(57)【要約】非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１０遺伝子、インテグリンα１１遺伝子または双方の遺伝子の少くとも一部が、インテグリンα１０コーディング配列、インテグリンα１１コーディング配列または双方のコーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１０遺伝子、インテグリンα１１遺伝子または双方の遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびそれらの子孫が提供される。破壊α１０遺伝子、破壊α１１遺伝子または双方の破壊遺伝子を有した上記非ヒト哺乳動物を作製するための方法、並びに上記非ヒト哺乳動物の使用も含まれている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１０遺伝子の少くとも一部が、インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１０遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２】
インテグリンα１０コーディング配列の一部が、インテグリンα１０イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項３】
インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列が、受託番号ＤＳＭ１４９３３でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項１または２に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項４】
非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１１遺伝子の少くとも一部が、インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換されている、インテグリンα１１遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項５】
インテグリンα１１コーディング配列の一部が、インテグリンα１１イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項４に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項６】
インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列が、受託番号ＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項４または５に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１０遺伝子の少くとも一部が、１）インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を第一のマーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列および２）インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部を第二の選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１０遺伝子およびインテグリンα１１遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項８】
インテグリンα１０をコードする遺伝子の発現が、野生型非ヒト哺乳動物と比較して抑制されている、ノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項９】
インテグリンα１０をコードする遺伝子の抑制が１００％である、請求項８に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１０】
α１０が、インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により抑制されている、請求項８または９に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１１】
インテグリンα１０コーディング配列の一部が、インテグリンα１０イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項１０に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１２】
ノックアウト構築物が、選択マーカー配列へ結合されたインテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３３でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項１０または１１に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１３】
インテグリンα１１をコードする遺伝子の発現が、野生型非ヒト哺乳動物と比較して抑制されている、ノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１４】
インテグリンα１１をコードする遺伝子の抑制が１００％である、請求項１３に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１５】
α１１が、インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部をマーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により抑制されている、請求項１３または１４に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１６】
インテグリンα１１コーディング配列の一部が、インテグリンα１１イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項１５に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１７】
ノックアウト構築物が、マーカー配列へ結合されたインテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項１６に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１８】
インテグリンα１０をコードする遺伝子およびインテグリンα１１をコードする遺伝子の発現が、野生型非ヒト哺乳動物と比較して抑制されている、ノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１９】
インテグリンα１０およびα１１をコードする遺伝子の抑制が１００％である、請求項１８に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２０】
α１０が、インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により抑制され、α１１が、インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部を第二の選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により抑制されている、請求項１８または１９に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２１】
インテグリンα１０コーディング配列の一部が、インテグリンα１０イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部であり、インテグリンα１１コーディング配列の一部が、インテグリンα１１イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項２０に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２２】
ノックアウト構築物が、マーカー配列へ結合されたインテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３３でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託され、ノックアウト構築物が、マーカー配列へ結合されたインテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項２０または２１に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２３】
非ヒト哺乳動物およびその子孫がげっ歯類である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２４】
げっ歯類がマウスである、請求項２３に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２５】
選択マーカー配列がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２６】
インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部をマーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１０遺伝子の一部を置き換えるステップからなる、破壊インテグリンα１０遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法。
【請求項２７】
ａ）インテグリンα１０のノックアウト構築物を用意し、
ｂ）ＥＳ細胞系を用意し、
ｃ）ｂ）のＥＳ細胞系をａ）の構築物で形質転換し、
ｄ）マーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、
ｅ）胚盤胞を用意し、
ｆ）ＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、
ｇ）胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、および
ｈ）胚をキメラ動物へ発育させて、破壊インテグリンα１０遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせる
ステップを更に含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
配列が、選択マーカー配列へ結合されたインテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３３でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、インテグリンα１０αノックアウト構築物をコードする核酸配列を含んでなるベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載されたインテグリンα１０αノックアウト構築物ベクターを含んでなるＥＳ細胞系。
【請求項３０】
インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１１遺伝子の一部を置き換えるステップからなる、破壊インテグリンα１１遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法。
【請求項３１】
ｉ）インテグリンα１１のノックアウト構築物を用意し、
ｊ）ＥＳ細胞系を用意し、
ｋ）ｊ）のＥＳ細胞系をｉ）の構築物で形質転換し、
ｌ）マーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、
ｍ）胚盤胞を用意し、
ｎ）ＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、
ｏ）胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、および
ｐ）胚をキメラ動物へ発育させて、破壊インテグリンα１１遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせる
ステップを更に含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列が、選択マーカー配列へ結合されたインテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、インテグリンα１１ノックアウト構築物をコードする核酸配列を含んでなるベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載されたインテグリンα１１ノックアウト構築物ベクターを含んでなるＥＳ細胞系。
【請求項３４】
ｑ）インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１０遺伝子の一部を置き換え、および
ｒ）インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１１遺伝子の一部を置き換える
ステップからなる、破壊インテグリンα１０遺伝子および破壊インテグリンα１１遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法。
【請求項３５】
ｓ）インテグリンα１０のノックアウト構築物を用意し、かつインテグリンα１１のノックアウト構築物を用意し
ｔ）ＥＳ細胞系を用意し、
ｕ）ｔ）のＥＳ細胞系をｓ）の構築物で同時にまたは１回で形質転換し、
ｖ）少くとも１つのマーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、
ｗ）胚盤胞を用意し、
ｘ）形質転換および選択されたＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、
ｙ）胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、および
ｚ）胚をキメラ動物へ発育させて、破壊インテグリンα１０遺伝子およびインテグリンα１１遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせる
ステップを更に含んでいる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
筋骨格および結合組織疾患で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項３７】
アテローム性動脈硬化症で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項３８】
線維症で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項３９】
幹細胞の分化または機能で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４０】
幹細胞が、間葉幹細胞、造血幹細胞および上皮幹細胞からなる群より選択される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
骨折治癒で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４２】
炎症疾患で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４３】
炎症疾患がリウマチ様関節炎または髄膜炎である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
α１０および／またはα１１の活性を調節するための遺伝子療法モデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４５】
心臓弁疾患で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４６】
活性を調節することが、疾患で活性を阻止、阻害、軽減または逆転することである、請求項３６〜４０または４２〜４５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４７】
活性を調節することが、骨折治癒で活性を刺激、阻止、阻害、軽減または逆転することである、請求項４１に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４８】
インテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部と反応性を示す抗体の作製のための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４９】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
インテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部が、ヒトインテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部である、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５２】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を筋骨格および結合組織疾患と関連付ける
ステップからなる、筋骨格疾患での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５３】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果をアテローム性動脈硬化症と関連付ける
ステップからなる、アテローム性動脈硬化症での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５４】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を線維症と関連付ける
ステップからなる、線維症での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５５】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を幹細胞の分化と関連付ける
ステップからなる、幹細胞の分化での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５６】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を骨折治癒と関連付ける
ステップからなる、骨折治癒での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５７】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を炎症疾患と関連付ける
ステップからなる、炎症疾患での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５８】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果をα１０および／またはα１１の発現と関連付ける
ステップからなる、α１０および／またはα１１の遺伝子療法での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５９】
試験剤が、デオキシ核酸、リボ核酸、ＰＮＡおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ｉ）インテグリンα１０‐β１もしくはその一部、またはインテグリンα１０‐β１もしくはその一部でマウスを免疫し、
ii）上記ｉ）の免疫マウスを免疫抗原で追加免疫し、
iii)免疫マウスを犠牲にし、
iv）iii)の犠牲マウスから単一細胞懸濁セルを作製し、
vii)ハイブリドーマ細胞を作製するために、上記iv）の単一細胞懸濁物を腫瘍細胞系と融合させ、
viii)免疫抗原との反応性についてハイブリドーマ細胞をスクリーニングする
ステップからなる、インテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部と反応性の抗体産生ハイブリドーマを作製するための方法。
【請求項６１】
vi）のスクリーニングされた融合ハイブリドーマ細胞を限界希釈することで、モノクローナルハイブリドーマ細胞を作製するステップを更に含んでなる、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α１０および／またはα１１インテグリン遺伝子の発現が該遺伝子の標的破壊により抑制された、非ヒト哺乳動物およびその子孫に関する。このような非ヒト哺乳動物の使用およびその非ヒト哺乳動物を作製するための方法も考えられている。
【発明の背景】
【０００２】
インテグリン
インテグリンは、特定の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質と結合するα‐およびβ‐サブユニットにより形成される大球状細胞外ドメインと、細胞内の細胞骨格タンパク質およびシグナリングタンパク質と相互作用する短い細胞質ドメインからなる、ヘテロ二量体貫膜分子である（Hynes(1992)Cell.69(1):11-25）。インテグリンファミリーは現在のところ２４メンバーあり、これは１８のα‐サブユニットのうち１つと８つのβ‐サブユニットのうち１つとの異なる組合せの結果である。
【０００３】
インテグリンは、細胞を細胞外マトリックスまたは他の細胞へつなぐ非共有結合αおよびβ鎖から構成されている（Hynes(1992)Cell.69(1):11-25）。細胞骨格と細胞外リガンドとの機械的リンクとして作用することに加えて、インテグリンは細胞増殖、細胞移動および細胞分化のようなプロセスに影響を与えるシグナル伝達レセプターである（Bengtsson et al.(2001)Matrix Biol.20(8):565-576；Bouvard et al.(2001)Circ.Res.89(3):211-223；Byzova et al.(1998)Circ.Res.80(5):726-734）。
【０００４】
α鎖
インテグリンの細分類はα鎖の構造類似性に基づき行われる。インテグリンαサブユニットは２０〜４０％の全体的同一率を有することが知られている（Hynes(1992)Curr.Opin.Genet.Dev.2:621-624）。あるインテグリンαサブユニットは、それらのＮ末端領域に〜２００アミノ酸挿入ドメインまたはＩ‐ドメインを含有している。これらの場合、Ｉ‐ドメインはリガンド結合部位と通常一致する（例えば、αサブユニット１、２、１０、１１）。非Ｉ‐ドメイン含有αサブユニットにおいて、リガンド結合部位はあまり詳しくわかっていない。
【０００５】
β鎖
インテグリンは、所有β‐サブユニットに基づきサブファミリーに分けられる。β１、β３、β４、β５、β６およびβ８インテグリンは主に細胞外マトリックス分子用のレセプターであり、一方β２およびβ７含有白血球インテグリンは免疫プロセスで細胞‐細胞相互作用に関与する。α‐ｖ‐サブユニットを除くほとんどのα‐サブユニットは、１つのβ‐サブユニットのみと結合する。所有β鎖によるサブファミリーのうち、β１サブファミリーがほとんどのメンバーを有している。現在まで、β１鎖と結合した１２種のインテグリンα鎖、即ちα１〜α１１およびαｖが同定および特徴付けられた（Camper et al.(2001)306(1):107-116）。
