(57)【要約】  抗再狭窄剤は、少なくとも一つのヘアピンループおよびＴＧ配列を含むホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドを含む。ヘアピンループは好ましくは、配列ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣを有する。特に、好ましいオリゴヌクレオチドは、ＴＧＧＧＧ  ＴＧＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣおよびＴＴＧＧＧ  ＴＴＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＴＴ  ＧＧＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣから選択される配列を含むものである。抗再狭窄剤は、例えばステントのような体内に注入するための装置としておよびそのような装置にコーティングするときに使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのヘアピンループおよびｄＴまたはｄＧ解放基（ＴＧ）を含むホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドを含む抗再狭窄剤。
【請求項２】
ヘアピンループがオリゴヌクレオチドの３’または５’末端に隣接して位置する請求項１に記載の抗再狭窄剤。
【請求項３】
ヘアピンループが配列ＸＹＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ（ここにＸおよびＹは、四つのヌクレオチドｄＡ、ｄＴ、ｄＧおよびｄＣから独立して選択される）を含む請求項１または請求項２のいずれかに記載の抗再狭窄剤。
【請求項４】
ＴＧ配列がヘアピンループ配列に隣接する請求項１から請求項３のいずれかに記載の抗再狭窄剤。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが末端配列ＣＡＧＣＧＡＡＧＣＴＧを有する請求項４に記載の抗再狭窄剤。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが３０から１００塩基を含む請求項１から請求項５のいずれかに記載の抗再狭窄剤。
【請求項７】
ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの複数グアノシン配列を含む請求項１から請求項６のいずれかに記載の抗再狭窄剤。
【請求項８】
複数グアノシン配列が、ＴＧＧＧＧ、ＴＧＧＧおよびＴＴＧＧＧから選択される請求項７に記載の抗再狭窄剤。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが中心Ｔを有するコア部分を含み、該中心Ｔは第一の複数グアノシン配列にすぐに続き、かつ該第一の複数グアノシン配列の鏡像である第二の複数グアノシン配列がその後すぐに続く請求項１から請求項８のいずれかに記載の抗再狭窄剤。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドが配列ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＧＧＴを含む請求項９に記載の抗再狭窄剤。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが配列ＴＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴを含む請求項９に記載の抗再狭窄剤。
【請求項１２】
ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドがＴＧＧ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣおよびＴＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣから選択される配列を含む請求項９に記載の抗再狭窄剤。
【請求項１３】
ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドがＴＧＧ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧおよびＴＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧから選択される配列を含む請求項１２に記載の抗再狭窄剤。
【請求項１４】
体内に注入することができるタイプの装置であって、請求項１から１３のいずれかに記載の抗再狭窄剤を含むコーティングを有する装置。
【請求項１５】
経皮経管的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）において使用されるステントである、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
抗再狭窄剤が組み込まれた電気伝導性ポリマーの層で覆われた電気伝導性支持体を含む、請求項１４または請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
ポリマーがチオフェンから誘導される、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
ポリマーがポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）である、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
請求項１から請求項１３のいずれかに記載の抗再狭窄剤と平滑筋細胞組織のような影響を受けた組織を接触させる段階を含む再狭窄の処置の方法。
【請求項２０】
請求項１５から請求項１８のいずれかに記載のステントが影響を受けた組織に隣接して位置する請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［緒言］
本発明は、抗再狭窄剤に関するものである。特に本発明は、本発明の抗再狭窄剤を担持するように修飾される装置、詳細にはステント、および再狭窄を局部的に処置する該装置の使用に関する。
【０００２】
圧縮されまたは狭められた冠動脈は、一般に狭窄したと呼称される。狭められた動脈を膨張させるため、バルーン形成術としても知られている経皮経管的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）が一般に用いられる。本手順において心臓病学者は、空気を抜いたバルーンを先端に付けたカテーテルを動脈の狭められた部分に挿入する。いったん挿入してバルーンをふくらませ、動脈中に存在するプラークを加圧し、血管の内径を大きくすることにより、血液を流れやすくする。続いてバルーンから空気を抜き、カテーテルを取り出す。
【０００３】
ステントは血管形成術と組み合わせて使用することができる。ステントは一般に、ＰＴＣＡ後に動脈壁を開けたままの状態にするために用いられる円筒形金属骨格を含む。その場合、ステントを血管形成バルーンカテーテルの上に置き、動脈の閉塞領域に移動させる。バルーンをふくらませると、ステントが広がり、それにより場所を確保し、骨格を形成し、動脈を開けたままの状態にする。ステントは動脈を開けた状態にしながら永久に動脈内にとどまり、それによって心筋への血流が改善される。
【０００４】
ＰＴＣＡを受けた約３分の１の患者は、本手順の後約６ヶ月以内に血管の広げられた部分の再狭窄（再び狭められる）を発症する。この再狭窄の理由は、ステントが動脈を刺激し、以下の反応に応答するからである：
−平滑筋細胞（ＳＭＣ）が成長し、ステントの移植部位を侵す細胞増殖、
−修復血液細胞である循環性の単球およびマクロファージが傷ついた動脈を侵す、プラークが内膜に対して押される際の炎症効果；および
−血小板またはフィブリノゲンの凝集が血管の内腔を減少させまたはブロックする血栓。
すべての場合において実質的な結果は、血液が血管内を適切に流れることができず、血管の再閉塞が起こりそうになることである。そのような場合、再狭窄した動脈には、さらに血管形成術が必要となるであろう。
