(57)【要約】本発明は、支持体から作製されかつ少なくても一の化学的機能化表面ゾーンを有する生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントであって、前記ゾーンにおいて、生物又は生化学要素を固定するための化学的性質の形成を可能とするため、及び／又は、電気的に、前記ゾーンにおいて電荷の形成を可能とするためのコンポーネントに関するものである。支持体はコンポジット材料から成る少なくとも一の部分（１６，２１，３３，４６）を備え、前記コンポジット材料が前記機能化表面ゾーンを提供するために少なくとも一の不活性材料と少なくとも一の化学的及び／又は電気的機能化可能材料との混合である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体から作製されかつ少なくても一の化学的機能化表面ゾーンを有する生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントであって、前記ゾーンにおいて、生物又は生化学要素を固定するための化学的性質の形成を可能とするため、及び／又は、電気的に、前記ゾーンにおいて電荷の形成を可能とするためのコンポーネントにおいて、前記支持体はコンポジット材料から成る少なくとも一の部分（１６，２１，３３，４６）を備え、前記コンポジット材料は前記機能化表面ゾーンを提供するために少なくとも一の不活性材料と少なくとも一の化学的及び／又は電気的機能化可能材料との混合物であることを特徴とするコンポーネント。
【請求項２】
コンポジット材料の不活性材料は、ポリマー、プラスチック、樹脂及び接着剤の中から選択された材料であることを特徴とする請求項１に記載されたコンポーネント。
【請求項３】
ポリマーは、ポリイミド、ポリ（ジメチルシロキサン ）又はエポキシ型感光樹脂であることを特徴とする請求項２に記載されたコンポーネント。
【請求項４】
前記部分（１６）はそれ全体を支持体を成していることを特徴とする請求項１に記載されたコンポーネント。
【請求項５】
支持体は、前記部分を支持する基板（２０，３０）を備えることを特徴とする請求項１に記載されたコンポーネント。
【請求項６】
基板（２０，３０）は、ガラス、シリカ、シリコン、ポリマー及び金属の中から選択された材料から成ることを特徴とする請求項５に記載されたコンポーネント。
【請求項７】
前記部分（２１）は構造化されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載されたコンポーネント。
【請求項８】
機能化可能材料は、シリカ、合成シリカ、窒化シリコン、金属及び機能化可能ポリマーの中から選択されたものであることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載されたコンポーネント。
【請求項９】
コンポジット材料は、不活性材料相と機能化可能材料相とを備えた混合物であることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載されたコンポーネント。
【請求項１０】
コンポジット材料は、不活性材料において分散された機能化可能材料の要素から成ることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載されたコンポーネント。
【請求項１１】
機能化可能材料はビーズ（４２）の形であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載されたコンポーネント。
【請求項１２】
前記表面ゾーンは、その表面ゾーン上で、生物要素の結合を確実にするのに適した化学的官能基、又は他の化学的官能基を支持することを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載されたコンポーネント。
【請求項１３】
前記表面ゾーンは、その表面ゾーン上で、電荷の存在を確実にするのに適した化学的官能基を支持することを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載されたコンポーネント。
【請求項１４】
支持体から生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントを製造する方法であって、前記支持体は、前記ゾーンにおいて生物又は生化学要素を固定するための化学的性質の形成を可能とするため、及び／又は電気的に、前記ゾーンにおいて電荷の形成を可能とするために少なくとも一の化学的機能化表面ゾーンを有することを必要とするものであるところの方法は、一のコンポジット材料において少なくとも一の部分（１６，２１，３３，４６）を備え、前記コンポジット材料は前記機能化表面ゾーンを提供するために少なくとも一の不活性材料と少なくとも一の化学的及び／又は電気的機能化可能材料との混合物であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
