(57)【要約】本発明はレプチン受容体とエネルギードナータンパク質から成る融合タンパク質およびレプチン受容体とエネルギーアクセプタータンパク質から成る融合タンパク質間におけるエネルギー転移を測定することによるレプチン受容体リガンドを検出する方法に関するものである。本発明は更に該方法において利用されている融合タンパク質にも関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
短い細胞内ドメインを有するレプチン受容体、又はレプチン−結合部位を含んでいるそのような受容体の可溶性型、又はそのようなレプチン受容体の実質的な部分、及びエネルギードナー又はエネルギーアクセプタータンパク質、又はエネルギードナー又はエネルギーアクセプタータンパク質の実質的でかつ活性な部分から成ることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
レプチン受容体が短鎖のアイソフォームであることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
レプチン受容体がＢｏｘ１細胞内ドメインを含むが、Ｂｏｘ３細胞内ドメインを含まないアイソフォームであることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
レプチン受容体がＯＢＲｓアイソフォームであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
レプチン受容体が配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のヒトＯＢＲｓアイソフォーム、又は配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２と少なくとも６５％の同一性を示す受容体のバリアントであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
レプチン受容体の配列が配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２のヒトＯＢＲｓアイソフォームのアミノ酸４６〜８６６の配列、又は少なくとも６５％の同一性を示す該配列のバリアントであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
レプチン受容体が配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４を有するか、又は少なくとも６５％の同一性を示す該配列のバリアントであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
タンパク質がルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
タンパク質がＧＦＰ又は該タンパク質の突然変異体、又はＤｓＲｅｄであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＧＦＰ突然変異体がＹＦＰ、ＥＹＦＰ、野生型ＧＦＰ、ＧＦＰＳ６５Ｔ、又はＴｏｐａｚであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６、又は少なくとも６５％の同一性を示す該配列のバリアントを含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８、又は少なくとも６５％の同一性を示す該配列のバリアントを含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載したタンパク質の１つをコードする核酸。
【請求項１４】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５を含んでいることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７を含んでいることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の配列と少なくとも６５％の同一性を示す核酸。
【請求項１７】
請求項１４又は１５に記載の配列と高いストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質を発現する細胞。
【請求項２０】
請求項１８又は１９に記載の細胞の断片。
【請求項２１】
請求項１８又は１９に記載の細胞の溶解物。
【請求項２２】
請求項１８又は１９に記載の細胞の膜。
【請求項２３】
請求項１８又は１９に記載の細胞及びサポニンを含んでいる組成物。
【請求項２４】
以下の工程：
−  請求項１〜１２のいずれか１項に記載したエネルギードナー融合タンパク質、及び請求項１〜１２のいずれか１項に記載したエネルギーアクセプター融合タンパク質又はこのようなタンパク質を含んでいる細胞、或いはそのような細胞の断片、溶解物又は膜、及び場合によっては、適当な酵素基質を有する系に、テスト化合物を接触させること、並びに
−  エネルギー転移を測定すること
より成る、レプチン受容体に対する化合物の結合を測定する方法。
【請求項２５】
エネルギードナー融合タンパク質が、レプチン受容体又はレプチン受容体の実質的な部分及びルシフェラーゼ又はルシフェラーゼの実質的な部分とを融合させたタンパク質であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
サポニンで処理した細胞を使用することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
エネルギーアクセプター融合タンパク質が、レプチン受容体又はレプチン受容体の実質的な部分及びＹＦＰ又はＹＦＰの実質的な部分とを融合させたタンパク質であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
基質がセレンテラジンであることを特徴とする、請求項２４に記載した方法。
【請求項２９】
テスト化合物の存在下で測定したエネルギー転移をテスト化合物のない状態で測定したものと比較することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
−  請求項１〜１２のいずれか１項に記載したエネルギードナー融合タンパク質及び請求項１〜１２のいずれか１項に記載したエネルギーアクセプター融合タンパク質、又はこのようなタンパク質を含む細胞、或いはそのような細胞の断片、溶解物又は膜、及び場合によっては適当な酵素基質を有する系に、テスト化合物を接触させること、並びに
−  エネルギー転移を測定すること
から成る、レプチンの関与する病理学的状態の予防及び／又は治療を目的とする化合物のスクリーニング又は探索の方法。
【請求項３１】
−  請求項１〜１２のいずれか１項に記載したエネルギードナー融合タンパク質、及び
請求項１〜１２のいずれか１項に記載したエネルギーアクセプター融合タンパク質、又はこのようなタンパク質を含む細胞、或いはそのような細胞の断片、溶解物、又は膜、及び場合によっては、適当な酵素基質を有する系に、アゴニスト又はアンタゴニスト候補化合物を接触させること、並びに
−  エネルギー転移を測定すること
から成る、レプチン受容体のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングする方法。
【請求項３２】
−  請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエネルギードナー融合タンパク質及び請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエネルギーアクセプター融合タンパク質、又はこのようなタンパク質を含む細胞、或いはそのような細胞の断片、溶解物又は膜、及び場合によっては適当な酵素基質を有する系にテスト化合物を接触させること、並びに
−  エネルギー転移を測定すること
から成る方法を用いて選択される化合物のレプチン又はレプチン受容体が関与する病気の治療又は予防処置の医薬品の製造のための使用。
【請求項３３】
＋  請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエネルギードナー融合タンパク質及び請求項１〜１２のいずれか１項に記載のエネルギーアクセプター融合タンパク質、又はこのようなタンパク質を含む細胞、或いはそのような細胞の断片、溶解物又は膜、及び場合によっては適当な酵素基質を有する系にテスト化合物を接触させること、及び
＋  エネルギー転移を測定すること
