(57)【要約】本発明は概して、シトクロームＰ４５０発現および／または薬物輸送タンパク質を調節する受容体の安定性を改変する能力に基づいて、生体異物除去に作用するリガンドを同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物代謝酵素の活性に対する薬物リードの作用を決定する方法であって、
（ａ）シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変する薬物リードを提供するステップと、
（ｂ）前記薬物リードを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップとを含み、
前記薬物リードおよび前記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子の存在下における前記受容体の安定性のさらなる改変は、前記薬物リードが薬物代謝酵素の活性を増加させるかどうかを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記受容体の安定性を改変する薬物リードを提供するステップが、多様な異なる分子の１つまたは複数を、前記受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングするステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多様な異なる分子の１つまたは複数の前記スクリーニングステップが、
（ａ）シトクロームＰ４５０を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の分子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を処理して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体のアンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体のアンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記アンフォールディング曲線それぞれを、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）前記多様な分子の不在下における前記標的分子のアンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記多様な分子のいずれかが前記受容体の安定性を改変するかどうかを決定するステップとを含み、
前記アンフォールディング曲線における変化によって、安定性の改変が示されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記スクリーニングステップがさらに、
（ａ）前記薬物リードおよびシトクロームＰ４５０発現を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の前記補助調節因子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を処理して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体のアンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体のアンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記アンフォールディング曲線それぞれを、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）（１）前記薬物リードおよび／または（２）前記補助調節因子の不在下における前記受容体のアンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記薬物リードがさらに前記受容体の安定性を改変するかどうか決定するステップとを含み、
前記アンフォールディング曲線におけるさらなる変化によって、安定性のさらなる改変が示されることを特徴とする請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数の補助調節因子が、補助活性化因子および／または補助抑制因子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分子が補助活性化因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変し、それによって、前記リガンドを、補助活性化因子の存在下における前記受容体のアゴニストとして同定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分子が補助抑制因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変し、それによって、前記リガンドを、前記補助活性化因子の存在下における前記受容体の非アゴニストとして同定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
薬物代謝酵素の活性に対する薬物リードの作用を決定する方法であって、
（ａ）シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる薬物リードを提供するステップと、
（ｂ）前記薬物リードを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップとを含み、
前記薬物リードおよび前記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子存在下における前記受容体の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトは、前記薬物リードが薬物代謝酵素の活性を増加させるかどうかを示すことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる薬物リードを提供するステップが、多様な異なる分子の１つまたは複数を前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
多様な異なる分子の１つまたは複数の前記スクリーニングステップが、
（ａ）シトクロームＰ４５０を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の分子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を加熱して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体の熱アンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体の熱アンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記熱アンフォールディング曲線のそれぞれを、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）前記多様な分子の不在下における前記標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記多様な分子のいずれかが前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうかを決定するステップとを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記スクリーニングステップがさらに、
（ａ）前記薬物リードおよびシトクロームＰ４５０発現を調節する前記受容体を多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の前記補助調節因子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を加熱して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体の熱アンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体の熱アンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記熱アンフォールディング曲線のそれぞれを、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）（１）前記薬物リードおよび／または（２）前記補助調節因子の不在下における前記受容体の熱アンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記薬物リードが前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせるかどうかを決定するステップとを含むことを特徴とする請求項１０または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の補助調節因子が、補助活性化因子および／または補助抑制因子を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記分子が、補助活性化因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変し、それによって、前記リガンドを、前記補助活性化因子の存在下における前記受容体のアゴニストとして同定することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分子が補助抑制因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変し、それによって、前記リガンドを、前記補助活性化因子の存在下における前記受容体の非アゴニストとして同定することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記非アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
異物代謝のアゴニストを同定する方法であって、
分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変し、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップを含み、
前記受容体の安定性を改変し、かつ補助活性化因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変する分子を、異物代謝のアゴニストとして同定することを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記スクリーニングステップがさらに、
（ａ）前記分子およびシトクロームＰ４５０発現を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の前記補助活性化因子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を処理して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体のアンフォールディングに関係する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体のアンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記アンフォールディング曲線それぞれを、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）（１）前記分子および／または（２）前記補助活性化因子の不在下における前記受容体のアンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記分子が前記受容体の安定性をさらに改変するかどうかを決定するステップとを含み、
前記アンフォールディング曲線におけるさらなる変化によって、安定性におけるさらなる改変が示されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
異物代謝のアゴニストを同定する方法であって、分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下で前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含み、
前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ補助活性化因子の存在下で前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる分子を、異物代謝のアゴニストとして同定することを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記スクリーニングステップがさらに、
（ａ）前記分子およびシトクロームＰ４５０発現を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の前記補助活性化因子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を加熱して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体の熱アンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体の熱アンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記熱アンフォールディング曲線のそれぞれを、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）（１）前記分子および／または（２）前記補助活性化因子の不在下における前記受容体の熱アンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記分子が前記受容体の安定性をさらに改変するかどうか決定するステップとを含み、
安定性におけるさらなる改変が、前記アンフォールディング曲線におけるさらなる変化によって示されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
異物代謝の非アゴニストを同定する方法であって、分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングするステップを含み、前記受容体の安定性を改変しない分子を異物代謝の非アゴニストとして同定することを特徴とする方法。
【請求項２６】
前記スクリーニングステップが、
（ａ）シトクロームＰ４５０を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の分子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を処理して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体のアンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体のアンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記アンフォールディング曲線それぞれを、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）前記多様な分子の不在下における前記標的分子のアンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記分子が前記受容体の安定性を改変するかどうか決定するステップとを含み、
安定性における改変が、前記アンフォールディング曲線におけるさらなる変化によって示されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
