(57)【要約】  本発明は、遺伝子発現の調節に関する核酸構築物、発現系、および方法を提供する。本発明を適用して、ウイルス粒子のパッケージングに必要なウイルス成分をコードするコード配列を含め、目的の任意のコード配列の発現を調節し得る。本発明は、例えば、第１核酸構築物、第２核酸構築物、および第３核酸構築物を含むパッケージング細胞であって、該核酸構築物は、ウイルスベクターをパッケージングするために必要な、１以上のウイルス遺伝子産物の発現を調節し、ここで該第１核酸構築物は、コードされる第１産物の発現を調節する、テトラサイクリンによって調節されるプロモーター／オペレーターを含み；該第１産物は、該第２核酸構築物にコードされる第２産物の発現を調節し得；そして該第２産物は、該ウイルス遺伝子産物の発現を調節し得、該ウイルス遺伝子産物は、該第３核酸構築物に存在する配列によってコードされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１核酸構築物、第２核酸構築物、および第３核酸構築物を含むパッケージング細胞であって、該核酸構築物は、ウイルスベクターをパッケージングするために必要な、１以上のウイルス遺伝子産物の発現を調節し、ここで
該第１核酸構築物は、コードされる第１産物の発現を調節する、テトラサイクリンによって調節されるプロモーター／オペレーターを含み；
該第１産物は、該第２核酸構築物にコードされる第２産物の発現を調節し得；そして
該第２産物は、該ウイルス遺伝子産物の発現を調節し得、該ウイルス遺伝子産物は、該第３核酸構築物に存在する配列によってコードされる、細胞。
【請求項２】
前記第１産物が、テトラサイクリンによって調節されるプロモーター／オペレーターのトランスアクチベーターまたは該トランスアクチベーター含有融合タンパク質である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記第２核酸構築物が、テトラサイクリンによって調節されるプロモーター／オペレーターを含む、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記第２産物が、ｒｅｖタンパク質である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項５】
前記第３構築物が、レトロウイルスの５’ＬＴＲ由来のプロモーターを含む、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項６】
第１核酸構築物、第２核酸構築物、および第３核酸構築物を含むパッケージング細胞であって、該核酸構築物は、ウイルスのエンベロープまたはＧタンパク質のうちの１以上の発現を調節し、ここで
該第１核酸構築物は、コードされる第１産物を発現し得；
該第１産物は、該第２核酸構築物にコードされる第２産物の発現を調節し得；そして
該第２産物は、該ウイルスのエンベロープまたはＧタンパク質の発現を調節し得、該ウイルスのエンベロープまたはＧタンパク質は、該第３核酸構築物に存在する配列によってコードされる、細胞。
【請求項７】
レトロウイルスのｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードするさらなる核酸構築物をさらに含む、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記第１産物が、ｔａｔタンパク質またはｔａｔタンパク質含有キメラタンパク質である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項９】
前記ウイルス遺伝子産物が、Ｇタンパク質である、請求項６に記載の細胞。
【請求項１０】
前記核酸構築物で安定にトランスフェクトされている、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項１１】
条件複製ウイルスベクターをさらに含み、前記細胞が、該ベクターをパッケージングする、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ベクターが、ＨＩＶ−１に由来する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記Ｇタンパク質が、ＶＳＶまたはモコラウイルスのＧタンパク質である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
ウイルスベクターをパッケージングする方法であって、前記第１核酸構築物が、前記第１産物を発現する条件下で請求項１２に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
前記ウイルス遺伝子産物が、ウイルスのエンベロープまたはＧタンパク質である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
レトロウイルスのｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードするさらなる核酸構築物をさらに含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記第２産物が、ｒｅｖタンパク質である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
前記ウイルス遺伝子産物が、Ｇタンパク質である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
条件複製ウイルスベクターをさらに含み、前記細胞が、該ベクターをパッケージングする、請求項１５に記載の細胞。
【請求項２０】
ウイルスベクターをパッケージングする方法であって、前記第１核酸構築物が、前記第１産物を発現する条件下で請求項１９に記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、遺伝子発現の調節のための系に関する。本発明は、目的のコード配列の発現を厳密に調節し得る、改善された核酸構築物を提供する。発現されるべき核酸または発現レベルが、発現が生じる細胞環境または宿主環境に対して毒性である場合、厳密な調節制御が望ましい。本発明はまた、ウイルスベクターをパッケージングするために用いられる細胞における発現系の適用に関し、そして必要な核酸構築物を調製する方法、ならびに組換えウイルス遺伝子発現の制御におけるそれらの使用を提供する。１つの局面では、本発明は、安定にトランスフェクトされた細胞における遺伝子発現の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
組換え核酸技術は、目的の核酸によってコードされる産物の発現のための強力なツールであることが証明されている。これにより、ポリペプチドおよび核酸を研究適用および商業的適用の両方のために産生する能力がもたらされている。
【０００３】
しかし、コードされるいくつかの産物は、それらの発現が生じる細胞環境または宿主環境に対して毒性である。なぜなら、この産物は、固有に毒性であるか、または発現が生じるレベルが高すぎで毒性を生じるかのいずれかであるからである。この困難性を扱う１つの手段は、このコードされる産物が発現され、そして毒性によって産物のレベル低下がもたらされる前にこのコードされる産物が回収される、一過性発現系を使用することである。あるいは、このコードされる産物は、この産物が発現され得、次いで毒性が致死レベルまで上昇する前に発現が終結し得るように、厳密に制御された調節系下に配置される。厳密に制御された調節系の１例は、ｔｅｔリプレッサーと組み合わせた、テトラサイクリンによって調節されるオペレーター／プロモーターの使用について見られる（例えば、米国特許第５，７５０，３９６号を参照のこと）。
【０００４】
毒性産物の発現は、その産物が、連続して発現されなければならない状況において特に重要である。なぜなら、これは、その細胞によって産生されるべき、より大きな産物の成分であるかまたはその細胞によって行われる代謝活性の成分であるからである。このような状況の１例は、ウイルス粒子のアセンブリおよびパッケージングに必要な産物を発現する、ウイルスパッケージング細胞株の場合である。必要なウイルス遺伝子産物のうちのいずれか１つがその細胞に対して毒性である場合、（一過性とは反対に）安定なパッケージング細胞株が用いられるべきならば、その発現を制御する必要性は重大なものとなる。必要な毒性ウイルス遺伝子の１例は、偽型ウイルス粒子の産生に望ましい、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来のＧタンパク質の場合である。
【０００５】
ｔｅｔオペレーターおよびリプレッサーを用いてＶＳＶ−Ｇの発現を調節する１例は、Ｈｅｎｒｉｅｔｔｅら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（１）：５７６−５８４，１９９９）によって記載されており、ここでは、ｔｅｔリプレッサー（ＶＰ−１６のドメインとのキメラ融合体産物としてであり、ｔＴＡと呼ばれる）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあり、そしてＶＳＶ−Ｇは、ｔｅｔオペレーターの制御下にある。テトラサイクリンの不存在下でのキメラリプレッサーの発現は、ＶＳＶ−Ｇの発現がないことをもたらす。テトラサイクリンの存在は、ｔＴＡとオペレーター中に見出されるｔｅｔ応答性エレメント（ＴＲＥ）との会合を防止して、ＶＳＶ−Ｇの発現を可能にする。この系は、「ｔｅｔ−オン」と呼ばれ、この系では、テトラサイクリンの存在は、目的の遺伝子（すなわち、ＶＳＶ−Ｇ）の発現をもたらす。
【０００６】
ｔＴＡがキメラトランスアクチベーターである、代替的「ｔｅｔ−オフ」系もまた存在する。これは、テトラサイクリンの存在下では、ｔｅｔオペレーターのＴＲＥに結合することができない。しかし、テトラサイクリンの不存在下では、ｔＴＡは、このオペレーターに結合し、そしてこのプロモーターを強力に活性化して目的のコード配列を発現させる。
【０００７】
Ｋｌａｇｅｓら（Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒａｐ．２（２）：１７０，２０００）は、ＶＳＶ−Ｇ発現を制御するための同様の２核酸系の使用を教示する。第１核酸はｔＴＡを発現し、ｔＴＡは次いで、ＴＲＥ含有ｔｅｔオペレーターを制御し、このＴＲＥ含有ｔｅｔオペレーターは、ＶＳＶ−Ｇ発現を制御する。同じｔＴＡタンパク質がまた、ｒｅｖタンパク質の発現を調節し、ｒｅｖタンパク質は次いで、ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）を介してｇａｇ／ｐｏｌメッセンジャーＲＮＡのスプライシングを制御することによって（ウイルスパッケージングのために必要な）ｇａｇ領域およびｐｏｌ領域の発現を調節する。
