(57)【要約】ヒト抗体を、免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主（例えば、ＳＣＩＤマウス）に一つ以上のヒト免疫器官由来の組織を移植することによって、産生する。１つの実施形態において、ヒト抗体を産生する方法であって、以下の工程：ａ）ヒト組織を、免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主に移植する工程であって、該ヒト組織が、ヒト抗体を産生するために、胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節および胎児肝臓の十分な部分を含む、工程；ｂ）組成物を該移植されたヒト組織に適用する工程であって、該組成物が、少なくとも１つの増殖因子および細胞増殖を支持する材料を含む、工程；ｃ）該宿主を免疫原で免疫する工程；ならびにｄ）ヒト抗体を産生する細胞を含む該移植された組織の少なくとも一部を収集する工程、を包含する、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗体を産生する方法であって、以下の工程：
ａ）ヒト組織を、免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主に移植する工程であって、該ヒト組織が、ヒト抗体を産生するために、胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節および胎児肝臓の少なくとも十分な部分を含む、工程；
ｂ）組成物を該移植されたヒト組織に適用する工程であって、該組成物が、少なくとも１つの増殖因子および細胞増殖を支持する材料を含む、工程；
ｃ）該宿主を免疫原で免疫する工程；ならびに
ｄ）ヒト抗体を産生する細胞を含む該移植された組織の少なくとも一部を収集する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主が齧歯類動物である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主がＳＣＩＤマウスである、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主がＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスである、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記移植工程の前に、前記免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主を照射する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記免疫工程の前に、ヒト抗体の存在について試験する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞を収集する工程が、前記宿主から前記ヒト組織の少なくとも一部を除去する工程、該除去されたヒト組織からＲＮＡを単離する工程、抗体ライブラリーを構築する工程、および前記免疫原に結合する１つ以上の抗体を同定する工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載される方法に従って作製された、ヒト抗体。
【請求項９】
免疫無防備哺乳動物であって、ヒト抗体を産生するための、胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節および胎児肝臓の少なくとも十分な部分を移植された、免疫無防備哺乳動物。
【請求項１０】
ＳＣＩＤマウスである、請求項９に記載の免疫無防備哺乳動物。
【請求項１１】
抗体ライブラリーであって、免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主内に移植されたヒト胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節および胎児肝臓から発生されたヒト細胞由来の抗体ライブラリー。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗体ライブラリーであって、前記免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主がＳＣＩＤマウスである、抗体ライブラリー。
【請求項１３】
請求項１１に記載の抗体ライブラリーであって、前記免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主がＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスである、抗体ライブラリー。
【請求項１４】
薬物の効果を試験する方法であって、以下：
薬物を非ヒト哺乳動物に投与する工程であって、該非ヒト哺乳動物が、Ｔ細胞、Ｂ細胞および樹状細胞からなる群から選択される１つ以上の型のヒト免疫細胞の発生を可能にするための、該非ヒト哺乳動物内に移植された胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節および胎児肝臓の少なくとも十分な部分を有する、工程；および
