(57)【要約】細胞を分類するための微量流体デバイスが、記載される。本デバイスは、注入チャネル（１２）、主チャネル（１４）、接合部で主チャネル（１４）と接続する少なくとも２つの分岐チャネル（１６、１８）、および接合部の上流に配置されたシース注入器（２０）を備える。サンプル溶液（細胞集団を含み得る）は、注入チャネル（１２）に入り得、サンプルリボン中に流体力学的に集束させられ得る。本デバイスは、検出される細胞の特徴に基づいて、流体フロー、特にサンプルリボンのフローを分岐チャネル（１６、１８）中に指向するためのシステムを使用する。本システムは、特定の分岐チャネル中へと、細胞フローを変化させるかまたは指向するための種々の分類技術を使用し得る。
2005520150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を分類するための微量流体デバイスであって、以下：
ａ．サンプル溶液を受け取るための注入チャネル；
ｂ．主チャネルであって、該主チャネルの第１末端が、シース溶液リザーバに接続されており、その第２末端が、接合部で接続する少なくとも２つの分岐チャネルに接続されている、主チャネル；
ｃ．該接合部より上流に配置され、該注入チャネルに接続されており、その結果、該主チャネルに入ったサンプル溶液が、該シース注入器を流れ、少なくとも２層のシース溶液の間の圧縮されたリボンの中に、流体力学的に集束される、シース注入器；
ｄ．該接合部と該シース注入器との間に配置された呼掛け信号領域であって、該呼掛け信号領域は、該リボンが、該呼掛け信号領域を通過する際に、少なくとも１つの細胞の特徴に従って該リボン中の細胞を評価するための認識装置と連結している、呼掛け信号領域；および
ｅ．該認識装置に応答性であり、そして検出した特徴に基づいて、流体フローを分岐チャネルに誘導し得る、細胞分配システム、
を備える、デバイス。
【請求項２】
請求項１に記載の微量流体デバイスであって、前記細胞分配システムが、各分岐チャネルの途中に配置された少なくとも１つのバルブからなり、１つの分岐チャネルの該バルブのみが、任意の時点で開いており、そして該バルブの状態が、前記認識装置との通信を通じて決定される、デバイス。
【請求項３】
請求項１に記載の微量流体デバイスであって、前記細胞分配システムは、前記分岐チャネル内のフローが、異なるように制限され、そして前記サンプルリボンが、分岐チャネル中に誘導され得るように、前記分岐チャネル内の圧力を操作するための手段からなる、デバイス。
【請求項４】
請求項１に記載の微量流体デバイスであって、前記細胞分配システムが、流体を導入するためのチャネルからなり、該チャネルが、前記接合部より上流に配置されており、該チャネルからの流体の導入が、前記認識装置との通信を通じて決定される、デバイス。
【請求項５】
請求項１に記載の微量流体デバイスであって、前記細胞分配システムが、主チャネルから流体を除去するためのチャネルからなり、該チャネルが、接合部の上流に配置されており、該チャネルからの流体の導入が、前記認識装置との通信を通じて決定される、デバイス。
【請求項６】
請求項１に記載の微量流体デバイスであって、前記細胞分配システムが、１つの磁力源からなり、磁気応答性の部分を有する標識と結合し、そして接合部を流れる細胞が、該磁力源に応答して１つ以上の分岐チャネルに誘導されるように、該磁力源が、前記接合部の近位に配置された、デバイス。
【請求項７】
請求項１に記載の微量流体デバイスであって、前記細胞分配システムは、適用される電場からなり、該電場を流れる細胞が、該細胞の電荷と該適用される電場との間の相互作用に応答して、１つ以上の分岐チャネルに誘導されるように、該適用される電場が、前記接合部の近位に配置される、デバイス。
【請求項８】
幾何学的に前記サンプルリボンを集束させるための手段をさらに備える、請求項１に記載の微量流体デバイス。
【請求項９】
評価する細胞の各特徴が、標識の使用によって検出可能となる、請求項１に記載の微量流体デバイス。
【請求項１０】
標識された細胞が、光学的検出手段からなる認識装置によって検出される蛍光シグナルを放出する、請求項１に記載の微量流体デバイス。
【請求項１１】
カートリッジ内に収容される分類ユニットであって、以下：
ａ．サンプル溶液を受け取るための注入チャネル；
ｂ．主チャネルであって、該主チャネルの第１末端が、シース溶液リザーバに接続されており、その第２末端が、接合部で接続する少なくとも２つの分岐チャネルに接続されている、主チャネル；
ｃ．シース注入器であって、該接合部より上流に配置され、そして該主チャネルに入ったサンプル溶液が、該シース注入器を流れ、少なくとも２層のシース溶液の間の圧縮されたリボンの中に、流体力学的に集束されるように、該注入チャネルに接続されている、シース注入器；
ｄ．該接合部と該シース注入器との間に配置された呼掛け信号領域であって、該呼掛け信号領域は、該リボンが、該呼掛け信号領域を通過する際に、標識された細胞を検出するための認識装置と連結している、呼掛け信号領域；および
ｅ．該認識装置に応答性であり、かつ検出した特徴に基づいて、流体のフローを分岐チャネルに誘導し得る、細胞分配システム、
