(57)【要約】本発明は、線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防のためのオステオプロテゲリンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維化疾患の治療および／または予防のための医薬品を製造するための物質の使用であって、ここで、当該物質は、
ａ）配列番号２または配列番号４を含んでなるポリペプチド；
ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸２２〜４０１を含んでなるポリペプチド；
ｃ）オステオプロテゲリンの１、２、３または４つのシステインリッチドメインを含んでなるポリペプチド；
ｄ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸２２〜１９４を含んでなるポリペプチド；
ｅ）アミノ酸配列が（ａ）〜（ｄ）における配列のいずれかに対して少なくとも４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％の同一性を有する、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｆ）中程度にストリンジェントな条件下かまたは高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）のいずれかをコードするＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされる、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｇ）アミノ酸配列の任意の変化が、（ａ）〜（ｄ）におけるアミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換である、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの塩またはイソ型、融合タンパク質、機能性誘導体、活性フラクションもしくは環状置換型誘導体、
よりなる群から選択される、使用。
【請求項２】
線維化疾患が結合組織病である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
線維化疾患が強皮症である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記物質が単量体または二量体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記物質が１つもしくはそれ以上の部位でグリコシル化される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記融合タンパク質が免疫グロブリン（Ｉｇ）融合物を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記Ｉｇ融合物がＦｃ融合物である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記機能性誘導体が、アミノ酸残基上の１つもしくは数個の側鎖として存在する１つもしくは数個の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記部分がポリエチレン部分である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
線維化疾患の治療および／または予防のための医薬品を製造するための核酸分子の使用であって、ここで、当該核酸分子は、
ａ）配列番号２または配列番号４を含んでなるポリペプチド；
ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸２２〜４０１を含んでなるポリペプチド；
ｃ）オステオプロテゲリンの１、２、３または４つのシステインリッチドメインを含んでなるポリペプチド；
ｄ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸２２〜１９４を含んでなるポリペプチド；
ｅ）アミノ酸配列が（ａ）〜（ｄ）における配列のいずれかに対して少なくとも４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％の同一性を有する、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｆ）中程度にストリンジェントな条件下かまたは高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）のいずれかをコードする生来のＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされる、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｇ）アミノ酸配列の任意の変化が、（ａ）〜（ｄ）におけるアミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換である、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのイソ型、融合タンパク質または活性フラクション、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる、使用。
【請求項１１】
線維化疾患が結合組織病である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
線維化疾患が強皮症である、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記核酸分子は発現ベクター配列を含んでなる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ベクター配列が遺伝子治療ベクター配列である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防のための医薬品を調製するために、細胞における請求項１に記載のポリペプチドの内因性産生を誘導ならびに／あるいは増強するためのベクターの使用。
【請求項１６】
線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防のための医薬品を調製するために、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる細胞の使用。
【請求項１７】
線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防のための医薬品を製造するために、請求項１〜９のいずれか一項に記載の物質を発現する細胞の使用。
【請求項１８】
線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防のための医薬品を製造するために、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生するために遺伝的に改変されている細胞の使用。
【請求項１９】
前記医薬品が、同時、連続、または個別使用のために、インターフェロンをさらに含んでなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記インターフェロンがインターフェロン−βである、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記医薬品が、同時、連続、または個別使用のために、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニストをさらに含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＴＮＦアンタゴニストがＴＢＰＩおよび／またはＴＢＰＩＩである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬品が、同時、連続、または個別使用のために、抗強皮症薬を含んでなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記抗強皮症薬が、ハロフジノン、ＡＣＥ阻害薬、カルシウムチャンネル遮断薬、プロトンポンプ阻害薬、ＮＳＡＩＤ阻害薬、ＣＯＸ阻害薬、コルチコステロイド、テトラサイクリン、ペントキシフィリン、ブシラミン、ゲラニルゲラニル転移酵素阻害薬、ロッテルリン、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ阻害薬、ｃ−プロテイナーゼ阻害薬、リシルオキシダーゼ阻害薬、レラキシン、ハロフジノン、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、エンドセリン−１、一酸化窒素、アンギオテンシンＩＩ阻害薬、抗酸化剤またはＳＡＲＰ−１よりなる群から選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２５】
線維化疾患、特に強皮症を治療および／または予防するための方法であって、該方法を必要とする患者に、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の有効量の物質を、必要に応じて薬学的に許容可能なキャリアとともに投与することを含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維化疾患および結合組織障害の分野に関する。より具体的には、本発明は、線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防のためのオステオプロテゲリンの使用に関する。オステオプロテゲリンとインターフェロン、ＴＮＦアンタゴニストまたはＳＡＲＰ−１などのさらなる抗線維化剤との組み合わせもまた、本発明の範囲内にある。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、例えば、腎臓、心臓、肺、胃および関節を含む内蔵におけるコラーゲンの過剰産生に関する状態である。
【０００３】
肺線維症は、線維化疾患の中でも特に多い疾患である。特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、進行性線維症を伴う病因不明の肺胞壁の慢性炎症を特徴とする。ＩＰＦ、または原因不明の線維性肺胞炎は、特発性間質性肺疾患の原因の５０〜６０％を占める。
【０００４】
通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、間質性肺炎の特定の組織病理学的パターンは、ＩＰＦの肺生検に見出される古典的なパターンである。低倍率では、組織は不均一性を呈し、正常肺の改変領域、間質性炎症、線維症、および蜂巣状を伴う。間質性炎症は、ＩＩ型肺胞細胞の過形成に関連するリンパ球、形質細胞、および組織球の肺中隔浸潤からなる。線維化区域は、主に密な無細胞コラーゲンからなるが、早期および進行中の疾患の部位である増殖線維芽細胞の散在巣（線維芽細胞巣）もまた、通常、肺胞内の位置に認めることができる。蜂巣領域は、しばしば気管支上皮で裏打ちされ、粘膜で満たされた嚢胞性線維空隙からなる。好中球は粘膜内にプールし得る。平滑筋過形成は、しばしば線維症および蜂巣の領域に生じる。胸膜下および傍隔壁での分布、不統一な特性、および一過的異質性は、ＵＩＰを同定するのに最も有用な特徴である。
【０００５】
膠原病（例えば、ＲＡ、ＳＬＥ、全身性進行性硬化症、混合型結合組織病、糖尿病）、塵肺（例えば、石綿症）、放射線障害、および所定の薬物誘導性肺疾患（例えば、ニトロフラントインによる）では、間質性炎症および線維症と同一のパターンが生じる。
【０００６】
ＩＰＦの臨床経過は進行性であり；生存中央値は診断後４〜６年である。プレドニゾンは、ＩＰＦの症例における通常の治療である。治療に対する応答は様々であるが、瘢痕形成が優位を占める前のより細胞段階の早期疾患の患者は、コルチコステロイドまたは細胞障害治療により改善する可能性が高い。支持療法および待機療法には、低酸素症を軽減するための高濃度のＯ2が含まれ、細菌感染が生じる場合は抗生物質が含まれる。末期段階の肺疾患を有する患者では、肺移植が成功している。
【０００７】
肺の線維症は、細胞外マトリックスの産生と分解との間の不均衡から生じ、既存線維の崩壊および濃縮によって顕著になる肝臓における結合組織の蓄積に関する。
【０００８】
肝線維症は肝細胞壊死または損傷に対する一般的な応答であり、広範な因子、例えば、肝ホメオスタシスを撹乱する任意のプロセス（特に炎症、毒性損傷、または肝血流の改変）および肝臓の感染症（ウイルス、細菌、真菌、および寄生物）によって誘導され得る。先天的代謝障害から生じる多数の蓄積障害は、脂質異常（ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ））；糖原病（特に、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＩＸ、およびＸ型）；α1−アンチトリプシン欠損症；鉄過剰症（ヘモクロマトーシス）および銅蓄積症（ウィルソン病（Ｗｉｌｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ））などに見られるような外因性物質の蓄積；毒性代謝物の蓄積（チロシン血症、フルクトース血症およびガラクトース血症）；ならびにペルオキシソーム障害（ツェルベーガー症候群（Ｚｅｌｌｗｅｇｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））を含む線維症にしばしば関連する。多数の化学物質および薬物、特に、アルコール、メトトレキセート、イソニアジド、オキシフェニサチン、メチルドーパ、クロロプロマジン、トルブタミド、およびアミオダロンは線維症を生じる。肝循環障害（例えば、慢性心不全、バッド−キアリ症候群（Ｂｕｄｄ−Ｃｈｉａｒｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、静脈閉塞性疾患、門脈血栓症）および胆汁流に対する慢性閉塞は線維症をもたらし得る。最後に、先天的線維症は常染色体劣性形成異常である。
【０００９】
正常な肝臓は、肝細胞ならびにコラーゲン（主にＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ型）ならびに糖タンパク質（例えば、フィブロネクチン、ラミニン）およびいくらかのプロテオグリカン（例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸）を含む非コラーゲンタンパク質からなる細胞外マトリックス内に分布する洞様毛細血管から構成される。通常、門脈路においてのみ見出される線維芽細胞は、コラーゲン、大きな糖タンパク質、およびプロテオグリカンを産生することができる。
【００１０】
他の肝細胞（特に、肝細胞ならびに脂肪摂取クッパー（Ｋｕｐｆｆｅｒ）細胞および内皮細胞）もまた、細胞外マトリックス成分を産生することができる。ディッセ（Ｄｉｓｓｅ）腔の洞様毛細血管内皮の下側に位置する脂肪摂取細胞は、増殖して過剰な細胞外マトリックスを産生することが可能な線維芽細胞の前駆体である。コラーゲンの能動的沈着からの線維症の発症は、肝細胞損傷、特に壊死および炎症細胞の結果である。これらの細胞から放出される正確な因子は不明であるが、１種もしくはそれ以上のサイトカインまたは脂質過酸化の産物が有望である。クッパー細胞および活性型マクロファージは炎症性サイトカインを産生する。新しい線維芽細胞が壊死性肝細胞の周囲に形成し；コラーゲン合成の増加により瘢痕形成が生じる。線維症は、能動的線維形成および正常または改変されたコラーゲンの分解障害から生じ得る。脂肪摂取細胞、クッパー細胞および内皮細胞は、Ｉ型コラーゲン、いくらかのプロテオグリカン、および変性したコラーゲンの浄化において重要である。これらの細胞の活性における変化は、線維症の程度を加減し得る。組織病理学者にとっては、線維性の組織は、既存線維の受動的崩壊および濃縮からより明らかである。
【００１１】
従って、コラーゲンの合成の増加または分解の減少は、肝機能に影響を及ぼす過剰な結合組織の能動的沈着を生じる：（１）細胞周囲性線維化により細胞の栄養物摂取が損なわれ、肝細胞萎縮が生じる。（２）ディッセ腔内では、線維組織が洞様毛細血管の周囲に蓄積し、血液から肝細胞への物質の自由な通過を妨害する。（３）肝細静脈および門脈路周囲の線維化は肝血流を妨害する。肝臓の静脈抵抗は、門脈分枝から洞様毛細血管および最終的に肝静脈にかけて増加する。３つのすべての経路が関与し得る。
【００１２】
門脈と中心静脈とを連結する線維結合もまた、吻合管を促進する：正常肝細胞を迂回する動脈血は遠心性肝静脈に短絡され、これは肝機能をさらに損ない、肝細胞壊死を顕著にし得る。これらの過程が存在する程度は、例えば先天的肝線維化における肝機能障害の大きさを決定し、大きな線維結合は主に門領域に関与するが、通常、肝実質までには及ばない。従って、先天的肝線維症は、肝細胞機能が保存された門脈圧亢進症として存在する。
【００１３】
強皮症は、皮膚および臓器の線維症を特徴とする結合組織疾患であり、器官不全および死をもたらす（ブラック（Ｂｌａｃｋ）ら、１９９８；クレメンス（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ）およびフルスト（Ｆｕｒｓｔ）、１９９６）。強皮症は、広範な徴候および多様な治療結果を呈する。該強皮症は、限局型強皮症、全身性硬化症、強皮症様障害、および皮膚硬化を欠く強皮症（Ｓｉｎｅ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）を含んでなる（スミス（Ｓｍｉｔｈ）、２０００）。限局型強皮症は線維症および皮膚に限局した徴候に関連する稀な皮膚疾患であるが、全身性硬化症は、臓器に係わる様々なリスクおよび様々な程度の皮膚疾患を伴う多系疾患である。全身性硬化症はびまん性または限局性であり得る。限局性全身性硬化症もまた、ＣＲＥＳＴ（石灰沈着症、レイノー食道機能障害、手指硬化症、毛細管拡張）と呼ばれる。強皮症様障害は、産業環境への暴露に関連すると考えられている。皮膚硬化を欠く（Ｓｉｎｅ）疾患では、皮膚の変化を伴わない臓器への関連が認められる。
