(57)【要約】本発明は、糖タンパク質（組換え産生糖タンパク質を含む）のグリコシル化パターンを改変するための方法を提供する。糖タンパク質が均一なグリコシル化パターンを有する糖タンパク質組成物もまた、提供される。本発明は、ＧｌｃＮＡｃに共有結合されたＡｓｎ残基を含む糖タンパク質をグリコシル化する方法であって、該方法は、該糖タンパク質を、ＧｌｃＮＡｃ残基を含む活性化グリコシルドナー分子および変異体エンドグリカナーゼ（エンドグリコシダーゼ）と、該活性化グリコシルドナーのＧｌｃＮＡｃ残基が該糖タンパク質の該ＧｌｃＮＡｃに結合するのに適した条件下で接触させる工程を包含する、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧｌｃＮＡｃに共有結合されたＡｓｎ残基を含む糖タンパク質をグリコシル化する方法であって、該方法は、該糖タンパク質を、ＧｌｃＮＡｃ残基を含む活性化グリコシルドナー分子および変異体エンドグリカナーゼ（エンドグリコシダーゼ）と、該活性化グリコシルドナーのＧｌｃＮＡｃ残基が該糖タンパク質の該ＧｌｃＮＡｃに結合するのに適した条件下で接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記エンドグリカナーゼが、エンド−Ｈ、エンド−Ｆ１、エンド−Ｆ２、エンド−Ｆ３、エンド−Ｄ、およびＰＮＧａｓｅ−Ａからなる群から選択されるメンバーの変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異体エンドグリカナーゼが、エンド−Ｈの変異体であり、これは、１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される活性部位酸性アミノ酸残基についてのアミノ酸残基の置換を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異体エンドグリカナーゼが、エンド−Ｆ１の変異体であり、これは、１２９位のＡｓｐ、１３１位のＧｌｕ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される活性部位酸性アミノ酸残基についてのアミノ酸残基の置換を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記変異体エンドグリカナーゼが、エンド−Ｆ２の変異体であり、これは、１２４位のＡｓｐ、１２６位のＧｌｕ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される活性部位酸性アミノ酸残基についてのアミノ酸残基の置換を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記変異体エンドグリカナーゼが、エンド−Ｆ３の変異体であり、これは、１２６位のＡｓｐ、１２８位のＧｌｕ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される活性部位酸性アミノ酸残基についてのアミノ酸残基の置換を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化グリコシルドナーが、該分子の還元末端で脱離基で改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記脱離基がハロゲンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ハロゲンがフッ化物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記脱離基が、ＧｌｃＮＡＣ−ＡｓｎまたはＧＬｃＮＡｃ−Ａｓｎ−ペプチド部分である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記グリコシルドナー上のＧＬｃＮＡｃ残基が改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変ＧｌｃＮＡｃ残基が１，２−オキサゾリン部分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記グリコシルドナー分子が、二触角構造、三触角構造、または四触角構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記グリコシルドナーが、ＧｌｃＮＡｃとマンノースとの間に結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記グリコシルドナーが、高マンノースＮ結合構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記グリコシルドナーが、マンノース−６−リン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記エンドグリカナーゼが固体支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記エンドグリカナーゼが前記支持体に可逆的に結合されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
原核生物細胞において前記糖タンパク質を組換え発現する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記原核生物細胞が細菌細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
真核生物細胞において前記糖タンパク質を発現する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記真核生物細胞が、酵母細胞および昆虫細胞からなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記糖タンパク質を前記変異体エンドグリカナーゼと接触させる工程の前に、該糖タンパク質を野生型エンドグリカナーゼと接触させて、該糖タンパク質から糖質構造を切断する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法に従ってグリコシル化された糖タンパク質を含む組成物。
【請求項２５】
前記糖タンパク質上のアクセプター部分の少なくとも８０％がグリコシル化されている、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記糖タンパク質が固体支持体に結合される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記糖タンパク質が全長糖タンパク質である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
糖ペプチドが細胞上にある、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
変異体エンドグリカナーゼについてのアクセプター部分を含むポリペプチドのグリコシル化パターンを改変するための大規模方法であって、該方法は、
少なくとも約５００ｍｇのポリペプチドを、該変異体エンドグリカナーゼについてのグリコシルドナー部分および該変異体エンドグリカナーゼを含む反応混合物と、グリコシル残基を該グリコシルドナー部分から該アクセプター部分へと転移させるのに適切な条件下で接触させ、それにより、改変されたグリコシル化パターンを有する糖ペプチドを生じる、工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記改変されたグリコシル化パターンが、実質的に均一なグリコシル化パターンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼについてのアクセプター部分を含み、そして前記方法は、該ポリペプチドを、グリコシルドナー部分およびグリコシルトランスフェラーゼを含む反応混合物と、グリコシル残基を該グリコシルドナー部分から該グリコシルトランスフェラーゼアクセプター部分へと転移させるのに適切な条件下で接触させる工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の方法により調製されたペプチド。
【請求項３４】
既知のグリコシル化パターンを有する糖ペプチドに実質的に同一であるグリコシル化パターンを有する糖ペプチドを生成する大規模方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも約５００ｍｇのポリペプチドを、グリコシルドナー部分および変異体エンドグリカナーゼを含む反応混合物と、グリコシル残基を該グリコシルドナー部分から該ポリペプチド上のグリコシルアクセプター部分へと転移させるのに適切な条件下で接触させる工程；および
（ｂ）該既知のグリコシル化パターンに実質的に同一であるグリコシル化パターンが得られた場合、該グリコシル残基の該グリコシルアクセプターへの転移を終結させる工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、以下：
（ｃ）前記糖ペプチドのグリコシル化パターンをアッセイし、それにより該グリコシル化パターンが前記既知のグリコシル化パターンに実質的に同一であるか否かを決定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３６】
前記終結させる工程が、前記変異体エンドグリカナーゼ、前記グリコシルドナー、前記グリコシルアクセプターから選択されるメンバーを前記反応混合物において枯渇させること、キレート剤でのクエンチ、およびそれらの組み合わせに起因する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法により調製されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、糖ペプチドをリモデリングするための方法の分野に関し、新規および／または実質的に均一なグルコシル化パターンをもつ糖ペプチドを提供する。
【背景技術】
【０００２】
（Ａ．タンパク質グリコシル化）
多くの糖ペプチドの生物学的活性は、この糖ペプチドに付着した特定のオリゴ糖構造の存在または不在に高度に依存している。不適正にグリコシル化された糖ペプチドは、癌、感染性疾患および炎症に関与している（Ｄｅｎｎｉｓら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２１：４１２〜４２１（１９９９））。さらに、治療用糖ペプチドのグリコシル化パターンは、溶解性、タンパク質分解攻撃および熱不活性化に対する抵抗性、免疫原性、半減期、生物活性、および安定性のような治療効力の多くの局面に影響し得る（例えば、Ｒｏｔｏｎｄａｒｏら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１１７〜１２８（１９９９）；Ｌｉｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１〜２７（１９９３）；Ｏｎｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０Ａ（補遣３）、Ｓ７〜Ｓ１１（１９９４）；およびＨｏｔｃｈｋｉｓｓら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６０：２５５〜２６１（１９８８）を参照のこと）。治療用糖ペプチドの規制認可はまた、グリコシル化が均一であり、そしてバッチ毎に一致していることを必要とする。
【０００３】
グリコシル化は、高度に細胞依存的である複雑な翻訳後改変である。翻訳の後、タンパク質は、小胞体（ＥＲ）中に輸送され、グリコシル化され、そしてさらなるプロセッシングのためにゴルジ体に送られる。得られる糖ペプチドは、次いで、種々のオルガネラを標的にし、膜成分になるか、またはそれらはペリプラズム中に分泌される。
【０００４】
グリコシル化の間、Ｎ結合糖ペプチドまたはＯ連結糖ペプチドのいずれかが形成される。Ｎ−グリコシル化は、高度に保存された代謝プロセスであり、これは、真核生物では、生存能力に必須である。Ｎ結合グリコシル化はまた、発生および恒常性に関与している；Ｎ結合糖ペプチドは、大部分の細胞表面タンパク質および分泌タンパク質を構成し、これらは、成長および発生の間に高度に調節されている（Ｄｅｎｎｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：５８２〜５８５（１９８７））。Ｎ−グリコシル化はまた、形態形成、成長、分化およびアポトーシスに関与していると考えられている（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（印刷中）（１９９８））。
【０００５】
真核細胞生物では、Ｎ結合グリコシル化は、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのアスパラギン上で起こり、ここで、Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸である（Ｋｏｒｎｆｅｌｄら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５４：６３１〜６６４（１９８５）；Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４５〜２１４９（１９８７）；Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓら、（ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７：５４０〜５５０（１９９３）；およびＯｒｌｅａｎ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  第３巻（１９９６））。Ｏ−連結グリコシル化はまた、セリンまたはスレオニン残基で起こる（Ｔａｎｎｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０６：８１〜９１（１９８７）；およびＨｏｕｎｓｅｌｌら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１３：１９〜２６（１９９６））。その他のグリコシル化パターンは、タンパク質のカルボキシル末端のカルボキシル基にグリコシルホスファチジルイノシトールを連結することにより形成される（Ｔａｋｅｄａら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：３６７〜３７１（１９９５）；およびＵｄｅｎｆｒｉｅｎｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：５９３〜５９１（１９９５））。
【０００６】
Ｎ結合糖ペプチドの生合成は、小胞体のドリコール経路で開始される（Ｂｕｒｄａ、Ｐら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４２６：２３９〜２５７（１９９９）；Ｋｏｒｎｆｅｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１〜６６４（１９８５）；Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：９１５〜９４４（１９８７）；Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：５４０〜５５０（１９９３））。ドリコール経路の心臓部に、ポリイソプレノールキャリヤ脂質に連結されるオリゴ糖の合成がある。オリゴ糖ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ９Ｇｌｃ３は、グリコシルトランスフェラーゼで触媒された単糖の段階的付加によりアセンブルされる。このドリコール経路は、酵母と哺乳動物間で高度に保存されている。
【０００７】
ドリコール−オリゴ糖複合体のアセンブリの後、オリゴ糖は、この複合体から、タンパク質コンセンサス配列のアスパラギン残基に転位される。このオリゴ糖の転位は、多サブユニット酵素であるオリゴ糖トランスフェラーゼにより触媒される（Ｋａｒａｏｇｌｕら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬＸ：８３〜９２（１９９５ｂ）；およびＳｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：８４９〜８５８（１９９６））。オリゴ糖のタンパク質への転位の次に、オリゴ糖を短縮化する一連の反応が起こる。これらの反応は、グルコシダーゼＩおよびＩＩならびにα−マンノシダーゼによって触媒される（Ｋｉｌｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：５２９９〜５３０３（１９８１）；Ｓａｕｎｉｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１４１５５〜１４１６１（１９８２）；およびＢｙｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１４６５７〜１４６６６（１９８２））。
【０００８】
小胞体におけるＮ結合糖ペプチドの合成およびプロセッシングの後、糖ペプチドは、ゴルジ体に輸送され、そこで、種々のプロセッシング工程が、成熟Ｎ結合オリゴ糖構造の形成を生じる。真核細胞生物では、ドリコール経路は高度に保存されているが、ゴルジ体で生成された成熟Ｎ結合糖ペプチドは、種を越えて有意な構造の変動を示す。例えば、酵母糖ペプチドは、９〜１３マンノース残基の高マンノースコア、または２００残基までからなる伸長した分岐のマンナン外部鎖からなるオリゴ糖構造を含む（Ｂａｌｌｏｕら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６：３６３〜３７９（１９９２）；Ｔｒｉｍｂｌｅら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：５７〜７５（１９９２））。高等真核細胞生物では、Ｎ結合オリゴ糖は、代表的には、酵母で生成されるそれとは有意に変動する、高マンノースの複雑かつ混合型の構造である（Ｋｏｒｎｆｅｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１〜６６４（１９８５））。さらに、酵母では、単一のα−１，２−マンノースが、オリゴ糖の中央アームから除去され、高等真核細胞生物では、マンノースの除去は、いくつかのマンノシダーゼの作用を含み、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５構造を生成する（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．９（４）：４１５〜４４８（１９９８））。複合オリゴ糖の分岐は、このオリゴ糖のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ５構造へのトリミングの後に起こる。分岐構造、例えば、２−アンテナ、３−アンテナおよび４−アンテナは、オリゴ糖残基の領域へのＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼで触媒される付加により合成される。それらの形成の次に、これらアンテナ構造は、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｆｕｃおよびシアル酸残基を含む異なる糖で終了する。
【０００９】
Ｎ−グリコシル化と同様に、Ｏ−グリコシル化もまた、哺乳動物と酵母との間で顕著に異なっている。Ｏ−グリコシル化の開始には、哺乳動物細胞は、グリコシルドナーとしてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを用い、ＧａｌＮＡｃ残基をＳｅｒまたはＴｈｒに直接付加する。この糖単位は、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＦｕｃおよびＮｅｕＮＡｃの添加により伸長される。哺乳動物細胞とは対照的に、下等真核生物細胞、例えば、酵母およびその-他の真菌は、グリコシルドナーとしてＭａｎ−Ｐ−ドリコールを用いてＳｅｒまたはＴｈｒにマンノースを付加する。これらの糖は、Ｍａｎおよび／またはＧａｌを付加することより伸長される。一般に、Ｇｅｍｍｉｌｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４２６：２２７〜２３７（１９９９）を参照のこと。
【００１０】
タンパク質グリコシル化の生物学的機構、および糖ペプチドのグリコシル化パターンを解明する努力は、多くの分析技法により支援されてきた。例えば、組換えアスパラギン酸プロテアーゼのＮ結合オリゴ糖は、質量分析法、２Ｄクロマトグラフィー法、化学的方法および酵素的方法の組合せを用いて特徴付けられた（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１０３７〜１０４３（１９９９））。同研究者らはまた、精製糖ペプチドから酵素によって放出されたオリゴ糖の、蛍光発色団支援糖質電気泳動（ＦＡＣＥ）と組み合わせた放出オリゴ糖の蛍光標識誘導体を用いる特徴付けを報告している（Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １４：１９７〜２０７（１９９８））。
【００１１】