から成る方法を用いて化合物を選択し、そして
その化合物を病気に患っている患者に投薬する
工程から成る、レプチン又はレプチン受容体の関与する病気の治療又は予防処置のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レプチン受容体(leptin receptor)とエネルギードナー(energy-donor)又は
エネルギーアクセプター(energy-acceptor)から構成される融合タンパク質間のエネルギ
ー転移を用いるレプチン受容体リガンドの検出方法に関するものである。
本発明は、また、この方法を実施するための融合タンパク質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
レプチンは、脂肪細胞から分泌される分子量１６ｋＤａのタンパク質である。このタンパク質は、満腹感に関与するものであり、体重調節、エネルギー消費、骨形成及び血管新生において重要な役割を演ずるものであるが、しかしながら、思春期の誘発や生殖の調節或いはＴリンパ球介在免疫応答の制御のような他の生理的作用においても重要な役割を演じている。
【０００３】
レプチン受容体（ＯＢＲ）は、サイトカイン受容体のファミリーに属するものである。
図１に図解されているように、レプチン受容体は、１個の膜貫通ドメインを含む一重のポリペプチド鎖から構成されている（Tartaglia et al., J. Biol. Chem., 272, 6093-6096, 1995）。特許出願ＷＯ ９７／１９９５２はこの受容体に関するものである。
【０００４】
異なる長さのＣ−末端ドメインを有する６種類の異なったＯＢＲのアイソフォームが記載されている。これら全てのアイソフォームは単一の遺伝子に由来し、選択的スプライシングにより生成されたものである。レプチン結合部位を含んでいるＯＢＲの可溶性型のものがあり、それは膜結合型の細胞外ドメインに対応するものである。この可溶性型は、膜結合型から、形質膜における翻訳後のタンパク質分解によって生じたものであり、血液中に見られるものである。他のＯＢＲの可溶性型も知られているが、それは膜貫通ドメイン前方に終結コドンを生じた突然変異によるものであるが、極めて希なケースである。
【０００５】
ＥＧＦＰ（増幅した緑色蛍光タンパク質）に融合させたレプチン受容体（ＯＢＲｌ）の長鎖型から成る融合タンパク質は、当該受容体の位置を調べるためにＬｕｎｄｉｎ等により用いられている（Biochemica and Biophysica Acta, 1499, 130-138, 2000）。
【０００６】
ＯＢＲの活性化は、２個のｊａｎｕｓキナーゼ２（ＪＡＫ２）及び２個のＯＢＲから成る四量体を経由して起こるものと思われている。受容体のレプチン誘導活性化がＯＢＲの立体配置に変化を誘導し、それがＪＡＫ２を活性化し、それに続いて他のＪＡＫ２、そしてそれからＯＢＲ受容体へとリン酸基転移を起こすものと考えられている。
【０００７】
ＯＢＲの活性化は、体重減少のようなレプチンの既知の効果の全て及び体重障害に関係する全ての現象の原因となっているものと思われる。
骨形成に関するレプチンの阻害的特性は、最近になって実証されてきている。レプチンは、骨形成を担う細胞集団である、骨芽細胞の活性を阻害する。
【０００８】
レプチン血症（Leptinemia）の改善は、例えば骨粗鬆症のような骨密度の減少に関連する病気、又は逆に多量のカルシウム沈着に関連する病気を治療することを可能とするかも知れない。１９９９年、Ｘｕ等は、生細胞におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法を記載している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 151-156）。この方法は、また特許出願ＷＯ／６６３２４の題目でもある。
【０００９】
ＢＲＥＴ（バイオルミネッセンス共鳴エネルギー転移）と呼ばれているこの方法は、海
洋生物による蛍光放射という自然現象に基礎付けられたものである。ウミシイタケレニラ（Renilla）ルシフェラーゼ（Luc）による酵素的形質転換により、膜を貫通することができる基質が、バイオルミネッセンスを発生し、それが黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のようなエネルギーアクセプターを励起する。この方法は、Ｗａｎｇ等によって記載された（ルミネッセンス共鳴エネルギー転移のための）ＬＲＥＴ法に対応するものである（Mol. Gen. Genet. 264: 578-587, 2001）。
【００１０】
エネルギー転移の効率は、アクセプターとドナーの物理的近接度及びそれぞれの方向性に依存している。このように、ルシフェラーゼとＹＦＰとの共役発現はエネルギー転移を生じさせるには十分ではないが、それは２つの共役体が１００オングストロームよりも近接していることが要求されるからである。この２つの可能性のある相互作用の共役体間における相互作用を調べるために、第一のタンパク質をルシフェラーゼに、そして第二のタンパク質をＹＦＰに融合させた。もしこの２つのタンパク質が相互作用するならば、エネルギー転移を観察することができる。
【００１１】
それ以降、レプチン受容体とは極端に異なる構造を有する幾つかの受容体にＢＲＥＴ法が使用されている。このように、或る著者は、アドレナリンβ−２受容体（Angers et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10, 1073）、コレシストシンＡ型受容体（CCK; Cheng et al., 2001, Biol. Chem. 276: 48040-48047）、及び甲状腺刺激ホルモン放出ホ
ルモン受容体（Kroeger et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 12736-12743）のようなＧ
タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーの受容体についての当該方法の使用について記載している。
これらの受容体は、サイズとしては大きく、７回膜貫通ドメインを含む複合体構造を有している。
【００１２】
最後に、Ｂｏｕｔｅ等は、ＢＲＥＴを用いたインスリン受容体の活性化について以下のように記載している（2001, Mol. Pharmacol. 60: 640-645）。
インスリン受容体は共有結合による二量体から構成されていて、レプチン受容体のような非共有結合による複合体ではない。加えて、それは可成り長い細胞内構成部分を含んでいる。最後に、著者は、インスリンによって誘導されたＢＲＥＴにおける変化は、可溶化された受容体上においてのみ起こることを示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ここ数１０年来、肥満症は工業化諸国においては重要な公衆衛生問題となってきていて、今日では、人口の２０から３０％にも影響を与えている。この数値はここ数年の内に驚くほどに増大するに違いない。
その多要素からなる原因により、その程度が大きいにしろ小さいにしろ、先ず第一には環境要因（食事行動、食料品の入手、エネルギー消費等）、そして第二には多様な遺伝的要素により、肥満病は医薬品にとって真の挑戦となるものである。
【００１４】
同様に、骨粗鬆症のような骨の病気も人口の大きな割合を占めるようになりつつある。
肥満症や骨粗鬆症のようなレプチン受容体の関与する種々の病気の治療に用いられる新規な化合物の発見は、それ故に、公衆衛生にとって高い関心事となっている。
【００１５】
しかしながら、高い処理率で用いることができるレプチン受容体のアゴニスト又はアンタゴニストの選択的スクリーニング方法は未だ存在しない。
そこで出願人は、レプチン受容体のアゴニスト又はアンタゴニストの迅速で、選択的で、かつ効率的なスクリーニングテストを種々試みた。
【００１６】
驚くべきことに、レプチンによって誘導されたＢＲＥＴにおける変化はレプチン受容体の１つのアイソフォームに用いることができるが、しかしながら、全てのアイソフォームに対して実施できるものではないことが解明された。
また、レプチン受容体上でのＢＲＥＴの実施は、ある操作条件下において最適となるということも示された。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
