(57)【要約】本発明は、生物学的サンプル中のPrPresを検出するための自動化可能な方法、およびその使用に関する。この検出方法は、プラスミノゲンが固定された固体支持体を使用する。本方法は、以下の工程を本質的に含む：(ａ)生物学的サンプルを調製することからなる工程。この間、生物学的サンプルは、イオン性または非イオン界面活性剤、グルコース含有緩衝液、スクロースベースの緩衝液、およびPBS緩衝液を含むホモジナイズ緩衝液中、またはイオン界面活性剤を含む捕捉緩衝液中でインキュベートされる。この工程は、任意に、１〜８μg/mlの範囲の最終濃度、好ましくは２〜４μg/mlの範囲の最終濃度のプロテイナーゼＫとのインキュベーションを含んでもよい；(ｂ)固体支持体にPrPresを捕捉することからなる工程。これは、必ず、上記のような捕捉緩衝液の存在下で実施しなければならない；(ｃ)支持体に固着したPrPresの制御された変性工程。これは、室温〜100℃の範囲の温度での少なくとも１つのカオトロピック剤を含む変性緩衝液とのインキュベーションを含む；(ｄ)PrPタンパク質特異的抗体で、支持体に固着した変性PrPresを検出することからなる工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)本工程の間に、生物学的サンプルを、
(ｉ)(１)イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む緩衝液、グルコース含有緩衝液、スクロースベースの緩衝液およびPBS緩衝液からなる群より選択される緩衝液と、(２)任意成分として、１〜８μg/mlの間の最終濃度、好ましくは２〜４μg/mlの間の最終濃度のプロテイナーゼＫとを含む生物学的サンプルをホモジナイズするための緩衝液；および
(ii)少なくとも(１)イオン界面活性剤からなる群より選択される界面活性剤と、(２)任意成分として、１〜８μg/mlの間の最終濃度、好ましくは２〜４μg/mlの間の最終濃度のプロテイナーゼＫとを含む捕捉緩衝液
からなる群より選択される緩衝液中でインキュベートする、生物学的サンプルを調製することからなる工程；
(ｂ)PKを含まない上記に規定した捕捉緩衝液の存在下で必ず実施し、工程(ａ)で得られた生物学的サンプルとプラスミノゲンを共有結合的に固定した固体支持体とのインキュベーションにより固体支持体にPrPresを捕捉することからなる工程；
(ｃ)少なくとも１つのカオトロピック剤を含む変性緩衝液とPrPresとの周囲温度〜100℃の温度でのインキュベーションを含み、プラスミノゲンにより固体支持体に付着したPrPresの制御された変性からなる工程；および
(ｄ)固体支持体に付着した変性PrPresをPrPタンパク質特異的抗体で検出することからなる工程
を含むことを特徴とする、プラスミノゲンを固定した固体支持体、特にマイクロタイトレーションまたは磁性ビーズを使用する生物学的サンプル中のPrPresを検出するための方法。
【請求項２】
工程(ａ)または工程(ｂ)で使用するイオン界面活性剤が
−  SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、サルコシル(ラウロイルサルコシン)、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム(DOC)またはタウロコール酸ナトリウムのようなアニオン性界面活性剤；および
−  SB 3-10(デシルスルホベタイン)、SB 3-12(ドデシルスルホベタイン)、SB 3-14(テトラデシルスルホベタイン)、SB 3-16(ヘキサデシルスルホベタイン)、CHAPSまたはデオキシ-CHAPSのような両性イオン界面活性剤
からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
本発明に従う方法の工程(ａ)で使用する非イオン界面活性剤が、C12E8(ドデシルオクタエチレングリコール)、Triton X100、Triton X114、Tween 20、Tween 80、MEGA 9(ノナノイルメチルグルカミン)、オクチルグルコシド、LDAO(ドデシルジメチルアミンオキシド)またはNP40からなる群より選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程(ａ)のインキュベーション時間が、37℃で５〜30分間であり、好ましくは37℃で10分間であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
捕捉緩衝液が、好ましくは0.5％〜２％(w/v)の最終濃度の、なおより好ましくは１％(w/v)の最終濃度のサルコシルを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
捕捉緩衝液がまた、塩、好ましくはアルカリ金属塩から選択される塩を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
塩が0.15Ｍ〜0.5Ｍの濃度の塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
捕捉緩衝液がまた、タンパク質、なおより好ましくは0.2mg/mlの濃度のウシ血清アルブミンを含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
工程(ｂ)のインキュベーション時間が周囲温度での１時間〜４時間であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
工程(ｂ)がまた、必要であれば、インキュベーションの前に、タンパク質濃度の調整をするために、工程(ａ)で得られた生物学的サンプルの捕捉緩衝液での希釈を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
制御された変性工程(ｃ)で使用するカオトロピック剤が、尿素、グアニジン塩(例えば塩酸グアニジンまたはチオシアン酸グアニジン)およびチオシアン酸ナトリウム、またはそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
工程(ｃ)のインキュベーション時間が、10〜60分間、好ましくはマイクロタイトレーションプレートで37℃にて30分間かまたは磁性ビーズで100℃にて10分間のいずれかであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
工程(ｄ)のトレーサ抗体が、SAF抗体および抗組換えPrP抗体からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
−  上記で規定したような少なくとも１つのホモジナイズ緩衝液
−  上記で規定したような少なくとも１つの捕捉緩衝液
−  上記で規定したような少なくとも１つの変性緩衝液
−  １〜８μg/mlの最終濃度、好ましくは２〜４μg/mlの最終濃度のプロテイナーゼＫ、および
−  プラスミノゲンを共有結合的に付着させた固体支持体