クローン化されたエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼは、糖ペプチドから単糖およびＮ−グリカンを放出するために標準的に用いられている。エンドグリコシダーゼは、Ｎ−グリカンのクラス間のＮ結合グリカンとＯ連結グリカンとの間の識別を可能にする。分離されたグリカン上の糖ペプチドを分離する方法はまた、漸次、より洗練され、かつ選択的になってきている。糖ペプチドと切断されたグリカンの混合物を分離する方法もまた、継続して改良され、そして高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）のような技術が、オリゴ糖の複合混合物から個々のオリゴ糖アイソマーの分離のために慣用的に用いられている。最近、糖ペプチドから放出された糖を単離するための大規模有機溶媒（アセトン）沈殿を基礎にした方法が、Ｖｅｒｏｓｔｅｋらにより報告された（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７８：１１１〜１２２（２０００））。糖ペプチドから放出されたオリゴ糖を単離および特徴付ける多くの他の方法は、当該技術分野で公知である。一般に、Ｆｕｋｕｄａら、ＧＬＹＣＯＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９３；およびＥ．Ｆ．Ｈｏｕｎｓｅｌｌ（編）ＧＬＹＣＯＰＥＰＴＩＤＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＥ、Ｈｕｍａｎａｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ．１９９３を参照のこと。
【００１２】
（Ｂ．糖ペプチドの合成）
相当の努力が、これら糖に由来する糖および糖ペプチドの調製のための新たな戦略の同定および最適化に向けられている。多くの有望な方法の中に含まれて、形成された糖ペプチドの所望のグリコシル化パターン、化学的合成、酵素的合成、酵素的リモデリングを有する糖ペプチドを生成する細胞宿主の操作、およびこれら技法の１つ以上のハイブリッドである方法がある。
【００１３】
薬学的薬剤としての目的の糖ペプチドが、商業的に実行可能な量で産生され得る、細胞宿主系が調査されている。原則的に、哺乳動物、昆虫、酵母、真菌、植物または原核生物細胞培養が、大部分の治療用糖ペプチドおよびその他の糖ペプチドの産生のために用いられ得る。しかし、原則的に、組換えにより産生されたタンパク質上の所望のグリコシル化パターンを達成することは困難である。例えば、細菌は、ドリコール経路を経由してＮ−グリコシル化せず、そして酵母は、ヒトにおいては一般に見出されないオリゴマンノース型Ｎ−グリカンのみを作製する（例えば、Ａｉｌｏｒら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １：８３７〜８４７（２０００）を参照のこと）。同様に、植物細胞は、ヒト糖ペプチドの共通の成分である、シアル酸をもつオリゴ糖を産生しない（一般に、Ｌｉｕ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０：１１４〜２０（１９９２）；およびＬｅｒｏｕｇｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：３１〜４８（１９９８）を参照のこと）。最近総説されているように、組換え哺乳動物糖ペプチドの産生に現在利用可能な昆虫細胞系のいずれも、それらが哺乳動物中で産生されるとき、通常見出される同じグリカンをもつ糖ペプチドを産生しない。さらに、組換え当ペプチドのグリコシル化パターンは、それらが、異なる細胞培養条件下で産生されるとき、しばしば異なっている（Ｗａｔｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１０：３９〜４４（１９９４）；およびＧａｗｌｉｔｚｅｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．４２：１１７〜１３１（１９９５））。ここで、組換え糖ペプチドのグリコシル化パターンは、２つの異なるバイオリアクター中の名目上同じ細胞培養条件下で産生され糖ペプチド間で変動し得るようである（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０００：４６２〜４７０（２０００））。最後に、多くの細菌系では、組換えにより産生されたタンパク質は、全くグリコシル化されていない。
【００１４】
組換え生成された糖ペプチドのグリコシル化における不均一性は、細胞機構（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）が種間、細胞間、または個体間でさえ変化し得るので、生じる。これらの種々の酵素により認識される基質は、グリコシル化がいくつかの部位で生じないかもしれないかまたはネイティブタンパク質のグリコシル化とは大きく改変され得るに十分に異なり得る。異種真核生物宿主において生成される組換えタンパク質のグリコシル化は、しばしば、ネイティブタンパク質とは異なる。例えば、酵母に発現される糖ペプチドおよび昆虫に発現される糖ペプチドは、代表的には、ヒトにおいて一般的には観察されない高マンノース構造を含む。
【００１５】
非常に興味深い領域は、適切にグリコシル化された組換えヒト糖ペプチドを調製するために必要なグリコシル化装置を有する、宿主細胞の設計である。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、特に十分に研究されているモデル細胞系である。なぜなら、ＣＨＯ細胞は、ヒトにおいて見出されるのと非常に類似するグリコシル化機構を備えるからである（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：９７５〜９８１（１９９６））。ヒト細胞由来の糖ペプチドのグリコシル化パターンと、ＣＨＯ細胞由来の糖ペプチドのグリコシル化パターンとの間の多くの類似性とは対照的に、重要な区別が存在する。ＣＨＯ細胞により生成される糖ペプチドは、α−２，３−末端シアル酸残基のみを保有し得る一方で、ヒト細胞により生成される糖ペプチドは、α−２，３−末端シアル酸残基およびα−２，６−シアル酸残基の両方を含む（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３８４８〜１３８５５（１９８９））。  
【００１６】
特定の宿主細胞のグリコシル化の欠損を修復する努力が、ヒトグリコシル化経路に欠くことのできない１つ以上の欠損酵素を発現するようにその細胞を操作することに対して集中されてきた。例えば、Ｂｒａｇｏｎｚｉら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４７４：２７３〜２８２（２０００））は、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する「汎用宿主」細胞として作用するＣＨＯ細胞を生成した。この汎用宿主を生成するために、ＣＨＯ細胞が、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼの発現をコードする遺伝子でトランスフェクトされた。その後、生じた宿主細胞は、他のタンパク質（ヒトインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む）をコードする遺伝子の第２の安定トランスフェクションを受けた。α−２，３−シアル酸残基およびα−２，６−シアル酸残基の両方を備えるタンパク質が、回収された。さらに、ＩＦＮ−γについてのインビボ薬物動力学データは、ＩＮＦ−γ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた通常のＣＨＯ細胞により分泌されるＩＦＮ−γと比較した、この汎用宿主により生成されるＩＦＮ−γの改善された薬物動力学を示す。同様の研究が、Ｗｅｉｋｅｒｔら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１１１６〜３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２，第１段落（１９９９））により報告されている。
【００１７】
酵素の必要な構成要素を含むようにこの宿主細胞を操作することによって適切にグリコシル化された糖ペプチドを調製することに加え、糖ペプチドの新規な合成と、糖ペプチドのグリコシル化を調整するインビトロ酵素法との両方の開発に対して、努力が向けられてきた。Ｏ結合型糖ペプチドおよびＮ結合型糖ペプチドの両方を合成する方法が、最近概説されている（それぞれ、Ａｒｓｅｑｕｅｌｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｓｙｍｅｔｒｙ  ８：２８３９（１９９７）；およびＡｒｓｅｑｕｅｌｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｓｙｍｅｔｒｙ  １０：２８３９（１９９７））。
【００１８】
２つの広範な合成モチーフが、Ｎ結合型糖ペプチドを合成するために使用される。収束型アプローチと、段階的構築ブロックアプローチとである。この段階的アプローチは、一般的には、固相ペプチド合成方法論を使用し、グリコシルアスパラギン中間体で始まる。収束型アプローチにおいて、ペプチドと糖質とが別々に構築され、そして、これら２つの構成成分間のアミド結合が、この合成後期に形成される。糖質化学および糖ペプチド合成の両方において、近年大きな進歩がなされたが、特に、哺乳動物オリゴ糖において見出される遍在性β−１，２−シス−マンノシド結合の形成に関して、糖ペプチドの化学合成に関係するかなりの困難がなお存在する。さらに、レジオ化学障害および立体化学障害が、糖質の新規合成の各工程において解決されなければならない。従って、この有機合成の分野は、他の生体分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチド）の新規合成よりかなり遅れている。
【００１９】
糖質の化学合成と関係する困難を考慮すると、糖ペプチドの糖質部分を合成するための酵素の使用は、糖ペプチドを調製するための有望なアプローチである。酵素ベースの合成は、レジオ選択性および立体選択性という利点を有する。さらに、酵素合成は、保護されていない基質を使用して実施され得る。３つの主要な酵素の種類（グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、グリコアミニダーゼ（例えば、ＰＮＧアーゼＦ）、ならびにグリコシダーゼ）が、糖質の合成において使用される。このグリコシダーゼは、エキソグリコシダーゼ（例えば、β−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、およびエンドグリコシダーゼ（例えば、Ｅｎｄｏ−Ａ、Ｅｎｄｏ−Ｍ）としてさらに分類される。これらの酵素の種類の各々は、糖質を調製するために合成により首尾良く使用されている。一般的概説について、Ｃｒｏｕｔら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：９８〜１１１（１９９８）およびＡｒｓｅｑｕｅｌｌ（上記）を参照のこと。
【００２０】
グリコシルトランスフェラーゼは、糖ペプチド上のオリゴ糖構造を改変するために使用されている。グリコシルトランスフェラーゼは、立体化学的およびレジオ化学的に良好に制御されて、特定の産物を生成するために非常に有効であることが示されている。グリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖を調製するため、ならびに特に哺乳動物細胞中で生成された糖ペプチド上の末端Ｎ結合型糖質構造および末端Ｏ結合型糖質構造を改変するために、使用されている。例えば、末端オリゴ糖は、糖ペプチドの薬力学および種々の他の生物学的特性を改善するより一貫した糖構造を提供するために、完全にシアリル化および／またはフコシル化されている。例えば、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが、ラクトサミンを合成するために使用された。これは、糖質の合成におけるグリコシルトランスフェラーゼの有用性の最初の例示である（例えば、Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：５４１６〜５４１８（１９８２）を参照のこと）。さらに、多数の合成手順が、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸からガラクトースの３−ＯＨまたは６−ＯＨへとシアル酸を転移するために、α−シアリルトランスフェラーゼを使用している（例えば、Ｋｅｖｉｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２：１３５９〜１３６２（１９９６）を参照のこと）。治療用途のための糖結合体合成における最近の進歩についての考察に関して、Ｋｏｅｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：８３５〜８４１（２０００）を参照のこと。
【００２１】
グリコシダーゼは、通常はグリコシド結合の加水分解を触媒するが、適切な条件下では、グリコシダーゼは、この結合を形成するために使用され得る。糖質合成のために使用されるほとんどのグリコシダーゼは、エキソグリコシダーゼであり、グリコシル転移が、基質の非還元末端にて生じる。このグリコシダーゼは、グリコシル酵素中間体におけるグリコシルドナーを利用し、この中間体は、加水分解産物を生じるように水により遮断されるか、または新規なグリコシドもしくはオリゴ糖を生じるようにアクセプターにより遮断されるかのいずれかである。エキソグリコシドを使用する例示的経路は、すべてのＮ結合型糖ペプチドのコアの三糖の合成であり、これは、β−マンノシダーゼの作用により形成された困難で有名なβ−マンノシド結合を含む（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．９９３〜９９４（１９９６））。
【００２２】
フコシルトランスフェラーゼは、グアノシン−５’−ジホスホフコースから糖アクセプターの特定のヒドロキシルへとフコース単位を転移するために、合成経路において使用されている。例えば、Ｉｃｈｉｋａｗａは、クローン化フコシルトランスフェラーゼを用いるシアリル化ラクトサミンのフコシル化を包含する方法によって、シアリルＬｅｗｉｓ−Ｘを調製した（Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３〜９２９８（１９９２））。
【００２３】
その使用がエキソグリコシダーゼよりも一般的ではないが、エンドグリコシダーゼもまた、糖質を調製するために利用されている。エンドグリコシダーゼの使用に基づく方法は、単糖ではなくオリゴ糖が転移されるという利点を有する。オリゴ糖フラグメントは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミン（例えば、ｅｎｄｏ−Ｆ、ｅｎｄｏ−Ｍ）を用いて基質に添加された（Ｗａｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：１９７５〜１９７８；ならびにＨａｎｅｄａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２９２：６１〜７０（１９９６））。
【００２４】
糖質を調製する際のその使用に加えて、上記で考察した酵素は、糖ペプチドの合成にも適用されている。リボヌクレアーゼＢの均質な糖形態の合成が、公表されている（Ｗｉｔｔｅ  Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２１１４〜２１１８（１９９７））。リボヌクレアーゼＢの高マンノースコアが、エンドグリコシダーゼＨを用いてその糖ペプチドを処置することによって切断された。この切断は、２つのコアＧｌｃＮＡｃ残基間で特異的に生じた。その後、四糖シアリルＬｅｗｉｓ  Ｘが、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−１，３−フコシルトランスフェラーゼＶを連続的に使用することによって、この今や均質であるタンパク質上に残るＧｌｃＮＡｃアンカー部位にて酵素的に再構築された。各酵素触媒工程は、優れた収率で進行した。
【００２５】
化学合成要素および酵素合成要素の両方を合わせる方法もまた、公知である。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏおよび共同研究者（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５〜４２２（１９９８））は、エンドグリコシダーゼを使用して糖ペプチド、グリコシル化ペプチドＴを化学酵素合成することを報告した。Ｎ−アセチルグルコサミニルペプチドが、純粋に化学手段によって合成された。このペプチドは、その後、酵素によってヒトトランスフェリン糖ペプチドのオリゴ糖を用いて合成された。この糖部分は、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで処理することによってこのペプチドに付加された。生じたグリコシル化ペプチドは、非常に安定であり、そしてペプチドＴおよびＮ−アセチルグルコサミニルペプチドＴと比較した場合に、タンパク質分解に対して耐性であった。
【００２６】
糖ペプチドを形成およびリモデリングするための酵素の使用における興味と合わせて、望ましいグリコシル化パターンを生成するために操作された酵素を生成することに興味が存在する。糖ペプチドを生成する際に有用である酵素の変異を生成しそれを特徴付ける方法が、報告されている。例えば、Ｒａｏら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８：２３３８〜２３４６（１９９９））は、構造変化により規定されるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの変異体を調製した。この変異体は、基質結合が減少し、そして酵素機能が変化する。Ｗｉｔｈｅｒｓら（米国特許第５，７１６，８１２号）は、活性部位内の通常の求核アミノ酸が非求核アミノ酸に変化している、変異体グリコシダーゼ酵素を調製した。これらの変異酵素は、二糖生成物を加水分解し得ないが、なお二糖生成物を形成し得る。
【００２７】
変異酵素およびネイティブ酵素の両方の全体的構造および活性部位の構造が、ｘ線結晶学によって特徴付けられた。例えば、ｖａｎ  Ｒｏｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１３９８９〜１３９９６（１９９４）；およびＮｏｒｒｉｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１０４９〜１０５９（１９９４）を参照のこと。
【００２８】
上記に示される酵素合成法の多くの利点に関わらず、いくつかの場合において、欠陥が残る。適切にグリコシル化された糖ペプチドの調製は、例示的な状況である。この状況において、さらなる努力が必要とされ、かつ糖ペプチドの合成、および適切にグリコシル化されていない生物学的もしくは化学的に生成された糖ペプチドのリモデリング方法の両方を改善することにその努力は関する。酵素的オリゴ糖および糖ペプチドの合成、ならびに糖ペプチドリモデリングの能力を実現するために、新規な合成アプローチについての必要性が存在する。多くの商業的に重要な組換え生成および遺伝子組換え生成された糖ペプチドの生物学的活性は、特定の糖形態の存在または不在に依存するので、そのような糖ペプチドに関するグリコシル化パターンを酵素的に改変するためのインビトロ手順に対する必要性が存在する。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
（発明の要旨）
本発明は、糖タンパク質のグリコシル化パターンをリモデリングする方法を提供する。代表的に、この方法は、Ａｓｎ残基またはＡｓｐ残基を含むポリペプチドをグリコシル化することによって行われる。このタンパク質は、一般に、組換え産生される。そしてこのタンパク質は、化学的にかまたは適切な酵素（例えば、エンドグリカナーゼ、またはプロテアーゼ）を用いて、存在する糖類構造の一部を取り除くために最初に処理される。この方法はまた、１以上の工程を利用し得る。この工程において、適切なアクセプター部分が、ペプチド上に結合される。本発明の方法は、ポリペプチドと活性化グリコシルドナー分子（例えば、脱離基を有する種）および変異体エンドグリカナーゼ（例えば、エンド−Ｈ）とを、この活性化グリコシルドナー分子をこのポリペプチド上のグリコシルアクセプターに連結するのに適切な条件下で接触させる工程を包含する。所望ならば、本発明の方法を使用して生成されるペプチドのグリコシル化パターンは、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知であるグリコシル化方法を使用して、さらに加工され得る。
【００３０】
変異体エンドグリカナーゼは、代表的に、アミノ酸残基での、活性部位酸性アミノ酸残基の置換を含む。例えば、このエンドグリカナーゼがエンド−Ｈである場合、その置換される活性部位残基は、代表的に、１３０位におけるＡｓｐ、１３２位におけるＧｌｕまたはそれらの組み合わせである。これらのアミノ酸は、一般に、セリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで置き換えられる。
【００３１】
変異体酵素は、通常エンドグリカナーゼ加水分解工程の逆反応と類似している合成工程によって、反応を触媒する。これらの実施形態において、グリコシルドナー分子（例えば、所望のオリゴ糖構造または単糖構造）は、脱離基を含み、そしてこの反応は、タンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基へのこのドナー分子の付加を生じさせる。第２の経路において、この反応は、タンパク質のＡｓｎ残基へのグリコシルドナーの付加を生じさせる。例えば、この脱離基は、ハロゲン（例えば、フルオリド）であり得る。別の実施形態において、この脱離基は、Ａｓｎ、またはＡｓｎペプチド部分である。なおさらなる実施形態において、グリコシルドナー分子上のＧｌｃＮＡｃ残基は、改変されている。例えば、このＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部分を含み得る。