を備える、ユニット。
【請求項１２】
請求項１１に記載の分類ユニットであって、前記細胞分配システムが、各分岐チャネルの途中に配置された少なくとも１つのバルブからなり、１つの分岐チャネルのバルブのみが任意の時点で開いており、そして該バルブの状態が、前記認識装置との通信を通じて決定される、ユニット。
【請求項１３】
請求項１１に記載の分類ユニットであって、前記細胞分配システムは、前記分岐チャネル内のフローが、異なるように制限され、そして前記サンプルリボンが、分岐チャネル中に誘導され得るように、前記分岐チャネル内の圧力を操作するための手段からなる、ユニット。
【請求項１４】
請求項１１に記載の分類ユニットであって、前記細胞分配システムが、流体を導入するためのチャネルからなり、該チャネルが、前記接合部より上流に配置されており、該チャネルからの流体の導入が、前記認識装置との通信を通じて決定される、ユニット。
【請求項１５】
請求項１１に記載の分類ユニットであって、前記細胞分配システムが、前記主チャネルから流体を除去するためのチャネルからなり、該チャネルが、接合部の上流に配置されており、該チャネルからの流体の導入が、前記認識装置との通信を通じて決定される、ユニット。
【請求項１６】
請求項１１に記載の分類ユニットであって、前記細胞分配システムが、磁力源からなり、磁気応答性の部分を有する標識と結合し、そして接合部を流れる細胞が、該磁力源に応答して１つ以上の分岐チャネルに誘導されるように、該磁力源が、前記接合部の近位に配置された、ユニット。
【請求項１７】
請求項１１に記載の分類ユニットであって、前記細胞分配システムが、適用される電場からなり、該電場を流れる細胞が、該細胞の電荷と該適用される電場との間の相互作用に応答して、１つ以上の分岐チャネルに誘導されるように、該適用される電場が、前記接合部の近位に配置される、ユニット。
【請求項１８】
前記呼掛け信号領域より上流に前記サンプルリボンを幾何学的に集束させるための手段をさらに備える、請求項１１に記載の分類ユニット。
【請求項１９】
微量流体デバイス中で細胞を分類する方法であって、以下の工程：
ａ．細胞集団を、少なくとも２層のシース溶液の間の圧縮されたリボンの中に、流体力学的に集束させる工程；
ｂ．該リボンを、呼掛け信号領域を備えるチャネルに流す工程；
ｃ．各細胞が、該呼掛け信号領域を通過する際に、該細胞上の標識の存在または標識の量を決定する工程；および
ｄ．細胞を、各細胞上の標識の存在または標識の量に基づいて、第１分岐チャネルまたは第２分岐チャネル中に分配する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記リボンを、サンプルリボンより上流に、幾何学的に集束させる工程をさらに包含する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法であって、前記細胞分配工程が、１つの分岐チャネルのバルブのみが任意の時点で開き得、そして該バルブの状態が、前記認識装置との通信を通じて決定されるように、少なくとも１つのバルブを各分岐チャネルの途中に配置する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法であって、前記細胞分配工程は、前記分岐チャネル内のフローが、異なるように制限され、そして前記サンプルリボンが、分岐チャネル中に誘導され得るように、前記分岐チャネル内の圧力を操作するための手段を備える、方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の方法であって、前記細胞分配工程が、流体を導入するためのチャネルを接合部より上流に配置する工程を包含し、該チャネルからの流体の導入が、前記認識装置との通信を通じて決定される、方法。
【請求項２４】
請求項１９に記載の方法であって、前記細胞分配工程が、主チャネルから流体を除去するためのチャネルを接合部より上流に配置する工程を包含し、該チャネルからの流体の導入が、前記認識装置との通信を通じて決定される、方法。
【請求項２５】
請求項１９に記載の方法であって、前記細胞分配工程が、磁気応答性の部分を有する標識と結合し、そして接合部を流れる細胞が、磁力源に応答して１つ以上の分岐チャネルに誘導されるように、該磁力源を該接合部の近位に配置する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項１９に記載の方法であって、前記細胞分配工程が、電場を通って流れる細胞が、該細胞の電荷と該適用される電場との間の相互作用に応答して、１つ以上の分岐チャネルに誘導されるように、該適用される電場を接合部の近位に配置する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／３６４，３４３号（タイトル「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２００２年３月１４日に出願された）からの優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、分析試験を実施するための微量流体デバイス、特に、細胞を流体力学的に集束し、分類するための微量流体デバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
