(57)【要約】本発明は、微生物における、組み換えの、機能的なプラスミノーゲンの生産方法、および、プラスミノーゲン活性化因子の同定方法に関する。そのプラスミノーゲンの機能的部分をコードする核酸配列は、少なくとも一つのシグナルペプチドをコードする核酸分子と融合される。そのプラスミノーゲンをコードする核酸分子、および、そのシグナルペプチドをコードする核酸分子は、そのシグナルペプチドを切断するタンパク質分解酵素の接触のためのコドンと共に結合される。その組み換えのプラスミノーゲン、または対応するプラスミンは、適切な組成におけるその酵素の使用によって、緩やかな治癒または治癒されない創傷の治療に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物内で機能的なプラスミノーゲンを組み換え生産する方法であって、少なくとも以下の：
ａ）少なくとも前記プラスミノーゲンの機能的部分をコードする核酸配列を、少なくとも一つのシグナルペプチドをコードする核酸配列と融合し、そして、
前記機能的なプラスミノーゲンをコードする前記核酸配列と、少なくとも前記シグナルペプチドをコードする前記核酸配列とは、前記シグナルペプチドの切断のために与えられるタンパク質分解酵素の切断点のコドンと共に結合されること、
のステップを含む方法。
【請求項２】
前記少なくともプラスミノーゲンの機能的部分をコードする核酸配列は、プラスミノーゲンのタンパク質分解のドメイン、またはその変異体、またはその断片を含む、
請求項１に記載の前記組み換え生産方法。
【請求項３】
前記少なくともプラスミノーゲンの機能的部分をコードする核酸配列は、グルタミン酸−プラスミノーゲン、またはリジン−プラスミノーゲンをコードする、
請求項１または２のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項４】
前記少なくとも一つのシグナルペプチドをコードする核酸配列は、プレプロペプチド、プレペプチド、またはプロペプチドをコードしており、および／または前記コドンは、プロテアーゼKex2および／またはSte13のための、タンパク質分解酵素の切断点をコードする、
請求項１から３のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項５】
前記少なくとも一つのシグナルペプチドをコードする核酸分子は、α因子またはSUC2のシグナルペプチド、PHA-E、または酵母サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のPH01をコードすることを特徴とする、
請求項４に記載の組み換え生産方法。
【請求項６】
少なくとも、２０mg/lの機能的なグルタミン酸−プラスミノーゲンまたはリジン−プラスミノーゲンが生産されることを特徴とする、
請求項１から５のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項７】
１２０時間の処理の後、少なくとも１２０U/lの機能的なリジン−プラスミノーゲンが生産されることを特徴とする、
請求項１から６のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項８】
増幅のためのプライマーとして、N036a (配列番号19)、N036b (配列番号20)、N036c (配列番号21)、N036d (配列番号22)、N036e (配列番号23)、N036f (配列番号24)、N036g (配列番号25)、N036h (配列番号26)、N036i (配列番号27)、およびN036j (配列番号28)からなる群より選ばれる２つのオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる、
請求項１から７のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項９】
増幅のためのプライマーとして、N034 (配列番号1)、N036 (配列番号2)、N057 (配列番号3)、N037 (配列番号4)、N035 (配列番号5)、N056 (配列番号6)からなる群、および、N036a (配列番号19)、N036b (配列番号20)、N036c (配列番号21)、N036d (配列番号22)、N036e (配列番号23)、N036f (配列番号24)、N036g (配列番号25)、N036h (配列番号26)、N036i (配列番号27)、およびN036j (配列番号28)からなる群より選ばれる２つのオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる、
請求項１から８のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項１０】
前記ステップａ）の結果である融合生産物は、微生物に適切な発現ベクターに組み込まれる、
請求項１から９のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項１１】
前記発現ベクターは菌類に適切なものである、
請求項１０に記載の組み換え生産方法。
【請求項１２】
前記発現ベクターは、誘導可能なプロモーター、または、恒常的なプロモーターを含む、
請求項１０または１１に記載の組み換え生産方法。
【請求項１３】
前記発現ベクターは、ピキア・パストリス由来の恒常的なGAP-プロモーターを含む、
請求項１０または１１に記載の組み換え生産方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の組み換え生産方法において、前記のようにして得られる核酸は、好ましくは、pPLG11.2、pPLG12.1、pPLG13.1、pPLG14.2、pPLG15.1、pPLG16.3、pPLG17.2、pPLG18.1、pPLG19.2、pPLG20.1、pAC37.1、pJW9.1、pMHS476.1、pSM54.2、pSM49.8、pSM82.1、およびpSM58.1からなる群より選ばれたプラスミドであることを特徴とする、
請求項１２に記載の組み換え生産方法。
【請求項１５】
前記プロテアーゼKex2の切断点をコードするコドン、および、前記プラスミノーゲンの前記融合遺伝子は、配列番号７、１３、５０、５２、５４、５６、または５８で表される核酸配列を有することを特徴とする、
請求項１から１４のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項１６】
前記プロテアーゼKex2の切断点をコードするコドン、および、前記プラスミノーゲンの前記融合タンパク質は、配列番号８、１４、４０、４２、４４、４６、または４８で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、
請求項１から１５のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項１７】
前記プロテアーゼKex2およびプロテアーゼSte13の切断点をコードするコドン、ならびに、前記プラスミノーゲンの前記融合遺伝子は、配列番号９、１５、５１、５３、５５、または５７で表される核酸配列を有することを特徴とする、
請求項１から１６のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼKex2およびプロテアーゼSte13の切断点をコードするコドン、ならびに、前記プラスミノーゲンの前記融合タンパク質は、配列番号１０、１６、４１、４３、４５、４７、または４９で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、
請求項１から１７のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項１９】
前記微生物による宿主は、請求項１４に記載された前記プラスミドによって形質転換される、
請求項１から１８のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項２０】
前記利用される宿主生体は、真核微生物である、
請求項１から１９のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項２１】
前記利用される宿主生体は、菌類の属とされるものであることを特徴とする、
請求項２０に記載の組み換え生産方法。
【請求項２２】
前記利用される宿主生体は、ピキア属、サッカロミセス属、ハンゼヌラ属、カンジダ属、またはアスペルギルス属とされるものであることを特徴とする、
請求項２１に記載の組み換え生産方法。
【請求項２３】
前記利用される宿主生体は、ピキア・パストリス種、ピキア・メタノリカ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クロカビ、コウジカビ、または偽巣性コウジ菌とされるものであることを特徴とする、
請求項２２に記載の組み換え生産方法。
【請求項２４】
前記核酸配列は、過剰発現される、少なくとも前記プラスミノーゲンの機能的部分をコードしており、ならびに、前記少なくともプラスミノーゲンの機能的部分は、前記ステップａ）によって生成される前記融合産物によって形質転換された微生物の宿主生体から分泌される、
請求項１から２３のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項２５】
前記プラスミノーゲンの核酸配列の機能的部分は、配列番号６０、６１、６２、６３、６４、６５、または６６の配列のいずれかである、
請求項１から２４のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項２６】
機能的な、ヒトのプラスミノーゲンが生産されることを特徴とする、
請求項１から２５のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項２７】
機能的な、ヒト相同の（human-homologous）プラスミノーゲンが生産されることを特徴とする、
請求項１から２６のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法。
【請求項２８】
プラスミドpPLG11.2、プラスミドpPLG12.1、プラスミドpPLG13.1、プラスミドpPLG14.2、プラスミドpPLG15.1、プラスミドpPLG16.3、プラスミドpPLG17.2、プラスミドpPLG18.1、プラスミドpPLG19.2、またはプラスミドpPLG20.1のいずれかのプラスミド。
【請求項２９】
プラスミドpMHS476.1、プラスミドpSM54.2、プラスミドpSM49.8、プラスミドpSM82.1のいずれかのプラスミド。
【請求項３０】
プラスミドpSM58.1、プラスミドpAC37.1、プラスミドpJW9.1のいずれかのプラスミド。
【請求項３１】
請求項１から２７のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法によって取得されうる核酸配列であって、
少なくとも前記プラスミノーゲンの機能的部分をコードする核酸配列は、
酵母において活性化するプロモーターと操作可能に結合し、さらに、少なくとも一つのシグナルペプチドをコードする核酸配列と結合しており、
前記機能的なプラスミノーゲンをコードする前記核酸配列と、少なくとも前記シグナルペプチドをコードする核酸配列とは、プロテアーゼKex2およびSte13の切断点のコドンと共に結合されることを特徴とする、
核酸配列。
【請求項３２】
請求項１から２７のいずれかの請求項に記載の組み換え生産方法によって取得されうるプラスミノーゲン。
【請求項３３】
マイクロプラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、リジン−プラスミノーゲン、グルタミン酸−プラスミノーゲン、またはプラスミノーゲン派生物が関連することを特徴とする、
請求項３２に記載のプラスミノーゲン。
【請求項３４】
前記プラスミノーゲン派生物は、プラスミノーゲンの機能的なタンパク質分解ドメインを含み、ならびに、少なくとも一つのアミノ酸の欠失、および／または、少なくとも一つのアミノ酸の置換を含み、および／または、少なくとも他のアミノ酸、または少なくともペプチド、または少なくともタンパク質と融合していることを特徴とする、
請求項３３に記載のプラスミノーゲン派生物。
【請求項３５】
前記プラスミノーゲン派生物は、少なくとも一つのプラスミノーゲン活性化因子によって、活性化プラスミンに活性化されうることを特徴とする、
請求項３３または３４に記載のプラスミノーゲン派生物。
【請求項３６】
前記プラスミノーゲン派生物は、少なくともプラスミノーゲンの機能的なタンパク質分解ドメインを含み、マイクロ−、ミニ−、リジン−、またはグルタミン酸−プラスミノーゲンに対して８０％より大きい配列相同性、好ましくは９０％より大きい、特に好ましくは９５％より大きい配列相同性を示すことを特徴とする、
請求項３３から３５のいずれかの請求項に記載のプラスミノーゲン派生物。
【請求項３７】
少なくとも一つのプラスミノーゲン活性化因子を用いることにより、請求項３２から３６のいずれかの請求項に記載のプラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン派生物の活性化によって取得されうるプラスミン。
【請求項３８】
請求項１から２７のいずれかの請求項に記載の、前記ステップａ）によって取得されるもの由来の、前記融合産物または一つの核酸配列を含む、微生物の宿主生体。
【請求項３９】
ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、サッカロマイセス・セレヴィシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クロカビ、コウジカビ、および偽巣性コウジ菌の群から選択されることを特徴とする、
請求項３８に記載の微生物の宿主生体。
【請求項４０】
薬剤の製造のための、請求項１から２７のいずれかの請求項に記載の方法によって生産されるものから現れる（emerging thereof produced）、機能的なプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンの使用。
【請求項４１】
創傷、血栓症状の治療のための、または血栓症状の予防のための、請求項１から２７のいずれかの請求項に記載の方法によって生産されるものから現れる、機能的なプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンの使用。
【請求項４２】
抗血栓および抗凝固性の活性薬剤としての、請求項１から２７のいずれかの請求項に記載の方法によって生産されるものから現れる、機能的なプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンの使用。
【請求項４３】
より詳細には、以下の、心臓発作、卒中、血栓症、静脈血栓症、再狭窄、低酸素症、虚血、凝固壊死、血管の炎症、急性の肺塞栓症, 急性および準急性の動脈血栓、静脈血栓の新鮮または古い凝固、臀部および四肢の深刻な静脈血栓症, 閉塞していない血管領域での初期の血栓、急性の目の中央の血管閉塞、１型プラスミノーゲンの欠失の場合の結膜炎、火傷、アルカリ火傷または酸火傷および凍傷、ショック中の播種性血管内凝固症候群、急性の四肢動脈閉塞、慢性的な閉塞性動脈疾患、動静脈シャントの血栓症、ならびに、心臓発作後の治療、バイパス手術後の治療、血管形成後の治療、およびバルーン拡張後の治療、急性の心臓発作の場合の血栓治療、動静脈シャントの再疎通、および、急性の心臓発作の場合の閉塞した冠動脈の再潅流の、予防および／または治療のための、
請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
抗凝固剤との組み合わせによる、請求項４０から４３のいずれかの請求項に記載の使用。
【請求項４５】
前記抗凝固剤は、ヘパリン、ヘパリン派生物、またはアセチルサリチル酸に関するものであることを特徴とする、
請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
ドレッシング剤、絆創膏に取り入れるために、または、外傷剤との組み合わせで使用するための、
請求項１から２７のいずれかの請求項に記載の方法によって生産されるものから現れる、機能的なプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンの使用。
【請求項４７】
請求項１から２７のいずれかの請求項に記載の方法によって生産されるものから現れる、機能的なプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンを含む、ドレッシング剤、外傷包帯、または絆創膏。
【請求項４８】
薬剤組成のｃｍ２（平方センチメートル）当たりのものから現れる、０．０１から５００ユニット（U）のプラスミノーゲンおよび／またはプラスミン、好ましくは、薬剤組成のｃｍ２当たりのものから現れる、０．１から２５０ユニットおよび特に好ましくは１から１５０ユニットのプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンを含む、
請求項４７に記載のドレッシング剤、外傷包帯、または絆創膏。
【請求項４９】
火傷、凍傷、アルカリ火傷または酸火傷、損傷、および／または創傷の治療のための、
請求項４７または４８に記載のドレッシング剤、外傷包帯、または絆創膏の使用。
【請求項５０】
請求項１から２７のいずれかの請求項に記載の方法によって生産されるものから現れるプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンと、薬学的に許容される担体（carrier）、添加剤、および／または溶剤、ならびに必要な場合には抗凝固性の活性薬剤とを含む薬剤組成物。
【請求項５１】
経口、局所的、または非経口、血管内、特に静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内への使用に適切な、
請求項５０に記載の薬剤組成物。
【請求項５２】
前記薬剤組成物の１グラム当たりのものから現れる、０．０１から５００Ｕ（ユニット）のプラスミノーゲンおよび／またはプラスミン、好ましくは、前記薬剤組成の１グラム当たりのものから現れる、０．１から２５０ユニット、および特に好ましくは、１から１５０ユニットのプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンを含む、
局所使用に適切な請求項５１に記載の薬剤組成物。
【請求項５３】
前記薬剤組成物の１グラム当たりのものから現れる、0.1から100.000U（ユニット）のプラスミノーゲンおよび／またはプラスミン、好ましくは、前記薬剤組成の１グラム当たりのものから現れる、100から80.000ユニット、および特に好ましくは、1.000から50.000ユニットのプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンを含む、
経口使用に適切な請求項５１に記載の薬剤組成物。
【請求項５４】
１０ml溶液当たりのものから現れる、0.1から100百万U（ユニット）のプラスミノーゲンおよび／またはプラスミン、好ましくは、１０mlの注射または注入液当たりのものから現れる、1から10百万ユニット、および特に好ましくは、３から５百万ユニットのプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンを含む、
注射または注入に適切な請求項５１に記載の薬剤組成物。
【請求項５５】
以下の、心臓発作、卒中、血栓症、静脈血栓症、再狭窄、低酸素症、虚血、凝固壊死、血管の炎症、急性の肺塞栓症、急性および準急性の動脈血栓、静脈血栓の新鮮または古い凝固、臀部および四肢の深刻な静脈血栓症, 閉塞していない血管領域での初期の血栓、急性の目の中央の血管閉塞、１型プラスミノーゲンの欠失の場合の結膜炎、火傷、アルカリ火傷または酸火傷および凍傷、ショック中の播種性血管内凝固症候群、急性の四肢動脈閉塞、慢性的な閉塞性動脈疾患、動静脈シャントの血栓症、ならびに、心臓発作後の治療、バイパス手術後の治療、血管形成後の治療、およびバルーン拡張後の治療、急性の心臓発作の場合の血栓治療、動静脈シャントの再疎通、および、急性の心臓発作の場合の閉塞した冠動脈の再潅流の、予防および／または治療のための、
請求項５０から５４のいずれかの請求項に記載の薬剤組成物の使用。
【請求項５６】
請求項１に記載のステップａ）によって取得されるもの由来の、前記融合産物または核酸配列を含むベクター。
【請求項５７】
請求項１に記載のステップａ）によって取得されるもの由来の、前記融合産物または核酸配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項５８】
請求項１に記載のステップａ）によって取得されるもの由来の、前記融合産物または核酸配列を含むＲＮＡ分子。
【請求項５９】
請求項３６または３７に記載の前記機能的なプラスミノーゲンの使用による、プラスミノーゲン活性化因子の同定のためのスクリーニング方法。
【請求項６０】
請求項３５または３６に記載の前記機能的なプラスミノーゲンと前記タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）のプレインキューべーションの後に、その結果としてのプラスミン活性を測定することを特徴とする、
請求項５９に記載のスクリーニング方法。
【請求項６１】
合成されたペプチド基質による、その結果としてのプラスミン活性を測定することを特徴とする、
請求項５９または６０に記載のスクリーニング方法。
【請求項６２】
N−トシル−グリシン−プロリン−リジン−パラニトロアニリンによる、その結果としてのプラスミン活性を測定することを特徴とする、
請求項６１に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物内での組み換えタンパク質の生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの線維素溶解系は、中心的な要素としてタンパク質分解酵素プラスミン（Pm）を含んでいる。プラスミンは、フィブリンを分解することができる一方で、細胞外基質の分解および創傷治癒に順番に協同的に関与するマトリックス・メタロプロテイナーゼ（MMPs）及び増殖因子を活性化することができる。
【０００３】
プラスミンは、その前駆体であるプラスミノーゲンから生成される。現在に至るまで、プラスミノーゲンの２つの生理活性物質（プラスミノーゲン活性化因子（PA）とも呼ばれる）が知られている。これらは、組織型プラスミノーゲン活性化因子（組織型PA；t-PA) およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ型PA; u-PA）である。さらに、線維素溶解系は、一連のプロテアーゼ阻害剤、例えば、α2-抗プラスミンによって調節される。プラスミノーゲンおよびプラスミンの２つの最も重要な生物学的性質は、それぞれ、２つの異なった活性化因子に直接的に関係していることである。
【０００４】
いわゆるt-PAを介した方法は、フィブリンのホメオスタシスに関与しており、一方、u-PAを介した方法は、細胞遊走および細胞組織修復において重要である。特に、慢性的なｕ−ＰＡ欠損マウスの場合には、創傷の治癒は起こらない。同様のことは、プラスミノーゲン、t-PA、およびu-PAのそれぞれの遺伝子を不活性化（deactivated）したマウスに対してもあてはまる。さらに、特に血栓症および器官の崩壊を原因として、その動物の寿命は明らかに短くなった。そのようなプラスミノーゲン/プラスミン系に関する概要は、Desire Collenによって公表された （血栓症および止血（Thrombosis and Haemostasis）, 82, 1999 (1))。
【０００５】
生存のために急速なフィブリン凝固の溶解が必須となっている場合、心臓発作または卒中（heart attack or a stroke）の患者の治療に対しては、プラスミンの治療上の利用が適している。そのような理由から、間接的にフィブリン凝固の加水分解を引き起こすプラスミノーゲン活性化因子を伴う代替的な治療が提案されている。