異物代謝の非アゴニストを同定する方法であって、分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含み、前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせない分子を、異物代謝の非アゴニストとして同定することを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記スクリーニングステップが、
（ａ）シトクロームＰ４５０を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の分子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を加熱して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体の熱アンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体の熱アンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記熱アンフォールディング曲線のそれぞれを、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）前記多様な分子の不在下における前記標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記分子が前記受容体の熱アンフォールディング曲線を改変するかどうかを決定するステップとを含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
異物代謝の非アゴニストを同定する方法であって、
（ａ）多様な分子の１つまたは複数を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングし、前記受容体の安定性を改変しない分子を異物代謝の非アゴニストとして同定するステップと、
（ｂ）前記受容体の安定性を改変するステップ（ａ）からの分子を、１つまたは複数の補助抑制因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングし、補助抑制因子存在下で前記受容体の安定性をさらに改変する分子を、異物代謝の非アゴニストとして同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
異物代謝の非アゴニストを同定する方法であって、
（ａ）多様な分子の１つまたは複数を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングし、前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせない分子を異物代謝の非アゴニストとして同定するステップと、
（ｂ）前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるステップ（ａ）からの分子を、１つまたは複数の補助抑制因子の存在下で前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングし、補助抑制因子存在下で前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる分子を、異物代謝の非アゴニストとして同定するステップとを含む方法。
【請求項３１】
前記スクリーニングステップ（ｂ）がさらに、
（ａ）前記分子およびシトクロームＰ４５０発現を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の前記補助活性化因子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を処理して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体のアンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体のアンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記アンフォールディング曲線それぞれを、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）（１）前記分子および／または（２）前記補助活性化因子の不在下における前記受容体のアンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記分子が前記受容体の安定性をさらに改変するかどうか決定するステップとを含み、前記アンフォールディング曲線におけるさらなる変化によって、安定性のさらなる改変が示されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記非アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
薬物クリアランスのアゴニストを同定する方法であって、分子を、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の安定性を改変し、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップを含み、前記受容体の安定性を改変し、かつ補助活性化因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変する分子が、薬物クリアランスのアゴニストとして同定されることを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記スクリーニングステップがさらに、
（ａ）前記分子およびシトクロームＰ４５０発現を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の前記補助活性化因子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を処理して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体のアンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体のアンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記アンフォールディング曲線それぞれを、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）（１）前記分子および／または（２）前記補助活性化因子の不在下における前記受容体のアンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記分子が前記受容体の安定性をさらに改変するかどうかを決定するステップとを含み、
前記アンフォールディング曲線におけるさらなる変化によって、安定性のさらなる改変が示されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
薬物クリアランスのアゴニストを同定する方法であって、分子を、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下において前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含み、前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ補助活性化因子の存在下で前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる分子が、薬物クリアランスのアゴニストとして同定されることを特徴とする方法。
【請求項３７】
前記スクリーニングステップ（ｂ）がさらに、
（ａ）前記分子およびシトクロームＰ４５０発現を調節する前記受容体を多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の前記補助活性化因子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を加熱して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体の熱アンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体の熱アンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記熱アンフォールディング曲線のそれぞれを、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）（１）前記分子および／または（２）前記補助活性化因子の不在下における前記受容体の熱アンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記分子が前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうかを決定するステップと、を含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
薬物排出活性に対する薬物リードの作用を決定する方法であって、
薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の安定性を改変する薬物リードを提供するステップと、前記薬物リードを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップとを含み、
前記薬物リードおよび前記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子の存在下における、前記受容体の安定性のさらなる改変は、前記薬物リードが薬物排出活性を増加させるかどうかを示すことを特徴とする方法。
【請求項４０】
前記受容体の安定性を改変する薬物リードを提供するステップが、多様な異なる分子の１つまたは複数を、前記受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングするステップを含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
多様な異なる分子の１つまたは複数の前記スクリーニングステップが、
（ａ）シトクロームＰ４５０を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の分子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を処理して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体のアンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体のアンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記アンフォールディング曲線それぞれを、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）前記多様な分子のいずれも存在しない場合の前記標的分子のアンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記多様な分子のいずれかが前記受容体の安定性を改変するかどうか決定するステップとを含み、
前記アンフォールディング曲線における変化によって、安定性の改変が示されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記スクリーニングステップがさらに、
（ａ）前記薬物リードおよびシトクロームＰ４５０発現を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の前記補助調節因子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を処理して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体のアンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体のアンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記アンフォールディング曲線それぞれを、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）（１）前記薬物リード、および／または（２）前記補助調節因子の不在下における前記受容体のアンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記薬物リードがさらに前記受容体の安定性を改変するかどうかを決定するステップとを含み、
前記アンフォールディング曲線におけるさらなる変化によって、安定性のさらなる改変が示されることを特徴とする請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つまたは複数の補助調節因子が、補助活性化因子および／または補助抑制因子を含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記分子が補助活性化因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変し、それによって、前記リガンドを、前記補助活性化因子の存在下における前記受容体のアゴニストとして同定することを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記分子が補助抑制因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変し、それによって、前記リガンドを、前記補助活性化因子の存在下における前記受容体の非アゴニストとして同定することを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記非アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
薬物排出活性に対する薬物リードの作用を決定する方法であって、
（ａ）薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる薬物リードを提供するステップと、
（ｂ）前記薬物リードを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップとを含み、
前記薬物リードおよび前記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子存在下における前記受容体の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトは、前記薬物リードが薬物排出活性を増加させるかどうかを示すことを特徴とする方法。
【請求項４９】
前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる薬物リードを提供するステップが、多様な異なる分子の１つまたは複数を、前記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含むことを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
多様な異なる分子の１つまたは複数の前記スクリーニングステップが、
（ａ）シトクロームＰ４５０を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の分子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を加熱して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体の熱アンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体の熱アンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記熱アンフォールディング曲線のそれぞれを、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）前記多様な分子のいずれも存在しない場合の前記標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記多様な分子のいずれかが前記熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうかを決定するステップとを含むことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記スクリーニングステップがさらに、
