(57)【要約】抗原提示の促進および免疫応答の増強のための担体分子およびアジュバントとしてのコレラ毒素およびそのＢサブユニットの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するための方法であって、下記工程：
ａ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）をエクスビボで、
ｉ）コレラ毒素、そのＢサブユニットまたは関連の毒素または細胞結合蛋白；
ｉｉ）該腫瘍細胞に特異的な抗原；
と、該ＡＰＣを活性化させ該腫瘍細胞に対する免疫応答を促進するために有効な濃度および時間において、接触させること；
ｂ）未結合分の該コレラ毒素またはそのＢサブユニットおよび該腫瘍抗原を該ＡＰＣから洗浄除去すること；および、
ｃ）該腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するために有効な該ＡＰＣの量を該哺乳類にインビボ投与すること、
からなる方法。
【請求項２】
関連の毒素または細胞結合蛋白がＡＤＰリボシル化毒素、そのサブユニット、植物レクチンおよびウィルス連結蛋白よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
該腫瘍細胞が肺、結腸直腸、膵臓、前立腺、卵巣、乳房、多発性骨髄腫、白血病および黒色腫の腫瘍から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
該腫瘍が固形腫瘍である請求項１記載の方法。
【請求項５】
該腫瘍が播種性の腫瘍である請求項１記載の方法。
【請求項６】
該腫瘍が転移腫瘍である請求項１記載の方法。
【請求項７】
該コレラ毒素またはＢサブユニットまたは関連の蛋白が、該腫瘍抗原に化学的にカップリングされる請求項１記載の方法。
【請求項８】
該コレラ毒素またはそのＢサブユニットが、該腫瘍抗原に遺伝子的にカップリングされる請求項１記載の方法。
【請求項９】
該腫瘍抗原が、該腫瘍からの抽出物からなり、該腫瘍抽出物が不活性化されている請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該抽出物が、膜調製物である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該膜調製物が、不活性化されている請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該ＡＰＣが、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肥満細胞および上皮細胞から選択される請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該上皮細胞が、ケラチノサイト、口腔上皮、胃腸上皮および生殖管上皮細胞から選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該ＡＰＣが、該ＡＰＣを投与する予定である哺乳類宿主から単離される請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該ＡＰＣが、該ＡＰＣを投与する予定であるものとは異なる哺乳類宿主から単離される請求項１記載の方法。
【請求項１６】
該コレラ毒素または関連の蛋白を該腫瘍抗原と混合する請求項１記載の方法。
【請求項１７】
該免疫応答を増強するために有効なコレラ毒素の量を該接触工程に加える請求項１記載の方法。
【請求項１８】
請求項１記載の方法に従って処理された単離ＡＰＣ。
【請求項１９】
該ＡＰＣが、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肥満細胞および上皮細胞から選択される請求項１８記載のＡＰＣ。
【請求項２０】
該上皮細胞が、ケラチノサイト、口腔上皮、胃腸上皮および生殖管上皮細胞よりなる群から選択される請求項１９記載のＡＰＣ。
【請求項２１】
哺乳類における抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、下記工程：
ａ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）をエクスビボで
ｉ）コレラ毒素、そのＢサブユニットまたは関連の毒素または細胞結合蛋白；
ｉｉ）非自己抗原または抗原の群；
と、該ＡＰＣを活性化させ、該抗原又は抗原類に対する免疫応答を促進するために有効な濃度および時間において、接触させること；
ｂ）未結合の該コレラ毒素またはそのＢサブユニットおよび非自己抗原または抗原類を該ＡＰＣから洗浄除去すること；および、
ｃ）該抗原または抗原類に対する免疫応答を誘導するために有効な該ＡＰＣの量を該哺乳類に投与すること、
からなる方法。
【請求項２２】
該毒素が、細胞結合蛋白である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該細胞結合蛋白が、ＡＤＰリボシル化毒素、そのサブユニット、植物レクチンおよびウィルス連結蛋白よりなる群から選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該非自己抗原が、細菌、ウィルス、真菌、原虫または蠕虫から誘導される請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
該非自己抗原が、蛋白、ペプチド、炭水化物、脂質またはその複合体である請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
該非自己抗原が、非自己蛋白、ペプチド、炭水化物、脂質またはその複合体をコードするＤＮＡである請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
該コレラ毒素またはＢサブユニットが、該免疫原性ペプチドまたは蛋白に化学的にカップリングされる請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
該コレラ毒素Ｂサブユニットが、該免疫原性ペプチドまたは蛋白に遺伝子的にカップリングされる請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
該ＡＰＣが、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肥満細胞および上皮細胞から選択される請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
該上皮細胞が、ケラチノサイト、口腔上皮、胃腸上皮および生殖管上皮細胞群から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
該ＡＰＣが、該ＡＰＣを投与する予定である哺乳類宿主から単離される請求項２１記載の方法。
【請求項３２】
該ＡＰＣが、該ＡＰＣを投与する予定であるものとは異なる哺乳類宿主から単離される請求項２１記載の方法。
【請求項３３】
該コレラ毒素またはＢサブユニットを該免疫原性ペプチドまたは蛋白と混合する請求項２１記載の方法。
【請求項３４】
該免疫応答を増強するために有効なコレラ毒素の量を該接触工程に加える請求項２１記載の方法。
【請求項３５】
請求項２１記載の方法に従って処理された、単離抗原提示細胞（ＡＰＣ）。
【請求項３６】
該ＡＰＣが、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、肥満細胞および上皮細胞から選択される請求項３５記載のＡＰＣ。
【請求項３７】
該上皮細胞が、ケラチノサイト、口腔上皮、胃腸上皮および生殖管上皮細胞よりなる群から選択される請求項３６記載のＡＰＣ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクスビボで種々の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する作用を通じて抗原提示を促進し免疫応答を増強するための、担体分子およびアジュバント（抗原性補強剤）としてのコレラ毒素（ＣＴ）およびそのＢサブユニット（ＣＴＢ）の使用に関する。ＣＴＢは、パルスしたＡＰＣの同系マウスへのワクチン接種およびそれに続く蛋白またはペプチドによる追加免疫により明らかにされるとおり、Ｔｈ２応答を強力に促進する樹状細胞（ＤＣ）および他のＡＰＣのエクスビボでの抗原パルシングのための効率的な担体分子である。アジュバントとしてのＣＴで樹状細胞を処理することもまた、その免疫刺激能力を顕著に増強したが、Ｔｈ１応答をひき出しやすくもあった。ＣＴおよびＣＴＢの見かけ上異なる担体およびアジュバント機能は、組み合わさると、先ず抗原が直接ＣＴに連結し、その後ＤＣパルシングを行なった場合に、効力が最高値となり、これはその後は更に強力なＴｈ１応答の傾向を示し、また、腫瘍モデル系においては、固形腫瘍ができた後においても、腫瘍抗原特異的細胞毒性リンパ球の発生および腫瘍細胞を排除する能力をもたらした。
【背景技術】
【０００２】
コレラ毒素（ＣＴ）は、関連および非関連の抗原に対する強力な粘膜アジュバントとして作用する能力も有する極めて強力な粘膜免疫原として知られており、また極めて高い毒性を有する（非特許文献１）。経口アジュバントとして作用するＣＴの能力はまた、多数の研究者により確認されている（非特許文献２）。コレラ毒素は、それ自体に対する免疫応答を刺激し、そのアジュバント活性はその免疫原性と緊密に関連していることから、アジュバントの伝統的な定義を満足しない（非特許文献３）。ＣＴおよび大腸菌熱感受性エンテロトキシン（ＬＴ）の強力なアジュバント活性を説明するそれらの免疫モジュレート作用としては、数種の型のＢ細胞による抗原提示の増強、ＩｇＡアイソタイプへのＢ細胞の分化の増加、Ｔ細胞との相互作用およびサイトカイン生産の誘導がある（非特許文献４）。
【０００３】
より毒性の低いコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）および緊密に関連する大腸菌熱感受性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴＢ）は、粘膜抗体応答の誘導のため  （非特許文献５〜８）並びに粘膜誘導された全身Ｔ細胞（非特許文献９）およびＢ細胞経口寛容性（非特許文献１０〜１２）の誘導のための、極めて効率的な担体分子である。後者の所見は、粘膜表面を介してのＣＴＢコンジュゲート抗原の投与によるＴ細胞媒介自己免疫（４，４３，４８）、ＩｇＥ−媒介アレルギー性（非特許文献１０〜１２）および感染症誘発病理学的炎症状態（非特許文献１３）の予防および／または治療のための抗原特異的免疫寛容手法の開発をもたらしている。
【０００４】
ＣＴＢ媒介経口寛容性の治療適用は、動物モデルにおいてはＴ細胞媒介自己免疫疾患（非特許文献１４〜１６）、ＩｇＥ媒介アレルギー反応（非特許文献１０〜１２）および感染症誘発病理学的炎症状態（非特許文献１７、非特許文献１３）の予防および治療を含む。粘膜担体分子としてのＣＴＢまたはＬＴＢの有する機序は完全に明確化されていないが、上皮細胞および白血球を含む体内の大部分の細胞上に存在するＧＭＩ受容体へのＣＴＢまたはＬＴＢの強力な結合に関与すると考えられている。ＧＭＩの効率的な結合は、潜粘膜を経由した抗原の取りこみも増強する可能性があり、免疫系へのコンジュゲート分子の提示を高めることになる（非特許文献６、非特許文献１８）。別の可能性は、ＣＴＢが免疫モジュレート特性を有することである。実際、ＣＴＢがＢ細胞上のＭＨＣクラスＩＩの発現を誘発し（非特許文献１９）、増強されたＭＨＣＩＩ発現がないときでもマクロファージによる抗原提示を増強し（非特許文献２０）、そして、調節細胞の発生を介してＮＯＤマウスの糖尿病の発症をブロックする（非特許文献２１）ことが示された。
【０００５】
粘膜抗原特異的抗体形成および寛容性の誘導は、初期免疫活性化を必要とする点で共通している（非特許文献２２）。抗原特異的Ｔ細胞の活性化の第１段階は、同時刺激シグナルとともに細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩとの複合体で抗原を吸着、加工および提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）により制御される。次に応答したＴ細胞はＣＤ４＋サブセットとなり、Ｔｈ１またはＴｈ２または他のヘルパーまたは調節細胞の何れかに成長する。ＡＰＣはまた、細胞表面のＭＨＣクラスＩ、または、より最近の報告によれば、ＣＤ１分子の何れかとの複合体で抗原を提示することもできる。ＭＨＣクラスＩの意味において提示される抗原は通常は、例えば細胞内の細菌、ウィルスまたは寄生性の抗原（細胞内で異種の抗原を発現するように操作された生物のような組み換え体を含む）による感染の結果としてＡＰＣ内において細胞内生産され、そしてＣＴＬに成長する場合のある同族のＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される。しかしながら、一部の型の外来性抗原、限定されるわけではないが、例えば粒子状の抗原製剤は、またＡＰＣＭＨＣクラスＩ経路に転座され、ＣＴＬを含むＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する場合がある。蛋白のＣＤ１ファミリーは、大部分のＡＰＣにおいて顕著に発現され、これらの蛋白は最近では、主に種々の脂質および糖脂質の抗原をＣＤ１反応性／制限性Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４／ＣＤ８二重陰性Ｔ細胞に提示することにより、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩに加えて別の抗原提示系をもたらすことが解かった。
【０００６】
ＡＰＣは細胞の型により異なる複数の抗原取りこみ機序を利用している。Ｂ細胞は通常は、１つの特異的抗原を認識して結合する膜結合抗体受容体を有するが、他のＡＰＣ、例えば樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージ（ＭΦ）はＦｃ受容体およびＣ型マルチレクチン受容体を介した、より広い範囲の結合特異性を有しており、マクロピノサイトーシスおよび貪食作用によって抗原を吸収することもできる（非特許文献２３）。抗原の性質の外に、関与するＡＰＣおよび存在する、及び／または誘導されるサイトカインの性質がその後のＴ細胞応答の結果にとって重要な決定要因となる。即ち、Ｔ細胞活性化の水準は、ＡＰＣ表面上に存在する、特異的ペプチド負荷ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６のような同時刺激分子の密度により  （非特許文献２４、２５）、そして、ＩＬ−１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８のような生産されるサイトカインのレベル（非特許文献２６〜２８）により異なる。
【０００７】
癌
癌は合衆国における死亡原因の第２位となっている。１９９９年の癌による死亡数は５６３，１００例と推定されている。毎年約１，２２２，０００例の新しい癌が診断されている。
【０００８】
癌の予防および腫瘍生育の抑制において免疫系が重要な役割を果たしていることを示す実質的証拠がある。これには自発的腫瘍退行がしばしば観察されること、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在との自発的退行の相関、および、腫瘍抗原に対して特異的なＴＩＬの同定が包含される。しかしながら、癌の発生率から明らかなように、免疫応答は腫瘍と対抗するには不十分である場合が多い。過去４０年間、免疫機序の理解の増進により腫瘍に対する免疫応答を増強する試みが開発されてきた。これらには免疫刺激分子をコードする遺伝子の腫瘍細胞中での発現および腫瘍抗原提示の増強のための幾つかの方法が含まれる。残念なことに、有益な効果を示すものは僅かであり、免疫療法のためにこのような新しい方法を利用する試みは失望させられるものであった。
【０００９】
近年、癌ワクチンの開発が新たな関心を呼んでいる。これは部分的には、新しい腫瘍特異的抗原が同定されたこと、および、抗原提示およびリンパ球活性化の重要性の理解が深まったことに起因している。
免疫療法の目的は、出来た腫瘍に対する患者の免疫応答を増強することである。免疫療法の１つの方法はアジュバントの使用を包含する。微生物に由来するアジュバント物質、例えばバチルスＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎは免疫応答を高め、動物における腫瘍への抵抗性を高める。バチルスＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎは多くの臨床治験において試験されているが、結果は決定的なものではなく、この型の細菌アジュバント療法の価値は不明である（非特許文献２９）。
【非特許文献１】
Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；１４９：３７１９−３７
【非特許文献２】
ＭｃＧｈｅｅ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９２；１０（２）：７５−８８
【非特許文献３】
Ｅｌｓｏｎ，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．１９８７；４６：１７７８
【非特許文献４】
Ｌｉｎｔｅｒｍａｎｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９５；１８：７３−８９
【非特許文献５】
Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９８９；５７：１０７２−７
【非特許文献６】
Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９６
【非特許文献７】
Ｌｉｐｓｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１；５：１３８５−１３９２
【非特許文献８】
ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８４；１３３：１８１８−１８２４
【非特許文献９】
Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９４；９１：１０７９５−１０７９９
【非特許文献１０】
Ｒａｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２０００；３０：１０２４−１０３２
【非特許文献１１】
Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９７；１５：２２５−２２９
【非特許文献１２】
Ｗｉｅｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１１：１７１７−１７２４
【非特許文献１３】
Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６３：１０４５−１０５２
【非特許文献１４】
Ｂｅｒｇｅｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７；９４：４６１０−４６１４
【非特許文献１５】
Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９６  ９３：７１９６−７２０１
【非特許文献１６】
Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  １９９９；４２：１６２８−１６３４
【非特許文献１７】
ＭｃＳｏｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；２８：４２４−３２
【非特許文献１８】
Ｐｒｏｃ．  ｎａｔｌ．  ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：２２６−２３０
【非特許文献１９】
Ｆｒａｎｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；１４８：１９９９−２００５
【非特許文献２０】
Ｍａｔｏｕｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９８；６６：３４８０−３４８４
【非特許文献２１】
Ｓｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９８；４７：１８６−１９１
【非特許文献２２】
Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９６；２６：３１９４−３２０２
【非特許文献２３】
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；３９２；２４５−２５２
【非特許文献２４】
ＭｃＡｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １９９８；  １６５：２３１−２４７
【非特許文献２５】
ｖａｎ  Ｇｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．１９９６；  １５３：４７−８３
【非特許文献２６】
Ｋｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；１５８：１５４１−１５５０
【非特許文献２７】
Ｏ’Ｇａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  １９９８；８：２７５−２８３
【非特許文献２８】
Ｗｅａｖｅｒｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １９９０；  １１：４９−５５
【非特許文献２９】
Ｐｉｅｓｓｅｎｓ，Ｗ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，“Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｉｎ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．１−１３，１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
