(57)【要約】本発明は、血液のプロテインＣ−抗凝固系において抗凝固活性を現すことができる野生型血液凝固成分に対してアミノ酸配列が実質的に相同的であり、そしてプロテインＣ（ＰＣ）および活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）から選択されるバリアント血液凝固成分に関し、該バリアント成分は対応する野生型の血液凝固成分により発現された抗凝固活性に比べて強化され抗凝固活性を現すことができ、そして該バリアント成分は該野生型の成分と比較して、プロテインＣのＧｌａ−ドメインを構成するそのＮ−末端アミノ酸残基配列に少なくとも１つアミノ酸残基の修飾、およびプロテインＣのセリン−プロテアーゼドメインに少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾を含む点が異なる。また本発明は、ＤＮＡ技術に基づくそのようなバリアントの生産法；該方法で使用することを意図するＤＮＡセグメント；および治療および診断目的のための該バリアントの使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液のプロテインＣ−抗凝固系において抗凝固活性を現すことができる野生型血液凝固成分に対してアミノ酸配列が実質的に相同であり、そしてプロテインＣ（ＰＣ）および活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）から選択されるバリアント血液凝固成分であって、該バリアント成分は対応する野生型の血液凝固成分により発現される抗凝固活性に比べて強化された抗凝固活性を現すことができ、そして該バリアント成分は該野生型の成分と比較して、最初の４５Ｎ−末端アミノ酸残基を含んでなり、そしてＧｌａ−ドメインと命名されたＮ−末端アミノ酸残基配列に少なくとも１つのアミノ酸残基修飾、および野生型成分のセリン−プロテアーゼ（ＳＰ）ドメインに対応するアミノ酸残基配列の領域中に少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾を含む点が各野生型成分とは異なる、上記バリアント血液凝固成分。
【請求項２】
対応する野生型成分と少なくとも９０％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、請求項１に記載のバリアント成分。
【請求項３】
対応する野生型成分と少なくとも９５％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、請求項１に記載のバリアント成分。
【請求項４】
対応する野生型成分と少なくとも９７％のアミノ酸残基配列の同一性を有する、請求項１に記載のバリアント成分。
【請求項５】
上記の少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾が置換、削除または挿入されたアミノ酸残基を含んでなる、前記請求項のいずれかに記載のバリアント成分。
【請求項６】
上記成分が野生型成分と比較して強化された膜−結合親和性を現すバリアントＰＣまたはバリアントＡＰＣである、前記請求項のいずれかに記載のバリアント成分。
【請求項７】
野生型プロテインＣに比較して強化されたカルシウム親和性をさらに現す、請求項６に記載のバリアント成分。
【請求項８】
上記バリアント成分が少なくとも６個、そして場合により７〜１０個のアミノ酸残基の修飾を上記Ｇｌａ−ドメインに含む、前記請求項のいずれかに記載のバリアント成分。
【請求項９】
上記バリアント成分が、置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含む修飾されたＧｌａ−ドメインを含み、該修飾されたＧｌａ−ドメインが以下のアミノ酸配列：
【表１】
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を有する、請求項１に記載のバリアント成分。
【請求項１０】
上記Ｇｌａ−ドメインが１０、１１、２８、３２または３３位から選択される位置にアミノ酸置換を含み、そして少なくとも１つのさらなる修飾をＧｌａ−ドメインに含み、場合により該少なくとも１つのさらなる修飾が１２、２３または４４位から選択される、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のバリアント成分。
【請求項１１】
Ｇｌａ−ドメイン中の上記の少なくとも１つのアミノ酸修飾が１２、２３および４４位から選択される位置での置換突然変異であり、該置換突然変異がＳ１２Ｎ、Ｄ２３ＳおよびＨ４４Ｙから選択される、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のバリアント成分。
【請求項１２】
Ｇｌａ−ドメイン中の上記の少なくとも１つのアミノ酸修飾が１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４位から選択される位置に配置され、そして場合によっては置換突然変異であり、そして場合により１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４位のすべてが修飾されている、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のバリアント成分。
【請求項１３】
上記成分が野生型成分と比べて、強化されたタンパク質分解活性、適当にはアミド分解活性を現すバリアントＰＣまたはバリアントＡＰＣである、前記請求項のいずれかに記載のバリアント成分。
【請求項１４】
野生型プロテインＣと同じグリコシル化部位を含み、該部位のアミノ酸残基がＡｓｎである、請求項１に記載のバリアント成分。
【請求項１５】
ＳＰ−ドメイン中の上記少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾が、野生型成分のアミノ酸残基番号２９０〜３２０、適切には３００から３１４の間のアミノ酸範囲に対応する領域に含まれる、請求項１に記載のバリアント成分。
【請求項１６】
野生型のアミノ酸残基番号３００〜３１４に対応する修飾された領域が、削除Δ３０３，３０４，３０５，３０８および置換Ｅ３０７Ｄ／Ａ３１０Ｔを含み、そして式ＷＧＹＲＤＥＴＫＲＮＲ（配列番号７）により表される、請求項１５に記載のバリアント成分。
【請求項１７】
上記バリアント成分が、置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含む修飾されたＧｌａ−ドメインを含み、そして該修飾されたＧｌａ−ドメインが以下のアミノ酸配列：
【表２】
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を有する、請求項１６に記載のバリアント成分。
【請求項１８】
Ｇｌａ−ドメイン中の上記修飾（１つまたは複数）が置換である、前記請求項のいずれかに記載のバリアント成分。  
【請求項１９】
さらに少なくとも１つの保存的置換を含む、前記請求項のいずれかに記載のバリアント成分。
【請求項２０】
上記の野生型血液凝固成分がヒト起源である、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のバリアント成分。
【請求項２１】
前記請求項のいずれかに記載のバリアント血液凝固成分をコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡセグメント。
【請求項２２】
適切には発現ベクターである複製可能なベクター、およびその中に挿入された請求項２１に記載のＤＮＡセグメントを含んでなる組換えＤＮＡ分子。
【請求項２３】
適切には中に安定に包含された請求項２２に記載の組換えＤＮＡ分子を持つ微生物または動物細胞、適切には培養された動物細胞系を含んでなる宿主細胞。
【請求項２４】
アデノウイルスでトランスフェクトしたヒトの腎臓細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分をコードする請求項２１に記載のＤＮＡセグメントの生産法であって；
（ａ）野生型血液凝固成分をコードするＤＮＡを準備し；
（ｂ）ヌクレオチドの修飾を該野生型ＤＮＡに導入して、該バリアント血液凝固成分をコードする修飾されたＤＮＡセグメントを形成し；そして
（ｃ）該修飾されたＤＮＡセグメントを複製させる、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２６】
請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分の生産法であって；
（ａ）該バリアント成分をコードするＤＮＡ−セグメントを準備し；
（ｂ）工程（ａ）で準備した該ＤＮＡセグメントを発現ベクターに導入し；
（ｃ）該ＤＮＡセグメントを含む該ベクターを、コンパチブルな宿主細胞に導入し；
（ｄ）工程（ｃ）で準備された宿主細胞を、該バリアント成分の発現に必要な条件下で培養し；そして
（ｅ）発現したバリアント成分を培養した宿主細胞から単離する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２７】
有効量の請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分および製薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項２８】
血液のプロテインＣ−抗凝固系に参加する成分をアッセイするための診断試験システム、適切にはキット形態であって、該システムが請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分を含んでなる上記システム。
【請求項２９】
バリアント血液凝固成分がバリアントＡＰＣであり、そして上記試験システムがプロテインＳまたは完全な抗凝固第Ｖ因子の機能活性をアッセイするシステムである、請求項２８に記載の診断試験システム。
【請求項３０】
患者の凝血を抑制する方法であって、該患者に凝固抑制量の請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント血液凝固成分を含んでなる生理学的に耐容可能な組成物を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項３１】
血栓症が抑制される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
血液凝固障害ＡＰＣ耐性を有する患者で凝血が抑制される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
血栓症のような凝固障害を処置または防止するための薬剤の製造における請求項１ないし２０のいずれか１項に記載のバリアント成分の使用。
【請求項３４】
バリアント成分がバリアントＰＣまたはバリアントＡＰＣをバリアントＰＳと組み合わせて含んでなる、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
ＡＰＣ耐性の処置のための薬剤の製造ににおける請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
Ｇｌａ−ドメインが突然変異Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｑ３２ＥおよびＮ３３Ｄを含む、請求項１６に記載のバリアント成分。
【請求項３７】
ＳＰドメイン中の上記の少なくとも１つの修飾が３０２または３１６位の修飾である、請求項９に記載のバリアント成分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、強化された抗凝固（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性を現す機能的組換えプロテインＣバリアント（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｖａｒｉａｎｔ）、およびそのようなバリアントの治療または診断目的のための使用を対象とする。より詳細には、本発明は修飾されたＧｌａ−ドメインおよび修飾されたセリンプロテアーゼ（ＳＰ）ドメインの両方を含むプロテインＣバリアント、およびそのようなバリアントの治療または診断目的のための使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロテインＣは、一般にプロテインＣ−抗凝固系と名付けられている血液の抗凝固系に参加する主要な生理学的に重要なビタミンＫ−依存性タンパク質である。すべてのビタミンＫ−依存性タンパク質のようにプロテインＣはＮ−末端の４５アミノ酸残基を含んでなるＧｌａ−ドメインまたはＧｌａ−モジュールを含み、該ドメインは以下にさらに詳細に検討するように膜結合親和性に重要である。プロテインＣのＳＰ−ドメインは、ｉ．ａ．プロテインＣのタンパク質分解活性およびセルピン耐性に関与する。
【０００３】
このようなプロテインＣ−抗凝固系において、プロテインＣはコファクターであるプロテインＳ、および血液凝固のダウン−レギュレーターとしてその活性化状態（ＡＰＣ、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）のプロテインＣに対する相乗的コファクターとして作用する完全な第Ｖ因子（ＦＶ）を含む他のタンパク質と協調して機能し、これにより血液の過剰な凝固を防止し、すなわち血栓症を抑制する。プロテインＣの活性化形により現される抗凝固活性は、血液凝固系の別のコファクターである活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）および活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）の特異的開裂および分解により、血液凝固反応を阻害する能力から発する。それらの結果として、血液凝固に必要な成分、すなわち第Ｘ因子（ＦＸ）およびプロトロンビンの活性化は阻害され、そして凝固系の活性の勢いは削がれる。このようにプロテインＣは血液凝固系が正しく機能するために主に生理学的に重要である。
【０００４】
プロテインＣの重要性は、臨床的な所見から推定することができる。例えば重篤な血栓塞栓症はホモ接合性プロテインＣ欠損症の個体に影響を及ぼし、そして影響を受けた個体はすでに彼らの新生児の段階（ｎｅｏｎａｔａｌ  ｌｉｆｅ）で血栓症を発症する。生じる臨床的状態である電撃性紫斑症は通常、この状態をプロテインＣで処置しなければ致命的である。一方、ヘテロ接合性プロテインＣ欠損症は、それほど重篤ではない血栓塞栓症の表現型を伴い、そして静脈血栓症の比較的穏やかな危険因子を構成するだけである。この遺伝的形質の保有者は正常なプロテインＣレベルの個体と比較して、５〜１０倍高い血栓症のリスクを有すると予想された。しかしより重要なことは血栓症に関する最も多い遺伝的欠損が、プロテインＣ系にも影響を及ぼすということである。この状態は通常、ＡＰＣ耐性（ＡＰＣ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）と呼ばれ、そして最も多くはＦＶ−遺伝子中の１つの点突然変異により引き起こされ、この突然変異はＦＶアミノ酸配列中のアミノ酸残基Ａｒｇ５０６のＧｌｎ残基への置換を導く。Ａｒｇ５０６はＡＰＣによる開裂作用に感受性である活性化ＦＶ（ＦＶａ）の３つの開裂部位の１つを構成し、そしてそのような突然変異したＦＶａは正常なＦＶａよりもＡＰＣにより効率的に分解されにくい（非特許文献１）。この突然変異したＦＶａはＲ５０６ＱＦＶａ、ＦＶａ  ＬｅｉｄｅｎおよびＱ５０６変異体ＦＶａとも命名されている。
【０００５】
血液凝固系における抗凝固成分としてプロテインＣおよび活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の生理学的重要性は、これらの物質の治療目的のための使用の可能性を示す。
【０００６】
実際にプロテインＣおよびその活性化形態であるＡＰＣは、すでにある程度、治療目的に使用されてきた（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。より詳細にはヒト血漿から精製したプロテインＣがホモ接合性プロテインＣ欠損症の補充療法として使用され（非特許文献６）、そして髄膜炎菌血症による重篤な播種性血管内凝固症候群の場合にも成功裏に使用されてきた（非特許文献７）。さらに（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用した）敗血症のヒヒのモデルでは、ＡＰＣは保護効果を有することが示され、これはＡＰＣが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の侵襲前に与えられた時に特に際立った（非特許文献８）。いずれの場合でも今日までに得られた結果は、プロテインＣが上記の状態の処置にのみ有用な薬剤となるだけでなく、凝固系が活性化される多くの他の状態、例えば静脈血栓症、心筋梗塞（ＭＩ）後および血管形成術後の冠状血管の再疎通後の血管閉塞の防止および処置に有用となることを示唆している。
【０００７】
血液凝固障害に関連する種々の状態の治療的処置は、改善された抗凝固特性を有するプロテインＣのバリアントを利用できれば改善され得ると構想されている。さらにそのようなバリアントは、改善された性能を有するアッセイを得るための、プロテインＣ系の他の成分の様々な生物学的アッセイを改善するために試薬として有用となるだろう。
【０００８】
過去数十年の組換えＤＮＡ技術の進歩は、所望する生物学的物質を効率的に生産するための、かつ／または所望する、そして場合により特別に設計された特性を有する生物学的物質を作成するための可能性に莫大な影響を持っていた。実際にプロテインＣの機能的バリアントだけでなく、本質的に野生型プロテインＣも以下の参考文献で報告されたように組換え技術により生産された。
【０００９】
特許文献１（Ｂａｎｇ  ｅｔ  ａｌ）では、ヒトプロテインＣ誘導体の組換え生産が開示されている。しかし本質的にヒトの野生型プロテインＣに相当する機能的活性を有するプロテインＣポリペプチドの生産だけが開示されている。最近、この参考文献に従い生産された野生型プロテインＣが重篤な敗血症の処置に成功裏に使用された（非特許文献９）。
【００１０】
組換え技術で調製されたプロテインＣの使用も、非特許文献１０および非特許文献１１に開示された。
【００１１】
残基１５８〜１６９を含む活性化ペプチド領域に向けられた突然変異誘発法により得られるプロテインＣの機能的バリアントは、トロンビンに対して強化された感度を有することができ、そのようなバリアントは野生型プロテインＣよりも早くトロンビンにより活性化される（非特許文献１２；および非特許文献１３）。これらの研究の１つ（非特許文献１３）では、たとえトロンビンによるプロテインＣの効率的活性化に通常必要とされる膜タンパク質であるトロンボ−モジュリンが存在しなくても、血液の凝固中に形成されるトロンビンにより比較的容易に活性化される変異体プロテインＣを導く多数の突然変異が活性化部位の回りに導入された。
【００１２】
より具体的には、非特許文献１３に開示されているトロンビンと強化された相互作用を有するこれらプロテインＣバリアントは、活性化ペプチド領域中に突然変異を含んでなり、トロンビン開裂部位に近い２つの推定される阻害酸性残基が改変されている。Ｇｒｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（以下）に開示された、該改変された残基を活性化ペプチド領域内に、そしてまたＡｓｎ３１３Ｇｌｎ突然変異を含んでなる１つのプロテインＣバリアントが、インビボで行われた実験で抗凝固物質としても機能することが最近示された（非特許文献１４）。しかしこのプロテインＣバリアントでは、強化された抗凝固活性はＡｓｎ３１３Ｇｌｎ突然変異によるものであり、他の突然変異はトロンビンとの強化された相互作用を生じた。
【００１３】
非特許文献１５では、ヒトプロテインＣの機能におけるグリコシル化の役割が調査され、位置指定突然変異誘発法を使用して、４つの潜在的Ｎ−連結グリコシル化部位、すなわち９７、２４８、３１３および３２９位の各々が１つずつ排除されている。ここに開示されるプロテインＣバリアントでは、Ｇｌｎが９７、２４８および３１３位でそれぞれＡｓｎから代わり、そして２４８および３１３位でこの置換変異を有するプロテインＣ変異体は、他の修飾された特性に加えて２〜３倍強化された抗凝固活性を現すことが示されている。
【００１４】
野生型プロテインＣのアミノ酸配列中、例えばセリンプロテアーゼ（ＳＰ）モジュールに、少なくとも１つのアミノ酸残基の修飾の導入により強化された抗凝固活性を現すプロテインＣおよびＡＰＣの機能的バリアントが（この修飾はプロテインＣのグリコシル化を改変しない）、特許文献２に開示されている。ここに具体的に開示されている１つのバリアントは、残基ｎｏ．３００から３１４の間の短いアミノ酸残基の範囲（ｓｔｒｅｔｃｈ）の中に位置するＳＰモジュール中に数個の突然変異を含み、該バリアントは野生型のヒトプロテインＣに比べて約２００％強化された抗凝固活性を現す。
【００１５】
非特許文献１６は、Ｇｌｕ３５７Ｇｌｎ突然変異（すなわちキモトリプシンの番号付けを使用するならばＧｌｕ１９２Ｇｌｎ）を含んでなるプロテインＣ変異体を開示する。この変異体は純粋系において約２〜３倍強化された速度でＦＶａを不活性化する一方、血漿では抗凝固活性は変異体がアルファ１−アンチトリプシンおよびアノチトロンビンＩＩＩのようなプロテアーゼインヒビターにより急速に阻害されるので、野生型プロテインＣに比べて強化されない。
【００１６】
天然のプロテインＣのＧｌａ−ドメインに修飾または欠損を有するプロテインＣバリアントも以前に報告された。
【００１７】
例えば天然のプロテインＣのＧｌａ−ドメインを欠き、しかもＴｈｒ２５４Ｔｙｒ突然変異（すなわちキモトリプシンの番号付けに基づきＴｈｒ９９Ｔｙｒ）を含んでなるプロテインＣバリアントが、非特許文献１７に開示されている。このバリアントプロテインＣはリン脂質の不存在下で純粋なＦＶａ、すなわち可溶性ＦＶａに対して２倍強化された活性を有するが、Ｇｌａ−ドメインが無いことにより血漿中での抗凝固活性を欠いている。
【００１８】
最近、修飾されたＧｌａ−ドメインを有する幾つかのプロテインＣバリアントが、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献１８）により報告された。これらプロテインＣバリアントはＧｌａ−ドメインに幾つかの置換を含み、そして強化されたＣａおよび／または膜結合特性を現し、すなわち活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の強化された抗凝固活性も現す。これらのバリアントの中には特許文献３にＧｌａ−ドメインに置換修飾を含む他のプロテインＣバリアントと一緒に開示されたものもある。後者の参考文献は一般に、それらのＧｌａ−ドメインに修飾、すなわち置換により改変、例えば強化された膜結合親和性を現す修飾されたビタミン−Ｋ依存性ポリペプチドに関する。ビタミン−Ｋ依存性ポリペプチドは第ＶＩＩ因子または任意の他のビタミン−Ｋ依存性タンパク質、例えばプロテインＣを含んでなることができる。Ｇｌａ−ドメイン残基の番号付けは、特許文献３によればプロテインＣ配列の４位がいかなる残基にも占有されていない点でＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌとこの特許文献３の間で異なることに注目すべきであり、これは例えばＳｈｅｎ（および本発明）による１０位が特許文献３による１１位に対応する。
【００１９】
特許文献４は、野生型プロテインＣと比べて重要な生物学的活性を保持するが、野生型プロテインＣと比べた時に上昇した抗凝固活性、セルピン不活性化に対する耐性およびトロンビンに対する上昇した感度も有するヒトプロテインＣ誘導体に関する。これらプロテインＣ誘導体はＡｓｐ１６７Ｐｈｅ置換（Ｄ１６７Ｆ）、Ａｓｐ１７２Ｌｙｓ置換（Ｄ１７２Ｋ）、および特にＧｌａ−ドメインまたはＳＰ−ドメイン中で特異的に定められ、そして含まれる少なくとも１つのさらなる置換を含む。Ｙ３０２ＱまたはＹ３０２Ｅ（すなわちＳＰ−ドメイン中）の置換はここに開示されているが、試験データを用いて改善された特性が確認されない。さらにこの置換はセルピンに対する耐性を提供することを構想しているが、真に強化された抗凝固活性、すなわち分子毎に強化されるものであり、時間経過を必要としない抗凝固活性を提供することを構想していない。
【００２０】
特許文献５では、修飾されたＧｌａ−ドメインを含むプロテインＣバリアントが開示され、ここでＳｅｒ１２（リン酸化可能）を非リン酸化可能なアミノ酸残基に交換する目的で、１以上の位置指定突然変異誘発がアミノ酸１０、１１および１２位（Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ）、すなわちアミノ酸１２、アミノ酸１２および１１、またはアミノ酸１２、１１および１０で行われた。実験結果は数個のバリアントについてのみ開示され、そして抗凝固活性は活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイにおける凝固時間の延長としてのみ評価される。
【００２１】
たとえ強化された抗凝固活性および／または他の修飾された特性を有するプロテインＣバリアントがすでに開示されても、未だに強化された抗凝固活性および／または治療および／または診断目的に有用となり得る他の有益な特性を現すプロテインＣバリアントの必要性が存在する。
【００２２】
さらに修飾されたＧｌａ−ドメインおよび修飾されたＳＰ−ドメインの両方を含むプロテインＣバリアント（このバリアントは分子毎に強化され、時間経過の延長を必要としない抗凝固活性に加えて、強化された膜結合親和性を現す）は、今まで報告されなかった。そのようなバリアントはより低用量の必要性またはより低い頻度の投与および／または例えば野生型のプロテインＣに比べて抗凝固活性の迅速な開始のような利点を提供することができる。上に挙げた特許文献４はセルピンに対して強化された耐性を有するプロテインＣ誘導体を指し、そして他の改善された特性に加えて、延長された、しかし強化されていない抗凝固活性を有することに注目されたい。
【特許文献１】米国特許第Ａ４７７５６２４号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／４４０００号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／２０７６７号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／５９０８４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／３６４６２号パンフレット
【非特許文献１】Ｄａｈｌｂａｅｃｋ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４，９４：９２３−９２７
【非特許文献２】Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ  ａｎｄ  Ｚｏｌｄｈｏｌｙｉ，Ｄｒｕｇｓ  １９９５，４９：８５６−８８４
