(57)【要約】本発明は、そのゲノム全体がプロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子を安定に組み入れているトランスジェニック魚を提供する。トランスジェニック魚を作成する方法およびその使用法も同様に提供する。一つの態様において、トランスジェニック魚は、腫瘍遺伝子による新生物もしくは過形成形質転換を調節する、または化学療法もしくは放射線療法に対する感受性を調節する薬物もしくは物質をスクリーニングする方法において都合よく用いられる可能性がある。もう一つの態様において、トランスジェニック魚は、腫瘍遺伝子による新生物もしくは過形成形質転換を調節する、または化学療法もしくは放射線療法に対する感受性を調節する変異を同定する方法に用いてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノムがプロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているトランスジェニック魚。
【請求項２】
プロモーターが臓器または組織特異的プロモーターである、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項３】
組織特異的プロモーターが、ケラチン-8、Islet-1、PDX-1、インスリン、GFAP、MYO-D、α-アクチン、チロシンヒドロキシラーゼ、MPO、およびPU.1プロモーターからなる群より選択される、請求項2記載のトランスジェニック魚。
【請求項４】
プロモーターが類リンパ特異的プロモーターである、請求項2記載のトランスジェニック魚。
【請求項５】
プロモーターがB-細胞またはT-細胞特異的プロモーターである、請求項4記載のトランスジェニック魚。
【請求項６】
類リンパ特異的プロモーターがRAG1、RAG2、およびCD2プロモーターからなる群より選択される、請求項4記載のトランスジェニック魚。
【請求項７】
プロモーターがT-細胞前駆体特異的プロモーターである、請求項4記載のトランスジェニック魚。
【請求項８】
プロモーターがRAG2プロモーターである、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項９】
腫瘍遺伝子が、MYC、CYCLIN D1、FOS、JUN、MYB、BCL2、HOX11、HOX11L2、LYL1、TAL1/SCL、LMO1、LMO2、MYCN、MDM2、CDK4、GLI1、IGF2、活性化RAS、活性化EGFR、変異FLT3-ITD、変異および活性化型の、TP53、PAX3、PAX7、BCR/ABL、HER2/NEU、FLT3R、NPM-ALK、SRC、RAS、ABL、TAN1、PTC、B-RAF、PML-RARα、およびE2A-PBX1、からなる群より選択される、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項１０】
腫瘍遺伝子が腫瘍遺伝子の哺乳類相同体である、請求項9記載のトランスジェニック魚。
【請求項１１】
腫瘍遺伝子がT-細胞腫瘍遺伝子である、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項１２】
T-細胞腫瘍遺伝子がMYC、TAL1/SCL、TAL2、LYL1、LMO1、LMO2、HOX11、HOX11L2、TAN1、およびLYL1遺伝子ファミリーからなる群より選択される遺伝子ファミリーメンバーである、請求項11記載のトランスジェニック魚。
【請求項１３】
腫瘍遺伝子がT-細胞腫瘍遺伝子の哺乳類相同体である、請求項12記載のトランスジェニック魚。
【請求項１４】
腫瘍遺伝子がB-細胞腫瘍遺伝子である、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項１５】
B-細胞腫瘍遺伝子が、MYC、E2A-PBX1、E2A-HLF、TEL-AML1、BCL6、BCL3、LYT10、MLL、HOX、およびPAX5遺伝子ファミリーからなる群より選択される遺伝子ファミリーのメンバーである、請求項14記載のトランスジェニック魚。
【請求項１６】
腫瘍遺伝子がB-細胞腫瘍遺伝子の哺乳類相同体である、請求項15記載のトランスジェニック魚。
【請求項１７】
腫瘍遺伝子がcMYCまたはBCL2である、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項１８】
腫瘍遺伝子がcMYCまたはBCL2と実質的に類似である、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項１９】
腫瘍遺伝子がレポーター遺伝子に融合している、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項２０】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびアルカリホスファターゼからなる群より選択される、請求項19記載のトランスジェニック魚。
【請求項２１】
レポーター遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子である、請求項19記載のトランスジェニック魚。
【請求項２２】
蛍光タンパク質遺伝子がGFP、RFP、BFP、YFP、およびdsRED2からなる群より選択される、請求項21記載のトランスジェニック魚。
【請求項２３】
蛍光タンパク質遺伝子がGFPである、請求項22記載のトランスジェニック魚。
【請求項２４】
cMYC腫瘍遺伝子が緑色蛍光タンパク質遺伝子に融合している、そのゲノムがRAG2プロモーターに機能的に結合したcMYC腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているトランスジェニック魚。
【請求項２５】
レポーター遺伝子が部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接する、そのゲノムが汎在遺伝子プロモーター、強い転写終止部位を含むレポーター遺伝子、および腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているトランスジェニック魚。
【請求項２６】
部位特異的リコンビナーゼ認識部位がFlox、Lox、およびFRTからなる群より選択される、請求項25記載のトランスジェニック魚。
【請求項２７】
汎在プロモーターがCMV、EF1-α、またはβ-アクチンである、請求項25記載のトランスジェニック魚。
【請求項２８】
レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびアルカリホスファターゼからなる群より選択される、請求項25記載のトランスジェニック魚。
【請求項２９】
レポーター遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子である、請求項25記載のトランスジェニック魚。
【請求項３０】
蛍光タンパク質遺伝子が、GFP、RFP、BFP、YFP、およびdsRED2からなる群より選択される、請求項29記載のトランスジェニック魚。
【請求項３１】
腫瘍遺伝子が腫瘍遺伝子による癌の進行を誘導し、癌が、非ホジキンリンパ腫、高度星状細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、膵臓癌、卵巣癌、睾丸癌、胃癌、結腸癌、腎癌、黒色腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、およびcMYC-誘導T-細胞急性リンパ芽球性白血病からなる群より選択される、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項３２】
腫瘍遺伝子がERに融合される、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項３３】
ERがタモキシフェン感受性ER（ERTm）である、請求項32記載のトランスジェニック魚。
【請求項３４】
トランスジェニック魚がトランスジェニックゼブラフィッシュである、請求項1記載のトランスジェニック魚。
【請求項３５】
そのゲノムが、ゼブラフィッシュTAG2プロモーターに機能的に結合したマウスcMYC腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているトランスジェニックゼブラフィッシュ。
【請求項３６】
以下を含む、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節する薬物または物質をスクリーニングする方法：
トランスジェニック魚が、プロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子をその中に組み入れているゲノムを有する、試験薬または物質にトランスジェニック魚を接触させるまたはそうでなければ曝露する段階。
試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節するか否かを決定する段階；および
試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節すれば、試験薬または物質を、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節する薬物または物質であると分類する段階。
【請求項３７】
プロモーターが臓器または組織特異的プロモーターである、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
組織特異的プロモーターが、ケラチン-8、Islet-1、PDX-1、インスリン、GFAP、MYO-D、α-アクチン、チロシンヒドロキシラーゼ、MPO、およびPU.1プロモーターからなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
プロモーターが類リンパ特異的プロモーターである、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
プロモーターがB-細胞またはT-細胞特異的プロモーターである、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
類リンパ特異的プロモーターがRAG1、RAG2、およびCD2プロモーターからなる群より選択される、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
プロモーターがT-細胞前駆体特異的プロモーターである、請求項39記載の方法。
【請求項４３】
プロモーターがRAG2プロモーターである、請求項36記載の方法。
【請求項４４】
腫瘍遺伝子が、MYC、CYCLIN D1、FOS、JUN、MYB、BCL2、HOX11、HOX11L2、LYL1、TAL1/SCL、LMO1、LMO2、MYCN、MDM2、CDK4、GLI1、IGF2、活性化RAS、活性化EGFR、変異FLT3-ITD、変異および活性化型の、TP53、PAX3、PAX7、BCR/ABL、HER2/NEU、FLT3R、NPM-ALK、SRC、RAS、ABL、TAN1、PTC、B-RAF、PML-RARα、およびE2A-PBX1、からなる群より選択される、請求項36記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍遺伝子が腫瘍遺伝子の哺乳類相同体である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍遺伝子がT-細胞腫瘍遺伝子である、請求項36記載の方法。
【請求項４７】
T-細胞腫瘍遺伝子がMYC、TAL1/SCL、TAL2、LYL1、LMO1、LMO2、HOX11、HOX11L2、TAN1、およびLYL1遺伝子ファミリーからなる群より選択される遺伝子ファミリーメンバーである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍遺伝子がT-細胞腫瘍遺伝子の哺乳類相同体である、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍遺伝子がB-細胞腫瘍遺伝子である、請求項36記載の方法。
【請求項５０】
B-細胞腫瘍遺伝子が、MYC、E2A-PBX1、E2A-HLF、TEL-AML1、BCL6、BCL3、LYT10、MLL、HOX、およびPAX5遺伝子ファミリーからなる群より選択される遺伝子ファミリーのメンバーである、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
腫瘍遺伝子がB-細胞腫瘍遺伝子の哺乳類相同体である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
腫瘍遺伝子がcMYCまたはBCL2である、請求項36記載の方法。
【請求項５３】
腫瘍遺伝子がcMYCまたはBCL2と実質的に類似である、請求項36記載の方法。
【請求項５４】
腫瘍遺伝子がレポーター遺伝子に融合している、請求項36記載の方法。
【請求項５５】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびアルカリホスファターゼからなる群より選択される、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
レポーター遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
蛍光タンパク質遺伝子がGFP、RFP、BFP、YFP、およびdsRED2からなる群より選択される、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
蛍光タンパク質遺伝子がGFPである、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
腫瘍遺伝子が緑色蛍光タンパク質遺伝子に融合している、腫瘍遺伝子がcMYCであって、プロモーターがRAG2である、請求項36記載の方法。
【請求項６０】
以下を含む、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節する薬物または物質をスクリーニングする方法：
トランスジェニック魚が、汎在遺伝子プロモーター、強い転写終止部位を含むレポーター遺伝子、および腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているゲノムを有し、レポーター遺伝子が部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接する、試験薬または物質にトランスジェニック魚を接触させるまたはそうでなければ曝露する段階。
試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節するか否かを決定する段階；および
試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節すれば、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節する薬物または物質をであると分類する段階。
【請求項６１】
部位特異的リコンビナーゼ認識部位がFlox、Lox、およびFRTからなる群より選択される、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
CREまたはFlipをコードするポリヌクレオチドを投与することをさらに含む、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
汎在遺伝子プロモーターがCMV、EF1-α、またはβ-アクチンである、請求項60記載の方法。
【請求項６４】
レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびアルカリホスファターゼからなる群より選択される、請求項60記載の方法。
【請求項６５】
レポーター遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子である、請求項60記載の方法。
【請求項６６】
蛍光タンパク質遺伝子が、GFP、RFP、BFP、YFP、およびdsRED2からなる群より選択される、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
腫瘍遺伝子が腫瘍遺伝子による癌の進行を誘導し、癌が、非ホジキンリンパ腫、高度星状細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、膵臓癌、卵巣癌、睾丸癌、胃癌、結腸癌、腎癌、黒色腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、およびcMYC-誘導T-細胞急性リンパ芽球性白血病からなる群より選択される、請求項36記載の方法。
【請求項６８】
腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換に起因する腫瘍形成の発生率を測定することをさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項６９】
腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換に起因する腫瘍の量または大きさを測定することをさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項７０】
試験薬または物質がアンチセンスDNA、アンチセンスRNA、または小さい干渉RNAである、請求項36記載の方法。
【請求項７１】
トランスジェニック魚がトランスジェニック魚胚である、請求項36記載の方法。
【請求項７２】
トランスジェニック魚がトランスジェニックゼブラフィッシュである、請求項36記載の方法。
【請求項７３】
トランスジェニック魚の胚がトランスジェニックゼブラフィッシュの胚である、請求項71記載の方法。
【請求項７４】
以下を含む、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節する薬物または物質をスクリーニングする方法：
トランスジェニックゼブラフィッシュゲノムが、ゼブラフィッシュRAG2プロモーターに機能的に結合したマウスcMYC腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れている、試験薬または物質にトランスジェニック魚を接触させるまたはそうでなければ曝露する段階。
試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節するか否かを決定する段階；および
試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節すれば、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節する薬物または物質であると分類する段階。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、トランスジェニック動物に関する。特に、本発明はトランスジェニック魚およびその使用法に関する。
【０００２】
疾患状態の動物モデルは、特定の疾患の基礎となる生化学メカニズムを同定する場合と共に、疾患を根治するまたはそうでなければその症状を軽減する治療物質を発見する場合に重要な役割を有する。例えば、家族性高コレステロール血症のウサギモデル、ラット非インスリン依存型真性糖尿病モデル、マウス癌モデル、およびハムスター自然発生心房血栓症モデルが知られている。さらに、遺伝疾患の動物モデルが、マウス、ネコ、およびイヌを含む多様な種において自然に発生している。そのような大きい動物による研究はいくつかの欠点を有する。
【０００３】
例えば、そのようなモデルにおいて用いられる動物の多くは、比較的大きい脊椎動物であり、これらは大きい研究空間を要し、飼料を与えるおよびそうでなければ維持するために費用がかかり、生殖サイクルが遅く、1回に産む子孫の数が比較的少なく、全ての望ましい疾患状態を有効に模倣することができない。研究者らは、これらの問題のいくつかを解決する動物モデルを得ようと試みたが、全ての望ましい疾患に関するそのような動物モデルはまだ得られていない。例えば、前悪性および非新生物または非悪性過増殖障害（例えば、炎症および網膜症）のトランスジェニック魚モデルも同様に有用であろう。さらに、魚は水生環境における変異原物質を検出するために利用されているが、例えば、ヒトT細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、高度星状細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、膵臓癌、卵巣癌、睾丸癌、胃癌、結腸癌、腎癌、黒色腫、および急性または慢性骨髄性白血病を含む、ヒト癌研究において適切な任意の癌を発症するトランスジェニック魚モデルは現在のところない。
【０００４】
ヒトT細胞白血病は、T-細胞受容体遺伝子を含む特定の染色体転座によって活性化された腫瘍遺伝子によって起こりうる。特に、T細胞急性リンパ芽球性白血病は、胸腺細胞の悪性疾患であり、小児の約10％〜15％および成人の急性リンパ芽球性白血病の症例の約25％を占める。T細胞急性リンパ芽球性白血病に関していくつかの治療法が利用できるが、それらは望むほど有効ではない。
【０００５】
濾胞中心細胞非ホジキンリンパ腫は、ほぼ成人に限って発生する普通の一般的に不活性型のB-細胞リンパ腫であり、濾胞中心細胞リンパ腫はt（14；18）染色体転座を有する。14；18転座の区切点に関する分子分析により、第14染色体上のIgH座へのこの転座により過剰発現された第18染色体上の遺伝子としてBCL2が同定された。機能的分析から、BCL2は、細胞の分化または増殖により典型的な影響を及ぼすよりむしろ、細胞生存を延長させるように作用する新しいクラスの癌原遺伝子産物を定義することが判明した。それ以降、BCL2は、アポトーシスを阻害または促進する高度に保存されたタンパク質の大きいファミリーメンバーであることがわかっている。さらに、BCL2およびその前生存近縁体は、t（14；18）によりBCL2の過剰発現を有する癌のみならず多くのヒト癌の異常な生存にとって重要である可能性がある。
【０００６】
高度星状細胞腫は、最も一般的で破壊的な脳腫瘍の一つであり、進行は急速で、患者が9〜12ヶ月より長く生存することはほとんどない。手術、放射線療法、および化学療法技術の進歩にもかかわらず、過去20年のあいだに星状細胞腫患者の転帰にはほとんど改善が認められていない。この疾患の生物学的基礎をよりよく理解するために明らかに新しいアプローチが必要であり、それによって初めて有効な療法を開発することができる。
【０００７】
