(57)【要約】本発明は、ルシフェラーゼまたはGFPなどのマーカータンパク質をコードするDNAセグメントの下流に機能的に接続された、核ホルモン受容体に対する応答エレメント、特にTREから選択される調節DNA配列を有する少なくとも1つの発現カセットを含むことを特徴とする、トランスジェニック水生動物、特にツメガエルおよびゼブラフィッシュならびにそれから誘導される細胞に関する。本発明はさらに、環境中の内分泌攪乱物質を同定するための、本発明に係るトランスジェニック細胞および動物を使用する方法に関する。
2005531303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの発現カセットを含む、両生類および硬骨類から選択される水生動物に由来するトランスジェニック細胞であって、該カセットが、
-リポータータンパク質をコードするDNAセグメントの上流に機能的に連結された、核ホルモン受容体応答エレメントから選択される脊椎動物由来の調節DNA配列と、
-選択的に、ポリアデニル化シグナルと、
-選択的に、該カセットの各末端における「インスレーター」配列とを含む、トランスジェニック細胞。
【請求項２】
カセットがプロモーター配列も含むことを特徴とする、請求項1記載の細胞。
【請求項３】
核ホルモン受容体応答エレメントが、エストロゲン応答エレメント（ERE）、甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）、グルココルチコイド応答エレメント（GRE）、プロゲステロン応答エレメント（PRE）、鉱質コルチコイド応答エレメント（MRE）、およびビタミンD応答エレメント（DRE）から選択されることを特徴とする、請求項1または2記載の細胞。
【請求項４】
核ホルモン受容体応答エレメントが、甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）であることを特徴とする、請求項3記載の細胞。
【請求項５】
リポータータンパク質が、組織化学的方法により検出可能な自己蛍光タンパク質および酵素の群から選択されることを特徴とする、請求項1〜4記載の細胞。
【請求項６】
蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（GFP）、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）、赤色蛍光タンパク質（CFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、およびこれらのタンパク質の蛍光変種、経時的に色を変化させる蛍光タンパク質（蛍光タイマー）、ならびに、蛍光色素が非常に短い寿命を有する蛍光タンパク質から選択されることを特徴とする、請求項5記載の細胞。
【請求項７】
5'-3'の方向で連続的に、
-ラットリンゴ酸酵素TRE配列、
-強化緑色蛍光タンパク質をコードするDNAセグメントに機能的に連結された、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の最小プロモーター、
-ポリアデニル化シグナル、および
選択的に、カセットの各末端における「インスレーター」配列を含むことを特徴とする、請求項6記載の細胞。
【請求項８】
組織化学的方法により検出可能な酵素が、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される、請求項5記載の細胞。
【請求項９】
5'-3'の方向で連続的に、
-ルシフェラーゼをコードするDNAセグメントに機能的に連結された、数個のTREを含むゼノプスストロメライシン3遺伝子のプロモーター配列；
-ポリアデニル化部位；
および、選択的に、カセットの各末端における「インスレーター」配列を含むことを特徴とする、請求項8記載の細胞。
【請求項１０】
5'-3'の方向で連続的に、
-ラットリンゴ酸酵素TRE配列、
-ルシフェラーゼをコードするDNAセグメントに機能的に連結された、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の最小プロモーター、
-ポリアデニル化シグナル、および
選択的に、カセットの各末端における「インスレーター」配列を含むことを特徴とする、請求項8記載の細胞。
【請求項１１】
発現カセットが細胞ゲノムに安定に挿入されていることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の細胞。
【請求項１２】
発現カセットが、該細胞にエピソーム形態で存在するベクターに挿入されていることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の細胞。
【請求項１３】
両生類が、好ましくはゼノプス・ラエビスおよびゼノプス・トロピカリスから選択されるカエルであり、硬骨類がゼブラフィシュおよびメダカから選択されることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項記載の細胞。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか一項記載の少なくとも1つの細胞を含む、非ヒト水生トランスジェニック動物。
【請求項１５】
両生類であることを特徴とする、請求項14記載の動物。
【請求項１６】
両生類が、ゼノプス・ラエビスおよびゼノプス・トロピカリスから選択されるカエルであることを特徴とする、請求項15記載の動物。
【請求項１７】
動物のすべての細胞がトランスジェニックであることを特徴とする、胚トランスジェネシスにより得られる、種々の発達段階における、好ましくはオタマジャクシ段階における、請求項16記載のトランスジェニックカエルおよびその子孫。
【請求項１８】
動物の一部の細胞がトランスジェニックであることを特徴とする、体細胞トランスジェネシスにより得られる、種々の発達段階における、好ましくはオタマジャクシ段階における、請求項16記載のトランスジェニックカエル。
【請求項１９】
連続的に5'-3'の方向に、
-ルシフェラーゼをコードするDNAセグメントに機能的に連結された、数個のTREを含むゼノプスストロメライシン3遺伝子のプロモーター配列、
-ポリアデニル化シグナル、および、
選択的に、カセットの各末端における「インスレーター」配列を含む
発現カセットを含有する少なくとも1つの細胞を含むトランスジェニックオタマジャクシ。
【請求項２０】
連続的に5'-3'の方向に、
-ラットリンゴ酸酵素TRE配列、
-ルシフェラーゼをコードするDNAセグメントに機能的に連結された、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の最小プロモーター、
-ポリアデニル化シグナル、および
選択的に、カセットの各末端における「インスレーター」配列を含む
DNA発現カセットを含有する少なくとも1つの細胞を含むトランスジェニックオタマジャクシ。
【請求項２１】
連続的に5'-3'の方向に、
-ラットリンゴ酸酵素TRE配列、
-強化緑色蛍光タンパク質をコードするDNAセグメントに機能的に連結された、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の最小プロモーター、
-ポリアデニル化シグナル、および
選択的に、カセットの各末端における「インスレーター」配列を含む
DNA発現カセットを含有する少なくとも1つの細胞を含むトランスジェニックオタマジャクシ。
【請求項２２】
核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を、変調、好ましくは刺激する少なくとも1つの環境汚染物質の存在を同定する方法であって、
a）請求項1〜13記載の細胞、請求項14〜16記載の動物、または請求項17もしくは18記載のカエルを、環境汚染物質を含む水性媒体中で接触させる段階、
