(57)【要約】  本発明はヒストンのメチル化、特にヒストンH3のリシン９のメチル化に関与することが見いだされたヒトポリペプチドの解析に関する。この残基のメチル化に関するさまざまな方法および手段、およびメチル化の転写活性化に対する効果が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) ESETポリペプチドとヒストンH3ポリペプチドを試験化合物の存在下で接触させ；そして
(b) ヒストンH3ポリペプチドとESETポリペプチドの間の相互作用を測定する
ことを含む、ヒストンH3とESETポリペプチドとの相互作用をモジュレートする化合物の取得方法。
【請求項２】
(a) ESETポリペプチドと試験化合物を接触させ；そして
(b) ESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性を測定する
ことを含む、ESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性をモジュレートする化合物の取得方法。
【請求項３】
ヒストンH3ポリペプチドのリシン９のメチル化を検出することによりヒストンH3メチラーゼ活性を測定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ヒストンH3ポリペプチドを、Lys 9でメチル化されたヒストンH3に特異的に結合する特異的結合メンバーと接触させることによりメチル化を検出する、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ヒストンH3ポリペプチドを、Lys 9でメチル化されていないヒストンH3に特異的に結合する特異的結合メンバーと接触させることによりメチル化を検出する、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
さらに、Lys 9でメチル化されたヒストンH3の生物学的機能を試験することを含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
上記の生物学的機能が転写抑制である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
さらに、Lys 9でメチル化されていないヒストンH3の生物学的機能を試験することを含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
上記の生物学的機能が転写活性化である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性をモジュレートする試験化合物を同定することを含む、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
上記の試験化合物を、単離、精製および/または製造することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
化合物を、その薬理的特性を最適化するために修飾する段階を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
上記の試験化合物を、製薬上許容される添加物（excipient）、賦形剤（vehicle）または担体と共に医薬組成物に製剤化することを含む、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
ESET活性をモジュレートし、請求項１から１０のいずれか１項記載の方法により得られる化合物。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれか１項記載の方法を用いてESETポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を同定し；そして
それにより同定された化合物を製薬上許容される担体と混合する
ことを含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１６】
化合物を、その薬理的特性を最適化するために修飾する段階を含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
i) ESETポリペプチドのアゴニスト/アンタゴニストを同定し；
ii) 同定された化合物を合成し；そして
iii) 上記化合物を医薬組成物に組み入れる
ことを含む、細胞増殖に関連する状態を治療するための医薬組成物の調製方法。
【請求項１８】
(a) ESETポリペプチドをコードする核酸を適当な発現系の中で発現させてポリペプチドを組換えにより製造し；
(b) 組換えにより製造されたポリペプチドを、ヒストンH3のリシン９をメチル化する能力について試験する
ことを含む、ESETポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
ヒストンH3メチラーゼ活性を有するESETポリペプチド断片。
【請求項２０】
ヒトまたは動物の体の治療法に使用するための、ヒストンH3メチラーゼ活性を有するESETポリペプチド。
【請求項２１】
ヒトまたは動物の体の治療法に使用するための、ヒストンH3メチラーゼ活性を有するESETポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２２】
細胞増殖に関連する状態の治療に使用するための医薬品の製造における、請求項１４記載の化合物、請求項２０記載のESETポリペプチドまたは請求項２１記載の核酸の使用。
【請求項２３】
請求項１４記載の化合物、ヒストンH3メチラーゼ活性を有するESETポリペプチドおよびヒストンH3メチラーゼ活性を有するESETポリペプチドをコードする核酸からなる群より選択される１つ以上の薬剤を個体に投与することを含む、細胞増殖に関連する状態の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンのメチル化、特にヒストンH3の特定の残基のメチル化に関与する酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞の核において、DNAは４つのヒストン、H4、H3、H2BおよびH2Aを含むタンパク質複合体であるヒストンコアに包まれている。このDNA-ヒストン構造（ヌクレオソーム）は、遺伝子発現に適合していない。転写に際して転写因子およびRNAポリメラーゼがDNAに接近するためにはヌクレオソームの再構成が必要である。
【０００３】
ヒストンのアミノ末端テールの共有結合による翻訳後修飾は、クロマチンの転写の「オン」または「オフ」状態を調節し、染色体の凝縮および分離に影響を与える。このような修飾にはアセチル化、リン酸化およびメチル化が含まれる。
【０００４】
Suv39H1は、ヒストンH3のリシン９に特異的なメチルトランスフェラーゼである(Reaら、(2000) Nature 406 593-598)。Suv39H1によるリシン９のメチル化は、HP1リプレッサータンパク質のリクルート(Bannisterら、(2001) Nature 410 120-124、Lachnerら、(2001) 410 116-120)および転写サイレント異質染色質の形成を導く。
【０００５】
Suv39H1は、ヒト(Suv39H2)、ショウジョウバエ(su(var)3-9)およびシゾサッカロミセス・ポンベ(S. pombe)(clr4)において同族体を有する。Suv39H1およびその同族体における欠陥は、転写の欠陥および異常有糸分裂および染色体の誤分離と関連がある。
【０００６】
また、Suv39H1タンパク質の発現は、哺乳類細胞の細胞増殖を阻害することも示されており、そのリン酸化状態は、細胞をG1からSに進行するように変化させることが知られている。
【０００７】
酵母Clr4（Suv39H1のS. pombe同族体）は、転写抑制に必須であることが示されているヒストンメチラーゼ活性を有する(Bannisterら、(2001) Nature 410 120-124)。Clr4メチラーゼ活性の欠除は、動原体において異質染色質により抑制された遺伝子を活性化し、染色体の誤分離を引き起こす可能性がある。
【０００８】
Suv39H1メチルトランスフェラーゼ活性は、SETドメインと呼ばれる進化的に保存されたドメイン(ZestおよびTrithoraxの SUV39エンハンサー)に依存する。けれども、SETドメインは、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有さない他のタンパク質にも見いだされる(Reaら、(2000))。ヒトタンパク質データベースには少なくとも73のSETドメインを含むタンパク質が存在し、その多くはヒストンメチルトランスフェラーゼ活性とは関連がない。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の発明者らは、以前に解析されていなかったヒトタンパク質がヒストンH3メチルトランスフェラーゼであることを同定した。このタンパク質は、SETドメインを含み、GenBank登録番号NP_036564の対象であり、本明細書においては、ESETと呼ぶ。
【００１０】
