(57)【要約】本発明は、材料表面にまたは適当な界面に安定な形で自己形成性単分子層（SAM）を設けるための表面コーティング組成物、加えてそのような組成物を製造する方法、および望ましい性質を備えた表面を設けるために移植可能な医療デバイス表面などの表面をコートするのにそのような組成物を使用する方法に関する。本発明の方法は、SAMおよび表面自体の両方の特性及び/又は性能を実質上保持または改良するように、表面にSAMの共有結合的な結合を提供する。共有結合的な結合は、例えばその表面及び/又はSAM−形成分子自体によって提供される１以上の潜伏性反応性基の使用によって達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上に自己形成性単分子層を設ける方法であって、a)自己形成性単分子層分子で成形された単分子層および潜伏性反応性基の両方を該表面に設けること、およびb) 自己形成性単分子層分子自体によって提供される妥当な基の重合を開始すること、及び/又は自己形成性単分子層分子間で分子間結合を形成することによって、該表面に該自己形成性単分子層分子を共有結合的に結合させるため、及び/又は該表面に安定な単分子層フィルムを形成させるために適した条件で該潜伏性反応性基を活性化すること、なる工程を含む方法。
【請求項２】
該潜伏性反応性基が該表面自体によって提供される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該SAM形成分子がそれ自体に潜伏性反応性基を備える、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該自己形成性単分子層分子が、a)極性溶剤で該表面と自発的に結合する疎水性ドメインであって、その親水性ドメインが該分子を該極性溶剤中に分散させ、また該表面上で単分子層形成の後に極性相と結合したままである、疎水性ドメイン、またはb)非極性溶剤で該表面と自発的に結合する親水性ドメインであって、その疎水性ドメインが該分子を該非極性溶剤中に分散させ、また該表面上で単分子層形成の後に非極性相と結合したままである、親水性ドメイン、のいずれかを備えた両親媒性分子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該方法が実質上平坦なまたは成形された表面を使用した用途に適用される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該表面がセラミック、金属およびポリマー材料から選ばれた材料によって供給される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該表面が、オルガノシラン−前処理ガラス、オルガノシラン−前処理ケイ素材料および水素化ケイ素から選ばれた材料によって供給される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
該材料が、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリオレフィン、ポリ−(p−フェニレンテレフタルアミド)、ポリホスファゼン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート（ポリメタアクリレート含有）、およびシリコーンエラストマー、加えてそれらのコポリマーおよび組合せからなる群から選ばれたポリマー材料を含む、請求項６記載の方法。
【請求項９】
該表面が、潜伏性反応性基を該表面に提供するために適用される中間コーティングでコートされる、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
該表面がセラミック、酸化ケイ素、金属酸化物、またはガラス表面を含み、該中間層が光反応性シランを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該材料が移植可能なバイオセンサーの形で設けられる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該材料が小孔を有する移植可能なデバイスの形で設けられる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該移植可能なデバイスが種々の血管外科処置用の末梢保護デバイスを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該潜伏性反応性基が光反応性アリールケトンの形の光反応性基を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該方法が、a) そのいずれかまたは両方が妥当な潜伏性反応性基を備えた表面を有する支持体およびSAM組成物を供給すること、およびb)該支持体表面で該SAM組成物のコーティングを形成し、該潜伏性反応性基を同時に及び/又は逐次に活性化することによって結果として生じるコーティングを該支持体表面に共有結合的に結合させること、なる工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
該自己形成性単分子層分子自体が熱化学反応性基を備え、該方法が、結合分子の対応する反応性基と該自己形成性単分子層分子の反応性基間の反応によって該結合分子を該単分子層に結合させる、さらなる工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
該方法が、a)１以上の対応する熱化学反応性基を有する結合分子を供給し、それらの各熱化学反応性基間の熱化学相互作用によって該結合分子を該自己形成性単分子層分子に結合させること、およびb)そこに結合させられた該結合分子を有する固定された自己形成単分子層を設けるために該表面を該単分子層でコートすること、なる工程を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該結合分子がカップリング分子および生物ポリマーからなる群から選ばれ、また該結合分子が自己形成性単分子層のコーティングおよび固定化の前に該自己形成性単分子層分子に結合される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
表面に自己形成性単分子層を設ける方法であって、a)潜伏性反応性基と自己形成性単分子層分子で形成された単分子層双方を該表面に設けること、およびb)該自己形成性単分子層を該表面に共有結合的に結合させるために妥当な条件下で該潜伏性反応性基を活性化すること、なる工程を含み、ここで
a) 該自己形成単分子層−形成分子が、それ自体に潜伏性反応性基を備え、
b) 該自己形成性単分子層分子が、水溶液で該表面と自発的に結合する疎水性ドメイン、および該分子を水中に分散させかつ該表面上で単分子層形成の後に水相と結合したままである親水性ドメインを備えた両親媒性分子を含み、
c) 該表面が、オルガノシラン前処理ガラス、オルガノシラン前処理ケイ素材料および水素化ケイ素から選ばれる材料によって提供され、
d) 該潜伏性反応性基が、光反応性アリールケトンの形の光反応性基を含む、
方法。
【請求項２０】
該材料が、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリオレフィン、ポリ−(p−フェニレンテレフタルアミド)、ポリホスファゼン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート（ポリメタアクリレート含有）、およびシリコーンエラストマー、加えてそれらのコポリマーおよび組合せからなる群から選ばれたポリマー材料を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
潜伏性反応性基および自己形成性単分子層分子と組合わされた表面を含む、請求項１記載の方法の実施に適用されるシステム。
【請求項２２】
請求項１記載の方法に従って自己形成性単分子層でコートされた表面を含む材料。
【請求項２３】
不動態化効果を提供するために体内に該表面を移植する工程を含む、請求項２２記載の材料の使用方法。
【請求項２４】
１以上の潜伏性反応性基で誘導される自己形成性単分子層分子を含む組成物。
【請求項２５】
該分子が疎水性ドメインおよび親水性ドメインを含む両親媒性分子である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
該潜伏性反応性基が該疎水性ドメインに結合された光反応性アリールケトンを含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項２７】
該潜伏性反応性基が該親水性ドメインに結合された光反応性アリールケトンを含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項２８】
該分子がリノールアミドポリ（エチレングリコール）およびポリエーテルからなる群から選ばれる、請求項２７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一側面において、本発明はセンサーのような移植可能なデバイスの表面を不動態化するための方法および材料に関するものである。もう一つの側面では、本発明は自己形成性単分子層に関し、特に移植可能な医療デバイスのようなデバイスにおける表面コーティングとしてその組成物を使用することに関する。さらに他の側面では、本発明は表面処理のための光化学反応性基の使用に関する。
【０００２】
米国国立衛生研究所(NIH)認可番号1R43 GM58342-01と1R43 DK52756 および全米化学財団(NSF) 認可番号DMI96-61439とDMI99-01713に従って、米国政府が本発明に関して特定の権利を有して良い。
【背景技術】
【０００３】
移植可能なバイオセンサーのような移植可能な医療デバイスを製作するために使用される材料は、一般に特定の表面特性よりも本体の物理的性質のために選択される。その結果、そのデバイスは強度および弾性のような望ましい性質を有するかもしれないが、その表面は通常体液との相互作用について最適化されてはいない。例えば、たんぱく質の吸着を低下させ、湿潤性および滑性を増加させ、血栓形成およびバクテリアのコロニー化を減少させるために、そのようなデバイスの表面改質のための商業上利用可能な方法および材料が使用され得る。しかしながら、慣用的なコーティング技術および薬剤はしばしば、極薄コーティングを要する応用のためには必ずしもよく設計されたものではない。
【０００４】
そのような「極薄」の応用分野には、微小の細孔または約1ミクロン未満の大きさの構造上の特徴のいずれかを備えたその表面が含まれる。例えば、ドットミクロアレイシステムのような固相の受容体−配位子検定に基づくバイオセンサーは、ガラスのような基材表面に結合するときに所望の方法でそれら自身を適応させるための高分子の能力に基づくものである。主として、表面自体の性質（例えば表面電荷及び/又は双極子モーメント）は、高分子の性質と相互に補足し合うべきものである。しかし、経験上、大部分の結合蛋白質がバイオセンサーの作成に使用されるガラスまたは他の表面と必ずしも十分に適合するものではないことが示される。
【０００５】
カップリング分子または部分（例えばN−オキシスクシンアミド,エポキシ基）または生体分子（ビオチン/アビジン、または生体ポリマー）のような結合分子は、しかし、他の場合なら基材表面において過酷であるかもしれない環境からその結合分子を遠ざける化学スペーサーを介して表面に化学的に結合させ得る。そのような一つの態様において、結合された可溶性ポリマーの中間部及び/又は端部に蛋白質が結合させられる、親水性の表面環境が備えられる。このアプローチが、結合された捕獲部分における補足し合う相手との好ましい相互関係のための強められた蛋白質易動度およびそれによるより大きな機会を提供するかもしれないことが、示唆されてきた。生化学的に変性された表面の有効性を改良するための最も大きな可能性が、特定の結合性配位子を含む反応性スペーサーの腕を介して蛋白質を固定し得る表面工学に存在するように見える。理想的には、その基材物質が結合蛋白質を安定化させ、また不特定な相互作用を最小化させるべきである。
