(57)【要約】本発明は、新規なヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物、及びオリゴマー化合物の該耐性を高めるための新規な方法に関する。本発明の好ましい実施態様では、オリゴマー化合物は、該オリゴマー化合物の３’又は５’末端のいずれかに、修飾糖部分を含有する少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含み、さらに、ホスホジエステル以外である、少なくとも１つのヌクレオシド間連結基を含む。本発明の他の好ましい実施態様は、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を強化する方法であって、修飾糖部分を含有する、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを、オリゴマー化合物の３’又は５’末端のいずれかに組み入れることを含む方法を包含する。
2005504020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｖ：
【化１】
2005504020.tif 000083
で示されるオリゴマー化合物、
上記式中：
ｎは３〜約５０であり；
各Ｙ１は、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり；
Ｙ２は、酸素又はヌクレオシド間連結基であり；
Ｙ３は、酸素又はヌクレオシド間連結基であり；
各Ｂｘは、任意に保護される複素環塩基部分であり；
各Ａ１は、独立的に、水素又は糖置換基であり；
Ｗ１は、水素、ヒドロキシル保護基又は、
【化２】
2005504020.tif 000084
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり；
Ｗ２は、水素、ヒドロキシル保護基又は、
【化３】
2005504020.tif 000085
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり；
各Ａ２は、独立的に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、アミノ、置換アミノ、−ＳＨ、−ＳＡ３、チオールエーテル、Ｆ、又はモルホリノであり；
各Ａ３は、独立的に、Ｈ、硫黄保護基、アリール、アルカリール、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、又はアルカリールであり、上記置換はＯＡ５又はＳＡ５である；
各Ａ４は、独立的に、Ｈ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、又はアルカリールであり、上記置換はＯＡ５又はＳＡ５である；
各Ａ５は、独立的に、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、シクロアルキル又はアリールであり；
各Ｖ１は、独立的に、Ｏ又はＳであり；
この場合に、Ｗ１とＷ２の少なくとも１つは、水素でもなく、またヒドロキシル保護基でもない、そして少なくとも１つのヌクレオシド間連結基は、ホスホジエステル連結基ではない。
【請求項２】
ｎが、約８〜約３０である、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項３】
ｎが、約１５〜約２５である、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項４】
前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項５】
前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項４記載のオリゴマー化合物。
【請求項６】
前記ヌクレオシド間連結基のいずれも、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基ではない、請求項５記載のオリゴマー化合物。
【請求項７】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、ホスホロチオエート・ヌクレオシド間連結基である、請求項５記載のオリゴマー化合物。
【請求項８】
前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも１つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項９】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項８記載のオリゴマー化合物。
【請求項１０】
前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項９記載のオリゴマー化合物。
【請求項１１】
前記ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−若しくは−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、又は−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１０記載のオリゴマー化合物。
【請求項１２】
前記オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項１３】
前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも１つの領域において、少なくとも１つの２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３糖置換基を含む、請求項１２記載のオリゴマー化合物。
【請求項１４】
Ｂｘが多環状複素環塩基部分である、少なくとも１つのヌクレオシドを含む、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項１５】
前記多環状複素環塩基部分の各々が、独立的に、式：
【化４】
2005504020.tif 000086
で示され、上記式において、
Ａ６がＯ又はＳであり；
Ａ７がＣＨ２、Ｎ−ＣＨ３、Ｏ又はＳであり；
各Ａ８及びＡ９が水素であるか、又はＡ８及びＡ９の一方が水素であり、Ａ８及びＡ９の他方が
【化５】
2005504020.tif 000087
［式中、Ｇは−ＣＮ、−ＯＡ１０、−ＳＡ１０、−Ｎ（Ｈ）Ａ１０、−ＯＮ（Ｈ）Ａ１０若しくは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０であり；Ｑ１はＨ、−ＮＨＡ１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０若しくは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０であり；各Ｑ２は、独立的に、Ｈ若しくはＰｇであり；Ａ１０は、Ｈ、Ｐｇ、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アセチル、ベンジル、−（ＣＨ２）ｐ３ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｐ３Ｎ（Ｈ）Ｐｇ、Ｄ若しくはＬα−アミノ酸、又はＤ、Ｌ若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり；Ｐｇは窒素、酸素若しくはチオール保護基であり；各ｐ１は、独立的に、２〜約６であり；ｐ２は１〜約３であり；そしてｐ３は１〜約４である］
から成る群から選択される、請求項１４記載のオリゴマー化合物。
【請求項１６】
Ｙ３がヌクレオシド間連結基であり、Ｗ１が修飾ヌクレオシドである、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項１７】
Ｙ２がヌクレオシド間連結基であり、Ｗ２が修飾ヌクレオシドである、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項１８】
前記Ｂｘの各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、５−メチルシトシニル（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、２−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、２−チオウラシリル、２−チオチミニル、２−チオシトシニル、５−ハロウラシリル、５−ハロシトシニル、５−プロピニルウラシリル、５−プロピニルシトシニル、６−アゾウラシリル、６−アゾシトシニル、６−アゾチミニル、５−ウラシリル（プソイドウラシル）、４−チオウラシリル、８−置換アデニニル及びグアニニル、５−置換ウラシリル及びシトシニル、７−メチルグアニニル、７−メチルアデニニル、８−アザグアニニル、８−アザアデニニル、７−デアザグアニニル、７−デアザアデニニル、３−デアザグアニニル及び３−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項１９】
各糖置換基が、独立的に、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−アルキルアミノ、−Ｏ−アルキルアルコキシ、−Ｏ−アルキルアミノアルキル、−Ｏ−アルキルイミダゾール、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキル、−Ｎ（Ｈ）−アルケニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキニル、−Ｎ（アルキル）２、−Ｏ−アリール、−Ｓ−アリール、−ＮＨ−アリール、−Ｏ−アラルキル、−Ｓ−アラルキル、−Ｎ（Ｈ）−アラルキル、フタルイミド（Ｎにおいて結合）、ハロゲン、アミノ、ケト（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ）、カルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、ニトロ（−ＮＯ２）、ニトロソ（−Ｎ＝Ｏ）、シアノ（−ＣＮ）、トリフルオロメチル（−ＣＦ３）、トリフルオロメトキシ（−Ｏ−ＣＦ３）、イミダゾール、アジド（−Ｎ３）、ヒドラジノ（−Ｎ（Ｈ）−ＮＨ２）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＨ２）、イソシアナト（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、スルホキシド（−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ）、スルホン（−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式（−Ｏ−アルキル）ｍ（式中、ｍは１〜約１０である）で示されるポリエーテルであり、この場合、各Ｒは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリール、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される；
或いは、各糖置換基が、式Ｉ又はＩＩのいずれかを有する：
【化６】
2005504020.tif 000088
上記式において、
Ｚ０はＯ、Ｓ若しくはＮＨであり；
Ｊは単結合、Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）であり；
ＥはＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ７）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ６ａ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ７ａ）であるか、又は式ＩＩＩ：
【化７】
2005504020.tif 000089
を有する；
各Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２は、独立的に、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される；
又は任意に、Ｒ１１とＲ１２は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する；
各Ｒ１３は、独立的に、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリールであり；
Ｒ５は、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｒ５ａは、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｔは、結合又は連結部分であり；
Ｌは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり；
各Ｒ６とＲ７は、独立的に、Ｈ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒ１４）（Ｒ１５）、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである；
或いは、Ｒ６とＲ７は一緒に、窒素保護基であるか、又はＮ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である；
各Ｒ１４とＲ１５は、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、窒素保護基であるか、又はＲ１４とＲ１５は一緒に、窒素保護基である；
或いは、Ｒ１４とＲ１５は、Ｎ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する；
Ｚ４は、ＯＸ、ＳＸ、又はＮ（Ｘ）２であり；
各Ｘは、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６である；
Ｒ１６は、Ｈ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、約４〜約７個の炭素原子を有するか又は約３〜約６個の炭素原子と１若しくは２個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり；
Ｚ５は、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）ＯＲ５、ハロ、ＳＲ５又はＣＮであり；
各ｑ１は、独立的に、１〜１０の整数であり；
各ｑ２は、独立的に、０又は１であり；
ｑ３は０又は１〜１０の整数であり；
ｑ４は、１〜１０の整数であり；
ｑ５は、０、１又は２から選択される；ただし、ｑ３が０であるときに、ｑ４は１より大きい、請求項１記載のオリゴマー化合物。
【請求項２０】
前記糖置換基の各々が、独立的に、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、又はフルオロである、請求項１９記載のオリゴマー化合物。
【請求項２１】
オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を強化する方法であって、前記オリゴマー化合物の３’又は５’末端に少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを与えて、式Ｖ：
【化８】
2005504020.tif 000090
で示される修飾オリゴマー化合物を得ることを含み、上記式において、
ｎは、３〜約５０であり；
各Ｙ１は、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり；
Ｙ２は、酸素又はヌクレオシド間連結基であり；
Ｙ３は、酸素又はヌクレオシド間連結基であり；
各Ｂｘは、任意に保護される複素環塩基部分であり；
各Ａ１は、独立的に、水素又は糖置換基であり；
Ｗ１は、水素、ヒドロキシル保護基又は、
【化９】
2005504020.tif 000091
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり；
Ｗ２は、水素、ヒドロキシル保護基又は、
【化１０】
2005504020.tif 000092
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり；
各Ａ２は、独立的に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、アミノ、置換アミノ、−ＳＨ、−ＳＡ３、チオールエーテル、Ｆ、又はモルホリノであり；
各Ａ３は、独立的に、Ｈ、硫黄保護基、アリール、アルカリール、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、又はアルカリールであり、この場合、前記置換はＯＡ５又はＳＡ５である；
各Ａ４は、独立的に、Ｈ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、又はアルカリールであり、この場合、前記置換はＯＡ５又はＳＡ５である；
各Ａ５は、独立的に、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、シクロアルキル又はアリールであり；
各Ｖ１は、独立的に、Ｏ又はＳであり；
この場合、Ｗ１及びＷ２の少なくとも一方は水素でもなく、またヒドロキシル保護基でもない方法。
【請求項２２】
ｎが、約８〜約３０である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ｎが、約１５〜約２５である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記ヌクレオシド間連結基のいずれも、ホスホジエステルヌクレオシド間連結基ではない、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、ホスホジエステルヌクレオシド間連結基である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも１つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、又は−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項２１記載の方法。
【請求項３３】
オリゴマー化合物が、前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも１つの領域において、少なくとも１つの２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３糖置換基を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
Ｂｘが多環状複素環塩基部分である、少なくとも１つのヌクレオシドを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３５】
前記多環状複素環塩基部分の各々が、独立的に、式：
【化１１】
2005504020.tif 000093
で示され、上記式において、
Ａ６がＯ又はＳであり；
Ａ７がＣＨ２、Ｎ−ＣＨ３、Ｏ又はＳであり；
各Ａ８及びＡ９が水素であるか、又はＡ８及びＡ９の一方が水素であり、Ａ８及びＡ９の他方が
【化１２】
2005504020.tif 000094
［式中、Ｇは−ＣＮ、−ＯＡ１０、−ＳＡ１０、−Ｎ（Ｈ）Ａ１０、−ＯＮ（Ｈ）Ａ１０若しくは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０であり；Ｑ１はＨ、−ＮＨＡ１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０若しくは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０であり；各Ｑ２は、独立的に、Ｈ若しくはＰｇであり；Ａ１０は、Ｈ、Ｐｇ、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アセチル、ベンジル、−（ＣＨ２）ｐ３ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｐ３Ｎ（Ｈ）Ｐｇ、Ｄ若しくはＬα−アミノ酸、又はＤ、Ｌ若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり；Ｐｇは窒素、酸素若しくはチオール保護基であり；各ｐ１は、独立的に、２〜約６であり；ｐ２は１〜約３であり；そしてｐ３は１〜約４である］
から成る群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
Ｙ３がヌクレオシド間連結基であり、Ｗ１が修飾ヌクレオシドである、請求項２１記載の方法。
【請求項３７】
Ｙ２がヌクレオシド間連結基であり、Ｗ２が修飾ヌクレオシドである、請求項２１記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｂｘの各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、５−メチルシトシニル（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、２−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、２−チオウラシリル、２−チオチミニル、２−チオシトシニル、５−ハロウラシリル、５−ハロシトシニル、５−プロピニルウラシリル、５−プロピニルシトシニル、６−アゾウラシリル、６−アゾシトシニル、６−アゾチミニル、５−ウラシリル（プソイドウラシル）、４−チオウラシリル、８−置換アデニニル及びグアニニル、５−置換ウラシリル及びシトシニル、７−メチルグアニニル、７−メチルアデニニル、８−アザグアニニル、８−アザアデニニル、７−デアザグアニニル、７−デアザアデニニル、３−デアザグアニニル及び３−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項３９】
各糖置換基が、独立的に、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−アルキルアミノ、−Ｏ−アルキルアルコキシ、−Ｏ−アルキルアミノアルキル、−Ｏ−アルキルイミダゾール、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキル、−Ｎ（Ｈ）−アルケニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキニル、−Ｎ（アルキル）２、−Ｏ−アリール、−Ｓ−アリール、−ＮＨ−アリール、−Ｏ−アラルキル、−Ｓ−アラルキル、−Ｎ（Ｈ）−アラルキル、フタルイミド（Ｎにおいて結合）、ハロゲン、アミノ、ケト（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ）、カルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、ニトロ（−ＮＯ２）、ニトロソ（−Ｎ＝Ｏ）、シアノ（−ＣＮ）、トリフルオロメチル（−ＣＦ３）、トリフルオロメトキシ（−Ｏ−ＣＦ３）、イミダゾール、アジド（−Ｎ３）、ヒドラジノ（−Ｎ（Ｈ）−ＮＨ２）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＨ２）、イソシアナト（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、スルホキシド（−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ）、スルホン（−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式（−Ｏ−アルキル）ｍ（式中、ｍは１〜約１０である）で示されるポリエーテルであり、この場合、各Ｒは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリール、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される；
或いは、各糖置換基が、式Ｉ又はＩＩのいずれかを有する：
【化１３】
2005504020.tif 000095
上記式において、
Ｚ０はＯ、Ｓ若しくはＮＨであり；
Ｊは単結合、Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）であり；
ＥはＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ７）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ６ａ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ７ａ）であるか、又は式ＩＩＩ：
【化１４】
2005504020.tif 000096
を有する；
各Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２は、独立的に、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される；
又は任意に、Ｒ１１とＲ１２は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する；
各Ｒ１３は、独立的に、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリールであり；
Ｒ５は、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｒ５ａは、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｔは、結合又は連結部分であり；
Ｌは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり；
各Ｒ６とＲ７は、独立的に、Ｈ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒ１４）（Ｒ１５）、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである；
或いは、Ｒ６とＲ７は一緒に、窒素保護基であるか、又はＮ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である；
各Ｒ１４とＲ１５は、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、窒素保護基であるか、又はＲ１４とＲ１５は一緒に、窒素保護基である；
或いは、Ｒ１４とＲ１５は、Ｎ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する；
Ｚ４は、ＯＸ、ＳＸ、又はＮ（Ｘ）２であり；
各Ｘは、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６である；
Ｒ１６はＨ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、約４〜約７個の炭素原子を有するか又は約３〜約６個の炭素原子と１若しくは２個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり；
Ｚ５は、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）ＯＲ５、ハロ、ＳＲ５又はＣＮであり；
各ｑ１は、独立的に、１〜１０の整数であり；
各ｑ２は、独立的に、０又は１であり；
ｑ３は０又は１〜１０の整数であり；
ｑ４は、１〜１０の整数であり；
ｑ５は、０、１又は２から選択される；ただし、ｑ３が０であるときに、ｑ４は１より大きい、請求項２１記載の方法。
【請求項４０】
前記糖置換基の各々が、独立的に、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、又はフルオロである、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を強化する方法であって、３’又は５’末端のいずれかに少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを有する前記オリゴヌクレオチドを調製することを含み、前記ヌクレオシドがその上に三環状複素環塩基部分を含む方法。
【請求項４２】
前記修飾ヌクレオシドが前記オリゴヌクレオチドの５’−末端に存在する、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記修飾ヌクレオシドが前記オリゴヌクレオチドの３’−末端に存在する、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
強化されたヌクレアーゼ耐性を有する前記オリゴヌクレオチドが、式：
【化１５】
2005504020.tif 000097
［式中、各Ｙ１は、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり；ＢＸ１、ＢＸ２及びＢＸ３の各々が複素環塩基部分であり、ＢＸ１及びＢＸ３の少なくとも１つは三環状塩基部分である；各Ａ１は、独立的に、水素又は２’−置換基であり；Ｔ１は水素又はヒドロキシル保護基であり；Ｔ２は水素又はヒドロキシル保護基であり；ｎは２〜約５０である］
で示される、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
ＢＸ１が三環状複素環塩基部分である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
ＢＸ３が三環状複素環塩基部分である、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記三環状複素環塩基部分の各々が、式：
【化１６】
2005504020.tif 000098
で示され、上記式において、
Ａ６はＯ又はＳであり；
Ａ７はＣＨ２、ＮＣＨ３、Ｏ又はＳであり；
各Ａ８及びＡ９は水素であるか、又はＡ８及びＡ９の一方は水素であり、Ａ８及びＡ９の他方は、
【化１７】
2005504020.tif 000099
［式中、Ｇ１は−ＣＮ、−ＯＡ２０、−ＳＡ２０、−Ｎ（Ｈ）Ａ２０、−ＯＮ（Ｈ）Ａ２０若しくは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０であり；Ｑ１はＨ、−ＮＨＡ２０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０若しくは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０であり；各Ｑ２は、独立的に、Ｈ若しくはＰｇであり；Ａ２０は、Ｈ、Ｐｇ、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アセチル、ベンジル、−（ＣＨ２）ｐ３ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｐ３Ｎ（Ｈ）Ｐｇ、Ｄ若しくはＬα−アミノ酸、又はＤ、Ｌ若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり；Ｐｇは窒素、酸素若しくはチオール保護基であり；各ｐ１は、独立的に、２〜約６であり；ｐ２は１〜約３であり；そしてｐ３は１〜約４である］
から成る群から選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
Ａ６がＯ又はＳであり；
Ａ７がＯ又はＳであり；
Ａ９がＨであり；
Ａ８が−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＮ（Ｈ）Ａ２１又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１であり；
Ａ２１が水素又はアミノ保護基である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
Ａ６がＯである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
Ａ６及びＡ７が両方ともＯである、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項４４記載の方法。
【請求項５２】
前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である、請求項４４記載の方法。
【請求項５４】
前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも１つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項４４記載の方法。
【請求項５５】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−から成る群から選択される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項４４記載の方法。
【請求項５９】
前記オリゴマー化合物が、前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも１つの領域において、少なくとも１つの２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３置換基を含む、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
ｎが約８〜約３０である、請求項４４記載の方法。
【請求項６１】
ｎが約１５〜約２５である、請求項４４記載の方法。
【請求項６２】
三環状複素環塩基部分ではない前記Ｂｘ１及びＢｘ３の各々と、前記Ｂｘ２の各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、５−メチルシトシニル（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、２−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、２−チオウラシリル、２−チオチミニル、２−チオシトシニル、５−ハロウラシリル、５−ハロシトシニル、５−プロピニルウラシリル、５−プロピニルシトシニル、６−アゾウラシリル、６−アゾシトシニル、６−アゾチミニル、５−ウラシリル（プソイドウラシル）、４−チオウラシリル、８−置換アデニニル及びグアニニル、５−置換ウラシリル及びシトシニル、７−メチルグアニニル、７−メチルアデニニル、８−アザグアニニル、８−アザアデニニル、７−デアザグアニニル、７−デアザアデニニル、３−デアザグアニニル及び３−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項６３】
各糖置換基が、独立的に、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−アルキルアミノ、−Ｏ−アルキルアルコキシ、−Ｏ−アルキルアミノアルキル、−Ｏ−アルキルイミダゾール、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキル、−Ｎ（Ｈ）−アルケニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキニル、−Ｎ（アルキル）２、−Ｏ−アリール、−Ｓ−アリール、−ＮＨ−アリール、−Ｏ−アラルキル、−Ｓ−アラルキル、−Ｎ（Ｈ）−アラルキル、フタルイミド（Ｎにおいて結合）、ハロゲン、アミノ、ケト（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ）、カルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、ニトロ（−ＮＯ２）、ニトロソ（−Ｎ＝Ｏ）、シアノ（−ＣＮ）、トリフルオロメチル（−ＣＦ３）、トリフルオロメトキシ（−Ｏ−ＣＦ３）、イミダゾール、アジド（−Ｎ３）、ヒドラジノ（−Ｎ（Ｈ）−ＮＨ２）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＨ２）、イソシアナト（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、スルホキシド（−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ）、スルホン（−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式（−Ｏ−アルキル）ｍ（式中、ｍは１〜約１０である）で示されるポリエーテルであり、この場合、各Ｒは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリール、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される；
或いは、各糖置換基が、式Ｉ又はＩＩのいずれかを有する：
【化１８】
2005504020.tif 000100
上記式において、
Ｚ０はＯ、Ｓ若しくはＮＨであり；
Ｊは単結合、Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）であり；
ＥはＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ７）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ６ａ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ７ａ）であるか、又は式ＩＩＩ又はＩＶ：
【化１９】
2005504020.tif 000101
のいずれかを有する；
各Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、独立的に、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される；
又は任意に、Ｒ９とＲ１０は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する；
又は任意に、Ｒ１１とＲ１２は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する；
各Ｒ１３は、独立的に、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリールであり；
Ｒ５は、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｒ５ａは、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｔは、結合又は連結部分であり；
Ｌは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり；
各Ｒ６とＲ７は、独立的に、Ｈ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒ１４）（Ｒ１５）、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである；
或いは、Ｒ６とＲ７は一緒に、窒素保護基であるか、又はＮ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である；
各Ｒ１４とＲ１５は、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、窒素保護基であるか、又はＲ１４とＲ１５は一緒に、窒素保護基である；
或いは、Ｒ１４とＲ１５は、Ｎ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する；
Ｚ４は、ＯＸ、ＳＸ、又はＮ（Ｘ）２であり；
各Ｘは、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６であり；
Ｒ１６はＨ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、約４〜約７個の炭素原子を有するか又は約３〜約６個の炭素原子と１若しくは２個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり；
Ｚ５は、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）ＯＲ５、ハロ、ＳＲ５又はＣＮであり；
各ｑ１は、独立的に、１〜１０の整数であり；
各ｑ２は、独立的に、０又は１であり；
ｑ３は０又は１〜１０の整数であり；
ｑ４は１〜１０の整数であり；
ｑ５は０、１又は２から選択される；ただし、ｑ３が０であるときに、ｑ４は１より大きい、請求項４１記載の方法。
【請求項６４】
前記２’−置換基が、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、又はフルオロである、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
式：
【化２０】
2005504020.tif 000102
で示されるオリゴマー化合物、
上記式において、
各Ｙ１は、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり；
各Ａ１は、独立的に、水素又は２’−置換基であり；
Ｔ１は、水素又はヒドロキシル保護基であり；
Ｔ２は、水素又はヒドロキシル保護基であり；
ｎは２〜約５０であり；
Ｂｘ４、Ｂｘ５及びＢｘ６の各々は、複素環塩基部分であり、Ｂｘ４、Ｂｘ５及びＢｘ６の少なくとも１つは、式：
【化２１】
2005504020.tif 000103
で示される三環状複素環塩基部分であり、この式において、
Ａ１０はＳであり、Ａ１１はＣＨ２、Ｏ若しくはＳである；又は
Ａ１０はＯであり、Ａ１１はＣＨ２である；
Ａ１２及びＡ１３の一方は水素であり、Ａ１２及びＡ１３の他方は、式：
【化２２】
2005504020.tif 000104
で示される基である、この場合、
各Ａ８及びＡ９は水素であるか、又はＡ８及びＡ９の一方は水素であり、Ａ８及びＡ９の他方は、
【化２３】
2005504020.tif 000105
［式中、Ｇ１は、−ＣＮ、−ＯＡ２０、−ＳＡ２０、−Ｎ（Ｈ）Ａ２０、−ＯＮ（Ｈ）Ａ２０若しくは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０であり；Ｑ１は、Ｈ、−ＮＨＡ２０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０若しくは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０であり；各Ｑ２は、独立的に、Ｈ若しくはＰｇであり；Ａ２０は、Ｈ、Ｐｇ、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アセチル、ベンジル、−（ＣＨ２）ｐ３ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｐ３Ｎ（Ｈ）Ｐｇ、Ｄ若しくはＬα−アミノ酸、又はＤ、Ｌ若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり；Ｐｇは、窒素、酸素若しくはチオール保護基であり；各ｐ１は、独立的に、２〜約６であり；ｐ２は１〜約３であり；そしてｐ３は１〜約４である］