【０００６】
α‐サブユニットと一緒に、β‐サブユニットエクトドメインのＮ末端ハーフは、ＥＣＭ分子の認識および結合に関与する細胞外球状インテグリンヘッドの一部を形成している。
【０００７】
インテグリンの多様性は、α‐およびβ‐サブユニットの一部のｍＲＮＡの別なスプライシングおよびインテグリンサブユニットの翻訳後修飾に起因したイソ型により更に増している（Flier and Sonnenberg(2001)Cell Tissue Res.305(3):285-298）。インテグリンのリガンド特異性を決定しているのは、α‐およびβ‐サブユニットの組合せにおけるこの異種性である。
【０００８】
結合存在物
インテグリンはそれらの結合存在物に応じてグループに細分類される。いくつかのインテグリンは、ＲＧＤ配列を含有する細胞外マトリックス成分、即ちフィブロネクチンおよびビトロネクチンと結合する（Hynes(1992)Cell.69(1):11-25）。他のインテグリンは、ラミニン（α３‐、α６‐またはα７‐サブユニット）およびコラーゲン（α１‐、α２‐、α１０‐およびα１１‐サブユニット）のようなリガンドと、非ＲＧＤ依存的に結合する。ラミニンおよびコラーゲンもＲＧＤ配列を含有しているが、自然状態のときこれらは隠れているため近づきにくい。
【０００９】
コラーゲン結合インテグリンは、α‐サブユニットでＩドメインの存在が知られているせいで、他の細胞外マトリックス結合インテグリンと構造的に区別される。現在まで、４種のＩドメイン含有、コラーゲン結合インテグリンがヒトで発見された：α１‐β１、α２‐β１、α１０‐β１およびα１１‐β１。インテグリンα１０‐β１は軟骨細胞におけるII型コラーゲンレセプターとして記載されており（Camper et al.(1998)J.Biol.Chem.273:20383-20389）、最も最近になり発見されたコラーゲンレセプター、インテグリンα１１‐β１は胎児筋細胞で初めは記載された（Velling et al.(1999)J.Biol.Chem.274:25735-25742）。
【００１０】
インテグリンの構造比較
異なるα‐サブユニットの構造比較では、上部表面にリガンド結合領域を有した１つの球状ドメインを形成する、所謂７枚羽根β‐プロペラ構造に、インテグリンが折りたたまれていることを示唆した（Springer(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94(1):65-72）。二価陽イオン、即ちＭｇ２＋、Ｃａ２＋またはＭｎ２＋が、ブレード４〜７の下部表面に位置する部位と結合している（Humphries(2000)Biochem.Soc.Trans.28(4):311-339）。いくつかのインテグリンα‐サブユニットの細胞外ドメインは、ブレード２と３の間に挿入されたＩドメインも含有している。Ｍｇ２＋の存在下で結晶化されたＩドメインの構造分析では、リガンド結合にとり重要な特徴的金属イオン依存性接着部位モチーフ（ＭＩＤＡＳ）の存在を明らかにした（Plow et al.(2000)J.Biol.Chem.275(29):21785-21788）。
【００１１】
インテグリンα鎖では、さほど保存されないストーク領域が短い貫膜領域から予想β‐プロペラを分離している。このストーク領域は、細胞外および細胞内領域間のコンホメーション変化を伝える上で、更にはタンパク質‐タンパク質相互作用を仲介する上で、おそらく関与している。インテグリンは細胞シグナリング現象に関与するが、細胞質尾部が短く、酵素活性を欠いている。配列ＧＦＦＫＲはインテグリンα‐サブユニット細胞質尾部の大部分で保存されており、カルレチキュリン結合に重要なことが示された（Rojiani et al.Biochemistry.(1991)30(41):9859-66）。
【００１２】
生物の異なる細胞タイプにおけるインテグリンの発現
哺乳動物において、インテグリンは事実上すべての有核細胞および血小板で発現される。一部のインテグリン、例えばフィブロネクチンレセプターα５‐β１は、体全体で広く発現される。他のインテグリンはそれらの発現プロファイルで多く制限され、例えばリンパ球機能性抗原１（ＬＦＡ１）αＬ‐β２はリンパ球で発現される。細胞は、細胞外マトリックスで異なるリガンドまたは他の細胞で異なるレセプターと相互作用しうるいくつか異なるインテグリンを、それらの表面で同時に発現する。一部のインテグリンはいくつか異なるリガンドを認識し、例えばαｖ‐β３インテグリンは、タンパク質配列ＲＧＤ（アスパラギン‐グリシン‐グルタミン酸）を含有するビトロネクチン、オステオポンチン、フビリノーゲンおよび他の細胞外マトリックスタンパク質と細胞を相互作用させられる。他方、ある場合には、同一リガンドと結合する異なるインテグリンも存在し、例えばインテグリンα１‐β１、α２‐β１はすべてコラーゲンＩ型と結合する。しかしながら、コラーゲンへのこれらインテグリンの結合により細胞へ伝達されるシグナルには、差異がある。コラーゲンＩ型へのα１‐β１結合は線維芽細胞でコラーゲン合成の負調節につながり、α２‐β１は線維芽細胞でコラーゲン合成の正調節につながる（Heino,J.,Matrix Biol.(2000)19(4):319-23）。
【００１３】
軟骨細胞
軟骨細胞が軟骨で唯一の細胞型である。関節軟骨細胞は、フィブロネクチン（α５‐β１）、IIおよびVI型コラーゲン（α１‐β１、α２‐β１、α１０‐β１）、ラミニン（α６‐β１）、ビトロネクチンおよびオステオポンチン（αＶ‐β３）のレセプターとして働く、インテグリンファミリーのいくつかのメンバーを発現することがわかった（Loesser(2000)Biorheology.37:109-116）。α２β１は軟骨マトリックスタンパク質コンドロアドヘリンのレセプターである（Camper et al.(1997)J.Cell Biol.138(5):1159-1167）。
【００１４】
骨格および軟骨の疾患
軟骨細胞および他の細胞外マトリックス産生細胞の機能不全は、異常細胞外マトリックスの合成、代謝回転または集合につながる。これは関与する組織または器官へ深刻な結果をもたらし、１種以上の筋骨格障害を招くことがある。筋骨格疾患はよく起き、現在では我々の健康社会システムに高コストを負わせている：
・年金受給者１０人中４人は日常的に関節痛を有しているが、半数が健康専門家と相談しているにすぎない。
・骨関節炎はリウマチ様関節炎より１０倍多い。
・スウェーデンでは、骨関節炎のせいで１５，０００ほどの関節が毎年外科的に取り換えられ、ＵＳＡでは５００，０００以上である。
・骨関節炎の罹患率は年齢が５０を越えると急増し、この年齢層は１９９０から２０２０の間に世界中で２倍になるであろう。
【００１５】
骨関節炎およびリウマチ様関節炎が２大関節疾患である。リウマチ様関節炎は炎症が激しい全身多関節自己免疫疾患と考えられるが、骨関節炎は多くが１または数箇所の関節に限定され、炎症の症状が限定される。双方の疾患とも、個体において関節の破壊と著しい機能制限を招くことがある。
【００１６】
リウマチ様関節炎の現行治療は、これらのプロセスを抑制する薬物で痛み、炎症および免疫応答を制限することに向けられている。最近導入された生物学的治療では、疾患プロセスの重要駆動因子の１つ、ＴＮＦの抗体または可溶性レセプターを用いる。これらの治療は多くの場合に有効であるが、それらの効果は治療期間に限定され、それらは非常にコスト高であり、それらは重大な副作用を有している。これらの欠点にもかかわらず、疾患プロセスが改変されて関節が更なる破壊から防御されるという概念の証明を行った、新たな‘生物学的手法’が打開策としてみなされている。
【００１７】
現在行われているような骨関節炎の薬理学的治療は、鎮痛剤および非ステロイド系抗炎症薬の使用により痛みを減少させて、機能を改善することが目的である。骨関節炎で関節を破壊するプロセスに確実に影響を与えられる、有効な治療法はない。最終段階の骨関節炎のとき、最善の治療法は関節取換えである。
【００１８】
２００１年度の筋骨格疾患用薬物の売上げは、１３大市場で１５５億ＵＳ＄であった。２００１年度の増加率は１６％であり、全薬物グループ中で最大であった。骨関節炎およびリウマチ様関節炎用の薬物が、このグループで大きなシェアを占めている。
【００１９】
リウマチ様関節炎の薬物開発には、市場で導入させようとする別な‘生物学的製剤’と、同一または他の経路で‘生物学的製剤’として同様の疾患改変効果を発揮する小分子化合物の真摯なサーチを要する。
【００２０】
骨関節炎の薬物開発にはいくつかの道筋を経由する。一方で、副作用の少ない良い鎮痛剤／非ステロイド系抗炎症薬が探し求められている。他方、疾患プロセスを改変しうる治療法が存在しないことは明らかである。関節を防御する手段としてプロテアーゼインヒビターに大きな関心が向けられたが、このような薬物は臨床試験で未だ成功していない。骨関節炎における炎症の役割にも注目が現在向けられており、経路が標的を特定するために調べられている。
【００２１】
要約すると、骨関節炎の現行治療法は症状のみを扱っており、十分でなければ関節が取り換えられる。疾患プロセスおよび軟骨破壊を制限する治療は大いに必要とされているが、未だ利用できない。別の長期目的は、関節軟骨の再生を刺激することである。
【００２２】
α１０
新たに発見されたコラーゲン結合インテグリン、α１０β１は、インテグリンサブユニットα１０を含有している（Camper et al.(1998)J.Biol.Chem.273:20383-20389）。そのインテグリンは軟骨細胞で発現され、コラーゲンII型アフィニティ精製でウシ軟骨細胞から単離された場合、還元後に１６０ｋＤａのＭｒを示す。
【００２３】
クローニングおよびｃＤＮＡ配列決定では、それが他のインテグリンαサブユニットの全体構造を有していることを示した。予想アミノ酸配列は、シグナルペプチド（２２アミノ酸）、長い細胞外ドメイン（１０９８アミノ酸）、貫膜ドメイン（２２アミノ酸）および短い細胞質ドメイン（２２アミノ酸）を含めて、１１６７アミノ酸成熟タンパク質からなる。ほとんどのα‐インテグリンサブユニットとは対照的に、α１０の細胞質ドメインは保存配列ＫＸＧＦＦ（Ｒ／Ｋ）Ｒを含有していない。代わりに、α１０の予想アミノ酸配列はＫＬＧＦＦＡＨである。α鎖のＧＦＦＫＲモチーフは、インテグリンサブユニットの会合および原形質膜へのインテグリンの輸送にとり重要であることが示唆された（De Melker et al.(1997)Biochem.J.328:529-537）。ＫＸＧＦＦ（Ｒ／Ｋ）Ｒは細胞内タンパク質カルレチキュリンと相互作用することが示され（Rojiani et al.Biochemistry.(1991)30(41):9859-66）、面白いことに、無カルレチキュリン胚幹細胞はインテグリン仲介細胞接着に欠陥がある（Coppolino et al.(1997)Nature.386:843-847）。
【００２４】
細胞外部分は、７回折りたたみ反復配列、Ｉドメイン（１９９アミノ酸）および３つの推定二価陽イオン結合部位を含有している。α１０の推定アミノ酸配列はインテグリンサブユニットα２と３５％同一であり、インテグリンサブユニットα１と３７％同一である。配列分析では、α１（３７％）およびα２（３５％）と最大同一率で、α１０サブユニットがＩドメイン含有αサブユニットと最も密接に関連していることを明らかにした。
【００２５】
α１０の細胞質ドメインに対するペプチド抗体はヒト軟骨の組織部分における軟骨細胞へ特異的に免疫局在化し、α１０α１が軟骨組織で発現されることを示している。
【００２６】
マウスの研究では、α１０インテグリンが様々なマウス組織、例えば関節、脊椎、気管および気管支のヒアリン軟骨で発現されることを示した（Camper et al.(2001)Cell Tissue Res.306(1):107-116）。加えて、α１０はRanvierの骨化溝、心臓の大動脈および房室弁、および骨格筋および靭帯の裏にある線維組織でみられた。全般的に、その分布はコラーゲン結合インテグリンα１β１およびα２β１の場合と異なっていた。マウスでα１０の発現は、軟骨形成が始まるのと同時に、胚１１．５日目に生じた。
【００２７】
α１１
α１１インテグリンが培養ヒト胎児筋細胞で最近同定された（３８）。クローニングおよび特徴付けにより、Ｉドメイン含有、β１会合タンパク質を明らかにした。
【００２８】
ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームは１１８８アミノ酸の前駆体をコードしている。１１６６アミノ酸の予想成熟タンパク質は、７つの保存ＦＧＧＡＰリピート、ＭＩＤＡＳモチーフ含有Ｉドメイン、短い貫膜領域および配列ＧＦＦＲＳ含有２４アミノ酸のユニーク細胞質ドメインを含有している。
【００２９】
α１１は、リピート５〜７で３つの潜在的二価陽イオン結合部位を含有している。細胞外軸部分（アミノ酸８０４‐８２６）における２２挿入アミノ酸の存在は、α１１インテグリン配列を他のインテグリンα鎖と更に区別している。
【００３０】
アミノ酸配列比較では、α１０インテグリン鎖と最高同一性（４２％）を示す。α１１インテグリンに対する抗体との免疫沈降では、非還元条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより分析されたとき、１４０ｋＤａ  α２インテグリン鎖より明らかに大きい、１４５ｋＤａタンパク質を捕捉した。
【００３１】
蛍光in situハイブリダイゼーションによると、Bardet-Biedl症候群に関して特定された座の付近、染色体１５ｑ２２．３‐ｑ２３に、インテグリンα１１遺伝子を位置づけた。ノーザンブロットに基づくと、インテグリンα１１  ｍＲＮＡレベルは試験された成人子宮および心臓で高く、骨格筋および一部他の組織で中程度である。インビトロ筋原性分化に際して、α１１  ｍＲＮＡおよびタンパク質が正調節される。リガンド結合性質の研究では、α１１β１がコラーゲンＩ型セファロースと結合し、培養筋細胞ではα１１β１がコラーゲンＩ型のフォーカル・コンタクト(focal contact)に局在することを示している。
【００３２】
アテローム動脈硬化症
アテローム動脈硬化症およびその血栓形成合併症が、工業国における死亡の主原因である。２０００年度のアテローム動脈硬化症例数は主要医薬市場でほぼ１．７４億人に達し、この数値は老人の増加に伴い増え続けるであろう。なお、これらのうち一部が疾患の明確な徴候を示すにすぎない。最悪の場合には心臓発作または卒中として、疾患が症状に現れるまで、残りは診断未確定のままである。アテローム動脈硬化症は、血管壁内における脂質（主に、コレステロールエステル）、炭水化物、血中産物、線維組織およびカルシウムの蓄積が内皮下層空隙で始まったことによる動脈の肥厚化および硬化で特徴付けられる、限局的病理現象である。脂肪沈着の漸増でプラークの形成を招き、最終的には動脈を狭め閉塞させる。このようなプラーク形成の原因および検出が真摯に研究されている。
【００３３】
ノックアウト動物
ノックアウト動物の作製には、最初に、特定遺伝子の発現を抑制するために用いられる核酸構築物を、胚幹細胞と称される未分化細胞タイプ中へ導入することを要する。次いで、この細胞は発育胚中へ注入される。次いで、胚は妊娠期間中フォスターマザーへ移植される。
【００３４】
多くのインテグリンの結合特異性が重複しているという事実にもかかわらず、ほぼすべてのインテグリンα‐またはβ‐サブユニットの喪失がノックアウトマウスで生物学的欠損をもたらす（Bouvard et al.(2001)Circ.Res.89(3):211-223）。これらの欠損は、偏在的発現β１インテグリン遺伝子の破壊で少くとも１２種の異なるインテグリンレセプターの喪失に至る胚致死から、α１ノックアウトマウスの潜在的不完全化まで、多岐にわたる。
【００３５】
マウスでα７インテグリン遺伝子の不活化と、ヒトＩＴＧＡ７遺伝子の変異は、双方とも筋ジストロフィーの原因となり、主に筋接着点に影響を与えることが示された。β１サブファミリーの１１メンバーのうち、α７は成人骨格筋線維鞘でβ１Ｄインテグリン鎖と会合した主要インテグリンα鎖として存在する。面白いことに、基底膜タンパク質ラミニンα２鎖の変異は、ラミニンレセプターインテグリンα７β１で観察されるものよりも重度の疾患を引き起こす。これは、ラミニンの他のレセプターが筋肉に存在することを示している。
【００３６】
加えて、類似したリガンド結合特異性と、一部の機能が他のインテグリンのもので補われる特性とを有した、２種のインテグリン、即ちα３およびα６インテグリンサブユニットのシングルおよびダブルノックアウトが発現されることは、組織でよくある（de Arcangelis et al.(1999)Development.126(17):3957-3968）。
【００３７】
多くのインビトロ研究が行われてきたが、骨格の主要細胞タイプ（軟骨細胞、造骨細胞および破骨細胞）におけるインテグリンの機能はよく解明されておらず、これらインテグリンの役割の一層の理解が必要とされている。特に、インテグリンα１０‐β１およびα１１‐β１の生物学についてはほとんど知られていない。
【００３８】
骨および軟骨の欠陥および他の細胞外マトリックス関連疾患のせいで生じる重度の障害からみて、障害の新たな改善された治療法を評価するためには、これらの障害を研究するためのインビボ系およびモデルを提供する必要性が当業界にある。
【００３９】
そのため、インテグリン、特にα１０‐β１およびα１１‐β１の生物学と骨格および軟骨並びにアテローム性動脈硬化症へ及ぼすそれらの効果との更なる理解のための手段および方法を開発することが、前記の問題および知識の欠如からみて高度に望まれる。この点において、本発明はこの必要性および関心を扱っている。
【発明の要旨】
【００４０】
インテグリン、特にα１０‐β１およびα１１‐β１と、骨格および軟骨、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織、筋骨格および結合組織疾患および炎症へ及ぼすそれらの効果とを研究するに際し当業界で知られた前記の欠点を考慮して、本発明は非ヒトノックアウト哺乳動物およびその子孫、このようなノックアウト非ヒト哺乳動物を作製するための方法、このようなものを作製するための、或いは方法を行うための構築物、並びに骨格、関節、筋肉、炎症、軟骨などに関連した様々な疾患をモデル化するための使用を提供する。
【００４１】
本発明の１つの目的は、上記のインテグリンα１０‐β１およびα１１‐β１と、骨格および軟骨、筋骨格および結合組織疾患および炎症へ及ぼすそれらの効果とを研究および調節するためのモデル系を提供することである。
【００４２】
このように、本発明は、非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１０遺伝子の少くとも一部が、インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１０遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫を提供する。
【００４３】
しかも、本発明は、非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１１遺伝子の少くとも一部が、インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１１遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫を提供する。
【００４４】
更に、本発明は、非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１０遺伝子の少くとも一部が、１）インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を第一のマーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列および２）インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を第二のマーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１０遺伝子およびインテグリンα１１遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫も提供する。更には、本発明は、インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部をマーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１０遺伝子の一部を置き換えるステップからなる、破壊されたインテグリンα１０遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法を提供する。本発明による方法は、インテグリンα１０のノックアウト構築物を用意し、ＥＳ細胞系を用意し、ｂ）のＥＳ細胞系をａ）の構築物で形質転換し、マーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、胚盤胞を用意し、ＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、胚をキメラ動物へ発育させて破壊インテグリンα１０遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせるステップを更に含んでいる。
【００４５】
同様に、本発明は、α１１ノックアウト並びにα１０およびα１１遺伝子双方の発現が破壊されたダブルノックアウトを作製するための方法を提供する。
【００４６】
本発明の異なる非ヒト哺乳動物およびそれら子孫の使用、並びに筋骨格および結合組織疾患、アテローム性動脈硬化症、線維症、間葉幹細胞のような幹細胞の分化、骨折治癒、炎症疾患、遺伝子療法における効果について剤をスクリーニングするための方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【００４７】
定義
ここで用いられている“ノックアウト”という用語は、細胞の内在ＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質の少くとも一部の発現の部分的または完全な抑制を意味する。
【００４８】
“ノックアウト構築物”という用語は、細胞の内在ＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質の発現を減少または抑制させるようにデザインされた核酸配列に関する。
【００４９】
“マーカー配列”という用語は、（１）対象の遺伝子の発現を壊すために、核酸構築物、即ち“ノックアウト構築物”の一部として用いられる、および（２）ノックアウト構築物をゲノム中へ組み込んだ細胞を同定するための手段として用いられる、核酸配列をここでは意味する。
【００５０】
“選択マーカー配列”という用語は、（１）核酸構築物、即ち“ノックアウト構築物”の一部として用いられる、および（２）ノックアウト構築物を細胞中へ取込むことで、ノックアウト構築物を取り込んでいない細胞にはない増殖利点を獲得した細胞、例えば胚幹細胞について選択するために選択ステップで用いられる、核酸配列をここでは意味する。
【００５１】
“遺伝子破壊”および“遺伝子の破壊”という用語は、遺伝子の野生型または天然配列と比較して、細胞で遺伝子の発現を減少または阻止するような、自然ＤＮＡ配列の１領域、例えば通常遺伝子の１以上のエキソンおよび／またはプロモーター領域中への核酸配列の挿入に関する。“発現を減少または阻止する”という用語は、遺伝子の発現の部分的または完全なブロックを意味する。
【００５２】
“げっ歯類”という用語は、由来する将来の全世代のあらゆる子孫を含めた、系統Rodentia目の全メンバーに関する。
【００５３】
“ネズミ”という用語は、ラットおよびマウスを含めたMuridae科のあらゆるメンバーに関する。
