(57)【要約】本発明は臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の分離培養方法及び間葉組織への分化誘導方法に関するものである。本発明の細胞分離培養方法では臍帯血をフィコールハイパック溶液にオーバーレイさせた後、遠心分離して単核細胞層沈澱を得、前記単核細胞を単層培養して得た細胞を間葉幹細胞・前駆細胞特異抗原に対する抗体と一定時間反応させ、細胞分離機を利用して該当抗体と結合した細胞のみを分離して培養することによって、高い純度と優れた生存度を有する間葉幹細胞・前駆細胞を得る。本発明の間葉幹細胞・前駆細胞は適切な分化培地及び条件下で軟骨細胞又は骨細胞等の多様な間葉組織に分化し得る能力を持つ。従って、本発明の細胞分離培養方法を通じて間葉幹細胞・前駆細胞を多量生産することができ、その結果得られた細胞は損傷した間葉組織の再生及び治療に有用に使用され得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血をフィコールハイパック溶液にオーバーレイさせた後、遠心分離して単核細胞層沈澱を得、前記単核細胞を単層培養して得た細胞を間葉幹細胞・前駆細胞特異抗原に対する抗体と一定時間反応させ、細胞分離機を利用して該当抗体と結合した細胞のみを分離して培養することを特徴とする臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の分離培養方法。
【請求項２】
間葉幹細胞・前駆細胞特異抗原に対する抗体はＣＤ１０５、ｓｔｒｏ−１、ＳＨ３及びＳＨ４に対する抗体のうち選択された１つ以上を使用することを特徴とする請求項１に記載の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の分離培養方法。
【請求項３】
請求項１又は２の方法を利用して分離培養された臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞。
【請求項４】
ＣＤ２９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４に対する抗体に対して陽性反応を示し、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３１、ＣＤ５１／６１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１０６、ＣＤ６４に対する抗体に対して陰性反応を示すことを特徴とする請求項３に記載の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞。
【請求項５】
請求項４の細胞を細胞分化用培地で一定時間培養することを特徴とする間葉組織細胞への分化方法。
【請求項６】
間葉組織細胞は軟骨細胞であることを特徴とする請求項５に記載の間葉組織細胞への分化方法。
【請求項７】
細胞分化用培地はＴＧＦ−βＩＩＩ１０ｎｇ／ｍｌ、ウシインシュリン（bovine insulin）６．２５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン（transferrin）ｌ、亜セレン酸（selenous acid）５．３５μｇ／ｍｌ、リノール酸（linoleic acid 6.25μｇ/m）１．２５μｇ／ｍｌ、ＢＳＡ（bovine serum albumin）1００μｇ／ｍｌ、ピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate）１００ｎＭ、デキサメタゾン（dexamethasone）１００ｎＭ、２リン酸アスコルビン酸（asocorbic acid 2-phosphate）５０μｇ／ｍｌ、プロリン（prolin）４００ΜＧ／ＭＬを含むことを特徴とする請求項６に記載の間葉組織細胞への分化方法。
【請求項８】
請求項７の方法によって得られた軟骨細胞。
【請求項９】
間葉組織細胞は骨細胞であることを特徴とする請求項５に記載の間葉組織細胞への分化方法。
【請求項１０】
細胞分化用培地はデキサメタゾン（dexametathasone）０．１μＭ、βグリセリンリン酸（β-glycerol phosphate）１０ｍＭ、２リン酸アスコルビン酸（ascorbic acid 2-phosphate）５０μＭを含むことを特徴とする請求項６に記載の間葉組織細胞への分化方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法によって得られた骨細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の分離培養方法及び間葉組織への分化誘導方法に関するものである。
背景技術
【０００２】
慢性疾患や癌等により損傷した組織と臓器を治療する技術は薬物療法等の内科的治療と、手術等の外科的治療が主流を成している。しかし、これは症状のみを緩和させる対症的治療にとどまる場合が多く、手術後合併症が多く発生し、長期間治療時に経済的負担が大きい等の問題点がある。
【０００３】
最近は、既存の問題点を解決し、より優れた治療効果を期待できる組織及び臓器の治療技術の１つの手段として、自家複製（self-renewal）及び分化（differentiation）が可能な細胞を再生が必要な組織及び臓器に注入する方法が注目されている。
【０００４】
