(57)【要約】サンプル中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの有無を検出する、又は濃度を決定する方法であって、レダクターゼ及び酸化還元活性剤を前記サンプルと接触させ；レダクターゼにより生成される還元された酸化還元活性剤の量を電気化学的手段により測定することを含む方法を提供する。該方法は、酸化還元酵素の量又は活性或いはその基質の量又は活性を定量化するために使用されてもよく、ここでは酸化還元酵素が、コファクターとしてＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰを使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの有無を検出する、又はその濃度を決定する電気化学的方法であって、
―レダクターゼ及び酸化還元活性剤を前記試料と接触させ、かつ
―レダクターゼにより生成される還元された酸化還元活性剤の量を電気化学的手段により測定することを含む方法。
【請求項２】
酸化還元酵素の量もしくは活性又は基質の量もしくは活性をモニターする方法であって、酸化還元酵素が、コファクターとしてＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を使用し、酸化還元活性剤と電極との間の電子移動が、酸化還元酵素の量もしくは活性又は基質の量もしくは活性と相関する請求項１記載の方法を実施することを含む方法。
【請求項３】
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが、付随して基質を酸化する酸化還元酵素によるＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の還元によって生成される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
形成されるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量が、存在する酸化還元酵素の量又はその基質の量に比例していて、それ故、試料中の酵素の検出もしくは定量化又は基質の検出もしくは定量化を可能にする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
酸化還元酵素が、デヒドロゲナーゼである、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
レダクターゼが、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから２個の電子を受け取ることができる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
レダクターゼが、シュードモナスプチダからのシトクロームＰ４５０ｃａｍ酵素系のプチダレドキシンレダクターゼ、バチルスメガテリウムからのＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、スピナチフェロドキシンレダクターゼ、ルブレドキシンレダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸レダクターゼ、シトクロームｂ５レダクターゼ、とうもろこしの硝酸レダクターゼ、テルプレドキシンレダクターゼ、及びイースト菌、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０レダクターゼ又はそれらのいずれもの機能的誘導体から選択される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
酸化還元活性剤が、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
レダクターゼが、ＮＡＤＨに対して特異的である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
レダクターゼが、プチダレドキシンレダクターゼである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
レダクターゼが、ＮＡＤＰＨに対して特異的である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
レダクターゼが、Ｐ４５０ＢＭ−３フラビンドメイン又はスピナチフェロドキシンレダクターゼである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
基質、酵素、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量の長期にわたるモニタリングを可能にする、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
酸化還元活性剤が、ジアフォラーゼ又は有機色素でない、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
―サンプル保持手段、
―レダクターゼ源、
―酸化還元活性剤、及び
―発生するいかなる電流でも検出及び／又は定量化する手段を含む、電気化学セル。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法を実施するために使用することができる、請求項１５記載の電気化学セル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中に存在するＮＡＤＰＨ（ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・ホスフェート）又はＮＡＤＨ（ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド）の量を決定する測定法に関する。測定法はまた、酸化還元酵素の活性又は量或いはその基質の活性又は量を決定するために使用されてもよい。
【背景技術】
【０００２】