を組み合わせて含むことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１つに記載の方法を実施するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプル中のPrPresを検出するために完全に自動化され得る高感度で迅速および単純な方法ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性亜急性海綿状脳症(TSSE)は、異常伝染性因子(nonconventional transmissible agent；NCTA)(プリオンとも呼ばれる)により引き起こされる。その正確な性質は今日まで依然として議論されている。TSSEは、本質的には、ヒトにおけるクロイツフェルト−ヤコブ病、ヒツジおよびヤギにおけるスクラピー、およびウシ海綿状脳症(BSE)を含む。他の脳症が、ネコ科、ミンク、または雄鹿のようなある種の野生反芻動物において証明されている。
これらの疾病は着実に死に至るまで進行し、現在のところ、有効な処置は存在しない。
【０００３】
TSSEにおいて、異常型の宿主タンパク質PrP(またはプリオンタンパク質)(PrPres)の蓄積が、この疾病の臨床期の間に、主に中枢神経系において、非定形凝集体またはアミロイド斑の形態で通常観察される。PrPresは感染性を伴って複製し、その蓄積は組織学的病変の出現に先行する。インビトロで、これはニューロン培養物に対して毒性である。
【０００４】
２つのイソ型のPrP同じアミノ酸配列を有するが、二次構造が異なる。PrPresはβプリーツシートを顕著により高い含有量で有する一方、正常Prp(PrPsens)はα−ヘリックスをより高い比率で有する。
感染性イソ型PrPresは、正常タンパク質(すなわちPrPsens)を感染性タンパク質に変換し得る。
【０００５】
２つの生化学的特性により、一般に、これら２つのイソ型を区別することができる：
−  PrPresは、プロテアーゼ、特にプロテイナーゼＫ(PK)に対して部分的に抵抗性である。プロテイナーゼＫはPrPresのＮ末端の切断を生じる。PKの作用の後、PrPresは、ジグリコシル化形態の見かけ上の分子量のためにPrP27-30としばしば呼ばれる。PrPres切断部位は、通常の株についてはアミノ酸89と90との間に位置する(Prusinerら、Cell，1984)ことが一般に受け入れられている。
−  PrPresは、非イオン界面活性剤(例えば、Triton X100またはTriton 114)で不溶であり凝集し、アミロイド線維(スクラピー関連原線維；SAF)を形成する。
正常形態のプリオンタンパク質(PrPsens)は、基本的に、プロテアーゼにより完全に分解され、非イオン界面活性剤の存在下で完全に可溶である。
この感染性物質の存在を検出するために、ほとんどの方法は、プロテアーゼに対する部分的抵抗性および凝集特性を利用することによる、感染性物質に関連する異常PrP(PrPres)の選択的検出に基づいている。
【０００６】
しかし、PrPresおよびPrPsensは物理学的特性に関して異なるが、実際は、特にPrPres特異的抗体を欠くため、２つのイソ型のPrPを信頼し得るように識別することを可能にするイムノアッセイを開発することは非常に困難である。事実、現在まで、利用可能な抗体は、PrPsensまたは変性工程に曝された後の２つの形態のPrP(sensもしくはres)のいずれかを認識するものだけである。このため、TSSEの診断に貢献する実質的にすべてのイムノアッセイには、PrPresの免疫検出を可能にするように変性工程が存在する。
【０００７】
TSSEを診断するために従来から使用される５つの主要な方法は次のものである：
１．組織病理学。これは、本質的には中枢神経組織において、TSSEに特徴的な病変(海綿状態、空胞化、アストログリオーシス、PrPアミロイド斑)を検出することを目的とする。これは、臨床診断を確認するための参照方法にとどまる。この疾病のマークを直接観察することが可能になるので、組織病理学は非常に特異的である。しかし、現在、他の技法より感受性が低いことが知られている。この方法は、解剖学的病変がその疾病の過程の後期に現れるという限りにおいて、症状発現前の診断ができないという欠点を有する。加えて、これは、大規模に連続して実施される分析には全く適切でない。
【０００８】
２．免疫組織化学。これにより、PrP特異的抗体を使用してアミロイド斑またはPrPresの沈着を検出することが可能になる。顕微鏡下での観察の感度は、事実、このアプローチにより顕著に増大させることができる。これら技法は、確かに、今日最も鋭敏である方法に含まれるが、これらは、依然として面倒であり、特に確証方法として使用される。
３．電子顕微鏡観察によるアミロイド線維の検出。この方法は、相対的に鋭敏でなく、実施が面倒であるという欠点を有する。これは、今日、実質的に用いられていない。
【０００９】
４．バイオアッセイ。これは、サンプルの感染性の性質を同定することを目的とする。事実、TSSEを診断するための最も鋭敏な方法は、疑問の余地なく、実験動物での実験的感染である。この方法は、調査する組織から調製したホモジネートを動物に注射すること、および臨床的徴候の出現をモニターすることからなる。この実験的疾病の発症は、従来の技法(組織学、免疫組織学、ウェスタンブロッティング)を使用して確証する。明らかな実務上の理由のため、これらの実験は、一般に、げっ歯動物(マウス、ハムスター)で実施されるが、特定の極端な場合には、実験的感染は、ヒツジ類またはウシ属の動物で実施されている。実験的伝染の効率は、多くの要因に依存し、特に種の壁、接種した伝染性物質の量、プリオンの系統、レシピエント種の感受性、および接種の経路に依存する。最も効率的な経路は頭蓋内経路であり、次いで静脈内経路(10倍低い効率)である。最も効率が悪い経路は経口経路である(頭蓋内経路より100,000倍低い効率)。したがって、BSEを担う伝染性物質を検出するための最も鋭敏な手段は、ウシ属における頭蓋内注入である。これら方法の主な欠点は、第１には、面倒であることであり、第２には、所要期間である。実際、マウスで実験的感染試験を行なうには300〜700日かかり、ウシ属では３〜10年かかる。ドナー種と同じPrPを発現するトランスジェニックマウスを利用できれば、これら期間の短縮が可能となるが、すべての場合において、これらの試験は少なくとも３ヶ月は続く。
【００１０】
５．ウェスタンブロッティング法。これは、正常イソ型のPrP(PrPsens)を破壊するためのプロテアーゼ(例えばPF)での組織抽出物の処理、電気泳動による抽出物のタンパク質の分離、ポリマー膜へのトランスファー、およびPrPを認識する特異抗体での検出(O. Schallerら、Acta Neuropathol(Berl)，1999，98，437-443)の後の組織抽出物中のPrPresの免疫検出に基づいている。上で説明した理由のため、ウェスタンブロッティング分析を実施するためにタンパク質を変性させる限りにおいてプロテアーゼでの消化が必要である。タンパク質を変性させることは、プリオンタンパク質の正常形態(PrPsens)と病的形態(PrPres)との間の差異はもはや存在しないことを意味する。PKでの消化は、PrPsensは完全に消化される一方PrPresは比較的改変されないので、この欠点を克服する。このアプローチの特異性は、とりわけ、プロテイナーゼＫの作用下で、PrPresの分子量がそのタンパク質のＮ末端部分の部分的分解に起因して特徴的様式で改変されるという事実から生じる。その感受性は免疫組織学と同じオーダーである。この技法の主な欠点は、実施が困難であること、分析の所要期間(＞８時間)、および自動化が不可能であることに関連する。
【００１１】
より最近では、ELISAタイプのアッセイが記載されている。これらのうち、いくつかのものは、プロテアーゼでの組織抽出物の処理を含む。以下ものが記載されている：
