(57)【要約】結腸の増殖性疾患の診断に有用なタンパク質が核マトリックスタンパク質調製物中に存在し、それらは分子量、等電点、およびアミノ酸配列によって特徴付けることができる。該タンパク質は、例えば2次元ゲル電気泳動、または抗体などの特異的結合パートナーによって同定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかまたは量が低下している精製タンパク質であって、該タンパク質が次のもの：
a)  分子量が約56kDでpIが約6.22のCC2；
b)  分子量が約43kDでpIが約6.3のCC3；
c)  分子量が約43kDでpIが約6.2のCC4；
d)  分子量が約42kDでpIが約6.2のCC5；
e)  分子量が約20kDでpIが約6.9のCC6a；
f)  分子量が約20kDでpIが約6.8のCC6b；
g)  分子量が約50kDでpIが約6.01のL1；
h)  分子量が約20kDでpIが約5.73のL2；および
i)  分子量が約19kDでpIが約5.88のL5；
からなる群から選択されたものである、精製タンパク質。
【請求項２】
該タンパク質がCC2である請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項３】
該タンパク質がCC3である請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項４】
該タンパク質がCC4である請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項５】
該タンパク質がCC5である請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項６】
該タンパク質がCC6aである請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項７】
該タンパク質がCC6bである請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項８】
該タンパク質がL1である請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項９】
該タンパク質がL2である請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項１０】
該タンパク質がL5である請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項１１】
該タンパク質が結腸癌の肝臓転移では正常肝臓組織よりもより多く検出される、請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項１２】
該タンパク質がL1、L2、またはL3である、請求項１１に記載の精製タンパク質。
【請求項１３】
CC2が配列番号14、15、16、17、または23に示すアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の精製タンパク質。
【請求項１４】
CC3が配列番号24〜26に示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の精製タンパク質。
【請求項１５】
CC4が配列番号27〜29に示すアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の精製タンパク質。
【請求項１６】
CC6aが配列番号18〜20に示すアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の精製タンパク質。
【請求項１７】
CC6bが配列番号21に示すアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の精製タンパク質。
【請求項１８】
L2が配列番号30〜32に示すアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の精製タンパク質。
【請求項１９】
L5が配列番号33〜36に示すアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の精製タンパク質。
【請求項２０】
該タンパク質が核マトリックス調製物中に存在する、請求項１に記載の精製タンパク質。
【請求項２１】
請求項１に記載の精製タンパク質に対して特異的な結合パートナー。
【請求項２２】
該結合パートナーがモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の精製タンパク質。
【請求項２３】
該結合パートナーがポリクローナル抗体である、請求項２１に記載の精製タンパク質。
【請求項２４】
正常な結腸上皮細胞中には存在するが癌性の結腸細胞中では全く存在しないかまたは量が低下している精製タンパク質であって、該タンパク質が次のもの：
a)  分子量が約40kDでpIが約5.5のN1；
b)  分子量が約30kDでpIが約5.94のN2；
c)  分子量が約30kDでpIが約5.88のN3；
d)  分子量が約30kDでpIが約5.80のN4；
e)  分子量が約30kDでpIが約5.73のN5；および
f)  分子量が約18kDでpIが約6.6のN6；
からなる群から選択されたものである、精製タンパク質。
【請求項２５】
該タンパク質がN1である、請求項２４に記載の精製タンパク質。  
【請求項２６】
該タンパク質がN2である、請求項２４に記載の精製タンパク質。  
【請求項２７】
該タンパク質がN3である、請求項２４に記載の精製タンパク質。  
【請求項２８】
該タンパク質がN4である、請求項２４に記載の精製タンパク質。  
【請求項２９】
該タンパク質がN5である、請求項２４に記載の精製タンパク質。  
【請求項３０】
該タンパク質がN5である、請求項２４に記載の精製タンパク質。  
【請求項３１】
該タンパク質が核マトリックス調製物中に存在する、請求項２４に記載の精製タンパク質。
【請求項３２】
請求項２４に記載の精製タンパク質に対して特異的な結合パートナー。
【請求項３３】
該結合パートナーがモノクローナル抗体である、請求項３２に記載の精製タンパク質。
【請求項３４】
該結合パートナーがポリクローナル抗体である、請求項３２に記載の精製タンパク質。
【請求項３５】
原発性結腸癌細胞およびそれから肝臓へ転移したものに存在し、癌の診断用マーカーとして有用な精製タンパク質であって、該タンパク質が次のもの：
a)  分子量が約18kDでpIが約6.09のL3；
b)  分子量が約18kDでpIが約6.00のL4；
からなる群から選択されたものである、精製タンパク質。
【請求項３６】
該タンパク質がL3である、請求項35に記載の精製タンパク質。
【請求項３７】
該タンパク質がL4である、請求項３５に記載の精製タンパク質。
【請求項３８】
該タンパク質が核マトリックス調製物中に存在する、請求項３５に記載の精製タンパク質。
【請求項３９】
請求項３５に記載の精製タンパク質に対して特異的な結合パートナー。
【請求項４０】
該結合パートナーがモノクローナル抗体である、請求項３９に記載の精製タンパク質。
【請求項４１】
該結合パートナーがポリクローナル抗体である、請求項３９に記載の精製タンパク質。
【請求項４２】
癌性の結腸上皮細胞と正常な結腸上皮細胞とを識別するポリクローナル抗体の作製方法であって、動物を請求項１に記載のタンパク質で免疫し、該抗体を回収することを含んでなる、方法。
【請求項４３】
癌性の結腸上皮細胞と正常な結腸上皮細胞とを識別するポリクローナル抗体の作製方法であって、動物を請求項２４に記載のタンパク質で免疫し、該抗体を回収することを含んでなる、方法。
【請求項４４】
結腸癌の肝臓へ転移したものと正常な肝臓上皮細胞とを識別するポリクローナル抗体の作製方法であって、動物を請求項３５に記載のタンパク質で免疫し、該抗体を回収することを含んでなる、方法。
【請求項４５】
癌性の結腸上皮細胞と正常な結腸上皮細胞とを識別するモノクローナル抗体を作製する方法であって、動物を請求項１に記載のタンパク質で免疫し、その免疫した動物からB細胞を取り出し、i)該タンパク質に対して特異的な抗体を産生する該B細胞を不死化および単離し、またはii)Ｂ細胞から抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を得て、宿主細胞が該核酸によってコードされる抗体を産生するように、該核酸を含んでいる1個以上の発現ベクターで該宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、または形質導入し、該タンパク質に対して特異的な抗体を産生する宿主細胞を選択することを含んでなる、方法。
【請求項４６】
癌性の結腸上皮細胞と正常な結腸上皮細胞とを識別するモノクローナル抗体を作製する方法であって、動物を請求項２４に記載のタンパク質で免疫し、その免疫した動物からB細胞を取り出し、i)該タンパク質に対して特異的な抗体を産生する該B細胞を不死化および単離し、またはii)Ｂ細胞から抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を得て、宿主細胞が該核酸によってコードされる抗体を産生するように、該核酸を含んでいる1個以上の発現ベクターで該宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、または形質導入し、該タンパク質に対して特異的な抗体を産生する宿主細胞を選択することを含んでなる、方法。
【請求項４７】
結腸癌の肝臓へ転移したものと正常な肝臓上皮細胞とを識別するモノクローナル抗体を作製する方法であって、動物を請求項３５に記載のタンパク質で免疫し、その免疫した動物からB細胞を取り出し、i)該タンパク質に対して特異的な抗体を産生する該B細胞を不死化および単離し、またはii)Ｂ細胞から抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を得て、宿主細胞が該核酸によってコードされる抗体を産生するように、該核酸を含んでいる1個以上の発現ベクターで該宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、または形質導入し、該タンパク質に対して特異的な抗体を産生する宿主細胞を選択することを含んでなる、方法。
【請求項４８】
患者の結腸の増殖性疾患を診断する方法であって、患者から得た組織、糞便、または体液中に、癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないか量が低下している、または正常な結腸上皮細胞中には存在するが癌性の結腸細胞中では全く存在しないか量が低下している、少なくとも1種のタンパク質の存在を分析することを含んでなる方法で、該タンパク質が次のもの：
a)  分子量が約56kDでpIが約6.22のCC2；
b)  分子量が約43kDでpIが約6.3のCC3；
c)  分子量が約43kDでpIが約6.2のCC4；
d)  分子量が約42kDでpIが約6.2のCC5；
e)  分子量が約20kDでpIが約6.9のCC6a；
f)  分子量が約20kDでpIが約6.8のCC6b；
g)  分子量が約50kDでpIが約6.01のL1；
h)  分子量が約20kDでpIが約5.73のL2；
i)  分子量が約19kDでpIが約5.88のL5；
j)  分子量が約40kDでpIが約5.5のN1；
k)  分子量が約30kDでpIが約5.94のN2；
l)  分子量が約30kDでpIが約5.88のN3；
m)  分子量が約30kDでpIが約5.80のN4；
n)  分子量が約30kDでpIが約5.73のN5；および
o)  分子量が約18kDでpIが約6.6のN6；
からなる群から選択されたものである、方法。
【請求項４９】
少なくとも1個の該タンパク質の存在が2次元ゲル電気泳動で検出される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも1個の該タンパク質の存在が該タンパク質に特異的な結合パートナーを用いて検出される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
該結合パートナーがモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも1個の該タンパク質の存在が該タンパク質をコードするmRNAを核酸とハイブリダイズさせて検出することによって調べる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
該精製タンパク質が核マトリックス調製物中に存在している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