【０００５】
ステント術の後、患者は通常、急性血小板凝集または炎症反応の予防のために処置されるが、現在までのところ、平滑筋細胞増殖を予防するいずれの製薬的試みも失敗に終わっている。それゆえ、研究者は、抗増殖薬および作用部位すなわちステント術部位にそれらの薬物を運搬する方法に焦点を当てた。
【０００６】
腫瘍形成と闘う能力が試験された薬物（例えば、タキソール、ラパマイシンおよびアクチノマイシン）のいくつかのクラスの中で、オリゴヌクレオチドが、インビトロおよびインビボの両方でＳＭＣ増殖を阻害する有望な効果を示す新たなクラスの生物活性物質として出現している（１−１０）。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡレベル（アンチセンス戦略）でまたは成長因子のようなタンパク質のレベルで抗メッセンジャーとして作用し、タンパク質が細胞成長および増殖を誘発することを妨害できる。このアプローチは「アプタメリック」効果としても知られている。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＳ  ＯＤＮ）は、そのヌクレオチド間リン酸基の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置換されているのであるが、それは、いくつかのグループによって証明されているように（１１−１３，１５）、成長因子を含むいくつかのタンパク質に対して特有の親和性を示す。詳細には、ＯＤＮ配列のＧ（グアノシン）ストレッチにグアノシン（Ｇ）または連続Ｇ、例えばＧ３、Ｇ４またはより高次のＧを高いパーセンテージで含むＰＳ  ＯＤＮは通常、タンパク質への高い結合可能性を有する（１２−１５）。適当な配列と化学的構成物（ホスホロチオエートがホスホジエステル結合よりも好ましい）を有するアプタメリックＯＤＮは、インビボでその寿命を改善できるなら、抗タンパク質物質としての活性を好ましく発揮することができる。ホスホロチオエート結合は、ホスホジエステル体よりもインビボでより遅く分解するため、ヌクレアーゼに対する良好な保護として長期間認識されていた。しかし、インビボでの長期間作用は、ヌクレアーゼがインビボで非常に活性であるため、十分でないかもしれない。ヌクレアーゼは同一種中、組織から組織で異なることがあり、ヒト血漿中では、何らかの５’エキソヌクレアーゼ活性も記載されているが、最も高活性なヌクレアーゼは３’エキソヌクレアーゼとして同定された。これは、インビボのＯＤＮを研究する研究者のほとんどが、ＯＤＮ分子の３’側を常に化学的に保護し続けていることを説明する。ＯＤＮ分子の末端を保護する一つの方法は、二本鎖ヘアピン構造を形成するために、オリゴヌクレオチドの各末端に付加的な配列を設計することである（１６−２４）。予期された通り、ヘアピン配列に依存して、ヘアピン保護ＯＤＮの寿命は非保護ＯＤＮよりも常に長いことが見出された。
【０００７】
別の章において、ステントの位置決めのすぐ後に傷ついた組織の中で始まりうる、ＳＭＣ増殖を誘発する最初の事象に対抗するため、細胞毒性薬物を使用できることを何人かの著者が提案している。オリゴヌクレオチドに関する限り、Ｖａｅｒｍａｎらのグループ（２５）は、種々の末端ジヌクレオチド配列を有する一連のオリゴヌクレオチドを使用することにより、細胞成長阻止を達成することができることを示している。細胞成長への有害な効果は、特定の末端配列の分解産物に由来することが証明された。これらの配列の中で、ＴＧジヌクレオチドは細胞増殖を妨げるのに最も有効であることが見出された（２５）。これに従って我々は、モノリン酸ヌクレオチドによって主に構成されるＯＤＮの分解産物が、ＳＭＣ増殖に有害となりうることを探し出した。
【０００８】
ステント術または静脈内潅流のいずれかによるＯＤＮ供給に続く毒物学的事柄が何人かの著者によって示されている（２６−２８）。３０ｍｇ／ｋｇと同程度に高用量である量においてさえ、げっ歯目（２７）およびヒト（２８）の両方で軽症の急性効果しか観察されないことが示された。
【背景技術】
【０００９】
当分野の従来技術を構成する特許の中で、以下のものが挙げられる。
【００１０】
ＷＯ９７／１２８９９は、再狭窄の処置におけるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用を示し、ここでは１８から１００の間のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００１１】
ＷＯ９６／１１２６６は、再狭窄の処置においてＳＭＣ増殖を阻害するための複数グアノシンホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用を示している。この文献は、配列中にＧ４または二つのＧ３配列を有するオリゴヌクレオチドの使用を示している。
【００１２】
ＷＯ９９／０３５１７は、再狭窄の処置において、特定のオリゴヌクレオチドを局所放出するための供給装置としてのポリマー被覆ステントの使用を示している。
【００１３】
ＷＯ９６／０８５５９には、グリコサミノグリカン分解酵素の阻害物質としての複数グアノシンを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが記載されている。
【００１４】
先の文献の治療用オリゴヌクレオチドに関連する問題は、それらがヌクレアーゼによりインビボで分解しやすいことである。現在の再狭窄の処置方法に関連する本問題および他の問題を克服することが本発明の目的である。
【発明の開示】
【００１５】
本発明によれば、少なくとも一つのヘアピンループおよびｄＴまたはｄＧ解放基ＴＧを含むホスホロチオエート（ＰＳ）修飾オリゴヌクレオチドを含む抗再狭窄剤が提供されている。本発明により形成される抗再狭窄オリゴヌクレオチドは、ヘアピンループの存在のため、インビボでより長い活性寿命を有する。ヘアピンループはオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に隣接して位置することができる。しかし好ましくは、ヘアピンループはオリゴヌクレオチドの３’末端に隣接して位置する。
【００１６】
好ましい態様によれば、ヘアピンループは、配列ＸＹＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ（ここにＸおよびＹは、ヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧおよびＣから独立して選択される）を含む。理想的には、ヘアピンループは、オリゴヌクレオチドの３’末端に隣接して位置し、配列ＸＹＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ（ここにＸおよびＹは上述のとおりであり、第三および第四の塩基が第八および第九の塩基と塩基対を形作り、ヘアピンループの幹を形成する）を含む。３’末端でのヘアピンに代わるものとしてまたはそれに加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは５’末端でもヘアピンを含むことができ、該ヘアピンは配列ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＧＹＸ（ここに第一および第二の塩基が第六および第七の塩基と塩基対を形作り、ヘアピンループの幹を形成し、ＸおよびＹが各々独立してそれぞれヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧまたはＣを表す）を含む。このように、特に好ましいヘアピンループは文献（１６−１８，１９，２２）に記載されている。好ましい態様では、ＴＧ配列はヘアピンループ配列に隣接する。特に好ましいものは、末端配列ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧを有するホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドである。
【００１７】