−  Serbanら(Neurology，1990，40，110)により記載されたもの。彼らは、ニトロセルロース膜上にタンパク質を固定すること、続いてプロテアーゼ消化、変性およびモノクローナル抗体での免疫検出を含む、PrPresを検出するためのアッセイを開発した；
−  Oeschら(Biochemistry，1994，33，5926-5931により記載されたもの。彼らは、PrPresの量を定量化するために、PrPresの精製のための免疫濾過アッセイ(ELIFAまたは酵素結合免疫濾過アッセイ)を提案した；
−  Gratwohlら(1997)により記載されたもの。彼らは、ELISAタイプのアッセイを提案する。プロテイナーゼＫでのサンプルの処理および遠心分離によるPrPresの精製の後に、当該PrPresをマイクロタイトレーションプレートに吸着させ、ウサギポリクローナル抗体により検出する。
【００１２】
上記の方法のいずれも、高スループットスクリーニングに真に適してはおらず、そして自動化に適切ではあり得ない。1996年の最初の「狂牛病危機」で、この疾病がヒトに伝染する可能性が考えられた後、より簡単でより迅速な新たな診断アプローチを開発する必要があることが痛感された。これらの方法により、この動物間流行病の特徴をより正確に評価するために大規模に疫学的研究を実施すること、または食物連鎖または産業的流通に載る前に、例えば屠殺場で、すべての動物を組織的に検査することのいずれかが可能にならなければならない。このように、新世代の「迅速な」診断検査が開発されたが、そのすべてがPrPresの免疫検出に基づくものである。
【００１３】
1998年５月に、欧州委員会総合理事会XXIV(消費者政策および消費者健康保護)は、高スループットのBSEスクリーニングを実施することが可能で、産業的開発を迅速に生起させ易い技法の目録の作成を意図して、世界規模の入札招請を発した。この入札招請の終わり(1998年６月)に、４つの検査が選択された。このうち３は製造業会社により開発された：Enfer Technology Ltd(Ireland)(PCT国際出願WO 98/35236(Enfer Technology Ltd名義)およびWO 93/11155(Proteus Molecular Design Limited名義)、Prionics(Switzerland)(PCT国際出願WO 99/15651)ならびにE.G. & G. Wallac(Great Britain)(国際出願WO 00/29850)。４つめは、CEA[原子力エネルギー委員会](France)の２つの研究所で開発された。これら４つの検査の目的は、動物の脳内のPrPresの存在を検出することである。これらはみな、PrPsensを破壊しそしてPrPresの選択的な測定を可能にするためにプロテイナーゼＫでの脳抽出物の処理を含む。Prionicsの検査は、産業化された形態のウェスタンブロッティング技法を使用する一方、Enfer TechnologyおよびWallacにより開発された検査は、ELISAタイプの免疫酵素アッセイである。CEAにより開発された検査は、最初に、PrPresの選択的精製を含み、PrPresは、次いで２つのモノクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイによりアッセイされる(二部位免疫酵素測定アッセイ)。この研究は、評価した３つの検査(Prionics、EnferおよびCEA)がこの疾病の臨床病期にあるウシを特異的に検出する優秀な能力を有することを示した。さらに、CEAにより開発された検査は、それが、特にPrPresの精製/濃縮工程に起因して、競合品より顕著により敏感であることを示した(Moynaghら、Nature，1999，400，105；http:/europa.eu.int/comm/dg24/health/)。
【００１４】
したがって、本出願人は、顕著により鋭敏な検出を生じる精製工程を含むPrPresを定量的に検出するための検査を提案している。この検査は、具体的にはPCT国際出願WO 99/41280および欧州委員会総合理事会XXIV(消費者政策および消費者健康保護； http://europa.eu.int/comm/dg24/health/)の予備報告書に記載されている。PCT国際出願WO 01/35104には、上記の精製の可能性の他に、PrPresの反復オクタペプチド単位のすべてまたはいくらかが保存される条件下でPrPsensを完全に分解するようなプロテアーゼでの生物学的サンプルの処理を使用する診断方法もまた提案している。これにより、高アフィニティ抗オクタペプチド抗体を使用してPrPresを検出することが可能になる。この方法は、非常に鋭敏で非常に特異的である。しかし、この精製/濃縮方法は、検査の完全な自動化を阻むいくつかの工程、特に遠心分離工程を含む。
【００１５】
1999年以来、これら迅速検査は、危険にさらされている集団(疾病のため非常手段として破棄されるかまたは安楽死させた死亡動物)に関連する疫学的研究に関してその使用が示されてきた。2001年年頭以来、食物連鎖に載る24または30月齢を超えたすべてのウシを検査するため、これらの検査は非常に大規模に使用されている(2001年中に8.5百万検査が実施された)。
【００１６】
今日、プリオン病診断の分野で優先されているのは、変異型クロイツフェルト−ヤコブ病に関する生前検査および病状発現前検査の開発である。目的は、第１に、輸血を安全にすることであり、次いで、神経侵襲(neuroinvasion)期および最初の不可逆性臨床徴候の出現の前に(現在のところ存在していない)処置を設定することを考えることができるように、この疾病に罹患している個体の早期検出を達成することである。このことは、必然的に、血液サンプルまたは尿サンプル(これらの生物学的流体のみが非侵襲的に容易にサンプリングできる)についての検査の開発を意味する。この目的は、いくつかの刊行物が血中(Brownら、Transfusion，1999，39，1169-1178；Houstonら、The Lancet，2000，356，999-1000；Schmerrら、J．Chromat．A.，1999，853，207-214)または尿中(Shakedら、J．Biol．Chem.，2001，276，31479-31482)での感染性プリオンまたはPrPresの存在に言及しているので、達成可能であるようにみえる。しかし、このタイプのサンプルの分析は、PrPresを複製および蓄積することが知られている組織(脳、リンパ系組織)を分析する際に遭遇する問題よりも解決することがはるかに困難である分析上の問題を提起する。事実、TSSEの生理病理学に関して利用可能なデータは、結局、PrPresが、血中または尿中では脾臓または脳内より少なくとも100倍低くしか濃縮されないことを示す。さらに、これら媒体(尿、白血球)中では、おそらく、PrPresの生化学的特性は、それが実質的に蓄積する組織で観察されるものとは異なる。特に、その凝集特性およびPKに対する抵抗性は、非常に減少しているかもしれない。例えば、脳サンプルを分析するために使用するプロテイナーゼＫ処理は、血中に含まれる痕跡量のPrPresをも破壊する可能性がある。結果的に、このタイプのサンプルを分析するためには、これまでに開発されたものとは異なるストラテジーが開発されなければならない。
【００１７】