こうした細胞の代表的な例として間葉幹細胞・前駆細胞と造血幹細胞らが挙げられる。そのうち造血幹細胞は赤血球、白血球、血小板等、血管内の血球細胞に分化され、一方、間葉幹細胞・前駆細胞はより多様な種類の細胞に分化し得る多能性の（multipotent）幹細胞である。間葉幹細胞・前駆細胞は骨髄の間質細胞をはじめ軟骨、骨、脂肪組織、筋肉、腱、靭帯及び神経組織等、人体を構成する各種細胞と組織に分化できるため、再生医学の実用化の側面において最も核心的な細胞として脚光を浴びている。
【０００５】
現在間葉幹細胞・前駆細胞を得ることのできる代表的な起源組織は骨髄（bone marrow）を挙げることができる。骨髄には間葉幹細胞・前駆細胞が豊富だが、骨髄採取は数回手術針で刺す等、侵襲的な（invasive）技術であるため実用化するのが難しく、施術する場合に全身麻酔を必要とするため患者に精神的・肉体的に大きな負担になり、施術時に経る苦痛もまた大きい。このような採取過程の困難により、骨髄保管バンク等のインフラ構築は非現実的で不可能な実情である。
【０００６】
一方、臍帯血の採取は子供の出産後、簡単に行うことができ、産婦と子供に全く害がないため実用化の可能性が高い。また臍帯血は骨髄に比べ保管産業が活性化されているため、供与者を探すのも容易である。臍帯血は造血幹細胞の優れた起源組織であって、臍帯血を利用した造血幹細胞移植は臨床的に活性化されている。しかし臍帯血が間葉幹細胞・前駆細胞の優れた起源組織となり得るかどうかについてはまだよく知られていないため、本発明においては臍帯血から間葉幹細胞・前駆細胞を分離、培養する技術及びその性状を究明しようとする。
【０００７】
臍帯血から間葉幹細胞・前駆細胞を得ようとする際に考慮しなくてはならない事項は、臍帯血内には血球をはじめとする多様な種類の細胞が存在し、そのうち間葉幹細胞・前駆細胞は極めて一部分に過ぎないため間葉幹細胞・前駆細胞のみを高い純度と優れた生存度（viability）を維持しつつ分離培養することの出来る技術が要求される。
【０００８】
現在、間葉幹細胞・前駆細胞の分離培養技術はフィコールハイパック（Ficoll-Hypaque）溶液を利用した遠心分離技術が主流をなしている。しかしこの方法は臍帯血内に存在する多様な種類の細胞のうち白血球のみを取除くことができるだけであるため、分離された細胞中に実際利用可能な間葉幹細胞・前駆細胞の数が非常に少なく、継代培養中にも他の細胞の影響を受けて生存度もまた低いという問題点がある。このように細胞の数的、質的低下によって間葉組織への分化誘導がうまく行われ得ず、特定組織に分化させるための条件もまた確立していないのが実情である。従って、効率的な臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の分離培養方法及び前記細胞を間葉組織に分化させる方法についての発明が要求されている。
発明の開示
発明が解決しようとする課題
【０００９】
本発明では間葉幹細胞・前駆細胞特異抗体を利用した抗原-抗体反応を通して、臍帯血から間葉幹細胞・前駆細胞を効率的に分離培養する方法及び前記細胞を間葉組織に分化誘導する方法を提供しようとする。
課題を解決するための手段
【００１０】
本発明は臍帯血から間葉幹細胞・前駆細胞を分離培養する方法を提供する。
本発明の細胞分離培養方法は臍帯血をフィコールハイパック溶液にオーバーレイさせた後、遠心分離して単核細胞層（mononuclear cells layer）沈澱を得、前記単核細胞を単層培養して得た細胞を間葉幹細胞・前駆細胞特異抗原に対する抗体と一定時間反応させ、細胞分離機を利用して該当抗体と結合した細胞のみを分離して培養することを特徴とする。
【００１１】
本発明の細胞分離培養方法において、細胞成分の起源組織である臍帯血は哺乳動物において胎盤と胎児を連結する臍帯静脈から採取された血液として定義される。本発明の細胞分離培養方法においては人間の臍帯血を使用するのが望ましい。
本発明の細胞分離培養方法において使用するフィコールハイパック溶液は密度１．０７７ｇ／ｍｌであることが望ましい。
【００１２】
本発明の細胞分離培養方法において、間葉幹細胞・前駆細胞特異抗原に対する抗体は間葉幹細胞・前駆細胞において発現される細胞表面抗原に対する抗体のうち選択された１つ以上を使用する。具体的にはＣＤ１０５、ｓｔｒｏ−１、ＳＨ３及びＳＨ４に対する抗体のうち選択された１つ以上を使用し、純度を最大限高めるためにはこれら抗体全てを同時に使用するのが望ましい。
本発明の細胞分離培養方法において使用する間葉幹細胞・前駆細胞特異抗原に対する抗体は細胞分離機の特性によって適切な標識物質を付着して使用する。具体的に、マグネティック細胞分離機（magnetic cell sorter）を使用する時はマグネティック微細ビーズ（magnetic microbead）が付着された抗体を使用し、FACsorterを使用するときはＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、ＰＥ（phycoerythrin）、ＰｅｒＣＰ等の蛍光物質が付着された抗体を使用する。
このようにして分離された細胞中には前記抗原を発現する細胞、即ち間葉幹細胞・前駆細胞のみが存在することになる。
【００１３】
このように本発明においては間葉幹細胞・前駆細胞特異抗体を利用して抗原-抗体間の免疫反応を誘導することによって、臍帯血に存在する多様な種類の細胞中から間葉幹細胞・前駆細胞のみを高い純度で分離した後培養するため、利用可能な幹細胞の実質的な数を増加させる。