コンポジット材料は、液体相で不活性材料と機能化可能材料とを混合することによって得られ、混合物はコンポジット材料において前記部分を提供するように固化されていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
コンポジット材料は、液体相の不活性材料において機能化可能材料の要素の分散によって得られ、混合物はコンポジット材料において前記部分を提供するように固化されていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
機能化可能材料の要素がビーズ（４２）の形であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記要素が分散した液体相である不活性材料を、固化前に型穴（１０）を有する支持体上に注がれることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
型穴（１０）を有する支持体を混合物の固化後に除去することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記要素が分散した液体相である不活性材料を、固化前に支持体（２０，３０）上に堆積することを特徴とする請求項１６又は１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
不活性材料が感光材料であり、コンポジット材料の前記部分（２１）を固化後にフォトリソグラフィによって構造化することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくても一の型穴（３１）を有する支持体（３０）の一表面上で堆積を行い、コンポジット材料（３２）を固化後に型穴の外側に除去することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
不活性材料は感光材料であり、型穴の外側へのコンポジット材料の除去をフォトリソグラフィで実施することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
支持体（４０）は少なくても一の型穴（４１）を有する一の面を有し、不活性材料の要素（４２）を型穴のベースに堆積して、次いで、液体相の不活性材料（４３）を支持体の前記面上に注ぎ、次いで、不活性材料を固化して型穴のベースにコンポジット材料（４６）を備え、次いで支持体を除去することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
機能化材料の前記要素（４２）はビーズの形であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記固化は熱処理によって得られることを特徴とする請求項１５から２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントであってコンポジット材料を用いるコンポーネントに関するものである。さらには前記コンポーネントを製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物又は生化学分析用のマイクロシステムは、支持体又は基板の表面（複数のゾーンを備えてもよい）が一又は二以上の複数の機能を提供するように選択された支持体又は基板から作製されるものである。前記機能は化学的機能性（化学的官能性）又は電気的機能性であってもよい。
【０００３】
化学的機能性は、生物又は生化学要素が支持体に固定される必要があるときに含まれる。一般的には、支持体は、良く制御されたカップリング化学、例えば、シラン化によって生物又は生化学要素の固定（アンカリング）を可能にする、ガラス製又はシリコン製である。
【０００４】
電気的機能性は、マイクロチャンネル又はマイクロリザーバにおける流体の循環のために含まれる。流体循環マイクロシステムは通常、電気浸透のような動電学的な（電気運動）ポンピングを用いて、支持体に作製されたマイクロチャンネル又はマイクロリザーバで流体を循環させる。前記ポンピング手段は、電気的活性面の存在を必要とする。電気的活性面の存在と組み合わせて高電界を用いて流体を流れさせるものである。ガラス製又はシリカ製の公知の支持体は前記ポンピング手段によく適している。
【０００５】
