(57)【要約】本発明は、1つまたはそれ以上の遺伝子配列においてヒト化された非ヒトトランスジェニック動物を作成するための方法および組成物を提供する。本発明の方法によれば、非ヒト動物に由来する配列に隣接したヒトDNA配列を含むDNA構築物が細菌細胞(例えば、大腸菌)における組換えによって作成される。次いで、生成されたDNA構築物は非ヒト胚形成幹細胞に導入することができ、ここで、非ヒト動物のゲノムDNAと組換えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化動物を作成する方法であり、以下の段階を含む方法:
第1のDNA構築物と第2のDNA構築物を組換える段階であり、第1のDNA構築物には非ヒト動物DNA配列が含まれ、第2のDNA構築物にはヒトDNA配列が含まれ、ヒトDNA配列は第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列に隣接して配置される、段階;
ヒトDNA配列が第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列に隣接して配置された、組換えられた第3のDNA構築物を単離する段階;および
組換えられた第3のDNA構築物を非ヒト胚形成幹細胞に導入する段階。
【請求項２】
胚形成幹細胞を非ヒト胚盤胞に導入し、キメラ胚盤胞を偽妊娠非ヒト動物に導入する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第1のDNA構築物が細菌人工染色体である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第2のDNA構築物が細菌人工染色体である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細菌人工染色体が線状化される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
組換えが大腸菌株において行われる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
大腸菌が、sbcB、sbcC、recB、recC、またはrecDの活性を欠損しており、recA温度感受性変異を有する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ヒト遺伝子配列が、Gタンパク質共役受容体をコードする遺伝子、キナーゼをコードする遺伝子、ホスファターゼをコードする遺伝子、イオンチャンネルをコードする遺伝子、核受容体をコードする遺伝子、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、ウイルス受容体をコードする遺伝子、細菌受容体をコードする遺伝子、P450遺伝子、インシュリン受容体をコードする遺伝子、免疫グロブリンをコードする遺伝子、代謝経路遺伝子、転写因子をコードする遺伝子、ホルモン受容体をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、細胞シグナル伝達経路遺伝子、および細胞周期遺伝子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
第3のDNA構築物が細菌人工染色体である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ヒトDNA配列が、少なくとも1つのイントロンを含むヒト遺伝子配列である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
第3のDNA構築物が、イントロンの中に含まれる選択マーカーを有する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
選択マーカーが組換え段階の後に加えられる、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
選択マーカーが正の選択マーカーである、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
第3のDNA構築物が、非ヒト動物DNA配列に隣接する第2の選択マーカーを有する、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
非ヒト動物がマウスであり、非ヒト胚性幹細胞がマウス胚性幹細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
第2の構築物のヒトDNA配列および第1の非ヒトDNA配列がヒト遺伝子コード配列の開始コドンの5'に連結される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
第2の構築物のヒトDNA配列および第2の非ヒトDNA配列がヒト遺伝子コード配列の停止コドンの3'に連結される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
細胞内で相同組換えを行うためのDNA構築物であり、
少なくとも1つのイントロンが配置されたヒトDNAコード配列;
該少なくとも1つのイントロンの中に含まれる選択マーカー遺伝子;
ヒトDNAに隣接する第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列を含み、ここで、非ヒト動物隣接配列は、ヒトDNAコード配列とオルソロガスな遺伝子に隣接する非ヒト動物ゲノム内の配列と相同である、DNA構築物。
【請求項１９】
非ヒトDNA配列の一方に隣接する第2の選択マーカーをさらに含む、請求項18記載のDNA構築物。
【請求項２０】
構築物が、線状化された細菌人工染色体である、請求項18記載のDNA構築物。
【請求項２１】
第1の非ヒトDNA配列および第2の非ヒトDNA配列がマウスゲノムDNA配列である、請求項18記載のDNA構築物。
【請求項２２】
隣接配列が約0.1〜200kb長である、請求項18記載のDNA構築物。
【請求項２３】
ヒトDNAコード配列および第1の非ヒト配列がヒトDNAコード配列の開始コドンの5'末端に隣接して連結される、請求項18記載のDNA構築物。
【請求項２４】
ヒトDNAコード配列および第1の非ヒト配列がヒトDNAコード配列の停止コドンの3'末端に隣接して連結される、請求項18記載のDNA構築物。
【請求項２５】
以下の段階によって細胞内で相同組換えを行うためのDNA構築物を作成する方法:
第1のDNA構築物と第2のDNA構築物を組換える段階であり、第1のDNA構築物には非ヒト動物DNA配列が含まれ、第2のDNA構築物にはヒトDNA配列が含まれ、ヒトDNA配列は第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列に隣接して配置される、段階;
ヒトDNA配列が第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列に隣接して配置された、組換えられた第3のDNA構築物を単離する段階;および
組換えられた第3のDNA構築物を非ヒト胚形成幹細胞に導入する段階。
【請求項２６】
胚形成幹細胞を非ヒト胚盤胞に導入し、キメラ胚盤胞を偽妊娠非ヒト動物に導入する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
第1のDNA構築物が細菌人工染色体である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
第2のDNA構築物が細菌人工染色体である、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
細菌人工染色体が線状化される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
組換えが大腸菌株において行われる、請求項25記載の方法。
【請求項３１】
大腸菌が、sbcB、sbcC、recB、recC、またはrecDの活性を欠損しており、recA温度感受性変異を有する、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
ヒト遺伝子配列が、Gタンパク質共役受容体をコードする遺伝子、キナーゼをコードする遺伝子、ホスファターゼをコードする遺伝子、イオンチャンネルをコードする遺伝子、核受容体をコードする遺伝子、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、ウイルス受容体をコードする遺伝子、細菌受容体をコードする遺伝子、P450遺伝子、インシュリン受容体をコードする遺伝子、免疫グロブリンをコードする遺伝子、代謝経路遺伝子、転写因子をコードする遺伝子、ホルモン受容体をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、細胞シグナル伝達経路遺伝子、および細胞周期遺伝子からなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項３３】
第3のDNA構築物が細菌人工染色体である、請求項25記載の方法。
【請求項３４】
ヒトDNA配列が、少なくとも1つのイントロンを含むヒト遺伝子配列である、請求項25記載の方法。
【請求項３５】
第3のDNA構築物が、イントロンの中に含まれる選択マーカーを有する、請求項25記載の方法。
【請求項３６】
選択マーカーが組換え段階の後に加えられる、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
選択マーカーが正の選択マーカーである、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
第3のDNA構築物が、非ヒト動物DNA配列に隣接した第2の選択マーカーを有する、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
第2の構築物のヒトDNA配列および第1の非ヒトDNA配列がヒト遺伝子コード配列の開始コドンの5'に連結される、請求項25記載の方法。
【請求項４０】
第2の構築物のヒトDNA配列および第2の非ヒトDNA配列がヒト遺伝子コード配列の停止コドンの3'に連結される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
請求項1記載の方法によって作成されたヒト化動物。
【請求項４２】
マウスである、請求項41記載のヒト化動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細菌人工染色体を用いた相同組換えによってヒト化マウスを作成するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景の情報
ヒトゲノムのDNA配列は今や完全なものとなり、マウスゲノムDNA配列のドラフトが報告されている。他のいくつかの高等真核生物について配列決定の取り組みが進められているが、集められた配列情報は、最終的に、ヒトの疾患を理解するためのゲノム機能情報に変換される。マウスは、様々なヒト疾患の遺伝学研究および病態生理学研究に重要な実験動物である。マウスの生化学、生理学、および遺伝学に関する多くの情報を科学者は入手することができる。最も重要なことに、マウスゲノムは操作することができるので、マウスはヒト疾患の病因を解明するための紛れも無く最も強力な動物ツールである。