から成る群から選択される。
【請求項６６】
Ａ１３がＨであり；
Ａ１２が、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＮ（Ｈ）Ａ２１若しくは−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１であり、Ａ２１が、水素又はアミノ保護基である、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項６７】
Ａ１０がＳである、請求項６６記載のオリゴマー化合物。
【請求項６８】
Ａ１１がＯである、請求項６７記載のオリゴマー化合物。
【請求項６９】
Ｂｘ４及びＢｘ６の少なくとも１つが三環状複素環塩基部分である、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項７０】
前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項７１】
前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項７０記載のオリゴマー化合物。
【請求項７２】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項７３】
前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも１つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項７４】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項７３記載のオリゴマー化合物。
【請求項７５】
前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項７４記載のオリゴマー化合物。
【請求項７６】
前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−から成る群から選択される、請求項７５記載のオリゴマー化合物。
【請求項７７】
オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項７８】
オリゴマー化合物が、前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも１つの領域において、少なくとも１つの２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３置換基を含む、請求項７７記載のオリゴマー化合物。
【請求項７９】
ｎが約８〜約３０である、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項８０】
ｎが約１５〜約２５である、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項８１】
三環状複素環塩基部分ではない前記Ｂｘ１及びＢｘ３の各々と、前記Ｂｘ２の各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、５−メチルシトシニル（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、２−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、２−チオウラシリル、２−チオチミニル、２−チオシトシニル、５−ハロウラシリル、５−ハロシトシニル、５−プロピニルウラシリル、５−プロピニルシトシニル、６−アゾウラシリル、６−アゾシトシニル、６−アゾチミニル、５−ウラシリル（プソイドウラシル）、４−チオウラシリル、８−置換アデニニル及びグアニニル、５−置換ウラシリル及びシトシニル、７−メチルグアニニル、７−メチルアデニニル、８−アザグアニニル、８−アザアデニニル、７−デアザグアニニル、７−デアザアデニニル、３−デアザグアニニル及び３−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項８２】
各糖置換基が、独立的に、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−アルキルアミノ、−Ｏ−アルキルアルコキシ、−Ｏ−アルキルアミノアルキル、−Ｏ−アルキルイミダゾール、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキル、−Ｎ（Ｈ）−アルケニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキニル、−Ｎ（アルキル）２、−Ｏ−アリール、−Ｓ−アリール、−ＮＨ−アリール、−Ｏ−アラルキル、−Ｓ−アラルキル、−Ｎ（Ｈ）−アラルキル、フタルイミド（Ｎにおいて結合）、ハロゲン、アミノ、ケト（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ）、カルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、ニトロ（−ＮＯ２）、ニトロソ（−Ｎ＝Ｏ）、シアノ（−ＣＮ）、トリフルオロメチル（−ＣＦ３）、トリフルオロメトキシ（−Ｏ−ＣＦ３）、イミダゾール、アジド（−Ｎ３）、ヒドラジノ（−Ｎ（Ｈ）−ＮＨ２）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＨ２）、イソシアナト（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、スルホキシド（−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ）、スルホン（−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式（−Ｏ−アルキル）ｍ（式中、ｍは１〜約１０である）で示されるポリエーテルであり、この場合、各Ｒは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリール、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される；
或いは、各糖置換基が、式Ｉ又はＩＩのいずれかを有する：
【化２４】
2005504020.tif 000106
上記式において、
Ｚ０はＯ、Ｓ若しくはＮＨであり；
Ｊは単結合、Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）であり；
ＥはＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ７）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ６ａ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ７ａ）であるか、又は式ＩＩＩ又はＩＶ：
【化２５】
2005504020.tif 000107
のいずれかを有する；
各Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、独立的に、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される；
又は任意に、Ｒ９とＲ１０は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する；
又は任意に、Ｒ１１とＲ１２は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する；
各Ｒ１３は、独立的に、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリールであり；
Ｒ５は、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｒ５ａは、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｔは、結合又は連結部分であり；
Ｌは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり；
各Ｒ６とＲ７は、独立的に、Ｈ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒ１４）（Ｒ１５）、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである；
或いは、Ｒ６とＲ７は一緒に、窒素保護基であるか、又はＮ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である；
各Ｒ１４とＲ１５は、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、窒素保護基であるか、又はＲ１４とＲ１５は一緒に、窒素保護基である；
或いは、Ｒ１４とＲ１５は、Ｎ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する；
Ｚ４は、ＯＸ、ＳＸ、又はＮ（Ｘ）２であり；
各Ｘは、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６であり；
Ｒ１６はＨ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、約４〜約７個の炭素原子を有するか又は約３〜約６個の炭素原子と１若しくは２個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり；
Ｚ５は、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）ＯＲ５、ハロ、ＳＲ５又はＣＮであり；
各ｑ１は、独立的に、１〜１０の整数であり；
各ｑ２は、独立的に、０又は１であり；
ｑ３は０又は１〜１０の整数であり；
ｑ４は、１〜１０の整数であり；
ｑ５は、０、１又は２から選択される；ただし、ｑ３が０であるときに、ｑ４は１より大きい、請求項６５記載のオリゴマー化合物。
【請求項８３】
前記２’−置換基が、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、又はフルオロである、請求項８１記載のオリゴマー化合物。
【請求項８４】
式：
【化２６】
2005504020.tif 000108
で示されるオリゴマー化合物、
上記式において、
各Ｙ１は、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり；
各Ａ１は、独立的に、水素又は２’−置換基であり；
Ｔ１は、水素又はヒドロキシル保護基であり；
Ｔ２は、水素又はヒドロキシル保護基であり；
ｎは、２〜約５０であり；
Ｂｘ７、Ｂｘ８及びＢｘ９の各々は、複素環塩基部分であり、Ｂｘ７、Ｂｘ８及びＢｘ９の少なくとも１つは、式：
【化２７】
2005504020.tif 000109
で示される三環状複素環塩基部分であり、上記式において、
Ａ１５は、Ｏ又はＳであり；
Ａ１６は、Ｈであり；
Ａ１７は、式：
【化２８】
2005504020.tif 000110
［式中、Ｇ１は、−ＣＮ、−ＯＡ２０、−ＳＡ２０、−Ｎ（Ｈ）Ａ２０、−ＯＮ（Ｈ）Ａ２０又は−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０であり；Ｑ１は、Ｈ、−ＮＨＡ２０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０又は−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０であり；各Ｑ２は、独立的に、Ｈ又はＰｇであり；Ａ２０は、Ｈ、Ｐｇ、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アセチル、ベンジル、−（ＣＨ２）ｐ３ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｐ３Ｎ（Ｈ）Ｐｇ、Ｄ若しくはＬα−アミノ酸、又はＤ、Ｌ若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり；Ｐｇは窒素、酸素若しくはチオール保護基であり；各ｐ１は、独立的に、２〜約６であり；ｐ２は１〜約３であり；ｐ３は１〜約４である］で示される基であるか、或いはＡ１７はＨであり、Ａ１６は、−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ１Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０、−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ１Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０、又は−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ１Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ２０から成る群から選択される。
【請求項８５】
Ａ１６がＨであり；
Ａ１７が−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＮ（Ｈ）Ａ２１若しくは−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ２１であり、Ａ２１は水素又はアミノ保護基である、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項８６】
Ａ１５がＳである、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項８７】
Ａ１５がＯである、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項８８】
前記ヌクレオシド間連結基の各々が、リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項８９】
前記リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及びボラノホスフェートから成る群から選択される、請求項８８記載のオリゴマー化合物。
【請求項９０】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項９１】
前記ヌクレオシド間連結基の少なくとも１つが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項９２】
前記ヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である、請求項９１記載のオリゴマー化合物。
【請求項９３】
前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、モルホリノ、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、及びアミドから成る群から選択される、請求項９２記載のオリゴマー化合物。
【請求項９４】
前記非リン含有ヌクレオシド間連結基の各々が、独立的に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−から成る群から選択される、請求項９３記載のオリゴマー化合物。
【請求項９５】
前記オリゴマー化合物が、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーである、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項９６】
オリゴマー化合物が、前記ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも１つの領域において、少なくとも１つの２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３置換基を含む、請求項９５記載のオリゴマー化合物。
【請求項９７】
ｎが約８〜約３０である、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項９８】
ｎが約１５〜約２５である、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項９９】
前記Ｂｘ２の各々と、三環状複素環塩基部分ではない前記Ｂｘ１及びＢｘ３の各々が、独立的に、アデニニル、グアニニル、チミニル、シトシニル、ウラシリル、５−メチルシトシニル（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシニル、キサンチニル、ヒポキサンチニル、２−アミノアデニニル、アデニニル及びグアニニルのアルキル誘導体、２−チオウラシリル、２−チオチミニル、２−チオシトシニル、５−ハロウラシリル、５−ハロシトシニル、５−プロピニルウラシリル、５−プロピニルシトシニル、６−アゾウラシリル、６−アゾシトシニル、６−アゾチミニル、５−ウラシリル（プソイドウラシル）、４−チオウラシリル、８−置換アデニニル及びグアニニル、５−置換ウラシリル及びシトシニル、７−メチルグアニニル、７−メチルアデニニル、８−アザグアニニル、８−アザアデニニル、７−デアザグアニニル、７−デアザアデニニル、３−デアザグアニニル及び３−デアザアデニニルから成る群から選択される、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項１００】
各糖置換基が、独立的に、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−アルキルアミノ、−Ｏ−アルキルアルコキシ、−Ｏ−アルキルアミノアルキル、−Ｏ−アルキルイミダゾール、−ＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキル、−Ｎ（Ｈ）−アルケニル、−Ｎ（Ｈ）−アルキニル、−Ｎ（アルキル）２、−Ｏ−アリール、−Ｓ−アリール、−ＮＨ−アリール、−Ｏ−アラルキル、−Ｓ−アラルキル、−Ｎ（Ｈ）−アラルキル、フタルイミド（Ｎにおいて結合）、ハロゲン、アミノ、ケト（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ）、カルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、ニトロ（−ＮＯ２）、ニトロソ（−Ｎ＝Ｏ）、シアノ（−ＣＮ）、トリフルオロメチル（−ＣＦ３）、トリフルオロメトキシ（−Ｏ−ＣＦ３）、イミダゾール、アジド（−Ｎ３）、ヒドラジノ（−Ｎ（Ｈ）−ＮＨ２）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＨ２）、イソシアナト（−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ）、スルホキシド（−Ｓ（＝Ｏ）−Ｒ）、スルホン（−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｒ）、シリル、ヘテロサイクリル、カルボサイクリル、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート基、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、又は式（−Ｏ−アルキル）ｍ（式中、ｍは１〜約１０である）で示されるポリエーテルであり、この場合、各Ｒは、独立的に、水素、保護基、又は置換若しくは非置換アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、これらにおいて、置換基はハロアルキル、アルケニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロアルコキシ又はアリールから選択される）、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド基、スルホニル基及びスルホキシド基から選択される；
或いは、各糖置換基が、式Ｉ又はＩＩのいずれかで示され、式中、
Ｚ０は、Ｏ、Ｓ若しくはＮＨであり；
Ｊは、単結合、Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）であり；
Ｅは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ７）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ６ａ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ７ａ）であるか、又は式ＩＩＩ若しくはＩＶ：
【化２９】
2005504020.tif 000111
のいずれかを有する；
各Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１及びＲ１２は、独立的に、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基若しくはコンジュゲート基であり、この場合、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される；
又は任意に、Ｒ９とＲ１０は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する；
又は任意に、Ｒ１１とＲ１２は一緒に、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する；
各Ｒ１３は、独立的に、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソーブチリル、フェニル又はアリールであり；
Ｒ５は、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｒ５ａは、水素、窒素保護基又は−Ｔ−Ｌであり；
Ｔは、結合又は連結部分であり；
Ｌは、化学官能基、コンジュゲート基又は固体支持体であり；
各Ｒ６とＲ７は、独立的に、Ｈ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルであり、これらにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒ１４）（Ｒ１５）、グアニジノ及びアシルから選択され、前記アシルは、酸アミド又はエステルである；
或いは、Ｒ６とＲ７は一緒に、窒素保護基であるか、又はＮ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合するか、又は化学官能基である；
各Ｒ１４とＲ１５は、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、窒素保護基であるか、又はＲ１４とＲ１５は一緒に、窒素保護基である；
或いは、Ｒ１４とＲ１５は、Ｎ及びＯから選択される付加的ヘテロ原子を任意に包含する環構造として結合する；
Ｚ４は、ＯＸ、ＳＸ、又はＮ（Ｘ）２であり；
各Ｘは、独立的に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６であり；
Ｒ１６は、Ｈ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、約４〜約７個の炭素原子を有するか又は約３〜約６個の炭素原子と１若しくは２個のヘテロ原子とを有し、前記ヘテロ原子が酸素、窒素及び硫黄から選択される環系を含み、前記環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は飽和若しくは不飽和複素環式であり；
Ｚ５は、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル若しくはハロアルキル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）ＯＲ５、ハロ、ＳＲ５又はＣＮであり；
各ｑ１は、独立的に、１〜１０の整数であり；
各ｑ２は、独立的に、０又は１であり；
ｑ３は０又は１〜１０の整数であり；
ｑ４は、１〜１０の整数であり；
ｑ５は、０、１又は２から選択される；ただし、ｑ３が０であるときに、ｑ４は１より大きい、請求項８４記載のオリゴマー化合物。
【請求項１０１】
前記２’−置換基が、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、又はフルオロである、請求項１００記載のオリゴマー化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２００１年１２月１０日出願の米国特許出願第１０／０１３，２９５号；２００１年１１月２８日出願の米国特許出願第０９／９９６，２９２号；および２００１年７月３日出願の米国仮特許出願第６０／３０２，６８２号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新規なヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物およびオリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を増加させる新規な方法に関する。
【０００３】
発明の背景
生体系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＮ）の効力および配列特異的性質は、酵素分解へのそれらの耐性に依存する。したがって、強力なアンチセンス薬を設計する場合、高い結合親和性およびミスマッチ感受性などの特徴とヌクレアーゼ耐性とを組み合わせることが不可欠である。未修飾ホスホジエステルアンチセンスオリゴヌクレオチドは、加水分解酵素を含有する体液中で速やかに分解されるが（Shaw,J.P.; Kent,K.; Bird,J.; Fishback,J.; Froehler,B. Nucleic Acids Res. 1991,19,747-750; Woolf,T.M.; Jennings,C.G.B.; Rebagliati,M; Melton,D.A. Nucleic Acids Res. 1990,18,1763-1769）、２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド薬の最初に作られたものも、酵素分解を受けた（Maier,M.; Bleicher,K.; Kalthoff,H.; Bayer,E. Biomed.Pept., Proteins Nucleic Acids 1995,1,235-241; Agrawal,S.; Temsamani,J.; Tang,J.Y. Proc.Natl.Acad.Sci. 1991,88,7595-7599）。生体系に存在する種々のヌクレアーゼに対する広範な安定性は、修飾オリゴヌクレオチドによって最も良く達成することができる。３’エキソヌクレアーゼ活性は、主に、血清含有培地中および種々の真核細胞系における酵素分解の原因となっているので、３’末端に位置する修飾は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性に有意に寄与する（Shaw,J.-P.; Kent,K.; Bird,J.; Fishback,J.; Froehler,B. Nucleic Acids Res. 1991,19,747-750; Maier,M.; Bleicher,K.; Kalthoff,H.; Bayer,E. Biomed.Pept., Proteins Nucleic Acids 1995,1,235-241）。
【０００４】
広範な修飾が、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合および糖部分に行われてきているが、複素環式塩基部分への修飾は、塩基対特異性に必要とされる特異的水素結合モチーフを維持する要望のために、比較的限られている（概説については、Herdewijn,P. Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 2000,10,297-310 を参照されたい）。２’位は、ヌクレアーゼ耐性および結合親和性双方を増大させる利点を与えるので、誘導体化にとって魅力的である（Manoharan,M. Biochim.Biophys.Acta 1999,1489,117-130; Kawasaki,A.M.; Casper,M.D.; Prakash,T.P.; Manalili,S.; Sasmor,H.; Manoharan,M.; Cook,P.D. Nucleosides Nucleotides 1999,18,1419-1420）。
【０００５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのそれらの相補的標的鎖への結合親和性を増大させるように設計されたきわめて多数の核酸塩基修飾が、最近紹介されている（Beaucage,S.L.; Iyer,R.P. Tetrahedron 1993;49,6123-94; Cook,P.D. Annu.Rep.Med.Chem. 1998,33,313-325; Goodchild,J. Bioconjugate Chemistry, 1990;1,165-87; Uhlmann,E.; Peyman,A. Chem.Rev. 1990,90,543-84. 概説については、Uhlmann,E.; Peyman,A. Chem.Rev. 1990,90,543-584; Milligan,J.F.; Matteucci,M.D.; Martin,J.C. J.Med.Chem. 1993,36,1923-37; Cook,P.D. Antisense medicinal chemistry. In: Antisense Research and Application, A Handbook of Experimental Pharmacology (ed. Crooke,S.t.), pp.51-101. Springer-Verlag, New York, 1998 を参照されたい）。若干の複素環修飾は、増加した水素結合および／または塩基スタッキング相互作用によって核酸の結合親和性を増大させることが分かっている。このような複素環修飾の例には、２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これは、チミジンとの第３位の水素結合、およびピリミジン塩基のＣ５位の水素原子のプロピニル基での置換を可能にし、増加したスタッキング相互作用を生じる（Chollet,A.; Chollet-Damerius,A.; Kawashima,E.H. Chem.Scripta 1986,26,37-40; Wagner,R.W.; Matteucci,M.D.; Lewis,J.G.; Guttierrez,A.J.; Moulds,C.; Froehler,B.C. Science 1993,260,1510-1513）。
【０００６】
より最近では、フェノキサジン、フェノチアジン（Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874）およびテトラフルオロフェノキサジン（Wang,J.; Lin,K.-Y., Matteucci,M. Tetrahedron Lett. 1998,39,8385-8388）などのいくつかの三環式シトシン類似体が開発され、グアニンにハイブリッド形成すること、しかもテトラフルオロフェノキサジンの場合はアデニンともハイブリッド形成することが分かっている。これら三環式シトシン類似体は、伸長したスタッキング相互作用によってらせんの熱安定性を増大させることも分かっている。
【０００７】
三環式シトシン類似体のらせんを安定化する性質は、剛性フェノキサジンスカホールドに取り付けられたアミノエトキシ部分を含むシトシン類似体であるＧ−クランプで更に向上する（Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532）。結合研究は、単一のＧ−クランプが、モデルオリゴヌクレオチドのその相補的標的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合親和性を、単一修飾について知られている最も高い親和性増大である５−メチルシトシン（ｄＣ５ｍｅ）に相対して１８°までのΔＴｍで増大させるということを示している。このＴｍデータは、ｄＣ５ｍｅと比較したところ、完全に対合した配列と誤対合配列との間になお一層大きい差を示すので、らせん安定性の増加は、オリゴヌクレオチドの結合特異性に影響することはない。束縛されたアミノ基は、相補的グアニンのフーグスティーン面、すなわちＯ６と相互作用する追加の水素結合ドナーとして役立ちうる。したがって、Ｇ−クランプの増加した親和性は、伸長した塩基スタッキングと追加の水素結合との組合せによって媒介されると考えられる。
【０００８】
フェノキサジン誘導体の増大した結合親和性は、それらの影響されない配列特異性と一緒に、それら誘導体を、アンチセンスに基づいたより強力な薬物の開発に有効な核酸塩基類似体にする。有望なデータは、フェノキサジン置換を含有するヘプタヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨを活性化することができ、細胞内取込みを促し、そして増加したアンチセンス活性を示すということを実証している in vitro 実験に由来している（Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532）。単一置換が、２０マーの２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの in vitro 力価を有意に向上させることが示されたところでは、この活性増大は、Ｇ−クランプの場合になお一層顕著であった（Flanagan,W.M.; Wolf,J.J.; Olson,P.; Grant,D.; Lin,K.-Y.; Wagner,R.W.; Matteucci,M. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1999,96,3513-3518）。
【０００９】
生体系におけるオリゴヌクレオチドの効力および配列特異性は、一部分は、それらのヌクレアーゼ安定性に依存する。生体系に存在する多数のヌクレアーゼへの耐性は、修飾オリゴヌクレオチドによって最も良く達成される。したがって、修飾ヌクレオチドを設計する場合、酵素分解へのそれらの耐性を評価し且つ最適化することが不可欠である。
【００１０】
発明の概要
本発明は、新規なヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物、及びオリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を増強するための新規な方法に関する。
【００１１】
好ましい実施態様では、本発明の化合物は、式Ｖ：
【００１２】
【化１】
2005504020.tif 000003
【００１３】
で示されるオリゴマー化合物に関する、上記式において、
ｎは３〜約５０であり；各Ｙ１は、独立的に、ヌクレオシド間連結基であり；Ｙ２は酸素又はヌクレオシド間連結基であり；Ｙ３は酸素又はヌクレオシド間連結基であり；各Ｂｘは任意に保護される複素環塩基部分であり；各Ａ１は、独立的に、水素又は糖置換基であり；Ｗ１は水素、ヒドロキシル保護基又は
【００１４】
【化２】
2005504020.tif 000004
【００１５】
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり；Ｗ２は水素、ヒドロキシル保護基又は
【００１６】
【化３】
2005504020.tif 000005
【００１７】
から成る群から選択される修飾ヌクレオシドであり；各Ａ２は、独立的に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルカリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、アミノ、置換アミノ、−ＳＨ、−ＳＡ３、チオールエーテル、Ｆ、又はモルホリノであり；各Ａ３は、独立的に、Ｈ、硫黄保護基、アリール、アルカリール、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、又はアルカリールであり、前記置換基はＯＡ５又はＳＡ５であり；各Ａ４は、独立的に、Ｈ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、又はアルカリールであり、前記置換基はＯＡ５又はＳＡ５であり；各Ａ５は、独立的に、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、シクロアルキル又はアリールであり；各Ｖ１は、独立的に、Ｏ又はＳであり；Ｗ１とＷ２の少なくとも１つは、水素でも又はヒドロキシル保護基でもなく、少なくとも１つのヌクレオシド間連結基は、ホスホジエステル連結基ではない。
【００１８】
ある一定の好ましい実施態様では、式Ｖで示される化合物のヌクレオシド間連結基は、リン含有ヌクレオシド間連結基である。さらにより好ましい実施態様では、式Ｖで示される化合物の少なくとも１つのヌクレオシド間連結基は、ホスホジエステル以外であり、より好ましくは、式Ｖで示される化合物のヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、非リン含有ヌクレオシド間連結基である。なお一層好ましい実施態様では、式Ｖで示される化合物のヌクレオシド間連結基の９０％より多くが、ホスホロチオエート連結基である。
【００１９】
本発明のある一定の他の実施態様では、式Ｖで示されるオリゴマー化合物は、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーを含む。より好ましい実施態様では、式Ｖで示されるオリゴマー化合物は、ギャップマー、ヘミマー又は逆ギャップマーの少なくとも１つの領域に少なくとも１つの２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３糖置換基を含む。
【００２０】
本発明の他の実施態様では、式Ｖで示されるオリゴマー化合物は、Ｂｘが多環状複素環塩基部分である、少なくとも１つのヌクレオシドを含む。より好ましい実施態様では、式Ｖで示されるオリゴマー化合物は、Ｂｘが、独立的に、式：
【００２１】
【化４】
2005504020.tif 000006
【００２２】
で示される、少なくとも１つのヌクレオシドを含む、上記式において、
Ａ６はＯ又はＳであり；Ａ７はＣＨ２、Ｎ−ＣＨ３、Ｏ又はＳであり；各Ａ８及びＡ９は水素であるか、又はＡ８及びＡ９の一方は水素であり、Ａ８及びＡ９の他方は、式：
【００２３】
【化５】
2005504020.tif 000007
【００２４】
から成る群から選択される、上記式において、
Ｇは、−ＣＮ、−ＯＡ１０、−ＳＡ１０、−Ｎ（Ｈ）Ａ１０、−ＯＮ（Ｈ）Ａ１０又は−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０であり；Ｑ１は、Ｈ、−ＮＨＡ１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０又は−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０であり；各Ｑ２は、独立的に、Ｈ又はＰｇであり；Ａ１０はＨ、Ｐｇ、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アセチル、ベンジル、−（ＣＨ２）ｐ３ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｐ３Ｎ（Ｈ）Ｐｇ、Ｄ若しくはＬα−アミノ酸、又はＤ、Ｌ若しくはラセミα−アミノ酸に由来するペプチドであり；Ｐｇは窒素、酸素又はチオール保護基であり；各Ｐ１は、独立的に、２〜約６であり；Ｐ２は１〜約３であり；そしてＰ３は１〜約４である。
【００２５】
本発明の他の好ましい実施態様では、式ＶのＹ３はヌクレオシド間連結基であり、式ＶのＷ１は修飾ヌクレオシドである。本発明の他の実施態様では、式ＶのＹ２はヌクレオシド間連結基であり、式ＶのＷ２は修飾ヌクレオシドである。
【００２６】
本発明のある一定の好ましい実施態様では、式Ｖの各糖置換基は、独立的に、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｏ−ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、又はフルオロである。
【００２７】
他の好ましい実施態様では、本発明は、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を強化する方法であって、該オリゴマー化合物の３’又は５’末端のいずれかに少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを与えて、式ＶのＷ１及びＷ２の少なくとも１つが水素でもなく、またヒドロキシル保護基でもないような、式Ｖで示される修飾オリゴマー化合物を得ることを含む方法に関する。
【００２８】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の文脈中において、「オリゴマー」および「オリゴマー化合物」という用語は、特異的配列中に互いに接続される複数の天然に存在するまたは天然に存在しないヌクレオシドを意味する。この「オリゴマー」および「オリゴマー化合物」という用語には、オリゴマー化合物を領域に分ける二つ以上のタイプのヌクレオシド間結合が存在しているオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシドおよびキメラオリゴマー化合物が含まれる。オリゴマー化合物は、典型的には、天然に存在するまたは合成の野生型オリゴヌクレオチドと構造的に区別しうるが、機能的になお交換可能である。したがって、オリゴマー化合物には、所望のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の構造および／または機能を模擬するように、例えば、標的にハイブリッド形成することによって有効に機能する全てのこのような構造が含まれる。
【００２９】
