(57)【要約】本発明は、インスリン＋、グルコース応答性島様構造をインスリン−細胞から分化させる改良された方法を提供する。この発明は、更に、インスリン＋、グルコース応答性島様構造を利用する方法、並びに該島様クラスターを構成するインスリン＋、グルコース応答性細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に精製されたインスリン−細胞を培養する方法であって、該インスリン−細胞がインスリン＋細胞に分化し、該インスリン＋細胞がグルコースに応答性である当該方法。
【請求項２】
インスリン＋細胞が、ｐｄｘ１＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インスリン−細胞を、膵臓から分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
インスリン−細胞を、管状又は細管組織から分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、管状又は細管組織を、膵管、肝管、腎管、腎細管(例えば、近位尿細管、遠位尿細管)、胆管、涙管、乳管、射精管、精細管、輸出管、胆嚢管、リンパ本幹、又は胸管の何れかから選択する、当該方法。
【請求項６】
インスリン−細胞が、インスリン＋細胞を含む島様構造を形成するように分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
インスリン＋細胞が、グルコース応答性である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
島様構造が、グルカゴン＋細胞及びソマトスタチン＋細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
グルカゴン＋細胞及びソマトスタチン＋細胞が、島様構造の周囲に局在化している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
インスリン−細胞が、幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
幹細胞を、胚性幹細胞、胎児幹細胞、又は成体幹細胞の何れかから選択する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
成体幹細胞を、神経幹細胞、神経冠幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚由来幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞及び間充織幹細胞の何れかから選択する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
成体幹細胞が、成体組織に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
成体組織を、脳、脊髄、上皮、真皮、膵臓、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、腎臓、膀胱、食道、肺、心筋、骨格筋、内皮、血液、脈管構造、軟骨、骨、骨髄、子宮、舌、又は嗅上皮の何れかから選択する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
実質的に精製された、インスリン−細胞をインスリン＋、グルコース応答性細胞に分化させる方法であって、下記を含む当該方法
(ａ)精製された細胞を非粘着性球として培養し；
(ｂ)細胞を、ｇｐ１３０アゴニストの存在下で培養することにより選択し；
(ｃ)該球を分離して、有糸分裂促進物質の存在下で培養し、少なくとも一つの有糸分裂促進物質はＦＧＦファミリーのメンバーであり；
(ｄ)該球を少なくとも２種の成長因子又は成長因子アゴニストの存在下で培養し、少なくとも一種の成長因子はＦＧＦファミリーのメンバーであり；
(ｅ)該球を被覆した下層上に高グルコース培地中にプレートし；
(ｆ)該球を標準的グルコースを含む培地中で培養する。
【請求項１６】
ｇｐ１３０アゴニストを、カージオトロフィン−１、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、繊毛神経栄養性因子又は顆粒球コロニー刺激因子の何れかから選択する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程(ｃ)又は(ｄ)のＦＧＦファミリーのメンバーを、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７又はＦＧＦ−１８の何れかから選択する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
工程(ｃ)又は(ｄ)のＦＧＦファミリーのメンバーを、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７、又はＦＧＦ−１８の何れかから選択する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
工程(ｃ)が、ソニックヘッジホッグ、デザートヘッジホッグ、又はインディアンヘッジホッグの何れかから選択するヘッジホッグファミリーのメンバーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
工程(ｃ)が、ヘッジホッグシグナリングのアゴニストを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
工程(ｃ)が、ヘパリンを含む、請求項１７〜２０の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
(ｄ)の成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ又はヘッジホッグの何れかから選択するファミリーのメンバーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
(ｅ)の被覆した下層が、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、又はスーパーフィブロネクチンの少なくとも一つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
被覆した下層が、スーパーフィブロネクチンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
(ｅ)の被覆した下層が、マトリゲル又は細胞性フィーダー層を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
(ｅ)の高グルコース培地が、少なくとも１０ｍＭグルコースを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
高グルコース培地が、少なくとも１１ｍＭグルコースを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
(ｅ)が、血清、ＰＹＹ、ＨＧＦ、又はフォルスコリンの何れかから選択する少なくとも一種の因子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
(ｅ)が、少なくとも一種のｃＡＭＰ上昇剤を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも一種のｃＡＭＰ上昇剤が、フォルスコリンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ｃＡＭＰ上昇剤を、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、Ｎａ−ブチレート、イソブチルメチルキサンチン、コレラ毒素、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ、ジオクタノイル−ｃＡＭＰ、百日咳毒素、プロスタグランジン、コルフォルシン、β−アドレナリン作動性レセプターアゴニスト、又はｃＡＭＰ類似体の何れかから選択する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも一種のｃＡＭＰ上昇剤が、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼのインヒビターである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
(ｆ)の標準的グルコース培地が、７．５ｍＭ未満のグルコースを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項３４】
標準的グルコース培地が、６ｍＭ未満のグルコースを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
標準的グルコース培地が、５．５ｍＭ未満のグルコースを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
(ｆ)の培地が、血清、レプチン、ニコチンアミド、マロニルＣｏＡ、又はエキセンジン−４の何れかから選択する少なくとも一種の因子を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項３７】
インスリン−細胞が、インスリン＋細胞を含む島様構造を形成するように分化する、請求項１５に記載の方法。
【請求項３８】
島様構造が、グルカゴン＋細胞及びソマトスタチン＋細胞をも含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
グルカゴン＋細胞及びソマトスタチン＋細胞が、島様構造の周囲に局在化される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
実質的に精製された、インスリン−細胞をインスリン＋細胞に分化させる方法が、非粘着性球内のｐｄｘ１＋細胞を拡大することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項４１】
実質的に精製された、インスリン−細胞をインスリン＋、グルコース応答性細胞に分化させる方法であって、下記を含む当該方法
(ａ)精製された細胞を非粘着性球として培養し；
(ｂ)細胞を、カージオトロフィン−１を補った無血清培地で培養することにより選択し；
(ｃ)これらの球を分離して、ＦＧＦ−１８及びヘッジホッグポリペプチドを補った無血清培地で培養し；
(ｄ)これらの球を、少なくとも２種の成長因子、又は成長因子アゴニストの存在下で培養し、ここに、少なくとも一つの成長因子は、ＦＧＦ−１８であり；
(ｅ)これらの球を、被覆した下層上に、高グルコース培地中でプレートし；
(ｆ)これらの球を、ニコチンアミドを補った標準的グルコースを含む培地で培養する。
【請求項４２】
(ｃ)の培地が、ヘパリンを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
(ｄ)の成長因子が、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ又はヘッジホッグの何れかから選択する成長因子ファミリーのメンバーである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
(ｄ)の培地が、ヘパリンを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
(ｅ)の被覆した下層が、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン又はスーパーフィブロネクチンの少なくとも一つを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
(ｅ)の被覆した下層が、スーパーフィブロネクチンを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
(ｅ)の被覆した下層が、マトリゲル又は細胞性フィーダー層を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
実質的に精製されたインスリン−細胞又はそれらの子孫から分化した島様構造を含む組成物。
【請求項４９】
実質的に精製されたインスリン−細胞又はそれらの子孫から分化したインスリン＋、グルコース応答性細胞を含む組成物。
【請求項５０】
実質的に精製されたインスリン−細胞又はそれらの子孫から分化した島様構造及び製薬上許容しうるキャリアー又は賦形剤を含む組成物。
【請求項５１】
実質的に精製されたインスリン−細胞又はそれらの子孫から分化したインスリン＋、グルコース応答性細胞及び製薬上許容しうるキャリアー又は賦形剤を含む組成物。
【請求項５２】
障害されたグルコースに対する応答性により特徴付けられる病気を有する患者を治療する方法であって、該患者に、グルコース応答性を改善するのに有効な量の請求項４８又は５０に記載の島様構造を投与することを含む、当該方法。
【請求項５３】
障害されたグルコースに対する応答性により特徴付けられる病気を有する患者を治療する方法であって、該患者に、グルコース応答性を改善するのに有効な量の請求項４９又は５１に記載のインスリン＋、グルコース応答性細胞を投与することを含む、当該方法。
【請求項５４】
インスリン−細胞の非粘着性球内のＰｄｘ１−細胞の数を増大させる方法であって、該方法において該Ｐｄｘ１−がＰｄｘ１＋細胞に分化することができ、該方法は、下記
(ａ)該インスリン−細胞を培養して、非粘着性球を形成し；そして
(ｂ)該非粘着性球を、ＦＧＦ有糸分裂促進物質及びｃＡＭＰ上昇剤を含む培地中で少なくとも一日間培養する
ことを含み、それにより、ＦＧＦ有糸分裂促進物質及びｃＡＭＰ上昇剤を含む培地での少なくとも一日の培養の後に、該非粘着性球内のＰｄｘ１＋細胞に分化することのできるＰｄｘ１−細胞の数が増大する、当該方法。
【請求項５５】
前記の培地が、ｐＨ５．０〜７．２の酸性培地である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記の培地が、ｐＨ６．９〜７．１の酸性培地である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記の細胞の非粘着性球を、ＦＧＦ有糸分裂促進物質及びｃＡＭＰ上昇剤を含む培地の添加の前に酸性培地で培養する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記のＦＧＦ有糸分裂促進物質及びｃＡＭＰ上昇剤を含む培地が、酸性培地である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記のＦＧＦ有糸分裂促進物質及びｃＡＭＰ上昇剤を含む培地が、中性培地である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記の方法が、前記の非粘着性球を、ＦＧＦ有糸分裂促進物質、ｃＡＭＰ上昇剤、インスリン及び／又はコルチコステロイドを含む培地中で培養することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記のＦＧＦ有糸分裂促進物質を、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７又はＦＧＦ−１８の何れかから選択する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ｃＡＭＰ上昇剤を、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、Ｎａ−ブチレート、イソブチルメチルキサンチン、コレラ毒素、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ、ジオクタノイル−ｃＡＭＰ、百日咳毒素、プロスタグランジン、コルフォルシン、β−アドレナリン作動性レセプターアゴニスト、又はｃＡＭＰ類似体の何れかから選択する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記のコルチコステロイドを、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、又はベタメタゾンの何れかから選択する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記の方法が、前記の非粘着性球を、少なくとも一種のフォリスタチンベースの因子又は少なくとも一種のＧＬＰ−１アゴニストを含む培地中で培養することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
前記の方法が、前記の非粘着性球を、少なくとも一種のフォリスタチンベースの因子及び少なくとも一種のＧＬＰ−１アゴニストを含む培地中で培養することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
前記のフォリスタチンベースの因子を、フォリスタチン、フォリスタチン関連遺伝子タンパク質、又はインヒビンの何れかから選択する、請求項６４又は６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記のＧＬＰ−１アゴニストを、エキセンジン−４、エキセンジン−３、ＧＬＰ−１、又はＧＬＰ−１類似体の何れかから選択する、請求項６４又は６５に記載の方法。
【請求項６８】
請求項５４、６０又は６５の何れかに記載の方法であって、前記のＰｄｘ１＋細胞を含む非粘着性球を分化させて、インスリン＋、グルコース応答性細胞を生成させることを更に含む当該方法。
【請求項６９】
細胞のクラスターを分離する方法であって、該細胞のクラスターをプロテアーゼＸＸＩＩＩの存在下で培養することを含む当該方法。
【請求項７０】
前記の細胞が、幹細胞である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記の幹細胞を、胚性幹細胞、胎児幹細胞、又は成体幹細胞の何れかから選択する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記の成体幹細胞を、神経幹細胞、神経冠幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚由来幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞、又は間充織幹細胞の何れかから選択する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記の成体幹細胞を、成体組織から分離する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記の成体組織を、脳、脊髄、上皮、真皮、膵臓、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、腎臓、膀胱、食道、肺、心筋、骨格筋、内皮、血液、脈管構造、軟骨、骨、骨髄、子宮、舌、又は嗅上皮の何れかから選択する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