b）請求項1〜13記載の細胞、請求項14〜16記載の動物、または請求項17もしくは18記載のカエルを、水性媒体中で接触させる段階、
（c）a）およびb）におけるリポータータンパク質の発現を定性的に、選択的に定量的に測定し、該発現を比較する段階であって、a）およびb）における該リポータータンパク質の発現の差異が媒体中の環境汚染物質の存在を示す段階を含む、方法。
【請求項２３】
別個のリポータータンパク質は、各々の種類の環境汚染物質に対応することを特徴とする、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を、変調、好ましくは刺激する単数または複数の化合物をスクリーニングする方法であって、
a）請求項1〜13記載の細胞、請求項14〜16記載の動物、請求項17もしくは18記載のカエル、または請求項19〜21記載のオタマジャクシを、単数または複数の化合物を含む水性媒体中で接触させる段階；
b）請求項1〜13記載の細胞、請求項14〜16記載の動物、請求項17もしくは18記載のカエル、または請求項19〜21記載のオタマジャクシを、水性媒体中で接触させる段階；
（c）a）およびb）におけるリポータータンパク質の発現を定性的に、選択的に定量的に測定し、該発現を比較する段階；
（d）a）およびb）における該リポータータンパク質の発現の差異を誘導する単数または複数の化合物を選択する段階を含む、方法。
【請求項２５】
核ホルモン受容体遺伝子を、請求項1〜13記載の細胞に、または請求項14〜16記載の動物の少なくとも1つのトランスジェニック細胞に、または請求項17もしくは18記載のカエルの少なくとも1つのトランスジェニック細胞に、または請求項19〜21記載のオタマジャクシの少なくとも1つのトランスジェニック細胞に体細胞導入する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
別個のリポータータンパク質は各化合物に対応することを特徴とする、少なくとも2つの化合物を同時にスクリーニングするための、請求項24または25記載の方法。
【請求項２７】
核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を変調する単数または複数の化合物の生物的作用の様式を解析および研究するための、請求項24〜26のいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項２８】
核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を刺激する環境汚染物質の用量効果を研究するための、請求項22または23記載の方法の使用。
【請求項２９】
特に水中での環境汚染物質を検出、解析および／または研究するための、請求項1〜13記載の細胞、請求項14〜16記載の動物、請求項17もしくは18記載のカエル、または請求項19から21記載のオタマジャクシの使用。
【請求項３０】
水の品質を解析および／または評価するための、請求項1〜13記載の細胞、請求項14〜16記載の動物、請求項17もしくは18記載のカエル、または請求項19〜21記載のオタマジャクシの使用。
【請求項３１】
特に美容学、農芸化学、または薬学における毒性および／または毒物学の研究を実施するための、請求項1〜13記載の細胞、請求項14〜16記載の動物、請求項17もしくは18記載のカエル、または請求項19〜21記載のオタマジャクシの使用。
【請求項３２】
カエル胚に対する催奇形性（FETAX:カエル胚における催奇形性アッセイ法）を研究するためのプロトコルにおける、請求項31記載の使用。
【請求項３３】
特に水中における環境汚染物質、および／または核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を変調する単数または複数の化合物を検出するための装置であって、請求項1〜13記載の少なくとも1つの細胞、および／または請求項14〜16記載の少なくとも1つの動物、および／または請求項17もしくは18記載のカエル、好ましくはオタマジャクシ段階のカエル、および／または請求項19〜21記載のオタマジャクシ、および選択的に、単数または複数のリポーター遺伝子の発現を検出する手段を含むことを特徴とする、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学の分野、より詳細には動物トランスジェネシスの分野に関する。より詳細には、本発明は、トランスジェニックカエル、特にオタマジャクシ段階のカエル、またはそれから誘導される細胞、および、核受容体アゴニストまたはアンタゴニストである分子などの、環境中の内分泌攪乱物質の存在を同定する目的の方法におけるその使用にも関する。
【０００２】
多種多様な化合物が天然環境に広く分散している。これらの中には、ホルモン型の効果を有し、その物理化学的特性から望ましくないものが数多くある。したがって、天然水中でのホルモン汚染物質の存在は、種々の水生種の受精に関する問題が観察されることにより判明している。事実、いくつかの現在の研究アプローチにより、我々の環境中の内分泌攪乱物質の存在が確認されている。
【０００３】
内分泌系を攪乱する物質は、ホメオスタシスの機能、生殖の機能、発達の機能、または行動の機能などの多くの機能を細かく調節するホルモン因子（エストロゲン、アンドロゲン、および甲状腺ホルモン）の生物学的作用を模倣している。これらの天然起源または合成起源の物質は、実際に、ホルモンにより調節されるプロセスに関与する分子因子として生物により認識され、したがって、ホルモンの作用を妨害する。
【０００４】
これらの因子が広範に存在することにより、世界中の政府機関の注目を集め、大会社が、その活動の環境的影響を考慮する必要をもたらしている。これらの問題に応答して、そのホルモン活性の観点からあらゆる化学製品または産業廃棄物を試験することが必要であるか、または法律的にさえ要求される。
【０００５】
したがって、感度が高く、迅速であり、定量可能で組織特異的な結果が得られ、環境内分泌攪乱物質の検出に使用する上で非常に柔軟性のある、統合モデルの作成に基づいた信頼性の高い評価を確立することが重要である。これは、トランスジェニック水生生物、好ましくは胚段階であり、したがって、透明である生物を提供することにより、本発明が解決を提案している問題であり、その生物の細胞においては、リポータータンパク質の発現が、ホルモン機能を破壊する因子の存在により細かくモデリングされている。さらに、本発明により、数個のリポータータンパク質、好ましくは蛍光タンパク質を組み合わせることにより、同じ動物内での種々の汚染物質の同時かつ早期の測定が可能となる。使用した遺伝子構築物により、組織に特異的な効果を検出することも可能である（神経毒性効果、肝毒性効果など）。
【０００６】
したがって、本発明は、少なくとも1つの発現カセットを含む、両生類および硬骨類から選択される水生動物由来のトランスジェニック細胞に関し、該カセットは、リポータータンパク質をコードするDNAセグメントの上流に機能的に連結した核ホルモン受容体応答エレメントから選択される調節DNA配列、好ましくは脊椎動物由来のもの、および選択的にポリアデニル化シグナル、および選択的に該カセットの各末端における「インスレーター」配列を含む。1つの態様によると、該カセットはまた、最小プロモーター配列も含む。
【０００７】
本発明の目的では、「トランスジェニック」という用語は、導入遺伝子を含む細胞または少なくとも1つの細胞を含む動物を示すことを意図する。本出願で区別せずに使用する用語である「導入遺伝子」という用語または「外来性核酸配列」という表現、または「外来性遺伝子」という用語または「発現カセット」という用語は、動物のゲノムに、特にインビトロで培養している動物細胞に、または生体動物の細胞に人工的に挿入されている、または挿入する、あるいは、前記細胞中でエピソーム形態で維持される遺伝子材料を示すものとする。好ましくは、本発明による導入遺伝子は、転写されるかまたはタンパク質に転写され翻訳されることのできる少なくとも1つの配列を含む。
