(57)【要約】線状核酸フラグメントをそれらのコンホメーションに基づいて分離するための方法を提供する。この方法は、新規な二次元ゲル電気泳動法に基づく。１態様において本発明方法は、第１次元において、核酸試料を第１組の予め定めた電気泳動条件下でゲルマトリックス中を電気泳動し；第２次元において、該ゲルマトリックスを第２組の電気泳動条件下で電気泳動することを含み、これにより、長さは等しいがコンホメーションの異なる核酸フラグメントが分離され；第１と第２の電気泳動条件は、これらの次元のうち一方では電気泳動により試料核酸フラグメントをコンホメーションと長さに基づいて分離でき、これらの次元のうち他方では電気泳動により試料フラグメントを実質的に長さに基づいて分離できるように異なっている。この相異は、好ましくは線状核酸フラグメント間のコンホメーションの相異を低減できる化学的作用因子により樹立される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非環状核酸フラグメントをそれらの長さおよびコンホメーションに基づいて複雑な核酸混合物から分離する方法であって、
−  核酸フラグメントの複雑な混合物を調製し；
−  その試料をゲル電気泳動装置に装填し、第１次元において、該試料を第１組の予め定めた電気泳動条件下でゲルマトリックス中を電気泳動し；
−  第２次元において、該ゲルマトリックスを第２組の電気泳動条件下で電気泳動する
ことを含み、
これにより、長さは等しいがコンホメーションの異なる核酸フラグメントが分離され、
第１と第２の電気泳動条件は、これらの次元のうち一方では電気泳動により試料分子をコンホメーションと長さに基づいて分離でき、これらの次元のうち他方では電気泳動により試料分子を実質的に長さに基づいて分離できるように異なっており、
この相異は化学的作用因子により、および所望により温度などの物理的作用因子の変更との組合わせにより樹立され、該因子は核酸フラグメント間のコンホメーションの相異を低減または増強できるものである方法。
【請求項２】
化学的作用因子が、核酸に対する相互作用を生じうる分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化学的作用因子が、天然または合成のインターカレーション分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
化学的作用因子が、臭化エチジウム、アクラシノマイシン、クロロキン、ジスタマイシン−エルプチシン、ダウノマイシン、ブレオマイシン、ベンゾ［ａ］ピレン、アイレマイシン、プロフラビン、ＣＩ−９５８、キアンクリン、アクチノマイシン、ＤＥＡＰフルオランテン、プソラレン、ビサントレン、ジテルカリニウム、ＢＢＭ−９３８Ａ、エチノマイシン、およびＴＯＴＯよりなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
化学的作用因子が溝結合分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
溝結合分子が、ネトロプシン、ジスタマイシン、ヘキスト３３２５８、およびＳＮ  ６９９９よりなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化学的作用因子が、核酸に対する静電相互作用を生じうる荷電分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
多型核酸を分離する、請求項１に記載の方法であって、核酸試料は１個体からの核酸または複数個体からのプールを含み、核酸は開裂、変性および再アニーリングされており、その際、プールした試料を混合した後に変性工程および再アニーリング工程を行ってホモ−およびヘテロハイブリッドの混合物を調製し、多型核酸を含む不適正対合ヘテロハイブリッドを完全適正対合ホモ−およびヘテロハイブリッドから分離する方法。
【請求項９】
さらに、多型核酸を含む不適正対合ヘテロハイブリッドを単離して該核酸を同定する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対立遺伝子頻度が個体間または個体プール間で異なる、個体または個体プールからの複雑なＤＮＡ試料のコンホメーション分離を行うための、下記の工程を含む請求項１に記載の方法：
ａ．２以上のＤＮＡ試料を混和することによりＤＮＡプールを調製し、または１個体からＤＮＡ試料を調製し、
ｂ．プール中または１個体からのＤＮＡ試料中のＤＮＡフラグメントに特異的なアダプターをアニーリングさせ、
ｃ．ＤＮＡフラグメントにライゲートしていない過剰のアダプターを除去し、
ｄ．２以上のプールを混和し、
ｅ．ＤＮＡ試料のプールまたは１個体からのＤＮＡ試料の混合物を変性させ、
ｆ．ＤＮＡ試料のプールを再アニーリングして、相同鎖を含むＤＮＡデュプレックスを形成し、
ｇ．不適正塩基対により、または完全適正対合した正常なコンホメーションをもつＤＮＡデュプレックスからの挿入／欠失ループにより形成された、異常なコンホメーションを含むデュプレックスを分離する。
【請求項１１】
正常または異常なコンホメーションをもつ単離フラグメントをシグナルで標識し、選択したゲノムクローンまたは中期染色体のサブセットのアレイ状ライブラリーであるアレイ状ライブラリーにハイブリダイズさせる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ試料をサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションの材料として使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸試料の再アニーリング効率を推定し、その際、完全適正対合デュプレックスの測定相対量が再アニーリング効率の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
非環状核酸フラグメントをそれらのコンホメーションに基づいて複雑な試料から分離する方法であって、
−核酸フラグメントの試料を調製し；
−該試料をゲル電気泳動装置に装填し、第１次元において、該試料を第１組の予め定めた電気泳動条件下でゲルマトリックス中を電気泳動し；
−第２次元において、該ゲルマトリックスを第２組の電気泳動条件下で電気泳動する
ことを含み、
これにより、長さは等しいがコンホメーションの異なる核酸フラグメントが分離され、
第１と第２の電気泳動条件は、これらの次元のうち一方では電気泳動がポリアクリルアミドゲルマトリックス中で行われ、その条件により試料分子をコンホメーションと長さに基づいて分離でき、これらの次元のうち他方では電気泳動がアガロースマトリックス中で行われ、その条件により試料分子を実質的に長さに基づいて分離できるように異なっており、下記から選択される１以上の特色を有する核酸フラグメントをコンホメーションに基づいて分離できるものである方法：挿入／欠失ループ、不適正対合核酸、スリップした不適正対の核酸；塩基のメチル化；塩基の損傷、ＵＶ損傷により生じた光生成物、電離性放射線による塩基の損傷、塩基の酸化的損傷、ＧＧＣＣ反復配列、プリン−ピリミジントラクト、塩基付加物の付加、三本鎖核酸、十字形構造、反復配列、ＤＮＡ  Ｚヘリックス、タンパク質結合核酸、ヘアピンループ、塩基ギャップ、ニック。
【請求項１５】
化学的作用因子が変性作用分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
化学的作用因子が、脂肪族アルコール：メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、アリル、ブチル、イソブチルおよびアミルアルコール、ならびにエチレングリコールなど；環状アルコール：シクロヘキシル、ベンジル、フェノールおよびｐ−メトキシフェノールなどのアルコールならびにイノシトール；脂環式化合物：アニリン、ピリジン、プリン、１，４−ジオキサン、ブチロラクトンおよびアミノトリアゾールなど；アミド：ホルムアミド、エチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、グリコールアミド、チオアセトアミド、バレロラクタムなど；尿素類：カルボヒドラジド、１，３−ジメチル尿素、エチル尿素、ｔ−ブチル尿素、チオ尿素およびアリルチオ尿素など；カルバメート：ウレタン、Ｎ−メチルウレタンおよびＮ−プロピルウレタンなど；界面活性剤：トゥイーン４０およびトリトンＸ−１００など；ならびに他の化合物：シアノグアニジン、スルファミド、グリシン、アセトニトリルなどよりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸フラグメントが、ＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、ＤＮＡ／ＲＮＡデュプレックス、ＰＮＡデュプレックス、ＰＮＡ／ＤＮＡデュプレックス、ＰＮＡ／ＲＮＡデュプレックス、ＬＮＡデュプレックス、ＬＮＡ／ＤＮＡデュプレックス、ＬＮＡ／ＲＮＡデュプレックスから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
核酸混合物が、下記の群から選択される１以上の特色により生じた異常なコンホメーションをもつ核酸フラグメントを含有する、請求項１に記載の方法：
ａ．挿入／欠失ループ；
ｂ．不適正対合核酸；
ｃ．スリップした不適正対の核酸；
ｄ．塩基のメチル化；
ｅ．塩基の損傷；
ｆ．ＵＶ損傷により生じた光生成物；
ｇ．電離性放射線による塩基の損傷；
ｈ．塩基の酸化的損傷；
ｉ．アデニントラクトおよびＧＧＣＣ反復配列など、内在屈曲により生じた配列；
ｊ．プリン−ピリミジントラクト；
ｋ．塩基付加物の付加；
ｌ．三本鎖核酸；
ｍ．十字形構造；
ｎ．反復配列；
ｏ．ＤＮＡ  Ｚヘリックス
ｐ．タンパク質結合核酸；
ｑ．ヘアピンループ；
ｒ．ＡＰ部位；
ｓ．塩基ギャップ；
ｔ．ニック。
【請求項１９】
さらに、分離した核酸フラグメントの少なくとも一部を単離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
核酸試料が１個体のゲノムに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
試料が、開裂、変性および再アニーリングした核酸フラグメントを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試料が１より多い個体からのゲノムを含むプールである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
試料が開裂、変性および再アニーリングした核酸フラグメントを含み、その際、変性工程および再アニーリング工程が試料またはプールした試料を混合してホモ−およびヘテロハイブリッドの混合物を得る前または後に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
試料またはプールした試料の各々が各ゲノムのサブセットである、請求項２０または２２に記載の方法。
【請求項２５】
試料またはプールした試料の各々が各ゲノムの高度多型性サブセットである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
試料またはプールした試料の各々が各ゲノムに由来するｃＤＮＡを含む、請求項２０または２２に記載の方法。
【請求項２７】
試料が１より多い試料プールを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析、詳細には核酸調製物をスクリーニングして、コンホメーションの変化した線状核酸フラグメントを同定、単離および特徴付けするための分野のものである。一例には、ＤＮＡ多型による、および塩基または主鎖の構造修飾によるコンホメーション変化が含まれるが、これらに限定されない。本発明方法は、不適正対合した（mismatched）非環状ＤＮＡフラグメントを、ヘテロ−およびホモハイブリッドの複雑な混合物から、それらのコンホメーションの相異に基づいて分離および単離するのに特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
線状ＤＮＡフラグメントの異常な二次構造は、分子全体の著しいコンホメーション変化をもたらすことがしばしばある。線状核酸フラグメントのそのようなコンホメーション変化は屈曲を生じる頻度が高く、これは末端−末端距離の縮小を特色とする。屈曲は、たとえば不適正対の（mispaired）塩基、挿入／欠失ループ、ＵＶ損傷、塩基付加物（base adducts）、塩基メチル化、Ａ−トラクト、ＧＧＣＣ配列、架橋、ＤＮＡヘアピンまたは十字形、スリップ鎖構造、タンパク質結合およびニッキングを含む線状ＤＮＡフラグメント中に検出または提唱されている。ＤＮＡコンホメーション全般、および二次構造変化による線状ＤＮＡフラグメントのコンホメーション変化が、各種の直接法および間接法、たとえばＸ線回折、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、電子顕微鏡検査（ＥＭ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、およびゲル・リターデーション（ゲルシフト）分析を用いて分析されている。
【０００３】
あるゲル電気泳動法では線状ＤＮＡフラグメントを長さとコンホメーションの両方に基づいて分離でき、一方、他の方法ではＤＮＡフラグメントを本質的にそれらの長さに基づいて分離する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は前者のカテゴリーに含まれる方法の例であり、アガロース電気泳動は後者の例である。ＤＮＡフラグメントを長さ、または長さとコンホメーションの両方に基づいて分離できるマトリックス中でのゲル電気泳動の厳密な物理的理論は、提示されていない。しかし、ＰＡＧＥによれば、分離される各線状ＤＮＡフラグメントの屈曲度の二乗に伴って泳動が低下するような、線状ＤＮＡフラグメントのコンホメーション依存分離が可能なことは認められている［１］。線状ＤＮＡフラグメントの屈曲と泳動のこの量的関係を実験的に利用して、ＤＮＡ屈曲の評価がなされている。そのような方法は、コンホメーションの変化した線状ＤＮＡフラグメントは正常なコンホメーションをもつＤＮＡフラグメントと比べて異なる速度でゲルマトリックス中を泳動するという事実に基づいている。各フラグメントの長さが既知である場合は、これらの泳動速度の相異をさらに利用し、それらのコンホメーションに基づいて線状ＤＮＡフラグメントを分離および単離することができる。原理的には、ＰＡＧＥを用いると多様なコンホメーションをもつ等しい長さの線状ＤＮＡフラグメントを十分な解像度で分離できるはずである。