【０００３】
現在、トランスジェニックマウスおよび他の遺伝子組換えマウスを作成するための技法は数種類ある。トランスジェニックマウス(TM)は、前核注入およびウイルス形質導入によって作成することができる(C.Lois,E.J.Hong,S.Pease,E.J.BrownおよびD.Baltimore.(2002)「Germline Transmission and Tissue-Specific Expression of Transgenes Delivered by Lentiviral Vectors.」Science 295:868)。トランスジーンに対応するマウス遺伝子がノックアウトまたは無効にされるマウス背景において、このような技法が行われない限り、作成されたマウスはマウスの遺伝子産物とトランスジーンの産物の両方を発現する。組換えに基づくアプローチを用いた他の技法が開発されているが、このようなアプローチには制限がある(Copelandら「Recombineering:A powerful new tool for mouse functional genomics.」Nature Reviews-Genetics 2:769-779)。これらの技法は、例外なく、内因性遺伝子の「部分的な」破壊または欠失、および細胞内のランダムな位置での1つまたはそれ以上のヒト遺伝子の挿入(一般的に、イントロンを含まないcDNAだけの挿入)に頼っている。導入されるヒトDNAは、ほとんどの場合、小さくなければならないので、イントロンは、通常、含まれない。これは、翻訳後制御機構(例えば、イントロンスプライシング間に働くもの)の中には失われるものがあることを意味している。スプライシングは遺伝子発現において重要な役割を果たしており、cDNAによって作成されたトランスジェニックマウスにはこの能力が無い。
【０００４】
薬物は、排泄のために肝臓内でより極性のある分子に代謝および変換される。CYP450酵素は体内の主要な薬物代謝酵素である。3種類のCYP450サブタイプ:CYP3A4、CYP2B6、およびCYP2C9が薬物不活化の大部分を担っている。多くの薬物がCYP450酵素の合成を誘導することができる。この誘導は毒性化学物質から体を守るための適応機構であり、体が病原体と戦おうとして免疫系が外来抗原を中和するのと非常に似ている(Holmes VF.(1990)Rifampin-induced methadone withdrawal in AIDS.J Clin Psychopharmacol.10:443-4.)。
【０００５】
CYP450系に加えて薬物間相互作用の別の部位がP-糖タンパク質である。このタンパク質はmulti-drug resistant(MDR1)遺伝子によってコードされ、多くの治療剤の排出に関与する腸の主用な薬剤排出ポンプ(efflux pump)である。P-糖タンパク質は抗癌剤の排泄に特に有効である。CYP450系と同様に、P-糖タンパク質は、リファンピシン、SR12813、選択的ヒトプレグナンX受容体(PXR)アゴニスト、およびタキソールを含む様々な薬物によって誘導される(Synoldら(2001)The orphan nuclear receptor SXR coordinately regulates drug metabolism and efflux.Nature Med.7:584-590.)。P-糖タンパク質の発現増大は、同時に投与される薬物の治療レベルを著しく低下させることがある。重要なことに、CYP450を誘導する同じ薬物の多くがP-糖タンパク質も誘導する。
【０００６】
薬物がCYP450酵素およびP-糖タンパク質を誘導する機構は、核ホルモン受容体PXRを伴う。Xieらによる研究から、PXR遺伝子がノックアウトされたマウスでは、薬物がCYP450遺伝子発現を誘導する能力は無くなることが分かった(Xieら(2000)Humanized xenobiotic response in mice expressing nuclear receptor SXR.Nature 406:435-439;Xie W.およびEvans R.(2001)Orphan uclear receptors:The Exotics of Xenobiotics.J.Biol.Chem.276:37739-37742.)。
【０００７】
マウスPXRのアミノ酸配列とヒトPXRのアミノ酸配列を比較すると、リガンド結合ドメインでは72％しか同一でないことが分かっている。これは大部分の核受容体と比較してかなり低い(Savas U.ら(1999)Molecular mechanisms of cytochrome P-450 induction by xenobiotics:An expanded role for the nuclear hormone receptors.Mol Pharmacol.56:851-857.)。対照的に、マウスPXR結合ドメインとラットPXR結合ドメインは97％以上同一である。ヒトPXRとげっ歯類PXRの間の低い配列類似性が、これらの受容体のリガンド特異性の大きな違いの原因であるように思われる。現在、多くの研究から、薬物がげっ歯類およびヒトにおいてCYP450発現を誘導する能力の大きな違いの原因が、PXRのリガンド結合薬理学的特性の種間の違いであることが分かっている。実際に、Xieら(2000)は、ヒト肝臓においてCYP3A4発現を刺激する薬物(例えば、リファンピシン、クロトリマゾール、フェノバルビタール、および17β-エストラジオール)がラット肝細胞におけるCYP3A発現に影響を及ぼさないことを示した。しかしながら、ヒトPXRをラット肝細胞にトランスフェクトすることによって、これらの薬物はCYP3A発現を刺激することが可能になった。次に、これらの著者らは、天然のPXRが部分的に欠失され、ヒトPXR遺伝子が肝臓に標的化されたトランスジェニックマウスを作成し、リファンピシンおよびクロトリマゾールがマウスにおいてCYP3A発現を誘導することを示した。
【０００８】
これらの種間の違いは創薬分野における大きな問題である。CYP450酵素は薬物を代謝し、P-糖タンパク質は循環から薬物を除去することが知られているので、これらの系の発現を刺激する全ての薬剤が、薬物間相互作用を引き起こして、同時投与される薬物の効力を低下させ、毒性を引き起こす可能性を持っている。この毒性は、数種類の薬物が同時に投与された場合に、ようやく明らかになる。従って、前臨床開発段階にある全ての新薬が、通常、CYP450系およびMDR1の誘導について試験される。
【０００９】
しかしながら、げっ歯類PXRとヒトPXRではリガンド結合に違いがあるために、げっ歯類モデルは、薬物がヒトにおいてCYP450系およびMDR1を誘導できるかを十分に予測するものではない。ヒト肝細胞に及ぼす影響について薬物をインビトロで試験することができるが、インビトロ系は、一般的に、インビボでの薬物間相互作用試験の十分に代わりとなるものではない。さらに、CYP450およびP-糖タンパク質系の誘導は薬物半減期に大きな影響を及ぼすことがあるので、げっ歯類において新薬の効力、薬物動態、および毒性を試験しても、ヒトでの作用が十分に予測されない可能性がある。
【００１０】
この問題を克服するアプローチの1つが、ヒトと同様に、CYP450系およびMDR1の誘導物質に応答するヒト化マウスを開発することである。Xieら(2000)は、天然のPXRが欠失され、ヒト受容体が肝臓において発現するマウスを作成した。しかしながら、これらの動物は、部分的にしか、ヒトPXR系を再現しなかった。第一に、ヒトPXRはマウス肝臓に標的化されたが、ヒトPXRは腸でもCYP3A4およびMDR1の発現を誘導する。胃腸管は、身体からの薬物の排泄におけるP-糖タンパク質の主要な作用部位である。
【００１１】
さらに、PXRは肝臓および腸以外の組織において発現する。ヒトのPXRおよびP-糖タンパク質は両方とも、腎臓および胎盤において同時に発現することが分かっている。これは、腎臓の薬物代謝および排泄におけるPXRの役割を示唆しているのかもしれない。さらに、これは、生体異物から胎盤を守るように機能しているのかもしれない。さらに、PXRおよびCYP450は、風媒性毒素の代謝に関与する肺において発現する。PXRとCYP450またはP-糖タンパク質とのこれらの潜在的な相互作用は、Xieらによって作成されたトランスジェニックマウスでは見られない。実際に、cDNAを用いた全てのトランスジェニック技術を使用しても、ヒト遺伝子を正常な組織分布で生理学的に発現することはできない。
【００１２】
第二に、PXRは、CYP450発現の調節において単独で働かない。CARはCYP2B遺伝子発現の主要な調節因子であり、CYP450酵素のフェノバルビタール誘導の媒介を担っている。PXRと同様に、マウスCARおよびヒトCARのアミノ酸配列および薬物感受性には大きなばらつきがある。マウスCARおよびヒトCARは、そのリガンド結合ドメインにおいて72％のアミノ酸配列同一性しかない。分子的研究から、ヒトPXRとCARとの間にはCYP450遺伝子調節においてかなりのクロストークがあることが分かっている。
【００１３】
実際に、大部分の研究は、CYP450およびP-糖タンパク質の発現調節におけるPXRの役割に焦点を当てているが、他の因子も、ヒトにおけるこれらのタンパク質の発現制御に関与し、薬物間相互作用に寄与している可能性が高い。例えば、PXRは、レチノイドX受容体(RXR)とのヘテロ二量体としてCYP450遺伝子の応答エレメントと相互作用する。RXR受容体のリガンドであるレチノイン酸および合成類似体レキシノイド(Rexinoid)はヒトPXR/RXR二量体を活性化することができるが、マウス二量体もラット二量体も活性化しない(Jones,S.A.ら(2000)The pregnane X receptor:a promiscuous xenobiotic receptor that has diverged during evolution.Mol.Endocrinol.14:27-39.)。従って、RXRは、ヒトPXRの独特のリガンド特異性の一要因であり、従って、ヒトにおいて見出されるが、げっ歯類では見出されない薬物間相互作用の違いに寄与するのかもしれない。しかしながら、cDNAを用いたトランスジェニック技術では、複数のヒト遺伝子をマウスにおいて天然の位置で発現させることができず、そのため、これらのアプローチを用いて、ヒトCYP450系およびP-糖タンパク質の協調的な調節を再現することはできない。
【００１４】
従って、ヒトにおける影響を予測するものとして、薬物の影響の試験に有用な遺伝子組換え動物を作成する改善された方法が当技術分野において依然として必要とされている。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、オルソロガス内因性動物遺伝子コード配列の代わりにヒト遺伝子コード配列を有する「ヒト化」動物を作成する方法に関する。1つの態様において、ヒトコード配列は遺伝子発現調節(制御)領域も含む。別の態様において、ヒト化動物は、オルソロガス内因性動物遺伝子調節(制御)領域の代わりにヒト遺伝子調節(制御)領域を有する。ヒト化マウスは製薬産業およびバイオテクノロジー産業にとって特に有用である。このようなヒト化マウスは、例えば、ヒトの薬理学的反応および毒物学的反応を模倣するために、ヒト疾患の改善されたモデル系を作成するために、ならびに異なるヒト遺伝子アレルに対する薬物反応の改善されたモデルを作成するために使用することができる。