微量流体デバイスは、分析試験の実施において、ますます一般的になりつつある。電子装置を小型化するために半導体産業によって開発されたツールのおかげで、複雑な流体システムの製造および安価な大量生産が可能になった。微量流体システムは、多数の分野（医療分野、生命科学、ならびに薬物の探索および開発が挙げられる）で、情報を入手するための種々の分析技術の実施において、ますます利用されている。
【０００４】
微量流体デバイスを製造するための多くの異なる方法（従来のリソグラフィック技術、ソフトリソグラフィー、および積層技術が挙げられる）が、存在する。積層製造においては、デバイスは、所望の形状に、例えば、レーザーによって切断されるかまたはスタンプされ、次いでいくつかの形態の接着剤（最も一般的には、感圧性接着剤または熱活性化接着剤）で保った、材料層または単層からなる。マイラープラスチックが、一般的には使用されるが、他の材料（例えば、ガラスおよびポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）（ＰＭＤＳ））もまた、首尾よく積層デバイスに組み込まれる。微量流体デバイス構造は、各層がチャネルを有する多層化積層構造および積層材料から製造された構造を含み得、流体が流れるマイクロスケールの空隙またはチャネルを形成する。マイクロスケールのチャネルは、概して、少なくとも１つの内側断面の寸法が、５００μｍ未満であり、代表的には約０．１μｍ〜約５００μｍの間である、流体通路として定義される。外部からの圧力が加えられて、積層板または積層板内に位置される構造の中に送りこまれた流体は、これらのチャネルを通じた流体の制御およびポンピングに影響を与える。
【０００５】
微量流体の状態の下では、流体は、通常、非常に予測可能な層流の形式で流れ、それによって、多数の流体が、乱流による混合が起こることなく、または膜による物理的な分離を必要とすることなく、同じチャネル中で互いに順番に流れることが可能となる。より小さな粒子は、代表的には、境界層を横切って素早く拡散し、一方、大きな分子および粒子（例えば、細胞）は、代表的には、最小限しか拡散しない。
【０００６】
米国特許第５，７１６，８５２号は、層流および拡散の原理を使用して、流れる細胞中の小さな粒子の存在および濃度を分析する方法を教示し、全ての目的のために本明細書中でその全体が参考として援用されている。指示ストリームとサンプルストリームを提供する少なくとも２つの入口手段を有する層流チャネルを使用して、サンプルストリーム中の分析物粒子の存在を検出するためのチャネル細胞システムが、記載されている。ここで、この層流チャネルは、ストリームを層流にするために十分に小さな深さおよび、分析物粒子を指示ストリーム中に拡散させ、検出領域を形成するために十分な長さを有し、そしてチャネルの出口を有し、単一の混合ストリームを形成する。このデバイス（Ｔ−センサーとして公知である）は、指示ストリーム中の拡散境界（ｂｏｕｎｄｒｙ）を検出するための外部の検出手段を備え得る。この検出手段は、当該分野で公知の任意の手段（光学的手段（例えば、光波分光学、蛍光吸光分光学）が挙げられる）によって提供され得る。
【０００７】
フローサイトメトリーは、単細胞または粒子が流体懸濁液中を流れる際に、光散乱特性、蛍光特性および吸光特性を同時に測定するための方法である。開発されたフローサイトメトリーの方法によって、細胞の特徴（例えば、大きさ、細胞膜の透過性、細胞内ｐＨ、および細胞内構成成分（例えば、核酸レベル、タンパク質レベル、表面レセプターの発現レベル、および細胞内カルシウムレベル）のレベルの決定が可能である。いくつかのシステムは、示される特性に従う粒子または細胞の分類または分離が可能である。フローサイトメトリーは、基礎研究ならびに臨床的適用、生物学的適用および環境的適用において、ますます使用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、フローサイトメトリー技術および細胞分類技術の分野において、流体力学的に集束させたコアストリームが使用され、このコアストリームは、およそ、流れに直交する次元での細胞の大きさにまで、２次元上で集束させられる。これは、１列の細胞のストリームを作製し、光散乱、蛍光検出器または画像ベースの細胞検出システムに供され得る。細胞分類技術は、一般に、圧電的ドロップ生成と静電気による偏向とを組み合わせる。この様式において、細胞は、微小ドロップ中に仕分けられ、そして各微小ドロップは荷電され、その結果、微小ドロップは、静電気的に偏向され得、分類用の別々のビンに入れられる。このスキームは、検出器が、１度に１つの細胞を検出し、そして指向することしかできないという重要な制限を受ける。大量の細胞を処理するためには、流体システムは、流体が、極めて早い速さで検出器を通るような様式で作動しなければならない。流体は、いくつかの適用に必要とされるスループットを達成するために、１ｍ／秒から１０ｍ／秒の速さで検出器を通らなければならない。これらの制限のために、液体調製物中のまれな細胞または粒子（例えば、癌細胞）、幹細胞、胎児性細胞などの探索は、非効率で、時間がかかり、そして費用がかかるものであり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、サンプル溶液を流体力学的にリボンに集束させ、所望の特徴に基づいて細胞を分類するための微量流体デバイスおよび方法を提供する。
