(57)【要約】本発明は、免疫療法応用における免疫賦活剤としてのオリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。さらには、本発明は、免疫反応を惹起する方法、あるいは、免疫賦活を必要とする患者を治療する方法に使用するイムノマー（immunomer）を提供する。本発明におけるイムノマーは、その３’末端、インターヌクレオシド結合、あるいは機能化された核酸塩基または糖に、非ヌクレオチドリンカーが結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、少なくともそのオリゴヌクレオチドのうちの１つは免疫賦活性オリゴヌクレオチドであってアクセス可能な５’末端を持つものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その３’末端、インターヌクレオシド結合、あるいは機能化された核酸塩基または糖において、非ヌクレオチドリンカーに結合した２つのオリゴヌクレオチドを含むイムノマー(immunomer)であって、前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、アクセス可能な５’末端を有し、かつ、免疫賦活性ジヌクレオチドを含む免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、前記イムノマー。
【請求項２】
免疫賦活性ジヌクレオチドが、CpG, C*pG, CpG*およびC*pG*からなる群より選択され、ここで、Cはシチジンまたは 2'-デオキシシチジンであり、C*は 2'-デオキシチミジン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、 2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Gはグアノシンまたは2'-デオキシグアノシンであり、G*は2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン, 2'-O-置換-アラビノグアノシン、または他の非天然プリンヌクレオシドであり、かつpはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群より選択されるインターヌクレオシド結合であり、ある好ましい態様において、免疫賦活性ジヌクレオチドは CpGではない、請求項１に記載のイムノマー。。
【請求項３】
構造            
5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3'     (III)
式中:
Yはシチジン、2'-デオキシシチジン、アラビノシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり; 
Zはグアノシンまたは2'-デオキシグアノシン、G*は2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、 2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
N1は、各場合において、好ましくは天然に存在するまたは合成のヌクレオシド、あるいは、無塩基（abasic）ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、および、ホスホジエステルまたは３’側に隣接するヌクレオシドへの修飾されたインターヌクレオシド結合により結合したヌクレオシドからなる群より選択される免疫賦活性部分であって、前記修飾されたインターヌクレオシド結合は、長さが約2オングストロームから約200オングストロームまでの長さを有するリンカー、C2-C18アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、2-アミノブチル-1, 3-プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、2'-5'インターヌクレオシド結合、および、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネートインターヌクレオシド結合から無制限に選択される;
で表される、構造を有する請求項１に記載のイムノマー。
【請求項４】
免疫賦活性部分が、無塩基（abasic）ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、および、３’側に隣接するヌクレオシドへの修飾されたインターヌクレオシド結合により結合したヌクレオシドからなる群より選択され、前記修飾されたインターヌクレオシド結合は、C2-C18アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、2-アミノブチル-1, 3-プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、2'-5'インターヌクレオシド結合、メチルホスホネートインターヌクレオシド結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、N-メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデート、特に一級アミノホスホルアミデート、N3ホスホルアミデートおよびN5ホスホルアミデートおよび立体特異的結合からなる群より選択され、ヌクレオシドは、制限されることなく、2'-O-メチルリボース、2'-O-メトキシエチルリボース、2'-O-プロパルギルリボース、および2'-デオキシ-2'-フルオロリボースを含む、2'-置換五単糖；3'-O-メチルリボースを含む3'-置換五単糖；1',2'-デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ-アノマーの糖修飾を有するヌクレオシド、ペプチド核酸(PNA)、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（PHONA）、ロックド核酸(LNA)、モルホリノ核酸、および、約２から約２００オングストロームの長さ、アルキルリンカーまたはアミノリンカーを有する骨格リンカー部分を有するオリゴヌクレオチド、DNAアイソフォーム、β-L-デオキシリボヌクレオシド、α-デオキシリボヌクレオシド、非天然インターヌクレオシド結合位置を有するヌクレオシド、および修飾された複素環塩基を有するヌクレオシドを含む、請求項２に記載のイムノマー。
【請求項５】
Nnは、各場合において、天然に存在するヌクレオシド、あるいは、無塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、2'-O-置換または2'-置換リボヌクレオシド、および修飾されたインターヌクレオシド結合によって３’側に隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシドからなる群より選択される免疫賦活性部分であって、前記修飾されたインターヌクレオシド結合は、アミノリンカー、2'-5'インターヌクレオシド結合、およびメチルホスホネートインターヌクレオシド結合からなる群より選択され；
少なくとも１つのN1またはNnは免疫賦活性部分であって、5'N1は塩基を含み；