【０００６】
上述のマウスモデルは、プラスミンがさらに、治癒創傷がないか、あるいは単に緩やかな治癒創傷がある治療において利用されうる有力な治療薬であることを示している。
【０００７】
通常、t-PAによるプラスミノーゲンの活性化は、血液凝固カスケードの終了後の、フィブリンの存在下においてのみ引き起こされる。基質の非存在下では、プラスミンは、α2-抗プラスミンによってほとんど直ちに阻害される。この反応は、フィブリンに対するプラスミンの結合によって明らかに遅くさせられ、その結果、フィブリン凝固の分解が可能となる。
【０００８】
プラスミノーゲン活性化の多様な戦略が治療に利用されている。なぜなら、心臓発作または卒中の場合には、血栓の溶解が患者の生存に頻繁に必然となっているからである。例えば、ストレプトキナーゼの注入は、血管の管腔の急速な再疎通を引き起こす。したがって、細菌のタンパク質であるストレプトキナーゼによるプラスミノーゲンの活性化は、タンパク質分解活性ではなく、複合体形成（complexation）に基づくものである。そして、この複合体は、他のプラスミノーゲン分子がプラスミンになるのを活性化することができる。
【０００９】
さらに、ウロキナーゼは治療的に利用されており、それは確かにストレプトキナーゼに類似するが、分子レベルにおいて、フリーのプラスミノーゲンとフィブリン結合のプラスミノーゲンとを区別することができない。それ故、組み換えヒトｔ−ＰＡが開発され、臨床試験において、その組み換えヒトｔ−ＰＡはストレプトキナーゼよりも優れていることが示された。しかし、これらの診断上の知見は、他の研究によっては確認されなかったようである。
【００１０】
まさに、rt-PA（および種々の派生物（derivatives））、組み換え単鎖ウロキナーゼ-PA、および組み換えスタフィロキナーゼのような組み換え的に生成されたプラスミノーゲン活性化因子は、近代的な治療において利用するための、組み換えタンパク質を生成するための分子−遺伝学な方法によって得られる産生系の重要性を強調している。
【００１１】
プラスミノーゲンは、線維素溶解性の酵素プラスミンの前駆体分子である。ヒトプラスミノーゲンのｃＤＮＡ（Malinowskiら, 生化学, 23,1984 (12); Forsgrenら, FEBS Lett. 213, 1987 (2))、および、非コード領域のイントロンを含む遺伝子(Petersenら, J. Biol. Chem., 265, 1990 (3))は、科学文献において既に公表されている。
【００１２】
セリンプロテアーゼ・プラスミンの酵素前駆体であるヒトプラスミノーゲン(hPg)は、７９１アミノ酸のポリペプチド鎖からなり、分子量92.000および理論等電点7.1の糖タンパク質である。糖の割合（carbohydrate rate）は、２％である(Collen, 1999, (1))。プラスミノーゲンは肝臓で生成され、プラズマ濃度は約200mg/l（ミリグラム／リットル） (1.5から2 μM（マイクロモル））である。
【００１３】
その分子は、Ｎ末端の前活性（preactivation）ペプチド (１位のグルタミン酸（Glu-1）から７７位のリジン（Lys-77）)、５つの部分的に相同するクリングルドメイン、および触媒活性タンパク質分解酵素（catalytically active proteinase）のドメイン（５６２位のバリン（Val-562）から７９１位のアスパラギン（Asn-791）; Collen, 1999 (1))に相当する、７つの構造ドメインに分けられる。その触媒トライアド（catalytic triad）の構造モチーフは、６０３位のヒスチジン（His-603）、６４６位のアスパラギン酸（Asp-646）、および７４１位のセリン（Ser-741）のアミノ酸で構成される全てのセリンプロテアーゼについて共通である。クリングルドメイン１は、プラスミノーゲンがフィブリンに結合するための認識配列(Petersenら, 1990 (3)) 、および、種々の細胞表面受容体として機能する。
【００１４】
翻訳後修飾の間、ともにクリングルドメイン３に位置する２つの必須のグリコシル化（glycosylation）部位である２８９位のアスパラギン（Asn-289）および３４６位のスレオニン（Thr-346）は、プラスミノーゲンの機能(種々のタンパク質分解酵素およびストレプトキナーゼのそれぞれによる活性化能力、受容体結合性質）にとって特に重要である。この修飾を考慮すると、プラスミノーゲンを以下の２つの主要な形態（forms）に区別することができる。
【００１５】
−  プラスミノーゲンＩは、上述のグリコシル化パターンを特徴としている。
【００１６】
−  プラスミノーゲンＩＩは、２８９位のアスパラギン（Asn-289）の修飾がされていない（lacking of the modification）。
【００１７】
その他のグリコシル化部位は、２４８位のセリン（Ser-248）のアミノ酸である。５７８位のセリン（Ser-578）のアミノ酸は、リン酸化フォーム（phosphorylated form）において存在しうる。
【００１８】
上記の活性化は、５６１位のアルギニン（Arg-561）と５６２位のバリン（Val-562）との間のアミノ酸の間のタンパク質切断を介して生体内で起こる。その後、別のタンパク質分解活性化が、ｈＰｇの７８位のリジン（Lys-78-hPg）に対し、７７位のリジン（Lys-77）と７８位のリジン（Lys-78）との間で起こる。一方、上記Ｐｇのグルタミン酸（Glu-Pg）においても直接的に、この結合は最初に加水分解されうる。その活性プラスミン、hPmの７８位のリジン（Lys-78-hPm）は、あらゆる場合にジスルフィド架橋によって結合される。それ故、ｈＰｍ (1/78-561) のＨ鎖（heavy chain）は、基質、例えばフィブリノーゲンおよびフィブリンの相互作用に関与している。Ｃ末端からのＬ鎖（light chain）(562-791)は、触媒活性サブユニットに対応する。
【００１９】
文献によって既知であるのは、 ピキア・パストリス（Pichia pastoris）において、収量（yield）１７mg/lにてプラスミノーゲンのフィブリン結合ドメインの組み換え生産（recombinant production）に利用された方法である(Dumanら, Biotechnol Appl Biochem. 28; 39-45, 1998 (4))。このドメイン （クリングル 1-4）のグリコシル化は、その著者によって証明されたようである。その他の引用例は、ヒトプラスミノーゲンのクリングル４および５の２つのドメインの生産について記載している(Guanら, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao, 17, 2001 (5))。その目的は、 内皮細胞（endothelic cells）の増殖を阻害することのできるドメインを特定することであった。
【００２０】
しかしながら、ピキア・パストリスについてのそれら２つの実験グループによって組み換え生産されたプラスミノーゲンドメインは、その生理機能性のために決定的に重要な触媒ドメインを有してはいない。
【００２１】
Gonzalez-Gronowら (Biochimica et Biophysica Acta, 1039, 1990 (6))は、大腸菌（Escherichia coli）およびＣＯＳ細胞（COS-cells）、サルの腎臓細胞株のそれぞれにおける、組み換えヒトプラスミノーゲンの発現を比較した。E.coliによる微生物生産は失敗しており、その著者によれば、不十分なクリコシル化が原因である。ペプチド鎖の生産は成功したが、ある形態（form）においては活性化することができなかった。すなわち、活性化因子 （ウロキナーゼおよびt-PA）による処理によって、活性プラスミンを生じなかった。
【００２２】
タンパク質においては、結果としてグルコシル化は起こっていない。このことは、活性化能力（検出できない酵素活性）と内皮細胞認識とに関する重要な生理機能を欠いていることになる(Gonzalez-Gronowら, Biochimica et Biophysica Acta, 1039, 1990 (6))。さらに、糖（carbohydrates）の翻訳後修飾は、哺乳動物の血液におけるその半減期に顕著な影響を及ぼす。
【００２３】
その著者は、ＣＯＳ細胞において機能的なプラスミノーゲンを生産したようである。一方、他の著者は、昆虫細胞において、その機能的な発現を記述している(Whitefleet-Smithら, Arch. Biochem. Biophys., 271, 1989 (7))。しかしながら、哺乳動物細胞および昆虫細胞の利用は時間がかかり、かつ、コストのかかる培養条件や、達成可能であるのが少ないタンパク質量である点が短所である。さらに、哺乳動物細胞は、細胞内発現および細胞質（cytoplasm）におけるタンパク質分解酵素のために、多量の酵素前駆体を生産するには適当ではない(NilsenおよびCastellino, Protein Expression and Purification, 16, 1999 (8) およびBusbyら, J. Biol. Chem., 266,1991 (9))。一般的に、バキュロウイルス/鱗翅目（lepidopteran）（昆虫細胞）系においては、発現の収量は単独で3から10 mg/mlの範囲である。
【００２４】
国際公開番号WO0250290（特許文献１）には、酵母における機能的なミニ−（mini-）およびマイクロ−（micro-）プラスミノーゲンの組み換え生産が開示された。その国際公開の著者は、宿主生物ピキア・パストリスにおいて、クリングルドメインを含む（ミニ−プラスミノーゲン）または含まない（マイクロ−プラスミノーゲン）ヒトプラスミノーゲンの触媒ドメインの遺伝子を発現させた。そのような組み換え生産されたミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲンのそれぞれは、続いて精製され、それぞれミニ−およびマイクロ−プラスミンに処理され、その活性が動物実験によって実証された。組み換えタンパク質について主張された収量は、ミニ−プラスミノーゲンについて100 mg/l、マイクロ−プラスミノーゲンについて3 mg/lである。しかしながら、タンパク質が大きくなればなるほど、その組み換え生産はより困難になる。このことは、国際公開番号WO0250290の記載によって確認されており、それによるとミニ−プラスミノーゲンに対するマイクロ−プラスミノーゲンの収量は、明らかに１０の２乗（two decimal powers）程度減少している。リジン−（Lys-）またはグルタミン酸−（Glu-）プラスミノーゲンのような長いプラスミノーゲンのバリアント（variants）の発現に関する実施形態の例は示されていなかった。
【００２５】
当業者が実行することが可能な、微生物における機能的なプラスミノーゲンの組み換え生産は未だ開示されていない。
【００２６】
【特許文献１】国際公開第０２／５０２９０号パンフレット。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
以上より、本発明の目的は、安価な方法にて機能的なヒトプラスミノーゲンを生産し、これを触媒的に活性のある（catalytically active）プラスミンに処理することである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
この目的は、請求項１による、微生物を利用したプラスミノーゲンの生産のための組み換え生産方法によって解決される。さらなる解決方法は、非従属請求項において言及される。従属請求項は、好適な実施形態を反映したものである。
【００２９】
驚くべきことに、機能的な、グルタミン酸−（Glu-）またはリジン−（Lys-）プラスミノーゲンの組み換え微生物による生産が、微生物内で可能であることが発見された。さらに、予測できないほどの大量の状態で、マイクロ−、ミニ−、リジン−（Lys-）およびグルタミン酸−（Glu-）プラスミノーゲンの組み換え生産が可能であることが発見された。
【００３０】
本発明の対象は、発現ベクター中のプラスミノーゲン遺伝子のクローニング、好ましくはマイクロ−およびミニ−プラスミノーゲン遺伝子、より好ましくはグルタミン酸−またはリジン−プラスミノーゲン遺伝子、またはそれらの機能的なバリアント（変種）、および、機能的なプラスミノーゲンの組み換え生産、好ましくは分子遺伝学的な方法を用いた機能的なヒトプラスミノーゲンの組み換え生産である。さらに、本発明は、プラスミノーゲンからプラスミンへの活性化を触媒するタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の同定について述べる。本発明によって生産されるプラスミノーゲンおよびプラスミンのそれぞれは、動物タンパクやウイルスのようなコンタミネーションがない。そのようなコンタミネーションは、ヒト、ウシ、その他の哺乳動物からの単離において通常起こるものであり、患者に対して副作用を及ぼす可能性がある。
【００３１】
本発明は、少なくとも以下のステップを含む組み換え生産の方法によって特徴付けられる。ａ）少なくとも、プラスミノーゲンペプチドの機能的部分をコードする核酸配列を、少なくとも一つのシグナルペプチドをコードする核酸配列に融合する。その機能的なプラスミノーゲンペプチドをコードする核酸配列と、少なくともそのシグナルペプチドをコードする核酸配列とは、そのシグナルペプチドの切断のためのタンパク質分解酵素の切断点（cut points）のためのコドンと併せて結合される。治療用のタンパク質の生産は、組み換え生産系によって加速的に実行される。コストの要素のために、微生物中、特に、細菌の生体内において組み換え生産を行うことは実行することは労力を要する。これらの系は、比較的安価な生産のうえ、タンパク質収量は、上記g/l範囲で達成可能であり、組み換えタンパク質は、ウイルスまたは患者にとって有害となりうるプリオンのようなタンパク質の混入がない、という利点に関連している。細菌生産系（bacterial production systems）は、たいてい、正確に折り畳まれたタンパク質を生産することができないため、その生産は、誤って折り畳まれたタンパク質のインビトロ（in vitro）での折り返し（back folding）に加えて、しばしば、例えば酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞のような真核生物の系において行われる。その真核生物の生産株および生産細胞株は、グリコシル化タンパク質がそれらによって生産されうるという利点を備える。特に、それは、組み換えタンパク質生産が非常にコストを要し、その収量がしばしば非常に低い昆虫細胞または哺乳動物細胞に対して適用される。さらに、そのような生産は、ウイルスおよびヒトに有害なタンパク質の混入の可能性があるという欠点も有している。このことは、真核生物の微生物を利用する場合には起こらない。真核生物の微生物の培養のための実験器具は、細菌生物のものと同様であり、哺乳動物ウイルスおよびタンパク質の混入はなく、g/l範囲でのタンパク質の収量も可能である。特に好適なのは、酵母から分岐（branch）した真核の宿主生物、好ましくは子嚢菌（Ascomycota）とされるものである。より好ましくは、サッカロミセスの亜門（Saccharomycotina）、特に、サッカロミセス（Saccharomycetes）の綱 （class）、ここでは、他のサッカロミセス目（Saccharomycetales）とされるものである。特に好適な実施形態によれば、宿主生物は、さらに、サッカロミセス科（Saccharomycetaceae）の科（family）とされるものであり、ここでは、特にピキア（Pichia）属とされるものである。本発明において利用される好適な真核の微生物は、典型的なパン酵母（baker’s yeast）サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）であり、その他の例は、カンジダ（Candida）、メタン資化の酵母（methanotrophic yeasts）ピキア・パストリス、ピキア・ メタノリカ（Pichia methanolica）、およびハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、または 、例えばクロカビ（Aspergillus niger）、コウジカビ（Aspergillus oryzae）、および偽巣性コウジ菌（Aspergillus nidulans）のようなアスペルギルス属（genus Aspergillus）の糸状菌（filamentous fungi）である。特に好適なのは、ピキア・パストリスである。
【００３２】
その組み換え生産方法は、さらに、少なくともプラスミノーゲンの機能的部分をコードする核酸分子が、その微生物のための発現ベクターに組み込まれ、好ましくはヒトプラスミノーゲンをコードする核酸分子が、好ましくは小胞体（endoplasmatic reticulum）への輸送のために、少なくとも一つのシグナルペプチド、好ましくはプレプロペプチド（prepropeptide）をコードする核酸分子と融合しており、シグナル配列または宿主生物中のプレプロペプチドの切断のためのタンパク質分解酵素の切断点のためのコドンが、それら２つの核酸分子の間に挿入されていること、によって特徴づけられる。好適に用いられるのは、ヒトプラスミノーゲンをコードする核酸分子である。ヒトプラスミノーゲンをコードする核酸分子に加えて、他の哺乳動物由来のプラスミノーゲンをコードする核酸分子を用いることも可能である。このことは、それら各哺乳動物のプラスミノーゲンの生産を提供することになる。さらに、本発明方法により、過剰発現によって組み換えヒトプラスミノーゲンが形成される。また必要に応じて、その組み換えヒトプラスミノーゲンは、遠心分離、ろ過、または遠心沈降（sedimentation）によって宿主細胞から分離されうる培養液に分泌されるようにすることができる。また、その組み換えヒトプラスミノーゲンは、当業者に既知の方法によって実行可能な複雑な細胞破壊プロセスを行うことなく、タンパク質精製の対象とすることが可能である。プラスミノーゲンからプラスミンへの活性化は、プラスミノーゲンから触媒活性プラスミンへの変換を可能とするタンパク質分解酵素によって解決される。
【００３３】
本発明との関連で用いられる用語は、以下のように定義される。
【００３４】
「組み換え生産方法」によれば、適切な宿主生物から、核酸配列、好ましくはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）配列からペプチドまたはタンパク質が発現される。そして、その核酸配列は、個別の核酸配列部分のクローニングおよび融合によって形成されている。
【００３５】
「クローニング」は、ここでは、先端技術に関連する全ての既知のクローニング方法を当然含むべきであるが、それらは当業者に自明の手段に属するものであるから詳細には記載されないであろう。
【００３６】
「適切な発現系における発現」は、ここでは、先端技術に関連する全ての既知の発現方法、特に、本願請求の範囲において言及されるものを当然含むべきである。
【００３７】
「機能的なプラスミノーゲン−ペプチド部分」においては、そのプラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン−ペプチドの部分は、プラスミノーゲンと生物学的に関連のある機能を実行することができるものと理解されるべきである。これらの生物学的に関連のある機能は、少なくとも、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、吸血コウモリ（vampire-bat）のプラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ペスト菌（Yersinia pestis）等由来のPla-タンパク質のようなプラスミノーゲン活性化因子によって、プラスミンに活性化する能力であり、そのタンパク質分解活性は、フィブリンの加水分解によって特徴付けられる。明細書および実験例で用いられている「プラスミノーゲン活性化因子」という文言は、タンパク質分解、および非タンパク質分解のプラスミノーゲン活性化因子について言及されるものとすべきである。
【００３８】
追加として、グルタミン酸−（Glu-）プラスミノーゲンの場合、そのプラスミンによって触媒された前活性ペプチドの切断によって、リジン−（Lys-）プラスミノーゲンに変換する能力（processing ability）であると理解されるべきである。
【００３９】
フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、４型コラーゲン、およびその他の基質に結合した後の、力価１０００（factor 1000）に至るまでのプラスミノーゲンの活性化能力の向上は、さらに、その生物学的機能とみなされるものである。
【００４０】
プラスミノーゲンの処理の後に認められるはずの、プラスミンの生物学的に関連する機能には、ラミニンの分解、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの分解、プロコラーゲン分解酵素（procollagenases）の活性化、プロマトリックス（promatrix）メタロプロテアーゼの活性化、潜在的な（latent）マクロファージエラスターゼの活性化、プロホルモン（prohormones）の活性化、および、例えばTGFβ-1 (潜在的な形質転換増殖因子)、VEGF (血管内皮増殖因子)、またはbFGF (塩基性線維芽細胞成長因子) のような増殖因子の活性化があると理解されるべきである。
【００４１】
その他の生物学的機能は、例えばα2-抗プラスミンおよびα2-マクログロブリンのようなプラスミン阻害剤による阻害能力である。
【００４２】
その生物学的に関連する機能とみなされるものは、さらに、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および４型コラーゲンへの結合、例えばα-エノラーゼ、アネキシンＩＩ、またはアンフォテリン（amphoterin）のような受容体への結合がある。
【００４３】
第一に、プラスミノーゲンは、不活性のグルタミン酸−（Glu-）プラスミノーゲンとして形成される。このグルタミン酸−プラスミノーゲンは、いわゆる前活性ペプチドの切断を経て、プラスミンによってリジン−（Lys-）プラスミノーゲンに変換されうる。それら両方は、タンパク質分解切断を経て、組織プラスミノーゲン活性化因子(この場合には、上述のタンパク質分解活性化因子のみによる)によってプラスミンに変換される。そのプラスミンは、スルフィド架橋を介して連結されたサブユニットからなる。その小さいサブユニットは、タンパク質分解ドメインとリン酸化部位とを有しており、その大きいサブユニットは、３つのグリコシル化を担っており、そして、フィブリンへの結合に関与している。そのグリコシル化は、後の、血漿（plasma）におけるその安定性のために重要である。ストレプトキナーゼまたはスタフィロキナーゼを備えた１：１の複合体の形成を経て、プラスミノーゲンは、追加的に、タンパク質分解活性酵素に変換されうる。そのタンパク質分解活性酵素は、プラスミノーゲンをプラスミンに処理（processing）することができる。
【００４４】
したがって、機能的なプラスミノーゲンは、プラスミノーゲン活性化因子によってタンパク質分解的に活性のプラスミンに処理されうるプラスミノーゲンである。機能的なプラスミノーゲンは、後に、好ましくはフィブリン結合ドメインを含み、好ましくは、少なくとも３つのグリコシル化の一つを含むことができる。
【００４５】
機能的なプラスミノーゲンの最小の形態は、マイクロ−およびミニ−プラスミノーゲン、リジン−プラスミノーゲンの大きい形態である。前活性ペプチドを含んだままのグルタミン酸−プラスミノーゲンもまた、機能的なプラスミノーゲンである。しかしながら、特に長いほうの鎖中の領域を、上述の機能性（特に、タンパク質分解、フィブリン結合）を著しく妨げることなく除外できることは想定可能である。
【００４６】
