(57)【要約】  本発明は、統合失調症、双極性障害、うつ病および他の気分障害などの精神障害の分野に関する。より詳細には、本発明は、モジュレータのスクリーニングのためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニット又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの使用、ならびに精神障害の治療のためのそのモジュレータの使用に関する。さらに、本発明は、精神障害の診断のためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットをコードする遺伝子に位置するバイアレリックマーカの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補となるモジュレータをスクリーニングするためのターゲットとしてのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットの使用。
【請求項２】
候補となるモジュレータをスクリーニングするためのターゲットとしてＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの使用。
【請求項３】
モジュレータが、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼを特異的に調節する請求項１又は２の使用。
【請求項４】
候補モジュレータが、天然リガンド、小分子、抗体、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー及び短干渉ＲＮＡからなる群から選択される請求項１から３のいずれかの使用。
【請求項５】
モジュレータが、精神障害の治療用の候補薬物である請求項１から４のいずれかの使用。
【請求項６】
精神障害の治療用医薬を製造するためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータの使用。
【請求項７】
モジュレータが、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼを特異的に調節する請求項６の使用。
【請求項８】
精神障害の治療用医薬を製造するためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターの使用。
【請求項９】
モジュレータが精神障害の治療用の公知薬物との組み合わせで使用される請求項１から８の使用。
【請求項１０】
精神障害が、双極性障害、総合失調症及びうつ病からなる群から選択される請求項５から９のいずれかの使用。
【請求項１１】
精神障害が双極性障害である請求項１０の使用。
【請求項１２】
自然結合パートナーをスクリーニングするためのターゲットとしてのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットの使用。
【請求項１３】
精神障害の治療のためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータの有効性を評価する方法であって、その方法は、精神障害の動物モデルにモジュレータを投与する工程を含み、モジュレータが動物モデルにおける精神障害の代表的な特徴を改善する決定は、アゴニストが、精神障害の治療用薬物であることを示す方法。
【請求項１４】
動物モデルが、シナプス欠損及び重篤な行動障害を有するＳＴＯＰ−／−マウスである請求項１３の方法。
【請求項１５】
モジュレータがＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼを特異的に調節する請求項１３又は１４の方法。
【請求項１６】
精神障害が、双極性障害、総合失調症及びうつ病からなる群から選択される請求項１３から１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
精神障害が双極性障害である請求項１６の方法。
【請求項１８】
個体が精神障害を患うか又は患うリスクがあるかどうかを診断するための少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーの使用。
【請求項１９】
ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーが、表３Ａに示されたような99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216ならびにそれらの相補体からなる群から選択される請求項１８の使用。
【請求項２０】
バイアレリックマーカー99-24169/139でのゲノタイプ「ＡＡ」の存在が、個体が精神障害を患うか又は患うリスクがあることを示す請求項１９の使用。
【請求項２１】
バイアレリックマーカー99-24169/139及び24-247/216でのハプロタイプ「ＡＧ」の存在が、個体が精神障害を患うか又は患うリスクにあることを示す請求項１９の使用。
【請求項２２】
バイアレリックマーカー99-24169/139、24-257/320及び99-24175/218でのハプロタイプ「ＡＡ」の存在が、個体が精神障害を患うか又は患うリスクにあることを示す請求項１９の使用。
【請求項２３】
ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーと精神障害との間に有意な関係があるかどうかを決定するための少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーの使用。
【請求項２４】
ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーが、表３Ａに示されたような99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216ならびにそれらの相補体からなる群から選択される請求項２３の使用。
【請求項２５】
精神障害が、双極性障害、総合失調症及びうつ病からなる群から選択される請求項１８から２４のいずれかの使用。
【請求項２６】
精神障害が双極性障害である請求項２５の使用。
【請求項２７】
生物学的サンプル中のＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカー又それらの相補体でのヌクレオチドの同一性を測定する工程を含むゲノタイピング方法。
【請求項２８】
生物学的サンプルが単一の被験者由来である請求項２７の方法。
【請求項２９】
バイアレリックマーカーでのヌクレオチドの同一性を、個体のゲノムに存在する前記バイアレリックマーカーの双方のコピーに対して測定する請求項２８の方法。
【請求項３０】
測定をマイクロシーケンシング解析によって行う請求項２７から２９のいずれかの方法。
【請求項３１】
さらに、測定工程前にバイアレリックマーカーを含むシーケンスの部分を増幅することを含む請求項２７から３０のいずれかの方法。
【請求項３２】
増幅をＰＣＲによって行う請求項３１の方法。
【請求項３３】
請求項２８から３２のいずれかの方法にしたがって少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーをゲノタイピングする工程を含む個体の精神障害を診断する方法。
【請求項３４】
ゲノタイピング工程の結果を、精神障害を患うリスクと関連付ける工程をさらに含む請求項３３の方法。
【請求項３５】
ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーが、表３Ａに示されたような99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216ならびにそれらの相補体からなる群から選択される請求項３３又は３４の方法。
【請求項３６】
バイアレリックマーカー99-24169/139でのゲノタイプ「ＡＡ」の存在が、精神障害を患うか又は患うリスクにあることを示す請求項３５の方法。
【請求項３７】
バイアレリックマーカー99-24169/139及び24-247/216でのハプロタイプ「ＡＧ」の存在が、精神障害を患うか又は患うリスクにあることを示す請求項３５の方法。
【請求項３８】
バイアレリックマーカー24-257/320及び99-24175/218でのハプロタイプ「ＡＡ」の存在が、精神障害を患うか又は患うリスクにあることを示す請求項３５の方法。
【請求項３９】
精神障害が、双極性障害、総合失調症及びうつ病からなる群から選択される請求項３３から３８のいずれかの方法。
【請求項４０】
精神障害が双極性障害である請求項３９の使用。
【請求項４１】
ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーでのヌクレオチドの同一性を測定するためのマイクロシーケンシング解析において、配列番号３７の少なくとも１２ヌクレオチドの連続スパンを含むポリヌクレオチド又はそれらに相補的なポリヌクレオチドの使用であって、前記ポリヌクレオチドの３’末端が、その配列におけるＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーの１ヌクレオチド上流に位置する使用。
【請求項４２】
少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーが、表３Ａに示されたような99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216ならびにそれらの相補体からなる群から選択される請求項４１の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、統合失調症、双極性障害、うつ病および他の気分障害などの精神障害の分野に関する。より詳細には、本発明は、モジュレータのスクリーニングのためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニット又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの使用、ならびに精神障害の治療のためのそのモジュレータの使用に関する。さらに、本発明は、精神障害の診断のためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットをコードする遺伝子に位置するバイアレリックマーカの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．ＰＰ２Ａホスファターゼ
プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、主な細胞内セリン／スレオニンプロテインホスファターゼの１つであり、ある細胞の全ホスファターゼ活性の大部分の説明となる。セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ活性に加えて、ＰＰ２Ａは、低いが、ホスホチロシンホスファターゼ活性をも示す。インビボにおけるＰＰ２Ａの正確な機能はまだ確定されていないが、ＰＰ２Ａは代謝、ＤＮＡ複製、細胞増殖、細胞周期及びウィルスの形質転換における役割を果たすことが証拠によって示唆されている。さらに、ＰＰ２Ａの脱調節は、発ガン及びアルツハイマー病のようなタウパシーの発現に寄与することが示唆されている(例えば、Janssens及びGoris (2001) Biochem J. 353:417-439参照)。したがって、ＰＰ２Ａは細胞プロセスの広い多様性において中心的な役割を果たす。
【０００３】
ＰＰ２Ａは２又は３のサブユニットによって構築されている。ＰＰ２Ａホスファターゼは、触媒サブユニット（ＰＰ２Ａ／Ｃ）、骨格（scaffolding）サブユニット（ＰＰ２Ａ／Ａ）及び最後に調節サブユニット（ＰＰ２Ａ／Ｂ）からなる。Ｂサブユニットの２つの目立った特徴は、それらの多様性、全サブユニット系統群の存在からの由来及びそれらにはＡサブユニットの類似の部分が認められるが、遺伝子系統群間での配列類似性が全て欠損している点である。したがって、少なくとも７５の異なる二量体及び三量体ＰＰ２Ａ異性体が、種々のＡ、Ｂ及びＣサブユニットの組み合わせの結合を通して発生し得る。
【０００４】
複数の系統群の存在及びＰＰ２Ａ／Ｂサブユニットの異性体は、生理学的機能が異なる異性体によってなされる可能性をもたらす。実際、生化学な特徴づけでは、サブユニット組成物及び特定の複合体形成が、ＰＰ２Ａの基質特異性及び触媒活性を調節する点において重要な役割を果たすことが証明されている（例えば、Usuiら(1988) J Biol Chem. 263:3752-3761参照）。また、調節サブユニットは、組織特異性、非細胞局在化及びＰＰ２Ａへの発達調節を与えると考えられている。
【０００５】
ＰＰ２Ａ／Ｂγは、二つのＢサブユニットのもう一方である。ＰＰ２Ａ／Ｂγは、マーカーD4S2925とD4S3007との間のヒト染色体4p16に位置するPPP2R2C遺伝子によってコードされている（Huら、Genomics., 2000, 67:83-6）。ストラックらは、ラットにおいて、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットは脳においてのみ検出することができることを示し、さらに、ＰＰ２Ａ／Ｂγは、細胞の細胞骨格画分において豊富で、発達上で調節される（Strackら(1998) J Comp Neurol. 1998 392:515-527）。この文献は、さらに、脳ＰＰ２Ａの分画は、異なるＢサブユニットによって調節されており、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットは細胞骨格構造にＰＰ２Ａを固着することを示す。酵素の局在化及びＰＰＰ２Ｒ２Ｃ発現の生後の増加（これはシナプス形成と同時に起こる）に基づいて、ストラックらは、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼは、シナプスの形成性及び神経障害に関連するかもしれないという仮説を立てている。
【０００６】
ＰＰ２Ａは主要なホスファターゼであるが、種々のＰＰ２Ａ異性体のホトンドにおいて、正確な生理学的役割はまだ解明されていない。特定のＢサブユニット及びそれらが明確に関連するプロセスにおけるさらなるデータは、新たな治療薬の発見を十分にもたらすであろう。
【０００７】
２．ＫＣＮＱカリウムチャネル
チャネルプロテインをコードする遺伝子の突然変異又は自己抗体の存在のため、イオンチャネルにおける機能不全は、チャネル疾患（channelopathy）と称され、病状の原因にますます密接に関与してきている。例えば、カリウムチャネルの機能不全は、中枢及び抹消神経系の双方に影響を及ぼす神経障害（例えば、偶発的失調症、癲癇、神経性筋緊張病、パーキンソン病、先天的聴覚消失症、遺伝性ＱＴ延長症候群）のいくつかの病態生理学に関連している。カリウムチャネルは、かなりの程度の多様性及び偏在を示し、膜の脱分極及び細胞興奮性の制御の基本となる。カリウムチャネル疾患の共通の特徴は、膜ポテンシャルの再分極の減少又は欠損である。市販のカリウムチャネルのオープナーは、例えば、疼痛治療用に用いられる鎮痛薬である、フルピルチンなどである。
【０００８】
ＫＣＮＱポリペプチドは、カリウムチャネル系統群に属する。ＫＣＮＱポリペプチドは、同価同義又は異価同義のカリウムチャネルを形成することに関与し、各ポリペプチドはそのチャネルのサブユニットに対応している。目下、ＫＣＮＱ系統群の５種の異なる構成物、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ３、ＫＣＮＱ４及びＫＣＮＱ５が知られている。異価同義のＫＣＮＱカリウムチャネルは、ＫＣＮＱ系統群の異なる構成物のいずれか、又はカリウムチャネル系統群のほかの構成物と関連するＫＣＮＱポリペプチドのいずれかを含むかもしれない。ＫＣＮＱカリウムチャネルのいくつかは、ＫＣＮＱ２及びＫＣＮＱ３を含み、Ｍ−電流を基礎とし、神経興奮性の重要な調節因子である。それらのアミノ末端及びカルボキシ末端の双方の末端は、膜の細胞内側に位置する。これらの末端は、他のプロテインとの相互作用及びチャネルの活性の調節の双方に重要な役割を果たす。
【０００９】
ＫＣＮＱチャネルの活性はプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）及びｃ−Ｓｒｃチロシンキナーゼ（Ｓｒｃ）によって調節されることが示されている。シュレーダーらは、異価同義ＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３チャネルによって生じる電流は細胞内サイクリックＡＭＰによって増大させることができ、この作用はＰＫＡが介在していることを示した。ＰＫＡは、電流強度を６６％刺激した（Schroederら(2000)、エチオピア(2000) 41:1068-1069）。Gamperらは、ＳｒｃのＫＣＮＱ２／ＫＣＮＱ３異価同義チャネルとの共発現が、電流密度の４．５倍減少及び０ｍＶでの活性化反応速度の２倍減速をもたらすことを示した。しかし、Ｓｒｃは、ＫＣＮＱ２同価同義チャネルによって生じる電流に作用しない（J Neurosci.(2003) 23:84-95）。したがって、ＫＣＮＱチャネルのリン酸化状態の調節（それはキナーゼ活性とホスファターゼ活性との間のバランスを示す）は、ニューロンの興奮性の制御に重要であると信じられている。
【００１０】
３．精神障害
精神障害は、広範囲のＣＮＳ障害を包含する。精神障害は、例えば、気分障害、精神病障害、不安障害、小児期障害、摂食障害及び人格障害を包含し、これら全ての用語は、ＤＳＭ−ＩＶの分類（Diagnosis and Statistical Manual of Mental Dis又はders, Fourth Edition, American Psychiatric Association, Washington D.C., 1994）に従って定義されている。気分障害は、双極性Ｉ障害（大うつ病を伴う又は伴わない躁病）、双極性ＩＩ障害（大うつ病を伴う軽躁病）、循環気質障害（軽躁病及び大うつ病の多数の短いエピソード）、気分変調障害（軽躁／躁病を伴わない長期大うつ病）及び大うつ障害（躁病を伴わない大うつ病）を含む。精神病性障害は、統合失調症、分裂感情性障害、総合失調症型障害、短期精神病性障害、妄想障害及び共有精神病障害を含む。双極性障害、総合失調症及びうつ病は３つの特に深刻で広く一般的な精神障害である。
【００１１】
３．１．双極性障害
双極性障害は、人口の約１．３％で発生している比較的一般的な障害であり、重症で潜在的な能力障害の影響に関して精神科クリニックで認められる気分障害の約半分を構成することが報告されている。双極性障害は、障害の型が性に依存して異なると認められている。例えば、双極性障害Ｉ型は男性と女性との間で同程度に認められるが、双極性障害ＩＩ型は、報告によれば、女性の方がより一般的である。双極性障害の発症年齢は、典型的には１３歳〜１９歳であり、診断は、典型的には患者の２０代早期になされる。また、双極性障害は、中高年においても、一般的には、神経学的障害または他の医学的状態の結果として発生する。患者の社会的発達に対する重度の影響に加えて、双極性患者における自殺完遂率は約１５％であることが報告されている。
【００１２】
双極性障害は、興奮相と、多くの場合にはうつ病相とによって特徴づけられる。興奮相（これは躁病または軽躁病と呼ばれる）およびうつ病相は交互に起こることがあり、または様々な混合状態で生じることがあり、異なる重症度で、種々の持続期間にわたって生じることがある。双極性障害は、種々の形態で存在し、種々の症状を示すことがあるため、双極性障害の分類は、これまで、双極性障害のサブタイプの定義をもたらし、異なる障害に罹患していると以前に考えられていた患者を含むように概念全体の拡大をもたらす広範な研究の主題であった。双極性障害は、多くの場合、一定の臨床的徴候、症状、治療および神経生物学的特徴を一般の精神病性疾患と共有しており、従って、正確な診断を行なうために精神科医に難題を与えている。さらに、双極性障害と種々の気分障害および精神病性障害との経過は非常に異なることがあるので、長期間にわたって疾患を管理する手段を提供するためには、できるだけ早期に疾患を特徴づけることが重要である。
【００１３】
この疾患に関連する躁病は動作を損ない、精神病を引き起こし、多くの場合には入院をもたらす。この疾患は、疾患に関係する直接的および間接的な費用ならびに疾患に伴なう社会的不名誉の両方の点から、時には世代をこえて、患者の家族および親類に重い負担を負わせている。そのような不名誉は孤立および無視をもたらすことが多い。さらに、発症が早いほど、教育および社会的発達の中断の影響がひどくなる。
【００１４】