【０００６】
不動態化された生体分子適合性の合成表面を提供するために、種々の試みがなされてきている。これらの試みには、改良されたプラスチックの設計および製造、加えてプラスチック、シリカ、半導体および金属表面の薄いフィルムコーティングの使用が含まれていた。後者のアプローチでの重要な進展が、いくつかの学術的な、政府関係のおよび工業的な研究所から報告されている。そのような研究は、実施された親水性の界面活性ポリマーの吸着および熱化学的結合、親水性で不溶性のポリマーフィルムを得るための現場(in situ)重合/架橋、または機能化された親水性ポリマーおよび界面活性ポリマーの光化学的結合に頼る傾向があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、これらのいずれのアプローチも、１）極薄フィルムでの完全で均一な表面被覆、２）生体分子および細胞に対して最小で不特定な引力を有する親水性表面、３）移植可能な医療用表面の表面として使用するための十分な安定性、４）種々のプラスチックおよび無機センサーおよび医療用ディバイス材料への応用、及び/又は５）コーティング工程の容易性と再現性、のような性質の最適の組合せを達成してはいないように思われる。さらに、不動態化された表面は、通常の製造プロセスによって簡単に形成され、外科移植の前に移植組織が受ける通常の滅菌技術に対して耐性を有するものでなければならない。
【０００８】
別の課題では、種々の基材上に生物学的および非生物学的（例えば合成ポリマーの）分子の単分子フィルムを生成するために、自己形成された単分子層（self-assembled monolayer）（SAM）の技術が使用されてきた。そのような単分子層システムの形成は、多用性があり、自然に生ずる分子認識プロセスを真似ることができる生物表面の生体外発現のための方法を提供し得る。SAMはまた、基材表面上で固定された一つの認識中心または複合の中心の充填密度およびその環境について信頼性のある制御を可能にする。
【０００９】
一般に、SAMは、両者間における種々の非共有の相互作用によって、一定の表面上に残存する。しかしながら、出願人は、ベンゾフェノンで官能基化された基材に、ポリマーで支持された2層の脂質が結合した、少なくとも一つの例に気付いている。シェン(Shen W.)らのBiomacromolecules ２：７０−７９（２０００年１０月）を参照されたい。わきせりふとして、またベンゾフェノン誘導化体表面を使用した蛋白質の結合に関して、ドーマン（Dorman）およびプレストウイッチ（Prestwich）のTIBTECH  １８：６４（２０００）も参照されたい。それは、蛋白質上および生体分子固定用の表面上でのベンゾフェノン基の使用を論評している。
【００１０】
さらに他の課題について、本発明の譲受人は以前に、例えば表面を支持するためにポリマーおよび他の分子を結合させるためのような、光化学用の、および特に光反応性基用の種々の応用を記載して来た。例えば、米国特許第４，７２２，９０６号、第４，８２６，７５９号、第４，９７３，４９３号、第４，９７９，９５９号、第５，００２，５８２号、第５，０７３，４８４号、第５，２１７，４９２号、第５，２５８，０４１号、第５，２６３，９９２号、第５，４１４，０７５号、第５，５１２，３２９号、第５，５１２，４７４号、第５，５６３，０５６号、第５，６３７，４６０号、第５，６５４，１６２号、第５，７０７，８１８号、第５，７１４，３６０号、第５，７４１，５５１号、第５，７４４，５１５号、第５，７８３，５０２号、第５，８５８，６５３号、第５，９４２，５５５号、第５，９８１，２９８号、第６，００７，８３３号、第６，０２０，１４７号、第６，０７７，６９８号、第６，０９０，９９５号、第６，１２１，０２７号、第６，１５６，３４５号、第６，２１４，９０１号および公開されたPCT出願US８２/０６１４８、US８７/０１０１８、US８７/０２６７５、US８８/０４４８７、US８８/０４４９１、US８９/０２９１４、US９０/０５０２８、US９０/０６５５４、US９３/０１２４８、US９３/１０５２３、US９４/１２６５９、US９５/１６３３３、US９６/０７６９５、US９６/０８７９７、US９６/１７６４５、US９７/０５３４４、US９８/１６６０５、US９８/２０１４０、US９９/０３８６２、US９９/０５２４４、US９９/０５２４５、US９９/０８３１０、US９９/１２５３３、US９９/２１２４７、US００/００５３５、US００/０１９４４、US００/３３６４３および非公開のPCT出願US０１/４０２５５を参照されたい。
【００１１】
明らかに必要なことは、改良された表面コーティングを提供するための方法および試薬であり、上にリストされた種々の望ましい性質のさらに改良された組合せを有するものを含んでいる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、材料表面または適した界面において安定な形の、自己形成性単分子層（self-assembling monolayer）（SAM）のような界面活性単分子層を設けるための表面コーティング組成物を提供する。さらに本発明は、そのような組成物を製造するための方法、およびその表面に望ましい性質を備えるため、移植可能な医療用デバイスの表面のような表面をコートするためにそのような組成物を使用する方法を提供する。他の実施態様で、本発明は、そのような組成物でコートされた、またはコートされるように適合（例えば下塗り）された材料表面、およびそのような材料から製作された物品、加えてそのような材料表面および結果として生ずる物品を製造および使用する方法を、提供する。
【００１３】
ここで使用されるように、「自己形成性単分子層」(self assembling monolayer)の語は、一般に使用条件下で特別の表面上で実質上の単分子層を形成するために十分に適したいかなる組成物、典型的には界面活性剤組成物を言う。該界面活性剤自体は、単一のタイプまたはドメインであり、好ましくは該表面およびキャリアー溶剤とそれぞれ相応した異なる性質の2個（ジブロック）、3個（トリブロック）またはそれより多い異なる極性のドメインであり得る。「実質的に単分子層」（substantially monolayer）によって、該分子が、該表面（またはその望ましい部分）を覆い、観念的には該表面自体の共有結合的結合に近接して該分子を位置させるような実質上完全な層を形成し得ることが意味される。そのような単分子層が、同一及び/又は異なる分子のいずれかの付加的な層を準備し使用することを妨げるものではなく、事実それを促進している。
【００１４】
一側面では、本発明は、SAMおよび表面自体の両方の特性及び/又は性能を実質上保持しまたは改良するように、該表面へのSAMの共有結合的な結合を提供する。共有結合的な結合は、例えば該表面及び/又は該SAM形成分子自体のいずれかによって提供される、1以上の潜伏性反応性基を使用して達成される。ここに記載されるように、それ自体が光反応性基と共に誘導されるSAMー形成分子は、新規であると考えられる。任意の実施態様では、本発明は、該潜伏性反応性基の活性化による、該表面でフィルムの形をしたSAM形成分子（例えばそれ自体が重合可能な基を提供する）の重合、及び/又は該表面で形成された自己形成性単分子層分子間での分子間結合の形成のいずれかによって、表面へのSAMの安定な（必ずしも共有結合を必要としないが）結合を提供する。安定なフィルム形成の形式のいずれかまたは両方に追加して、本発明は、同一または異なる潜伏性反応性基の活性化による、該表面自体への共有結合的な結合の追加的選択肢を含む。
【００１５】
本発明に沿ってSAMでコートされた表面は、不動態化表面として、及び/又は該表面上での結合分子の固定のため、加えて滑性のような新しいまたは改良された物理化学的性質のためなど、種々の目的に使用され得る。本発明の方法は、特に多くのポリマー（例えばプラスチック）の表面を含めて、種々の材料の表面へSAMを直接結合させるために使用され得る。適した表面としては、チップ、シート、ビーズ、ミクロタイターウエルで提供され、単独でまたは他の材料またはデバイスと組合せて使用されるもののような、例えば平坦なまたは形づくられた（例えば成形された）表面が含まれ得る。該方法は、完全で均一なコーティングを提供する資質とともにその使用の容易性および低コストの面で、格別な有利性を提供する。
【００１６】
そのような表面は、望ましい不動態化効果を与えるために、移植可能なバイオセンサーの表面としての使用について、格別な実用性を有する。ここで使用されるように、「不動態化」（passivating）によって、体内での使用中に化合物または細胞の望ましくない不特定な結合に対して該表面が十分に保護されるということが意味される。さらに、該バイオセンサーは、該表面に設けられた特有の結合分子に対応する分子の特定の結合についてその望まれる用途に使用され得る。
【００１７】
そのような表面は、また体の内腔内での塞栓捕獲のために挿入可能な「塞栓捕獲」（emboli capturing）デバイスの製造で、格別な実用性を有する。そのようなデバイスは、典型的には、細長く伸びた部材上に設けられ、放射状に拡張される位置と放射状に収縮される位置の間で動き得る、拡張可能なメッシュまたはウエブのような塞栓捕獲デバイスを含む。その拡張される位置にあるときには、塞栓捕獲デバイスが、近位に開いた口で籠を形成する。
【００１８】
また任意に、該表面自体が光反応性基との反応に適合しない場合に特別に、該表面自体に潜伏性反応性（例えば光反応性）基を設けるために、適当な中間コーティングが適用され得る。例えば、セラミックまたはガラス表面に、光反応性シランがここで記載したように準備または入手され、適用され得る。同様に、金または他の貴金属の表面に、光反応性硫黄化合物（例えばメチルチオキサントンのようなチオールまたはチオエーテル）またはここに記載されるような他の適した化合物を使用して、中間コーティングが施され得る。さらに他の任意の、および好ましい実施態様では、SAMが、適当な界面で形成され、任意に固体支持表面に転写され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、a)自己形成性単分子層（SAM）分子で成形された単分子層および潜伏性反応性基の両方を表面に設けること、およびb) 自己形成性単分子層分子自体によって提供される適した基の重合を開始すること、及び/又は自己形成性単分子層分子間で分子間結合を形成することによって、該表面に該自己形成性単分子層分子を共有結合的に結合させる、及び/又は該表面に安定な単分子層フィルムを形成させるのに適した条件で該潜伏性反応性基を活性化すること、なる工程を含む、表面上に自己形成性単分子層を設ける方法を提供する。好ましい一実施態様では、該潜伏性反応性基が光反応性アリールケトンであり、該表面自体によって提供される。もう一つの実施態様では、該SAM形成分子がそれ自体に光反応性アリールケトンを備える。
【００２０】
さらに好ましくは、該自己形成性単分子層分子が、a)極性溶剤で該表面と自発的に結合する疎水性ドメインであって、それの親水性ドメインが該分子を該極性溶剤中に分散させ、また該表面上で単分子層形成の後に極性相と結合したままである、疎水性ドメイン、またはb)非極性溶剤で該表面と自発的に結合する親水性ドメインであって、それの疎水性ドメインが該分子を該非極性溶剤中に分散させ、また該表面上で単分子層形成の後に非極性相と結合したままである、親水性ドメイン、のいずれかを備えた両親媒性分子を含む。
【００２１】