【非特許文献３】Ｅｓｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．１９８７，６７：５１−５７
【非特許文献４】Ｏｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９０，３３：２７７−２７８
【非特許文献５】Ｄｒｅｆｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９１，３２５：１５６５−１５６８
【非特許文献６】Ｍａｒｌａｒ  ａｎｄ  Ｎｅｕｍａｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．１９９０，１６：２９９−３０９
【非特許文献７】Ｒｉｖａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１９９５，１２６：６４６−６５２
【非特許文献８】Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８７，７９：９１８−９２５
【非特許文献９】Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．重篤な敗血症のための組換えヒト活性化プロテインＣの効力および安全性（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｆｏｒ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｓｅｐｓｉｓ），Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒｃｈ，８．２００１；３４４（１０）：６９９−７０９
【非特許文献１０】Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１９９３，１４：９７２−９７８
【非特許文献１１】Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．１９９４，６７：Ｓｕｐｐｌ．３：２１７−２２０
【非特許文献１２】Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ．Ｊ．１９９０，９：２３６７−２３７３
【非特許文献１３】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２，３６０：２６１−２６４
【非特許文献１４】Ｋｕｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９７，８９：５３４−５４０
【非特許文献１５】Ｇｒｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，９７７８−９７８５
【非特許文献１６】Ｒｅｚａｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８：１９９４３−１９９４８
【非特許文献１７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：２３８０７−２３８１４
【非特許文献１８】Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．４７：３１０８６−３１０９１
【発明の開示】
【００２３】
発明の要約
本発明は、修飾されたＧｌａ−ドメインおよび修飾されたＳＰ−ドメインを含むプロテインＣの機能的バリアント（このバリアントは活性化された時、好ましくは分子毎に強化される強化された抗凝固活性を現す）に関する。本発明のプロテインＣバリアントの強化された抗凝固活性は本質的に、修飾されたＧｌａ−ドメインによる強化されたカルシウムおよび／または膜結合特性、あるいは修飾されたＳＰ−ドメインによる強化されたタンパク質分解、適当にはアミド分解活性、または好ましくは両方から発する。さらに該活性は主にプロテインＣチモーゲンの活性形であるＡＰＣにより発現され、該チモーゲンはほとんど不活性である。したがって本発明は修飾されたＧｌａ−ドメインおよび修飾されたＳＰ−ドメインを含み、そして強化された抗凝固活性を現すＡＰＣのバリアントにも関する。Ｇｌａ−ドメインはプロテインＣの最初のアミノ−末端４５残基を含んでなり、そしてその構造および機能は、以下でさらに詳細に検討する。ヒトに由来するプロテインＣ中のＳＰ−ドメインは、２６２アミノ酸残基（ｎｏ．１５８〜４１９）を含んでなり、これも以下でさらに詳細に検討する。
【００２４】
本発明に従い少なくとも１個、しかし好ましくは１個より多くのアミノ酸残基の修飾の各Ｇｌａ−およびＳＰ−ドメインへの導入、適当には少なくとも４個、そして特に７個以上の修飾をＧｌａ−ドメインに、そして６以上の修飾をＳＰ−ドメインに導入することにより、野生型タンパク質に比べて改善された特性を有するプロテインＣまたはＡＰＣバリアント、そして特に改善された抗凝固活性（それ自体または活性化された時）を有するバリアントを提供することが見いだされた。
【００２５】
適当には本バリアントはそれらのＧｌａ−ドメイン中に１０個より多くのアミノ酸修飾を含まず、そしてそれらのＳＰ−ドメイン中に１０個より多くのアミノ酸修飾を含まず、そして好ましくはハイブリッドが野生型のプロテインＣと高度な相同性を有するほど、他のＧｌａ−ドメインとプロテインＣのＧｌａ−ドメインとの間の差異が数個のアミノ酸残基しか構成しないかぎり、プロトロンビンまたは第Ｘ因子に由来するＧｌａ−ドメインを有するハイブリッドプロテインＣバリアントのような異なるビタミンＫ−依存性タンパク質間のハイブリッドは包含しない。同様に、ＳＰ−ドメインおよびプロテインＣの残りが異なる種に由来するハイブリッドは通常、本発明に包含しない。
【００２６】
より一層強化された抗凝固活性のような改善された特性を現す本発明のプロテインＣバリアントは、例えば治療目的に使用する時、投薬用量または投与頻度を下げることにより利点を提供することができる。
【００２７】
また本発明は、ＤＮＡ技術に基づきそのようなバリアントを生産する方法、該方法での使用を意図するＤＮＡセグメント、および治療および／または診断目的のための該バリアントの使用に関する。
【００２８】
本発明に従い、野生型物質の抗凝固活性に比べて強化された抗凝固活性とは、分子あたり強化された活性を意味し、例えば分子を安定化することにより時間経過が延長される必要はないことを意味する。
発明の詳細な説明
Ａ．プロテインＣの分子配列
プロテインＣ分子は４種の型のモジュールまたはドメインからなる。アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、Ｇｌａ−モジュール、２つのＥＧＦ−様モジュール、すなわち上皮増殖因子相同体モジュール、および最後に典型的なセリンプロテアーゼ（ＳＰ）モジュールからなる。血漿では、循環しているほとんどのプロテインＣが、限定タンパク質分解により１本鎖前駆体から生じる、成熟した２本鎖のジスルフィド結合したプロテインＣチモーゲンからなる。これらの２本の鎖は２０ｋＤａの軽鎖（これはＧｌａ−およびＥＧＦ−モジュールを含む）とＳＰ−モジュールを構成する４０ｋＤａの重鎖である。トロンボモジュリンに結合したトロンビンによる活性化中、Ａｒｇ−Ｌｅｕ（残基１６９および１７０）のペプチド結合が重鎖のＮ−末端部分で開裂され、そして１２個のアミノ酸残基（残基１５８〜１６９）を含んでなる活性化ペプチドが放出される。本発明と関連して、プロテインＣおよびそのバリアントのアミノ酸配列中の残基の番号付けは、成熟プロテインＣに基づく。
【００２９】
プロテインＣのアミノ酸配列は、対応するｃＤＮＡヌクレオチド配列から推定され、そして技術文献に報告された。さらにプロテインＣに関するｃＤＮＡヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、ＨＳＰＲＯＴＣと命名されたヒトプロテインＣについて寄託番号Ｘ０２７５０で、およびＢＴＰＢＣと命名されたウシプロテインＣについて寄託番号ＫＯ２４３５で、ＥＭＢＬ遺伝子データベースから利用可能である（ハイデルベルグ、ドイツ））。
【００３０】
上に述べたように、ビタミンＫ−依存性タンパク質のＧｌａ−ドメインは、Ｎ−末端４５アミノ酸残基を含んでなる。すなわち全Ｇｌａ−ドメインのアミノ酸配列は、ヒトおよびウシプロテインＣのようなタンパク質について知られており、その全アミノ酸配列またはそのＮ−末端部分（４５残基）が決定された。上記のデータベースの配列に基づき、ヒトプロテインＣおよびウシプロテインＣのＧｌａ−ドメインは、以下のように具体的に説明することができる（それぞれ配列番号１および配列番号２）。
【００３１】
【表１】
2005518801.tif 000003
【００３２】
同様に、ＳＰ−ドメインのアミノ酸配列（それぞれヒトおよびウシ）は、これらデータベースの配列から得られ、ここでヒトプロテインＣのＳＰ−ドメインは、アミノ酸残基ｎｏ．１５８〜４１９を含んでなり、そしてウシＳＰ−ドメインは、アミノ酸残基１５８〜４１７を含んでなる。好ましくはＳＰ−ドメイン中の修飾はヒトＳＰ−ドメインのアミノ酸ｎｏ．２９０と３２０との間およびその全てを含むアミノ酸残基の範囲に位置し、該範囲は以下のアミノ酸配列：
【００３３】
【表２】
2005518801.tif 000004
【００３４】
に対応する。
【００３５】
ウシプロテインＣのＳＰ−ドメイン中、アミノ酸ｎｏ．２９２と３１８との間およびその全てを含む、対応するがより短いアミノ酸範囲は、以下のアミノ酸配列：
【００３６】
【表３】
2005518801.tif 000005
【００３７】
を有する。
【００３８】
Ｇｌａ−ドメイン中の修飾標的の選択に関連して、個々の配列間（異なるビタミンＫ依存性タンパク質に由来、および／または異なる種に由来する）の類似性および片寄りに関して、そのようなＮ−末端配列の比較は、突然変異誘発（すなわち修飾）標的として適する可能性があるプロテインＣのＧｌａ−ドメイン中の位置を示すことができる。そのような比較について、Ｇｌａ−ドメインの全アミノ酸配列を知る必要はなく、抗凝固活性に潜在的に重要な位置のアミノ酸残基が決定されていれば十分となるだろう。異なる種、例えばヒトとウシとのＳＰ−ドメイン間のプロテインＣ中のＳＰ−ドメイン、またはそれらの特別な部分の配列の同様の比較は、適切な突然変異誘発標的となり得るＳＰ−ドメイン中の位置を示すことができる。
【００３９】
本発明と関連して、アミノ酸に関する略号として通常の１文字または３文字記号を以下の対応表に示すように使用する：
【００４０】
【表４】
2005518801.tif 000006
【００４１】
Ｂ．プロテインＣのバリアント
上に述べたように、本発明は組換えプロテインＣの機能的バリアントに関し、該バリアントは修飾されたＧｌａ−ドメインおよび修飾されたＳＰ−ドメインを含み、そして該バリアントは強化された抗凝固活性を表す。これらのバリアントは１個以上、適当には数個の、そして好ましくは１０〜１５個のアミノ酸残基について野生型組換えプロテインＣとは異なり、該残基は対応する野生型配列のＧｌａ−ドメインおよびＳＰ−ドメイン中の両方に挿入され、削除されまたは置換（すなわち置き換え）されており、これにより本発明のプロテインＣバリアントを生じる。該差異はプロテインＣのＡＰＣへの活性化後にも維持されるので、本発明は強化された抗凝固活性を有するＡＰＣバリアントにも関する。本発明の適切な態様に従い、Ｇｌａ−ドメイン中の修飾（１つまたは複数）は、置換（１つまたは複数）であり、そしてＳＰ−ドメインは少なくとも１つの置換および少なくとも１つの削除を含む。
【００４２】
現在、そのようなバリアントは突然変異誘発法、特にオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含む位置指定突然変異誘発法により都合よく得られる。しかし本発明はこれらのバリアントを得る様式にかかわらず機能的バリアント自体に関する。
【００４３】
ＰＣとＡＰＣとの間の緊密な関係の観点から、しばしば本発明と関連してＰＣとＡＰＣとの間で明確な区別はせず、しかしＰＣ／ＡＰＣの名称を使用し、そしてこれら物質の１つまたは両方を考察すれば、内容は明らかとなるだろう。さらにプロテインＣチモーゲンはほとんど不活性であり、すなわちプロテインＣの強化された抗凝固活性は、該チモーゲンのインビボまたはインビトロでの活性化後にのみ本質的に現れる。したがって本発明と関連して「強化された抗凝固活性を現すプロテインＣバリアント」等の表現は、この強化された活性がプロテインＣ（チモーゲン）バリアントの活性化後に現れるか、または該バリアントがＡＰＣバリアントであることを意味する。
【００４４】
本発明と関連して「バリアント」という表現は、一般に野生型分子と比べて高度な相同性、適当には少なくとも９０％の相同性を有する変異体分子のような修飾された野生型分子を意味する。  
【００４５】
したがって、そのようなバリアントは野生型物質に関する実質的相同性を保存するために、適切にはわずかな修飾されたアミノ酸残基、そして可能ならばわずか１個のアミノ酸残基を各Ｇｌａ−およびＳＰ−ドメインに包含する。これは処置に使用するバリアントに対する可能な免疫応答を回避し、または少なくとも減らすために、インビボでの処置について本バリアントの使用と関連して特に重要である。
【００４６】
このように製薬学的目的には、好ましくは本バリアントは対応する野生型物質と実質的に相同的であり、そして点突然変異、例えば１もしくは数個の単一アミノ酸残基の置換、削除および／または挿入を該各ドメインに含むだけである。好ましくはバリアントは該各ドメインに１個より多くのアミノ酸残基の修飾を含み、そしてインビボの使用には多くて最高１０個以上のアミノ酸残基修飾を該各ドメインに含むことができる。
【００４７】
したがってＰＣ／ＡＰＣの適切なバリアントは、野生型の成熟ＰＣ／ＡＰＣと高度、すなわち少なくとも９０％、適切には少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、そして特別には少なくとも９８％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【００４８】
本発明の診断的態様と関連して、高度な相同性はもちろんそれほど重要ではないが、主要な要件は機能的バリアントが１以上の所望する活性を、野生型タンパク質と比べて強化されたレベルで現すことである。
【００４９】
製薬学的目的には、本発明の好適な態様はヒトＰＣ／ＡＰＣバリアントに関する。しかしまた本発明は、修飾されたＧｌａ−ドメインおよび修飾されたＳＰ−ドメインにより強化された膜結合特性および強化された抗凝固活性を有する、マウスもしくはラット起源のバリアントのような哺乳動物起源、例えばウシ起源またはマウス起源の他のＰＣ／ＡＰＣバリアントに関する。
【００５０】
上記のように、Ｇｌａ−ドメインまたはＧｌａ−モジュールはビタミンＫ依存性タンパク質ファミリーに特異的であり、その員は特異的タンパク質モジュール（該Ｇｌａ−モジュール）を含み、ここでグルタミン酸（Ｅ）残基がγ−カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ）に修飾される。この修飾は、ビタミンＫを使用してプロテインＣ前駆体のグルタミン酸残基の側鎖をカルボキシル化する酵素により肝臓で行われる。配列では（配列番号１および２）、ヒトおよびウシプロテインＣのＧｌａ−ドメインについてそれぞれ上記を仮定し、Ｅ残基はこのように循環しているタンパク質ではＧｌａ−残基に転換されている。      
【００５１】
Ｇｌａ−ドメインは、ビタミンＫ−依存性タンパク質の最初のアミノ末端４５残基を含んでなり、そしてカルシウムに結合し、そして負に荷電したプロコアグラント（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）リン脂質に結合する能力を持つタンパク質を提供する。さらにＦＶａおよびＦＶＩＩＩａのタンパク質分解において、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の機能に極めて重要な膜接触部位が該Ｇｌａ−ドメインに含まれ、ＡＰＣの活性はＡＰＣと他のタンパク質、すなわち第Ｖ因子およびプロテインＳコファクターとの膜表面上の会合で現れる。しかし種々のビタミンＫ−依存性タンパク質のＧｌａ−含有領域間の高度な配列相同性にかかわらず、これらのタンパク質は広い範囲の膜親和性を表す。これは低い親和性タンパク質であるプロテインＣ、例えばヒトプロテインＣの膜親和性を修飾し、そしてより具体的には強化することが可能となることを示している。
【００５２】
このために、高親和性ビタミンＫ依存性タンパク質の構造は、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（同上）に示唆されるように、膜結合親和性、すなわちプロテインＣのような低親和性タンパク質の抗凝固活性を強化することができる修飾の可能性を示唆するための鋳型として役立つことができる。例えば位置指定突然変異誘発法を野生型プロテインＣに行って、プロテインＺのような高親和性ビタミンＫ依存性タンパク質の構造に近付く構造を有するプロテインＣバリアントを生産することができる。
【００５３】
しかしすべてのビタミンＫ依存性タンパク質に有効であり、そして強化された膜結合親和性を生じることができるアミノ酸修飾の可能な位置を予測する静電的分布について、共通の原型の存在が国際公開第９９／２０７６７号パンフレットに示唆されているが、この原型はＧｌａ−ドメインの数個の位置、すなわち１０、１１、２８、３２および３３（本発明に関連して使用する番号付けに従う）に関するだけである。さらにＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（同上）に報告されているように、プロテインＣは独特な特徴を有し、そして必ずしもそのような共通の仮説に当てはまらないことが示された。
【００５４】
プロテインＣのＳＰ−ドメインは、ＡＰＣ−インヒビター、例えばα１ＡＴ（アルファ１−アンチ−トリプシン）およびＰＣＩ（プロテインＣインヒビター）中の配列と相互作用する配列、およびＦＶａまたはＦＶＩＩＩａ中の配列と相互作用する配列も含む。ＡＰＣ／ＰＣのそのような配列は、分子毎に強化される抗凝固活性を有し、そして場合によってはセルピンおよび他のＡＰＣ−インヒビターに耐性でもあるＡＰＣ／ＰＣバリアントを生成するために行う位置指定突然変異誘発法の推定上の標的を構成する。
【００５５】
本発明に従い、修飾（１つまたは複数）がプロテインＣのＧｌａ−ドメインおよびＳＰ−ドメインの両方に導入されて、強化された膜結合親和性または強化された抗凝固活性および好ましくは両方のようなインビボおよびインビトロでの改善された特性を現すと同時に、繊溶および抗炎症活性のような他の望ましい生物学的特性を維持するバリアントプロテインＣを生成できることが予期せずに見いだされた。
Ｂ（１）Ｇｌａ−ドメインの修飾
この章では、Ｇｌａ−ドメインにおける適切な修飾を開示する。これにより得られる修飾されたバリアントは、さらに以下のＢ（２）に開示するように、それらのＳＰ−ドメイン中にも少なくとも１つの修飾を含む。
【００５６】
本バリアントはＧｌａ−ドメイン中に置換（置き換え）、削除または挿入（付加）のような少なくとも１個、適切には少なくとも４個、例えば４〜６個または７〜１０個のアミノ酸修飾（１つまたは複数）を含む。
【００５７】
本発明の１つの観点に従い、Ｇｌａ−ドメイン中の該少なくとも１つのアミノ酸修飾は、プロテインＣのＧｌａ−ドメインの任意の位置で、１つのアミノ酸残基の別のアミノ酸残基への置換である。本発明のさらなる観点に従い、該位置は１０、１１、２８、３２または３３位以外の位置である。本発明の適切な態様に従い、該少なくとも１つのアミノ酸修飾は、２３または４４位に位置する。
【００５８】
本発明のさらなる観点は、上記の少なくとも１つのアミノ酸修飾がＤ２３ＳおよびＨ４４Ｙから選択される置換突然変異であるプロテインＣバリアントに関する。
【００５９】
本発明の１つの態様は、上記の少なくとも１つのアミノ酸修飾がアミノ酸残基ｎｏ．１〜９、１３〜２７、２９、３０、３１および３４〜４５からなる群から選択される位置、またはアミノ酸残基ｎｏ．１〜３、５〜７、９、１２〜２７、２９〜３１および３６〜４５からなる群から選択される位置に位置するプロテインＣバリアントに関する。
【００６０】
本発明の他の態様は、Ｇｌａ−ドメイン中の該少なくとも１つのアミノ酸修飾がアミノ酸残基ｎｏ．１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４から選択される位置に位置するプロテインＣバリアントに関する。適切には１より多くの、そして好ましくはすべてのアミノ酸残基１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４が例えば置換により修飾されている。
【００６１】
本発明の１つの観点に従い、該少なくとも１つのアミノ酸修飾は、１つの修飾以外の１以上のアミノ酸修飾、あるいは配列Ｅ１０Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３、Ｑ１０Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３、Ｇ１１Ｎ１２Ｅ３２Ｄ３３、Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３、Ｅ３２Ｄ３３およびＥ３２中で定められる修飾の組み合わせを含んでなる。共通する実施に従い、例えばＥ３２Ｄ３３は３２位でＥが野生型残基（Ｑ）から置き換えられ、そして３３位でＤが野生型（Ｎ）から置き換えられた突然変異した配列を意味する。あるいは本バリアントはＧｌａ−ドメイン中に１以上のこれら修飾（直前に述べた）、およびＳＰ−ドメイン中の少なくとも１つ、そして適切には１より多くの修飾を含むことができる。場合によりそのようなバリアントはＧｌａ−ドメイン中に少なくとも１つのさらなる修飾、例えばＹ４４も含む。
【００６２】
さらに一層強化された抗凝固活性を有する具体的なヒトプロテインＣバリアントは、すべての置換突然変異Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを含む。このようにＳＰ−ドメイン中の少なくとも１つの修飾に加えて、このプロテインＣバリアントは、以下のアミノ酸配列：
【００６３】
【表５】
2005518801.tif 000007
【００６４】
を有する修飾されたＧｌａ−ドメインを有する。
【００６５】
本発明の別の観点は、Ｇｌａ−ドメイン中に単一の突然変異として１以上の前記置換を含むプロテインＣバリアント、および適切には置換Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｑ３２ＥおよびＮ３３Ｄを含むバリアントに関する。
Ｂ（２）ＳＰ−ドメインの修飾
本発明に従い、Ｇｌａ−ドメイン中の１以上の修飾は、ＳＰ−ドメイン中の少なくとも１つの修飾と組み合わされる。
【００６６】
ヒトＰＣの機能におけるグリコシル化の役割に関するＧｒｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（同上）の研究、および国際公開第９８／４４  ０００号パンフレットを除いて、このモジュール、すなわちＰＣ／ＡＰＣ分子のセリンプロテアーゼ（ＳＰ）モジュール中の１以上の突然変異が、強化されたタンパク質分解および分子毎に強化される抗凝固活性を導くことを示す従来技術の参考文献は無い。しかし一方では以前に、ヒトＡＰＣが幾つかのセルピン、すなわち蛇毒タンパク質により、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）により、およびアルファ１−アンチ−トリプシン（α１ＡＴ）により阻害されることが知られ、さらに他方では、ウシＡＰＣがα１ＡＴにより阻害されないことが知られていた。この現象を理解するための努力では、Ｈｏｌｌｙ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３：１８７６−１８８０）がヒトとウシのプロテインＣ間のハイブリッド分子を構築し、そしてプロテインＣのＳＰ−モジュール中のどこか異なる残基について、分子的背景を示すことができた。しかしこの報告からはＳＰ−モジュール中の突然変異が強化されたタンパク質分解および抗凝固活性を導くことをそこに示唆していないし、またはそれらから明らかではない。たとえＨｏｌｌｙ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒが、ＰＣバリアントが修飾されたＳＰドメイン（ここでアミノ酸残基ｎｏ．３００〜３１４は以下に開示する配列番号６と同じである）を含むと実際に解釈しても、彼らはこのバリアントのいかなる強化された抗凝固活性も、延長された抗凝固活性さえも開示しなかった。
【００６７】
本発明者は、ヒトおよびウシＡＰＣとα１ＡＴとの異なる反応性の原因であるＳＰ−モジュール中の部位を厳密に同定することを企図して、さらに詳細にＳＰ−モジュールを研究した。これらの研究に関連して、ヒト野生型プロテインＣ中の残基番号３００と３１４の間（およびその全てを含む）のアミノ酸配列がタンパク質分解およびアミド分解活性、すなわちＰＣ／ＡＰＣの抗凝固活性に必須であり、そしてこのアミノ酸範囲中に突然変異（１つまたは複数）を導入することは、野生型物質に比べてより高速で該活性を現すＰＣ／ＡＰＣの機能的バリアントを生じるということが全く予期せずに見いだされた。この知見は上に引用した国際公開第９８／４４  ０００号パンフレットの主題である。
【００６８】
たゆまぬ科学実験、分析および革新を通じて、本発明者はＳＰ−ドメイン中の修飾（１つまたは複数）とＧｌａ−ドメイン中の修飾（１つまたは複数）とを組み合わせて、Ｇｌａ−ドメインおよびＳＰ−ドメインの両方の中に突然変異を含み、そして強化された膜結合親和性および強化されたタンパク質分解および／またはアミド分解活性、すなわち強化された抗凝固活性を現すと同時に、他の望ましい特性を維持するＰＣバリアントを生成することが可能であることを見いだした。
【００６９】
このように本発明の適切な態様は、強化されたタンパク質分解および抗凝固活性を発現するＰＣ／ＡＰＣの機能的バリアントを対象とし、このバリアントは上で検討した修飾されたＧｌａ−ドメインに加えて、１以上の突然変異をＳＰ−モジュール中にも含む点で野生型ＰＣ／ＡＰＣとは異なる。特別な態様に従い、本発明はＰＣ／ＡＰＣのバリアントを企図し、ここでＳＰ−モジュール中の突然変異（１つまたは複数）、適当には点突然変異（１つまたは複数）は、野生型ヒトプロテインＣの残基番号２９０〜３２０、そして適切には残基番号３００〜３１４からなるアミノ酸範囲内に位置する。
【００７０】
ヒトＰＣ／ＡＰＣでは、残基番号３００〜３１４からなる上に挙げた配列は、アミノ酸に関する１文字暗号を使用した配列ＷＧＹＨＳＳＲＥＫＥＡＫＲＮＲ（配列番号６）を含んでなる。本発明の１つの好適な態様は、Ｇｌａ−ドメイン、および該アミノ酸配列（配列番号６）に含まれる突然変異（１つまたは複数）を除いて野生型ＰＣ／ＡＰＣ分子と同一のアミノ酸配列を有するヒトＰＣ／ＡＰＣバリアント対象とし、ＳＰ−ドメイン中の突然変異した配列はＷＧＹＲＤＥＴＫＲＮＲ（配列番号７）を含んでなる。
【００７１】
