(57)【要約】本発明は、タンパク質アミノ酸配列における少なくとも１つのアミノ酸が、アミノ酸プロリンと置換されることによりタンパク質の発現レベルを増大させる方法に関する。好ましくは置換は、システインアミノ酸残基の15アミノ酸内、より好ましくは10のアミノ酸内、そして最も好ましくは5のアミノ酸内にて起こる。本発明では、プロリン置換を有するポリペプチドの方法みならず、プロリンを除いて、任意のアミノ酸に対するコドンが、プロリンをコードするコドンとして置換される置換コドンを有するポリヌクレオチドのための方法が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現系によりタンパク質の発現を増大させる方法において、その発現系が、タンパク質をコードするコドンのポリヌクレオチド配列を含み、ここでそのポリヌクレオチドの少なくとも１つが、プロリンをコードするコドンに置換されることを含む方法。
【請求項２】
プロリンをコードする置換された核酸コドンが、アミノ酸システインをコードする核酸コドンから5の核酸コドン内に配置される請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロリンをコードする置換された核酸コドンが、アミノ酸システインをコードする核酸コドンから10の核酸コドン内に配置される請求項１記載の方法。
【請求項４】
プロリンをコードする置換される核酸コドンが、アミノ酸システインをコードする核酸コドンから15核酸コドン内に配置される請求項１記載の方法。
【請求項５】
その配列内に少なくとも１つのアミノ酸が、アミノ酸プロリンに代え置換されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項６】
置換されるアミノ酸が、ポリペプチドのアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の5のアミノ酸内に配置される請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
置換されたアミノ酸が、ポリペプチドのアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の10のアミノ酸内に配置される請求項１記載のポリペプチド。
【請求項８】
置換されるアミノ酸が、ポリペプチドのアミノ酸配列に含まれるシステイン残基の15のアミノ酸内に配置される請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
タンパク質が、組織障害性因子結合タンパク質(Tissue Necrosis Factor Binding Protein)である請求項１記載のタンパク質。
【請求項１０】
そのタンパク質が、タンパク質の多くの形質転換増殖因子(Transforming Growth Factor)ファミリーである請求項１記載のタンパク質。
【請求項１１】
少なくとも１つのコドンが、プロリンをコードするコドンに置換されるアミノ酸をコードするコドンのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
置換されるコドンが、システインをコードするコドンのうち5のコドン内に配置される請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
置換されるコドンが、システインをコードするコドンのうち10のコドン内に配置される請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
置換されるコドンが、システインをコードするコドンのうち15のコドン内に配置される請求項７記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸が、アミノ酸のプロリンと置換されることによりタンパク質の発現レベルを増大させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
酵母、及び哺乳動物の細胞において分泌される組み換え型タンパク質の高レベルな発現を獲得できる能力は、タンパク質に依存することがしばしば見出されている。組み換え型タンパク質の発現を最大にする努力は、組み換え型遺伝子におけるmRNAのレベルを増大することに関し、しばしば中核的課題とされる。しかしながら、特定タンパク質の発現の律速段階(rate-limiting step)は、mRNAのレベルではなく、むしろ効率の悪い折りたたみ、翻訳後の修飾の付加、及び組み換え型タンパク質の分泌による。
【０００３】
酵母の表面におけるタンパク質の表示と無作為な突然変異の形成との組み合わせは、変更された特性を伴うタンパク質を同定するための強力な技術である。この技術において変異体タンパク質が、細胞表面に表示され、そしてFACS(蛍光活性化細胞選別機)により表示されるタンパク質の高親和性による結合か又は発現レベルを増大させるかのいずれかとして選別される。酵母細胞の表面における変異体ライブラリー表示が、抗原又はペプチド/MHCそれぞれに対し高い親和性を有する一本鎖抗体と一本鎖T-細胞受容体との両方の変異体を同定するために用いられてきた。さらに酵母表面の表示方法は、T-細胞受容体の発現レベルを改良するために使用されてきた。
【０００４】
組み換え型タンパク質、特に真核タンパク質を高発現することができるが、それらに発現が、非効率な畳み込み、翻訳後の修飾の付加、そして/又はタンパク質の分泌により制限される場合のあるタンパク質の構造的特徴又は特性を同定することが、先行技術として必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の要約
本発明は、タンパク質のアミノ酸配列中少なくとも1つのアミノ酸を、アミノ酸のプロリンと置換させることにより、タンパク質の発現レベルを増大させ方法に関する。好ましくは、その置換が、システインアミノ酸残基の15のアミノ酸内にて、好ましくは10のアミノ酸内にて、そして最も好ましくは5のアミノ酸内にて起こることである。本発明は、プロリン置換を有するポリペプチドのみならず、プロリンを除く任意のアミノ酸に対するコドンがプロリンをコードするコドンで置換される置換コドンを有するポリヌクレオチドを形成する方法を含む。特にプロリンをコードするコドンには、RNAではCCU,CCC,CCA及びCCGで、そしてDNAではCCT,CCC,CCA及びCCGがある。
【０００６】
適切な宿主細胞の組み換え型DNA分子から発現され、そして機能的な活性を保持できる、関連する任意のタンパク質を、本発明において含むことができる。好ましくはそのタンパク質は、その発現が、構成的な折り畳みを制約することにより制限されるものである。より好ましくは、そのタンパク質が、1又は複数のシステインアミノ酸残基を含み、そして正しい二硫化結合を形成する必要があり、その結果ポリペプチドの3次構造が構成的に正しく折り畳まれていることである。
本発明は、哺乳動物及び他の宿主細胞内における組み換え型タンパク質の発現の効率を改良する手段を、継続的に必要な技術としてある程度解決する。本発明は、ポリペプチドの非効率な折り畳み問題を克服し、そして特定の異種ポリペプチドの発現を制限する方法を提供し、そしてこうしたポリペプチドの高レベルな発現を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ポリペプチドのアミノ酸配列において1又は複数のアミノ酸のアミノ酸プロリンへの置換により、そのタンパク質が高レベルに発現するという予期しない知見に基づいている。一方理論と結び付けることを望まないが、高レベルな発現を可能にする生物化学的機構が、構成として正しく折り畳まれたタンパク質の促進に関係すると示唆していることが、実証(evidence)により裏付けられている。
【０００８】
酵母表示システムにて組織障害性因子(Tissue Necrosis Factor)の受容体の細胞外領域(TNFrED)の変異体クローンのスクリーニングを介して、本発明者が、野生型TNFrEDと比較した場合の酵母内の有意的に高レベルの発現を与えるというTNFrEDの変異化を同定することができた。一方のクローンがS87Pへの変異化を含むが、他方のクローンでは、H34PとS57Iへの変異化を含む。これらの変異化は、TNF-αに対するTNFrEDの親和性を変化しない。類似した知見により生成される哺乳動物の細胞内のこれら変異体の発現は、変異化が発現を増大させるという機構が、酵母と哺乳動物の細胞との間にて保守されることを強く示唆している。個別に又は組み合わせによる変異化の試験では、そのどれかのプロリンが変化すればTNFrEDの発現が増大し、一方S57Iの変異化では発現に影響を及ぼさないことを表している。