ヒト抗体産生に対する薬物の任意の効果を観察する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
方法であって、以下：
抗体産生細胞を免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主から単離する工程であって、該免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主に、ヒト胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節および胎児肝臓の少なくとも十分な部分が移植されていて、ヒト抗体を産生する、工程；ならびに
単離された細胞の１つ以上をハイブリドーマに融合する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
（技術分野）
本開示は、非ヒト哺乳動物レシピエント（特に、ＳＣＩＤマウスのような免疫欠損マウス）における機能的ヒト免疫系の作製に関する。ヒト免疫器官由来の組織を、非ヒト哺乳動物レシピエント（特に、ＳＣＩＤマウスのような免疫欠損マウス）に移植することによって、ヒト抗体を産生するための方法もまた、記載される。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の背景）
治療剤としてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用は、過去数年にわたって劇的に拡大している。大部分のｍＡｂは、非ヒト（多くは、齧歯類動物）起源である。しかし、非ヒトｍＡｂは、ヒトにおける免疫原性の問題（齧歯類動物ｍＡｂが導入される）を引き起こす。齧歯類動物ｍＡｂの導入によって産生される抗齧歯類動物抗体は、血清の増強されたクリアランス、齧歯類動物ｍＡｂの治療効果の妨害、および過敏性反応を生じ得る。これらの制限は、それをヒト抗体により関連させるために、齧歯類動物抗体を変化させる「ヒト化」技術の開発を促進した。それにも関わらず、完全ヒト抗体の使用が最も望ましい。
【０００３】
ＳＣＩＤ−ｈｕマウスは、実験条件下でヒト免疫系を研究するための動物モデルとして設計されている。ヒト初代血液リンパ球をＳＣＩＤマウスに注射する最初のＳＣＩＤ−ｈｕマウスモデル（Ｍｏｓｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８８，３２５，２５６）に続いて、造血器官を移植する多くの研究がなされた（Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９６、Ｖｏｌ．８、２０７において概説される）。ＳＣＩＤ−ｈｕ−ＰＢＬモデルは、ウイルス抗原を用いる免疫後に、血清内にヒト抗体の分泌を惹起するために首尾良く使用されている（例えば、Ｄｕｃｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２，３５５，２５８）。しかし、ＳＣＩＤ−ｈｕ−ＰＢＬマウスにおける抗体産生は、ドナーの成熟し偏った（ｂｉａｓｅｄ）免疫レパートリーに制限される。同様に、ＢｒａｍｓおよびＭｏｒｒｏｗ（係属中の出願７７０，０５７を参照のこと）によって開示されるような、インビトロでプライムされ、続いてＳＣＩＤマウスに移入され、そして免疫される脾細胞の使用は、成熟し偏った免疫系に依存する。従って、免疫系の全ての成分を含むＴ細胞およびＢ細胞の幅広いレパートリーの開発を可能にする系を設計することが望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
リンパ系は、免疫細胞が生じるか、成熟するか、または存在する器官を含む。免疫系の主要な器官は、胸腺、脾臓、骨髄、皮膚およびリンパ節であり、胎児においてはまた、肝臓である。これらの器官の全てを免疫欠損非ヒト哺乳動物宿主（例えば、ＳＣＩＤマウス）への移植が、種々の免疫原に対する免疫応答を開始（ｍｏｕｎｔ）し得るヒト免疫系を確立することが、ここで見出された。免疫器官を移植することに加えて、適切な増殖因子およびサイトカイン環境を提供することは、抗体応答を得ることを補助する。一旦、検出可能な免疫原特異的応答が開始すると、移植された免疫器官由来の細胞は、収集され得、そして細胞または細胞由来の遺伝物質が所望のように不死化および／またはクローン化され得る。
【０００５】
従って、この開示に従って、ヒト抗体は、ヒト免疫器官由来の組織を非ヒト哺乳動物レシピエントに移植することによって産生され得る。特定の有用な実施形態において、レシピエントは、ＳＣＩＤマウスである。ヒト抗体を産生する方法は、ヒト組織を免疫欠損非ヒト哺乳動物レシピエントに移植する工程で始める。宿主に移植されるヒト組織は、抗体を産生するための１つ以上のヒト免疫器官の十分な部分を含む。機能的ヒト免疫系の開発は、例えば、メトカルト（ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ）およびマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で提供される適切なサイトカインおよび増殖因子の注射によって可能にされる。免疫不全非ヒト哺乳動物レシピエントは、好ましくは、ヒト抗体の存在が検出された後に、免疫原を用いて免疫される。免疫に応答してヒト抗体を産生する細胞が、次いで収集される。