【０００８】
遺伝子発現を制御するためのｒｅｖタンパク質の使用の別の例は、Ｙｕら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（７）：４５３０−４５３７，１９９６）によって記載された。彼らは、ｔＴＡの発現を用いて、単一のＴＲＥ含有ｔｅｔオペレーターの調節下に同時にある、ＨＩＶ−１のｒｅｖタンパク質およびエンベロープタンパク質の両方の発現を調節した。次いで、このｒｅｖタンパク質は、ウイルスエンベロープタンパク質の発現をＲＲＥを介して調節し、そしてこのｇａｇ／ｐｏｌメッセンジャーＲＮＡの発現を別のＲＲＥを介して調節する。ｇａｇ／ｐｏｌコード配列の転写は別のプロモーターによって調節されたが、その発現は、このｒｅｖタンパク質によって直接的に調節され、従って、ｔＴＡによって間接的に調節された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な説明）
本発明は、１以上の目的のコード配列の発現を調節するための核酸（発現）構築物および方法を提供する。この核酸構築物は好ましくは、本質的に組換え体であり、そして少なくとも３つの構築物を含み、ここで、最後の構築物が、目的のコード配列を含む。この構築物は、目的のコード配列を発現するための発現系とみなされ得かつ用いられ得、ここで、各構築物は、次の構築物の発現を調節する産物を発現し、次いで最終的に、最後の構築物を介して目的のコード配列の発現が制御される。各構築物は、好ましくは、そして個々に、調節領域（例えば、プロモーター（必要に応じてオペレーターを有する））を含む。
【００１０】
本発明の１つの局面では、この発現系は、ウイルスベクターをパッケージングするために用いられる細胞または細胞株の一部として、このベクターをパッケージングするために必要な成分の発現を調節するために利用される。この発現系を用いて、目的のウイルスベクターをパッケージングするために必要なウイルスの構造遺伝子産物または調節遺伝子産物の発現を調節し得る。１より多くの目的のウイルス遺伝子産物が発現されるべきである場合、これらは、別個の核酸分子に存在してもよく、そして依然として本発明の発現系の一部であり続ける。
【００１１】
従って、本発明の発現系は、２以上の系が組み合わされて、この系によって調節される２以上の目的のコード配列を発現し得るように、共通の構築物を有し得る。共通の構築物を有する系の例としては、同じ第１核酸構築物および同じ第２核酸構築物だが、２つの目的のコード配列を含む２つの第３構築物（両方とも第１核酸構築物および第２核酸構築物を介して同じ機構によって調節される）を用いる使用が挙げられる。
【００１２】
本発明の別の局面では、第１核酸構築物からの発現は、好ましくは厳密に調節されるかまたは自己調節すらされる。１つの非限定的な例は、第１核酸構築物の産物がそれ自体の発現を抑制し得る、正のフィードバック機構を通してである。活性化の不存在下では、第１核酸構築物のこの自己調節は、非常に低い基底活性を可能にし、その結果、（さらなる核酸構築物中の）目的のコード配列の発現はほとんどまたはまったく生じない。一旦、第１核酸構築物の発現が活性化されると、この系における全てのさらなる構築物の発現が続く。第１構築物の自己調節を本発明の好ましい実施形態において用いて、この系におけるさらなる構築物からの発現の制御を最大にする。
【００１３】
本発明の構築物および系は、ベクターに組み込まれ得るか、または細胞に導入され得る。細胞については、これらの構築物は、細胞ゲノム中に組み込まれ得るかまたはエピソーム性の構築物として維持され得る。細胞の選択は、その細胞が本発明の構築物および系の発現を許容する限り、重要ではない。細胞を用いてウイルスベクターをパッケージングする本発明の実施形態では、得られるウイルスベクターは好ましくは、補体耐性である。
【００１４】
本発明の各構築物は、個々の核酸分子に存在してもよく、または１以上の他の構築物（例えば、同じプラスミド、ベクターまたは染色体であるがこれらに限定されない）と同じ核酸分子に存在してもよい。発現系をウイルスベクターをパッケージングするための細胞中で用いる本発明の好ましい実施形態では、個々の構築物は好ましくは、別個の核酸分子に分けられる。構築物の配置によって、各構築物が任意のその後の構築物の発現を調節する能力の干渉がもたらされない限り、１以上の核酸分子上でのこの構築物の存在は一般に、本発明の実施に重大ではない。
【００１５】
あるいは、そして本発明のさらなる局面では、これらの構築物は、その配置から生じる調節効果が存在するように配置される。非限定的な例は、一方のプロモーターの活性化が他方のものの活性化の容易さを増すように、配列が反対方向に発現されるように２つの構築物のプロモーターが方向付けられている（ここで、各プロモーターの５’部分は、各プロモーターの３’部分よりも互いに近い）、２つの構築物が１つの分子に配置されるものである。ウイルスベクターをパッケージングするための細胞において用いられる場合、プラスミド上でのこの配置は、ベクター産生力価を増加させることが見出されている。この配置は、１つの分子に反対方向に方向付けられるべき２つの構築物を調製し、次いでこの分子を細胞ゲノムに組み込むことによって、核酸構築物の安定な組込みを含む細胞においえ反映され得る。従って、反対方向の方向付けは、この２つの構築物の相対位置とともに維持される。
【００１６】
本発明のさらなる局面では、本発明の１以上の構築物によって発現される１以上の産物は、好ましくは、ウイルス起源であり、そして別の構築物からの発現を厳密に制御し得る。従って、本発明の好ましい発現系は、この系の別の構築物からの発現を制御し得る、１以上のウイルス調節タンパク質を発現する。
【００１７】
本発明の構築物および系は、好ましくは、細胞または宿主に対して毒性の産物（例えば、ウイルスタンパク質であるがこれに限定されない）をコードする配列の発現を調節するために用いられる。この構築物および系は、もちろん、非毒性産物の発現を調節するために用いられ得る。
【００１８】
本発明の１つの好ましい局面では、本発明の構築物は、ウイルスベクターをパッケージングしてウイルス粒子にするために用いられる細胞中に組み込まれる。このような細胞は、「パッケージング細胞」と呼ばれ得る。なぜなら、これらは、ウイルスベクター核酸をパッケージングしてウイルス粒子にするために必要な全ての成分を産生するからである。組換えウイルス核酸（必要に応じて、目的の他の異種配列または内因性配列を含む）は、このような細胞によってパッケージングされ得る。これらの核酸構築物が、必要なウイルス成分の発現を調節するための誘導性系をもたらす本発明の局面では、このような細胞はまた、ウイルス粒子をパッケージングするための誘導性系とみなされ得かつ用いられ得る。
【００１９】
本発明の構築物は、細胞に導入されて、染色体外コピーおよび／または組込みコピーとしてのこの構築物の維持をもたらし得る。本発明の好ましい実施形態では、この構築物の組込みは、長期間または無期限にウイルス粒子をパッケージングするために用いられ得る、安定にトランスフェクトされた細胞を産生するために用いられる。
【００２０】
本発明はまた、上記の構築物および系の産生のための方法、ならびにコード配列の発現を調節するためのこのような系の使用方法を提供する。これらの方法は、ウイルスベクターをパッケージングするために必要な１以上の成分を産生するための本発明の使用を包含する。本発明の構築物を含むキットまたは開示された方法に関して使用するためのキットもまた提供される。
【００２１】
（好ましい実施形態の説明）
（定義）
「核酸」または「核酸構築物」または「核酸分子」は、ポリヌクレオチド、すなわち、任意の長さの、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドのポリマー形態である。この用語は、この分子の一次構造のみをいう。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。この用語はまた、直鎖状または環状のポリマーを包含する。
【００２２】
本明細書中で用いられる場合、「目的のコード配列」は、発現が所望される、目的のポリヌクレオチド配列である。このコード配列は、その実際の配列に関して公知であっても公知でなくてもよいが、目的のＲＮＡまたはポリペプチドをコードする。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、「細胞」または「宿主」とは、本発明の核酸構築物または発現系が導入および発現され得る、対応する生きた生物をいう。「細胞」は、任意の細胞であり得、好ましくは真核生物細胞である。この細胞は、新たに単離されそして本発明の核酸構築物の導入によってまたはこの導入を伴って形質転換された、細胞株の細胞または初代細胞であり得る。細胞株または培養物とは、細胞株または培養物が由来する親細胞と同一でないかもしれない、インビトロでの培養によって維持された細胞をいう。細胞の非限定的な例としては、真核生物細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＨＴ−１０８０細胞、ＣＶ−１細胞、ＴＥ６７１細胞もしくは他のヒト細胞；Ｖｅｒｏ細胞；またはＤ１７細胞）が挙げられる。他の細胞としては、リンパ球（例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞）またはマクロファージ（例えば、単球マクロファージ）が挙げられるか、または細胞は、これらの細胞のいずれかの前駆体（例えば、造血幹細胞）である。本発明の実施のためのさらなる細胞としては、星状細胞、皮膚線維芽細胞、腸上皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、単球、筋肉細胞、ニューロン細胞（例えば、脳および眼であるがこれらに限定されない）、肝細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、精子または卵母細胞を生じる細胞、間質細胞、粘膜細胞などが挙げられる。好ましくは、宿主細胞は、（例えば、単細胞酵母細胞とは反対に）真核生物の多細胞種の細胞であり、さらにより好ましくは、哺乳動物（例えば、ヒトの）細胞である。
【００２４】