従って、ガラス製又はシリコン製の支持体は、化学的及び電気的機能性を得るのによく適している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記マイクロシステムを製造する際、ポリマー、プラスチック及び接着剤のような不活性材料を用いることが増加している。しかしながら、前記不活性材料に生物又は生化学要素を固定するための化学は、化学的構成に依存し、実施には不適当である。マイクロチャンネルを形成するための鋳造プラスチック、感光性ポリマー又はマイクロ構造を形成するための樹脂のような材料は、それらに生物又は生化学要素を容易に固定するのが可能であれば、非常に広く使用されるだろう。また、それらの材料は廉価であり、大量生産に使用される。
【０００７】
さらに、動電学的な流れは従来のポリマーのような材料においては問題があり、荷電表面を生成するためにプラズマ活性のような高価な技術の使用を必要とする。しかしながら、これは、処理された表面を確実に活性化するわけではないことが示されている。従って、システムは時間が経てば徐々に変化する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上述の問題に対する解決手段を提供する。これは、（ポリマー、樹脂、プラスチック、接着剤等）化学的不活性材料の使用によって、生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネント支持体を作製を可能にするものである。ここで、前記不活性材料は、生物又は生化学要素の固定を可能とするために、機能化可能材料と組み合わせて使用する。生物又は生化学要素は、従来技術例えば、シラン化技術によってグラフト（移植、接ぎ木）してもよい。
【０００９】
生物又は生化学的機能化可能材料を不活性材料（プラスチック、接着剤）に直接組み込んでコンポジット材料を得る。前記コンポジット材料を得るために複数の溶液を考えている。
【００１０】
一の溶液は、複数の技術的段階の後に、コンポジット材料の形で凝結される２つの液体相の混合物を形成して成る。相の一つ（例えば、合成シリカ）によって、ガラス基板（例えば、シラン化）上に形成されるものと同一の様式のアンカリング化学的要素によって機能化を保証することができる。
【００１１】
他の溶液は、不活性材料を備えたプラスチック又は感光性若しくは非感光性材料のいずれかと、シリカ製、ガラス製、金属製若しくは機能化可能ポリマー製の要素（好適にはビーズ）とを直接混合して成る。前記ビーズは、生物又は生化学要素が付くことを保証し、生物又は生化学要素のためのアンカリング表面を増大するという利点もある。
【００１２】
感光性材料を不活性材料として使用するならば、得られるコンポジット材料によってマイクロテクノロジーで使用する方法によって構造化（structured）コンポーネントを形成するのを可能にする。機能化は、感光性材料における分散相上、又は前記材料に含まれる要素上のいずれかで生ずる。
【００１３】
堆積された材料は、動電学的な（電気運動）ポンピングによる流体循環を可能にする、コンポーネントに電気的機能を付与する材料であってもよい。
【００１４】
従って、本発明の目的は、支持体から作製されかつ少なくても一の化学的機能化表面ゾーンを有する生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントであって、前記ゾーンにおいて、生物又は生化学要素を固定するための化学的性質（構成）の形成を可能とするため、及び／又は、電気的に、前記ゾーンにおいて電荷の形成を可能とするためのコンポーネントにおいて、前記支持体がコンポジット材料から成る少なくとも一の部分をを備え、前記コンポジット材料が前記機能化表面ゾーンを提供するために少なくとも一の不活性材料と少なくとも一の化学的及び／又は電気的機能化可能材料との混合であることを特徴とする。
【００１５】
好適には、コンポジット材料の不活性材料は、ポリマー、プラスチック、樹脂及び接着剤の中から選択された材料である。ポリマーは、ポリイミド、ポリ（ジメチルシロキサン ）又はエポキシ型感光樹脂であってもよい。
【００１６】
前記部分はそれ全体を支持体を成してもよい。
【００１７】
支持体は、前記部分を支持する基板を備えてもよい。基板は、ガラス、シリコン、ポリマー及び金属の中から選択された材料製であってもよい。
【００１８】
前記部分は構造化されていてもよい。
【００１９】
機能化可能材料は、シリカ、合成シリカ、窒化シリコン、金属及び機能化可能ポリマーの中から選択するのが好都合である。
【００２０】
コンポジット材料は、不活性材料の相と機能化可能材料の相との混合物であってもよい。
【００２１】
それは、不活性材料において分散された機能化可能材料の要素から成ってもよい。機能化可能材料はビーズ状でもよい。
【００２２】