双極性障害のＤＳＭ−ＩＶ分類は、躁病または軽躁病の程度および持続期間に基づいて４つの型の障害を区別し、そして同様に、典型的には医学的症状又はその治療に関して、あるいは物質乱用に対して、典型的に明らかな２つの型の障害を区別している。躁病は、高揚した気分、誇大妄想気分または過敏性気分によって認識され、注意散漫、衝動的行動、活動亢進、誇大性、意気高揚、観念の競合および精神的圧迫を受けた会話によっても認識される。
【００１５】
躁病の特定の程度および持続期間によって特徴づけられる双極性障害の４つの型のうち、ＤＳＭ−ＩＶには、下記が含まれる。
−双極性障害Ｉ型、これには、少なくとも１週間にわたって躁病を示す患者が含まれる、
−双極性障害ＩＩ型、これには、躁病よりも穏やかな興奮症状によって特徴付けられ、少なくとも４日間にわたる軽躁病を示す患者が含まれるが、この患者は以前には躁病を示したことがないが、以前に大うつ病の症状発現に苦しんだことがある、
−特定不能（ＮＯＳ）型双極性障害、これには、それ以外の点では双極性障害ＩＩ型の特徴を示すが、興奮相については４日の持続期間を満たさない患者、または大うつ病の症状発現を伴わない軽躁病を示す患者が含まれ、および
−循環気質、これは、軽躁病または大うつ病に対する基準を満たさないが、無症状の間隔が２ヶ月を越えることはなく、２年間にわたって非常に多くの躁病性症状およびうつ病性症状を示す患者が含まれる。
【００１６】
ＤＳＭ−ＶＩに分類されるような双極性障害の残りの２つの型は、種々の医学的障害およびその治療によることが明らかであるか、またはそれらによって引き起こされる障害、ならびに物質乱用を伴うか、または物質乱用に関連する障害である。双極性障害を引き起こし得る医学的障害には、典型的には内分泌障害および脳血管損傷が含まれ、双極性傷害を引き起こす医学的治療には、グルココルチコイドおよび興奮薬の乱用が含まれることが知られている。物質の使用または乱用に関連する障害は、「躁病性特徴または混合型特徴を伴う物質誘発性気分障害」と称されている。
【００１７】
双生児および養子の研究からの証拠及び世界的な発生率において変動がないことは、環境的リスク因子もまた、必要な、十分なまたは相互作用的な原因としていくらかのレベルで関与するが、双極性障害が本来的には遺伝的症状であることを示している。家族における双極性障害及び総合失調症の集合体は、これら２つの別個の障害が、いくつかの共通の遺伝的な感受性を共有しているということを示唆している。双極性障害のいくつかの関連研究が報告されており、いくつかの感受性領域が同定されている。双極性障害に関連するその領域は、1q31-q32、4p16、7q31、12q23-q24、13q32、18p11.2、21q22及び22q11-q13を含む（Detera-Wadleighら、(1999) Proc Natl Acad Sci USA A96(10):5604-9）。これらの領域のいくつか、例えば、4p16、12q24、18p11、21q21及び22q11は、独立した研究者によって、たびたび結び付けられている。さらに、例えば、13q32及び18p11.2のような双極性障害に関連する領域は、総合失調症のゲノムスキャンにも結びつけられ、これら２つの別個の障害が、いくつかの共通の遺伝的な感受性を共有していること確認している。しかし、双極性傷害及び／又は総合失調症の基礎をなす遺伝子は、また同定されていない。
【００１８】
３．２．統合失調症
４５００万人の統合失調症患者が世界には存在すると推定されており、開発途上国にはそのうちの３３００万人以上の患者がいると推定される。先進諸国では、統合失調症が、成人集団の約１パーセントにおいてその生涯のどこかの時点で発生している。祖父母の一人が総合失調症であれば、その疾患に罹るリスクは約３％に増加し、両親の一人が総合失調症であれば、約１０％に増加する。両親が総合失調症であれば、そのリスクは約４０％にまで上昇する。大部分の統合失調症患者は全く働くことができない。統合失調症患者に対する標準化死亡比（ＳＭＲ）は一般集団よりも２倍〜４倍高いと推定され、そして統合失調症患者の余命は、全体的には、一般集団の場合よりも２０％短い。統合失調症患者における最も一般的な死亡原因は自殺であり（患者の１０％で）、これは、一般集団の場合よりも２０倍高いリスク性であることを表している。また、心臓疾患による死亡ならびに呼吸器系および消化器系の疾患による死亡も、統合失調症患者の間では増加している。
【００１９】
統合失調症は、「陽性」症状または「陰性」症状のいずれかを伴う一群の精神病を含む。陽性症状は、幻覚、妄想および思考障害からなり、一方、陰性症状には、感情の平板化、意欲の欠如および運動活動の低下が含まれる。
多くの生化学的異常が同定されており、その結果、近年には、神経伝達物質に基づく仮説がいくつか提唱されている。最も一般的な仮説は「ドーパミン仮説」であり、その変形の１つは、大脳辺縁系中心部のドーパミン経路の過剰活性がＤ2受容体のレベルで存在することを述べている。しかし、研究者らは、ドーパミン作動系の様々な受容体と統合失調症との関連を矛盾なく認識することができないでいる。
【００２０】
３．３うつ病
うつ病は、世界中で３億４０００万の人々が罹患する深刻な医学的疾患である。悲哀、喪失感または一時的な気分状態の正常な感情的経験とは対照的に、臨床的なうつ病は持続的であり、個人の活動能力を著しく妨げることがある。結果として、うつ病は世界中で能力障害の最も有力な原因である。
うつ病の症状には、抑うつ気分、活動における興味または喜びの減少、食欲または体重の変化、不眠または過眠、精神運動の激越または遅滞、疲労または気力喪失、無価値感または過度の罪責感、不安、集中できないことまたは決断的に行動できないこと、および死または自殺についての反復思考が含まれる。単極性大うつ病（すなわち、大うつ病性障害）の診断は、人が、同じ２週間の間のほぼ毎日、通常の機能においてこれらの症状および障害のうちの５つ以上を有するか否かで行なわれる。うつ病の発症は、一般的には、青年期後期または成人期初期に始まる。しかし、最近の証拠は、うつ病が、過去３０年に生まれた人々では生涯のより早い時期に発生しつつあると考えられることを示唆している。
【００２１】
世界保健機関は、２０２０年までに、うつ病が開発途上国では人々に対する不健康の最大の負荷になり、それまでに、うつ病が死亡および能力障害の２番目に大きな原因になると予想している。大うつ病が引き起こすほとんど耐えられない苦悩のほかに、大うつ病における大きなリスク性は自殺である。大うつ病に罹患して５年以内に、罹患者の推定２５％が自殺を試みる。さらに、うつ病は、心臓発作、卒中、糖尿病およびガンの頻繁かつ重篤な合併症となる。１３年間に及ぶ１つの最近の研究によれば、大うつ病の病歴を有する人は、そのような病歴のない人々と比較して、心臓発作を経験する可能性が４倍であった。また、うつ病は、パーキンソン病およびアルツハイマー病などのＣＮＳ障害を伴う患者の５０％までの特徴となることがある。
【００２２】
３．４．治療
現在、統合失調症、双極性障害、うつ病および他の気分障害などのＣＮＳ障害に対する治療法がないため、治療の目的は、症状の重症度を、可能であれば、寛解点まで軽減させることである。症状が類似しているため、統合失調症、うつ病および双極性障害は、いくつかの同じ医薬品を用いて治療されることが多い。
【００２３】
３．４．１．双極性障害の治療
抑うつ障害エピソードはうつ病のように治療されるかもしれない。しかし、大部分の抗うつ薬は、うつ病から軽躁又は躁病への変化を招くことがあり、時折、それらの間の急速な周期を招くことがある。従って、これらの薬物は短期間のみ使用され、気分に対するそれらの作用は、厳重にモニターされる。軽躁又は躁病への変化の最初の兆候で、抗うつ薬は中止される。うつ病−抑うつ性障害の大部分の人々はリチウム、カルバマゼピン及びジバルプロエクスのような気分安定作用を有する薬物が与えられる。
【００２４】
リチウムは正常な気分に対して作用しないが、うつ病−抑うつ性疾患の人々の約７０％において、躁うつの傾向を低減させる。医師は血液検査で血中のリチウム濃度をモニターする。リチウムの起こり得る副作用は、振せん、筋肉痙攣、悪心、嘔吐、下痢、口渇、頻尿及び体重増加を含む。リチウムは、ざ瘡又は乾癬を悪化させ、甲状腺ホルモンの血中濃度の低下を引き起こし、まれに、頻尿を引き起こすことがある。血中においてリチウムが非常に高濃度であれば、持続的な頭痛、精神錯乱、嗜眠状態、痙攣及び異常心律動を引き起こすことがある。副作用は、年配者に起こりやすい。リチウムは発達中の胎児に心欠陥を引き起こすため、妊娠しようとする女性には、リチウムの摂取は中止しなければならない。
【００２５】
新たな薬物治療は過去何年にもわたって展開されている。これらは、カルバマゼピン及びジバルプロエクスを含む。しかし、カルバマゼピンは赤血球及び白血球数を相当減少させることがあり、ジバルプロエクスは肝障害（主として小児に）を引き起こすことがある。医師による注意深いモニタリングにより、これらの問題はまれになり、特に、他の治療が報告されていない、うつ病−抑うつ性障害の混合型又は急速な周期型の人々にとって、カルバマゼピン及びジバルプロエクスはリチウムの代替品として有用である。
【００２６】
３．４．２．総合失調症の治療
総合失調症に関して、抗精神病薬による薬物療法が最も一般的かつ最も有用な治療である。統合失調症のために一般に処方されている抗精神病性薬物には、４つの主要な種類がある。第１に、クロルプロマジン（トラジン）によって例示される神経遮断薬は、陽性（精神病性）症状を軽減させ、その再発を防止することによって、統合失調症患者の治療に大変革を起こしている。クロルプロマジンが投与された患者は、精神病院から退院することが可能になり、そして地域社会プログラムまたは患者自身の家で生活することが可能になっている。しかし、これらの薬物は理想からほど遠いものである。約２０％〜３０％の患者が薬物に全く応答せず、他の患者は最終的には再発する。これらの薬物は、種々の重篤な神経学的副作用を引き起こすので、神経遮断薬と名づけられた。そのような副作用には、腕および下肢における硬直および振戦、筋痙攣、異常な身体運動およびアカシジア（休みなく歩き回り、そわそわすること）が含まれる。これらの副作用はとても煩わしいので、多くの患者は薬物を服用することを簡単に拒絶する。さらに、神経遮断薬は統合失調症のいわゆる陰性症状を改善せず、その副作用はこれらの症状を悪化させることさえあり得る。従って、神経遮断薬の明らかに有用な効果にもかかわらず、良好な短期応答を有する患者でさえも、全体的な機能が最終的には悪化する患者がいる。
【００２７】
標準的な神経遮断薬におけるよく知られている欠陥により、新しい治療に対する探索が刺激され、非定型神経遮断薬と呼ばれる新しい種類の薬物がもたらされている。最初の非定型神経遮断薬であるクロザピンは、標準的な神経遮断薬に応答しない患者の約１／３に対して有効である。クロザピンは、陽性症状と同様に陰性症状を軽減させるようであり、または少なくとも陰性症状を標準的な神経遮断薬の場合よりも悪化させない。さらに、クロザピンは、全体的な機能に対して有用な効果を有しており、統合失調症患者における自殺の可能性を減少させることができる。クロザピンは標準的な神経遮断薬の煩わしい神経学的症状を生じさせないか、または、ホルモンであるプロラクチンの血中レベルを上昇させない。過剰なプロラクチンは、女性において月経不順および不妊症を生じさせることがあり、男性において性的不能または乳房拡大を生じさせることがある。標準的な神経遮断薬に耐えることができない多くの患者は、クロザピンを服用することが可能になった。しかし、クロザピンには種々の制限がある。クロザピンは、顆粒球減少症、すなわち、潜在的に致死的な白血球産生不能を生じさせ得るために、当初は市場から回収された。顆粒球減少症は依然として脅威であり、そのため、注意深い監視および定期的な血液検査が要求される。また、クロザピンは、発作および不安にさせる他の副作用（例えば、嗜眠状態、血圧低下、流涎、夜尿症および体重増加）を引き起こすことがある。従って、クロザピンは、通常的には、他の薬物に応答しない患者によってのみ服用される。
【００２８】
研究者は、クロザピンの欠点がなく、クロザピンの長所を有する３番目の種類の抗精神病性薬物を開発した。これらの薬物の１つがリスペリドン（リスパダール）である。初期の研究により、リスペリドンは、陽性症状については標準的な神経遮断薬と同じくらい効果的であり、陰性症状についてはいくらかより効果的となることがあると示唆されている。リスペリドンは、クロザピンよりも多くの神経学的副作用をもたらすが、標準的な神経遮断薬よりも副作用が少ない。しかし、リスペリドンはプロラクチンのレベルを上昇させる。現在、リスペリドンは広範な精神病患者に処方されているが、多くの臨床医は、リスペリドンの方が安全であると考えているので、標準的な薬物に応答しない患者に対しては、リスペリドンをクロザピンの前に使用するようである。
【００２９】
別の新しい薬物はオランザピン（ジプレキサ）である。これは、陽性症状については標準的な  薬物と少なくとも同じくらい効果的であり、陰性症状についてはより効果的である。オランザ  ピンは、通常の臨床的用量では神経学的副作用をほとんど有しておらず、プロラクチンのレベ  ルを著しく上昇させない。オランザピンは、顆粒球減少症を含むクロザピンの非常に面倒な副  作用の大部分を生じさせないが、オランザピンを服用する患者の一部は、鎮静化するか、また  はめまい、口渇を生じるか、あるいは体重を増加することがある。まれに、肝機能検査が一時  的に異常になる。
【００３０】
３．４．３．抑うつ症の治療
抗抑うつ薬は、いくつかのタイプが有用である。これらの抗抑うつ薬は、４種の主なカテゴリーに属する。三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤及び精神刺激薬である。三環系抗うつ薬は、例えば、アミトリプチリン、アモキサピン、ブプロピオン、クロミプラミン、デシプラミン、ドキセピン、イミプラミン、マプロチリン、ネフェゾドン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トラゾドン、トリミプラミン及びベンラファキシンを含む。選択的セロトニン再取り込み阻害剤は、例えば、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン及びセルトラリンを含む。モノアミンオキシダーゼ阻害剤は、例えば、イソカルボキサジド、パルギリン、フェネルジン及びトラニルシプロミンを含む。精神刺激薬は、例えば、デキストロアンフェタミン及びメチルフェニデートを含む。
【００３１】
これら抗抑うつ薬のすべては、彼らが仕事を始める前、少なくとも数週間定期的に摂取しなければならない。いずれかの与えられた抗抑うつ薬が特定のヒトに作用するであろう見込みは、約６５％である。しかし、これらの薬物の大部分は薬物の各タイプによって異なる副作用を有する。例えば、三環系抗うつ薬は、しばしば、鎮静を引き起こしたり、体重増加を招く。また、それらは、心拍数の増加、起立した際の血圧低下又はかすみ目のような副作用に関連することがある。
【００３２】
このように、双極性障害、総合失調症失調症、うつ病及び他の気分障害などの精神障害の場合、治療のために使用されている公知の分子は、副作用を有しており、疾患の症状に対してのみ作用するだけである。その結果、関連した副作用を伴なわず、そのようなＣＮＳ障害の原因となる機構に関与するターゲットに指向する新しい分子が強く求められている。従って、双極性障害及び総合失調症に関連するプロテインを同定することが必要である。双極性障害及び総合失調症に関連した新たなターゲットを提供することは、薬物の新たなスクリーニングを可能にし、その結果、これらの重篤な精神障害の治療に有効な新たな薬物をもたらす。
【００３３】
さらに、診断手段も必要とされている。疾患の過程における初期に長期間治療せずに総合失調症を放置しているという証拠が増加していることは、成果にネガティブな影響を与えるかもしれない。しかし、疾患の第１エピソードを体験している患者では、しばしば、薬物の使用が遅れる。患者は、彼らが病気であることを認識していないか、あるいは助けを求めることを恐れているかもしれない。家族の一員は、時折、問題が単純に消失することを望み、あるいは患者に治療を求めるように説得することができない。臨床医は、副作用の可能性があるので、診断がはっきりとしない場合、抗精神病を処方することを躊躇するかもしれない。実際、疾病の最初の発現で、総合失調症又は双極性障害は、例えば、薬物関連障害及びストレス関連障害から区別することが困難である。従って、双極性障害、総合失調症及びうつ病のような精神障害の感受性を検出する新たな方法が求められている。
【発明の開示】
【００３４】
本発明は、ＰＰ２Ａ／Ｂγの脱調節が双極性障害の発現に関連するという発見に基づいている。
従って、本発明の第１の観点では、候補となるモジュレータをスクリーニングするためのターゲットとして、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットの使用に指向する。
本発明の第２の観点では、候補モジュレータをスクリーニングするためのターゲットとして、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの使用に指向する。
第３の観点では、本発明は、精神障害の治療のための医薬を製造するために、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータの使用に関し、精神障害の治療用医薬を製造するために、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターの使用に関する。
【００３５】
自然結合パートナーのためのスクリーニングのためのターゲットとしてのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットの使用は、本発明の第４の観点である。
本発明の第５の観点は、精神障害の治療のためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータの有効性を評価する方法に関し、この方法は、精神障害の動物モデルにモジュレータを投与することを含む。ここで、モジュレータが、動物モデルにおける精神障害の典型的な特徴を改善するという決定は、アゴニストが、精神障害の治療用薬物であることを示す。
本発明の構成において、ＰＰ２Ａ／Ｂγをコードする遺伝子に位置するバイアレリックマーカーが同定されている。
したがって、本発明の第６の観点は、個体が精神障害を患っているか又は患うリスクにあるかを診断するための、少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーの使用に関する。
第７の観点では、本発明は、前記マーカーと精神障害との間に有意な関連があるかどうかを決定するための、少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーを包含する。
【００３６】
第８の観点では、本発明は、生物学的サンプルにおける、ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカー及びそれらの相補体でヌクレオチドの同一性を測定する工程を含むゲノタイピング法に関する。
第９の観点では、本発明は請求項２９から３３のいずれかの方法に従って、少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーをゲノタイピングする工程を含む個体における精神障害の診断方法に関する。
第１０の観点では、本発明は、ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーでヌクレオチドの同一性を決定するマイクロシーケンシング・アッセイにおいて、配列番号３７の少なくとも１２のヌクレオチドの連続スパンを含むポリヌクレオチド又はそのポリヌクレオチドの相補体の使用に関する。
【００３７】
（配列表に示された配列の簡単な説明）
配列番号１：ＫＣＮＱ２−１５ｂｘのＣＤＳからなるポリヌクレオチドに相当；
配列番号２：ＫＣＮＱ２−１５ｂｘポリペプチドに相当；
配列番号３：ＫＣＮＱ２−１５ｂｙのＣＤＳからなるポリヌクレオチドに相当；
配列番号４：ＫＣＮＱ２−１５ｂｙポリペプチドに相当；
配列番号５：ＫＣＮＱ２−１５ｂｚのＣＤＳからなるポリヌクレオチドに相当；
配列番号６：ＫＣＮＱ２−１５ｂｚポリペプチドに相当；
配列番号７：ＫＣＮＱ２−ｆｌポリペプチドに相当；
配列番号８から３６：実施例１から４で使用したプライマー及びプローブに相当；
配列番号３７：ＰＰ２Ａ／ＢγサブユニットをコードするＰＰＰ２Ｒ２Ｃ遺伝子に相当、ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーを示す；
配列番号３８：ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットに相当；
配列番号３９から４１：ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーのいくつかをマイクロシーケンシングするために使用されたプライマーに相当；