nは0-30の数であり；
3'末端、インターヌクレオシド結合、あるいは、機能化された核酸塩基または糖が、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して、もう一つのオリゴヌクレオチドに結合している、
請求項２に記載の免疫賦活性オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
構造
【化１】
2005518402.tif 000030
を有する請求項２に記載のイムノマー。
【請求項７】
イムノマーが、遺伝子に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項８】
イムノマーが、少なくとも１つのリボザイムまたはおとりオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項９】
イムノマーが、G4テトラヌクレオチドを含む少なくとも１つのNn部分を含む、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項１０】
天然に存在しないピリミジンが、構造(I)
【化２】
2005518402.tif 000031
式中:
Dは水素結合ドナーであり；
D'は水素、水素結合ドナー、水素結合アクセプター、親水基、疎水基、電子吸引基、臭素を除く電子供与基よりなる群より選択され；Aは 水素結合アクセプターまたは親水基であり；
Aは 水素結合アクセプターまたは親水基であり；
A'は 水素結合アクセプター、親水基、疎水基、電子吸引基および電子供与基よりなる群より選択され；
Xは炭素または窒素であり；かつ
S'は五単糖または六単糖環、あるいは、天然に存在しない糖である、
で表される構造を有する、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項１１】
糖環が、ホスフェート部分、修飾されたホスフェート部分、あるいは、ピリミジンヌクレオシドが他のヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに結合するのに適した他の非ヌクレオチドリンカー部分で誘導体化されている、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１２】
水素結合ドナーが、-NH-、-NH2、-SHおよび-OHからなる群より選択される、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１３】
水素結合アクセプターが、C=O、C=Sおよび芳香族複素環の環窒素原子からなる群より選択される、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１４】
天然に存在しないピリミジン塩基が、5-ヒドロキシシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、N4-アルキルシトシン、N4-エチルシトシンおよび4-チオウラシルからなる群より選択される、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１５】
天然に存在しない糖が、アラビノースおよびアラビノースアナログから選択される、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１６】
プリンヌクレオシドが構造（II)：
【化３】
2005518402.tif 000032
式中：
Dは水素結合ドナーであり；
D'は水素、水素結合ドナー、および親水基よりなる群から選択され；
Aは 水素結合アクセプターまたは親水基であり；
Xは炭素または窒素であり；
各Lは独立にC、O、NおよびSからなる群より選択され；
かつ
S'は五単糖または六単糖環、あるいは、天然に存在しない糖である、
で表される構造を有する、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１７】
糖環が、ホスフェート部分、修飾されたホスフェート部分、あるいは、ピリミジンヌクレオシドが他のヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに結合するのに適した他のリンカー部分で誘導体化されている、請求項１３に記載のイムノマー。
【請求項１８】
水素結合ドナーが、-NH-、-NH2、-SHおよび-OHからなる群より選択される、請求項１３に記載のイムノマー。
【請求項１９】
水素結合アクセプターが、C=O、C=S、-N=および芳香族複素環の環窒素原子からなる群より選択される、請求項１３に記載のイムノマー。
【請求項２０】
天然に存在しないプリンが、6-チオグアニンまた7-デアザグアニンである、請求項１３に記載のイムノマー。
【請求項２１】
非ヌクレオチドリンカーが、長さが約２オングストロームから約２００オングストロームまでのリンカー、金属、可溶性または不溶性の生物分解性ポリマービーズ、オリゴヌクレオチドの3'末端への結合を許容する官能基を有する有機部分、生体分子、環状または非環状の小分子、いずれも任意に直鎖中でオリゴヌクレオチドに結合するかまたはリンカーに付加されていることができる脂肪族または芳香族炭化水素、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレアおよびチオウレアよりなる群より選択される1または2以上の官能基、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテン、抗生物質、o およびp は独立に1から 約6までの整数で表される式HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH のグリセロールまたはグリセロールホモログ、および、1, 3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項２２】
インターヌクレオシド結合が本質的にホスホジエステル結合よりなる、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項２３】
請求項１に記載のイムノマーおよびアクセス可能な5'末端以外の位置でイムノマーに結合した抗原を含む、イムノマー複合体。
【請求項２４】
C*G*が、アラビノシトシンまたは2'-デオキシ-2'-置換アラビノシトシン、および、アラビノグアノシンまたは2'-デオキシ- 2'-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシ-7-デアザグアノシンまたは2'-デオキシ-6-チオグアノシン、あるいは2'-デオキシイノシンである、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項２５】
請求項１に記載のイムノマーおよび生理的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
【請求項２６】
脊椎動物において免疫反応を惹起する方法であって、請求項１に記載のイムノマーを脊椎動物へ投与することを含む前記方法。
【請求項２７】
脊椎動物において免疫反応を惹起する方法であって、請求項１９に記載のイムノマー複合体を脊椎動物へ投与することを含む前記方法。
【請求項２８】