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは、ヒト細胞を含めて全ての生体細胞で生じる生理学上の物質である。両者は、多くの酸化還元酵素、特にデヒドロゲナーゼの副生成物である。多くのデヒドロゲナーゼは、コファクターとしてＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を使用する。デヒドロゲナーゼの基質が酸化されるにつれて、同時にＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに還元される。この還元は、二個の電子と一個の陽子のＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋への移動（或いは水素移動）を含み、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを発生させる。グルタミン酸デヒドロゲナーゼなどのいくつかのデヒドロゲナーゼの場合、反応を反対方向に促進することができる。
【０００３】
広範囲なデヒドロゲナーゼが存在し、多くの生物学的に重要な機能を行う。デヒドロゲナーゼの基質は、アミノ酸、乳酸塩、コレステロール及びグリセロールなどの生物学上の重要な化合物を含む。これらの化合物の量をモニターできることは重要なことであり、生体サンプル中のこのような代謝産物の量を測定するためにデヒドロゲナーゼを使用する測定法が存在する。
【０００４】
測定法は、一般的にはデヒドロゲナーゼが基質を酸化するとき生成されるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量を測定し、それ故、基質の定量化を可能にする。これらの測定法は、一般的にはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量を検出する分光光度法を使用する。しかしながら、そのような分光光度測定法は面倒で、それらを実施するための熟練したオペレータを必要とする。加えて、サンプルが、測定される波長で吸収する多量のタンパク質を含有していたり、吸収の妨害もする構造物、例えば血液細胞を含有していたりする問題又は費用を伴うかもしれない。このことは、余分な処理工程が実施されなければならないことを意味するかもしれない。
【０００５】
電気化学的な方法が、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量を試験及び測定するため試みられてきた。しかしながら、今までのところ開発された唯一の方法は、一般的にはメンドラブルー（Mendola blue）及びメチルビオロゲンなどの有機色素、又はメタディエータとしてのジアフォラーゼを使用しているが、これらは不安定で、かつしばしば毒性がある。更に、電気化学的な方法は、一般的にはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから一度に単一電子を受容のみできる電子受容体を使用するが、これは非常にゆっくりとした効果なので非常に少量の電流が生成されるだけか、或いは生成される電流は、存在する基質の量に比例してしない、それ故、定量可能な結果を得ることが出来ない。
【０００６】
発明の要約
本発明は、レダクターゼとして公知の酸化還元タンパク質の部類が、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから二個の電子を同時に受け取り、そしてそれらを酸化還元活性小分子に素早く移動することができるという発見に基づく。その結果、一般的には電気化学的方法を使用して、上記の酸化還元活性分子の再酸化を検出することができる。レダクターゼによる酸化還元活性小分子錯体の電子移動還元の早い速度は、基質濃度により制限され、かつそれに対して線形であることができる効果的な接触電流を発生させることができるということを意味する。従って、正確に定量的な結果を得ることができる。また、上記の方法は、長期にわたる測定を可能にする。その結果、有毒で不安定な有機色素を必要とせずに、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを効果的に電気化学的に定量化することができる。また、上記測定法は、実施するには従来技術のものよりもはるかに簡単であり、それを実施するのにあまり経験を必要とせずその費用を削減することを意味する。
【０００７】
従って、本発明は、サンプル中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの有無を検出したり、その濃度を決定したりする方法であって；
―レダクターゼ及び酸化還元活性剤を上記サンプルに添加し；かつ
―レダクターゼにより生成される還元された酸化還元活性剤の量を測定することを含む方法を提供する。
【０００８】
特に、本発明は、サンプル中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの有無を検出したり、その濃度を決定したりする方法であって；
―レダクターゼ及び酸化還元活性剤を上記サンプルと接触させ；かつ
―レダクターゼにより生成される還元された酸化還元活性剤の量を電気化学的手段により測定することを含む方法を提供する。
更に、本発明は、
―サンプル保持手段、
―レダクターゼ源、
―酸化還元活性剤、及び
―発生するいかなる電流でも検出及び／又は定量化する手段
を含む電気化学セルを提供する。
【０００９】
本発明はまた、
―レダクターゼ、
―酸化還元活性剤、及び
―酸化還元活性剤の還元を検出する手段
を含むキットを提供する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本明細書及び付随の請求項を通じて、単語「含む（comprise）」及び「包含する（include）」及びバリエーション、例えば「含む（comprises）」、「含むこと（comprising）」、「包含する（includes）」及び「包含すること（including）」は、包括的に解釈されるべきである。すなわち、これらの単語は、文脈が許す場合には、特に列挙されていない他の要素又は整数の可能な包含を伝達することを目的としている。
【００１１】
測定法の一般的なスキーム
本発明の測定系の一般的なスキームは、下記のとおりである：
【００１２】
【表１】
2005517960.tif 000002
【００１３】
測定法のスキームは、最も一般的には上記に示したとおりであるが、電子及び陽子をレダクターゼからＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋へ移動し、それぞれＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを発生させながら、逆順に上記の系を効率的に実施することができる。この実施形態では、酸化された酸化還元剤の量は、例えば電極への電子移動によりモニターされる。