【０００９】
それぞれの変異体クローンにおいて、有意に高いタンパク質の発現レベルに対する要因となる残基が、二硫化結合に関与するシステインに隣接するプロリン置換体であることを、本発明者が示した。プロリンにおける窒素原子が、剛性環の1部分であり、環のN-C結合を全く回転することができない。従ってφ-Ψ.角の選択は、野生型TNFrED(図３における影の部分)に見出されるヒスチジン又はセリン残基よりプロリン置換において極めて少ない。さらにTNFrEDの結晶構造に見出せるヒスチジン又はセリン残基のφ-Ψ.角が、プロリン残基のφ-Ψ.プロットのより好ましい領域に配置される。これらの結果は、プロリンが、主鎖の立体配座の点からみて、34又は87の位置において好ましい残基であることを示している。
【００１０】
この現象は、最も高い分解能により(pdbコード:1ext;図3に赤色にて塗りつぶした四角形を参照)、複合化された構造のTNFrEDにおいてより明らかである。そのため変異化には、複合化された形状において、複合化されない形状と比較して利点がなく、これは、この変異体が、リガンドに対するTNFrEDの親和性に効果を及ぼさないとする、本発明者の観察と一致する。
さらに隣接する1又は２のアミノ酸も考えられる場合の所定のφ-Ψ.角に対するプロリンの好ましい状態に何らかの変化があるかどうかを試験するため、本発明では、変異化された形状及び野生型形状の同じ配列に対する代表的なPDBのデータセットを検索した。野生型配列より変異化された配列の例が有意に多くある(表３を、そして図３の緑「ｘ」sをも参照)。
【００１１】
さらに主鎖立体配座の点からみてその特定残基に対しても、さらに残基の周辺及び構造的環境が考慮に入れられる場合に対しても、共にプロリンが位置34又は87にて好ましい残基であることを、これらの結果がさらに強調している。
S57Iの変異化は異なる状況である。それは、有意に狭い領域のφ-Ψ.角度となるが、好ましいφ-Ψ.角度の領域から好ましさがわずかに劣る領域にそれている(図３)。従って、その地点にて好ましいφ-Ψ.を基準とする点からみて、S57Iの変異化の利点がないと見られる。
【００１２】
これは、S57Iへの変異化だけの存在が、TNFrEDの発現レベルを実質的に変更しないとする本発明者の観察と一致する。全てのデータを合わせて取ることにより、プロリン残基の導入が、各変異体の局在する配列を支援し、TNFrEDの結晶構造に見られる立体配座に適合し、それにより隣接するシステイン残基を正しい配列に固定することを、本発明者が結論付けている。次にシステインの正しい配置が、さらに正しい二硫化結合を容易にし、そしてその結果、正しく折り畳まれた分子の収率が高くなることを、本発明者が提案した。これらのプロリン置換が、TNFrEDの発現レベルを増大させるという、本発明者の知見は、この提示と一致する。さらにプロリンの置換は、二硫化結合が発現の制限要因となると考えられる、他のタンパク質に伸張することが可能である。
【００１３】
本発明が、タンパク質のアミノ酸配列における少なくとも１のアミノ酸が、アミノ酸プロリンに置換されることによりタンパク質の発現レベルを増大させる方法に関する。好ましくは、これらプロリンで置換されたポリペプチドにおける置換が、システインアミノ酸残基の15のアミノ酸内に、より好ましくは10のアミノ酸内に、最も好ましく5のアミノ酸内にておこる。本発明は、プロリン置換を有するポリペプチドのみならず、プロリンを除く任意のアミノ酸に対するコドンが、プロリンをコードするコドンに置換されるコドン置換体を有するポリヌクレオチドに対する方法を含んでいる。特にプロリンをコードするコドンは、RNAではCCU,CCC,CCA,CCG、そしてDNAではCCT,CCC,CCA,CCGである(表１を参照)。
【００１４】
１．定義：
一般に以下の語又は句が、実施例及びクレームの記載に使用される場合、明示された定義を有す。
「タンパク質」は、アミノ酸から成り、そして固有のアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドの意味である。用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と本明細書にて相互交換して使用することができる。
「置換」は、既存のアミノ酸残基を交換するか、又は付加する残基を挿入するかのいずれかによるアミノ酸の導入を意味する。本発明において、置き換えられるか又は挿入されるアミノ酸は、プロリンである。
「増大する発現」は、元のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現レベルと、1又は複数のプロリン置換による同じタンパク質の発現レベルとを比較する場合、タンパク質の発現レベルが高いか又は有意に大きいことを意味する。
「アミノ酸」は、天然に形成する20のアミノ酸から成る群に含まれるアミノ酸残基を意味する。
【００１５】
本出願において、アミノ酸の命名は、タンパク質データバンク(PDB)(www.pdb.org)にて定義されたものとして、使用され、それはIUPAC命名法(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides(残基名),Eur.J.Biochem.,138,9-37(1984) together with their corrections in Eur.J.Biochem.,152,1(1985)、すなわちアラニン(Ala又はA)、システイン(Cys又はC)、アスパラギン酸(Asp又はD)、グルタミン酸(GLU又はE)、フェニルアラニン(Phe又はF)、グリシン(Gly又はG)、ヒスチジン(His又はH)、イソロイシン(Ile又はI)、リジン(Lys又はK)、メチオニン(Met又はM)、アスパラギン(Asn又はS)、プロリン(Pro又はP)、グルタミン(Gln又はQ)、アルギニン(Arg又はR)、セリン(Ser又はS)、トレオニン(Thr又はT)、バリン(Val又はV)、トリプトファン(Trp又はW)、及びチロシン(Tyr又はY)残基である。
「その内に配置された」とは、アミノ酸配列の3'か5'のいずれかにて、特定基準のアミノ酸に隣接して配置されている、との意味である。
「コドン」とは、単一アミノ酸をコードする3量体ヌクレオチドの意味である(表1参照)。
【００１６】
「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAの一本鎖分子の意味である。
アミノ酸部位/置換体を同定するために用いられる専門用語は以下に示し、すなわちH34Pとは、図４及び配列番号第１にて示される特定タンパク質に対するアミノ酸の線形配列における位置番号34が、ヒスチジン残基により占められ、それがプロリン残基にて置換されていることを明示している。その他に明示がなければ、本明細書に記載されるアミノ酸残基の番号付けは、図４及び配列番号第１(組織障害性因子(Tissue Necrosis Factor)として)に示されるアミノ酸配列に行はれる。複数の置換には、「＋」で示され、たとえばH34P+S57Iは、位置34においてプロリンによるヒスチジン残基への置換、及び位置57においてイソロイシン残基によるセリン残基への置換を含むアミノ酸配列の意味である。
【００１７】
表1  遺伝子コード(アミノ酸に対するRNA)*
【表１】
2005535281.tif 000002
プロリンにて置換されたポリペプチドに向けた発現系を生成する方法：
本発明のプロリンに置換されたポリペプチドを、技術的に周知な何か適切な方法により生成することができる。これらの方法は、特異的にプロリンにて置換されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を構成し、そして適切にトランスフェクトされた宿主におけるアミノ酸配列の発現を含む。さらに本発明のプロリンにて置換されたポリペプチドは、化学合成により又は化学合成とDNA組み換え技術との組み合わせにより、生成することができる。