病気または疾患を有する患者を治療上処置するための方法であって、請求項１に記載のイムノマーを患者に投与することを含む前記方法。
【請求項２９】
治療される病気または疾患が、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息、または病原体によって引き起こされる病気である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
病気または疾患を有する患者を治療上処置するための方法であって、請求項２０に記載のイムノマー複合体を患者に投与することを含む前記方法。
【請求項３１】
病気または疾患を有する患者を治療上処置するための方法であって、請求項１９に記載のイムノマーを患者に投与することを含む前記方法。
【請求項３２】
治療される病気または疾患が、癌、自己免疫疾患、気道炎症、アレルギー、喘息、または病原体によって引き起こされる病気である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
治療される病気または疾患が、癌、自己免疫疾患、気道炎症、アレルギー、喘息、または病原体によって引き起こされる病気である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
ワクチンを投与することをさらに含む、請求項２５の方法。
【請求項３５】
イムノマーまたはワクチン、あるいはその両者が免疫原性タンパクと結合している、請求項３１の方法。
【請求項３６】
アジュバントを投与することをさらに含む、請求項２５の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は免疫学および免疫賦活剤としてのオリゴヌクレオチドを用いた免疫療法応用に関する。
【０００２】
関連技術の要約
オリゴヌクレオチドは現代の分子生物学において不可欠な手段となっており、PCRを用いるプローブ方法による診断から遺伝子発現のアンチセンス阻害および免疫療法応用まで広範囲の技術において利用されている。オリゴヌクレオチドのこの幅広い用途は、早く安価で効率的なオリゴヌクレオチドの合成方法に対する要求を増すに至っている。
【０００３】
アンチセンスや診断応用のためのオリゴヌクレオチドの合成は現在では日常的になされている。例えば、Methods in Molecular Bioloy, Vol. 20 : Prolocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189 (S.Agrawal, ed. , Humana Press,1993) ; Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, ed., 1991) ; Uhlmann and Peyman, supra ;Agrawal andlyer, Curr. Op. in Biotech. 6 : 12 (1995); Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, eds. , CRC Press, Boca Raton, 1993)などに記載されている。
【０００４】
早期の合成アプローチはホスホジエステルおよびホスホトリエステル化学を含むものであった。例えば、Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972) はオリゴヌクレオチド合成のためのホスホジエステル化学を開示している。Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179(1978)はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド合成のためのホスホトリエステル化学を開示している。これら早期のアプローチはより効率的なホスホルアミダイトおよびH-ホスホネートの合成に大きく移行してきた。例えば、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22 : 1859-1862 (1981)はポリヌクレオチド合成におけるデオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイトの使用を開示する。Agrawal and Zamecnik, U. S. Patent No. 5,149, 798  (1992) はH-ホスホネートアプローチによる最適化されたオリゴヌクレオチド合成を開示する。
【０００５】
これら現代的アプローチはいずれも種々の修飾されたインターヌクレオチド結合を持つオリゴヌクレオチドの合成に用いられてきた。Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドメチルホスホネート合成を示している。Connolly etal., Biochem. 23: 3443 (1984)は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成を開示する。Jager et al., Biochem. 27: 7237  (1988)は、ホスホルアミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホルアミデートの合成を開示する。Agrawal etal., Proc.Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7079- 7083(1988) はH-ホスホネート化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホルアミデート及びホスホロチオエートの合成を開示する。
【０００６】
さらに最近では、何人もの研究者が免疫治療応用における免疫賦活剤としてのオリゴヌクレオチドの使用の有効性を明らかにしている。ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが免疫賦活を引き起こし得るという知見は、この副次的作用を治療手段として開発することへの関心を生み出している。これらの試みは、ジヌクレオチドである天然のCpGを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに焦点を当てている。
【０００７】
Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992) は、CpGジヌクレオチドの入ったパリンドロームを含むホスホジエステルオリゴヌクレオチドがインターフェロン−アルファおよびガンマの合成を惹起し、ナチュラルキラー活性を増強し得ることを示している。 Krieg etal., Nature 371: 546-549 (1995)はホスホロチオエート CpGを含むオリゴヌクレオチドが免疫賦活性を有することが開示されている。Liang et al., J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996) はそのようなオリゴヌクレオチドがヒトB細胞を活性化することを開示している。 Moldoveanu et al., Vaccine 16 : 1216-124 (1998) はCpGを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがインフルエンザウイルスに対する免疫反応を増強することを示している。 McCluskie and Davis, J. Immunol. 161:4463-4466 (1998) はCpGを含むオリゴヌクレオチドが強力なアジュバントとして作用し、B型肝炎の表面抗原に対する免疫反応を増強することを示している。