【００１４】
―酸化還元酵素の量；
―基質の量；或いは
―生物学的サンプルに存在するＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋、又はＮＡＤＰ＋又はこれらのいずれもの類似物の量；
を検出及び／又は定量化するため、測定法を使用することができる。特に、サンプル中に存在又は発生するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量の直接測定をサンプル中に存在する基質の量又は酸化還元酵素の量と相関させることができる。この実施形態において、電極を介してレダクターゼ及び酸化還元活性剤によるＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨの発生を長期にわたってプロットし、存在する酸化還元酵素の活性、存在及び量を明らかにすることに特に有用である。
【００１５】
測定法の系は、また追加工程を含むことができる。例えば、追加の段階を上記に示したレダクターゼの後又は酸化還元酵素の前に含んでもよい。また、そのような追加工程は、電子の移動を含んでもよいし、一般的には触媒作用を及ぼされる酵素であることもできる。ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋をＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨに、或いはその反対に変換させる酸化還元酵素の前に追加工程がある場合、測定法の目的は、酵素の量又は酸化還元酵素の上流にある化合物の量を測定することであってもよい。
【００１６】
一つの実施形態では、上流での事象は、その後の検出可能な結合物の放出を含む。一般的には、結合物は、酵素的に放出される。例えば、結合物は、コレステロールであってもよいし、その放出を引き起こす酵素は、リパーゼであってもよい。他の物質又はコファクター、例えば洗浄剤がまた存在していてもよい。コレステロールなどの物質が、一度放出されるとその後、酸化還元酵素の基質となる。このような測定法は、コレステロールなどの結合物又はその放出を引き起こすリパーゼなどの酵素のいずれかの有無を検出し、その量を定量化するのに使用される。好ましくは、上記測定法は、結合物を検出及び／又は定量化するのに使用される。
【００１７】
測定されるべき検体又は酵素
測定法において最初の工程を担う酸化還元酵素は、多くの考えられる酵素のいずれでもよく、酵素又はその基質の量を測定するため測定法を使用してもよい。コファクターとしてニコチンアミドアデニンジヌクレチドを使用して酵素が基質を酸化又は還元できるような適切な組み合わせが選択されるように酵素を基質と適合させる。一般的に、酵素は、基質を酸化し、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を還元する。酵素は、組み替え酵素又は自然源からのものであってもよい。
【００１８】
使用又は定量化可能な考えられる酵素の例としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、エチレングリコールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びアラニン・アミノトランスフェラーゼなどが挙げられる。本発明のより好ましい実施形態では、酸化還元酵素は、デヒドロゲナーゼであり、より好ましくはグリセロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、エチレングリコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、又はアルコールデヒドロゲナーゼである。
【００１９】
多数の化合物のいずれもが、基質として使用することができる。基質は、例えば尿素、尿酸、アンモニア、乳酸、トリグリセリド、ＬＤＬ、サリチル酸塩、グルコース、ピルビン酸、二酸化炭素、アデノシン５′三リン酸、２，３−ジホスホグリセレートなどの生物学的に重要な分子であってもよい。もう一つの方法として、基質は、薬又は薬の代謝産物であってもよい。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態において、測定法は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋それ自身を定量化するために使用される。例えば、そのような測定法は、これらの化合物が含まれる生物学的な系を研究するために使用されてもよい。もう一つの方法として、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは、例えばアテローム性動脈硬化、エイズ、癌、慢性疲労症候群、パーキンソン病、アルツハイマー病などを含む多くの病気を処置するために使用されてきており、これらの化合物が投与されてきた被験者からの生物学的サンプル中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを測定するために、本発明の測定法を使用することができる。
【００２１】
測定法で使用される基質、酵素、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の量は、一般的には測定されているもの及びレダクターゼによる電子の移動を測定するために用いられている系に依存する。基質、酵素、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の一つは、それが定量化されている物質である場合、一般的には未知量で存在する。一般的には、その化合物が定量化されているものでない場合、
―存在する酸化還元酵素の量は、０〜１０００μＭ、１〜１００μＭ、好ましくは５〜７５μＭ、更により好ましくは５〜５０μＭ；
―存在するレダクターゼの量は、０〜１０００μＭ、０．００１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜５０μＭ、更により好ましくは１〜１０μＭ；
―存在するＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の量は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜７５ｍＭ、更により好ましくは０．１〜５０ｍＭ；及び／又は
