(57)【要約】開示は、選択可能なマーカー及びｌｏｘＰ部位を含むトランスポゾン（transposon）、及びＣｒｅ発現ベクターによるＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えを用いる、染色体の特定部位が除去された新しい菌株の作成方法である。該方法は、（１）選択可能なマーカーとｌｏｘＰ部位を含むトランスポゾンを調製する工程と、（２）前記トランスポゾンを微生物染色体の任意の位置に挿入させ、その挿入された部位を決定する工程と、（３）異なる選択可能なマーカーを含む二つのトランスポゾンを一つの染色体に一体化する工程と、（４）工程（３）の染色体にＣｒｅ発現ベクターを導入することによって二つのｌｏｘ部位間の染色体部位を除去する工程と、（５）前記染色体の一部が除去された突然変異体に前記（３）及び（４）工程を反復的に行うことで、漸進的に突然変異体の染色体を短縮させる工程と、を含む。
2005517447.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方の末端の配列番号３の塩基配列を有する外端トランスポザーゼ認識配列、他方の末端のその逆相補的な配列、配列番号４で表現されるｌｏｘＰ部位、配列番号５で表現されるＫｍＲ遺伝子、及び配列番号６で表現されるＧＦＰ遺伝子を含む、トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰ。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列を含む、請求項１記載のトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰ。
【請求項３】
一方の末端の配列番号３の塩基配列を有する外端トランスポザーゼ認識配列、他方の末端のその逆相補的な配列、配列番号４で表現されるｌｏｘＰ部位、及び配列番号７で表現されるＣｍＲ遺伝子を含む、トランスポゾンＴｎＣｌｏｘＰ。
【請求項４】
配列番号２の塩基配列を含む、請求項３記載のトランスポゾンＴｎＣｌｏｘＰ。
【請求項５】
下記工程：
（１）外端トランスポザーゼ認識配列、ｌｏｘＰ部位及び異なる選択可能なマーカーを含む二種類のトランスポゾンを調製すること、
（２）前記二種類のトランスポゾンを異なる微生物染色体の任意の位置にそれぞれ挿入し、それぞれの挿入された部位を決定すること、
（３）Ｐ１ファージ形質導入によって二つの微生物染色体を一体化し、異なる選択可能なマーカーを含む二種類のトランスポゾンを一つの染色体上に位置させること、及び
（４）導入されたＣｒｅ発現ベクターによってＣｒｅ遺伝子を発現させることによって二つのｌｏｘＰ部位間の染色体部位を除去すること
を含む、特定の染色体部位の欠失を含む新規菌株の構築方法。
【請求項６】
前記二種類のトランスポゾンが、請求項１または請求項２に係るトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰ及び請求項３または請求項４に係るトランスポゾンＴｎＣｌｏｘＰである、請求項５記載の新規菌株の構築方法。
【請求項７】
請求項５記載の新規菌株の構築方法であって、
−  配列番号１の塩基配列を含むトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰを、
リガーゼを用いてＧＦＰ遺伝子をＫｍＲ及びｌｏｘＰを有する線状のｐＫＫｌｏｘＰベクター内に挿入することによってベクターｐＫＧｌｏｘＰを調製すること
上記ｐＫＧｌｏｘＰベクターを制限酵素で処理することによってＫｍＲ、ＧＦＰ及びｌｏｘＰ部位を含むＤＮＡ断片を分離すること、
リガーゼを用いて上記分離されたＤＮＡ断片を線状ｐＭＯＤＴＭ＜ＭＣＳ＞ベクターに挿入することによってｐＴｎＫＧｌｏｘＰベクターを調製すること、
上記ｐＴｎＫＧｌｏｘＰベクターのＰＣＲを行うこと、
によって調製し、そして、
−  配列番号２の塩基配列を含むトランスポゾンＴｎＣｌｏｘＰを、
上記ＣｍＲ及びｌｏｘＰ部位を含むｐＫＧｌｏｘＰベクターを制限酵素で処理することによってＣｍＲ及びｌｏｘＰ部位を含むＤＮＡ断片を分離すること、
上記分離されたＤＮＡ断片をリガーゼを用いて線状ｐＭＯＤＴＭ＜ＭＣＳ＞ベクターに挿入することによってｐＴｎＣｌｏｘＰベクターを調製すること、及び
上記ｐＴｎＣｌｏｘＰベクターのＰＣＲを行うこと
によって調製する、新規菌株の構築方法。
【請求項８】
請求項５又は７記載の新規菌株の構築方法であって、下記工程：
−  特定の染色体部位の欠失を含む突然変異体から２つの突然変異体を選択し、そして選択された突然変異の一方をドナーとしてそして他方をレシピエントとして用いるＰ１ファージ形質導入を行い、上記２つの突然変異体の全ての染色体欠失部位を含む新規突然変異体を構築すること、