【０００６】
ヒト抗体を産生する細胞を収集する工程は、以前に移植されたヒト組織の少なくとも一部またはヒト細胞が移動したマウス免疫器官をレシピエントから除去することによって達成され得る。次いで、除去されたヒト組織由来のＲＮＡを、従来の技術を使用して単離し得る。一旦、ＲＮＡが単離されると、免疫原と相互作用する１つ以上の抗体を同定するためにスクリーニングされ得る抗体ライブラリーを構築するために使用され得る。あるいは、ヒトＢ細胞を収集し、そしてハイブリドーマパートナーに融合される。
【０００７】
別の局面において、移植されたヒト組織を有する新規な有用なハイブリッドＳＣＩＤマウスが記載される。マウスに移植されるヒト組織は、ヒト抗体を産生するための、少なくとも１つのヒト免疫器官の少なくとも十分な部分を含む。
【０００８】
なお別の局面において、免疫欠損非ヒト哺乳動物レシピエント内に移植されるヒト組織から開発されたヒト細胞由来の抗体ライブラリーが記載される。
【０００９】
なお別の局面において、ヒト免疫系に対する薬物の効果を試験するための方法が記載され、ここで、薬物は、ヒト抗体を産生するための、移植された胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節および胎児肝臓の少なくとも十分な部分を有する非ヒト哺乳動物に投与され、そしてヒト抗体産生に対する薬物の任意の効果が観察される。
【００１０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ヒト抗体は、非ヒト哺乳動物レシピエントに移植されたヒト組織によって産生される。移植された組織は、完全ヒト抗体を産生するための、１つ以上のヒト免疫器官の十分な部分を含む。用語「ヒト免疫器官」は、ヒト抗体の産生に関与する１つ以上の分子を産生する任意の器官由来のヒト組織を含むように意図される。従って、例えば、抗体を実際に産生する細胞型を含むかまたは発生し得る組織は、移植片に含まれる。さらに、抗体産生細胞に対する抗原の認識、破壊または提示に関与する組織はまた、移植組織に含まれ得る。「ヒト免疫器官」のカテゴリーに入る適切な組織型としては、胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節および肝臓の組織型が挙げられる。他の適切な型の組織は、当業者に容易に明らかである。
【００１１】
移植される組織は、好ましくは、組織または器官の性質に依存して、胎児供給源（少なくとも４ヶ月の胎齢、より通常は、１８〜２４週の範囲を有し、新生児組織までの範囲を有する）から得られる。単一のドナー由来の組織が好ましい。成体組織の代わりに胎児組織を使用することが好ましい。なぜなら、これは、レシピエント内で直接免疫系の発生を可能にするからである。胎児細胞が発生するので、これらは、レシピエントに対してネイティブなタンパク質に暴露され、そして免疫器官が、レシピエント内の環境に対して寛容になる。
【００１２】
特に有用な実施形態において、胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節および胎児肝臓は、全てレシピエント内に移植されて、抗体産生の全ての局面が提供されることを確実にする。骨、胎児肝臓および胸腺を移植することによって、Ｔ細胞およびＢ細胞の発生が可能になり、それによって、潜在的抗原特異性の幅広いレパートリーを提供する。皮膚の添加は、免疫原注射の部位（以下にさらに詳細に記載される）に、ヒト抗原提示細胞が免疫原を拾い上げる最も高い可能性を提供する。リンパ節は、Ｔ／Ｂ細胞相互作用に重要であり得、脾臓が、ディスプレーライブラリーを構築するためのＢ細胞の潜在的供給源である。
【００１３】
レシピエントに移植される組織の量は、抗体を産生するのに十分な量であるべきである。移植される組織の量は、１ｍｍ３ほどの小さな各型の組織であり得る。他方、１００ｍｍ３以上の移植片は、選択された特定のレシピエントに依存して、使用され得る。
【００１４】
組織は、新鮮な組織であり得、死の約４８時間以内に得られ得るか、または組織の生存力を維持する様式で凍結保存され得る。
【００１５】
レシピエントは、ヒト組織が移植され得、そして生存可能なままであり得る動物の任意の型であり得る。遺伝的に免疫無防備状態のマウスは、特に好ましいレシピエント（特に、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス）である。
【００１６】