本発明の好ましい態様においては、ＰＳ修飾オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの複数グアノシン配列を含む。本明細書において、「複数グアノシン配列」という用語は、少なくとも一つのＴＧＧＧＧ、ＴＧＧＧまたはＴＴＧＧＧ配列を有する配列を含む。特に好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、中心Ｔを有するコア部分を含み、該中心Ｔは第一の複数グアノシン配列にすぐに続き、かつ該第一の複数グアノシン配列の鏡像である第二の複数グアノシン配列がその後すぐに続く。例えば、オリゴヌクレオチドのコア配列は、例えばＴＧＧＧＧ  ＴＧＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴのような配列において中心Ｔに関して互いに鏡像であるＴＧＧＧＧの４つのブロックを含むことができ、または例えばＴＴＧＧＧ  ＴＴＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＴＴ  ＧＧＧＴＴのような配列において中心Ｔに関して互いに鏡像であるＴＴＧＧＧの４つのブロックを含むことができる。
【００１８】
本発明の一つの態様において、ＰＳ修飾オリゴヌクレオチドの３’末端は、配列ＴＧを含み、このＴＧ配列は理想的にはヘアピンループ配列に隣接する。一般に、ＰＳオリゴヌクレオチドは３０から１００塩基を含む。
【００１９】
本発明はまた、３０から１００塩基を有するホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドであって、その３’末端が配列ＴＧを含むものを含む抗再狭窄剤に関する。典型的には、このホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドは、先に定義した複数グアノシン配列を少なくとも一つ含む。本発明の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは上記ヘアピンループを含む。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、抗再狭窄剤は、
ＴＧＧＧＧ  ＴＧＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ；
ＴＧＧＧＧ  ＴＧＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧ；
ＴＴＧＧＧ  ＴＴＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＴＴ  ＧＧＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ；および
ＴＴＧＧＧ  ＴＴＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＴＴ  ＧＧＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧ；
から選択されるホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドを含む。上記の好ましいオリゴヌクレオチドは、以下のグループ：ＯＨ，Ｆ，ＮＨ２，ＯＣＨ３，ＯＣＨ２ＣＨ３のうちの一つを２’位に含むリボース部分のような修飾された糖間結合、および／またはホスホロ−ジチオエート、メチル−ホスホネートのような修飾されたリン酸基を含むことができ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として一般に知られているようなペプチド様骨格から作られるオリゴマー、発蛍光団、コレステロール、ポルフィリンおよびアルキルまたはホスホ−アルキル鎖のような親油性基、などの末端置換基を含むオリゴヌクレオチドがあり得る。
【００２１】
さらなる側面では、本発明は、体内に注入することができるタイプの装置であって、本発明による抗再狭窄剤を含むコーティングを有する装置に関する。典型的に、該装置は経皮経管的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）において一般に使用されるタイプのステントであり、理想的には、抗再狭窄剤が組み込まれた電気伝導性ポリマーの層で覆われた電気伝導性支持体を含む。
【００２２】
適切には、ポリマーは例えばチオフェンから誘導されるポリマーである。一つの態様において、ポリマーはポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）である。
【００２３】
さらなる側面では、本発明は、動脈硬化（ａｒｔｈｅｒｏｍａ）組織のような影響を受けた組織を本発明による抗再狭窄剤に接触させる段階を含む再狭窄の処置方法に関する。典型的に本法は、本発明によるステントを影響を受けた組織に隣接して配置させる。
【００２４】
本発明によるステントの調製に用いられる電解槽を説明する添付図面とともに、例示のみを目的として示す以下のいくつかの態様の記載から、本発明はより明確に理解されるだろう。
【００２５】
抗再狭窄オリゴヌクレオチド
本発明による抗再狭窄オリゴヌクレオチドは抗再狭窄コア配列を含み、修飾されてその３’および／または５’末端にヘアピンループおよびその３’および／または５’末端にＴＧ配列を含む。そのようなオリゴヌクレオチドへの修飾を行う方法は、オリゴヌクレオチド化学の分野における当業者によく知られているだろう。抗再狭窄剤のいずれかの末端において特に好ましいヘアピンループは、３’末端ではＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣまたはＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧ、および５’末端ではＣＧＡ  ＡＧＣ  ＧＡＣまたはＧＴ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＧＡＣである。
【００２６】
コア抗再狭窄配列は、複数グアノシン配列を含んでもよくまたは含まなくてもよい。コア部分の適当な配列は、Ｂｕｒｇｅｓｓらの論文（５）に記載されたものに含まれている。複数グアノシン配列を含まない適当なオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９７／１２８９９に記載されている。
【００２７】
本発明による特に好ましいオリゴヌクレオチドは、
ＴＧＧＧＧ  ＴＧＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ；
ＴＧＧＧＧ  ＴＧＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＧＴ  ＧＧＧＧＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧ；
ＴＴＧＧＧ  ＴＴＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＴＴ  ＧＧＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ；および
ＴＴＧＧＧ  ＴＴＧＧＧ  Ｔ  ＧＧＧＴＴ  ＧＧＧＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＴＧ；
から選択される。
購入可能な自動核酸合成器のいずれかを利用することにより、さらなる化学修飾を行うことなく、従来からの通常の技術により、これらオリゴヌクレオチドは合成することができる。
【００２８】
抗再狭窄オリゴヌクレオチドのステントへの結合
本発明による抗再狭窄オリゴヌクレオチドは、ステントに結合する前に、酢酸テトラエチルアンモニウム／アセトニトリル溶出緩衝液を用いた逆相Ｃ１８カラムの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、精製する。オリゴヌクレオチドのステントへの導入をモニターするために、同位体標識として３２Ｐを用いた通常の技術により、放射性標識を行うことができる。標識は、標識緩衝媒体中３７℃におけるポリヌクレオチドキナーゼによる３２Ｐ放射性リン酸基の３２Ｐ−ガンマ−ＡＴＰからオリゴヌクレオチドの５’位への転移により行うことができる。