野生型分子中の突然変異の位置は、以下に表示する突然変異した配列：ＷＧＹ．．．ＲＤ．ＥＴＫＲＮＲ（配列番号７）から明らかであり、ここで点は削除されたアミノ酸を具体的に示し、そして置換には下線を付す。このようにこの特別な態様のＰＣ／ＡＰＣバリアントは、野生型のＰＣ／ＡＰＣモジュールと比較して４個のアミノ酸残基が短縮化され、そして２つの置換を含むＳＰモジュール中のアミノ酸範囲を含む。
【００７２】
このように本発明の適切な態様は、Ｇｌａ−ドメイン中に少なくとも１つの修飾を含み、そしてＳＰ−モジュール中のアミノ酸残基３００〜３１４からなる範囲内に削除および置換突然変異を含むＰＣ／ＡＰＣバリアントに関する。好ましくはアミノ酸残基ｎｏ．３０３、３０４、３０５および３０８が削除され、そしてアミノ酸残基ｎｏ．３０７および３１０が置換されて（Ｅ３０７Ｄ／Ａ３１０Ｔ）、配列番号７の突然変異した配列を含んでなる上に挙げたＰＣ／ＡＰＣバリアントを生成する。したがって該配列内に突然変異を含む好適なバリアントは、配列番号６の配列により表される野生型の配列の代わりに配列番号７の配列により表される突然変異した配列をＳＰ−ドメイン中に含む。
Ｂ（３）Ｇｌａ−ドメインおよびＳＰ−ドメイン中の修飾
本ＰＣバリアントはＧｌａ−ドメインに少なくとも１つの修飾を、そしてＳＰ−ドメインに少なくとも１つの修飾を含み、そして適当には各ドメインに１より多くの修飾を含む。より詳細には本発明はＢ（１）で述べたようなＧｌａ−ドメイン中の修飾を、そしてＢ（２）で述べたようなＳＰ−ドメイン中の修飾を有するＰＣバリアントに関する。本バリアントはこれらの修飾を任意の組み合わせで含むことができる。さらに具体的に述べたアミノ酸置換を、同じ効果を提供する他の置換に置き換えることができ、すなわち同様な特徴の他のアミノ酸残基を使用して野生型の残基を置き換えることができる。さらに削除、付加または置換突然変異を加えることができ、この突然変異は本発明の基本的特徴に影響を及ぼさない変化を生じる。そのような修飾は以下のＢ（４）章の突然変異誘発法の考察から明らかである。例えば野生型アミノ酸残基をＢ（４）章に掲げる群１から選択される具体的アミノ酸へ置換することは、該野生型残基をこの群に属する他の任意のアミノ酸残基へ置換することに代えることができる。
【００７３】
本発明の適当な態様は、Ｇｌａ−ドメイン中の１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４位に置換を有し、そしてＳＰ−ドメイン中の２９０から３２０位の間および全てを含む、好ましくは３００から３１４位の間および全てを含むアミノ酸範囲に、そしてより特別には３０３、３０４、３０５、３０７、３０８および３１０位に突然変異を含むプロテインＣバリアントに関する。他の適切なプロテインＣバリアントは、３０３から３１０位の間および全てを含むアミノ酸範囲内、または３０２から３１６位の間および全てを含むアミノ酸範囲内に修飾を含む。ＳＰ−ドメイン中の適切な修飾は、場合によっては少なくとも１つの置換と一緒の削除である。
【００７４】
１つの好適な態様に従い、プロテインＣバリアントはＧｌａ−ドメイン中に置換Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙを、そしてＳＰ−ドメインの３０３、３０４、３０５および３０８位に削除および置換Ｅ３０７ＤおよびＡ３１０Ｔを含む。ここで該バリアントはしばしば「スーパー−ＡＰＣ」と呼ぶ。さらなる態様に従い、プロテインＣバリアントはスーパー−ＡＰＣと同じＳＰ−ドメイン突然変異を含むが、Ｇｌａ−ドメインは置換Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｑ３２ＥおよびＮ３３Ｄのみを含む。
【００７５】
組み合わせて強力に強化された抗凝固活性を有するＰＣ／ＡＰＣバリアントを生成することができるＳＰ−ドメイン中およびＧｌａ−ドメイン中の他の突然変異を以下で検討する。
【００７６】
ＳＰドメイン中の突然変異は少なくともわずかに上昇した抗凝固活性、および場合により強化されたアミド分解活性を伴うはずである。主要な例は本明細書中ですでに記載したＳＰ変異体である（Ｂ（２）章）。しかし多くの他のバリアントを、プロテインＣ中のこの領域、すなわちセリンプロテアーゼドメイン中の所謂１４８ループを含んでなる３００〜３１４アミノ酸残基の領域の突然変異誘発により作成することができる。
【００７７】
Ｇｌａ−ドメイン中の突然変異も多くの異なる突然変異を含んでなることができるが、原理的にはそれらは自身により強化、または改変されたリン脂質−結合能をもたらすはずである。Ｇｌａドメイン中の適当な突然変異はその幾つかが本明細書にすでに記載され、それらにはＥ３２；Ｅ３２Ｄ３３；Ｇ１１；Ｑ１０Ｇ１１；Ｇ１１Ｎ１２；Ｑ１０Ｇ１１Ｎ１２；Ｓ２３；Ｓ２３Ｅ３２Ｄ３３Ｙ４４、Ｑ１０Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３、Ｇ１１Ｎ１２Ｅ３２Ｄ３３、Ｑ１０Ｇ１１Ｎ１２Ｓ２３Ｅ３２Ｄ３３Ｙ４４を含むが、多くの他のバリアントも可能である。Ｇｌａ−ドメインを突然変異させるために挿入する問題の位置は、このようにＮｏ．１０、１１、１２、２３、２８、３２、３３、３４、３５および４４を含む。
【００７８】
原理的には、本明細書中および従来技術ですでに検討したありとあらゆるＧｌａ−ドメインバリアント、およびこれまでの既知の突然変異、例えばＧｒｉｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（同上）にすでに記載された炭水化物に影響を及ぼす突然変異および／または国際公開第０１／５９０８４号パンフレットに開示された突然変異をさらに含むようなバリアントも、Ｂ（２）および以下に開示するＳＰ突然変異と一緒に使用することができる。
【００７９】
本明細書に特別に記載する１つのＳＰ変異体は、この領域、すなわちＷＧＹＨＳＳＲＥＫＥＡＫＲＮＲ（配列番号６）中のｗｔヒトプロテインＣ配列に比べて、配列ＷＧＹ．．．ＲＤ．ＥＴＫＲＮＲ（配列番号７）を含む。ループは短縮されるべきであるという考えに基づき、多数の選択的突然変異を以下に掲げる。
【００８０】
【表６】
2005518801.tif 000008
【００８１】
以下の方法に従い、可能な大変多数の変化が存在する。理論的には、これらは削除または置換に供する７個のアミノ酸残基の無作為な変化を可能とする現代の分子生物学的道具を介して見いだすことができる。スクリーニングは合成基質に対して強化された触媒活性を生じる興味深い変異体の能力に基づき構築することができる。
【００８２】
修飾することができるＳＰ−ドメイン中の他の位置は、３０２および３１６位である。これらの位置でｗｔアミノ酸はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙおよびＧｌｎから選択されるアミノ酸と置換することができ、例えば置換はＹ３０２ＱまたはＹ３０２Ｅである。
【００８３】
上で述べたように、修飾された、すなわちＧｌａ−ドメインに少なくとも１つの修飾を、そしてＳＰ−ドメインに少なくとも１つの修飾を含むバリアントまたは変異体である本発明のＰＣ／ＡＰＣは、強化された膜結合親和性および強化されたタンパク質分解および／またはアミド分解活性、すなわち強化された抗凝固活性を有する。そのような抗凝固活性は、すなわち本バリアントがインビトロの標準的な凝固アッセイにおいて凝固時間を上昇させる能力として決定することができる。強化された抗凝固活性は、血漿に由来するか、または組換えＤＮＡ技術により得ることができる野生型ＰＣ／ＡＰＣと比べて測定される。このように本発明に従い有用となるには、ＰＣ／ＡＰＣバリアントは野生型物質の抗凝固活性よりも高い抗凝固活性を現すべきである。適当には本バリアントは少なくとも約５０％、、そして適切には少なくとも約１００％強化された抗凝固活性を現す。好適なＰＣ／ＡＰＣバリアントは、野生型のプロテインＣよりも約４００％以上、例えば１０００％まで、またはさらに３０００％まで強化された抗凝固活性を現す。
【００８４】
強化された膜結合とは別に、Ｇｌａ−ドメイン中の突然変異は他の改善された特性も提供することができることを構想する。例えばＧｌａ−ドメインは幾つかの他のタンパク質との相互作用に関する部位を有するので、Ｇｌａ−ドメインはおそらくプロテインＳおよび第ＶおよびＶＩＩＩ因子と相互作用することができる。このようにこれらのタンパク質との相互作用は、Ｇｌａ−ドメイン中の突然変異により改善され得ると構想する。
【００８５】
上で述べたように、本バリアントは好ましくは対応する野生型物質と高度な相同性を有する。すなわち本バリアントは好ましくは点突然変異、すなわち１または数個の単一アミノ酸残基の置換、削除および／または挿入のみを含む。
【００８６】
本発明の好適な態様は、ヒトＰＣ／ＡＰＣバリアントに関する。しかし本発明は、マウスおよびラットのような哺乳動物起源、例えばウシおよびマウスの強化された抗凝固活性を有するＰＣ／ＡＰＣバリアントに関する。
【００８７】
本発明の別の態様に従い、これらのバリアントがさらに野生型物質に比べて強化された抗凝固活性を有するならば、バリアントはプロテインＣについて前に記載した１または数個の突然変異をさらに含むことができる。そのような突然変異はＧｌａ−ドメイン、ＳＰ−ドメインおよび／またはプロテインＣ分子の他のドメインに位置することができる。
【００８８】
本修飾はＡＰＣ中の活性部位の修飾と組み合わせてもよい。ＡＰＣの活性部位は、活性部位の位置指定突然変異誘発法により、または例えばＮ−ダンシル−グルタミル−グリシル−アルギニル−クロロメチル−ケトンにより化学的に不活性化することができる。Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１１８６３−１１８６８を参照にされたい。活性化部位が修飾されたＡＰＣはプロトロンビナーゼ複合体のインヒビターであるので、強化された膜親和性を現す活性化部位が修飾されたＡＰＣは、治療的に有利なＡＰＣバリアントを提供する。
Ｂ（４）突然変異誘発法
当業者には置換以外のＧｌａ−ドメイン中の修飾および削除以外の修飾およびＳＰ−ドメイン中の置換が、上記のように改善された特性を有するプロテインＣバリアントを提供できることが明らかである。さらに本明細書に具体的に挙げた置換以外の置換もそのような改善されたバリアントを提供することができる。そのような置換は保存的または非保存的である。共通の側鎖特性に基づき、自然に存在する残基は以下の種類に分類される：
１）ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅを含んでなる疎水性残基；
２）Ｃｙｓ、ＳｅｒおよびＴｈｒを含んでなる中性の疎水性残基；
３）ＡｓｐおよびＧｌｕを含んでなる酸性残基；
４）Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んでなる塩基性残基；
５）ＧｌｙおよびＰｒｏを含んでなる鎖の方向に影響を及ぼす残基；および
６）Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅを含んでなる芳香族残基．
非保存的置換はこれらの１種類の員が別の種類の員に置き換えることを含み、一方、保存的置換はアミノ酸残基を同じ種類の員と置き換えることを含むことができる。置換突然変異誘発法に興味深い位置は、異なる種に由来する野生型プロテインＣに見いだされるアミノ酸残基が、例えば側鎖の嵩、荷電および／または疎水性に関して異なる位置を含む。しかし興味深い他の位置は、特定のアミノ酸残基が少なくとも幾つかの異なる種間では異ならず、同一であるような位置であり、なぜならばそのような位置は生物学的活性に潜在的に重要であるからである。最初に候補位置を比較的保存的な様式で置換する。次いでそのような置換が生物学的活性に変化をもたらす場合、より実質的な置換を導入し、かつ／または付加、削除または挿入のような他の修飾を作成し、そして生じたバリアントを生物学的活性についてスクリーニングする。
【００８９】
アミノ酸配列の保存的置換または修飾は、野生型プロテインＣに類似する機能的および化学的特徴を有するバリアントを生じることが期待できるので、適切には本プロテインＣバリアントは少なくとも１つの非保存的置換、例えば塩基性残基の代わりに芳香族残基への、または酸性残基の代わりに塩基性残基への置換を含む。
【００９０】
修飾した、すなわちバリアントもしくは変異体である本発明のＰＣ／ＡＰＣは、強化された抗凝固活性を有するので、生物学的活性に関する上記のスクリーニングは、抗凝固活性の測定に適切に関連する。そのような抗凝固活性はｉ．ａ．、本バリアントが標準的なインビトロ凝固アッセイにおいて凝固時間を上げる能力として決定することができる。強化された凝固活性は、血漿に由来するか、または組換えＤＮＡ技術により得られる野生型ＰＣ／ＡＰＣに対する比較で測定される。このように本発明に従い有用となるには、ＰＣ／ＡＰＣバリアントは野生型の物質の抗凝固活性よりも高い抗凝固活性を現すべきである。適当には本バリアントは野生型のプロテインＣよりも少なくとも約４００％以上、例えば１０００％まで、またはさらに３０００％まで強化された抗凝固活性を現す。
【００９１】
上記の、そして類似の原理に基づき、本発明のバリアントのＧｌａ−ドメイン（配列番号５）中の好適な突然変異を決定した。より詳細にはＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７；３６：５１２０−５１２７）による理論的文献で、すべてが既知のＧｌａ−ドメインの配列が比較され、そしてこれらＧｌａ−ドメインが負に荷電したリン脂質に結合する能力を持つ配列と関連させることを試みた。この分析から、種々のＧｌａドメインの中でも負に荷電したリン脂質に関する親和性に関する大きな変動が、主に１０および３２および３３位の残基周辺のアミノ酸配列の差異に関連することが示唆された。
【００９２】
Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）による以前の文献では、数個の異なる変異体が作成され、そしてＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌの理論的考察に従い試験された。これらの変異体に関する共通のテーマは、１１位をセリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）に、そして３２位をグルタミン（Ｇ）からグルタミン酸（Ｅ、成熟タンパク質ではＧｌａに転換されるだろう）に、そして３３位をアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）へ変えることであった。さらに１０および１２位をその時点で１つ、一緒にではなく変えた。すなわち試験した変異体はＧ１１Ｅ３２Ｄ３３（ＧＥＤ）、Ｅ３２Ｄ３３（ＥＤ）およびＥ３２（Ｅ）に加えて、Ｅ１０Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３（ＥＧＥＤ）、Ｑ１０Ｇ１１Ｅ３２Ｄ３３（ＱＧＥＤ）、Ｇ１１Ｎ１２Ｅ３２Ｄ３３（ＧＮＥＤ）であった。
【００９３】
ＱＧＥＤおよびＧＮＥＤは抗凝固物質として本質的に等しく効果的であり、そして両方がｗｔＡＰＣよりも抗凝固的であることが観察された。ｗｔＡＰＣと比較して、両方の変異体が優れた様式で負に荷電したリン脂質を含むリン脂質小胞に結合し、そしてまたＣａ２＋にも強固に結合した。たとえその試験の最も効率的な変異体がｗｔＡＰＣよりも抗凝固的であっても、これは低濃度のリン脂質を使用した時にのみ見いだされた。すなわちたとえＡＰＣの改善された酵素活性が使用したすべての膜について増加した膜親和性と関連したことが見いだされても、負に荷電したリン脂質に関するＡＰＣの強化された親和性は、低濃度の負に荷電したリン脂質でＡＰＣの抗凝固（酵素）活性を改善しただけであることを示唆した。
【００９４】
Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）の研究により刺激されて、本調査を開始した。この考えは１０、１１および１２位での突然変異を１つのバリアントに組み合わせ、そして加えて２３および４４位での突然変異が変異体ＡＰＣの効力に影響を及ぼすことができるかどうかを試験することにより、恐らくより効率的な突然変異を作成することができるということであった。３２および３３位はＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．による研究から重要であると考えられたが（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）、これは示されて無かった。Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．により試験された変異体、すなわちＧＥＤ、ＥＤ（３２、３３位）およびＥ（３２位）に加えてＥＧＥＤ、ＱＧＥＤ、ＧＮＥＤは、以下の理由から３２および３３位の重要性を確実に証明できなかった。変異体ＥＧＥＤ、ＱＧＥＤ、ＧＮＥＤおよびＧＥＤはすべて、ｗｔＡＰＣよりも効率的であったが、２つの変異体ＥＤおよびＥはより効率的ではなかった。これは１０〜１２位周辺の突然変異がより効率的なタンパク質を生じるものであり、３２および３３突然変異が必要無い可能性を生じた。証明されてはいないが、１０〜１２位周辺の突然変異は、３２および３３位での突然変異と組み合わされなければならないと仮定された。しかしＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）の研究から、３２および３３位のみの突然変異では強化された抗凝固活性を現すプロテインＣバリアントの作成には不十分であることは明らかであった。以下に示すように、１０〜１２位（ＱＧＮバリアント）も２３、３２、３３および４４位（ＳＥＤＹバリアント）の突然変異誘発も、わずかに改善された抗凝固活性以上の分子を作成しなかった。上に確認されるすべての修飾（ＱＧＮＳＥＤＹまたは“ＡＬＬ”と命名）を含む特別な変異体（配列番号３）のみが高度に効率的であった。
【００９５】
野生型残基を野生型プロテインＣの上で確認した位置で置換するために使用する適切なアミノ酸残基に関して、これらのアミノ酸配列と種々のビタミンＫ依存性タンパク質のリン脂質結合能との間の相関分析を含め、種々のＧｌａ−ドメインのアミノ酸配列の比較を行った。これによりヒトプロテインＳおよびウシ第Ｘ因子の両方がこれらの配列を含んでなり、そしてこれらタンパク質の両方が負に荷電したリン脂質に高親和性で結合するので、ＱＧＮが１０、１１および１２位の興味深い選択であることが示唆された。多くのＧｌａドメインにおいて、２３位はセリン（Ｓ）残基に占有され、そしてこれはなぜプロテインＣの野生型残基が本発明の適切なバリアントを作成する時にセリン残基と置き換えられたのかの理由である。４４位での修飾はこれまでに考えられなかったことに注目されたい。しかし４４位にヒスチジン（Ｈ）残基を含むＧｌａドメインはヒトプロテインＣのＧｌａドメインだけであるので、４４位にチロシン残基を有するすべての他のＧｌａドメインでは、４４位でヒスチジン残基をチロシン（Ｙ）と置き換えることが有用な修飾となり得るのが合理的と思われる。
【００９６】
このようにＧｌａ−ドメイン中の突然変異の選択に関する適切な方法は、類似のＧｌａドメインを有する幾つかのビタミンＫ依存性タンパク質が存在するという事実に基づく。実際に、すべてのＧｌａ−ドメインは同じ基本フォールド（ｆｏｌｄ）を有する。ドメインのこのフォールディングに重要なアミノ酸残基は高度に保存されており、これはカルシウムに結合する多数のＧｌａ残基を含み、これによりドメインのフォールディングに決定的となる。また幾つかの他のアミノ酸残基も、ドメインのフォールディングに関与している。すべての既知のＧｌａ−ドメインを含むタンパク質に由来する配列のアライメントは、Ｇｌａ−ドメインの配列の自然な変化を示し、そして保存されたアミノ酸残基がそのような分析で強調されている。これらのアミノ酸残基はドメインの内部に位置する傾向がある。対照的に露出したアミノ酸残基により占有されている位置は、より高度に多様性であり、そしてこれらの位置は突然変異がフォールディングの問題を引き起こす見込みが低いので突然変異誘発法に好適な位置である。これらの位置のアミノ酸残基もＧｌａ−ドメインのファミリー内で高度に可変性である。これらの位置は例えば１０〜１２、２３、３２および３３位である。種々のＧｌａ−ドメインは負に荷電したリン脂質膜に高度に異なる親和性を有し、これは可変性位置におけるアミノ酸の差異によるはずである。Ｇｌａ−ドメインのアミノ酸配列を負に荷電したリン脂質に対する親和性と比較することにより、突然変異誘発法に有用となり得る情報を引き出すことができ、これは以前に調製され、そして上で考察した種々のプロテインＣバリアントについて証明されている。これらには１０〜１２、２３、３２および３３位で突然変異したタンパク質を含む。これらの位置をすでに試されたもの以外のアミノ酸残基に突然変異させる多くのさらなるバリアントが可能である。置換のためのアミノ酸の選択において、アミノ酸のファミリー内にあるものを試すことができるが、ファミリーの境界を越えて行くことも興味深いかもしれない。４４位でＨｉｓからＴｙｒへの突然変異誘発は、すべての他のＧｌａ−ドメインが４４位にＴｙｒを有するように行った。
【００９７】
Ｇｌａ−ドメインを修飾する主な目的は、負に荷電したリン脂質膜に対して増加した親和性を有するプロテインＣバリアントを得ることである。この利点はより多くのＡＰＣがリン脂質膜上に存在し、すなわち凝固に及ぼす阻害効果がより顕著になるということである。この利点はＡＰＣの効果がプロテインＳおよび第Ｖ因子のようなコファクターの存在に依存しなくなることである。多くの病理学的状況において、コファクターは病理的タンパク質分解に消費される。高効率の「スーパーＡＰＣ」バリアントは、コファクターの不存在下でもｗｔ−ＡＰＣより明らかに有利であろう。
【００９８】
上記の検討から、たとえＧｌａ−ドメインが４５アミノ酸残基を含んでも、その各々が独立して、または組み合わされて修飾されることができ、そしてこれにより生成されたＡＰＣバリアントは強化された抗凝固活性を有するさらなるバリアントに関する調査で特徴付けられなければならず、そのような調査は実際に当業者の技術的範囲内にある。さらに当該技術分野の状況に基づき、例えば前駆体として本明細書に具体的に開示したバリアントを使用して、前駆体バリアント（例えば実験の部で具体的に調製されるようなバリアント）と同じ特性を本質的に有するさらなるバリアントを、１または数個の保存的置換を導入することにより、またはＧｌａ−ドメインの部分またはプロテインＣ分子の他の部分に修飾を導入することにより（ここでそのような修飾は、修飾されることを意図する前駆体の特性に影響を及ぼさない）生成することができる。本質的に変化していないか、または本バリアントと同じ特性を現すようなバリアントは本バリアントと均等であると考え、すなわち本発明により包含される。これは少なくとも突然変異の誘発の標的がアミノ酸残基ｎｏ．２９０〜３２０、または特別にはアミノ酸残基ｎｏ．３００〜３１４から選択されるならば、ＳＰ−ドメインについてもあてはまる。
Ｃ．ＤＮＡセグメントおよびその調製
本発明はＰＣ／ＡＰＣバリアントに関係するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）セグメントまたは配列、例えばこれらバリアントをコードする構造遺伝子、修飾されるアミノ酸範囲等のコード配列を含んでなる突然変異誘発プライマー等に関する。
【００９９】
これに関連して、遺伝子暗号の周知の重複を考慮しなければならない。すなわちタンパク質を作るために使用するほとんどのアミノ酸について、１以上のコーディイングヌクレオチドトリプレット（コドン）が特定のアミノ酸残基をコードするか、または定めることができる。したがって多数の異なるヌクレオチド配列が特定のアミノ酸残基配列をコードすることができる。しかしそのようなヌクレオチド配列は、それらが同じアミノ酸残基配列の生成をもたらすことができるので、機能的に均等であると考えられる。さらに場合により、プリンまたはピリミジンのメチル化バリアントを上記ヌクレオチド配列に包含することができるが、そのようなメチル化はいかなる様式でもコード関係に影響を与えない。すなわちメチル化バリアントを含んでなるか、または含まないそのような機能的に均等な配列も本発明により包含される。
【０１００】
本発明の適切なＤＮＡセグメントは、本発明の修飾された（バリアントまたは変異体）ＰＣ／ＡＰＣをコードするＤＮＡ配列を含んでなり、すなわちＤＮＡセグメントは、修飾ＰＣ／ＡＰＣをコードする構造遺伝子を含んでなる。しかし本発明のＤＮＡセグメントは例えば突然変異誘発プライマーとして使用するために、修飾されたアミノ酸範囲を含む数個から約１５個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドトリプレットを含んでなる比較的短い配列からなることができる。
【０１０１】
本発明の構造遺伝子は好ましくはイントロンを含まず、すなわち遺伝子はコドンの非中断配列からなり、各コドンが該修飾ＰＣ／ＡＰＣ中に存在するアミノ酸残基をコードする。しかし遺伝子はイントロンおよび自然な遺伝子中に存在する遺伝子発現の他の制御要素を含んでなってもよい。
【０１０２】
本発明の１つの適切なＤＮＡセグメントは、野生型タンパク質のＧｌａ−ドメインに対応するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸修飾（挿入、削除、置換）、および野生型タンパク質のＳＰ−モジュールに対応するアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸修飾（挿入、削除、置換）を除き、野生型ヒトＰＣ／ＡＰＣに対する配列に対応するＰＣ／ＡＰＣバリアントを定めるアミノ酸残基配列をコードする。
【０１０３】
他の適当なＤＮＡセグメントはＰＣ／ＡＰＣバリアントをコードし、ここでＧｌａ−ドメインの該修飾（１つまたは複数）は、１０、１１、２８、３２または３３位以外の位置でそのアミノ酸残基配列中に含まれる。好適なＤＮＡ−セグメントは、そのＧｌａ−ドメイン中に修飾Ｈ１０Ｑ、Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｄ２３Ｓ、Ｑ３２Ｅ、Ｎ３３ＤおよびＨ４４Ｙまたは修飾Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｑ３２ＥおよびＮ３３Ｄを、そしてそのＳＰ−ドメインのアミノ酸残基の範囲に修飾された範囲がＷＧＹＲＤＥＴＫＲＮＲ（配列番号７）を含んでなる残基ｎｏ．３００〜３１４を含んでなる修飾を含むＰＣバリアントをコードする。
【０１０４】
加えて本発明は、本ＰＣ／ＡＰＣバリアントをコードする相同的および類似的ＤＮＡ配列、およびそれらに相補的なＲＮＡ配列に関する。
【０１０５】
本ＤＮＡセグメントは、以下（Ｄ章）でさらに説明するように、従来の発現ベクター／宿主細胞系に適するＰＣ／ＡＰＣバリアントを生産するために使用することができる。
【０１０６】
ＤＮＡセグメント自体に関して、これらは周知技術に従い得ることができる。例えば、いったんジデオキシチェーンターミネーションシークエンシング法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）のような通例のシークエンシング法を使用してヌクレオチド配列を決定すれば、該セグメントは、特に大きなＤＮＡセグメントを調製する場合、適当には自動化合成法に従い化学的に合成することができる。大きなＤＮＡセグメントは、周知技術を使用して、本ＤＮＡセグメントを構成する数個の小さいオリゴヌクレオチドを合成し、続いてこのオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションおよび連結して大きなＤＮＡセグメントを形成することにより調製することができる。