それ故、本発明は、レプチン受容体又はレプチン受容体の実質的な部分及びエネルギードナータンパク質又はエネルギードナータンパク質の実質的でかつ活性な部分から構成される第一融合タンパク質と、レプチン受容体又はレプチン受容体の実質的な部分及びエネルギーアクセプタータンパク質又はエネルギーアクセプタータンパク質の実質的でかつ活性な部分から構成される第二融合タンパク質との間における共鳴エネルギー転移を用いたレプチン受容体リガンドの検出方法に関するものである。
【００１８】
本発明は、また、この方法を実施するための融合タンパク質、及びこれらのタンパク質をコードする核酸にも関係するものである。
本発明は、また、レプチン関与の病気に患っている患者に対し、上記に定義した方法を用いて選択されたリガンドを投薬することによるレプチン関与の病気の治療又は予防の処置の方法をも対象とするものである。
それ故、本発明の最初の課題は、レプチン受容体、又はレプチン受容体の実質的な部分、及びエネルギーアクセプター又はドナータンパク質、又はエネルギーアクセプター又はドナータンパク質の実質的でかつ活性な部分、それぞれから構成される融合タンパク質である。
【００１９】
本発明に係る融合タンパク質は、実質的には、レプチン受容体の全体又は部分的配列に対応する部分、及びエネルギードナー又はアクセプタータンパク質に対応する部分から構成されるものである。しかしながら、それらは、シグナル配列のような他のタンパク質由来のアミノ酸配列をも含むことができる。
このように、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２配列及び他の配列、特にマウスインターロイキン３のシグナル配列から構成されている。
【００２０】
有利には、エネルギードナータンパク質はレニラ（Renilla）ルシフェラーゼである。
しかしながら、いかなる他のエネルギードナータンパク質であっても、ドナーの放射スペクトルがアクセプターの励起スペクトルと十分に重なり合って、両者間に効率的なエネルギー転移が許容されるものである限り用いることができる。それ故、エネルギー転移がＦＲＥＴの場合はＧＦＰ、或いは、エネルギー転移がＣＲＥＴの場合は、イクオリン(aequorin)が用いられる。イクオリンは特許出願ＥＰ ０ １８７ ５１９又はＩｎｏｕｙｅ等の文献（PNAS USA 82: 3154-3158, 1985）の記載のように入手し使用することができる。
【００２１】
エネルギーアクセプター蛍光タンパク質としては、好ましくは、ＤｓＲｅｄ、又はＧＦＰ或いはこのタンパク質の突然変異体であるＹＦＰ、ＥＹＦＰ、野生型ＧＦＰ、ＧＦＰＳ６５Ｔ又はＴｏｐａｚが挙げられる。
しかしながら、いかなる他のエネルギーアクセプター蛍光タンパク質であっても、アクセプターの励起スペクトルがドナーの放射スペクトルが十分に重なり合って、両者間に効率的なエネルギー転移が許容されるものである限り用いることができる。
【００２２】
これらのタンパク質は、当業者にとって既知のものであり、それらの配列は、文献、特にＢｌｉｎｋｓ等による概説の中に見出すことができる（Pharmacol. Rev. 28: 1-93, 1976）。特にＧＦＰについてはＴｓｉｅｎによる記載（Annu. Rev. Biochem. 67: 509-544, 1998）、及びそのクローニングについてはＰｒａｓｈｅｒ等の記載（Gene 111: 229-233, 1992）がある。ＤｓＲｅｄのクローニングについては、Ｍａｔｚ等の記載（Nat. Biotechnol. 17: 969-973, 1999）がある。Ｒｌｕｃについては、当業者にはＢｌｉｎｋｓ等の文献（Pharmacol. Rev. 28: 1-93, 1976）又はＬｏｒｅｎｚ等の文献（PNAS 88: 4438-4442, 1991）等が参考となる。
【００２３】
有利なことに、融合タンパク質に完全に又は部分的に含まれているレプチン受容体のアイソフォームは短いアイソフォームであるか、或いは短い細胞内ドメインを表しているアイソフォームである。
このようなアイソフォームは、有利なことに、Ｂｏｘ１細胞内ドメインを含むが、Ｂｏｘ３細胞内ドメインは含まない。
好ましくは、このアイソフォームは、ＯＢＲｓアイソフォームであり、更に好ましくはヒトのＯＢＲｓアイソフォームである。しかしながら、このアイソフォームは、いかなる他の種に由来するものであってもよい。
【００２４】
更に、いかなる他のアイソフォーム、好ましくは短いもの、特に好ましくはＯＢＲの細胞外ドメインを少なくとも含んでいるもの、例えばレプチン−結合部位を含んでいるＯＢＲの可溶性型が挙げられ、これらはＬｅｅ等（Nature 379, 632-635, 1996）、Ｇａｖｒ
ｉｌｏｖａ等（JBC 272: 30546-30551, 1997）、Ｍａａｍｒ等（Endocrinology 142: 4389-4393, 2001）又はＣｌｅｍｅｎt等（Nature 392: 398-401, 1998）に記載されている。
【００２５】
殊に好ましい態様では、アイソフォームは配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２のヒトＯＢＲｓア
イソフォームである。それはまた、このタンパク質のバリアント（変異体）で、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは少なくとも８５％又は９５％のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２配列との同一性を有することである。
【００２６】
融合タンパク質は、ヒトＯＢＲｓアイソフォームの一部分のみを含むことができる。有利には、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２のアミノ酸４６から８６６の部分を含むものである。
レプチン受容体に対応する部分は、このように、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４或いは、そ
のバリアントで、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは少なくとも８５％又は９５％の同一性を有するものである。
【００２７】
殊に有利には、ドナー融合タンパク質は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６或いはそのバリア
ントで少なくとも６５％の同一性を有するものである。
殊に有利には、アクセプター融合タンパク質は、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８或いはその
バリアントで少なくとも６５％の同一性を有するものである。
【００２８】
本発明の他の課題は、これらのタンパク質をコードする核酸である。そのような核酸は、相補的ＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ又はＲＮＡである。これらの核酸又はポリヌクレオチドは、一重鎖型又は二重鎖型である。これらのうち特に有利なものは、相補的ＤＮＡである。
【００２９】
好ましくは、本発明の課題は、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、更に好ましくは少なくとも８５％又は９５％の、配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５又はＳＥＱ ＩＤ 
Ｎｏ.７の核酸とのヌクレオチド同一性を有するものである。
【００３０】
他の側面においては、本発明は、高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において上記に定義した核酸とハイブリダイズする核酸に関するものであり、更に好ましくはヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５及びＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７、又は相補的配列の核酸とハイブリダイズする核酸に関するものである。
【００３１】
本発明の目的のために、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間における「百分率で表した同一性」は、最適に並んだ２つの配列を比較の窓を通して比較することによって決定することができる。
比較の窓におけるヌクレオチド又はポリペプチドの部分は、参照する配列（付加又は欠失を含んでいないもの）と対比して、２つの配列の最適の並びを得るために付加又は欠失（例えばギャップ）を含んでいてもよい。
【００３２】