機能的な触媒ドメインを有する、プラスミノーゲンの種々の形態（以下、プラスミノーゲンの派生物（derivatives）とする）を生産することは、当業者にとって自明である。機能に関して、上述したように、 そのプラスミノーゲンのバリアント（variant）は、例えばストレプトキナーゼまたはウロキナーゼのようなプラスミノーゲン活性化因子による活性化後、タンパク質分解活性の特徴を有する。
【００４７】
−  その触媒ドメインは、欠失およびアミノ酸置換を含んでもよく、または、他のアミノ酸またはペプチドまたはタンパク質と融合していてもよい。
【００４８】
−  その大きいドメインは、プラスミノーゲン活性化因子によって活性プラスミンに活性化されうる、２０位のグルタミン酸（Glu20）から５８０位のアルギニン（Arg580）まで（プレ−プラスミノーゲンの配列による）の全ての中間体（intermediates）を含んでもよい。
【００４９】
詳細な実験例として、リジン−（Lys-）プラスミノーゲンの３つの形態について述べる。
【００５０】
バリアント１：Ｎ末端のアミノ酸：８８位のメチオニン（Met88）
バリアント２：Ｎ末端のアミノ酸：９７位のリジン（Lys97）
バリアント３：Ｎ末端のアミノ酸：９８位のバリン（Val98）
プラスミノーゲン派生物は、好ましくはマイクロ−、ミニ−、リジン−またはグルタミン酸−プラスミノーゲンに対して１から５０アミノ酸短いかまたは長く、あるいは、好ましくは１から１０のアミノ酸置換を特徴としており、これらの派生物はさらにプラスミノーゲン活性化因子によって活性化されるという特性を示す。典型的なマイクロ−、ミニ−、リジン−、またはグルタミン酸−プラスミノーゲン、およびそれらに対応するプラスミノーゲン派生物の間では、８０％以上、好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％、さらに特に好ましくは９９％以上の配列相同性（シークエンスマッチ）がある。
【００５１】
好ましくは、そのプラスミノーゲン派生物は、以下のような特徴を有している：
−  その触媒ドメインは、少なくとも１の欠失、および／または少なくとも１アミノ酸の置換、および／または少なくとも他のアミノ酸または少なくとも他のペプチドまたは少なくとも他のタンパク質との融合を含んでもよい。
【００５２】
−  その大きいドメインは、プラスミノーゲン活性化因子によって活性プラスミンに活性化されうる、２０位のグルタミン酸（Glu20）から５８０位のアルギニン（Arg580）まで（プレ−プラスミノーゲンの配列による）の全ての中間体（intermediates）を含んでもよい。
【００５３】
−  プラスミノーゲン派生物は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、さらに特に好ましくは９９％のアミノ酸配列ホモロジー（マッチ）を特徴としている。
【００５４】
「微生物」、そのような全ての生命体は、微少なサイズであることのみを特徴とする。したがって、真核生物および原核生物の微生物が含まれるべきである。特に、細菌、酵母、菌類（fungi）、およびウイルスについて言及される。
【００５５】
「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、両方の全ての考え得る形状、例えば二重鎖核酸の形態、一本鎖核酸の形態、それらの組み合わせ、および、線状または環状核酸を含む。
【００５６】
「シグナル配列」は、例えば小胞体への運搬のように、他のペプチド配列を膜中へ運搬または膜を横切って運搬させることを認めることのできる、ペプチド配列であると理解される。したがって、例示的な（exemplary）プレプロペプチド、プレペプチド、またはプロペプチドが考慮されうる。
【００５７】
「切断点」の点は、シグナル配列、プレプロペプチド、または他のペプチド配列由来のプロペプチド、または宿主生体の２つの部分中のペプチド配列の一般的な切断のために与えられるペプチド配列中において示される。
【００５８】
「少なくとも一のシグナルペプチドまたはプレプロペプチドをコードする核酸」は、他のポリペプチドの膜への移入（transfection）、例えば小胞体への移入のために与えられる、ペプチドまたはタンパク質構造をコードする核酸配列である。
【００５９】
「プライマー」として、開始（starter）オリゴヌクレオチドが示される。ここでは、一本鎖核酸分子のある領域に相補的な、短鎖、一本鎖オリゴリボ−、またはデオキシリボ核酸（desoxyribonucleotides）を意味しており、それとハイブリダイズして二重鎖になりうる。この二重鎖における自由な３’−水酸基末端は、ＤＮＡポリメラーゼのための基質として機能し、二重鎖中のその全体的な一本鎖の重合反応のための開始点として機能する。そのプライマーは、特にＰＣＲ、すなわち、当業者に既知のポリメラーゼ連鎖反応において利用される。
【００６０】
「プラスミド」として、核酸分子が示される。プラスミドは、染色体に組み込まれておらず、多くの原核生物、および、約２ｋｂから２００ｋｂ以上の長さのいくらかの真核生物の微生物においてみられる。
【００６１】
「ライゲーション」は、一つのリガーゼにより、またはセルフ−ライゲーション、すなわち、直鎖ＤＮＡ分子の２つの一本鎖末端が、それらの末端が互いに塩基対を形成しうることによって二量体化することにより、２つの核酸分子の末端が連結することを意味する文言である。
【００６２】
「制限酵素」は、ＤＮＡ分子の両方の鎖において特定の塩基配列のリン酸ジエステル結合を切断する、細菌酵素の種類を意味する文言である。
【００６３】
「エレクトロポレーション」は、核酸を細胞に導入する方法である。それに関して、懸濁液中に位置し、指数関数的に増殖する受けて側の細胞（receiver cells）の細胞膜は、それらを核酸溶液にさらす（exposing）間に、短時間の高電圧電気パルスによって高分子分子が透過性にされる。
【００６４】
「過剰発現」は、野生型の細胞による生産と比較した場合に、ある細胞による機能的プラスミノーゲンの増大した生産であると理解される。通常、発現した外来（alien）遺伝子量が、細胞内生産の場合に宿主細胞の全細胞たんぱく質の約１−４０％である場合に、過剰発現について述べている。 
「発現ベクター」は、そのベクター中にクローン化された外来遺伝子の転写、および、適切な宿主細胞に組み込まれた後に、形成されたｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の翻訳を可能にするようなベクターであると理解される。発現ベクターは、通常、原核生物または真核生物の細胞中の遺伝子の発現のために必要なコントロールシグナル（control signals）を含んでいる。
【００６５】
本発明においては、ＡＯＸ１−プロモーターのような、好ましくはメタノールによって誘導可能な（inducible）プロモーター、または、ＹＰＴ１−プロモーターのような、特に好ましい恒常的な（constitutive）プロモーター、またはＧＡＰ−プロモーターが、ピキア・パストリスのような酵母における遺伝子発現を制御するために利用される。特に好適なのは、恒常的なＧＡＰ−プロモーターである。
【００６６】
「AOX1」は、ピキア・パストリス由来のアルコールオキシダーゼ１の遺伝子である。；
「GAP」は、ピキア・パストリス由来のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子である。；そして、
「YPT1」は、ピキア・パストリス由来のＧＴＰ−結合たんぱく質の遺伝子である。
【００６７】
遺伝子PHO-1、SUC-2、PHA-E、またはα−ＭＦによってコードされるタンパク質のシグナルペプチドは、酵母における分泌生産に頻繁に用いられる。
【００６８】
「PHO1」は、ピキア・パストリス由来の酸性フォスファターゼの遺伝子である。；
「SUC-2」は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来の分泌性のインベルターゼである。；
「PHA-E」は、インゲンマメアグルティニス（Phaseolus vulgaris Agglutinis）由来の酸性フォスファターゼの遺伝子である。；そして、
「α−ＭＦ（alpha-MF）」は、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のα−交配因子（alpha-mating factors）の遺伝子である。
【００６９】
特に好適なのは、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の切断点のためのコドン、および、プロテアーゼKex2またはプロテアーゼSte13のための、そのプロペプチドの切断用の切断点のためのコドンである。特に好適なのは、上述の、Kex2切断点および追加的に２つのSte13切断点をコードする、ステップａ）において上述のコドンにて起こる結合（connection）である。本発明の好適な実施形態では、そのシグナルペプチドまたはプレプロペプチドをコードする核酸分子は、酵母、特にサッカロマイセス・セレヴィシエ由来である。より好適な実施形態は、そのシグナルペプチドまたはプレプロペプチドをコードをコードする、つまり酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のシグナルペプチドまたはプレプロペプチドをコードする、核酸分子に関するものである。上述のステップａ）にて形成された融合産物は、好ましくはＰＣＲによって増幅され、さらに好ましくは続いて精製される。
【００７０】
国際公開番号WO02/50290には、誘導ＡＯＸ１−プロモーターおよび酵母のα因子のプレプロペプチドを含む酵母に適切な発現ベクターｐＰＩＣＺαＡととともに、ミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲンの組み換え生産が記載されている。これらの小さいプラスミノーゲンのバリアントは、クリングルドメインを全く含まない（例えばマイクロ−プラスミノーゲンなど）か、あるいは、少なくとも一つのクリングルドメインを有する（例えばミニ−プラスミノーゲン）かのいずれかである。その発現ベクターpPICZαA は、プロテアーゼKex2およびSte13のための切断点を含む。しかしながら、そのSte13の切断点は、クローニング化された、対応するミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲンの発現ベクターにおいて欠失されていた。
【００７１】
一連のプロモーターは、酵母における誘導発現系として知られている。ここでは、特に、AOX1-プロモーター、AOX2、CUP1 (Koller A, Valesco J, Subramani S.,Yeast 2000: 16(7), 651-6)、PHO1（欧州特許番号EP0495208）、HIS4 （米国特許番号US4885242）、FLD1（Shenら, Gene 1998: 216(1), 93-10）、およびXYL1-プロモーター（Den HaanおよびVan Zyl, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001: 57(4), 521-7）が説明される。
【００７２】
メタノール誘導AOX1-プロモーターの手段によって、異種タンパク質（heterologous protein）生産が選択的に指示されるようにすることができ、均質な生体試料（homogeneous biomass）を得ることができる。外来タンパク質の発現が誘導される前に、その宿主生体は、外来タンパク質の発現において起こる可能性のある選択（selection）の不利益なしで、高い増殖密度（growth density）に到達することができる。
【００７３】
国際公開番号WO02/50290における、AOX1−プロモーターの制御下で発現されるそれらの小さいバリアントとは反対に、本発明において組み換え生産されるグルタミン酸−およびリジン−プラスミノーゲンは、全ての５つのクリングルドメインを有しており、以下のような理由により、それらの組み換え生産は困難である。：
−  外来タンパク質の発現における、宿主生体の増殖の不利益を原因とした、発現カセットの減少（loss）の可能性；
−  発現したタンパク質のタンパク質分解（proteolytic degradation）、および、
−  低収量。
【００７４】
グルタミン酸−またはリジン−プラスミノーゲンの生産は、上述した不利益のために、国際公開番号WO02/50290には記載されていない。
【００７５】
本発明では、これらの困難性は、特に、シグナルペプチド、Kex2、および少なくとも一つのSte13、好ましくは２つのSte13プロテアーゼ切断点を含む、組み換えタンパク質によって解決される。後述する好適な実施形態では、他の炭素源として、０．１から１０ｍｌ／ｈの間、好ましくは０．５から５ｍｌ／ｈの間、より好ましくは０．８から１．５ｍｌ／ｈの間によってグリセロールの供給（feed）を行った。その培養液は、ｐＨ７．０の中性にて緩衝化した。十分な酸素の供給がされるように留意した。
【００７６】
好適な実施形態においては、組み換え核酸のAOX1遺伝子の５’部位への結合だけではなく、ピキア・パストリス由来のグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の５’部位への連結についての組み込み（integrate）に留意した。これについて、誘導性があるだけではなく、恒常的なプロモーターを用いた。酵母において活性があり、利用可能な恒常的なプロモーターは、GAP-プロモーター、YPT1-プロモーター(Searsら, Yeast 1998: 14(8), 783-90)、TKL-プロモーター (Den HaanおよびVan Zyl, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001: 57(4), 521-7)、ACT-プロモーター(Kangら,  Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001: 55(6), 734-41)、およびPMA1-プロモーター(Yeast 2000 : 16(13), 1191-203)である。好適なプロモーターは、GAP-プロモーターおよびYPT1-プロモーターである。特に好適なプロモーターは、GAP-プロモーターである。
【００７７】
誘導プロモーターに対して、恒常的なプロモーターは、増殖期全体にわたって、発現されるべき外来タンパク質が恒常的に生産されるという不利益を有している。このことを通じて、特に増殖の低下を示すという、宿主細胞にとっての不利益が起こる。その優勢な選択の圧力を原因として、組み換えた発現カセットを減少した宿主細胞は、利点を有しており、その組み換え宿主細胞を過剰増殖（overgrow）させることができる。これにより、避けるべき均質な混合集団が生じうる。しかしながら、驚くべきことに、その恒常的なGAP−プロモーターは、本発明の好適な実施形態によって高い収量をもたらすことが発見された。
【００７８】
そのAOX1プロモーターを用いたときには、少なくとも１７Ｕ（ユニット）／ｌ（約１．５ｍｇ／ｌに対応）、より好ましくは１２０Ｕ／ｌ（約１１ｍｇ／ｌに対応）、より好ましくは１８０Ｕ／ｌ（約１６ｍｇ／ｌに対応）、さらにより好ましくは２００Ｕ／ｌ（約１８ｍｇ／ｌに対応）、より好ましくは２２０Ｕ／ｌ（約２０ｍｇ／ｌに対応）、さらにより好ましくは２４０Ｕ／ｌ（約２２ｍｇ／ｌに対応）、特に好ましくは２６０Ｕ／ｌ（約２４ｍｇ／ｌに対応）、およびさらに特に好ましくは２８０Ｕ／ｌ（約２５．５ｍｇ／ｌに対応）による誘導の１２０時間後にリジン−プラスミノーゲンの収量を得た。その収量は、恒常的なプロモーター、特にGAP−プロモーターを利用したときに著しく高かった。
【００７９】
好適な実施形態においては、恒常的なプロモーター、例えば、GAP−プロモーターは、少なくともプラスミノーゲン配列の機能的部分をコードする核酸に対して操作可能に結合し、そして、少なくとも１つのシグナルペプチドをコードする核酸配列と融合しており、その機能的なプラスミノーゲンをコードする核酸配列と、少なくともそのシグナルペプチドをコードする核酸配列とは、そのシグナルペプチドの切断のために与えられるタンパク質分解酵素の切断点のためのコドンと併せて結合されている。
【００８０】
少なくとも、シグナルペプチドの切断のために与えられるタンパク質分解酵素の切断点のためのコドンと結合されたシグナルペプチドをコードする核酸配列と一緒に融合している。
【００８１】
特に好適な実施形態では、恒常的なプロモーター、例えばGAP−プロモーターは、酵母由来のシグナルペプチドの核酸配列と一緒に融合されている、マイクロ−、ミニ−、リジン−、またはグルタミン酸−プラスミノーゲンの核酸配列に対して操作可能に結合している。
【００８２】
この点について、本発明の好適な実施形態におけるその恒常的なGAP−プロモーターは、驚くべきことに、約１０倍高い（実験例７ｃ、リジン−プラスミンの生産、１３７５Ｕ／ｌ、変換した結果では１２５ｍｇ／ｌ、を参照）収量を得ることがわかった。その他の好適な実施形態では、他の炭素源として、０．１から１０ｍｌ／ｈの間、好ましくは０．５から５ｍｌ／ｈの間、より好ましくは０．８から１．５ｍｌ／ｈの間によってグリセロールの供給を行った。その培養液は、ｐＨ７．０の中性にて緩衝化した。その結果、その増殖率μ（マイクロ）［１／ｈ］は、０．００２から０．１０の間、好ましくは０．００４から０．０２０の間、より好ましくは０．００８から０．０１０の間の値に到達する。
【００８３】
そのＧＡＰ−プロモーターリジンープラスミノーゲンを用いた場合、少なくとも、660 U/l (60 mg/l)、好ましくは1000 U/l (約91 mg/l)、好ましくは1500 U/l (約136 mg/l)、より好ましくは2000 U/l (約182 mg/ml)、特に好ましくは2500 U/l (約227 mg/l)、さらに特に好ましくは2750 U/l (約250 mg/l)による、２５０時間の発酵期間（fermentation period）の後に収量を得た。
【００８４】
ミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲンの組み換え生産においては、結果的に高い収量が得られた。ミニ−プラスミノーゲンの場合の収量は、１００ｍｇから２ｇ／ｌの間、好ましくは３００ｍｇ／ｌから１．５ｇ／ｌの間、さらに好ましくは４００ｍｇ／ｌから１ｇ／ｌの間、さらにより好ましくは５００ｍｇ／から８００ｍｇ／ｌ、および、特に好ましくは６００から７００ｍｇ／ｌの間である。マイクロ−プラスミノーゲンの収量は、さらに、上記ミニ−プラスミノーゲンのものよりも少なくとも１０％上回る。リジン−プラスミノーゲンと比較して、グルタミン酸−プラスミノーゲンの組み換え生産ではわずかに劣った収量が得られた。
【００８５】
本発明にかかる方法は、ミニ−、マイクロ−、リジン−、およびグルタミン酸−プラスミノーゲンの生産に適している。したがって、好適な実施形態は、ミニ−、マイクロ−、リジン−、およびグルタミン酸−プラスミノーゲンの組み換え生産を主に対象とする。それらは、恒常的なプロモーター、例えばＧＡＰ−プロモーターを含む発現ベクターにおいて、シグナルまたはプレプロ配列に対して結合する。より好適な実施形態では、そのシグナル配列は、シグナルペプチド、または酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドからなる。特に好適な実施形態では、恒常的なプロモーター、例えばGAP−プロモーターは、配列番号７、または配列番号９、または配列番号１３または１５のいずれか、または配列番号５０から５９の中のいずれかの配列の核酸に対して操作可能に結合し、適切な発現ベクターにおいて発現する。
【００８６】
さらに好適な実施形態では、恒常的なプロモーター、例えばGAP−プロモーターは、少なくとも、プラスミノーゲン配列の機能的部分をコードする核酸配列に対して操作可能に結合する。特に好適な実施形態では、恒常的なプロモーター、例えばＧＡＰ−プロモーターは、配列番号１３、１５、７および９、あるいは、配列番号５０から５９の中のいずれか、または配列番号１１の配列の核酸に対して操作可能に結合し、適切な発現ベクターにおいて発現する。
【００８７】
−  グルタミン酸−プラスミノーゲン
(データは、プログラムEditSeq（登録商標） (DNASTAR)によって算出された。)
・分子量: 88431.67 ダルトン
・791アミノ酸
・ｐＨ７．０での7.121等電点: 1.351
・グリコシル化部位: ２６８位のＯ（O-268）、３０８位のＮ（N-308）、３６５位のＯ（O-365）
番号は、８１０アミノ酸からなるプレ−プラスミノーゲンに関する。
【００８８】
−  リジン−プラスミノーゲン
(データは、プログラムEditSeq（登録商標） (DNASTAR)によって算出された。)
・分子量: 79655.71 ダルトン
・741 アミノ酸
・ｐＨ７．０での7.492 等電点: 5.287
・グリコシル化部位:２６８位のＯ（O-268）、３０８位のＮ（N-308）、３６５位のＯ（O-365）
番号は、８１０アミノ酸からなるプレ−プラスミノーゲンに関する。
【００８９】
−  ミニ−プラスミノーゲン
(データは、プログラムEditSeq（登録商標） (DNASTAR)によって算出された。)
・分子量: 38169.63 ダルトン
・348 アミノ酸
・ｐＨ７．０での7.203 等電点: 0.893
・グリコシル化部位:無効（not any）
−  マイクロ−プラスミノーゲン
(データは、プログラムEditSeq（登録商標） (DNASTAR)によって算出された。)
・分子量: 27230.41 ダルトン
・249 アミノ酸
・pH 7.0での7.934等電点: 3.733
・グリコシル化部位:無効（not any）
【発明を実施するための最良の形態】
【００９０】
本発明にかかる方法について、以下に詳細を記述する。
【００９１】
本発明のステップａ）において生成される融合産物は、さらに、微生物に適切な発現ベクターにおいて実行されうる。この発現ベクターは、好ましくは、 pPICZαA、BおよびC、pPICZ A、BおよびC、pGAPZαA、BおよびC、pGAPZA、BおよびC、pPIC6αA、BおよびＣ、pPIC6A、BおよびC、pAO815、pPIC3.5K、およびpPIC9Kからなる群より選ばれる。その発現ベクターへの導入は、好ましくはライゲーションによって行われる。そのＰＣＲ産物および発現ベクターは、好ましくは、それらをＴ４  ＤＮＡリガーゼによって連結する前に、制限酵素KspＩおよびXhoＩによって切断される。その連結された核酸は、エレクトロポレーションによって、微生物、好ましくはE.coliに形質転換されることができ、そのＤＮＡは、そのような方法で得られた形質転換株から単離され、好ましくはXhoＩまたはSfuＩ、およびKspＩによる内ヌクレオチド切断的な（endonucleolytic）切断によって分離されうる。そのような方法で得られた核酸は、好ましくは、pMHS476.1、pSM54.2、pSM49.8、pSM82.1、およびpSM58.1、pAC37.1、pJW9.1、pPLG1.1、pPLG2.1、pPLG3.2、pPLG4.2、pPLG5.3、pPLG6.1、pPLG7.1、pPLG8.3、pPLG9.1、pPLG10.1、pPLG11.2、pPLG12.1、pPLG13.1、pPLG14.2、pPLG15.1、pPLG16.3、pPLG17.2、pPLG18.1、pPLG19.2およびpPLG20.1からなる群から選ばれたプラスミドとなりうる。上述の増幅のためのプライマーとして、好ましくは、N034 (配列番号1)、N036 (配列番号2)、N036a (配列番号19)、N036b (配列番号20)、N036c (配列番号21)、N036d (配列番号22)、N036e (配列番号23)、N036f (配列番号24)、N036g (配列番号25)、N036h (配列番号26)、N036i (配列番号27)、N036j (配列番号28)、N057 (配列番号3)、N037 (配列番号4)、N035 (配列番号5)、およびN056 (配列番号6)からなる群より選ばれた２つのオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。