【００１８】
本発明のプロリンにて置換されたポリペプチドが、その親コードのヌクレオチド配列を単離又は合成することにより構成される。次にヌクレオチド配列が、関連アミノ酸残基の置換ができるように変化される。ヌクレオチド配列を、本明細書の実施例のような、部位指向の突然変異誘発により修飾することができる。選択肢において、ヌクレオチド配列を、化学合成により調製することができ、ここでオリゴヌクレオチドが、プロリン置換のポリペプチドの特異的アミノ酸配列に基づいて設計される。
【００１９】
プロリンで置換されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、組み換え型ベクター内に組み入れて、そして所望のトランスフェクトされた宿主細胞にポリペプチドの発現に必要なコントロール配列に操作により結合される。当業者が、過剰な実験を行うことなく、これらのベクター、発現コントロール配列及び宿主より選択することができる。
組み換え型ベクターでは、自律的な複製ベクターがよく、すなわち染色体の外にあり、染色体の複製に依存しない複製物として存在し、たとえばプラスミドなどのベクターである。
選択肢として、そのベクターが、宿主細胞に導入されると、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものである。
【００２０】
そのベクターは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の転写に必要とされる付加断片を操作により結合した発現ベクターであることが好ましい。そのベクターは、典型的にはプラスミド又はウイルスDNAから誘導される。  本明細書に記載されている宿主細胞における発現のための多数の適切な発現ベクターは、商業的に入手することができ、あるいは文献において記載されている。
さらに組み換えベクターは、問題の宿主細胞にてベクターを複製できるDNA配列を含むことができる。こうした配列の例(宿主細胞が哺乳動物の細胞である場合)としては、複製元としてのSV40である。
さらにベクターは、選択可能な標識物、たとえばこれらの生成物が、ジヒドロフォレイト・リダクターゼ(DHFR)としてコードする遺伝子など、宿主細胞における欠陥を補足する遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトロトレキシエイトなどの薬剤に対する抵抗性を与える遺伝子を含む。さらにそのベクターは、プロリンにて置換されたポリペプチドDNAを含む、増幅可能な遺伝子及びフランキング配列の複数の複製を有する細胞が、適切な媒体にて選択できるよう、DHFRなどの増幅可能な遺伝子を含む。
【００２１】
用語「コントロール配列」は、本発明のポリペプチドの発現に必要又は利点のある全ての成分を含むよう、本明細書に定義される。哺乳動物の細胞の転写を対象とした適切なコントロール配列の例は、SV40及びアデノウイルス、たとえばアデノウイルス２主要後期プロモータ、MT-1(メタロチオネン遺伝子)プロモータ、及びヒト・サイトメガロウイルス即時型遺伝子プロモータ(CMV)などの早期、及び後期プロモータを含む。
【００２２】
プロリンにて置換されたポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列は、たとえ部位指向の突然変異誘発、合成、PCR又は他の方法により調製されたとしても、所望によりシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。シグナルペプチドは、それが発現される細胞から分泌される場合に存在する。こうしたシグナルペプチドは、もし存在すれば、ポリペプチドの発現のため選択される細胞により認識されるべきものである。シグナルペプチドは、ポリペプチドに対し相同性(たとえば親ペプチドと通常関連したものである)、又は異種性(すなわち親ペプチドより別の資源から始まる）か、又は宿主細胞に対し相同性か異種性で可能であり、すなわち宿主細胞から通常発現されるシグナルペプチドであるか、又は宿主細胞から通常発現されないシグナルペプチドである。
【００２３】
何か適切な宿主は、細菌、菌類(酵母を含む)、植物、昆虫、哺乳動物、又は他の適切な動物の細胞類又は細胞株、及びトランスゲニックの動物類又は植物類を含む、本発明のプロリンに置換されたポリペプチドを生成するため、使用することができる。適切な哺乳動物の宿主細胞の例は、中国ハムスターの卵巣(CHO)細胞株、(たとえばCHO-KL;ATCC CCL-61),緑サル細胞株(COS)(たとえばCOS 1(ATCC CRL-1650),COS 7(ATCC CRL-1651));マウスの細胞(たとえばNSIO),ベビーハムスターの腎臓(BI-EK)細胞株(たとえばATCC CTL-1632又はATCC CCL-10)、及びヒトの細胞(たとえばBEK293(ATCC CRL-1573))及び組織培養における植物細胞を含む。
【００２４】
さらに適切な細胞株が、米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションなどの公共の供託所より入手することができる。哺乳動物宿主細胞に外因性DNAを導入するための方法では、リン酸カルシウム媒介によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム-媒介トランスフェクション、及びウイルスベクターが含まれる。
細胞を、技術的に周知な方法を用いプロリンにて置換されたポリペプチドを生成するために適切な滋養培地にて培養する。たとえば、その細胞を、フラスコ振盪、小規模又は大規模な醗酵(連続、バッチ、フェド-バッチ(fed-batch)、又は固体状態による醗酵)により、適切な培地にてそしてプロリンで置換されるポリペプチドを発現され、そして/又は単離できる条件下で行はれる実験室又は工業的な醗酵装置にて培養することができる。
【００２５】
培養は、炭素と窒素資源及び無機塩を含む適切な滋養培地にて、技術的に周知な方法を用い行はれる。適切な媒体は、商業的な供給会社から入手できるか、又は公開された組成物により調製することもできる(たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログにおいて)。プロリンにて置換されたポリペプチドが、滋養培地に分泌されるとその培地から直接回収することができる。プロリンにて置換されたポリペプチドが、分泌されない場合溶離した細胞から回収することができる。
【００２６】
得られたプロリン置換によるポリペプチドを、技術的に周知な方法により回収することができる。たとえば、それが、遠心分離、ろ過、スプレイ乾燥、蒸留、又は沈殿を含むがそれに限定されない従来の方法により、滋養培地から回収することができる。
プロリンにて置換されたポリペプチドは、クロマトグラフィ(たとえばイオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排他)、電気泳動法(たとえば分離性等電点電気泳動)、分画溶解性(  硫化アンモン沈降法),SDS-PAGE、又は抽出が含まれるが、それに限定されない従来の種々の方法により精製することができる。
本発明の医薬的組成物及びその使用
【００２７】
１の観点において、プロリンにて置換されたポリペプチド又は本発明のよる医薬的組成物は、疾患、障害、又は症状を治療する薬剤を生成するため使用される。
別の観点において、プロリン置換によるポリペプチド又は本発明による医薬的組成物が、こうしたプロリン置換によるポリペプチド又はその医薬的組成物を、必要な場合哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物、特にヒトを治療する方法に用いられる。
本発明による結合、調製又は組成物の有効量は、とりわけ疾患、投与量、投与計画、ポリペプチド、又は複合体又は組成物が、単独か又は別の治療薬と結合させて投与されたとして、その組成物の血清半減期、及び患者の通常の健康に依存することが、当業者に明らかになるであろう。典型的に本発明の調製又は組成物の有効な投与量は、治療が確実に効果を得るに十分なものである。
【００２８】