請求項１、１５、４１又は６８の何れかに記載の方法により分化させた、実質的に精製されたインスリン＋、グルコース応答性細胞を含む組成物。
【請求項７６】
請求項１、１５、４１又は６８の何れかに記載の方法により分化させた、単離されたインスリン＋、グルコース応答性細胞。
【請求項７７】
インスリン＋、グルコース応答性細胞の、患者の病気を治療するための医薬の製造における利用であって、該病気が、グルコース応答性の阻害により特徴付けられる当該利用。
【請求項７８】
インスリン＋、グルコース応答性細胞を含む島様構造の、患者の病気を治療するための医薬の製造における利用であって、該病気が、グルコース応答性の阻害により特徴付けられる当該利用。
【請求項７９】
前記の病気が、糖尿病を含む、請求項７７又は７８に記載の利用。
【請求項８０】
前記の病気が、膵臓損傷又は膵臓疾患を含む、請求項７７又は７８に記載の利用。
【請求項８１】
前記の病気が、β細胞の損傷又は病気を含む、請求項７７又は７８に記載の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
多能性幹細胞は、生物医学界に多大な関心を生んできた。幹細胞が多くの成体、胎児及び胚組織から単離されうるということが実感されるようになって、比較的純粋な幹細胞の培養を、広範囲の病気の治療での利用のためにイン・ビトロで維持することができるという希望がもたらされた。イン・ビトロでの自己再生能力及び分化した細胞型を生成する能力を有するが故に、幹細胞は、殆ど如何なる臓器系においても老化し又は弱った細胞の機能を置き換えるのに有用でありうる。幾つかの推定値によれば、一億人より多くの米国人が、幹細胞を利用する移植技術により軽減できる病気を患っている(Perry (2000) Science 287: 1423)。かかる病気には、例えば、心臓血管疾患、自己免疫疾患、糖尿病、骨粗鬆症、癌及び火傷が含まれる。
【０００２】
インスリン依存性の糖尿病(ＩＤＤＭ)は、幹細胞の利用によって治癒し又は改善しうる病気の良い例である。上昇したグルコースレベルの原因は、膵臓によるホルモンのインスリンの不十分な分泌である。このホルモンの非存在下では、身体の細胞は、グルコースを血流から吸収することができず、血中への蓄積を引き起こす。慢性的に上昇した血中グルコースは、組織及び臓器を傷つける。ＩＤＤＭは、インスリン注射により治療される。インスリン注射の大きさ及びタイミングは、血中グルコースの測定値により影響される。
【０００３】
世界には、現在、４億人より多くの糖尿病患者がいる。糖尿病は、米国で最も一般的な慢性疾患の一つであり、主な死亡原因である。１９９３年のナショナル・ヘルス・インタビュー・サーベイ(ＮＨＩＳ)に基づく評価は、４５歳未満の米国人口の１％、４５〜６４歳の米国人口の６．２％、及び６５歳より高齢の米国人口の１０．４％が、糖尿病と診断されたことを示している。換言すれば、１９９３年に、米国において、推定で７８０万人が、この慢性疾患を有すると報告された。加えて、糖尿病の年間発病率に基づいて、毎年約６２５，０００人が、新たな糖尿病患者と診断されている(これは、５９５，０００人の非インスリン依存性糖尿病(ＮＩＤＤＭ)の患者と３０，０００人のインスリン依存性糖尿病(ＩＤＤＭ)の患者を含む)ということが見積もられている。糖尿病を有する人は、糖尿病性ケトアシドーシス、末期腎臓病、糖尿病性網膜症及び手足等の切断を含む主要な合併症の危険にある。高血圧症、心臓病、抹消血管病及び感染症等の一層直接的でない関連疾患の宿主もいる(これらに対して、糖尿病を有する人は、かなり高い危険にある)。
【０００４】
注射可能なインスリン及び経口血糖降下薬等の薬物は糖尿病患者を一層長生きさせるが、糖尿病は、薬物療法が、腎臓、眼及び血管へのダメージを生じる高い及び低い血中グルコースレベルの間の変動を防止するのに十分なだけ血中グルコースレベルを制御しないので、心臓病及び癌に次ぐ、第三の主要な死因であり続けている。
【０００５】
島移植による、機能的なグルコースを感知する、インスリン分泌性膵臓ベータ細胞の補充は、長年にわたる治療の標的であった。このアプローチにおける制限因子は、安全で、再生可能で且つ豊富な島の供給源の利用可能性である。現在の方法論は、死体材料又はブタの島を移植基材として利用する(Korbutt等(1997) Adv.Exp.Med.Biol. 426:397-410)。しかしながら、克服すべき重大な問題は、ドナー組織の低い利用可能性、分離により得られる島の変化しやすさと低い収量、及び分離工程の結果として生じうる酵素的・物理的ダメージである(Secchi等(1997) Horm．Metab．Res. 29:1-8；Sutherland等(1996) Transplant Proc. 28:2131-2133により総説されている)。加えて、免疫拒絶の問題及び現在のブタ島を利用する異種移植への懸念がある(Weir & Bonner-Weir (1997) 46:1247-1256により総説されている)。
【０００６】
発明の要約
糖尿病は、経済的に及び患者の人生の質に対する影響の両方において、甚だしい犠牲を強いる重大な病気である。糖尿病並びに他の膵臓の損傷及び病気を含む異常及びグルコースに適当に応答する身体の能力に影響する病気に対する一つの魅力的な潜在的治療には、失われ又は傷害された細胞型を置き換えるための幹細胞の利用が含まれる。糖尿病の場合には、傷害されたβ−細胞を、イン・ビボで分化する幹細胞の移植により、エキソ・ビボで分化させたβ−細胞の移植により、又はβ−細胞を含む分化した島の移植によって、置き換えることができよう。加えて、幹細胞に由来するβ−細胞の分化に多く焦点が絞られてきたが、グルコース応答性のβ−細胞を生じるように分化するように影響されうる任意の細胞型(幹細胞又は拘束された細胞)は、糖尿病又は他の機能的β−細胞の傷害又は破壊を生じる異常の治療に有用であろう。
【０００７】
幹細胞及びそれらの分化した子孫の大きな治療的潜在能力にもかかわらず、幹細胞治療の広く行きわたった実現を妨げる幾つかの重大な制限がある。成人の幹細胞は極めて稀少であり、幹細胞を培養して特定の細胞系統に沿って分化させるための以前の方法は、有望ではあるが非常に不十分な結果を生じてきた。幹細胞を採用する治療方法が妥当な治療選択肢となるために、幹細胞を精製し、かかる幹細胞を特定の細胞系統に沿って分化させるための改良された方法に対する要求がある。その上、特定の細胞系統に沿って分化することのできる細胞の数を所定の組織試料中で拡大させるための改良された方法に対する要求がある。
【０００８】
幹細胞を分化させるための一層効率的な方法に対する要求に加えて、内因性細胞型として機能することのできる成熟細胞型を分化させる(幹細胞からか又は一層拘束された細胞集団から)改良された方法に対する要求もある。例えば、ニューロン性の分化のマーカーを発現するように細胞の分化に影響を与える方法は存在しうるが、その細胞は、最終的にニューロンとして機能する(即ち、神経伝達物質を伝達し／該物質に応答する)ことができなければならない。糖尿病に対する治療介入は、膵臓分化のマーカー(即ち、インスリン)を発現する細胞だけでなく、グルコース応答性である細胞をも必要とする。本発明は、膵臓の内分泌分化のマーカーを発現するだけでなくグルコースに応答性でもある(例えば、上昇した血漿グルコースレベルに応答してのインスリンの分泌によって)細胞の分化のための改良された方法を提供する。かかる細胞は、膵臓の損傷及び異常並びに他のグルコースに適当に応答する身体の能力に影響を及ぼす異常を治療する改良された方法の基礎を与える。
【０００９】
本発明は、インスリン＋の、グルコース応答性細胞の分化のための改良された方法を提供する。この発明は、かかるインスリン＋の、グルコース応答性細胞が、幹細胞(成体幹細胞、胎児幹細胞及び胚性幹細胞を含む)並びに一層拘束された組織から分化しうることを企図している。本発明は、更に、開示した方法を利用して分化させた分離された島様構造を提供する。これらの島様構造は、インスリン＋の、グルコース応答性細胞並びにソマトスタチン＋の及びグルカゴン＋の細胞を含む。この発明は、更に、治療上有効な量のこの発明の島様構造の移植によって、患者を治療する方法を提供する。
【００１０】
一つの面において、この発明は、実質的に精製されたインスリン−細胞を培養する方法であって、該方法において、該細胞は、インスリン＋の、グルコース応答性細胞に分化する当該方法を提供する。
一具体例において、インスリン−細胞は、幹細胞である。
一具体例において、インスリン−細胞は、サイトケラチン＋細胞である。
一具体例において、インスリン−細胞は、サイトケラチン−細胞である。
【００１１】
一具体例において、これらの細胞の実質的に精製された集団は、少なくとも約５０％純粋であるが、一層好ましくは、約６０％、７０％、８０％、最も好ましくは約９０％、９５％若しくは９９％純粋である。他の具体例において、これらの細胞の精製された集団は、約２０％より少ない夾雑細胞系統を有し、一層好ましくは約１０％より少ない、一層好ましくは約５％より少ない夾雑細胞系統を有する。本発明の文脈において、夾雑細胞系統は、少なくとも一種の次の分化した内分泌細胞のマーカーを発現するものである：インスリン、ソマトスタチン、又はグルカゴン。
【００１２】
一具体例において、インスリン＋細胞は、ｐｄｘ１＋でもある。
一具体例において、インスリン−細胞は、膵臓組織から分離される。
【００１３】
他の具体例において、インスリン−細胞は、管又は細管組織から分離される。他の具体例において、この管又は細管組織は、膵管、肝管、腎管、腎細管(例えば、近位尿細管、遠位尿細管)、胆管、涙管、乳管、射精管、精細管、輸出管、胆嚢管、リンパ本幹、及び胸管よりなる群から選択する。
【００１４】
他の具体例において、これらのインスリン−細胞は、胚性幹細胞、胎児幹細胞、及び成体幹細胞よりなる群から選択する幹細胞である。一具体例において、これらの成体幹細胞は、神経幹細胞、神経冠幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚由来幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞及び間充織幹細胞よりなる群から選択する。他の具体例において、これらの成体幹細胞は、成体組織から分離される。更に別の具体例において、これらの幹細胞は、脳、脊髄、上皮、真皮、膵臓、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、腎臓、膀胱、食道、肺、心筋、骨格筋、内皮、血液、脈管構造、軟骨、骨、骨髄、子宮、舌、及び嗅上皮よりなる群から選択する成体組織から分離される。
【００１５】
他の具体例において、これらのインスリン−細胞は、インスリン＋細胞を含む島様構造を形成するように分化する。好適具体例において、これらのインスリン＋細胞は、グルコース応答性である。他の好適具体例において、これらの島様構造は、グルカゴン＋及びソマトスタチン＋細胞を更に含む。更に別の好適具体例において、これらのグルカゴン＋及びソマトスタチン＋細胞は、島様構造の周囲に局在する。
【００１６】
第二の面において、この発明は、実質的に精製された、インスリン−細胞を、インスリン＋の、グルコース応答性細胞に分化させる方法を提供する。この方法は、次のステップを含む：(ａ)実質的に精製された細胞を非粘着性球として培養し；(ｂ)ｇｐ１３０アゴニストの存在下で培養することにより細胞を選択し；(ｃ)これらの球を分離して、有糸分裂促進物質の存在下で培養し、少なくとも一種の有糸分裂促進物質はＦＧＦファミリーのメンバーであり；(ｄ)これらの球を、少なくとも二種の成長因子又は成長因子アゴニストの存在下で培養し、少なくとも一種の成長因子はＦＧＦファミリーのメンバーであり；(ｅ)これらの球を、高グルコース中の被覆された下層上にプレートし；そして(ｆ)これらの球を、標準的グルコースを含む培地中で培養する。
【００１７】
一具体例において、インスリン−細胞は、幹細胞である。
一具体例において、インスリン−細胞は、サイトケラチン＋である。
一具体例において、インスリン−細胞は、サイトケラチン−である。
【００１８】
一具体例において、ステップ(ｂ)で述べたｇｐ１３０アゴニストは、カージオトロフィン−１、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、繊毛神経栄養性因子及び顆粒球コロニー刺激因子よりなる群から選択する。
【００１９】
他の具体例において、ステップ(ｃ)又は(ｄ)で述べたＦＧＦメンバーは、独立に、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７及びＦＧＦ−１８よりなる群から選択する。好適具体例において、ステップ(ｃ)又は(ｄ)で述べたＦＧＦファミリーメンバーを、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７及びＦＧＦ−１８よりなる群から独立に選択する。
【００２０】
他の具体例において、ステップ(ｃ)は、ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ、及びデザートヘッジホッグよりなる群から選択するヘッジホッグポリペプチドを含む。このポリペプチドは、完全長ペプチドであっても、ヘッジホッグシグナリングを活性化することのできる活性断片であってもよい。更に、このヘッジホッグポリペプチド又はその活性断片は、該ポリペプチドの疎水性を増大させる少なくとも一種の親油性成分又は他の成分により改変されてよい。他の具体例において、ステップ(ｃ)は、ヘッジホッグポリペプチド又はヘッジホッグシグナリングを強化することのできる小分子よりなる群から選択するヘッジホッグアゴニストを含む。
【００２１】
前述の具体例の何れかにおいて、ステップ(ｃ)及び／又は(ｄ)は、ヘパリンを含むことができる。
【００２２】
他の具体例において、ステップ(ｄ)の成長因子は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ及びヘッジホッグよりなる群から選択するファミリーメンバーである。
【００２３】
他の具体例において、ステップ(ｅ)の被覆された下層は、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、又はスーパーフィブロネクチンの少なくとも一つを含む。好適具体例において、この被覆された下層は、スーパーフィブロネクチンを含む。
【００２４】
他の具体例において、ステップ(ｅ)の被覆された下層は、マトリゲル又は細胞性フィーダー層を含む。
【００２５】
他の具体例において、ステップ(ｅ)の高グルコース培地は、少なくとも１０ｍＭのグルコースを含む。他の具体例において、ステップ(ｅ)の高グルコース培地は、少なくとも１１ｍＭのグルコースを含む。この培地中のグルコースは、ステップ(ｅ)において、１０〜１７ｍＭに及びうる。
【００２６】
他の具体例において、ステップ(ｅ)は、血清、ＰＹＹ、ＨＧＦ、及びフォルスコリンよりなる群から選択する少なくとも一種の因子を含む培地を含む。
【００２７】
他の具体例において、ステップ(ｅ)は、少なくとも一種のｃＡＭＰ上昇剤を含む。好適具体例において、このｃＡＭＰ上昇剤は、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、Ｎａ−ブチレート、イソブチルメチルキサンチン、コレラ毒素、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ、ジオクタノイル−ｃＡＭＰ、百日咳毒素、プロスタグランジン、コルフォルシン、β−アドレナリン作動性レセプターアゴニスト、及びｃＡＭＰ類似体よりなる群から選択する。他の好適具体例において、このｃＡＭＰ上昇剤は、フォルスコリンである。他の具体例において、少なくとも一種のｃＡＭＰ上昇剤は、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼのインヒビターである。
【００２８】
他の具体例において、ステップ(ｆ)の標準的グルコース培地は、７．５ｍＭ未満のグルコースを含む。他の具体例において、ステップ(ｆ)の標準的グルコース培地は、６ｍＭ未満のグルコースを含む。更に別の具体例において、ステップ(ｆ)の標準的グルコース培地は、５．５ｍＭ未満のグルコースを含む。
【００２９】
他の具体例において、ステップ(ｆ)の培地は、血清、レプチン、ニコチンアミド、マロニルＣｏＡ、及びエキセンジン−４よりなる群から選択する少なくとも一種の因子を更に含む。
【００３０】
一具体例において、これらのインスリン−細胞は、膵臓組織から分離される。
他の具体例において、これらのインスリン−細胞は、管又は細管組織から分離される。他の具体例において、この管又は細管組織は、膵管、肝管、腎管、腎細管(例えば、近位尿細管、遠位尿細管)、胆管、涙管、乳管、射精管、精細管、輸出管、胆嚢管、リンパ本幹、及び胸管よりなる群から選択する。
【００３１】
他の具体例において、これらのインスリン−細胞は、胚性幹細胞、胎児幹細胞、及び成体幹細胞よりなる群から選択する幹細胞である。一具体例において、これらの成体幹細胞は、神経幹細胞、神経冠幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚由来幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞及び間充織幹細胞よりなる群から選択する。他の具体例において、これらの成体幹細胞は、成体組織から分離される。更に別の具体例において、これらの幹細胞は、脳、脊髄、上皮、真皮、膵臓、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、腎臓、膀胱、食道、肺、心筋、骨格筋、内皮、血液、脈管構造、軟骨、骨、骨髄、子宮、舌及び嗅上皮よりなる群から選択する成体組織から分離される。
【００３２】
他の具体例において、これらのインスリン−細胞は、インスリン＋細胞を含む島様構造を形成するように分化する。好適具体例において、これらの島様構造は、グルカゴン＋及びソマトスタチン＋細胞を更に含む。他の好適具体例において、これらのグルカゴン＋及びソマトスタチン＋細胞は、島様構造の周囲に局在する。
【００３３】
第三の面において、この発明は、実質的に精製された、インスリン−細胞をインスリン＋の、グルコース応答性細胞に分化させる方法を提供する。この方法は、次のステップを含む：(ａ)実質的に精製された細胞を非粘着性球として培養し；(ｂ)カージオトロフィン−１を補った無血清培地中で培養することによって細胞を選択し；(ｃ)これらの球を分離して、ＦＧＦ−１８及びヘッジホッグポリペプチドを補った無血清培地中で培養し；(ｄ)これらの球を、少なくとも二種の成長因子又は成長因子アゴニストの存在下で培養し、少なくとも一種の成長因子はＦＧＦ−１８であり；(ｅ)これらの球を、高グルコース培地中の被覆された下層にプレートし；そして(ｆ)これらの球を、ニコチンアミドを補った標準的グルコースを含む培地中で培養する。
【００３４】
一具体例において、これらのインスリン−細胞は、幹細胞である。
一具体例において、これらのインスリン−細胞は、サイトケラチン＋である。
一具体例において、これらのインスリン−細胞は、サイトケラチン−である。
一具体例において、ステップ(ｃ)の培地は、ヘパリンを含む。
【００３５】