【００１６】
本発明の方法によれば、ヒトDNA配列が非ヒト動物に由来する配列に隣接して配置されたDNA構築物が、細菌細胞(特に、大腸菌)での組換えによって作成される。次いで、生成されたDNA構築物は非ヒト胚形成幹細胞に導入することができ、そこで、非ヒト動物のゲノムDNAとの組換えを行うことができる。別の態様において、ヒトDNA配列はヒト調節配列に隣接して配置される。さらに別の態様において、非ヒト動物DNA配列がヒト調節配列に隣接して配置されたDNA構築物が作成される。
【００１７】
1つの態様において、本発明は、第1のDNA構築物と第2のDNA構築物を組換える段階を含む、ヒト化動物を作成する方法を提供する。第1のDNA構築物には非ヒト動物DNA配列が含まれ、第2のDNA構築物にはヒトDNA配列があり、ヒトDNA配列は第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列に隣接して配置される。または、第2の構築物にはヒトDNA配列があり、ヒトDNA配列はヒト調節配列に隣接して配置される。さらに別の態様において、第2のDNA構築物には非ヒト動物DNA配列があり、非ヒト動物DNA配列はヒト配列に隣接して配置される。1つの態様において、配列は、本発明の方法を用いて構築されることが望ましい同じ非ヒト動物に由来する。
【００１８】
1つの特定の局面において、第1の組換え段階は、sbcB、sbcC、recB、recC、またはrecDの活性を欠損しており、recA温度感受性変異を有する大腸菌株において行われる。組換え段階の後、組換えられた第3のDNA構築物が単離される。この構築物は、ヒトDNA配列が第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列に隣接して配置されている;ヒトDNA配列がヒト配列に隣接して配置されている;または非ヒト動物DNA配列がヒト配列に隣接して配置されている。次いで、この組換え構築物は非ヒト胚形成幹細胞に導入される。
【００１９】
本発明はまた、細胞内で相同組換えを行うためのDNA構築物を提供する。このDNA構築物は、少なくとも1つのイントロンを有するヒトDNAコード配列、および少なくとも1つのイントロンの中に含まれる選択マーカー遺伝子を有する。この構築物はまた、ヒトDNAに隣接する第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列も有する。非ヒト動物隣接配列は、ヒトDNAコード配列とオルソロガスな遺伝子に隣接する非ヒト動物ゲノム内の配列と相同である。1つの態様において、ES細胞内での組換えによって、非ヒト遺伝子がそのヒトオルソログに置き換えられる。別の態様において、本発明は、ヒトDNA配列がヒト配列に隣接して配置されたDNA構築物を提供する。さらに別の態様において、本発明は、非ヒト動物DNA配列がヒト配列に隣接して配置されたDNA構築物を提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、細菌細胞(好ましくは、大腸菌)における組換えによって、細胞内で相同組換えを行うためのDNA構築物を作成する方法を提供する。次いで、生成されたDNA構築物は非ヒト胚形成幹細胞に導入することができ、そこで、非ヒト動物のゲノムDNAとの組換えを行うことができる。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の方法によって作成されたヒト化動物を提供する。別の態様において、ヒト化動物はマウスである。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト薬物代謝系の動物モデルを提供する。本発明は、ヒトPXRをその天然の位置で発現するマウスを作成するために細菌人工染色体(BAC)を利用する。本明細書で使用する「天然の位置」は、遺伝子コード配列の実際の位置(例えば、第16番染色体)と、その遺伝子の内因性オルソロガス特徴の両方を述べるために用いられる。BACを用いると、非常に長いヒトDNA配列をマウスまたは他の非ヒト動物に挿入することが可能になる。これらの配列は、トランスジェニックマウスを作成するための標準的なDNA導入技術に用いられるものより非常に長く、選択的に、遺伝子コード領域と共に組織選択的調節領域を含めることができる。結果として、問題になっている遺伝子は、欠失された内因性遺伝子のプロモーターによって適切な制御下で発現されるか、または所望であれば、標準的な遺伝子ターゲティング手順のために全ての細胞または体内のある部位で発現されるのではなく、体内の正常な位置において生理学的なレベルで、対応するヒト調節領域の制御下で発現される。例えば、以前の研究(Nielsen L.ら(1997)Human apolipoprotein B transgenic mice generated with 207- and 145 kb pair BAC.Evidence that distant 5'-element confers appropriate transgene expression in intestine.J.Biol.Chem.272:29752-29758)から、標準的なトランスジェニック手順を用いてヒトApoB遺伝子をマウスにおいて発現させると、この遺伝子はマウスの肝臓において発現するが、腸では発現しないことが分かった。対照的に、BACを使用すると、150〜200kbのヒトApoB遺伝子がマウスに挿入され、肝臓および腸の両方で発現し、正常なヒト発現がマウスにおいて再現された。BAC系の有用性のさらなる例は、ShizuyaおよびHosein-Mehr(Shizuya H.およびKouros-Mehr H.(2001)The development and application of the BAC cloning system.Keio J.Med.50:26-30.)ならびにNeuhausen(Neuhausen S.ら(1994)A P1- based physical map of the region from D17S776 to D17S78 containing the breast cancer susceptibility gene BRAC1.Hum Mol.Genet.3:1919-1926.)に記載されている。
【００２３】
請求された本発明の利点の1つは、創薬の初期段階で薬物候補をスクリーニングすることができるので、特定の薬物候補を探求するコストが大幅に削減されることである。どの候補を探求するかの決断を助ける新たな技術およびツールは製薬産業が貴重な人的資源および資金を節約するのに重要である。特に、動物試験から効力および毒物学的特性の予測が十分に得られずに、ヒトでの臨床試験を開始するのは非常に費用がかさんで時間がかかり、患者に不必要なリスクを課す可能性がある。従って、前臨床試験での薬物評価に使用するための信頼性の高い動物モデルがかなり必要とされている。
【００２４】
本発明の方法によって作成されるBACヒト化トランスジェニックマウスは、以前の方法より優れた以下の利点をもたらす:適切な組織特異的発現を可能にする;発現の内因性調節を可能にする;生理学的レベルの発現をもたらす;組込み部位に関して正確である;内因性コード領域を除去する;遺伝子スプライシングをもたらす;および約1〜350kbのトランスジーン(例えば、約1kb、10kb、50kb、100kb、200kb、300kb、350kbなどを超えるトランスジーン)を可能にする(これは、主に、コード領域のサイズおよびベクター(例えば、BAC)のサイズによって限定される)。
【００２５】
BAC系の1つの態様では、F2ホモ接合性動物にBACを連続的に導入することにより、非常に大きなオルソロガス遺伝子の連続領域を連続的に置き換えることによって、非常に大きな遺伝子(150Kbを超える遺伝子、例えば、ヒトのIg遺伝子座はほぼ970Kbであり、1つのBACには大きすぎる)を組み立てることができる。本発明は、約150Kbのヒト遺伝子を有する動物の作成、次いで、次の150Kbが導入された次の動物の作成などを可能にする。
【００２６】
本発明の動物モデルは、挿入遺伝子の任意の複数の組み合わせを有してもよい。1つの態様において、動物は、動物のオルソロガス内因性遺伝子コード配列の代わりにヒト遺伝子コード配列を有する。別の態様において、動物がオルソロガス遺伝子に対するヒト制御領域およびヒトコード領域の両方を有するように、ヒトコード配列は遺伝子発現調節(制御)領域も含む。別の態様において、ヒト化動物は、動物のオルソロガス内因性遺伝子調節(制御)領域の代わりにヒト遺伝子調節(制御)領域を有するが、内因性コード領域を保持する。
【００２７】
さらに、BACを用いると、げっ歯類宿主において複数のヒト遺伝子を発現することが可能になる。例えば、潜在的に、ヒトPXR、CAR、RXR、ならびにこれらが調節する標的遺伝子およびヒトプロモーターを全て、同じ動物において発現させることができる。従って、本発明は、複数の遺伝子を1つのBACに加えることができる。結果として、遺伝子ネットワークをBACマウスに挿入することができる。遺伝子クラスター全体または複数の遺伝子経路(例えば、ヒト代謝経路)、免疫グロブリンなどを、これらの関連するヒト調節配列と共に、またはヒト調節配列を伴わずに、複数のヒト遺伝子を有する動物宿主において発現させることができる。「正常な」協調した組織発現および誘導性発現を伴う、遺伝子ネットワークまたはクラスターの挿入は、他のトランスジェニック技術では実施できない可能性がある。例えば、本発明の方法を用いて、連続した遺伝子をES株に加え、このES株を用いてトランスジェニックBAC動物を作成することができる。または、望ましい遺伝子の1つまたはそれ以上(一般的であるが全てとは限らない)を含むES株を用いてトランスジェニック動物を作成し、次いで、さらなる望ましいネットワークまたはクラスター遺伝子を含む他のトランスジェニックBAC動物と交雑することができる。
【００２８】
さらに、BAC系には柔軟性がある。交雑によって、さらなる遺伝子をBACマウスに加えることができる。従って、マウスにおいて、CYP450およびMDR1遺伝子の誘導に関与するヒト系の基礎が作成され、薬物間相互作用に寄与する他のエレメントについてはより知られているように、これらのエレメントの遺伝子をヒト化マウスに加えることができる。
【００２９】
ヒト化BACマウスには、製薬産業での創薬にとって数多くの重要な用途がある。前臨床開発に入っている薬物がヒトにおいてCYP450およびMDR1系を誘導する可能性が高いかどうかさらにはっきりと評価するために、薬物をヒト化BACマウスにおいて試験することができる。さらに、効力試験がこのマウスにさらに関係している。なぜなら、薬物の代謝はヒトでの作用をより正確に反映するからである。
【００３０】