本発明の文脈中において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその模擬体のオリゴマーまたはポリマーを意味する。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖およびヌクレオシド間（主鎖）共有結合を含んでなるオリゴヌクレオチド、更には、天然に存在しない部分を有する同様に機能するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、増大した細胞内取込み、増大した核酸標的への親和性およびヌクレアーゼの存在下の増加した安定性などの望ましい性質ゆえに、しばしば、天然の形より好適である。
【００３０】
当該技術分野において知られているように、ヌクレオシドは塩基−糖組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は、複素環式塩基である。このような複素環式塩基の最も一般的な二つのクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドであって、そのヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に包含するヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するそれらヌクレオシドについて、リン酸基は、糖の２’か、３’かまたは５’ヒドロキシル部分に連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成する場合、これらリン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて、直鎖状ポリマー化合物を形成する。順次に、この直鎖状ポリマー構造のそれぞれの末端を更に接続して、環状構造を形成することができる。しかしながら、概して、開放直鎖状構造が好適である。オリゴヌクレオチド構造内では、これらリン酸基は、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成しているといわれている。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または主鎖は、３’〜５’ホスホジエステル結合である。
【００３１】
本発明において有用な好ましいオリゴマー化合物の具体的な例には、修飾された主鎖または天然に存在しないヌクレオシド間結合を有するものが含まれる。本明細書中に定義されるように、修飾された主鎖には、主鎖中にリン原子を有するもの、および主鎖中にリン原子を有していないものが含まれる。本明細書の目的のために、および当該技術分野において時々論及されるように、ヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。
【００３２】
好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート；キラルホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；ホスホトリエステル；アミノアルキルホスホトリエステル；３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート；ホスフィネート；３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含めたホスホロアミデート；チオノホスホロアミデート；チオノアルキルホスホネート；チオノアルキルホスホトリエステル；通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、および１個またはそれを超えるヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である逆方向極性を有するものが含まれる。逆方向極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、大部分の３’−ヌクレオチド間結合に単一の３’−３’結合、すなわち、非塩基性であってよい（核酸塩基が欠失しているまたは核酸塩基の代わりにヒドロキシル基を有する）単一逆ヌクレオシド残基を含む。種々の塩、混合塩および遊離酸の形も包含される。
【００３３】
代表的なリン含有結合
ホスホロジチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｓ）−Ｏ−）；
ホスホロチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）−Ｏ−）；
ホスホロアミデート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＪ２）−Ｏ−）；
ホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｊ）（Ｏ）−Ｏ−）；
ホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（ＯＪ）（Ｏ）−Ｏ−）；
ホホスホロアミデート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｓ−）；
チオノアルキルホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｊ）−Ｏ−）；
チオノアルキルホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＪ）−Ｓ−）；
ホスホロアミデート（−Ｎ（Ｊ）−Ｐ（Ｏ）（Ｏ）−Ｏ−）；
ボラノホスフェート（−Ｒ５−Ｐ（Ｏ）（Ｏ）−Ｊ−）
式中、Ｊは、一般的には、水素またはアルキル基、または一つのタイプの結合から別のものへと変化する一層複雑な基である置換基を示す。
【００３４】
上記のリン含有結合の製造を教示している代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用され且つ若干のものは本出願と同一所有される、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号；および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００３５】
リン原子をその中に包含しない好ましい修飾主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または一つまたはそれを超える短鎖ヘテロ原子または複素環のヌクレオシド間結合によって形成されるものである。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部分形成される）を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；およびＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合成分部分を有するその他が含まれる。
【００３６】
代表的なリン不含結合
チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）；
チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｓ−）；
シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｊ）２−Ｏ−）；
カルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−および−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）；
スルファメート（−Ｏ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｎ−および−Ｎ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｎ−）；
モルホリノスルファミド（−Ｏ−Ｓ（Ｏ）（Ｎ（モルホリノ）−）；
スルホンアミド（−Ｏ−ＳＯ２−ＮＨ−）；
スルフィド（−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−）；
スルホネート（−Ｏ−ＳＯ２−ＣＨ２−）；
Ｎ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）；
チオホルムアセタール（−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−）；
ホルムアセタール（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）；
チオケタール（−Ｓ−Ｃ（Ｊ）２−Ｏ−）；および
ケタール（−Ｏ−Ｃ（Ｊ）２−Ｏ−）；
アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）；
ヒドロキシルアミン（−ＣＨ２−Ｎ（Ｊ）−Ｏ−）；
ヒドロキシルイミン（−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−）；および
ヒドラジニル（−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｎ（Ｈ）−）。
【００３７】
式中、Ｊは、一般的には、水素またはアルキル基、または一つのタイプの結合から別のものへと変化する一層複雑な基である置換基を示す。
上記のオリゴヌクレオシドの製造を教示している代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用され且つ若干のものは本出願と同一所有される、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号；および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００３８】
ある一定の好ましいオリゴヌクレオチド模擬体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、すなわち、主鎖は両方とも、新規な基で置換される。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが分かっているオリゴヌクレオチド模擬体である一つのこのようなオリゴマー化合物を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称する。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミド含有主鎖、具体的には、アミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の製造を教示している代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用される米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号が含まれるが、これに制限されるわけではない。ＰＮＡ化合物の更に別の教示は、Nielsen et al., Science, 1991,254,1497-1550 に見出されうる。
【００３９】
本発明の好ましい化合物の中には、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子主鎖、具体的には、上に挙げられた米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）ＭＭＩ主鎖としてまたはより一般的には、メチレンイミノとして知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−、および上に挙げられた米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖を有するオリゴヌクレオチドがある。更に好適なのは、上に挙げられた米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【００４０】
本明細書中で用いられる「Ｂｘ」は、複素環式塩基部分を示すものである。本発明にしたがう複素環式塩基部分（しばしば、当該技術分野において単純に「塩基」または「核酸塩基」と称される）には、天然に存在するまたは天然に存在しない核酸塩基が含まれる。この塩基の一つのまたはそれを超える官能基は、保護基を有することができる。本明細書中で用いられる「未修飾」または「天然の」核酸塩基には、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）のプリン塩基、およびチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）のピリミジン塩基が含まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、および３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。更に別の修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）のようなＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）のような三環式ピリミジンが含まれる。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置換されているものが含まれる。
【００４１】
更に別の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz,J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990 に開示されたもの、Englisch et al., Angewandte Chemie,International Edition, 1991,30,613 によって開示されたもの、および Sanghvi,Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke,S.T. and Lebleu,B., ed., CRC Press, 1993 によって開示されたものが含まれる。ある一定のこれら核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、および２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めたＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重らせん安定性を０．６〜１．２℃増加させることが分かっており（Sanghvi,Y.S., Crooke,S.T. and Lebleu,B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993,pp.276-278）、現在のところ、より具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合でも、好適な塩基置換である。
【００４２】
ある一定の上記修飾核酸塩基並びに他の修飾核酸塩基の製造を教示する代表的な米国特許には、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、並びに、各々が本明細書中に援用され且つ若干のものは本出願と同一所有される米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８号；第６，００５，０９６号；第５，６８１，９４１号；および第５，７５０，６９２号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００４３】
本発明の一つの側面において、オリゴマー化合物は、多環式複素環式塩基部分を含む一つまたはそれを超える複素環式塩基部分を有して製造される。本明細書中で用いられる多環式複素環式塩基部分という用語は、少なくとも３個またはそれを超える縮合環を含む化合物を包含する意味である。多数の三環式および若干の四環式の複素環式化合物が製造されていて、オリゴマー化合物中の天然に存在する複素環式塩基部分の代わりに代用されている。得られたオリゴマー化合物は、例えば、標的鎖への修飾鎖の結合性を増加させるアンチセンス用途に用いられてきている。より多くの研究された修飾は、グアノシンに集中していて、一般的には、シチジン類似体と称される。
【００４４】
本発明の一つの側面において、多環式複素環式塩基部分は、式
【００４５】
【化６】
2005504020.tif 000008
【００４６】
を有する。
第２鎖中または同じ鎖中の他のところのグアノシンと３個の水素結合を作る代表的なシトシン類似体には、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ，Ｒ１１〜Ｒ１４＝Ｈ）［Kurchavov, et al., Nucleosides and Nucleotides, 1997,16,1837-1846］、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｓ，Ｒ１１〜Ｒ１４＝Ｈ）［Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874］および６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ，Ｒ１１〜Ｒ１４＝Ｆ）［Wang,J.; Lin,K.-Y., Matteucci,M. Tetrahedron Lett. 1998,39,8385-8388］が含まれる。オリゴヌクレオチド中に包含されると、これら塩基修飾は、相補的グアニンとハイブリッド形成することが分かっており、この後者は、アデニンとハイブリッド形成することおよび伸長したスタッキング相互作用によってらせん熱安定性を増大させることも分かっている。
【００４７】
更に別の、らせんを安定化させる性質が、アミノエトキシ部分を有するシトシン類似体が剛性１，３−ジアザフェノキサジン−２−オンスカホールドに取り付けられた場合に認められている（Ｒ１０＝Ｏ，Ｒ１１＝−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２，Ｒ１２−１４＝Ｈ，この類似体は、「Ｇ−クランプ」という具体的な名称を与えられている）［Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532］。結合研究は、単一の包含が、モデルオリゴヌクレオチドのその相補的標的ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合親和性を、単一修飾について知られている最も高い親和性増大でもある５−メチルシトシン（ｄＣ５ｍｅ）に相対して１８℃までのΔＴｍで増大させうるということを示した。もう一方において、らせん安定性の増加は、それらオリゴヌクレオチドの特異性に影響することはない。このＴｍデータは、ｄＣ５ｍｅと比較して、完全な対合配列と誤対合配列との間になお一層大きい差を示す。束縛されたアミノ基は、相補的グアニンのフーグスティーン面、すなわちＯ６と相互作用することによって４個の水素結合を形成する追加の水素結合ドナーとして役立つということが示唆された。これは、Ｇ−クランプの増加した親和性が、伸長した塩基スタッキングと追加の特異的水素結合との組合せによって媒介されるということを意味している。
【００４８】
本発明にしたがう更に別の多環式複素環式塩基部分およびそれらの使用方法は、２０００年５月２２日発行の米国特許第６，０２８，１８３号および１９９９年１２月２８日発行の米国特許第６，００７，９９２号に開示され、この両者の内容は、本出願と共通に譲渡され且つ本明細書中に援用される。このような化合物には、次の式
【００４９】
【化７】
2005504020.tif 000009
【００５０】
を有するものが含まれる。
式中、Ｒ１１には、（ＣＨ３）２Ｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−；Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−；Ｐｈ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−；Ｈ２Ｎ−；フルオレニル−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−；フタルイミジル−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−；Ｐｈ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｏ−；Ｐｈ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−Ｏ−；（ＣＨ３）２Ｎ−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｏ−；フルオレニル−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｏ−；フルオレニル−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−Ｏ−；Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−；Ｎ３−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−；Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−およびＮＨ２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ−が含まれる。
【００５１】
更に開示されるのは、式
【００５２】
【化８】
2005504020.tif 000010
【００５３】
を有する多環式複素環式化合物である。
式中、Ｒ１０ａは、Ｏ、ＳまたはＮ−ＣＨ３であり；
Ｒ１１ａは、Ａ（Ｚ）Ｘ１であり、ここにおいて、Ａはスペーサーであり、そしてＺは、独立して、検出可能な標識に結合されてよい基を結合している標識結合性基であるが、Ｒ１１ａは、アミン、保護されたアミン、ニトロまたはシアノではなく；
Ｘ１は、１、２または３であり；そして
Ｒｂは、独立して、−ＣＨ＝、−Ｎ＝、−Ｃ（Ｃ１−８アルキル）＝または−Ｃ（ハロゲン）＝であるが、隣接したＲｂが両方とも−Ｎ＝であることはないし、または二つの隣接したＲｂは一緒になって、次の構造
【００５４】
【化９】
2005504020.tif 000011
【００５５】
（式中、Ｒｃは、独立して、−ＣＨ＝、−Ｎ＝、−Ｃ（Ｃ１−８アルキル）＝または−Ｃ（ハロゲン）＝であるが、隣接したＲｂが両方とも−Ｎ＝であることはない）
を有する環を形成する。
【００５６】
フェノキサジン誘導体の増大した結合親和性は、それらの影響されない配列特異性と一緒に、これら多環式複素環式塩基部分を、アンチセンスに基づいたより強力な薬物の開発に有効な核酸塩基類似体にする。事実、有望なデータは、フェノキサジン置換を含有するヘプタヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨを活性化することができ、細胞内取込みを促し、そして増加したアンチセンス活性を示すということを実証している in vitro 実験に由来している［Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532］。単一置換が、２０マーの２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの in vitro 力価を有意に向上させることが示されたところでは、複素環式塩基部分がＧ−クランプであった場合、活性増大はなお一層顕著であった［Flanagan,W.M.; Wolf,J.J.; Olson,P.; Grant,D.; Lin,K.-Y.; Wagner,R.W.; Matteucci,M. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1999,96,3513-3518］。それにもかかわらず、オリゴヌクレオチド設計を最適にするためにおよび生物学的活性へのこれら多環式複素環式塩基修飾の影響をより良く理解するためには、オリゴマーのヌクレアーゼ安定性へのそれらの作用を評価することが重要である。
【００５７】
本発明にしたがう三環式および四環式ヘテロアリール化合物を含む更に別の多環式複素環式塩基部分には、式
【００５８】
【化１０】
2005504020.tif 000012
【００５９】
（式中、Ｒ１４はＮＯ２であり、またはＲ１４およびＲ１２は両方とも、独立して、−ＣＨ３である）
を有するものが含まれる。これら化合物の合成は、１９９５年７月１８日発行の米国特許第５，４３４，２５７号、１９９６年３月２６日発行の米国特許第５，５０２，１７７号および１９９７年７月８日発行の米国特許第５，６４６，２６９号に開示され、これらの内容は、本出願と共通に譲渡され且つ本明細書中に援用される。
【００６０】
この「２５７号，１７７号および２６９号」特許にも開示された、本発明にしたがう更に別の多環式複素環式塩基部分には、式
【００６１】
【化１１】
2005504020.tif 000013
【００６２】
（式中、ａおよびｂは、独立して、０または１であり、但し、ａおよびｂの合計は０または１であり；
Ａは、Ｎ、ＣまたはＣＨであり；
Ｘは、Ｓ、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、ＮＨまたはＮＣＨ２、Ｒ６であり；
Ｙは、Ｃ＝Ｏであり；
Ｚは、Ａと一緒になって、５個または６個の環原子を含むアリールまたはヘテロアリール環構造を形成し、ここにおいて、このヘテロアリール環は、１個のＯ環ヘテロ原子、１個のＮ環ヘテロ原子、１個のＳ環ヘテロ原子、炭素原子で隔てられた１個のＯおよび１個のＮの環ヘテロ原子、Ｃ原子で隔てられた１個のＳおよび１個のＮの環ヘテロ原子、炭素原子で隔てられた２個のＮ環ヘテロ原子、または少なくとも２個は炭素原子で隔てられている３個のＮ環ヘテロ原子を含み、そしてこのアリールまたはヘテロアリール環の炭素原子は、Ｈ以外で未置換であり、または少なくとも１個の非架橋環炭素原子は、Ｒ２０または＝Ｏで置換されていて；または
Ｚは、Ａと一緒になって、６個の環原子を含むアリール環構造を形成し、ここにおいて、アリール環炭素原子は、Ｈ以外で未置換であり、または少なくとも１個の非架橋環炭素原子は、Ｒ６または＝Ｏで置換されていて；
Ｒ６は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ３）２、ＣＮまたはハロであり、またはＲ６は、隣接したＺ基Ｒ６と一緒になって、フェニル環を完成し；
Ｒ２０は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ２１）２、ＣＮまたはハロであり、またはＲ２０は、隣接したＲ２０と一緒になって、５個または６個の環原子を含有する環、およびその互変異性体、溶媒和化合物および塩を完成し；
Ｒ２１は、独立して、Ｈまたは保護基であり；
Ｒ３は、保護基またはＨである）
を有するもの；およびそれらの互変異性体、溶媒和化合物および塩が含まれる。
【００６３】
この「２５７号，１７７号および２６９号」特許に含まれるより具体的な例は、式
【００６４】
【化１２】
2005504020.tif 000014
【００６５】
（式中、Ｒ１６は、各々独立して、水素および種々の置換基より選択される）
を有する化合物である。
本発明は、好ましいヌクレオシド間結合が３’，５’−結合である複数の連結したヌクレオシドを含むオリゴマー化合物を提供する。或いは、２’，５’−結合を用いることができる（１９９８年７月１４日出願の米国特許出願第０９／１１５，０４３号に記載のような）。２’，５’−結合は、一つのヌクレオチドサブユニットの糖部分の２’位を、隣接したヌクレオチドサブユニットの糖部分の５’位と共有結合によって連結するものである。
【００６６】
本明細書中に記載の化合物は、不斉中心を有してよい。特に断らない限り、キラルの形、ジアステレオマーおよびラセミ体は全て、本発明中に包含される。幾何異性体は、本明細書中に記載の化合物中にも存在してよいが、このような安定な異性体は全て、本発明によって包含される。非対称的に置換された炭素原子を含有する本発明による化合物を、光学活性体またはラセミ体で、または合成によって単離することができるということは理解されるであろう。
【００６７】
本発明は、中間体または最終化合物中に存在する原子の同位体を全て包含する。同位体には、同じ原子番号であるが、異なった質量数を有する原子が含まれる。例として、制限することなく、水素の同位体には、トリチウムおよびジュウテリウムが含まれる。
【００６８】
本明細書中で用いられる「糖置換基」という用語は、選択された糖部分の２’位、３’位または５’位に取り付けられている保護されていてよい基を意味する。糖置換基は、複素環式塩基に、例えば、アミノ官能基における取り付けによって取り付けられてもいる。
【００６９】
本発明にしたがう糖置換基の代表的なリストには、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ２−Ｃ２０アルケニル、Ｃ２−Ｃ２０アルキニル、Ｃ５−Ｃ２０アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｓ−アルキル、Ｓ−アルケニル、Ｓ−アルキニル、ＮＨ−アルキル、ＮＨ−アルケニル、ＮＨ−アルキニル、Ｎ−ジアルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アリール、ＮＨ−アリール、Ｏ−アラルキル、Ｓ−アラルキル、ＮＨ−アラルキル、Ｎ−フタルイミド、ハロゲン（特に、フルオロ）、アミノ、チオール、ケト、カルボキシル、ニトロ、ニトロソ、ニトリル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、イミダゾール、アジド、ヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、イソシアナト、スルホキシド、スルホン、スルフィド、ジスルフィド、シリル、アリール、複素環、炭素環、インターカレーター、レポーター基、コンジュゲート、ポリアミン、ポリアミド、ポリアルキレングリコール、および式（Ｏ−アルキル）ｍ（但し、ｍは１〜約１０である）を有するポリエーテルが含まれる。これらポリエーテルの中で好ましいのは、直鎖状および環状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および（ＰＥＧ）含有基であり、例えば、各々本明細書中にそのまま援用される、Ouchi et al.（Drug Design and Discovery 1992,9,93）、Ravasio et al.（J.Org.Chem. 1991,56,4329）および Delgardo et al.（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1992,9,249）によって開示されているものおよびクラウンエーテルなどがあげられる。更に別の糖修飾は、Cook,P.D., Anti-Cancer Drug Design, 1991,6,585-607 に開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキルおよびアルキルアミノ置換基は、本明細書中にそのまま援用される１９９５年３月６日出願の、Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions という表題の米国特許出願第０８／３９８，９０１号に記載されている。
【００７０】
本発明にしたがう更に別の糖置換基には、基−ＳＲ１および−Ｎ（Ｒ１）２（式中、Ｒ１は、各々独立して、水素、保護基、または置換または未置換のアルキル、アルケニルまたはアルキニルである）が含まれる。２’−Ｓ−Ｒ１ヌクレオシドは、本明細書中にそのまま援用される１９９７年９月２３日発行の米国特許第５，６７０，６３３号に開示されている。２’−ＳＲ１モノマーシントンの包含は、Hamm et al., J.Org.Chem., 1997,62,3415-3420 によって開示されている。２’−Ｎ（Ｒ１）２ヌクレオシドは、Goettingen,M., J.Org.Chem., 1996,61,6273-6281; および Polushin et al., Tetrahedron Lett., 1996,37,3227-3230 によって開示されている。
【００７１】
更に代表的な糖置換基には、式ＩまたはIIのいずれかの構造を有する基が含まれうる。
：
【００７２】
【化１３】
2005504020.tif 000015
【００７３】
［式中、Ｚ０は、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｊは、単結合、ＯまたはＣ（＝Ｏ）であり；
Ｅは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ７）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ６ａ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒ５ａ）（Ｒ７ａ）であるまたは式III
【００７４】
【化１４】
2005504020.tif 000016
【００７５】
を有し；
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１およびＲ１２は、各々独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ１３、置換または未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、置換または未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換または未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基またはコンジュゲート基であり、ここにおいて、これら置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルより選択され；
または場合により、Ｒ１１およびＲ１２は一緒に、それらが取り付けられている窒素原子と共にフタルイミド部分を形成する；
Ｒ１３は、各々独立して、置換または未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニルまたはアリールであり；
Ｒ５は、水素、窒素保護基または−Ｔ−Ｌであり；
Ｒ５ａは、水素、窒素保護基または−Ｔ−Ｌであり；
Ｔは、結合または連結部分であり；
Ｌは、化学官能基、コンジュゲート基または固体支持体であり；
Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、水素、窒素保護基、置換または未置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、置換または未置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換または未置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル（ここにおいて、この置換は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニルである）；ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒ１４）（Ｒ１５）、グアニジノまたはアシル（但し、このアシルは、酸アミドまたはエステルである）であり；
またはＲ６およびＲ７は一緒に、窒素保護基であるか、又はＮおよびＯより選択される追加のヘテロ原子を包含してよい環構造中に接続されるか、または化学官能基であり；
Ｒ１４およびＲ１５は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、窒素保護基であるか、またはＲ１４およびＲ１５は一緒に、窒素保護基であり；
またはＲ１４およびＲ１５は、ＮおよびＯより選択される追加のヘテロ原子を包含してよい環構造中に接続される；
Ｚ４は、ＯＸ、ＳＸまたはＮ（Ｘ）２であり；
Ｘは、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６またはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒ１６であり；
Ｒ１６は、ＨまたはＣ１−Ｃ８アルキルであり；
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は、約４〜約７個の炭素原子を有するまたは約３〜約６個の炭素原子および１個または２個のヘテロ原子を有する環系を含み、ここにおいて、このヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄より選択され、そしてこの環系は、脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、または飽和または不飽和の複素環式であり；
Ｚ５は、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキルまたはハロアルキル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）ＯＲ５、ハロ、ＳＲ５またはＣＮであり；
ｑ１は、各々独立して、１〜１０の整数であり；
ｑ２は、各々独立して、０または１であり；
ｑ３は、０または１〜１０の整数であり；
ｑ４は、１〜１０の整数であり；
ｑ５は、０、１または２であり；そして
ｑ３が０である場合、ｑ４は１より大であるという条件付きである］。
【００７６】
式Ｉの代表的な糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、１９９８年８月７日出願の "Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides," という表題の米国特許出願第０９／１３０，９７３号に開示されている。
【００７７】
式IIの代表的な環状糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、１９９８年７月２７日出願の "RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized," という表題の米国特許出願第０９／１２３，１０８号に開示されている。
【００７８】
特に好ましい糖置換基には、Ｏ［（ＣＨ２）ｐ１Ｏ］ｐ２ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｐ１ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｐ１ＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｐ１ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｐ１ＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｐ１ＯＮ［（ＣＨ２）ｐ１ＣＨ３）］２（式中、ｐ１およびｐ２は、１〜約１０である）が含まれる。
【００７９】
本発明の若干の好ましいオリゴマー化合物は、次の糖置換基、すなわち、Ｃ１−Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴマー化合物の薬物動態学的性質を向上させる基またはオリゴマー化合物の薬力学的性質を向上させる基、および類似の性質を有する他の糖置換基の内の一つを有する少なくとも一つのヌクレオシドを含有する。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）［Martin et al., Helv.Chim.Acta, 1995,78,486］、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。更に好ましい修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基である。代表的なアミノオキシ糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、１９９９年６月２５日出願の "Aminooxy-Functionalized Oligomers" という表題の同一所有される米国特許出願第０９／３４４，２６０号；および１９９９年８月９日出願の "Aminooxy-Functionalized Oligomers and Methods for Making Same;" という表題の米国特許出願第０９／３７０，５４１号に記載されている。
【００８０】
他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。類似した修飾は、ヌクレオシドおよびオリゴマー上の他の位置に、具体的には、３’末端ヌクレオシド上の糖の３’位、または２’−５’連結したオリゴマーのような２’位からの結合を有するヌクレオシドの３’位および５’末端ヌクレオシドの５’位に行われてもよい。オリゴマーは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模擬体を有してもよい。このような修飾された糖構造の製造を教示する代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用され且つ若干のものは同一所有される米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３１号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号、および本明細書中にも援用される１９９５年６月５日出願の同一所有される米国特許出願第０８／４６８，０３７号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００８１】
式IIIに示される代表的なグアニジノ糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、２０００年７月７日出願の "Guinidinium Functionalized Oligomers and Methods" という表題の同一所有される米国特許出願第０９／６１２，５３１号に開示されている。
【００８２】
代表的なアセトアミド糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、１９９９年８月１９日出願の "2'-O-Acetamido Modified Monomers and Oligomers" という表題の米国特許出願第０９／３７８，５６８号に開示されている。
【００８３】