本発明の方法により生成されるプロリン置換によるポリペプチドは、1又は複数の医薬的に受け入れ可能な担体又は賦形剤を含む組成物にて、通常投与される。「医薬的に受け入れ可能な」は、投与される患者に何か不適切な影響を起こさない担体又は賦形剤の意味である。こうした医薬的に受け入れ可能な担体及び賦形剤は、技術的に周知であり、そしてその発明のポリペプチド又は複合体を、よく知られた方法により医薬組成物に生成することができる(Remington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.R.Gennaro,Ed.,Mack Publishing Company(1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,S.Frokjaer and L.Hovgaard,Eds,Taylor & Francis(2000);and Handbook of Pharmaceutical Excipients,3rd edition,A.Kibbe,Ed.,Pharmaceutical Press(2000)を参照）。本発明のポリペプチド又は複合剤を含む組成物に使用することができる医薬的に受け入れ可能な賦形剤は、たとえば緩衝剤、安定剤、保存剤、等浸透圧化剤、非イオン界面活性剤又は洗剤(「加湿剤」),抗酸化剤、バルク剤又は充填剤、キレート剤及び共溶媒が含まれる。
【００２９】
本発明のプロリン置換によるポリペプチドの医薬的組成物が、液体、たとえば容易に使用できる溶液、又は懸濁液、ゲル、親脂質物又はその他の適切な形状、たとえば溶液を調製するために適切な粉末又は結晶を含む種々の形状に形成することができる。好ましい形状は、治療すべき具体的な特定の指示に依存することになり、当業者には明らかになるであろう。
本発明のプロリン置換によるポリペプチドを含む医薬的組成物を、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内の、皮下、舌下、頬側、鼻内、経皮より、吸入、又は何か他の受け入れ可能な方法、たとえばPowderJet（商標)、又はProLease(D)技術又はペン注入システムを用いて、投与するすることができる。投与の好ましい形態は、治療される具体的指示に基づき、そして当業者には明らかになるであろう。特にその組成物が、患者には自己投与することができることから、皮下に投与することが好ましい。
【００３０】
本発明の医薬的組成物が、他の治療剤と組み合わせて投与することができる。これらの薬剤を、同じ医薬的組成物の1部として組み入れることができるか、又は本発明のポリペプチド又は組み合わせたものと切り離し並行か、何か他の受け入れ可能な治療計画に従って投与することができる。加えて本発明によるポリペプチド、組み合わせ物、又は医薬的組成物を、他の治療に対する付加物として使用することができる。
例示：組織障害性因子(Tissue Necrosis Factor)(TNF)の発現の促進
【００３１】
p55TNF受容体の細胞外領域(TNFrED)が、無作為に変異化され、TNFrED変異体のライブラリーを、酵母細胞の表面に表示した。TNFrEDの２つの変異体が、酵母において野生型TNFrEDと比較して2乃至5倍強く発現する蛍光活性化細胞選別機(FACS)により、同定される。一方の変異体クローンにおいて、位置87でSerからProへの変化があり、そしてもう一方の変異体クローンにおいて、位置34でHisからProへの変化、そして位置57でSerからIleへの変化がある。
【００３２】
S87P又はH34P変異体のいずれかが存在すると、HEK293-EBNA細胞におけるTNFrEDの発現レベルが有意に高くなり、一方でS57Iの変異体は発現に影響を及ぼさない。これらの置換された残基が、TNF-αに対する親和性に影響を及ぼさない。TNFrEDの結晶構造における置換された残基の実験及び分析では、適切な二硫化結合を形成するため正しい配置に隣接するシステイン残基を固定する好ましい配座と成るように、プロリン残基を導入し変異体の局所的な配列を同様に支援することを明示する。次ぎに選択された二硫化結合の形成を容易にすれば、酵母及び哺乳動物の細胞内の正しく折りたたまれた分子の収率が有意に高くなる。
【実施例１】
【００３３】
サッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)の表面に官能性TNFrEDの発現
【００３４】
p55TNF受容体の細胞外領域(TNFrED)が、α-アグルチニンのC-末端部に融合され、そしてpYES2ベクターを使用し、サッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)菌株BJ2168(a,prc1-407,prb1-1122,pep4-3,leu2,trp1,ura3-52)において発現される。
α-アグルチニンのC-末端部が、細胞壁にしっかり固定され、そして細胞表面上TNFrEDを提示するよう、スカフォルドとして使用される。TNFrED-アグルチニン融合タンパク質を分泌経路に移送することを容易にするために、TNF受容体のシグナル配列を、酵母インベルターゼ・シグナル配列と置き換えた。TNFrED-アグルチニン融合遺伝子が、誘発できるGAL1プロモータの調節に基づくものである。グルコースからガラクトースへの酵母培養物の炭素資源の切り替え(switching)により、GAL1プロモータの誘発し、そしてTNFrED-アグルチニンの発現が起こる。TNFrEDを対象とするポリクロナール抗体を用いるフローサイトメトリーにて、誘発される培養物において約70%の酵母が、細胞表面上のTNFrED-アグルチニンを発現したことを、本発明者が見出した(図１(Ａ))。
【００３５】
酵母細胞上TNFrEDが正しく折り畳まれ、そしてTNF-αに結合できるかどうか決定するため、本発明者は、プローブとしてビオチン化TNF-αを、そして検出試薬としてFITCで標識化したアビジンを用いてフローサイトメトリー分析を行った。TNFrED-アグルチニンの融合遺伝子を発現する酵母が、pYES2ベクターを含む酵母よりビオチン化TNF-αを多く結合した(図1(Ｂ))。過剰な標識化されないTNF-αを加えると(データ示されていない)、TNFrED-アグルチニンの融合遺伝子を発現する酵母にて見られるヒストグラム上にて逆方向に移動する。
【実施例２】
【００３６】
ビオチン化したTNF-αの結合を促進させ、変異体TNFrEDクローンの選択
【００３７】
前に記載されている突然変異誘発方法を変更(Hermes,J.D.,Parekh,S.M.,Blacklow,S.C.,Koster,H.& Knowles,J.R.A reliable method for random mutagenesis:the generation of mutant libraries using spiked oligodeoxyribonucleotide primers.Gene 84,143-151(1989))して使用することにより、無作為な変異体ライブラリーを生成することができる。この方法において、変異体オリゴヌクレオチドが、「悪い」ヌクレオチドのそれぞれの位置で、予め定められたレベルをスパイクすることにより生成される。悪いヌクレオチドの汚染レベルが、オリゴヌクレオチド当たり無作為な点変異化を平均2か3のいずれかを生成するように調節される。各変異体のライブラリーが、TNFrEDの40と105塩基対の間に含まれる。各ライブラリーから10の無作為なクローンが配列決定される。変異体の型及び位置が無作為であり、その領域では変異体の予期された平均数を含むことが見出された。クローンの約40-50%が、小さな欠失又は挿入を含み、その結果切断されたTNFrEDを発現することになる。
【００３８】
おそらくこれらの欠失又は挿入は、オリゴヌクレオチド合成過程中に組み込まれるエラーから起こってくる。それぞれのライブラリーのサイズは、変異体クローンに依存せず0.5x106と10x106の間であった。各ライブラリーは、菌株BJ2168に形質転換され、そして約1x106の独立した形質転換体が、ビオチン化したTNF-αとTNFrEDを対象とするポリクロナール抗体との両方に結合するために選択された。活性なTNFrEDを発現する酵母の亜集団を選択するため、選択された二次元蛍光ヒストグラムのウインドウが、(図１(Ｃ))に示される。酵母の選択された亜集団を増殖させ、そして二色選別処理により再選択した。
【００３９】