【００５４】
“子孫”という用語は、特定の哺乳動物、即ちゲノムＤＮＡ中へ挿入されたノックアウト構築物を含有する哺乳動物に由来した、あらゆる将来の世代に関する。そのため、次に続く世代の子孫がここでは含まれ、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３世代などと順次続く子孫がこの定義に含まれる。
【００５５】
“活性を調節する”および“活性を調節している”という用語は、特定系、例えば野生型またはノックアウトげっ歯類、または該げっ歯類における軟骨、関節または骨疾患の諸成分の活性レベルについて、特定種に関するその成分の平均活性と比較した変化に関する。このような調節は、特定種に関するその成分の平均活性と比較して、活性レベルの増加でもまたは減少でもよい。
【００５６】
“筋骨格疾患”という用語は、筋肉およびそれらの関連靭帯および他の結合組織、並びに包括的にみた骨および軟骨の疾患に関する。
【００５７】
“遺伝子療法”という用語は、生物の細胞へ変異または野生型遺伝子を加えることによる、遺伝子の機能不全に起因した疾患の治療に関する。
【００５８】
ノックアウトされる遺伝子の選択
上記のように、本発明はインテグリン遺伝子が破壊された非ヒト哺乳動物およびその子孫、即ちノックアウト動物に関する。
【００５９】
本発明によると、ノックアウトされる遺伝子は、軟骨、腱、靭帯、無脊椎円板、角膜、関節または骨形成、骨折治癒、および分化、筋骨格および結合組織疾患、アテローム性動脈硬化症、線維症、炎症疾患、心臓弁疾患、幹細胞の分化または機能の活性、並びにこのような現象に関連した異なる疾患段階のような病気状態を含めた、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織の調節に直接または間接的に関与する遺伝子である。
【００６０】
破壊されるＤＮＡに関する少くとも一部の配列情報が、ノックアウト構築物およびスクリーニングプローブ双方の作製に用いる上で利用しうるならば、ノックアウトされる遺伝子はいかなるインテグリンα１０または１１遺伝子でもよい。ノックアウトされる好ましい遺伝子は、マウスのようなげっ歯類におけるインテグリンα１０またはインテグリンα１１遺伝子である。
【００６１】
ノックアウトマウス
遺伝子ターゲティング技術は、作製されるマウスがα１０およびα１１遺伝子座で破壊された、特定のインテグリンを欠くマウスを作製すること、ひいてはインテグリンα１０β１およびα１１β１の機能的役割を更に洞察することを最近可能にした。
【００６２】
本発明によると、非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１０遺伝子の少くとも一部が、インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１０遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫が提供される。
【００６３】
別な態様において、インテグリンα１０コーディング配列の一部が、インテグリンα１０イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である。
【００６４】
更に別の態様において、インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列が、受託番号ＤＳＭ１４９３３でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されたベクターに含有されているＤＮＡ配列である。
【００６５】
更に本発明には、非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１１遺伝子の少くとも一部が、インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１１遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫が含まれる。
【００６６】
別な態様において、インテグリンα１１コーディング配列の一部が、インテグリンα１１イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である。
【００６７】
更に別の態様において、インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列が、受託番号ＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されたベクターに含有されているＤＮＡ配列である。
【００６８】
加えて、単一のインテグリン遺伝子が破壊されたときに、もう１つのインテグリンによる補償メカニズムが知られているため、α１０およびα１１双方のサブユニットを欠く非ヒト哺乳動物、即ちダブルノックアウトが作製された。
【００６９】
そのため、本発明の範囲内には、２種の遺伝子、α１０およびα１１がノックアウトされた非ヒト哺乳動物が含まれる。このような哺乳動物は、各タイプのノックアウトマウスを作製するためにここで記載された操作を繰返すことにより、または単純に、インテグリンα１０およびα１１をコードする単一遺伝子が各々でノックアウトされた２種の哺乳動物を互いに交配させて、ダブルノックアウト遺伝子型のものについてスクリーニングすることにより作製しうる。
【００７０】
したがって、非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１０遺伝子の少くとも一部が、１）インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を第一の選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列および２）インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部を第二の選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１０遺伝子およびインテグリンα１１遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫が提供される。
【００７１】
別な態様において、インテグリンα１０およびα１１コーディング配列の一部が、インテグリンα１０およびα１１イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である。
【００７２】
対象の遺伝子、即ちインテグリンα１０および／またはα１１の破壊は、自然ゲノムＤＮＡ配列の１領域中への核酸配列の挿入により行われる。通常遺伝子の１以上のエキソンおよび／またはプロモーター領域が破壊されると、対象の非ヒト哺乳動物における遺伝子の野生型または天然配列と比較して、細胞においてその遺伝子の抑制、減少または阻止された発現をもたらす。
【００７３】
このように、本発明は、野生型非ヒト哺乳動物と比較して、遺伝子の破壊のせいで対象の遺伝子の発現が抑制された、ノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫を更に提供する。上記遺伝子の発現の減少、抑制または阻止の確認は、下記方法のいずれか、即ちノーザン、サザンまたはウエスタンブロットおよびＰＣＲ技術または当業者に知られた他の方法、例えば免疫沈降法に従い行われる。
【００７４】
本発明によると、α１０および／またはα１１遺伝子発現の完全阻止、即ち遺伝子発現の１００％抑制または阻止が好ましい。
【００７５】
別な態様は、インテグリンα１０をコードする遺伝子の発現が、野生型非ヒト哺乳動物と比較して減少、抑制または阻止される、ノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫である。このような非ヒト哺乳動物およびその子孫は、インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入によりα１０が抑制されている。
【００７６】
同様に、インテグリンα１１をコードする遺伝子の発現が、野生型非ヒト哺乳動物と比較して減少、抑制または阻止される、ノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫が考えられる。具体的態様において、上記のα１１は、インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により抑制されている。
【００７７】
ダブルノックアウトにおいて、２種の異なる遺伝子の発現は、該２遺伝子の破壊のせいで減少、抑制または阻止される。本発明によると、インテグリンα１０をコードする遺伝子およびインテグリンα１１をコードする遺伝子の発現が、野生型非ヒト哺乳動物と比較して減少、抑制または阻止される、非ヒト哺乳動物およびその子孫が提供される。上記ダブルノックアウトの具体的態様として、インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入によりα１０が抑制され、かつインテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を第二の選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入によりα１１が抑制される、非ヒト哺乳動物およびその子孫が開示されている。
【００７８】
別な態様では、インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により、α１０および／またはα１１が抑制されている。
【００７９】
更に別の態様において、インテグリンα１０および／またはα１１コーディング配列の一部が、インテグリンα１０および／またはα１１イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である。
【００８０】
更に他の別な態様において、ノックアウト構築物が選択マーカー配列へ結合されたインテグリンα１０またはα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでおり、受託番号ＤＳＭ１４９３３およびＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに各々寄託されたベクターに含有されている。
【００８１】
上記ダブルノックアウトの異なる態様において、上記の選択マーカー配列は、上記態様で記載された、遺伝子がシングル遺伝子ノックアウトとして破壊されるときに用いられるものと同様のマーカー配列でも、または異なっていてもよい。本発明に従い開示された上記非ヒト哺乳動物およびその子孫の一態様において、α１０またはα１１遺伝子は、選択マーカー配列の少くとも一部がネオマイシン耐性遺伝子である構築物を用いて破壊される。用いられる他の選択マーカー配列は当業者に明白であり、例えばZeocineTM、ゲンタマイシン、ハイグロマイシンおよびプロマイシンがある。
【００８２】
更に別の態様において、マーカー配列は、対象の遺伝子、即ちα１０および／またはα１１を破壊した細胞を同定するために用いられる。適切なマーカー配列の例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｌａｃ‐ｚについてコードする配列である。当業者に周知の他のマーカーも用いてよい。
【００８３】
本発明の一態様において、α１０で用いられるマーカー配列はＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）である。
【００８４】
α１０に関する更に他の態様において、α１０で用いられるマーカー配列はｌａｃ‐ｚである。
【００８５】
本発明の他の態様において、α１１で用いられるマーカー配列はｌａｃ‐ｚである。
【００８６】
α１１に関する更に他の態様において、α１１で用いられるマーカー配列はＧＦＰである。
【００８７】
本発明は、異なる種からのα１０およびα１１ノックアウト非ヒト哺乳動物の作製も含む。好ましい態様にはウサギ、ラット、ハムスターおよびマウスを含めたげっ歯類のあらゆる種を含むが、それらに限定されない。好ましいげっ歯類はラットおよびマウスを含めたMuridae科のメンバーであり、マウスが最も好ましい態様である。
【００８８】
このように、非ヒト哺乳動物の具体的態様において、非ヒト哺乳動物およびその子孫はげっ歯類である。
【００８９】
更に別の態様において、上記のげっ歯類はマウスである。
【００９０】
破壊インテグリンα１０遺伝子および／または破壊インテグリンα１１遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を前作製するための方法
本発明は、インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部をマーカー分子へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１０遺伝子の一部を置き換えるステップからなる、破壊インテグリンα１０遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法も提供する。
【００９１】
このような方法は、別な態様において、
ａ）インテグリンα１０のノックアウト構築物を用意し、
ｂ）ＥＳ細胞系を用意し、
ｃ）ｂ）のＥＳ細胞系をａ）の構築物で形質転換し、
ｄ）マーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、
ｅ）胚盤胞を用意し、
ｆ）ＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、
ｇ）胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、および
ｈ）胚をキメラ動物へ発育させて、破壊インテグリンα１０遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせる
ステップを含んでいる。
【００９２】
同様に、破壊インテグリンα１１遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法が開示されている。このような方法は、インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部をマーカー分子へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１１遺伝子の一部を置き換えるステップからなる。
【００９３】
更に、破壊インテグリンα１１遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法は、
ｉ）インテグリンα１１のノックアウト構築物を用意し、
ｊ）ＥＳ細胞系を用意し、
ｋ）ｊ）のＥＳ細胞系をｉ）の構築物で形質転換し、
ｌ）マーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、
ｍ）胚盤胞を用意し、
ｎ）ＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、
ｏ）胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、および
ｐ）胚をキメラ動物へ発育させて、破壊インテグリンα１１遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせる
ステップを含んでいる。
【００９４】
更には、破壊インテグリンα１０遺伝子および破壊インテグリンα１１遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫、即ちダブルノックアウトを作製するための方法が本発明に含まれ、
ｑ）インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部をマーカー分子へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１０遺伝子の一部を置き換え、および
ｒ）インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部をマーカー分子へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１１遺伝子の一部を置き換える
ステップを含んでいる。
【００９５】
ダブルノックアウトを作製するための方法は、
ｓ）インテグリンα１０のノックアウト構築物を用意し、かつインテグリンα１１のノックアウト構築物を用意し
ｔ）ＥＳ細胞系を用意し、
ｕ）ｔ）のＥＳ細胞系をｓ）の構築物で同時にまたは１回で形質転換し、
ｖ）少くとも１つのマーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、
ｗ）胚盤胞を用意し、
ｘ）形質転換および選択されたＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、
ｙ）胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、および
ｚ）胚をキメラ動物へ発育させて、破壊インテグリンα１０遺伝子およびインテグリンα１１遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせる
ステップを更に含んでいる。
【００９６】
上記において略述したこれらの方法は、哺乳動物で遺伝子を破壊する当業者に周知である。更に、これらは時間のかかる方法であり、遺伝子の破壊と生殖細胞系伝達の成功がみられるまで、数回繰返す必要があるかもしれない。特にダブルノックアウトを作製するとき、ステップｕ）〜ｚ）は数回繰返されるかもしれない。
【００９７】
これらの方法は下記段落と後の例で詳細に更に記載されている。
【００９８】
ノックアウト構築物およびその製作
本発明は、インテグリンα１０ノックアウト構築物を含んでなる核酸配列を提供する。インテグリンα１０ノックアウト構築物の配列は、当業者に知られた標準ＤＮＡ配列決定により、受託番号ＤＳＭ１４９３３でBudapest条約に従い寄託されたＤＮＡを含んでなるベクターから求められる。
【００９９】
インテグリンα１１ノックアウト構築物を含んでなる核酸配列も提供される。インテグリンα１１ノックアウト構築物の配列は、当業者に知られた標準ＤＮＡ配列決定により、受託番号ＤＳＭ１４９３４でBudapest条約に従い寄託されたＤＮＡを含んでなるベクターから求められる。
【０１００】
対象の遺伝子を破壊するためにノックアウト構築物として用いられる核酸配列は、典型的には、１）抑制される遺伝子のある部分、例えばエキソン配列、イントロン配列および／またはプロモーター配列からの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のような核酸、および２）細胞でノックアウト構築物の存在を選択するために用いられる選択マーカー配列、場合により細胞でノックアウト構築物の存在を検出するために用いられるマーカー配列から構成されている。ノックアウト構築物は細胞中へ挿入され、自然ＤＮＡ配列の転写を阻止または遮断するような位置で細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。
【０１０１】
通常、ノックアウト構築物で用いられる核酸は１以上のエキソンおよび／またはイントロン領域および／またはプロモーター領域であるが、ノックアウト構築物がＥＳ細胞のゲノムＤＮＡ中へ導入されたときハイブリダイゼーション向けに十分な相補的配列を供せるほどｃＤＮＡが十分に大きいならば、ｃＤＮＡ配列でもよい。
【０１０２】
選択遺伝子をノックアウトするために用いられる核酸配列は、Current Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience and Greene(Publishers)Ausubel,F.M.,Brent R.,Kingston R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith J.A.,Struhl.K.）または類似した書籍、例えば（Sambrook et al.(1989)Molecular cloning:A laboratory manual,2nd edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）で記載されたような、当業界で周知の方法を用いて得られる。このような方法では、例えば、ゲノム配列の少くとも一部を得るために、同遺伝子の少くとも一部をコードするｃＤＮＡプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングする。一方、ｃＤＮＡ配列がノックアウト構築物で用いられるならば、ライブラリーが発現ベクター中へクローニングされたｃＤＮＡライブラリーを、オリゴヌクレオチドプローブまたは抗体でスクリーニングすることにより、ｃＤＮＡは得てもよい。プロモーター配列がノックアウト構築物で用いられるならば、プロモーター配列を含有したゲノムライブラリーをスクリーニングするための合成ＤＮＡまたはＲＮＡプローブがデザインされる。当業者に知られたスクリーニングのための他の方法は、ゲノムクローンからの配列のデータベース検索、例えばwww.ensembl.org/Mus Musculus/およびwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/による。このようなデータベースから、物理的配列が核酸サンプルとして得られる。
【０１０３】
ノックアウト構築物で用いられる核酸を得るためのもう１つの方法は、例えばＤＮＡシンセサイザーを用いて、ＤＮＡ配列を合成で製造することである。
【０１０４】
ノックアウト構築物をコードする核酸配列は、遺伝子操作およびＥＳ細胞中への挿入にとり十分な量で作製されねばならない。増幅は、１）その配列を適切なベクター中へ入れて、該ベクターを急速に増幅しうる細菌または他の細胞へ導入すること、２）ＰＣＲ増幅、または３）ＤＮＡシンセサイザーでの合成により行われる。
【０１０５】
マーカー配列は、アッセイまたは検出可能なマーカーであるという目的に沿う配列であれば何でもよいが、典型的には、細胞で検出可能な特性を呈するタンパク質をコードする核酸配列、例えば抗生物質耐性遺伝子、またはゲノムでの発現または存在が容易に検出しうる、典型的には細胞でみられないアッセイ可能な酵素である。
【０１０６】
マーカー配列は、それ自身のプロモーター、あるいは活性であるかまたは挿入された細胞で容易に活性化される供給源からの別な強いプロモーターへ、作働可能に結合させてもよい。マーカー配列がタンパク質をコードしている場合、マーカー配列はその発現を調節するプロモーターも含有してよい。
【０１０７】
マーカー配列は、抑制される遺伝子のプロモーターを用いて転写されるようにすれば、それ自身のプロモーターを付着させる必要はない。加えて、マーカー遺伝子は該遺伝子の３′末端へポリＡ配列を付着させてもよい；この配列は遺伝子の転写を終結させるように働く。
【０１０８】
本発明によると、ノックアウト構築物はマーカー配列を含んでいる。本発明の一態様において、α１０遺伝子はＧＦＰマーカー配列をα１０プロモーターへ結合させている。
【０１０９】
本発明の他の態様において、α１１遺伝子はＧＦＰマーカー配列をα１１プロモーターへ結合させている。
【０１１０】
別の態様では、α１０および／またはα１１がｌａｃ‐ｚをα１０プロモーターまたはα１１プロモーターへ結合させている。
【０１１１】