抗菌剤の中には、CYP450系およびMDR1の誘導をヒトにおいて著しく刺激するが、げっ歯類では刺激しないことが知られているものもあるので、ヒト化PXR BACマウスは、新規の抗生物質の開発および新たな抗生物質がCYP450系の著しい誘導を引き起こすかの確認に特に重要な場合がある。
【００３１】
薬剤耐性細菌の発生率がますます高くなってきているために、新たな抗生物質の開発が極めて必要とされている。例えば、Neuhauser Mら((2003) Antibiotic resistance among gram-negative bacilli in US intensive care units:implications for fluoroquinolone use.JAMA.19:885-8)は、米国において、広範囲に用いられている抗生物質シプロフロキサシンに対する細菌の感受性が1994年の86％から2000年の76％に低下したことを報告した。シプロフロキサシンは生物戦病原体である炭疽菌を治療するのに用いられる主要な薬物であるので、このことは特に重要である。
【００３２】
BACヒト化マウスモデルは、生物戦病原体を治療するための新規の治療薬の開発に有用である。第一に、現在利用可能なものより優れたヒトでの薬物間相互作用を予測する系を提供する。第二に、生物戦病原体を治療するための薬物の効力を試験する新たな動物モデルが開発された時に、このモデルにおいてBACヒト化マウスを使用することができる。重要なことに、生物戦による感染を治療するための新薬を試験する遺伝子モデルが開発された場合、新薬の効力、毒性、および代謝が同じ動物において試験できるように、BACヒト化マウスは、その遺伝子改変を組み込むことができる。
【００３３】
本明細書で使用する「ヒト化」動物は、元の遺伝子構造の1つまたはそれ以上の遺伝子および/または遺伝子調節配列が類似するヒト配列で置き換えられているのに加えて、マウスまたは他の非ヒト動物の遺伝子配列を保持する複合遺伝子構造を有する、マウスまたは他の非ヒト動物を意味する。
【００３４】
本明細書で使用する「BAC」は細菌人工染色体を意味する。本発明はBACクローニング系を提供する。大腸菌シングルコピープラスミドF因子に基づくベクターpBACは、BACの形で350kbと大きな複雑なゲノムDNAを維持することができる(概要についてはShizuyaおよびHosein-Mehr,2001を参照のこと)。数千個のBACの分析および特徴付けから、BACは、コスミドまたは酵母人工染色体(YAC)より非常に安定であることが分かっている。さらに、BACクローンはコスミドまたはYACよりはるかに正確にヒトゲノムの代わりを務めることを証拠が示唆している。大腸菌におけるゲノムDNAのこの容量および安定性のために、BACは、現在、配列決定作業ならびにゲノム学研究および機能ゲノム学研究において多くの科学者に広く用いられている。
【００３５】
例示的な例では、本発明は、非ヒト動物DNA配列を含む第1のDNA構築物と第2のDNA構築物を組換える段階を含む、ヒト化動物を作成する方法を提供する。第2のDNA構築物にはヒトDNA配列があり、ヒトDNA配列は、第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列に隣接して配置される。別の態様において、ヒトDNA配列はヒト配列に隣接して配置される。さらに別の態様において、第2の構築物は、非ヒト動物DNA配列がヒト配列に隣接して配置されたDNA構築物である。1つの態様において、配列は、本発明の方法を用いて構築されることが望ましい同じ非ヒト動物に由来する。本発明の例示的なBACとして、pBAC108L(ATCCアクセッション番号U511140)およびpBeloBAC11(ATCCアクセッション番号U51113)が挙げられるが、これに限定されない。
【００３６】
第1の組換え段階は、sbcB、sbcC、recB、recC、またはrecDの活性を欠損しており、recA温度感受性変異を有する大腸菌株において行われる。組換え段階の後、組換えられたDNA構築物が単離される。この構築物は、ヒトDNA配列が第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列に隣接して配置されている;ヒトDNA配列がヒト配列に隣接して配置されている;または非ヒト動物DNA配列がヒト配列に隣接して配置されている。次いで、組換えられた構築物は非ヒト胚形成幹細胞に導入される。
【００３７】
組換えられる構築物は、組換え前に線状化することができる。1つの態様において、構築物は、大腸菌細胞に導入される前に線状化される。第2の構築物が選択マーカーを含む場合、組換えられていないベクターを含む大腸菌細胞は取り除くことができる。
【００３８】
第2のDNA構築物はまた正の選択マーカーおよび/または負の選択マーカーを有してもよく、正の選択マーカーおよび/または負の選択マーカーはヒトDNA配列を分断してもよい。
【００３９】
本発明において用いられるコードDNA配列に隣接する領域は、相同組換えが可能な長さであるべきである。例えば、大腸菌では、高い組換え頻度のための最小隣接領域の長さは約1〜2kbである。より短い隣接領域の長さを使用することができるが、低い組換え頻度をもたらす可能性がある。例えば、隣接領域は約0.1〜200kbでもよく、一般的に、約1kbまたは2kb〜20kbである。
【００４０】
組換えられたDNAベクターに正の選択マーカーおよび/または負の選択マーカーを含めることによって、非ヒト動物に由来する胚形成幹(ES)細胞を組換え体について選択することができる。次いで、ES細胞は非ヒト動物の胚盤胞に導入される。次いで、ヒト化非ヒト動物を作成するために、キメラ胚盤胞を偽妊娠宿主動物に導入することができる。ES細胞から胚を作成する他の方法も本発明の方法と共に使用することができる。
【００４１】
様々なDNA構築物が、構築物に挿入されるDNAのサイズに適切なように選択される。1つの態様において、第1のDNA構築物および第2のDNA構築物は細菌人工染色体またはその断片である。別の態様において、第1のDNA構築物および第2のDNA構築物は大腸菌細胞での組換えの前に線状化される。
【００４２】
さらに別の態様において、ヒトDNA配列は、ヒト遺伝子をコードするヒト遺伝子配列であり、その中には少なくとも1つのイントロンが含まれる。イントロンの中に選択マーカーがコードされるように、ベクターを操作することができる。選択マーカーが含まれる場合、望ましい組換え事象を受けたクローンは、適切な抗生物質または薬物を用いて選択することができる。
【００４３】
本発明において用いられるヒト遺伝子配列として、Gタンパク質共役受容体をコードする遺伝子、キナーゼをコードする遺伝子、ホスファターゼをコードする遺伝子、イオンチャンネルをコードする遺伝子、核受容体をコードする遺伝子、癌遺伝子、癌抑制遺伝子、ウイルス受容体をコードする遺伝子、細菌受容体をコードする遺伝子、P450遺伝子、インシュリン受容体をコードする遺伝子、免疫グロブリンをコードする遺伝子、代謝経路遺伝子、転写因子をコードする遺伝子、ホルモン受容体をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、細胞シグナル伝達経路遺伝子、および細胞周期遺伝子を挙げることができるが、これに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用する「Gタンパク質共役受容体」は、様々なグループのシグナル伝達分子(ホルモン、神経伝達物質、および局所メディエーターを含むが、これに限定されない)と結合することによって細胞応答を媒介する受容体である。このようなシグナル伝達分子はタンパク質および小さなペプチド、ならびにアミノ酸および脂肪酸誘導体でもよい。全ての既知のGタンパク質共役受容体は、脂質二重層を7回貫通する1本のポリペプチド鎖からなる類似した構造を有する。Gタンパク質共役受容体はGタンパク質を利用し、Gタンパク質によって、細胞外リガンドが存在するというメッセージを細胞内部に伝達する。
【００４５】
キナーゼは、高エネルギーリン酸含有分子(ATPまたはADP)から基質へのリン酸基の転移を触媒する酵素である。本発明において用いられるキナーゼとして、EGFR、PI3K、MAPキナーゼ、およびAktを挙げることができるが、これに限定されない。
【００４６】
ホスファターゼは、リン酸有機エステルの加水分解および合成ならびに他の化合物へのリン酸基の転移を促進する酵素である。本発明において用いられるホスファターゼとして、PTPα、SHP1、SHP2、およびCD45を挙げることができるが、これに限定されない。
【００４７】
イオンチャンネルは、電荷を帯びた特定の分子を通過させる細胞膜の孔である。この通過によって、電流が細胞内外に流れる。刺激に反応して、イオンが通過する。イオンチャンネルはタンパク質である。イオンチャンネルは、通過するイオンおよび刺激によって分類される。イオンチャンネルを通過するイオンの例として、カリウムイオン、ナトリウムイオン、およびカルシウムイオンが挙げられるが、これに限定されない。
【００４８】
核受容体は、核に存在し、ホルモンに結合することができるタンパク質である。従って、核受容体は、様々な生理学的機能に関与する細胞の核に位置するレギュレーターとして重要であり、従って、癌、糖尿病、またはホルモン耐性などの疾患に関連する。本発明において用いられる核受容体として、TRR、ANDR、およびGCRを挙げることができるが、これに限定されない。
【００４９】
本明細書で使用する「癌遺伝子」は、通常、細胞増殖おいて役割を果たしているが、過剰発現または変異すると、癌の増殖を促進ことができる1つまたはそれ以上の遺伝子を意味する。例として、N-myc、c-myc、erb-B、Her2、neu、ras、ABL、RASK、int、flg、Lck、およびfosを挙げることができるが、これに限定されない。
【００５０】
癌抑制遺伝子は、通常、細胞増殖を抑制しているが、変異によって欠失または不活化されると、細胞を無秩序に増殖させる遺伝子である。従って、腫瘍形成に関連する腫瘍抑制遺伝子の変異は、一般的に、機能の喪失を引き起こし、この抑制を開放する。
【００５１】
ウイルス受容体および細菌受容体は、ウイルスまたは細菌が標的細胞に進入することができる細胞の進入点である。本発明において用いられるこのような受容体として、ヒトB型肝炎およびC型肝炎、HIV、結核菌(M.tuberculosis)を挙げることができるが、これに限定されない。
【００５２】
P450遺伝子は、前記のように、体内において薬物代謝を担うタンパク質をコードする。これらの酵素は、ホルモン、低分子薬物、毒素、および環境化学物質を排出できるように、より極性にすることによって、これらを不活化する。これらの酵素は薬物間相互作用の主要な部位でもある。例示的なP450遺伝子として、CYP3A4、CYP2B6、およびCYP2C9を挙げることができるが、これに限定されない。
【００５３】
インシュリン受容体は、標的細胞が血中のインシュリンと結びつく、または結合するのを可能にする、標的細胞の細胞膜を貫通する受容体である。細胞およびインシュリンが結合すると、細胞は血液からグルコース(糖)を取り込み、エネルギーとして使用することができる。
【００５４】