【００１４】
本発明は前記細胞分離培養方法によって得られた臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞を提供する。
本発明で前駆細胞は臍帯血間葉幹細胞から由来する細胞中から、臍帯血間葉幹細胞が軟骨細胞又は骨細胞に分化される過程中に得られ得る全ての前駆細胞と軟骨細胞（chondrocyte）及び骨芽細胞（osteoblast）等を全て含む概念である。
本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は免疫表現型（immunophenotyping）的特性において、ＣＤ２９、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ１３、ＣＤ９０、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４に対する抗体に対して陽性反応を示し、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３１、ＣＤ５１／６１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１０６、ＣＤ６４に対する抗体に対して陰性反応を示すことを特徴とする。
【００１５】
以下、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞が持つ前記免疫表現型的特性の意義を詳細に説明する。
本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は造血関連抗原であるＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、そして組織適合抗原であるＨＬＡ−ＤＲに対する抗体に対して陰性反応を示す。このように本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は造血関連抗原と組織適合抗原が欠如しているため、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は組織又は臓器移植の最大の問題点である拒否反応を最小化することができる。従って、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は同種間移植（allogeneic transplantation）の細胞ソースであって普遍的な供与者細胞として有用に使用され得る。
本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は内皮細胞（endothelial cell）関連抗原であるＣＤ３１、そして破骨細胞（osteoclast）関連抗原であるＣＤ５１／６１に対する抗体に対して陰性反応を示す。
従って、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞を組織移植に使用する場合、不要に血管を生成したり、又は軟骨や骨生成過程中に破骨細胞に分化することによって惹起され得る副作用が最小化される。
本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞はインテグリン受容体（integrin receptor）関連抗原であるＣＤ２９及びＣＤ４９ｅに対する抗体に対して陽性反応を、ＣＤ４９ｄに対する抗体に対しては陰性反応を示す。
本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞はマトリックス受容体（matrix receptor）関連抗原であるＣＤ４４、ＣＤ５４に対する抗体に対して陽性反応を、ＣＤ１０６に対する抗体に対しては陰性反応を示す。
本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞はその他抗原、即ちＣＤ１３、ＣＤ９０に対する抗体に対して陽性反応を、そしてＣＤ６４に対する抗体に対しては陰性反応を示す。
本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は間葉幹細胞・前駆細胞関連抗原であるＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４に対する抗体に対して陽性反応を示し、こうした免疫表現型は数世代を経た後にも安定的に維持される。
前記のような本発明の細胞の免疫表現型は典型的な間葉幹細胞・前駆細胞の免疫表現型と一致するものである。
【００１６】
本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞は自家複製する能力があるため、特定の細胞や組織に分化されないながら適切な条件下で継続的な増殖が可能である。
本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は骨髄、筋肉、皮膚等の一般間葉組織から分離された間葉幹細胞から由来した細胞らに比べ、より若い個体から起源した細胞であるため細胞の増殖及び分化能力が遥かに優れている。このような多能性によって、本発明の細胞は適切な分化条件下において骨、軟骨、脂肪組織、筋肉、腱等のような間葉組織に分化され得る。
【００１７】