患者の結腸癌を診断する方法であって、患者から得た組織、糞便、または体液中のカルレティキュリンの存在を分析することを含んでなる、方法。
【請求項５５】
該検出が2次元ゲル電気泳動で行われる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
カルレティキュリンが特異的な結合パートナーによって検出される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
該特異的結合パートナーがモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
カルレティキュリンがカルレティキュリンの核酸とハイブリダイズさせることによって検出される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
組織が分析される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
該組織が核マトリックス調製物である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該増殖性疾患が結腸直腸癌である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
該増殖性疾患が結腸腺腫である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
該タンパク質がCC3、CC4、またはCC5である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
結腸腺腫が悪性のものとなる可能性を評価する方法であって、癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、または正常な結腸上皮細胞中には存在するが癌性の結腸細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、少なくとも1種のタンパク質の存在について該腺腫を分析することを含んでなる方法で、該タンパク質が次のもの：
a)  分子量が約56kDでpIが約6.22のCC2；
b)  分子量が約43kDでpIが約6.3のCC3；
c)  分子量が約43kDでpIが約6.2のCC4；
d)  分子量が約42kDでpIが約6.2のCC5；
e)  分子量が約20kDでpIが約6.9のCC6a；
f)  分子量が約20kDでpIが約6.8のCC6b；
g)  分子量が約50kDでpIが約6.01のL1；
h)  分子量が約20kDでpIが約5.73のL2；
i)  分子量が約19kDでpIが約5.88のL5；
j)  分子量が約40kDでpIが約5.5のN1；
k)  分子量が約30kDでpIが約5.94のN2；
l)  分子量が約30kDでpIが約5.88のN3；
m)  分子量が約30kDでpIが約5.80のN4；
n)  分子量が約30kDでpIが約5.73のN5；および
o)  分子量が約18kDでpIが約6.6のN6；
からなる群から選択されたものであり、該タンパク質が検出されることが、悪性なものとなる可能性の増大を示すものである、方法。
【請求項６５】
少なくとも1個の該タンパク質の存在が2次元ゲル電気泳動で検出される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
少なくとも1個の該タンパク質の存在が該タンパク質に特異的な結合パートナーを用いて検出される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
該結合パートナーがモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
少なくとも1個の該タンパク質の存在が該タンパク質をコードするmRNAを核酸とハイブリダイズさせて検出することによって決定される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
該タンパク質がCC3、CC4、およびCC5である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
患者の結腸癌の肝臓への転移を診断する方法であって、肝臓のサンプル中の、少なくとも1種のタンパク質の存在を分析することを含んでなる方法で、該タンパク質が次のもの：
a)  分子量が約50kDでpIが約6.01のL1；
b)  分子量が約20kDでpIが約5.73のL2；
c)  分子量が約17kDでpIが約6.09のL3；
d)  分子量が約17kDでpIが約6.00のL4；および
e)  分子量が約19kDでpIが約5.88のL5；
からなる群から選択されたものである、方法。
【請求項７１】
少なくとも1種の該タンパク質の存在が高分解能2次元ゲル電気泳動によって検出される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも1個の該タンパク質の存在が該タンパク質に特異的な結合パートナーを用いて検出される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
該結合パートナーがモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
該タンパク質がカルレティキュリンの核酸とハイブリダイズさせることによって検出される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
請求項１に記載のタンパク質の存在を調べるための診断用アッセイキットであって、該タンパク質と特異的に結合することのできる少なくとも1種の結合パートナーを含んでなる、診断用アッセイキット。
【請求項７６】
該結合パートナーは固相支持体上に固定化されたものである、請求項７５に記載の診断用アッセイキット。
【請求項７７】
該結合パートナーが検出しうるように標識されたものである、請求項７５に記載の診断用アッセイキット。
【請求項７８】
該結合パートナーが抗体である、請求項７５に記載の診断用アッセイキット。
【請求項７９】
患者の結腸の増殖性疾患の生物学的マーカーとしてのタンパク質の使用であって、患者から得た組織、糞便、または体液中で該タンパク質を検出し、該タンパク質が癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下していることで特徴付けられるか、または該タンパク質が正常な結腸上皮細胞中には存在するが癌性の結腸細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下していることで特徴付けられ、該タンパク質が次のもの：
a)  分子量が約56kDでpIが約6.22のCC2；
b)  分子量が約43kDでpIが約6.3のCC3；
c)  分子量が約43kDでpIが約6.2のCC4；
d)  分子量が約42kDでpIが約6.2のCC5；
e)  分子量が約20kDでpIが約6.9のCC6a；
f)  分子量が約20kDでpIが約6.8のCC6b；
g)  分子量が約50kDでpIが約6.01のL1；
h)  分子量が約20kDでpIが約5.73のL2；
i)  分子量が約19kDでpIが約5.88のL5；
j)  分子量が約40kDでpIが約5.5のN1；
k)  分子量が約30kDでpIが約5.94のN2；
l)  分子量が約30kDでpIが約5.88のN3；
m)  分子量が約30kDでpIが約5.80のN4；
n)  分子量が約30kDでpIが約5.73のN5；および
o)  分子量が約18kDでpIが約6.6のN6；
からなる群から選択されたものである、使用。
【請求項７９】
結腸の該増殖性疾患が結腸の腺癌である、請求項７８に記載の使用。
【請求項８０】
結腸の該増殖性疾患が結腸腺腫である、請求項７８に記載の使用。
【請求項８１】
患者の結腸癌の肝臓への転移を診断する生物学的マーカーとしてのタンパク質の使用であって、該タンパク質を患者から得た肝臓のサンプル中で検出し、該タンパク質が次のもの：
a)  分子量が約50kDでpIが約6.01のL1；
b)  分子量が約20kDでpIが約5.73のL2；
c)  分子量が約17kDでpIが約6.09のL3；
d)  分子量が約17kDでpIが約6.00のL4；および
e)  分子量が約19kDでpIが約5.88のL5；
からなる群から選択されたものである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の研究に関する供述
本発明は米国国立衛生研究所(United States National Institutes of Health)からの政府援助を受けてなされたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有しうるものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は結腸癌および結腸癌の肝臓への転移を含む結腸の細胞増殖障害に伴うタンパク質に関する。本発明はまた、正常な結腸組織に関わるタンパク質に関する。
【０００３】
手術手技、補助療法、およびスクリーニング法の改良によって、結腸癌の死亡率は過去20年間、全体として減少した(1)。それでもやはり、結腸直腸癌は依然として米国では全ての癌のうちの11%を占める重要な疾患であり、2001年では、130,200例の新患者および48,100例の死亡があるものと推測されている(2)。初期の限局性のステージで診断を受けた場合は結腸癌の5年生存率は90%である。このステージで偶然に結腸癌であると診断される症例は37%にすぎず、残りの人々では、腫瘍が転移してしまってから医師の診断を仰ぐことがよくある。
【０００４】
このような公衆衛生上の問題を解決するには、結腸直腸癌に対するより効果的なスクリーニング法と予防策が必要である。結腸大腸癌の早期発見法には、糞便中の血液の試験または内視鏡の使用が含まれる。糞便中の血液試験での検出には、腫瘍が非常に大きくなっていることが必要であり(小さなポリープでは感度は90%で、微小なポリープでは75%である)、感度は約26%で、このことは悪性の病変のある患者の74%が検出されないことを意味する。便潜血の試験では初期の結腸癌のステージでは糞便中には血液はほとんど放出されないので、初期の結腸癌の多数のものを検出することができない。また、便潜血試験は一般的なスクリーニングとしてはさほど特異性が高くなく、多数の人々にこの試験後の腸の精密検査で不必要な不快感と危険性をもたらすこととなる。
【０００５】
前癌状態および癌の病変を内視鏡で観察することは、早期発見に効果的ではあるが、合併症の大きな危険性を伴う侵襲的な方法である(4,5)。例えば、この方法の実施例のうちで盲腸まで到達するのは80%〜95%であり(22)、結腸鏡観察が不完全な場合には、結腸鏡での観察を反復するかまたは補助的にバリウム浣腸のいずれかを行う必要がある。
【０００６】
結腸鏡観察の複雑性とコストはかなり大きく、癌のスクリーニングの道具としてこの方法をどの程度の頻度で用いるべきかは不明である。さらに、内視鏡の操作を行う作業者によってこの方法への適性がかなり異なる。従って、結腸鏡観察は現在のところ一般人での結腸癌のスクリーニングには有用でない。
【０００７】
癌の早期発見または早期の予後判定のための情報を高い信頼性で提供することのできる、結腸癌のより良い診断用マーカーを見出すための努力が、長年にわたってなされてきた。癌胎児性抗原(CEA)は腫瘍関連糖タンパク質であるが、結腸直腸癌、胃癌、および膵臓癌の95%、乳癌、肺癌、および頭頚部癌の多数でその発現レベルが上昇していることが見出された(6)。診断用の血中CEA試験は結腸直腸癌の管理で治療の結果をフォローするために用いられている。術後のフォローアップではCEAは再発、主として肝臓転移のマーカーとして有用であると考えられるが(感度77%；特異性98%)、モニタリング療法では結腸直腸癌の検出に十分なだけのCEAのレベルを放出する結腸直腸癌は半数にすぎないことが示されている(7,8)。
【０００８】
癌の再発の検出におけるCEAの有用性は議論のあるところであり、広く適用されるには至っていない(9,10)。非悪性疾患の患者でのCEAの高値が報告されており、また結腸癌の患者、特に結腸癌の初期の患者の多数で血清中のCEAのレベルは正常である(7,11)。現在得られているデータからは、血清CEA測定は、無症状の人々での結腸直腸癌の早期スクリーニング試験として必要とされる感度、特異性のいずれも有していない(12)。
【０００９】