細胞は、単一の実体として存在し得るか、または細胞のより大きなコレクションの一部であり得る。このような「細胞のより大きなコレクション」は、例えば、以下を含み得る：細胞培養物（混合物または純粋物のいずれか）、組織（例えば、内皮組織、上皮組織、粘膜組織もしくは他の組織（上記のＣＤ４欠除細胞を含む組織を含む））、器官（例えば、心臓、肺、肝臓、筋肉、胆嚢、膀胱、性腺、眼および他の器官）、器官系（例えば、循環器系、呼吸器系、胃腸系、泌尿器系、神経系、外皮系もしくは他の器官系）、または生物体（例えば、鳥類、哺乳動物など）。好ましくは、器官／組織／細胞は、以下の系のものである：循環器系（例えば、心臓、血管および血液（白血球および赤血球を含む）を含むがこれらに限定されない）、呼吸器系（例えば、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺など）、胃腸系（例えば、口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢などを含む）、泌尿器系（例えば、腎臓、尿管、膀胱、尿道など）、神経系（例えば、脳および脊髄、ならびに特殊感覚器（例えば、眼）を含むがこれらに限定されない）ならびに外皮系（例えば、皮膚、表皮、および皮下組織もしくは皮膚組織の細胞）。さらにより好ましくは、これらの細胞は、心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、膀胱、および眼の細胞からなる群より選択される。これらの細胞は、正常細胞である必要はなく、罹病細胞であり得る。このような罹病細胞としては、腫瘍細胞、感染細胞、遺伝的に異常な細胞、または異常組織（例えば、腫瘍血管内皮細胞）に近いかもしくは接触している細胞であり得るがこれらに限定されない。
【００２５】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの、本明細書中で交換可能に用いられる、「部分」または「領域」は、２以上の塩基の連続配列である。他の実施形態では、領域または部分は、少なくとも約３、５、１０、１５、２０、２５のいずれか連続したヌクレオチドである。
【００２６】
「ウイルス」は、タンパク質および核酸からなる感染性因子であり、これは、宿主細胞の遺伝機構を用いて、ウイルス核酸によって特定されるウイルス産物を産生する。本発明は、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスの両方に適用され得る局面（例えば、ウイルスコード配列の発現）を包含する。ＲＮＡウイルスは、原核生物（例えば、バクテリオファージ）ならびに多くの真核生物（哺乳動物（特に、ヒト）を含む）に感染する多様な群である。大部分のＲＮＡウイルスは、１本鎖ＲＮＡをそれらの遺伝物質として有するが、少なくとも１つの科は、二本鎖ＲＮＡを遺伝物質として有する。これらのＲＮＡウイルスは、主に３つの群に分けられる：＋鎖ウイルス、−鎖ウイルス、および二本鎖ＲＮＡウイルス。本発明に関連するＲＮＡウイルスとしては、以下が挙げられる：シンドビス様ウイルス（例えば、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ、Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ、Ｉｌａｒｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ、およびＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス様ウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ、Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ、およびＰｏｔｙｖｉｒｕｓ）、−鎖ウイルス（例えば、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、およびＡｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、二本鎖ウイルス（例えば、ＲｅｏｖｉｒｉｄａｅおよびＢｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス様ウイルス（例えば、ＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅおよびＰｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス様ウイルス（例えば、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、および他のウイルス群（Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅを含むがこれらに限定されない）。本発明は、好ましくはＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のＲＮＡウイルス、より好ましくはＦｉｌｏｖｉｒｕｓ属のウイルスに、そして特にマルブルグウイルスまたはエボラウイルスに適用される。Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科の１つのウイルスは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ属のウイルスであり、例えば、黄熱ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ロシオ（Ｒｏｃｉｏ）ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスなどである。本発明は好ましくは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス、好ましくはＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＢＣ）、または非Ａまたは非Ｂ肝炎ウイルスに適用される。
【００２７】
本発明が適用され得る別の好ましいＲＮＡウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス（すなわち、レトロウイルス）、特にＯｎｃｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｐｕｍａｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ、Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ、およびＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓの属または亜科のウイルスである。Ｏｎｃｏｖｉｒｉｎａｅ亜科のＲＮＡウイルスは、望ましくは、以下である：ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型もしくは２型（すなわち、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−２）またはウシ白血病ウイルス白血病ウイルス（ＢＬＶ）、トリ白血病肉腫ウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、およびラウス関連ウイルス（ＲＡＶ；ＲＡＶ−０〜ＲＡＶ−５０））、哺乳動物Ｃ型ウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）、ＡＫＲ−ＭｕＬＶ、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、サル肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ））、Ｂ型ウイルス（例えば、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ））、およびＤ型ウイルス（例えば、マソン−ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）および「ＳＡＩＤＳ」ウイルス）。Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ亜科のＲＮＡウイルスは望ましくは、以下である：ヒト免疫不全ウイルス１型もしくは２型（すなわち、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２、ここで、ＨＩＶ−１は、以前は、リンパ節症関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれた）、またはＡＩＤＳもしくはＡＩＤＳ様疾患について同定され、これらに付随している、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２に関連する別のウイルス。略語「ＨＩＶ」または「ヒト免疫不全ウイルス」は、これらのＨＩＶウイルス、ならびにＨＩＶ関連ウイルスおよびＨＩＶ付随ウイルスを一般にいうために本明細書中で用いられる。さらに、Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ亜科のＲＮＡウイルスは、好ましくは、ビスナ／マエディウイルス（例えば、ヒツジに感染する）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）である。本発明はまた、ＤＮＡウイルスに適用され得る。好ましくは、このＤＮＡウイルスは、ヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス）、アデノウイルス、ＡＡＶ、パピローマウイルス、ワクシニアウイルスなどである。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、対応する複数形の言及を包含することに留意しなければならない。
【００２９】
「発現」は、デオキシリボ核酸の転写および／またはリボ核酸の翻訳を包含する。
【００３０】
本明細書中で用いられる場合、用語「含む」およびその同族語は、それらの包括的意味で用いられる；すなわち、用語「含んでいる」およびその対応する同族語と同等である。
【００３１】
事象が生じ「させ」る条件または事象が生じる（例えば、転写もしくは翻訳、鎖の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）もしくは延長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）などの開始）に適切な条件は、このような事象が生じるのを妨害も阻害もしない条件である。従って、これらの条件は、事象を許容し、増強し、促進し、そして／または事象に好都合である。このような条件は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載されており、例えば、ヌクレオチド配列の性質、温度、および緩衝液条件に依存する。これらの条件はまた、どのような事象が所望されるか（例えば、核酸／タンパク質相互作用、タンパク質／タンパク質相互作用、転写または翻訳）に依存する。