何回かの二色選別の後、選択されたウインドウにおいて、酵母の集団の濃度を高くした(図１(Ｃ))。次ぎに3から4回の細胞を選別した後、個々のクローンを、細胞表面上にTNFrEDに対しビオチン化されたTNF-αの結合を試験することにより分析した。それぞれ選別されたライブラリーから分析される大部分のクローンを、高レベルなビオチン化したTNF-αを結合するためと考えられる。変異体TNFrEDプラスミドが、それぞれの酵母クローンから回収され、BJ2168菌株に再形質転換され、その後ビオチン化TNFαの結合に対し、フローサイトメトリーにより分析される。大部分の酵母クローンは、回収されたプラスミドが、高レベルなビオチン化-TNF-αの結合を与えなかったため、偽陽性(false positives)であった。
【００４０】
偽陽性(false positives)酵母クローンが、ビオチン化TNF-α及びアビジン-FITCの存在しない状態にて分析された場合、これらを、親菌株BJ2168と比較して移動することが見出された。これらの偽陽性酵母クローンが、親BJ2168と比較してサイズが有意に約30%大きく、これは、おそらく吸光度の基本線における移動が生ずることである。しかしながら、異なるライブラリーから2の変異体クローン6、及び11が、BJ2138菌株に形質転換した場合、高レベルな結合のビオチン化TNFを同定し、そのため真の陽性(真の陽性)である(図１(Ｄ))。
【実施例３】
【００４１】
変異体クローン６、及び１１の特徴付け
【００４２】
変異体クローン６及び１１におけるTNFrEDコード領域が、配列決定され、そして予期されるように各クローンに対する変異化が、その特異的ライブラリーとして変異化された配列領域においてのみ見出された。変異体クローン１１において、位置87にてSerからProへの変化を生ずる変異化する地点があり、変異体クローン６において、位置34でHisからProへの変化、そして位置57にて、SerからIleへの変化を生ずる変異化する地点がある。
【００４３】
その変異体が、TNFrEDの発現の増大により、又はTNFに対するTNFrEDの親和性の増大により、ビオチン化TNFの結合を増大させるかどうかを決定するために、本発明者は、変異体クローン６か１１のいずれかを発現する酵母上にて飽和結合実験を行う。飽和結合実験の分析(図２(Ａ))乃至(図２(Ｃ))が、変異体クローン６か１１のいずれかを発現する酵母が、野生型TNFrEDより高レベルな官能性TNFrEDを発現し、そしてこれらの変異体の存在が、TNF-αに対するTNFrEDの親和性に影響を与えないことを示している。変異体クローン６、変異体クローン１１及び野生型TNFrEDを発現する酵母に対する受容体/細胞の数は、それぞれ約3930,1490,740である。
【実施例４】
【００４４】
哺乳動物の細胞における変異化されたTNFrEDの発現
【００４５】
次に、酵母において誘導される変異体クローンの特徴付けは、哺乳動物の細胞と類似しているかどうかを決定した。この目標に向けて本発明者により、成熟したTNFrEDをコードする配列に、アミノ末端にて融合されるヒト成長ホルモンシグナル配列を含む哺乳動物発現ベクターが構成される。発明者が、ヒトホルモン成長シグナル配列が、TNFrEDの分泌の誘発において天然のシグナル配列より有意に効率的であることを、以前に見出していた。部位に向けられた変異体の誘発は、変異体６及び１１に見出されるそれぞれの変異体を、個々か種々に組み合わせるかのいずれかにて組み込むために用いられた。TNFrED変異体を、HEK283-EBNA細胞において一過性に発現され、そして分泌されるTNFrEDの量を、TNFrEDに対し特異的なELISAにより定量する。その結果(表2）は、変異化したH34P又はS87Pのいずれかが、TNFrEDの発現レベルを増大させることを示している。これらの変異化による影響は、同じ構成体にH34P及びS87Pの両方の存在が、H34Pだけにて見出されるものと比較して分泌されるTNFrEDのレベルを増大しないことから、付加されていっるように見えない。
【００４６】
さらにBIAコア装置における表面プラスモン共鳴により、TNFrEDの種々の変異体にTNF結合の反応速度が測定された。表2におけるその結果が、TNF-α結合について試験される野生型TNFrEDと変異体TNFrEDとが相違しないことを示している。実験方法において示されているように、発明者は、穏やかな再生条件を使用し、典型的に全ての表面での30-40サイクルのデータを収集する。発明者は、コントロールとしてパラメータの平均(及び95%の信頼区間)を得るため３の異なる表面にて得られた結果を平均した。このデータを得る方法により導入される主なエラーは、データが異なる表面及び異なる実験を介し蓄積される時(表3における精製されたTNFrEDに対する結果を参照)のコントロールとして適合するパラメータが増加することにある。それにもかかわらずそのデータが、Konの15%変化、KOffの33%の変化、又はその両方を検出するに十分に良好である。
【００４７】
発明者が、27及び36サイクル後に収集された負のコントロール(negative control)及びHBS(HePes緩衝生理食塩水)として示す結果において、このことを実証した。これらの「リガンド」(負のコントロール(negative control)、条件による媒体、及びHBS)が、実験開始時点で試験されると、TNF-αの結合が全く測定できないことから、これは、最悪な例となる事柄を示すために行はれた。種々部分的に変性の起こったTNF受容体タンパク質の36サイクルによる増強した残基を、不活性なコントロール、野生型、又は何らかの変異化されたTNF受容体から、際立って異なる反応速度を実証する。酵母発現研究から本発明者の知見と一致して、H34P,S87P又はS57Iの変異体の存在は、TNF-αとしてTNFrEDの親和性を変化させなかった。
【表２】
2005535281.tif 000003
表２：  野生型TNFrED、及びTNFrEDの変異体の一過性トランスフェクト
【００４８】
HEK293-EBNA細胞を、プラスミドDNAにより一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、条件とされる媒体を収集し、そしてTNFrEDの量をELISAにより定量した。TNFrEDの量を、±の標準偏差にて4個の皿の平均である。この実験を３回繰り返し、そして同様の結果が得られた。１の代表的実験を示す。
【表３】
2005535281.tif 000004
表３：  TNF-rED変異体の結合反応速度及びそのTNF親和性
【００４９】
一覧に示された各TNFrED試料及びコントロール試料を、TNF-αの７の異なる濃度に分析した(実験方法を参照)。７つのレベルの設定データとして、Kon,Koff,及びKmaxを、ベースラインの移動を組み入れるモデルを使用して、全体的に適合させる。負のコントロール(条件付けされた媒体)、及びHBSコントロールは、使用される緩やかな再生条件(実験方法を参照)により、〜1.5nMのKd置を示している。これらの条件に基づき、当発明者は、Rポイント・ベースラインの絶対値(データに示されていない)の、分析物に関係なく0.5-1.0のRU/サイクル上方向への移動を通して注意する。この結果が、各再生処理後に残っている少量の１部変性したTNFrED及び変異化TNFrEDによるものであるかを、当研究者が疑い、そしてそれが変異体の性質(データに示されていない）によらないことを示すため、調査した。データ収集を27-36サイクル走行する前に分析すると、負のコントロールが、TNF-α結合の無いことを示した。
【実施例５】
【００５０】
TNFrEDの結晶構造における置換された残基のいる場所の実験
【００５１】
変異体クローン6及び11におけるプロリン置換が、二硫化結合に関与するシステイン残基(システイン33及び88)に隣接している。変異体残基に対し有力な構造的役割があるかどうかを分析するために、発明者が、TNFrEDの結晶構造において(pdbコード：1ext,1ncf及び1tnr)、及び通常のタンパク質構造において、プロリン、セリン、ヒスチジン、及び
イソロイシン残基の構造的により好ましいものをまとめた。
【００５２】