他の具体例において、ステップ(ｄ)の成長因子は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ及びヘッジホッグよりなる群から選択する成長因子ファミリーのメンバーである。他の具体例において、ステップ(ｄ)の培地は、適宜、ヘパリンを含む。
【００３６】
他の具体例において、ステップ(ｅ)の被覆された下層は、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、又はスーパーフィブロネクチンの少なくとも一つを含む。好適具体例において、ステップ(ｅ)の被覆された下層は、スーパーフィブロネクチンを含む。
【００３７】
他の具体例において、ステップ(ｅ)の被覆された下層は、マトリゲル又は細胞性フィーダー層を含む。
【００３８】
一具体例において、これらのインスリン−細胞は、膵臓組織から分離される。
他の具体例において、これらのインスリン−細胞は、管又は細管組織から分離される。他の具体例において、この管又は細管組織は、膵管、肝管、腎管、腎細管(例えば、近位尿細管、遠位尿細管)、胆管、涙管、乳管、射精管、精細管、輸出管、胆嚢管、リンパ本幹、及び胸管よりなる群から選択する。
【００３９】
他の具体例において、これらのインスリン−細胞は、胚性幹細胞、胎児幹細胞、及び成体幹細胞よりなる群から選択する幹細胞である。一具体例において、これらの成体幹細胞は、神経幹細胞、神経冠幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚由来幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞及び間充織幹細胞よりなる群から選択する。他の具体例において、これらの成体幹細胞は、成体組織から分離される。更に別の具体例において、これらの幹細胞は、脳、脊髄、上皮、真皮、膵臓、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、腎臓、膀胱、食道、肺、心筋、骨格筋、内皮、血液、脈管構造、軟骨、骨、骨髄、子宮、舌及び嗅上皮よりなる群から選択する成体組織から分離される。
【００４０】
第四の面において、この発明は、、非粘着性細胞クラスター内で、膵臓細胞系統に沿って分化することのできる細胞の数を拡大する方法を提供する。
【００４１】
一具体例において、この方法は、インスリン−の、非粘着性細胞クラスター中のｐｄｘ１＋細胞の数を拡大することを含む。
【００４２】
一具体例において、この方法は、インスリン−の、非粘着性細胞クラスター中のｐｄｘ１−細胞の数を拡大させ、それにより、該ｐｄｘ１−細胞をｐｄｘ１＋細胞に分化させることを含む。
【００４３】
一具体例において、膵臓細胞系統に沿って分化することのできる細胞の数を拡大させる方法は、細胞を酸性培地中で培養し、それにより、それらの細胞が酸ショックを受けるようにすることを含む。一具体例において、該酸ショックは、細胞を酸性培地中で少なくとも１分間培養することを含む。他の具体例において、この方法は、細胞を、酸性培地中で少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５分間培養することを含む。他の具体例において、この方法は、細胞を、酸性培地中で、少なくとも１５、３０、４５、６０、９０又は１２０分間培養することを含む。他の具体例において、この方法は、細胞を、酸性培地中で、少なくとも２〜２４時間にわたって培養することを含む。更に別の具体例において、この方法は、細胞を酸性培地中で、２４〜４８時間にわたって培養することを含む。
【００４４】
他の具体例において、この方法は、細胞を、酸性培地中で、ＦＧＦ有糸分裂促進物質及び細胞内ｃＡＭＰを増大させる因子の存在下で培養することを含む。
【００４５】
他の具体例において、この方法は、細胞を、酸性培地中で、ＦＧＦ有糸分裂促進物質、細胞内ｃＡＭＰ及び／又はインスリンを増大させる因子並びにコルチコステロイドの存在下で培養することを含む。
【００４６】
更に別の具体例において、この方法は、細胞を、酸性培地中で、ＦＧＦ有糸分裂促進物質、細胞内ｃＡＭＰを増大させる因子、インスリン及びコルチコステロイドの存在下で培養することを含む。
【００４７】
本発明のこの面の前述の具体例の何れかにおいて、この発現用培地は、フォリスタチン及び／又はフォリスタチン関連タンパク質(ここでは、用語フォリスタチンベースの因子を、総称的に、フォリスタチン及びフォリスタチン関連タンパク質を指すために用いる)を含む。一具体例において、このフォリスタチン関連タンパク質は、フォリスタチンと同じ機構(例えば、アクチビンに直接結合すること)によってアクチビンを負に調節するインヒビン又は他の関連タンパク質を含む。他の具体例において、この拡大用培地は、フォリスタチン関連遺伝子タンパク質を含む。更に別の関連する具体例において、この拡大用培地は、アクチビンのインヒビターを含む。この発明は、前述のフォリスタチンベースの因子又はアクチビンのインヒビターの少なくとも一種の、分離又は拡大プロトコールの何れかの時点における添加を企図している。同様に、この発明は、前述のフォリスタチンベースの因子又はアクチビンのインヒビターの少なくとも一種の、分離又は拡大プロトコールの多数の時点における添加を企図している。その上、この発明は、前述のフォリスタチンベースの因子又はアクチビンのインヒビターの少なくとも一種の、拡大された細胞の分化中での添加を企図している。
【００４８】
本発明のこの面の前述の具体例の何れかにおいて、この拡大用培地は、エキセンジン−４及び／又はＧＬＰ−１類似体(ここでは、用語ＧＬＰ−１アゴニストを、総称的に、エキセンジン−４、エキセンジン−３、ＧＬＰ−１、及び前述のＧＬＰ−１類似体の何れかの模倣物及び改変型又は誘導体型を含む他のＧＬＰ−１類似体を指すために用いる)を含む。この発明は、前述のＧＬＰ−１アゴニストの少なくとも一つの、分離又は拡大プロトコール中の任意の時点における添加を企図している。同様に、この発明は、前述のＧＬＰ−１アゴニストの少なくとも一つの、分離又は拡大プロトコール中の多数の時点における添加を企図している。その上、この発明は、前述のＧＬＰ−１アゴニストの少なくとも一つの、拡大された細胞の分化中での添加を企図している。更に、この発明は、ＧＬＰ−１アゴニストの少なくとも一種及び少なくとも一種のフォリスタチンベースの因子の、これらの細胞の分離、拡大及び／又は分化中の何れかのステップでの添加を企図している。
【００４９】
本発明のこの面の前述の具体例の何れかにおいて、このＦＧＦ有糸分裂促進物質は、任意のＦＧＦポリペプチドから選択することができる。一具体例において、このＦＧＦ有糸分裂促進物質は、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７及びＦＧＦ−１８から選択する。他の具体例において、このＦＧＦ有糸分裂促進物質は、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７及びＦＧＦ−１８から選択する。他の具体例において、このＦＧＦ有糸分裂促進物質は、ＦＧＦ−１８から選択する。
【００５０】
本発明のこの面の前述の具体例の何れかにおいて、細胞内ｃＡＭＰを増大させる剤は、細胞内ｃＡＭＰを上昇させる任意の剤から選択することができる。一具体例において、この剤は、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、Ｎａ−ブチレート、イソブチルメチルキサンチン、コレラ毒素、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ、ジオクタノイル−ｃＡＭＰ、百日咳毒素、プロスタグランジン、コルフォルシン、β−アドレナリン作動性アゴニスト、及びｃＡＭＰ類似体から選択する。他の具体例において、この剤は、フォルスコリンから選択する。
【００５１】
本発明のこの面の前述の具体例の何れかにおいて、コルチコステロイドは、任意のコルチコステロイドから選択することができる。他の具体例において、このコルチコステロイドは、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、及びベタメタゾンよりなる群から選択する。
【００５２】
一具体例において、これらのインスリン−細胞は、膵臓組織から分離する。
他の具体例において、これらのインスリン−細胞は、管又は細管組織から分離する。他の具体例において、この管又は細管組織は、膵管、肝管、腎管、腎細管(例えば、近位尿細管、遠位尿細管)、胆管、涙管、乳管、射精管、精細管、輸出管、胆嚢管、リンパ本幹、及び胸管よりなる群から選択する。
【００５３】
他の具体例において、これらのインスリン−細胞は、胚性幹細胞、胎児幹細胞及び成体幹細胞よりなる群から選択する幹細胞である。一具体例において、これらの成体幹細胞は、神経幹細胞、神経冠幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚由来幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞、及び間充織幹細胞よりなる群から選択する。他の具体例において、これらの成体幹細胞は、成体組織から分離される。更に別の具体例において、これらの幹細胞は、脳、脊髄、上皮、真皮、膵臓、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、腎臓、膀胱、食道、肺、心筋、骨格筋、内皮、血液、脈管構造、軟骨、骨、骨髄、子宮、舌及び嗅上皮よりなる群から選択する成体組織から分離される。
【００５４】
第五の面において、この発明は、実質的に精製された、インスリン−細胞を、インスリン−細胞のクラスター内のｐｄｘ１＋細胞の最初の発現後に、インスリン＋の、グルコース応答性細胞に分化させる方法を提供する。
【００５５】
第六の面において、この発明は、前述の方法の何れかによって分化させた島様構造の組成物を提供する。かかる島様構造は、インスリン−細胞のクラスター内のｐｄｘ１＋細胞を増大させる初期拡大法に従って分化させることができる。好適具体例において、これらの島様構造は、インスリン＋の、グルコース応答性細胞を含む。他の好適具体例において、これらの島様構造は、更に、グルカゴン＋で且つソマトスタチン＋の細胞を含む。更に別の好適具体例において、これらのグルカゴン＋且つソマトスタチン＋細胞は、島様構造の周囲に局在化される。
【００５６】
第七の面において、この発明は、前述の方法の何れかによって分化させたインスリン＋の、グルコース応答性細胞の組成物を提供する。かかるインスリン＋、グルコース応答性細胞は、インスリン−細胞のクラスター内のｐｄｘ１＋細胞を増大させる初期拡大法に従って分化させることができる。
【００５７】
第八の面において、この発明は、増大されたｐｄｘ１＋細胞の集団を含むようにこの発明の方法によって拡大された細胞クラスターの組成物を提供する。一具体例において、これらの細胞クラスターは、本発明の方法によって予め拡大されてない細胞クラスターで認められたｐｄｘ１＋細胞より少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、６０倍、８０倍、又は１００倍多いｐｄｘ１＋細胞を含む。他の具体例において、これらの細胞クラスターは、本発明の方法によって予め拡大されてない細胞クラスターで認められたｐｄｘ１＋細胞より少なくとも１００倍、１５０倍、２００倍、２２５倍、２５０倍、２７５倍、３００倍又は５００倍多いｐｄｘ１＋を含む。
【００５８】
第九の面において、この発明は、治療上有効な量のグルコース応答性の、インスリン＋細胞を移植することにより患者を治療する方法を提供する。一具体例において、グルコース応答性、インスリン＋細胞は、島様構造を含む。一具体例において、患者は、ヒト患者である。他の具体例において、患者は、グルコースに対する弱った応答性により特徴付けられる病気を有する。かかる病気には、糖尿病、肥満症、癌、及び膵臓損傷が含まれる。
【００５９】
他の具体例において、この発明は、インスリン＋、グルコース応答性細胞は、単独で、又は他の治療剤又は養生法と共に投与することができるということを企図する。典型的な治療剤及び養生法には、インスリン、食事及び運動が含まれるが、これらに限られない。
【００６０】
第十の面において、この発明は、インスリン＋、グルコース応答性細胞の、患者の病気を治療するための医薬の製造における利用であって、該病気が、該患者の身体のグルコースに対して適当に応答する能力の阻害によって特徴付けられる当該利用を提供する。
【００６１】
一具体例において、この病気は、糖尿病を含む。他の具体例においては、この病気は、膵臓の損傷又は病気を含む。他の具体例においては、この病気は、膵臓のβ−細胞の損傷又は病気を含む。
【００６２】
第十一の面において、この発明は、培養中の細胞の集団をプライムする方法であって、当該細胞を酸性培地中で培養し、それにより、当該細胞をプライムする酸性ショックを与え、そうして、これらの細胞のｐｄｘ１＋細胞へ拡大する能力を促進することを含む当該方法を提供する。
【００６３】
一具体例において、酸性ショックは、該細胞を酸性培地中で少なくとも１分間培養することを含む。他の具体例においては、酸性ショックは、該細胞を、酸性培地中で、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５分間培養することを含む。他の具体例において、酸性ショックは、該細胞を、酸性培地中で、少なくとも１５、３０、４５、６０、９０又は１２０分間培養することを含む。更に別の具体例においては、酸性ショックは、該細胞を、酸性培地中で、少なくとも２〜２４時間にわたって培養することを含む。
【００６４】
一具体例において、これらの細胞は、幹細胞である。他の具体例において、これらの幹細胞は、胚性幹細胞、胎児幹細胞、及び成体幹細胞よりなる群から選択する。他の具体例において、これらの成体幹細胞は、神経幹細胞、神経冠幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚由来幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞及び間充織幹細胞よりなる群から選択する。他の具体例において、これらの成体幹細胞は、成体組織から分離される。更に別の具体例において、これらの幹細胞は、脳、脊髄、上皮、真皮、膵臓、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、腎臓、膀胱、食道、肺、心筋、骨格筋、内皮、血液、脈管構造、軟骨、骨、骨髄、子宮、舌、及び嗅上皮よりなる群から選択する成体組織から分離される。
【００６５】
第十二の面において、この発明は、細胞のクラスターを分離する改良された方法であって、プロテアーゼＸＸＩＩＩの存在下で細胞のクラスターを培養することを含む当該方法を提供する。一具体例において、これらの細胞は、幹細胞である。他の具体例においては、これらの幹細胞は、胚性幹細胞、胎児幹細胞、及び成体幹細胞よりなる群から選択する。他の具体例においては、これらの成体幹細胞は、神経幹細胞、神経冠幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚由来幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞及び間充織幹細胞よりなる群から選択する。他の具体例において、これらの成体幹細胞は、成体組織から分離される。更に別の具体例において、これらの幹細胞は、脳、脊髄、上皮、真皮、膵臓、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、腎臓、膀胱、食道、肺、心筋、骨格筋、内皮、血液、脈管構造、軟骨、骨、骨髄、子宮、舌、及び嗅上皮よりなる群から選択する成体組織から分離される。
【００６６】
特記した場合を除いて、この発明の前述の面の何れかにおいて、所定のマーカーの発現は、免疫組織化学により測定しての、特定のタンパク質の発現を含むことを意味する。例えば、インスリン＋又はインスリン−は、所定の細胞が、インスリンタンパク質を発現し(＋)又はインスリンタンパク質を発現しない(−)ことを示す。
【００６７】
本発明の実施は、別途示さない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の慣用の技術を利用し、これらは、当業者の技能の内にある。かかる技術は、文献に記載されている。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版、Sambrook, Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)；DNA Cloning, 第I及びII巻(D.N. Glover編、1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編、1984)；Mullis等、米国特許第４，６８３，１９５号；Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames及びS.J. Higgins等、1984)；Transcription And Translation (B.D. Hames及びS.J. Higgins編、1984)；Culture Of Animal Cells(R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)； Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；学術論文、Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller及びM.P. Calos編、1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, 第154及び155巻(Wu等、編)、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及びWalker編、Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology, 第I-IV巻(D.M. Weir及びC.C. Blackwell編、1986)；Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【００６８】
この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
【００６９】
図面の詳細な説明
図１は、本発明の方法を利用して生成した分化した島様構造が、グルコース応答性であることを示している。島様構造を、血清及び３ｍＭ又は２０ｍＭのグルコースの存在下で、ステップ(ｆ)により分化させて培養した。このグラフは、島様構造が、インスリン放出によってグルコースに応答することを示している。加えて、この培地には、これらの島様構造のグルコースへの応答性を増進すると思われる因子を補った。これらの因子には、カクテルＥＬＭＮ(エキセンジン−４、レプチン、マロニルＡ、ニコチンアミド)又はヘッジホッグポリペプチド(デザート、インディアン及びソニック)が含まれる。これらの因子は、島様構造がグルコースに応答するのを助成してプライムすることができる。或は、これらの因子は、イン・ビボ環境で起きるシグナリングを再現するのを助成することができる。