【００３２】
用語「３’」（３’）は一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の領域または位置から３’（下流）の、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または位置をいう。
【００３３】
用語「５’」（５’）は一般に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の領域または位置から５’（上流）の、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド中の別の領域または位置をいう。
【００３４】
用語「３’−ＤＮＡ部分」、「３’−ＤＮＡ領域」、「３’−ＲＮＡ部分」、および「３’−ＲＮＡ領域」とは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’末端側に位置する、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの、部分または領域をいい、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのうちの、最も３’側のヌクレオチドまたは最も３’側のヌクレオチドに結合した部分を含んでも含まなくてもよい。
【００３５】
用語「５’−ＤＮＡ部分」、「５’−ＤＮＡ領域」、「５’−ＲＮＡ部分」、および「５’−ＲＮＡ領域」とは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端側に位置する、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの、部分または領域をいい、同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのうちの、最も５’側のヌクレオチドまたは最も５’側のヌクレオチドに結合した部分を含んでも含まなくてもよい。
【００３６】
用語「異種」とは、天然ではまたはそれらの天然状態では通常一緒に見出されない、２つの物質の間の関係をいう。用語「内因性」とは、天然ではまたはそれらの天然状態で通常一緒に見出される、２つの物質の間の関係をいう。例えば、コード配列は、異種プロモーターに作動可能（異種プロモーターは、通常、天然ではその配列と関連していない）に、その内因性プロモーター（この配列が天然で通常関連している）に、連結され得る。あるいは、核酸は、異種配列がアンチセンス方向にあること以外はこの核酸が通常一緒に見出される、異種配列に共有結合され得る。コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を導き得る場合（例えば、コード配列およびプロモーターの両方が一緒に、発現され得る、ネイティブまたは組換え体の構築物を構成する場合）、プロモーターに「作動可能に連結されている」。
【００３７】
他に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００３８】
本発明は、組合せて用いた場合、１以上の目的のコード配列の発現を調節する、核酸（発現）構築物を提供する。この目的のコード配列は、その発現が目的とされるかまたは望ましい、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードし得る。この核酸構築物は、好ましくは本質的に組換え体であり、そして目的のコード配列の発現を調節するように連続的に作用する。従って、これは、「最後の」構築物に位置する。各構築物は、最終的に、最後の構築物による目的のコード配列の発現が制御されるまで、次の構築物からの発現を次々と調節する産物の発現をもたらす。各構築物は好ましくは、そして個々に、誘導性であるかおよび／または別の構築物からの発現によって調節される、調節領域を含む。この構築物は、必要に応じてまた、選択マーカーまたは検出可能マーカーを含み、それらの同定および使用を容易にする。構築物に存在するが、この構築物が導入されている細胞にとって内因性ではない、調節配列またはコード配列は、検出可能マーカーとして役立ち得る。
【００３９】
本発明の構築物は、好ましくは、ウイルスベクターをパッケージングするために用いられる細胞または細胞株中に存在する。従って、この構築物は、このベクターをパッケージングするために必要な、１以上のウイルス成分の発現を調節する。このウイルス成分は、適切なパッケージングに必要な、任意のウイルス遺伝子産物であり得り、この成分としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ウイルスのエンベロープタンパク質、キャプシドタンパク質、レトロウイルスの場合、ｇａｇもしくはｐｏｌによってコードされるタンパク質、および／またはウイルスの調節タンパク質。これらのウイルス成分をコードする核酸は、これらが発現されてこのウイルスベクターの適切なパッケージングをもたらし得る限り、１以上の核酸分子に配置され得る。全てのウイルス成分を含むベクターをもたらす、このウイルスベクターとこの構築物との間での組換えの確率を減らすために、ウイルス成分をコードする核酸は、好ましくは、別個の核酸分子中に分割される。発現されるべき好ましいウイルス成分は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のｇａｇ／ｐｏｌ配列によってコードされるウイルス成分、レトロウイルスの（好ましくはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２由来の）ｒｅｖタンパク質、およびウイルスのエンベロープタンパク質である。
【００４０】
例えば、そして本発明を限定しないが、本発明は、目的のコード配列の発現のための３つの構築物を含み得る。この第１核酸構築物は、第１産物を発現し得、ここで、この第１産物は、第２核酸構築物からの第２産物の発現を調節し得、そしてここで、この第２産物は、この目的のコード配列によってコードされる産物の発現を調節し得、この目的のコード配列は、第３核酸構築物に存在する。好ましくは、この３つの核酸構築物のうちの少なくとも１つは、異種核酸を含む。他の好ましい実施形態では、第１構築物および第２構築物からの発現は、転写および／または翻訳の直接的調節により、一方、この第３構築物からの目的のコード配列の発現は、スプライシングおよび／または核輸送の調節による。
【００４１】
本発明の１つの実施形態では、この第１構築物は、誘導性プロモーターまたは他の様式で調節されるプロモーター（例えば、テトラサイクリンプロモーター／オペレーターまたはステロイドプロモーター領域もしくはエクジソンプロモーター領域）を含む。別の調節系は、ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．によって開発された系である。このプロモーターは、この第２構築物からの発現を調節する産物をコードする第１コード配列に作動可能に連結される。本発明の１つの好ましい実施形態では、この第１構築物は、第１構築物が自律的であるように、そしてテトラサイクリンの存在下で発現が生じないように、テトラサイクリンプロモーターと、テトラサイクリンプロモーターのアクチベーター（またはこのアクチベーターを含む融合タンパク質（例えば、ｔＴＡであるがこれらに限定されない）をコードする第１コード配列とを含む。あるいは、この第１コード配列は、レトロウイルス（好ましくはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）のｔａｔタンパク質をコードする。
【００４２】
この例におけるテトラサイクリン除去による転写誘導は、ｔｅｔアクチベーター、あるいは、このｔａｔタンパク質の発現をもたらす。従って、この第２核酸構築物は、ｔｅｔプロモーター／オペレーター、あるいはｔａｔによって調節されるプロモーター領域（例えば、発現されたｔａｔタンパク質によって調節される５’ＬＴＲプロモーター）を含む。この第２核酸配列のコード配列は、第３構築物の発現を調節する任意の産物をコードし得る。本発明の非限定的実施形態では、この第２核酸配列は、第３構築物に存在する目的のコード配列のｍＲＮＡスプライシングおよび／または核輸送を調節するための、レトロウイルスのｒｅｖタンパク質をコードし得る。このｒｅｖタンパク質の発現を含む本発明の実施形態では、第３構築物に存在するプロモーターは、このｒｅｖタンパク質の存在下で適切にスプライシングおよび／または核輸送が起こる際に所望レベルのタンパク質産生をもたらすに十分なレベルのｍＲＮＡとして目的のコード配列を発現し得る任意の適切なプロモーターであり得る。好ましくは、このプロモーターは、レトロウイルス（好ましくは、ＨＩＶ）の５’ＬＴＲのプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（好ましくは、ヒトＣＭＶもしくはサルＣＭＶ）由来のプロモーターである。
【００４３】
本発明のパッケージング細胞に適用されると、第３構築物の目的のコード配列は、以下をコードし得る：ウイルスエンベロープタンパク質（例えば、レトロウイルスのエンベロープタンパク質）（より好ましくは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＭＭＬＶのエンベロープタンパク質）；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、モコラウイルス、または狂犬病ウイルス由来のＧタンパク質；ＧａＬＶ、アルファウイルスＥ１／２糖タンパク質、またはＲＤ１１４、ネコ内因性ウイルス由来のｅｎｖタンパク質。あるいは、キメラエンベロープタンパク質をコードする配列もまた用いられ得る。以下のウイルス科由来のエンベロープタンパク質をコードする配列もまた用いられ得る：Ｐｉｃｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｎｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｒ、Ｏｒｔｈｏｍｉｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、およびヘルペスウイルス。