可能な選択肢の１つは、PrPresを特異的に認識することができるリガンドを使用することである。このリガンド(適切な固体支持体に固定された)により、PrPresが比較的濃縮していない媒体(例えば血液または尿)中のPrPresを濃縮することが可能になり得る。リガンドとPrPresとの間の相互作用が真に特異的である限り、プロテイナーゼＫ処理は必要なく、またPrPresの凝集特性を利用する必要もない。
【００１８】
このタイプのリガンドは、最近、Adriano Aguzzi(Fischerら、Nature，2000，408，479-483；Maissenら、The Lancet，2001，357，2026-2028)のチームにより記載されており、国際出願WO 01/23425の主題である。この国際出願では、少量のプリオンの検出を可能にするために、プリオン結合部位(精製プラスミノゲン、フィブリノーゲン、血清もしくは血漿の硫酸アンモニウム沈降物の画分Ｉ、または血清もしくは血漿の硫酸アンモニウム沈降物の画分II)を有する磁性ビーズで問題の生物学的サンプルを処理することによってPrPresまたはそのPK消化産物を濃縮することが提案されている。したがって、PrPresは、まず、プラスミノゲンまたはフィブリノーゲンを有する磁性ビーズとのインキュベーションによって濃縮され、次いで固体支持体からのPrPresの溶離後に、ウェスタンブロッティング分析、ELISA、免疫沈降、BIACOREアッセイ、免疫細胞化学アッセイまたは組織ブロットアッセイにより検出される。この方法では、条件は以下のとおりである：
【００１９】
−  サンプル調製工程：ホモジネーションおよびホモジネートの遠心分離；最初のホモジネーション工程の間は、低濃度のイオン界面活性剤を、続いて低速遠心分離(500ｇを30分間)を使用することが重要である。他方、後続の工程では、高濃度の非イオン界面活性剤を使用する。好ましくは、ホモジネート中でたかだか５mg/mlのタンパク質濃度を得る。
【００２０】
−  プロテイナーゼＫでの消化。好ましくは、50μg/mlのPKの存在下で37℃にて少なくとも30分間。
−  非イオン性緩衝液中での磁性ビーズとホモジネートとのインキュベーションの条件：周囲温度にて約１時間半。
【００２１】
−  検出条件：この操作を実施するためには、最初に、付着したタンパク質を変性させることが必要である。変性は、磁性ビーズからのタンパク質の脱着を生じる。この手順は２段階で実施する：PBS中に２％のTween 20および２％のNP-40を含む洗浄緩衝液でのビーズの洗浄、次いで、50mMのトリス(pH6.8)、２％のSDS、0.01％のブロモフェノールブルーおよび10％のグリセロールを含む電気泳動用ローディング緩衝液の添加および95℃で５分間の加熱。プラスミノゲンを含む固体支持体からこのようにして溶離させた変性PrPresは、次いで、ウェスタンブロッティングにより分析する。事実、プラスミノゲンに結合しているときにPrPresを検出することが可能なPrPresに特異的な抗体は存在しないので、プラスミノゲン/PrPres結合を破壊し、したがってPrPresを変性させて他の方法により変性形態のPrPres(このことはPrPresがビーズから脱着していることを意味する)を検出する必要がある。このような手順は、ウェスタンブロッティング分析に適切であるが、マイクロタイトレーションプレートまたは磁性ビーズのような支持体を使用するELISAタイプのアッセイには全く適切ではない。事実、国際出願WO 01/23425に記載された方法で使用される条件(特にSDSの使用)は、変性させたときのプラスミノゲン/PrPres複合体の解離のために、固体支持体に結合させる追加工程が必要であることを意味する。加えて、この出願に記載された方法は、大量のサンプル中に含まれるPrPresを濃縮することが可能であることを示していないことに留意すべきである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
このため、本出願人は、特に以下の点において先行技術の検出方法よりTSSEの診断の現在の目的に完全に合致する、PrPresを検出するための特異的で高感度の単純および迅速な方法を提供することを目標とすることを自らに課した：
−  使用が容易であること、すなわち、ルーチン使用の条件により適切であり、したがって完全に自動化できるという点、および
−  そのPK抵抗性または凝集特性を利用することなくPrPresを精製および濃縮することができる点。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の主題は、プラスミノゲンを固定した固体支持体(特に磁性ビーズまたはマイクロタイトレーションプレート)を使用して生物学的サンプル中のPrPresを検出するための方法である。この方法は、以下の点を特徴とする：
【００２４】
(ａ)生物学的サンプルを調製することからなる工程。生物学的サンプルは、組織もしくは細胞のホモジネート、血清もしくは血漿、または尿のいずれかからなってもよく、この工程の間、サンプルは以下からなる群より選択される緩衝液中でインキュベートされる。
(ｉ)(１)イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１つの界面活性剤を含む緩衝液、グルコース含有緩衝液、スクロースベースの緩衝液、ならびにPBS緩衝液からなる群より選択される緩衝液、および(２)任意成分として、１〜８μg/mlの最終濃度、好ましくは２〜４μg/mlの最終濃度のプロテイナーゼＫ、を含む生物学的サンプルをホモジナイズするための緩衝液；および
(ii)少なくとも(１)イオン界面活性剤からなる群より選択される界面活性剤、および(２)任意成分として、１〜８μg/mlの最終濃度、好ましくは２〜４μg/mlの最終濃度のプロテイナーゼＫ、を含む捕捉緩衝液。
【００２５】
下記の工程(ｂ)で選択される捕捉条件下では、プラスミノゲンはPrPresを非常に優先的に認識するが、ある状況では、事前の制御されたPKでの処理(すなわち、生物学的サンプルを調製するための工程(ａ)の間の)により、残るPrPsens認識に関連するシグナルを排除することが可能になる。この理由のため、この工程でのPKの制御された使用は任意であると考える。さらに、PKでの処理がPrPres(例えば血液または尿サンプル中の)に影響する心配があり得る状況では、このPK処理工程は省略することができる。
使用するPKの濃度は、国際出願WO 01/23425で使用された濃度(50μg/ml)またはPKを使用する他の検査での濃度(通常40と100μg/mlとの間)よりずっと低いことに留意すべきである。
【００２６】
(ｂ)固体支持体にPrPresを捕捉することからなる工程。これは、必ず、工程(ａ)で得られた生物学的サンプルとプラスミノゲンが共有結合的に固定された支持体とのインキュベーションにより、PKを含まない上記のような捕捉緩衝液(すなわち、その中の界面活性剤はもっぱらイオン界面活性剤である)の存在下で実施される。この工程は、必要であれば、インキュベーションの前に、特に工程(ａ)がホモジナイズ用緩衝液中で実施されたときには、タンパク質濃度の調整をするために、当該捕捉緩衝液中の工程(ａ)で得られた生物学的サンプルの希釈を含む。
【００２７】