１つの実施態様において、本発明は哺乳類における非自己、外来の抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、コレラ毒素（ＣＴ）またはそのＢサブユニット（ＣＴＢ）または関連毒素または細胞結合蛋白および外来抗原に抗原提示細胞（ＡＰＣ）を接触させ、ＡＰＣを活性化するのに十分な時間ＡＰＣ／毒素／抗原をインキュベートし、未結合のＡＰＣ／毒素／抗原を洗浄し、そして、抗抗原免疫応答を誘導するために効果的な量のＡＰＣを哺乳類に投与する工程を包含する方法を提供する。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、哺乳類における抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、コレラ毒素、そのＢサブユニットまたは関連の毒素または細胞結合蛋白、非自己抗原または抗原の群と、該ＡＰＣを活性化させ該抗原に対する免疫応答を促進するために有効な濃度および時間、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をエクスビボで、接触させること、未結合の該コレラ毒素またはそのＢサブユニットおよび非自己抗原または抗原類を該ＡＰＣから洗浄除去すること；および、該抗原または抗原類に対する免疫応答を誘導するために有効な該ＡＰＣの量を該哺乳類に投与する工程を包含する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の上記態様およびその他の態様は、本発明の明細書および図面を参照することにより当業者が容易に理解できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書中に引用した全ての特許出願、特許および参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は化学的コンジュゲートによる、または、コレラ毒素またはその非毒性Ｂサブユニットおよび蛋白またはペプチド抗原のキメラコンストラクトによるカップリングが、抗原提示細胞に曝露された場合の免疫応答を高めるという予測できなかった発見に関する。
【００１４】
定義
本明細書において使用する用語は一般的に、本発明の記述の範囲において、そして各用語が使用される特定の記述において、当該分野で通常の意味を有する。特定の用語を以下および明細書中の別の個所に記載することにより、本発明の組成物および方法、およびその製造および使用方法の説明において、当業者に対して更に指針が与えられる。
【００１５】
「約」または「概ね」という用語は、数値を計測または測定する方法、即ち測定系の限度に一部依存している、当業者により決定される特定の数値の許容できる誤差範囲内にあることを意味する。例えば「約」とは当該分野の慣行により、標準偏差１またはそれ以上の範囲内にあることを意味する。或いは、「約」とは所定の数値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで更に好ましくは１％までの範囲にあることを意味する。或いは、特に生物学的な系または方法に関しては、用語はあるオーダー内、好ましくは数値の５倍以内、更に好ましくは２倍以内にあることを意味する。
【００１６】
「突然変異体」または「突然変異」という用語は遺伝子的物質、例えばＤＮＡにおける検知可能な何らかの変化、またはそのような変化の何らかの過程、機序または結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えばＤＮＡ配列）が変化するような遺伝子の突然変異、何らかの突然変異過程により生じる何らかの遺伝子またはＤＮＡ、および、修飾された遺伝子またはＤＮＡの配列により発現される何らかの発現産物（例えばＲＮＡ、蛋白または酵素）が包含される。「変異体」という用語もまた修飾または改変された遺伝子、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ、酵素、細胞等、即ち何れかの種類の突然変異体を指すために使用してよい。
【００１７】
本明細書においては、「単離された」という用語は対象となる物質が通常存在する環境から取り除かれることを意味する。即ち、単離された生物学的物質は細胞成分、即ち、その物質が見い出されるまたは生産される細胞の成分を含有しない。核酸分子の場合は、単離された核酸はＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは制限フラグメントを含む。別の実施態様において、単離された核酸は好ましくは、それが存在する染色体から切り出されたものであり、より好ましくは、染色対中に見い出される場合の単離された核酸分子により含まれる遺伝子の上流または下流に位置する非調節、非コーディング領域または他の遺伝子にもはや連結していないものである。
【００１８】
更に別の実施態様においては、単離された核酸はイントロン１個以上を欠失している。単離された核酸分子には、プラスミド、コスミド、人工染色体等に挿入された配列を包含する。即ち、特定の実施態様においては、組み換え核酸が単離された核酸である。単離された蛋白は、細胞内でこれと会合している他の蛋白または核酸、または双方、または膜関連蛋白である場合は細胞膜を伴っていてもよい。単離されたオルガネラ、細胞または組織はそれらが生物中に見い出される解剖学的部位から取り除かれる。単離された物質は精製してもよいが、それを必要としない。
【００１９】
本明細書において「精製された」という用語は無関係の物質、即ち混在物、例えばその物質の原料となった天然物の存在が低減されているか除去されている条件下に単離されている物質を意味する。例えば精製された蛋白は好ましくは、それが細胞内で会合している他の蛋白または核酸を実質的に含有せず；精製された核酸分子は好ましくはそれが細胞内で共存している蛋白または他の核酸分子を実質的に含有しない。本明細書においては、「実質的に含有しない」とは、作業上、物質の分析試験について云う場合に用いる。好ましくは、混在物を実質的に含有しない精製された物質は、少なくとも５０％純粋；より好ましくは少なくとも９０％純粋、そして更に好ましくは少なくとも９９％純粋である。純度はクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫測定、組成分析、生物学的試験、および他の当該分野で知られた方法により評価できる。
【００２０】
精製方法は当該分野でよく知られている。例えば核酸は沈殿、クロマトグラフィー（プリペラティブ固相クロマトグラフィー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび３重螺旋クロマトグラフィーを含む）、超遠心分離および他の手段で精製することができる。ポリペプチドおよび蛋白は種々の方法、制限はなく、プリペラティブディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出および向流分配などにより精製できる。いくつかの目的のためには、精製を容易にする別の配列タグ、例えばしかし制限はなく、ポリヒスチジン配列、または抗体に特異的に結合する配列、例えばＦＬＡＧおよびＧＳＴを蛋白が含んでいる組み換え系においてポリペプチドを作成することが好都合である。次にポリペプチドを適切な固相マトリックス上のクロマトグラフィーにより宿主細胞の粗製溶解物から精製することができる。或いは、蛋白に対して、またはそれより誘導されたペプチドに対して生成された抗体を精製試薬として使用することができる。細胞は種々の方法、例えば遠心分離、マトリックス分離（例えばナイロンウール分離）、パニングおよび他の免疫選択的方法、枯渇（例えば汚染細胞の補体枯渇）および細胞ソーティング（例えば蛍光細胞分離［ＦＡＣＳ］）により精製することができる。他の精製方法も可能である。精製された物質はそれが元々会合していた細胞成分を約５０％未満、好ましくは約７５％未満、最も好ましくは約９０％未満を含有してよい。「実質的に純粋な」とは、当該分野で知られた従来の精製方法を用いて達成できる最高水準の純度を指す。
【００２１】
「コーディング配列」または発現産物、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、蛋白または酵素を「コードする」配列とは、発現されるとこのようなＲＮＡ、ポリペプチド、蛋白または酵素の生成をもたらすヌクレオチド配列であり；即ち、ヌクレオチド配列はそのようなＲＮＡを「コード」するか、そのポリペプチド、蛋白または酵素に対するアミノ酸配列をコードする。
【００２２】
「プロモーター配列」とは細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。本発明の定義の目的のためには、プロモーター配列はその３’末端において転写開始部位に結合し、上流（５’方向）に伸長し、バックグラウンドを超えて検出可能な濃度で転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むものである。プロモーター配列内には転写開始部位（好都合には、例えばヌクレアーゼＳ１によるマッピングにより発見できる）並びにＲＮＡポリメラーゼへの結合に関与する蛋白結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。
【００２３】
コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがそのコーディング配列をＲＮＡに転写し、それが次にトランスＲＮＡスプライスされ（イントロンを含む場合）、そして、配列が蛋白をコードしている場合は蛋白に翻訳される場合に、細胞内の転写および翻訳の制御配列の「制御下にある」か、これと「作動可能に連結されている」。
「発現する」または「発現」という用語は、遺伝子またはＤＮＡ配列中の情報の顕在化を可能にするかまたは誘発する、例えば相当する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞内機能を活性化することによりＲＮＡ（例えばｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）または蛋白を生産することを意味する。ＤＮＡ配列は細胞により発現され、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ）や蛋白のような「発現産物」を形成する。発現産物そのもの、例えば形成したＲＮＡまたは蛋白もまた細胞により「発現された」と言ってもよい。
【００２４】
「トランスフェクション」という用語は、外来性の核酸が細胞内に導入されることを意味する。「形質転換」という用語は「外来性」（すなわち、外因性または細胞外の）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の宿主細胞への導入により宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現し、所望の物質、本発明においては典型的には導入された遺伝子または配列によりコードされるＲＮＡであるが、やはり導入された遺伝子または配列によりコードされる蛋白または酵素であってもよいものを生産することを意味する。導入された遺伝子または配列は、また「クローニングされた」または「外来性の」遺伝子または配列と称される場合もあり、これには、調節配列または制御配列（例えば開始、終止、プロモーター、シグナル、分泌または細胞の遺伝的機序により使用されるその他の配列）が包含される。遺伝子または配列は、非機能性の配列または機能が未知である配列を含んでもよい。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受領して発現する宿主細胞は「形質転換され」、そして「形質転換体」または「クローン」となる。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、何らかの入手源、例えば宿主と同じ属または種の細胞または異なる属または種の細胞から得たものであることができる。
【００２５】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、これによりＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来性遺伝子）を宿主細胞に導入することができ、これにより宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進することのできるビヒクルを意味する。ベクターにはプラスミド、ファージ、ウィルス等が包含され、後により詳細に説明する。
【００２６】
一般的に、外来性ＤＮＡはベクターＤＮＡの１箇所以上の制限部位に挿入され、次にベクターにより伝達性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞内に運ばれる。発現ベクターのような、挿入された、または付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列はまた、「ＤＮＡコンストラクト」とも称される。ベクターの一般的な形態は「プラスミド」であり、これは一般的には通常は、細菌起源の二重鎖ＤＮＡの自己含有分子であり、別の（外来性の）ＤＮＡを容易に受け入れ、適当な宿主細胞に容易に導入できるものである。プラスミドおよび真菌ベクターを含む多数のベクターが、種々の真核細胞および原核細胞の宿主における複製および／または発現に関して報告されている。「宿主」という用語は、細胞による物質の製造のための何れかの方法において選択され、修飾され、形質転換され、生育されまたは使用もしくは操作される何れかの生物の何れかの細胞を意味する。例えば、宿主細胞は特定の遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、蛋白または酵素を発現する様に操作されるものであってよい。宿主細胞は、さらに後に記載するスクリーニングまたは他の試験のために用いることもできる。宿主細胞は、インビトロで培養して良く、または、非ヒト動物（例えばトランスジェニックな動物または一過性にトランスフェクトされた動物）の１種以上の細胞であってよい。
【００２７】
広範な種類の宿主／発現ベクター組み合わせ（即ち発現系）を用いて本発明のＤＮＡ配列を発現させてよい。有用な発現ベクターは、例えば染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列のセグメントより成るものであってよい。安定なベクターにはＳＶ４０の誘導体および既知の細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミドｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０，１９８８）、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡＳ、例えばファージｌの種々の誘導体、例えばＮＭ９８９および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３およびフィラメント一重鎖ファージＤＮＡ；コウボプラスミド、例えば２ｍプラスミドまたはその誘導体；真核細胞で有用なベクター、例えば昆虫または哺乳類細胞で有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミド等が包含される。更にまた、種々の腫瘍細胞系統も本発明の発現系に使用することができる。
【００２８】
コウボ発現系もまた目的の何れかの蛋白を発現するために本発明に従って使用することができる。例えば２つだけ挙げると非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を用いて精製し、エンテロキナーゼで切断したＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を本発明に従って用いることができる。
【００２９】
蛋白またはペプチドの発現は、当該分野で知られている何れかのプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御してよいが、これらの調節エレメントは発現のために選択された宿主において機能可能でなければならない。遺伝子の発現のために使用してよいプロモーターは、制限されないが例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許５，３８５，８３９号および５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０早期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウィルスの３’長鎖末端リピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２，１９８２）；ｂ−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：３７２７−３７３１，１９７８）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２１−２５，１９８３）；“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４−９４，１９８０に記載のもの；コウボまたは他の真菌に由来するプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および造血組織特異性を示す転写制御領域、特に：骨髄性細胞において活性なベータグロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８−３４０，１９８５；  Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４，１９８６）、造血幹細胞分化因子プロモーター、エリスロポエチン受容体プロモーター（Ｍａｏｕｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１５：２５５７，１９９１）等である。
【００３０】
特に細胞のインビトロおよびインビボの試験のために好ましいベクターは、ウィルスベクター、例えばレンチウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルスおよび所望の細胞向性を有する他の組み換えウィルスである。即ち、機能性または突然変異性の蛋白またはそのポリペプチドドメインフラグメントをコードする遺伝子は、ウィルスベクターを用いるか、またはＤＮＡの直接導入を介して、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで導入することができる。標的組織における発現は、トランスジェニックなベクターを特定の細胞にターゲティングする、例えばウィルスベクターまたは受容体リガンドを用いるか、または、組織特異的プロモーターを用いるかその両方により行うことができる。ターゲティングされた遺伝子のデリバリーは１９９５年１０月に公開された国際特許出願ＷＯ９５／２８４９４に記載されている。
【００３１】
インビボまたはエクスビボのターゲティングおよび治療処置に共通して使用されているウィルスベクターは、ＤＮＡ系ベクターおよびレトロウィルスベクターである。ウィルスベクターの構築および使用の方法は当該分野で知られている（例えばＭｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，７：９８０−９９０，１９９２を参照できる）。好ましくは、ウィルスベクターは複製能欠損で、即ち、これらは標的細胞内で自己複製できない。好ましくは、複製能欠損ウィルスは最小ウィルスで、即ち、ゲノムをカプシド化してウィルス粒子を形成するために必要なゲノムの配列のみを保有する。
【００３２】
「発現系」という用語は、例えばベクターにより担持され、宿主細胞に導入される外来性ＤＮＡによりコードされた蛋白の発現のために適する条件下における宿主細胞と適合するベクターを意味する。一般的な発現系には大腸菌宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞、例えばＳｆ９、Ｈｉ５またはＳ２細胞とバキュロウィルスベクター、ショウジョウバエ細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞）と発現系、魚細胞と発現系（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能であり受託番号ＣＲＬ−１７１０で登録されているニジマス由来のＲＴＨ−１４９細胞）および哺乳類宿主細胞およびベクターを包含する。
【００３３】
「異種の」という用語は天然には存在しないエレメントの組み合わせを指す。例えば、本発明はｒＲＮＡ配列およびｒＲＮＡ配列の部分ではない異種のＲＮＡ配列を有するキメラＲＮＡ分子を包含する。この点に関し、異種ＲＮＡ配列は、リボソームＲＮＡ配列内にＲＮＡ配列に天然には見つからないＲＮＡ配列を指す。或いは、異種ＲＮＡ配列は、リボソームＲＮＡ配列内に天然に見つかるかもしれないが、それが天然には存在しないｒＲＮＡ配列内の位置に存在する。別の例として、異種ＤＮＡは、細胞内または細胞の染色体部位中に天然には存在しないＤＮＡを指す。好ましくは異種ＤＮＡは、細胞にとって外来である遺伝子を含む。異種発現調節エレメントは、それが天然に作動可能に会合しているものとは異なる遺伝子と作動可能に会合している調節エレメントである。
【００３４】
「抗原」という用語は、本明細書においては、生物の免疫細胞に提示された場合に特異的な免疫応答を誘導する物質を指すものとする。即ち、抗原は、その意味で、担体蛋白に連結した単一の免疫原性エピトープまたはＢ細胞受容体（即ちＢ細胞の膜上の抗体）またはＴ細胞受容体により認識される免疫原性エピトープの複数のものを含む。分子は抗原およびアジュバントの両方であってよい（例えばコレラ毒素）。
【００３５】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は構成的に、または隣接細胞またはその産物による、または、外因性の手段による刺激の後に、免疫応答をもたらすような方法で免疫系の細胞に抗原を提示することのできる何れかの哺乳類細胞である。ＡＰＣの例には例えば、種々の型および成熟段階の樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ（ＭΦ）、Ｂ細胞、肥満細胞および上皮細胞（後者は限定されないが、例えば皮膚から誘導された上皮細胞（ケラチノサイト）、口腔上皮、腸上皮、または泌尿器生殖器管上皮である）が包含される。
【００３６】
「連係させて」とは、２種以上の反応体（例えば抗原またはその部分と免疫モジュレート剤、例えばコレラ毒素（ＣＴ）またはコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）またはその部分で、サイトカインまたは免疫モジュレート核酸またはオリゴヌクレオチドを含む他の薬剤の加えられていたり、加えられていないもの）との間の製剤として定義され、ここで、これらの反応体は何れかの効果的な製剤、限定されないが、混合物、化学的抱合体、遺伝子融合蛋白または反応物の何れかまたはすべてをコードする核酸調製物中で、相互に連携してＡＰＣに提示される。
【００３７】
「細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）」とは、クラスＩ組織適合性分子の部分であるエピトープに結合するＣＤ８＋「キラー」Ｔ細胞である。それらはそれらが結合している細胞を破壊する分子を分泌する。ウィルスに感染している、または癌により形質転換されている細胞の本体を取り除くことに加えて、ＣＴＬは組織および臓器の移植片の拒絶反応にも関与している。
【００３８】