比較する２つの（核酸又はペプチド）配列における同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が観察された位置の数を測定し、次に、２つの塩基間、又はアミノ酸残基間に同一性のある位置の数を、比較の窓における位置の合計数で割って、次いで、その結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率を計算した。
【００３３】
比較のための配列の最適な並びは、既知のアルゴリズムを用いたコンピューター上で行うことができるが、そのアルゴリズムは、ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＧＲＯＵＰ（ＧＣＧ），５７５ Science Dr., Madison, WisconsinのＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＧＥＮ
ＥＴＩＣＳ ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＰＡＣＫＡＧＥに組込まれている。
【００３４】
実例として挙げれば、百分率配列の同定は、ＢＬＡＳＴプログラム（1996年3月のバー
ジョンBLAST 1.4.9，1998年2月のBLAST 2.0.4及び1998年9月のBLAST 2.0.6）を用い、デ
フォルトパラメター（S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S.F. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402）を専用的に用いることによって実行可能である。
【００３５】
Ｂｌａｓｔは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等のアルゴリズムを用いることによって、参照する「要望」の配列に類似／相同する配列を捜し出すことができる。ここで用いる要望の配列及びデータベースは、ペプチド−又は核酸関連のものであるが、いかなる組合せも可能である。
【００３６】
本発明の目的のため、「高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下における発現とは、下記の条件を意味するものである。
１．膜競合及びプレハイブリダイゼーション
−  サケ精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）４０μｌとヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）４０μlを混合する。
−  この混合物を９６℃５分間で変性した後、氷に浸す。
−  ＳＳＣを２回取り除いた後、ホルムアミド混合液４ｍｌを、膜を含んでいるハイブリダイゼーション管の中へ注ぎ込む。
−  ２本の変性したＤＮＡ混合液を添加する。
−  インキュベーションは回転を続けながら、４２℃で５〜６時間行った。
【００３７】
２. 標識プローブ競合
−  反復実験の量に依存するが、Ｃｏｔ Ｉ ＤＮＡの１０〜５０μｌを標識し精製したプローブに添加する。
−  変性は９５℃で７〜１０分間行う。
−  インキュベーションは６５℃で２〜５時間行う。
【００３８】
３． ハイブリダイゼーション
−  プレハイブリダイゼーション混合液を除去する。
−  サケ精子ＤＮＡ ４０μｌとヒト胎盤ＤＮＡ ４０μｌを混合する；その混合液を９６℃で５分間変性した後、氷に浸す。
−  ホルムアミド混合液４ｍｌ、２つのＤＮＡ混合液及び変性標識プローブ／Ｃｏｔ 
Ｉ ＤＮＡとをハイブリダイゼーション管へ添加する。
−  インキュベーションは回転を続けながら、４２℃で１５〜２０時間行う。
【００３９】
４. 洗浄
−  ２×ＳＳＣ中、常温ですすぎのため１回洗浄した。
−  ６５℃の２×ＳＳＣと０.１％ＳＤＳ溶液中、その溶液温度で５分間の洗浄を２回
行った。
−  ６５℃の１×ＳＳＣと０.１％ＳＤＳ溶液中、６５℃で１５分間洗浄を２回行った
。
この膜をサランラップで包んだ後照射した。
【００４０】
上記のハイブリダイゼーション条件は、２０ヌクレオチドから数百ヌクレオチドの種々のヌクレオチド分子の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下におけるハイブリダイゼーションに適するものである。
言うまでもなく、上記のハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションに係る核酸の長さにより、或いは、選択した標識タイプによる機能に合わせて、当業者にとって既知の技術に基づいて調節することができる。
【００４１】
好適なハイブリダイゼーション条件は、例えば、ＨＡＭＥＳとＨＩＧＧＩＮＳ（「Nucleic acid hybridization: a practical approach」, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford, 1985), 或いはＦ.ＡＵＳＵＢＥＬ等（Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989）の研究に見られる教訓に基づいて調節することができる。
【００４２】
本発明の対象とするタンパク質は当業者に既知のいかなる方法によってでも得ることができる。しかしながら、有利な方法としては、上記に記載の如く、これらのタンパク質をコードする核酸を、場合により発現ベクター中、有利には選択された細胞中へ挿入して発現させ、場合により、完全に又は部分的に抽出し或いは精製して得ることができる。
本発明は、また、本発明に係る核酸を含んでいる組換えＤＮＡに関するものである。
【００４３】
有利には、組換えベクターは、以下の核酸から選択された核酸から構成される。
ａ） 配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６、又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８と少なくとも６５％のアミ
ノ酸同一性を有するタンパク質、或いはそれらのペプチド断片又はバリアントをコードする核酸；
ｂ） 配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５、又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７を有するポリヌクレオチド
、或いはそれらの断片又はバリアントを含む核酸；
ｃ） 配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５、又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７、或いはそれらの断片又は
バリアントを有する核酸と少なくとも６５％のヌクレオチド同一性を有する核酸；
ｄ） 高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５、又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７の核酸、或いはそれらの断片又はバリアントとハ
イブリダイズする核酸。
【００４４】
本発明の目的のためには、「ベクター」という用語は、それぞれ独立に、一重鎖又は二重鎖である環状又は直鎖状ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味するものである。
一つの態様において、発現ベクターは本発明の核酸の他に、その転写及び／又は翻訳を方向付ける制御配列をも含んでいる。
【００４５】
有利な態様として、本発明に係る組換えベクターは、好ましくは以下の要素を含んでいる。
(１)  プロモーター及びエンハンサーのような、核酸の発現を制御するために挿入され
る要素；
(２)  本発明に係る核酸に含まれているコード配列で、ベクターに挿入され、(１)に記載の制限シグナルに相応して位置付けられるもの；
(３)  適当な転写開始及び終結配列。
【００４６】
加えて、本発明に係る組換えベクターは、宿主細胞中で増幅又は発現に必要な１つ又はそれ以上の複製起点、マーカー或いは選択マーカーを含むことができる。
例としては、真核細胞のプロモーターは、ＨＳＶウイルスチミジンキナーゼプロモーター又はマウスメタロチオネイン−Ｌプロモーターを含むことができる。
【００４７】
一般的には、適切なプロモーターを選択するために、当業者は、ＳＡＭＢＲＯＯＫ等(
「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1989)の研究成果或いはＦＵＬＬＥＲ等（Immunology in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.）の記載による技術を、有利に参照することができる。