【００９２】
本発明について、以下の実施形態が特に好適である。：
−  配列番号７または１３で表される核酸配列を特徴とするプロテアーゼKex2およびプラスミノーゲン融合遺伝子の切断点をコードするコドン。
【００９３】
−  配列番号８または１４で表されるアミノ配列を特徴とするプロテアーゼKex2およびプラスミノーゲン融合タンパク質の切断点をコードするコドン。
【００９４】
−  配列番号９または１５で表される核酸配列を特徴とする、プロテアーゼKex2、およびプロテアーゼSte13、およびプラスミノーゲン融合遺伝子の切断点をコードするコドン。
【００９５】
−  配列番号１０または１６で表されるアミノ酸配列を特徴とする、プロテアーゼKex2、およびプロテアーゼSte13、およびプラスミノーゲン融合タンパク質をコードするコドン。
【００９６】
好ましくは、上述の群から選ばれた上述のプラスミドは、微生物宿主に形質転換される。その形質転換は、例えばエレクトロポレーションによって実行されうる。利用される微生物は、好ましくは、菌類から分岐したものとされる（accounted to）真核生物の微生物である。好適な微生物は、子嚢菌、好ましくはサッカロミセスの亜門（Sacchariomycotina）、および、その中から好適なのはサッカロミセス（Saccharomycetes）の綱 （class）、さらに好適なのは、サッカロミセス目（Saccharomycetales）の系列（order）、より好適なのはサッカロミセス科（Saccharomycetaceae）の科（family）、その中から特に好適なのはピキア属、サッカロミセス属、ハンゼヌラ属、およびアスペルギルス属とされるものである。
【００９７】
本発明の特に好適な実施形態によれば、少なくともプラスミノーゲンの機能的な部分をコードする核酸配列は、上述のステップａ）において生産される融合産物を形質転換した微生物宿主の生体から過剰発現され、そして、少なくともプラスミノーゲンの機能的な部分は、好ましくは培養液中に分泌される。その他の好適な実施形態実施形態によれば、プラスミノーゲンの核酸配列の機能的部分は、配列番号60、61、62、63、64、65、または66のうちのいずれかである。その他の好適な実施形態によれば、プラスミノーゲンの核酸配列の機能的部分は、完全なプラスミノーゲン配列に相当する。好ましくは、ヒトの機能的プラスミノーゲンは、本発明にかかる組み換え生産の方法によって生産される。
【００９８】
本発明にかかる組み換え生産方法によって取得されうるプラスミノーゲン、または、そのタンパク質分解酵素の影響の結果得られるプラスミンは、創傷の治療、特に、遅い、または不十分な創傷治癒の治療、血栓症状の治療、または血栓症状の予防のための薬剤の生産に用いることができる。
【００９９】
さらに、本発明によって生産されたプラスミノーゲン、およびそれから得られたプラスミンは、抗凝固性の性質の特徴を有する。これらの有効な性質は、さらに、プラスミノーゲンおよび／またはプラスミンの、心臓発作、血栓症、再狭窄、低酸素症、虚血、凝固壊死、血管の炎症の予防および／または治療のため、および、心臓発作後の治療、バイパス手術後の治療、血管形成後の治療、およびバルーン拡張後の治療のための、抗血栓および抗凝固性の活性薬剤としての利用を可能とする。そのプラスミノーゲンは、また、急性の心臓発作の場合の血栓治療、動静脈シャントの再疎通、および、急性の心臓発作の場合の閉塞した冠動脈の再潅流のために利用することが可能である。本発明によって生産されるプラスミノーゲンのさらなる利用は、急性の肺塞栓症、静脈血栓の新鮮または古い凝固、急性および準急性の動脈血栓、静脈血栓症、急性の四肢（extremities）動脈閉塞、慢性的な閉塞性動脈疾患、動静脈シャントの血栓症、臀部および四肢の深刻な静脈血栓症、閉塞していない（desobliterated）血管領域での初期の血栓、急性の目の中央の血管閉塞、１型（type-I）プラスミノーゲンの欠失（deficiency）の場合の結膜炎、火傷および凍傷、アルカリ火傷または酸火傷、およびショック中（during shock）の播種性血管内凝固症候群の予防および治療を含む。
【０１００】
以上示したプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンの場合は、好ましくは、抗凝固剤（anticoagulant）とともに用いられる。抗凝固剤としては、適切なヘパリン、ヘパリン派生物、またはアセチルサリチル酸がある。
【０１０１】
したがって本発明は、必要な場合には薬学的に許容される基質、添加剤、および／または溶剤と組み合わせられる、本発明の組み換え生産方法によって生産されたプラスミノーゲン、または、それから得られたプラスミンを含む薬剤組成物も、主な対象としている。さらに、その薬剤組成物は、好ましくは抗凝固性の活性薬剤、特に、ヘパリン、ヘパリン派生物、またはアセチルサリチル酸を含むことができる。
【０１０２】
本発明によって生産されたプラスミノーゲン、および／またはそれから得ることのできるプラスミンは、好ましくはその局所的な使用（topic application）に適切な薬剤組成による、創傷の外用治療に利用される。それに関して、プラスミノーゲンおよび／またはプラスミンは、０．０１から５００Ｕ／グラムの薬剤組成、好ましくは０．１から５００Ｕ、より好ましくは０．１から２５０Ｕ、さらにより好ましくは０．５から２５０Ｕ／グラムの濃度によって、および、特に好ましくは、１から１５０Ｕの濃度のプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンの薬剤組成によって用いられる。例えば軟膏、ペースト剤、ゲル等の形態での半固形組成の替わりに、ドレッシング（dressings）のための絆創膏（plasters）またはその他の材料が用いられる場合には、絆創膏および各ドレッシングのための材料の表面につき、２ｃｍ２当たり上述の濃度が考慮されるべきである。
【０１０３】
本発明の薬剤組成物は、既知の方法による適切な投与量での、使用に要求される型にしたがった、一般的な固体または流体の基材、または賦形剤（diluents）、および一般的に用いられる薬剤の補助剤（auxiliary agents）によって生産される。好適な薬剤処方または薬剤組成は、局所的な外用適用（local external application）に適切な薬剤の形態において存在する。そのような薬剤の形態は、例えば、軟膏、ペースト剤、ゲル、塗布剤（coatings）、分散剤（dispersions）、乳濁液（emulsions）、懸濁液、あるいは、例えばリポゾームの形態によるナノ分散系、ナノエマルジョン、または脂質ナノ粒子、テンシデ（tenside）の無い処方、安定化ポリマー、または微粒子が安定したエマルジョン（particulate stabilized emulsions）のような特別な配合である。
【０１０４】
多様な処方の生産方法および多様な適用方法は、当業者に既知であり、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA」に詳細が記載されている。
【０１０５】
非経口使用のために生産される組成は、心臓発作、血栓症、再狭窄、低酸素症、虚血、凝固壊死、血管の炎症、急性の心臓発作の予防および／または治療のため、および、心臓発作後の治療、バイパス手術後の治療、血管形成後の治療、およびバルーン拡張後の治療のための薬剤組成を用いた場合に有効である。
【０１０６】
さらに、その薬剤組成物は、急性の肺塞栓症、急性の心臓発作の場合の血栓治療、静脈血栓の新鮮または古い凝固、急性および準急性の動脈血栓、動静脈シャントの再疎通、静脈血栓症、急性の心臓発作の場合の閉塞した冠動脈の再潅流、急性の四肢（extremities）動脈閉塞、慢性的な閉塞性動脈疾患、動静脈シャントの血栓症、臀部および四肢の深刻な静脈血栓症、閉塞していない（desobliterated）血管領域での初期の血栓、急性の目の中央の血管閉塞、１型（type-I）プラスミノーゲン欠失の場合の結膜炎、火傷、アルカリ火傷または酸火傷、凍傷、およびショック中（during shock）の播種性血管内凝固症候群の場合の利用を含む、多様な全身適用の場合に適切である。
【０１０７】
その他の可能性のある適用は、例えば、結膜炎リグノーサ（conjunctivitis lignosa）または栓友病（thrombophilia）を引き起こす可能性のある、遺伝性または先天性のプラスミノーゲンの欠失（ホモ接合体（homozygote）、１型プラスミノーゲンの欠乏）のようなプラスミノーゲンの欠失の場合がある。例えば、グルタミン酸−、リジン−、ミニ−、およびマイクロ−プラスミノーゲン、およびそれらから由来したバリアントを含む、組み換えプラスミノーゲンの静脈内投与によって、その疾患を治療できる可能性がある(Heinzら, Klin. Monatsblatt Augenheilkunde 2002, 219(3): 156-8)。
【０１０８】
その他の適用の可能性は、偽膜（pseudo membranes）の回復（resolutin）、気道（respiratory passages）の正常化（normalizaion）、および創傷治癒の向上は、プラスミノーゲンの投与によって達成できる可能性がある。この適用は、新生児に対するものとして記載されている(The New England Journal of Medicine 1998, 339, 23, 1679-1686)。
【０１０９】
以上より、その組み換え生産されたプラスミノーゲンは、場合によっては、それから得られるプラスミンとともに、あるいは単なるプラスミンとともに、急性肺塞栓症、急性の心臓発作の場合の血栓治療、静脈血栓の新鮮または古い凝固、急性および準急性の動脈血栓、動静脈シャントの再疎通、静脈血栓症、急性の心臓発作の場合の閉塞した冠動脈の再潅流、急性の四肢動脈閉塞、慢性的な閉塞性動脈疾患、動静脈シャントの血栓症、臀部および四肢の深刻な静脈血栓症、閉塞していない血管領域での初期の血栓、急性の目の中央の血管閉塞、１型（type-I）プラスミノーゲン欠失の場合の結膜炎、火傷、アルカリ火傷または酸火傷、および凍傷、およびショック中（during shock）の播種性血管内凝固症候群の予防および／または治療のために適切な薬剤組成中にて用いられる。
【０１１０】
本発明によって組み換え生産されたプラスミノーゲンは、好ましくは、傷, 凍傷, アルカリ火傷または酸火傷、損傷、および／または創傷、特に、不十分な創傷治癒の局所的な治療に適切な薬剤組成物中にて用いられる。その点で、その組み換えプラスミノーゲンは、好ましくは、少なくとも１つの活性化因子（例えばウロキナーゼまたはストレプトキナーゼのようなプラスミノーゲン活性化因子）とともに用いられる。その他好ましい可能性があるのは、本発明によって生産されたプラスミノーゲンを、その使用の前に、活性化因子によってプラスミンに完全にまたは部分的に変換し、上述した処方の形式により、プラスミン、またはプラスミノーゲンを伴ったプラスミンとして用いることである。
【０１１１】
非経口使用は、特に、静脈内、血管内（intravasale）、腹腔内、皮下、および筋肉内の適用が考慮される。非経口の処方、特に、注射または注入用の溶液の形態の場合、そのタンパク質は、０．１から１００百万ユニット（million units）、好ましくは１０ｍｌ溶液当たり１０から１００百万ユニット、より好ましくは１０ｍｌ溶液当たり１から１０百万ユニット、特に好ましくは１０ｍｌ溶液当たり３から５百万ユニットの濃度で用いられる。経口使用に適切な処方の場合、そのタンパク質は、０．１から１００．０００ユニット／グラムの処方、好ましくは１００から８０．０００ユニット／グラムの処方、および特に好ましくは１．０００から５０．０００ユニット／グラムの処方の濃度によって用いられる。
【０１１２】
さらに有効な処方には、例えば、タンパク質分解酵素を含む、絆創膏、ドレッシング、またはドレッシングのためのその他の材料がある。これらの処方は、特に、創傷治癒の場合の局所的な使用、あるいは、火傷、凍傷、アルカリ火傷または酸火傷、および／または損傷の治療のために適切である。本発明によって組み換え生産されたプラスミノーゲンは、好ましくは、特に、少なくとも１つの活性化因子（例えばウロキナーゼまたはストレプトキナーゼのようなプラスミノーゲン活性化因子）を伴った創傷治癒剤、絆創膏、およびドレッシングのための材料としての薬剤組成物中で用いられる。あるいは、そのプラスミノーゲンは、上述の活性化因子によって前もってプラスミンに変換され、場合によってプラスミノーゲンを伴うプラスミンとして、および、場合によって上記薬剤組成および処方の中の少なくとも一つの活性化因子、および／または上記薬剤組成および組成と組み合わせた少なくとも一つの活性化因子を伴うプラスミンとして用いられる。特に好適なのは、プラスミノーゲンの使用、一つの活性化因子を伴う好適なプラスミノーゲン、あるいは、プラスミン、またはプラスミノーゲンを伴うプラスミン、創傷治癒、特に、不十分な創傷治癒の治療、および、火傷、凍傷、アルカリ火傷または酸火傷、または他の損傷の治療のために適切な絆創膏およびドレッシングのための材料中の一つの活性化因子、および／または絆創膏およびドレッシングのための材料と組み合わせた一つの活性化因子である。
【０１１３】
ドレッシングのための材料、創傷治癒ドレッシング、または絆創膏は、薬剤組成のｃｍ２ 当たり０．０１から５００ユニットの濃度のプラスミノーゲンおよび／またはプラスミンについて、本発明によって生産されるプラスミノーゲン、および／またはそれから得られるプラスミン、および、好ましくは、ドレッシング剤および絆創膏のそれぞれのｃｍ２当たり０．１から５００ユニットのプラスミノーゲン、および／または、プラスミンを含む。好ましくは、プラスミノーゲンおよび／またはプラスミンは、０．１から２５０ユニットの濃度、さらにより好ましくは０．５から２５０ユニットの濃度、特に好ましくは、絆創膏またはドレッシング剤の薬剤組成のｃｍ２当たり、１から１５０ユニットユニットのプラスミノーゲンおよび／またはそれから得られる一つのプラスミンを含む。
【０１１４】
１ｍｇ（ミリグラム）のプラスミノーゲンの活性化のために、ウロキナーゼは、１００μｇ（マイクログラム）から１ｎｇ（ナノグラム）の範囲で用いられ、好ましくは、１０μｇから１０ｎｇの範囲のウロキナーゼが用いられる。１ｍｇのプラスミノーゲンの活性化のために、ストレプトキナーゼは、１ｍｇから１μｇの範囲、好ましくは、３００μｇから３μｇの範囲で用いられる。１ｍｇのプラスミノーゲンの活性化のために、ストレプトマイセス・グリセウス（S.griseus）由来のタンパク質分解酵素は、１００μｇから１０ｎｇの範囲、好ましくは、１０μｇから１００ｎｇの範囲で用いられる。１ｍｇのプラスミノーゲンの活性化のために、プロテアーゼＶＩＩＩは、１００μｇから１０ｎｇの範囲、好ましくは、１０μｇから１００ｎｇの範囲で用いられる。
【０１１５】
好ましくは、プラスミノーゲンの機能的部分をコードする核酸配列は、ＤＮＡ配列である。
【０１１６】
本発明は、さらに以下のプラスミドが関連している。：
プラスミド pPLG1.1
プラスミド pPLG2.1
プラスミド pPLG3.2
プラスミド pPLG4.2
プラスミド pPLG5.3
プラスミド pPLG6.1
プラスミド pPLG7.1
プラスミド pPLG8.3
プラスミド pPLG9.1
プラスミド pPLG10.1
プラスミド pPLG11.2
プラスミド pPLG12.1
プラスミド pPLG13.1
プラスミド pPLG14.2
プラスミド pPLG15.1
プラスミド pPLG16.3
プラスミド pPLG17.2
プラスミド pPLG18.1
プラスミド pPLG19.2
プラスミド pPLG20.1
プラスミド pMHS476.1 (寄託番号（deposit No.）: DSM 14678)
プラスミド pSM54.2 (寄託番号: DSM 14682)
プラスミド pSM49.8 (寄託番号: DSM 14681)
プラスミド pSM82.1 (寄託番号: DSM 14679)
プラスミド pSM58.1 (寄託番号: DSM 14680)
プラスミド pAC37.1 (寄託番号: DSM 15369)
プラスミド pJW9.1 (寄託番号: DSM 15368)。
【０１１７】
寄託番号は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures Ltd., Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweigにおける寄託を示す。
【０１１８】
本発明は、さらに、少なくとも、本発明による組み換え生産方法によって取得可能なプラスミノーゲンの機能的部分をコードする核酸配列を含む、発現に適したＤＮＡ配列に関連する。また、本発明は、上述のステップａ）において含まれており、および、それから生成される一つの核酸配列を有する融合産物を含んだ微生物宿主生体に関連する。さらに、本発明は、上述のステップａ）またはそれから生成される一つの核酸配列を含む融合産物を有する、ベクター、ＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子に関連する。
【０１１９】
最後に、本発明は、また、上述の組み換え生産方法によって生産される機能的なプラスミノーゲンが用いられることに対する、プラスミノーゲン活性化因子、特にプラスミノーゲン活性化タンパク質分解酵素の同定のためのスクリーニング方法に関連する。この目的のために、好ましくはタンパク質分解酵素のプレインキュベーションの後に、本発明によって生産された、結果として生ずる機能的プラスミノーゲンのプラスミン活性が測定される。結果として生ずる、合成されたペプチド基質によるプラスミン活性は、測定可能である。特に好適なプラスミン活性は、N−トシル−グリシン−プロリン−リジン−パラニトロアニリン（N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA）によるものである。
【０１２０】
宿主生体として、グリコシル化、および、必要であればタンパク質の選択をすることのできる全ての微生物が考慮されうる。ここでは、代表的に、サッカロマイセス・セレヴィシエ、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、糸状菌類（filamentous fungus）のアスペルギルス種（Aspergillus sp.）について言及されるべきである。
【０１２１】
特に、本発明の生産方法によって生産される、機能的なプラスミノーゲンおよびプラスミンのそれぞれの利用は、薬学的な処方が考慮されるべきである。そのような処方においては、その機能的なプラスミノーゲンは、当業者に既知の方法によって、薬学的に許容可能な基剤または補助剤、およびその他の好適な補助剤または添加剤とともに混合することができる。
【０１２２】
Kex2切断点は、ゴルジ装置に局在するタンパク質分解酵素Kex2による、プロペプチドの切断のためのものである。このタンパク質分解酵素は、タンパク質分解酵素YscFとして、またはKexinとして示されることもあるこのタンパク質分解酵素は、塩基性アミノ酸対（例えば：リジン−アルギニン）のＣ末端を切断する、プロタンパクプロセッシング（proprotein processing）・セリンプロテアーゼである。
【０１２３】
Ste13切断点は、ゴルジ装置に局在するタンパク質分解酵素Ste13による、プロペプチドの切断のためのものである。（タンパク質分解酵素YscVI、またはジペプチジル・アミノペプチダーゼＡとして示されることのある）Ste13は、後期のゴルジ（late Golgi）に局在し、例えば、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエの未熟α因子（unripe a-factor）の、Xaa−アラニンのジペプチドのN末端を段階的に取り除く。
【０１２４】
タンパク質分解酵素Kex2およびSte13の切断点に加えて、その他の切断点を挿入することもできる。その他の切断点は、小胞体またはゴルジ装置に局在するタンパク質分解酵素の基質として認識される。
【０１２５】
プラスミノーゲン遺伝子を、小胞体への輸送を担うシグナル配列（プレペプチド）と独占的に（exclusively）融合することも可能である。すなわち、プロペプチド、例えば酵母サッカロマイセス・セレヴィシエの交配因子は、必ずしも必要ではない。
【０１２６】
実験例で述べる、微生物学的、分子生物学的、およびタンパク質化学的な方法は、当業者に既知である。以下の参考文献が、参考として言及される：Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor press, 1989 (10); Gassen & Schrimpf, Genetic Engineering Methods, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1999 (11); EasySelect（登録商標）ピキア発現キット取扱説明書（Pichia Expression Kit Instruction Manual）, Invitrogen,Groningen, The Netherlands, カタログ番号K1740-01。また、ピキア・パストリス株および発現系は、Invitrogenから入手したものであり、上述の取扱説明書の中で述べれられている。
【０１２７】
3.3kbの短い、pPICZA、BおよびCの場合、ピキア・パストリスの発現ベクターが関連する。そのベクターは、ピキア形質転換体の直接的な選択のために、ゼオシン（zeocin）耐性遺伝子を有する。さらに、そのベクターは、高速精製および融合タンパク質の検出のための、Ｃ末端のタグ配列を有する。pPICZalpha A、B、およびCの場合、3.6 kbのピキア・パストリスの発現ベクターが関連する。そのベクターもまた、ゼオシン耐性遺伝子および上述のＣ末端タグ配列を有する。さらに、それらのベクターは、タンパク質が培養液に効率的に輸送されるようにするために、サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子の分泌シグナルを含む。
【０１２８】
さらに、そのプラスミノーゲンは、活性化されうる。そのために、そのプラスミノーゲンは例示的に、本発明によるスクリーニング方法によって同定されたタンパク質分解酵素とともにインキュベートされうる。
【０１２９】
好ましくは、そのプラスミノーゲンは、ストレプトマイセス・グリセウス由来のタンパク質分解酵素、プロテアーゼVIIIまたはプロテアーゼXVIII、フィシン（ficin）、メタロエンドペプチダーゼ、クロストリパイン（clostripain）、エンドプロテイナーゼGlu-C、プロテアーゼXIII、プロテイナーゼA、トリプシン、エンドプロテイナーゼAsp-N、またはエラスターゼとともにインキュベートされる。
【０１３０】
さらに、プラスミノーゲンを、タンパク質分解酵素t-PA、u-PA、またはvb-PA（吸血コウモリ−PA）のいずれかひとつとともにインキュベーションすることによる活性プラスミノーゲンも想定可能である。
【０１３１】
その他の好適な実施形態においては、プラスミノーゲンは、スタフィロキナーゼ、またはストレプトキナーゼをともなったインキュベーションによって活性化される。ストレプトキナーゼまたはスタフィロキナーゼは、プラスミノーゲンと１：１−複合体を形成する。この複合体の形成によって、複合体中で結合したプラスミノーゲンは構造変化を受け、そのためにタンパク質分解的に活性となり、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化することができる。
【０１３２】
その機能的なプラスミノーゲン、または、本発明の組み換え生産方法によって生産された活性化機能的プラスミノーゲンは、フィブリンを加水分解することができる。さらに、それは、プロマトリックス・メタロプロテアーゼおよび増殖因子を活性化することができる。
【０１３３】
本発明の詳細は、以下の実験例よって説明されるであろう。
【実施例】
【０１３４】