配列番号４２から４７：ＫＣＮＱ２遺伝子の領域に相当、ＫＣＮＱ２関連バイアレリックマーカーを示す。
【００３８】
（表の簡単な説明）
表１は、KCNQ2-fl、KCNQ2-15bx、KCNQ2-15by及びKCNQ2-15bzの構造を示す。
表２Ａ及び２Ｂは、それぞれ、PPP2R2C及びＫＣＮＱ２遺伝子におけるＰＣＲによるゲノムＤＮＡの増幅のために使用されたプライマーの位置を示す。
表３Ａ及び３Ｂは、それぞれ、PPP2R2C及びＫＣＮＱ２遺伝子に位置するバイアレリックマーカーを示す。
表４Ａ及び４Ｂは、それぞれ、PPP2R2C及びＫＣＮＱ２遺伝子に位置するバイアレリックマーカーをマイクロシーケンシングするために使用されたプライマーを示す。
表５Ａ及び５Ｂは、それぞれ、PPP2R2C及びＫＣＮＱ２遺伝子に位置するバイアレリックマーカーのｐ値を示す。
表６Ａ及び６Ｂは、それぞれ、PPP2R2C及びＫＣＮＱ２遺伝子に位置するバイアレリックマーカーの遺伝子型オッズ比を示す。
表７Ａ及び７Ｂは、PPP2R2Cに位置するバイアレリックマーカーの２セットのリスクハプロタイプを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、ＰＰ２Ａ／Ｂγ（ＰＰＰ２Ｒ２Ｃ）をコードする遺伝子と双極性障害との間の関連研究に由来する。実施例１５に示すように、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃは、２つの異なる集団において双極性障害に強力に関連する。ＰＰＰ２Ｒ２Ｃに位置し、かつ双極性障害に関連する新たに確認されたバイアレリックマーカーが提供される。さらに、本発明の構成において、ＰＰ２Ａ／Ｂγは、ＫＣＮＱ２カリウムチャネルの新規なスプライシング多型と相互作用し、また、ＫＣＮＱ２遺伝子は、双極性障害と関連することが証明された。さらに、（ｉ）ＰＰ２Ａは、新規なＫＣＮＱ２スプライシング多型を脱リン酸化し、（ii）ＧＳＫ３β及びＰＫＡは、新規なＫＣＮＱ２スプライシング多型をリン酸化することが示された。加えて、新規なＫＣＮＱ２スプライシング多型のリン酸化は、公知の精神安定剤であるリチウムの存在によって阻害される。
【００４０】
したがって、本発明は、双極性障害、総合失調症、うつ病及び他の気分障害のような精神障害の治療に有用な化合物を確認する手段を提供する。さらに、本発明は、それらのモジュレータをスクリーニングするターゲットとしてのＰＰ２Ａ／Ｂγの使用又はＰＰ２Ａ／Ｂγを含むＰＰ２Ａホスファターゼの使用、さらに精神障害を治療するためのモジュレータの使用に関する。また、本発明は、精神障害の診断のために、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃ遺伝子に位置するバイアレリックマーカーの使用に関する。
【００４１】
１．定義
用語「治療する（treatまたはtreating）」は、症状を改善又は緩和すること、症状の原因を一時的又は永続的に除くこと、あるいは指定された障害又は症状の兆候の発現を防止又は遅延させることを意味する。また、ここで用いられている用語「治療」も用語「障害の防止」を含み、これは、例えば、障害の兆候の発現を医学的に有意な程度に遅延させることによって明らかになる。障害の治療は、例えば、障害に関連する兆候を減少させること、あるいは障害の徴候の再発を改善させることによって明らかになる。
【００４２】
用語「精神障害」は、ＤＳＭ−ＩＶ分類（精神障害の診断と統計の手引き［Diagnostic and Statistical Manual of Mental Dis又はders］、改訂第４版、１９９４年）において、気分障害、精神病性障害、不安障害、小児期障害、摂食障害、人格障害、適応障害、自閉症、知覚障害、痴呆、多重梗塞性痴呆症及びトゥーレット症候群として特徴付けられる疾患を示す。
【００４３】
用語「統合失調症」は、ＤＳＭ−ＩＶ分類（精神障害の診断と統計の手引き［Diagnostic and Statistical Manual of Mental Dis又はders］、改訂第４版、１９９４年）において、統合失調症として特徴付けられる症状を示す。
【００４４】
ここで使用される用語「双極性障害」は、ＤＳＭ−ＩＶにおいて双極性障害として特徴づけられる状態を示す。双極性障害は、ＤＳＭ−ＩＶに記載されるような双極性障害Ｉ型および双極性障害II型かもしれない。さらに、その用語には、循環気質障害が含まれる。循環気質障害は、抑うつ性症状および軽躁症状が交互に生じることをいう。当業者は、病的な心理的状態に対する代わりの用語、薬量学および疾病分類法および分類システムが存在すること、これらのシステムが医学的科学的進歩とともに進化することを認識する。
【００４５】
用語「含む」、用語「からなる」または用語「から本質的になる」は、異なる意味を有しており、それぞれの用語は、本発明の範囲を変化させるために別の用語に代わって使用してもよい。
【００４６】
本明細書中で交換可能に使用される用語「オリゴヌクレオチド」および用語「ポリヌクレオチド」は、単鎖または二重鎖形態のいずれかで２つ以上のヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。用語「ヌクレオチド」は、単一らせんまたは二重らせん形態でいずれかの長さであるＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む化合物を示すために形容詞としてここで使用される。また、用語「ヌクレオチド」は、化合物を意味する個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドの変異体を示すために、あるいはプリンもしくはピリミジン、リボースもしくはデオキシリボースの糖残基、およびリン酸基、またはオリゴヌクレオチド内もしくはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合にはホスホジエステル結合を含む、より大きな核酸化合物における個々のユニットを示すために名詞として使用される。また、用語「ヌクレオチド」は、少なくとも１つの修飾、すなわち、（ａ）代わりの結合基、（ｂ）プリンのアナログ形態、（ｃ）ピリミジンのアナログ形態または（ｄ）糖のアナログ、例えば、類似的な結合基、プリン、ピリミジンおよび糖の修飾（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ９５／０４０６４を参照のこと、その開示は参考として本明細書中に組み込まれる）を含む「修飾ヌクレオチド」を包含するために本明細書中で使用される。しかし、本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、５０％を越える従来型のデオキシリボースヌクレオチドを含み、最も好ましくは９０％を越える従来型のデオキシリボースヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、エクスビボ作製またはそれらの組み合せを含むいずれかの公知の方法によって、ならびにこの分野で知られているいずれかの精製方法を用いることによって製造することができる。
【００４７】
用語「単離された」は、物質が、その最初の環境（例えば、物質が天然に存在する場合には自然環境）から取り出されることを必要とする。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドが、天然の系において共存する物質の一部またはすべてから分離されているとき、それらは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく及び／またはそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であってもよく、従って、そのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは、ベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点でやはり単離され得る。
【００４８】
用語「プライマー」は、ターゲットヌクレオチド配列に対して相補的であり、ターゲットヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせるために使用される特定のオリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のいずれかによって触媒されるヌクレオチド重合のための開始点としての役割を果たす。
【００４９】
用語「プローブ」は、サンプルに存在する特定のポリヌクレオチド配列を同定するために使用することができる規定された核酸セグメント（またはヌクレオチドアナログセグメント、例えば、ここで規定されるようなポリヌクレオチド）を意味し、その核酸セグメントは、同定される特定のポリヌクレオチド配列の相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
用語「相補的」または用語「それらの相補体」は、相補的な領域の全体にわたって別の特定されたポリヌクレオチドとワトソン＆クリック塩基対形成を形成することができるポリヌクレオチドの配列を示すために本明細書中では使用される。この用語は、それらの配列にのみ基づくポリヌクレオチドの対に適用され、２つのポリヌクレオチドが実際に結合する状態のいずれの特定セットにも適用されない。
【００５１】
用語「ポリペプチド」は、ポリマーの長さには関係なくアミノ酸のポリマーを示す。従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義に含まれる。また、この用語は、ポリペプチドの発現後の修飾を規定しないし、排除もしない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合的結合を含むポリペプチドは、明らかにポリペプチドの用語によって包含される。また、（例えば、天然に存在しないアミノ酸、関連しない生物学的系に天然に存在するだけのアミノ酸、哺乳動物系に由来する修飾されたアミノ酸などを含む）１つ以上のアミノ酸アナログを含有するポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、ならびにこの分野で知られている他の修飾体（天然に存在する修飾体および天然に存在しない修飾体の両方）もこの定義に含まれる。
【００５２】
ここで使用されるように、用語「エキソン」は、同様に、アミノ酸がＤＮＡのその部分によってコードされるように、スプライシングされたｍＲＮＡの部分をコードするＤＮＡの部分を示す。
【００５３】
ここで使用されるように、用語「スプライシング多型（splice variant）」は、代わりのスプ  ライシング事象によって生成された及び同じ遺伝子から形質転換された種々のｍＲＮＡを示す  。用語スプライシング多型は、同様に、対応ポリペプチドのようにｍＲＮＡも示す。
【００５４】
ここで使用されるように、用語「非ヒト動物」は、いずれかのヒト以外の脊椎動物、鳥類、より通常的には哺乳動物、好ましくは霊長類、飼育動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバおよびウマなど）、ウサギ、または齧歯類（より好ましくはラットまたはマウス）を示す。ここで使用されるように、用語「動物」は、いずれかの脊椎動物（好ましくは哺乳動物）を示すために使用される。用語「動物」および用語「哺乳動物」はともに、用語「非ヒト」が前に付かない限り、明らかにヒトを包含する。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「形質」及び「表現型」は、ここで交換可能に使用され、例えば、疾患の症状または感受性などの生物のいずれかの臨床的に区別可能、検出可能または他の場合には測定可能な性質を示す。典型的には、用語「形質」または用語「表現型」は、双極性障害の症状または感受性を示すために、あるいは双極性障害に対して作用する薬剤に対する個体の応答を示すために、あるいは双極性障害に対して作用する薬剤に対する副作用の症状または感受性を示すためにここで使用される。
【００５６】
ここで使用されるように、用語「アレル」は、そのヌクレオチド配列においてほかの形態とは異なった、バイアレリックマーカーの変異形態のひとつを示す。典型的には、最初に同定されたアレルは、オリジナル・アレルと呼び、これに対して、他のアレルは代替アレルと呼ばれる。二倍体生物はアレル形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性であるかもしれない。
【００５７】
ここで用いられる用語「多型」は、種々のゲノム又は個体間又はそれらの中での２以上の代替ゲノム配列又はアレルの発現を示す。「多型の（polymorphic）」は、特定のゲノム配列の２以上の変異体を集団で見出すことができる状態を意味する。「多型部位（polymorphic site）」は、変異体が発現する位置である。多型は、１以上のヌクレオチドの置換、欠損又は挿入を含む。単一のヌクレオチドの多型は、単一の塩基対変化である。一般に単一のヌクレオチド多型は、多型部位で、他のヌクレオチドによって１つのヌクレオチドが置き換わることである。「単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、単一の塩基対が異なる配列多型である。
【００５８】
２．ＰＰ２Ａ／Ｂγ及びＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの使用
本発明は、精神障害の治療又は診断のためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニット及びＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの使用に指向する。
本発明の第１の観点では、候補となるモジュレータをスクリーニングするためのターゲットとして、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットの使用に指向する。ここで使用されるように、用語「ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニット」は、「ＰＰ２Ａ／Ｂγ」と交換可能に用いられており、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃ遺伝子によってコードされるポリペプチドを示す。よって、用語ＰＰ２Ａ／Ｂγは、例えば、代替スプライシング多型又は代替開始メチオニンから翻訳されたポリペプチドに対応するＰＰＰ２Ｒ２Ｃによってコードされる全ての変異体を包含する。好ましいＰＰ２Ａ／Ｂγ変異体は配列番号３８のポリペプチドである。
【００５９】
ここで用いられているように、「ＰＰ２Ａ／Ｂγモジュレータ」は、ＰＰ２Ａ／Ｂγポリペプチドの活性を増減する化合物及び／又はそのポリペプチドをコードするＰＰ２Ａ／ＢγｍＲＮＡの転写レベルを増減する化合物を示す。用語「モジュレータ」は、アゴニスト及びアンタゴニストの双方を包含する。
【００６０】
ここで用いられているように、「ＰＰ２Ａ／Ｂγアンタゴニスト」は、ＰＰ２Ａ／Ｂγポリペプチドの活性を減少させる化合物及び／又はそのポリペプチドをコードするＰＰ２Ａ／ＢγｍＲＮＡの発現レベルを減少させる化合物を示す。用語「アンタゴニスト」及び「阻害剤」は、類義語であるとみなされ、この開示にわたって交換可能に使用することができる。
【００６１】
ここで用いられているように、「ＰＰ２Ａ／Ｂγアゴニスト」は、ＰＰ２Ａ／Ｂγポリペプチドの活性を増加させる化合物及び／又はそのポリペプチドをコードするＰＰ２Ａ／ＢγｍＲＮＡの発現レベルを増加させる化合物を示す。用語「アゴニスト」及び「活性化剤」は、類義語であるとみなされ、この開示にわたって交換可能に使用することができる。
【００６２】
モジュレータにおける、ＰＰ２Ａ／Ｂγポリペプチドの活性を増減させる又はＰＰ２Ａ／ＢγｍＲＮＡの発現を増減させるそれらの能力を試験するために使用することができる方法は、当該分野でよく知られており、さらに以下に詳細に示す。
ＰＰ２Ａ／Ｂγは、ＰＰ２Ａホスファターゼの２つの調節Ｂサブユニットの１つである。実施例４及び６に示すように、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットは、インビトロにおいてＫＣＮＱ２ポリペプチドに結合することができる。ここで使用されるように、用語「ＫＣＮＱ２ポリペプチド」は、ＫＣＮＱ２遺伝子によってコードされるいずれかのポリペプチドを示す。よって、用語「ＫＣＮＱ２ポリペプチド」は、例えば、配列番号２のポリペプチド、配列番号４のポリペプチド、配列番号６のポリペプチド、配列番号７のポリペプチドおよび他の先に示した異性体（例えば、SwissProt Accession No. O43526参照）等のＫＣＮＱ２遺伝子によってコードされる全ての代替スプライシング多型を包含する。実施例２に記載されたエキソン１５ｂを含むポリペプチド、例えば、配列番号２、４及び６のポリペプチドは、さらに、「ＫＣＮＱ２−１５ｂポリペプチド」と定義される。
【００６３】
よって、用語「ＰＰ２Ａ／Ｂγ活性」は、ここで用いられるように、ＫＣＮＱ２ポリペプチドに結合するＰＰ２Ａ／Ｂγの能力を示す。好ましくは、ＰＰ２Ａ／ＢγはＫＣＮＱ２ポリペプチドに結合するＰＰ２Ａ／Ｂγの能力である。あるいは、用語「ＰＰ２Ａ／Ｂγ活性」は、触媒又は骨格サブユニットのようなＰＰ２Ａホスファターゼのほかのサブユニットに結合するＰＰ２Ａ／Ｂγの能力であってもよい。ＫＣＮＱ２ポリペプチドに結合するＰＰ２Ａ／Ｂγの能力又はＰＰ２Ａホスファターゼのほかのサブユニットに結合する能力は、例えば、実施例４に記載された酵母マッチング試験、実施例６に記載された固相オーバーレイ・アッセイを含む、当業者によく知られたいくつかのアッセイによって測定することができる。
【００６４】
本発明の第２の観点では、候補モジュレータをスクリーニングするためのターゲットとしてＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの使用に指向する。ここで用いられているように、用語「ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータ」は、ここで用いられているように、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのいずれかの活性を増減する化合物を示す。モジュレータは、アゴニスト及びアンタゴニストの双方を包含し、つまり、アゴニストは、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性を増加させる化合物であり、アンタニストは、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性を減少させる化合物である。ＰＰ２Ａ／Ｂγモジュレータは、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性を調節すると信じられている。したがって、ここで用いられるように、用語「ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータ」は、用語「ＰＰ２Ａ／Ｂγモジュレータ」を包含する。
【００６５】
用語「ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性」は、ここで用いられているように、ＰＰ２Ａ異性体（isoform）のような酵素活性を示す。ＰＰ２Ａの活性は、セリン／セロトニンプロテインホスファターゼ活性及びホスファチロシンホスファターゼ活性の双方を示す。ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性は、例えば、実施例７で記載されている脱リン酸化アッセイを含む当業者によく知られたくつかのアッセイによって測定することができる。
【００６６】
本発明の全ての観点及び実施形態においては、モジュレータは、好ましくは、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼを特異的に調節する。言い換えると、モジュレータは、(i) ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性を増減し、(ii) ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含まないＰＰ２Ａホスファターゼの活性にまったく又は有意に作用しない。
インビボ又はインビトロのいずれかでモジュレータのスクリーニングを行う場合、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性を測定するためのアッセイは、さらに、以下に詳細に示す。
【００６７】