【００３２】
本発明の方法において使用される特定のグリコシルドナー分子は、本発明の重要な局面ではない。任意の所望の糖質構造が、本発明の方法を使用して糖タンパク質に付加され得る。代表的に、この構造は、ヒト糖タンパク質にて共通して見出される、二触角構造、三触角構造、または四触角構造を含む。
【００３３】
アクセプター糖タンパク質はまた、本発明の重要な局面ではない。代表的に、糖タンパク質は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞）において組換え発現される。糖タンパク質は、全長タンパク質またはフラグメントのいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、糖タンパク質は、周知の技術に従って、固体支持体に可逆的に結合され得る。
【００３４】
本発明はまた、グリコシル化パターンを有する糖ペプチドを生成するための方法を提供する。このグリコシル化パターンは、既知の糖ペプチドのグリコシル化パターンと実質的に同一である。この方法は、本発明の変異体エンドグリカナーゼに対するアクセプターを有するペプチドまたは糖ペプチドを、グリコシルドナーおよび変異体エンドグリカナーゼと接触させる工程を包含する。ペプチドまたは糖ペプチド上への、グリコシルドナーの転移は、所望のグリコシル化レベルに到達した際に停止される。本発明のこの局面の使用のうち、治療上適切な糖ペプチド構造の重複は、ヒトにおける使用に関する管理機関によって、承認されているかまたは承認へと向かっている。従って、より全体にわたってグリコシル化されているペプチド（または全体にわたってほとんどグリコシル化されていないペプチド）は、改善された特性を有し得るが、すでに承認されている糖ペプチド構造を重複させる能力は、本方法によって調製される特定の糖ペプチドを完全規制の再調査プロセスに供する必要性を排除し、それによって重要な経済上の利点を提供する。これは、適切なグリコシル化能力を有する産生細胞株からの転換を可能にするが、発現レベルにおいて、有意に多量の産物を生成する能力を有するが、劣悪なグリコシル化パターンを生じる産生細胞株に制限される。次いで、このグリコシル化パターンは、所望の産物のグリコシル化パターンと一致するように、インビトロで改変され得る。次いで、所望のグリコシル化産物の収率は、所定のバイオリアクタサイズについて、実質的に増大され得、生産経済学と工場設備能力との両方に影響する。本発明の方法において使用される特定の糖ペプチドは、一般に、本発明の重要な局面ではない。糖ペプチドは、フラグメントまたは全長糖ペプチドであり得る。代表的に、糖ペプチドは、治療用途を有する糖ペプチド（例えば、ホルモン、成長因子、酵素インヒビター、サイトカイン、レセプター、ＩｇＧキメラ、またはモノクローナル抗体）である。
【００３５】
実質的に均一なグリコシル化パターンを有するグリコシル化糖ペプチドの大規模生成のための方法、および本発明の変異体エンドグリカナーゼを使用して、既知のグリコシル化パターンを有する糖ペプチドを生成するための大規模方法もまた、提供される。
【００３６】
本発明はまた、本発明の方法によって調製される糖ペプチドを含有する組成物、ならびに治療および診断においてこの組成物を使用する方法を提供する。
【００３７】
本発明のさらなる目的および利点が、以下の詳細な説明から明らかとなる。
【００３８】
（発明および好ましい実施形態の詳細な説明）
（定義）
以下の略語が本明細書中で用いられる：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＡ＝ガラクツロニル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ＝グリコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ＝マンノシル；
ＮｅｕＡｃ＝Ｎ−アセチルノイラミニル；
ＮｅｕＧｃ＝Ｎ−グリコリルノイラミニル；
Ｘｙｌ＝キシロシル。
【００３９】
特に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する当業者により一般に理解されている意味と同じ意味を有する。一般に、細胞培養、分子生物学、有機化学および核酸化学における本明細書中で使用する命名法、実験室手順、およびハイブリダイゼーションは、当該技術分野で周知であり通例使用されるものである。核酸およびペプチドの合成には、標準的な技術が使用される。これらの技術および手順は、一般に、当該技術分野および種々の一般的な参考文献（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版、（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；その内容は、本明細書中で参考として援用されている）（これらは、この文書全体を通して提供される）で通常の方法に従って実行される。本明細書中で使用する命名法および分析化学の実験室手順、および下記の有機合成は、当該技術分野で周知かつ通例使用されているものである。化学合成および化学分析には、標準的な技術またはそれらの改良が使用される。
【００４０】
本明細書中に記載される全てのオリゴ糖は、非還元糖（すなわち、Ｇａｌ）についての名前または略語、次いで、グリコシド結合（αまたはβ）の立体配置、環結合（１または２）、この結合に関与する還元糖の環の位置（２、３，４、６または８）、次いで、還元糖の名前または略語（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）を用いて記載される。各糖は、好ましくは、ピラノースである。標準的な糖鎖生物学命名法の総説については、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖａｒｋｉら編、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。
【００４１】
オリゴ糖は、還元末端の糖が、実際に、還元糖であるか否かに関わらず、還元末端および非還元末端を有すると考えられる。受け入れられている命名法に従って、オリゴ糖は、左に非還元末端および右に還元末端を有して、本明細書中で示される。
【００４２】
用語「シアル酸」は、９個の炭素のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーをいう。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ）−１−オン酸（頻繁に、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される））である。このファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、ここで、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基は、ヒドロキシル化される。第３のシアル酸ファミリーのメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９（１９９０））である。９置換シアル酸（例えば、９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ様の９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ）もまた含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２５−４０（１９９２）；Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））を参照のこと。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、国際出願ＷＯ９２／１６６４０（１９９２年１０月１日公開）に開示される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「変異体エンドグリカナーゼ」とは、本発明のエンドグリカナーゼをいう。例示的な変異体エンドグリカナーゼは、組換え的に生産されるが、本発明はまた、変異の化学的方法によって、およびまたエンドグリカナーゼペプチド配列の全体、または一部の合成によって生産された変異体エンドグリカナーゼの使用を含む。好ましい変異体エンドグリカナーゼは、膜結合領域を欠損する。
【００４４】
用語「組換え」は、細胞に関して用いられる場合、細胞が、異種核酸を複製するか、または異種核酸によりコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、ネイティブ（非組換え）形態の細胞の中で見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、ネイティブ形態の細胞において見出される遺伝子を含み得、ここで、この遺伝子は、改変され、そして人工的手段により細胞へと再導入される。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変されている細胞に対して内因性の核酸を含む細胞を包含し；このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異誘発、および関連する技術により得られるものが挙げられる。「組換えポリペプチド」は、組換え細胞により産生されているものである。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「異種配列」または「異種核酸」は、外来の供給源から特定の宿主細胞を作り出すものであるか、あるいは同一の供給源由来の場合、その本来の形態から改変されるものである。したがって、原核生物宿主細胞中の異種糖ペプチド遺伝子は、改変されている特定の宿主細胞に内在性である糖ペプチド遺伝子を含む。例えば、制限酵素を用いてＤＮＡを処理し、プロモーターに作動可能に連結され得るＤＮＡフラグメントを作製することによって、異種配列の改変が生じ得る。部位特異的変異誘発のような技術はまた、異種配列を改変するために有用である。
【００４６】
「部分配列」とは、それぞれ核酸またはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）のより長い配列の一部を含む核酸またはアミノ酸の配列をいう。
【００４７】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、このような配列と適合性の宿主内の構造遺伝子の発現に影響し得る核酸エレメントを用いて、組換え的または合成的に作製される核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーターおよび必要に応じて、転写終止シグナルを含む。代表的には、組換え発現カセットは、転写される核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現を果たすのに必要または役立つさらなる因子はまた、本明細書中に記載されるように用いられ得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞からの発現したタンパク質の分泌を指向するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含む。転写終止シグナル、エンハンサー、および遺伝子発現に影響する他の核酸配列もまた、発現カセットに含まれ得る。
【００４８】
用語「変更された」とは、本発明の方法の適用の後、本来生成（例えば、発現）されるようなペプチド上で観察されるグリコシル化パターンとは異なる、グリコシル化パターンを有するペプチドをいう。代表的に、本来生成されたペプチド上のオリゴ糖の構造は、野生型アミダーゼまたはエンドグリカナーゼによって初めに除去され、次いで本発明の方法を使用して所望の構造によって置き換えられる。
【００４９】
「ペプチド」および「ポリペプチド」とは、交換可能に使用され、そのモノマーがアミノ酸であって、アミノ結合を介して共に結合するポリマーをいい、これは、あるいは、ポリペプチドと呼ばれている。さらに、非天然アミノ酸（例えば、βアラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニン）もまた、含まれる。遺伝子でコード化されていないアミノ酸はまた、本発明において使用され得る。さらに、反応基、グリコシル化部位、ポリマー、治療的部分、生体分子などを含むように改変されたアミノ酸もまた、本発明において使用され得る。本発明で使用されるアミノ酸の全ては、Ｄ−異性体またはＬ−異性体のいずれかであり得る。Ｌ−異性体が一般に好ましい。それに加えて、他のペプチド模倣物もまた、本発明に有用である。本明細書中で使用される場合、「ペプチド」および「ポリペプチド」とは、グリコシル化ペプチドおよびグリコシル化していないペプチドの両方をいう。ペプチドを発現するシステムによってグリコシル化された不完全なペプチドもまた含まれる。一般的な概説としては、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ，ＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照のこと。
【００５０】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する、アミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸、および後で改変されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造（すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合されるα−炭素）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保存する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能する、化学化合物をいう。
【００５１】
「公知のグリコシル化パターン」とは、任意の公知のグリコシル化レベルを有する、任意の供給源からの公知の糖ペプチドのグリコシル化パターンをいう。
【００５２】
用語「単離された」とは、ある物質を生成するために用いられる成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。本発明の糖ペプチドについて、用語「単離された」とは、通常、糖ペプチドを調製するために用いられる混合物中にある物質を伴う成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。「単離された」および「純粋」は、交換可能に用いられる。代表的には、本発明の単離された糖ペプチドは、好ましくは、ある範囲で表される、純度のレベルを有する。糖ペプチドについての純度の範囲の下端は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、そして純度の範囲の上端は、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％よりも高い。
【００５３】
糖ペプチドが、約９０％よりも高い純度である場合、これらの純度はまた、好ましくは、ある範囲で表される。純度の範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。純度の範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の純度である。
【００５４】
純度は、当該技術分野で認められた任意の分析方法（例えば、銀染色ゲル、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または類似の手段上のバンド強度）により、決定される。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「本質的に集団の各メンバー」は、本発明の糖ペプチドの集団の特徴を記述し、ここで、ペプチドに付加したグリコシルドナーの選択した割合は、ペプチド上の複数の同じアクセプタ部位に付加される。「本質的に集団の各メンバー」とは、改変された糖に結合体化されるペプチド上の部位の「同質性」を言い、少なくとも約８０％、好ましくは、少なくとも約９０％、さらに好ましくは、少なくとも約９５％が同質である本発明の結合体をいう。
【００５６】
「同質性」とは、グリコシルドナー部分が結合体化されるアクセプタ部分の集団にわたる構造上の一貫性を意味する。従って、各グリコシルドナー部分が、全ての他のグリコシルドナーが結合体化されるアクセプタ部位と同じように、同じ構造を有するアクセプタ部位に結合体化される本発明の糖ペプチドにおいて、その糖ペプチドは、約１００％同質であると言われる。同質性は、典型的には、範囲で表わされる。糖ペプチド結合体に対する同質性の範囲の下限は、約６０％、約７０％または約８０％であり、そして、この純度範囲の上限は、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％以上である。
【００５７】
糖ペプチドが約９０％に等しいかそれより高い同質性である場合、それらの同質性はまた、好ましくは、範囲として表わされる。同質性の範囲の下限は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％または約９８％である。この純度範囲の上限は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約１００％の同質性である。これらの糖ペプチドの純度は、典型的には、当業者に公知の１種またはそれ以上の方法（例えば、液体クロマトグラフィー−質量スペクトル（ＬＣ−ＭＳ）、フライト分光測定のマトリックス補助レーザー脱離マス時間（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動など）により、決定される。
【００５８】
「実質的に均一なグリコフォーム」または「実質的に均一なグリコシル化パターン」とは、糖ペプチド種を意味する場合、目的のグルコシルドナーによりグリコシル化されたアクセプタ部分の割合を意味する。例えば、変異体Ｅｎｄｏ−Ｆ３の場合、ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ部分の実質的に全て（以下で定義する）が、本発明の糖ペプチド中にて、グリコシル化される場合、実質的に均一なフルコシル化パターンが存在している。その出発物質が、グルコシルドナー（代表的に脱離基を有さない）と同じ構造を有する種でグリコシル化されるグルコシル化アクセプタ部分（例えば、フルコシル化Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含有し得ることは、当業者に理解される。従って、計算した割合のグリコシル化は、本発明の方法によりグリコシル化されるアクセプタ部分を含有するだけでなく、この出発物質中で既にグリコシル化されたアクセプタ部分も含有する。
【００５９】
「実質的に均一な」との上記定義における「実質的に」との用語は、一般に、特定の変異体エンドグリカナーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプタ部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、またはより好ましくは、少なくとも約９０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９５％がグリコシル化されることを意味する。
【００６０】
本発明の実行は、組換え核酸の構築およびトランスフェクトされた宿主細胞中の遺伝子発現を包み得る。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当該技術分野において公知である。広範な種々のクローニングおよびインビトロでの組換え核酸の構築に適切な増幅方法（例えば、発現ベクター）は、当業者に周知である。これらの技術の例および多くのクローニングの実行による当業者に対する十分な説明書は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２巻  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．のジョイントベンチャー、（１９９９  補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）中に見出される。組換えポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、当業者に公知であり、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、および真菌細胞を含む、真核細胞が挙げられる。
【００６１】
（方法）
改変されたグリコシル化パターンを有する糖ペプチドは、特定用途に決して最適でないグリコシル化状態でのタンパク質にわたって、重要な利点を有する。このような最適でないグリコシル化パターンは、組換え糖ペプチドが、所望のグリコシル化パターンを生じるためのグリコシル化機構の適切な補体を有さない細胞において産生される場合、生じ得る。最適なグリコシル化パターンまたは好ましいグリコシル化パターンは、そのネイティブな細胞中で産生される場合、糖ペプチドのネイティブなグリコシル化パターンであってもなくてもよい。