免疫グロブリンはプラズマ細胞によって産生されるタンパク質であり、外来抗原として認識された体内物質に結合することによって細胞外液での免疫応答を制御するように設計されている。免疫グロブリンは構造および活性によって分類される。免疫グロブリンの5つのクラスがIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。それぞれのIg単位は2本の重鎖および2本の軽鎖で構成され、2つの抗原結合部位を有する。
【００５５】
本明細書で使用する「代謝経路遺伝子」は、生物系において酵素によって触媒される一連の化学反応である代謝経路に関与する遺伝子である。一般的に、経路は、大きな化合物をより小さな単位に分解するか(異化)、小さな分子からより複雑な分子を合成する(同化)。ある経路のある反応の産物は、後の反応の基質として働く。経路の最終産物は生物系において不可欠な機能を有する。代謝経路の例として解糖およびクレブス回路が挙げられるが、これに限定されない。さらに、ポリケチド合成酵素が遺伝子クラスターの一例である。
【００５６】
本明細書で使用する「転写因子」は、特定の遺伝子に関連する特定のDNA配列を認識し、特定のDNA配列に結合し、遺伝子をオンまたはオフすることができるタンパク質を意味する。従って、遺伝子発現は、様々な転写因子の利用可能性および活性によって制御される。多数の疾患および障害が、転写因子の欠如または機能不全によって引き起こされる遺伝子発現の混乱に起因することが知られている。転写因子は、DNAテンプレートを用いてRNAを合成するのを助ける。例示的な転写因子として、NF-κB、AP-1、Sp-1、Oct-1、およびTFIIDを挙げることができるが、これに限定されない。
【００５７】
「ホルモン受容体」は、特定のホルモンを認識し、それと結合する、細胞表面上の受容体である。ホルモン受容体が糖尿病および癌などの疾患と関連していることがあるように、様々な形の核ホルモン受容体が体内の様々なプロセスを媒介する。前記のPXRは、未知の化学物質に対して身体反応を引き起こすホルモン受容体であり、従って、薬物間相互作用および薬物代謝に関与する。
【００５８】
本明細書で使用する「サイトカイン」は、多くの異なる細胞タイプによって分泌され、通常、単鎖からなる、比較的小さな分子量のタンパク質である。サイトカインは、他の細胞を活性化し、細胞増殖および免疫などの生物学的プロセスを協調および調節するシグナル伝達分子である。多くの点で、サイトカインはホルモンと似ている。例示的なサイトカインとして、インターフェロン-a、インターフェロン-b、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、血小板活性化因子(PAF)、リンフォカイン、インターロイキン(IL)、およびモノカインが挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
本明細書で使用する細胞シグナル伝達経路は、生物の個々の細胞が、その挙動を協調するために連絡する手段である。細胞シグナル伝達は、ほとんどの生物学的プロセスの中心にある。細胞シグナル伝達系として、細胞表面受容体タンパク質および細胞内受容体タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、およびGTP結合タンパク質を挙げることができるが、これに限定されない。「細胞シグナル伝達経路遺伝子」は、このような経路に関与する遺伝子である。
【００６０】
本明細書で使用する「細胞周期」は、細胞増殖および1個の細胞から2個の娘細胞への分裂をもたらす事象を意味する。細胞周期には、S期、G2期、M期、およびG1期が含まれる。細胞周期遺伝子は、細胞周期に関与する遺伝子または細胞周期を調節する遺伝子である。細胞周期遺伝子として、Cdk、MPF、およびp53を挙げることができるが、これに限定されない。
【００６１】
組換え段階の後に、1つまたはそれ以上のさらなる選択マーカーを、組換えされた構築物に加えることができる。1つの態様において、正の選択マーカーが、ヒトDNA配列のイントロンの中に加えられる。さらに別の態様において、負の選択マーカーが、非ヒトDNA配列のいずれかに隣接する位置に加えられる。
【００６２】
本発明の方法は、ES細胞が利用可能な任意の非ヒト動物を用いて使用することができる。1つの態様において、ES細胞はマウスES細胞であり、非ヒト動物はマウスであり、本発明の方法はヒト化マウスを作成するために用いられる。
【００６３】
本発明の方法は、ヒト配列と非ヒト配列との連結部を正確に決定するのに使用することができる。1つの態様において、非ヒト動物のコード配列だけがヒト化される。このような態様において、第2の構築物の第1の非ヒトDNA配列は、ヒト遺伝子コード配列の開始コドンの5'に連結され、第2の構築物の第2の非ヒトDNA配列は、ヒト遺伝子コード配列の停止コドンの3'に連結される。別の態様において、非ヒト動物の調節(制御)配列だけがヒト化される。さらに別の態様において、非ヒト動物のコード配列および調節(制御)配列の両方がヒト化される。
【００６４】
使用されるヒトDNA配列はヒトゲノム配列でもよく、ヒト遺伝子産物をコードする非天然配列でもよい。1つの態様において、配列は、ヒト遺伝子産物をコードするが、非ヒト動物での発現を改善するためにコドンが最適化された非天然配列である。別の態様において、配列は、ある特定のヒトエキソンを組み込んでいるが、一部の非ヒトエキソンを保持しているキメラ遺伝子である。さらに別の態様において、配列は、一部のまたは全てのヒトエキソンを有するが、一部のまたは全ての非ヒトイントロンを保持しているキメラ遺伝子である。
【００６５】
本発明はまた、少なくとも1つのイントロンを有するヒトDNAコード配列および少なくとも1つのイントロンの中に含まれる選択マーカー遺伝子を有する、細胞内で相同組換えを行うためのDNA構築物を提供する。このDNA構築物はまた、ヒトDNAに隣接する第1の非ヒト動物DNA配列および第2の非ヒト動物DNA配列も有する。非ヒト動物隣接配列は、ヒトDNAコード配列とオルソロガスな遺伝子に隣接する非ヒト動物ゲノム内の配列と相同である。1つの態様において、ES細胞内での組換えによって、非ヒト遺伝子がそのヒトオルソログに置き換えられる。さらに、もしくは、または、構築物はヒト隣接配列を有してもよく、非ヒト動物DNA配列がヒト配列に隣接して配置されてもよい。
【００６６】
別の態様において、DNA構築物はまた、非ヒトDNA配列の一方に隣接した第2の選択マーカーも有する。1つの態様において、構築物は細菌人工染色体である。別の態様において、構築物は線状化される。1つの態様において、DNA構築物がマウス遺伝子を置き換える構築物である場合、第1の非ヒトDNA配列および第2の非ヒトDNA配列はマウスゲノムDNA配列である。別の態様において、非ヒト配列はヒト遺伝子コード領域に隣接して連結されてもよく、コード領域外で連結されてもよい。別の態様において、非ヒト配列は、コード領域外にあり、かつ5'側および3'側の調節DNA配列または制御DNA配列(例えば、プロモーターおよびエンハンサーを含む)の一部または全てを含むヒト配列に連結される。従って、非ヒト配列は、開始コドンの5'末端に隣接するヒト配列または停止コドンの3'末端に隣接するヒト配列に連結されてもよい。
【００６７】
本発明の1つの態様において、ヒトDNAがマウスDNAに隣接して配置された第1のDNAベクターが構築される。このDNAベクターは、プラスミド、BAC、YAC、またはPACを含む任意の適切なDNAベクターでよい。1つの態様において、DNAベクターは細菌人工染色体である。
【００６８】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、ベクターの自己複製能を失うことなく別の核酸断片を組み込むことができる核酸分子を意味する。ベクターは、ウイルス、プラスミド、または高等生物の細胞に由来してもよい。ベクターは外来DNAを宿主細胞に導入するのに用いられ、宿主細胞内でベクターは複製される。
【００６９】
本明細書で使用する用語「構築物」は、遺伝子工学またはリコンビニアリング(recombineering)によって人工的に構築されたDNA配列を意味する。
【００７０】
ポリヌクレオチドの操作(標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を含む)を容易にすることができるベクターに、ポリヌクレオチド因子を含めることができる。ベクターは、ポリヌクレオチドを維持するのに有用なクローニングベクターでもよく、ポリヌクレオチドの他に、ポリヌクレオチドを発現させるのに有用な調節エレメントおよび(ポリヌクレオチドがペプチドをコードする場合)コードされるペプチドを特定の細胞において発現させるのに有用な調節エレメントを含む、発現ベクターでもよい。発現ベクターは、例えば、コードポリヌクレオチドの持続的な転写を行うのに必要な発現エレメントを含んでもよく、ポリヌクレオチドがベクターにクローニングされる前に、調節エレメントがポリヌクレオチドに作動可能に連結されてもよい。
【００７１】
発現ベクター(またはポリヌクレオチド)は、一般的に、コードポリヌクレオチドの構成的発現あるいは所望であれば誘導性発現または組織特異的発現もしくは発生段階特異的発現をもたらすプロモーター配列、ポリA認識配列、およびリボソーム認識部位または内部リボソーム進入部位、あるいはエンハンサーなどの他の調節エレメント(これは組織特異的でもよい)を含むか、またはコードする。ベクターはまた、原核生物宿主系もしくは真核生物宿主系または所望であればその両方での複製に必要なエレメントを含んでもよい。このようなベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクター(例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アルファウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクター)を含み、周知であり、商業的供給元(プロメガ(Promega),Madison WI;ストラタジーン(Stratagene),La Jolla CA;ギブコ(GIBCO)/BRL,Gaithersburg MD)から購入することができるか、または当業者によって構築することができる(例えば、Meth.Enzymol,Vol.185,Goeddel編(Academic Press,Inc.,1990);Jolly,Canc.Gene Ther.1:51-64,1994;Flotte,J.Bioenerg.Biomemb 25:37-42,1993;Kirshenbaumら,J.Clin.Invest 92:381-387,1993を参照のこと;これらの各々が参照として本明細書に組み入れられる)。
【００７２】
本発明の方法において用いられるDNAベクターは正の選択マーカーおよび負の選択マーカーを含んでもよい。正の選択マーカーおよび負の選択マーカーは、発現された時に、これらの遺伝子を発現する細胞に抗生物質耐性を付与する遺伝子でもよい。適切な選択マーカーとして、Km(カナマイシン耐性遺伝子)、tetA(テトラサイクリン耐性遺伝子)、およびG418(ネオマイシン耐性遺伝子)を挙げることができるが、これに限定されない。選択マーカーはまた、ある物質を毒性物質に変換することができる代謝遺伝子でもよい。例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が発現されると、薬物ガンシクロビル(gancylcovir)を毒生産物に変換する。従って、細胞をガンシクロビルで処理すると、チミジンキナーゼを発現しない遺伝子について負の選択を行うことができる。