本発明の候補となる化合物は、自然に発生する及び合成の化合物を含む。そのような化合物は、例えば、天然リガンド、小分子、アンチセンスｍＲＮＡ、抗体、アプタマー及び短干渉ＲＮＡを含む。ここで用いられるように、用語「天然リガンド」は、インビボで、ＰＰ２Ａ／Ｂγを含むホスファターゼに結合するいずれかのシグナリング分子を指し、例えば、脂質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ぺプチド、ポリペプチド、プロテイン、炭水化物及び無機分子のような分子を含む。ここで用いられるように、用語「小分子」は、有機化合物を指す。ここで用いられるように、用語「抗体」は、免疫系の細胞によって生成されるプロテイン又は抗原に結合するそれらのフラグメントを指す。ここで用いられているように、用語「アンチセンスｍＲＮＡ」は、普通にｍＲＮＡに加工され、翻訳されたらせん構造に相補的な、あるいはそれらの領域に相補的なＲＮＡ分子を指す。ここで用いられているように、用語「アプタマー」は、人工的な核酸リガンドを指す（例えば、Ellingからn及びSzostak (1990) Nature 346:818-822参照）。ここで用いられるように、用語「短干渉ＲＮＡ」は、配列−特異的転写後遺伝子サイレンシングを含む二重らせんＲＮＡを指す（例えば、Elbashirら、 (2001) Genes Dev. 15:188-200参照）。
【００６８】
そのような候補となる化合物は、例えば、生物学的ライブラリ、空間アドレス可能並行固相又は液相ライブラリ及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリ法を含む当該分野で公知の無作為配列ライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリアプローチは一般にペプチドライブラリが用いられ、一方、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチド、オリゴマー、アプタマー又は化合物の小分子ライブラリが用いられる。
【００６９】
モジュレータのための候補となる化合物をスクリーニングするために用いることができる方法の一例は、
ａ）ＰＰ２Ａ／Ｂγ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼと候補となる化合物とを接触させ、及び
ｂ）その候補となる化合物の存在下で、ＰＰ２Ａ／Ｂγ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性を試験する工程を含む方法であり、ここで、その化合物の非存在下でのＰＰ２Ａ／Ｂγ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性に対する比較におけるその化合物の存在下でのその活性の差は、その化合物が、ＰＰ２Ａ／Ｂγ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータであることを示す。
【００７０】
あるいは、そのアッセイは、
ａ）ＰＰ２Ａ／Ｂγ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼを発現する細胞を、候補となる化合物と接触させ、及び
ｂ）その候補となる化合物の存在下でのＰＰ２Ａ／Ｂγ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性を試験する工程を含むセルベースアッセイであってもよく、ここで、その候補化合物の非存在下での活性に対する比較におけるその化合物の存在下でのＰＰ２Ａ／Ｂγ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性における差は、その化合物がＰＰ２Ａ／Ｂγ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータとなることを示す。
【００７１】
モジュレータは、ＰＰ２Ａ／Ｂγ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのいずれかの活性を調節することができる。モジュレータは、例えば、細胞におけるＰＰ２Ａ／ＢγｍＲＮＡ発現を調節し、又はＰＰ２Ａ／ＢγのＫＣＮＱ２ポリペプチドへの又はＰＰ２Ａの他のサブユニットへの結合を調節する。さらに、測定することができる活性は、セロトニン／スレオニンプロテインホスファターゼ活性及びＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのホスホチロシンホスファターゼ活性を含む。
【００７２】
好ましい実施形態では、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性は、そのセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ活性を測定することによって評価される。この活性は、実施例７に示されたように測定することができる。ＰＰ２Ａのセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ活性を測定するほかのいくつかの方法は、当該分野で公知である。そのような方法は、例えば、プライスら (Biochemistry. (2000) 39:11312-11318)及びカミバヤシら (J Biol Chem. (1994) 269:20139-20148) によって示されたホスファターゼ・アッセイを含む。いずれかの公知のＰＰ２Ａ基質をそのようなアッセイで使用してもよい。ある実施形態では、そのような基質はＫＣＮＱ２ポリペプチドである。
他の好ましい実施形態では、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性は、そのホスホチロシンホスファターゼ活性を測定することによって評価することができる。この活性は、例えば、アゴスティニスら (Eur J Biochem. (1996) 236:548-557)によって示されたように測定することができる。
【００７３】
さらに好ましい実施形態では、ＰＰ２Ａ／Ｂγの活性は、ＰＰ２Ａ／ＢγのＫＣＮＱ２ポリペプチドへの結合を測定することによって評価される。ＫＣＮＱ２ポリペプチドのＰＰ２Ａ／Ｂγへの結合は、例えば、実施例３に示したような酵母マッチング試験又は実施例６に示したような固相オーバーレイ・アッセイによって測定することができる。
他の好ましい実施形態では、ＰＰ２Ａ／Ｂγの活性は、ＰＰ２Ａ／ＢγがＰＰ２Ａの他の触媒サブユニット又はＰＰ２Ａの骨格サブユニットへ結合することを測定することによって評価される。また、このアッセイは、実施例３及び６に示したような酵母マッチング試験または固相オーバーレイ・アッセイを用いて行うことができる。
【００７４】
さらなる好ましい実施形態では、ＰＰ２Ａ／Ｂγの活性は、細胞内におけるＰＰ２Ａ／ＢγｍＲＮＡレベルを測定することによって評価される。この実施形態では、活性は、ＰＰ２Ａ／ＢγｍＲＮＡに特異的なプライマー及びプローブで、例えば、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定することができる。用語「ＰＰ２Ａ／ＢγｍＲＮＡ」は、ここで用いられているように、ＰＰ２Ａ／ＢγをコードするＰＰＰ２Ｒ２Ｃ遺伝子から翻訳された全ての代替多型及びスプライシング多型を包含する。プライマー及びプローブは、１つの特異的ＰＰ２Ａ／Ｂγスプライシング多型を検出することができるし、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃから翻訳された全ての代替スプライシング多型を検出することもできる。あるいは、ＰＰ２Ａ／ＢγｍＲＮＡの発現は、ポリペプチドレベルで、ＥＬＩＳＡアッセイ又はＲＩＡアッセイ、ウェスタンブロットもしくは免疫組織化学的アッセイのようなイムノアッセイにおいてＰＰ２Ａ／Ｂγに特異的に結合する標識抗体を用いることによって測定することができる。
【００７５】
実施例１５で示したように、ＰＰ２Ａ／Ｂγ調節サブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの脱調節は、双極性障害の発現及び発展に寄与する。したがって、例えば、上記スクリーニングのいずれかによって見出すことができるＰＰ２Ａ／Ｂγの又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータは、精神障害の治療用の候補薬物となる。
【００７６】
本明細書の開示にわたって用いられているように、用語「精神障害」は、ＤＳＭ−ＩＶの分類（Diagnosis and Statistical Manual of Mental Dis又はders, Fourth Edition, American Psychiatric Association, Washington D.C., 1994）に従って定義されている。本発明の全ての観点及び実施形態では、用語「精神障害」は、好ましくは、双極性障害、総合失調症及びうつ病からなる群から選択される精神障害である。全ての観点及び実施形態では、用語「精神障害」は、もっとも好ましくは双極性障害である。
【００７７】
本発明のさらなる観点は、精神障害の治療用医薬を製造するためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータの使用である。そのような医薬は、いずれかの生理的に許容される担体との組み合わせでのＫＣＮＱ２ポリペプチドのモジュレータを含む。生理的に許容される担体は、当業者に公知のいずれかの方法で製造することができる。生理的に許容される担体は、限定されないが、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA 1985)に記載されたものを含む。ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータを含む医薬組成物及び生理的に許容される担体は、例えば、静脈内、局所、直腸、局部、吸入、皮下、皮内、筋肉内、口内、大脳内及び硬膜下腔内へ投与することができる。その組成物は、液体（例えば、溶液、懸濁液）、固体（例えば、丸剤、錠剤、座剤）又は半固体（例えば、クリーム、ゲル）の形態とすることができる。投与されるべき用量形態は、個体の必要、所望の作用、投与経路の選択に依存する。
【００７８】
患者が、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼの活性の増加を得ようとする場合には、特に有効は医薬は、ＰＰ２Ａ／Ｂγをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターである。患者への投与では、そのようなベクターは、インビボにおいて、好ましくは、適当な細胞又は組織で特異的に発現する活性剤をもたらすであろう。このように、本発明のほかの観点では、精神障害の治療のための医薬を製造するためのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターの使用である。
【００７９】
遺伝子治療に用いることができる発現ベクターは、当該分野でよく知られており、それらは、問題となる遺伝子の発現のために役立つさらなる要素を含む。それらは、プロモータのような調節配列及びエンハンサー配列、選択マーカー配列、増殖の起源等を含む。好都合には、ＰＰ２Ａ／Ｂγの発現は、よって、その部位でなされ、例えば、脳又は脳の所定の領域に限定される。
好ましい実施形態では、発現ベクターは、レンチウィルス由来のベクターである。レンチウィルスベクターは、遺伝子の転写に、特にＣＮＳ内において、非常に有効なものとして示されている。他の十分に確立されたウィルスベクター、例えば、アデノウィルス由来ベクターも、本発明にしたがって用いることができる。
本発明の好ましい実施形態では、発現ベクターは、筋肉注射によって投与することができる。
【００８０】
細胞でのＰＰ２Ａ／Ｂγの内因性の生成を誘導する及び／又は高めるベクターの使用は、通常、ＰＰ２Ａ／Ｂγの発現を現さないか、あるいは十分でないＰＰ２Ａ／Ｂγ量を発現するが、これは本発明によって意図されている。そのベクターは、ＰＰ２Ａ／Ｂγを発現することを所望する細胞において機能的な調節配列を含んでいてもよい。そのような調節配列は、例えば、プロモータであり、あるいはエンハンサーであってもよい。このように、調節配列は、相同組換えによってゲノムの適当な座に導入することができ、よって、ＰＰ２Ａ／Ｂγは調節配列と遺伝子とともに結合し、必要とされる発現が誘導され又は高められる。その技術は、通常、「内因性遺伝子活性」（ＥＧＡ）として示され、例えば、国際特許公開公報ＷＯ９１／０９９５５号に記載されている。
【００８１】
ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータ又はＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターのいずれかを含む医薬は、精神障害の治療用のいずれかの公知の薬物との組み合わせて投与してもよい。モジュレータは、例えば、リチウム、カルバマゼピン又はジバルプロエキスのような双極性障害を治療するために用いられる精神安定剤との組み合わせで投与することができる。また、モジュレータは、例えば、三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、モノアミンオキシダーゼ阻害剤及び精神刺激薬のような抗うつ薬との組み合わせで投与することができる。総合失調症及び他の精神病性障害を治療する際、モジュレータを、例えば、クロルプロマジン、クロザピン、リスペリドン又はオランザピンのような抗精神病薬と組み合わせて投与することができる。
【００８２】
他の観点は、自然結合パートナーのスクリーニングのためのターゲットとしてのＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットの使用である。自然結合パートナーをスクリーニングする方法は、例えば、実施例１で示された酵母２−ハイブリッド（yeast two-hybrid）スクリーニングを含む。ターゲットとしてのＰＰ２Ａ／Ｂγの使用は、双極性障害に含まれるプロテインの同定のために、ならびに双極性障害及び他の気分障害の治療における新たな介入ポイントを提供するために非常に有用である。
【００８３】
精神障害の治療用のＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットを含むＰＰ２Ａホスファターゼのモジュレータの有効性を評価する方法もまた、本発明によって意図されており、その方法は、精神障害の動物モデルにそのモジュレータを投与することを含んでいる。ここで、動物モデルにおける精神障害の代表的な特徴をモジュレータが改善することは、アゴニストが、精神障害の治療のための薬物であることを示す。
【００８４】
精神障害の動物モデル及び化合物が動物モデルでの精神障害の代表的な特徴を改善したかどうかの決定のためのアッセイは、近年用いられており、科学及び特許文献に記載されている。例えば、上記方法で使用することができる動物モデルは、限定されないが、ラットでの条件回避行動モデル（これは、抗精神病活性の標準的な行動試験予測である）、Omnitech Digiscan動物活性モニターにおけるマウス及びラットでの行動活性評価（その目的は、抗精神病様ＣＮＳ作用及び一般にＣＮＳ活性と関連する他の行動作用の多様性のために化合物を評価することである）、ラットにおけるアンフェタミン刺激行動の遮断、ラットにおける聴覚驚愕モデルのプレパルス阻害のためのプロトコル、アポモルフィン誘発漸増行動の阻害及びＤＯＩ誘発頭部攣縮及び引っかきの阻害を含む。好ましい動物モデルは、シナプス欠損及びAndrieuxらによって示されたいくつかの行動障害を伴うSTOP-/- マウスである（2002, Genes Dev., 16:2350-2364）。
【００８５】
３．ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカー
本発明は、個体が、精神障害を患っているか患うリスクがあるかどうかを診断するための少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーの使用に関する。ここで用いられているように、「ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカー」は、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃのエキソンに、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃのイントロンに、又はＰＰＰ２Ｒ２Ｃの調節領域に位置するバイアレリックマーカーを指し、ＰＰＰ２Ｒ２ＣはＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットをコードする遺伝子である。ＫＣＮＱ２関連バイアレリックマーカーは、実施例１２における表３Ａに示されたバイアレリックマーカーを包含する。
【００８６】
ある実施形態では、単一のバイアレリックマーカーが、個体のゲノタイプを測定することによって、個体が精神障害を患っているか患うリスクがあるかどうかを診断するために用いられる。他の実施形態では、いくつかのバイアレリックマーカーの組み合わせを、個体のハプロタイプを測定することによって、個体が精神障害を患っているか患うリスクがあるかどうかを診断するために用いることができる。例えば、２−マーカーハプロタイプ、３−マーカーハプロタイプ又は４−マーカーハプロタイプを測定することができる。
【００８７】
ここで用いられているように、用語「バイアレリックマーカー」は、集団におけるかなり高頻度での２つのアレルを有する多型を指し、好ましくは、単一ヌクレオチド多型を指す。本発明のバイアレリックマーカーの共通でないアレルの一般的な頻度は、１％を超えることが確認されており、好ましくはその頻度は１０％を超え、より好ましくはその頻度は２０％を超え（つまり、ヘテロ接合性率が少なくとも０．３２）、さらに好ましくはその頻度は３０％を超える（つまり、ヘテロ接合性率が少なくとも０．４２）。この明細書では、用語「バイアレリックマーカー」は、多型及び多型を有する座の双方を指す。
【００８８】
ここで用いられているように、用語「ゲノタイプ」は、個体又は試料において存在するアレルの同一性を指す。用語「ゲノタイプ」は、好ましくは、個体のゲノムに存在する単一バイアレリックマーカーの双方の複製の種類を指す。個体は、ゲノムに存在するバイアレリックマーカーの２つのアレルが同一であれば、ホモ接合とする。個体は、ゲノムに存在するバイアレリックマーカーの２つのアレルが異なれば、ヘテロ接合とする。
バイアレリックマーカーに対して試料又は個体を、用語「ゲノタイピングする」とは、バイアレリックマーカーで個体によって担われる特異的なアレル又は特異的なヌクレオチドを決定することを含む。
【００８９】
ここで用いられているように、用語「ハプロタイプ」とは、一つの染色体に存在するバイアレリックマーカーに密接に関連するアレルのセットを指し、それはともに遺伝によって受け継がれる傾向にある。
個体が有するアレル、ゲノタイプ又はハプロタイプを決定する方法は、当業者によく知られており、以下でさらに説明する。
全ての実施形態では、好ましい「精神障害」は、双極性障害、総合失調症及びうつ病を含む。最も好ましい精神障害は双極性障害である。
本発明の文脈において、個体は、一般にヒトと理解される。
【００９０】
本発明の構成において、４つの確認されたＰＰ２Ａ／Ｂγバイアレリックマーカーが提供される。これら４つのマーカーは、99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216であり、実施例１２の表３Ａに示す。よって、好ましい実施形態は、個体が精神障害を患っているか又は患うリスクがあるかどうかを診断するために99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216からなる群から選択されるＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーの使用である。これら４つのバイアレリックマーカーの代替アレルを表３Ａに示す。また、ＰＰＰ２Ｒ２Ｃにけるこれらバイアレリックマーカー（配列番号３７に対応）の位置を表３Ｂに示す。他の好ましい実施形態は、99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216に相補的なバイアレリックマーカー（つまり、ＤＮＡの相補的ならせん構造において位置する対応代替アレル）の使用に指向する。
【００９１】