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル糖置換基は、本明細書中にそのまま援用される、１９９９年８月６日出願の "2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Modified Oligonucleotides" という表題の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７８９５号に開示されている。
【００８４】
更に好ましい修飾には、２’−ヒドロキシル基が、糖環の３’または４’炭素原子に連結することによって二環式糖部分を形成しているロックド核酸（Locked Nucleic Acids）（ＬＮＡ）が含まれる。この結合は、好ましくは、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基（式中、ｎは１または２である）である。ＬＮＡおよびその製造は、ＷＯ９８／３９３５２号およびＷＯ９９／１４２２６号に記載されている。
【００８５】
所定の化合物中の全ての位置が均一に修飾される必要はないが、実際上、前述の修飾の二つ以上が、単一化合物中にまたはオリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシドにでも包含されてよい。
【００８６】
本発明は、更に、キメラ化合物であるオリゴマー化合物を包含する。本発明の文脈中の「キメラ」オリゴマー化合物または「キメラ」は、少なくとも一つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドで各々が成っている二つまたはそれを超える化学的に異なる領域を含有するオリゴマー化合物、具体的には、オリゴヌクレオチドである。キメラオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解への増加した耐性、増加した細胞内取込みおよび／または標的核酸への増加した結合親和性をオリゴヌクレオチドに与えるようにそのオリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも一つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのもう一つの領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素への基質として役立つことができる。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重らせんのＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を引き起こし、それによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率を大きく増大させる。その結果として、キメラオリゴヌクレオチドを用いる場合、同じ標的領域にハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較してより短いオリゴヌクレオチドで、しばしば、比較しうる結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動と、必要ならば、当該技術分野において知られている関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって常套的に検出することができる。
【００８７】
本発明のキメラオリゴマー化合物は、上記のような二つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模擬体の複合構造として形成されてよい。このような化合物は、当該技術分野においてハイブリッドまたはギャップマー（gapmers）とも称されている。このようなハイブリッド構造の製造を教示している代表的な米国特許には、各々が本明細書中にそのまま援用され且つ若干のものは本出願と同一所有される米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；および第５，７００，９２２号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００８８】
ある一定の態様において、本発明のオリゴマー化合物は、「ギャップマー」、「逆ギャップマー」または「ヘミマー（hemimers）」を含めたキメラオリゴヌクレオチドでありうる。「ヘミマー」の場合、オリゴヌクレオチドの一つの末端（５’かまたは３’）領域は、修飾ヌクレオシドを含有する。オリゴヌクレオチドの両末端が修飾ヌクレオシドを含有する場合、そのオリゴヌクレオチドを「ギャップマー」と称し、修飾された５’および３’末端領域を「ウィング（wings）」と称する。ギャップマーの場合、５’および３’ウィングは、同じまたは異なった方式で修飾されたヌクレオシドを含有することができる。「逆ギャップマー」の場合、オリゴヌクレオチドの中心領域は、修飾ヌクレオシドを含有する。
【００８９】
本発明は、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性を増大させるのに有用である化合物および方法を提供する。より詳しくは、本発明は、増大したヌクレアーゼ耐性を示すオリゴマー化合物、およびオリゴマー化合物のヌクレアーゼ安定性を向上させる方法に関する。上記のように、酵素分解への耐性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬の重要な特徴であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド薬の効力は、生体系に存在するヌクレアーゼの活性によって妨害されている。驚くべきことに、オリゴマー化合物のある一定の修飾は、それらのヌクレアーゼ安定性を増大させるということが発見された。修飾ヌクレオシドの包含を伴う、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ安定性を増加させる新規な方法も発見された。
【００９０】
本発明は、医薬品として有用でありうるヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子産物が疾患をもたらすその遺伝子の発現の選択的阻害を引き起こすことができるある一定の核酸標的配列に、予想可能な方法で結合するように設計することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ上の特定の相補的領域に結合することにより、スプライシング、ポリアデニル化、正しいＲＮＡフォールディング、ｍＲＮＡのトランスロケーションおよび翻訳開始、またはｍＲＮＡに沿ったリボソーム移動のような過程の破壊によってタンパク質生合成を阻害することができる。本発明のオリゴマー化合物は、典型的に、増大したヌクレアーゼ耐性を示すので、特定の疾患の処置のための治療的用途において有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる。本発明の方法は、オリゴマー化合物のヌクレアーゼ耐性の増大によって治療薬としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を増加させるのに用いることもできる。
【００９１】
本発明の好ましい態様は、少なくとも一つの修飾された５’または３’末端ヌクレオシドまたはヌクレオチドと、ホスホジエステル以外の少なくとも一つのヌクレオシド間連結基を含み、そしてギャップマー、ヘミマーおよび逆ギャップマーの配置の修飾された２’置換基および一つまたはそれを超える修飾核酸塩基を含んでいてよいヌクレアーゼ耐性オリゴマー化合物を包含する。
【００９２】
三環式シトシン類似体フェノキサジンおよび９−（アミノエトキシ）フェノキサジン（Ｇ−クランプ）は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を有意に増大させることが分かった。フェノキサジンおよびＧ−クランプを、天然のホスホジエステル主鎖を有するモデルオリゴマー中に包含させて、ヘビ毒ホスホジエステラーゼで処理後の酵素分解を監視した。３’末端におけるフェノキサジンかまたはＧ−クランプの単独包含は、３’エキソヌクレアーゼ攻撃からオリゴヌクレオチドを完全に防御した。修飾オリゴヌクレオチドは、ウシ腸管粘膜ホスホジエステラーゼによる天然ＤＮＡフラグメントの分解を用量依存方式で遅らせることができるので、フェノキサジンおよびＧ−クランプを含有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性が、酵素の活性部位への低い結合親和性によって引き起こされるとは考えられない。フェノキサジンとＧ−クランプとの間には、ヌクレアーゼ耐性へのそれらの作用およびヌクレアーゼ活性を阻害するそれらの能力に関して、有意差が認められなかった。
【００９３】
グアニジニル部分は、三環式シトシン類似体（Ｇ−クランプ）の２’位かまたはフェノキサジン環系に束縛された第一アミノ基の合成後グアニジニル化によってオリゴヌクレオチドに加えることができる。前者のアミノ基は、固体支持体上に選択的に脱保護し且つグアニジニル化することができるが、Ｇ−クランプのアミノエトキシ束縛は、オリゴヌクレオチドの脱保護および支持体からの切断後に水溶液中でグアニジニル化することができる。どちらの方法も、種々のグアニジニル修飾オリゴヌクレオチドを合成し且つ特性決定するのに成功して用いられている。第一アミンの、第一アミンより有意に高いｐＫαを有するグアニジニウム部分への変換は、オリゴヌクレオチドに陽電荷を導入させ、これは、広いｐＨ範囲にわたって維持される。２’位における陽イオン残基の導入は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を大きく増大させる（Prakash,T.P.; Kawasaki,A.M.; Vasquez,G.; Fraser,A.S.; Casper,M.D.; Cook,P.D.; Manoharan,M. Nucleosides Nucleotides 1999,181,1381-1382）。グアニジニルＧ−クランプヌクレオチドを含有する十量体二重らせんのＸ線結晶解析研究は、束縛されたグアニジニウムのイミノまたはアミノ窒素と、相補的グアニン塩基のＮ７との間に追加のフーグスティーン結合を示したが、これは、合計５個の水素結合数を含有する核酸二重らせん内の単一塩基対の最初の知見であった。
【００９４】
オリゴマー化合物の製造に現在選択される方法は、支持基剤を使用する。支持基剤を用いて、最初のヌクレオシドまたはより大きいヌクレオシドシントンを取り付け、次に、それを繰り返し伸長させて、最終オリゴマー化合物を生じる。支持基剤は、不溶性であるようにまたはいろいろな溶媒中で変化しうる溶解度を有するように選択されて、成長しているオリゴマーを所望のように、溶液中に入れないまたは溶液中で保持させることができる。伝統的な固体支持体は、不溶性であり、常套的には、試薬および溶媒が反応しおよび／または成長している鎖を洗浄している間、最終オリゴマーを切断して分離するまで反応容器中に入っている。より最近のアプローチは、合成における所望の時点で、結合したオリゴマーを沈殿させることおよび溶解させることを可能にする可溶性ポリマー支持体を含めた可溶性支持体を導入している（Gravert et al., Chem.Rev., 1997,97,489-510）。
【００９５】
本発明の方法にしたがう代表的な支持基剤には、制限されることなく、制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）；オキサリル制御多孔質ガラス（例えば、Alul, et al., Nucleic Acids Research 1991,19,1527 を参照されたい）；ＴＥＮＴＡＧＥＬ Support（例えば、Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993,34,3373 を参照されたい）；または Perceptive Biosystems から入手可能なポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーＰＯＲＯＳが含まれる。可溶性支持基剤である５〜２０ｋＤａの分子量のポリ（エチレングリコール）の使用は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの大規模合成について、Bonora et al., Organic Process Research & Development, 2000,4,225-231 に記載されている。このような合成のための装置は、例えば、Applied Biosystems（Foster City, CA）を含めたいくつかの販売業者によって販売されている。当該技術分野において知られているこのような合成のためのいずれか他の手段を、更にまたは代わりに用いることができる。類似した技法を用いて、ホスホロチオエート誘導体およびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを製造することは周知である。
【００９６】
活性リン組成物（例えば、活性リン含有置換基を有する化合物）は、オリゴマー化合物の合成のためのカップリング反応において用いることができる。本明細書中で用いられる「活性リン組成物」という用語は、別のモノマーまたはオリゴマー化合物のヒドロキシル基と反応性であってリン含有ヌクレオチド間結合を形成する活性リン含有置換基を有する、モノマーおよびオリゴマーを包含する。このような活性リン基は、活性リン原子をＰIII原子価状態で含有する。このような活性リン原子は、当該技術分野において知られていて、ホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート、リン酸トリエステルおよびキラル補助部分（chiral auxiliaries）が含まれるが、これに制限されるわけではない。好ましい合成固相合成法は、ホスホロアミダイトを活性ホスフェートとして利用する。ホスホロアミダイトは、ＰIII化学を利用する。中間体ホスフィット化合物は、引き続き、既知の方法を用いてＰＶ状態に酸化されて、好ましい態様において、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を生じる。更に別のホスフェートおよびホスフィットは、Tetrahedron Report Number 309 (Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 1992,48,2223-2311) に開示されている。
【００９７】
活性リンを含有するモノマーまたはオリゴマーの代表的なリストには、式
【００９８】
【化１５】
2005504020.tif 000017
【００９９】
（式中、Ｂｘは、各々独立して、複素環式塩基部分または保護された複素環式塩基部分であり；そして
Ｒ１７は、各々独立して、Ｈ、保護されたヒドロキシル基、糖置換基または保護された置換基であり；
Ｗ３は、ヒドロキシル保護基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドであり；
Ｒ１８は、Ｎ（Ｌ１）Ｌ２であり；
Ｌ１およびＬ２は、各々独立して、Ｃ１−６アルキルであり；
またはＬ１およびＬ２は、互いに接続して、Ｌ１およびＬ２が取り付けられている窒素原子を含めた４〜７員複素環式環系を形成し、ここにおいて、この環系は、Ｏ、ＮおよびＳより選択される少なくとも１個の追加のヘテロ原子を包含してよく；そして
Ｒ１９はＸ１であり；
Ｘ１は、Ｐｇ−Ｏ−、Ｐｇ−Ｓ−、Ｃ１−Ｃ１０直鎖または分岐状鎖アルキル、ＣＨ３（ＣＨ２）ｐ５−Ｏ−またはＲ２０Ｒ２１−Ｎ−であり；
ｐ５は、０〜１０であり；
Ｐｇは保護基であり；
Ｒ２０およびＲ２１は、各々独立して、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、シクロアルキルまたはアリールであり；
または場合により、Ｒ２０およびＲ２１は、それらが取り付けられている窒素原子と一緒に、Ｏ、ＳおよびＮより選択される追加のヘテロ原子を包含してよい環状部分を形成し；または
Ｒ１８およびＲ１９は、Ｒ１８およびＲ１９が取り付けられているリン原子と一緒に、キラル補助部分(chiral auxiliary)を形成する）
を有するものが含まれる。
【０１００】
酸化前および後のヌクレオチド間結合のリン原子に取り付けられている基（Ｒ１８およびＲ１９）には、モルホリンのような窒素含有環状部分が含まれうる。このような酸化したヌクレオシド間結合には、ホスホロモルホリドチオエート結合（Wilk et al., Nucleosides and nucleotides, 1991,10,319-322）が含まれる。本発明にしたがう更に別の環状部分には、オキソ、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アミド、アジド、アリール、ヘテロアリール、カルボン酸、シアノ、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドラジノ、ＯＤＭＴ、アルキルスルホニル、ニトロ、スルフィド、スルホン、スルホンアミド、チオールおよびチオアルコキシなどの基で置換されていてよい単環式、二環式または三環式の環部分が含まれる。窒素を包含する好ましい二環式環構造は、フタルイミドである。
【０１０１】
本明細書の文脈中において、アルキル（概して、Ｃ１−Ｃ２０）基、アルケニル（概して、Ｃ２−Ｃ２０）基およびアルキニル（概して、Ｃ２−Ｃ２０）基には、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基および他の高級炭素アルキル基を含めた、置換されたおよび未置換の直鎖、分岐鎖および脂環式炭化水素が含まれるが、これに制限されるわけではない。追加の例には、２−メチルプロピル基、２−メチル−４−エチルブチル基、２，４−ジエチルブチル基、３−プロピルブチル基、２，８−ジブチルデシル基、６，６−ジメチルオクチル基、６−プロピル−６−ブチルオクチル基、２−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−エチルヘキシル基および他の分岐状鎖基、アリル基、クロチル基、プロパルギル基、２−ペンテニル基、およびπ結合を含有する他の不飽和基、シクロヘキサン基、シクロペンタン基、アダマンタン基、並びに他の脂環式基、３−ペンテン−２−オン基、３−メチル−２−ブタノール基、２−シアノオクチル基、３−メトキシ−４−ヘプタナール基、３−ニトロブチル基、４−イソプロポキシドデシル基、４−アジド−２−ニトロデシル基、５−メルカプトノニル基、４−アミノ−１−ペンテニル基、更には、他の置換された基が含まれる。代表的なアルキル置換基は、本明細書中にそのまま援用される米国特許第５，２１２，２９５号の段落１２の４１〜５０行に開示されている。
【０１０２】
多くの化学官能基は、本発明の化合物中に保護された形で導入した後、脱保護して、最終の所望の化合物を形成することができる。複素環式塩基、例えば、ヌクレオシド間結合および糖置換基に、一つ以上の位置または２’位、３’位および５’位で直接的にまたは間接的に取り付けられた基。保護基は、反復するオリゴヌクレオチド合成中に成長しているオリゴマー化合物中に位置する官能基を保護するように選択することができ、他の位置は、必要とされるように選択的に脱保護することができる。概して、保護基は、より大きい分子の化学官能基を特定の反応条件に不活性にさせ、そしてその後、分子の残り部分を実質的に損傷することなく、このような官能基から除去することができる（Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed, John Wiley & Sons, New York, 1999）。例えば、アミノ基の窒素原子は、フタルイミド基として、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基として、およびトリフェニルメチルスルフェニル基、ｔ−ＢＯＣ基またはベンジル基で保護することができる。カルボキシル基は、アセチル基として保護することができる。代表的なヒドロキシル保護基は、Beaucage et al., Tetrahedron 1992,48,2223 によって記載されている。好ましいヒドロキシル保護基は、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）のような、酸に反応活性である。
【０１０３】
化学官能基は、それらを前駆体に包含させることによって「保護される」こともできる。例えば、アジド基は、容易にアミンに変換されるので、アジド基をアミンの「保護された」形とみなして用いることができる。オリゴヌクレオチド合成に利用される更に代表的な保護基は、Agrawal, et al., Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Eds, Humana Press; New Jersey, 1994; Vol.26 pp.1-72 に考察されている。
【０１０４】
ヒドロキシル保護基の例には、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ＝−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピバロエート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、９−フルオレニルメチルカーボネート、メシラートおよびトシラートが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１０５】
チオール（硫黄）保護基の例には、ベンジル、置換されたベンジル、ジフェニルメチル、フェニル、ｔ−ブチル、メトキシメチル、チアゾリジン類、アセチルおよびベンゾイルが含まれるが、これに制限されるわけではない。更に別のチオール保護基は、Greene and Wuts, 同書に詳しく説明されている。
【０１０６】
追加のアミノ保護基には、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）などのカルバメート保護基；ホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイルおよびニトロフェニルアセチルなどのアミド保護基；２−ニトロベンゼンスルホニルなどのスルホンアミド保護基；フタルイミドおよびジチアスクシノイルなどのイミン保護基および環状イミド保護基が含まれるが、これに制限されるわけではない。これらアミノ保護基の均等物も、本発明の化合物および方法によって包含される。
【０１０７】
若干の好ましいアミノ保護基は、酸処理に安定性であるので、反応性アミノ基を選択的に置換に利用可能にする塩基処理で選択的に除去することができる。このような基の例は、Ｆｍｏｃ（E.Atherton and R.C.Sheppard in The Peptides, S.Udenfriend, J.Meienhofer, Eds., Academic Press, Orlando, 1987, volume 9, p.1）、およびＮｓｃ基で代表される種々の置換スルホニルエチルカルバメート（Samukov et al., Tetrahedron Lett, 1994,35:7821; Verhart and Tesser, Rec.Trav.Chim.Pays-Bas, 1987,107:621）である。
【０１０８】
若干の特に好ましい態様において、オリゴマー化合物のヌクレオシド成分は、保護されていてよいホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって互いに連結されている。ホスフィット結合、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合などのリン含有ヌクレオシド間結合のための代表的な保護基には、β−シアノエチル基、ジフェニルシリルエチル基、δ−シアノブテニル基、シアノｐ−キシリル（ＣＰＸ）基、Ｎ−メチル−Ｎ−トリフルオロアセチルエチル（ＭＥＴＡ）基、アセトキシフェノキシエチル（ＡＰＥ）基およびブテン−４−イル基が含まれる。例えば、米国特許第４，７２５，６７７号および再発行３４，０６９号（β−シアノエチル）；Beaucage,S.L. and Iyer,R.P., Tetrahedron, 49 No.10, pp.1925-1963(1993); Beaucage,S.L. and Iyer,R.P., Tetrahedron, 49 No.46, pp.10441-10488(1993); Beaucage,S.L. and Iyer,R.P., Tetrahedron, 48 No.12, pp. を参照されたい。
【０１０９】
本発明は、更に、本発明のオリゴマー化合物を包含する医薬組成物および製剤を包含する。本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の処置が望まれるかどうかおよび処置される部位に依存して多くの方法で投与することができる。投与は、局所（眼を含めた、および膣および直腸供給を含めた粘膜へ）、肺（例えば、ネブライザーによるを含めて、散剤またはエアゾル剤の吸入または吹入による）、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口投与であってよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または注入；または頭蓋内、例えば、鞘内(intrathecal)または脳室内投与が含まれる。少なくとも一つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【０１１０】
局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤が含まれうる。慣用的な医薬担体、水性、粉末または油状の基剤、増粘剤等は、必要であるまたは望まれることがありうる。被覆コンドーム、グローブ等も有用でありうる。好ましい局所製剤には、本発明のオリゴマー化合物が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤およびサーファクタントなどの局所供給剤（topical delivery agents）との混合物であるものが含まれる。好ましい脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）および陽イオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が含まれる。本発明のオリゴマー化合物は、リポソームに内包されていてよいしまたはそれと、具体的には、陽イオンリポソームと複合体を形成してよい。或いは、オリゴマー化合物は、脂質と、具体的には、陽イオン脂質と複合体形成してよい。好ましい脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、１−モノカプリン酸グリセリル、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはそのＣ１−１０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容しうる塩が含まれるが、これに制限されるわけではない。局所製剤は、本明細書中にそのまま援用される、１９９９年５月２０日出願の米国特許出願第０９／３１５，２９８号に詳細に記載されている。
【０１１１】
経口投与用の組成物および製剤には、散剤または顆粒剤、ミクロ粒子、ナノ粒子、水中または非水性基剤中の懸濁剤または水剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が、望ましいと考えられる。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴマー化合物が、一つまたはそれを超える浸透促進剤、サーファクタントおよびキレート化剤と一緒に投与されるものである。好ましいサーファクタントには、脂肪酸および／またはそのエステルまたは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。好ましい胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。好ましい脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはそのモノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容しうる（例えば、ナトリウム）塩が含まれる。更に好ましいのは、浸透促進剤の組合せ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩である。特に好ましい組合せは、ラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸およびＵＤＣＡである。更に別の浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明のオリゴマー化合物は、噴霧乾燥された粒子を含めた粒状の形で経口供給されてよいし、またはミクロ粒子またはナノ粒子を形成するように複合体形成されてよい。オリゴヌクレオチド複合体形成剤（complexing agents）には、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥで誘導体化されたポリイミン、ポルラン（pollulans）、セルロースおよびデンプンが含まれる。特に好ましい複合体形成剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアク���レート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸コグリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネートおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。オリゴヌクレオチドの経口製剤およびそれらの製造は、各々が本明細書中にそのまま援用される、米国特許出願第０８／８８６，８２９号（１９９７年７月１日出願）、同第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、同第０９／２５６，５１５号（１９９９年２月２３日出願）、同第０９／０８２，６２４号（１９９８年５月２１日出願）および同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）に詳細に記載されている。
【０１１２】
非経口、鞘内または脳室内投与用の組成物および製剤には、緩衝剤、希釈剤、並びに浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容しうる担体または賦形剤などがあるがこれに制限されるわけではない他の適当な添加剤を含有してもよい滅菌水溶液が含まれてよい。
【０１１３】
本発明の医薬組成物には、液剤、エマルジョンおよびリポソーム含有製剤が含まれるが、これに制限されるわけではない。これら組成物は、予備成形された液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体が含まれるがこれに制限されるわけではない種々の成分から生じてよい。
【０１１４】
本発明の医薬製剤は、好都合には、単位剤形で与えられてよく、製薬産業において周知の慣用的な技法によって製造することができる。このような技法は、活性成分を、一つまたは複数の医薬担体または賦形剤と一緒にする工程を包含する。概して、製剤は、活性成分と液状担体または微粉固体担体または双方とを、均一に且つ密に一緒にした後、必要ならば製品を造形することによって製造される。
【０１１５】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液状シロップ剤または軟質ゲル剤、坐剤および浣腸剤などがあるがこれに制限されるわけではないいずれかの多数の可能な剤形に製剤化することができる。本発明の組成物は、水性基剤、非水性基剤または混合基剤中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含めた、懸濁剤の粘度を増加させる物質を更に含有してよい。この懸濁剤は、安定化剤も含有してよい。
【０１１６】
本発明の一つの態様において、医薬組成物は、フォーム剤として製剤化し且つ用いることができる。医薬フォーム剤には、エマルジョン、ミクロエマルジョン、クリーム剤、ゼリー剤およびリポソームなどがあるがこれに制限されるわけではない製剤が含まれる。基本的に性質は似ているが、これら製剤は、最終製品の成分およびコンシステンシーが異なる。このような組成物および製剤の製造は、概して、製薬および製剤技術業者に知られており、本発明の組成物の製剤に応用することができる。
【０１１７】
本発明の組成物は、エマルジョンとして製造し且つ製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、一つの液体が別の液体中に、通常は０．１μｍ直径を超える液体粒子の形で分散した不均一系である。（Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245; Bolck in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 2,p.335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985,p.301）。エマルジョンは、しばしば、互いに密に混合され且つ分散した二つの不混和液相を含んで成る二相系である。概して、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）かまたは水中油（ｏ／ｗ）の種類であってよい。水性相が、大部分の油相中で微細に分割されて、微細な液体粒子として分散している場合、得られた組成物を、油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンと称する。或いは、油相が、大部分の水性相中で微細に分割されて、微細な液体粒子として分散している場合、得られた組成物を、水中油（ｏ／ｗ）エマルジョンと称する。エマルジョンは、分散相及び、水性相中、油相中の溶液としてまたはそれ自体別の相として存在してよい活性薬物に加えて、追加の成分を含有してよい。乳化剤、安定化剤、色素および酸化防止剤などの医薬賦形剤も、必要に応じてエマルジョン中に存在してよい。医薬エマルジョンは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のような、二つより多い相を含んで成る多重エマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単純な二成分エマルジョンが与えないような、ある種の利点を与える。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油粒子が、小さい水粒子を閉じ込めている多重エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油状連続相中に安定化した水の小球中に閉じ込められた油粒子の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンを与える。
【０１１８】
エマルジョンは、熱力学的安定性がないまたは少ないことを特徴とする。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相は、乳化剤の手段または製剤の粘度によって、外部相または連続相中に充分に分散し且つこの形で維持される。エマルジョンの相のどちらかは、エマルジョン型軟膏基剤およびクリーム剤の場合のように、半固体または固体であってよい。エマルジョンを安定化させる他の手段は、エマルジョンのどちらかの相中に包含されてよい乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広範囲に、４種類、すなわち、合成サーファクタント、天然に存在する乳化剤、吸収基剤および微細分散固体に分類することができる（Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199）。
【０１１９】
界面活性剤としても知られる合成サーファクタントは、エマルジョンの製剤に広く応用されており、文献に概説されている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1,p.199）。サーファクタントは、典型的には、両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。サーファクタントの親水性対疎水性の比率は、親水親油バランス（ＨＬＢ）と称されていて、製剤の製造においてサーファクタントを分類し且つ選択する場合に有効な手段である。サーファクタントは、親水基の性状に基づく異なったクラス、すなわち、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性および両性に分類することができる（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.285）。
【０１２０】
エマルジョン製剤に用いられる天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアラビアゴムが含まれる。吸収基剤は、水を吸収してｗ／ｏエマルジョンを形成しうるような親水性を有するが、なお、無水ラノリンおよび親水ワセリンのように、それらの半固体コンシステンシーを保持する。微粉固体は、良好な乳化剤として、特に、サーファクタントとの組合せでおよび粘稠な製剤中で用いられてもいる。これらには、重金属水酸化物のような極性無機固体；ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイドケイ酸アルミニウムおよびコロイドケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤性クレー；炭素またはグリセリルトリステアレートなどの顔料および無極性固体が含まれる。
【０１２１】
種々の非乳化性材料も、エマルジョン製剤中に包含され、エマルジョンの性質に寄与する。これらには、脂肪、油、ロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水コロイド、保存剤および酸化防止剤が含まれる（Bolck, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199）。親水コロイドまたはヒドロコロイドには、多糖類などの天然に存在するガムおよび合成ポリマー（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、カラジーナン、グアーゴム、カラヤゴムおよびトラガカントゴム）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー（carbomers）、セルロースエーテルおよびカルボキシビニルポリマー）が含まれる。これらは、水中で分散しまたは膨潤して、分散相液体粒子の周りに強い界面膜を形成することによっておよび外部相の粘度を増加させることによってエマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。
【０１２２】
エマルジョンは、しばしば、微生物の成長を容易に支持することがありうる炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどの多くの成分を含有するので、これら製剤は、しばしば、保存剤を包含する。エマルジョン製剤中に含まれる一般的に用いられる保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルおよびホウ酸が含まれる。さらに酸化防止剤も、一般的に、製剤の劣化を防止するためにエマルジョン製剤に加えられる。用いられる酸化防止剤は、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、およびクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの酸化防止相乗剤であってよい。
【０１２３】
皮膚科的、経口および非経口の経路によるエマルジョン製剤の適用およびそれらの製造方法は、文献に概説されている（Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199）。経口供給用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、吸収およびバイオアベイラビリティーの見地からの効力の理由ゆえに、きわめて広範囲に用いられてきている。（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.199）。鉱油基剤緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養製剤は、ｏ／ｗエマルジョンとして一般的に経口投与されてきた材料の中にある。
【０１２４】
本発明の一つの態様において、オリゴマー化合物および核酸の組成物は、ミクロエマルジョンとして製剤化される。ミクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な溶液である、水、油および両親媒性物質の系として定義することができる（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245）。典型的には、ミクロエマルジョンは、最初に、油をサーファクタント水溶液中に分散させた後、透明な系を形成するのに充分な量の第四成分、概して、中間鎖長アルコールを加えることによって製造される系である。したがって、ミクロエマルジョンは、界面活性分子の界面膜によって安定化される二つの不混和液の、熱力学的に安定で、等方性によって透明な分散液としても記載されている（Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff,M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215）。ミクロエマルジョンは、一般的には、油、水、サーファクタント、コサーファクタントおよび電解質が含まれる３〜５種類の成分の組合せによって製造される。そのミクロエマルジョンが、油中水（ｗ／ｏ）タイプであるか水中油（ｏ／ｗ）タイプであるかは、用いられる油およびサーファクタントの性質、およびサーファクタント分子の極性ヘッドおよび炭化水素テールの構造および幾何学的充填率に依存する（Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985,p.271）。
【０１２５】
相図を利用した現象学的アプローチは、広範囲に研究されており、ミクロエマルジョンを製剤化する方法の包括的知識を当業者に与えている（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245; Bolck, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.335）。慣用的なエマルジョンと比較して、ミクロエマルジョンは、自然に形成される熱力学的に安定な液体粒子の製剤として、水に不溶性の薬物を可溶化する利点を与える。
