これは、ヒトの細胞において、３００，０００の異なるｍＲＮＡ種および、平均転写物のサイズ（１３００ｎｔ）であると仮定する。
【０１０４】
これらのアレイ実験のための偽ネガティブ（ＦＮ）率を、スパイクされた細菌ＲＮＡコントロール転写物の本発明のセグメント、および逆転写酵素媒介性ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅アッセイにより各細胞株から抽出されたポリＡ＋ＲＮＡサンプルに存在することが決定されたエキソン配列を使用することによって、見積もった。合計５２／９９のエキソン領域が、抽出されたポリＡ＋ＲＮＡに存在すると検出された。これらの実験から、一定のＲ値およびＤ値のセットについての各細胞株に対する偽ポジティブ（ＦＰ）、感受性（Ｓｎ）および特異性（Ｓｐ）の値を決定することが可能であった（２０）。
【０１０５】
特定の標的偽ポジティブ率のマップを、マキシギャップ、ミニランおよびＤ値を固定し、次いで、標的偽ポジティブ率が細菌コントロールにおいて達成されるまで、Ｒを１．１〜１．５の範囲にわたって調整することによって作製した。この標的率が、Ｒの特定の範囲にわたって達成されない場合、最も近い値に達する値を使用した。
【０１０６】
第２２染色体ＤＧＣＲにおける各塩基を質問するアレイについて、表１Ａは、５％のＦＰ率において、細菌コントロール配列について、４７〜６５％のＳｎの範囲、およびヒトエキソンＲＮＡ配列について、１５〜２６％のＳｎの範囲を示す。表１Ｂは、一定のＲ値およびＤ値における染色体２１ ２２アレイ実験の類似のデータを提供する。これらのデータは、細菌コントロール配列をコントロールとして使用して、Ｓｎ値およびＳｐ値を評価することが、ヒトエキソン配列の使用よりも高い感度を生じ得るという点を強調する。細菌およびヒトのＳｎ値における差異は、細菌標的とヒト標的との間に存在する濃度の差異、ヌクレオチド組成物における差違、およびヒト細胞において見出される競合ＲＮＡとの相互作用の点における２つのタイプのコントロール（ヒトおよび細菌）の配列の差異に起因し得る。
【０１０７】
（表１．感受性および特異性の推定）
Ａ．ＤＧＣＲ（２２ｑ  １１．２）１
【０１０８】
【表１Ａ】
2005512527.tif 000002
１Ａ−３７５（ＦＰ＝３％）およびＳＫ−Ｎ−ＡＳ（ＦＰ＝１．４％）を除く、約５％のＦＰ率において行った推定。Ｒ値は、１．１７〜１．４７の範囲である（１７．１８）。２細菌特異性。３細菌感度。４ヒト感受性。５３６０ｋｂのＤＧＣＲ全体における％ポジティブプローブ。６３６０ｋｂのＤＧＣＲの非反復性配列における％ポジティブプローブ。細菌コントロールについて：ＦＰ率を、サンプル中に存在しない細菌コントロールの領域においてポジティブと呼ばれるプローブの割合として計算した；ＢａｃＳｐ２は、式ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）から計算した。ここで、ＴＰは、細菌コントロールの提示領域におけるポジティブプローブの数であり、そして細菌コントロールの欠失領域におけるポジティブプローブのＦＰ数およびＢａｃＳｎを、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）から計算し、ここでＦＮは、細菌コントロールの提示領域におけるネガティブプローブの数である。ヒトＤＧＣＲ領域について：ＨｕｍＳｎは、５２エキソン内のポジティブと呼ばれるプローブの画分または、既知の遺伝子（ＤＧＣＲ６、ＤＧＣＲ２エキソン６−１０、ＤＧＳ−Ｉ、ＤＧＳ−Ｈ、ＤＧＳ−Ａ、ＳＬＣ２５Ａ１エキソン１−４およびクラスリン）に対応するエキソンの一部であり、１つの確認された遺伝子座ＲＰ８は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ヒト細胞株に存在することが示されている。ＨｕｎＳｎ率を計算するために使用される領域の正確な座標および説明は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｔａｆｆｘ．ｃｏｍ／ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅに見出され得る。