【００１４】
強皮症、特に全身性硬化症の主な徴候は、不適切な過剰なコラーゲン合成および沈着、内皮機能障害、痙攣、虚脱ならびに線維症による閉塞である。
【００１５】
強皮症は、１００万人に約１９症例の安定した発症率を有する稀な疾患である。強皮症の原因は不明である。しかし、遺伝的素因は重要である。異常は自己免疫ならびに内皮細胞および線維芽細胞機能の改変に関与する。実際、全身性硬化症は、おそらく最も重度な自己免疫疾患であり、診断５年以内の死亡率が５０％であることが報告されている（シルマン（Ｓｉｌｍａｎ）、１９９１）。
【００１６】
診断上重要な臨床パラメータは、中手指節関節に近接での皮膚の肥厚である。レイノー（Ｒａｙｎａｕｄ）現象は、強皮症症の頻度の高い、ほとんど普遍的な成分である。該レイノー現象は、低温暴露時の皮膚の色の変化によって診断される。虚血および皮膚肥厚は、レイノー（Ｒａｙｎａｕｄ）疾患の徴候である。
【００１７】
いくらかの根本的な生物学的プロセスは該疾患の開始、重症度および進行に関係し、血管機能障害、内細胞活性化および損傷、白血球蓄積、自己免疫産生ならびに決定的に死をもたらし得る制御されていない線維化応答を含む（クレメンス（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ）およびフルスト（Ｆｕｒｓｔ）、１９９６）。線維芽細胞は、本疾患の病因において中枢的役割を果たす。強皮症患者から得られる初代線維芽細胞は、インビボで認められる疾患の多くの特徴的特性、顕著に増加した細胞外マトリックス合成ならびに特にコラーゲンおよびフィブロネクチンの沈着、ならびにＴＦＧβおよびＣＴＧＦなどの改変された成長因子およびサイトカイン産生を示す（ストレロウ（Ｓｔｒｅｈｌｏｗ）およびコーン（Ｋｏｒｎ）、１９９８ならびにレロイ（ＬｅＲｏｙ）、１９７４）。
【００１８】
強皮症の治療方法は認められていない。革新的であるがしかしリスクの高い療法として、幹細胞の自家移植が提唱された（マルチニ（Ｍａｒｔｉｎｉ）ら、１９９９）。特に、線維化プロセスを標的とする強皮症の治療法は、現在のところ認められていない（ウィグレイ（Ｗｉｇｌｅｙ）およびボーリング（Ｂｏｌｉｎｇ）、２０００）。
【００１９】
疾患のリスクおよび強皮症の進行に関連する遺伝子を同定すれば、疾患の様々な段階での治療処置のための有効な戦略を開発することができ得る。
【００２０】
オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、１９９７年に線維芽細胞から分泌される新規のサイトカインとして同定された（シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら、１９９７）。ヒトＯＰＧは４０１アミノ酸タンパク質であり、グルタミン酸２２の前で切断され、３８０アミノ酸成熟タンパク質を生じる２１アミノ酸のシグナルペプチドを含有する。従って、ＯＰＧは可溶性タンパク質である。該ＯＰＧはＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり（モリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）ら、１９９８、ヤスダ（Ｙａｓｕｄａ）ら、１９９８）、Ｎ末端部分に４つのシステインリッチＴＮＦＲ様ドメインを含んでなる（シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら、１９９７）。ＯＰＧは、骨の発達において役割を果たすことが示されており、ＯＰＧ遺伝子を欠くマウスは、骨粗鬆症表現型および顕著な骨格異常を有する（ミン（Ｍｉｎ）ら、２０００）。
【００２１】
骨芽細胞および骨髄間質細胞から産生されるオステオプロテゲリンは、膜貫通ドメインを欠き、直接的シグナル伝達能を有さない分泌されたデコイ受容体として作用する。ＯＰＧは、その天然のリガンドであり、ＲＡＮＫＬ（ＮＦ−κＢリガンドの受容体アクチベーター）としても知られるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）に結合することによって作用する。ＯＰＧとＯＰＧＬ結合との間の結合は、ＯＰＧがその同族受容体であり、破骨細胞の分化、活性化および生存に極めて重大な破骨細胞受容体であるＲＡＮＫに作用することを妨げる。
【００２２】
ヒトＯＰＧは、ＴＮＦＲファミリーのメンバーであり、５つのエキソンからなり、２９ｋｂに及ぶゲノムを有する単一コピー遺伝子である（シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら、１９９７）。組換えＯＰＧは、単量体および二量体型で存在し、見かけの分子量がそれぞれ５５および１１０ｋＤａである（シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら、１９９７）。システイン１８５に対するＮ末端ドメインをトランケーションすると、おそらく、ＴＮＦＲ様ドメインのＳＳ３ジスルフィド結合の分裂によって不活性化が生じるが、アミノ酸１９４に対するタンパク質のＣ末端部分をトランケーションしても生物学的活性は変わらない。従って、ＯＰＧのＮ末端ＴＮＦＲ様ドメインは、破骨細胞形成を妨げるのに十分である（シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら、１９９７）。
【００２３】
トランスジェニックマウスでＯＰＧが過剰産生されると、破骨細胞のほぼすべてが欠乏することに付随して重大な大理石骨症が生じる。対照的に、マウスでＯＰＧ遺伝子が除去されると、重度の骨粗鬆症が生じる。ＯＰＧＬまたはＲＡＮＫが除去される場合でも重大な大理石骨症が生じ、これは、骨再吸収の調節においてこれらのタンパク質が重要な生理学的役割を果たすことを示す。骨芽細胞および間質細胞からのＯＰＧならびにＯＰＧＬの分泌は、多数のホルモンおよびサイトカインによって、しばしば、相反する方法で調節される。ＯＰＧおよびＯＰＧＬ産生の相対レベルは、骨再吸収の程度を究極的に指令すると考えられる。過剰のＯＰＧＬは骨再吸収を増加するが、過剰のＯＰＧは再吸収を阻害する。組換えＯＰＧは、インビトロおよびインビボで破骨細胞を刺激するすべての因子の効果を実質的に遮断する。ＯＰＧはまた、卵巣摘出誘導性骨粗鬆症、悪性腫瘍の体液性高カルシウム血症、および実験的骨転移を含む多様な動物疾患モデルにおいて骨再吸収を阻害する。従って、ＯＰＧは、過剰な破骨活性に関連する疾患について有効な治療選択肢を示すことができうる（コステヌイック（Ｋｏｓｔｅｎｕｉｋ）およびシャルホウブ（Ｓｈａｌｈｏｕｂ）、２００１）。
【００２４】
しかし、オステオプロテゲリンが線維化疾患に関与していることについては未だ示唆されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、オステオプロテゲリンの投与により、樹立した肺線維症の動物モデルの疾患が著しく改善されるという研究結果に基づく。肺線維症は、強皮症の徴候の１つである。
【００２６】
従って、本発明の第１の目的は、線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防のための医薬品を調製するために、オステオプロテゲリンを使用することである。本発明の第２の目的は、線維化疾患、特に全身性硬化症の治療および／または予防のための医薬品を調製するために、オステオプロテゲリンを発現する細胞、もしくはオステオプロテゲリンのコード配列を含んでなる発現ベクターを使用することである。オステオプロテゲリンおよびハロフジノンなどのさらなる抗線維化薬を含んでなる薬学的組成物、ならびにオステオプロテゲリンをヒト身体に投与することを含んでなる治療方法もまた、本発明の請求の範囲内にある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明に従って、ＤＮＡ遺伝子フィルターマイクロアレイ技術を使用し、全身性硬化症（強皮症）患者から得られた正常皮膚線維芽細胞と比較して、同じ疾患から得られた線維化病変由来の皮膚線維芽細胞において特異に発現した遺伝子を同定した。強皮症線維芽細胞において一貫して負に調節された１つの遺伝子は、破骨細胞形成阻害因子とも呼ばれるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）であった。異常な線維芽細胞は、試験した９例中７例において、正常線維芽細胞と比較して有意に低いレベルのＯＰＧ  ｍＲＮＡを発現した。これらの結果をリアルタイムＰＣＲ分析によって確認した。さらに、強皮症患者由来の異常皮膚の全生検標本から単離された総ＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、臨床的に正常、年齢、性別および解剖学的部位が一致したコントロール生検と比較して、低いレベルのＯＰＧ  ｍＲＮＡを示した。病変線維芽細胞のＯＰＧタンパク質もまた、同じ患者から単離された正常線維芽細胞と比較して、減少した。インビトロでは、ＯＰＧは、ＯＰＧ  ｃＤＮＡによる線維芽細胞のトランスフェクション後または組換えタンパク質による処置後にＴＧＦβ仲介コラーゲン合成を減少することが可能である。ＯＰＧのさらなるインビトロ活性は、ＴＧＦβ誘導性結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）発現を阻害するはずである。ＣＴＧＦは通常、線維芽細胞において、細胞外マトリックス成分の合成を誘導する。
【００２８】
これらのインビトロデータは、樹立された動物モデルのインビボデータによってさらに支持された。オステオプロテゲリンを投与すると、ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルの肺線維症が減少し、コラーゲン沈着が低下する。組織学的レベルでは、オステオプロテゲリン処置した動物の肺は、生来の未処置マウスの肺に類似する。
【００２９】
従って、本発明は、線維化疾患の治療および／または予防のための医薬品を製造するための物質の使用であって、ここで、物質は：
ａ）配列番号２または配列番号４を含んでなるポリペプチド；
ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸２２〜４０１を含んでなるポリペプチド；
ｃ）オステオプロテゲリンの１、２、３または４つのシステインリッチドメインを含んでなるポリペプチド；
ｄ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸２２〜１９４を含んでなるポリペプチド；
ｅ）アミノ酸配列が（ａ）〜（ｄ）における配列の少なくとも１つに対して少なくとも４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％の同一性を有する、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｆ）中程度にストリンジェントな条件下かまたは高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）のいずれかをコードするＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされる、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｇ）アミノ酸配列の任意の変化は、（ａ）〜（ｄ）におけるアミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換である、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの塩またはイソ型、融合タンパク質、機能性誘導体、活性フラクションもしくは環状置換型誘導体、よりなる群から選択される上記使用に関する。
【００３０】
当業者であれば、本発明に従って、内因性オステオプロテゲリンの放出を刺激するかまたは該内因性オステオプロテゲリンの活性を増強する物質は、線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防にも同様に使用することができることを理解するであろう。前記物質は、成熟オステオプロテゲリン自体であっても、またはＯＰＧＬに結合し、従って、ＲＡＮＫに結合するＯＰＧＬを妨害し、ＲＡＮＫを介するシグナル伝達を開始することを妨害するオステオプロテゲリンの任意のフラグメントであってもよい。そのような物質は、例えば、ＯＰＧＬに対する抗体であってもよい。ＯＰＧがＯＰＧＬに結合し、この相互作用は、ＯＰＧＬが、その受容体であるＲＡＮＫに結合することを妨害することは公知である。従って、当業者であれば、ＯＰＧＬが、その受容体であるＲＡＮＫに結合することを妨害するいずれの物質、またはＲＡＮＫ活性もしくはシグナル伝達を遮断する他のいずれの物質も、線維化疾患、特に強皮症の予防および／または治療において、オステオプロテゲリンと同じ活性を有することを理解するであろう。ＲＡＮＫに結合するＯＰＧＬを遮断する薬剤は、例えば、ＯＰＧＬに対するアンタゴニスト抗体であってもよい。ＲＡＮＫ活性を遮断する薬剤は、さらに、例えば、ＲＡＮＫに対するアンタゴニスト抗体であってもよい。さらに、ＯＰＧＬ／ＲＡＮＫ相互作用を遮断する薬剤は、例えば、これらの２つのタンパク質が相互に結合することを妨害する化学化合物であってもよいが、またさらにＲＡＮＫ受容体を介するシグナル伝達の他のいずれの化学的または生物学的インヒビターであってもよい。
【００３１】
ヒトオステオプロテゲリンの全長ｃＤＮＡをクローニングし、添付の配列表の配列番号１として示す。対応するアミノ酸配列を添付の配列表の配列番号２として示す。配列については、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいてＡＢ＿００８８２１の下で説明しており、ならびにモリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）ら（１９９８）も説明している。オステオプロテゲリンのイソ型または多型については、シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら（１９９７）が説明している。シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら（１９９７）によるｃＤＮＡを添付の配列表の配列番号３として示し、対応するアミノ酸配列を配列番号４として示す。両配列とも、さらにｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいてＵ９４３３２の下で入手可能である。モリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）らおよびシモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）らが見出したタンパク質間の唯一の差異は、それぞれアスパラギン酸またはアラニンであり得るアミノ酸位置２６３に関する。
【００３２】
本明細書で使用する用語「オステオプロテゲリン」は、（ａ）〜（ｈ）において上記で考慮した任意の物質に関する。
【００３３】
本明細書で使用する用語「治療および／または予防」は、疾患の形成、発達、進行、あるいは疾患のいずれか１つもしくはいくらかもしくはすべての徴候の形成、発達または進行の任意の減弱、減少、または部分的、実質的もしくは完全な予防、あるいは妨害を包含する。
【００３４】
本明細書で使用する用語「線維化疾患」は、例えば、慢性炎症または組織の修復および再構成によりなり得る線維症に関与する疾患に関する。線維症は、例えば、皮膚、肺、膵臓、肝臓または腎臓などのヒトの身体の任意の器官に関与し得る。従って、本発明はまた、肝硬変、間質性肺線維症、デュピュイトラン拘縮、ケロイドおよび他の瘢痕形成／創傷治癒異常、術後癒着および反応性線維症、ならびに特に心筋梗塞後の慢性心不全などの線維化疾患の治療および／または予防に関する。さらに、オステオプロテゲリンにより治療可能な疾患または障害は、創傷治癒疾患、特に肺の慢性炎症および究極的に肺表面の線維症もしくは瘢痕形成を含んでなる肺における創傷治癒を含んでなる。肺の炎症に関与する障害は、例えば、特発性肺線維症、サルコイドーシス、気管支肺異形成症、線維増殖性ＡＲＤＳ、ならびに肺徴候または慢性関節リウマチなどの全身性疾患を含んでなる（クレイン（Ｋｒｅｉｎ）ら、２００１）。
【００３５】
線維症は、一般に、所定の器官の機能的分化した組織を配置する結合組織の作製または増殖に関与する。従って、本発明の好適な実施態様では、線維化疾患は結合組織疾患である。
【００３６】
好適な実施態様では、線維化疾患は強皮症である。
【００３７】
本明細書で使用する用語「強皮症」は、全身性硬化症または全身性強皮症とも呼ばれる疾患に関する。これらの用語は、本出願の範囲内において同じ意味で使用される。全身性硬化症は、皮膚、関節構造、ならびに臓器（特に、例えば、食道、消化管、肺、心臓、および腎臓）におけるびまん性線維症；退行性変化；および血管異常を特徴とする原因不明の慢性疾患である。それは限局型または混合型、全身性、限局性、もしくはびまん性であり得る。
【００３８】
用語「強皮症」は、好ましくは、限局型、全身性、限局性およびびまん性強皮症ならびに重複徴候に関連する。
【００３９】
限局型強皮症は、主に皮膚に影響を及ぼすが、下にある筋肉および骨にも影響を及ぼし得る。しかし、一般に該限局型強皮症は臓器には影響しない。限局型強皮症は、比較的軽度であり、顕微鏡下での皮膚生検の外観などの同様の表面的徴候では、全身性強皮症に関連し得る。