該方法は、例えば実質的に平坦なまたは成形された表面などの適したいかなる表面での使用に適用され得る。次に、該表面は、セラミック、金属およびプラスチック材料から選ばれる材料によって提供され得る。例えば、該表面は、オルガノシラン−前処理ガラス、オルガノシラン−前処理ケイ素材料および水素化ケイ素から選ばれた材料によって、または、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリオレフィン、ポリ−(p−フェニレンテレフタルアミド)、ポリホスファゼン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート（ポリメタアクリレート含有）、およびシリコーンエラストマー、加えてそれらのコポリマーおよび組合せからなる群から選ばれたポリマー材料によって、提供され得る。
【００２２】
任意の実施態様では、該表面が、潜伏性反応性基を該表面に提供するために適用される中間コーティングでコートされ得る。例えばそこでは、該表面がセラミック、酸化ケイ素、金属酸化物またはガラス表面、および光反応性シラン含有該中間層を含む。
【００２３】
もう一つの任意の実施態様では、自己形成性単分子層分子自体が熱化学反応性基を備え、該方法が、結合分子の対応する反応性基と該自己形成性単分子層分子の反応性基間の反応によって該単分子層に結合分子を結合する更なる工程を含む。そのような分子は、
a)  １以上の対応する熱化学反応性基を有する結合分子を提供して、それらの熱化学反応性基間の熱化学反応によって該結合分子を該自己形成性単分子層分子に結合すること、および
b)  そこに結合した結合分子を有する固定されたSAMを設けるために、該表面を該単分子層でコートする、
更なる工程を含む方法で使用され得る。
【００２４】
好ましくは、該結合分子がカップリング分子および生体ポリマーからなる群から選ばれ、自己形成性単分子層をコートして固定する前に、該結合分子が該自己形成性単分子層分子に結合される。
【００２５】
出願人は、改良されたコーティングを施すために、自己形成性単分子層と組合せて潜伏性反応化学が使用され得る方法を見出した。出願人は、例えば該SAM自体の種々の物理化学的特性（例えば界面活性性）が、保持（および任意に改良）され、界面でまたは表面上で望まれる分子相互作用を得るために、使用され得ることを見出した。
【００２６】
本発明に関して使用されるように、「SAM組成物」（SAM composition）の語は、一般にキャリアー相（例えばキャリアー溶剤）中で提供される界面活性剤（好ましくは両親媒性SAM形成）分子を含む組成物を言う。該組成物は、次に、該分子を表面上でまたは界面で実質上単分子層の形に自然とならせるために、適当な表面または界面（例えば液−液、液−空気または液−固体界面）に十分に近接させられ得る。「両親媒性」(amphiphilic)によって、該分子が、各々が対応しかつ異なった物理的性質を備えた２以上の官能基（かつ一般に分離した）ドメインを有することが意味される。好ましい実施態様では、これらの性質は、例えば水−可溶基および水−不溶基のような水に対する異なった親和性の形になる。さらに、１以上の第１のドメインが、該表面または界面に対して強化された親和性（例えば疎水性）を有し、１以上の第２のドメインが、キャリアー溶剤に対して強化された親和性（例えば親水性）を有する。
【００２７】
該キャリアー溶剤（該SAM形成分子が最初にその中に供給される）および該支持体表面（該キャリアー溶剤がそこに適用される）が、典型的にはそれ自体で該SAMのそれぞれのドメインに対応した水に対する異なる親和性を有するだろう。さらに、キャリアー溶剤中のSAM分子の組成物が該表面または界面に物理的に近接するとき、該分子ドメインは、単分子層形成のため、該溶剤または表面/界面のいずれかの方に自ら自然と且つ優先的に向かう。該キャリアー溶剤は、さらに理想的には、そこでの該SAM形成分子の第２ドメインが優先的な溶解性または親和性を有し、それ自体は該表面に対する溶剤ではないようなものである。
【００２８】
該単分子層の形成中及び/又は形成の際に、該表面（または他の相との界面で）及び/又は該SAM形成分子自体によって提供される潜伏性反応性基は、かくして形成される単分子層を該表面または界面に共有結合的に結合させるために活性化され得る。本発明は、結果的にSAM組成物の選択によって、または表面/界面の選択によって限定されるものではなく、対応した表面または対応した界面に形成された単分子層を共有結合的に結合させるための一般的に応用可能な方法を提供するものである。
【００２９】
本発明の方法および組成物は、好ましくは無傷で完全な被覆の形で、表面上に安定なフィルムを施すという要望に向けられており、それに答えるものである。例えば界面活性性、遊離基架橋、および光化学ジラジカルカップリングを含む性質の任意の組合せが、提供され得る。さらに、本発明は、１）疎水性表面を実質上完全に覆い（可塑剤および粒子としての表面上におけるそのように可動性の「傷」（flaw）を置き換えないならば、少なくとも被覆）、２）弱い非共有結合的な会合から遊離基架橋を経て共有結合的な実質上単分子層のフィルムに転換し、および３）該重合（および分子間で架橋）された単分子層フィルムを下に敷かれた表面に共有結合的に結合する、単分子層を自発的に形成するために適用される組成物を提供する。
【００３０】
好ましい実施態様では、該方法および組成物が、オルガノシラン−前処理ガラス、オルガノシラ−ン−前処理ケイ素、水素化ケイ素、またはプラスチック（例えば、ポリメチルメタアクリレート、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、またはポリプロピレン）によって提供されるような、実質上平坦または成形された表面との使用のために適用される。もう一つの実施態様では、該方法および組成物が、例えばハイブリド化検定での使用のためのミクロウエルプレートのようなプラスチック材料上へSAMを固定するために使用される。
【００３１】
支持体表面は、結晶性熱可塑性プラスチック（例えば高密度および低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、アセタールレジン、ナイロンおよび熱可塑性ポリエステル）および非晶性熱可塑性プラスチック（例えばポリカーボネートおよびポリ（メチルメタアクリレート））からなる群から選ばれたプラスチック材料を含むが、それに限定されない種々の材料から製造され得る。適したプラスチックまたはガラス材料は、表面均一性、長期変形耐性、および熱分解耐性のような性質の望ましい組合せを提供する。
【００３２】
適した支持体表面の例は、金属、鉱物またはセラミック、およびポリマーを含む。適した金属は、例えばアルミニウム、クロム、コバルト、鉄、チタン、およびそれらの合金、加えてニチノールおよび他のニッケル−チタン合金、およびステンレススチールのような反応性金属を含む。適した鉱物またはセラミックの例は、アルミナ、ヒドロキシアパタイト、水晶、サファイア、シリカおよびガラスを含む。
【００３３】
他の適した支持体材料は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリオレフィン、ポリ−(p−フェニレンテレフタルアミド)、ポリホスファゼン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート（ポリメタアクリレート含有）、およびシリコーンエラストマー、加えてそれらのコポリマーおよび組合せのようなポリマーを含む。
【００３４】
さらに本発明は、支持体表面上にSAMを固定する方法を提供し、その方法は、
a)  表面を有する支持体とSAM組成物のいずれかまたは両方が妥当な潜伏性反応性基を備えた、該支持体とSAM組成物の両方を提供すること、および
b)  該支持体表面で該組成物のコーティングを形成し(例えば組成物に支持体を浸漬する)、該支持体表面に結果として生じるコーティングを共有結合的に結合させる（例えば該潜伏性反応性基を同時に及び/又は逐次に活性化することによって）こと、なる工程を含む。
【００３５】
任意に、またもし該SAMが残存するまたは他の適した反応性基を有するならば特に、該方法は、生体ポリマー、および特に、核酸、蛋白質、多糖から選ばれたもののような生体分子をさらに固定するために使用され得る。その場合の該方法は更なる工程を含むことになる。そのような生体分子は、該SAM自体の形成および結合と同時にまたは逐次に固定され得る。
【００３６】
そのような任意のアプローチでは、該方法が
c)  １以上の対応する熱化学反応性基（例えばアミン、ヒドロキシル、またはスルフヒドリル）を有する生体ポリマー（例えば核酸、蛋白質及び/又は多糖）のような生体分子を供給すること、
d)  SAMおよび支持体に該生体分子を結合させる（例えばかくしてコートされ固定されたSAMとの熱化学的相互作用によって）こと、および
e)  結合された生体分子と反応性のある生体分子をさらに固定するような意図された目的のために、結果として得られた支持体表面を使用すること、
なる更なる工程を含み得る。そのような更なる生体分子は、例えば、アレイにまたはミクロプレートウエル中に結合された対応する核酸のハイブリド化での使用のための核酸を含み得る。
【００３７】
そのようなSAM形成組成物は、また例えば２つの不混和材料間の界面で単分子層を自発的に形成させるためにも使用され得る。可逆的に活性化し得るアリールケトン光化学の使用は、結果として安定な炭素−炭素結合を形成させる水素引抜き反応の手段で、広い種々の目的物質との最適のカップリング効率を提供する。本発明の組成物及び方法は、潜伏性反応性の界面活性性との最適な組合せを提供するため、および望まれる場合には、マクロマー特性とともに、望まれ得る新しい性質（例えば不動態化）を該表面に安定して与える比較的薄いフィルムで表面をコートするための手段を提供するために使用され得る。
【００３８】
本発明のSAMは、空気−水の界面で予備形成されたフィルムの固体基材への転写を含むラングミュア  ブロジェット(Langmuir Blodgett)技術のような種々の方法を使用して製造され得る。SAMは、また適当な両親媒性剤を含む溶液中に適した基材を自然に浸漬させる自己形成プロセスによっても製造され得る。
【００３９】
水溶性のポリマーの候補であるポリ（エチレンオキサイド）（PEO）は、それが帯電されず、水素結合形成が比較的弱く、水相中で比較的大きな排除体積を該界面に存在させるためにつながれた（すなわち共有結合的に結合された）状態で十分に柔軟であるので、親水性ドメインとして使用するのに特に好ましい。
【００４０】
本発明で使用に適した好ましいSAM−形成分子は、例えばバスフ(BASF Corporation)から得られる界面活性剤であるPluronics系として商業的に入手できる。そのような界面活性剤は、エチレンオキサイド（EO）とプロピレンオキサイド（PO）のブロックコポリマーの形で供給される。バスフの文献によれば、他の非イオン系界面活性剤のクラスの大部分が入手可能な疎水性剤の数を限定し、親水性を変えることによってのみ界面活性機能における効果が変化する。PLURONICとPLURONIC Rの界面活性剤を比較すれば、それらは、疎水剤と親水剤の両方について増分を変化させている。加えて、異なるまたは交互に変わるEO/PO構造は、分子の内部でまたは端部で導入され得る。最後に、全分子量は変化しうるものである。
【００４１】
PLURONIC（商標）の非イオン系界面活性剤は、プロピレンオキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマーである。該プロピレンオキサイドブロックが、２個のエチレンオキサイドブロック（そこではxおよびyの両方が約１０から約５０の範囲で独立して変化する）間に挟まれている。
【化１】
2005520126.tif 000002
【００４２】
PLURONIC（商標）の界面活性剤の合成は、２工程のプロセスを含む。
１．プロピレングルコールの２個のヒドロキシル基にプロピレンオキサイドを制御して付加することによって、所望の分子量の疎水剤を作る。
２．親水性基の間に疎水剤を挟み込むためにエチレンオキサイドを付加する。その親水性基は、最終分子の１０−８０重量％を構成する。
【００４３】
この界面活性剤の群内でEOとPOの比率および重量が共に変化するので、コポリマーの構造、物理的構成および界面活性剤特性の間の関係を理解するための情報が製造者によって商業的に入手できる。
【００４４】