【００２９】
本発明によるステントへのオリゴヌクレオチドの付加のための適当な技術は、ＷＯ９９／０３５１７に記載されており、ここにポリマーマトリックスはポリマーマトリックスによるオリゴヌクレオチドの結合よりも前にステントに付加する。典型的な例においておよび図１、２および３を参照すると、ポリマーマトリックスは３，４−エチレンジオキシチオフェンから形成される。
【００３０】
図４から９のいずれかで示したように、良好な条件下でステントをコーティングするために、医療装置の代替および／または変形をしないで、ステントと慣習的な電気化学セル間の接触ポイントを増やし、接続系を使用する。電析の前に、一対のステント／接続系の表面の前処理を無水エタノールで超音波をあてて行う。
【００３１】
図１から３によると、三つの電極、対向電極１、一定の電位を提供する基準電極として作用する塩化銀で覆われた銀線２および対向電極に関して電位を与える作用電極３を含む慣習的な電気化学セルを用い、電解融合を行う。電解槽４にポリマー化されるモノマーの溶液、電気伝導を与える塩およびこの場合ステンレス鋼製のステント５を入れる。モノマーは３，４−エチレンジオキシチオフェンで、これにポリビニルピロリドン（２ｘ１０−３Ｍ）を加える。電解溶液は、次の塩Ｎａ２ＨＰＯ４；ＮａＨ２ＰＯ４を含むｐＨ７．４でのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（１０ｍＭ）である。モノマーをＰＢＳ溶液に加える。ポテンシオダイナミック法（時間電流法）を用い、電位はＡｇ／ＡｇＣｌに関して＋１．１Ｖから＋１．３Ｖの範囲であった。
【００３２】
ポリマー化の前にオリゴヌクレオチドに電解溶液を加える。電位を約１０から４０分間維持した。ＯＤＮでコーティングしたステントを調製する本法は、「一段階ポリマー化」とも呼ばれる。
【００３３】
図４から９において、参照数字３は作用電極を示し、５はステントを示し、６はステンレス鋼ワイヤーを示し,７はポリマーワイヤーを示す。これらの図は、ステントおよび図１から３に示されるようなステント上に適当なポリマーマトリックスを沈殿させるために用いられる電気化学セル中で使用することができる作用電極を含む接続系の例を示している。
【００３４】
上記方法により、形成されるオリゴヌクレオチドでコーティングしたステントは、ＰＴＣＡ手順で用いることができる。
【００３５】
本発明は、解釈および詳細な説明の両方の点において多様化することができる本明細書中に記載した態様に制限されない。
【実施例】
【００３６】
実施例１
二つの異なるホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドＣおよびＤ（以下に定義する）を用い、四つの異なる濃度（５，１０，２０および６０μｍｏｌｌ−１）においてインビトロで増殖の研究を行った。どのオリゴヌクレオチドが最も低い細胞毒性効果で最良の細胞増殖の抑制効果を与えるかを調査するために、ヒト冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）について本研究を行った。プロトコルは、Ｃ．Ａ．Ｓｔｅｉｎ（２９）プロトコルの必要条件の適応を基本とした。
【００３７】
ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドＣおよびＤは、以下のとおりであった：
オリゴヌクレオチドＣは、配列：−
ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣＴＧ
を有するものであった。
オリゴヌクレオチドＤは、配列：−
ＴＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＴＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣＴＧ
を有するものであった。
５％平滑筋成長補給物（ＳＭＧＳ）を補充した培地２３１を入れた開放フラスコ中、５％ＣＯ２気体環境中３７℃でＨＣＡＳＭＣを変態させ、増殖させた。得られた細胞を４回の継代後に使用した。ＨＣＡＳＭＣ表現型の立証を、α−アクチンの陽性染色およびフォン・ウィルブランド因子の陰性染色を経由して行った。
細胞表現型評価（免疫学的蛍光抗体法）
細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、メタノール中−２０℃で固定した。
非特異的結合部位をウシ胎児血清でブロックした。
細胞にトリトン溶液を浸透させた。特異的抗体を使用した（モノクローナル抗ヒトα−アクチンおよびヤギＩｇＧ抗フォン・ウィルブランド因子）。
そして蛍光イソチオシアネートでマークした結合抗体の特異的な溶液を加えた（抗ムースＩｇＧまたは抗ヤギＩｇＧ）。
調製物をマウンティングメディアで覆い、蛍光顕微鏡で検査した。
複数の単離細胞から集めたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を対照として用い：フォン・ウィルブランド因子を陽性およびα−アクチン染色を陰性とした。
分析の結果
−α−アクチンの陽性染色がＨＣＡＳＭＣ細胞において観察された。
−α−アクチンの陰性染色がＨＵＶＥＣ細胞において観察された。
−フォン・ウィルブランド因子の陽性染色がＨＵＶＥＣ細胞において観察された。
−フォン・ウィルブランド因子の陰性染色がＨＣＡＳＭＣ細胞において観察された。
【００３８】
実施例の手順
Ｉ．乳酸脱水素酵素溶出分析
Ｉ−１）手順
ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性分析（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。比色法を用いた細胞溶解で溶出された安定なサイトソル酵素であるＬＤＨを、ＣｙｔｏＴｏｘ９６分析で定量的に測定する。テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）の赤色ホルマザン産物への変換を引き起こし、ジアホラーゼ酵素を用いる酵素分析で、培養上清中に溶出したＬＤＨを測定した。４９０ｎｍの可視波長で検出された形成された色の量は、溶解した細胞の数に比例した。ＣｙｔｏＴｏｘ９６分析の一般的な化学反応は以下のとおりである:
ＬＤＨ
ＮＡＤ−＋乳酸＝＞ピルビン酸＋ＮＡＤＨ
ジアホラーゼ
ＮＡＤＨ＋ＩＮＴ＝＞ＮＡＤ−＋ホルマザン
本分析は、他の方法論を用いたときに失敗しうる細胞膜への損傷を早期で、低レベルのものとすることができる。
【００３９】
Ｉ−２）対照記事
培地バックグラウンド対照：
細胞の非存在下、試験記事に記載の条件と同じ条件下に置いた基底培地（Ｍ１９９）または０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した培地（Ｍ１９９）または血小板由来成長因子−ＡＢ（ＰＤＧＦ）（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充した培地（Ｍ１９９）の三成分からなる１００μＬの溶液を培地バックグラウンドとして用いた。
【００４０】
容積修正対照：
細胞の非存在下、基底培地（Ｍ１９９）または０．２％ＢＳＡまたは１０％ＦＣＳを補充した培地（Ｍ１９９）またはＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充した培地（Ｍ１９９）の三成分からなる１００μＬの溶液に、溶解溶液（１５μＬ）（１０Ｘ）を加え、試験記事に記載の条件と同じ条件下に置いたものを容積修正対照として使用した。
【００４１】
陰性対照：
細胞の存在下、試験記事に記載の条件と同じ条件下に置いた基底培地（Ｍ１９９）または０．２％ＢＳＡまたは１０％ＦＣＳを補充した培地（Ｍ１９９）またはＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充した培地（Ｍ１９９）の三成分からなる１００μＬの溶液を陰性対照として使用した。
【００４２】
陽性対照：