【００７３】
本発明の1つの態様において、第1のDNAベクターは、一方がヒト遺伝子のDNAを含み、他方がマウス遺伝子のDNAを含む2つのBACベクターを用いてPCRによって作成される。本明細書で使用する「遺伝子」は、野生型対立遺伝子(天然に生じる多型を含む)および変異体または操作された対立遺伝子を意味してもよい。1つの態様において、ある対立遺伝子が、天然に生じるヒト対立遺伝子をコードするように操作されるが、そのDNA配列は、非ヒト生物のコドン優先(codon preference)を反映するようにコドンが最適化されている。コドン優先は当業者に周知である。本発明において用いられる遺伝子は、例えば、遺伝子コード配列でもよく、遺伝子調節領域でもよい。
【００７４】
図1Aは、マウス配列とヒト配列との間で組換えDNAを作成するために用いられるPCR手順を示す。マウス遺伝子を有するBAC(BAC-1)とマウス遺伝子のヒトオルソログ遺伝子を有するBAC(BAC-2)が作成される。これらのBACはコード領域に隣接する制御領域を含んでもよい。2つのPCR産物(pAおよびpB)が作成される;両方とも、ヒトDNAとマウスDNAとのハイブリッド産物である。pAの前半は、コード領域の開始点から2kb上流のマウスDNAであり、後半は、ヒトコード領域の最初のコドンATGから始まる2kbのヒトDNAである。同様に、pBの半分は、後半との接合部である最後のコドンTAGを含む2kbのヒトDNAであり、後半は、TAGから2kb下流のマウスDNAである。PCRのさらに詳細な説明を図1Bおよび図1Cに示す。
【００７５】
図1Bは、最初のアミノ酸コドンATGの上流にある約2kb領域の末端に由来する約20塩基長のプライマーp1と、約40塩基のハイブリッド配列を有する他方のプライマーp2を用いて行われたPCR-1を示す。p2の前半(5'末端)配列は、ヒトコード領域の最初の20塩基(ATGで終わる)を含み、後半は、ATGコドン下流の約20塩基のマウスDNAを含む。従って、PCR産物(産物1)は、約20塩基のヒトDNAおよび約2kbのマウスDNAを含む、ヒトDNAとマウスDNAとのハイブリッド産物である。産物3は、停止コドンTAGを含むヒトコード領域の最後の20塩基およびマウスBAC DNAの約2kbの下流領域を含む。産物2および4は長さが約2kbである。これらの産物は、それぞれ、ヒトコード領域のATGおよびTAGを含む。図1Bに示したように、遺伝子のコード領域と非コード領域の接合部に対応するDNA断片を生じるプライマーを使用することができる。遺伝子の3'末端および5'末端のいずれかまたは両方に調節配列領域を含む接合部を選択することも可能である。例えば、図5〜8は、遺伝子の3'末端および5'末端の両方に調節配列を含むように、望ましい領域が遺伝子のコード領域に隣接する一例を示す。図5では、マウス遺伝子を有するBAC(マウスBAC)またはオルソログであるヒト遺伝子を有するBAC(ヒトBAC)が用いられる。これらのBACはコード領域に隣接する制御領域を含む。2つのPCR産物(産物Aおよび産物B)が作成される。両方とも、ヒトDNAとマウスDNAとのハイブリッド産物である。pAの前半は、制御領域の開始点から約2kb上流のマウスDNAであり、後半は、ヒトコード領域の制御領域の開始点から始まる約2kbのヒトDNAである。同様に、pBの半分は、3'制御領域の望ましい領域の末端を含む2kbのヒトDNAであり、後半は、オルソロガスマウス制御領域の末端から2kb下流のマウスDNAである。
【００７６】
2回のPCRを用いて、マウスおよびヒトに由来するDNAを有するPCR産物を作成することができる。例えば、図1Cは、遺伝子コード領域の末端にヒトDNAとマウスDNAとの接合部を有する、断片で標識された産物5および産物6を作成するためのPCRプライマーの使用を示す。図1Cに示すように、産物1の3'末端と産物2の5'末端との間には重複する20塩基がある。プライマーp1およびp4ならびに2つの産物を用いて、PCR-5では、重複領域で融合したDNAである約4kbの産物5が作成される。同様に、産物3と産物4との融合DNAとして、約4kbの産物6が作成される。
【００７７】
図2は、3部の連結反応による産物5、産物6、および正/負のマーカーの組立を示す。正の選択マーカーを含む構築物のみが、培地に存在する抗生物質の存在下で増殖する。構築物で形質転換された細胞を、抗生物質を含む培地において増殖させる。産物7として示した、結果として得られた構築物には、正のマーカーおよび負のマーカーがヒトDNA配列に隣接して、さらにマウスDNA配列に隣接して配置される。
【００７８】
この構築物、産物7は線状化し、recB、recC、またはrecDを欠損し、ならびにsbcBおよびsbcCを欠損し、recA温度感受性である大腸菌細胞に導入することができる。対応するヒト遺伝子配列を有するBAC(BAC-2)と、線状化された産物7との一般的組換えが、大腸菌株において行われる(図3)。recA tsのために、エレクトロコンピテント細胞は30℃(一般的組換えにおけるrecAの許容温度)での増殖によって調製される。エレクトロポレーションによって、既に存在するBAC-2と、入ってくる産物7の両方を有する株にした後、形質転換細胞を、望ましい組換えを選択するのに適した条件下で、42℃(recA tsの非許容温度)でインキュベートする。結果として生じた産物8は、マウス遺伝子が対応するヒト遺伝子で置き換えられた改変BAC-1である。
【００７９】
1つの態様において、新たな産物9を得るために、産物8は、ヒト遺伝子のイントロンの中に配置される正のマーカー遺伝子を用いて、ならびに産物8の少なくとも一方の側面に隣接する負のマーカーを用いて改変される。1つの態様において、使用される正の選択マーカーはG418(ネオマイシン耐性遺伝子)であり、負のマーカーはTK(チミジンキナーゼ遺伝子)である。
【００８０】
マウス胚形成幹(ES)細胞がヒト化マウスBAC,産物9で形質転換される(図4)。産物9を有する(正の選択マーカーを有し(ネオマイシン耐性)、負の選択マーカーを欠く(ガンシクロビル非感受性))ES細胞が選択される。結果として得られた組換え体はマウスに移植するのに用いられる。
【００８１】
ES細胞はマウス胚盤胞に移植することができる。次いで、このマウス胚盤胞は、マウスを出産することができる偽妊娠雌マウスに導入することができる。1つの態様において、ES細胞は、代理マウスとは異なる遺伝的背景のES細胞である。このような違い(例えば、体色)は、ES細胞を組み込んだマウスを迅速に特定するのを可能にする。
【００８２】
2サイクルの一般的組換えが行われる。第1のサイクルでは、一般的組換えは大腸菌株において行われる。この大腸菌株は、例えば、ノックアウト変異によってrecB、recC、sbcB、およびsbcCが無効にされており、recA温度感受性変異を有する。
【００８３】
第2のサイクルでは、一般的組換えはES細胞または卵において行われる。ヒト化BACは、一般的組換えによってマウスゲノム内の対応するマウス遺伝子を置き換える。
【００８４】
哺乳動物細胞に見られるほとんど全てのタンパク質がそれ自身とおよび/または他のタンパク質と相互作用する。タンパク質はある経路において一緒に働き、関連する生化学的作業を行うために活性に加わる。マウスおよびヒトは、ある特定の経路について相同な遺伝子を有する。しかしながら、あるマウス遺伝子がヒト化されると、ヒト化タンパク質とマウスタンパク質との連係が正しく行われない可能性がある。経路において十分に機能するヒト化マウスを作成するために、その連係に関与するマウス遺伝子の全てまたは大部分を、対応するヒト遺伝子で置き換えなければならない。
【００８５】
例えば、2つの相互作用タンパク質があり、一方がエンドペプチダーゼ酵素であり、他方がその基質タンパク質である場合、酵素は、基質タンパク質に局在する特異的部位を認識し、その部位に切り込みを入れて、タンパク質を2つの部分に分ける。基質タンパク質がヒト化されると、マウスペプチダーゼはもはや特異的部位を認識することができない可能性があり、ヒトタンパク質部位に、適切な切り込みが入れられない可能性がある。これは、マウスエンドペプチダーゼ遺伝子をヒト化することによって直すことができる。
【００８６】
ヒトゲノムの比較DNA配列分析によって、30億塩基のヒトゲノムにわたって分散する多数の一塩基多型(SNP)が明らかになった。遺伝子のアミノ酸を変更しないSNPもあれば、遺伝子のアミノ酸を変更するが遺伝子の機能を変更しないSNPもある。他のSNPは、遺伝子の機能に重大な結果を引き起こし、時として、表現型を著しく変える。薬物の大部分はヒトタンパク質の野生型または最も一般的な形態を用いて開発され、タンパク質の変異型を用いて開発されていない。このような薬物が患者(恐らく遺伝子が改変されている)に投与されると、標的タンパク質の形が異なるので、個体において予想通り作用しない可能性がある。
【００８７】
これらのヒト多型は、それぞれの薬物候補の薬物動態プロファイルと関連しているのにちがいない。このプロファイルは、ヒト遺伝子の変異型を有するヒト化マウスを用いて作成することができる。この種のヒト化マウスは、ヒトに由来する遺伝子以外は、改変されていないマウスと同じ遺伝的背景を共有する。薬物プロファイル研究では、薬物応答および代謝を妨害し、それらに影響を及ぼすことが多い環境条件および非遺伝的条件が、全てのヒト化マウスおよび非ヒト化マウスについて同一の条件に管理および設定される。動物間の唯一の違いは遺伝子型であり、従って、薬物評価および代謝の結果を直接比較および評価することができ、これにより高度に正確で信頼性の高いプロファイルが作成される。
【００８８】
多くの非感染性ヒト疾患には、臨床評価のための実証された動物モデルがない。これらの疾患は、しばしば、対立遺伝子変異の遺伝子多型と関連している。ある特定の疾患に関連する対立遺伝子を組み込むことによって作成されるヒト化マウスは、疾患進行のモニタリングおよびその後の薬物効力の評価にとって貴重なモデルであり得る。
【００８９】
感染症の領域において、ヒトウイルスの大部分は、マウスおよびラットなどの非霊長類実験動物に感染しない。このように感染しない理由の1つは感染の細胞内ブロックであるかもしれない。例えば、VSVg偽型EIAウイルス(ウマレンチウイルス)はヒト細胞に容易に入るが、ある特定の種特異的細胞因子が無いために増殖性複製サイクルを経ることができない。感染しないもう1つの理由は、ヒト受容体だけがヒトウイルスと相互作用することができ、逆もまた同じであるからかもしれない。しかしながら、対応するマウス受容体または因子をヒトオルソログで置き換えることによってマウスがヒト化されると、ヒト化マウスは感染時に、同じヒトウイルス疾患進行を示すと予想される。このアプローチを用いると、ヒトウイルス感染症のマウスモデルならびにヒト用の抗ウイルス薬およびワクチンの応答を生きたヒト化マウスにおいて評価するためのマウスモデルの作成が可能になる。
【００９０】