【０００８】
好ましくは、しかし排他的ではないが、核ホルモン受容体応答エレメントは、エストロゲン応答エレメント（ERE）（Maderら、1993）、甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）、グルココルチコイド応答エレメント（GRE）、および鉱質コルチコイド応答エレメント（MRE）（Kollaら、1999）、プロゲステロン応答エレメント（PRE）（Hechtら、1988）およびビタミンD応答エレメント（DRE）（Kitazawaら、2002）から選択される。
【０００９】
本発明の第一の好ましい態様によると、核ホルモン受容体応答エレメントはTREである。TREを含む種々の調節配列を本発明において使用できる；例えば、ラットリンゴ酸酵素のTRE配列（配列番号:1）、1コピーのDR4共通TRE配列（配列番号:5；配列番号:6）、3コピーの共通TRE配列（DR4）X3、DR4配列は4ヌクレオチド離れている。本発明の第二の好ましい態様によると、核ホルモン受容体応答エレメントはEREである。
【００１０】
「遺伝子の発現のための調節配列または調節エレメント」という表現は、遺伝子発現の調節に関与するすべてのDNA配列、すなわち、本質的に転写、スプライシング、および翻訳の調節配列を意味することを意図する。転写の調節DNA配列の中では、最小プロモーター配列、上流配列（例えば、核ホルモン受容体応答エレメント、例えばTRE、ERE、GREなど）、活性化配列（エンハンサー）、選択的に阻害配列（サイレンサー）、隔離する配列（インスレーター）、例えばMAR（マトリックス付着領域）（配列番号:10、11）およびスプライシング配列を注記すべきである。本発明による調節DNA配列は、好ましくは、脊椎動物配列、好ましくはゼノプスまたは硬骨類配列、より好ましくはヒト配列である。
【００１１】
これらの発現調節配列は、単数または複数のリポーター遺伝子に機能的に連結している。核酸配列は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に「機能的に連結」している。例えば、上流プロモーターまたは調節配列は、コード配列の転写を変調または影響を及ぼす場合に、該コード配列と機能的に連結している。転写の調節配列については、「機能的に連結」という用語は、連結しているDNA配列は連続的であり、タンパク質の2つのコード領域の連結に関与している場合、それらは連続的であり、読み枠内にあることを意味する。
【００１２】
「最小プロモーター配列」という表現は、その上流調節配列がなくても、機能的に連結している遺伝子の転写を基線レベルで誘導できるプロモーターを意味することを意図する。最小プロモーターの例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、サルサイトメガロウイルス（サルCMV IE94）およびアデノウイルスE1bプロモーター（Argentonら、1996）を注記すべきである。
【００１３】
本発明によるプロモーターおよび調節配列は、リポータータンパク質の望ましい発現プロファイルにより規定される。好ましくは、リポーター遺伝子は、組織特異的または細胞特異的または遍在的発現エレメントの制御下に置かれる。
【００１４】
組織特異的発現エレメントまたは組織特異的プロモーターは、本発明による水生動物の1つ以上の細胞、組織、細胞型または器官において特異的な発現、好ましくは強力な発現を得ることを可能とするプロモーターから選択される。これらのプロモーターは、生物に対して異種であってもなくてもよく、生物のゲノムに天然に存在していてもいなくてもよい。本発明による組織特異的プロモーターは、好ましくは、肝臓、中枢神経系、特に視床下部、および骨芽細胞における発現を指令する配列から選択される。肝臓での発現が特に有利である。それは、環境汚染物質はこの解毒臓器に集中するからである。この点から、以下の遺伝子のプロモーターについて注記し得る：
-ビテロゲニンでは、肝臓において遺伝子の発現を指令するCYP26、CYP3A。ゼノプスおよびニワトリビテロゲニン遺伝子のプロモーターは、組織特異的プロモーターの一例である。肝臓におけるこの遺伝子の発現は、エストロゲンにより誘導される。ゼノプスビテロゲニンA2遺伝子は、-331と-319の間にエストロゲン応答エレメントを含む。ニワトリビテロゲニン遺伝子は、-721と-591bpの間に位置する、グルココルチコイド、エストロゲン、および黄体ホルモンなどのホルモンについての種々の応答エレメントを含む；
-肢芽に、変態中の腸に、および再構築中の特定の組織に発現される細胞外マトリックスの再構築に関与する酵素をコードするストロメライシン3のプロモーター（Ishizuya-Okaら、1996）；
-バソプレッシンでは、脳における遺伝子の発現を指令するBTEB、TH／bZIP。バソプレッシンは、水の代謝および血圧の調節に関与する神経下垂体ホルモンであり；中枢神経系の神経伝達および神経変調にも関与している。この遺伝子の発現は、エストロゲンおよびテストステロンにより調節されている。ラットバソプレッシンのプロモーター配列は、1.5kbpの遠位断片に位置する2つのエストロゲン応答エレメント（ERE）を含む（Shapiroら、2000）。BTEB（塩基性転写エレメント結合）遺伝子のプロモーターは、組織特異的プロモーターの別の例を構成する（Denversら、1997）。BTEB遺伝子は脳で発現され、その発現は、インビボにおいてT3甲状腺ホルモンにより誘導される（Denversら、1999）。ゼノプスBTEB遺伝子のプロモーターの一部がクローニングされている（Brownら、1996）。組織特異的プロモーターの別の例は、塩基性ロイシンジッパー転写因子をコードするTH／bZIP遺伝子のプロモーター（配列番号:12）から構成される（Wangら、1993）。TH／bZIP遺伝子の発現は効果的に外来性甲状腺ホルモンにより、甲状腺ホルモン依存的プロセスであるゼノプスにおける変態時に調節される（Furlowら、1999）。-246bpと＋130bpの間のTH／bZIP遺伝子のプロモーター部分は2つのTREを含む（配列番号:2および3）；
-骨芽細胞で特異的に発現される転写因子をコードするCbf1（Kasentyら、2000）。骨芽細胞分化および機能に決定的な役割を果たしているこの因子の発現はエストロゲンにより誘導され、そのプロモーターはEREを含む。
【００１５】
本発明による多トランスジェック細胞または動物に関して、リポーター遺伝子の発現の正または負の調節を同時に解析することが可能である。例えば、GFPの上流にあるTSH（甲状腺刺激ホルモン）プロモーターはT3ホルモンにより正に調節され、一方、TRH（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）プロモーターはT3により負に調節される。従って、「TSHプロモーター／GFP」および「TRHプロモーター／RFP」発現カセットを含む細胞により、遺伝子発現に対して正または負に作用する化合物を同定またはスクリーニングすることが可能となる。
【００１６】
Metzgerおよび Feil（1999）による論文により、非制限的な例（471ページの表を参照）として、種々の組織においてリポータータンパク質の発現を指令するのに使用できる組織特異的プロモーターのリストが与えられる。組織特異的プロモーターは、より一般的に、生理的系、臓器、組織、細胞型、または特定の細胞（とりわけ、網羅するわけではないが、一般に中枢神経系、特に脳、小脳、ニューロン、運動ニューロン、グリア細胞、シュワン細胞、脳下垂体、視床下部、下垂体、海馬、皮質、心臓、心室心筋細胞および心房心筋細胞、肺、骨、眼、およびより詳細には網膜および水晶体、皮膚、より詳細には真皮および表皮、筋肉、より詳細には骨格筋、心筋、および平滑筋、乳腺、生殖腺、より詳細には精巣、卵巣、胚細胞、卵細胞、卵原細胞、精子、精原細胞および精母細胞、腎臓、肝臓および特に肝細胞、脾臓、膵臓、特にランゲルハンス細胞およびβ細胞、舌、食道、脂肪組織、および内皮細胞を注記すべきである）において、リポータータンパク質の発現を指令するプロモーターから選択される。