前記表面ゾーンは、その表面ゾーン上で、生物要素の結合を保証するのに適した化学的官能基、又は他の化学的官能基を支持してもよい。
【００２３】
前記表面ゾーンは、その表面ゾーン上で、電荷の存在を保証するのに適した化学的官能基を支持してもよい。
【００２４】
本発明の他の目的は、支持体から生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントを製造する方法であって、前記支持体は、前記ゾーンにおいて生物又は生化学要素を固定するための化学的性質（構成）の形成を可能とするため、及び／又は電気的に、前記ゾーンにおいて電荷の形成を可能とするために少なくとも一の化学的機能化表面ゾーンを有することを必要とするものであるところの方法は、一のコンポジット材料において少なくとも一の部分を備え、前記コンポジット材料は前記機能化表面ゾーンを提供するために少なくとも一の不活性材料と少なくとも一の化学的及び／又は電気的機能化可能材料との混合であることを特徴とする。
【００２５】
第１の実施形態では、コンポジット材料は、液体相において不活性材料と機能化可能材料とを混合することによって得られてもよく、混合物はコンポジット材料において前記部分を提供するために固化される。
【００２６】
第２の実施形態では、コンポジット材料は、液体相である不活性材料の機能化可能材料における要素の分散によって得られてもよく、混合物はコンポジット材料において前記部分を提供するために固化される。
【００２７】
前記要素が分散した液体相である不活性材料を、固化前に型穴（陥凹）を有する支持体上に注いでもよい。
【００２８】
型穴を有する支持体を混合物の固化後に除去してもよい。
【００２９】
前記要素が分散した液体相である不活性材料を、固化前に支持体上に堆積してもよい。不活性材料が感光材料であれば、コンポジット材料の前記部分を固化後にフォトリソグラフィによって構造化してもよい。少なくても一の型穴を有する支持体の一表面上で堆積を行った場合は、コンポジット材料を固化後に型穴の外側に除去してもよい。不活性材料が感光材料である場合は、型穴の外側にコンポジット材料の除去をフォトリソグラフィで実現してもよい。
【００３０】
第３の実施形態では、少なくても一の型穴を有する一の面を有し、不活性材料の要素を型穴のベース上に堆積して、それから液体相の不活性材料を支持体の前記面上に注ぎ、それから不活性材料を固化して型穴のベースにコンポジット材料を備え、最後に支持体を除去する。機能化材料の前記要素はビーズ状であるのが好都合である。
【００３１】
いずれの実施形態の場合も、固化は熱処理によって得られてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、非限定的に実施例を示した以下の詳細な説明を添付図面を参照して読むことによって、さらによく理解され、他の利点及び特徴がより明確になるだろう。
図１Ａ及び図１Ｂは、型穴を有する支持体を用いる本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントの作製を示している。
【００３３】
図１Ａは、例えばシリコン製の支持体１０であって、上面が機械加工され又はエッチングされて、トレンチ１２によって延長されて凹みである型穴を形成する。ポリマー（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン ））から成る液体コンポジット材料とマイクロビーズ（例えば、直径1ミクロンのシリカのマイクロビーズ）との混合物を、その型穴上に注ぐ。液体コンポジット材料の量は型穴を完全に満たすようにする。
【００３４】
支持体及びその内容物を4時間60℃に維持したオーブンに配置する。
【００３５】
ポリマーに含まれる溶媒を除去した後、コンポジット材料を支持体から型からはずす。得られたコンポーネント１６を図１Ｂに示す。それは、凹み１１を補完するベース１４とトレンチ１２を補完しかつベースに直交するウォール１５とを備える。連続するウォールはチャンネルを画定する。できたコンポーネントは、それを機能化する化学的及び／又は電気的プロトコルを実施する準備ができている。
【００３６】
図２Ａ及び図２Ｂは、感光性コンポジット材料からの生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントの作製を示している。
【００３７】
感光性ポリマー又は樹脂製のパターンを平坦な基板上に形成して、複雑なエッチング装置の使用を回避している。例えば、ガラス又はシリコンのシートにブロック又はチャンネルの形成を簡単なフォトリソグラフィによって置換する。
【００３８】