「同時刺激分子」は、抗原提示細胞の表面上に発現される受容体リガンド対とＴ細胞との間の相互作用に関わっている。受容体リガンド対の一例は、ＤＣ表面上のＢ７同時刺激分子およびＴ細胞上のその対向受容体ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４である（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：９０９−９１１；  Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）  ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：２２９；Ｎａｂａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２６６）。他の重要な同時刺激分子はＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６である。
【００３９】
「主要組織適合性複合体」即ち「ＭＨＣ」とは、Ｔ細胞への抗原提示のため、および、急速な移植片拒絶のために必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を指す。ヒトにおいては、ＭＨＣ複合体はまたＨＬＡ複合体としても知られている。ＭＨＣ複合体によりコードされる蛋白は、「ＭＨＣ分子」として知られており、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子に分類される。クラスＩのＭＨＣ分子には、ベータマイクログロブリンと非共有結合的に会合しているＭＨＣにおいてコードされるアルファ鎖よりなる膜ヘテロダイマー蛋白を含む。クラスＩＭＨＣ分子は、殆ど全ての有核細胞により発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原提示において機能することがわかっている。クラスＩ分子にはヒトにおけるＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃが含まれる。クラスＩＩＭＨＣ分子もまた非共有結合的に会合したアルファ、およびベータ鎖よりなる膜ヘテロダイマー蛋白を含む。クラスＩＩＭＨＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞への抗原提示に関与することがわかっており、ヒトにおいては、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱおよびＤＲを含む。
【００４０】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は抗原提示細胞の外部で生成される蛋白に由来するペプチドに結合する。一方、ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞内部で生産される蛋白から誘導されるペプチドに結合する。クラスＩＩ分子の意味においてペプチドを提示するためには、ＡＰＣは抗原を貪食して細胞内ベシクル中に取りこみ、ここで抗原を切断し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合させ、次に抗原提示細胞の表面に戻す。
【００４１】
「アジュバント」という用語は、本明細書においては、抗原への免疫応答の誘導を促進するために製剤に添加される物質を意味する。
「治療有効量」とは、所望の活性をもたらすのに十分な化合物または組成物の量を指す。即ちワクチンを記載するために用いる場合は、治療有効量とは有効な免疫応答を起こすのに十分な化合物または組成物（例えば抗原）の量を指す。
【００４２】
コレラ毒素は、ＡＤＰリボシル化体外毒素のファミリーから得る細菌体外毒素である。大部分のＡＤＰリボシル化体外毒素は、Ａ：Ｂ二量体として機能的に組織されており、ここで結合Ｂ部またはサブユニットまたはＡ部またはサブユニットは、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を含んでいる。このような毒素には、ジフテリア毒素、シュードモナス体外毒素Ａ、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌熱感受性エンテロトキシン（ＬＴ）、百日咳毒素（パーツシゲン）、Ｃ．ボツリナム毒素Ｃ２、Ｃ．ボツリナム毒素Ｃ３、Ｃ．リモサムエキソ酵素、Ｂ．セレウスエキソ酵素、シュードモナス体外毒素Ｓ、スタフィロコッカス・アウレウスＥＤＩＮおよびＢ．サフェリカス毒素が包含される。
【００４３】
コレラ毒素は、ＡおよびＢサブユニットにより組織されているＡＤＰリボシル化体外毒素の原型の例である。Ｂサブユニットは、結合サブユニットであり、単一のサブユニットであるＡサブユニットに非共有結合的に結合するＢサブユニットのホモ五量体よりなる。Ｂサブユニット五量体は標的細胞上のＧＭ1−ガングリオシドに結合する左右対称のドーナツ型の構造に構成されている。Ａサブユニットは、環状ＡＭＰの細胞内レベル上昇をもたらすＧｓ蛋白を含むヘテロ三量体ＧＴＰ蛋白（Ｇ蛋白）のサブセットのアルファサブユニットをＡＤＰリボシル化する作用を有する。これによりコレラの症例において腸細胞からのイオンおよび液体の放出が促進される。
【００４４】
コレラ毒素およびそのＢサブユニット（ＣＴＢ）は、筋肉内または経口の免疫原のいずれかとして使用される場合にアジュバント特性を有する（Ｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｒｔｚｂａｕｇｈ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９５；１５４（３）：１０３２−４０；  Ｔｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１９９７；３４９（９０４７）：２３１−５）。別の抗原である大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）は、ＣＴとアミノ酸レベルで８０％の相同性を有し、同じ結合特性を有する。これはまた腸内のＧＭ1−ガングリオシド受容体に結合すると考えられ、同様のＡＤＰリボシル化体外毒素活性を有する。別のＡＤＰリボシル化体外毒素であるシュードモナス体外毒素Ａ（ＥＴＡ）はアルファ−２−マクログロブリン受容体−低密度リポ蛋白受容体−関連蛋白に結合する（Ｋｏｕｎｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９３；２６８（１９）：１４１７６−８１）。ＡＤＰリボシル化体外毒素は、Ｋｒｕｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｒｂｉｅｒｉ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，１９９５；８（１）：３４−４７により検討されている。
【００４５】
ＣＴ、ＣＴＢおよび誘導体は、ＥＬＩＳＡまたはＧＭ１−ＥＬＩＳＡ試験により検出する場合に、ＧＭ１ガングリオシドに結合するか、および／またはＣＴ、ＣＴＢまたはＣＴのＡサブユニット（ＣＴＡ）に対するポリクローナル抗血清と反応する何れかの蛋白として定義され、限定されないがエシェリシア・コリの熱感受性エンテロトキシン（ＬＴ）およびその複合サブユニット（ＬＴＢおよびＬＴＡ）、および、何れかまたはすべての突然変異した、延長した、トランケートされたまたは何らか別の態様に修飾された形態のＣＴ、ＬＴ、そのサブユニットまたはＧＭ１と、またはこのような型の抗血清と反応する何れかの他の蛋白、並びにこのような基準を満足する蛋白をコードする何れかの核酸調製物を含む。
【００４６】
本発明によれば、ＣＴおよびＣＴＢは、ＤＣおよびＢ細胞のみならず表面ＭＨＣクラスＩＩが低レベルであるために、ナイーブのＴ細胞の活性化剤としては、通常は劣っているＭΦによる結合抗原の提示も促進する。理論に制約されないが、この増強された抗原提示はインビボの担体分子としてのＣＴＢの効果に寄与する重要な機序を呈している。
【００４７】
今回意外にも、化学的または遺伝子的手段によりＣＴまたはＣＴＢと混合、好ましくはカップリングまたは融合された抗原に種々のＡＰＣを曝露することによりその同族Ｔ細胞活性化能力が定量的および定性的にモジュレートできることが解かった。この目的のために、所定のＡＰＣ集団を遊離のペプチドまたは蛋白抗原により、またはそのＣＴまたはＣＴＢ連結誘導体により、またはＣＴまたはＣＴＢと混合した抗原によりパルスした。次にパルスしたＡＰＣを抗原特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス由来の精製Ｔ細胞と共にインキュベートし、増殖応答およびサイトカイン特性をこれらの培養物で測定した。ＤＣおよびＢ細胞は遊離のペプチドおよび蛋白抗原をナイーブなトランスジェニックＴ細胞に提示できる効率的なＡＰＣであるが、ＭΦは提示できない。異なるＡＰＣをＣＴまたは遊離ではなくむしろＣＴＢ連結の抗原に曝露することにより、その抗原提示能は大きく高まり、同族Ｔ細胞による増殖応答の刺激に必要な抗原の量の１０4倍超の低減が見とめられた。更にまた、ＭΦはまた、ＣＴまたはＣＴＢコンジュゲート抗原に曝露された場合には、効率的なＡＰＣとして機能した。得られたＴ細胞増殖応答の増大は、分泌されたＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの増大およびＡＰＣ表面上のＣＤ４０およびＣＤ８６の発現の増大と関連していた。
【００４８】
更にわかったことは、マウス由来のＤＣおよび他のＡＰＣは、ＣＴまたはＣＴＢと混合、あるいは好ましくはカップリングまたは融合された抗原にエクスビボで曝露され、その後インビボでマウスに注射した場合、抗原のみに曝露された相当するＡＰＣよりも遥かに強力な免疫応答を誘導した。更にまた、ＣＴまたはＣＴＢの何れを用いるかにより異なる多様にモジュレートされた免疫応答が引き出された。このことは、抗原としてＯＶＡおよびＡＰＣとしてＤＣを用いて以下のとおり例示される。同系のマウスへの注射より前に、骨髄由来ＤＣを遊離のＯＶＡ、ＣＴまたはＣＴＢ連結ＯＶＡ、またはＯＶＡとＣＴまたはＣＴＢの混合物の何れかでパルスした。その後の免疫応答を二種のＤＣワクチン接種後測定し、そしてその後ＯＶＡを作用させた後に再度測定した。結果は、ＣＴＢはエクスビボのＤＣの抗原パルスのための効率的な担体分子であり、Ｔｈ２応答を強力に促進した。ＣＴアジュバントでＤＣを処理すると、その免疫刺激能が顕著に増強したが、その限りＴｈ１応答の傾向も呈した。ＣＴおよびＣＴＢの見かけ上異なる担体およびアジュバントの機能は、抗原をＣＴに直接連結した後ＤＣパルシングを行う場合に、その組み合わせで最大の力価が得られるが、その後Ｔｈ１応答も強化される傾向があった。ＣＴおよびＯＶＡ−ＣＴのＴｈ１誘導能は、ＲＡＮＴＥＳ生産のアップレギュレーションと組み合わせられたパルスＤＣによるＭＩＰ−１ａ生産の強力な抑制と関連している。
【００４９】
更にわかったことは、ＣＴまたはＣＴＢと連係する、そして好ましくはこれらに連結した腫瘍特異的抗原をエクスビボで処理し、次いでマウスに注射されたＡＰＣは、腫瘍特異的抗原を発現している移植腫瘍の生育を抑制し、ＣＴにカップリングされた場合は、意外にも、脾臓および／またはリンパ節における腫瘍細胞特異的ＣＴＬの発生に伴い既に出来ている腫瘍の拒絶も誘導した。
【００５０】
更にまた、ＣＴまたはＣＴＢと連係させた抗原でエクスビボで処理したヒトＡＰＣは、ネズミモデルで観察されたものと同様の態様で同族のＴ細胞に対する増強された抗原提示能を示した。
【００５１】
本発明に従ってＣＴ、ＣＴＢまたは関連毒素または細胞結合蛋白と混合、コンジュゲートまたは遺伝子的に融合された抗原と共にＡＰＣをエクスビボでインキュベートし、その後患者に投与することにより、抗原に対する免疫応答が増強される。本発明は細菌毒素または毒素サブユニットまたは他の毒素サブユニット誘導体と連係させた特定の抗原でインビトロで処理され、その後哺乳類宿主に投与された抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびその何れかの部分またはそれから誘導したものに関する。本発明によれば、ＡＰＣは樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、肥満細胞または上皮細胞である。
【００５２】
担体抗原に蛋白またはペプチドをコンジュゲートさせ、融合蛋白を生成する方法は当該分野でよく知られている。抗原ＣＴＢコンジュゲートおよび融合蛋白の生成の説明例は以下の「方法」のセクションに記載する。ＣＴＢを用いる詳細なプロトコルはＲａｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２０００，３０：１０２４−１０３２およびＳｃｈｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９１；９９：２５５−５９に記載されている。
【００５３】
別の実施態様において、本発明は細菌毒素または毒素サブユニットまたは他の毒素サブユニット誘導体と連係させた特定の抗原でインビトロに処理されているＡＰＣおよびその何れかの部分に関し、ここで、毒素はコレラ毒素（ＣＴ）、ＣＴの結合サブユニット（ＣＴＢ）、大腸菌ＬＴまたはＬＴＢ、上記した他のＡＤＰリボシル化毒素、および、更には、限定されないがＢ．パーツシス由来の百日咳毒素、赤痢菌属由来の赤痢毒素および何れかの細菌由来の関連毒素、植物毒素、例えばアブリンおよびリシンまたはそれらのサブユニットである。既知の免疫モジュレーション特性を有する他の非限定的な細胞結合毒素またはサブユニットも意図される。いくつかの例として挙げられるものは、グラム陰性内毒素、例えばリポ多糖類、破傷風毒素、クロストリジウムディフィシレ毒素、スタフィロコッカスエンテロトキシンおよびステプトコッカス発赤毒素およびこれらの蛋白の何れかまたは全ての誘導体、例えば突然変異体、伸長体または遺伝子融合蛋白である。非細菌細胞結合剤には植物レクチン（市販品はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより）、例えばコンカナバリンＡ、フィトフェマグルチニンおよびコムギ胚芽アグルチニンがあり、これらは有糸分裂促進作用または複製能欠損ウィルス粒子および細胞連結蛋白が含まれる（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１；１９：１６９−１７７，Ｃａｓａｌ，ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇ．  Ｒｅｖ．  ２００１；１８：７３−８７）。
【００５４】
別の実施態様において、ＡＰＣ由来のフラクションまたはベシクル、例えばエキソソームを全ＡＰＣの変わりに使用することができる。本明細書においては、エキソソームは細胞内連絡を促進するために細胞により形成される小型（６０〜１００ナノメーター）の球状のベシクルである。樹状細胞により生産されるエキソソーム（デキソソーム）は、十分特性が調べられており、後天的および先天的な免疫応答の両方を活性化するために必要な全ての既知成分を含む天然由来の産物である。デキソソームは、一旦生成されると別の免疫細胞、例えば他の樹状細胞、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を活性化させる。多くの免疫細胞の活性化は、疾患抗原によりもたらされる元シグナルを増幅すると考えられており、免疫応答が開始される（Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；  １６６：７３０９−７３１８，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９８；４：５９４−６００）。
【００５５】
本発明の方法は更に、哺乳類への投与の前にＡＰＣ調製物から未処理ＣＴまたはＣＴ連結蛋白またはペプチドを除去することから、ＣＴのような毒素の毒性の問題点を克服する。
【００５６】
ＣＴおよびＣＴＢコンジュゲート抗原の増強された抗原提示は、ＡＰＣ上のＧＭ１受容体へのＣＴ−およびＣＴＢ−抗原複合体の結合活性の保持に依存していることがわかった。得られるＴ細胞応答は抗原特異的であることがわかった。より高レベルのＭＨＣクラスＩＩを発現するＤＣおよびＢ細胞による抗原提示の増強に加えて、ＣＴＢへの抗原のコンジュゲーションによって、低レベルのＭＨＣクラスＩＩしか発現せず、通常はナイーブなＴ細胞を活性化できないＭΦさえも効率的に抗原を提示することが可能となる。増強された抗原提示には、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの発現の増大、並びに、ＣＤ４０およびＣＤ８６、即ちＡＰＣ上の活性化および成熟マーカーの発現の増大が伴う。
【００５７】
抗原のＣＴまたはＣＴＢへのカップリングがＡＰＣ上のＧＭ１受容体への結合を介してカップリングした抗原の取り込みを増大させ抗原提示を促進することは、抗ＣＴＢ抗血清および遊離のＧＭ１ガングリオシドの両方がＣＴＢ媒介抗原提示をブロックできることを示す実験から推論された。ＣＴＢはその受容体であるＧＭ１ガングリオシドに対し高い親和性を有する（ＫＡ〜１ｘ１０9ｍｏｌ-1）（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９７４；１３９：８０１−８１９）。ＧＭ１への結合の結果、ベシクルへのＣＴＢの細胞内在化が起こる（Ｌｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １９９９；１４５０：１７７−１９０，Ｒａｐｐｕｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ．  １９９９；２０：４９３−５００）。ＧＭ１への結合は、以前はＣＴＢの免疫原性にとって必須であると考えられており（Ｎａｓｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９６；９３：２２６−２３０）、ＧＭ１結合は、危険信号であることも示唆されている（Ｒａｐｐｕｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １９９９；２０：４９３−５００）。本発明においては、ＣＴＢコンジュゲート抗原とのインキュベーションの後のＡＰＣの表現型活性化は、ＣＤ４０およびＣＤ８６の双方のアップレギュレートされた発現並びにＩＬ−１２の顕著な分泌により明らかになった。即ち、理論に制約されないが、ＧＭ１結合はＡＰＣによるＣＴＢコンジュゲート抗原の取りこみを大きく改善し、ＭＨＣＩＩ上の相当するペプチドのより豊富な提示をもたらし、これはＡＰＣによる増強されたＩＬ−１２分泌に伴ってＡＰＣ表面上に誘導されたＣＤ４０およびＣＤ８６のような同時刺激分子のレベル上昇と組み合わさって、ＡＰＣのＴ細胞活性化能を増強するのである。ペプチドのマンノシル化がＤＣによるマンノース受容体媒介抗原吸収を促進し、これにより必要なペプチドの閾値濃度を２００〜１０００倍低減すると報告されている（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；２７：２４２６−２４３５）。本明細書においては、抗原のＣＴＢコンジュゲーションは、ＡＰＣによる抗原の受容体媒介取りこみのための別の強力な機序であることが示され、さらにまた、この効果は、全てのＡＰＣがＧＭ１を発現することからユニバーサルなものであることが示された。
【００５８】
以前の研究によれば、免疫応答又は寛容性は、潜在的にはＣＴおよびＣＴＢを用いた場合に起こっている。ＣＴＢではなくＣＴを用いる場合は常時、寛容性の誘導の如何なる危険性も伴わないが、免疫応答の増強が起こることは明白である（Ｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｒｔｚｂａｕｇｈ，Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９，Ｅｄ．Ｐ．Ｌ．Ｏｇｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ｐｐ．８１７−８３８，Ａｃａｄ．  Ｐｒｅｓｓ；  Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  １９９６；９３：７１９６−７２０１）。その他の点においては、単に抗原、免疫原ｖｓ寛容原の問題である。意外にも、ＣＴＢ連結抗原をエクスビボの粘膜投与に用いた場合、寛容原に対してのみならず卵白アルブミンのような弱い免疫原に対しても寛容性が誘導される。これとは対称的に、インビトロワクチン接種のために本明細書に記載したとおり樹状細胞（または他のＡＰＣ）にＣＴＢ連結抗原（ＯＶＡを含む）を与え、その後インビボ注入した所、免疫応答の増強および如何なる寛容性の徴候も一貫して観察されない。組織培養により得られた骨髄由来またはヒト血液単球由来の樹状細胞については、このことは恐らくはこれらのＤＣが既にむしろ成熟していることを反映している（成熟したＤＣは免疫をもたらすが、未成熟のＤＣは寛容性を誘導すると一般的に考えられている）。ＣＴおよびＣＴＢの両方が、ＤＣおよび他のＡＰＣ上のＣＤ４０およびＣＤ８６のような同時刺激分子の発現を誘導し、そして（恐らくは最も重要な点として）ＩＬ−１の発現も誘導する。後者のサイトカインの検出は、免疫応答は得られるが寛容性の誘導の危険性はないことのインビトロの試験確認法として使用することができると考えられる。
【００５９】
本発明によれば、好ましくはＣＴＢまたはＣＴに化学的にカップリングされるか遺伝子的に融合された、または、これらの蛋白（恐らくはＣＴと）と混合された免疫原性の蛋白およびペプチドをＡＰＣとインキュベートし、その後、洗浄して蛋白またはペプチドに対する免疫応答を増大させるのに有効な量で哺乳類に投与する。
【００６０】
１つの実施態様において、ＡＰＣは、ＡＰＣがそのまま、または細胞未満の形態で、投与される予定であるものと同じ哺乳類宿主から単離または発生させられたものである。
さらに別の実施態様において、ＡＰＣ、ＡＰＣがそのまま、または細胞未満の形態で、投与される予定であるものとは別の哺乳類宿主から単離または発生させられたものである。
【００６１】
この好ましい実施態様において、ＡＰＣは単離され、そして、ＣＴまたはＣＴＢと化学的にカップリングされるか遺伝子的に融合された、免疫原性ペプチドをインビトロで処理（約１時間〜約２４時間インキュベートする）されるか、またはＣＴまたはＣＴＢと混合され免疫応答を誘導するために哺乳類に投与される。本実施態様において、免疫応答を誘導するために有効なＡＰＣの量を使用する。ＡＰＣはレシピエントから、または、ドナーから得ることができる。
【００６２】
ヒトＡＰＣ、ＤＣ、Ｂ細胞およびＭΦの単離は、以下の「方法」のセクションにおいて記載する。ＤＣは本発明において特に好ましく用いられる。
【００６３】