横紋筋肉腫は、骨格筋前駆体の悪性腫瘍の不均一な集団であり、年齢15歳またはそれ未満の子供における最も一般的な軟組織肉腫である。横紋筋肉腫は、組織学的に二つのサブタイプからなり、それぞれが異なるサブセットの遺伝子の誤発現を特徴とする胞巣状と胎児性である。これらの腫瘍の攻撃的な特性により、その有効な治療は特に難しくなる。横紋筋肉腫は遺伝子操作された哺乳類疾患モデルにおいて認められうるが、それらはしばしば他の腫瘍タイプに関連している。その分子的基礎を解明するため、および新規治療戦略を開発するための標的として最終的に用いられる可能性がある新規遺伝子を同定するためには、有益でより特異的な横紋筋肉腫のモデルが必要である。
【０００８】
急性骨髄性白血病において一般的に認められる変異および遺伝子の再配列は典型的に、t（8；21）またはt（15；17）のような染色体転座が原因で起こり、一つまたは二つの転写因子を融合させることによってキメラ腫瘍タンパク質を生成する（Look、1997）。しかし、これらの変化は、急性白血病の誘導を説明するためには十分ではない。例えば、他の哺乳類モデルにおいて現在可能ではない、白血病に至る多くの可能性がある新規遺伝子における変異を偏りなく検出するためには、さらなる動物モデルが必要である。
【０００９】
神経芽腫、神経内分泌癌、膵臓癌、卵巣癌、睾丸癌、胃癌、結腸癌、腎癌、黒色腫および急性または慢性骨髄性白血病に至る基礎となるメカニズムの多くはまだ十分に理解されていない。これらの疾患において変異している遺伝子を同定すれば、癌全体に対する新しい洞察が得られるであろう。さらに、標的化化学療法を開発するための新規薬物標的を同定するためには、疾患の進行、または化学療法もしくは放射線によるプログラムされた細胞死に対する感受性を阻害もしくは遅らせる遺伝的または化学的抑制物質を同定することができる脊椎動物モデル系を用いることが必要であろう。例えば、特異的標的に関する先験的知識を必要としないモデル系が必要である。標的の解明は、調節する標的薬または物質が安全かつ有効であることが証明された後に行ってもよく、このように薬物発見プロセスにおける時間と費用の双方が節約される。
【００１０】
上記の癌のような様々な疾患状態に関する細胞および分子遺伝学的特徴をさらに理解する必要がある。遺伝子変異の多段階プロセスを解明するためのみならず、より有効な薬物を開発するためには、適当な動物モデルが貴重となるであろう。本発明はこれらの必要に取り組む。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
トランスジェニック魚を作製して、これを癌、および特にヒトの癌を含む哺乳類疾患の魚モデルとして都合よく利用できる可能性があることが発見された。したがって、トランスジェニック魚と共に、その作製および使用法を提供する。
【００１２】
本発明の一つの局面において、そのゲノムがプロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているトランスジェニック魚が提供される。一つの形において、レポーター遺伝子が部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接する、そのゲノムの中に汎在遺伝子プロモーター、強い転写終止部位を含むレポーター遺伝子、および腫瘍遺伝子を安定に組み入れているトランスジェニック魚が提供される。好ましくは、プロモーターは臓器または組織特異的プロモーターである。一つの態様において、プロモーターは類リンパ特異的プロモーターである。本発明の特定の形において、腫瘍遺伝子は、T-細胞リンパ腫またはT-細胞急性リンパ芽球性白血病を含む白血病またはリンパ腫を誘導する。他の態様において、腫瘍遺伝子は非ホジキンリンパ腫、高度星状細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、膵臓癌、卵巣癌、睾丸癌、胃癌、結腸癌、腎癌、黒色腫、および急性または慢性骨髄性白血病を誘発する。
【００１３】
本発明の第二の局面において、トランスジェニック魚を作製する方法が提供される。一つの形において、方法には、プロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子を含む核酸を魚の受精卵に導入すること、および魚の胚をトランスジェニック魚に生育させることが含まれる。もう一つの形において、方法には、プロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子を含む核酸を魚の未受精卵に導入すること、魚の卵子を受精させること、および魚の胚をトランスジェニック魚に生育させることが含まれる。
【００１４】
本発明のもう一つの局面において、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節（例えば、増強または抑制）する薬物または物質をスクリーニングする方法。一つの態様において、方法には、（a）プロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているゲノムを有するトランスジェニック魚（例えば、成体トランスジェニック魚またはトランスジェニック魚胚）を、試験薬または物質に接触させるまたはそうでなければ曝露すること；（b）試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節（例えば、増強または抑制）するか否かを決定すること；および（c）試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を抑制または増強すれば、試験薬または物質を、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節する薬物または物質であると同定すること、が含まれる。
【００１５】
もう一つの態様において、方法には、（a）トランスジェニック魚が、汎在遺伝子プロモーター、強い転写終止部位を含むレポーター遺伝子、および腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているゲノムを有し、レポーター遺伝子が部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接している、トランスジェニック魚（例えば、成体トランスジェニック魚またはトランスジェニック魚胚）を試験薬または物質に接触させるまたはそうでなければ曝露すること；（b）試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節するか否かを決定すること；および（c）腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節する試験薬または物質を分類すること、が含まれる。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの局面において、放射線療法または化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性を調節する薬物または物質をスクリーニングする方法が提供される。方法には、プロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているゲノムを有するトランスジェニック魚（例えば、成体トランスジェニック魚またはトランスジェニック魚胚）を、試験薬または物質に接触させるまたはそうでなければ曝露する段階；（b）試験薬または物質が、放射線または化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性を調節（例えば、抑制または増強）するか否かを決定する段階；および（c）試験薬または物質が、放射線療法または化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性を抑制または増強すれば、試験薬または物質を、放射線療法または化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性を抑制または増強する薬剤または物質であると同定する段階、が含まれる。
【００１７】
もう一つの態様において、方法には、（a）トランスジェニック魚が、汎在遺伝子プロモーター、強い転写終止部位を含むレポーター遺伝子、および腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているゲノムを有し、レポーター遺伝子が部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接している、試験薬または物質にトランスジェニック魚（例えば、成体トランスジェニック魚またはトランスジェニック魚胚）を接触させるまたはそうでなければ曝露させる段階；（b）試験薬または物質が、放射線療法または化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性を調節するか否かを決定する段階；および（c）試験薬または物質が放射線療法または化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性を抑制または増強すれば、放射線療法または化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性を調節する試験薬または物質であると同定する段階、が含まれる。
【００１８】
本発明のもう一つの局面において、腫瘍遺伝子による新生物もしくは過形成形質転換、または放射線療法もしくは化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性を調節する変異を同定する方法が提供される。一つの態様において、方法には、（a）そのゲノムがプロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているトランスジェニック魚を変異誘発させる段階；（b）トランスジェニック魚を変異誘発していない魚と交配させてF1子孫を生成する段階；（c）F1子孫から卵子を得る段階；（d）卵子を不活化精子と受精させて、F2子孫を生成する段階；（e）F2子孫における新生物もしくは過形成の有無および程度、または放射線療法もしくは化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性の有無および程度を決定する段階；および（f）F1子孫における調節因子（例えば、増強因子または抑制因子）の変異を同定する段階、が含まれる。
【００１９】
もう一つの態様において、方法には、（a）レポーター遺伝子が部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接している、そのゲノムが汎在遺伝子プロモーター、強い転写終止部位を含むレポーター遺伝子、および腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているトランスジェニック魚を変異誘発させる段階；（b）トランスジェニック魚を変異誘発していない魚と交配させてF1子孫を産生する段階；（c）F1子孫から卵子を得る段階；（d）卵子を不活化精子と受精させて、F2子孫を生成する段階；（e）F2子孫における新生物もしくは過形成の有無および程度、または放射線療法もしくは化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性の有無および程度を決定する段階；および（f）腫瘍遺伝子による新生物もしくは過形成形質転換を調節する、または放射線療法もしくは化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性を調節する変異を同定する段階、が含まれる。
【００２０】
他の態様において、方法には、トランスジーンに関してホモ接合である、第一のトランスジェニック魚を変異誘発させる段階；（b）該第一のトランスジェニック魚を、トランスジーンに関してホモ接合である変異誘発していない第二の魚と交配させてF1魚を生成する段階；（c）雌性F1魚から卵子を得る段階；（d）該卵子を不活化精子と受精させる段階；（e）該受精卵に初期圧を与えて、雌性発生二倍体F1魚を産生する段階；（f）臓器または組織特異的新生物または過形成の発生および／または程度の割合を調べて、腫瘍抑制遺伝子の不活化に関してヘテロ接合であるF1魚を同定する段階、および（g）選択的に、F1雌性魚を外部交雑させて変異を同定する段階が含まれる。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの局面において、トランスジェニック魚において一つより多い哺乳類腫瘍遺伝子を同時発現させる方法が提供される。一つの態様において、方法には、（a）そのゲノムが第一のプロモーターに機能的に結合した第一の哺乳類腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れている第一のトランスジェニック魚を産生する段階；（b）該第一の哺乳類腫瘍遺伝子と該第二の哺乳類腫瘍遺伝子とが異なる、そのゲノムが第二のプロモーターに機能的に結合した第二の哺乳類腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れている第二のトランスジェニック魚を産生する段階；および（c）該第一のトランスジェニック魚を該第二のトランスジェニック魚と交配させて、該異なる哺乳類腫瘍遺伝子を同時発現する子孫を生成する段階、が含まれる。
【００２２】
もう一つの態様において、方法には、（a）レポーター遺伝子が部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接する、そのゲノムが汎在遺伝子プロモーター、強い転写終止部位を含むレポーター遺伝子、および第一の哺乳類腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているトランスジェニック魚を産生する段階；（b）該第一の哺乳類腫瘍遺伝子と該第二の哺乳類腫瘍遺伝子とが異なる、そのゲノムが第二のプロモーターに機能的に結合した第二の哺乳類腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れている第二のトランスジェニック魚を産生する段階；および（c）該第一のトランスジェニック魚を該第二のトランスジェニック魚と交配させて、該異なる哺乳類腫瘍遺伝子を同時に発現する子孫を作製する段階、が含まれる。
【００２３】
本発明のもう一つの局面において、調節可能な部位特異的リコンビナーゼを用いることによって、腫瘍遺伝子を任意の組織において調節することができる、ヒト癌の安定なトランスジェニック魚モデルを作製する方法が提供される。一つの形において、方法には、（a）そのゲノムが汎在遺伝子プロモーター、強い転写終止部位を含み、部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接しているレポーター遺伝子、および腫瘍遺伝子を含むカセットその中に安定に組み入れている第一のトランスジェニック魚を産生する段階；（b）そのゲノムが熱ショックプロモーターに機能的に結合した部位特異的リコンビナーゼをその中に安定に組み入れている第二のトランスジェニック魚を作製する段階；（c）該第一のトランスジェニック魚を該第二のトランスジェニック魚と交配させてF1子孫魚を作製する段階；（d）該F1子孫の魚の細胞をレーザー活性化して、それによって該レーザー活性化が該F1子孫の魚の細胞において、該レポーター遺伝子と、該腫瘍遺伝子に隣接する該汎在遺伝子プロモーターの近位との組換えおよび切り出しを引き起こす段階、が含まれる。
【００２４】
本発明の目的は、例えば疾患、好ましくは癌の動物モデルにおいて用いてもよいトランスジェニック魚を提供することである。好ましくは癌はヒト癌である。
【００２５】
本発明のもう一つの目的は、BCL2またはcMYCを過剰発現する腫瘍細胞を、放射線療法または化学療法剤による治療のアポトーシス誘導効果に対して感作する薬物または遺伝子改変剤を発見するための動物モデルとして用いてもよいトランスジェニック魚を提供することである。
【００２６】
本発明のもう一つの目的は、上記のトランスジェニック魚を作製する方法を提供することである。
【００２７】
本発明のさらにもう一つの目的は、疾患、特に腫瘍遺伝子による形質転換を調節する薬物または物質をスクリーニングする方法において、ならびに腫瘍抑制遺伝子および可能性がある薬物標的を含む、新生物または過形成プロセスに関係する薬物、物質、および／または遺伝子を発見するために魚を用いることを含む、上記のトランスジェニック魚を用いる方法を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、例えば、疾患の発症の加速を決定することを含む、トランスジェニック魚における一つより多い哺乳類腫瘍遺伝子を同時発現させる方法を提供することである。
【００２９】
本発明のこれらおよび他の目的および長所は本明細書の説明から明らかとなるであろう。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明の原理に関する理解を促進する目的で、ここに好ましい態様を参照して、特殊な言い回しを用いてこれを説明する。それにもかかわらず、本発明の範囲をそれによって制限するとは意図されず、本発明が関係する技術分野の当業者に通常想起されるように、本発明のそのような変更およびさらなる改変、および本明細書に記載の本発明の原理のそのようなさらなる応用が企図されると理解されるであろう。
【００３１】
本発明は、トランスジェニック魚およびその作製および使用法に関する。本発明の一つの局面において、そのゲノムがプロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子を含む核酸をその中に安定に組み入れているトランスジェニック魚を提供する。本発明のさらに他の局面において、トランスジェニック魚を作製するおよび用いる方法を提供する。本発明の特定の型において、腫瘍遺伝子による新生物もしくは過形成形質転換を調節する、または放射線療法もしくは化学療法の毒性作用に対するトランスジェニック細胞の感受性を増加させる薬物または物質をスクリーニングする、またはそうでなければ同定する方法を提供する。さらに、本明細書に記載のトランスジェニック魚は、例えば、非ホジキンリンパ腫、高度星状細胞腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、神経内分泌癌、膵臓癌、卵巣癌、睾丸癌、胃癌、結腸癌、腎癌、黒色腫、および急性または慢性骨髄性白血病、ならびにcMYC-誘導T-細胞急性リンパ芽球性白血病を含む、脊椎動物における腫瘍遺伝子による癌進行に至る保存された経路を研究するためのモデルとして用いてもよい。
【００３２】
本発明の一つの局面において、安定に形質転換されたトランスジェニック魚を提供する。一つの態様において、トランスジェニック魚は、プロモーターに機能的に結合した導入された腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているまたはそうでなければ組み入れているゲノムを有する。プロモーターは、好ましくは臓器または組織特異的（細胞特異的を含む）プロモーターまたは特定の組織において調節することができるプロモーターである。最も好ましくは、プロモーターは、RAG1またはRAG2プロモーターのような、T-細胞またはB-細胞特異的プロモーターを含む類リンパ特異的プロモーターである。腫瘍遺伝子は典型的に、魚以外の動物または魚そのものに由来し、本明細書にさらに記述されるように組換えベクターの一部であることが都合がよい可能性がある。好ましくは腫瘍遺伝子は哺乳類の腫瘍遺伝子である。そのような魚は、生殖能を有し、腫瘍遺伝子に関連するその遺伝情報をその子孫に伝える能力を有するという点において安定な魚の系統を形成してもよい。
【００３３】
本発明において広範な魚を利用してもよい。例としての魚には、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）、メダカ（Oryzias latipes）、ムミックホグ（mummichog、Fundulus teteroclitus）、タップミノー（Genus Fundulus）、チャンネルナマズのようなナマズ（Genus Ictalurus）のような真骨魚類；コモンカープのようなコイ（Genus Cyprinus）；およびマスまたはサケ（例えば、Genus Salvelinus、Salmo、およびOncorhynchus）が含まれる。
【００３４】
特にゼブラフィッシュは、他の動物モデルと比較して都合よく利用される可能性がある。例えば、ゼブラフィッシュは遺伝子スクリーニング、改変剤のスクリーニング、および化学物質のスクリーニングに対して感受性があり、急速に子宮外で生育し、そのライフサイクルのほとんどにおいて透明であり、毎週多数の子孫を生成する。ゼブラフィッシュは比較的小さい施設（9 Lタンク1個に成魚約54匹までを収容する）で飼育することができ、大量の子孫を信頼できるように産生し、成熟したそれぞれの雌が毎週100〜300個の卵を産卵する。これらの卵子を外部受精させると、胚は透明であり、造血組織ならびに他の臓器および組織系の初期発達を単に解剖顕微鏡によって直接観察することができる。胚の発達は、極めて急速であり、血球形成を含むほとんどの臓器系は、受精後5日までに十分に発達する。約3ヶ月で完全な性的成熟に達する。
【００３５】
ベクターには、プロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子が含まれる。好ましくは、プロモーターは、臓器または組織特異的プロモーターである。当技術分野で既知であるように、腫瘍遺伝子は、その発現によって、細胞増殖の制御の変化またはプログラムされた細胞死の予防が起こりうる遺伝子である。本明細書に記述の核酸構築物において広範な腫瘍遺伝子を利用してもよい。腫瘍遺伝子はウイルスまたは細胞起源であってもよい。細胞起源の腫瘍遺伝子には、内因性の腫瘍遺伝子が含まれる。発現されると、そのような腫瘍遺伝子は細胞の新生物または過形成形質転換を引き起こす。例としての腫瘍遺伝子には、MYC、SRC、FOS、JUN、MYB、RAS、ABL、BCL2、HOX11、HOX11L2、TAL1/SCL、LMO1、LMO2、EGFR、MYCN、MDM2、CDK4、GL11、IGF2、活性化RAS、活性化EGFR、FLT3-ITDのような変異遺伝子、変異および活性化版のTP53、PAX3、PAX7、BCR/ABL、HER2/NEU、FLT3R、FLT3-ITD、SRC、RAS、ABL、TAN1、PTC、B-RAF、PML-PARα、E2A-PBX1、およびNPM-ALKと共にPAXおよびFKHR遺伝子ファミリーのメンバーの融合体が含まれる。
【００３６】