具体的に本発明においては前記臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞を間葉組織細胞に分化させる方法を提供する。
【００１８】
本発明の細胞分化方法は分化させることを所望する間葉組織細胞の種類によって、適切な細胞分化用培地で本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞を一定時間及び条件下に培養することを特徴とする。
本発明の細胞分化方法において、分化させようとする間葉組織細胞は具体的に軟骨細胞又は骨細胞であり得、本発明で使用する軟骨分化用培養液及び骨分化培養液の組成は表１及び表２に夫々示されている。
【表１】
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【表２】
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【００１９】
前記表１及び表２に記載された成分らはＤＭＥＭ、α−ＭＥＮ、ＭｃＣｏｙｓ５Ａ培地、Ｅｅａｇｌｅのｂａｓａｌ培地、ＣＭＲＬ培地、Ｇｌａｓｇｏｗ最小必須培地、Ｈａｍの Ｆ１２培地、Ｔｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏの培地、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚの Ｌ−１５培地、ＲＰＭＩ １６４０培地等、一般的に使用される細胞培養用培地のうち選択された１つに添加して使用し、軟骨分化用培養液の場合、ＤＭＥＭを、骨分化用培養液の場合α−ＭＥＭを使用することが望ましい。
【００２０】
また本発明で使用する細胞分化用培地は前記成分以外にも必要に応じて１種類以上の補助成分を追加で含有し得る。その例として、成長因子（growth factor）、ウマ又は人等の血清をはじめとして微生物の汚染を防ぐためにペニシリンＧ（penicillin G）、硫酸ストレプトマイシン（streptomycin sulfate）、アンフォテリシンＢ（amphotericin B）、ゲンタマイシン（gentamycin）、又はナイスタチン（nystatin）等の抗生剤及び抗真菌剤（antifungal agent）等を追加することができる。
【００２１】
実施例において確認されるように、本発明の細胞分離培養方法を通じて臍帯血から高い純度と優れた生存度を持つ間葉幹細胞・前駆細胞を得ることができる。
本発明の間葉幹細胞・前駆細胞は多様な間葉組織に分化することのできる能力を有しており、適切な培地及び条件下において軟骨細胞の典型的なマーカーであるタイプIIコラーゲン、タイプＸコラーゲン及びアグリカン（aggrecan）遺伝子を発現する。
また本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は適切な培地及び条件下において骨芽細胞の典型的なマーカーであるオステオカルシン（osteocalcin）、オステオポンチン（osteopontin）、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）遺伝子を発現し、骨芽細胞と同様に細胞外部にカルシウムを蓄積することができる。
【００２２】
従って、本発明の細胞分離培養方法はいわゆる万能細胞である間葉幹細胞・前駆細胞の大量生産に使用され得、これは現在臍帯血保管バンクによって活発に進行中の臍帯血保管システムの拡張と相まってさらにその実用性を発揮することになるであろう。
また本発明の細胞分離培養方法によって得た臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は必要に応じて多様な間葉組織細胞に分化され得るため、再生が難しかった損傷した間葉組織の治療において画期的な発展をもたらし得る。
実施例
【００２３】
以下、実施例を通して本発明を具体的に説明するが、下記実施例によって本発明の範囲が限定されるものではない。
〈実施例１〉本発明による臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の分離
【００２４】
１）臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の分離及び体外培養
臍帯血はこどもが分娩された後、臍帯静脈から採取して得た。臍帯血を採取する際には、臍帯をアルコールとベタジンでよく消毒した後、ＣＰＤＡ−１抗凝固剤が２３ｍｌ入っている臍帯血採取バッグに連結された１６Ｇ注射針を臍帯静脈に刺し、臍帯血が重力によって採取バッグに採取されるようにした（図１）。
５０ｍｌコニカルチューブ（conical tube）にフィコールハイパック（Ficoll-Hypaque,密度は１．０７７ｇ／ｍｌ）１５ｍｌを入れた後、前記で採取した臍帯血２５ｍｌをフィコールハイパック上にゆっくりオーバーレイさせ、４００×ｇの速度で室温で４０分間遠心分離して単核細胞層（mononuclear cells layer）を得た。上層液を除去した後単核細胞層を新しいチューブに移し、２％ＦＢＳ（fetal bovine serum）を含有するＰＢＳ（phosphate buffered saline）３０ｍｌを添加した後、２００×ｇの速度で１０分間遠心分離して洗浄した。
前記洗浄過程を２回実施した後、単核細胞層にＮＨ４Ｃｌ−Ｔｒｉｓ溶液３０ｍｌを添加して１５分間放置した後、２００×ｇの速度で室温で１０分間遠心分離した。上層液を捨て、２％ＦＢＳ−ＰＢＳ３０ｍｌを添加して２００×ｇの速度で室温で１０分間遠心分離して洗浄した。