―酸化還元活性剤の量は、１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜２５ｍＭ、更により好ましくは１〜１０ｍＭである。
【００２２】
ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を使用する代わりに、上記測定法は、これらの化合物の一つの類似体を使用してもよい。このような類似体は、一般的には安定性の増加或いは類似体が特定の酸化還元酵素と相互作用する様式などの特殊な特徴で選択される人工的又は合成された類似体であろう。
【００２３】
レダクターゼ
本発明の測定法におけるレダクターゼの使用は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから酸化還元活性剤への或いはその反対への、いずれかで電子の迅速な移動を可能にする。レダクターゼは、一般的にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから二個の電子を受け取るが、かなりの電流を発生させることができるのは、この二個の電子の同時受け取りとその後の酸化還元活性剤への電子の迅速な個別的移動であって、発生する電流の規模は、存在する基質の量に直接比例しており、それ故、有意義で正確な結果が得られる。
【００２４】
使用するレダクターゼは、検出できる電流を発生可能にするのに十分な素早さで電子を移動することができるどのようなレダクターゼであってもよい。好ましいレダクターゼは、シトクロームＰ４５０レダクターゼを含む。特に、好ましいレダクターゼは、シュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）からのシトクロームＰ４５０ｃａｍ酵素系のプチダレドキシン（putidaredoxin）レダクターゼ、バチルスメガテリウム（Bacillus megaterium）からのＰ４５０ＢＭ−３酵素のフラビン（ＦＡＤ／ＦＭＮ）ドメイン、スピナチフェロドキシン（spinach ferrodoxin）レダクターゼ、ルブレドキシン（rubredoxin）レダクターゼ、アドレノドキシン（adrenodoxin）レダクターゼ、硝酸（nitrate）レダクターゼ、シトクロームｂ５レダクターゼ、とうもろこしの硝酸レダクターゼ、テルプレドキシン（terpredoxin）レダクターゼ、及びイースト菌、ラット、ウサギ及びヒトＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０レダクターゼを含む。硝酸レダクターゼが使用される場合、好ましくはとうもろこしの硝酸レダクターゼが使用される。特に迅速な電子の移動ができ、それ故、最適な結果を得ることができるということで、本発明で使用される特に好ましいレダクターゼは、プチダレドキシンレドクターゼ及びＰ４５０ＢＭ−３のフラビンドメインである。
【００２５】
レダクターゼは、組み換えタンパク質又は精製され若しくは単離された自然に存在するタンパク質であってもよい。レダクターゼは、その性能を改善するため、例えば電子移動を行うスピードを最適化するため又はその基質特異性を改善するために、突然変異させてもよい。使用するレダクターゼの量は、測定されるものの正確な性質及び測定法の詳細に依存するが、一般的にはレダクターゼは、０〜１０００μＭ、０．００１〜１００μＭ、好ましくは０．０１〜５０μＭ、より好ましくは０．１〜２５μＭ、更により好ましくは１〜１０μＭの濃度で存在するであろう。
【００２６】
プチダレドキシンレダクターゼに関しては、使用する酵素の量は、一般的には１００〜１００００ｃａ、好ましくは１０００〜５０００ｃａ、より好ましくは２０００〜４０００ｃａ、更により好ましくは３０００ｃａとなるであろう。上記ｃａは、フェリシアニドによるＮＡＤＨの酸化を仲介する際のプチダレドキシンレダクターゼの活性単位であって、毎分レダクターゼ１ｍｇ当たり酸化されるＮＡＤＨ１μモルとして定義される。
【００２７】
レダクターゼによる小さな分子の還元の一般的な性質は、小さな分子のメデイエーターを検出する酸化還元電位が、自然に存在する生物学的流体中に見出される酸化還元活性分子からの干渉を避けることができるように配位化学の標準方法により調整可能であることを意味する。
【００２８】
酸化還元活性剤
酸化還元活性剤は、レダクターゼから電子を受け取るため使用される。一般的には、酸化還元活性剤は、一つずつ電子を受け取るであろう。酸化還元剤は、酸化還元活性分子又は無機錯体であってもよい。酸化還元剤は、タンパク質などの自然に存在する電子受容体であってもよいし、合成分子であってもよい。一般的には、酸化還元剤は、少なくとも二つの酸化状態を有し、レダクターゼから電子を受容できるであろう。
【００２９】
好ましくは、酸化還元剤は、無機錯体である。酸化還元剤は、金属イオンを含んでもよく、好ましくは少なくとも２価の原子価を有するであろう。特に、酸化還元剤は、遷移金属イオンを含んでもよく、好ましい遷移金属イオンとしては、コバルト、銅、鉄、クロミウム、マンガン、ニッケル又はルテニウムのイオンが挙げられる。酸化還元剤は、帯電されてもよく、例えばそれが陽イオンでもあるいは陰イオンでもよい。適切な陽イオン酸化還元剤の例は、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋などのルテニウム錯体であり、適切な陰イオン酸化還元剤の例は、Ｆｅ（ＣＮ）６３ーのようなフェリシアニド錯体である。各々の反応スキームは、
【００３０】
【表２】
2005517960.tif 000003
【００３１】
酸化還元活性剤は、疎水性であってもよく、例えばフェロセニウム錯体が使用されてもよいし又は親水性であってもよい。使用してもよい錯体の例としては、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）２−、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｆｅ（ＣＮ）５（Ｏ２ＣＲ）３−、Ｆｅ（ＣＮ）４（シュウ酸）３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋、及びそれらのキレートアミン配位子誘導体（エチレンジアミンなど）、Ｒｕ（ＮＨ３）５（ｐｙ）３＋、フェロセニウム及び２個のシクロペンタジエニル環の１つ又は両方に置換された−ＮＨ２−、−ＮＨＲ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、及び−ＣＯ２Ｈなどの基を１つ以上有するそれらの誘導体が挙げられる。好ましくは、無機錯体は、Ｆｅ（ＣＮ）６３−、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋又はフェロセニウムモノカルボン酸（ＦＭＣＡ）である。