本発明によるノックアウト構築物を作製する上で用いられるＤＮＡ配列は、マーカー遺伝子をコードする新ＤＮＡ配列がこのＤＮＡ配列内に適正な位置で挿入されるような箇所において切るように選択された、特定の制限酵素または一連の酵素で切断される。マーカー遺伝子挿入にとり適正な位置は、自然遺伝子の発現を阻止するように働く位置である。該位置は、切断される配列における制限部位の箇所のような、様々なファクターに依存する。考えられる他のファクターは、エキソン配列、プロモーター配列または双方が遮断されるのかどうか、即ちプロモーター機能を阻害するまたは自然エキソンの合成を阻害する上で必要な挿入の正しい箇所である。好ましくは、ＤＮＡを切るために選択された酵素は長いアームと短いアームを作り出すが、短いアームは少くとも約３００塩基対（ｂｐ）である。
【０１１２】
本発明の一態様において、α１０短アームは１．３ｋｂおよび長アームは１０ｋｂである。
【０１１３】
更に他の態様において、α１１短アームは２．５ｋｂおよび長アームは５．５ｋｂである。
【０１１４】
一部の態様において、挿入される構築物または核酸では、抑制されるα１０および／またはα１１遺伝子の１以上のエキソンの一部または全部であっても実際に除去することが望ましい。これは、マーカー遺伝子がノックアウト構築物に挿入されたときに、元々のゲノム配列に相当するノックアウト構築物の長さを保つためである。これらの場合において、適正なサイズの断片が除去されるように、構築物中の核酸は適切な制限エンドヌクレアーゼで切断される。
【０１１５】
抑制される、即ち構築物中へ入れられる、α１０および／またはα１１遺伝子をコードする核酸配列が、適切な制限酵素で切断された後、マーカー配列が（Sambrook et al.(1989)Molecular cloning:A laboratory manual,2nd edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）で記載された当業者に周知の方法を用いて上記の核酸配列へ連結されるか、またはＰＣＲ技術によりノックアウト構築物の残部へ導入される。連結が用いられるならば、連結されるＤＮＡ断片の末端も適合性でなければならない。これは、適合末端を作製する酵素で全断片を切断するか、または連結前に末端をブラント化させることにより行える。ブラント化は、当業界で周知の方法を用いて、例えば付着末端を埋めるためにＤＮＡポリメラーゼＩのKlenow断片の使用により行われる。適合末端を導入する他の手法は、当業者に周知のＰＣＲ技術である。
【０１１６】
連結、またはそれ以外で一緒に結合されたノックアウト構築物は、下記のような胚幹細胞中へ直接挿入されるか、またはそれは挿入前に増幅に適したベクター中へ最初に入れられる。好ましいベクターは、ｐBluescript II ＳＫベクター（Stratagene,San Diego,ＣＡ）またはｐＧＥＭ７（Promega Corp.,Madison,ＷＩ）のような、細菌細胞で急速に増幅されるものである。
【０１１７】
本発明の一態様では、ｐBluescript II ＳＫ（＋）ベクターが用いられる。
【０１１８】
インテグリン遺伝子を破壊するためのターゲティング戦略
挿入によるターゲティングは相同的組換えにより通常生じ、即ちノックアウト構築物が細胞中へ挿入されたとき、内在ＤＮＡ配列と相同的なノックアウト構築物の領域が互いにハイブリッド形成して、ノックアウト構築物が内在ＤＮＡの相当位置へ組み込まれるような組換えが生じる。
【０１１９】
ノックアウト構築物核酸配列は、１）抑制される遺伝子の１以上のエキソンおよび／またはイントロンの全部または一部配列、２）抑制される遺伝子の全部または一部プロモーター配列、または３）それらの組合せを含んでなる。典型的には、ノックアウト構築物が胚幹細胞（ＥＳ細胞）中へ挿入され、通常相同的組換えのプロセスにより、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡ中へ組み込まれる。次いで、このＥＳ細胞は以下で更に記載される発育胚中へ注入され、それに組み込まれる。
【０１２０】
胚幹細胞のトランスフェクション
通常、ノックアウト哺乳動物を作製するために用いられる胚幹細胞（ＥＳ細胞）は、作製すべきノックアウト哺乳動物と同種のものである。そのため、例えば、マウス胚幹細胞がノックアウトマウスの作製に通常用いられる。
【０１２１】
本発明によると、インテグリンα１０ノックアウト構築物を含むＥＳ細胞系が提供される。
【０１２２】
更には、インテグリンα１１ノックアウト構築物を含むＥＳ細胞系が提供される。
【０１２３】
更に他には、インテグリンα１０ノックアウト構築物およびインテグリンα１１ノックアウト構築物を含むＥＳ細胞系が提供される。
【０１２４】
インテグリンα１０およびα１１に関するノックアウト構築物の例は、α１０およびα１１ノックアウト構築物を含んでなる２つの寄託ベクターＤＳＭ１４９３３およびＤＳＭ１４９３４からすべて検索しうる。
【０１２５】
胚幹細胞は、典型的には、ノックアウト構築物の生殖細胞系伝達を行えられるように、発育胚の生殖細胞系に組み込まれて、その一部になりうる能力に関して選択される。そのため、この能力を有すると思われるＥＳ細胞系がここでの使用に適している。本発明に従い用いられる適切なＥＳ細胞系の例は、ネズミＥＳ細胞系ＧＳ１‐１（以前はＢＷＥ４）（Incyte Genomics,Inc.3160 Porter Drive,Palo Alto,California 94304 ＵＳＡ）およびＲ１（Samuel Lunenfeld Research Institute,Room 881,Mount Sinai Hospital,600 University Avenue,Toronto,Ontario,Canada M5G 1X5）である。当業者に知られた他のネズミＥＳ細胞系も用いてよい。
【０１２６】
細胞は、Robertson（Teratocarcinomas and Embryonic Stem cells:A Practical Approach,E.J.Robertson,ed.IRL Press,Washington,D.C.(1987)）、Bradley et al.（Current Topics in Devel.Biol.,20:357-371(1986)）、Hogan et al.（Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1986)）およびTalts,J.F.,Brakebusch,C.,and Fassler R.,（Meth.Mol.Biol.129:153-187(1999)）により記載されたような当業者に周知の方法を用いて、ＤＮＡ挿入用に培養および作製される。
【０１２７】
ＥＳ細胞中へのノックアウト構築物の挿入は、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびリン酸カルシウム処理を含めた、当業界で周知の様々な方法を用いて行える。
【０１２８】
本発明の一態様において、挿入の方法はエレクトロポレーションである。
【０１２９】
ノックアウト構築物がベクターへ挿入されたならば、細胞中へ挿入される各ノックアウト構築物ＤＮＡは最初に直線化されねばならない。直線化は、ノックアウト構築物配列内ではなくベクター配列内のみで切るように選択された、適切な制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを切断しすることにより行われる。
【０１３０】
ＥＳ細胞中へのＤＮＡ配列の挿入の場合、ノックアウト構築物ＤＮＡは選択された挿入法に適した条件下でＥＳ細胞へ加えられる。２種以上の構築物がＥＳ細胞中へ導入される場合、各構築物をコードするＤＮＡは同時にまたは１回で導入される。
【０１３１】
細胞がエレクトロポレーションされるならば、ＥＳ細胞およびノックアウト構築物ＤＮＡはエレクトロポレーション機器を用いて製造業者の使用ガイドラインに従い電気パルスへ曝される。エレクトロポレーション後、細胞が適切なインキュベーション条件下で回収される。次いで、細胞はノックアウト構築物の存在についてスクリーニングされる。
【０１３２】
ノックアウト構築物の存在に関するスクリーニングは、様々な方法を用いて行える。選択マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、細胞は致死濃度の抗生物質の存在下で培養される。残存した細胞はノックアウト構築物をおそらく組み込んでいる。選択マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子以外であるならば、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡのサザンブロットにより、マーカー配列のみとハイブリッド形成するようにデザインされたＤＮＡの配列とプロービングさせる。最後に、マーカー遺伝子が、活性が検出しうる酵素、例えばβ‐ガラクトシダーゼをコードする遺伝子であるならば、酵素基質が適切な条件下で細胞へ加えられ、酵素活性が分析される。
【０１３３】
ノックアウト構築物がＥＳ細胞ゲノムの数箇所へ組み込まれ、ランダム挿入現象の出現のせいで各細胞ゲノムの異なる箇所へ組み込まれることがある。挿入の望ましい箇所は、ノックアウトされるＤＮＡ配列に相補的な位置である。典型的には、ノックアウト構築物を取り込んだＥＳ細胞の約１〜５％未満が、望ましい箇所にノックアウト構築物を現実に組み込んでいるにすぎない。
【０１３４】
ノックアウト構築物を適正に組み込んだ細胞を正確に同定および確認するために、（Sambrook et al.(1989)Molecular cloning:A laboratory manual,2nd edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）またはCurrent Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience and Greene(Publishers)Ausubel,F.M.,Brent R.,Kingston R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith J.A.,Struhl.K.）で記載されたような標準方法を用いて、ＤＮＡが細胞から抽出される。次いで、この場合には、特定の制限酵素で切断されたＥＳ細胞からのゲノムＤＮＡと特定のパターンでハイブリッド形成するようにデザインされたプローブを用いて、ＤＮＡがサザンブロットでプロービングされる。一方または加えて、ゲノムＤＮＡは、特定サイズおよび配列のＤＮＡ断片を増幅するように特別にデザインされたプローブを用いてＰＣＲにより増幅させてもよく、即ち適正な位置にノックアウト構築物を含有した細胞のみが適正サイズのＤＮＡ断片を作製することになるのである。
【０１３５】
胚の注入／移植
適正な箇所にノックアウト構築物を含有した適切なＥＳ細胞が同定された後、細胞が胚へ挿入される。挿入は様々な手法で行われるが、しかしながら好ましい方法はマイクロインジェクションによる。マイクロインジェクションの場合、約１０〜３０の細胞がマイクロピペット中に集められ、発育胚中へＥＳ細胞を組み込むために、発育の適正な段階にある胚中へ注入される。
【０１３６】
胚の発育の適切な段階は非常に種依存性であるが、しかしながらマウスの場合それは約３．５日である。胚は妊娠雌の子宮内を灌流することにより得られる。これを行うために適した方法は当業者に公知であり、Bradley et al.,前掲およびHogan et al.,（Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1986)）およびTalts,J.F.,Brakebusch,C.,and Fassler R.,（Meth.Mol.Biol.129:153-187(1999)）により記載されている。
【０１３７】
適正な発育年齢／段階の胚はいずれも使用に適しているが、胚は雄でもよく、ＥＳ細胞遺伝子によりコードされた毛色とは異なる毛色についてコードする遺伝子を有してもよい。こうして、ＥＳ細胞が発育胚中へ組み込まれたことを示すモザイク毛色を捜すことにより、ノックアウト構築物の存在について子孫が容易にスクリーニングされる。こうして、例えば、ＥＳ細胞系が白毛の遺伝子を有しているならば、選択される胚は黒色または褐色毛の遺伝子を有してもよい。ＥＳ細胞が好結果で胚へ組み込まれたならば、子孫は毛色がモザイクになる。
【０１３８】
ＥＳ細胞が胚へ導入された後、胚が偽妊娠フォスターマザーの子宮中へ移植される。いかなるフォスターマザーも用いうるが、それらは典型的にはうまく生育および繁殖する能力と、それらの仔の世話をする能力について選択される。このようなフォスターマザーは、典型的には、同種の精管切除雄と交配することにより作製される。偽妊娠フォスターマザーの段階は移植に成功する上で重要であり、種依存性である。マウスの場合、この段階は約２〜３日の偽妊娠時である。
【０１３９】
非ヒト哺乳動物でノックアウト遺伝子の存在に関するスクリーニング
毛色選択戦略が用いられたならば、フォスターマザーから生まれた子孫は初めにモザイク毛色についてスクリーニングされる。加えて、または代わりに、例えば子孫の尾組織からのＤＮＡも、前記のようなサザンブロットおよび／またはＰＣＲを用いてノックアウト構築物の存在についてスクリーニングしてよい。
【０１４０】
ノックアウト遺伝子の存在に関するスクリーニングのもう１つの適切な手法は、下記例で示されているような免疫沈降法である。
【０１４１】
次いで、モザイクに見える子孫は、それらがその生殖細胞系にノックアウト構築物を有して同型接合ノックアウト動物を作製しうると思われるならば、互いに交配される。子孫が生殖細胞系伝達を行うかどうかが不明ならば、それらは親または他の株と交配させて、子孫が異型接合についてスクリーニングされる。異型接合体は、前記のようなサザンブロットおよび／またはＰＣＲ増幅により同定される。次いで、異型接合体は同型接合ノックアウト子孫を作製するために互いに交配される。同型接合体は、この交配の産物であるマウス、並びに既知の異型接合体であるマウスおよび野生型マウスからの、相当量のゲノムＤＮＡのサザンブロットにより同定される。サザンブロットをスクリーニングするためのプローブは、前記の胚幹細胞のトランスフェクションの項目で記載されたようにデザインしうる。
【０１４２】
ノックアウト子孫を同定および特徴付ける他の手段も利用しうる。例えば、ノックアウトされた遺伝子、マーカー遺伝子または双方をコードする転写物の存在または不在についてマウスのｍＲＮＡをブロービングするために、ノーザンブロットが用いうる。加えて、ノックアウトされた遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体、または遺伝子が発現されたマーカー遺伝子産物に対する抗体でウエスタンブロットをブロービングすることにより、これら子孫の様々な組織でノックアウトされた遺伝子の発現レベルを評価するために、ウエスタンブロットも用いうる。
【０１４３】
最後に、ノックアウト動物、例えばマウスからの組織または血液細胞を固定し、抗体で標識するようなin situ分析、および／または子孫からの様々な細胞のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）分析も行ってよい。ノックアウト構築物遺伝子産物、例えば発現タンパク質の存在または不在を調べられる適切な抗体が存在する場合は、この方法がうまくいく。
【０１４４】
ノックアウト非ヒト哺乳動物の使用
本発明の非ヒト哺乳動物は、抑制された遺伝子がインテグリンα１０遺伝子、α１１遺伝子または双方であるかに応じて、様々な使用を有する。本発明による非ヒト哺乳動物の異なる使用には、マウス全体ばかりか、インビトロ使用向けに動物の一部、例えば細胞、組織、器官および骨も含む。
【０１４５】
このように、本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の一使用は、筋骨格疾患で活性を調節するためのモデルとしてである。
【０１４６】
筋骨格および結合組織疾患の例は、関節症、例えば関節炎、例えば骨関節炎（ＯＡ）およびリウマチ様関節炎（ＲＡ）；背部症、例えば無脊椎円板障害、例えば胸部、胸腰および腰仙円板障害；軟組織障害、例えば滑膜炎、腱滑膜炎と、滑膜、腱および筋肉の他の障害；骨症および軟骨症、例えば骨粗鬆症、骨軟化症、骨軟骨症、軟骨形成不全症および骨軟骨形成不全症である。
【０１４７】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の第二の使用は、アテローム性動脈硬化症で活性を調節するためのモデルとしてである。
【０１４８】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の第三の使用は、線維症で活性を調節するためのモデルとしてである。
【０１４９】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の他の使用は、幹細胞の分化で活性を調節するためのモデルとしてである。別な態様において、幹細胞は間葉幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞などである。
【０１５０】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、骨折治癒で活性を調節するためのモデルとしてである。
【０１５１】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、炎症疾患で活性を調節するためのモデルとしてである。
【０１５２】
別な態様において、炎症疾患は例えばリウマチ様関節炎および髄膜炎である。
【０１５３】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、α１０および／またはα１１の活性を調節するための遺伝子療法モデルとしてである。本発明による非ヒト哺乳動物でのα１０およびα１１の発現が抑制、阻止または減少される。核酸、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはその混合物の再導入により活性は調節され、α１０およびα１１遺伝子の不在が部分的または完全に補われる。しかも、このようなモデルはα１０およびα１１遺伝子の過剰発現を研究するために用いてもよい。別な態様では、本発明による非ヒト哺乳動物でのα１０およびα１１の発現が抑制、阻止または減少され、他種からのインテグリンα１０および１１遺伝子が例えばマウス中へ導入される。一態様において、ヒトインテグリンα１０および／または１１核酸が本発明によるノックアウトマウス中へ導入される。
【０１５４】
更に他の使用では、本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫が心臓弁疾患で活性を調節するためのモデルとして用いられる。
【０１５５】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、筋骨格疾患で活性を阻止、阻害、軽減または逆転するためのモデルとしてである。
【０１５６】
筋骨格および結合組織疾患の例は、関節症、例えば関節炎、例えば骨関節炎（ＯＡ）およびリウマチ様関節炎（ＲＡ）；背部症、例えば無脊椎円板障害、例えば胸部、胸腰および腰仙円板障害；軟組織障害、例えば滑膜炎、腱滑膜炎と、滑膜、腱および筋肉の他の障害；骨症および軟骨症、例えば骨粗鬆症、骨軟化症、骨軟骨症、軟骨形成不全症および骨軟骨形成不全症である。
【０１５７】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、アテローム性動脈硬化症で活性を阻止、阻害、軽減または逆転するためのモデルとしてである。
【０１５８】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、線維症で活性を阻止、阻害、軽減または逆転するためのモデルとしてである。
【０１５９】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、骨折治癒で活性を阻止、阻害、軽減または逆転するためのモデルとしてである。
【０１６０】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、炎症疾患で活性を阻止、阻害、軽減または逆転するためのモデルとしてである。
【０１６１】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、α１０および／またはα１１発現の活性を阻止、阻害、軽減または逆転するための遺伝子療法モデルとしてである。ここで用いられている“活性を逆転する”という用語は、開始時における動物の状態と関連していることを意味する。それ自体、無発現、野生型動物と比較して減少した発現、同等の野生型発現、または野生型動物よりも高い発現、即ち過剰発現を意味する。そのため、活性の逆転とは実際のα１０および／または１１発現の増加または減少の双方をいう。
【０１６２】
更に他の使用では、本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫が心臓弁疾患で活性を阻止、阻害、軽減または逆転するためのモデルとして用いられる。
【０１６３】
本発明によるマウスは、異なる疾患で活性を刺激、阻止、阻害、軽減または逆転する上で、活性に関して剤をスクリーニングするためにも用いうる。このような剤は、化学化合物、薬物または医薬化合物である。それは、核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質またはその断片；抗体またはその断片；ペプチド、例えばポリペプチドまたはオリゴペプチド；またはその混合物でもよい。しかも、剤は植物界または動物界から天然抽出物として入手した剤または剤の混合物でもよい。
【０１６４】
有用な薬物または剤のスクリーニングでは、マウスにある範囲の用量で候補薬物または剤を投与し、評価される障害に対する薬物の調節効果について様々な時点で調べる。
【０１６５】
本発明の哺乳動物は、例えばある活性の部分的または全体的回復または活性化が起きるかどうかを調べる上で、様々な剤を単独でまたは組合せでスクリーニングするために用いられる。
【０１６６】
そのため、本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の一使用は、筋骨格疾患で活性を阻止、阻害、軽減または逆転する上で、活性に関して剤をスクリーニングするためである。
【０１６７】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の他の使用は、アテローム性動脈硬化症で活性を阻止、阻害、軽減または逆転する上で、活性に関して剤をスクリーニングするためである。
【０１６８】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、線維症で活性を阻止、阻害、軽減または逆転する上で、活性に関して剤をスクリーニングするためである。
【０１６９】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、骨折治癒で活性を刺激、阻止、阻害、軽減または逆転する上で、活性に関して剤をスクリーニングするためである。
【０１７０】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、炎症疾患で活性を阻止、阻害、軽減または逆転する上で、活性に関して剤をスクリーニングするためである。
【０１７１】
本発明による非ヒト哺乳動物およびその子孫の更に他の使用は、α１０‐β１、α１１‐β１またはその一部と反応性を示す抗体の作製用である。
【０１７２】
このような使用の一態様において、作製される抗体はポリクローナル抗体である。
【０１７３】
他の態様では、抗体がモノクローナル抗体である。
【０１７４】
更に他の態様では、インテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部がヒトインテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部である。