（ａ）前記薬物リードおよびシトクロームＰ４５０発現を調節する前記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の前記補助調節因子と接触させるステップと、
（ｂ）前記多様なコンテナのそれぞれの中にある前記受容体を加熱して、前記受容体をアンフォールディングさせるステップと、
（ｃ）前記コンテナのそれぞれにおいて、前記受容体の熱アンフォールディングに関連する物理的変化を測定するステップと、
（ｄ）前記コンテナのそれぞれについて、前記受容体の熱アンフォールディング曲線を作成するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における前記熱アンフォールディング曲線のそれぞれを、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または
（ｉｉ）（１）前記薬物リードおよび／または（２）前記補助調節因子の不在下における前記受容体の熱アンフォールディング曲線と比較するステップと、
（ｆ）前記薬物リードがさらに前記受容体の安定性を改変するかどうかを決定するステップとを含み、前記アンフォールディング曲線におけるさらなる変化によって、安定性のさらなる改変が示されることを特徴とする請求項４８または請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
１つまたは複数の補助調節因子が補助活性化因子および／または補助抑制因子を含むことを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記分子が補助活性化因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変し、それによって、前記リガンドを、前記補助活性化因子の存在下における前記受容体のアゴニストとして同定することを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記分子が補助抑制因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変し、それによって、前記リガンドを、前記補助活性化因子の存在下における前記受容体の非アゴニストとして同定することを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記非アゴニストが部分的アゴニストであることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記受容体がＳＸＲまたはＰＸＲであることを特徴とする請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記受容体がＡｈ、ＸＲＥ、ＣＡＲ、またはＰＰＡＲ−αであることを特徴とする請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
異物代謝および／または薬物クリアランスに対する分子の作用を決定する方法であって、分子を、ＳＸＲ受容体の安定性を改変し、かつ１つまたは複数の補助調節因子の存在下で前記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップを含み、前記分子および前記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子存在下における前記受容体の安定性のさらなる改変は、前記分子が異物代謝および／または薬物クリアランスのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを示すことを特徴とする方法。
【請求項６０】
異物代謝および／または薬物クリアランスに対する分子の作用を決定する方法であって、分子を、ＳＸＲ受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ１つまたは複数の補助調節因子の存在下で前記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含み、前記分子および前記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子存在下における、前記受容体の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトは、前記分子が異物代謝および／または薬物クリアランスのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを示すことを特徴とする方法。
【請求項６１】
前記補助調節因子が、補助活性化因子および／または補助抑制因子であることを特徴とする請求項１から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
補助調節因子依存性受容体のアゴニストが、強い誘導物質であることを特徴とする請求項１から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記強い誘導物質が、１１−α−ヒドロキシプロゲステロンであることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記強い誘導物質が、約５μＭ未満の結合親和性および約０．８から約１．０のアゴニスト状態の統計的な確率を有することを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
補助調節因子依存性受容体の部分的アゴニストが、弱い誘導物質であることを特徴とする請求項１から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記弱い誘導物質が、約５μＭ未満の結合親和性および約０．４から約０．８のアゴニスト状態の統計的な確率を有することを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記弱い誘導物質が、少なくとも約５μＭの結合親和性および約０．４から約１．０のアゴニスト状態の統計的な確率を有することを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
補助調節因子依存性受容体のアンタゴニストが、非誘導物質であることを特徴とする請求項１から６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記非誘導物質が、約５μＭ未満の結合親和性および約０．４未満のアゴニスト状態の統計的な確率を有することを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記非誘導物質が、少なくとも約５μＭの結合親和性および約０．４未満のアゴニスト状態の統計的な確率を有することを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、シトクロームＰ４５０発現および／または薬物輸送タンパク質を調節する受容体の安定性を改変する能力に基づいて、生体異物除去に作用するリガンドを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００２年７月２４日出願の米国仮出願第６０／３９８，０２３号明細書、ならびに第６０／４１３，８６６号明細書および第６０／４１３，８４３号明細書（ともに２００２年９月２７日出願）に対して優先権の利益を主張する。そして、それらは参照によって本明細書にそのまま援用される。
【０００３】
多くの薬物は、オキシドレダクターゼのシトクロームＰ４５０ファミリーによって代謝される。これらの酵素の発現は、核受容体などの受容体によって一部調節される。
【０００４】
薬物またはステロイド代謝産物のような生体異物は、関連する受容体によって、相互作用を通してシトクロームＰ４５０酵素の発現を変化させることができる。例えば、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲまたはＳＸＲ）は、生体異物の解毒と除去に関与しているシトクロームＰ４５０ＣＹＰ３Ａ４モノオキシゲナーゼおよび他の遺伝子の転写を刺激することが報告されており（非特許文献１）、アリール炭化水素受容体（ＡｈまたはＸＲＥ）は、タバコ喫煙やバーベキューした食物に含まれる誘導物質からＰ４５０のＣＹＰＩＡとＣＹＰｌＢファミリーを活性化させることが報告された。構成性アンドロスタン受容体（ＣＡＲ：ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、生体異物誘導物質によってＰ４５０のＣＹＰ２ＡおよびＣＹＰ２Ｂファミリーを活性化し、ＰＰＡＲアルファは、抗リピジミドフィブラート（ａｎｔｉ−ｌｉｐｉｄｉｍｉｄ  ｆｉｂｒａｔｅｓ）の指定されたクラス（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｃｌａｓｓ）によって、Ｐ４５０のＣＹＰ４Ａファミリーを活性化することが報告されている。例えば、非特許文献２、および中で引用されている参考文献を参照のこと。
【０００５】
薬物はまた、薬物クリアランスまたは身体からの排出を調節するタンパク質の発現を変化させることもできる。例えば、ステロイドおよび生体異物受容体（ＳＸＲ）は、プレグナンＸ受容体（ＳＸＲ）としても知られるが、タンパク質Ｐ糖タンパク質（ＡＢＣＢ１）をコードする遺伝子ＭＤＲ１の発現を活性化することによって薬物排出を調節することが報告されている（非特許文献３、およびその中で引用された参考文献、非特許文献４）。
【０００６】
このように、薬物は、薬物の活性を制限するか、または他の薬物の代謝を変化させる代謝酵素の発現を変化させることができ、望ましくない危険な薬物−薬物相互作用を創り出す。さらに、生体異物の有効性は、薬物排出経路の発現活性化によって制限することができる。遺伝子調節における種差のため、現在、異物代謝酵素または薬物クリアランスに作用するタンパク質の発現レベルに対する作用を予測するのは困難である。
【０００７】
核受容体は、生殖、成長分化、細胞機能（脂質および糖ホメオスタシスを含む）を制御する転写因子のスーパーファミリーのメンバーである。それらの機能は、リガンドの多様なセット（生体異物、ホルモン、脂質および他の既知のおよび未発見のリガンド）によって調節される。現在まで、４８の核受容体が同定されており、２８が既知のリガンドであり、残りのリガンドはオーファンとして分類されている。上記受容体の生物学は、複雑で組織特異的（非特許文献５）であり、分子的作用メカニズムは、これらの受容体の機能をリガンド非依存的または依存的に調節する補助タンパク質（補助調節因子という）の優先的補充機能であるように見える。適切な補助調節因子の補充は、遺伝子転写または抑制を引き起こすことができる。
【０００８】
シグナル伝達および遺伝子発現における中心的テーマは、タンパク質−タンパク質モジュラードメインの構成的相互作用または誘導性相互作用である。これらの相互作用を可能にするリガンドの知識は、生物学的事象の基礎となる分子メカニズムの性質に関する情報、および疾患治療のための治療的アプローチの開発に関する情報を提供する。リガンドを同定する既存の方法は扱いにくく、特に機能が知られていないタンパク質の場合は限定的である。
【０００９】
Ｐａｎｖｅｒａ社は、エストロゲン受容体サブタイプベータに対するアゴニストリガンドとアンタゴニストリガンドを区別するための試薬を提供し、補助活性化因子タンパク質の優先的補充についてのデータを公開している。例えば、非特許文献６、および非特許文献７を参照のこと。その試薬は、蛍光エネルギー共鳴移動法（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイで使用される。
【００１０】
他の核受容体（ＥＲ−α、ＥＲＲおよびＰＰＡＲファミリー）に対する、やはりＦＲＥＴに基づく類似のアッセイについての刊行物がある。例えば、非特許文献８および非特許文献９を参照のこと。類似の実験が、Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いて行われている。例えば、非特許文献１０および非特許文献１１を参照のこと。
【００１１】
リードアウトが遺伝子発現である場合には、細胞的アッセイが存在する。例えば、非特許文献１２および非特許文献１３を参照のこと。例えば、Ｋａｒｏ−Ｂｉｏ社は、核ホルモン受容体に対するアゴニストリガンドとアンタゴニストリガンドを区別するために、配座感受性ペプチドプローブを含む遺伝子発現リードアウトアッセイを開発した。例えば、非特許文献１４および非特許文献１５を参照のこと。
【００１２】
Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄらの非特許文献１６は、エストラジオール存在下におけるＥＲ−α受容体の熱安定性を報告している。しかし、上記参考文献は、分子を、上記ＥＲ−α受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして同定することは示していない。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，５８５，２７７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６７９，５８２号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０２０，１４１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０３６，９２０号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２９１，１９１号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２６８，２１８号明細書
【特許文献７】米国特許第６，２３２，０８５号明細書
【特許文献８】米国特許第６，２６８，１５８号明細書
【特許文献９】米国特許第６，２１４，２９３号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，２９１，１９２号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，３０３，３２２号明細書
【非特許文献１】Goodwinら、Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42:1-23 (2002)
【非特許文献２】Tredgerら、Hospital Pharmacist、9、167-173、(2002)
【非特許文献３】Schuetz & Strom、Nat. Med. 7:536-537
【非特許文献４】Synoldら、Nat. Med. 7:584-590
【非特許文献５】Shang & Brown、Science 295:2465-2468、(2002)
【非特許文献６】Bolgerら、Environmental Health Perspectives 106:1-7 (1998)
【非特許文献７】the Orphan Receptor Meeting San Diego (June 2002)でなされたPanvera社の発表
【非特許文献８】Zhouら、Molecular Endocrinology 12:1594-1604 (1998)
【非特許文献９】Cowardら、98:8880-8884、(2001)
【非特許文献１０】Cheskisら、J. Biological Chemistry 11384-11391 (1997)
【非特許文献１１】Wongら; Biochemistry 40:6756-6765 (2001)
【非特許文献１２】Campら、Diabetes 49:539-547 (2001)
【非特許文献１３】Kraichelyら、Endocrinology、141:3534-3545、(2000)
【非特許文献１４】Paigeら、PNAS 96:3999-4004 (1999)
【非特許文献１５】the Orphan Receptor Meeting San Diego (June 2002)でのKaro-Bio社による発表