生物学的サンプル中の最適なタンパク質濃度は、研究する媒体に従って変化する。脳ホモジネートの場合、約２mg/ml(２％w/vのホモジネートに対応する)を超えないのが好ましい。そうでなければ、PrPresの捕捉効率の損失が観察されるかもしれない。この限界は、おそらく、サンプル中の特徴付けられていない物質(これ自体はまたプラスミノゲンに結合し得る)の存在に関連する。これは、より濃縮されたホモジネート(20％w/v(すなわち約20mg/mlのタンパク質)のホモジネート)を処理することを可能にする他の方法の濃縮(例えばPCT国際出願WO 99/41280に記載されたもの)と比較して欠点を構成する。
【００２８】
(ｃ)プラスミノゲンにより支持体に付着したPrPresの制御された変性からなる工程。これは、周囲温度と100℃との間の温度での少なくとも１つのカオトロピック剤を含む変性緩衝液とPrPresとのインキュベーションを含む。
この制御された変性工程は、プラスミノゲン/PrPres複合体の維持と両立する。
(ｄ)PrPタンパク質特異的抗体を用いて支持体に付着した変性PrPresを検出することからなる工程。
【００２９】
有利には、捕捉工程(ｂ)の後、PrPresが付着している可能性がある支持体を、洗浄することができる。洗浄条件、特に使用する洗浄緩衝液は、本発明に従う方法では本質的でない。
【００３０】
本発明に従う方法の有利な実施形態によれば、工程(ａ)または工程(ｂ)で使用するイオン界面活性剤は、以下からなる群より選択する：
−  アニオン性界面活性剤、例えばSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、サルコシル(sarkosyl)(ラウロイルサルコシン)、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム(DOC)またはタウロコール酸ナトリウム；および
−  両性イオン界面活性剤、例えばSB 3-10(デシルスルホベタイン)、SB 3-12(ドデシルスルホベタイン)、SB 3-14(テトラデシルスルホベタイン)、SB 3-16(ヘキサデシルスルホベタイン)、CHAPSまたはデオキシ-CHAPS。
【００３１】
本発明に従う方法の別の有利な実施形態によれば、本発明に従う方法の工程(ａ)で使用する非イオン界面活性剤は、C12E8(ドデシルオクタエチレングリコール)、Triton X100、Triton X114、Tween 20、Tween 80、MEGA 9(ノナノイルメチルグルカミン)、オクチルグルコシド、LDAO(ドデシルジメチルアミンオキシド)またはNP40からなる群より選択する。
【００３２】
本発明に従う方法の別の有利な実施形態によれば、工程(ａ)のインキュベーション時間は、37℃で５〜30分の間であり、好ましくは37℃で10分間である。
【００３３】
本発明に従う方法の別の有利な実施形態によれば、捕捉緩衝液は、好ましくは0.5％〜２％(w/v)の間の最終濃度のサルコシル、なおより好ましくは１％(w/v)の最終濃度のサルコシルを含む。
本発明に従う方法の別の有利な実施形態によれば、捕捉緩衝液はまた、塩を、好ましくはアルカリ金属塩から選択される塩、好ましくは塩化ナトリウムを、なおより好ましくは0.15Ｍ〜0.5Ｍの間の濃度で含む。
本発明に従う方法のなお別の有利な実施形態によれば、捕捉緩衝液はまた、タンパク質を、なおより好ましくは0.2mg/mlの濃度のウシ血清アルブミンを含む。
【００３４】
本発明に従う方法の別の有利な実施形態によれば、工程(ｂ)のインキュベーション時間は、周囲温度での１時間〜４時間の間である。
【００３５】
本発明に従う別の有利な実施形態によれば、制御された変性工程(ｃ)で使用するカオトロピック剤は、尿素、グアニジン塩(例えば塩酸グアニジンまたはチオシアン酸グアニジン)およびチオシアン酸ナトリウム、またはそれらの混合物からなる群より選択する。
本発明に従う方法の別の有利な実施形態によれば、工程(ｃ)のインキュベーション時間は、10〜60分の間、好ましくはマイクロタイトレーションプレートで37℃にて30分間か、または磁性ビーズで100℃にて10分間のいずれかである。
【００３６】
本発明に従う方法の別の有利な実施形態によれば、工程(ｄ)のトレーサ抗体は、SAF抗体および抗組換えPrP抗体からなる群より選択されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。より正確にはSAF抗体、より具体的にはSAF-34、SAF-53およびSAF-61抗体は、PrP遺伝子をノックアウトしたマウスを変性ハムスターSAFで免疫することにより得られた(Demartら、Biochem．Biophys．Res．Commun.，1999，265，652-657)。BAR-221、BAR-224およびBAR-233抗体は、PrP遺伝子をノックアウトしたマウスを組換えヒツジPrPで免疫することにより得られた。8G8抗体は、PrP遺伝子をノックアウトしたマウスを組換えヒトPrPで免疫することにより得られた(Krasemannら、J．Immunol．Methods，1996，199，109-118およびMol．Med.，1996，2，725-734)。
【００３７】
本発明に従えば、固体支持体は、有利には、磁性ビーズおよびマイクロタイトレーションプレートからなる群より選択する。
【００３８】
驚くべきことに、生物学的サンプルを、
−  必要であれば、任意にPKを非常に低濃度(１〜８μg/mlの間)で含んでもよいホモジナイズ用緩衝液中でホモジナイズし、
−  界面活性剤としてもっぱらイオン界面活性剤を含む捕捉緩衝液中でインキュベートし、
−  プラスミノゲンを共有結合的に付着させた固体支持体と接触させ、
−  次いで、制御された変性工程(これもまた驚くべきことに、PrPres−プラスミノゲン結合の破壊を生じない)に付すことにより、追加の工程を必要とすることなく、固体支持体へのPrPresの選択的付着および固体支持体上のPrPresの直接アッセイが可能になる。
【００３９】
このような方法は、遠心分離工程を必要とするPCT国際出願WO 99/41280に記載された方法とは異なり、連続的な完全自動化アッセイの実施を可能にする。このようなアッセイはまた、PCT国際出願WO 99/41280に記載されるような精製工程を使用する方法で得られる感度と少なくとも同様に良好である感度を有する。
【００４０】
本発明の主題はまた、
−  上記のような少なくとも１つのホモジナイズ用緩衝液
−  上記のような少なくとも１つの捕捉緩衝液
−  上記のような少なくとも１つの変性緩衝液
−  １〜８μg/mlの間の最終濃度、好ましくは２〜４μg/mlの間の最終濃度のプロテイナーゼＫ、および
−  プラスミノゲンが共有結合的に付着した固体支持体
を組み合わせて含むことを特徴とする上記の方法を実施するための診断キットである。
【００４１】
上記のものを提供するほか、本発明は、以下の記載から明らかになる他のものも提供する。以下の記載は本発明に従う非限定的な実施例に言及し、また添付の図面にも言及する。
【００４２】
添付図面において、
−  図１は、CP(ポジティブコントロール)対CN(ネガティブコントロール)のシグナル比に対するプロテイナーゼＫ濃度の効果を説明する。
−  図２は、従来の「サンドイッチ」アッセイ(BAR-224/SAF-34)を使用するかまたはプラスミノゲン/BAR224カップルを用いるヒツジPrPres検出の比較研究を表す。
−  図３は、国際出願WO 99/41280に記載の技法または本発明に従う方法(マイクロタイトレーションプレート上でのプラスミノゲン/BAR224サンドイッチアッセイ)を使用する、スクラピーに罹患しているヒツジからのPrPresのアッセイの比較研究を表す。