【０００４】
変異または多型をスクリーニングするために用いられるこれまで記載されている幾つかの分析法は、この原理に基づいている。ヘテロデュプレックス分析（ＨＡ）は、不適正対合（mismatched）ヘテロハイブリッドと完全適正対合（parfectly matched）ヘテロ−およびホモハイブリッドの泳動速度を比較することにより多型を走査するのに用いる方法である。２以上の個体からの相同ＤＮＡ試料を融解および再アニーリングした後のＤＮＡ混合物は、個体間に多型性がある場合は一部または全部が不適正対合したヘテロハイブリッド、および完全適正対合したホモハイブリッドの両方を含有するであろう。あるいは、ＤＮＡ試料の配列が同一である場合、この混合物は完全適正対合したヘテロ−およびホモハイブリッドを含有するであろう。再アニーリング後、ＤＮＡ混合物をＰＡＧＥにより分析する。試料が不適正対合ハイブリッドを含有する場合、完全適正対合デュプレックスと比較してそれらのコンホメーションが変化しているため、ゲル中でのそれらの泳動は遅滞するであろう。ＨＡの感度および信頼性を高めるための幾つかの変法が開発された。コンホメーション感受性ゲル電気泳動（ＣＳＧＥ）は、ＨＡの周知の変法である［２，３］。この方式は、一塩基不適正対合の傾向を増強してコンホメーション変化を生じさせるために、緩和な変性作用溶剤を使用する（参照：ＵＳＰ５，８７４，２１２、Ｐｒｏｃｋｏｐらに交付）。
【０００５】
線状ＤＮＡフラグメントを分離するためにこれまで記載されているコンホメーション依存分離法、たとえばＨＡおよびＣＳＧＥの利用は、分析されるＤＮＡ分子が既知の長さのものである場合に限定される。さらに、１種類または多くとも数種類のＤＮＡフラグメントを含有する単純なＤＮＡ試料を検査できるにすぎない。試料が長さの異なるＤＮＡフラグメントの複雑な混合物を含有する場合、個々のバンドが重なるか、または十分には解像されないため、それらのうちどれがコンホメーションのため泳動の相異を示すかを同定するのは不可能である。これはこの手法の利用を制限するので、重大な欠点である。同様な制限が、これに類する毛細管電気泳動またはクロマトグラフィーに基づく他の手法（たとえばｄＨＰＬＣ）にも当てはまる。
【０００６】
複雑な混合物から個々の線状ＤＮＡフラグメントをそれらの長さとは関係なくコンホメーションの相異のみに基づいて分離する方法は、きわめて有用であろう。そのような方法があれば、長さの異なる多数の線状ＤＮＡフラグメントを含有する複雑な試料を分析できる。そのような方法を利用できる例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：不適正対合ヘテロデュプレックスと完全適正対合ヘテロ−およびホモデュプレックスの物理的分離により、いずれかのクラスを単離および富化することができる；多数のフラグメントの不適正対合を同時走査する；損傷を受けたＤＮＡ分子を多量の非損傷分子から単離する；ならびに核酸再アニーリングの効率を推定する。
【０００７】
線状ＤＮＡフラグメントを、長さに依存せずに、または本質的に長さに依存せずに、それらのコンホメーションに基づいて分離できる方法のひとつは、二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動系の開発である。そのような系は、ＤＮＡフラグメントを一方の次元では長さとコンホメーションの両方に基づいて分離するが、他方の次元では長さのみに基づいて分離するものであろう。
【０００８】
線状ＤＮＡフラグメントをコンホメーションに基づいて分離できる２種類の２−Ｄゲル電気泳動法が８０年代後期に記載された［４，５］。これら２方法は、異なる方式を用いて特定のコンホメーションをもつ線状ＤＮＡフラグメントを解像する。これら両方法では、アデニン−トラクト（ａｄｅｎｉｎｅ−ｔｒａｃｔ、Ａ−ｔｒａｃｔ）を含む屈曲した線状ＤＮＡフラグメントが分離された。これらの方法のうち一方は、アガロース電気泳動とＰＡＧＥ電気泳動を組み合わせて、これら２種類のマトリックス中における屈曲した線状ＤＮＡフラグメントの異なる泳動挙動を利用している。他方の方法は、ＤＮＡ構造およびコンホメーションの温度依存性を利用している。各次元について異なる温度（１０℃と６０℃）を用いることにより、異なるコンホメーションが誘導され、泳動速度の差が生じる。Ａ−トラクトによるＤＮＡ屈曲は、分子内の隣接アデニン塩基間の積み重なり相互作用の相異により起きる。Ａ−トラクト屈曲はきわめて剛性というわけではないので、系の温度を上昇させることにより排除または低域できる［６，７］。この先行技術には、より剛性である他のコンホメーション、たとえば不適正対合デュプレックスまたはＵＶ損傷を受けたデュプレックス中に形成されたものを、これらまたは他の系で分離できることは開示または示唆されていない。本発明者らの経験では、温度を２つの次元間の変量として用いて不適正対合デュプレックスを完全適正対合デュプレックスから分離することは不可能である。これは、不適正対合により生じる二次元および三次元構造がＡ−トラクトの場合より温度依存性が低いためであろう。組合わせアガロース−ＰＡＧＥ系は、線状ＤＮＡフラグメントを２種類の異なるマトリックス間で効率的に再現性をもってトランスファーするのが困難であることによって制限される。
【０００９】
弛緩型環状ＤＮＡおよびスーパーコイルＤＮＡを線状ＤＮＡから分離するために、第２次元において臭化エチジウムを用いる中性−中性アガロースゲル電気泳動による２−Ｄゲル電気泳動系が、ＷＯ９７／３９１４９に開示されている。第１次元では、低い電圧を用いて低い％のアガロース中でＤＮＡ分子がそれらの質量に従って分離される。第２次元は、高い電圧で、より高いアガロース濃度のゲル中において、インターカレーター臭化エチジウムの存在下に行われる。これらの条件下で、すべての環状ＤＮＡ分子の移動度はそれらの形状によって著しく影響されるが、線状ＤＮＡフラグメントの移動度は本質的に第１次元の場合と同じである。分離および核酸染色の後、パターンを検出する。このパターンは一般に、線状または直線化ＤＮＡを含有する第４アークの前にある３つのアークからなる。アーク１は、開環（弛緩）ＤＮＡを含有する。アーク２は、共有結合により閉じた環が弛緩形に変換したものを含有する。アーク３は、共有結合により閉じた（スーパーコイル）ＤＮＡを含有する。この方法は線状ＤＮＡフラグメントをコンホメーションに従って分離するのには使用できない点を強調すべきである。アガロースゲル電気泳動では異なるコンホメーションをもつ同じ長さの線状ＤＮＡフラグメントはほとんど完全にそれらのサイズに従って分離されるという事実があるからである。さらに、おそらくこれらの制限によるものであろうが、参考文献には、コンホメーションの異なる他のタイプのＤＮＡ分子、たとえば異常な二次元構造を含む屈曲した線状ＤＮＡフラグメント、たとえば不適正対合デュプレックスを分離するための２−Ｄゲル電気泳動法は、参考文献に開示または示唆されていない。
【００１０】
複製起点をマッピングするための２つのタイプの２−Ｄゲル電気泳動系が記載されている［８，９］。これらの系のうち一方は、前記の中性−中性アガロースゲル電気泳動を用いる。他方の系は、中性−アルカリ性アガロースゲル電気泳動を用い、第１次元ではサイズと構造による分離を行い、第２次元ではサイズのみによる分離を行う。これらの系は、レプリコン中に形成されるような異常な構造をもつ大型の非環状ＤＮＡ分子（大型のＤＮＡバブルおよびＹ字形ＤＮＡ複製フォーク）を分離することはできる。局部的な異常な二次構造、たとえばＵＶ損傷または挿入バルジの存在のため屈曲しているＤＮＡフラグメントは、これらの系では分離できない。異常な局部的二次構造を含むそのような線状ＤＮＡフラグメントと含まないものとのコンホメーションの相異は、アガロース電気泳動における泳動が確実に異なるほど大きくはなく、したがってこの系では検出されないであろう。
【００１１】
線状核酸フラグメントをコンホメーション依存分離するための理想的な２−Ｄゲル電気泳動系は、好ましくは、２つの異なるゲルマトリックス間の繁雑なトランスファー工程を排除した単一ゲルマトリックスに基づくものであろう。そのようなトランスファーはしばしばトレーリング作用を生じ、その系の検出能を低下させる。次いで、第１次元の後に物理的または化学的な因子を導入（または排除）して、異なる線状ＤＮＡフラグメントのコンホメーションに二次元および三次元構造に応じて異なる程度に影響を与える。そのような物理的または化学的な因子は、大きなコンホメーション相異のほか、たとえば一塩基対の不適正対合ＤＮＡおよび挿入または欠失バルジにより起きる小さな相異も識別できるものでなければならない。
【００１２】
線状ＤＮＡ分子に影響を与える多数の化学的因子、たとえば一価および二価カチオン、たとえばＮａ＋およびＭｇ２＋が報告されている。ＤＮＡ屈曲は一般にカチオン濃度の上昇に伴って増大する。異常な二次構造を含むＤＮＡフラグメントの屈曲を低減させる化学的因子の方が、ＤＮＡ屈曲を増大させるものより一般に有用であろう。インターカレーターは平面状の小分子であり、ＤＮＡ塩基対間に挿入（インターカレーション）することにより、核酸との疎水性相互作用を生じる。そのような相互作用は、ＤＮＡ分子の捩れがほどけて（アンツィスティング）隣接塩基対間にインターカレーター分子にとって十分な空間ができることを必要とする。この塩基対分離および同時に起きるアンツィスティングのためＤＮＡ分子の長さおよび剛性が増大し、こうしてその全コンホメーションが影響を受ける［１０］。Ａ−トラクトのため屈曲している線状ＤＮＡフラグメントにインターカレーターを添加すると、その屈曲が大幅に低減する可能性のあることが報告されている［１１〜１４］。これは、ＰＡＧＥ電気泳動と電子顕微鏡検査の両方により判定された。本発明者らは、ＰＡＧＥ電気泳動におけるゲル・リターデーション分析により測定して、あるインターカレーターが挿入／欠失ループまたはＵＶ付加物を含む線状ＤＮＡフラグメントの屈曲を同様に大幅に低減させる条件を今回決定した。
【００１３】
高濃度の変性作用性化学物質を含有するＰＡＧＥにおいて、線状一本鎖ＤＮＡフラグメントが本質的に長さのみに従って泳動することは、周知の事実である。一本鎖ＤＮＡのそのような挙動が一般的なＤＮＡ配列決定法の基礎である。本発明者らは、不適正対合ＤＮＡ分子を長さとコンホメーションの両方に従って分離した後、変性作用性化学物質を添加して一定時間加熱したゲル中でＤＮＡ分子を変性させうることを見いだした。こうして、一本鎖ＤＮＡフラグメントを第２次元で長さのみに従って分離することができ、コンホメーション依存分離可能な電気泳動系を形成できる。
【００１４】
発明の概要
線状核酸フラグメントの複雑な混合物をそれらの長さに関係なくコンホメーション依存分離するための方法を提供する。本発明方法は、種々の供給源から得られる線状核酸フラグメントに利用でき、核酸フラグメントの特別な前操作を必要としない。本発明は、下記のような（これらに限定されない）多様な概念に使用できる一般法を提供する：不適正対合ヘテロハイブリッドを完全適正対合ヘテロ−およびホモハイブリッドから物理的に分離して、いずれかのクラスを単離および富化することができる；多数のフラグメントを変異について同時走査する；損傷を受けたＤＮＡ分子を非損傷分子から単離する；ならびに核酸再アニーリングの効率を推定する。
【００１５】
本発明方法は新規な２−Ｄゲル電気泳動系を用いる。この系においてコンホメーション依存分離を達成するための２つの一般法が開発された。両方法とも、第１次元において泳動速度が長さとコンホメーションの両方に従って決定されるゲルマトリックス中で線状ＤＮＡフラグメントを分離することに基づく。この第１次元において、長さの等しい線状ＤＮＡフラグメントは、コンホメーションが異なる場合、異なる速度で泳動する。第１次元の線状ＤＮＡフラグメント分離の後、化学的作用因子を含有する電気泳動緩衝液にゲルマトリックスを浸漬する。１方法において、この化学的作用因子は可逆的相互作用により線状ＤＮＡフラグメント間のコンホメーションの相異を低減させる。他の方法では、ＤＮＡを一本鎖形に変換することにより線状ＤＮＡフラグメント間のコンホメーションの相異が排除される。これは、たとえば変性作用性化学物質の添加により、また一定期間、温度を融解点より高く保持することにより、達成される。両方法において、次いで好ましくは第１次元に対して垂直に第２次元を実施する。第２次元を第１次元に対して９０°で実施することによって最大の解像度が得られるが、他の角度も使用できる。第２次元では、コンホメーションの相異が最小限に抑えられており、または排除されているので、線状ＤＮＡフラグメントが本質的にそれらの長さに従って分離される。
【００１６】
このような２−Ｄゲル電気泳動方法により、すべての線状ＤＮＡフラグメントが長さとコンホメーションの両方の相異に基づいて分離される。正常なコンホメーションをもつ（異常な局部的二次構造の無い）線状ＤＮＡフラグメントの泳動は、両次元とも主にそれらの相対長さにより決定され、本質的にゲルマトリックスを貫く対角線状に位置するＤＮＡフラグメントの線またはアークが得られる（複雑なＤＮＡ試料の場合）。コンホメーションの変化した線状ＤＮＡフラグメント（たとえば不適正対合または損傷のため）は、第１次元において第２次元と比較して相対的に低速で泳動する。したがって、それらは第２次元の電気泳動の後、正常なコンホメーションをもつＤＮＡフラグメントのアークの前方に押しやられる。
【００１７】
本発明方法の他の態様では、異常なコンホメーションをもつ線状ＤＮＡフラグメントの泳動速度を上昇または低下させる作用因子を使用し、それらを第１次元または第２次元のいずれかで適用できる。その結果、コンホメーションの変化したそのようなＤＮＡフラグメントは、２−Ｄ電気泳動の完了後、アークの後方または前方に位置する。しかし一般に、問題のＤＮＡフラグメント（一般的には異常なコンホメーションをもつもの）がアークの前方に泳動することが好ましい。このような方法を用いると、単離された調製物はトレーリング作用のためアークから遅滞したＤＮＡフラグメントが混入しないので、より純粋である。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、生物学的機能またはゲノム位置が予め分かっている核酸フラグメントまたは分かっていない核酸フラグメントの複雑な試料をスクリーニングし、核酸をコンホメーションの相異に基づいて分離および所望により単離する方法を提供する。コンホメーションの変化した線状ＤＮＡフラグメントは、下記を含めた多様な様式で生成する可能性がある（これらに限定されない）：