図２は、本発明の方法を利用して生成した分化した島様構造が、グルコース応答性であることを示している。図１に要約された結果と同様に、図２は、これらの島様構造が、グルコース応答性であり、マロニルＣｏＡ、エキセンジン−４、ニコチンアミド及びレプチンを含む因子が、これらの島様構造のグルコースへの応答性を更に刺激することを助成しうることを示している。
図３は、イン・ビトロ分化した、インスリン＋、グルコース応答性ヒト細胞の移植が、ＳＴＺ処理した糖尿病マウスにおいて、上首尾に正常血中グルコースレベルを救済しうることを示している。９０〜１２０ｍｇ／ｄｌの正常血中グルコースレベルを有するＮＯＤ−Ｓｃｉｄ雌マウスに、ストレプトゾトシン(ＳＴＺ)の単一投与量を注射した。２日連続で３５０ｍｇ／ｄｌを超える血中グルコースレベルを有するマウスに、持続的放出用のウシインスリンのインプラントを皮下に移植した。２日後に、動物に、ラットの島又はイン・ビトロで分化させたインスリン＋のヒト細胞を移植した。ウシインプラントにより送達されるインスリン治療は、島又はヒト細胞の移植の後、これらの細胞の植え付けを確実にするために７日間にわたって続けられた。ウシインスリンインプラントの除去後に、血中グルコースレベルは、ラットの島を移植されたマウス(ｎ＝２／２)について及びイン・ビトロ分化させたインスリン＋のヒト細胞を移植されたマウス(ｎ＝２／３)について、９０〜１２０ｍｇ／ｍｌで正常化した。
図４は、ヒトインスリンＣ−ペプチドについてのラジオイムノアッセイの結果を示している。ラジオイムノアッセイは、ヒト細胞を移植されたマウス中での分泌されたヒトインスリンの存在を確実にするために、血中グルコース値が安定化した後６週間行なった。非空腹時血清試料を、対照用マウス、ラットの島を移植されたマウス、及びイン・ビトロで分化させたインスリン＋のヒト細胞を移植されたマウスから得た。ヒト血清の試料の分析は、このアッセイ方法のための陽性対照として役立った。グラフは、未処理のマウスがヒトＣ−ペプチドについて陰性の評価を得るが、イン・ビトロで分化させたインスリン＋のヒト細胞を移植されたマウスはヒトＣ−ペプチドについて陽性の評価を得ることを示している。
図５は、この拡大プロトコール(フォリスタチン及び／又はエキセンジン−４の存在下及び非存在下)の、ｐｄｘ１＋細胞の数及び島同等物(ＩＥ)の総数の両方の増大における、この拡大プロトコールの存在しない多段階分化プロトコール単独と比較しての有効性を示す実験をまとめてある。簡単にいえば、この拡大プロトコールの利用は、ｐｄｘ１＋細胞及び全ＩＥの、多段階分化プロトコール単独の利用と比べて凡そ６２倍の増大を生じた。加えて、この拡大プロトコールで用いたフォリスタチン又はフォリスタチンとエキセンジン−４の組合せによる、因子の補足は、それぞれ、ｐｄｘ１＋細胞及び全ＩＥの両方において、２８１倍及び３００倍の増大を生じた。
図６は、拡大条件下で又はフォリスタチンを補った拡大条件下で培養した細胞クラスターにおけるｐｄｘ１＋細胞とインスリン＋細胞の比較を示している。これらの結果は、フォリスタチンの拡大培地への添加が、ｐｄｘ１＋細胞の数を、フォリスタチンを欠く拡大培地での培養と比較して増大させたことを示している。
図７は、拡大条件下で又はフォリスタチンとエキセンジン−４を補った拡大条件下で培養した細胞クラスターにおけるｐｄｘ１＋細胞とインスリン＋細胞の比較を示している。これらの結果は、フォリスタチンの拡大培地への添加が、ｐｄｘ１＋細胞の数を、フォリスタチンを欠く拡大培地での培養と比較して増大させたことを示している。
【００７０】
発明の詳細な説明
(ｉ)定義
便宜のために、明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いた幾つかの用語を、ここに集めておく。
【００７１】
用語「粘着性マトリクス」は、培養中の細胞の粘着性を促進する任意のマトリクスを指す(例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、スーパーフィブロネクチン)。典型的マトリクスには、マトリゲル(Beckton-Dickinson)、ＨＴＢ９マトリクス、及びスーパーフィブロネクチンが含まれる。マトリゲルは、マウス肉腫細胞株から得られる。ＨＴＢ９は、膀胱細胞癌株(米国特許第５,８７４，３０６号)から得られる。
【００７２】
ここで用いる場合、用語「動物」は、哺乳動物、好ましくはヒト等の哺乳動物を指す。同様に、この発明の方法により治療される「患者」又は「被験者」は、ヒト又は非ヒト動物の何れをも意味することができる。
【００７３】
本願のコンテキストにおける「分化」は、更に分裂又は分化することのできない、一層特化して最終分化した細胞に一層近い細胞に結合していることが知られているマーカーを発現する細胞の形成を意味する。例えば、膵臓のコンテキストにおいて、分化は、増大した量のインスリンを生成するβ−上皮細胞の増大した生成を含む島様細胞クラスターの生成において見られる。
【００７４】
用語「前駆細胞」は、「幹細胞」と同義に用いられる。両用語とも、増殖することができ及び、分化した又は分化可能な娘細胞を生じることのできる多数の母細胞を生成する能力を有する更なる前駆細胞を生じさせることのできる未分化細胞を指す。好適具体例において、用語前駆細胞又は幹細胞は、子孫(後代)が分化することによって(例えば、胚細胞及び組織の漸進的多様化において起きるように、完全に別々の特性を得ることによって)しばしば異なる方向へ特殊化する分化してない母細胞を指す。細胞分化は、典型的に多くの細胞分裂を通して起きる複雑な過程である。分化した細胞は、多能性細胞から得ることができ、多能性細胞自体が多能性細胞等から得られる。これらの多能性細胞の各々は、幹細胞であると考えられるが、細胞型(各々が生じさせうる)の範囲は、かなり変化しうる。幾つかの分化した細胞は又、一層大きい発生潜在能力のある細胞を生じさせる能力も有する。かかる能力は、自然のものであってもよいし、様々な因子による処理により人工的に誘導してもよい。
【００７５】
用語「胚性幹細胞」は、胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すために用いる(米国特許第５８４３７８０号、第６２００８０６号参照)。かかる細胞は、体細胞核移植から得られる胚盤胞の内部細胞塊から同様に得ることができる(例えば、米国特許第５９４５５７７号、５９９４６１９号、６２３５９７０号参照)。
【００７６】
用語「成体幹細胞」は、胎児、若年、及び成体組織を含む非胚性組織に由来する任意の多能性幹細胞を指すために用いる。幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、及び心筋を含む広範な成体組織から分離されてきた。これらの幹細胞の各々は、遺伝子発現、因子応答性、及び培養における形態に基づいて特性決定されうる。
【００７７】
「増殖」は、細胞数の増加を示す。
【００７８】
用語「組織」は、一定の特定の機能を一緒に実行する同様に特化された細胞の群又は層を指す。
【００７９】
用語「膵臓」は、当分野で認められており、一般に、胃の後ろに横向きに、脾臓と十二指腸の間に位置する、大きい、伸長した、ブドウ房状腺を指す。膵臓の外分泌機能例えば外分泌は、消化酵素の供給源を与える。実際、「パンクレアチン」は、酵素(主として、アミラーゼ、プロテアーゼ、及びリパーゼ)を含む膵臓からの物質を指す(この物質は、消化補助剤として用いられる)。外分泌部分は、内腔を囲む幾つかの漿液細胞よりなる。これらの細胞は、消化酵素例えばトリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ2、エラスターゼ、及びアミラーゼを合成して分泌する。
【００８０】
膵臓の内分泌部分は、ランゲルハンス島よりなる。ランゲルハンス島は、外分泌膵臓内に埋め込まれた細胞の丸いクラスターに見える。α、β、δ及びφの４つの異なる型の細胞が、これらの島において同定されている。α細胞は、膵島で見出される細胞の約２０％を構成し、ホルモンのグルカゴンを生成する。グルカゴンは、幾つかの組織に作用して、摂食の合間にエネルギーを利用可能にする。肝臓においては、グルカゴンは、グリコーゲンの分解を引き起こして、アミノ酸前駆体からの糖新生を促進する。δ細胞は、ソマトスタチンを生成し、これは膵臓で作用して、グルカゴン放出を阻害して膵臓の外分泌を減少させる。ホルモン膵臓ポリペプチド(ＰＰ)は、φ細胞で生成される。このホルモンは、重炭酸塩及び酵素の膵臓外分泌を阻害し、胆嚢の弛緩を引き起こして、胆汁の分泌を減少させる。島の細胞の６０〜８０％を構成する最も豊富な細胞は、β細胞であり、これは、インスリンを生成する。インスリンは、摂食中又は摂食後短時間で生じる過剰の栄養分の蓄積を引き起こすことが知られている。インスリンの主な標的器官は、肝臓、筋肉及びエネルギーの蓄積のために特化された脂肪器官である。
【００８１】
用語「膵管」は、副膵管、背側膵管、主膵管及び腹側膵管を含む。漿液腺は、隣接する分泌細胞間の内腔の拡張を有し、これらは、細胞間小管と呼ばれる。用語「小葉間管」は、膵臓の分泌単位の小葉内に見出される介在導管及び線条部導管を指す。この「介在導管」は、分泌腺房又は細管からの排出のための第一の管セグメントを指す。介在導管は、しばしば、炭酸脱水酵素活性を有し、それで、重炭酸イオンをこのレベルで分泌物に加えることができる。「線条部導管」は、最大の小葉内管要素であり、分泌物のイオン組成を改変することができる。
【００８２】
用語「膵臓前駆細胞」は、膵臓細胞系統の細胞へ分化することのできる細胞、例えば通常膵臓細胞により生成されるホルモン又は酵素を生成することのできる細胞を指す。例えば、膵臓前駆細胞は、少なくとも部分的に、α、β、δ、若しくはφ島細胞、又は外分泌運命の細胞への分化を引き起こされうる。この発明の膵臓前駆細胞は又、細胞の増殖及び分化を促進する条件下で、患者への投与前に培養することもできる。これらの条件には、イン・ビトロで細胞増殖を与え、その際、細胞が擬似島様凝集又はクラスターを形成し且つインスリン、グルカゴン及びソマトスタチンを分泌するように細胞を培養することが含まれる。
【００８３】
用語「島様構造」は、この発明の方法により得られる膵島の外観並びに機能を有する細胞のクラスターを指す。かかる機能は、グルコースに応答する能力を含む。この発明の島様構造は、以前に他の方法を利用して培養された多くのものとは異なるものである。何故なら、それらは、様々な細胞型の間の空間的関係を再現するからである(即ち、ソマトスタチン＋及びグルカゴン＋細胞は、この島の周囲に向かって配向される)。加えて、この発明の島様構造は、インスリン＋、ソマトスタチン＋及びグルカゴン＋細胞を、内因的に膵臓で見出されるのとほぼ同じ割合で含む。
【００８４】
用語「実質的に純粋」は、特定の細胞集団に関して、全細胞集団を作る細胞の少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、一層好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の純度の細胞の集団を指す。書き直せば、用語「実質的に純粋」は、約２０％より、一層好ましくは約１０％より、最も好ましくは約５％より少ない細胞系統の拘束された細胞を含む細胞の集団を指す。本発明のコンテキストにおいて、細胞系統の拘束された細胞は、次の分化した内分泌細胞のマーカーの少なくとも一つを発現する：インスリン、ソマトスタチン又はグルカゴン。
【００８５】
用語「非粘着性球」は、この発明の前駆細胞の、クラスター中で増殖する能力を指す。これらの細胞は、互いに粘着性であるが、標準的な培養用基には付着しない傾向がある。しかしながら、これらの細胞は、粘着性下層上にプレートされ又は該層の存在下で培養された場合には、付着する。
【００８６】
ここで用いる場合、「ヘッジホッグポリペプチド」は、配列、構造及び機能的特徴に基づいて、ヘッジホッグファミリーのメンバーであるポリペプチドを指す。かかる機能的特徴には、ヘッジホッグシグナリング経路によるシグナリングを刺激する能力及びレセプターのパッチトに結合する能力が含まれる。ヘッジホッグポリペプチドは、当分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５６及びＷＯ９６／１７９２４(参考として本明細書中に、そっくりそのまま援用する)に記載されている。
【００８７】
ここで用いる場合、「ヘッジホッグ治療剤」は、ヘッジホッグシグナリングを刺激し又は代行するポリペプチド、核酸及び小分子を指す。典型的なヘッジホッグ治療剤には、ヘッジホッグポリペプチド、パッチトに細胞外で結合してヘッジホッグシグナリングを模倣する小分子、スムースンドに結合する小分子、及びヘッジホッグシグナリングの細胞内変換に関与するタンパク質に結合する小分子が含まれる。ヘッジホッグシグナリングを刺激して強化するヘッジホッグ治療剤は又、ヘッジホッグアゴニストとも呼ばれる。
【００８８】
ここで用いる場合、「島同等物」又は「ＩＥ」は、細胞の集団又はクラスターを横切る総インスリン含量の比較に用いられる尺度である。島同等物は、総インスリン含量及び細胞数の評価(総タンパク質含量として典型的に定量される)に基づいて定義される。これは、細胞クラスター、培養、球、又は他の細胞集団内の細胞総数に基づくインスリン含量の尺度の標準化を可能にする。標準のラット及びヒトの島は、直径約１５０μｍであり、総タンパク質１μｇ当たり４０〜６０ｎｇのインスリンを含む。本発明の方法により分化したヒトの島様構造は、平均で、総タンパク質１μｇ当たり約５０ｎｇのインスリンを含む。
【００８９】
(ii)典型的具体例
ｇｐ１３０アゴニスト：サイトカインのファミリーは、同定されており、それらは、共通のシグナルトランスデューサーｇｐ１３０によるシグナリングに基づいて特性表示される(Wijdenes等(1995) European Journal of Immunology 25:3474-3481)。サイトカインのこのファミリーには、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、繊毛神経栄養性因子(ＣＮＴＦ)、白血病阻害因子(ＬＩＦ)、オンコスタチンＭ(ＯＳＭ)、及びカージオトロフィン−１が含まれる。これらの因子は、様々な役割を有することが知られている。例えば、ＬＩＦは、一般に、胚性幹細胞の増殖を助成して促進するために利用され、加えて、筋芽細胞、始原生殖細胞及び幾つかの内皮細胞の増殖の引き金を引くことが示されている(Taupin等(1998) International Review of Immunology 16:397-426)。カージオトロフィン−１は、心筋細胞肥大をイン・ビトロで誘導し、肝臓急性期応答をも誘導する(Peters等(1995) FEBS Letter 372:177-180)。これらのカージオトロフィン−１のラット肝細胞に対する効果は、ＬＩＦのそれに似ており、カージオトロフィン−１及びＬＩＦの両者は、この系において、オンコスタチンＭ又はＩＬ−６よりも一層明白な応答を有する(Peters等、前出)。
【００９０】
一層最近の研究は、カージオトロフィン−１が心臓、肝臓、腎臓及び脾臓組織の成長を刺激するマウスにカージオトロフィン−１を投与した場合にイン・ビボで広範囲の効果を有することを示した(Jin等(1996) Cytokine 8:920-926)。加えて、２つの報告が、カージオトロフィン−１が、ドーパミン作動性ニューロンの生存を含むニューロンの生存を促進することを示している(Oppenheim等(2001)Journal of Neuroscience 21:1283-1291；Pennica等(1995) Journal of Biological Chemistry 270:10915-10922)。
【００９１】
明らかに、ｇｐ１３０アゴニストは、多くの異なる系の発生において、様々な役割を有している。この発明の方法におけるそれらの機能は、決定的には示されていないが、ｇｐ１３０アゴニストの一つの可能な役割は、細胞の生存を促進することである。その目的のために、この発明の方法において、他のｇｐ１３０アゴニストが機能的にカージオトロフィン−１の代用となりうるということが予想される。これらのｇｐ１３０アゴニストは、同等の潜在能力をもって機能してもしなくてもよいし、最適なｇｐ１３０アゴニストは、例えば、前駆細胞の供給源によって変わりうる。
【００９２】
ＦＧＦファミリーメンバー：成長因子のＦＧＦファミリーは、広範囲の組織における細胞のパターニング、増殖、分化及び生存に関係する分子の大きいファミリーを包含する。現在２０種類の哺乳動物ＦＧＦが同定されており、胎児及び成体の発生中に並びに多くの病理学的状態で発現される。
【００９３】
様々なＦＧＦファミリーメンバーの機能活性について、文献中に多くの例がある。例えば、ＦＧＦ−５又はＦＧＦ−１８は、網膜変性の２つのマウスモデルにおいて、光受容体細胞死を救済し(Green等(2001) Mol Ther 3:507-515)、ＦＧＦシグナリングは、発生中の下垂体前葉における前駆細胞の増殖及びパターニングに必要であり(Norlin等(2000) Mechanisms of Development 96:175-182)、そしてＦＧＦ−８及びＦＧＦ−１７の調節された勾配は、正中小脳構造の増殖及び分化を調節する(Xu等(2000) Development 127:1833-1843)。
【００９４】
本発明の方法は、任意のＦＧＦファミリーメンバーを利用することができるが、様々なＦＧＦファミリーメンバーがクレームした方法において差次的効率を有することが予想される。我々は、ここに例示した分化方法論並びに分化前のｐｄｘ１＋細胞の拡大の方法の両方におけるＦＧＦファミリーメンバーの有用性を調べた。従って、本発明は、これらのＦＧＦファミリーメンバーの何れかの、本願で詳細に記載した拡大及び／又は分化の方法における利用を企図する。同様に、本発明は、ここに記載の拡大及び／又は分化の方法において、多数のＦＧＦファミリーメンバーが利用される具体例を企図する(例えば、２種以上のＦＧＦファミリーメンバーを、これらの細胞のインスリン＋、グルコース応答性細胞への分化における特定のステップで利用する)。加えて、本発明は、特定の細胞の培養又はクラスターの拡大及び分化の両方において一種以上のＦＧＦファミリーメンバーを利用する具体例を企図するが、両方法は、同じＦＧＦファミリーメンバーを利用することを要しない。
【００９５】
好適なＦＧＦポリペプチドは、脊椎動物のＦＧＦポリペプチドと少なくとも６０％同一の、一層好ましくは７０％同一の、最も好ましくは８０％同一のアミノ酸配列又は生物活性を有するこれらの断片を含み核酸によりコードされる。脊椎動物のＦＧＦポリペプチドと少なくとも約８５％、一層好ましくは少なくとも約９０％又は９５％、最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％同一のポリペプチド、又は生物活性を有するこれらの断片をコードする核酸も又、この発明の範囲内にある。ＦＧＦの生物活性を有する断片は、(ａ)ＦＧＦレセプターに結合する能力によって容易に同定することができる(現在、４つの同定された哺乳動物ＦＧＦレセプターがある)。
【００９６】