【００４８】
本発明に係る好ましいベクターとしてはプラスミドがあり、例えばベクターｐＣＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Qiagen）、ｐｓｉＸ１７４、pBluescript ＳＡ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ又はｐＳＧ（Stratagene）等が挙げられる。
【００４９】
また、ヨトウ虫スポドプテラフルギペルダ（Spodoptera frugiperda）由来のＳｆ９細
胞系（ATCC No. CRL 1711）の細胞を感染させるのに使用されるベクターｐＶＬ１３９２
／１３９３（Pharmingen）のようなバキュロウイルス（baculovirus）型のベクターも挙
げられる。
更に、ヒトアデノウイルス２型又は５型のようなアデノウイルスも挙げることができる。
【００５０】
本発明に係る組換えベクターは、レトロウイルスベクター又は選択的にアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）であってもよい。アデノ随伴ベクターとしては、例えばFLOTTE等（Am. J.
Respir. Cell Mol. Biol., 7: 349-356, 1992）の記載のものが挙げられる。
【００５１】
本発明の対象は、また上記に記載したタンパク質、核酸、又はベクターを含む細胞であり、或いは、これら細胞の断片、これら細胞の溶解物又はこれら細胞の膜にも及ぶものである。
このような細胞は生体から単離されて適当な培地中で培養されたものである。しかしながら、それらは好ましくは細胞系である。それ故、細胞系としては好ましくは、有利な細胞系であるＨＥＫ２９３、ＣＯＳ（ＡＴＣＣ Ｎｏ.ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−Ｍ６及
びＨｅＬａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ＣＣＬ２）、又はＣｖ １（ＡＴＣＣ Ｎｏ. ＣＣＬ７０）
、Ｓｆ−９（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ １７１１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−６
１）或いは３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−６３６１）が挙げられる。
【００５２】
これらの細胞の膜は当業者に既知の方法により調製することができる。
好ましくは、細胞を機械的に粉砕して、得られる懸濁液を遠心分離する方法であるが、それについては後述する実施例において説明している。
本発明は、また、上記に記載した細胞及びサポニンを含む組成物に関するものである。
【００５３】
本発明は、更にレプチン受容体に対する化合物の結合を測定する方法に関するものであり、それは以下の工程より成る：
−  上記に記載したエネルギードナー融合タンパク質及び上記に記載したエネルギーア
クセプター融合タンパク質、又はこのようなタンパク質を含んでいる細胞、或いは、そのような細胞の断片、溶解物、又は膜及び適当な酵素基質を有する系に、テスト化合物を接触させること、並びに
−  エネルギー転移を測定すること。
【００５４】
好ましくは、当該方法はサポニンを処理した細胞を用いて使用することができる。
エネルギードナー融合タンパク質及びエネルギーアクセプター融合タンパク質は、ドナーの活性化によって発生するエネルギーを効率良くアクセプターへ転移することができるように選択されたものである。
【００５５】
当該方法の有利な態様においては、エネルギードナー融合タンパク質は、レプチン受容体又はレプチン受容体の実質的な部分及びルシフェラーゼ又はルシフェラーゼの実質的な部分とを融合させたタンパク質であり、その場合の基質は有利なものとしてはセレンテラジン(coelenterazine)がある。
【００５６】
当該方法の有利な態様においては、エネルギーアクセプター融合タンパク質は、レプチン受容体又はレプチン受容体の実質的な部分及びＹＦＰ又はＹＦＰの実質的な部分とを融合させたタンパク質である。
当該方法の有利な態様においては、テスト化合物の存在下で測定したエネルギー転移をテスト化合物のない状態で測定したエネルギー転移と比較する。
好ましくは、当該方法は、上記に記載したように細胞膜上で使用されるものである。
【００５７】
好ましくは、本発明に係るドナー及びアクセプタータンパク質は、エネルギー転移がＢＲＥＴ又はＬＲＥＴ共鳴によって引き起こされるように選択されている。しかしながら、そのようなエネルギー転移は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）又はＣＲＥＴ（化学発光共鳴エネルギー転移）によって影響を受けるものである。
エネルギー転移がいかなる型のものであるにせよ、エネルギードナー融合タンパク質／エネルギーアクセプター融合タンパク質対はそのような転移を可能とするように選択されなければならない。
【００５８】
ＣＲＥＴはイクオリン（これはルシフェラーゼである）及びＧＦＰ間のエネルギー転移から成るものである。
ＦＲＥＴは、異なるスペクトルを有するＧＦＰファミリーに属する２つのタンパク質間におけるエネルギー転移から成るものである。
これらの転移を起こさせるためには、当業者は、ＣＲＥＴについてはＢａｕｂｅｔ等の文献（PNAS USA 97: 7260-7265，2000）、またＦＲＥＴについてはＭａｔｙｕｓの文献（J. Photochem. Photobiol. B 12: 323-337，1992）及びＰｏｌｌｏｋとＨｅｉｍの文献（Trends Cell Biol. 9: 57-60，1999）を参照することができる。
【００５９】
本発明のもう一つの対象は、レプチンが関与する病理学的状態を予防及び／又は処置するために用いられる化合物のスクリーニング又は検出する方法であり、それは以下の工程を含んでいる。
−  上記に記載したエネルギードナー融合タンパク質及び上記に記載したエネルギーアクセプター融合タンパク質、或いはそのようなタンパク質を含む細胞（サポニンの存在下又は不存在下で）、或いは細胞の断片、溶解物又は膜、及び場合によっては適当な酵素基質を有する系に、テスト化合物を接触させること、並びに
−  エネルギー転移を測定すること。
このような方法は、レプチン受容体のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングするのに用いることもできる。
【００６０】
本発明に係る方法は通常使用されている９６穴又は３８４穴プレートに適合するものである。この方法は放射性物質を用いる必要がなく、感度が高く、再現性が良く、迅速で、かつ測定結果は読み易いものである。特に、本測定法はシグナル／バックグランドノイズ比が良好であり、レプチン以外のリガンドとの交差反応は低いものである。
【００６１】
これらのことは、少なくとも部分的には、ＯＢＲ活性が受容体のレベルにおいて直接検出することができ、その結果、レポーター遺伝子又は細胞増殖に基礎を置く検定法では観察されるような、シグナル経路のレベルにおいて交差活性を引き起こす可能性のある物質を除去することを可能とするからである。
【００６２】
付言するに、本測定法は特異なシグナルを有する変換経路に限らず、ＯＢＲと相互作用する全ての化合物を検出することができる。
この特性は、特に大規模なスクリーニングを行うに有利である。何故ならば、膜受容体リガンドの数を増加しても、ある経路は活性化されるが、他の経路は活性化されないことが知られているからである。
【００６３】
本発明は更に：
−  上記に記載したエネルギードナー融合タンパク質及び上記に記載したエネルギーアクセプター融合タンパク質、又はこのようなタンパク質を含んでいる細胞、或いはそのような細胞の断片、溶解物又は膜、及び場合によっては、適当な酵素基質を有する系に、テスト化合物を接触させること、並びに
−  エネルギー転移を測定すること
から成る方法を用いて選択した化合物をレプチン又はその受容体の関与した病気の治療又は予防処置のための医薬品の製造に使用するものである。
【００６４】
最後に、本発明の対象とする１つには、以下の工程を含む、レプチン又はその受容体の関与する病気の治療又は予防処置のための方法がある：
−  以下の構成による方法を用いて当該化合物を選択すること：