【００１７】
遍在的発現エレメントまたは遍在的プロモーターは、本発明による生物の臓器または組織のすべてまたは少なくとも高い比率における発現、好ましくは強力な発現を可能とするプロモーターから選択される。これらのプロモーターは、本発明による生物に関して異種でも異種でなくてもよい。遍在的プロモーターの非制限的な例として、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（Schmidtら、1990）およびインターフェロン誘導プロモーター（M×1）（Hugら、1998；Arnheiterら、1990）を注記し得る。さらに、本発明による発現エレメントまたはプロモーターは、融合遺伝子の発現の構成的または誘導性制御を与え得る。誘導性発現を提供するエレメントには、重金属により（Mayoら、1982；Brinsterら、1982；Searkら、1985）、熱的ショックにより（Noverら、1991）、ホルモンにより（Leeら、1981；Hynesら、1981；Klockら、1987；Israelら、1989）、またはインターフェロンにより（Hugら、1998；Arnheiterら、1990）誘導しうる真核プロモーターを注記すべきである。E.coliのLacリプレッサーシステム（LacR／オペレーター／インデューサー）（Huら、1987；Brownら、1987；Figgeら、1988；Deuschleら、1990；Labowら、1990）またはE.coliのテトラサイクリン耐性システム（Gossenら、1992）（WO9404672, EP804565）などの誘導原核発現エレメントも注記すべきである。
【００１８】
前記リポータータンパク質は、組織化学的方法により検出可能である自己蛍光タンパク質および酵素の群から選択される。好ましくは、該蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（GFP）、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）、赤色蛍光タンパク質（CFPおよび赤FP、RFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、およびこれらのタンパク質の蛍光変種、経時的に色が変化する蛍光タンパク質（「Clontechにより販売されているフルオレセントタイマー（商標）」）、蛍光色素が非常に短い寿命を有する蛍光タンパク質、および少なくとも2つの蛍光タンパク質からなり視覚的および定量的解析が可能なルシフェラーゼ／GFP融合タンパク質などの融合タンパク質から選択される。使用する蛍光タンパク質の中で、蛍光タイマータンパク質が特に好ましい。それは、緑色蛍光から赤色蛍光への変化は、このリポータータンパク質の発現を指令するプロモーターの活性を反映するからである。したがって、本発明による動物または細胞を汚染物質に接触させた後に、プロモーターの活性により化合物または汚染物質の残留を評価することが可能である。このような種類のリポータータンパク質の使用により、プロモーターの活性化の動態を評価することが可能である。別の種類の態様によれば、蛍光が短い寿命を有するタンパク質を使用することが有利である。したがって、単数または複数の汚染物質との接触が終了した直後に細胞および動物を調べる。蛍光の消失または蛍光色素の半減期の期間より長い期間の後の持続により、単数または複数のプロモーターが依然として活性化されているかどうかが示される。別の種類の態様によると、カスパーゼ-3認識部位を含むリンカーペプチドにより会合した2つの異なる蛍光タンパク質からなる融合タンパク質をコードするリポーター遺伝子を使用することが有利である（Xuら、1998およびLuoら、2001）。したがって、GFPおよびBFPをコードする配列、それぞれCFPおよびYFPは、プログラム化細胞死のエフェクタータンパク質の1つである、カスパーゼ3に特異的な切断配列を含む、18アミノ酸ペプチドにより組み合わせられている。
【００１９】
カスパーゼ-3プロテアーゼが活性化されていない限り、2つのフルオロフォアの間にはエネルギー転移が存在する。細胞がアポトーシスに入ると、カスパーゼ-3プロテアーゼが活性化され、その結果融合タンパク質は切断され、エネルギー転移は終結し、したがって、それぞれCFPのGFPが可視化できる。したがって、このようなトランスジェニック細胞または動物により、アポトーシスの現象に対する汚染物質の効果を検出することが可能となる。自己蛍光融合タンパク質GFP／BFPおよびCFP／YFPをコードする2つのリポーター遺伝子を含むトランスジェニック細胞または動物の使用により、2つの別個のカテゴリーの汚染物質の可能性ある毒性についての同じ種類の情報を同時に得ることが可能となる（例えばエストロゲンおよび甲状腺ホルモン）。このようなトランスジェニック細胞または動物は、異なるホルモン型に応答するが、同じ組織に発現されるかまたは遍在的に発現されている2つの導入遺伝子の場合には特に有用である。
【００２０】
別の態様によると、組織化学的方法により検出可能である酵素は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される。好ましい態様によると、それはルシフェラーゼである。「ルシフェラーゼ」という用語は、ルシフェリンと呼ばれる基質の存在下で生物発光反応を触媒または開始するすべてのタンパク質を示すことを意図する。本発明によるルシフェラーゼは、生物発光を生じる多くの生物または系に由来し得る（米国特許第6,152,358号参照）。例えば、本発明によるルシフェラーゼは、Renilla（米国特許第5,418,155号および米国特許第5,292,658号）またはPhotinus pyralisまたはLuciola cruciata（米国特許第4,968,613号）に由来し得る。
【００２１】
発現カセットまたはそれを含む発現ベクターの構築に使用した組換えDNA技術は、公知であり、当業者により一般的に使用されるものである。標準的な技術が、クローニング、DNA単離、増幅および精製に使用され；DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、および制限エンドヌクレアーゼを含む酵素反応は、製造業者の推奨に従って実施する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ファージミド、バクテリオファージ、レトロウイルス、および他の動物ウイルス、人工染色体、例えばYAC、BAC、またはHAC、および他の類似のベクターが含まれる。これらの技術およびその他は一般的にSambrookら（1989分子クローニング：実験マニュアル第2版-Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring、NY、米国）に従って実施する。
【００２２】
本発明はまた、本発明による発現カセットまたは導入遺伝子、およびまたそれを含むベクターも網羅する。事実、導入遺伝子は、宿主細胞中でのその増殖を可能とするクローニングベクター中に、および／または選択的に導入遺伝子の発現をもたらす発現ベクター中にクローニングすることができる。
【００２３】
トランスジェニック細胞を作製する方法は当業者に周知である。選択的に線形化または非線形化ベクターに含まれるか、またはベクター断片の形態の、本発明による発現カセットまたは導入遺伝子は、宿主細胞に、例えば核へのマイクロインジェクション（米国特許第4,873,191号）、リン酸カルシウム沈降によるトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法、熱ショック、カチオンポリマーを用いた形質転換（PEG、ポリブレン、DEAE-デキストランなど）、ウイルス感染、または精子（KrollおよびAmaya、1996）などの標準的な方法により導入することができる。KrollおよびAmaya（1999）は、より詳細に、トランスジェニックカエル胚を作製する方法を記載している。少なくとも1つの導入遺伝子が導入されている細胞を選別するために、選択遺伝子とも呼ばれる正および／または負のマーカーを、ベクターに挿入することができる。細胞を選択する種々のシステムが記載されており；正／負の選択ベクターを使用するシステムを注記すべきである（Capecchiら、1989）。