【００４０】
全身性強皮症は、ＣＲＥＳＴ、限局性およびびまん性などの徴候のいくらかのタイプまたは徴候のグループを含んでなる。それは、進行性全身性硬化症、または家族性進行性全身性硬化症と称することもできる。全身性強皮症は、例えば、皮膚、血管、および／または臓器に影響を及ぼし得る。該全身性強皮症が皮膚に影響を及ぼす場合、最も一般的には手および／または顔の皮膚が硬化し得る。該硬化症が血管に影響を及ぼす場合、レイノー疾患を発症し得る。最も重度の形態の全身性硬化症は臓器に影響を及ぼし、障害または死さえ生じ得る。特に、全身性硬化症は：強皮症肺疾患、強皮症腎クリーゼ、心臓の徴候、疲労または限局性ＣＲＥＳＴを含む筋力低下、胃腸の運動障害および痙攣、ならびに中枢、抹消および自律神経系の異常を含んでなる。神経系の異常に関しては、手根管症候群に続いて三叉神経痛が出現するのが最も一般的である。
【００４１】
限局性強皮症は、例えば、手に限局され得るが、顔および頚部も関与し得る。
【００４２】
びまん性強皮症は皮膚の硬化を含んでなり、また、手首（または肘）より上で生じる。「皮膚症状を伴わない強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｓｉｎｅ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）」（臓器線維症が認められるが、皮膚の硬化は認められない）などのびまん性全身性硬化症；および家族性進行性全身性硬化症（家族内に発症する稀な形態）のいくらかの下位範疇が存在する。
【００４３】
重複徴候は、強皮症患者が他の自己免疫疾患（例えば、狼瘡、慢性関節リウマチなど）にも罹患している場合、例えば、狼瘡と重複するびまん性強皮症にあるという。強皮症の徴候は、混合型結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、または分類不能の結合組織疾患（ＵＣＴＤ）の一部であり得る。
【００４４】
本明細書で使用する用語「オステオプロテゲリン」は、添付の配列表の配列番号２または４の配列（両方ともヒト）の全部、もしくは一部を含んでなるタンパク質、ならびにその塩、イソ型、突然変異タンパク質、活性フラクション、機能性誘導体、および環状置換型誘導体に関する。マウスまたはラットなどのヒト以外の種由来のＯＰＧも、該タンパク質がその生物学的活性を示すことを可能にするのに十分な同一性がタンパク質間に存在し、ヒトにおける実質的な免疫応答を誘発しない限り、本発明に従って使用することができる。
【００４５】
好ましくは、用語「オステオプロテゲリン」は、シグナルペプチドを欠く成熟タンパク質を指す。シグナルペプチドは、配列番号２または４において規定されるＯＰＧのＮ末端の２１アミノ酸を含んでなり、即ち、成熟タンパク質は、配列番号２または４に記載のアミノ酸２２〜４０１を含んでなる。本明細書で使用する用語「オステオプロテゲリン」は、強皮症または他の線維化疾患において所望される活性を示す配列番号２または４に記載の任意のフラグメント、部分、ドメインもしくはサブドメインにさらに関する。タンパク質フラグメント、イソ型、特異的グリコシル化もしくはシアリル化型またはタンパク質の１つもしくはそれ以上のドメインは、それらが、線維化疾患に対して任意の有益な効果、好ましくは全長タンパク質に少なくとも匹敵する効果を示す限り、本発明に従って使用することができる。以下の実施例に記載のインビトロもしくはインビボ試験の１つ、または線維化疾患、特に強皮症における効果を実証するのに適切な他の任意のアッセイにおいて、有益な効果を測定することができる。
【００４６】
例えば、オステオプロテゲリンは、シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら（１９９７）が記載しているように、Ｎ末端部分にシステインリッチＴＮＦＲ様ドメインを含んでなる。このドメインを含んでなるフラグメントは、インビトロ試験でＯＰＧの生物学的活性を保持することが示された。従って、好適なＯＰＧフラグメントは、ＯＰＧのＴＮＦＲ様ドメイン、特に、配列番号２または４に記載のアミノ酸２２〜１９４を含んでなるフラグメントを含んでなる。
【００４７】
本発明に従えば、オステオプロテゲリンは、天然に存在する、従って、生来のタンパク質であるか、または組換えタンパク質であることができる。組換え産生は、酵母細胞または哺乳動物細胞のような真核細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞（ヒト胎児腎細胞）またはヒト線維芽細胞または細胞株において実施することができる。該タンパク質は、さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞において産生させることもできる。
【００４８】
オステオプロテゲリンは、単量体および二量体の形態で生じることが記載されている（シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら（１９９７））。従って、本発明によれば、ＯＰＧは、単量体、二量体、または多量体であってもよい。
【００４９】
好ましくは、オステオプロテゲリンは、１つもしくはそれ以上の部位でグリコシル化されている。該オステオプロテゲリンはまた、所定の必要性およびタンパク質の産生または単離の供給源に依存して、非グリコシル化されていてもよい。
【００５０】
本明細書で使用する用語「塩」は、オステオプロテゲリン分子またはその類似体のカルボキシル基およびアミノ基の酸付加塩の両方をさす。カルボキシル基の塩は、当該分野において公知の手段によって形成することができ、無機塩、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩などおよび例えば、トリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミン類と共に形成される基などの有機塩基との塩を含む。酸付加塩としては、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸との塩、および例えば、酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が挙げられる。もちろん、そのような任意の塩は、本発明に関するオステオプロテゲリンの生物学的活性を保持し、即ち、線維化疾患、特に強皮症に対して有益な効果を発揮する。
【００５１】
オステオプロテゲリンのイソ型またはスプライス変異体もまた、それらが疾患の進行および／または該疾患の徴候を阻害することが可能ある限り、本発明に従って使用することができる。
【００５２】
本明細書で使用する用語「突然変異タンパク質」は、天然のオステオプロテゲリンの１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置き換えられているか、または欠失されているか、あるいは１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基がオステオプロテゲリンの天然の配列に付加され、好ましくは、野生型オステオプロテゲリンと少なくとも同じ活性を有するかあるいはより強力な活性を有する、オステオプロテゲリンの類似体を指す。ＯＰＧの生物学的活性は、例えば、ＯＰＧの天然のリガンドであるＯＰＧＬへの結合をアッセイすることによって、測定することができる。タンパク質−タンパク質相互作用を評価するためのアッセイは、当業者に周知である。そのようなアッセイの例には、ＥＬＩＳＡ型結合アッセイ、免疫沈降アッセイ、またはＢＩＡコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）システムなどの他の任意のシステムにおける測定がある。これらの突然変異タンパク質は、公知の合成および／または部位特異的変異、あるいは該突然変異タンパク質に適切な他の任意の公知の技術によって調製される。
【００５３】
任意のそのような突然変異タンパク質は、好ましくは、オステオプロテゲリンに少なくとも実質的に類似の活性を有するように、成熟オステオプロテゲリンの配列に十分重複するアミノ酸配列を有する。オステオプロテゲリン変異体の活性は、以下の実施例で説明するアッセイでさらに試験することができる。例えば、ＯＰＧで処置した線維芽細胞におけるコラーゲン合成量を測定することは、オステオプロテゲリン突然変異タンパク質の活性を評価するのに適切な試験であり得る。
【００５４】
本発明に従う突然変異タンパク質は、ストリンジェントな条件下で、本発明に従って、オステオプロテゲリンをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるタンパク質を含む。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が慣例的に「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーションおよびその後の洗浄条件を指す。アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、上掲、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）、セクション６．３および６．４（１９８７，１９９２）、ならびにサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（サンブルック，Ｊ．Ｃ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．）、フリッス，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ））を参照のこと。
【００５５】
ストリンジェントな条件には、研究下でのハイブリッドの算出されたＴｍ未満の１２〜２０℃での洗浄条件、例えば、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で１５分間；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中３７℃で３０〜６０分間、次いで、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中６８℃で３０〜６０分間が含まれるが、これに制限されない。当業者であれば、ストリンジェンシー条件はまた、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、１０〜４０塩基）または混合型オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解している。混合型プローブが使用される場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、上掲を参照のこと。
【００５６】
任意のそのような突然変異タンパク質は、好ましくは、オステオプロテゲリンに実質的に類似するかまたはより良好な生物学的活性を有するように、オステオプロテゲリンの配列に十分重複するアミノ酸配列を有する。
【００５７】
オステオプロテゲリンの１つの容易な測定可能な活性は、コラーゲン合成を減少する能力である。突然変異タンパク質が実質的なコラーゲン減少活性を有する限り、該突然変異タンパク質は、オステオプロテゲリンに実質的に類似の活性を有するとみなすことができる。従って、所定の突然変異タンパク質を供することを含んでなる日常的実験によって、前記任意の所定の突然変異タンパク質がオステオプロテゲリンに少なくとも実質的に類似の活性を有するかどうかを決定することができる。
【００５８】
好適な実施態様では、任意のそのような突然変異タンパク質は、成熟オステオプロテゲリンの配列に少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、該突然変異タンパク質は、該配列に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性もしくは相同性を有する。
【００５９】
同一性は、配列を比較することによって決定される２つもしくはそれ以上のポリペプチドまたは２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係に反映する。一般に、同一性は、比較する配列の長さにわたって、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列のそれぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応関係を指す。
【００６０】
正確な対応関係が存在しない配列については、「同一％」を決定することができる。一般に、比較しようとする２つの配列は、配列間の最大の相対関係を与えるように整列される。このことは、１つまたは両方の配列のいずれかに「ギャップ」を挿入して、アラインメントの程度を増強することを含む。同一％は、同じまたは極めて類似の長さの配列に特に適切である比較する核配列の全長（いわゆる包括的アラインメント）か、または等しくない長さの配列により適切であるより短い、規定された長さ（いわゆる局所アラインメント）にわたって決定することができる。
【００６１】
２つもしくはそれ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、当該分野において周知である。従って、例えば、ウィスコンシン配列解析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン９．１（デベルクスＪ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ）ら、１９８４）、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを使用して、２つのポリヌクレオチド間の同一％および２つのポリペプチド配列間の同一％および相同％を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）の「局所相同性」アルゴリズム（１９８１）を使用し、２つの配列間で類似性の最も良好な単一の領域を見出す。配列間の同一性および・または類似性を決定するための他のプログラムもまた当該分野で知られている。例えば、プログラムのＢＬＡＳＴファミリー（アルスルＳＦ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ）ら、１９９０、アルスルＳＦ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ）ら、１９９７（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣＢＩのホームページよりアクセス可能））およびＦＡＳＴＡ（ピアソンＷＲ（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ  Ｒ）、１９９０；ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）１９８８）。
【００６２】
本発明に従って使用することができるオステオプロテゲリンの突然変異タンパク質、または該突然変異タンパク質をコードする核酸は、本明細書に提示した教義および指針に基づいて、過度の実験を行うことなく、当業者が日常的に入手することができる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして、実質的に対応する限定された組の配列を含む。
【００６３】
本発明に従う突然変異タンパク質の好適な変化は、「保存的」置換として公知であるものである。オステオプロテゲリンポリペプチドまたはタンパク質の保存的アミノ酸置換は、グループのメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保存するような十分に類似の物理化学的特性を有するグループ内の同義のアミノ酸を含むことができる（グランタム（Ｇｒａｎｔｈａｍ）、１９７４）。アミノ酸の挿入および欠失もまた、特に、挿入または欠失が数個のアミノ酸、例えば、３０個未満、好ましくは１０個未満のみに関与し、機能的コンホメーションに極めて重要なアミノ酸、例えば、システイン残基を除去することもまたは置換することもない場合、上記で規定された配列において、該配列の機能を改変することなく作製することができることが明らかである。そのような欠失および／または挿入によって産生されるタンパク質ならびに突然変異タンパク質は、本発明の範囲内にある。
【００６４】
好ましくは、同義のアミノ酸のグループは、表Ｉに規定されるグループである。より好ましくは、同義のアミノ酸のグループは、表ＩＩに規定されるグループであり；最も好ましくは、同義のアミノ酸のグループは、表ＩＩＩに規定されるグループである。
【００６５】
【表１】
2005530720.tif 000002
【００６６】
【表２】
2005530720.tif 000003
【００６７】
【表３】
2005530720.tif 000004
【００６８】
本発明における使用のために、オステオプロテゲリンポリペプチドまたはタンパク質の突然変異タンパク質を得るために使用することができるタンパク質のアミノ酸置換の生成の例として、マーク（Ｍａｒｋ）らの米国特許第４，９５９，３１４号、米国特許第４，５８８，５８５号および米国特許第４，７３７，４６２号；コス（Ｋｏｔｈｓ）らの米国特許第５，１１６，９４３号、ネイメン（Ｎａｍｅｎ）らの米国特許第４，９６５，１９５号；コング（Ｃｈｏｎｇ）らの米国特許第４，８７９，１１１号；ならびにリー（Ｌｅｅ）らの米国特許第５，０１７，６９１号に提示されるような任意の既知の方法；ならびに米国特許第４，９０４，５８４（シャウ（Ｓｈａｗ）ら）に提示されるリジン置換タンパク質などが挙げられる。
【００６９】
