(57)【要約】本発明は、癌腫額の分野に関し、腫瘍病変の治療、予防又は診断用の薬剤組成物に関係し、前記薬剤組成物は、細胞骨格のアクチン網を安定させ得る活性作用物質、特にザイキシン遺伝子をコードするＤＮＡを含む。本発明は、細胞骨格のアクチン網を安定させ得る化合物の識別方法にも関する。本発明は、細胞によるザイキシン発現の数量化に基づく腫瘍病変の診断方法及び患者の腫瘍表現型の分析方法にも同様に関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍病変の治療、予防又は診断用薬剤組成物を調製するための細胞骨格のアクチン網を安定させ得る活性作用物質の使用。
【請求項２】
−ザイキシンタンパク質又はそのポリペプチド断片、
−ザイキシン遺伝子のｃＤＮＡ、その断片又はその相補的配列を含む、又はそれからなる核酸分子、又はそのアンチセンス核酸、
−ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過剰発現させる細胞又は細胞集合、
−コフィリン阻害剤を含む群から選択される活性作用物質を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記活性作用物質は、前記活性作用物質がＧ非重合アクチンを結合する親和力定数より少なくとも２ログ大きい親和力定数でＦ重合アクチンを結合することを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
アクチンを結合する前記活性作用物質は、環状ペプチドであることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ザイキシンタンパク質又はそのポリペプチド断片を、活性作用物質として含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
ザイキシン遺伝子のｃＤＮＡ、その断片又はその相補的配列を含む、又はそれからなる核酸分子を、活性作用物質として含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項７】
ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過剰発現させる細胞又は細胞集合を、活性作用物質として含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項８】
コフィリン阻害剤を、活性作用物質として含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項９】
活性作用物質は、細胞内輸送ベクターと結合されることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
細胞内輸送ベクターは、ウイルス組み換え発現ベクター又は非ウイルス輸送ベクターの中から選択されることを特徴とする請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
非ウイルス細胞内輸送ベクターは、脂質、粒子、微小又はナノ粒子、重合体又はポリプレックスベクター、又はカチオン抗生物質から選択されることを特徴とする請求項９又は１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
活性作用物質及び細胞内輸送ベクターの間の結合は、非共有結合によって行われることを特徴とする請求項９から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
活性作用物質及び細胞内輸送ベクターの間の結合は、共有化学結合によって行われることを特徴とする請求項９から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
細胞内輸送ベクターは、ウイルス組み換え発現ベクターであること、及び活性作用物質及び前記細胞内輸送ベクターの間の結合は、前記ウイルス発現ベクター中の前記活性化合物の組み込みであることを特徴とする請求項９又は１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
ウイルス組み換え発現ベクターは、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）又はレトロウイルスから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ウイルス組み換え発現ベクターは、レンチウイルス又はオンコウイルスであることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過剰発現させるために遺伝的に修飾された細胞は、株細胞、骨髄細胞、造血細胞又は肝臓癌細胞から選択されることを特徴とする請求項１、２又は７のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過剰発現させるために遺伝的に修飾された細胞は、ＣＤ３４＋細胞であることを特徴とする請求項１、２、７又は１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過剰発現させるために遺伝的に修飾された細胞は、腫瘍病変に罹患した患者由来であることを特徴とする請求項１、２、７、１７又は１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
請求項９から１３のいずれかに定義された活性作用物質に結合されることを特徴とする非ウイルス細胞内輸送ベクター。
【請求項２１】
活性作用物質は、非共有結合により前記輸送ベクターに結合されることを特徴とする請求項２０に記載の細胞内輸送ベクター。
【請求項２２】
ザイキシン遺伝子又はその機能断片をコードするｃＤＮＡを含むウイルス組み換え発現ベクターからなることを特徴とする細胞内輸送ベクター。
【請求項２３】
ウイルス組み換え発現ベクターは、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）又はレトロウイルスから選択されることを特徴とする請求項２２に記載の細胞内輸送ベクター。
【請求項２４】
ザイキシン遺伝子を過剰発現させるために遺伝的に修飾されることを特徴とする細胞。
【請求項２５】
ザイキシン遺伝子を過少発現させるために遺伝的に修飾されることを特徴とする細胞。
【請求項２６】
株細胞、骨髄細胞、造血細胞又は肝臓癌細胞から選択されることを特徴とする請求項２４又は２５に記載の細胞。
【請求項２７】
ＣＤ３４＋細胞であることを特徴とする請求項２５又は２６のいずれかに記載の細胞。
【請求項２８】
腫瘍病変に罹患した患者由来であることを特徴とする請求項２５から２７のいずれかに記載の細胞。
【請求項２９】
ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過少発現させる遺伝的に修飾された少なくとも１つの細胞を含むことを特徴とする非ヒト遺伝子導入哺乳動物。
【請求項３０】
細胞骨格のアクチン網を安定させ得る化合物によって誘発されるザイキシン発現の表現型復帰を検出することからなる、前記化合物の識別方法であって、次のステップ：
ａ）テストする化合物の前記細胞との接触、
ｂ）前記細胞中のザイキシン発現の数量化、を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
ザイキシン発現の数量化は、テストする化合物の存在下及び不存在下での前記細胞中のザイキシンのメッセンジャーＲＮＡ発現の比較によって行われることを特徴とする請求項３０に記載の識別方法。
【請求項３２】
ザイキシン発現の数量化は、テストする化合物の存在下及び不存在下での前記細胞中のザイキシンタンパク質発現の比較によって行われることを特徴とする請求項３０に記載の識別方法。
【請求項３３】
次のステップ：
ａ）患者の細胞採取、
ｂ）採取された細胞中のザイキシン発現の数量化、を含むことを特徴とする腫瘍病変の診断方法。
【請求項３４】
ザイキシン発現の数量化は、ザイキシンのメッセンジャーＲＮＡ発現の測定によって行われることを特徴とする請求項３１に記載の診断方法。
【請求項３５】
ザイキシン発現の数量化は、前記異なる間隔で採取された細胞のザイキシンタンパク質発現の比較によって行われることを特徴とする請求項３１に記載の診断方法。
【請求項３６】
次のステップ：
ａ）異なる２つの間隔での患者の細胞採取、
ｂ）前記異なる間隔で採取された細胞中のザイキシン発現の数量化、
ｃ）前記患者の表現型鑑別プロフィールを作るための、２つの発現レベルの比較、を含むことを特徴とする患者の腫瘍表現型の分析方法。
【請求項３７】
間隔は、患者の抗腫瘍治療中の異なる２つの期間に対応することを特徴とする請求項３６に記載の分析方法。
【請求項３８】
ザイキシン発現の数量化は、前記異なる間隔で採取された細胞のメッセンジャーＲＮＡ発現の比較によって行われることを特徴とする請求項３７に記載の分析方法。
【請求項３９】
ザイキシン発現の数量化は、前記異なる間隔で採取された細胞のザイキシンタンパク質発現の比較によって行われることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
癌治療における活性化合物のスクリーニング方法であって、次のステップ：
ａ）前記活性化合物による腫瘍細胞のインキュベーション、
ｂ）前記細胞のアクチン網の重合の安定化測定、を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
薬剤組成物は、表現型復帰を引き起こすためのものであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４２】
第７染色体の長腕レベル、特には７ｑ３４／ｑ３５領域レベルでの染色体異常の結果生じる病変の治療及び／又は予防用の医薬品を調製するための細胞のアクチン網構造を復元し得る化合物の、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
第７染色体の長腕レベルでの染色体異常の結果生じる病変は、７ｑ３４／ｑ３５ザイキシン遺伝子領域中の染色体異常に関連した悪性血液病であることを特徴とする請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
肝臓癌の治療又は予防用の医薬品を調製するための請求項４１に記載の使用。
【請求項４５】
間葉腫瘍、特に肉腫の治療又は予防用の医薬品を調製するための請求項４１に記載の使用。
【請求項４６】
神経外胚葉癌の治療又は予防用の医薬品を調製するための請求項４１に記載の使用。
【請求項４７】