特に好ましい実施態様においては、ペプチドまたは蛋白はＣＴに化学的にカップリングされるか遺伝子的に融合される。ＣＴおよびＣＴＢにペプチドおよび蛋白を化学的にカップリングさせるための方法は以下の「方法」のセクションにおいて記載する。如何なる化学カップリングも使用される。好ましくは、カップリングは市販の官能性アダプターを用いる。これらは全て多くの供給元、例えばＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＭｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅ  Ｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）から商業的に入手可能である。ペプチド−蛋白担持重合体は、カルボジイミド類のような従来の架橋剤を用いて形成してよい。カルボジイミドの例は１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および１−エチル−３（４−アゾニア−４４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。
【００６４】
他の適当な架橋剤の例は臭化シアン、グルタルアルデヒドおよび無水コハク酸である。一般的に、多くのホモ二官能性の試薬、例えばホモ二官能性アルデヒド、ホモ二官能性エポキシド、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性マレイイミド、ホモ二官能性アルキルハライド、ホモ二官能性ピリジルジスルフィド、ホモ二官能性アリールハライド、ホモ二官能性ヒドラジド、ホモ二官能性ジアゾニウム誘導体およびホモ二官能性光反応性化合物を使用してよい。更にまた、ヘテロ二官能性化合物、例えばアミン反応性およびスルフィドリル反応性の基を有する化合物、アミン反応性および光反応性の基を有する化合物およびカルボニル反応性およびスルフィドリル反応性の基を有する化合物も包含される。
【００６５】
このようなホモ二官能性の架橋剤の具体例は、二官能性のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル：ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、ジスクシンイミジルスベレートおよびジスクシンイミジルタータレート；二官能性のイミドエステル：ジメチルアジピミデート、ジメチルピメリミデートおよびジメチルスベリミデート；二官能性のスルフィドリル反応性架橋剤：１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ブタン、ビスマレイミドヘキサンおよびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン；二官能性のアリールハライド、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンおよび４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン；二官能性の光反応性の試薬：例えばビスー［ｂ−（４−アジドサリシルアミド）エチル］ジスルフィド；二官能性のアルデヒド：ホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびアジフアルデヒド；二官能性のエポキシド：例えば１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、二官能性のヒドラジド：アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジドおよびコハク酸ジヒドラジド；二官能性のジアゾニウム：ｏ−トルイジン、ジアゾ化およびビスジアゾ化ベンジジン；二官能性のアルキルハライド：Ｎ１Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ウンデカメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）並びにベンジルハライドおよびハロマスタード、例えばａ１ａ’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸およびトリ（２−クロロエチル）アミンを包含する。
【００６６】
蛋白とペプチドのコンジュゲートを行うために使用してよい他の一般的なヘテロ二官能性架橋剤は、限定されないが例えば、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＭＰＨＢ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、Ｍ２Ｃ２Ｈ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド）、ＳＭＰＴ（スクシンイミジルオキシカルボニル−ａ−メチル  −ａ−（２−ピリジルジチオ）トルエン）およびＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）を包含する。
【００６７】
架橋は還元的アミノ化によりアミン基またはヒドラジド基にカルボニル基をカップリングさせることにより行なってよい。
更にまた、組み換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  （Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ，１９８５）；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ，１９８４）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｅ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８５）］Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．  （１９８４）］；  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．  （１９８６）］；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；  Ｂ．ＥＰｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；  Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．  （１９９４）に記載されている。
【００６８】
ＣＴＢとの免疫原性ペプチドの遺伝子的融合は、以下の方法のセクションにおいて記載する。免疫応答を誘導するために効果的なＡＰＣの量は、以下のとおり計算することができる。例えば、ヒトにおけるワクチン接種のためのインビトロ抗原処理ＡＰＣを用いる標準的な臨床プロトコルを用いる。１〜１０百万個／注入用量の細胞を先ず使用し、そのその個数の投与を５〜１０回以上反復する。有効量は比較的少数の細胞、例えば１０，０００個で開始し、ＣＴ（またはＣＴＢ）と連係させた抗原の３種の用量で２週間の間に２回処置することによる、ヒトにおける典型的な第１相実験により、有効量を求める。重度の副反応がないかどうか患者をモニタリングする。免疫応答（抗原特異的抗体＋抗原特異的Ｔ細胞の増殖）も測定する。処置が安全点からみて許容できると判断される場合、同じ方法で処置された１００，０００個の細胞を用い；次に１，０００，０００個を用いる。より長い臨床治験のための細胞数および抗原の用量は、上記試験より決定してよい。ＭＨＣ同系細胞のみが機能することが予測されるが、本発明者等は、異種のＡＰＣを本発明に用いることができると判断した。理論に制約されないが、初期に（エクスビボで）処置されたＡＰＣに由来する一ある物質が免疫応答のトリガーのためにインビボでレシピエント中の他のＡＰＣにより捕獲されたと考えられる。インビボの外来性ＡＰＣに対する小さい免疫応答反応は、実際にサイトカイン炎症性刺激を与えることにより担持された抗原に対する免疫応答を補助すると考えられる。
【００６９】
免疫応答を誘導するために有効な抗原の量は、当該分野で良く知られた日常的な操作法を用いて実験的に求めることができる。即ち、比較的低用量、例えば１マイクログラム／１０6を先ず用い、ＡＰＣを観察して細胞関連抗原（ＣＤ４０、ＣＤ８０またはＣＤ８６）の誘導および／またはサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＭＦ等）の放出があるかどうか調べる。量は最大活性化が達成されるように調節することができる。
【００７０】
本発明の本実施態様においては、レシピエントに投与される前にＡＰＣを十分に洗浄するため、患者にコレラ毒素の毒性量が注入される危険性は無い。いかなる生理食塩水または他の生理的緩衝液または組織培養用培地、例えばＩｓｃｏｖｅ培地またはＨａｎｋの緩衝塩溶液（Ｇｉｂｃｏ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）等も、ＡＰＣのエクスビボ処理、洗浄、および細胞の患者への注入のために用いてよい。
【００７１】
本発明によれば、抗原の有効量は、広範には、約０．０１〜１０μｇの範囲にある。ＣＴＢと共に用いる場合の精製抗原の有効量は、約０．１〜１μｇ／１０3〜１０6ＡＰＣである。ＣＴの場合は、有効量は約０．００１μｇ〜０．１μｇの範囲である。腫瘍細胞抽出液の有効量は、約０．１〜１μｇの範囲である。
本発明のＡＰＣは非経腸的に、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（Ｓ．Ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）および結腸内（ｉ．ｃ．）で投与して良く、ｉ．ｖ．、ｓ．ｃ．およびｉ．ｍ．が実験的に有用であることがわかっているため、ヒトに対しては好ましい。
【００７２】
ＡＰＣは活性化の前または後に、即座に使用する（哺乳類への注入）か、または、必要時まで保存することができる。使用するまで保存する場合は、単離されたＡＰＣは数週間凍結するか、または数日間メチルセルロースゲル中に入れておく。
【００７３】
別の実施態様においては、突然変異したＣＴまたはＣＴＢまたは他の毒素を使用する。このような突然変異の例には、何れかの点突然変異、これらの毒素、サブユニットまたは他の蛋白の欠失または挿入、並びに、蛋白中のアミノ末端、カルボキシ末端またはその他の部位に位置するかどうか、そして、それらのペプチドＢ細胞エピトープであること、Ｔ細胞エピトープまたは免疫応答を刺激または変動させることにより免疫学的特性を有するかどうかに関らず、何れかのペプチドのこれらの蛋白への伸長が包含される。例えば、多くのこのような突然変異が文献に記載されている（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９５；１６５：１６３−１７１；  Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９６；１６９：２１１−２１７；  Ｓｃｈｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９１；９９：２５５−２５９；  Ｄｅｒｔｚｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  １９９０；５８：７０−７９）。
【００７４】
ＣＴおよびＣＴＢは、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｃａｌｌｉｐ  ９５００８，ＵＳＡより商業的に入手可能である。組み換え（ｒＣＴＢ）ＳＢＬは、Ｖａｃｃｉｎ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎより購入可能である。大腸菌  ＬＴおよびＬＴＢはＲａｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＰＭＩＳ  ２０００；１０８：１７８−８６に記載のようにして得ればよい。
【００７５】
抗原提示細胞
樹状細胞（ＤＣ）
樹状細胞（ＤＣ）は、その主な機能が抗原の捕獲、プロセシングおよびＴ細胞への提示である白血球の独特のクラスである（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１；９：２７１−９６）。これらは非リンパ系組織中に存在するが、リンパ系臓器のＴ依存性領域に移行する。非リンパ系臓器においては、ＤＣはランゲルハンス細胞、血液および粘膜ＤＣを包含する。リンパ系臓器においては、それらはリンパ系ＤＣおよび鉗合ひだＤＣを包含する。末梢免疫系におけるＤＣと特異的Ｔ細胞との間の相互作用により免疫応答の誘導がもたらされるが、胸腺においては、樹状細胞による提示は否定的選択をもたらす（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９３；２３：２６１４−２６２１；  Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９；３３８：７４−７６）。
【００７６】
樹状細胞（ＤＣ）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に対し最も効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＤＣの大部分は、リンパ系組織のＴ細胞リッチの領域中に主に存在する骨髄由来細胞である。これらの細胞は、高レベルのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ癒着および同時刺激分子およびマンノース受容体様蛋白を発現する（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，上記；Ｍｅｔｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９０；１７１：１７５３−１７７１；Ｋｒａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１９８６；１６３：９８１−９９７；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９５；３７５：１５１−１５５）。成熟ＤＣは種々のサイトカインを用いて骨髄および臍帯血ならびにＰＢＭＣから誘導できる。（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９２；１７３：５４９−５５９；  Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９２；１７６：１６９３−１７０２；  Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９３；９０：３０３８−３０４２）。明らかな表現型の相違は無いが、成熟したＤＣは、未成熟のＤＣよりも効率的にＴ細胞にプロセシングされた抗原を提示することが解かっている。これとは対照的に、未成熟のＤＣは、内因性蛋白のプロセシング、並びに、外因性蛋白の吸収とプロセシングにおいて効率的であり、そして、抗原ペプチドを提示するが、Ｔ細胞の活性化をもたらす同時刺激分子およびサイトカインの発現は欠失している。
【００７７】
ＤＣは抗腫瘍および感染症のワクチン並びに移植寛容性のための使用に係わっている。ＤＣはＴ細胞免疫性およびＴ細胞寛容性の両方の重要なインデューサーである（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；３９２：２４５−２５２，Ｖｉｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；１６０：５８１５−５８２５）。同時刺激非存在下に抗原ペプチドを提示する未成熟ＤＣは、免疫性よりはむしろ寛容性を誘導すると云われており、そして、重要な点は、粘膜組織が表現型的には未成熟ＤＣが豊富であることである（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．  Ｗ．Ｅ．  Ｐａｕｌ，１９９９；ｐｐ．５４７−５７３，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。しかしながら、免疫性および寛容性は、むしろ異なるサブセットのＤＣにより誘導される可能性が示されており、免疫性は顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に応答して骨髄系のＤＣにより誘導され、そして、寛容性はＧＭ−ＣＳＦにより影響されないリンパ系ＤＣにより誘導される（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，前出）。従って、インビトロのＤＣによるＣＴＢコンジュゲート抗原の増強された提示は、種々のＣＴＢカップリング抗原を粘膜投与した場合に観察された増強された抗体応答および末梢Ｔ細胞寛容性のインビボでの誘導の両方と合致しており、また、後に記載するエクスビボのＣＴＢカップリング抗原またはＤＣによる一貫した免疫刺激とも合致している。ヒト樹状細胞の獲得および精製のための方法はよく知られている。例えば、後に記載する方法、および、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ等への米国特許６，００４，８０７号およびＣｒａｗｆｏｒｄ等への米国特許６，１９４，２０４号を参照できる。
【００７８】
マクロファージ（ＭΦ）
マクロファージ（ＭΦ）は、一般的には多くのホメオスタシス、免疫学的および炎症の過程、例えばＡＰＣと同様の役割に関与している遍在性の単核貪食細胞の集団である。それらは広範に組織分布していることから、白血球の侵入よりも前に外来性エレメントに対して迅速な防御を与えるために極めて適している。マクロファージは、ＩＬ−１の生産をもたらすＭＣＨクラスＩＩ制限経路を介した抗原提示による特異的免疫性、および、細菌、ウィルス、真菌および新生物病原体に対する非特異的免疫性の両方に関与していることから、マクロファージが一定範囲の機能的および形態学的な表現型を示すことは意外なことではない。
【００７９】
ＡＰＣとしてＭΦが機能する際の基本的な機序は、クラスＩＩ組織適合性分子の溝部分に存在する細胞表面における内在化抗原のフラグメントの提示、それに続く、後に刺激されてリンホカインを放出するディスプレーされた抗原を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞による認識である。
【００８０】
Ｂリンパ球
Ｂリンパ球はＭＨＣクラスＩＩ経路により抗原をプロセシングする。しかし、Ｂ細胞によりプロセッシングした抗原は、マクロファージのような貧食細胞のそれとは、決定的に異なる。先ずＢ細胞は、受容体媒介エンドサイトーシスにより抗原を取りこむ。抗原に対するＢ細胞受容体は、原型質膜に係留された抗体である。抗原上のエピトープに対するＢ細胞受容体の親和性は、Ｂ細胞がマクロファージが必要とする濃度よりも数千倍低濃度で体液中に存在する場合でも抗原と結合して内在化させることができるほど、高いものである。抗原プロセシングの残りの過程は、マクロファージについて上述したものと同様のクラスＩＩ経路により起こる。これらが、次にＢ細胞を刺激して細胞周期を開始させる。他のＡＰＣと同様、Ｂ細胞もまた細胞表面にディスプレーされたＧＭ1分子を有する。このことによりＧＭ1結合分子、例えばＣＴまたはＣＴＢおよびそのカップリングまたは融合された抗原は、通常の抗体受容体とは異なる別の経路を介してＡＰＣとしてのＢ細胞に進入し、これを使用することができるようになる。従って、ＣＴまたはＣＴＢに限り、全てのＢ細胞は、ナイーブおよび記憶Ｂ細胞の両方ともＡＰＣとして使用できる。
【００８１】
抗体応答をもたらすＴ細胞のプライミングおよび／または末梢寛容性にＢ細胞が寄与する程度は明らかにされていない。Ｂ細胞は、インビボの免疫プライミングには必要ではなく（Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９５；１８２：９１５−９２２）そして、ナイーブのＴ細胞を活性化するよりはむしろ消失させる（Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２；２５８：１１５６−１１５９）。同時に、いくつかの粘膜アジュバントは、同時に抗原を活性化してＢ細胞にターゲティングすることにより強力な抗体応答を促進することができる（Ａｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；１５８：３９３６−３９４６）。
【００８２】
抗原
ＣＴまたはＣＴＢと共に用いる免疫原蛋白またはペプチドまたはその部分は、直接免疫応答を意図する標的抗原からのＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの何れかまたは両方を含有するように選択するのが好ましい。このようなエピトープを含むペプチドは、多くの場合文献に記載されている。従って、融合蛋白の構築またはまたは同じ配列を有する合成ペプチドの購入を記載した文献から情報を得ることができる。特定の配列に関する情報が無い場合は、Ｔ細胞およびＢ細胞のエピトープは、標的蛋白抗原からの合成したペプチドを用いた標準的なＴ細胞増殖および／またはＥＬＩＳＡスクリーニング法により同定することができる。Ｂ細胞エピトープの大きさは、ある程度の折りたたみを可能とするのに十分なものでなければならず、そして、Ｔ細胞エピトープは、エピトープ全体を含むのに十分大きいものでなければならず、典型的には約１０アミノ酸残基の長さである。現実的には、毒素担体に連結または融合されているペプチドは、１０アミノ酸超、通常は約２０アミノ酸の長さであるが、５０アミノ酸以上の長さであってもよい。場合に応じて最適化することができる。
【００８３】
本発明の目的のためには、ペプチドはアミノ酸２種以上の化合物であり、蛋白を包含する。ペプチドは好ましくは、約１０００ｋＤ〜約１００００ｋＤ、より好ましくは、約１０００ｋＤ〜約５０００ｋＤの低分子量のものである。本発明のペプチドは約８〜約５０アミノ酸、好ましくは約１０〜約２０アミノ酸である。本発明のペプチドには、限定されないが、ＭＨＣ分子に結合するペプチド、細胞表面関連蛋白、熱ショック蛋白関連ペプチド／シャペロニン、発癌遺伝子または突然変異抗発癌遺伝子によりコードされる蛋白が包含される。本発明の１つの好ましい実施態様において、ペプチドはＭＨＣ分子に結合する。本発明の目的のためには、「ペプチド等価物」とは、ペプチドを含む蛋白の分解によるか、インビトロで合成されるか、組み換えＤＮＡ法を用いて調製されるものの、ＭＨＣ分子から単離されるペプチドと同じアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００８４】
特に腫瘍抗原に着目した抗原
本発明の目的のためには、ＣＴまたはＣＴＢまたは関連蛋白と連係して使用される抗原は、好ましくは蛋白またはペプチドであるが、炭水化物または脂質または抗原複合体（例えば糖脂質、糖蛋白、リポ蛋白等）並びに蛋白またはペプチド抗原をコードする核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）も包含してもよい。好ましい実施態様においては、抗原は、ワクチン接種目的のための該当する標的を提示する蛋白またはペプチドの抗原の群から選択され、限定されないが、感染性の物質（例えば細菌、ウィルス、真菌、原虫、蠕虫、プリオン）の抗原、腫瘍細胞、および、異常蛋白、例えばアルツハイマー病および他の神経変性障害に関与しているβ−アミロイドが挙げられる。特に好ましい実施態様においては、抗原は正常細胞と比較して腫瘍細胞に特異的であるか、これにより過剰発現される蛋白またはペプチドである。