大きな形態学的変形を含む核の形、大きさ、およびDNA組織化の変化は癌細胞のユニークな特徴であり、癌の診断に用いられてきた。核の構造は核の足場をなすものである各マトリックスで決定されている。この核マトリックスは末梢ラミン、タンパク質複合体、内部リボ核酸タンパク質ネットワーク、および、残りの核小体から構成されている(23)。核のフレームワークは約10%の核タンパク質からなり、および実質的には脂質、DNA、およびヒストンを欠いている(24)。これまでに同定された核マトリックスタンパク質の大部分は全ての細胞タイプに共通したものであったが、同定されたNMPのいくつかは組織および細胞系統特異的なものであり、NMPは分化とともに変化していくことが示されている(25,26)。
【００１０】
異常な核マトリックスタンパク質の細胞タイプ特異的な「フィンガープリント」および癌の発達において核マトリックスタンパク質が出現してくるので、これらの核マトリックスタンパク質を癌の診断のための、および/または予後判定のためのマーカーとして開発しうるか否かを調べる努力において種々の腫瘍での核マトリックスタンパク質組成の分析を行うこととなった。高分解能の2次元電気泳動によって特異的な核マトリックスタンパク質の変化が、前立腺、膀胱、腎臓、および結腸の原発性癌に存在することが示された(27-30)。種々のタイプの癌を有する患者の血清中に核マトリックスタンパク質が検出された(31)。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
本発明の1態様では、癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかまたは量が低下している、精製タンパク質が提供される。特定のタンパク質としては、CC2、CC3、CC4、CC5、CC6a、CC6b、L1、L2、およびL5が含まれる。これらのタンパク質の見かけの分子量、等電点、および部分アミノ酸配列は、本明細書の実施例の記載中で提供される。好ましい1実施形態においては、該タンパク質は核マトリックス調製物(「NMP」)中に検出される。
【００１２】
本発明の別の1態様では、正常な結腸上皮細胞中には存在するが、癌性の結腸細胞中で全く存在しないかまたは量が低下しているタンパク質が提供される。特定されたタンパク質には、N1〜N6が含まれ、それらの見かけの分子量、および等電点の値は提供されている(後記の実施例を参照のこと)。好ましい1実施形態においては、該Nタンパク質は核マトリックスタンパク質中に検出される。
【００１３】
本発明のまた別の1態様では、結腸癌の診断マーカーとして有用な、癌性の結腸細胞およびそれから由来した肝臓への転移癌中の精製タンパク質が提供される。特定のタンパク質としてはL1、L2、L3、L4、およびL5が含まれ、これらの見かけの分子量および等電点は下記に示す。好ましい1実施形態においては、タンパク質L1〜L5はNMP中で検出される。
【００１４】
本発明のさらに別の1態様では、本発明のタンパク質に対して特異的な結合パートナーが提供される。結合パートナーは例えば診断用または治療用に用いることができる。結合パートナーを作製する方法が提供される。結合パートナーは好ましくはモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。本発明のさらに別の1態様では、患者から得た組織、糞便、または体液中に、癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、または正常な結腸上皮細胞中には存在するが癌性の結腸細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、少なくとも1種のタンパク質の存在を分析することによって、その患者の体内の、結腸の細胞増殖性疾患、好ましくは結腸癌を診断するための方法が提供される。そのような診断用タンパク質としては、CC2、CC3、CC4、CC5、CC6a、CC6b、L1、L2、およびL5、ならびにN1〜N6が含まれる。これらのタンパク質は、2次元ゲル電気泳動、特異的結合パートナーによる検出などの生化学的方法を含む種々の方法によって、またはコードするmRNAのレベルを測定することによって、検出することができる。1実施形態においては、該増殖性疾患は結腸直腸の腺癌であり、また別の実施形態では、該増殖性疾患は結腸腺腫である。
【００１５】
本発明のさらにまた別の1態様では、患者体内の結腸癌を診断する方法が提供され、その方法は、その患者から得た組織、糞便、または体液にカルレティキュリン(calreticulin)がないか分析することを含んでなる。カルレティキュリンは2次元電気泳動、特異的結合パートナーによる検出、またはカルレティキュリンをコードするmRNAのレベルの測定などの生化学的方法を含む種々の方法のいずれかで検出することができる。好ましい1実施形態においては、カルレティキュリンはNMP調製物中に検出される。
【００１６】
本発明のまた別の1態様では、結腸腺腫が悪性のものとなる可能性があるかを評価する方法が提供される。その方法は、その腺腫について、癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、または正常な結腸上皮細胞中には存在するが癌性の結腸細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、少なくとも1種のタンパク質の存在を分析することを含む。そのようなタンパク質とは、CC2、CC3、CC4、CC5、CC6a、CC6b、L1、L2、およびL5、ならびにN1〜N6である。好ましい1実施形態においては、該タンパク質はCC3、CC4、およびCC5である。該タンパク質は2次元電気泳動、特異的結合パートナーとの結合の検出、または該タンパク質をコードするmRNAのレベルの測定などの生化学的方法を含む種々の方法のいずれかで検出することができる。
【００１７】
本発明のさらに別の1態様では、患者体内での結腸癌の肝臓への転移を診断する方法が提供される。その方法は、肝臓のサンプルについて少なくとも1種のタンパク質の存在を分析することを含んでなるものであり、そのタンパク質とはL1〜L5のうちのいずれかである。該タンパク質は2次元電気泳動、特異的結合パートナーとの結合の検出、または該タンパク質をコードするmRNAのレベルの測定などの生化学的方法を含む種々の方法のいずれかで検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
上述のとおり、本発明の重要な1態様は発明者らが、癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかまたは量が低下している精製タンパク質を提供することである。それらのタンパク質ならびにそれらの見かけの分子量(SDS-PAGEによる測定)および等電点は下記のとおりである：
a)  CC2は分子量が約56kDでpIは約6.22；
b)  CC3は分子量が約43kDでpIは約6.3；
c)  CC4は分子量が約43kDでpIは約6.2；
d)  CC5は分子量が約42kDでpIは約6.2；
e)  CC6aは分子量が約20kDでpIは約6.9；
f)  CC6bは分子量が約20kDでpIは約6.8；
g)  L1は分子量が約50kDでpIは約6.01；
h)  L2は分子量が約20kDでpIは約5.73；
および
i)  L5は分子量が約19kDでpIは約5.88。
【００１９】
また、これらのタンパク質は表5、6、および9に示すアミノ酸配列によって、ならびにNMP調製物中に存在することによって定義づけることもできる。例えば、CC2の場合には、分子量が約56kDで等電点が約6.22の1種以上のタンパク質を含むものであって、そのタンパク質のアミノ酸配列が配列番号14〜17および23のうちのいずれか1種以上のものを含む、と定義される。このようにCC2は、その分子量とpI、NMP調製物中の存在、および配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、もしくは配列番号23、またはこれらの配列の任意の組み合わせによって定義することができる。
【００２０】
また、正常な結腸上皮細胞中には存在するが癌性の結腸細胞中では全く存在しないかまたは量が低下している精製タンパク質も提供される。それらのタンパク質ならびにそれらの見かけの分子量(SDS-PAGEによる測定)および等電点は下記のとおりである：
a)  N1は分子量が約40kDでpIは約5.5；
b)  N2は分子量が約30kDでpIは約5.94；
c)  N3は分子量が約30kDでpIは約5.88；
d)  N4は分子量が約30kDでpIは約5.80；
e)  N5は分子量が約30kDでpIは約5.73；および
f)  N6は分子量が約18kDでpIは約6.6。
【００２１】
タンパク質N1〜N5はそれらの分子量とpI、およびNMP調製物中に存在することによって定義づけることができる。
【００２２】
さらに、結腸癌の肝臓転移についての診断用マーカーとして有用な種々の精製タンパク質が提供される。それらのタンパク質ならびにそれらの見かけの分子量(SDS-PAGEによる測定)および等電点は下記のとおりである：
a)  L1は分子量が約50kDでpIは約6.01；
b)  L2は分子量が約20kDでpIは約5.73；
c)  L3は分子量が約17kDでpIは約6.09；
d)  L4は分子量が約17kDでpIは約6.00；および
e)  L5は分子量が約19kDでpIは約5.88。
【００２３】
L1〜L5は結腸癌の肝臓転移の診断用マーカーとして有用であるが、それは、これらのタンパク質が正常な肝臓組織のサンプル中よりも結腸癌を含んでいる肝臓のサンプル中でより高く検出されるからである。これらのタンパク質は分子量およびpI、NMP調製物中に存在すること、ならびに表9に示すアミノ酸配列によって定義することができる。
【００２４】
本明細書で用いる「正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかまたは（もしくは）量が低下している」という用語は、該タンパク質が正常な結腸上皮細胞中では検出されないか、またはそのような細胞中で検出はされるが結腸直腸癌細胞中で認められるよりも低いレベルであることを意味する。正常結腸上皮細胞に対して結腸直腸癌でより高く検出される、とは、該タンパク質は癌のサンプルのうちの80%以上で検出されうるのに対して、それに対応する癌でないサンプルでは50%以下しか検出されないことである。同様にして、結腸癌の肝臓転移のマーカーに関しても、「全く存在しないかまたは（もしくは）量が低下している」という用語は、該タンパク質が結腸癌を含んでいる肝臓のサンプル中では、正常な肝臓組織のサンプル中よりも高く検出されることを意味する。「より高く検出される」とは、タンパク質L1〜L5が結腸癌の肝臓転移のサンプルの80%で検出されるのに対し、正常肝臓組織のドナーサンプルでは50%以下しか検出されないことである。
【００２５】
正常な肝臓組織に対して結腸癌の肝臓転移したものでL1〜L5が高く検出されることは、これらのタンパク質が結腸癌細胞中では、肝細胞を含む正常な肝臓細胞よりもその発現レベルが上昇していることによるものと思われる。「正常な肝臓組織」としては、「正常なドナー肝臓組織」が含まれ、それは転移性肝癌を有していないドナーから得た肝臓組織を意味し、「隣接正常肝臓組織」とは結腸癌が転移した肝臓から得た正常な肝臓組織を意味する。「隣接」という用語は、そのような正常組織と転移癌との間の近接性の程度を示すのではなく、この「正常な」肝臓組織を得た元の肝臓のタイプ(すなわち転移した肝臓)を同定するために用いられる。
【００２６】
結腸癌の転移を含む肝臓サンプルおよび正常肝臓組織を含むサンプル中でL1〜L5が検出された2次元ゲルのパーセンテージを表7(実施例5)に示す。L3およびL4タンパク質は正常な隣接肝臓組織中および正常ドナー肝臓組織中で検出されたが、検出されたタンパク質の量は転移癌組織中の量よりも低かった。
【００２７】
本発明のタンパク質が特定の組織で別の組織よりもより高く検出されるか否かを測定するためには、核マトリックス調製物の銀染色した高分解能2次元ゲル電気泳動での分析によるタンパク質の同定が好ましい方法である。その他のアプローチも可能であり、その様なアプローチとしては、該タンパク質に特異的な結合パートナー用いた、または該タンパク質をコードするRNAを検出することによって、組織もしくは組織抽出物中のそのタンパク質を検出することが含まれる。
【００２８】
この説明において、「核マトリックス」という用語は分裂間期核中に存在する3次元の繊維状タンパク質の網状構造を意味する。このタンパク質網状構造のNMPは核の全体としての大きさと形を維持するための枠組みを提供し、分裂間期の間のDNA螺旋の構造的付着部位として働く。
【００２９】