【０１０９】
Ｂ．染色体２１−２２１
【０１１０】
【表１Ｂ】
2005512527.tif 000003
１Ｒ＝１．３およびＤ＝１２Ｑ（１７）において、全ての細胞株について固定された閾値。ＢａｃＦＰ率は変化する。表１Ａの脚注を参照のこと。
【０１１１】
（ＤＧＣＲの高分解能マップ）
予測されるように、染色体２１−２２について作製されたマップは、以下を含むいくつかの理由のために、高度に断片化される：ハイブリダイゼーションのための熱力学的条件の単一のセットの使用、プローブ対特異的ハイブリダイゼーション特性、部分的に相補的な配列のプローブ対交差ハイブリダイゼーションの比較的小さい間隔、および２つの隣接するポジティブプローブの間の構造的関係を予測するためのアルゴリズムの開発の必要性。マップの断片的性質を減少するための１つのアプローチは、質問プローブの密度を増加させることである。ＤＧＣＲ（２２ｑ１１．２）の転写活性領域を、３６２，９０１ｂｐごとに間隔を空けられたオリゴヌクレオチドプローブを使用してマッピングした。反復性配列（４２％）および非反復性配列（５８％）の両方を、このアレイによって質問した。この領域の一部についての第１の転写マップを、Ｇｏｎｇら（Ｇｏｎｇ，Ｗ．，ら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５，７８９（１９９６）；Ｇｏｎｇ，Ｗ，ら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６，２６７（１９９７））によって作製した。１３個の十分に特徴付けされた遺伝子（９９エキソン）および２個の偽遺伝子を、ＤＧＣＲに対してマッピングした。注釈付きのエキソン配列およびアレイベースで検出される転写活性領域の両方の位置を示す高分解能マップを開発し、この領域由来の注釈付きの遺伝子の４個を、図１Ａ〜１Ｄに示す。重複プローブ対の使用は、この領域内のコンティグの構築を可能にし、そしてマップの脱断片化を助けた。このマップについてのコンティグの形成によって、本発明者らは、１１の細胞株の各々について見積もったＦＰ率を、ヒト制御配列に基づいて１５〜２５％の範囲の感度で、３〜５％まで下げることが可能となった（表１Ａ）。第２１染色体および第２２染色体のマップを用いて観察されるのと同様に、検出された転写物のほとんど（５９．４〜６５．９％）が、注釈付きエキソン配列およびＥＳＴ配列から離れて位置する（表２Ｂ）。
【０１１２】
【表２Ａ】
2005512527.tif 000004
１（ＲｅｆＳｅｑ  Ｓａｎｇｅｒ  ｈａｎｄ−ｃｕｒａｔｅｄおよびＧｅｎｂａｎｋ  ｍＲＮＡのような、公知のｍＲＮＡにおいて注釈されるような１，０１１，７６８プローブ、２６，５１６クエリエキソン、ＥＳＴは、ゲノムの発現部分の一部として含まれない。）
【０１１３】
【表２Ｂ】
2005512527.tif 000005
１．値は、６１，８４２プローブがＤＧＣＲの注釈した発現領域内に非重複塩基を質問する２１３，００９プローブに基づいて計算される；２．各々の細胞株に対する標的ＦＰの比。３．表２Ａにおいて言及されたデータベースおよびこの領域に対する全てのＥＳＴマッピングの言及。
【０１１４】