実験例１ａ：５’末端にKex2切断点のコドンが挿入されたリジン−プラスミノーゲン遺伝子の増幅
QIAGENプラスミドmidiキット (キアゲン（QIAGEN）, Hilden)を用いて、E.coliHB101（pPLGKG）株から、プレ−グルタミン酸−（pre-Glu-）プラスミノーゲンの遺伝子を含むプラスミドpPLGKG (Forsgrenら, FEBS Lett. 1987 Mar 23;213(2):254-60 (2))を単離した。１５０ｎｇのpPLGKG-DNAを、１０Ｕ（ユニット）の制限酵素EcoRI (ロシュ（Roche）, Mannheim) を用いて線状にし、その後、QIAクイック（quick）PCR精製キット(キアゲン, Hilden)によって精製した。プラスミノーゲン遺伝子の増幅のために、オリゴヌクレオチドプライマーのペアであるN034 (配列番号1) およびN036 (配列番号2)を用いた。そのオリゴヌクレオチドプライマーN036は、さらに、プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点のコドンと相補的な塩基を有する。ＰＣＲのために、各４００ｎＭ（ナノモル）のオリゴヌクレオチドプライマー、各２００μＭ（マイクロモル）のdNTP、３ｎｇ（ナノグラム）の線状のpPLGKGのＤＮＡ、および、最終容量５０μｌ（マイクロリットル）の各反応バッファーとともに、０．５ＵのPwo−ＤＮＡポリメラーゼ(Hybaid, Heidelberg)を用いた。そのプライマーの結合温度は、５８℃であった。
【０１３５】
所望のサイズのために、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけて、QIAクイックＰＣＲ精製キットによって精製した。
【０１３６】
実験例１ｂ：ベクターpPICZaAへのプラスミノーゲン遺伝子のクローニング
４００ｎｇの上記ＰＣＲ産物を、各１０Ｕの制限酵素KspIおよびXhoI（ロシュ, Mannheim)によって切断した。また、サッカロマイセス・セレヴィシエ,由来のα因子のプレプロペプチド配列を含む、プラスミド pPICZαAA (インビトロゲン（Invitrogen）, Groningen, The Netherlands)の３００ｎｇのＤＮＡを、１０Ｕの制限酵素KspIおよびXhoIによって切断した。そして、処理されたＤＮＡを０．９％アガロースゲル中で電気泳動的に分離し、QIAクイック ゲル抽出キット (キアゲン, Hilden)を用いて、そのゲルから断片を抽出した。そのベクターＤＮＡを挿入ＤＮＡと一緒にして（merged with）、１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ(ロシュ, Mannheim)を用いて一晩４℃にて連結した。
【０１３７】
そのライゲーションのバッチのＤＮＡを、その後ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キットを用いて精製し、エレクトロポレーション（電気穿孔法）によってE.coli  JM109の形質転換に用いた。
【０１３８】
エレクトロポレーションされたE.coli JM109の細胞を、１ｍｌのSOC培養液中で１時間３７℃でインキュベートし、その後、20 μg/μlのゼオシンとともにＬＢ寒天固形培地の上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１３９】
キアゲンプラスミドminiキット(キアゲン, Hilden)を用いて、その得られたE.coliの中の一つからＤＮＡを単離し、その後、酵素XhoIおよびKspIの３００ｎｇによる内ヌクレオチド切断的な切断物（endonucleolytic cleavage）を、 アガロースゲル電気泳動を用いて分離した。その分離したプラスミドは所望のサイズの断片を含み、 pMHS476.1 (図１)として示した。酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子由来の融合遺伝子、および、リジン−プラスミノーゲン遺伝子、および、タンパク質分解酵素Kex2の切断点の配列のコドンの正確な（correct）配列は、シークエンス解析によって確定した（配列番号7)。
【０１４０】
実験例１ｃ：プラスミド pMHS476.1によるピキア・パストリスの形質転換
キアゲンプラスミドmidiキットを用いて、E.coli JM109（pMHS476.1）株からプラスミノーゲン発現ベクターpMHS476.1のプラスミドＤＮＡを単離した。10μgのpMHS476.1のDNAを、100UのPmeI (New England Biolabs, Frankfurt) を用いて線状にし、EasySelect（登録商標）ピキア発現キットの取扱説明書（EasySelectTM Pichia Expression Kit Instruction Manual）に示されたプロトコールにしたがって、ピキア・パストリス KM71H  his 4:: HIS 4 arg 4 aox1::ピキア・パストリス Y-11430のARG4遺伝子型 (Northern Regional Research Laboratories, Peoria, USA)のエレクトロポレーションに用いた。YPDS固形培地 (EasySelect（登録商標）ピキア発現キットの取扱説明書) 上にて100 μg/mlのゼオシン存在下で生育したコロニーを、３から４日後にYPDS 固形培地上に１００μg/mlのゼオシンとともにプレートし、液体培養の接種（inoculation）に用いた。そのコロニーは、ピキア・パストリス KM71H/pMHS476.1-1/aとして示した。ここで、「a」は、１から始まるコロニーの連続番号を表す。
【０１４１】
実験例１ｄ：ピキア・パストリス KM71H/pMHS476.1-1/1から-1/3の増殖、および、プラスミノーゲン遺伝子発現の誘導
前培養の作成のために、100mlのBMGY培養液 (EasySelect（登録商標）ピキア発現キットの取扱説明書) を１ｌ（リットル）のバッフルフラスコ（Schikane flasks）中で２８℃、２５０ｒｐｍ（毎分回転数）にてOD600（600 nmの吸光による光学密度）＝２０から３０に至るまでインキュベートした。その後、その前培養を、１０分間、４６４５ｇ（重力加速度）、４℃にて遠心分離した。そして、収集した細胞を、80 g/lの生物−湿性（bio-moist）の質量濃度を得るために、BMMY培地(0.5 % メタノール)に再懸濁した。これらの本培養の６０ｍｌを、１１８時間、３００ｍｌのバッフルフラスコ中で２８℃、２５０ｒｐｍにてインキュベートした。２４および７２時間後、２％メタノールを加えた。AOX−プロモーターを用いる際に必要な十分な酸素供給のために、バッフルフラスコ、および２５０ｒｐｍの毎分の高回転を利用した。
【０１４２】
実験例１ｅ：  ストレプトキナーゼによる活性化後の、本培養の上清中のプラスミノーゲン活性の測定
本培養のサンプル（試料）を、１０分間、１６０００ｇにて遠心分離した。その上清３００μｌを、1 μl ストレプトキナーゼ (S8026) (Sigma, Deisenhofen)とともに、２０分、３７℃でインキュベートした。
【０１４３】
750μlの100 mM リン酸ナトリウムバッファーpH 8、0.36 mM 塩化カルシウム（CaCl2）、0.9% 塩化ナトリウム（NaCl）に対して、100 μl のN−トシル−グリシン−プロリン−リジン−パラニトロアニリン（N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA）溶液（７５ｍｇグリシン/10 ml、2% Tween（登録商標）20に溶解したものの９．５ｍｇ)をピペットし（pippeted）、１０分間、３７℃にてインキュベートした。反応の開始のために、ストレプトキナーゼによって前処理した上清２５０μｌを加えて、さらに３７℃にてインキュベートした。吸光度の上昇を、４０５ｎｍにて光度的（photometrically）に測定した。コントロール値（control values）の決定のために、並行して増殖したピキア・パストリス KM71H 培養液の上清、および、ストレプトキナーゼ活性化のないものの上清を用いた。誘導の７２時間後に採取されたサンプルについて、以下のような活性値を決定した(1 U/l = 1 μmol（マイクロモル）N−トシル−グリシン−プロリン−リジン−パラニトロアニリン、培養上清の１リットル当たり、毎分に換算して): KM71H/pMHS476.1-1/1: 2 U/l; KM71H/pMHS476.1-1/2: 2 U/l; KM71H/pMHS476.1-1/3: 1 U/l。誘導の１１８時間後、以下のような活性値が決定されうる: KM71H/pMHS476.1-1/1: 7 U/l; KM71H/pMHS476.1-1/2: 9 U/l; KM71H/pMHS476.1-1/3: 8 U/l。
【０１４４】
実験例２ａ：５’末端において、Kex2切断点および２つのSte13切断点のコドンを挿入したリジン−プラスミノーゲン遺伝子の増幅
Kex2切断点および２つのSte13切断点のコドンが挿入されたベクターpPICZαA へのクローニングのために、実験例１ａで言及した条件により、リジン−プラスミノーゲン遺伝子の増幅を２つのオリゴヌクレオチドプライマーN034およびN057 (配列番号3) によって行った。そのオリゴヌクレオチドプライマーN057は、さらに、プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点および２つのSte13切断点のコドンに相補的な塩基を有する。
【０１４５】
実験例２ｂ：実験例２ａに記載された、増幅されたリジン−プラスミノーゲン遺伝子のベクターpPICZαAへのクローニング
実験例１ｂに記載したクローニングと類似の方法により、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子と、タンパク質分解酵素Kex2およびSte13の切断点のコドンが挿入されたヒトのプラスミノーゲン遺伝子との融合遺伝子の生産のための、リジン−プラスミノーゲン遺伝子のベクターpPICZαAへのクローニングを行った。得られたプラスミドは、pSM54.2 (図２)として示した。その正確な配列(配列番号9)は、シークエンス解析によって確定した。
【０１４６】
実験例２ｃ：プラスミド pSM54.2によるピキア・パストリスの形質転換
実験例１ｃのpMHS476.1についての記載のように、プラスミド pSM54.2とともにピキア・パストリス KM71H を形質転換した。得られたコロニーは、ピキア・パストリス KM71H/pSM54.2-1/aとして示した。ここで、再び「a」は、１から始まるコロニーの連続番号を表す。
【０１４７】
実験例２ｄ：  ピキア・パストリス KM71H/pSM54.2-1/1から-1/3の培養、および、プラスミノーゲン遺伝子の誘導
実験例１ｄに記載されたものと類似の条件により、前培養および本培養の作成、および、メタノールによる誘導を行った。
【０１４８】
実験例２ｅ：  ストレプトキナーゼによる活性化後の本培養サンプルのプラスミノーゲン活性の測定
ストレプトキナーゼによる活性化後のプラスミノーゲン活性を、実験例１ｅにおいてKM71H/pMHS476.1-1/1から-1/3について記載された方法によって決定した。誘導の７２時間後に採取されたサンプルについて、以下の活性値が得られた：KM71H/pSM54.2-1/1: 2 U/l; KM71H/pSM54.2-1/2: 8 U/l; KM71H/pSM54.2-1/3: 6 U/l。誘導の１１８時間後について、以下の活性値が決定されうる：KM71H/pSM54.2-1/1: 8 U/l; KM71H/pSM54.2-1/2: 17 U/l; KM71H/pSM54.2-1/3: 13 U/l。
【０１４９】
実験例３ａ：  独自の（own）シグナル配列によるプラスミノーゲン遺伝子の増幅、および、ベクターpPICZAへのクローニング；ピキア・パストリスの形質転換
ベクターpPICZA へのクローニングのために、その独自のシグナルペプチド（プレ−プラスミノーゲン）をコードする配列を含むプラスミノーゲン遺伝子の増幅を、実験例１ａに記載した条件により、２つのオリゴヌクレオチドプライマーN034およびN037 (配列番号4)を用いて行った。
【０１５０】
実験例１ｂに記載したクローニングと類似の方法により、プレプラスミノーゲン遺伝子のベクターpPICZA へのクローニングを行った。そのベクターおよびＰＣＲ産物を、制限酵素SfuIおよびKspIによって切断した。得られたプラスミドを、pSM49.8 (図３)として示した。正確な配列(配列番号11)は、シークエンス解析によって確定した。
【０１５１】
実験例１ｃのpMHS476.1についての記載のように、プラスミド pSM49.8とともにピキア・パストリス KM71Hを形質転換した。得られたコロニーは、ピキア・パストリス KM71H/pSM49.8-1/aとして示した。ここで、再び「a」は、１から始まるコロニーの連続番号を表す。
【０１５２】
実験例４ａ：  Kex2切断点のコドンを挿入したヒトのグルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子の増幅、および、発現ベクター pPICZa（アルファ）Aへのクローニング；ピキア・パストリスの形質転換
Kex2切断点のコドンを挿入したベクター pPICZαA へのクローニングのために、実験例１ａで言及した条件により、グルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子の増幅を、２つのオリゴヌクレオチドプライマーN034およびN035 (配列番号５) によって行った。オリゴヌクレオチドプライマーN035は、さらに、グルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点のコドンに相補的な塩基を有する。
【０１５３】
実験例１ｂに記載したクローニングと類似の方法により、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子と、タンパク質分解酵素Kex2切断点のコドンが挿入されたヒトのグルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子との融合遺伝子の生産のための、グルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子のベクターpPICZαAへのクローニングを行った。
【０１５４】
得られたプラスミドは、pSM82.1 (図４)として示した。その正確な配列(配列番号１３)は、シークエンス解析によって確定した。
【０１５５】
実験例１ｃのpMHS476.1についての記載のように、プラスミドpSM82.1とともにピキア・パストリス KM71H を形質転換した。得られたコロニーは、ピキア・パストリスKM71H/pSM82.1/aとして示した。ここで、再び「a」は、１から始まるコロニーの連続番号を表す。
【０１５６】
実験例５ａ：  ５’末端において、Kex2切断点および２つのSte13切断点のコドンを挿入したグルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子の増幅、および、発現ベクターpPICZaAへのクローニング；  ピキア・パストリスの形質転換
Kex2切断点および２つのSte13切断点のコドンが挿入されたベクターpPICZαA へのクローニングのために、実験例１ａで言及した条件により、グルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子の増幅を、２つのオリゴヌクレオチドプライマーN034およびN056 (配列番号6) によって行った。そのオリゴヌクレオチドプライマーN056は、さらに、プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点およびSte13切断点のコドンに相補的な塩基を有する。
【０１５７】
実験例１ｂに記載したクローニングと類似の方法により、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子と、タンパク質分解酵素Kex2およびSte13の切断点のコドンが挿入されたヒトのグルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子との融合遺伝子の生産のための、グルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子のベクターpPICZαAへのクローニングを行った。得られたプラスミドは、pSM58.1（図５）として示した。その正確な配列（配列番号１５）は、シークエンス解析によって確定した。
【０１５８】
実験例１ｃのpMHS476.1についての記載のように、プラスミドpSM58.1とともにピキア・パストリス KM71H を形質転換した。得られたコロニーは、ピキア・パストリスKM71H/pSM58.1/aとして示した。ここで、再び「a」は、１から始まるコロニーの連続番号を表す。
【０１５９】
実験例６ａ：  pSM54.2由来のリジン−プラスミノーゲン遺伝子の、ベクターpPIC9Kへの挿入
150 ngのベクター pPIC9K (インビトロゲン, Groningen, The Netherlands) を、10Uの制限酵素SacIおよびNotI (両方ともRoche Diagnostics, Mannheim)のそれぞれで切断した。300 ngのプラスミノーゲン発現プラスミド pSM54.2 (実験例２ｂ参照）を、制限酵素SacIおよびNotIで切断した。そして、その処理したＤＮＡを、0.9%アガロースゲルのゲル電気泳動によって分離した。長い断片については、キアゲンゲル抽出キット(キアゲン, Hilden)によってそのゲルから抽出した。その２つの断片を一緒にして、１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて一晩４℃にて連結した。
【０１６０】
実験例１ｂに記載されたものと類似の方法によって、E. coli DH5αの形質転換、結果として得られたプラスミドの単離および特定（characterization）を行った。ここでは、形質転換体の選択のために、抗生物質ゼオシンに替えて、抗生物質アンピシリンを用いた。その構築したプラスミドを、pAC37.1 (図６)として示した。
【０１６１】
実験例６ｂ：プラスミドpAC37.1によるピキア・パストリスの形質転換
実験例１ｃの、プラスミドpMHS476.1によるピキア・パストリス KM71Hの形質転換の記載のように、制限酵素 SalIによって線状にされたプラスミドpAC37.1とともにピキア・パストリスKM71を形質転換した。形質転換した細胞を、ヒスチジンの入っていない培地ＭＤ寒天（medium MD-agar）(マルチコピー  ピキア発現キット  取扱説明書)にプレートし、インキュベートした。得られたコロニーは、ピキア・パストリスKM71/pAC37.1-3/aとして示した。ここで、再び「a」は、１から始まるコロニーの連続番号を表す。
【０１６２】
実験例６ｃ：  ピキア・パストリス KM71/pAC37.1-3/1の培養、および、プラスミノーゲン遺伝子の誘導
実験例１ｄに記載されたものと類似の条件により、前培養および本培養の作成、および、メタノールによる誘導を行った。その誘導は、２１６時間を超えて行った（over 216h）。それは、メタノール濃度０．５％によって始め、そして、４８時間毎に２％メタノールを再供給した。
【０１６３】
実験例６ｄ：  ストレプトキナーゼによる活性化後の本培養サンプルのプラスミノーゲン活性の測定
ストレプトキナーゼによる活性化後のプラスミノーゲン活性を、実験例１ｅにおいてKM71H/pMHS476.1-1/1から-1/3について記載された方法によって決定した。誘導の１２０時間後に採取されたサンプルについて、120 U/l の活性が得られた。誘導の２１６時間後には、190 U/lの活性が測定されうる。
【０１６４】
実験例６ｅ：  最小培地（BSM）でのピキア・パストリス KM71/pAC37.1-3/1の誘導、および、ストレプトキナーゼによる活性化後の、本培養サンプルのプラスミノーゲン活性の測定
BMGY-複合培地 (実験例１ｄ参照)でのピキア・パストリス KM71/pAC37.1-3/1の増殖後、遠心分離後の細胞８０ｇを、導入期（induction phase）のための１００ｍｌのBSM−最小培地に再懸濁した。そのBSM（Basal Salts Medium) -最少培地の組成は以下の通りである:
リン酸（H3PO4），85 %: 26.0 ml/l; 塩化カルシウム・二水和物（CaCl2・2H2O）: 0.6 g/l; 硫酸カリウム（K2SO4）： 18.0 g/l; 硫酸マグネシウム・七水和物:14.0 g/l; 水酸化カリウム（KOH）: 4.0 g/l; グリセリン: 20 ml/l; 消泡剤（antifoam）: 1.0 ml/l; トレース溶液（trace solution）: 8.0 ml/l; ビオチン溶液(0.2 g/l): 8.0 ml/l。
【０１６５】
トレース溶液の組成：硫酸（H2SO4）： 5.0 ml/l; 硫酸銅・五水和物（CuSO4・5H2O）: 6.0 g/l; ヨウ化カリウム（KI）: 0.08 g/l; 硫酸マンガン・一水和（MnSO4・H2O）: 3.0 g/l; モリブデン酸ナトリウム（Na2MoO4）：0.2 g/l; ホウ酸（H3BO3）：0.02 g/l; 塩化コバルト（CoCl2）：0.5 g/l; ZnCl2: 20.0 g/l; 硫酸鉄・七水和物（FeSO4・7H2O）: 65.0 g/l。
【０１６６】
誘導のために、２％メタノールを一日毎に加えた。ストレプトキナーゼによる活性化後のプラスミノーゲン活性を、実験例１ｅにおいてKM71H/pMHS476.1-1/1から-1/3について記載された方法によって決定した。誘導の１２０時間後、プラスミノーゲン活性は、193 U/lとして決定した。誘導の１６８時間後について、２８９Ｕ／Ｉ として測定されうる。
【０１６７】
実験例６ｆ：  クラーホフ（Klarhof）の繊維素溶解実験における、ストレプトキナーゼによる活性化後の本培養サンプルのプラスミノーゲン活性の検出
クラーホフ繊維素溶解実験(Stack, M. S., Pizzo, S. V., および Gonzalez-Gronow, M. (1992)）: ヒトプラスミノーゲンの生物学的性質における脱シアリル化（desialylation）の効果. Biochem. J. 284, 81-86) (13)）の準備のために、1.5 gのGTG-低融点アガロースを、７５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４中で沸騰させて溶かした。35 mlのフィブリノーゲン溶液(225 mg/37.5 ml 50 mM リン酸ナトリウムバッファー pH 7.4)を、気泡を生じないように350 μl トロンビン溶液（50 mM リン酸ナトリウムバッファー pH 7.4中で、１０Ｕ／ｍｌ）と混合し、そのアガロース溶液中で攪拌し、ペトリ皿にそそいだ。そのフィブリン寒天が固まった後、その寒天中に１ｍｍサイズの穴を彫った。
【０１６８】
ストレプトキナーゼ活性後の、組み換え生産されたプラスミノーゲンの繊維素溶解活性の検出のために、以下の各溶液の２０μｌを上記穴にピペットし、２０時間、３７℃でインキュベートした：
1: 0.5 mg/ml プラスミノーゲン (ロシュ, Mannheim)
2: 実験例６ｅから得られる、培養液上清 KM71/pAC37.1-3/1
3:ストレプトキナーゼによって活性化された、0.5 mg/ml プラスミノーゲン
4:実験例６ｅから得られる、ストレプトキナーゼによって活性化された培養液上清 KM71/pAC37.1-3/1
5:ストレプトキナーゼによって活性化された、0.25 mg/ml プラスミノーゲン
6:実験例６ｅから得られる、ストレプトキナーゼによって活性化された、培養液上清 KM71/pAC37.1-3/1、１：２に希釈されたもの