「NMP調製物」とは、核マトリックスタンパク質(「NMP」)を豊富に含んでいる生物学的供給源(例えば、細胞、組織、または体液)から調製したものである。「豊富に含んでいる」とは、少なくともいくつかのNMPが、天然の状態で(例えば、細胞、組織、または体液中に)存在するNMP中にあるよりも、より高頻度で存在することを意味する。NMP調製物は、界面活性剤および尿素での抽出などの当業界ではよく知られた方法で調製することができる(Getzenbergら, 参考文献29を参照のこと)。NMPを豊富に含んでいるNMP調製物は核マトリックスの一部分ではないタンパク質を含んでいてもよい。
【００３０】
本発明は、本発明のタンパク質に特異的な結合パートナーを提供する。その結合パートナーはサンプル中の該タンパク質の存在を検出するために有用である。該タンパク質とその結合パートナーは分子の結合ペアであり、それらは、例えばイオン結合、共有結合、疎水結合、ファン・デル・ワールス力および水素結合を含む種々の分子間力のいずれかを介して互いに相互作用し、それによって該ペアは互いに特異的に結合する性質を有する。特異的結合とは、その結合ペアが、別の分子とは結合しないような条件下で互いに結合することを意味している。特異的結合ペアのタイプの例としては、抗原-抗体、ビオチン-アビジン、ホルモン-受容体、受容体-リガンド、酵素-基質、IgG-プロテインA、および類似のものが挙げられる。本発明のタンパク質にとって好ましい結合パートナーは抗体であるが、その他の望ましい結合パートナーとしては、核酸(例えば、天然または合成のDNA、RNA、gDNA、cDNA、mRNA、tRNAなど)、レクチン、オリゴサッカライド、糖タンパク質、候補薬剤(例えば、ランダムペプチドライブラリー、天然物ライブラリー、レクチンライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、オリゴサッカライドライブラリー、またはファージディスプレイライブラリー)、代謝産物、ビタミン、脂質、ステロイド、金属、および類似のものが含まれる。
【００３１】
本明細書の文脈において、「抗体」とは1種以上のポリペプチドから成り立っている、実質的には免疫グロブリン遺伝子またはその遺伝子の断片でコードされているタンパク質である。免疫グロブリンの遺伝子として認められているものには、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、それらは免疫グロブリンのクラスであるIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEをそれぞれ定義することとなる。
【００３２】
典型的な免疫グロブリン(抗体)は、2本の全く同じ「軽」鎖のペア(各々が約25kD)と、2本の全く同じ「重」鎖のペア(各々が約50〜70kD)から構成される四量体である。各鎖のN末端は約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を定義づけるもので、主として抗原の認識を行っている。「軽鎖可変部」(variable light chain:VL)および「重鎖可変部」(variable heavy chain:VH)という用語は軽鎖および重鎖の可変部分をそれぞれ意味している。免疫グロブリン分子の抗原認識部位またはリガンド/基質結合部位は、重鎖と軽鎖のV領域内の3個の高度に多様なストレッチから形成される「超可変領域」として知られているものであり、それは「フレームワーク領域」として知られている、より保存されている隣接のストレッチ間に挟まれている。1つの抗体分子中で1本の軽鎖の3個の超可変領域および1本の重鎖の3個の超可変領域は3次元空間内で互いに相対するように配置されて抗原結合を行う表面を形成する。この表面は標的抗原またはリガンド/基質の認識と結合を仲介する。重鎖と軽鎖の各々の3個の超可変領域は「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれ、それについては例えば、Kabatら(15)に述べられている。抗体のCDRと相互作用する抗原の部分はエピトープと呼ばれる。
【００３３】
抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、またはよく特徴の調べられた多数のフラグメント、例えば種々のペプチダーゼで消化して作製したものおよび組換えDNA技法で作製しうるものなどとして、存在する。抗体フラグメントとしては、Fab'モノマー、Fab'2ダイマー、Fvフラグメント、単鎖Fv(「scFv」)フラグメント、および類似のものが含まれる。例えば、Hustonら(16)を参照のこと。抗体フラグメントとしてはまた、軽鎖および/または重鎖定常領域の欠失セグメントまたは末端切断型セグメントも含まれる。
【００３４】
本発明の抗体はモノクローナルまたはポリクローナルなものとすることができる。一般的には、ポリクローナル抗体は本発明のタンパク質またはその断片を1回以上注射することによって免疫した動物の血清中に存在する。一般的には、モノクローナル抗体は、適切に免疫された動物からB細胞源を得て、そのB細胞を不死化し、個々の不死化した細胞からB細胞集団をクローン化し、目的の抗体を産生するクローンを選択することによって調製される。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当業界でよく知られている。例えば、HarlowとLane(17)を参照のこと。
【００３５】
したがって、原発性結腸癌を正常な結腸から、および/または結腸癌の肝臓転移を正常な肝臓組織から識別するポリクローナル抗体を作製するための方法が提供される。その方法は、本発明のタンパク質の1種以上を用いて動物を免疫し、その抗体を回収することを含む。さらに、原発性結腸癌を正常な結腸から、および/または結腸癌の肝臓転移を正常な肝臓組織から識別するモノクローナル抗体を作製するための方法が提供される。その方法は、本発明のタンパク質の1種以上のものを用いて動物を免疫し、その免疫した動物からB細胞を取り出し、不死化し、そのタンパク質に対して特異的な抗体を産生するB細胞を単離することを含む。不死化の代わりに、抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を、免疫した動物の免疫細胞から得ることができる。次いでその核酸を適切な発現ベクター中にクローン化し、宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、または形質導入して、それによって宿主細胞が、免疫した動物のB細胞中に存在する重鎖および軽鎖由来の抗体を産生するようにすることができる。目的の抗体を産生する宿主細胞を選択することができる。
【００３６】
本発明のタンパク質に対して特異的な抗体を引き出すために適した免疫原は、該タンパク質の精製した、または部分的に精製した調製物を含むことができる。本発明の精製タンパク質は少なくとも20%の純度、好ましくは少なくとも40%の純度、より好ましくは少なくとも60%の純度、さらにより好ましくは少なくとも80%の純度、さらによりいっそう好ましくは少なくとも90%の純度、および最も好ましくは少なくとも約95%から99%の間の純度のものである。
【００３７】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本説明ではアミノ酸残基のポリマーを示すものとして相互交換可能なものとして用いられている。「タンパク質」のカテゴリーには、他の分子と会合しているタンパク質、例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク質、核酸、およびそれらの組み合わせが含まれる。特に断らない限りは、「a」、「an」、または「the」という用語は1以上であることを意味する。本発明のタンパク質には保存的に置換されたそのタンパク質の変異体も含まれる。一次アミノ酸配列の小さな改変は、本明細書に記載の天然ポリペプチドと比較して実質的に等価な活性を有するタンパク質をもたらしうる。配列内での保存的な置換とは、あるアミノ酸残基を構造的に類似の残基と置換することを意味するものだが、そのような置換が好ましい。保存的な置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなどの疎水性残基の1つを別の疎水性残基と置換すること、または極性の残基1つを別の極性残基と置換すること、例えばリジンの替わりにアルギニン、アスパラギン酸の替わりにグルタミン酸、アスパラギンの替わりにグルタミンなどに置換することなどが含まれる。そのような改変は、部位特異的突然変異誘発によるもののような計画的なものとすることができ、または自然発生的なものとすることができ、非必須アミノ酸の欠失も含むことができる。改変には、1もしくは複数のアミノ酸の欠失が含まれ、それはより広い用途を有する活性のあるより小さい分子を開発するために用いることができる。これらの改変で作製されたポリペプチドの全ては、該天然タンパク質の生物学的活性が同等に維持されているものである限りは本発明に含まれる。本発明のタンパク質はまた、例えばそのタンパク質の結合パートナーを作製するために有用なタンパク質断片をも含む。
【００３８】
あるNMP調製物を免疫原用の部分的に精製されたタンパク質源として用いることができる。本発明のタンパク質は、多数のよく知られた精製方法のいずれかによって精製することができ、そのような精製方法としては、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が関与する免疫学的分離、および類似のものが含まれる。例えば、精製タンパク質調製物はNMPの2次元ゲル電気泳動を行った後に該タンパク質のスポットを切り取り、そのゲルからの該タンパク質の溶出に電気泳動を用いることによって得ることができる(実施例を参照のこと)。あるいはまた、該タンパク質またはそれらの断片は、タンパク質の配列に基づいて、例えば、Merrifield(13)またはStewartとYoung(14)が報告した、よく知られた固相ペプチド合成法によって合成することができる。
【００３９】
本発明のタンパク質またはその断片の精製調製物は、Goeddelら(18)が報告しているものなどの当業界ではよく知られた市販のベクターと宿主細胞を用いて組換えで発現させることによっても調製することができる。宿主細胞としては、例えば、哺乳類細胞、細菌、酵母、および類似のものが含まれる。宿主細胞は当業界で既知の従来の技法によって組換えDNAで形質転換することができる。例えば、宿主が大腸菌(E.coli)などの原核生物である場合には、コンピテントな細胞を調製することができ、それはDNAを取り込むことのできるものであり、そのような細胞は対数増殖期の後に従来法によってCaCl2で処理した細胞から採取することができる。形質転換はまた、宿主細胞のプロトプラストを形成させることによって、または電気穿孔法によって行うこともできる。真核生物の宿主は、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、電気穿孔法、リポソーム封入、ウイルスベクター、および類似のものなどのよく知られた方法を用いて外来DNAで形質転換することができる。組換えDNAも当業界でよく知られているトランスフェクションおよび形質導入法によって導入することができる。
【００４０】
真核細胞はまた、本発明のタンパク質をコードするDNA配列、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択しうる表現型をコードする第2の外来DNA分子を用いて同時形質転換することもできる。別の方法としては、真核細胞性のウイルスベクター、例えばSV40(Simian Virus 40)またはウシパピローマウイルスなどを用いて、真核細胞を一過性に感染させるかまたは形質転換して、該タンパク質を発現させることである。
【００４１】
本発明のタンパク質またはその断片は外来ポリペプチド、例えばGSTまたは連鎖球菌のプロテインAなどの細菌性のリガンド結合配列などに融合させた融合体として発現させることもできる。例えば、GSTとの融合によって融合産物の精製、または免疫原性の増大のための効率的な方法が提供される(例えば、UhlenとMoks, (19)を参照のこと)。免疫原性はまた、該タンパク質またはその断片を適切な免疫原性キャリアータンパク質と化学的に結合することによって増強させることもできる。本発明に有用なキャリアータンパク質は少なくとも約20,000ダルトンの分子量を有する。本発明に有用なキャリアータンパク質としては、例えば、GST、キーホールリンペットから得たものなどのヘモシアニン、血清アルブミンもしくは陽イオン化血清アルブミン、チログロブリン、卵白アルブミン、破傷風トキソイドもしくはジフテリアトキソイドなどの種々のトキソイドタンパク質、免疫グロブリン、または熱ショックタンパク質が含まれる。あるポリペプチドをキャリアータンパク質と化学的に結合させる方法は当業界ではよく知られており、そのような方法としては、塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなどの水溶性カルボジイミドによるコンジュゲーション、例えばNHSエステル基もしくはスルホ-NHSエステル類似体を有するホモ二官能性架橋剤によるコンジュゲーション、例えばNHSエステルおよびスルホスクシニミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートなどのマレイミド基を有するヘテロ二官能性架橋剤によるコンジュゲーション、グルタルアルデヒドを用いたコンジュゲーション、および類似のものが含まれる。例えば、Hermanson(20)ならびに米国特許第4,608,251号および第4,161,519号を参照せよ。