−  図４は、スクラピーに罹患しているヒツジからのPrPresの直接アッセイ(本発明)および間接アッセイ(国際出願WO 01/23425に従う方法)の比較研究を表す。本発明に従って磁性ビーズに固定したプラスミノゲンによる捕捉条件と国際出願WO 01/23425に従って磁性ビーズに固定したプラスミノゲンによる捕捉条件の比較。
−  図５は、SAFの調製、続いて免疫測定アッセイからなる技法を使用するPrPresの検出(PCT国際出願WO 99/41280)と、プラスミノゲンとカップリングさせたビーズへのPrPresの捕捉、続いて直接アッセイを使用するPrPresの検出(本発明)との比較を説明する。
−  図６は、磁性ビーズにカップリングさせたプラスミノゲン上での直接アッセイによるPrPresの検出に対する、スクラピーに罹患しているヒツジからの脳ホモジネートの希釈の効果を表す。
−  図７は、TSSEに罹患しているマウス、ウシおよびヒトからの脳についての希釈曲線を表す。これは、本発明に従う方法がすべてのTSSEについての診断を提供することができることを説明する。
【実施例】
【００４３】
実施例１：本発明に従う検出方法：種々のパラメータの最適化
１．Covalink NH固体支持体とのプラスミノゲンのカップリング
プラスミノゲンを、ホモ二官能性カップリング剤であるジスクシンイミジルスベレート(DSS)を用いてCovalik NHマイクロタイトレーションプレート(Nunc)の表面に共有結合的に固定する。100μlのDSS溶液(50mlのDMSOおよび50mlの50mMカルボン酸緩衝液(pH9.5)に溶解した12.5mgのDSS)を、Covalink NHウェルの表面で周囲温度にて１時間インキュベートする。
ウェルを蒸留水で３回洗浄し、次いで50mMカルボン酸緩衝液(pH9.5)中2.5μg/mlのプラスミノゲン溶液100μlを、ウェルの表面で周囲温度にて一晩インキュベートする。ウェルを空にして、EIA緩衝液(0.15ＭのNaCl、0.1％BSAおよび0.01％アジ化ナトリウムを含む0.1Ｍリン酸緩衝液(pH7.4))で飽和させる。
【００４４】
２．サンプルの調製(本方法の工程(ａ))およびプラスミノゲンを含むCovalink NHマイクロタイトレーションプレート上へのPrPresの捕捉(本方法の工程(ｂ))
Ａ．捕捉の観点でサンプルを調製するための条件
スクラピーに罹患しているヒツジ(CP＝ポジティブコントロール)または正常ヒツジ(CN＝ネガティブコントロール)からの25μlの脳ホモジネートを、イオン界面活性剤および１μg/mlの最終濃度のプロテイナーゼＫを含む225μlのEIA緩衝液(pH7.4)と37℃にて10分間インキュベートし、次いで10μlの100mM Pefabloc(商標)([4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニル]フルオリドHClに対応するプロテアーゼインヒビター)を添加する。100μlのサンプルを、プラスミノゲンを含むCovalink NHマイクロタイトレーションプレートのウェル中に堆積させ、周囲温度にて２時間インキュベートする。
【００４５】
Ｂ．Covalink NH固体支持体に固定したプラスミノゲンによるPrPresの捕捉に対する界面活性剤の効果
下記の表Ｉは、BAR-224抗体を使用して、グアニジン/HClでの処理による制御された変性の後にプラスミノゲンと会合しているPrPresを検出して得られた結果を説明する。
この表Ｉは、プラスミノゲンによるPrPresの捕捉について試験した条件を記述する。この表は、種々の界面活性剤：サルコシル＝SK、Triton X100＝Ｔ、NP40＝Nonidet P40、Tween 20＝Tweenおよびドデシル硫酸ナトリウム＝SDSの効果の詳細を提供する。
【００４６】
【表１】
2005537463.tif 000002
【００４７】
残りのアッセイのために選択した捕捉条件は、たとえ上記表Ｉにおいて他の条件がわずかにより高いCP/CN比を与えるとしても、EIA緩衝液＋１％SKである。なぜなら、他の条件は差分CP-CNが高く、他の実験ではCN値が変化して結果が逆転したからである。
界面活性剤の非存在下では、特異的な捕捉は観察されない(PrPsensの結合さえ観察される)。
最良の結果は、界面活性剤としてサルコシルを使用して得られる。
【００４８】
Ｃ．Covalink NH固体支持体に固定したプラスミノゲンによるPrPresの捕捉に対するpHおよびNaCl濃度の効果
スクラピーに罹患しているヒツジまたは正常ヒツジからの25μlの脳ホモジネートを、種々のNaCl濃度を含有し種々のpH値でありそして１％の最終濃度(w/v)のサルコシルおよび１μg/mlの最終濃度のプロテイナーゼＫを含む225μlのEIA緩衝液と37℃にて10分間インキュベートし、次いで10μlの100mMのPefabloc(商標)を添加する。次いで、上記のような手順を実施する。
表IIに得られた結果を示す。
【００４９】
【表２】
2005537463.tif 000003
【００５０】
好ましく選択されたPrPres捕捉条件は、以下のとおりである：EIA緩衝液＋0.5Ｍ  NaCl＋１％SK。
【００５１】
Ｄ．CP/CN比に対するプロテイナーゼＫ濃度の効果
スクラピーに罹患しているヒツジまたは正常ヒツジからの25μlの脳ホモジネートを、0.5Ｍ  NaCl、１％の最終濃度のサルコシルおよび種々の濃度(０、0.5、１、２、４および８μg/mlの最終濃度)のプロテイナーゼＫを含む225μlのEIA緩衝液(pH7.4)と37℃にて10分間インキュベートし、次いで10μlの100mM  Pefabloc(商標)を添加する。
次いで、上記のような手順を実施した。
表IIIおよび図１に得られた結果を示す。
【００５２】
【表３】
2005537463.tif 000004
【００５３】
これらの結果は、低濃度(２〜４μg/ml)のPKは、CP/CN比を改善しつつ、同時に良好なCPシグナルを保存することを示す。
【００５４】
３．プラスミノゲン/PrPres複合体が解離していない条件下でのPrPresの制御された変性
Ａ．好ましい変性条件
周囲温度にて２時間の反応後、ウェルを洗浄し、次いで100μlのグアニジン/HCl(８Ｍ)と37℃にて30分間インキュベートする。
【００５５】
Ｂ．捕捉後で標識抗体でのPrPresの検出前に使用する変性剤の効果
スクラピーに罹患しているヒツジおよび正常ヒツジからの25μlの脳ホモジネートを、0.5Ｍ  NaCl、１％のサルコシルおよび１μg/mlの最終濃度のプロテイナーゼＫを含む225μlのEIA緩衝液(pH7.4)と37℃にて10分間インキュベートし、次いで10μlの100mM  Pefabloc(商標)を添加する。100μlを、固定したプラスミノゲンを含むマイクロタイトレーションプレートのウェル中に堆積させる。
周囲温度にて２時間の反応後、ウェルを洗浄し、次いで100μlの種々の変性剤と37℃にて30分間インキュベートする。
ウェルを再び洗浄し、次いでトレーサ抗体(５エルマン単位/mlのBAR224)と周囲温度にて２時間インキュベートする。
洗浄後、200μlの可視化溶液(エルマン試薬)を添加する。ウェルの414nmでの吸光度を、30分間の反応後に測定する。
表IVに得られた結果を示す。
【００５６】
【表４】
2005537463.tif 000005
【００５７】