【０１７５】
ノックアウト非ヒト哺乳動物で剤／化合物をスクリーニングするための方法
本発明によると、異なる疾患での効果に関して剤をスクリーニングするために、いくつかの方法が考えられる。このような方法では、例えば、インテグリン、例えばα１〜２、α５、α１０〜１１、αｖのレベル増加または減少；コラーゲン、例えばコラーゲンＩ、II、VIおよびIX型のような細胞外マトリックス分子の合成または分解；コンドロアドヘリン（ＣＨＡＤ）、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、軟骨中間層タンパク質（ＣＩＬＰ）のような非コラーゲンタンパク質；アグレカン、バーシカン、ロイシンリッチリピートタンパク質（ＬＲＲＰ）のようなプロテオグリカン；軟骨、腱、靭帯、無脊椎円板、角膜、関節または骨を含めた、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織に及ぼす効果；骨折治癒、骨形成および分化、筋骨格および結合組織疾患、小人症、アテローム性動脈硬化症、線維症、炎症疾患、心臓弁疾患、幹細胞の分化または機能の活性、並びにこのような現象に関連した異なる疾患段階のような病気状態について調べる。
【０１７６】
筋骨格および結合組織疾患の例は、関節症、例えば関節炎、例えば骨関節炎（ＯＡ）およびリウマチ様関節炎（ＲＡ）；背部症、例えば無脊椎円板障害、例えば胸部、胸腰および腰仙円板障害；軟組織障害、例えば滑膜炎、腱滑膜炎と、滑膜、腱および筋肉の他の障害；骨症および軟骨症、例えば骨粗鬆症、骨軟化症、骨軟骨症、軟骨形成不全症および骨軟骨形成不全症である。追加例は、骨および軟骨の腫瘍、例えば骨肉種、骨軟骨種および軟骨肉種である。
【０１７７】
非ヒト哺乳動物の組織、例えば関節、心臓弁、血管、軟骨、結合組織、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織の組織学的分析；非ヒト哺乳動物の形態学的分析、例えば骨格の寸法、骨測定および体重曲線；免疫グロブリン産生の増加または減少、サイトカイン（例えば、インターロイキン、ケモカインなど）のような化学的メッセンジャーのレベル増加または減少、および／または特定障害に関与する特定遺伝子の発現レベル増加または減少により、効果が評価される。
【０１７８】
更に、例えばインテグリンα１１発現用の転写因子scleraxisのような異なる転写因子も、タンパク質発現の調節に関して分析してよい。
【０１７９】
更に他には、タンパク質遺伝子発現の制御メカニズムとして、例えばインテグリンα１１遺伝子発現を制御するためのメカニズムとして、細胞周期調節が分析される。
【０１８０】
筋骨格疾患での効果に関して剤をスクリーニングするための方法
本発明による一方法は、筋骨格疾患での効果に関して剤をスクリーニングするための方法であり、
ｉ）本発明によるノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態；組織；タンパク質、例えばインテグリン、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質および細胞外マトリックス分子、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織のような分子の合成および分解；細胞の転写および翻訳活性の調節に関する上記試験剤の効果を調べ、
iv）上記iii)における試験剤の効果を筋骨格疾患と関連付ける
ステップからなる。
【０１８１】
α１０またはα１１欠損マウスで関節疾患の進行を研究するために、マウスが運動プログラム、トレッドミルランニングプログラムに付され、関節軟骨で機械的負荷の影響を試験し、年齢同一野生型マウスでの結果と比較する。
【０１８２】
次いで、野生型マウスとα１０またはα１１ＫＯマウスが、異なる年齢で、例えば８週齢、１２週齢で、１０５５Ｍ‐Ｄ４０ Exer ６Ｍオープントレッドミル（Columbus Instruments,Columbus,ＯＨ）で毎日のランニングに付される。マウスは、例えば１日１回、１週間５日で３０分間に６メートル／minのトレーニングプログラムに付され、８週間／１２週間後にマウスがＣＯ２吸引により殺される。コントロールとして、ランニングさせなかった野生型およびインテグリンα１０／α１１欠損年齢同一マウスが用いられる。
【０１８３】
形態もＸ線または成長および体長曲線により分析しうる。野生型およびα１０／１１ＫＯマウスの四肢の発育をみるために、骨成長測定が行われる。マウスをAvertinで麻酔し、例えばX-OMAT TL Kodak診断用フィルムを用い３０ｋＶで９０秒間にわたりFaxitron MS-20試料ラジオグラフィーシステムを用いて、Ｘ線分析を行うことにより、分析が行われる。例えばアルシアンブルーおよびアリザリンレッドで、染色法も用いうる。野生型およびα１０／１１欠損マウスの体重および体長（鼻から肛門まで）が、生まれてから適切な時間間隔で測定される。
【０１８４】
更に、組織分析、免疫組織化学、電子顕微鏡観察および骨格の染色で効果に関して分析してもよい。野生型およびα１０／１１ノックアウトマウスからの組織、例えば関節軟骨が、分析のために様々な年齢で集められる。パラフィン包埋用の組織が、４℃で一夜かけてＰＢＳ中または９５％エタノール／５％酢酸中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定される。四肢は、脱水および包埋前に、１０％ＥＤＴＡ‐ＰＢＳまたは１０％ギ酸で脱石灰化される。パラフィン切片が切り出され、凍結切片化用の組織がスナップ凍結され、染色前に、例えばアセトンで固定される。軟骨の分析の場合、すべての切片が、抗体染色前に、３７℃で３０分間にわたり２ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼで処理される。免疫蛍光染色およびＤＡＢ染色、またはそれに相当する染色および検出システムが、標準操作に従い行われる。組織の形態を視覚化するために、切片はいかなる公知の染色法で染色してもよい。このような方法には、細胞外マトリックス分子、例えばプロテオグリカンを視覚化するヘマトキシリン／エオシンでの染色およびSafronin Ｏでの染色、並びに例えばvan Kossa染色で、組織の石灰化の程度を調べる染色がある。他の細胞タイプ、例えば骨芽細胞および破骨細胞も、アルカリホスファターゼおよび酸性ホスファターゼを各々用いて、容易に検出される。
【０１８５】
増殖細胞は５‐ブロモ‐２′‐デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）および抗ＢｒｄＵ  ｍＡｂを用いて検出しうる。アポトーシスは、市販in situ細胞死検出キットを用いて、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）仲介ｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）法を用いることにより、分析しうる。電子顕微鏡観察も、例えば組織内における細胞外マトリックス分子の構造、例えば関節軟骨内のコラーゲン構造を見るために、例えば野生型およびα１０／１１ノックアウトのような新生児マウスで、様々な年齢時に行える。
【０１８６】
更に、腱構造の生体力学分析で効果に関し分析してもよい。腱構造に及ぼす負荷プログラムの効果も研究しうる。腱の堅さも単調破損試験から調べられる。その場合、長趾屈筋（ＦＤＬ）腱で、サンドペーパー被覆プレート間に腱の末端を挟むことにより、負荷が加えられる。これらは一定の堅さおよびエネルギーロス（ヒステリシス）に条件設定され、破損するまで１％／ｓで負荷が加えられる。膝蓋骨腱は、サンドペーパー被覆プレート間に膝蓋骨および四頭筋腱を挟むことにより、負荷が加えられる。脛骨は真鍮管内の末端挿入部位に達するまでエポキシ中に包埋される。膝蓋骨腱は適切な負荷機器を用いて破損するまで０．１ｍｍ／ｓで負荷が加えられる。すべての機械的試験は、例えばサーボヒドローリック(servohydraulic)物質試験システム（Instron,Canton,ＭＡ）を用いて、室温で行われる。次いで、堅さが負荷変形曲線の直線的回帰から計算される。腱の断面が、１０％中性ホルマリン緩衝液で対側肢を固定し、ポリメチルメタクリレートに包埋した後、例えば公有ドメインイメージ分析ソフトウェア（Scion Corp.,Frederick,ＭＤ）を用いて、透過型光学顕微鏡で調べられる。
【０１８７】
発育四肢の分化に関与する分子の発現パターンを研究するために、In situハイブリダイゼーションがコントロールおよびα１０または１１ノックアウト、または双方のマウスで行われる。その場合、新生児マウスの四肢が集められ、４％ＰＦＡ  ｐＨ９．５で一夜かけて固定される。組織は脱水、包埋および切断され、ｍＲＮＡがＲＮＡ検出に適した方法、例えば細胞外マトリックス分子、例えばコラーゲンII、コラーゲンＸ、Indian Hedgehogタンパク質（Ｉｈｈ）および副甲状腺関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）用のＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを用いて検出される。
【０１８８】
細胞接着および細胞拡散も効果に関して研究しうる。インテグリンα１０およびα１１が主要なコラーゲン結合インテグリンであるため、細胞接着および拡散研究は野生型およびα１０／１１ＫＯマウスの組織から単離された細胞、例えば軟骨細胞で行われる。典型的には、細胞接着研究は、対象の様々な細胞外マトリックスリガンド、例えばコラーゲンＩ、コラーゲンII、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびＢＳＡで被覆された、例えば４８ウェルプレートで行われる。ある量、典型的には１０μｇ／ｍｌのリガンドが適切な時間、例えば４℃で一夜インキュベートされ、単離されたばかり細胞、例えば軟骨細胞が１００，０００細胞／ウェルのような適切な密度で接種され、３７℃で１時間にわたり基質上でインキュベートされる。洗浄後、適切な基質、例えば０．１Ｍクエン酸ｐＨ５および０．５％ Triton Ｘ‐１００含有緩衝液中のｐ‐ニトロフェニル‐Ｎ‐アセチル‐β‐Ｄ‐グルコサミニドが加えられ、約１６０分間インキュベートされる。停止用溶液、例えば５０ｍＭグリシン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ１０．４が加えられ、吸光度が適切な波長で読まれる。細胞拡散の場合、単離されたばかり細胞、例えば軟骨細胞が０．５％ＦＣＳの存在下１０μｇ／ｍｌのような適切な量で、異なる基質、例えばコラーゲンＩ、コラーゲンIIおよびフィブロネクチン上に接種される。細胞は３７℃で一夜または３日間インキュベートされ、固定および透過化後、細胞構造および運動にとり重要な分子、例えばファロイジン（Ｆ‐アクチン）またはＤＮアーゼＩ（Ｇ‐アクチン）に対する抗体で細胞が染色される。
【０１８９】
野生型およびα１０／１１ＫＯマウスの細胞、例えば軟骨細胞からの細胞外マトリックス分子、例えばアグレカン、コラーゲンIIの合成および分解も、当業界で知られたいくつかの慣用法により、タンパク質レベルで容易に調べられる。細胞は、例えばマウスの関節から単離され、細胞培養物中へ入れられる。細胞はウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ‐グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびアスコルビン酸を含有したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養される。次いで、例えばアグレカン合成用に、適切なパルスまたはパルスチェイスプロトコールを用いて、細胞外マトリックス分子合成または分解をモニターするために、適切な放射能標識が加えられる。細胞は２０μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ‐サルフェート（Ｎａ２ＳＯ４）で標識され、またはコラーゲン合成の場合は３Ｈ‐プロリンが加えられる。
【０１９０】
一方、細胞外マトリックス分子の定量的放出および分解は、色素、例えばプロテオグリカンと選択的に結合するジメチルメチレンブルー（ＤＭＢ）を用いることにより（Farndale RW et al.(1982)Conn.Tiss.Res.9:247-288）、または細胞外マトリックス分子の分解により生じる新規エピトープの放出がネオエピトープに特異性な抗体で検出されるＥＬＩＳＡアッセイ（Caterson B et al.(2000)Matrix Biol.19(4):333-44）によりモニターしてもよい。
【０１９１】
同様に、遺伝子発現は野生型およびα１０／１１ＫＯマウスの細胞からｍＲＮＡを単離することにより研究してもよい。ｍＲＮＡ単離は、例えば全ＲＮＡ単離用のRNeasy Mini Protocol（Qiagen）のような、いずれか適切なキットを用いて行われる。次いで、単離されたＲＮＡはいずれか適切な逆転写酵素、例えばSuperscript II ＲＮアーゼＨ‐逆転写酵素（Invitrogen）により、製造業者の指示に従い逆転写される。次いで、定量的ＰＣＲが、対象の細胞外マトリックス分子、例えばコラーゲンII、アグレカン用の遺伝子特異的プライマーと共に、いずれか適切なシステム、例えばLightCyclerシステム‐Faststart ＤＮＡ Master ＳＹＢＲ Green Ｉ（Roche）を用いて行われる。
【０１９２】
アテローム性動脈硬化症での効果に関して剤をスクリーニングするための方法
もう１つの方法は、アテローム性動脈硬化症での効果に関して剤をスクリーニングするためであり、
ｉ）本発明によるノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態；組織；タンパク質、例えばインテグリン、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質および細胞外マトリックス分子、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織のような分子の合成および分解；細胞の転写および翻訳活性の調節に関する上記試験剤の効果を調べ、
iv）上記iii)における試験剤の効果をアテローム性動脈硬化症と関連付ける
ステップからなる。
【０１９３】
アテローム性動脈硬化症のプロセスは、単球が血管壁に付着して内膜に蓄積する、特別なタイプの慢性炎症とみなされる。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の存在下で、単球は活性化マクロファージへ変換され、リポタンパク質粒子を取込んで泡沫細胞になる。次いで動脈内膜中でｖＳＭＣｓの移動および増殖が生じ、アテローム性動脈硬化プラークでみられる大きな内膜膨張を招く。ｖＳＭＣｓの増殖には、収縮性から合成表現型へのｖＳＭＣｓの表現型変化も付随する。増殖に加えて、この表現型変化はThyberg et al（Arteriosclerosis.1990,10(6):966-90）で詳細に記載された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子の産生増加を招く。ＥＣＭは血管完全性の維持にとり重要であり、その構成要素の個別的性質により引張強度、粘弾性、弾性反跳および圧縮性を付与する。ＥＣＭとｖＳＭＣｓとの相互作用は、インテグリンのような細胞表面レセプターにより仲介される。将来の療法は、インテグリンにより仲介されるこれら接着相互作用を調節し、ひいてはアテローム性動脈硬化プラークの進行を阻止し、プラーク活性化を制限し、活性化に伴う血栓応答を弱めることに向けられるのかもしれない。
【０１９４】
インテグリンα１０鎖が本発明者らによりアテローム性動脈硬化プラークに存在することが示された‐データはここでは示されていない。
【０１９５】
アテローム性動脈硬化症で薬物の効果を研究するための動物モデルが用いられる。プラーク破裂および心筋梗塞に関与する石灰化が、ヒトのアテローム性動脈硬化プラークでしばしば生じている。軟骨化生および石灰化を含めて重度の自然発生アテローム性動脈硬化症を示すアポＥ欠損マウスは、アテローム性動脈硬化症の一モデルとして働き、Qiao J-H et al.（Arterioscler Thromb.1994.14:1480-1497）で詳細に記載されている。本発明のノックアウトマウスは、ダブルノックアウトを作製するために、アポＥ欠損マウスと交配される。次いで、これらのマウスは、アテローム性動脈硬化症で、活性を調節するためのモデル、活性を阻止、阻害、軽減または逆転するためのモデル、および効果に関して剤をスクリーニングするための方法として用いられる。ヒトアテローム性動脈硬化プラークでみられる大きな内膜膨張は、Dimayuga P et al.（Biomech.and Biophys.Res.Com.(1999)264:465-468）で記載された外膜周囲カフ誘導性頚動脈損傷により、マウスで再現される。本発明のノックアウトマウスにこの損傷モデルを適用することにより、追加のモデルが作製され、アテローム性動脈硬化症で、活性を調節するため、活性を阻止、阻害、軽減または逆転するためのモデル、および効果に関して剤をスクリーニングするための方法として用いられる。
【０１９６】
形態学または組織病理学に関する上記試験剤の効果の測定は、例えば心臓、大動脈および頚動脈からの、例えば１０％アセトンで固定されたスナップ凍結組織切片またはホルマリン固定パラフィン包埋組織切片での研究によるものでもよい。組織染色はオイルレッドＯおよびヘマトキシリンで行われ、更にQiao J-H et al.（Arterioscler Thromb.1994.14:1480-1497）で詳細に記載されたアテローム病変（脂肪線条）、動脈石灰化および大動脈軟骨化生の同定のために、ファストグリーンで対比染色される。カルシウムミネラル沈着の確認のために、代表的切片も、例えばアリザリンレッドＳおよびvon Kossa技術により染色してよい。
【０１９７】
タンパク質、例えば抗体、サイトカイン、酵素、インテグリン、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲンＩ、II、VIおよびIX型；非コラーゲンタンパク質、例えばコンドロアドヘリン（ＣＨＡＤ）、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、軟骨中間層タンパク質（ＣＩＬＰ）；プロテオグリカン、例えばアグレカン、バーシカン、ロイシンリッチリピートタンパク質（ＬＲＲＰ）の合成または分解に及ぼす効果；常在または浸潤細胞に及ぼす効果；および細胞表面マーカーに及ぼす効果は、例えば、例えば１０％アセトンで固定されたスナップ凍結組織切片またはホルマリン固定パラフィン包埋組織切片で免疫組織化学技術を用いるか、または上記細胞または分子のｍＲＮＡレベルを分析するために、例えばＰＣＲ技術を用いることで、調べられる。組織および血漿コレステロールレベルに及ぼす効果（Dimayuga P et al.Biomech.and Biophys.Res.Com.(1999)264:465-468）。細胞で転写および翻訳活性の調節に及ぼす効果。外膜周囲カフ誘導性頚動脈損傷に及ぼす効果。
【０１９８】
幹細胞の分化での効果に関して剤をスクリーニングするための方法
更にもう１つの方法は、幹細胞の分化での効果に関して剤をスクリーニングするためであり、
ｉ）本発明によるノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態；組織；タンパク質、例えばインテグリン、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質および細胞外マトリックス分子、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織のような分子の合成および分解；細胞の転写および翻訳活性の調節に関する上記試験剤の効果を調べ、
iv）上記iii)における試験剤の効果を幹細胞での効果と関連付ける
ステップからなる。
【０１９９】
方法の別な態様において、幹細胞は間葉幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞などである。
【０２００】
線維症での効果に関して剤をスクリーニングするための方法
もう１つの方法は、線維症での効果に関して剤をスクリーニングするためであり、
ｉ）本発明によるノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態；組織；タンパク質、例えばインテグリン、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質および細胞外マトリックス分子、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織のような分子の合成および分解；細胞の転写および翻訳活性の調節に関する上記試験剤の効果を調べ、
iv）上記iii)における試験剤の効果を線維症と関連付ける
ステップからなる。
【０２０１】
線維症は線維組織の形成として定義され、その主成分は細胞外マトリックス分子、コラーゲンである。インテグリンα１０およびα１１は双方ともコラーゲン結合インテグリンのメンバーであり、コラーゲン結合インテグリンの他のメンバー、例えばα１は腎線維症のような疾患での病理学的変化に関与していたため（Sampson NS et al.,2001.J.Biol.Chem.276(36):34182-8）、本発明によるα１０およびα１１ノックアウトマウスは線維症疾患、例えば肺線維症、肝線維症、腎線維症でこれらインテグリンの役割を研究するために理想的なモデルを提供する。実験マウスで線維症を誘導しうるいくつかの方法が知られている。方法として、有機溶媒、例えば、皮膚および肺線維症を誘導しうる塩化ビニル、肺線維症を誘導するために用いられるブレオマイシン、および肝線維症を誘導するために用いられる四塩化炭素の使用がある。これら３通りの方法と、線維症で剤の効果を調べる方法が、以下で記載されている；
【０２０２】
ｉ）ブレオマイシン誘導性肺線維症
ブレオマイシン誘導性肺線維症はLasky JA et al（1998,Am.J.Physiol.275:L365-L371）で記載されている。インテグリンα１０または１１ノックアウトマウスは、無菌気管切開手術前に腹腔内トリブロモエタノールで無痛化される。０．９％ＮａＣｌ中ある量、例えば４単位／ｋｇのブレオマイシンが気管腔中へ投与される。同量の無菌０．９％ＮａＣｌが年齢同一コントロール（野生型）マウスに注入される。ブレオマイシンの投与後、首の創傷はクリップで閉じられ、動物は麻酔から回復させられる。
【０２０３】
暴露後所定の時点（例えば、８、１６および３０日目）に、マウスはトリブロモエタノールの腹腔内注入で麻酔される。腹部大動脈の結紮後、胸腔が開かれる。次いで、更なる分析、即ち、例えばKivirikko,KI et al（1967,Anal.Biochem.109:249-255）で記載されたようなヒドロキシプロリン測定による、またはSircol Collagen Assay Kit（Biocolor Ltd,Belfast,ＵＫ）のようなキットでの、コラーゲン含有量分析のために、肺臓が摘出される。
【０２０４】
後の組織学的分析、例えばピクロシリウスでのコラーゲン染色のために、パラフィン包埋用に、肺組織がホルマリンで灌流される。肺臓は、マトリックスおよびマトリックス改造タンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチン、プロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビター、例えばＭＭＰ‐１、ＴＩＭＰ‐１およびＰＡＩ‐１、並びにサイトカインおよび成長因子、例えばトランスフォーミング成長因子およびインシュリン様成長因子の特異的遺伝子発現をみるために、ＲＮＡ調製に用いてもよい。