可能である場合、ヒト組織が移植される前に、レシピエントを照射することが好ましい。当業者が理解するように、レシピエントの照射は、レシピエントのネイティブな免疫機能を排除する。照射の特定のパラメーターは、レシピエントの特定の型（特に、レシピエントの容積）に依存する。もちろん、照射の条件は、レシピエントを殺傷するほど十分に厳しくないことが理解されるべきである。種々の型のレシピエントに対する照射条件は、当業者に公知である。一般的に、免疫機能の喪失をもたらすのに必要な最も低い線量の照射が適用されるべきである。低く開始して、漸進的により高い線量の照射を適用することによって、有効線量の照射が、過度な実験無しで決定され得る。ＳＣＩＤマウスは、１００〜２０００ＲＡＤの範囲の量で、γ線を照射され得る。
【００１７】
移植は、レシピエントの皮膚に切開を単純に作製し、そしてレシピエントの皮膚の下にヒト組織を配置することによって達成され得る。所望である場合、移植される組織は、例えば、縫合糸またはステープルによって、レシピエントの身体内の所望の位置に固定され得る。ヒト組織が移植される位置は、重要ではない。移植片のための位置を選択することにおける考慮には、移植組織が脈管新生する可能性、移植の容易さおよび移植された組織の回収の容易さが挙げられる。好ましくは、移植部位は、高度に脈管新生された位置である。移植の部位は、以下に記載されるような抗原の導入のための血液またはリンパ系の便利な部位から下流であり得る。特に有用な実施形態において、初代リンパ器官（例えば、骨、肝臓および胸腺）は、２次リンパ器官（例えば、脾臓、リンパ節および皮膚）から遠位の位置に移植される。一旦、組織が配置され、そして／またはレシピエント内に固定されると、レシピエントの皮膚の切開は、（例えば、縫合、ステープリングまたは接着によって）閉じられ得る。ヒト皮膚がレシピエントの皮膚の下に配置され得るが、レシピエントの皮膚の一部を除去し、そしてヒト皮膚移植片に直接通る免疫原の注射を可能にするためにヒト皮膚の表面移植片を提供することが好ましい。必要に応じて、臍帯血の単核画分を、移植のときまたはおよそ移植のときに、レシピエントの血流に注射し得る。
【００１８】
移植片の配置のときまたは移植片の配置の後に、移植片の周りの隣接する環境は、必要に応じて、リンパ球発生および抗体産生を増強するために処理される。適切な処理としては、脈管新生および細胞増殖、細胞の分化ならびに／あるいは抗体の産生を増強することが公知の成分を含む組成物の適用が挙げられる。適切な組成物としては、増殖因子（例えば、幹細胞因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、ＩＬ−３、ＩＬ−６、顆粒球コロニー刺激因子およびエリスロポイエチン）を含むゲル化剤（例えば、メチルセルロースまたは寒天）が挙げられる。この目的のために使用され得る市販の製品としては、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａから入手可能なＭＥＴＨＯＣＵＬＴ（登録商標）ＧＦ  Ｈ４４３５が挙げられる。ＭＥＴＨＯＣＵＬＴ（登録商標）製品に関する詳細は、以下の文献に開示される：Ｃｏｎｎｅａｌｌｙ  Ｅ，Ｂａｒｄｙ  Ｐ，Ｅａｖｅｓ  ＣＪ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｔ，Ｃｈａｐｐｅｌ  Ｓ，Ｓｈｐａｌｌ  ＥＪ，Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ＲＫ：Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｓ  ａｎ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｂｌｏｏｄ  ８７：４５６，１９９６；Ｅａｖｅｓ  ＣＪ：Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，５（Ｅ  Ｂｅｕｔｌｅｒ，ＭＡ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＢＳ  Ｃｏｌｌｅｒ，ＴＪ  Ｋｉｐｐｓ編），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，ｐｐ  Ｌ２２−６，１９９５；Ｅａｖｅｓ  Ｃ，Ｌａｍｂｉｅ  Ｋ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｏｌｏｎｉｅｓ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，１９９５；Ｅａｖｅｓ  ＡＣ，Ｅａｖｅｓ  ＣＪ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４：１５９，１９９２；Ｈｅｌｇａｓｏｎ  ＣＤ，Ｓａｕｖａｇｅａｕ  Ｇ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＨＪ，Ｌａｒｇｍａｎ  Ｃ，Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ＲＫ：Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＯＸＢ４  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｌｏｏｄ  ８７：２７４０，１９９６；Ｈｏｇｇｅ  ＤＥ，Ｌａｎｓｄｏｒｐ  ＰＭ，Ｒｅｉｄ  