ａ）ハイブリダイゼーションにより不適正対合した線状ＤＮＡフラグメントの形成：２つの試料または２つの試料プールを混和し、すべてのデュプレックスが一本鎖フラグメントに分離するように変性させる。この混合物を冷却すると、一本鎖が再アニーリングして、ホモ−およびヘテロハイブリッドの混合物になる。デュプレックスの融解のための時間および温度などのパラメーターは、再ハイブリダイゼーションに必要なパラメーターと同様に、当業者に既知である。これに関してヘテロハイブリッドは、供給源の異なる２本の核酸鎖からなる線状ＤＮＡフラグメントである。それらは完全適正対合または不適正対合のいずれかの可能性がある。これに関して完全適正対合ヘテロハイブリッドは、２つの異なる供給源からの完全相補鎖を含む、線状二本鎖核酸を表わす。不適正対合ヘテロハイブリッドの形成は、２つの異なる供給源からの鎖が実質的に相補的であるにすぎず、非相補鎖、たとえば１以上の不適正塩基対の領域を含む可能性がある場合に起きる。非相補鎖の領域は、不適正対合ヘテロハイブリッドの一方または両方の鎖内にループを生じる場合がある。ハイブリダイゼーションのために選択した条件下でヘテロハイブリッドが生成する可能性がある限り、不適正対合ヘテロハイブリッド当たり１領域という少ない非相補鎖、あるいはより多数の領域がありうる。非相補領域は、一方の鎖に他方の鎖と比較して１以上の塩基の挿入または欠失を含む場合がある。これに関してホモハイブリッドは、両方とも同一供給源（染色体）からの完全相補鎖を含む、線状二本鎖核酸を表わす；
ｂ）核酸の修飾：核酸は、それらのコンホメーションが変化するように修飾される可能性がある。そのような修飾は細胞内機序の一部（たとえばメチル化）、自然損傷（たとえば脱アミノ化）であるか、または環境に存在する化学物質および物理的作用因子による可能性がある。核酸の構造およびコンホメーションを変化させる可能性のある物理的作用因子の一例は、紫外（ＵＶ）線である。ＤＮＡ分子が紫外線照射されると、隣接ピリミジン塩基が共有修飾されて、シクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン−ピリミドン（６−４）およびＤｅｗｅｒ異性体などの光生成物を生じる可能性がある。これら３種類の主要な光生成物は、そのような分子損傷を含む線状核酸フラグメントのコンホメーション変化を誘発する；
ｃ）ＤＮＡの内在屈曲：ＤＮＡが外部からの拘束なしに永久的に弯曲した形状で存在する樹立した例がある。そのような内在屈曲は配列依存性の特性であり、ＡまたはＴヌクレオチドの短かい連続、およびらせん反復と同調したＧＧＣＣ反復などの配列のいずれによっても生じる。そのような配列を含む線状ＤＮＡフラグメントは、それらを含まないＤＮＡ配列と比較して異なるコンホメーションをもつ；
ｄ）三次元構造：ＤＮＡは、古典的なＢ形二重らせんのかなり均一な構造とは別の三次元構造をとる可能性があり、これはそのヌクレオチド配列の関数としての変動はほとんど示さない。知られている多数の大規模な核酸三次元構造が、それらを含む線状ＤＮＡフラグメントのコンホメーション変化を生じる。一例には、分子内三本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの十字形構造および接合、ならびにスリップした不適正対の（mispaired）ＤＮＡが含まれる；
ｅ）一方の鎖の加水分解（ニッキング）またはギャップ構造：線状ＤＮＡフラグメントは、ニックまたは一塩基ギャップを含む場合、変化したコンホメーションをとる可能性がある。一般に、ギャップ構造は２つのファミリーのコンホメーションを示す。一方はＢ−ＤＮＡに近似し、他方はそのギャップにおいて著しく捩れている。ニック付きＤＮＡフラグメントは一塩基ギャップと比較して小さなコンホメーション相異を示す。それらのコンホメーション相異は、７Ｍ尿素を用いて増強することができる；
ｆ）ＤＮＡ−リガンド相互作用：ＤＮＡフラグメント変化に対する相互作用を生じるリガンドがＤＮＡのコンホメーションに大幅な影響を与えることは周知である。タンパク質相互作用は、ＤＮＡのコンホメーションを著しく変化させる可能性がある。タンパク質誘発によるＤＮＡの曲がりの最も顕著な例はクロマチンであろう。ＤＮＡの曲がりは、遺伝子発現に際しても重要な役割を果たす。ＩＨＦのようなＤＮＡ結合タンパク質およびＣＡＰまたはＴＢＰのような転写因子も、著しい曲がりをＤＮＡに導入する。たとえば構築タンパク質である組込み宿主因子（ＩＨＦ）は、二本鎖ＤＮＡを特定の認識配列において１６０°曲げる。
【００１９】
以上の記載から示唆されるように、本発明は特に線状核酸、すなわちたとえばスーパーコイルＤＮＡまたは他の圧縮された三次元構造の核酸ではない、非環状核酸の分析に関する。
【００２０】
本発明による分析に適した核酸試料は、一般に５０〜１００００ｂｐ、たとえば１００〜５０００ｂｐ、好ましくは１００〜１０００ｂｐの長さの線状フラグメントを含む。核酸フラグメントの供給源は、原核細胞、真核細胞、ウイルス、または合成によるものであってもよい。供給源はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＬＮＡ、ＰＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはウイルスＤＮＡもしくはそのデュプレックスであってもよく、ウイルスは天然のもの、または異なる供給源からの核酸のベクターとして用いられるものなどであってもよい。核酸フラグメントの供給源に応じて、それらをたとえば細胞源からの単離、タンパク質からの分離、制限酵素およびＰＣＲ阻害薬の除去など、ある程度、精製処理しなくてはならない場合がある。本発明方法は、複雑なＤＮＡ試料、すなわち多数の異なる線状核酸フラグメント、たとえば少なくとも１００、または少なくとも５００、または少なくとも１０００のフラグメント；たとえば全ゲノムのフラグメントまたはそのサブセット、および１以上の個体からのゲノムＤＮＡの混合物を含有する試料に利用できるので、特に有利である点を強調すべきである。複雑な試料は長さの異なる多数のフラグメントを含有するので、一次元分離では解像しない。これには、変化したコンホメーションのため異常に泳動するフラグメントが含まれる。
【００２１】
目的長さの線状核酸フラグメントは、特にＤＮＡの場合、制限酵素消化、ＰＣＲ法の使用、ライゲーション、化学的または物理的に誘発した開裂などにより得ることができる。ターゲット核酸を同位体法または非同位体法で標識することができ、またそれらは分離後に特異的に捕獲できるタグを含むことができる。本発明方法のある態様においては、アダプターまたはリンカーを核酸フラグメントにライゲートさせる。
【００２２】
本発明の１態様においては、非環状核酸フラグメントをそれらの長さおよびコンホメーションに基づいて分離するための、下記の方法が提供される：線状核酸フラグメントの試料を調製し；その試料をゲル電気泳動装置に装填し、第１次元において、該試料を第１組の予め定めた電気泳動条件下でゲルマトリックス中を電気泳動し；第２次元において、該ゲルマトリックスを第２組の電気泳動条件下で電気泳動することを含み、これにより、長さは等しいがコンホメーションの異なる核酸が分離され、第１と第２の電気泳動条件は、これらの次元のうち一方では電気泳動により試料核酸フラグメントをコンホメーションと長さに基づいて分離でき、これらの次元のうち他方では電気泳動により試料フラグメントを実質的に長さに基づいて分離できるように異なっており、この相異は線状核酸フラグメント間のコンホメーションの相異を低減または増強できる化学的作用因子により樹立される。
【００２３】
この方法のある態様においては、第１次元のゲル電気泳動を本発明方法に従って非変性条件下で、ポリアクリルアミドゲルまたは架橋剤を含有する他のゲルマトリックスを用いて実施する。本発明の他の態様は、第１次元においてＤＮＡフラグメントのコンホメーション分離を増強するために、緩和な変性条件を用いる。この第２方式を用いる目的のひとつは、一塩基対不適正対合を含む線状核酸フラグメントの分離である。これは、たとえば第１次元において低濃度の尿素を添加するか、あるいはコンホメーション感受性ゲル電気泳動（ＣＳＧＥ）を用いて達成できる（参照：ＵＳＰ５，８７４，２１２、Ｐｒｏｃｋｏｐらに交付）。
【００２４】
本発明方法に有用なポリアクリルアミドゲルは、標的とする線状核酸フラグメントの好ましい長さ分布に応じて、広範な％のポリアクリルアミドを含有することができる。一般にそれらは約５〜約１５％のポリアクリルアミドを含有する。ゲルのサイズおよび電気的条件は、異なるコンホメーションをもつ核酸フラグメントの分離を最大限にするのに必要な泳動度に応じて調整できる。
【００２５】
いずれの次元についても、電気泳動緩衝液系は本発明方法の個々の具体的態様に用いるゲルマトリックスに応じて選択できる。両次元に同じ緩衝液系を用いる必要はない。
前記の第１次元の具体的な目的に応じて、第１ゲル電気泳動工程を広範な温度で実施できるが、一般的な用途においては温度を５〜５０℃の間で選択した温度に維持する。本発明方法の一般的な態様においては、不適正対合ヘテロハイブリッドならびに完全適正対合ヘテロ−およびホモハイブリッドの混合物を、Ａ−トラクトおよびＣＣＧＧ反復配列を含む線状ＤＮＡフラグメントの屈曲が確実に限定されるように、３５℃で分離する。そのような屈曲は低温ではより顕著である。
【００２６】
前記のように線状核酸フラグメントの長さとコンホメーションの両方による分離が可能な第１次元電気泳動の後、好ましくはゲルを電気泳動装置から取り出し、緩衝液に浸漬する。ゲルを緩衝液に一定期間浸漬し、この期間は本発明方法のその態様に用いるゲルのサイズ、マトリックスのタイプおよび厚さに応じて変更できる。この緩衝液は一般に、１種類以上の化学的作用因子を含有する、第２次元に用いる電気泳動緩衝液（たとえばＴＢＥ）から調製される。この緩衝液は、ゲルマトリックス内にある線状核酸フラグメント間のコンホメーションの相異を低減または排除する。緩衝液中の化学的作用因子は一般に、核酸との相互作用を生じうる分子、たとえば天然または合成の挿入分子、または溝（ｇｒｏｏｖｅ）結合分子である。
【００２７】
本発明方法のある態様において、化学的作用因子は核酸に対する静電相互作用を生じうる荷電分子である。
第２次元電気泳動の条件は、化学的作用因子のほかに、試料核酸のコンホメーションにさらに影響を与える物理的作用因子またはパラメーター、たとえば温度の変更により、第１次元のものと異なってもよいことを留意すべきである。
【００２８】
緩衝液は、下記よりなる群から選択される少なくとも１種類の化学的作用因子を含むが、これらに限定されない：天然または合成のインターカレーターおよびビスインターカレーター（ｂｉｓｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、たとえば臭化エチジウム、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎ）、クロロキン、ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）−エルプチシン（ｅｌｌｐｔｉｃｉｎｅ）、ダウノマイシン、ブレオマイシン、ベンゾ［ａ］ピレン、アイレマイシン（ｉｒｅｍｙｃｉｎ）、プロフラビン（ｐｒｏｆｌａｖｉｎ）、ｃＩ−９５８、キアンクリン（ｑｕｉａｃｒｉｎｅ）、アクチノマイシン、ＤＥＡＰフルオランテン（ＤＥＡＰ  ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｅ）、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、ジテルカリニウム（ｄｉｔｅｒｃａｌｉｎｉｕｍ）、ＢＢＭ−９３８Ａ、エチノマイシン（ｅｃｈｉｎｏｍｙｃｉｎ）、およびＴＯＴＯ；溝結合分子、たとえばネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ）、ジスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ）、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８、およびＳＮ  ６９９９；変性剤、たとえば脂肪族アルコール、たとえばメチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、アリル、ブチル、イソブチルおよびアミルアルコール、ならびにエチレングリコール；環状アルコール、たとえばシクロヘキシル、ベンジル、フェノールおよびｐ−メトキシフェノールなどのアルコールならびにイノシトール；脂環式化合物、たとえばアニリン、ピリジン、プリン、１，４−ジオキサン、ブチロラクトンおよびアミノトリアゾール；アミド、たとえばホルムアミド、エチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、グリコールアミド、チオアセトアミド、バレロラクタム；尿素化合物、たとえばカルボヒドラジド、１，３−ジメチル尿素、エチルチオ尿素、ｔ−ブチル尿素、チオ尿素およびアリルチオ尿素；カルバメート、たとえばウレタン、Ｎ−メチルウレタンおよびＮ−プロピルウレタン；界面活性剤、たとえばトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０およびトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００；ならびに他の化合物、たとえばシアノグアニジン、スルファミド、グリシン、およびアセトニトリルなど。コンホメーションの相異を低減させるために本発明に使用できる他の化学的作用因子および物理的作用因子は、当業者が同定または開発できる。本発明方法に用いる化学的作用因子の濃度は、それの核酸結合親和性、コンホメーションの相異を低減させる能力、および緩衝液中におけるその作用因子の安定性に依存する。
【００２９】
適切な期間のインキュベーション後、ゲルを第２次元電気泳動装置に装入する。化学的作用因子と線状核酸フラグメントの相互作用により、核酸フラグメント間のコンホメーションの相異が低減する。したがって線状核酸フラグメントは、本質的に、または完全に、それらの長さに従って分離する。第２次元電気泳動を第１次元に対して垂直に実施することにより、長さのみに従って泳動する線状核酸フラグメント（たとえば完全適正対合デュプレックス）を、第１次元において長さとコンホメーションの両方に従って泳動したもの（たとえば不適正対合デュプレックス）から分離できる。この分離は、核酸フラグメント間のコンホメーションの相異の低減度に依存する。第２次元電気泳動の後、正常構造の核酸フラグメント、すなわち異常な屈曲のない完全適正対合したものはすべて、本質的にゲルを貫く対角線に位置するアークまたは線を形成する。異常なコンホメーションにより泳動が影響を受けた線状核酸フラグメントは第２次元においては相対的に高速で泳動し、したがってそれらはアークの前方へ押しやられる。その結果、線状核酸フラグメントがそれらの長さとは関係なくコンホメーションに基づいて分離する。