＋  エネルギードナー融合タンパク質及びエネルギーアクセプター融合タンパク質、又はこのようなタンパク質を含む細胞、或いはそのような細胞の断片、溶解物又は膜、及び適当な酵素基質を有する系に、テスト化合物を接触させること、並びに
＋  エネルギー転移を測定すること、
並びに
−  当該化合物を当該病気に患っている患者へ投薬すること。
【００６５】
このような病気としては、例えば骨粗鬆症のような骨密度の減少に関係する病気、或いは逆に、可成りの量のカルシウム沈着に関係する病気が挙げられる。
更に、肥満症、糖尿病又は食欲不振のような体重に影響をもたらす病気も挙げられる。
【００６６】
本発明の化合物は、局所、経口、腸管外、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内等の投薬に用いるために医薬品組成物として製剤することができる。好ましくは、医薬品組成物は注入可能な製剤のために医薬品として許容され得る賦形剤を含むものである。
それらは、特に、生理的塩類溶液（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウム等、或いはそれらの塩の混合物）、滅菌した等張溶液、又は乾燥した特に減圧凍結乾燥した組成物であり、その組成物は適当な場合は滅菌水又は生理的食塩水を加えて、注入可能な溶質の構成とするものである。
【００６７】
最後に、本発明に係る方法は、更に、肥満症患者からの血清中に機能喪失のレプチンが存在するか否かを検査することにも、或いはＯＢＲの二量化を妨げる化合物を選抜するこ
とにも用いることができる。
【００６８】
図１は、当該融合タンパク質を図解的に表示している。Ｂｏｘ１はＪＡＫ２−結合部位を表わし；Ｂｏｘ３はＳＴＡＴタンパク質−結合部位を表わし；ＴＭは膜貫通ドメインを表わしている。
図２ａ及びｂは、ＣＯＳ細胞中でのＯＢＲ構成体の発現を図解するものであり、放射性リガンドとして125Ｉ−レプチンを用いた放射性標識実験により評価したものである。図
２ａ及びｂにおいては、ＯＢＲの総細胞量及び細胞表面結合部位の百分率をそれぞれ測定している。
図２ｃは、レプチン存在下及び欠如下におけるＯＢＲｌ−ＹＦＰ及びＯＢＲｓ−ＹＦＰ構成体発現の細胞内部位を図解している。
図２ｄは、種々のＯＢＲ構成体によるＪＡＫ２の活性化を図解している。
図２ｅは、ＳＴＡＴ３のレポーター遺伝子及び種々のＯＢＲ構成体を共役発現している細胞におけるレプチンによる促進効果を図解している。
図３は、ＯＢＲの構造的二量化を図解している。表示された種々のＯＢＲ構造体を発現しているＨＥＫ ２９３細胞は、セレンテラジンの存在下でインキュベートしたものであ
る。エネルギー転移はルミノメーター（輝度計）を用いて測定している。
【００６９】
図４ａ及びｂは、ＯＢＲの構造的ＢＲＥＴに付するレプチン結合の効果を図解している。
図４ａ：表示された種々のＯＢＲ構成体を発現しているＨｅＬａ細胞を、ルシフェラーゼ反応の開始前にレプチン存在下でインキュベートした。エネルギー転移はルミノメーターを用いて測定している。
図４ｂ：レプチンの効果を、ＯＢＲｓ−Ｌｕｃ及びＯＢＲ−ＹＦＰを共役発現している総生細胞中、サポニンの存在下又は不存在下で、総溶解物中及び膜標品中において比較している。
【００７０】
図５ａ〜ｅは、ＯＢＲｓ上でレプチンにより誘導されたＢＲＥＴにおける変化の最適化と特性とを図解している。ＯＢＲｓ−Ｌｕｃ及びＯＢＲｓ−ＹＦＰとを共役発現しているＨｅＬａ又はＣＯＳ細胞から調製した膜は、ルシフェラーゼ反応の開始前にレプチンを含む又は含まない溶液でプレインキュベートしている。
図５ａ：ＯＢＲｓ−Ｌｕｃ及びＯＢＲｓ−ＹＦＰの発現の相対的又は絶対的レベルの最適化。
図５ｂ：時間との相関におけるレプチンにより誘導されたＢＲＥＴシグナルの変化。
図５ｃ：サポニン存在下（０.０５％）、膜及び無傷細胞におけるＢＲＥＴ／レプチン
濃度用量−反応曲線。
図５ｄ：レプチン濃度の増加に伴う125Ｉ−レプチン結合の競合。
図５ｅ：レプチンによって誘導されたＢＲＥＴにおける変化の特異性。膜標品はそれぞれエルスロポエチン（ＥＰＯ，１０Ｕ／ｍｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ，１０ｎＭ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ，２５０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン３（ＩＬ３，２８０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン６（ＩＬ６，１００ｎｇ／ｍｌ）、プロラクチン（ＰＲＬ，２００ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子α（ＳＣＦα，２５０ｎｇ／ｍｌ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ，１００ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（Ｉｎｓ，１００ｎＭ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ，１００ｎｇ／ｍｌ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα，５０ｎｇ／ｍｌ）の飽和濃度によりプレインキュベートしている。
【００７１】
図６：一定量のＯＢ−Ｒｓ−Ｌｕｃ（５０ｎｇ）と増大する量のＯＢ−Ｒｓ−ＹＦＰ（〇，２００ｎｇ；●，４００ｎｇ；△，８００ｎｇ；◆，１６００ｎｇ；◇，３２００ｎｇ）を用いるＣＯＳ細胞のコトランスフェクション。ＢＲＥＴ測定はサポニン存在下（０.０１５％）、レプチン用量の増加させてインキュベートし、又はインキュベートしない細胞中で行ない、ｍＢＲＥＴとして表示した。
【００７２】
本発明は以下の実施例により説明してあるが、しかしながら、これらに限定されるものではない。
【００７３】
実施例における材料及び方法
プラスミド構成体、トランスフェクション及び細胞培養
ＯＢ−Ｒ−ＹＦＰとＯＢ−Ｒ−Ｌｕｃとの融合タンパク質は、通常の分子生物学の技術を用いて、受容体のＣ−末端にＹＦＰとＬｕｃを連結することによって構成した。
ベクターpGFPtpz-N１ Cytogem(R)-Topaze (Packard, Meriden, CT)から入手したＹＦＰのコード領域を修飾したポリリンカーを含んでいるｐｃＤＮＡ３／ＣＭＶ（Invitrogen, Groningen, The Netherlands）のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。
【００７４】
レニラルシフェラーゼのコード領域は、ｐＲＬ−ＣＭＶ（Promega, Madison, WI）から入手し、そして、ｐｃＤＮＡ３修飾のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。ＯＢＲｌ及びＯＢＲｓ（Gainsford博士からのギフト, Royal Melbourne Hospital, Victoria, Australia）は、上記に記載した２つのベクター、ＥｃｏＲI／ＢａｍＨI及びＮｈｅIクローニング部位に
それぞれ挿入した。終結コドンは位置指定突然変異誘発により除去し、そして融合タンパク質の骨格を整えた。
【００７５】
ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−Ｍ６及びＨｅＬａの細胞系は以下の要素を補充したＤＭＥＭ中で培養した：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、グルコース（４.５ｇ／Ｌ）、ペニシリン（１０
０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（０.１ｍｇ／ｍｌ）、１ｍＭグルタミン (Life Technologies, Gaithersburg, MD)。
トランジェントトランスフェクションはＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Roche, Basle, Switzerland）を用いて行った。
【００７６】
蛍光顕微鏡
ＹＦＰ構成体によるトランスフェクションの２日後に、細胞は１００ｎＭレプチン中６０分間、更に０.０１ｍＭビスベンズアミド中１５分間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含む冷却ＰＢＳ溶液中常温で２０分間固定した。切片はＦＩＴＣ及びＤＡＰＩフィルターを用いた蛍光顕微鏡で観察した。
【００７７】