【００２４】
第一の態様によると、本発明による細胞は、連続的に5'-3'の方向に、ラットリンゴ酸酵素TRE配列（配列番号:1）、強化緑色蛍光タンパク質をコードするDNAセグメントに機能的に連結した単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の最小プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および選択的に、該カセットの各末端における「インスレーター」配列（配列番号:10または配列番号:11）を含む、発現カセットを含む。
【００２５】
第二の態様によると、本発明による細胞は、連続的に5'-3'の方向に、ルシフェラーゼをコードするDNAセグメントに機能的に連結したいくつかのTREを含むゼノプスストロメライシン3遺伝子のプロモーター配列（配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9）、ポリアデニル化部位、および選択的に、該カセットの各末端における「インスレーター」配列（配列番号:10または11）を含む。
【００２６】
第三の態様によると、本発明による細胞は、連続的に5'-3'の方向に、ラットリンゴ酸酵素TRE配列（配列番号:1）、ルシフェラーゼをコードするDNAセグメントに機能的に連結した単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の最小プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および選択的に、該カセットの各末端における「インスレーター」配列（配列番号:10または11）を含む。
【００２７】
本発明による水生動物細胞および／または非ヒトトランスジェニック動物は、リポータータンパク質をコードする少なくとも1つの発現カセットを細胞、接合体、または動物の初期胚に導入することにより得られる。種々の導入遺伝子の本発明による細胞への導入はまた、同時にまたは時間を離して実施することができる。細胞が多トランスジェニックである場合には、導入遺伝子は、好ましくは、各々、別個のリポータータンパク質をコードし、各リポータータンパク質の発現は、環境汚染物質の種類に特異的である。
【００２８】
本発明による細胞は、染色体外エレメントの形態で存在するか、または無作為または標的化した様式で染色体DNAに安定に組み込まれている、本発明による少なくとも1つの導入遺伝子を含む。数個の導入遺伝子が本発明による細胞に存在する場合、染色体外エレメントの形態で、および／または無作為または標的化した様式で染色体DNAに安定に組み込まれて存在し得る。
【００２９】
好ましい態様によると、発現カセットは、無作為または標的化した様式で染色体DNAに安定に組み込まれている。「安定に組み込まれる」という用語は、本発明による細胞のゲノムDNAへの導入遺伝子の挿入を意味するものとする。その後、このようにして挿入された導入遺伝子は、細胞子孫に伝達される。
【００３０】
本発明の別の態様によると、細胞は、少なくとも1つのリポータータンパク質をコードする該発現カセットまたは導入遺伝子は、該細胞においてエピソーム形態で存在することを特徴とする。本発明の細胞において、エピソーム形態で導入遺伝子を維持および発現するのに使用した発現ベクターの性質および特徴を規定するのは、当業者の範囲内である。
【００３１】
胚トランスジェネシスに関しては、動物のすべての細胞、および特にその胚系細胞はトランスジェニックである。この場合、発現カセットは、好ましくは、無作為または標的化した様式で染色体DNAに安定に組み込まれる。リポーター遺伝子の組込みを生物のゲノムにおいて相同的組換えにより標的化する場合（「ノックイン」）、リポーター遺伝子は、プロモーターおよび／または発現エレメントを欠失し得、内因性プロモーターまたは内因性発現エレメントの制御下に配置し得る。
【００３２】
体細胞トランスジェネシスに関しては、動物の細胞のほんのいくつかが、導入遺伝子の注入部位においてトランスジェニックである。この場合、発現カセットまたは導入遺伝子は、好ましくは細胞中でエピソーム形態で存在する。
【００３３】
本発明による細胞は、好ましくは、両生類の細胞、好ましくはゼノプス・ラエビス（Xenopus laevis）およびゼノプス・トロピカリス（Xenopus tropicalis）から選択されるカエルの細胞である。個体群に存在する遺伝子多形を考えると、特徴的な生理的または挙動的応答を解析または得るために、本発明によるトランスジェニック両生類、特に本発明によるトランスジェニックカエルは、ゼノプス・ラエビス種およびゼノプス・トロピカリス種などの異なる遺伝的背景を有することが有利であり得る。別の態様によると、本発明による細胞は、硬骨類細胞、好ましくはゼブラフィッシュ細胞またはメダカ細胞である。
【００３４】
本発明はまた、前記したような本発明による少なくとも1つの細胞を含む、両生類および硬骨類から選択される非ヒトトランスジェニック水生動物に関する。この動物が、両生類（amphibians）または両生類（batrachians）などの水生／陸生動物である場合、カエル目（Anura）、有尾目（Urodela）、および無足動物（Apoda）から選択される。それらは好ましくはAnuraであり、より好ましくはpipidae科およびアカガエル科（ranidae）のツメガエルである。ツメガエルは、好ましくは、ゼノプス・ラエビスおよびゼノプス・トロピカリスから選択される。本発明の第二の態様によると、動物は硬骨類である。「硬骨類」という用語は、「骨の多い」魚を示すものとされ、すなわち、その骨格が完全に骨化している。硬骨類群には、例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアント・レリオ（giant rerio）、およびフグ類が含まれる。
【００３５】
本発明の水生動物は、マウス、ショウジョウバエ、または線虫などの慣用的な動物モデルシステムと比べて特定数の利点を有する。最初に、ゼノプスおよび硬骨類は、進化的な観点からヒトにより近く、この点で本発明のスクリーニングモデルははるかにより関連性が高い。組織および臓器発達の分子的および形態的基礎は、ヒトを含む他の脊椎動物と同一または類似している。本発明の水生動物モデルにより提供される第二の利点は、その胚が非常に透明であるということである。胚の透明性から、動物に投与するかまたは動物に接触させる化合物の活性を、非透明動物よりもはるかに迅速に検出および診断することができる。これらの活性は、ゼノプスにおいて胚段階のみで実質的に検出することができる。これらの水生動物の他の利点は、マウスなどの動物と比べて急速に発達するということである。本発明による水生動物はまた、試験化合物を発達を受けている動物に直接投与することができるという利点を有し、これは、インビトロで発達する動物においてはそうではない。最後に、本発明による水生動物を選択することの別の重要である利点は、維持および育種の費用であり、これはマウスなどの動物により生じるコストと比べて低い。最後に、ゼノプスおよびゼブラフィッシュ胚のサイズが小さいことから、本発明によるシステムは、大量のリポーター遺伝子の発現の検出におけるマルチウェルマイクロプレートの使用に非常に適しており、よって、この検出を自動化することができる。
【００３６】