【０２０５】
ii）四塩化炭素誘導性線維症
四塩化炭素誘導性線維症はYu C et al（2002,Am.J.Path.161(6):2003-2010）で記載されている。急性ＣＣｌ４誘導性肝障害の研究の場合、１回分用量、例えば２．０ｍｌ／ｋｇ体重（鉱油中２．５ｖ／ｖ）で、野生型またはα１０もしくはα１１ノックアウトマウスへの腹腔内（ＩＰ）注入により投与される。慢性ＣＣｌ４誘導性肝障害の研究の場合、例えばＣＣｌ４２．０ｍｌ／ｋｇ体重の用量で、１週間に２回ＩＰ投与される。次いで、マウスが体重測定、麻酔および放血された後で、肝臓が分析用に摘出される。
【０２０６】
次いで、例えばコラーゲン含有量を調べるために、例えばヒドロキシプロリン測定により、またはSircol Collagen Assay Kitのようなキットで、更なる分析が摘出肝臓で行われる。パラフィン包埋、および例えばピクロシリウスで切片のコラーゲン染色を行うことによる組織学的分析のために、組織がホルマリンで灌流される。
【０２０７】
マトリックスおよびマトリックス改造タンパク質、例えばヘパリン硫酸プロテオグリカン、コラーゲン、インテグリン、プロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビター、例えばＭＭＰ‐１、ＴＩＭＰ‐１およびＰＡＩ‐１、並びにサイトカインおよび成長因子、例えばトランスフォーミング成長因子およびインシュリン様成長因子の特異的遺伝子発現をみるために、肝臓はＲＮＡ調製に用いてもよい。
【０２０８】
iii)腎線維症
腎線維症はSampson NS et al(2001.J.Biol.Chem.276(36):34182）で記載されている。ほとんどのタイプの進行性腎臓疾患は、腎糸球体および間質性線維症を伴う腎不全で特徴付けられる。腎糸球体内で間質マトリックスが膨張し、コラーゲンを含めた細胞外マトリックス成分の沈着増加がある。腎糸球体濾過および腎血流は次第に損なわれ、細管萎縮し、組織損傷に対する一般的炎症応答が続いて起こる。腎糸球体機能の進行性喪失により管状間質性線維症に至る。腎線維症の病因は、疾患関連二次病変、例えば糖尿病性腎症から、基底膜タンパク質の常染色体変異まで、幾重にもわたる。
【０２０９】
１つのこのような遺伝性基底膜障害は、Lemmink,H.et al（(1994)Hum.Mol.Genet.3:1269-1273）で記載されたコラーゲン４Ａ５、コラーゲン４Ａ３またはコラーゲン４Ａ４遺伝子の変異の結果、アルポート症候群である。アルポート症候群にはいくつかの動物モデルがあり、そのうち１つはマウスにおけるコラーゲン４Ａ３遺伝子ノックアウトである（Cosgrove,D.et al.1996,Genes Dev.10:2981-2992）。このモデルは、疾患の組織病理および発病させうる基本的遺伝子発現変化を双方とも研究する上で非常に有用である。
【０２１０】
アルポート症候群（ｃｏｌ４Ａ３−／−）マウスは以前に記載されていた（Lemmink,H.et al（(1994)Hum.Mol.Genet.3:1269-1273）。これらのマウスは１２９Ｓｖ／Ｊバックグラウンドであり、本発明のα１０またはα１１ノックアウトマウスと更に交配させてもよい。マウスの遺伝子型はＰＣＲにより決定される。望ましい年齢（例えば４または７週齢）でマウスが犠牲にされ、例えば腎臓が摘出され、直ちに液体窒素でまたは組織切片を調製するための常法により凍結され、例えば腎臓がＯＣＴ（Tissue Tek）に包埋され、液体窒素で凍結される。例えば５μｍのクリオスタット切片が切り出され、氷冷アセトンで、３％ウシ血清アルブミンブロック後に、リン酸緩衝液で固定される。切片は、例えばマトリックスおよびマトリックス改造タンパク質、プロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビター、成長因子または単球／マクロファージマーカーに対する抗体で染色される。
【０２１１】
マトリックスおよびマトリックス改造タンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチン、プロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビター、例えばＭＭＰ‐１、ＴＩＭＰ‐１およびＰＡＩ‐１、成長因子、例えばエンドセリン‐１およびインシュリン様成長因子、単球／マクロファージ由来遺伝子、例えばＭＣＰ‐１、マクロファージ誘導性タンパク質（ＩＰ‐１０）、マクロファージコロニー刺激因子およびマクロファージマンノースレセプターの特異的遺伝子発現をみるために、腎臓はＲＮＡ調製に用いてもよい。腎臓はTrizol中４℃でホモゲナイズされ、全ＲＮＡが抽出される。次いで、ＲＮＡは製造業者（Valencia,ＣＡ）の指示に従いQiagen RNeasyキットのようなＲＮＡ単離プロトコールで更に精製される。単離された全ＲＮＡは、定量的ＰＣＲで使用のためにいずれか適切な逆転写酵素系を用いて、例えば定量的ＰＣＲのために何らかのシステム、例えば上記遺伝子用の遺伝子特異的プライマーと共にLightCyclerシステム‐Faststart ＤＮＡ Master ＳＹＢＲ Green Ｉ（Roche）を用いて逆転写される。
【０２１２】
炎症疾患での効果に関して剤をスクリーニングするための方法
更にもう１つの方法は、炎症疾患での効果に関して剤をスクリーニングするためであり、
ｉ）本発明によるノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態；組織；タンパク質、例えばインテグリン、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質および細胞外マトリックス分子、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織のような分子の合成および分解；細胞の転写および翻訳活性の調節に関する上記試験剤の効果を調べ、
iv）上記iii)における試験剤の効果を炎症疾患と関連付ける
ステップからなる。
【０２１３】
炎症疾患の一例は、例えばリウマチ様関節炎である。
【０２１４】
リウマチ様関節炎は、周辺関節に対する組織特異的炎症攻撃により特徴付けられる疾患であり、最終的には軟骨および骨の破壊を引き起こす。コラーゲン誘導性関節炎は、遺伝的感受性動物で誘導されうるリウマチ様関節炎の動物モデルである（Holmdahl,R.et al.(1990)Immunological Reviews.118:193-232）（Genetic Analysis of Mouse Models for Rheumatoid Arthritis in:Human genome methods,(1998)chapter 11,pp.215-238,CRC Press ＮＹ,Ed.Adolph KW）。ＤＢＡ／１マウスがコラーゲンII誘導性関節炎に罹患しやすい株の例であり、本発明のノックアウトマウスがＤＢＡ／１バックグラウンドへ戻し交配され、次いでリウマチ様関節炎を研究するためにモデルとして用いられる。コラーゲン誘導性関節炎は、異種または自己II型コラーゲンでの（Holmdahl,R.et al.(1990)Immunological Reviews.118:193-232）、あるいはコラーゲンII病原性エピトープに対するII型コラーゲン免疫血清またはモノクローナル抗体での受動的な（Holmdahl,R.et al.(1990)Scand.J.Immunol.31:147-157；Holmdahl,R.et al.(1991)Autoimmunity.10:27-34）免疫により、ＤＢＡ／１バックグラウンドを有する本発明のノックアウトマウスで誘導される。
【０２１５】
これらのマウスは、炎症および筋骨格および結合組織疾患で、活性を調節するためのモデル、活性を阻止、阻害、軽減または逆転するためのモデル、並びに効果に関して剤をスクリーニングするための方法として用いられる。疾患の進行に関して上記剤の効果を調べる例は、足蹠および足首で炎症の活性および重篤度の視覚的スコアリングと、関節炎の活性および重篤度の評価を含めた足蹠および足首の微視的スコアリングである（Genetic Analysis of Mouse Models for Rheumatoid Arthritis in:Human genome methods,(1998)chapter 11,pp.215-238,CRC Press ＮＹ,Ed.Adolph KW）。治癒プロセスの評価の場合、サフラニン‐Ｏ染色が用いられ、そこでは新たな軟骨および骨双方の形成の視覚化を含める。タンパク質、例えば抗体、サイトカイン、酵素、インテグリン、細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲンＩ、II、VIおよびIX型；非コラーゲンタンパク質、例えばコンドロアドヘリン（ＣＨＡＤ）、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、軟骨中間層タンパク質（ＣＩＬＰ）；プロテオグリカン、例えばアグレカン、バーシカン、ロイシンリッチリピートタンパク質（ＬＲＲＰ）の合成または分解に及ぼす効果；常在または浸潤細胞に及ぼす効果；および細胞表面マーカーに及ぼす効果は、１０％アセトンで固定されたスナップ凍結組織切片またはホルマリン固定パラフィン包埋組織切片で免疫組織化学技術を用いるか、または上記細胞または分子のｍＲＮＡレベルを分析するためにＰＣＲ技術を用いることにより調べられる。循環タンパク質、例えば自己抗体およびサイトカインに及ぼす効果は、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）標準技術による。リンパ節または脾臓の抗体産生血漿細胞に及ぼす効果はＥＬＩＳＰＯＴ技術により分析され、Ｔ細胞反応に及ぼす効果は増殖アッセイで分析され、ＥＬＩＳＰＯＴはサイトカイン産生能力の分析のために用いられる。細胞で転写および翻訳活性の調節に及ぼす効果も、例えばＰＣＴおよび／またはin situハイブリダイゼーションで分析してよい。
【０２１６】
骨折での効果に関して剤をスクリーニングするための方法
更にもう１つの方法は、骨折治癒での効果に関して剤をスクリーニングするためであり、
ｉ）本発明によるノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態；組織；タンパク質、例えばインテグリン、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質および細胞外マトリックス分子、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織のような分子の合成および分解；細胞の転写および翻訳活性の調節に関する上記試験剤の効果を調べ、
iv）上記iii)における試験剤の効果を骨折治癒と関連付ける
ステップからなる。
【０２１７】
骨折治癒の生物学は、Hiltunen,A.et al.（J.Orthopaedic Res.(1993)11:305-312）およびEkholm,E.et al.（Am.J.Pathol.(2002)160:1779-1785）で記載されているように、マウス脛骨の標準化実験骨折によりマウスで研究される。
【０２１８】
形態に関する上記試験剤の効果測定は、ラジオグラフィー、化学および機械的分析による（Hiltunen,A.et al.,J.Orthopaedic Res.(1993)11:305-312）。ラジオグラフで骨折パターンについて試験し、仮骨のサイズが測定される。化学的分析の場合、骨折仮骨が摘出、測定、秤量、切片化され、凍結乾燥され、例えば窒素、ヒドロキシプロリンおよびカルシウム含有量に関して分析される。骨折の機械的性質は、普遍的試験器具（Alwetron;Lorenzen and Wettre,Stockholm,Sweden）により四点曲げ技術で調べられる。負荷変形曲線が記録され、最終曲げ堅さおよび曲げ負荷について分析される。骨折治癒に際して合成される３種の主要組織成分‐未分化間葉組織、軟骨および新骨の合成の効果が、組織学的技術を用いて測定される（Ekholm,E.et al.,Am.J.Pathol.(2002)160:1779-1785）。組織学的評価が、Van Gieson、ヘマトキシリンおよびエオシンまたはサフラニンで染色された脱石灰化およびパラフィン包埋骨片で行われ、次いで主要組織成分の面積が測定され、軟骨細胞核の数が計測される。新たに合成された組織の組成に及ぼす効果は、免疫組織化学またはＲＮＡ抽出およびノーザン分析により調べられる（Ekholm,E.et al.,Am.J.Pathol.(2002)160:1779-1785）。免疫組織化学分析は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片または１０％アセトンで固定された凍結組織切片において、異なる細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲンＩ、II、VIおよびIX型；非コラーゲンタンパク質、例えばコンドロアドヘリン（ＣＨＡＤ）、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、軟骨中間層タンパク質（ＣＩＬＰ）；プロテオグリカン、例えばアグレカン、バーシカン、ロイシンリッチリピートタンパク質（ＬＲＲＰ）に対する抗体で行われる。骨髄誘導性間葉幹細胞（ＭＳＣ）に及ぼす効果（Ekholm,E.et al.,Am.J.Pathol.(2002)160:1779-1785）。骨髄が骨から洗い出され、コロニー形成分析の場合、細胞が組織培養プレートで培養される。骨芽細胞移行ＭＳＣは、アルカリホスファターゼ用にクエン酸／アセトン／ホルマリン固定細胞を染色し、フェノールレッドで対比染色することにより、多能性前駆体から分化される。
【０２１９】
遺伝子療法での効果に関して剤をスクリーニングするための方法
更にもう１つの方法は、α１０および／またはα１１の遺伝子療法での効果に関して剤をスクリーニングするためであり、
ｉ）本発明によるノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態；組織；タンパク質、例えばインテグリン、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質および細胞外マトリックス分子、コラーゲン含有組織またはコラーゲンマトリックスを含有した組織のような分子の合成および分解；細胞の転写および翻訳活性の調節に関する上記試験剤の効果を調べ、
iv）上記iii)における試験剤の効果をα１０および／またはα１１の発現と関連付ける
ステップからなる。
【０２２０】
一態様において、該方法では、本発明によるノックアウトマウスがヒトα１０、α１１または双方について更にトランスジェニックであることを含む。
【０２２１】
遺伝子療法での効果に関して剤をスクリーニングするための上記方法の一態様において、試験剤はデオキシ核酸、リボ核酸、ＰＮＡおよびそれらの混合物からなる群より選択される。
【０２２２】
α１０およびα１１ノックアウトマウスまたはダブルノックアウトマウスは、本発明のマウスにα１０またはα１１遺伝子を逆デリバリーする効果について研究するために用いてもよい。
【０２２３】
こうして、遺伝子療法は、標的組織で対象の細胞へ直接的なα１０およびα１１または双方のような遺伝子のインビボデリバリーのために、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスのようなウイルス；または非ウイルスデリバリー系を用いて、例えば裸ＤＮＡ、カチオン性リポソーム、カチオン性脂質およびポリマー並びにＤＮＡ／カチオン性リポソーム／ポリカチオン複合体の使用により行われる。
【０２２４】
α１０またはα１１遺伝子と一緒に同時デリバリーしうる他の適切な遺伝子の例には、インシュリン様成長因子‐１（ＩＧＦ‐１）、トランスフォーミング成長因子‐β（ＴＧＦ‐β）、線維芽細胞成長因子、骨形成タンパク質、ＳＯＸ‐９のような転写因子、ＳＭＡＤのようなあるシグナリング分子、ＢＣＬ‐２のようなアポトーシスを阻害する分子、メタロプロテイナーゼインヒビターのような酵素インヒビター、コラーゲン、例えばコラーゲンII型のような遺伝子のプロモーターがある。
【０２２５】
α１０β１およびα１１β１と反応性の抗体‐ハイブリドーマを作製するための方法
更にもう１つの方法は、インテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部と反応性の抗体産生ハイブリドーマを作製するためであり、
ｉ）インテグリンα１０‐β１もしくはその一部、またはα１０‐β１もしくはその一部でマウスを免疫し、
ii）上記ｉ）の免疫マウスを免疫抗原で追加免疫し、
iii)免疫マウスを犠牲にし、
iv）iii)の犠牲マウスから単一細胞懸濁セルを作製し、
ｖ）ハイブリドーマ細胞を作製するために、上記iv）の単一細胞懸濁物を腫瘍細胞系と融合させ、
vi）免疫抗原との反応性についてハイブリドーマ細胞をスクリーニングする
ステップからなる。
【０２２６】
該方法の別な態様では、上記vi）のスクリーニングされた融合ハイブリドーマ細胞を限界希釈することで、モノクローナルハイブリドーマ細胞を作製するステップを更に含む。
【０２２７】
別な方法が、α１０およびα１１ノックアウトマウスを用いて、α１０およびα１１インテグリンに特異的なモノクローナル抗体の産生のために用いうる。
【０２２８】
一方法において、α１０およびα１１ノックアウトマウスは、α１０、１１またはその一部を発現する細胞系から精製された、組換えα１０、１１またはその一部で免疫される。ハイブリドーマ細胞系が、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）へ融合された、または単独の、Ｈｉｓ標識α１０、１１またはその一部についてコードする発現ベクターｐＣＥＰ４で、ＨＥＫ２９３‐ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクトすることにより作製される。マウスは、例えば、マウスアジュバントImmuneasy（Qiagen）と混合されたα１０またはα１１のアルカリホスファターゼ融合タンパク質、またはマウスアジュバントImmuneasy（Qiagen）と混合されたα１１‐グルタチオントランスフェラーゼ融合タンパク質で、筋肉内免疫される。１５日後、マウスは同一抗原で追加免疫される。２週間隔で２または３回のブーストにより尾の基部に皮下投与することで、マウスは更に追加免疫される。
【０２２９】
最終免疫後２日目に、マウスからの脾臓細胞がポリエチレングリコールを用いてＮＳＯミエローマ細胞と融合される。融合細胞は９６ウェルマイクロプレートに接種され、ＢＭ Condimed Ｈ１（Roche）およびＨＡＴ（ヒポキサチン、アミノプテリン、チミジン混合物Sigma）セレクションを含有したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）培地で増殖される。
【０２３０】
ハイブリドーマ細胞クローン上澄は、例えばＥＬＩＳＡでは、固定されたα１０またはα１１タンパク質またはその一部と結合しうるそれらの能力により、および、例えばＦＡＣＳ分析では、α１０β１またはα１１β１発現細胞系との結合により、抗α１０およびα１１抗体産生について試験される。
【０２３１】
インテグリンα１０β１およびα１１β１に対するモノクローナル抗体を産生するための別な方法は、マウスＣ２Ｃ１２細胞または野生型軟骨細胞もしくは線維芽細胞でのα１０またはα１１インテグリン欠損マウスの免疫による。免疫のため、ヒトα１０鎖またはヒトα１１鎖を発現するマウスＣ２Ｃ１２細胞のような細胞が、皮下注射の前にアジュバントへ懸濁される。３回のブースター注射後、脾臓細胞がＳＰ／２ミエローマ細胞と融合され、得られたハイブリドーマ細胞がクローン化される。上澄が軟骨切片の免疫蛍光によりスクリーニングされ、関節軟骨の軟骨細胞を特異的に染色したクローンがサブクローン化され、次いで大量培養で増殖される。
【０２３２】
トランスジェニックマウスを作製するための方法
インテグリンα１０およびα１１に関する本発明によるノックアウトマウスモデルは、ヒトインテグリンα１０鎖およびヒトインテグリンα１１鎖または双方を含有したトランスジェニックマウスを更に作製するために用いてもよい。このようなトランスジェニックマウスは、ここで略述および例示されたような疾患の治療用の抗体、ペプチドおよび小分子をスクリーニングする目的のために用いてもよい。
【０２３３】
ヒトインテグリンα１０鎖およびヒトインテグリンα１１鎖または双方の鎖を含有したトランスジェニックマウスを作製するために、以下で要約して記載された次の操作が用いうる。
【０２３４】
本発明のα１０およびα１１ノックアウトマウス、即ちダブルノックアウトマウスを作製するために用いられた胚幹細胞（ＥＳ細胞）が、ヒトα１０、α１１または双方の遺伝子を含むトランスジェニックマウスの作製に用いられる。胚幹細胞（ＥＳ細胞）がマウス胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から回収される。ｉ）望ましい構造遺伝子、即ちヒトインテグリンα１０遺伝子またはヒトインテグリンα１１遺伝子、ii）該分子を宿主ＤＮＡ分子へ挿入しうるベクターＤＮＡ、iii)宿主細胞で該遺伝子を発現させるプロモーターおよびエンハンサー配列を含有したＤＮＡの分子を構築するために、組換えＤＮＡ法が用いられる。組換えＤＮＡ法は当業界で周知であり、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（Wiley Interscience and Greene(Publishers)Ausubel,F.M.,Brent R.,Kingston R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith J.A.,Struhl.K.）または類似した書籍、例えば（Sambrook et al.(1989)Molecular cloning:A laboratory manual,2nd edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）で更に記載されている。
【０２３５】
対象のＤＮＡを含有したターゲティングベクターはＥＳ細胞中へ通常エレクトロポレーションされる。典型的には、陽性選択マーカー、例えばｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８またはネオマイシンに対する耐性を付与する）が標的遺伝子と相同的なクローン化ゲノムＤＮＡの大きな方のストレッチと隣接した、ターゲティングベクターがデザインされる。相同的組換えよりもむしろランダム挿入によりターゲティングベクターを組み込んだＥＳ細胞の除去に役立てるためは、陰性選択マーカー、例えば一面で薬物ガンシクロビアに対する感受性を付与するヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ遺伝子）で、ターゲティングベクターが構築される。
【０２３６】
次いで、好結果に形質転換された細胞が下記手法で選択される：
・ベクターを取り込めなかった細胞は、ネオマイシンに曝されると殺される。
・ベクターがランダムに挿入された細胞はネオマイシンに耐性であるが、ガンシクロビアにより殺される（ｔｋ遺伝子の存在下で、ガンシクロビアは細胞に毒性である）。
・選択培地に残存するＥＳ細胞が個別のコロニーまたはクローンを形成し、サザンブロットまたはＰＣＲが好結果の遺伝子ターゲティングを同定するために用いられる。
【０２３７】
次いで、通常約１０〜１５の適切な標的細胞が胚盤胞中へのマイクロインジェクションにより注入され、次いで偽妊娠マウスの子宮中へ外科的に移される。