使用の直前に調製した三成分からなる１００μＬのＬＤＨ陽性対照（ウシ心臓ＬＤＨ、１：５０００リン酸緩衝生理食塩水希釈液）を陽性対照として使用した。
【００４３】
Ｉ−３）予備試験
そのような方法で適切なＳ／Ｎ比を確かめるのに十分に高い光学濃度（ＯＤ）に到達させるために、予備試験で細胞シーディングを最適化した。異なる細胞シーディングを５ｘ１０３，１ｘ１０４および２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬで試験した。０．２％ＢＳＡを補充した培地（Ｍ１９９）（１００μＬ）の存在下４８時間、９６ウェルプレートで三成分からなる細胞単層を培養した。その後、基底培地（Ｍ１９９）（１００μＬ）または０．２％ＢＳＡを補充した培地、１０％ＦＣＳまたはＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充した培地で４８時間、細胞をインキュベートした。培地バックグラウンド対照を調製した。そして溶解緩衝液（１５μＬ）をいくつかの培養ウェルに加え、３７℃で４５分間インキュベートし、２５０ｇで４分間遠心分離した。すべてのウェルからアリコート（５０μＬ）を酵素分析プレートに移し、混合基質（５０μＬ）を加え、光を遮断して室温で３０分間プレートをインキュベートした。そして反応停止液（５０μＬ）を各ウェルに加え、光学濃度（ＯＤ）を１時間以内で記録した。培地バックグラウンド対照の少なくとも２倍のＯＤとなるようなＯＤ値により細胞の適切な濃度を決定した。結果を以下に示す。
第１表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の予備試験結果：培養試薬
【表１】
2005512617.tif 000002
第２表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の予備試験結果：５ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬの培養物
【表２】
2005512617.tif 000003
第３表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の予備試験結果：１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬの培養物
【表３】
2005512617.tif 000004
第４表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の予備試験結果：２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬの培養物
【表４】
2005512617.tif 000005
（１）培地バックグラウンド対照
（２）容積修正対照
陽性対照は、４９０ｎｍでＯＤとして表される１．８１１の結果を示した。
溶解後のＯＤの増加は、５ｘ１０３ｃｅｌｌｓシーディングよりも２ｘ１０４ｃｅｌｌｓシーディングでより高いものであった。それゆえ、この細胞濃度（２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ）をさらなる実験のために選択した。
Ｍ１９９＋１０％ＦＢＳ培地の存在下、干渉が観察されたが、結果は６ページに与えられた式により解釈できた。特にＦＢＳと比較したとき、ＰＤＧＦはごくわずかにしかＨＣＡＳＭＣ成長を広げなかった。
【００４４】
Ｉ−４）最終的な試験
基本的な試験（細胞溶解の前後の試験のためのウェル）で決定したシーディングを用い、０．２％ＢＳＡを補充した培地（Ｍ１９９）（１００μＬ）の存在下、９６ウェルプレート中で４８時間全く同一に三成分からなる細胞単層を培養した。その後、第５表で示した条件下４８時間、細胞をインキュベートした。
第５表：
試験条件
【表５】
2005512617.tif 000006
培地バックグラウンド対照、容積修正対照、陰性および陽性対照を調製した。溶解緩衝液（１５μＬ）を実験の一つの標本（最大ＬＤＨ溶出）に加え、３７℃で４５分間インキュベートし、２５０ｇで４分間遠心分離した。細胞形態を各条件でメモした他の標本（経験的ＬＤＨ溶出）は、細胞溶解のために処置しなかった。そしてすべてのウェルからアリコート（５０μＬ）を酵素分析プレートに移し、混合基質（５０μＬ）を各ウェルに加え、３０分間室温で光を遮断してインキュベートした。その後、反応停止液（５０μＬ）を各ウェルに加え、ＯＤを１時間以内で記録した。平均ＯＤを各条件で計算し、細胞毒性の割合を以下のとおりに計算した:
％細胞毒性＝｛実験的平均ＬＤＨ溶出（ＯＤ）−平均対照培地バックグラウンド（ＯＤ）｝ｘ１００／｛最大ＬＤＨ溶出平均（ＯＤ）−容積修正対照平均（ＯＤ）｝
結果は以下に示す。
第６表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：培養試薬＋１０％ＦＢＳ
【表６】
2005512617.tif 000007
第７表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：オリゴヌクレオチドＣ＋１０％ＦＢＳおよびオリゴヌクレオチドＤ＋１０％ＦＢＳ
【表７】
2005512617.tif 000008
第７表の結果を図１０にグラフを用いて示す。
第８表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：培養試薬＋ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）
【表８】
2005512617.tif 000009
（１）第一分析
（２）第二分析
*：分析の細胞毒性％−陰性対照の細胞毒性％
第９表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：オリゴヌクレオチドＣ＋ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびオリゴヌクレオチドＤ＋ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）
【表９】
2005512617.tif 000010
第９表の結果を図１１にグラフを用いて示す。
第１０表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：陽性および陰性対照
【表１０】
2005512617.tif 000011
（１）第一分析
（２）第二分析
*：分析の細胞毒性％−陰性対照の細胞毒性％
【００４５】
コメント：
対照プレートは、ＦＢＳの場合の約１４．６％からＰＤＧＦの場合の約２８．７％の範囲で相対的な細胞毒性効果を示した。この状況は、活性な構成要素にさらされる前の細胞の「飢餓」を現実化する培養条件に関連しそうなことであった（ＦＢＳまたはＰＤＧＦなしでＭ１９９＋０．２％ＢＳＡと接触して４８時間）。ＦＢＳなしのＰＤＧＦはＨＣＡＳＭＣの最適な成長および生存条件を表さなかった。
オリゴヌクレオチドＣおよびＤはともに、ＦＢＳと比較したときＰＤＧＦの存在下ではより著しく、投与量に依存した細胞毒性効果を示した。理想的な濃度下において、オリゴヌクレオチドＣはオリゴヌクレオチドＤよりも一様により細胞毒性であった。
【００４６】
ＩＩ−増殖分析
ＩＩ−１）手順
ＳＭＧＳ（０．５ｍＬ／ウェル）を補充したＭ２３１培地を用い、１２−ウェルプレート中で６０〜７０％コンフルーエンスまで三成分からなる細胞単層を成長させた。細胞単層をＭ１９９で３回洗浄し、０．２％ＢＳＡを補充した培地（Ｍ１９９）（０．５ｍＬ）の存在下で４８時間インキュベートした。その後、第５表に記載した条件下で４８時間、細胞をインキュベートした。陰性および陽性対照を調製した。細胞をトリプシン処理し、トリパンブルーを加え、マラッセ細胞を用い、細胞を２回数えた。平均を計算し、増殖分析の割合を以下のとおりに計算した：
％増殖＝実験条件平均（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）ｘ１００／対照平均に対応する実験条件（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）
【００４７】
ＩＩ−２）対照
陰性対照：