用語「融合タンパク質」は、例えば、体液中に長期滞留時間を有する別のタンパク質と融合した、オステオプロテゲリンを含んでなるポリペプチド、またはその突然変異タンパク質を指す。ヒト身体内における半減期などの分子の生物学的活性を改善することが可能なタンパク質の全部もしくは機能的部分と融合したオステオプロテゲリンの全部または機能的部分を含んでなる融合タンパク質は、本発明では好適である。好適な実施態様では、融合タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合物を含んでなる。免疫グロブリンの全部もしくは一部と融合したオステオプロテゲリンの全部または一部を含んでなる融合タンパク質は、極めて好適である。それらは、単量体または多量体、ヘテロもしくはホモ多量体であることができる。有利なことに、融合タンパク質は、免疫グロブリン、特に、免疫グロブリンのＦｃ部分の定常領域を含んでなる。免疫グロブリンがＩｇＧ１またはＩｇＧ２イソタイプである実施態様は、本発明ではさらに好適である。好ましくは、融合物はＦｃ融合物である。
【００７０】
従って、オステオプロテゲリンは、別のタンパク質、ポリペプチドなど、例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメントと融合してもよい。融合物は直接的でもよく、または１〜３アミノ酸残基長ほどの短いもしくはそれより長い、例えば、１３アミノ酸残基長であり得る短いリンカーペプチドを介してもよい。前記リンカーは、例えば、配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチドであっても、またはオステオプロテゲリン配列と免疫グロブリン配列との間に導入されるＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含んでなる１３アミノ酸リンカー配列であってもよい。
【００７１】
本明細書において使用される「機能性誘導体」は、オステオプロテゲリンの誘導体、ならびにそれらの突然変異タンパク質および融合タンパク質を含み、当該分野において既知の手段によって、残基上の側鎖またはＮもしくはＣ末端基として存在する官能基から調製することができ、それらが薬学的許容可能性を保持し、すなわち、それらが、オステオプロテゲリンの活性に少なくとも実質的に類似するタンパク質の活性を破壊せず、該活性を含有する組成物に毒性を付与しない限り、本発明に含まれる。従って、好適な実施態様では、機能性誘導体は、アミノ酸残基上の１つもしくはそれ以上の側鎖として存在する１つもしくはそれ以上の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含んでなる。
【００７２】
本発明に従えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）側鎖は極めて好適な部分である。ＰＥＧ側鎖は、抗原部位を遮蔽し、体液中においてそれらが結合する物質の滞留を延長することができる。他の誘導体として、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第１級もしくは第２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分により形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（例えば、アルカノイルまたは炭素環式アロイル基）あるいはアシル部分により形成される遊離の水酸基（例えば、セリンまたはスレオニン残基の水酸基）のＯ−アシル誘導体が挙げられる。
【００７３】
オステオプロテゲリンならびにその突然変異タンパク質および融合タンパク質の「活性フラクション」は、タンパク質分子単独かまたはそれに連結する関連分子または残基、例えば、糖もしくはリン酸残基を伴うタンパク質分子のポリペプチド鎖の任意のフラグメントまたは前駆体、あるいはタンパク質分子または糖残基自体の凝集体を含むが、但し、前記活性フラクションは、オステオプロテゲリンに対して少なくとも実質的に類似の活性を有する。
【００７４】
本発明は、強皮症の治療および／または予防のための医薬品を製造するための核酸分子の使用に関連し、ここで、核酸分子は、線維化疾患の治療および／または予防のための医薬品を製造するために：
ａ）配列番号２または配列番号４を含んでなるポリペプチド；
ｂ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸２２〜４０１を含んでなるポリペプチド；
ｃ）オステオプロテゲリンの１、２、３または４つのシステインリッチドメインを含んでなるポリペプチド；
ｄ）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸２２〜１９４を含んでなるポリペプチド；
ｅ）アミノ酸配列が（ａ）〜（ｄ）における配列の少なくとも１つに対して少なくとも４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％の同一性を有する、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｆ）中程度にストリンジェントな条件下かまたは高度にストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｄ）のいずれかをコードする生来のＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされる、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｇ）アミノ酸配列の任意の変化は、（ａ）〜（ｄ）におけるアミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換である、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの突然変異タンパク質；
ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのイソ型、融合タンパク質または活性フラクション、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる。本発明は、好ましくは、結合組織疾患、特に強皮症の治療および／または予防のための前記核酸分子の使用に関する。
【００７５】
本発明に従えば、オステオプロテゲリンは、前記核酸分子を含んでなるベクターの形態で、ヒト身体に投与してもよい。従って、本発明は、強皮症もしくは別の線維化疾患の治療および／または予防のための医薬品を製造するための前記核酸分子を含んでなるベクターの使用にさらに関する。好ましくは、ベクターは、オステオプロテゲリンのコード配列の全部または一部に作動可能に連結したプロモーターを含んでなる発現ベクターである。さらに好適な実施態様では、ベクターは、遺伝子療法ベクターである。遺伝子療法ベクターは、当該分野において公知であり、それらのほとんどは、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターなどのウイルス由来ベクターである。
【００７６】
本発明に従えば、オステオプロテゲリンはまた、オステオプロテゲリンを産生および／分泌する細胞の形態でヒト身体に投与してもよい。従って、本発明は、強皮症もしくは他の任意の線維化疾患の治療および／または予防のための医薬品を製造するためのオステオプロテゲリンを発現する細胞の使用、即ち、強皮症もしくは他の線維化疾患の治療および／または予防のための細胞療法にさらに関する。細胞は、天然にオステオプロテゲリンを産生する細胞および／または組換えオステオプロテゲリンを産生するトランスフェクトされた細胞であってもよい。オステオプロテゲリンをコードする核酸分子を含んでなる高コピー数の発現ベクターを担持する過剰発現細胞などの大量のタンパク質を発現および分泌する細胞が好ましい。
【００７７】
線維芽細胞が線維症の機構を示すため、該線維芽細胞は抗線維化および強皮症療法に最も適切な細胞である。従って、好ましくは、線維芽細胞を発現するオステオプロテゲリンが、本発明に従って使用される。
【００７８】
本発明は、線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防のための医薬品を調製するためのオステオプロテゲリンの全部もしくは一部をコードする核酸分子を含んでなるベクターを含んでなる細胞にさらに関する。本発明のポリペプチドを産生するように遺伝子が改変されている細胞もまた、本発明の範囲内にある。
【００７９】
通常サイレントであるかもしくはインヒビターの発現量が十分ではない細胞において、オステオプロテゲリンの内因性産生を誘導および／または増強するための発現ベクターを使用することもまた、本発明に従って考慮される。従って、本発明は、所望されるタンパク質の産生のための内因性遺伝子活性化（ＥＧＡ）として知られる技術を使用する。
【００８０】
いくつかの併用療法が本発明では好適である。従って、好ましくは本発明の医薬品は：
・インターフェロン、特に、インターフェロン−β
・腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト、特に、可溶性ｐ５５（ＴＢＰＩ）および／または可溶性ｐ７５（ＴＢＰＩＩ）などの可溶性ＴＮＦＲ；
・さらなる抗強皮症薬；
・ハロフジノン、ＡＣＥ阻害薬、カルシウムチャンネル遮断薬、プロトンポンプ阻害薬、ＮＳＡＩＤ阻害薬、ＣＯＸ阻害薬、コルチコステロイド、テトラサイクリン、ペントキシフィリン、ブシラミン、ゲラニルゲラニル転移酵素阻害薬、ロッテルリン（ｒｏｔｔｅｒｌｉｎ）、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ阻害薬、ｃ−プロテイナーゼ阻害薬、リシルオキシダーゼ阻害薬、レラキシン、ハロフジノン、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、エンドセリン−１、一酸化窒素、アンギオテンシンＩＩ阻害薬、抗酸化剤またはＳＡＲＰ−１からなる群から選択される抗強皮症薬、
をさらに含んでなる。
【００８１】
ＳＡＲＰ−１は、強皮症などの線維化疾患において有益な効果を有することが示されているタンパク質である（国際公開第０２／４６２２５号パンフレット）。国際公開第０２／４６２２５号パンフレットに記載されているＳＡＲＰ−１のフラグメント、イソ型、活性フラクション、融合タンパク質または機能性誘導体はまた、本発明に従って、オステオプロテゲリンと組み合わせて使用してもよい。
【００８２】
すべての治療は、同時、連続または個別での使用を意図している。
【００８３】
１つもしくはそれ以上の上記の物質をオステオプロテゲリンと共に含んでなる薬学的組成物は、本発明の範囲内にある。
【００８４】
強皮症の治癒方法は現在のところ存在しないが、現在、いくらかの薬剤または治療法が強皮症の徴候を治療するために使用されている。本発明による併用療法として使用することができるそのような抗強皮症薬については、例えば、ライトン（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ）（２００１）またはウィグレイ（Ｗｉｇｌｅｙ）およびシュール（Ｓｕｌｅ）（２００１）が概要を述べており、本明細書において参照により完全に組み込まれている。
【００８５】
インターフェロンは、ウイルスの複製および細胞増殖に対する阻害効果が主に知られている。例えば、インターフェロン−γは、免疫および炎症応答を促進するのに重要な役割を果たす。インターフェロンβ（ＩＦＮ−β、インターフェロンＩ型）は、抗炎症の役割を果たすといわれている。
【００８６】
本発明のなおさらなる実施態様では、オステオプロテゲリンはＴＮＦアンタゴニストとの併用で使用される。ＴＮＦアンタゴニストは、いくつかの方法でそれらの活性を発揮する。第１に、アンタゴニストは、十分な親和性でＴＮＦ分子自体に結合あるいは隔離し、ＴＮＦエピトープもしくはＴＮＦ受容体結合を担うエピトープを部分的または実質的に中和することができる（以後「隔離アンタゴニスト」と称する）。隔離アンタゴニストは、例えば、ＴＮＦに対する抗体であってもよい。
【００８７】
あるいは、ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ結合後に細胞表面受容体によって活性化されたＴＮＦシグナル伝達経路を阻害することができる（以後「シグナル伝達アンタゴニスト」と称する）。ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦが増殖および免疫グロブリン分泌を生じさせる感受性細胞株、例えば、ヒトＢ細胞における生来のＴＮＦの活性に対するインビトロでの効果に対する候補物の日常的なスクリーニングによって、容易に同定および評価される。アッセイは、様々な希釈の候補アンタゴニスト、例えば、アッセイに使用するＴＮＦのモル量の０．１〜１００倍でのＴＮＦ処方、およびＴＮＦを伴わないかまたはアンタゴニストのみを伴うコントロールを含有する（ツッチ（Ｔｕｃｃｉ）ら、１９９２）。
【００８８】
隔離アンタゴニストは、本発明に従って使用すべき好適なＴＮＦアンタゴニストである。隔離アンタゴニストのうち、高い親和性でＴＮＦに結合し、低い免疫原性を有する該ポリペプチドが好適である。可溶性ＴＮＦ受容体分子およびＴＮＦに対する中和抗体が特に好ましい。例えば、ＴＮＦ−ＲＩ（ｐ５５）およびＴＮＦ−ＲＩＩ（ｐ７５）の可溶性形態は、本発明において有用である。受容体の細胞外ドメインまたはその機能性部分を含んでなるこれらの受容体の短縮型は、本発明の特に好適なアンタゴニストである。短縮型可溶性ＴＮＦＩ型およびＩＩ型受容体については、例えば、ＥＰ９１４４３１に記載されている。
【００８９】
ＴＮＦ受容体の短縮型は可溶性であり、それぞれＴＢＰＩおよびＴＢＰＩＩと呼ばれる約３０ｋＤａまたは４０ｋＤａのＴＮＦ阻害結合タンパク質として、尿および血清中に検出されている（インゲルマン（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ）ら、１９９０）。ＴＮＦアンタゴニストおよび／またはインターフェロンとのオステオプロテゲリンの同時、連続、または個別使用が、本発明では好適である。
【００９０】
本発明によれば、ＴＢＰＩおよびＴＢＰＩＩは、オステオプロテゲリンとの併用で使用すべき好適なＴＮＦアンタゴニストである。受容体分子の誘導体、フラグメント、領域および生物学的に活性な部分は、本発明において使用することもできる受容体分子に機能的に類似する。受容体分子のそのような生物学的に活性な等価物あるいは誘導体とはポリペプチド、または受容体分子をコードする配列の部分を指し、十分なサイズがありかつ膜結合型ＴＮＦ受容体との相互作用が阻害もしくは遮断されるような親和性でＴＮＦに結合可能な部分である。
【００９１】
さらに好適な実施態様では、ヒト可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（ＴＢＰＩ）は、本発明に従って使用すべきＴＮＦアンタゴニストである。天然および組換え可溶性ＴＮＦ受容体分子およびそれらの産生方法については、欧州特許第  ３０８  ３７８号明細書、欧州特許第  ３９８  ３２７号明細書および欧州特許第  ４３３  ９００号明細書に記載されている。
【００９２】
該ＴＮＦ受容体分子は、疾患の早期段階においてＴＮＦ−αを遮断するのに有用であり得るが、後期段階では、ＴＮＦ自体は強皮症において有益な効果を発揮し得ることが考察されている（アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら、２０００）。従って、本発明は、強皮症、特に進行した段階の疾患での治療または予防のためのオステオプロテゲリンとＴＮＦとの併用にさらに関する。本発明に従い、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βを使用することができる。
【００９３】
本発明は、線維化疾患、特に強皮症の治療および／または予防のために、オステオプロテゲリンを、場合により１つもしくはそれ以上の薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と共に含んでなる薬学組成物にさらに関する。薬学的組成物は、上記で同定したさらなる成分を任意に、特に、インターフェロン、ＴＢＰまたはＣＯＸ阻害薬をさらに含んでなり得る。
【００９４】
本発明の薬学的組成物はまた、本発明の核酸分子を含んでなるベクター、またはオステオプロテゲリンを発現する細胞を含んでなり得る。
【００９５】
製薬の有効成分、即ち、本発明のポリペプチド、核酸もしくは細胞、またはそれらの組み合わせ、ならびに上記の物質の組み合わせは、様々な方法で個体に投与することができる。投与経路としては、皮内、経皮（例えば、徐放性処方において）、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所、および鼻腔内経路が挙げられる。他の任意の治療上有効な投与経路、例えば、上皮もしくは内皮組織を介するか、または有効因子をコードするＤＮＡ分子が（ベクターを介して）患者に投与される遺伝子療法（有効因子をインビボで発現および分泌させる）による吸収を使用することもできる。さらに、本発明のタンパク質は、薬学的に許容可能な界面活性剤、賦形剤、キャリア、希釈剤およびビヒクルなどの生物学的に活性な薬剤の他の成分と共に投与することができる。
【００９６】
「薬学的に許容可能な」の定義は、有効成分の生物学的活性の有効性を阻害せず、該有効成分を投与する宿主に毒性を示さない任意のキャリアを包含することを意味する。例えば、非経口投与用として、塩水、ブドウ糖溶液、血清アルブミンおよびリンゲル溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などのビヒクル中の注射用単位剤型で、活性タンパク質を処方してもよい。