さらに、本発明の発明者らは、このメチルトランスフェラーゼがSuv39H1と同様の活性を有し、ヒストンH3のリシン９を特異的にメチル化することを発見した。
【００１１】
本発明のさまざまな態様は、ESETポリペプチドによるヒストンH3のメチル化をモジュレートし、それにより細胞増殖のモジュレート、たとえば癌のような状態の治療に有用であり得る薬剤のスクリーニング法およびアッセイにおける、ESETポリペプチドおよびヒストンH3ポリペプチドの使用を提供する。
【００１２】
一般的な態様において、本発明は、ヒストンH3のESETポリペプチドとの相互作用および/または結合をモジュレート、たとえば崩壊、干渉、または増加する能力を有する薬剤のアッセイ法を提供する。上記方法は、
(a) ESETポリペプチドとヒストンH3ポリペプチドを接触させ；そして
(b) ヒストンH3ポリペプチドとESETポリペプチドの間の結合および/または相互作用を測定する
ことを含む。
【００１３】
アッセイは、試験化合物が存在しない場合にESETポリペプチドがヒストンH3と相互作用または結合するような条件下で、試験化合物の存在下で実施し得る。
【００１４】
ヒストンH3のESETポリペプチドとの相互作用および/または結合をモジュレートする化合物を同定および/または入手する方法は、
(a) ESETポリペプチドとヒストンH3ポリペプチドを試験化合物の存在下で接触させ；そして
(b) ヒストンH3ポリペプチドおよびESETポリペプチドの間の結合および/または相互作用を測定する
ことを含む。
【００１５】
上記の２つのポリペプチドを、試験化合物を存在させておよび存在させずに接触させ、結合および/または相互作用を測定する。試験化合物が存在する場合に、存在しない場合と比較して結合および/または相互作用が増加または減少することは、試験化合物が相互作用のモジュレーターであることを示している。たとえば、試験化合物が存在する場合に、存在しない場合と比較して結合および/または相互作用が増加することは、試験化合物が相互作用のエンハンサーまたは増強物質であることを示しており、試験化合物が存在する場合に、存在しない場合と比較して結合および/または相互作用が減少することは、試験化合物が結合および/または相互作用の阻害剤であることを示している。
【００１６】
ESETポリペプチドおよびヒストンH3ポリペプチドの間の結合および/または相互作用を安定化させ、ESET活性をアップレギュレートし得る試験化合物は、上記化合物が存在しない場合にはESETポリペプチドがヒストンH3ポリペプチドと結合できない厳しい条件を用いて得られる。
【００１７】
相互作用を崩壊させ、ESET活性をダウンレギュレートする試験化合物は、正常にはESETポリペプチドがヒストンH3ポリペプチドと結合するような条件下で得られる。
【００１８】
当業者は、通常の技術および知識を用いて本発明のアッセイの正確なフォーマットを変更してもよい。たとえば、ポリペプチド間の相互作用は、一方を検出可能な標識で標識して、それを固相支持体上に固定化した他方と接触させることにより、in vitroで研究してもよい。好適な検出可能な標識には35S-メチオニンが含まれ、これを組換えにより作られるペプチドおよびポリペプチドに組み入れることができる。組換えにより作られるペプチドおよびポリペプチドは、抗体により標識することができるエピトープを含む融合タンパク質として発現されてもよい。
【００１９】
組換えタンパク質のN-末端またはC-末端のいずれか一方に６個のヒスチジン残基を組み入れた融合タンパク質を作ることができる。このようなヒスチジンタグは、ニッケルまたはコバルトのいずれかの金属イオンを含む市販のカラム(Clontech, Palo Alto, CA, USA)によるタンパク質の精製に用いることができる。これらのタグは、６個のヒスチジン残基に対する市販のモノクローナル抗体(Clontech, Palo Alto, CA, USA)を用いてタンパク質を検出するために用いることもできる。
【００２０】
固相支持体上に固定化されるタンパク質は、固相支持体に結合するタンパク質に対する抗体を用いて、または他の公知の技術により、固定化することができる。好ましいin vitroの相互作用は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を含む融合タンパク質を利用し得る。これは、グルタチオンアガロースビーズに固定化され得る。上記のタイプのin vitroアッセイフォーマットにおいて、試験化合物は、固定化されたGST-融合ポリペプチドに結合する標識されたペプチドまたはポリペプチドの量を減少させる能力を測定することによりアッセイすることができる。これは、グルタチオン-アガロースビーズをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画することにより測定される。あるいは、ビーズをすすいで未結合のタンパク質を除去し、結合したタンパク質の量を、たとえば、適当なシンチレーションカウンターで存在する標識の量を計数することにより測定することができる。
【００２１】
本発明の方法は、in vivo法の形をとってもよい。in vivo法は、必要なポリペプチドまたはペプチドが細胞内に導入された１以上のベクターから発現される、酵母株のような細胞系中で実施される。
【００２２】
ESETポリペプチドによるヒストンH3のメチル化を阻害、増強、増加または促進するモジュレーターのさまざまな方法および使用は、本発明の別の態様として提供される。
【００２３】
ESETポリペプチドによるヒストンH3のメチル化の崩壊、干渉またはモジュレーションの目的は、上で、および以下に論じる転写のように、上記のメチル化により仲介される転写および増殖のような細胞機能をモジュレートすることである。
【００２４】
ESETポリペプチドの活性をモジュレートする化合物をスクリーニング、同定および/または入手する方法には、適当な反応媒体中で１以上の試験化合物または薬剤をESETポリペプチドと接触させること、処理されたポリペプチドの活性を試験すること、およびその活性を、試験化合物（１つまたはそれ以上）または薬剤により処理されていない同様の反応媒体中のポリペプチドの活性と比較することを含む。処理されたESETポリペプチドと処理されていないESETポリペプチドの間の活性の違いは、問題となっている試験化合物（１つまたはそれ以上）のモジュレート効果を示している。
【００２５】
そこで、別の態様において、本発明は、ESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性をモジュレート、たとえば、崩壊、干渉、増加または促進する能力を有する薬剤のアッセイ法を提供する。上記の方法は、
(a) ESETポリペプチドと試験化合物を接触させ；そして
(b) ESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性を測定する
ことを含む。
【００２６】
ESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性をモジュレートする化合物を同定および/または入手する方法は、
(a) ESETポリペプチドおよび試験化合物を接触させ；そして
(b) ESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性を測定する
ことを含む。
【００２７】
ヒストンH3メチラーゼ活性は、試験化合物を存在させて、および存在させずに測定する。試験化合物が存在しない場合と比較して存在する場合の活性が増加または減少することは、試験化合物が活性のモジュレーターであることを示している。
【００２８】
上記の方法は、アンタゴニスト活性を有する試験化合物が存在しない場合にESETポリペプチドがヒストンH3のリシン９残基をメチル化するような条件下でおこなう。あるいは、上記の方法は、アゴニスト活性を有する試験化合物が存在しない場合にESETポリペプチドがヒストンH3のリシン９残基をメチル化しないような条件下でおこなう。ESETポリペプチドによるヒストンH3ポリペプチドのメチル化は本明細書に記載される方法で測定される。
【００２９】
ヒストンH3のリシン９残基は、ESETポリペプチドによりモノ、ジまたはトリメチル化される。
【００３０】
別の態様において、本発明は、ESETポリペプチドによるヒストンH3のメチル化をモジュレート、たとえば、崩壊、干渉、増加または促進する能力を有する薬剤のアッセイ法を提供する。上記方法は、
(a) 試験化合物の存在下でESETポリペプチドとヒストンH3ポリペプチドを接触させ；そして
(b) ヒストンH3ポリペプチドのメチル化を測定する
ことを含む。
【００３１】
方法は、試験化合物が存在しない場合に、ESETポリペプチドがヒストンH3をメチル化するような条件下でおこなう。
【００３２】
通常、ヒストンH3のリシン９残基のメチル化、たとえば、リシン９残基のモノ、ジまたはトリメチル化を測定する。
【００３３】
ヒストンH3ポリペプチドのメチル化を増加、増強、促進、崩壊、減少、干渉または完全にもしくは部分的に廃止し、それによりESETポリペプチドの活性をモジュレートする試験化合物は、上記のようにして同定および/または入手される。