【００４２】
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体などの結合パートナーは、RIA、EIA、および類似のものなどのイムノアッセイで本発明のタンパク質を検出するために用いることができる。そのようなアッセイは競合的なものまたは非競合的なものとすることができ、直接的または間接的方式に基づいたものとすることができる。このような結合パートナーは液相中で、および/または固相担体と結合させて用いることができる。担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、磁鉄鉱、および類似のものが含まれる。担体の性質は、可溶性または不溶性のいずれであってもよい。イムノアッセイで典型的に見られるとおり、該結合パートナーまたは本発明のタンパク質は当業界でよく知られた種々の方法で標識して、検出しうるようにすることができる。結合パートナーはまた、電気泳動で分離したゲル(例えば2次元ゲル)中にある、またはウエスタンブロットなどのような固相膜に付着した状態の、本発明のタンパク質の検出にも用いることができる。
【００４３】
本発明のタンパク質もしくはその断片を含む免疫原は、該タンパク質もしくは断片をアジュバントと混合するか、またはそのアジュバントとコンジュゲートさせるかもしくはその他の方法で連結させることによって、そのアジュバントとともに投与することもできる。種々のアジュバントが知られており、そのようなものとしては、フロイントのアジュバント(完全および不完全)、水酸化アルミニウム(alum)、ムラミルジペプチド、BCG、LPS、Ribi Adjuvant System(登録商標)、TiterMax(登録商標)、および類似のものが含まれる。当業者であればある与えられた状況での使用に適するアジュバントのタイプは承知しているであろう。
【００４４】
本発明はまた、患者の体内での結腸の増殖性疾患を診断する方法をも提供し、その方法は、患者から得た組織、糞便、または体液中に、癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、または正常な結腸上皮細胞中には存在するが癌性の結腸細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、少なくとも1種のタンパク質の存在を分析することを含んでなるものであり、該タンパク質は次のものからなる群から選択されたものである：
a)  分子量が約56kDでpIが約6.22のCC2；
b)  分子量が約43kDでpIが約6.3のCC3；
c)  分子量が約43kDでpIが約6.2のCC4；
d)  分子量が約42kDでpIが約6.2のCC5；
e)  分子量が約20kDでpIが約6.9のCC6a；
f)  分子量が約20kDでpIが約6.8のCC6b；
g)  分子量が約50kDでpIが約6.01のL1；
h)  分子量が約20kDでpIが約5.73のL2；
i)  分子量が約19kDでpIが約5.88のL5；
j)  分子量が約40kDでpIが約5.5のN1；
k)  分子量が約30kDでpIが約5.94のN2；
l)  分子量が約30kDでpIが約5.88のN3；
m)  分子量が約30kDでpIが約5.80のN4；
n)  分子量が約30kDでpIが約5.73のN5；および
o)  分子量が約18kDでpIが約6.6のN6。
【００４５】
既に述べたとおり、該タンパク質は2次元電気泳動、モノクローナルまたはポリクローナル抗体などの特異的結合パートナーによる検出、および類似のものなどの生化学的手段を含む種々の方法のいずれかで検出することができる。該タンパク質はまた、該タンパク質をコードするmRNAを、適切なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることによって、該ｍRNAのレベルを測定することによって検出することもできる。ここで「患者」とは哺乳類、好ましくはヒトである。
【００４６】
本明細書で「結腸の増殖性疾患」という用語は、悪性の、ならびに悪性でない(または良性の)結腸疾患を意味する、ここで結腸には、限定はされないが結腸上皮が含まれる。そのような疾患としては、異型または異形成を伴うようなポリープ、無茎の絨毛腺腫、有茎の管状腺腫、および類似のものが含まれる。これらの増殖性疾患を構成している細胞は周囲の正常組織とは形態学的および遺伝子型からみて異なっていることが多いように思われる。該増殖性疾患は、例えば、本発明のCCまたはLタンパク質、後者の場合は特にL1、L2、およびL5の発現を伴っている可能性がある。細胞周期の不適切な時点での、または適正でない細胞タイプ中での、同定されたタンパク質の発現によって細胞増殖性疾患がもたらされる可能性がある。該タンパク質をコードするポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド(またはリボザイム)の形態のものは結腸の過形成および悪性腫瘍の治療に有用である。好ましい実施形態においては、該増殖性疾患は結腸癌である。表2(実施例2)は、正常な隣接結腸組織と正常ドナー結腸組織の核マトリックス調製物中でL1、L2、およびL5が検出された2次元ゲルのパーセンテージを示している。
【００４７】
また本明細書は結腸腺腫が悪性腫瘍となる可能性を評価する方法をも提供し、その方法は、癌性の結腸細胞中には存在するが正常な結腸上皮細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、または正常な結腸上皮細胞中には存在するが癌性の結腸細胞中では全く存在しないかもしくは量が低下している、少なくとも1種のタンパク質の存在について該腺腫を分析することを含んでなるものであり、該タンパク質は次のものからなる群から選択されたものである：
a)  分子量が約56kDでpIが約6.22のCC2；
b)  分子量が約43kDでpIが約6.3のCC3；
c)  分子量が約43kDでpIが約6.2のCC4；
d)  分子量が約42kDでpIが約6.2のCC5；
e)  分子量が約20kDでpIが約6.9のCC6a；
f)  分子量が約20kDでpIが約6.8のCC6b；
g)  分子量が約50kDでpIが約6.01のL1；
h)  分子量が約20kDでpIが約5.73のL2；
i)  分子量が約19kDでpIが約5.88のL5；
j)  分子量が約40kDでpIが約5.5のN1；
k)  分子量が約30kDでpIが約5.94のN2；
l)  分子量が約30kDでpIが約5.88のN3；
m)  分子量が約30kDでpIが約5.80のN4；
n)  分子量が約30kDでpIが約5.73のN5；および
o)  分子量が約18kDでpIが約6.6のN6、
ここで該タンパク質が検出されることは、悪性化する可能性の増大を示している。好ましい実施形態においては、該タンパク質はCC3、CC4、およびCC5である。
【００４８】
本発明はまた、患者の体内での結腸癌の肝臓転移の診断をも包含しており、それはその患者の組織または体液中に次のものからなる群から選択されたタンパク質の少なくとも1種が存在するか分析することによるものである：
a)  分子量が約50kDでpIが約6.01のL1；
b)  分子量が約20kDでpIが約5.73のL2；
c)  分子量が約17kDでpIが約6.09のL3；
d)  分子量が約17kDでpIが約6.00のL4；および
e)  分子量が約19kDでpIが約5.88のL5。
【００４９】
本発明によるタンパク質の検出は、結腸細胞増殖性疾患のうちで悪性腫瘍となる可能性のあるまたは転移する可能性のある疾患のそれぞれを識別することを可能にする。本明細書で述べているタンパク質組成物もまた、結腸直腸癌などの結腸細胞増殖性疾患の早期診断、および再発の早期発見、ならびにそれから由来した転移性疾患の早期発見のためのマーカーとして有用であり、そのマーカーから得られた知識はこの疾患の効果的な治療法にとって中心的なものとなるものである。これらのタンパク質を個々に用いることに加えて、本発明のタンパク質のいずれか2種以上の検出を組み合わせて、結腸癌およびその肝臓への転移を含む結腸の増殖性疾患を診断することができる。本発明のタンパク質の検出はまた、その他の結腸癌のマーカー、例えばCEAまたはすでに報告されている結腸癌NMP(32)などの検出と組み合わせて結腸癌およびその肝臓への転移を診断することができる。
【００５０】
本明細書に記載の特定のタンパク質またはその断片は、例えば、それをコードするmRNAのレベルを検出することによって、間接的に検出することができる。従って、本発明は前述した実施形態の同定タンパク質またはその断片をコードする精製ポリヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は上述のタンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする(または相補的な配列とハイブリダイズする)核酸プローブを提供する。本明細書で用いている「核酸」という用語はデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーで一本鎖もしくは二本鎖のいずれかの形態であり、また天然のヌクレオチドと類似の様式で機能する、天然のヌクレオチドの既知の類似体をも包含する。プローブは好ましくは一本鎖であり、好ましくは少なくとも約14ヌクレオチドの長さからなり、より好ましくは少なくとも約18ヌクレオチドの長さからなり、最も好ましくは少なくとも約25ヌクレオチドの長さからなる。核酸プローブは放射性同位元素、生物発光性化合物、化学発光性化合物、蛍光性化合物、金属キレート、酵素、および類似のもので、検出しうるように標識することができる。
【００５１】
また、結腸細胞増殖性疾患を検出するためのキットも提供される。そのキットには本発明のタンパク質のいずれか1種以上に対して特異的な結合パートナーまたは核酸プローブを含むものとすることができる。該結合パートナーまたはプローブは検出が容易となるように標識することができる。そのキットには各試薬を別々のバイアル瓶に入れたものとすることができ、陽性および陰性の対照、反応を行うためのものなどのバッファー、ならびに使用説明書を含めることができる。また、そのキットは、本発明のタンパク質の1つをコードする標的ポリヌクレオチド配列を、例えば、ポリメラーゼラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって増幅できるようにオリゴヌクレオチドプライマーを含めることもできる。
【００５２】
本発明はまた、原発性の結腸癌およびそれから由来する肝臓への転移癌に存在するタンパク質の発現または活性のレベルを低下させることによる、結腸癌およびその肝臓転移を治療する方法をも提供する。そのようなタンパク質としては、本明細書で開示しているCCまたはLタンパク質のうちのいずれかが含まれる。該タンパク質の発現のレベルは、例えば、その個体をアンチセンス核酸またはリボザイムを用いて治療することによって低減させることができる。
【００５３】
アンチセンス核酸はある特定の遺伝子配列に対して相補的となるように設計された、短いDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドである。アンチセンスを用いることの目的は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが特定の遺伝子配列に結合することによってその特定の遺伝子の発現に変化を与えることである。DNAヘリックスの特定の領域と結合するアンチセンス分子は、そのヘリックスを構成している2本の鎖と結合する部位で第3の鎖を形成するので3本鎖を作ることができる。RNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは触媒作用を持たないもの、または触媒作用を持つもの(すなわち、リボザイム)のいずれかとすることができる。触媒作用のないアンチセンス分子の標的RNAへの結合は、RNAがさらにプロセシングされることをブロックするか、またはいくつかの可能な機序のいずれかを介する輸送をブロックすることができ、そのような機序としては、例えば1)リボソームの該RNAへの結合をmRNA上のリボソーム結合部位をマスクして妨げることによる一時的な阻害；2)大多数の細胞中に存在する酵素であるRNアーゼHがRNA/:DNAハイブリッド中のRNAを分解することによる該プロセスの永続的な阻害；および該オリゴヌクレオチドの標的RNAへの架橋による永続的な阻害が含まれる。