PLURONIC界面活性剤の幅広い使用が、界面活性剤の性質および特性のさらに広い選択を提供する更なる変性に導いてきた。PLURONICの構造での疎水性ブロックと親水性ブロックの置換えが、所謂似た性質を有するがいくつかの重要な違いを有する界面活性剤のPLURONIC R系を生み出している。
【化２】
2005520126.tif 000003
【００４５】
PLURONIC Rの界面活性剤の合成もまた、２工程のプロセスを含む。
１．  エチレングルコールにエチレンオキサイドを制御して付加することによって、所望の分子量の疎水剤を作る。
２．  その分子の外側に疎水性ブロックを形成するために、プロピレンオキサイドを付加する。
【００４６】
同様に、PLURONIC Rグリッドが入手でき、界面活性剤の構造、重要な物理化学的性質および機能の間の関係を理解するのに図式的なアプローチが提供される。
【００４７】
ここに記載されるように、自己形成は、該基材とコーティング材料間の固有な引力のため、最小の量のコーティング材料により均一で完全なコーティングを達成するための手段を提供する。加えて、それはまた、最も薄いコーティングすなわち単分子層の結合の機構も提供する。単分子層（または実質上単分子層）の自己形成は、医療デバイスおよびバイオセンサーへのコーティングで、非特定蛋白質の吸着およびバクテリア付着に対して改良された不動態性を備えた表面を生じさせるために使用され得る。そのような改良は、少なくとも部分的には、該層自体によって達成されるスムーズで完全な被覆、および本発明に沿った共有結合的な結合によって与えられる改良された耐久性の両方によってなされる。出願人は、自己形成が必要最小量の材料で薄くて均一なかつ不動態のコーティングの形成を促進するということを見出した。
【００４８】
自己形成する光反応性ポリマーの特に好ましい２つのクラス、すなわち脂肪酸PEGおよびポリエーテルが合成され、以下のように実施例とされた。２クラスの化合物は、それぞれ光反応性ジブロック分子の形であり、さらにそれぞれが、蛋白質吸着に対して表面を不動態化するのに十分なポリエチレングリコール（PEG）ドメイン、およびプラスチック表面上での形成を助けるのに十分な疎水性ドメインを含む。そのようなPEGジブロックは、疎水性表面で自然と自己形成し得る。実施例とされた化合物の他の重要な特徴は、それらの各々がベンゾフェノン部分を含むことによる光反応性である。一度照射されれば、ベンゾフェノンが反応性の三重項状態で存在し、該表面から水素原子を引抜き、さらに炭素−炭素結合形成のため結果的に生ずる表面ラジカルと結合し得る。結果的に生じる組成物は、紫外線で表面上の分子を照射することによってプラスチック上の自己形成する両親媒性ジブロック分子を「固定」(fix)させる。
【００４９】
自己形成プロセスによる表面のコーティングは、単一工程で実施され得て、大部分の生体物質に対して適用可能である。これらの両親媒性分子は、水溶液から該表面と自発的に結合する光反応性疎水性ドメイン、および水中に該分子を分散させて、該表面上での単分子層形成後に水相と結合したままになる親水性ドメインで構成される。
【００５０】
共有結合は、かくして生体物質表面とコポリマーの疎水性ドメイン間に達成され得る。さらに、親水性ドメインは、基礎をなす疎水性ドメインまたは基礎材料とは対照的に、自由でかつ水溶液中に広がったままで残り、多分溶液中の生体分子を親水性ドメインで覆われた表面のみと効果的に「出会う」(see)ようにする。それ故、親水性ドメインは、観念的には、生体分子への最小の引力と最大の斥力を示す。静電力は、大部分の蛋白質および細胞物質に対して引力と斥力の両方であり、水素結合は、それらについて本質的に万能の引力である。それ故、親水性ドメインは、最小の水素結合の可能性と最大の力学的斥力エネルギーを備えて中立であるだろう。
【００５１】
本発明の試薬は、任意に、ポリマーの骨格に共有結合的に結合した１以上のペンダントの潜伏性反応性（好ましくは光反応性）基を有する。他に、そのような光反応性基は、支持体表面自体または適当な結合試薬によって提供され得る。光反応性基は、ここで定義されており、好ましい基はそのような性質を維持した状態で保存されるのに十分に安定である。ここに参考として開示がなされている米国特許第５，００２，５８２号を参照されたい。潜伏性反応性基としては、その電磁気スペクトルの種々の蛋白質に反応するものが、特に好ましくはそのスペクトルの紫外部および可視部に反応するもの（ここでは「光反応性」（photoreactive）と言う）が選択され得る。
【００５２】
光反応性基は、例えば同一または異なる分子によって提供されるような、隣接する化学構造との結果的な共有結合的結合を伴う活性種が生成するように、特定的に適用される外部刺激に反応する。光反応性基は、保存条件下で変化しない共有結合的結合を維持するが、外部からのエネルギー源によって活性化されて他の分子と共有結合的結合を形成する分子中の原子の群である。
【００５３】
光反応性基は、遊離基、特にニトレン、カルベン、および電磁気エネルギーを吸収して活性化された状態のケトンのような活性種を生成させる。光反応性基は、電磁気スペクトルの種々の部分に反応するように選択されるかもしれない。そして例えばそのスペクトルの紫外部および可視部に反応する光反応性基は、ここでは時には「光化学基」（photochemical group）または「光基」（photogroup）と言われるかも知れない。
【００５４】
アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン系複素環（すなわち第１０位の位置にN、OまたはSを有するもののようなアントロンの複素環式類似物）、またはそれらの置換（例えば環置換）誘導体のような光反応性アリールケトンが好ましい。ここで記載される活性化/不活性化/再活性化のサイクルを受けるようにすでにできていることから、そのようなケトンの官能基が好ましい。三重項への項間交差を受ける励起された一重項の初期形成を伴う光化学的励起が可能であることから、ベンゾフェノンが特に好ましい光反応性部分である。励起された三重項状態は、水素原子（例えば支持体表面から）の引抜きによって炭素−水素結合に挿入可能であり、かくしてラジカルペアーを生じる。そのラジカルペアーのその後の崩壊は、新しい炭素−炭素結合の形成につながる。もし結合のための反応性結合（例えば炭素−水素）がなければ、ベンゾフェノン基の紫外線誘導の励起が可逆的であり、エネルギー源の除去でその分子が基底状態のエネルギーレベルの戻る。ベンゾフェノンおよびアセトフェノンのような光活性化可能なアリールケトンは、これらの群が水中で複合の再活性化を受けやすく、高められたコーティング効率を提供することから、特に重要なものである。かくして、光活性化可能なアリールケトンが特に好ましい。
【００５５】
アジ化物が、光反応性基の好ましいクラスを構成し、フェニルアジドおよび特に４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジドのようなアリールアジド（C6R5N3）、ベンゾイルアジドおよびｐ−メチルベンゾイルアジドのようなアシルアジド（−CO−N3）、ギ酸エチルアジド、ギ酸フェニルアジドのようなギ酸アジド（−O−CO−N3）、ベンゼンスルホニルアジドのようなスルホニルアジド（−SO2−N3）、ジフェニルホスホリルアジドおよびジエチルホスホリルアジドのようなホスホリルアジド（RO）2PON3、を含む。ジアゾ化合物が、もう一つの光反応性基の好ましいクラスを構成し、ジアゾメタンおよびジフェニルジアゾメタンのようなジアゾアルカン（−CHN2）、ジアゾアセトフェノンおよび１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノンのようなジアゾケトン（−CO−CHN2）、ｔ−ブチルジアゾアセテートおよびフェニルジアゾアセテートのようなジアゾアセテート（−O−CO−CHN2）、t−ブチルアルファジアゾアセトアセテートのようなベータ−ケト−アルファ−ジアゾアセテート（−CO−CN2−CO−O−）を含む。他の光反応性基は、３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリンのようなジアジリン（−CHN2）、およびケテンおよびジフェニルケテンのようなケテン（−CH＝C=O）を含む。
【００５６】
光反応性基の活性化については、試薬分子が、該光反応性基の残基を介して共有結合的結合によって、他の及び/又は材料表面のいずれかに共有結合的に結合される。実施例としての光反応性基、および活性化でのそれらの残基が、以下に示される。
【００５７】
光反応性 基 残基の官能基
アリールアジド                            アミン            R−NH−R’
アシルアジド                              アミド            R−CO−NH−R’
ギ酸アジド                                カルバメート      R−O−CO−NH−R’
スルホニルアジド                          スルホンアミド    R−SO2−NH−R’
ホスホリルアジド                          ホスホルアミド    （RO）2PO−NH−R’
ジアゾアルカン                            新C−C結合
ジアゾケトン                              新C−C結合およびケトン
ジアゾアセテート                          新C−C結合およびエステル
ベータ−ケト−アルファ−ジアゾアセテート  新C−C結合およびベータ−ケトエステル
脂肪族アゾ                                新C−C結合
ジアジリン                                新C−C結合
ケテン                                    新C−C結合
光活性化ケトン                            新C−C結合およびアルコール
【００５８】
１以上の潜伏性反応性基が、いかなる適した方法によってもSAM−形成試薬に結合され得る。好ましくは潜伏性反応性基それ自体が、直接または結合基を介して、該試薬に共有結合的に結合される。本発明のコーティング組成物は、例えばその調整の前または後に混合された１以上の潜伏性反応性基をSAM−形成分子に供給することによって、いかなる形式によっても調整され得る。例えば、完全なSAM−形成分子が、分子の反応性のまたは官能基化された端部のいずれかで、または反応性のまたは官能基化されたペンダント位置で、潜伏性反応性基を共有結合的に結合することによって、１以上の潜伏性反応性基と共に誘導され得る。SAM−形成分子は、しばしばヒドロキシルまたは他の官能基を分子のいずれかの端部に有する。それ程頻繁ではないが、それらの同様な官能基が、主なポリマー骨格を枝分れさせ、また潜伏性反応性基と共に誘導化される。
【００５９】
対照的に、SAM−形成分子は、例えば該SAM−形成分子自体を準備するために使用される結合ブロックにそのような基を導入することによって、１以上の潜伏性反応性部分を備えた合成分子を供給する形式で合成され得る。例えば、光反応性基を含む重合のためのモノマーが作られ得る。紫外線無しに、または保護されるべき基を用いずに重合がなされるならば、該光反応性基が自己形成後に該自己形成性分子を適切に光固定するための能力を保持する。代わって、該SAM−形成分子が、いずれかが潜伏性反応性基を含んで良い２または３セクションから合成され得て、その後そのセクション自体が該SAM−形成分子を供給するために結合され得る。
【００６０】