【０１２６】
ミクロエマルジョンの製造に用いられるサーファクタントには、イオン性サーファクタント、非イオン性サーファクタント、Brij ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（sequioleate）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が単独でまたはコサーファクタントとの組合せとして含まれるが、これに制限されるわけではない。このコサーファクタント、通常は、エタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールなどの短鎖アルコールは、サーファクタント膜中に浸透し、その結果、サーファクタント分子の間で生じるボイド空間のために破壊された膜を生じることによって、界面流動性を増加させるのに役立つ。ミクロエマルジョンは、しかしながら、コサーファクタントを使用することなく製造することができるので、アルコール不含の自己乳化性ミクロエマルジョン系が当該技術分野において知られている。水性相は、典型的には、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であってよいが、これに制限されるわけではない。油相には、Captex ３００、Captex ３３５、Capmul ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中位の鎖（Ｃ８−Ｃ１２）のモノ−、ジ−およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの材料が含まれうるが、これに制限されるわけではない。
【０１２７】
ミクロエマルジョンは、薬物可溶化および増大した薬物吸収の見地から、特に興味深い。脂質基剤のミクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏ双方）は、ペプチドを含めた薬物の経口バイオアベイラビリティーを強化させるために提案されている（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994,11,1385-1390; Ritschel, Met.Find.Exp.Clin.Pharmacol., 1993,13,205）。ミクロエマルジョンは、向上した薬物可溶化、酵素加水分解からの薬物の保護、サーファクタントに誘導される膜流動性および透過性の変化によって可能な薬物吸収増大、浸透の容易さ、固体剤形にまさる経口投与の容易さ、向上した臨床的力価、および減少した毒性の利点を与える（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994,11,1385; Ho et al., J.Pharm.Sci., 1996,85,138-143）。しばしば、ミクロエマルジョンは、それらの成分が周囲温度で一緒になった場合に、自然に形成されることがありうる。これは、熱不安定性の薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを製剤化する場合に特に好都合でありうる。ミクロエマルジョンは、化粧品用途および医薬用途双方における活性成分の経皮供給にも有効であった。本発明のミクロエマルジョン組成物および製剤は、オリゴヌクレオチドおよび核酸の胃腸管からの増大した全身性吸収を容易にし、更には、胃腸管、膣、口腔および他の投与部位内でのオリゴヌクレオチドおよび核酸の局所性細胞内取込みを向上させることが期待される。
【０１２８】
本発明のミクロエマルジョンは、本発明のオリゴマー化合物および核酸の製剤の性質を向上させるためにおよび吸収を高めるために、ソルビタンモノステアラート（Grill ３）、Labrasol および浸透促進剤などの追加の成分および添加剤を含有してもよい。本発明のミクロエマルジョンに用いられる浸透促進剤は、大まかな５種類、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤および非キレート化非サーファクタントの内の一つに属するとして分類することができる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,p.92）。これらクラスは各々、上に論じられた。
【０１２９】
薬物の製剤化について研究され且つ用いられてきたミクロエマルジョンの他にも、多数の組織的なサーファクタント構造が存在する。これらには、単分子層、ミセル、二分子層および小胞が含まれる。リポソームなどの小胞は、それらが提供する、それらの特異性および作用期間ゆえに、薬物供給の見地からきわめて興味をひいている。本発明で用いられる「リポソーム」という用語は、一つまたは複数の球状層に配列した両親媒性脂質を含んでなる小胞を意味する。
【０１３０】
リポソームは、親油性材料から形成される膜と水性内部を有する単層または多重層の小胞である。この水性部分は、供給される組成物を含有する。陽イオンリポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非陽イオンリポソームは、効率よくというように細胞壁と融合することはできないが、in vivo でマクロファージによって取り込まれる。無傷の哺乳動物皮膚を越えるためには、脂質小胞は、適当な経皮的勾配の影響下において、各々５０ｎｍ未満の直径を有する一連の細孔を通過しなければならない。したがって、きわめて変形性であり且つこのような細孔を通過することができるリポソームを使用することが望まれる。
【０１３１】
リポソームの更なる利点には、下記が含まれる：天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性であり且つ生物分解性である；リポソームは、広範囲の水溶性および脂質可溶性の薬物を包含することができる；リポソームは、それらの内部区画中に内包された薬物を代謝および分解から保護することができる（Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker(Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1,p.245）。リポソーム製剤の製造における重要な問題は、脂質表面電荷、小胞サイズおよびリポソームの水性容量(aqueous volume)である。
【０１３２】
リポソームは、作用部位への活性成分の輸送および供給に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜に似ているので、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜と合体し始める。リポソームと細胞の合体が進行するにつれて、リポソーム内容物は細胞中に移され、そこで活性剤が作用しうる。
【０１３３】
リポソーム製剤は、多数の薬物の供給様式としての広範囲の研究の焦点になっている。局所投与について、リポソームは他の製剤にまさるいくつかの利点を与えるということがますます証明されている。このような利点には、投与される薬物の高い全身性吸収に関連する減少した副作用、所望の標的部位における投与される薬物の増加した蓄積、および親水性および疎水性双方の種々の薬物を皮膚中に投与する能力が含まれる。
【０１３４】
いくつかの報告は、高分子量ＤＮＡを含めた薬剤を皮膚中に供給するリポソームの能力を詳述している。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含めた化合物は、皮膚に投与されている。大部分の用途は、上部表皮の標的指向（ターゲッティング）をもたらした。
【０１３５】
リポソームは、二つの大まかなクラスに分類される。陽イオンリポソームは、陰電荷ＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する陽電荷リポソームである。陽電荷のＤＮＡ／リポソーム複合体は、陰電荷細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に取り込まれる。エンドソーム内の酸性ｐＨのために、リポソームは破裂し、それらの内容物が細胞質中に放出される（Wang et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 1987,147,980-985）。
【０１３６】
ｐＨ感受性または陰電荷であるリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するよりもむしろＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡも脂質も、同様に帯電しているので、複合体形成よりもむしろ反発が生じる。それにもかかわらず、若干のＤＮＡは、これらリポソームの水性内部中に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に供給するのに用いられている。外因性遺伝子の発現は、標的細胞中で検出された（Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992,19,269-274）。
【０１３７】
一つの主要なタイプのリポソーム組成物は、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質を包含する。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成されうる。陰イオンリポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、陰イオン性融合誘導リポソームは、主に、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、ダイズＰＣおよび卵ＰＣなどから形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１３８】
いくつかの研究は、皮膚へのリポソーム薬製剤の局所供給を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス潰瘍の減少をもたらしたが、他の手段による（例えば、溶液としてまたはエマルジョンとしての）インターフェロンの供給は、無効であった（Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992,2,405-410）。更に、追加の研究は、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの効力を、水性系を用いたインターフェロンの投与に対して調べ、リポソーム製剤が水性投与より優れていたと結論づけた（du Plessis et al., Antiviral research, 1992,18,259-265）。
【０１３９】
非イオンリポソーム系も調べて、皮膚への薬物の供給、特に、非イオンサーファクタントおよびコレステロールを含む系におけるそれらの有用性を決定した。NovasomeＴＭＩ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）および NovasomeＴＭII（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオンリポソーム製剤を用いて、サイクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮中に供給した。結果は、このような非イオンリポソーム系が、皮膚の異なった層中へのサイクロスポリンＡの沈着を促進する場合に有効であったことを示した（Hu et al., S.T.P.Pharma.Sci., 1994,4,6,466）。
【０１４０】
リポソームには、特殊化された脂質が、リポソーム中に包含された場合に、このような特殊化された脂質を欠いたリポソームに比べて増大した循環寿命を生じる、一つまたはそれを超える特殊化された脂質を含むリポソームを意味する、本明細書中で用いられる用語である「立体的に安定化された」リポソームも含まれる。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部分が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの一つまたはそれを超える糖脂質を含むもの、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの一つまたはそれを超える親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いずれの特定の理論によっても拘束されたくはないが、当該技術分野において、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧで誘導体化された脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについては少なくとも、これら立体的に安定化されたリポソームの増大した循環半減期が、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中への減少した取込みに由来しているということが考えられる（Allen et al., FEBS Letters, 1987,223,42; Wu et al., Cancer Research, 1993,53,3765）。
【０１４１】
一つまたはそれを超える糖脂質を含む種々のリポソームは、当該技術分野において知られている。Papahadjopoulos et al.（Ann.N.Y.Acad.Sci., 1987,507,64）は、リポソームの血中半減期を向上させるモノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これら知見は、Gabizon et al.（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1988,85,6949）によって説明された。双方とも Allen et al., による米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Webb et al.）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−sn−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９号（Lim et al.）に開示されている。
【０１４２】
一つまたはそれを超える親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多数のリポソームおよびそれらの製造方法が、当該技術分野において知られている。Sunamoto et al.（Bull.Chem.Soc.Jpn., 1980,53,2778）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオンデタージェント２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。Illum et al.（FEBS Lett., 1984,167,79）は、ポリマー性グリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングが、有意に増大した血中半減期をもたらすということに注目した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の取り付けによって修飾された合成リン脂質は、Sears（米国特許第４，４２６，３３０号および第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Klibanov et al.（FEBS Lett., 1990,268,235）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期の有意の増加を有するということを示す実験を記載した。Blume et al.（Biochimica et Biophysica Acta, 1990,1029,91）は、このような知見を、他のＰＥＧで誘導体化されたリン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組合せから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧへと拡大させた。共有結合したＰＥＧ部分を外表面上に有するリポソームは、Fisher による欧州特許ＥＰ０４４５１３１Ｂ１号およびＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。１〜２０モルパーセントの、ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含有するリポソーム組成物およびそれらの使用方法は、Woodle et al.（米国特許第５，０１３，５５６号および第５，３５６，６３３号）および Martin et al.（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号）によって記載されている。若干数の他の脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、ＷＯ９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（双方とも Martin et al. による）およびＷＯ９４／２００７３号（Zalipsky et al.）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１号（Choi et al.）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Miyazaki et al.）および同第５，５５６，９４８号（Tagawa et al.）は、官能基部分で表面上に更に誘導体化されうるＰＥＧ含有リポソームを記載している。
【０１４３】
核酸を含む限られた数のリポソームが、当該技術分野において知られている。Thierry et al. によるＷＯ９６／４００６２号は、高分子量核酸をリポソーム中に内包する方法を記載している。Tagawa et al. による米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質に結合したリポソームを開示し、そしてこのようなリポソームの内容物がアンチセンスＲＮＡを包含しうるということを主張している。Rahman et al., による米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中に内包する若干の方法を記載している。Love et al., によるＷＯ９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子に標的指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示している。
【０１４４】
トランスファーソーム（transfersomes）は、また別のタイプのリポソームであり、薬物供給ビヒクルにとって魅力的な候補であるきわめて変形性の脂質凝集体である。トランスファーソームは、きわめて変形性の脂質液体粒子であるので、その液体粒子より小さい細孔を介して容易に浸透することができる脂質液体粒子として記載することができる。トランスファーソームは、それらが用いられる環境に適応性であり、例えば、それらは、自己最適化性（皮膚の細孔の形状に適応できる）、自己修復性であり、しばしば、フラグメント化することなくそれらの標的に達する、そしてしばしば、自己ローディングする。トランスファーソームを作るために、表面端活性化因子（surface edge-activators）、通常は、サーファクタントを、標準的なリポソーム組成物に加えることは可能である。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを供給するのに用いられてきている。トランスファーソームに媒介される血清アルブミン供給は、血清アルブミン含有溶液の皮下注射と同程度に有効であることが分かっている。
【０１４５】
サーファクタントは、エマルジョン（ミクロエマルジョンを含めた）およびリポソームなどの製剤で広く応用されている。天然および合成双方の多数の異なったタイプのサーファクタントの性質を分類し且つ格付けする最も一般的な方法は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）の使用による。親水基（「ヘッド」としても知られる）の性状は、製剤中で用いられるいろいろなサーファクタントを分類する最も有用な手段を与える（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., 1988, p.285）。
【０１４６】
サーファクタント分子がイオン化されない場合、それは、非イオンサーファクタントとして分類される。非イオンサーファクタントは、医薬製品および化粧品で広く応用されていて、広範囲のｐＨ値にわたって使用できる。概して、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に依存して２〜約１８である。非イオンサーファクタントには、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオンサーファクタントクラスで最も一般的なメンバーである。
【０１４７】
サーファクタント分子が、水中に溶解したまたは分散した時に陰電荷を有する場合、そのサーファクタントは陰イオン性として分類される。陰イオンサーファクタントには、石けんなどのカルボキシラート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルスルフェートおよびエトキシル化アルキルスルフェートなどの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、およびホスフェートが含まれる。陰イオンサーファクタントクラスの最も重要なメンバーは、アルキルスルフェートおよび石けんである。
【０１４８】
サーファクタント分子が、水中に溶解したまたは分散した時に陽電荷を有する場合、そのサーファクタントは陽イオン性として分類される。陽イオンサーファクタントには、第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩は、このクラスで最も用いられるメンバーである。
【０１４９】
サーファクタント分子に、陽電荷または陰電荷のいずれもを有する能力がある場合、そのサーファクタントは両性として分類される。両性サーファクタントには、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが含まれる。薬物製品、製剤およびエマルジョンでのサーファクタントの使用は概説されている（Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., 1988, p.285）。
【０１５０】
一つの態様において、本発明は、動物の皮膚への核酸、特に、オリゴマー化合物の有効な供給を行うのに、種々の浸透促進剤を用いている。大部分の薬物は、溶液中にイオン化された形およびイオン化されない形の両方で存在している。しかしながら、通常は、脂質可溶性または親油性の薬物だけが、容易に細胞膜を越える。越えるべき膜が浸透促進剤で処理されているならば、非親油性薬物でも細胞膜を越えることができるということが発見されている。細胞膜を越えた非親油性薬物の拡散を助けることに加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も増大させる。浸透促進剤は、大まかな５種類、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤および非キレート化非サーファクタントの内の一つに属するように分類することができる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,p.92）。上述の浸透促進剤のクラスは各々、下に更に詳細に記載される。
【０１５１】
本発明に関連して、サーファクタント（または「界面活性剤」）は、水溶液中に溶解した場合に、その水溶液の表面張力またはその水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させる化学物質であり、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が増大するという結果を伴う。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これら浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,p.92）；およびＦＣ４３などのペルフルオロ化学エマルジョンが含まれる。Takahashi et al., J.Pharm.Pharmacol., 1988,40,252）。
【０１５２】
浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−rac−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、およびそれらのモノ−およびジグリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエート等）（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1-33; El Hariri et al., J.Pharm.Pharmacol., 1992,44,651-654）が包含される。
【０１５３】
胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996,pp.934-935）。種々の天然の胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁酸塩」という用語には、いずれかの天然に存在する胆汁成分並びにいずれかのそれらの合成誘導体が含まれる。本発明の胆汁酸塩には、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容しうるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,page 92; Swinyard, Chapter 31 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990,pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1-33; Yamamoto et al., J.Pharm.Exp.Ther., 1992,263,25; Yamashita et al., J.Pharm.Sci., 1990,79,579-583）。
【０１５４】
本発明に関連して用いられるキレート化剤は、それと複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去する化合物として定義することができ、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が増大するという結果を伴う。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、キレート化剤は、大部分の特性決定されたＤＮＡヌクレアーゼが、触媒作用のために二価の金属イオンを必要とし、したがって、キレート化剤によって阻害されるので、ＤＮアーゼ阻害剤としても役立つという追加の利点を有する（Jarrett,J. Chromatogr., 1993,618,315-339）。本発明のキレート化剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これに制限されるわけではない（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1-33; Buur et al., J.Control Rel, 1990,14,43-51）。
【０１５５】
本明細書中で用いられる非キレート化非サーファクタント浸透促進性化合物は、キレート化剤としてもサーファクタントとしても無意味な活性を示すが、それにもかかわらず、消化器粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収を増大させる化合物として定義することができる（Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7,1-33）。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキルアルカノンおよび１−アルケニルアザシクロアルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991,page 92）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド系抗炎症薬（Yamashita et al., J.Pharm.Pharmacol., 1987,39,621-626）が含まれる。
【０１５６】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取込みを増大させる薬剤も、本発明の医薬組成物および他の組成物に加えることができる。例えば、リポフェクチン（Junichi et al., 米国特許第５，７０５，１８８号）などの陽イオン脂質、陽イオングリセロール誘導体、およびポリリシン（Lollo et al., ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１号）などのポリカチオン分子も、オリゴヌクレオチドの細胞内取込みを増大させることが知られている。
【０１５７】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール類、２−ピロールなどのピロール類、アゾン類およびリモネンおよびメントンなどのテルペン類を含めた、他の薬剤を、投与される核酸の浸透を促進するのに利用することができる。
【０１５８】
本発明のある種の組成物は、製剤中に担体化合物も包含する。本明細書中で用いられる「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわち、それ自体は生物学的活性を有していない）が、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを、例えば、生物学的に活性な核酸を分解することまたは循環からのその除去を促進することによって減少させる in vivo 過程で、核酸として認識される核酸またはその類似体を意味することができる。核酸および担体化合物の、典型的には、過剰の後者物質を含む共投与は、おそらくは、共通の受容体への担体化合物と核酸との間の競合のために、肝、腎臓または他の循環外貯蔵器に回収される核酸の量の実質的減少を引き起こすことがありうる。例えば、肝組織中の部分ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収は、それを、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸または４−アセトアミド−４’−イソチアシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与した場合に減少することがありうる（Miyao et al., Antisense Res.Dev., 1995,5,115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl.Acid Drug Dev., 1996,6,177-183）。
【０１５９】
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、一つまたはそれを超える核酸を動物に供給するための薬学的に許容しうる溶媒、懸濁化剤またはいずれか他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であってよく、計画される投与方式を考慮して、核酸とある一定の医薬組成物の他の成分とを組み合わせた場合の所望の嵩、コンシステンシー等を与えるように選択される。典型的な医薬担体には、結合剤（例えば、プレゲル化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウム等）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩類、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコラートナトリウム等）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１６０】
核酸と有害な反応をしない、非経口的でない(non-parenteral)投与に適した薬学的に許容しうる有機または無機賦形剤を、本発明の組成物を製剤化するのに用いることもできる。適当な薬学的に許容しうる担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１６１】
核酸の局所投与用製剤には、滅菌および非滅菌の、水溶液、アルコールなどの一般溶媒中の非水溶液、または液体または固形油基剤中の核酸の溶液が含まれうる。これら溶液は、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有してよい。核酸と有害な反応をしない、非経口的でない投与に適した薬学的に許容しうる有機または無機賦形剤を用いることができる。
【０１６２】
適当な薬学的に許容しうる賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１６３】
本発明の組成物は、更に、医薬組成物中で慣用的に見出される他の補助成分を、それらの技術分野で確立された使用レベルで含有してよい。したがって、例えば、これら組成物は、追加の相容性で薬学的に活性な材料、例えば、止痒薬、収斂薬、局所麻酔薬または抗炎症薬などを含有してよいし、または本発明の組成物の種々の剤形を物理的に製剤化する場合に有用な、色素、着香剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤などの追加の材料を含有してよい。しかしながら、このような材料は、加えられる場合、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げるべきではない。これら製剤は、滅菌し、そして所望ならば、製剤の一つまたは複数の核酸と有害な反応をしない補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩類、緩衝剤、着色剤、着香剤および／または芳香物質等と混合することができる。
【０１６４】
水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含めた、懸濁剤の粘度を増加させる物質を含有してよい。この懸濁剤は、安定化剤も含有してよい。
【０１６５】
本発明の化合物は、取込み、分配および／または吸収を助けるための、例えば、リポソーム、受容体標的指向分子、経口、直腸、局所用のまたは他の製剤のような、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合する、カプセルに内包する、コンジュゲートするまたはそれ以外の形式で会合することもできる。このような取込み、分配および／または吸収を助ける製剤の製造を教示する代表的な米国特許には、各々が本明細書中に援用される、米国特許第５，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１５８号；第５，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５，４６９，８５４号；第５，５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５，５８０，５７５号；および第５，５９５，７５６号が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１６６】
本発明のオリゴマー化合物は、いずれかの薬学的に許容しうる塩、エステル、またはこのようなエステルの塩、またはヒトを含めた動物への投与で、その生物学的に活性な代謝産物または残渣を（直接的にまたは間接的に）与えることができるいずれか他の化合物を包含する。したがって、例えば、この開示は、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容しうる塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容しうる塩、および他の生物学的同等物にも及ぶ。
【０１６７】
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素または他の化学物質および／または状態の作用によって体内またはその細胞内で活性型（すなわち、薬物）に変換される不活性型で製造される治療薬を意味する。具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、１９９３年１２月９日公開の Gosselin et al. によるＷＯ９３／２４５１０号または Imbach et al. によるＷＯ９４／２６７６４号およびＵ．Ｓ．５，７７０，７１３号に開示された方法にしたがって、ＳＡＴＡ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として製造される。
【０１６８】
「薬学的に許容しうる塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的におよび薬学的に許容しうる塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し且つそれに望ましくない毒物学的効果を与えない塩を意味する。
【０１６９】
薬学的に許容しうる塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンのような、金属またはアミンで形成される。陽イオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適当なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインである（例えば、Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. of Pharma Sci., 1977,66,1-19 を参照されたい）。この酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸の形と充分な量の所望の塩基とを慣用法で接触させて塩を生じることによって製造される。遊離酸の形は、塩の形と酸とを慣用法で接触させ且つ遊離酸を単離することによって再生することができる。遊離酸の形は、極性溶媒への溶解度などの一定の物理的性質が、それらのそれぞれの塩の形とある程度異なるが、それ以外では、これら塩は、本発明の目的のそれぞれの遊離酸に等しい。本明細書中で用いられる「薬学的付加塩」には、本発明の組成物の一つの成分の酸の形の薬学的に許容しうる塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩または無機酸塩が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適当な薬学的に許容しうる塩は、当業者に周知であり、種々の無機酸または有機酸、例えば、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸などとの；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ若しくはホスホ酸(sulfo and phospho acids)、またはＮ−置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸（embonic acid）、ニコチン酸またはイソニコチン酸との；および天然のタンパク質合成に関与する２０α−アミノ酸などのアミノ酸、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸との、そして更に、フエニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−または３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成で）との、またはアスコルビン酸などの他の酸有機化合物とのような塩基性塩が含まれる。化合物の薬学的に許容しうる塩は、薬学的に許容しうる陽イオンで製造することもできる。適当な薬学的に許容しうる陽イオンは、当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四級アンモニウムの陽イオンが含まれる。炭酸塩または炭酸水素塩も可能である。
【０１７０】
オリゴマー化合物について、薬学的に許容しうる塩の好ましい例には、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミン等のような陽イオンで形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等で形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸等などで形成される塩；および（ｄ）塩素、臭素およびヨウ素などの元素陰イオンから形成される塩が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１７１】
本明細書中に示される材料、方法および実施例は、例示するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中に挙げられた公報、特許出願、特許および他の参考文献は全て、本明細書中にそのまま援用される。特に断らない限り、専門用語および科学用語は全て、それら技術分野で認められる意味を有するものである。
【０１７２】
実施例１
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−チミジン（２）。
【０１７３】
【化１６】
2005504020.tif 000018
【０１７４】