【００３０】
ゲル中の核酸フラグメントは、生化学的標準法を用いて容易に検出できる。それらには、周知の方法、たとえば当業者に慣用される検出システムを利用した、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩのような蛍光性核酸染料によるゲルの後染色が含まれる。本発明方法のある態様においては、核酸間のコンホメーションの相異を低減させるために用いる化学的作用因子が蛍光性核酸染料としても作用し、核酸を視覚化するための後染色が除かれる。同位体または非同位体で前標識した核酸、ならびに当業者に慣用される検出システム、たとえばホスホルイマージャー（ｐｈｏｓｐｈｒ  ｉｍａｇｅｒ）およびフルオロイマージャー（ｆｌｕｏｒｏ  ｉｍａｇｅｒ）またはこれらに類する方法を用いて、核酸を検出することもできる。
【００３１】
２−Ｄゲル電気泳動後のゲルからの核酸フラグメントの単離は、ゲル片からの溶出および電気溶出など周知の方法により実施できる。本発明方法のある態様において、核酸フラグメントはゲルマトリックスからの単離後のＰＣＲ増幅を確実にするために特定のアダプターを含有してもよい。
【００３２】
本発明方法の特に有用な態様においては、第２次元電気泳動の前に、挿入分子である臭化エチジウムを第２次元電気泳動緩衝液に添加して、下記の間のコンホメーション相異を低減させる；ａ）不適正対合した線状ＤＮＡフラグメントと完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメント、ｂ）Ａ−トラクトの存在のため屈曲した線状ＤＮＡフラグメントと屈曲していない線状ＤＮＡフラグメント、ｃ）ＵＶ損傷を含む線状ＤＮＡフラグメントと無傷の線状ＤＮＡフラグメント、およびｄ）ニック付き鎖を含む線状ＤＮＡフラグメントと無傷の線状ＤＮＡフラグメント。
【００３３】
本発明方法の他の態様においては、第１次元の後に、変性剤尿素を含有する電気泳動緩衝液にゲルを浸漬する。次いで、第２次元電気泳動の前に、すべてのＤＮＡフラグメントが一本鎖になるまでゲルマトリックスの温度を高めて、不適正対合した線状ＤＮＡフラグメントと完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメントのコンホメーションの相異を排除する。
【００３４】
第１次元と第２次元の電気泳動条件を変更するための１方法は、異なるゲルマトリックス、たとえば一方の次元ではポリアクリルアミド、他方の次元ではアガロースを用いるものである。したがって本発明の関連態様においては、非環状核酸フラグメントをそれらのコンホメーションに基づいて複雑な核酸混合物から分離するための、下記の方法が提供される：線状核酸フラグメントの試料を調製し；該試料をゲル電気泳動装置に装填し、第１次元において、該試料を第１組の予め定めた電気泳動条件下でゲルマトリックス中を電気泳動し；第２次元において、該試料を第２組の電気泳動条件下で電気泳動する工程を含み、これにより、長さは等しいがコンホメーションの異なる線状核酸フラグメントが分離され；第１と第２の電気泳動条件は、これらの次元のうち一方では電気泳動がアガロースマトリックス中で行われ、その条件により試料分子を実質的に長さに基づいて分離でき、これらの次元のうち他方では電気泳動がポリアクリルアミドゲルマトリックス中で行われ、その条件により試料分子をコンホメーションと長さの両方に基づいて分離できるように異なっており；この方法で、下記から選択される１以上の特色を有する核酸フラグメントをコンホメーション依存分離できる：挿入／欠失ループ、不適正対合核酸、スリップした不適正対の核酸（slipped mispaired nucleic acid）；塩基のメチル化；塩基の損傷、ＵＶ損傷により生じた光生成物、電離性放射線による塩基の損傷、塩基の酸化的損傷、ＧＧＣＣ反復配列、プリン−ピリミジントラクト、塩基付加物の付加、三本鎖核酸、十字形構造、反復配列、ＤＮＡ  Ｚヘリックス、タンパク質結合核酸、ヘアピンループ、ＡＰ部位、塩基ギャップ、およびニック。
【００３５】
本発明の１態様においては、２−Ｄ電気泳動の前に、核酸試料を特定のタンパク質、ペプチドまたは抗体と共にインキュベートする。核酸フラグメントが特定のタンパク質、ペプチドまたは抗体に対する適切な結合基質を含む場合、安定な複合体が形成される。その複合体は、複合体のサイズがより大きく、線状核酸フラグメントのコンホメーションが変化しているという両方の理由で、第１次元電気泳動において、より低速で泳動するであろう。第２次元電気泳動の前に、ゲルを緩衝液に浸漬して複合体の成分間の可逆性相互作用を排除することにより、複合体を脱安定化する。したがって、線状ＤＮＡフラグメントの第２次元泳動はそれらの長さのみにより決定され、第１次元においてタンパク質に結合していた核酸フラグメントが、相互作用を生じなかったものから分離される。この方法により、被験タンパク質、ペプチドまたは抗体に対する結合部位をもつ核酸配列を分離し、次いで単離することができる。
【００３６】
後記の実施例（１〜１０）はこれらの態様の有用性を証明する。
本明細書に記載するように、本発明方法は、多様な特色のため異常なコンホメーションをもつ線状ＤＮＡデュプレックスを正常な線状ＤＮＡデュプレックスから分離するために容易に利用できる。ＤＮＡのコンホメーションを変化させ、これを本発明に従って分離できるこれらの特色は、下記のうち１以上であってよい：挿入／欠失ループ、不適正対合核酸、スリップした不適正対の核酸、塩基のメチル化、塩基の損傷、ＵＶ損傷により生じた光生成物、電離性放射線による塩基の損傷、塩基の酸化的損傷、内在屈曲を生じる配列：アデニン−トラクト、ＧＧＣＣ反復配列、プリン−ピリミジントラクト、塩基付加物の付加、三本鎖核酸、十字形構造、反復配列、ＤＮＡ  Ｚヘリックス、タンパク質結合核酸、ヘアピンループ、および一本鎖ニック。
【００３７】
本発明のさらに他の態様においては、前記の二次元電気泳動によるコンホメーションに基づく分離を含む多型核酸の検出および単離方法が提供され、その際、核酸試料は１個体からの線状核酸フラグメントを含み、または複数個体からプールされ、核酸は消化、変性および再アニーリングされており、その際、プールした試料を混合した後に変性工程および再アニーリング工程を行ってホモ−およびヘテロハイブリッドの混合物を調製し、多型核酸を含む不適正対合ヘテロハイブリッドを完全適正対合ホモ−およびヘテロハイブリッドの混合物から分離する。
【００３８】
こうして、多型核酸を含む不適正対合ヘテロハイブリッドを、たとえば前記に従って容易に分離して、それらの核酸フラグメントを同定することができる。
後記の実施例１３の具体的態様により説明するように、本発明方法は１より多い個体からのゲノムまたはゲノムサブセットを含むプールである核酸試料に利用できる。このような有用な態様において、被分析試料は消化、変性および再アニーリングされた線状核酸フラグメントを含み、その際、複数試料またはプールした試料の混合前または混合後に変性工程および再アニーリング工程を行ってホモ−およびヘテロハイブリッドの混合物を調製する。このような用途において、各個体からのサブサンプルは、当業者に周知の多数の方法で得たそのゲノムのサブセットであってもよい（実施例１３の場合）。有用な態様において、そのようなサブセットまたはサブセットのプールは、それらのゲノムの高度多型サブセットである。
【００３９】
その用途について本発明の希望する目的に応じて、被分析試料は単一個体、複数個体、１個体からのゲノムサブセット、または複数個体からの同じゲノムサブセット、あるいは多数のプールを混和したプールに由来するものであってよく、その際、試料をプールする、および／またはプールを混和する前または後に、核酸を多様な様式で処理することができる（たとえば消化、変性および再アニーリング）。
【００４０】
本発明方法のある態様においては、ゲノムＤＮＡの代わりにゲノム呈示物（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を用いる。ゲノム呈示物の調製方法は記載されている（たとえばＰＣＴ／ＵＳ９９／２４９８４、エール大学）。
【００４１】
ある態様においては、正常または異常なコンホメーションをもつ単離フラグメントをシグナル標識し、アレイ状ライブラリー、すなわち選択したゲノムクローンまたは中期染色体のサブセットのアレイ状ライブラリーにハイブリダイズさせる。
【００４２】
本発明の他の関連態様においては、個体またはプールからの複雑なＤＮＡ試料のコンホメーション分離を行い、その際、対立遺伝子頻度が個体間または個体プール間で異なる、下記の工程を含む方法が提供される：２以上のＤＮＡ試料を混和することによりＤＮＡプールを調製し、または１個体からＤＮＡ試料を調製し、プール中または１個体からのＤＮＡ試料中のＤＮＡフラグメントに特異的なアダプターをアニーリングさせ、ＤＮＡフラグメントにライゲートしていない過剰のアダプターを除去し、２以上のプールを混和し、ＤＮＡ試料のプールまたは１個体からのＤＮＡ試料の混合物を変性させ、ＤＮＡ試料のプールを再アニーリングさせて、相同鎖を含むＤＮＡデュプレックスを形成し、不適正塩基対により形成された、または完全適正対合した正常なＤＮＡデュプレックスからの挿入／欠失ループにより形成された、異常なコンホメーションを含むデュプレックスを、前記の電気泳動分離法により分離する。
【００４３】
本発明方法の有用な態様においては、個体、１以上の個体、または２以上の個体群からの再アニーリングしたＤＮＡ試料を２−Ｄ電気泳動分離して、個体または個体群において示される特定の表現型に関連する配列を単離および特徴付けする。完全適正対合ホモ−およびヘテロハイブリッド、または不適正対合ホモ−およびヘテロハイブリッドを単離した後、単離ＤＮＡフラグメントの比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を実施して、個体ゲノム内または２個体もしくは２個体群間の多型性の相異を検出する。
【００４４】
本発明方法の１態様においては、１以上の個体からの核酸試料を、当業者に周知の方法であるサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションにおいて、”ドライバー”として用いる１以上の個体からの核酸試料に対する”テスター”として用いる。この方法は、１つのゲノム試料または試料プール中にのみ存在するか、または他の試料より高濃度で存在するフラグメントを単離するために用いられる。サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションは、ゲル分析およびゲル単離の前に、完全適正対合ホモ−およびヘテロハイブリッドを不適正対合ハイブリッドから分離するために（これに限定されない）実施できる。サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションは、ゲル単離の後に、ゲルから分離した試料間の相異を同定するためにも採用できる。これには、ゲル単離とは異なる増幅用アダプターをもつ試料が含まれる。
【００４５】
本発明の他の態様においては、核酸試料の再アニーリング効率を推定する方法が提供される。この方法の一般的な態様においては、消化、変性および再アニーリングしたゲノム試料または試料プールをゲルに装填する。２−Ｄゲル電気泳動の前に、その系における完全適正対合ＤＮＡの泳動の標準品として用いる完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメントとゲノム材料を混合する。再アニーリング効率の推定は、完全適正対合標準品から形成されたアーク中における完全適正対合ゲノム材料の画分を基準とする。
【００４６】
実施例
実施例１
インターカレーター法を用いた、完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメントからの、シトシンバルジを含むＣｙ５標識した線状ＤＮＡフラグメントの分離および検出
５種類の異なる２９８ｂｐ線状ＤＮＡフラグメントを作製した。各フラグメントは、中央に１つの特定シトシンバルジを含んでいた；シトシン１〜５個のバルジサイズ。他の点ではＤＮＡフラグメントは互いに同一であった。完全適正対合２９８ｂｐ線状ＤＮＡフラグメントも作製した。シトシンバルジを含まない点以外は、このフラグメントはバルジ付きＤＮＡフラグメントと比較して同一の塩基配列をもっていた。これらの２９８ｂｐ線状ＤＮＡフラグメントは、３つの短かいＤＮＡフラグメントを用いて作製された。２つのフラグメントはプラスミドｐＢＲ３２２からＰＣＲ増幅された。一方のフラグメント（１２７ｂｐ）はＣｙ５蛍光分子で５’末端標識され、ＡｖａＩ消化後に３’側−非対称オーバーハングを含んでいた。他方（１３２ｂｐ）は、ＢａｎＩＩ消化後に５’側−非対称オーバーハングを含んでいた。１つのフラグメント（３１ｂｐ）は、特定シトシンバルジを含む２つのオリゴヌクレオチドとして合成された。それは、他の２つのフラグメント上のオーバーハングの１つにそれぞれ相補的な５’および３’側−非対称オーバーハングを含んでいた。３種類すべてのフラグメントを等モル濃度でライゲートさせると、フラグメントの中央に特定バルジをもつ１つの２９８ｂｐ  ＤＮＡフラグメントが形成された。
【００４７】
５’Ｃｙ５標識を含む５種類の完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメント（１５５ｂｐ、３５７ｂｐ、５４３ｂｐ、８５７ｂｐおよび１３９５ｂｐ）を、同様にｐＢＲ３２２からのＰＣＲ増幅により作製した。
【００４８】
前記すべてのフラグメントの混合物を２−Ｄ  ＣＤＥゲル電気泳動により分離した。ゲルマトリックスは、２９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド混合物から調製した１０％ポリアクリルアミドからなっていた。このゲルを１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭのトリス塩基、８９ｍＭのボラート、および２ｍＭのＥＤＴＡ）中で１時間、重合させた。第１次元電気泳動を、Ｈｏｅｆｅｒ  ＳＥ  ６６０垂直電気泳動システムにおいて、１８×２４ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。３５℃で２時間、１０Ｗで、１×ＴＢＥを上下両方の緩衝液チャンバーに入れて、ゲルを操作した。ゲルをガラスサンドイッチから取り出して、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌに浸漬した。ゲルをこの緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで１００ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液中で短時間洗浄した。