【００１０】
細胞を分類するための微量流体デバイスが、本明細書中で提供される。本デバイスは、注入チャネル、主チャネル、接合部で主チャネルと交わる少なくとも２つの分岐チャネル、および接合部より上流に配置されたシース注入器を備える。細胞集団を含み得るサンプル溶液は、注入チャネル中に入れられ、流体力学的にサンプルリボン中に集束され得る。本デバイスはまた、流体フロー、特にサンプルリボンのフローを、検出した細胞の特徴に基づいて、分岐チャネル中に指向するための粒子分散システムからなる。
【００１１】
さらに、微小製造された構造中で細胞を分類する方法が、記載される。本方法は、細胞集団を流体力学的にサンプルリボンに集束させる工程、そのリボンをチャネルに流す工程、各細胞上の標識の存在または量を決定する工程、および各細胞上の標識の存在または量に基づいて細胞を特定の分岐チャネルに分配する工程からなる。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
用語「微量流体の」とは、一般的に、少なくとも１つの内部断面の寸法が、５００μｍ未満であり、代表的には約０．１μｍ〜約５００μｍの間である流体通路を有する基板として定義される。本明細書中で使用される場合、用語「チャネル」とは、微量流体チャネルをいい、そこでのフローが、実質的に層流であるように寸法付けられた流体要素を記載する。用語「頂部」、「底部」および「側面」とは、図面中の配向をいい、それは、必ずしも実施中のメンバーの配向ではない。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「カートリッジ」とは、代表的には、必ずしもそうではないが、使い捨てであり、そして測定装置、ポンプ装置、電気的装置、流体的装置および他の装置と連結され得る、微量流体デバイスをいう。カートリッジは、種々の方法（従来のリソグラフィック技術、ソフトリソグラフィー、積層技術などが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して、微小製造され得る。例えば、カートリッジは、任意の成形可能な基板、被削性基板またはエッチング可能基板から微小製造され得る。本明細書中で使用される場合、用語「機械加工」としては、印刷、スタンプ切断、およびレーザーアブレーションが挙げられるが、これらに限定はされない。カートリッジは、単一のシート、挟まれて１つになった１対のシート、または積層されて１つになった複数のシート中に形成され得る。用語「シート」とは、任意の固体基板、可撓性基板または他のものをいう。チャネルは、シリコン基板上にエッチングされ、カバーシート（透明なカバーであり得る）で覆われ得る。積層された実施形態において、チャネル壁は、少なくとも１つのシートから材料を除去することで定義され、従って、チャネルおよび空隙を作製し、そして改変されたシートのいずれかの側面の上にさらなるシートを配置する。任意の層が、流体チャネルを含み得る。ある場合において、チャネルは単純な穴（または、流体ビア（ｖｉａ））であり、流体を次の流体積層板層へと導く。任意の隣接する２つの積層板層は、一緒に結合され、より複雑な単一の部分を形成する。
【００１４】
本明細書中で使用する場合、用語「フロー」は、微量流体デバイスを通るか、または本発明に従う方法における、液体または固体の任意の様式の動きをいう。微量流体の状態の下では、流体フローは、低いレイノルド数によって特徴付けられ、そして主に拡散によって、隣接する流体と任意の混合を生じる層流である。フローはまた、任意の流体ストリームおよび、その流体ストリームと共に動くか、その流体ストリーム中で動くか、またはその流体ストリームとは逆に動く、任意の材料、細胞または粒子を含むが、これらに限定されない。フローを提供するために、任意の様式の力が、適用され得る。このような力としては、圧力、毛管作用、磁力および電磁力、電気泳動、ジエレクトロフォレシス（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、電気浸透、光ピンセット、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明のフローシステムの「接続された」メンバーは、流体的に接続されている。用語「の間」は、流体配置をいい、これは、必ずしも幾何学的配置とは対応しない。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞」は、生物学的な細胞に類似する微視的な大きさを有する、任意の細胞、ウイルス、材料または粒子を意味する。生物学的な細胞としては、任意の原核生物細胞、真核生物細胞、細菌細胞、菌細胞、動物細胞、植物細胞、藻細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞のサイズは、代表的には、直径が約０．１〜１２０ミクロンの範囲であり、代表的には、直径が約１〜５０ミクロンである。細胞は、生存しているかまたは死んでいる場合があり得るし、荷電しているかまたは荷電していない場合があり得る。細胞は、球体または非球体（細長い細胞、平らな細胞、形が崩れた細胞および任意の他の非対称な細胞が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。用語「細胞」としてはまた、微視的なビーズ、リポソーム、エマルジョン、細胞内成分および細胞内のオルガネラ複合体、または細胞と同じ大きさの任意の他の粒子が挙げられる。