高分解能アレイの組み合わせを使用することによって、および核から特異的に輸送されたＲＮＡ転写物の最も成熟した部分分画の選択によって、トランスクリプトームの注釈箇所についての付加的な情報はまた、明らかとなる。例えば、ＤｉＧｅｏｒｇｅ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｇｉｏｎ遺伝子６（ＤＧＣＲ６）は、ＤＧＣＲの最初の遺伝子である（Ｄｅｍｃｚｕｋら、Ｈｕｍａｎ  ＭｏｌＧｅｎｅｔ５，６３３（１９９６））。ＤＧＣＲアレイを使用して、この注釈のついた領域の転写活性の分析は、この遺伝子のエキソンおよびイントロンの両方の構造に関する新規の情報を提供する。図１Ａは、Ｓａｎｇｅｒ−ｈａｎｄ  ｃｕｒａｔｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＨＧＰ／Ｃｈｒ２２）を使用して作製されたＤＧＣＲ６に関する現在の注釈構造の例示である。５％ＦＰエラー推定値を使用するＤＣＧＲアレイによって作成されたマップは、エキソン１およびエキソン５が、以前に示されたものよりも長くあり得、そして、イントロン３内に転写活性に関する証拠が存在することを示す。ＲＴ−ＰＣＴ分析およびそれに続くＰＣＲ産物のクローニング／配列決定は、アレイデータを確証し、そしてイントロン３内の転写活性に加えて、ＤＧＣＲ６のエキソン１およびエキソン５の標準的な形態および代替形態の両方の同定を生じる。興味深いことに、Ｅｄｅｌｍａｎｎらによる最近の研究は、エキソン１の長さの伸長および、イントロン３を取り除かないＤＧＣＲ６の選択的スプライス形態（２６．Ｅｄｅｌｍａｎｎ，Ｌら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１、２０８（２００１））に関するこれらのデータを支持する。
【０１１５】
類似の代替物は、第２２染色体ＤＧＣＲの他の３つの領域の注釈を作りだし得る（図１Ｂ〜１Ｄ）。１０のエキソンＤＧＣＲ２遺伝子（図１Ｂ）は、イントロン３（ＤＧＳｙｎｄＤ）およびイントロン５（ＤＧＳｙｎｄＥ）内に２つの非コード遺伝子を含む（２２）。イントロン５におけるＲＴ−ＰＣＲ分析およびそれに続く転写物の配列決定は、ＤＧＳｙｎｄＥの延長バージョンおよびこの遺伝子に対して５’の転写物を明らかにした。さらに限定したＲＴ−ＰＣＲの解析は、ＤＧＣＲ２遺伝子座における他の転写物の存在の確証的な証拠を提供した（図１Ｂ）。同じように、新規転写物が、ＤＧＣＲ５（図１Ｄ）のイントロン１および高度に発現されたＳＣＬ２５Ａ遺伝子由来の５’領域において観察され、確証されている。ＤＧＣＲにおいて観察されているアレイ検出転写物に関して付加的な支持的証拠は、この領域に対してマップしたＥＳＴ由来である。従って、これらのマップは、転写されるヒトゲノムの全ての機能を推測することにおいて有用であるだけでなく、新規転写物を単離するための、さらなる生化学的および分子的試みに関するガイドとして有用である。ＤＧＣＲの全配列および、第２１染色体および第２２染色体の非繰り返し配列に関する高い分解能のマップもまた有用である。
【０１１６】
（第２１染色体および第２２染色体の転写活性な遺伝子座）
第２１染色体および第２２染色体は、それぞれ少なくとも２２５および５４５個の良く特徴づけされたそして予想された遺伝子を有する。これらの約１２７および２４７は、良く特徴づけされた、「公知遺伝子」（Ｄｕｎｈａｍ，Ｉら、Ｎａｔｕｒｅ４０２，４８９（１９９９）；Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ４０５，３１１（２０００））である。これらの良く特徴づけされた遺伝子は、それぞれ約１４３０個および３１３４個のエキソンを第２１染色体および第２２染色体に含み（Ｒｅｆｓｅｑのゲノムアライメントにおいて最高であり、ｃｍｍａおよびＳａｎｇｅｒ配列は、エキソンのセットのリストを作成するために使用された）。図２Ａ〜図２Ｂは、第２１染色体および第２２染色体上に、以前に同定され、そしてアレイで予想した転写活性の概要を提供する。第２１染色体および第２２染色体（〜３５Ｍｂ）の非繰り返しゲノム配列を５７Ｋｂの増分（第２１染色体の平均的な長さ）に分割することによって（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５，３１１（２０００））、全体の６２０遺伝子サイズの遺伝子座は、両方の染色体を横切って作製される。