実施例１５の表５Ａに示されているように、関連研究は、４つのバイアレリックマーカーに対して行われた。これらＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーの４つ全てが、双極性障害関連マーカーであることを見出された。したがって、本発明の好ましい実施形態は、個体が精神障害を患っているか又は患うリスクがあるかどうかを診断するために、バイアレリックマーカー99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216と、それらの相補体からなる群から選択されるＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーを使用することに指向する。
個体は、白色人種の個体のいずれとしてもよい。ある実施形態においては、個体は、イギリス  諸島起源の白色人種個体である。
【００９２】
バイアレリックマーカー99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216に対するリスクアレルは、実施例１５に示されている。ここで使用される「リスクアレル」とは、双極性障害を有する可能性が、他のアレルを有する個体よりも、バイアレリックマーカーのリスクアレルを有する個体の方が高いことを意味する。99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216に対するリスクアレルは、「Ａ」である。よって、本発明の好ましい実施形態は、個体が精神障害を患っているか又は患うリスクがあるかどうかを診断するために、バイアレリックマーカー99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216又はそれらの相補体のいずれかを用いることであり、ここでバイアレリックマーカー99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216のいずれかでのアレル「Ａ」の存在は、精神障害に精神障害を患っているか又は患うリスクがある個体を示す。
【００９３】
バイアレリックマーカー99-24169/139に対するリスクゲノタイプは、実施例１５の表６Ａに示されている。ここで用いられるように、「リスクゲノタイプ」とは、双極性障害を有する可能性が、他のゲノタイプを有する個体よりも、リスクゲノタイプを有する個体の方が高いことを意味する。バイアレリックマーカー99-24169/139に対するリスクゲノタイプは、「ＡＡ」である。よって、本発明の好ましい実施形態は、個体が精神障害を患っているか又は患うリスクがあるかどうかを診断するために、バイアレリックマーカー99-24169/139又はそれらの相補体を用いることであり、ここでバイアレリックマーカー99-24169/139でのゲノタイプ「ＡＡ」の存在は、精神障害を患っているか又は患うリスクがある個体を示す。
【００９４】
４つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカー99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216に対するハプロタイプ頻度分析を行った（実施例１５）。より詳細には、バイアレリックマーカー99-24169/139及び24-257/320ならびにバイアレリックマーカー99-24175/218及び24-247/216のリスクハプロタイプを測定した。ここで使用されているように「リスクハプロタイプ」とは、双極性障害を有する可能性が、他のハプロタイプを有する個体よりも、リスクハプロタイプを有する個体の方が高いことを意味する。バイアレリックマーカー99-24169/139及び24-247/216に対するリスクハプロタイプは、「ＡＧ」である。よって、本発明の好ましい実施形態は、個体が精神障害を患っているか又は患うリスクがあるかどうかを診断するために、バイアレリックマーカー99-24169/139及び24-247/216又はそれらの相補体を用いることであり、ここでバイアレリックマーカー99-24169/139及び24-247/216でのハプロタイプ「ＡＧ」の存在は、精神障害を患っているか又は患うリスクがある個体を示す。バイアレリックマーカー24-257/320、99-24175/218に対するリスクハプロタイプは、「ＡＡ」である。よって、本発明の他の好ましい実施形態は、個体が精神障害を患っているか又は患うリスクがあるかどうかを診断するために、バイアレリックマーカー24-257/320及び99-24175/218又はそれらの相補体を用いることであり、ここでバイアレリックマーカー24-257/320及び99-24175/218でのハプロタイプ「ＡＡ」の存在は、精神障害を患っているか又は患うリスクがある個体を示す。
【００９５】
本発明の全ての観点及び実施形態において、「ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカー」は、バイアレリックマーカー99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216ならびにそれらの相補体を包含する。好ましいＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーは、99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216ならびにそれらの相補体である。バイアレリックマーカー99-24169/139及びそれらの相補体は、最も好ましいＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーである。
【００９６】
本発明のさらなる観点は、そのマーカーと精神障害との間に有意な相関関係があるかどうかを決定するために少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーを用いることに指向する。そのような測定は、例えば、以下の実施例１０から１５に記載されている方法（しかし、ＵＣＬ及びラビモ集団とは異なる集団、例えば、少数民族起源とは異なる集団を用いる）を使用することによって行うことができる。また、その測定は、双極性障害以外、例えば、総合失調症又は他の気分もしくは精神障害の形質のために行ってもよい。本発明のこの観点では、ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーは、99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216ならびにそれらの相補体からなる群から選択することができる。あるいは、ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーは、本明細書に特に開示されていないマーカーであってもよい。
【００９７】
さらに、本発明は、生物学的試料中のＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカー又はそれらの相補体でヌクレオチドの同一性を測定する工程を含むゲノタイピングする方法に指向する。好ましくは、その生物学的試料は、単一の被験者からのものである。バイアレリックマーカーでのヌクレオチドの同一性は、その個体のゲノムに存在するバイアレリックマーカーの双方の複製に対して測定されることが好ましい。好ましい実施形態では、バイアレリックマーカーでのヌクレオチドの同一性は、マイクロシーケンシング・アッセイによって測定される。好ましくは、バイアレリックマーカーを含む配列の部分が、ヌクレオチドの同一性の測定前に増幅されることである。増幅は、好ましくは、ＰＣＲによって行うことができる。そのようなゲノタイピングの方法は、例えば、本明細書の実施例１０から１４に記載されたプロトコルのいずれかを用いて行うことができる。さらにゲノタイピングの方法は、当業者によく知られており、他の既知のプロトコルを用いてもよい。
【００９８】
バイアレリック多型を検出するためのゲノタイピングに用いることができる、当業者によく知られた方法は、従来のドットブロット分析、一重ストランド構造多型分析（ＳＳＣＰ）(Oritaら、(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:2766-2770)、変性勾配ゲル電気泳動(DGGE) (Borresenら、(1988) Mutat Res. 202:77-83)、ヘテロ二本鎖分析 (Lessa ら、(1993) Mol Ecol. 2:119-129)、ミスマッチ分割検出 (Grompeら、(1989) Proc Natl Acad Sci USA. 86:5888-5892)のような方法を含む。特別な多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を測定するほかの方法は、米国特許第4,656,127号に記載されたような、特殊エキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を用いる。オリゴヌクレオチドマイクロアッセイ又は固相捕獲ジデオキシヌクレオチド及びマススペクトル法も用いることができる(Wenら、(2003) World J Gastroenterol. 9:1342-1346；Kimら、(2003) Anal Biochem. 316:251-258)。好ましい方法は、シーケンシングアッセイ、マイクロシーケンシングアッセイ、酵素ベースミスマッチ検出法又はハイブリダイゼーションアッセイによってバイアレリックマーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を直接測定する方法を含む。
【００９９】
ここで用いられているように、用語「生物学的試料」は、核酸を含む試料を指す。核酸のいかなる源も（精製されていようと、精製されていまいと）原料核酸として利用することができる。ただし、それは、所望の特定の核酸配列を含んでいるか、含んでいることが予想されるものである。ＤＮＡ又はＲＮＡは細胞、組織、体液等から抽出することができる。
【０１００】
ゲノタイピングの方法は、例えば、関連研究における症例−対照集団をゲノタイピングすることにおいて、ならびに与えられた形質に関連することが知られているバイアレリックマーカーのアレルの検出にける個体をゲノタイピングすることにおいて使用することができる。本発明の文脈では、好ましい形質は、双極性障害、総合失調症及びうつ病からなる群から選択される精神障害であり、より好ましくは双極性障害である。
【０１０１】
ゲノタイピングの方法は、個体のゲノタイピングを測定するのみならず、個体のハプロタイプを測定するために用いてもよい。個体のハプロタイプを測定する場合、それぞれ単一の染色体が独立的に試験されるべきである。個体のハプロタイプを測定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、非対称ＰＣＲ増幅（Newornら(1989) Nucleic Acids Res. 17:2503-2516；Wuら(1989) Proc.Natl. Acad. Sci. USA.  86:2757-2760）、制限希釈による単一の染色体の単離及びそれに続くＰＣＲ増幅（Ruanoら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6296-6300）及び十分に近接するバイアレリックマーカーに対して、特異的アレルの二重ＰＣＲ増幅（Sarkar及びSommer、(1991) Biotechniques. 10:436- 440）を含む。
【０１０２】
よって、本発明はさらに、個体のハプロタイプを測定するために少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーの使用に指向する。例えば、個体における一セットのバイアレリックマーカーのハプロタイプを測定する方法は、ａ）少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ２関連バイアレリックマーカーのために個体をゲノタイピングし、ｂ）第２のバイアレリックマーカーでヌクレオチドの同一性を測定することによって第２のバイアレリックマーカーのために個体をゲノタイピングする工程を含んでいてもよい。好ましくは、双方のマーカーは、ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーである。また、個体における少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーを含む２つより多いバイアレリックマーカーの組み合わせのためのハプロタイプを測定する方法は、本発明によって包含される。そのような方法において、工程（ｂ）は、組み合わせの追加したマーカーのそれぞれで繰り返される。そのような組み合わせは、例えば、３、４又は５つのバイアレリックマーカーを含んでいてもよい。これらのバイアレリックマーカーは、すべてＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーとすることができる。
【０１０３】
集団におけるハプロタイプ頻度を評価する場合、それぞれの個体にハプロタイプを対応付けることのない方法を用いてもよい。そのような方法はハプロタイプ測定の統計学的方法を使用する。よって、本発明の他の局面は、集団における一セットのバイアレリックマーカーのハプロタイプの頻度を評価する方法を包含し、その方法はａ）少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ２関連バイアレリックマーカーのためにその集団におけるそれぞれの個体をゲノタイピングし、ｂ）第２のバイアレリックマーカーでヌクレオチドの同一性を測定することによって第２のバイアレリックマーカーのためにその集団におけるそれぞれの個体をゲノタイピングし、及びｃ）工程ａ）及びｂ）で測定されたヌクレオチドの同一性にハプロタイプ決定方法を適用して、その頻度の評価を得る工程を含む。また、そのような方法は、２より多いバイアレリックマーカーの組み合わせで行ってもよい。工程（ｃ）は、集団におけるハプロタイプの頻度を測定し、又は評価する、当該分野で公知のいずれの方法を用いて行ってもよい。好ましくは、ハーディ‐ヴァインベルク平衡（ランダムマッチング）の仮定の下、ハプロタイプ頻度の最大尤度推定値を導く期待値−極大化（ＥＭ）アルゴリズム（Dempster ら(1977) JRSSB, 39:1-38；Excoffier及びSlatkin、(1995) Mol Biol Evol. 12:921-7）が、工程（ｃ）を行うために用いられる。
【０１０４】
本発明の好ましい観点は、その個体由来の生物学的試料におけるＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカー又はそれらの相補体でヌクレオチドの同一性を測定する工程を含むゲノタイピング法を用いて、少なくとも１つのＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーをゲノタイピングする方法を含む、個体における精神障害を診断する方法に指向する。そのような診断方法は、さらに、ゲノタイピング工程の結果と精神障害を患うリスクとを互いに関係づける工程を含んでいてもよい。一般に、ゲノタイピングされたＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーのリスクアレル、リスクゲノタイプ、リスクハプロタイプの存在は、精神障害を患うリスクと互いに関係している。ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーは、バイアレリックマーカー99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216ならびにそれらの相補体からなる群から選択することができる。ある実施形態では、バイアレリックマーカー99-24169/139でゲノタイプ「ＡＡ」の存在は精神障害にかかるリスクがあることを示す。他の実施の形態では、バイアレリックマーカー99-24169/139及び24-247/216でのハプロタイプ「ＡＧ」は精神障害にかかるリスクがある個体を示す。さらなる他の実施の形態では、バイアレリックマーカー24-257/320及び99-24175/218でのハプロタイプ「ＡＡ」は精神障害にかかるリスクがある個体を示す。
【０１０５】
さらなる観点では、本発明は、ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーでのヌクレオチドの同一性を測定するためのマイクロシーケンシング・アッセイにおいて、配列番号３７の少なくとも１２のヌクレオチドの連続スパンからなるポリヌクレオチド又はそれらに相補的なポリヌクレオチドの使用に関し、ここで、ポリヌクレオチドの３’末端はその配列におけるＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーの１ヌクレオチド上流に位置する。そのようなヌクレオチドは、配列番号３７の少なくとも１２、１５、１８、１９又は２０のヌクレオチドの連続スパン又はそれらに相補的なポリヌクレオチドを含む。それらは、好ましくは、配列番号３７の約１９ヌクレオチドの連続スパン又はそれらに相補的なヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ＰＰ２Ａ／Ｂγ関連バイアレリックマーカーは、99-24169/139、24-257/320、99-24175/218及び24-247/216ならびにそれらの相補体からなる群から選択される。好ましい実施形態では、配列番号３７の少なくとも１２の連続スパンを含むポリヌクレオチドあるいはそれらに相補的なポリヌクレオチドが、実施例１４における表４Ａに示されたプライマーからなる群から選択される。
【０１０６】
実施例
実施例１：酵母２ハイブリッドスクリーニング
１．pGBKT7-PPP2R2Cの構築
PPP2R2C遺伝子の領域をコードする全長は、ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットをコードし、はじめに配列番号８及び配列番号９の２つの遺伝子特異的プライマーを有するヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリ（Marathon-Ready cDNA、クローンテック）から増幅した。この第１のＰＣＲ生成物を、次いで、配列番号１０及び配列番号１１のプライマーの新しい組み合わせで増幅した。増幅フラグメントは、ｃＤＮＡの全長のヌクレオチド52-1540、EcoRI及びBamHIクローニング部位でそれぞれ延長されたゲンバンク受け入れ番号AF086924を包含する。得られた1503-bpフラグメントを、EcoRI及びBamHIで消化し、精製し、pGBKT7ベクター（クローンテック）のEcoRI及びBamHIクローニング部位に挿入した。
【０１０７】
２．酵母２ハイブリッドスクリーニング
ＰＰ２Ａ／Ｂγサブユニットと相互作用するポリペプチドを見つけるために、酵母２ハイブリッドスクリーニングを行った。Saccharomyces cerevisiae株AH109 （MATa、trp1-901、leu2-3、112、ura3-52、his3-200、gal4Δ、gal80Δ、LYS2 :: GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3、GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2、URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ）をpGBKT7-PPP2R2C 構造に形質変換した。酢酸リチウム形質変換を、製造業者の指示に従って行った（Matchmaker Two-Hybrid system、クローンテック）。次いで、ベイト（bait）を発現するMATa形質変換細胞を、Y187株で予め形質変換されたマッチマーヒト脳cDNAライブラリ（MATα、ura3-52、his3-200、ade2-101、trp1-901、leu2-3、112、gal4Δ、met-、gal80Δ、URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ）に混合した。３種の独立したマッチングを、それぞれ、ヒト脳ｃDNAライブラリの、それぞれ5.106、5.106及び2.105 クローンで行った。プレートに含まれたSD/-Leu/-Trpメディウムにおいて生長することができる、得られた２倍体細胞を、さらに、ベイト−プレイ（prey）相互作用を確認するためにメディウム−ストリンジェンシーSD/-Leu/-Trp/-His選択メディウムで選択した。次いで、陽性のクローンを採取し、高ストリンジェンシーSD/-Leu/-Trp/-His/-Ade選択メディウムで培養した。SD/-Leu/-Trp及びSD/-Leu/-Trp/-His/-Adeメディウムで同時に生長することができるクローンのｃDNAのみをシーケンシング及びさらなる研究のために保持した。