【０１０７】
本ＤＮＡセグメントを合成するために化学的方法を使用する場合、もちろん野生型分子中の１以上のアミノ酸残基をコードする適切な塩基の置換、挿入および／または削除により野生型ＰＣ／ＡＰＣをコードするＤＮＡ配列を修飾することは容易である。
【０１０８】
適切には組換えＤＮＡ技術を使用して、修飾された構造遺伝子を含んでなる本ＤＮＡセグメントを調製する。このように遺伝子、すなわち野生型ＰＣ／ＡＰＣをコードするｃＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ分子から出発して、修飾されたＰＣ／ＡＰＣをコードする構造遺伝子を含んでなる本発明のＤＮＡセグメントは、該修飾された組換えＤＮＡ分子の発現後に、置換（置き換え）、削除および／または挿入（付加）のような所望するアミノ酸残基の変化を導入するために該組換えＤＮＡ分子の修飾により得ることができる。これらの変化を達成するために都合が良い１つの方法は、例えばＰＣＲ技術を用いて行う位置指定突然変異誘発法による。ＰＣＲはＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎの略であり、そしてＭｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ（１９８７）により最初に報告された。  
【０１０９】
部位特異的プライマー指定突然変異誘発法は今では当該技術分野で標準的であり、そして合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われ、このプライマーは所望する突然変異（１つまたは複数）を表す限定された誤対合を除き、突然変異させるＤＮＡを含んでなる一本鎖ファージＤＮＡに相補的である。簡単に説明すると、ヘテロロガスなＤＮＡを含むファージＤＮＡに相補的な鎖の直接的合成に対するプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを使用し、そして生じた二本鎖ＤＮＡをファージが支援する宿主細菌中で形質転換させる。形質転換した細菌のカルチャーをトップアガー（ｔｏｐ  ａｇａｒ）にまき、ファージを有する単一細胞からプラークが形成するようにする。この方法では、突然変異させるＤＮＡは一本鎖形で利用できなければならず、これはＭ１３ファージでのクローニング後に得ることができる。位置指定突然変異誘発法も、“ギャップ化二本鎖（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）”法により達成することができる（Ｖａｎｄｅｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｒａｌｅｉｇｈ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，１９８６）。
【０１１０】
本発明の適当な態様に従い、位置指定突然変異誘発法を標準的なＰＣＲ技術で行う（Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ（１９８７））。例示的なＰＣＲに基づく突然変異誘発法は、本明細書中の実験の部に記載する。これらの実施例では、変異体ＤＮＡセグメントの複製がインビトロで行われ、原核でも真核でもなく無細胞を使用する。
【０１１１】
明らかに位置指定突然変異誘発法は、例えば野生型ＰＣ／ＡＰＣをコードし、そして発現するｃＤＮＡ配列または構造遺伝子を含むベクターから始め（該ベクターは少なくともＤＮＡを複製することができる）、そして選択したヌクレオチドを本明細書に記載するように突然変異させて、本発明のバリアントをコードする１以上の本ＤＮＡセグメントを形成することにより、本明細書に記載するＰＣ／ＡＰＣバリアントをコードする本ＤＮＡセグメントを構築するための便利な道具として使用することができる。突然変異したＤＮＡを含む該ベクターの複製は、通常は該ベクターを含む原核細胞である宿主細胞の形質転換後に得ることができる。突然変異誘発、複製、発現およびスクリーニング法の具体的説明は、本明細書の実験の部に記載する。
Ｄ．ＰＣ／ＡＰＣバリアントの調製
ＰＣ／ＡＰＣバリアントをコードする完全なｃＤＮＡ配列または構造遺伝子を含んでなるようなＤＮＡセグメントは、適切な宿主細胞、好ましくは真核細胞中で該ｃＤＮＡの発現によりコードされたバリアントを生産するために使用することができる。一般にそのような本発明のバリアントの調製は、本発明のバリアントをコードするＤＮＡセグメントを提供し；提供されたＤＮＡセグメントを発現ベクターに導入し；ベクターをコンパチブルな宿主細胞に導入し；宿主細胞を該バリアントの発現に必要な条件下で培養し；そして発現したバリアントを宿主細胞から回収する工程を含んでなる。上に挙げた各工程に適切な方法は、本明細書の実験の部に記載する。
【０１１２】
本発明に従い使用することができるベクターはＤＮＡ複製ベクターを含んでなり、このベクターは通常は適切な宿主細胞中でベクターの自律複製能によりこのＤＮＡセグメントの複製をもたらすことができるように、本発明のＤＮＡセグメントに操作可能に連結され得る。
【０１１３】
ＤＮＡの複製だけでなく、本発明のＤＮＡセグメントによりコードされるバリアントの生産も達成するために、該ＤＮＡセグメントは発現ベクター、すなわち中に導入されたＤＮＡセグメントの発現を支配することができるベクターに操作可能に連結される。ＤＮＡの複製および発現は、同じかまたは異なるベクターから達成することができる。
【０１１４】
本発明は組換えＤＮＡ分子も対象とし、これはＤＮＡ複製および／または発現ベクターに操作可能に連結された本発明のＤＮＡのセグメントを含む。
【０１１５】
本発明のＤＮＡのセグメントが操作可能に連結され得るベクターの選択は、例えばタンパク質発現について組換えＤＮＡ分子に望まれる機能的特性、および形質転換される宿主細胞に直接依存することは周知である。市販されている、および／または従来の技術文献に開示された種々のベクターは、そのようなベクターが該ＤＮＡセグメントの複製を支配することができる限り、本ＤＮＡセグメントと共に使用することができる。ＰＣ／ＡＰＣバリアントの構造遺伝子を含むＤＮＡセグメントの場合、好ましくはベクターはベクターが該ＤＮＡセグメントまたは遺伝子に操作可能に連結された時、構造遺伝子も発現することができる。
【０１１６】
本発明の適切な態様は真核細胞発現系、適切には脊椎動物、例えば哺乳動物の細胞発現系に関する。真核細胞で使用することができる発現ベクターは当該技術分野では周知であり、そして幾つかの市販の供給元から入手可能である。一般にそのようなベクターは所望するＤＮＡセグメントの挿入に都合の良い制限部位を含む。典型的なそのようなベクターは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン）、ｐＢＰＶ１／ｐＭＬ２ｄ（インターナショナルバイオテクノロジーズ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社）、ストラタジーン（ラジョラ、カリフォルニア州）から入手可能なｐＸＴ１、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；ロックヴィル、メリーランド州）から寄託番号ＡＴＣＣ３７７２２で入手可能なｐＪ５ω、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）等の真核発現ベクターである。本開示の実験の部では、ｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能、カリフォルニア州、米国）を使用してアデノウイルスでトランスフェクトしたヒト腎臓細胞で使用するための発現プラスミドを得た。
【０１１７】
本発明の組換えＤＮＡ分子を構築するために使用する適当な真核細胞発現ベクターは、真核細胞中で効果的である選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含む。適当な薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性を生じる遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子である、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７−３４１（１９８２）。さらに適切な薬剤耐性マーカーはジェネティシン（Ｇ４１８）に耐性を生じるマーカーである。あるいは選択性マーカーは別のプラスミド上に存在することができ、この場合、２つのベクターが宿主細胞のコトランスフェクションにより導入され、そして選択は選択性マーカーについて適切な薬剤中で培養することにより成される。
【０１１８】
本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換される宿主細胞として使用することができる真核細胞は、細胞培養法、発現ベクターの増殖法および意図する遺伝子産物の発現法と適合する細胞系を使用する限り、どのようにも限定されることはない。適当な宿主細胞には酵母および動物細胞を含む。脊椎動物細胞、そして特に哺乳動物細胞、例えばサル、マウス、ハムスターまたはヒト細胞系が好ましい。適当な真核宿主細胞には、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１で入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８で入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）等の真核組織培養細胞系を含む。本明細書の実験の部では、アデノウイルスでトランスフェクトしたヒト腎臓細胞系２９３（アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能、ロックビル、メリーランド州、米国）を使用した。
【０１１９】
本発明に従い発現系を得るためには、真核細胞、好ましくは哺乳動物の宿主細胞のような適当な宿主細胞は本組換えＤＮＡ分子を用いて、例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，５２：４５６（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：１３７３−７６（１９７９）に開示されている方法のような既知の方法を使用して形質転換される。
【０１２０】
このように本発明のＤＮＡセグメントを真核宿主細胞中で発現させるために、一般に複製起点、本発明のＤＮＡセグメントの上流に位置するプロモーター、リボゾーム結合部位、ポリアデニレーション部位および転写終結部位のような遺伝子発現を制御する機能的配列を含む本発明の組換えＤＮＡ分子を使用する。真核細胞中で本発明のＤＮＡセグメントを発現するために使用するそのような機能的配列は、ウイルスまたはウイルス性物質から得ることができ、または例えば該セグメントが完全な構造遺伝子を含んでなる時、本ＤＮＡセグメント中に本来含まれてもよい。
【０１２１】
真核発現系で使用することができるプロモーターは、このようにアデノウイルス２、ポリオーマウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のようなウイルスから得ることができる。特にアデノウイルス２の主要後期プロモーターおよびＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーターが好適である。
【０１２２】
適当な複製起点は、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、ＳＶ４０、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）のようなウイルスに由来することもできる。あるいはもし宿主の染色体に組み込むことができるベクターを発現ベクターとして使用する場合、宿主染色体の複製起点を利用してもよい。
【０１２３】
たとえ真核発現系が好適であっても、原核発現系を本発明と共に使用することもできる。さらに原核系は本発明のＤＮＡセグメントの複製または増幅を行うために有利に使用し、続いて該原核系で生産されたＤＮＡセグメントを、コードされた産物の発現に例えば真核発現系で使用することができる。
【０１２４】
このように本発明の原核ベクターには原核レプリコン、すなわちそれらで形質転換される細菌宿主細胞のような原核宿主細胞中での自律複製および組換えＤＮＡ分子の染色体外での維持を支配する能力を有するＤＮＡ配列を含む。そのようなレプリコンは当該技術分野では周知である。加えて、原核レプリコンを含むそれら態様は遺伝子も含み、この発現はそれにより形質転換される細胞宿主に薬剤耐性を付与する。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【０１２５】
原核系を使用する場合、ＤＮＡ複製のためだけでなく発現系としても原核レプリコンを含むこれらベクターは、それにより形質転換される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主細胞中で、構造遺伝子を含む本ＤＮＡセグメントの発現、すなわち転写および翻訳を支配することができる原核プロモーターも含む。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こることを可能とするＤＮＡ配列により形成される発現制御要素である。
【０１２６】
細菌宿主と適合性があるプロモーター配列は、典型的には本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合が良い制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。そのようなベクタープラスミドの典型は、カリフォルニア州、リッチモンドのバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）から入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、およびスウェーデンのファルマシアから入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。
【０１２７】
したがって本発明の遺伝子産物を発現することができる原核発現系を得るために、適切な原核宿主細胞は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．モレキュラークローニング、ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８２）に開示されているように、典型的には使用するベクターの種類に依存する周知の方法に従い、本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換される。
【０１２８】
もちろん成功裏に形質転換された原核または真核細胞を、非形質転換細胞から区別し、そして分離することが必要である。このために様々な方法が知られ、そして従来の技術文献に記載されたきた。
【０１２９】
そのような方法に従い、組換えＤＮＡの存在は形質転換手順に供された細胞に由来するモノクローナルコロニーのＤＮＡ含量を調査することによりアッセイされる。そのような方法はＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５）およびＢｅｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ，３：２０８（１９８５）により開示された。
【０１３０】
成功裏の形質転換は、例えば発現した遺伝子産物に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用した周知の免疫学的方法により、あるいは発現した遺伝子産物の生物学的活性の検出により確認することもできる。
【０１３１】
このように発現ベクターで成功裏に形質転換された細胞は、表示される抗原性または生物学的活性により同定することができる。このために、形質転換したと思われる細胞のサンプルを回収し、そして該生物学的活性または抗原性のいずれかについてアッセイする。
【０１３２】
そのように選択された、成功裏に形質転換された細胞を使用して、上に開示した所望のＰＣ／ＡＰＣバリアントを生産する。
Ｅ．生物学的活性のアッセイ
本発明のＰＣ／ＡＰＣバリアントの生物学的活性をアッセイするために適当な方法は、ＡＰＴＴ系のような血漿凝固系、および精製された第ＶＩＩＩａ因子および第Ｖａ因子の分解に関する試験に基づく。そのような方法は本明細書の実験の部により詳細に開示する。
Ｆ．組成物
本ＰＣ／ＡＰＣバリアントは典型的には意図する使用に適する組成物の形態で提供される。そのような組成物はＰＣ／ＡＰＣバリアントの生物学的活性を保存し、そしてそれらの安定性が与えられるべきである。適当な組成物は、例えば生理学的に耐容され得る担体と組み合わせた治療的に活性な量の本発明のバリアントを含む治療用組成物である。適切にはそのような組成物は凍結乾燥されている。さらに該組成物はそれらの抗凝固活性を強化するために、プロテインＳおよび／または第Ｖ因子のような治療に活性な量のさらなる有効成分も含むことができる。プロテインＣはカルシウム依存性タンパク質であるので、適当には本発明の組成物は二価のカルシウムも好ましくは生理学的な量で含む。
【０１３３】
一般に、そして具体的な治療用組成物において、組成物の形態の設計に関連して考慮する配慮は当業者には周知であり、これらをさらに詳細に記載する必要はない。
Ｇ．治療法
本発明に従い、本ＰＣ／ＡＰＣバリアントは強化された抗凝固活性を現すことが示された。すなわち本発明は個体、例えばヒトの凝血を抑制する方法にも関し、該方法は該個体に治療的に有効量の本発明のバリアントＰＣ／ＡＰＣを含んでなる組成物を投与することを含んでなる。処置することができる状態は、本明細書のいたるところに開示する。
【０１３４】
組成物について、治療法の計画に関連して考慮する配慮、例えば適当な投薬用量範囲および投与経路は当業者には周知であり、したがってこれらの方法をさらに詳細に記載する必要はない。
【０１３５】
しかし簡単に説明すると、本プロテインＣバリアントは種々の投与経路を介して投与することができる。例えばプロテインＣバリアントは非経口投与、経口投与、または鼻内投与のための組成物として調製することができる。このように血流への効果的送達を確実とするために、プロテインＣバリアントを静脈内注射、連続注入、ボーラス注射またはそれらの組み合わせにより投与することができる。あるいはプロテインＣバリアントは血流へのゆっくりとした放出を望む場合、皮下に投与することができる。
【０１３６】
プロテインＣバリアントの適切な用量は、処置する個体の年齢、性別および全体的な健康状態のような様々な状況を考慮して担当医師により容易に決定され得る。有効な用量は０．０２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ未満の血漿範囲、適当には０．２〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２〜６０ｎｇ／ｍｌ、そして特に４０〜５０ｎｇ／ｍｌを生じるべきである。このように望ましくない血液凝固を抑制するために、多くの血栓塞栓状態の処置法で、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ／日の用量の注射を、１日に１〜６回、１〜１０日間使用することができる。
【０１３７】
好ましくは非経口投与用の調製物は、水性の生理学的バッファー溶液中の液体溶液または懸濁液からなる。経口投与には、錠剤またはカプセルが適当な単位剤形である。
Ｈ．考察
本発明は少なくとも１つの修飾を、野生型ＰＣの各Ｇｌａ−およびＳＰ−ドメインを含むＰＣ−バリアントに関する。
【０１３８】
本明細書の実験の部で調製した本発明の具体的なバリアントは、突然変異した配列番号５の配列を含むバリアントのＧｌａ−ドメイン中の突然変異を、３００〜３１４位を含んでなるアミノ酸残基の範囲中のＳＰ−ドメイン中の突然変異と組み合わせ、この突然変異した配列は突然変異した配列番号７の配列に対応する。さらなるバリアントはＳＰ−ドメイン中の前記突然変異、すなわち突然変異した配列番号７を、Ｇｌａ−ドメイン中の突然変異Ｓ１１Ｇ、Ｓ１２Ｎ、Ｑ３２ＥおよびＮ３３Ｄと組み合わせて含む。
【０１３９】
以前に発明者はＧｌａ−ドメインにのみ突然変異を含むＰＣ−バリアント、およびＳＰ−ドメインにのみ突然変異を含むＰＣ−バリアントも研究した。後者のＰＣ−バリアント（“ＳＰ−変異体”）は国際公開第９８／４４  ０００号パンフレットに記載されたが、“Ｇｌａ−変異体”は２００１年３月２日に出願された米国特許仮出願第６０／２７２，４６６号明細書に開示されている。
Ｈ（１）Ｇｌａ−突然変異
Ｇｌａ−変異体に関する上に挙げた研究では、配列番号５の配列を有し、そしてＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）と命名した突然変異したＧｌａ−ドメインを含むバリアントが、ｗｔＡＰＣよりも抗凝固的であり、そしてまた以前に報告されたＧＮＥＤまたはＱＧＥＤ（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、同上により記載されている）のようなＧｌａ−ドメインよりも抗凝固的であることが分かった。ｉ．ａ．２つのバリアントＱＧＮおよびＳＥＤＹのいずれも増加した抗凝固活性、増加した抗凝固活性または負に荷電したリン脂質膜に対する増加した親和性を現さないか、またはわずかに現すだけなので、このバリアントがさらに強化された活性を現すことは極めて驚くべきことである。これはＧｌａ−ドメインの膜結合能が大変複雑であり、そして単一のアミノ酸置換により容易に影響を受けないことを示唆している。Ｇｌａ−ドメインの多くの領域が突然変異した時のみ、一層強化されたリン脂質親和性および一層増加した抗凝固活性を現すＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）のような独自のバリアントを得ることが可能である。
【０１４０】
ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）の抗凝固活性はプロテインＳにより強化され（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ）、これはＳｍｉｒｎｏｖ  ａｎｄ  Ｅｓｍｏｎにより米国特許第５，８３７，８４３号明細書に記載されたキメラＡＰＣバリアントの活性とは対照的である。このバリアントはプロテインＣとプロトロンビンとの間のハイブリッドであり、ここでプロトロンビンＧｌａ−ドメインはプロテインＣ（ＰＣ）中の対応するＧｌａ−ドメインに置き換えられている。強化されたリン脂質結合により、このＰＣ／ＡＰＣバリアントは野生型ＡＰＣよりも抗凝固的であるが、その活性はプロテインＳにより強化されない。
【０１４１】
また欧州特許第０２９６４１３Ａ２号明細書は、プロトロンビンとＰＣだけでなくＦＶＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸとＰＣとの間のプロテインＣとのハイブリッドに関する。これらのバリアントはプロトロンビン、ＦＶＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸに由来するＧｌａ−ドメインおよびＰＣに由来する残りを含む。しかしこれらのバリアント中、Ｇｌａ−ドメインは最初のＮ−末端４３アミノ酸残基に限られ、すなわちこれらのバリアントはｗｔプロテインＣの４４位の修飾されたアミノ酸残基を含まない。そこではこれらのバリアントが凝血形成に対して改善された活性、または改善された繊溶促進効果を有すると述べられているが、これらのバリアントはそのような活性に関して十分に特性が決定されなかった。ＦＸ／ＰＣハイブリッドのみが調製そして特性決定され、そしてこのハイブリッドが第Ｖａ因子の改善された不活性化とは別に、ｗｔＰＣよりも改善された抗凝固特性を有することは見いだされなかった。
【０１４２】
本バリアントＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）が持つさらに全く予期せぬ利点は、Ａｒｇ３０６でＦＶａを開裂することができるので、ＡＰＣにより攻撃される主要な開裂部位、すなわちＡｒｇ５０６位で突然変異した突然変異ＦＶａ（ＦＶ：Ｑ５０６またはＦＶＬｅｉｄｅｎと命名）を正に開裂することができるということである。この突然変異した第Ｖａ因子は、ＡＰＣ−耐性と名付けられた共通の血液凝固障害に存在する。したがってＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）がＦＶａをＡｒｇ３０６で開裂する能力は、開裂した時、ＦＶａの完全な不活性化をもたらす部位であるＡｒｇ３０６の開裂が大変悪い野生型ＡＰＣよりも有利である。このように野生型ＡＰＣとは対照的に、本バリアントＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）は活性化ＦＶ：Ｑ５０６を開裂し、そして不活性化することができる。Ａｒｇ５０６での開裂とは対照的に、Ａｒｇ３０６での開裂はプロテインＳにより強化される。しかし本バリアントＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）のさらなる利点は、これがたとえプロテインＳが不在でも活性化ＦＶ：Ｑ５０６を開裂することである。さらにこの開裂はたとえプロテインＳが必要でなくてもプロテインＳにより刺激される。本バリアントＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）が活性化第Ｖ因子をＡｒｇ３０６で開裂する能力は、ＡＰＣ−耐性の患者にも抗凝固物質として魅力的となる。
Ｈ（２）ＳＰ−変異体
国際公開第９８／４４  ０００号パンフレットでは、発明者はＰＣのＳＰ−ドメイン中の修飾、そして具体的には配列番号７の突然変異した配列を含む修飾ＳＰ−ドメインに関する調査を報告する。
【０１４３】