機能分析は、ＦＧＦ−８／１７／１８がＦＧＦファミリー内にサブグループを構成することを示唆している(Reifers等(2000) Mechanisms of Development 99:39-49)。他の具体例において、好適なＦＧＦポリペプチドは、核酸によってコードされ、脊椎動物のＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７又はＦＧＦ−１８ポリペプチド、又は生物活性を有するこれらの断片と少なくとも６０％同一の、一層好ましくは７０％同一の、最も好ましくは８０％同一のアミノ酸配列を含む。脊椎動物のＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７又はＦＧＦ−１８ポリペプチドと少なくとも約８５％、一層好ましくは少なくとも約９０％又は９５％、最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％同一のポリペプチド、又は生物活性を有するこれらの断片をコードする核酸も又、この発明の範囲内にある。ＦＧＦの生物活性を有する断片は、(ａ)ＦＧＦレセプターに結合する能力によって容易に同定することができる(現在、４つの同定された哺乳動物ＦＧＦレセプターがある)。
【００９７】
加えて、最近の証拠は、ＦＧＦ−７が、膵臓前駆細胞の刺激において特に有用であることを示唆している(Elghazi等、PNAS 99:3884-3889)。従って、他の具体例において、本発明は、ＦＧＦ−７と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一の又は同一のＦＧＦポリペプチドが本発明の方法において有用でありうることを企図している。
【００９８】
任意のＦＧＦファミリーメンバーをこの発明の方法の実施に利用することができるが、ＦＧＦ−１８が、これらの方法における好適な活性を有する優れた候補であることを示唆する証拠がある。ＦＧＦ−１８は肝臓及び膵臓で発現され、マウスにおけるＦＧＦ−１８の異所的発現は、様々な組織において増殖を誘導する。特に、ＦＧＦ−１８の発現は、肝臓及び小腸において有意の増殖を誘導した(Hu等(1998) Molecular and Cellular Biology 18:6063-6074)。それにもかかわらず、多くのＦＧＦファミリーメンバーの重複する機能を仮定すれば、本発明は、多くのＦＧＦファミリーメンバーの何れかの又はファミリーメンバーの組合せの、インスリン−細胞及び細胞球の発現又はインスリン＋、グルコース応答性細胞及び島様構造への分化における利用を企図する。
【００９９】
ヘッジホッグファミリーメンバー：シグナリング分子のヘッジホッグファミリーのメンバーは、無脊椎動物及び脊椎動物の発生における多くの重要な短距離及び遠距離のパターニング過程を媒介する。ハエにおいて、単一のヘッジホッグ遺伝子は、体節及び成虫盤のパターニングを調節する。対照的に、脊椎動物においては、ヘッジホッグ遺伝子ファミリーは、左右非対称性、ＣＮＳの極性、体節及び肢、器官形成、軟骨形成及び精子形成の制御に関与する。
【０１００】
ヘッジホッグ遺伝子の脊椎動物のファミリーは、少なくとも４つのメンバー(例えば、単一のキイロショウジョウバエヘッジホッグ遺伝子のパラログ)を含む。典型的なヘッジホッグ遺伝子及びタンパク質は、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５６及びＷＯ９６／１７９２４に記載されている。これらのメンバーの内の３つは、ここではデザートヘッジホッグ(Ｄｈｈ)、ソニックヘッジホッグ(Ｓｈｈ)及びインディアンヘッジホッグ(Ｉｈｈ)と呼ぶが、明らかに、魚類、鳥類及び哺乳類を含むすべての脊椎動物に存在している。第四のメンバーは、ここではティギーウィンクルヘッジホッグ(Ｔｈｈ)と呼ぶが、魚類に特異的であるようである。デザートヘッジホッグ(Ｄｈｈ)は、マウスの胚発生及び成体のゲッ歯類及びヒトにおいては、主として精巣で発現され；インディアンヘッジホッグ(Ｉｈｈ)は、胚形成及び成体の骨形成において、骨の発生に関与し；そして、Ｓｈｈは、上記のように、主として、形態形成及び神経誘導活動に関与している。正常発生におけるこれらのヘッジホッグファミリーメンバーにより遂行される種々の役割にもかかわらず、それらは、すべて、同じ機能を実施することができる。Pathiとその同僚による最近の研究は、ソニックヘッジホッグ、デザートヘッジホッグ及びインディアンヘッジホッグが、すべて、レセプターパッチトに同じ速度論で結合することを示している。加えて、これらの３つのヘッジホッグファミリーメンバーは、細胞及び組織ベースのアッセイの範囲内で潜在力は異なるが、細胞の運命と振る舞いに、同じ仕方で影響を与える(Pathi等(2001) Mechanisms of Development 106:107-117)。
【０１０１】
本発明の方法は、細胞をヘッジホッグポリペプチドと接触させることを含む工程を採用する。如何なる特定の理論に縛られることも望まないが、細胞をヘッジホッグポリペプチドに接触させることの結果は、それらの細胞におけるヘッジホッグシグナリングを活性化させ、そうして、細胞の成長、増殖、パターニング、分化及び／又は生存に影響を与えることであろう。好適なヘッジホッグポリペプチドは、脊椎動物のヘッジホッグポリペプチド又はその生物活性を有する断片と少なくとも６０％同一の、一層好ましくは７０％同一の、最も好ましくは８０％同一のアミノ酸配列を含み核酸によりコードされる。脊椎動物ヘッジホッグポリペプチド又は生物活性を有するその断片と少なくとも約８５％、一層好ましくは少なくとも約９０％又は９５％、最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％同一なポリペプチドをコードする核酸も又、この発明の範囲内にある。ヘッジホッグの生物活性を有する断片は、(ａ)ヘッジホッグレセプターのパッチトに結合する能力、(ｂ)ヘッジホッグシグナル変換を活性化する能力(例えば、ヘッジホッグ標的遺伝子の転写により評価することができる)によって容易に同定することができる。主題の方法における利用に特に好適なヘッジホッグ核酸及びポリペプチドは、ヒトソニック、ヒトデザート又はヒトインディアンヘッジホッグと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％同一であり又は９５％を超えて同一である。ヘッジホッグポリペプチド又はその活性な断片は、例えば、一つ以上の疎水性部分を含むように改変することができる(Pepinsky等(1998) Journal of Biological Chemistry 273:14037-45；Porter等(1996) Science 274:255-9)。
【０１０２】
加えて、当業者は、細胞をヘッジホッグポリペプチドと接触させる機能がヘッジホッグシグナリングを刺激するならば、これが細胞を他のヘッジホッグ治療剤(即ち、ヘッジホッグアゴニスト)と接触させることによっても達成されうることを認めるであろう。かかるヘッジホッグ治療剤は、ヘッジホッグシグナリングを、ヘッジホッグシグナリング経路にその経路の何れかの点で影響を与えることにより刺激することができる。当業者は、かかるヘッジホッグ治療剤には、ヘッジホッグシグナリングをヘッジホッグ経路の何れかの点で作用することにより刺激する核酸、ポリペプチド、及び小分子が含まれることを認めるであろう。典型的なヘッジホッグ治療剤には、パッチトに結合してヘッジホッグ媒介のシグナリングを刺激する小分子及びパッチトの下流のヘッジホッグシグナリングを刺激し、そうしてヘッジホッグシグナリングのパッチト媒介の抑制を解放する必要をバイパスする小分子が含まれる。本発明の方法は、細胞をヘッジホッグポリペプチド及び少なくとも一種のヘッジホッグ治療剤と接触させ、又は細胞を少なくとも一種のヘッジホッグ治療剤と接触させる(ヘッジホッグポリペプチドの非存在下で)ことを含む。
【０１０３】
フィーダー層：本発明の面において、この方法は、球を粘着性下層上で培養する工程を含む。特定の理論に縛られることは望まないが、この下層は、誘導因子を分泌し、そうして高い局所濃度の特定の因子を送達することができる。この下層は又、所望の前駆細胞の更なる精製をも与えるようである。これらの球の下層上での培養中に、細胞は、球から出て下層に付着することが認められる。そうして、これらの球の粘着性下層上での培養工程は、誘導シグナルを与えることができ並びに所望の細胞を更に富化させる手段を提供することができる。
【０１０４】
多くの種類の粘着性マトリクス／下層を利用することができる。一具体例において、これらの球は、マトリゲル層上で培養される。マトリゲル(Collaborative Research, Inc., マサチューセッツ、Bedford在)は、マトリクスと、マウス基底膜タンパク質の抽出物として得られた結合材料との複雑な混合物であり、主として、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、及びニドゲン及びエンタクチンよりなり、ＥＨＳ腫瘍から調製される(Kleinman等(1986) Biochemistry 25:312-318)。他のかかるマトリクス例えばＨｕｍａｔｒｉｘを用意することができる。同様に、天然の及び組換えにより処理した細胞を、即時的培養にフィーダー層として用意することができる。
【０１０５】
他の具体例において、これらの培養容器は、少なくとも一種の細胞外マトリクスタンパク質(フィブロネクチン、スーパーフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、及びヘパリン硫酸プロテオグリカンを含むが、これらに限られない)で被覆される。
【０１０６】
ｃＡＭＰ上昇剤：ここに詳細に記載したように、我々は、本発明の拡大及び／又は分化方法におけるｃＡＭＰ上昇剤の利用の有用性を試験した。ある具体例において、その培養物を、ｃＡＭＰ上昇剤フォルスコリンと接触させる。同様に、他の具体例において、この培養物を、少なくとも一種のｃＡＭＰ上昇剤例えば８−(４−クロロフェニルチオ)−アデノシン−３’:５’−環状一リン酸(ＣＰＴ−ｃＡＭＰ)(例えば、Koike(1992) Prog.Neuro-Psychopharmacol.and Biol.Psychiat 16:95-106参照)、ＣＰＴ−ｃＡＭＰ、フォルスコリン、Ｎａ−ブチレート、イソブチルメチルキサンチン(ＩＢＭＸ)、コレラ毒素(Martin等(1992) J.Neurobiol 23:1205-1220参照)、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃＡＭＰ及びジオクタノイル−ｃＡＭＰ(例えば、Rydel等(1988) PNAS 85:1257参照)と接触させる。
【０１０７】
以下に更に詳しく記載したように、主題の方法は、環状ＡＭＰ(ｃＡＭＰ)アゴニストを利用して実施することができるということが企図される。更に別の具体例において、この発明は、ｃＡＭＰアゴニストの、膵臓組織を移植された患者並びに膵臓の能力特にグルコース依存性インスリン分泌の能力を改善する必要のある患者へのイン・ビボ投与を企図する。
【０１０８】
本願の開示に照らして、当業者には、ｃＡＭＰ依存性の活性をアップレギュレートする様々な異なる小分子を、例えば、日常的な薬物スクリーニングアッセイによって、容易に同定することができるということは明らかであろう。例えば、主題の方法は、アデニレートシクラーゼを活性化しうる化合物{フォルスコリン(ＦＫ)、コレラ毒素(ＣＴ)、百日咳毒素(ＰＴ)、プロスタグランジン(例えば、ＰＧＥ−１及びＰＧＥ−２)、コルフォルシン及びβ−アドレナリン作動性レセプターアゴニストを含む}を利用して実施することができる。β−アドレナリンレセプターアゴニスト(ここでは、ときとして「β−アドレナリン作動性アゴニスト」と呼ぶ)には、アルブテロール、バムブテロール、ビトルテロール、カルブテロール、クレンブテロール、クロルプレナリン、デノパミン、ジオキセテドリン、ドペクサミン、エフェドリン、エピネフリン、エタフェドリン、エチルノルエピネフリン、フェノテロール、フォルモテロール、ヘキソプレナリン、イボパミン、イソエタリン、イソプロテレノール、マブテロール、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、オキシフェドリン、ピルブテロール、プレナルテロール、プロカテロール、プロトキロール、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、ソテレノール、サルメテロール、テルブタリン、トレトキノール、ツロブテロール及びキサモテロールが含まれる。
【０１０９】
ｃＡＭＰホスホジエステラーゼを阻害し、それによりｃＡＭＰの半減期を増大させうる化合物も又、主題の方法において有用である。かかる化合物には、アムリノン、ミルリノン、キサンチン、メチルキサンチン、アナグレリド、シロスタミド、メドリノン、インドリダン、ロリプラム、３−イソブチル−１−メチルキサンチン(ＩＢＭＸ)、ケレリトリン、シロスタゾール、グルココルチコイド、グリセオール酸、エタゾレート、カフェイン、インドメタシン、テオフィリン、パパベリン、メチルイソブチルキサンチン(ＭＩＸ)、及びフェノキサミンが含まれる。
【０１１０】
ｃＡＭＰのある種の類似体例えばｃＡＭＰのアゴニストも又、利用することができる。本発明の方法において有用でありうる典型的なｃＡＭＰ類似体には、ジブチリル−ｃＡＭＰ(ｄｂ−ｃＡＭＰ)、(８−(４)−クロロフェニルチオ)−ｃＡＭＰ(ｃｐｔ−ｃＡＭＰ)、８−[(４−ブロモ−２，３−ジオキソブチル)チオ]−ｃＡＭＰ、２−[(４−ブロモ−２，３−ジオキソブチル)チオ]−ｃＡＭＰ、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジオクタノイル−ｃＡＭＰ、Ｓｐ−アデノシン３’，５’−環状ホスホロチオエート、８−ピペリジノ−ｃＡＭＰ、Ｎ6−フェニル−ｃＡＭＰ、８−メチルアミノ−ｃＡＭＰ、８−(６−アミノヘキシル)アミノ−ｃＡＭＰ、２’−デオキシ−ｃＡＭＰ、Ｎ6，２’−Ｏ−ジブチリル−ｃＡＭＰ、Ｎ6，２’−Ｏ−ジスクシニル−ｃＡＭＰ、Ｎ6−モノブチリル−ｃＡＭＰ、２’−Ｏ−モノブチリル−ｃＡＭＰ、２’−Ｏ−モノブチリル−８−ブロモ−ｃＡＭＰ、Ｎ6−モノブチリル−２’−デオキシ−ｃＡＭＰ、及び２’−Ｏ−モノスクシニル−ｃＡＭＰが含まれる。
【０１１１】
上に列記した主題の発明で有用な化合物は、改変して、該化合物の生物学的利用能、活性、又は他の薬理学的に関連する性質を増大させることができる。例えば、フォルスコリンは、下記式を有する：
【化１】
2005534345.tif 000002
フォルスコリンを所望の生物学的活性をひどく弱めることなくその親水性を増大させることが見出されているフォルスコリンの改変には、Ｃ６及び／又はＣ７のヒドロキシルの、親水性アシル基によるアシル化(アセチル基の除去後)が含まれる。Ｃ６が親水性アシル基によりアシル化された化合物において、Ｃ７は、適宜、脱アシル化することができる。適当な親水性アシル基には、構造−(ＣＯ)(ＣＨ2)nＸ{式中、ＸはＯＨ又はＮＲ2であり；Ｒは水素、Ｃ1〜Ｃ4アルキル基又は２つのＲは一緒に３〜８原子(好ましくは、５〜７原子)を含む環を形成し、該環はヘテロ原子を含むことができ(例えば、ピペラジン又はモルホリン環)；そしてｎは１〜６の、好ましくは１〜４の、尚一層好ましくは１〜２の整数である}を有する基が含まれる。他の適当な親水性アシル基には、親水性アミノ酸又はその誘導体例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン等が含まれる(ヘテロ環式側鎖を有するアミノ酸を含む)。当業者に公知の他の可能な親水性アシル側鎖により改変されたフォルスコリン又は上記の他の化合物は、容易に合成して、本発明の方法において活性を試験することができる。
【０１１２】
同様に、上に列記した任意の化合物の変異体又は誘導体は、主題の方法において、ｃＡＭＰアゴニストとして有効でありうる。当業者は、かかる誘導体を容易に合成して、適当な活性について試験することができよう。
【０１１３】
ある具体例において、２種以上の上記のｃＡＭＰアゴニスト(好ましくは、異なる種類)を投与することは、有利でありうる。例えば、アデニレートシクラーゼのアゴニストをｃＡＭＰホスホジエステラーゼアンタゴニストと共に利用することは、有利な又は相乗的な効果を有しうる。
【０１１４】
本発明は、これらのｃＡＭＰ上昇剤の何れかを、本願で詳細に記載した拡大及び／又は分化の方法において利用することを企図している。同様に、本発明は、ここに記載した拡大及び／又は分化の方法において、多数のｃＡＭＰ上昇剤を利用する具体例を企図している(例えば、２種以上のｃＡＭＰ上昇剤を、これらの細胞のインスリン＋、グルコース応答性細胞への分化の特定の工程で利用する)。加えて、本発明は、少なくとも一種のｃＡＭＰ上昇剤を、特定の細胞の培養又はクラスターの拡大及び分化の両方で利用する具体例(両方法が、同じｃＡＭＰ上昇剤を利用する必要はない)を企図している。
【０１１５】
コルチコステロイド：本発明の方法は、コルチコステロイドと呼ばれるステロイドのサブクラスのメンバーが、Ｐｄｘ１＋細胞を形成するように分化することのできるインスリン−細胞の非粘着性クラスター内の細胞数の拡大において(即ち、拡大法において)有用であることを企図している。用語ステロイドは、水素化されたシクロペンタノ−ペルヒドロフェナントレン環系を含む脂質の任意の群を指す。ステロイドの典型的なクラスは、副腎皮質ホルモン(コルチコステロイドとしても知られる)、生殖腺ホルモン、強心アグリコン、胆汁酸、ステロール(例えば、コレステロール)、ガマ毒、及びサポニンを包含する。
【０１１６】
コルチコステロイドは、下垂体により放出された副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)に応答して、副腎皮質により内因的に合成された任意の２１炭素ステロイド(副腎起源の性ホルモンを除く)を包含する。コルチコステロイドは、典型的には、それらの主要な生物学的活性に基づいて、糖質コルチコイドと鉱質コルチコイドに細分される。一般に、糖質コルチコイドは、脂肪、炭水化物及びタンパク質代謝に影響するが、鉱質コルチコイドは、電解質と水のバランスに影響する。しかしながら、これらの分類は、絶対的なものではなく、幾つかのコルチコステロイドは、両方の型の活性を示す。典型的なコルチコステロイドには、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、及びベタメタゾンが含まれるが、これらに限られない。
【０１１７】
コルチコステロイドは、臨床状況において、下垂体前葉によるＡＣＴＨ分泌の抑制のために、ホルモン置換療法のために、抗新生物薬として、抗アレルギー薬として、抗炎症剤として、及び免疫抑制剤として用いられてきた。
【０１１８】
本発明は、これらの任意のコルチコステロイドを、本願で詳細に記載した拡大の方法において利用することを企図している。同様に、本発明は、多数のコルチコステロイドを利用する(例えば、２種以上のコルチコステロイドを、これらの細胞の拡大の特定の工程において利用する)具体例を企図している。多数のコルチコステロイドを利用する場合には、この発明は、それらの同じ又は異なる時点での投与を企図する。加えて、本発明は、を企図する。少なくとも一種のコルチコステロイドを、拡大プロトコール中の多数の時点で投与することができる。理論には縛られないが、当業者は、更なるコルチコステロイドを拡大培地に、コルチコステロイドの濃縮を促進し又はコルチコステロイドの特定の濃度を培養期間中維持するために加えることを希望することができる。この経時的に培養培地を促進又は回復させる考えは、細胞培養の分野で周知であり、多くのタンパク質及び小分子の有限の半減期を仮定すれば、しばしば、必要である。従って、本発明は、本発明の方法において培養培地を補うために用いられる任意特定のタンパク質又は非タンパク質薬剤の最初の添加後に、その薬剤を培養培地に再添加する具体例を企図する。