【００３４】
メチル化は本明細書に記載される公知の方法により測定される。
【００３５】
ESETポリペプチドによるヒストンH3のメチル化を増加または増強する化合物および薬剤は、正の作用をする薬剤が存在しない場合にはメチル化がおこらないような条件を用いて同定される。このような化合物は、ESETポリペプチドの機能を増強するために用いられ、たとえば、転写および/またはDNA複製に効果を有する。
【００３６】
本発明の方法において、ヒストンH3ポリペプチドを、SAM(S-アデノシル-(メチル)-L-メチオニン)のような適当な基質の存在下でESETポリペプチドと接触させる。基質は標識され（たとえば、S-アデノシル-(メチル-14C)-L-メチオニン）、ESETポリペプチドと共にインキュベートした後にヒストンH3上の標識の量を測定する。
【００３７】
試験化合物または本発明の方法に加えられる化合物の量は、通常は使用される化合物のタイプに応じて試行錯誤により決定される。典型的には、阻害剤と推定される化合物は、約0.001nmから1mMまたはそれ以上の濃度、たとえば、0.01nMから100μM、0.1から50μM、たとえば約10μMで用いられる。
【００３８】
本明細書に記載されたアッセイ法に使用される試験化合物、化合物または薬剤は、サンプル、混合物または抽出物、たとえば生体サンプルからなってよい。
【００３９】
方法は、混合物または抽出物からの試験化合物および/または関心のある化合物の精製および/または単離、すなわち、混合物または抽出物の少なくとも１つの成分、たとえば、試験化合物が天然に会合している成分の含有量を減少させることを含む。上記方法は、試験混合物または抽出物の１以上のフラクションの、ESETポリペプチドのメチラーゼ活性をモジュレートする能力の測定を含む。
【００４０】
精製および/または単離は当業者に公知のいかなる方法を用いておこなってもよい。
【００４１】
当業者は、通常の技術および知識を用いて本発明の方法の正確なフォーマットを変更してもよい。当業者は適切な対照実験をおこなうことの必要性を十分に承知している。
【００４２】
本明細書に記載されるアッセイ法を用いてスクリーニングされる化合物は、薬剤スクリーニングプログラムに用いられる天然または合成の化学物質であってよい。いくつかの解析されたまたは解析されていない成分を含む植物、微生物または他の生物体の抽出物もまた使用することができる。
【００４３】
組合せライブラリー技術は、可能性のある非常に多くの異なる化合物を、相互作用をモジュレートする能力について試験する有効な方法を提供する。あらゆる種類の天然産物、小分子、およびとりわけペプチドについて、このようなライブラリ−およびその使用は当業者に公知である。ある状況においてはペプチドライブラリーの使用が好ましい。
【００４４】
ESETポリペプチドによるヒストンH3のメチル化、たとえば、モノ、ジまたはトリメチル化を測定する方法、およびESETポリペプチドによるヒストンH3のメチル化をモジュレートする化合物を入手および/または同定する方法には、相互作用を評価するために適当な終点を用いる方法が含まれる。
【００４５】
適当な終点には、本明細書に記載される方法を用いるヒストンH3のリシン９残基のメチル化の測定が含まれる。
【００４６】
メチル化は、当業者に公知のいかなる従来の方法により測定されてもよい。たとえば、ヒストンH3ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体を、たとえばビーズまたは板に固定化して、残基がメチル化された場合に残基がメチル化されていない場合と異なる親和性でヒストンH3のN末端領域に結合する抗体または他の結合分子を用いて、リシン９残基のメチル化を検出する。いくつかの実施形態において、抗体は、モノ、ジまたはトリメチル化リシン９残基を有するヒストンH3ポリペプチドに特異的である。このような抗体は、本明細書の他の部分で論じられるような標準的な技術により、たとえば、メチル化されたペプチド（ヒストンH3のN末端断片のような）を用いて入手することができる。
【００４７】
ヒストンH3ポリペプチドのメチル化型と非メチル化型を、またはヒストンH3のモノ、ジおよび/またはトリメチル化型と他の形を識別する分子の結合は、適当な標識の存在を測定することを含む、当業者に公知のいかなる技術を用いて評価されてもよい。
【００４８】
メチル化はまた、たとえば、Reaら、(2000), Nature, 406:593-599に記載されるように、溶液中でアッセイすることもできる。簡単に述べると、10μgの遊離のヒストン基質（H1、H2、H3、およびH4の混合物；Boehringer Mannheim）を、メチラーゼ活性緩衝液（50mM Tris.HCl pH8.5、 20mM KCl、10mM MgCl2、10mM β-メルカプトエタノール、250mM スクロース）中で、メチル供与体の300nCiのS-アデノシル-[メチル-14C]-L-メチオニン(25 :Ci ml-1)(Amersham)と混合し、最終体積を50μlにする。10 :gのESETポリペプチド標品を加え、反応液を37℃で60分間インキュベートする。次いで、反応生成物をSDS-PAGEにより分離し、ゲルのフルオログラフィー後に目視する。あるいは、SDS-PAGE後に、分離したタンパク質をニトロセルロース膜にウエスタンブロットした後、乾燥してフィルムに曝す。
【００４９】
メチル化は下記の実施例に記載する方法で測定してもよい。
【００５０】
もちろん、当業者は、試験アッセイで得られた結果を比較する適当な対照実験を設計するであろう。
【００５１】
試験サンプル中のESETポリペプチドの存在の測定、および必要ならば定量の方法は、診断または予後の目的、たとえば、本明細書に論じられた医学的状態（たとえば、癌のような増殖性障害）の診断または予後、またはそのような状態を治療する療法の評価の目的を有していてよい。
【００５２】
本明細書に記載されるESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性およびその細胞増殖の調節における役割を解析することにより、上で開示し、論じたもののような材料および方法を、たとえば個体から得られた試験サンプル中に、異常な、すなわち増加、減少または根絶したESETポリペプチドヒストンH3メチラーゼ活性が存在するかしないかを立証するために使用することが可能になる。このような異常な活性は、細胞増殖に関連する状態に対する個体の素因を診断する目的で、または癌のような細胞増殖に関連する状態に冒されている個体を診断するために、本明細書に記載される方法で測定される。異常なESETポリペプチドヒストンH3メチラーゼ活性の存在は、細胞増殖に関連する状態を有する、または細胞増殖に関連する状態に対する素因を有する、すなわち感受性のより大きい個体の指標となる。
【００５３】
異常な発現は、本明細書に記載される方法で、ESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性を、たとえばメチラーゼ活性が存在するか否か、またはその量について測定することによりタンパク質レベルで検出することができる。あるいは、異常な発現は、異常な活性を有するESETポリペプチドをコードする、または異常な、すなわち根絶、減少または増加したレベルのESETポリペプチドを発現するESET遺伝子の突然変異体、変異体または対立遺伝子の存在を測定することにより核酸レベル（すなわち、DNAまたはRNA）で検出することができる。ESETポリペプチド発現の存在または量は、ポリペプチドをコードするmRNAの存在および/または量を測定することにより測定することができる。
【００５４】
ヒストンH3ポリペプチドは、酵母または哺乳類、たとえばヒトのような真核細胞からの全長のヒストンH3タンパク質であってよい。この用語はまた、リシン９残基を含む断片のような全長のタンパク質配列の断片、たとえば全長のタンパク質のN末端残基を含む断片をも含む。
【００５５】
ESETポリペプチドは、NP_036564 (Version NP_036564.1; GI:6912652; PID: g6912652)の全長のESETタンパク質、または全長のESETタンパク質のメチラーゼ活性の一部または全部を保持するその断片、たとえば全長のESETのSETドメインの一部または全部を含むポリペプチドであってよい。全長のESETのSETドメインはアミノ酸803から1272までであると定義される。
【００５６】
SETドメインは３つの保存されたモチーフ、NHSC、GT(x)5YおよびC-リッチ(C-rich)を含み得る(Rhea S.ら、(2000) Nature 406 593-599)。ESETポリペプチドは、特にこれらのモチーフの１つまたはそれ以上を含み得る。
【００５７】
適当なポリペプチドは、上記のアッセイに用いられる、ヒストンH3および/またはESETの適当な変異体、対立遺伝子または同族体を含む。ヒストンH3の適当な変異体または誘導体は、ESETによりメチル化される生物活性を保持するものである。すなわち、これらは、ESETによるメチル化に適した部位、たとえばリシン９を含む。ESETの適当な変異体または誘導体はヒストンH3メチラーゼ活性を保持するものである。
【００５８】