各々の質問プローブ対との間の平均距離が、３０ｂｐである場合、各遺伝子についてのポジティブプローブおよびエキソン密度（これはポジティブプローブ対の分画を第２１染色体および第２２染色体に対する非重複の５７Ｋｂウインドウにおいて、質問プローブの数で割った１１の細胞株のうち、少なくとも８においてＲ＝１．５および、Ｄ＝１２Ｑを使用してポジティブであると規定して計算される）をプロットして、そして比較する。エキソンおよびポジティブプローブ密度との間の相関は、両方の染色体配列の長さの大多数を超える非ランダムな関係を提唱した。約３５，０００，０００の非反復性ｂｐ両方の染色体を質問する１，０１１，７６８個のプローブ対のうち、２６，５１６個（２．６％）のプローブ対は、良く特徴づけされた遺伝子の４，５６４の注釈エキソン内に位置する。これらの注釈固定プローブの合計の６９．８％および４０．７％は、それぞれ、１１細胞株のうち少なくとも１または５においてＲＮＡ転写物を検出する（表２Ａ）。検出された全体のポジティブプローブの％は、１１細胞株の１または５において、それぞれ１，０１１，７６８プローブの３４．８％および９．６％であった。これは、プローブ検出転写物の９４％および８８％は、それぞれ１１細胞株の１または５における注釈エキソンの外側に位置することを示す。約５０％のこれらのポジティブプローブが最も近い注釈エキソンから３００ｂｐを越える距離で位置する。これは、ポジティブエキソンとプローブ密度との間の緊密な相関関係において反映される。
【０１１７】
（マッピング結果の検証）
プローブ対レベルでの、相補的ＲＮＡ標的を検出する差異の誤差を、スパイクされたＲＮＡ制御配列および内因性ＲＮＡ制御配列を使用してＦＰ速度およびＦＮ速度を測定することによって、評価した。ＤＧＣＲおよび２１＿２２アレイの両方によって検出されるＲＮＡの構造が何であるかの決定は、３つの異なる実験アプローチの使用を包含した。注釈つき（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）エキソンから離れた、第２１染色体および第２２染色体上の１４の分散した遺伝子の大きさの遺伝子座に位置する、１４の個々のアレイで予測された転写部位（図２Ａ〜２Ｂ）を、独立した検証および分析のための部位として選択した（表３）。逆転写酵素により媒介されるＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応を、アレイによって検出されたポジティブプローブ領域の配列由来のプライマー、および細胞質のポリＡ＋ＲＮＡをテンプレートとして使用して実施した（ＲＴ−ＰＣＲの手順を、Ｃ．ｔｈｅｒｍ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して実施した。このＲＴ−ＰＣＲ手順を、特定された細胞株の各々由来の１０〜５０ｎｇの細胞質ポリＡ＋ＲＮＡを使用し、製造業者の指示に従って実施した。産物を確認するために、少なくとも４０サイクルの増幅が必要であった。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でクローニングし、そしてこの産物の配列を決定した）。約１７８〜１０３６ｂｐの大きさの範囲の、予測されたＰＣＲ産物をクローニングし、そしてこれらの遺伝子座の１２から配列決定した。これらのＰＣＲ産物のうちの５つについてのヌクレオチド配列は、第２１染色体または第２２染色体に対して独特であることが観察された。残りの分析された領域は、他の染色体上に存在するホモログコピーを有する。各ホモログ部位から転写されるＲＮＡ産物は、分析された染色体を起源とする転写物から区別可能であった。全ての場合において、検出されたＲＮＡ転写物の少なくとも一部は、第２１染色体ホモログまたは第２２染色体ホモログから発し、そして公開されたゲノムヒト配列と共直線性であった。アレイにより予測された結果におけるさらなる信頼度は、予測された長さのＰＣＲ産物の世代、ならびにＨｅｐＧ２細胞株およびＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３細胞株の細胞質ＲＮＡから作製されたｃＤＮＲライブラリー由来の１２の遺伝子座のうちの９の配列によって得られた。