【０１１９】
細胞クラスターを分離するための改良された方法：本発明の方法により、細胞を、非粘着性クラスターとして一定期間培養し、次いで、分離してプレートする。理論においては細胞クラスターを多くの方法の何れかを利用して分離することができるが、これらの方法の多くは、比較的苛酷であり、細胞及び／又は細胞表面上のレセプターにダメージを生じうるものであり、これらの細胞の健康及び将来の増殖及び分化能を危険にさらすものである。従って、本発明は、従来技術を超える相当な改良を、細胞のクラスターを、それらの細胞の増殖及び分化能を保存して分離する方法を提供することにより提供する。
【０１２０】
理論に縛られはしないが、我々は、プロテアーゼＸＸＩＩＩが、効果的に、細胞クラスターを、それらの細胞の健康を危険にさらすことなく分離することを発見した。プロテアーゼＸＸＩＩＩは又、当分野において、プロテイナーゼＸＸＩＩＩ型又はプロテアーゼＭアマノとしても知られており、最初に、アスペルギルス・オリゼーから精製された。それは、Sigma社(www.sigmaaldrich.com) から購入可能であり、我々は、用語プロテイナーゼＸＸＩＩＩ型、プロテアーゼＸＸＩＩＩ、及びプロテアーゼＭアマノを、この酵素を指すために交換可能に使用する。市販の酵素の一単位は、ｐＨ７．５で、３７℃で、カゼインを加水分解して、毎分、１．０μモルのトリプシンに等しい色を生成する量として定義される。本発明は、更に、細胞クラスターを、プロテアーゼＸＸＩＩＩと実質的に同じ基質特異性と活性を有する酵素を用いて分離する方法を企図する。
【０１２１】
本発明の方法は、プロテアーゼＸＸＩＩＩが、幹細胞のクラスターを含む(これに限定されない)細胞のクラスターを分離するために利用できることを企図する。一具体例において、幹細胞のクラスターは、胚性幹細胞、胎児幹細胞、及び成体幹細胞の何れかから選択することができる。成体幹細胞は、神経幹細胞、神経冠幹細胞、膵臓幹細胞、皮膚由来幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、内皮幹細胞、造血幹細胞及び間充織幹細胞の何れかから選択することができる。その上、成体幹細胞は、任意の成体組織から分離することができる。更に別の具体例においては、幹細胞は、脳、脊髄、上皮、真皮、膵臓、肝臓、胃、小腸、大腸、直腸、腎臓、膀胱、食道、肺、心筋、骨格筋、内皮、血液、脈管構造、軟骨、骨、骨髄、子宮、舌、及び嗅上皮の何れかから選択する成体組織から分離される。
【０１２２】
拡大方法：本発明は、インスリン＋、グルコース応答性細胞に分化することのできる細胞のクラスター中の細胞数を拡大する(例えば、増大させる)方法を提供する。従って、本願に詳細に記載した多段階分化方法が、インスリン＋、グルコース応答性細胞と、内因性島において見出されるのと一致する細胞組織化を含む島様構造の両方の生成を生じても、ここに概説した拡大方法論は、この過程の効率を増大させるために利用することができる。理論に縛られはしないが、インスリン＋、グルコース応答性細胞に分化することのできるインスリン−細胞の培養又は球内の細胞数を拡大させることにより、この拡大方法は、所定のインスリン−細胞の初期培養からインスリン＋、グルコース応答性細胞の数を増大させるための多段階分化方法と組み合せて利用することができる。
【０１２３】
しかしながら、更に、本発明は、拡大方法単独の利用を企図する。この拡大方法は、インスリン＋、グルコース応答性細胞に分化することのできる細胞の培養又は球内の細胞数を増大させる。かかる拡大された細胞集団は、ｐｄｘ１を発現する細胞数の増加によってアッセイすることができる。未だインスリン＋、グルコース応答性細胞まで最終分化してなくても、これらの拡大された細胞培養又は球は、ｐｄｘ１＋細胞の最終分化(例えば、インスリン＋、グルコース応答性細胞への分化；グルカゴン＋細胞への分化；ソマトスタチン＋細胞への分化等)に影響を与えるのに有用な他の因子を同定するためのスクリーニングアッセイに利用することができる。その上、かかる偏向され、拡大された細胞又は細胞クラスターは、それら自体、治療剤の基礎を形成することができる。偏向された細胞又は細胞クラスターは、必要とするヒト又は動物患者(例えば、糖尿病患者)にイン・ビボで移植することができる。移植後に、これらの偏向した細胞は、局所的なイン・ビボのシグナルに応答して、インスリン＋、グルコース応答性細胞に分化することができよう。この拡大方法が、インスリン＋、グルコース応答性細胞へ分化することのできる細胞の集団を増大させるように機能するように見えるならば、かかる偏向した細胞は、一層容易にイン・ビボ因子及びイン・ビボ微小環境によって影響されえて、効率的な細胞治療を提供しうるであろう。
【０１２４】
実施例で詳述するように、これらの拡大方法は、細胞クラスターをある種の因子を補った培地中で培養することを含む。加えて、この方法は、酸パルスを利用する。酸パルスとは、細胞を酸性培地中で少なくとも１分間培養することを意味する。理論には縛られないが、当業者は、最初、本発明の方法で詳述するように、細胞を酸性培地にさらすことが、それらの増殖及び／又は分化能に有害であると考えるであろう。しかしながら、我々は、今や、かかる酸性パルスが、インスリン＋、グルコース応答性細胞へ分化することのできる細胞の拡大を促進するということを示す。この酸パルスは、細胞をプライムして、それらの、細胞培養又は球内のｐｄｘ１＋細胞の集団を拡大させる因子に対する応答性を促進することを助成することができる。この酸パルスのプライム又は偏向性の影響を媒介する機構は未知であるが、一つの可能性は、この酸パルスが、細胞クラスター内の細胞の同期化を促進し、そうして細胞周期のＳ期に入る細胞の数を増大させることを助成するということである。この方法において、培養中の一層大きい割合の細胞が、培養中のｐｄｘ１＋細胞を拡大する因子に応答することができる。ｐｄｘ１＋細胞の拡大の促進における酸性パルスの有用性を支配する下にある機構にかかわらず、実施例に概説した実験は、かかる有用性を示している。これは、培養における細胞に対する酸性条件の悪影響に関する当分野の如何なる一般的見解にも意地悪である。従って、本発明は、細胞をプライムし、そうして、細胞培養におけるｐｄｘ１発現の拡大を促進する因子に対するそれらの応答性を促進するために酸パルスを利用する方法を提供する。本発明は、更に、酸パルス及び他の酸性培養条件を、細胞培養におけるｐｄｘ１発現の拡大を促進する方法の部分として利用する方法を提供する。
【０１２５】
一具体例において、この酸パルスは、少なくとも１分間であるが、最長で数日間の酸パルスも企図される。酸パルスを用いるならば、その酸性媒質には、実施例６に概説したように、追加の因子を補うことができる。短い酸パルスを用いる場合には、その酸性媒質を補うことができる。しかしながら、我々は、更に、これらの媒質を酸性媒質から中性媒質に換えるならば、この中性媒質も又、追加の因子を補うことができるということに注意する。従って、実施例６に詳述した特定の具体例は、これらの細胞の酸性媒質中での連続培養を含み、該媒質にはその後追加の因子を補うが、この発明は、更に、酸性ショックの利用(追加の因子の存在下又は非存在下で)とその後のこれらの細胞の中性ｐＨへのトランスファー及びその後の拡大因子(例えば、フォルスコリン、ＦＧＦ等)の補足を企図する。
【０１２６】
ここに詳述した拡大方法(その局面は、実施例で類型化されている)は、適宜、その拡大プロトコールの一つ以上のフェーズにおける、少なくとも一種の因子の培養培地への添加を包含する。多くの因子を、上で詳細に論じた。ｃＡＭＰ上昇剤、ＦＧＦ、及び／又はコルチコステロイドの少なくとも一つを利用する方法に加えて、本発明は、フォリスタチン(又は他のフォリスタチン関連因子)及び／又はエキセンジン−４(又は他のＧＬＰ−１アゴニスト)を、単独で又は実施例６で詳述した拡大因子の少なくとも一つと共に利用する拡大方法を企図する。
【０１２７】
フォリスタチンベースの因子
実施例で詳細に概説したように、本発明は、少なくとも一種のフォリスタチンベースの因子(以後、交換可能に、フォリスタチンベースの因子又はフォリスタチン関連因子と呼ぶ)の添加を利用する方法を企図する。
【０１２８】
フォリスタチンは、ニューロン及び上皮細胞のみならず、中胚葉及び内胚葉に由来する細胞をも含む多くの異なった細胞型の運命に影響を与えることのできる分泌タンパク質である。理論には縛られないが、フォリスタチンの機能は、少なくとも部分的に、アクチビン阻害活性によって媒介されると考えられる。フォリスタチンは、アクチビンタンパク質と物理的に相互作用することによってアクチビンを阻害する(Phillips及びde Kretser (1998) Front Neuroendocrinology 19: 287-322；Mather等(1997) Proc Soc Exp Biol Med 215: 209-222)。
【０１２９】
フォリスタチンのアクチビン阻害活性を有する他のタンパク質が同定されている。これらのフォリスタチンベースの因子の例には、フォリスタチン関連遺伝子タンパク質及びインヒビンが含まれる(Wankell等 (2001) Journal of Endocrinology 171: 385-395；Schneyer等(2001) Mol Cell Endocrinol 180: 33-38；Gaddy-Kurten等(2002) Endocrinology 143: 74-83)。従って、本発明の拡大方法は、フォリスタチンの拡大培地への添加だけでなく、少なくとも一種のフォリスタチンベースの因子の添加をも企図する。
【０１３０】
本発明は、本願で詳細に記載した拡大方法において、少なくとも一種のフォリスタチンベースの因子の利用を企図する。同様に、本発明は、多数のフォリスタチンベースの因子を利用する(例えば、２種以上のフォリスタチンベースの因子を、細胞の拡大中の特定の工程で利用する)具体例を企図する。多数のフォリスタチンベースの因子を利用する場合には、この発明は、それらの同じ又は異なる時点での投与を企図する。加えて、本発明は、少なくとも一種のフォリスタチンベースの因子を、拡大プロトコール中の多数の時点で投与することができることを企図する。理論には縛られないが、当業者は、フォリスタチンベースの因子の濃縮を促進し又はフォリスタチンベースの因子の特定の濃度を培養期間にわたって維持するために、追加のフォリスタチンベースの因子を拡大培地に加えることを希望することができる。この培養培地を経時的に促進し又は回復する考えは、細胞培養の分野で周知であり、多くのタンパク質と小分子の有限の半減期を仮定するならば、しばしば必要である。従って、本発明は、本発明の方法において培養培地を補うために用いる任意特定のタンパク質又は非タンパク質剤の最初の添加後に、該剤を培養培地に再添加する具体例を企図する。
【０１３１】
加えて、フォリスタチンベースの因子の潜在的用途は、ここに詳述した拡大方法論に限られない。本発明は、組織からの細胞の最初の分離における(例えば、膵臓又は他の管状組織からの細胞の最初の分離における)フォリスタチンベースの因子の添加を企図する。同様に、本発明は、細胞のインスリン＋、グルコース応答性細胞への分化におけるフォリスタチンベースの因子の添加を企図する。フォリスタチンベースの因子は、ここに記載の多段階分化プロトコールの任意の時点で利用することができ、かかる因子は又、分化過程の一段階より多くの段階で加えることもできる。加えて、この発明は、フォリスタチンベースの因子が細胞の拡大に用いられたかどうかにかかわらず、細胞を予め拡大したかどうかにもかかわらず、細胞のインスリン＋、グルコース応答性細胞への分化におけるフォリスタチンベースの因子の利用を企図する。その上、フォリスタチンベースの因子を細胞の拡大と分化の両方において利用する具体例において、この発明は、同じフォリスタチンベースの因子を両方法において利用する方法並びに、細胞の拡大のためと細胞の分化のためとで異なるフォリスタチンベースの因子を利用する具体例を企図する。
【０１３２】
ＧＬＰ−１アゴニスト
実施例で詳細に概説したように、本発明は、少なくとも一種のＧＬＰ−１アゴニストの添加を利用する方法を企図している。ＧＬＰ−１(グルカゴン様ペプチド−１)は、ＧＬＰ−１レセプターとの相互作用によってその作用を発揮する向インスリン性ホルモンである。エキセンジン−３、エキセンジン−４及びＧＬＰ−１類似体(これらは、安定性及びイン・ビボでの半減期を増すように改変されている)を含む幾つかのＧＬＰ−１アゴニストが同定されている(Thum等(2002) Exper Clin Endocrinol Diabetes 110:113-118；Aziz及びAnderson(2002) Journal of Nutrition 132:990-995；Tourrel等(2002) Diabetes 51:1443-1452；Egan等(2002) Journal of Clin Endocrinol Metab 87:1282-1290；Peters等(2001) Journal of Nutrition 131:2164-2170；Tourrel等(2001) Diabetes 50:1562-1570；Doyle及びEgan(2001) Recent Prog Horm Res 56:377-399)。
【０１３３】
従って、本発明の拡大方法は、エキセンジン−４の拡大培地への添加だけでなく、少なくとも一種のＧＬＰ−１類似体の添加をも企図している。
【０１３４】
本発明は、本願に詳細に記載した拡大方法における少なくとも一種のＧＬＰ−１類似体の利用を企図する。同様に、本発明は、多数のＧＬＰ−１類似体を利用する(例えば、２種以上のＧＬＰ−１類似体を細胞の拡大の特定の工程で利用する)具体例を企図する。多数のＧＬＰ−１類似体を利用する場合には、この発明は、それらの同時の又は異なる時点での投与を企図する。加えて、本発明は、少なくとも一種のＧＬＰ−１類似体を、拡大プロトコールの多数の時点で投与することができることを企図する。理論には縛られないが、当業者は、ＧＬＰ−１類似体の濃縮を促進し又はＧＬＰ−１類似体の特定の濃度を培養期間にわたって維持するために、追加のＧＬＰ−１類似体を拡大培地に添加することを希望することができる。この培養培地を経時的に促進し又は回復させる考えは、細胞培養の分野において周知であり、多くのタンパク質及び小分子の有限の半減期を仮定するならば、しばしば必要である。従って、本発明は、本発明の方法において、培養培地を補うために用いる任意特定のタンパク質又は非タンパク質剤の最初の添加後に、該剤を培養培地に再添加する具体例を企図する。
【０１３５】
加えて、ＧＬＰ−１類似体の潜在的利用は、ここに詳細に記載した拡大方法論に限られない。本発明は、組織からの細胞の最初の分離における(例えば、膵臓又は他の管状組織からの細胞の最初の分離における)ＧＬＰ−１類似体の添加を企図する。同様に、本発明は、細胞のインスリン＋、グルコース応答性細胞への分化におけるＧＬＰ−１類似体の添加を、ここに記載の多段階分化プロトコールの任意の時点で利用できること及びかかる因子を、分化過程の一段階より多くの段階で添加することができることを企図する。加えて、この発明は、ＧＬＰ−１類似体を細胞の拡大において利用したかどうかによらず且つ細胞を予め拡大させたかどうかにもよらずに、細胞のインスリン＋、グルコース応答性細胞への分化におけるＧＬＰ−１類似体の利用を企図する。その上、細胞の拡大と分化の両方においてＧＬＰ−１類似体を利用する具体例において、この発明は、同じＧＬＰ−１類似体を利用する方法並びに、細胞の拡大とそれらの分化とで異なるＧＬＰ−１類似体を利用する具体例を企図する。
【０１３６】
(iii)治療方法
本発明は又、膵臓の機能不全と関係する様々な異常の治療のために利用することのできる実質的に純粋なグルコース応答性、インスリン＋細胞をも提供する。この発明は更に、実質的に純粋な島様構造を提供し、この島様構造は、膵臓の機能不全と関係する様々な異常の治療のために利用することのできる実質的に純粋なインスリン＋、グルコース応答性細胞を含む。
【０１３７】
説明のために、主題の島様構造は、様々な膵臓疾患(外分泌及び内分泌の両方)の治療又は予防に利用することができる。例えば、これらの島様構造は、部分的膵切除術(例えば、膵臓の一部の摘出)後に移植することができる。同様に、かかる細胞集団は、膵臓組織崩壊(例えば、膵臓炎等の膵臓組織の破壊、酵素の基質への漏出により引き起こされた膵臓組織の自己消化による病気)のために失われた膵臓組織を生成し又は置換するために利用することができる。この発明の方法を利用して生成されたこれらの島様構想は、内因性の膵臓で見出されるのと一致する細胞型の比率を有するので、又、それらの細胞型は、互いに適当に配向している(即ち、ソマトスタチン＋で且つグルカゴン＋の細胞が島の周囲で見出される)ので、それらが、膵臓の全体又は一部分に影響する異常に対して十分な治療を与えることは、ありそうなことである。
【０１３８】
真性糖尿病の両方の型における治療の主な目的は、同じであり、即ち、血中グルコースレベルをできるだけ正常近くまで下げることである。１型糖尿病の治療は、置換量のインスリンの投与を含む。対照的に、２型糖尿病の治療は、しばしば、インスリンの投与を必要としない。例えば、２型糖尿病の初期の治療は、経口血糖降下薬例えばスルホニル尿素を用いる治療により増強された食事及び生活スタイルの変更に基づくものであってよい。しかしながら、特にこの病気の後期ステージでは、島消耗から起こりうるこの病気の合併症を最少にする試みにおける低血糖の制御を生成するために、インスリン療法が必要でありうる。
【０１３９】
一層最近、ティシューエンジニアリングの治療へのアプローチは、通常、免疫の拒絶を回避するために膜に封入された健康な膵島の移植に集中してきた。３つの一般的アプローチが、動物モデルにおいて試験された。最初のテストにおいては、管状の膜が島を含むハウジングにおいて渦巻き状に巻かれる。この膜は、ポリマアグラフに繋がれ、それは、更に、デバイスを血管に繋ぐ。膜を通って前後へのグルコース及びインスリンの自由拡散を可能にし、しかも抗体及びリンパ球の通過はブロックするための膜透過性の操作により、正常血糖が、このデバイスで処置された膵切除された動物において維持された(Sullivan等(1991) Science 252:718)。
【０１４０】
第二のアプローチにおいては、島細胞を含む中空繊維を、多糖アルギネート中に固定化した。このデバイスを糖尿病の動物の腹腔内に置いた場合に、血中グルコースレベルが低下し、良好な組織適合性が認められた(Lacey等(1991) Science 254:1782)。
【０１４１】
この発明のこれらの島様構造及び／又は分化したインスリン＋、グルコース応答性細胞は、何れかの型の糖尿病のための優れた潜在的治療選択肢に相当する。治療上有効量のこの発明の島様構造を、適当なグルコース応答性を改善するために必要な患者に移植することができる。これらの島様構造は、容易に患者に移植することができ、又は上で概説した方法の何れかを利用して移植することができ、該方法は、移植された組織の効力を改善するのを助成することができる。その上、この発明は、島様構造及び／又は分化した細胞の移植を、他の治療と組合せることができることを企図する。例えば、移植は、外因性インスリンの投与により補うことができる。その上、１型糖尿病の病因論における自己免疫の重要な役割を仮定すれば、移植は、免疫抑制剤の投与によって補うことができる。