【００６２】
多くの糖ペプチドの生物学的活性は、特定のグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）の存在または非存在に依存する；従って、本発明の方法は、本発明の方法の適用の前に、糖ペプチドと比較して所望の生物学的活性の増大したレベルを有する糖ペプチドの組成物を得るために有用である。例えば、アクセプタ部分で増大したグリコシル化は、糖ペプチドの高度多価を与え、それによって、糖ペプチドの生物学的活性を増大する。所望のグリコシル化パターンを有する糖ペプチド組成物の他の利点としては、例えば、減少したクリアランス率に基づいて増大した糖ペプチドの治療的半減期が挙げられる。グリコシル化パターンを変化ことはまた、外来タンパク質上の抗原性決定因子をマスクし得、従って、このタンパク質に対する免疫応答を低下または排除する。糖ペプチド連結糖のグリコフォームの改変はまた、タンパク質を、特定の組織または所望のオリゴサッカリドに特異的な細胞表面レセプタに標的化するために、使用され得る。所望のオリゴサッカリドはまた、レセプタとそのネイティブなリガンドとの間の相互作用を阻害するために使用され得る。
【００６３】
公知の化学的ペプチド生産ストラテジーおよび酵素的ペプチド生産ストラテジーとは対照的に、本発明の方法は、実質的に同種の誘導体化パターンを有するペプチドおよび糖ペプチドのアセンブリを可能にする。この方法はまた、改変されたペプチドおよび改変された糖ペプチドの大量生産について実用的である。従って、本発明の方法は、あらかじめ選択された均一な誘導体化パターンを有する糖ペプチドの大量生産のための実用的手法を提供する。この方法は、治療的ペプチドの改変に特に十分適し、これらの治療的ペプチドとしては、培養細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または原核生物細胞）あるいはトランスジェニック植物またはトランスジェニック動物における生産の間に不完全にグリコシル化された糖ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
従って、第１の局面において、本発明は、糖タンパク質をグリコシル化する方法を提供する。この方法は、糖タンパク質と、ＧｌｃＮＡｃ残基を含む活性化グリコシルドナー分子および変異エンドグリカナーゼ（エンドグリコシダーゼ）とを、この活性化グリコシルドナーのＧｌｃＮＡｃ残基が糖タンパク質のＧｌｃＮＡｃに連結するのに適切な条件下で、接触させる工程を包含する。
【００６５】
別の局面において、本発明は、工業的に適切な量の、選択されたグリコシル化パターンを有するペプチドを調製する方法を提供する。従って、変異エンドグリカナーゼについてのアクセプター部分を含むポリペプチドのグリコシル化パターンを改変するための大規模方法が提供される。この方法は、少なくとも約５００ｍｇのポリペプチドと、変異エンドグリカナーゼのためのグリコシルドナー部分および変異エンドグリカナーゼを含む反応混合物とを、グリコシルドナー部分からアクセプター部分へグリコシル残基を転移させるのに適切な条件下で接触させる工程を包含し、それにより改変されたグリコシル化パターンを有する糖ペプチドを生成する。
【００６６】
なおさらなる局面において、本発明は、既知の糖ペプチドのグリコシル化パターンと実質的に同一なグリコシル化パターンを有するペプチドを調製するための大規模方法を提供する。この局面の例において、この方法は、少なくとも約５００ｍｇのポリペプチドと、グリコシルドナー部分および変異エンドグリカナーゼを含む反応混合物とを、グリコシルドナー部分からポリペプチド上のグリコシルアクセプター部分へとグリコシル残基を転移させるのに適切な条件下で接触させる工程を包含する。この反応は、所定の期間の間、進行させられ、次いで既知のグリコシル化パターンに実質的に同一であるグリコシル化パターンが得られる場合に、終結される。
【００６７】
本発明はまた、実質的に均一なグリコシル化パターンを有する糖タンパク質種を含む組成物を提供する。このような組成物を得るための方法およびキットもまた提供される。本発明の方法は、その初期発現の際に、糖タンパク質上に存在するグリコシル化パターンを改造するかまたは変更するために有用である。
【００６８】
この方法はまた、改変された糖タンパク質の大規模産生について実用的である。従って、本発明の方法は、所望のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質の大規模調製のための実用的手段を提供する。この方法は、細胞培養物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、または原核生物細胞）またはトランスジェニック植物もしくはトランスジェニック動物における産生の間に不完全にグリコシル化される治療的糖タンパク質の改変によく適する。さらに、この方法は、非ヒト糖質形態（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）をヒト糖質形態に変換するために一般的に有用である。さらに、この方法を使用して、特定の特性（例えば、組織標的化、インビボにおける残留時間の向上など）を有する糖質をペプチド上に結合体化させ得る。このプロセスは、組成物中に存在する糖タンパク質上の所望のＮ結合糖質形態の増加したレベルおよび一定のレベルを提供する。
【００６９】
活性結合部位または水結合部位のアミノ酸は、制限なく、天然または非天然の任意のアミノ酸により置き換えられ得る。例示的なアミノ酸置換は、セリン、アラニン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。
【００７０】
例示の実施形態において、本発明の方法はさらに、変異エンドグリカナーゼに加えて、グリコシルトランスフェラーゼとポリペプチドを接触させる工程を包含する。例えば、１つの実施形態において、ポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼに対するアクセプター部分を含む。この方法はさらに、グリコシルドナー部分およびグリコシルトランスフェラーゼを含む反応混合物とポリペプチドを、グリコシル残基がグリコシルドナー部分からアクセプター部分に移動する適切な条件下で接触させる工程を包含する。好ましい実施形態において、得られるポリペプチドは、実質的に均一なグリコシル化パターンを有する。さらに別の好ましい実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される。
【００７１】
変異エンドグリカナーゼに加えて１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが使用される実施形態において、前駆体ペプチドまたは糖ペプチドは、１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼと実質的に同時に接触され得る。あるいは、前駆体ペプチドまたは糖ペプチドは、１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼおよび変異エンドグリカナーゼと実質的に同時に接触される。本発明の方法は、必要に応じて、１つ以上の酵素を用いる２つ以上の独立工程からなる。
【００７２】
本発明の方法は、実質的に任意のペプチドまたは糖ペプチドを用いて首尾よく実施される。ペプチドまたは糖ペプチドが適切なアクセプター部分を含まない場合、酵素的方法および／または化学的方法によって適切な部分を付加することは、本発明の範囲内である。本発明の方法は、概して、実質的に均一なグリコシル化パターンにより特徴付けられる純粋、均質な糖ペプチドを提供する。
【００７３】
アクセプターペプチド（グリコシル化されているかまたはグリコシル化されていない）は、代表的に、デノボ合成されるか、または原核生物細胞（例えば、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））もしくは真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または植物細胞）中で組換え発現される。ペプチドは、全長タンパク質かまたはフラグメントのいずれかであり得る。
【００７４】
本発明の方法はまた、組換え産生された不完全なグリコシル化ペプチドの改変を提供する。多くの組換え産生糖ペプチドは、不完全にグリコシル化され、望ましくない特性（例えば、免疫原性、ＲＥＳによる認識）を有し得る糖質残基を晒す。本発明の方法を用いて改変され得る例示のペプチドを、表１に示す。
【００７５】
【表１】
2005535280.tif 000002
本発明の方法によって改変される他の例示のペプチドとしては、イムノグロブリンファミリーのメンバー（例えば、抗体、ＭＨＣ分子、Ｔ細胞レセプターなど）、細胞間レセプター（例えば、インテグリン、ホルモンレセプター、または増殖因子など）、レクチン、およびサイトカイン（例えば、インターロイキン）が挙げられる。さらなる例としては、中でも、組織型プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、レニン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）、ボンベシン、トロンビン、造血増殖因子、コロニー刺激因子、ウイルス抗原、補体タンパク質、α１−抗トリプシン、エリスロポエチン、Ｐ−セレクチン糖ペプチドリガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、抗トロンビンＩＩＩ、インターロイキン、インターフェロン、プロテインＡおよびプロテインＣ、フィブリノーゲン、ヘルセプチン、レプチン、グリコシダーゼが挙げられる。このポリペプチドのリストは、例示であって、限定ではない。この方法はまた、キメラタンパク質（イムノグロブリン（例えば、ＩｇＧ）由来の部分を含むキメラタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない）を改変するのに有用である。本発明の方法によって改変され得るなおさらなる例示のペプチドを、添付書類１に示す。
【００７６】
本発明の方法によって改変されるペプチドは、合成ペプチドもしくは野生型ペプチドであり得るか、またはそれらは当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発）によって産生される変異ペプチドであり得る。ペプチドのグリコシル化は、代表的に、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。例示のＮ結合は、アスパラギン残基の側鎖への改変糖の結合である。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖質部分の酵素結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生成される。当業者に明らかなように、この方法において、アスパラギンは、必要に応じて、アスパラギン酸によって置換される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸（好ましくは、セリンまたはスレオニン（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る））のヒドロキシ側鎖への１つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコース、またはキシロース）の結合をいう。
【００７７】
本発明はまた、発現の際にこのような部位を有さない箇所において、ペプチド上にグリコシル化部位をグラフト化する方法に関連して有用である。ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、１つ以上のグリコシル化部位を含むように、アミノ酸配列を変更することにより、簡便に達成される。この付加はまた、（ＮＨ２連結グリコシル化部位については）ペプチドの配列内に、−ＮＨ２基を提示する１つ以上の種（好ましくは、Ａｒｇ残基またはＡｓｐ残基）を組み込むことによりなされ得る。容易さのために、ペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化により変更され、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成するように、予め選択された塩基においてペプチドをコードするＤＮＡを変異させることにより変更される。このＤＮＡ変異は、好ましくは当該分野で公知の方法を使用して生成される。
【００７８】
本発明はまた、エンドグリカナーゼが、ペプチドの選択されたアミノ酸残基の少なくとも１つに対して糖質を結合体化する前または後のいずれかに、１つ以上の選択されたグリコシル残基をペプチドに付加する手段を提供する。本実施形態は、例えば、ペプチド上に存在しないかまたは所望の量でペプチド上に存在しないかのいずれかである、選択されたグリコシル残基に糖質部分を結合体化させるのに所望される場合、有用である。従って、ドナー糖質部分をペプチドへカップリングする前に、アクセプターグリコシル残基が、酵素的カップリングまたは化学的カップリングによりペプチドに結合体化される。別の実施形態において、糖ペプチドのグリコシル化パターンは、ドナー糖質部分の結合体化の前に、この糖ペプチドから糖質残基を除去して所望のアクセプター部分を形成することにより変更される。例えば、ＷＯ９８／３１８２６を参照のこと。
【００７９】
糖ペプチドに存在する任意の糖質部分の付加または除去は、化学的にかまたは酵素的のいずれかで達成される。化学的脱グリコシル化は、好ましくは、化合物（トリフルオロメタンスルホン酸）または等価な化合物にポリペプチド改変体を晒すことによって実施される。この処理により、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたは全ての糖が切断されるが、ペプチドはインタクトなままである。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。ポリペプチド改変体上の糖質部分の酵素切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）により記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成され得る。
【００８０】
グリコシル部分の化学的付加は、当該分野で認識されている任意の方法によって実施される。好ましくは、糖部分の酵素的付加が、達成される。例えば、米国特許第５，８７６，９８０号、同第６，０３０，８１５号、同第５，７２８，５５４号、および同第５，９２２，５７７号を参照のこと。
【００８１】
選択されたグリコシル残基の例示的結合点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化のためのコンセンサス部位；（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼについてのアクセプターである末端グリコシル部分；（ｃ）アルギニン、アスパラギンおよびヒスチジン；（ｄ）遊離カルボキシル基；（ｅ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システインの遊離スルフヒドリル基）；（ｆ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基）；（ｇ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基）；または（ｈ）グルタミンのアミド基。本発明における例示的な使用方法は、ＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公開）およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載される。
【００８２】
本発明は、変異体エンドグリカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｙｃａｎａｓｅ）（例えば、エンド−Ｈ、エンド−Ｆ１、エンド−Ｆ２、エンド−Ｆ３、エンド−ＤおよびＰＮＧａｓｅ−Ａ）を利用して、糖ペプチドのグリコシル化パターンをリモデリングする。置換されるアミノ酸は、一般に、活性部位、すなわち水結合部位内またはそれらの近傍に位置する。例示的な置換としては、以下が挙げられる：活性部位の酸性アミノ酸残基（これは、１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕおよびそれらの組み合わせから選択される）があるアミノ酸残基で置換されたエンド−Ｈ；１２９位のＡｓｐ、１３１位のＧｌｕおよびそれらの組み合わせから選択される活性部位の酸性アミノ酸残基がアミノ酸残基で置換されたエンド−Ｆ１；１２４位のＡｓｐ、１２６位のＧｌｕおよびそれらの組み合わせから選択される活性部位の酸性アミノ酸残基があるアミノ酸残基で置換された、エンド−Ｆ２；ならびに１２６位のＡｓｐ、１２８位のＧｌｕおよびそれらの組み合わせから選択される活性部位の酸性アミノ酸残基があるアミノ酸で置換された、エンド−Ｆ３。
【００８３】
これらのタンパク質の野生型は、ＧｌｃＮＡｃ残基の間のＮ結合型オリゴ糖のキトビオースコアを切断して、このタンパク質に結合したＧｌｃＮＡｃの１つを遊離させる（図１）。これらのエンドグリカナーゼの構造的相同性は、オリゴ糖の切断に関与する各酵素について保存された触媒残基が存在することを示唆する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ．ら，「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｉｐｔｉｃｕｍ  Ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ  Ｆ２  ａｎｄ  Ｆ３」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，９７０２，１９９３；Ｒａｏ，Ｖ．，ら，「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｈ  ａｔ  １．９  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，３，４４９，１９９５；Ｒａｏ，Ｖ．，ら，「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｈ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ａｓｐ１３０  ａｎｄ  Ｇｌｕ  １３２：Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，８，２３３８，１９９９；Ｖａｎ  Ｒｏｅｙ，Ｐ．，ら，「Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｆ１，ａｎ  α／β  Ｂａｒｒｅｌ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄａｐｔｅｄ  ｆｏｒ  ａ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，１３９８９，１９９４）。加水分解工程に関与する２つの重要な触媒性酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）が同定されている。これらのエンド−グリカナーゼ間の残基の保存された性質は、概説されている。エンド−Ｈ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ；１ＥＤＴ）およびエンド−Ｆ１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ；２ＥＢＮ）の結晶構造は、各酵素の活性部位においてこれらの酸性アミノ酸が中心に位置することを確認し、そしてさらに、各酵素において保存されたアミノ酸残基が酵素の触媒作用に重要であるという考えを支持する。
【００８４】
保存されたアミノ酸残基としては、以下が挙げられる：
【００８５】
【表２】
2005535280.tif 000003
活性部位のアミノ酸改変またはペプチドの再操作を用いて、活性化されたオリゴ糖基質についてのこれらの酵素の合成能力を改善する。最初の試みは、２つの酸性アミノ酸（ａｓｐおよびｇｌｕ）のいずれかまたは両方を別のアミノ酸（例えば、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＡｓｎまたはＧｌｎ）に最初に変化させることによってこの酵素の加水分解能力を変更することに焦点が当てられる。活性化された形態のオリゴ糖および合成機構を、図２に示す。オリゴ糖に関する基質特異性は、どのエンドグリカナーゼが改変されて使用されるかに依存する。オリゴ糖が付加される好ましい糖タンパク質は、付加が生じるＮ結合型ＧｌｃＮＡｃを含む。このタンパク質上の末端ＧｌｃＮＡｃ残基は、発現系から自然に誘導されてもよく、またはこのアプローチによってリモデリング前に作製されてもよい。例えば、酵母から誘導された糖タンパク質は代表的に、ヒトにとってネイティブではない、高マンノースＮ結合型オリゴ糖基質を含む。これは、酵母由来糖タンパク質が直接的に投与される場合、迅速なクリアランスおよび免疫原性効果をもたらす。しかし、未改変のエンドグリカナーゼを用いてＮ結合型オリゴ糖を最初に切断するかまたは除去して末端Ｎ結合型ＧｌｃＮＡｃを作製すれば、改変されたエンド−グリカナーゼを用いて、適切なＮ結合型オリゴ糖構造を導入し得る（図３）。