【非特許文献１６】Greenfieldら、Biochemistry 40:6446-6652 (2001)
【非特許文献１７】Aranda および Pascual、Physiological Reviews 81:1269-1304 (2001)
【非特許文献１８】Collingwoodら、Journal of Molecular Endocrinology 23:255-275 (1999)
【非特許文献１９】Robyrら、Molecular Endocrinology 23:329-347 (2000)
【非特許文献２０】Leeら、Cellular and Molecular Life Sciences 58:289-297 (2001)
【非特許文献２１】Laudet、J. Molecular Endocrinology 19:207-226 (1997)
【非特許文献２２】Maglichら、Genome Biology 2:1-7 (2001)
【非特許文献２３】Eftink、M. R.、Biophysical J. 66: 482-501 (1994)
【非特許文献２４】Weber、P. C.ら、J. Am. Chem. Soc. 116:2717-2724 (1994)
【非特許文献２５】Clegg, R.M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2994-2998 (1993)
【非特許文献２６】Synold ら、Nat. Med. 7:584-590
【非特許文献２７】Hugh D. Young、Statistical Treatment of Experimental Data (1962)
【非特許文献２８】White、Robert S..、Statistics (1989)
【非特許文献２９】Pitman、Jim、Probability (1993)
【非特許文献３０】Brown、Byron W.、Statistics、A Biomedical Introduction (1977)
【非特許文献３１】Ekins & Erickson、Drug Metabolism and Disposition、30、96-99、2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述の技術にはいくつかの難点がある。例えば、核受容体の分析においては、同定されたリガンドまたは補助調節因子が、シグナル伝達または遺伝子活性化／抑制アッセイリードアウトを発生させることのできる他のタンパク質を通してではなく、対象とする上記受容体と直接に相互作用をすることを確実にするために、遺伝子発現リードアウトアッセイおよび細胞に基づくアッセイ、カウンタースクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｃｒｅｅｎｓ）が必要である。さらに、細胞リードアウト技術は、弱いリガンドの同定では感度が悪く（一般的には、１μＭを越える親和性の化合物が同定されるのは稀である）、良好な細胞透過性プロフィールを有する化合物に対してのみ適用可能である。他の市販  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  アッセイは、競合置換アッセイを確立するためにリガンドの知識が必要であり、またはＦＲＥＴに基づく補助調節因子アッセイを有効にする道具としてそれらを使用する必要がある。
【００１５】
薬物代謝酵素の発現を調節する受容体に対するリガンドの作用、および異物代謝に対するリガンドの結果的作用、同様に薬物排出の発現を調節する受容体に対する作用について、迅速でハイスループットなリガンド同定を円滑にする、正確で信頼できる技術の必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一つの実施形態において、本発明は、薬物リードによる薬物代謝酵素活性に対する作用を決定する方法を提供する。上記方法は、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変する薬物リードを提供するステップと、上記薬物リードを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップとを含み、上記薬物リードおよび補助調節因子存在下における上記受容体の安定性のさらなる改変によって、上記薬物リードが薬物代謝酵素の活性を増加させるかどうかが示される。
【００１７】
もう一つの実施形態において、上記方法は、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる薬物リードを提供するステップと、上記薬物リードを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップとを含み、上記薬物リードおよび補助調節因子存在下における上記受容体の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトによって、上記薬物リードが薬物代謝酵素の活性を増加させるかどうかが示される。
【００１８】
他の実施形態において、上記方法は、分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変し、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下において上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップを含み、上記受容体の安定性を改変し、かつ補助活性化因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する分子を、異物代謝のアゴニストとして同定する。
【００１９】
さらに別の実施形態において、上記方法は、分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下において上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含み、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ補助活性化因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる分子を、異物代謝のアゴニストとして同定する。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態において、上記方法は、分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングするステップを含む。上記受容体の安定性を改変しない分子を、異物代謝の非アゴニストとして同定する。本発明の様々な実施形態は、異物代謝の非アゴニストを同定する別の方法を提供する。上記方法は、分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含む。上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせない分子が異物代謝の非アゴニストとして同定される。
【００２１】
本発明の様々な実施形態は、（ａ）多様な分子の１つまたは複数を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングし、上記受容体の安定性を改変しない分子を、異物代謝の非アゴニストとして同定するステップと、（ｂ）上記受容体の安定性を改変するステップ（ａ）からの分子を、１つまたは複数の補助抑制因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングし、補助抑制因子存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する分子を、異物代謝の非アゴニストとして同定するステップを含む。
【００２２】
他の本発明の実施形態は、（ａ）多様な分子の１つまたは複数を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングし、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせない分子を、異物代謝の非アゴニストとして同定するステップと、（ｂ）上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるステップ（ａ）からの分子を、１つまたは複数の補助抑制因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングし、補助抑制因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる分子を異物代謝の非アゴニストとして同定するステップとを含む。
【００２３】
いくつかの本発明の実施形態は、薬物クリアランスのアゴニストを同定する方法であって、分子を、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の安定性を改変し、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下において上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップを含み、上記受容体の安定性を改変し、かつ補助活性化因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する分子を、薬物クリアランスのアゴニストとして同定する方法を提供する。
【００２４】
他の本発明の実施形態は、薬物クリアランスのアゴニストを同定する方法であって、分子を、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下において上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含み、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ補助活性化因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる分子を、薬物クリアランスのアゴニストとして同定する方法を提供する。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態は、薬物排出活性に対する薬物リードの作用を決定する方法であって、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の安定性を改変する薬物リードを提供するステップと、上記薬物リードを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップとを含み、上記薬物リードおよび上記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子存在下における上記受容体の安定性のさらなる改変が、上記薬物リードが薬物排出活性を増加するかどうかを示す方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらに他の実施形態は、薬物排出活性に対する薬物リードの作用を決定する方法であって、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる薬物リードを提供するステップと、上記薬物リードを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップとを含み、上記薬物リードおよび上記１つまたは複数の補助調節因子の補助調節因子存在下における上記受容体の熱アンフォールディング曲線におけるさらなるシフトが、上記薬物リードが薬物排出活性を増加させるかどうかを示す方法を提供する。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、異物代謝および／または薬物クリアランスに対する分子の作用を決定する方法であって、分子を、上記ＳＸＲ受容体の安定性を改変し、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下において上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングするステップを含み、分子および上記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子存在下における上記受容体の安定性のさらなる改変が、分子が異物代謝および／または薬物クリアランスのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを示す方法を提供する。
【００２８】
本発明のさらに別の一般的な実施形態は、異物代謝および／または薬物クリアランスに対する分子の作用を決定する別の方法であって、分子を、上記ＳＸＲ受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするステップを含み、分子および上記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子存在下における上記受容体の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトが、分子が異物代謝および／または薬物クリアランスのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを示す方法を提供する。
【００２９】
以下、添付した図面を参照しながら、本発明のさらなる特徴および有利性を詳細に述べる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下の記述において、生化学的および薬理学的分野の当業者に周知の様々な用語および方法について述べる。そうした既知の用語および方法を記述した刊行物および他の資料は、本明細書に、参照によって全て記述されたかのようにそのまま援用される。
【００３１】
本発明の方法の一つの有利性は、アッセイを確立するために、遺伝子発現リードアウトおよび細胞基盤のアッセイ、または既知リガンドの使用を必要としないことである。そのような直接的方法で情報を作成する能力によって、所望の特徴を有する薬物の発見が可能になる。
【００３２】
単一の統一されたアッセイにおいて、単離および／または精製したタンパク質およびペプチドを使用することで、タンパク質−タンパク質相互作用の調節に関与するリガンドを同定し、生物学的反応を予測することができる。リガンドを同定するだけでなく、標的タンパク質に対する内在親和性を計算することもでき、その後それを使用して生物学的活性と関連づけることができる。
【００３３】
さらに、本発明の方法によって、薬物候補などの分子をスクリーニングし、それらが、薬物の活性を制限する代謝酵素の発現を変化させるかどうか、または他の薬物の代謝を変化させ、望ましくない危険な薬物−薬物相互作用を創りだすかどうか、またはそれらがどのように薬物クリアランスのメカニズムに作用するかを決定することができる。
【００３４】
本発明の方法によって作成したデータは、カウンタースクリーニングを必要としない。タンパク質などの受容体の溶融温度における変化が、マクロ分子および対象とするタンパク質に対するリガンドの結合エネルギーの熱力学的関連性（ｌｉｎｋａｇｅ）の直接的結果であるためである。さらに、受容体に対するリガンドの親和性は感度がよく（ｐＭからｍＭの親和性を決定する）、上記方法は細胞浸透性の低い化合物によって制限されない。
【００３５】
本発明の実施形態において、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変する分子に基づいて、薬物候補または薬物リードなどの分子の、薬物代謝酵素活性および異物代謝に対する作用を決定する方法を提供する。上記受容体の安定性を改変する分子（薬物候補または薬物リードを含む）を、上記受容体および１つまたは複数の補助調節因子存在下で、上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングすることができる。上記受容体の安定性がさらに改変されるかどうかは、上記補助調節因子の存在下で、分子が上記受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかについての指標である。この情報に基づいて、薬物代謝酵素活性に対する作用および、したがって、リガンドの異物代謝を決定することができる。