より詳細には、本発明は、動物のすべての細胞がトランスジェニックであることを特徴とする、胚形質転換により得られた、種々の発達段階の、好ましくはオタマジャクシ段階のトランスジェニックカエルおよびその子孫を網羅する。「種々の発達段階」という表現は、接合体、オタマジャクシ、および成体カエルを示すものとする。
【００３７】
別の態様によると、本発明は、該動物の細胞のいくつかがトランスジェニックであることを特徴とする、体細胞形質転換により得られる、種々の発達段階の、好ましくはオタマジャクシ段階の、トランスジェニックカエルを網羅する。
【００３８】
本発明によるトランスジェニック動物は、胚トランスジェネシスから誘導されるトランスジェニック細胞、および、体細胞トランスジェネシスから誘導されるトランスジェニック細胞を含むことができるということは明らかである。
【００３９】
より好ましくは、本発明によるトランスジェニックカエルはオタマジャクシ段階のものである。第一の態様によると、本発明は、連続的に5'-3'の方向に、ルシフェラーゼをコードするDNAセグメントに機能的に連結した、数個のTREを含むゼノプスストロメライシン3遺伝子のプロモーター配列（配列番号:7、8、9）、ポリアデニル化シグナル、および選択的に、前記カセットの各末端における「インスレーター」配列を含む、発現カセットを含む、少なくとも1つの細胞を含む、トランスジェニックオタマジャクシを網羅する。第二の態様によると、本発明は、連続的に5'-3'の方向に、ラットリンゴ酸酵素TRE配列（配列番号:1）、ルシフェラーゼをコードするDNAセグメントに機能的に連結した、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の最小プロモーター、ポリアデニル化配列、および、選択的に、該カセットの各末端における「インスレーター」配列を含む、DNA発現カセットを含む、少なくとも1つの細胞を含む、トランスジェニックオタマジャクシを網羅する。第三の態様によると、本発明は、連続的に5'-3'の方向に、ラットリンゴ酸酵素TRE配列（配列番号:1）、強化緑色蛍光タンパク質をコードするDNAセグメントに機能的に連結した単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）遺伝子の最小プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および、選択的に、該カセットの各末端における「インスレーター」配列を含む、DNA発現カセットを含む、少なくとも1つの細胞を含む、トランスジェニックオタマジャクシを網羅する。
【００４０】
本発明の目的の1つはまた、
a）本発明による細胞または動物を、環境汚染物質を含む水性媒体中で接触させる段階；
b）本発明による細胞または動物を水性媒体中で接触させる段階；
c）a）およびb）のリポータータンパク質の発現を定性的に、選択的に定量的に測定し、その後、前記発現を比較する段階、
a）およびb）における前記リポータータンパク質の発現の差異は、媒体中の環境汚染物質の存在を示すという段階を含む、核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を変調、すなわち阻害または刺激（好ましくは刺激）する、少なくとも1つの環境汚染物質の存在を同定する方法を提供することである。この方法は、別個のリポータータンパク質が、各種類の環境汚染物質に対応することを特徴とする。
【００４１】
本発明の目的はまた、
a）本発明による細胞または動物を、単数または複数の化合物を含む水性媒体中で接触させる段階；
b）本発明による細胞または動物を、該水性媒体中で接触させる段階；
c）a）およびb）におけるリポータータンパク質の発現を定性的に、選択的に定量的に測定し、その後、該発現を比較する段階；
（d）a）およびb）における該リポータータンパク質の発現の差異を誘導する単数または複数の化合物を選択する段階を含む、
（a）核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を変調、すなわち阻害または刺激（好ましくは刺激）する化合物をスクリーニングする方法を提供することである。
【００４２】
本発明によるスクリーニング法はまた、少なくとも1つの核ホルモン受容体遺伝子を、細胞に、または、本発明による動物の少なくとも1つのトランスジェニック細胞に体細胞導入する段階を含み得る。事実、本発明による動物の細胞に少なくとも1つの核ホルモン受容体を過剰発現している導入遺伝子を加えることにより、本発明の方法を実施する場合の検出感度を高くすることができる。このような導入遺伝子は、適切な部位で該リポーターの発現を指令する組織特異的または遍在的プロモーターを含む。
【００４３】
本発明による方法はまた、別個のリポータータンパク質が各化合物に対応することを特徴とする、少なくとも2つの化合物の同時スクリーニングを意図する。
【００４４】
本発明による方法は、公知の化合物が内分泌攪乱物質となり得るかどうかを決定するのに特に有用である。実際に、核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写に対して効果を有しやすい試験化合物を、該化合物を、生存細胞または動物を含む水性媒体に直接添加することにより、細胞または水生動物と接触させる。実際的に、それが細胞である場合、単数または複数の該試験化合物を培養培地に入れる。それが動物である、特にオタマジャクシである場合、単数または複数の試験化合物は、動物が生存している水性媒体に入れる。または、環境混入物質の存在が疑われる川、湖、または他のあらゆる天然水性媒体の水の中における化合物の存在の検出に関与する場合、動物はこの水性媒体の中に入れる。この場合、本発明による方法の段階b）を実施するための対照として作用する水性媒体は、処理していても処理していなくてもよく、試験化合物またはスクリーニングする化合物を含んでいない川からの、湖からの、または他のあらゆる天然水性媒体からの水であり得る。このようなアプローチは、化学試薬を魚の胚に導入するのに使用される（M. Westerfield、The zebrafish book：ゼブラフィッシュの実験使用ガイド第3版、1995）。または、前記化合物は、本発明による水生動物に、電気穿孔、リポフェクション、または摂取により投与し得る。または、スクリーニングまたは検出される単数または複数の化合物は、それを直接生存している細胞または動物に注入することにより、本発明による細胞または動物に直接接触させることができる。例えば、該化合物は、オタマジャクシの脳または背筋に注入し得る。
【００４５】
スクリーニングされる、または研究される化合物は、単独で、または、他の化合物または溶媒または輸送体と共に投与することができる。前記化合物は、同時期に、同時に、または、試薬またはリポーター遺伝子の発現の検出に使用する着色剤の投与後に、動物と接触させ得る。
【００４６】
本発明による方法を実施する前に、本発明による細胞または動物を前処理して、スクリーニング、検出、または測定する化合物の感度を増加することが有利であり得る。したがって、本発明者らは、過塩素酸塩に基づいた処理法を開発した。動物または細胞を、1ヶ月までの範囲の期間、それぞれ水性媒体または培養培地中で約1g/lで過塩素酸塩で処理する。その後、動物または細胞を化合物に感作する（それが公知である場合）。
【００４７】
本発明による方法によりスクリーニングできる化合物は極めて多種であり、直接的にまたは間接的に核ホルモン受容体に結合する能力により特徴づけられる。従って、該化合物は、核ホルモン受容体応答エレメント（RE）への結合に関して該核受容体と競合し得るか、または、受容体リガンド、すなわちホルモンと競合し得る。化合物は、甲状腺ホルモン受容体（TR）、エストロゲン受容体（ER）、レチノイン酸受容体（RAR）、グルココルチコイド受容体（GR）、鉱質コルチコイド受容体（MR）、オーファン受容体、またはビタミンD受容体などの、核受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである分子である。「化合物」なる用語は、以下に限定されることなくまたは網羅するわけでないが、医薬的、治療的、薬理的、化学的、環境的、農業的、水生的または美容的汚染物質または化合物、薬物、医薬製品、および天然または合成製品を含む、あらゆる要素、実体、または薬剤を含む。例えば、好ましい態様によれば、該スクリーニングした化合物は、有害な子宮向性効果のない骨保護的効果を有し、したがって、医薬を構成する。