−  Ｐ１ファージレシピエントとして上記で得られた突然変異体、そしてドナーとして特定の染色体部位の欠失を含む既に調製された突然変異体を用い、Ｐ１ファージ形質導入を連続的かつ反復的に行うこと、及び
−  連続的に得られた突然変異体の染色体から他のドナー突然変異体の染色体欠失部位を除去し、得られた突然変異体の染色体を徐々に短くすること
をさらに含む、新規菌株の構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｌｏｘＰ部位を有するトランスポゾン（transposon）、及びＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換え（site-specific recombination）を用いる、染色体の特定部位が除去された菌株、及びそれらの構築方法に関する。より詳しくは、本発明は、選択可能な選択可能なマーカー（selectable marker）とｌｏｘＰ部位（loxP site）を含むトランスポゾン及びＣｒｅ発現ベクターを用いるＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えによって、染色体の特定部位を除去し、新しい菌株を構築する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えを利用して大腸菌（E.coli）染色体の特定部位を除去する技術は、一般に知られているが、従来の方法においては、染色体の特定部位を除去するために、実験ごとにターゲティングベクター（targeting vector）を調製してＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行う必要があった。また、染色体内のトランスポゾンの無作為な転移も、周知である。しかし、トランスポゾンとＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えを共に使用して微生物の染色体部位を除去する技術は、未だに報告されていない。
【０００３】
発明の開示
本発明は、毎実験ごとにターゲティングベクターを調製してＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行う必要があった従来の方法を改善するための、トランスポゾンとＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えを利用する、染色体の特定部位を除去する方法に関する。
【０００４】
本発明は、トランスポゾンとＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えを利用して、染色体の特定部位が除去された菌株を調製する方法に関する。より詳しくは、選択可能なマーカーとｌｏｘＰ部位を含むトランスポゾン及びＣｒｅ発現ベクターを利用するＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えによる、染色体の特定部位が除去された新しい菌株を作成する方法に関する。
【０００５】
本発明に係る特定の染色体部位が除去された新規菌株の作成方法は、下記工程：
下記工程：
（１）外端トランスポザーゼ認識配列、ｌｏｘＰ部位及び異なる選択可能なマーカーを含む二種類のトランスポゾンを調製すること、
（２）前記二種類のトランスポゾンを異なる微生物染色体の任意の位置にそれぞれ挿入し、それぞれの挿入された部位を決定すること、
（３）Ｐ１ファージ形質導入によって二つの微生物染色体を一体化し、異なる選択可能なマーカーを含む二種類のトランスポゾンを一つの染色体上に位置させること、及び
（４）導入されたＣｒｅ発現ベクターによってＣｒｅ遺伝子を発現させることによって二つのｌｏｘＰ部位間の染色体部位を除去すること
を含む。
【０００６】
以下、調製方法をより詳しく説明する。
【０００７】
前記工程（１）において、前記二種類のトランスポゾンは、異なる選択可能なマーカーを有している。本発明の実施例では、前記二種類の異なるトランスポゾンとしてＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰを調製して使用した。ＴｎＫＧｌｏｘＰは、ｌｏｘＰ部位（配列番号４）と選択可能なマーカーとしてＫｍＲ（カナマイシン抵抗遺伝子；kanamycin resistant gene、配列番号５）及びＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質；Green Flurolecent Protein、配列番号６）遺伝子を含む。ＴｎＣｌｏｘＰは、ｌｏｘＰ部位（配列番号４）と選択可能なマーカーとしてＣｍＲ（クロラムフェニコール抵抗遺伝子；chlroramphenicol resistant gene、配列番号７）を含む。前記二種類のトランスポゾンは、その両側の末端に１９塩基対を含む外端トランスポザーゼ認識配列（outer end transposase recognition sequence；OE sequence）を有しており、それは配列番号３（5'-ctgtctcttatacacatct-3'）及びこれと逆相補的な配列（5'-agatgtgtataagagacag-3'）をそれぞれ有する。