これはウシＳＰモジュールの対応するアミノ酸配列と同一である野生型ヒトプロテインＣに比べて短縮化されたアミノ酸配列（配列番号７）である。ＳＰモジュールのヒト、ウシ、ラットおよびマウスの配列間の比較により、ラットおよびマウスのＰＣ／ＡＰＣ分子がウシＰＣ／ＡＰＣの場合よりもヒトＰＣ／ＡＰＣに類似することが明らかになったので、ヒトＰＣ／ＡＰＣ中に削除および置換突然変異を含んでなり、３００〜３１４アミノ酸配列をウシＰＣ／ＡＰＣの対応する配列と同一とした変異体を調製し、そして調査した。反対に挿入および置換突然変異をウシＰＣ／ＡＰＣに導入してヒトＰＣ／ＡＰＣのアミノ酸３００〜３１４番に相当するウシの配列を延長し、そしてその配列をヒトのアミノ酸配列Ｎｏ．３００〜３１４と同一とした。本明細書の実験の部および国際公開第９８／４４０００号パンフレットでは、ヒトＰＣ／ＡＰＣおよびウシＰＣ／ＡＰＣの変異体の単離および特性決定が記載されている。標準的なＰＣＲ技術（Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ（１９８７），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５，３３５−３５０）を使用して、上記の削除、置換および挿入突然変異を、ヒトＰＣ／ＡＰＣおよびウシＰＣ／ＡＰＣのｃＤＮＡに作成した。このように真核系でこれら突然変異したｃＤＮＡの発現後、配列番号７の配列を含んでなる突然変異ヒトＰＣ／ＡＰＣ分子および配列番号６の配列を含んでなる突然変異ウシＰＣ／ＡＰＣ分子が生産され、そして均一に精製された。さらに野生型ヒトおよびウシプロテインＣ／ＡＰＣのｃＤＮＡをこの真核系で発現し、そして発現産物を均一に精製した。これらの手順で得られた精製した野生型ＰＣ／ＡＰＣ分子およびそのバリアントを特性決定するために、これらの分子をトロンビンで活性化し、そしてトロンビン活性化産物をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーにより分離した。次いで単離されたＰＣ／ＡＰＣ分子の機能的特性を特性決定した。上に述べたｃＤＮＡの発現、そして続く精製手順により得られた種々のＰＣ／ＡＰＣ構築物は以下のように称する：ｗｔ−ｈＰＣ／ＡＰＣ、野生型ヒトＰＣ／ＡＰＣ：Δ−ｈＰＣ／ＡＰＣ、配列番号７の配列に対応する短縮化配列を含んでなるヒトプロテインＣ；ｗｔ−ｂＰＣ／ＡＰＣ、野生型ウシＰＣ／ＡＰＣ：ｉｎｓ−ｂＰＣ／ＡＰＣ、配列番号６の配列に対応する延長された配列を含んでなるウシＰＣ／ＡＰＣ。これらの変異体、Δ−ｈＰＣ／ＡＰＣおよびｉｎｓ−ｂＰＣ／ＡＰＣはそれぞれヒトＡＰＣ−ＳＰおよびウシＡＰＣ−ＳＰとも命名し、後者の名称を以下の実施例１およびこの実施例に関する図面で主に使用する。
【０１４４】
以下の実施例１から明らかであるように、標準的なＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、これら組換えＰＣ／ＡＰＣ構築物は還元および非還元条件下の両方で泳動した時、予想された分子量を有した。アミド分解活性、すなわちＳ−２２３８（クロモジェニックス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）社、メルンダル、スウェーデン）のような低分子量物質に対するタンパク質分解活性を特性決定し、そして突然変異したヒトＰＣ／ＡＰＣ（Δ−ｈＰＣ／ＡＰＣ）が野生型ヒトＰＣ／ＡＰＣよりもこの基質に対して一層高い活性を有することが観察された。一方、ウシの突然変異（ｉｎｓ−ｂＰＣ／ＡＰＣ）は、合成基質に対して一層低い活性を有し、これはたとえ突然変異が活性部位から幾らか離れて位置しても、削除／挿入突然変異がＰＣ／ＡＰＣの触媒部位に影響を及ぼすことを示唆した。
【０１４５】
すなわちこの以前の調査では、突然変異がＰＣ／ＡＰＣの活性部位から幾らか離れて位置するＰＣ／ＡＰＣのＳＰ−モジュール中の突然変異が、強化されたタンパク質分解、そしてより具体的には強化されたアミド分解活性により強化された抗凝固活性を有するＰＣ／ＡＰＣバリアントを生じることができるということが予期せずに明らかとなった。本突然変異はこの活性部位内またはそれに隣接して位置しないという結論は、ＡＰＣの公開された仮説の分子モデルおよびＡＰＣのＳＰ−モジュールの３次元的構造について説明されたモデルに基づき、これはＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，１５：６８１０−６８２１（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ）に開示されている。これらのモデルから、上で述べた構築物中に含まれる突然変異は、ＳＰ−モジュールのループ５に位置し、このループは活性部位の領域と直接接触していない。
【０１４６】
本明細書の実験の部では、上記組換えＰＣ／ＡＰＣ分子の合成的基質開裂のキネティックスが、国際公開第９８／４４０００号パンフレットに報告されたように特性決定され、すなわちＫｍ、Ｖｍａｘおよびｋｃａｔの値が以下の実施例１により詳細に説明されているように基質濃度を変化させることにより決定された。国際公開第９８／４４０００号パンフレットに報告されたように、Ｋｍ値の減少が見いだされ、この基質に対する種々のＡＰＣ−分子の親和性がより高いことが示唆された。さらにＶａｍｘ値は大変異なり、Δ−ｈＰＣ／ＡＰＣはｗｔ−ｈＰＣ／ＡＰＣのＶｍａｘより少なくとも７倍高いＶｍａｘ値を有し；一方、ｉｎｓ−ｂＰＣ／ＡＰＣは明らかに低いＶｍａｘ値を有したが、Ｋｍ値はほとんど影響を受けなかった。これらの結果はΔ−ｈＰＣ／ＡＰＣの上昇した活性が、突然変異により引き起こされた上昇した触媒活性と基質に対する上昇した親和性の組み合せに依ったことを示唆している。
【０１４７】
さらに国際公開第９８／４４０００号パンフレットおよび以下の実施例１に報告されるように、上で述べた突然変異ＰＣ／ＡＰＣ分子の抗凝固活性をＡＰＴＴに基づく血漿凝固系（活性化部分トロンボプラスチン時間：ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｔｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ  ｔｉｍｅ）反応（本来の経路による活性化）で測定した。これらの試験では、ヒト血漿に加えた時、Δ−ｈＰＣ／ＡＰＣはｗｔ−ｈＰＣ／ＡＰＣに比べて抗凝固応答を強化したことが観察された。加えるウシプロテインＳが存在しなければ、ｗｔ−ｂＰＣ／ＡＰＣおよびｉｎｓ−ｂＰＣ／ＡＰＣは両方とも大変悪い抗凝固応答を有するが、これら両方のウシ組換え化合物は反応混合物にウシプロテインＳも含めた時、明らかな抗凝固活性を現した。
【０１４８】
上記の結果は報告されたヒトＡＰＣ中の削除−突然変異がヒト血漿に存在する天然の基質に対して強化された活性を導いたが（ＦＶａおよびＦＶＩＩＩａ）、報告されたウシＡＰＣ中の挿入−突然変異はたとえ合成基質に対する活性が損なわれても天然基質に対する反応性に有意に影響を及ぼさなかったことを示す。ヒトＡＰＣ中の削除突然変異が実際に天然基質ＦＶＩＩＩａに対するタンパク質分解活性の上昇を導くことを確認するために、精製された成分（以前に記載された系、Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｄａｈｌｂｅａｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９：１８７３５−１８７３８）を使用してＦＶＩＩＩａ分解系における組換えＡＰＣの効果を、国際公開第９８／４４０００号パンフレットに報告されたように調査した。この系はＦＩＸａ、ＦＶＩＩＩａ、リン脂質小胞およびカルシウムを含み、そしてＦＶＩＩＩａの活性はＦＸの添加により、そして短いインキューベーション時間の後、ＦＸａに対する合成基質の添加でも測定した。種々のＡＰＣ分子の効果は、ＡＰＣをその相乗的コファクターであるプロテインＳ（ＡＰＣと同じ種の）およびウシＦＶと一緒に加えることにより試験した。この系では、Δ−ｈＰＣ／ＡＰＣがｗｔ−ｈＰＣ／ＡＰＣによりも高い活性を有することが明らかであったが、２つのウシＰＣ／ＡＰＣは互いに比較的類似していた。精製したＦＶａの分解に関して、種々のＡＰＣは試験しなかったが、Δ−ｈＰＣ／ＡＰＣはｗｔ−ｈＰＣ／ＡＰＣよりも高い活性を有することが予想される。ヒトおよびウシＡＰＣに導入された変化は阻害速度に影響するかもしれないので、突然変異ＡＰＣ分子の阻害速度をヒト血漿中で試験した。すなわちＡＰＣを血漿に加え、そして種々の間隔で、残るアミド分解活性を測定した。突然変異したヒトの分子が野生型ヒトＡＰＣと同じ半減期を有することが分かり、突然変異はセルピンによる阻害速度に影響しないことが示唆された。これをさらに試験するために、突然変異および野生型ＡＰＣの精製ＰＣＩおよびα１ＡＴによる阻害速度を試験し、そして本質的に同一であることが分かった。他方、ウシＡＰＣおよび突然変異ウシＡＰＣはα１ＡＴにより阻害されず、これは阻害速度の決定に関与する突然変異した領域についての仮説が正しくないこと、すなわちヒトおよびウシＡＰＣの異なるの阻害パターンに関する説明は、同定された配列の差異により生じなかったが、別の配列の差異をさらに定めるべきであることを示している。
【０１４９】
結論すると、実施例１で報告する結果は、ｈＡＰＣ中の削除−突然変異が天然基質ＦＶＩＩＩａおよびＦＶａに対して、ならびに低分子量基質に対して、より高い触媒活性を有する分子を導く一方、この突然変異はセルピンによる阻害速度に影響をおよぼさなかったことを示す。
Ｈ（３）組み合わせたＧｌａ−およびＳＰ−ドメイン変異体
Ｇｌａ−およびＳＰ−モジュールに関する知見に基づき、発明者はＧｌａ−ドメインおよびＳＰ−ドメインの両方に修飾を含むＰＣ／ＡＰＣバリアントが、ｗｔＰＣ／ＡＰＣだけでなく、好ましくは上に挙げたＰＣ／ＡＰＣのＧｌａ−およびＳＰ−変異体よりも改善された特性を有するＰＣ／ＡＰＣバリアントを提供できることを認識した。
【０１５０】
修飾されたＧｌａ−ドメインおよび修飾されたＳＰ−ドメインの組み合わせが、Ｇｌａ−ドメインまたはＳＰ−ドメイン中の修飾により該変異体に付与される改善された特性を完全に破壊し得る相互作用を導かなければ、該組み合わせ変異体は、Ｇｌａ−およびＳＰ−変異体の一方によっては現されない、さらに強化された抗凝固活性および／またはｗｔＰＣ／ＡＰＣよりも改善された特性の組み合わせを示すであろう。
【０１５１】
例えば上記Ｈ（１）で示したように、ＦＶ  Ｌｅｉｄｅｎを開裂する強化された能力、およびまた強化されたタンパク質分解、例えばアミド分解活性により強化された抗凝固活性を有するＡＰＣバリアントを得ることができる。
【０１５２】
したがって実施例８に具体的に説明するように、発明者は配列番号５の修飾されたＧｌａ−ドメインおよび配列番号７の修飾された配列を含むＳＰ−ドメインを含む好適なＰＣ／ＡＰＣバリアントを調製した。実施例８に示すようにＡＰＴＴ試験では、このバリアントがｗｔＰＣ／ＡＰＣよりも一層強化された抗凝固活性を有する。
【０１５３】
さらに発明者は、Ｇｌａ−ドメインが突然変異Ｇ１１Ｎ１２Ｅ３２Ｄ３３を含み、そしてＳＰ−ドメインが配列番号７の修飾された配列を含むＰＣ／ＡＰＣバリアントを調製した。このバリアントもｗｔＰＣ／ＡＰＣよりも改善された抗凝固活性を現す（実施例９を参照にされたい）。
Ｉ本ＰＣ／ＡＰＣバリアントの潜在的用途
ＡＰＣへの活性化後に強化された抗凝固活性を現す組換えプロテインＣ分子が、可能性のある治療用化合物、およびプロテインＣ系の他の成分のための種々の生物学的アッセイで使用される試薬としての両方で大きな潜在的用途を有することは明らかである。本発明に従い、突然変異がプロテインＣ分子のＧｌａモジュールおよびＳＰ−モジュールの両方に存在する場合、例えば強化された膜結合活性、および強化されたタンパク質分解、例えばアミド分解活性によっても実質的に強化された抗凝固活性を有するバリアントプロテインＣを得ることができることが示された。すなわちそのような突然変異の系統的調査により、さらに良い特性を有する他のプロテインＣ分子を生産することができると期待できる。例えばＧｌａ−ドメイン中の特別な突然変異を選択することにより、より高い特異的機能を持つＡＰＣ分子、例えばＦＶａをＡｒｇ３０６で開裂するさらなる分子を設計し、すなわち血液凝固障害であるＡＰＣ−耐性に存在する該突然変異ＦＶを十分よく分解するさらなるＡＰＣバリアントを生産することが可能となり得る。ＳＰ−ドメイン中の特別な突然変異の選択は、ＦＶＩＩＩａに対して主に働く、またはＦＶａを主に開裂するＡＰＣ分子を設計することを可能にすることができる。
【０１５４】
強化された抗凝固活性を発現する本プロテインＣバリアントは、望ましくない血液凝固が抑制されるすべての状況に有用になると想定する。すなわち本バリアントは血栓症および他の血栓塞栓状態を防止または処置するために使用することができる。そのような状態の具体例は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、アテローム硬化症、心筋梗塞、種々の凝固能亢進性状態および血栓塞栓症、およびまた敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）および敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）である。本バリアントは、例えば心筋梗塞に関連した、および手術に関連した血栓溶解治療後の血栓症の予防に、およびＡＰＣ−耐性（先天的または後天的）またはプロテインＣ欠損症（先天的または後天的）の処置に使用することもできる。本プロテインＣバリアントとプロテインＳ（野生型プロテインＳまたはそのバリアント）との組み合わせは有用であり、この組み合わせにはＡＰＣのコファクターとしての活性を現す第Ｖ因子を含むこともできる。
【０１５５】
さらにＡＰＣは多くの活性を有し、例えばこれは抗血栓活性を現すだけでなく、プロフィブリン溶解、抗炎症および抗アポトーシス活性も現すので、本ＡＰＣバリアントは重篤な敗血症、血栓症および発作のような種々の複雑な医学的障害の処置に有力な役割を有する。ＡＰＣは全身的な抗凝固物質および抗炎症因子でもあり、そして敗血症、虚血、損傷および発作の動物モデルでは臓器の損傷を減らすことが見いだされた。これはまた、重篤な敗血症患者において、死亡率を実質的に下げる。
【０１５６】
ＡＰＣバリアントのさらなる潜在的用途は、神経病理的障害または脳炎症疾患、例えば発作、アルツハイマー病のような様々な種類の神経障害がある神経変性疾患および種々の自己免疫疾患を有する個体の処置である。
【０１５７】
本ＰＣ／ＡＰＣバリアントは天然ＡＰＣと同じ条件の処置にも使用することができると構想する。
【０１５８】
本ＰＣ／ＡＰＣバリアントの診断的用途に関して、プロテインＳに関する改善された機能的アッセイおよびまた第Ｖ因子の抗凝固活性にも大きな必要性がある。強化された膜結合および強化されたタンパク質分解、適当にはアミド分解活性により、強化された抗凝固活性を有する突然変異ＡＰＣは、そのようなＡＰＣがより強いシグナルを与え、そしてこれが種々のアッセイでノイズに対して増加したシグナル比を導くので、そのようなアッセイに大変有用となるだろう。ＳＰ−変異体について、これはアミド分解活性がここに開示する変異体ｈＡＰＣが正常（ｎｏｒｍａｌ）ＡＰＣよりも高く、そしてまた抗凝固効果も該変異体ｈＡＰＣが標準ＡＰＣよりも一層高いことを示す実施例１で報告された突然変異ＡＰＣ分子の最初のインビトロ特性決定により確認される。この突然変異分子とそのコファクターであるプロテインＳおよび完全なＦＶとの相互作用は、ＳＰ−モジュール中の突然変異にはより影響を受けなったようであり、これはインビトロ試験で突然変異ｈＡＰＣ（Δ−ｈＡＰＣ）を使用する概念が正しいことを示唆している。
【０１５９】
Ｇｌａ−モジュールおよびＳＰ−モジュール中の突然変異の組み合わせを、プロテインＣの他の部分中のさらなる突然変異と組み合わせて、大変独特な特性を持つプロテインＣを生成することも可能となる。イーライ  リリー（Ｅｌｙ  Ｌｉｌｌｙ）の科学者（Ｅｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｍｂｏ．Ｊ．１９９０，９：２３６７−２３７３；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２，３６０：２６１−２６４）および他のグループは、活性化ペプチド領域周辺の突然変異がＴＭ（トロンボモジュリン）の不存在下でも容易に活性化されるプロテインＣを生じたことをすでに示した。同様に、活性化ペプチド領域中の別の組の突然変異が、合成している細胞から活性化形で分泌されるプロテインＣ分子を導いた（Ｅｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９，２６４：１４２９８−１４３０４）。また本突然変異と、ＡＰＣとそのコファクターとの間の相互作用を強化することができる将来の突然変異との組み合わせも企図する。
【０１６０】
もちろん本発明はそれらの生産様式とは無関係に本明細書に定めるプロテインＣバリアントを対象とする。前の章、例えばＤ章では、幾つかの適切な方法を開示する。
【０１６１】
しかしトランスジェニック動物に関する方法のような他の方法が有用になると予見する。例えばヒトプロテインＣを乳の中に生産するトランスジェニックブタが開示されているサイエンティフィックアメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ）、１９９７年１月、のＶｅｌａｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，「薬剤工場としてのトランスジェニック家畜（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）」を引用する。このように本プロテインＣバリアントを生産するトランスジェニック動物を得ることができると思われる。
実験の部
以下の実施例では、本発明を具体的に説明する適切な態様を開示する。しかしこれらの実施例は本発明を限定すると解釈されるべきではない。この中で特に言及しない限り、ヒトＰＣ／ＡＰＣバリアントを調製し、そしてヒト凝固因子、血漿等を使用した。
【０１６２】
これらの実施例で以下の材料を使用した。
【０１６３】
ヒトα１−アンチトリプシン（α１ＡＴ）およびプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）は、それぞれＣａｒｌ−Ｂ．Ｌａｕｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｇａｒｅｔａ  Ｋｊｅｌｌｂｅｒｇ博士からの好意により与えられた（スウェーデン、マルメの大学病院の臨床化学部）。ＨＰＣ４免疫アフィニティーカラムはＣｈａｒｌｅｓ  Ｔ．Ｅｓｍｏｎ博士（ハワード  ヒュー医学研究所、オクラホマ医学調査基金、米国）から得た。Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＦＦＱ）およびＯｃｔｏｎａｔｉｖｅＭ（第ＶＩＩＩ因子の供給源として）は、スウェーデンのファルマシアから購入した。リポフェクチンおよびジェネティシン（Ｇ４１８）は、スウェーデンのライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社から入手することができ、そしてダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）はギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社から入手可能である。精製されたウシ第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、リン脂質小胞および発色基質Ｓ−２２２２は、スウェーデンのクロモジェニック社のＳｔｅｆｌｅｎ  Ｒｏｓｅｎ博士の好意により贈られた。ヒルジンは米国のシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社から得、そしてＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）は米国のカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から得た。ウシ第Ｖ因子、α−トロンビンおよびヒトプロテインＳならびにウシプロテインＳは以前に記載された方法に従い精製した（Ｄａｈｌｂａｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０：Ｄａｈｌｂａｅｋ  ａｎｄ  Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，１９９４）。
【実施例１】
【０１６４】
プロテインＣのＳＰ−変異体
この実施例は国際公開第９８／４４００号パンフレットに対応する。
（ａ）位置指定突然変異誘発法
Ｊｏｈａｎ  Ｓｔｅｎｆｌｏ博士（スウェーデン、マルメの大学病院の臨床化学部）の好意により贈られた完全長のヒトプロテインＣのｃＤＮＡクローン、およびＤｏｎａｌｄ  Ｆｏｓｔｅｒ博士（ザイモジェネティックス：ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）社、米国）から親切にも提供された完全長のウシプロテインＣのｃＤＮＡクローンは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩにより別々に消化し、そして生成した完全長のプロテインＣのｃＤＮＡであるヒトまたはウシのいずれかの完全なＰＣコード領域を含んでなる制限断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化した発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶにクローン化した。
【０１６５】
野生型のヒトまたはウシプロテインＣのコード配列を含む生成した発現ベクターを、プロテインＣのＳＰ−モジュールの位置指定突然変異誘発法に使用し、ここで標的ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲ手順を以下に記載し、そして以下の反応スキームに示すように行った（スキームＩ）。この手順に使用したプライマーのヌクレオチド配列を、以下の表Ｉに掲げる。
【０１６６】
【表７】
2005518801.tif 000009
【０１６７】
突然変異したヒトプロテインＣのｃＤＮＡを得るために、５’末端アミノ酸から３１３位までのコード領域を含むヒトプロテインＣのｃＤＮＡの断片を、鋳型として完全なヒトプロテインＣのｃＤＮＡおよび１対のプライマーＡおよびＢを使用して増幅した。プライマーＢは突然変異誘発性オリゴヌクレオチドであった（スキーム１のＰＣＲ１）。一部が第１断片と重複する３０３位後の残りのアミノ酸を含むヒトプロテインＣのｃＤＮＡの第２断片は、鋳型として完全なヒトプロテインＣのｃＤＮＡおよび１対のプライマーＣおよびＤを使用して増幅し、プライマーＣは突然変異誘発性オリゴヌクレオチドであった（スキーム１のＰＣＲ２）。
【０１６８】
上記ＰＣＲ増幅手順から、２つの部分的に重複した二本鎖ｃＤＮＡ断片が得られ、この両方が突然変異したＤＮＡ配列を含んだ。これら２つのｃＤＮＡは、さらなるＰＣＲ手順で２つのプライマーＡおよびＤと一緒に鋳型として使用して、所望する突然変異アミノ酸を含む完全長のヒトプロテインＣのｃＤＮＡを増幅した（スキーム１のＰＣＲ３）。
【０１６９】
上記各ＰＣＲ反応の試薬混合物は、０．２５μｇの鋳型ＤＮＡ、２００μＭの各デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰ）、０．５μＭの各プライマーおよび２．５ＵのＰｗｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４および２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ８．８５）中に含む１００μｌであった。サンプルは、９４℃で２分の変性期間、５５℃で２分のアニーリング期間、そして７２℃で２分の延長期間からなる３０サイクルのＰＣＲにかけた。増幅後、ＤＮＡは１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸バッファー中で０．８％アガロースゲルの電気泳動にかけた。すべてのＰＣＲ増幅産物は、ＪＥＴプラスミドＭｉｎｉｐｒｅｐ−キット（サビーンバイオテック（Ｓａｖｅｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社、スウェーデン）を使用することにより精製した。
【０１７０】
所望する突然変異を含有する生成したヒトプロテインＣのｃＤＮＡは、ＳａｃＩＩおよびＡｐａＩで消化し、そして次いでＳａｃＩＩおよびＡｐａＩ消化からの断片（ヌクレオチド７２８〜１３１１）を、完全なヒトプロテインＣ断片を含むベクターｐＵＣ１８にクローン化して（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩＩ、５’末端−ヌクレオチド７２８；およびＡｐａＩ−ＸｂａＩ、ヌクレオチド１３１１−３’末端）、所望の突然変異、すなわち配列番号６のヒト野生型配列の代わりに突然変異した配列番号７の配列を含んでなるヒトプロテインＣをコードするヒトプロテインＣの完全長ｃＤＮＡを生成した。
【０１７１】
さらにウシプロテインＣのｃＤＮＡを突然変異させ、そして突然変異したｃＤＮＡは、異なるプライマーおよび鋳型を使用したことを除き、本質的に上記に開示したように増幅させた。所望の突然変異を含むウシプロテインＣのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅産物は、ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで開裂し、そしてＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩでの消化に由来する断片（ヌクレオチド６００〜１１２３）を、完全なウシプロテインＣ断片を含むベクターｐＵＣ１８にクローン化して（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ、５’末端−ヌクレオチド６００；およびＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ、ヌクレオチド１１２３−３’末端）、ベクターｐＵＣ１８中に突然変異したウシプロテインＣの完全長ｃＤＮＡを生成し、その後にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを使用して所望の突然変異を含む、すなわち配列番号７のウシ野生型配列の代わりに突然変異した配列番号６の配列を含んでなるウシプロテインＣ変異体をコードするウシプロテインＣの完全長ｃＤＮＡを開裂した。
【０１７２】
次いで上記突然変異した各ヒトおよびウシプロテインＣのｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そして適切な制限断片をベクターｐＲｃ／ＣＭＶにクローン化し、これを同じ制限酵素で消化した。得られたベクターは突然変異したヒトまたはウシプロテインＣの真核細胞中での発現に使用した。
【０１７３】
適切な宿主細胞のトランスフェクション前に、すべての突然変異はＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，同上のジデオキシチェーンターミネーション法によるＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【０１７４】
上記の位置指定突然変異誘発法について、表Ｉに５’から３’方向で掲げた以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
【０１７５】
【表８】
2005518801.tif 000010
【０１７６】