【００３６】
本発明の他の実施形態において、熱変化によるシトクロームＰ４５０発現を調節する受容体のアンフォールディングに基づいて、薬物リードなどの分子の、薬物代謝酵素活性および異物代謝に対する作用を決定する方法を提供する。上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる分子を、上記受容体および１つまたは複数の補助調節因子存在下において上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることができる。上記受容体の熱アンフォールディング曲線がさらにシフトされるかどうかが、上記補助調節因子の存在下で、分子が上記受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかについての指標となる。この情報に基づいて、薬物代謝酵素活性に対する作用および、したがって、リガンドの異物代謝を決定することができる。
【００３７】
「受容体」という用語は、ペプチド、タンパク質、核酸、および他の受容体を包含する。上記用語は、酵素および酵素ではないタンパク質の両方を包含する。上記用語は、モノメリックおよびマルチメリックタンパク質を包含する。マルチメリックタンパク質は、ホモマーでもヘテロマーでもよい。上記用語は、オリゴヌクレオチドなどの少なくとも２つのヌクレオチドからなる核酸を包含する。核酸は、一本鎖、二本鎖または三本鎖であることができる。上記用語は、核酸であって、合成オリゴヌクレオチド、組換えＤＮＡ分子の一部、または染色体ＤＮＡの一部であるものを包含する。
【００３８】
「受容体」という用語はまた、ペプチド、タンパク質、および他の受容体であって、フォールディング、コイル化またはねじりによって、二次構造、三次構造、または四次構造をとることができるものの一部をも包含する。
【００３９】
上記受容体は、代用物であって、補助因子、補酵素、補欠分子族、脂質、オリゴ糖、またはリン酸基（それに限定されない）を含めたもので代用してもよい。
【００４０】
より具体的には、本発明で利用する上記受容体は、補助調節因子依存性である。「補助調節因子依存性」とは、上記受容体が少なくとも１つのリガンドを結合させること、および少なくとも１つの補助調節因子を結合させることができることを意味する。さらに、上記受容体の活性は、リガンド依存的であろうと非依存的であろうと、少なくとも部分的に、補助調節因子に依存する。補助調節因子依存性受容体は、核受容体を含むがそれに限定されない。
【００４１】
核受容体、およびそれに関係する補助調節因子の役割は、当業界で周知である。例えば、非特許文献１７、非特許文献１８、および非特許文献１９、および非特許文献２０を参照のこと。参考文献は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【００４２】
さらに、補助調節因子依存性受容体は、脊椎動物種（ヒトを含むがそれに限定されない）、および無脊椎動物（昆虫を含むがそれに限定されない）を包含する。
【００４３】
例えば、昆虫は何百もの核受容体を含有しており、それに対して、リガンドをアゴニストまたはアンタゴニストとして同定することができる。脊椎動物、線虫、および節足動物の中に存在する核受容体についての議論は、非特許文献２１および非特許文献２２を参照のこと。参考文献は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【００４４】
より詳細には、本発明の実施形態において、「受容体」という用語は、Ｐ４５０発現を調節する受容体（ステロイドＸ受容体（ＳＸＲ）を含むがそれに限定されない）を表す。
【００４５】
本発明の他の実施形態において、「受容体」という用語は、薬物輸送タンパク質発現を調節する受容体（ＰＸＲおよびＳＸＲを含むがそれに限定されない）を表す。
【００４６】
「タンパク質」という用語は、全長タンパク質またはポリペプチド断片を包含する。「ペプチド」という用語は、合成またはペプチドライブラリー由来のタンパク質断片を表す。本明細書で使用されるように、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は同義である。
【００４７】
「補助調節因子」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、およびペプチドなどの核酸（それに限定されない）を含めた、リガンド依存的または非依存的に上記受容体を調節する任意の構造の化学的化合物を表す。上記用語は、天然、合成および仮想の分子を表す。より具体的には、上記用語は、リガンド依存的または非依存的に上記受容体を調節するペプチドまたはポリペプチド／タンパク質（天然または合成）を表す。上記用語は、天然配列またはファージディスプレイライブラリー由来のペプチドを包含する。上記ペプチドは、ネイティブタンパク質の断片であることができる。より具体的には、上記用語は補助活性化因子および補助抑制因子を表し、さらにより具体的には、本発明の実施形態において、シトクロームＰ４５０酵素または薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の補助活性化因子および補助抑制因子を表す。
【００４８】
「補助活性化因子」という用語は、受容体に結合し、上記受容体の活性における活性化または増加を引き起こす分子を表す。本発明の実施形態において、上記用語は、受容体に結合して遺伝子転写を誘導する、またはシグナル伝達機能（例えば、シグナル伝達）を誘導する分子を表す。
【００４９】
「補助抑制因子」という用語は、受容体に結合し、上記受容体の活性における不活化または減少を引き起こす分子を表す。本発明の実施形態において、上記用語は、受容体に結合して遺伝子転写を抑制する、またはシグナル伝達機能（例えば、シグナル伝達）を抑制する分子を表す。
【００５０】
「アゴニスト」という用語は、受容体に結合し、上記受容体に結合するための補助活性化因子を誘導または補充する分子を表す。本発明の実施形態において、「アゴニスト」という用語は、核受容体に結合し、補助活性化因子を補充する分子を表す。これらの実施形態において、上記用語は、より具体的には、補助活性化因子との直接的相互作用を促進する核受容体における配座変化を誘導することによって遺伝子発現を変化させる分子を表す。いくつかの実施形態において、上記アゴニストは補助活性化因子依存性受容体の強い誘導物質である。他の実施形態においては、上記アゴニストは部分的アゴニストであり、補助調節因子依存性受容体の弱い誘導物質である。
【００５１】
「アンタゴニスト」という用語は、受容体に結合し、上記受容体に結合するための補助抑制因子を誘導または補充する分子を表す。本発明の実施形態において、「アンタゴニスト」という用語は、核受容体に結合し、補助抑制因子を補充する分子を表す。これらの実施形態において、上記用語は、より具体的には、補助抑制因子との直接的相互作用を促進する核受容体における配座変化を誘導することによって遺伝子発現を変化させる分子を表す。
【００５２】
いくつかの実施形態において、上記アンタゴニストは補助調節因子依存性受容体の非誘導物質または非アゴニストである。
【００５３】
「分子」という用語は、補助調節因子などの付加的化合物の存在下または不在下において、上記受容体に結合するかどうかを検査される化合物を表す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにペプチドなど（これらに限定されない）の核酸を含めた任意の構造の化学的化合物を包含する。上記用語は、天然、合成および仮想の分子を表す。上記用語は、化合物ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリー内の化合物を含む。上記用語はまた、薬物リードまたは薬物候補も含む。「分子」および「リガンド」という用語は同義である。
【００５４】
「多様な分子」、「多様な化合物」、または「多様なコンテナ」という用語は、少なくとも２つの分子、少なくとも２つの化合物、または少なくとも２つのコンテナを表す。
【００５５】
「熱アンフォールディング曲線」は、タンパク質または核酸のアンフォールディングに関連する物理的変化を温度の関数としてプロットしたものである。
【００５６】
「結合する（ｂｉｎｄ）」および「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、２つ以上の分子間における相互作用を表す。より具体的には、上記用語は、リガンドと受容体、または補助調節因子と受容体、またはリガンド、受容体、および補助調節因子の間の、非共有結合のような相互作用を表す。
【００５７】
「安定性の改変」という用語は、１つまたは複数のリガンドが結合した標的タンパク質内で所与の程度の物理的変化を引き起こすのに必要な、圧力の量、熱の量、洗剤の濃度、または変性剤の濃度を、いずれのリガンドも存在しない状態で、標的タンパク質内で同程度の物理的変化を引き起こすのに必要な、圧力の量、熱の量、洗剤の濃度、または変性剤の濃度と関連させた変化をいう。安定性の改変は、安定性における増加または減少として表すことができる。リガンドによる受容体の安定性の改変によって、上記リガンドが上記受容体に結合することが示される。
【００５８】
「安定性のさらなる改変」という用語は、上記受容体の安定性を改変することが知られている分子および１つまたは複数の別の分子の存在下における、上記受容体の安定性の付加的な改変を表す。より具体的には、上記１つまたは複数の別の分子は、補助調節因子であることができる。
【００５９】
「アンフォールディング」という用語は、アミノ酸側鎖の結晶秩序、二次、三次、または四次タンパク質構造のような構造の喪失を表す。タンパク質などの受容体は、尿素、グアニジニウム塩酸塩、またはグアニジニウムチオサクシシナート（ｔｈｉｏｓｕｃｃｉｃｉｎａｔｅ）などの変性剤、洗剤で処理することにより、上記受容体を圧力で処理することにより、上記受容体を加熱することにより、または他の適切な変化によって、アンフォールディングを引き起こすことができる。
【００６０】
「物理的変化」という用語は、光または熱の形態によるエネルギーの放出、光または熱の形態によるエネルギーの吸収、濁度における変化、および光の偏光特性における変化を包含する。具体的には、上記用語は、赤外線分光法を含む分光法によって測定した変化、蛍光発光、蛍光エネルギー移動、紫外線または可視光線の吸収、光の偏光特性における変化、蛍光発光の偏光特性における変化、時間経過による蛍光の変化率における変化（すなわち、蛍光存続時間）、蛍光異方性における変化、蛍光エネルギー共鳴移動における変化、濁度における変化、および酵素活性における変化を表す。好ましくは、上記用語は、蛍光を表し、より好ましくは、蛍光発光を表す。蛍光発光は、タンパク質に内在のものであることができ、または蛍光レポーター分子によるものであることもできる。タンパク質のアンフォールディングをモニターするために蛍光技術を使用することは、当業者に周知である。例えば、非特許文献２３を参照のこと。
【００６１】
「アンフォールディング曲線」は、タンパク質のアンフォールディングに関連する物理的変化を温度、変性剤濃度、および圧力などのパラメータの関数としてプロットしたものである。
【００６２】
「熱安定性の改変」という用語は、１つまたは複数のリガンドが結合した標的タンパク質内で所与の程度の物理的変化を引き起こすのに必要な、熱エネルギーの量を、いずれのリガンドも存在しない状態で、標的タンパク質内で同程度の物理的変化を引き起こすのに必要な、熱エネルギーの量と関連させた変化をいう。熱安定性の改変は、熱安定性における増加または減少として表すことができる。リガンドによる受容体の熱安定性の改変によって、上記リガンドが上記受容体に結合することが示される。
【００６３】
「熱アンフォールディング曲線におけるシフト」という用語は、リガンドの非存在下におけるタンパク質の熱アンフォールディング曲線に対する、リガンドに結合する受容体の熱アンフォールディング曲線におけるシフトをいう。
【００６４】
「熱アンフォールディング曲線におけるさらなるシフト」という用語は、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせることが知られている分子および１つまたは複数の追加の分子の存在下における、上記受容体の熱アンフォールディング曲線の付加的なシフトをいう。より具体的には、上記１つまたは複数の追加の分子は、補助調節因子であることができる。
【００６５】
「受容体を接触させる」という用語は、広くは、結合状態についてスクリーニングするために、上記標的タンパク質を分子とともに溶液の中に入れることを表す。狭くは、接触は、結合状態についてスクリーニングするために、上記受容体および分子の溶液を回転、旋回、振盪または振動させることを表す。より具体的には、接触は、結合状態について検査するために、上記受容体を分子と混合させることを表す。混合は、例えば、ピペットの先端からの取り込みと排出を繰り返すことによって達成することができる。
【００６６】
好ましくは、接触は、結合状態で検査するため、標的タンパク質と分子の間における結合の平衡化をいう。接触は、コンテナ内で、またはスクリーニングすべき上記受容体および分子をコンテナに入れる前に行うことができる。
【００６７】
「コンテナ」という用語は、結合状態を検査すべき受容体および分子を入れることのできる容器またはチャンバーを表す。「コンテナ」という用語は、反応管（例えば、試験管、微細管、小びん、キュベット、その他）を包含する。本発明の実施形態において、「コンテナ」という用語は、マルチウェルマイクロプレートの１つのウェルまたはマイクロタイタープレートを表す。
【００６８】
本発明の実施形態において、上記受容体に結合する分子を、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で受容体に結合する能力についてスクリーニングすることができる。「スクリーニング」という用語は、概して、分子または化合物を、変性またはアンフォールディングすることのできる受容体に結合する能力で検査することを表す。上記スクリーニングプロセスは、繰り返し、すなわち反復プロセスであって、アンフォールディングアッセイにおいて分子をタンパク質への結合について試験するプロセスである。
【００６９】
本発明の様々な実施形態において、上記化合物はＰ４５０発現の強い誘導物質である。他の実施形態において、上記強い誘導物質の結合親和性は約５μＭ未満、または約４．５μＭ、または約４μＭ、または約３．５μＭ、または約３μＭ、または約２．５μＭ、または約２μＭ、または約１．５μＭ、または約１μＭである。および、上記強い誘導物質の統計的なアゴニスト状態の確率は約０．８から約１．０である。さらに別の実施形態において、上記強い誘導物質の統計的確率は少なくとも約０．８、または少なくとも約０．８５、または少なくとも約０．９、または少なくとも約０．９５、または少なくとも約１．０である。
【００７０】
他の実施形態において、上記化合物はＰ４５０発現の弱い誘導物質である。他の実施形態において、上記弱い誘導物質の結合親和性は約５μＭ未満、または約４．５μＭ、または約４μＭ、または約３．５μＭ、または約３μＭ、または約２．５μＭ、または約２μＭ、または約１．５μＭ、または約１μＭであり、上記弱い誘導物質の統計的なアゴニスト状態の確率は約０．４から約０．８である。もう一つの実施形態において、上記弱い誘導物質の統計的確率は約０．４および０．５の間、または約０．５から約０．６の間、または約０．６から約０．７の間、または約０．７から約０．８の間である。
【００７１】
本発明のもう一つの実施形態において、上記化合物は、Ｐ４５０発現の非誘導物質である。他の実施形態において、上記非誘導物質の結合親和性は約５μＭ未満、または約４．５μＭ、または約４μＭ、または約３．５μＭ、または約３μＭ、または約２．５μＭ、または約２μＭ、または約１．５μＭ、または約１μＭであり、上記非誘導物質の統計的なアゴニスト状態の確率は約０．０から約０．４である。もう一つの実施形態において、上記非誘導物質の統計的確率は約０．０５、または約０．１未満、または約０．１５未満、または約０．２未満、または約０．２５未満、または約０．３未満、または約０．３５未満、または約０．４未満である。いくつかの実施形態において、上記弱い誘導物質は不活性であるように見える。
【００７２】