ユーイング肉腫の治療又は予防用の医薬品を調製するための請求項４１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌腫学の分野に関し、細胞が腫瘍表現型に変化する時の、前記細胞の、付着及び運動性のような細胞骨格の構造に関連したある種の細胞表現型特性の調節の観察を拠り所とする。
【０００２】
これらの表現型特性は、安定性が、細胞骨格を構成するアクチン網の重合によって確保される前記細胞の骨格の構造に関連する。
【０００３】
本発明は、例えばザイキシン遺伝子の過少発現のような、細胞骨格のアクチン網の安定化に介在する遺伝子の過少発現、及び前記細胞の正常表現型対腫瘍表現型の形質転換の間で、出願人によって観察された相関関係に基づく。
【０００４】
本発明は、例えば、腫瘍表現型を含む細胞中にザイキシン遺伝子の過剰発現を誘発する化合物のような、細胞骨格のアクチン網を安定化させ得る薬剤組成物の投与が、前記細胞の正常な表現型への表現型復帰を引き起こすことを、行われる実験作業に基づき、明らかにすることにも基づく。
【０００５】
これらの結果により、アクチン重合の力学を介した細胞骨格の構造化が、浸潤性腫瘍表現型の維持において必要不可欠な役割を果たし、かつ従って、結果として腫瘍細胞中の定常状態のＦアクチン量の増加を招く薬理作用が、悪性細胞の浸潤性を減少させ、更には正常な表現型を復元させさえする手段となることを理解することが可能になった。
【０００６】
このようにして、本発明は、アクチン重合状態を調節し得る化合物の識別、及び腫瘍病変の診断、予防及び／又は治療に有用な医薬品を調製するための前記化合物の使用を対象とする。
【背景技術】
【０００７】
アクチン網を安定させ得るかかる化合物は、Ｆアクチンの解重合メカニズムに対する作用で知られる酵素である、例えばコフィリン阻害剤であり得、その活性型（脱リン酸コフィリン）で、らせん体の破裂を誘発し、かつＦアクチンの解重合を促進する。
【０００８】
腫瘍形質転換、及び悪性表現型の維持に関与する遺伝子の識別は、腫瘍病変の新規な治療アプローチの概念に先立つ要素である。適切な実験アプローチは、「正常系統／腫瘍系統」又は「正常組織／腫瘍組織」タイプの対から特になる生物材料を利用できることを必要とする。これらの対により、発現鑑別測定を行うことが可能になる。
【０００９】
しかしながら、結果の妥当性は、使用される対の有意義な性質に左右されるので、これらのアプローチは、不都合を有する。系統は、非常に特徴のある表現型を有さねばならない。系統は、非腫瘍不死表現型を有さねばならず、かつ不死系統の悪性形質転換は、特異な遺伝子現象によって誘発されねばならない。最後に、表現型復帰突然変異体を容易に得ることができねばならない。
【００１０】
最も適切なモデルは、白血病表現型に至らせるＢＣＲ−Ａｂｌ、ＰＭＬ−ＲＡＲ並びにユーイング肉腫の原因であるＥＷＳ−Ｆｌｉ−１のような発癌融合タンパク質によって誘発される腫瘍表現型によって提供される。
【００１１】
ユーイング肉腫は、ＥＷＳ癌原遺伝子をＥＴＳ遺伝子ファミリーのメンバーに結合させるキメラ遺伝子の形成に至らせる、第１１染色体のｑ２４バンドにより改変される第２２染色体のｑ１２バンドを関係させる染色体転座：ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）（Ｔｕｒｃ−Ｃａｒｅｌら、１９８４）を特徴とする神経外胚葉由来の腫瘍である。ｔ（１１；２２）多数転座に関連した亀裂点は、第２２染色体に関してＥＷＳ遺伝子に属する７ｋｂ領域に、かつ第１１染色体に関してＦＬＩ−１に属する５０ｋｂ領域に局在化される（Ｚｕｃｍａｎら、１９９３）。この染色体転座の結果は、ＥＷＳ遺伝子の５’部分が、ＦＬＩ−１遺伝子の３’部分に結合した第２２染色体の誘導体を発生させる（Ｄｅｌａｔｔｒｅら、１９９２）。
【００１２】
融合遺伝子は、発癌性を有するＥＷＳ−ＦＬＩ−１キメラタンパク質を発現させる。このようにして、ＥＷＳ−Ｆｌｉ−１キメラタンパク質は、培養中のＮＩＨ３Ｔ３型のマウス線維芽細胞を形質転換し（Ｏｈｎｏら、１９９３）、かつ「ヌード」マウスにおいて腫瘍を誘発し得る。ＥＷＳのＮ末端及びＦＬＩ−１のＣ末端のドメイン結合は、その形質転換力に必要である（Ｍａｙら、１９９３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の枠内で、一方で不死非腫瘍の正常なマウスＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞、及び他方でＥＷＳ−Ｆｌｉ−１融合タンパク質を構成的に発現させ、かつヌードマウスにおいて腫瘍表現型を有する線維芽細胞からなる調査モデルを発達させた。この細胞対により、腫瘍表現型の獲得の特徴を示す鑑別評価を行うことが可能になる。
【００１４】
この評価は、５８８の遺伝子の発現を同時に評価することを可能にするＣｌｏｎｔｅｃｈの「ｃＤＮＡマイクロアレイ」を用いて行われた。
【００１５】
第２のステップで、安定した表現型復帰突然変異体が、発癌融合遺伝子指向アンチセンスＲＮＡをコードするレトロウイルスベクターによって形質転換された細胞を感染させて、得られた。第２細胞対（腫瘍細胞／非腫瘍復帰突然変異体細胞）は、このようにして得られ、かつ鑑別発現調査の対象となり得た。
【００１６】
このようにして、本発明の枠内で行われた実験により、癌の新規な治療、予防又は診断手段を提供するように、発現の変異が、発癌タンパク質の発現及び表現型の性質に関連する遺伝子を識別することが可能になった。
【００１７】
本発明の枠内で行われた実験の中で、線維芽細胞に対するアクチンフィラメントの免疫着色は、ＥＷＳ−Ｆｌｉ−１キメラタンパク質によって媒介される前記線維芽細胞の悪性形質転換が、特に病巣点減少を伴う線維芽細胞の高度な形態修飾として現れることを示す。このことは、細胞骨格及び特に重合アクチン網の再造形を伴う。
【００１８】
特に、腫瘍表現型は、ザイキシン発現率によって影響を及ぼされること、及びザイキシン遺伝子の過少発現は、正常な線維芽細胞を腫瘍形成線維芽細胞に形質転換するための十分条件であることが証明された。
【００１９】
ザイキシンは、高次真核生物細胞のラメリポディウム及び線維芽細胞の病巣付着板中に存在するＬＩＭドメインを含むタンパク質であることが知られている。亜鉛フィンガー形状のこれらのＬＩＭモチーフは、タンパク質−タンパク質型の相互作用に関係する（Ｓｃｈｅｉｍｅｃｈｅｌら、１９９４「Ｔｈｅ  ＬＩＭ  ｄｏｍａｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｔｉｆ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｚｉｎｃ−ｐｒｉｎｔｅｒ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」。Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１０：３１５−３２０）。
【００２０】
ザイキシンは、アクチンフィラメントの重合の調節に関係し、かつリステリアのＡｃｔＡと共通の構造及び機能特性を有する（Ｇｏｌｓｔｅｙｎら、１９９７）。ザイキシンは、アクチンフィラメント及びインテグリン及びα−アクチンを介する外膜の間に係留中間体として作用すると見なされる。ザイキシンは、細胞骨格の構成、付着及び細胞運動性に明らかに関係する（Ｃｒａｗｆｏｒｄ及びＢｅｃｋｅｒｌｅ、１９９１）。構造上、ザイキシンは、プロリンの豊富なＮ末端領域、核外移行シグナル（ＮＥＳ）ペプチド、並びにＣ末端部分でＬＩＭモチーフを形成するヒスチジン及びシステインアミノ酸の豊富な領域を含む（Ｓａｄｌｅｒら、１９９２。「Ｚｙｘｉｎ  ａｎｄ  ｃＣＲＰ：Ｔｗｏ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ＬＩＭ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ」Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：１５７３−１５８７）。
【００２１】
ザイキシン依存腫瘍形成メカニズムは、運動性、付着及び細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリックスの相互作用に関連する信号の修飾を伴う。
【００２２】
上記の調査モデルにより行われた鑑別発現プロフィールの分析により、ＥＷＳ−Ｆｌｉ−１キメラタンパク質の発現に依存する形態修飾が、ザイキシン遺伝子の発現変異と相互に関係することを確認することが可能になった。
【００２３】
このようにして、細胞骨格の編成に介在するアクチン網の安定化に関係するザイキシン遺伝子の発現減少は、腫瘍表現型の獲得及び維持に直接関連すること、及び前記遺伝子の過剰発現の誘発により腫瘍表現型の復帰に至ることが確認された。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
このようにして、本発明は、癌治療又は予防のための医薬品を調製するための細胞骨格のアクチン網を安定させ得る化合物を含む、癌治療及び予防用の新規な薬剤組成物を提供することを対象とする。
【００２５】
本発明の枠内で行われた研究作業により、癌治療及び／又は予防に有用な無細胞毒性薬剤組成物を開発することが可能になった。実際、本発明による組成物は、細胞を破壊し、かつそれ故に副作用を誘発する可能性がある先行技術の大部分の組成物とは異なり、非腫瘍表現型を修復することが可能である。
【００２６】
この作業により、ザイキシン発現に関連する腫瘍表現型の復帰の検出に基づく、細胞骨格のアクチン網を安定させ得る抗腫瘍化合物の識別方法の発展にも至った。
【００２７】
従って、本発明は、腫瘍病変の治療、予防又は診断用薬剤組成物であって、
−ザイキシンタンパク質、
−ザイキシン遺伝子、その断片又はその相補的配列を含む、又はそれからなる核酸分子、又はそのアンチセンス核酸、
−ザイキシン遺伝子又はその断片によってコードされたタンパク質を過剰発現させる細胞又は細胞集合、
−コフィリン阻害剤を含む群から選択される細胞骨格のアクチン網を安定させ得る活性作用物質を含むことを特徴とする薬剤組成物を対象とする。
【００２８】
定義
【００２９】
本発明の枠内で、ザイキシン断片とは、ザイキシンの生物学的機能、及び特に細胞骨格のアクチン網の安定化機能を保存し得る、そのあらゆるポリペプチド断片を意味する。
【００３０】
ザイキシン遺伝子断片とは、ザイキシンのあらゆる核酸断片、及び特に、
−プロリンの豊富なタンパク質のＮ末端領域、
−核外移行シグナル（ＮＥＳ）、
−Ｃ末端部分でＬＩＭモチーフを形成する領域をコードする前記遺伝子のｃＤＮＡのような、ザイキシン及び／又はその様々な機能ドメインをコードする前記遺伝子のｃＤＮＡを意味する。
【００３１】