【０１４２】
上述の何れかの病気の治療において、投薬量(即ち、島様構造の治療上有効な量を構成するもの)は、様々な因子に依って、患者ごとに異なると予想される。選択される投薬量レベルは、治療すべき特定の病気、特定の移植物と共に用いられる他の薬物、化合物及び／又は物質、患者の病気の重さ、患者の年齢、性別、体重、一般的健康及び病歴を含む様々な因子及び同様の医療分野で周知の因子に依存する。
【０１４３】
通常の知識を有する医師又は獣医師は、容易に、必要な治療用組成物の有効量を決定して規定することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるより低いレベルで治療用組成物において用いられるこの発明の化合物の投与量で開始して、徐々にその投薬量を、所望の効果が達成されるまで増大させることができよう。
【０１４４】
一般に、この発明の化合物の適当な日々の投与量は、治療効果を生じるのに有効な最低の投与量である化合物の量である。かかる有効投与量は、一般に、患者の年齢、性別、及び傷害又は病気の重さを含む因子に依存する。
【０１４５】
本発明の場合には、医薬組成物は、本発明の方法により分化されたインスリン＋、グルコース応答性細胞及び少なくとも一種の製薬上許容しうるキャリアー又は賦形剤を含む。上で概説したように、この医薬組成物は、全身投与、腹腔投与、直接的移植を含む(これらに限られない)多くの方法の何れかで投与することができ、その上、中空繊維、管状膜、シャント、又は他の生体適合性デバイス若しくは足場と結合させて投与することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、本発明の方法により分化したインスリン＋、グルコース応答性細胞を含む島様構造及び少なくとも一種の製薬上許容しうるキャリアー又は賦形剤を含むことができる。上で概説したように、この医薬組成物は、全身投与、腹腔内投与、直接的移植を含む多くの方法(これらに限られない)の何れかで投与することができ、その上、中空繊維、管状膜、シャント、又は他の生体適合性のデバイス若しくは足場と結合させて投与することができる。
【０１４６】
その上、本発明は、ｐｄｘ１＋細胞の割合を増大するように培養において拡大した細胞又は細胞クラスターの投与に基づく治療方法を企図する。かかる細胞は、膵臓細胞系統に沿って分化する能力を増強するように偏向されている。理論には縛られないが、かかる偏向された細胞は、イン・ビボで移植することができ、インスリン＋、グルコース応答性細胞並びに他の型の細胞(患者において必要とされる細胞型)を生じさせるイン・ビボ微小環境に一層容易に応答しうる。
【０１４７】
従って、本発明は、本発明の方法によってｐｄｘ１＋細胞の数を増強するように培養において拡大された細胞又は細胞クラスター及び少なくとも一種の製薬上許容しうるキャリアー又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。上で概説したように、この医薬組成物は、全身投与、腹腔内投与、直接的移植を含む(これらに限られない)多くの方法の何れかで投与することができ、その上、中空繊維、管状膜、シャント、又は他の生体適合性のデバイス若しくは足場に結合させて投与することができる。
【０１４８】
用語「治療」は、予防、治療及び治癒をも包含することを意図しており、そしてこの治療を受ける患者は、霊長類(特に、ヒト)、及び他の哺乳動物例えばウマ、ウシ、ブタ及びヒツジ；並びに一般に家禽及び愛玩動物を含む、治療の必要のある任意の動物である。
【０１４９】
典型的具体例
この発明は、今や、一般的に説明してあり、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう。これらの実施例は、単に、本発明のある面及び具体例の説明を目的とするものであり、この発明を制限することを意図するものではない。
【０１５０】
実施例１：精製された膵臓細胞の分離
本発明の方法の重要な段階は、組織からの細胞の精製である。我々は、管状組織から高度に精製された細胞集団を生じ、任意の管状又は細管組織から細胞を精製するために利用することのできる改良された方法を提供する。次の例において、細胞を膵管上皮から精製した。
【０１５１】
膵臓を成体ラットの脾臓及び腸から切り離して、外側脂肪及び膜様組織をその膵臓から除去した。その膵臓を切開して、マグネシウム及びカルシウムを含む１×ＨＢＳＳ培地中で２ｍｍ2の組織片にした。その組織を、氷冷１×ＨＢＳＳ中ですすいで、過剰の血液と脂肪組織を除去した。
【０１５２】
次いで、その組織を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して、培地を吸引して、該遠心分離した組織をリベラーゼ溶液(Roche)に移した。その組織をリベラーゼ溶液中で３７℃で１５分間、１８０ｒｐｍで震盪しつつインキュベートした。この工程の後に、約９０％の上清を、１０％ＢＳＡを含む円錐管に注いだ。残った組織片を、大豆トリプシンインヒビター(ＳＢＴＩ)を含む氷冷ＨＢＳＳですすぎ、この上清も、このＢＳＡ中に注いでから、新鮮な氷冷リベラーゼ溶液を残った組織に加えた。
【０１５３】
注いだ全上清を、５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去して、ペレットを、マグネシウム及びカルシウムを含む１００ｍＬのＨＢＳＳに再懸濁した。この工程を必要なだけ反復する。
【０１５４】
分離した管断片の容積を、マグネシウム及びカルシウムを含むＨＢＳＳで２２５ｍＬとし、ダンスＩ及びアプロチニンを加えて、これらの試料を、３７℃で２０分間インキュベートした。このインキュベーションの後に、これらの試料を、１５００ｒｍｐで、５分間遠心分離して、上清を吸引除去し、ペレットを、マグネシウム及びカルシウムを欠くＨＢＳＳに再懸濁させた。この工程を反復し、得られたペレットを、１．０６ｇ／ｍＬのパーコールに再懸濁させた。
【０１５５】
パーコール勾配を、１．０４、１．０３及び１．０２ｇ／ｍＬのパーコールを含むパーコール／ペレット懸濁液を層状に重ねることによって調製し、これらの試料を、１９７０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離後に、三層の見える細胞及び外分泌ペレットがあるはずである。
【０１５６】
この精製方法を利用して、我々は、実質的にインスリン＋細胞を含まない細胞集団を管状組織から分離した。我々は、これらの分離された細胞は、１％未満の夾雑インスリン＋細胞を含むと評価した。従って、これらの細胞は、免疫組織化学的にアッセイした場合に、インスリン−と特性表示することができる。その上、これらの細胞は、膵臓又はβ細胞の運命に沿った分化と一致する更なるマーカーであるｇｌｕｔ２について陰性である。これらの細胞は又、幾つかの他の幹細胞集団と典型的に相関するマーカーであるネスチンタンパク質についても陰性である。
【０１５７】
実施例２：精製されたヒト膵臓細胞の分離
ヒトの膵臓を、心臓が鼓動しているドナー(７〜３０歳)から収穫して、ウィスコンシン大学(ＵＷ)溶液中に最長で２４時間保存した。一つのヒト膵臓を、ＵＷ溶液から無菌的に取り出して、脂肪組織、脾臓及び腸を切り取った。この膵臓を、次いで、３〜４の等しい部分に切断し、冷組織ミンス用緩衝液(ＵＷ溶液＋０．２％ＢＳＡ＋０．６２５ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター)を含む無菌のディッシュに移した。これらの膵臓の部分を、一層小さい切片に切断して、円錐管に移して、１５００ｒｐｍで、４℃で５分間遠心分離した。上清の除去後に、この組織を、消化洗浄緩衝液(１×カルシウム／マグネシウムを含むハンクス平衡塩溶液＋０．１２５ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター)で洗って、再び遠心分離した。
【０１５８】
第二の遠心分離工程及び上清の除去の後に、これらの細胞を１０ｍｌのリベラーゼＨＩ酵素溶液に再懸濁させてから、更なる８０ｍｌのリベラーゼＨＩ酵素溶液を含む他のボトルに移した。この組織と９０ｍｌのリベラーゼＨＩ酵素溶液を含むボトルを３７℃で、水浴中で、最大振盪速度１８８サイクル／分でインキュベートした。最初に、この組織は、１５分間で消化された。この最初の消化の工程の後に、上清を、これらの管が分離される際に酵素活性を阻害するための８０ｍｌの１０％ＢＳＡを含む遠心管に注いだ(組織片は、元のボトルに残す)。残りの組織片をＳＢＴＩを含む氷冷ＨＢＳＳ緩衝液ですすぎ、この上清もＢＳＡ中に注ぎ、そして残りの組織片を、新鮮な氷冷リベラーゼＨＩ酵素中に再懸濁させた。上記の工程を、必要であれば、２〜１０回反復した。
【０１５９】
この注入した上清(消化した膵臓組織から遊離した管を含む)を、２０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離し、ペレットを、直ちに、４０ｍｌの懸濁用緩衝液(０．２％ＢＳＡ、１×カルシウム／マグシウム含有ハンクス平衡塩溶液＋０．１２５ｍｇ／ｍｌ大豆トリプシンインヒビター)＋ＤＮアーゼに再懸濁させて、室温で１０分間インキュベートした。ＤＮアーゼ処理後に、これらの管を、２０００ｒｍｐで、４℃で１０分間遠心分離して、ペレットを、氷冷１×カルシウム／マグネシウム含有ハンクス平衡塩溶液に穏やかに再懸濁させた。
【０１６０】
この管懸濁液を、ショ糖のクッションの上に層状に重ねて、２０００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離して、脂質と細胞残渣の除去を促進した。この上清の除去の後に、ペレットを、基本培地(２％Ｂ−２７、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、８ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２)に穏やかに再懸濁させてから、基本培地＋ＤＮアーゼを含む新しい管に移した。
【０１６１】
この時点で、この試料は、管を含み、その上、外分泌組織及び島を夾雑している。外分泌組織及び島はこれらの管より重いので、これらの試料は、この外分泌組織と島を２０分間室温で沈降させることにより重力によって更に精製される。その上清(管につき富化されている)を、新たな試験管に移して２０００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離した。この上清を別容器に移して、管を含むペレットを基本培地に再懸濁させた。
【０１６２】
実施例３：インスリン＋、島様構造を分化させるための改良された方法
管及び細管組織から分離されたインスリン−細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのｇｐ１３０アゴニストヒトカージオトロフィン−１を補った、８ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び２％ Ｂ−２７(基本培地)を含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で培養した。これらの細胞を、６〜７日間培養し、その間、それらは、非粘着性球を形成した。如何なる特定の理論に縛られることも希望しないが、カージオトロフィン−１又は他のｇｐ１３０アゴニストの存在は、培養培地に添加された外因性ＬＩＦがヒトの胚性幹細胞の増殖を促進するように見えるのと殆ど同じ生存因子として作用しうる。
【０１６３】
次の段階において、これらの球を、プロテアーゼＸＸＩＩＩ／ＥＤＴＡを利用して単一の細胞に分離して、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−１８、１００ｎｇ／ｍＬのソニックヘッジホッグ及び２μｇ／ｍＬのヘパリンを補った基本培地中で培養した。これらの細胞を６〜７日間培養し、この拡大期間にそれらは増殖して、非粘着性球を形成するように凝集する。如何なる特定の理論に縛られることも望まないが、ＦＧＦファミリーメンバーは、公知の有糸分裂促進特性を有する成長因子であり、ＦＧＦ−１８は、通常、肝臓及び膵臓で発現される。他のＦＧＦファミリーメンバーが、この方法において類似の結果を有するということはありそうなことであり、特に、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−１７等のＦＧＦ−１８に密接に関連しているＦＧＦファミリーメンバーが、この方法において同様に振る舞うということは、ありそうなことである。同様に、ヘッジホッグファミリーメンバーは、広範囲の細胞コンテキストにおいて成長及び増殖を促進することが知られており、様々なヘッジホッグファミリーメンバー(ソニック、デザート及びインディアン)は、様々な生化学的及び細胞アッセイにおいて同様に振る舞う(Thomas等(2000) Diabetes 49:2039-2047；Thomas等(2001) Endocrinology 142:1033-1040)。従って、ソニックヘッジホッグをここでは利用するが、我々は、他のヘッジホッグポリペプチドを用いても同様の結果を生じると考える。事実、ヘッジホッグポリペプチドは、ヘッジホッグシグナリング経路を活性化することにより作用するので、我々は、ヘッジホッグシグナリングを代行する他の剤を用いても類似の効果を得られると考える。かかるヘッジホッグアゴニストの例には、ヘッジホッグの効果をレセプターパッチトに結合することにより真似る小型有機分子、又はヘッジホッグシグナリングの下流の標的に作用する小型有機分子が含まれる。ヘパリンは、ＦＧＦファミリーメンバーの細胞膜への局在化を増大させると考えられる。
【０１６４】
次の工程において、これらの球を、幾つかの成長因子を補った基本培地で６〜７日間培養する。これらの実験において、この培地に、ＥＧＦ、ＦＧＦ−１８、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−α、ＶＥＧＦ、ソニックヘッジホッグ及びヘパリンを補足した。かかる成長因子のカクテルは、他者により利用されており、我々は、当業者であれば、これらの成長因子ファミリーに属する成長因子の組合せを、本発明における最適の利用のために、容易に選択することができると考える。このステージにおいて、これらの細胞は、インスリンの発現により測定して、膵臓細胞系統に沿った分化の徴候を示す。これらの球内の低いパーセンテージではあるが、かなりのパーセンテージの細胞が、インスリンを発現する(球内の細胞の約１０％)。
【０１６５】
次の工程において、これらの球を、被覆した組織培養用プラスチック上にプレートした。これらの細胞は、分離されず、プレートされなかったが、むしろ、これらの球がプレートされる。これらの実験において、この組織培養用プラスチックは、スーパーフィブロネクチン又はポリ−Ｌ−オルニチンで被覆された。我々は、これらの球内の細胞が、このマトリクスに付着して、該球から出て行くことを認める。如何なる特定の理論に縛られることも希望しないが、これは、この球内で膵臓細胞系統に沿って分化する細胞を富化させることを助成することができる。これらの球を４〜５日間、１〜５％の血清、ＰＹＹ、ＨＧＦ及びフォルスコリンを補った比較的高濃度(１１．１ｍＭ)のグルコースを含むＲＰＭＩ培地中で培養した。
【０１６６】
当業者は、フォルスコリンがｃＡＭＰ上昇剤であることを認めるであろう。我々は、広範囲のｃＡＭＰ上昇剤を、本発明の方法において利用することができる(単独でも、組み合せても)と考える。
【０１６７】
最終段階において、この培地を除去して、これらの球を４〜５日間、比較的低濃度のグルコース(５ｍＭ)を含み、１〜５％の血清、エキセンジン−４、レプチン及びニコチンアミドを補ったＣＭＲＬ培地中で培養した。類似の因子のカクテルが、過去に、他者により膵臓の発生における最終分化事象への影響を助成するために利用されている(Lumelsky等 (2001) Science 292:1389-1394)。この時点で、我々は、これらの球において、インスリン＋細胞の実質的な富化を認めた。我々は、これらの球内に残っている細胞の約９０％がインスリン＋であると評価した。加えて、我々は、ソマトスタチン＋且つグルカゴン＋の細胞を認める。これらのマーカーの発現は、膵臓の発生において内因的に認められるのと凡そ同じパーセンテージで認められる。特に注意すべきことには、これらのソマトスタチン＋且つグルカゴン＋の細胞は、これらの球の周囲に向かって配向され、これは、今、島様構造と考えられる。これらのインスリン＋、ソマトスタチン＋及びグルカゴン＋細胞の間の空間的関係は、膵臓において内因的に生じる細胞の間の空間関係を再現するので、重要である。
【０１６８】
実施例４：島様構造は、グルコース応答性である
島様構造の形成及び膵臓分化マーカーの発現は、機能的島形成と一致するが、これらの島様構造が実際に機能的であることを確認する唯一の方法は、これらの細胞がグルコースに応答性であることを示すことである。図１及び２には、これらの島様構造がグルコースに応答性であったことを示す実験をまとめてある(ここでは、３ｍＭグルコース及び２０ｍＭグルコースが示されている)。
【０１６９】
実施冷２に詳細に記載した完全な分化プロトコールの後に、これらの島様構造を、３ｍＭグルコース又は２０ｍＭグルコースの存在下で培養して、グルコース刺激されたインスリン放出をアッセイした。インスリン放出及び総インスリン含量を、標準的方法を利用して測定した。加えて、因子を、この島様構造の培養に加えた。図１には、ヘッジホッグポリペプチド(ソニック、デザート又はインディアン)の添加が、これらの構造の高グルコースに対する応答性を低下させることをを示した結果をまとめてある。図２には、マロニルＣｏＡ、エキセンジン−４、ニコチンアミド及びレプチンを含む膵臓成熟因子の添加が、これらの構造の高グルコースに対する応答を低下させることを示した結果をまとめてある。
【０１７０】
如何なる特定の理論に縛られることも望まないが、膵臓成熟因子及び／又はヘッジホッグポリペプチドを含む因子の添加は、これらの島様構造が、グルコースに対する最適の応答のために必要な成熟の幾つかの最終段階を完了するのを助成するのであろう。或は、これらの因子は、膵臓内でグルコース応答の際に起きる内因性シグナリングの幾つかを真似るのであろう。
【０１７１】
治療目的のためには、島様構造を、該島様構造を最適なグルコース応答のために「プライム」し又は準備させるために、移植前に、少なくとも一種の上記の成熟因子の存在下で培養することは有利でありうる。しかしながら、これらの島様構造が、一度該構造が移植されたならば、最大で且つ効率的なグルコース応答がイン・ビボで起きるように、これらの因子(及び必要な任意のプライミング)を、移植後の細胞性環境によって供給するということも可能である。
【０１７２】
実施例５：イン・ビトロで分化させたインスリン＋ヒト細胞の移植