他の例としての腫瘍遺伝子は当技術分野で周知であり、そのようないくつかの例は、例えばその全文が参照として本明細書に組み入れられる、Look, A.T.「Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphoma」、109〜141頁の表5.1〜5.3のように、「The Genetic Basis of Human Cancer」、（Vogelstein, B. and Kinzler, K.W.編、マグローヒル、ニューヨーク、ニューヨーク州）に記述されている。そのような遺伝子の哺乳類相同体は、それらを内因性の魚の遺伝子と区別することができるから好ましい。そのような遺伝子のヒト相同体はさらに好ましい。腫瘍遺伝子のヒト相同体を含むそのような腫瘍遺伝子の対応する配列は既知であり、例えばNCBIデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov）において認められる可能性がある。
【００３７】
腫瘍遺伝子は、トランスジェニック魚が生育することが望ましい癌の形に基づいて選択される。例えば、RASファミリーの変異または活性化遺伝子は、腎臓、膵臓、または結腸癌のような、広範なタイプの癌を誘導するために用いてもよく、HOX11およびTAL1は、T-細胞癌を誘導するために用いてもよい。好ましくは、腫瘍遺伝子は、T-細胞またはB-細胞腫瘍遺伝子である。最も好ましくは、T-細胞腫瘍遺伝子は、MYC、TAL1/SCL、TAL2、LYL1、LMO1、LMO2、HOX11、HOX11L2、TAN1、およびLYL1遺伝子ファミリーメンバーであり、B-細胞腫瘍遺伝子は、MYC、E2A-PBX1、E2A-HLF、TEL-AML1、BCL6、BCL3、LYT10、MLL、HOX、またはPAX5遺伝子ファミリーのメンバーである。一つの形において、腫瘍遺伝子は、cMYCのようなMYCである（ゲンバンクアクセッション番号XM_122917.1、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotideにおいて入手可）。魚のT-細胞前駆体におけるそのようなヌクレオチド配列の発現によって、急性T-細胞リンパ芽急性白血病またはリンパ腫を発症する。本発明は、そのような腫瘍遺伝子配列に限定されない。例えば、腫瘍遺伝子の形質転換能を増加または減少させる、cMYCまたは本明細書に記述の他の腫瘍遺伝子ヌクレオチド配列のような、腫瘍遺伝子ヌクレオチド配列の変化形も同様に想像される。
【００３８】
本発明の一つの形において、本発明において利用される腫瘍遺伝子は、本明細書に記述のヌクレオチド配列または他の腫瘍遺伝子ヌクレオチド配列と少なくとも約60％、好ましくは少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約80％、および最も好ましくは少なくとも約90％の同一性を有するcMYCヌクレオチド配列（ゲンバンクアクセッション番号XM_122917.1）を有してもよい。
【００３９】
パーセント同一性は、例えば、米国国立衛生研究所（www:ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）から入手可能な進行BLASTコンピュータープログラム、バージョン2.0.8を用いて配列情報を比較することによって決定してもよい。BLASTプログラムは、Karlin and Altschul（1990）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：2264〜2268およびAltschulら（1990）、J. Mol. Biol. 215：403〜410；Karlin and Altschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1993）90：5873〜5877；およびAltschulら（1997）、Nucleic Acids Res. 25：3389〜3402に記載されるようなアラインメント法に基づく。
【００４０】
さらに、腫瘍遺伝子には、MYCヌクレオチド配列（ゲンバンクアクセッション番号XM_122917.1）または本明細書に記載の他の腫瘍遺伝子ヌクレオチド配列と実質的な類似性を有するヌクレオチド配列が含まれてもよい。「実質的な類似性」とは、本明細書においてヌクレオチド配列が、中等度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする参照ヌクレオチド配列と十分に類似であることを意味する。この類似性決定法は、本発明が属する技術分野において十分に既知である。簡単に説明すると、中等度にストリンジェントな条件は、Sambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第二版、第一巻、101〜104頁、コールドスプリングハーバー研究所出版（1989）において、5×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム溶液）、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1.0 mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（pH 8.0）の前洗浄溶液、および55℃、5×SSCのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いることを含むとして定義されている。腫瘍遺伝子のヌクレオチド配列のさらなる必要条件は、それが細胞の新生物形質転換能を有するタンパク質をコードすることである。すなわち、タンパク質は、正常細胞（すなわち非癌様細胞）の癌様細胞（すなわち、腫瘍）への転換能を有する。
【００４１】
本明細書においてトランスジーンとして見なされる腫瘍遺伝子、すなわち本明細書に記述のゲノムに組み入れられている遺伝子は、インビトロで合成してもよく、または生物起源から単離してもよい。そのような合成および単離法は、当業者に周知である。
【００４２】
腫瘍遺伝子はプロモーターに機能的に結合している。好ましくはプロモーターは、臓器または組織（細胞を含む）特異的プロモーターである。最も好ましくは、プロモーターは、類リンパ特異的プロモーターである。例えば、「類リンパ特異的」とは、本明細書において、プロモーターが当技術分野で既知のB-およびT-細胞前駆細胞のような類リンパ起源の組織に限って腫瘍遺伝子の発現を促進することを意味する。類リンパ特異的プロモーターは、任意の類リンパ特異的遺伝子に由来してもよい。本発明において都合よく用いられる可能性がある類リンパ特異的プロモーターの例には、RAG1およびRAG2を含む組換え活性化遺伝子（RAG）；T-細胞特異的非受容体チロシンキナーゼをコードするLCK；IgMエンハンサー要素、およびCD2のプロモーターが含まれる。組織限定発現を指示するいくつかのプロモーター、例えば類リンパ組織に関してゼブラフィッシュRAG1（Jessenら、Nat. Genet. 23：16〜17（1999））およびゼブラフィッシュRAG2（Jessenら、Genesis、29：156〜162（2001））、上皮細胞に関してKeratin-8（Gongら、2002）、神経特異的発現に関してIslet-1（Motoikeら、Genesis 28：75〜81（2000））、膵臓に関してPDX-1およびインスリン（Huangら、Genesis 30：134〜6（2001））、グリア細胞に関してGFAP、ならびに筋肉に関してMYO-Dおよびα-アクチン（Higashima、1997）が同定されている。それらが機能的に結合している腫瘍遺伝子の転写を促進する限り、本明細書に記述の組織特異的プロモーターのヌクレオチド配列と少なくとも約70％同一性、少なくとも約80％同一性、およびさらに少なくとも約90％同一性を有するプロモーターも同様に想像される。ほとんどの哺乳類プロモーターは、魚では十分に作用しないことが判明していることから、ゼブラフィッシュ、フグ、または他の魚種のゲノム調節配列は、しばしば対象コード配列の上流、内部、および下流で特異的にクローニングしなければならいが、これは当業者に日常的な技法によって行ってもよい。特定の態様において、プロモーターは、それがT-細胞前駆体に限って腫瘍遺伝子の発現を促進するという点においてT-細胞前駆体特異的である。そのような構築物は、遺伝子のコード領域の上流でRAG2またはLCKゲノム配列を用いることによって作製してもよい。ゲノム配列が発達の際に組織特異的にこの蛍光マーカーの発現を促進することができるか否かを調べるために、ゲノム配列をGFPの上流でまずクローニングし、もしそうであれば、同じ配列を用いてcMYCおよび他の腫瘍遺伝子の発現を促進する。ドーパミン作動神経系に関するチロシンヒドロキシラーゼ、筋系に関するMYO-D、および骨髄系に関してMPOまたはPU.1をコードする遺伝子からクローニングされるプロモーターのような、当業者に周知である他の、例えばゼブラフィッシュ、臓器および組織特異的プロモーターを構築するために、類似の技法を利用してもよい。
【００４３】
本明細書において定義したように、ヌクレオチド配列は、もう一つのヌクレオチド配列と機能的関係で配置された場合、もう一つのヌクレオチド配列と「機能的に結合している」。例えば、コード配列がプロモーター配列に機能的に結合している場合、これは一般的に、プロモーターがコード配列の転写を促進する可能性があることを意味する。機能的に結合したとは、結合されるDNA配列が、典型的に隣接しているが、必要であれば、隣接して読み取り枠に存在する二つのタンパク質コード領域を結合することを意味する。エンハンサーは、プロモーターから数キロベース離れていても機能する可能性があり、イントロン配列は多様な長さであってもよいことから、いくつかのヌクレオチド配列は機能的に結合しているが隣接しなくてもよい。
【００４４】
トランスジーンは、輸送ベクターに含まれてもよい。本明細書において用いられる、および当技術分野で既知のベクターは、標的化細胞の形質転換を指示するように設計された遺伝子材料が含まれる核酸構築物を指す（すなわち、それによって外因性のDNAをそのゲノムに組み入れることによって個々の細胞の遺伝子材料が変化するプロセス）。ベクターは、カセットにおける核酸が転写され、望ましければマイクロインジェクションされた単細胞受精卵において翻訳されるように、位置的および配列的に一定方向を向いた、すなわち他の必要なまたは所望の要素と機能的に結合した多数の遺伝要素を含んでもよい。
【００４５】
組換え発現ベクターは、当業者に周知の方法に従って、および例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、コールドスプリングハーバー研究所、第二版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（1989）に記述されるように、上記の引用されたヌクレオチド配列をベクター内に組み入れることによって構築してもよい。分子生物学および組換えDNA技術について記述する他の参考文献には、例えば、定期的および周期的に更新される、「DNA Cloning 1：Core Techniques」（D.N. Gloverら編、IRL出版、1995）；「DNA Cloning 2：Expression Systems」（B.D. Hamesら編、IRL出版、1995）；「DNA Cloning 3：A Practical Approach」（D.N. Gloverら編、IRL出版、1995）；「DNA Cloning 4：Mammalian Systems」（D.N. Gloverら編、IRL出版、1995）；「Oligonucleoride Synthesis」（M.J. Gaitら、IRL出版、1992）；「Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach」（S.J. Higgins and B.D. Hamesら、IRL出版、1991）；「Transcription and Translation：A Practical Approach」（S.J. Higgins and B.D. Hamesら、IRL出版、1996）；R.I. Freshney「Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique」、第四版（ウィリー-リス、1986）；およびB. Perbal、「A Practicel Guide To Molecular Cloning」、第二版（ジョンウィリー＆サンズ、1988）；および「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編、ジョンウィリー＆サンズ）が含まれる。
【００４６】
本発明において用いられる広範なベクターが既知である。適したベクターには、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター（例えば、Millerら、Methods of Enzymology 217：581〜599（1993）を参照されたい）、アデノウイルスベクター（例えば、Erzurumら、Nucleic Acids Res. 21：1607〜1612（1993）；Zabnerら、Nature Genetics 6：75〜83（1994）；およびDavidsonら、Nature Genetics 3：219〜223（1993）を参照されたい）、アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Flotteら、PNAS 90：10613〜10617（1993）を参照されたい）、ヘルペスウイルスベクター（例えば、Andersonら、Cell Mol. Neurobiol. 13：503〜515（1993）を参照されたい）、およびレンチウイルスベクター（例えば、Lever、Curr. Opin. Mol. Ther. 2：488〜496（2000）を参照されたい）を含むウイルスベクターが含まれる。ベクターには、本明細書に記述のトランスジェニック魚宿主細胞のような特定の宿主細胞において核酸を効率よく発現するために必要なまたは望ましい、調節要素を含む他の既知の遺伝子要素が含まれてもよい。例えば、ベクターには、本明細書に記述されるように臓器または組織特異的（例えば類リンパ組織に対して特異的な）であるプロモーターを含むプロモーター、および遺伝子の転写を得るためにプロモーターと協調して作用する任意の必要なエンハンサー配列が含まれてもよい。「エンハンサー」とは、本明細書に記述のトランスジェニック魚宿主細胞のような、細胞においてプロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列要素を意味する。ベクターは、例えば直線型であってもよい。
【００４７】
腫瘍遺伝子ヌクレオチド配列はまた、融合タンパク質が形成され、その存在または位置が可視化されるもしくはそうでなければ同定されるように、レポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に融合させてもよい。「コードする（encoding）」または「コードする（coding）」という用語は、それによってヌクレオチド配列が、転写および翻訳のメカニズムを通して、そこから一連のアミノ酸を特定のアミノ酸配列に集合させてポリペプチドを形成することができる情報を細胞に提供するプロセスを指す。そのようなヌクレオチド配列の一例として、GFPをコードするヌクレオチド配列は、発達中の胚および／または孵化したまたはそうでなければ成熟した魚の領域が融合タンパク質が発現されると蛍光を発するように、本発明において都合よく用いられる可能性がある。または、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含む、他のレポーター遺伝子産物を利用してもよい。本明細書において記述されるレポーター遺伝子産物の活性または量を決定することを含む、有無を決定するためのアッセイは当技術分野で既知であり、例えば、定期的および周期的に更新される「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編、ジョンウィリー＆サンズ）において考察されている。本明細書において考察したレポーター遺伝子産物のアッセイに関する詳しい説明は、例えば以下の出版物に認められる可能性がある：ルシフェラーゼに関しては、Nguyen, V.T.ら、Anal. Biochem. 171：404〜408（1988）を参照されたい；β-ガラクトシダーゼに関しては、例えば、Martin, C.S.ら、「Bioluminescence and Chemiluminescence：Molecular Rreporting with Photons」、525〜528頁（J.W. Hastingsら編、ジョンウィリー＆サンズ、1997）を参照されたい；Jain, V.K. and Magrath, I.T.、Anal. Biochem. 199：119〜124（1991）；β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、およびアルカリホスファターゼに関しては、例えばBronstein, I.ら、「Bioluminescence and Chemiluminescence：Fundamentals and Applied Aspects」、20〜23頁（A.K. Campbellら編、ジョンウィリー＆サンズ、1994）を参照されたい；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに関しては、Cullen, B.、Methods Enzymol. 152：684（1987）；Gorman, C.ら、Mol. Cell Biol. 2：1044（1982）；Miner, J.N.ら、J. Virol. 62：297〜304（1988）；Sleigh, M.J.、Anal. Biochem. 156：251〜256（1986）；Hruby, D.E. and Wilson, E.M.、Methods Enzymol. 216：369〜376（1992）を参照されたい。
【００４８】
腫瘍遺伝子緑色蛍光融合タンパク質を産生するために本発明において用いてもよいゼブラフィッシュRAG2プロモーターによって調節されるマウスcMYC-コードヌクレオチド配列およびGFPコードヌクレオチド配列（Yiら、2001）を含む適したプラスミドベクターの例を図5に示す。この融合構築物は、cMYC単独と類似のようにゼブラフィッシュにおいてリンパ腫を誘導した。特定のプロモーターによって類リンパ組織のような特定の臓器または組織に向けられ、GFPに融合される可能性がある他の腫瘍遺伝子には、活性化RAS、BCL2、HOX11、HOX11L2、LMO1、LMO2、およびTAL1/SCL遺伝子ファミリーのメンバーが含まれる。本明細書において記述されるように、当業者に周知である他のレポーター遺伝子も同様に腫瘍遺伝子融合体に用いてもよい。
【００４９】
本発明のなおもう一つの局面において、腫瘍遺伝子の前に、強い転写終止部位を含み、部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、Flox、Lox、またはFRT部位）に隣接する蛍光タンパク質遺伝子（例えば、GFP、RFP、BFP、YFP、またはdsRED2）またはルシフェラーゼタンパク質遺伝子のようなレポーター遺伝子が存在する。汎在遺伝子プロモーター（例えば、EF1-αまたはβ-アクチン）は、「Loxed」、「Floxed」、または「FRPed」レポーター遺伝子の発現を促進する可能性がある。第二の遺伝子産物（例えば、腫瘍遺伝子）は、レポーター遺伝子に隣接するが、レポーター遺伝子内の強い転写終止部位のために、リコンビナーゼタンパク質発現の非存在下で発現されない。しかし、リコンビナーゼタンパク質発現が細胞において活性化されると、Loxed、Floxed、FRPedレポーター遺伝子産物が切り出され、第二の遺伝子は汎在遺伝子プロモーターの近位に存在する。さらに、組織特異的組換えは、レーザーを用いることによる熱ショック誘導型部位特異的リコンビナーゼトランスジーンのレーザー活性化によって促進される可能性がある。レーザー活性化を、胚発達の際に個々の細胞にターゲティングしてもよい。このトランスジェニック戦略により、腫瘍遺伝子を有する親細胞に対する毒性が防止されるのみならず、同じ腫瘍遺伝子を発現する広範な癌モデルを作製するために二つのトランスジェニック魚系統を用いることができる。例えば、MYC腫瘍遺伝子は、T-細胞白血病／リンパ腫、バーキットリンパ腫および他の非ホジキンリンパ腫、膵臓β細胞腫瘍、浸潤性島腺癌、腎細胞癌、卵巣癌、急性骨髄性白血病、結腸癌、神経膠芽細胞腫、および黒色腫において誤調節される。このように、これらの疾患の全ては、本明細書に記述の戦略を用いてモデルとしてもよい。
【００５０】
本発明のなおもう一つの局面において、本明細書において、トランスジェニック魚を作製する方法が提供される。一つの態様において、方法は、魚の受精卵または魚の非受精卵に、プロモーターに機能的に結合した哺乳類の腫瘍遺伝子を含む核酸を導入することを含む。核酸は、本明細書に記述のベクターの一部であってもよい。受精卵を用いる場合、方法には、魚の胚をトランスジェニック魚に生育させることが含まれる。腫瘍遺伝子を非受精卵に導入する場合、方法には、卵子を受精させる段階および魚の胚をトランスジェニック魚に生育させる段階が含まれる。核酸構築物は、機械的方法、化学的方法、親油性の方法、レトロウイルス感染法、および電気穿孔を含む当技術分野で既知の様々な方法によって卵子に導入してもよい。例としての機械的方法には、例えばマイクロインジェクションが含まれる。例としての化学的方法には、例えば燐酸カルシウムまたはDEAE-デキストランを用いることが含まれる。例としての親油性方法には、リポソームおよび脂質媒介トランスフェクションのための他の陽イオン物質を用いることが含まれる。そのような方法は一般的に、当技術分野で周知であり、そのような方法の多くが、例えば定期的および周期的に更新される、「Gene Transfer Methods：Introducing DNA into Living Cells and Organisms」、（P.A. Norton and L.F. Steel編、バイオテクニークス出版、2000）；および「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編、ジョンウィリー＆サンズ）に記述される。魚を含むマイクロインジェクション技術は、例えば、Chen, T.T. and Powers, D.A.、Trends Biotechnol. 8：209〜215（1990）およびFletcher, G.L. and Davis, P.L.、「Transgenic fish for aquaculture」、Genetic Engineering（Setlow, J.K.編、プレナム出版、1991）にさらにより詳しく記述されている。魚を含む電気穿孔技術は、例えばPowers, D.A.ら、Molec. Mar. Biol. Biotechnol. 1：301〜308（1992）およびLu, J.K.ら、Molec. Mar. Biol. Biotechnol. 1：366〜375（1992）にさらにより詳しく記述されている。汎親和性レトロウイルスベクターのようなレトロウイルスによる感染によって、DNAを魚の卵子または胚に導入する技術は、例えば、Burns, J.C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：8033〜8037（1993）にさらに記述されている。