7:ストレプトキナーゼによって活性化された、0.125 mg/ml プラスミノーゲン
8:実験例６ｅのKM71/pAC37.1-3/1から生産される、ストレプトキナーゼによって活性化された、培養液上清 KM71H
ストレプトキナーゼによる活性化については、2 μlのストレプトキナーゼ (100 U/μl, Sigma, Deisenhofen)を40 μlの上記各溶液にピペットし、６０分、３７℃でインキュベートした。
【０１６９】
線維素溶解活性によって得られたスポットを、図１０に示す。
【０１７０】
実験例６ｇ：  アフィニティークロマトグラフィーによる、ピキア・パストリス KM71/pAC37.1-3/1中で組み換え生産されたプラスミノーゲンの精製
実験例6c/6dのピキア・パストリス KM71/pAC37.1-3/1の培養液上清の５０ｍｌを、４℃にて、4 lの50 mM リン酸ナトリウムバッファーpH 7.5に対して透析した。２４時間後、透析バッファーを交換し、さらに２４時間透析した。その後、透析液を０．０２μｍフィルターに通過させ、50 mM リン酸ナトリウムバッファーpH 7.5で平衡化したリジン−セファロースTM 4Bカラム(直径: 16 mm、高さ: 95 mm) (アマシャム バイオサイエンス)に通した。非特異的に結合したタンパク質を、50 mM リン酸ナトリウムバッファーpH 7.5、0.5 M 塩化ナトリウムによってカラムから洗浄した。結合したプラスミノーゲンを、50 mM リン酸ナトリウムバッファーpH 7.5、0.01 M ε-アミノカプロン酸によって溶出した。個別のサンプルを、7.5% SDS-PAGEと、その後の銀染色によって解析した（図１１）。フラクション（fractions）に含まれた組み換えプラスミノーゲンは、ゲル中において、基準として加えられたヒトのプラスミノーゲンの高さに位置している。
【０１７１】
図１１は、実験例６ｇの精製フラクションの7.5 % SDS-PAGEを示す。図１１では、用いた略号は以下のような意味を持つ：
Ｍ：サイズスタンダード（上から下に向かって：116 kDa（キロダルトン）, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa)
D: 透析液
N: 非結合フラクション
W: 洗浄フラクション
F1-F5：溶出フラクションに含まれるプラスミノーゲン
Plg: プラスミノーゲン (American Diagnostica, Pfungstadt)。
【０１７２】
実験例６ｈ：ｐＨ値および基質の影響の評価のための、ピキア・パストリス KM71/pAC37.1-3/1の発酵
バッフルのない（without Schikanes）１ｌのワイドネックフラスコ（wide neck flask）中で、50 mlのYEP-G-培地(10 g/l 酵母エキス、20 g/l カゼインペプトン、20 g/l グリセロール) に対して、2 ml グリセロールの低温培養（cryo-culture）ピキア・パストリス KM71/pAC37.1-3/1を接種し、３０℃で９時間、３００ｒｐｍにてインキュベートした。この培養液5 mlを、バッフルのない１ｌのワイドネック振盪フラスコ中の、50 mlのMG-培地(5 g/l yeast nitrogen base w/o amino acids, 20 g/l グリセロール, 2.5 ml/l ビオチン溶液(0.2g/l)) に接種するために用いた。この２番目の前培養を、１６時間、３０℃、３００ｒｐｍにてインキュベートした。その本培養液を、多様な条件で４つの培養液を並行して発酵させることのできるマルチ発酵装置（multi fermentation apparatus）「スターラー−プロ（stirrer-pro）」(DASGIP, Julich)によって発酵させた。そして、それぞれ、１５０ｍｌのＢＳＭ培地（実験例６ｅ参照）を１５ｍｌの上記２番目の前培養に接種した。発酵はｐＨ６で開始し、基質の投与を開始後、目的のｐＨ値を上げていった。並行した発酵の様々な条件および結果を、テーブル（表）１に示す。
【０１７３】
テーブル１：
【０１７４】
【表１】
2005525798.tif 000002
【０１７５】
実験ＩＶでは、３０ｇ／ｌのペプトンを培養液に加えた。メタノールの投与開始前に、グリセロール投与培養液(500 g/lの水を含まないグリセロール、10 ml/lトレース溶液、10 ml /l ビオチン溶液（実験例６ｅ参照））を、４時間の間、２４ｍｌ／ｈの一定の割合で加えた。上記実験例Ｉ、ＩＩ、ＩＶのプロファイルについては、投与関数（dosage function）として以下の条件が与えられた。f(x)=P1+(P2/1+exp(-P3(t-P4))))+(P5/(1+exp(-P6(t-P7))))   ただし、P1=0; P2=0.7; P3=0.2; P4=15; P5=P6=P7=0。テーブル１からわかるように、中性のｐＨ値でのプラスミノーゲン濃度は、グリセロール/メタノールの混合投与の場合に最も高い。
【０１７６】
実験例７ａ：ベクターpGAPZaAへの、pAC37.1 由来のリジン−プラスミノーゲン遺伝子の挿入
150 ngのベクター pGAPZαA (インビトロゲン, Groningen, The Netherlands)を、10 Uの制限酵素XhoIおよびNotI (両方ともRoche Diagnostics, Mannheim)のそれぞれで切断した。300 ngのプラスミノーゲン発現プラスミドpAC37.1 (実験例６ａ参照)を、制限酵素XhoIおよびNotIで切断した。そして、その処理したＤＮＡを、0.9%アガロースゲルのゲル電気泳動によって分離した。pAC37.1由来の長い２７１５ｂｐのプラスミノーゲン遺伝子断片、および、pGAPZαA由来の長い3073 bpのベクター断片は、キアゲンゲル抽出キット(キアゲン, Hilden)によってそのゲルから抽出した。その２つの断片を一緒にして、１ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて一晩４℃にて連結した。
【０１７７】
実験例１ｂに記載されたものと類似の方法によって、E. coli DH5αの形質転換、結果として得られたプラスミドの単離および特定を行った。ここでは、形質転換体の選択のために、抗生物質ゼオシンに替えて、抗生物質アンピシリンを用いた。その構築したプラスミドを、pJW9.1 (図７)として示した。
【０１７８】
実験例７ｂ：プラスミドpJW9.1によるピキア・パストリスの形質転換
実験例１ｃの、プラスミドpMHS476.1によるピキア・パストリス KM71Hの形質転換の記載のように、制限酵素BlnIによって線状にされたプラスミドpJW9.1とともにピキア・パストリスKM71H を形質転換した。形質転換した細胞を、100 μg/ml ゼオシンの入ったYPDS寒天（YPDS-agar）(EasySelect（登録商標）ピキア発現キットの取扱説明書（EasySelectTM Pichia Expression Kit Instruction Manual）にプレートし、インキュベートした。得られたコロニーは、ピキア・パストリスKM71H/pJW9.1-aとして示した。ここで、再び「ａ」は、１から始まるコロニーの連続番号を表す。
【０１７９】
実験例７ｃ：グリセロール投与量における、ｐＨ値の評価のための、ピキア・パストリスKM71H/pJW9.1-3の発酵
前培養および「スターラー−プロ」（stirrer-pro）における発酵を、実験例６ｉに記載されているように行った。その結果を、テーブル２に示す。
【０１８０】
テーブル２：
【０１８１】
【表２】
2005525798.tif 000003
【０１８２】
同様に、グリセロール投与の場合では、中性ｐＨ値における発酵において最高の収量が得られた。明らかに、生産物の形成における基質の投与（投与量）の影響がみられるようである。
【０１８３】
実験例７ｄ：ピキア・パストリスKM71H/pJW9.1-3の発酵
バッフルのない（without Schikanes）１ｌのワイドネックフラスコ（wide neck flask）中で、５０ｍｌのYEP-G−培養液(10 g/l 酵母エキス、20 g/l カゼインペプトン、20 g/l グリセロール) に対して、ピキア・パストリス KM71H/pJW9.1-3を接種し、３０℃で９時間、３００ｒｐｍにてインキュベートした。この培養液１０mlを、バッフルのない１ｌのワイドネック振盪フラスコ中の、４0 mlのMG-培地(5 g/l yeast nitrogen base w/o amino acids, 20 g/l グリセロール, 2.5 ml/l ビオチン溶液(0.2g/l)) に接種するために用いた。この培養液を、１６時間、３０℃、３００ｒｐｍにてインキュベートした。
【０１８４】
３ｌのBSM培地（実験例６ｅ参照）を、７．５ｌのラボラトリーファーメンター（(type Labfors, Infors AG, CH)に入っている３０ｍｌの上記培養液に接種した。発酵は、２５℃、３．２ｌ／ｍｉｎの定速のガス供給量で行った。２４時間後、グリセロール溶液（500g/l グリセロール, 10 ml/l トレース溶液, 10 ml/l ビオチン溶液（実験例６ｅ参照））を加えた。その発酵の間、投与量を、１０ｍｌ／ｈから４５ｍｌ／ｈまで順々に増やした。２５０時間後、ストレプトキナーゼ活性化後のプラスミノーゲン活性として、１３７５Ｕ／ｌが測定されうる。
【０１８５】
実験例８：プラスミノーゲン活性化因子の同定
プラスミノーゲン活性化の適格性について、２４の市販のタンパク質分解酵素を調べた。実験は、100 mM リン酸ナトリウムバッファーpH 8、0.36 mM塩化カルシウム、0.9% 塩化ナトリウムにて行った。
【０１８６】
粉末形態で供給されたタンパク質分解酵素をバッファーに溶かし、その溶液中のタンパク質分解酵素を、直接に、および、必要に応じてバッファーに希釈して用いた。25 μl のタンパク質分解溶液を、本発明による25 μl プラスミノーゲン(20 mg/ml) と混合し、１０分間、３７℃にてインキュベートした。その後、基質N−トシル−グリシン−プロリン−リジン−パラニトロアニリン（N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA）に関して、プラスミン活性を測定した。この２００μlの基質溶液(9.5 mg N−トシル−グリシン−プロリン−リジン−パラニトロアニリン、75 mg グリシン/10 ml, 2% Tween（登録商標）20中に溶解)を８５０μｌバッファーにピペットし、５０μｌの プレインキュベートしたプラスミノーゲンタンパク質分解酵素混合液とあわせて３７℃にてさらにインキュベートした。吸光度の上昇を、４０５ｎｍにて光度的に測定した。実験したタンパク質分解酵素に起因する吸光度の測定を行った。ここでは、プレインキュベートされたプラスミノーゲンタンパク質分解酵素混合液の替わりに、プレインキュベートされたバッファーと同様のタンパク質分解酵素混合液を用いた。
【０１８７】
ストレプトマイセス・グリセウス由来のプロテアーゼ、プロテアーゼVIII、プロテアーゼXXIII、プロテアーゼXIX、プロテアーゼXVIII、フィシン、メタロエンドペプチダーゼ、クロストリパイン、Glu-C、プロテアーゼXIII、キモパパイン（chymopapain）、キモトリプシン、プロテアーゼX、ブロメライン、カリクレイン、およびプロテイナーゼAは、Sigma, Deisenhofenから購入した; トリプシン、パパイン、Asp-N、ディスパーゼ（dispase）I、Lys-C、トロンビン、およびエラスターゼは、ロシュ, Mannheimから取得した;  プロテイナーゼKはキアゲン, Hildenから取得した。生産したプロテアーゼ保存液（stock solutions）は、テーブル３に記載するタンパク質濃度を有していた。希釈係数Ｆは、測定のためにその保存液を希釈する比率（ratio）を示す。
【０１８８】
活性化後のプラスミン活性は、以下のように測定されうる（1 U/mg は、１分間につき、１ｍｇのタンパク質当たり（per minute per mg protein）1 μmol のN−トシル−グリシン−プロリン−リジン−パラニトロアニリンの変換に相当）。
【０１８９】
テーブル３：
【０１９０】
【表３】
2005525798.tif 000004
【０１９１】
＊  プロテアーゼXXIII、プロテアーゼXIX、キモパパイン、エンドプロテイナーゼ Lys-C、キモトリプシン、パパイン、ディスパーゼ I、プロテアーゼ X、ブロメライン、カリクレイン、およびプロテイナーゼ Kのタンパク質分解酵素については、プラスミノーゲン活性化は検出されないようである。
【０１９２】
実験例９：薬剤組成（Pharmaceutical formulations）
以下の実験例で用いられた組み換えの機能的なプラスミノーゲンは、本発明の生産方法によって取得した。これとの関係で、「プラスミノーゲン」という文言は、組み換えのマイクロ−、ミニ−、リジン−、またはグルタミン酸−プラスミノーゲンに関連する。「プラスミン」という文言は、組み換えのマイクロ−、ミニ−、リジン−、またはグルタミン酸−プラスミノーゲンのタンパク質分解切断によって得られるプラスミンに関連する。マイクロ−、ミニ−、リジン−、またはグルタミン酸−プラスミノーゲンの活性化は、同様のプラスミノーゲン活性化因子、特に、上述したプラスミノーゲン活性化タンパク質分解酵素の利用によって得ることができるが、これらの実験例に限定されるものではない。ここでは、単位プラスミノーゲン（マイクロ−、ミニ−、リジン−、またはグルタミン酸−プラスミノーゲン）に対する単位活性化因子の割合は、約１：１０００である。
【０１９３】
このプラスミノーゲンは、タンパク質分解的に活性化されうる。すなわち、プロテアーゼ組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、またはタンパク質分解酵素プロテアーゼVIII、または上記特許に記載されたストレプトマイセス・グリセウス由来のプロテアーゼによって、および、ストレプトキナーゼまたはスタフィロキナーゼとの複合体形成によって活性化されうる。
【０１９４】
実験例９ａ：  薬剤組成
−  ハイドロゲル（Hydrogels）
ハイドロゲルのための基本組成（Base formulation）(100g)
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子：0.1 U
ヒドロキシエチルセルロース10 000：3.5 g
任意の保存（optional conservation） (ソルビン酸（sorbinic acid）／ソルビン酸カリウム 0.1-0.4%、PHB-エステル 0.1%)
純水（purified water）：１００．０に調整するように追加（ad 100.0）。
【０１９５】
上記ヒドロキシエチルセルロースではなく（resp.）、ハイプロメロース（hypromellose resp.）、またはメチルセルロースを、０．５〜１５．０ｇの量で代替的に用いることもできる。
【０１９６】
−  ゲル
プラスミノーゲン：1000 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：1 U
グリセロール(85%)：150.0 g 
ヒドロキシエチル セルロース 10 000：32.5 g 
任意の保存 (ソルビン酸/ソルビン酸カリウム 0.1-0.4%, PHB-エステル 0.1%)
乳酸が入っていないリンガー溶液（Ringer's solution without lactate）：1000.0gに調整するように追加。
【０１９７】
代替として（alternatively）:
100g  含有:
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.1 U
ヒドロキシエチルセルロース 30 000：2.5 g 
グリセロール 85%：10.0 g
任意の保存 (ソルビン酸/ソルビン酸カリウム 0.1-0.2%, PHB-エステル 0.1%)
純水：１００．０に調整するように追加。
【０１９８】
代替として:
100g ゲル 含有:
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.1 U
ポリアクリル酸：1 g
プロピレングリコール：8 g
中鎖トリグリセリド（Mid-chained triglyceride）：8 g
ジエチルアミン（ｐＨの調整用）：十分量（q.s.）
任意の保存 (ソルビン酸/ソルビン酸カリウム 0.1-0.2%, PHB-エステル 0.1%)
2-プロパノール：0 - 1 g
水：１００ｇに調整するように追加。
【０１９９】
−  親水性軟膏 (マクロゴール軟膏)
50g 含有：
プラスミノーゲン：50 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.05 U
マクロゴール 400：30.0 g
マクロゴール 4000：10.0 g
任意の保存 (ソルビン酸/ソルビン酸カリウム 0.1-0.2%, PHB-エステル 0.1%)
純水：50.0 gに調整するように追加。
【０２００】
代替として:
−  水を含まないマクロゴール軟膏
100g 含有:
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.1 U
マクロゴール 300：50 g
マクロゴール 1500：100 gに調整するように追加。
【０２０１】
代替として:
−  吸水軟膏
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子(またはその複数)：0.1 U
セチルステアリル（Cetylstearyl ）アルコール：29 g
パラフィン、粘性（viscous）：34 g
ワセリン、白色（white）：100 g。
【０２０２】
−  疎水性軟膏
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.1 U
ワセリン：80.0 g
パラフィン薄流体（thin fluid）：１００ｇに調整するように追加。
【０２０３】
−  疎水性ペースト（hydrophobic paste）
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.1 U
ハイプロメロース 400：20 g
ワセリン、白色：１００ｇに調整するように追加。
【０２０４】
代替として:
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.1 U
カルボマー（Carbomer）（例えば、カルボポル（carbopol） 974p)：15 g
パラフィン、粘性：40 g
ワセリン、白色：１００ｇに調整するように追加。
【０２０５】
−  クリーム（Creme）
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.1 U
中鎖トリグリセリド（Mid-chained triglycerides）：20 g
乳濁化した（Emulgating）セチルステアリルアルコール：10 g
ラノリン：10 g
ソルビトール：10 g
任意の保存 (ソルビン酸/ソルビン酸カリウム 0.1-0.2%, PHB-エステル 0.1%)
純水：１００ｇに調整するように追加。
【０２０６】
−  非イオン性親水性クリーム
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.1 U
セチルアルコール：20 g
２−エチルラウロミリスチン酸塩（2-Ethyllauromyristat）：10 g
グリセロール 85%：6 g
ソルビン酸カリウム：0.14 g
クエン酸：0.07 g
水：１００ｇに調整するように追加。
【０２０７】
−  非イオン性クリーム
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.1 U
ポリソルベート（Polysorbat）60：5 g
セチルステアリルアルコール：10 g
グリセロール 85% ：10 g
ワセリン、白色：25 g
任意の保存 (ソルビン酸/ソルビン酸カリウム 0.1-0.2%, PHB-エステル 0.1%)
水：１００ｇに調整するように追加。
【０２０８】
−  リポソームの組成（Liposomal formulation）
プラスミノーゲン：100 U
プラスミノーゲン活性化因子(またはその複数)：0.1 U
大豆レシチン、ニワトリのレシチン（Chicken lecithin）：15 g
任意の保存 (ソルビン酸/ソルビン酸カリウム 0.1-0.2%, PHB-エステル 0.1%, または（resp.）ジアゾジニル尿素（diazodinyl urea 1-2g)
水：１００ｇに調整するように追加。
【０２０９】
−  カプセル
０．２５ｇの粉末／粒状（powder/granulate）による一つのカプセル  含有：
プラスミノーゲン：5 U
プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）：0.005 U
デンプン（Starch）：0.1 g
二酸化珪素（Siliciumdioxide）：0.02 g
マグネシウムステアレート：0.002 g
ポリメタクリレート共重合体／ポリメタクリル酸（Polymethacrylate copolymerisates/polymethacrylic acid）：0.015 g
クエン酸トリエチル（Triethylcitrate）：0.0005 g
タルカム（Talkum）：0.001 g
結晶セルロース（Cellulose,microcrystalline）：０．２５ｇに調整するように追加。
【０２１０】
代替として:
０．２５ｇの粉末／粒状による一つのカプセル  含有：
プラスミノーゲン：5 U
プラスミノーゲン活性化因子(またはその複数)：0.005 U
二酸化珪素：0.01 g
マグネシウムステアレート（Magnesiumstearat）：0.002 g
ポリメタクリレート共重合体／ポリメタクリル酸（Polymethacrylat copolymerisates/polymethacrylic acid）：0.015 g
クエン酸トリエチル：0.0001 g
タルカム：0.001 mg
マンニトール：０．２５ｇに調整するように追加。
【０２１１】
−  錠剤（Pill）
100mgの錠剤・粒状（pill granulate）含有：
プラスミノーゲン：5 U
プラスミノーゲン活性化因子(またはその複数)：0.005 U
デンプン：30 mg
二酸化珪素：2 mg
マグネシウムステアレート：4 mg
ポリメタクリレート共重合体／ポリメタクリル酸：5 mg
クエン酸トリエチル：0-1 mg
タルカム：0.0001 mg
結晶セルロース：１００ｍｇに調整するように追加。
【０２１２】
−  ペレット（Pellets）
100gのペレット  含有:
プラスミノーゲン：2000 U
プラスミノーゲン活性化因子(またはその複数)：2 U
デンプン：20 g
スクロースステアレート：20 g
二酸化珪素：2 g
マグネシウムステアレート：3 g
ポリビニルピロリドン：0 - 1 g
ポリメタクリレート共重合体／ポリメタクリル酸：5 g
タルカム：0.2 g
クエン酸トリエチル：0.1 g
結晶セルロース：１００ｇに調整するように追加。
【０２１３】
−  注射液（Injection solution）
プラスミノーゲン：500 U
プラスミノーゲン活性化因子(またはその複数)：0.5 U
エタノール：0 - 1 g
プロピレングリコール：10 g
ポリエチレングリコール：0 - 1 g
塩化ナトリウム：十分量（q.s.）
任意のバッファー(リン酸水素ナトリウム／リン酸二水素ナトリウム（sodium hydrogen phosphate/sodium dihydrogen phosphate)）
純水：１００ｍｌに調整するように追加。
【０２１４】
マイクロ−、ミニ−、リジン−、またはグルタミン酸−プラスミノーゲンの替わりに、上記列挙した組成の場合、プラスミンの活性に基づいた同様の量のものも用いることができる。プラスミンを直接的に用いる場合、上記薬剤組成中には、プラスミノーゲン活性化因子（またはその複数）は含まれてはならない。