【００８５】
好ましくは、蛋白またはペプチドは腫瘍特異的抗原を提示するか、これらから誘導される。蛋白またはペプチドは、細胞表面、細胞内部または２箇所の組み合わせから単離してよい。抽出物は（正常細胞と比較して）癌細胞の型に特徴的なものである。同じＴ細胞決定型の腫瘍抗原が異なるヒトの腫瘍により発現されており、形質転換関連の事象が、関連組織および／または細胞起源の腫瘍において、同じ腫瘍抗原の反復発現をもたらしていることが示唆されている（Ｓｈａｍａｍｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，１９９４；３９：７３−８３；  Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４；２６４：７１６）。このような腫瘍の例には、固形および播種性の腫瘍、限定されないが肺、結腸直腸、膵臓、前立腺、卵巣、乳房、多発性骨髄腫、白血病および黒色腫が包含される。腫瘍関連抗原の例には、限定されないがＨＥＲ２／ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ−２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４（乳房）、ＭＡＧＥ−１およびＭＡＧＥ−３（膀胱、頭部および頸部、非小細胞癌）；ＭＡＲＴ１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ−１００およびチロシナーゼ（黒色腫）；癌胚性抗原（ＣＥＡ−結腸、乳房、胃腸管）；ＭＵＣ−１複合体抗原、例えば１９−９およびＣＡ２４２（乳房、膵臓、結腸および前立腺）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７蛋白（頸癌）；腫瘍関連熱ショック蛋白抗原、および糖特異性を有する種々の他の糖脂質抗原、例えばフコシル−ＧＭ１、ＧＤ３、およびシアリルＴが包含される（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９８５；４５：２４０５−１４；  Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１９８４；  １：４３−４９；  Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９８６；４６：１４０３０１４０７；  Ｆｒｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １９８６；  ８７５：３１６−３２３）。
【００８６】
上記した腫瘍抗原は、上述のように合成によるか、または、全照射腫瘍細胞、腫瘍細胞抽出物または膜調製物から得ることができる（Ｈｅｒｌｙｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８８；６：２８３−３０８；  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８８；６：３５９−８０；  Ｓｃｒｅｉｂｅｒ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｅｄ．Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ  １９９９，ｐｐ．１２３７−１２７０，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。腫瘍細胞、抽出物または膜調製物を使用することの利点は、本発明の方法が既知の腫瘍関連抗原またはペプチドおよびその配列情報がなくても達成できる点にある。
【００８７】
腫瘍細胞の原型質膜上に位置するＭＨＣ分子からもともと単離されるペプチドを含む本発明のコンジュゲートは、Ｔ細胞を刺激する性質を有する。本発明の目的のためには、刺激とは、細胞抽出物に応答したＴ細胞の増殖並びにＴ細胞によるサイトカインの生成を指す。Ｔ細胞の増殖は、修飾核酸、例えば限定されないが3Ｈチミジン、125ＩＵＤＲ（ヨードデオキシウリジン）；および、生細胞を染色する３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）のような染料のＴ細胞による取り込みにより観察してよい。更に、例えばガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）のようなサイトカインの生産を用いて、例えばＥＬＩＳＡにより刺激をモニタリングしてよい（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮより入手可能）。サイトカインの生産は好ましくは、１５ｐｇ／ｍｌ以上、より好ましくは約２０〜約３０ピコグラム／ｍｌ、更に好ましくは約５０ｐｇ／ｍｌの量である。或いは、細胞毒性試験を用いてＴ細胞刺激を評価することもできる。
【００８８】
本発明を実施例により更に説明するが、それらは本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８９】
本発明を以下に示す特定の実施例を含む実施例により更に説明する。明細書の如何なる個所におけるこのような実施例の使用も説明のみを目的としており、本発明の範囲や意味、または例示した用語の何れもを限定するものではない。同様に、本発明は明細書中に記載した如何なる特定の好ましい実施態様にも限定されない。実際、本発明の多くの変更や改変が本明細書を参考にすることにより当業者には自明であり、その思想、範囲を逸脱せずに実行できる。従って本発明は、請求項に該当する同等物の完全な範囲を含む添付の請求項の用語によってのみ限定される。
【００９０】
方法
呈示した説明および参考文献により、当業者は容易に実験を反復でき、使用する抗原の性質および選択に関する種々の変更や改変、コンジュゲートまたは遺伝子融合の方法、および、細胞調製方法および免疫学的試験を実施できる。
【００９１】
ＣＴＢまたはＣＴへのペプチドまたは蛋白抗原の化学的コンジュゲーション
ＣＴＢへのインフルエンザウィルス  ヘマグルチニンペプチドのカップリング
インフルエンザウィルス  ヘマグルチニンＨ１サブタイプ（ＨＡペプチド）のアミノ酸残基１０８〜１１９に相当する合成ペプチドをＮｅｏｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）より購入した。組み換えＣＴＢ（ｒＣＴＢ）は文献記載に従ってＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株３５８から製造し精製した（Ｌｅｂｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９３；１１：１５７４−１５７８）。ＣＴはＬＩＳＴ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）から購入した。全卵白アルブミン（ＯＶＡ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【００９２】
文献記載の方法に従って２官能性カップリング剤としてＮ−スクシンイミジル（３−［２−ピリジル］−ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＳ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてｒＣＴＢまたはＣＴにＨＡペプチドおよびＯＶＡ蛋白を化学的にカップリングした（Ｒａｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２０００；３０：１０２４−１０３２）。コンジュゲートした物質をＦＰＬＣゲル濾過により定量し精製した（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。ビオチニル化抗ＣＴＢモノクローナル抗体を用いたＧＭ１−ＥＬＩＳＡにおいてコンジュゲートを分析（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９７８；１：１９−２３）したところ、ＧＭ１−結合活性を保有していたことがわかった。
【００９３】
ＣＴまたはＣＴＢへの卵白アルブミンまたは破傷風トキソイドのカップリング
破傷風に対するヒトワクチンに使用するための破傷風毒素のホルマリン不活性化により調製した破傷風トキソイド（ＴＴ）をＳＢＬ  Ｖａｃｃｉｎ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎより無料で入手した。ＣＴおよびｒＣＴＢは上記したとおり製造し、精製した。
【００９４】
ＯＶＡまたはＴＴ蛋白をＣＴまたはｒＣＴＢに化学的にカップリングし、上記したように定量し、精製した。精製したコンジュゲートはそれぞれＣＴおよびＣＴＢに対して等モル濃度のＯＶＡを含有していた。ビオチニル化抗ＣＴＢおよび抗ＣＴＡモノクローナル抗体、並びに、ポリクローナル抗血清を用いて、そしてＯＶＡおよびＴＴに対するポリクローナルマウスまたはウサギ抗血清によって、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡにおいてコンジュゲートを分析したところ、ＧＭ１に対し、並びに抗ＣＴＢ、抗ＯＶＡまたは抗ＴＴに対し適宜、そして、ＣＴコンジュゲートの場合には抗ＣＴＡ抗体に対しても反応性を保有していたことがわかった。
【００９５】
ＣＴＢ融合蛋白の構築および精製
ＣＴＢまたはＬＴＢによる融合蛋白の作成のための方法は報告されており、そこでは、目的の抗原のＴまたはＢエピトープの何れかまたは両方をコードする核酸をＣＴＢのＮまたはＣ末端の何れかまたは両方のコーディング配列に遺伝子的に融合させるか、またはＣＴＢまたはＬＴＢコーディング配列内の鎖内位置にいれるか、またはＣＴＡまたはＬＴＡの類似の位置に入れる（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９５；１６５：１６３−１７１；  Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９４；１４９：２１１−２１７；  Ｓｃｈｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９１；９９：２５５−２５９；）。方法はまたＣＴＡまたはＬＴＡのカルボキシまたはアミノ末端へのペプチドの融合に関し、および、ＣＴＢまたはＬＴＢを用いたこれらの融合蛋白の同時発現に関して記載している（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８６；２０８：１９４−１９８，Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９９７；４０１：９５−９７）。
【００９６】
以下に記載する実施例において使用するために、このような組み換えＣＴＢ融合分子２種を作成したが、そのうち１つはＯＶＡのペプチド３２３〜３３９がＣＴＢのＣ末端に融合し（ＣＴＢ：：ＯＶＡｐ、図１Ａ）、もう１つはインフルエンザウィルス  ヘマグルチニン残基１０８〜１１９（ＨＡ）に相当するペプチドがＣＴＢ構造の残基５６〜６３を置き換えていたものであった（ＣＴＢ５６  ６３Ｈａｐ）。
【００９７】
ＣＴＢ：：ＯＶＡｐ：１７アミノ酸ＯＶＡペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを合成した（Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ  ＡＢ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、次にＣＴＢ遺伝子の３’末端に連結した。最終プラスミドｐＭＬＣＴＢ：：ＯＶＡのＤＮＡ配列決定により、遺伝子融合の最終配列を確認した。
【００９８】
ＣＴＢ５６  ６３ＨＡｐ：１２アミノ酸ＨＡペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを合成した（Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ  ＡＢ）。オリゴヌクレオチドを成熟ＣＴＢの５５位および６４位の間でプラスミドｐＣＢ５６  ６３ｇｐ１２に挿入した（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９５；１６５：１６３−１７１）。ＤＮＡ配列決定を用いてｐＣＢ５６  ６４ＨＡ中のインサートの配列を確認した。
【００９９】
ＣＴＢに挿入されたペプチドを担持する組み換え蛋白は、ＮまたはＣ末端に連結したペプチドを担持するものよりも安定である（Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９４；１４９：２１１−２１７）。即ち、ＣＴＢ５６  ６３ＨＡｐは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ中に発現されるが、ＣＴＢ：：ＯＶＡｐは、大腸菌中に発現され、ＣＴＢ上のｃ末端ペプチドの伸長を容易に破壊することがわかっている細胞外のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅプロテアーゼによる切断を回避する（Ｓｃｈｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９１；９９：２５５−２５９）。
【０１００】
ｐＣＢ５６  ６３ＨＡｐをＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株ＪＳ１５６９内にエレクトロポレーションにより移行させた。蛋白をヘキサメタリン酸塩を使った成長培地から沈殿させ、（Ｌｅｂｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９３；１１：１５７４−１５７８）、そして次に０．２Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０の最小容量に再溶解し、ＰＢＳｐＨ７．２に対して透析した。
【０１０１】
ｐＭＬ  ＣＴＢ：：ＯＶＡを大腸菌ＢＬ２１中に移行させた（Ｇｒｏｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，J．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９８；  １７０：１２４５−１２５３）。使用したＣＴＢ遺伝子は、原形質周囲への合成蛋白の輸送を指示するシグナルペプチドを欠いていた。このため、単量体としての生成物（ＣＴＢ：：ＯＶＡｐ）の原形質蓄積が起こり、これにより不溶性の封入体が形成された。これを６．５Ｍ尿素に溶解し、透析により再組立した（Ｌ’Ｈｏｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９０；８９：４７−５２）。
【０１０２】
Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ＦＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｃａ，ＵＳＡ）を用いながら、イオン交換（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  カラム，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＦＰＬＣゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １６／６０カラム，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により、ＣＴＢ：：ＯＶＡｐおよびＣＴＢ５６  ６４ＨＡｐの融合蛋白を更に精製した。
【０１０３】
ビオチニル化抗ＣＴＢモノクローナル抗体を用いたＧＭ１  ＥＬＩＳＡによればＣＴＢ融合蛋白は、ＧＭ１結合活性を保有していたことがわかった。
【０１０４】
マウスＡＰＣおよび他の細胞の調製およびマウスの免疫学的試験
以下のプロトコルに特段に記載しない使用した方法の全てに関する詳細な説明は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．  Ｊ．大腸菌ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｉｎｃ．  １９９７，ｖｏｌｕｍｅ  １に記載されており、これを参照することができる。
【０１０５】
ＡＰＣの生成。骨髄由来ＤＣおよびマクロファージ（ＭＯ）の生成のために、雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂ＆Ｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を屠殺し、大腿骨および頚骨から骨髄を洗い出し、塩化アンモニウムで赤血球を枯渇させた。「全ＡＰＣ」の調製のために、文献記載の方法により標準的なニューラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球ロゼット法によりＴ細胞を除去した後に全脾臓細胞を用いた（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．  Ｊ．大腸菌ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｉｎｃ．  １９９７，ｖｏｌｕｍｅ  １）。
【０１０６】
ＤＣは文献記載のとおり骨髄前駆体から発生させた（Ｉｎａｂａ，Ｋ，Ｍ．  Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １９９２；  １７６：１６９３−１７０２）。要すれば、赤血球の除去後、ラット抗マウスＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０およびＩ−Ａｄ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ラットＩｇＧコーティングおよび抗マウスＩｇＧコーティングビーズ（Ｄｙｎａｌ）各々１μｇ／ｍｌと共にインキュベートすることによりＴ細胞、Ｂ細胞およびＭＨＣＩＩ陽性細胞を除去した。残りの細胞を１０％ＦＣＳおよび１１２５Ｕ／ｍｌ組み換えネズミＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加したＩｓｃｏｖｅｓ培地（ＤＣ培地と称する）中で２４穴プレート（１０6個／ウェル）にプレーティングした。ＤＣ培地の半量を２日おきに交換した。第６日に非付着細胞を採取し、更に、８００ｘｇのメトリザミド密度遠心分離により（ＰＢＳ中１８％メトリザミド；Ｓｉｇｍａ）精製した。得られたＤＣの９０％超がＣＤ１１ｃ陽性であった。一部の実験においては、ＤＣを更に製造元の指示に従って抗マウスＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製し、９９％より高純度のＣＤ１１ｃ陽性ＤＣを得た。
【０１０７】
マクロファージを生成するために（Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８５；  １３４：９８２−９８９）、３７℃で一夜２０ｍｌフラスコ中でインキュベーションすることによりプラスチック付着細胞を骨髄前駆細胞から除去し、コロニー刺激因子１（Ｓｉｇｍａ）２０ｎｇ／ｍｌを含有する完全培地中、７５ｃｍ2フラスコ（２０ｍｌ／フラスコ）中で５ｘ１０5個細胞／ｍｌで残りの細胞を培養した。２．５Ｕのジスパーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有するＰＢＳ５ｍｌにより３７℃で５分間インキュベートすることにより第７日に付着したマクロファージを回収した。
【０１０８】
Ｂ細胞は、Ｂ２２０特異的磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、プラスチック付着細胞の初期枯渇の後に脾細胞懸濁液から精製し、これによりＦＡＣＳで分析した場合に９０％超の純度のＢ２２０陽性細胞が得られた（下記参照）。
【０１０９】
ＨＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックおよび非トランスジェニックＴ細胞の精製
Ｔ細胞は、Ｉ  Ｅｄに関してインフルエンザウィルス  ヘマグルチニン（ＨＡ）のペプチド１１１〜１１９に特異的なトランスジェニックアルファ／ベータ鎖Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するナイーブのＢＡＬＢ／ｃマウス（１９−寄贈元：Ｄｒ．Ｈ．ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｈａｒｖａｒｄ，ＵＳＡ）およびＯＶＡのペプチド３２３〜３３９に特異的なトランスジェニックアルファ／ベータ鎖Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＢＡＬＢ／ｃマウス（３２−寄贈元：Ｄｒ．Ｎｉｌｓ  Ｌｙｃｋｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｅｂｏｒｇ）の末梢リンパ節および脾臓より、Ｔ細胞精製カラム（Ｒ＆Ｄ）を用いて精製し、その後、抗ＩＡｂ，ｄモノクローナル抗体（５ｍｇ／ｍｌ，Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）をコーティングしたペトリ皿上にパニングした。得られたＴ細胞集団の９８％超がＣＤ３＋であり、そのうち約１０％がＨＡ  ＴＣＲ動物中でトランスジェニックＴＣＲを発現し、５０〜７０％がＯＶＡ−ＴＣＲ動物中でトランスジェニックＴＣＲを発現していた。
ナイーブな、または、免疫化した非トランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂ＆Ｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）の末梢リンパ節または脾臓から得たＴ細胞を、Ｔ細胞精製カラム（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いるＴＣＲトランスジェニックＴ細胞に使ったのと同じ方法で精製および特性を調べ、その後、抗ＩＡｂ，ｄモノクローナル抗体（５ｍｇ／ｍｌ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をコーティングしたペトリ皿上にパニングした。得られたＴ細胞集団の９８％超がＦＡＣＳにより試験したところＣＤ３＋であった。
【０１１０】
ＦＡＣＳ分析