【００５１】
トランスジーンを含むベクターまたは他の核酸は、発達の所望の段階で非受精卵または受精卵に導入してもよい。それぞれが本明細書に記述するように異なるトランスジーンをコードする多数のベクターを用いてもよい。受精卵または胚を用いる場合、核酸を胚（すなわち発達の一細胞期に）に導入することが好ましい。しかし、核酸はまた、二細胞期、四細胞期等を含む発達のより後期の段階に導入してもよい。したがって、核酸を、桑実胚、胞胚等に導入してもよい。上記のトランスジェニック構築物を組み入れる少なくとも一つの単離された核酸分子を、受精卵に導入する。さらに、より後期の発達段階の卵子に核酸を導入する場合、上記のトランスジェニック構築物を組み入れる少なくとも一つの単離された核酸分子を、例えば桑実胚、胞胚等の少なくとも一つの細胞に導入する。
【００５２】
魚の卵子は標準的な方法によって適当な魚から得てもよい。魚の多くは、例えばペットショップから購入してもよい。受精卵は、当技術分野で既知の方法によって得てもよい。例えば、約3〜約12月齢の魚のような、所望の数の適当な月齢の魚を、所望の雌雄比で（約2：1のような）タンクのような適当な大きさの容器に入れてもよい。卵子は、例えば約10〜60分のような交配後適当な時間にタンクの交尾室に魚を入れることによって採取してもよい。そのような方法は、例えば、Culp, P.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：7953〜7957（1991）に記述されている。または、魚の卵子は、当業者に既知の方法によって人工的に受精させてもよい。当業者は、そのような魚の受精卵を得る他の方法を周知している。
【００５３】
核酸構築物を魚の卵子または胚に導入した後、魚の卵子または胚に、成魚に生育させる環境を提供する。そのような環境には、例えばE3卵海水において28.5℃で15日間の生育させた後に、16日までに循環システムの水に入れることが含まれてもよい（「The Zebrafish Book：A Guide For the Laboratory Use of Xebrafish（Danio rerio）」、第4版（M. Westerfieldら、オレゴン大学出版、ユージン、オレゴン州（2000））。
【００５４】
本明細書に記述されるように産生されたトランスジェニック魚は、ゲノムDNAのドットブロットおよびサザンブロットハイブリダイゼーションを含む当技術分野で一般的な技法によって同定してもよい。簡単に説明すると、そのような方法は、例えばChen, T.T.ら、Biotech. Ann. Rev. 2：205〜236（1996）に記述されるように、魚の組織からのゲノムDNAの単離、制限酵素によるDNAの消化、および消化したDNA産物のサザンブロットハイブリダイゼーションを含む。予備的なスクリーニングは、Lu, J.K.ら、Molec. Mar. Biol. Biotechnol. 1：366〜375（1992）およびChen, T.T.ら、Molec. Mar. Biol. Biotechnol. 2：88〜95（1993）において記述されるように、ゲノムDNAをひれ組織片から単離すること、トランスジェニック配列をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅すること、および増幅された産物のサザンブロット分析を行うことによって行ってもよい。さらに、腫瘍遺伝子-GFP融合タンパク質を含む腫瘍遺伝子-蛍光融合タンパク質が、導入された核酸によってコードされる場合、蛍光に関する肉眼的な予備的なスクリーニングを用いてもよい。
【００５５】
作製されたトランスジェニック魚は好ましくは、そのゲノムに安定に組み入れられたトランスジーンを有する。このことは、染色体外であることとは対照的に魚のゲノムにトランスジーンが組み入れられていることを意味する。トランスジーンは、魚の生殖細胞およびB-細胞および／またはT-細胞前駆体または他の臓器もしくは組織特異的細胞に存在することが、さらに好ましい。生殖細胞にトランスジーンが存在することによって、トランスジーンをその後の世代に伝幡することができる。特定の態様において、トランスジーンは、魚がリンパ腫または白血病を発生するようにB-またはT-細胞前駆体において発現されることが好ましい。一つの態様において、トランスジーンは、魚がT-細胞急性リンパ芽球性白血病のようなT-細胞リンパ芽球性白血病を発症するようにT-細胞前駆体において発現される。他の態様において、魚はB-細胞リンパ腫および白血病、骨髄性白血病、神経系腫瘍（例えば、脳腫瘍）、黒色腫、腸管腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、筋肉腫瘍、生殖細胞腫瘍、卵巣癌、または当業者に周知の他の腫瘍もしくは癌を発症する。このように、そのような動物は、例えばT-細胞急性リンパ芽球性白血病のモデルの場合を含む癌のモデルとして都合よく用いてもよい。したがって、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換と共に、放射線療法または化学療法に対する治療に対するトランスジェニック細胞の感受性を調節する薬物または物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００５６】
本発明のもう一つの局面において、調節可能な部位特異的リコンビナーゼによって任意の組織において腫瘍遺伝子を調節することができる、ヒト癌の安定なトランスジェニック魚モデルを作製する方法が提供される。一つの態様において、方法には、（a）レポーター遺伝子が汎在遺伝子プロモーター（例えば、β-アクチンまたはEF1-α）によって調節され、腫瘍遺伝子がレポーター遺伝子の直後に配置される、そのゲノムが、強い転写終止部位を含むFloxed、Loxed、またはFRPedレポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質遺伝子またはルシフェラーゼ）を含む第一のトランスジーンカセットをその中に安定に組み入れている、第一のトランスジェニック魚を作製する段階；（b）そのゲノムが熱ショック誘導型プロモーター（例えば、HSP-70）に機能的に結合したflipまたはcre-レコンビナーゼ（CRE）遺伝子を含む第二のトランスジーンカセットをその中に安定に組み入れている第二のトランスジェニック魚を作製する段階；（c）該第一のトランスジェニック魚を該第二のトランスジェニック魚と交配させて、該レポーター遺伝子および該flipまたはCRE遺伝子を同時発現する子孫を作製する段階；（d）レポーター遺伝子が切り出されて、汎在遺伝子プロモーターが腫瘍遺伝子に隣接して近位に存在する、第一のトランスジェニックカセットの組換えを引き起こす体の単一の細胞において、熱ショック誘導型CREトランスジーンをレーザー活性化させる段階が含まれる。
【００５７】
もう一つの局面において、腫瘍遺伝子によって媒介されるもしくはそうでなければ誘導される新生物もしくは過形成形質転換を調節する、または放射線療法もしくは化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性を調節する薬物または物質をスクリーニングする方法が提供される。方法は、（a）トランスジェニック魚のゲノムがプロモーターに機能的に結合した腫瘍遺伝子を含む核酸をその中に安定に組み入れている、本明細書に記述のトランスジェニック魚（例えば、成体トランスジェニック魚またはトランスジェニック魚胚）を試験薬または物質に接触させるまたはそうでなければ曝露する段階；（b）試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物もしくは過形成形質転換を抑制もしくは増強するか、または放射線療法もしくは化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性を調節する否かを決定する段階；および（c）試験薬または物質が、腫瘍遺伝子による新生物もしくは過形成形質転換を抑制もしくは増強するか、または放射線療法もしくは化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性を調節すれば、試験薬または物質を、腫瘍遺伝子による新生物もしくは過形成形質転換を抑制もしくは増強する、または放射線療法もしくは化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性を調節する薬物または物質であると分類する段階を含む。本明細書において述べるように、調節は、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換の発生率、または放射線療法もしくは化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性を含む、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を、抑制もしくはそうでなければ減少させること、または増強もしくはそうでなければ刺激することが含まれてもよい。
【００５８】
試験薬または物質は典型的に、腫瘍遺伝子による新生物もしくは過形成形質転換の調節能、または放射線療法もしくは化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性の調節能を有すると考えられる薬物または物質を同定するために、何千もの化合物の大規模ロボット操作スクリーニングから同定される。そのようなスクリーニングは、日常的で、これらおよび他のスクリーニング法は当業者に周知である。試験薬または物質は、腫瘍遺伝子RNAおよび／または腫瘍遺伝子タンパク質産物の発現、または腫瘍遺伝子形質転換プロセスに関係する他の遺伝子のRNAもしくはタンパク質発現を抑制する、そうでなければ変化させる、または増強してもよい。さらに、試験薬または物質は、新生物／過形成形質転換プロセスに、または放射線療法もしくは化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性に、直接または間接的に関与する他の分子の活性を阻害または刺激してもよい。広範な薬物または物質を、本発明のスクリーニング法において試験してもよい。例えば、Peterson, R.T.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：12965〜12969（2000）およびPeterson, R.T.ら、Curr. Biol. 11：1481〜1491（2001）において同定された分子と類似の低分子化合物、またはFDAが承認した化学物質のパネルをアッセイしてもよい。低分子化合物は、生育中の魚の水に化合物を添加する効果に関して大きい化学物質ライブラリをスクリーニングすることによって同定される。さらに、オリゴおよびポリペプチドのようなタンパク質も同様に試験薬または物質として作用する可能性がある。
【００５９】
そのような試験薬または物質のさらなる例には、例えばアンチセンスデオキシリボ核酸（DNA）、アンチセンスリボ核酸（RNA）、および小さい干渉RNAsのようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。アンチセンスヌクレオチド配列には典型的に、本明細書に記述の標的ヌクレオチド配列のような、ならびにcMYC標的ヌクレオチド配列（ゲンバンクアクセッション番号XM_122917.1）および本明細書に記載の他のヌクレオチドを含む、標的ヌクレオチド配列の一部と相補的である、またはそうでなければハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列が含まれる。アンチセンスヌクレオチド配列は、長さが少なくとも約10ヌクレオチドであってもよいが、約10〜約1000ヌクレオチドの長さの範囲であってもよく、または遺伝子標的の全長であってもよい。当業者は、当技術分野で既知の、および例えば、「Methods in Enzymology, Antisense Tehcnology」、AおよびB部（313および314巻）（M. Phillips編、アカデミック出版、1999）に記述されるような標準的な技法によって所望の治療効果を有するように、適当な標的および適当な長さのアンチセンス核酸を選択することができる。
【００６０】
RNA干渉は、沈黙化された遺伝子標的と相同である二本鎖RNAによって生じた配列特異的な転写後遺伝子沈黙化に関する（Leeら、Nature Biotech. 19：500〜505（2002））。そのような方法は、腫瘍遺伝子タンパク質の産生を防止するために用いてもよい。小さい干渉RNAsを利用してタンパク質の産生を阻害する方法は当技術分野で周知であり、例えば、PCT国際出願番号国際公開公報第01/75164号、国際公開公報第00/63364号、国際公開公報第01/92513号、国際公開公報第00/44895号、および国際公開公報第99/32619号に開示されている。
【００６１】
試験薬および物質は典型的に、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を抑制、そうでなければ変化させる、または増強するために必要な量および時間で投与される。そのような量および時間は、既知の標準的な技法によって当業者にが決定してもよい。
【００６２】
トランスジェニック魚は、典型的にふ化後所望の時期に試験薬または物質に接触させる。本発明の他の形において、魚の卵子と共に含まれる魚の胚を試験薬または物質に接触させてもよい。
【００６３】
本発明の一つの態様において、試験薬または物質が腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を抑制する、そうでなければ変化させる、または増強するか否かを決定することは、魚において形成された腫瘍の量および／または大きさを測定することによって、および／または腫瘍形成の発生率を測定することによって行ってもよい。腫瘍遺伝子によって媒介されるまたはそうでなければ誘導される新生物もしくは過形成形質転換、または放射線療法もしくは化学療法による治療に対するトランスジェニック細胞の感受性の調節に関する他の指標も同様に測定してもよい。例えば、レポーター遺伝子-腫瘍遺伝子融合構築物を用いる場合、レポーター遺伝子発現は、当業者に周知のおよび本明細書に記述の方法を用いて決定してもよい。例えば、GFP-腫瘍遺伝子融合構築物に機能的に結合した組織特異的プロモーターを利用することによって、特定の組織において特に発現されたタンパク質から放出されたGFP蛍光を測定することができる。転移性腫瘍のさらなる肉眼的または他のスクリーニングも同様に用いてもよい。
【００６４】
本発明のいくつかの態様において、腫瘍遺伝子は、MYCまたはBCL2遺伝子ファミリーのメンバーであり、プロモーターはRAG2プロモーターである。他の態様において、腫瘍遺伝子は、MYCまたはBCL2に実質的に類似である、または哺乳類相同体である。
【００６５】
本発明のなおもう一つの形において、悪性腫瘍を含む新生物もしくは過形成増殖の発生率のような、腫瘍遺伝子によって媒介されるまたはそうでなければ誘導される新生物または過形成形質転換を調節する（すなわち、増強、抑制、またはそうでなければ変化させる）変異を同定する方法が提供される。一つの形において、方法は、遺伝子改変剤のスクリーニングを用いることを含む。そのようなスクリーニングは、本明細書に記述のトランスジェニック魚の前進遺伝能を利用する。悪性腫瘍の発生率を増強する変異は、例えば、腫瘍抑制遺伝子、腫瘍遺伝子、または新生物もしくは過形成プロセスに関与する他の遺伝子に認められる可能性がある。ゲノムの安定性を変化させる他の変異も同様に、悪性腫瘍の発生率を増強する可能性がある。新生物または過形成増殖の発生率を抑制する変異には、例えばまだ同定されていないタンパク質を含む、悪性の表現型にとって必要なタンパク質が含まれる。
【００６６】
一つの態様において、腫瘍遺伝子による新生物または過形成形質転換を調節する変異を同定する方法には、腫瘍抑制遺伝子または腫瘍遺伝子のような、新生物または過形成形質転換プロセスに関与する遺伝子における変異を同定することが含まれる。そのような遺伝子は既知または未知であってもよく、このように、そのような方法によって、新生物または過形成形質転換プロセスに関与する新規腫瘍抑制遺伝子、腫瘍遺伝子、または他の遺伝子を発見することができる。一つの態様において、変異誘発魚を、本明細書に記述の癌を発生する傾向を有する非変異誘発トランスジェニック魚と交雑またはそうでなければ交配させて、F1子孫を作製する。方法には、F1雌性魚から卵子を得る段階、卵子を不活化精子と受精させてF2子孫を得る段階、および腫瘍抑制遺伝子の不活化を示すF1魚を同定するために、胸腺の過形成のような過形成の発生率および程度を調べる段階が含まれる。次に、方法には、当技術分野で既知の方法によって変異を同定することが含まれる。
【００６７】
特定の態様において、トランスジェニック魚、好ましくはトランスジーンに関してホモ接合である雄性魚を変異誘発して、トランスジーンに関してホモ接合である変異誘発されていない雌性魚と交配させる。F1雌性魚からの卵子を不活化精子と受精させて、スピンドルによるような受精初期圧を与えて、雌性発生二倍体F2子孫を作製する。臓器または組織特異的新生物または過形成の発生率または程度を調べて、発生を加速させる腫瘍抑制遺伝子の不活化に関してヘテロ接合であるF1魚を同定する。次に、F1雌性魚を外部交雑させて変異を同定することができる。次に、変異体対立遺伝子をマッピングして、当技術分野で既知の標準的な方法によって推定の腫瘍抑制遺伝子を同定してクローニングしてもよい。
【００６８】
もう一つの態様において、優性改変剤スクリーニングを行って、本明細書に記述のトランスジェニック魚における腫瘍遺伝子によって誘導される癌の発生率を増加、抑制、またはそうでなければ変化させることに関係する遺伝子を同定する。本明細書に記述するように、トランスジェニック魚は、臓器または組織特異的プロモーターに機能的に結合した任意の腫瘍遺伝子を含んでもよく、レポーター遺伝子をさらに含んでも含まなくてもよい。例えば、RAG2-GFPトランスジェニック魚におけるcMYC機能を、このタイプのスクリーニングを利用する癌の発生の加速または遅延のいずれかに関して分析してもよい（図6）。例えば、F0雄性魚をENUによって変異誘発させて、魚のゲノム内に点突然変異を作製してもよい。次に、これらの魚をホモ接合RAG2-GFP雌性魚と交配させて、点突然変異とRAG2-GFPトランスジーンの双方に関してヘテロ接合であるF1魚を作製してもよい。次に、これらの魚をホモ接合RAG2-cMYCトランスジェニック魚と交配させて、得られたF2子孫を当業者に周知の方法を用いて分析することができる。例えば、GFP陽性魚を、胸腺の肥大、またはえら、頭部領域、および／または体筋系における転移性腫瘍形成によって示される、蛍光顕微鏡による腫瘍形成の可視化に基づいて疾患の発病に関して採点してもよい。T-細胞におけるGFPの発現は必要はないが、これは疾患の早期発病を同定するために役立ち、それによってF2魚をスクリーニングするために必要な時間を短縮するであろう。
【００６９】
もう一つの局面において、放射線療法または化学療法によって誘導されたプログラムされた細胞死に対する感受性を調節する変異を同定する方法を提供する。特定の態様において、方法は、そのゲノムがゼブラフィッシュRAG2プロモーターに機能的に結合したマウスcMYC腫瘍遺伝子をその中に安定に組み入れているトランスジェニックゼブラフィッシュを変異誘発することを含む。トランスジェニックゼブラフィッシュを非変異誘発ゼブラフィッシュと交配させて、F1子孫を作製する。F1子孫からの卵子を不活化精子と受精させてF2子孫を作製し、F2子孫において放射線療法または化学療法によって誘発されるプログラムされた細胞死に対する感受性の有無および程度を決定する。放射線療法または化学療法によって誘発されるプログラムされた細胞死に対する感受性を調節する変異を同定する。
【００７０】
もう一つの特定の態様において、方法は、精子における点突然変異を誘導するWik対立遺伝子を含む雄性魚を変異誘発させることを含む。AB系統RAG2-RGFP-zBCL2トランスジェニック雌性魚も同様に作製し、トランスジェニック雌性魚をWik雄性魚と交配させて、それによってRAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンに関してヘテロ接合であって、Wik対立遺伝子に連鎖した変異を有するF1子孫魚を作製する。雌性F1子孫魚からの卵子を不活化野生型精子と受精させて、受精卵に初期圧を与え、それによってRAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンを発現して、変異に関してホモ接合であるF2子孫を作製する。放射線療法または化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性の有無および程度を、F2子孫において決定する。次に、F2ヘテロ接合変異体魚を近交系交配させて、それによってRAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンを含み、変異に関してホモ接合であるF3ホモ接合変異体魚を作製する。次に、放射線療法または化学療法によって誘発されるプログラムされた細胞死に対する感受性を調節するF3ホモ接合変異体魚における変異を同定する。
【００７１】
さらにもう一つの特定の態様において、方法は、精子において点突然変異を誘導するWik対立遺伝子を含む雄性魚を変異誘発させることを含む。AB系統RAG2-RGFP-zBCL2トランスジェニック雌性魚も同様に作製し、トランスジェニック雌性魚をWik雄性魚と交配させて、それによってRAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンに関してヘテロ接合であって、Wik対立遺伝子に連鎖した変異を有するF1子孫魚を作製する。次に、F1子孫魚をAB系統RAG2-EGFP-zBCL2トランスジェニック魚と交配させて、F2子孫における放射線療法または化学療法によって誘発されるプログラムされた細胞死に対する感受性の有無および程度を決定する。放射線療法または化学療法によるプログラムされた細胞死に対する感受性を調節するF3ホモ接合変異体魚における変異を同定する。
【００７２】
トランスジェニック魚における変異は、様々な化学物質、放射線、および／またはウイルス形質導入を用いることを含む、多様な方法によって誘導してもよい。そのような化学物質には、例えばエチルニトロソウレアおよびDMBAが含まれる。Gollingらは、マイクロインジェクションおよびレトロウイルス挿入を用いることによってウイルスの変異誘発スクリーニングを行ったが（Nat. Genet. 31：135〜40（2002））、この方法は本明細書に記述のトランスジェニック魚における様々なスクリーニングと共に用いてもよい。精子は雄性魚を絞り出して、精子の放出を刺激するか、または精巣を顕微解剖するこことによって得てもよい。精子はUV放射線曝露によって不活化してもよい。