【００８６】
このアプローチをまた用い、上記と同じ一般的アプローチを用いて、哺乳動物または植物の細胞に由来する糖タンパク質上のＮ結合型構造体を改変し得る。エンドグリカナーゼの異なる酵素特異性を用いることによって、任意のＮ結合型構造を、この方法論を用いて、標的糖タンパク質に導入し得る。
【００８７】
本発明は、エンドグリカナーゼ（例えば、上記のエンドグリカナーゼ）が、分解性酵素から合成酵素へと変換され得るという観察に基づく。触媒活性における変化は、この酵素のアミノ酸残基を改変して、この変換を促進することによって誘導される。このように改変されると、この酵素は、切断するのではなく、より多くの産物を糖タンパク質へと付加し得る。点変異ならびにペプチド置換全体を用いて、この酵素の合成能力を改善し得る。代表的に、これらの酵素は、この酵素の活性部位に２以上のカルボン酸基を有する。本発明は、活性部位の１以上のカルボン酸アミノ酸が、異なるアミノ酸で置換された、上記の変異体形態の酵素を提供する。このような変異は、オリゴ糖の加水分解を触媒しないが、それにもかかわらず、その反応の立体化学およびレジオ化学に対する良好な制御を伴いながらオリゴ糖を合成する活性を保持する、酵素を提供する。
【００８８】
従って、一般に、この置換は、野生型酵素のグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基を、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、またはチロシンで置換することを含む。好ましくは、この置換されるアミノ酸は、活性部位のサイズおよび形状を有意に変化させることを回避するために、野生型アミノ酸残基の側鎖とほぼ等しいかまたはより小さなサイズの側鎖を有する。このようにして変異させた酵素は、通常の基質について不活性であり、従って、オリゴ糖産物を加水分解し得ない。しかし、これらは、改変されたアクセプターへの、改変されたグリコシルドナー分子のカップリングを触媒し得る。
【００８９】
エンド−Ｈ、エンド−Ｄ、エンド−Ｆ１、エンド−Ｆ２、エンド−Ｆ３および同様の酵素を変異させて、所望のＧｌｃＮＡｃ−オリゴ糖をＧｌｃＮＡｃ−ＡＳＮ−タンパク質（ペプチド）骨格へと転移させ得る酵素を作製する、当業者に公知の多くの方法が存在する。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ遺伝子が合成され、そしてコドンがＥ．ｃｏｌｉにおける発現について最適化される。さらに、この合成遺伝子は、ペプチド配列を保持するだけでなく、便利でかつ独特の制限エンドヌクレアーゼ部位を触媒部位残基（Ａｓｐ１３０およびＧｌｕ１３２）のいずれかの側に導入するようにも、設計される。Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎを、２つの触媒性酸性アミノ酸のうちのいずれかまたは両方に導入し、Ａｓｐ１３０残基およびＧｌｕ１３２残基の５’側または３’側に独特の制限エンドヌクレアーゼ部位もまたコードするＰＣＲプライマーが設計される。次いで、変異させたアミノ酸を含むＰＣＲ産物は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける変異したエンド−Ｈ遺伝子の発現を可能にする適切な誘導性発現ベクターへとサブクローニングされる。次いで、変異させたエンド−Ｈは、図３に示される反応を触媒する能力についてアッセイされる。
【００９０】
同じアプローチは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼのＦ３遺伝子について採られ得る。この合成遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドンが最適化されている。さらに、この合成遺伝子は、ペプチド配列を保存するが、触媒部位の残基（Ａｓｐ１２６およびＧｌｕ１２８）のいずれかの側に便利でかつ独特な制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するように設計される。２つの触媒性酸性アミノ酸のいずれかまたは両方へとＳｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎを導入し、Ａｓｐ１２６残基およびＧｌｕ１２８残基の５’側または３’側に独特の制限エンドヌクレアーゼ部位もまたコードするＰＣＲプライマーが設計される。次いで、変異させたアミノ酸を含むＰＣＲ産物は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける変異したエンド−Ｈ遺伝子の発現を可能にする適切な誘導性発現ベクターへとサブクローニングされる。次いで、変異させたエンド−Ｈは、図３に示される反応を触媒する能力についてアッセイされる。
【００９１】
特定の酵素における変異のための部位は、標準的な技術を使用して同定され得る。例えば、この部位は、活性部位におけるグリコシル−酵素中間体の捕獲後に同定され得る。この中間体は、例えば、基質との接触後の酵素の迅速な変性によって、捕獲され得る。あるいは、この中間体は、比較的安定なグリコシル−酵素中間体を形成する、改変基質を使用して捕獲され得る。一旦、この中間体が捕獲されると、標識された酵素が、プロテアーゼの使用によって、または特定の化学分解によって、ペプチドに切断され、次いで、この糖標識を有するペプチドは、クロマトグラムまたは他の分離方法に置かれ、そしてそのアミノ酸配列が決定される。この配列の、インタクトな酵素の配列との比較は、目的のアミノ酸を容易に同定する。
【００９２】
触媒残基がまた、Ｘ線結晶構造学またはＮＭＲ分光法によって決定された酵素の三次元構造において、活性部位領域を検査し、同様に活性な部位の残基（例えば、Ｇｌｕ残基またはＡｓｐ残基）を検索することによって、同定され得る。例えば、結晶構造の分析およびＰＮＧａｓｅ  Ｆの部位特異的変異誘発を使用して、活性部位（糖結合部位および触媒部位が挙げられる）が特徴付けられた（例えば、Ｎｏｒｒｉｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１０４９（１９９４）およびＫｕｈｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９４９３−２９４９７（１９９５）を参照のこと）。
【００９３】
触媒残基の改変に加えて、糖結合部位の変更もまたなされ、基質のオリゴ糖部分についての酵素の特異性を変化させ得る。点変異またはタンパク質再操作を使用して、標準的な技術に従って、この酵素の糖特異性を変化させ得る。
【００９４】
一旦、活性部位の残基が１つの酵素において同定されると、関連する酵素における相同な残基もまた、標準的な配列比較プログラムを使用して、見出され得る。比較のための配列のアライメントの方法は、当該分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによってか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによってか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によってか、これらのアルゴリズムのコンピューター化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によってか、または手動のアライメントおよび目視検査によって行われ得る。
【００９５】
変異体遺伝子は、代表的に、部位特異的変異誘発を使用して調製され、所望の結果に達する。変異をポリヌクレオチド配列に導入するための方法は、周知である。このような周知の方法としては、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅、および他の周知の技術が挙げられる。例えば、ＧｉｌｉｍａｎおよびＳｍｉｔｈ（１９７９）Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７，Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４を参照のこと。
【００９６】
本発明による変異体酵素は、宿主生物の増殖培地から、所望であれば、カラムクロマトグラフィーによって（例えば、ＤＥＡＥ−セルロースで）精製され得る。高レベルの純度は、オリゴ糖合成を触媒する際に使用するためには必要とされないが、但し、野生型グリコシダーゼ活性を有する不純物は、実質的に非存在でなければならない。
【００９７】
本発明の変異体酵素は、改変グリコシルドナーをグリコシドアクセプターに結合させるために使用される。任意の所望の糖質構造が、本発明の方法を使用してペプチドに付加され得る。代表的に、この構造は、単糖類であるが、本発明は、改変単糖類の糖に限定されない；オリゴ糖類および多糖類が、同様に有用である。
【００９８】
他の実施形態において、グリコシルドナーは、活性化糖である。本発明において有用な活性化糖は、代表的に、脱離基を含むように合成的に変更されたグリコシドである。本明細書中において使用される場合、用語「脱離基」とは、酵素により調節される求核置換反応において容易に置換される部分をいう。多くの活性化糖が、当該分野において公知である。例えば、Ｖｏｃａｄｌｏら，ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２．Ｅｒｎｓｔら編，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０００；Ｋｏｄａｍａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：６４１９（１９９３）；Ｌｏｕｇｈｅｅｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７（１９９９））を参照のこと。
【００９９】
活性化する基の例としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシレートエステル、メシレートエステル、トリフレートエステルなどが挙げられる。本発明において使用するために好ましい活性化された脱離基は、アクセプターへのグリコシドの酵素的転移をさほど立体的に妨害しない基である。従って、活性化されたグリコシド誘導体の好ましい実施形態としては、グリコシルフルオリドおよびグリコシルメシレートが挙げられ、グリコシルフルオリドが特に好ましい。グリコシルフルオリドの中でも、α−ガラクトシルフルオリド、α−マンノシルフルオリド、α−グルコシルフルオリド、α−フコシルフルオリド、α−キシロシルフルオリド、α−シアリルフルオリド、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリド、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリド、β−ガラクトシルフルオリド、β−マンノシルフルオリド、β−グルコシルフルオリド、β−フコシルフルオリド、β−キシロシルフルオリド、β−シアリルフルオリド、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリドおよびβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリドが最も好ましい。
【０１００】
例として、グリコシルフルオリドは、まず糖をアセチル化し、次いで、それをＨＦ／ピリジンで処理することによって、遊離の糖から調製され得る。これにより、保護（アセチル化）されたグリコシルフルオリドの熱力学的に最も安定なアノマー（すなわち、α−グリコシルフルオリド）が生成される。安定性の低いアノマー（すなわち、β−グリコシルフルオリド）が所望される場合、それは、過アセチル化された糖をＨＢｒ／ＨＯＡｃまたはＨＣｌで変換してアノマー性の臭化物または塩化物を生成することによって調製され得る。この中間体を、フッ化物の塩（例えば、フッ化銀）と反応させて、グリコシルフルオリドを生成する。アセチル化されたグリコシルフルオリドは、メタノール中におけるマイルドな（触媒性）塩基（例えば、ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）との反応によって脱保護され得る。さらに、多くのグリコシルフルオリドが市販されている。
【０１０１】
ドナー分子は、標準的な技術に従って調製され得る。例えば、グリコシルフルオリドは、米国特許第５，７１６，８１２号に一般的に記載されるように調製され得るか、またはＤｕｌｌｅｎｋｏｐｆら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ２９６：１３５−４７（１９９６）によって記載されるようなイミデート中間体を介して調製され得る。他の活性化グリコシル誘導体は、当業者に公知である従来の方法を使用して、調製され得る。例えば、グリコシルメシレートは、完全にベンジル化したヘミアセタール形態の糖を、塩化メシルで処理し、次いで、触媒水素化でベンジル基を除去することによって、調製され得る。
【０１０２】
好ましいドナー分子は、ハロゲン化化合物（例えば、グリコシルフルオリドまたはグリコシルクロリド）であるが、合理的に小さくかつ比較的良好な脱離基として機能する他の基もまた、使用され得る。他のグリコシルドナー分子の例としては、グリコシル−Ａｓｎ、グリコシル−Ａｓｎ−ペプチド、グリコシルクロリド、酢酸グリコシル、プロピオン酸グリコシル、およびグリコシルピバロエート（ｐｉｖａｌｏａｔｅ）、ならびに置換フェノールで改変されたグリコシル分子が挙げられる。
【０１０３】
本発明の例示的ドナー分子は、以下の式のグリコシル残基を含む：
【０１０４】
【化１】
2005535280.tif 000004
式１において、記号Ｒは、置換または非置換のアルキルまたはアリールを表す。
【０１０５】
タンパク質に結合した特定の糖類は、本発明の重要な局面ではない。代表的に、オリゴ糖類は、Ｎ結合型構造の任意の二触角（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）構造、三触角構造および四触角構造を含む。高マンノースおよび高ハイブリッドの構造はまた、転移され得る（マンノース−６−リン酸を含む構造が挙げられる）。図１は、本発明において使用され得る例示的な構造のまとめを提供する。
【０１０６】
変異体エンドグリカナーゼに加えて、ペプチド上のオリゴ糖構造は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用して、改変され得る。例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組み合わせを使用し得る。１種より多くの酵素を使用する実施形態において、これらの酵素および基質は、好ましくは、最初の反応混合物において合わせられるか、または第二の酵素反応のための酵素および試薬が、一旦、第一の酵素結合が完了したら、もしくはほぼ完了したら、反応媒体に添加される。２つの酵素反応を単一の容器中で連続して実施することによって、全体の収率が、中間体の種が単離される手順より改善される。さらに、過剰の溶媒および副生成物のクリーンアップおよび廃棄が、減少される。
【０１０７】
好ましい実施形態において、第一の酵素および第二の酵素の各々は、グリコシルトランスフェラーゼである。別の好ましい実施形態において、１つの酵素は、エンドグリコシダーゼである。さらなる好ましい実施形態において、２種より多い酵素が使用されて、本発明の改変糖ペプチドを組み立てる。酵素が使用されて、ペプチド上の糖構造を、任意の地点で、このペプチドへの改変糖の付加の前または後のいずれかで、変化させる。
【０１０８】
別の好ましい実施形態において、本発明の結合体を生成するために利用される酵素の各々は、触媒量で存在する。特定の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度ならびに反応条件（例えば、温度、時間およびｐＨ値）によって変動する。所定の酵素の触媒量を、予め選択された基質濃度および反応条件下で決定するための手段は、当業者に周知である。
【０１０９】
上記プロセスが実施される温度は、凍結点のすぐ上から、ほとんどの感受性酵素が変性する温度までの範囲であり得る。好ましい温度範囲は、約０℃〜約４５℃であり、そしてより好ましくは、約２０℃〜約３０℃である。別の例示的な実施形態において、本発明の方法の１つ以上の成分は、好熱性酵素を使用して、高温で実施される。
【０１１０】
この反応混合物は、アクセプターがグリコシル化され、これによって、所望の結合体を形成するために十分な時間にわたって、維持される。結合体のいくつかは、しばしば、数時間後に検出され得、回収可能な量は、通常、２４時間以下で得られる。当業者は、反応の速度が、多数の可変要因（例えば、酵素濃度、ドナー濃度、アクセプター濃度、温度、溶媒体積）に依存することを理解し、これらの要因は、選択された系に対して最適化される。
【０１１１】
本発明はまた、改変されたペプチドの産業規模での生成を提供する。産業規模において、エンドグリカナーゼを固体支持体に固定して、生成物のバッチからのその除去および引き続く再使用を容易にすることが、有利であり得る。このような固定は、変異体グリコシドが、不溶性マトリックスへの高い親和性を有する別のタンパク質に操作された、融合タンパク質の使用によって達成され得る。タンパク質を固体支持体に固定するための技術は、当該分野において周知である。例えば、Ｏｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：６０４−６０７（１９８９）によって記載された様式で調製された、セルロース結合タンパク質を有する融合タンパク質は、本発明に従って使用され得る。
【０１１２】
他の実施形態において、標的糖ペプチドが、固体支持体上に固定化される。好ましくは、標的糖ペプチドが、可逆的に固定化され、その結果、グリコシル化反応が完了した後に、この糖ペプチドが放出され得る。用語「固体支持体」はまた、半固体支持体を包含する。多数の適切なマトリクスが、当業者に公知である。例えば、イオン交換が、グリコシル化反応が進行する間、適切な樹脂に糖ペプチドを一時的に固定化するために用いられ得る。目的の糖ペプチドに特異的に結合するリガンドがまた、親和性に基づく固定化のために用いられ得る。目的の糖ペプチドに結合する抗体が適切である；目的の糖ペプチド自体が、抗体またはそのフラグメントである場合、親和性樹脂としてプロテインＡまたはプロテインＧを使用し得る。グリコシル化される目的のタンパク質に特異的に結合する色素および他の分子もまた適切である。
【０１１３】
以下の議論において、本発明と組み合わせた使用方法は、本発明の方法によりグリコシル化されるペプチドへのシアル酸部分の結合体化により例示される。シアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に対する以下の議論の焦点は、説明を明確にするためのものであり、そして本発明がこれらの２つのパートナーの結合体に限定されることを意味することは意図されない。当業者は、この議論が、一般的に、シアル酸以外のグリコシル部分の付加に適用可能であることを理解する。
【０１１４】
一般的に、シアリルトランスフェラーゼについてのアクセプターは、本発明の方法により改変されるペプチド上に、天然に存在する構造としてか、または組換え、酵素、もしくは化学的に配置された構造で存在する。適切なアクセプターとしては、例えば、ガラクトシルアクセプター（例えば、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース））および当業者に公知の他のアクセプターが挙げられる（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７−５６２４（１９７８）を参照のこと）。
【０１１５】
１つの実施形態において、シアリルトランスフェラーゼについてのアクセプターは、糖ペプチドのインビボでの合成の際に改変される糖ペプチド上に存在する。そのような糖ペプチドは、本発明の方法を用いて、糖ペプチドのグリコシル化パターンの事前の改変をすることなく、シアリル化され得る。あるいは、本発明の方法が用いられて、適切なアクセプターを含まないペプチドをシアリル化し得る；最初にこのペプチドを、当業者に公知の方法によりアクセプターを含むように改変する。例示的な実施形態において、ＧａｌＮＡｃ残基が、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用により付加される。
【０１１６】
例示的な実施形態において、このアクセプターは、例えば、このペプチドに連結されるＧｌｃＮＡｃまたは他の適切な糖部分にガラクトース残基を付加することによりアセンブルされる。この方法は、改変されるべきペプチドを、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ｇａｌβ１，３またはｇａｌβ１，４）および適切なガラクトシルドナー（例えば、ＵＤＰ−ガラクトース）を含む反応混合物と共にインキュベートする工程を包含する。この反応が、実質的に完了するまで進められるか、あるいは、この反応が、予め選択された量のガラクトース残基が付加されたときに終了させられる。選択された糖アクセプターをアセンブルする他の方法は、当業者に明らかである。
【０１１７】
なお別の実施形態において、糖ペプチド連結オリゴ糖が、第一に、全体的または部分的に「トリム」されて、シアリルトランスフェラーゼに対するアクセプターまたは１つ以上の適切な残基が付加されて適切なアクセプターを得ることができる部分を露出する。酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびエンドグリコシダーゼ（例えば、米国特許第５，７１６，８１２号を参照のこと））が、付加反応およびトリミング反応に有用である。