ザイキシン遺伝子誘導体とは、化学的に、又は遺伝的組み換えにより修飾されたが、前記遺伝子の機能、特にザイキシンタンパク質の生物学的機能、及び特に細胞骨格のアクチン網の安定化機能を保存する、適切な宿主中で発現する時に、ポリペプチドをコードする能力を保っているあらゆる核酸を意味する。かかる修飾は、例えば当業者に公知の技術により、対応するｃＤＮＡの融合によって得られる異種ｃＤＮＡを含むキメラ分子又は調節要素のような、他の核酸との融合による、塩基の修飾、付加又は削除を例えば含む。
【００３２】
ザイキシンタンパク質誘導体とは、化学官能基との結合により例えば化学的に修飾されたあらゆるポリペプチドを意味し、前記化学官能基は、酵素、免疫原製造のためのキャリアタンパク質の、例えばマーカーのような、他の分子への、又は有機重合体、又は無機担体のような固体担体に対する前記タンパク質又はその断片の結合を行い得る基から選択される。
【００３３】
本発明の第１の実施態様は、ザイキシンタンパク質又はその機能断片を含む薬剤組成物に関する。
【００３４】
この第１の実施態様によれば、本発明の薬剤組成物は、
−アニオン又は中性リポソーム、及び特にホスファチジルコリン（ＰＣ）又はジオレイルホスファチジルコリン（ＤＰＥ）を主成分とするリポソーム、カチオンリポソーム、特に大豆油及び１，２−ジオルコイル−グリセロ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）等を主成分とするエマルジョンのようなカチオンエマルジョンの、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＢ）、臭化ジオレイルオキシプロピル−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、ＤＯＧＳ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））、ＤＤＰＰＥＳ等を主成分とするリポソームのような脂質系、
−粒子状系：非限定的な例として、ポリ（ラクチドコグリコリド）酸（ＰＬＧ）、臭化セチルメチルアンモニウム（ＰＬＧ−ＣＴＡＢ）、ＰＬＧ−ＰＥＩを主成分とする微小粒子、又はＰＬＧ−ポリ−Ｌ−リジン等を主成分とする微小粒子か、キトサン、ＰＬＧのナノ粒子、ゼラチン等を主成分とするナノ粒子、を挙げることができる、
−ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー、キトサン、ＤＥＡＥ−デキストランのようなカチオン重合体、ＴＭＡＥＭ（トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート）及びＮ−２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）の共重合体を主成分とする重合体又はポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）系、
−ＲＡＷＡペプチドのようなペプチド系、
−アムホテリシンＢのカチオン誘導体のようなカチオンポリエン抗生物質を含む群から選択された輸送ベクターに結合されたザイキシンタンパク質又はその機能断片を含む。
【００３５】
好適には、本発明の薬剤組成物中で、ザイキシンは、共有又は非共有化学結合によって前記細胞内輸送ベクターに結合される。
【００３６】
本発明の第２の実施態様は、ザイキシン遺伝子のｃＤＮＡ、その断片又は誘導体を含む核酸分子を活性作用物質として含む薬剤組成物に関する。
【００３７】
この第２の実施態様によれば、薬剤組成物は、ウイルス組み換え発現ベクター又は粒子型非ウイルス輸送ベクターに結合されたザイキシン遺伝子のｃＤＮＡ、その断片又は誘導体を含む核酸を含む。
【００３８】
本発明の枠内で、活性作用物質及び輸送ベクター間の結合とは、当業者に周知である技術により、例えば疎水型の例えば非共有結合により、又はカップリング剤による、又はよらない共有化学結合によるような、輸送ベクターに対する前記活性作用物質の固定か、ウイルス又は細菌組み換え発現ベクター中への前記活性化合物の挿入を意味する。後者の場合、活性化合物は、前記活性化合物を発現させるウイルス粒子による感染によるか、前記宿主細胞中の組み込みの際に活性化合物を発現させ得る組み換え発現ベクターによるトランスフェクションによってターゲットまで運ばれる。
【００３９】
好適には、本発明の薬剤組成物は、前記発現ベクターがターゲット細胞に導入される時、ザイキシン遺伝子のｃＤＮＡ配列の転写制御及び翻訳制御に必要な要素を含む組み換えウイルス発現ベクターを含む。
【００４０】
好適には、本発明の薬剤組成物は、誘発可能な又は構成プロモーターのような調節配列、更には本発明の組成物が投与される宿主細胞中でザイキシン発現を可能にする、ザイキシン遺伝子の非コーディング配列を含む組み換えウイルス発現ベクターを含む。
【００４１】
好適には、本発明の薬剤組成物は、５’のＬＴＲのプロモーターの依存下で、例えばモロニー白血病ウイルスのＬＴＲｓ配列のようなＬＴＲｓ配列から選択される調節配列を含む組み換えウイルス発現ベクターを含む。
【００４２】
好ましくは、本発明の薬剤組成物は、当業者に周知である遺伝的組み換え技術により、宿主細胞中のザイキシン発現を可能にする宿主細胞のプロモータの制御下に置かれるあらゆる組み換えウイルス発現ベクターを、細胞内輸送ベクターとして含む。
【００４３】
例として、かつ非限定的に、アデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）、バキュロウイルス又は組み換えレトロウイルス由来の発現ベクター、及び非常に好ましくは組み換えレンチウイルス型のベクターを挙げることができる。
【００４４】
全く好ましくは、本発明の薬剤組成物は、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター又はＰＧＫプロモーターから例えば、かつ非限定的に選択されるプロモーター配列を含むウイルス発現ベクターを含む。
【００４５】
特殊な実施態様によれば、本発明の薬剤組成物は、ザイキシン遺伝子を発現させるために遺伝的に修飾された腫瘍病変に罹患した患者由来の細胞を、活性作用物質として含む。
【００４６】
本発明の薬剤組成物は、腫瘍病変の治療又は予防のための医薬品調製に有用である。
【００４７】
本発明の薬剤組成物は、ザイキシン遺伝子の局在化領域７ｑ３４／ｑ３５の染色体異常に関連した悪性血液病のような病変の治療のための医薬品調製に有用である。
【００４８】
同様に、本発明の薬剤組成物は、肝臓癌、神経外胚葉癌、ユーイング肉腫の治療又は予防のための医薬品調製に有用である。
【００４９】
本発明は、上記薬剤組成物中に使用され得る、活性作用物質に関連するウイルス及び非ウイルス細胞内転移ベクターにも関する。
【００５０】
本発明のもう一つの対象は、上記に定義された薬剤組成物中に使用され得るウイルスベクターに関係する。
【００５１】
このようにして、本発明は、ザイキシン遺伝子又はその機能断片をコードするｃＤＮＡを含むウイルスベクターを対象とする。
【００５２】
特には、本発明のウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）又はレトロウイルス由来の組み換えベクターから選択される。
【００５３】
本発明の第３の実施態様は、ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過剰発現させるために遺伝的に修飾されることを特徴とする細胞を活性作用物質として含む薬剤組成物に関する。
【００５４】
好適には、前記細胞中のザイキシン遺伝子の過剰発現は、ザイキシン遺伝子のｃＤＮＡを含む発現ベクターによる細胞のトランスフェクションか、前記ザイキシン遺伝子を発現させるウイルス粒子による細胞の感染によって得られる。
【００５５】
好ましくは、本発明による薬剤組成物は、ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過剰発現させるために遺伝的に修飾された、株細胞、骨髄細胞、造血細胞又は肝臓癌細胞から選択される細胞を有効成分として含む。
【００５６】
好ましくは、本発明の薬剤組成物は、ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過剰発現させるために遺伝的に修飾された、ＣＤ３４＋細胞を活性作用物質として含む。
【００５７】
非常に好ましくは、本発明の薬剤組成物は、ザイキシン遺伝子又はその機能断片を発現させるために遺伝的に修飾された腫瘍病変に罹患した患者由来の細胞を、活性作用物質として含む。
【００５８】
本発明は、ザイキシン遺伝子を過剰発現させる、遺伝的に修飾された細胞を同様に対象とする。
【００５９】
本発明は、ザイキシン遺伝子を過少発現させる、遺伝的に修飾された細胞を同様に対象とする。
【００６０】
かかる細胞は、例えば、ザイキシンのＡＵＧをターゲットとし、かつ輸送ベクターを含むシャトル中のクローン化合成のオリゴヌクレオチドを介して細胞中に導入されるアンチセンスＲＮＡを用いて得られる。
【００６１】
好ましくは、本発明により遺伝的に修飾された細胞は、株細胞、骨髄細胞、造血細胞又は肝臓癌細胞から選択される。
【００６２】
好適には、本発明により遺伝的に修飾された細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
【００６３】
好ましい実施態様によれば、本発明により遺伝的に修飾された細胞は、腫瘍病変に罹患した患者由来である。
【００６４】
本発明のもう一つの実施態様は、活性作用物質として、前記活性作用物質がＧ非重合アクチンを結合する親和力定数より少なくとも２ログ大きい親和力定数でＦ重合アクチンを結合する化合物を含む薬剤組成物に関する。
【００６５】
好ましくは、本発明の組成物の作用活性物質は、Ｆ重合アクチンに関して約１０７〜１０８Ｍ−１の親和力定数を有する。
【００６６】
本発明の特殊な実施態様によれば、重合アクチンを結合する作用活性物質は、環状ペプチドである。
【００６７】
本発明は、ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過少発現させる遺伝的に修飾された少なくとも１つの細胞を含む非ヒト遺伝子導入哺乳動物にも同様に関する。
【００６８】
本発明は、ザイキシン遺伝子又はその機能断片を過少発現させる遺伝的に修飾された少なくとも１つの細胞を含む非ヒト遺伝子導入哺乳動物も同様に対象とする。
【００６９】
本発明は、細胞骨格のアクチン網を安定させ得る化合物によって誘発されるザイキシン発現の表現型復帰を検出することからなる、前記化合物の識別方法であって、次のステップ：
ａ）テストする化合物の前記細胞との接触、
ｂ）前記細胞中のザイキシン発現の数量化、を含むことを特徴とする方法にも同様に関する。
【００７０】