【００７３】
二つまたはそれ以上の腫瘍遺伝子の同時発現によって、疾患の発病が加速する可能性がある。例えば、マウスモデルにおいて、TAL1/SCL単独の誤発現によって後発型T-細胞急性リンパ芽球性白血病（Kelliherら、EMBO J. 15：5160〜5166（1996）；Condorelliら、Cancer Res. 56：5113〜5119（1996））が起こるが、LMO1またはLMO2の誤発現と組み合わせると、より短い潜時でT-細胞悪性疾患を引き起こすであろう（Larsonら、EMBO J. 15：1021〜1027；Aplanら、EMBO J. 16：2406〜2419（1997）：（Chervinskyら、Mol. Cell Biol. 19：5025〜5035（1999））。さらに、Eμ-MYCおよびEμ-BCL2トランスジーンの双方に関してトランスジェニックであるマウスは、Eμ-MYCまたはEμ-BCL2トランスジェニック系統単独のいずれかよりB-細胞発達のより初期段階で停止した腫瘍を発生し、より短い潜時の疾患を発症する。悪性疾患の発生における変異の協調作用は、ほとんどの腫瘍において一般的であり、典型的に、癌の発生にとって必要である。
【００７４】
このように、一つの態様において、腫瘍遺伝子の同時発現の効果を、本明細書に記述するように、特定の臓器または組織において異なる腫瘍遺伝子を発現するトランスジェニック魚（例えば、ゼブラフィッシュ）系統を交配させることによって直接試験する。それぞれの異なる腫瘍遺伝子を、本明細書に記述するように、レポーター遺伝子に機能的に結合させてもよい。例えば、ホモ接合RAG2-MYCまたはRAG2-cMYC魚をホモ接合RAG2-EGFP-BCL2系統と交配させてもよい。子孫を、例えば胸腺におけるGFP陽性T細胞の異常な増殖に基づく疾患の早期発生に関して分析してもよい。他の例には、RAG2-MYC魚を、RAS、HOX11、HOX11L2、LMO1、LMO2、またはSCL遺伝子ファミリーの腫瘍遺伝子を含むトランスジェニック魚と交配させることが含まれてもよい。そのような同時発現の転帰は、得られた子孫において明らかであり、これらは本明細書に記述の、そして当業者に周知の方法を用いて、標的組織または臓器に応じて分析してもよい。例えば、T-細胞特異的腫瘍遺伝子を発現するトランスジェニック魚を交配させる場合、子孫を、例えばGFP陽性細胞の集団の増加、T-細胞組織病理学、T-細胞腫瘍遺伝子の誤発現（例えば、インサイチューハイブリダイゼーションによって）、および胸腺特異的分子マーカーの存在に関して分析してもよい。発症の急激性は、T-細胞急性リンパ芽球性白血病の発病において遺伝子が協調して作用する証拠として、一重または二重トランスジェニック動物少なくとも約50例のコホートにおいて決定してもよい。動物は、胸腺肥大の発生時期および／または罹患率／死亡率に関して毎日調べてもよい。次に、疾患の発生および死亡率が二重トランスジェニック魚系統において有意に短縮されたか否かを評価するために、生存データを周知の統計学的方法を用いて分析してもよい。
【００７５】
さて、上記のトランスジェニック魚および方法を説明する特定の例を参照する。実施例は好ましい態様を説明するために提供され、本発明の範囲に対する制限はそれによって意図されないと理解すべきである。
【００７６】
実施例1：T-細胞白血病のRAG2-MYCトランスジェニックモデル
cMYC遺伝子がT-細胞受容体座または免疫グロブリンエンハンサー領域に転座すると、cMYC遺伝子の調節障害を引き起こし、それによってT-細胞急性リンパ芽球性白血病およびB-細胞非ホジキンリンパ腫においてT-およびB-細胞の悪性形質転換が起こる。ゼブラフィッシュが遺伝子スクリーニングに対して感受性があること、子宮外で急速に発達すること、そのライフサイクルのほとんどが透明であること、および毎週多数の子孫を産むことを考慮すると、ゼブラフィッシュは脊椎動物におけるMYC誘発癌進行に至る保存された経路を調べるための理想的なモデルとして役立つ。本実施例は、モザイク（またはキメラ）F0魚において、および子孫がEGFP-mMYCトランスジーンを発現してこれをその子孫に伝幡するゼブラフィッシュの安定な系統において、マウスcMYCがT-細胞前駆体にターゲティングされる、T-細胞急性リンパ芽球性白血病のゼブラフィッシュモデルの作製を記述する。
【００７７】
マウスcMYCおよびEGFP-mMYC融合タンパク質を、ゼブラフィッシュRAG2プロモーターを用いることによって、生育中のゼブラフィッシュにおけるT-細胞前駆体にターゲティングした（Yinら、Oncogene, 20：4650〜4664（2001））。MYCタンパク質ファミリーは、種を超えて非常に進化的および機能的に保存されている（Schreiber-Agusら、Mol. Cell Biol. 13：2765〜2775（1993）；Schreiber-Agusら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：1235〜1240（1997）；Yuanら、Oncogene 17：1109〜1118（1998））。例えば、ゼブラフィッシュcMYC-I（Schreiber-Agusら、Mol. Cell Biol. 13：2765〜2775（1993））およびショウジョウバエMYC（Schreiber-Agusら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：1235〜1240（1997））は、哺乳類細胞の悪性の形質転換を行うために活性化H-RASと協調作用することができ、このことは、これらのタンパク質が系統を超えて機能的に類似であること、および異なる種からのcMYCタンパク質がヒト細胞株に加えられた場合に類似の形質転換特性を有することを示している。
【００７８】
A．材料および方法
1．DNA構築物
RAG2-GM2プラスミドをBamHIおよびHindIIIによって37℃で一晩消化して、GM2カセットを放出した。直線状のプラスミドベクターを含む酵素消化混合物を80℃で熱不活化して、4℃に冷却し、アルカリホスファターゼによって37℃で一晩燐酸化した。翌日、反応を熱不活化して、使用するまで4℃で保存した。
【００７９】
mcMYCおよびEGFP-mcMYCを、直線状にしたRAG2-ベクターにライゲーションした。特に、PCRを用いてマウスcMYCオープンリーディングフレームを増幅した。フォワードPCRプライマーは、6 bpのリーダー配列（AATTCC）の後にBamHIおよびSmaIクローニング部位、6 bp 5' ATG開始部位（おそらくコザック配列を示す）、およびATG開始部位を含む17 bpのコード配列を含む。リバースプライマーは、6 bpのリーダー配列、HindIIIクローニング部位、および終止コドン配列を含む24 bpのコード配列を含んだ。PCR増幅した断片をBamHIおよびHindIIIによって37℃で一晩消化して、エチジウムブロマイド含有アガロースゲル（1×TBE中に1％）において分離させた。ゲルのバンドを切り出して、キアゲンQIAquick（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州）によってDNAを抽出した。DNAを、直線状にしたRAG2ベクターに4℃で一晩ライゲーションして、これをコンピテントJM109細菌細胞（プロメガ（Promega）、マディソン、ウィスコンシン州）への形質転換に用いた。細胞をアンピシリン-含有アガロースプレートにおいて増殖させ、cMYC特異的プライマーを用いて、陽性クローンをコロニーPCRによって同定した。陽性クローンをLB+アンピシリンにおいて一晩増殖させ、プラスミドを準備した（Wizard（登録商標）SVミニプレップス、プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）。
【００８０】
リンカー媒介ライゲーションを用いてRAG2-EGFP-MYC構築物を作製した。特に、EGFP-MYCベクターをNheIおよびEcoRIによって消化して、EGFP-MYCコード配列を含むベクターの一部を放出した。この断片を、燐酸化二本鎖リンカーの存在下で、直線状のアルカリホスファターゼ処理PCS2ベクター（BamHIおよびEcoRIによって消化した）にライゲーションした。リンカーは、PCS2ベクターからのBamHI突出末端をNheI適合性末端に適合させた。これらのPCS2-EGFP-MYCベクターをBamHIおよびHindIIIによって消化して、コード配列を放出して、上記のように直線状のRAG2-構築物にライゲーションした。RAG2ベクターにクローニングするこれらの方法はいずれも、当業者に周知の方法である。
【００８１】
さらに、RAG2-ヒトMYC-ER構築物を、PCRに基づくクローニング戦略（上記のように）を用いて作製した。MYC-ERトランスジーンは、ヒトcMYC遺伝子とエストロゲンの結合に関与するエストロゲン受容体（ER）の一部との融合体である。この融合体トランスジーンは、マウスにおいて条件的に活性化されると報告されている。タモキシフェン（エストロゲン類似体）の非存在下において、MYC-ERは細胞質において保持され、機能的ではない。タモキシフェンの存在下において、MYC-ERは、核に転座してそこでMYC誘導形質転換に関与する遺伝子を活性化することができる。タモキシフェンは、その飲料水によってマウスに投与してもよく、それによってMTC-ER対立遺伝子の活性化が起こる。タモキシフェンを水に添加することによって、トランスジェニック魚におけるMYC-ER対立遺伝子を活性化する、類似のトランスジェニックシステムも同様に魚において用いてもよい。
【００８２】
最後に、loxed dsRED2対立遺伝子を、EGFP-mMYCトランスジーンの上流のBamHI部位でRAG2-EGFP-mMYCプラスミドにクローニングした。得られたRAG2-Lox-dsRED2-EGFP-mMYCプラスミドは、dsRED2トランスジーンに隣接するlox部位を含む（図7.A）。CREリコンビナーゼの非存在下では、dsRED2トランスジーンが発現されるが、EGFP-mMYCトランスジーンは活性ではない（図7.B〜7.C）。CREリコンビナーゼ活性の存在下では、dsRED2対立遺伝子が切り出されて、RAG2-プロモーターをEGFP-mMYCトランスジーンに隣接させるであろう。これによって、胸腺前駆体においてEGFP-mMYCの発現が起こり、トランスジェニック魚においてT-細胞白血病／リンパ腫が発生する。
【００８３】
このCRE/Lox-媒介戦略が魚において作用することを確認するために、本発明者らは、EGFPトランスジーンを含む汎在発現CMVプロモーターの制御下でdsRED2 loxed対立遺伝子を発現する発現ベクターを作製した（図8.A）。得られたプラスミドは、EGFPトランスジーンの上流に存在するdsRED2トランスジーンに隣接するlox部位を含む（上記の通り）。RAG2-Lox-dsRED2-EGFP-mMYCの場合と同様に、dsRED2は、CRE誘導の非存在下で発現されるが、EGFP発現は沈黙化される。CRE誘導によって、dsRED2対立遺伝子が切り出され、CMVプロモーターをEGFPトランスジーンに隣接して近位に配置させる。これによって、CRE媒介組換え後にGFPの発現が起こる。CREの発現を促進するCMVプロモーターを含むベクターも同様に、初期発達時の胚にCREレコンビナーゼ活性を輸送するために確立された（PCS2+CRE）。
【００８４】
2．胚の注入：魚におけるCRE組換えに関する一過性の分析
CREレコンビナーゼ戦略がゼブラフィッシュにおいて作用することを確認するために、本発明者らは、CMV-lox-dsRED2-EGFPプラスミドをPCS2+CREプラスミドDNAまたはこのプラスミドから作製されたCRE mRNAと同時注入した。特に、PCS2+CREベクターを一晩のNotI消化によって直線にして、得られた切断DNAをフェノール：クロロホルム／エタノール沈殿させた。PCS2+ベクターは、CRE転写開始部位の5'にSp6プロモーター部位を含むことから、本発明者らは、SP6 RNAポリメラーゼを用いてCRE RNAを作製することができた。RNAを塩化リチウム抽出を用いて精製して、200 ng/μlの最終濃度で再浮遊させた。
【００８５】
DNA：DNA注入の場合、50 ng/μl CMV-lox-dsRED2-EGFPプラスミドおよび50 ng/μl PCS2+Creプラスミドを含む溶液を、発生の一細胞期の胚に注入した。DNA：RNA注入の場合、25 ng/μl CMV-lox-dsRED2-EGFPプラスミドを含む溶液をCRE DNA 50 ngと共に注入した。胚を、GFPおよびdsRED2の発現に関して24および48時間で、蛍光顕微鏡によって調べて分析した。
【００８６】
3．胚の注入：モザイク創始魚および安定なトランスジェニック系統の作製
RAG2-cMYC、RAG2-EGFP-MYC、RAG2-hMYC-ER、およびRAG2-Lox-dsRED2-EGFP-mMYCベクターをXhoIまたはNotIによる37℃で一晩の消化によって直線状にして、DNAをフェノール：クロロホルム抽出の後にエタノール沈殿によって精製した。DNA濃度はUV分光光度法およびゲル定量の双方によって評価した。直線状のDNAを、0.5×TE/100 mM KClにおいて100〜200 ng/μlに希釈して、ガラスマイクロピペットを用いて発生の一細胞期の野生型AB配に注入した。注入したDNAの容積を、胚の20〜50％がDNAの過剰注入に関連する形態学的特徴を示す点まで滴定（titter）した。これは、ゼブラフィッシュへのマイクロインジェクションでは普通に認められ、これによって生存している胚は細胞への高レベルのDNA組込みを確実に有する。「奇形」形態を示す胚の20〜50％を廃棄した。胚を発達の15日までE3卵海水において28.5℃で増殖させ、その後胚を本発明者らの再循環系に入れる。これらのF0モザイク魚を、胸腺の肥大（えら蓋ひだからの胸腺の突出）、および眼または頭部における腫瘍形成を含む、リンパ腫の特徴である外部形態学的特徴に基づいて腫瘍の発生に関して毎日分析した。
【００８７】
RAG2-cMYCのマイクロインジェクションはまた、蛍光顕微鏡によって腫瘍の形成を可視化するために、RAG2-GFPに関してヘテロ接合であるAB胚においても行った。RAG2-GFPの安定なトランスジェニック系統は既に確立されていた。腫瘍の発生は、蛍光顕微鏡によって毎週1回モザイクRAG2-mcMYC内でGFPの異常な発現によって評価した。
【００８８】
4．組織学的方法
腫瘍形成魚およびAB対照魚を組織学的に分析した。魚を4％パラホルムアルデヒドにおいて4℃で一晩固定して、パラフィンにおいて抱埋するために処理した。組織試料の脱水法は当業者に周知である。魚を5〜10 mmの部分に横断面で切断して、パラフィンに抱埋した。ブロックを魚の全長について5〜10ミクロンの切片にして、それぞれ10枚目のスライドガラスをヘマトキシリン／エオジンによって染色した。スライドガラスを野生型ABスライドガラスと比較して、腫瘍の形成に関して光学顕微鏡によって分析した。
【００８９】
5．インサイチューハイブリダイゼーション
パラフィン抱埋スライドガラスにおけるRNAインサイチューハイブリダイゼーションの方法は当業者に周知であり（例えば、Wilcoxら、「In situ cDNA：mRNA hybridization：Development of a technique to measure mRNA levels in individual cells.」、Methods in Enzymol. 124巻、Neuroendocrine Peptides（P.M. Conn.編）、アカデミック出版、510〜533頁（1986）；Rosenthalら、EMBO J. 6：6341〜3646（1987）；Wilcoxら、J. Neurosci. 8：1901〜4、1988；Wilcoxら、Mol. Cell Biol.8：3415〜22（1988）；Meltonら、Nucleic Acids Res. 12：7035〜56（1984）；Maniatisら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1982）；およびYangら、J. Histochem. Cytochem. 47：431〜46（1999））、これらに軽微な改変を加えて行った。簡単に説明すると、cMYC、SCL、LMO1、LMO2、RAG1、RAG2、TCRα、LCK、IgLCおよびIgMを含む対象遺伝子のコード配列を含むプラスミドDNAのPCRによって、cDNAプローブを作製した。PCRプライマーには、T7およびSp6プロモーター配列が含まれ、これを増幅された断片に組み入れた。PCR産物は長さが400〜600 bpであり、QIAquick（登録商標）PCR精製キット（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて精製した。RNAプローブは、T7およびSp6 RNAポリメラーゼを用いて作製した。ハイブリダイゼーションを行って、ペルオキシダーゼ染色技術を用いてRNA染色を可視化した。
【００９０】
6．サザン分析
サザン分析は、Haireら、Immunogenetics 51：915〜923（2000）に記述された内容にいくつかの改変を加えて行った。特に、ゲノムDNAを魚の後方部分から単離した。魚を麻酔して肛門で横半分に切断した。魚の尾の部分からゲノムDNAを抽出して（PUREGENE（商標）DNA単離キット、ゲントラシステムズ（Gentra Systems）、ミネアポリス、ミネソタ州）、分光光度分析によって定量し、DNA 8 mgをBglII制限酵素によって37℃で一晩消化した。DNA断片を、エチジウムブロマイドを含む0.8％アガロースゲル（1×TBE）上で4時間電気泳動した。DNAをナイロンメンブレンに移して、ブロットを放射標識TCRαまたはIgMプローブによって調べた。これらのプローブは、これらの遺伝子の定常領域に対して特異的であり、ランダムプライミング標識によって作製した（Rediprime（商標）II、アマシャムバイオサイエンシズ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）。メンブレンの洗浄は、高ストリンジェンシー条件で行い、メンブレンをx-線フィルムに1〜3日間曝露した後、それらを現像した。
【００９１】
7．FACS分析
腎細胞および脾細胞を、解剖後の野生型AB魚またはモザイクRAG2-MYC/EGFP-MYC魚から単離した。回収した細胞を0.9×PBSおよび5％FBSにおいて浮遊させて、40ミクロンフィルターによって分離し、洗浄して、ヨウ化プロピジウムによって染色した。FACSは、前方および側方散乱に基づいて、場合によってはGFP蛍光に基づいて行った。
【００９２】
8．芽球の形態学
全腎髄質および全脾臓と共に、FACSソーティング細胞集団についてサイトスピンを行った。細胞をメイグリュンワルドによって染色して、カバーグラスを載せて、高倍率下で観察した。
【００９３】
9．切断面接触標本
魚を麻酔して肛門のところで横半分に切断した。魚の切断部分をスライドガラス上に繰り返し置いた（すなわち「切断面接触標本」）。スライドガラスを数分乾燥させて、上記のようにメイグリュンワルドによって染色した。
【００９４】
10．ゲノムDNAへのトランスジーン組込のPCRによる確認
魚を麻酔して肛門で横半分に切断した。「The Zebrafish Book：A Guide For the Laboratory Use of Xebrafish（Danio rerio）」、第4版（M. Westerfield編、オレゴン大学出版、ユージーン、オレゴン州（2000））に概要されるように、尾の部分をPUROGENE（商標）プロトコール（ゲントラシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）、またはプロテナーゼ-K消化のいずれかによってゲノムDNAに関して抽出した。RAG2-プロモーターおよびMYCコード配列の双方に及ぶプライマーを用いて、PCRを行った。フォワードプライマーは、RAG2-プロモーター配列に存在し、リバースプライマーは、MYCコード配列内に存在した。対照プライマーは、RAG2プロモーターおよびRAG2オープンリーディングフレームを超えて増幅した。
【００９５】
11．DNAフローサイトメトリー
腫瘍形成魚の後方部分から得た体の筋系を、氷冷0.9×PBSおよび5％FBSにおいて細切して、40ミクロンフィルターによって分離して、洗浄し、ヨウ化プロピジウムによって染色した。野生型の魚からの腎細胞を解剖によって採取して、0.9×PBSおよび5％FBSにおいて再浮遊させて、40ミクロンフィルターによって分離して、洗浄し、ヨウ化プロピジウムによって染色した。細胞2500個をDNAフローサイトメトリーによって分析した。腫瘍と野生型細胞との組み合わせによって、腫瘍試料において同定されたピークが2Nまたはヘテロ二倍体であることを確認した。
【００９６】
12．半定量的RT-PCR
トリゾール抽出プロトコールを用いて、RNAをRAG2-EGFP-mMYCの安定なトランスジェニック子孫から単離した。RNAを定量して、逆転写酵素反応を用いてcDNAにして、水によって2倍、10倍、100倍、1000倍希釈した。ゼブラフィッシュLMO1、LMO2、HOX11、TLX-3a、TLX-3b、SCL、LCK、およびマウスcMYCに対して特異的なプライマーの存在下で、cDNAの希釈液にPCR増幅を行った。
【００９７】
B．RAG2-cMYC、RAG2-EGFP-cMYC、およびRAG2-ヒトMYC-ER構築物は、F0キメラ魚において腫瘍形成を促進する
F0 RAG2-mcMYC F0創始動物215匹中、11匹は、広範な腫瘍形成に関連した外部表現型を示し、RAG2-EGFP-mcMYC魚122匹中7匹は、疾患の兆候を示した。腫瘍発生の平均潜時はRAG2-mcMYCおよびRAG2-EGFP-mcMYC魚に関してそれぞれ、45日および52日であった。魚が最終的に病気であると決定され、屠殺されるまでの期間である平均生存日数は、双方の構築物に関して64日であった。腫瘍の発生は30〜131日の範囲であった。最も長く生存している担癌魚は178日生存し、その時点で屠殺した。
【００９８】
数匹のRAG2-MYC-ERキメラ魚は、タモキシフェン誘導の非存在下で腫瘍を発生し（114日までに178例中4例、2.2％）、このことは、融合トランスジーンが活性であるが、いくぶん「漏出性」であることを示している。RAG2-MYC魚の中で、5.3％（337匹中18匹）が白血病を発症し、平均潜時は51日であった（範囲30〜131日）。114日までに腫瘍を有したのはRAG2-MYC-ERTmキメラ魚の2.2％に過ぎなかった。このように、ER条件システムを用いることは有望である。類似の結果がCD2-ER-MYCTmマウスモデルにおいても認められ、この場合、タモキシフェンの非存在下で腫瘍を発生したのは子孫の23％までであったのに対し、タモキシフェンの存在下では62％が生育の300日までに腫瘍を発生した（Blythら、2000）。