当業者は、ここでの記載を得て、潜伏性反応性基の数、位置および空間が、自己形成性分子の合成のデザインで制御され得ることを理解するだろう。例えば、異なる疎水性を備えるブロックを作り出すために２以上のセクションを組み合わせるデザインでは、潜伏性反応性基の異なる量で異なる結合ブロックが使用され得る。自己形成は、溶剤に対して異なった疎水性または引力のブロックを必要とするが、その違いはPluronics（商標）の三重項化合物の場合のように小さくて良く、そこでは中間ブロックがモノマー単位で外側ブロックよりも１個多い炭素を有する。そのため、光反応性基は、該SAM−形成分子のいずれのブロックにも導入され得る。結合ブロックは、光反応性モノマーおよび非光反応性モノマーのランダム重合によって作成され得て、そこでのその系に導入されるモノマー比を制御することで、最終的に合成されるブロックの光負荷を制御する。また、結合ブロックは、並んでまたは他方からある距離に位置して指定された場所において特定の数の光反応性基で作成され得る。少なくとも１個、可能なら数個が光反応性である異なった結合ブロックをカップリングして、異なる光反応性SAMが、異なるブロックについての、または異なる比の光反応性基と共に作られ得る。
【００６１】
好ましい実施態様では、例えば光基が、エポキシド、アクリレート、アクリルアミド、メタアクリレート、メタアクリルアミド、スチレン、ビニルピリジン、ビニルピロリドン、または他の適したモノマーに結合されたベンゾフェノンのような光反応性モノマーを重合することによって結合される。この光反応性モノマーはまた、同一または異なるタイプの非光反応性モノマーの存在で合成され得る。特に好ましい実施態様では、重合が、異なった疎水性の非光反応性ブロックの除去で開始され、かくして単一工程で光反応性SAMが作り出される。比較すれば、光反応性ポリマーもまた、リンカーを介して異なる疎水性の他のブロックに共有結合的に結合されることができ、または第２ブロックが、異なるモノマーと共に、または異なるモノマー比で、第１ブロックの除去で重合され得る。
【００６２】
もう一つの好ましい実施態様では、予備成形された親水性ブロックが、ヒドロキシル官能基を介して、より疎水性の他の予備成形ブロックに結合される。この疎水性ブロックは、一端でベンゾフェノン、または他の光反応性基を結合させることによって、その前に誘導されている。この合成法は、２工程で達成され、非常によく明確化された構成で生成物を提供する。
【００６３】
本発明の組成物および方法は、例えばそれらの隙間をふさぐことなく材料がコートされるように、小さい隙間を有するポリマー材料にコーティングするモノマーを提供するために使用され得る。そのような好ましい１実施態様では、例えばSAM−形成分子自体が、１以上の適した光基で誘導体化される。特に好ましい実施態様では、１以上の第１ドメイン（表面または界面について親和性を有する）が、そこへ共有結合的に結合した１以上の潜伏性反応性基を備える。単分子層を形成する過程では、第１ドメイン自体が、SAMと表面間に共有結合的結合を形成するために結合された潜伏性反応性基を活性化させるため、表面に十分に接近して（単分子層形成の間及び/又はそれに続いて）位置する。
【００６４】
該組成物および方法はまた、ガラス、セラミックおよび貴金属などの金属のような無機基材をコーティングする単分子層を提供するためにも使用され得る。そのような実施態様では、光反応性基とのカップリングに適した潜伏性反応性基または疎水性ターゲットを提供するように、直接または中間コーティングを介して、表面自体が誘導体化され得る。SAM組成物は、それ自体の潜伏性反応性基と共にまたは無しに、潜伏性反応性基の活性化によって、表面にコートされてそこへ共有結合的に結合され得る。本発明は、例えば、表面に潜伏性反応性基を提供するため、無機表面をコートするために使用され得る中間コーティング試薬を提供する。好ましい実施態様では、例えば、この中間コーティング試薬は、ここに記載されるような光シラン試薬を含む。SAM−形成組成物は、第１ドメイン（表面について親和性を有する）を共有結合的に結合させるため、表面結合潜伏性反応性基を活性化させるのに適した条件下でそのようにコートされた表面に適用され得る。
【００６５】
特に好ましい実施態様では、該方法および組成物が、ここで参考資料に含められる米国特許第６，２４５，０８９号に記載されるタイプの塞栓捕獲（「末梢の保護」（distal protection）としても知られる）デバイスのようなデバイスの表面をコートするために使用される。その組成物は、多孔性材料の表面を適切にコートできることによる特別な利点を提供し、意図される目的に適さないものになる程不当に細孔をふさぐことがなく、望ましい制御可能な形でそれらの物理化学的特長を変える。
【００６６】
他の好ましい実施態様では、本発明は、とりわけ光化学カップリングおよび表面コーティング技術を、ガラスおよびシリコンのチップセンサー表面を用いる光ミクロセンサーデバイス技術と組み合わせる。その結果として得られる組合せは、センサー表面における特定結合分子の化学結合のコスト、容易さ、および空間の制御において有意な改良をもたらす。
【００６７】
そのような実施態様で、本発明の方法および組成物は、a)センサー表面での阻害分子の不特定吸着を減少させ、b)固定化された結合生体分子の保存および機能のための安定化された分子環境を提供し、c)溶剤中でその配位子と作用し合うために最適な自由度を固定化結合生体分子に与え、そしてd)生物学的原材料のためにコスト的に有効な固定化手順を提供するために適用される、ガラスおよび他のセンサー材料についてのコーティング化学を提供することによって、蛋白質コートバイオセンサーの表面の開発での現状の問題点に向けられている。
【００６８】
本発明は、例えば、遺伝子シークエンス、癌、伝染病、および毒性薬剤に関する複数のマーカーの適時の測定のための信頼できるバイオセンサーシステムの開発に対する決定的で持続的な障害を解決するためのアプローチを示す。本発明は、例えば健康関連ミクロ分析のための改良された複数分析バイオセンサー技術の開発と使用を可能にする。本発明はさらに、潜伏性反応性基技術の表面の一般的な不動態化およびセンサー表面でパターン化された結合基の固定への展開を可能にする。
【００６９】
典型的なセンサー表面は、例えば、両親媒性ポリマーまたは蛋白質で不動態化され、広範囲で有用なビオチン−−アビジン結合ペアーでパターン化されたガラスである。ビオチンは、（１）マスクを介しての照明で、光化学的に微小ドット状に（例えば平均直径約１ミクロンと５００ミクロンの間で）共有結合的に不動態化表面に結合され、（２）粗原料物質から由来した親和性による非常に高い親和性の複数−部位結合蛋白質X−アビジン（NeutravidinTMのアビジンまたはストレプトアビジン）で飽和され、（３）検出/特定のための望ましくビオチン化されたオリゴヌクレオチドでのインク−ジェットプリント及び/又は接触プリントによって、その固定されたX−アビジンドットに負荷がかけられ得る。かくしてこのアプローチは、模様のついた複数分析バイオセンサー表面に関するコスト的に有効なコーティング技術を提供するための、ジラジカル光化学、自己形成、および高親和性の特定結合ペアーの革新的な組合せを示す。
【００７０】
表面のミクロ/ナノ−パターンでの改質は、情報の獲得、保存、処理および分配に急速に拡大している技術である。特別に興味ある応用分野は、（１）バイオセンサー（特に、特定−結合分子のセンサー表面との結合および機能の相互関係）[１]、（２）診断および複合組織表面でのパターン化された成長および機能細胞（例えば神経再生および機能的な神経−電極接続）[２]、および（３）絶縁体表面の導電回路の安定な堆積/接着[３]を含む。出願人は、改良された光反応性試薬を合成して提供し、感度が良く、特異的で、かつ迅速な複数−分析検知能力のための光デバイスで使用されるガラスおよびシリコンウエハーに広く応用可能な生化学的結合剤（ビオチン）のミクロ−パターン結合のための表面コーティング技術を示す。
【００７１】
本発明の組成物および方法は、バイオセンサー表面での機能的に安定な特定−結合分子を準備するためのコスト的に有効な方法の要求に対して、商業的に利用可能な解決を提供する。この組成物およびその使用は、オリゴヌクレオチドおよび抗体を含む広範囲の特定結合蛋白質の、この不動態化/安定化コーティングによって生体分子の保存および機能に有意により適合して作成されたセンサー表面上での、たやすい固定に応用可能である。光活性化可能なセンサー表面と、特定結合基の配列を含む不動態化親水性ポリマー[１９]の共有結合的に結合された薄いフィルムでの完全なカバーの提供は、特定結合蛋白質の活性消失、および検定サンプルの組成の非特定結合による検定障害から生ずる弱い信号−ノイズ比の問題を緩和し得る。
【００７２】
バイオセンサー表面の不動態化、および遺伝子シークエンスの分析のための特定生化学的結合剤のそこへのミクロパターン固定のための試薬と技術に関するこの開発は、その様なコーティング技術を、
・  伝染病診断−−抗生物質耐性を含むウイルスおよび微生物の病原菌診断−関連基；
・  遺伝子シークエンス−−アフィメトリック（Affymetrix）およびその他[２９]によっ    て活用された光非保護順列組合せ論的固相合成化学の代替；
・  遺伝子欠陥評価−−嚢胞性fibrosis 肺癌  結腸癌等のような遺伝病
・  血統の評価/法廷での判決
・  化学的および生物学的な原因物質の検出と特定；
・  誤用薬剤の検出と測定
のように、ビオチン化オリゴヌクレオチドおよび抗体との使用に適用できることを示す。関連する形として、出願人は、これらのおよび他の特徴と特性によって、この技術がパターンにされた高度の解の生体分子固定に特に適するようになることを見出した。出願人は、バイオセンサー応用のためのこのユニークな光化学的表面「テイラリング」(tailoring)技術の開発のための適当なモデルとして、アビジン−−ビオチンの高親和性（ka=1015M-1）一般−結合バイオセンサーを目指した。
【００７３】
ここに記載されるように、「不動態化」(passivation)の誤は、一般に水性（および典型的には生物学的）環境中に置かれた表面上のまたは表面への蛋白質および細胞物質の不特定な結合の阻止を言う。本発明では、典型的には本来的に疎水性の材料の表面上に、自発的に形成される界面活性剤分子の単分子層を供給して、共有結合的に結合させることによって、表面が不動態化され得る。
【００７４】
好ましい界面活性剤分子は、水性キャリアー流体中に分子を分散させるのに十分な、a)１以上の疎水性第１ドメイン、およびb)１以上の分離性親水性第２ドメイン、の両方を含む両親媒性分子である。その組成物が疎水性表面に適用されるとき、疎水性ドメインが、水性相と結合したままの親水性ドメインと共に、自発的に水性キャリアー流体から表面の方に結合させられて、該分子の単分子層を形成する。さらに、該基が活性化されて、疎水性部分（およびさらに該試薬自体）と表面間に共有結合的な結合を形成するように、疎水性ドメイン及び/又は該表面自体のいずれかによって、潜伏性反応性基が供給され得る。
【００７５】
さらに、親水性ドメインが、周囲環境（例えば該表面に接触する溶液及び/又は組織）中の分子と自由に接触、または作用し合う。親水性ドメインは、選択された分子に対する望ましいレベルの引力または斥力を提供するように、選択されて使用される。
【００７６】
ここに記載される安定な薄いフィルムによる表面の不動態化へのアプローチは、例えば
ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレンのような材料でできたもの、ヘキサメチルジシラザンで予備コートされた（界面活性剤の堆積および光化学カップリングのための疎水性炭化水素−コーティング表面を提供するため）ミクロウエルプレートおよびガラススライドを含むバイオセンサーおよび医療デバイス用に使用される種々の材料で使用され得る。
【００７７】
本発明の組成物および方法はまた、使用されまたは開発中として現在知られたものに比べて、たやすく、再現性があり、コストの点で有効である。コートされるべき表面は、適当な形式で簡単に水性溶液または光界面活性剤の懸濁液にさらされることができて、必要に応じて、ミセルまたは他の過剰の試薬を除くために簡単にリンスされ、そして濡れた状態で照射される。
【００７８】