本明細書に記載されたアミノ酸配列のアミノ酸配列変異体、対立遺伝子、または突然変異体であるポリペプチドは、本明細書に記載されたアミノ酸配列（たとえば、ESETのアミノ酸配列）と約50%より大きい、約60%より大きい、約70%より大きい、約80%より大きい、約90%より大きい、または約95%よりも大きい配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。配列は、本明細書に記載されるアミノ酸配列（たとえば、ESETのアミノ酸配列）と、約70%より大きい類似性、約80%より大きい類似性、約90%より大きい類似性または約95%より大きい類似性を有する。NP_036564のESETタンパク質からの配列の変異は、たとえば、種内の個体の間で異なる多形性対立遺伝子の存在のために、または異なる種からの相同配列の間で保存されない残基の存在のために生じる。
【００５９】
「ESETポリペプチド」という用語は、上記のESET (NP_036564)の変異体、誘導体、対立遺伝子および同族体を包含するものとする。特に、ESETポリペプチドは、70%より大きい、75%より大きい、80%より大きい、85%より大きい、90%より大きい、95%より大きいESETのSETドメインとの配列同一性を有するSETドメインを含み得る。さらに特定的には、ESETポリペプチドは、公知のリシン９メチラーゼ（たとえば、Suv39H1、Suv39H2およびG9A）のSETドメインとESETのSETドメインとの配列同一性よりも大きいレベルの、ESETのSETドメインとの配列同一性を有するSETドメインを含み得る。
【００６０】
アミノ酸類似性および同一性は、一般的にアルゴリズムGAP (Wisconsin Package, Acelerys Ltd, CA)を参照して定義される。GAPは、対になるもの(match)の数を最大にして、ギャップの数を最小にするような２つの完全な配列のアライメントをおこなうためにNeedlemanおよびWunschアルゴリズムを用いる。一般的に、ギャップ発生ペナルティー＝12およびギャップ延長ペナルティー＝４のデフォールトパラメーターを用いる。GAPの使用が好ましいが、他のアルゴリズム、たとえば、BLAST（Altschulら、(1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を用いる）、FASTA（PearsonおよびLipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を用いる）、またはSmith-Watermanアルゴリズム（SmithおよびWaterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197）を、一般的にデフォールトパラメーターを採用して、用いてもよい。
【００６１】
類似性は、「保存的変異」、すなわち、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換、または１つの極性残基の別の極性残基への置換、たとえばリシンをアルギニンに、アスパラギン酸をグルタミン酸に、またはアスパラギンをグルタミンに置換することを許容する。特定のアミノ酸配列変異体は、１アミノ酸、２、３、４、5〜10、10〜20、20〜30、30〜50、50〜100、100〜150、または150以上のアミノ酸の、挿入、付加、置換または欠失により、本明細書に記載される配列と異なる。
【００６２】
配列の比較は、本明細書に記載される関連する配列の全長にわたっておこなってもよい。または、より好ましくは、関連するアミノ酸配列と比較して約20、25、30、33、40、50、67、133、167、200、233、267、300、333、400またはそれ以上多い、連続的な配列にわたっておこなわれる。
【００６３】
ESETポリペプチドのヒストンH3メチル化活性をモジュレートすることができる薬剤を得る方法には、試験化合物が存在する場合および存在しない場合における相互作用を評価するために適当な終点を用いる方法が含まれる。
【００６４】
メチル化アッセイのために、全長のタンパク質、端を切り取ったタンパク質、または他のタンパク質（たとえばGST）との融合体の一部、またはこれらのいずれかの適当な変異体もしくは誘導体であるヒストンH3またはESETポリペプチドを用いる。
【００６５】
ペプチドメチル化アッセイは、メチル化されたヒストンH3の領域を含むペプチドを用いる。
【００６６】
ヒストンH3のメチル化は、下に論じるようなさまざまな方法のいずれを用いてアッセイしてもよく、高処理量スクリーニング法に変えてもよい。
【００６７】
当業者に公知の適当な方法で全長のタンパク質の断片を生成および使用してもよい。断片を生成する適当な方法には、コードするDNAからの断片の組換え発現が含まれるが、これに限定されない。このような断片は、コードするDNAを取り、発現される部分のいずれかの側に適当な制限酵素認識部位を同定し、上記の部分をDNAから切り出すことにより作ることができる。次いで、上記部分を標準的な市販の発現系で適当なプロモーターと操作可能に結合する。別の組換え法は、DNAの関連する部分を適当なPCRプライマーにより増幅するものである。小さな断片（たとえば、約20または30アミノ酸まで）は当業者に公知のペプチド合成法を用いて作ることもできる。
【００６８】
上記のように、全長のESETタンパク質の断片を含む、または断片からなるポリペプチドは、本明細書で定義される「ESETポリペプチド」の用語に包含される。ポリペプチドの断片は全長のポリペプチドよりも少ない残基、たとえば、１以上、２以上、３以上、５以上または10以上少ない残基を有する。
【００６９】
本発明の別の態様は、ヒストンH3メチラーゼ活性を有する本明細書に記載されるESETタンパク質(NP_036564)の断片、および上記の断片をコードする核酸配列を提供する。適当な断片は、好ましくはヒストンH3をリシン９でメチル化するものである。
【００７０】
本発明はまた、たとえば調節要素と機能的に連結された上記の核酸配列を含むベクター、およびこのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００７１】
当業者は、本明細書に記載される技術および当業者に公知の他の技術を用いて、たとえばコードする核酸の発現により、大量のペプチドまたはポリペプチドを製造することができる。ESETポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含むベクターは、ESETポリペプチドの発現に用いるために、上記のような適当な宿主細胞にトランスフォームされる。そこで、本発明の別の態様は、上記のような発現ベクターをトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞を、ESETポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現が可能な条件下で培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含むESETポリペプチドを調製する方法を提供する。ポリペプチドはまた、網状赤血球溶菌液のようなin vitro系で発現することもできる。ESET (NP_036564)のコード配列は、登録番号NM_012432 (Version NM_012432.1; GI: 6912651)で利用可能である。
【００７２】
ESETポリペプチドの製造後に、これをヒストンH3メチルトランスフェラーゼ活性について、たとえば、ポリペプチドをヒストンH3ポリペプチドと共にインキュベートした場合のリシン９のメチル化の測定により、試験する。
【００７３】
そこで、本発明はまた、コードする核酸からのESETポリペプチドの発現、および発現されたESETポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性の測定からなる、ESETポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００７４】
メチルトランスフェラーゼ活性は、ヒストンH3残基リシン９のメチル化、たとえば、リシン９のモノ、ジまたはトリ-メチル化を含む。
【００７５】
本発明のアッセイ法の実施の後、ヒストンH3の適当な残基のメチル化をモジュレートする能力および/またはESETポリペプチドのメチラーゼ活性に対して陽性の結果が出た化合物または分子について、化合物の単離および/または製造および/または使用がおこなわれる。適当な薬剤の同定の後、それについてさらに研究をおこなう。さらに、それを調製物の形で製造および/または使用してもよい。すなわち、医薬品、医薬組成物または薬剤のような組成物を製造または製剤する。これらを個体に投与する。
【００７６】
上記のように、さまざまな態様において、本発明は、本発明の方法により同定および/または入手されるモジュレーター、たとえば、ESETポリペプチドのヒストンH3メチラーゼ活性を阻害または減少、増加または増強する化合物を提供する。
【００７７】
モジュレーターの同定の後、化合物を精製および/またはさらに研究および/または製造してもよい。モジュレーターは、たとえば、当業者に公知の方法および本明細書に記載される方法により、ペプチジルまたは非ペプチジル擬似物を得るために用いられる。これを下で論じるように治療用に用いることができる。