【０００８】
CpGを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに他の修飾をすると、免疫反応の修飾因子として作用する性能に影響を及ぼしうる。例えば、Zhao etal., Biochem. Pharmacol. (1996) 51: 173-182; Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52: 1537-1544 ; Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7: 495- 502; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9 : 3453-3458 ; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10 : 1051-1054 ; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Letl. (2000) 10: 2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med Chem. Lett. (2001) 11: 2263-2267; Kandimalla et al., Bioorg. Med Chem. (2001) 9:807-813. などに記載されている。
【０００９】
これらの報告は免疫賦活性オリゴヌクレオチドにより引き起こされる免疫反応を増強しうる必要性が依然としてあることを明らかにしている。
【００１０】
本発明の簡単な要約
本発明は、オリゴヌクレオチド化合物により引き起こされる免疫反応を増強する方法を提供する。本発明による方法は、免疫療法応用のための免疫賦活性オリゴヌクレオチドの免疫賦活効果を増加しうるものである。 本発明者らは、 驚いたことに、免疫賦活性オリゴヌクレオチドの最適に存在する５’末端の修飾がその免疫賦活性を劇的に増強することを発見した。そのようなオリゴヌクレオチドをここでは「イムノマー(immunomer)」と言う。
【００１１】
したがって、１番目の観点においては、本発明は、その３’末端、インターヌクレオシド結合、あるいは機能化された核酸塩基または糖に、非ヌクレオチドリンカーを介して結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、、少なくともそのオリゴヌクレオチドのうちの１つは免疫賦活性オリゴヌクレオチドであってアクセス可能な５’末端を持つものである。
【００１２】
１態様においては、本イムノマーは、式中Pyrは天然または非天然のピリミジンヌクレオシドでありPurは天然または非天然のプリンヌクレオシドである、式5'-Pyr-Pur-3'で表される免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。
【００１３】
他の態様においては、本イムノマーは、式中、 Cはシチジンまたは2'-デオキシシチジンであり、C*は 2'-デオキシチミジン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン, 2'-O-置換アラビノシチジン、 2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジン または他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Gは グアノシンまたは2'-デオキシグアノシンであり、G*は2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、 2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン, 2'-O-置換-アラビノグアノシン、または他の非天然プリンヌクレオシドであり、pはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群より選択されるインターヌクレオシド結合である、で表される、CpG、C*pG、CpG*およびC*pG*からなる群より選択される免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。好ましい態様においては、免疫賦活性ジヌクレオチドはCpGではない。
【００１４】
さらに他の態様としては、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは式(III)：
5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3'        (III)
【００１５】
式中：
Yはシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシシチジン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり; 
【００１６】
Zはグアノシンまたは2'-デオキシグアノシン、G*は2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、 2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
【００１７】
N1は、各場合において、好ましくは天然に存在するまたは合成のヌクレオシド、あるいは、無塩基(abasic)ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、および、ホスホジエステルまたは修飾されたインターヌクレオシド結合によって３’側に隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシドからなる群より選択される免疫賦活性部分であって、前記修飾されたインターヌクレオシド結合は、長さが約2オングストロームから約200オングストロームまでの長さを有するリンカー、C2-C18アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、2-アミノブチル-1, 3-プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、2'-5'インターヌクレオシド結合、および、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネートインターヌクレオシド結合から制限されることなく選択され;
【００１８】
Nnは、 各場合において、天然に存在するヌクレオシド、あるいは、好ましくは無塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、2'-O-置換リボヌクレオシド、および修飾されたインターヌクレオシド結合によって３’側に隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシドからなる群より選択される免疫賦活性部分であって、前記修飾されたインターヌクレオシド結合は、アミノリンカー、2'-5'インターヌクレオシド結合、およびメチルホスホネートインターヌクレオシド結合からなる群より選択され;