【０１１８】
上記の例は、本明細書中に示される方法の能力の例示を提供する。本発明の方法を用いて、実質的に任意の所望の構造の糖質残基を「トリムバック」および構築することが可能である。改変された糖質が、上記のように糖部分の末端に付加され得るか、またはそれは、ペプチド核と糖質の末端との間の中間体であり得る。
【０１１９】
例示的な実施形態において、存在するシアル酸が、シアリダーゼを用いて糖ペプチドから除去され、これにより、その下にあるガラクトシル残基の全てまたはほとんどを露出させる。あるいは、ペプチドまたは糖ペプチドが、ガラクトース残基またはガラクトース単位で終結するオリゴ糖残基を用いて標識される。ガラクトース残基の露出または付加の後、適切なシアリルトランスフェラーゼが、改変されたシアル酸を付加するために用いられる。
【０１２０】
構造的分析によってだけでなく、このタンパク質の１つ以上の生物学的活性の比較によっても、グリコシル化パターンにおける差異を評価し得る。本発明の方法により生成された糖ペプチドは、代表的に、改変されていない糖ペプチドと比較した際に、１つ以上の生物学的活性において、改善を示す。例えば、本発明の糖ペプチドは、溶解度、タンパク質溶解の攻撃および熱不活化に対する耐性、免疫原性、半減期、生物活性、安定性などにより測定される場合、より高い治療有効性を有し得る。好ましくは、観察される改善の量は、統計的に有意であり、より好ましくは、少なくとも約５０％の改善であり、そしてなおより好ましくは、少なくとも約８０％である。
【０１２１】
（ｉ酵素）
（１グリコシルトランスフェラーゼ）
グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、糖ペプチド、脂質もしくは糖脂質へか、または増殖オリゴ糖の非還元末端への活性化された糖（例えば、ドナーＮＤＰ−糖）の段階的様式での付加を触媒する。Ｎ結合型糖ペプチドが、ひとまとめの移動において、トランスフェラーゼおよび脂質連結オリゴ糖ドナーＤｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ２Ｇｌｃ３Ｍａｎ９を介して合成され、その後、コアのトリミングを受ける。この場合において、「コア」糖の性質は、次の付加物とは幾分か異なる。非常に多数のグリコシルトランスフェラーゼが当該分野において公知である。
【０１２２】
本発明において用いられるグリコシルトランスフェラーゼは、それが、糖部分として選択されたグリコシルドナー部分を使用し得る限り、任意のものであり得る。そのような酵素の例としては、Ｌｅｌｏｉｒ経路グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼなどが挙げられる。
【０１２３】
グリコシルトランスフェラーゼ反応に関与する酵素的糖合成のために、グリコシルトランスフェラーゼが、クローニングされ得るか、または任意の供給源から単離され得る。多数のクローニングされたグリコシルトランスフェラーゼは、それらのポリヌクレオチド配列のように、公知である。例えば、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、２００２、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｔｏｋｙｏ；および「Ｔｈｅ  ＷＷＷ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ  ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照のこと。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、およびそのアミノ酸配列が推定され得る、グリコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列もまた、種々の公的に利用可能なデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬなどが挙げられる）において見出される。
【０１２４】
本発明の方法において用いられ得るグリコシルトランスフェラーゼとしては、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｎｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）トランスフェラーゼ、およびオリゴ糖トランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。適切なグリコシルトランスフェラーゼは、真核生物から得られるグリコシルトランスフェラーゼおよび原核生物から得られるグリコシルトランスフェラーゼを含む。
【０１２５】
グリコシルトランスフェラーゼを用いて所望のオリゴ糖構造物を合成する多数の方法は、公知であり、そして本発明に一般的に適用可能である。例示的な方法が、例えば、ＷＯ９６／３２４９１、Ｉｔｏら、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３（１９９３）、および米国特許第５，３５２，６７０号、同第５，３７４，５４１号、同第５，５４５，５５３号に記載される。
【０１２６】
本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせを用いて実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの組み合わせを使用し得る。１つより多い酵素を用いる実施形態において、好ましくは、酵素および基質が最初の混合物中で合わせられるか、または一旦第一の酵素反応が完了もしくはほぼ完了すると、第二の酵素反応のための酵素および試薬が反応培地に添加される。単一の容器中で、連続して２つの酵素反応を実施することにより、全体としての収率は、中間体種が単離される手順より改善する。さらに、余剰の溶媒および副産物の除去および廃棄が軽減される。
【０１２７】
酵素グリコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、化学合成によって、適切な細胞もしくは細胞株培養物からｍＲＮＡの逆転写物をスクリーニングすることによって、適切な細胞からゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、またはこれらの手順の組み合わせによって得ることができる。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングが、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作製されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施され得る。プローブは、公知の手順に従い、かつ従来のハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられる検出可能基（例えば、蛍光基、放射性原子、または化学発光基）を用いて標識され得る。代替的に、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順（ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から産生される）の使用により得ることができる。Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号およびＭｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと。
【０１２８】
グリコシルトランスフェラーゼ酵素が、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された宿主細胞中で合成され得る。ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物である。ベクターが、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを増幅するためおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを発現するためのいずれかのために用いられる。発現ベクターは、複製可能ＤＮＡ構築物であり、この構築物において、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列が、適切な宿主におけるグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現に影響し得る適切な制御配列に作動可能に連結されている。そのような制御配列の必要性は、選択される宿主および選択される形質転換方法に依存して変化する。一般的に、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは、発現コントロールドメインを必要としない。通常、複製起点により与えられる、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子が必要とされる全てのものである。
【０１２９】
（ａ）フコシルトランスフェラーゼ）
いくつかの実施形態では、本発明の方法において使用されるグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者に公知である。例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、ＧＤＰ−フコースからアクセプター糖のヒドロキシル位へとＬ−フコースを転移する酵素が挙げられる。アクセプターへ非ヌクレオチド糖を転移するフコシルトランスフェラーゼもまた、本発明において使用される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、アクセプター糖は、例えば、オリゴ糖グリコシドにおけるＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−基中のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適切なフコシルトランスフェラーゼとしては、Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）（これは、ヒト乳汁から最初に特徴付けられた（Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照のこと））、ならびにＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−α−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ（これは、ヒト血清において見出される））が挙げられる。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）（シアリルα（２→３）Ｇａｌβ（（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼ）もまた、特徴付けられている。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え形態もまた、特徴付けられている（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：４２５−４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１２８８−１３０３（１９９０）を参照のこと）。他の例示的フコシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６９）が挙げられる。酵素的フコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号に記載される方法により実行され得る。フコシルトランスフェラーゼを産生するために用いられる細胞はまた、ＧＤＰ−フコースを合成するための酵素系を含む。
【０１３１】
（ｂ）ガラクトシルトランスフェラーゼ）
別の群の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的ガラクトシルトランスフェラーゼとしては、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：２２９−２３３（１９９０）を参照のこと）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊ０４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０−１４２９７（１９８９））、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７−８２３１（１９８９））、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１０１−１０５（１９９５））が挙げられる。別の適切なα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｂ型血液抗原の合成に関与するα１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６−１１５１（１９９０）（ヒト））である。
【０１３２】
また、本発明の方法における使用に適切なものは、β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これには、例えば、ＥＣ  ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンセターゼ）およびＥＣ  ２．４．１．２２（ラクトースシンセターゼ）（ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７（１９８９））、ヒト（Ｍａｓｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７−６６３（１９８８））、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５−１６８（１９８８））、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４−２４２（１９９４））が挙げられる。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来、Ｃｈａｐｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５１９−５２８（１９９４））が挙げられる。
【０１３３】
遺伝学的操作によってクローニングされた遺伝子に由来する酵素ＧａｌＮＡｃＴＩ−ＸＸのようなタンパク質の産生は、周知である。例えば、米国特許第４，７６１，３７１号を参照のこと。ある方法は、十分なサンプルの収集を含み、次いで、この酵素のアミノ酸配列は、Ｎ−末端配列決定によって決定される。次いで、この情報を使用して、昆虫細胞株Ｓｆ９中で発現されると完全に活性な酵素の合成を生じる、全長（膜結合）トランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを単離する。次いで、この酵素のアクセプター特異性は、１６の異なるタンパク質中の既知のグリコシル化部位の周辺にあるアミノ酸の半定量的分析、その後の合成ペプチドのインビトログリコシル化研究を使用して決定される。この研究によって、特定のアミノ酸残基がグリコシル化されたペプチドセグメントにおいて過剰に存在していること、およびグリコシル化されたセリン残基およびスレオニン残基の周辺の特定の位置の残基は、他のアミノ酸部分よりも、アクセプター効率に対する顕著な影響を有し得ることが証明された。
【０１３４】
（ｃ）シアリルトランスフェラーゼ）
シアリルトランスフェラーゼは、本発明の組換え細胞および反応混合物において有用であるガラクトシルトランスフェラーゼの別の型である。組換えシアリルトランスフェラーゼを産生する細胞はまた、ＣＭＰ−シアル酸を産生し、これはシアリルトランスフェラーゼについてのシアル酸ドナーである。本発明における使用に適切であるシアリルトランスフェラーゼの例としては、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ（例えば、ラットまたはヒトのＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ  Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ  Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ  ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩ、およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  ＩＩＩ（本明細書中で用いられるシアリルトランスフェラーゼ命名法は、Ｔｓｕｊｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖ（１９９６））に記載されるような方法である）が挙げられる。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．６）といわれる例示的α（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、シアル酸を、Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃ二糖またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌへと転移する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１０１１（１９９２）を参照のこと。別の例示的α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．４．９９．４）は、シアル酸を、二糖またはグリコシドの非還元末端Ｇａｌへ転移する。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１００４（１９９２）を参照のこと。さらなる例示的酵素としては、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ  α−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４））が挙げられる。
【０１３５】
好ましくは、糖ペプチドの糖質のグリコシル化について、シアリルトランスフェラーゼは、配列Ｇａｌβ１，４ＧｌｕＮＡｃ−（完全にシアリル化された糖質構造上で末端シアル酸の下にある最も一般的な最後から２番目の配列）にシアル酸を転移することができる（表２を参照のこと）。
【０１３６】
【表３】
2005535280.tif 000005
特許請求される方法において有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、ＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩであり、これは、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）ともまた称される。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃグリコシドまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアリル酸への転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９９１）を参照のこと）、そして糖ペプチドにおけるアスパラギンに結合したオリゴ糖のシアリル化の原因である。シアル酸は、これら２つの糖の間でのα−結合の形成によりＧａｌに結合する。これらの糖の間の結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）（結合（ｌｉｎｋａｇｅ））は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位との間である。この特定の酵素は、ラット肝臓（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２））；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７；ＫｉｔａｇａｗａおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１）から単離され得、そしてゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１−９３８）ＤＮＡ配列が既知であり、組換え発現によるこの酵素の産生を容易にしている。好ましい実施形態において、特許請求されるシアリル化方法は、ラットＳＴ３Ｇａｌ  ＩＩＩを使用する。
【０１３７】
本発明において使用される他の例示的なシアリルトランスフェラーゼとしては、α（２，３）を含むＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉから単離されるシアリルトランスゲラーゼが挙げられる。Ｗ０９９／４９０５１を参照のこと。
【０１３８】