固体表面への蛋白質および細胞構造体の結合を最小にする能力は、一般的な医療デバイス工業および特にバイオセンサー工業にとって大きな商業的価値がある。本発明の組成物および方法は、種々のバイオセンサーおよび医療デバイスの材料と共に改良された結果を呈してきており、特にパイロット段階の形成および製造段階の形成規模にまで最適化および開発されるのに良く適している。
【００７９】
本発明は、次の非限定の実施例と共にさらに記載される。本発明の範囲から離れることなく記載された実施態様において多くの変更がなされ得ることは、当業者にとって明らかである。かくして、本発明の範囲は、この出願に記載の実施態様に限定されるものではなく、請求の範囲の語によって記載された実施態様およびそれらの実施態様と均等なものによってのみ限定される。もし他に示されなければ、全パーセンテージは重量によるものであり、全分子量は数平均として表される。
［実施例］
【００８０】
次の実施例は、１）潜伏性反応性基がコーティング組成物の一部である潜伏性反応性の自己形成性単分子層（SAM）コーティング、および２）それ自体が潜伏性反応性の機能を備える非光反応性の自己形成性単分子層（SAM）コーティングの使用の、二つの一般的カテゴリーに分類される。もし他に示されなければ、分子量は数平均分子量として提供される。その実施例の概略は、次のように述べられる。
I. 潜伏性反応性基を含む自己形成性単分子層コーティング
１．合成
A.脂肪酸−ポリエチレングリコール（PEG）化合物
１．４,４’−ジアミノベンゾフェノンのリノレオイルクロライドへの付加
２．４−アミノ，４’−リノールアミド−ベンゾフェノンのモノ−メトキシ−ポ            リエチレングリコール−酸塩化物への付加
B.ポリエーテル
１．一般的なエポキシド重合
２．ジブロックコポリマーの一般的なコーティング方法
３．表面分析
４．表面評価−最適化されたコーティングの不動態化レベル
II. 潜伏性反応性基を含む表面での自己形成性単分子層コーティング
１．光反応性ガラス表面の準備
２．生体分子の不特定吸着に対するバイオセンサー表面の生成と不動態化
３．光表面での官能基化されたSAMを備えたバイオセンサーの生成
４．４検体のオリゴヌクレオチドミクロアレイを生成するための光表面上でのSAMの        使用
【００８１】
本実施例は、とりわけ、潜伏性反応性（例えば光反応性）基を付加した、少なくとも一種の実質上親水性のポリエチレングリコール（PEG）ドメインと少なくとも一種の実質上疎水性のアルカンドメインを含むコポリマーの形でのSAM−形成分子の合成を記載する。適当な（極性）キャリアー溶剤内に供給されるとき、これらの分子は、疎水性プラスチック上で自己形成可能であり、照明によって固定され、耐久性のある不動態化コーティングを生ずる。任意に疎水性ドメインにビニル基を導入することは、付加されたモノマー、マクロマー、及び/又は望まれればポリマーでのコーティングの架橋および重合を生じさせる。この記載により当業者は、光反応性基の数と場所、ポリマー基（例えばビニル）のタイプ、数および場所、および親水性基の特性（例えばPEG骨格の長さ）が独立して変えられ得ることを理解するだろう。
【００８２】
一度表面に適用されると、SAM−形成分子水溶液の使用で、非常に薄い濃度（０．０１mg/ml−１mg/mlのオーダーのキャリアー溶剤）で３０分以内に自己形成が生じ得る。本発明のコーティングは、極端に薄く、理想的には単分子層として、また表面に耐久性を持って結合された形で、形成され得る。好ましいコーティング（例えば親水性ドメインとしてPEGと有する）は、不特定の蛋白質吸着とバクテリア付着に対して不動態化の効果を呈する。
【００８３】
光反応性SAM形成化合物の一般的な２タイプが、以下に実施例として示される。１タイプの例として、ベンゾフェノンを介して、親水性PEGを疎水性脂肪酸と接続することによって、脂肪酸−PEG化合物が合成される。この場合、その分子の全く別の２部分を結合するために、ベンゾフェノンが、光固定剤およびスペーサーの両方の役目をする。これらの化合物は、PEG鎖の長さを変化させることによって、または疎水性鎖として異なる脂肪酸を使用することによって変えられ得る。分子当り１ベンゾフェノンのみが使用されるので、このアプローチを使用して、光反応性の程度が一般的に変えられるわけではない。第２のタイプの光反応性ポリエーテルは、SAMのデザインおよび合成においてより多くの柔軟性をもたらす。この群のジブロックポリマーは、エポキシド重合の陰イオン開始剤として供するPEG鎖を使って生成される。重合のために使用されるエポキシドモノマーの数を変えることによって、光負荷、疎水性および付加的な架橋可能性が選択され、制御され得る。
【００８４】
ジブロック化合物の両タイプは、例えば疎水性プラスチック表面上で水溶液からの自己形成が可能である。両者は、紫外線照射によりプラスチックへ共有結合的に結合されることが可能であり、プラスチック上のPEGコーティングを提供する。生成されたPEGコーティングに結合されて、不特定の蛋白質吸着とバクテリア付着に対してプラスチックを不動態化することが提供される。
【実施例１】
【００８５】
脂肪酸−PEG化合物の合成
光反応性脂肪酸−PEGジブロックの合成を記載するために、リノール酸が代表的な脂肪酸として選択された。合成されたリノールアミドPEG化合物は、メトキシ末端PEGドメインと疎水性リノールドメインを含む、２ドメインから成る。リノールアミドPEG化合物生成のための全体合成スキームは、図１に示されるように、４,４’−ジアミノベンゾフェノンのリノレオイルクロライドへの最初の付加、それに続くPEGの付加、酸塩化物部分との適当な官能基化を含む。典型的には、未反応薬剤およびリノール酸が両方のアミノの位置で反応した生成物を含む望ましくない生成物を除くために、第１工程の後に、精製が必要とされる。
【００８６】
【化３】
2005520126.tif 000004
【００８７】
４,４’−ジアミノベンゾフェノンのリノレオイルクロライドへの付加
ジアミノベンゾフェノン（０．７１ｇ）が、窒素雰囲気下で、火炎で乾燥された丸底フラスコ内の乾燥テトラハイドロフラン（THF,65ｍｌ）に溶解された。リノレオイルクロライド（１ｇ）が、注入器を介してシールされたアンプルから添加された。その反応混合物が、室温で１時間攪拌され、次いで水冷却、抽出精製および洗浄がなされた。その黄色い粗反応混合物が、９５：５クロロホルム：メタノール溶離剤でカラムクロマトグラフィによってさらに精製されて、０．９６ｇの黄色オイルを得た。
【００８８】
４−アミノ，４’−リノールアミド−ベンゾフェノンのモノ−メトキシ−ポリエチレングリコール−酸塩化物への付加
モノ−メトキシ−ポリエチレングリコール酸（１．７５ｇ、分子量〜５０００、Shearwater Polymers, Huntsvill，アラバマ州）が、乾燥塩化メチレン中に溶解され、かつ塩化オキサリル（０．５ml）が窒素雰囲気下で添加された。泡立ちが続き、反応混合物が室温で一晩中攪拌された。溶剤が回転蒸発によって除去され、PEG−酸塩化物がクロロホルムで２回洗浄された。PEG酸塩化物が、アルゴン雰囲気下で、塩化メチレン：テトラハイドロフランの１：１（v/v）混合物中に再溶解された。ベンゾフェノンリノールアミド（０．１５ｇ）のテトラハイドロフラン（１０ｍl）溶液が反応混合物に液滴添加され、トリエチルアミン（０．１ml）の液滴添加がその後に続けられた。２時間後に、その反応は完了され、１０％w/vの炭酸ナトリウム水溶液の添加により冷却された。その有機層が、再度炭酸ナトリウム水溶液で洗浄され、さらにHCl（０．１N）水溶液で洗浄され、硫酸マグネシウムで乾燥される前に、最後に脱イオン水で洗浄された。生成物が、９０：１０（v/v）クロロホルム：メタノール溶離剤でカラムクロマトグラフィによって単離されて、０．９９ｇの最終生成物を得た。
【００８９】
同様の手順で、それぞれ分子量７５０および３５０のポリエチレングリコールドメインを備えた化合物が合成された。
【００９０】
ポリエーテルの合成
ポリエーテルが、図２に示されるように、脱プロトン化され予備成形されたモノ−メトキシPEGから陽イオン重合を開始し、種々の官能基化されたエポキシドを重合することによって合成された。エポキシドが、ベンゾフェノン基、エチル基またはアリルオキシ基で誘導された。これら全ての基は、ポリエチレングリコールより有意に疎水性であり、そこではPEG−リノールアミドと同様に、親水性ドメインと疎水性ドメインを持つジブロックを形成する。
【００９１】
【化４】
2005520126.tif 000005
【００９２】
一般的エポキシド重合
モノ−メトキシPEG（１．１５ｇ、Shearwater Polymers、分子量７５０）およびカリウムｔ−ブトキシド（０．１５ｇ）が混合され、９０℃に過熱され、モノ−メトキシPEGを脱プロトン化するために４５分間攪拌された。暗褐色の発現が、その反応の完了を示した。ベンゾフェノンエポキシド（１．５ｇ）、1，２−エポキシブタン（0．7ｍｌ）、およびアリルグリシジルエーテル（0．7ｍｌ）が添加され、一晩反応させるためにその溶液の温度が７０℃に下げられた。その後、反応混合物が室温に冷却された。その生成物が、脱イオン水および１０００MW透析管を使用した連続流透析によって精製された。
【００９３】
結果として得られたポリマーの純度が1HNMRによる透析の前後で変化したことから、重合の完了が示された。この合成は、異なるベンゾフェノンおよびアリル基の導入を可能にし、それ故ここで記載されるPEG−リノールアミド合成に比較してこの方法が柔軟性を有することが示される。異なる４ポリマーが生成されて、それぞれ分子量７５０のPEGアーム（約１７単位）を備え、ベンゾフェノン：エチル：アリルオキシ基のモル比としてそれぞれ３０：４０：３０、１５：５５：３０、３０：２０：５０、１５：１５：７０を有していた。他に示されない限り、モル比は、ここではそのポリエーテルの疎水性ブロックでのベンゾフェノン：アルキル：アリルオキシ置換基のモル比を言うように表現された。光反応性SAM−形成分子が合成された後、コーティング方法がこれらの化合物のために生み出された。
【実施例２】
【００９４】
コーティング方法
光反応性SAMコーティングのためのいくつかのコーティング方法が、自己形成性分子に関する従来方法の種々の側面を含めて、試験された。例えば、濡れた状態と乾燥状態の両方で、そのコーティングの照射が比較された。両方のアプローチが、表面改質についてのいくつかの証拠を呈したが、濡れた状態での照射が典型的に乾燥よりも優れていた。多分、基材の乾燥が、表面に形成された単分子層を乱れさせるのであろう。論理に結びつけることを意図しないものの、その表面にもとからあった水−基材の界面での疎水性部分が、空気−基材の界面でそれ自体を変え、より疎水性の空気と結合するように見える。
【００９５】
ここで他に特定しなければ、全てのコーティングは、光−固定プロセスの間に自己形成があるべきところに保持されるように、濡れた状態の照射で実施された。溶液濃度、温度、および浸透持続時間は、コーティングのために全て最適化された。最後に、種々の両親媒性コーティングが、最適条件を使って互いに比較された。それらのコーティングが、次の一般的方法に適用された。
【００９６】
一般的コーティング方法；きれいにされたプラスチック試験片が細長く切断され、試験管に垂直に吊り下げられた。その試験管が、一般に０．０１−１０mg/mlのポリエーテルSAMまたはリノールアミド−PEG SAMの脱イオン水溶液なるコーティング溶液で満たされた。そのプラスチック片は、照射前に少なくとも１５分間浸漬される。その細長片を８分間照射するために、鉄ドープ水銀蒸気ランプ（商標Dymax）が使用され、その間均一な露光と完全な結合を確保するため細長片が回転された。照射後、細長片が脱イオン水で３回洗浄され、随意にメタノールでさらに洗浄された。
【００９７】
照射されたコーティングは、静的接触角および蛋白質吸着によって評価された。静的接触角は、表面堆積(deposition)後すぐに測角器（Micro Vu モデル400）で、各表面上で少なくとも３滴についての平均結果を用いて、測定された。メトキシ−PEGコート表面については、水との接触角が、大部分の試験プラスチックについて７０−80度から５５度に減少した。