【０１０８】
３．酵母２ハイブリッドスクリーニングの結果
494のクローンを得、シーケンシングし、分析した。これらのクローンの中で、2E11及び1D3クローンは、ＫＣＮＱ２カリウムチャネルの新規なスプライシング多型をコードする部分的ｃDNAを含んでいた。2E11は、配列番号２のアミノ酸433から643をコードするｃDNAを含み、1D3は配列番号２のアミノ酸454から643をコードするｃDNAを含んでいた。全長スプライシング多型を、実施例２に示すようにクローン化し、シーケンシングした。
【０１０９】
実施例２：全長ＫＣＮＱ２スプライシング多型のクローニング
１．クローン化及びシーケンシング
ヒト脳からのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡであるサラムス（thalamus、クローンテック）を、2E11でクローン化した新規なスプライシング多型と特異的にハイブリダイジングする配列番号１２のプライマーで、ネズミ科モロニー白血病ウィルス逆転写酵素(RT-PCR Advantage kit、クローンテック)を用いて逆転写（ＲＴ）した。フェノール−クロロホルム抽出及び精製工程の後、先のＲＴ−ＰＣＴで得られた生成物を、以下の、配列番号１３及び配列番号１４の遺伝子特異的プライマーを用いて、直接、ＰＣＲ増幅した。増幅されたフラグメントは、ＫＣＮＱ２全長ｃＤＮＡ（ゲンバンク受け入れ番号AF033348）のヌクレオチド127-148を包含する。これらのプライマーを、それぞれ、EcoRI及びBa/IIクローニング部位で延長した。PCR生成物は、EcoRI及びBa/II制限酵素（ニューイングランドバイオラボ）で消化し、精製し、次いで、pCMV-Mycベクター（クローンテック）のEcoRI及びBa/IIクローニング部位に結紮した。２つのpCMV-Myc-3H9及びpCMV-Myc-3H2クローンを、完全にシーケンシングした。pCMV-Myc-3H2に挿入された配列は配列番号１を含み、pCMV-Myc-3H9に導入された配列は、配列番号３を含む。
同様に、ｃDNAを、ヒト胎児脳からのポリ（A）＋ｍRNAライブラリからクローン化した。一つのクローンを得、完全にシーケンスした。その挿入物は、配列番号５を含んでいた。
【０１１０】
２．新規なスプライシング多型の詳細
配列番号１は、配列番号２（ＫＣＮＱ２−１５ｂｘ）のポリペプチドをコードし、配列番号３は、配列番号４（ＫＣＮＱ２−１５ｂｙ）のポリペプチドをコードし、配列番号５は、配列番号６（ＫＣＮＱ２−１５ｂｚ）のポリペプチドをコードし、配列番号７は、全長ＫＣＮＱ２ポリペプチド（ＫＣＮＱ２―ｆｌ）に対応する。
【０１１１】
配列番号７、配列番号２、配列番号４及び配列番号６間の配列で示したように(図１)、３つのスプライシング多型は、ＫＣＮＱ２と比較して新規なカルボキシル−末端を示す。配列番号２、配列番号４及び配列番号６の５５のカルボキシ末端アミノ酸は、これら３つのスプライシング多型に特有のものである。これら５５のアミノ酸は、配列番号２の589から643位でのアミノ酸に対応する。
【０１１２】
ＫＣＮＱ２遺伝子のゲノム構造を、図３及び表１に示した。ＫＣＮＱ２遺伝子は、１７のエキソンを含む。いずれの新規なスプライシング多型も、ＫＣＮＱ２遺伝子のエキソン１５、１６及び１７に対応するエキソンを示していない。それらは全て、新規のエキソン、エキソン１５ｂを示し、それは、配列番号２の５４５から６４３位でのアミノ酸をコードする。エキソン１５及び１５ｂによってコードされる４４のはじめのアミノ酸は、同一である（配列番号２の５４５から５８８位のアミノ酸）。エキソン１５ｂによってコードされる５５の最後のアミノ酸は、エキソン１５ｂに特有である（配列番号２の５８９から６４３位のアミノ酸）。さらに、新規なスプライシング多型は、ＫＣＮＱ２―ｆｌのエキソン１６及び１７を示さない。これらのスプライシング多型の大部分のカルボキシ末端はエキソン１５ｂである。さらに、配列番号２は、ＫＣＮＱ２のエキソン１からエキソン１４を含む。ＫＣＮＱ２のエキソン１２は、配列番号４で欠損している。ＫＣＮＱ２のエキソン９及び１２は、配列番号６で欠損している。
【０１１３】
2E11クローンの導入物は、部分ｃDNAに対応するが、それは、エキソン１３、１４及び１５ｂを含む。
【０１１４】
【表１】
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【０１１５】
実施例３：酵母マッチング試験
１．ベクターの構築
１．１．EX１３−１７（エキソン１３、１４、１５、１６及び１７を含む）
pGADT7-EX13-17プラスミドを、以下のように構築した：１４１４−ｂｐフラグメントを、はじめに、配列番号１５及び配列番号１６の２つの遺伝子特異的プライマーを用いてヒト胎児脳ｃDNAライブラリ（マラソン−レディー ｃDNA、クローンテック）からPCR増幅した。次いで、このはじめのPCR生成物を、配列番号１７及び配列番号１８の遺伝子特異的プライマーの第２セットで増幅した。これらのプライマーは、それぞれEcoRI及びBamHIクローニング部位で延長された。EcoRI及びBamHI制限酵素で消化した後、1338-bp精製フラグメントをｐGADT７（クローンテック）の同クローニング部位に結紮した。
【０１１６】
１．２．EX１３−１５（エキソン１３、１４及び１５を含む）
pGADT7-EX13-15プラスミドを以下のように得た。484-bpのフラグメントを配列番号１９及び配列番号２０のプライマー（それらは、それぞれ、EcoRI及びBamHIクローニング部位で延長された）を用いて、pGADT7-EX13-17構造の第１のＰＣＲ生成物から、ＰＣＲ増幅した。次いで、得られたフラグメントを、 EcoRI及びBamHI で消化し、精製し、pGADT7(クローンテック）の同クローニング部位に結紮した。
【０１１７】
１．３. EX16-17（エキソン１６及び１７を含む）
pGADT7-EX16、17プラスミドを以下のように得た。883-bpのフラグメントを配列番号２１及び配列番号２２のプライマー（それらは、それぞれ、EcoRI及びBamHIクローニング部位で延長された）を用いて、pGADT7-EX13-17構造の第１のＰＣＲ生成物から、ＰＣＲ増幅した。次いで、得られたフラグメントを、 EcoRI及びBamHI で消化し、精製し、pGADT7(クローンテック）の同クローニング部位に結紮した。
【０１１８】
１．４．EXsp１５ｂ（エキソン１５ｂに特有の領域を含む）
pGADT7-EXsp１５ｂプラスミドを以下のように得た。400-bpのフラグメントを、配列番号２３（EcoRIクローニング部位で延長された）及び配列番号２４プライマーを用いて、pACT2-2E11プラスミドから、ＰＣＲ増幅した（実施例１参照）。次いで、得られたフラグメントを、 EcoRI及びXholで消化し、精製し、pGADT7(クローンテック）の同クローニング部位に結紮した。
【０１１９】
１．５．EXco１５（エキソン１５及び１５ｂに共通の領域を含む）
pGADT7-EXco１５ドメインプラスミドを以下のように構築した。146-bpのフラグメントを、配列番号２５及び配列番号２６のプライマー（それらは、それぞれ、EcoRI及びBamHIクローニング部位で延長された）を用いて、pACT2-2E11プラスミドから、ＰＣＲ増幅した。次いで、得られたフラグメントを、 EcoRI及びBamHI で消化し、精製し、pGADT7(クローンテック)の同様のクローニング部位に結紮した。
【０１２０】
１．６．EX１３−１４（エキソン１３及び１４を含む）
pGADT7-EX13-14プラスミドを以下のように得た。300-bpのフラグメントを配列番号２７及び配列番号２８のプライマー（それらは、それぞれ、EcoRI及びBamHIクローニング部位で延長された）を用いて、pACT2-2E11プラスミドから、ＰＣＲ増幅した。次いで、得られたフラグメントを、 EcoRI及びBamHI で消化し、精製し、pGADT7(クローンテック)の同クローニング部位に結紮した。
【０１２１】
２．酵母マッチング試験のプロトコル
酵母マッチング試験を異なるパートナー間で相互作用ドメインをマッピングするために行った。選択されたSaccharomyces cerevisiaeマッチングパートナー株（AH109及びY184）を、問題のプラスミドとの組み合わせで試験すべきプラスミドに、別々に形質転換した。酢酸リチウム形質変換方法を、製造者の指示（マッチマーカー２ハイブリッドシステム、クローンテック）に従って行った。形質転換体を、適当なSDドロップアウトメディウム（クローンテック）上に選択した。用いるためにそれぞれのタイプの１つの新鮮なコロニーをワーキング・ストック・プレートから採取し、０．５ｍｌのYPDメディウム（クローンテック）を含有する1本の１．５ｍｌマイクロ遠心管に入れた。次いで、細胞を、２００rpmで振盪させながら３０℃で２４時間インキュベートした。次いで、１：１００希釈のマッチング培養株１００μｌを、適当なSDメディウム: SD/-Leu/-Trp及びSD/-Leu/-Trp/-His/-Ade上に広げた。選択メディウム上での生長から７から１５日後、陽性のコロニーを計数した。
【０１２２】
３．ＫＣＮＱ２ポリペプチド及びＰＰ２Ａ／Ｂγ間の直接マッチング試験結果
上述した各構築物び実施例１に記載したpGBKT7-PPP2R2C構築物間のマッチング試験を行った。その結果を図２に示す。記号「＋」はコロニーが生長したことを示し、よって、試験ポリペプチドがＰＰ２Ａ／Ｂγと相互作用することが可能であることを示す。記号「−」はコロニーが生長しなかったことを示し、よって、試験ポリペプチドがＰＰ２Ａ／Ｂγと相互作用しなかったことを示す。
【０１２３】
EX13-17、EX16-17、EX13-14及びEXsp15bは、PP2A/B(と相互作用しない。EX13-15b、EX13-15及びEXco15は、PP2A/B(と相互作用する。EX13-15bは、PP2A/B(と相互作用し、これは、ＫＣＮＱ２−１５ｂポリペプチドはPP2A/B(と相互作用することができることを示す。EXsp15bではなく、EX13-15b, EX13-15及びEXco15は、PP2A/B(と相互作用するので、エキソン１５とエキソン１５ｂとの間の共通の領域は、この相互作用において役割を示す。さらに、EX13-17はPP2A/B(と相互作用を示さないので、エキソン１５又はエキソン１５ｂがＫＣＮＱ２ポリペプチドの大部分のカルボキシル末端に位置するという事実は、PP2A/B(との有効な相互作用にとって重要である。
【０１２４】
４．異なるＫＣＮＱ２ポリペプチド間の直接マッチング試験の結果
種々の上述した構築物間のマッチング試験を行った。その結果を図４に示す。４つのマッチング試験を構築物の各対で行い、その結果を図３に示す。記号「＋＋」は、４つ全てのコロニーが生長したことを示す。記号「＋」は４つのうち３つのコロニーが生長したことを示す。記号「＋／−」は、４つのうち１つのコロニーが生長したことを示す。記号「−」は、コロニーが生長しなかったことを示す。
【０１２５】
この実験は、ＫＣＮＱ２ポリペプチドが結合することができ、同質二量体を形成することができることを示す。また、ＫＣＮＱ２−１５ｂポリペプチドは、エキソン１５を含むＫＣＮＱ２ポリペプチドと、それらのカルボキシ末端で結合することができ、異質二量体を形成することができる。
【０１２６】
実施例４：グルタチオンS−トランスフェラーゼ融合プロテインの発現及び精製
１．プラスミドの構築
１．１．pGBKT7-2E11
酵母２−ハイブリッドスクリーニングから回収されたpACT2-2E11プラスミド をEcoRI及びBglIIで消化し、精製した後、得られた687-bpフラグメントを、pGBKT7ベクター（クローンテック）のEcoRI及びBamHIクローニング部位に挿入した。
【０１２７】
２．２．pGEX-2TK-2E11
ＫＣＮＱスプライシング多型の部分cDNAを、配列番号２９の遺伝子特異的プライマー又は配列番号３０のpACT2ベクターにおけるプライマーを用いて、酵母２ハイブリッドスクリーニングから回収したpACT2-2E11プラスミドからPCR増幅した。これらのプライマーは、それぞれ、BamHI及びEcoRIクローニング部位で延長された。892-bpPCR生成物をBamHI及びEcoRIで消化し、精製し、pGEX-2TKベクター(アミシャム・ファルマシア・バイオテック)のBamHI及びEcoRI 部位に挿入した。この構構築物に用いられたpACT2プラスミドを以下のような２倍体細胞から回収した。２倍体細胞の新鮮なコロニーを5 mlのSD/-Leu/-Trp (クローンテック)に接種し、200から250rpmで振盪しながら３０℃で一晩生長させた。一晩培養株の２mlに対応する細胞を、4300rpmで１０分間遠心分離によってスピンダウンした。ペレットを100μｌのザイモリエース(1U/(l) (セイカガク・コーポレーション)に再懸濁し、３０℃で１時間インキュベートした。次いで、100μｌのプロテイナーゼKミックス(100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH [pH 8.0]、25 mM EDTA、0.5 % SDS、0.1 mg/ml プロテイナーゼK)を2.5時間で、40℃にて添加した。ＤＮＡを、２つの連続するフェノール：クロロホルム工程によって抽出し、0.3 Mの酢酸ナトリウム及びエタノール2.5容量で沈殿させた。DH10B ElectroMAXコンピテント細胞（インビトロゲン）をDNAで形質変換し、120 (g/ml アンピシリン補足寒天培地上で選択した。pGEX-2TK-2E11によってコードされたプロテインを、GST-2E11と名づけた。
【０１２８】
１．３．pGEX-2TK-PPP2R2C
PP2A/B(の全長cDNAのヌクレオチド55-1540を包含するPPP2R2Cの1485-bpフラグメント (ゲンバンク受け入れ番号AF086924)を配列番号３１及び配列番号３２の遺伝子特異的プライマー（それらは、それぞれ、BamHI及びEcoRIクローニング部位で延長された。）を用いて、pGBKT7-PPP2R2CプラスミドからPCＲ増幅した。フラグメントをBamHI及びEcoRIで消化し、精製し、pGEX-2TKベクター（アミシャム・ファルマシタ・バイオテック）の同クローニング部位に結紮した。pGEX-2TK-2E11によってコードされたプロテインをGST-PPP2R2Cと名づけた。
【０１２９】
１．４．pGEX-2TK-KCNQ2-Cter 
全長cDNAのヌクレオチド1544-2924を包含するＫＣＮＱ２−ｆｌの１３９３−ｂｋフラグメント (ゲンバンク受け入れ番号AF033348)を、配列番号３３及び配列番号３４の遺伝子特異的プライマー（それらは、それぞれ、XhoI及びEcoRIクローニング部位で延長された）を用いて、pCMV-HA-KCNQ2-iso1構築物からPCＲ増幅した。このＰＣＲ生成物をXhoI及びEcoRIで消化し、精製し、pGEX-2TK-2E11プラスミド767-bp XhoI-EcoRI フラグメントを同じ部位で置換した。pGEX-2TK-KCNQ2-Cter の構築物に用いたpCMV-HA-KCNQ2-iso1プラスミドを以下のように得た。KCNQ2-flの領域をコードする全長（全長cDNA のヌクレオチド126-2924を含む、ゲンバンク受け入れ番号AF033348）を、配列番号３５及び配列番号３６の遺伝子特異的プライマー（それらは、それぞれEcoRI 及びBgIIクローニング部位で延長された）を用いて、ヒト脳ｃDNAライブラリ（マラソン−レディｃDNA、クローンテック）から、はじめに増幅した。PCR生成物を、EcoRI 及びBgIIで消化し、精製し、pCMV-HAベクター（クローンテック）の同じクローニング部位に結紮した。pGEX-2TK-2E11によってコードされたプロテインを、GST-KCNQ2-Cterと名づけた。
【０１３０】
２．発現及び精製
Kaelinら(1991, Cell, 64:521-532)に示された方法を適用して、グルタチオンSトランスフェラーゼ融合プロテインの発現及び精製を行った。MAX能DH5(F'IQ コンピテント細胞の一晩培養株（インビトロゲン）をpGEX2TKプラスミド又はpGEX2TK-2E11で形質変換し、pGEX2TK-KCNQ2-Cter及びpGEX2TK-PPP2R2Cの組替体を、アンピシリン（100μg/ml）含有のLBメディウム中で1:10に希釈し、３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG、プロメガ）を最終濃度0.1 mMまで添加し、バクテリアを３７℃にてさらに３時間生長させた。グルタチオン−セファロース４Bビーズ（アミシャム・バイオサイエンス）を用いて融合タンパクを回収するために、バクテリア培養株を5000 x gで、15分間、4℃にて遠心分離によってペレット化し、1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド (PMSF、シグマ)及び7mlバッファに対してプロテアーゼ阻害剤カクテル（Complete（商標）ミニ、ロシュ）１錠が補足されたNETN (20mM Tris-HCl [pH 8.0]、120mM NaCl、1mM EDTA、0.5% ノニデットP-40、シグマ)1/10容量中で再懸濁した。次いで、バクテリアを穏やかな超音波処理によって氷中で溶解し、10,000 x gで、10分間、4℃にて遠心分離した。次いで、バクテリアの透明な溶解物のアリコート (1 ml)を１時間、４℃にて、50 (lのグルタチオン−セファロース４Bビーズ（それは、予め４回、１％アルブミン・ボビン（BSAフラクションV、シグマ）を含むNETN中で洗浄している）で振盪し、NETN中で再懸濁した（最終濃度1:1 [v/v]）。次いで、グルタチオン−セファロース４BビーズをNETNで３回洗浄した。結合した組換えプロテインを回収するために、ビーズを２回より多く、100mM Tris-HCl [pH 8.0]、120 mM NaClで洗浄し、20 mMグルタチオン（シグマ）を含有する同バッファ中で溶出した。溶出された融合プロテインの定量を標準ブラッドフォード法（バイオラッド・プロテイン・アッセイ）で行った。
【０１３１】
実施例５：GST融合プロテインのインビトロでの標識付け
バクテリアの透明な溶解物１mlに対応する結合GST融合プロテインを有するビーズをNETNで３回、DTT (20 mM Tris-HCl [pH 7.5]、120 mM NaCl、12 mM MgCl2)なしのHMKバッファで１回洗浄した。 次いで、ビーズを30(lの反応混合物 (3 (l の10X HMK バッファ＋20 mM DTT、40mM DTT中の10ユニットのプロテインキナーゼA触媒サブユニット[牛の心臓からのPKA 、250ユニット／バイアル、シグマ]、2 (lの[32P]-(ATP 6000 Ci/ミリモル及び24(lの蒸留水)中で再懸濁し、4℃にて、30分間インキュベートした。インキュベーションの間、ビーズをときどき揺り動かすこをよって再懸濁した。反応を1 mlのHMKストップバッファ (10 mM リン酸ナトリウム [pH 8.0]、10 mMピロリン酸ナトリウム、10 mM EDTA、1 mg/ml BSA)を添加することによって中止させ、ビーズをNETNバッファで５回洗浄した。放射性同位元素で標識した融合プロテインの溶解物を、先に述べたように、100 mM Tris-HCl [pH 8.0]、120 mM NaCl中に新たに調製した20 mMグルタチオン1 mlで溶出した。
【０１３２】
実施例６：固相オーバーレイ・アッセイ
１．固相オーバーレイ・アッセイのプロトコル
固相オーバーレイ・アッセイを、Kaelin 及び協力者によって示された方法(Kaelinら、1992, Cell, 70:351-364)を適用して行った。100 ng、10 ng及び0.1 ngのGST及びGST-2E11 組換えプロテインを、9% SDS-PAGEに溶解し、ニトロセルロース膜に電気ブロットによって転写した(ニトロセルロース転写膜プロトランBA 83、Schleicher及びSchuell)。次いで、その膜を、5% (w/v) 無脂肪ドライミルク、1 mM DTT、0.05%のノイデットP-40 を有するHBBバッファ (25 mM Hepes-KOH [pH 7.7]、25 mM NaCl、5 mM MgCl2) 中で、１時間、室温でブロックした。結合反応を、1% (w/v) 無脂肪ドライミルク、1 mM DTT、1 mM PMSF及びプローブとして用いた3.5 105 dpmの [32P]-(ATP GST-PPP2R2C組換えプロテインを有するHyb75バッファ (20 mM ヘペス [pH 7.7]、75 mM KCl、2.5 mM MgCl2、0.1 mM EDTA、0.05% Nonidet P-40)中で、室温で行った。 ４．５時間のインキュベーションの後、その膜を、Hyb75バッファ、1 mM DTT、1% (w/v)無脂肪ドライミルクで、３回、室温で、１５分間洗浄した。ブロットを、オートラジオグラフィーによって分析した。