基底培地（Ｍ１９９）（０．５ｍＬ）または０．２％ＢＳＡまたは１０％ＦＣＳを補充した培地（Ｍ１９９）またはＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充した培地（Ｍ１９９）を含む三成分からなる培養ウェルを細胞の存在下、試験記事に記載の条件と同じ条件に置き、陰性対照として使用した。
【００４８】
陽性対照：
基底培地（Ｍ１９９）（０．５ｍＬ）または０．２％ＢＳＡまたは１０％ＦＣＳを補充した培地（Ｍ１９９）またはＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充した培地（Ｍ１９９）を含む三成分からなる培養ウェルを、６．４ｇ／Ｌフェノールを加えた細胞の存在下、試験記事に記載の条件と同じ条件に置き、陽性対照として使用した。
結果の平均値は以下の表に示す：
第１１表：
細胞の数として表される増殖試験の結果：陰性対照（Ｍ１９９＋ＢＳＡ）
【表１１】
2005512617.tif 000012
第１２表：
細胞の数として表される増殖試験の結果：オリゴヌクレオチドＣおよびオリゴヌクレオチドＤ（Ｍ１９９＋１０％ＦＢＳ）
【表１２】
2005512617.tif 000013
第１２表の結果を図１２にグラフを用いて示す。
第１３表：
細胞の数として表される増殖試験の結果：オリゴヌクレオチドＣおよびオリゴヌクレオチドＤ（Ｍ１９９＋ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ））
【表１３】
2005512617.tif 000014
第１３表の結果を図１３にグラフを用いて示す。
【００４９】
ＩＩ−２）コメント
オリゴヌクレオチドＣおよびＤはともに、ＨＣＡＳＭＣの増殖への抑制効果を有し、その効果は投与量に依存したことがこれらの結果で示された。ＦＢＳ１０％およびＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下、本効果を観察した。ＦＢＳまたはＰＤＧＦのどちらを用いても、オリゴヌクレオチドＣはオリゴヌクレオチドＤよりも常に、より大きな抑制を示した。
ＦＢＳまたはＰＤＧＦの存在下、それぞれ４５％および７８％のＨＣＡＳＭＣ成長を減少させるために、５μｍｏｌ／ＬのオリゴヌクレオチドＣの濃度ですでに有効であった。
オリゴヌクレオチドＣが７８％のレベルで細胞成長を抑制することができる濃度は、ＰＤＧＦ存在下において５μｍｏｌ／Ｌであり、類似の抑制がＦＢＳの存在下においては６０μｍｏｌ／Ｌで得られた。これは、ＦＢＳによるオリゴヌクレオチドＣの相対的中和価および／または細胞へのＦＢＳのより強い増殖効果のいずれかにより説明できた。
【００５０】
実施例２
インビトロで増殖の研究を、二つの異なるホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２（以下に定義）を用い、実施例１に記載の手順により行った。ＨＣＡＳＭＣにおいて本研究を行った。ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２は、以下のとおりであった:
オリゴヌクレオチドＣ１は、配列
ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＧＡＡＧＣ
を有するものであった。
オリゴヌクレオチドＣ２は、配列
ＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴ
を有するものであった。
５％平滑筋成長補給物（ＳＭＧＳ）を補充した培地２３１を入れた開放フラスコ中、５％ＣＯ２気体環境中３７℃でＨＣＡＳＭＣを変態させ、増殖させた。得られた細胞を６回の継代後に使用した。ＨＣＡＳＭＣ表現型の立証は、実施例１に記載のとおりに、α−アクチンの陽性染色およびフォン・ウィルブランド因子の陰性染色により行った。
【００５１】
実施例の手順
１．乳酸脱水素酵素溶出分析
１）手順−実施例１に記載のとおり。
２）対照記事
実施例１中Ｉ−２）に記載のとおり。
３）方法
基本的な試験（実施例１）（細胞溶解の前後の試験のためのウェル）で決定したシーディングを用い、０．２％ＢＳＡを補充した培地（Ｍ１９９）（１００μＬ）の存在下、９６ウェルプレート中で４８時間、全く同一に三成分からなる単層を培養した。その後、第１４表で示した条件下４８時間、細胞をインキュベートした。
第１４表：
試験条件
【表１４】
2005512617.tif 000015
培地バックグラウンド対照、容積修正対照、陰性および陽性対照を調製した。溶解緩衝液（１５μＬ）を実験の一つの標本（最大ＬＤＨ溶出）に加え、３７℃で４５分間インキュベートし、２５０ｇで４分間遠心分離した。細胞形態を各条件でメモした他の標本（経験的ＬＤＨ溶出）は、細胞溶解のために処置しなかった。そしてすべてのウェルからアリコート（５０μＬ）を酵素分析プレートに移し、混合基質（５０μＬ）を各ウェルに加え、３０分間室温で光を遮断してインキュベートした。その後、反応停止液（５０μＬ）を各ウェルに加え、ＯＤを１時間以内で記録した。平均ＯＤを各条件で計算し、細胞毒性の割合を以下のとおりに計算した：
％細胞毒性＝｛実験的平均ＬＤＨ溶出（ＯＤ）−平均対照培地バックグラウンド（ＯＤ）｝ｘ１００／｛最大ＬＤＨ溶出平均（ＯＤ）−容積修正対照平均（ＯＤ）｝
結果は以下に示す。
第１５表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：培養反応物＋１０％ＦＢＳ
【表１５】
2005512617.tif 000016
第１６表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：オリゴヌクレオチドＣ１＋１０％ＦＢＳおよびオリゴヌクレオチドＣ２＋１０％ＦＢＳ
【表１６】
2005512617.tif 000017
第１７表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：培養試薬＋ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）
【表１７】
2005512617.tif 000018
第１８表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：オリゴヌクレオチドＣ１＋ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／１００ｍｌ）およびオリゴヌクレオチドＣ２＋ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／１００ｍｌ）
【表１８】
2005512617.tif 000019
第１９表：
４９０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）として表されるＬＤＨ溶出の結果：陽性および陰性対照
【表１９】
2005512617.tif 000020
（１）培地バックグラウンド対照
（２）容積修正対照
*：分析の細胞毒性％−陰性対照の細胞毒性％
【００５２】
コメント：
対照プレートは、ＦＢＳの場合の約１４．６％からＰＤＧＦの場合の約２８．７％の範囲で相対的な細胞毒性効果を示した。この状況は、活性な構成要素にさらされる前の細胞の「飢餓」を現実化する培養条件に関連しそうなことであった（ＦＢＳまたはＰＤＧＦなしでＭ１９９＋０．２％ＢＳＡと接触して４８時間）。ＦＢＳなしのＰＤＧＦはＨＣＡＳＭＣの最適な成長および生存条件を表さなかった。二種のオリゴヌクレオチドは約８％のＦＢＳ存在下、比較的細胞毒性効果を示した。二種のオリゴヌクレオチドは、ＰＤＧＦの存在下、増殖効果を示した。この増殖は、Ｃ１の存在下においてより重要であった。
【００５３】
ＩＩ−増殖分析
１）手順
これは、第１４表に記載の条件下４８時間、細胞をインキュベートした場合を除いて、実施例１中の手順ＩＩ−１）に記載したとおりに行った。
対照−実施例１に記載のとおり。
結果の平均値を以下の表に示す。
第２０表：
細胞の数として表される増殖試験の結果：陰性対照＋ＢＳＡ
【表２０】
2005512617.tif 000021
ＢＳＡの存在が細胞毒性効果を誘発した（細胞の増殖なし）。