化合物１（８００ｍｇ，３．３ｍｍｏｌ，（Smejkal,J. et al. Collect.Czech.Chem.Commun. 1964,29,2809-2813 および Jung,M.E. et al. Tetrahedron Lett. 1998,39,4615-4618 にしたがって製造される））を、高真空下のＰ２Ｏ５上において４０℃で一晩乾燥させた。次に、それを無水ピリジン（１０ｍＬ）と共蒸発させた。得られた残留物を、ピリジン（９ｍＬ）中にアルゴン雰囲気下で溶解させた。４−ジメチルアミノピリジン（４０ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）および塩化ＤＭＴ（ＤＭＴ−Ｃｌ，１．３３ｇ，３．９３ｍｍｏｌ）をその混合物に加え、反応混合物を室温で、出発物質が全て消失するまで（１２時間）撹拌した。メタノール（０．５ｍＬ）を加え、溶媒を真空中で除去した。残留物をクロマトグラフィーによって分離し、６：４の酢酸エチル：ヘキサンで溶離して、２（１．４２ｇ，７９％）を生じた。
Ｒｆ＝０．１７（６：４の酢酸エチル：ヘキサンで）。
ＭＳ（ＥＳ＋）ｍ／ｚ５４３（Ｍ−Ｈ）。
【０１７５】
実施例２
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−チミジン−３’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（３）。
化合物２（１．００ｇ，１．８４ｍｍｏｌ）を、トルエン（２０ｍＬ）と共蒸発させた。その残留物に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．１６ｇ，０．９２ｍｍｏｌ）を加え、高真空下のＰ２Ｏ５上において４０℃で一晩乾燥させた。乾燥した反応混合物を、無水アセトニトリル：ＣＨ２Ｃｌ２（９：２ｍＬ）中に溶解させ、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（１．２ｍＬ，３．６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、不活性雰囲気下において周囲温度で４時間撹拌した。反応の進行は、ＴＬＣ（１：１のヘキサン：酢酸エチル）によって監視した。溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチル（７０ｍＬ）中に溶解させ、５％水性ＮａＨＣＯ３（４０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。得られた残留物を、クロマトグラフィーによって分離して（溶離剤として３：２の酢酸エチル：ヘキサン）、３を泡状物（０．８２ｇ，６０．３％）として生じた。
Ｒｆ＝０．４７（３：２の酢酸エチル：ヘキサン）。
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１４９．９８，１４９．５７ｐｐｍ；
ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）ｍ／ｚ７４３．３（Ｍ−Ｈ）
【０１７６】
実施例３
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−チミジン−３’−Ｏ−スクシニルＣＰＧ（４）。
化合物２（０．２ｇ，０．３７ｍｍｏｌ）を、無水コハク酸（０．０７４ｇ，０．７３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０２３ｇ，０．１９ｍｍｏｌ）と混合した。その混合物を、真空中においてＰ２Ｏ５上で一晩乾燥させた。これに、Ｃｌ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃｌ（１．１ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．２ｍＬ，１．４６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を６０℃で２時間加熱した。その反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、５％水性クエン酸（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で濃縮して（０．２２ｇ，９３％）泡状物とした。
Ｒｆ＝０．２３（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ中の５％ＭｅＯＨ）。
得られた残留物を、次の反応にそのまま用いた。
【０１７７】
【数１】
2005504020.tif 000019
【０１７８】
スクシニル誘導体（０．１９ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を、真空中のＰ２Ｏ５上において４０℃で一晩乾燥させた。無水ＤＭＦ（０．６２ｍＬ）を加えた後、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール）−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（０．０８１ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（５５μＬ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。旋回させて透明溶液を生じた。これに、無水ＤＭＦ（２．４ｍＬ）および活性ＣＰＧ（１．０８ｇ，１１５．２ｍｍｏｌ／ｇ，粒度１２０／２００，平均細孔直径５２０Å）を加えた。次に、それを振とう機上で１８時間振とうさせた。アリコートを取り、負荷能力を推定した。機能付加されたＣＰＧを濾過し、ＤＭＦ、ＣＨ３ＣＮおよびＥｔ２Ｏで充分に洗浄した。真空中で一晩乾燥させた。機能付加されたＣＰＧ（３）を、キャッピング溶液（２ｍＬ，ＣａｐＡ，無水酢酸／ルチジン／ＴＨＦ，２ｍＬ，ＣａｐＢ，Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ，Perspective Biosystems Inc.）中に懸濁させ、振とう機上で２時間振とうさせた。濾過し、ＣＨ３ＣＮおよびＥｔ２Ｏで洗浄した。真空中で乾燥させ、そして負荷能力を標準法によって決定した。最終負荷能力５２．６２μｍｏｌ／ｇ。
【０１７９】
実施例４
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（５）。
１−クロロ−５，３−ビス（トリル）−２−デオキシＬ−リボースを、［Jung,M.E. et al. Tetrahedron Lett. 1990,31,6983-6986; Gosselin,G. et al. Tetrahedron Lett. 1997,38,4199-4202, Nucleosides & Nucleotides 1998,17,1731-1738］に記載のように製造する。次に、これを、Vorbruggen 条件下においてＮ４−ベンゾイルアデニンとカップリングさせて、Ｎ４−ベンゾイル−５’，３’−トリル−１−アデノシンを生じる。メチルアミンでのトリル基の脱保護は、Ｌ−アデノシンを生じる。次に、それを、塩化ベンゾイル、ＴＭＳＣｌ、ピリジンおよび水性アンモニアの存在下の一時的な保護条件下においてＮ４−ベンゾイル−Ｌ−アデノシンに変換する。ピリジン中ＤＭＴＣｌの存在下での５’−トリチル化および３’位におけるホスフィチル化は、化合物５を生じる。
【０１８０】
実施例５
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（６）
化合物２を、参考文献手順［Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176］にしたがって、５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−５−メチルシチジンに変換する。次に、それを、参考文献手順［Bhat,V. et al. Nucleosides Nucleotides 1989,8,179-183］にしたがって、Ｎ４−ベンゾイル誘導体に変換する。次に、これを、３’位においてホスフィチル化して、化合物６を生じる。
【０１８１】
実施例６
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（７）
１−クロロ−５，３−ビス（トリル）−２−デオキシＬ−リボースを、Jung,M.E. et al. Tetrahedron Lett. 1997,38,4199-4202 および Gosselin,G. et al. Nucleosides & Nucleotides 1998,17,1731-1738 に記載のように製造する。次に、これを、４−クロロ−２−アミノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン［Davoll,J. et al. J.Chem.Soc. 1960,131-138 によって記載の手順にしたがって製造される］と、ＮａＨおよびアセトニトリルの下でカップリングさせる［Ramasamy,K. et al. J.Hetrocyclic Chem., 1988,25,1893-1897］。次に、これを、８０℃において水性アンモニアで処理して、Ｌ−２’−デオキシグアノシンを生じる。これを、塩化イソブチリル、ピリジンおよびＴＭＳＣｌの存在下の一時的な保護条件下においてＬ−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシンに変換する［Ti,G.S. et al. J.Am.Chem.Soc., 1982,104,1316-1319］。次に、これを、ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰおよびピリジンの存在下で５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシンに変換後、３’位にホスフィチル化して、化合物７を生じる。
【０１８２】
実施例７
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−５−（１−プロピニル）ウリジン−３’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスファミダイト］（８）
１−クロロ−５，３−ビス（トリル）−２−デオキシＬ−リボースを、Jung,M.E. et al. Tetrahedron Lett. 1997,38,4199-4202 および Gosselin,G. et al. Nucleosides & Nucleotides 1998,17,1731-1738 に記載のように製造する。次に、これを、Vorbruggen 条件下において５−ヨードウラシルとカップリングさせて、Ｌ−５−（ヨード）−５’，３’−トリル−１−ウリジンを生じる。次に、これをプロピン［Switzer C. et al., Bioorg.Med.Chem.Lett. 1996,6,815-818 に記載の］とカップリングさせて、Ｌ−５−（プロピニル）−５’，３’−トリルウリジンを生じる。５’位および３’位の保護基の脱保護は、Ｌ−５−（プロピニル）ウリジンを生じる。この化合物を、ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰおよびピリジンで５’−Ｏ−ＤＭＴ化合物に変換後、ホスフィチル化して、標題化合物８を生じる。
【０１８３】
実施例８
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−５−（１−プロピニル）シチジン−３’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（９）
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−５−（１−プロピニル）ウリジン（化合物７について記載の手順にしたがって製造される）を、参考文献手順［Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176］にしたがって、５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−５−（１−プロピニル）シチジンに変換する。これを、３’位にホスフィチル化して、化合物９を生じる。
【０１８４】
実施例９
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−３（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）（９Ｉ）−１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン−３’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（１０）
Ｌ−５−ブロモウリジンを、５−ブロモウリジンおよび１−クロロ−５，３−ビス（トリル）−２−デオキシＬ−リボースから、Vorbruggen 条件下で得る。これを、参考文献手順［Lin,K-Y. et al J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874, Matteucci,M.D. et al. ９４−ＵＳ１０５３６］にしたがって、５，３−ビス（トリル）−Ｌ−３（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）（９Ｉ）−１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オンに変換する。次に、これを、メチルアミンで脱保護し、５’位にトリチル化し、そして３’位にホスフィチル化して、化合物１０を生じる。
【０１８５】
実施例１０
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｏ−スクシニルＣＰＧ（１１）。
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン（化合物５の合成に記載のように製造される）を、無水コハク酸およびＤＭＡＰの存在下のジクロロエタン中において６０℃で、３’−Ｏ−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール）−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびＮ−メチルモルホリンの存在下のＤＭＦ中においてアミノアルキルＣＰＧにカップリングさせて、化合物１１を生じる。
【０１８６】
実施例１１
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−スクシニルＣＰＧ（１２）。
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−２’−デオキシシチジン（化合物６の合成に記載のように製造される）を、無水コハク酸およびＤＭＡＰの存在下のジクロロエタン中において６０℃で、３’−Ｏ−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール）−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびＮ−メチルモルホリンの存在下のＤＭＦ中においてアミノアルキルＣＰＧにカップリングさせて、化合物１２を生じる。
【０１８７】
実施例１２
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−スクシニルＣＰＧ（１３）。
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン（化合物７の合成に記載のように製造される）を、無水コハク酸およびＤＭＡＰの存在下のジクロロエタン中において６０℃で、３’−Ｏ−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール）−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびＮ−メチルモルホリンの存在下のＤＭＦ中においてアミノアルキルＣＰＧにカップリングさせて、化合物１３を生じる。
【０１８８】
実施例１３
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−５−（１−プロピニル）ウリジン−３’−Ｏ−スクシニルＣＰＧ（１４）。
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−５−（１−プロピニル）ウリジン（化合物８の合成に記載のように製造される）を、無水コハク酸およびＤＭＡＰの存在下のジクロロエタン中において６０℃で、３’−Ｏ−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール）−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびＮ−メチルモルホリンの存在下のＤＭＦ中においてアミノアルキルＣＰＧにカップリングさせて、化合物１４を生じる。
【０１８９】
実施例１４
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−５−（１−プロピニル）シチジン−３’−Ｏ−スクシニルＣＰＧ（１５）。
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−５−（１−プロピニル）シチジン（化合物８の合成に記載のように製造される）を、無水コハク酸およびＤＭＡＰの存在下のジクロロエタン中において６０℃で、３’−Ｏ−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール）−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびＮ−メチルモルホリンの存在下のＤＭＦ中においてアミノアルキルＣＰＧにカップリングさせて、化合物１５を生じる。
【０１９０】
実施例１５
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−３（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）（９Ｉ）−１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン−３’−Ｏ−スクシニルＣＰＧ（１６）。
５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｌ−３（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）（９Ｉ）−１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン（化合物１０の合成に記載のように製造される）を、無水コハク酸およびＤＭＡＰの存在下のジクロロエタン中において６０℃で、３’−Ｏ−スクシニル誘導体に変換する。このスクシニル誘導体を、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール）−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートおよびＮ−メチルモルホリンの存在下のＤＭＦ中においてアミノアルキルＣＰＧにカップリングさせて、化合物１６を生じる。
【０１９１】
実施例１６
Ｌ−チミジン修飾を含有するオリゴヌクレオチドの合成
アミダイト３を、無水アセトニトリル中に溶解させて０．１Ｍ溶液を生じ、Expedite Nucleic Acid Synthesis システム（Millipore ８９０９）に装填して、オリゴヌクレオチドを合成した。カップリング効率は９８％を超えた。修飾されたアミダイト（３）のカップリングのために、カップリング時間を１０分に延長し、この工程を２回行った。Millipore によって供給されるプロトコールにおける他の工程は全てそのまま用いた。合成の完了後、ＣＰＧを水性アンモニア（３０重量％）中に室温で２時間懸濁させて、オリゴヌクレオチドをＣＰＧから脱保護した。ＣＰＧを濾過し、濾液を５５℃で６時間加熱して、全ての保護基の脱保護を完了した。アンモニアをスピードバクコンセントレーター（speed vac concentrator）で除去後、生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Waters，Ｃ−４，７．８Ｘ３００ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセトニトリル，５５分以内に５〜６０％Ｂ，流速２．５ｍＬ／分，λ＝２６０ｎｍ）によって精製した。水性８０％酢酸での脱トリチル化および蒸発後、Waters Ｃ−４カラムでのＨＰＬＣによって脱塩して、２’−修飾オリゴヌクレオチド（表Ｉ）を生じた。オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣ、ＣＧＥおよび質量分析法によって分析した。
【０１９２】
実施例１７
【０１９３】
【表１】
2005504020.tif 000020
【０１９４】
Ｔ＊＝Ｌ−チミジン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ，ａWaters Ｃ−４，３．９ｘ３００ｍｍ，溶媒Ａ＝５０ｍｍＴＥＡＡｃ，ｐＨ７；溶媒Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ；５５分以内に５〜６０％Ｂの勾配；流速１．５ｍＬ／分，λ＝２６０ｎｍ。
【０１９５】
実施例１８
【０１９６】
【表２】
2005504020.tif 000021
【０１９７】
Ｔ＊＝Ｌ−チミジン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
Ｌ−異性体配置による結合親和性損失を克服するために、本発明者は、Ｌ／Ｄ−キメラ中に２’−Ｏ−ＭＯＥ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））修飾も包含させ、そして得られたキメラ化合物のＲＮＡ標的への結合親和性を評価した。Ｔｍ分析は、キメラ中のＬ−チミジンと一緒の２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾の包含が、ＲＮＡ結合に対するＬ−チミジンによる親和性損失を補うということを示した。したがって、２’−Ｏ−ＭＯＥおよび２’−デオキシホスホロチオエートの組合せのＬ−チミジンキャップから成るデゼイナーのオリゴヌクレオチド構築体は、優れたアンチセンスオリゴヌクレオチド薬のために好ましい性質を提供する。
【０１９８】
実施例１９
【０１９９】
【表３】
2005504020.tif 000022
【０２００】
Ｃ＊＝Ｌ−シチジン，Ａ＊＝Ｌ−アデノシン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２０１】
実施例２０
新規な核酸塩基を有するＬ−ヌクレオシドおよびそれから誘導されるオリゴヌクレオチド
【０２０２】
【化１７】
2005504020.tif 000023
【０２０３】
実施例２１
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’，３’−ジデオキシ−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルシチジン（２９）。
２’，３’−ジデオキシシチジン２６［Horwitz,J.P. et al. J.Org.Chem. 1967,32,817-818 の参考文献手順によって製造される］を、ＴＢＤＭＳＣｌおよびピリジンの存在下において５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物２７（スキーム３）を生じる。化合物２７を、１，２−ジクロロエタン中において無水コハク酸およびＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物２８を生じる。化合物２８を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のＤＭＴＣｌおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物２９を生じる。
【０２０４】
スキーム３
【０２０５】
【化１８】
2005504020.tif 000024
【０２０６】
実施例２２
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’，３’−ジデオキシ−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルアデノシン（３３）。
２’，３’−ジデオキシアデノシン３０［Horwitz,J.P. et al. J.Org.Chem. 1967,32,817-818 の参考文献手順によって製造される］を、ＴＢＤＭＳＣｌおよびピリジンの存在下において５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物３１（スキーム４）を生じる。化合物３１を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物３２を生じる。化合物３２を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中の塩化ＤＭＴおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物３３を生じる。
【０２０７】
スキーム４
【０２０８】
【化１９】
2005504020.tif 000025
【０２０９】
実施例２３
２’，３’−ジデオキシオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）および３５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を、化合物１７〜２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８〜１５）の合成について用いられた手順にしたがって、固体支持体２９および３３をそれぞれ用いて製造する。
【０２１０】
実施例２４
【０２１１】
【表４】
2005504020.tif 000026
【０２１２】
Ｃ＊＝２，−３’−ジデオキシシチジン，Ａ＊＝２，−３’−ジデオキシアデノシン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２１３】
実施例２５
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロ−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルシチジン（３９）。
２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロシチジン３６［Chu,C.K. et al. J.Org.Chem. 1989,54,217-225 に報告された手順にしたがって製造される］を、ＴＢＤＭＳＣｌの存在下のピリジンにおいて５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物３７（スキーム５）を生じる。化合物３７を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物３８を生じる。化合物３８を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中の塩化ＤＭＴおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物３９を生じる。
【０２１４】
スキーム５
【０２１５】
【化２０】
2005504020.tif 000027
【０２１６】
実施例２６
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシ−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルアデノシン（４３）。
２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロアデノシン４０［Chu,C.K. et al. J.Org.Chem. 1989,54,217-225 に報告された手順にしたがって製造される］を、ＴＢＤＭＳＣｌおよびピリジンの存在下において５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物４１（スキーム６）を生じる。化合物４１を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物４２を生じる。化合物４２を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のＤＭＴＣｌおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物４３を生じる。
【０２１７】
スキーム６
【０２１８】
【化２１】
2005504020.tif 000028
【０２１９】
実施例２７
【０２２０】
【表５】
2005504020.tif 000029
【０２２１】
Ｃ＊＝２，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシシチジン，Ａ＊＝２，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシアデノシン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２２２】
実施例２８
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルシチジン（５０）。
２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロウリジン４６［Martin J.A. et al. J.Med.Chem. 1990,33,2137-2145 に報告されたように製造される］を、報告された手順［参考文献：Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176］にしたがって、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロシチジン４７（スキーム７）に変換する。化合物４７を、ＴＢＤＭＳＣｌおよびピリジンの存在下において５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物４８を生じる。化合物４８を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物４９を生じる。化合物４９を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のＤＭＴＣｌおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物５０を生じる。
【０２２３】
スキーム７
【０２２４】
【化２２】
2005504020.tif 000030
【０２２５】
実施例２９
【０２２６】
【表６】
2005504020.tif 000031
【０２２７】
Ｃ＊＝２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロシチジン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２２８】
実施例３０
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’，３’−デオキシ−３’−フルオロ−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルシチジン（５６）。
２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロウリジン５２［Zaitseva,G.V. et al. Bioorg.Khim. 1988,14,1275-1281 に報告された手順にしたがって製造される］を、報告された手順［参考文献：Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176］にしたがって、２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロシチジン５３（スキーム８）に変換する。化合物５３を、ＴＢＤＭＳＣｌおよびピリジンの存在下において５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物５４を生じる。化合物５４を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物５５を生じる。化合物５５を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中の塩化ＤＭＴおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物５６を生じる。
【０２２９】
スキーム８
【０２３０】
【化２３】
2005504020.tif 000032
【０２３１】
実施例３１
【０２３２】
【表７】
2005504020.tif 000033
【０２３３】
Ｃ＊＝２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロシチジン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２３４】
実施例３２
５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−デオキシ−２’−Ｏ−［２−（メトキシ）エチル］−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルシチジン（６２）。
５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン５８を、参考文献手順［Reese,C.B. et al. Tetrahedron Lett. 1999,55,5635-5640］にしたがって合成する。次に、化合物５８を、報告された手順［Danel,K. et al. J.Med.Chem. 1996,39,2427-2431］にしたがって５９に変換する。化合物５９を、ＴＢＤＭＳＣｌおよびピリジンの存在下において５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物６０を生じる。化合物６０を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物６１を生じる。化合物６１を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のＤＭＴＣｌおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物６２を生じる。
【０２３５】
スキーム９
【０２３６】
【化２４】
2005504020.tif 000034
【０２３７】
実施例３３
【０２３８】
【表８】
2005504020.tif 000035
【０２３９】
Ｃ＊＝３’−デオキシ−２’−Ｏ−［２−（メトキシ）エチル］−５−メチルシチジン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２４０】
実施例３４
Ｎ−トリフルオロアセチルピロリジン−２−（ＤＭＴ）メタノール−３−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］（６７）。
化合物６４を、参考文献手順［Huwe,C.M. et al. Synthesis, 1997,1,61-67］にしたがって合成する。次に、それを、エタノール中のトリフルオロ酢酸エチルの存在下においてトリフルオロメチル誘導体６５に変換する。化合物６５をトリチル化して、化合物６６を生じる。化合物６６をホスフィチル化して、化合物６７を生じる。
【０２４１】
実施例３５
３−Ｏ−（ＣＰＧ−スクシニル）−Ｎ−トリフルオロアセチルピロリジン−２−（ＤＭＴ）メタノール（６８）。
化合物６６を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物６８を生じる。
【０２４２】
スキーム１０
【０２４３】
【化２５】
2005504020.tif 000036
【０２４４】
実施例３６
【０２４５】
【表９】
2005504020.tif 000037
【０２４６】
Ｂ＊＝３−ヒドロキシ−２−ピロリジンメタノール，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２４７】
実施例３７
１−［２−（Ｏ−スクシニルＣＰＧ）−１−［２−ヒドロキシ−１−（Ｏ−ＤＭＴ−メチル）エトキシ］エチル］シトシン（７６）。
化合物７３を、報告された手順（スキーム１１）［参考文献：Bessodes,M. et al. Tetrahedron Lett. 1985,26(10),1305-1306］にしたがって製造する。これを、ピリジン中の１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサンの存在下でシリル化化合物に変換後、環外アミノ基をＤＭＦ中の無水安息香酸でベンゾイル化して、化合物７４を生じる。化合物７４をスクシニル化して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物７５を生じる。これを脱シリル化し、そしてトリチル化して、化合物７６を生じる。
【０２４８】
スキーム１１
【０２４９】
【化２６】
2005504020.tif 000038
【０２５０】
実施例３８
１−［２−Ｏ−（アセチル）−１−［２−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］−１−（Ｏ−ＤＭＴ−メチル）エトキシ］エチル］シトシン（７９）。
化合物７３を、ピリジン中の１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサンでシリル化して、化合物７７を生じる。次に、これを、ピリジン中の塩化アセチルでアセチル化して、化合物７８を生じる。化合物７８を、ＴＨＦ中のＴＥＡ．３ＨＦおよびＴＥＡで脱シリル化する。これを、ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰおよびピリジンでトリチル化後、ホスフィチル化して、化合物７９を生じる。
【０２５１】
スキーム１２
【０２５２】
【化２７】
2005504020.tif 000039
【０２５３】
実施例３９
【０２５４】
【表１０】
2005504020.tif 000040
【０２５５】
Ｃ＊＝１−［２−ヒドロキシ−１−［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ］エチルシトシン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２５６】
実施例４０
１−［２−Ｏ−（アセチル）−１−［２−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト］−１−（Ｏ−ＤＭＴ−メチル）チオエチル］エチル］シトシン（８６）。
化合物８２を、参考文献手順［Nake,T. et al. J.Am.Chem.Soc. 2000,122,7233-7243］にしたがって合成する。これを８３に変換後、ビシナルジオールの切断について報告された手順を行い、その後、このようにして得られたアルデヒドを還元する［Bessodes,M. et al. Tetrahedron Lett. 1985,26(10),1305-1306］。化合物８３を、ピリジン中の１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサンでシリル化して、化合物８４を生じる。次に、これを、ピリジン中の塩化アセチルでアセチル化して、化合物８５を生じる。化合物８５を、ＴＨＦ中のＴＥＡ．３ＨＦおよびＴＥＡで脱シリル化する。これを、ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰおよびピリジンでトリチル化後、ホスフィチル化して、化合物８６生じる。
【０２５７】
スキーム１３
【０２５８】
【化２８】
2005504020.tif 000041
【０２５９】
実施例４１
１−［２−（Ｏ−スクシニル−ＣＰＧ）−１−［２−ヒドロキシ−１−（Ｏ−ＤＭＴ−メチル）チオエチル］エチル］シトシン（８９）。
化合物８３を、ピリジン中の１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサンの存在下でシリル化化合物に変換後、環外アミノ基をＤＭＦ中の無水安息香酸でベンゾイル化して、化合物８７を生じる。化合物８７をスクシニル化して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物８８を生じる。これを脱シリル化後、トリチル化して、化合物８９を生じる。
【０２６０】
スキーム１４
【０２６１】
【化２９】
2005504020.tif 000042
【０２６２】
実施例４２
【０２６３】
【表１１】
2005504020.tif 000043
【０２６４】
Ｃ＊＝１−［２−ヒドロキシ−１−［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）チオエチル］エチルシトシン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２６５】
実施例４３
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’，３’−ジデオキシ−３’−（Ｎ−アセチル）アミノ−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルシチジン（９５）。
化合物９２を、文献に報告された手順（参考文献：Krenitsky,T.A. etal. J.Med.Chem. 1983,26(6),891-895）にしたがって製造する。次に、これを、ＤＭＴＣｌおよびピリジンで選択的にトリチル化して、５’−Ｏ−ＤＭＴ誘導体を生じ、これをアセチル化して、アセチル化生成物を生じる。Ｎ４位のアセチル基を水性アンモニアで室温において選択的に除去して、化合物９３を生じる。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物９４を生じる。化合物９４を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物９５を生じる。
【０２６６】
スキーム１５
【０２６７】
【化３０】
2005504020.tif 000044
【０２６８】
実施例４４
【０２６９】
【表１２】
2005504020.tif 000045
【０２７０】