【００９９】
RAG2-mMYC、RAG2-EGFP-mMYC、およびRAG2-MYC-ER発現に関してモザイクである白血病の魚は、腹腔が重度に膨隆しており、眼が傾いており、眼のあいだおよび周囲に様々な腫瘍が形成された（図1A〜1F）。数匹の魚は、おそらく胸腺に対応する位置にえら蓋から突出している増殖物を有し（図1E〜1F）、腫瘍は、一般的に胸ひれの基底部に認められた（図1C〜1D）。魚の多くは皮膚の真下に腫瘍を有し、それによって時間と共に色素のより薄い魚が得られた。対照的に、RAG2-Lox-deRED2-EGFP-mMYCキメラ魚は白血病／リンパ腫を発症しなかった。
【０１００】
C．トランスジェニック魚における腫瘍形成の分析
RAG2-mcMYC F0魚3匹およびRAG2-EGFP-mcMYC魚4匹を切片にして、ヘマトキシリン／エオジン染色に基づいて腫瘍形成に関して分析した。分析した魚は全て、体全体に広範な腫瘍形成が起こり、大量の腫瘍を有した（図1I〜1P）。肝臓、脾臓、および腎臓（哺乳類の骨髄同等物）へのリンパ球の大量の浸潤を認めた（図1L）。腫瘍細胞は、背側筋系（図1N）、腸管、えら、ひれ、眼の周辺領域、腹の皮膚において認められた。顕著な腫瘍は鼻の領域（図1P）に認められ、これは嗅球のRAG2-発現上皮細胞から発生しないように思われた。そのかわりに、鼻領域における腫瘍は、インサイチュー分析によりLCK陽性であり、ケラチン抗体によって染色されず（データは示していない）、これらの鼻腫瘍は、魚全体を通して認められた同じT-細胞腫瘍であったことを示している。RAG2-EGFP-mcMYC F0魚（n＝4）は、RAG2-mcMYCに関して記述される腫瘍と類似の腫瘍を有したが、GFPは、蛍光顕微鏡またはFACS分析によって検出できなかった。cMYCの半減期は正常細胞において約30分であって、GFPタンパク質の成熟期間が約4時間であると仮定すると、GFPが成熟して蛍光を発生できる前に融合タンパク質のほとんどが破壊の標的となるであろうことから、GFPが検出されなかったことは意外ではなかった。
【０１０１】
組織学的に分析した担癌魚の中で、全てがT-細胞急性リンパ芽球性白血病を有した。T-細胞遺伝子TCRαおよびLCKならびにB細胞遺伝子IgMおよびIgLCのRNA発現に関してパラフィン切片を分析した。リンパ様マーカーRAG1およびRAG2、ならびにmcMYC発現をインサイチューハイブリダイゼーションによって分析した。腫瘍は全て、mcMYC（図2A〜2B）、RAG1、RAG2（図2C〜2D）、およびLCK（図2E〜2F）に関して陽性であった。他の遺伝子のRNA発現は検出できなかった。RAG2-EGFP-mcMYC魚を、抗GFP抗体（クロンテック（Clontech）、JL-8）を用いて免疫組織化学によってGFP-融合タンパク質の発現に関して分析し、腫瘍細胞において強い核タンパク質発現を示した（図2G〜2J）。これらの結果は、RAG2-プロモーターが、mcMYC RNAおよびタンパク質発現の双方を促進し、モザイクF0魚においてT-細胞の腫瘍形成形質転換に関与することを示している。
【０１０２】
RAG2-mMYC 2匹およびRAG2-EGFP-mMYC F0モザイク魚2匹をFACS分析によって分析して、総細胞数を腎臓および脾臓に関して計数した。野生型AB魚において、腎臓は典型的に、血液細胞8.4±3.7×105個（N＝7）を有するが、脾臓は8.2±6.3×104個（N＝6）を有する（Traverら、準備中）。担癌魚において、細胞4.95±3.3×106個（N＝5）を腎臓に認め、細胞4.64±1.5×105個（N＝4）を脾臓において認めた。白血病腎臓および脾臓は、全体では野生型対照より多くの細胞を含んだが、総赤血球細胞および骨髄集団数は劇的に変化せず、このことは、リンパ球が脾臓および腎臓において認められた細胞数の増加の原因であることを示している（図3）。腎臓における芽球の割合は、87.1±3.9％（N＝4、範囲83.1〜92.2％）であったが、脾臓における芽球の百分率は、75.7±10.5％（N＝4、範囲、60.8〜85.3％）であった。腫瘍細胞は、側方散乱に基づくと正常なリンパ球と類似の粒状度を有したが（図3A〜EのY-軸のSSC）、前方散乱（X-軸に関してFSC）に基づくとわずかに大きかった。腎髄質は、哺乳類における骨髄と類似であることから、そして白血病は一般的に骨髄における芽球が＞30％であるとして定義されることから、モザイク魚は、腎臓における細胞の87.1±3.9％を占める芽球を有する播種性T-細胞急性リンパ芽球性白血病を有した。
【０１０３】
D．他の腫瘍のクローン性および系列の確認
腫瘍細胞の系列と共にクローン性を決定するために、ゼブラフィッシュTCRα（Haireら、Immunogenetics 51：915〜923（2000））およびIgM定常領域に対応する放射標識プローブを用いて制限酵素消化腫瘍DNAsに関するサザンブロット分析を行った。分析した腫瘍3例中、1例はモノクローナルTCRα遺伝子再配列を有し、1例は、オリゴクローン性TCRα遺伝子再配列を有した（図2I）。第三の腫瘍は、TCRαの生殖系列形状を示したが、非常に強いLCK RNA発現を有し、これはT-細胞起源であることが確認された。第三の腫瘍からの腫瘍細胞は、典型的にTCRα遺伝子再配列の前に胸腺分化において停止した。いずれの腫瘍もIgM遺伝子の再配列を示さず、TCRα遺伝子再配列とLCK遺伝子発現の存在と組み合わせると、同定された全ての腫瘍が胸腺起源であることが示された。
【０１０４】
CD2またはThy1プロモーターの制御下でcMYCを発現するマウスも同様に、T-細胞リンパ腫を発症し、これは、T-細胞のモノクローンまたはオリゴクローン集団から生じた。このように、魚およびマウス腫瘍は、分化停止段階およびクローン性に関して類似であった。
【０１０５】
E．レシピエント魚に対する腫瘍の移植
腫瘍を移植できるか否かを分析するために、腫瘍細胞をF0モザイク魚の腎臓から採取して、2日齢AB野生型胚に腹腔内注射した。注射した魚25匹中、魚1匹が44日までに白血病を発症した（図4A）。この魚は、膨隆した腹部、傾いた眼、およびえら蓋から胸ひれの関節に伸長する腫瘍を有するF0モザイク魚において認められた表現型と類似の表現型を有した。切断面接触標本により、組織学的分析（データは示していない）と同様に、この移植された魚がF0モザイク魚（図4B〜D）と類似の腫瘍を有することが確認された。尾の領域における浸潤細胞から抽出した腫瘍DNAに関してPCRを行い、魚がcMYCトランスジーン構築物を有することを確認した（図4E）。
【０１０６】
腫瘍はまた、放射線照射した成魚にも移植可能であった。魚をトリカインによって麻酔して、腫瘍細胞を注入する2日前に35Cs源から2500 Radsを致死的に放射線照射した。魚5匹に、総腎細胞3.6×105個またはソーティングした芽球1×105個を腹腔内注射した。全腎髄質を注入した魚5匹の中で、1匹は、注射技法の結果として死亡し、2匹は分析を行うことができる前に死亡した。残っている魚2匹を注射後25日に屠殺して、腫瘍の形成に関して組織学的に分析した。いずれの魚も、注射していない放射線照射した対照魚（図4Fおよび4H）と比較して、腎臓（図4G）および体筋系（図4I）への腫瘍細胞の大量の浸潤を認めた。ソーティングした芽球を注射した魚5匹の中で3匹は注射後25日まで生存し、その時点でそれらを屠殺した。3匹全ての魚がF0モザイク魚および全腎髄質を注射した魚と類似の腫瘍形成を示した。しかし、魚2匹は、おそらくソーティングした芽球細胞を投与された魚に注入した細胞がより少なかった結果として、他の移植した魚と比較してあまり重度でない腫瘍浸潤を示した。RNAインサイチューハイブリダイゼーションから、移植した腫瘍がmMYC、RAG1、およびRAG2を発現し、F0モザイクzRAG2-mMYC魚において発生した腫瘍（データは示していない）と形態学的に区別できなかったことが確認された。分析した対照放射線照射魚は全て、非照射対照魚と比較して正常な組織学的形態を示した。
【０１０７】
F．RAG2-mcMYC腫瘍の多倍数性の決定
腫瘍におけるMYC発現によってしばしば、ゲノムの不安定性および染色体外断片の蓄積が起こる。RAG2-mcMYC腫瘍がヘテロ二倍体であるか否かを決定するために、担癌魚1匹についてFACS分析を行い、腫瘍細胞におけるDNA含有量を決定した（図4B）。分析した腫瘍はDNA指数1.15を有した。腫瘍と野生型試料とを混合すると、腫瘍のピークは減少したが、2Nのピークは増加し（データは示していない）、2Nおよび腫瘍のピークは、腫瘍試料において異なることを確認した。
【０１０８】
G．RAG2-EGFP-mMYCトランスジーンを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの安定な系統の作製
F0モザイク魚の5％がリンパ腫を発症したが、注射した他のF0魚は、トランスジーンをリンパ様細胞に組み入れることなく、生殖細胞に組み入れる可能性がある。これらの魚は健康であるはずで、トランスジェニックF1子孫を生じるはずである。350匹までのF0創始魚からの子孫をゲノムPCRによってスクリーニングして、トランスジーンをF1子孫に伝えることができる個体7例を同定した。これらの中で、EGFP-MYCトランスジーンを発現したのは1例に過ぎなかった。この創始魚のRAG2-EGFP-MYC F1魚子孫は、発達22日までにGFP陽性胸腺腫瘍を発症した（Laugenauら、2003）。
【０１０９】
これらの腫瘍は、ゼブラフィッシュRAG1、RAG2、およびLck遺伝子を発現し、このことはRAG2-EGFP-mMYCの安定な系統において発生した腫瘍がモザイク魚において発生した腫瘍と類似であることを示した。さらに、腫瘍は、TCRαゲノム座のクローン性再配列を有し、いくつかの腫瘍は、DNA含有量によって決定した場合に、クローン的に異数性であった。分析した腫瘍34例中5例（15％）がDNA指数1.02〜1.10を有した。最後に、LMO2およびSCLは、RT-PCR（図10）およびインサイチュー分析（図11）の双方によって確認したところ、本発明者らのEGFP-mMYC誘導白血病において発現された。小児T-ALLの最も一般的なサブクラスは、SCLおよびLMO1/2の双方を発現するが、このサブクラスの患者は、全ての患者群の最悪の予後転帰を有した。このように、このゼブラフィッシュモデルは、最も一般的で最も致死性の型のヒト小児T-ALLのために用いられる可能性がある。
【０１１０】
EGFP-MYCトランスジーンを有するF1 RAG2-トランスジェニック魚において腫瘍形成が早期に起こること、およびトランスジェニック魚の平均生存日数が81日（範囲50〜111日、n＝53）であることを考慮すると、F1魚を交配させることは可能ではなかった。しかし、精巣は8〜12週齢までに発達することから、系統を維持するために、白血病の雄性魚からの精巣をインビトロ受精において用いるために抽出した。この系統を維持してF3魚を作製し、現在、本発明者らの系において生育中である。IVF技法は厄介であることから、そして大規模遺伝子スクリーニングにおいて用いるために感受性がない可能性があることから、タモキシフェン感受性MYC-ERTmトランスジーン（Blythら、2000）を用いて条件的トランスジェニックゼブラフィッシュ系統を作製して、CRE媒介戦略に従って、先に概要したようにEGFP-mMYCトランスジーンの発現を誘導する（実施例1.A.1）。
【０１１１】
H．誘導型MYCトランスジーンを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの条件的安定な系統の開発
少なくとも二つの異なる戦略を用いて、RAG2プロモーターの制御下で誘導型MYC対立遺伝子を発現する条件的トランスジェニックゼブラフィッシュ系統を作製してもよい。
【０１１２】
第一の戦略は、タモキシフェン誘導型ヒトMYC-ER融合トランスジーンを利用する。魚約400匹にRAG2-MYC-ERTmトランスジーンを注射して、本発明者らの系において現在生育中である。これらの魚のいくつかは腫瘍を発生し（114日までに178例中4例、2.2％）、このことは、トランスジーンが活性であるが、いくぶん「漏出性」であることを示した。RAG2-MYC魚の中で、5.3％（337例中18例）が白血病を発症し、平均潜時は51日であった（範囲30〜131日）。RAG2-MYC-ERTmキメラ魚の2.2％のみが114日までに腫瘍を発生した。このように、ER-条件系を用いることは有望である。類似の結果はCD2-MYC-ERTmマウスモデルにおいて認められ、この場合タモキシフェンの非存在下で腫瘍を発症したのは子孫の23％までであったが、タモキシフェンの存在下では62％が300日までに腫瘍を発症した（Blythら、2000）。
【０１１３】
PCR陽性子孫を生じるF0魚を毎週交配させて、幼魚を産生させる。いくつかの幼魚の集団を用いて、ヒトcMYCまたはエストロゲン受容体に対して特異的な抗体を用いる全封入インサイチューハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学のいずれかによって、子孫においてトランスジーンが発現されることを確認する。残りの集団を成魚まで生育させ、PCRスクリーニングのためにひれからDNAを単離して、F1創始魚を同定する。
【０１１４】
魚におけるタモキシフェンに対するMYC-ERTmの反応を調べるために、RAG2-MYC-ERTmトランスジーンをRAG2-GFP系統からの胚に注入して、タモキシフェンの非存在下で6日間生育させ、GFP陽性性に関して採点した。発達の6日までにGFP陽性T細胞を有する胚をタモキシフェンの存在下（0、0.1、1.0、および10 μM）で6〜35日まで生育させ、35日目に腫瘍の発生に関して採点した。3日ごとに水を交換して、この期間においてタモキシフェンを毎回交換する。これらの実験によって、タモキシフェンのどの用量がMYC-ERTmを誘導するために必要であるかが決定されるであろう。注入された魚の5％がトランスジーンをそのT-細胞に組み入れることから（Langenauら、2003）、1群あたり初代注入魚少なくとも100匹を評価する。反応はタモキシフェンによるものであって、MYC-ERTmトランスジーンの「漏出性」によるものではないことを確認するために、白血病の魚をタモキシフェンから除去して、腫瘍の退縮に関して採点する。
【０１１５】
条件的トランスジェニックゼブラフィッシュ系統を作製する第二の戦略は、EGFP-mMYCトランスジーンの発現を促進するために、CRE/Lox-媒介切り出し事象を利用する。本発明者らは、CREプラスミドまたはCRE RNAと共にCMV-Lox-dsRED2-EGFPプラスミドを同時注入した。CMV-Lox-dsRED2-EGFPプラスミドのみを注入した胚では、魚は赤色の蛍光によって標識され、緑色では標識されなかった。対照的に、プラスミドを同時注射した胚では、魚は蛍光下で赤色と緑色の双方を有し、このことは、CRE組換えがゼブラフィッシュ胚において起こったこと、そしてプラスミドがいくつかの細胞において同時発現されたが全ての細胞では同時発現されていないことを示した（図8.B〜8.E.）。dsRED2 loxed対立遺伝子のCRE切り出しの効率を調べるために、本発明者らは、CMV-Lox-dsRED2-EGFPをCRE RNAと共にまたは単独で注入した。CRE RNAの非存在下では、魚は赤色であり、緑色ではなかった（図9.A〜9.C）。50 ng/μlのCREをCMV-lox-dsRNA-EGFPプラスミドと同時注射すると、dsRED2対立遺伝子は100％切り出され、魚は緑色であり、赤色ではなかった（図9.D〜9.F）。これらの結果は、CRE/lox戦略が魚において一過性に作用することを示し、CRE RNAが魚に対して毒性ではなく、インビボで注入してもよいという事実を強調した。
【０１１６】
RAG2-loxed-dsRED2-EGFP-MYCを作製して、生きている魚300匹以上に注射した。トランスジーンは、受精後6日目にdsRED2蛍光によって検出した（図7.Bおよび7.C）。3ヶ月齢でのT-細胞において赤色蛍光の強い発現を有するモザイク魚を同定した。しかし、これらの魚のいずれも腫瘍を発生せず、このことはds-Redタンパク質が発現されているが、EGFP-MYCタンパク質は発現されなかったことを示した。F0創始魚を、dsRed2蛍光によって検出して、トランスジーンの伝幡能に関してスクリーニングした。
【０１１７】
I．考察
cMYC発現細胞における腫瘍の形成に至る遺伝子事象を理解することは、バーキットリンパ腫、濾胞性B-細胞リンパ腫、およびT-細胞急性リンパ芽球性白血病のような疾患の治療を開発するために重要である。cMYC誘導腫瘍を発生する傾向を有する魚において形質転換を停止させる遺伝子事象を同定することによって、ヒト疾患に関与する保存されたメカニズムを同定することが可能となる可能性がある。遺伝子抑制因子スクリーニングによって同定された遺伝子は、薬物開発のための標的となる可能性があり、cMYCが増幅または過剰発現されている多様な癌における新規戦略となる可能性がある。さらに、本明細書において記述されたトランスジェニック魚においてMYC-誘導白血病を抑制する化学物質スクリーニングにおいて同定された低分子阻害剤または他の薬物もしくは物質は、ヒト患者における臨床試験の候補物質である可能性があり、将来的に新規治療物質の発見に至る可能性がある。最後に、魚において癌のモデルを作製することは、他のプロモーターおよび他の腫瘍遺伝子を利用する魚における悪性形質転換の他のモデルを作製するための先例を提供し、さらにいくつかの例を下記に述べる。
【０１１８】
実施例2：T-細胞におけるBCL2機能の化学的および遺伝子抑制物質を同定するためのRAG2-EGFP-ゼブラフィッシュBCL2トランスジェニックモデルの利用
A．材料および方法
濾胞性B-細胞リンパ腫のような疾患は、抗アポトーシス遺伝子であるBCL2の活性化を有し、それによってこれらの腫瘍はアポトーシスに対して耐性となり、それらは、他のメカニズムによって形質転換されたB-細胞より化学療法および放射線療法に対する感受性が低くなる。さらに、腫瘍の大部分がMYC腫瘍遺伝子を誤発現し、これはアポトーシス機構の不活化を必然的に必要とする形質転換事象である。形質転換細胞におけるBCL2またはMYC機能を阻害する薬物を作製することは、ヒト腫瘍を治療するために有利となり、この腫瘍遺伝子を過剰発現する細胞を選択的に殺すために、化学療法および放射線療法と組み合わせて用いてもよい。本明細書においてBCL2に関して記述した実験と類似の実験はまた、例えばcMYCについて行ってもよい。
【０１１９】
1．DNA構築物
縮重PCRを用いて、1〜5日の胚からゼブラフィッシュBCL2-関連cDNA断片を増幅し、得られたDNA断片をpGEMT-EASYベクター（プロメガ）にクローニングした。クローンをシークエンシングして、これをプローブとして用いて全胚cDNAライブラリ（RZPD）をスクリーニングすることによって完全長のクローンを得た。特に、プラスミドDNAを消化して、BCL2-関連cDNA断片を放出させ、エチジウムブロマイド含有アガロースゲルにおいて分離して、DNAをゲルバンドから抽出した。ゲル精製DNAをREDI-PRIME IIランダム標識システム（アマシャム）を用いて放射標識して、これを用いて完全長のcDNAライブラリをプロービングした。完全長のクローン1個を得てシークエンシングした。
【０１２０】
ゼブラフィッシュBCL2（zBCL2）の推定されるアミノ酸類似性により、本発明者らの遺伝子は、他のBCL2ファミリーメンバーに入った（図12）。系統発生学的分析から、本発明者らのゼブラフィッシュBCL2-様遺伝子が、他の脊椎動物BCL2タンパク質と群を形成し、BCL-xLタンパク質とは群を形成しなかったことから、魚における真のBCL2相同体である可能性があることが示唆された。
【０１２１】
本発明者らは、EGFPをzBCL2のアミノ末端に融合させることによってEGFP-zBCL2遺伝子融合体を作製した（図13A）。詳しく述べると、zBCL2 cDNAを、メチオニン開始部位が変化したフォワードプライマーの存在下でPCRを用いて増幅した。さらに、フォワードプライマーはSal I部位を含み、リバースプライマーは、EGFP-C1ベクター（クロンテック）へのクローニングを促進するためにHind III部位を含んだ。得られたPCR断片をQIAQUICK PCR精製システム（キアゲン）を用いてPCR精製して、SalIおよびHindIIIによって一晩消化した。消化されたPCR産物をエチジウムブロマイド含有アガロースゲルにおいて分離した。得られたDNAバンドを切り出して、DNAを抽出した。このDNAを、XhoIおよびHindIIIによって消化しておいたEGFP-C1ベクターにクローニングした。得られたプラスミドはEGFP-zBCL2遺伝子融合体を作製した。
【０１２２】
次に、上記のベクター（EGFP-C1-zBCL2）をBamHIおよびHindIIIによって消化することによってRAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンを作製し、本質的に実施例1.A.1に概要した通りに、得られた断片をRAG2-プロモーター含有ベクターにクローニングした。このRAG2-EGFP-zBCL2ベクターをClaIおよびBamHIによって消化して、pCS2+ベクターにクローニングした。
【０１２３】
2．胚の注入：魚におけるEGFP-zBCL2トランスジーンの一過性の分析
本発明者らの融合タンパク質が機能的であることを確認するために、EGFP-zBCL2 RNAおよびGFP対照RNAを一細胞段階の胚に注入した。次に、16、20、および24時間での発達的に調節されるアポトーシスの阻害に関して胚を分析した。さらに、GFP-陽性EGFP-zBCL2 RNAおよびGFP対照RNA注入胚に14 hpfで16 Gyの放射線を照射して、20 hpfでパラホルムアルデヒドにおいて固定した。RNAは、実施例1.A.2において本質的にPCS2+CRE RNAに関して記述されたとおりに作製して注射した。GFP陽性魚を屠殺してTUNNELアッセイによってアポトーシス細胞の有無に関して分析した。
【０１２４】
3．全封入tunel分析
全封入TUNEL分析は、TMR-Redインサイチュー細胞死キット（ロシュ）を用いて行った。
【０１２５】
4．胚の注入：モザイク創始魚および安定なトランスジェニック系統の作製
RAG2-EGFP-zBCL2ベクターを37℃でXhoIまたはNotIによる一晩の消化によって直線にして、DNAをフェノール：クロロホルム抽出の後エタノール沈殿によって精製した。DNA濃度はUV分光光度法とゲル定量の双方によって評価した。直線にしたDNAを0.5×TE/100 mM KClにおいて100〜200 ng/μlに希釈して、ガラス製のマイクロピペットを用いて発達の一細胞期の野生型AB胚に注入した。注入したDNAの容量は、DNAの過剰注射に関連した形態学的特徴を胚の20〜50％が示す点まで滴定した。これはゼブラフィッシュへのマイクロインジェクションにおいて普通に認められ、これによって生存胚は細胞への高レベルのDNA組込を確実に有する。「奇形」形態を示す胚の20〜50％を廃棄した。胚をE3卵海水において28.5℃で、発達の15日まで増殖させてから、胚を再循環系に入れた。