ガラスの深いエッチングは厄介である。それは、ガラス内に含まれるイオン性金属不純物によるエッチングのブロッキングによるプラズマによっては達成できない。従って、ガラスは等方性の化学的手段によってエッチングして、小さなピッチの微細なパターンの形成を妨げる。本発明によって、感光コンポジット材料を用いてこのような構造を形成することが可能となる。
【００３９】
図２Ａは、上面がコンポジット材料２１の層で被覆されたシリコン製の直径100mm支持体２０を示している。前記コンポジット材料は、分散マイクロビーズ例えば、直径1ミクロンのシリカのマイクロビーズが含まれている“プロビマイド（Probimide）7510”の商品名で流通している感光性ポリイミドから成る。混合物は支持体２０上で、スピンコーターによって3000rpmの速度で堆積し、それから加熱プレート上で110℃でアニールする。
【００４０】
コンポジット材料は、例えば図２Ｂで示したようにトレンチ２２がコンポジット材料２１に見ることができるという所望のトレンチ２２を得るためにマスクを介して紫外線を照射して現像する。次いで、コンポジット材料を加熱プレート上で150℃でアニールし、さらに、熱処理オーブンの中で300℃でアニールする。
【００４１】
図３Ａ及び図３Ｂは、コンポジット材料がチャンネルに閉じ込められている生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントの作製を示している。
【００４２】
図３Ａは、一の面が、圧印加工（エンボス）、鋳造又はレーザーアブレーションのような従来技術によって形成された型穴３１を有するポリマー製支持体３０を示している。コンポジット材料層３２を型穴を有する表面上に堆積し、他方、前記型穴のウォールを被覆する。コンポジット材料は、分散マイクロビーズ例えば、直径1ミクロンのシリカのマイクロビーズである購入可能な感光性ポリイミド“プロビマイド（Probimide）7510”から成る。コンポジット材料をディッピングによって堆積し、次いで加熱プレート上で110℃でアニールする。
【００４３】
堆積したコンポジット材料をマスクを介して紫外線で照射して、図３Ｂで示したような所望のコンポーネントを得る。前記コンポーネントについては、型穴３１のウォールだけをコンポジット材料層３３によって被覆する。前記コンポジット材料を加熱プレート上で150℃でアニールして、次いで、熱処理オーブンで300℃でアニールする。  
【００４４】
図４Ａ及び図４Ｂは、コンポジット材料がビーズベッド上に不活性材料を堆積することによって得られる生物又は生化学分析マイクロシステム用のコンポーネントの作製を示している。
【００４５】
図４Ａは、上面が機械加工されて又はエッチングされ、一連の平行なトレンチ４１で成る型穴が形成されている支持体４０例えば、直径100mmのシリコン製支持体を示している。前記トレンチ４１のベースに、直径100ミクロンのシリカ製のビーズ４２を堆積する。
【００４６】
図４Ｂに示しているように、不活性材料４３例えば、ポリ（ジメチルシロキサン ）を支持体４０上に注ぐ。前記不活性材料はトレンチ４１を埋め、トレンチのベースでビーズ４２と混合する。
【００４７】
次いで、全体を4時間60℃のオーブンに配置する。ポリマーに含まれる溶媒の排出後、型からはずす。そして、ベース４４及びウォール４５から成る図４Ｃに示したコンポーネントを得る。ここで、前記ウォールの頂部４６はコンポジット材料製である。コンポーネントは、それを機能化することができる化学的プロトコルを実施する準備ができている。
【００４８】
購入可能なもののような前に機能化されたビーズを用いてもよい。前記ビーズは、その表面に化学的機能（酸、アミン、アルデヒド）又は生物官能基（アビジン、ビオチン）を有する。前記機能化ビーズを、不活性相と機能化相とを備えたコンポジット材料を形成するために不活性材料と混合する。
【００４９】
機能化可能材料の性質に依存して、異なる技術を用いてそれを機能化してもよい。シリコン、酸化シリコン、窒化シリコン又は合成シリカのような材料の場合に、シラン化処理によって、生物要素又は化学的機能（官能基）の付きを連続して保証する化学的機能を前記材料の表面に付けることが可能となる。
【００５０】
異なる種類のシランを用いてもよい。それぞれが、機能化される材料の表面に固定するために固有のプロトコルを有する。使用するシランの選択は、直接、又は化学反応あるいは生物機能の取付をその後実施するために用いる化学機能に依存する。最も広く用いるシランの中で、アミノプロピル、トリエトキシシラン、アミノプロピル ジメチルエトキシシラン エポキシシラン、２−（ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピル トリエトキシシランを引用してもよい。
【００５１】