【０１３３】
２．結果
この実験を、KCNQ2-15bポリペプチド及びPP2A/B(間の相互作用を確認するために行った。この実験では、PP2A/B(サブユニットを、プロテインがニトロセルロース膜に存在しない状態で、放射性同位元素で標識した。これにより、負荷されたプロテインがPP2A/B(と相互反応をした場合にのみ、オートラジオグラフィーによって視覚化され、シグナルが現れる。GST-2E11は、エキソン１３、１４及び１５ｂを含むＫＣＮＱ２−１５ｂポリペプチドとＧＳＴとの間の融合プロテインに対応する。ＧＳＴは負の対照に対応する。GST-2E11組換えプロテインが負荷された３つのラインでは、約４５ｋＤのサイズのプロテインに対応する位置にバンドが現れた。これは、GST-2E11プロテインとして予想されたプロテインサイズに対応する。さらに、バンドの強度は、負荷されたGST-2E11の量に比例した。これにより、GST-2E11は、PP2A/B(と相互作用している。GSTプロテインが負荷された３つのラインでは、バンドは現れず、PP2A/B(がGSTプロテインと相互反応しないことを示す。よって、PP2A/B( とGST-2E11融合プロテインとの間の相互作用は、2E11をコードするプロテインの部分のためであって、ＧＳＴをコードするプロテインの部分のためではない。この実験は、ＫＣＮＱ２−１５ｂポリペプチドがPP2A/B(と、インビトロで相互作用することができることを示す。さらに、これは、KCNQ2-15bポリペプチドが、第３の結合パートナーなしで、PP2A/B(と相互作用することができることを示し、酵母２ハイブリッドアッセイによって排除することができない仮説を示す。
【０１３４】
実施例７：インビトロでの組換えＧＳＫ−３βキナーゼを用いたリン酸化及びインビトロでのＨＢＴ−１４全細胞抽出物を用いた脱リン酸化アッセイ
１．リン酸化アッセイ
ＫＣＮＱ２−１５ｂのリン酸化状態がＧＳＫ３β、つまり、MAP1B、タウ及びシナプシン１へのその作用によって種々の細胞骨格プロセスを調節することによって中枢神経系で重要な役割を果たすキナーゼによって修飾されるかどうかを測定するために、リン酸化分析を行った。ＧＳＫ３βは、双極性障害の治療において用いられている２つの精神安定剤、リチウムとバルポラートとによって阻害されることが知られている。
【０１３５】
１．１．プロトコル
ＧＳＴ−２Ｅ１１融合プロテインの発現及び精製を、上述したように行った。１ｍｌのバクテリアの透明溶解物に対応する結合した融合プロテインを有するビーズをＮＥＴＮ中で３回、ＤＴＴなしのＨＭＫバッファ（20 mM Tris-HCl [pH 7.5]、120 mM NaCl、12 mM MgCl2）で１回洗浄した。ビーズを、２４０μｌの反応混合物(24 (lの10X HMK バッファと20 mM DTT、40mM DTT中の40ユニットのプロテインキナーゼＡ触媒サブユニット [牛の心臓からのPKA、250 units/vial、シグマ] 、5 (l の24 mM ATP及び207 (lの蒸留水)中で再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。ビーズをNETNバッファで３回、GSK-3(反応バッファ (20 mM Tris-HCl [pH 7.5]、10 mM MgCl2、5 mM DTT) (ニューイングランドバイオラボ)で１回洗浄した。次いで、ビーズを、50 (lの反応混合物 (5 (lの10X GSK-3(反応バッファ、1 (lの[32P](ATP 10mCi/ml、50 U の組換えGSK-3([ニューイングランドバイオラボ]及び最終容量50 (lとなる蒸留水)中に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。ＥＮＴＮバッファで３回洗浄した後、リン酸化プロテインを２Ｘサンプルバッファ(125 mM Tris-HCl [pH 6.8]、4% SDS、20%グリセロール、1.4 Mの(-メルカプトエタノール)中で沸騰させ、10% SDS-PAGEによって再溶解し、オートラジオグラフィーで視覚化した。
【０１３６】
１．２．結果
このリン酸化分析では、試験すべき非放射性同位元素標識ポリペプチドを、GSK-3(、PKA及び放射性同位元素活性のATPの存在下でインキュベートした。次いで、プロテインを、10% SDS-PAGEマイグレーションによって再溶解し、オートラジオグラフィーで視覚化した。インキュベーションの間に試験すべきプロテインがGSK-3(及びPKA によってリン酸化された場合にのみ、シグナルがオートグラフィーによって視覚化される。GST-2E11プロテイン（エキソン１３、１４及び１５ｂ及びＧＳＴポリペプチドとの間の融合プロテインに対応する）が負荷されたラインでは、約４５ｋＤのサイズのプロテインに対応する一に負荷されたバンドが現れた。これは、GST-2E11として予想されたプロテインサイズである。よって、GST-2E11プロテインは、GSK-3(及びPKA によって、インビトロでリン酸化される。負の対照に対応する３つの実験が、平行に行われた。１つの実験は、インキュベーションの間、ＧＳＫ−３βキナーゼを添加することなしに行い、一つを、インキュベーションの間、ＰＫＡキナーゼを添加することなしに行い、一つを、GST-2E11プロテインに代えてＧＳＴを用いて行った。負の対照に対応する３つのラインでは、バンドは現れなかった。したがって、この実験は、ＫＣＮＱ２−１５ｂポリペプチドが、インビトロで、ＧＳＫ−３β及びＰＫＡキナーゼによって相乗的にリン酸化されることを示す。
【０１３７】
この結果は、ＣＲＥＢホスホペプチド（これは、ＧＳＫ−３β及びＰＫＡによってリン酸化されることが知られている）がインキュベーションの間に添加された競合実験によって確認された。この競合実験では、5 (gのCREB ホスホペプチド（ニューイングランドラボ）がキネーション混合物に添加された。バンドは、GST-2E11のサイズに対応する位置になおも現れたが、バンドの強度は極めて有意に弱かった。
【０１３８】
GST-2E11のリン酸化状態におけるＬｉＣｌの影響を、さらに、それぞれ0、8.3、25、75及び225 mMの最終濃度でのキネーション混合物にＬｉＣｌを添加することによって調べた。約４５ｋＤの位置に現れたバンドの強度は、ＬｉＣｌの存在で減少し、シグナル強度は、キネーション混合物に添加したＬｉＣｌ濃度に相関して反対方向であった。約５０ｍｌのＬｉＣｌの存在では、GST-2E11のリン酸化状態は、５０％減少した。これは、ＬｉＣｌ、つまり双極性障害の治療において用いられているよく知られた精神安定剤が、インビトロにおいてＫＣＮＱ２−１５ｂポリペプチドのリン酸化を阻害することを示す。
【０１３９】
２．脱リン酸化分析
脱リン酸化分析を、ＫＣＮＱ２−１５ｂポリペプチドのリン酸化状態がＰＰ２Ａによって修飾されるかどうかを測定するために行った。
【０１４０】
２．１．プロトコル
インビトロで、リン酸化されたGST-2E11融合プロテインを、ヒトグリア芽細胞腫、星状細胞腫のセルライン（ATCC番号：HTB-14）の全細胞抽出物５００μｇを用い、ＰＰ２Ａホスホターゼ阻害剤オカダイックアシッド（シグマ）４００μＭあり又はなしで、３０分間、室温でインキュベートした。ＨＴＢ−１４全細胞抽出物を以下のように調製した。細胞を、氷冷TBSバッファ(10 mM Tris-HCl [pH 8.0]、120 mM NaCl)で３回洗浄し、３０分間、４℃にて、EBCバッファ(50 mM Tris-HCl [pH 8.0]、120 mM NaCl、0.5 % Nonidet P-40)中で溶解した。次いで、溶解物を10分間、13.000 x gで、4°Cにて、ペレット状の細胞デブリスに遠心分離した。上澄に存在するプロテインを標準ブラッドフォード法（バイオ−ラド・プロテイン・アッセイ）によって定量した。次いで、プロテインを10% SDS-PAGEに再溶解し、オードラジオグラフィーで視覚化した。
【０１４１】
２．２．結果
PP2AがGST-2E11プロテインを脱リン酸化する能力を有するかどうかを測定するために、先のアッセイで得られたリン酸化放射性同位元素標識GST-2E11プロテインを、PP2A ホスホターゼ含有HTB-14細胞抽出物の存在下でインキュベートした。この実験では、HTB-14細胞抽出物の存在下でインキュベートした後は、もはやＰＰ２Ａによって脱リン酸化されたプロテインは、放射性同位元素活性でなかった。よって、GST-2E11プロテインの脱リン酸化を、オートラジオグラフィーによるシグナル視覚化の消失によってモニターした。リン酸化GST-2E11プロテインとして現れるバンド強度のための参照として、10% SDS-PAGEゲルの一つのラインを、HTB-14細胞抽出物の非存在下でインキュベートされたリン酸化GST-2E11融合プロテインで負荷した。HTB-14細胞抽出物の存在下でインキュベートされたリン酸化GST-2E11融合プロテインで負荷したラインでは、バンドは非常に弱い強度であった。よって、GST-2E11融合プロテインは、HTB-14細胞抽出物の存在下でインキュベートされた場合、脱リン酸化される。GST-2E11融合プロテインがHTB-14細胞抽出物及びPP2Aホスホターゼ阻害剤として知られているオカダイックアシッドの存在下でインキュベートされた場合、バンドの強度は、リン酸化されたGST-2E11に対応するバンドの強度よりもわずかに弱いのみであった。よって、PP2Aホスホターゼは、HTB-14細胞抽出物の存在下でインキュベートされたGST-2E11融合プロテインで観察された脱リン酸化の役割を担っている。したがって、この実験は、インビトロにおいて、ＫＣＮＱ２−１５ｂポリペプチドは、PP2Aホスホターゼによって脱リン酸化されることを示す。
【０１４２】
実施例８：細胞培養、形質移入、免疫沈降及びウェスタンブロット解析
１．細胞培養
HEK293-H細胞（ジブコ・インビトロゲン・コーポレーション）を、0.1 mM 非必須アミノ酸及び10%ウシ胎仔血清 (ジブコ・インビトロゲン・コーポレーション)が捕捉されたDMEMメディウム(ジブコ・インビトロゲン・コーポレーション)中で生長させ、20 (gのpCMV-Myc-3H9又はpCMV-Myc-3H2プラスミド／60 mm皿で、 インビトロゲン燐酸カルシウムキットとプロトコルを用いて一時的に形質移入した。形質移入後４８時間で、細胞を、氷冷リン酸バッファ（ＰＢＳ、ジブコ・インビトロゲン・コーポレーション）で３回洗浄し、こすり落とし、２時間、４℃にて、プロテアーゼ阻害剤 (1 mM フェニルメチルスルホニルフルオライド、Complete（商標）ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル１錠（ロシュ）)及びホスファターゼ阻害剤 (1 mM Na3VO4 及び1 mM NaF)が捕捉された可溶化バッファ（150 mM NaCl、5 mM EDTA、1% Triton X-100、0.1% デオキシコール酸ナトリウム、10 mM Tris-HCl [pH 8.0]を含有する）中に溶解した。次いで、溶解物を、10分間、13.000 x g、4°Cにて、細胞デブリをペレット化するために遠心分離した。上澄に存在するプロテインを標準ブラッドフォード法（バイオラッド・プロテイン・アッセイ）によって定量した。
【０１４３】
２．免疫沈降
500 (g (最終容量：500 (l)の透明細胞溶解物を２時間４℃にて、1 (lのウサギ免疫前血清及び1%ウシのアルブミン (BSA fraction V、シグマ)で飽和させたプロテインA セファロースCL-4Bビーズ (アミシャム・ファルマシア・バイオテック) 50 (lを用いて、インキュベートした。次いで、涸渇上澄を、4℃で、1 (gの抗-Mycモノクローナル抗体 (Myc-Tag 9B11 モノクローナル抗体、セル・シグナアリング)を用いて一晩インキュベートした。次いで、1%ウシのアルブミンで飽和させたプロテインAセファロースCL-4Bビーズを添加し、その混合物を4℃にて、さらに２時間インキュベートした。氷冷可溶化バッファ免疫複合体を５回洗浄した後、2X サンプルバッファ (125 mM Tris-HCl [pH 6.8]、4% SDS、20% グリセロール、1.4 M (-メルカプトエタノール)中で沸騰させ、8% SDS-PAGEで再溶解し、付した。
【０１４４】
３．ウェスタンブロット
プロテインを、Towbinバッファ(Towbinら、1979, PNAS, 76:4350-4354)と電気転移装置を用いて、ニトロセルロース膜（ニトロセルロース膜転写膜プロトランBA 83、Schleicher及びSchuell）に転写した。転写後、ナトリウムアジド（0.1%）が捕捉されたTBST (10 mM Tris-HCl [pH 8.0]、150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)中の５％無脂肪ドライミルク中で、２時間、ブロックし、次いで、室温にて、１６時間、同バッファで1:1000に希釈された抗−Mycものモノクローナル抗体（Myc-Tag 9B11モノクローナル抗体、セル・シグナリング）を用いてインキュベートした。TBSTで数回洗浄した後、ブロットを、1:5000に希釈されたセイヨウワサビパーオキシターゼ−複合第２抗体（抗マウスIgG、Fab特異的、パーオキシターゼ複合体、シグマ）を用いてインキュベートし、ECLウェスタンブロット検出試薬（アミシャム・バイオサイエンス）によって展開した。
【０１４５】
実施例９：電気生理学的解析
１．プロトコル
ツメガエル属 laevis 卵母細胞へのｃDNA注入
動物を麻酔し、卵巣片を外科的に取り出し、それぞれの卵母細胞を、96 mM NaCl、2 mM KCl、2 mM CaCI2、2 mM MgCl2及び5 mM HEPESを含有するpH 7.4の食塩水中で分割した。ステージV及びVIの卵母細胞を、小脳細胞を廃棄するために、室温で、２時間、食塩水中の0.2 mg/mlトリプシン阻害剤の存在下、コラゲナーゼタイプ1A (1mg/ml)で処理した。濃縮物を、260ｎｍの吸光度で測定することによって決定した。KCNQ2、3H2及び3H9 K+チャネルに対応するDNAを、それぞれのcRNAを発生させるために、PECOベクターにサブクローン化した。ｃRNA濃縮物を260nmの吸光度で測定した。CRNA溶液を、圧力マイクロインジェクター (Inject+matic、ジュネーブ)を用いて注入した（約50 nL/卵母細胞）。次いで、卵母細胞を2から6日間、50U/mLペニシリンと50 U/mLストレプトマイシンを捕捉されたND96溶液中で保持した。
【０１４６】
電気生理学的測定
0.3 rmL 還流チャンバにおいて、単一の卵母細胞に、3M KClが充填された２つの標準ガラスマイクロ電極 (0.5から2 Mオーム抵抗)を突き刺し、Dagan TEV2OO増幅システム（米国）を用いて電圧固定法下で保持した。電気刺激、データ取得、解析を、pClamp ソフトウェア(Axon Instruments, USA)を用いて行った。増分脱分極電圧ステップ（10 mV増分）を適用して、-80 mVの保持電圧 (K+イオンの平衡電圧) 再分極から、「テイル電流」からK+チャネル非活性化を測定する-60mVまでの電流−電圧関係を得た。
【０１４７】
２．結果
KCNQ2-15bx及びKCNQ2-15by 同属四量体カリウムチャネルの活性を試験し、KCNQ2-fl同属四量体カリウムチャネルの活性と比較した。0.2 ng又は0.4 ngのDNAを卵母細胞に注入した。その結果を図５に示し、それは、カリウムチャネルによって生じるM−電流の強度を示す。約1 μAの強度が、0.4 ngのDNAを注入した場合にKCNQ2-fl同属四量体カリウムチャネルによって生じた電流として認められた。この値は、科学文献によって報告された値と同様であった。0.4 ngのDNAが注入された場合、KCNQ2-15bx同属カリウムチャネルは、約800 nAの電流を産生し、0.4 ngのDNAが注入された場合、KCNQ2-15by同属四量体カリウムチャネルは、約700 nAの電流を産生した。よって、KCNQ2-15bx及びKCNQ2-15byスプライシング多型は、インビボにおいて、機能的相同カリウムチャネルとして関連し得る。
【０１４８】
図６A及び６Bは、KCNQ2-15bx (図6A)及びKCNQ2-15by (図6B)同属四量体カリウムチャネルによって異なった電圧で発生した電流に対応する電圧クランプ・トレースを示す。このトレースで観察されるゆっくりとした活性化は、ＫＣＮＱカリウムチャネル系統群の一員の特徴的な性質である。
【０１４９】
実施例１０：影響個体又は非影響個体からのDNAサンプルの収集
ドナーは、血縁で健常者であった。１００人からのDNAを抽出し、バイアレリックマーカーの検出のために試験した。
30 mlの末梢静脈血を、EDTAの存在下、各ドナーから採血した。細胞（ペレット）を2000 rpmで１０分間の遠心分離した後に収集した。赤血球を、溶解液(50 ml最終濃度： 10 mM Tris pH7.6、5 mM MgCl2、10 mM NaCl)によって溶解した。溶解物溶液中にペレットを再懸濁した後、上澄に存在する赤血球の残渣を除去するために必要なだけ何度も遠心分離(10分間、2000 rpm)した。
白血球のペレットを、
−3 ml TE 10-2 (Tris-HCl 10 mM、EDTA 2 mM) / NaCl 0 4 M、
−200 μl SDS 10%、
−500 μl K-プロテイナーゼ (TE 10-2 / NaCl 0.4 M 中2 mg K-プロテイナーゼ)を含有する溶解物溶液３．７ｍｌを用いて、４２℃にて一晩溶解した。
【０１５０】
プロテインの抽出のため、1 ml飽和NaCl (6M) (1/3.5 v/v)を添加した。強い振盪の後、溶液を10000 rpmで、２０分間遠心分離した。DNA沈降のため、2から3容量の100%エタノールを、先の上澄に添加し、溶液を2000 rpmで、３０分間遠心分離した。DNA溶液を３回、70%エタノールで、塩を除去するために洗浄し、 2000 rpmで、２０分間遠心分離した。ペレットを３７℃で乾燥し、1 ml TE 10-1又は1 ml水で再懸濁した。DNA濃縮物を260 nm (1ユニットOD = 50 μg/ml DNA)でのODで測定して評価した。DNA溶液中のプロテインの存在を測定するために、OD 260 / OD 280比を測定した。OD 260 / OD 280比が1.8から2であるDNAプレパレーションのみを以下に続く実施例において使用した。各個体からのDNAの同量を混合することによってプールを構築した。
【０１５１】
実施例１１：PCRによるゲノムDNAの増幅
実施例１０のDNAサンプルの特定のゲノムシーケンスを、先に得られたDNAプールで増幅した。さらに、５０個体のサンプルを同様に増幅した。
PCRアッセイを、以下のプロトコルを用いて行った。
最終容量                                                        25 μl
DNA                                                             2 ng/μl
MgCl2                                                           2 mM
dNTP (それぞれ)                                                 200 μM
プライマー(それぞれ)                                            2.9 ng/μl
Ampli Taq Gold DNA ポリメラーゼ                         0.05 unit/μl
PCR バッファ(10x = 0.1 M TrisHCl pH8.3 0.5M KCl)                1x
最初のプライマーの各ペアをゲノムDNAシーケンスのシーケンス情報及びOSP スフトウェア（Hillier & Green, 1991）を用いて設計した。
【０１５２】
PPP2R2Cに位置するプライマーバイアレリックマーカー
配列番号３７に示すPPP2R2Cのゲノム配列を、(i) Genset S.A.で構築されたBACクローン、 (ii) EMBL受け入れ番号：AC114815.5、AC004599.6、AC122939.3及びAC004689.5に対応するBACクローン及び (iii) RefseqN受け入れ番号：NT#006051に基づいて生命情報科学分析によって構築した。多型を実施例１２及び１３で示したように同定し、実施例１４で示したように確認した。
【０１５３】
KCNQ2遺伝子に位置するバイアレリックマーカー
KCNQ2遺伝子に位置するバイアレリックマーカーを、セレラによって提供されたデータを用いて認定した。さらに、これらのマーカーのそれぞれを、実施例１４に示した方法で確認した。