少なくとも１つのN1またはNnは免疫賦活性部分であり;
式中、nは0-30の数であり;
【００１９】
式中、前記３’末端、インターヌクレオシド結合、あるいは機能化された核酸塩基または糖は、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して、もう一つの、免疫賦活性を有するまたは有しない、オリゴヌクレオチドに結合している、
で表される、免疫賦活性領域を含む。
【００２０】
2番目の観点においては、本発明は、上記イムノマーと、アクセス可能な5'末端以外の位置でイムノマーと結合した抗原とを含むイムノマー複合体を提供する。
【００２１】
3番目の観点においては、本発明は、イムノマーまたは本発明によるイムノマー複合体と、生理的に許容しうるキャリアーとを含む薬学的製剤を提供する。
【００２２】
4番目の観点においては、本発明は、脊椎動物において免疫反応を惹起するための方法を提供するものであって、前記方法は、脊椎動物へのイムノマーまたは本発明によるイムノマー複合体への投与を含む。態様によっては、脊椎動物は哺乳類である。
【００２３】
5番目の観点においては、本発明は、病気や疾患を罹患している患者を治療上処置するための方法を提供するものであって、前記方法は、本発明によるイムノマーやイムノマー複合体の患者への投与を含む。種々の態様において、治療されるべき前記病気や疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、喘息、アレルギー、あるいは病原体によって引き起こされる病気である。 
【００２４】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は免疫療法応用のための免疫賦活剤としてのオリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。ここで引用され登録された特許、特許出願および参考文献は、それぞれ明確かつ個別に示された場合と同程度に参考のため本明細書に組み込まれる。ここで引用される参考文献の教示と本明細書との間に矛盾がある場合には、本明細書が本発明のために優先する。
【００２５】
本発明は、癌、自己免疫疾患、喘息、呼吸器アレルギー、食物アレルギー、細菌、寄生虫およびウイルスの感染など、これらに限られることなく、成人や小児および動物への適用において、免疫療法応用に用いられる免疫賦活性化合物によって引き起こされる免疫反応を増強するための方法を提供する。従って、本発明はさらに、免疫療法のための最適なレベルの免疫賦活効果を有する化合物、および、そのような化合物を作製しまた使用するための方法を提供する。加えて、本発明のイムノマーは、DNAワクチン、抗体、アレルゲン、化学療法剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせてアジュバントとしても有用である。
【００２６】
本発明者らは、驚くべきことに、免疫賦活性オリゴヌクレオチドの最適に存在する５’末端を修飾することにより劇的にその免疫賦活性に影響することを発見した。そのようなオリゴヌクレオチドをここではイムノマー（immunomer）と言う。
【００２７】
１番目の観点においては、本発明は、その３’末端、インターヌクレオシド結合、あるいは機能化された核酸塩基または糖が、非ヌクレオチドリンカーに結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、少なくともそのオリゴヌクレオチドのうちの１つは免疫賦活性オリゴヌクレオチドであってアクセス可能な５’末端を持つものである。
【００２８】
ここでいう「アクセス可能な5'末端」とは、オリゴヌクレオチドの5'末端が、イムノマーを認識して結合し、免疫系を刺激する因子が近づくことができるように、十分に利用できることを意味する。アクセス可能な5'末端を有するオリゴヌクレオチドにおいては、末端の糖の5'OHの位置は2以上のヌクレオシド残基に共有結合していない。任意には、前記5'OHは、ホスフェート、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート部分、芳香族または脂肪族リンカー、コレステロールあるいはアクセス可能性を阻害しない他の構成要素に結合していてもよい。
【００２９】
本発明において、「イムノマー」とはその３’末端、インターヌクレオシド結合、あるいは機能化された核酸塩基または糖に、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、（イムノマーとの関連においては）少なくともそのオリゴヌクレオチドのうちの１つは免疫賦活性オリゴヌクレオチドであってアクセス可能な５’末端を持つ全ての化合物を言い、前記化合物は脊椎動物に投与した場合には免疫反応を惹起するものである。態様によっては、脊椎動物はヒトを含む哺乳類である。
【００３０】
ある態様においては、イムノマーは2またはそれ以上の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含み、（イムノマーとの関連においては）前記オリゴヌクレオチドは同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、各前記免疫賦活性オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのアクセス可能な5'末端を有する。
【００３１】
ある態様においては、イムノマーは免疫賦活性オリゴヌクレオチドに加えて、遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含む。ここで言う「相補的」とは、オリゴヌクレオチドが生理的条件下で遺伝子のある領域とハイブリダイズすることを意味する。態様によっては、オリゴヌクレオチドは遺伝子の発現を下方制御する。そのような下方制御するオリゴヌクレオチドは好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムオリゴヌクレオチド、抑制性小分子RNAおよびおとりオリゴヌクレオチドからなる群より選択される。ここでいう「遺伝子の下方制御」とは、遺伝子の転写または遺伝子産物の翻訳を阻害することをいう。したがって、本発明のこれらの態様によれば、イムノマーは、免疫系を刺激する一方で、1または2以上の特異的な病気の標的を目標にするのに使うことができる。
【００３２】
ある態様においては、イムノマーはリボザイムまたはおとりオリゴヌクレオチドを含む。ここでいう「リボザイム」とは、触媒活性を有するオリゴヌクレオチドをいう。好ましくは、リボザイムは特異的な核酸を標的として結合し、その標的を切断する。ここでいう「おとりオリゴヌクレオチド」とは配列特異的に転写因子に結合し、転写活性を停止させる。好ましくは、リボザイムまたはおとりオリゴヌクレオチドは、制限なくステムループまたはヘアピン構造を含む2次構造を示す。ある態様においては、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはポリ(I)-ポリ(dC)を含む。ある態様においては、少なくとも1組のNnが3から10のdGおよび/または Gあるいは2'-置換リボ またはアラビノG を含む。