BAC工学を用いて、マウス標的遺伝子全体を対応するヒト遺伝子で置き換えることによって、ヒト化マウスが作成される。この置き換えのために、操作された領域のヒト遺伝子だけが、生きたヒト化マウスにおいて機能的に発現される。薬物評価および毒性スクリーニングに関連する様々なヒト遺伝子を発現する、一連のヒト化マウスが作成される。ヒト化マウスを用いると、開発中の薬物がヒトにおいてどれくらい良好に、かつどれくらい安全に作用するかを、さらに直接的に評価することが可能になる。次いで、このような評価は、開発初期段階での潜在的な薬物候補の迅速な決断につながる。
【００９１】
ヒト化マウスの有用性はまた、ヒト疾患進行のモニタリングおよびその後の治療薬の開発のための新たな動物モデルの確立に広げることもできる。さらに、遺伝子多型を有する人間の薬物応答を評価するために、ヒト遺伝子の様々な対立遺伝子をヒト化マウスに導入することができる。
【００９２】
本発明は、生理学的レベルで、かつ正常な調節の下での、(スプライスバリアントを含む)遺伝子の天然の組織特異的発現を可能にする。これは、他のどのトランスジェニック(cDNA)技術でも達成することができない。この能力は、BACが、相同組換えによってほぼ無制限のサイズのヒト配列を対応するマウスゲノムに正確に組み込むことができるためである。これらの導入されるヒト配列は、ヒト遺伝子の5'調節領域および3'調節領域の全てではないとしても多くを含んでもよく、または内因性マウス調節領域によって調節制御できるようにコード領域(イントロンを含む)に限定されてもよい。
【００９３】
下記の実施例は、CYP450系およびP-糖タンパク質を誘導する薬物にヒトと同じように応答するマウスを作成するための基本原理を提供する。詳細に述べると、実施例1では、BACを用いて、ヒトPXRをマウスにおいて適切な組織位置で、かつ正常な生理学的制御の下で発現させる。実施例2では、ヒトのCYP450系を誘導することが知られているが、野生型マウスでは不活性の薬物に適切に応答するかどうか、形質転換マウスが試験される。BAC系の力のために、さらなるヒト遺伝子を、既にヒト化されヒトPXR遺伝子を発現するマウスに挿入することができる。
【００９４】
本発明において開発されたヒト化マウスPXR系は、生物テロの脅威に対抗する新たな治療薬の開発に重要である。なぜなら、ヒトCYP450系の最も効果的な刺激薬が抗菌剤リファンピシンおよびクロトリマゾールであり、これらはマウスCYP450系に影響を及ぼさないことが知られているからである。生物戦病原体を治療するために開発されている新たな抗生物質がヒトにおいて薬物間相互作用を引き起こすかどうかを予測するために、ヒト化マウスを使用することができる。最も重要なことには、新たな抗生物戦薬物の開発を容易にする遺伝子モデルが作成されたら、これらの遺伝子モデルをヒト化マウスに組み込んで、有効かつ安全な生物戦防衛(Biodefense)治療薬を開発するための完全に統合された系を得ることができる。
【００９５】
ヒト化PXRマウスを作成するためには、2つのBAC(ヒトおよびマウス)が、ヒト化マウスPXR BACの構築を完了するのに必要とされる。ヒトBAC CTD-2319P20は、ヒト染色体3q13.33の119,074,966から始まり119,201,951で終わる領域に及んでいる。ヒトPXRゲノムコード部分は2319P20 BACの54,947〜89,905のセグメント(長さ=126,986bp)(図9)を含む。マウスBAC(RPC23-257N19)は159,948bp長であり、マウス16番染色体の38,010,752〜38,170,699の領域に位置する。マウスPXRゲノムコードセグメントは257N19 BACの66,913〜111,570(図5)である。
【００９６】
図9〜図11に概説するように、一組の頭部キメラおよび尾部キメラの構築ならびにその後の融合産物の構築が完了している。頭部キメラは、マウスPXRの最初のコドンGTGから上流の1,169bp領域、およびヒトPXRの最初のコドンGTGから下流の1,929bp領域に由来する。このキメラは二段階PCR手順によって作成された(全てのPCR実験において、PCRサイクル間の変異率を大幅に低下させるために、ヘルクラーゼ(Herculase)ポリメラーゼが用いられる)。1回目のPCRによって、対応する領域から1,169bpおよび1,929bpの産物が作成され、2回目のPCTによって、2つの初期産物間の40bpの重複セグメントを介してキメラ産物が作成された。結果として得られた産物を5'頭部キメラと呼ぶ。同様に、1,194bpヒトセグメントと1,223bpマウスセグメントの融合によって、3'尾部キメラが構築された(図9)。図9に示すように、最後のターミネーターコドンTGAは2つのセグメントの接合部にある。
【００９７】
図10に示すように、5'頭部キメラおよび3'尾部キメラは、5'ヒトセグメントと3'ヒトセグメントとの間の短い重複セグメントを用いて同様の融合PCRによって合体された。結果として得られた5.5kb断片をpBACベクターにクローニングし、次いで、tetA遺伝子をClaI部位に挿入した(図11)。最終産物は、キメラの頭部および尾部ならびに正の選択マーカーtetAからなる14.2kbである。
【００９８】
薬物間相互作用を測定する動物モデルとして機能するようにヒト薬物代謝系を再現する、さらなる研究によって、ヒト化マウスの限界が広がるだろう。本発明の方法は、ヒトPXRおよびCAR(CYP2B遺伝子の発現の主要な調節因子であり、CYP450酵素のフェノバルビタール誘導を媒介し、PXRと同様にアミノ酸配列および薬物感受性に種間で大きなばらつきがある)を同時発現するマウスを作成するのに使用されるだろう。BAC系には力があるので、ヒトRXR(CYP450遺伝子の調節においてPXRとの補助因子として働く)を同時発現させることによって、さらには、完全に一体化したヒトP450系を作成するために、(マウスCYP450遺伝子をノックアウトしながら)ヒトCYP450遺伝子それ自体とその特有の調節領域を挿入することによって、さらに大きなヒト遺伝子ネットワークをマウスにおいて作成することができるだろう。
【００９９】
次いで、これらのヒト化マウスにおいてCYP450およびMDR1の発現を誘導する能力を評価して、抗菌剤の薬物間相互作用の可能性を確かめるために、ほとんどの利用可能な抗菌剤のスクリーニングが始まるだろう。これは少なくとも2つの目的を果たしている。第一に、ほとんどの抗生物質および抗ウイルス薬はヒトでのP450誘導および薬物間相互作用について試験されており、従って、ヒトでの結果と本発明の方法によって作成されたヒト化マウスでの結果を比較すると、動物モデルが抗菌剤の影響をどれくらい厳密に予測できるかが確かめられるので、これは、薬物間相互作用を評価するためのマウス系の有用性をさらに実証するだろう。第二に、このような研究は、ヒトでの潜在的な副作用を確かめるために、感染症および生物戦病原体を治療するために開発されている新たな抗生物質および抗ウイルス薬を初期段階でスクリーニングするためのヒト化マウスの使用を確立する基礎となるだろう。これは、ヒトにおいてP450またはMDR1の誘導および他の合併症を引き起こす可能性が最も低い治療薬の開発を優先するのに役立つだろう。
【０１００】
以下の実施例は例示を目的とし、本発明を限定することを目的としない。
【０１０１】
実施例1
BACを使用したヒトPXR発現マウスの開発
BAC技術を用いて、マウスPXRコード領域全体が、相同組換えによって、対応するヒトPXRコード領域(イントロンを含む)で置き換えられる。ヒトPXR遺伝子の発現は、ノザン分析およびPCRによって形質転換マウスにおいて検出されるだろう。ヒトPXRが肝臓および胃腸管ならびにヒトではこの受容体を通常発現しない他の組織において発現しているかどうかを確かめるために、特別の配慮がなされるだろう。これにより、このアプローチは、ヒトPXRをマウスにおいて発現するために用いられる他のどのトランスジェニック手順とも区別されるだろう。
【０１０２】
最初に、BACベクター内の大きな哺乳動物DNAインサートを安定に増殖することができるある特定の特徴を有し、必要な場合、適切な相同組換えを選択的に行うことができる大腸菌宿主が必要とされる。これらの研究に用いられる株HS996は大きなBACインサートを収容するように構築されおり、そのrecA+誘導体HS985は、さらなる改良のための出発株(founder strain)として選択されている。この株は、条件付き相同組換えを行うように改良されている。細胞は30℃で増殖された場合にのみ、良好に組換えを行うことができる。
【０１０３】
本研究のためのHS985の関連する遺伝子型は、RecB21、recC22、sbcB15、sbcC201、mcrA-、del(mrr-mcrBC)、およびendA1である。RecB、RecC、およびendA1に変異があると、大腸菌は、入ってくる線状DNAが分解するのを防ぐことができる。sbcBおよびsbcCに変異があると、ヘアピン構造を有するDNAの分解が阻害される。mcrA-およびdel(mrr-mcrBC)に変異があると宿主制限修飾系が取り除かれ、従って、哺乳動物DNAは分解されない。
【０１０４】
recAts200は、一般的組換え用の温度感受性変異体である。recAts200の変異は、P1形質導入によってHS985に導入された。recAts200を有する株において増殖させたファージP1を調製し、温度感受性組換えの表現型を有する組換えクローンを得るためにHS985に感染させた。HS985の遺伝子型を確かめるために、結果として得られた株HS2001がさらに試験された。
【０１０５】
HS2001は、高温(40℃)では組換えに欠陥があるが、低温(30℃)では組換えを正常に行うことができる。BAC DNAトランスフェクション研究には、30℃で調製されたエレクトロコンピテントHS2001を使用し、組換えが終わるまで、トランスフェクトされた細胞を30℃で増殖させ、次いで、望ましくない組換え事象を妨げるために温度を40℃まで上げる。望ましくない組換え事象として、哺乳動物DNAにおいてよく見られる反復DNA配列による欠失および再配列の形成を挙げることができる。BAC DNAの欠失および再配列はrecA変異体において極めて稀であることが分かっており(Shizuya H.ら(1992)Cloning and stable maintenance of 300 kb-pair fragments of human DNA in E.coli using F-factory based vector.PNAS 89:8794-8797.)、従って、40℃で、HS2001株での望ましくない組換えは実質的に無いと予想される。
【０１０６】
図9〜図11に概説したように、BAC-ヒトPXR構築物DNAは既に作成されている。次の段階は、ES細胞へのBAC-PXR構築物DNAのトランスフェクションであろう。この場合、約1000万個のC57BL/6 ES細胞がBAC-PXR構築物DNAでトランスフェクトされる。次いで、トランスフェクトされたES細胞は、G418の存在下で2週間まで、胚性線維芽細胞フィーダー層上で培養される。500個までのG418耐性C57BL/6 ESクローンが単離され、個々のゲノムDNA単離および凍結細胞ストックの作成のために増殖される。標的クローンを選択するために一次サザンブロット分析が行われ、大規模DNA調製およびさらなる凍結ストックのために4個までの選択された一次クローンが増殖される。標的遺伝子座での相同組換え事象を確認するために、複数の酵素および複数のプローブ(5'、3'、およびneoプローブ)用いて、二次サザンブロット分析が一次標的クローンに対して行われる。マイクロインジェクション用の増殖に最も適した1つまたはそれ以上のクローンを同定するために、3個までの二次クローンの核型分析が用いられる。