Ｃ＊＝２’，３’−ジデオキシ−３’−（アミノ）シチジン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２７１】
実施例４５
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−３’−Ｓ−フェニル−３’−チオ−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルシチジン（１０１）。
２’−デオキシ−３’−Ｓ−フェニル−３’−チオウリジン９７［Kawakami,H. et al. Heterocycles, 1991,32(12),2451-2470に報告されたように製造］を、報告された手順［Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176］にしたがって、２’−デオキシ−３−Ｓ−フェニル−３−チオシチジン９８（スキーム７）に変換する。化合物９８を、ＴＢＤＭＳＣｌおよびピリジンの存在下で５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物９９を生じる。化合物９９を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物１００を生じる。化合物１００を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のＤＭＴＣｌおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物１０１を生じる。
【０２７２】
スキーム１６
【０２７３】
【化３１】
2005504020.tif 000046
【０２７４】
実施例４６
【０２７５】
【表１３】
2005504020.tif 000047
【０２７６】
Ｃ＊＝２’−デオキシ−３’−Ｓ−フェニル−３’−チオシチジン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２７７】
実施例４７
５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−デオキシ−２’−Ｓ−フェニル−２’−チオ−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイルシチジン（１０７）。
３’−デオキシ−２’−Ｓ−フェニル−２’−チオウリジン１０３［Kawakami,H. et al. Heterocycles, 1991,32(12),2451-2470に報告されたように製造］を、報告された手順［Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176］にしたがって、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロシチジン１０４（スキーム１７）に変換する。化合物１０４を、ＴＢＤＭＳＣｌおよびピリジンの存在下で５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物１０５を生じる。化合物１０５を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物１０６を生じる。化合物１０６を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中のＤＭＴＣｌおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物１０７を生じる。
【０２７８】
スキーム１７
【０２７９】
【化３２】
2005504020.tif 000048
【０２８０】
実施例４８
【０２８１】
【表１４】
2005504020.tif 000049
【０２８２】
Ｃ＊＝３’−デオキシ−２’−Ｓ−フェニル−２’−チオシチジン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２８３】
実施例４９
５’−Ｏ−ＤＭＴ−１［２，３−デオキシ−２−Ｎ−モルホリノ−β−Ｄ−グリセロ−ペント−２−エノフラノシル］−シトシン−Ｎ４−［４−（ＣＰＧ−スクシニル）メチルエステル］ベンゾイル（１１３）。
１［２，３−デオキシ−２−Ｎ−モルホリノ−β−Ｄ−グリセロ−ペント−２−エノフラノシル］ウラシル１０９［Kandasamy,S. et al. Tetrahedron, 1996,52(13),4877-4882 に報告されたように製造される］を、報告された手順［Divakar,K.J. et al. J.Chem.Soc.Perk.Trans. 1 1982,1171-1176］にしたがって、２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロシチジン１１０（スキーム１８）に変換する。化合物１１０を、ＴＢＤＭＳＣｌおよびピリジンの存在下で５’−Ｏ−シリル誘導体に変換する。次に、これを、ピリジン中の４−（ヒドロキシメチル）ベンゾイルクロリドで処理して、化合物１１１を生じる。化合物１１１を、１，２−ジクロロエタン中、無水コハク酸、ＤＭＡＰで処理して、スクシニル誘導体を生じる。このスクシニル誘導体を、ＤＭＦ中のＴＢＴＵおよび４−メチルモルホリンの存在下においてアミノアルキルＣＰＧとカップリングさせて、化合物１１２を生じる。化合物１１２を、ＴＨＦ中においてトリエチルアミントリヒドロフルオリドおよびトリエチルアミンで脱シリル化する。次に、それを、ピリジン中の塩化ＤＭＴおよびＤＭＡＰでトリチル化して、化合物１１３を生じる。
【０２８４】
スキーム１８
【０２８５】
【化３３】
2005504020.tif 000050
【０２８６】
実施例５０
【０２８７】
【表１５】
2005504020.tif 000051
【０２８８】
Ｃ＊＝１［２，３−デオキシ−２−Ｎ−モルホリノ−β−Ｄ−グリセロペント−２−エノフラノシル］シトシン，全て  Ｐ＝Ｓ，Ｃｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＣ，Ａｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ａ，Ｔｏ＝２’−Ｏ−ＭＯＥ５ＭｅＵ，Ｇｏ＝２’−Ｏ−２’−Ｏ−ＭＯＥ  Ｇ。
【０２８９】
実施例５１
９−（アミノエトキシ）フェノキサジンヌクレオシド（Ｇ−クランプ）、Ｇ−クランプスクシネート１５４で置換されたＣＰＧ樹脂の製造
２’−デオキシヌクレオシドＧ−クランプ（化合物１５２，０．５１ｇ，０６８４ｍｍｏｌ）を、真空中において５０℃で一晩乾燥後、無水ＤＣＭ／Ｐｙｒ（５：１）中に溶解させ、０．１０３ｇ（１．０３ｍｍｏｌ）の無水コハク酸をその溶液に加えた。その後、１ｍＬのＤＭＦ中の４１．５ｍｇ（０．３４ｍｍｏｌ）ＤＭＡＰを加え、混合物を一晩撹拌した。反応の完了（ＴＬＣ）後、溶媒を真空中で蒸発させ、残りの黄色油状物をＤＣＭ中に溶解させ、１０％水性ＮＡＨＣＯ３、１０％水性クエン酸およびブラインで２回洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥後、有機相を真空中で蒸発させて、黄色固体（０．４５ｇ，７５％）を生じた。
ＭＳ（ＨＲ−ＦＡＢ）ｍ／ｚ８９７．２５６（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【０２９０】
【化３４】
2005504020.tif 000052
【０２９１】
実施例５２
Ｇ−クランプ−スクシニル−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ１５６
１３１ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のＧ−クランプスクシネートを、ＤＭＦ中に溶解させ、６８μＬ（０．４ｍｍｏｌ）ＤＩＥＡを加えた。次に、ＤＭＦ中の５７ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）ＨＡＴＵ溶液を、その混合物に撹拌しながら加えた。予め活性化させるために、撹拌を約１分間続けた後、その混合物を、１ｇのＬＣＡＡ−ＣＰＧ（初期負荷能力：１１５μｍｏｌ／ｇ）に加え、懸濁液を一晩振とうさせた。次に、樹脂を、各々ＤＭＦ、ＤＣＭおよびＣＨ３ＣＮで３回洗浄し、そして５ｍｌのＭｅＯＨ中の０．２４ｍＬ（２ｍｍｏｌ）トリフルオロ酢酸エチルおよび０．２８ｍｌ（２ｍｍｏｌ）ＴＥＡと一緒に樹脂を振とうさせることにより、樹脂の未反応アミノ基をキャッピングした。最後に、樹脂を、ＭｅＯＨ、ＣＨ３ＣＮおよびＤＣＭで洗浄し、真空中で乾燥させた。Ｇ−クランプスクシネートでの負荷能力は、ＤＭＴ検定によって決定した（最終負荷能力：６５μｍｏｌ／ｇ）。
【０２９２】
実施例５３
２’−デオキシフェノキサジンＣＰＧ
２’−デオキシフェノキサジンＣＰＧを、上の実施例５２に示された手順にしたがって合成した。
【０２９３】
実施例５４
オリゴヌクレオチド合成
Ｇ−クランプおよびフェノキサジン単位を含有するオリゴヌクレオチドの固相合成は、標準的なホスホロアミダイト化学および Applied Biosystems（Perkin Elmer Corp.）ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー３８０Ｂを用いて行った。オリゴヌクレオチドの切断および脱保護は、４０％水性ＭｅＮＨ２および２８〜３０％水性ＮＨ３（１：１）の溶液を室温で４時間用いて行った。オリゴヌクレオチドは、逆相ＨＰＬＣにより、３０６ Piston Pump System、８１１Ｃ Dynamic Mixer、１７０ Diode Array Detector および２１５ Liquid Handler を、Gilson（Middleton, Wi）製の Unipoint Software と一緒に用いて精製した。ＨＰＬＣ条件は、次の通りであった。カラム：Waters Deltapak Ｃ１８逆相（３００ｘ３．９ｍｍ，１５μ，３００Å）；溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ；溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（８０：２０）中０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ；勾配：０〜４０分０〜５０％Ｂ。クロマトグラフィー精製後、オリゴヌクレオチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって脱塩し、凍結乾燥させ、そして−２０℃で貯蔵した。
【０２９４】
実施例５５
固体支持体へのグアニジニル化
スキーム２１に概略されるように、本発明者は、二つの異なった戦略を用いて、グアニジニウム部分を導入した。一つの戦略は、第一級アミノ基を選択的に保護後、固体支持体（Ａ）にグアニジニル化を行うことである。２’−Ｏ−（アミノヘキシル）官能基の場合、支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、ＴＨＦ中１．２ＭのｎＢｕＮＨ２／ＨＣＯＯＨ溶液中に１０ｍｇのＰｄ２［（Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ）２ＣＯ］３および２６ｍｇのＰ（Ｐｈ）３の１．０ｍＬで５０℃において１．５時間処理することによって、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）保護基を選択的に除去した。Ａｌｌｏｃの除去後、それら支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、ＤＣＭ、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（ｄｄｔｃＮａ＋）、Ｈ２Ｏ、アセトン、ＤＣＭ、ジエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させた。グアニジニル化の前に、樹脂を、ＤＭＦ中１０％ＤＩＥＡ溶液中に懸濁させ、５分間振とうし、そしてＤＭＦで、次にＤＣＭで洗浄した。次に、ＤＭＦ中のＤＩＥＡおよび１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩の１．０Ｍ溶液を、支持体に結合したオリゴヌクレオチドに加え、その懸濁液を室温で５時間振とうした。オリゴヌクレオチドの最終的な脱保護および切断には、樹脂を濃アンモニア水で５５℃において１時間処理した。ＣＰＧ支持体からの分離およびアンモニアの蒸発後、その水溶液を、０．４５μｍナイロン６６フィルターを介して濾過し、更に分析するために−２０℃で凍結貯蔵した。
【０２９５】
スキーム２０
【０２９６】
【化３５】
2005504020.tif 000053
【０２９７】
スキーム２０。
修飾ヌクレオチド２’−Ｏ−（グアニジニルヘキシル）−５−メチルウリジン（Ａ）；９−グアニジニルエトキシフェノキサジンヌクレオチド（Ｂ）
【０２９８】
【化３６】
2005504020.tif 000054
【０２９９】
スキーム２１。
（Ａ）反応条件：（ｉ）ＴＨＦ中１．２ＭのｎＢｕＮＨ２／ＨＣＯＯＨ中に１０ｍｇのＰｄ２［（Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ）２ＣＯ］３、２６ｍｇのＰ（Ｐｈ）３の１．０ｍＬ、５０℃、１．５時間；（ii）ＤＣＭ、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（ｄｄｔｃＮａ＋）、Ｈ２Ｏ、アセトン、ＤＣＭ、ジエチルエーテルで洗浄する；（iii）ＤＭＦ中１．０Ｍの１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩およびＤＩＥＡ、室温、５時間。
（Ｂ）（ｉ）４０％水性ＣＨ３−ＮＨ２／濃水性ＮＨ３（１：１）、５５℃、１時間；（ii）１．０Ｍ水性Ｎａ２ＣＯ３中１．０Ｍの１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩、それぞれ、ＯＮ−３、ＯＮ−４については室温で３時間、およびＯＮ−５、ＯＮ−６については５５℃で１２時間。
【０３００】
実施例５６
溶液中の完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドのグアニジニル化
塩基に反応活性なトリフルオロアセチル基（Ｔｆａ）は、オリゴヌクレオチドの合成および脱保護の条件に相容性であり、これを、Ｇ−クランプの第一級アミノ基の保護のために選択した。オリゴヌクレオチドを脱保護し、固体支持体から切断後、４０％水性ＣＨ３−ＮＨ２および濃水性アンモニア（ＡＭＡ）の１：１混合物を用いることによってグアニジニル化したが、これは、きわめて求核性の第一級アミノ基とのアシル−またはアクリロニトリル付加物の形成を防止する。脱保護工程中のシトシンにおけるアミノ基転移を免れるために、Ｎ−ベンゾイルで保護されたＣの代わりにＮ−アセチルで保護されたＣを、オリゴヌクレオチド合成に用いた。これらオリゴマーをＲＰ−ＨＰＬＣで精製し且つＥＳ−ＭＳで分析後、オリゴヌクレオチドを、２ｍＬの１．０Ｍ水性Ｎａ２ＣＯ３溶液中の２ｍｍｏｌ（２９７ｍｇ）の１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩の１〜２μｍｏｌで室温において３時間処理することによって、Ｇ−クランプの第一級アミノ基をグアニジニル化した。次に、それらオリゴヌクレオチドを、ゲルクロマトグラフィー（Sephadex Ｇ２５）で、次にＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、そしてキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）およびエレクトロスプレー質量分析法（ＥＳ−ＭＳ）で分析した。この研究中に合成されたグアニジニル修飾オリゴヌクレオチドを、表XVIに要約する。
【０３０１】
興味深いことに、ＯＮ−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）またはＯＮ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）のような自己相補的配列の場合、上記の条件は、グアニジニルＧ−クランプオリゴマーの低分子画分だけを生じた。明らかに、相補的グアニンとの塩基対相互作用に関与している第一級アミノ基を有するこれらパリンドロームオリゴヌクレオチドの二本鎖構造は、グアニジニル化を妨げた。水素結合相互作用を破壊し且つ二重らせん形成を防止するために、反応は、５５℃の高温および約１２時間の長い反応時間で行った。これら条件を用いて、ＯＮ−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）およびＯＮ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）のアミノ基の完全なグアニジニル化を、検出可能な副反応を全く引き起こすことなく達成した。
【０３０２】
第一級アミノ基のグアニジニル化は、該当するオリゴマーの疎水性を僅かに増加させたが、これは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって、保持時間の僅かな変化として検出されると考えられる。未修飾のＧ−クランプＯＮ−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）と比較したＯＮ−３のＴｍデータは、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡに対して、それぞれ５．９°Ｋおよび５．７°Ｋのハイブリダイゼーション親和性の減少を示す（表XVII）。これら知見は、グアニジニルＧ−クランプと相補的グアニンとの間の追加の水素結合の形成に反駁すると考えられるが、自己相補的ＯＮ−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）の二重らせんの結晶学的Ｘ線解析で認められる別の構造的詳細によって説明されると考えられる［Wilds,C.J.; Maier,M.A.;Tereshko,V.; Manoharan,M.; Egli,M. 準備中］。修飾された塩基対Ｃ＊およびＧは、二重らせん中の他の塩基対に相対して若干の座屈を示したが、これは、ワトソン・クリック型およびフーグスティーン型双方の水素結合の幾何学的境界内のグアニジニウム−エトキシ部分に適応するための変化した立体必要条件の結果であると考えられる。平面外のゆがみは、親Ｇ−クランプ含有ＯＮ−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）と比較してグアニジニル修飾ＯＮ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）について認められる親和性の損失に原因になっていると考えることができる。
【０３０３】
要するに、オリゴヌクレオチドの合成後修飾のために、１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩を用いることによって第一級アミノ官能基をグアニジニウム基に変換することを伴う二つの方法が開発された。固体支持体上の反応には、アミノ基をＡｌｌｏｃで保護したが、これは、支持体からオリゴヌクレオチドを切断することなく選択的に除去することができ、このグアニジニル化は、ＤＭＦ中１０％ＤＩＥＡ中で行った。もう一方では、水溶液中での合成後グアニジニル化のために、第一級アミノ基をＴｆａで保護したが、これは、オリゴヌクレオチドの脱保護および切断の条件下で容易に除去することができる。これら方法を用いて、主溝かまたは副溝に面してグアニジニウム部分を有するいくつかの修飾オリゴヌクレオチドを製造し且つ分析した。
【０３０４】
実施例５７
【０３０５】
【表１６】
2005504020.tif 000055
【０３０６】
実施例５８
【０３０７】
【表１７】
2005504020.tif 000056
【０３０８】
実施例５９
グアニジニルＧ−クランプ修飾
グアニジニルＧ−クランプ修飾を、グアノシンのＯ６およびＮ７フーグスティーン型結合部位への追加の水素結合を考慮して設計した（図１Ｂ）。単一の単位を含有するＤＮＡオリゴマーのＲＮＡ標的への結合研究は、野生型ＤＮＡに相対して、元のＧ−クランプ修飾について認められるΔＴｍより僅かに低い１６℃の融解温度の増加を示した。この修飾の構造的性質を調べるために、本発明者は、配列ＧＣ＊ＧＴＡＴＭＯＥＡＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）（但し、Ｃ＊はグアニジノＧ−クランプであり、２’−Ｏ−メトキシエチルチミンがＴＭＯＥである）（図１Ｃ）を有する修飾十量体二重らせんのＸ線結晶構造を決定した。Altmann,K.-H.; Dean,N.M.; Fabbro,D.; Freier,S.M.; Geiger,T.; Haner,R.; Husken,D.; Martin,P.; Monia,B.P.; Muller,M.; Natt,F.; Nicklin,P.; Phillips,J.; Pieles,U.; Sasmor,H.; Moser H.E. Chimia 1996,50,168-176; Teplova,M.; Minasov,G.; Tereshko,V.; Inamati,G.B.; Cook,P.D.; Manoharan,M.; Egli,M. Nature Struct.Biol. 1999,6,535-539。オリゴヌクレオチドの合成および精製は、標準法にしたがって行った。この十量体二重らせんの結晶は、商業的に入手可能なスクリーンを用いた懸滴蒸気拡散法によって成長させた（Hampton Researchm, Laguna Niguel, CA）［懸滴蒸気拡散：２μＬ液体粒子（１．２ｍＭ  ＤＮＡ，５％ＭＰＤ，２０ｍＭカコジル酸Ｎａ  ｐＨ６．０，６ｍＭスペルミン・４ＨＣｌ，４０ｍＭ  ＮａＣｌ，６ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を、１ｍＬの３５％ｖ／ｖＭＰＤのレザバーに対して平衡させた。空間群Ｐ２１２１２１；細胞寸法ａ＝２４．５２Å，ｂ＝４３．０２Å，ｃ＝４６．６８Å）。データ収集は、シンクロトロン源で行った［結晶（０．７ｘ０．２ｘ０．２ｍｍ）を、液体粒子からナイロンループで拾い、冷Ｎ２流（１２０Ｋ）中に移した。高分解能および低分解能データセットを、Advanced Photon Source, Argonne, IL におけるＤＮＤ−ＣＡＴの５−ＩＤビーム線（λ＝０．９７８Å）で、ＭＡＲＣＣＤ検出器を用いて集めた。データを組込み、ＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＥＰＡＣＫ１０と併合した。２０〜１Åの全ての反射の全Ｒｍｅｒｇｅは４．７％であったが（Otwinowski,Z.; Minor,W. Methods Enzymol. 1997,276,307-326）、データ収集および精密統計を表XVIIIに挙げる。構造は、ＤＮＡ十量体を初期モデルとして用いた分子置換によって解明し、プログラムＣＮＳ１２およびＳＨＥＬＸ−９７１３で精密にした。１０％の反射を用い且つ２２％に達しさせてＲｆｒｅｅを監視した後、全ての反射を、最終回の等方性精密に包含させた；Brunger,A.T. Crystallography & NMR System (CNS), Version 0.9, Yale University, New Haven, CT, 1998［Sheldrick,G.M.; Schneider,T.R. Methods Enzymol. 1997,277,319-343; Egli,M.; Tereshko,V.; Teplova,M.; Minasov,G.; Joachimiak,A.; Sanishvili,R.; Weeks,C.M.; Miller,R.; Maier,M.A.; An,H.Y.; Cook,P.D.; Manoharan,M. Biopolymers: Nucleic Acids Sciences 1998,48,234-252; Clarke,N.D.: Beamer,L.J.; Goldberg,H.R.; Berkower,C.; Pabo,C.O. Science 1991,254,267-270; Rich,A. In The Chemical Bond: Structure and Dynamics; Zewail,A. Ed.; Academic Press, New York, 1992; pp31-86; Pabo,C.O.; Sauer,R.T. Annu.Rev.Biochem. 1992,61,1053-1059; Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M.D. J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874］。
【０３０９】
この二重らせんの全体構造は、この二重らせんの６位および１６位の２’−Ｏ−メトキシエチルチミン単位の結果としてＡ形である。Ａ形環境は、アンチセンス目的の核酸修飾の構造を研究するのに望ましい。塩基対Ｃ１２＊−Ｇ９の場合に示されるように（図２）、これら複素環の周りの電子密度は、明らかに、束縛されたグアニジニウムのアミノ窒素およびイミノ窒素と、それぞれ、グアノシンのＯ６およびＮ７との間に形成される二つのフーグスティーン型水素結合を示している。この水素結合長さは２．８８Åおよび２．８６Åであり、塩基対Ｃ２＊−Ｇ１９中の該当する水素結合の長さは、それぞれ、２．９２Åおよび２．８７Åである。フェノキサジン環および束縛された基の個々の原子の周りの電子密度の特質は、この修飾が充分に規則的であり且つランダムなコンホメーションをとらないということを示している。二重らせんには、修飾された塩基対の若干の座屈が他の塩基対に相対して存在する。Ｇ−クランプとＧとの間の塩基対のこの平面外ゆがみは、グアニジニウム−エトキシ部分によって与えられる幾何学的境界内のワトソン・クリック型およびフーグスティーン型双方の水素結合の幾何学的形を最適にする必要条件の結果でありうる。更に、認められる配置は、ＧのＯ６と、Ｇ−クランプのエトキシリンカー酸素との間の立体接触を免れるのに役立つ（図１および図２）。
【０３１０】
Ｇ−クランプの存在は、シトシンとその５’−隣接塩基（それぞれ、Ｇ１およびＧ１１）との間のスタッキングと比較して、ＧｐＣ＊段階での鎖内スタッキングをかなり改善させる。Ｇ１とＣ２＊との間のオーバーラップを図３に示す。「シトシンコア」は、グアノシン塩基への比較的小さいスタッキングを示すが、フェノキサジン環系の残部は、事実上、グアノシン塩基全体を覆っている。しかしながら、Ｇ−クランプと塩基との間の５’側へのスタッキングは改善されるが、３’−隣接塩基へのスタッキングは、修飾塩基の包含によって影響されない。
【０３１１】
強い負のポテンシャル部位である主溝の中心にある陽電荷グアニジニウム部分の配置は、安定性に有意の静電的寄与をもたらすと考えられる。更に、対向鎖からのグアニジニウム基およびリン酸基は、比較的接近した間隔にある。Ｃ＊のイミノ窒素とリン酸基のＯ２Ｐ酸素との間の平均距離は、５．８Åである。直接的塩架橋には長すぎるが、水分子はグアニジニウム基とリン酸基を連結する。Ｃ１２＊の場合、単一水分子は、グアニジニウムイミノ窒素間に結合した水と、残基Ｃ８およびＧ９のＯ２Ｐ酸素との間の接触を媒介する。
【０３１２】
陽電荷アミンとグアノシンのフーグスティーン型結合部位との相互作用は周知である。例えば、二重らせんＤＮＡに結合したλリプレッサーのＸ線結晶解析研究は、リシンとＧのＯ６位との間の特異的接触を示した［Clarke,N.D.; Beamer,L.J.; Goldberg,H.R.; Berkower,C.; Pabo,C.O. Science 1991,254,267-270; Rich,A. In The Chemical Bond: Structure and Dynamics; Zewail,A. Ed.; Academic Press, New York, 1992,31-86; Pabo,C.O.; Sauer,R.T. Annu.Rev.Biochem. 1992,61,1053-1059］。グアニジルＧ−クランプの本構造は、タンパク質−核酸相互作用におけるグアニンのＮ７位およびＯ６位でのアルギニン分岐の二座配位（bidentate）水素結合に似ている［Clarke,N.D.; Beamer,L.J.; Goldberg,H.R.; Berkower,C.; Pabo,C.O. Science 1991,254,267-270; Rich,A. In The Chemical Bond: Structure and Dynamics; Zewail,A. Ed.; Academic Press, New York, 1992,31-86; Pabo,C.O.; Sauer,R.T. Annu.Rev.Biochem. 1992,61,1053-1059］。認められる構造は、おそらくは、伸長したグアニジニルエトキシスペーサーアームの結果としての立体構造のために、Ｃ＊−Ｇ塩基対の若干の座屈を示す。Ｇ−クランプとグアニジノＧ−クランプとのＴｍデータの比較は、グアニジニル化が、全体の安定性に僅かしか作用しないと考えられるということを示した。
【０３１３】
この修飾の二つの決定的な安定化因子は、水素結合数の増加および改善されたスタッキング相互作用である。安定性に更に寄与するのは、好都合な静電的相互作用および充分に規則的な水ネットワークである。これら寄与の一つが、他のものより重要な役割を果たしているかどうか見分けることは難しい。フェノキサジン部分を単独で有するオリゴマーの結合研究は、２〜７℃の中程度のＴｍの増加を示した［Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M.D. J.Am.Chem.Soc. 1995,117,3873-3874］。安定性は、いくつかのフェノキサジン基が、同じ鎖上に一緒にクラスター形成された場合に最も多く増加し、三環式−三環式スタッキング相互作用を可能にした。非環式Ｇ−クランプ修飾の場合、結合の増大は認められなかった。フェノキサジンおよび束縛されたアミノ基の双方が存在した場合のみ、結合の劇的改善が認められた［Lin,K.-Y.; Matteucci,M.D. J.Am.Chem.Soc. 1998,120,8531-8532; Flanagan,W.M.; Wolf,J.J.; Olson,P.; Grant,D.; Lin,K.; Wagner,R.W.; Matteucci,M.D. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1999,96,3513-3518］。明らかに、グアニジニウム基からの水素結合は、スタッキング相互作用および安定な水ネットワークの形成を可能にする位置にグアニジノＧ−クランプ修飾を維持している。これは、核酸二重らせん内の単一塩基対が、合計５個の水素結合にワトソン・クリック型およびフーグスティーン型結合を組み合わせていることの最初の報告である。
【０３１４】
実施例６０
反射データおよび精密統計。
【０３１５】
【表１８】
2005504020.tif 000057
【０３１６】
実施例６１
ｃ−ｒａｆメッセージに標的指向するＧ−クランプ修飾オリゴヌクレオチドの合成
【０３１７】
【表１９】
2005504020.tif 000058
【０３１８】
Ｃ＊＝Ｇ−クランプ修飾。
実施例６２
修飾ＭＤＭ−２オリゴヌクレオチドの in vivo 安定性
【０３１９】
【表２０】
2005504020.tif 000059
【０３２０】
Ｃ＊＝Ｇ−クランプ修飾。
合成される選択された修飾オリゴヌクレオチドの in vivo 安定性を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて決定する。５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの単回静脈内投与後、血液試料をいろいろな時間間隔で採取し、ＣＧＥで分析する。
【０３２１】
調べられる各々のオリゴヌクレオチドについて、約２５ｇ体重の９匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River, Wilmington,MA）を用いる。１週間順化後、それらマウスに、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．０中で投与されるオリゴヌクレオチド（５ｍｇ／ｋｇ）の単回尾静脈注射を行う。１回の眼窩後採血（投与後０．２５時間、０．５時間、２時間かまたは４時間）および終末採血（投与後１時間、３時間、８時間かまたは２４時間）を、各々の群から集める。終末採血（約０．６〜０．８ｍＬ）は、ケタミン／キシラジン麻酔後に心臓穿刺によって集める。この血液をＥＤＴＡ被覆採集管に移し、遠心分離して血漿を得る。最後に、肝および腎臓を各々のマウスから採取する。血漿および組織ホモジネートを分析に用いて、無傷のオリゴヌクレオチド含量をＣＧＥによって決定する。試料は全て、採取後直ちにドライアイス上で凍結させ、分析するまで−８０℃で貯蔵する。
【０３２２】
ＣＧＥ分析は、親ＭＤＭ−２と比較して、Ｇ−クランプ修飾含有オリゴマーの相対ヌクレアーゼ耐性を示した（一様に、２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはマウスＭＤＭ−２に集中した）。Ｇ−クランプ修飾のヌクレアーゼ耐性のために、修飾オリゴヌクレオチドは、血漿中において一層安定であることが判明しているが、ＩＳＩＳ１１０６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）は安定ではなかった。同様の知見が、腎臓および肝組織で認められる。これは、Ｇ−クランプ修飾が、血漿、腎臓および肝において、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対する優れたヌクレアーゼ耐性を与えるということを意味している。したがって、より長い作用期間を有するオリゴヌクレオチドは、Ｇ−クランプ修飾および他の類似のモチーフ双方をそれらの構造中に包含することによって設計することができる。５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの静脈内ボーラス投与後１時間に、血漿中に無傷のまま残っている完全長オリゴヌクレオチドの百分率のプロットを決定して、血漿中における安定性を評価する。
【０３２３】
５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの静脈内ボーラス投与後２４時間に、組織中に無傷のまま残っている完全長オリゴヌクレオチドの百分率のプロットを決定する。マウス肝試料およびマウス腎試料双方における２４時間後の試験オリゴヌクレオチドおよび標準ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのＣＧＥトレースを評価する。未修飾の親の標準と比較したところ、本発明のオリゴヌクレオチドについて一層多量の無傷のオリゴヌクレオチドが存在する。最大安定性は、５’および３’両末端がＣ＊でキャッピングされた時に認められた。
【０３２４】
実施例６３
Ｇ−クランプ修飾オリゴヌクレオチドを用いたｂＥＮＤ細胞におけるｃ−ｒａｆメッセージの制御
【０３２５】
【表２１】
2005504020.tif 000060
【０３２６】
Ｃ＊＝Ｇ−クランプ修飾。
若干のオリゴヌクレオチドの活性を評価するために、in vitro 細胞培養検定を用いて、ｂＥＮＤ細胞におけるｃ−ｒａｆ発現の細胞性レベルを測定する。
【０３２７】
細胞および試薬
脳内皮腫であるｂＥＮＤ．３細胞系を、Dr. Werner Risau（Max-Planck Institute）より入手する。Opti−ＭＥＭ、トリプシン−ＥＤＴＡおよび高グルコース含有ＤＭＥＭは、Gibco−ＢＲＬ（Grand Island, NY）より購入する。Dulbecco=s ＰＢＳは、Irvine Scientific（Irvine, CA）より購入する。無菌の１２ウェル組織培養プレートおよび Facsflow 溶液は、Becton Dickinson（Mansfield, MA）より購入する。超純粋ホルムアルデヒドは、Polysciences（Warrington, PA）より購入する。ＮＡＰ−５カラムは、Pharmacia（Uppsala, Sweden）より購入する。
【０３２８】
オリゴヌクレオチド処理
細胞を、４．５ｇ／Ｌのグルコースおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを含む１２ウェルプレート中において約７５％密集まで成長させる。細胞を、３７℃に予め暖められた Opti−ＭＥＭで３回洗浄する。オリゴヌクレオチドを、陽イオン脂質（Lipofectin 試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ））と予め混合し、所望の濃度まで連続希釈し、そして洗浄された細胞上に入れ、３７℃で４時間インキュベーションする。次に、培地を除去し、普通の成長培地と交換して２４時間おいて、ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を行う。
【０３２９】
ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析によるｍＲＮＡレベルの決定のために、オリゴヌクレオチド処理の開始後２４時間に、全ＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネート法［Monia et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1996,93,15481-15484］によって細胞から調製する。全ＲＮＡを、細胞溶解産物のＣｓＣｌクッションでの遠心分離によって単離する。ノーザンブロット分析、ＲＮＡ定量およびＧ３ＰＤＨｍＲＮＡレベルへの規格化は、報告された手順［Dean and McKay, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1994,91,11762-11766］にしたがって行う。
【０３３０】
ｂＥＮＤ細胞において、Ｇ−クランプオリゴヌクレオチドは、濃度の関数としてのｃ−ｒａｆメッセージ活性の減少を示した。これら修飾オリゴヌクレオチドが活性を保持したということは、増加した in vivo ヌクレアーゼ活性も示すこれらオリゴヌクレオチドについて、少ない回数で投薬する可能性がある。Ｇ−クランプ修飾オリゴヌクレオチドは全て、親１１０６１オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）の活性を保持し、そしてなお一層活性を向上させた。
【０３３１】
実施例６４
化合物２０１（Ｒ’＝ＣＮ，ｎ＝１，スキーム２２ａ，表XX）。
スキーム２２ａ
【０３３２】
【化３７】
2005504020.tif 000061
【０３３３】
【表２２】
2005504020.tif 000062
【０３３４】
実施例６５
化合物２４８（Ｒ’＝ＮＨＣｂｚ，ｎ＝０，スキーム２２）。
化合物２４８を、化合物２４６（１ｍｍｏｌ）およびＮ−（２−ヒドロキシエチル）カルバミン酸ベンジル（１ｍｍｏｌ）から、参考文献手順［Lin and Matteucci, J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532］にしたがって製造する。
【０３３５】
実施例６６
化合物２４９（ｎ＝０，スキーム２２ｂ）。
化合物２４８（１ｍｍｏｌ）は、ピリジン中のＤＭＴ−Ｃｌ（１モル当量）での処理で、対応する５’−Ｏ−ＤＭＴ誘導体を生じる。このＤＭＴ誘導体を、ＴＥＡの存在下においてトリフルオロ酢酸エチルと一緒に撹拌して、化合物２４８のＮ−トリフルオロアセチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ誘導体を得る。得られた生成物のフリーの３’−ヒドロキシ官能基を、無水ピリジン中の無水酢酸と反応させて、完全に保護されたヌクレオシド２４９を得る。
【０３３６】
スキーム２２ｂ
【０３３７】
【化３８】
2005504020.tif 000063
【０３３８】
実施例６７
化合物２５０（ｎ＝０，スキーム２２ｂ）。
酢酸エチル中の化合物２４９（１ｍｍｏｌ）およびギ酸アンモニウム（５ｍｍｏｌ）の懸濁液を、アルゴン下において脱酸素化し、そして活性炭上１０％パラジウム（１０ｍｏｌ％）を、アルゴン下の懸濁液中に加える。反応混合物を周囲温度で１０分間撹拌して、化合物２５０を得る。
【０３３９】
実施例６８
化合物２０６（ｎ＝０，Ｒ＝Ｍｅ，スキーム２２ｃ，表XX）。
無水ＴＨＦ中の化合物２５０（１ｍｍｏｌ）を、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ，１ｍｍｏｌ）と一緒に、アルゴン下において周囲温度で２時間撹拌する。２時間後、反応混合物を氷浴上で冷却し、無水メチルアミンガスを反応混合物中に１０分間通気する。得られた混合物を３０分間撹拌して、化合物２０６を得る。
【０３４０】
スキーム２２ｃ
【０３４１】
【化３９】
2005504020.tif 000064
【０３４２】
実施例６９
化合物２０６ａ（ｎ＝０，Ｒ＝Ｍｅ，スキーム２２ｃ）。
化合物３の合成について実施例２に記載のような、化合物２０６の３’−ヒドロキシ基のホスフィチル化は、化合物２０６ａを生じる。
【０３４３】
実施例７０
化合物２０７（ｎ＝０，Ｒ＝Ｍｅ，スキーム２２ｃ，表XX）。
化合物２０７を、化合物２５０、１，１’−チオカルボニルジイミダゾールおよびメチルアミンから、化合物２０６の合成について実施例６８に記載されたのと同様の反応条件下で得る。
【０３４４】
実施例７１
化合物２０７ａ（ｎ＝０，Ｒ＝Ｍｅ，スキーム２２ｃ）。
化合物３の合成について実施例２に記載のような、化合物２０７の３’−ヒドロキシ基のホスフィチル化は、化合物２０７ａを生じる。
【０３４５】
実施例７２
化合物２０２（ｎ＝０，ｍ＝０，スキーム２２ｃ，表XX）。
化合物２５０（１ｍｍｏｌ）を、ＤＩＥＡの存在下の無水ＤＣＭ中においてＮ−ベンジルオキシカルボニル−２−アミノエタノール−Ｏ−メタンスルホネート（１ｍｍｏｌ）と一緒に一晩撹拌する。このようにして得られた第二級アミンに、実施例５９に記載のように転移水素化を行って、ベンジルオキシカルボニル保護を除去する。次に、未保護アミンを、ＤＩＥＡの存在下のＤＣＭ中においてトリフルオロ酢酸エチルと一緒に撹拌して、所望の化合物２０２を得る。
【０３４６】
実施例７３
化合物２０２ａ（ｎ＝０，ｍ＝０，スキーム２２ｃ）。
化合物３の合成について実施例２に記載のような、化合物２０２のホスフィチル化は、化合物２０２ａを生じる。
【０３４７】
実施例７４
化合物２０８ａ（ｎ＝０，スキーム２２ｄ，表XX）。
化合物２５０（１ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１ｍｍｏｌ）を、化合物Ａ（１ｍｍｏｌ，スキーム１ｄ）の溶液中に加え、得られた混合物を周囲温度で撹拌して、化合物２０８ａを得る。
【０３４８】
スキーム２２ｄ
【０３４９】
【化４０】
2005504020.tif 000065
【０３５０】
実施例７５
化合物２０８ｂ（ｎ＝０，スキーム２２ｄ）。