【００５４】
該アンチセンス化合物は好ましくは約8個から約30個の核酸塩基(すなわち、約8個から約30個の連結されたヌクレオシド)を含み、より好ましくは約12個から約25個の核酸塩基を含む。該アンチセンスオリゴヌクレオチドはその形状を直鎖状または環状とすることができる。本発明で有用なアンチセンス化合物としては、骨格の修飾されたもの、または非天然のヌクレオシド間の結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸3'-アルキレンおよびキラルホスホン酸を含むホスホン酸メチルおよびその他のホスホン酸アルキル、ホスフィネート、3'-アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な3'-5'結合をもつボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が3'-5'から5'-3'に、もしくは2'-5'から5'-2'に結合された逆極性をもつものが含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製する方法に関する広範な引用は、例えばBennett, 米国特許第6,210,892号に見出すことができる。
【００５５】
細胞増殖性疾患が本発明のタンパク質(例えば、N1またはN6)の発現が低いという特徴を持っている場合には、欠落したその発現の低いタンパク質(例えば増殖または腫瘍抑制タンパク質)をコードするポリヌクレオチド配列を、その発現レベルを上昇させるために投与することができる。このことは、宿主被験者の細胞内に、本発明のタンパク質のいずれか1種以上をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入することによって行うことができる。好ましくは、該発現ベクターは宿主被験者の細胞中へex vivoで導入され、形質転換された細胞が得られ、その形質転換された細胞が被験者の体内へ再導入される。このことは、例えば、レトロウイルスベクターなどのRNAウイルスベクターを用いて行うことができる。該タンパク質を発現するように形質転換された細胞は、例えば、腫瘍ワクチンとしても有用である。細胞内にセンスまたはアンチセンス核酸を(in vivoまたはin vitroで)送達するためのベクターの調製方法、およびこれらの送達ベヒクルを投与用に製剤化する方法は当業界ではよく知られている。例えば、Coffeyらの米国特許第5,824,490号を参照のこと。
【００５６】
本発明のタンパク質の発現レベルはまた、プロモーターやエンハンサーなどの発現を制御する調節領域に影響を及ぼす化合物、または該タンパク質の活性を調節する化合物で個体を処置することによって低減させることもできる。そのような化合物は、a)本発明のタンパク質を発現している増殖性の細胞(例えば、結腸直腸癌細胞)を、その細胞と試験組成物が相互作用することのできる条件下で試験組成物とインキュベートし、b)その試験組成物が該タンパク質の機能をブロックまたは増強するかを測定することによって同定することができる。Caco-2細胞はこの点で有用な結腸直腸癌細胞系統の1例である。
【００５７】
本発明は下記の非限定的な実施例を参照してよりいっそう詳細に説明される。
【実施例１】
【００５８】
NMPの単離と精製方法
A.  組織のプロセシング
結腸腺癌の肝臓転移サンプル(N=12)およびそれと適合する隣接正常肝臓組織(N=12)を、施設内倫理委員会(IRB)の承認を得てピッツバーグ大学メディカルセンターの早期発見研究ネットワーク(Early Detection Research Network：EDRN)を通じて収集した。患者の年齢の範囲は44〜75歳であり、平均年齢は62.4歳であった。サンプリングした集団の60%は女性であった。癌は標準TNMシステムに従ってステージ分けし、そのカテゴリーは表1に示すとおりであった。
【００５９】
結腸腺癌のサンプル(N=10)およびそれと適合する隣接正常肝臓組織(N=10)も、施設内倫理委員会(IRB)の承認を得てピッツバーグ大学メディカルセンターの早期発見研究ネットワーク(EDRN)を通じて収集した。患者の年齢の範囲は36〜82歳であり、平均年齢は71歳であった。サンプリングした集団の60%は女性であった。癌はステージ分けし、そのカテゴリーは表1に示すとおりであった。
【表１】
2005525103.tif 000002
【００６０】
正常肝臓組織は外傷を受けた被害者から得たもので、その内訳は、銃撃の被害者1例、および交通事故の被害者2例であった(N=3)。患者の年齢の範囲は36〜48歳で、平均年齢40．3歳であった。これらの正常人のうちの2例は男性で、1例は女性であった。これらの患者で肝硬変の患者はいなかった。患者の30%は軽度の脂肪症を有していた。診断は、各検体に付けられた病理所見報告から得て、組織学的に確認した。組織はプロセシングするまでは−80℃で保存した。散在性の結腸腺癌サンプルおよびそれと適合する隣接正常組織、ならびに正常ドナーの結腸組織は既に報告されているとおり集めた(30)。
【００６１】
正常結腸組織は外傷の被害者から得た。すなわち、それらの被害者の内訳は、銃撃創を有するものが2例、交通事故による外傷が1例、および臓器のドナーが1例であった(N=4)。患者の年齢の範囲は20〜59歳であり、平均年齢は47.2歳であった。これらの正常結腸ドナーは全員男性であった。診断は、各検体に付けられた病理所見報告から得て、組織学的に確認した。
【００６２】
結腸癌の細胞系統であるSW480およびCaco-2は、American Type Culture Collection(Manassas, Virginia)から得た。これらの細胞系統は双方とも原発性ヒト結腸癌細胞から樹立されたものである。SW480細胞系統は10% ウシ胎児血清を添加したLeibovitz培地中で37℃でCO2なしで増殖させた。Caco-2細胞系統は、10%ウシ胎児血清、1% L-グルタミン(200mM)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム(100mM)、1% MEN 非必須アミノ酸、1.5% HEPESバッファー(1M)を添加したダルベッコ最小必須培地(DMEM)中で37℃で5% CO2雰囲気で増殖させた。
【００６３】
結腸癌細胞系統CX-1はピッツバーグ大学のLee YJ, Ph.D.から贈与を受けたものである。この細胞系統は原発性ヒト結腸癌細胞から樹立されたものである。この細胞系統は、10%ウシ胎児血清、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMI-1640培地中で37℃で5% CO2雰囲気で増殖させた。
【００６４】
正常ヒト肝細胞(50 x 106)は63歳の女性の臓器ドナーから得たもので、Dr. Stephan Strom(ピッツバーグ大学, PA)から贈与を受けたものである。ヒト原発性肝癌細胞系統のhuh 7、HepG 2はDr. George Michalopoulos（ピッツバーグ大学, PA）から贈与を受けたものである。細胞系統は双方とも、10%ウシ胎児血清、1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM中で37℃で5% CO2雰囲気で増殖させた。
【００６５】
B.  核マトリックス調製物
核マトリックスタンパク質はGetzenbergら(29)の方法に従って種々の細胞および組織から抽出した。簡潔に記せば、組織を小片に細かく切断し、2mMのバナジルリボヌクレオシド(RNアーゼの阻害剤)を含有する溶液中の0.5% Triton X-100を用いて、氷上でテフロンの乳棒でホモジナイズして、脂質および可溶性タンパク質を放出させた。そのホモジネートを350μmのナイロンメッシュを通過させてろ過した。DNアーゼおよびRNアーゼでの処理を行って可溶性クロマチンを除去し、中間径フィラメントおよびNMPを含む残存画分を得た。次いでこの画分を8M尿素で解離し、炭水化物と細胞外マトリックスからなる不溶性の成分を遠心によって除去した。透析して尿素を除いた後、中間径フィラメントを再び組み立て、その後それらのフィラメントを遠心によって分離した。
【００６６】
次いでNMPをエタノールで沈殿させ、9M尿素、65nM 3-((3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ)-1-プロパンスルホネート、2.2% アンフォライト、および140mM DTTからなる2Dサンプルバッファー中に再懸濁し、クーマシープラスタンパク質アッセイ(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)でウシ血清アルブミンを標準品として用いて定量した。エタノール沈殿後に得たNMPを含有するペレットは出発材料中の細胞性タンパク質の合計量の1%未満であった。
【００６７】
C.  高分解能2次元電気泳動
この方法はInvestigator 2-D ゲルシステム(Genomic Solution, Ann Arbor, MI)を用いて既に報告されているとおり行った(29, 33-34)。ゲルあたり100μgのタンパク質を毛細管サイズのIEFカラム上にロードした。プレフォーカシングの1.5時間後に1次元等電点フォーカシングを1mm x 18インチのチューブゲルを用いて18000ボルト-時間行った。そのチューブゲルを押し出し、1mmのSDS Duracryl(Genomic Solution, Ann Arbor, MI)高引っ張り強度のPAGEスラブゲル上においた。そのゲルを12℃の定温で4.5〜5時間電気泳動した。ゲルを50%のメタノールと10%の酢酸で固定した。十分に洗い脱水した後、50mM リン酸塩(pH7.2)で緩衝化した後、ゲルを5% グルタルアルデヒドと5mM DTTで処理した。ゲルをWrayらの方法(Accurate Chemical Co., Westbury, NY) (21)を用いて銀染色した。結腸NMPの分子量はGenomic Solutionsが提供している標準品を用いて求めた。等電点(PI)はカルバミル化した標準品（Gallard-Schlessinger(Carle Place, NY)およびSigma Chemical Co.(St. Louis, MO)が販売しているBDH）を用いて測定した。
【００６８】
各サンプルについて複数のゲルを用いて測定し、複数のサンプルを別々の時点で測定した。ゲルはBioImage 2D Electrophoresis Analysis System(BioImage, Ann Arbor, MI)を用いて分析し、このシステムはゲル間のタンパク質スポットをぴったり一致させてゲルとタンパク質スポットをデータベース中で分類するものである。あるサンプルタイプのゲル全てで複数のタンパク質スポットが明確かつ再現性をもって同一であるときにのみ、報告されているNMPを示しているものであるとした。
【実施例２】
【００６９】
結腸癌または正常な結腸上皮に特徴的なNMPの同定
A.  結腸直腸癌および正常結腸上皮から得たNMPの分析
高分解能2次元ゲル電気泳動によって分離したNMPを評価して、主として結腸直腸腺癌中で発現された臨床的に価値のある7種類のNMPを同定し、表2に示すとおり名付けた。CC2からCC6a, bは全ての結腸腫瘍中で強く発現されていたが、隣接正常組織では検出されなかった。これに対して、CC1は癌の抽出物と隣接正常組織またはドナー組織では発現されたが、そのシグナルは結腸癌では正常組織源のいずれよりも強かった。
【００７０】
主として正常な結腸上皮で発現された臨床的に価値のある6種類のNMPを表2に示すとおり名付けた。N2〜N6は結腸癌の少数で発現していたが(約20%)、隣接する正常組織およびドナー組織の抽出物では全てで発現していた。これに対してN1は癌の抽出物の多数(約70%)、および正常組織抽出物の全てで発現していたが、正常組織抽出物ではそのシグナルがより強かった。同定した結腸癌NMP`の特徴を表2に要約する。
【表２】
2005525103.tif 000003
【００７１】
*NCとは参考文献で、大きさまたはpIが近似しているものが報告されていないものを意味する。