【０１２６】
5．組織学的方法
RAG2-EGFP-zBCL2トランスジェニックおよびAB対照魚を組織学的に分析した。魚を4％パラホルムアルデヒドにおいて4℃で一晩固定して、パラフィンに抱埋するために処理した。組織試料の脱水法は当技術分野で周知である。魚を5〜10 mmの部分に横に切断して、パラフィンに抱埋した。ブロックを魚の全長にわたって5〜10ミクロンの切片にして、スライドガラス10枚毎にヘマトキシリン／エオジンによって染色した。スライドガラスを光学顕微鏡によって分析して、野生型AB魚切片と比較した。
【０１２７】
6．放射線照射感度
RAG2-GFPおよびRAG2-EGFP-zBCL2トランスジェニック魚を全身線量15、20、および25 Gyの電離放射線によって処理した。魚を6 dpf、21 dpf、および3ヶ月齢で、胸腺におけるGFP標識T-細胞の喪失によって決定する放射線照射反応に関して分析した。
【０１２８】
B．EGFP-zBCL2トランスジーンは機能的である
本発明者らの融合タンパク質が機能的であることを確認するために、EGFP-zBCL2 RNAを一細胞期の胚に注入した。胚を、受精後16時間で発達的に調節されたアポトーシスの阻害に関して分析した。GFP陽性魚を屠殺して、TUNELアッセイによってアポトーシス細胞の有無に関して分析した。EGFP-zBCL2 RNAは、発達中の胚において通常起こるアポトーシスを救出した（図13.B〜G.D）。さらに、EGFP-zBCL2 RNAは、発達中の胚における放射線によるアポトーシスを救出した（図14）。これらの実験は、EGFP-zBCL2トランスジーンがインビボでアポトーシスの強力な阻害剤であること、そしてトランスジーンが生きている魚において容易に可視化される可能性があることを示した。
【０１２９】
C．RAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンを発現するT-細胞は、放射線照射によるアポトーシスから保護される
RAG2-EGFP-zBCL2トランスジェニック魚からのT-細胞は、胸腺における持続的なGFP発現によって決定すると、電離放射線による処置（15、20、および25 Gy）後アポトーシスを受けなかった。対照的に、RAG2-GFPトランスジェニック魚は、8日齢魚（図15）および3ヶ月齢魚（図16）の双方において電離放射線処置後2〜3日目にGFP標識T-細胞を喪失した。放射線に対する反応は、「全か無か」の反応であった。このように、胸腺におけるGFP発現によって示された表現型の変化を採点することは、8および23日齢でのT-細胞および3ヶ月齢でのT細胞におけるアポトーシスの容易なアッセイである。
【０１３０】
D．高スループット96ウェルアッセイの開発
次に、5〜8日齢のゼブラフィッシュ胚が96ウェルプレートにおいて生存できるか否か、および高レベルの生存を得るためにどの濃度の水が必要であるかを決定した。6日齢のゼブラフィッシュ胚を96ウェルプレートのウェルに割付した。胚3〜4個を1％DMSOを含むおよび含まない卵海水250、150、および100 μlにおいて生育させ、死亡率に関して毎日分析した。
【０１３１】
E．薬物処理に関する96ウェルアッセイ
5〜8日齢のゼブラフィッシュ胚は、処置後2日まで卵海水100 μlもの少量において生存することができた。しかし、処置後3日目では水100 μlを含むウェルにおいて有意な死亡率を認めた。魚は処置2日までに高い生存率で150および250 μlの水において生存することができた。しかし、2および3日目では150 μlを含むウェルにおいて数例の死を認めた。対照的に、魚は処置後3日目で250 μlを含むウェルにおいて生存した。DMSOは、胚の生存に対して有意な作用を示さなかった。
【０１３２】
このように、2日の分析を必要とする治療レジメに関して、アッセイ容積にとって卵海水150 μlで十分である。対照的に、3日の分析を必要とする治療レジメでは、卵海水250 μlが必要である。
【０１３３】
F．デキサメタゾンに対するRAG2-GFP胸腺細胞の反応
5〜8日齢の魚が水から化学物質を吸収できるか否かを決定するために、そして正常なGFP標識T-細胞が化学的除去に対して反応性であるか否かを決定するために、本発明者らは、5日齢のRAG2-GFP魚を様々な用量のデキサメタゾン（DEX）によって処置した。詳しく述べると、GFP陽性RAG2-GFP胚を卵海水5 mlを含む6ウェルプレートに配列させた。ウェルは0.1％エタノール（対照）、250 μg/mL（1％エタノール）、25 μg/mL DEX（0.1％エタノール）、12.5 μg/mL DEX（0.05％エタノール）、5 μg/mL DEX（0.02％エタノール）、または1 μg/mL DEX（0.004％エタノール）のいずれかを含んだ。魚は6、7、および8 dpfで胸腺におけるGFP発現に関してアッセイした。
【０１３４】
G．RAG2-GFP胸腺細胞は化学的除去に対して反応性である
RAG2-GFP魚はDEX処置に対して反応した（図17）。詳しく述べると、GFP-陽性T-細胞は処置後3日目（8 dpf）で250 μg/mL DEXによって処置したRAG2-GFP胚において検出されなかった。対照的に、GFP-標識T-細胞は、0.1％エタノールによって処置した魚に存在した。25 μg/mL用量を投与したDEX処置魚では部分的反応を認めたが、魚6匹中2匹ではT-細胞が全く存在せず、数匹は処置後3日までに胸腺においてT-細胞が減少した。
【０１３５】
これらの結果は、5〜8日齢のゼブラフィッシュ胚が水から化学物質を吸収できたこと、および正常なGFP-標識T-細胞がDEXによる化学的除去に対して反応性であったを示した。最後に、これらの実験は、免疫抑制剤に関するスクリーニングに基づく薬剤を開発する際にトランスジェニック魚を用いることを強調し、魚における化学物質抑制剤のスクリーニングの容易さを説明する。
【０１３６】
H．BCL2機能を阻害する薬物を同定するための化学物質スクリーニング
5日齢RAG2-EGFP-zBCL2トランスジェニックゼブラフィッシュ胚に放射線を放射して、96ウェルプレートにおいて1ウェルあたり魚3匹を並べた。各ウェルは、化学化合物8〜10個を含む卵海水150〜250 μlを含む。魚を、アポトーシスによるT-細胞除去の指標として処置後2および3日目に胸腺におけるGFPの発現に関して分析する。RAG2-EGFP-zBCL2トランスジェニック系統におけるT細胞は、放射線照射に対して非感受性であることから、そしてほとんどの薬剤がBCL2機能に影響を及ぼさないことから、トランスジェニック魚からの胸腺は、IR処置後2日間GFP標識されたままであろう。しかし、化学物質がBCL2機能を阻害することができれば、T-細胞は死滅し、処置後2〜3日までに胸腺細胞はなくなるであろう（GF蛍光によって検出）。（1）BCL2機能を阻害する単一の化合物を同定するため、および（2）T-細胞機能を除去する薬物（すなわち、用いられるトランスジェニック系統とは無関係にT-細胞を殺す化合物）を制御するために、BCL2機能を抑制する薬物の組み合わせを、RAG2-EGFP-zBCL2およびRAG2-GFPトランスジェニック魚の双方に関して個々に試験する。
【０１３７】
I．BCL2機能の抑制剤を同定するための優性遺伝子スクリーニング
本発明者らのRAG2-EGFP-zBCL2魚はまた、インビボでT-細胞におけるアポトーシスを調節する遺伝子プログラムを理解する際に役立つであろう。詳しく述べると、遺伝子改変剤スクリーニングを用いて、5日齢の胚の放射線照射処置後のT-細胞抑制を評価する。RAG2-EGFP-zBCL2魚におけるGFP-陽性T-細胞は、放射線照射誘導アポトーシスに対して耐性であることから、スクリーニングしたほとんどの魚は8 dpfでの放射線照射後GFP-陽性T-細胞を有するであろう。しかし、BCL2機能の遺伝子改変剤が変異体魚に存在すれば、GFP陽性T-細胞は、放射線照射後にアポトーシスを受けて、これらの魚からのT-細胞はGFP-陰性となるであろう。
【０１３８】
例えば、以下の優性改変剤スクリーニングを用いて、BCL2機能を阻害する変異を同定してもよい（図18）。Wik雄性魚をエチル-ニトロソウレア（ENU）によって処置して、その精子において点突然変異を誘導する。平均すると、これらのENU処置雄性魚は、精子1個あたり点突然変異100個を含む。これらの雄性魚をAB系統のRAG2-EGFP-zBCL2魚と交配させる。得られたF1子孫は双方のRAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンに関してヘテロ接合であり、変異はWik対立遺伝子に連鎖するであろう。これらのF1魚をAB系統のRAG2-EGFP-zBCL2魚と交配させて、得られたF2子孫を放射線照射に対する感受性に関して採点する。5日齢のF2魚に放射線を照射して、胸腺におけるGFP発現によって決定されるように、8日目でT-細胞退行に関して評価する。放射線照射後の胸腺においてGFP-陽性T-細胞を欠損するF2変異体魚を同定した後、F1創始魚をAB系統RAG2-EGFP-zBCL2魚と交配させて、得られた子孫を成魚まで生育させる。これらの魚は、放射線照射に限って活性化され、BCL2発現細胞に影響を及ぼすことによって作用する優性変異体対立遺伝子を有することから、ヘテロ接合変異体魚は生存するであろう。これらのF2魚を変異のマッピングのために用いると、優性対立遺伝子はWik対立遺伝子と共に分離する。
【０１３９】
ゼブラフィッシュゲノムに遺伝子約40,000個が存在すると仮定すると、F1変異誘発ゼブラフィッシュ400匹の分析は、一つの半数体ゲノム同等物を構成するはずである。ゼブラフィッシュゲノムの7倍範囲を生じるはずであるF1魚3,000匹を分析する必要があるであろう。
【０１４０】
J．BCL2機能の抑制物質を同定するための劣性遺伝スクリーニング
本発明者らのモデルはまた、放射線照射後のT-細胞におけるBCL2機能を破壊する劣性変異を同定するために用いてもよい。例えば、以下の劣性変異体スクリーニングを用いて、BCL2機能を阻害する変異を同定してもよい（図19）。Wik優性魚をENUによって処理して、その精子において点突然変異を誘導する。これらの優性魚をAB系統RAG2-EGFP-zBCL2魚と交配させる。得られたF1子孫は、RAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンに関してヘテロ接合であり、変異はWik対立遺伝子に連鎖するであろう。個々のF1雌性魚からの卵子をUV不活化野生型精子と受精させる。UV処置は、精子DNAをクロスリンクさせ、そのため、生育しつつある受精卵のゲノムに貢献しないであろう。フレンチプレスを用いて、受精後90秒以内に受精卵に「初期圧」を適用すると、減数分裂IIにおける紡錘糸の形成が破壊され、ホモ接合染色体の分離を障害する。これによって、雌性発生二倍体子孫が得られ、子孫の10〜50％は変異した対立遺伝子に関してホモ接合である。得られたF2胚はRAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンを発現し、変異に関してホモ接合である。5日齢F2魚に放射線を照射して、胸腺におけるGFP発現によって決定して、8日目にT細胞退行に関して評価した。放射線照射後の胸腺においてGFP-陽性T-細胞を欠損するF2変異体魚を同定した後、F0創始魚をAB系統RAG2-EGFP-zBCL2魚と交配させて、得られた子孫を成魚まで生育させる。これらの魚は、放射線照射に限って活性化され、BCL2発現細胞に影響を及ぼすことによって作用する劣性変異体対立遺伝子を有することから、ヘテロ接合変異体魚は生存するであろう。これらのF2魚を近交系間交配させて、RAG2-EGFP-zBCL2トランスジーンを含むF3ホモ接合変異体魚を作製する。次に、F3魚を用いて変異をマッピングしたところ、表現型（すなわち、放射線照射後のGFP標識T-細胞の喪失）はWik対立遺伝子に連鎖した変異を分離する。
【０１４１】
K．考察
ゼブラフィッシュは、トランスジェニックRAG2-魚におけるT-細胞退行を「全てまたは無」の反応（上記を参照されたい）として採点できること、そしてT-細胞がインビボで容易に可視化されうることから、BCL2または関連ファミリーメンバーの新規低分子阻害剤を発見するための有用な系である。このモデルは、細胞株に基づくスクリーニングと比較した場合に、薬物スクリーニングに関していくつかの長所を提供する。第一に、薬物をインビボで試験する。このように、罹患組織における毒性および取り込みがスクリーニングの時点で決定される。第二に低分子阻害剤を、魚が泳ぐ水に加え、これは水溶性で経口で利用できる化合物を同定するために用いられる可能性がある。最後に、RAG2-EGFP-mMYCトランスジェニック魚と共にこのゼブラフィッシュ系統を用いる遺伝子スクリーニングによって、T-細胞を形質転換する経路に新しい洞察が得られると共に、BCL2の遺伝子増強剤および抑制剤の同定が得られるであろう。
【０１４２】
実施例3：高度星状細胞腫のトランスジェニックモデル
高度星状細胞腫は、最も一般的で破壊的な成人脳腫瘍であり、非常に急激に伝幡するために、患者が9〜12ヶ月より長く生きることはまれである。手術、放射線、および化学療法技術の進歩にもかかわらず、過去20年のあいだに星状細胞腫の患者の転帰にはほとんど改善が見られていない。明らかに、この疾患の生物学的基礎をよりよく理解するために新規アプローチが必要であり、それによって初めて有効な治療法を開発することができる。
【０１４３】
脳は主に二つのタイプの細胞、ニューロンとグリアで構成され、これは初期発達の際に正確なパターンで複製および移動して、脳の複雑な構造となる。脳が胚において発達する際に、グリアの増殖および移動は多くの遺伝子の協調活性によって制御される。正常なグリア細胞の増殖および移動を開始するために必要な遺伝子もあれば、これらのプロセスを適切に停止するために必要な遺伝子もある。星状細胞腫は、グリアに対して特異的な癌であり、ヒト腫瘍試料では、グリア細胞発達の際に正常に機能する多くの遺伝子が一貫して変異している。これらの変異によって、正常な細胞増殖の制御が失われ、腫瘍が形成される。発達の際の細胞増殖を制御して、これを一生を通してチェックし続ける遺伝子は、腫瘍抑制因子と呼ばれる。星状細胞腫において、変異した腫瘍抑制遺伝子には、p53（全ての症例の60〜70％において認められる）、およびヒト染色体10q（全ての症例の75〜90％）の領域における二つの遺伝子：PTENおよびMXI1が含まれる。これらの腫瘍では、他の遺伝子は変異していないが、EGFR遺伝子のように（全ての症例の50％）不適切にスイッチが入れられている。悪性高度星状細胞腫を生成するためには、これらの遺伝子事象の組み合わせが必要であり、このために疾患およびその治療の複雑度が増加する。
【０１４４】
ゼブラフィッシュの脳は、ヒトに非常に類似して形成されることから、ゼブラフィッシュは星状細胞腫を研究するために都合よく用いられる。上記の遺伝子を含む同じ遺伝子がその発達の際に機能するのみならず、脳腫瘍も発生させることができる。ゼブラフィッシュは、以下を含む多くの長所を提供する：生殖能、各雌性魚が毎週2〜300個を産卵し、そして母親の体外で発達する透明な胚。これによって、48時間以内に十分に形成される、急速に発達する脳を直接観察することができる。GFAP（神経膠線維酸性タンパク質）のようなグリア特異的プロモーターを用いて遺伝子発現を指示することによて、グリア細胞においてEGFRのような遺伝子を特異的に誤発現するゼブラフィッシュを作製してもよい。実施例1において概要した実験の場合と同様に、そのグリアに緑色蛍光タンパク質を発現する操作された魚によって、GFAP-EGFRトランスジーンを発現する透明な生きている動物において形質転換されたグリア細胞を直接観察することができるであろう。他の遺伝子およびプロモーターを用いて、高度星状細胞腫の新規モデルを作製してもよい。
【０１４５】
これらの動物における疾患を抑制または改変する可能性がある遺伝子ならびに他の試験薬および物質を同定するために（実施例1においてより詳しく記述したように）、星状細胞腫トランスジェニック魚の系統をさらなる変異誘発および化学物質試験において用いてもよい。次に、この疾患の有効な治療を開発するためにこの情報を用いてもよい。
【０１４６】
実施例4：横紋筋肉腫のトランスジェニックモデル
横紋筋肉腫は、不均一な悪性腫瘍群であり、年齢15歳またはそれより若い子供における最も一般的な軟組織肉腫である。横紋筋肉腫は、それぞれが異なるサブセットの遺伝子の誤発現を特徴とする二つの組織学的サブタイプ、すなわち胞巣状と胎児性からなる。胞巣状横紋筋肉腫は、通常、発達しつつある骨格筋において認められる転写因子の筋原性調節（MRF）ファミリーのメンバー、ならびに一対のBox転写因子ファミリーメンバーであるPAX3およびPAX7遺伝子を発現する。ほぼ全ての胞巣状横紋筋肉腫の症例において、これらのPAX遺伝子は特異的転座、特に症例の95％を含むt(2；13)(q35；q14)および変種、その症例の5％におけるt(1；13)(p36；q14)により、フォークヘッドファミリーメンバー遺伝子（FKHR）に融合して認められる。得られた融合タンパク質は、PAX3およびPAX7の下流の標的を活性化して、細胞の形質転換を引き起こすと考えられる。これらの転座はしばしば、MYCN、MDM2、CDK4、およびGLI1のような遺伝子の過剰発現を伴う。横紋筋肉腫の優性型である胎児性サブタイプの分子的基礎は、まだわかっていないが、ヘテロ接合性の喪失（LOH 11p15）およびIGF2、ATR、ATM、PTEN、PTC、pRB、p16、およびTP53のような他の遺伝子の破壊を特徴とすると考えられる。
【０１４７】
これらの腫瘍の攻撃的な特性のため、その有効な治療は特に難しくなっている。横紋筋肉腫は、遺伝子操作された哺乳類疾患モデルにおいて認められうるが、それらはしばしば他の腫瘍タイプに関連する。その分子的基礎を解明するため、および新規治療戦略を開発するための標的として最終的に用いられる可能性がある新規遺伝子を同定するためには、情報が多いが、より特異的な横紋筋肉腫のモデルが必要である。
【０１４８】
ゼブラフィッシュは、自然発生的に、および変異原物質に胚が曝露されたことに反応して、軟組織腫瘍を発生し、MyoDおよびα-アクチンのような組織特異的プロモーターが同定されており、その双方が発達しつつある筋肉においてGFPの強い発現を促進する。
【０１４９】
胞巣状横紋筋肉腫の典型である特異的転座によって、PAX3-FKHRおよびPAX7-FKHR融合タンパク質が生成される。これらの融合体遺伝子、および／またはMYCN、MDM2、CDK4、およびGLI1のような横紋筋肉腫において発現されている他の遺伝子をMyoDおよびαアクチンプロモーター構築物に組み入れることは、ゼブラフィッシュにおける横紋筋肉腫のモデルとして有用であろう。
【０１５０】
または、初期ゼブラフィッシュ発達を通してインビボでのトランスジーン発現を直接可視化するために、PAX3-FKHRおよびPAX7-FKHR遺伝子をGFPに融合させてもよい。ゼブラフィッシュの成熟のあいだインビボでトランスジーン-GFP発現を直接可視化できることによって、腫瘍形成表現型の同定および分析が容易となるであろう。
【０１５１】
胞巣状横紋筋肉腫関連転座において認められる融合タンパク質に基づくゼブラフィッシュの疾患モデルは、おそらく横紋筋肉腫を表現型模写するための最も有効な方法であるが、腫瘍形成を観察するためには、この疾患において過剰発現されることがわかっている他の遺伝子の発現が必要である可能性がある。したがって、全て横紋筋肉腫に関連することが示されているMYCN、MDM2、CDK4、GLI1またはp53のドミナントネガティブ型のような個々の腫瘍遺伝子の発現を促進するために、本明細書に記述のような筋特異的プロモーター構築物を用いて、さらなるトランスジェニック系統を作製する。さらに、そのようなトランスジェニック系統が確立された後、それらを実施例1および本明細書において他所で記述するように、それらを異種交配させて、相乗的または相補的効果に関してその表現型を分析することによって、互いに遺伝的に相互作用できるか否かに関して調べてもよい。
【０１５２】
横紋筋肉腫と共に他のタイプの癌のトランスジェニックモデルの開発は、横紋筋肉腫の発生を調節する遺伝子を同定するために、この脊椎動物モデル系の前進遺伝能を利用するために有用である。横紋筋肉腫の表現型を生じるトランスジェニック系統が作製された後、それらを本明細書に記述するようにエチル-ニトロソウレア（ENU）変異誘発スクリーニングの基礎として用いてもよい。簡単に説明すると、雄性トランスジェニック魚を例えばENUによって処置して生殖細胞において点突然変異を誘発させた後、トランスジェニック雌性魚と交配させて、起こりうる変異に関してヘテロ接合であるF1子孫を生じる。成熟F1雌性魚から卵子を採取して、UV不活化精子と受精させ、「初期圧」を与える。これによって、トランスジェニック系統において通常認められる横紋筋肉腫表現型に変化が起こる可能性がある変異を有する対立遺伝子に関して、子孫の50％までがホモ接合である雌性発生二倍体動物が得られる。可能性がある変異体を、特定のF1雌性魚の子孫において同定した後、これをヘテロ接合変異体の系統を回収するために外部交雑させる。これらの魚を近交系交配させて、変異体ホモ接合子孫を同定してもよい。次に、例えばゲノム全体に及ぶスキャニングアプローチを用いることによって、変異を特定の連鎖群に遺伝子マッピングしてもよい。連鎖群が決定された後、変異した遺伝子に隣接する多形性マーカーを同定して、当業者に周知の他の方法を用いて、物理的放射線ハイブリッドマップを用いて位置クローニングを開始してもよい。このプロセスによって、直接シークエンシングおよび候補遺伝子分析によって、変異した遺伝子のクローニングが得られるであろう。実施例1の場合のように、当業者に周知である、優性改変剤スクリーニング、ホモ接合初期圧スクリーニング、またはホモ接合F3スクリーニングが含まれるがこれらに限定されない多数のタイプの遺伝子スクリーニングをデザインしてもよい。変異原は、例えばENU、EMS、またはウイルス挿入であってもよい。
【０１５３】
このゼブラフィッシュ疾患モデルの結果として同定された遺伝子は、横紋筋肉腫に至る分子遺伝子経路の可能性がある調節物質を表し、これを用いてヒト相同体を同定してもよい。この方法を用いて、ドラッグデザインおよびこの破壊的な疾患を治療するための改善された治療を開発するための新規標的を決定してもよい。同様に、化学物質に基づくスクリーニングによって、筋細胞における腫瘍遺伝子の過剰発現に関連した表現型を抑制することができる治療物質が同定される可能性がある。そのような化学物質は、横紋筋肉腫を有するヒト患者において臨床試験の候補物質となる可能性がある。
【０１５４】
実施例5：急性骨髄性白血病のトランスジェニックモデル