本発明の方法の特殊な実施によれば、ザイキシン発現の数量化は、前記テストする化合物の存在下及び不存在下での前記細胞中のザイキシンのメッセンジャーＲＮＡ発現の比較によって行われる。
【００７１】
本発明の方法のもう一つの特殊な実施によれば、ザイキシン発現の数量化は、前記テストする化合物の存在下及び不存在下での前記細胞中のザイキシンタンパク質発現の比較によって行われる。
【００７２】
本発明は、次のステップ：
ａ）患者の細胞採取、
ｂ）採取された細胞中のザイキシン発現の数量化、を含む腫瘍病変の診断方法を同様に対象とする。
【００７３】
本発明の診断方法の好ましい実施態様によれば、ザイキシン発現の数量化は、ザイキシンのメッセンジャーＲＮＡ発現の測定によって行われる。
【００７４】
本発明による診断方法のもう一つの実施形によれば、ザイキシン発現の数量化は、前記異なる間隔で採取された細胞のザイキシンタンパク質発現の比較によって行われる。
【００７５】
本発明は、抗腫瘍治療中の２つの異なる間隔で得られる患者の細胞中のザイキシン遺伝子発現を測定して、前記患者における抗腫瘍治療の効率を決定するためのザイキシン発現表現型の復帰検出方法の使用も対象とする。
【００７６】
このようにして、本発明は、次のステップ：
ａ）異なる２つの時間間隔での患者の細胞採取、
ｂ）前記異なる間隔で採取された細胞中のザイキシン発現の数量化、
ｃ）前記患者の表現型鑑別プロフィールを作るための、２つの発現レベルの比較、を含むことを特徴とする患者の腫瘍表現型の分析方法を対象とする。
【００７７】
本発明の分析方法の実施態様によれば、ザイキシン発現の数量化は、前記異なる間隔で採取された細胞のメッセンジャーＲＮＡ発現の比較によって行われる。
【００７８】
本発明の分析方法の実施態様によれば、ザイキシン発現の数量化は、前記異なる間隔で採取された細胞のザイキシンタンパク質発現の比較によって行われる。
【００７９】
本発明のもう一つの対象は、癌治療における活性化合物のスクリーニング方法であって、次のステップ：
ａ）前記活性化合物による腫瘍細胞のインキュベーション、
ｂ）前記細胞のアクチン網の重合の安定化測定、を含む方法に関する。
【００８０】
本発明は、無細胞毒性の抗腫瘍医薬品を調製するための細胞のアクチン網を復元し得る物質の使用にも同様に関する。
【００８１】
本発明は、第７染色体の長腕レベル、特には７ｑ３４／ｑ３５領域レベルでの染色体異常の結果生じる病変の治療及び／又は予防用の医薬品を調製するためのかかる物質の使用も対象とする。
【００８２】
本発明は、７ｑ３４／ｑ３５ザイキシン遺伝子領域中の染色体異常に関連した悪性血液病の治療用の医薬品を調製するためのかかる物質の使用も対象とする。
【００８３】
本発明は、肝臓癌又は神経外胚葉癌の治療又は予防用の医薬品を調製するための物質の使用も対象とする。
【００８４】
本発明は、間葉腫瘍、特に肉腫の治療又は予防用の医薬品を調製するための物質の使用も対象とする。
【００８５】
本発明は、ユーイング肉腫の治療又は予防用の医薬品を調製するためのかかる物質の使用も対象とする。
【００８６】
本発明のその他の利点は、添付図面を参照する、次の材料及び方法の部に記載された出願人によって行われた実験作業を読めば現れるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
材料及び方法
【００８８】
Ｉ−ザイキシンの腫瘍表現型及び過少発現の間の相関関係
【００８９】
１−記述及び細胞培養
【００９０】
細胞系統の集合は、５％のＣＯ２を含む湿潤大気で３７℃で培養される。ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２は、離して置かれ、１０％の新生の子ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）及び抗生物質（ペニシリン１００ＵＩ／ｍＬ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）を補ったＤＭＥＭ媒質（ＧＩＢＣＯ）中で保たれる。
【００９１】
ＥＷＳ−ＦＬＩ系統は、そのゲノム中でＥＷＳ−ＦＬＩ−１融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。このタンパク質の発現は、２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて選択される。
【００９２】
Ｍ．Ｈｅｒｖｙらによって作られたＡＳ−Ａ系統は、ＥＷＳ−Ｆｌｉ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡ指向小型アンチセンスＲＮＡを生じさせる。この系統は、ピューロマイシンの他に、１ｍｇ／ｍＬのジェネティシンから選択される。ジェネティシンにより、ＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質をコードするｍＲＮＡ指向小型アンチセンスＲＮＡを生じさせる細胞を選択することが可能になる。ＡＳザイキシンＮＩＨ３Ｔ３系統は、ザイキシンをコードするｍＲＮＡのＡＵＧ指向小型アンチセンスＲＮＡを生じさせる細胞である。それらは、アンチセンスの発現を選択するために、ジェネティシン１ｍｇ／ｍＬを補った媒質中で培養される。ＧＰ＋ｅｎｖ  Ａｍ１２細胞は、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子によってコードされるタンパク質をトランスで提供し得、プラスミドに担持されるトランスコンプリメンティング細胞（ｃｅｌｌｕｌｅｓ  ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｎｔｅｓ）であり、かつｅｎｖは、他のプラスミドによって担持される。この系統は、アンホトロピックウイルス粒子を生じさせることが可能である。この系統は、ペニシリン及びストレプトマイシンを補った１０％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）及びＤＭＥＭを含む媒質中で培養される。この細胞は、レトロウイルスシャトルによるトランスフェクション前の２週間、３つの化合物（２００μｇ／ｍＬのＢハイグロマイシン、１５μｇ／ｍＬのヒポキサンチン、２５０μｇ／ｍＬのマイコフェノール酸）の混合物を用いて選択される。
【００９３】
２−免疫蛍光
【００９４】
細胞は、付着するまで（２４〜４８時間）ガラス薄板上に植え付けられる。細胞は、３％のパラホルムアルデヒド溶液によって固定され、ＰＢＳですすがれ、かつＰＢＳ／×１００トリトン０．２％の溶液によって透過化処理をされる。透過化処理された細胞は、ＰＢＳ／ＢＳＡ２％の溶液によって飽和させられる。ザイキシンタンパク質の免疫着色の場合、細胞は、４０分間、２倍に希釈された（Ｊ．Ｗｅｈｌａｎｄの抗ザイキシン）一次抗体によってインキュベートされ、ＰＢＳで５分間３回すすがれ、かつ次に４０分間テキサス赤色（ＴＲＩＴＣ）に結合されたマウスの抗ＩｇＧ二次抗体でインキュベートされる。アクチンの免疫着色のために、細胞は、４０分間ＦＩＴＣに結合されたファロイジンによって直接インキュベートされる。ラメラが、蛍光顕微鏡で観察される。
【００９５】
３−構成：
【００９６】
３．１−ｐＬＮＣＸからのＡＤＡ（アダプター）ｐＬＮＣＸベクターの生成。
【００９７】
ｐＬＮＣＸレトロウイルスベクターは、一方でモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来のＬＴＲｓ配列及びｐｓｉ配列を含み、かつ他方で５’のＬＴＲのプロモーターの依存下で、ジェネティシン耐性を与えるネオマイシン耐性の遺伝子を含む。このベクターは、直接的にサイトメガロウイルス早成プロモーター（ｐＣＭＶ）の依存下でマルチクローニング部位（ＭＣＳ）も含む。ｐＬＮＣＸベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃ１ａＩによってＭＣＳのレベルに指向され、相補的に自己結合され得る２つのアダプターを含む配列をそこに挿入する。これらの２つのアダプター間に、この配列は、他の単一制限部位を含み、その中にＮｓｉＩ及びＳａｌＩがある。
【００９８】
３．２−ヒトザイキシンをコードするレトロウイルスベクターの生成
【００９９】
ｐｚｙｘｉｎｅ  ＧＦＰプラスミドは、（Ｍ．Ｂｅｃｋｅｒｌｅにって与えられた）「緑色蛍光タンパク質」ＧＦＰの遺伝子の位相に結合されたヒトザイキシンをコードするｃＤＮＡを含む。それは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢａｍＨ  Ｉによって指向され、次にＭＣＳ（ＨｉｎｄＨ  Ｉ／ＢｇｌＩＩ）のレベルでＰＬＮＣＸベクター中でクローン化される；ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩは、適合部位である。Ｈｉｎｄ  ＩＩ／ＢｇｌＩＩによる消化は、２つのアダプターの一方を除去し、このことは、このベクターにより生じるザイキシンをコードするＲＮＡの自己結合を妨げる。
【０１００】
この構成の結果は、ｐＣＭＶの直接的な影響下でヒトザイキシンをコードするザイキシンＡＤＡ  ｐＬＮＣＸと名付けられたレトロウイルスベクターである。
【０１０１】
３．３−ザイキシン：ａｓザイキシンＡＤＡ  ｐＬＮＣＸ指向アンチセンスを生じさせるベクターの生成
【０１０２】
ａｓザイキシンＡＤＡ  ｐＬＮＣＸは、直接的に、ｐＣＭＶプロモーターの依存下でザイキシンをコードするｍＲＮＡのＡＵＧ指向のループ軸構造の小型ＲＮＡを生じさせる能力を有するベクターである。
【０１０３】
ベクターの構成は、ザイキシンのｍＲＮＡのＡＵＧ指向小型配列を、ＭＣＳのＮｓｉＩ及びＳａｌＩ部位のレベルに挿入して行われる。
【０１０４】
４−トランスフェクション
【０１０５】
ベクターのレトロウイルスシャトルは、ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２（ＧＰＡ）トランスコンプリメンティング細胞系統中でレトロウイルスベクターをトランスフェクトして、対応するウイルスに形質転換される。ＧＰＡトランスコンプリメンティング系統は、供給者の勧めにより、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）の存在下で、レトロウイルスシャトル（ザイキシンｐＬＮＣＸ又はａｓザイキシンＡＤＡ  ＰＬＮＣＸ）によってトランスフェクトされる。
【０１０６】