【００４４】
本発明の代替の実施形態では、および第１構築物がステロイドホルモンレセプターについてのコード配列に作動可能に連結されたテトラサイクリンプロモーター／オペレーターを含む実施形態では、発現の誘導は、このレセプターの発現をもたらす。従って、この第２構築物は、このステロイドホルモンレセプターによって調節されるプロモーターを有する（このプロモーターからの開始は、このレセプターおよび活性化リガンドを含む複合体によって活性化される）。この複合体の不存在下では、このプロモーターは不活性である。この第２構築物のコード領域は、この第３構築物からの発現を調節する任意の産物をさらにコードし得る。例えば、この第２構築物のコード配列は、レトロウイルスのｔａｔタンパク質またはｒｅｖタンパク質をコードし得る。コードされるｔａｔタンパク質を用いて、この第３構築物は、発現がこのｔａｔタンパク質によって調節されるのを可能にする領域（例えば、レトロウイルスの５’ＬＴＲプロモーターおよびシス作用性ＲＮＡエレメントをコードする配列（ＴＡＲと称される）であるがこれらに限定されない）を含む。コードされるｒｅｖタンパク質を用いて、この第３構築物の発現は、上記で考察したように、（ｍＲＮＡスプライシングおよび／または核輸送制御による）このｒｅｖタンパク質の調節下にあることのみを必要とする。
【００４５】
ウイルスベクターをパッケージングするための細胞に適用すると、このレトロウイルスのｔａｔタンパク質は、このウイルスベクターのウイルスに対して異種ウイルス由来であり得る。このウイルスベクターは、ＨＩＶ−１由来であり得、そして本発明を限定しないが、キメラレトロウイルスのプロモーターは、本発明の核酸構築物のうちの１以上において用いられ得る。キメラレトロウイルスプロモーターの非限定的な例は、同族異種ｔａｔタンパク質の発現が、このプロモーターに連結されたコード配列の発現に必要とされるように、異種ＴＡＲ配列を含む、レトロウイルスの５’ＬＴＲプロモーターである。好ましいキメラプロモーターは、ＨＩＶ−２  ＴＡＲ配列を含んだＨＩＶ−１の５’ＬＴＲプロモーターを含む。ＨＩＶ−２  ｔａｔタンパク質を発現し得る構築物と組合わせて用いられる場合、このキメラプロモーターに作動可能に連結されたコード配列が発現される。
【００４６】
ＴＡＲエレメントが本発明の１以上の構築物において用いられる、本発明のさらなる実施形態では、ｔａｔタンパク質コード配列は、本明細書中に開示されるように、発現系の任意の構築物中に存在する必要はない。その代わり、同族ｔａｔタンパク質についてのＴＡＲの必要要件は、ｔａｔタンパク質を別の供給源から供給することによって満たされ得る。例えば、そして本発明の構築物が細胞中に導入される場合、この細胞は、必要なｔａｔタンパク質を発現する、（細胞ゲノムに必要に応じて組み込まれた）さらなる核酸構築物を含み得る。このような単純な発現構築物は、当該分野で周知である。
【００４７】
上記の１例は、ｔａｔタンパク質が本発明の発現系と組合わせて用いられる場合である。目的の２つの核酸配列が発現されるべきである場合、第１のものは、本発明の発現系の制御下にあり得、一方、第２のものは、この系および上記の通りに別の供給源によって発現されたｔａｔタンパク質の両方の制御下にある。例えば、３つの構築物を用いて、（第２構築物からの）ｒｅｖタンパク質を介して（第３構築物からの）目的の第１配列の発現を制御し得る。次いで、目的の第２配列は、（第２構築物からの）このｒｅｖタンパク質およびこのｔａｔタンパク質によって調節される第４構築物から発現される。従って、目的の第１配列はこの系のみの制御下にあり、一方、目的の第２配列は、この系およびｔａｔタンパク質の両方の制御下にある。異種ｔａｔタンパク質およびＴＡＲエレメントは、もちろん、本発明のこの代替の実施形態において用いられ得る。さらなる代替物では、目的の第１配列はまた、ｔａｔ調節されるようにされ得る。
【００４８】
上記のｔａｔコード配列の使用の代替物として、キメラｔａｔタンパク質をコードする配列が用いられ得る。Ｔａｔは、融合タンパク質（例えば、Ｔａｔ−Ｇａｌ４）にされており、そしてＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターのトランス活性化活性を保持することが示されている。充分なトランス活性化活性が保持される限り、他のキメラＴａｔタンパク質もまた、用いられ得る。
【００４９】
ｒｅｖタンパク質を用いて、その後の構築物からの発現を調節する場合は常に、このその後の構築物のコード配列は、ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）、ならびにｒｅｖタンパク質によって調節されるに適切なスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含むかまたはこれらを含むように改変される。例えば、本発明を限定しないが、この第３構築物が、ウイルスのエンベロープまたはＧタンパク質をコードするコード配列を含む場合、このコード配列は、このエンベロープタンパク質またはＧタンパク質が発現され得るように、適切なスプライシングおよび／または核輸送のために同族ｒｅｖタンパク質を必要とする、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む。この部位は、このｒｅｖタンパク質に関連して、弱まったスプライス機能を提供するように必要に応じて選択され得る。弱めることは、発現をこのｒｅｖタンパク質およびこのＲＲＥにさらに依存性にする手段を提供する。例えば、スプライス部位があまりにも迅速に内因的に機能する場合、この目的のコード配列は、このｒｅｖタンパク質およびＲＲＥがこのｍＲＮＡを輸送してその発現を許容する機会を有する前にスプライシングされ得る。従って、このスプライス部位は、ｒｅｖタンパク質の不存在下ではスプライシングを可能にしかつ発現を抑制し、一方、ｒｅｖタンパク質の存在下ではスプライシングを抑制しかつ発現を可能にするするに充分であるように選択される。
【００５０】
本発明の構築物は、目的のコード配列のための発現系と組合わされるとみなされ得、そして組合わせて用いられ得る。さらに、同一の構築物を含む２以上の発現系は、２以上の目的のコード配列の発現を同時に制御するために組み合わされ得る。例えば、本発明を限定しないが、この２つの第１構築物は、２以上の第３構築物における目的のコード配列の発現を調節する第２構築物と同一であり得、この第３構築物の各々は、目的のコード配列を発現し得る。この例の１つの実施形態では、この第１構築物は、この第２構築物中のｒｅｖタンパク質コード配列の発現を調節する産物をコードするコード配列に作動可能に連結されたテトラサイクリン誘導性プロモーターを含み得る。２以上の第３構築物の各々における目的のコード配列は、そのコードするタンパク質の発現が、この第２構築物によって発現されるｒｅｖタンパク質の存在によって生じるように、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含むように改変される。特定の例では、２つの目的のコード配列は、２つの第３構築物中に存在し得る：第１コード配列は、ＲＲＥに作動可能に連結されたレトロウイルス（好ましくはＨＩＶ）のｇａｇ／ｐｏｌ配列であり、そして第２コード配列は、ＲＲＥに作動可能に連結されたＶＳＶ−ＧまたはモコラウイルスＧタンパク質である。上記で注記したように、これらの２つの第３構築物についてのプロモーターは、このｒｅｖタンパク質が存在すると充分に発現し得る任意のプロモーターであり得る。
【００５１】
本明細書中で注記したように、この第１核酸構築物からの発現は好ましくは、厳密に調節されるかまたは自己調節すらされる。非限定的な例として、強固な調節に、この第１核酸構築物の産物がそれ自体の発現を（直接的または間接的に）抑制し得る正のフィードバック機構が提供される。活性化の不存在下では、この第１核酸構築物のこの自己調節は、非常に低い基底活性をもたらし、その結果、本発明の発現系の他の構築物からの発現は、ほとんどまたはまったく生じない。その代わり、そしてこの第１核酸構築物からの発現が活性化されると、この系における全てのさらなる構築物の活性が続く。
【００５２】
本発明の構築物および系は、ベクター中に組み込まれ得るか、または細胞（例えば、哺乳動物、齧歯動物、霊長類またはヒトの細胞であるがこれらに限定されない）中に導入され得る。本発明の構築物は、細胞ゲノム中に組み込まれてもよく、またはエピソーム性構築物として維持されてもよい。本発明の好ましい細胞は、単独でか、または他の核酸発現との組み合わせて、目的のコード配列の発現が所望される細胞である。本発明の構築物は、任意の順番で細胞中に導入され得る。導入後、この細胞におけるこの構築物の存在が、この構築物に配置された選択マーカーまたは検出可能マーカーを介してこの構築物を検出することによって確認され得る。
【００５３】
本発明の各構築物は、個々の核酸分子に存在し得るが、本発明のいくつかの好ましい適用としては、１より多くの本発明の構築物を含む、単一核酸分子が挙げられる。例えば、安定な細胞株の調製に関する非限定的な例として、本発明の構築物は、１以上の染色体に安定に組み込まれて、安定にトランスフェクトされた細胞株が産生される。あるいは、この構築物は、１以上のエピソーム性ベクターまたはプラスミドに配置されて、その後、この細胞に導入され得る。ウイルスベクターのパッケージングのための細胞に適用して、この個々の構築物は好ましくは、ウイルスベクターを複製コンピテントにするために必要とされるウイルスベクターとの組換えの数を増やすために、別個の核酸分子に分けられる。好ましくは、本発明の構築物は、特に、その調節配列およびコード配列部分は、起源がウイルス性である配列を含む。従って、ウイルス調節領域（これは、シスで作用する）およびコード領域（これは、トランスで作用する）は、本発明の実施のために好ましい。シス作用性領域の例は、レトロウイルスのＴＡＲおよびＲＲＥ、ＩＮＳ（阻害配列または不安定配列、ＣＲＳともいう）エレメントであり、トランス作用性コード領域の例は、ｔａｔコード配列およびｒｅｖコード配列である。ウイルス構築物について用いられる細胞は好ましくは、本発明の構築物によって導入されるウイルス配列以外のウイルス配列を含まない。
【００５４】
好ましくは、目的のウイルス核酸に対して異種のＲＲＥは、本発明の構築物において用いられる。例としては、ＨＩＶ−１由来核酸についてのＨＩＶ−２  ＲＲＥ、ＣＴＥ（保存的輸送エレメント（例えば、マソン−ファイザーサルウイルスおよび他のレトロウイルス由来の保存的輸送エレメント））またはＰＲＥ（転写後調節エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメント））が挙げられるがこれらに限定されない。異なる配列を有する異なるＲＲＥに基づく相同組換えの可能性を低減するか、最小にするか、またはなくすことに加えて、約５倍も多い、パッケージングされたウイルス核酸の産生における驚くべきでかつ予想外の増加が観察されている。