ポリペプチドの構成は、残基のφ-Ψ.角により調節されることから、当発明者は、高分解能のデータセット(dataset)におけるこれらの残基、及び非相同タンパク質構造のφ-Ψ分布をプロットした。(図３(Ａ))乃至(図３(Ｃ))に示すように、プロリン残基のφ-Ψ.分布が、他の３残基のものより有意に制限され、そしてセリン残基のφ-Ψ分布が、イソロイシン残基のものより有意に大きい。特にセリン対プロリンの分布のサイズ比が、2.5であり、ヒスチジン対プロリンでは1.8であり、そしてセリン対イソロイシンでは1.4である。さらにTNFrED結晶構造(赤色にて塗りつぶした記号)におけるS87及びH34のφ-Ψ.角が、セリン又はヒスチジンに対するφ-Ψ.プロットの好ましい領域と比較して、プロリンのφ-Ψ.プロットの好ましい領域と重ね合わさることが好ましい。
【００５３】
この優位性は、TNF/TNFrED複合体(pdbコード:1tnr;解像2.85A,[赤色の三角形])の結晶構造におけるよりもTNFrEDそれ自体の結晶構造(pdbコード：1ext;解像1.85A[赤色の四角形],又は1ncf;解像2.85A[赤色の菱形])においてわずかに顕著である。
いずれかの残基の非常に好ましい領域が、結晶構造から取り入れられる分布と実質的に重ね合わないとしても、対照的に、TNFrED結晶構造におけるSer57のφ-Ψ.角が、イソロイシンにて見出されたものと比較して、セリンφ-Ψ.プロットにおいて、わずかに好ましい領域に配置される。
【００５４】
置換される残基により優先するφ-Ψ.の選択に隣接する残基の影響を評価するために、当発明者は、クローン6、クローン11又は野生型TNFrEDにおける断片と同じトリ(緑色「x」s)ペプチド又はテトラ(緑色の円)ペプチド断片を含むpdbデータベースの代表的な集合体におけるφ-Ψ.角を分析した。(図３(Ａ))乃至(図３(Ｃ))に示し、そして表４に一覧が記載されているように、φ-Ψ.角が、H34又はS87のものと類似するφ-Ψ.角を有するヒスチジン又はセリン残基の例があるものより、TNFrED結晶構造におけるH34又はS87のものと類似するプロリン残基の例がより多くある。そのデータは、イソロイシンに対するよりセリン残基としてわずかに好ましいTNFrED結晶構造におけるS57のφ-Ψ.角と一致する。
【表４】
2005535281.tif 000005
表４：野生型TNFrED又は変異化クローンにおけるものと同じトリー又はテトラ-アミノ酸配列を含む結晶構造の一覧
【００５５】
(a). 同様のφ-Ψ.角に対する基準が、対象とする残基のTφ-Ψ.角度が、NFrED結晶構造のいずれかの相当する残基おいて見出されるφ-Ψ.角度の15度程度以内である。
(b). 太字の残基は、変異体クローンにおいて置換された残基か又は野生型TNFrEDに見出される残基のいずれかである。
実施例において使用される実験方法
【００５６】
プラスミド
TNFrED-アグルチニン(agglutinin)の融合が、hTNFrED配列をコードする残基12から172にインベルターゼ遺伝子からのシグナル配列を結合することにより構成され、さらにα-アグルチニン(agglutinin)遺伝子をコードする残基330から650(1,27)のC末端に融合された。TNFrEDとα-アグルチニン(agglutinin)遺伝子との間が、柔軟なリンカーGQPAAAPAをコードする配列であった。このリンカーは、免疫グロブリン領域間のヒンジ配列と類似する。TNFrED-アグルチニン(agglutinin)の融合遺伝子を、pYES2ベクター(Invitrogen Corp.)にサブクローンし、酵母において発現するためのpYES2-TNFrED-Aggを生成した。
残基12から残基172へのhTNFrEDをコードする配列を、哺乳動物発現ベクターのpCMVにサブクローンし、pCMV-TNFrEDを生成した。
【００５７】
pCMV-TNFrEDにおいて、ヒト成長ホルモンシグナル配列が、hTNFrED配列の上流にて融合される。pCMVにおけるhTNFrEDの発現が、ヒト・サイトメガロウイルス(CMV)即時型エンハンサー/プロモータ領域により調節される。hTNFrEDの下流では、ヒト成長ホルモンポリアデニール化シグナルがある。変異化したS57I又はS87Pの何れかを含むpCMV-TNFrEDを、変異体クローン6と11のそれぞれからの適切な領域をサブクローンすることにより生成した。H34P変異体を含むpCMV-TNFrEDを、全ベクターのPCR技術(6)を用いて生成した。TNFrED(H34P+S57I,H34P+S87P,H34P+S57I+S87P)の変異体の組み合わせが、適切な領域をサブクローンすることにより行った。構成する全てのコード領域の配列は、熱シークエナーゼ(thermo Sequenase)放射能標識化末端サイクル配列キット(radiolabeled terminator cycle sequencing kit)(Amersham Pharmacia Biotech)にて検証した。
酵母細胞の表面にてTNFrEDの発現
【００５８】
サッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)菌株BJ2168(a,prc1-407,prb1-1122,pep4-3,leu2,trp1,ura3-52,Yeast Genetic Stock Center,Berkeley,CA)を、前記（Gietz,R.D.,Schiest,R.H.,Willems,A.R.& Woods,R.A.Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG prodedure.Yeast.11,355-360,1995）の酢酸リチウム法を用いて、pYES2かpYES2-TNFrED-Aggのいずれかにて形質転換した。
形質転換された酵母細胞を、30℃にて振盪して2%グルコースを補給されるUra-培地にて、1昼夜培養した。
【００５９】
発現が、2%のガラクトースおよび1%のラフィノーズを含むUra-培地にて、30℃にて振盪しながら1昼夜形質転換された酵母を増殖することにより誘発された。細胞を16,060xgにて2分間遠心分離にかけることにより採集し、Dulbecco’の燐酸緩衝生理食塩水(PBS)(Gibco/BRL)にて2回洗浄し、そして4x106細胞/ml.に細胞を希釈した。4x105細胞(100μl)を、ビオチン化hTNF-α(50nM又は10nM)かヤギ抗ヒトsTNF RI抗体(0.7μg/ml,R&DSystems)あるいはその両方を、室温にて1時間、140μlの最終容量にてインキュベートした。hTNF-α(タンパク質精製群、Serono Reproductive Biolory Institute)を、EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit(Pierce Corp.)にてビオチン化した。インキュベーションの後、細胞を、16,060xgにて2分間遠心分離し、0.1%の仔牛血清アルブミン(BSA)を含む140μlの氷冷PBSにて再懸濁した。
【００６０】
FITCにて標識したアビジン(2.2μg/ml,Jackson ImmunoResearch)又はR-Phycoerythhrin-結合donkey抗ヤギIgG(2.2ug/ml,Jackson ImmunoResearch)又はその両方を、全容量180μlにて細胞に加え、4℃にて45分間インキュベートした。その細胞を16,060xgにて2分間遠心分離にかけ、氷冷した1X RDF1緩衝液(R & D Systems)により1回洗浄し、〜400μの1XのRDF1緩衝液にて再懸濁し、Becton Dickinson FACSortにて分析した。事象率(event rate)を約150細胞/secに設定し、総数10,000細胞を、分析当たりに収集した。酵母菌集団が、固定された細胞の分析を避けるために、光の散乱(サイズ)によりゲートされた。
無作為な変異体ライブラリー作成及び選択
【００６１】
5つの固有の制限酵素エンドヌクレアーゼ認識部位を、Site-Directed Mutagenesis System(Promega Corp.)のin vitroにおいて、GeneEditorを用いサイレント突然変異誘発によりTNFrEDのコード領域に誘導した。TNFrEDを40から105bp間の6の領域に分割するために、この工程を完了した。6の領域のうち5が、前記無作為な突然変異誘発法の変更を別々に行った。簡単には、固有の制限酵素エンドヌレアーゼ認識部位によりフランクされたTNDrED領域にまたがる(spanning)長いオリゴヌクレオチド(Midland Certified Reagent Company)が、それぞれの位置にて3つの「悪い」ホスホロアミダイトの所定量を含むよう生成された。スパイクされた悪いホスホロアミダイトの量は、オリゴヌクレオチド当たり2又は3変異体のいずれかの平均を生成するように調整された。