【００９８】
蛋白質吸着は、蛍光によって測定された。コートされたプラスチック片は、望ましい蛍光蛋白質を含むリン酸塩緩衝塩水（PBS）溶液内で１５分間振とうされ、結果的に３７℃で１時間温置された。この工程の次に、それぞれPBSおよび脱イオン水で３回のリンスがなされた。表面に吸着されたまま残った蛋白質は、テトラハイドロフラン（１ml）中に各基材片を溶かすことによって追い出された。それらのテトラハイドロフラン溶液の蛍光は、分光蛍光度計（島津  RF−1501）で分析された。種々のコーティングにおける不動態化の程度とコーティング方法を相互に関連付けるために、コートされた片に吸着した蛋白質の程度が、コートされていない対象物と比較された。一般的に、より低い蛍光蛋白質吸着が、より良いコーティングと不動態化を示すことが見出された。
【００９９】
コーティング条件は、光反応性SAM−形成化合物の濃度、浸透持続時間及び/又は温度、洗浄条件、および基材材料を含む種々のパラメータのもとで評価された。評価された条件下で、これらのどのパラメータも、いかなる特別な化合物および基材について達成された不動態化の最大の程度においても大きな差が見られなかった。例えば、0．01mg/mlの低さでのSAM−形成化合物の濃度は、５mg/mlと均等な結果を達成することが一般に見出された。この発見は、さらに医療デバイスのようなデバイスが最小量の材料でコートされ得て、製造のコストおよび容易性を含む改良された特徴の組合せを提供することを示す。
【０１００】
追加的に、5分間と言う短さの浸透継続時間で、十分なコーティングが提供されることが一般に見出された。少し長めの浸透時間は、より小さい標準偏差でより再現性のあるコーティングを与えるが、30分を超えた浸透時間では付加的な効果が通常見当たらない。ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレンおよびシラン化ガラスを含む種々の基材について、コーティングが比較された。いかなる特別なコーティング化合物についても、その結果は、基材間で有意なほどに変化しなかった。適したコーティングを提供するために、最も簡単で、最もコスト的に効果的なコーティング方法（短い浸透時間、低濃度）が使用され得ることを示すこれらの結果は、加えて有望である。
【０１０１】
種々のパラメータのうちで照射の使用のみが、そのコーティング、および結果物の性質について有意な効果を提供することが見出だされた。照射無しでは、簡単な脱イオン水洗浄またはより過酷なメタノール洗浄で、そのコーティングが取り除かれ得た。いったん照射されれば、そのコーティングはそのような洗浄条件に対して無傷であった。
【０１０２】
全ての条件は、図３，４および５に示されるように、ポリスチレン上のポリエーテル（３０：４０：３０）コーティングについて最適化された。その最適条件がいったん確立されて、図６に示されるように、種々のポリエーテルとリノールアミド−PEG化合物が互いに比較された。30：40：30および15：55：30のポリエーテル（PE）が最良の成績を上げたが、いかなるコーティング間でも大きな差は無かった。表面不動態化のための光反応性ジブロック化合物のデザインに、多くの柔軟性があるように見える。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
【表４】
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【０１０７】
表面分析
表面分析は、その表面の均一性と完全な被覆に関して、光反応性SAMコーティングを測定する機会を提供する。表面は、主として原子間力顕微鏡（AFM）および飛行時間型二次イオン質量分析法（TOF−SIMS）によって分析された。最初のAFMは、リノールアミドPEGとポリエーテルでコートされた表面を分析するために使用された。驚くべきことに、結果がコーティング方法に高く依存していた。標準的方法（垂直浸漬と照射工程を使用）によってコートされた試験片は、コートされていないポリスチレンから大きく見分けがつかない表面を呈した。ここでのように、コート厚さがプラスチックの表面粗さに比較して小さい場合にこのような結果になるようである。比較すると、水平な位置で浸透させられた試験片が、そこでミセル形成と一致した通常の円状構造を生成した。水平な位置での浸透が、多分溶液からそのプラスチック上にミセルを堆積させる。このミセルのような構造は、直径で約５０ナノメートルである。そのような構造の形成は、溶液中および疎水性表面上で、界面活性剤のように、ジブロックポリマーが自己形成することを示す。
【０１０８】
AFM測定がタッピングモードのDigital Instruments Nanoscope IIIを使用してなされた。相測定が以下に示される。標準的コーティング方法について、大きな特徴が存在しない程均一な被覆を、AFM測定が示した。コートされた試験片が水との低い接触角を示して蛋白質吸着を少なくし、成功を示したものの、異なるコーティングが特徴付けられ得なかった。
【０１０９】
TOF−SIMSは、コーティングの本質を見分ける手段を提供し、加えて厚さの定性的理解を可能にする。TOF−SIMSは、PE 30：40：30でコートされたポリスチレン試験片のサンプルの最上部１−２単分子層に関する質量分析データを提供する。全てのTOF−SIMSの作業は、１５ｋVのインジウムイオン源を使用したPhysical Electronics Trift II TOF−SIMSで実施され、２マイクロメートルの大きさのサンプルを備えた１５０マイクロメートルｘ１５０マイクロメートルの面積のラスター上で、そのサンプルが分析された。TOF−SIMSは、コーティングが期待されたようにその試験片上にあることを総体的に証する、コーティング（m/z ４５，８９，１３３）のPEGドメイン、ベンゾフェノン部分（m/z ７７，１０５）、加えてアリルオキシ部分（m/z ４１，５７，７１）およびエチル部分（m/z ２９，４３）からの疎水性ドメインを伴った質量を示した。加えて、TOF−SIMSは、ポリエーテルコーティングが非常に薄くかつ単分子層２層よりも薄いに違いないことを示す、最上部の１−２層の単分子層（m/z ７７，９１，１０３，１０５，１１５，１２８，１４１，１９３）での有意のポリスチレンの証拠を呈した。TOF−SIMSが真空下でなされ、そのコーティングを乾燥してしまうために、TOF−SIMS分析は、溶液中で実際に生じるかもしれないコーティングよりやや薄いコーティングを示すようである。さらに、TOF−SIMSデータは、本発明が本当に表面の単分子層被覆を提供することを示唆している。この結論は、AFMによる検出性能の無さに良く関係する。と言うのは、もしAFMによって見えるようであれば、コーティングがかなり厚くなければならないからである。
【０１１０】
表面分析は、コーティングのより良い理解を提供してきた。AFMは、コーティングが極薄でほどよく均一であることを示した。TOF−SIMSは、ジブロックポリマーが表面に存在し、コーティングが単分子層２層未満の厚みであることの明確な証拠を与えた。加えて、AFM分析は、ジブロックポリマーが、図７に示すように、溶液中でまたは固体−液体界面でミセルのような構造に自己形成する証拠を示した。この全ての情報が、ジブロックポリマーのデザインに一致し、それらの更なる改良と応用についての兆候を良く示す。
【０１１１】
【表５】
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【０１１２】
〔比較例１〕
表面の評価；最適化されたコーティングの不動態化のレベル
光反応性自己形成性分子でコートされた表面は、不特定蛋白質吸着またはバクテリア付着に対する不動態化のような重要な性質を示すようにデザインされ得る。ポリスチレン上で３０分間浸透されて０．１mg/mlのPE 30：40：30でできた最適の光反応性SAMを生成するための上記方法を使用することが、蛋白質不動態化およびバクテリア付着に対して評価された。３種の蛋白質：フィブリノーゲン、IgGおよびアビジンが不動態化を検討するために使用された。これらの蛋白質の不特定吸着が、コートなし、ポリエーテル30：40：30コーティング、およびポリアクリルアミド（PA）とポリビニルピロリドン（PVP）に基づく２つの商業的コーティングについて比較された。
【０１１３】
ポリエーテルコーティングは、図８に示すように、フィブリノーゲンに対してはPAおよびPVPと同様に、アビジンに対してはPAより良いがPVPよりも悪く、またIgGに対してはPAおよびPVPの両方より劣って、不動態化した。加えて、コーティングが丈夫であることを確かめるために、蛋白質吸着の前に、模擬的使用条件下で最初の３日間の塩溶液中での振とうで、示されるようなフィブリノーゲンの結果を生じた。結果は、模擬的使用条件ではないフィブリノーゲン吸着に匹敵するものであった。
【０１１４】
【表６】
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【０１１５】
ポリエーテルでコートされたポリスチレンへのバクテリア付着が、ポリスチレンのコートされ洗浄された試験片を１ｘ１０8CFU/ml P. mirabilis (ATC#15565)のリン酸塩緩衝塩水溶液中で2時間温置することによって試験され、さらに追加のリン酸塩緩衝塩水で一晩リンスされた。その試験片は、バクテリアコロニーを除去するために３サイクルで高周波分解され、その結果得られた溶液は、トリプティックソイ（tryptic soy）寒天板上に広げられて、３７℃で一晩温置された。コロニーを数えることが、バクテリア付着に関して良いデータを与えた。図９に示されるように、ポリエーテルコーティングは、現在の商業的なPAおよびPVPコーティングよりかなり優れていて、バクテリア付着をコートなしポリスチレンでの結果の５％未満に低下させた。
【０１１６】
ポリエーテルコーティングは、コートなしのサンプルに対して蛋白質吸着８９−７０％およびバクテリア付着９５．５％を低減させた。これは、コートなしのサンプルに対して有意な改良を示し、望ましい極薄コーティング方法を使用する商業的コーティングに対しても同様な結果をしめす。出願人は、そのような薄いコーティングでのみ達成され得る多くの商業的応用があり、光反応性ジブロックコポリマーのアプローチがこのニッチ市場に非常に有用であることが判明するものと信ずる。
【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
前に実施例は全て、自己形成性単分子層中に光反応性官能基部を含むタイプのコーティングに関するものであった。PEG基をベンゾフェノンと共に脂肪酸に接続させることが、蛋白質およびバクテリアの付着を防ぐために有用であると示された。次の記載は、本発明の他の実施態様、すなわち光反応性表面上の自己形成性単分子層の使用を示す。
【実施例３】
【０１１９】
光反応性ガラス表面の準備と特性付与
光シラン試薬（ｐSil）または光反応性ポリスチレン誘導体（ｐPS）を適用することによる光反応性ガラス表面の準備を例示するために、次の２つの方法が記載される。これらの両方の方法は、紫外線の存在で自己形成性分子を共有結合的に結合し得る表面を形成した。
【０１２０】
シラン部分がガラス表面に直接共有結合的に結合し得るように、光シラン分子が合成された。UV露光後に、これが、光基であるベンゾフェノンに水素原子を引抜かせ、分子をシラン表面の最上部に結合することを可能にする。図１０に示されるように、ｐSilを生成するために、３−アミノプロピルトリエトキシシランをテトラハイドロフラン中のトリエチルアミン（Et3N）の存在下でベンゾイル安息香酸クロライドに付加することによって、光シランが合成された。純度を確立するために、光シランが濾過され、次いで薄膜クロマトグラフィ（TLC）、核磁気共鳴分光学（NMR）およびフーリエ変換赤外分光学（FTIR）よって分析された。材料の乾燥を確実にするために、好適な研究室的方法が使用された。光活性表面が普通にコートされて、すぐにその生成物を伴った。
【０１２１】
【化５】