【０００８】
即ち、トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰは、両末端に１９個の塩基対を含む外端トランスポザーゼ認識配列（OE sequence）、ｌｏｘＰ部位、選択可能なマーカーとしてＫｍＲ及びＧＦＰ遺伝子を有する。トランスポゾンＴｎＣｌｏｘＰは、両末端に１９個の塩基対を含む外端トランスポザーゼ認識配列、ｌｏｘＰ部位及び選択可能なマーカーとしてＣｍＲを有する。前記トランスポゾンにおいて、トランスポゾンの長さ及び配列は、組換えに不可欠である、両末端に位置するＯＥ配列及びｌｏｘＰ部位を除いてトランスポゾンの製造過程で使用されるベクターによって配列異なることができる。
【０００９】
前記トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰは、それぞれ、ｐＴｎＫＧｌｏｘＰベクターとｐＴｎＣｌｏｘＰベクターからＰＣＲ反応により得ることができる（図１を参照）。
【００１０】
好ましい実施例の一つによると、前記トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰは、次のような方法で調製することができる。
【００１１】
まず、前記トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰの調製方法は、下記工程：
−  リガーゼを利用してＧＦＰ遺伝子を線状（linear）のＫｍＲ及びｌｏｘＰ部位を含むｐＫＫｌｏｘＰベクターに挿入して、新しいベクターｐＫＧｌｏｘＰを調製する工程と、
前記ｐＫＧｌｏｘＰベクターに制限酵素を処理して、ＫｍＲ、ＧＦＰ及びｌｏｘＰ部位を含むＤＮＡ断片を分離する工程と、
リガーゼを利用して前記分離したＤＮＡ断片を線状のｐＭＯＤＴＭ＜ＭＣＳ＞ベクターに挿入してｐＴｎＫＧｌｏｘＰベクターを調製する工程と、
前記ｐＴｎＫＧｌｏｘｐベクターのＰＣＲを行う工程とを含む。
【００１２】
また、前記トランスポゾンＴｎＣｌｏｘＰの調製方法は、下記工程：
ＣｍＲとｌｏｘＰ部位を有するｐＫＣｌｏｘＰベクターに制限酵素を処理して、ＣｍＲとｌｏｘＰ部位を含むＤＮＡ断片を分離する工程と、
リガーゼを使用して前記分離されたＤＮＡ断片を線状のｐＭＯＤＴＭ＜ＭＣＳ＞ベクターに挿入してｐＴｎＣｌｏｘＰベクターを調製する工程と、
前記ｐＴｎＣｌｏｘＰベクターのＰＣＲを行う工程とを含む。
【００１３】
このような方法で調製されたトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰ及びＴｎＣｌｏｘＰの下記の塩基配列を配列番号１と配列番号２にそれぞれ示した。
【００１４】
【表１】
2005517447.tif 000003
2005517447.tif 000004
2005517447.tif 000005
【００１５】
【表２】
2005517447.tif 000006
2005517447.tif 000007
【００１６】
前記したように、ｌｏｘＰ部位、ＯＥ配列、ＫｍＲ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子及びＣｍＲ遺伝子部位を除いた残りの部分の塩基配列や長さは、トランスポゾンの調製に使用されるベクターの種類によって変わることができる。もし、ｌｏｘＰ部位、ＯＥ配列、選択可能なマーカー（ＫｍＲ／ＧＦＰまたはＣｍＲ）の塩基配列が全て含まれ、保存されると、一つ以上の塩基が欠失、挿入および／または置換されても、トランスポゾンの機能には影響がない。また、ｌｏｘＰ部位は、両末端の外端トランスポザーゼ認識配列間に位置しながら選択可能なマーカーの中間または内部に挿入されなければよく、ｌｏｘＰ部位が選択可能なマーカーの３’側または５’側に位置してもかまわない。
【００１７】