【００５５】
本発明の種々の実施形態でも特に、目的のコード配列の発現であり、ここで、コードされる産物は、発現が生じる細胞または宿主に対し毒性である。このことの例としては、ウイルスのｇａｇ−ｐｏｌタンパク質およびエンベロープタンパク質（例えば、ＶＳＶ  Ｇタンパク質）が挙げられる。しかし、本発明の充分な範囲としては、細胞もしくは宿主に対して毒性でないかまたは特定の条件下（例えば、高レベルでの発現または毒性に寄与するさらなる因子の存在下）でのみ毒性である配列を発現するためのその使用が挙げられる。
【００５６】
本発明の１つの好ましい局面は、本発明の構築物を含む、細胞および細胞株の調製に関する。細胞への核酸構築物の導入のための方法（細胞ゲノムへの組込みに有利な条件（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびリン酸カルシウム沈澱）の使用を含む）は、当該分野で公知である。好ましい実施形態では、この構築物および細胞は、目的の特定のウイルス核酸を含むウイルス粒子を産生するに必要な因子を提供するように設計される。好ましくは、このウイルス核酸は複製欠損であり、そして内因性「パッケージングシグナル」が除去も喪失もされていない、天然に存在するウイルスに由来する。本発明の特に好ましい実施形態では、このウイルス核酸は、ＨＩＶ−１に由来する。ＨＩＶ−１由来のウイルス核酸は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈによってＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｃａｔａｌｏｇから入手可能である野生型株であるｐＮＬ４−３  ＨＩＶ−１分子クローンから産生され得る（Ａｄａｃｈｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５９，２８４−２９１（１９８６）もまた参照のこと）。これらの細胞は、ウイルス核酸についての「パッケージング細胞」としてみなされ得、そして用いられ得、このウイルス核酸は、細胞に別々に導入され得る。なぜなら、これらは、ウイルス核酸をパッケージングして感染性ウイルス粒子にするに必要な全ての成分を産生するからである。
【００５７】
好ましいパッケージング細胞は、このウイルス核酸が全ての他の成分を提供する場合、目的のコード配列から、少なくともウイルスエンベロープタンパク質、またはその等価物（例えば、その変異体、融合体、もしくは短縮化形態）もしくは異種形態を発現する。好ましいエンベロープタンパク質は、その天然形態の（すなわち、ウイルス核酸を誘導したウイルスのパッケージングにおいて通常用いられる）このウイルス核酸にとって内因性の配列またはこのウイルス核酸にとって異種の配列によってコードされるエンベロープタンパク質である。種々のエンベロープタンパク質（パッケージングされたウイルス粒子の標的細胞特異性を変更するためのタンパク質または偽型ウイルス粒子をもたらす代替のエンベロープタンパク質が挙げられる）は、本発明のこの局面の実施において発現され得る。ＨＩＶ−１由来ウイルス核酸について使用するための好ましい異種エンベロープタンパク質としては、ＶＳＶ  Ｇタンパク質、モコラウイルスＧタンパク質、およびＨＩＶ−２エンベロープタンパク質が挙げられる。
【００５８】
あるいは、この細胞は、少なくともウイルスエンベロープタンパク質およびパッケージングされるべきウイルス核酸からのパッケージング成分の発現に必要な１以上のタンパク質を提供する。非限定的な例は、エンベロープタンパク質ならびに同族ｔａｔタンパク質の両方を提供する細胞、またはレトロウイルス核酸をパッケージングするためにトランスで必要な１以上の他のタンパク質を提供する細胞（例えば、ＨＩＶ−１由来ベクターをパッケージングするための、ＶＳＶ  Ｇタンパク質およびＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質を提供する細胞）である。トランスで必要とされるさらなるタンパク質の例としては、ｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、およびｒｅｖ配列によってコードされるタンパク質が挙げられる。
【００５９】
好ましくは、パッケージングされる目的のウイルス核酸は、この核酸を病原性またはおそらく病原性にする、１以上のウイルス付属タンパク質配列（例えば、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、ＶｐｒもしくはＮｅｆ、またはそれらの組み合わせもしくはフラグメントであるがこれらに限定されない）を発現する能力またはコードする能力を欠く。これは、対応するコード配列の除去または転写レベルもしくは翻訳レベルでのその発現を防止する、これらの変異によって達成され得る。このようなタンパク質は、パッケージングに必要である程度まで、本発明の構築物を介して、またはさらなる核酸構築物によってのいずれかにより、このパッケージング細胞によって供給される。
【００６０】
本発明のパッケージング細胞による１以上のウイルスタンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡ法（例えば、ウイルスタンパク質を認識する１以上の抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ）を含め、当該分野で公知の種々の方法によって確認され得る。方法の他の非限定的な例としては、免疫染色およびウェスタンブロッティングが挙げられる。
【００６１】
このような細胞によってパッケージングされるべき目的のウイルス核酸は、必要に応じて、上記のパッケージング細胞によるパッケージングのための１以上の目的の異種配列を含み得る。このような異種配列の例としては、米国特許第６，１６８，９５３号に記載されるような遺伝的抗ウイルス剤が挙げられる。見本としては、リボザイム、アンチセンス配列、および／または核酸デコイが挙げられる。
【００６２】
本発明の１つの好ましい実施形態では、このウイルス核酸は、２０００年５月１日出願の米国特許第５，８８５，８０６号および同時係属中の米国特許出願第０９／５６２，８９４号に記載されるとおりの条件複製ベクターである。別の好ましい実施形態では、このウイルス核酸は、ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードする内因性配列をも含むような条件複製ベクターである。従って、この細胞は、この異種配列をパッケージングしてウイルス粒子にするための系とみなされ得、そして用いられ得る。次いで、この粒子は、感染による細胞への、パッケージングされた配列についての送達ビヒクルとみなされ得、そして用いられ得る。
【００６３】
なお別の好ましい実施形態では、このウイルス核酸および本発明の構築物は、それらの配列の間に最小の同一性が存在して、これらの間の組換えの可能性を低減して、複製能のある（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）ウイルス核酸を作製する確率を低減するように設計される。好ましくは、ウイルス核酸と本発明の構築物との間に約８より少ない同一の核酸残基が存在するが、約６および約４より少ない同一の残基がさらにより好ましい。このような非同一性を導入するための方法としては、このウイルス核酸および／もしくはこの構築物から発現されない配列もしくは重要でない配列を除去すること、または両方に見出される配列を縮重させて、配列同一残基の頻度を低下させることが挙げられる。
【００６４】
本発明の構築物の使用のための方法としては、これらの構築物を発現し得る細胞へとこれらの構築物を導入して、１以上の目的のコード配列についての細胞発現系を生成することが挙げられる。このような細胞系は、目的のコード配列をインビボで発現するために、多細胞宿主へと必要に応じて導入され得るか、またはそのような宿主中に既に存在し得る。この細胞発現系は、その後の単離もしくは精製のいずれかのためにこの目的のコード配列を発現するために、または他の細胞代謝活性（例えば、ウイルス粒子のパッケージング）において用いられるために、用いられ得る。
【００６５】
パッケージングされたウイルス粒子は、このパッケージング細胞を取り囲む上清中に見出され得、そして必要に応じてそこから単離され得る。この粒子は好ましくは、このパッケージングされた目的のウイルス核酸を標的細胞へと導入するために、高い力価および形質導入効率の両方を有する。
【００６６】
本発明の別の局面では、本発明は、当該分野で公知の方法による、開示された構築物および系の生成のための方法を提供する。種々の核酸構築物（核酸スプライシングおよび細胞形質転換技術を含む）の組換え使用が当該分野で充分に確立されており、そして過度の実験を伴わずに用いられ得る。ウイルスベクターのパッケージングのための細胞に関して、本発明は、このウイルスベクターの導入後の、当該分野で充分に確立された方法による細胞増殖およびベクター産生に有利な条件下での、このような細胞の培養のための方法を提供する。
【００６７】
本発明のさらなる局面では、この構築物およびその系は、１以上の目的の配列の発現において使用するためのキットの形態で調製され得る。このようなキットは、必要に応じて、本発明の実施に必要な他の成分を備え、このような成分としては、適切な細胞株、緩衝剤、塩、凍結乾燥安定剤、または安定化補助剤が挙げられるがこれらに限定されない。本発明のキットは、本明細書中に記載されるような構築物を備え、そしてまた、本発明の実施を容易にする他の物質を備え得、このような他の物質は、例えば、本発明の使用のためのデバイスおよび／またはこの構築物、系もしくはこれらを含む細胞の使用のためのデバイスであるがこれらに限定されない。キットを構成するアイテムは、当業者によって所望されるように、個々のパッケージの形態で、および／または一緒にパッケージングされて供給され得る。
【００６８】