ＰＣＲ産物がｃＤＮＡライブラリーから得られた９の遺伝子のうちの、部分的クローンまたは全長クローンが、単離および配列決定されている。最後に、ノーザンハイブリダイゼーション実験もまた、１１の細胞株のうちの７由来のポリＡ＋ＲＮＡ（Ａ−３７５、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＯＬＯ  ２０５、ＦＨｓ  ７３８Ｌｕ、ＨｅｐＧ２、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３）を標的として使用して実施した（ノーザンブロット実験を、標準的な技術を使用して実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ���）。各特定の細胞株の各々由来の３〜５μｇの細胞質ポリＡ＋ＲＮＡを、ゲル上に配置した。ＤＮＡプローブを、［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、ランダムヘキサマー標識キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して標識した。フィルタを、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１％ウシ血清アルブミン、７％ＳＤＳ中で、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、フィルタを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび０．３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、各洗浄１５分間で、６５℃で連続的に洗浄し、そしてＸ線フィルムに３週間曝露した）。クローニングおよび配列決定されたＲＴ−ＰＣＲ産物の各々を標識し、そしてこれらのハイブリダイゼーション実験のためのプローブとして使用した。第２１染色体および第２２染色体由来の１２の遺伝子座のうちの４つが、試験した７の細胞株のうちの少なくとも１つにおいて、同定可能な全長転写物を含んだ（図３Ａ〜３Ｄ）。これらの遺伝子座のうちの１つ（Ｃｈｒ２１−９）が、１〜１０ｋｂの範囲の大きさの異種の転写物にハイブリダイズした（データは示さない）。ノーザンハイブリダイゼーション分析を使用して、ＤＧＣＲ２領域由来のさらなる４つの他の遺伝子座を分析した。このハイブリダイゼーション結果は、さらなる２つのより異種の群の転写物を示した。従って、ノーザンハイブリダイゼーション分析によって、１６の遺伝子座のうちの７が、検出可能なＲＮＡ転写物を与え、いくつかの遺伝子座が、０．６〜１０ｋｂの範囲の異なる大きさまたは異ならない大きさの複数の転写物によって、特徴付けられた。
【０１１８】
まとめると、細胞質ポリＡ＋ＲＮＡサンプルおよびｃＤＮＡライブラリーのＲＴ−ＰＣＲおよび配列分析は、アレイ実験によって新規転写物の部位であると予測された１２／１４の遺伝子座が、転写されたことを示した。さらに、ノーザンハイブリダイゼーション実験を使用してこれらのＲＮＡの全長の大きさを直接検出および決定することを目的とする実験は、これらが代表的に、成熟したプロセシングされたＲＮＡであることを明らかにした。興味深いことに、ＲＴ−ＰＣＲアンプリコンから収集された配列は、いくらかのノーザンハイブリダイゼーション産物によって示される大きさの全長またはかなりの部分に達した。これらのアンプリコン産物の配列分析は、新規転写物のこれらの特徴付けられた部分に存在するコード能力を、ほとんど明らかにしなかった。最後に、フィルタに基づくハイブリダイゼーション実験は、観察された新規ＲＮＡが、１つの細胞あたり非常に低いコピー数で存在することを強く示唆し、これらの転写物がなぜ以前には観察されなかったかについての何らかの説明を提供する。７の遺伝子座についての、ノーザンハイブリダイゼーションによって検出可能なＲＮＡの非存在もまた、これらの転写物についての非常に低いコピー数の提示と一致するが、これらの転写物が、配列がアレイデータから示唆されたプライマー対を使用して試験されたｃＤＮＡライブラリーの一部として検出されたことを強調することが、重要である。