【００３２】
酸化還元活性剤は、レダクターゼと相互に作用し、それ故、酸化還元活性剤とレダクターゼとの特定の組み合わせは、電子移動の割合又は生成される電荷又は他の望ましい特性の点で、最適な結果を提供することができる。例えば、レダクターゼは、その活性部位近くに特定のアミノ酸を有していてもよく、そのことは、疎水性酸化還元剤が好まれることを意味し、或いは上記の領域が、正又は負に帯電した残基又は極性基を含有していてもよく、それ故、陰イオン又は陽イオン酸化還元剤がより適切である。酵素及び酸化還元剤の特定の組み合わせは、互いに相補的に選ばれていて、それ故、最適な結果を提供する。好ましい組み合わせとしては、プチダレドキシンレダクターゼ又はＰ４５０ＢＭ−３のフラビンドメインに対するＦｅ（ＣＮ）６３−又はＲｕ（ＮＨ３）６３＋及びスピナチフェレドキシンレダクターゼに対するＦｅ（ＣＮ）６３−又はＲｕ（ＮＨ３）６３＋のいずれかが挙げられる。酸化還元剤は、生成される電荷を検出するために使用される手段、例えば使用される電極に基づいて選択されてもよい。
【００３３】
使用される酸化還元試薬の濃度は、測定されているもの及び測定法における他の成分によって異なってもよいが、一般的には０．０１〜５００ｍＭ、好ましくは０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭ、更により好ましくは５〜２５ｍＭの範囲である。
【００３４】
本発明の方法は、酸化還元活性剤としてのジアフォラーゼ又はメンドラブルー及びメチルビオロゲンなどの有機色素の使用を含まない。
【００３５】
検出方法
酸化還元剤から酸化還元剤への電子の移動が、検出される。これは、好ましくは電気化学的手段によってなされるが、必要に応じて、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの濃度は、波長３４０ｎｍで測定することができ、Ｆｅ（ＣＮ）６３−濃度は、波長４２０ｎｍで測定することができる。
【００３６】
一般的には、酸化還元剤は、電流を発生させる電極へ電子を移動させる。発生する電流は、一般的にはサンプル中に存在する基質の量に比例していて、それ故、基質の量を測定することができる。
【００３７】
本発明で使用することができる電気化学的検出に基づく代表的なセンサーシステムは、例えばカーボンペースト、白金、金、又はある適合する導電性材料から構成される作用電極、一般的にはＡｇＣｌ／Ａｇ電極である参照電極、及び場合により対電極を含む。全ての電極は、当業者によく知られているスクリーン印刷などの技術により作製される。目標検体基質をその生成物に変換するデヒドロゲナーゼ酵素、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨレダクターゼ、及びフェリシアニド又はＲｕ（ＮＨ３）６３＋などの酸化還元剤の緩衝液を電極システムの上に堆積させ乾燥させることができる。
【００３８】
センサーシステムの全部又は一部は、例えば血液サンプルから赤血球を分離するため又は望ましくない物質又は細胞がセンサーに入らないということを確実にするため、一つの薄膜又は多くの薄膜又はフィルタによりカバーされてもよい。
【００３９】
血液などの液体サンプルが塗布される場合、液体は、一般的にセンサー区画に入り込み、酵素と酸化還元剤の混合物を再溶解する。その後、目標検体は、酸化され、レダクターゼを素早く還元するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する。次には、レダクターゼは、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋などの酸化還元剤を還元された形態に、この場合Ｒｕ（ＮＨ３）６２＋に素早く還元し、その後これは適当な電位で設定される作用電極により酸化される。生成される電流は、目標検体の濃度に比例するであろう。
【００４０】
本発明のもう一つの実施形態において、作用電極の汚れをできるだけ少なくするため、デヒドロゲナーゼ／ＮＡＤ＋／レダクターゼ／酸化還元剤の混合物から離して作用電極を配置してもよく、このようにしてセンサー性能を改善する。
【００４１】
適当な基質特異性を有するデヒドロゲナーゼを使用し、反応条件を変更することにより、例えば脂質、洗浄剤、界面活性剤又は他の蛋白質などの適切な化学的生物学的成分を含有することにより、高速センサーを構成してもよい。加えて、デヒドロゲナーゼにより酸化され、その後、本電気化学的方法により検出される物質に目標検体を変換するために、別の酵素系を使用することができる。例えば、トリグリセライドを検出及び／又は定量化するためのセンサーが構成されてもよく、そこではトリグリセライドが、適当なリパーゼによりグリセロールと脂肪酸とに開裂され、その後、該グリセロールが、本発明のレダクターゼ／酸化還元剤系と一体となったグリセロールデヒドロゲナーゼにより検出されてもよい。
【００４２】
サンプル
多様なサンプル中の特別な検体又は酵素の存在をモニターするため本発明の測定法を使用することができる。一般的には、分析されるサンプルは液状であり、通常水性液体であろう。特に、サンプルは、尿、血清、血液、羊水又は脳脊髄液（ＣＳＦ）のような体液であってもよいし、或いはミルク、ワイン又はジュースのような流体であってもよいし、或いはこれらの一つから調製されてもよい。サンプルは、原核細胞又は真核細胞、特に哺乳類細胞からの培養培地であってもよい。サンプルは、食材又は飲み物でもよいし、或いは工業プロセスの生産品であってもよく、化合物の生成物、又は副生成物若しくは毒性化合物の発生をモニターするために上記測定法を使用することができる。
【００４３】
また、対照サンプルが分析されてもよい。これらは、基質、酸化還元酵素、レダクターゼ、酸化還元剤、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の一つ以上が欠如していてもよい。対照資料は、患者のものと比較するため、健康な個人から得てもよい。既知量の測定されるべき基質又は酵素を含有する参照サンプルを使用してもよく、それ故、装置の校正及び／又は描かれるべき検量線を未知のサンプルの結果と比較することができる。サンプルは、連続的に希釈されてもよく、測定されるべき基質又は酵素の濃度として分析されるいくつかの希釈溶液では、高濃度すぎて薄めていない状態では効果的に測定できないかもしれない。