【００１７】
用語「標識」は、光学的手段、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、化学的手段または磁気的手段によって検出可能な分子または分子の組成物をいう。標識は、具体的には、選択される細胞に標的化され得るが、それが必要なわけではない。そのようなマーカーまたは標識としては、抗体あるいは細胞または細胞内成分に結合することが公知である他の分子または粒子と結合体化した、有色の分子または粒子、放射性の分子または粒子、蛍光性の分子または粒子、紫外線を生じる分子または粒子、あるいは磁性の分子または粒子が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、その特定の細胞型を標的とする能力のために、しばしば標識成分として使用される。抗体の代替物として働き得る他の反応性の標識成分としては、遺伝子プローブ、染料、蛍光色素、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、酵素、補酵素、補助因子、抗生物質、ステロイド、ホルモンまたはビタミンが挙げられるが、これらに限定されない。標識は、しばしば測定可能なシグナルを生成する。それは、ある種の刺激性の事象を伴うかまたは伴わずに検出され得、そして結合している標識の存在の検出、および場合によっては、サンプル中の結合している標識の量の定量を行うために使用され得る。さらに、標識は、細胞の検出可能な内因性の特質（例えば、細胞の大きさ、または形態）（例えば、光散乱特徴の測定によって検出可能な）であり得る。標識は、直接的または間接的に検出可能であり得、別の標識との結合体として機能し得る。標識のさらなる例については、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第９版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ中で列記されたものを参照のこと。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、用語「標識化」は、標識を細胞に貼り付けるかまたは結合体化するプロセスをいい、これによって、（しばしば、更なる処理の後で）本発明に従う、それらの細胞の不均質な懸濁液からの分離、および／または検出、分析、もしくは計数が可能となる。
【００１９】
用語  細胞「特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）」および細胞「特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）」は、相互に交換可能に使用され得、標識化によって検出可能な細胞の任意の特質をいう。非限定的な例としては、大きさ、形状、形態、細胞の内部、細胞の外側、またはそれらの任意の組合せに位置する特定の細胞内分子（例えば、タンパク質、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、ホルモンなど）の存在または量、遺伝子またはタンパク質の発現、細胞の透過性、染料への親和性、細胞周期の段階、有糸分裂の数、あるいはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００２０】
分類ユニットによって、本発明に従って細胞を分類することが可能となり、分類ユニットは、注入チャネル、主チャネル、少なくとも２つの分岐チャネル、シース注入器、および呼掛け信号（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）領域からなる。分類ユニットは、さらに細胞分配システムからなり、これによって、呼掛け信号領域での試験に関して受容したシグナルに依存して、細胞のフローが方向を変え、１つ以上の分岐チャネルに入ることが可能となる。注入チャネルは、サンプル溶液を受容するチャネルであり、シース注入器と接続されている。サンプル溶液は、注入チャネルおよびシース注入器を通って流れる流体であり、主チャネルに流体力学的に集束させられる。サンプル溶液は、代表的には、細胞集団を含む（必ずしもそうではない）。
【００２１】
主チャネルによって、細胞のフローが、呼掛け信号領域を通過することが可能となり、本発明に従って分類することが可能となる。主チャネルは、シース溶液リザーバと接続された第１端部、および接合部で交わる少なくとも２つの分岐チャネルと接続された第２端部からなる。