第２１表：
細胞の数として表される増殖試験の結果：オリゴヌクレオチドＣ１＋１０％ＦＢＳおよびオリゴヌクレオチドＣ２＋１０％ＦＢＳ
【表２１】
2005512617.tif 000022
第２２表：
細胞の数として表される増殖試験の結果：オリゴヌクレオチドＣ１＋ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／１００ｍｌ）およびオリゴヌクレオチドＣ２＋ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／１００ｍｌ）
【表２２】
2005512617.tif 000023
【００５４】
ＩＩ−２）コメント
両方のオリゴヌクレオチドがＨＣＡＳＭＣの増殖への抑制効果を有することが、これらの結果で示された。ＦＢＳ１０％およびＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下、本効果を観察した。ＦＢＳまたはＰＤＧＦのどちらを用いても、オリゴヌクレオチドＣ１はオリゴヌクレオチドＣ２よりも常に、より大きな抑制を示した。
【００５５】
［結論］
本研究の条件において：細胞の表現型（抗α−アクチン抗体の陽性染色および抗フォン・ウィルブランド因子抗体の陰性染色）を評価した。
これらの結果で、以下のことが示された：
−両方のオリゴヌクレオチドは、ＦＢＳの存在下、わずかな細胞毒性効果をおよびＰＤＧＦの存在下、増殖効果を示した。
−１０μｍｏｌ／Ｌの濃度において、オリゴヌクレオチドＣ２は一様に、オリゴヌクレオチドＣ１よりもより細胞毒性であった。
−１０μｍｏｌ／Ｌの濃度において、オリゴヌクレオチドＣ１はオリゴヌクレオチドＣ２よりもより効果があり、ＨＣＡＳＭＣ成長を抑制した。
【００５６】
参考文献
1. Bennett, M. R., Lindner, V., DeBlois, D., Reidy, M. A. and Schwartz, S. M.  "Effects of phosphorothioate oligonucleotides on neointima formation in the rat carotid artery, Dissecting the mechanism of action".  Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1997, 17: 2326-32.
2. Wang, W. Z., Chen, H. J., Schwartz, A., Cannon, P. J., Stein, C. A. and Rabbani, L. E.  "Sequence-independent inhibition of in vitro vascular smooth muscle cells proliferation, migration and in vivo neointimal formation by phosphorothioate oligodeoxynucleotides".  J. Clin. Invest. 1996, 98: 443-50.
3. Villa, A. E., Guzman, L. A., Poptic, E. J., Labhasetwar, V., D'Souza, S., Farrell, C. L., Plow, E. F., Levy, R. J., DiCorleto, P. E. and Topol, E. J.  "Effects of c-myb oligonucleotides on vascular smooth muscle cells proliferation and response to vessel wall injury".  Circ. Res. 1995, 76: 505-13.
4. Burgess, T.L., Fischer, E. F., Ross, S.L., Bready, J. V., Qian, Y. X., Bayewitch, L. A., Cohen, A. M., Herrera, C. J., Hu, S. S.F., Kramer, T. B., Lott, F. D., Martin, F. H., Pierce, G. F., Simonet, L., and Farrell, C. L.  "The anti-proliferate activity of c-myc and c-myb antisense oligonucleotides in smooth muscle cells is caused by a non-antisense mechanism".  Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 4051-4055 and WO 97 12899.
5. Autieri, M. V., Yue, T. L., Fernstein, G. Z. andOhlstein, E.  "Antisense oligonucleotides to the P65 subunit of NF-KB inhibit human vascular smooth muscle cell adherence and proliferation and prevent neointima formation in rat carotid arteries".  Bichem. Biophys. Res. Commun. 1995, 213: 827-36.
6. Abe, J. I., Zhou, W., Taguchi, J. I., Takuwa, N., Miki, K., Okazaki, H., Kurokawa, K., Kumada, M. and Takuwa, Y.  "Suppression of neointimal smooth muscle cell accumulation in vivo by antisense CDC2 and CDK2 oligonucleotides in rat carotid artery".  Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 198: 16-24.
7. Shi, Y., Fard, A., Galeo, A., Hutchinson, H. G., Vermani, P., Dodge, G. R., Hall, D. J., Shaheen, F. andZalewski, A.  "Transcatheter delivery of c-myc antisense oligomers reduces neointimal formation in a porcine model of coronary artery balloon injury".  Circ. 1994, 90: 944-51.
8. Biro, S., Fu, Y. M., Yu, Z. X. and Epstein, S. E.  "Inhibitory effects of antisense oligodeoxynucleotides targeting c-myc mRNA on smooth muscle cell proliferation and migration".  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 654-8.
9. Morishita, R., Gibbons, G. H., Ellison, K. E., Nakajima, M., Zhang, L. N., Kaneda, Y., Ogihara, T. and Dzau, V. J.  "Single intraluminal delivery of antisense cdc2 kinase and proliferating-cell nuclear antigen oligonucleotides results in chronic inhibition of neointimal hyperplasia".  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 8474-8.