【０１１９】
【表３−１】
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【０１２０】
【表３−２】
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１．いくつかのＰＣＲプライマー対は、チップによってポジティブであると呼ばれた領域における１４の遺伝子座の各々について設計された。プライマーは、代表的に、順方向プライマーと逆方向プライマーとの間の、２００〜５００ｂｐのオーダーの距離で、ポジティブプローブまたはコンティグ（ＤＧＣＲ領域の場合）またはその近くで拾われた。代表的に、３〜１５のプライマー対が、各遺伝子座について設計される。ＤＧＣＲ領域（Ｃｈｒ２２  ＤＧＣＲ）については、５％ＦＰマップが、プライマー選択のために使用され、一方で第２１染色体領域（Ｃｈｒ２１）については、Ｒ＝１．３およびＤ＝１２を有する１１のうちの１のマップが使用された。いくつかの遺伝子座については、１より多くの領域が、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された。各確認された領域の開始および終了は、Ｃｈｒ２２  ＤＧＣＲ遺伝子座についてチップ上に並べられたＤＧＣＲ領域の配列の座標において、またはＣｈｒ２１領域についてのＧｏｌｄｅｎ  Ｐａｔ配列の２０００年１０月凍結の座標においてのいずれかで示される。ＨｅｐＧ２およびＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３由来のｃＤＮＡライブラリーを使用して、これらの細胞のポリＡ＋ＲＮＡから単離されたＲＴ−ＰＣＲ産物と同一のＲＴ−ＰＣＲ産物を含むクローンを検出した。ＢＬＡＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｔｅｓｔ．ｃｓｅ．ｕｓｃｓ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＢｌａｔ）によって示されるようなＲＴ−ＰＣＴ産物において同定されたものと類似の配列を有する、他の染色体上の位置。ゲノム上の他の箇所でホモログが同定された全ての場合において、第２１染色体および第２２染色体で問い合わせられた部位に特異的なＲＴ−ＰＣＲ産物が、第２１染色体遺伝子特異的ＳＮＰおよび第２２位染色体遺伝子特異的ＳＮＰに起因して、観察された。＊ＲＴ−ＰＣＲ産物はいずれも、これらの遺伝子座について検出されなかった。Ｎ／Ｔ−試験せず：Ｎ／Ｄ−検出した。
【０１２１】
（結論）
この実施例は、本発明の方法の例示的な実施形態が、トランスクリプトームを探求するための強力な道具であることを示す。例えば、この実施例において、発達的に異なる１１の細胞株由来の細胞質ポリＡ＋ＲＮＡは、ヒトゲノムの配列の以前の注釈によって考慮され得る細胞質に移入される、成熟ＲＮＡの転写の９倍もの多い部位が存在し得ることを示した。
【０１２２】
上記説明は、説明を意図され、そして限定であるとは意図されないことが、理解されるべきである。本発明の多くのバリエーションが、上記説明を再調査する際に、当業者に明らかである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲を、これらの特許請求の範囲が包含される均等物の全範囲と共に参照して決定されるべきである。全ての引用される参考文献（特許文献および非特許文献を含む）は、その全体が、全ての目的で本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
本明細書中に組み込まれ、そして本明細書の一部をなす添付の図面は、説明と共に、本発明の実施形態を例示し、本発明の原理を説明する役に立つ。