前記工程（２）において、前記二種類のトランスポゾン、ＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰにトランスポザーゼをそれぞれ添加してトランスポゾーム（transposome）をそれぞれ形成させ、異なるトランスポゾンを含むトランスポゾームをなエレクトロポレーション（electroporation）方法を利用して異なる微生物に移し、微生物の染色体の任意の部位に各トランスポゾンを挿入させた、前記トランスポゾンが挿入された突然変異体微生物を選択した、選択された突然変異体内のトランスポゾンの挿入部位を特定する。このとき、トランスポザーゼの任意の挿入機能はＭｇ2+イオンによって活性化されるため、トランスポゾームの形成はＭｇ2+イオンのない条件下で行い、微生物内におけるトランスポゾンの任意の挿入はＭｇ2+イオンの存在する条件下で行う。
【００１８】
また、前記二種類のトランスポゾンは、カナマイシン抵抗遺伝子とクロラムフェニコール抵抗遺伝子をそれぞれ含み、そして前記二つの抗生物質に対して抵抗性を有するため、前記トランスポゾンの挿入工程後、菌株をカナマイシン含有培地またはクロラムフェニコール含有培地で培養して、各トランスポゾンを有する菌株を選択することができる。任意のトランスポゾンの挿入はサザンブロット（Southern blot）分析によって、そして、挿入されたトランスポゾンの位置は任意的ＰＣＲ（arbitrary PCR）によって確認することができる。
【００１９】
前記工程（３）において、前記トランスポゾンの位置を確認した菌株の中から、除去しようとする染色体部位の一方の末端に一種類のトランスポゾンが挿入された菌株と、別の種類のトランスポゾンが挿入された菌株を選択する。選択された菌株の中の一つを供与者（donor）として、他の一つをレシピエント（recipient）として用い、一般的なＰ１ファージ形質導入法により前記二つのトランスポゾンを、除去しようとする染色体部位の両端に位置させる。このとき、ｌｏｘＰ部位は同じ方向に位置させなければならない。
【００２０】
前記工程（４）において、前記突然変異株内にｐＴＳＣｒｅ発現ベクターを移入させることで、除去しようとする染色体部位の両端にトランスポゾンを含む突然変異株へＣｒｅ遺伝子を移入させる。このとき、ｐＴＳＣｒｅ発現ベクター内のＣｒｅ遺伝子の転写は、テトラサイクリンプロモーター（Ptet）によって制御されるため、前記ｐＴＳＣｒｅ発現ベクターが導入された突然変異株をクロロテトラサイクリン含有培地で培養してＣｒｅ遺伝子を発現させ、Ｃｒｅリコンビナーゼリコンビンナーゼ（Cre Recombinase）を合成する。このとき、Ｃｒｅリコンビナーゼリコンビナーゼは、前記二つのｌｏｘＰ部位を特異的に切断してｌｏｘＰを両端に含む染色体部位を除去し、切断された部分を再びつなぐ役割をする。
【００２１】
さらに、本発明に係る調製方法は、染色体の一部が除去された突然変異株に前記工程（３）及び（４）を反復的に行って、染色体を漸進的に縮小させる工程を更に含むことができる。即ち、前記特定の染色体部位が除去された突然変異株中任意に２個を選択することによって、Ｐ１ファージ形質導入法によって２個の選択された突然変異体を一つの染色体に融合させ、前記二つの突然変異体の染色体の除去された部位と同様な大きさだけ除去部位が拡張された新しい変異株を得、そして得られた新しい菌株と異なる突然変異株とのＰ１ファージ形質導入法を反復して行って染色体の除去部位を拡張させ、より大きな染色体の除去された部位を有する突然変異体を得る。前記連続的Ｐ１ファージ形質導入の時、所望の除去部位を有する突然変異株の効果的な選択のために、Ｐ１授与者として作用する選択可能なマーカーを相同組換え（homologous recombination）して除去する。
【００２２】
本発明において、前記微生物として大腸菌（E. coli）を使用し、前記トランスポゾンとしてＴｎ５を使用した。Ｔｎ５は染色体の任意の部位に挿入可能であることが報告されており（Berg, D.D., and M.M.Howe.1989.Mobile DNA. American Society for Microbiology, Washington, D.C.）、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼは、二つのｌｏｘＰ部位を認識して、これら間のＤＮＡ再組換え反応を触媒すると報告されている（Abremski, K., HoessR.,and Sternberg,N.1984.Studies on the properties of P1 site-specific recombination. Cell 32,1301-1311）。
【００２３】