ＡＰＣは、ａ）単離／インビトロ生成の直後、または、ｂ）１０6抗原パルスＡＰＣを単独または１０6抗原特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と共に平底２４穴プレート（Ｎｕｎｃ）中でインキュベートした２４時間後に分析した。細胞はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手した以下の抗体：即ち、ＦＩＴＣ抗ＩＡｂ  クローン２５  ９  １７、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ４０クローンＨＭ４０  ３、ＰＥ抗マウスＣＤ８０クローン１６  １０Ａ１、ＰＥ抗マウスＣＤ８６クローンＧＬ１、ＰＥ抗マウスＢ２２０クローンＲＡ３  ６Ｂ２およびＰｅｒＣＰ抗マウスＣＤ３ｅクローン−Ｎ１４５  ２Ｃ１１を用いてＦＡＣＳにより分析した。抗原パルスＤＣもまたネズミ抗ＯＶＡ血清（１／１０希釈）を用いるか、または３０分４℃でＣＴＢへのモノクローナル抗体（ＬＴ３９；１／１０希釈の上澄み）（Ｒａｐｐｕｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １９９９；２０：４９３−５００）、次いでＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）で分析した。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手したＰＥ抗マウスＣＤ３ｅクローン１４５−２Ｃ１１、およびＨＡ特異的トランスジェニックＴＣＲを認識するＦＩＴＣ標識ラットクロノタイプモノクローナル抗体６．５（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：７９３−７９６）またはＯＶＡ特異的トランスジェニックＴＣＲを認識するＦＩＴＣ標識ＫＪ１−２６ｍＡｂ（Ｍａｒｒａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １９８３；１５８：１６３５−１６４６）を用いて分析した。
【０１１１】
増殖試験
ＡＰＣは、９００ｒａｄで照射し、３７℃で９０分間漸増量の抗原と共にインキュベートし、十分洗浄し、そして完全培地中ＨＡ特異的またはＯＶＡ特異的なトランスジェニックＴ細胞１０5個と共に平底９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）中１０4または１０5個細胞／ウェルとなるように３連でプレーティングした。プレートを３７℃で２〜３日間インキュベートした。培養上澄みを４８時間目に採取し、サイトカイン含量測定時まで−７０℃で凍結した。１ｍＣｉ（6-3Ｈ）チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  ＵＫ）を回収前８時間に各ウェルに添加し、取りこまれた放射能を測定した。結果は抗原特異的3Ｈチミジン取りこみ（ｃｐｍ）として、または、抗原処理ＡＰＣと共にインキュベートしたＴ細胞への3Ｈチミジン取りこみと擬似処理ＡＰＣと共にインキュベートしたＴ細胞への3Ｈチミジン取りこみとの間の比率として定義される刺激指数（ＳＩ）として表示する。
【０１１２】
サイトカイン測定
２００μＬの完全培地中、ＣＴ（０．０５μＭ）またはＣＴＢ（０．５μＭ）と連係させた特異的抗原の存在下または非存在下において、平底９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）中１０5個細胞／ウェルでＤＣをインキュベートした。培養上澄みは２４時間以降に採取し、サイトカイン含量測定時まで−７０℃で凍結した。取扱説明書に従って、Ｒ＆Ｄから入手した特異的Ｄｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡを用いて培養上澄みのＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１α含量を測定した。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８も同様にしてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＵＳＡ）より入手したＯｐｔＥＩＡマウスＩＬ−１２（ｐ４０）およびＩＬ−１８のセットを用いて測定した。取扱説明書に従って、Ｒ＆Ｄから入手したマウスＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γのためのＤｕｏｓｅｔ  ＥＬＩＳＡを用いて培養上澄みのＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γ含量を測定した。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８も、同様にしてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＵＳＡ）より入手したＯｐｔＥＩＡマウスＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）およびＩＬ−１８のセットを用いて測定した。ＩＬ−４およびＩＬ−１０は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎより入手した特異的抗体対を用いてＥＬＩＳＡまたはより感度が高い変法である細胞ＥＬＩＳＡ法により測定した（Ｂｅｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９７；  ２０５：１６３−１６８）。両方の試験法の感度は３０ｐｇ／ｍｌであった。
【０１１３】
エクスビボおよびインビボのワクチン接種および試料採取
ＤＣ（または他の型のＡＰＣ）を、ＣＴ（０．０５μｍ）またはＣＴＢ（０．５μＭ）の存在下または非存在下で、等モル濃度のＯＶＡ（０．５μｍまたは０．０５μＭ）において、ＯＶＡ，ＣＴＢにコンジュゲートしたＯＶＡ（ＯＶＡ−ＣＴＢ）またはＣＴにコンジュゲートしたＯＶＡ（ＯＶＡ−ＣＴ）で３７℃で２時間パルスし、次に遠心分離３回により十分洗浄した後、注射した。
【０１１４】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに対し、ＰＢＳ１００μｌ中の２ｘ１０6ＤＣ（または他の型のＡＰＣ）を２週間の間隔を空けて２回、静脈内注射（或いは、比較のために、皮下または腹腔内注射）した。２回目のＤＣワクチン接種の２週間後、皮下投与により、ＦＣＡ中３μｇのＯＶＡでマウスをブーストした。ブースター投与時（ＤＣ２後１４日）、および、ＯＶＡ−ＦＣＡ後９日目にワクチン接種前に血清を採取し、ＯＶＡ特異的抗体生産量の分析時まで−２０℃で凍結した。ＯＶＡブースター注射後９〜１４日にマウスを屠殺した。脾臓を採取し、単細胞懸濁液はインビトロでＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ生産量を分析した。これらの試験は動物実験倫理委員会によって承認された（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，  Ｓｗｅｄｅｎ）。
【０１１５】
血清中の抗体応答
高結合マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を一夜ＯＶＡ（ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌ）でコーティングした。血清の連続希釈物を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で９０分間インキュベートした。その後パーオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（１／３０００）、ＩｇＧ１（１／１０００）またはＩｇＧ２ａ（１／１０００）（全てＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより入手）を室温で９０分間添加した。反応混合物を０．０４％Ｈ2Ｏ2含有０．１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ４．５中の１ｍ／ｍｌのＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）１００μｌで展開し、４５０ｎｍで読みとった。特異的抗体力価はバックグラウンド値より０．４だけ高値の吸光度を与える内挿した試料希釈度として推定した。免疫化前の血清には抗ＯＶＡ抗体は検出されなかった。データは３匹以上のマウスの平均の逆数の力価＋ＳＤで表示した。
【０１１６】
ＤＣ免疫化動物由来のＴ細胞を用いたサイトカインの測定
ＤＣ免疫化動物のＴ細胞の分析は、ＤＣがＦＣＳ特異的Ｔ細胞応答を誘導することにより妨害された。この問題を回避するために、別の入手元の血清（ウマ血清）をインビトロ分析で使用し、その際、短時間の試験しかできなかった（即ち、サイトカインは測定したが増殖試験は行わなかった）。
【０１１７】
脾臓細胞中のＩＦＮ−γの生産の測定は、取扱説明書に従って、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）を用い、細胞ＥＬＩＳＡ法の変法（Ｂｅｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９７；  ２０５：１６３−１６８）によって行なった。要すれば、単核脾臓細胞懸濁液をＯＶＡ（５００μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、５％ウマ血清を含有するＩｓｃｏｖｅｓ培地中に種々の細胞密度で２連で播種し、抗ＩＦＮガンマコーティング平底９６穴プレート中２４時間３７℃でインキュベートした。十分に洗浄して細胞を除去し、ビオチニル化抗マウスＩＦＮガンマを一夜４℃で添加し、その後、室温で２μｇ／ｍｌパーオキシダーゼ標識アビジン（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）と共に４５分間インキュベートした。０．０５Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液ｐＨ５．０中、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（０．１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）および０．０６％Ｈ2Ｏ2を含有するパーオキシダーゼ基質を用いて発色を行なった。反応は２５μＬの１ＭＨ2ＳＯ4を用いて停止し、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＩＦＮ−γの濃度は、組み換えサイトカインを用いた標準曲線から外挿により求めた。結果は１００万個の脾臓細胞当たり分泌されたＩＦＮ−γの濃度として表示した。１つの実験においては、脾臓細胞懸濁液からＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞を枯渇させた後に、それぞれ、ラット抗マウスＣＤ４およびラット抗マウスＣＤ８抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、および抗ラットＩｇＧコーティングビーズ（Ｄｙｎａｌ）を用いて分析を行った。
【０１１８】
ヒトＡＰＣおよび他の細胞の調整および使用したヒト免疫学的試験
種々のヒトＡＰＣ、例えばＤＣ、単球／マクロファージ、Ｂ細胞および「全ＡＰＣ」を以下に記載するとおり、ヘパリン処理ヒト静脈血から調整した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製した。代替となる単離原料としては、例えば、末梢血「バフィーコート」、骨髄吸引物、外科的に切除したリンパ節、胸膜液、および外科的に採取した腫瘍および上皮の組織の標本が挙げられる。
【０１１９】
樹状細胞
ＤＣの生成のためには、文献記載のとおりＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心分離によりヘパリン処理静脈血からＰＢＭＣを調製した（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．Ｊ．大腸菌ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｉｎｃ．  １９９７，  ｖｏｌｕｍｅ  ２）。次に１ｘ１０6個細胞／ウェルの細胞を５％自己（またはヒトＡＢ）血清を添加したＩｓｃｏｖｅ完全培地中、６穴のプラスチック組織培養プレート中、３７℃で２時間インキュベートし、付着細胞をプラスチックに付着させた。非付着の材料は廃棄し、次に付着した細胞を５％自己（またはヒトＡＢ）血清、１％ゲンタマイシン、１％Ｌ−グルタミン＋８００Ｕ／ｍｌＧＭＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌＩＬ−４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加したＩｓｃｏｖｅ完全培地−ＤＣ培地と称する−中、３７℃で６〜７日間、２日おきに培地の半量を交換しながらインキュベートした。別法として、ＣＤ１４＋細胞を、先ず抗ＣＤ１４コーティング磁気ビーズおよび分離カラムを用いて製造元の指示に従ってＰＢＭＣから単離した（ＣＤ１４マイクロビーズおよびＬＳ分離カラムはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨより入手）。更に成熟したＤＣを得るために、インキュベートの最後の２日に使用したＤＣ培地には、一部の試験において、更にＴＮＦ−α１００Ｕ／ｍｌ、および／または、２日間抗イムノグロブリンコーティングプレート中ＰＢＭＣを培養し、次いで上澄みの培地を用いることにより得たいわゆる単球コンディショニング培地を更に添加した。
【０１２０】
単球／ＭΦ
５％自己（またはヒトＡＢ）血清を添加したＩｓｃｏｖｅ培地にＰＢＭＣを付着させるという変更を加えた文献記載（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．Ｊ．大腸菌ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｉｎｃ．  １９９７，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ７．６．１  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）のプラスチック付着法を用いて、ＰＢＭＣから単球／マクロファージ集団を単離した。更に精製するために、ウシ胎児血清の代わりに自己血清（またはヒトＡＢ血清）を用いた以外は文献記載の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．Ｊ．大腸菌ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｉｎｃ．  １９９７，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ７．６．２  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配により遠心分離することにより脱着した付着細胞をサイズ沈降した。
【０１２１】
Ｂリンパ球
Ｂ細胞は、文献記載の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．Ｊ．大腸菌ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｉｎｃ．  １９９７，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ７．５．３  ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により、抗ＣＤ１９コーティングＭＡＣＳビーズ（Ｄｙｎａｌ）を用いた免疫磁気的陽性選択法を用いてＰＢＭＣから単離した。
【０１２２】
「総ＡＰＣ」は、文献記載の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｅｄ．Ｊ．大腸菌ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｉｎｃ．  １９９７，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ７．２．１  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により、ニューラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）によるロゼット法を用いてＴ細胞を枯渇させることによりＰＢＭＣから調製した。
使用前の保存のためには、単離したＡＰＣを数週間凍結するか、または、数日間メチルセルロースゲル中に投入することができる。
【０１２３】
Ｔ細胞の精製
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心分離により静脈血から単離した。１０％ＦＣＳおよび抗生物質を添加したＩｓｃｏｖｅ培地（培養液）中のＰＢＭＣを３７℃で９０分間ペトリ皿（２ｘ１０7個細胞／ペトリ皿）でインキュベートした。文献記載の方法（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｓｅｃｔ．  ７．２，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．  Ｉｎｃ．  １９９７）により、ニューラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）によるロゼット法を用いてＴ細胞を精製し；細胞をＦＡＣＳで確認したところ、９５％超のＣＤ２＋Ｔ細胞を含有していた。
【０１２４】
ＡＰＣのエクスビボ処理
ＤＣまたは他のＡＰＣを、等濃度のＴＴ（０．５μグラム／ｍｌ）を用いながら、抗原（ＴＴ）のみ、または、ＣＴＢまたはＣＴにコンジュゲートした抗原（ＴＴ‐ＣＴＢまたはＴＴ‐ＣＴ）またはＣＴ（０．１または０．０１μｇ／ｇｍｌ）またはＣＴＢ（０．１μｇ／ｇｍｌ）と混合した抗原［ＴＴ＋ＣＴまたはＴＴ＋ＣＴＢ］と共に３７℃で２時間インキュベート（パルス）し、次に遠心分離３回により十分洗浄した。メンブレンフィルターを用いてＡＰＣを洗浄することもできる。後述するＴ細胞増殖試験の前に、ＡＰＣを２０００ｒａｄで照射した。
【０１２５】
インビトロ増殖試験
９６穴の平底マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を用いた。単独、または、実施例で記載するとおりＣＴまたはＣＴＢと連係した抗原に曝露した１種または他の種類の２０００ｒａｄ処理ＡＰＣ（ＤＣ、Ｂ細胞、単球または「全ＡＰＣ」）とともにウェル当たり７．５ｘ１０4個のＴ細胞を添加した。プレートを７．５％ＣＯ2存在下、３７℃で５日間インキュベートした。１(Ｃｉ（6-3Ｈ）チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  ＵＫ）を回収前１６時間に各ウェルに添加し、取りこまれた放射能を測定した。結果は３連で行なった実験の平均のｃｐｍ値として表示する。
【０１２６】
［実施例１］
抗原のＣＴＢへのカップリングにより未分画「全ＡＰＣ」によるインビトロでの抗原提示が増強される
種々のＡＰＣによる抗原提示に対する担体蛋白としてのＣＴＢの作用を調べるために、抗原を化学的または遺伝子的にＣＴＢにカップリングさせ、ＡＰＣと共にインキュベートした。ＡＰＣとして全脾細胞懸濁液を用いたところ、ＣＴＢへの蛋白またはペプチドのコンジュゲーションにより、同族のＴＣＲトランスジェニックＴ細胞に対する効果的な提示に必要な抗原の濃度が大きく低下することがわかった（図２）。ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞への提示に先だって、ＡＰＣを１０-8ＭＯＶＡに相当するＯＶＡまたはＣＴＢ−ＯＶＡの固定濃度で予備インキュベートした場合、ＣＴＢ−ＯＶＡコンジュゲートは、遊離のＯＶＡで得られるものよりも８０倍高値の増殖応答をもたらした（図２Ａ）。同様に、ＯＶＡペプチドを担持したＣＴＢ融合蛋白（ＣＴＢ：：ＯＶＡｐ）は、必要とされる遊離のＯＶＡペプチドの濃度と比較して１０4倍超低値の濃度において有効であった（図２Ｂ）。同様の結果は、読み出し系としてＨＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を用いて、ＣＴＢに遺伝子的に融合したＨＡペプチドを遊離のＨＡペプチドと比較した場合にも観察されている（図２Ｃ）。得られた増殖応答は、ｗｔＢＡＬＢ／ｃ動物由来のＴ細胞がＨＡまたはＯＶＡペプチドまたは相当するＣＴＢ誘導体に応答して増殖しなかったことから、抗原特異的であった（データ示さず）。
【０１２７】
遊離のＣＴＢおよび遊離の抗原の同時投与では、抗原のみで得られた結果と比較してＴ細胞増殖応答の増強がもたらされなかったことから、抗原提示に対する有益な効果が起こるためには抗原とＣＴＢ分子との間に物理的な相互作用が必要であった（図２Ａ，Ｃ）。
【０１２８】
［実施例２］
ＣＴＢへの抗原のコンジュゲーションにより、精製されたＡＰＣ、ＤＣ、Ｂ細胞およびＭΦの種々の型による抗原提示が増強される
本実施例においては、ナイーブなＢＡＬＢ／ｃ動物の脾臓から精製したＤＣ、ＭΦまたはＢ細胞の何れかに分化する特異的サイトカインの存在下において生育させた骨髄前駆細胞から生成した３種の異なるＡＰＣ源を用いた。異なる型のＡＰＣをＨＡまたはＯＶＡペプチド、またはそれらのＣＴＢ融合蛋白誘導体とともに９０分間インキュベートし、次に十分洗浄し、１：１０の細胞比率で、ＨＡ−またはＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニック動物から精製したＴ細胞の培養物に添加した。データは、１０4ＡＰＣとともに１０5個の精製されたＴ細胞を用いた２つの実験のうちの１つからとり出し、異なる濃度（１０0、１０2および１０4ｎＭ）で得られた刺激指数として表示した。これらの条件下、ＭＨＣＩＩを構成的に発現するＤＣおよびＢ細胞は、遊離のペプチド（ＯＶＡおよびＨＡ）、化学的にコンジュゲートされたＣＴＢ−ペプチド（ＯＶＡおよびＨＡ）、遺伝子的にカップリングされたＣＴＢ−ＨＡペプチド、または全蛋白（ＯＶＡ）に対する効率的なＡＰＣであり、抗原は検知可能なインビトロのＴ細胞増殖応答を誘導するために、それぞれ約１０および１００ｎＭの遊離抗原を必要とした。これとは逆に、遊離のペプチドまたは蛋白抗原で処理したＭΦは、遊離または連結したペプチドまたは蛋白を用いてＨＡ−またはＯＶＡ特異的なＴＣＲトランスジェニックＴ細胞による顕著な増殖をまったく誘導できなかった。これらの結果は、ＤＣおよびＢ細胞上では顕著なＭＨＣＩＩの発現を示すが、ＭΦ上では示さないＦＡＣＳのデータと合致している（データ示さず）。
【０１２９】
ＣＴＢ連結抗原への増殖応答は、ＤＣまたはＢ細胞をＡＰＣとして用いた場合に最も強力であり、これは１００ｎＭの濃度ではＨＡで１００〜１０００、ＯＶＡで１００〜１００００の刺激指数を与えた。しかしながら、ＣＴＢへの抗原のコンジュゲーションはまたＭΦをＡＰＣとして用いた場合にも強力なＴ細胞増殖を誘導しており、ＣＴＢ−ＨＡでは約１００、ＣＴＢ−ＯＶＡでは４００の刺激をもたらした。遺伝子的および化学的なＣＴＢペプチドのコンジュゲートは、両方とも、この目的のために使用でき、そしてＣＴＢコンジュゲーションは、ペプチド（ＯＶＡペプチド）および蛋白（ＯＶＡ）の抗原の両方へのその後の増殖応答を増強する効率的な手段であることがわかった。