【０２３８】
ヒトインテグリンα１０またはα１１遺伝子の存在についてＤＮＡを分析するために、例えばマウスの尾から組織が取り出される。
【０２３９】
次いで野生型およびキメラマウスとの交配後、Ｆ１異型接合マウスが作製され、異型接合、同型接合および野生型マウスを作製するために飼育される。
【例】
【０２４０】
例１  インテグリンα１０遺伝子の破壊
インテグリンα１０ノックアウトマウス‐ノックアウト構築物のターゲティング戦略および作製
インテグリンα１０のｎｔ−３２〜ｎｔ８０１に相当するヒトｃＤＮＡプローブ（GenBankTM／ＥＢＩ Data Bank受託番号ＡＦ０７４０１５）を、１２９ＳｖＪマウスゲノムコスミドライブラリー（Evans and Kaufman(1981)Nature.292:154-156）からいくつかのオーバーラップクローン（Bengtsson et al.(2001)Matrix Biology.20(8):565-576）を単離するために用いた。エキソン１（ＡＴＧ開始コドン含有）〜エキソン７を含有する６ｋｂ  ＨｉｎｄIII断片をBluescript ＳＫベクター中へサブクローニングして、ｐＩ３を作製した。ｐＩ３から、１．３ｋｂ  ＨｉｎｄIII‐ＮｃｏＩ断片をＮｅｏ遺伝子のＮｃｏＩ‐ＸｂａＩ断片と連結させ、次いでプラスミドの３′側ＸｈｏＩ部位にＮｏｔＩリンカーを加えた。次いで、この構築物１をＮｏｔＩおよびＸｂａＩで移動させ、プラスミドｐＢＳ  ＥＧＦＰ  ｌｏｘＰ  Ｎｅｏ  ｌｏｘＰの主鎖中これらの部位へそれを挿入して、構築物２を得た。
【０２４１】
プラスミドｐＢＳ  ＥＧＦＰ  ｌｏｘＰ  Ｎｅｏ  ｌｏｘＰからの完全ＥＧＦＰ遺伝子（エンハンスト緑色蛍光タンパク質遺伝子）およびＮｅｏ遺伝子の残部を含有した２．１ｋｂ  ＮｃｏＩ断片を構築物２のＮｃｏＩ部位へ挿入し、配向決定した。この構築物におけるＮｅｏ遺伝子はｌｏｘＰ部位と隣接しているため、Ｎｅｏ遺伝子の将来の欠失を可能にしうる。
【０２４２】
α１０のＡＴＧ開始コドンはＮｃｏＩ部位のすぐ３′側に位置し、ＥＧＦＰ遺伝子のＡＴＧコドンもそうである。ＥＧＦＰをＮｃｏＩ部位へ挿入することにより、α１０の内在ＡＴＧコドンはＥＧＦＰのＡＴＧで置き換えられる。構築物３の３′側ユニークＮｏｔＩ部位にＸｈｏＩリンカーを挿入することにより、全体構築物をＸｈｏＩ切断により移動させ、プラスミドｐＩ１（Bengtsson et al.(2001)Matrix Biology.20(8):565-576）のＸｈｏＩ部位へ連結させて、ターゲティングベクターを得ることができた。プラスミドｐＩ１はα１０遺伝子のエキソン２〜２５を含有し、ｐＢＳの３′側にユニークＮｏｔＩ部位を有しており、これはＥＳ細胞のエレクトロポレーション前にターゲティングベクターを直線化するために用いた。
【０２４３】
図１Ａでは、α１０遺伝子のノックアウト構築物が制限酵素地図で示されている。全構築物をコードする核酸配列を含んだベクターは、Budapest条約に従い受託番号ＤＳＭ１４９３３でＧＳＭＺ，Germanyに寄託されている。
【０２４４】
ＥＳ細胞のトランスフェクションおよび選択
Ｒ１（Samuel Lunenfeld Research Institute,Room 881,Mount Sinai Hospital,600 University Avenue,Toronto,Ontario,Canada M5G 1X5）胚幹細胞を、２０％熱不活化仔ウシ血清（BIGCO BRL）、０．１ｍＭ  β‐メルカプトエタノール（Sigma Chemical CO.,St Louise,ＭＯ）、非必須アミノ酸（BIGCO BRL）および白血病増殖阻止因子（ＬＩＦ）で補充されたＤＭＥＭ培地中、γ照射胚線維芽細胞の支持細胞層上で増殖させた。約５×１０７Ｒ１  ＥＳ細胞を、ＲＴで０．８ｋＶおよび３μｆに設定したBio-Rad Gene PulserTMを用いて、ＮｏｔＩ直線化構築物６０μｇでエレクトロポレーションした。２４時間の増殖後、５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（BIGCO BRL）を培地へ加えることにより選択を開始した。約７日後、３２０クローンを選び出し、３〜５日間の追加増殖用に２４ウェルプレートへ移した。次いで、各ウェルの半分を凍結させ、半分をサザンブロット分析用にＤＮＡを単離するために用いた。
【０２４５】
遺伝子型決定のためのサザンブロットおよびＰＣＲ
サザンブロットをＥＳ細胞ＤＮＡまたは尾ＤＮＡから行い、制限酵素ＸｂａＩで切断した。結果は図１Ｂの上で示されている。ＤＮＡを０．７％アガロースゲルでの電気泳動により展開させ、プライマー５′‐ｔａｃａｇｃａｇｇｃｇａａｔｇａａｇｇ（フォワード）および５′‐ａａｃｔｔａａｇｃｔｔｃｃｃｃｔａｃｃ（リバース）で作製されたランダムプライム化３２Ｐ標識０．６ｂｐプローブによりプロービングし、６６℃から始め−１℃／サイクルで１２サイクルにわたるタッチダウンＰＣＲ増幅、次いで５５℃で１３サイクルにわたる更なる増幅に付した。
【０２４６】
尾ＤＮＡのＰＣＲは、６８℃から始め１℃／サイクルで減少させて８サイクル、次いで更に６０℃で３５サイクルにわたるタッチダウンＰＣＲ増幅において、プライマー５′‐ａｃｇａａａａｃａｇｃｃａａｇｇａｇａｇｇ（フォワード）、５′‐ｔｇｇｔｇｃａｇａｔｇａａｃｔｔｃａｇｇｇ（リバース変異体）および５′‐ａｇａｇａｃａｃｇｔｃｔｃｔｔｔｔｃｔｇｔｇ（リバース野生型）で行った。この増幅で３７０ｂｐの野生型バンドおよび２１０ｂｐの変異体断片を生じる。結果は図１Ｂの下で示されている。
【０２４７】
α１０インテグリン欠損マウスおよびキメラマウスの作製
胚盤胞をＣ５７ＢＬ／６マウスから交尾後３．５日目に単離し、２種のＥＳクローン（約１５個のＥＳ細胞）を注入し（Fassler and Meyer(1995)Genes Dev.9(15):1896-1908）、偽妊娠Ｃ５７ＢＬ／６雌から交尾後２．５日目の子宮に移した。キメラ雄をＣ５７ＢＬ／６雌と交配させて生殖細胞系について試験し、次いでＣ５７ＢＬ／６雌と交配させて、α１０変異対立遺伝子を有する異系交配系を作製した。次いで、α１０欠損マウスを、Ｃｒｅリコンビナーゼを有するディリーター(deletor)マウスと交配させて、Ｎｅｏ遺伝子をもたないα１０欠損マウスを作製した。
【０２４８】
ターゲティング戦略の結論
変異α１０遺伝子と同型接合性のマウスの誕生は、図１Ｂで示されているように、尾バイオプシーＤＮＡのサザンブロット分析またはＰＣＲにより確認した。サザンブロット分析では、−／−マウスで同型接合対立遺伝子（５．５ｋｂ）の予想構造が確認されたことを示した。特異的プライマーを用いた尾バイオプシーＤＮＡにおける標的対立遺伝子のＰＣＲ検出により、変異体で２１０ｂｐバンドおよび野生型で３７０ｂｐバンドを検出した。
【０２４９】
ノックアウトマウスにおけるα１０の不在の確認
４週齢野生型マウスおよび変異α１０遺伝子と異型接合性および同型接合性のマウスの心臓からRNeasy Kit（Qiagen,Valencia,ＣＡ,ＵＳＡ）で全ＲＮＡを抽出することによりＲＴ‐ＰＣＴを行ったが、結果は図２Ａで示されている。ＲＮＡ３．７μｇを用い、SuperscriptTM II ＲＮアーゼＨ‐逆転写酵素合成系（Life Technologies Inc.,Grand Island,ＮＹ,ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【０２５０】
６８℃から始め１℃／サイクルで減少させて８サイクルにわたるタッチダウンプログラム、次いで最後に６０℃で更に３０サイクルにわたる増幅で、α１０特異的プライマー、５′‐ｔｇｇａｇｔｃｔｃｔｃｔｃｃａｔｃｃ（フォワード、エキソン１）および５′‐ｔｃｇａｔｇａａｃａｇｔｃｔｔｃｃｔａｃｃａｇｃ（リバース、エキソン６）によりＰＣＲを展開させた。陽性コントロールとして、β‐アクチン特異的プライマー、５′‐ｇｔｇｇｇｃｃｇｃｔｃｔａｇｇｃａｃｃａａ（フォワード）および５′‐ｃｔｃｔｔｔｇａｔｇｔｃａｃｇｃａｃｇａｔｔｔｃ（リバース）を同プログラムで並行して展開させた。
【０２５１】
細胞表面におけるα１０インテグリンのタンパク質検出のため、Bengtsson,et al.,2001で記載されたように、肋骨軟骨細胞を新生児野生型およびα１０欠損マウスから単離した。軟骨細胞表面をビオチニル化し、次いで図２Ｂで示されたようにα１０インテグリンに対する抗血清で免疫沈降させ、（Bengtsson et al.(2001)Matrix Biology.20(8):565-576）記載されたようにウエスタンブロットにより分析した。
【０２５２】
野生型およびα１０ノックアウトマウスからの組織を様々な年齢時に採取した。パラフィン包埋用の組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）またはSaint-Marie（ＳＭ）で固定し、四肢を、脱水および包埋前に、１０％ＥＤＴＡまたは１０％ギ酸（Sigma-Aldrich）で脱石灰化した。次いで、パラフィン切片をミクロトームで６μｍに切り出した。凍結切片化用の組織をスナップ凍結し、６μｍに切り出し、染色前に、アセトン中−２０℃で５分間かけて固定した。軟骨を含有したすべての切片を、抗体染色前に、３７℃で３０分間にわたり２ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ（Sigma）で処理した。免疫蛍光染色およびＤＡＢ染色（Vector Laboratories Inc.,Burlingham,ＣＡ,ＵＳＡのVectastain ABC-Kit）を標準操作に従い一次抗体と共に１時間インキュベートして行った。α１０の認識に用いられる抗体は、１：１００の濃度における、ヒトα１０の細胞質尾部に対するウサギポリクローナルであった（Camper et al.(1998)J.Biol.Chem.273:20383-20389）。
【０２５３】
図３では、野生型（Ａ）およびノックアウトα１０マウス（Ｂ）からの膝関節の免疫組織化学染色が示されている。免疫蛍光（Ｃｙ３）標識二次抗体を用いることにより、膝関節をα１０サブユニットで染色した。α１０を野生型膝関節（Ａ）で検出したが、α１０ノックアウト膝関節（Ｂ）では検出しなかった。
【０２５４】
α１０破壊の結論
インテグリン遺伝子の同型接合性破壊を有する動物で、インテグリンα１０ｍＲＮＡおよびタンパク質の不在が確認された。あるレベルのα１０を発現することが知られた心臓組織からの全ＲＮＡは、−／−マウスで検出可能なα１０特異性転写物を示さなかった。そのため、α１０遺伝子の両コピーがターゲティングベクターにより好結果に失われていたのである。
【０２５５】
ｍＲＮＡレベルで得られる結果は、野生型およびＫＯマウス軟骨細胞からのα１０の表面ビオチニル化および免疫沈降後に、免疫反応性α１０の不在によりタンパク質レベルで確認された。
【０２５６】
軟骨細胞におけるα１０の不在に関する更なる証拠は、野生型およびノックアウトマウスからの膝関節の免疫組織化学染色により示された。α１０は＋／＋マウス膝関節で検出されたが、−／−膝関節では検出されなかった。
【０２５７】
要約すると、これらの結果は、マウスα１０遺伝子の両対立遺伝子の破壊がα１０ｍＲＮＡおよびタンパク質の喪失をもたらしたことを示している。
【０２５８】
脛骨および大腿骨の骨格染色および長さ測定
図４では、脛骨および大腿骨の長さ測定がα１０ノックアウトマウスで示されている。脛骨および大腿骨の測定長さ（８週齢、１２週齢および１年齢時）が野生型長さの％で示されている。α１０ノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して、約５〜１０％短い成長率を示している。１２週齢で、大腿骨の場合ｐ＝０．０００７および脛骨の場合ｐ＝０．０５（野生型の場合ｎ＝４およびノックアウトの場合ｎ＝６）。１年齢で、大腿骨の場合ｐ＝０．０８および脛骨の場合ｐ＝０．０１（野生型の場合ｎ＝３およびノックアウトの場合ｎ＝４）。
【０２５９】
図５は、野生型（Ａ）およびα１０ノックアウト（Ｂ）マウスからの脛骨成長板のヘマトキシリン／シトクロム染色を示している。８週齢までに、成長板の上部増殖ゾーンにおける軟骨細胞の形態は、ノックアウトマウス（Ｂ）と比較して、野生型（Ａ）で著しい変化を示している。ノックアウトマウスからの軟骨細胞はサイズが不規則で、野生型と比較して形状が丸い。加えて、野生型では軟骨細胞の規則的円柱積層構造が失われて、更にランダムで無秩序な増殖ゾーンを形成している。
【０２６０】
骨および軟骨形態の変化
図６では、野生型（Ａ）およびα１０ノックアウト（Ｂ）マウスからの膝関節のヘマトキシリン／エオシン染色が示されている。初期原線維化と似た巨視的変化が１年齢ノックアウトマウス（Ｂ）の関節軟骨で観察される。逆に、同年齢の野生型マウス（Ａ）は正常な非原線維化関節表面を示している。
【０２６１】
例２  インテグリンα１１遺伝子の破壊
インテグリンα１１ノックアウトマウス‐ターゲティング戦略
ヒトα１１ｃＤＮＡ（ｎｔ−３７〜９１７）（Velling,T.,Kusche-Gullberg,M.,Sejersen,T.,and Gullberg,D.(1999)J.Biol.Chem.274(36):25735-25742）,JCB 274:25735-42の５′末端からの０．９５ｋｂプローブを用いて、スポット化１２９／ＳｖＪゲノムライブラリー（ＢＡＣ Mouse Release II,Genome Systems Inc,St.Louis,ＭＯ）から４つのＢＡＣクローンを同定した。ＢＡＣクローンをGenome Systemsから入手し、ＳａｃＩで開裂後、０．９５ｋｂプローブと反応性の１２ｋｂ断片を同定し、ｐBluescript ＳＫ（＋）クローニングベクター中へサブクローニングし、配列決定した（ＭＷＧ Biotech AG,Germany）。
【０２６２】
マウスｉｔｇａ１１の１２ｋｂゲノム断片から、ＮｈｅＩを用いてホモロジーアームを切り出し長い５．５ｋｂホモロジーアームを得、ＢｓａＷＩ＋ＰａｅＩを用いて短い２．５ｋｂホモロジーアームを得た。ホモロジーアーム間で得られるギャップは３７５ｂｐの欠損を生じ、エキソン３の最終３７ヌクレオチドから始まりイントロン３まで続いていた。短いアームをＩＲＥＳ‐ｌａｃＺリポーターカセットへ連結させ、次いでｌｏｘ‐ｐ隣接ＰＧＫｎｅｏカセットを逆方向に連結させ、長いアームで終わらせることにより、ターゲティング構築物を得た。
【０２６３】
その構築物は図８Ａで略記されている。図８Ｂにおいて、制限酵素地図は標的α１１対立遺伝子の作製に際して重要な部位を示している。
【０２６４】
遺伝子型決定のためのサザンブロット
ゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ切断、次いでハイブリダイゼーションブローブとして短いホモロジーアームのすぐ上流の７１４ｂｐ  ＨｉｎｄIII／ＰａｅＩ断片を用いたサザンブロットにより、標的対立遺伝子を検出した。ターゲティング構築物からの新規ＢａｍＨＩ部位の導入のせいで形成された短いバンド（野生型の８ｋｂに対して６．５ｋｂ）により、標的対立遺伝子を同定した。
【０２６５】
α１１インテグリン欠損マウスおよびキメラマウスの作製
胚盤胞を前記のように３．５日目に単離した。
用いられた胚幹細胞はＲ１（Samuel Lunenfeld Research Institute,Room 881,Mount Sinai Hospital,600 University Avenue,Toronto,Ontario,Canada M5G 1X5）であった。細胞培養、相同的組換えおよびＣ５７ＢＬ／６胚盤胞中へのＥＳ細胞クローンのマイクロインジェクションは、例１で記載されたように行った。ターゲティング構築物をＮｏｔＩで直線化した。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させることにより、変異異型接合マウスを得た。異型接合体（Ｆ１）を交雑させて、同型接合（Ｆ２）マウスを得た。ＥＳクローンの遺伝子型をサザンブロットで調べ、マウスの遺伝子型をサザンブロットまたはゲノムＰＣＲで調べた。表現型分析の場合、３種すべての遺伝子型のＦ２同腹仔を用いた。線維芽細胞におけるタンパク質発現および胚切片における免疫組織化学の分析の場合には、Ｆ３同腹仔を用いた。
【０２６６】
ノックアウトマウスにおけるα１１の不在の確認
尾ＤＮＡを（Kogan,S.C.,Doherty,M.,and Gitschier,J.(1987)N.Engl.J.Med.317(16),985-90）記載されたように調製し、４プライマーのミックスを用いて、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％ＤＭＳＯおよび各プライマー５ｐＭ含有の反応液２０μＬ中でＰＣＲに付した。プライマー配列は次の通りであった：α１１エキソン３Ｆ：５′ｃａａｃｔｇｃａｃｃａａｇｃｔｃａａｃｃｔ３′；α１１イントロン３Ｒ：５′ｔｔｃｔｇｃｔｇｔｃａｃｔｔｃｃｔｃａｔｃ３′；ＬａｃＺＦ５′ｇａｇｃｇｔｇｇｔｇ  ｇｔｔａｔｇｃｃｇａ  ｔｃｇｃ３′；ＬａｃＺＲ５′ｃｃｇａ  ａｃｃａｔｃｃｇｃｔ  ｇｔｇｇｔａ３′。
【０２６７】
ＤＮＡを最初に９５℃で３分間、次いで９５℃で１分間の３０サイクル；６０℃で１分間；７２℃で１分間かけて変性させ、最後に７２℃で５分間伸張させた。反応物を２％アガロース上で分離させ、７８０ｂｐ野生型バンドおよび／または３７４ｂｐＫＯバンドを得た。
【０２６８】
α１１破壊の結論
マウスＥＳ細胞で遺伝子座の破壊により、インテグリンα１１欠損マウスを作製した。変異α１１遺伝子と同型接合性のマウスの誕生は、マウス尾バイオプシーから単離されたＤＮＡのサザンにより確認した。図９では、野生型（＋／＋）、異型接合（＋／−）および同型接合（−／−）α１１マウスから単離されたＤＮＡのサザンブロット分析が示されている。野生型対立遺伝子および同型接合標的α１１対立遺伝子は、サザンブロットで各々８ｋｂおよび６．５ｋｂ断片を生じる。図９ＡはサザンブロットでのＥＳ細胞を示しており、そこでのデータは非組換え野生型ＥＳクローン（＋／＋）および組換え異型接合ＥＳクローン（＋／−）を示している。図９Ｂはマウス尾のサザンブロットを示しており、そこでＦ２世代は標的対立遺伝子について野生型（＋／＋）、マウス異型接合（＋／−）および同型接合（−／−）を示している。
【０２６９】
α１１標的マウスにおける体重曲線
３週齢時に、尾を遺伝子型決定用に切り取ったとき、同腹仔よりも小さいマウスを各仔が含むことに気付いた。ＥＳ細胞クローン９５および２１５双方から樹立されたマウスを異なる年齢時に体重測定し、データを雌性および雄性ｗｔ、異型接合および同型接合同腹仔について別々の成長曲線にまとめた。雌性および雄性双方の同型接合マウスは、成熟期に入ると、平均で２０〜３０％のサイズ減少を示した。骨格の全体的サイズも小さかった。
【０２７０】
２つの異なる異型接合胚幹細胞クローン（クローン９５および２１５）のキメラに由来する２つの別々なマウス株からのＦ２子孫を遺伝子型決定し、体重を雌性および雄性の野生型およびノックアウトマウスについて異なる時点で測定した。結果は図１０ＡおよびＢでクローン９５のみについて示されている。各性別で、用いられた個体数が測定データポイントの数と一緒に示されている。雌性クローン９５は野生型（７マウス、１９データポイント）およびノックアウト（１１マウス、２４データポイント）を含んでいる。雄性クローン９５は野生型（１１マウス、３０データポイント）およびノックアウト（９マウス、２８データポイント）を含んでいる。
【０２７１】
表現型の結論
インテグリンα１１に欠損のあるマウスは、野生型および異型接合同腹仔の体重の約７０〜８０％に相当する、体重（およびサイズ、データ示さず）の有意な減少を示す。
【０２７２】
野生型およびノックアウトα１１マウスにおける被膜間皮膚の皮膚コラーゲン含有量の変化
被膜間皮膚の皮膚コラーゲン厚さを野生型（Ａ、図１１）およびノックアウト（Ｂ、図１１）マウスで測定した。図１１でみられるように、皮膚厚さは野生型と比較してノックアウトの場合約５０％減少している。
【０２７３】
寄託
Budapest条約に従いGermanyのDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）に以下の寄託を行った。
【０２７４】
α１０ノックアウト構築物をコードするＤＮＡを含んだベクターおよびα１１ノックアウト構築物をコードするＤＮＡを含んだ一ベクターが各々寄託されている。
【０２７５】
ＤＳＭＺ受託番号は：
‐α１０ノックアウト構築物をコードするＤＮＡを含んだα１０ノックアウトベクターｐＴＮ６．２：ＤＳＭ１４９３３
‐α１１ノックアウト構築物をコードするＤＮＡを含んだα１１ノックアウトベクター１．１：ＤＳＭ１４９３４
【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１Ａ】α１０遺伝子の標的破壊を示しており、制限酵素地図は標的α１０対立遺伝子の作製に際して重要な部位を示している。Ｘ，ＸｂａＩ；Ｎ，ＮｏｔＩ。標的α１０対立遺伝子では、エンハンスト(enhanced)緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の遺伝子がエキソン１に挿入され、内在翻訳開始配列に置き換わっている。Ｎｅｏ遺伝子は、Ｎｅｏカセットの除去を行えるｆｌｏｘ部位に隣接している。矢印は、マウスの遺伝子型決定のためにＰＣＲで用いられるプライマー対の位置を示している。図の下部は、相同的組換えＥＳクローンの同定およびサザンブロット分析によるマウスの遺伝子型決定のために用いられる外部プローブの位置を示している。
【図１Ｂ】野生型、異型接合および同型接合α１０マウスから単離されたＤＮＡのサザンブロット分析（上）およびＰＣＲ（下）を示している。野生型対立遺伝子および同型接合標的α１０対立遺伝子は、サザンブロットで１０ｋｂおよび５．５ｋｂ断片を各々生じる。ＰＣＲで、野生型対立遺伝子は３７０ｂｐバンド、変異体は２１０ｂｐバンドを生じる。
【図２Ａ】野生型、異型接合および同型接合ノックアウトα１０マウスからの心臓のＲＴ‐ＰＣＲ分析における、α１０ノックアウトマウスのＲＴ‐ＰＣＲを示している。プライマーはエキソン１およびエキソン６に位置し、５５０ｂｐのバンドを生じる。ｍＲＮＡメッセージはα１０ノックアウトマウスから検出されない。陽性コントロールとして、β‐アクチンに特異的なプライマーが用いられる。
【図２Ｂ】野生型およびノックアウトマウスからの肋骨軟骨細胞を用いた、α１０インテグリンの表面ビオチニル化および免疫沈降を示している。α１０インテグリンは、ノックアウトマウスからの軟骨細胞の表面細胞で検出されなかった。
【図３】野生型（Ａ）およびノックアウトα１０マウス（Ｂ）からの膝関節の免疫組織化学染色を示している。膝関節は、免疫蛍光（Ｃｙ３）標識二次抗体を用いることにより、α１０サブユニットで染色した。α１０は野生型膝関節（Ａ）で検出されたが、α１０ノックアウト膝関節（Ｂ）では検出されなかった。
【図４】α１０ノックアウトマウスにおける脛骨および大腿骨の長さ測定を示している。脛骨および大腿骨の測定長さ（８週齢、１２週齢および１年齢目）が野生型長さの％で示されている。α１０ノックアウトマウスは、野生型マウスと比較して、約５〜１０％短い成長率を示している。
【図５】野生型（Ａ）およびα１０ノックアウト（Ｂ）マウスからの脛骨成長板のヘマトキシリン／シトクロム染色を示している。８週目までに、成長板の上部増殖ゾーンにおける軟骨細胞の形態は、ノックアウトマウス（Ｂ）と比較して、野生型（Ａ）で著しい変化を示している。ノックアウトマウスからの軟骨細胞はサイズが不規則で、野生型と比較して形状が丸い。加えて、野生型における軟骨細胞の規則的円柱積層構造が失われ、よりランダムで無秩序な増殖ゾーンを形成している。
【図６】野生型（Ａ）およびα１０ノックアウト（Ｂ）マウスからの膝関節のヘマトキシリン／エオシン染色を示している。初期原線維化と似た巨視的変化が１年齢ノックアウトマウス（Ｂ）の関節軟骨で観察される。逆に、同年齢の野生型マウス（Ａ）は正常な非原線維化関節表面を示している。