【００３３】
本発明の目的のためには「オリゴヌクレオチド」とは、複数の結合したヌクレオシド単位よりなるポリヌクレオシドをいう。前記オリゴヌクレオチドはゲノムDNAまたはcDNAを含む既存の核酸源から得ることができるが、好ましくは合成法により産生される。好ましい態様においては、各ヌクレオシド単位は複素環塩基および、ペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、2'-デオキシ-2'-置換アラビノース、2'-O-置換アラビノースまたは六単糖類を含む。ヌクレオシド残基は多くの知られたインターヌクレオシド結合によって互いに結合しうる。
【００３４】
前記インターヌクレオシド結合は制限されることなく、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンインターヌクレオシド結合を含む。
【００３５】
「オリゴヌクレオチド」はまた1または2以上の立体特異的インターヌクレオシド結合（例えば、(Rp)-または (Sp)-ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、あるいはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドをも含む。ここでいう「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は特にいずれの前記インターヌクレオシド結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを意味し、前記結合はホスフェート基を含むか含まないかを問わない。ある好ましい態様においては、これらインターヌクレオシド結合はホスホジエステル、ホスホロチオエート、あるいはホスホジチオエート結合、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００３６】
態様によっては、各オリゴヌクレオチドは約3から約35までのヌクレオシド残基を有し、好ましくは約4から約30までのヌクレオシド残基、より好ましくは 約4から約20までのヌクレオシド残基 を有する。態様によっては、オリゴヌクレオチドは約5から約18まで、あるいは、約5から約14までのヌクレオシド残基を有する。ここでいう「約」は正確な数は重要でないことを意味している。したがって、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド残基の数は重要でなく、1または2のより少ないヌクレオシド残基、あるいは、1からいくつかの追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは上記態様のそれぞれが同等であることを意味する。態様によっては、1または2以上のオリゴヌクレオチドは、11ヌクレオシドを有する。
【００３７】
「オリゴヌクレオチド」はまた制限なくタンパク質基、親油性基、インターカレート剤、ジアミン、葉酸、コレステロール、およびアダマンタンを含む付加的置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。「オリゴヌクレオチド」はまたペプチド核酸(PNA)、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（PHONA）、ロックド核酸(LNA)、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチドおよびアルキルリンカーやアミノリンカーをもつ骨格部分を有するオリゴヌクレオチドを含む、ポリマーを包含する他のいかなる核酸塩基をも含む。
【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドは天然に存在するヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはこれらの混合物を含む。ここでいう「修飾ヌクレオシド」とは、修飾複素環塩基、修飾糖部分またはそれらの組み合わせを含むヌクレオシドをいう。いくつかの態様においては、修飾ヌクレオシドとはここで述べたような非天然のピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。いくつかの態様おいては、修飾ヌクレオシドとは2'-置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは2'-デオキシ-2'-フルオロアラビノシドである。
【００３９】
本発明のためには、「2'-置換リボヌクレオシド」は五単糖部分の2'の位置のヒドロキシル基が置換されて2'-O-置換リボヌクレオシドになっているリボヌクレオシドを含む。好ましくは、そのような置換は、1-6個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、あるいは、6-10個の炭素原子を含むアリール基を有し、そのようなアルキルまたはアリール基は置換されなくても、あるいは、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシロキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、またはアミノ基に置換されてもよい。そのような2'-O-置換リボヌクレオシドの例は制限されることなく2'-O-メチルリボヌクレオシドおよび2'-O-メトキシエチルリボヌクレオシド を含む。
【００４０】
「2'-置換リボヌクレオシド」はまた、2'ヒドロキシル基が1-6個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基、または、アミノもしくはハロ基に置換されているリボヌクレオシドを含む。そのような2'-置換リボヌクレオシドの例は制限されることなく2'-アミノ、2'-フルオロ、2'-アリル、および2'-プロパルギルリボヌクレオシド を含む。
【００４１】
「オリゴヌクレオチド 」はハイブリッドまたはキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」とは1種以上のインターヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチドである。そのようなキメラオリゴヌクレオチドの好ましい例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、またはホスホロジチオエート部位およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオネート結合などの非イオン結合を含む。( 例えばPederson etal. U.S. Patent Nos. 5, 635,377 および5, 366, 878などを参照)
【００４２】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」とは、一種類以上のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの好ましい例は、リボヌクレオチド、または2'-置換リボヌクレオチド部位、およびデオキシリボヌクレオチド部位を含む(例えばMetelev and Agrawal, U. S. Patent No. 5,652,355, 6,346,614 および 6,143,881を参照)。