表２Ａは、PPP2R2Cの特定の領域を増幅するために用いたプライマーのペアの配列番号３７における位置を示す。表２Ｂは、KCNQ2の特定の領域を増幅するために用いた配列番号４２から４７のプライマーの位置を示す。プライマーの配位を第３のカラムに示す。記号 (+1)は、プライマーのシーケンスが配列番号３７及び４２から４７の対応領域と同一であることを示す。記号 (-1)は、プライマーのシーケンスが配列番号３７及び４２から４７の対応領域と相補的であることを示す。
【０１５４】
【表２】
2005530503.tif 000003
【０１５５】
好ましくは、プライマーは、シーケンシングのために有用な増幅のためにターゲットとされた特定の塩基の共通オリゴヌクレオチドテイルの上流を含む。
これらのプライマーの合成は、GENSET  UFPS２４．１シンセサイザーで、ホスホラミジット法（phosphoramidite）に従って行った。
DNA 増幅をGenius II サーモサイクラーで行った。95°Cで10分間加熱した後、40サイクルを行った。それぞれのサイクルは、30秒間95°C、54°Cで１分間及び30秒間 72°Cからなる。最終延長のために、10分間72°Cで増幅を終了した。得られた増幅生成物の定量を、蛍光計および介入試薬（モレキュラープローブ）としてピコグリーンを用いて、96-ウェルマイクロタイタープレート上で測定した。
【０１５６】
実施例１２：増幅されたゲノミDNAからのバイアレリックマーカーの同定
実施例１１で得られた増幅DNAのシーケンシングをABI 377シーケンサーで行った。増幅生成物のシーケンスを、染色ターミネーター・サイクル・シーケンシング・プロトコルを用いて、自動ジデオキシ・ターミネーター・シーケンシング反応により測定した。シーケンシング反応の生成物をシーケンシング・ゲルに流し、シーケンスを、ゲル・イメージ解析(ABI プリズムDNAシーケンシング解析ソフトウェア(2.1.2バージョン)を用いて測定した。
さらに、シーケンスデータを増幅フラグメント内にバイアレリックマーカーが存在することを検出するために評価した。先に示したように、同じ位置で生じる種々の塩基から得られた電気泳動パターンの頂上ピークの存在に基づいて、多型調査を行った。
増幅フラグメントで検出されたバイアレリックマーカーの位置を、以下の表３Ａ及び３Ｂに示す。
【０１５７】
【表３】
2005530503.tif 000004
「BM」はバイアレリックマーカーを示す。All１及びAll２は、それぞれバイアレリックマーカーのアレル１及びアレル２を示す。BMのスタンダード欄の記号(+)又は(-)は、示された代替アレルが見いだされたストランドを示す。配列番号３７及び４２から４７は、ストランド(+)に対応する。実施例に示したように、バイアレリックマーカー24-257/320は、ストランド(-)の109663位での多型「a又はg」に対応する。よって、配列番号３７の109663位のヌクレオチドは「ｙ」であり、それは、標準PCT命名法に従って、「t又はc」に対応する。バイアレリックマーカー24-247/216は、ストランド(＋)の99505位での多型「a又はg」に対応する。よって、配列番号３７の99505位のヌクレオチドは、「ｒ」であり、標準PCT命名法に従って、「a又はg」に対応する。
【０１５８】
実施例１３：オーバーラッピングBACからのゲノムDNAの比較による多型の同定
同じDNAドナーサンプル由来のマルチBACクローンからのゲノムDNA及び配列番号３７のゲノムDNAの領域でのオーバーラップをシーケンシングした。シーケンシングは、ABI３７７シーケンサーで行った。増幅生成物のシーケンスを、染色ターミネーター・サイクル・シーケンシング・プロトコルで自動ジデオキシ・ターミネーター・シーケンシング反応を用いて測定した。シーケンシング反応の生成物を、シーケンシング・ゲルに流し、シーケンスを、ゲル・イメージ解析(ABI プリズムDNAシーケンシング解析ソフトウェア(2.1.2バージョン)を用いて測定した。
【０１５９】
実施例１４：マイクロシーケンシングによる多型の変異体
さらに、実施例１２及び１３で同定されたバイアレリックマーカーを確認し、これらのそれぞれの頻度をマイクロシーケンシングによって測定した。マイクロシーケンシングは、実施例１１に示された各個体のDNAサンプルに対して行った。
個体のベノムDNAの増幅を、表１Ａ及び１Ｂに示されたPCRプラマーの同じセットを用いて、バイアレリックマーカーの検出のために上述したようにPCRによって行った。
マイクロシーケンスで用いた好ましいプライマーは、約１９ヌクレオチドの長さであり、問題となる多型塩基のハイブリダイズされた即上流である。本発明による、マイクロシーケンシングに用いたプライマーを表４Ａ及び４Ｂに示す。
【０１６０】
【表４】
2005530503.tif 000005
【０１６１】
表２A及び２Bのプライマーのように、カラム「配位」における記号 (+1)は、プライマーのシーケンスが配列番号３７及び４２から４７の対応領域と同一であることを示し、記号 (-1)は、プライマーのシーケンスが配列番号３７及び４２から４７の対応領域と相補的であることを示す。
マイクロシーケンス反応を、以下のように行った。増幅生成物を精製した後、マイクロシーケンス反応混合物を、20μl最終容量： 10 pmolマイクロシーケンシングオリゴヌクレオチド、1 U サーモシーケンナーゼ (アミシャムE79000G), 1.25 μl サーモシーケンナーゼバッファ (260 mM Tris HCl pH 9.5、65 mM MgCl2)及び試験された各バイアレリックマーカーの多型部位でのヌクレオチドに相補的な２つの適当な蛍光のddNTPs (Perkin Elmer, Dye Terminator Set 401095)中に添加することによって、製造者の推奨に従って調製した。4分間、94°Cで保持した後、15秒間55°C, 5秒間 72°C及び10秒間 94°Cの20 PCRサイクルを、テトラッドPTC-225サーモサイクラー (MJリサーチ)中で行った。次いで、組み込まれていない染料ターミネーターをエタノール沈降によって除去した。ポリアクリルアミド・シーケンシング・ゲルに負荷する前に、サンプルを最終的にホルムアミド−EDTA負荷バッファに再懸濁し、２分間９５℃で加熱した。データをABI PRISM 377 DNA シーケンサーによって収集し、GENESCANソフトウェア (Perkin Elmer)を用いて処理した。
【０１６２】
ゲル解析にしたがって、データを、各増幅フラグメントに存在するバイアレリックマーカーのアレルを決定するソフトウェアで自動的に処理した。
ソフトウェアは、上述のマイクロシーケンシング手順から得られたシグナルの強度が弱いか、正常か又は飽和しているかどうか、あるいはシグナルが不明瞭であるかどうかのようなファクターを評価する。さらに、そのソフトウェアは、顕著なピーク(形状及び高さ基準に従って)を同定する。顕著なピークのなかで、ターゲットとなる部位に対応するピークをそれらの位置に基づいて同定する。２つの顕著なピークが同じ位置に検出された場合、各サンプルを、その高さに基づいてホモ接合又はヘテロ接合の分類に類別する。
【０１６３】
実施例１５：双極性障害と本発明のバイアレリックマーカーとの間の関連研究
５．１．影響又は非影響個体からのDNAサンプルの収集
関連研究を２つの異なる集団で行った。サンプルの一つの収集は、ホスピタル・ピネロ、ブエノスアイレス、アルゼンチン（「ラビモ」収集）によって提供された。もう一つのサンプルの収集は、ロンドン・ユニバーシティ・カレッジ（「UCL」収集）によって提供された。双方の収集は、双極性障害に影響されているか又は影響されていない個体によって構築されている。
【０１６４】
A)ラビモ収集
ａ）影響集団
双極性障害を患う患者（症例）から206 DNAサンプルをゲノタイピング解析のために収集した。
全ての患者は、双極性タイプI (ICD-10: F30.x, F31.x)又は双極性タイプII (ICD-10: F31.8)のDSM-IV及びICD-10基準を満たしていた。全ての患者は白色人種の民族起源の第２世代までであった。
医学的障害を患う又は薬物乱用の潜在的患者を全て除外した。
DSM−IV基準によれば、１１５症例が双極性タイプI、６９症例が双極性タイプII、２２症例が非分類であり、２０症例（８．５％）が双極性障害のタイプに関する情報を欠いていた。
【０１６５】
症例の主なフェノタイプ・データは以下のようであった。
第１の兆候の平均年齢：25.6歳(SD, 11; 範囲8-58)
試験時の平均年齢：43.3 years (SD, 13.8; 範囲17-76)
性別：女性142名、男性84名(比1.7)
民族起源：欧州白色人種213名、非欧州白色人種７名、情報欠如６名 (2.5%)
双極性障害の家族歴有18.5%、総合失調症0.9%。
【０１６６】
ｂ）非影響集団
双極性障害を患っていない個体（対照）からの201 DNAサンプルをゲノタイピング解析のために収集した。
全ての対照は、精神病の病歴及び家族歴がない個体であった。
対照の主なフェノタイプ・データは以下のようであった。
平均年齢：43.8歳(SD, 12; 範囲21-72)
性別：女性118名、男性83名（比1.4）
180名の対照が欧州白色人種、21名の対照が民族起源の混血であった。
【０１６７】
ｃ）関連研究のために選択された症例及び対照集団
症例対照集団を、１５９症例と１５９対照個体になるように、民族性及び性別をそろえた。症例のうち、９６例がタイプIの双極性障害、５６例がタイプIIの双極性障害、７例が非決定タイプの双極性障害を患っていた。症例の33.8%が男性であり、症例の平均年齢が43歳であり、中央の年齢が44歳であった。対照の41.4%が男性であった。対照の平均年齢は44歳で、中央の年齢は46歳であった。
集団構造の存在によっては、擬似関連（これは、いかなる座の原因にも結びついかないが、種々の民族起源に結びついている表現型とマーカーとの間における関連である）を招くことがある。Fst試験は、ばらつきを分析するための一般的な統計の手段であり、収集が均等である、つまり、集団の構造に結びつかない関係を見出すことを実証するために用いることができる。Fst値は、(i) 同一連鎖群に属さず、(ii)研究されるべき形質に関連しないランダムマーカーを用いて算出した。０に近いFst値は、収集が均等であり、見出された顕著な関連が調査下の形質のためであることを示す (例えば、Bruce S.Weir, Genetic Data Analysis II, Edition Sinauer, San Francisco and Hartl and Clark, Populations genetics, Edition Sinauer, San Francisco参照)。 (i) 同一連鎖群に属さず、(ii)双極性障害に関連しない６６のランダムマーカーを、Fstの算出に用いた。1.68e-01のFst値が、ラビノ収集における認定で認められ、この収集が均等であることを示す。
【０１６８】
B) UCL収集
ａ）影響集団
双極性障害を患う患者（症例）から315サンプルをゲノタイピング解析のために収集した。
全ての患者は、DSM-IV分類で双極性タイプI (ICD-10: F30.x, F31.x)又は双極性タイプII (ICD-10: F31.8)であった。全ての患者は、イギリス諸島の白色人種起源(イングランド人、ウェールズ人、スコットランド人及びアイルランド人を含む)の２世代までの血縁でない個体であった。
【０１６９】
ｂ）非影響集団
非影響対照個体（双極性障害を患っていない）からの300サンプルをゲノタイピング解析のために収集した。
全ての対照個体は、 (i)精神病の病歴及び家族例がなく、 (ii) 一親等の親族に精神病の家族歴がなかった。全ての対照個体は、イギリス諸島の白色人種起源(イングランド人、ウェールズ人、スコットランド人及びアイルランド人を含む)の２世代までの個体であった。
【０１７０】
ｃ）関連研究のために選択された症例及び対照集団
研究のために確保した集団は、315症例と295対照から構成された。症例のうち、256例がタイプIの双極性障害、26例がタイプIIの双極性障害、33例が非決定タイプの双極性障害を患っていた。約36%が男性であり、症例の平均年齢が46歳であり、中央の年齢が46歳であった。対照の48%が男性であった。対照の平均年齢は37歳で、中央の年齢は32歳であった。
(i) 同一連鎖群に属さず、(ii)双極性障害に関連のない59のランダムマーカーを用いてFst値を算出した。3.41e-01のFst値が、UCL収集における認定で認められ、この収集が均等であることを示す。
【０１７１】
５．２．関連研究
Ａ）影響及び対照個体のゲノタイピング
バイアレリックマーカー、それらのうち、本発明のバイアレリックマーカーのアレル頻度を確立するために、関連研究を行うための一般的戦略は、上述した集団のそれぞれにおける全ての個体からのDNAサンプルを（これらの集団のそれぞれに属する試験された個体の二倍体ゲノムで）個々にスキャンすることであった。
各個体（症例及び対照）における全てのバイアレリックマーカーの頻度を、各個体からのDNAサンプルにおいて行われたゲノムPCRによって得られた増幅フラグメントで、マイクロシーケンス反応を行うことによって測定した。ゲノムPCR及びマイクロシーケンシングを、示されたPCRプライマー及びマイクロシーケンシングプライマーを用いて実施例１１から１３に詳細に示したように行った。
【０１７２】
B) 単一バイアレリックマーカー頻度解析
双極性障害の非影響集団と影響集団とにおけるアレル頻度の間の差を、KCNQ2遺伝子に位置する全５のマーカー及びPPP2R2C遺伝子に位置する全４のマーカーについて算出した。症例及び対照間のマーカーのアレル頻度を、アレル頻度及びゲノタイプ頻度分布のためのPearson Chi標準テストを用いて調査した。症例及び対照集団間の特定のマーカーの観察アレル／ゲノタイプと予想アレル／ゲノタイプとの間に顕著な差があれば、この特定のバイアレリックマーカーを含む遺伝子と双極性障害との間には関連があることを意味する。アレルｐ値及びゲノタイプｐ値の双方を全てのマーカーで算出した。表５A及び５Bのｐ値は、頻度を考慮するとバイアレリックマーカーと双極性障害との間には関連がない可能性を示す。
【０１７３】
オッズ比の測定は、与えられたアレルを有する場合対そのアレルを有しない場合の、疾患を有する可能性を比較する方法である。オッズ比が１より大きいと、代替アレル、ハプロタイプ又はゲノタイプの一つを有する場合の方が、ほかの１つを有する場合よりも、双極性障害の可能性が高いことを示す。オッズ比は、関連バイアレリックマーカーに対して「リスク」アレル、ハプロタイプ又はゲノタイプの同定を可能にする。ゲノタイプオッズ比は、PPP2R2Cに位置する１つのバイアレリックマーカー及びKCNQ2遺伝子に位置する２つのマーカーを算出する（表６A及び６B）。
【０１７４】
【表５】
2005530503.tif 000006
【０１７５】
【表６】
2005530503.tif 000007
【０１７６】
PPP2R2Cにおけるバイアレリックマーカー
このように、PPP2R2C遺伝子に位置する４つの研究されたバイアレリックマーカーは、双極性障害に関連することが認められる。より詳細には、99-24169/139はUCL収集において、双極性障害に関連が高いことが認められる(優位なアレル及びゲノタイプｐ値)。24-257/320及び99-24175/218は、ラビノ収集において双極性障害に関連が高いことが認められる(有意なアレルｐ値)。さらに、99-24175/218も、UCL収集において双極性障害に関連している(有意なゲノタイプｐ値) 。24-247/216は、UCL収集において双極性障害に関連している(有意なゲノタイプｐ値) 。
【０１７７】
99-24169/139バイアレリックマーカーのリスクアレルは、「A」である。24-257/320バイアレリックマーカー及び99-24175/218バイアレリックマーカーのリスクアレルも「A」である。99-24169/139バイアレリックマーカーのリスクゲノタイプは「AA」である。このように、バイアレリックマーカー99-24169/13にゲノタイプ「AA」を有する個体は、双極性障害の発現のリクスがある。
【０１７８】
KCNQ2遺伝子におけるバイアレリックマーカー
KCNQ2遺伝子に位置する２つのバイアレリックマーカー、30-2/62及び30-7/30は、有意に双極性障害に関連する。より詳細には、30-2/62はUCL収集において、双極性障害の関連が高いことが認められる(有意なアレル及びゲノタイプｐ値)。30-7/30は、UCL収集において双極性障害に関連する(有意なゲノタイプｐ値) 。
30-2/62のリスクゲノタイプは、「AG」である。30-7/30のリスクゲノタイプは「CC」である。このように、バイアレリックマーカー30-2/62にゲノタイプ「AG」を有する個体及びバイアレリックマーカー30-7/30にゲノタイプ「CC」を有する個体は、双極性障害の発達のリスクがある。
単一バイアレリックマーカー頻度解析の関連研究は、PPP2R2C遺伝子及びKCNQ2遺伝子の双方が双極性障害に関連することを示す。したがって、KCNQ2ポリペプチド及びPP2A/B(調節サブユニットを含むPP2Aホスファターゼの脱調節及び機能不全は、双極性障害の発症及び発現に寄与する。
【０１７９】
C)ハプロタイプ頻度解析
個体のマーカーの統計学的能力を増加する一つの方法は、ハプロタイプ関連解析を行うことである。
ハプロタイプ頻度の解析は、観察されたゲノタイプのデータから直ちに誘導することができない。EM (期待値-最大値)アルゴリズム (Excoffier L & Slatkin M, 1995)によって、調査集団のハプロタイプの推定値を得ることができる。ハプロタイプ頻度推定をオムニバス尤度比試験(PCT公開公報WO 01/091026)を適用することによって行った。
ハプロタイプ解析をPPP2R2Cに位置する２セットのマーカーで行った。24-257/320及び99-24175/218のハプロタイプ解析をラビモ収集で行った。99-24169/139及び24-247/216をUCL収集で行った。それらの結果を表７（ｐ値）及び７B（オッズ比）に示す。
【０１８０】
【表７】
2005530503.tif 000008
24-257/320及び99-24175/218のリスクハプロタイプは、「AA」とした。99-24169/139 及び24-247/216のリスクハプロタイプを「AG」とした。このように、バイアレリックマーカー24-257/320及び99-24175/218でハプロタイプ「AA」を有する個体は双極性障害発現のリスクがあり、バイアレリックマーカー99-24169/139及び24-247/216でハプロタイプ「AG」を有する個体も、双極性障害発現のリスクがある。
【０１８１】
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【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、全長KCNQ2ポリペプチド（KCNQ2-fl, SEQ ID NO: 7）、KCNQ2-15bx (配列番号２)、KCNQ2-15by (配列番号４)及びKCNQ2-15bz (配列番号６)間の配列を示す。ボックスは、KCNQ2-fl に比較して、KCNQ2-15bx、KCNQ2-15by及びKCNQ2-15bzにおいて特有のアミノ酸のハイライトを示す。
【図２】KCNQ2-15bx、KCNQ2-15by及びKCNQ2-15bz cDNAの構成の図である。
【図３】実施例３に記載したように、PP2A/B(及び異なるKCNQ2ポリペプチド間のマッチング試験結果を示す。
【図４】実施例３に記載したように、種々のＫＣＮＱ２ポリペプチド間のマッチング試験結果を示す。
【図５】KCNQ2-15bx、KCNQ2-15by、KCNQ2-15bz又はKCNQ2-flサブユニットを含む同属四量体カリウムチャネルによって発生した電流強度をそれぞれ比較したものである。
【図６Ａ】KCNQ2-15bxサブユニットを含む同属四量体カリウムチャネルによって発生した電流の電圧クランプトレースを示す。
【図６Ｂ】KCNQ2-15byサブユニットを含む同属四量体カリウムチャネルによって発生した電流の電圧クランプトレースを示す。
2005530503.tif 000009
2005530503.tif 000010
【図２】
2005530503.tif 000011
【図３】
2005530503.tif 000012
【図４】
2005530503.tif 000013
【図５】
2005530503.tif 000014
【図６Ａ】
2005530503.tif 000015
【図６Ｂ】
2005530503.tif 000016
【配列表】
2005530503000001.app
【国際調査報告】
2005530503.tif 000017
2005530503.tif 000018
2005530503.tif 000019