他の実施形態において、上記化合物はＰ４５０発現に対する弱い誘導物質である。様々な実施形態において、上記弱い誘導物質は、約５μＭを越える結合親和性、および約０．４から約１．０、または約０．４から約０．５の間、または約０．５から約０．６の間、または約０．６から約０．７の間、または約０．７から約０．８の間、または約０．８から約０．９の間、または約０．９から約１．０の間のアゴニスト状態の確率を有する。
【００７３】
さらに別の実施形態において、上記化合物は、Ｐ４５０発現に対して不活性であるように見える。様々な実施形態において、上記非誘導物質は、約５μＭを越える結合親和性、および約０．４未満、または約０．３５未満、または約０．３未満、または約０．２５未満、または約０．２未満、または約０．１５未満、または約０．１未満、または約０．５未満のアゴニスト状態の確率を有する。
【００７４】
上述のように、本発明の様々な実施形態によると、薬物代謝酵素活性および異物代謝に対する薬物リードなどの分子の作用は、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性の改変に基づいて同定することができる。上記受容体の安定性を改変する分子は、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングすることができる。
【００７５】
一つの実施形態において、上記スクリーニングを実行するために、上記受容体の安定性を改変する１つまたは複数の分子（例えば、１セットの）を、多様なコンテナのそれぞれの中にある上記受容体および１つまたは複数の補助調節因子と接触させることができる。その後、コンテナのそれぞれの中にある上記受容体を処理して、上記標的タンパク質のアンフォールディングを引き起こさせることができる。上記受容体のアンフォールディングに関連する物理的変化は測定することができる。その後、コンテナのそれぞれについて上記受容体に対するアンフォールディング曲線を作成することができる。アンフォールディング曲線のそれぞれは、（１）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または（２）（ｉ）上記セットからの分子および／または（ｉｉ）上記補助調節因子の不在下における上記受容体に対するアンフォールディング曲線と、比較することができる。
【００７６】
作成されたデータに基づいて、スクリーニングした分子が、上記補助調節因子の存在下で、上記受容体の安定性をさらに改変するかどうかを決定し、したがって分子が異物代謝のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを同定することができる。上記受容体の安定性のさらなる改変は、上記受容体のアンフォールディング曲線におけるさらなる変化によって示される。
【００７７】
本発明の他の実施形態において、薬物代謝酵素活性、したがって異物代謝に関して、薬物リードなどの分子の作用を、熱安定性を改変する分子、より詳細には、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる分子を分析することによって同定することができる。上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる分子を、１つまたは複数の補助調節因子の存在下で、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることができる。
【００７８】
本発明の実施形態において、上記スクリーニングは、上記受容体を、多様なコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の補助調節因子とともに上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１つまたは複数のリガンド（例えば、１セットの）と接触させることによって達成することができる。上記多様なコンテナは加熱することができ、上記受容体に対する温度の関数としての熱アンフォールディング曲線に関連する物理的変化は、上記コンテナのそれぞれについて測定することができる。その後、上記受容体に対する温度の関数としての熱アンフォールディング曲線を作成することができる。作成された上記熱アンフォールディング曲線は、（１）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または（２）（ｉ）上記セットからの分子および／または（ｉｉ）上記補助調節因子の不在下における上記受容体に対する熱アンフォールディング曲線と、比較することができる。
【００７９】
上記スクリーニング方法の実施形態において、上記コンテナを、ある温度範囲にわたって、間隔を置いて加熱することができる。上記多様なコンテナを、同時に加熱してもよい。上記受容体の熱アンフォールディングに関連する物理的変化は、それぞれの加熱期間の後に測定することができる。この方法の別の実施形態では、上記コンテナを連続的に加熱することができる。
【００８０】
本発明の実施形態において、上記受容体に対するアンフォールディング曲線の作成において、熱アンフォールディング曲線は、上記コンテナのそれぞれについて、上記受容体に対する温度の関数としてプロットすることができる。
【００８１】
本発明の実施形態において、上記熱アンフォールディング曲線の比較は、アンフォールディング曲線それぞれの中間点温度、Ｔｍを比較することで達成することができる。「中間点温度、Ｔｍ：ｍｉｄｐｏｉｎｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ」は、熱アンフォールディング曲線の温度中間点である。Ｔｍは、当業者に周知の方法を使用して容易に決定することができる。例えば、非特許文献２４および非特許文献２５を参照のこと。
【００８２】
例えば、熱アンフォールディング曲線それぞれのＴｍを同定し、（１）他の熱アンフォールディング曲線および／または（２）（ｉ）上記セットからの分子および／または（ｉｉ）コンテナ内の補助調節因子の不在下における上記受容体に対する熱アンフォールディング曲線に対して得られるＴｍと比較することができる。
【００８３】
あるいは、またはそれに加えて、熱アンフォールディング曲線全体は、他の熱アンフォールディング曲線全体と、コンピュータ分析ツールを使用して、同様に比較することができる。例えば、熱アンフォールディング曲線全体はそれぞれ、（１）他の熱アンフォールディング曲線および／または（２）（ｉ）上記セットからの分子および／または（ｉｉ）コンテナ内の補助調節因子の不在下における上記受容体に対する熱アンフォールディング曲線と比較することができる。
【００８４】
作成したデータに基づいて、スクリーニングした分子が、補助調節因子の存在下において、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせるかどうかを決定し、したがって分子が異物代謝のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを同定することができる。
【００８５】
分子が受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、および／またはさらにシフトさせるかどうかを決定するステップを含む本発明の方法は、分子が受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、および／またはさらにシフトさせるかどうかを決定するステップを含まない方法、例えばタンパク質分解に対する感受性、タンパク質による表面結合、タンパク質による抗体結合、タンパク質の分子シャペロン結合、固定されたリガンドに対する特異的結合、およびタンパク質凝集のアッセイなどと区別される。そうしたアッセイは当業者に周知である。例えば、特許文献１および特許文献２を参照のこと。特許文献１、および特許文献２で開示されたこれらのアプローチは、結合状態を検査されている分子の存在下および不在下においてタンパク質のフォールディングおよび／またはアンフォールディングの程度を比較するステップを含む。これらのアプローチは、上記受容体に結合する分子が上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうか決定するステップを含まない。
【００８６】
上述のように、上記受容体の安定性を改変する分子は、補助調節因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングすることができる。例えば、上記受容体の安定性を改変することが知られている分子を、同定された上記受容体に対する一団の補助調節因子（補助活性化因子および／または補助抑制因子を含む）に対してスクリーニングすることができる。便宜上、上記受容体の安定性を改変することが知られている分子を、１「セット」の分子と表す。
【００８７】
上記受容体の安定性が、上記受容体および上記セットからの分子だけの場合と比較して、上記セットからの分子および上記受容体の補助活性化因子の存在下でさらに改変される場合、そのときは、このことが、上記セットからの分子が補助活性化因子の存在下における上記受容体のアゴニストであることの指標となる。このように、上記分子が薬物代謝酵素活性に対する作用を増加させ、および／またはそうでない場合、異物代謝のアゴニストであることができることを決定することができる。
【００８８】
上記受容体の安定性が、上記受容体および上記セットからの分子だけの場合と比較して、上記セットからの分子および上記受容体の補助抑制因子の存在下でさらに改変される場合、そのときは、このことが、上記セットからの分子が補助抑制因子の存在下における上記受容体のアンタゴニストであることの指標となる。このように、上記分子が薬物代謝酵素活性に対する作用を減少させ、および／またはそうでない場合、異物代謝のアンタゴニストであることができることを決定することができる。
【００８９】
同様に、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる分子を、補助調節因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることができる。例えば、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせることが知られている分子を、同定された上記受容体に対する一団の補助調節因子（補助活性化因子および／または補助抑制因子を含む）に対してスクリーニングすることができる。便宜上、上記受容体の熱アンフォールディング曲線を改変することが知られている分子を１「セット」の分子と表す。
【００９０】
上記受容体の熱アンフォールディング曲線が、上記受容体および上記セットからの分子だけの場合と比較して、上記セットからの分子および上記受容体の補助活性化因子の存在下でさらにシフトされる場合は、そのときは、このことが、上記セットからの分子が補助活性化因子の存在下における上記受容体のアゴニストであることの指標となる。このように、上記分子が薬物代謝酵素活性に対する作用を増加させ、および／またはそうでない場合、異物代謝のアゴニストであることができることを決定することができる。
【００９１】
上記受容体の熱アンフォールディング曲線が、上記受容体および上記セットからの分子だけの場合と比較して、上記セットからの分子および上記受容体の補助抑制因子の存在下でさらにシフトされる場合、そのときは、このことが、上記セットからの分子が補助抑制因子の存在下における上記受容体のアンタゴニストであることの指標となる。このように、上記分子が薬物代謝酵素活性に対する作用を減少させ、および／またはそうでない場合、異物代謝のアンタゴニストであることができることを決定することができる。
【００９２】
本発明はまた、安定性のさらなる改変の欠如、および／またはシトクロームＰ４５０発現を調節する受容体のアンフォールディング曲線におけるさらなるシフトの欠如に基づいて、異物代謝のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法を提供する。
【００９３】
「上記受容体の安定性の改変の欠如」または「上記受容体の安定性のさらなる改変がない」とは、上記セットからの分子および補助調節因子両方の存在下における上記受容体の安定性において、さらなる有意な変化がない、または全くないということを意味する（上記受容体および上記セットからの分子の場合と比較して）。
【００９４】
「上記受容体の熱アンフォールディング曲線におけるさらなるシフトの欠如」または「上記受容体の熱アンフォールディング曲線におけるさらなるシフトがない」とは、上記セットからの分子および補助調節因子の存在下における上記受容体の熱アンフォールディング曲線のシフトにおいて、さらなる有意な変化がない、または全くないということを意味する（上記受容体および上記セットからの分子の場合と比較して）。
【００９５】
本発明の実施形態において、異物代謝のアンタゴニストは、補助活性化因子の存在下におけるシトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性のさらなる改変の欠如および／または熱アンフォールディング曲線におけるさらなるシフトの欠如に基づいて同定する。本発明の他の実施形態において、異物代謝のアゴニストは、補助抑制因子の存在下におけるシトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性のさらなる改変の欠如および／または熱アンフォールディング曲線におけるさらなるシフトの欠如に基づいて同定する。
【００９６】
異物代謝のアンタゴニストは、上記受容体の安定性を改変する１セットの分子からの１つまたは複数の分子を、１つまたは複数の補助活性化因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングすることによって同定することができる。上記セットからの分子を、上記受容体の安定性のさらなる改変に対する作用についてスクリーニングする方法は上述した。上記セットの分子および補助活性化因子の存在下で、上記受容体の安定性のさらなる改変がない場合、そのときは、このことが、上記セットの分子が補助活性化因子の存在下における上記受容体のアンタゴニストであることの指標となる。このようにして、そのような分子が異物代謝のアンタゴニストであると決定することができる。
【００９７】
アンタゴニストはまた、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１セットの分子からの１つまたは複数の分子を、１つまたは複数の補助活性化因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることによって同定することができる。１つまたは複数の上記セットの分子を、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングする方法は上述した。上記セットの分子および補助活性化因子の存在下で、上記受容体の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトがない場合、そのときは、このことが、そのような上記セットの分子が補助活性化因子の存在下における上記受容体のアンタゴニストであることの指標となり、こうして異物代謝のアンタゴニストであると決定することができる。
【００９８】
異物代謝のアゴニストは、上記受容体の安定性を改変する１セットの分子からの１つまたは複数の分子を、１つまたは複数の補助抑制因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングすることによって同定することができる。上記セットからの分子を、上記受容体の安定性のさらなる改変に対する作用についてスクリーニングする方法は上述した。上記セットの分子および補助抑制因子の存在下で、上記受容体の安定性のさらなる改変がない場合、そのときは、このことが、そのような上記セットの分子が補助抑制因子の存在下における上記受容体のアゴニストであることの指標となる。このようにして、そのような分子が異物代謝のアゴニストであると決定することができる。
【００９９】
異物代謝のアゴニストは、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１セットの分子からの１つまたは複数の分子を、１つまたは複数の補助抑制因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることによって同定することができる。上記セットからの１つまたは複数の分子を、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングする方法は上述した。上記セットの分子および補助抑制因子の存在下で、上記受容体の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトがない場合、そのときは、このことが、そのような上記セットの分子が補助抑制因子の存在下における上記受容体のアゴニストであり、したがって、異物代謝のアゴニストであることの指標となる。