【００７８】
モジュレーターと推定される化合物の１つのクラスは、ESETポリペプチド配列および/またはヒストンH3のようなそれが相互作用するリガンドに由来する。これらのポリペプチドのペプチド断片、または上記断片の対立遺伝子、突然変異体または誘導体は本明細書に記載されている。上記のペプチドをコードする核酸、および上記の核酸を含むベクターおよび宿主細胞、および上記のペプチドをコードする核酸を発現する方法は本発明の別の態様である。
【００７９】
ヒストンH3のメチル化をモジュレートし、それによりクロマチン内でのその機能の１つ以上をモジュレートするのに有用な、本発明の他の薬剤は、ESETポリペプチドのメチラーゼ活性をモジュレートする。このような薬剤は、ESETポリペプチドのヒストンH3の適当な残基をメチル化する能力を特異的に阻害または増強する。このような薬剤のアッセイおよびスクリーニングは、薬剤そのもの、およびそれらのメチル化のモジュレーションおよびそれによるヒストンH3の機能のモジュレーションへの使用と共に、本発明により提供される。
【００８０】
ESETポリペプチドによるヒストンH3のメチル化を阻害または増強することができる薬剤には、メチラーゼの酵素活性部位の触媒特性に影響を与えることのできる化合物が含まれる。メチル化の阻害剤または増強剤は、SETメチラーゼドメイン内でESETポリペプチドと相互作用する可能性がある。このドメイン内の残基が、ヒストンH3との相互作用およびメチル化の触媒に関与している。ドメインの外側の残基もまたヒストンH3との相互作用に関与している可能性があり、そのような相互作用に干渉する薬剤もまた、本明細書の他の部分に記載されるように、メチル化に影響を与える可能性がある。
【００８１】
本発明に有用な薬剤および化合物は、試験を行っている薬剤がESETポリペプチドによるヒストンH3ポリペプチドのメチル化を増加または減少させるかどうかを決定することを含む方法により同定される。
【００８２】
ESETポリペプチドが全長のタンパク質の断片である場合、全長のポリペプチドのメチラーゼ活性を保持しており、ヒストンH3をメチル化することができる断片が適している。
【００８３】
ヒストンH3ポリペプチドが全長のタンパク質の断片である場合、リシン９を含み、ESETポリペプチドによりメチル化されることができる断片が適している。より小さい断片、およびこれらの断片の類似体および変異体も、たとえば、欠失分析またはアラニンスキャニングのような技術を用いて同定して、用いることができる。
【００８４】
そこで、本発明は、好ましくはペプチド断片であって、ヒストンH3のメチル化を阻害または増強することができるESETポリペプチドを提供する。
【００８５】
上記のペプチド断片は、問題となっているタンパク質の欠失分析および/またはアラニンスキャニング - 配列に適当な突然変異を作り、ESETポリペプチドおよびヒストンH3ポリペプチドを突然変異した断片の存在下で混合し、ヒストンH3ポリペプチドのメチル化を測定することにより得られる。好ましい実施形態において、下で論じるようにペプチドは短く、問題となる相手のタンパク質と相互作用し、メチル化を阻害または増強することができる最小の部分である。
【００８６】
ここで、ポリペプチドの「断片」は一般的に、約５個以上の連続的なアミノ酸、通常約７個以上の連続的なアミノ酸、典型的には約９個以上の連続的なアミノ酸、より好ましくは約13個以上の連続的なアミノ酸、および、より好ましくは約20から30個以上の連続的なアミノ酸のアミノ酸残基の伸長を意味する。ESETの断片、またはESETポリペプチドは、アミノ酸配列の部分に対する抗体を作るために有用な抗原決定基またはエピトープを含んでもよい。アラニンスキャニングは通常ポリペプチド内のペプチドモチーフを見いだし、精製するために用いられ、これは、系統的にそれぞれの残基を順にアミノ酸アラニンで置き換えた後に生物活性を評価することからなる。
【００８７】
本発明のこの態様によるペプチドは短い傾向があり、約40以下のアミノ酸の長さ、好ましくは約35以下のアミノ酸の長さ、より好ましくは約30以下のアミノ酸の長さ、より好ましくは約25以下のアミノ酸、より好ましくは約20以下のアミノ酸、より好ましくは約15以下のアミノ酸、より好ましくは約10以下のアミノ酸、または、９、８、７、６、５またはそれ未満の長さである。本発明のペプチドは、約10〜40のアミノ酸の長さ、約5〜10、約10〜15、約10〜20、約10〜30、約20〜30、または約30〜40のアミノ酸の長さである。ヒストンH3断片であるペプチドは一般的にリシン９残基を含む。
【００８８】
本発明はまた、天然型ESETタンパク質配列(NP_036564)の配列変異体または誘導体であるペプチドをも包含する。天然型ESETタンパク質配列の変異体であるペプチドは、ヒストンH3のメチル化をモジュレートする能力を保持している。
【００８９】
ESETポリペプチドまたはヒストンH3ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の付加、挿入、欠失および置換によって、天然型アミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドであってよい。したがって、変異体、誘導体、対立遺伝子、突然変異体および、たとえば、他の生物体（たとえばマウスまたはショウジョウバエ）からの、同族体が含まれる。
【００９０】
好ましくは、アミノ酸配列は本明細書に記載されるESETタンパク質またはヒストンH3ポリペプチドの領域と相同性（すなわち、配列類似性または同一性）を有し、好ましくは少なくとも約60%、または70%、または75%、または80%、または85%、または90%、または95%の相同性を有する。したがって、ESETポリペプチドまたはヒストンH3ポリペプチドのペプチド断片は、天然型配列と比べて１、２、３、４、５、６以上の、または11以上の、置換のようなアミノ酸の変更を含む。
【００９１】
本明細書に特定の配列が開示されているペプチドの誘導体は、ある実施形態において、特定のペプチドと同じ長さであるか、これよりも短い。別の実施形態において、ペプチド配列またはその変異体は、上記のように、ESETタンパク質またはヒストンH3ポリペプチドの付加的部分を含んでも含まなくてもよい、より大きいペプチドに含まれる。ESETタンパク質またはヒストンH3ポリペプチドの問題となっている特定のペプチド断片に隣接する、１、２、３、４または５以上の付加的アミノ酸、またはその異型が、ペプチドの一方または両方の末端に含まれてもよい。
【００９２】
ESETポリペプチドの結合部位に対する抗体は、ESETメチラーゼ活性のモジュレーターと推定されるものの別のクラスを形成する。阻害剤の候補である抗体を解析し、その結合領域を決定して、結合の崩壊に関与する単鎖抗体およびその断片を得ることができる。
【００９３】
抗体は当業界で標準的な技術を用いて得ることができる。抗体を生産する方法は、哺乳類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル）をESETポリペプチドにより免疫することを含む。抗体は当業者に公知のさまざまな技術のいずれかを用いて免疫した動物から入手し、好ましくは興味のある抗原への抗体の結合を用いてスクリーニングされる。たとえば、ウエスタンブロット技術または免疫沈降が用いられる（Armitageら、1992, Nature 357: 80-82）。抗体および/または抗体生産細胞の動物からの単離は動物を殺す段階を含む。
【００９４】
ペプチドによる哺乳類の免疫化の代わりまたは補足として、ESETポリペプチドに特異的な抗体は、たとえば、その表面に機能的免疫グロブリン結合ドメインを有するラムダバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを用いて発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換えにより作られたライブラリーから得ることができる（たとえば、WO92/01047参照）。ライブラリーはいかなるタンパク質（または断片）によっても免疫されていない生物体から得られた配列から構築された実験未使用のものであってよく、または興味ある抗原に曝した生物体から得られた配列を用いて構築されてもよい。
【００９５】
本発明の抗体は多くの方法により修飾されてもよい。実際に、「抗体」の用語は、要求される特異性を有する免疫グロブリン結合ドメインを有するすべての結合化合物を含むものと解釈される。したがって、本発明は、合成分子およびその形が抗体の抗原またはエピトープへの結合を可能にする形によく似ている分子を含む、抗体の断片、誘導体、機能的に同等のものおよび抗体の同族体を包含する。
【００９６】