【００４３】
本発明の目的のためには、「免疫賦活性オリゴヌクレオチド」とは、魚類、鳥類、または哺乳類などの脊椎動物に投与した場合に免疫反応を惹起する上記のようなオリゴヌクレオチドをいう。ここでいう「哺乳類」は制限なくラット、マウス、猫、犬、馬、家畜、牛、豚、兎、ヒトを除く霊長類、ヒトなどを含む。有用な免疫賦活性オリゴヌクレオチドはAgrawal et al., WO 98/49288,  November 5,1998 公開; WO01/12804,  February 22,2001 公開; WO01/55370, August2, 2001 公開;PCT/USO1/13682, April 30,2001 出願; およびPCT/USOI/30137, September 26,2001出願に記載されているのを見出すことができる。好ましくは、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートインターヌクレオシド結合を含む。
【００４４】
いくつかの態様おいては、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは Pyrは天然または合成ピリミジンヌクレオシドであり Purは天然または合成プリンヌクレオシドである、式5'-Pyr-Pur-3'で表される免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。ここでいう「ピリミジンヌクレオシド」とは、ヌクレオシドの塩基成分がピリミジン塩基であるヌクレオシドをいう。同様に、「プリンヌクレオシド」とは、ヌクレオシドの塩基成分がプリン塩基であるヌクレオシドをいう。本発明の目的のためには、「合成」ピリミジンまたはプリンヌクレオシドは、天然に存在しないピリミジンまたはプリン塩基、天然に存在しない糖部分、あるいはこれらの組み合わせを含む。
【００４５】
好ましいピリミジンヌクレオシドは本発明によれば、(I)：
【化１】
2005518402.tif 000002
式中：
Dは水素結合ドナーであり；
D'は水素、水素結合ドナー、水素結合アクセプター、親水基、疎水基、電子吸引基、電子供与基よりなる群より選択され；
Aは 水素結合アクセプターまたは親水基であり；
A'は 水素結合アクセプター、親水基、疎水基、電子吸引基、電子供与基よりなる群より選択され；
Xは炭素または窒素であり；
S'は五単糖または六単糖環、あるいは、天然に存在しない糖である、
で表される構造を有する。
【００４６】
好ましくは、前記糖環が、ホスフェート部分、修飾されたホスフェート部分、あるいは、ピリミジンヌクレオシドが他のヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに結合するのに適した他のリンカー部分で誘導体化されている。
【００４７】
好ましい水素結合ドナーは、制限されることなく、-NH-、-NH2、-SHおよび-OHを含む。好ましい水素結合アクセプターは制限されることなく、C=O、C=Sおよび芳香族複素環の環窒素原子を含む。例えば、N3はシトシンである。
【００４８】
いくつかの態様においては、（I)における塩基部分は天然に存在しないピリミジン塩基である。好ましい天然に存在しないピリミジン塩基の例は、制限されることなく、5-ヒドロキシシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、N4-アルキルシトシン、好ましくはN4-エチルシトシンおよび4-チオウラシルを含む。しかし、いくつかの態様においては、5-ブロモシトシンは特別に除かれる。
【００４９】
いくつかの態様においては、（I)における糖部分S'は天然に存在しない糖部分である。本発明のためには、「天然に存在する糖部分」とは、例えばリボースおよび2'-デオキシリボースなど、核酸の一部として存在する糖部分であり、「天然に存在しない糖部分」とは核酸の一部として存在しない糖部分全てであるが例えば六単糖など、オリゴヌクレオチドのための骨格として用いられる。アラビノースおよびアラビノース誘導体は好ましい糖部分の例である。
【００５０】
好ましいプリンヌクレオシドアナログは本発明によれば（II)：
【化２】
2005518402.tif 000003
式中：
Dは水素結合ドナーであり；
D'は水素、水素結合ドナー、水素結合アクセプター、親水基よりなる群より選択され；
Aは 水素結合アクセプターまたは親水基であり；
Xは炭素または窒素であり；
各Lは独立にC、O、NおよびSよりなる群より選択され；
かつ
S'は五単糖または六単糖環、あるいは、天然に存在しない糖である、
で表される構造を有する。
【００５１】
好ましくは、糖環はホスフェート部分、修飾ホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドがもう1つのヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに結合するのに適した他のリンカー部分を用いて誘導体化されている。
【００５２】
好ましい水素結合ドナーは、制限されることなく、-NH-、-NH2、-SHおよび-OHを含む。好ましい水素結合アクセプターは制限されることなく、C=O、C=S、-NO2および芳香族複素環の環窒素原子を含む。例えば、N1はグアニンである。
【００５３】
いくつかの態様においては、（II)における塩基部分は天然に存在しないプリン塩基である。好ましい天然に存在しないプリン塩基の例は、制限されることなく、6-チオグアニンおよび7-デアザグアニンを含む。いくつかの態様においては、（II)における糖部分S'は天然に存在しない構造(I)で上記に述べたような糖部分である。
【００５４】
好ましい態様においては、免疫賦活性ジヌクレオチドは、CpG, C*pG, CpG*およびC*pG*からなる群より選択され、ここで、Cはシチジンまたは 2'-デオキシシチジンであり、C* は 2'-デオキシチミジン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、2'-O-置換アラビノシチジン、 2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジン または他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり、Gはグアノシンまたは2'-デオキシグアノシンであり、G*は2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ-2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然 プリンヌクレオシドであり、pはホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群より選択されるインターヌクレオシド結合である、で表される。ある好ましい態様においては、免疫賦活性ジヌクレオチドは CpGではない。