インスリン＋、グルコース応答性細胞及び島様クラスターのイン・ビトロ分化のための本発明の方法の一つの重要な有用性は、かかる組織がイン・ビボ移植できることである。これらの細胞及び／又は島様クラスターの移植は、糖尿病並びに他の機能的β島の破壊又は血中グルコースレベルを調節する能力の障害を生じる病気に対する魅力的な治療選択肢を表す。このアプローチの実用性を、糖尿病のマウスモデル(ＳＴＺ処理マウス)において試験した。かかるマウスは、非常に上昇した血中グルコースレベルにより特徴付けられる。我々は、本発明の方法により分化させたインスリン＋ヒト細胞の移植が、これらのマウスにおいて、正常血中グルコースレベルを回復させたことを示す。更に、移植したヒト細胞の利用は、我々が、処理したマウスにおける血中グルコースレベルの改善が、ヒトインスリン(移植された組織により生成されたもの)の結果であることを確認することを可能にした。
【０１７３】
この実験の実験計画及び結果は、図３にまとめてある。簡単にいえば、６週齢の、９０〜１２０ｍｇ／ｄｌの正常血中グルコースレベルを有するＮＯＤ−ＳＣＩＤ雌マウスに、単一ＩＰ投与量のストレプトゾトシン(ＳＴＺ)を与えた。注射されたマウスの大多数は、２４時間以内に上昇した血中グルコースレベルを示した。血中グルコースレベルが２日間連続で３５０ｍｇ／ｄｌより高かったマウスを、更なる研究に用いた。かかるマウスに、ウシインスリンの持続的放出のための治療用インプラント(Lin Shin Inc.)を皮下に移植して、３つの無作為のグループ(対照用グループ、ラットの島のレシピエントグループ、及びイン・ビトロで分化させたヒト細胞のレシピエントグループ)に分けた。ウシインプラントの移植後に、マウスの血中グルコースレベルが正常に戻るのに気づくであろう。このウシインプラントの移植の２日後に、マウスに、ラットの島又はヒトのインスリン＋細胞(本発明の方法によりイン・ビトロで分化させたもの)の第二の移植を行なった。これらのラット又はヒト細胞を第四乳腺の脂肪パッドに直接移植した。マウスは、約４００の、インスリン産生細胞(ラット又はヒト)の島同等物(インスリンの細胞性抽出物から測定)を移植の１日前に受けた。対照用マウスは、更なる処理を受けなかった。ウシインプラントによるインスリン治療を、イン・ビボの植え付き及びインスリン生成を確実にするために、ラット又はヒト組織の移植後７日間継続した。
【０１７４】
ラットの島又はヒトのインスリン＋細胞(本発明の方法によりイン・ビトロで分化させたもの)の移植の７日後に、ウシインプラントを除去した。ウシインプラントの非存在下で、これらの動物におけるインスリン生成は、移植されたラット又はヒト組織により供給されなければならない。これらのウシインプラントの除去後に、血中グルコースレベルは、約２日間にわたって一時的に上昇した。この血中グルコースレベルは、その後、ラットの島(ｎ＝２／２)又はイン・ビトロで分化させたヒト細胞(ｎ＝２／３)を移植したマウスについては、９０〜１２０ｍｇ／ｄｌの正常範囲に戻った。これらの正常血中グルコースレベルは、８週間持続した。対照的に、対照用マウス(ウシインプラント後に更なる治療を受けていないマウス)は、インプラント除去後、直ぐに血中グルコースレベルが上昇した。
【０１７５】
図３にまとめた結果は、本発明の方法によりイン・ビトロで分化させたインスリン＋細胞をイン・ビボで移植して、正常血中グルコースレベルを回復することができることを示している。しかしながら、我々は、移植されたヒト細胞が、実際にインスリンを生成していることを確認するために更なる分析を行なった。処理したマウスの血清中のヒトインスリンのＣ−ペプチドの存在を測定することにより、これらの実験は、処理したマウスにおける正常血中グルコースレベルの回復が、ヒトの細胞により生成されたインスリンの結果であることを確認した。
【０１７６】
図４には、未処理のマウスが、ヒトインスリンのＣ−ペプチドについて、予想通り陰性の試験結果となることを示したこれらの実験の結果をまとめてある。対照的に、イン・ビトロで分化されたインスリン＋、ヒト細胞を移植されたマウスは、ヒトインスリンＣ−ペプチドについて陽性の試験結果となり、かかる陽性試験結果は、移植されたヒト細胞の存在に依存している(即ち、ヒトインスリンＣ−ペプチドの存在は、移植されたヒト細胞の除去に際して急速に減少する)。
【０１７７】
簡単にいえば、処理したマウスの血清中のヒトインスリンＣ−ペプチドの存在は、血中グルコース値が安定化した６週間後にラジオイムノアッセイにより測定した。血清試料を未処理マウス、ラットの島を移植されたマウス、及びイン・ビトロで分化させたヒト細胞を移植されたマウスから得た。図４に示したように、未処理マウスは、ヒトインスリンのＣ−ペプチドについて陰性の試験結果を与える。対照的に、本発明の方法によりイン・ビボで分化させたインスリン＋、ヒト細胞を移植したマウスは、ヒトインスリンのＣ−ペプチドについて陽性の試験結果を与え、この陽性結果は、ヒト細胞のこの動物中の存在に依存している。加えて、我々は、ラットの島を移植したマウスも又、ヒトインスリンのＣ−ペプチドについて陰性の試験結果を与えることを確認した。
【０１７８】
実施例６：インスリン＋、グルコース応答性細胞を生成することのできる細胞の拡大
細胞ベースの治療(例えば、幹細胞ベースの治療)の分野における有意の限界は、所望の特性を有するように見えて、所定の組織試料から容易に分離することのできる細胞の制限数である。従って、前駆細胞を特定の経路に沿って分化させるためにデザインされた広範囲の方法に適用できる有意の改善は、関心ある分化した細胞又は組織を生成するための所定の分化プロトコールに応答することができる細胞の集団を拡大する方法を包含する。本発明の拡大プロトコールは、この要求を扱う。我々は、所定の組織試料から得ることのできる膵臓前駆細胞の数を増大させ、そうして、インスリン＋、グルコース応答性細胞を生成するための分化プロトコールに応答することのできる細胞の数を増大させる拡大方法を同定した。
【０１７９】
膵管細胞を、ヒトドナーの組織から、実施例２に詳細に記載した方法を利用して分離した。これらの細胞を、非粘着性細胞クラスターとして、ＤＭＥＭ−Ｆ１２(ｐＨ７．４)、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、２％ Ｂ２７(Life Sciences Technologies)及び８ｍＭ ＨＥＰＥＳ中にプレートした。１〜４日の培養後に、培地を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２(ｐＨ６．９〜７．１)、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン及び２％ Ｂ２７(Life Sciences Technologies)に交換する。この培地に、次の４つの因子を補足した：デキサメタゾン(１０-7〜１０-9Ｍ)、フォルスコリン(１０μＭ)、インスリン(２０μｇ／ｍｌ)及びＦＧＦ−１８(２０ｎｇ／ｍｌ)。この培地に、適宜、ＦＧＦの効果を増強するためにしばしば用いられるヘパリンを補った。これらの細胞を、数日間、この補足した培地中で培養し、該培地は毎日交換した。
【０１８０】
約１日の培養の後に、Ｐｄｘ１＋細胞(膵臓前駆細胞のマーカー)が、非粘着性クラスターの表面上に出現し始めた。Ｐｄｘ１＋細胞の大きさ及び数は、約１２日間にわたって増大し続ける。拡大条件下での８〜１２日間の培養の後に、増大した数のＰｄｘ１＋細胞を含む非粘着性細胞クラスターを、インスリン＋、グルコース応答性細胞クラスターを生成するための分化プロトコールにかけた。我々は、この拡大プロトコールが、マウス胚性幹細胞のクラスター中にＰｄｘ１＋細胞クラスターの生成をも生じたこと、及び該プロトコールは細胞を膵臓細胞系統に沿って偏向させる一般的方法に相当しうることに注意する。
【０１８１】
更なる実験は、Ｐｄｘ１＋細胞の生成における、この拡大プロトコールの様々な成分の相対的寄与を評価した。拡大は、酸性培養条件により促進される。我々は、非粘着性クラスターをｐＨ７．２〜７．４に維持された培地中で培養したときにＰｄｘ１＋細胞の増大を認めたが、Ｐｄｘ１＋細胞の出現は、酸性培養条件(約ｐＨ６．９〜７．１)下で増強された。その上、この発明は、Ｐｄｘ１＋細胞の出現が、約ｐＨ５．０〜７．２の酸性培養条件下で細胞を培養することにより増強されうることを企図する。
【０１８２】
細胞拡大に対する最大の効果は、デキサメタゾン、細胞内ｃＡＭＰを増大させる薬剤、インスリン及びＦＧＦ有糸分裂促進物質を補った酸性培地の存在下で起きたが、我々は、これらの因子の部分集合だけでこの培地を補足した場合に、Ｐｄｘ１＋細胞の拡大を認めた。特に、培養培地への、ＦＧＦ有糸分裂促進物質及び細胞内ｃＡＭＰを増大させる薬剤(即ち、ｃＡＭＰ上昇剤)の添加は、Ｐｄｘ１＋細胞の数の増大を生じさせるのに十分であるようである。この発明は、更に、培養培地の、次の濃度の因子での補足を企図する：デキサメタゾン(１０-5Ｍ〜１０-10Ｍ)、フォルスコリン(１〜５０μＭ)、インスリン(５〜２００μｇ／ｍｌ)、及びＦＧＦ(１〜２００ｎｇ／ｍｌ)。
【０１８３】
実施例７：培養において予め拡大させた非粘着性クラスターの分化
細胞を、実施例６に記載したように８〜１２日間の培養において拡大した。拡大後に、非粘着性クラスターを、インスリン＋、グルコース応答性島様クラスターを生成するための分化条件にかけた(実施例２参照)。特に、増大した数のＰｄｘ−１＋細胞を含む非粘着性細胞クラスターを、ＦＧＦ有糸分裂促進物質及び少なくとも一種の更なる成長因子又は清澄因子アゴニストの存在下で培養した。非粘着性の球を、次いで、被覆した下層上に、高グルコース培地の存在下でプレートし、最終的に、被覆した下層上で、標準的レベルのグルコースを含む培地の存在下で培養して、インスリン＋、グルコース応答性島様構造を生成した(分化プロトコールのこれらの工程の詳細な記載は、実施例２を参照されたい)。
【０１８４】
実施例８：培養において予め拡大させた非粘着性クラスターの分化
細胞を、実施例６に記載したように８〜１２日間の培養において拡大した。拡大後に、非粘着性クラスターを、インスリン＋、グルコース応答性細胞及び島様クラスターを生成するための分化条件にかけた(主として、実施例２に概説した方法による)。特に、増大した数のＰｄｘ−１＋を含む非粘着性細胞クラスターを、ＦＧＦ有糸分裂促進物質及び少なくとも一種の更なる成長因子又は成長因子アゴニストの存在下で培養する。非粘着性の球を、次いで、被覆した下層上にプレートして、インスリン＋、グルコース応答性の島様クラスターを生成させる(分化プロトコールのこれらの工程の詳細な記載は、実施例２を参照されたい)。
【０１８５】
しかしながら、この発明は、拡大した細胞を酸性培地(この拡大方法において利用できるようなもの)から、変化する濃度のグルコースを含む一層中性の培地に移すよりも、むしろ、それらの細胞が、酸性ｐＨ(例えば、ｐＨ５．０〜７．２、一層好ましくは、ｐＨ６．９〜７．１)に緩衝されたＤＭＥＭ／Ｆ１２中で分化しうることを企図する。この別法の分化培地も、やはり、実施例２で詳述したように因子を補う。この分化培地中のグルコース濃度は、広く、１ｍＭ〜２０ｍＭで変化しうるし、このグルコース濃度は、分化プロトコール中同じであってもよいし、変化してもよい(即ち、実施例２で示したように、一層高濃度で開始して、一層低濃度に進む)。従って、本発明は、１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲の一定濃度のグルコースを含む培地中又は変化する濃度のグルコースを含む培地中での拡大した細胞の分化を企図する。これらの細胞を変化する濃度のグルコースを含む培地中で培養する具体例において、これらの細胞は、先ず、一層高濃度のグルコース(１０ｍＭより高濃度)を含む培地中で培養し、次いで、一層低濃度のグルコース(１０ｍＭ未満)を含む培地に移す。上記のように、この培地への因子の添加の順序は、前に記載されたのと同じにすべきである。
【０１８６】
実施例９：インスリン＋、グルコース応答性細胞を、フォリスタチン及び／又はエキセンジン−４の存在下で生成することのできる細胞の拡大
実施例６に詳細に概説した因子に加えて、前駆細胞が、インスリン＋、グルコース応答性細胞に分化することのできる細胞の数を増大させるように拡大される効率に影響を与える更なる因子が見出されている。特に、我々は、フォリスタチンベースの因子(例えば、フォリスタチン、フォリスタチン関連遺伝子タンパク質、インヒビン、アクチビンを阻害する他の剤等)及び／又はＧＬＰ−１アゴニスト(例えば、エキセンジン−３、エキセンジン−４、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アナログ等)が、インスリン−細胞の培養又は球におけるｐｄｘ１＋細胞の拡大を更に増大させるために利用されうることを示す。
【０１８７】
これらの研究の結果は、図５にまとめてあり、それは、実施例６の方法(基本培地中に４日；フォルスコリン、デキサメタゾン、インスリン、ＦＧＦ１８及びヘパリンを補った酸性拡大培地中に４日)によって、分化前に拡大された前駆細胞クラスターが、この拡大プロトコールなしで分化させた細胞よりも約６２倍多いｐｄｘ１＋細胞を生成したことを示している。このｐｄｘ１発現に対する効果は、更に、フォリスタチン関連因子フォリスタチン又はフォリスタチンとＧＬＰ−１アゴニストエキセンジン−４の組合せを上記の因子のリストに加えたならば増大された。簡単にいえば、フォルスコリン(ｃＡＭＰ上昇剤)、デキサメタゾン(コルチコステロイド)、インスリン、ＦＧＦ１８(ＦＧＦファミリーのメンバー)、ヘパリン(ＦＧＦファミリーメンバーの活性を強化することが知られている)、及びフォリスタチン(フォリスタチン関連因子)にて拡大された培養は、この拡大プロトコールなしで分化させた細胞の約２８１倍多いｐｄｘ１＋細胞を含んだ。フォルスコリン(ｃＡＭＰ上昇剤)、デキサメタゾン(コルチコステロイド)、インスリン、ＦＧＦ１８(ＦＧＦファミリーのメンバー)、ヘパリン(ＦＧＦファミリーメンバーの活性を強化することが知られている)、フォリスタチン(フォリスタチン関連因子)、及びエキセンジン−４(ＧＬＰ−１アゴニスト)にて拡大された培養は、この拡大プロトコールなしで分化させた細胞の約３００倍多いｐｄｘ１＋細胞を含んだ。
【０１８８】
図６は、拡大培地だけで培養した細胞クラスターと、更にフォリスタチンを補った拡大培地で培養した細胞クラスターとにおけるｐｄｘ１発現を比較している。フォリスタチンを含む培養におけるｐｄｘ１発現の増大に注意されたい。図７は、拡大培地単独で培養した細胞クラスターと、更にフォリスタチン及びエキセンジン−４を補った拡大培地で培養した細胞クラスターとにおけるｐｄｘ１発現を比較している。フォリスタチン及びエキセンジン−４を含む培養におけるｐｄｘ１発現の増大に注意されたい。
【０１８９】
理論には縛られないが、フォリスタチン及び／又はエキセンジン−４の酸性培地への添加後のｐｄｘ１＋細胞の拡大の基礎は、未だ未知である。しかしながら、これらのタンパク質の各々が他のタンパク質と機構的に関連しているとすれば、この発明は、フォリスタチンのみならず、フォリスタチンと機能的に同等の他のタンパク質又は小分子(フォリスタチンベースの因子)の利用をも企図する。典型的な関連因子には、フォリスタチン関連遺伝子タンパク質及びインヒビンが含まれる。加えて、フォリスタチンの活性の殆どが、そのアクチビンのインヒビターとしての役割により媒介されると仮定すれば(フォリスタチンは、アクチビンタンパク質と物理的に相互作用して、該タンパク質を阻害する)、この発明は、この拡大プロトコールにおいて、他のアクチビンインヒビターの利用を企図する(それらが、アクチビンを、フォリスタチンと同じ機構により阻害するにせよ、異なる機構により阻害するにせよ)。この発明は、フォリスタチン及び／又は一層多くのフォリスタチンベースの因子の一つの添加(多くの濃度の何れかで)を企図する。好ましくは、この培養培地中でのフォリスタチン又はフォリスタチン関連因子の終濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌとすべきである。しかしながら、一層好ましくは、この終濃度は、１００ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌとすべきである。多数のフォリスタチンベースの因子を添加する場合には、この発明は、各因子を上記の濃度範囲で添加する具体例並びに２以上の因子の合計濃度が上記の濃度範囲に入る具体例を企図する。
【０１９０】
エキセンジン−４は、他のタンパク質と機構的に関係しており、この発明は、エキセンジン−４のみならず(フォリスタチンベースの因子の存在下又は非存在下で)、エキセンジン−４と機構的に同等の他のタンパク質又は小分子(ＧＬＰ−１アゴニスト)の利用をも企図する。典型的なＧＬＰ−１アゴニストには、エキセンジン−３、エキセンジン−４、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１類似体が含まれる。この発明は、少なくとも一種のＧＬＰ−１アゴニストの拡大培地における、少なくとも一種のフォリスタチンベースの因子の存在下又は非存在下での利用を企図する。この発明は、エキセンジン−４及び／又は少なくとも一種のＧＬＰ−１アゴニストの、何れかの濃度での添加(少なくとも一種のフォリスタチンベースの因子の存在下又は非存在下で)を企図する。好ましくは、この培養培地におけるエキセンジン−４又は他のＧＬＰ−１アゴニストの終濃度は、１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌとすべきである。しかしながら、一層好ましくは、この終濃度は、５０〜４００ｎｇ／ｍｌとすべきである。多数のＧＬＰ−１アゴニストを添加する場合には、この発明は、各因子を上記の濃度範囲で添加する具体例並びに２以上の因子の合計濃度が上記の濃度範囲に入る具体例を企図する。
【０１９１】
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【０１９２】
同等物
当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物を認識し、又は日常的実験を利用して確認することができよう。かかる同等物は、後記の請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】本発明の方法を利用して生成した分化した島様構造が、グルコース応答性であることを示している図である。
【図２】本発明の方法を利用して生成した分化した島様構造が、グルコース応答性であることを示している図である。
【図３】イン・ビトロ分化した、インスリン＋、グルコース応答性ヒト細胞の移植が、ＳＴＺ処理した糖尿病マウスにおいて、上首尾に正常血中グルコースレベルを救済しうることを示している図である。
【図４】ヒトインスリンＣ−ペプチドについてのラジオイムノアッセイの結果を示している図である。
【図５】この拡大プロトコール(フォリスタチン及び／又はエキセンジン−４の存在下及び非存在下)の、ｐｄｘ１＋細胞の数及び島同等物(ＩＥ)の総数の両方の増大における、この拡大プロトコールの存在しない多段階分化プロトコール単独と比較しての有効性を示す実験をまとめてある図である。
【図６】拡大条件下で又はフォリスタチンを補った拡大条件下で培養した細胞クラスターにおけるｐｄｘ１＋細胞とインスリン＋細胞の比較を示している図である。
【図７】拡大条件下で又はフォリスタチンとエキセンジン−４を補った拡大条件下で培養した細胞クラスターにおけるｐｄｘ１＋細胞とインスリン＋細胞の比較を示している図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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