実施例２に記載のような、化合物２０８ａのホスフィチル化は、化合物２０８ｂを生じる。
【０３５１】
実施例７６
化合物２０１ａ（ｎ＝１，スキーム２２ｅ）。
化合物２０１と、ピリジン中のＤＭＴＣｌとの反応は、化合物２０１ａを生じる。
【０３５２】
スキーム２２ｅ
【０３５３】
【化４１】
2005504020.tif 000066
【０３５４】
実施例７７
化合物２０９（ｎ＝１，スキーム２２ｅ，表XX）。
化合物２０１ａを、ＴＨＦ中のアンモニアおよび塩化アンモニウムで、圧力下の高温において処理して、化合物２０９を得る［Granik, Russ.Chem.Rev., 1983,52,377-393］。
【０３５５】
実施例７８
化合物２０９ａ（ｎ＝１，スキーム２２ｅ）。
２−シアノエトキシカルボニルオキシスクシンイミド（２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡを、ＤＣＭ中の化合物２０９（１ｍｍｏｌ）の溶液中に加え、得られた混合物を周囲温度で撹拌して、化合物２０９ａを得る。
【０３５６】
実施例７９
化合物２０９ｂ（ｎ＝０，スキーム２２ｅ）。
化合物３の合成について実施例２に記載のような、化合物２０９ａのホスフィチル化は、化合物２０９ｂを生じる。
【０３５７】
実施例８０
化合物２５２（スキーム２３ａ）。
所望の束縛部分（tether）Ｘを有するフェノキサジンヌクレオシド２５２を、［Lin and Matteucci, J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532］による参考文献手順にしたがって、５−ブロモ−３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−ｄＵ（２５１）から５段階で合成する。
【０３５８】
実施例８１
化合物２５３（スキーム２３ａ）。
スキーム２３ａ
【０３５９】
【化４２】
2005504020.tif 000067
【０３６０】
化合物２５２（１ｍｍｏｌ）とエタノール（１ｍｍｏｌ）との、ＤＩＥＡの存在下のアセトニトリル中の Mitsunobu アルキル化条件（各１ｍｍｏｌのＰｈ３ＰおよびＤＥＡＤ）下における反応は、化合物２５３を生じる。
【０３６１】
実施例８２
化合物２５４（スキーム２３ａ）。
化合物２５３を、真空下においてＰ２Ｏ５上で充分に乾燥後、アルゴン下の反応容器中に入れる。凍結浴上に置かれた無水ピリジン中のＴＭＧ（１０ｍｍｏｌ）を、無水Ｈ２Ｓで４５分間飽和させる。４５分後、得られた溶液を、アルゴン下において化合物２５３が入っている予冷された容器中に入れ、密封する。次に、この密封された容器を、周囲温度に達しさせ、周囲温度で３日間貯蔵する。クロロクス浴（chlorox bath）中にＨ２Ｓを通気して除去し、真空下において反応混合物からピリジンを除去する。残留物は、標準的な処理および精製後、化合物２５４を生じる。
【０３６２】
実施例８３
化合物２１０ａ（ｎ＝１，スキーム２３ａ，表XXI）。
化合物２５４（Ｘ＝Ｏ−（ＣＨ２）３−ＣＮ）を、ＴＨＦ中のＴＢＡＦで処理して、３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ基を除去する。得られた３’−ＯＨ基に、実施例２に記載の条件下においてホスフィチル化を行って、化合物２１０ａを得る。
【０３６３】
【表２３】
2005504020.tif 000068
【０３６４】
実施例８４
化合物２１０ｂ（ｎ＝０，スキーム２３ｂ，表XXI）。
化合物２５４（１ｍｍｏｌ，ｎ＝０，スキーム２３ｂ）を、ＴＨＦ中のＴＢＡＦで処理して、３’−Ｏ−保護を除去する。得られた生成物に、酢酸エチル中のＰｄ−Ｃ（１０％）およびギ酸アンモニウムを用いて転移水素化を行って（詳細については、実施例６７を参照されたい）、側鎖部分からベンジルオキシカルボニル保護を除去する。次に、このようにして形成される遊離アミンおよび環窒素を、ピリジン中のトリフルオロ酢酸エチル（１０ｍｍｏｌ）と一緒に化合物（１ｍｍｏｌ）を周囲温度で撹拌することによってトリフルオロアセトアミドとして保護する。最後に、得られたトリフルオロアセトアミド誘導体を、化合物３の合成について実施例２に記載のようにホスフィチル化して、所望のホスホロアミダイト２１０ｂを得る。
【０３６５】
スキーム２３ｂ
【０３６６】
【化４３】
2005504020.tif 000069
【０３６７】
実施例８５
化合物２５５（ｎ＝０，スキーム２３ｂ）。
化合物２５４（ｎ＝０，１ｍｍｏｌ）を、ピリジン中のトリフルオロ酢酸エチル（５ｍｍｏｌ）と一緒に撹拌する。形成されるトリフルオロアセトアミドを精製後、実施例６７に記載のように酢酸エチル中のＰｄ−Ｃ（１０％）の存在下においてギ酸アンモニウム（１０ｍｍｏｌ）と一緒に撹拌して、化合物２５５を得る。
【０３６８】
実施例８６
化合物２１５ａ（ｎ＝０，Ｒ＝Ｍｅ，スキーム２３ｂ，表XXI）。
化合物２５５（１ｍｍｏｌ）を、実施例６８に記載のようにＣＤＩおよびメチルアミンと反応させる。このようにして得られた尿素誘導体を、ＴＨＦ中のＴＢＡＦと一緒に撹拌して、３’＝Ｏ−保護を除去する。３’−Ｏ−ＴＢＤＭＳの脱保護後、得られた生成物を、無水ピリジン中の過剰のトリフルオロ酢酸エチルと一緒に撹拌することによって、その環窒素においてトリフルオロアセチル化する。化合物３の合成について実施例２に記載の条件下におけるこのトリフルオロアセトアミド誘導体のホスフィチル化は、化合物２１５ａを生じる。
【０３６９】
実施例８７
化合物２１６ａ（ｎ＝０，Ｒ＝Ｍｅ，スキーム２３ｂ，表XXI）。
化合物２１６ａを、化合物２５５、１，１’−チオカルボニルジイミダゾールおよびメチルアミンから、化合物２１５ａの合成について実施例８６に記載のように合成する。
【０３７０】
実施例８８
化合物２５６（ｍ＝０，ｎ＝０，スキーム２３ｂ）。
化合物２５６を、化合物２５５（１ｍｍｏｌ）およびＮ−ベンジルオキシカルボニル−２−アミノエタノール−Ｏ−メタンスルホネート（１ｍｍｏｌ）から、実施例７２に記載のように製造する。
【０３７１】
実施例８９
化合物２１１ａ（ｍ＝０，ｎ＝０，スキーム２３ｂ，表XXI）。
化合物２５６を、ＴＨＦ中のＴＢＡＦと一緒に撹拌して、３’−ＯＨ基上のＴＢＤＭＳ保護を除去する。脱保護後、その３’−ＯＨ基を、化合物３の合成について実施例２に記載のようにホスフィチル化して、化合物２１１ａを得る。
【０３７２】
実施例９０
化合物２５７（ｎ＝０，スキーム２３ｃ）。
化合物２５７を、化合物２５５から、実施例７４に記載の条件下で得る。
【０３７３】
実施例９１
化合物２１７ａ（ｎ＝０，スキーム２３ｃ，表XXI）。
化合物２１７ａを、化合物２５７から、化合物２１１ａの製造について実施例８９に記載のように製造する。
【０３７４】
スキーム２３ｃ
【０３７５】
【化４４】
2005504020.tif 000070
【０３７６】
実施例９２
化合物２５８（ｎ＝１，スキーム２３ｄ）。
化合物２５８を、化合物２５２から、実施例７７および７８に記載のように合成する。
【０３７７】
スキーム２３ｄ
【０３７８】
【化４５】
2005504020.tif 000071
【０３７９】
実施例９３
化合物２１８ａ（ｎ＝１，スキーム２３ｄ，表XXI）。
このホスホロアミダイト２１８ａを、化合物２５８から、化合物２１０ａの化合物２５３からの製造について実施例８１および８３に記載されたのと同一条件下で合成する。
【０３８０】
実施例９４
化合物２６２（スキーム２４）。
２−アミノ−３−メトキシ−ベンゼンチオール［Inoue et al., Chem.Pharm.Bull., 1997,45,1008-1028］を、ＮａＨＣＯ３の存在下においてＢｏｃ２Ｏと反応させ、次に、ピリジン中のＡｃ２Ｏと反応させて、化合物２６２を得る。
【０３８１】
スキーム２４
【０３８２】
【化４６】
2005504020.tif 000072
【０３８３】
実施例９５
化合物２６３（スキーム２４）。
真空下においてＰ２Ｏ５上で充分に乾燥後、無水ジクロロメタン中の化合物２６２を、ＴＭＳ−Ｉで５分間処理して、化合物２６３を得る。
【０３８４】
実施例９６
化合物２６４（スキーム２４）。
選択された束縛部分を、化合物２６３のヒドロキシル官能基に、Ｐｈ３ＰおよびＤＥＡＤの存在下（Mitsunobu アルキル化）で取り付けて、化合物２６４を得る。
【０３８５】
実施例９７
化合物２６５（スキーム２４）。
化合物２６４を、ＤＣＭ中のＴＦＡと一緒に３０分間撹拌して、化合物２６５を得る。
【０３８６】
実施例９８
化合物２６７（スキーム２５ａ）。
化合物２６７を、化合物２６６および化合物２６５から、報告された手順［Lin et al., J.Am.Chem.Soc., 1995,117,3873-3874］にしたがって合成する。
【０３８７】
スキーム２５ａ
【０３８８】
【化４７】
2005504020.tif 000073
【０３８９】
実施例９９
化合物２６８（スキーム２５ｂ，表XXII）。
三環式ヌクレオシド２６８を、化合物２６７から、報告された手順［Lin and Matteucci, J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532］にしたがって製造する。
【０３９０】
スキーム２５ｂ
【０３９１】
【化４８】
2005504020.tif 000074
【０３９２】
【表２４】
2005504020.tif 000075
【０３９３】
【表２５】
2005504020.tif 000076
【０３９４】
実施例１００
化合物２１９（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］３ＣＮ，スキーム２５ｂ，表XXII）。
化合物２６８（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］３ＣＮ，スキーム２５ａ）を、実施例２に記載の条件下でホスフィチル化して、化合物２１９を得る。
【０３９５】
実施例１０１
化合物２２０［Ｘ＝Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＯＣＦ３）［ＣＨ２］Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ３］，スキーム２５ｂ，表XXII）。
化合物２２０（明記の）を、化合物２６８（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣｂｚ）およびＮ−ベンジルオキシカルボニルアミノエタノール−Ｏ−メチルスルホネートから、実施例６７、７２および７３に記載のように製造する。
【０３９６】
実施例１０２
化合物２２４（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣＯＮＨＣＨ３，スキーム２５ｂ，表XXII）。
化合物２２４（明記の）を、化合物２６８（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣｂｚ）、ＣＤＩおよびメチルアミンから、実施例６７、６８および６９に記載のように合成する。
【０３９７】
実施例１０３
化合物２２５（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣＳＮＨＣＨ３，スキーム２５ｂ，表XXII）。
化合物２２４（明記の）を、化合物２６８（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣｂｚ）、１，１’−チオカルボニルジイミダゾールおよびメチルアミンから、実施例６７、７０および７１に記載のように合成する。
【０３９８】
実施例１０４
化合物２２６（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣ［ＮＨ］ＮＨ３，スキーム２５ｂ，表XXII）。
化合物２２６（明記の）を、化合物２６８（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣｂｚ）および化合物Ａ（スキーム２２ｄを参照されたい）から、実施例６７、７４および７５に記載のように合成する。
【０３９９】
実施例１０５
化合物２２７（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］３ＣＨ２Ｃ［ＮＨ］ＮＨ３，スキーム２５ｂ，表XXII）。
化合物２２７（明記の）を、化合物２６８（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］３ＣＮ）から、実施例７７、７８および７９に記載のように合成する。
【０４００】
実施例１０６
化合物２７０（スキーム２６）。
選択された束縛部分（表XXIVに規定される）を用いた、Ｐｈ３ＰおよびＤＥＡＤの存在下における化合物２６９［Bigge,C.F. et al., PCT Int.Appl. (1997), 280pp ＣＯＤＥＮ  ＰＩＸＸＤ２  ＷＯ９７２３２１６Ａ１  １９９７０７０３］のヒドロキシル官能基のアルキル化は、化合物２７０を生じる。
【０４０１】
実施例１０７
化合物２７１（スキーム２６）。
化合物２７１（１ｍｍｏｌ）を、１０％酢酸を含有する酢酸エチル中に溶解させ、得られた溶液を脱酸素化後、１０ｍｏｌ％のＰｄ−Ｃ（１０％）と混合して圧力下で接触水素添加を行って、化合物２７１を得る。
【０４０２】
スキーム２６
【０４０３】
【化４９】
2005504020.tif 000077
【０４０４】
実施例１０８
化合物２７３（スキーム２７ａ）。
化合物２７２を、化合物２６６および化合物２７１から、実施例８８および９８に記載のように得る。
【０４０５】
スキーム２７ａ
【０４０６】
【化５０】
2005504020.tif 000078
【０４０７】
実施例１０９
化合物２３７（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２Ｎ（フタロイル），スキーム２７ｂ，表XXIV）。
実施例２に記載されたのと同一条件下における化合物２７３（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２Ｎ（フタロイル），スキーム２７ａ）のホスフィチル化は、化合物２３７を生じる。
【０４０８】
【表２６】
2005504020.tif 000079
【０４０９】
実施例１１０
化合物２３８（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２Ｎ｛ＣＯＣＦ３｝［ＣＨ２］２ＮＨ｛ＣＯＣＦ３｝，スキーム２７ｂ，表XXIV）。
化合物２７３（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２Ｎ｛フタロイル｝，スキーム２７ａ）を、ヒドラジンで処理して、側鎖からフタロイル保護を除去する。このようにして形成された対応する遊離アミンを、実施例６４に記載のように塩基の存在下においてＮ−ベンゾイルオキシカルボニルアミノエタノール−Ｏ−メタンスルホネートと反応させた後、ホスフィチル化して（実施例２）、化合物２３８を生じる。
【０４１０】
スキーム２７ｂ
【０４１１】
【化５１】
2005504020.tif 000080
【０４１２】
実施例１１１
化合物２４２（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣＯＮＨＣＨ３，スキーム２７ｂ，表XXII）。
化合物２７３（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２Ｎ｛フタロイル｝，スキーム２７ａ）を、ヒドラジンで処理して、側鎖からフタロイル保護を除去する。所望の化合物２４２は、実施例６８および６９に記載のように、形成された遊離アミノ基とＣＤＩおよびメチルアミンとを反応させることによって得る。
【０４１３】
実施例１１２
化合物２４３（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣＳＮＨＣＨ３，スキーム２７ｂ，表XXII）。
化合物２７３（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２Ｎ｛フタロイル｝，スキーム２７ａ）を、ヒドラジンで処理して、側鎖からフタロイル保護を除去する。所望の化合物２４３は、実施例６８および６９に記載のように、形成された遊離アミノ基と１，１’−チオカルボニルジイミダゾールおよびメチルアミンとを反応させることによって得る。
【０４１４】
実施例１１３
化合物２４４（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２ＮＨＣ｛ＮＨ｝ＮＨ３，スキーム２７ｂ，表XXII）。
化合物２７３（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］２Ｎ｛フタロイル｝，スキーム２７ａ）を、ヒドラジンで処理して、側鎖からフタロイル保護を除去する。所望の化合物２４３は、アミノ化合物および化合物Ａ（スキーム２２ｄを参照されたい）から、実施例６７、７４および７５に記載のように製造する。
【０４１５】
実施例１１４
化合物２４５（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］３ＣＨ２Ｃ［ＮＨ］ＮＨ３，スキーム２７ｂ，表XXII）。
化合物２２７（明記の）を、化合物２７３（Ｘ＝Ｏ［ＣＨ２］３ＣＮ）から、実施例７７、７８および７９に記載のように合成する。
【０４１６】
実施例１１５
化合物２８４（スキーム２８）。
参考文献手順［Pal,B.C. et al., Nucleosides & Nucleotides, 1988,7,1-21］にしたがって製造された化合物２８３を、ＮａＨＣＯ３の存在下の水性メタノール中においてＢｏｃ２Ｏと一緒に撹拌して、環窒素をＢｏｃとして保護する。次に、Ｂｏｃで保護されたヌクレオシドを、無水ピリジン中でアセチル化して、化合物２８４を得る。
【０４１７】
スキーム２８
【０４１８】
【化５２】
2005504020.tif 000081
【０４１９】
実施例１１６
化合物２８５（Ｒ＝［フタロイル］Ｎ［ＣＨ２］３−，スキーム２８）。
Ｎ−（フタロイル）エチレンジアミンを、化合物２８４のカルボキシル基に、ＨＡＴＵおよびＨＯＡＴの存在下のペプチドカップリング条件下においてカップリングさせて、化合物２８５を得る。
【０４２０】
実施例１１７
化合物２８６（Ｒ＝［フタロイル］Ｎ［ＣＨ２］３−，スキーム２８）。
化合物２８５に、ジクロロメタン中のＴＦＡ処理を３０分間施して、Ｂｏｃ保護を除去する。環窒素の脱保護後、得られた化合物を、０．１Ｍ  ＬｉＯＨを含有する水性ＴＨＦ中において０℃で撹拌して、化合物２８６（明記の）を得る。
【０４２１】
実施例１１８
化合物２８７（Ｒ＝［フタロイル］Ｎ［ＣＨ２］３−，スキーム２８）。
無水ピリジン中の化合物２８７（１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＡＰ（１０ｍｏｌ％）の存在下においてＤＭＴ−Ｃｌ（１ｍｍｏｌ）で処理して、対応する５’−Ｏ−ＤＭＴ誘導体を得る。ジメトキシトリチル化後、得られた生成物を、ＤＩＥＡの存在下の無水ジクロロメタン中の過剰のトリフルオロ酢酸エチルと一緒に撹拌して、化合物２８７を得る。
【０４２２】
実施例１１９
化合物２７４（Ｒ＝［フタロイル］Ｎ［ＣＨ２］３−，スキーム２８，表XXV）。
化合物３の合成について実施例２に記載の条件下での化合物２８７のホスフィチル化は、化合物２７４を生じる。
【０４２３】
【表２７】
2005504020.tif 000082
【０４２４】
実施例１２０
選択された修飾を有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性
フェノキサジン１５１およびＧ−クランプ１５２の両ヌクレオシドを、以前に公表された手順［Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc., 1995,117,3873-3874; Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532］を改変することによって製造した。スクシネート１５３および１５４、および対応する置換された固体支持体１５５および１５６は、スキーム１９に概略されたように製造した。ＣＰＧ支持体を用いて、二つのシチジン類似体１５１および１５２を、Ｔ１８ｄＣ＊の配列をそれぞれ有する二つのモデルオリゴヌクレオチド１５７および１５８（ｄＣ＊＝フェノキサジン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）またはＧ−クランプデオキシリボヌクレオシド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３））の３’末端に包含させた。固相オリゴヌクレオチド合成は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いて行った。Ｇ−クランプ含有オリゴヌクレオチド１５８の脱保護は、ＭｅＮＨ２（４０％水性）およびＮＨ３（２０〜３０％水性）の１：１溶液で、室温において４時間行った。これらオリゴヌクレオチドは、逆相ＨＰＬＣで精製し且つ脱塩した。
【０４２５】
ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）およびウシ腸管粘膜ホスホジエステラーゼ（ＢＩＰＤ）を、in vitro ヌクレアーゼ耐性研究のための加水分解酵素として利用した。どちらの酵素も、主に、３’エキソヌクレアーゼ活性を示す。未修飾の１９マーオリゴチミジレート（オリゴヌクレオチド１５９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）を、対照として用いた。オリゴヌクレオチド試料を、ＳＶＰＤ（２．５単位／μｍｏｌ基質）またはＢＩＰＤ（０．５５単位／μｍｏｌ基質）と一緒に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液、ｐＨ７．５中において３７℃でインキュベートした。ある一定の時点で、１０μｌのアリコートを取り出し、沸騰水中で２分間加熱して酵素を失活させた。次に、それら試料を、Millipore ０．０２５μｍ  ＶＳメンブランを用いた Nanopure 脱イオン水に対する膜透析によって脱塩し、それらを分析するまで凍結貯蔵した。酵素分解の進行は、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって監視した。
【０４２６】
ＳＶＰＤを加水分解酵素としたヌクレアーゼ耐性研究の結果を、図４に示す。予想されるように、未修飾対照オリゴヌクレオチド１５９（インサート）は、末端ヌクレオチドの逐次的除去によって速やかに分解された。適用された条件下において、このオリゴヌクレオチドのｔ１／２には、約３分で達した。２０分間のインキュベーション後、完全長オリゴマーは、一連のより短いフラグメントへとほぼ完全に分解された。対照的に、複素環修飾を３’末端に有する修飾オリゴヌクレオチド１５７および１５８は、８時間のインキュベーション時間後でも、ほとんど分解されなかった。分解速度およびＣＧＥプロフィールによれば、これら二つのオリゴマーの３’エキソヌクレアーゼ耐性には大差がない。加水分解酵素としてのＢＩＰＤに対するヌクレアーゼ耐性のきわめて類似の結果が、修飾オリゴヌクレオチド１５７および１５８双方について得られた。
【０４２７】
もう一組の実験で、ヌクレアーゼ活性へのフェノキサジンおよびＧ−クランプ両オリゴヌクレオチドの阻害作用を調べた。未修飾オリゴヌクレオチド１５９を、ＢＩＰＤと一緒にインキュベートし、フルオレセインで５’標識されている１９マーオリゴチミジレートの分解を、いろいろな量のオリゴヌクレオチド１５７および１５８それぞれの存在下で追跡した。オリゴヌクレオチド試料を、ＢＩＰＤ（０．５５単位／μｍｏｌ基質）と一緒に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５中において３７℃でインキュベートした。ある一定の時点で、１０μｌのアリコートを取り、２００μＬのｄＨ２Ｏ中に直接的に希釈後、ＣＧＥ分析をした。核酸分解活性へのこれら修飾オリゴヌクレオチドの影響を、全体の酵素反応速度を調べることによって決定した。したがって、分解生成物は全て、各々の時点で定量し、それらの分解段階（ｎ−ｘ）を考慮して秤量し、要約して、加水分解された結合数を得た。酵素反応速度は、加水分解されたホスホジエステル結合の数からインキュベーション時間の関数として図式的に決定した。
【０４２８】
本研究のこのもう一つの項目は、これら三環式塩基修飾を３’末端に有するオリゴヌクレオチドが、なぜこのような異例のヌクレアーゼ耐性を示すのかという疑問によって進められた。したがって、それらが基質として認識されるか否か、すなわち、そられが酵素の活性部位に結合し且つ天然のＤＮＡフラグメントの分解に影響を与えることができるか否かを決定することを計画した。図５において、未修飾オリゴヌクレオチド１５９の酵素分解速度を、オリゴヌクレオチド１５７および１５８の濃度の関数として示す。この図より、これら修飾オリゴヌクレオチドの存在は、酵素反応に明白な阻害作用を有するということが明らかである。再度、フェノキサジンおよびＧ−クランプの二つの誘導体の間には、検出可能な有意の差がない。両方とも、０．２μＭを超える濃度で、オリゴヌクレオチド１５９の分解過程を遅くすることができる。ＩＣ５０値には約０．５μＭで達し、しかも５μＭおよびそれを超える濃度では、酵素反応はほぼ完全に妨げられる。
【０４２９】
実施例１２１
選択された修飾を有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性
フェノキサジン１５１およびＧ−クランプ１５２の両ヌクレオシドを、以前に公表された手順［Lin,K.-Y.; Jones,R.J.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc., 1995,117,3873-3874; Lin,K.-Y.; Matteucci,M. J.Am.Chem.Soc., 1998,120,8531-8532］を改変することによって製造した。スクシネート１５３および１５４、および対応する置換された固体支持体１５５および１５６は、スキーム１９に概略されたように製造した。ＣＰＧ支持体を用いて、二つのシチジン類似体１５１および１５２を、Ｔ１８ｄＣ＊の配列をそれぞれ有する二つのモデルオリゴヌクレオチド１５７および１５８（ｄＣ＊＝フェノキサジン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）またはＧ−クランプデオキシリボヌクレオシド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３））の３’末端に包含させた。固相オリゴヌクレオチド合成は、標準的なホスホロアミダイト化学を用いて行った。Ｇ−クランプ含有オリゴヌクレオチド１５８の脱保護は、ＭｅＮＨ２（４０％水性）およびＮＨ３（２０〜３０％水性）の１：１溶液で、室温において４時間行った。これらオリゴヌクレオチドは、逆相ＨＰＬＣで精製し且つ脱塩した。
【０４３０】
ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）およびウシ腸管粘膜ホスホジエステラーゼ（ＢＩＰＤ）を、in vitro ヌクレアーゼ耐性研究のための加水分解酵素として利用した。どちらの酵素も、主に、３’エキソヌクレアーゼ活性を示す。未修飾の１９マーオリゴチミジレート（オリゴヌクレオチド１５９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）を、対照として用いた。オリゴヌクレオチド試料を、ＳＶＰＤ（２．５単位／μｍｏｌ基質）またはＢＩＰＤ（０．５５単位／μｍｏｌ基質）と一緒に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２緩衝液、ｐＨ７．５中において３７℃でインキュベートした。ある一定の時点で、１０μｌのアリコートを取り出し、沸騰水中で２分間加熱して酵素を失活させた。次に、それら試料を、Millipore ０．０２５μｍ  ＶＳメンブランを用いた Nanopure 脱イオン水に対する膜透析によって脱塩し、それらを分析するまで凍結貯蔵した。酵素分解の進行は、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって監視した。
【０４３１】
ＳＶＰＤを加水分解酵素としたヌクレアーゼ耐性研究の結果を、図４に示す。予想されるように、未修飾対照オリゴヌクレオチド１５９（インサート）は、末端ヌクレオチドの逐次的除去によって速やかに分解された。適用された条件下において、このオリゴヌクレオチドのｔ１／２には、約３分で達した。２０分間のインキュベーション後、完全長オリゴマーは、一連のより短いフラグメントへとほぼ完全に分解された。対照的に、複素環修飾を３’末端に有する修飾オリゴヌクレオチド１５７および１５８は、８時間のインキュベーション時間後でも、ほとんど分解されなかった。分解速度およびＣＧＥプロフィールによれば、これら二つのオリゴマーの３’エキソヌクレアーゼ耐性には大差がない。加水分解酵素としてのＢＩＰＤに対するヌクレアーゼ耐性のきわめて類似の結果が、修飾オリゴヌクレオチド１５７および１５８双方について得られた。
【０４３２】
もう一組の実験で、ヌクレアーゼ活性へのフェノキサジンおよびＧ−クランプ両オリゴヌクレオチドの阻害作用を調べた。未修飾オリゴヌクレオチド１５９を、ＢＩＰＤと一緒にインキュベートし、フルオレセインで５’標識されている１９マーオリゴチミジレートの分解を、いろいろな量のオリゴヌクレオチド１５７および１５８それぞれの存在下で追跡した。オリゴヌクレオチド試料を、ＢＩＰＤ（０．５５単位／μｍｏｌ基質）と一緒に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５中において３７℃でインキュベートした。ある一定の時点で、１０μｌのアリコートを取り、２００μＬのｄＨ２Ｏ中に直接的に希釈後、ＣＧＥ分析をした。核酸分解活性へのこれら修飾オリゴヌクレオチドの影響を、全体の酵素反応速度を調べることによって決定した。したがって、分解生成物は全て、各々の時点で定量し、それらの分解段階（ｎ−ｘ）を考慮して秤量し、要約して、加水分解された結合数を得た。酵素反応速度は、加水分解されたホスホジエステル結合の数からインキュベーション時間の関数として図式的に決定した。
【０４３３】
本研究のこのもう一つの項目は、これら三環式塩基修飾を３’末端に有するオリゴヌクレオチドが、なぜこのような異例のヌクレアーゼ耐性を示すのかという疑問によって進められた。したがって、それらが基質として認識されるか否か、すなわち、そられが酵素の活性部位に結合し且つ天然のＤＮＡフラグメントの分解に影響を与えることができるか否かを決定することを計画した。図５において、未修飾オリゴヌクレオチド１５９の酵素分解速度を、オリゴヌクレオチド１５７および１５８の濃度の関数として示す。この図より、これら修飾オリゴヌクレオチドの存在は、酵素反応に明白な阻害作用を有するということが明らかである。再度、フェノキサジンおよびＧ−クランプの二つの誘導体の間には、検出可能な有意の差がない。両方とも、０．２μＭを超える濃度で、オリゴヌクレオチド１５９の分解過程を遅くすることができる。ＩＣ５０値には約０．５μＭで達し、しかも５μＭおよびそれを超える濃度では、酵素反応はほぼ完全に妨げられる。
【０４３４】
ヌクレアーゼ耐性データは、双方の複素環修飾が、それらの天然のホスホジエステル主鎖にもかかわらず、３’エキソヌクレアーゼ攻撃をほぼ完全に防ぐということを示している。明らかに、この酵素は、修飾核酸塩基フェノキサジンまたはＧ−クランプを３’末端に含有するオリゴヌクレオチドを消化することができない。認められた高いヌクレアーゼ安定性には、主に、いろいろな理由があると考えられる。嵩高な複素環部分はどちらも、この酵素が３’末端に結合することを立体障害によって簡単に妨げるので、これらオリゴヌクレオチドは基質として認識されない、またはそれらは、加水分解されないで酵素の活性部位に結合するということになり、これが、酵素の活性に直接的に影響を与えると考えられる。天然のＤＮＡフラグメントの酵素分解で認められた速度減少は、フェノキサジン残基およびＧ−クランプ残基を含有するオリゴヌクレオチドが、酵素の活性部位に結合できるということを示している。しかしながら、３’末端ヌクレオチドホスホジエステル結合の加水分解は、不自然な三環式塩基部分の存在のために妨げられる。約０．５μＭｏｌのＩＣ５０値での阻害作用の用量依存性は、これら修飾オリゴヌクレオチドの結合が競合的で且つ可逆的であるということを示唆している。
【０４３５】
オリゴヌクレオチド１５７と１５８とのヌクレアーゼ耐性の間には、検出可能な差がなく、認められた安定化作用は、主に、嵩高な複素環の存在のためであるということが示される。しかしながら、このデータでは、Ｇ−クランプ部分の陽電荷アミノ束縛部分が、オリゴヌクレオチド１５８のヌクレアーゼ耐性にどの程度寄与しているかは、依然として不明である。以前の研究において、２’−Ｏ−アミノアルキルなどの糖部分の陽イオン修飾は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドを酵素分解から効率よく守ることができるということが分かっている［Manoharan,M.; Tivel,K.L.; Anrade,L.K., Cook,P.D. Tetrahedron Lett. 1995,36,3647-3650; Teplova,M.; Wallace,S.C.; Tereshko,V.; Minasov,G.; Symonas,A.M.; Cook,P.D.; Manoharan,M.; Egli,M. PNAS 1999,96,14240-14245］。２’−アミノプロピル修飾オリゴヌクレオチドとエキソヌクレアーゼ（ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント）との間に形成される複合体の結晶構造研究は、このアミノプロピル残基が、３’ホスホジエステル結合の加水分解を触媒するのに必要とされる金属イオンの結合を妨げるということを示している。しかしながら、Ｇ−クランプ残基のアミノ束縛は、主溝に突出しているが、この２’修飾は二重らせんの浅溝に向いている。後者の陽電荷が、エキソヌクレアーゼの金属結合を妨げることがありうるか否かは、依然として調べられている。
【０４３６】
実施例１２２
ＳＶＰＤによる分解
オリゴヌクレオチドを、２μＭの最終濃度で、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（０．００５Ｕ／ｍｌ）と一緒に、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２中において３７℃でインキュベートした。全反応容量は１００μＬであった。各々の時点で、各々の反応混合物からの１０μＬアリコートを、５００μＬミクロ遠心管に入れ、沸騰水浴中に２分間置いた。次に、それら試料を氷上で冷却し、容量全体が管の底にいくように急速回転させ、そして６０ｍｍペトリ皿中の水中に浮遊している Millipore ０．０２５ミクロンフィルターディスク（Bedford, MA）で脱塩した。そのメンブラン上で３０〜６０分後、試料を２００μＬの蒸留Ｈ２Ｏで希釈し、ゲル充填キャピラリー電気泳動によって分析した。オリゴヌクレオチドおよび代謝産物は、ｅＣＡＰｓｓＤＮＡ１００−Ｒゲル（Beckman Ｎｏ．４７７６２１）および Tris-Borate Urea 緩衝液（Beckman Ｎｏ．３３８４８１）を含む１００μｍＩＤ３０ｃｍコーティングキャピラリー（Beckman Ｎｏ．４７７４７７）を用いた Beckman Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱキャピラリー電気泳動装置を用いて分離し且つ分析した。これら試料は、動電学的に、５〜１０秒間に５〜１０ｋＶの電界強さを用いて注入した。分離ウォッシュは、４０℃において１５ｋＶの印加電圧で行った。完全長オリゴヌクレオチドの百分率は、Caesar v.６ソフトウェア（Senetec Software, New Jersey）を用いた組込み後、異なった長さのオリゴヌクレオチドの吸光係数の差を補正することによって計算した。
【０４３７】
実施例１２３
Ｌ／Ｄ−オリゴヌクレオチドキメラの in vivo ヌクレアーゼ安定性および結合親和性
天然に存在するＤ−オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによってきわめて急速に分解されるが、鏡像異性体のＬ−ＤＮＡオリゴマーは、ヌクレアーゼの作用への増大した耐性を有する１。しかしながら、Ｌ−ＤＮＡは、天然のＲＮＡおよびＤＮＡとは全くかまたは弱くしかハイブリッド形成しないことが判明している。Damha および Capobianco［Damha,M.J.; Giannaris,P.A.; Marfey,P. Biochemistry, 1994,33,7877-7885; Capobianco,m.L.; Garbesi,A.; Arcamone,F.; Maschera,B.; Palu,G. Nucleic Acids Symp.Series 1991,24,274］は、独立して、末端Ｌ単位を有するキメラＬ／Ｄ−オリゴマーが、ヒト血清中において適切な二重らせん形成能力と優れた酵素的安定性を与えたということを示している［Damha,M.J.; Giannaris,P.A.; Marfey,P. Biochemistry, 1994,33,7877-7885; Capobianco,m.L.; Garbesi,A.; Arcamone,F.; Maschera,B.; Palu,G. Nucleic Acids Symp.Series 1991,24,274］。
【０４３８】
ここで、本発明者は、マウスにおけるＬ／Ｄ−オリゴヌクレオチドキメラの in vivo ヌクレアーゼ安定性を報告する。本発明者は、新規な経路［Jung,E.M.; Xu,Y. Tetrahedron Lett. 1997,24,4199-4202］から合成された、Ｌ−チミジンから誘導されるホスホロアミダイトおよびＣＰＧを合成した。２０マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ−１２０７４５（マウスＩＣＡＭ−１にアンチセンス）に、Ｌ−２’−デオキシチミジンで３’位および５’位にキャッピングした。次に、このオリゴヌクレオチドを、ＢａｌｂＣマウスにIVボーラス投与した。２４時間後、マウスを屠殺し、いろいろな器官からオリゴヌクレオチドを単離した。いろいろな器官中に存在する完全長オリゴヌクレオチドの百分率を、ＣＧＥで分析した。主要器官全てから、そこでは親オリゴヌクレオチドが完全に分解されていたので、＞９０％の無傷のＬ−チミジンキャップ付きオリゴヌクレオチドを単離した（図６および図７）。
【図面の簡単な説明】
【０４３９】
【図１】図１Ａは、三環式シトシン類似体Ｇ−クランプの構造を示し、図１Ｂは、相補的グアノシンにハイブリッド形成したグアニジニルＧ−クランプを示し、そして図１Ｃは、ｘ線結晶解析に用いられたパリンドローム十量体二重らせんを示す。Ｃ＊とＧとの間に形成される５個の水素結合を、水平線で示している。Ｃ＊は、グアニジニルＧ−クランプを意味し、Ｔは、２’−Ｏ−ＭＯＥ−Ｔを意味する。
【図２】図２は、Åで示される距離を有する細い実線によって示されている５個の水素結合の形成を確認する、グアニジニルＧ−クランプヌクレオシド類似体およびグアノシンの周囲の（１．２５σで輪郭を描いた）フーリエ（２Ｆ０−Ｆｃ）総和電子密度地図を示す。
【図３】図３は、フェノキサジン環へほぼ垂直線に沿って見た、グアニジニルＧ−クランプ核酸塩基類似体とグアノシンとの間に生じる塩基スタッキングを示す。
【図４】図４は、ＣＧＥ分析によって決定されるオリゴヌクレオチド１５７（白三角）および１５８（黒丸）のＳＶＰＤでの分解を、インキュベーション時間の関数としておよび未修飾対照オリゴヌクレオチド１５９（黒菱形）の分解と比較して示す。
【図５】図５は、オリゴヌクレオチド１５９のＢＩＰＤでの加水分解速度を、共インキュベートされたオリゴヌクレオチド１５７（白三角）および１５８（黒丸）の濃度の関数として示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＢａｌｂＣマウスに投与前の完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＢａｌｂＣマウス中へのIVボーラスによる２５ｍｇ／ｋｇ用量の投与後１時間に肝中に存在した完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＢａｌｂＣマウス中へのIVボーラスによる２５ｍｇ／ｋｇ用量の投与後１時間に腎臓中に存在した完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＢａｌｂＣマウス中へのIVボーラスによる２５ｍｇ／ｋｇ用量の投与後１時間に脾臓中に存在した完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＢａｌｂＣマウス中へのIVボーラスによる２５ｍｇ／ｋｇ用量の投与後１時間に肺中に存在した完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＢａｌｂＣマウスに投与前の完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＢａｌｂＣマウス中へのIVボーラスによる２５ｍｇ／ｋｇ用量の投与後２４時間に肝中に存在した完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＢａｌｂＣマウス中へのIVボーラスによる２５ｍｇ／ｋｇ用量の投与後２４時間に腎臓中に存在した完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＢａｌｂＣマウス中へのIVボーラスによる２５ｍｇ／ｋｇ用量の投与後２４時間に脾臓中に存在した完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＢａｌｂＣマウス中へのIVボーラスによる２５ｍｇ／ｋｇ用量の投与後２４時間に肺中に存在した完全長Ｌ／Ｄキメラオリゴヌクレオチドの相対単位を示す。
【図４】
2005504020.tif 000112
【図５】
2005504020.tif 000113
【図６Ａ】
2005504020.tif 000114
【図６Ｂ】
2005504020.tif 000115
【図６Ｃ】
2005504020.tif 000116
【図６Ｄ】
2005504020.tif 000117
【図６Ｅ】
2005504020.tif 000118
【図７Ａ】
2005504020.tif 000119
【図７Ｂ】
2005504020.tif 000120
【図７Ｃ】
2005504020.tif 000121
【図７Ｄ】
2005504020.tif 000122
【図７Ｅ】
2005504020.tif 000123
【国際公開パンフレット】
2005504020.tif 000124
2005504020.tif 000125
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