【００４９】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平電気泳動システムにおいて実施された。２０℃で２時間、１０Ｗで、両緩衝液チャンバー内に５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥを用いて、第１次元電気泳動に対して垂直に、ゲルを操作した。ゲルマトリックスを介した緩衝液チャンバー内の電極間の接続は、紙電極芯材料（ｐａｐｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｗｉｃｋ）により行われた。第２次元ゲル電気泳動の後、ゲルマトリックスを２００ｍｌの１×ＴＢＥ中で５分間洗浄した。
【００５０】
蛍光走査方式のＡＰ  バイオテック、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００可変方式イマージャーにより、励起波長６３３ｎｍおよび６７０ＢＰ３０発光フィルターを走査に用いて、線状ＤＮＡフラグメントの蛍光検出を実施した。図１に示すように、完全適正対合ＤＮＡフラグメントはすべて、ゲルを貫く対角線に位置するアークを形成する。シトシン２〜５個のバルジを含むＤＮＡフラグメントは明らかにアークの前方へ移動するが、シトシン１個のバルジはこのゲルマトリックスではそれの完全適正対合ＤＮＡカウンターパートから解像されない。
【００５１】
実施例２
インターカレーター法を用いた、完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメントからの、フラグメント中央または一端付近にシトシンバルジを含む線状ＤＮＡフラグメントの分離および検出
特定シトシンバルジを含む非標識線状ＤＮＡフラグメントを、実施例１の記載に従って作製した。等モルライゲーションを行う代わりに、過剰の一方の末端フラグメントとのライゲーションを行って、２種類の主ライゲーション生成物を形成した。一方は、実施例１に記載したように中央にバルジをもつ２９８ｂｐの生成物であった。他方は、バルジ分子を含む３１ｂｐの合成分子と１２７ｂｐのＰＣＲフラグメントとのライゲーションにより形成された１５８ｂｐの生成物であった。このフラグメントはその末端から１５ｂｐの位置にバルジをもつ。
【００５２】
５’Ｃｙ５標識を含む５種類の完全適正対合したＤＮＡフラグメント（１５５ｂｐ、３５７ｂｐ、５４３ｂｐ、８５７ｂｐおよび１３９５ｂｐ）を、同様にｐＢＲ３２２からのＰＣＲ増幅により作製した。
【００５３】
前記すべてのフラグメントの混合物を２−Ｄ  ＣＤＥゲル電気泳動により分離した。ゲルマトリックスは、９９：１  アクリルアミド：ビス−アクリロイルピペラジン（ＢＡＰ）混合物から調製した１０％ポリアクリルアミドからなっていた。このゲルを１×ＴＴＥ緩衝液（９０ｍＭのトリスＨＣｌ、３０ｍＭのタウリンおよび１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）中で重合させた。第１次元電気泳動を、Ｈｏｅｆｅｒ  ＳＥ  ６６０垂直電気泳動システムにおいて、１８×２４ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。３５℃で２時間、１０Ｗで、１×ＴＴＥを上下両方の緩衝液チャンバーに入れて、ゲルを操作した。ゲルをガラスサンドイッチから取り出して、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＴＥ緩衝液１００ｍｌに浸漬した。ゲルをこの緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで１００ｍｌの１×ＴＴＥ緩衝液中で短時間洗浄した。
【００５４】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平電気泳動システムにおいて実施された。２０℃で２時間、１０Ｗで、両緩衝液チャンバー内に５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＴＥを用いて、第１次元電気泳動に対して垂直に、ゲルを操作した。ゲルマトリックスを介した緩衝液チャンバー内の電極間の接続は、紙電極芯材料により行われた。第２次元ゲル電気泳動の後、臭化エチジウム染色ＤＮＡフラグメントのＵＶ検出のために、ゲルマトリックスをＵＶＰ  ＧＤＳ−８０００ゲルドキュメンテーションシステムに装入した。
【００５５】
図２に示すように、完全適正対合ＤＮＡフラグメントは、ゲルを貫く対角線に位置するアークを形成した。中央にシトシン１〜５個のバルジを含むＤＮＡフラグメントは明らかにアークの前方へ移動する。末端付近にシトシン１〜５個のバルジを含むＤＮＡフラグメントもアークの前方へ移動する。各組のＤＮＡ分子は、第２次元においてほぼ同じ速度で泳動し、異なるバルジにより誘発されたコンホメーション変化で第２次元において類似の移動度をもつＤＮＡフラグメントが得られたことを示す。
【００５６】
実施例３
インターカレーター法を用いた、７×８ｃｍゲル方式における、完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメントからの、シトシンバルジを含むＣｙ５標識した線状ＤＮＡフラグメントの分離および検出
シトシンバルジを含むＣｙ５標識線状ＤＮＡフラグメントを、実施例１の記載に従って作製した。これらのフラグメントを、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００および１０００ｂｐのフラグメントを含む１００ｂｐフルオレセインラダー（バイオラド）と混和した。次いでこのＤＮＡ混合物を、６％ポリアクリルアミドゲルを用いる２−Ｄ  ＣＤＥゲル電気泳動により分離した。ゲルを１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭのトリス塩基、８９ｍＭのボラート、および２ｍＭのＥＤＴＡ）中で１時間、重合させた。第１次元ゲル電気泳動を、バイオラドＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ垂直電気泳動システムにおいて、７×８ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。室温で９０分間、２０ｍＡで、１×ＴＢＥを上下両方の両衝液チャンバーに入れて、ゲルを操作した。ゲルをガラスサンドイッチから取り出して、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌに浸漬した。ゲルをこの緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで１００ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液中で短時間洗浄した。
【００５７】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平電気泳動システムにおいて実施された。合計４５分間、２０ｍＡで、両緩衝液チャンバー内に５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥを用いて、第１次元電気泳動に対して垂直に、ゲルを操作した。ゲルマトリックスを介した緩衝液チャンバー内の電極間の接続は、紙電極芯材料により行われた。実施例３に記載したものと同じゲル電気泳動設定を用いた。第２次元ゲル電気泳動の後、ゲルマトリックスを２００ｍｌの１×ＴＢＥ中で５分間洗浄した。
【００５８】
蛍光走査方式のＡＰ  バイオテック、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００可変方式イマージャーにより、励起波長６３３ｎｍおよび６７０ＢＰ３０発光フィルターをＣｙ５検出に用い、励起波長５３２ｎｍおよび５３６ＳＰ発光フィルターをフルオレセイン検出に用いて、ＤＮＡフラグメントの蛍光検出を実施した。図３に示すように、完全適正対合ＤＮＡフラグメントはゲルを貫く対角線に位置するアークを形成した。シトシン３〜５個のバルジを含むＤＮＡフラグメントは明らかにアークの前方へ押しやられたが、シトシン１および２個のバルジはこのゲルマトリックスではそれの完全適正対合ＤＮＡから解像されなかった。
【００５９】
実施例４
インターカレーター法を用いた、複雑なゲノム呈示物からの、フラグメント中央にシトシンバルジを含む線状ＤＮＡフラグメントの分離および検出
シトシンバルジを含むＣｙ５標識した線状ＤＮＡフラグメントを、実施例１の記載に従って作製した。
【００６０】
１個体からの全血よりＤＮＡ試料を単離し、ＢｓｔＹ  Ｉで消化し、精製した。これらの制限フラグメントにアダプターをライゲートさせた。アダプター特異的プライマーおよびＣｙ５標識Ａｌｕ  ３’特異的プライマー（内部ＢｂｓＩ部位を含む）を用いるＰＣＲを実施し、得られたＡｌｕ  ３’フラグメントをＧＦＸ（商標）カラムにより精製し、次いでＢｂｓＩおよびＢｓｔＹ  Ｉで消化し、ＧＦＸ（商標）により精製した（参照：ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４９８４、エール大学）。
【００６１】
バルジを含むＤＮＡフラグメントを２μｌのＡｌｕフランクフラグメントと混合した。次いでこのＤＮＡ混合物を、８％ポリアクリルアミドゲルを用いる２−Ｄゲル電気泳動により分離した。ゲルを１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭのトリス塩基、８９ｍＭのボラート、および２ｍＭのＥＤＴＡ）中で１時間、重合させた。第１次元ゲル電気泳動を、バイオラドＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ垂直電気泳動システムにおいて、７×８ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。室温で９０分間、２０ｍＡで、１×ＴＢＥを上下両方の両衝液チャンバーに入れて、ゲルを操作した。ゲルをガラスサンドイッチから取り出して、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌに浸漬した。ゲルをこの緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで１００ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液中で短時間洗浄した。
【００６２】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平電気泳動システムにおいて実施された。合計６０分間、２０ｍＡで、両緩衝液チャンバー内に５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥを用いて、第１次元電気泳動に対して垂直に、ゲルを操作した。ゲルマトリックスを介した緩衝液チャンバー内の電極間の接続は、紙電極芯材料により行われた。実施例３に記載したものと同じゲル電気泳動設定を用いた。第２次元ゲル電気泳動の後、ゲルマトリックスを２００ｍｌの１×ＴＢＥ中で５分間洗浄した。
【００６３】
蛍光走査方式のＡＰ  バイオテック、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００可変方式イマージャーにより、励起波長６３３ｎｍおよび６７０ＢＰ３０発光フィルターをＣｙ５検出に用い、励起波長５３２ｎｍおよび５３６ＳＰ発光フィルターをフルオレセイン検出に用いて、ＤＮＡフラグメントの蛍光検出を実施した。図４に示すように、ＡｌｕフランクＤＮＡフラグメントはゲルを貫く対角線に位置するアークを形成した。シトシン３〜５個のバルジを含むＤＮＡフラグメントは明らかにアークの前方へ押しやられたが、シトシン１および２個のバルジはこのゲルマトリックスではそれの完全適正対合ＡｌｕフランクＤＮＡフラグメントから解像されなかった。
【００６４】
実施例５
インターカレーター法を用いた、完全適正対合ＤＮＡフラグメントからの、Ａ−トラクトを含むＤＮＡフラグメントの分離
ＨａｅＩＩＩ消化したファイ−ｘ  １７４の制限フラグメントは、Ａ−トラクトのため屈曲した１種類の２８１ｂｐフラグメントを含有する。本発明方法の有効性を証明するために、２−Ｄゲル電気泳動系によりこのフラグメントを、ＨａｅＩＩＩ消化したファイ−ｘ  １７４中の残りの制限フラグメントから分離した。実施例１の記載に従って作製した、中央にシトシン３個のバルジを含む２９８ｂｐフラグメントを、ＨａｅＩＩＩ消化したファイ−ｘ  １７４に対する対照として添加し、ヘテロデュプレックス分析について周知のマトリックスであるＭＤＥ（商標）ゲルマトリックス（ＦＭＣ  バイオプロダクツ）を用いて、２−Ｄゲル電気泳動系の有効性を証明した。
【００６５】
このゲルマトリックスは０．７５×ＭＤＥ溶液からなっていた。ゲルを１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭのトリス塩基、８９ｍＭのボラート、および２ｍＭのＥＤＴＡ）中で１時間、重合させた。第１次元ゲル電気泳動を、バイオラドＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ垂直電気泳動システムにおいて、７×８ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。室温で９０分間、２０ｍＡで、１×ＴＢＥを上下両方の両衝液チャンバーに入れて、ゲルを操作した。ゲルをガラスサンドイッチから取り出して、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌに浸漬した。ゲルをこの緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで１００ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液中で短時間洗浄した。