【０１００】
他の本発明の実施形態は、異物代謝の非アゴニストを同定する方法を含む。「非アゴニスト」とは、薬物候補または薬物リードなどの分子が、補助調節因子の存在下におけるシトクロームＰ４５０発現を調節する受容体に対するアンタゴニスト、すなわち上記受容体にまったく結合せず、したがって薬物代謝酵素の発現を増加させない分子であることを意味する。
【０１０１】
例えば、異物代謝の非アゴニストは、分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングすることによって同定することができる。分子が上記受容体の安定性を改変しない場合、その分子を異物代謝の非アゴニストとして同定する。
【０１０２】
もう一つの実施形態において、異物代謝の非アゴニストは、分子を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングすることによって同定することができる。分子が上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトしない場合、その分子を異物代謝の非アゴニストとして同定する。
【０１０３】
さらに別の実施形態において、異物代謝の非アゴニストは、多様な分子の１つまたは複数を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングすることによって同定することができる。上記受容体の安定性を改変しない分子を異物代謝の非アゴニストとして同定する。上記受容体の安定性を改変する分子を、１つまたは複数の補助抑制因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングすることができる。補助抑制因子存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する分子を、異物代謝の非アゴニストとして同定することができる。
【０１０４】
さらにまた別の実施形態において、異物代謝の非アゴニストは、多様な分子の１つまたは複数を、シトクロームＰ４５０発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングすることによって同定することができる。上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせない分子を異物代謝の非アゴニストとして同定する。上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる分子を、１つまたは複数の補助抑制因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることができる。補助抑制因子存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる分子を、異物代謝の非アゴニストとして同定することができる。
【０１０５】
上記受容体の安定性を改変し、および／または熱アンフォールディング曲線をシフトさせることが知られている分子を提供し、そのような分子を、上記受容体の安定性をさらに改変し、および／または熱アンフォールディング曲線をシフトする能力についてスクリーニングすることに基づいて、異物代謝のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法を上述してきた。本発明はまた、そのような分子を提供する方法とともに、そのような分子を異物代謝のアゴニストまたはアンタゴニストとして同定する方法を包含する。そうした方法は、特に、オーファン受容体に対するリガンド（このリガンドでその受容体に結合するものは知られていない）の同定に有用である。
【０１０６】
上記受容体の安定性を改変する、および／または熱アンフォールディング曲線をシフトさせる分子（「セット」として上述した）は、多数の異なる分子をスクリーニングすることによって得ることができる。例えば、上記受容体の安定性を改変する分子は、１つまたは複数の多数の異なる分子を、上記受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングすることによって得ることができる。同様に、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる分子は、１つまたは複数の多数の異なる分子を、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングすることによって得ることができる。本発明の実施形態において、スクリーニングすることができる分子の数は千から百万の範囲である。
【０１０７】
分子を、アゴニストまたはアンタゴニストを同定する上述のスクリーニング方法と類似の方法によって、上記受容体の安定性を改変する能力についてスクリーニングすることができる。例えば、上記受容体を、多数のコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の多数の異なる分子と接触させることができる。多数のコンテナのそれぞれの中にある受容体を処理して、アンフォールディングを引き起こすことができる。上記受容体のアンフォールディングに関連する物理的変化を測定することができる。上記コンテナのそれぞれについて、上記受容体に対するアンフォールディング曲線を作成することができる。これらアンフォールディング曲線はそれぞれ、（１）他のアンフォールディング曲線それぞれと、および／または（２）上記多様な異なる分子の不在下における上記受容体に対するアンフォールディング曲線と比較することができる。
【０１０８】
作成したデータに基づいて、スクリーニングした分子が上記受容体の安定性を改変するかどうか決定することができる。上記受容体の安定性の改変は、上記受容体のアンフォールディング曲線における変化によって同定することができる。分子が上記受容体の安定性を改変する場合、そのときは、上述の方法によって、それをスクリーニングして、補助調節因子の存在下において、それがシトクロームＰ４５０発現を調節する受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを同定することができる。
【０１０９】
同様に、分子を、アゴニストまたはアンタゴニストを同定するスクリーニング方法と類似の方法によって、上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングすることができる。例えば、上記受容体を、多数のコンテナのそれぞれの中にある１つまたは複数の多数の異なる分子と接触させることができる。上記コンテナを加熱し、上記受容体の熱アンフォールディングに関連する物理的変化を上記コンテナのそれぞれにおいて測定することができる。上記受容体に対する熱アンフォールディング曲線は、コンテナのそれぞれについて、温度の関数として作成することができる。
【０１１０】
上記熱アンフォールディング曲線は、（１）他の熱アンフォールディング曲線それぞれと、および／または（２）上記多様な異なる分子の不在下における上記受容体に対する熱アンフォールディング曲線と比較することができる。本発明の実施形態において、熱アンフォールディング曲線それぞれのＴｍを同定し、（１）他の熱アンフォールディング曲線および／または（２）上記多様な分子の不在下における上記受容体に対する熱アンフォールディング曲線で得たＴｍと比較することができる。あるいは、それぞれの熱アンフォールディング曲線全体は、（１）他の熱アンフォールディング曲線、および／または（２）上記多様な異なる分子の不在下における上記受容体に対する熱アンフォールディング曲線と比較することができる。
【０１１１】
作成したデータに基づいて、スクリーニングした分子が上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうか決定することができる。分子が上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる場合、そのときは、上述の方法によって、それをスクリーニングして、補助調節因子の存在下で、それがシトクロームＰ４５０発現を調節する受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを同定することができる。
【０１１２】
本発明の実施形態において、マイクロプレート熱シフトアッセイは、リガンドを同定するための、かつ異物代謝のアゴニストまたはアンタゴニストなどのリガンドを同定するための、特に有用な手段である。マイクロプレート熱シフトアッセイは、標的受容体の熱安定性に対する１つまたは複数の分子の作用をアッセイするための、直接的かつ定量的な技術である。
【０１１３】
マイクロプレート熱シフトアッセイの理論、概念、および応用、ならびにマイクロプレート熱シフトアッセイの実行に有用な装置は、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、および特許文献１１に記述されている（これらは、参照によってその全体を本明細書に援用される）。これらの参考文献で議論されるマイクロプレート熱シフトアッセイを使用して、上述のスクリーニング方法を実施することができる。
【０１１４】
上記マイクロプレート熱シフトアッセイは、リガンド結合親和性のリードアウトを提供する。上記アッセイは、それぞれの機能的に活性な受容体が、安定化エネルギーを表す、それぞれの受容体に特徴的な温度で協同的に溶融する高度に組織化された構造であるという事実に依存する。分子が受容体に結合するとき、その受容体は、リガンド結合親和性に比例する量で安定化し、したがって中間点温度をより高い温度にシフトさせる。
【０１１５】
熱シフトアッセイは、結合状態のモニターリングを助けるために、放射性標識化合物も、蛍光または他の色素嫌性標識も必要としないため、その使用には多くの利点がある。上記アッセイは、生体分子の熱アンフォールディング、すなわち全てではないにしても多くの薬物標的生体分子に内在する一般的物理化学的プロセスを利用する。このアッセイの重要な特徴は、汎用的な適用性である。新しい治療的受容体タンパク質が入手可能になるたびに、新しいアッセイを発明する必要がなくなるからである。
【０１１６】
さらに、熱シフトアッセイを使用すると、Ｔｍの比例性およびリガンド結合親和性において、１０マイクロモル超から１ナノモル未満までのリガンド結合親和性を１回のウェル実験で測定することができる。したがって、熱シフトアッセイを使用して、単独、および／または補助調節因子の存在下で、受容体に対するリガンド結合親和性を定量的に検出することができる。
【０１１７】
さらに、熱シフトアッセイは、リガンドおよび受容体、およびリガンド、受容体および補助調節因子の間のＴｍにおける変化に基づいて、定量ベースで、アゴニストおよびアンタゴニストの同定に使用することができる。マイクロプレート熱シフトアッセイは、１つの受容体に対する多様なリガンド結合事象を、上記受容体の溶融温度の増分のまたは付加的増加として測定することができる。
【０１１８】
本発明は、リガンドの同定、およびシトクロームＰ４５０発現を調節する核受容体など核受容体内のアゴニストまたはアンタゴニストなどのリガンド同定において、特別な有用性を有する。
【０１１９】
例えば、本発明を使用して、ＥＲ−αおよびＥＲ−β（エストロゲン受容体ファミリーの２つのサブタイプ）のリガンド結合ドメインと相互作用するリガンドを同定してもよい。これらのドメインは、既知の結合部位を２つ含む。１つはエストロゲン様化合物に対するものであり、もう１つは補助調節因子タンパク質に対するものである。本発明を使用して、エストロゲン受容体と相互作用するリガンドを同定することができる。これらのリガンドは、そのリガンドの内在親和性に比例する上記受容体の安定性における観察される増加を生成する。
【０１２０】
核受容体と補助調節因子タンパク質のリガンド結合ドメインは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の中で、標準的組換え方法を用いて発現させることができる。補助調節因子ペプチドは、標準的方法を用いて合成することができる。対象とする精製タンパク質の溶融温度は、小さい分子リガンドの不在下および存在下で、マイクロプレート熱シフトアッセイによって決定することができる。
【０１２１】
対象とする上記受容体を安定化させる分子を提供する。そのような小さい分子は、上述のように、マイクロプレート熱シフトアッセイにおけるスクリーニングによって、得ることができる。スクリーニングにおける小さい分子の数は、約千から百万の範囲とすることができる。上記小さい分子は、天然または合成であることができる。
【０１２２】
いったん、１セットの小さな分子が対象とするタンパク質を安定化させると同定されれば、その後、これらの分子を一団の補助調節因子、例えばタンパク質またはペプチド断片などに対してスクリーニングし、タンパク質の熱安定性に対する作用を測定することができる。相乗的作用が観察されれば、上記化合物をアゴニストまたはアンタゴニストとして分類することができる。平衡定数をリガンドおよび補助調節因子両方に対して算出し、生物学的反応に関係づける。
【０１２３】
薬物排出／薬物クリアランスの調節を決定する
薬物リードなどの分子によって、異物代謝および薬物代謝酵素活性のアゴニストおよび非アゴニスト（アンタゴニストを含む）を同定かつ決定するための方法を述べてきた。上述したすべてのスクリーニング方法および概念は、薬物排出または薬物クリアランスの調節を決定するために等しく応用可能であり、そのように応用することを意図している。以下の議論は上記方法の実例であるが、アゴニストおよび非アゴニスト（アンタゴニストを含む）ならびにシトクロームＰ４５０発現を調節する核受容体に対する作用（および異物代謝に関して結果として生じる効果）の上述の議論および概念は、薬物輸送タンパク質を調節する受容体に対する作用（薬物排出または薬物クリアランスに関して起こる）に転用可能であることが理解されるべきである。
【０１２４】
薬物排出／薬物クリアランスの概念は、非特許文献３および非特許文献２６で述べられている。これらの参考文献は、参照によってその全体が援用される。
【０１２５】
例えば、本発明を使用して、分子を、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の安定性を改変し、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングすることによって、薬物クリアランスのアゴニストを同定することができる。上記受容体の安定性を改変し、かつ補助活性化因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する分子を、薬物クリアランスのアゴニストとして同定することができる。
【０１２６】
また、分子を、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ１つまたは複数の補助活性化因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることによって、薬物クリアランスのアゴニストを決定することができる。上記受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ補助活性化因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる分子を、薬物クリアランスのアゴニストとして同定することができる。
【０１２７】
薬物排出活性に対する薬物リードの作用は、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の安定性を改変する薬物リードを提供し、上記薬物リードを１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングすることによって決定することができる。上記薬物リードおよび補助調節因子の存在下における上記受容体の安定性のさらなる改変があるかどうかは、上記薬物リードが薬物排出活性を増加させるかどうかの指標である。
【０１２８】