【００４４】
本発明の方法は、いろいろな病気の経過を診断又は評価するため、或いはそのような病気に対する個人の感受性を決定するために使用することができる。一般的には、上記の方法は、病気の状態と関連する化合物又は酵素の有無を検出するため、或いはそれらの量を定量化するために使用される。例えば、上記の方法は、糖尿病患者からの尿又は血液中のグルコースの量を検出又は定量化するため、或いは心臓病に苦しむ患者のコレステロール値又は特別な酵素の値を測定するために使用されてもよい。また、上記の方法は、化合物又は酵素を測定し、薬又は治療が、いつ患者に施される必要があるのかを決定するため、或いは一旦投薬された薬がどのくらい残存しているか又はその目標に到達したかを測定するために使用されてもよい。また、上記の方法は、個人からの試料中の乱用の薬を検出及び定量化するために使用することもできる。
【００４５】
本発明の方法は、コレステロール値又はトリグリセライド値などの脂質値をモニターするために使用することができ、特に血液又は血漿中の脂質の値を定量化するために使用してもよい。これは、異常な脂質値と関連する病気、例えば上昇した脂質値又は脂質不足と関連する病気の危険性がある個人の検出を可能にするかもしれない。また、それは、脂質値が通常に戻ったかどうかを評価するためにそのような病気の治療経過をモニターすることを可能にするかもしれない。病気としては、アテローム性動脈硬化症、脳梗塞、心疾患、心臓発作、及び不適切な食事又は代謝障害から生じる脂質不足が挙げられる。
【００４６】
また、本発明の方法は、他の代謝障害、例えばアミノ酸代謝作用にかかわる障害などをモニターするために使用することができる。そのような病気としては、本発明の系における酸化還元酵素としてフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを使用することによりモニター又は検出される可能性があるフェニールケトン尿症（ＰＫＵ）が挙げられる。
【００４７】
キット
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。一般的には、キットは、
―レダクターゼ；
―酸化還元活性剤；及び
―酸化還元活性剤の還元を検出する手段；
を含むだろう。
キットはまた、酸化還元酵素、好ましくはデヒドロゲナーゼ及び／又は酸化還元酵素の基質を含んでもよい。酸化還元酵素、基質、レダクターゼ及び酸化還元活性剤は、上記で論じられたもののいずれでもよい。
【００４８】
酸化還元剤の還元を検出する手段は、電気化学的手段、例えば電気化学セル又はその構成部品であってもよく、或いはあまり好ましくはないが、分光学的手段であってもよい。
【００４９】
キットは、電流を検出及び定量化する手段と、場合により結果を分析及び表示するコンピューターシステムとを含んでいてもよい。キットはまた、キットの使用方法及びそれをどのように保管すべきかを詳述している様々な梱包及び適切な説明書を含んでいてもよい。
【００５０】
実施例
下記の実施例は、更に本発明を説明する。
【００５１】
実施例１−プチダレドキシンレダクターゼの分光学的分析
プチダレドキシンレダクターゼは、ＮＡＤＨに対して特異的である。プチダレドキシンレダクターゼにより触媒作用を及ぼされるＦｅ（ＣＮ）６３−によるＮＡＤＨの酸化は、分光学的測定法により実証された。
【００５２】
ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液、０．１ｎＭプチダレドキシンレダクターゼ及び１ｍＭＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を含むインキュベーション混合物１．５ｍｌをキュベットに添加した。波長３４０ｎｍでの吸光度を測定するために分光光度計を使用し、インキュベーション混合物だけを含んでいるキュベットを使用してゼロに設定した。
【００５３】
次に、最終濃度３００μＭ（Ａ３４０ｎｍ約１．８）になるように、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液中３０ｍＭストックとして、インキュベーション混合物を含むいくつかのキュベットにＮＡＤＨを添加し、波長３４０ｎｍでの吸光度をモニターした。図１ａに示されるように、一方から他方への電子の移動に触媒作用を及ぼすプチダレドキシンレダクターゼにより仲介される反応において酸化剤として機能するフェリシアニドによりＮＡＤＨが酸化されてＮＡＤ＋になるにつれ、ＮＡＤＨに起因する吸光度は、時間とともに徐々に減少した。レダクターゼ又はフェリシアニドのいずれかが除かれた場合、吸光度の変化は何も見られなかった（図１ｂ）。反応はまた、波長４２０ｎｍでのフェロシアニド吸光度でモニターすることができる。
【００５４】
プチダレドキシンレダクターゼ濃度が１μＭ、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋濃度が２ｍＭであることを除いて全く同一の条件下、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋還元測定法を実施した。最終濃度約３００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝１．８）になるように、ＮＡＤＨを添加し、３４０nｍでのＮＡＤＨ吸光度をモニターした。図１ｃに示されるように、ＮＡＤＨは、２分未満で酸化された。プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）が存在しないとき、検出可能なＮＡＤＨの酸化は全くなかった（図１ｄ）。
【００５５】
実施例２−Ｐ４５０ＢＭ−３フラビンドメインの分光学的分析
Ｐ４５０ＢＭ−３フラビンドメインは、ＮＡＤＰＨに対して特異的である。Ｐ４５０ＢＭ−３フラビンドメインにより触媒作用を及ぼされるＦｅ（ＣＮ）６３−とＲｕ（ＮＨ３）３＋の両者によるＮＡＤＰＨの酸化は、分光学的測定法により実証された。
【００５６】
ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液、５０ｎＭＰ４５０ＢＭ−３フラビンドメイン、及び１ｍＭＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６又は２ｍＭＲｕ（ＮＨ３）６３＋のいずれかを含むインキュベーション混合物１．５ｍｌをキュベットに添加した。該当する波長での吸光度の変化を測定するために分光光度計を使用した。