前記過程を再度繰り返した後、上層液を除去して得た単核細胞層に１０％ウシ胎仔血清を含有した基本培地（ａ−ＭＥＭ培地或いはＤＭＥＭ培地）１０ｍｌを添加した後充分に混合した。
前記のように分離した単核細胞の生存度と細胞数を測定した後、細胞培養容器に基本培地と適正数（５×１０５〜１×１０６細胞／ｃｍ２）の分離された細胞を入れた後、５％二酸化炭素が供給される細胞培養器に入れて３７℃で単層培養（Monolayer culture）した。毎日顕微鏡を利用してコロニーを観察してコロニーが培養容器底に単層を成し、うまく付着して（well-attached）大きくなるかどうかを確認した。
細胞が９０％コンフルエント（confluent）して大きくなると、吸入装置（suction pump）とピペットを使用して培地を取除いた後、カルシウム及びマグネシウムが取除かれたＰＢＳで細胞を洗浄した。洗浄された細胞に０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を添加した後、５％二酸化炭素が供給される３７℃細胞培養器で１０分間放置した。細胞培養容器から落ち出た細胞を再度チューブに集めた後、２００×ｇの速度で室温で１０分間遠心分離して洗浄した。
【００２５】
洗浄された細胞を間葉幹／前駆細胞特異抗原に対する抗体と一定時間反応させた。この時、使用された間葉幹／前駆細胞特異抗原に対する抗体はＣＤ１０５、ｓｔｒｏ-1、ＳＨ３及びＳＨ４に対する抗体であって、各抗体はマグネティック微細ビーズ（magnetic microbead）、又はＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、ＰＥ（phycoerythrin）、PerCP等の蛍光物質が付着されている。抗体と反応させた後、マグネティック細胞分離機（magnetic cell sorter）又はＦＡＣｓｏｒｔｅｒ等の細胞分離装備を利用して、該当抗体と結合した間葉幹細胞・前駆細胞を分離した。
【００２６】
上記のように分離した細胞に１０％ＦＢＳを含む基本培地１０ｍｌを添加して充分に混合した後、生存度と細胞数を測定した。細胞培養容器に基本培地と敵整数（４〜５×１０４細胞／ｃｍ２）の間葉幹細胞・前駆細胞を入れ、５％二酸化炭素が供給される３７℃細胞培養器で培養した。
以後細胞が１００％コンフルエントする度ごとに継代培養（subcultivation）を反復施行して、臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の数を体外増幅（exvivo expansion）させた。
【００２７】
本発明の方法によって分離された細胞の形態学的特徴は図２に示されている。図２ａにおいて、本発明の方法によって分離された細胞は間葉幹細胞・前駆細胞の典型的形態である紡錘形態（spindle shape）及び均一な（homogeneous）繊維細胞様（fibroblast-like）コロニーの形態を呈して成長した。図２ｂのように、本発明の細胞をトリパンブルー（trypan blue）で染色して生存度を確認した結果、生存度もまた９８〜９９％で非常に優れていた。
従って、本発明の方法は臍帯血から間葉幹細胞・前駆細胞を効率的に分離培養することができる。
【００２８】
２）本発明の方法で得た臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の特性分析
本発明の方法で得た臍帯血由来の細胞が間葉幹細胞・前駆細胞の特性を有しているかどうか確認するために、前記実施例１の１）で得た細胞の細胞表面抗原の発現様態を次の通り調査した。
本実施例において免疫表現型確認対象となった抗原は造血関連抗原であるＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、組織適合抗原であるＨＬＡ−ＤＲ、内皮細胞関連抗原であるＣＤ３１、破骨細胞関連抗原であるＣＤ５１／６１、インテグリン受容体関連抗原であるＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、マトリックス受容体関連抗原であるＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ１０６、間葉幹細胞・前駆細胞特異的抗原であるＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４及びその他抗原ＣＤ１３、ＣＤ６４、ＣＤ９０であった。
前記１）で培養した細胞を２×１０６個になるように準備して２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ溶液で洗浄し、各抗原に該当する抗体と室温で反応させた。抗原の発現有無は流細胞分析機（flow cytometer）を利用して確認し、造血関連抗原及び組織適合抗原に対する結果は図３に、内皮細胞関連抗原及び破骨細胞関連抗原に対する結果は図４に、インテグリン受容体関連抗原に対する結果は図５に、マトリックス受容体関連抗原に対する結果は図６に、その他抗原に対する結果は図７に示されている。
図３で、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は造血関連抗原であるＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、そして組織適合抗原であるＨＬＡ−ＤＲに対する抗体に対して陰性反応を示した。