【００６２】
変異化された長オリゴヌクレオチドをフランキング(flanking)するプライマーを、TNFrEDの各領域のカセット内のDNAを、増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応に使用した。  無作為に変異誘発されたDNA領域を、適切な制限酵素エンドヌクレアーゼにより消化し、そしてpYES2-TNFrED-Aggの構成体に結合した。各変異体ライブラリーに対する結合反応(ligation reactions)により、製造方法に従い、70μlの適合する細胞当たり1μl比の結合混合物を用いて、XL10-Gold ultracompetent細胞を形質転換させた。形質転換の後、各変異体ライブラリーから20の形質転換混合物を溜めて、50μg/mlのアンピシリンを含む500mlのNZY培地にて37℃で1昼夜増殖させた。
【００６３】
各変異体ライブラリーから10の無作為クローンを、サーモ・シークエナーゼ(商標)放射能標識化ターミネータ・サイクル配列キット(Thermo Sequenase radiolabeled terminator cycle sequencing kit)(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて配列決定した。各無作為ライブラリーから約5.0μgのDNAを、酢酸リチウム形質転換法を用いて、10滴量(1x109細胞/滴量)のBJ2168細胞に形質転換した。細胞を、30℃にて24-30時間振盪しながら増殖した。次ぎに約1x108の細胞を、発現を誘導するために2%のガラクターゼ及び1%のラフィノーズを含むUra-培地にて、30℃で1昼夜増殖させた。それぞれのFACS実験のため、他の変異体ライブラリーのための6又は10ｎMの変異体クローンを含む変異体ライブラリーとして、最終濃度50nMのビオチン化hTNF-αを用い、4x106の細胞を上記のように標識化した。
【００６４】
ヤギ抗ヒトsTNF R1抗体を、FITC-アビジン及びR-phycoerythrin結合抗ヤギIgGと共に加えた。全量1.2x107細胞を、各ライブラリーに対し選別した。FACSを、<2000細胞/secの事象率にてBecton Dickinson FACsortで行った。第一回目の選別は、排他モードにより行い、そして次の選別を単一細胞モードにて行った。採集された細胞を、グルコースによる選択培地に植え付けし、そして収集された細胞の実際数を計算するために1/100容量をプレートに入れた。選択された細胞を、30℃にて再度増殖し、その後次回の選別のためガラクターゼ及びラフィノーズにて選択培地にて誘発した。各ライブラリーを、全部で３乃至４回選別した。細胞の約0.08%から0.4%を最初の回にて収集し、そして後の回では0.01%から0.2%であった。最後の回の選別により採取された細胞を、単一コロニーを形成するようUra-プレートに入れた。
変異体TNFrEDクローンの回収及び分析：
【００６５】
各ライブラリーの選別から約50の個々の酵母を、フローサイトメトリーにより分析した。0.15のOD600nmにて100μlの誘発された細胞を、上記と同じ条件下で、全量140μlにて、ビオチン化されたTNF-αの50nMか10nMのいずれかにてインキュベートした。TNF-αの結合が、FITC-アビジン(2.2μg/ml)にて検出され、そして細胞をBecton Dickinson FACsortのフローサイトメトリーにより分析した。
【００６６】
酵母発現pYES2hTNFrED-Aggコントロールより有意な半蛍光を有するクローンは、プラスミド・レスキュー(rescue)として選択された。DNAプラスミドは、酵母より回収され、製造方法に従い適合する大腸菌(E.coli)JM109(Promega Corp.)に形質転換される。精製されたプラスミドDNAを、上記のBJ2168の酵母細胞に形質転換し、個々のクローンを、上記方法を用いて再分析した。再形質転換したポジテブなクローンのTNFrED領域を、サーモ・シークエナーゼ(商標)放射能標識化ターミネータ・サイクル配列キット(Thermo Sequenase radiolabeled terminator cycle sequencing kit)(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて配列決定した。
TNF-α結合アッセイ
【００６７】
野生型又は変異型TNFrED-アグルーチン融合体のいずれかを発現する酵母、又はコントロール・ベクターpYES2を含む酵母を、PBS/BSA(10mg/ml)にて、1x108細胞/mlの濃度で再懸濁した。Durapore96-マルチウエル・プレート(Millipore Corp.)の各ウエルにおいて、50μlの細胞懸濁物を、種々の濃度の125I-TNF-α(Amersham Pharmacia Biotech)を含む50μlのPBS/BSA(10mg/ml)にて、室温にて2時間インキュベートした。インキュベート後、そのウエルを、MultiScreen Filtration system(Millipore Corp.)を用いて、氷冷PBSにて3回洗浄した。非特異的な結合は、コントロール・ベクターpYES2を含む酵母にて決定し、そして非特異的結合が、全計数の<10%であった。Kd及びBmaｘを、グラフパッドプリズム・プログラムを用いて決定した。
TNFrED変異体の発現
【００６８】
pCMVhTNFrEDの構造体を、燐酸カルシウム法を用いHEK293-EBNA細胞へ一過性的にトランスフェクトした。トランスフェクションを３重にして行って、そしてhTNFrED発現を、hTNF R-1用ELISA(R & D Systems)を用いてトランスフェクションから48時間後に、採集培地により定量した。
TNFrED変異体のBIAcore分析
【００６９】
ポリクロナールのヤギ抗ヒトTNFrEDの表示表面を、ストレプトアビジン被覆Sensor SA chips(P/N BR-1000-32,BIAcore Inc.)にビオチン化抗体(R&D SystemからBAF225)を結合することにより構成した。
これらの実験条件に基づいて、ストレプトアビジン-ビオチン化した抗TNFｒEDの相互作用が、あたかも可逆できないような動きをする。変異体と野生型TNFrEDとの間のTNFrED/TNF-αの相互作用を比較するためのデータが、下記のようにHBS(10mMのHEPES pH7.4、150mMのNaCl、3.4mMのEDTA、0.005%のP20)にて採集される。
【００７０】
HEK293-EBNA細胞を一過性トランスフェクションより条件化された媒体を、Centricon 10sにて濃縮し、そしてTNDrEDタンパク質の量を、hTNF R-1用のR & D Systems ELISAにより定量した。緩衝液にて希釈し、精製されたTNFrED(IRCSから得られたBS03-99)、又は変異化されたタンパク質を含む緩衝液にて希釈し、条件付けされた媒体を、BAF255の表面に50nMにて注入し、その結果抗体-TNFrED複合体を形成した。次ぎにTNF-αを1nM(HBSにおいて3量体)にて注入し、そしてその結合及び解離速度を、表面プラスモン共鳴応答の時間経過を介して記録した。
【００７１】
BAF-225表面を、50%、100mMのクエン酸ナトリウム、pH2.5/50%、100mMのクエン酸ナトリウム、pH3.0にて再生成し、TNFrED及びTNF-αを除去した。この一連の注入では、50nMにて注入されるTNFrED(野生型又は変異型)の濃度を保持しながら、TNF-αを2,5,10,20,50,及び100nMにて繰り返し行った。結合曲線のそれぞれの設定は、線形ベースライン・ドリフトに向けた条件(a term)を含む1:1の相互作用のモデル(model)を使用し、全体的に適合させた。条件付けされた媒体(TNFrEDでない）及びHBSを、負のコントロールとして使用した。BAF225表面を、50%、100mMのクエン酸ナトリウム、pH2.5/50%、100mMのクエン酸ナトリウム、pH3.0にて再生成し、TNFrED及びTNF-αを除去した。当発明者側において、この技術を有益に行うために、有意に高いデータ収集速度を実現するために、かなり穏やかな再生条件を有する必要があった。