ｎｅｏｒ遺伝子を発現させる細胞は、１μｇ／ｍＬのＧ４１８を含む媒質中で選択される。耐性菌は、採集され、増幅され、かつ２×１０６の細胞の割合で７５ｃｍ２のフラスコに植え付けられる。２日後、媒質は、非選択的媒質に取り替えられる。上澄みは、３日間２４時間毎に取り入れられ、再編成され、分別され、かつ凝固させられる。レトロウイルス滴定量は、ジェネティシン（１ｍｇ／ｍＬ）への細胞選択後にＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して算定される。ＧＰＡ細胞のウイルス上澄みは、次に約０．１の多数の感染により所望の細胞を感染させるために使用される。感染の３日後、細胞は、１μｇ／ｍＬのＧ４１８により選択される。レトロウイルスシャトルを加えた細胞のみが、Ｇ４１８に耐性を有し、かつ永久細胞系統を生じさせるために分離され、かつ増幅されるクローンを形成する。
【０１０７】
５−免疫沈降
【０１０８】
付着細胞は、トリプシン処理され、キャッピングされ、かつＰＢＳですすがれる。細胞は、プロテアーゼ混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）の存在下で、低温ＲＩＰＡ（１０ｍＭのトリス−ＨＣＬ  ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％の×１００トリトン、０．５％のデオキシコール酸Ｎａ、０．１％のＳＤＳ）により溶解する。４℃のホイール上で２０分のインキュベーション後、試料は、１４０００ｒｐｍで１５分遠心分離される。上澄みは、回収され、かつタンパク質濃度は、ブラッドフォードテストによって推算される。１．５ｍｇの全タンパク質抽出物を含むアリコットは、（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＳＣ−３５６）Ｆｌｉ−１のＣ末端ドメイン指向の０．２μｇの抗体によって４℃で１時間３０分、次にＡタンパク質に結合されたアガロースボール及びＧタンパク質に結合されたボールの２０μＬの混合物（Ｓｉｇｍａ）によって１時間インキュベートされる。低温ＲＩＰＡで３回の洗浄後、ボールは、２０μＬのＬａｅｍｍｌｉ  ２×緩衝液中で懸濁状態に置かれ、かつ１０分間沸騰させられる。試料は次に、５ｍＬのＴＢＳ−０．１％（ｖ／ｖ）のツイーン中に１μｇの抗Ｆｌｉ−１を含む溶液を、一次抗体のインキュベーションのために使用する従来の免疫ブロットによって分析される。
【０１０９】
６−ウェスタンブロット
【０１１０】
ザイキシンタンパク質の生成率の分析は、ＮＥＳ及びＬＩＭドメインの間に位置する領域指向の、Ｊ．Ｗｅｈｌａｎｄによって与えられたマウスのモノクローナル抗ザイキシン抗体を一次抗体として使用して、全細胞抽出物に対してウェスタンブロットによって行われる。この膜は、化学発光試薬によって表される（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ：Ｂｉｏｒａｄ）。
【０１１１】
７−ＲＮＡ分析
【０１１２】
７．１−ノーザンブロット
【０１１３】
様々な細胞系統の全ＲＮＡ抽出は、供給者の勧めにより、ＲＮＡｐｌｕｓ溶解溶液（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）を使用して行われる。１０μｇの全ＲＮＡのアリコットは、０．０４ＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７、０．０１Ｍの酢酸ナトリウム、２．２Ｍのホルムアルデヒド及び５０％のホルムアミドを含む溶液中で変成される。試料は、ホルムアルデヒドで変成されたアガロースゲル上で分析され、かつ荷電ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に伝達される。膜は、一晩中、４２℃で５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ、０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子のＤＮＡ、０．１ｍｇ／ｍＬの酵母のｔＲＮＡ、０．１％のＳＤＳ、２５ｍＭのｐＨ７  ＫＨ２ＰＯ４及び５０％のホルムアミドを含むプレハイブリダイゼーション溶液中で無作為プライミング（ランダムプライミング）（Ｐｒｉｍｅ−ａ−ｇｅｎｅ（登録商標）標識化システム：Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、［３２Ｐ］ｄＣＴＰで無線マーキングされたｃＤＮＡプローブでハイブリダイズされる。翌日膜は、外界温度でＳＳＣ２×／０．１％のＳＤＳにより３回、かつ４２℃で０．５×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳによって２回すすがれる。次に膜の信号が、ｐｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒで観察される。
【０１１４】
７．２−ＲＴ−ＰＣＲ
【０１１５】
全ＲＮＡは、上記の同じ技術により生成される。ＲＮＡの性質及び清浄度は、変成ゲル上で確認される。レトロトランスクリプション（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）は、２０  ｍｅｒｓ  ＬＴＲプライマーを用いて特異的にＱｉａｇｅｎのＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔキットを用いて行われる。使用される条件は、１０ｎｇのＬＴＲプライマー、２．５ｍＭのｄＮＴＰ、２０ＵのＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ（登録商標））を補った１μｇの全ＲＮＡ、ＲＴ緩衝液及び４０Ｕの逆転写酵素である。混合物は、３７℃で１時間及び９４℃で５分インキュベートされる。特異なｃＤＮＡのＲＴ生成物は、ａｓ１及びａｓ２と名付けられた２つの他のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅される。反応条件は、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｎｇの各プライマー及び１／２０のＲＴ生成物、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、Ｔａｑ  ｐｏｌ緩衝液及び１ＵのＴａｑ  ｐｏｌ酵素（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｎ８０１−００６０）である。使用されるサイクルは、９４℃４分及び３０サイクル（９４℃３０秒、６１℃４５秒、７２℃１分）及び７２℃１０分である。
ＬＴＲ：ＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＧＣＣＡＴ
ＡＳ１：ＧＣＣＧＴＧＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＣＴＧ
ＡＳ２：ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＧＡＴＣＴＧ
【０１１６】
８−腫瘍形成能テスト
【０１１７】
テストする様々なクローン由来の細胞は、トリプシン処理され、キャッピングされ、かつ１ｍＬ当り５×１０６の細胞の割合で無菌ＰＢＳ中に再懸濁される。２００μＬの細胞のアリコットは、前日に５グレイで放射線を照射された、生後６〜８週間のヌードマウスに皮下注射される。マウスは、無菌かつ温度調節された雰囲気中で飼育される。腫瘍発達の観察は、５〜６週間の各週で行われる。
【０１１８】
９−マクロアレイ実験
【０１１９】
ｃＤＮＡの発現マップ「Ａｔｌａｓ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙｓ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が、供給者の勧めにより行われる。５８８の遺伝子に対応する、マウスの５８８のｃＤＮＡ試料が堆積される２つの同一のナイロン膜（７７４１−１号）により、異なる２つの細胞系統のｃＤＮＡを並行してハイブリダイズすることが可能になる。５８８の遺伝子に関する情報は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ａｔｌａｓ．ｇｅｎｅｌｉｓｔ／ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｌｍ）で入手可能である。無線マーキングされたｃＤＮＡプローブの調製は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈキットを使用して［３２Ｐ］ｄＡＴＰでのレトロトランスクリプションによって行われる。ハイブリダイゼーションは、供給者の指示により行われる。信号は、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒで観察される。
【０１２０】
結果
【０１２１】
１−ＥＷＳ−ＦＬＩ融合タンパク質によって誘発される細胞形質転換におけるザイキシンの役割調査
【０１２２】
１．１−ザイキシンを過剰発現させるＥＷＳ−ＦＬＩ系統の作成
【０１２３】
ＥＷＳ−Ｆｌｉ（ＥＷＳ−ＦＬＩ）融合タンパク質を発現させるＮＩＨ３Ｔ３細胞中のザイキシンの過剰発現は、ｐＬＮＣＸレトロウイルスシャトルを使用して感染によって行われた。ｐＺｙｘｉｎｅ−ＧＦＰプラスミド（図２）由来のザイキシンに対応するオープンリーディングフレームは、ＣＭＶプロモーターの下流に位置するｐＬＮＣＸプラスミドのマルチクローニング部位中に導入される。このようにして、２つのＬＴＲ（５’及び３’）配列、レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成に必要なＰＳＩ＋配列、ＬＴＲ５’の依存下でジェネティシン耐性の原因であるＮｅｏＲ遺伝子及びＣＭＶプロモーターの影響下でヒトザイキシン読み枠を含む、ｐＬＮＣＸ−ｚｙｘｉｎｅと名付けられたプラスミドが得られた（図２）。
【０１２４】
ウイルス生成は、ＧＰＡと名付けられたアンホトロピックマウスキャプシド形成系統中でこのプラスミドをトランスフェクトすることによって得られる。ＥＷＳ−ＦＬＩ細胞は、ＧＰＡ細胞によって生成されたウイルス上澄みを用いて感染し、かつジェネティシンの存在下で選択される。
【０１２５】
このようにして得られたクローンは、Ｅ−Ｆ／ザイキシンと名付けられる。蛍光顕微鏡検査による調査（図３）は、ＥＷＳ−ＦＬＩ細胞が、アクチンのマイクロフィラメント束、及び形質転換された線維芽細胞の典型的な特性である、広がる能力を喪失したことを示している（Ｐｏｌｌａｃｋ、Ｒら；１９７５、Ｍａｎｅｓｓ、Ｐ、Ｅ；１９８１）。逆に、Ｅ−Ｆ／ザイキシンクローン細胞は、アクチンのマイクロフィラメント構造、並びにＮＩＨ３Ｔ３細胞の広がる能力を部分的に回復した（図４）。更に、これらの細胞は、形質転換された細胞に典型的な、多層成長能力をもはや有さない。これらの構造修飾と並行して、付着板のレベルで、細胞間結合中で、かつストレスケーブルに沿ってザイキシンの再局在化が観察される（図３）。