【００９７】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与用には、薬学的に許容可能な非経口ビヒクル（例えば、水、塩水、ブドウ糖溶液）ならびに等張性（例えば、マンニトール）もしくは化学的安定性（例えば、保存剤および緩衝液）を維持する添加物を配合した溶液、懸濁液、乳濁液または凍結乾燥した粉末として、活性タンパク質を処方することができる。処方物は、一般に使用される技術によって滅菌される。
【００９８】
本発明の活性タンパク質のバイオアベイラビリティはまた、ヒト身体において分子の半減期を増加する配合手順を使用すること、例えば、ＰＣＴ特許出願国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載のように、分子をポリエチレングリコールに連結させることによって、改善することもできる。
【００９９】
活性タンパク質の治療有効量は、受容体のタイプ、本発明の物質のその受容体に対する親和性、それらが示す残存する任意の細胞障害性活性、投与経路、患者の臨床症状を含む多くの変数の関数である。
【０１００】
「治療有効量」は、投与する場合に、本発明の物質が疾患の発達または進行に対してインビボで有益な効果を生じるような量である。個体に対する単回または複数投与としての投与量は、ＯＰＧの薬物動態学特性、投与経路、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、徴候の程度、併用治療、治療回数ならびに所望される効果を含む様々な因子に依存して変動する。確立された用量範囲の調整および操作することは、十分に、当業者の能力の範囲内にある。
【０１０１】
要求される本発明のポリペプチドの用量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇまたは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１〜５ｍｇ／ｋｇまたは約１〜３ｍｇ／ｋｇにまで変動するが、上記のように、十分慎重に治療上の配慮がなされる。本発明の医薬品は、連日、隔日または週３回、投与することができる。
【０１０２】
連日投与は、通常、分割用量または所望される結果を得るのに有効な持効型で与えられる。第２またはその後の投与は、個体に投与された初回または前回の用量と同じか、より少ないかまたはより多い用量で実施することができる。第２またはその後の投与は、罹患中または発病前に投与することができる。
【０１０３】
さらに本発明は、線維化疾患、特に、強皮症を治療および／または予防するための方法に関し、該方法を必要とする患者に、治療有効量の本発明の物質を、場合により薬学的に許容可能なキャリアと共に投与することを含んでなる。あるいは、またはさらに、オステオプロテゲリンを産生する細胞または場合により発現ベクターに含まれる本発明の核酸分子を本発明に従って投与してもよい。
【０１０４】
発現ベクターは、全身投与することができる。好ましくは、発現ベクターは、筋肉内注射によって投与される。特に、肺線維症が疾患に関与する場合、さらなる好適な投与経路は吸入である。特に、皮膚への関与が認められる場合、ＯＰＧ配列を含んでなる発現ベクターまたは本発明のＯＰＧポリペプチドの局所投与は、さらなる好適な投与経路である。
【０１０５】
本発明は、薬学的組成物を調製するための方法であって、有効量のオステオプロテゲリンと薬学的に許容可能なキャリアとを混合することを含んでなる上記方法ならびに関節炎を治療および／または予防するための方法であって、該方法を必要とする宿主に有効阻害量のオステオプロテゲリンを投与することを含んでなる上記方法にさらに関する。
【０１０６】
ジャーナルの記事または要約、公開または非公開の米国もしくは外国の特許出願、発行された米国もしくは外国の特許あるいは他の任意の参照文献を含む本明細書において引用されたすべての参照文献は、引用文献に提示されたすべてのデータ、表、図および本文を含めてその全体が本明細書において参照として援用される。さらに、本明細書に引用された参照文献内において引用された参照文献のすべての内容もまた、その全体が参照として援用される。
【０１０７】
既知の方法工程、従来の方法工程、既知の方法または従来の方法を参照することは、本発明の任意の局面、説明または実施態様を当該分野において開示するか、教示するか、または示唆することを容認するいずれの様式にも当てはまらない。
【０１０８】
特定の実施態様に関する前述の説明は、当業者の知識（本明細書において引用した参照文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験を行うことなく、また本発明の一般概念から逸脱することなく、他者が多様な応用のために前記特定の実施態様を容易に改変および／または適応する程度に、本発明の一般的性質を十分に示している。従って、そのような適応および改変は、本発明において提示された教義および指針に基づいて、開示された実施態様の等価物の意味の範囲内にあることが意図される。本発明に記載の語句および専門用語は、説明を目的とするものであり、限定されるものではなく、このため、本明細書の専門用語および語句は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書において提示された教義および指針に照らし合わせて当業者が解釈すべきものであることはいうまでもない。
【０１０９】
ここまで、本発明について説明してきたが、以下の実施例を参考にすることによって、本発明はさらに容易に理解されるであろう。但し、以下の実施例は例示により提供するものであって、本発明を制限することは意図していない。
【０１１０】
実施例
方法
患者サンプル
９例の年齢および性別の一致したびまん性全身性皮膚硬化症（ＳＳｃ）患者の病変または非病変皮膚（通常、前腕の皮膚）から２ｍｍ3のパンチ型生検を採取した。すべての患者はＳＳｃ診断のための米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）の基準を満たした。
【０１１１】
線維芽細胞の培養
線維芽細胞は、先に記載（アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら、１９９１）の通り、インビトロ培養によって生検から入手した。簡単に説明すると、生検を細かく切断し、滅菌プラスチック製ディッシュまたはフラスコに置いた。室温で１５分間乾燥後、生検の片々を組織培養プラスチックに付着させ、次いで、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍｌあたり１００単位のペニシリン、１ｍｌあたり１００μｇのストレプトマイシン、１ｍｌあたり５０μｇのゲンタマイシンおよび１ｍｌあたり２．５μｇのアムホテリシンＢを含有するダルベッコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）からなる線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中で培養した。空気中５％ＣＯ2の加湿大気中で２〜３週間のインキュベーション後、線維芽細胞の発芽後成長を簡単なトリプシン処理によって分離し、ゲンタマイシンおよびアムホテリシンＢを含まないＦＧＭ中で再培養した。実験では、線維芽細胞を２〜５継代の間で使用した。線維芽細胞の表現型は、単層および３次元コラーゲンゲル培養において、それらの典型的な形態学によって確認した。
【０１１２】
ＲＮＡの単離
総ＲＮＡは、製造者のプロトコルに従い、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、初代継代の密集強皮症線維芽細胞から単離した。最終ＲＮＡペレットを滅菌ＤＥＰＣ処理した水中に１μｇ／μｌの濃度で再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０１１３】
ｃＤＮＡプローブの合成
２μｇの総ＲＮＡを１．３μｌのサイトカイン特異的プライマー（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）カタログ番号ＧＡＣ１１）と混合し、０．５ｍｌエッペンドルフチューブ中７０℃で２分間、インキュベートした。次いで、チューブを５０℃まで冷却し、２分後、２μｌの５×反応緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、３７５ｍＭ  ＫＣｌおよび１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）、１μｌの１０×ｄＮＴＰ混合物（５ｍＭ  ｄＧＴＰ、５ｍＭ  ｄＣＴＰおよび５ｍＭ  ｄＴＴＰ）、３．５μｌのα32Ｐ−ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）カタログ番号ＰＢ１０２０４）、０．５μｌ  ＤＴＴ（１００ｍＭ）ならびに１μｌのスーパースクリプトＩＩ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含有する反応混合物を添加した。反応混合物をピペッティングで簡単に混合し、５０℃で２５分間、インキュベートした。１ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを含有する１μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０を添加することによって、反応を停止した。次いで、製造者の指示に従い、クロマスピン（Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ）−２００  ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏカラム（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して、標識したｃＤＮＡを、組み入れられなかったデオキシヌクレオチドから精製した。クゼレンコフ（Ｃｚｅｒｅｎｋｏｖ）計数によって、ｃＤＮＡ含有画分を同定した。ピーク画分（通常、回収した６本のすべての画分のうちの画分２）を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．１容積の１Ｍ  ＮａＯＨにより２０分間、７０℃で処置して、ＲＮＡを加水分解し、次いで、２．５μｇのヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含有する等容積の１Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4により、２０分間、７０℃で中和した。次いで、熱処置かつ中和したｃＤＮＡプローブを、ハイブリダイゼーション混合物に直接添加した。
【０１１４】
遺伝子フィルターマイクロアレイに対するハイブリダイゼーション
遺伝子フィルターマイクロアレイ（ヒトサイトカイン発現アレイ、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）カタログ番号ＧＡ００１）を、ハイベイド（Ｈｙｂａｉｄ）ハイブリダイゼーション・オーブン（ＭＷＧバイオテック（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））内のローラーボトル中０．５μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含有する５ｍｌのエクスプレス・ハイブリダイゼーション（Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）溶液（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））中で、６８℃で２時間、プレハイブリダイズさせた。この後、プレハイブリダイゼーション溶液を、０．２５〜１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの比放射能のｃＤＮＡプローブ調製物を含有する新鮮ハイブリダイゼーション溶液と置き換えた。ハイブリダイゼーションは、１６〜２０時間、６８℃であった。ハイブリダイゼーション後、１回の洗浄あたり２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳにより６８℃、２０分間で４回、１回の洗浄あたり０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳにより１５分間で２回、フィルターを洗浄した。フィルターをサラン・ラップ（Ｓａｒａｎ  ｗｒａｐ）TMで密封し、Ｋタイプ・ストレージ・ホスホル・イメージング・スクリーン（Ｋ−ｔｙｐｅ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎ）（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ））に様々な時間（４時間〜４日間）、室温で暴露させた。
【０１１５】
画像解析
イメージング・スクリーンを、バイオラド・パーソナル・ＦＸホスホイメージャー（Ｂｉｏｒａｄ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ＦＸ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を使用して、５０μｍの解像度でスキャンした。得られた１６ビットのデジタルファイルをＴＩＦ形式に変換し、アレイビジョン（Ａｒｒａｙｖｉｓｉｏｎ）ソフトウェア（イメージング・リサーチ社（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．））を使用して、画像を解析した。それぞれのサンプルについて、本発明者らは、フィルター上に２回反復でスポットした３８４遺伝子のピクセル強度を測定した。バックグランドのシグナルを差し引いて、アレイにおける各対のスポットに対する平均のピクセル強度を作成した（＝発現レベル）。
【０１１６】
ＲＴ−ＰＣＲによる選択された遺伝子に対するマイクロアレイ結果の確認
５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１ｍＭのそれぞれｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、０．５単位の組換えＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））および１５単位のＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含有する２０μｌ反応容積中でオリゴｄＴプライマー（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して、各患者サンプル由来の１μｇの総ＲＮＡを逆転写した。反応混合物を４２℃で６０分間、インキュベートし、９５℃で５分間加熱し、次いで、滅菌水で２００μｌに希釈した。次いで、遺伝子フィルター製造者によって提供されたデータベースの取得番号に基づきプライマー・エクスプレス（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）ソフトウェア（ＰＥアップライド・バイオシステムズ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用してオステオプロテゲリン用に設計した特異的プライマー対：オステオプロテゲリン−１１２Ｆ  ５’ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＴＣＴ（配列番号５）およびオステオプロテゲリン−１８５Ｒ  ５’ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＧ（配列番号６）を使用し、逆転写酵素反応物の希釈物を、タックマン（Ｔａｑｍａｎ）（ＰＥアップライド・バイオシステムズ７７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００））上でリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、各サンプルにおけるハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現に対して正規化し、異常患者サンプルの発現値を対応する正常患者サンプルで徐することによって決定された倍率変化として表す。
【０１１７】
ヒトオステオプロテゲリンの全ｃＤＮＡコード配列のクローニング
次いで、ＯＰＧの全長ｃＤＮＡコード配列を、ＥＭＢＬデータベースにおいて利用可能なｃＤＮＡ配列（取得番号Ｕ９４３３２）に基づく次のプライマー：ＯＰＧ  Ｆ  ５’ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＣＴ（配列番号７）およびＯＰＧ  Ｒ  ５’ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＴＡＡ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＴＴＴをそれぞれ５０ｐｍｏｌｅで、０．３ｍＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、５μｌの正常ヒト皮膚（包皮）線維芽細胞ｃＤＮＡテンプレート（上記の通りに調製した）、５μｌの１０×Ｐｆｘ増幅緩衝液（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））および１μｌのプラチナ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含有する５０μｌ反応混合物中で使用する逆転写酵素ＰＣＲによって、クローニングした。反応混合物を９４℃で２分間加熱し、次いで、次のような３５サイクルのＰＣＲに供した：９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および６８℃で１分間。増幅産物を１×ＴＡＥ緩衝液（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中で１％アガロース上で分析し、予想される分子量（１２０５ｂｐ）に泳動するＰＣＲ産物を、ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ精製キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用してゲルから精製した。