このように本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は造血関連抗原と組織適合抗原が欠如しているため、組織移植時の問題点である拒否反応を最小化することができる。
図４において、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は内皮細胞関連抗原であるＣＤ３１、そして破骨細胞関連抗原であるＣＤ５１／６１に対する抗体に対して陰性反応を示した。
従って、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞を組織移植に使用する場合、不要に血管を生成したり、又は軟骨や骨生成過程中、破骨細胞に分化することによって惹起され得る副作用がないであろうことが分かる。
図５で、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞はインテグリン受容体関連抗原であるＣＤ２９及びＣＤ４９ｅに対する抗体に対して陽性反応を、ＣＤ４９ｄに対する抗体に対しては陰性反応を示した。
図６において、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞はマトリックス受容体関連抗原であるＣＤ４４、ＣＤ５４に対する抗体に対して陽性反応を、ＣＤ１０６に対する抗体に対しては陰性反応を示した。
図７において、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞はその他抗原、即ちＣＤ１３、ＣＤ９０に対する抗体に対して陽性反応を、そしてＣＤ６４に対する抗体に対して陰性反応を示した。
また図８において、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の継代培養１世代（ｐａｓｓａｇｅ）、５世代、１０世代及び１５世代において夫々間葉幹細胞・前駆細胞の代表的な表面抗原であるＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４の発現有無を調査した結果、数回の継代培養後にも骨髄由来の間葉幹細胞・前駆細胞１世代と同様にこれら抗原に対して陽性表現を示していたため、数世代を経た後にもこのような免疫表現型は安定的に維持されることを確認することができた。
前記図３から図８まで確認された本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の免疫表現型は既存の間葉幹細胞・前駆細胞と一致するものである。本発明の方法によって臍帯血から分離した細胞は間葉幹細胞・前駆細胞としての特性を充分に有していることが分かる。
＜実施例２＞本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞から軟骨細胞の分化
【００２９】
１）本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞から軟骨組織の分化
本発明の間葉幹細胞・前駆細胞が間葉組織細胞に分化する特性を有するかどうか確認するために、軟骨細胞への分化を誘導した。
軟骨細胞分化に使用された培養液は表１のような組成を有し、ペレット培養（pellet culture）を行って分化を誘導した。培養液は３日毎に交替し、分化誘導培養後、１週間隔で細胞をサンプリングして免疫標識子発現分析及び分子生物学的分析を行った。
２）分化誘導培養軟骨組織の免疫化学的分析
【００３０】
軟骨分化誘導培養後、軟骨組織の特異抗原であるタイプIIコラーゲン（type II collagen）の発現有無を確認するために次の通り免疫染色（immunostaining）を行った。
軟骨分化後、各時期ごとに採取した細胞ペレットサンプルをパラフィンに埋め込ませたり或いはエピトープ（epitope）の抗原性をうまく維持させるために凍結薄切（frozen section）して略３〜５μｍの厚さでペレット組織をスライドに固定させた後、免疫染色を行った。
各スライドを過酸化水素で５分間処理して細胞内部に既に存在するペルオキシダーゼ（peroxidase）を取除き、蛋白質ブロッキング（blocking）試薬で5分処理した。
続いてネズミのモノクローナル抗体と１０分間インキュベーションした。洗浄過程後ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（streptavidin peroxidase）を使用して１０分間処理した。以後発色基質であるクロモジェン（chromogen）で処理して発色反応が起こるようにし、対照染色としてヘマトキシリン染色（hematoxilin）を行った。
その結果、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞を軟骨に分化誘導した後に１週目からペレットの一部で陽性所見が観察され、図９に示したように分化誘導３週目に至るとペレット全体的に陽性所見が観察された。
このように分化された細胞がＥＣＭ（extracellular matrix）の重要成分であるタイプIIコラーゲンを分泌するものと見え、前記細胞は軟骨細胞としての機能を充分に行うことができるものと考えられる。
３）分化誘導培養軟骨組織の分子生物学的分析