【０１３０】
［実施例３］
ＣＴＢへのペプチドのコンジュゲートはペプチド特異的Ｔ細胞の増殖応答を増強し、増強されたＩＦＮ−およびＩＬ−１２生産を誘発する
ＣＴＢコンジュゲート抗原を用いて得られた増強された抗原提示は、マウス由来の抗ＣＴＢ免疫血清（１／１００で使用）またはＧＭ１（１０ｍＭ）を予備インキュベーション工程に使用した場合には、ブロックされ（データ示さず）、増強された抗原提示は、ＡＰＣ上のＧＭ１受容体へのＣＴＢ媒介結合に依存していることが示された。増強された抗原提示は、前炎症性サイトカインの生産をもたらし、従って増強された免疫応答をもたらした。ＣＴＢコンジュゲート抗原は増強されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２のインビトロの分泌を誘導することが解かった。遊離またはＣＴＢカップリングされた抗原でパルスした場合に、種々のＡＰＣがＩＦＮ−γ生産を誘導する能力を比較した。ＩＦＮ−γ分泌は、種々の濃度（１０〜１０4ｎＭ）のＯＶＡ、ＯＶＡペプチドまたはＨＡペプチド、またはそのＣＴＢ誘導体で予備処理しておいたＡＰＣと共にインキュベートしたＯＶＡ特異的またはＨＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の培養物の４８時間上澄み中で測定した。
【０１３１】
更に、異なるＡＰＣでは、サイトカイン生産を起こす能力が異なることが解かった。ＡＰＣとしてＤＣ、Ｂ細胞またはＭΦを使用した場合のＩＦＮ−γ生産に対するＨＡペプチドとＣＴＢカップリングＨＡペプチドの効果を比較した。ＨＡペプチド単独では、ＤＣまたはＭΦをＡＰＣとして使用した場合には、極めて高用量（１０4ｎＭでそれぞれ約２０００および２００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ）で与えない限り、低レベルのＩＦＮ−γを誘導し、Ｂ細胞をＡＰＣとして使用した場合はＩＦＮ−γを誘導しなかった。ＨＡペプチドを化学的または遺伝子的にＣＴＢにカップリングした場合、分泌されたＩＦＮ−γのレベルはかなり高くなり、ＤＣおよびＭΦではそれぞれ約２０００および５０００ｎｇ／ｍｌであり、１０００倍超の低濃度で起った（１０1ｎＭ）。更に、ＣＴＢカップリングＨＡペプチドはまた、Ｂ細胞をＡＰＣ源として利用した場合にも測定可能なＩＦＮ−γ応答（約９００ｐｇ／ｍｌ）を誘導した。
【０１３２】
更にまた、遺伝子的および化学的なＣＴＢ−ＨＡコンストラクトを比較した。一般的に、ＩＦＮ−γ応答を誘導する能力に関しては、遺伝子的および化学的なＣＴＢ−ＨＡコンストラクトの間の相違は小さかった。しかしながら、ＭΦをＡＰＣとして使用した場合、遺伝子的コンストラクトは化学的コンジュゲートよりも優れたものとなり、１０2ｎＭにおいてＩＦＮ−γ生産は約５５００ｐｇ／ｍｌであり、これに対し後者は同じ濃度で約３００ｐｇ／ｍｌであった。より低用量のＡＰＣ（１０4ＡＰＣ／ウェル）を使用した場合、分泌のパターンは高用量のＡＰＣを使用した場合と同様であるが、生産されたＩＦＮ−γの量は一般的に低値となる。
【０１３３】
次に、ペプチド（ＯＶＡペプチド）および蛋白（ＯＶＡ）の抗原のＣＴＢコンジュゲーションの効果を比較した。ＤＣによるＩＦＮ−γ応答を誘導するためには、同程度の濃度の遊離のＯＶＡまたはＯＶＡペプチドが必要であるが、ＯＶＡはペプチドと比較して一貫してより高値のＩＦＮ−γを誘導したことがわかった。ＯＶＡおよびＯＶＡペプチドの何れもＢ細胞をＡＰＣとして使用した場合は、測定可能なＩＦＮ−γ応答を誘導しなかった。ＣＴＢ５６−６３ＨＡ融合蛋白と同様に、ＣＴＢ：：ＯＶＡハイブリッド蛋白は、遊離のＯＶＡペプチドと比較して、必要な抗原の用量（ＤＣについては１０-2ｖｓ１０2ｎＭ、ＭΦについては１０2ｖｓ１０1ｎＭ）および得られたＩＦＮ−γ応答の程度（ＤＣについては約４５００ｖｓ約５００ｐｇ／ｍｌ、ＭΦについては約４０００ｖｓ約１２０００）の両方に関し、ＩＦＮ−γ応答の誘導において遥かに優れていた。ＣＴＢをネイティブのＯＶＡに化学的にコンジュゲートした場合、ＩＦＮ−γ応答はより低いＯＶＡ濃度でたしかに起こったが、ペプチド抗原を使用した場合と比較して相違はそれほど顕著ではなかった。
【０１３４】
培養物は更にＴｈ２サイトカイン、例えばＩＬ−４およびＩＬ−１０の存在に付いても分析したが、ＡＰＣ源または抗原の性質とは無関係にこれらのサイトカインの何れも測定可能なレベルで観察されなかった。
【０１３５】
ＩＬ−１２はＩＦＮ−γ応答の誘導において重要な因子である（Ｏ’Ｇａｒｒａ，  Ａ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  １９９８；８：２７５−２８３）。従って、ＩＦＮ−γに関して上記のとおり分析した培養上澄み中のＩＬ−１２の濃度を測定した。データは１０5個のＡＰＣと共に１０5個の精製Ｔ細胞を用いた２つの実験の一方を用いてとった。非コンジュゲート抗原は、ＤＣをＡＰＣとして用いた場合にかなりのレベルのＩＬ−１２ｐ４０を誘導した。即ち、ＨＡペプチド、ＯＶＡペプチドおよびＯＶＡは１０ｎＭにおいて、強力なＩＬ−１２ｐ４０応答をもたらし（約１０００ｐｇ／ｍｌ）、これは抗原をＣＴＢにカップリングした場合は、より低い抗原用量でも誘導できた。ＩＬ−１２ｐ７０もまたこれらの培養物中に検出できた。ＩＬ−１２ｐ７０分泌のパターンは、ＩＬ−１２ｐ４０のものと同様であったが、検出されたレベルは、かなり低値であった。抗原パルスＭΦは、低値ではあるが検出可能なレベルのＩＬ−１２ｐ４０（約１００ｐｇ／ｍｌ）を分泌し、これらのレベルはＣＴＢコンジュゲート抗原を使用した場合には上昇した（ＨＡでは約４００ｐｇ／ｍｌ、ＯＶＡでは約３５００ｐｇ／ｍｌ）。抗原の組成やＩＦＮ−γの検出レベルとは無関係に、ＡＰＣとしてＢ細胞を含む培養物中には、無視できるレベルのＩＬ−１２があった。更にまた、ＭΦおよびＤＣは、ともに特異的Ｔ細胞の非存在下においてもＣＴＢコンジュゲート抗原への曝露後は、低レベルのＩＬ−１２を分泌した。
【０１３６】
ＣＴＢ５６−６３ＨＡ融合蛋白およびＣＴＢとＨＡペプチドとの間の化学的コンジュゲートは、ＤＣから同レベルのＩＬ−１２ｐ４０（約２０００ｐｇ／ｍｌ）を誘導したが、遺伝子的コンストラクトは、ＭΦにおいてＩＬ−１２ｐ４０の生産の誘導がより優れていた（約４００ｖｓ約５０ｐｇ／ｍｌ）。
【０１３７】
ＩＦＮ−γ生産の場合と同様、低用量のＡＰＣ（１０4ＡＰＣ／ウェル）は同じパターンのＩＬ−１２ｐ４０分泌を示したが、１０5ＡＰＣで得られた数値より４〜１０倍低値であった。更にまた、全てのＩＬ−１２ｐ４０応答は、純粋なＡＰＣ培養物中でＩＬ−１２ｐ４０が全く検出されなかったように、Ｔ細胞の存在に依存していた。
【０１３８】
［実施例４］
動物に投与する前のＣＴまたはＣＴＢと混合または連結した抗原でＤＣをインビトロ処理することによりインビボの体液性免疫応答の誘導能力を増強する
ＣＴは抗原提示細胞に対する直接の効果を介してそのアジュバント特性の多くを発揮することが推定されている（Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９；１８９：５４１，  Ｇａｇｌｉａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；３０：２３９４，  ５９．Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；１５９：５３０１）。従って、ＣＴアジュバントがＤＣワクチン接種の後の抗体応答に影響するかどうか調べた。
【０１３９】
ＣＴＢまたはＣＴと連係された抗原、即ち、ＣＴＢまたはＣＴとコンジュゲートされるかこれらと混合された抗原の何れかでＤＣをエクスビボで処理することが、エクスビボ処理細胞の再注入（「ＤＣワクチン接種」）後にインビボで体液性の免疫応答を誘導するか強化するかどうかを調べるために、マウスに遊離のペプチドまたはＣＴまたはＣＴＢと混合または連結したペプチドでパルスした同系ＤＣを２回静脈内注射した。前記した実施例において記載した方法と同様にして、Ｂａｌｂ／ｃマウスの骨髄幹細胞からＤＣを発生させ、次にＯＶＡのみ（０．５μＭ）、０．０５μＭＣＴと混合した０．０５μＭＯＶＡまたは０．５μＭＣＴＢと混合した０．５μＭＯＶＡ、ＣＴまたはＣＴＢに化学的にカップリングされたＯＶＡ（０．０５μＭＣＴまたは０．５μＭＣＴＢ）またはＰＢＳのみにより、３７℃で２時間パルスした。洗浄後、異なる処理したＤＣを二百万ＤＣ／動物となる様にＢａｌｂ／ｃマウス３匹の群にｉｖ注射した。２週間後、２回目の同用量の新しく調製し同様に処理し洗浄されたＤＣをマウスに与えた。最後に、更に２週間の後、マウスにＦＣＡ中ＯＶＡ３μｇを皮下ブースター注射した。初回のＤＣ投与前、ｓｃブースティング直前の２回目のＤＣ注射の２週間後、および最終ｓｃブースター注射の９日後に血清を全動物から採取し、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。
【０１４０】
結果は以下の表１に示すとおりであり、これによればＰＢＳ処理ＤＣを２回投与された動物の群は、ＯＶＡで皮下免疫化後９日でも有意な抗ＯＶＡ抗体応答を示さなかったのに対し、ｓｃＯＶＡブースター注射の前にＯＶＡパルスＤＣを２回投与されたマウスの群は全て、ブースティングの９日後までにＯＶＡに対する有意な血清抗体応答を示した。しかしながら、この応答は比較的中等度であり、ＯＶＡ単独でパルスされたＤＣを投与されたマウスの群においてはｓｃブースティング前には殆ど検出できず、ＣＴまたはＣＴＢの何れかと混合したＯＶＡでパルスしたＤＣを投与された群では遥かに強力な応答が得られ、ＣＴまたはＣＴＢに連結されたＯＶＡを投与された群では特に顕著であった（ｐ＜０．０１）。後者の群において、かなりの抗ＯＶＡ抗体力価がパルスＤＣそのものでの処理に応答して生じており、この応答はその後のＯＶＡのｓｃブースティングにより更に増強された。
【０１４１】
ＤＣがインビボのプライミングに関与していることを確認するために、骨髄培養物由来のＣＤ１１ｃ陽性細胞を精製し、これらの細胞並びに非精製骨髄由来ＤＣをＯＶＡ−ＣＴＢでパルスした後にワクチン接種を行った。両方の細胞集団ともＢ細胞（ＩｇＧ）およびＴ細胞（増殖）の応答をプライミングした。レシピエントマウスの２群間で抗ＯＶＡ血清力価またはＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ応答に統計的に有意差は無かった。
【０１４２】
これらの結果から、ＣＴおよびＣＴＢは共に、特定の抗原でインビトロパルスされたＤＣのインビボ免疫原性を増強し、そして、この効果は、抗原がＤＣに提示される際に、これらの蛋白の何れかにカップリングしている場合に特に強力となることが解かった。
【０１４３】
【表１】
2005506315.tif 000002
【０１４４】
比較のために、ＣＴＢと連係された抗原でインビトロ発生されたＤＣ以外の他のＡＰＣをエクスビボ処理した場合にも、上記実験においてＤＣにより誘導されたものと同様の免疫応答をプライミング或いは誘導できるかどうかを調べた。これは、「全ＡＰＣ」のＣＴＢまたはＣＴと連係された抗原でパルスすることによるエクスビボ処理も、上記したＤＣで観察されたものと同様の体液性免疫応答をプライミングまたは誘導できるかどうかを調べることにより行なった。Ｔ細胞枯渇後の全脾臓細胞を含有する全ＡＰＣを遊離のＯＶＡまたはＣＴＢ−ＯＶＡまたはＣＴ−ＯＶＡでエクスビボでパルス処理し、次にＤＣに関して上記したものと同様にしてマウスのワクチン接種に使用した。結果によれば、ＯＶＡ単独で処理したＡＰＣは、それ自体では検知可能な抗体応答は誘導せず、そしてＯＶＡ／ＦＣＳでブーストした後の中程度の抗体応答のみをプライミングしたが、ＣＴＢ−ＯＶＡまたはＣＴ−ＯＶＡでより強力な投与を受けたＡＰＣは、ともにそれら自体で有意な抗ＯＶＡ抗体応答を誘導（ただし力価はＤＣの場合よりも１〜２対数低値であった）し、そしてＯＶＡ／ＦＣＳブースティング後、動物の高力価抗体応答をプライミングした（相当する処理ＤＣで得られる数値よりも僅か約５倍低値の力価であった）。
【０１４５】
エクスビボ処理ＡＰＣを静脈内注射以外の経路で効果的に投与できるかどうか調べた。従って、ＤＣに前述したとおりＣＴＢ−ＯＶＡでエクスビボで処理し、標準的な静脈内投与経路、または皮下または腹腔内の投与経路でマウスに２回注射し、前述のとおりＯＶＡ／ＦＣＳでブースティングする前後に抗体応答を測定した。結果によれば、皮下または腹腔内に投与したＤＣに対する応答は、静脈内投与後と同等又はそれより以上の十分強かった。
【０１４６】
［実施例５］
ＤＣへのＣＴ処理により混合Ｔｈ１およびＴｈ２応答が促進され、ＣＴＢ処理によりＴｈ２応答が促進される
ＣＴのアジュバント効果はＴｈ２に偏向していることが報告されている（Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９１；１８９：５４１，  Ｇａｇｌｉａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；３０：２３９４）。しかしながら、これとは対照的に、ＣＴはむしろＴｈ１発生を促進することが観察された。即ち、ＯＶＡパルスまたはＯＶＡ−ＣＴＢパルスのＤＣを用いたワクチン接種では、抗ＯＶＡＩｇＧ１応答が好ましく誘導（Ｔｈ２型応答を示す）されたが、ＣＴ処理ＤＣのワクチン接種でもまた強力な抗ＯＶＡＩｇＧ２ａ応答が誘導（Ｔｈ２型応答を示す）された（表２）。
【０１４７】
更にまた、これらのマウスから得た脾臓細胞懸濁液をＯＶＡでインビトロで活性化し、ＩＦＮ−γ生産を測定したところ、ＣＴアジュバント処理ＤＣによるワクチン接種は、ＯＶＡパルスおよびＯＶＡ−ＣＴＢパルスのＤＣの両方を用いるＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ応答を増強した（表２）。ＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ生産はＯＶＡ−ＣＴパルスＤＣによるワクチン接種後では、ＯＶＡ＋ＣＴパルスＤＣまたはＯＶＡ−ＣＴＢパルスＤＣによるワクチン接種と比較して、４倍以上もの高値（ｐ＜０．０１）となった（表２）。
【０１４８】
【表２】
2005506315.tif 000003
【０１４９】
［実施例６］
ＣＴおよびＣＴＢは同時刺激分子の発現を増強し、パルスされたＤＣによるサイトカインおよびケモカインの生産に対して異なる効果を有する
ＡＰＣの表面上のＭＨＣおよび同時刺激分子のレベルは、Ｔ細胞の応答の誘導に影響するのみならず、その大きさや応答のサイトカインパターンにも影響する（Ｒａｓｋｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  ２０００；３０：１０２４，Ｋｕｃｈｒｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９９５；８０：７０７）。ＣＴＢコンジュゲート抗原が種々のＡＰＣ集団の表現型に影響するかどうかを調べるために、抗原パルスまたは未処理のＤＣまたはＭΦを抗原特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の存在下または非存在下に２４時間インキュベートし、次にＭＨＣＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６のレベルをＦＡＣＳで分析した。混在Ｔ細胞はＰｅｒＣＰ−標識抗ＣＤ３抗体を用いて除去した。ＤＣを何れかの抗原または何れかの特異的Ｔ細胞の非存在下でインキュベートしておいた場合、それらは、高レベルのＭＨＣＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現したが、同様にインキュベートしたＭΦのＭＨＣＩＩおよびＣＤ４０の発現は低値であり、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は高値であった（データ示さず）。
【０１５０】
抗原パルスＡＰＣをＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と共にインキュベートした場合、ＭΦで観察されたようなＡＰＣにおける表現型の変化が誘導された。遊離のＯＶＡまたはＯＶＡペプチドでパルスされたＭΦは、未パルスのＭΦと比較して、ＣＤ４０およびＣＤ８６の両方の表面発現を有意に増強した（データ示さず）。ＭＨＣＩＩのレベルは、未変化のままであったが、ＣＤ８０の弱いアップレギュレーションが観察された。ＡＰＣにＣＴＢカップリングＯＶＡまたはＯＶＡペプチドで予備処理しておいた場合、ＣＤ４０およびＣＤ８６の両方ともその細胞表面密度が更に高くなった。興味深い事に、ＣＴＢ−ＯＶＡまたはＣＴＢ−ＯＶＡペプチドで予備処理しておいたＡＰＣは、特異的Ｔ細胞の非存在下においても、Ｔ細胞存在時よりも遥かに低値ではあったが、その細胞表面上のＣＤ４０およびＣＤ８６をアップレギュレートした。即ち、ＣＴＢ−カップリング抗原それ自体は、ＡＰＣの成熟を誘導できる。
【０１５１】
ＣＴは以前よりＤＣ上の同時刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の細胞表面レベルを上昇させることがわかっている。今回、ＯＶＡ−ＣＴＢに加えて、ＯＶＡ−ＣＴおよびＣＴもまた、パルスされたＤＣ上のＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を増強したが、遊離のＯＶＡや遊離のＣＴＢでは増強されなかった（データ示さず）。
【０１５２】
更に免疫応答に関るサイトカインの特徴を評価した。ＩＬ−１β、ＩＬ１２−ｐ４０、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αのレベルを遊離のＯＶＡ、ＣＴＢまたはＣＴ、またはＯＶＡ−ＣＴＢおよびＯＶＡ−ＣＴコンストラクトの何れかでパルスしたＤＣから得た２４時間培養上澄み中で測定した（図３）。試料の何れにもＩＬ−１８は検出されなかった。同様に、分泌されたＩＬ−１２のレベルは、全体的に低かったが、ＯＶＡ、ＣＴＢ、ＯＶＡ−ＣＴＢまたはＯＶＡ−ＣＴによるＤＣのパルシングにより、ＩＬ−１２ｐ４０の生産はわずかに増大した。ＣＴのみではＩＬ−１２は誘導されなかった。
【０１５３】
一方、ネイティブ、ＯＶＡ−ＣＴＢ、ＣＴおよびＯＶＡ−ＣＴコンストラクトは、共にＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αの生産に対してより強い効果を示した（図３Ｂ−Ｄ、レーン４〜６）。即ち、ＯＶＡやＣＴＢではなくＣＴでＤＣをパルスすることによりＩＬ−１β応答が誘導された。このＩＬ−１β応答は、ＯＶＡ−ＣＴＢまたはＯＶＡ−ＣＴの何れかでＤＣをパルスした場合にむしろ強力となった（図３Ｂ、レーン４および６）。ＯＶＡ−ＣＴＢはまたＲＡＮＴＥＳを生産するようにＤＣを誘導し、この生産はＯＶＡ−ＣＴと共にインキュベートした後に更に増強されたが、ネイティブのＣＴ、ＣＴＢまたはＯＶＡは何れも有意な効果を示さなかった（図３Ｃ）。ＣＴ、ＯＶＡ−ＣＴおよびＯＶＡ−ＣＴＢは、ＭＩＰ−１αの生産に対して逆の効果を現わした（図３Ｄ）。すなわち、未処理のＤＣならびにＯＶＡまたはＣＴＢのいずれかでパルスしたＤＣは、かなりの量のＭＩＰ−１αを生産した。この生産はＣＴまたはＯＶＡ−ＣＴ処理により完全に抑制された。ＯＶＡ−ＣＴＢはまた、ＣＴほど効率的ではなかったがＭＩＰ−１α生産もブロックした（図３Ｄ、レーン４）。
【０１５４】
［実施例７］
ＣＴと連係された腫瘍特異的抗原でエクスビボでパルス処理されたＤＣによるワクチン接種により抗原特異的ＣＴＬが誘導され、既にできた腫瘍を除去することができる
ＣＴＢまたはＣＴと連係された特異的抗原でエクスビボ処理したＤＣおよび他のＡＰＣに対する強力な免疫刺激効果、および、それぞれＣＴおよびＣＴＢによるＴｈ１およびＴｈ２に対する免疫応答の異なる挙動に基づき、このようなＤＣエクスビボ処理により、インビボでマウスにおける抗原特異的腫瘍抑制性免疫応答を誘導する能力が、更にＤＣに付与されるかどうか関心が持たれた。この点に関し、ＭＨＣクラスＩと共に所定のＯＶＡペプチドを含むＯＶＡをトランスジェニックに発現し、これによりＯＶＡペプチド特異的細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）が抗原特異的態様で腫瘍細胞を攻撃し、殺すことができるようにするＣ５７／Ｂ１マウス胸腺腫瘍細胞系統ＥＧ．７により試験した。Ｃ５７／Ｂ１マウスに皮内注射すると、ＥＧ．７細胞は、大きさをカリパスを用いて容易に、そして非侵襲的に測定することができる持続的に生育する皮膚腫瘍を形成する。
【０１５５】
ＥＧ．７細胞は、Ｉｓｃｏｖｅ培地中組織培養することにより増殖させ、Ｃ５７／Ｂ１マウスへの注射の１日前に分割し、２ｘ１０6個の細胞をＣ５７／Ｂ１マウスに皮内注射する時点で非コンフルエントの状態となるようにした。ＥＧ．７細胞が平均直径６ｍｍの小型ではあるが顕著な皮膚腫瘍をつくった３日後、マウスを５処理群に分割し、表ＩＩＩに示すとおり、異なるエクスビボの処理を受けたＤＣによる静脈内注入／「ワクチン接種」を受けるか、または、ＰＢＳのみの注射を受け、該処理を７日後まで反復し、その時点でＰＢＳ処理動物における平均腫瘍直径は１１ｍｍまで増大していた。結果は表ＩＩＩに示すとおりである。ＰＢＳ処理動物と比較して、ＤＣによるワクチン接種では１１日目までは測定可能な抑制はもたらされておらず、即ち、２回目のＤＣ投与の１日後に小型ではあるが明確な腫瘍サイズの低減がＯＶＡ−ＣＴパルスＤＣワクチン接種マウス群で観察された。その後の数日間に腫瘍は後者の群の動物では実質的に溶解し、１６日目には１匹を除く全ての動物において測定可能な大きさ以下となり、２１日目には全ての動物で検出不可能であった（表ＩＩＩ）。ＯＶＡのみ、ＯＶＡ−ＣＴＢコンジュゲートでエクスビボで処理した、または、処理しないＤＣを与えた群では、ＰＢＳ処理動物と比較して１０日目から腫瘍生育の沈滞が起こったが、群間に差は無く、何れの群においても腫瘍サイズの如何なる絶対的な減少の徴候もなかった（表３）。明らかに、ＯＶＡ−ＣＴのエクスビボ処理により、ＤＣは、抗原特異的な態様で、既にできた腫瘍を実質的に除去することができるようになり、この現象は、伝統的なＣＴＬ試験によりＣｒ５１標識ＥＧ．７について脾細胞を用いて試験した場合のようにＯＶＡ−ＣＴパルスＤＣによる２回のワクチン接種後５日以内のマウスの脾臓中のＯＶＡ特異的ＣＴＬの存在とかかわっていた。
【０１５６】
【表３】
2005506315.tif 000004
【０１５７】
［実施例１０］：
ＣＴまたはＣＴＢと連係された抗原でヒトＤＣおよび他のヒトＡＰＣを処理することにより抗原特異的Ｔ細胞応答が増大する