試験した特定の条件のみが良好なCPシグナルを与える：PrPresの良好な検出を与えるのは常に、強力なカオトロピック剤(例えば、尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジンおよびチオシアン酸ナトリウム)である。
【００５８】
４．固体支持体上で直接プラスミノゲンと複合体化したPrPresの検出：可視化抗体の選択
変性剤として８Ｍグアニジン/HClを使用して、３．に記載したように手順を実施する。
８つの抗体SAF34、SAF53、SAF61、8G8、BAR221、BAR224、BAR231およびBAR233を５エルマン単位/mlで試験した。
表Ｖに得られた結果を示す。
【００５９】
【表５】
2005537463.tif 000006
【００６０】
トレーサ抗体BAR224が、ヒツジPrPresを検出するために、最良のCP/CN比を、そしてまた良好なCPシグナルも与える。
【００６１】
実施例２：従来の「サンドイッチ」アッセイ(BAR224/SAF34)を使用するヒツジPrPresとプラスミノゲン/BAR224カップルを用いるヒツジPrPresの検出の比較研究
本研究により、２つのタイプのサンドイッチの検出感度を比較することが可能となった。PrPresの調製物(SAF)をスクラピーに罹患しているヒツジの脳から得た：
−  BAR224/SAF34サンドイッチアッセイについて：スクラピーに罹患しているヒツジまたは正常ヒツジからの250μlの脳ホモジネートからのSAF調製物(PCT国際出願WO 99/41280に記載されたような迅速SAFプロトコルに従う)を得、25μlの変性緩衝液(PCT国際出願WO 99/41280に記載されたような緩衝液Ｃ)で100℃にて10分間変性させる。ペレットを250μlのEIA緩衝液を用いて採取し、EIA緩衝液に系列希釈する。希釈物を、BAR224抗体を含むマイクロタイトレーションプレートのウェル中に堆積させる。周囲温度にて２時間の反応後、ウェルを洗浄し、次いで100μlのSAF34トレーサ抗体(５EU/ml)と周囲温度にて２時間インキュベートする。洗浄後、200μlの可視化溶液を添加する。414nmでの吸光度を30分間の反応後に測定する。
−  プラスミノゲン/BAR224サンドイッチアッセイについて：SAF調製物(上記と同一)を、最終濃度４mMのPefabloc(商標)を含む250μlのEIA緩衝液を用いて採取し、次いでペレットが溶解するまで超音波により処理する。次いで、系列希釈を、Pefabloc(商標)を含むEIA緩衝液中で実施する。希釈物を、プラスミノゲンを含む固体支持体(マイクロタイトレーションプレート)上に堆積させる。周囲温度にて２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄する。洗浄工程後、PrPresを、グアニジン/HCl(８Ｍ、37℃にて30分間)を用いて制御された様式で変性させ、次いで種々のウェルを100μlのBAR224トレーサ抗体(５EU/ml)と周囲温度にて２時間インキュベートする。洗浄後、200μlの可視化溶液を添加する。414nmでの吸光度を30分間の反応後に測定する。
図２に得られた結果を示す。図２は、２つのシステムが匹敵する感度を提示し、完全な免疫学的アッセイがわずかには有利であることを示す。
【００６２】
実施例３：PCT国際出願WO 99/41280に従う技法および本発明に従うマイクロタイトレーションプレート上でのプラスミノゲン/BAR224サンドイッチアッセイを使用する、スクラピーに罹患しているヒツジからのPrPresのアッセイの比較研究
この第２の実験では、国際出願WO 99/41280に従う方法については、SAF調製技法を、そしてプラスミノゲン技法については、特には20mg/ml(２％w/v)のホモジネート中のタンパク質濃度を得るために、捕捉前に実施しなければならない希釈を含めて、２つの方法の感度比較する。
スクラピーに罹患しているヒツジからの脳を20％含むホモジネートを、正常ヒツジ脳ホモジネートで希釈する(1/5、1/10、1/20、1/40、1/80、1/160および1/320希釈)かまたは希釈しない。
【００６３】
国際出願WO 99/41280に従う試験の場合、SAFを250μlのホモジネートから調製する。検出パートのためには、それぞれ捕捉抗体およびトレーサ抗体としてBAR224抗体およびSAF34抗体を使用する。
本発明に従う試験の場合：
・プラスミノゲンを実施例１で示したようにマイクロタイトレーションプレートに固定し、
・捕捉緩衝液として、0.5Ｍ  NaCl、１％のサルコシルおよび2.5μg/mlのプロテイナーゼＫ、変性剤としての８Ｍグアニジン/HClおよびトレーサ抗体としてのBAR224を含むEIA緩衝液を使用して、25μlのホモジネートでアッセイを実施する。
【００６４】
結果を図３に示す。結果は、PCT国際出願WO 99/41280に従う試験が、感度に関して非常に明らかな利点を有することを示す。この理由は、その試験が、250μlの20％ホモジネート(すなわち50mgの脳組織)を、本発明に従う試験のための25μlの同じ20％ホモジネート(すなわち５mg)の代わりに処理することによる。この不利は、マイクロタイトレーションプレートを使用することの結果である。なぜなら、処理される２％ホモジネートの容量が制限されている(最大300μl)からである。しかし、非常に大容量(少なくとも50ml)を処理することを可能にする磁性ビーズを使用するときにはこのような不利はなくなる。
【００６５】
実施例４：磁性ビーズに固定したプラスミノゲンに付着させたスクラピーに罹患しているヒツジからのPrPresの本発明に従う直接アッセイと間接アッセイの比較研究。国際出願WO99/41280で使用した捕捉条件との比較
−  100μgのプラスミノゲンを１mlの磁性ビーズ(Dynal M-280)に製造業者が記載した方法に従ってカップリングさせた。
−  スクラピーに罹患しているヒツジまたは正常ヒツジからの脳を20％含む25μlのホモジネートを、
(１)225μlの上記のような捕捉緩衝液、または
(２)３％のNP-40および３％のTween-20を含む225μlのPBS(PCT国際出願WO 01/23425に記載された条件)
のいずれかとインキュベートする。
−  プラスミノゲンとカップリングした10μlのビーズを各サンプルに添加し、次いで周囲温度にて２時間、回転させながらインキュベートする。ビーズを
(１)１％のTween 20を含むEIA緩衝液、または
(２)２％のNP-40および２％のTween 20を含むPBS
のいずれかで３回洗浄する。
PBSでの洗浄後、直接アッセイのためには30μlの６Ｍグアニジン/HClを添加し、間接アッセイのためには30μlの６Ｍ尿素および0.25％サルコシルを添加し、次いで100℃にて10分間インキュベーションを実施する。
【００６６】
結果を図４に示す。
・直接アッセイの場合、変性工程後、プラスミノゲンとカップリングしたビーズを洗浄し、次いでEIA緩衝液/１％Tween 20中の500μlのBAR224トレーサ(５EU/ml)と周囲温度にて２時間、激しく撹拌しながらインキュベートする。次いで、ビーズを、EIA緩衝液/１％Tween 20で２回、PBSで１回洗浄した後に600μlのエルマン試薬を添加する。30分間の反応後、200μlの反応媒体を取り出し、412nmでの吸光度を測定する。
・間接アッセイの場合、変性工程後、プラスミノゲンから溶離した変性PrPを、300μlのEIA緩衝液で採取し、そしてBAR224/SAF34「サンドイッチ」アッセイを使用して測定する。