また、Ｐ１ファージは、宿主微生物の染色体の一部を他の微生物に伝達する機能があることが知られている（Watanabe, T., Furuse, C., and Sakaizumi,S.1968. Transduction of various R factors by phage P1 in Escherichia coli and by phage P22 in Salmonella typhimurium）。したがって、本発明は、ｌｏｘＰ部位を有するトランスポゾンを微生物染色体内の任意の部位に挿入し、Ｐ１ファージ形質転換法を利用して２個のｌｏｘＰ部位を同一染色体の同じ方向に位置させ、次いで、Ｃｒｅ発現ベクターを導入させてＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現させることによる、２個のｌｏｘＰ部位間の部分的染色体が除去された新しい突然変体微生物の調製方法を開発した。
【００２４】
以下、本発明を次の実施例により詳しく説明する。この分野における通常の知識を有する者にとって、この実施例が本発明をより明りょうに説明するためにのみ示されたものであり、本発明が示された実施例に限定されるものでないことは明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
実施例１
大腸菌染色体の任意の部位に挿入可能なトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰの調製
図１は直線型のトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰを示したもので、ＴｎＫＧｌｏｘＰはＫｍＲ、ＧＦＰ（pGFPuv、Clontech、Palo Alto、CA）及びｌｏｘＰ部位を含み、ＴｎＣｌｏｘＰはＣｍＲとｌｏｘＰ部位を含んでいる。前記二種類のトランスポゾンは、その両側末端に１９塩基対を含む外端トランスポザーゼ認識配列（Epicentre technologies、Madison、WI）を有している。図１から分かるように、前記トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰは、それぞれｐＴｎＫＧｌｏｘＰベクターとｐＴｎＣｌｏｘＰベクターからＰＣＲによって得ることができる。
【００２６】
前記ｐＴｎＫＧｌｏｘＰベクターは、次のような方法で調製した。まず、ＰＣＲから得たＧＦＰ遺伝子をＥｃｏＲＩ制限酵素（New England Biolabs、Beverly、MA）を利用して切断した後、リガーゼ（New England Biolabs、Beverly、MA）を利用して、前記ＧＦＰ遺伝子をＥｃｏＲＩ制限酵素によって切断させた線状（linear）のＫｍＲとｌｏｘＰ部位を有するｐＫＫｌｏｘＰ（Michael D.Koob,et al,1994,In vivo excision and amplification of large segment of the Escherichia coli genome,Nucleic Acids Reserch 22(12),2392-2398）ベクターに挿入して新しいベクターを得た。この新しいベクターをｐＫＧｌｏｘＰと命名した。
【００２７】
前記ｐＫＧｌｏｘＰをＮｏｔＩ／ＸｂａＩ制限酵素（New England Biolabs、Beverly、MA）と反応させて、ＫｍＲ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子及びｌｏｘＰ部位を有する２．２ｋｂ大きさのＤＮＡ断片を分離した後、リガーゼを利用して、前記分離したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ制限酵素（New England Biolabs、Beverly、MA）で処理した線状のｐＭＯＤＴＭ＜ＭＣＳ＞（Epicentre technologies、Madison、WI）に挿入してｐＴｎＫＧｌｏｘＰベクターを得た（図１を参照）。
【００２８】
前記ｐＴｎＣｌｏｘＰベクターを、次のような方法で調製した。ＣｍＲとｌｏｘＰ部位を含むｐＫＣｌｏｘＰ（Michael D.Koob,et al,1994,In vivo excision and amplification of large segment of the Escherichia coli genome,Nucleic Acids Reserch 22(12),2392-2398）ベクターをＮｏｔＩとＢａｍＨＩ制限酵素（New England Biolabs、Beverly、MA）を利用して切断し、ＣｍＲ、ｌｏｘＰ部位を有する１．２ｋｂのＤＮＡ断片を分離した後、リガーゼを使用して、前記ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ制限酵素で処理した線状のｐＭＯＤＴＭ＜ＭＣＳ＞ベクターに挿入してｐＴｎＣｌｏｘＰベクターを調製した（図１を参照）。