Ｄ，Ｇｅｒｈａｒｄ  Ｂ，Ｅａｖｅｓ  ＣＪ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｈｕｍａｎ  Ｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ  ８８：３７６５，１９９６；Ｈｏｕｇｈ  ＭＲ，Ｃｈａｐｐｅｌ  ＭＳ，Ｓａｕｖａｇｅａｕ  Ｇ，Ｔａｋｅｉ  Ｆ，Ｋａｙ  Ｒ，Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ＲＫ：Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５６：４７９，  １９９６；Ｌｅｍｉｅｕｘ  ＭＥ，Ｒｅｂｅｌ  ＶＩ，Ｌａｎｓｄｏｒｐ  ＰＭ，Ｅａｖｅｓ  ＣＪ；Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏ−ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  Ｍａｒｒｏｗ  ”ｓｗｉｔｃｈ”  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８６：１３３９，１９９５；Ｍａｙａｎｉ  Ｈ，Ｄｒａｇｏｗｓｋａ  Ｗ，Ｌａｎｓｄｏｒｐ  ＰＭ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８１：３２５２，１９９３；Ｐｅｔｚｅｒ  ＡＬ，Ｈｏｇｇｅ  ＤＥ，Ｌａｎｓｄｏｒｐ  ＰＭ，Ｒｅｉｄ  ＤＳ，Ｅａｖｅｓ  ＣＪ：Ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１４７０，１９９６。これらの参考文献の各々の開示は、本明細書において参考として援用される。
【００１９】
移植されるヒト組織に適用され得る別の有用な組成物は、細胞増殖を支持し得る組成物である。このカテゴリーの適切な組成物としては、生物学的に活性な重合可能抽出物（ラミニン、コラーゲンＩＶ、ニドゲン（ｎｉｄｏｇｅｎ）、ヘパランスルフェートプロテオグリカンおよびエンタクチンを含む）を含む、基底膜由来組成物が挙げられる。用語「生物学的に活性」とは、この基底膜由来組成物とともに使用される場合、培養される場合に種々の細胞型（上皮細胞を含む）の正常な増殖および分化を支持し得ることを意味する。１つのこのような組成物は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡから入手可能な商品名ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘで市販される。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）製品に関する詳細は、米国特許第４，８２９，０００号に開示され、この開示は、本明細書中において参考として援用される。このような材料の組み合わせは、有利に使用され得る。
【００２０】
組成物は、移植の部位への注射によって、移植のときにおよび／または移植に続いて、移植される器官の位置に直接適用され得る。適用される組成物の量は、重要ではなく、移植されるヒト組織の型および量、使用される特定の組成物、特定のレシピエント、および移植片の位置のような因子に依存する。代表的には、約１００μｌ〜５００μｌの組成物が、移植のときに適用される。特に有用な実施形態において、組成物は、以下にさらに詳細に考察されるように、免疫まで、７日と１０日との間の間隔で、移植後に再適用される。
【００２１】
移植が達成された後、レシピエントは、ヒト抗体が産生されているか否かを確認するためにモニターされる。ヒト抗体の検出のための技術は、当業者の範囲内である。動物の血清におけるヒト抗体の存在を検出するためのキット（例えば、Ｅａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ（登録商標）ヒトＩｇＧアッセイキット）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から市販される。通常、ヒト抗体が検出されるときまで、移植された組織は、生存可能なままであり、脈管新生され、そしてこの移植された組織に接続されたリンパ管を有することが考えられる。一般的に、少なくとも１週間は、発散（ｔｒａｎｓｐｉｒｅ）するが、次の工程（免疫）が実施される前に、２〜２０週間以上の間のいずれかが経過し得る。
【００２２】
一旦、ヒト抗体がレシピエントに存在することが検出されると、レシピエントは、１つ以上の抗原で免疫される。適切な免疫原は、ハプテンおよび抗原の両方を含み、ここで、ハプテンは、免疫応答を提供するために改変される。目的の化合物としては、合成有機低分子（一般的に、約５ｋＤ（キロドルトン）未満、通常、約２ｋＤ未満）、ポリペプチドおよびタンパク質、脂質、糖類、およびこれらの組み合わせが挙げられ得る。化合物は、合成または天然に存在し得、薬物、ホルモン、サイトカイン、表面膜タンパク質、酵素、糖側鎖基、毒素などが挙げられる。細胞または腫瘍組織はまた、免疫原として使用され得る。免疫原は、幅広い種々のアジュバント（例えば、アリム（ａｌｉｍ）、ＲＩＢＩ、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、完全フロイントアジュバント、スペコル（ｓｐｅｃｏｌ）、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはその毒素など）と組み合わされ得る。