急性骨髄性白血病において一般的に認められる変異および遺伝子再配列は、典型的にt(8；21)またはt(15；17)のような染色体転座に起因し、一つまたは二つの転写因子を融合させることによってキメラ腫瘍タンパク質を生成する（Look、1997）。しかし、これらの変化は、急性白血病の誘導を説明するためには十分ではない。例えば、マウス骨髄細胞におけるPML-PARαの発現によって、長い前白血病相の後に限って白血病が引き起こされるが（Heら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：5302〜5307（1997）およびGrisolanoら、Blood 89：376〜387（1997））、このことは、アポトーシスおよび細胞周期制御に関係する経路に特に影響を及ぼす他の変異が起こるに違いないことを示している。活性化FLT3キナーゼ変異がAPL患者において高い割合で発生し、おそらく第二の形質転換事象を提供することは現在では知られている。FLT3-活性化変異は、AML症例の約25％において起こり、それによってそれらはヒトAMLの分子発病に連鎖した最も頻繁な変異に入る。これらの変異は、FLT3受容体の膜隣接ドメインにおいて起こる内部タンデムリピート（ITD）、またはFLT3の構成的活性化を引き起こすキナーゼの負の調節ループドメインにおける点突然変異（Yamamotoら、Blood 97：2193A（2001））のいずれかである。FLT3活性化を調べるためにインビボ細胞株およびマウスモデルが開発されているが、ゼブラフィッシュ系の前進遺伝能は、それによって白血病に至る多くのおそらく新規の遺伝子における変異を偏りなく検出できるという点において独自の長所を提供する。最近の研究から、既知の哺乳類造血遺伝子のゼブラフィッシュ相同体の空間-時間的発現、およびゼブラフィッシュの骨髄発生の形態学的および細胞化学的特徴が顕著に保存されていることが示されている（Bennettら、Blood 98：643〜651（2001）、Herbornelら、Development 126：3735〜3745（1999）、Hsuら、Current Opinion in Hematol. 81：245〜251（2001）において論評）。
【０１５５】
マウスにおける研究から、FLT3-ITD変異cDNAの過剰発現が骨髄増殖障害を引き起こすことが示されている（Kellyら、Blood 99：310〜318（2002））。さらに、マウスにおけるBCR/ABLのような他のチロシンキナーゼ腫瘍遺伝子に関する研究により、分化ブロックの欠損、より活発な増殖、および強い抗アポトーシス活性（Evansら、Cancer Res. 53：1735〜1738（1993）；Laneuvilleら、Cancer Res. 54：1360〜1366（1994）；Drukerら、Nat. Med. 2：561〜566（1996）；およびCarlessoら、Oncogene 9：149〜156（1994））が示された。本明細書に記述のように、PU.1、MPO、またはC/EBPαプロモーターを含む、骨髄細胞におけるGFPの強い発現を促進する多数のゼブラフィッシュプロモーターが同定されている。構成的に活性化されたFLT3、BCR/ABL、およびPML-PARαを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの安定な系統を利用することによって、ゼブラフィッシュにおける急性骨髄性白血病の研究が可能となり、骨髄細胞におけるFLT3の過剰発現によって、多細胞腎髄質、脾腫、および骨髄増殖障害に類似する好中球増加症が起こる。本明細書において記述するように、エンハンサー-抑制物質スクリーニングは、クローン性骨髄新生物に関する治療として用いることができる低分子阻害剤を開発するための標的をコードする特異的改変剤遺伝子を同定するであろう。
【０１５６】
実施例6：条件的癌モデル
神経内分泌癌、膵臓癌、卵巣癌、睾丸癌、胃癌、結腸癌、腎臓癌、黒色腫および急性または慢性骨髄性白血病に至る基礎となるメカニズムの多くは、まだ完全にはわかっていない。これらの疾患において変異した遺伝子を同定すれば、全体としての癌に新しい洞察を与えるであろう。さらに、疾患の進行を阻害または遅らせる遺伝子または化学物質抑制剤を同定することができる脊椎動物モデル系を用いることは、標的化学療法の開発のための新規薬物標的を同定するために必要であろう。
【０１５７】
実施例1に記述するように、EGFP-mMYCトランスジーンの発現を促進するために、CRE/Lox媒介切り出し事象を用いて条件的トランスジェニックゼブラフィッシュ系統を作製してもよく、CRE-媒介組換えはゼブラフィッシュにおいて活性であることが示された。しかし、部位特異的組換え戦略の使用は、神経内分泌癌、膵臓癌、卵巣癌、睾丸癌、胃癌、結腸癌、腎臓癌、黒色腫および急性または慢性骨髄性白血病が含まれるがこれらに限定されない多様な他の癌に関する開発中のゼブラフィッシュモデルにより広く応用できる可能性がある。
【０１５８】
一つの戦略を用いて、調節可能な部位特異的リコンビナーゼを用いることによって腫瘍遺伝子が如何なる組織においても調節される癌の安定なトランスジェニック魚モデルを作製してもよい。そのゲノムがその中に、強い終止部位を含み、汎在遺伝子プロモーター（例えば、β-アクチン、またはEF1-α）によって調節される、蛍光タンパク質遺伝子（例えば、GFP、RFP、BFP、YFP、またはdsRED2）、またはルシフェラーゼ遺伝子のようなFloxed、Loxed、またはFRTedレポーター遺伝子、およびレポーター遺伝子の直後に配置される第二のトランスジーン（例えば、腫瘍遺伝子）を含むトランスジーンカセットを安定に組み入れたトランスジェニック魚。第二の遺伝子産物はレポーター遺伝子に隣接するが、レポーター遺伝子内の強い転写終止部位のためにリコンビナーゼ活性の非存在下では発現されない。そのゲノムがその中に、熱ショック誘導型プロモーター（例えば、HSP-70）に機能的に結合しているflip（FRTと共に用いるため）またはCre-レコンビナーゼ（FloxまたはLoxについて用いるため）遺伝子を安定に組み入れた第二のトランスジェニック魚を、第一のトランスジェニック魚と交配させた。次に、子孫における細胞を、本明細書において他所に記述するように、レーザーによって加熱することによって活性化する。特定の細胞をレーザーによって加熱すると、組換えが活性化されて、蛍光タンパク質遺伝子が切り出されて汎在遺伝子プロモーターが腫瘍遺伝子に隣接して近位となる。これによって、特異的細胞において腫瘍遺伝子の活性化が起こり、多くの異なるT-細胞タイプにターゲティングされる可能性がある。
【０１５９】
これまでの実験から、HSP-70プロモーターが個々の細胞のレーザー活性化によってトランスジェニックゼブラフィッシュにおいて厳密に調節可能であること（Halloranら、2000）、およびHSP-70プロモーターがトランスジェニック動物においてGFP以外の遺伝子の発現を促進できることが示された（Xiaoら、2003）。個々の細胞は、魚が発達の際に半透明であることから容易に同定することができる。さらに、魚は5 dpfまでにほとんどの臓器系を発達させ、ほぼ全ての細胞タイプをレーザー活性化によってターゲティングすることができる。この戦略は、腫瘍遺伝子の活性化を体内の任意の細胞にターゲティングすることができるトランスジェニック魚の作製に依存することから（すなわち、レポーター遺伝子と第二の腫瘍遺伝子の発現を促進する汎在プロモーターを用いる）、調べるそれぞれの癌に関して新規トランスジェニック系統の作製を必要としない、魚における新規癌モデルを開発することができるであろう。
【０１６０】
例えば、β-アクチンプロモーター（β-アクチン-Lox-dsRED-Lox-EGFP-mMYC）によって調節されるEGFP-mMYCトランスジーンに隣接するloxed-dsRED対立遺伝子を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの作製は、その全てがMYC腫瘍遺伝子の活性化を有する、膵臓β細胞腫瘍、浸潤性島腺癌、バーキットリンパ腫、急性骨髄性白血病、結腸癌、神経膠芽腫、および黒色腫を調べるためのモデルを作製するために有用となる可能性がある。これらのモデルのそれぞれは、罹患組織を生じる細胞内でのCREの活性化を必要とするに過ぎず、それは本明細書に記述のレーザー活性化によって促進される。
【０１６１】
本発明は、図面および先の記述において詳細に説明および記述してきたが、これは特徴を説明するためであって、制限するためではないと見なされ、好ましい態様のみを示して記述していること、そして本発明の趣旨に含まれる全ての変更および改変は保護されることが望ましいと理解される。さらに、本明細書において引用した全ての参考文献は当業者のレベルを示しており、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図1A〜1Hは、RAG2プロモーター-マウスcMYC（mcMYC）トランスジーン（本明細書においてRAG2-mcMYCとも呼ばれる）を含む核酸の導入によって作製されたトランスジェニック魚を示し、実施例1Bおよび1Cにより詳しく示すように、腫瘍形成性RAG2-mcMYCの外観を示す。野生型の魚を図1A、1B、1G、1I、1K、1M、および1Oに示す；RAG2-mcMYC F0モザイク魚は、図1C〜1F、1H、1J、1L、1N、および1Pにおいて認められる。図1A、1C、および1Eは、魚の側面図であり、図1B、1D、および1Fは、図1A、1C、および1Eにそれぞれ示す同じ魚の上から見た図である。図1GはRAG2-GFP魚の側面図であり、1Hは、RAG2-GFPバックグラウンドに注入して、GFP蛍光によって得たRAG2-mcMYC F0魚の側面図である。腫瘍は矢印で示し、鼻（N）、眼（E）、ひれ（F）、可能性がある胸腺腫瘍（T）と表示する。  図1I〜1Pは、例1Bおよび1Cにおいてより詳しく記述するように、RAG2-cMYCを含む核酸の導入によって作製されたトランスジェニック魚のヘマトキシリン／エオジン染色した断面の図である。野生型魚からの切片（図1I）と比較して、腫瘍を有する魚におけるリンパ芽球の塊状の浸潤（図1J）が認められる。図1K〜1L、腎臓；図1M〜1N、筋系；図1O〜1P、鼻領域。腫瘍は矢印で示し、ひれ（F）、腎臓（K）、筋肉（M）、皮膚（S）および腸管（G）を示す。図1I、1K、1Mおよび1Oは、野生型魚を表し、図1J、1L、1N、および1Pは、腫瘍を有するトランスジェニック魚を表す。図1I〜Jにおける尺度のバーは、1 mmを表し、図1K〜Nでは100ミクロンを表し、そして図1O〜Pでは500ミクロンを表す。
【図２】RAG2-cMYCを含む核酸の導入によって作製して、腫瘍の細胞系列を同定するために、実施例1Cにより詳しく説明するように、T-細胞遺伝子のRNA発現に関して分析したトランスジェニック魚の横断パラフィン切片の図を示す。図2A〜2B、マウスcMYC RNAプローブによるRNAインサイチュー分析；図2C〜2D、ゼブラフィッシュRAG2；および図2E〜2F、ゼブラフィッシュLCK。図2A、2C、および2Eではアンチセンスプローブを用い、図2B、2D、および2Fではセンス対照プローブを用いる。図2A〜2Fにおいて示した全ての切片は、体の筋系においてT細胞が浸潤している図である。  図2G〜2Hは、RAG2-EGFP-mcMYC発現F0モザイク魚（図2H）において、ヘマトキシリン／エオジン（図2G）によって、または抗GFP抗体によって染色した全身断面連続切片を示す。  図2Iは、実施例1Dにより詳細に説明するように、腫瘍を有する魚（T1〜T3）および野生型の魚（WT1〜WT4）のサザン分析である。尾から抽出した腫瘍DNAを、Bgl-IIによって消化して、TCRαおよびIgM定常領域特異的プローブによって調べた。BGl-IIは、IgMの定常領域内で切断して、その結果二つのバンドが検出された（T2およびWT4）。残っているDNA試料において四つのバンドが検出され、これらはIgM遺伝子座（T1、T3およびWT1〜WT3）において認められた多形に起因する。
【図３】図3A〜3Fは、実施例1Cにおいてより詳しく説明するように、RAG2-cMYCを含む核酸を有するトランスジェニック魚において形成された腫瘍の蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）および芽球の形態を示す。ゲートを設定した集団には、赤血球（赤）、リンパ様細胞（青）、骨髄細胞（緑）および前駆細胞（ピンク）が含まれる。ソーティングした腎臓の芽球をFACSによって再分析して（図3C）、ソーティングした芽球の代表的な視野を示す図3Fにおいて示すようにサイトスピン細胞調製物のメイ-グリュンワルド染色によって形態学的に分析した。各ゲート内の細胞集団を総細胞数として記す。前方散乱（FSC-H）および側方散乱（SSC-H）。3Fにおける像は、倍率1000倍で撮影した。
【図４】実施例1Eにおいてより詳しく説明するように、44日での2日齢胚として、腫瘍細胞を移植した野生型AB魚の上から見た図を示す。  図4B〜4Dは、トランスジェニック魚の体の筋系の切断面接触標本を示す。図4Bは、F0モザイクRAG2-mcMYC担癌魚の切断面接触標本を示す。図4Cは、図4Aからの腫瘍細胞を移植した魚を示す；および図4Dは、野生型魚を示す。図4B〜4Dにおける尺度のバーは、10ミクロンを表す。  図4Eは、野生型AC魚（WT）、F0モザイク魚（F0-モザイク）、および図4Aからの腫瘍細胞移植体を有する胚（移植体）の尾の筋系から単離したゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）分析を示すエチジウムブロマイドによって染色したアガロースゲルを示す。PCRは、陽性対照（＋対照）として注入するために用いたプラスミドについて行った。分子量マーカー（MWM）およびバンドの大きさを記入した。  図4F〜4Iは、腎臓（図4F〜G）および筋系（図4H〜I）のヘマトキシリン／エオジン染色切片を示す。成体野生型魚に致死量下の放射線2500 Radを照射して全腎髄質を注入した。図4F〜Hは放射線照射対照であり、図4G〜Iは、移植体である。図4F〜Iの尺度のバーは、50ミクロンである。  図4Jは、実施例1においてより詳しく記述するようにDNA含有量を決定するためにRAG2-mcMYC F0モザイク魚からの腫瘍のフローサイトメトリー分析を示す。
【図５】緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合させた腫瘍遺伝子タンパク質を産生するように腫瘍遺伝子配列を組み入れるために用いてもよいプラスミドベクターの例を示す。GM2は、緑色蛍光オープンリーディングフレームを指し、pAは、構築物において用いられる合成ポリアデニル化配列を指す。T7およびT3は、インビトロ転写のために用いられるプロモーターを指し、ベクター配列は、円上の一本線として記される。制限部位を記す。腫瘍遺伝子構築物に関して、GM2オープンリーディングフレームは切り出されて、マウスcMYC、EGFP-mcMYC、EGFP-BCL2、TAN1、およびHOX11の配列に置換されている。
【図６】可能性があるエチル-ニトロソウレア（ENU）誘導遺伝子改変剤のゼブラフィッシュにおけるスクリーニングの一例を示す。ゼブラフィッシュの系統をXプラスwikまたはABのいずれかの上付き文字として示す。ENUによって誘導された点突然変異を星印で示し、wik対立遺伝子に連鎖している。トランスジェニック系統を記し（EGFPとしてRAG2-GFPおよびcMYCとしてRAG2-mcMYC）、プラスの印は、トランスジーンを伝幡していないことを示している（すなわち、魚はそれらが例えばcMYC+であればヘテロ接合であり、それらがcMYC/cMYCであればトランスジーンに関してホモ接合である）。交配は集束する矢印によって示す。変異は、「改変体変異」によって示される世代において同定されるが、系統は「系統維持」によって示される世代において疾患を発生せずに維持される。
【図７】RAG2-Lox-dsRED2-EGFP-mMYC構築物を示す。A）構築物のダイヤグラム。B）GFP蛍光顕微鏡によって決定した場合に、この構築物の一過性の注入によって、生育中のモザイク魚におけるdsREDの発現が促進されるが、EGFP-mMYCトランスジーンは発現されない。ポリアデニル化および転写終止コドンは（pA）と記す。
【図８】CMV-Lox-dsRED2-EGFPおよびPCS2+CREプラスミドの双方を一過性に注入した魚におけるdsRED2対立遺伝子のCREによる切り出しを示す。A）構築物のダイヤグラム。B）PCS2+CREプラスミドの非存在下でのCMV-Lox-deRED2-EGFP構築物の一過性の注射は、生育しつつあるモザイク魚（B）におけるdsREDの発現を促進するが、GFP（C）では促進しない。一方、CMV-Lox-deRED2-EGFPおよびPCS2+CREプラスミドの双方を注射した魚はいずれもsdRED2（D）およびGFP標識（E）である。ポリアデニル化および転写終止コドンは（pA）と記す。
【図９】CMV-Lox-deRED2-EGFPおよびCRE RNAの双方を一過性に注入した魚におけるdsRED2対立遺伝子のCRE媒介切り出しを示す。注入した魚の明視野画像（A、D）。CRE RNAの非存在下でCMV-Lox-deRED2-EGFP構築物を一過性に注入すると、生育しつつあるモザイク魚においてdsREDの発現を促進するが（B）、GFPの発現を促進しない（C）。一方、CMV-Lox-deRED2-EGFPおよびCRE RNAの双方を注入した魚は、sdRED2を発現することができないが（E）、GFPを強く発現する（F）。この切り出し事象は100％有効である。
【図１０】ゼブラフィッシュMYC-誘導白血病におけるT-ALL腫瘍遺伝子のRT-PCR発現を示す。腫瘍の試料を数字で示す。T-ALL腫瘍遺伝子には、SCL、LMO2、LMO1、HOX-11、TLX-3a、およびTLX-3bが含まれる。β-アクチンおよびEF1-αは、ハウスキーピング遺伝子であり、それぞれの試料においてcDNAの等量が用いられたことを確認する。
【図１１】パラフィン抱埋切片のSc1およびLmo2とのRNAインサイチューハイブリダイゼーションを示す。アンチセンスプローブ（a-）および対照センスプローブ（s-）。MYC-GおよびMCMYCは、モザイク注射RAG2-mcMYC魚からの腫瘍である。
【図１２】脊椎動物BCL2タンパク質のアミノ酸アラインメントおよび系統発生的分析を示す。（A）ゼブラフィッシュ（z）、アフリカツメガエル（X）、ニワトリ（c）およびヒト（h）からのBCL2およびBCL-xLタンパク質のアラインメント。BCL2およびBCL-xLファミリーメンバーの双方において保存されたアミノ酸残基を（#）で示し、BCL2タンパク質に限って保存されたアミノ酸残基を（*）で示す。保存されたBH1、BH2、BH3、およびBH4ドメインは、アラインメントの上の一本線によって示される。破線はアラインメントを最大にするために導入されたギャップを指す。配列アラインメントはMegalignを用いて行った。（B）ゼブラフィッシュbcl-2をヒトBCL2タンパク質と比較した場合に、保存されたドメイン相同性を有するダイヤグラム。（C）脊椎動物BCL2およびBCL-xLタンパク質の系統発生的分析。
【図１３】胚発生の際のEGFP-zBCL2融合タンパク質の発現は、発達によって調節されたアポトーシスを救出する。（A）EGFP-zBCL2融合トランスジーンのダイヤグラム。GFP対照RNA（B）またはEGFP-zBCL2 RNA（C）を注入したTUNEL染色した16 hpf胚。胚におけるアポトーシス細胞数は、非注入対照またはGFP注入対照魚と比較してEGFP-zBCL2 RNAを注入した胚において有意に減少することを示している。
【図１４】胚形成の際のEGFP-zBCL2融合タンパク質の発現は、放射線によるアポトーシスを救出する。14 hpfでの放射線照射後のGFP対照RNA（A）またはEGFP-zBCL2 RNA（B）を注入したTUNEL染色20 hpf胚。
【図１５】6日齢RAG2-EGFP-zBCL2トランスジェニック魚からのT-細胞は、放射線によるアポトーシスに対して耐性である。放射線照射を行わない（A）または放射線処置後2日目（B）の8日齢のRAG2-GFP（GM2）。放射線照射を行わない（C）または放射線処置後2日目（D）の8日齢RAG2-EGFP-zBCL2トランスジェニック魚。星印は浮き袋の自己蛍光を示す。魚は左側が前方を向き、上が背側である。
【図１６】3ヶ月齢RAG2-EGFP-zBCL2トランスジェニック魚からのT-細胞は、放射線によるアポトーシスに対して耐性である。放射線照射を行わない（A）、または放射線処置後4日目（D）のRAG2-GFP-zBCL2トランスジェニック魚。魚は左側が前方を向き、上が背側である。
【図１７】5日齢のRAG2-GFP魚からのT-細胞は、8 dpfまでにデキサメタゾン処置によって除去される。RAG2-GFP対照魚を0.1％エタノール（A）によって処置した。デキサメタゾン250 mg/μl（B）または25 mg/μl（C、D）によって処置したRAG2-GFP魚。デキサメタゾン250 mg/μlを処置した魚6匹は全て、8 dpf（処置3日目）までにGFP標識T-細胞を欠損したが、デキサメタゾン25 mg/μlを処置した魚6匹中2匹はGFP標識細胞を欠損した（D）。25 mg/μl処置群における数匹の魚は対照（C）と比較した場合に有意に少ないT-細胞を有した。
【図１８】RAG2-EGFP-zBCL2魚におけるBCL2機能の抑制物質を同定するための優性遺伝子スクリーニング。X遺伝子におけるENU誘導点突然変異を星印で示し、これはWik対立遺伝子（XWik*）に連鎖し、またはAB系統における野生型X対立遺伝子を記す（XAB）。5日齢の魚に放射線照射して（15 Gy）、8 dpfまでにGFP陽性T-細胞の喪失に関して分析した。
【図１９】RAG2-EGFP-zBCL2魚におけるBCL2機能の抑制物質を同定するための劣性遺伝子スクリーニング。X遺伝子におけるENU誘導点突然変異を星印で示し、これはWik対立遺伝子（XWik*）に連鎖し、またはAB系統における野生型X対立遺伝子を記す（XAB）。5日齢の魚に放射線照射して（15 Gy）、8 dpfまでにGFP陽性T-細胞の喪失に関して分析した。
【図２０】MYC誘導白血病の抑制因子または増強因子を同定するための劣性遺伝子スクリーニング。成体ゼブラフィッシュ雄性魚をENUによって処置して、RAG2プロモーターによってT-細胞にターゲティングされた条件的MYC対立遺伝子を含むトランスジェニック雌性魚と交配させた。F1雌性魚からの卵子を絞り出して得て、インビトロでUV不活化精子と受精させて、初期圧を与えた。得られたF2雌性発生二倍体胚は、条件的EGFP-mMYCトランスジーンを発現するように誘導され、腫瘍を形成する傾向がある魚を生じるであろう。稚魚をT-ALLの発生における変動に関して分析する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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