【０２１５】
実験例９ｂ：薬剤組成
a)  ハイドロゲル
ハイドロゲルのための基本組成（100 g)
プラスミン：100 U
ヒドロキシエチルセルロース 400：2.5 - 5.0 g
純水：１００．０ｇに調整するように追加。
【０２１６】
膨張するまでの時間は、１から３時間である。１グラムのハイドロゲル当たり、１から１０００Ｕのプラスミンの利用が可能である。
【０２１７】
b)  親水性軟膏
親水軟膏の基本組成(1000 g):
プラスミン：1000 U
水を含まないグリセロール：85.0 g
ヒドロキシエチルセルロース10.000：32.5 g
任意のポリヘキサニド（polyhexanide）：0.2 重量％（パーセント）（weight-%）
乳酸が入っていないリンガー溶液：1000.0 gに調整するように追加。
【０２１８】
ポリヘキサニドは、０．２重量％までの濃度において、抗菌活性剤として加えてもよい。ヒドロキシエチルセルロース10.000 (ナトロソル（Natrosol）250（登録商標）HX PHARM)の替わりに、ヒドロキシエチルセルロース 400 (例えばタイローズ（Tylose）（登録商標）Ｈ 300、またはナトロソル250（登録商標）HX PHARM)を加えてもよい。
【０２１９】
１グラムの軟膏当たり、１から１００００Ｕのプラスミンの利用が可能である。
【０２２０】
c)  軟膏
軟膏のための基本組成(50 g)
プラスミン：50 U
マクロゴール400：30.0 - 32.5 g
マクロゴール4000：12.5 - 7.5 g
純水：50.0 gに調整するように追加。
【０２２１】
前処理（Preparation）:
１２．5 gのマクロゴール4000、30.0 g マクロゴール 400（やわらかい（supple）軟膏の場合、7.5 gのマクロゴール 4000 、および32.5 g のマクロゴール 400) を、そのマクロゴールが溶融するまで、水槽内の軟膏の皿（dish）の中で加熱する。本発明の方法によって生産された適当量のプラスミンを冷却した後、７．５ｇの純水中に溶解し、その後、ホモジナイズした（homogenized）。
【０２２２】
d）  カプセル
０．５ｇのための基本組成
プラスミン：5 U
ラクトース：0.42 g
デンプン：0.06 g
マグネシウムステアレート：0.02 g
１カプセル当たり、０．１から１００Ｕのプラスミンの利用が可能である。
【０２２３】
ｅ）  注射液/ 注入液（infusion solution）
１００ｍｌのための基礎組成
プラスミン：500 U
エタノール：0.01 g
プロピレングリコール：30 ml
純水：１００ｍｌに調整するように追加。
【０２２４】
１ｍｌの溶液当たり、１から５００Ｕのプラスミンの利用が可能である。
【０２２５】
プラスミンの替わりに、同時に少なくとも一つのプラスミノーゲン活性化因子を、１：１００００から１：１００の量、好ましくはプラスミノーゲン活性に基づき、１：１０００の量によって加える場合には、マイクロ−、ミニ−、リジン−、またはグルタミン酸−プラスミノーゲンを、上述の量によって、単位当たりの活性（activity in units）に基づく上記プラスミンのために用いてもよい。
【０２２６】
実験例１０ａ：様々な形態のミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の増幅およびクローニング、および、ベクターpPICZaAへのクローニング；ピキア・パストリスの形質転換
ミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲンは、そのＮ末端のドメインが欠失し、それにもかかわらず活性プラスミンへ活性化される、短いプラスミノーゲン派生物を意味する。ベクターpPICZαAへのクローニングのために、実験例１ａで言及した条件を利用して、ミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の増幅を、３’末端用にオリゴヌクレオチド プライマー N034と、 各場合について、特定の５’末端用にプライマーN036a-j（配列番号１９から２８）の中の一つとを用いて行った。そのオリゴヌクレオチドプライマーN036a、c、e、g、iは、さらに、プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点のコドンと相補的な塩基を有しており、プライマーN036b、d、f、h、j は、そのKex2切断点のコドンに続いて、さらに、２つのSte13切断点のコドンを有している。そのプライマーN034は、さらに、KspI切断点を有しており、プライマーN036a-jは、XhoI切断点を有している。
【０２２７】
実験例１ｂに記載したクローニングと類似の方法により、ミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子のベクターpPICZαA へのクローニングを行った。そのベクター、およびその特定のＰＣＲ産物を、制限酵素XhoIおよびKspIによって切断した。用いたプライマー、プラスミノーゲン派生物の名称、コードされたタンパク質分解酵素の切断点、得られたプラスミドのラベリング（labeling）、および、分泌されたプラスミノーゲン派生物のＮ末端のアミノ酸は、以下のテーブルにまとめられる。
【０２２８】
【表４】
2005525798.tif 000005
【０２２９】
＊   このラベリングは、８１０アミノ酸の長いプレプラスミノーゲン（配列番号１２）を示す。
【０２３０】
図８は、例示的なプラスミドpPLG1.1を示す。
【０２３１】
実験例１ｃのpMHS476.1について述べたように、ピキア・パストリス KM71Hをプラスミド pPLG1.1によって形質転換した。そのコロニーは、ピキア・パストリス KM71H/pPLG1.1-1/aとして示した。ここで、再び「a」は、１から始まるコロニーの連続番号を表す。
【０２３２】
プラスミドpPLG2.1、pPLG3.2、pPLG4.2、pPLG5.3、pPLG6.1、pPLG7.1、pPLG8.3、pPLG9.1、およびpPLG10.1を基礎とした菌株の生産は、菌株KM71H/pPLG1.1-1/aの生産によって行った。
【０２３３】
−  オリゴヌクレオチドプライマー N036a-j
N036a：AAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTG
N036b：AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG
N036c：AAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTG
N036d：AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTG
N036e：AAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTG
N036f：AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTG
N036g：AAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTG
N036h：AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTG
N036i：AAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCC
N036j：AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC
【０２３４】
実験例１０ｂ：様々な形態のミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の増幅およびクローニング、および、ベクターpGAPZaAへのクローニング；ピキア・パストリスの形質転換
ベクターpGAPZαAへのクローニングのために、実験例１ａで言及した条件を利用して、ミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の増幅を、３’末端用にオリゴヌクレオチド プライマー N034と、 各場合について、特定の５’末端用にプライマーN036a-j（配列番号１９から２８）の中の一つとを用いて行った。そのオリゴヌクレオチドプライマーN036a、c、e、g、iは、さらに、プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点のコドンと相補的な塩基を有しており、プライマーN036b、d、f、h、j は、そのKex2切断点のコドンに続いて、さらに、２つのSte13切断点のコドンを有している。そのプライマーN034は、さらに、KspI切断点を有しており、プライマーN036a-jは、XhoI切断点を有している。
【０２３５】
実験例１ｂに記載したクローニングと類似の方法により、ミニ−およびマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子のベクターpGAPZαAへのクローニングを行った。そのベクター、およびその特定のＰＣＲ産物を、制限酵素XhoIおよびKspIによって切断した。用いたプライマー、プラスミノーゲン派生物の名称、コードされたタンパク質分解酵素の切断点、得られたプラスミドのラベリング（labeling）、および、分泌されたプラスミノーゲン派生物のＮ末端のアミノ酸は、以下のテーブルにまとめられる。
【０２３６】
【表５】
2005525798.tif 000006
【０２３７】
＊   このラベリングは、８１０アミノ酸の長いプレプラスミノーゲン（配列番号１２）を示す。
【０２３８】
図９は、例示的なプラスミドpPLG11.2を示す。
【０２３９】
実験例７ａのpJW9.1について述べたように、ピキア・パストリス KM71Hを、制限酵素BlnIによって線状にしたプラスミドpPLG11.2によって形質転換した。得られたコロニーは、ピキア・パストリス KM71H/pPLG11.2-1/aとして示した。ここで、再び「ａ」は、１から始まるコロニーの連続番号を表す。
【０２４０】
プラスミドpPLG12.1、pPLG13.1、pPLG14.2、pPLG15.1、pPLG16.3、pPLG17.2、pPLG18.1、pPLG19.2 、およびpPLG20.1を基礎とした菌株の生産は、菌株KM71H/pPLG1.1-1/aの生産によって行った。
【０２４１】
配列プロトコール（Sequence protocol）
【０２４２】
配列番号1: オリゴヌクレオチド プライマー N034
AAAAACCGCGGTCAATTATTTCTCATCACTCCC
【０２４３】
配列番号2: オリゴヌクレオチド プライマー N036
AAAAACTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTG
【０２４４】
配列番号3: オリゴヌクレオチド プライマー N057
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTG
【０２４５】
配列番号4: オリゴヌクレオチド プライマー N037
AAAAATTCGAAAAATGGAACATAAGGAAGTGG
【０２４６】
配列番号5: オリゴヌクレオチド プライマー N035
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTAT
【０２４７】
配列番号6: オリゴヌクレオチド プライマー N056
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTAT
【０２４８】
配列番号7：Kex2切断点のコドン、および、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のシグナル配列の遺伝子を有する、ヒトのリジン−プラスミノーゲン融合遺伝子
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTAC
AGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCT
CCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTAC
TGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAG
AGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAA
AACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCT
CAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAG
AATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAAC
AAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCC
ACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTT
TCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCA
GAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGG
GCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCC
TGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACC
CCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACC
ACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAG
ACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCC
GATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTG
AAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCA
GATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGC
AAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCAT
AGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGC
CGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTT
TACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAA
GTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCC
TGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTG
ATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCA
TCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAA
ATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTA
AGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTAT
GTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTT
GGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGC
TATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGA
GGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAA
TACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGT
GTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０２４９】
配列番号8：Kex2切断点、および、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のシグナルペプチドを有する、ヒトのリジン−プラスミノーゲン
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV
AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRKVYLSECKTGNGKNY
RGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQG
PWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDS
QSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPR
CTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTP
ENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQ
LAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQK
TPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASV
VAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPH
RHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCA
APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTL
ISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEP
TRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTF
GAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSG
GPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２５０】
配列番号9：Kex2切断点および２つのSte13切断点のコドン、および、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のシグナル配列の遺伝子を有する、ヒトのリジン−プラスミノーゲン融合遺伝子
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAAT
GGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGG
AGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTG
GAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACT
GATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCAT
TGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAG
GCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAG
AACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACC
ACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCA
TCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTG
GCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACAT
AACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCT
GACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGT
AAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCA
CCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGC
ACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACAC
CGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGG
AATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAG
TACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTT
GTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAA
GGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCC
CAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAA
AAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAAT
CCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGT
GGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCC
CACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGT
GGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCC
CCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCG
CATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCC
TTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCA
TCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACC
CAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAA
GTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGG
CATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTC
GAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCC
AATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATG
AGAAATAATTGA                                               .