【００２９】
前記ｐＴｎＫＧｌｏｘＰベクターとｐＴｎＣｌｏｘＰベクターにＰＣＲを行うことで、トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰをそれぞれ調製した。前記ＰＣＲに使用したプライマーはｐＭＯＤ＜ＭＣＳ＞ＦＰ−１（配列番号８）とｐＭＯＤ＜ＭＣＳ＞ＲＰ−１（配列番号９）であり、その塩基配列は次のようである。
pMOD<MCS>FP-1:5¢ATTCAGGCTGCGCAACTGT-3¢
pMOD<MCS>RP-1:5¢-TCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG-3¢
【００３０】
実施例２
トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰを大腸菌染色体の任意の部位に挿入させた二種類の大腸菌突然変異体ライブラリーの調製及び挿入された部位確認
５００ngのＴｎＫＧｌｏｘＰ及び５００ngのＴｎＣｌｏｘＰをそれぞれ１０μlのＴｎ５トランスポザーゼと反応させ、そしてＤＤＷ（Double Distilled Water）を加え、溶液の総容量を２０μlにした後、２５℃で３０分間反応させて各トランスポゾームを形成させた。このとき、トランスポザーゼの任意の挿入機能を阻害するために、前記反応は、Ｍｇ2+イオンのない状況で行った。その後、Ｍｇ2+イオンの存在する反応条件下で通常的なエレクトロポレーション方法［Bio-RAD,Bacterial electro-transformation and Plus Controller Instruction Manual,Cat.No 165-2098;Thompson,JR,et al.An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation.Yeast 14,565-571 (1998);Grant,SG,et al.Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methyllation-restriction mutants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4645-4649 (1990)］により１μlのトランスポゾームを大腸菌ＭＧ１６５５菌株（ソウル大生命科学部ノジョンヘ教授）内に移した。このような菌を培養するためにＬＢ培地（トリプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％）を使用し、前記培地内には、少量のＭｇ２＋イオンが含まれた。
【００３１】
従って、トランスポゾームは、大腸菌の細胞内でＭｇ2+イオンによって任意の挿入機能が活性化され、大腸菌染色体の任意の部位に挿入されることができる。前記二種類のトランスポゾンを含む各大腸菌突然変異体は、トランスポゾンにＫｍＲまたはＣｍＲ遺伝子が存在することで、カナマイシン抵抗性またはクロラムフェニコール抵抗性を有するため、カナマイシン培地またはクロラムフェ二コール培地で選択した。このとき、大腸菌ＭＧ１６５５菌株の染色体内に挿入された各トランスポゾンをサザンブロット（Southern blot）分析によって確認した。
【００３２】
サザンブロット分析の条件は、次のようである。トランスポゾンが挿入された大腸菌突然変異体から染色体ＤＮＡを分離し、これをＣｌａＩ制限酵素（New England Biolabs、Beverly、MA）で反応させて切断させた後、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。このとき、アガロースゲルのＤＮＡをハイボンドＮ＋メンブラン（Hybond N+ membrane、Amersham）に移し、移されたＤＮＡを、32Ｐで標識されたＫｍＲまたはＣｍＲ遺伝子をプローブに使用してブロッティングした。トランスポゾンの挿入位置を、任意的ＰＣＲによって確認した（Caetano-Annoles,G.1993.Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers.PCR Methods Appl.,3,85-92.）。
【００３３】
トランスポゾンが挿入された位置の周囲にあるＤＮＡを、Ｔｎ５挿入配列（insertion sequence）に特異的なプライマーと、トランスポゾンの外端の染色体ＤＮＡに任意に結合するプライマーを使用して増幅させた。前記任意的ＰＣＲは、二つの工程で構成される。
【００３４】