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【０１２２】
１％ｐSilのエタノール：水：酢酸（９５：５：０．０１１）溶液に浸透することによって洗浄ガラススライドをコートするために、このｐSil試薬が使用され、一度エタノールでリンスされ、次いで過剰の水とエタノールを除去するために３０分間１００℃に加熱された。コートなしのガラスの接触角３０度に比較して、水との約６０度の静的接触角は、これらのｐSil表面について普通であった。これらの表面は、TappingModeTM原子間力顕微鏡（AFM）によって試験され、ガラス表面の完全な被覆が示された。さらに、後に記載される蛍光アビジンの吸着に基づく検定がその結果を確認した。そのコーティングは、引っかきおよび溶剤リンスに対して耐久性があった。
【０１２３】
他のアプローチでは、ポリマーに２度照射する、すなわち一度は分子を互いに架橋させるため、２度目は表面に分子を結合させるために、過剰の光基を有する光ポリマーが使用された。pPSおよびpSilの両方の表面は、光表面として使用されることができて、紫外線にさらされたときに分子の追加の層を結合し得る。光−ポリスチレンが、ポリスチレンの塩化ベンゾイルとカーボンサルファイド中の塩化アルミニウムでフリーデル−クラフツアシレーションによって合成された。紫外線分析で、最初のポリスチレンの９０％アシレーションが示された。この光−ポリスチレン（pPS）は、トルエンに溶解し得る。ｎ−デシルシランの最初の層を備えるガラススライドと、その層を備えないガラススライドが、１％v/v pPSのトルエン溶液に手で浸漬され、次いでDymax鉄ドープ水銀蒸気ランプで２分間照射された。これらの表面は約７０度の水との接触角を有していた。蛍光アビジン検定により、ｐSilに等しい有効性でｐPS表面が不動態化化合物を共有結合的に結合し得ることが示された。ｐSilまたはｐPSで光反応性表面を形成することは、SAMを結合するための信頼できる基礎を与えた。
【実施例４】
【０１２４】
生体分子の不特定吸着に対するバイオセンサー表面の形成と不動態化
光反応性表面上で自己形成性分子由来のコーティングの最も価値ある使用の一つは、生体分子の不特定吸着の防止または不動態化である。増加したバックグラウンドシグナルを通して、またはカップリングサイトでの直接阻害によって、プラスチックまたは他の基材上での生体分子の不特定吸着が、望ましい生体分子を検知するための移植されたセンサーの能力を阻害し得る。
【０１２５】
紫外線への露出による不動態化分子の共有結合的結合で、光表面の結合能力および分子の不動態化能力の両方を試験する方法が提供された。光表面へのアビジンおよびDANの不特定吸着をテストするための検定が開発された。その実験的表面が、蛍光アビジンまたはDNAのリン酸塩緩衝液溶液中で、湿っぽい条件下３７℃で４５分間水に浸された。４５分後にスライドは、リン酸塩緩衝液で３回リンスされ、脱イオン水で３回リンスされた。そのスライドは、表面上で蛍光の像を反射する、蛍光スキャナー General Scanning ScanArray 3000で分析された。低い蛍光は、表面での低い蛋白質吸着または不動態化を示す。
【０１２６】
異なった分子量および組成を備えたポリ（エチレンオキサイド）−ポリ（ブチレンオキサイド）−ポリ（エチレンオキサイド）（PEO−PBO−PEO）（Dow Polyglycols）のトリブロックコポリマー群から、数個の異なる自己形成性化合物が、不動態化試薬として試験された。それらは、共有結合的に結合でき（過酷なイソプロピルアルコールIPAリンスがトリブロックを除去し得なかった）、表１に示されるように、アビジンおよびDNAの両方に対して良く不動態化した。トリブロックコポリマーの濃度および組成が最適化された。
B20−5000（Dow Polyglycol）5mg/mlの脱イオン水溶液中でスライドを照射し、次いで3倍のイソプロパノールリンスで洗浄したときに、最も良い条件が見出された。
【０１２７】
【表８】
2005520126.tif 000014
【０１２８】
トリブロック−不動態化ｐSil表面への蛍光３０鎖長DNAストランドの吸着が、コート無しの表面のシグナル強度に比較して約９５％低減された。両方の光表面は、不特定アビジン結合を最小にするのに十分なトリブロックコポリマーを結合した。表面上に固定されたトリブロックコポリマーで、水との接触角が、ｐSilについての６０度、またはｐPSについての７０度から５５度に低下した。光表面がトリブロックコポリマーを共有結合的に結合し、加えてDNAおよび蛋白質に対してその表面を不動態化したことを、アビジン検定および表面接触角の両方が示した。
【実施例５】
【０１２９】
光表面に官能基化されたSAMを備えたバイオセンサーの生成
光表面に結合するための官能基化された自己形成性分子を使用することによって、新規な官能基が表面上に導入され得る。出願人は、上記のような光表面でのビオチン化されたトリブロックコポリマーでこのアプローチを使用した。使用のために選択されたビオチンスペーサー誘導体は、ビオチン化（TB−b）されたTriBlock 40-2500(Dow Polyglycol)であった。この試薬は、アビジンを結合するのに、光ガラス表面を不動態化することができるために選択された。Mayer Rodで堆積された均一なTB−bの最初の層に一工程プリント技術を使用して、パターン化固定が達成された。使用されたロッドは、0.0007インチ（17．8マイクロメートル）のウエットコーティングを生成するために設計された。TB−b  (3mg/ml)溶液が、スライド上にコートされて、空気乾燥された。そのスライドは、次いで照射され、水とイソプロピルアルコールの両方で洗浄された。アルコール中での行き渡った洗浄は、表面上に固定されていないいかなるTB−bも除去するだろう。これは、アビジン固定用に準備されている完全で均一なビオチン表面を提供する。
【０１３０】
アビジン(１mg/ml)が、炭酸塩−重炭酸塩（０．１M,CBC）緩衝液中で室温の湿った条件で10分間のあいだカップリングされた。ビオチンオリゴのプリント前に、カップリングされていないアビジンを除去するために、CBC（０．１M）緩衝液および脱イオン水の両方でスライドが洗浄された。アビジンは、そのビオチン結合能力に基づいて表面に固定された。表面に結合されたストレプトアビジン（ＳＡ）の量、および更なる工程用にビオチンを結合するためのＳＡの能力を検査するために、放射性ラベルの実験が使用された。表面でのＳＡ−結合能力2．43±0．106 pmol/cm2、およびビオチン−結合能力1．180±0．141 pmol/cm2を、その表面が有していた。ビオチン結合を使用せずに、アビジンが表面に直接光カップリングされる第2の方法が試験された。アビジンが表面上にある（2．217±0．272 pmol/cm2）が、ビオチンに活発に結合しない（0．280±0．025 pmol/cm2）ので、表面に光カップリングされたアビジンは、多分その光分解の間に変性した。
【０１３１】
表面において利用可能なビオチンが、特に重要であるように見える。特別の応用のためには利用可能ビオチンの高すぎるレベルは、例えば、アビジンの4個のビオチン−結合サイト全てに結合している過剰の表面ビオチンのために、ビオチン化されたオリゴヌクレオチドの結合がより低いと言う結果をもたらし得る。対照的に、利用可能ビオチンの低すぎるレベルは、表面に結合しているアビジンがより少なく、そのためにビオチン化されたオリゴヌクレオチドがより少ない結果をもたらし得る。トリブロック自己形成は、特定量のビオチンを提供するためのアビジンカップリングの好適な最適化と安定化を可能にする。蛋白質が変性するため光反応性表面単独で、または蛋白質および自己形成されたコーティングが簡単に洗浄されてしまうことができるため自己形成単独で、のいずれによっても、これが容易に得られ得ない。光表面上に自己形成性分子を用いることによって、バイオセンサーおよび他の応用のための好適な表面を生成することが可能である。
【実施例６】
【０１３２】
４分析対象物のオリゴヌクレオチドのミクロアレイを生成するための光表面でのSAM使 用
光表面に共有結合的に結合した官能基化自己形成単分子層を使用することによって、高い性能のバイオセンサーが生成され得る。自己形成のアプローチが表面形成を簡単にし、使用されるブロックコポリマーが生体分子を安定化するのに好適な環境を提供する。出願人は、表面上にビオチン化されたオリゴヌクレオチドをプリントすることによって遺伝子チップを生成するために、上記のビオチン化されたSAM−光表面を使用した。その後、それはアビジンとのカップリングによってさらに誘導された。
【０１３３】
図１１に示されるように、４個のオリゴヌクレオチドが、それぞれが異なるキャプチャーオリゴヌクレオチドを備えた４ｘ４スポットの４シリーズのパターンにプリントされた。オリゴが、150mMのリン酸塩緩衝液（ｐH7）中において８nmol/mlでプリントされた。ひとたびプリントされ、0．05％ Tween−20を含むd−ビオチン(0.1mg/ml)の１X PBS緩衝液溶液洗浄がなされて、その表面に残っているアビジンを不動態化するために、そのスライドは、d−ビオチン(0.1mg/ml)の５X塩−ナトリウム  シトレート緩衝液（SSC）/１−サルコシン（0.1％w/v）溶液中５０℃で３０分間温置された。スライドは、脱イオン水で再洗浄され、４X SSC/1−サルコシン（0.1％）/ tRNA(2mb/ml)/d−ビオチン(0.1mg/ml)/検知プローブ(20pmol/ml)の溶液中５０℃で２時間ハイブリッド化された。ハイブリッド化後、そのスライドは、低減モラル濃度のSSC溶液でリンスされ、乾燥された。目的の蛍光オリゴヌクレオチドが、レーザパワー８０％、PMT電圧８０％で、蛍光スキャナー General Scanning ScanArray 3000により検知された。複数の分析対象物を使用するハイブリッド化は、出願人のアビジン表面で達成された。出願人は、同様な検定で少なくとも４個の分析対象物を検知できる。
【０１３４】
【表９】
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【０１３５】
これらのシステムを使用することによって、出願人は各目的のオリゴの検知ができた。プリンティング条件は、直接検知を可能にするビオチン化および蛍光的ラベル（Cy3）の両方が施されたオリゴヌクレオチドを使用してより適切に設定された。これは、オリゴ結合機能の濃度および均一性もプリントするための投与量応答曲線を決定するのに非常に有用であった。均一性検定を使用してプリントした後の平均蛍光シグナルは、40±６のバックグランドと、大きいピンを用いた303±52マイクロメートルのスポットサイズで、22214±1911であった。これは、１０％未満のスポットからスポットへの平均変動を与えた。
【０１３６】
スポットサイズは、プリントに使用されるピンの大きさに直接関係している。大きいピン（注射器チップの内側直径0.006インチ）が、300−500マイクロメートルの範囲にあり、平均で約450マイクロメートルのスポットを生じる。小さいピン（Telechem International CMP2B）が、160−180マイクロメートルの範囲のスポットを生じる。全体として、pSil−アビジンチップ表面は、商業的遺伝子チップ表面に比較して良好に長持ちする。それは、複数分析対象システムについて400より大きいノイズに対するシグナルを与えるハイブリッド化検定においてうまく行く。
【０１３７】
前の実施例に見られるように、光表面に共有結合的に結合した自己形成分子の使用は、このバイオセンサーの構成において極めて重要であった。SAMは、低いバックグランドシグナルを有する好適な表面を提供するのみならず、その次のパターン化分子の簡単な製作をも可能にした。光表面に基礎の層は、バイオセンサーにとって好適な基礎を築く基礎的基材に、多数の異なるSAMを共有結合的に結合させ得る。
【国際調査報告】
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