【００５７】
フェリシアニド還元測定法として、４２０ｎｍでのフェリシアニド吸光度で反応をモニターした。最終濃度約５００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝３．０）になるように、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸中３０ｍＭストックとして、サンプルキュベットにＮＡＤＰＨを添加し、４２０ｎｍでの吸光度をモニターした。図２に示されるように、全てのフェリシアニドが、８０秒未満でフェロシアニドに還元された。
【００５８】
Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋還元測定法として、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ吸光度で反応をモニターした。最終濃度約３００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝１．８）になるように、ＮＡＤＰＨを添加した。図３に示されるように、全てのＮＡＤＰＨが、９０秒未満で消費された。
【００５９】
実施例３−スピナチフェレドキシンレダクターゼの分光学的分析
スピナチフェレドキシンレダクターゼは、ＮＡＤＰＨに対して特異的である。スピナチフェレドキシンレダクターゼにより触媒作用を及ぼされるＦｅ（ＣＮ）６３−及びＲｕ（ＮＨ３）６３＋の両者によるＮＡＤＰＨの酸化は、分光学的測定法により実証された。
【００６０】
ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液、スピナチフェレドキシンレダクターゼ０．０５ユニット、及び１ｍＭＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６又は２ｍＭＲｕ（ＮＨ３）６３＋のいずれかを含むインキュベーション混合物１．５ｍｌをキュベットに添加した。該当する波長での吸光度の変化を測定するために分光光度計を使用した。
【００６１】
フェリシアニド還元測定法として、４２０ｎｍでのフェリシアニドの吸光度で反応をモニターした。最終濃度約５００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝３．０）になるように、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸中３０ｍＭストックとして、サンプルキュベットにＮＡＤＰＨを添加し、４２０ｎｍでの吸光度をモニターした。図４ａに示されるように、全てのフェリシアニドが、約６０秒でフェロシアニドに還元された。レダクターゼ又はフェリシアニドのいずれかが存在しない場合、ＮＡＤＰＨの酸化は、非常に遅かった（図４ｂ、４ｃを参照）。
【００６２】
Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋還元測定法として、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ吸光度で反応をモニターした。最終濃度約４００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝２．５）になるように、ＮＡＤＰＨを添加した。図５ａに示されるように、全てのＮＡＤＰＨが、９０秒未満で消費された。レダクターゼ又はＲｕ（ＮＨ３）６３＋のいずれかが存在しない場合、ＮＡＤＰＨの酸化は、非常に遅かった（図５ｂ、５ｃを参照）。
【００６３】
実施例４−電気化学的分析
電気化学的検出に基づくセンサーシステムは、カーボンペースト、白金、金又はある適合する導電性材料から構成される作用電極、ＡｇＣｌ／Ａｇ電極である参照電極、及び場合により対電極を使用して構成される。電極は、スクリーン印刷を使用して作製してもよい。
【００６４】
目標検体基質をその生成物に変換するデヒドロゲナーゼ酵素、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨレダクターゼ、及び酸化還元剤としてのフェリシアニド又はＲｕ（ＮＨ３）６３＋の緩衝液を電極システム上に堆積させ乾燥させることができる。
【００６５】
液体サンプルが系に塗布され、該液体がセンサー区画に入り込み、酵素と酸化還元剤の混合物を再溶解する。その後、目標検体は、酸化され、レダクターゼを素早く還元するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成する。レダクターゼは、ＮＡＤＨが使用されるプチダレドキシンレダクターゼ或いはＮＡＤＰＨが使用されるＰ４５０ＢＭ−３フラビンドメイン又はスピナチフェレドキシンレダクターゼであってもよい。次には、レダクターゼは、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋又はＦｅ（ＣＮ）６３＋などの酸化還元剤を素早く還元された形態に、換言すればＲｕ（ＮＨ３）６２＋又はＦｅ（ＣＮ）６４−にそれぞれ順番に還元する。その後、Ｒｕ（ＮＨ３）６２＋又はＦｅ（ＣＮ）６４−は、適当な電位で設定された作用電極により酸化される。生成された電流は、目標検体の濃度に比例する。系を校正するため及び／又は試験されているサンプルにおいて検体の濃度を決定可能にする検量線を作製するため、既知量の検体を含んでいる種々の溶液を使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１ａ】プチダレドキシンレダクターゼの分光学的分析。ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液、０．１ｎＭプチダレドキシンレダクターゼ及び１ｍＭＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を含むインキュベーション混合物１．５ｍｌをキュベットに添加した。波長３４０ｎｍでの吸光度を測定するために分光光度計を使用し、インキュベーション混合物だけを含んでいるキュベットを使用してゼロに設定した。次に、最終濃度３００μＭ（Ａ３４０ｎｍ約１．８）になるように、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液中３０ｍＭストックとして、インキュベーション混合物を含むいくつかのキュベットにＮＡＤＨを添加し、波長３４０ｎｍでの吸光度をモニターした。