第１工程では、トランスポゾンの特異的なプライマーＴｎ５Ｅｘｔ（5¢AGCATACATTATACGAAGTTATATTAAG-3¢、（株）ゼノテクで合成）を利用してトランスポゾンの端部とその外側の配列を含む一本鎖ＤＮＡ、次いで、不特定部位に結合するプライマーＡｒｂ１（5¢TTGAGCGATAGACGTACGATNNNNNNNNNNGATAT-3¢、（株）ゼノテクで合成）を前記合成された一本鎖ＤＮＡの不特定部位に結合させて、二本鎖のＤＮＡを合成した。
【００３５】
第２工程では、トランスポゾンの特異的なプライマーＴｎ５ＩｎｔとＡｒｂ１の３’末端の２５個の配列と同じであるプライマーＡｒｂ２（５¢TTGAGCGATAGACGTACGAT-3¢、（株）ゼノテクで合成）を利用して、前記合成した二本鎖ＤＮＡを大量に増幅させた。増幅されたＤＮＡを、クィアクィックスピンＰＣＲ精製キット（Qiaquic spin PCR purification kit、Quiagen）を利用してアガロースゲルから分離し、プライマーＴｎ５Ｉｎｔ（5¢TCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCA-3¢、（株）ゼノテクで合成）を利用して前記分離されたＤＮＡの塩基配列分析を行い、その分析結果をＢＬＡＳＴプログラムを利用して遺伝子銀行ＤＮＡ配列（Gene Bank DNA sequence）と比較して挿入位置を同定した。前記方法によって確認されたＴｎＫＧｌｏｘＰ及びＴｎＣｌｏｘＰの挿入位置を図３に示した。
【００３６】
実施例３
Ｐ１ファージ形質導入法による染色体上に二種類のトランスポゾンを含む大腸菌突然変異体の構築
実施例２によって調製されたＴｎＫＧｌｏｘＰ突然変異体ライブラリーとＴｎＣｌｏｘＰ突然変異体ライブラリーから、除去しようとする染色体の特定部位の一方端部と他方端部に異なるトランスポゾンを有する突然変異体を選択した。次に、Ｐ１ファージ形質導入法を利用して、二種類のトランスポゾンを、一つのトランスポゾンが除去しようとする染色体の一方の末端に位置し、そして他のトランスポゾンが他方の末端に位置するように導入させた。ｌｏｘＰを同じ方向に位置させ、Ｐ１ファージ形質導入法は、周知のプロトコールによって行った（Miller,J,H.,editors,1992,A short Course in Bacterial Genetics;A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria,New York:Cold Spring Harbor）。
【００３７】
実施例４
ｐＴＳＣｒｅ発現ベクターを導入させることによるＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼを発現させることによる欠失突然変異を含む大腸菌突然変異体の調製
除去しようとする染色体の両端にＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰを有する大腸菌突然変異体に、ｐＴＳＣｒｅ発現ベクター（Yoon YG,et al,1998,Cre/loxP-mediated excision and amplification of the Eshcerichia coli genome,Gene 14,89-95）を導入させた。ｐＴＳＣｒｅ発現ベクターに存在するＣｒｅ遺伝子の転写は、テトラサイクリンプロモーター（Ptet）により制御されるため、クロロテトラサイクリンを含む培地で４２℃で培養してＣｒｅリコンビナーゼを発現させた。Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼの発現によって得られる染色体の欠失突然変異を有する大腸菌突然変異体を、ＰＣＲによって確認した。
【００３８】
本実施例３及び４において、ｂ０５３２部位にＴｎＫＧｌｏｘＰが挿入された突然変異体とｂ０６１９部位にＴｎＣｌｏｘＰが挿入された突然変異体、ｂ２０１１部位にＴｎＫＧｌｏｘＰが挿入された突然変異体とｂ２０７３部位にＴｎＣｌｏｘＰが挿入された突然変異体、ｂ２８２９部位にＴｎＫＧｌｏｘＰが挿入された突然変異体とｂ２８９０部位にＴｎＣｌｏｘＰが挿入された突然変異体、及びｂ４２７１部位にＴｎＫＧｌｏｘＰが挿入された突然変異体とｂ４３２６部位にＴｎＣｌｏｘＰが挿入された突然変異体をＰ１形質導入のために使用し、Ｃｒｅ遺伝子を発現させた。その結果を図４のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに示した。
【００３９】
実施例５
Ｐ１ファージ形質導入方法を反復的に行うことによる拡張された染色体欠失部位を有する突然変異体の構築