プライマーＡ〜Ｄは、上に開示したようにヒトプロテインＣのｃＤＮＡを突然変異させ、そして増幅させるために使用した。ウシプロテインＣのｃＤＮＡを突然変異させ、そして増幅させるために、同様に２組のプライマー、すなわちプライマーＡおよびＥおよびプライマーＦおよびＤを使用し、プライマーＥおよびＦは突然変異誘発性プライマーである。これらプライマーのヌクレオチド配列は以下に説明するように、ベクターのヌクレオチド配列の一部またはプロテインＣのｃＤＮＡヌクレオチド配列の一部に関連している。
【０１７７】
プライマーＡは、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ中のヌクレオチド８６０〜８９５に対応し、そしてｐＲｃ／ＣＭＶベクターＤＮＡとプロテインＣのｃＤＮＡとの間にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を提供する。
【０１７８】
プライマーＢは、ヒトプロテインＣのｃＤＮＡの部分的な修飾されたアンチセンスヌクレオチド配列に対応し、修飾されたセンス配列は：ＬＶＴＧＷＧＹＲＤＥＴＫＲＮ（配列番号４０）をコードする。
【０１７９】
このアミノ酸残基の配列は、包括的なアミノ酸残基番号２９６〜３１３に由来するヒトプロテインＣの修飾された配列に対応し、ここで残基３０３〜３１０の配列は突然変異を含み、すなわち残基３０３、３０４、３０５および３０８が削除され、そして残基３０７および３１０は置換され、生じる配列ＲＤＥＴ（配列番号４３）はウシプロテインＣの対応する部分と同一である（残基３０５〜３０８）。
【０１８０】
プライマーＣは、ＲＤＥＴＫＲＮＲＴＦＶＬ（配列番号４１）をコードするヒトプロテインＣのｃＤＮＡの部分的な修飾されたヌクレオチド配列に対応する。
【０１８１】
このアミノ酸残基の配列は、包括的なアミノ酸残基番号３０３〜３１８に由来するヒトプロテインＣの修飾された配列に対応し、これは上記プライマーＢについて開示されたものと同じ突然変異を含み、すなわち残基番号３０３〜３０５および３０８が削除され、そして残基番号３０７および３１０は置換されている。すなわちプライマーＣはウシプロテインＣの対応する配列と同一の短縮化配列ＲＤＥＴをコードする。
【０１８２】
プライマーＤは、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ中のヌクレオチド９８４〜１０１９の配列に対するアンチセンス配列に対応し、そしてｐＲｃ／ＣＭＶベクターＤＮＡとプロテインＣのｃＤＮＡとの間にＸｂａｌ制限部位を提供する。
【０１８３】
プライマーＥは、ウシプロテインＣのｃＤＮＡの部分的な修飾されたアンチセンスヌクレオチド配列に対応し、修飾されたセンス配列は；ＶＴＧＷＧＹＨＳＳＲＥＫＥＡ（配列番号４２）をコードする。
【０１８４】
このアミノ酸残基の配列は、包括的なアミノ酸残基番号２９９〜３０８に由来するウシプロテインＣの修飾された配列に対応し、ここで残基番号３０５〜３０８（ＲＤＥＴ）（配列番号４３）に対応する配列は突然変異、すなわち４つの挿入および２つの置換を含み、突然変異した配列はヒトプロテインＣ（残基番号３０３〜３１０）の対応する部分と同一のＨＳＳＲＥＫＥＡ（配列番号４４）である。
【０１８５】
プライマーＦは、ＨＳＳＲＥＫＥＡＫＲＮＲＴＦ（配列番号４５）をコードするウシプロテインＣのｃＤＮＡの部分的な修飾されたアンチセンスヌクレオチド配列に対応する。このアミノ酸残基配列は、包括的なアミノ酸残基番号３０５〜３１４に由来するウシプロテインＣの修飾された配列に対応し、これは上記プライマーＥで述べたものと同じ突然変異を３０５と３０８位の間に含む。すなわちプライマーＦは、ヒトプロテインＣの対応する配列と同一である延長された配列ＨＳＳＲＥＫＥＡ（配列番号４６）をコードする。
（ｂ）バリアントまたは野生型プロテインＣを生産する安定な形質転換体の生産
バリアントまたは野生型プロテインＣを生産する安定な形質転換体を生産するために、アデノウイルスでトランスフェクトしたヒト腎細胞系２９３を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのビタミンＫ１を含有するＤＥＭＥ培地中で成長させ、そして工程（ａ）からの野生型または突然変異したプロテインＣのｃＤＮＡを含んでなる発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションは以前に記載された（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）ようにリポフェクチン法に従い行った。簡単に説明すると、２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＤＥＭＥで１００μｌに希釈した２μｇのベクターＤＮＡを、同じバッファーで１００μｌに希釈した１０μｌリポフェクチン（１μｇ／μｌ）と混合した。混合物を室温に１０〜１５分間維持し、そして１．８ｍｌに培地で希釈し、そして次いで同じ培地で２回洗浄した細胞（５ｃｍのペトリ皿中、２５〜５０％の集密度）に加えた。
（ｃ）バリアントまたは野生型プロテインＣの発現。（ｂ）章のトランスフェクトした細胞を１６時間インキューベーションし、その後、培地を１０％のウシ血清を含有する完全培地に交換し、そして細胞をさらに４８〜７２時間インキューベーションした。次いで細胞をトリプシン処理し、そして選択培地（１０％血清、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのビタミンＫ１を含んでなるＤＭＥＭ）を含む１０ｃｍの皿に播種した（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９０）。Ｇ４１８耐性コロニーは３〜５週の選択後に得た。各ＤＮＡトランスフェクション手順から、２４コロニーを選択し、そしてコンフルエンスになるまで成長させた。すべてのコロニーは、モノクローナル抗体ＨＰＣ４（ヒトプロテインＣについて）またはモノクローナル抗体ＢＰＣ５（ウシプロテインＣについて）を使用したドット−ブロットアッセイによりスクリーニングしてプロテインＣの発現を調査した。高発現細胞コロニーを選択し、そして選択培地中でコンフルエンスになるまで成長させた。その後、これらの細胞をならし培地（血清を欠く選択培地）中で成長させて、プロテインＣまたはそのバリアントの発現を開始させ、この培地は選択培地のように７２時間毎に交換した。適当な時間後、各発現産物を含有するならし培地は該産物を（ｄ）章で精製するために集めた。
（ｄ）組換え野生型および突然変異タンパク質の精製
（ｉ）ウシ組換えプロテインＣおよびその変異体は、以前に記載されたように精製した（Ｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２μＭのＰＰＡＣＫを、（ｃ）章で集めたならし培地に加えた。次いで培地をファルマシアＦＦＱアニオン−交換カラムにのせ、そして室温でＣａＣｌ２勾配で溶出した（出発溶液、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４；限定溶液、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／３０ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）。ＣａＣｌ２はＣｈｅｌｅｘ１００処理と組み合わせて一晩透析することにより除去した（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）。透析物を２回目のＦＦＱカラムにのせてプロテインＣまたはその変異体をカラムに吸着させ、その後にタンパク質をＮａＣｌ勾配溶液（出発溶液、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４；限定溶液、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で溶出した。
（ｉｉ）ヒト野生型または変異体プロテインＣを生産する形質転換体から（ｃ）章で得られた培養基を最初にカラム精製に供し、次いでわずかに変更した（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）したことを除き以前に記載されたように（Ｒｅｚａｉｅ  ａｎｄ  Ｅｓｍｏｎ，１９９４）、モノクローナル抗体ＨＰＣ４を持つアフィニティーカラムにのせた。
【０１８６】
（ｉ）および（ｉｉ）で得た精製タンパク質をＹＭ１０フィルター（アミコン）で濃縮し、ＴＢＳバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して１２時間透析し、そしてその使用まで−８０℃で保存した。
【０１８７】
上記野生型および変異体プロテインＣの純度および均一性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確立した。この電気泳動手順はポリアクリルアミド（１０〜１５％）のスラブ−ゲル電気泳動として、０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下、還元および非還元条件下で行い、ここで該タンパク質は銀染色により視覚化された（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，１９８１）。
【０１８８】
５〜１５％のアクリルアミド濃度勾配を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および上記のように精製したタンパク質の泳動の結果は、実施例１（ｃ）での発現から得られたすべての組換えプロテインＣが単一バンドとして非還元条件下で各血漿由来タンパク質の分子量に類似する相対的分子量で移動することを示した。ヒトプロテインＣは６２ｋＤａの見かけの分子量を有し、一方ウシプロテインＣは幾分小さかった。以前の報告と一致して、血漿由来ヒトプロテインＣ、組換え野生型プロテインＣおよび変異体プロテインＣは、グリコシル化バリアントとしてαおよびβプロテインＣに相当する２つのサブフォームを現した（Ｍｉｌｅｔｉｃｈ  ａｎｄ  Ｂｒｏｚｅ，１９９０）。しかしこれら２つのサブフォームはウシプロテインＣでは明らかではなかった。還元条件下で、各組換えプロテインＣに由来する重鎖は二本鎖として移動した（Ｍｒ  ４１ＫＤａ）。軽鎖（Ｍｒ  ２１ＫＤａ）も観察された。これは実施例１（ｂ）からの形質転換細胞が組換え野生型および変異体プロテインＣ誘導体を類似様式で生産することを示す。
（ｅ）プロテインＣ変異体の特性決定
（１）前記工程で得られたプロテインＣ変異体を特性決定するために、変異体および野生型プロテインＣを活性化し、そしてそれらの活性を以下の試験法に従い測定した。以下に記載するような活性阻害試験も行った。
（１）（ｉ）プロテインＣの活性化およびアミド分解活性アッセイ
トロンビンによるプロテインＣの活性化形（活性化プロテインＣ、ＡＰＣ）への活性化は、わずかな変更を除き以前に記載されたように行った（Ｓｏｌｙｍｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。簡単に説明すると、プロテインＣをα−トロンビン（１：１０、重量／重量）と３７℃で２時間、５ｍＭのＥＤＴＡの存在下でＴＢＳ中にてインキューベーションした。インキューベーション後、混合物をスルホプロピル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに通してトロンビンを除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元したプロテインＣとＡＰＣとの間の移動度の差異により、プロテインＣが完全に活性化されたことを確認した。ＡＰＣのアミド分解活性は、合成基質Ｓ２２３８（クロモジェニックス社、スウェーデン）の加水分解の決定により測定し、この過程はＶｍａｘキネティックマイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ、モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社、米国）中、室温にて４０５ｎｍで監視した。
（１）（ｉｉ）活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイ
ＡＰＣ活性の定量的測定は、ＡＰＴ時間の延長に基づいた。Ｃｏａｔｅｓｔ  ＡＰＣ耐性キット（クロモジェニックス社、メルンダール、スウェーデン）をＡＰＣのＡＰＴＴアッセイに使用した。５０μｌのヒトまたはウシクエン酸処理正常血漿を５０μｌのＡＰＴＴ試薬と３７℃で２００秒間インキューベーションし、そして次いでＡＰＣ（０〜１０ｎＭの最終濃度）を含有する１００μｌのＣａＣｌ２（１２．５ｍＭ）を加えた。凝固時間はＡｍｅｌｕｎｇ−ＣｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒＫＣ１０（スウェディッシュ  ラベックス（Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｌａｂｅｘ）社）を使用して測定した。すべての希釈はＴＢＳバッファー中、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下で作成した。
（１）（ｉｉｉ）ＦＶＩＩＩａ不活性化アッセイ
種々の濃度のヒトまたはウシ組換えＡＰＣ（０〜３２ｎＭ）を、プロテインＳ（２０ｎＭ）および第Ｖ因子（２０ｎＭ）とマイクロタイタープレートウェル（Ｌｉｎｂｒｏ、フローラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））内で、２５μｌの最終容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー中（１０．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡを含有する、ｐＨ７．４）を用いて混合した。８０μｌの第ＶＩＩＩａ試薬（ウシ第ＩＸａ因子、ヒト第ＶＩＩＩａ因子、ＣａＣｌ２およびリン脂質を含む）を混合物に加えた。室温で５分間インキューベーションした後、ウシ第Ｘ因子を加えた。続いて形成された活性化第Ｘ因子の量は、５分間のインキューベーション後に５０μｌの合成基質Ｓ−２２２２を加えることにより測定した。反応は暗中、室温で５分間のインキューベーション後に５０μｌの２０％酢酸を加えることにより停止し、そして４０５ｎｍの吸収を監視した。第Ｘａ因子の生産は第ＶＩＩＩａ因子の活性に直線的に相関し、これを各対照の活性の割合として表す（Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｄａｈｌｂａｅｃｋ，１９９４）。上に与えたすべての試薬濃度は最終濃度である。
（１）（ｉｖ）プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ
ＡＰＣによる第Ｖ因子の不活性化は、ＰＴアッセイに従い測定した。１００μｌのヒトまたはウシ血漿（１：３希釈）を３７℃で１２０秒間インキューベーションし、その後、凝固は３００μｌのネオプラスチン（Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｎ）およびＡＰＣの混合物（ネオプラスチン：ＡＰＣ、２：１、容量／容量）を加えることにより開始した。ＡＰＣの最終濃度は０〜３０ｎＭであった。このアッセイはＡｍｅｌｕｎｇ−ＣｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒＫＣ１０で行った。
（１）（ｖ）ヒト血漿中でのプロテインＣおよびプロテインＣ変異体の不活性化
プロテインＣの活性化に由来するＡＰＣ（ヒトまたはウシ野生型またはそれらの変異体のいずれか）は、３００μｌのクエン酸処理ヒト血漿を用いて３７℃で７０ｎＭに希釈した。サンプル（４０μｌ）を集め、そして０〜６０分の範囲の時点で冷ＴＢＳ中で５倍に希釈した。各希釈したサンプルから、６０μｌをマイクロタイタープレート上のウェル中の５０μｌの合成基質Ｓ−２２３８（クロモジェニックス社、スウェーデン）（１ｍＭ）に加えた。ＡＰＣによるＳ−２２３８のアミド分解速度は、４０５ｎｍで０〜１０分間、連続的に記録した（Ｈｏｌｌｙ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，１９９４）。
（１）（ｖｉ）プロテインＣおよびその変異体のα１ＡＴによる不活性化
野生型または突然変異ヒトＡＰＣまたはウシＡＰＣ（各々１７０ｎＭ）を、ヒトα１ＡＴ（０〜１６μＭ）と８０μｌのＴＢＳバッファー（０．１％ＢＳＡを含む）と３７℃で一晩、別個にインキューベーションした（Ｈｏｌｌｙ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，１９９４）。サンプル（２０μｌ）を集め、そしてマイクロタイタープレート上のウェル中の１００μｌのＳ−２２３８（１ｍＭ）に加えた。Ｓ−２２３８の加水分解速度は、４０５ｎｍで室温にて０〜１０分間、Ｖｍａｘキネティックプレートリーダー中で監視した。
（１）（ｖｉｉ）プロテインＣおよびプロテインＣ変異体のＰＣＩによる不活性化
種々の組換えＡＰＣ（４０ｎＭ）を、８８ｎＭのＰＣＩと１ｍｌのＴＢＳバッファー（０．１％ＢＳＡを含む）中にて３７℃でインキューベーションした。インキューベーション後、サンプル（５０μｌ）を集め、そして０〜１２０分の時間範囲の時点で氷上に置き、次いで５０μｌのＳ−２２３８（１ｍＭ）に加えた。Ｓ−２２３８の加水分解速度は、４０５ｎｍで室温にて０〜１０分間、測定した。
（２）上に開示したように行った活性試験の結果を以下にまとめる。
（２）（ｉ）実施例１（ｄ）からのプロテインＣの活性化後、活性化プロテインＣについて泳動したＳＤＳ−ＰＡＧＥは、すべての組換え野生型および変異体ＡＰＣの分子量が対応する血漿由来のＡＰＣに類似したが、各不活性化形よりも小さいことを示した。完全なプロテインＣのバンドはＡＰＣサンプル中には観察されず、そしてこれらすべてのタンパク質の純度はゲル上で９０％より高かった。すべてのＡＰＣのアミド分解活性は、合成基質Ｓ−２２３８を用いて測定した。野生型ヒトおよびウシＡＰＣについて、初速度は本質的に同じであるが、変異体組換えヒト活性化プロテインＣ（ヒトＡＰＣ−ＳＰと命名）の初速度は野生型ＡＰＣよりも約５倍高かった。しかし変異体組換えウシ活性化プロテインＣ（ウシＡＰＣ−ＳＰと命名）については、初速度は野生型ＡＰＣのわずか約１／１０であった。これらの結果を図１に示す。
（２）（ｉｉ）ＡＰＴＴアッセイでは、組換え野生型および変異体ＡＰＣの抗凝固活性をヒト血漿、ウシプロテインＳを補充したヒト血漿およびウシ血漿中で分析した。図２Ａから明らかであるように、ヒト血漿中でヒトＡＰＣ−ＳＰは野生型ヒトＡＰＣよりも高い抗凝固活性を現すが、野生型ＡＰＣもウシＡＰＣ−ＳＰもいかなる実質的な抗凝固活性を現さなかった。一方、これらすべてのＡＰＣはウシ血漿中およびウシプロテインＳを補充したヒト血漿中で抗凝固機能を現した。しかしウシＡＰＣおよびヒトＡＰＣ−ＳＰはヒトＡＰＣおよびウシＡＰＣ−ＳＰよりも高い抗凝固活性を示した（図２Ｂ、２Ｃ）。
（２）（ｉｉｉ）ヒトプロテインＳおよび第Ｖ因子の存在下で行った第ＶＩＩＩａ因子不活性化アッセイにおいて、第ＶＩＩＩａ因子の活性は上の（２）（ｉ）章からのすべてのＡＰＣにより不活性化されたが、高濃度が必要であった。低濃度で、ウシ野生型ＡＰＣもウシＡＰＣ−ＳＰも第ＶＩＩＩａ因子を不活性化できなかった。ヒトＡＰＣ−ＳＰは野生型ヒトＡＰＣよりも強力な抗凝固活性を現した（図３Ａ、３Ｂ）。野生型ヒトおよびウシＡＰＣならびにそれらの変異体は、ウシプロテインＳおよびウシ第Ｖ因子の存在下で第ＶＩＩＩａ因子活性を阻害することができたが、野生型ウシＡＰＣおよびウシＡＰＣ−ＳＰは両方とも野生型ヒトＡＰＣおよびヒトＡＰＣ−ＳＰよりも効率的に働いた（図３Ｃ）。
（２）（ｉｖ）（１）（ｉｖ）のＰＴアッセイに従い、野生型ＡＰＣおよびその変異体による第Ｖａ因子の不活性化を、ヒト血漿およびウシ血漿中で試験した。両野生型ヒトＡＰＣおよびヒトＡＰＣ−ＳＰともこのＰＴアッセイにおいて凝固時間を本質的に上げた。さらにヒトＡＰＣ−ＳＰは野生型ヒトＡＰＣよりも活性であった。野生型ウシＡＰＣもウシＡＰＣ−ＳＰもヒト血漿にいかなる効果も及ぼさなかった（図４Ａ）。図４Ｂから明らかであるように、野生型ヒトＡＰＣおよびヒトＡＰＣ−ＳＰはウシ血漿中で凝固時間を効率的に延長したが、野生型ウシＡＰＣおよびその変異体は、ウシ血漿中で弱い抗凝固活性を現しただけであった（図４Ｂ）。
（２）（ｖ）−（ｖｉｉ）ＡＰＣ不活性化試験の結果
上記ＡＰＣ不活性化試験（１）（ｖ）は、野生型および変異体ＡＰＣのアミド分解活性が０〜６０分で６０〜９０％下降したことを示した（図５）。すなわちこれらＡＰＣはＰＣＩ、α１ＡＴ、α２−マクログロブリン等のような数種のセリンプロテアーゼインヒビターにより不活性化されるはずである。
【０１８９】
実際に両野生型ヒトＡＰＣおよびヒトＡＰＣ−ＳＰとも、試験（１）（ｖｉ）で高濃度のα１ＡＴにより実質的に阻害された。しかし野生型ウシＡＰＣおよびウシＡＰＣ−ＳＰはこの阻害に対してほぼ完全に耐性であった。
【０１９０】
（１）（ｖｉｉ）に従い得られた試験結果は、ウシ野生型ＡＰＣがヒトＰＣＩにより効率的に分解されるが、ウシＡＰＣ−ＳＰはヒトＰＣＩによりさほど効率的に阻害されなかったことを示した。一方、ヒトＡＰＣ−ＳＰのアミド分解活性は、野生型ヒトＡＰＣよりもはるかに早かったが、その速度は野生型ウシＡＰＣの速度に類似した。
【実施例２】
【０１９１】
プロテインＣのＧｌａ−ドメイン変異体の調製
（ａ）位置指定突然変異誘発法
Ｇｌａ−ドメインに修飾を含む種々のプロテインＣバリアントは、以前にＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７，３６  １６０２５−１６０３１）により本質的に記載されたように、組換え技術を用いて作成した。
【０１９２】
Ｊｏｈａｎ  Ｓｔｅｎｆｌｏ博士（スウェーデン、マルメの大学病院、臨床化学部）の好意により贈られた完全長のヒトプロテインＣのｃＤＮＡクローンを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そして完全なＰＣコード領域、すなわち完全長のプロテインＣのｃＤＮＡを含んでなる生成した制限断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化した発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶにクローン化した。
【０１９３】
野生型ヒトプロテインＣのコード配列を含む生成した発現ベクターを、プロテインＣのＧｌａ−モジュールの位置指定突然変異誘発法に使用し、ここで標的ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ手順を以前に記載されたように行った（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，同上）。
【０１９４】
突然変異誘発プライマーをこの手順に使用するために設計して、１０、１１、１２、２３、３２、３３および４４位での野生型アミノ酸残基の種々の別のアミノ酸に交換した。より具体的には１０位でヒスチジン（Ｈ）をグルタミン（Ｑ）に置き換え；１１位でセリン（Ｓ）をグリシン（Ｇ）に置き換え；１２位でセリン（Ｓ）をアスパラギン（Ｎ）に置き換え；２３位でアスパラギン酸（Ｄ）をセリン（Ｓ）に置き換え；３２位でグルタミン（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）に置き換え、これは成熟タンパク質でＧｌａ（ガンマ−カルボキシグルタミン酸に転換される）：３３位でアスパラギン（Ｎ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置き換え；そして最後に４４位でヒスチジン（Ｈ）をチロシン（Ｙ）に置き換えた。これらのプライマーは以下のバリアント（または変異体）を生産するために使用した：
変異体１）はＱＧＮと命名した（１０、１１、１２位を突然変異させた）。
変異体２）はＳＥＤと命名した（２３、３２および３３位を突然変異させた）。
変異体３）はＳＥＤＹと命名した（２３、３２、３３および４４位を突然変異させた）。
変異体４）はＱＧＮＳＥＤＹと命名し、これは変異体１）と３）の組み合わせである（ＱＧＮおよびＳＥＤＹ）。
変異体５）はＧＮＥＤと命名し、そして変異体６）はＱＧＥＤと命名した（両方ともＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌにより以前に記載された）を比較として使用した。
【０１９５】
ＱＧＮ変異体を作成するために、２つの以下のオリゴヌクレオチドを合成し、そして第１のＰＣＲ手順に使用した、すなわちプライマーＡはヌクレオチド配列：５’−ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ−３’（配列番号３４）（ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を含むベクターｐＲｃ／ＣＭＶ中のヌクレオチド８６０〜８９５のセンスに対応）を有し、そしてプライマーＢはヌクレオチド配列：ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴ ＧＣＣ ＴＴＧ  ＡＣＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＡ（配列番号４７）（対応するヌクレオチドを下線により示す突然変異した１０〜１２位を含むアミノ酸４〜１７をコードするＤＮＡ範囲の第２鎖に対応する）。これらプライマーＡおよびＢはＰＣＲ反応に使用し、ここでｗｔヒトプロテインＣのｃＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲ産物は、変異体アミノ酸残基を含む適切な約２００ｂｐ長の断片を生じるＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｒＢＩで開裂した。この断片を２つの他のＤＮＡ片に連結し、その１つはｗｔヒトプロテインＣのｃＤＮＡの大きな部分をコードするＢｓｒＢＩ−ＸｂａＩ断片であり、そしてもう１つはＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ開裂ｐＲｃ／ＣＭＶベクターであった。連結したｃＤＮＡは制限酵素開裂（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｒＢＩ）で検査し、そしてシークエンシングによりＱＧＮ突然変異を確認した。
【０１９６】