【００２２】
分岐チャネルは、主チャネルに接続されたチャネルである。代表的には、分岐チャネルは、目的の細胞の特徴に依存して、つまり、呼掛け信号領域で検出され、そして細胞分配システムによって分類されたように、細胞を受容する。分岐チャネルは、他のチャネルと接続され、さらなる分類を可能とし得る。あるいは、分岐チャネルは、細胞の収集または廃棄が可能なように、ウェルまたはリザーバで終結し得る。
【００２３】
接合部は、主チャネルと少なくとも２つの分岐チャネルが、接合して１つになる領域である。呼掛け信号領域での試験に関して受容したシグナルに依存して、細胞のフローが、方向を変え、他の１つ以上のチャネル（例えば、分岐チャネル）に入り得る場所が、接合部である。呼掛け信号領域は、主チャネルに沿って、接合部、接合部の近位、または接合部の上流のいずれかに、配置され得る。
【００２４】
シース注入器は、代表的には、主チャネルに沿って配置され、注入チャネルに接続される。シース注入器は、主チャネル中へのサンプル溶液の導入および、流体力学的に集束させられることを可能にする。本発明に従うシース注入器は、流体力学的に集束させることを可能にする（例えば、サンプルリボンが、１次元で、作製されることを可能にする）。
【００２５】
例えば、サンプルリボンは、サンプル溶液を、流体力学的に１次元に集束させることにより作製される。サンプルリボンの幅は、代表的には、その高さよりも大きい。本発明の１つの実施形態において、サンプルリボンの寸法は、少なくとも単一細胞と同じ高さおよび少なくとも２つの細胞と同じ幅を有する細胞層からなる。リボンは、少なくとも１細胞の長さであり得、サンプル溶液内に含まれる細胞の量に依存して、さらに拡張し得る。
【００２６】
呼掛け信号領域は、代表的には、主チャネルの部分に沿って位置し、そこでは、分類されるべき細胞が、所定の特徴に基づいて分類するために試験される。本発明に従う１つの実施形態において、サンプルリボンの１部分が、呼掛け信号領域を流れる際に試験され、複数の細胞の試験が１度にできるようになる。用語「複数」は、２以上の数をいう。所定の特徴が、（例えば、標識の存在または量を試験することにより）検出または測定される。例えば、呼掛け信号領域は、認識装置と接続され得る。
【００２７】
認識装置は、１つ以上の標識によって決定される少なくとも１つの細胞の特徴の同定、検出、および／または定量（時々）を可能とする。例えば、認識装置は、１つ以上の顕微鏡、カメラ、画像装置、ダイオード、光刺激性デバイス（例えば、レーザー、ランプなど）、光電子増倍管、およびプロセッサー（例えば、コンピューターとソフトフェア）、ならびにそれらの任意の組合せからなり得、協調して、細胞の特徴または標識を示すシグナルを検出し、測定、および分類する細胞の特定の分岐チャネルへの指向を、可能とする。
【００２８】
細胞分配システムは、それによって、呼掛け信号領域での試験に関して受容したシグナルに依存して、細胞のフローが、方向を変え、１つ以上の分岐チャネルに入り得る手段である。細胞分配システムは、種々の分類技術を行い、細胞のフローを特定の分岐チャネル中に変化または指向し得る。そのような細胞分配システムとしては、電気、電気浸透、バルブ、磁気、流体置換、圧力などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
図１は、本発明の例示的な実施形態に従う分類ユニット１０の側面図を示す。分類ユニット１０は、本発明に従う細胞の分類を可能とし、注入チャネル１２、主チャネル１４、少なくとも２つの分岐チャネル１６、１８、シース注入器２０、および呼掛け信号領域２２からなる。主チャネル１４は、代表的にはシース流体リザーバ２４に接続された第１端部からなる。シース流体リザーバ２４は、例えば、主チャネル１４を備える同じ微小製造された基板の中かまたはそれとは離れて位置し得る。主チャネル１４は、さらに、接合部２６で接続する少なくとも２つの分岐チャネル１６、１８と接続された第２端部からなる。呼掛け信号領域２２は、主チャネル１４に沿って配置され、接合部２６とシース注入器２０との間に位置する。注入チャネル１２は、シース注入器２０と接続されることで、主チャネル１４と連絡する。注入チャネル１２はまた、サンプル流体リザーバ２８とも接続される。分類ユニットは、さらに細胞分配システムからなる（図１には示していない）。細胞分配システムは、代表的には、接合部、接合部の近く、または接合部の近位に位置する。細胞分配システムは、細胞のフローが、呼掛け信号領域での試験に関して受容したシグナルに依存して、方向を変え、１つ以上の分岐チャネルに入ることを可能にする。
【００３０】