表４に列挙されるものを含む、他のシアリルトランスフェラーゼはまた、商業上重要な糖ペプチドのシアリル化のための経済的かつ効率大規模のプロセスに有用である。これらの他の酵素の有用性を見出すための簡便な試験として、種々の量の各々の酵素（タンパク質１ｍｇあたり１〜１００ｍＵ）を、ウシＳＴ６ＧａｌＩ，ＳＴ３ＧａｌＩＩＩのシアリルトランスフェラーゼまたはその両方のシアリルトランスフェラーゼのいずれかに関連する糖ペプチドをシアリル化する、目的のシアリルトランスフェラーゼの能力を比較するためにアシアロ−α１ＡＧＰ（１〜１０ｍｇ／ｍｌ）と反応させる。あるいは、他の糖ペプチドもしくは糖ペプチドまたはペプチド骨格から酵素的に解放されたＮ結合オリゴサッカリドは、この評価に対するアシアロ−α１ＡＧＰの代わりに使用され得る。ＳＴ６ＧａｌＩより効率的に糖ペプチドのＮ結合オリゴサッカリドをシアリル化する能力を有するシアリルトランスフェラーゼは、（この開示におけるＳＴ３ＧａｌＩＩＩについての説明として）ペプチドシアリル化についての実際の大規模のプロセスにおいて有用である。
【０１３９】
（ｄ．他のグリコシルトランスフェラーゼ）
当業者は、他のグリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼについて詳細に記載されたのと類似のトランスフェラーゼサイクルに置換され得ることを理解する。特に、グリコシルトランスフェラーゼはまた、例えば、グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９７７（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１（１９９４））である。
【０１４０】
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼはまた、本発明を実施する際に有用である。適切なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ，β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））およびポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））。適切なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとしては、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１，Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ  １７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＩＶおよびＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））、Ｏ−連結Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３２６（１９９２））Ｎ−アセチルグルコサミンサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：９８５（１９９２））およびヒアルロナンシンターゼが挙げられる。
【０１４１】
マンノシルトランスフェラーゼは、改変されたマンノースの一部を転移するのに有用である。適切なマンノシルトランスフェラーゼとしては、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，６）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈｌおよびＰｍｔｌが挙げられる（Ｋｏｒｎｆｅｌｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６６４（１９８５）を参照のこと）。
【０１４２】
キシロシルトランスフェラーゼはまた、本発明において有用である。例えば、Ｒｏｄｇｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８８：８１７−８２２（１９９２）；およびＥｌｂａｉｎら、米国特許第６，１６８，９３７号を参照のこと。
【０１４３】
他の適切なグリコシルトランスフェラーゼサイクルは、ＩｃｈｉｋａｗａらＪＡＣＳ  １１４:９２８３(１９９２）、ＷｏｎｇらＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７:４３４３(１９９２）、およびＩｃｈｉｋａｗａらＩｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｙａｌｔａｍｉ編（ＡＴＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）に記載されている。
【０１４４】
原核生物のグリコシルトランスフェラーゼはまた、本発明の実施において有用である。このようなグリコシルトランスフェラーゼには、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素が挙げられ、この酵素は、多くのグラム陰性細菌によって産生される。このＬＯＳは、代表的に、ヒトの上皮細胞の表面上または宿主分泌物中に見出された複合糖質を模倣する末端グリカン配列を有する（Ｐｒｅｓｔｏｎら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２３（３）：１３９−１８０（１９９６））。このような酵素には、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような種のｒｆａオペロンのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素には、β１，６ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＭＢＬ登録番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（Ｅ．ｃｏｌｉ）；ＥＭＢＬ登録番号Ｓ５６３６１（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を参照のこと）、グルコシルトランスフェラーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２５７４０（Ｅ．ｃｏｌｉ））、β１，２−グルコシルトラスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２７１２９（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１９８１７（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、ならびにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬ登録番号Ｕ０００３９（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。アミノ酸配列が公知である他のグリコシルトランスフェラーゼは、ｒｆａＢ（これは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｓｕｍのような生物体において特徴づけされている）のようなオペロン、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのｒｈｌオペロンによってコードされる配列を含む。
【０１４５】
また、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ）、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース、およびＰｋ血液群三糖の配列、Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコースを含む構造物を産生することに関与するグリコシルトランスフェラーゼは、本発明において使用するために適切であり、これらは、粘膜病原体Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｈｏｅａｅおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＬＯＳにおいて同定されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２３６−２４３（１９９４））。これらの構造物の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードするＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の遺伝子は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫型Ｌ３およびＬ１より同定されている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：７２９−７４０（１９９５））およびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ変異体Ｆ６２（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１−２１９０（１９９４））。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて、３種の遺伝子（ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢおよびｌｇＥ）からなる遺伝子座は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖中の最後の３つの糖の付加に必要とされるグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６−７３（１９９６））。最近、ｌｇｔＢ遺伝子産物およびｌｇｔＡ遺伝子産物の酵素活性が実証され、これらは、これらの提唱されたグリコシルトランスフェラーゼ機能について第１の直接的な証拠を提供する（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１−２７６（１９９６））。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて、２種のさらなる遺伝子が存在し、ｌｇｔＤは、β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃをラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造体の末端ガラクトースの３位に付加し、そしてｌｇｔＣは、末端α−Ｄ−Ｇａｌを短縮型ＬＯＳのラクトース要素に付加し、これによりＰｋ血液群抗原構造物を形成する（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ（１９９４）前出）。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて、分離免疫型Ｌ１はまた、Ｐｋ血液群抗原を発現し、そしてｌｇｔＣ遺伝子を有することが示されている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら，（１９９５）前出）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａグリコシルトランスフェラーゼおよびその関連の遺伝子はまた、ＵＳＰＮ５，５４５，５５３（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ）に記載されている。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来のα１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子もまた、特徴づけされている（Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１３４９−２１３５６（１９９７））。本発明において使用される遺伝子もまた、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉのグリコシルトランスフェラーゼである（例えば、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／−ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ＿４２．ｈｔｍｌを参照のこと）
（２  スルホトランスフェラーゼ）
本発明はまた、硫酸化分子を含むペプチドを産生するための方法を提供し、この硫酸化分子としては、例えば、硫酸化ポリサッカリド（例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、カラゲーナン（ｃａｒｒａｇｅｎｅｎ）、および関連化合物）が挙げられる。適切なスルホトランスフェラーゼとしては、例えば、コンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（Ｆｕｋｕｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８５７５−１８５８０（１９９５）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ４９９１５に記載のニワトリｃＤＮＡ）、グリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（Ｄｉｘｏｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２６：２３９−２４１（１９９５）；ＵＬ１８９１８）、およびグリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（Ｏｒｅｌｌａｎａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２７０−２２７６（１９９４）およびＥｒｉｋｓｓｏｎらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４３８−１０４４３（１９９４）に記載のマウスのｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２３０４に記載のヒトｃＤＮＡ）が挙げられる。
【０１４６】
（３．細胞結合グリコシルトランスフェラーゼ）
別の実施形態において、本発明の方法において利用される酵素は、細胞結合グリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶グリコシルトランスフェラーゼが、公知である（例えば、米国特許第５，０３２，５１９号を参照のこと）が、グリコシルトランスフェラーゼは、一般的に、細胞と会合する場合、膜結合形態にある。これまで研究された多くの膜結合酵素は、固有のタンパク質であると考えられる；すなわち、それらは、超音波破砕によって膜からは放出されず、そして揮発のために界面活性剤を必要とする。表面グリコシルトランスフェラーゼは、椎骨細胞および椎骨間細胞の表面上で同定されており、これらの表面トランスフェラーゼが、生理学的条件下で触媒活性を維持することも認識されている。しかし、細胞表面グリコシルトランスフェラーゼの機能についてより認識されているのは、細胞間認識についてである（Ｒｏｔｈ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ  ｔｏ  ＳＵＰＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＨＥＮＯＭＥＮＡ，１９９０）。
【０１４７】
細胞によって発現されるグリコシルトランスフェラーゼを変更するための方法が、開発されている。例えば、Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７〜８２３１（１９８９）は、細胞表面オリゴサッカリド構造体およびそれらの同族グリコシルトランスフェラーゼの発現を決定するクローン化ｃＤＮＡ配列を単離するための遺伝的アプローチを報告する。ＵＤＰ−ガラクトース：β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現するための、公知のネズミ細胞株から単離されたｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリを、ＣＯＳ−１細胞中にトランスフェクトした。次いで、このトランスフェクトされた細胞を培養し、そしてα１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。
【０１４８】
Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２７１３〜２７１７（１９９２）は、β−ラクタマーゼをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの外側表面に係留する方法を開示する。（ｉ）外側膜タンパク質のシグナル配列、（ｉｉ）外側膜タンパク質の膜貫通セクション、および（ｉｉｉ）完全成熟β−ラクタマーゼ配列からなる三分節系融合が、生成され、活性な表面結合β−ラクタマーゼ分子が生じる。しかし、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏの方法は、原核細胞系にのみ限定されており、そして著者らによって認識されるように、適切な機能化について完全な三分節系融合を必要とする。
【０１４９】
（４．融合タンパク質）
他の例示的な実施形態において、本発明の方法は、所望の糖ペプチド結合体の合成に関与する１つより多い酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば、アクセサリー酵素の触媒的に活性なドメインに結合するグリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性なドメインからなり得る。アクセサリー酵素触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼについてのドナーであるヌクレオチド糖の形成工程を触媒し得るか、またはグリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与する反応を触媒し得る。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド糖合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドにインフレームで結合され得る。次いで、生じた融合タンパク質は、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、糖部分のアクセプター分子への輸送も触媒し得る。融合タンパク質は、１つの発現可能なヌクレオチド配列中に結合された２つ以上のサイクル酵素であり得る。他の実施形態において、この融合タンパク質は、２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒的に活性なドメインを含む。例えば、米国特許第５，６４１，６６８号を参照のこと。本発明の改変された糖ペプチドは、種々の適切な融合タンパク質を利用して、容易に設計および製造され得る（例えば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０、これは、１９９９年６月２４日にＷＯ９９／３１２２４として公開された）。
【０１５０】
（タンパク質のリモデリングおよび精製）
本明細書に示される方法は、（例えば、発現された場合に）粗製形態、部分的に精製されたか、または完全に精製されたペプチドおよび糖ペプチドに対して、任意の有用な順序で実施され得る。例えば、１つの実施形態において、ペプチドまたは糖ペプチドは、本発明の方法を使用して、発現され、精製され、リモデリングされ、そして実質的に精製される。別の例示的な実施形態において、ペプチドまたは糖ペプチドは発現され、そして粗製形態で単離される。粗製物質は、本発明の方法を使用してリモデリングされ、そしてリモデリングされたペプチドまたは糖ペプチドは、精製される。なお別の例示的な実施形態において、発現されたペプチドまたは糖ペプチドは、部分的に精製され、例えば、リモデリングおよび実質的に精製された細胞破片を除去する。これらのスキームに対する他のバリエーションは、当業者に対して明らかであり、そしてそれらは、本発明の範囲内にある。
【０１５１】
（ペプチド結合体およびオリゴサッカリドの精製）
（ａ．オリゴサッカリド精製）
上記のプロセスによって精製される試薬であるオリゴサッカリドは、精製することなく使用され得る。しかし、精製は、産物を回収するのに通常は好ましい。グリコシル化されたサッカリドの回収のための標準的な周知の技術（例えば、薄層クロマトグラフィー、厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜濾過）が、使用され得る。膜濾過の使用が好ましく、より好ましくは、逆浸透圧膜の利用、または本明細書の以降に議論され、そして本明細書に引用される文献において議論されるような回収のための１つ以上のカラムクロマトグラフィー技術が、好ましい。例えば、膜が、約３０００〜約１０，０００に区切られた分子量を有する膜濾過を使用して、タンパク質（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）を除去し得る。次いで、ナノ濾過または逆浸透圧を使用して、塩を除去し、そして／または産物のサッカリドを精製し得る（例えば、ＷＯ９８／１５５８１を参照のこと）。ナノ濾過膜は、使用される膜に依存して、一価の塩は、通過するが、多価塩および約１００〜約４，０００ダルトンよりも大きい非荷電溶解物を保持する逆浸透圧膜の分類に入る。従って、代表的な適用において、本発明の方法により調製されたサッカリドは、膜に保持され、汚染塩は、通過する。さらなる精製技術としては、再結晶、クロマトグラフィー（シリカ、逆相、イオン交換）および沈殿が挙げられる。