【００６６】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平電気泳動システムにおいて実施された。合計６０分間、中間写真を０、３０および４５分目に撮影しながら、２０ｍＡで、両緩衝液チャンバー内に５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥを用いて、第１次元電気泳動に対して垂直に、ゲルを操作した。ゲルマトリックスを介した緩衝液チャンバー内の電極間の接続は、紙電極芯材料により行われた。第２次元ゲル電気泳動の後、臭化エチジウム染色ＤＮＡフラグメントのＵＶ検出のために、ゲルマトリックスをＵＶＰ  ＧＤＳ−８０００ゲルドキュメンテーションシステムに装入した。図５に示すように、正常な二次構造を含むＤＮＡフラグメントはゲルを貫く対角線に位置するアークを形成する。異常な二次構造を含むＤＮＡフラグメントは明らかにアークの前方へ泳動し、その際、低速で泳動するバンドは３塩基シトシンバルジを含むフラグメントであり、高速で泳動するバンドはＡ−トラクトを含むＤＮＡフラグメントである。第２次元電気泳動時間を延長することにより、これ以上の分離を達成できる（図２ｂをｄと対比）。
【００６７】
実施例６
インターカレーター法を用いた、無傷ＤＮＡフラグメントからの、ＵＶ損傷を含むＤＮＡフラグメントの分離
光生成物を効率的に形成するために、下記の手法を用いた。５４５ｂｐのＰＣＲ生成物（０．３ｐｍｏｌ／μｌ；１０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ８、および２０ｍＭのアセトフェノン中）を３００ｎｍで０、５、１５、３０および６０分間、ＵＶＰ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ＴｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒによりＵＶ照射した。小滴（３μｌ）をペトリ皿の底に入れた。濡れたティッシュペーパーを皿の側面に付着させることにより、水凝固環境を形成した。次いでペトリ皿を裏返してＵＶ源に乗せた。滴を効率的に冷却するために、角氷を入れたプラスチックバッグでペトリ皿を覆った。照射されたＰＣＲ生成物が光源に暴露されないように注意した。ＵＶ照射後、ＵＶ損傷を含むＤＮＡフラグメント３μｌを、１μｌのＨａｅＩＩＩ消化したファイ−ｘ  １７４に添加した。
【００６８】
次いでこのＤＮＡ混合物を、９％ポリアクリルアミドゲルを用いる２−Ｄゲル電気泳動により分離した。ゲルを０．５×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭのトリス塩基、８９ｍＭのボラート、および２ｍＭのＥＤＴＡ）中で１時間、重合させた。第１次元ゲル電気泳動を、バイオラドＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ垂直電気泳動システムにおいて、７×８ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。室温で９０分間、２０ｍＡで、１×ＴＢＥを上下両方の両衝液チャンバーに入れて、ゲルを操作した。ゲルをガラスサンドイッチから取り出して、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌに浸漬した。ゲルをこの緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで１００ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液中で短時間洗浄した。
【００６９】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平電気泳動システムにおいて実施された。合計９０分間、１５ｍＡで、両緩衝液チャンバー内に５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥを用いて、第１次元電気泳動に対して垂直に、ゲルを操作した。ゲルマトリックスを介した緩衝液チャンバー内の電極間の接続は、紙電極芯材料により行われた。第２次元ゲル電気泳動の後、臭化エチジウム染色ＤＮＡフラグメントのＵＶ検出のために、ゲルマトリックスをＵＶＰ  ＧＤＳ−８０００ゲルドキュメンテーションシステムに装入した。図６に示すように、無傷のＤＮＡフラグメントはゲルを貫く対角線に位置するアークを形成する。ＵＶ損傷を含むＤＮＡフラグメントは、明らかにアークの前方へ泳動する。ＵＶ損傷がＤＮＡフラグメント中に非特異的に形成されるため、ＵＶ損傷を含むＤＮＡフラグメントが幅広いバンド状に分離する。
【００７０】
実施例７
インターカレーター法を用いた、無傷ＤＮＡフラグメントからの、単一ニックを含むＤＮＡフラグメントの分離
ＨｉｎｄＩＩＩ消化したファイ−ｘプラスミドをニッキングエンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ（ニューイングランド・バイオラボ）で処理した。Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉは、デュプレックスの１本の鎖のみを配列特異的に加水分解する。Ｎ．ＢｓｔＮＢ  Ｉ処理の後、１０のＤＮＡフラグメントのうち４つが特異的ニックを含む；５’末端から８５ｂｐの位置にニックを含む７７０ｂｐフラグメント、５’末端か１８１ｂｐの位置にニックを含む３４５ｂｐフラグメント、５’末端から３２ｂｐおよび７１ｂｐの位置にニックを含む３３５ｂｐフラグメント、ならびに５’末端から２３ｂｐおよび２５６ｂｐの位置にニックを含む２９１ｂｐフラグメント。
【００７１】
次いで１０全部のフラグメントを２−Ｄ  ＣＤＥゲル電気泳動により分離する。ゲルマトリックスは、７Ｍの尿素を含有する２９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド混合物から調製した８％ポリアクリルアミドからなっていた。このゲルを１×ＴＢＥ緩衝液中で１時間、重合させた。第１次元ゲル電気泳動を、バイオラドＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ垂直電気泳動システムにおいて、７×８ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。室温で４５分間、２０ｍＡで、１×ＴＢＥを上下両方の両衝液チャンバーに入れて、ゲルを操作した。ゲルをガラスサンドイッチから取り出して、１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌに１０分間、３回浸漬した。次いで５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌにゲルを１０分間浸漬し、１００ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液中で短時間洗浄した。
【００７２】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平電気泳動システムにおいて実施された。合計４５分間、５Ｗで、両緩衝液チャンバー内に５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥを用いて、第１次元電気泳動に対して垂直に、ゲルを操作した。ゲルマトリックスを介した緩衝液チャンバー内の電極間の接続は、紙電極芯材料により行われた。第２次元ゲル電気泳動の後、臭化エチジウム染色ＤＮＡフラグメントのＵＶ検出のために、ゲルマトリックスをＵＶＰ  ＧＤＳ−８０００ゲルドキュメンテーションシステムに装入した。図７に示すように、無傷のＤＮＡフラグメントはゲルを貫く対角線に位置するアークを形成する。ニックを含む３つのＤＮＡフラグメント（３４５ｂｐ、３３５ｂｐおよび２９１ｂｐ）は明らかにアークの前方へ泳動する。
【００７３】
実施例８
インターカレーター法を用いた、７×８ｃｍゲル方式における、完全適正対合したＤＮＡフラグメントからの、ＰｖｕＩＩ結合部位を含むＣｙ５標識したＤＮＡフラグメントの分離および検出
ＮａｒＩおよびＡｖａＩを用いるｐＵＣ１８の二重消化により、２つのフラグメントが形成された；５’末端から７２ｂｐの位置にＰｖｕＩＩ認識部位を含む１９８ｂｐ線状ＤＮＡフラグメント、および５’末端から１９６ｂｐの位置にＰｖｕＩＩ認識部位を含む２４８８ｂｐフラグメント。生成物をクレノー延長によりＣｙ５標識した。これら２つのフラグメントを、ファイ−Ｘ／ＨａｅＩＩＩ消化ＤＮＡ（ＰｖｕＩＩ認識部位を含まない）およびＰｖｕＩＩと、結合反応物中で混合した。結合反応物（２０μｌ）は、ＰｖｕＩＩ（１ｎＭ）、１０ｎＭのＰｖｕＩＩ部位含有ＤＮＡフラグメント、５０ｎｇのファイ−ｘ／ＨａｅＩＩＩ消化ＤＮＡ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＤＴ、１ｍＭのＥＤＡ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、３０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、および７．５％のグリセロールを含有していた。２−Ｄ電気泳動の前に、結合反応物を室温で２０分間、インキュベートした。
【００７４】
ゲルマトリックスは、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド混合物から調製した９％ポリアクリルアミドからなっていた。ゲルを０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１時間、重合させた。第１次元ゲル電気泳動を、バイオラドＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ垂直電気泳動システムにおいて、７×８ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。４℃で１２０分間、５Ｗで、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する０．５×ＴＢＥを上下両方の両衝液チャンバーに入れて、ゲルを操作した。ゲルをガラスサンドイッチから取り出して、１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌに１０分間、３回浸漬した。次いで５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌにゲルを１０分間浸漬し、１００ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液中で短時間洗浄した。
【００７５】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平電気泳動システムにおいて実施された。室温で合計５５分間、５Ｗで、両緩衝液チャンバー内に５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１×ＴＢＥを用いて、第１次元電気泳動に対して垂直に、ゲルを操作した。ゲルマトリックスを介した緩衝液チャンバー内の電極間の接続は、紙電極芯材料により行われた。
【００７６】
蛍光走査方式のＡＰ  バイオテック、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００可変方式イマージャーにより、励起波長６３３ｎｍおよび６７０ＢＰ３０発光フィルターをＣｙ５検出に用い、励起波長５３２ｎｍおよび６１０ＢＰ３０発光フィルターを臭化エチジウム検出に用いて、ＤＮＡフラグメントの蛍光検出を実施した。図８に示すように、結合部位を含まない完全適正対合ＤＮＡフラグメントおよび結合部位を含む１９６ｂｐの非結合ＤＮＡフラグメントはゲルを貫く対角線に位置するアークを形成する。ＰｖｕＩＩに対する結合部位を含む１９６ｂｐのＤＮＡフラグメントは明らかにアークの前方へ押しやられたが、２４５５ｂｐフラグメントは、このゲルマトリックスにおいて他の非結合ＤＮＡフラグメントから解像するには大きすぎた。
【００７７】
実施例９
インターカレーター法を用いた、７×８ｃｍゲル方式における、完全適正対合したフルオレセイン標識ＤＮＡフラグメントからの、シトシン４個のバルジを含むＣｙ５標識ＤＮＡフラグメントの分離および検出
中央にシトシン４個のバルジを含む５’Ｃｙ５標識した２９８ｂｐフラグメントを、実施例１の記載に従って作製した。バルジを含むフラグメントを、７５〜１６３２ｂｐの１０種類の完全適正対合ＤＮＡフラグメントを含むフルオレセイン低域ＤＮＡ標準品（バイオラド）と混和し、次いで２−Ｄ  ＣＤＥゲル電気泳動により分離した。ゲルマトリックスは、２９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド混合物から調製した８％ポリアクリルアミドからなっていた。ゲルを１×ＴＢＥ緩衝液中で１時間、重合させた。第１次元ゲル電気泳動を、バイオラドＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ垂直電気泳動システムにおいて、７×８ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。室温で９０分間、２０ｍＡで、１×ＴＢＥを上下両方の両衝液チャンバーに入れて、ゲルを操作した。ゲルをガラスサンドイッチから取り出して、７Ｍの尿素を含有する１×ＴＢＥ緩衝液１００ｍｌに浸漬した。ゲルをこの緩衝液中で１０分間インキュベートし、次いで９４℃に５分間保持した。ゲルの乾燥を防ぐために、ゲルをＰｌｅｘｉｇｌａｓサンドイッチ内で加熱した。
【００７８】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平電気泳動システムにおいて実施された。２０℃で１時間、２０Ｗで、両緩衝液チャンバー内に１×ＴＢＥを用いて、第１次元電気泳動に対して垂直に、ゲルを操作した。ゲルマトリックスを介した緩衝液チャンバー内の電極間の接続は、紙電極芯材料により行われた。
【００７９】
実施例３の記載に従ってＤＮＡフラグメントの蛍光検出を実施した。図９に示すように、完全適正対合ＤＮＡフラグメントに相当するＤＮＡ鎖はゲルを貫く対角線に位置するアークを形成する（図中の緑色バンド）。シトシン４個のバルジを含む二本鎖ＤＮＡフラグメントに由来するＤＮＡ鎖（図中の赤色バンド）は、明らかにアークの前方へ泳動した。
【００８０】
実施例１０
第１次元においてＰＡＧＥ、第２次元においてアガロース電気泳動を用いた、完全適正対合ＤＮＡフラグメントからの、シトシン３個のバルジを含むＤＮＡフラグメントの分離および検出