特定の染色体部位を含む大腸菌突然変異体の染色体の除去された部位を前記実施例３及び４に記載されたようにＰ１ファージ形質導入によって拡張させた。まず、特定の染色体部位が除去された突然変異体から二個の突然変異体を選択した。一つをＰ１ファージの供与者にし、他の一つをＰ１ファージ溶解物（lysate）の授与者にしてＰ１ファージ形質導入法を行い、前記二つの変異株の染色体除去部分が全て除去された染色体を有する新しい突然変異体を調製した。次に、この突然変異体を再びＰ１ファージの授与者にし、既に作られた他の染色体部分が除去された変異株を供与者にして、連続的かつ反復的にＰ１ファージ形質導入法を行った。この方法によって、前記で得られた突然変異体の染色体から他の突然変異体の染色体の除去部位を反復的に除去させた。連続的なＰ１ファージの形質導入において、微生物の効果的な選択のために、相同組換え（homologous recombination）を利用してＰ１授与者として作用するの選択可能なマーカーを除去した。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
以上説明したように、本発明は、トランスポゾンとＣｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えを利用して、染色体の特定部位を除去した新規大腸菌株の作成方法に関する。より効率的に多様な部位の大腸菌染色体を選択的に除去して、特定の染色体部位が除去された大腸菌突然変異体のライブラリーを獲ることができ、Ｐ１ファージ形質転換法を継続的に行い、漸進的に染色体を縮小させることによって、選択的に染色体が縮小された多様な大腸菌変異株を作成することができる。本発明の方法によって、大腸菌内の成長に不必要な遺伝子を除去し、より遺伝的に単純化された大腸菌突然変異体を構築し、ゲノミクスにおける機能的研究に使用することができる。また、成長に不必要な遺伝子が除去されたことから、迅速に成長する大腸菌突然変異体を選択して人工細胞系として使用することもできる。また、本発明は、大腸菌のみならず、他の微生物にも適用することでき、したがって、染色体が選択的に縮小された多様な突然変異微生物を作成することができる。また、本発明の方法によって調製された最小化染色体に、外来の新しい代射に関する遺伝子を集めたカセットを構築し、微生物に導入し、多様な有用な機能を有する新しい生物体を作ることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰ及びＴｎＣｌｏｘＰの調製過程及び構造を示す。
【図２】図２は、トランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰ及びＴｎＣｌｏｘＰを利用して染色体の特定部位が除去された染色体を有する大腸菌（E.coli）の調製工程を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、大腸菌ゲノム内のＴｎＫＧｌｏｘＰ及びＴｎＣｌｏｘＰの挿入可能な部位を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、大腸菌ゲノム内のＴｎＫＧｌｏｘＰ及びＴｎＣｌｏｘＰの挿入可能な部位を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、多様な部位に挿入されたトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰを利用して、大腸菌染色体の特定部位を除去する方法と除去された染色体のＰＣＲ結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、多様な部位に挿入されたトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰを利用して、大腸菌染色体の特定部位を除去する方法と除去された染色体のＰＣＲ結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、多様な部位に挿入されたトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰを利用して、大腸菌染色体の特定部位を除去する方法と除去された染色体のＰＣＲ結果を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、多様な位置に挿入されたトランスポゾンＴｎＫＧｌｏｘＰとＴｎＣｌｏｘＰを利用して、大腸菌染色体の特定部位を除去する方法と除去された染色体のＰＣＲ結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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