【図１】図１Ａ〜図１Ｄは、染色体２２（２２ｑ１１．２）のＤＧＣＲ内の４つの領域の高解像度マップである。各マップについて、分析した１１個の細胞株のうち６個についてのＤＧＣＲアレイによって予測されるコンティグが示される。アレイマップの下には、この領域のＳａｎｇｅｒの手動補正（ｈａｎｄ  ｃｕｒａｔｅｄ）マップ由来のカーツーン（ｃａｒｔｏｏｎ）またはｄｂＥＳＴ由来のＥＳＴマップがある。アレイマップによって示唆される選択された領域を、ＲＴ−ＰＣＲを使用してさらに分析した。これらの分析からの配列決定した産物を、ＳａｎｇｅｒマップおよびＥＳＴマップの下にマップした（図１Ａ）ＤＣＧＲ６遺伝子領域（ＧＰ配列１５，８３３，９５０−１５，８４０，３９０）、（図１Ｂ）ＤＧＣＲ２領域（ＧＰ配列１５，９５９，８５０−１６，０５７，８５０）、（図１Ｃ）ＳＬＣ２５Ａ１  ２５および５’隣接領域（ＧＰ配列１６，０９８，５９０−１６，１０７，０９０）、（図１Ｄ）ＤＧＣＲ５エキソン領域（ＧＰ配列１５，８９８，３００−１５，９０５，０４０）。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、染色体２１（図２Ａ）および染色体２２（図２Ｂ）についてのポジティブプローブ密度マップおよびエキソン密度マップの相関を示す（５％  ＦＰ率）。各マップについて、下のグラフは、５７ｋｂのビン（染色体２１上の遺伝子についての平均ゲノムサイズ）中に存在するポジティブプローブ密度を示す。上のこのプロットは、各ビン中に存在するエキソン内に位置するヌクレオチドの密度である。各染色体のカーツーンと重なるグラフは、５．７ＭＢのウインドウにわたって計算されたエキソン密度とポジティブプローブ密度との、局所的相関係数である。相関係数は、ポジティブエキソン密度の割合が、５．７ＭＢウインドウにわたって、２５％未満に入る領域においては計算されない。従って、エキソン注釈（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）の密度が比較的低い動原体近傍の染色体２１領域は、これらの染色体領域中のエキソン密度におけるバリエーションの相対的な欠如を考慮して、ポジティブプローブ密度との相関について分析されない。上のポジティブプローブ密度マップは、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンハイブリダイゼーション確認のために選択された領域である（下向きの矢印）。染色体２２のＤＧＣＲ領域は、四角で囲まれている（図２Ｂ）。ＤＧＣＲの高解像度マップは、図１Ａ〜１Ｄに示される。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、１１個の細胞株のうち７個から得られたポリＡ＋細胞質ゾルＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション分析を示す（１：ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３、２：Ｊｕｒｋａｔ、３：ＨｅｐＧ２；４：ＦＨｓ  ７３８Ｌｕ；５：ＣＯＬＯ  ２０５；６：ＣＣＲＦ−ＣＥＭ；７：Ａ−３７５；８：ＤＮＡｓｅ  Ｉで処理したＡ−３７５）。以下のプローブを放射性標識し、そしてフィルタにハイブリダイズさせた：（図３Ａ）Ｃｈｒ２２  ＤＧＣＲ−３−２領域由来であり、ＤＧＣＲ配列のｂｐ  ２７７３０４〜２７７５６９により示される、ｃＤＮＡ（表３、実施例）；ならびに確認した全領域にわたるｃＤＮＡ（図３Ｂ）Ｃｈｒ２２  ＤＧＣＲ−２−１；（図３Ｃ）Ｃｈｒ２１−８および（図３Ｄ）Ｃｈｒ２２  ＤＧＣＲ−１−２。フィルムを、３週間感光させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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