本発明に従う捕捉条件により、国際出願WO 01/23425の捕捉条件で得られる結果より顕著に優れた結果を得ることが可能になることが本実施例から明らかになる。より単純な直接アッセイがまたより高感度であることにも注目すべきである。
【００６７】
実施例５：SAF調製技法、続いて免疫測定アッセイを使用するPrPresの検出(国際出願WO 99/41280に従う方法)と、プラスミノゲンとカップリングしたビーズへのPrPresの捕捉、続いて直接アッセイを使用するPrPresの検出の比較
PCT国際出願WO 99/41280に記載された方法に従うPrPresアッセイの場合、SAFを、正常ヒツジまたはスクラピーに罹患しているヒツジからの脳を20％含む500μlのホモジネートから調製する(正常ヒツジ脳ホモジネートで1/10、1/50および1/100に希釈するか、または希釈しない)。SAFペレットを採取し、50μlの変性緩衝液(PCT国際出願WO 99/41280に記載のような緩衝液Ｃ)で100℃にて10分間変性させる。次いで、PrPの量を、BIO-RAD Platelia(商標)BSE検出キット(ref.51103)(PCT国際出願WO 99/41280に記載された方法に従う精製後のPrPresのインビトロ検出用の酵素抗体キット)で測定する。
【００６８】
磁性ビーズにカップリングしたプラスミノゲンを使用するアッセイの場合、500μlのホモジネート(上記と同一)を、0.5Ｍ  NaClおよび１％のサルコシルを含むEIA緩衝液中に10倍に希釈し、次いで固定化プラスミノゲンを含む30μlのビーズと周囲温度にて３時間インキュベートする。洗浄後、制御された変性を、グアニジン/HCl溶液で100℃にて10分間処置することにより実施する。EIA緩衝液/１％Tween 20での３回の洗浄およびPBSでの１回の洗浄後、ビーズを、EIA緩衝液中のBAR224トレーサと周囲温度にて２時間インキュベートする。ビーズを再びEIA緩衝液/１％Tween 20で３回、そしてPBSで１回洗浄した後、可視化溶液(エルマン試薬)を添加する。
【００６９】
結果を図５に示す。図５は、プラスミノゲン技法がPCT国際出願WO 99/41280に従う試験と少なくとも同程度の感度であるようであることを示す。磁性ビーズの使用により、より大容量での作業およびプラスミノゲンでの捕捉の前にホモジネートを希釈する必要性に関連する不利点の補償が可能になる。
【００７０】
実施例６：磁性ビーズにカップリングさせたプラスミノゲンでの直接アッセイによるPrPres検出に対するスクラピーに罹患しているヒツジからの脳ホモジネートの希釈の効果。本方法が大容量のサンプルに希釈したPrPresを濃縮することが可能であることの証明
スクラピーに罹患しているヒツジからの500μlの脳ホモジネートを、0.5Ｍ  NaClおよび１％のサルコシルを含む５、10、20および50mlのEIA緩衝液(pH7.4)に希釈し、次いで30μlのプラスミノゲンにカップリングさせたビーズと周囲温度にて４時間インキュベートする。次いで手順を上記のように実施する。
結果を図６に示す。図６は、本発明に従う方法が希PrPresを濃縮することができることを示す。
【００７１】
実施例７：TSSEに罹患しているマウス、ウシおよびヒトからの脳ホモジネート中のPrPresの検出への本発明の適用
(ヒツジスクラピー系統に感染した)マウスの脳、(BSEに感染した)ウシまたは(クロイツフェルト−ヤコブ病に感染した)ヒトの脳から得た20％(w/v)のホモジネートを、捕捉緩衝液(0.5Ｍ  NaClおよび１％(v/v)サルコシル(最終濃度)を含むEIA緩衝液)に１％(w/v)の濃度に希釈した。次いで、これらのホモジネートを、固定化プラスミノゲンを含む磁性ビーズと接触させ、実施例４に記載の条件下で分析した。
より正確には、850μlのEIA緩衝液/0.5Ｍ  NaCl＋50μlの10％SK＋10μlのプラスミノゲンカップリング磁性ビーズを、50μlのネガティブコントロールまたはポジティブコントロールの脳ホモジネート(ネガティブホモジネート＋50μlの10％SKに希釈するかまたは希釈しない)に添加する。インキュベーションを周囲温度にて２時間30分間、回転させながら実施する。次いで、ビーズを、１％のTween 20を含むEIA緩衝液で３回洗浄し、次いでPBSで１回洗浄する。制御された変性を、50μlの４Ｍチオシアン酸グアニジン(Gn/SCN)の存在下で、100℃にて８分間実施する。変性工程の後、ビーズをPBS中で洗浄し、次いで500μlのトレーサ抗体と周囲温度にて２時間、激しく撹拌しながらインキュベートする(５EU/ml)。次いで、ビーズを、EIA緩衝液/１％Tween 20で２回、そしてPBSで１回洗浄した後、１mlのエルマン試薬を添加する。20分間の反応後、200μlの反応媒体を取り出し、412nmでの吸光度を測定する。
この実験(図７)は、記載した試験がヒツジ以外の種で機能し、スクラピー系統以外のプリオン系統を検出することが可能であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】CP(ポジティブコントロール)対CN(ネガティブコントロール)のシグナル比に対するプロテイナーゼＫ濃度の効果を説明する。
【図２】従来の「サンドイッチ」アッセイ(BAR-224/SAF-34)を使用するかまたはプラスミノゲン/BAR224カップルを用いるヒツジPrPres検出の比較研究を表す。
【図３】国際出願WO 99/41280に記載の技法または本発明に従う方法(マイクロタイトレーションプレート上でのプラスミノゲン/BAR224サンドイッチアッセイ)を使用する、スクラピーに罹患しているヒツジからのPrPresのアッセイの比較研究を表す。
【図４】スクラピーに罹患しているヒツジからのPrPresの直接アッセイ(本発明)および間接アッセイ(国際出願WO 01/23425に従う方法)の比較研究を表す。本発明に従って磁性ビーズに固定したプラスミノゲンによる捕捉条件と国際出願WO 01/23425に従って磁性ビーズに固定したプラスミノゲンによる捕捉条件の比較。
【図５】SAFの調製、続いて免疫測定アッセイからなる技法を使用するPrPresの検出(PCT国際出願WO 99/41280)と、プラスミノゲンとカップリングさせたビーズへのPrPresの捕捉、続いて直接アッセイを使用するPrPresの検出(本発明)との比較を説明する。
【図６】磁性ビーズにカップリングさせたプラスミノゲン上での直接アッセイによるPrPresの検出に対する、スクラピーに罹患しているヒツジからの脳ホモジネートの希釈の効果を表す。
【図７】TSSEに罹患しているマウス、ウシおよびヒトからの脳についての希釈曲線を表す。これは、本発明に従う方法がすべてのTSSEについての診断を提供することができることを説明する。
【図１】
2005537463.tif 000007
【図２】
2005537463.tif 000008
【図３】
2005537463.tif 000009
【図４】
2005537463.tif 000010
【図５】
2005537463.tif 000011
【図６】
2005537463.tif 000012
【図７】
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【国際調査報告】
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