また、薬物排出活性に対する薬物リードの作用は、薬物輸送タンパク質の発現を調節する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる薬物リードを提供し、上記薬物リードを１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることによって決定することができる。上記薬物リードおよび補助調節因子の存在下における上記受容体の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトがあるかどうかは、上記薬物リードが薬物排出活性を増加させるかどうかの指標である。
【０１２９】
また、異物代謝および／または薬物クリアランスに対する分子の作用は、本発明を使用して決定してもよい。上記ＳＸＲ受容体が、シトクロームＰ４５０発現および薬物輸送タンパク質を調節することによって、薬物異化作用を調節することが報告されている。上記発明的方法は、分子を、上記ＳＸＲ受容体の安定性を改変し、かつ１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の安定性をさらに改変する能力についてスクリーニングすることを含む。分子および上記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子存在下における上記受容体の安定性のさらなる改変によって、分子が異物代謝および／または薬物クリアランスのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかが示される。
【０１３０】
異物代謝および／または薬物クリアランスに対する分子の作用もまた、分子を、上記ＳＸＲ受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせ、かつ１つまたは複数の補助調節因子の存在下で上記受容体の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることによって決定してもよい。上記分子および補助調節因子の存在下における上記受容体の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトが、上記分子が異物代謝および／または薬物クリアランスのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを示す。
【０１３１】
シトクロームＰ４５０発現および薬物輸送タンパク質を調節する受容体のリガンド結合ドメイン、リガンドおよびこのドメインと相互作用する補助調節因子について記述したが、本発明は、付加的調節因子の存在下、および最終的にはＤＮＡの存在下における全長タンパク質にまで拡張することができる。
【０１３２】
また、これらの研究は、タンパク質−タンパク質相互作用に限定されないだけでなく、タンパク質−ペプチド相互作用のために使用することもできる。ここで、ペプチドは、対象とするタンパク質と優先的に相互作用するタンパク質ドメインを表す短い線状配列を表す。
【０１３３】
いま、本発明を一般的に説明してきたが、次の具体的な実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解されるであろう。実施例は例示のみを目的として本明細書に含まれるのであり、特に明記しない限り、限定的であることを意図するものではない。
【実施例】
【０１３４】
核受容体についての実験結果
補助活性化因子の存在下において、アゴニスト反応とアンタゴニスト反応で、予期される実験結果を、図１および図２に示す。アゴニストリガンドの場合、補助活性化因子タンパク質／ペプチド存在下で、上記受容体の安定性における増加が予測される（図１）が、アンタゴニストでは、付加的安定化は観察されないであろう（図２）。
【０１３５】
（実施例１）
表１は、補助活性化因子タンパク質ＳＲＣ−３の存在下、補助活性化因子ＳＲＣ−１およびＳＲＣ−３の配列に由来する２つの補助活性化因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２およびＳＲＣ３−ＮＲ２の存在下、および補助抑制因子ＮＣｏＲ−１由来の補助抑制因子ペプチドＮＣｏＲ−１の存在下において、４つの既知のアゴニストと３つの既知のアンタゴニストの一団を研究するために、ＥＲ−αおよびＥＲ−βに対して得られたデータの要約である。
【０１３６】
全ての実験におけるＥＲ−αおよびＥＲ−βの濃度は８μＭであり、リガンド濃度は２０μＭ、ＳＲＣ−３は１１μＭ、ならびに補助調節因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２、ＳＲＣ３−ＮＲ２、およびＮＣｏＲ−１は１００μＭであった。実験は、２５ｍＭリン酸塩ｐＨ８．０、２００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール内、および２５μＭ  ｄａｐｏｘｙｌスルフォンアミド染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから入手可能）存在下で、行った。
【０１３７】
最終濃度の２倍のリガンド溶液２μＬを、マイクロピペットを使って、３８４穴ブラックウォールグライナープレート（ｂｌａｃｋ  ｗａｌｌ  Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｐｌａｔｅ）内に分注した。その後、タンパク質染料溶液２μＬを３８４穴プレート内のリガンド溶液上に分注した。プレートをスピニングして、タンパク質染料とリガンド溶液の混合を確実にし、続いて、試料を加熱する間の蒸発を防ぐためにシリコーンオイル１μＬで層形成した。データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ装置上で収集し（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、および特許文献１１を参照のこと）、非線形最小二乗フィッティングソフトウェアを使用して分析した。下記に挙げた結果は、４回の実験の平均である。補助調節因子に対する値は、受容体−リガンドΔＴｍ値からのＴｍ安定化における変化を表す。
【０１３８】
【表１】
2005534011.tif 000002
【０１３９】
上記の結果から、エストロゲン様化合物の存在下、補助活性化因子タンパク質／ペプチド存在下でのカウンタースクリーニングから、付加的安定化が、両受容体で観察された。このように、これらの化合物は、文献にある通り、アゴニストのように作用する。タモキシフェンおよびＩＣＩ化合物は既知のアンタゴニストであり、補助活性化因子を補充する能力を有していない。これもまた文献と一致する。
【０１４０】
（実施例２）
表２は、補助活性化因子ＳＲＣ−１の配列由来の補助活性化因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２の存在下、および補助抑制因子ＮＣｏＲ−１由来の補助抑制因子ペプチドＮＣｏＲ−１の存在下において、既知のステロイドおよび薬物リガンドの一団を研究するため、ＳＸＲに対して得られたデータの要約を表す。
【０１４１】
全ての実験におけるＳＸＲの濃度は６μＭであり、リガンド濃度は５０μＭ、および補助調節因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２、およびＮＣｏＲ−１は、１００μＭであった。実験は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９、２００ｍＭＮａＣｌ、５％グリセロール内、２５μＭ  ｄａｐｏｘｙｌスルフォンアミド染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから入手可能）存在下で、行った。
【０１４２】
最終濃度の２倍のリガンド溶液２μＬを、マイクロピペットを使って、３８４穴ブラックウォールグライナープレート内に分注した。その後、タンパク質染料溶液２μＬを３８４穴プレート内のリガンド溶液上に分注した。プレートをスピニングして、タンパク質染料とリガンド溶液の混合を確実にし、続いて、試料を加熱する間の蒸発を防ぐためにシリコーンオイル１μＬで層形成した。データは、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ装置上で収集し（特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、および特許文献１１を参照のこと）、非線形最小二乗フィッティングソフトウェアを使用して分析した。下記に挙げた結果は、４回の実験の平均である。補助調節因子に対する値は、受容体−リガンドΔＴｍ値からのＴｍ安定化における変化を表す。
【０１４３】
例えば、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９、および非特許文献３０を参照のこと。
【０１４４】
【表２】
2005534011.tif 000003
【０１４５】
図３は、所与のリガンドに対する補助調節因子ペプチドの存在下での上記受容体の安定性における観察された変化から導かれた親和性から計算された、活性化された配座においてあるべき上記受容体に対して算出した統計的確率を示す（ΔΔＴｍ値は表２より）。
【０１４６】
表２および図３から、以下のように結論づけることができる。
【０１４７】
ａ）生体異物リガンドおよびステロイドはすべて、補助活性化因子および補助抑制因子ペプチドの補充に対して、特異的に作用する。
【０１４８】
ｂ）タクソールを除いて、リガンドはすべて、補助活性化因子ペプチドをより効率的に補充する（表２よりのＳＲＣＩ−ＮＲ２に対するΔΔＴｍ値）。
【０１４９】
ｃ）補助抑制因子ペプチドを、リガンドフリーの受容体より効率的に補充する化合物はない（表２よりのＮｃｏＲｌ−ＮＲ１に対するΔΔＴｍ値）。
【０１５０】
【表３】
2005534011.tif 000004
【０１５１】
４列と５列のデータは、非特許文献３１およびその中の参考文献から得た。
【０１５２】
表３のデータから、われわれは以下のように結論づけることができる。
【０１５３】
ａ）検査したリガンドはすべて、ＳＸＲの基礎的な生物学的状態を撹乱させる。
【０１５４】
ｂ）アゴニスト状態の確率は、文献の化合物サブセットに対する報告されたフォールド活性化と関連がある。
【０１５５】
ｃ）Ｐ４５０の誘導に関するこれらの化合物の生物学的作用は、上記受容体に対する上記化合物の親和性と、上記受容体の、補助活性化因子と補助抑制因子を区別する能力との両方に依存する。
【０１５６】
したがって、上記受容体に対して高い親和性（約５μＭ以下の結合親和性）および高い確率のアゴニスト状態（約０．８から約１．０の統計的なアゴニスト状態の確率）を有する化合物は、Ｐ４５０発現の強い誘導物質であり、中程度アゴニスト確率（約０．４から約０．８の統計的なアゴニスト状態の確率）はＰ４５０発現の弱い誘導物質であるように見え、低いアゴニスト確率（約０．０から約０．４の統計的なアゴニスト状態の確率）を有する化合物は不活性のように見える。他方、高いまたは中程度確率のアゴニスト状態（約０．４から約１．０の統計的なアゴニスト状態の確率）を有する弱い相互作用化合物（約５ｐＭ以上の結合親和性）はＰ４５０発現の弱い誘導物質のように見え、低い確率のアゴニスト状態（約０．０から約０．４の統計的なアゴニスト状態の確率）を有する化合物は不活性のように見える。
【０１５７】
上記実施例１で示した結果は、本発明を使用して、どのように核受容体ＥＲ−αおよびＥＲ−βのアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができるかを例示する。実施例２の結果は、本発明を使用して、どのように薬物候補または薬物リードなどの分子の、薬物代謝酵素／異物代謝または薬物クリアランスに対する作用を、リガンドをＳＸＲの熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングすることによって同定することができるかを例示する。同様に、本発明を使用して、薬物候補または薬物リードなどの分子の、薬物代謝酵素／異物代謝または薬物クリアランスに対する作用を、リガンドをＡｈ／ＸＲＥ、ＣＡＲおよびＰＰＡＲ−α受容体、すなわちシトクロームＰ４５０発現または薬物輸送タンパク質を調節する核受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力でそれぞれスクリーニングすることによって同定することができる。
【０１５８】
特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、および特許文献１１に記述された熱シフトアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（登録商標））によって、ステロイドまたは生体異物の、シトクロームＰ４５０発現または薬物輸送タンパク質の調節に関与する核受容体との結合に伴う溶融温度の変化を測定することができる。その後、上記熱シフトアッセイによって、補助活性化因子または補助抑制因子タンパク質の結合ドメインの、リガンド複合化された（ｌｉｇａｎｄｅｄ）核受容体との結合における付加的作用を決定することができる。
【０１５９】
システムに対する生体異物の作用は、以下のように達成される。まず、一連の検査試薬を、シトクロームＰ４５０発現を調節する核受容体または薬物輸送タンパク質に結合させてその溶融温度を変化させる能力についてスクリーニングすることができる。次に、補助抑制因子助活性化因子および補助抑制因子助抑制因子タンパク質の結合ドメインの、上記複合体の溶融温度をさらにシフトさせる能力を検査することができる（ペプチド断片は、置き換えることができる）。作用のパターンに基づいて、薬物代謝酵素の発現レベルまたは薬物排出における変化を予測することができる。
【０１６０】
補助抑制因子助活性化因子タンパク質が上記複合体の熱安定性を増加させれば、そのときは、上記生体異物はそれぞれＰ４５０酵素または薬物輸送タンパク質の発現を刺激するアゴニストであることが予測される。補助抑制因子助抑制因子ドメインが二元複合体に結合すれば、そのときは、上記生体異物はそれぞれＰ４５０酵素または薬物輸送タンパク質のアンタゴニストであることが予測される。上記生体異物が核受容体に結合しなければ、そのときは、上記化合物はそれぞれＰ４５０酵素または薬物輸送タンパク質の発現に作用しないことが予測できる。したがって、上記熱シフトアッセイを使用して、薬物候補助抑制因子または生体異物によって引き起こされる、薬物代謝酵素レベルまたは薬物クリアランスにおける変化を予測することができる。
【０１６１】
非特許文献３および非特許文献４は、ＳＸＲ（ＰＸＲとしても知られている）は生体異物の代謝を調節すること、およびタンパク質Ｐ糖タンパク質をコードする遺伝子ＭＤＲ１の発現を活性化することによって薬物排出を調節することを報告している。
【０１６２】
上述の方法によって、ＳＸＲ、Ａｈ／ＸＲＥ、ＣＡＲおよびＰＰＡＲ−α受容体をスクリーニングし、補助抑制因子助活性化因子および補助抑制因子助抑制因子タンパク質の存在下における上記受容体の熱アンフォールディング曲線に対する生体異物の作用を決定することができ、生体異物が異物代謝および／または薬物排出に対してどのような作用を有するかを決定することができる。
【０１６３】
上に述べた刊行物および特許はすべて、本明細書に参照によってその全体が援用される。また、本出願における「ａ」という用語の使用は、単数および複数の両方、すなわち１つまたは複数（１以上）を含むことを意図する。
【０１６４】
前述の発明を、明確化と理解のためにいくらか詳細に説明してきたが、当業者はこの開示を読んで、本発明および添付した特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、形式および細部における様々な変更を行うことができることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】補助抑制因子助活性化因子の存在下でのアゴニストリガンドの同定において、予期される実験結果を表す図である。
【図２】補助抑制因子助活性化因子の存在下でのアンタゴニストリガンドの同定において、予期される実験結果を表す図である。
【図３】ＳＸＲと相互作用するときの、アゴニスト反応を誘導するリガンドの統計的確率を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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