【００２３】
代替の実施形態において、免疫化組成物は、樹状細胞を増殖させるために、臍帯血の単核画分を培養することによって調製される。次いで、樹状細胞は、免疫原を用いて刺激される。次いで、得られた組成物をレシピエントに注射されて、免疫を達成する。
【００２４】
免疫原は、移植片のレシピエントに全身的に投与され得るか、または移植の部位に局所的に注射され得る。投与は、好ましくは、移植されたヒト組織の部位に直接、通常、皮下的、筋肉内的、腹腔内的または静脈内的な注射のいずれかによってである。特に有用な実施形態において、レシピエントは、ヒト皮膚移植片を受容し、そして免疫原は、移植された皮膚またはその隣接部に注射される。どれだけ多くの免疫原が投与されるかを決定するための考察は、免疫原の性質、レシピエントへ移植された組織の量、ならびに求められる免疫応答の所望の程度および速さが挙げられる。１回以上のブースター注射は、通常、先の注射の１〜６週以内、より通常には、２〜４週以内で作製され得る。ブースター注射は、先の注射と同じ組成物または異なる組成物を有し得る。免疫はまた、当業者に周知のＲＩＭＭＳ技術によって達成され得る。
【００２５】
次いで、レシピエントは、免疫原特異的応答が開始されたか否かを確認するためにモニターされる。任意の所定の免疫原に特異的な抗体の検出のための技術は、当業者の範囲内である。動物の血清におけるヒト免疫原特異的抗体の存在を検出する１つの適切な方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２．１（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，２０００編）に開示され、この開示は、本明細書中において参考として援用される。
【００２６】
一旦、免疫原特異的免疫応答が検出されると、移植された組織の少なくとも一部は、レシピエントから除去される。ヒト細胞が移動し得るマウス組織はまた、収集される細胞を産生する抗体の量を最大にするために抽出され得る。組織由来の細胞または遺伝材料は、所望のように、不死化され得るかおよび／またはクローン化され得る。従って、例えば、除去された組織由来のＲＮＡは、当業者に周知の技術を使用して単離される。回収されたＲＮＡは、１つ以上の抗体ライブラリーを作製するために使用され、そしてライブラリーは、抗原またはその成分に結合する抗体を同定するためにスクリーニングされる。好まし実施形態において、ライブラリーは、抗原に対するアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果のいずれかを有する抗体を同定するためにスクリーニングされる。抗体ライブラリーを作製およびスクリーニングするための技術は、当業者に周知である。例えば、Ｌｅｒｎｅｒらに対する米国特許第６，２９１，１６１号および係属中の米国仮出願番号６０／３２３，４５５および６０／３２３，４００（これらの開示は、その全体が、本明細書中で、参考として援用される）を参照のこと。
【００２７】
別の例として、抗体産生細胞は、選択され得、そして非抗体産生細胞（例えば、不死化細胞株）と融合され得る。これらの融合パートナーは、代表的に、形質転換されたヒト細胞（例えば、ヒトミエローマ細胞）である。１つの適切なヒトミエローマ細胞株は、Ｋａｒｐａｓら、ＰＮＡＳ、ｖｏｌ．９４、ｎｏ．４、１７９９−１８０４頁、２００１によって開示される。融合後、融合された細胞は、個々の培養物に分離され、そして増殖され、免疫特異的モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ株が選択される。これらの細胞株は、当業者に周知の技術を使用して、培養物で維持され得るか、または凍結保存され得る。
【００２８】
次いで、ハイブリドーマは、宿主動物（例えば、マウスまたはラット）に導入されて、スピナーフラスコ、ローラーボトルなどを使用して、腹水液を産生し得るかまたは機械的に増殖され得る。宿主は、新生物形成移植片を受容し得るように、免疫無防備状態である。得られる抗体は、種々の方法（診断および治療の両方）で使用され得る。
【００２９】
しかし、通常より容易に得られる他の抗体（例えば、非ヒト抗体）がインビトロ診断において使用され得るので、大部分について、被験体の抗体は、ヒトにおいてインビボ診断および治療使用に使用される。従って、被験体抗体は、移植などと組み合わせて、疾患の処置、ウイルスまたは他の病原体の中和、インビボ診断、新生物細胞またはこのような細胞に対する前駆体に対する標的化された毒性、受動免疫に使用され得る。被験体抗体は、放射標識、他の化合物（例えば、ビオチン、アビジン、酵素、細胞傷害剤（例えば、リシン、ジフテリア毒素、アルビン（ａｒｂｉｎ）など）などに対する結合によって改変され得る。
【００３０】