【００７２】
**癌のサンプルでは発現頻度が約10〜20%であること意味する。
【００７３】
B.  結腸直腸腫瘍細胞系統から得たCC NMPの分析
NMP調製物を2つのヒト結腸癌細胞系統、Caco-2およびSW480、から、本質的にはヒト組織からのNMP調製物について報告されているとおりの方法で単離した。これらのNMPを上述のヒト組織NMPについて説明した2次元ゲル電気泳動法によって分析した。2つの細胞系統はどちらも、隣接またはドナーゲルでは発現されていたタンパク質(N1〜N6)のいずれをも発現していなかった。細胞系統SW480は結腸癌関連タンパク質であるCC1およびCC6a/bを発現していた(図5)；Caco-2細胞系統はCC1、CC3、CC4、CC6a, bを発現していた。Caco-2、SW480のNMP調製物中でCC2は検出されなかったが、癌細胞系統CX-1では検出された。CX-1 NMP中ではCC3、CC4は検出されたがCC5は検出されなかった。
【００７４】
これらの調査は、ヒト結腸癌から単離された核マトリックスタンパク質は正常な隣接組織および正常なドナー組織と異なり、特定のタンパク質の喪失および獲得の双方を示すことを実証している。癌細胞中でのユニークなNMPの存在または不在は疾患の診断に有用であり、発癌におけるNMPの機能についての新たな情報を提供するものである。
【００７５】
C.  結腸の腺腫性ポリープでのCC NMPの分析
結腸ポリープ(n=20)は、施設内倫理委員会(IRB)の承認を得てピッツバーグ大学メディカルセンターの早期発見研究ネットワーク(EDRN)を通じて収集した。若年性ポリープの1検体、管状腺腫(TA)の6検体、管状絨毛腺腫(tubulovillus adenoma; TVA)の7検体、高度な異形成を伴う管状絨毛腺腫(HGDを伴うTVA)の6検体を調べた。患者の年齢の範囲は18〜77歳であり、平均年齢は58歳であった。サンプリングした集団の55%は女性であった。診断は、各検体に付けられた病理所見報告から得て、組織学的に確認した。結腸ポリープを組織学的に分けたものは表3に示している。組織はプロセシングするまで−80℃で保存した。
【表３】
2005525103.tif 000004
【００７６】
結腸の種々の腺腫におけるCC2、CC3、CC4、およびCC5 NMPの存在の検出結果を表4に示す。
【表４】
2005525103.tif 000005
【００７７】
CC2は前悪性(pre-malignant)ポリープのいずれでも全く認められなかった。CC5はHGDを伴う前悪性TVAでは2検体(33%)、TAでは1検体(17%)にのみ存在していた。CC3とCC4は、TAでは83〜100%、TVAでは86%、HGDを伴うTVAでは83〜100%に存在していた。若年性ポリープ（結腸癌の前駆状態ではない）では核マトリックスタンパク質は認められなかった。
【００７８】
CC5はHGDを伴う前悪性TVAで2検体のみに、およびTAの1検体に存在していたが、結腸癌組織ではその全てに存在し、進行した腺腫と侵襲的な結腸癌の境界で発現されている。CC5は進行したポリープと結腸癌上皮に発現されるので、結腸ポリープの悪性化の可能性を示すための有望なマーカーである。CC3とCC4は大部分の腺腫に、その進行の程度にかかわらず存在していた。この2種のタンパク質は双方とも腺腫性ポリープの発達の初期から発現されており、また結腸癌でもその全てで発現されている(表2)。ここで試験した4種類のCCマーカーの全てを組み合わせたものも、結腸ポリープの悪性化の早期発見に診断的価値を提供する。
【実施例３】
【００７９】
結腸癌NMPの部分アミノ酸配列
A.  ポリペプチドの単離と配列分析の方法
2次元ゲルで単離した特定のCCマーカーについて部分アミノ酸配列を、Gaevaertら(35)が開発した技法を改変して用いて決定した。簡潔に記せば、NMP調製物を泳動させた2次元ゲルを0.2M イミダゾール中で15分間ネガティブ染色し、脱イオン水で数回洗い、加温した0.3M 塩化亜鉛溶液で染色し、その染色反応を脱イオン水中で洗うことによって停止させた。タンパク質のスポットをゲルから切り取り、−80℃で凍結した。そのゲルスポットを融解し、プールし、45%メタノール/9%酢酸中に0.25% クーマシーブルーを含む液で20分間染色した。単離したゲルスポットを脱色溶液(5%メタノール/7.5%酢酸)中で1時間振盪して脱色し、脱イオン水で1時間洗い、SDSポリアクリルアミドサンプルバッファー(1% SDS/10% グリセロール/50mM DTT/12mM Tris-HCl pH7.1)中で1時間平衡化した後、SDSアクリルアミド/アガロースゲルにロードした。
【００８０】
脱色後、各ゲルのスポットから得たタンパク質を、ミニアガロース/アクリルアミドゲル上で濃縮した。このゲルは、幅1cm、厚さ1.5mmのスペーサーを介して分離された2枚のあらかじめ加温した(60℃)ガラスプレート(10cm x 9cm)間で作製された。Whatman 3MMろ紙の紙片を底部において低い位置のアガロースゲルの支持体として用いて、ゲルが電気泳動中に滑らないようにした。2個の平行においたスペーサー間に幅2cm x  厚さ1.5 cmのスペーサーを1個挿入してゲルスポットを受容するサンプルウエルを形成させた。そのサンプルウエルは、ガラスプレートの中心部に挿入し、接着テープでバックプレートの上端を接着した各々幅1cm x 厚さ1.5cmの2個の平行においたスペーサー間にセットした幅2cm x 厚さ1.5cmのスペーサーによって形成された。
【００８１】
ミニゲルの泳動ゲル部分は2cmの深さのアガロース(0.36M Tris-HCl pH8.7/0.1% SDS中の1.45% アガロース)からなり、アガロースを注ぎ入れ、硬化させた。ポリアクリルアミド分離用ゲル(5.45% アクリルアミド/ 0.13% ビスアクリルアミド/0.12M Tris-HCl pH6.8/0.1% SDS)をそのアガロースの上に載置した。分離用ゲルが重合した後、中心のウエルを形成しているスペーサーを除去すると、高さ2cm、幅2cm、および厚さ1.5mmの大きさのローディングウエルが残された。次いでそのミニ濃縮ゲルを小さな電気泳動タンク(BioRad, Hercules, CA)上に固定し、ローディングスロットをSDSサンプルバッファーで平衡化したゲルスポットで満たした。残存する容積はブランクのゲル片で満たした。
【００８２】
ミニゲルを100Vで泳動させると、該タンパク質が組み合わせたゲル片からアクリルアミド中に溶出される。この時点で、中心スペーサーを、染料の先端が2つの平行におかれた幅1cmのスペーサーを通り過ぎるまで、再度サンプルウエルに挿入した。その場所で中心スペーサーを除去し、電気泳動を染料の先端がアガロースに入りろ紙に到達するまで継続した。
【００８３】
アガロースの泳動ゲルを取り外し、新鮮な50%メタノール/10% 酢酸中で室温30分間振盪して固定した。そのゲルを0.05% クーマシーブルー(50%メタノール/10% 酢酸)で5分間染色し、次いで5% メタノール/7% 酢酸中で一定に振盪しつつ2時間かけて脱色した。次いでタンパク質のバンドをアガロースゲルの容積が最小となるように切り取り、滅菌済の試験管に移し、トリプシンで十分に消化させた。トリプシン消化した断片を分取用逆相C18 HPLCにかけ、種々のペプチドを含んだ画分を単離した。種々の画分中の断片の配列は自動配列分析機を用いて決定した。
【００８４】
B.  ペプチド配列分析の結果
Caco-2細胞のNMP調製物から単離した特定の単離CCポリペプチドのトリプシン消化断片のN末端アミノ酸配列は表5に示し、ヒト結腸直腸癌検体のNMP調製物から単離した特定のCCポリペプチドの配列は表6に示す。
【表５】
2005525103.tif 000006
【表６】
2005525103.tif 000007
【００８５】
該アミノ酸配列を公開されているアミノ酸データベースに対して検索して既知のタンパク質でないか調べた。CC1から作製した断片のアミノ酸配列(配列番号9、10、および11)はカルレティキュリンというタンパク質と一致しており、一方、配列番号12および13を有するCC1配列はカルレティキュリンの前駆体と一致していた。カルレティキュリンは重要な多機能性のカルシウム結合タンパク質で、平滑筋の筋小胞体および筋肉以外の小胞体(ER)の膜中に見出される主要なカルシウム結合タンパク質である。カルレティキュリンは主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)クラスIタンパク質の新たに合成された分子の折り畳みとペプチドのローディングにおいて免疫学的機能を有している。完全なMHCクラスI分子は、短いペプチド断片と結合したα鎖の3個のドメインとより小さなβ2-ミクログロブリンからできている。β2-ミクログロブリンがα鎖にまず最初に結合すると、この部分的に折りたたまれたヘテロダイマーはカルレティキュリンを含んでいるタンパク質の複合体と結合する。カルレティキュリンとMHC分子との結合は発生期のN-結合型オリゴサッカライドのグルコーストリミングによって調節される--MHCクラスI分子のα1ドメイン中のオリゴサッカライド部分およびα3ドメイン内の残基はカルレティキュリンとの結合(intersection)にきわめて重要である。ペプチドのローディングとN-結合型グリカンの糖の除去後、カルレティキュリンはそのヘテロダイマーから解離する。
【実施例４】
【００８６】
結腸癌NMP調製物中のカルレティキュリンの同定
結腸癌中のカルレティキュリンの存在をNMP調製物ならびに核および細胞質抽出物を用いて評価した。
【００８７】
A.  方法
核および細胞質抽出物：NE-PER核および細胞質抽出試薬(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を、核および細胞質抽出物の調製に用いた。そのタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準品として用いてクーマシー・プラス・プロテインアッセイ(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)で定量した。
【００８８】
1次元イムノブロット：1次元イムノブロット分析は標準的な確立されたプロトコールに従って行った。抽出したNMPの各サンプルの10μgをPBS(リン酸塩緩衝食塩水)中に懸濁し、核抽出試薬(NER)中、または細胞質抽出試薬(CERII)中に懸濁した核および細胞質抽出物を12% SDS-PAGEで分離した。10μLのRainbowマーカー(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL)もロードした。次いでタンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜(Millipore, Bedford, MA)に転写し、その膜を0.2% Tween 20を加えたPBSに4% 脱脂粉乳を入れた液中で4℃で一晩ブロックした。次いでその膜をPBSと0.2%Tween20で洗った後、1:2000希釈の抗カルレティキュリンIgG(Research Diagnostics, NC, Flanders, NJ)および0.2% Tween 20を加えたPBSに2% 脱脂粉乳を入れた液で1時間インキュベートした。その膜をさらにPBSと0.2% Tween20で洗い、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL)をコンジュゲートさせた1:5000希釈のヤギ抗ウサギIgG(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL)二次抗体中で1時間インキュベートした。各タンパク質抽出の相対純度の測定には、その膜を、モノクローナルα-チューブリンマウス抗体(1:500)(細胞質チューブリンに特異的なもの)と0.2% Tween 20を加えたPBS中に2% 脱脂粉乳を入れた液で、プローブした。これらの膜をさらにPBSと0.2% Tween 20で洗い、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートさせた1:5000希釈のヤギ抗マウスIgG(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL)中で1時間インキュベートした。その膜を再度PBSと0.2% Tween 20で洗い、タンパク質をECL イムノブロットキット(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL)を用いて化学発光反応で検出した。
【００８９】