【０１２６】
２−Ｅ−Ｆザイキシン細胞中のザイキシンのｍＲＮＡ発現
【０１２７】
ノーザンブロットによる分析は、ザイキシンをコードするＲＮＡが、ＮＩＨ３Ｔ３系統中よりもＥＷＳ−ＦＬＩ腫瘍形成系統中で低く発現することを示している（図４）。この結果は、ＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ−ＦＬＩ細胞の間で、マイクロアレイによって以前に観察された発現差を確認している。レトロウイルスシャトル由来の、かつＣＭＶプロモーターから発現するヒトザイキシンｍＲＮＡの期待される大きさ（２．２ｋｂ）（図４Ｂ）は、ザイキシンの内因性ｍＲＮＡのそれと同一である。従って、３つのＥ−Ｆ／ザイキシンクローン中で、観察されるバンドの強さの増加が、レトロウイルスシャトルから発現するザイキシンＲＮＡの発現によることは、非常に確からしい。その上、４．７ｋｂを超える大きさの他のＲＮＡは、Ｅ−Ｆ／ザイキシンクローン由来のＲＮＡ中にのみ示される。このＲＮＡは、レトロウイルスシャトルのＬＴＲ  ５’（５．７ｋｂ）のＵ３領域に位置するプロモーターから発現するＲＮＡと適合できる５．５〜６ｋｂの大きさを有する（図４Ｂ）。
【０１２８】
この仮説を立証するために、第２のノーザンブロットが、ＬＴＲ  ５’由来のＲＮＡのみを検出し得る、ザイキシンＡＤＡ  ｐＬＮＣＸプラスミド由来の制限断片に対応する１０８１ｐｂの（ｎｅｏ／ＣＭＶ）プローブを使用して行われた（図５）。
【０１２９】
図５に示した結果は、Ｅ−Ｆザイキシンクローン中のみのハイブリダイゼーションを表している。ＵＶで観察可能な、２８Ｓ  ＲＮＡの位置を参照すると、検出されたバンドは、ザイキシンプローブを使用するノーザンブロット中に存在する不明確なバンドと同じレベルに位置付けられる。従ってそこから、レトロウイルスシャトルは、ザイキシン配列を含む２つのＲＮＡを生成し、一方は、ＣＭＶプロモーター由来であり、かつ他方は、ＬＴＲ  ５’中に存在するプロモーター由来であるという結論を引き出すことができる。
【０１３０】
３−外因性ザイキシンタンパク質の過剰発現調査
【０１３１】
レトロウイルスシャトル由来のザイキシンＲＮＡを含むＥ−Ｆザイキシンクローンが、対応するタンパク質を生成し得るか判定するために、抗ザイキシン抗体によって免疫表示されたウェスタンブロットが行われた。この実験の結果は、図６に示す。系統の集合に対して、８０ｋＤａを僅かに超える分子量のタンパク質の特異な、かつ唯一のバンドが検出される。この分子量は、Ｓｃｈｍｅｉｃｈｅｌら、１９９８に記載されたザイキシンの見かけの分子量（８２ｋＤａ）と一致する。ＮＩＨ３Ｔ３系統に対するＥＷＳ−Ｆｌｉ系統中のザイキシンのｍＲＮＡの過少発現は、対応するタンパク質の減少として現れる。
【０１３２】
同じように、Ｅ−Ｆザイキシン１、２及び３のクローンのＲＮＡレベルでのザイキシンの過剰発現は、ＮＩＨ３Ｔ３系統の率に近いザイキシンタンパク質の率の修復として現れる。従ってこれらの結果は、細胞によって生成されるＲＮＡの率及び発現するタンパク質の率の間の相関関係を示す。結論として、ＥＷＳ−ＦＬＩ形質転換細胞中のザイキシンをコードするｃＤＮＡの導入により、ＮＩＨ３Ｔ３親細胞の発現率と比較し得るレベルで、更には、それを超えるレベルでこのタンパク質の発現率を修復することが可能になる。ザイキシンタンパク質の過剰発現は、おそらくはＣＭＶプロモーターから発現されるＲＮＡによる。実際、ＬＴＲ  ５’由来の少数ＲＮＡの場合に、ジェネティシン耐性を細胞に与えるＡＰＨ（３’）ＩＩリン酸転移酵素の読み枠（Ｄａｖｉｅｓ及びＳｍｉｔｈ、１９７８）は、翻訳される。従って、翻訳開始内部配列の不在は、下流のヒトザイキシンのオープンリーディングフレームが、翻訳されることを妨げる。
【０１３３】
４−Ｅ−Ｆザイキシンクローン中のＥＷＳ−ＦＬＩ−１の発現調査
【０１３４】
並行して、調査されたＥ−Ｆザイキシンクローンが、腫瘍形成性の原因となるＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質の発現を保つことが立証された。
【０１３５】
このために、ＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質の発現調査は、Ｅ−Ｆザイキシンクローンのタンパク質抽出物の免疫沈降後にウェスタンブロットによって行われた（図７）。図７に示す結果は、６１ｋＤａを超える分子量のタンパク質の特異な検出を示す。この質量は、期待されるＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質の見かけの分子量（６８ｋＤａ）と適合し得る。このバンドの下に、他のバンドが現れる。それらは、免疫沈降に使用される抗体の変成の生成物に対応する（抗Ｆｌｉ−１抗体の重鎖（５０ｋＤａ））。
【０１３６】
タンパク質抽出物の２つの異なる量の存在下で検出される強さの差は、使用される抗体の量が、制限的でないことを示す。ＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質に対応するバンドの強さを比較し得るために、検出される抗Ｆｌｉ−１抗体の量によって免疫検出されるＥＷＳ−ＦＬＩ−１の量は、補正される。ヒストグラムの形で示される結果（図７Ｂ）は、ＮＩＨ３Ｔ３系統中にＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質がないこと、及びＥＷＳ−ＦＬＩ系統に対して（ＥＷＳ−ＦＬＩ接合の配列指向アンチセンスを発現させる）ＡＳ−Ａ系統中の過少発現を示している。Ｅ−Ｆザイキシンクローンに関して、ＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質の量は、非腫瘍形成ＡＳ−Ａ系統中で検出されるタンパク質の量よりも明らかに大きく、かつ腫瘍形成ＥＷＳ−ＦＬＩ細胞中に存在する量と比較し得るままである。
【０１３７】
これらの細胞は、ヌードマウスにおいて、皮下腫瘍を誘発するために十分な量のＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質を保っていることが、推測できる。このようにして、Ｅ−Ｆザイキシンクローンの腫瘍形成能の場合によって起こり得る損失は、ＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質の発現減少にはよらない。
【０１３８】
５−Ｅ−Ｆザイキシンクローンの腫瘍形成能調査
【０１３９】
ＥＷＳ−ＦＬＩ系統中のザイキシンの過剰発現によるヌードマウスにおける悪性表現型損失誘発の判定を、次の表１に示す。
【０１４０】
【表１】
2005504521.tif 000002
【０１４１】
これらの結果は、５週間の様々な細胞系統の１０６の細胞の皮下注射後にヌードマウスにおいて発達した腫瘍数の調査に対応する。これらの細胞は、５グレイでのマウス照射の２４時間後に注射される。
【０１４２】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞の注射は、腫瘍の発達をもたらさない。この系統は、非腫瘍形成として公知であるので、負の制御として使用される。逆に腫瘍形成として公知であるＥＷＳ−ＦＬＩ系統に関して、全てのマウスが、２及び３週目の間に腫瘍を発達させた。Ｅ−Ｆザイキシンクローンの腫瘍形成能調査に関して、腫瘍の発達がない（５匹のマウスに対して３匹）か、約２〜３週で、腫瘍の発達に遅延が観察される（５匹のマウスに対して２匹）かの、２つの場合の図が現れ得る。これらの腫瘍の分析は、レトロウイルスシャトルのＤＮＡが常に存在し、逆にザイキシンをコードする外因性ＲＮＡが検出され得なかったことを示している。従って、マウスにおける腫瘍の発達遅延は、外因性ザイキシンタンパク質の発現損失によるように見える。
【０１４３】
６−腫瘍表現型獲得におけるザイキシンの過少発現調査
【０１４４】
６．１−ザイキシンを過少発現させるＮＩＨ３Ｔ３系統の作成
【０１４５】
ＥＷＳ−ＦＬＩ融合タンパク質により形質転換されるＮＩＨ３Ｔ３細胞の腫瘍表現型の維持におけるザイキシンの発現率の重要性を考えて、出願人は、非腫瘍形成細胞系統中のこのタンパク質の強制減少の結果を判定することを望んだ。このために、ザイキシンのＡＵＧをターゲットとする小型アンチセンスＲＮＡが使用された（図８Ａ）。このアンチセンスＲＮＡは、ＮｓｉＩ／ＳａｌＩ制限部位のレベルでｐＬＮＣＸシャトル中のクローン化合成オリゴヌクレオチドを介して細胞中に導入された（図８Ｂ）。
【０１４６】
（Ｇ４１８  １ｍｇ／ｍｌの存在下で）選択され、かつＡＳ−ＺＹＸ１、２及び３と名付けられた３つのクローンにおいて、アンチセンスの発現（図８Ｃ）は、ザイキシンタンパク質の減少を伴う（図９）。この発現減少は、ＥＷＳ−ＦＬＩ融合タンパク質により形質転換されるＮＩＨ３Ｔ３細胞において検出されるそれと同じ次元のものである。
【０１４７】
この、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のザイキシンの発現率の減少は、細胞の大きな形態変化として現れる。このようにして、アクチンフィラメントの構造の著しい修飾、並びに細胞質拡大及び付着力大きな損失が観察され得る（図３）。形質転換された細胞に典型的な、これらの形態変化は、これらの細胞の増殖特性において修飾を同様に伴う。このようにして、これらの細胞の倍増時間（２０〜２２時間）は、ＥＷＳ−ＦＬＩ形質転換細胞のそれ（１７〜１８時間）及びＮＩＨ３Ｔ３親細胞のそれ（２４〜２６時間）の中間である。これらのデータは、ＥＷＳ−ＦＬＩ細胞のように、ＡＳ−ザイキシン細胞が、接触阻害を喪失したことも同様に示す。
【０１４８】
６．２−ＡＳ−ザイキシンクローンの腫瘍形成能調査
【０１４９】
ヌードマウスにおける腫瘍発達テストは、ザイキシン及びＮＩＨ３Ｔ３親細胞指向アンチセンスを発現させる細胞間で観察される形態変化及び成長の修飾を裏付ける（表２）。ＡＳ−ザイキシンクローンからの腫瘍の出現において、ＥＷＳ−ＦＬＩ腫瘍系統から観察されるそれに対して、僅かな遅延が存在するが、３つのクローンは、腫瘍を発達させる。ＥＷＳ−ＦＬＩ細胞注射後の腫瘍の発達速度は、同様にＡＳ−ザイキシンクローンの注射に続き観察されるそれよりも速い。これらの２つの観察は、細胞の固有増殖速度からおそらくは生じる。
【０１５０】
【表２】
2005504521.tif 000003
【０１５１】
７−ＮＩＨ３Ｔ３系統及びＡＳ−ザイキシン間の遺伝子発現プロフィールの比較