膜の調製と可溶化
細胞を氷の上に静置し、氷で冷却しつつＰＢＳ中２回洗浄し、更に氷で冷却しつつ緩衝液１（５ｍＭ Ｔｒｉｓ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７.４，大豆トリプシンインヒビター（
５ｍｇ／Ｌ），ロイぺプチン（５ｍｇ／Ｌ）及びベンズアミド（１０ｍｇ／Ｌ））中で機械的に分離した。
細胞懸濁液をポリトロンホモジナイザー（Janke & Kunkel Ultra-Turrax T25）を用い
て５秒間ずつ３回ホモジナイズした。その溶解物を４５０×ｇ下、４℃で５分間遠心分離した後、上澄画分を更に４８０００×ｇ下、４℃で３０分間遠心分離した。最終沈殿物を緩衝液１で２回洗浄した後、溶液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７.４），１２.５ｍＭ ＭｇＣｌ2，５ｍＭ ＥＤＴＡ，上記に記載したプロテアーゼインヒビター）中に再び懸濁し、そして直ちに放射性リガンド−結合実験又はＢＲＥＴ実験に使用した。
【００７８】
ＪＡＫ２の免疫沈降法
ＨｅＬａ細胞をＨＡ２で標識したＪＡＫ２を発現するプラスミド（Wojchowski博士からのギフト，Pennsylvania State University, Pennsylvania, USA）及び種々のＯＢＲ構成体を含んでいるプラスミドとをコトランスフェクトさせた。細胞は溶解緩衝液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，５％グリセロール，０.０２％Ｎａ
Ｎ3，０.１％ＮＰ４０，１ｍＭオルトバナジン酸塩，大豆トリプシンインヒビター（５ｍｇ／Ｌ）、ベンズアミド（１０ｍｇ／Ｌ））中で溶解した後、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。可溶画分を抗−ＪＡＫ２ポリクローナル抗体（ＨＲ−７５８）（１μｇ／ｍｌ）（Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を用いて２時間、免疫沈降法で処理した。
【００７９】
ＳＤＳ−Ｐａｇｅ免疫吸収
ＪＡＫ２免疫沈降物を溶液（６２.５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６.８），５％ＳＤ
Ｓ，１０％グリセロール，０.０５％ブロモフェノールブルー）中１００℃で１０分間、
変性させた。タンパク質は７％ポリアクリルアミド中ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ニトロセルロース上に移した。免疫検定は抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（５μｇ／ｍｌ）（Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY）を用いて行った。免疫活性は西洋ワサビペルオキシダーゼにカップルした適当な第二抗体、及びＥＣＬ化学発光試薬（Amersham, Aylesbury, UK）を用いて検出することができた。
【００８０】
125Ｉ−レプチン−結合検定
トランスフェクトした細胞は、結合実験の開始前２４時間ＤＭＥＭ（１％ＢＳＡ）中で血清放血をした。細胞表面に結合するレプチンを測定するため、細胞は氷冷却中ＰＢＳで２回洗浄した後、125Ｉ−レプチン（Perkin Elmer Life Sciences, Paris, France）１００ ０００ｃｐｍ／ｗｅｌｌを含む結合緩衝液（ＤＭＥＭ，２５ｍＭヘペス，ｐＨ７.４，１％ＢＳＡ）中で、無標識レプチン（組換えヒトレプチン（PeproTech Inc.,USA））２００ｎＭの存在下又は欠如下で、４℃で４時間インキュベートした。細胞は氷冷却中ＰＢＳで２回洗浄した後、１Ｎ ＮａＯＨ中で溶解し、放射能をガンマ放射能測定機で測定した。当該エキス中におけるレプチン結合の総量を測定するため、細胞を０.１５％のジギトニンを含む緩衝液（１.５ｍｌ）中、４℃で２時間かけて懸濁した。当該エキスをEppendorf遠心分離を用いて、最高速度で４℃で３０分間遠心分離した。上澄画分（０.２ｍｌ）を２００ｎＭのレプチン存在下又は欠如下で、125Ｉ−レプチン（１００ ０００ｃｐｍ）を含む溶液（総量０.２５ｍｌ）中、４℃で一夜攪拌を続けながらインキュベートした。
０.５ｍｌのγ−グロブリン（１.２５ｍｇ／ｍｌ）及び０.５ｍｌのポリエチレングリ
コール６０００（２５％ｗ／ｖ）を加えて沈殿する受容体−リガンド複合体を遠心分離（１７０００×ｇ，３分間）にかけて採集した。沈殿画分を１ｍｌのポリエチレングリコール６０００（１２％ｗ／ｖ）で洗浄した後、測定した。
【００８１】
レポーター遺伝子の活性化
ＨｅＬａ細胞を、ＳＴＡＴ３レポーター遺伝子（Levy博士からのギフト, New York University, New York, USA）、レニンルシフェラーゼのコード領域を含むｐｃＤＮＡ３（２００ｐｇ）（内部対照として使用）を有するプラスミド（２.６μｇ）及び種々のＯＢＲ構成体（１.４μｇ）或いはその運搬体のみとをコトランスフェクトさせた。
４８時間のトランスフェクションの後、細胞はＤＭＥＭ（１％ＢＳＡ）中で一夜放血し、１ｎＭのレプチンで６〜８時間活性化した。細胞はその後洗浄し、受動溶解緩衝液（Promega Corporation, Madison, WI）中で、常温で１５分間かけて溶解した。総溶解物を１５０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、上澄画分をＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメーター（Lumat LB 9507）を用いたルシフェラーゼ（Promega Corporation, Madison, WI）の測定のための検定に使用した。
結果は、ホタルルシフェラーゼ／レニラルシフェラーゼの活性比で表している。
【００８２】
ＢＲＥＴの測定
トランスフェクションの４８時間後に、ＯＢＲを発現しているＨｅＬａ、ＣＯＳ及びＨＥＫ２９３細胞を引き離してＰＢＳで洗浄した。１〜２×１０5個の細胞を２５℃でリガ
ンドを含む又は含まない９６穴の可視プレート（Packard Instrument Company, Meriden,
CT）に分配した。ＯＢＲを発現している細胞から調製した膜をＢＲＥＴの測定のために
使用した。基質であるセレンテラジンｈ（Molecular Probes, Eugene, OR）を最終濃度が５μＭとなるように添加し、測定は、Ｆｕｓｉｏｎ(TM)フルオロ／ルミノメーター（Packard Instrument Company, Meriden, CT）で行った。この測定機によれば、２種類のフィルター（Ｌｕｃフィルター：４８５±１０ｎｍ；ＹＦＰフィルター：５３０±１２.５ｎｍ）により検出される発光シグナルの逐次的積分値を求めることができる。
ＢＲＥＴ比は、コトランスフェクトしたＬｕｃとＹＦＰ融合タンパク質の５３０ｎｍ／４８５ｎｍにおける発光、及びＬｕｃ融合タンパク質のみの５３０ｎｍ／４８５ｎｍにおける発光との間の差異として定義される。測定結果は、ミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）として表されるが、１ｍＢＲＥＴ単位は、ＢＲＥＴ比に１０００を乗じた値に相当するものである。以下のリガンド：組換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン（Ｉｎｓ）、リポポリサッカライド（LPS, Sigma Aldrich, St. Louis, USA）、組換えヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、プロラクチン（ＰＲＬ）、ＳＣＦ、ＥＧＦ及びＴＮＦαを、当該検定の特異性を調べるために用いた。
【実施例１】
【００８３】
ＯＢＲ融合タンパク質の機能的発現
ＯＢＲの長鎖（ＯＢＲｌ）及び短鎖（ＯＢＲｓ）のＣ末端にＹＦＰ又はＬｕｃを融合させた（図１）。これら融合タンパク質の発現は、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞における125Ｉ−レプチンを用いた結合実験により確認された（図２ａ）。同様の結果はトラン
スフェクトしたＨｅＬａ細胞においても観察された。
ＣＯＳ細胞中、細胞表面で発現した融合タンパク質及び野生型受容体の発現は５〜１０％の間で変動するものであったが、これは既知の測定値に符合するものである。同様の結果は、外来性ＯＢＲを発現しているＨＥＫ２９３細胞においても得られた（１４±３％）。