【図１ｂ】プチダレドキシンレダクターゼの分光学的分析。レダクターゼが除かれた場合。
【図１ｃ】プチダレドキシンレダクターゼの分光学的分析。プチダレドキシンレダクターゼ濃度が１μＭ、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋濃度が２ｍＭであることを除いて全く同一の条件下、Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋還元測定法を実施した。最終濃度約３００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝１．８）になるように、ＮＡＤＨを添加し、３４０nｍでのＮＡＤＨ吸光度をモニターした。
【図１ｄ】プチダレドキシンレダクターゼの分光学的分析。プチダレドキシンレダクターゼ（ＰｄＲ）が存在しないとき。
【図２】Ｐ４５０ＢＭ−３フラビンドメインの分光学的分析。ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液、５０ｎＭＰ４５０ＢＭ−３フラビンドメイン、及び１ｍＭＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６又は２ｍＭＲｕ（ＮＨ３）６３＋のいずれかを含むインキュベーション混合物１．５ｍｌをキュベットに添加した。該当する波長での吸光度の変化を測定するために分光光度計を使用した。フェリシアニド還元測定法として、４２０ｎｍでのフェリシアニド吸光度で反応をモニターした。最終濃度約５００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝３．０）になるように、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸中３０ｍＭストックとして、サンプルキュベットにＮＡＤＰＨを添加し、４２０ｎｍでの吸光度をモニターした。
【図３】Ｐ４５０ＢＭ−３フラビンドメインの分光学的分析。ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液、５０ｎＭＰ４５０ＢＭ−３フラビンドメイン、及び１ｍＭＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６又は２ｍＭＲｕ（ＮＨ３）６３＋のいずれかを含むインキュベーション混合物１．５ｍｌをキュベットに添加した。該当する波長での吸光度の変化を測定するために分光光度計を使用した。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋還元測定法として、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ吸光度で反応をモニターした。最終濃度約３００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝１．８）になるように、ＮＡＤＰＨを添加した。
【図４ａ】スピナチフェレドキシンレダクターゼの分光学的分析。ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液、スピナチフェレドキシンレダクターゼ０．０５ユニット、及び１ｍＭＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６又は２ｍＭＲｕ（ＮＨ３）６３＋のいずれかを含むインキュベーション混合物１．５ｍｌをキュベットに添加した。フェリシアニド還元測定法として、４２０ｎｍでのフェリシアニドの吸光度で反応をモニターした。最終濃度約５００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝３．０）になるように、ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸中３０ｍＭストックとして、サンプルキュベットにＮＡＤＰＨを添加し、４２０ｎｍでの吸光度をモニターした。
【図４ｂ】スピナチフェレドキシンレダクターゼの分光学的分析。フェリシアニドが存在しない場合。
【図４ｃ】スピナチフェレドキシンレダクターゼの分光学的分析。レダクターゼが存在しない場合。
【図５ａ】スピナチフェレドキシンレダクターゼの分光学的分析。ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸緩衝液、スピナチフェレドキシンレダクターゼ０．０５ユニット、及び１ｍＭＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６又は２ｍＭＲｕ（ＮＨ３）６３＋のいずれかを含むインキュベーション混合物１．５ｍｌをキュベットに添加した。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋還元測定法として、３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ吸光度で反応をモニターした。最終濃度約４００μＭ（Ａ３４０ｎｍ＝２．５）になるように、ＮＡＤＰＨを添加した。
【図５ｂ】スピナチフェレドキシンレダクターゼの分光学的分析。レダクターゼが存在しない場合。
【図５ｃ】スピナチフェレドキシンレダクターゼの分光学的分析。Ｒｕ（ＮＨ３）６３＋が存在しない場合。
【図１ａ】
2005517960.tif 000004
【図１ｂ】
2005517960.tif 000005
【図１ｃ】
2005517960.tif 000006
【図１ｄ】
2005517960.tif 000007
【図２】
2005517960.tif 000008
【図３】
2005517960.tif 000009
【図４ａ】
2005517960.tif 000010
【図４ｂ】
2005517960.tif 000011
【図４ｃ】
2005517960.tif 000012
【図５ａ】
2005517960.tif 000013
【図５ｂ】
2005517960.tif 000014
【図５ｃ】
2005517960.tif 000015
【国際調査報告】
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2005517960.tif 000017
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