【０１１８】
１００ｎｇのゲル精製したＤＮＡを、製造者の条件に従って制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））により消化し、上記のように再精製し、標準的な分子生物学技術に従って、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を使用して、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結した。連結産物を、バイオラド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）を使用するエレクトロポレーションによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ  １０  Ｆ’ 株（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換した。プラスミドＤＮＡを、得られるコロニーから増殖させた５ｍｌの培養液から単離し、ＯＰＧの配列を確認するためにＴ７およびｐｃＤＮＡ３．１ＡＳプライマー（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して、アップライド・バイオシステムズ３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７００）シークエンサー上の自動化配列分析に供した。
【０１１９】
病変および正常皮膚線維芽細胞から単離したタンパク質抽出物におけるオステオプロテゲリンの検出
上記のように培養した強皮症患者およびコントロール被験体由来の低継代病変および正常線維芽細胞を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで細胞単層を、５分間、３７℃で処置することによって回収した。分離した細胞を、遠心分離で回収し、５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、５０μｌのサンプル緩衝液（２０％ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール、１Ｍ  Ｔｒｉ  ｐＨ６．８）により処置し、−８０℃で凍結し、次いで融解した。製造者のプロトコルに従い、ＢＣＡキット（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用して、タンパク質含有量を決定した。約１０μｇのタンパク質を０．１容積のＤＴＴ（０．１Ｍ）で処置し、製造者の指示に従って、４〜１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ））上で稼動させた。次いで、ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）ウェットボルト装置を３０Ｖで１時間、使用して、タンパク質のバンドをニトロセルロースフィルターに移した。次いで、５％脱脂粉乳を含有するＰＢＳ中４℃で、膜を１晩ブロックし、次いで、ＰＢＳＴで洗浄した。膜を、ＰＢＳＴ／１％ＢＳＡ中０．５μｇ／ｍｌの１次抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＯＰＧモノクローナル抗体、カタログ番号ＭＡＢ８０５１）と共に、１時間、室温で、振盪しながらインキュベートした。この後、ＰＢＳＴ／１％ＢＳＡ中、１／３０００希釈で２次抗体（抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））と共にインキュベーションする前に、ＰＢＳＴで徹底的に膜を洗浄した。ＥＣＬ試薬およびアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製のハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）TMを使用して現像および可視化する前に、最後に膜を徹底的に洗浄した。
【０１２０】
組換えＯＰＧで処置したかまたはＯＰＧ／ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのトランスフェクション後の線維芽細胞の細胞培養上清中のＩ型コラーゲンを測定するためのＥＬＩＳＡ
シ−ウェン（Ｓｈｉ−ｗｅｎ）ら（シ−ウェン（Ｓｈｉ−ｗｅｎ）ら、１９９７）により記載されている捕捉ＥＬＩＳＡシステムを使用して、培養ヒト線維芽細胞におけるコラーゲン合成をインビトロで測定した。簡単に説明すると、ＡＧ１５１８ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣより購入）を、５％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に維持した。トリプシン処理により細胞を回収し、４８ウェル細胞培養プレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））中７０％のコンフルエンスで、５％血清を含有する培地中に播種し、次いで、８時間後に、血清を含まない培地に移した。２４時間後、培地を取り出し、５０μＭ  Ｌ−アスコルビン酸（和光純薬工業（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ））および漸増濃度のヒト組換えオステオプロテゲリン（ＯＰＧ−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）より購入）を含有する血清を含まない新鮮培地と置き換えた。１６時間後、ＴＧＦβ１（ペプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ））を、２ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで培地に添加し、さらに２４時間後、培地を取り出し、遠心分離して、細胞破砕物を除去し、希釈し、下記のようにＩ型コラーゲンのためのＥＬＩＳＡに供した。
【０１２１】
ＯＰＧ  ｃＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１−ＯＰＧ）によるトランスフェクション後または次の通りのモックトランスフェクション（ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみ）後の初代ヒト線維芽細胞におけるコラーゲン合成を測定した：ＯＢＨＣ細胞をトリプシン処理により回収し、４８ウェルプレート中５０％コンフルエンスで完全培地中にプレート化した。製造者の指示に従い、フュージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）Ｖトランスフェクション試薬（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用して、プラスミドをＯＢＨＣ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの５時間後、培地を、Ｌ−アスコルビン酸を含有する血清を含まない新鮮培地と１晩置き換え、次いで、上記のように、ＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処置した。
【０１２２】
マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））を、１晩、４℃、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中５μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩ型コラーゲン（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．  Ｉｎｃ．））で被覆した。次いで、抗体溶液を取り出し、プレートを、ＰＢＳ−１％ＢＳＡにより、１時間、室温でブロックした。次いで、プレートを、ＰＢＳ／０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。１００μｌ馴化培地の３回重複サンプルを試験した。サンプルを２時間、室温（ＲＴ）でインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄した。次いで、サンプルを、１：２０００希釈のビオチン化ヤギ抗体ヒトＩ型抗体（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．  Ｉｎｃ．））と共に１時間、ＲＴでインキュベートし、次いで、ＰＢＳＴで４回洗浄した。次いで、サンプルを１／４０００希釈のＨＲＰ−ストレプトアビジン結合抗体（ザイメド（Ｚｙｍｅｄ））と共に、１時間、ＲＴで振盪しながらインキュベートした。最後に、サンプルをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＯＰＤ基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｐ９１８７）を添加し、発色のために１０分間、放置した。２０％Ｈ2ＳＯ4ミックスで反応を停止し、ビクター（Ｖｉｃｔｏｒ）2マルチレベルカウンター（ワラック（Ｗａｌｌａｃ））上、４９６ｎｍでプレートを読み取った。モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）製サイクアント（ＣｙＱｕａｎｔ）細胞増殖アッセイキット（Ｃ−７０２６）を使用して、細胞数に対して、結果を正規化した。
【０１２３】
ＣＴＧＦ−ＳＥＡＰプロモーターアッセイ
オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＴＣＧＴＣＣＣＴＴＧＴＣＣ（配列番号９）および５’−ＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＧＴＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＴＣＴＣＣ（配列番号１０）により実施されるＰＣＲによって、ＣＴＧＦ−ＳＥＡＰプロモーター−レポータープラスミドを構築し、ヒトＣＴＧＦ（結合組織成長因子）遺伝子プロモーター領域（７８８ｂｐ）を増幅した。ゲル精製した増幅産物をｐＳＥＡＰ２−ベイシック（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））にサブクローニングした。
【０１２４】
ＮＩＨ  ３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＣＣ）をＴ−７５フラスコに播種し、５μｇのＣＴＧＦ−ＳＥＡＰおよび１μｇのｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））プラスミドで同時トランスフェクトした。８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ（Ｓｉｇｍａ））上で細胞を選択した。
【０１２５】
安定に組み込まれたＣＴＧＦ−ＳＥＡＰプロモーター−レポーターを有するクローンを樹立し、クローンについて分析し、細胞に基づくアッセイを開発するために最も感受性の高いクローンを選択した。
【０１２６】
このクローン（ＣＴＧＦ−ＳＥＡＰ）由来の細胞を、０．５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中、９６ウェルプレートあたり１０，０００細胞でプレート化した。翌日、異なる濃度のＴＧＦβおよびＯＰＧ（オステオプロテゲリン）を伴うかまたは伴わずに、新鮮培地を添加し、ＳＥＡＰアッセイのために上清を回収する前に、細胞をさらに７２時間、インキュベートした。
【０１２７】
製造者のプロトコル（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）キット）に従って、ＳＥＡＰ発現を測定した。
【０１２８】
インビボ研究
１日目に、塩水中ブレオマイシン（０．０７５ＩＵ）の気管内投与によって、雄性マウス（２０〜２５ｇ）に肺線維症を誘発させた。マウスを、１０匹の３つの個別のグループに分けた。１つのグループには、５ｍｇ／ｋｇ（塩水中）のＯＰＧの皮下（ｓ．ｃ．）注射を連日行った。第２のグループには、ＯＰＧ（０．５ｍｇ／ｋｇ）ｓ．ｃ．連日投与を行った。第３のグループは、塩水（ｓ．ｃ．）を連日投与した。第４のグループは週齢および性別の一致した非処置の生来のマウスを含んだ。連日、体質量を測定し、すべてのマウスを１２日目に屠殺した。ヒドロキシプロリン決定のために個々の肺胞を単離する（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９９４）か、またはホルマリン固定化して、組織学のためにパラフィンで包埋した。肺切片を、コラーゲンのためにトリクロムまたはピクロ・シリウス・レッド（ｐｉｃｒｏ  ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ）で染色し（バンクロフト（Ｂａｎｃｒｏｆｔ）およびスティーブンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ））、線維症／肺の程度を評価した。
【０１２９】
インビトロでハロフジノン処置した強皮症患者線維芽細胞におけるＯＰＧ  ｍＲＮＡの半定量的逆転写酵素ＰＣＲ分析
病変および非病変線維芽細胞を上記の培地で維持した。細胞単層（７０％のコンフルエント）をハロフジノン（１０-8Ｍ）（コルゲート・ファーマシューティカルズ（Ｃｏｌｌｇａｒｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））で１２時間処置した。処置期間後、細胞を回収し、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）方法を使用して、総ＲＮＡを単離した。次いで、オステオプロテゲリンに特異的なＰＣＲプライマー（ＯＰＧ  ７４０  Ｆ  ５’ＡＣＧ  ＣＣＴ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  ＧＴ（配列番号１１）およびＯＰＧ  １２８０Ｒ  ５’ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＣＴ  配列番号１２）を使用して、１μｇの総ＲＮＡを上記の逆転写酵素ＰＣＲに供した。３０サイクルのＰＣＲ後、反応産物を臭化エチジウムで染色した１％アガロースゲル上で稼動させ、コダック１Ｄデジタルサイエンス（Ｋｏｄａｋ  １Ｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）ソフトウェアを使用して写真撮影し、解析した。次いで、予想された分子量に泳動するＰＣＲ産物を、ゲル抽出したＤＮＡの直接配列決定によって、オステオプロテゲリンであることを確認した。ゲノムＤＮＡ混入のコントロールとして、適切なＲＮＡを含有するが逆転写酵素を含有しない逆転写酵素反応混合物上でＰＣＲ反応を実施した。逆転写酵素反応物もまた、初期反応のインプットＲＮＡの完全性および量の陽性コントロールとして、ＧＡＰＤＨ特異的ＰＣＲプライマーで増幅させた。
【０１３０】
Ｉ型コラーゲンα２プロモーター活性
マウス胚線維芽細胞（πＳ３細胞）を、２％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭ−Ｆ１２中で維持した。トリプシン処理により細胞を回収し、４８ウェル細胞培養プレート中５０％のコンフルエンスでプレート培養した。翌日、血清を含まない培地中、製造者の指示に従い、フュージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）Ｖ試薬（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用して、ルシフェラーゼｃＤＮＡに連結された３．５ｋｂのコラーゲン１α２プロモーター（ロイヤル・フリー・ホスピタル（ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、英国、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ））からデビッド・アブラハム博士（Ｄｒ．  Ｄａｖｉｄ  Ａｂｒａｈａｍ）により贈与された）を含有するｐＧＬ３ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で細胞をトランスフェクトした。５時間のトランスフェクション後、２％ＦＣＳを含有する新鮮培地に細胞を移し、０、１、１０または１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトオステオプロテゲリンの存在下、ハロフジノン単独（１０-10Ｍ）、ＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ）単独またはＨＦ（１０-8Ｍ）＋ＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ）で１２時間、処置した。処置期間後、２％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含有する完全培地に細胞を移し、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）より購入したブライト−グロ（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ）アッセイシステムを使用して、各ウェルにおいて４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。結果を相対発光単位として表し、サイクワント（Ｃｙｑｕａｎｔ）キット（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））を使用して、平行実験で決定した細胞／ウェルの数に正規化した。