【０１５２】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＡＳ−ザイキシン１又は２クローン間の「ｃＤＮＡ発現アレイ」技術による遺伝子発現の比較調査は、ザイキシン阻害が、遺伝子発現を混乱させることを示す。それぞれ１０及び１３の遺伝子が、発現がＮＩＨ３Ｔ３細胞に対して修飾されるＡＳ−ザイキシン１又は２クローン中で識別された（図１０）。これら様々な遺伝子の中で、９つが２つのクローンと共通である。
【０１５３】
これらの遺伝子は、４つのファミリーに再編成され得る：腫瘍サプレッサー（ＥＧＲ１及びｐ５３）、修復に関わるタンパク質（ＥＲＣＣ−１）、区別及び細胞成長において役割を果たすタンパク質（ＡＤＡＰ、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＣＥ）及び細胞マトリックスに介在するタンパク質（ＴＩＭＰ２、ＰＮ−１及びウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子）である。更に、これらの遺伝子の９つが、ＮＩＨ３Ｔ３親系統及びＥＷＳ−ＦＬＩによって形質転換された系統間の発現プロフィールの分析の際に識別された（図１０）。これらの結果は、使用される細胞中のザイキシンの発現率が、遺伝子調節プロセスに影響を及ぼすことを非常に明白に示す。
【０１５４】
８．アクチン網の安定化による癌治療の薬学的アプローチ
【０１５５】
８．１  蛍光異方性によるアクチン重合のインビトロ測定
【０１５６】
ＮＩＨ３Ｔ３又はＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の細胞抽出物は、Ｇ緩衝液（４．３μＭのトリスｐＨ８．１；１７０μＭのＣａＣｌ２；１７０μＭのＤＴＴ；１７０μＭのＡＴＰ）中でＡｌｅｘａ４８８アクチンの存在下に置かれる。重合反応は、Ｐ緩衝液（ＫＣｌ  ５１ｍＭ、ＭｇＣｌ２１ｍＭ及びＡＴＰ０．５ｍＭ）の付加により開始される。ドラスタチン（μＭ）は、Ｐ緩衝液と同時にＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の細胞抽出物に付加される。アクチン重合の後に、Ｂｅａｃｏｎ２０００に対する蛍光異方性が続く。得られた結果を図１１に示す。
【０１５７】
８．２  ドラスタチン（Ｄ１１）存在下のＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の形態修飾の調査
【０１５８】
細胞（５×１０３）は、直径１０ｍｍのガラス薄板上に植え付けられ、かつ２４時間培養される。固定（パラホルムアルデヒド３％）及び透過化処理（×１００トリトン０．２％）後、細胞のアクチンフィラメントは、ＦＩＴＣに結合されたファロイジンを介して免疫着色される。非治療ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＥＷＳ−Ｆｌｉ（ＥＦ）によってトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３；１０μＭ又は１００μＭのＪａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅの存在下でインキュベートされた（ＥＦ）；１０μＭ又は２０μＭのＤ１１によりインキュベートされたＥＦ。（図１２）
【０１５９】
これらの結果は、細胞骨格に対するこれら２つの活性作用物質、Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ又はドラスタチン−１１の効果を示す。
【０１６０】
８．３  ＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ／Ｆｌｉ細胞に対するドラスタチン１１（Ｄ１１）の毒性調査
【０１６１】
細胞（穴当り１０４）は、様々な濃度のＤ１１の存在下で９６穴の板中に植え付けられる。時間に応じたＤ１１の毒性検査は、ＮＩＨ３Ｔ３（Ａ）及びＥＷＳ−Ｆｌｉ（Ｂ）細胞に対するＭＴＴテストを介して行われた。結果は、図１３に示す。
【０１６２】
８．４  ドラスタチン−１１存在下でのヌードマウスにおける腫瘍発達の調査
【０１６３】
マウスの照射（５Ｇｙ）の２４時間後に、ＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞（１０６）は、皮下に植え付けられる。その時マウスは、２つのロットに分離され、第１のロットは、治療されないマウスに対応し、かつ第２のロットは、ＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の注射後の５、８及び１１日目に、ドラスタチン１１（１０μｇ／ｋｇ）の３回の注射を静脈内に受けたマウスに対応する。腫瘍の発達測定は、２８日目に行われたが、それらを、図１４に示す。
【０１６４】
８．５  位相差顕微鏡検査による細胞移動速度の調査
【０１６５】
細胞は、直径２０ｍｍのガラス薄板上に植え付けられる（２０％の集密）。植え付けの３日後、ガラス薄板は、温度（３７℃）及びＣＯ２（５％）を調節した、密封した部屋に置かれる。細胞の運動性測定は、２４時間の間、４分毎の、位相差光学顕微鏡検査の写真撮影によって行われる。プログラム「ｍｅｔａｍｏｒｐｈ」を用いて行われる運動性分析は、１０の細胞に対して、各細胞型につき行われる。結果を図１５に示す。
【０１６６】
８．６  結果分析
【０１６７】
（ＮＩＨ３Ｔ３）非腫瘍細胞か、ＥＷＳ−Ｆｌｉ腫瘍細胞の抽出物から、出願人によって行われた蛍光異方性による（図１１）アクチン重合の調査は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の抽出物が、ＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の抽出物よりも遥かに大きなアクチンを重合する能力を有することを示す。しかしながら、ＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の抽出物の重合緩衝液中にドラスタチン１１を付加すること（Ｒ  Ｂａｉら；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：２００１）により、ＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の欠乏を部分的に補うことが可能になる（図１１）。
【０１６８】
抽出物に対して得られたこれらの結果に応じて、出願人は、重合アクチンを安定させるドラスタチン１１（Ｄ１１）のこの能力により、ザイキシンタンパク質の発現率が、これらのＥＷＳ−Ｆｌｉ腫瘍細胞中で復元された際に観察された形態復帰と同一な形態復帰に至り得るか分析した。
【０１６９】
１０又は２０ｎＭのドラスタチン１１によるＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞治療により、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態と似ている形態を有する、細胞のストレスファイバーを修復することが可能になるだけでなく、細胞間の接触構造を復元することも同様に可能になる（図１２）。
【０１７０】
逆に、ドラスタチン１１の同じ濃度は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態を少しも修飾しない（図１２）。更に、全く驚くべきことに、これらの低いドラスタチン１１濃度に関して、いかなる細胞毒性又は細胞静止性効果も２つの細胞系統に関して観察されない（図１３）。ヌードマウスに関して行われた実験は、インビトロで得られた結果を確認している。ＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の皮下注射による腫瘍の発達は、ドラスタチン１１の静脈内注射によって明らかに遅くされる（図１４）。これらの実験は、マウスの余命に影響しない分量より５倍低いドラスタチン１１濃度（１０μｇ／ｋｇ）により行われただけに、一層興味深い。
【０１７１】
チューブリンフィラメントをターゲットとするＤ１０及びＤ１５のような、ドラスタチンファミリーの他の化合物は、それらが抗腫瘍治療に活性化合物として使用された、幾つもの調査の対象ではあったが、それらは腫瘍細胞を殺すことを目的とする細胞毒性作用物質として常に使用された。従って、必要量は、多数の望ましくない副作用をもたらす。
【０１７２】
逆に、本発明の薬剤組成物は、先行技術で公知な分量よりも遥かに少ない分量を腫瘍表現型の表現型復帰のために必要とする。
【０１７３】
これらの結果の集合は、特にザイキシンの過少発現により、誘発される腫瘍の枠内で、腫瘍細胞のアクチンの細胞骨格を復元すること可能にする、非毒性の、薬学的アプローチを使用することが可能であることを示す。
【０１７４】
本発明の薬剤組成物によって治療され得る癌ファミリーの１つは、出願人がザイキシン遺伝子の過少発現の特徴を示した、黒色腫ファミリーである。
【０１７５】
これらの結果を得るために、出願人は、マウス黒色腫系統における幾つかの遺伝子発現の特徴を、非腫瘍系統におけるこれらの同じ遺伝子の発現に対して示した。
【０１７６】
Ｂ１６／Ｆ１０細胞は、非常に攻撃的なマウス黒色腫系統である。それらは、非腫瘍形成ＮＩＨ３Ｔ３系統と比較される。
【０１７７】
２つの細胞系統の全ＲＮＡは、ＲＴ  ＰＣＲによって増幅され、かつ無線マーキングされる。（ｃＤＮＡ）ＲＴ  ＰＣＲ生成物は、Ａｔｌａｓ（登録商標）  Ｍｏｕｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ膜（参照番号７７４１−１）によってインキュベートされる。膜は、次に露出され、かつ像が、ソフトウェアＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ（登録商標）によって分析される。
【０１７８】
この特徴付けの結果を以下の表３に示す。
【０１７９】
【表３】
2005504521.tif 000004
【０１８０】
これらの結果は、ザイキシン遺伝子が、黒色腫中で過少発現されることを示す。
【０１８１】
考察
【０１８２】
本発明の枠内で遂行された実験作業によって、細胞中のザイキシンの発現率及び腫瘍表現型の獲得又は維持の間の関係を明らかにすることが可能になった。悪性形質転換におけるザイキシンの役割調査は、幾つかの間接的観察の結果行われた：
Ａ）これらの細胞中のＥＷＳ−ＦＬＩ融合タンパク質発現に続く、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の腫瘍表現型の獲得、並びにこの発癌タンパク質の消滅による腫瘍形成能の損失は、大きな形態修飾を伴う（図３）。
Ｂ）悪性の形質転換が、一般的に付着及び運動能力の修飾という形で現れること。これらの修飾は、アクチンフィラメントの構造喪失に常に関連する。
Ｃ）直接的に、ＥＷＳ−ＦＬＩ発癌タンパク質の依存下にあると識別された約１０の遺伝子の中で、ザイキシンは、細胞骨格の構造、付着及び細胞運動性に役割を果たす唯一のものである。