１つの実施形態では、キットは、少なくとも１つの発現系を適用な容器中に備える。好ましくは、このキットは、少なくとも１つの指示（例えば、このキットを同定する、パッケージもしくはラベル、本発明について本明細書中に記載される適用における使用に適切であるようなアイテム、および／または本発明について本明細書中に記載される適用におけるキットもしくはアイテムの使用に関する少なくとも１つの使用説明書であるがこれらに限定されない）を備える。必要に応じて、この少なくとも１つの使用説明書は、本発明について本明細書中に記載される適用におけるこのキットまたはアイテムの使用に関する、または本発明の実施におけるこのキットもしくは化合物の使用に関する、より大きな使用説明書セットの一部であり得る。さらにより好ましいのは、目的の配列を発現する際の使用に適切であると、パッケージ、ラベル、または使用説明書によって示されるようなキットである。
【実施例】
【００６９】
本発明の化合物および方法を、以下の実施例に関してさらに記載する。これらの実施例は、本発明をさらに例示するに役立ち、そして本発明の範囲を限定することは意図していない。
【００７０】
（実施例１：テトラサイクリン遺伝子調節系による調節）
図１は、本発明の例示的な調節される遺伝子発現系の模式図を示し、ここでは、２つの目的のコード配列（レトロウイルスのｇａｇ／ｐｏｌ配列およびＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質）が、２つの他の核酸構築物からの発現によって同時に調節される。従って、この系は、第１構築物および第２構築物がこの２つの系の間で通常用いられる、３つの核酸構築物の各々のうちの２つの系の組み合わせとみなされ得る。
【００７１】
本発明の好ましい発現系では、ｔＴＡは、ＴＲＥプロモーター（ｔｅｔオペロン）から発現されて、高い誘導性発現レベルおよび誘導の不存在下での低い基底発現の両方を可能にする。これが、このＴＲＥプロモーターが非常に弱く、そしてこのプロモーターからのあらゆるｔＴＡ発現が、この系と接触したテトラサイクリンの存在によって充分に不活化される理由である。テトラサイクリンが除去されると、ｔＴＡ発現は、正のフィードバック機構によって強固に誘導されて、高レベルのｔＴＡを産生し、このｔＴＡは、第２核酸構築物の発現を誘導する。
【００７２】
２つの第１構築物（ｐＴＲＥ−ｔＴＡＳｖＰｕｒｏＴＫＴａｔおよびｐＴＲＥ−Ｒｅｖ）（図１）の構造の模式図を図２に示す。ｐＴＲＥ−ｔＴＡＳｖＰｕｒｏＴＫＴａｔでは、ｔＴＡは、ＴＲＥプロモーターから発現され、Ｔａｔは、ＨＳＶ  ＴＫプロモーターから発現され、そして選択マーカーピューロマイシン耐性遺伝子が、ＳＶ４０初期プロモーターから発現される。細胞への両方の構築物の組込みが生じたら、この細胞におけるＲｅｖ発現は、上記の通り、テトラサイクリンの制御下にある。
【００７３】
（実施例２：ＨＴ１０８０に基づくパッケージング細胞株の構築）
ＨＴ１０８０細胞を、ｐＴＲＥ．ＲｅｖプラスミドＤＮＡおよびｐＴＲＥ．ｔＴＡＳｖＰｕｒｏＴＫＴａｔプラスミドＤＮＡを１０：１のモル比で用いて共トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、ピューロマイシン耐性のために選択された培地中で培養した。２〜３週間後、シングルセルコロニーが形成され、そしてこれを選択し、拡大し、そして抗Ｒｅｖ抗体を用いた免疫染色によってスクリーニングした。
【００７４】
テトラサイクリンによるＲｅｖ発現の調節：ポジティブクローンのうちの１つに由来する細胞２Ａ３（１）−２−Ｆ７を、テトラサイクリンの存在下または不存在下で、４８時間にわたって、４ウェルチャンバースライド中で増殖させた。次いで、細胞を固定し、そして抗Ｒｅｖ抗体または抗Ｔａｔ抗体で染色した。図３は、ＴＲＥプロモーターから発現されたＲｅｖが、テトラサイクリンによって厳密に制御されることを示す。テトラサイクリンの存在下では、ポジティブ細胞は存在しなかったが、ほぼすべてのシングル細胞が、テトラサイクリンの不存在下で抗Ｒｅｖ抗体を用いてポジティブに染色された。Ｔａｔ遺伝子はＨＳＶ  ＴＫプロモーターから構成的に発現されたので、ほぼ全ての細胞は、テトラサイクリンの存在下および不存在下の両方で、抗Ｔａｔ抗体によってポジティブに染色された。これらの結果は、このＲｅｖ発現が、テトラサイクリンおよびこのＴＲＥプロモーターから発現されるｔＴＡによって厳密に調節されることを示す。
【００７５】
（実施例３：ＧａｇＰｏｌ組込み）
２つのＨＴ１０８０−ＴＲクローン（上記の通り、ｐＴＲＥ．ＲｅｖおよびｐＴＲＥ．ｔＴＡＳｖＰｕｒｏＴＫＴａｔで安定にトランスフェクトされた）を、ｐ（ＳＣＭＶ．Ｎｅｏ）およびｐ（Ｕ３−１ＴＡＲ２．ＧａｇＰｏＩＲＲＥ）を１：１０の比で用いて共トランスフェクトし、そしてＧａｇＰｏｌ組込みのためのトランスフェクションの開始の４８時間後にネオマイシンを用いて選択した。ｐ（ＳＣＭＶ．Ｎｅｏ）は、サルＣＭＶプロモーターの制御下に、選択可能なネオマイシン耐性遺伝子を有する。ｐ（Ｕ３−１ＴＡＲ２．ＧａｇＰｏｌＲＲＥ）は、ＨＩＶ−２由来のＴＡＲ２配列を含む、ＨＩＶ−１由来の改変されたＵ３プロモーターの制御下に、ＲＲＥ含有ＧａｇＰｏｌコード配列を有する。
【００７６】
耐性クローンをｐ２４アッセイによってスクリーニングし、異なるｐ２４値を有する合計４０個のポジティブクローンを選択し、そしてＨＴ１０８０−ＴＲＧＰまたはプレパッケージング細胞株と命名した。最高のクローンは５０００ｎｇ／ｍｌを超えるｐ２４を産生し得、そして１０００倍を超えて誘導された（表１を参照のこと）。大部分のクローンは１００〜２００倍の誘導を生じ、そしてテトラサイクリンの存在下で低レベルのバックグラウンドのｐ２４（３〜９ｎｇ／ｍｌ）を与えた（表１）。このことは、Ｒｅｖを通してテトラサイクリンによってＧａｇｐｏｌ発現が制御されることを示す。１０７２ｎｇ／ｍｌおよび１８５４ｎｇ／ｍｌのｐ２４値を有する２つのポジティブクローン１１−６および１２−５を、ＶＳＶ  Ｇ組込みのために選択した。
【００７７】
【表１】
2005512573.tif 000002
（実施例４：ＶＳＶ−Ｇ組込み）
２つのＨＴ１０８０−ＴＲＧＰクローン（上記からの１１−６および１２−５）を、２０μｇのｐ（ＳＣＭＶ．ＶＳＶＧＲＲＥ，ＴＫ．Ｈｙｇ）でトランスフェクトし、そしてトランスフェクション開始の４８時間後にハイグロマイシンを用いて選択した。耐性クローンをインサイチュでの抗ＶＳＶＧ免疫染色によってスクリーニングし、強力な抗ＶＳＶＧ染色および５０％〜９０％の純度を有する合計７個のポジティブクローンを選択し、そしてＨＴ１０８０−ＴＲＧＰＧまたはパッケージング細胞株と命名した。ＶＳＶＧ染色は、Ｔｃの存在下で、および親ＨＴ１０８０細胞において見出されず、一方、ポジティブクローンのＶＳＶＧ染色は細胞質に位置し、そしてまた、Ｔｃの不存在下および酪酸ナトリウムの存在下では細胞表面に濃縮された。この結果は、ＶＳＶＧ発現もまた、Ｒｅｖを介してテトラサイクリンによって制御されることを示す。
【００７８】
（実施例５：ウイルスベクターパッケージング）
実施例２からの選択されたＨＴ１０８０−ＴＲクローンを、９６ウェルプレートにおける限界希釈によってさらに精製した。５つの最終的なクローンを免疫染色に基づいて選択し、そして共トランスフェクションによってベクター産生についてさらに分析した。９０％を超える純度であるＨＴ１０８０−ＴＲクローンを、６ウェルプレート中に１×１０６細胞／ディッシュの細胞密度でプレーティングし、そしてテトラサイクリン（Ｔｃ）の除去および２．５ｍＭ酪酸ナトリウムの添加の２４時間後に、各々５ｍｇのｐＮ２ＣＧＦＰおよびｐＣＧＣＲＳＲＲＥでトランスフェクトした。ｐＮ２ＣＧＦＰは、ＨＩＶ−１に基づく複製欠損ウイルスベクターであり、これは、５’−ＬＴＲから発現されるｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子の後ろのＲＲＥ、および内部ＣＭＶプロモーターから発現されるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含む。ｐＣＧＣＲＳＲＲＥの一般的構造を図２に示し、ここで、「Ｇ」とは、ＶＳＶ−Ｇタンパク質をいう。
【００７９】
トランスフェクション後、培地を、３ｍｌのＴｃを含まず酪酸ナトリウムを含まない培地に交換し、その４８時間後、ＨＴ１０８０細胞を形質導入する際に使用するために上清を収集した。形質導入の４８時間後、形質導入された細胞を、ＦＡＣＳによってＧＦＰ発現について分析した。ベクターの力価を、ＧＦＰ発現細胞の％によって決定した。結果を以下の表２に示し、ここで、クローン２Ａ（１）−２−Ｅ５および２Ａ３（２）は、５つの最終的なクローンの中でも比較的高い力価を産生した。
【００８０】
【表２】
2005512573.tif 000003
全てのサンプルを２連で行った。ＨＴ１０８０コントロールを、４つ全てのプラスミドで同時に共トランスフェクトして、これらの細胞におけるこれらのプラスミドの一過性トランスフェクションを得た。４つのＨＴ１０８０−ＴＲクローンの終点での力価は、以下の順番である：２Ａ３（２）＞２Ａ２（１）−２−Ｅ５＞７Ａ２（２）＞２Ａ３（１）−２−Ｆ７。表から明らかなように、ＨＴ１０８０−ＴＲクローンの使用によるベクター産生は、ＨＴ１０８０コントロールのベクター産生と同様の一過性トランスフェクション系のベクター産生よりも高い。クローン２Ａ（１）−２−Ｅ５および２Ａ３（２）は、テトラサイクリンを含まない培地中で１０倍の誘導を有する。
【００８１】
（実施例６：安定にトランスフェクトされたパッケージング細胞を用いたウイルスベクター産生）
実施例４由来のパッケージング細胞のポジティブクローンを、ｍｏｉ７０でのｐＮ１（ｃｐｔ）ＧＦＰベクター形質導入によって、終点力価についてスクリーニングした。これらの細胞をテトラサイクリンの存在下で形質導入し、残りのベクターを洗浄除去し、次いで、形質導入の１２時間後、テトラサイクリンを含まず７ｍＭ酪酸ナトリウムを含む新鮮な培地を用いて培養した。この上清を、酪酸ナトリウム処理の２４、４８および７２時間後に収集し、そしてＨｅＬａ−Ｔａｔ細胞中で力価測定した。平均１細胞あたり１０コピーのベクターを含む、プールした混合プロデューサー細胞は、それぞれ、１２ウェルプレートまたはＴ７５フラスコ中で、４８時間で収集したとき、１．４×１０６ＴＵ／ｍｌまたは４．０×１０６ＴＵ／ｍｌの終点力価を生じた（表３を参照のこと）。ＴＵは、形質転換単位を表す。
【００８２】
全ての細胞を、３日間の誘導後に溶解した。テトラサイクリンの存在下で観察された、低レベル（＜１×１０２ＴＵ／ｍｌ）のベクター産生が存在した（表３）。ベクター産生は、プロデューサー細胞の少なくとも７週間の継代にわたって、同じレベルで維持された（表３）。このことは、ベクター産生／ベクターパッケージングが、テトラサイクリンによって制御され、テトラサイクリンは最初にｔＴＡ発現を制御し、ｔＴＡは次いでＲｅｖ発現を制御し、Ｒｅｖは次いで（そしてＲＲＥ配列を介して）ＧａｇＰｏｌタンパク質およびＶＳＶ−Ｇタンパク質（これらは、ウイルスベクターパッケージングについて必要な成分である）の発現を制御することを示す。