【００３１】
軟骨分化誘導培養後、軟骨細胞特異的遺伝子の発現有無を確認するために次の通りＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polymerase chain reaction）を行った。
軟骨分化後、各時期ごとに採取した細胞ペレットにトライゾールＲ（Trizol R）を５分間処理した後、クロロフォルムを処理して１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上層液を取りイソプロパノールを添加してＲＮＡを沈澱させた。
ＲＴ反応は前記で得たＲＮＡ、オリゴｄ（Ｔ）プライマー（oilgo d（T）primer）１μｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ及びＲＮＡ分解酵素が取除かれた水（RNase free water）を混合して６５℃で５分間反応させた後、ＲＴ反応緩衝液４μｌ、ＤＴＴ２μｌ、及びＲＮＡ分解酵素抑制剤１μｌを添加して４２℃で２分間反応させた。以後逆転写酵素を添加して４２℃で５０分間反応させた後、その結果得られたｃＤＮＡを７０℃で１５分間不活性化させてＰＣＲの鋳型（template）として使用した。
ＰＣＲはタイプＩコラーゲン、タイプIIコラーゲン、タイプＸコラーゲン及びアグリカン遺伝子に対して行い、陽性対照群として人間の関節軟骨細胞を、そして陰性対象群として細胞内で常に一定量発現されるＧＡＰＤＨ遺伝子を選択した。
夫々の反応チューブにｃＤＮＡ５μｌ、プライマー、ｄＮＴＰ混合液、塩化マグネシウム、１０倍ＰＣＲ反応緩衝液及びＴａｑポリメラーゼ（polymerase）を添加した後、滅菌された３次蒸留水を添加して最終反応の嵩を５０μｌに合わせた後にＰＣＲを行った。各遺伝子に対するプライマーの塩基配列及び反応条件は表３の通りである。
【表３】
2005517441.tif 000005
【００３２】
夫々のＰＣＲ生成物を電気泳動してその結果を図１０に示した。図１０に示されたように、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は軟骨分化誘導後１週目からタイプＩＩコラーゲン、タイプＸコラーゲン及びアグリカン遺伝子を全て発現した。
特に分化誘導時間が経過するに従って各遺伝子の発現強度はより増加し、分化誘導４週経過後に各遺伝子の発現量は陽性対照群である人間の関節軟骨細胞（'ｃｈｏｎ’と表示）と類似した程度の高い水準であった。
これに対し、対照群であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量は分化誘導時間の経過に関係なく一定であった。従って、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は適切な条件下で軟骨細胞に分化され得る。
〈実施例３〉本発明による臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞から骨芽細胞の分化
【００３３】
１）本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞から骨組織の分化
本発明の間葉幹細胞・前駆細胞が間葉組織細胞に分化する特性を有するかどうかを確認するために、骨細胞への分化を誘導した。骨細胞分化に使用された培養液は表１のような組成を有し、単層培養を行って分化を誘導した。培養液は３日毎に交替し、分化誘導培養後に１週間隔で細胞をサンプリングして免疫標識子発現分析及び分子生物学的分析を行った。
【００３４】
２）分化誘導培養骨組織の組織化学的分析
骨分化誘導培養後、骨組織の特異抗原であるアルカリホスファターゼの発現有無を確認するために次の通り組織化学染色を行った。
骨分化後、各時期ごとに単層培養を通して骨分化誘導させた骨組織をメタノールで固定させた後、骨芽細胞（osteoblast）特異抗原であるアルカリホスファターゼに対する組織化学染色を行い、骨組織の重要な細胞外成分であるカルシウムが蓄積されたことを確かめるためにホンコッサ（von Kossa）染色を行いその結果を図１１に示した。
その結果、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞を骨に分化誘導した後1週目から組織の一部で陽性所見が観察され、分化誘導３〜４週目に至ると組織の全体に亘り陽性所見が観察された。
またホンコッサ染色の結果、３〜４週になるに伴って細胞外カルシウム蓄積量が増加するのが確認された。
このように分化された細胞が骨芽細胞の重要成分であるアルカリホスファターゼを発現し、細胞外部にカルシウムを蓄積することができるものと見え、前記細胞は骨芽細胞としての機能を充分に行うことができるものと考えられる。
【００３５】
３）分化誘導培養骨組織の分子生物学的分析
骨分化誘導培養後、骨組織特異的遺伝子の発現有無を確認するために次のようにＲＴ−ＰＣＲを行った。
骨分化後、各時期ごとに採取した細胞組織にトリゾールＲを５分間処理した後、クロロホルムを処理して１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上層液を取りイソプロバノールを添加してＲＮＡを沈澱させた。