本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、遺伝子突然変異または他の変化を受けてもよい。さらに、モノクローナル抗体に組換えDNA技術を適用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を作ってもよいことは、当業者に理解されるであろう。このような技術には、免疫グロブリン可変領域、または、異なる免疫グロブリンの、定常部もしくは定常部プラスフレームワーク領域に対する抗体の相補的決定領域(CDR) をコードするDNAの導入が含まれる。たとえば、EP184187A、GB2188638AまたはEP-A-0239400を参照されたい。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP-A-0120694およびEP-A-0125023に記載されている。
【００９７】
望まれる結合特性を有する抗体を生産することができるハイブリドーマは、真核または原核の、抗体（抗体断片を含む）をコードする核酸を含み、その発現が可能な宿主細胞と共に本発明の範囲に含まれる。本発明はまた、抗体が生産され、好ましくは分泌される条件下で、抗体を生産することができる細胞を増殖させることを含む、抗体を生産する方法を提供する。
【００９８】
サンプルに対する抗体の反応性は、いかなる適切な方法により測定されてもよい。個々のレポーター分子による標識は１つの可能な方法である。レポーター分子は直接的または間接的に、検出可能および好ましくは測定可能なシグナルを作り出す。レポーター分子の結合は、直接的または間接的な共有結合、たとえば、ペプチド結合、または非共有結合であってよい。ペプチド結合による結合は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合の組換え発現の結果であってよい。結合を決定する方式は本発明の特徴ではなく、当業者がその好みおよび一般的な知識に従って適当な方式を選択することができる。
【００９９】
抗体はまた、たとえばコードする核酸からの発現によるESETポリペプチドの生産の後に、ESETポリペプチドを精製および/または単離するために用いることができる。抗体は、治療（予防を含んでもよい）に際して、ESETポリペプチドのヒストンH3への結合を崩壊または増大し、メチル化、たとえばリシン９残基のモノ、ジまたはトリメチル化をモジュレート（すなわち、阻害または増強）するのに有用であると考えられる。たとえば、抗体は、細胞、たとえば放射線および/または化学療法を受ける腫瘍部位における細胞にマイクロインジェクトすることができる。抗体は、本明細書の別の部分で論じるような他の治療および治療以外の目的のために本発明に従って用いることができる。
【０１００】
上記のように、薬剤はペプチジル、たとえば、上に記載された配列を含むペプチドであってもよく、またはそのようなペプチドの機能的類似体であってもよい。
【０１０１】
本明細書において、「機能的類似体」という表現は、ESETポリペプチドによるヒストンH3のリシン９残基のメチル化に干渉することのような、問題のペプチドと同じ機能活性を有するペプチド変異体または有機化合物に関する。そのような類似体の例には、接触する領域におけるSETメチラーゼドメインの３次元構造に似せて作られた化学物質、および特に重要なアミノ酸残基の配列法が含まれる。
【０１０２】
別の態様において、本発明は、ESETポリペプチドの活性部位と相互作用し、ESETポリペプチドによるリシン９残基のメチル化をモジュレートすることができるペプチドまたは非ペプチド擬似体を設計する方法における、ヒストンH3のリシン９残基をメチル化することができるESETポリペプチド、特にペプチド断片の使用法を提供する。
【０１０３】
したがって、本発明は、ESETポリペプチドによるリシン９残基のメチル化をモジュレートする生物活性を有する、たとえばヒストンH3アミノ末端断片の擬似体を設計する方法を提供する。上記方法は、
(i) 化合物を分析して、生物活性に不可欠で重要なアミノ酸残基を決定し、ファーマコフォア(pharmacophore)を規定し；そして、
(ii) 上記のようにメチル化をモジュレートする候補の擬似物を設計および/またはスクリーニングするためのファーマコフォアのモデルを作る
ことを含む。
【０１０４】
適当なモデル化技術は当業者に公知である。これには、ESETポリペプチドとヒストンH3の間の結合の研究、およびその結合を再現することができるように配列された相当する官能基を含む化合物の設計が含まれる。
【０１０５】
公知の薬理活性化合物の擬似体の設計は、「リード」化合物に基づく医薬品開発のアプローチとして公知である。これは、活性化合物を合成するのが困難であるか費用がかかる場合、または活性化合物が特定の投与方法に適さない場合に望ましい。たとえば、ESETポリペプチドは、消化管の中でプロテアーゼにより迅速に分解される傾向があるので経口用組成物の活性薬剤としてはあまり適さない。
【０１０６】
ある目的とする特性を有する化合物から擬似体を設計するために通常とられるいくつかの段階がある。第１に、目的とする特性を決定する上で決定的および/または重要な化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合には、これはペプチド中のアミノ酸残基を、たとえばそれぞれの残基を順に置換することにより、系統的に変えることによりおこなうことができる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファーマコフォア」として知られている。
【０１０７】
ファーマコフォアを見いだした後に、ある範囲の分析、たとえば、分光学技術、X-線回折データおよびNMRにより得られたデータを用いて、その物理的特性、たとえば、立体化学、結合、大きさおよび/または電荷によってその構造をモデル化する。コンピューターによる分析、類似性マップ（原子間の結合よりもファーマコフォアの電荷および/または体積をモデル化する）および他の技術をこのモデル化のプロセスに用いることができる。
【０１０８】
上記のアプローチの変形として、リガンドおよびその結合相手の三次元構造をモデル化する。これはリガンドおよび/またはその結合相手が結合に際してコンホメーションを変える場合に特に有用であり、モデルはこれを考慮して擬似物の設計をおこなう。
【０１０９】
ESETメチラーゼ活性に影響を与える能力を有することが見いだされた化合物は、上記のように多くの状況で治療上のおよび他の能力を有する。治療のために、上記の化合物は他の活性な化合物と組み合わせて、たとえば、抗腫瘍治療には放射線療法または化学療法のような別の抗腫瘍化合物または治療法と組み合わせて、用いてもよい。
【０１１０】
１つ以上の１次スクリーニング（細胞を用いない系で）を用いてESETポリペプチドのメチラーゼ活性をモジュレートする能力を有すると同定された薬剤は、さらに１つ以上の２次スクリーニングを用いて評価される。２次スクリーニングは、転写抑制のような、リシン９位でメチル化されたヒストンH3の生物学的機能の試験を含む。あるいは、２次スクリーニングは、転写活性化のような、リシン９位でメチル化されていないヒストンH3の生物学的機能の試験を含む。
【０１１１】
一般的に、本発明のモジュレーターは単離および/または精製された形で、すなわち実質的に純粋な形で提供される。これは、約90%以上、より好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の活性成分を含む組成物を含む。けれども、このような組成物は、不活性な担体物質または他の製薬上および生理的に許容される添加物（excipients）を含んでもよい。下記のように、本発明の組成物は開示されたモジュレーター化合物に加えて、抗腫瘍薬のような、１つ以上の他の治療用の分子を含んでいてもよい。
【０１１２】
本発明はさらに、ESETポリペプチドによるヒストンH3の標的の残基のメチル化を低下または減少または増加または増強させる化合物を患者に投与することを含む治療の方法を提供する。適当な化合物は下で論じる。上記の治療の典型的な目的は本明細書の他の部分で論じる。
【０１１３】
適当な化合物は、たとえば、腫瘍サプッレサー遺伝子においてESETポリペプチドによるヒストンH3のリシン９残基のメチル化を減少させる、または癌遺伝子または腫瘍増強遺伝子においてESETポリペプチドによるヒストンH3のリシン９残基のメチル化を増大させる。
【０１１４】
本発明はさらに、さまざまな治療法および、(i) ヒストンH3をリシン９でメチル化することができるESETポリペプチド；(ii) ヒストンH3をリシン９でメチル化することができるESETポリペプチドをコードする核酸；(iii) 本発明のスクリーニング法により同定された、上記のメチル化を低減または減少（すなわち阻害）または増加または増強（すなわち、促進）することができるモジュレーター；(iv) ヒストンH3またはESETポリペプチドに結合することができる上記のいずれかの化合物の擬似物から選択される１つ以上の化合物の使用法を提供する。
【０１１５】
本発明の態様は、治療の方法、たとえば細胞増殖に関連する状態の治療の方法に使用するための上記の(i)、(ii)、(iii)および(iv)からなる群より選択される化合物、および細胞増殖に関連する状態の治療に使用するための医薬品の製造への上記の(i)、(ii)、(iii)および(iv)からなる群より選択される化合物の使用を提供する。
【０１１６】