図２は、本発明の別の例示的な実施形態に従う分類ユニット３０の３次元図を示す。図２の分類ユニット３０は、注入チャネル３２、主チャネル３４、少なくとも２つの分岐チャネル３６，３８、シース注入器４０、および呼掛け信号領域４２からなる。分類ユニット３０の操作を示すために、図２において、リボン４４が、分類ユニット３０と共に示されている。シース溶液は、シース流体リザーバ４６に入り得、分類ユニット３０を通って（主チャネル３４を通る）流れ得る。サンプル溶液は、サンプルリザーバ４８に入れられ得、注入チャネル３２を流れて主チャネル３４に流れ得る。シース溶液は、シース注入器４０を通って主チャネル３４に入り得る。図３および図４に見られ得るように、シース注入器４０で、サンプル溶液５４は、シース溶液５２に囲まれ、サンプルリボン４４に集中される。シース溶液５２は、より低い圧力で流れているサンプル溶液５４のより上とそれより下に２つの高圧な流れを形成し、サンプルリボン４４が形成される。サンプルリボン４４は、入口５６で、主チャネル３４のより狭い部分にまで、幾何学的にさらに集中される。サンプルリボン４４は、主チャネル３４を通り、呼掛け信号領域４２を通過して接合部５８まで流れる。接合部５８の近くで、細胞分配システムは、細胞のフローが、呼掛け信号領域４２での試験に関して受容した信号に依存して、方向を変え、そして１つ以上の分岐チャネル３６、３８に入ることを可能とする。
【００３１】
細胞分配システムを含む本発明の１つの特定の例示的な実施例が、図５Ａおよび図５Ｂに示される。図５Ａおよび図５Ｂには、分類ユニット６０の少なくとも一部分（接合部６８で接続する主チャネル６２および複数の分岐チャネル６４、６６の一部分を含む）が、例示される。この実施形態において、分岐チャネル６４、６６に沿って配置されたバルブ７０、７２が、サンプルリボン７４のフローの方向を制御する。バルブ７０、７２は、認識装置、コンピューター、または他の自動化システムを介して、呼掛け信号領域７６に相互接続され、所望の材料が検出されるか否かに依存して、適切なバルブを開閉することが可能となる。例えば、まず、頂部バルブ７０が、閉じた状態であり、底部バルブ７２が、開いた状態であって、流体（サンプルリボン７４を含む）が、主チャネル６２から接合部６８を通って、底部分岐チャネル６６に流れることを可能にする。呼掛け信号領域７６において所望の標識が検出される場合、底部バルブ７２は閉じられ、頂部バルブ７０が開かれて、リボン７４が頂部分岐チャネル６４中に指向されることを可能にする。
【００３２】
本発明の実施形態の別の例において、２つ以上の分岐チャネル間のフローを差次的に制限する他の手段が、使用され得る。例えば、米国特許第５，７２６，４０４号（Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．に譲渡されたものであり、全ての目的のために、その全体が本明細書中で参考として援用される）は、バルブのいらない液体微小スイッチを記載し、交差する微小チャネル間の液体フローを高速で切り替えるための、バルブのいらない方法および装置を教示する。圧力を操作することによって、バルブの無い状態で、流体フローが、差次的に制限され、１つ以上の分岐チャネル６４、６６中へのサンプルリボンの指向が可能となる。
【００３３】
細胞分配システムを含む本発明の別の例示的な実施形態が、図６Ａおよび図６Ｂで示されている。分類ユニット８０の少なくとも一部分（接合部８８で接続する主チャネル８２および複数の分岐チャネル８４、８６の少なくとも一部分）が、示される。この実施形態において、サンプルリボン９０は、流体置換によって１つ以上の分岐チャネル８４、８６に指向され得る。ここで示すように、チャネル９２は、接合部８８と呼掛け信号領域９４との間で主チャネル８２と接合されており、チャネル９２は、流体が、接合部８８の上流で主チャネル８２に入ることを可能とする。流体は、主チャネル８２から接合部８８を通って流れ得る。最初は、流体は、チャネル９２から主チャネル８２には入らず、主チャネル８２および分岐チャネル８４、８６の幾何学的配置に起因して、サンプルリボン９０を含む流体の一部が、底部分岐チャネル８６に流れる。呼掛け信号領域９４において所望の標識が、検出される場合、流体は、チャネル９２から主チャネル８２に入り得る。入った流体が、主チャネル８２を通って流れる流体を部分的に置き換え、サンプルリボン９０が、頂部分岐チャネル８４中に指向されるようにする。
【００３４】
あるいは、別の実施例において、サンプルリボン９０は、チャネル９２によって主チャネル８２から流体が除去されるネガティブ流体置換によって、分岐チャネルに指向され得る。この実施例において、チャネル９２へ流れる流体による主チャネル８２からの流体の除去によって、主チャネル８２中の流体の体積が減少し、サンプルリボン９０を、底部分岐チャネル８６に指向させる。チャネル９２による主チャネル８２からの流体の除去が中断される場合、主チャネル８２中の流体の体積は増加し、サンプルリボン９０は頂部分岐チャネル８４に指向される。
【００３５】