【００８３】
【表３】
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（実施例７：Ｔａｔ発現およびＲｅｖ発現による目的の遺伝子の調節）
本発明者らは、ＨＩＶ−１のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子（ＣＭＶプロモーターから発現される）、続いて下流ＨＩＶ−２  ＲＲＥ（ＲＲＥ２）が、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖによって調節され得ることを以前に実証した。Ｃｈａｎｇら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（２０）：５４６５−５４７２，１９９２）は、真のＴＡＲ（ＴＡＲ１）エレメントがＨＩＶ−２  ＴＡＲ（ＴＡＲ２）によって置換されたキメラＨＩＶ−１  ＬＴＲが、ＨＩＶ−１  Ｔａｔによって活性化され得ることを見出した。ＴＡＲエレメントのみが置換されたので、ＨＩＶ−１  ＬＴＲにおける残りのＲおよびＵ５は、依然としてこのキメラＬＴＲ中に存在する。本発明は、ＨＩＶ−１  Ｕ３およびＴＡＲ２のみを含むキメラプロモーターＵ３／ＴＡＲ２（図４）を包含する。これを用いて、構築物ｐＶＰ１．２ＲｚｎｏＧ（図２を参照のこと）中の、ｇａｇ−ｐｏｌを発現するＣＭＶプロモーターを置換して、ｐＶＰ１．２ＲｚｎｏＧ−Ｕ３１ＴＡＲ２を作製した（図２を参照のこと）。プラスミドｐＶＰ１．２ＲｚｎｏＧまたはｐＶＰ１．２ＲｚｎｏＧ−Ｕ３１ＴＡＲ２を、ｐＮ１ＣＧＦＰおよびｐＣＧＣＲＳＲＲＥとともに２９３Ｔ細胞中に共トランスフェクトした。上清をトランスフェクションの４８時間後に収集し、そしてＨＴ１０８０で力価測定した。両方の構築物は、等しい量のパッケージングされたベクター（ｐＮ１ＣＧＦＰ）を産生することが見出された。力価は、ｐＶＰ１．２ＲｚｎｏＧおよびｐＶＰ１．２ＲｚｎｏＧ−Ｕ３１ＴＡＲ２についてそれぞれ、９．０×１０６ＴＵ／ｍｌおよび９．２×１０６ＴＵ／ｍｌであった（ここで、ＴＵは、形質転換単位を表す）。この結果は、キメラプロモーターがＴａｔによってトランス活性化されて、ＣＭＶプロモーターのレベルと匹敵するレベルで発現し得ることを示す。
【００８４】
（実施例８：Ｒｅｖ発現による目的の遺伝子の調節）
Ｈａｍｍａｒｓｋｊｏｌｄら（Ｊ．Ｖｉｒ．６８（２）：９５１−９５８，１９９４）は、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子（ＲＲＥエレメントを含む）の発現が、Ｒｅｖがイントロン中に存在する場合のみ、Ｒｅｖによって調節されることを見出した。このｅｎｖ遺伝子が非イントロンｃＤＮＡとして発現されるならば、このｅｎｖ遺伝子発現は、Ｒｅｖによってはもはや調節されない。ＣｈａｎｇおよびＳｈａｒｐ（Ｃｅｌｌ  ５９：７８９−７９５，１９８９）は、Ｒｅｖによって調節される遺伝子発現が、スプライスドナーシグナルの強さに依存することを見出した。スプライスドナーシグナルが非常に強力であってこのＲＮＡが非常に効率的にスプライシングされる場合、遺伝子発現は、Ｒｅｖによって調節され得なかった。
【００８５】
ＶＳＶ−Ｇ  ｃＤＮＡ（「遺伝子」）がイントロン中に挿入された一連のＶＳＶ−Ｇ発現構築物を作製した。ＶＳＶ−Ｇコード領域（「遺伝子」）の下流は、ＣＲＳエレメントおよびＲＲＥである。ＲＲＥの３’末端は、スプライスアクセプター部位を含む（図５における「Ｒｅｖ応答性」を参照のこと）。５つの異なるスプライスドナー（ＳＤ）シグナルを、ＶＳＶ−Ｇ  ｃＤＮＡの前にクローニングした（以下の表４を参照のこと）。
【００８６】
【表４】
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従って、ＶＳＶ−Ｇ領域、ＣＲＳ領域、およびＲＲＥ領域の全体は、イントロンとして発現される（図５、「Ｒｅｖ応答性」を参照のこと）。これらの５つのＶＳＶ−Ｇ発現構築物を、ＶＳＶ−Ｇの発現がＲｅｖによって調節されるか否かをみるために、２９３Ｔ細胞において試験した。結果を図６に示す。これらの５つの構築物を、ｐＣＭＶＲｅｖ（ｒｅｖ発現構築物）またはｐＣＩ（Ｒｅｖ遺伝子を含まず、ネガティブコントロールとして用いられる、ｐＣＭＶＲｅｖの親構築物）のいずれかを２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。ウェスタンブロット（図６（Ｆｏｇ／６））は、ＶＳＶ−Ｇ発現が、５つの構築物のうちの３つによってトランスフェクトした細胞においてＲｅｖによって調節されることを示す。
【００８７】
ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ｐＣＭＶＲｅｖと、ｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−１ＭまたはｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−ＨまたはｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−１Ｅのいずれか１つとで共トランスフェクトした細胞において検出される。しかし、ＶＳＶ−Ｇは、ｐＣＩと、ｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−１ＭまたはｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−ＨまたはｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−１Ｅのいずれか１つとで共トランスフェクトした細胞において検出されない。このデータは、これらの３つの構築物からのこのＶＳＶ−Ｇ発現が、Ｒｅｖによって調節されることを示す。
【００８８】
他の２つの構築物（ｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−ＧおよびｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−２Ｅ）を用いてトランスフェクトした細胞においてＶＳＶ−Ｇは検出されなかった。ｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−Ｇにおけるβ−グロビンスプライスドナーシグナルは、コンセンサススプライスドナーシグナルと同一であり、そしてｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−２ＥにおけるＨＩＶ−２  ｅｎｖスプライスドナーシグナルは、コンセンサス配列（上記を参照のこと）から１ヌクレオチド異なる。これらのスプライスドナーシグナルは、（効率的にスプライシングしすぎて）Ｒｅｖによる調節を可能にするには強すぎるようである。
【００８９】
ＶＳＶ−ＧがｐＣＭＶＧでトランスフェクトした細胞において発現され、この発現がｒｅｖ発現とは独立であることに留意すべきである。ＣＲＳ、ＲＲＥ、およびスプライスシグナルのいずれも、この構築物中に存在せず、この構築物は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＶＳＶ  Ｇタンパク質を直接的に発現する。
【００９０】
上記は、３つのＶＳＶ−Ｇ発現構築物からのＶＳＶ−Ｇの発現がＲｅｖによって調節され得る、３つのＶＳＶ−Ｇ発現構築物の同定を実証する。
【００９１】
特許、特許出願、および刊行物を含め、本明細書中に引用した全ての参考文献は、上記で具体的に援用しようとしまいと、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００９２】
ここまで本発明を充分に記載してきたが、本発明が、過度の実験を伴わずに、広い範囲内の等価なパラメーター、濃度、および条件で実施され得ることが当業者によって理解される。本願は、本開示からの逸脱を含め、一般に、本発明の原理に従う、本発明のあらゆる改変物、使用、または適用を包含することを意図し、本発明が関与する分野で公知であるか慣用的に実施されるものであり、そして本明細書の上記に示す必須の特徴に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、細胞中でのレトロウイルスのｇａｇ／ｐｏｌコード領域およびＶＳＶ−Ｇタンパク質の両方の発現を調節するための、本発明の発現系の模式図である。この系は、４つの構築物を用い、第１は、ＴＲＥ調節プロモーターの制御下でｔＴＡについて自己調節される発現構築物である。第２構築物は、レトロウイルスのｒｅｖタンパク質をＴＲＥ調節プロモーターの制御下で発現する。第３構築物は、レトロウイルスの、ＲＲＥ含有、ｇａｇ／ｐｏｌコード領域を、キメラレトロウイルスプロモーターの制御下で発現する。第４構築物は、ＲＲＥ調節性ＶＳＶ−Ｇ転写産物を、異種プロモーター（例えば、サルサイトメガロウイルスプロモーター）の制御下で発現する。
【図２】図２は、本発明の多数の異なる核酸構築物の構造を示す。ｒｅｖコード配列をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはテトラサイクリン（ＴＲＥ）プロモーターの制御下に置く、構築物を示す。ｐＴＲＥ−ｔＴＡＳｖＰｕｒｏＴＫＴａｔの構成を、本明細書中の実施例１に記載する。ｐＣＧＣＲＳＲＲＥ−１Ｍを、図５に部分的に詳細に示す。プラスミドｐＶＰ１．２ＲｚｎｏＧおよびｐＶＰ１．２ＲｚｎｏＧ−Ｕ３１ＴＡＲ２（ここで、ＩＲＥＳは、内部リボソーム進入部位である）を、本明細書中の実施例７に詳細に示す。プラスミドｐＮ２ＣＧＦＰおよびｐＮ１（ｃｐｔ）ＣＧＦＰを、本明細書中の実施例５および７において考察する。
【図３】図３は、ｒｅｖ発現を調節するためのテトラサイクリンの存在下または不存在下での、抗Ｒｅｖ抗体および抗Ｔａｔ抗体を用いて免疫染色した、トランスフェクトしたＨＴ１０８０−ＴＲクローンを示す。本明細書中の実施例２を参照のこと。
【図４】図４は、本明細書中の実施例７において考察したキメラＵ３／ＴＡＲ２プロモーターの模式図を示す。
【図５】図５は、遺伝子発現をＲｅｖ応答性（依存性）または非応答性（独立性）にするための、異なる配置のスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む、構築物の模式図を示す。
【図６】図６は、異なるスプライスドナー部位の使用によるｒｅｖ依存性ＶＳＶ−Ｇタンパク質発現を実証するウェスタンブロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2005512573.tif 000013