【０１５２】
（ｂ．タンパク質（糖タンパク質）精製）
改変された糖ペプチドが、細胞内で精製される場合、第１の工程として、粒状破片（宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される；必要に応じて、タンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮され得、その後、以下から選択される１つ以上の工程によって、他の不純物からポリペプチド改変体を分離し得る：免疫アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換カラム画分化（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）上でか、またはカルボキシル基もしくはスルホプロピル基を含むマトリックス上で）、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ  Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＷＧＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｃｏｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｅｔｈｅｒ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、またはプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上でのクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基が添加されたシリカゲル）、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ分子ふるいを使用するゲル濾過あるいはサイズ排除クロマトグラフィー、ポリペプチドに選択的に結合するカラム上でのクロマトグラフィー、およびエタノール沈殿または硫酸アンモニウム沈殿。
【０１５３】
培養物において産生される改変された糖ペプチドは、細胞、酵素などからの初期抽出、その後の、１つ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換クロマトグラフィー、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程によって通常単離される。さらに、改変された糖ペプチドは、アフィニティクロマトグラフィーによって精製され得る。最後に、ＨＰＬＣが、最終精製工程に使用され得る。
【０１５４】
プロテアーゼインヒビター（例えば、メチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））は、前出の任意の工程に含まれ、タンパク質分解を阻害し得、そして抗生物質が含まれて、外来性汚染物質の発生を予防し得る。
【０１５５】
別の実施形態内で、本発明の改変された糖ペプチドを産生する系からの上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して、初めに濃縮される。濃縮工程後、濃縮物は、適切な精製マトリックスに付与され得る。例えば、適切な親和性マトリックスは、ペプチドに対するリガンド、適切な支持体に結合されたレクチンまたは抗体分子を含み得る。あるいは、アニオン交換樹脂（例えば、ペンダントＤＥＡＥ基を有するマトリックスまたは基材）が、使用され得る。適切なマトリックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製の際に一般的に使用される他の型が挙げられる。あるいは、カチオン交換工程が、使用され得る。適切なカチオン交換としては、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。スルホプロピル基が、特に好ましい。
【０１５６】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１つ以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ポリペプチド改変体組成物をさらに精製し得る。前述の精製工程の幾つかまたは全部を、種々の組み合わせで使用して、均質な改変された糖ペプチドもまた提供し得る。
【０１５７】
大規模発酵から得られる本発明の改変された糖ペプチドは、Ｕｒｄａｌら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１（１９８４）によって開示される方法と類似の方法によって精製され得る。この参考文献は、分取ＨＰＬＣカラム上での組換えヒトＩＬ−２の精製について、２つの連続したＲＰ−ＨＰＬＣ工程を記載する。あるいは、アフィニティクロマトグラフィーのような技術を利用して、改変された糖ペプチドを精製し得る。これらとしては、抗体、補因子、基質または目的のタンパク質に選択的に結合する低分子因子を使用する方法が挙げられる。
【０１５８】
親和性タグは、変異体エンドグリカナーゼ上に取り込まれ得、反応混合物からの簡単な除去を可能にする。
【０１５９】
（組成物）
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって調製された糖ペプチドの組成物を提供する。本発明の方法を使用して、糖ペプチド上の特定のグリコシル残基を実質的に完全にリモデリングすることが可能である。従って、例示的な実施形態において、本発明は、糖ペプチド上の選択されたアクセプター部分の少なくとも約８０％の集団が、変異エンドグリカナーゼによって添加されるグリコシル残基でグルコシル化される糖ペプチドを提供する。
【０１６０】
多くの反応形式（例えば、固相および溶液方法論）が、それら自体を提案する。例示的な実施形態において、本発明の方法は、固体支持体に結合された糖ペプチドを産生するために使用される。
【０１６１】
本発明の糖ペプチドのアミノ酸配列は、全長であり得るか、または短縮であり得るかのいずれかである。例示的なタンパク質としては、インターフェロンβ、インターフェロンω、エンブレル（ｅｎｂｒｅｌ）、ＥＰＯ、ＮＥＳＰ、ＦＳＨ、および血液因子（ＶＩＩａ、ＩＸ、ＶＩＩＩ）が挙げられる。
【０１６２】
（薬学的処方物）
本発明の方法によって作製される化合物は、次いで、種々の用途において（例えば、抗原として、診断試薬として、または治療剤として）使用され得る。従って、本発明はまた、種々の状態の処置において使用され得る薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、上記の方法に従って作製された糖ペプチドから構成される。
【０１６３】
本発明の薬学的組成物は、種々の薬物送達系において使用するのに適切である。本発明において使用するために適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）において見出される。薬物送達のための方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと。
【０１６４】
薬学的組成物は、任意の投与に適切な様式（例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与を含む）のために処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）のために、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与のために、上記キャリアのいずれかまたは固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム）が、使用され得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテート  ポリグリコレート）はまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９号に開示される。
【０１６５】
一般に、薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈内的にまたは皮下的に）投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、生理食塩水、ＰＢＳなど））に溶解または懸濁された化合物を含む、非経口投与のための組成物を提供する。組成物は、生理学的条件に近付けるために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、張度調節剤、湿潤剤、界面活性剤など）を含み得る。例示的な緩衝液としては、ホスフェート、ヒスチジン、グリシンおよびこれらの組合せが挙げられ、これはまた、賦形剤（例えば、糖（すなわち、トレハロース、マンノース、スクロース、グルコース、ガラクトースおよびシアル酸））、塩（すなわち、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マグネシウム塩、カルシウム塩）、タンパク質（すなわち、アルブミン）、界面活性剤（すなわち、ポリソルベート８０）および保存剤（すなわち、安息香酸ナトリウム）を含み得る。
【０１６６】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、そのままの使用のためにパッケージングされ得るか、または凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌水性キャリアと組み合わされる。この調製物のｐＨは、代表的に、３と１１との間、より好ましくは、５〜９、そして最も好ましくは、７〜８である。いくつかの実施形態において、本発明の糖ペプチドは、標準的なベシクル形成脂質から形成されるリポソームに組み込まれ得る。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号および同第４，８３７，０２８号に記載されるような、様々な方法が、リポソームを調製するために利用可能である。様々な標的化剤（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を使用するリポソームの標的化は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，００４号を参照のこと）。
【０１６７】
標的薬剤をリポソームに結合するための標準的な方法が使用され得る。これらの方法は、一般的に、ホスファチジルエタノールアミンのような、脂質成分のリポソーム内への組み込むを含み、この脂質成分は、標的薬剤、または誘導体化親油性化合物（例えば、本発明の脂質誘導体化糖ペプチド）の結合のために活性化され得る。
【０１６８】
標的化機構は、一般的に、標的部分が、標的（例えば、細胞表面レセプター）との相互作用のために利用可能である様式で、リポソームの表面上に、標的薬剤が、位置付けられることを必要とする。本発明の糖質は、リポソームが当業者に公知の方法（例えば、長鎖アルキルハライドまたは脂肪酸をそれぞれ用いる、糖質上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）を使用して形成される前に、脂質分子に結合され得る。あるいは、リポソームは、コネクター部分が、最初に、膜を形成するときに膜内に組み込まれるような方法で形成され得る。コネクター部分は、膜内にしっかり埋め込まれ、そして係留される親油性部分を有しなければならない。このコネクター部分はまた、リポソームの水性表面上に化学的に利用可能な反応性部分を有しなければならない。反応性部分は、標的化剤または糖質（後に添加される）と安定な化学結合を形成するのに化学的に適するように、選択される。いくつかの場合において、標的薬剤をコネクター分子に直接結合することは可能であるが、大部分の場合において、化学的架橋として作用する第３の分子を使用し、従って、膜内にあるコネクター分子と標的薬剤または糖質（これは、ベシクル表面から三次元的に伸長される）と連結させることがより適切である。
【０１６９】
治療糖ペプチドの血液残留性（ｂｌｏｏｄ−ｒｅｓｉｄｅｎｃｙ）もまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて増強され得る。ＰＥＧを用いるタンパク質の化学的改変（ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ））は、それらの分子サイズおよび立体的障害（この両方が、タンパク質に結合したＰＥＧに依存する）を増加する。これは、血漿半減期の改善およびタンパク質分解安定性、ならびに免疫原性および肝臓取り込みの減少を生じる（Ｃｈａｆｆｅｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３−１６５１（１９９２）；Ｐｙａｔａｋら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３−１２７（１９８０））。インターロイキン−２のＰＥＧ化は、インビボでその抗腫瘍効力を増加することが報告されており（Ｋａｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７−１４９１（１９８７））、そしてモノクローナル抗体Ａ７由来のＦ（ａｂ’）２のＰＥＧ化は、その腫瘍局在化を改善した（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７−１３９４（１９９０））。
【０１７０】
糖ペプチドを含む組成物は、予防的処置および／または治療的処置のために投与され得る。治療適用において、組成物は、上記のように疾患に既に苦しむ患者に、その疾患およびその合併症の症状を治癒するかまたは少なくとも部分的に停止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効用量」として規定される。この使用に有効な量は、疾患の重篤度ならびに患者の体重および一般的な状態に依存するが、一般的に、７０ｋｇの患者に対して、１日当たり約０．５ｍｇ〜約２，０００ｍｇの糖ペプチドの範囲であり、１日当たり約５ｍｇ〜約２００ｍｇの化合物の投薬量が、より一般的に使用される。
【０１７１】
予防的適用において、本発明の糖ペプチドを含む組成物は、特定の疾患に感受性であるか、またはそうでなければこの疾患の危険にある患者に対して投与される。そのような量は、「予防的有効用量」と規定される。この使用において、正確な量は、再度患者の健康状態および体重に依存するが、一般的な範囲は、７０ｋｇの患者につき約０．５〜約１，０００ｍｇの範囲であり、より一般的には、体重７０ｋｇ当り約５ｍｇ〜約２００ｍｇである。
【０１７２】
組成物の単回投与または複数回投与が、処置する医者によって選択される用量レベルおよびパターンで実施され得る。任意の事象において、その薬学的処方物は、患者を効果的に処置するのに十分な量の本発明の糖ペプチドを提供すべきである。
【０１７３】
この糖ペプチドはまた、診断試薬としての使用を見出し得る。例えば、標識化化合物は、炎症を有すると疑われる患者において、炎症または腫瘍転移の領域を位置付けるために使用され得る。この使用のために、この化合物は、適切な放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１４Ｃまたはトリチウム）で標識され得る。
【０１７４】
本発明の糖ペプチドは、本発明の化合物と特異的に反応性のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のための免疫原として使用され得る。種々の免疫グロブリン分子の産生および操作のための当業者に利用可能な多数の技術が、本発明において使用され得る。抗体は、当業者に周知の種々の手段によって生成され得る。
【０１７５】
非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス、ウサギ、ウマなど）の産生は、周知であり、例えば、本発明の糖ペプチドを含む調製物を用いて動物を免疫することによって達成され得る。免疫された動物より得られる抗体産生細胞を、不死化してスクリーニングするか、または始めに所望の抗体の産生についてスクリーニングし、次いで不死化する。モノクローナル抗体産生の一般的な手順の議論については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。
【０１７６】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、本発明を限定するために提供されない。
【実施例】
【０１７７】
（実施例１）
（１．１  二触角−グリカン−Ｆの調製（図２．１））
卵タンパク質から単離された二触角−Ｎ結合グリカン（０．５ｇ）およびエンド−Ｆ３を、ピリジン（２０ｍＬ）およびＤＭＡＰ（０．１ｇ）を含有する溶液に添加する。この溶液を、０℃まで冷却し、無水酢酸（４００モルｅｑ）をゆっくりと添加する。反応物を、反応が完了する（ＴＬＣによって決定される）まで、４０℃まで加熱する。反応混合物を、乾燥状態まで濃縮し、酢酸エチルを添加し、残渣を溶解する。有機層を、水、飽和重炭酸ナトリウム／水、水で洗浄した。有機層を、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。濾過後、濾過物を、乾燥状態まで濃縮し、クロマトグラフィー（シリカ）を、残渣に対して実施する。適当な画分を回収し、濃縮し、そしてＮＭＲおよびＭＳによって特徴付ける。
【０１７８】
クロマトグラフィーを行った物質を、ピリジン中に溶解し、０℃まで冷却する。次いで、ピリジン−ＨＦ複合体の溶液を、溶液に加え、これを、添加完了後、８時間攪拌する。次いで、反応混合物を、０℃で飽和重炭酸ナトリウム溶液にゆっくりと添加し、水層のｐＨを、７．０より上に維持する。添加を完了する場合、水溶液を、酢酸エチルで２回抽出し、有機層を、水で洗浄し、そして乾燥する。濃縮によって固体が得られ、この固体をメタノール中に直ちに溶解する。メタノール中のナトリウムメトキシドを、溶液のｐＨが１４を超えるまで添加する。反応混合物を、ｐＨ１２を超える反応混合物のｐＨを維持しながら、４０℃で攪拌する。反応を完了する場合、溶液を、酢酸で中和し、溶液を乾燥状態まで濃縮する。クロマトグラフィー（シリカ）を、残渣に対して実施し、適当な画分を回収する。これらを、合わせ、濃縮し、物質の構造を、ＮＭＲおよびＭＳによって検証する。
【０１７９】
（１．２  四触角−グリカン−オキサザリンの調製（図２．２））
合成四触角−Ｎ結合グリカン（０．５ｇ）を、ピリジン（２０ｍＬ）およびＤＭＡＰ（０．１ｇ）の溶液に添加する。この溶液を、０℃まで冷却し、無水酢酸（４００モルｅｑ）をゆっくりと添加する。反応物を、反応が完了する（ＴＬＣによって決定される）まで、４０℃まで加熱する。反応混合物を、乾燥状態まで濃縮し、酢酸エチルを添加し、残渣を溶解する。有機層を、水、飽和重炭酸ナトリウム／水、水で洗浄する。有機層を分離し、そして乾燥する（Ｎａ２ＳＯ４）。濾過後、濾過物を、乾燥状態まで濃縮し、クロマトグラフィー（シリカ）を、残渣に対して実施する。適当な画分を回収し、濃縮し、そしてＮＭＲおよびＭＳによって特徴付ける。
【０１８０】
得られた固体を、ジクロロメタン中に溶解し、ＢＦ３を添加し、反応混合物を、室温で攪拌する。反応を完了する（ＴＬＣによる）と、反応混合物を、水／炭酸水素ナトリウムで洗浄し、乾燥する。次いで、混合物を濾過し、濾過物を濃縮する。
【０１８１】
次いで、残渣をメタノール中に溶解し、メタノール中のナトリウムメトキシドを、溶液のｐＨが１４を超えるまで添加する。反応混合物を、ｐＨ１２を超える反応混合物のｐＨを維持しながら、４０℃で攪拌する。反応が完了すると、溶液を、酢酸で中和し、乾燥状態まで濃縮する。次いで、クロマトグラフィー（シリカ）を、残渣に対して実施し、適当な画分を回収する。画分を、合わせ、濃縮し、そして、産物の構造を、ＮＭＲおよびＭＳによって検証する。
【０１８２】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみのためであり、それを考慮した種々の改変または変更が、当業者に示唆され、この種々の改変または変更は、本明細書の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的についてこれらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】図１は、エンドグリカナーゼによる、ＧｌｃＮＡｃ残基間のＮ結合型オリゴ糖のキトビオースコアの切断を示した絵である。
【図２】図２は、本発明の変異体エンドグリカナーゼを使用する糖類のアセンブリについての反応スキームである。
【図３】図３は、Ｅｎｄｏ−Ｈによる糖質部分の切断、この切断後の、本発明の変異体Ｅｎｄｏ−Ｆ３を使用する、ペプチド上に残存する残基への置換糖類単位の連結についての反応スキームである。
【図１】
2005535280.tif 000006
【図２】
2005535280.tif 000007
【図３】
2005535280.tif 000008
【国際調査報告】
2005535280.tif 000009
2005535280.tif 000010
2005535280.tif 000011