【００４８】
単数または複数のリポーター遺伝子の発現の検出のための技術および手段は当業者に公知である。それらは、網羅的ではないが、ヒト眼、写真フィルム、光電子倍増器、光ダイオード（総説については米国特許第5,571,722号を参照）を含む。検出手段はまた、測定装置および／またはデータを保存し、標準と比較することによりリポーター遺伝子発現レベルを計算し、媒体中の該化合物または環境汚染物質の濃度を計算するコンピューターを含み得る。より一般的には、生物発光を検出する手段は、化合物または環境汚染物質の濃度の関数として、光の強度を測定する。
【００４９】
本発明は、核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を変調する単数または複数の化合物の生物学的作用形態を解析および研究するための、本発明による方法の使用に関する。本発明はまた、核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を刺激する環境汚染物質の用量効果を研究するための、本発明による方法の使用にも関する。
【００５０】
より一般的には、本発明の目的は、特に水中での、環境混入物を検出、解析および／または研究するために、本発明による細胞および／または動物を使用することである。本発明は、水の品質を解析および／または評価するのに特に有用である。
【００５１】
本発明による細胞および／または動物の別の使用は、毒性および／または毒物学、特に美容学、農芸化学、または薬学の研究にある。したがって、本発明は、FETAX研究プロトコルに特に有用である。
【００５２】
本発明によるトランスジェニック細胞および動物はまた、特定の化合物により誘導される細胞死亡率、特定の化合物の催奇形性および腫瘍原性、およびまた特定の化合物のアポトーシス促進特性を検出、研究および測定するのに特に有用である。
【００５３】
本発明はまた、本発明による少なくとも1つの細胞および／または少なくとも1匹の動物、好ましくはオタマジャクシ段階のゼノプスまたはゼブラフィッシュを含むことを特徴とする、特に水中での環境汚染物質および／または核ホルモン受容体応答エレメントにより媒介される転写を変調する単数または複数の化合物を検出するための装置を保護すること、および、選択的に、単数または複数のリポーター遺伝子の発現の検出手段に関する。
【００５４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例を読めばより明瞭に実証される。これらの実施例において、後に図面について言及する。
【００５５】
実施例
1.材料および方法
1.1.クローニングベクター
発現カセットを、基礎ベクターpBluescript II SK（PROMEGA）の、特に制限部位：SacI、SacII、NotI、XbaI、BamHI、SmaI、PstI、EcorI、EcorV、HindIII、SalI、XhoI、ApaI、KpnIを含むマルチクローニングサイトに挿入する。
【００５６】
好ましくは、発現カセットを、SalI 部位に導入する。カセットおよびベクターは、前もってSalIで線形化し、末端を平滑にした。
【００５７】
1.2.核ホルモン受容体応答エレメント
種々のTRE（甲状腺応答エレメント）配列を使用する：
-ラットリンゴ酸酵素TRE（配列番号:1）、
-1コピーの共通TRE（DR4）（配列番号:3、5、6、7、9）、
-3コピーの共通TRE（DR4）×3、4ヌクレオチド離れている。
【００５８】
TREを含む種々のプロモーター配列を使用する：
-ネガティブTREを含むネズミmycプロモーター（Perez-Justeら、2000）（pBS-SK IIの PstI-XhoI 部位におけるクローニング）（配列番号:4）。
-2つのポジティブTRE（配列番号:2および3）を含むゼノプス遺伝子TH／bZIPのプロモーター（FurlowおよびBrown、1999）（配列番号:12；アクセッション番号AF192492（gi 6707362）genbank）（pBS-SK IIの SacI-PstI 部位におけるクローニング）（図1）、
-数個のTREを含むゼノプスストロメライシン3プロモーター（HindIII部位におけるクローニング）。
【００５９】
これらの配列を含むオリゴヌクレオチドを、ベクター pBS-SKII（PROMEGA）、好ましくはXbaIおよびBamHI部位にクローニングする。
【００６０】
1.3.最小プロモーター
単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）遺伝子の170bpの最小プロモーターをPCRにより単離し、その後、TREを含むプロモーター配列を含むpBS-SK IIの BamHI-HindIII部位にクローニングする。
【００６１】
リポーター遺伝子を、TRE-tk配列の下流にクローニングする。
【００６２】
次に、「TRE-tk-リポーター遺伝子」配列をベクターpBS-SK IIから切り出し、その後、その末端を平滑にし、インスレーターを含むベクターにクローニングする。
【００６３】
1.4.リポーター遺伝子
最初に、構築物をEGFPおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いて調製する。
【００６４】
以下の構築物をこのように作成した：
-TRE（リンゴ酸酵素）-TK-EGFP
-TRE（リンゴ酸酵素）-TK-ルシフェラーゼ
-ストロメライシン-3-ルシフェラーゼ。
【００６５】
続いて、融合遺伝子を、EGFPまたはRedFep蛍光タンパク質（CLONTECH）をコードする配列をホタルルシフェラーゼ（PROMEGA）またはウミシイタケルシフェラーゼと合わせることにより作成する。EGFPまたはRedFep  cDNA配列は、KpnIおよびBglII制限部位を含むプライマーを使用してPCRにより増幅する。増幅断片を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む、PROMEGAのpGL2基礎ベクターのこれらの部位にクローニングする。「蛍光タンパク質／ルシフェラーゼ／ポリアデニル化シグナル」配列ブロックは、SmaIおよびSalI酵素での消化によりpGL2基礎ベクターから抽出する。その後、末端は平滑にし、消化断片は、例えばSalI部位などのようにフリーでプロモーターの3'位に位置するベクターpBS-SK IIのマルチクローニングサイトの制限部位の1つに、種々のプロモーターの下流にクローニングする。
【００６６】
融合遺伝子を「空」で前試験する、すなわち、それらをpBS-SK IIのHSV TKプロモーターの下流のBamHI-HindIII部位にクローニングして、プロモーターの応答に影響を及ぼすことができ、したがって、「エンハンサー」配列のように挙動できる潜在的核ホルモン受容体応答エレメントの不在を確認する。
【００６７】
1.5.「インスレーター」配列
ニワトリβ-グロビン遺伝子（配列番号:11；genbankアクセッション番号AY040835（gi:17149284）およびニワトリリゾチーム遺伝子（配列番号:10；アクセッション番号X98408（gi:1403311）の、インスレーター配列を好ましくは使用する。
【００６８】