ＲＴ反応は前記で得たＲＮＡ、オリゴｄ（Ｔ）プライマー１μｌ、ｄＮＴＰ混合液１μｌ及びＲＮＡ分解酵素が取除かれた水を混合して６５℃で５分間反応させた後、ＲＴ反応緩衝液４μｌ、ＤＴＴ２μｌ、及びＲＮＡ分解酵素抑制剤１μｌを添加して４２℃で２分間反応させた。以後逆転写酵素を添加して４２℃で５０分間反応させた後、その結果得たｃＤＮＡを７０℃で１５分間不活性化させてＰＣＲの鋳型として使用した。
ＰＣＲは骨特異的遺伝子であるオステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼに対して行い、陰性対照群は細胞内で常に一定量発現されるＧＡＰＤＨ遺伝子を選択した。
夫々の反応チューブにｃＤＮＡ５μｌ、プライマー、ｄＮＴＰ混合液、塩化マグネシウム、１０倍ＰＣＲ反応緩衝液およびＴａｑポリメラーゼを添加した後、滅菌された3次蒸留水を添加して最終反応嵩を５０μｌに合わせた後、ＰＣＲを行った。各遺伝子に対するプライマーの塩基配列及び反応条件は表４の通りである。
【表４】
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【００３６】
夫々のＰＣＲ生成物を電気泳動しその結果を図１２に示した。
図１２に示したように、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は軟骨分化誘導後１週目からオステオカルシン、オステオポンチン、アルカリホスファターゼを全て発現し、分化誘導時間が経過するに従って各遺伝子の発現強度はより増加した。
一方、対照群であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量は分化誘導時間の経過に関係なく一定であった。
従って、本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は適切な条件下で骨細胞に分化され得る。
産業上の利用可能性
【００３７】
本発明の細胞分離培養方法は臍帯血から間葉細胞・前駆細胞を高い生存度と純度を維持しつつ分離し出す効果がある。
本発明によって分離培養された臍帯血由来の間葉細胞・前駆細胞は適切な条件下で完全な軟骨細胞及び骨細胞等の間葉組織に分化され得る。従って、本発明の細胞分離培養方法及びそれによって分離培養された臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞は損傷した間葉組織の再生及び治療に有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は臍帯静脈から採取された臍帯血を入れた採取バッグを示した図である。
【図２】図２は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の形態学的特徴を示した図である。
【図３】図３は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の造血関連抗原及び組織適合抗原の発現有無を確認した結果を示した図である。
【図４】図４は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の内皮細胞関連抗原及び破骨細胞関連抗原の発現有無を確認した結果を示した図である。
【図５】図５は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞のインテグリン受容体関連抗原の発現有無を確認した結果を示した図である。
【図６】図６は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞のマトリックス受容体関連抗原の発現有無を確認した結果を示した図である。
【図７】図７は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞のその他の抗原の発現有無を確認した結果を示した図である。
【図８】図８は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞において間葉幹細胞・前駆細胞の表面抗原が発現するかどうかを確認した結果を示した図である。
【図９】図９は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の軟骨分化培養後に軟骨組織関連蛋白質に対する免疫染色結果を示した図である。
【図１０】図１０は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の軟骨分化培養後に軟骨組織関連遺伝子に対するＲＴ−ＰＣＲ結果を示した図である。
【図１１】図１１は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の骨分化培養後に骨組織関連蛋白質及び無機質に対する組織化学染色結果を示した図である。
【図１２】図１２は本発明の臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の骨分化培養後に骨組織関連遺伝子に対するＲＴ−ＰＣＲ結果を示した図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月9日(2004.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005517441000001.app
【国際調査報告】
2005517441.tif 000026
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