インビトロの標準的なＴ細胞増殖試験においてＴＴと反応することをあらかじめ試験した２人のＰＢＭＣからＤＣを生成させた。表４に示すとおり、これらのＤＣをＣＴまたはＣＴＢと連係させたＴＴでパルス処理するか、処理せず、その後増殖試験において自己Ｔ細胞に添加してこれと共にインキュベートした。結果は表ＩＶに示すとおりであり、両方のＣＴＢとも、ＴＴと混合のみの場合は僅かにであったがＴＴにコンジュゲートした場合は強力に、そして特にＣＴはＴＴと混合したのみの場合でも連結させた場合でも、前述したマウスＴ細胞を用いた同様の試験において、マウスＤＣに対するＣＴＢまたはＣＴと連係された別の蛋白抗原（ＯＶＡ）の効果に関して上記したものと全く同様の態様において、ＴＴ特異的Ｔ細胞増殖応答を増大させたことが解かった。
【０１５８】
【表４】
2005506315.tif 000005
【０１５９】
ＤＣの代わりにヒト全ＡＰＣを調製し、ＣＴまたはＣＴＢと連係させたＴＴの上記した種々の製剤で処理し、Ｔ細胞増殖応答の刺激のために使用した場合にも同様の結果が得られ、ＴＴ−ＣＴＢ、ＴＴ−ＣＴまたはＴＴ＋ＣＴでＡＰＣを処理するとやはり、相当する処理を受けたＤＣで得られた応答よりも低値であった（約５倍低値のｃｐｍ値）ものの、ＴＴのみでパルスしたＡＰＣで得られた程度よりも遥かに高度に抗原特異的Ｔ細胞増殖応答を増大させた。
【０１６０】
考察
我々はＤＣワクチン接種に関するＣＴおよびＣＴＢの免疫モジュレーション能力を検討した。同系マウスへの注射に先立ち、骨髄由来ＤＣを遊離のＯＶＡ、ＣＴまたはＣＴＢに連結させたＯＶＡ、またはＯＶＡとＣＴまたはＣＴＢの混合物の何れかでパルスした。その後の免疫応答は、２回のＤＣワクチン接種の後、そして、その後のＯＶＡを作用させた後に再度、測定した。ＣＴＢはＤＣのエクスビボの抗原パルスのための効率的な担体分子で、強力にＴｈ２応答を促進することが解った。ＣＴアジュバントでＤＣを処理することもまたその免疫刺激能を顕著に高めたが、Ｔｈ１応答もでやすくなり、混合型Ｔｈ１／Ｔｈ２応答をもたらすことになった。ＣＴおよびＣＴＢの見かけ上異なる担体およびアジュバント機能は、先ず抗原が直接ＣＴに連結し、その後ＤＣパルシングを行なった場合に、組み合わせることにより力価が最高値となり、これはその後は更に強力なＴｈ１応答をするようになり、また、抗原特異的ＣＴＬ応答も誘導した。ＣＴおよびＯＶＡ−ＣＴのＴＨ１誘導能はＲＡＮＴＥＳ生産のアップレギュレーションと組あわせられたパルスＤＣによるＭＩＰ−１α生産の強力な抑制に関連していると考えられる。
【０１６１】
ＣＴＢがインビボのＤＣワクチン接種のための効率的な担体蛋白であるという今回の所見は、これまでのインビトロの所見を裏付けるものである。これらの試験において、ＣＴＢへの抗原のカップリングによりＤＣおよび他のＡＰＣによる抗原提示の効率が上昇し、そして効率的な提示に必要な抗原の用量も劇的に低減され、この効果は、ＧＭ１受容体の結合を介したカップリング抗原の取りこみの増大およびＡＰＣ上のＣＤ４０およびＣＤ８６のアップレギュレートされた発現と関連している（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｃｈａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２００１；  ６９：５７１６）。ＯＶＡ−ＣＴＢパルスＤＣのワクチン接種後に本試験で観察された応答は、Ｔｈ２に偏向しており（ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１は高力価、ＩｇＧ２ａは観察されず）、このことはＤＣのＣＴＢ処理は、ＩＬ−１２またはＩＬ−１８のようなＴｈ１促進サイトカインの生産を全く、或いは、僅かにしか誘導しないという事実を最も良く反映している。一方、Ｔ細胞との相互作用の後にＯＶＡ−ＣＴＢ処理したＤＣ上でアップレギュレートされるＣＤ４０（Ｇｅｏｒｇｅ−Ｃｈａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２００１；６９：５７１６）は、最近Ｔｈ２の発生を誘導することがわかった（ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６８：５３７）。更にまた、これらの結果は、経口投与したＣＴＢカップリング抗原をＴｈ１媒介病理による免疫応答を変える治療手段として使用できることを示すインビボのデータと合致している（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９６；９３：７１９６，  Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  １９９９；  ４２：１６２８，  Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０００；  １９：１４４９）。
【０１６２】
更に今回ＣＴが、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方の応答を増強するＤＣワクチン接種のための強力なアジュバントであることが解かった。ＣＴは、以前よりＤＣ上の両方のＭＨＣ、同時刺激分子およびケモカイン受容体の細胞表面発現を高め、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αのようなサイトカインの分泌に影響することがわかっている（Ｇａｇｌｉａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；  ３０：２３９４）。今回更に、同時刺激因子、特にＣＤ８０の強力なアップレギュレーションを観察した。しかしながら過去の報告とは対照的に（Ｇａｇｌｉａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；  ３０：２３９４）ＣＴそのものがＤＣからのＩＬ−１βの分泌を誘導したことが今回わかった。同様の観察結果が関連の細胞型、例えばマクロファージでも得られている（Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１５９：５３０１，  Ｂｒｏｍａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１；１４６：２９０８，  Ｆｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；  ６７：５２７５）。ＩＬ−１は、ＤＣの成熟を誘導するのみならず（Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９５；１８２：３８９）、蛋白抗原と同時投与した場合に効率的な粘膜アジュバントとなり（Ｓｔａａｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；１６２：６１４１）、そして、ＣＴのアジュバント活性のかなりの部分に関与していると考えられる（Ｂｒｏｍａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９１；１４６：２９０８，  Ｆｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；  ６７：５２７５，  Ｓｔａａｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；１６２：６１４１）。
【０１６３】
ＣＴへの抗原の直接のカップリングは、同じＤＣ、または恐らくは同じ細胞未満のコンパートメントへの抗原とアジュバントの共同ターゲティングを反映しているであろうＣＴの存在下におけるＯＶＡ−ＣＴＢを用いたＤＣのパルシングよりも優れていた。ＯＶＡ−ＣＴでパルスしたＤＣと比較してＯＶＡ−ＣＴＢプラスＣＴでパルスしたＤＣにおいてＯＶＡの低い取りこみをもたらすＧＭ１結合に関するＣＴとＯＶＡ−ＣＴＢとの間の競合があるというもう１つの可能性は低いと考えられ、その理由は、他のインビトロの試験ではこのような競合のためには本試験において用いたものより１００倍超高濃度のＣＴが必要となるためである（Ｊａｎ  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，  未発表所見）。
【０１６４】
ＣＴのアジュバント作用は、免疫応答をＴｈ１型応答に強力に指向させた。これは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８プライミングがないにも拘らず起こり、ＩＬ−１βの生産に起因していなかった（ＯＶＡ−ＣＴＢおよびＯＶＡ−ＣＴは、同等の水準のＩＬ−１βを誘導した）。むしろ、今回、ＯＶＡ−ＣＴはＯＶＡ−ＣＴＢよりも大きくＤＣからのケモカイン分泌に影響した。未処理のＤＣにおいてＲＡＮＴＥＳとＭＩＰ−１αのｗ／ｗ比は０．６であった。ＯＶＡ−ＣＴＢ処理の後、この比は３４まで上昇し、そしてＯＶＡ−ＣＴで処理後は１７２まで上昇した。ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ−１αは、共にＴｈ１／Ｔｈ２の発生に強く影響した。ＤＮＡワクチンへのＲＡＮＴＥＳの遺伝子の封入は、Ｔｈ１応答（増大したＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比およびＩＦＮ−ガンマ応答並びに細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞のより強力な誘導）を促進し、そして、ウィルス感染からの保護を増強した。ＭＩＰ−１αの遺伝子をＤＮＡワクチンに同様に封入した場合、反対の効果、即ち抗体生産の増大、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比の低下およびウィルス感染からの保護能力の低下を伴う強いＴｈ２応答が得られた（Ｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ２０００；７４：１１１７３，  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２０００；２０：４８７）。更にまた、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉに感染したマウスにおいて、ＲＡＮＴＥＳはＴｈ１応答と、そしてＭＩＰ−１αはＴｈ２応答に関連していた（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２００１；  ６９：６７５５）。即ち、ＣＴは、ＩＬ−１２非依存的な態様で、ＲＡＮＴＥＳ生産に対してはプラスに、ＭＩＰ−１α生産に対してはマイナスに影響することによりＴｈ１の発生を促進すると考えられる。
【０１６５】
しかしながら、他の因子もまたＴｈ１／Ｔｈ２バランスに影響している。ＣＴパルスＤＣは、その細胞表面上にかなりの量のＣＴアジュバントを担持していた。どの程度までこのような細胞表面結合ＣＴが隣接細胞に向けてアジュバント特性を保持するのか、そして細胞表面結合ＣＴがＴｈ１の発生を強化するのかどうかは不明である。しかしながら、我々の予備的インビトロのデータによればＴ細胞に対するＣＴの毒性作用は、ＣＴがＤＣに結合すると消失し、このことはＤＣ細胞表面結合ＣＴが、隣接細胞には侵入しないことを示唆している。遊離のＣＴが、ａＴｈ１および／またはＴｈ２応答を誘導するかどうかも論じられている。幾つかの試験によれば、ＣＴそのものは、ＩＬ−１２の生産を抑制することにより排他的Ｔｈ２応答をプライミングすることがわかっている（Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９；１８９：５４１，  Ｇａｇｌｉａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；３０：２３９４）。しかしながら、ＣＴをアジュバントとして粘膜に投与した場合、ＣＴは今回のＣＴパルスＤＣと同様の態様で複合Ｔｈ１／Ｔｈ２応答を誘導し、（Ｈｏｒｎｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９３；２３：２１３６，  Ｋｊｅｒｒｕｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；  ９２：６０）、そして、ＣＴＢとは反対に、Ｔｈ１媒介ＤＴＨおよび自己免疫組織反応を悪化させる（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９６；９３：７１９６）。別の可能性として、注射したＣＴパルスＤＣ上の同時刺激分子のレベルがＴｈ１／Ｔｈ２の作用に影響することが考えられる。ＣＴ処理またはＯＶＡ−ＣＴパルスのＤＣは、ＯＶＡ−ＣＴＢパルスＤＣよりも遥かに高い水準までそのＣＤ８０の発現をアップレギュレートした。Ｔｈ１／Ｔｈ２の発生に対するＣＤ８０およびＣＤ８６の役割に関して統一された見解はないものの、幾つかの報告では、高濃度のＣＤ８０はＴｈ１特異的な経路を介するか、単により多くの同時刺激を与えるかの何れかにより、確かにＴＨ１挙動をもたらす（Ｋｕｃｈｒｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９９５；８０：７０７，  Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９７；  １５８：２７１３，  Ｓｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；  １１：１１６９）。更にまたＣＴおよびＣＴＢが細胞内プロセシングおよび種々の方法でのＭＨＣ分子上へのＯＶＡ装荷に影響する可能性、または、ケモカイン受容体の発現とＯＶＡ−ＣＴＢおよびＯＶＡ−ＣＴパルスＤＣの細胞内生存が異なるかもしれないという可能性を排除することはできない。ＣＴコンジュゲート抗原によるＤＣのエクスビボ処理とその後の処理ＤＣのマウスへの注入もまた、抗原特異的なＣＴＬを誘導し、抗原特異的態様で既にできた腫瘍であっても消失させることができた。伏在する機序とは無関係に、ＤＣアジュバントとしてのＣＴの使用は、強力なＴｈ１およびＣＴＬ応答が望まれる選択されたウィルス性感染症または腫瘍に対抗するＤＣワクチン接種にとって特に興味深いものである。インビボ投与されたワクチンのためのアジュバントとし���の使用を妨げているＣＴの通常の毒性は、ＣＴ処理をインビトロで行ない、インビボ注入の前にＤＣを十分洗浄するＤＣワクチン接種とは無関係であると考えられる。
【０１６６】
ＯＶＡ−ＣＴＢおよびＯＶＡ−ＣＴの化学的コンジュゲートが、サイトカインおよびケモカインの生産に対してＣＴを含むネイティブの蛋白単独よりも強力な影響を与えることは興味深い。即ち、ＤＣにより生産された最高レベルのＩＬ−１２、ＩＬ−１βおよびＲＡＮＴＥＳは、化学的コンジュゲートにより誘導された。ＣＴ、ＯＶＡ−ＣＴおよびＯＶＡ−ＣＴＢもまたＣＤ８０およびＣＤ８６の増大された発現を誘導したが、遊離のＯＶＡおよび遊離のＣＴＢは誘導しなかった。サイトカインおよびケモカインの生産および同時刺激分子のレベルに対して化学的コンジュゲートがこのような強力な免疫モジュレート能力を有する理由は不明であるが、カップリング操作により誘発される何らかの化学的修飾よりはむしろ、ＣＴ／ＣＴＢおよび特異的抗原の連結された結合と取りこみに関連すると考えられる。伏在する機序とは無関係に、ＤＣ表現型およびサイトカインおよびケモカインの生産に対するＤＣのこの強力な効果は、ＣＴおよびＣＴＢコンジュゲートの免疫強化能力を部分的に説明していると考えられる。
【０１６７】
総括すると、ＣＴおよびＣＴＢは両方とも、ＤＣワクチン接種への応答性を増強するために利用できる。ＣＴまたはＣＴＢに抗原をコンジュゲートした後にＤＣパルシングを行なうことにより、いくつかの機序、即ち（ｉ）コンジュゲート蛋白の取りこみおよび提示の増強、（ｉｉ）ＩＬ−１βおよび特にＣＴを用いたＲＡＮＴＥＳの同時刺激、および（ｉｉｉ）同時刺激分子の増強された発現を介して、後の免疫応答が増強されると考えられる。より重要な点は、担体抗原としてＣＴまたはＣＴＢの何れかを選択的に使用することにより、ケモカインの発現および同時刺激分子のレベルに関ると考えられる過程において、それぞれＴｈ１およびＣＴＬまたはＴｈ２の応答に免疫応答を指向させることができる。
【０１６８】
本発明は記載した特定の実施態様により範囲を限定されるわけではない。実際、前述の説明および添付した図面から、当業者には本明細書に記載したもののほかに本発明の種々の変更が明らかであろう。このような変更は、添付した請求項の範囲内に含まれるものである。
更に、全ての数値は概数であり、説明を目的としていると理解すべきである。
本明細書中を通じて特許、特許出願、参考文献、製品の説明書およびプロトコルを引用したが、その開示内容は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】遺伝子的ＣＴＢ融合蛋白の構築  （Ａ）ＣＴＢのＣ末端への１７アミノ酸ＯＶＡペプチドの付加。（Ｂ）１０３アミノ酸の代わりに１０７アミノ酸の蛋白をもたらす成熟蛋白の残基５６〜６４を置きかえるＣＴＢ分子への１３アミノ酸ＨＡペプチドの挿入。ペプチドの最初の残基およびＣＴＢの残基５５は共にセリンである。更に、ペプチドの最後の残基およびＣＴＢの６３位は共にリジンである。白いブロックはＨＡまたはＯＶＡペプチドを示し、黒いブロックは成熟ＣＴＢ蛋白を示す。ＣＴＢ５５−６４ＨＡにおけるペプチド配列と共有されているＣＴＢの５５位のセリン残基および６３位のリジン残基は□中に示す。
【図２Ａ】ＣＴＢへの抗原のコンジュゲーションによりインビトロ抗原提示が増強される。脾細胞を遊離の形態またはＣＴＢにコンジュゲートさせた状態の抗原と共に、精製された抗原特異的ＴＣＴトランスジェニックＴ細胞の存在下、インキュベートした。データは遊離またはＣＴＢコンジュゲートの（Ａ）全ＯＶＡ、（Ｂ）ＯＶＡペプチドおよび（Ｃ）ＨＡペプチドに応答して得られた増殖応答として表示する。（Ａ）ＡＰＣおよびＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を１０-8Ｍ  ＯＶＡ、ＯＶＡ−ＣＴＢまたは１０-8Ｍ  ＯＶＡ＋６×１０-9Ｍ  ＣＴＢと共にインキュベートし、（Ｂ）ＡＰＣおよびＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を漸増量のＯＶＡペプチド（□）と共に、または、ＣＴＢコンジュゲートＯＶＡペプチド（□）と共にインキュベートし、（Ｃ）ＡＰＣおよびＨＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を漸増量の遊離ＨＡペプチド（□）、ＣＴＢコンジュゲートＨＡペプチド（○）または等量の非コンジュゲートＨＡペプチドおよびＣＴＢ（○）と共にインキュベートした。
【図２Ｂ】ＣＴＢへの抗原のコンジュゲーションによりインビトロ抗原提示が増強される。脾細胞を遊離の形態またはＣＴＢにコンジュゲートさせた状態の抗原と共に、精製された抗原特異的ＴＣＴトランスジェニックＴ細胞の存在下、インキュベートした。データは遊離またはＣＴＢコンジュゲートの（Ａ）全ＯＶＡ、（Ｂ）ＯＶＡペプチドおよび（Ｃ）ＨＡペプチドに応答して得られた増殖応答として表示する。（Ａ）ＡＰＣおよびＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を１０-8Ｍ  ＯＶＡ、ＯＶＡ−ＣＴＢまたは１０-8Ｍ  ＯＶＡ＋６×１０-9Ｍ  ＣＴＢと共にインキュベートし、（Ｂ）ＡＰＣおよびＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を漸増量のＯＶＡペプチド（□）と共に、または、ＣＴＢコンジュゲートＯＶＡペプチド（□）と共にインキュベートし、（Ｃ）ＡＰＣおよびＨＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を漸増量の遊離ＨＡペプチド（□）、ＣＴＢコンジュゲートＨＡペプチド（○）または等量の非コンジュゲートＨＡペプチドおよびＣＴＢ（○）と共にインキュベートした。
【図２Ｃ】ＣＴＢへの抗原のコンジュゲーションによりインビトロ抗原提示が増強される。脾細胞を遊離の形態またはＣＴＢにコンジュゲートさせた状態の抗原と共に、精製された抗原特異的ＴＣＴトランスジェニックＴ細胞の存在下、インキュベートした。データは遊離またはＣＴＢコンジュゲートの（Ａ）全ＯＶＡ、（Ｂ）ＯＶＡペプチドおよび（Ｃ）ＨＡペプチドに応答して得られた増殖応答として表示する。（Ａ）ＡＰＣおよびＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を１０-8Ｍ  ＯＶＡ、ＯＶＡ−ＣＴＢまたは１０-8Ｍ  ＯＶＡ＋６×１０-9Ｍ  ＣＴＢと共にインキュベートし、（Ｂ）ＡＰＣおよびＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を漸増量のＯＶＡペプチド（□）と共に、または、ＣＴＢコンジュゲートＯＶＡペプチド（□）と共にインキュベートし、（Ｃ）ＡＰＣおよびＨＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を漸増量の遊離ＨＡペプチド（□）、ＣＴＢコンジュゲートＨＡペプチド（○）または等量の非コンジュゲートＨＡペプチドおよびＣＴＢ（○）と共にインキュベートした。
【図３Ａ】抗原パルスしたＤＣによるサイトカインおよびケモカインの分泌。ＯＶＡ−、ＣＴＢ−、ＣＴ−、ＯＶＡ−ＣＴＢ−またはＯＶＡ−ＣＴ−パルスしたＤＣの２４時間培養物のＩＶ−１２（Ａ）のレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。データは少なくとも２つの独立した実験の平均および標準偏差として示す。
【図３Ｂ】抗原パルスしたＤＣによるサイトカインおよびケモカインの分泌。ＯＶＡ−、ＣＴＢ−、ＣＴ−、ＯＶＡ−ＣＴＢ−またはＯＶＡ−ＣＴ−パルスしたＤＣの２４時間培養物のＩＬ−１β（Ｂ）のレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。データは少なくとも２つの独立した実験の平均および標準偏差として示す。
【図３Ｃ】抗原パルスしたＤＣによるサイトカインおよびケモカインの分泌。ＯＶＡ−、ＣＴＢ−、ＣＴ−、ＯＶＡ−ＣＴＢ−またはＯＶＡ−ＣＴ−パルスしたＤＣの２４時間培養物のＲＡＮＴＥＳ（Ｃ）のレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。データは少なくとも２つの独立した実験の平均および標準偏差として示す。
【図３Ｄ】抗原パルスしたＤＣによるサイトカインおよびケモカインの分泌。ＯＶＡ−、ＣＴＢ−、ＣＴ−、ＯＶＡ−ＣＴＢ−またはＯＶＡ−ＣＴ−パルスしたＤＣの２４時間培養物のＭＩＰ−１α（Ｄ）のレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。データは少なくとも２つの独立した実験の平均および標準偏差として示す。
【図１】
2005506315.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2005506315.tif 000008
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2005506315.tif 000010
【図３Ｂ】
2005506315.tif 000011
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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