【実施例】
【０１３１】
実施例１：病変対非病変線維芽細胞においてオステオプロテゲリンｍＲＮＡは有意に負に調節される
６例の強皮症患者由来の正常および異常線維芽細胞サンプルに対して、遺伝子フィルターマイクロアレイ分析を実施した。オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の平均発現レベルを図１ａに示し、各患者についての発現レベルを図１ｂに示す。
【０１３２】
マイクロアレイ上で得られた結果は、ＯＰＧ特異的ＰＣＲプライマーを使用して９例の患者から単離されたＲＮＡサンプルのリアルタイムＰＣＲ分析によってさらに確認した。結果を図２に示し、発現レベルの倍数の変化（病変を非病変で割る）として表す。９例中７例の患者において、ＯＰＧは、同じ患者から単離された非病変線維芽細胞と比較して病変線維芽細胞では少なくとも２分の１に調節された。
【０１３３】
正常ヒト皮膚線維芽細胞の初代培養物におけるＯＰＧ  ｍＲＮＡ発現は、細胞を継代する際に有意に変化しないことから、同じ患者由来の非病変および病変線維芽細胞間で観察された発現の差異は、２つの集団間の培養条件の差異によるものではないと思われる（データ示さず）。さらに、強皮症患者由来の異常皮膚の全生検標本から単離された総ＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、同じ患者由来の臨床上正常な外観を呈する解剖学的部位が一致する皮膚と比較して、オステオプロテゲリンｍＲＮＡのレベルは低いことを示した（図３）。
【０１３４】
実施例２：ＯＰＧは、強皮症患者由来の病変対非病変線維芽細胞において、タンパク質レベルで負に調節される
オステオプロテゲリンｍＲＮＡの負の調節がオステオプロテゲリンタンパク質の変化に反映するかどうかを決定するために、年齢および性別が一致する被験者由来の解剖学的部位が一致する正常および病変皮膚線維芽細胞のＯＰＧ含有量を、抗ヒトオステオプロテゲリンモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロット分析によって決定した。結果を図４に示す。オステオプロテゲリン単量体および二量体は、３／４正常線維芽細胞において明らかに検出可能であり、１つの正常サンプルでは弱く発現した。異常線維芽細胞では、試験した４つのすべてのサンプルにおいて単量体のバンドが弱く認められた。組換えにより発現されるＯＰＧ−Ｆｃ融合タンパク質は、染色の陽性コントロールとしての役割を果たす。
【０１３５】
実施例３：ヒトＯＰＧのクローニング
インビトロおよびインビボでＯＰＧ活性を特徴付けるために、予想される開始および終止コドンに隣接するＯＰＧの公開された配列に基づくプライマーを使用して、逆転写酵素ＰＣＲによって、全ｃＤＮＡコード配列をクローニングした。得られるＯＰＧ  ｃＤＮＡクローン（ｐｃＤＮＡ３．１中）の配列分析は、モリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）ら（モリナガ（Ｍｏｒｉｎａｇａ）ら、１９９８）によって公開されたＯＰＧの配列のヌクレオチドレベルで１００％同一を示したが、シモネット（Ｓｉｍｏｎｅｔ）ら（１９９７）によって公開された配列に対しては１アミノ酸だけ異なった（配列番号２および４を参照のこと）。
【０１３６】
実施例４：ヒト皮膚線維芽細胞株におけるＯＰＧ  Ｉ型コラーゲン合成に対する効果
Ｌ−アスコルビン酸の存在下で培養される線維芽細胞は、ＥＬＩＳＡによるコラーゲン検出を可能にする培養培地にコラーゲンを分泌する。ヒト線維芽細胞は、前線維化（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ）サイトカインＴＧＦβ１による刺激応答するコラーゲン合成を正に調節する。従って、本発明者らは、ＡＧ１５１８Ｃ線維芽細胞におけるＴＧＦβ１誘導性コラーゲン合成に対する組換えオステオプロテゲリン（オステオプロテゲリン−Ｆｃ融合タンパク質）の効果について試験した。ＴＧＦβ１処置の前に線維芽細胞培養物に添加されたオステオプロテゲリンは、用量依存的様式で、ＴＧＦβ１により仲介されるコラーゲン合成の増加を阻害することが可能であった（図５）。中和抗ＯＰＧモノクローナル抗体の存在下で実験を行った場合、コラーゲン合成に対する効果は認められなかった。同様に、組換えＯＰＧの非存在下で抗ＯＰＧのみを投与すると、コラーゲン合成に対する効果が認められなかったことから、観察されるコラーゲン合成の減少は、ＯＰＧの特異的効果であることが示唆された。
【０１３７】
同様の効果は、ＯＰＧの全コード配列を含有するプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ＯＰＧ）による初代ヒト線維芽細胞（ＯＢＨＣ）のトランスフェクション時のコラーゲン合成に対して観察された。ＯＰＧプラスミドによりトランスフェクトされたＯＢＨＣでは、モック（ｐｃＤＮＡ３．１空ベクター）トランスフェクトＯＢＨＣとは対照的に、ＴＧＦβ１刺激に対する応答でのコラーゲン合成の増加は観察されなかった（図６）。
【０１３８】
実施例５：ＯＰＧ処置は、マウス肺線維芽細胞における基底およびＴＧＦβ１誘導性両方の１型コラーゲンα２プロモーター活性を有意に減少する
ＯＰＧによるコラーゲン合成の減少がコラーゲンプロモーターに対する効果によるものであるかどうかを評価するために、本発明者らは、３．５ｋｂ領域のＩ型コラーゲンα２プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子ｃＤＮＡ、ルシフェラーゼを含有するプラスミドでトランスフェクトされているマウス肺線維芽細胞に対するＯＰＧ処置の効果について調べた。構築物中のコラーゲンプロモーターの刺激は、発光アッセイによって基質であるホタルルシフェリンの存在下で活性を測定することができるルシフェラーゼ遺伝子の転写活性を生じる。
【０１３９】
１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌでのＯＰＧによる処置は、コラーゲンプロモーター活性の基底レベルを有意に減少することが可能であった（図７Ａ、コントロール）。ＴＧＦβ１刺激の後、コラーゲンプロモーター活性の少なくとも２倍の増加が認められた（図７Ａ、ＴＧＦβ１）。細胞が１００ｎｇ／ｍｌのＯＰＧで同時に処置されると、これは有意に減少する（Ｐ≦０．０５）。
【０１４０】
植物アルカロイドのハロフジノンは、Ｉ型コラーゲン合成の特異的阻害剤であることが報告されている（グラノット（Ｇｒａｎｏｔ）ら、１９９３）。線維芽細胞を低濃度のハロフジノン（１０-10Ｍ）で処置した場合、本発明者らは、試験した最も高いＯＰＧ用量（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐ≦０．０１）で極めて有意であった漸増濃度のオステオプロテゲリン（１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）でコラーゲンプロモーター活性が用量依存的に減少することを観察した（図７Ａ、ＨＦ）。ハロフジノンは、ＴＧＦβ１誘導性コラーゲンプロモーター活性を阻害することができる（マックガハ（ＭｃＧａｈａ）ら、２００２）。ＯＰＧはまた、用量依存的様式でコラーゲンプロモーター活性のＴＧＦβ１誘導性増加を阻害することによって、ハロフジノンの効果を増強することが可能であった。この効果は、１００ｎｇ／ｍｌのＯＰＧで極めて有意であり（Ｐ≦０．０１）、この濃度でコラーゲンプロモーター活性は、ほとんど基底レベルに戻る（図７、ＨＦ＋ＴＧＦβ１）。
【０１４１】
実施例６：結合組織成長因子のＴＧＦβ仲介トランス活性化はＯＰＧによって妨げられる
結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、３８−ｋＤシステインリッチタンパク質は、線維芽細胞によって細胞外マトリックスの産生を刺激する。ＣＴＧＦ過剰産生は、肺、皮膚、肝臓、腎臓および血管を含む多くのヒト線維化組織において見出されることが報告されている。インビトロでは、ＴＧＦβは、ヒト肺線維芽細胞におけるＣＴＧＦ遺伝子の転写を活性化する。ＣＴＧＦプロモーター−レポーターを、レポーターとしての分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）により構築したが、その発現は、細胞抽出物ではなく馴化培地で測定することができる。
【０１４２】
細胞発現について、ＣＴＧＦ−ＳＥＡＰレポーター遺伝子をＴＧＦβおよび０．４６、１．４または４．６μｇ／ｍｌのＯＰＧと共にインキュベートした。この実験の結果を図７Ｂに示す。ＯＰＧとのインキュベーションは、ＴＧＦβ誘導性ＣＴＧＦ発現を抑制したことから、ＯＰＧの抗線維化活性がさらに示された。
【０１４３】
実施例７：ハロフジノン処置した強皮症患者線維芽細胞におけるＯＰＧ  ｍＲＮＡの発現
ハロフジノンは、線維芽細胞でのコラーゲン合成を負に調節することが可能である機構については、十分に解明されていない。従って、本発明者らは、逆転写酵素ＰＣＲによって、強皮症患者由来の病変および非病変線維芽細胞の対におけるＯＰＧ  ｍＲＮＡの発現に対するハロフジノンの効果を調べた。
【０１４４】
ＯＰＧ  ｍＲＮＡ発現は、１０-8Ｍハロフジノンによる処置の１２時間後に測定する場合、試験したすべてのサンプル（正常３および異常２）の病変および非病変線維芽細胞の両方で高度に正に調節される（少なくとも３倍）（図８）。興味深いことに、遺伝子濾過マイクロアレイ分析実験では、ＯＰＧは、ハロフジノンによる線維芽細胞の処置に対して最も正に調節された遺伝子の１つであった（データ示さず）。
【０１４５】
実施例８：インビボでのＯＰＧ投与はマウスにおけるブレオマイシン誘導性肺線維症に対して保護する
単回の気管内注射のブレオマイシンのＣ５７ＢＬ／６マウスへの投与は、１４日以内に肺線維症の迅速な誘発を生じ、肺の間隙内におけるコラーゲン沈着の増加を特徴とする（ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら、２０００）。ＯＰＧ投与が線維症の発達に対する任意の保護効果を有するかどうか、または実際に疾患の重症度が減少するかどうかを決定するために、本発明者らは、ブレオマイシン処置したマウスにおけるＯＰＧの連日注入の効果を試験した。
【０１４６】
ブレオマイシンを単回の気管内滴注によって１０匹の３つのグループに投与した。ブレオマイシン処置の翌日に皮下注射を開始することによりＯＰＧを投与した。１つのグループは高用量（５ｍｇ／ｋｇ）および第２のグループはより低い用量（０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。コントロールマウスには塩水ｓ．ｃ．を連日投与した。比較のため、完全に非処置で、週齢および性別が一致した個体（生来のマウス）を含んでなる第４のグループのマウスを研究に含めた。
【０１４７】
ブレオマイシンで処置した動物は、直ちに悪化した。不自由なく健康を保持し、正常な体重増加を示す非処置の動物とは対照的に、これは迅速な体質量の消失を生じ、死をもたらし得る（図９Ａ）。低用量のＯＰＧで処置したマウスは、コントロールマウスに匹敵する重量の消失を示した。このグループでも死亡率の増加が上昇するようであった（図９Ｂ）。高用量のＯＰＧを投与したマウスの方がより良好で、体質量の低下は処置の最初の５日間のみであった。このことは、このグループの死亡率が低いこと（＜１０％）にも反映した。
【０１４８】
ブレオマイシン処置の１２日後に生存していたすべてのマウスを屠殺した。肺の組織学的分析は、高用量のＯＰＧ処置動物では、線維化病変が肺表面の約７０％を占めるコントロールマウスと比較して、線維化症に冒された肺の表面積が有意に低かったことを示した（図１０Ａ）。高用量のＯＰＧで処置したマウスはまた、コントロールマウスと比較して、肺中のヒドロキシプロリンの含有量が有意に低く（Ｐ≦０．０５）、非処置マウスに認められる含有量に匹敵した（生来グループ、図１０Ｂ）。低用量のＯＰＧで処置したマウスでもヒドロキシプロリン含有量の減少が観察されたが、このグループでの生存数が少数であったため、統計的有意には至らなかった。ヒドロキシプロリンの含有量はコラーゲン沈着の測定になる。ここでの結果は、ＯＰＧ処置が肺のコラーゲン沈着を効果的に減少することを示す。
【０１４９】
参照文献
１．アブラハム  Ｄ．（Ａｂｒａｈａｍ  Ｄ．）、ルポリ  Ｓ．（Ｌｕｐｏｌｉ  Ｓ．）、マックウィルター  Ａ．（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ  Ａ．）、プラッター−ザイベルク  Ｃ．（Ｐｌａｔｅｒ−Ｚｙｂｅｒｋ  Ｃ．）、ピーラ  Ｔ．Ｈ．（Ｐｉｅｌａ  Ｔ．Ｈ．）、コーン  Ｊ．Ｈ．（Ｋｏｒｎ  Ｊ．Ｈ．）、オルセン  Ｉ．（Ｏｌｓｅｎ  Ｉ．）およびブラック  Ｃ．（Ｂｌａｃｋ  Ｃ．）（１９９１）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３４，１１６４−１１７２．
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４．アルトシュール  Ｓ  Ｆ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３８９−３４０２，１９９７
５．バンクロフトＪ．Ｄ．（Ｂａｎｃｒｏｆｔ  Ｊ．Ｄ．）およびスティーブンス  Ａ．（Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ａ．）Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ．
６．ブラック  Ｃ．Ｍ（Ｂｌａｃｋ  Ｃ．Ｍ）およびデントン  Ｃ．Ｐ．（Ｄｅｎｔｏｎ  Ｃ．Ｐ．）（１９９８）Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｉｎ  “Ｏｘｆｏｒｄ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｇ．マディソン（Ｐ．Ｇ．  Ｍａｄｄｉｓｏｎ）、Ｄ．Ａ．イーセンベルグ（Ｄ．Ａ．  Ｉｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｐ．ウー（Ｐ．Ｗｏｏ）およびＤ．Ｎ．グラス（Ｄ．Ｎ．  Ｇｌａｓｓ）編）７７１−７８９頁、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）．
７．クレメンツＰ．Ｊ．（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  Ｐ．Ｊ．）およびフルスト  Ｄ．Ｅ．（Ｆｕｒｓｔ  Ｄ．Ｅ．）（１９９６）“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”ウイリアマ・アンド・ウイリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍａ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）．
８．デベルックス  Ｊ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１２，３８７−３９５，１９８４．
９．エンゲルマン，Ｈ．（Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ，  Ｈ．）、ノビック，Ｄ．（Ｎｏｖｉｃｋ，  Ｄ．）、およびワラヒ，Ｄ．（Ｗａｌｌａｃｈ，  Ｄ．）、１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１５３１−１５３６．  
１０．グラノット  Ｉ（Ｇｒａｎｏｔ  Ｉ）、ヘレビー  Ｏ（Ｈａｌｅｖｙ  Ｏ）、ヒューイッツ  Ｓ（Ｈｕｒｗｉｔｚ  Ｓ）、ピネス  Ｍ（Ｐｉｎｅｓ  Ｍ）．（１９９３）Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ：ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１５６，１０７−１１２
１１．グランタム（Ｇｒａｎｔｈａｍ）（１９７４），Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８５．８６２−８６４．
１２．ハットリ  Ｎ．（Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｎ．）、デーゲン  Ｊ．Ｌ．（Ｄｅｇｅｎ  Ｊ．Ｌ．）、シッソン  Ｔ．Ｈ．（Ｓｉｓｓｏｎ  Ｔ．Ｈ．）、リウ  Ｈ．（Ｌｉｕ  Ｈ．）、モーレ  Ｂ．Ｂ．（Ｍｏｏｒｅ  Ｂ．Ｂ．）、パンドランギ  Ｒ．Ｇ．（Ｐａｎｄｒａｎｇｉ  Ｒ．Ｇ．）、シモン  Ｒ．Ｈ（Ｓｉｍｏｎ  Ｒ．Ｈ．）およびデュルー  Ａ．Ｆ．（Ｄｒｅｗ  Ａ．Ｆ．）（２０００）Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１０６，１３４１−１３５