【図７】α１０免疫血清を用いたα１０の免疫沈降を示している。α１０トランスフェクトされた２９３細胞が表面ビオチニル化され、次いで溶菌された。免疫沈降が抗α１０細胞質ドメイン抗血清（レーン１）、モノクローナル抗β１抗体（レーン２）、マウス非免疫血清（レーン３）およびα１０マウス免疫血清（レーン４）を用いて行われた。免疫沈降物は８％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで展開され、ＰＶＤＦ膜へ移された。ビオチニル化タンパク質を検出するために、ブロットがアビジン‐ペルオキシダーゼ複合体／ＥＣＬで染色された。
【図８Ａ】α１１遺伝子の標的破壊を示している。制限酵素地図では標的α１１対立遺伝子の作製に際して重要な部位を示している。
【図８Ｂ】α１１遺伝子の標的破壊を示している。制限酵素地図では標的α１１対立遺伝子の作製に際して重要な部位を示している。
【図９】野生型（＋／＋）、異型接合（＋／−）および同型接合（−／−）α１１マウスから単離されたＤＮＡのサザンブロット分析を示している。野生型対立遺伝子および同型接合標的α１１対立遺伝子は、サザンブロットで８ｋｂおよび６．５ｋｂ断片を各々生じる。    図９Ａ：ＥＳ細胞を示している。サザンブロットデータは、非組換え野生型ＥＳクローン（＋／＋）および組換え異型接合ＥＳクローン（＋／−）を示している。    図９Ｂ：マウス尾を示している。Ｆ２世代のサザンブロットデータは、野生型（＋／＋）と標的対立遺伝子のマウス異型接合（＋／−）および同型接合（−／−）を示している。
【図１０】インテグリンα１１雌性および雄性野生型およびノックアウトマウスの体重曲線を示している。体重は、雌性および雄性野生型およびノックアウトマウスについて、異なる時点で測定された。各性別で、用いられた個体数が測定データポイントの数と一緒に示されている。    図１０Ａ：雌性クローン９５を示している。野生型（７マウス、１９データポイント）およびノックアウト（１１マウス、２４データポイント）    図１０Ｂ：雄性クローン９５を示している。野生型（１１マウス、３０データポイント）およびノックアウト（９マウス、２８データポイント）、および
【図１１】野生型およびノックアウトα１１マウスにおける被膜間皮膚の皮膚コラーゲン含有量の変化を示している。被膜間皮膚の皮膚コラーゲン厚さが野生型（Ａ）およびノックアウト（Ｂ）マウスで測定された。
【図１２】新生児野生型およびα１０ノックアウト（変異）マウスからの成長板のＥＣＭの電子顕微鏡写真を示している。
【図１Ａ】
2005522232.tif 000002
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005522232.tif 000009
【図７】
2005522232.tif 000010
【図８Ａ】
2005522232.tif 000011
【図８Ｂ】
2005522232.tif 000012
【図９】
2005522232.tif 000013
【図１０】
2005522232.tif 000014
【図１１】
2005522232.tif 000015
【図１２】
2005522232.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月7日(2004.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１０遺伝子の少くとも一部が、インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１０遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２】
インテグリンα１０コーディング配列の一部が、インテグリンα１０イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項３】
インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列が、受託番号ＤＳＭ１４９３３でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項１または２に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項４】
非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１１遺伝子の少くとも一部が、インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換されている、インテグリンα１１遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項５】
インテグリンα１１コーディング配列の一部が、インテグリンα１１イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項４に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項６】
インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列が、受託番号ＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項４または５に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項７】
非ヒト哺乳動物およびその子孫のインテグリンα１０遺伝子の少くとも一部が、１）インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を第一のマーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列および２）インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部を第二の選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列で置換された、インテグリンα１０遺伝子およびインテグリンα１１遺伝子を含む非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項８】
インテグリンα１０をコードする遺伝子の発現が、野生型非ヒト哺乳動物と比較して抑制されている、ノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項９】
インテグリンα１０をコードする遺伝子の抑制が１００％である、請求項８に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１０】
α１０が、インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により抑制されている、請求項８または９に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１１】
インテグリンα１０コーディング配列の一部が、インテグリンα１０イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項１０に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１２】
ノックアウト構築物が、選択マーカー配列へ結合されたインテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３３でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項１０または１１に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１３】
インテグリンα１１をコードする遺伝子の発現が、野生型非ヒト哺乳動物と比較して抑制されている、ノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１４】
インテグリンα１１をコードする遺伝子の抑制が１００％である、請求項１３に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１５】
α１１が、インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部をマーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により抑制されている、請求項１３または１４に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１６】
インテグリンα１１コーディング配列の一部が、インテグリンα１１イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項１５に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１７】
ノックアウト構築物が、マーカー配列へ結合されたインテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項１６に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１８】
インテグリンα１０をコードする遺伝子およびインテグリンα１１をコードする遺伝子の発現が、野生型非ヒト哺乳動物と比較して抑制されている、ノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項１９】
インテグリンα１０およびα１１をコードする遺伝子の抑制が１００％である、請求項１８に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２０】
α１０が、インテグリンα１０コーディング配列の少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により抑制され、α１１が、インテグリンα１１コーディング配列の少くとも一部を第二の選択マーカー配列へ結合させたノックアウト構築物の挿入により抑制されている、請求項１８または１９に記載のノックアウト非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２１】
インテグリンα１０コーディング配列の一部が、インテグリンα１０イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部であり、インテグリンα１１コーディング配列の一部が、インテグリンα１１イントロン、エキソン、プロモーターまたはその混合物の少くとも一部である、請求項２０に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２２】
ノックアウト構築物が、マーカー配列へ結合されたインテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３３でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託され、ノックアウト構築物が、マーカー配列へ結合されたインテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、請求項２０または２１に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２３】
非ヒト哺乳動物およびその子孫がげっ歯類である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２４】
げっ歯類がマウスである、請求項２３に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２５】
選択マーカー配列がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物およびその子孫。
【請求項２６】
インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部をマーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１０遺伝子の一部を置き換えるステップからなる、破壊インテグリンα１０遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法。
【請求項２７】
ａ）インテグリンα１０のノックアウト構築物を用意し、
ｂ）ＥＳ細胞系を用意し、
ｃ）ｂ）のＥＳ細胞系をａ）の構築物で形質転換し、
ｄ）マーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、
ｅ）胚盤胞を用意し、
ｆ）ＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、
ｇ）胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、および
ｈ）胚をキメラ動物へ発育させて、破壊インテグリンα１０遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせる
ステップを更に含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
配列が、選択マーカー配列へ結合されたインテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３３でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、インテグリンα１０αノックアウト構築物をコードする核酸配列を含んでなるベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載されたインテグリンα１０αノックアウト構築物ベクターを含んでなるＥＳ細胞系。
【請求項３０】
インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１１遺伝子の一部を置き換えるステップからなる、破壊インテグリンα１１遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法。
【請求項３１】
ｉ）インテグリンα１１のノックアウト構築物を用意し、
ｊ）ＥＳ細胞系を用意し、
ｋ）ｊ）のＥＳ細胞系をｉ）の構築物で形質転換し、
ｌ）マーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、
ｍ）胚盤胞を用意し、
ｎ）ＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、
ｏ）胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、および
ｐ）胚をキメラ動物へ発育させて、破壊インテグリンα１１遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせる
ステップを更に含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列が、選択マーカー配列へ結合されたインテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を含んでなり、受託番号ＤＳＭ１４９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Germanyに寄託されている、インテグリンα１１ノックアウト構築物をコードする核酸配列を含んでなるベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載されたインテグリンα１１ノックアウト構築物ベクターを含んでなるＥＳ細胞系。
【請求項３４】
ｑ）インテグリンα１０コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１０遺伝子の一部を置き換え、および
ｒ）インテグリンα１１コーディング配列の１エキソンの少くとも一部を選択マーカー配列へ結合させたＤＮＡ配列との相同的組換えにより、胚幹細胞でインテグリンα１１遺伝子の一部を置き換える
ステップからなる、破壊インテグリンα１０遺伝子および破壊インテグリンα１１遺伝子を有する非ヒト哺乳動物およびその子孫を作製するための方法。
【請求項３５】
ｓ）インテグリンα１０のノックアウト構築物を用意し、かつインテグリンα１１のノックアウト構築物を用意し
ｔ）ＥＳ細胞系を用意し、
ｕ）ｔ）のＥＳ細胞系をｓ）の構築物で同時にまたは１回で形質転換し、
ｖ）少くとも１つのマーカー配列を用いて形質転換ＥＳ細胞系を選択し、
ｗ）胚盤胞を用意し、
ｘ）形質転換および選択されたＥＳ細胞系を胚盤胞中へ導入し、
ｙ）胚盤胞をフォスターマザー非ヒト哺乳動物へ移し、および
ｚ）胚をキメラ動物へ発育させて、破壊インテグリンα１０遺伝子およびインテグリンα１１遺伝子の生殖細胞系伝達を行わせる
ステップを更に含んでいる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
筋骨格および結合組織疾患で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項３７】
アテローム性動脈硬化症で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項３８】
線維症で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項３９】
幹細胞の分化または機能で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４０】
幹細胞が、間葉幹細胞、造血幹細胞および上皮幹細胞からなる群より選択される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
骨折治癒で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４２】
炎症疾患で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４３】
炎症疾患がリウマチ様関節炎または髄膜炎である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
α１０および／またはα１１の活性を調節するための遺伝子療法モデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４５】
心臓弁疾患で活性を調節するためのモデルとしての、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４６】
活性を調節することが、疾患で活性を阻止、阻害、軽減または逆転することである、請求項３６〜４０または４２〜４５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４７】
活性を調節することが、骨折治癒で活性を刺激、阻止、阻害、軽減または逆転することである、請求項４１に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４８】
インテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部と反応性を示す抗体の作製のための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載された非ヒト哺乳動物およびその子孫の使用。
【請求項４９】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
インテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部が、ヒトインテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部である、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５２】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を筋骨格および結合組織疾患と関連付ける
ステップからなる、筋骨格疾患での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５３】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果をアテローム性動脈硬化症と関連付ける
ステップからなる、アテローム性動脈硬化症での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５４】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を線維症と関連付ける
ステップからなる、線維症での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５５】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を幹細胞の分化と関連付ける
ステップからなる、幹細胞の分化での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５６】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を骨折治癒と関連付ける
ステップからなる、骨折治癒での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５７】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果を炎症疾患と関連付ける
ステップからなる、炎症疾患での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５８】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスを用意し、
ii）上記のノックアウトマウスに試験剤を投与し、
iii)形態、組織、細胞外マトリックス分子の合成および分解、およびインテグリンの合成に関する上記試験剤の効果を調べ、および
iv）上記iii)における試験剤の効果をα１０および／またはα１１の発現と関連付ける
ステップからなる、α１０および／またはα１１の遺伝子療法での効果に関して剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５９】
試験剤が、デオキシ核酸、リボ核酸、ＰＮＡおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載されたノックアウトマウスをインテグリンα１０‐β１もしくはその一部、またはインテグリンα１１‐β１もしくはその一部で免疫し、
ii）上記ｉ）の免疫マウスを免疫抗原で追加免疫し、
iii)免疫マウスを犠牲にし、
iv）iii)の犠牲マウスから単一細胞懸濁セルを作製し、
ｖ）ハイブリドーマ細胞を作製するために、上記iv）の単一細胞懸濁物を腫瘍細胞系と融合させ、
vi)免疫抗原との反応性についてハイブリドーマ細胞をスクリーニングする
ステップからなる、インテグリンα１０‐β１、α１１‐β１またはその一部と反応性の抗体産生ハイブリドーマを作製するための方法。
【請求項６１】
vi）のスクリーニングされた融合ハイブリドーマ細胞を限界希釈することで、モノクローナルハイブリドーマ細胞を作製するステップを更に含んでなる、請求項６０に記載の方法。
【国際調査報告】
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