2次元イムノブロット：2次元電気泳動を行った後、ペプチド配列分析の結果カルレティキュリンと同定されたスポットが位置するゲル部分を取り出し、ポリビニリデンジフルオリド膜(Millipore, Bedford, MA)に転写した。ゲルのこの部分はゲル全体の替わりに用いたが、それは大きなゲルを用いるとブロッティングとプロセシングが困難となるためである。その後、上述と同じ方法で1次元イムノブロットを行った後、0.2% Tween 20を加えたPBSに2% 脱脂粉乳を入れた液中に1:2000の希釈の抗カルレティキュリンIgG(Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ)と1時間インキュベートした。その膜をさらにPBSと0.2% Tween 20で洗い、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL)をコンジュゲートさせた1:5000希釈のヤギ抗ウサギIgG(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL)二次抗体中で1時間インキュベートした。その膜を再度PBSと0.2% Tween 20で洗い、タンパク質をECL イムノブロットキット(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL)を用いて化学発光反応で検出した。
【００９０】
B.  結果
CC1の2次元イムノブロットは抗カルレティキュリン抗体をプローブとして調べると陽性を示した。結腸癌組織、正常隣接結腸組織および正常ドナー結腸組織の細胞質、核、および核マトリックスタンパク質画分の1次元イムノブロットをカルレティキュリンおよびα-チューブリン(細胞質にある51kDタンパク質)に対して特異的な抗体をプローブとして調べた。チューブリンは核および核マトリックスタンパク質画分には検出されず、このことは、これらの画分には細胞質物質の夾雑はないことを示している。カルレティキュリンはヒト結腸癌組織、隣接正常組織および正常ドナー組織の3種類の異なるタンパク質画分の全てで検出された(60kDバンド付近)。これらの結果はカルレティキュリンが結腸癌細胞の核タンパク質画分、より具体的には核マトリックスタンパク質画分中に存在し、その画分に存在することは細胞質のカルレティキュリンの夾雑によるものではないことを示している。1次元イムノブロッティングでは、カルレティキュリンは正常隣接結腸組織および正常ドナー結腸組織のNMP調製物中では、より検出が少なかった。
【実施例５】
【００９１】
肝臓転移した結腸癌細胞と原発性結腸癌細胞のNMPの特徴の同定
A.  種々の供給源から得たNMP中でのL1〜L5の発現
種々のNMP調製物について高分解能2次元（2D）ゲル電気泳動を行い、臨床的に価値のある5種類のタンパク質(L1〜L5)を同定した(表7)。NMP L1〜L5は、肝臓に転移した結腸癌の種々のもののNMP調製物についての2Dゲルの約83%から100%で検出された。L1〜L5は正常な肝細胞のNMP調製物中には検出されなかった。L1、L2、およびL5の3種のタンパク質は正常ドナー肝臓組織のNMP調製物中には検出されず、L3およびL4の2種のタンパク質は、正常ドナー肝臓組織のNMP調製物から調製したゲルでは結腸癌の肝臓転移の組織のものと比較すると検出のパーセンテージは低かった。これらのタンパク質のうちの4種(L1、L2、L4、およびL5)は隣接正常肝臓組織サンプル中では40%未満に検出され(表7)、一方L3タンパク質は隣接肝臓組織サンプルの92%に検出された(表7)。
【００９２】
L1、L2、L3、およびL4の4種のタンパク質はまた、原発性結腸癌細胞のNMP調製物を用いて調製されたゲルの60%以上で検出された(表7)。他方、L5タンパク質は原発性結腸癌細胞のNMP調製物を用いて調製されたゲルの20%で検出されたにすぎなかった(表7)。L3およびL4タンパク質は正常隣接結腸のNMP調製物を用いて調製したゲルでは100%で発現されており、ドナー結腸組織ではそれぞれ100%および75%に発現されていた。L2タンパク質は隣接正常結腸組織の10%で発現され、一方L1は隣接正常結腸では検出されなかったが、ドナー結腸サンプル4検体のうちの1つでは検出された(25%、表7)。同定したタンパク質の電気泳動で調べた特徴を表7に示している。
【００９３】
このように、L1〜L5は正常肝臓への転移と正常な肝細胞とではその発現に差がある。L1とL2はこれらのタンパク質の全種類のうちで最も差が大きく、その相違は結腸癌の肝臓転移対隣接肝臓組織、および原発性結腸癌対隣接結腸組織の双方で認められる。L3は肝臓転移対隣接肝臓組織、または原発性結腸癌対正常隣接結腸で差が認められる。
【表７】
2005525103.tif 000008
【００９４】
B.  肝臓および結腸癌組織ならびに細胞系統から得たNMPの分析
組織サンプルは上皮細胞、基質細胞、免疫細胞、およびその他の細胞タイプの複雑な混合物である。検出された核マトリックスの変化が実際に悪性新生物細胞中で起こっていた変化を示しているのかを調べるため、またモデルとなりうるものを同定するために、2種類のヒト原発性肝癌細胞系統のNMP組成を調べた。純粋な細胞系統から得たNMPフィンガープリントは、肝臓転移および結腸癌検体の3次元複合体と異なるであろうと予想されるが、そのNMPフィンガープリントは試薬を作製するための道具、また単一の細胞タイプを調べるための道具として役立つ。ヒト肝臓癌細胞系統Huh 7およびHepG 2、ならびにヒト結腸癌細胞系統Coco-2およびSW480を増殖させ、それらのNMPを単離した。次いでこれらのNMPを分離し、上述のとおり分析した。HepG 2細胞系統では、肝臓転移に関わるタンパク質は全く発現されず、Huh 7細胞系統は肝臓転移に関わるタンパク質のうちの1種(L1)を発現した。Caco-2細胞系統はそれらのタンパク質のうちの2種(L3、L2)を発現し、SW480細胞系統は1種のタンパク質(L2)を発現したにすぎない。これらの細胞系統中で同定されたタンパク質の電気泳動で調べた特徴は表8に示す。
【表８】
2005525103.tif 000009
【００９５】
これらの研究からは、核マトリックスタンパク質がヒトの肝臓転移から得られたNMP調製物中に一様に存在するが、正常なドナー組織または単離した肝細胞中には容易には見つからないことを示している。さらに、場合によっては、正常隣接肝臓組織に、肝臓転移に認められるものと類似の核マトリックスパターンの変化がみられる。これらの5種類のタンパク質は、原発性結腸癌中にも程度は様々ながら認められたが、その他のタイプの癌では認められなかった。
【００９６】
NMP抗体の作製を介してのこれらのタンパク質の機能の同定と検出を、結腸癌の予後判定および転移の早期発見のための試験法を開発するために用いることができる。血液または組織サンプル中の特定の核マトリックスタンパク質を検出するための抗体を作製し、ここで同定した個々のタンパク質の検出と組み合わせを含むアッセイ法を開発しうる。これらの抗体を用いたアッセイ法を開発すれば、高い感度と特異性を有する腫瘍マーカーとして用いうる。
【００９７】
さらに、肝臓転移でのユニークなNMPの存在、または癌細胞中でのアップレギュレーションは、転移の発症におけるNMPの機能に関しての新たな情報を提供しうるものであり、抗癌治療法のための新たな標的を提供しうるものである。
【実施例６】
【００９８】
2次元ゲルからの"L"タンパク質の単離および配列分析
Lタンパク質の単離と配列分析の方法は、実施例3においてCCタンパク質について述べたものと同様である。結腸直腸癌の肝臓転移のNMP調製物から単離した特定のLポリペプチドのトリプシン処理断片についてN末端アミノ酸配列分析したものを表9に示している。
【表９】
2005525103.tif 000010
【００９９】
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本発明を、広く開示し、上述の代表的な実施形態を参照して説明してきた。当業者であれば、本発明の思想および範囲から逸脱することなく様々な変形を行いうることは理解されよう。
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月24日(2004.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臨床症状の指標となるアナライトの存在について生物学的検体を分析する方法であって、該アナライトに結合する抗体と該検体とを接触させる工程、該検体中の該抗体の結合を検出する工程、及び該検出された結合を該臨床症状と相関させる工程を含み、
ここで該抗体が、
Asn-Leu-Pro-Gln-Glu(配列番号14)、
Thr-Glu-Pro-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His-Gln(配列番号15)、
Thr-Asp-Ala-Pro-Ser-Phe-Ser-Asp-Ile-Pro-Asn-Leu(配列番号16)、
Xaa-Gln-Lys-Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu(配列番号17)、または
Leu-Lys-Tyr-Glu-Asn-Glu-Val-Ala-Leu-Arg(配列番号23)
と結合するものであり、ならびに該検出される結合が細胞増殖性疾患と相関する、上記方法。
【請求項２】
前記検出される結合が結腸の細胞増殖性疾患と相関する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記検体が組織、糞便または体液サンプルである請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がAsn-Leu-Pro-Gln-Glu(配列番号14)と結合する請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がThr-Glu-Pro-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His-Gln(配列番号15)と結合する請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がThr-Asp-Ala-Pro-Ser-Phe-Ser-Asp-Ile-Pro-Asn-Leu(配列番号16)と結合する請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がXaa-Gln-Lys-Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu(配列番号17)と結合する請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がLeu-Lys-Tyr-Glu-Asn-Glu-Val-Ala-Leu-Arg(配列番号23)と結合する請求項１記載の方法。
【請求項９】
臨床症状の指標となるアナライトの存在について生物学的検体を分析する方法であって、該アナライトに結合する抗体と該検体とを接触させる工程、該検体中の該抗体の結合を検出する工程、及び該検出された結合を該臨床症状と相関させる工程を含み、
ここで該生物学的検体が体液であり、該抗体が
Thr-Glu-Pro-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His-Gln(配列番号15)
と結合し、ならびに該検出される結合が結腸の細胞増殖性疾患と相関する、上記方法。
【請求項１０】
前記体液が血清である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
本質的にAsn-Leu-Pro-Gln-Glu(配列番号14)からなる合成ペプチド。
【請求項１２】
本質的にThr-Glu-Pro-Glu-Leu-Gln-Asp-Lys-Ile-His-Gln(配列番号15)からなる合成ペプチド。
【請求項１３】
本質的にThr-Asp-Ala-Pro-Ser-Phe-Ser-Asp-Ile-Pro-Asn-Leu(配列番号16)からなる合成ペプチド。
【請求項１４】
本質的にXaa-Gln-Lys-Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu(配列番号17)からなる合成ペプチド。
【請求項１５】
本質的にLeu-Lys-Tyr-Glu-Asn-Glu-Val-Ala-Leu-Arg(配列番号23)からなる合成ペプチド。
【国際調査報告】
2005525103.tif 000011
2005525103.tif 000012
2005525103.tif 000013
2005525103.tif 000014
2005525103.tif 000015
2005525103.tif 000016
2005525103.tif 000017