【０１０７】
ES細胞が作成されたら、キメラマウスが作成される、キメラマウスのスクリーニングを容易にするために、作成されたC57BL/6「ブラック」マウスES細胞はFVB「ホワイト」マウスに注入される。「ブラック」ES細胞を組み込んだ移植胚盤胞から生まれた子は体色がキメラであり、容易に特定される。それぞれのクローンについて、合計100個の「キメラ」胚盤胞が注入される。注入された胚盤胞は、キメラ作成のために偽妊娠FVB雌に移される。
【０１０８】
PXR組換えの生殖細胞系列遺伝および「ブラック」マウス背景への組換え遺伝子型の導入の可能性を最大限にするために、5匹までのハイパーセンテージ(high percentage)体色キメラがC57BL/6マウスと交雑される。ヘテロ接合体(F1)を特定するために、PCRおよびサザン遺伝子型分析が子孫に対して行われる。ヒトPXR(huPXR)ホモ接合性C57BL/6マウスを得るために、これらのマウスは交雑される。ホモ接合性マウスはPCRおよびサザンブロット分析によって特定され、コロニーになるまで増やされる。交雑されたhuPXRホモ接合性C57BL/6マウスの胚を凍結することによって、この系統を確保する。この時点で、ヒト化PXRマウスが作成されているだろう。
【０１０９】
ヌルマウスにおけるマウスPXRの発現を試験するために、RNA抽出物が肝臓および小腸から抽出され、マウスPXR mRNAを検出するために、Xieら(2000)に記載のように、マウスPXR cDNAプローブを使用したノザンブロッティングが用いられる。ヒトPXRを発現するマウスでは、RNAが肝臓および小腸から単離され、ヒトPXR mRNAを検出するために、Lehmannら((1998)The Human Orphan nuclear receptor PXR is activated by compounds that regulate CYP3A4 gene expression and cause drug interactions.JCI102:1016-1023.)に記載のように、(マウスPXRとはかなり異なる)ヒトPXRのリガンド結合ドメインをコードする1.0kb断片に対する32P標識プローブが用いられる。ノザン分析からの結果を確認するために、PCRが用いられる。
【０１１０】
実施例2
ヒトにおいてCYP450発現を誘導する薬物に対するヒトPXR発現マウスの応答を試験する
実施例1において開発された動物は、ヒトにおいてCYP450発現を誘導する薬物に応答する能力について試験されるだろう。試験しようとする薬物は抗菌剤リファンピシンおよびクロトリマゾールである。肝臓およびヒトにおいてPXRを正常に発現する他の組織において、CYP3A、CYP2B6、およびCYP2C9を含む主要なCYP450酵素の発現を増大させる能力が、ノザン分析、RNAse保護アッセイ、およびELISAによって測定される。対照として、マウスPXRを刺激してCYP450を誘導するが、ヒトPXRと相互作用しない分子であるプレグネノロン16α-カルボニトリルの影響も試験される。さらに、これらの薬物が、ヒトPXRの調節下で薬物排出に関与する主要な薬剤排出トランスポーター(drug efflux transporter)であるP-糖タンパク質(MDR1)の発現を増大させるかどうか試験される。マウスが、ヒトPXRを通常、刺激する薬物に反応すれば、ヒトでの薬物間相互作用を予測することが可能な、完全に機能するヒト薬物代謝系を含むヒト化マウスを作成する第一段階が達成されたことになるだろう。
【０１１１】
これらの研究のために、実施例1において作成されたマウスは薬理学的分析について研究されるだろう。Xieら(2000)に記載のように、肝臓および腸においてCYP450遺伝子の発現を誘導するリファンピシンの時間経過および用量依存性を確かめるために、マウスにリファンピシン(胃管栄養法により5mg/kg)が様々な期間(12時間、1日、2日、および3日)で、および3日間、異なる濃度(胃管栄養法により1、3、5、および10mg/kg)で投与される。他のヒト化PXRマウスは、一日の間に単回量のクロトリマゾール(50mg/kg)、デキサメサゾン(50mg/kg)、またはプレグネノロン-16α-カルボニトリル(PCN)(40mg/kg)でip(腹腔内に)処置される。クロトリマゾールはリファンピシンと同様にヒトPXRを選択的に刺激するが、デキサメサゾンおよびPCNは、主に、マウスPXRを刺激し、ヒト化PXR動物に対するこれらの研究の対照として働く。肝臓および腸のCYP3A mRNAならびに肝臓のCYP2B6、CYP2C9、CYP7A、およびCYP1A2 mRNAに及ぼすこれらの薬物処置の影響は、対照としてβ-アクチンcDNAプローブ(クロンテックラボラトリーズ(CLONTECH Laboratories Inc.),Palo Alto,CA)を用いたノザンブロットおよびRNAse保護アッセイによって検出される。
【０１１２】
これらの研究のために、薬物処置の後、マウスはイソフルラン(isofluorane)で麻酔をかけられ、屠殺時に放血される。放血の直後に、門脈を介して肝臓の中に、氷冷1.15％塩化カリウム約50mLを灌流させる。肝臓および小腸は解剖され、脂肪組織および他の隣接する組織が同様に取り除かれる。肝臓および腸は氷冷1.15％塩化カリウムで洗浄され、水気を取られ、秤量される。秤量の直後に、肝臓および腸はアルミ箔の中に入れられ、適切なラベルを付けられ、凍結のために液体窒素環境に移される。液体窒素環境において凍結させた後、試料は、気密性のあるプラスチック容器の中に入れられ、約-70℃で保存するまでドライアイス上に置かれる。凍結された肝臓および腸はアリバ(Aliva)に送られ、解凍され、4℃でホモジナイズされ、総RNAがトリゾル試薬(TRIZOL Reagent)(ギブコ,BRL)を用いて調製され、Xieら(2000)に記載のように、ノザン分析が行われる。異なるCYP450 mRNAのプローブは、PCRを行い、その後に野生型マウス肝臓mRNAから逆転写を行うことによってクローニングされる。CYP450タンパク質濃度は市販のELISAキットを用いて測定される。これらの研究において、研究されている組織のタンパク質濃度はバイオラド(Biorad)ブラッドフォードアッセイを用いて求められる。ヒト化PXRマウスの肝臓および腸において、MDR1発現に及ぼす薬物処置の影響は、Synoldら(2001)に記載のcDNAプローブを用いたノザンブロッティングによって測定される。P-糖タンパク質濃度は、オンコジーンリサーチプロダクツ(Oncogene Research Products)(Boston,Mass)の抗血清を用いたウェスタンブロッティングによって測定される。
【０１１３】
試験材料が肝臓または腸のCYP450またはMDR1を誘導したかどうかについての関連情報をもたらす重要なデータの統計解析は、体重、肝臓調製物または腸調製物のタンパク質濃度、組織タンパク質1mg当たりの存在するCYPの量(CYP450濃度の測定にELISAが用いられた場合)を含む。統計解析は、パラメトリック統計法(例えば、一元配置分散分析、ダンネット(Dunnett)のt検定、スチューデントのt検定)またはノンパラメトリック統計法(例えば、クラスカル-ウォリス(Kruskal-Wallis)統計学、ダン(Dunn)の検定、マン-ホィットニー(Mann-Whitney)のU検定)を用いて処置群間で行われる。パラメトリック検定またはノンパラメトリック検定の選択は、比較しようとする群が、分散基準の等質性(バートレットの検定またはF検定によって評価される)を満たしているかどうかに基づいている。p<0.05の時に、統計学的に有意であるとする。
【０１１４】
本発明は前記の実施例を参照して説明されたが、本発明の精神および範囲の中で修正および変更が含まれることが理解されるだろう。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１Ａ】マウスDNAとヒトDNAとの融合DNAを作成するための一般的な手順を図示したものである。2種類のPCR産物(pAおよびpB)が作成される。両方ともヒトDNAとマウスDNAとのハイブリッド産物である。
【図１Ｂ】プライマーp1およびp2を用いて行われたPCR-1を図示したものである。結果として生じたPCR産物はヒトDNAとマウスDNAとのハイブリッドである。
【図１Ｃ】産物1の3'末端と産物2の5'末端との間の重複する20塩基を示す。プライマーp1およびp4ならびに2種類の産物を用いて、PCR-5では、重複領域で融合したDNAである約4kbの産物5が作成される。同様に、約4kbの産物6が、産物3と産物4との融合DNAとして作成される。
【図２】連結による産物5および産物6ならびに正/負のマーカーの組立てである。結果として得られた産物7は、続いてヒト化マウスBACを作成するためにBACベクターにクローニングされる。
【図３】大腸菌株において行われる、BAC-2と線状化された産物7との一般的組換えである。
【図４】一般的組換えによる、線状化された産物9とマウスゲノム内のオルソロガスマウス遺伝子との組換えを示す。
【図５Ａ】マウスDNAとヒトDNAとの融合DNAを作成するための一般的な手順を図示したものである。ここで、遺伝子の5'および3'の両方に調節配列を含めるように、望ましい領域が遺伝子のコード領域に隣接している。2種類のPCR産物(pAおよびpB)が作成される。両方ともヒトDNAとマウスDNAとのハイブリッド産物である。
【図５Ｂ】プライマーp1およびp2を用いて行われるPCR-1を図示したものである。結果として生じたPCR産物はヒトDNAとマウスDNAとのハイブリッドである。
【図５Ｃ】図5Bからの産物1の3'末端と産物2の5'末端との間の重複する20塩基を示す。プライマーp1およびp4ならびに2種類の産物を用いて、PCR-5では、重複領域で融合したDNAである約4kbの産物5が作成される。同様に、約4kbの産物6が、産物3と産物4との融合DNAとして作成される。
【図６】連結による図5Cの産物5および産物6ならびに正/負のマーカーの組立てである。結果として得られた産物7は、続いてヒト化マウスBACを作成するためにBACベクターにクローニングされる。
【図７】大腸菌株において行われる、BAC-2と図6の線状化された産物7との一般的組換えである。
【図８】一般的組換えによる、線状化された産物9とマウスゲノム内のオルソロガスマウス遺伝子との組換えを示す。
【図９】ヒト化PXRマウスの構築における5'頭部キメラおよび3'尾部キメラの作成を示す。
【図１０】図9の5'頭部キメラおよび3'尾部キメラの合体ならびにpBACベクターへのクローニングを示す。
【図１１】図10のpBACベクターのClaI部位へのtetA遺伝子の挿入を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
2005537805.tif 000017