結晶構造の分析
【００７２】
前記のデータセット(Wang,Y.,Huq,H.I.,de,I.C.,X & Lee,B.A new procedure for constructing peptides into a given Calpha chain.Fold.Des.3,1-10,1998)を使用して、プロリン、セリン、ヒスチジン、及びイソロイシン残基の高い解像度におけるφ-Ψ.角の分布、及び非相同性タンパク質結晶構造が、分析するために用いられる。このデータセットには、1.8オングストローム以上の分解能によるX線構造体を含み、そして集合体における任意の塩基対間で25%より低い配列の同一性を有する。
【００７３】
データセットにおいて、803のプロリン、1251のセリン、409のヒスチジン、及び959のイソロイシン残基がある。そのスペースは、φ又はΨ.角を-180度から180度まで、10度の間隔にて、36x36のビンに等しく分割した。φ-Ψ.角分布略図(図3)におけるビン(bin)の暗さは、データセットにおけるアミノ酸残基の2項分布の頻度と関連している。頻度が高くなればそれだけビンがより暗くなる。最も明るいグレイのビンは、１のZ値の無次元比(基礎確率で割ったエラー確率の倍率)を表している。最も暗いZ値(黒)のビン(bins)が40以上であり、他のグレイのビン(bins)が、それぞれ3,5,10及び30である。基本確率がnpであり、ここでnは、データセットにおけるアミノ酸残基の総数であり、そしてpは、1/(36x36)であり、エラー変動数σは：
【数１】
2005535281.tif 000006
【００７４】
上記データセット及びHobohm'sデータセット(Hobohm,U.& Sander,C.Enlarged representative set of protein structures.Protein Sci.3,522-524,1994)の両方を使用して、変異化された残基か野生型配列のいずれかの周辺の同じ配列に相当するトリ-又はテトラ-アミノ酸配列を検索した。検索のためHobohm'sデータセットを含む理由は、統計的関連性を増大させるべき配列を含むタンパク質構造の数を増大させるためである。
【００７５】
Hobohmデータセットに168のタンパク質構造があり、そして35の構造が、最初のデータセットと重なり合う。組み合わされたデータセットには、269の非重複タンパク質構造が含まれ、それは、全PDBデータベースの異なる型の折り畳み及び配列を表している。TNFrED分子を含む3つの結晶構造のpdbコードは、1ext,1ncf及び1tnrである。これらの構造は、上記データセットのいずれにもない。
本発明は、その好ましい例を引用として詳細に記載した。しかしながら、この開示を考慮して当業者が、本発明の精神及び範囲内にて変更及び改良することができることは、理解できるであろう。
【００７６】
文献一覧
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【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１（Ａ）】図１Ａは、TNFrED及びR-phycoerthrin-結合したドンケイ(donkey)抗-ヤギIgGに対し、対象とされるポリクロナール抗体にて染色された酵母細胞のフローサイトメトリー分析の概要的図を示している。酵母細胞には、pYES2プラスミド(左パネル)、又はpYES2-TNFrED-Aggプラスミド(右パネル)のいずれかが、含まれている。
【図１（Ｂ）】図１Ｂは、ビオチン化されたhTNF-α及びFITC-標識化したアビジンにて染色された酵母細胞のフローサイトメトリー分析の概要的表を示している。酵母細胞には、pYES2プラスミド(左パネル)、又はpYES2-TNFrED-Aggプラスミド(右パネル)のいずれかが、含まれている。
【図１（Ｃ）】図１Ｃは、ビオチン化されたhTNF-α及びFITC-標識化したアビジン、及びTNFrED及びR-phycoerthrin-結合したドンケイ(donkey)抗-ヤギIgGに対し、対象とされるポリクロナール抗体にて染色された酵母細胞の二色フローサイトメトリー分析の概要的図を示している。酵母が変異体ライブラリー(左側パネル)、３周ソーチングの後に同じライブラリーにて形質転換された。
【図１（Ｄ）】図１Ｄは、ビオチン化されたhTNF-α及びFITC-標識化したアビジンにて染色された酵母細胞のフローサイトメトリー分析の概要的図を示している。左側パネルにおいて、影が付けられたヒストグラムは野生型TNFrEDを、一方影の付かないヒストグラムがクローン11を発現する酵母を表している。右側パネルにおいて、影が付けられたヒストグラムは野生型TNFrEDを、一方影の付かないヒストグラムがクローン6を発現する酵母を表している。
【図２（Ａ）】図２(Ａ)は、野生型TNFrEDを発現する酵母の飽和結合分析の概要線図である。
【図２（Ｂ）】図２(Ｂ)は、変異クローン６を発現する酵母の飽和結合分析の概要線図である。
【図２（Ｃ）】図２(Ｃ)は、変異クローン11を発現する酵母の飽和結合分析の概要線図である。
【図３（Ａ）】図３(Ａ)は、変異クローン6及び11における置換残基、及び野生型TNFrEDにて見出される相当残基のφ-Ψ.プロットの概要図を示し、S57IのSer,及びS57IのIleを表している。
【図３（Ｂ）】図２(Ｂ)は、変異クローン6及び11における置換残基、及び野生型TNFrEDにて見出される相当残基のφ-Ψ.プロットの概要図を示し、S87PIのSer,及びS87PのProを表している。
【図３（Ｃ）】図３(Ｃ)は、変異クローン6及び11における置換残基、及び野生型TNFrEDにて見出される相当残基のφ-Ψ.プロットの概要図を示し、H34PのHis,及びH34PのProを表している。  図３(Ａ)から図３(Ｃ)は、変異クローン6及び11における置換残基、及び野生型TNFrEDにて見出される相当残基のφ-Ψ.プロットの概要図を示し、そこで影の付いた領域が、136の非相同タンパク質構造を1.8Å以上の解像度による分析から得られた好ましい形状である。色彩が暗くなれば、残基のφ-Ψ.角の頻度(frequency)が高くなり、さらに構成が有意に好ましくなる。TNFrED結晶構造における該当残基のφ-Ψ.角は、赤色の四角形(1ncf.pdb,TNFrED、2量体構造、1.851.8Å分解能)、赤色の菱形(1ext.pdb, TNFrED、2量体構造、2.851.8Å分解能)、及び赤色の三角形(1tnr.pdb,TNF/ TNFrEDの複合構造体、2.851.8Å分解能)にて示される。代表的な高分解能のデータ・セットを用いて緑色の符号を生成し、そしてこれらの符号は、野生型TNFrED又は変異クローンにおいて見出せるような同じ3級(緑「x」s)又は4級(緑の円)アミノ酸の内容を示している(さらに表４を参照)。(A).Ser87.(B)Pro87.(C).His34(D).Pro34.(E).Ser57.(F).Ile57.
【図４】図４は、TNFrEDのアミノ酸及びポリヌクレオチドの配列を表す。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図１（Ｃ）】
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【図１（Ｄ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図２（Ｃ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図４】
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【図４−１】
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【国際調査報告】
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