１３．コステヌイック  ＰＪ（Ｋｏｓｔｅｎｕｉｋ  ＰＪ）、シャルホウブ  Ｖ．（Ｓｈａｌｈｏｕｂ  Ｖ．）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ２００１  Ｍａｙ；７（８）：６１３−３５
１４．クレイン，ＰＭ（Ｋｒｅｉｎ，  ＰＭ）、ハング  Ｙ（Ｈｕａｎｇ  Ｙ）およびウィンストン  ＢＷ（Ｗｉｎｓｔｏｎ  ＢＷ）（２００１）．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ  １１（７）：１０６５−１０７９．
１５．レイトン，Ｃ．（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｃ．）Ｄｒｕｇｓ  ２００１  ６１（３），４１９−４２７．
１６．レロイＥ．Ｃ．（ＬｅＲｏｙ  Ｅ．Ｃ．）（１９７４）  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ５４，８８０−８８９．
１７．マーチニ（Ｍａｒｔｉｎｉ）、マッカリオ（Ｍａｃｃａｒｉｏ）、ラベリ（Ｒａｖｅｌｌｉ）ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  １９９９，４２，８０７−８１１．
１８．マックガハ  ＴＬ（ＭｃＧａｈａ  ＴＬ）、フェルプス  ＲＧ（Ｐｈｅｌｐｓ  ＲＧ）、スピーラ  Ｈ（Ｓｐｉｅｒａ  Ｈ）、ボナ  Ｃ（Ｂｏｎａ  Ｃ）．（２００２）Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ，ａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ−Ｉ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｂｌｏｃｋｓ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ−Ｇｒｏｗｔｈ−Ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｍａｄ３  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １１８，４６１−７０．
１９．ミン  Ｈ．（Ｍｉｎ  Ｈ．）、モロニー  Ｓ．（Ｍｏｒｏｎｙ  Ｓ．）、サロシ  Ｉ．（Ｓａｒｏｓｉ  Ｉ．）、デュンスタン  Ｃ．Ｒ．（Ｄｕｎｓｔａｎ  Ｃ．Ｒ．）、カッパレリ  Ｃ．（Ｃａｐｐａｒｅｌｌｉ  Ｃ．）ら、（２０００）Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｔｅａｌ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２，  ４６３−４７４．
２０．モリナガ  Ｔ．（Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｔ．）、ナガカワ  Ｎ．（Ｎａｇａｋａｗａ  Ｎ．）、ヤスダ  Ｈ．（Ｙａｓｕｄａ  Ｈ．）、ツダ  Ｅ．（Ｔｓｕｄａ  Ｅ．）およびヒガシ  Ｋ．（Ｈｉｇａｓｈｉ  Ｋ．）（１９９８）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ／ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４，６８５−６９１．
２１．ピアソン  Ｗ  Ｒ（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ  Ｒ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １８３，  ６３−９９，  １９９０
２２．ピアソン  Ｗ  Ｒ（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ  Ｒ）およびリップマン  Ｄ  Ｊ（Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ  Ｊ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８５，  ２４４４−２４４８，１９８８
２３．シルマン  Ａ．Ｊ．（Ｓｉｌｍａｎ  Ａ．Ｊ．）（１９９１）Ｍｏｒａｔｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｉｎ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗａｌｅｓ  １９６８−１９７５．  Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕ．  Ｄｉｓ．  ５０，  ９５−９６．
２４．シモネット  Ｗ．Ｓ．（Ｓｉｍｏｎｅｔ  Ｗ．Ｓ．）、ラセイ  Ｄ．（  Ｌａｃｅｙ  Ｄ．）：．，ダンスタン  Ｃ．Ｒ．（Ｄｕｎｓｔａｎ  Ｃ．Ｒ．）、ケリー  Ｍ．（Ｋｅｌｌｅｙ  Ｍ．）ら（１９９７）Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｄｅｎｓｉｔ  ｙ．  Ｃｅｌｌ  ８９，  ３０９−３１９．
２５．シ−ウェン  Ｘ．（Ｓｈｉ−ｗｅｎ  Ｘ．）、デントン  Ｃ．Ｐ．（Ｄｅｎｔｏｎ  Ｃ．Ｐ．）、マックウィルター  Ａ．（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ  Ａ．）、ボウ−ガリオス  Ｇ．（Ｂｏｕ−Ｇｈａｒｉｏｓ  Ｇ．）、アブラハム  Ｄ．Ｊ．（Ａｂｒａｈａｍ  Ｄ．Ｊ．）、デュ  ボイス  Ｒ．Ｍ．（ｄｕ  Ｂｏｉｓ  Ｒ．Ｍ．）およびブラック  Ｃ．Ｍ．（Ｂｌａｃｋ  Ｃ．Ｍ．）（１９９７）Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ４０，  １２３７−１２４４．
２６．シ−ウェン  Ｘ（Ｓｈｉ−Ｗｅｎ  Ｘ）、デントン  ＣＰ（Ｄｅｎｔｏｎ  ＣＰ）、マックウィルター  Ａ（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ  Ａ）、ボウ−ガリオス  Ｇ（Ｂｏｕ−Ｇｈａｒｉｏｓ  Ｇ）、アブラハム  ＤＪ．（Ａｂｒａｈａｍ  ＤＪ）、デュ  ボイス  ＲＭ（ｄｕ  Ｂｏｉｓ  ＲＭ）、ブラック  ＣＭ（Ｂｌａｃｋ  ＣＭ）．（１９９７）Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ４０，１２３７−１２４４
２７．スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１４７，１９５−１９７，１９８１，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，  ２，  ４８２−４８９，  １９８１．
２８．スミスＲ．Ｅ．（Ｓｍｉｔｈ  Ｒ．Ｅ．）、ストリーターＲ．Ｍ．（Ｓｔｒｉｅｔｅｒ  Ｒ．Ｍ．）、ファンＳ．Ｈ．（Ｐｈａｎ  Ｓ．Ｈ．）、ルカクスＮ．Ｗ．（Ｌｕｋａｃｓ  Ｎ．Ｗ．）、ホッフネーグルＧ．Ｂ．（Ｈｕｆｆｎａｇｌｅ  Ｇ．Ｂ．）、ウィルケＣ．Ａ．（Ｗｉｌｋｅ  Ｃ．Ａ．）、ブルディックＭ．Ｄ．（Ｂｕｒｄｉｃｋ  Ｍ．Ｄ．）、リンカーンＰ．（Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐ．）、エバノッフＨ．（Ｅｖａｎｏｆｆ  Ｈ．）およびクンケルＳ．Ｌ．（Ｋｕｎｋｅｌ  Ｓ．Ｌ．）（１９９４）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１α  ｉｎ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３，４７０４．
２９．スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ラヒタ（Ｌａｈｉｔａ）、キオラッジ（Ｃｈｉｏｒａｚｚｉ）およびリーベス（Ｒｅｅｖｅｓ）編、リッピンコット  ウイリアムス＆ウイルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）２０００．
３０．ストレロウ  Ｄ．（Ｓｔｒｅｈｌｏｗ  Ｄ．）およびコーン  Ｊ（Ｋｏｒｎ  Ｊ）（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１０，５７２−５７８．
３１．ツッチ，Ａ．（Ｔｕｃｃｉ，  Ａ．）、ジェームス，Ｈ．（Ｊａｍｅｓ，  Ｈ．）、チケポルチシェ，  Ｒ．（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ，  Ｒ．）、ボンネホイ，Ｊ．Ｙ．（Ｂｏｎｎｅｆｏｙ，  Ｊ．Ｙ．）、デイヤー，Ｊ．Ｍ．（Ｄａｙｅｒ，  Ｊ．Ｍ．）、およびツブラー，Ｒ．Ｈ．（Ｚｕｂｌｅｒ，  Ｒ．Ｈ．）１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，２７７８−２７８４．  
３２．フォン  ヘイジン  Ｇ（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ  Ｇ）．（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４，  ４６８３−４６９０．
３３．ウィグレイ  Ｆ．  Ｍ．（Ｗｉｇｌｅｙ  Ｆ．  Ｍ．）およびスーレ  Ｓ．  Ｄ．（Ｓｕｌｅ  Ｓ．  Ｄ．）（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １０（１）  ３１−４８．
３４．ウィグレイ  Ｆ．  Ｍ．（Ｗｉｇｌｅｙ  Ｆ．Ｍ．）およびボーリング  Ｃ．Ｌ．（Ｂｏｌｉｎｇ  Ｃ．Ｌ．）（２０００）  Ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ．  ２，  ２７６−２９２．
３５．ウィルム  Ｍ．（Ｗｉｌｍ  Ｍ．）、シェベヘンコ  Ａ．（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ａ．）、ホウタエベ  Ｔ．（Ｈｏｕｔｈａｅｖｅ  Ｔ．）ブレイト  Ｓ．（Ｂｒｅｉｔ  Ｓ．）、シュバイガーラー  Ｌ．（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒｅｒ  Ｌ．）、フットシス  Ｔ．（Ｆｏｔｓｉｓ  Ｔ．）およびマン  Ｍ．（Ｍａｎｎ  Ｍ．）（１９９６）  Ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ  ｂｙ  ｎａｎｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７９：４６６−４６９
３６．ヤスダ  Ｈ．（Ｙａｓｕｄａ  Ｈ．）、シマ  Ｎ．（Ｓｈｉｍａ  Ｎ．）、ナガカワ  Ｎ．（Ｎａｇａｋａｗａ  Ｎ．）、モチヅキ  Ｓ．（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｓ．）、ヤノ  Ｋ．（Ｙａｎｏ  Ｋ．）ら（１９９８）  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  （ＯＣＩＦ）  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  （ＯＰＧ）：ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｂｙ  ｗｈｉｃｈ  ＯＰＧ／ＯＣＩＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９，  １３２９−１３３７．
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】遺伝子フィルターマイクロアレイ分析によって決定した６例の強皮症患者由来の正常（斜線）および疾患（平行線）線維芽細胞におけるＯＰＧ  ｍＲＮＡの発現を表す。平均発現レベルを（ａ）に示し、中央値を（ｂ）に示す。
【図２】９例の強皮症患者におけるＯＰＧ  ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析を表す。それぞれの患者に対する結果を、病変／非病変線維芽細胞におけるＯＰＧ  ｍＲＮＡの発現の割合として表す。
【図３】リアルタイムＰＣＲ分析によって決定した５例の強皮症患者の病変および非病変皮膚から採取した生検におけるＯＰＧ  ｍＲＮＡ発現を表す。横棒は、各グループに対する発現の中央値を示す。
【図４】病変および正常皮膚線維芽細胞におけるＯＰＧ発現のウエスタンブロット分析を表す。病変線維芽細胞（Ａ１〜Ａ４）および正常線維芽細胞（Ｎ１〜Ｎ４）。ゲルの左側の矢印は生来のＯＰＧ（５５ｋＤａ単量体）およびその二量体型（１１０ｋＤａ）の位置を示す。抗体に対する陽性コントロールとして、ＯＰＧ  Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）から購入）を使用した。
【図５】ＡＧ１５１８ヒト線維芽細胞のコラーゲン合成に対するＯＰＧの影響を表す。ＡＧ１５１８細胞は、完全に未処置であるか、あるいは１０、２０もしくは４０ｎｇ／ｍｌ  ＯＰＧで２４時間予め処置したか、または４０ｎｇ  ＯＰＧ＋抗ＯＰＧ中和モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）、もしくは抗ＯＰＧ中和モノクローナル抗体単独で予め処置したかのいずれかの後、２ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１で２４時間処置した。コラーゲン合成をＥＬＩＳＡで決定した。結果は、３回測定した値＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．の平均値である。
【図６】ヒト初代線維芽細胞（ＯＢＨＣ細胞）のＩ型コラーゲンアルファ２合成に対するＯＰＧトランスフェクションの効果を表す。方法に記載のように、ＯＢＨＣ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＯＰＧ（ＯＰＧ）またはｐｃＤＮＡ３．１単独（モック）でトランスフェクトした。ＴＧＦβ１処置２４時間後に馴化倍地中のコラーゲンをＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、３回測定した値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．の平均値である。
【図７Ａ】マウス胚線維芽細胞の１型コラーゲンα２プロモーター活性ＯＰＧの影響を表す。マウス胚線維芽細胞（πＳ３細胞）を、ルシフェラーゼｃＤＮＡに連結した３．５ｋｂのコラーゲン１α２プロモーターを含有するｐＧＬ３ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を新鮮培地に移し、未処置（コントロール）か、またはハロフジノン（１０-10Ｍ）単独（ＨＦ）；ＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ）（ＴＧＦβ１）；もしくはＴＧＦβ１（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＨＦ（１０-8Ｍ）（ＨＦ＋ＴＧＦβ１）のいずれかと共に、漸増濃度のオステオプロテゲリンで１２時間処置した。結果は、３回測定した値の平均値である。*はＰ＜０．０５を示し、**はＰ＜０．０１を示す。
【図７Ｂ】ＴＧＦβ単独かまたは異なる量のＯＰＧとの組み合わせのいずれかと共にインキュベーション後のＣＴＧＦプロモーター下でのレポーター遺伝子発現の程度を示す。
【図８】強皮症患者由来の病変および非病変線維芽細胞をハロフジノンでインビトロ処置した後のオステオプロテゲリンｍＲＮＡの逆転写酵素ＰＣＲ分析を表す。病変（接尾辞Ａ）、または非病変（接尾辞Ｎ）、線維芽細胞におけるオステオプロテゲリン（上部）およびＧＡＰＤＨ（下部）のＲＴ  ＰＣＲ反応産物を示す１％アガロース−臭化エチジウム染色ゲル。
【図９】ブレオマイシン処置したマウスにおける肺線維症の発達に対するオステオプロテゲリンのインビボ投与の効果を表す。Ａ：オステオプロテゲリン処置後のマウス体質量の変化。結果を、ブレオマイシンの気管内滴注後毎日測定した平均質量（ｇ／グループ）として表す。Ｂ：ブレオマイシン投与による死亡率。結果を、１０匹の動物あたりの死亡数の百分率として表す。
【図１０】ブレオマイシン処置したマウスにおける肺線維症の発達に対するオステオプロテゲリンのインビボ投与の効果を表す。Ａ：ブレオマイシン投与１２日後に測定した肺における線維症の程度。肺はトリクロムで染色した。結果を、各生存動物について、線維症に冒された代表的肺葉の％として表す。Ｂ：ブレオマイシン投与１２日後に測定した肺におけるコラーゲン沈着の程度。各生存動物から採取した代表的肺葉において、ヒドロキシプロリン含有量を測定した。
【図１】
2005530720.tif 000005
【図２】
2005530720.tif 000006
【図３】
2005530720.tif 000007
【図４】
2005530720.tif 000008
【図５】
2005530720.tif 000009
【図６】
2005530720.tif 000010
【図７Ａ】
2005530720.tif 000011
【図７Ｂ】
2005530720.tif 000012
【図８】
2005530720.tif 000013
【図９】
2005530720.tif 000014
【図１０】
2005530720.tif 000015
【配列表】
2005530720000001.app
【国際調査報告】
2005530720.tif 000016
2005530720.tif 000017
2005530720.tif 000018
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