中央にシトシン３個のバルジを含む２９８ｂｐフラグメントを、実施例１の記載に従って作製した。バルジを含むフラグメントを、ＨａｅＩＩＩ消化したファイ−ｘ  １７４の制限フラグメントに添加した。これは、Ａ−トラクトのため屈曲した２８１ｂｐフラグメントも含有する。この混合物を２−Ｄゲル電気泳動により分離した。第１次元ゲルマトリックスは、２９：１  アクリルアミド：ビスアクリルアミド混合物から調製した１０％ポリアクリルアミドからなっていた。ゲルを１×ＴＡＥ緩衝液中で１時間、重合させた。第１次元ゲル電気泳動を、バイオラドＭｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ垂直電気泳動システムにおいて、７×８ｃｍのガラスサンドイッチ（１ｍｍのスペーサー）を用いて実施した。室温、２０ｍＡで、１×ＴＡＥを上下両方の両衝液チャンバーに入れ、ブロムフェノールブルー色素がゲルの２／３の長さを泳動するまでゲルを操作した。第２次元電気泳動のために、１．７％アガロースゲルを１×ＴＡＥ中でキャストした。このゲルは、ゲル上端付近に水平に位置する１ｍｍのレーンを備えていた。第１次元電気泳動の後、ＤＮＡ含有レーンをゲルから切り取った。温アガロースを用いて、このＰＡＧＥストリップをアガロースゲルの上記レーンにシールした。
【００８１】
第２次元ゲル電気泳動は、ファルマシアＭｕｌｔｉｐｈｏｒ水平サブマリン電気泳動システムにおいて実施された。２０℃で１時間、１１０Ｖで、１×ＴＡＥ緩衝液を用いてゲルを操作した。第２次元ゲル電気泳動の後、臭化エチジウム染色ＤＮＡフラグメントのＵＶ検出のために、ゲルをＵＶＰ  ＧＤＳ−８０００ゲルドキュメンテーションシステムに装入した。図１０に示すように、正常な二次構造を含むＤＮＡフラグメントはゲルを貫く対角線に位置するアークを形成する。異常な二次構造を含むＤＮＡフラグメントは明らかにアークの前方へ泳動する。ここで、低速で泳動する方のバンドは３塩基シトシンバルジを含むフラグメント、高速で泳動する方のバンドはＡ−トラクトを含むＤＮＡフラグメントである。
【００８２】
実施例１１
ヒトゲノムからの高多型性配列の単離および特徴付け
１０人の個体からの全血よりＤＮＡ試料を単離し、個別にＢｓｔＹ  Ｉで消化し、精製した。アダプターをこれらの制限フラグメントにライゲートさせた。アダプター特異的プライマーおよびＡｌｕ  ３’特異的プライマー（内部ＢｂｓＩ部位を含む）を用いるＰＣＲを実施し、得られたＡｌｕ  ３’フランクフラグメントをＧＦＸ（商標）カラムにより精製し、次いでＢｂｓＩおよびＢｓｔＹ  Ｉで消化し、ＧＦＸ（商標）により精製した（参照：ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４９８４、エール大学）。次いで、各個体からのＰＣＲ生成物４μｇを混和し、沈殿させ、４μｌの３×ＥＥ緩衝液に再懸濁し、３５μｌの鉱油を試料上部に添加した。次いで試料を９４℃に５分間加熱し、１μｌの５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、６７℃の水浴内で２０時間インキュベートした。
【００８３】
２０時間後、試料を１×ＴＥおよびｔＲＮＡ（１００ｎｇ／μｌ）中に希釈して８０μｌにした。再アニーリングしたフラグメント１０μｌまたは５μｌにアダプターをライゲートさせ、ポリメラーゼを用いてフラグメントを延長し、平滑末端を形成した。次いでこの試料を前記に従って２−Ｄゲル電気泳動した。アークの前方へ泳動するＤＮＡ、したがって完全には適正対合していないＤＮＡをゲルから切り取り、１×ＴＥ中、３７℃で一夜、ゲルから溶出させた。アークから単離したＤＮＡも溶出させた。これは完全適正対合のはずである。単離したＤＮＡフラグメントを、アダプター特異的プライマーを用いてさらに増幅した。次いで得られたＰＣＲフラグメントをプラスミド中へクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。次いで挿入配列を配列決定し（４例を表１に示す）、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（商標）によるジェノタイピングのために、Ａｌｕ特異的プライマーに対する特異的リバースプライマーを２３クローン（アーク前方において単離した１４クローン、およびアークからの９クローン）について作製した。１０人の個体からのＤＮＡ試料についての配列決定およびジェノタイピングにより、アーク前方において単離した１４中７クローンは最初のプールの１０人の個体間で多型性であることが確認された（２つの多型配列の例を図１１ａおよび１１ｂに示す）。これに対し、アーク自体から単離した９配列はいずれも多型性でなかった（２つの配列の例を図１１ｃおよび１１ｂに示す）。したがってこの方法で、ヒトゲノムおよび他のゲノム中の新規な未知の多型配列を単離および検出できる。
【００８４】
【表１】
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表１は、２−Ｄ  ＣＤＥゲルから単離した４つのクローン化フラグメントの配列、ジェノタイピングに用いたリバースプライマー、および１０人の個体からの配列のジェノタイピングのサイズ結果を示す。配列２．４および３．６はアークの前方で単離されたものであるが、Ｒ１３およびＡｒｃｈ２４はアーク自体から単離されたものである。
【００８５】
実施例１２
インターカレーター法を用いた、複雑な線状ＤＮＡフラグメントの混合物についての再アニーリング効率の推定
９人の個体からプールしたＡｌｕ  ３’フラグメントの試料を、実施例１１の記載に従って特異的ＰＣＲにより得た。混合物を３部分に分けた。１つは未処理のまま残し、他の１つを実施例１１の記載に従って再アニーリングし、第３部分を９５℃で５分間融解し、次いで直ちに氷冷した。同様に１個体からのゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ消化し、精製し、同様な方法で再アニーリングした。次いで各混合物を、実施例１の記載に従って作製した完全適正対合ＰＣＲフラグメントの混合物と混和した。これらのフラグメントは完全適正対合ＤＮＡの泳動についての対照として用いられた。次いでＤＮＡプールを、実施例１の記載に従って２−Ｄゲル電気泳動により分析した。第２次元ゲル電気泳動の後、臭化エチジウム染色ＤＮＡフラグメントのＵＶ検出のために、ゲルマトリックスをＵＶＰ  ＧＤＳ−８０００ゲルドキュメンテーションシステムに装入した。図１１ａに示すように、未処理のプールＤＮＡ試料は完全適正対合した対照ＤＮＡフラグメントと同じ泳動挙動を示し、アークを形成した。再アニーリングしたプールＤＮＡ試料は未処理ＤＮＡと同様な結果を示し、これは再アニーリング反応について高度有効性の指標となった（図１１ｂ）。これは、この調製物の複雑さがヒトゲノムＤＮＡと比較して顕著に低下したことと一致する。氷上に保持した融解ＤＮＡフラグメントの複雑な混合物は、完全適正対合した対照ＤＮＡフラグメントとは全く異なる挙動を示した（図１１ｃ）。これは、再アニーリングに際して、完全適正対合した対照ＤＮＡフラグメントの形成が効率的でないことを証明する。予想どおり、ＢｓｔＹ  Ｉ消化した全ヒトゲノムの再アニーリングについても同様な結果がみられた（図１１ｄ）。このパネルの結果は、本発明方法が複雑な核酸試料の再アニーリング効率を評価できることを示す。
【００８６】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】実施例１の記載に従って実施した２−Ｄゲル分析の蛍光イメージである。このゲルは、完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメント、およびこの例では解像しないシトシン１個のバルジを含む線状ＤＮＡフラグメントを含む、アークの形成を示す。アークをさらに強調するために、完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメント間に点線を引いてある。０から５まで表示したＤＮＡスポットは、シトシンバルジを含む２９８ｂｐの線状ＤＮＡフラグメントの位置を示す。バルジ中のシトシンヌクレオチドの個数は表示数字と等しい。２〜５ヌクレオチドのサイズ範囲のシトシンバルジを含むＤＮＡフラグメントは、明らかにアークの前方へ泳動し、したがって長さの異なる多数のフラグメントを含有する混合物において完全適正対合ＤＮＡフラグメントからの分離を示す。バルジを含む等しい長さのＤＮＡフラグメントは第２次元では類似の速度で泳動するが、コンホメーションによる相異は完全には除かれない。したがってこれらのフラグメントはわずかなアークを形成する。最大バルジを含むフラグメントは第１次元において最低速度で泳動し、したがって第２次元ではアークから最大のずれをもつ。
【図２】実施例２の記載に従って実施した２−Ｄゲル分析のデジタル写真である。この写真は、インターカレーターとしての臭化エチジウムを用いる第２次元電気泳動、およびＤＮＡ染色の後に撮影したものである。シトシン０〜５個のバルジを中央に含むＤＮＡフラグメント（０ａ〜５ａと表示）またはそれらの末端から１５ｂｐの位置に含むＤＮＡフラグメント（０ｂ〜５ｂと表示）を完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメントと混合した。図１に記載したと同様な結果、すなわち完全適正対合ＤＮＡフラグメントを含むアークの形成、およびバルジ構造をもつＤＮＡフラグメントのアーク前方への泳動が得られる。シトシンバルジを中央に含むＤＮＡフラグメント（１ａ〜５ａと表示）または一端付近に含むＤＮＡフラグメント（１ｂ〜５ｂと表示）は、両方ともほぼ垂直なＤＮＡバンドをアーク前方に形成する。これは、すべてのバルジ含有フラグメントが第２次元において類似の速度で泳動することを示す。この実験で、１〜５個のシトシンを含有する線状ＤＮＡフラグメントは、そのバルジがＤＮＡフラグメントの中央または末端付近のいずれにあるかに関係なく、完全適正対合した線状ＤＮＡから分離する。
【図３】実施例３に従って実施した２−Ｄゲル分析の二色蛍光イメージである。完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメントは蛍光色素で標識されて、図中に緑色バンドを生じる。完全適正対合ＤＮＡフラグメントは、ゲルを貫く対角線を形成する。シトシン０〜５個のバルジを中央に含むＤＮＡフラグメントをＣｙ５で標識すると、赤色ＤＮＡバンドを生じる。７×８ｃｍのゲルを用いるこの系で、完全適正対合ＤＮＡフラグメントと３〜５塩基のサイズ範囲のバルジを含むＤＮＡフラグメントの分離が達成される。
【図４】実施例４の記載に従って実施した２−Ｄゲル分析の蛍光イメージである。電気泳動の前に、シトシン１〜５個のサイズ範囲のバルジを含む線状ＤＮＡフラグメントを、数十万の線状ＤＮＡフラグメントを保有する複雑なヒトゲノム呈示物と混合した。複雑なゲノム呈示物とこの設定では解像されない１または２塩基バルジをもつフラグメントを含むアークが形成される。呈示物が著しく複雑であるため、アーク内の個々のフラグメントは解像されない。３〜５塩基のサイズ範囲のバルジを含む線状ＤＮＡフラグメントは、２−Ｄ電気泳動後にアークの前方に位置する。
【図５】実施例５の記載に従って実施した２−Ｄゲル分析のデジタル写真である。この写真は、第１次元電気泳動の後（ａ）、次いで第２次元電気泳動の中間時点、３０分（ｂ）、４５分（ｃ）、および６０分（ｄ）で撮影したものである。図５ａは、コンホメーションと長さの両方に従ったＤＮＡフラグメントの一次元分離を示す。図５ｂ〜ｄは、１および２と表示した２つのＤＮＡフラグメントの第２次元分離を示す。１と表示したＤＮＡフラグメントは、シトシン３個のバルジを含み、この実験の陽性対照である。２と表示したＤＮＡフラグメントは、ＨａｅＩＩＩで消化した複製形のプラスミド、ファイ−ｘからの２８１ｂｐ制限フラグメントである。このＤＮＡフラグメントはＡ−トラクトを含み、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異常な泳動を示す。３Ｃ−バルジおよびＡ−トラクトと表示したＤＮＡフラグメントは、第２次元において他のＤＮＡフラグメントより相対的に高速で泳動し、したがって異常な二次構造を含む２つのＤＮＡフラグメントを、正常な二次構造をもつ完全適正対合した多量の線状ＤＮＡフラグメントから分離できる。この分離は、電気泳動時間の延長に伴って向上する。
【図６】実施例６の記載に従って実施した２−Ｄゲル分析のデジタル写真である。非特異的ＵＶ損傷を含む５４５ｂｐのＰＣＲ生成物を無傷の線状ＤＮＡフラグメントと混合し、２−Ｄゲル系を用いてインターカレーター法により分離した。このゲルは、無傷の線状ＤＮＡフラグメントを含むアークの形成を示す。このアークの前方に、ほぼ垂直な線を形成した数個のＤＮＡスポットが明瞭に検出される。ＵＶ損傷の形成は特異的ではなく、したがって各分子のＵＶ損傷量の相異のため幅広い垂直な線がアークの前方に検出される。表示’Ａ’は、多様な部位にＣＰＤ損傷を含むこれら５４５ｂｐのＤＮＡを表わす。
【図７】実施例７の記載に従って実施した２−Ｄゲル分析のイメージである。ＨｉｎｄＩＩで消化したファイ−ｘプラスミドをニッキングエンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢ  Ｉで処理した。次いでこれらの線状ＤＮＡフラグメントを２−Ｄゲル電気泳動により分離した。無傷の線状ＤＮＡフラグメントはアークを形成する。配列特異的に加水分解した一本鎖をもつ３つのＤＮＡフラグメントは明らかに無傷の線状ＤＮＡフラグメントの前方へ移動し、したがって第１次元での７Ｍの尿素およびインターカレーター法を用いた系において無傷のＤＮＡフラグメントとニック付きＤＮＡフラグメントの分離が示される。
【図８】実施例８の記載に従って実施した２−Ｄゲル分析の二色蛍光イメージである。ＰｖｕＩＩと複雑な線状ＤＮＡフラグメント混合物とのタンパク質−ＤＮＡ結合アッセイを実施する。混合物中の２つのＤＮＡフラグメントはＰｖｕＩＩ認識部位を含み、これらのフラグメントはＣｙ５で特異的に標識される。一定のインキュベーション時間後、インターカレーター法を用いる２−Ｄゲル電気泳動により、結合反応物を分離した。ＰｖｕＩＩとの相互作用を生じないＤＮＡフラグメントは、ゲルを貫くアークを形成する（緑色のバンド）。認識部位をもつ結合していないＤＮＡフラグメントもこのアーク内に位置する（赤色のバンド）。ＰｖｕＩＩに結合したＤＮＡフラグメントは明らかにこのアークの前方へ移動し（赤色のバンド）、したがって結合していないＤＮＡフラグメントと結合したＤＮＡフラグメントの分離がこの系において示される。ＰｖｕＩＩ認識部位を５’末端から１９６ｂｐに含む２４８８ｂｐのフラグメントは、このゲルにおいて解像するには大きすぎる。