ＨｅＬａ細胞におけるＯＢＲ融合タンパク質の部位は、ＹＦＰと融合したタンパク質を用いた蛍光顕微鏡によって調べた。ＯＢＲｌ−ＹＦＰによる蛍光は細胞中点状模様に散らばっていたが、一方ＯＢＲｓ−ＹＦＰによるものはプラーク内に存在していた。レプチンの刺激がＯＢＲｌ−ＹＦＰを、おそらくエンドソーム小胞に相応する大きな細胞内プラークに局在させた。ＯＢＲｓ−ＹＦＰにおいてはレプチン活性化による有意義な変化は見られなかった。蛍光顕微鏡により得られた結果から、細胞内小胞におけるＯＢＲの優勢な部位が確認され、そしてそれはＣＯＳ細胞におけるＯＢＲｌ−ＧＦＰ融合タンパク質の既知の部位に一致するものであった。
【００８４】
融合タンパク質の機能的発現は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路の活性化を測定することによって評価することができる。ＪＡＫ２キナーゼはＯＢＲｓとＯＢＲｌの細胞内ドメインに関係している。リガンド結合によりＪＡＫ２のリン酸転移及びＯＢＲｌのリン酸化が起こるが、しかしながら、ＯＢＲｓには変化はなかった。
リン酸化されたＯＢＲｌはＳＴＡＴタンパク質に対して接触部位を提供し、その結果、ＳＴＡＴタンパク質は受容体に結合後チロシンのリン酸化により活性化される。活性化されたＳＴＡＴタンパク質はニ量体化して、核へ移動し、そこでＳＴＡＴ応答配列によって遺伝子転写を刺激することはTartagliaにより記載された通りである（J. Biol. Chem. 272, 6093-6096, 1997）。
図２ｃに示したように、全てのＯＢＲｓ構成体はＪＡＫ２リン酸化を誘導しているが、これはＪＡＫ２を活性化していることを意味している。ＳＴＡＴ３レポーター遺伝子の活性はＯＢＲｌ−ｗｔ及びＯＢＲｌ融合タンパク質によって２倍から４倍も活性化されているが、一方の短いアイソフォームではレポーター遺伝子の活性に対する効果は見られなかった。これらの結果から、ＯＢＲ融合タンパク質はＨｅＬａ細胞において機能的に発現していることが示唆される。
【実施例２】
【００８５】
生細胞におけるＯＢＲの構造的二量体化
ＯＢＲ−Ｌｕｃ及びＯＢＲ−ＹＦＰの二量体化について生細胞中で調べた。
ＯＢＲｓ−ＬｕｃとＯＢＲｓ−ＹＦＰ間、及びＯＢＲｌ−ＬｕｃとＯＢＲｌ−ＹＦＰ間において、有意義なエネルギー転移が観察され、等モル量で発現されていることより、これら２つの受容体には構造的なホモダイマーが存在していることが示唆される（図３ａ，ｂ）。
生細胞におけるＯＢＲｓ／ＯＢＲｌヘテロダイマーの存在はＯＢＲｓ−ＬｕｃとＯＢＲｌ−ＹＦＰ間、及びＯＢＲｌ／ＬｕｃとＯＢＲｓ−ＹＦＰ間においてＢＲＥＴが検出されたことによって実証された。これら相互作用の特異性は、ＯＢＲｓ−ＬｕｃとＯＢＲｌ−Ｌｕｃ間、及び最近の文献（Boute et al., 2001, 上記で言及）に記載されているＹＦＰとインスリン受容体間の融合に由来するタンパク質において有意義な転移が観察されなかったことにより実証されている。
これらの結果は、短鎖及び長鎖のアイソフォームが生細胞におけるヘテロ−及びホモ複合体に関与していることを指摘している。
【実施例３】
【００８６】
ＯＢＲの構造的ＢＲＥＴに対するレプチン結合の効果
構造的ＢＲＥＴに対するアゴニスト効果を評価するためにルシフェラーゼと基質との反応を開始する前に、細胞をレプチンとプレインキュベートした。
ＯＢＲｌホモダイマー及びヘテロダイマーＯＢＲｓ／ＯＢＲｌの２つの組合せは、どちらも構造的ＢＲＥＴにおける変化は観察されなかったが、しかしながら、ＯＢＲｓホモダイマーによって増大した（図４ａ）。
そこで、レプチンによって誘導されたＯＢＲｓホモダイマーのＢＲＥＴにおける変化を種々の細胞標品において測定した。
低張緩衝液中での細胞の機械的破裂は有意義にレプチンによるＢＲＥＴにおける増加を促進したが、しかしながら基本的なＢＲＥＴには変化は見られなかった。
【００８７】
同様の結果は、細胞質ゾルから分離後の膜画分においても得られた。全てのＯＢＲｓ−Ｌｕｃ／ＯＢＲｓ−ＹＦＰの組合せが基本的ＢＲＥＴに対して寄与するものではあるが、細胞表面に現れた受容体（５〜１０％）のみがレプチンによって刺激されたことは、無傷細胞においてはレプチンは膜を透過することができないことによるものである。細胞膜の破壊によりレプチンに近接できることとなったＯＢＲ画分が増加し、その結果として、レプチンにより誘導されたＢＲＥＴにおける増加に影響をもたらしたものと思われる。
同様の結果はサポニン処理の細胞においても得られた。この物質は膜に穴を開けて、レプチンのようなタンパク質をＯＢＲｓの大部分が存在している細胞内小胞へと透過させるためである。
【００８８】
ＯＢＲｌホモダイマー又はＯＢＲｓ／ＯＢＲｌヘテロダイマーを発現している細胞を用いて同様の実験を行ったが、レプチン−誘導ＢＲＥＴにおける変化は観察されなかった。
それ故、ＯＢＲｓ−Ｌｕｃ及びＯＢＲｓ−ＹＦＰの量とその比率とが、レプチン−誘導ＢＲＥＴを最適化するように調節されているものと思われる（図５ａ）。最良の結果は、ＯＢＲｓ−ＬｕｃをコードしているＤＮＡ ５００ｎｇとＯＢＲｓ−ＹＦＰをコードして
いるＤＮＡ ２５０ｎｇを用いたときにおいて得られた。
これら最適条件下で、飽和濃度のレプチンはサポニン又はＯＢＲｓホモダイマーを発現している細胞から調製された膜とインキュベートした細胞における、基本的ＢＲＥＴシグナルを２倍から２.５倍増加させた。この増加は時間依存的であった。最大値は、１ｎＭ
レプチンを添加して常温で２０分間インキュベートしたときに達成した（図５ｂ）。より高い濃度のレプチンを用いた場合は、最大値は常温における５分間のインキュベーション
により達成された。
【００８９】
レプチンの効果は用量依存的であり、ＥＣ50は約１００ｐＭである（図５ｃ）。これは、ＯＢＲｓ−Ｌｕｃ（１１６ｐＭ）及びＯＢＲｓ−ＹＦＰ（３５ｐＭ）融合タンパク質について得られたＫｉ値と良く一致するものである（図５ｄ）。検定の特異性は、種々のサイトカイン及びエリスロポエチン、トロンボポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＰＲＬ、ＳＣＦα、ＥＧＦ、インスリン、ＬＰＳ及びＴＮＦαのような他の膜受容体リガンドの飽和濃度を用い、リガンドで誘導されたＢＲＥＴが存在しないことにより実証された。
【００９０】
二量体となる受容体の分布は、統計的法則に従い、１／１受容体数の比率では、全ての受容体が二量体型とした場合、次の分布が期待される：１／４ Ｌｕｃ／Ｌｕｃ、１／４ ＹＦＰ／ＹＦＰ、そして１／２受容体がＢＲＥＴシグナルを発生することができる（１／４ Ｌｕｃ／ＹＦＰ、１／４ ＹＦＰ／Ｌｕｃ）。
【００９１】
しかしながら、ＢＲEＴ測定において、Ｌｕｃに融合した全ての分子は発光シグナルを
発生し、それ故、１／１の比率においては、全てのドナー集団に対し、半分の受容体はＢＲＥＴ能があると観察された。このように、ＢＲＥＴシグナルを増大させるためには、Ｌｕｃ分子がＹＦＰ分子によって飽和され、その結果、全てのＬｕｃ分子がＹＦＰ分子（ＢＲＥＴ能がある）と二量体型であるようにして実験が行われた。
【００９２】
図６の結果は、基本的ＢＲＥＴシグナルは飽和するにつれて増大し、レプチンによる誘導は基本シグナルに対して正比例し、基本的ＢＲＥＴを２から２.５倍刺激している。飽
和濃度においては、基本的及び誘導されたＢＲＥＴ共により良い解像力が得られており、分子探索にとって容易なスクリーニングを可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】当該融合タンパク質を図解的に表示したものである。
【図２】ａ及びｂは、ＣＯＳ細胞中でのＯＢＲ構成体の発現を示したものである。ｃは、レプチン存在下及び欠如下におけるＯＢＲｌ−ＹＦＰ及びＯＢＲｓ−ＹＦＰ構成体発現の細胞内部位を示している。ｄは、種々のＯＢＲ構成体によるＪＡＫ２の活性化を示している。ｅは、ＳＴＡＴ３のレポーター遺伝子及び種々のＯＢＲ構成体を共役発現している細胞におけるレプチンによる促進効果を示している。
【図３】ＯＢＲの構造的二量化を示している。
【図４】ａ及びｂは、ＯＢＲの構造的ＢＲＥＴに付するレプチン結合の効果を示している。
【図５】ａ〜ｅは、ＯＢＲｓ上でレプチンにより誘導されたＢＲＥＴにおける変化の最適化と特性とを示している。
【図６】一定量のＯＢ−Ｒｓ−Ｌｕｃ（５０ｎｇ）と増大する量のＯＢ−Ｒｓ−ＹＦＰによってＣＯＳ細胞をコトランスフェクションしたもののｍＢＲＥＴを示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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