例として、アミノプロピル トリエトキシシラン用に使用されるシラン化プロトコルは以下の通りである：
−表面上にシラノール機能を作るために、30秒間150ワットで酸化プラズマ（Nextral 310）によって表面を処理する段階と；
−12時間95％エタノールで10％シラン溶液にインキュベートする段階と；
−蒸留水ですすぐ段階と；
−オーブンで3時間110℃でアニールする段階。
【００５２】
合成されたオリゴヌクレオチドを直接アルデヒド機能（官能基）に付けてもよいし、又は、オリゴヌクレオチドをＮＨ２官能基で合成するならばグルタルアルデヒドの仲介によって付けてもよい。 
【００５３】
このシラン化技術によって、オリゴヌクレオチド、プロテイン、又は、機能化材料（アミン、アルデヒド酸、活性化エステル官能基等）に付けられるシラン上に存在する官能基に適合する他の生物あるいは化学要素を付けることが可能となる。
【００５４】
機能化される材料は金の層であれば、前記金属層の表面上にチオール又はジスルフィド化合物のアタッチメントを利用する。シランについては、異なるチオールによって、機能化された層の表面上に所望の化学反応に要する化学的機能（化学官能基）を得ることが可能となる。金属表面上にチオールを付ける技術は、例えば、以下の文献、すなわち、J. Am. Chem. Soc.の１９８９年の第III巻第1号の321頁から335頁に掲載されたベイン（C.D.BAIN）らによる“溶液から有機チオールの自発アセンブリによって単層膜の金の上への形成”によって公知である。 
【００５５】
例えば、外界温度で無水エタノールに3時間1mM溶液をインキュベートすることによって、メルカプト−プロピオン酸又はシスタミンのグラフトを引用してもよい。 
【００５６】
電気的機能化のために、上述のプロトコルに従って、機能化される層上にアミノプロピルトリエトキシシランをグラフトすることによって、合成シリカ、シリコン、窒化シリコン及び酸化シリコンの表面上に電荷を得てもよい。酸媒体（例えば、0.2M HCl）中での処理によって、シランのアミノ基を保護し、機能化材料の表面上に電荷を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用の第１のコンポーネントの形成を示す断面図である。
【図１Ｂ】本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用の第１のコンポーネントの形成を示す断面図である。
【図２Ａ】本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用の第２のコンポーネントの形成を示す断面図である。
【図２Ｂ】本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用の第２のコンポーネントの形成を示す断面図である。
【図３Ａ】本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用の第３のコンポーネントの形成を示す断面図である。
【図３Ｂ】本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用の第３のコンポーネントの形成を示す断面図である。
【図４Ａ】本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用の第４のコンポーネントの形成を示す断面図である。
【図４Ｂ】本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用の第４のコンポーネントの形成を示す断面図である。
【図４Ｃ】本発明の生物又は生化学分析マイクロシステム用の第４のコンポーネントの形成を示す断面図である。
【符号の説明】
【００５８】
１０  型穴
１６，２１，３３，４６  部分
２０，３０  基板
３１  型穴
３２  コンポジット材料
４０  支持体
４１  型穴
４２  ビーズ
４３  不活性材料
【図１Ａ】
2005517958.tif 000003
【図１Ｂ】
2005517958.tif 000004
【図２Ａ】
2005517958.tif 000005
【図２Ｂ】
2005517958.tif 000006
【図３Ａ】
2005517958.tif 000007
【図３Ｂ】
2005517958.tif 000008
【図４Ａ】
2005517958.tif 000009
【図４Ｂ】
2005517958.tif 000010
【図４Ｃ】
2005517958.tif 000011
【国際調査報告】
2005517958.tif 000012
2005517958.tif 000013
2005517958.tif 000014
2005517958.tif 000015