上記の方法または使用の治療/予防の目的は、モジュレーション、たとえば残基リシン９におけるヒストンH3のメチル化の阻害または増強であってよい。序論に記載したように、ヒストンH3のリシン９のメチル化は転写活性化の阻害およびクロマチンサイレンシングの促進に関与している。この活性は細胞増殖に直接的な効果を有する。
【０１１７】
したがって、治療/予防の目的は、
(i) たとえば化学療法および/または放射線療法と併用した、癌の治療；
(ii) 癌の予防；
(iii) 本明細書に記載される他の増殖性障害、たとえば、乾癬、白内障、多発性骨髄腫の治療である。
【０１１８】
そこで、さまざまな別の態様において、本発明は、医薬組成物、医薬品、薬剤または上記の目的のための他の組成物；上記の化合物(i)から(iv)の１つ以上を含む組成物；上記の化合物の医学的治療の方法への使用；たとえば医学的状態（たとえば転写制御、DNA複製または細胞周期制御における欠陥または障害に伴う状態）の治療（予防的処理も含む）のために、たとえば再狭窄、乾癬、白内障、多発性骨髄腫および癌、好ましくはすべてのタイプの固形癌および悪性リンパ腫、特に白血病、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌および大脳癌のような細胞増殖に関連する障害または状態の治療のために、上記の化合物を患者に投与することを含む方法；上記の化合物(i)から(iv)の１つ以上の、上記の目的、たとえば、増殖に関連する状態の治療のために投与される組成物、医薬品または薬剤の製造への使用；および上記の化合物を、製薬上許容される添加物、賦形剤（vehicle）または担体、および必要に応じて他の成分と混合することを含む医薬組成物を製造する方法を提供する。
【０１１９】
化合物は、単独の活性成分として、または他の１つ以上の活性化合物と組み合わせて、たとえば、抗腫瘍治療のためには別の抗腫瘍化合物または放射線療法または化学療法のような療法と組み合わせて用いることができる。
【０１２０】
本発明の医学的治療法に用いられる化合物が何であれ、投与は好ましくは「予防上有効な量」または「治療上有効な量」（場合によっては、予防は治療であると見なされるが）でおこなわれる。これは個体に効果が示されるのに十分な量である。投与される実際の量、および投与の速度および時間経過は、治療されるものの性質および程度による。治療の処方、たとえば、投与量の決定等は、医師の裁量の範囲である。
【０１２１】
化合物または組成物は、癌のような治療される状態に応じて、単独で、または他の治療と組み合わせて、同時にもしくは順次のいずれかで、投与される。
【０１２２】
本発明の、および本発明による使用のための医薬組成物には、活性成分のほかに、製薬上許容される添加物、担体、緩衝剤、安定化剤または当業者に公知の他の物質が含まれる。上記のような物質は毒性がなく、活性成分の効力に干渉しないものである。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路に依存する。投与経路は、経口、または注射、たとえば、皮膚、皮下または静脈注射であってよい。
【０１２３】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形であってよい。錠剤はゼラチンのような固体の担体またはアジュバントを含んでよい。液体の医薬組成物は一般的に、水、石油、動物性油または植物油、鉱油または合成油のような液体の担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他のサッカリド溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールを含んでもよい。
【０１２４】
静脈内、皮膚または皮下注射、または病気の部位への注射のためには、活性成分を、発熱物質を含まず、適当なpH、等張性および安定性を有する非経口で許容される水溶液の形にする。当業者は、たとえば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液のような等張の媒体を用いて適した溶液を調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および/または他の添加剤（additives）を含んでもよい。
【０１２５】
リポソーム、特にカチオン性リポソームを製剤の担体として用いることができる。
【０１２６】
上記の技術およびプロトコールの例は、「Remingtonの薬学」(Remington’s Pharmaceutical Sciences)、第16版、Osol, A.編、1980に記載されている。
【０１２７】
化合物または組成物は、腫瘍の部位または他の所望の部位に局所的な方法で投与されてもよいし、腫瘍または他の細胞を標的とする方法で送達されてもよい。
【０１２８】
ターゲッティング療法は、抗体または細胞特異的リガンドのようなターゲッティングシステムを用いることにより、活性化合物をあるタイプの細胞に、より特定的に送達するために用いられる。ターゲッティングは、たとえば、薬剤の毒性が許容できないほど強い場合、または他の方法では非常に高い投与量を必要とする場合、または他の方法では標的の細胞に入ることができない場合のようなさまざまな理由から望ましい。
【０１２９】
上記の化合物を直接投与する代わりに、細胞に導入されたこれらをコードする核酸から、たとえばウイルスベクターから発現することにより標的細胞の中でこれを生産してもよい。上記ベクターは治療される特定の細胞を標的とする。あるいはベクターは、標的細胞により、より大きいまたは小さい選択性をスイッチされる調節因子を含んでもよい。
【０１３０】
このように、化合物、たとえば、ヒストンH3のリシン９残基のメチル化をモジュレート（たとえば阻害または増強）することができるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子療法の方法、たとえば、障害を（完全にまたは部分的に）予防または治療する目的の個体の治療に用いることができる。
【０１３１】
ウイルスベクターのようなベクターは、先行技術において、さまざまな異なる標的細胞中に核酸を導入するために用いられてきた。典型的には、ベクターは、望まれるペプチドの発現から有用な治療または予防効果を得るのに十分な割合の細胞においてトランスフェクションがおこるように、標的細胞に曝される。トランスフェクトされた核酸は、それぞれの標的細胞のゲノム中に恒久的に組み込まれて、長時間続く効果を与える場合、および、治療を周期的に繰り返す必要がある場合がある。
【０１３２】
ウイルスベクターおよびプラスミドベクターの両方のさまざまなベクターが当業者に公知である。米国特許第5,252,479号およびWO93/07282を参照されたい。特に、SV40のようなパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、HSVおよびEBVを含むヘルペスウイルスおよびレトロウイルスを含む、多くのウイルスが遺伝子転移ベクターとして使用されてきた。先行技術の多くの遺伝子療法プロトコールでは、能力を奪われたマウスレトロウイルスを用いる。
【０１３３】
遺伝子療法においてウイルスベクターの使用に代わるものとして、細胞内に核酸を導入する他の公知の方法には、マイクロインジェクション、リポソームにより仲介される転位および受容体仲介DNA転位のような機械的技術が含まれる。
【０１３４】
受容体仲介遺伝子転移は、特定の細胞への核酸の特異的ターゲッティングの技術の一例である。ここでは核酸はポリリシンを介してタンパク質リガンドに結合しており、上記リガンドは標的細胞の表面に存在する受容体に特異的である。
【０１３５】
ESETポリペプチドによるヒストンH3のリシン９残基のメチル化をモジュレートする能力を有するペプチドまたは他の化合物、またはそのような能力を有するペプチドをコードする核酸分子は、キット、たとえば、内容物を外部の環境から保護する適当な容器に密封されたキットとして提供されてもよい。このようなキットには使用説明書を付けてもよい。
【０１３６】
さらに別の態様において、本発明はESETポリペプチドの精製法、またはヒストンH3ポリペプチドの精製法を提供する。本発明はまた、精製されたESETポリペプチドを提供する。精製されたポリペプチドは、約10%純粋、より好ましくは約20%純粋、より好ましくは約30%純粋、より好ましくは約40%純粋、より好ましくは約50%純粋、より好ましくは約60%純粋、より好ましくは約70%純粋、より好ましくは約80%純粋、より好ましくは約90%純粋、より好ましくは約95%純粋、または実質的に純粋である。
【０１３７】
別の態様において、本発明はESETポリペプチドをヒストンH3ポリペプチドと接触させることを含む、ESETポリペプチドを精製する方法を提供する。
【０１３８】
ESETポリペプチドを含む物質の混合物を、固定化されたヒストンH3ポリペプチド（たとえば、ストレプタビジンまたはビオチンのような特異的結合分子を介するもののような、共有結合または非共有結合のいずれかにより固定化された）に接触させ、ヒストンH3ポリペプチドに結合しない分子を洗い流す。
【０１３９】
精製の後、ESETポリペプチドを所望の通りに、たとえば、その活性をモジュレートする薬剤のアッセイに、たとえば特異的抗体または他の結合分子を生成または入手する際の結合に、または治療に際して使用することができる。