細胞分配システムを含む本発明のさらに別の例示的な実施形態が、図７に示される。図７では、分類ユニット１００の少なくとも一部（接合部１０８で接続する主チャネル１０２および複数の分岐チャネル１０４、１０６の一部を含む）が示される。この実施形態において、サンプルリボン１１０の少なくとも一部は、磁力の適用によって、１つ以上の分岐チャネル１０４、１０６に指向され得る。磁力源１１２が示される。例えば、細胞は選択的に標識され得、ここで、結合された標識は、磁気応答性部分（例えば、抗体と結合体化した磁気ビーズ）を含む。例えば、最初は、主チャネル１０２と分岐チャネル１０４、１０６の幾何学的配置に起因して、サンプルリボン１１０を含む流体の一部が、分岐チャネルの１つ（例えば、底部分岐チャネル１０６）に流れる。磁力が適用される場合、磁性標識を含む細胞は、その適用された力に応答して流れる。例えば、磁力が適用され、磁気的に標識された細胞を頂部分岐チャネル１０４に指向し得るが、一方、適用される磁力の非存在下では、それらの細胞は、底部分岐チャネル１０６に流れ得る。
【００３６】
図８は、本発明のさらに別の例示的な実施形態を例示する。図８では、分類ユニット１２０の少なくとも一部（接合部１２８で接続する主チャネル１２２および複数の分岐チャネル１２４、１２６の一部を含む）が示される。この実施形態において、サンプルリボン１３０の少なくとも一部は、電場の付加によって、１つ以上の分岐チャネル１２４、１２６に指向され得る。電場源１３２が示されており、矢印は電場を表す。電場を流れる細胞は、細胞の電荷と適用される電場との間の相互作用に応答して、１つ以上の分岐チャネル１２４、１２６に指向され得る。例えば、最初は、主チャネル１２２と分岐チャネル１２４、１２６の幾何学的配置に起因して、サンプルリボンを含む流体の一部が、分岐チャネルの１つ（例えば、底部分岐チャネル１２６）に流れる。電場が適用される場合、細胞は、細胞の電荷に依存して、適用される電場に応答して流れ得る。例えば、電場が適用され、特定の電荷を帯びた細胞を頂部分岐チャネル１２４へ指向し得るが、一方、そうではなく、適用される電場の非存在下では、これらの細胞は、底部分岐チャネル１２６に流れ得る。
【００３７】
細胞分配システムを含む本発明の他の実施形態は、種々の分類技術を使用し、細胞の流れを特定の分岐チャネルへと変化または指向し得る。このような分類技術としては、電気、電気浸透、他のバルブ配置、流体置換の他の手段、圧力などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３８】
上述の分類デバイスは、Ｙ型接合部を使用するが、これは、必ずしも必要ではない。他の型の接合部（Ｔ型接合部または４つより多いチャネルの交差によって形成される接合部が挙げられるが、これらに限定はされない）が、本発明に従って分類するために利用され得る。
【００３９】
さらに、上記の図中では、単一の分類ユニットのみが例示されていたが、本発明は、この単一の構造に限定されない。本発明の実施形態に従う分類ユニットは、同じ微小製造された基板上の他の構造体と容易に一体化される。例えば、本発明に従う実施形態は、連続的な分類作業によって集団中の異なる細胞を分離するために有用である、連続して配置された１連の分類ユニットを含み得る。本発明に従う別の実施形態は、１つ以上の分類ユニットまたは連続して配置された１連の分類ユニットを含むように微小製造されたカートリッジを含み得る。
【００４０】
他の配置、構成および方法が、当業者にとっては、容易に明らかであるはずである。本発明の他の実施形態、組合せおよび改変は、これらの教示の観点から、当業者に対して容易に生じる。それゆえに、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定されるべきであり、上述の説明および添付した図面を組み合わせて見た場合の全てのこのような実施形態および改変を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本発明に従う細胞を分類するための微量流体デバイスの側面図を例示する。
【図２】図２は、本発明に従う細胞を分類するための微量流体デバイスの３次元図を示す。
【図３】図３は、本発明のシース注入器の側面図である。
【図４】図４は、図３のシース注入器の上面図である。
【図５Ａ】図５Ａは、バルブを使用してサンプルリボンのフローを指向する工程に携わる、本発明の実施形態に従う分類ユニットの部分の概略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、バルブを使用してサンプルリボンのフローを指向する工程に携わる、本発明の実施形態に従う分類ユニットの部分の概略図である。
【図６Ａ】図６Ａは、流体ディスプレースメント（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を使用してサンプルリボンのフローを指向する工程に携わる、本発明の実施形態に従う分類ユニットの部分の概略図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、流体ディスプレースメントを使用してサンプルリボンのフローを指向する工程に携わる、本発明の実施形態に従う分類ユニットの部分の概略図である。
【図７】図７は、本発明に従う分類ユニットの代替的な実施形態の概略図である。
【図８】図８は、本発明に従う分類ユニットの別の代替的な実施形態の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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