10. Simons, M., Edelman, E. R., DeKeyser, J. L., Langer, R. and Rosenberg, R. D.  "Antisense c-myb oligonucleotides inhibit intimal arterial smooth muscle cell accumulation in vivo".  Nature, 1992, 359: 67-70.
11. Wang, W. Z., Chen, H. J., Schwartz, A., Cannon, P. J., Stein, C. A. and Rabbani, L. E.  "Sequence-independent inhibition of in vitro vascular smooth muscle cell proliferation, migration, and in vivo neointimal formation byphosphorothioate oligodeoxynucleotdies".  J. Clin. Invest., 1996, 98: 443-50.
12. Rockwell, P., O'Connor, W. J., King, K., Goldstein, N. I., Zhang, L. M. and Stein, C. A.  "Ceil-surfaces perturbations of the epidermal growth factor and vascular endothelial growth factor receptors by phosphorothioate oligodeoxynucleotides".  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94: 6523-8.
13. Kitajima, I., Unoki, K. and Maruyama, I.  "Phosphorothioate oligodeoxynucleotides inhibit basicfibroblast growth factor-induced angiogenesis in vitro and in vivo".  Antisense and Nucl. Acid Drug Dev. 1999, 9: 233-9.
14. Wang, W. Z., Chen, H. J., Sun, J., Benimetskaya, L., Schwartz, A., Cannon, P. J., Stein, C. A. and Rabbani, L. E.  "A comparison of guanosine-quartet inhibitory effects versus cytidine homopolymer inhibitory effects on rat neointimal formation".  Acid Drug Dev. 1998, 8: 227-36.
15. Yaswen P., Stampfer, M. R., Ghosh, K. and Cohen, J. S.  "Effects of sequence of thioated oligonucleotdies on cultured human mammary epithelial cells".  Antisense Res. Dev. 3: 67-77, 1993.
16. Hirao, I., Nishimura, Y., Tagawa, Y., Watanabe, K. and Miura, K.  "Extraordinarily stable mini-hairpins.  Electrophoretical and thermal properties of the various sequences variant ofd (GCGAAAGC) and their effect on DNA sequencing".  Nucl. Acids Res. 1992, 20: 3891-6.
17. Khan,I. M. and Coulson, J. M.  "A novel method to stablize antisense oligonucleotides againstexonuclease degradation".  Nucl. Acids Res. 1993, 21: 2957-8.
18. Hirao, I., Kawai, G., Yoshizawa, S., Nishimura, Y., Ishido, Y., Watanabe, K. and Miura, K.  "Most compact hairpin-turn structure exerted by a short DNA fragment, d(GCGAAGC) in solution: an extraordinarily stable structure resistant to nucleases and heat".  Nucl. Acids Res. 1994, 22: 576-82.
19. Yoshizawa, S., Ueda, T., Ishido, Y., Miura, K., Watanabe, K. and Hirao, I.  "Nuclease resistance of an extraordinarily thermostable mini-hairpin DNA fragment, d(GCGAAGC) and its application to in vitro protein synthesis".  Nucl. Acids Res. 1994, 22: 2217-21.
20. Poddevin, B., Meguinni, S., Elias, I., Vasseur, M. and Blumenfeld, M.  "Improved anti-herpes simplex virus type I activity of a phosphodiester antisense oligonucleotide containing a 3'-terminal hairpin-like structure".  Antisense Res. and Dev. 1994, 4: 147-54.
21. Refregiers, M., Laigle, A., Jolles, B. and Chinsky, L. J.  "Fluorescence resonance energy transfer analysis of the degradation of an oligonucleotide protected by a very stable hairpin".  Biomol. Struct. and Dynamics 1996, 14: 365-71.
22. Yoshizawa, S., Kawai, G., Watanabe, K., Miura, K., andHirao, I. "GNA trinucleotide loop sequence producing extraordinarily stable DNA hairpin".  Biochemistry, 1997, 36: 4761-7.
23. Jolles, B., Refregiers, M. and Laigle, A.  "Opening of the extraordinarily stable mini-hairpin d(GCGAAGC)".  Nucl. Acids Res. 1997, 25: 4608-13.
24. Maksimenko, A. V., Gottikh, M. B., Helin, V., Shabarova, Z. A. and Malvy, C.  "Physico-chemical and biological properties of antisense phosphodiester oligonucleotides with various secondary structures".  Nucleos. and Nucleot. 1999, 18: 9, 2071-91.
25. Vaerman, J. L., Moureau, P., Deldime, F., Lewalle, P., Lammineur, C., Morschauser, F. and Martiat, P.  "Antisense oligodeoxynucleotides suppress hematologic cell growth through stepwise release of deoxyribonucleotides".  Blood, 1997, 90: 331-9.
26. Roque, F., Mon, C.,Belardi, J., Rodriguez, A.,Grinfeld, L., Fischman, D., Shi, Y andZalewski, A. "Safety of intracoronary administration of c-myc antisense after PTCA"  Antisense Nucl. Acids. Res. Dev. 2001, 11: 99-106.
27. Agrawal, S., Zhao, Q. Y., Jiang, Z. W., Oliver, G., Giles, H., Heath, J. and Serota, D.  "Toxicologic effects of an oligodeoxynucleotide phosphorothioate and its analogs following intravenous administration in rats".  Antisense and Nucl. Acid Drug Dev., 1997, 7: 575-84.
28.28. Zhang, R. W., Yan, J. M., Shahinian, H., Amin, G., Lu, Z. H., Lui, T. P., Saag, M. S., Jiang, Z. W., Temsamani, J., Martin, R. R., Schechter, P. J., Agrawal, S. and Diasio, R. B.  "Pharmacokinetics of an anti- human immunodeficiency virus antisense oligodeoxynucleotide phosphorothioate (GEM 91) inHIV-infected subjects".  Clin. Pharmacol. and Ther. 1995, 58: 44-53.
29. Weizhen, Wang, Hong Jun Chen, Allan Schwartz, Paul J. Cannon, C. A. Stein and LeRoy E. Rabbani.  "Sequence independent inhibition of in vitro vascular smooth muscle cell proliferation, migration, and in vivoneointimal formation by phosphorothioate oligodeoxynucleotides".  J. Clin. Invest. Vol 98, No. 2, July 1996, 443-450.
【図面の簡単な説明】
【００５７】
（原文に記載なし）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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