【０１４０】
本発明のさまざまな他の態様および実施形態は、本明細書の開示を参照すれば、当業者には明白であろう。
【０１４１】
本発明のある態様および実施形態を、実施例として、下記の図面を参照して説明する。
【実施例】
【０１４２】
材料および方法
ヒトESETタンパク質の免疫沈降
ヒトESETを、N-末端にインフルエンザウイルスのHAエピトープのタグを付けて標識した。ESET発現プラスミドのリン酸カルシウムトランスフェクションの後に、タンパク質をヒト293T細胞に発現させた。1:1000希釈の抗-HA抗体(MAP、マウス、Roche 12CA5)を用いたウエスタンブロットにより、予想された大きさのタグ付きタンパク質を、総抽出物中に検出した。HA-ESETを発現する細胞をIPH緩衝液(50mM Tris. Cl pH8.0、150mM NaCl、5mM EDTA、0.5% (v/v) NP-40)中で溶解し、３μgの抗-HA抗体を加えた。アガロースに結合したタンパク質Aの50%スラリーを15μl加えて、反応液を4℃で一晩ゆっくりと回転させた。翌日に免疫複合体を遠心分離にかけてペレットにした。次にペレットを1mlのIPH緩衝液で４回洗浄した。
【０１４３】
メチルトランスフェラーゼアッセイ
子ウシ胸腺からの可溶性ヒストンの混合物(H2A、H2B、H3およびH4)、Sigma；または組換えアフリカツメガエルH3を用いて酵素アッセイをおこなった。それぞれの反応に、60μgの子ウシヒストンまたは20μgの組換えH3を用いた。以下の混合物を調製した。
【０１４４】
1) 10μgのビーズに付けた免疫沈降したESET  ＋  30μlのメチル化緩衝液  ＋  ２μlの14C-SAM (NEC-363アデノシル-L-メチオニン、S-(メチル-14C)。
【０１４５】
2) 10μlのビーズに付けた免疫沈降したESET  ＋  30μlのメチル化緩衝液  ＋  ３μlの可溶性ヒストン(10μg)  ＋  ２μlの14C-SAM (NEC-363アデノシル-L-メチオニン、S-(メチル-14C)。
【０１４６】
3) 10μgのビーズに付けた免疫沈降したESET  ＋  30μlのメチル化緩衝液  ＋  4μlの組換えxH3 (10μg)  ＋  ２μlの14C-SAM (NEC-363アデノシル-L-メチオニン、S-(メチル-14C)。
【０１４７】
4) 10μlのIgGセファロースビーズ（あらかじめメチル化緩衝液中で平衡化したもの）  ＋  30μlのメチル化緩衝液  ＋  ３μlの可溶性ヒストン(10μg)  ＋  ２μlの14C-SAM (NEC-363アデノシル-L-メチオニン、S-(メチル-14C)。
【０１４８】
5) 10μlのIgGセファロースビーズ（あらかじめメチル化緩衝液中で平衡化したもの）  ＋  30μlのメチル化緩衝液  ＋  ４μlの組換えxH3 (20μg)  ＋  ２μlの14C-SAM (NEC-363アデノシル-L-メチオニン、S-(メチル-14C)。
【０１４９】
メチル化緩衝液：50mM Tris-HCl pH8.5; 75mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、0.5% NP-40。
【０１５０】
マイクロフュージチューブを30℃で２時間振とうしながらインキュベートした。その後、それぞれの反応液に15μlの４x（タンパク質サンプル緩衝液）を加えた（それぞれの反応の液体の総容積は約45μlであった）。サンプルを３分間煮沸した。ヒストンを1.5mmの20%アクリルアミドゲル中、200Vの電圧を１時間15分かけて分離し、標準的な方法によりニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を、−80℃で36から48時間、Biomax Transcreen-LE増感紙を用いてKodak Biomax MSフィルムに曝した。
【０１５１】
ヒストンH3内のメチル化部位のマッピング
ヒストンH3を、本明細書に記載された方法を用いて免疫沈降したESETにより14C-メチル基でメチル化した。次に、Rein D.およびSpeicher D. Current Protocols in Protein Science (1997) 11.10.01-11.10.38に記載されるN末端配列分析を用いて、メチル化された残基を同定した。
【０１５２】
簡単に述べると、染色されたタンパク質バンドをPVDF膜から切り取り、bothソニケーター中で音波処理して、Hewlett-Packard G 100SA型配列決定システムを用いて配列決定した。配列決定は、取り扱い説明書に従っておこない、それぞれの配列決定サイクルからのPTH（フェニルチオヒダントイン）アミノ酸をシステムにつなげたHPLCにより分離して配列データを得た。
【０１５３】
結果
ヒトESETはヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMT)である
抗HA抗体免疫沈降により、 HAタグ付きESETをヒト293T細胞から精製した。ウエスタンブロットにより、免疫沈降物中に全長のHA-ESETに相当する強いバンドが現れた。
【０１５４】
免疫沈降したHA-ESETを、(14C-Me) S-アデノシルメチオニンの存在下で、10:gの子ウシ胸腺可溶性ヒストン(H2A、H2B、H3およびH4)の混合物または10:gの組換えアフリカツメガエルヒストンH3に対するメチルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。48時間の露出の後オートラジオグラムを現像した。
【０１５５】
子ウシまたは組換えヒストンが存在しない場合には、HA-ESETに関してメチル化は観察されなかった。
【０１５６】
HA-ESETが組換えアフリカツメガエルヒストンH3をメチル化することが観察された。ヒストンH2A、H2B、H3およびH4の標品を用いた場合、HA-ESETはヒストンH3を特異的にメチル化することが観察された。
【０１５７】
ESETのメチルトランスフェラーゼ活性はヒストンH3のリシン９に特異的である
それぞれのアッセイにおいて、10μgの組換えアフリカツメガエルH3ヒストンおよび免疫沈降したHA-ESETを(14C-Me) S-アデノシルメチオニンの存在下でインキュベートした。14C標識の存在を示すオートラジオグラムを48時間後に現像した。ゲル上の基質の存在をポンソー染色により確認した。
【０１５８】
ヒストンH3基質が存在しない場合にはメチル化は観察されなかった。
【０１５９】
HA-ESETが全長のアフリカツメガエルヒストンH3をメチル化することが観察された。
【０１６０】
H3アミノ末端内のメチル化部位のマッピング
上記のように免疫沈降されたESETにより14C-メチル基で標識されたアフリカツメガエルH3ヒストンを、順次エドマン分解をおこなうことにより配列決定し、それぞれのアミノ酸サイクルに相当する分画を収集して、シンチレーション計数により計数した。結果を図２に示す。アフリカツメガエルヒストンH3のN末端配列を相当する分画の下に示す。
【０１６１】
これらの結果はヒストンH3のリシン９残基がESETにより特異的にメチル化されることを示している。リシン４のメチル化は観察されなかった。
【０１６２】
したがって、ESETによるヒストンH3のメチル化は、転写活性の調節および細胞増殖の制御に重要な役割を果たしている可能性がある。したがって、ESETのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性の操作を、癌のような細胞増殖に関連する状態の治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】ESETのメチルトランスフェラーゼ活性は、ESETのSETドメインで突然変異した点突然変異体(C1226A)には存在しないことを示す。
【０１６４】
A:全長のヒトHAタグ付きESETおよびHAタグ付きESET点突然変異体(C1226A)を、抗HA抗体を用いてトランスフェクトされた293T細胞から免疫沈降した。次に、免疫沈降物を、14C放射線標識SAMおよび反応緩衝液(50mM Tris pH8.5、75mM NaCl、0.5% NP40、1mM DTT、5mM MgCl)を用いた標準的なヒストンメチルトランスフェラーゼアッセイに用いた。ESETはヒストンH3を特異的にメチル化し、点突然変異体は不活性である。
【０１６５】
B: 突然変異体および野生型ESETの両方の発現を示す293T抽出物のHAウエスタンブロットを示す。
【図２】ESETがヒストンH3のリシン９を特異的にメチル化することを示す。
【０１６６】
免疫沈降したESETを用いるメチル化反応を、図１のように3H標識SAMを用いて実施した。次にH3ヒストンをN-末端エドマン分解し、それぞれのアミノ酸分画を収集した。アミノ酸分画をシンチレーション分析した。図２に示した結果は、ESETがリシン９を特異的にメチル化することを示している。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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