【０２５１】
配列番号10：Ste13およびKex2切断点、および、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のシグナルペプチドを有する、ヒトのリジン−プラスミノーゲン
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV
AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKVYLSECKTGN
GKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDN
DPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQ
AWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELC
DIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTH
NRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPV
STEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPH
RHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGT
EASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAA
QEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDV
PQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFC
GGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRL
FLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGET
QGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQ
GDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVM
RNN*                                             .
【０２５２】
配列番号11：ヒトのプレプラスミノーゲン遺伝子
ATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAGAG
CCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAG
CTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACC
TGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGG
AAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTC
TCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAAT
GGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCT
ACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAG
GGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAG
TGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACC
ATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATT
CCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAG
CTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCC
CGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGT
GAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGT
GCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGAT
GAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGC
CAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAA
CAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGT
GATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCT
TGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGC
CTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACA
GACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGT
GTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGAC
TGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACG
CCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACA
AATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGT
CCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGT
GCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGG
GTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACA
AGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCT
GCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACAC
CAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAG
CCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAA
GTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTC
ATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAG
CTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAA
TCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGT
GGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGG
GGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTT
ACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA                          .
【０２５３】
配列番号12：ヒトのプレプラスミノーゲン
MEHKEVVLLLLLFLKSGQGEPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECA
AKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYL
SECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEEN
YCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKT
MSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDP
NKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWS
AQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIP
SCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQS
WSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCN
LKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGT
PCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRK
LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRT
RFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQ
EIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECF
ITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLA
GGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFV
TWIEGVMRNN*                                      .
【０２５４】
配列番号13：Kex2切断点のコドン、および、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のシグナル配列の遺伝子を有する、ヒトのグルタミン酸−プラスミノーゲン融合遺伝子
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTC
AGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAG
GAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTG
ATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTT
GAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACG
ATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGA
CCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAAT
CCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGAC
TACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGAC
GGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCA
CACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGT
CGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGG
GAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAG
TGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCAC
ACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTC
CCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGG
TGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCC
TCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTC
CAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACA
GGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAA
AACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGC
CCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGC
TCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAG
ACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCG
ACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGC
ATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCT
GATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTAC
TGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCG
AAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGG
CAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCA
GAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAG
GTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTG
TCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCT
GCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCT
GACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGC
CTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTT
CTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGAC
AGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTA
CAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTT
CGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA        .
【０２５５】
配列番号14：Kex2切断点、および、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のシグナルペプチドを有する、ヒトのグルタミン酸−プラスミノーゲン
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV
AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREPLDDYVNTQGASLF
SVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSI
IIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHR
PRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEE
CMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYC
RNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYR
GNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPW
CHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQS
YRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKG
PWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFG
NGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNP
DGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGG
CVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYK
VILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPA
CLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEF
LNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGC
ARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*                      .
【０２５６】
配列番号15：Kex2切断点および２つのSte13切断点、および、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のシグナル配列の遺伝子を有する、ヒトのグルタミン酸−プラスミノーゲン融合遺伝子
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGG
GCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCA
GCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAG
CAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGAT
GTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAAC
TACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACT
TCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAAC
TACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAA
AAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGA
GAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGAC
TCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAG
AAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCC
AACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGT
CCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACC
GTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACA
CCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAA
AGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCG
TCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTA
ACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCC
ACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAG
AAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGAT
GCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAAC
CTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTT
CCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGA
GGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCC
CATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTAC
TGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAA
CTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCT
CAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACAT
TCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACC
TTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCT
TCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAG
GAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAG
CTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAAT
TATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACT
TTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAAT
CGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCC
GGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGAC
AAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCT
GGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAAT
TGA                                                        .
【０２５７】
配列番号16：Ste13およびKex2切断点、および、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のシグナルペプチドを有する、ヒトのグルタミン酸−プラスミノーゲン
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV
AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAEPLDDYVNTQG
ASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENR
KSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSST
SPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILE
CEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLK
KNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTG
ENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGK
RAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHG
DGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPD
ADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEED
CMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNY
CRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGR
VVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRP
SSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDK
VIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCN
RYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSW
GLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*         
【０２５８】
配列番号17：培養液に分泌されるグルタミン酸−プラスミノーゲン（pSM49.8, pSM58.1 および pSM82.1)の配列
EPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSK
EQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTK
NGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDP
EKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGY
IPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSS
GPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNL
DENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPE
LTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNA
GLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVL
LPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPE
TNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGK
PQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLT
AAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALL
KLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEA
QLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEK
DKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２５９】
配列番号18：培養液に分泌されるリジン−プラスミノーゲン(pMHS476.1, pSM54.2, pAC37.1 およびpJW9.1)の配列
KVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEG
LEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGK
ISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCF
TTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTC
QHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEY
CKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGK
KCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRW
EYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATT
VTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTT
NPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQV
SLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLE
PHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADR
TECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCA
GHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRV
SRFVTWIEGVMRNN*
【０２６０】
配列番号19：オリゴヌクレオチド プライマー N036a
AAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTG 
【０２６１】
配列番号20：オリゴヌクレオチド プライマー N036b
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG
【０２６２】
配列番号21: オリゴヌクレオチド プライマー N036c
AAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTG
【０２６３】
配列番号22: オリゴヌクレオチド プライマー N036d
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTG
【０２６４】
配列番号23: オリゴヌクレオチド プライマー N036e
AAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTG
【０２６５】
配列番号24: オリゴヌクレオチド プライマー N036f
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTG
【０２６６】
配列番号25: オリゴヌクレオチド プライマー N036g
AAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTG
【０２６７】
配列番号26: オリゴヌクレオチド プライマー N036h
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTG
【０２６８】
配列番号27: オリゴヌクレオチド プライマー N036i
AAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCC
【０２６９】
配列番号28: オリゴヌクレオチド プライマー N036j
AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC
【０２７０】
配列番号29：ミニ−プラスミノーゲン (pPLG1.1およびpPLG2.1)
APPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHR
HSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAA
PSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLI
SPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPT
RKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFG
AGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGG
PLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２７１】
配列番号30：マイクロ−プラスミノーゲン(pPLG3.2およびpPLG4.2)
KLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLR
TRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHV
QEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTEC
FITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHL
AGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRF
VTWIEGVMRNN*
【０２７２】
配列番号31：マイクロ−プラスミノーゲン (pPLG5.3およびpPLG6.1)
LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRT
RFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQ
EIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECF
ITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLA
GGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFV
TWIEGVMRNN*
【０２７３】
配列番号32：マイクロ−プラスミノーゲン (pPLG7.1およびpPLG8.3)
APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTL
ISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEP
TRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTF
GAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSG
GPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２７４】
配列番号33：マイクロ−プラスミノーゲン (pPLG9.1およびpPLG10.1)
SFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLIS
PEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTR
KDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGA
GLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGP
LVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２７５】
配列番号34：pPICZαAにおける、Kex2切断点までの、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のα因子のＤＮＡ配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAG
【０２７６】
配列番号35：pPICZαにおける、Kex2切断点までの、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のα因子のアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLE
【０２７７】
配列番号36：Kex2切断点のＤＮＡ配列
AAAAGA
【０２７８】
配列番号37：Ste13切断点のＤＮＡ配列
GAGGCTGAAGCT
【０２７９】
配列番号38：Kex2切断点のアミノ酸配列
KR
【０２８０】
配列番号39：Ste13切断点のアミノ酸配列
EAEA
【０２８１】
配列番号40：Kex2切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG1.1内のヒトのミニ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV
AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPPPVVLLPDVETPS
EEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLE
KNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKC
PGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKS
PRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVI
TDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENK
VCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGV
TSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２８２】
配列番号41：Kex2切断点および２つのSte1切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG2.1内のヒトのミニ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDV
AVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAPPPVVLLPDV
ETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPR
AGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVE
PKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHC
LEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSS
PAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPV
IENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYI
LQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２８３】
配列番号42：Kex2切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG3.2内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２８４】
配列番号43：Kex2切断点および２つのSte13切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG4.2内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２８５】
配列番号44：Kex2切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG5.3内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２８６】
配列番号45：Kex2切断点および２つのSte13切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG6.1内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEALYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２８７】
配列番号46：Kex2切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG7.1内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２８８】
配列番号47：Kex2切断点および２つのSte13切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG8.3内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２８９】
配列番号48：Kex2切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG9.1内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２９０】
配列番号49：Kex2切断点および２つのSte13切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドとを有する、pPLG10.1内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEASFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
【０２９１】
配列番号50：Kex2切断点と、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG1.1 内のヒトのミニ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０２９２】
配列番号51：Kex2切断点およびSte13切断点のコドンと、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG2.1内のヒトのミニ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０２９３】
配列番号52：Kex2切断点のコドンと、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG3.2内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０２９４】
配列番号53：Kex2切断点およびSte13切断点のコドンと、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG4.2内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０２９５】
配列番号54：Kex2切断点のコドンと、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG5.3内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０２９６】
配列番号55：Kex2切断点およびSte13切断点のコドンと、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG6.1内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０２９７】
配列番号56：Kex2切断点のコドンと、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG7.1内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０２９８】
配列番号57：Kex2切断点およびSte13切断点のコドンと、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG8.3内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０２９９】
配列番号58：Kex2切断点のコドンと、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG9.1内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０３００】
配列番号59：Kex2切断点およびSte13切断点のコドンと、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエのα因子のプレプロペプチドの遺伝子とを有する、pPLG10.1内のヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０３０１】
配列番号60：pPLG1.1およびpPLG2.1内の、ヒトのミニ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
GCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATG
TTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGC
CAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCA
CGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGG
TGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCC
CCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTG
GGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTT
GGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCAC
TGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAA
GTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACA
CGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATC
CCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACT
GGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCT
GTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACC
GAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGT
CCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTT
GGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGG
ATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０３０２】
配列番号61：pPLG3.2およびpPLG4.2内の、ヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
AAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０３０３】
配列番号62：pPLG5.3およびpPLG6.1内の、ヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
CTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０３０４】
配列番号63：pPLG7.1およびpPLG8.3内の、ヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
GCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０３０５】
配列番号64：pPLG9.1およびpPLG10.1内の、ヒトのマイクロ−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
TCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０３０６】
配列番号65：ヒトのグルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
GAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAG
CAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTC
ACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAAC
AGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTAT
CTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAA
AATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCT
GCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCG
CAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTT
GAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAG
ACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATAC
ATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGG
GAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATC
CCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACA
GGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGG
AGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTG
GATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAAC
AGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACG
GAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCAT
GGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAG
TCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCT
GGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACC
ACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCG
AGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAA
GACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGG
ACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAG
ACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGT
GGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAG
TGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGA
AGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGA
ACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACT
GCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCA
CACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTG
GAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGAC
AAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGT
TTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCC
CAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTC
CAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGAC
AGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCT
TGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTT
GTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０３０７】
配列番号66：ヒトのリジン−プラスミノーゲン遺伝子の核酸配列
AAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCC
AAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGA
TTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGAC
AACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGC
GACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAA
ATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCT
CATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAAC
CCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTT
TGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTG
AAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGT
CAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGC
AAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCAT
ACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCA
GTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGAC
TGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAG
AAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTAC
CCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGG
TGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGA
ACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCT
TCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACT
GTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTC
ACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGT
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GTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAA
TGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTC
AGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGG
GTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATC
CTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGG
CTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTC
ATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGG
ACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTC
AAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAAT
GGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGC
CAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGA
GTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTT
TCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
【０３０８】
参考文献
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(13)  =  Stack et al., Biochem. J. 284, 1992
【図面の簡単な説明】
【０３０９】
本発明は、以下に示す図面によってその詳細が説明される。：
【図１】図１は、プラスミド pMHS476.1 (5682 bp（塩基対）)の物理的地図（Physical mapping）である。α因子のプレプロペプチドの遺伝子は、ヒトのリジン−プラスミノーゲン遺伝子のKex２切断点のためのコドンによって連結されており、AOX1−プロモーターの制御下におかれる。
【図２】図２は、プラスミド pSM54.2 (5694 bp)の物理的地図である。α因子のプレプロペプチドの遺伝子は、ヒトのリジン−プラスミノーゲン遺伝子のKex２切断点および２つのSte13の切断点のためのコドンによって連結されており、AOX1−プロモーターの制御下におかれる。
【図３】図３は、プラスミド pSM49.8 (5715 bp)の物理的地図である。ヒトのプレプラスミノーゲン（preplasminogen）遺伝子は、AOX1-プロモーターの制御下におかれる。
【図４】図４は、プラスミド pSM82.1 (5913 bp)の物理的地図である。α因子のプレプロペプチドの遺伝子は、ヒトのリジン−プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点のためのコドンによって連結されており、AOX1-プロモーターの制御下におかれる。
【図５】図５は、プラスミド pSM58.1 (5925 bp)の物理的地図である。α因子のプレプロペプチドの遺伝子は、ヒトのグルタミン酸−プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点および２つのSte13切断点のためのコドンによって連結されており、AOX1−プロモーターの制御下におかれる。
【図６】図６は、プラスミド pAC37.1 (11400 bp)の物理的地図である。α因子のプレプロペプチドの遺伝子は、ヒトのリジン−プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点および２つのSte13切断点のためのコドンによって連結されており、AOX1−プロモーターの制御下におかれる。
【図７】図７は、プラスミド pJW9.1 (5925 bp)の物理的地図である。α因子のプレプロペプチドの遺伝子は、ヒトのリジン−プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点および２つのSte13切断点のためのコドンによって連結されており、GAP−プロモーターの制御下におかれる
【図８】図８は、プラスミド pPLG1.1の物理的地図である。α因子のプレプロペプチドの遺伝子は、ヒトのミニ−プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点および２つのSte13切断点のためのコドンによって連結されており、AOX1−プロモーターの制御下におかれる。
【図９】図９は、プラスミド pPLG11.2の物理的地図である。α因子のプレプロペプチドの遺伝子は、ヒトのミニ−プラスミノーゲン遺伝子のKex2切断点および２つのSte13切断点のためのコドンによって連結されており、GAP−プロモーターの制御下におかれる。
【図１０】図１０は、クラーホフ・アッセイ（Klarhof assay）における繊維素溶解活性の検出を示す図である。
【図１１】図１１は、実験例６ｇの精製フラクションの7.5 % SDS-PAGEを示す図である。
【図１】
2005525798.tif 000007
【図２】
2005525798.tif 000008
【図３】
2005525798.tif 000009
【図４】
2005525798.tif 000010
【図５】
2005525798.tif 000011
【図６】
2005525798.tif 000012
【図７】
2005525798.tif 000013
【図８】
2005525798.tif 000014
【図９】
2005525798.tif 000015
【図１０】
2005525798.tif 000016
【図１１】
2005525798.tif 000017
【配列表】
2005525798000001.app
【国際調査報告】
2005525798.tif 000018
2005525798.tif 000019
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