幾つかの工程を作ってＳＥＤＹを作成した。第１はすでにＥ３２Ｄ３３突然変異を有するｃＤＮＡにＳ２３突然変異を作成することであった（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ    Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）。Ｓ２３突然変異には１つはプライマーＣと命名し、そしてもう１つはプライマーＤと命名した２つのプライマーを作成した。プライマーＣはヌクレオチド配列：ＡＴＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡＧ（配列番号４８）（突然変異には下線を付す）を有し；そしてプライマーＤはヌクレオチド配列：ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＴＡＴ（配列番号４９）（突然変異には下線を付す）を有した。変異体ｃＤＮＡを作成するために、２つのＰＣＲ反応を行い、ここで変異体ｃＤＮＡ  ＥＤを鋳型として使用し、そしてプライマーＡおよびＣは第１反応で使用する一方、プライマーＤおよびＥは第２反応で使用した。プライマーＥはヌクレオチド配列：５’−ＧＣＡ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ−３’（配列番号３７）（ＸｂａＩクローニング部位を含むベクターｐＲｃ／ＣＭＶ中のヌクレオチド９８４〜１０１９に対するアンチセンス）を有した。プライマーＡおよびＣが関与した第１ＰＣＲ反応は、プロテインＣのｃＤＮＡの５’部分を増幅し（アミノ酸２８までをコードする）、一方プライマーＤおよびＥが関与した第２ＰＣＲ反応は、アミノ酸１８からプロテインＣの終わりまでをコードするｃＤＮＡの３’部分を生成した。この反応で生産されたこれら２つの産物は、次いでプライマーＡおよびＥを使用するさらなるＰＣＲ反応で合わされた。この手順に由来する最終産物は、２３、３２および３３位に突然変異を持つ全プロテインＣをコードするｃＤＮＡであった。次いでこのＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで開裂し、これは３６０ｂｐの５’断片を与え、これを精製し、そしてｗｔプロテインＣのＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片とＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで開裂したｐＲｃ／ＣＭＶベクター中で連結した。このベクターはこのように完全長変異体ＳＥＤのｃＤＮＡを含んだ。このｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として使用して、変異体ＳＥＤＹ（すなわち４４位がヒスチジンからチロシン（Ｙ）に突然変異した）を作成した。この反応で、プライマーＡは４４位が突然変異するように設計し、そして以下のヌクレオチド配列：ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＧＴＡ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ（配列番号５０）（アミノ酸残基３９〜４９をコードする第２鎖に対応する−下線を付したコドンは突然変異スポットである）を有するプライマーＦと合わせた。このＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで開裂し、そして約３６０ｂｐ長の断片をプロテインＣのｃＤＮＡの残りの部分、すなわちＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片およびＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで開裂したｐＲｃ／ＣＭＶに連結した。
【０１９７】
次いで変異体ＱＧＮＳＥＤＹをコードする完全に突然変異したプロテインＣのｃＤＮＡは、ＱＧＮおよびＳＥＤＹ変異体のｃＤＮＡを使用して作成した。この組み合わせは制限酵素消化および適切な断片の連結を使用して作成した。すなわちＱＧＮ変異体のｃＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｒＢＩで開裂し、そして約２００ｂｐ長の５’断片を単離し、そしてＳＥＤＹのｃＤＮＡに由来するＢｓｒＢＩ−ＸｂａＩ断片（約１０００ｂｐ長）と一緒に使用した。２つの断片をＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで開裂したｐＲｃ／ＣＶＭと連結して、ＱＧＮＳＥＤＹ（本明細書中では“ＡＬＬ”とも呼ぶ）をコードする完全長の変異体プロテインＣのｃＤＮＡを生成した。最終産物はシークエンシングで試験し、そして正しい突然変異を含むことが分かった。
【０１９８】
記録のために、Ｅ３２Ｄ３３変異体はプライマーＧ：５’−ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＣ ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ−３’（配列番号５１）（アミノ酸２７〜３８に関するアンチセンス、Ｅ３２Ｄ３３の突然変異に下線を付した）を使用して、類似様式で作成した（この変異体はＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１に記載されている）。
【０１９９】
ＤＮＡシークエンシングですべての突然変異を確認した。ヒト２９３細胞での細胞培養、発現、精製およびプロテインＣ分子の特性決定は、以前に記載したように（Ｓｈｅｎ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９８；２７３：３１０８６−３１０９１）に記載されているように行った。
【０２００】
簡単に説明すると、望ましい突然変異を含む生成したヒトプロテインＣのｃＤＮＡを、ＳａｃＩＩおよびＡｐａＩで消化し、次いでＳａｃＩＩおよびＡｐａＩ消化からの断片（ヌクレオチド７２８〜１３１１）を、完全なヒトプロテインＣ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩＩ、５’末端−ヌクレオチド７２８；およびＡｐａＩ−ＸｂａＩ、ヌクレオチド１３１１−３’末端）を含むベクターｐＵＣ１８にクローン化して、所望する突然変異を含んでなる、すなわちヒト野生型配列の代わりに突然変異した配列を含んでなるヒトプロテインＣ変異体をコードするヒトプロテインＣ完全長ｃＤＮＡを生成した。
【０２０１】
次いで上記の各突然変異ヒトプロテインＣのｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、そして適切な制限断片をすでに同じ制限酵素で消化したベクターｐＲｃ／ＣＭＶにクローン化した。得られたベクターは真核細胞中での突然変異ヒトプロテインＣの発現に使用した。
【０２０２】
適切な宿主細胞のトランスフェクション前に、すべての突然変異はＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，同上のジデオキシチェーンターミネーション法によるＤＮＡシークエンシングにより確認した。
（ｂ）バリアントまたは野生型プロテインＣを生産する安定な形質転換体の生産
バリアントまたは野生型プロテインＣを生産する安定な形質転換体を生産するために、アデノウイルスでトランスフェクトしたヒト腎臓細胞系２９３を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのビタミンＫ１を含有するＤＭＥＭ培地中で成長させ、そして工程（ａ）からの野生型または突然変異したプロテインＣのｃＤＮＡを含んでなる発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションは以前に記載された（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）ようにリポフェクチン法に従い行った。簡単に説明すると、２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＤＭＥＭで１００μｌに希釈した２μｇのベクターＤＮＡを、同じバッファーで１００μｌに希釈した１０μｌリポフェクチン（１μｇ／μｌ）と混合した。混合物を室温に１０〜１５分間維持し、そして１．８ｍｌに培地で希釈し、そして次いで同じ培地で２回洗浄した細胞（５ｃｍのペトリ皿中、２５〜５０％の集密度）に加えた。
（ｃ）バリアントまたは野生型プロテインＣの発現。
【０２０３】
工程（ｂ）のトランスフェクトした細胞を１６時間インキューベーションし、その後、培地を１０％のウシ血清を含有する完全培地に交換し、そして細胞をさらに４８〜７２時間インキューベーションした。次いで細胞をトリプシン処理し、そして選択培地（１０％血清、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌのビタミンＫ１を含んでなるＤＭＥＭ）を含む１０ｃｍの皿に播種した（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９０）。Ｇ４１８耐性コロニーは３〜５週間の選択後に得た。各ＤＮＡトランスフェクション手順から、２４個のコロニーを選択し、そしてコンフルエンスになるまで成長させた。すべてのコロニーは、モノクローナル抗体ＨＰＣ４（ヒトプロテインＣについて特異的）を使用したドット−ブロットアッセイによりスクリーニングしてプロテインＣの発現を調査した。高発現細胞コロニーを選択し、そして選択培地中でコンフルエンスになるまで成長させた。その後、これらの細胞をならし培地（血清を欠く選択培地）中で成長させて、プロテインＣまたはそのバリアントの発現を開始させ、この培地は選択培地のように７２時間毎に交換した。適当な時間後、各発現産物を含有するならし培地は該産物を以下の工程（ｄ）で精製するために集めた。
（ｄ）組換え野生型および突然変異タンパク質の精製
ヒト野生型または変異体プロテインＣを生産する形質転換体から、（ｃ）章で得た培養基は、「プソイド−アフィニティー（ｐｓｅｕｄｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）」と命名されたクロマトグラフィー法を含んでなり、そして以前に記載された簡便かつ好都合の精製法（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９０，Ｖｏｌ．８，６６５−６１）にかけた。
【０２０４】
上記で得た精製したタンパク質を、ＹＭ１０フィルター（アミコン：Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、ＴＢＳバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して１２時間透析し、そしてそれらを使用するまで−８０℃で保存した。
【０２０５】
上記野生型および変異体プロテインＣの純度および均一性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確立した。この電気泳動手順はポリアクリルアミド（１０〜１５％）のスラブ−ゲル電気泳動として、０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下、還元および非還元条件下で泳動し、ここで該タンパク質は銀染色により視覚化された（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，１９８１）。
【実施例３】
【０２０６】
プロテインＣのＧｌａ−ドメイン変異体の特性決定
前記工程で得られたプロテインＣ変異体を特性決定するために、変異体および野生型プロテインＣを活性化し、そしてそれらの抗凝固活性を、血漿に基づくアッセイおよび精製した成分を用いた装備を含む種々の実験系で試験した。
【０２０７】
２つの血漿系、１つは活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）系およびもう１つはトロンボプラスチン時間（ＴＰ）系を試験した。ＡＰＴＴおよびＴＰ系の両方において、濃度を増加させてｗｔまたは変異体ＡＰＣの抗凝固活性を試験した。ＡＰＴＴ系では、ＡＰＣの抗凝固活性はＦＶＩＩＩａおよびＦＶａの両方の分解に依存する一方、ＴＰ系は主にＦＶａの分解に感受性である。しかし希釈したＴＰ系はある程度、ＦＶＩＩＩａの分解にも感受性である。
（ａ）ＡＰＴＴ反応により監視したＡＰＣバリアントによる凝固阻害
（ｉ）方法：血漿（５０μｌ）を５０μｌのＡＰＴＴ試薬（オルガノン  テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａ）からのＡＰＴＴ  Ｐｌａｔｅｌｉｎ  ＬＳ）と混合し、そして３７℃で２００秒間インキューベーションした。凝固は５０μｌのＡＰＣ（図６に与える最終濃度）および５０μｌの２５ｍＭのＣａＣｌ２との混合物により開始した。凝固時間はＡｍｅｌｕｎｇ  ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒで測定した。  
（ｉｉ）結果：このＡＰＴＴに基づくアッセイで、ｗｔＡＰＣの活性は変異体１）、３）および４）、すなわちＱＧＮ、ＳＥＤＹおよびＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）の活性、ならびにＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）により以前に記載された２つの変異体、すなわちそれぞれＧＮＥＤおよびＱＧＥＤと命名された変異体５）および６）の活性と比較した。
【０２０８】
図６に関して、ＡＬＬの抗凝固活性がｗｔＡＰＣの抗凝固活性に比べてかなり強化されることが明らかである。使用した最高濃度で、ＡＬＬは１０００秒を越える凝固時間を生じるが、ｗｔＡＰＣはわずか約２００秒の凝固時間を与えただけであった。ＡＰＣを加えない基本の標準凝固時間は、約３０〜４５秒である。一方、２つの以前に記載された変異体ＱＧＥＤおよびＧＮＥＤは、大変異なる結果を与えた。ＧＮＥＤはｗｔＡＰＣよりもかなり活性である一方、ＱＧＥＤは実際にはｗｔＡＰＣよりも活性が低かった。バリアントＱＧＮおよびＳＥＤＹはＧＮＥＤと同程度に活性であったが、ＡＬＬよりは活性が低かった。
【０２０９】
このＡＰＴＴアッセイで、試薬は標準的な市販の試薬であり、これはＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９８，２７３：３１０８６−３１０９１）による実験で使用された試薬とは対照的である。この実験では、希釈しないとＡＰＣバリアントがｗｔＡＰＣよりもより活性な抗凝固物質とならないので、希釈したＡＰＴＴ試薬を使用した。Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌの参考文献の検討では、これは試薬中のリン脂質のレベルによると説明された。高レベルのリン脂質を使用すると、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌによる実験で使用したＡＰＣバリアントの上昇した活性は容易に認識されなかった。希釈した試薬を使用した時のみ、著者はＡＰＣバリアントの抗凝固活性における強い上昇を証明することができた。
【０２１０】
本バリアントＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）は、標準的レベルのリン脂質でもｗｔＡＰＣよりも明らかに一層活性であるので、独特であると思われる。
（ｂ）ＡＰＴＴアッセイにおけるヒトプロテインＳの影響
（ｉ）方法：プロテインＳの濃度を増加させながらプロテインＳ欠損血漿に加えて、図７に示す最終濃度を得た。血漿アリコート（５０μｌ）をＡＰＴＴ試薬と混合し、次いで３７℃で２００秒間インキューベーションした。その後、ｗｔまたはＡＬＬ変異体（ＱＧＮＳＥＤＹ）のいずれかのＡＰＣを５０μｌ（２０ｎＭ濃度）の容量で加え、次いで５０μｌの２５ｍＭのＣａＣｌ２を加えることにより凝固を直ちに開始した。結果はプロテインＳ欠損血漿中のプロテインＳの濃度に対して凝固時間をプロットした図７に示す。
【０２１１】
これらの実験は本質的に図６を参照にして上記のように行い、プロテインＳ欠損血漿を正常血漿の代わりに使用した。このプロテインＳ欠損は血漿ヒト起源であり、そしてプロテインＳの消耗はヒトプロテインＳに対する高度に効率的なモノクローナル抗体（ＨＰＳ５４−Ｄａｈｌｂｅａｃｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９０  ２６５：８１２７−３５））を使用した免疫−吸着の結果であった。
（ｉｉ）結果：図７に関連して、好適なＧｌａ−ドメインバリアント、すなわちＱＧＮＳＥＤＹバリアントは、プロテインＳ欠乏血漿を使用した時でもｗｔＡＰＣよりかなり活性であったことは明らかである。特に興味深い考察は、外因性プロテインＳの添加がＱＧＮＳＥＤＹならびにｗｔＡＰＣの抗凝固活性を強化したことである。プロテインＳの不存在下では、変異体ＡＬＬは約１６０秒の凝固時間を生じ、そしてこの凝固時間は試験系にプロテインＳを加えることにより３５０秒まで延長された。ｗｔＡＰＣで得られた対応する値は、プロテインＳの不存在下で約１００秒の基本凝固時間、そしてこの試験で使用した最高のプロテインＳ濃度の存在下で１５０秒の延長された凝固時間であった。このようにＡＬＬはプロテインＳの存在および不存在下の両方で本質的にｗｔＡＰＣよりも活性であり、そしてＡＬＬはプロテインＳの存在によりさらに強化されることは明らかである。これは、プロテインＳにより刺激されなかったＥｓｍｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｒｎｏｖにより彼らのＡＰＣバリアントで得られた結果とは対照的である（米国特許第９８／２０１１８号明細書）。明らかに本バリアントＱＧＮＳＥＤＹはプロテインＳにより刺激されので、Ｅｓｍｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｒｎｏｖにより開示されたバリアントよりも優れている。
（ｃ）ＴＰ系により監視したＡＰＣバリアントによる凝固阻害
（ｉ）方法：正常血漿（５０μｌ）を濃度を増加させた種々のＡＰＣバリアント（５０μｌアリコート）と混合し、その後、凝固は組織因子の供給元として１／５０に希釈したトロンボプラスチンの添加により開始した。凝固を開始するために、希釈したトロンボプラスチンは２５ｍＭのＣａＣｌ２も含んだ。
（ｉｉ）結果：図８から明らかであるように、このアッセイで得られた結果はＡＰＴＴ系で得られた結果に類似した。すなわちバリアントＱＧＮＳＥＤＹはｗｔＡＰＣよりもかなり活性であった。より具体的には使用した最高濃度で、バリアントＱＧＮＳＥＤＹ（図８でＡＬＬと命名する）は、６００秒に近い凝固時間を生じた。２番目に高いバリアントはＧＮＥＤであり、これは最高濃度で約１８０秒の凝固時間を生じた。対照的に、ｗｔＡＰＣは約７０秒の凝固時間を生じただけであった。外因性のＡＰＣを加えずに得られる基本凝固時間は、約４０秒であった。
【０２１２】
明らかにこの実験結果は、たとえｗｔＡＰＣの濃度を上げてもｗｔＡＰＣがバリアントＱＧＮＳＥＤＹの抗凝固活性ほど高い抗凝固活性を現さないので、ｗｔＡＰＣと比べた時、バリアントＱＧＮＳＥＤＹは独自の特性を有することを示唆している。これはバリアントＱＧＮＳＥＤＹのＧｌａ−ドメインを作成するために行った突然変異誘発法により、ｗｔＡＰＣに比べて新規かつ独自な機能を現す分子が作成されたことを示唆するのかもしれない。１つのそのような機能はＦＸａにより提供されるＦＶａ中のＡｒｇ５０６部位の保護に関する可能性がある。ＦＸａはＦＶａにＡｒｇ５０６に近い部位で結合し、そしてこれによりＡｒｇ５０６部位の保護を生じることが知られている。恐らくＱＧＮＳＥＤＹの独自かつ高リン−脂質結合能は、ＦＸａにより提供される保護を排除する。凝固アッセイ中、特定量のＦＸａが形成され、そしてこれはｗｔＡＰＣがＦＶａ中のＡｒｇ５０６部位を開裂する能力を制限するかもしれない。ＱＧＮＳＥＤＹバリアントのリン脂質膜だけでなくＦＶａ分子に対する高い親和性により、ＦＸａを置き換えることができる可能性はある。さらにこの試験で使用したＡＰＣの最高濃度で、ＱＧＮＳＥＤＹバリアントはｗｔＡＰＣよりもかなり長く凝固時間を延長することができる。これはＡＰＣバリアントＱＧＮＳＥＤＹが独自のインビボ特性を有し、すでに進行している凝固反応を阻害することができるかもしれないことを示唆している。
（ｄ）ＰＴアッセイにおけるプロテインＳの影響
実施例３（ｂ）（ｉ）に記載したもののようなプロテインＳ欠損血漿を用いた実験も行い、実施例３（ｃ）（ｉ）のトロンボプラスチン系を使用した。これにより得られた結果は、実施例３（ｂ）（ｉｉ）のＡＰＴＴ系に記載した結果に類似した。簡単に説明すると、ＱＧＮＳＥＤＹバリアントはプロテインＳの不存在下で活性であるが、さらにその活性はプロテインＳにより強化される。
【実施例４】
【０２１３】
ＡＰＣによるＦＶａの不活性化
この実施例ではＡＰＣバリアントＱＧＮＳＥＤＹの強化された活性が、ＦＶａ活性の損失が経時的に示されるＦＶａの分解をより具体的に特徴付けるように計画された系で確立された。
（ｉ）方法：血漿ＦＶａ（０．７６ｎＭ）（血漿を１／２５に希釈し、そしてそれに含まれるＦＶをトロンビン添加により活性化する−これはＦＶａの供給源として使用した）をＡＰＣ（０．３９ｎＭ）と、２５μＭのリン脂質小胞（１０％のホスファチジルセリンおよび９０％のホスファチジルコリンの混合物）の存在下でインキューベーションした。バッファーは２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５、および５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡであり、そして温度は３７℃であった。
【０２１４】
種々の時点で、アリコートを取り出し、そして残るＦＶａ活性をＦＶａアッセイにより決定した。このアッセイはＦＶａが、ＦＸａが媒介するプロトロンビン活性化を強化する能力に基づいた。このアッセイはウシＦＸａ（５ｎＭの最終濃度）、５０μＭリン脂質小胞（１０％のホスファチジルセリンおよび９０％のホスファチジルコリンの混合物）および０．５μＭのウシプロトロンビンを含んだ。トロンビンの生成は発色基質Ｓ２２３８（クロモジェニックス社から入手可能）を使用して測定した。
（ｉｉ）結果：ＦＶａとｗｔＡＰＣとのインキューベーション後のＦＶａ活性の損失は、主に２つの開裂反応、すなわちＡｒｇ５０６およびＡｒｇ３０６での開裂反応の結果である。キネティクス的に優先される反応はＡｒｇ５０６で起こる反応であり、これはインキューベーションの最初の５分間に観察されるＦＶａ活性の初期の迅速な損失をもたらす。Ａｒｇ５０６開裂はＮｉｃｏｌａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．により示されたように（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  １９９５  ２７０：２１１５８−６６）、Ａｒｇ５０６で開裂されたＦＶａはＦＸａのコファクターとして未だ部分的に活性であり、その活性の約４０％は維持されているので、ＦＶａの部分阻害をもたらすだけである。一方、Ａｒｇ３０６でのよりゆっくりとした開裂は、ＦＶａ活性の完全な損失をもたらす。このＡｒｇ３０６開裂はインキューベーションの５分から２５分の間に観察されるＦＶａ活性のゆっくりとした減少に反映されるようにゆっくりと進行する。図９から明らかであるように、バリアントＱＧＮおよびＳＥＤＹはｗｔＡＰＣよりもわずかに良いだけだが、バリアントＱＧＮＳＥＤＹの存在はさらにかなり有力である。バリアントＱＧＮＳＥＤＹの存在は最初の５分間に約２０％のＦＶａ活性までＦＶ活性の大変迅速な低下をもたらすだけでなく、最終的にはＦＶａをほぼ完全に阻害する。これらの結果は本バリアントＱＧＮＳＥＤＹがｗｔＡＰＣで見られるよりも迅速にＡｒｇ５０６でＦＶａを開裂するだけでなく、ｗｔＡＰＣに反して、Ａｒｇ３０６でもＦＶａを開裂することを示唆している。
【０２１５】
バリアントＱＧＮＳＥＤＹおよびｗｔＡＰＣがＦＶａを不活性化する能力を、以前に特性決定したバリアントＧＮＥＤの能力と比較する、上記に記載したものと同様な実験（結果は示さず）を行った（図６および図８を参照にされたい）。ＧＮＥＤバリアントは他の２つのＡＰＣについて得られた曲線のほとんど中間に位置する曲線を与えることが分かり、すなわちＧＮＥＤはｗｔＡＰＣよりも有力であるが、本バリアントＱＧＮＳＥＤＹよりも効率が低かった。これらの実験はすべて、外因性プロテインＳを加えずに行った。得られた結果は実施例３（ａ）および（ｃ）で行い、そしてそれぞれ図６および８で具体的に説明する実験結果と一致し、そして以前に開示したＧＮＥＤバリアントが中間の活性を有することも示す。
【実施例５】
【０２１６】
ＡＰＣによるＦＶａの不活性化
この実施例ではＡＰＣ濃度を変動させ、そして残るＦＶａ活性を実施例４（ｉ）に記載したプロトロンビナーゼアッセイを使用してインキューベーションの１０分後に測定した。
（ｉ）方法：希釈した正常混合血漿（０．７６ｎＭ）から得たＦＶａを、濃度を上昇させたＡＰＣ（図１０に与える最終濃度）、および２５μＭのリン脂質小胞（ホスファチジルセリン／ホスファチジルコリン、１０／９０、モル／モル）と、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２および５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中にて３７℃でインキューベーションした。ＦＶａ活性は実施例４（ｉ）に記載したプロトロンビナーゼアッセイで測定した。
（ｉｉ）結果：図１０から、これらの実験が変異体ＡＬＬ、すなわちバリアントＱＧＮＳＥＤＹの優れた効力を明らかに証明していることは明白である。大変低濃度のＡＰＣでも、ＦＶａ活性の有力な阻害がもたらされた。さらに図１０の曲線から、変異体ＡＬＬは約４０％の活性を現すＦＶａの中間分解産物を生じるＡｒｇ５０６部位で開裂するだけでなく、ＦＶａ活性のほぼ完全な損失をもたらすＡｒｇ３０６部位でも開裂することは明らかである。
【実施例６】
【０２１７】
ＡＰＣによる正常およびＱ５０６変異体ＦＶａの不活性化
この実施例では、正常血漿ＦＶａをＡＰＣ耐性血漿（ＦＶ：Ｑ５０６−ＦＶ  Ｌｅｉｄｅｎについてホモ接合性の個体から得た）に由来するＦＶａに置き換えた。この実験は外因性プロテインＳの存在および不存在下で行った。
（ｉ）方法：正常プール血漿から、またはホモ接合性ＡＰＣ耐性（ＦＶ：Ｑ５０６またはＦＶ  Ｌｅｉｄｅｎ）の個体のいずれかから得た血漿ＦＶａを、０．４ｎＭのＡＰＣおよび２５μＭのリン脂質小胞と、精製することを除き実施例（４）（ｉ）に記載したようにインキューベーションした。ヒトプロテインＳ（１００ｎＭ）を加えてＡｒｇ３０６での開裂を確実とした。図１１に示す時点で、残るＦＶａ活性を測定した。
（ｉｉ）結果：ｗｔＡＰＣの添加はＡｒｇ３０６での開裂に相当するＦＶａ活性にゆっくりとした減少をもたらし、図１１の曲線に相当するその傾斜は、図９で具体的に説明したｗｔＡＰＣの曲線の第２部分に類似した。対照的に、本バリアントＱＧＮＳＥＤＹ（またはＡＬＬ）は、ＡＰＣバリアントによるＡｒｇ３０６でのＦＶａの強化された開裂と一致するＦＶａ活性に、より迅速な低下をもたらした。プロテインＳの添加はｗｔＡＰＣおよびＱＧＮＳＥＤＹを両方の効果を強化したが、それでも２つのタンパク質間の差異が残った。このようにプロテインＳはｗｔＡＰＣを刺激するだけでなく、本ＡＰＣバリアントも刺激し、後者はリン脂質に対してかなり強化された結合親和性を現す。これはプロテインＳがＡＰＣのリン脂質に関する結合親和性を強化することにより機能することを示唆したので興味深い。これがプロテインＳが働く唯一のメカニズムとなるならば、プロテインＳの添加はｗｔＡＰＣとＱＧＮＳＥＤＹバリアントとの間の差異を減らすと期待される。