ヒト抗体の産生のための本発明の方法を使用することに加えて、移植されたヒト免疫器官の非ヒトレシピエントは、ヒト免疫系に対する薬物の効果を試験するための方法で使用され得る。これらの方法において、薬物は、ヒト抗体を産生するために、移植された胸腺、脾臓、骨髄、皮膚、リンパ節およびウシ肝臓の少なくとも十分な部分を有する非ヒト哺乳動物に投与される。ある期間の後に、ヒト抗体産生に対する薬物の任意の効果が観察される。ヒト免疫系に対する薬物の効果を決定するための技術は、当業者に公知であり、そして当業者の範囲内である。
【００３１】
以下の非限定的な実施例は、本明細書中に記載される方法の１つの実施形態を説明するために提供される。
【００３２】
（実施例）
ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスを２５０ＲＡＤで照射して、任意の残りの免疫機能を完全に除去した。妊娠の１８〜２４週由来の胎児組織を得、そして肝臓、脾臓および胸腺皮質（ｔｈｙｍｕｓ  ｃｏｒｔｅｘ）および胸腺骨髄（ｔｈｙｍｕｓ  ｍｅｄｕｌｌａ）の小片を調製した。また、骨は、大腿および脛骨の両側において、端部で、約０．５ｃｍを切り取ることによって処理された。パイエル板由来のリンパ節を収集し、そして約１ｃｍ２の皮膚片を調製した。１つの切開を上記各脚に作製し、そして骨、肝臓および胸腺の切片を、皮膚の下に配置した。リコール（新たな免疫応答ではない）を生じる最初の実験の後、系を、メトカルトを移植された器官を含む領域に注射することによって改善されて、免疫細胞移植のための適切なサイトカイン環境を提供した。皮膚の１ｃｍ２パッチを、マウスの背から除去し、そしてヒト皮膚を欠損に移植した。切開をヒト皮膚移植片に隣接して作製され、リンパ節および脾臓組織をレシピエントの皮膚の下に配置した。リコール（新たな免疫応答ではない）を生じる最初の実験の後、系を、２００μｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を注射することによって改善し、移植された脾臓領域に注射して、増強された血管形成を提供した。
【００３３】
移植の１ヶ月後、２ヶ月後または３ヶ月後に、血液、骨髄および脾臓において、ヒトＴ細胞、Ｂ細胞および樹状細胞の存在を、ＦＡＣＳ分析によって確認した。血清を複数の時点で収集し、そしてヒト免疫グロブリン力価を決定した。２７匹の移植されたマウスのうちの２５匹が、１ヶ月以内に少なくとも２５００ｎｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ力価を生じた。一旦、ヒトＩｇＧがマウス血清において検出されると、免疫原での免疫を開始した。最初に、マウスは、移植された皮膚に隣接して、皮下的に、完全フロイントアジュバント中の１０μｇのＢ型肝炎表面抗原または破傷風トキソイドを受容した。完全フロイントアジュバント中の１０μｇ抗原を使用して、３週間後および６週間後に免疫を繰り返した。いくらかのマウスを、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを使用して免疫した。１００μｇのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよび１０μｇの抗原を、１〜３週間の間隔で、皮下的に注射した。破傷風トキソイドまたはＢ型肝炎表面抗原に特異的な血清ＩｇＧ力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。破傷風トキソイドに対する弱い応答が観察されたが、Ｂ型肝炎表面抗原に対する応答は、観察されなかった。系を改善し、そしてリコール応答だけでなく、新たな免疫応答を可能にするために、マトリゲルおよびメトカルトを、上記のように導入した。この改善とともに、Ｂ型肝炎で免疫された３匹のマウスうちの２匹および破傷風トキソイドで免疫した７匹のマウスのうちの６匹は、第３の免疫後にそれぞれの抗原に対して特異的なヒト抗体を示した。また、５匹のマウスのうちの３匹は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃでの免疫後、実質的な力価（１：５０００まで）を有する抗ＩｇＥ応答を生じた。ＬＦで免疫された４匹のマウスのうちの２匹は、その抗原に対する中程度の応答を示した。
【００３４】
マウスをもう一回免疫し、そして免疫器官を抽出してＲＮＡを単離する。ＲＮＡを、収集した免疫器官から単離し、そして抗体ライブラリーを作製する。マウスが免疫された免疫原を使用してライブラリーをパニング（ｐａｎｎｅｄ）した。従って、免疫原に結合するかまたはそれ以外で相互作用する完全ヒト抗体を同定する。
【００３５】
上記は、本発明に従う方法の多くの特定の詳細を含むが、これらの特定の詳細は、本発明の範囲に対する制限として解釈されるべきではなく、単にその好ましい実施形態の例示である。当業者は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲および精神の中にある全ての多くの他の可能な改変を把握する。
【国際調査報告】
2005517401.tif 000002
2005517401.tif 000003