【０１８３】
ザイキシン及び悪性形質転換の間の直接的な関係を明らかにするために、一方でザイキシン発現を復元することを可能にするベクターが、腫瘍系統中（ＥＷＳ−ＦＬＩ）に導入され、かつ他方でザイキシンのＡＵＧ指向アンチセンスを発現させるベクターが、非腫瘍形成系統（ＮＩＨ３Ｔ３）中に導入された。得られた結果は、腫瘍系統中のザイキシン発現の修復（図６）により、これらの細胞の腫瘍形成力を著しく減少させることが可能になることを示す。ザイキシンは、非常に良く保存されるタンパク質なので（ヒト及びマウスの間に９７％の相同）、ヒト及びマウスのザイキシンの間の配列の差は、おそらく、この減少の原因ではない。
【０１８４】
更に、非腫瘍形成の、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞中のザイキシン発現の選択的阻害により（図９）、これらの細胞の悪性形質転換に至る。他の幾つかのデータは、悪性形質転換に対して観察される効果及びザイキシン発現率の間の直接的な関係が存在することを示している。ヒトザイキシンを過剰発現させるＥＷＳ−ＦＬＩ細胞を注射した何匹かのマウスは、腫瘍を発達させた。これらの腫瘍の分析は、ザイキシンを発現させることを可能にするベクターが常に存在し、逆にヒトザイキシンをコードするＲＮＡがもはや検出されなかったことを示す（示さない実験）。ＮＩＨ３Ｔ３親系統及びそこから生じ、かつザイキシンを過少発現させるクローンの間マイクロアレイの比較分析により、α−アクチニン、トロポミオシン、アクチン又はビンキュリンのようなマイクロフィラメントの他のタンパク質、又はチューブリン又はビメンチンのような細胞骨格のタンパク質の発現修飾を検出することが可能にならないことを示している（図１０）。
【０１８５】
得られた結果は、機序が明らかにされないが、ザイキシン発現率及び悪性形質転換の間の直接的な関係が存在することを明白に示す。外膜と結合したアクチン細胞骨格は、運動性（ラメリポディウム）、付着（付着板）又は細胞間の相互作用（接合板）において特異な機能を確実に行い得る、専門化されたドメインで組織される。蛍光顕微鏡の調査（図３）は、細胞中のザイキシン発現の減少が、付着及び接合板を犠牲にしてラメリポディウム型のドメインの配置という形で現れることを示す。アクチンフィラメントは、これら様々なドメイン、特に様々な構造の形成及び付随する分解を必要とする動的ドメインの形成及び維持に必要不可欠な役割を果たす。この条件で、これらの構造に介在する要素の１つの調節解除が系全体を混乱させるためには十分であることは、明らかである。ザイキシンは、マイクロフィラメント及び付着板の必要不可欠な構造上の構成要素であり、かつこれらマイクロフィラメントの組織（Ｃｒａｗｆｏｒｄ、Ａ．Ｗら、１９９２）並びに細胞の付着性（Ｍａｃａｌｍａ、Ｔら；１９９６）及び運動性（Ｄｒｅｅｓ、Ｂ．Ｅら、１９９９）に影響を及ぼす。従って、ザイキシンが過少発現する時に観察される細胞構造の修飾が、これらの細胞を腫瘍形成にするためには十分であることが可能である。細胞付着パラメーターの修飾は、細胞／環境の相互作用の修飾という形で現れ、結果として表現型修飾の原因となるキー遺伝子の発現の再プログラミングを伴う。このようにして、ザイキシンタンパク質の減少によってＮＩＨ３Ｔ３細胞中で誘発された腫瘍表現型の獲得により、浸潤性表現型の特徴を示す遺伝子発現の修飾、特にＴＩＭＰ２及びＴＩＭＰ３遺伝子及びプロテアーゼネキシン−１（ＰＮ−１）の過少発現及びプラスミノゲンの活性化因子ウロキナーゼの過剰発現に至ることが観察された（図１０）。従って、これらの遺伝子及びその発現生成物はザイキシンに関して前に記載したように、癌診断、予防又は治療、あるいは化合物のスクリーニングに有用な薬剤組成物の調製に、使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】外膜レベルでのザイキシン及びその細胞パートナー間の相互作用の図式である。
【図２】ザイキシンに結合されたウイルス輸送ベクターの構成の図式を表す。
【図３】特別に表される細胞構造の像を示す。図３Ａは、ＦＩＴＣに結合されたファロイジンプローブによる細胞のマーキングによって表されるアクチンフィラメントを示す。図３Ｂは、ＴＲＩＴＣに結合されたマウスの抗ＩｇＧ抗体によって表される抗ザイキシン抗体による細胞のマーキングによって表されるザイキシンの局在化を示す。
【図４Ａ】２５０ｐｂのヒトザイキシンプローブによる、１０μｇの全ＲＮＡからの、ザイキシンｍＲＮＡの検出によるノーザンブロットの結果を示す。
【図４Ｂ】ザイキシンの読み枠を含むレトロウイルスシャトル、ヒトザイキシン及びｎｅｏ／ＣＭＶプローブのオープンリーディングフレームを含むｍＲＮＡ及びノーザンブロットを表示するために使用されるザイキシンの略図である。
【図５】１０８１ｐｂのｎｅｏ／ＣＭＶプローブにより変成アガロースゲル上に堆積した１０μｇの全ＲＮＡから、ＬＴＲ  ５’由来のｍＲＮＡ検出によるノーザンブロットの結果を示す。
【図６】様々な細胞系統由来の６０μｇのタンパク質抽出物からの様々な細胞系統中ザイキシンタンパク質のウェスタンブロット及び免疫検出の像を示す。
【図７】ザイキシンＥ−Ｆクローンから抽出されたＥＷＳ−ＦＬＩ−１タンパク質のタンパク質抽出物の免疫沈降後に得られるウェスタンブロットの像を示す。
【図８Ａ】アンチセンス配列を表す。
【図８Ｂ】ザイキシンのＡＵＧに対するアンチセンスを発現させるレトロウイルスシャトルの構成の図式である。
【図８Ｃ】ザイキシンのＡＵＧ指向アンチセンスＲＮＡのＲＴＰＣＲによる検出を示す。
【図９】様々な細胞系統由来の４０μｇのタンパク質抽出物からのザイキシンタンパク質のウェスタンブロット及び免疫検出の像を示す。
【図１０】ＮＩＨ３Ｔ３系統及びＥＷＳ−ＦＬＩ系統、ａｓザイキシン１及びａｓザイキシン２の間の、マクロアレイによって行われる遺伝子発現率の変化の比較調査のグラフ図である。
【図１１】蛍光異方性によるアクチン重合のインビトロ測定を示す。
【図１２Ａ】ドラスタチン（Ｄ１１）の存在下でのＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の形態修飾の調査結果を示す：ＮＩＨ３Ｔ３非治療細胞。
【図１２Ｂ】ドラスタチン（Ｄ１１）の存在下でのＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の形態修飾の調査結果を示す：ＥＷＳ−ＦｌｉによってトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞。
【図１２Ｃ】ドラスタチン（Ｄ１１）の存在下でのＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の形態修飾の調査結果を示す：ＥＷＳ−ＦｌｉによってトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞。
【図１２Ｄ】ドラスタチン（Ｄ１１）の存在下でのＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の形態修飾の調査結果を示す：１０μｍのＪａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅの存在下でインキュベートされたＥＷＳ−ＦｌｉによってトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞。
【図１２Ｅ】ドラスタチン（Ｄ１１）の存在下でのＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の形態修飾の調査結果を示す：１００μｍのＪａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅの存在下でインキュベートされたＥＷＳ−ＦｌｉによってトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞。
【図１２Ｆ】ドラスタチン（Ｄ１１）の存在下でのＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の形態修飾の調査結果を示す：１０μｍのＤ１１によりインキュベートされたＥＷＳ−ＦｌｉによってトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞。
【図１２Ｇ】ドラスタチン（Ｄ１１）の存在下でのＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ−Ｆｌｉ細胞の形態修飾の調査結果を示す：２０μｍのＤ１１によりインキュベートされたＥＷＳ−ＦｌｉによってトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞。
【図１３】ＮＩＨ３Ｔ３及びＥＷＳ／Ｆｌｉ細胞に対するドラスタチン１１（Ｄ１１）の毒性の調査結果を示す。
【図１４】ドラスタチン１１の存在下のヌードマウスにおける腫瘍発達の調査結果を示す。
【図１５】位相差顕微鏡検査による細胞移動速度の調査結果を示す。
【図１６Ａ】ドラスタチン１１の化学構造を示す。
【図１６Ｂ】Ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅの化学構造を示す。
【図１】
2005504521.tif 000005
【図２】
2005504521.tif 000006
【図３】
2005504521.tif 000007
【図４Ａ】
2005504521.tif 000008
【図４Ｂ】
2005504521.tif 000009
【図５】
2005504521.tif 000010
【図６】
2005504521.tif 000011
【図７】
2005504521.tif 000012
【図８Ａ】
2005504521.tif 000013
【図８Ｂ】
2005504521.tif 000014
【図８Ｃ】
2005504521.tif 000015
【図９】
2005504521.tif 000016
【図１０】
2005504521.tif 000017
【図１１】
2005504521.tif 000018
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
2005504521.tif 000031
2005504521.tif 000032
2005504521.tif 000033
2005504521.tif 000034
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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