【図９】実施例９の記載に従って実施した２−Ｄゲル分析の二色蛍光イメージのコピーである。完全適正対合ＤＮＡフラグメントをフルオレセイン色素で標識すると、緑色のＤＮＡバンドが得られる。完全適正対合ＤＮＡフラグメントは、ゲルを貫く対角線を形成する。シトシン０または４個のバルジを中央に含むＤＮＡフラグメントをＣｙ５で標識すると、赤色のＤＮＡバンドが得られる（図中に０および４と表示）。シトシン４個のバルジを含むＤＮＡフラグメントは明らかに完全適正対合ＤＮＡフラグメントの前方へ移動し、したがって第２次元において十分な変性条件を用いた系において、完全適正対合ＤＮＡフラグメントと不適正対合ＤＮＡフラグメントの分離が示される。
【図１０】実施例１０の記載に従って実施した２−Ｄゲル分析のデジタル写真である。図１０は、１および２と表示した２つのＤＮＡフラグメントの第２次元コンホメーション分離を示す。１と表示したＤＮＡフラグメントはシトシン３個のバルジを含み、２と表示したＤＮＡフラグメントはＨａｅＩＩＩで消化した複製形プラスミド、ファイ−ｘからの２８１ｂｐの制限フラグメントである。このＤＮＡフラグメントはＡ−トラクトを含み、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異常な泳動を示す。１および２と表示したＤＮＡフラグメントは、第２次元において他のＤＮＡフラグメントより相対的に高速で泳動し、したがって２つの異なる異常な二次構造を含むＤＮＡフラグメントを、正常な二次構造をもつ多量の完全適正対合した線状ＤＮＡフラグメントから、第１次元のＰＡＧＥおよび第２次元のアガロース電気泳動により分離できる。
【図１１ａ】実施例１１に記載した実験で得たＰＣＲ配列のジェノタイピング結果の例である。最初に２−Ｄ  ＣＤＥにより単離した試料配列と同じ１０人の匿名者から遺伝子型を決定した。図１１ａは、アーク前方のゲル領域から単離した配列のジェノタイピングを示す。これから分かるように、配列は個体内および個体間で多型性である。
【図１１ｂ】図１１ｂは、アーク前方のゲル領域から単離した配列のジェノタイピングを示す。これから分かるように、配列は個体内および個体間で多型性である。
【図１１ｃ】図１１ｃは、アーク自体から単離した配列のジェノタイピングを示す。これから分かるように、配列は多型性ではない。
【図１１ｄ】図１１ｄは、アーク自体から単離した配列のジェノタイピングを示す。これから分かるように、配列は多型性ではない。
【図１２】実施例１２の記載に従って実施したＵＶ照射２−Ｄゲルのデジタル写真である。ＤＮＡをＤＮＡ染料としての臭化エチジウムにより視覚化する。図１２ａは、Ａｌｕ反復配列の３’側フランキング配列フラグメントを選択的に増幅できる特定のＰＣＲにより得たＤＮＡフラグメントの未処理プールの２−Ｄ電気泳動を示す。ｐＢＲ３２２からＰＣＲにより得たＤＮＡフラグメントを、種々の長さの完全適正対合ＤＮＡフラグメントの標準品として用いた。ＤＮＡプールは明らかに、このプラスミドから得た完全適正対合ＤＮＡフラグメントと同様な様式で移動し、幅広い長さ範囲の線状ＤＮＡフラグメントを含むアークを形成する。図１２ｂでは、再アニーリングしたＤＮＡフラグメントのプールを分析している。このＤＮＡプールは、未処理プール（図１２ａ）について得たものと類似の挙動を示すが、形成されたアークはより狭い長さ範囲をもつ。同一ＤＮＡプールを９５℃で５分間変性させ、氷上で急冷し、次いで２−Ｄゲルで分析すると、全く異なる挙動が得られる（図１２ｃ）。予想どおりプール中のごく少数のＤＮＡが完全適正対合ＤＮＡフラグメントを形成する。したがって、プラスミド由来の完全適正対合ＤＮＡフラグメントのみがアークを形成する。これに対し、プールからのＤＮＡフラグメントはアーク前方へ移動し、これは完全再アニーリングの欠如による異常な構造の指標となる。プールしたゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで消化したものを、変性および再アニーリング操作の後、同様に２−Ｄゲル電気泳動により分析した。ヒトゲノムは著しく複雑であるため、このような再アニーリングはきわめて非効率的である。事実、プラスミド由来の完全適正対合したＰＣＲ生成物のみがアークを形成する（図１２ｄ）。
【図１】
2005518202.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年1月20日(2004.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖非環状核酸フラグメントをそれらの長さおよびコンホメーションに基づいて複雑な核酸混合物から分離する方法であって、
−  二本鎖核酸フラグメントの複雑な混合物を調製し；
−  その試料をゲル電気泳動装置に装填し、第１次元において、該試料を非変性電気泳動条件下でポリアクリルアミドゲルマトリックス中を電気泳動し、これによりフラグメントがコンホメーションおよび長さに基づいて分離され；
−  第２次元において、同じゲルマトリックスを用い、化学的作用因子の存在下で、所望によりゲルマトリックス内の温度などの物理的作用因子の変更と組合わて、該試料を電気泳動し、該因子は核酸フラグメント間のコンホメーションの相異を低減できるものであり、これにより第２次元においてフラグメントが実質的に長さに基づいて分離される
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
化学的作用因子が、核酸に対する相互作用を生じうる分子または分子混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化学的作用因子が、天然または合成のインターカレーション分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
化学的作用因子が、臭化エチジウム、アクラシノマイシン、クロロキン、ジスタマイシン−エルプチシン、ダウノマイシン、ブレオマイシン、ベンゾ［ａ］ピレン、アイレマイシン、プロフラビン、ＣＩ−９５８、キアンクリン、アクチノマイシン、ＤＥＡＰフルオランテン、プソラレン、ビサントレン、ジテルカリニウム、ＢＢＭ−９３８Ａ、エチノマイシン、およびＴＯＴＯよりなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
化学的作用因子が溝結合分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
溝結合分子が、ネトロプシン、ジスタマイシン、２ｐ−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５ｐ−ビ−ベンゾイミダゾール、および１−メチル−４−［４−［４−（４−（１−メチルキノリニウム）アミノ）ベンズアミド］アニリノ］ピリジニウム・ジクロリドよりなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化学的作用因子が、核酸に対する静電相互作用を生じうる荷電分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
多型核酸フラグメントを検出するための請求項１に記載の方法であって、核酸試料は１個体からの核酸または複数個体からのプールを含み、核酸は開裂、変性および再アニーリングされており、その際、変性工程および再アニーリング工程を行ってホモ−およびヘテロハイブリッドの混合物を調製し、多型核酸を含むコンホメーションの変化した不適正対合ヘテロハイブリッドを完全適正対合ホモ−およびヘテロハイブリッドから分離する方法。
【請求項９】
さらに、多型核酸を含む不適正対合ヘテロハイブリッドを単離して該核酸を特徴付けおよび同定する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに：
ａ．２以上のＤＮＡ試料を混和することによりＤＮＡプールを調製し、または１個体からＤＮＡ試料を調製し、
ｂ．プール中または１個体からのＤＮＡ試料中のＤＮＡフラグメントに特異的なアダプターをアニーリングさせ、
ｃ．ＤＮＡフラグメントにライゲートしていない過剰のアダプターを除去し、
ｄ．２以上のプールを混和し（１以上の個体からの試料の場合）、
ｅ．ＤＮＡ試料のプールまたは１個体からのＤＮＡ試料の混合物を変性させ、
ｆ．ＤＮＡ試料のプールを再アニーリングして、相同鎖を含むＤＮＡデュプレックスを形成し、
ｇ．不適正塩基対により、または完全適正対合した正常なコンホメーションをもつＤＮＡデュプレックスからの挿入／欠失ループもしくはニック付きＤＮＡにより、形成された異常なコンホメーションを含むデュプレックスを、請求項１に記載の工程により分離する
工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
正常なまたは異常なコンホメーションをもつ単離フラグメントをシグナルで標識し、アレイ状ライブラリー、選択したゲノムクローンまたは染色体のサブセットのアレイ状ライブラリーにハイブリダイズさせる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ試料をサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションの材料として使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸試料の再アニーリング効率を推定し、その際、完全適正対合デュプレックスの測定相対量が再アニーリング効率の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
非環状二本鎖核酸フラグメントをそれらのコンホメーションに基づいて複雑な試料から分離する方法であって、
−  核酸フラグメントの試料を調製し；
−  該試料をゲル電気泳動装置に装填し、第１次元において、該試料を第１組の予め定めた非変性電気泳動条件下でポリアクリルアミドゲルマトリックス中を電気泳動し、これによりフラグメントがコンホメーションおよび長さに基づいて分離され；
−  第２次元において、該ゲルマトリックスに結合したフラグメントを第２組の電気泳動条件下でアガロースマトリックス中を電気泳動し、これによりフラグメントが実質的に長さに基づいて分離される
工程を含み、
これにより、長さは等しいがコンホメーションの異なる核酸フラグメントが分離される、前記方法。
【請求項１５】
化学的作用因子が変性作用分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
化学的作用因子が、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、アリル、ブチル、イソブチルおよびアミルアルコール、ならびにエチレングリコールのような脂肪族アルコール；シクロヘキシル、ベンジル、フェノールおよびｐ−メトキシフェノールアルコールならびにイノシトールのような環状アルコール；アニリン、ピリジン、プリン、１，４−ジオキサン、ブチロラクトンおよびアミノトリアゾールのような脂環式化合物；ホルムアミド、エチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−エチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピオンアミド、グリコールアミド、チオアセトアミド、バレロラクタムのようなアミド；カルボヒドラジド、１，３−ジメチル尿素、エチル尿素、ｔ−ブチル尿素、チオ尿素およびアリルチオ尿素のような尿素類；ウレタン、Ｎ−メチルウレタンおよびＮ−プロピルウレタンのようなカルバメート；トゥイーン４０およびトリトンＸ−１００のような界面活性剤；ならびにシアノグアニジン、スルファミド、グリシン、アセトニトリルのような他の化合物よりなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸フラグメントが、ＤＮＡデュプレックス、ＲＮＡデュプレックス、ＤＮＡ／ＲＮＡデュプレックス、ＰＮＡデュプレックス、ＰＮＡ／ＤＮＡデュプレックス、ＰＮＡ／ＲＮＡデュプレックス、ＬＮＡデュプレックス、ＬＮＡ／ＤＮＡデュプレックス、ＬＮＡ／ＲＮＡデュプレックスから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
核酸混合物が、下記の群から選択される１以上の特色により生じた異常なコンホメーションをもつ核酸フラグメントを含有する、請求項１に記載の方法：
ａ．挿入／欠失ループ；
ｂ．不適正対合核酸；
ｃ．スリップした不適正対の核酸；
ｄ．塩基のメチル化；
ｅ．塩基の損傷；
ｆ．ＵＶ損傷により生じた光生成物；
ｇ．電離性放射線による塩基の損傷；
ｈ．塩基の酸化的損傷；
ｉ．アデニントラクトおよびＧＧＣＣ反復配列など、内在屈曲により生じた配列；
ｊ．プリン−ピリミジントラクト；
ｋ．塩基付加物の付加；
ｌ．三本鎖核酸；
ｍ．十字形構造；
ｎ．反復配列；
ｏ．ＤＮＡ  Ｚヘリックス
ｐ．タンパク質結合核酸；
ｑ．ヘアピンループ；
ｒ．ＡＰ部位；
ｓ．塩基ギャップ；
ｔ．ニック。
【請求項１９】
さらに、分離した核酸フラグメントの少なくとも一部を単離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
核酸試料が１個体のゲノムに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
試料が、開裂、変性および再アニーリングした核酸フラグメントを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試料が１より多い個体からのゲノムを含むプールである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
試料が開裂、変性および再アニーリングした核酸フラグメントを含み、その際、変性工程および再アニーリング工程が試料またはプールした試料を混合してホモ−およびヘテロハイブリッドの混合物を得る前または後に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
試料またはプールした試料の各々が各ゲノムのサブセットである、請求項２０または２２に記載の方法。
【請求項２５】
試料またはプールした試料の各々が各ゲノムの高度多型性サブセットである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
試料またはプールした試料の各々が各トランスクリプトームに由来するｃＤＮＡを含む、請求項２０または２２に記載の方法。
【請求項２７】
試料が１より多い試料プールを含む、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2005518202.tif 000019
2005518202.tif 000020
2005518202.tif 000021