【実施例７】
【０２１８】
ＡＰＣの膜結合親和性
ｗｔおよびバリアントプロテインＣがリン脂質膜に結合する能力を調査するために、表面プラズマ共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍａ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用した。この技法の市販のバリアントは、ＢＩＡｃｏｒｅから入手可能である。この実施例ではＢＩＡｃｏｒｅ２０００を使用した。
（ｉ）方法：リン脂質小胞はＢＩＡｃｏｒｅからＬ１センサーチップの表面上で捕捉した。これらのチップは共有的に結合した疎水性の脂肪族基を持つデキストランヒドロゲルからなる。３つの異なる種類の小胞は押出し法を使用して（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｌｉｐｏｆａｃｔ基本押出し装置を使用して）調製され、３種類の小胞は異なるリン脂質組成、すなわち１）１００％のホスファチジルコリン（図１２）、２）８０％のホスファチジルコリンおよび２０％のホスファチジルセリン（図１３）および３）２０％のホスファチジルセリン、２０％のホスファチジルエタノールアミンおよび６０％のホスファチジルコリン（図１４）を有した。４つのプロテインＣ変異体、すなわちＨＰＣ  ＡＬＬ（すなわちＱＧＮＳＥＤＹ）、ＳＥＤＹ、ＱＧＮおよびＳＥＤ、およびｗｔＨＰＣを試験した。これらの実験ではプロテインＣ濃度は０．５μＭであり、そして使用したバッファーは５ｍＭのＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５であった。
【０２１９】
ホスファチジルコリンを含有する膜は、負に荷電したホスファチジルセリンが膜の一部でなければビタミンＫ依存性タンパク質に結合しない。ホスファチジルエタノールアミンは、膜中のこの種のリン脂質の存在がプロテインＣの結合を強化し、そしてＦＶａの分解速度を強化することが示されたので特に興味深い。このように本実施例では、プロテインＣバリアントがリン脂質の型に対して変化した特異性を示すかどうかを調査する。種々の組換えプロテインＣバリアントをＢＩＡｃｏｒｅ機に注入し、この機械は３種のリン脂質膜により覆われた異なる表面積を含むチップを装備していた。
（ｉｉ）結果：プロテインＣの負に荷電したリン脂質膜に対するＫｄは約１５μＭであるので、０．５μＭのプロテインＣ濃度（この濃度ではｗｔプロテインＣが任意の特に強力な結合を与えると予想されないので）を使用した。このようにこれらの実験では、プロテインＣバリアントの結合能のいかなる上昇も見ることが可能なはずである。図１２から明らかであるように、あるとしても大変少ないプロテインＣバリアントの１００％ホスファチジルコリンを含有する膜への結合があった。達成された最大の応答単位は、わずか約１６０であった。図１３から、明らかに２０％のホスファチジルセリンを含む膜上で、Ｙ−軸上にプロットされる応答で鋭い上昇により反映されるようなプロテインＣの迅速な会合を示す特にバリアントＱＧＮＳＥＤＹ（またはＡＬＬ）によるかなり良い結合が存在した。他のバリアント、すなわちＱＧＮ、ＳＥＤＹおよびＳＥＤはｗｔプロテインＣと同様に挙動した。図１４に示すこの結果は、ＱＧＮＳＥＤＹ（またはＡＬＬ）バリアントとｗｔプロテインＣとの間の最も顕著な差異が、ホスファチジルエタノールアミンを含有する膜を使用した時に観察されたことを具体的に説明している。ＱＧＮＳＥＤＹバリアントは膜への結合において鋭い上昇を示し、そして大変急速に約７００単位の応答に達した。続く２００秒間、約８５０応答単位まで上がった。解離に続いてプロテインＣ注入の中止、そして結合したタンパク質が比較的迅速に膜から放出された。結合はＥＤＴＡが結合を完全に逆行するので、カルシウム依存的であった。この挙動はビタミンＫ依存性タンパク質から予想される。
実施例８〜１０
上記で調製したプロテインＣのＳＰ−変異体およびＧｌａ−ドメイン変異体を、都合よく前駆体として使用して、プロテインＣのＧｌａ−およびＳＰドメインの両方に突然変異を含むプロテインＣの組み合わせバリアントを作成する。これは標準的なＤＮＡ分子生物学法を使用してｃＤＮＡレベルでなされる。
【０２２０】
好ましくは制限酵素開裂、断片の単離および断片の連結を使用する。
【実施例８】
【０２２１】
組換えバリアントの調製  
個々のプロテインＣバリアントに関するｃＤＮＡはＰｃＤＮＡ３ベクター中に存在し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位を使用してベクターにクローン化する。プロテインＣバリアントに関する全ｃＤＮＡはそれ故に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでの消化によりベクターから放出され得る。このｃＤＮＡはさらに特異的酵素により断片化される。組み合わせバリアントの作成に特に有用な酵素はＳａｌＩであり、これはプロテインＣのｃＤＮＡを２つの断片、ｃＤＮＡの５’部分に対応する小さい断片（コード配列の最初の２５９ヌクレオチド）、すなわちＧｌａ−ドメインを含むタンパク質のＮ−末端をコードする部分、およびプロテインＣの残りをコードするより大きな３’断片に開裂する。ＳａｌＩの開裂部位は４４位のコドンのちょうど３’位に位置し、したがってより小さい断片が完全長のＧｌａ−ドメインをコードする。Ｇｌａ−ドメインおよびＳＰドメインの両方に突然変異を有する組み合わせバリアントは、Ｇｌａ−ドメインが変異したプロテインＣからのより小さい５’断片を、ＳＰドメインに突然変異を有するプロテインＣバリアントのより大きな３’断片とを組み合わせることにより作成することができる。２つのプロテインＣのｃＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ開裂ＰｃＤＮＡ３ベクターと連結反応で組み合わせ、そして連結したＤＮＡは細菌を形質転換させるために使用する。抗生物質耐性クローンを標準技術で選択し、そしてプラスミドＤＮＡを単離し、そして配列をｃＤＮＡ中の突然変異の存在について確認する。次いでＤＮＡはＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトするために使用し、そして組換えプロテインＣが発現され、精製され、そして他のプロテインＣバリアントについて記載したように特性決定される。
【０２２２】
この方法に従い、Ｇｌａ−ドメイン突然変異ＱＧＮＳＥＤＹおよび配列番号７の修飾された配列からなるＳＰ−ドメイン突然変異を含む「スーパーＰＣ／ＡＰＣ」を調製する。
【０２２３】
組換えプロテインＣはトロンビンにより活性化され、そしてＡＰＴＴ反応で試験される。スーパー−ＡＰＣは野生型ＡＰＣによりも顕著な凝固時間の延長をもたらした（図１５）。この実験では、上昇した濃度のｗｔ−またはスーパー−ＡＰＣをＡＰＴＴ凝固時間反応に加え、そして凝固時間を監視する。ｗｔ−プロテインＣは期待どおり凝固時間を延長し、そして試験した最高濃度（２０ｎＭ）で、約１００秒の凝固時間を生じ、これはＡＰＣの不存在下で観察される時間のおよそ倍である。スーパーＡＰＣはさらにかなり活性であり、そしてすでに５ｎＭのＡＰＣ濃度で凝固時間は同様のレベルまで延長される。より高いスーパーＡＰＣ濃度で、凝固時間はさらに延長され、そして２０ｎＭのスーパー−ＡＰＣで、血漿は２００秒の観察時間内に凝固しない。
【０２２４】
ＡＰＴＴ試験は以下の手順に従いヒト血漿中で行った。
【０２２５】
ヒトのクエン酸処理血漿（５０μｌ）を５０μｌのＡＰＴＴ試薬と混合した。３７℃で１８０秒のインキューベーション後、５０μｌのＡＰＣを図１５に示した濃度で加えた。ＡＰＣは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌバッファー、ｐＨ７．５中に含まれ、また３０ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）も含んだ。図１５では、点は２回の測定の平均を表す。
【実施例９】
【０２２６】
この実施例では、ＧＮＥＤと呼ばれるＧｌａバリアント中の突然変異をＳＰ突然変異と組み合わせることによる効果、ここで修飾された領域ＷＧＹＲＤＥＴＫＲＮＲ（配列番号７）に、包括的な３００から３１４位からの野生型配列を置き換える。ＧＮＥＤ変異体は突然変異Ｇ１１、Ｎ１２、Ｅ３２およびＤ３３をＧｌａドメインに持つ（このバリアントはＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ  ＪＢＣ  １９９８に記載されている）。この組み合わせは、負に荷電したリン脂質膜に対して強化された親和性、および例えば国際公開第９９／２０７６７号パンフレットに記載されているような希釈されたＡＰＴＴおよび希釈された組織因子依存的アッセイにおいて、低濃度のリン脂質を含む凝固アッセイで強化された抗凝固活性が示されたバリアントの活性化形を有するプロテインＣバリアントを生じた。しかし通常のＡＰＴＴ反応では、ＧＮＥＤ−ＡＰＣはｗｔ−ＡＰＣほどに活性であるか、またはわずかに良いだけである。実施例１では、ＳＰバリアントが強化された抗凝固活性（少なくとも１００％の増加）を生じることが示されたが、幾つかの凝固アッセイ条件下では（特定のＡＰＴＴ試薬）、ＳＰ変異体の強化された抗凝固活性を明らかに示すことは難しかった。この意図は今、ＧＮＥＤおよびＳＰ突然変異を１つの新たなプロテインＣバリアントに組み合わせることであった。上で検討したように、仮定はＧｌａ突然変異の強化されたリン脂質結合能力が、より効率的なＳＰ変異体と組み合わされた時、有意に強化された抗凝固能力を持つプロテインＣハイブリッドを生じるだろうということであった。そのようなバリアントは血栓塞栓障害、敗血症等のような強化された凝固活性の状況において治療薬として有用となり得る。この新規バリアントはＧＮＥＤ−ＳＰと表し、そしてＧＮＥＤバリアントに由来するＧｌａドメインをコードするｃＤＮＡを、ＳＰ変異体のセリンプロテアーゼドメインをコードするｃＤＮＡと組み合わせることにより作成された。これは方法の章で概説した標準的なＤＮＡ技術で行った。次いで変異体ｃＤＮＡは２９３ＨＥＫ細胞をトランスフェクトするために使用し、そして高発現コロニーを単離し、そして拡大し、そして組換えタンパク質を含有するならし培地を集めた。組換えタンパク質を精製し、そして特性決定し、そしてトロンビンにより活性化して、前の章に記載したＡＰＣを生成した。
【０２２７】
ＡＰＴＴに基づくアッセイは以下のように行った：正常な個体に由来する５０μｌのヒト血漿を、５０μｌのＡＰＴＴ試薬（２部のオルガノンのＰｌａｔｅｌｉｎおよび０．１％ＢＳＡを含む１部のＴＢＳバッファー）（ＴＢＳは５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５を表す）と混合した。３７℃で１８０秒間インキューベーションした後、上昇する濃度のＡＰＣを含む５０μｌの２５ｍＭ  ＣａＣｌ２を加え、そして凝固時間を記録した。結果を図１６に示す。この実験で、ＳＰバリアントはｗｔＡＰＣと同様に活性であったが、ＧＮＥＤ−ＡＰＣバリアントはｗｔＡＰＣよりも明らかに良かった。しかしＧＮＥＤ−ＳＰが最高であり、そして試験した他のどのバリアントよりも明らかに抗凝固的であった。
【０２２８】
次のアッセイでは、正常な個体に由来する５０μｌのヒト血漿を、濃度が上昇するＡＰＣも含む１００μｌの希釈したシムプラスチン（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ）（１：５０に希釈して約３５秒の凝固時間を与える組織因子を含有する試薬）と混合した。ＳＰおよびｗｔバリアントはほぼ同等に活性であるが、ＧＮＥＤ−ＡＰＣはｗｔ−ＡＰＣよりも抗凝固的であった。しかしＧＮＥＤ−ＡＰＣバリアントは大変効率的であり、そしてすでに１〜２ｎＭのＧＮＥＤ−ＳＰでＡＰＣは明らかに延長された凝固時間を生じた（図１７）。
【実施例１０】
【０２２９】
この実施例では、実施例８のバリアント、すなわちＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）に由来するＧＬＡドメインを実施例１のＳＰ変異体のＳＰドメインと組み合わせることにより作成し、スーパー−ＡＰＣと呼ぶこのハイブリッドをさらに試験する。スーパー−ＡＰＣはＧＮＥＤ−ＳＰ  ＡＰＣよりも徹底的に試験し、血小板が支持する凝固に及ぼすＡＰＣの効果も関与する全血を使用した試験を含める。ヒト血漿だけでなく、ラットおよびマウス血漿も試験した。スーパー−ＡＰＣの抗凝固効果は、動物の血漿中で特に強力であった。これら動物血漿実験は、スーパー−ＡＰＣがＱＧＮＳＥＤＹ−ＡＰＣよりも効率的である点を証明するために取ることができる。スーパー−ＡＰＣのインビボ効果は予測することが難しいが、スーパー−ＡＰＣはＱＧＮＳＥＤＹ−ＡＰＣよりも抗凝固物質として効率的であるようである。
【０２３０】
ＡＰＴＴ反応では（図１８）（同じＡＰＴＴを用いて上記のように行った実験）、スーパー−ＡＰＣがＡＰＴＴ凝固時間の延長において任意の他のバリアントより効率的であった。ＱＧＮＳＥＤＹ−ＡＰＣと同じであるＡＬＬ−ＡＰＣは、ｗｔＡＰＣおよびＳＰ−ＡＰＣよりも効率的であった。スーパー−ＡＰＣは高度に効率的であり、そしてすでに１ｎＭの濃度未満のＡＰＣで明らかな抗凝固効果が観察されることは注目すべきである。
【０２３１】
組織因子に基づくアッセイでは（図１９）類似の結果が得られ、スーパー−ＡＰＣは任意の他のバリアントよりも効力的な抗凝固物であった。最低濃度のスーパー−ＡＰＣは、ｗｔＡＰＣの１０倍高いレベルとおよそ等しく、スーパー−ＡＰＣバリアントの高い効率を証明する。
【０２３２】
スーパー−ＡＰＣの抗凝固効果がプロテインＳの存在に依存的であるかどうかを試験するために、血漿プロテインＳがＨＰＳ５４（これはプロテインＳのＡＰＣコファクター活性の阻害に効率的であることが知られている）と表される過剰のモノクローナル抗体で阻害されるさらなる実験を行った。この実験では、血漿をＨＰＳ５４（５０μｇ／ｍｌの最終濃度）と室温で１時間インキューベーションし、これは以前に示されたように（Ｄａｈｌｂａｅｃｋ，Ｂ．，Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｍａｌｍ，Ｊ．、モノクローナル抗体を使用したビタミンＫ依存性プロテインＳ中の機能的に重要なドメインの特性決定（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎＳ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｐｄｉｅｓ）（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，８１２７−８１３５）、プロテインＳコファクター活性を阻害するために十分である。次いで血漿をＡＰＴＴ反応に使用し、そしてこの場合、スウェーデンのクロモジェニックス社のＡＰＴＴ試薬を使用した。他の観点では、実験は図１６について記載したように行った。ｗｔＡＰＣおよびＳＰ−ＡＰＣの両方が凝固時間を延長するのにむしろ非効率的であった（図２０）。対照的に、ＡＬＬ−ＡＰＣおよびスーパー−ＡＰＣの両方が、すでに１ｎＭ未満の濃度で凝固時間を効率的に延長した。スーパー−ＡＰＣの効果はＡＬＬ−ＡＰＣよりも強力であった。この実験では、スーパー−ＡＰＣバリアントがプロテインＳの不存在下でも効率的な抗凝固物質であることを示す。プロテインＳの不存在下でのスーパー−ＡＰＣのこの強力な抗凝固効果は、治療的に高度に興味深い特徴となるかもしれない。またスーパー−ＡＰＣがプロテインＳの存在下で刺激されたことにも注目することが重要である。
【０２３３】
通常のＡＰＣは血小板の存在下では抗凝固物質としてむしろ非効率的である。すなわち正常な生理学的条件下で、ＡＰＣは血小板表面上で起こる反応に及ぼす効果は無いか、または弱い効果を有するだけらしい。動脈血栓症は一般に血小板が関与するので、血小板上での凝固反応の阻害に効率的であるＡＰＣバリアントを得ることは興味深いかもしれない。これを試験するために、全血凝固試験を考案し、これは第Ｘａ因子（ＦＸａ）による凝固の開始に依存する。クエン酸処理した全血（７５μｌ）を３７℃で１８０秒間インキューベーションした後、２５ｍＭのＣａＣｌ２および濃度が上昇する種々のＡＰＣバリアントを含む７５μｌのＦＸａ（１ｎＭ）を加えた。バッファーは上で述べたＴＢＳ−ＢＳＡであった。ＡＰＣの不存在下で、凝固時間は約３３秒であった。ｗｔＡＰＣの添加（図２１）はむしろ非効率的であり、そして延長した凝固時間は＞２０ｎＭのＡＰＣでのみ観察された。ＳＰ−ＡＰＣバリアントはｗｔＡＰＣとほぼ同等に効率的であった。対照的にＡＬＬおよびスーパーバリアントは、より一層効力的であった。ＡＬＬ−ＡＰＣの場合、ｗｔＡＰＣよりも約２０倍活性であるが、スーパー−ＡＰＣはさらにより活性であると推定される。図２１から、スーパー−ＡＰＣは全血系でｗｔＡＰＣよりも約４０倍活性であると推定される。
【０２３４】
動物血漿実験は、ＡＰＴＴ−および組織因子に基づくアッセイ系の両方を使用して行った。ラット血漿を用いてＡＰＴＴ反応で得られた凝固時間は、一般にヒトの系で観察された時間よりも短かった。ＡＰＴＴ試薬をＴＢＳ−ＢＳＡで１：２に希釈して、約２５秒周辺の合理的な凝固時間を得ることが十分であると分かった（図２２）。ｗｔＡＰＣの添加はラット血漿の凝固時間の延長には非効率的であることが分かった。対照的に、ＳＰ−ＡＰＣおよびＡＬＬ−ＡＰＣの両方が効果は穏やかでも効果的であった。対照的にスーパー−ＡＰＣは高度に効率的であり、そして試験した最低濃度（２．５ｎＭ）でも、凝固時間を効果的に延長した。たとえラット血漿に基づくものであっても、この実験はスーパー−ＡＰＣがＳＰ−ＡＰＣまたはＡＬＬ−ＡＰＣのいずれよりも大変良いことを証明した。組織因子が誘導する系で得られた結果は、類似の結論をもたらした（図２３）。この系で、ｗｔ−ＡＰＣおよびＳＰ−ＡＰＣは同様であり、一方、ＡＬＬ−ＡＰＣはより有力な抗凝固物質であった。しかしスーパー−ＡＰＣは他のどのバリアントよりも明らかに大変効率的であった。
【０２３５】
マウス血漿を使用して、ＡＰＴＴおよび組織因子系の両方で得られた結果は、ラット血漿で得られた結果に類似した（図２４および２５）。両系で、効率に関してはスーパー−ＡＰＣが最も有力であり、ＡＬＬ−ＡＰＣが次に並ぶ。ＡＰＴＴ系では、ＳＰ−ＡＰＣがｗｔＡＰＣよりもわずかに効力的であったが、２つとも組織因子に基づく系での効率は類似した。特に組織因子に基づく系は、大変明瞭な結果をもたらし、スーパー−ＡＰＣが試験した他のすべてのバリアントよりも優れていた。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
以下では、本発明を図面を参照にしてより詳細に開示し、ここで図１〜５はＳＰ−ドメインにのみ突然変異を有するバリアントに関する、すなわち：
【図１】ヒトおよびウシ野生型ＡＰＣおよびＡＰＣ変異体のアミド分解活性を具体的に説明する。ヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）、ウシＡＰＣ−ＳＰ（■）。
【図２】Ａ〜Ｃは種々のＡＰＣがヒトおよびウシ血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間に及ぼす効果を具体的に説明する。Ａ）ヒト血漿では：ヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）、ウシＡＰＣ−ＳＰ（■）。Ｂ）ウシプロテインＳ（５μｇ／ｍｌの最終濃度）を補充したヒト血漿において：ヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）、ウシＡＰＣ−ＳＰ（■）。Ｃ）ウシ血漿では：ヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）、ウシＡＰＣ−ＳＰ（■）。
【図３】Ａ〜Ｃは種々のＡＰＣがヒト第ＶＩＩＩａ因子の不活性化に及ぼす効果を具体的に説明する。異なる濃度の種々のＡＰＣを第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、リン脂質およびＣａ２＋混合物と５分間、ウシ第Ｖ因子およびヒトもしくはウシプロテインＳの存在下でプレインキューベーションした。第Ｘ因子はこの溶液により活性化され、そして第Ｘａ因子の形成速度を合成基質で測定した。吸収は第ＶＩＩＩａ因子の活性に直線的に相関し、そして結果を各対照の割合として表した。Ａ）ヒトプロテインＳおよびウシ第Ｖ因子の存在下での高濃度のＡＰＣ（最終濃度を示す）による第ＶＩＩＩａ因子の不活性化；ヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）、ウシＡＰＣ−ＳＰ（■）。Ｂ）ヒトプロテインＳまたはウシ第Ｖ因子の存在下での低濃度のＡＰＣ（最終濃度を示す）による第ＶＩＩＩａ因子の不活性化；ヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）、ウシＡＰＣ−ＳＰ（■）。Ｃ）ウシプロテインＳおよびウシ第Ｖ因子の存在下でのＡＰＣ（最終濃度を示す）による第ＶＩＩＩａ因子の不活性化；ヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）、ウシＡＰＣ−ＳＰ（■）。
【図４】ＡおよびＢは種々のＡＰＣがヒトおよびウシ血漿のプロトロンビン時間に及ぼす効果を具体的に説明する。Ａ）ヒト血漿では：ヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）、ウシＡＰＣ−ＳＰ（■）。Ｂ）ウシ血漿では：ヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）、ウシＡＰＣ−ＳＰ（■）。
【図５】種々のＡＰＣ、すなわちヒトＡＰＣ（〇）、ヒトＡＰＣ−ＳＰ（●）、ウシＡＰＣ（□）およびウシＡＰＣ−ＳＰ（■）のヒト血漿による不活性化を具体的に説明する。
【０２３７】
図６〜１４は、Ｇｌａ−ドメインに突然変異を有するバリアントに関する。すなわち：
【図６】種々のＡＰＣバリアント（変異体）がヒト血漿で活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に及ぼす効果を具体的に説明する。以下のＡＰＣバリアントを調査した：ヒト野生型（ｗｔ）ＡＰＣ（●）、ＡＰＣ変異体ＱＧＮ（□）、ＡＰＣ変異体ＱＧＥＤ（▲）、ＡＰＣ変異体ＧＮＥＤ（×）、ＡＰＣ変異体ＳＥＤＹ（｜）およびＡＰＣ変異体ＡＬＬ（またはＱＧＮＳＥＤＹ）（△）。
【図７】ＡＰＴＴアッセイにおいてヒトプロテインＳがＡＰＣ（ｗｔおよび変異体）の効果に及ぼす影響を具体的に説明する。以下のＡＰＣバリアントを調査した：ｗｔＡＰＣ（●）およびＡＰＣ変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）（□）。
【図８】種々のＡＰＣバリアントがヒト血漿におけるプロトロンビンに及ぼす効果を具体的に説明する。以下のＡＰＣバリアントを調査した：ｗｔＡＰＣ（●）、ＡＰＣ変異体ＱＧＮ（□）、ＡＰＣ変異体ＱＧＥＤ（▲）、ＡＰＣ変異体ＧＮＥＤ（×）、ＡＰＣ変異体ＳＥＤＹ（｜）およびＡＰＣ変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（△）。
【図９】プロトロンビンのＦＸａが媒介する活性化（該活性化はＦＶａにより強化される）により生成されるトロンビンにより測定される、種々のＡＰＣバリアントがヒト第Ｖａ因子を不活性化する能力を具体的に説明する。以下のＡＰＣバリアントを調査した：ｗｔＡＰＣ（●）、ＡＰＣ変異体ＱＧＮ（□）、ＡＰＣ変異体ＳＥＤＹ（＋）、およびＡＰＣ変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）（△）。
【図１０】種々のＡＰＣバリアントがヒト第Ｖａ因子を不活性化する能力を具体的に説明し、ＦＶａの活性はプロトロンビナーゼアッセイにより測定される。以下のＡＰＣバリアントを調査した：ｗｔＡＰＣ（●）、ＡＰＣ変異体ＱＧＮ（▲）、ＡＰＣ変異体ＳＥＤＹ（△）、およびＡＰＣ変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）（□）。
【図１１】ＡＰＣによる正常、すなわち野生型（ｗｔ）、ＦＶａおよびＱ５０６変異体ＦＶａ（ＦＶａ  Ｌｅｉｄｅｎ）の不活性化を具体的に説明する。値は：ｗｔＡＰＣによるｗｔＦＶａ（●）；ＡＰＣ変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）によるｗｔＦＶａ（□）；ｗｔＡＰＣによるＲ５０６ＱＦＶａ（▲）；およびＡＰＣ変異体ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）によるＲ５０６ＱＦＶａ（×）の不活性化について表す。
【図１２−１４】ｗｔおよび変異体プロテインＣがホスホ−膜に結合する能力を具体的に説明する。ＢＩＡｃｏｒｅからの表面プラズマ共鳴法を使用した。これらの図面で異なるリン脂質、すなわち１００％ホスホァチジルコリン（図１２）；２０％ホスホァチジルセリンおよび８０％ホスホァチジルコリンの混合物（図１３）；および２０％ホスホァチジルセリン、２０％ホスファチジルエタノールアミンおよび６０％ホスホァチジルコリンの混合物（図１４）を使用した。すべての試験でヒト野生型プロテインＣ（ｗｔ）およびＡＰバリアントＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）、ＳＥＤＹ、ＳＥＤおよびＱＧＮを分析した。
【０２３８】
図１５〜２５は本発明のバリアント、すなわちＳＰ−ドメインおよびＧｌａ−ドメインの両方に突然変異を含むバリアントに関する。すなわち：
【図１５】ＱＧＮＳＥＤＹ（ＡＬＬ）の突然変異したＧｌａ−ドメインおよび突然変異したＳＰ−ドメインを含んでなる変異体（スーパー−Ａｐｃ）が、ヒト血漿における活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に及ぼす効果を具体的に説明する。
【図１６】ＡＰＴＴ反応における組換えＡＰＣバリアントの効果を具体的に説明する。
【図１７】ＧＮＥＤ−ＳＰが、組織因子が誘導する凝固に及ぼす効果を具体的に説明する。
【図１８】ＡＰＴＴ反応におけるＡＰＣバリアントの効果を具体的に説明する。
【図１９】ＡＰＣバリアントが、ＴＦが誘導する凝固に及ぼす効果を具体的に説明する。
【図２０】ＡＰＣバリアントが、Ｍａｂ  ＨＰＳ５４（プロテインＳ特異的）の存在下でＡＰＴＴ凝固時間に及ぼす効果を具体的に説明する。
【図２１】ＡＰＣバリアントが全血凝固に及ぼす効果を具体的に説明する。
【図２２】ｒａｔ血漿を使用したＡＰＴＴ反応におけるＡＰＣバリアントの効果を具体的に説明する。
【図２３】ｒａｔ血漿を使用したＴＦが誘導する凝固におけるＡＰＣバリアントの効果を具体的に説明する。
【図２４】マウスＡＰＴＴ反応におけるＡＰＣバリアントの効果を具体的に説明する。
【図２５】マウス血漿の組織因子が誘導する凝固に及ぼすＡＰＣバリアントの効果を具体的に説明する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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