「インスレーター」配列は、DNAマトリックスとして、ニワトリゲノムDNAまたはそれを含むベクターを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により単離する。使用したプライマー対には、その後のクローニングを容易にするための制限部位が含まれている。したがって、β-グロビン遺伝子の「インスレーター」配列を、5'位ではSacI-BamHI部位に、3'位ではXhoI-KpnI部位でベクターにクローニングする。リゾチーム遺伝子の「インスレーター」配列は、5'位ではBamHI-HindIII部位に、3'位ではXhoI-KpnI部位でベクターにクローニングする。
【００６９】
このようにして単離した「インスレーター」配列は、核ホルモン受容体応答エレメントから選択された転写用の調節配列の制御下のリポーター遺伝子を含む発現カセットのいずれかの側にクローニングする。
【００７０】
最終的な「プロモーター-リポーター遺伝子」配列はpBS-SK IIから抽出し、末端を平滑にし、これらの配列を、インスレーターを含むベクターに組み込む（図2）。
【００７１】
1.6.体細胞トランスジェネシス
体細胞トランスジェネシス（Ouatasら、1998）を使用して、胚トランスジェネシスに使用する前に、構築物の妥当性（図3）およびT3甲状腺ホルモンなどの化合物によるその調節の可能性について確認する。
【００７２】
体細胞トランスジェネシスは、以下のいずれかにより実施する：
-裸DNA  1μlを、胚の背筋に注入することにより。DNA濃度は、0.07M NaCL中で100ng/μl〜5μg/μlである；
-DNA／PEI（ポリエチレンイミン）  1μlを胚の脳にマイクロインジェクトすることによる。DNA濃度は、5％グルコース中で50〜500ng/μlである。
【００７３】
胚1μlのは、Krollおよび Amaya（1996）により記載されたプロトコルに従って実施する。
【００７４】
2.構築物機能性アッセイ法
2.1.培養液中の細胞に対するアッセイ法
トランスジェニック構築物を、培養液中のXTCゼノプス細胞で試験する。
【００７５】
XTC細胞は、変態の直前のゼノプスオタマジャクシの死体から得られる（Pudneyら、1973）。細胞を周囲温度で20継代まで培養する。
【００７６】
細胞を、DNAを6当量の22kDaポリエチレンイミン（PEI）と複合体を形成することによりトランスフェクトする（Ouatasら、1998）。
【００７７】
プロトコルにより構築物を迅速に確認することが可能となり、したがって、細胞培養培地に注入した場合に、T3甲状腺ホルモンなどの物質に正しく応答するかどうかを確認できる。
【００７８】
XTC細胞は、アッセイ法を実施するために、トランスジェニックオタマジャクシから生成する。これらのトランスジェニックXTC細胞は、内分泌攪乱物質の作用を研究するために、核ホルモン受容体の種々のアイソフォームを過剰発現しているベクターを用いてトランスフェクトし得る。
【００７９】
2.2.ストロメライシン3／ルシフェラーゼ構築物を用いてのXTC細胞トランスフェクション
トランスジェニックXTC細胞用の培養培地中におけるT3甲状腺ホルモンの不在下では、基礎レベルのルシフェラーゼリポータータンパク質の発現が観察される。10-8Mの濃度で培養培地にT3甲状腺ホルモンを加えることにより、リポータータンパク質のより高い発現が誘導される（図4）。
【００８０】
3.TRE-tk-ルシフェラーゼを用いてのゼノプスにおける体細胞形質転換
3.1.TRE-tk-ルシフェラーゼ作成物を、ゼノプス胚の背筋に注入した（1mg／動物）。動物の半分を、10-8MのT3甲状腺ホルモンで処理する。4日後、リポーター遺伝子の発現を、処理（10-8MのT3）および非処理（-T3）動物において測定する。10-8Mの濃度で培養培地にT3甲状腺ホルモンを加えることにより、リポータータンパク質のより高い程度での発現が誘導される（図5）。
【００８１】
3.2.代替の方法によれば、本発明によるトランスジェニック動物を、1ヶ月間、1g/lの過塩素酸塩で前処理し、その後、食物を与えずに、18〜48時間、T3ホルモン（10-11M）などの試験化合物で感作する。その後、動物をT3を含まない培地中で洗浄し、36時間餌を与える。構築物（例えばTRE-tk-ルシフェラーゼ）を、ゼノプス胚の背筋に注入する（1mg／動物）。
【００８２】
前処理し、その後、体細胞形質転換にかけた24匹のオタマジャクシの中で、12匹のオタマジャクシを10-8MのT3甲状腺ホルモンで48時間処理し；その他の残りの12匹のオタマジャクシは対照として使用する。10-8Mの濃度でT3甲状腺ホルモンを培養培地に添加することにより、リポータータンパク質のより高い程度での発現が誘導される（図6）。
【００８３】
3.3.TRE-tk-EGFP構築物を、ゼノプス胚の背筋に注入する（1mg／動物）。動物の半分を10nMのT3甲状腺ホルモンで処理する。4日後、リポーター遺伝子の発現を、処理（10nMのT3）および非処理（-T3）動物において検出する。10nMの濃度でT3甲状腺ホルモンを培養培地に添加することにより、リポータータンパク質のはるかに高い程度での発現が誘導される（図7）。
【００８４】
参考文献
2005531303.tif 000003
2005531303.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】TH／bZIP遺伝子のプロモーターを示す図、および、2つの甲状腺ホルモン応答エレメント（TRE）を含むDNA断片をPCRにより単離するためのプライマーの位置を示す図である。410bp増幅産物がアガロースゲル上に可視化されている。
【図２】TRE（甲状腺応答エレメント）を含むプロモーター配列を含む発現カセットを示す図である。
【図３】筋肉（左）および脳（右）の体細胞トランスジェネシスを示す図である。筋肉では、DNAを、裸DNAのマイクロインジェクションにより細胞に導入する。脳では、DNAをポリエチレンイミン（PEI）と複合体を形成させ、その後、脳にマイクロインジェクトする。
【図４】構築物「ルシフェラーゼに結合したゼノプスストロメライシン3プロモーター」の機能性のアッセイを示す図である。構築物は、DNAをPEI（22kDA、6当量）と複合体を形成させることによりXTC細胞に導入し、トランスフェクトした細胞は、T3甲状腺ホルモンの存在下（10-8M）または不在下（-T3）で培養する。
【図５】構築物TRE-tk-ルシフェラーゼを、ゼノプス背筋に注入することによる体細胞トランスジェネシスを示す図である。背筋に、1mg／動物の構築物TRE-tk-ルシフェラーゼを注入することにより動物をトランスフェクトする。その後、動物を、T3甲状腺ホルモンの存在下（10-8M）または不在下（-T3）で処理する。処理の4日後、ルシフェラーゼ発現を測定する。
【図６】構築物TRE-tk-ルシフェラーゼを、前処理したゼノプス動物の背筋に注入することによる体細胞トランスジェネシスを示す図である。動物を、48時間、10-11MのT3甲状腺ホルモンで前処理し、その後、24時間洗浄する。その後、背筋に、1mg／動物の構築物TRE-tk-ルシフェラーゼを注入することにより動物をトランスフェクトする。その後、動物を、48時間（10-8M）または甲状腺ホルモンの不在下（-T3）で処理する。処理の2日後、ルシフェラーゼ発現を測定する。
【図７】構築物TRE-tk-EGFPを、ゼノプスの背筋に注入することによる体細胞トランスジェネシスを示す図である。背筋に、1mg／動物の構築物TRE-tk-EGFPを注入することにより動物をトランスフェクトする。その後、動物を、48時間、T3甲状腺ホルモンの存在下（＋T3 10nM）または不在下（-T3）で処理する。生物発光は、処理動物の細胞では可視である。
【図８】神経系および肢芽の全体を通じての蛍光の放出により、水槽の水中の甲状腺ホルモンの存在（10-8M）に応答する、インスレート遺伝子エレメント（「インスレーター」）を有する構築物DR4（X3）-GFPについてトランスジェニックである、オタマジャクシの腹側図を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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