【００５５】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは免疫賦活性ジヌクレオチド片側または両側に免疫賦活性部分を含んでいてもよい。したがって、いくつかの態様においては、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは構造（III）：
5'-Nn-N I-Y-Z-N I-Nn-3'    （III）
式中:
【００５６】
Yはシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシシチジン、アラビノシチジン、2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジ、2'-O-置換アラビノシチジン、 2'-デオキシ-5-ヒドロキシシチジン、2'-デオキシ-N4-アルキル-シチジン、2'-デオキシ-4-チオウリジンまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドであり; 
Zはグアノシンまたは2'-デオキシグアノシン、G* は2'-デオキシ-7-デアザグアノシン、 2'-デオキシ-6-チオグアノシン、アラビノグアノシン、2'-デオキシ- 2'-置換-アラビノグアノシン、2'-O-置換-アラビノグアノシン、2'-デオキシイノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
【００５７】
N1は、各場合において、好ましくは、天然に存在するまたは合成のヌクレオシド、あるいは、無塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、および、ホスホジエステルまたは修飾されたインターヌクレオシド結合によって３’側に隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシド、からなる群より選択される免疫賦活性部分であって、前記修飾されたインターヌクレオシド結合は、限定されることなく、長さが約2オングストロームから約200オングストロームまでの長さを有するリンカー、C2-C18アルキルリンカー、ポリエチレングリコールリンカー、2-アミノブチル-1, 3-プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、2'-5'インターヌクレオシド結合、および、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネートインターヌクレオシド結合、から選択され;
【００５８】
Nnは、各場合において、好ましくは、天然に存在するヌクレオシド、あるいは、無塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2'-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、2'-O-置換リボヌクレオシド、および修飾されたインターヌクレオシド結合によって３’側に隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシドからなる群より選択される免疫賦活性部分であって、前記修飾されたインターヌクレオシド結合は、アミノリンカー、2'-5'インターヌクレオシド結合、およびメチルホスホネートインターヌクレオシド結合からなる群より選択され;
少なくとも１つのN1またはNnは免疫賦活性部分を有し;
式中、nは0-30の数であり;   かつ
【００５９】
式中、３’末端、インターヌクレオシド結合、あるいは、機能化された核酸塩基または糖は、直接または非ヌクレオチドリンカーを介して、もう一つの、免疫賦活性を有するまたは有しない、オリゴヌクレオチドに結合している、
で表される、免疫賦活性領域を含む。
【００６０】
いくつかの好ましい態様においては、YZはアラビノシチジンまた2'-デオキシ-2'-置換アラビノシチジン、および、アラビノグアノシンまたは2'-デオキシ-2'-置換アラビノグアノシンである。
【００６１】
好ましい免疫賦活性部分は、限定されることなく、メチルホスホネート、メチルホスホノチオネート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、N-メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデート、特に一級アミノホスホルアミデート、N3ホスホルアミデートおよびN5ホスホルアミデート、および立体特異的結合（例えば、(Rp)-または（Sp)-ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、あるいはホスホトリエステル結合）を含むホスフェート骨格における修飾を含む。
【００６２】
好ましい免疫賦活性部分は、本発明によれば、さらに、限定されることなく2'-O-メチルリボース、2'-O-メトキシエチルリボース、2'-O-プロパルギルリボース、および2'-デオキシ-2'-フルオロリボースを含む、2'-置換五単糖；限定されることなく3'-O-メチルリボースを含む3'-置換五単糖；1',2'-デオキシリボース；アラビノース；限定されることなく1'-メチルラビノース、3'-ヒドロキシメチルアラビノース、4'-ヒドロキシメチルアラビノースおよび2'-置換アラビノース糖を含む置換アラビノース糖；限定されることなく1,5-アンヒドロヘキシトールを含む六単糖；およびアルファ-アノマーを限定されることなく含む糖修飾を有するヌクレオシドを包含する。
【００６３】
修飾された糖が3'-デオキシリボヌクレオシドまたは 3'-O-置換リボヌクレオシドである態様おいては、免疫賦活性部分は2'-5'インターヌクレオシド結合を介して隣接するヌクレオシドに結合している。
【００６４】
好ましい免疫賦活性部分は本発明よれば、さらに、ペプチド核酸(PNA)、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（PHONA）、ロックド核酸(LNA)、モルホリノ骨格オリゴヌクレオチドおよび限定されることなくアルキルリンカーまたはアミノリンカーを含む約2オングストロームから約200オングストロームの長さを持つリンカー部分を有するオリゴヌクレオチドを含む、他のカルボヒドレート骨格修飾および置換を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００６５】
アルキルリンカーは分枝していても分枝していなくてもよく、置換されていても置換されていなくてもよく、キラル純粋物でもラセミ混合物でもよい。もっとも好ましくは、そのようなアルキルリンカーは約2から約18までの炭素原子を有する。
【００６６】
いくつかの好ましい態様おいてはそのようなアルキルリンカーは約3から約9までの炭素原子を有する。いくつかのアルキルリンカーは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレアおよびチオエーテルからなる群より選択される1または2以上の官能基を含む。いくつかのそのような官能性を持たせたアルキルリンカーは、式-O-(CH2-CH2-O-)n (n = 1-9)で表されるポリエチレングリコールリンカーである。いくつかの他の官能性を持たせたアルキルリンカーはペプチドあるいはアミノ酸である。
【００６７】
好ましい免疫賦活性部分は本発明によれば、さらに、限定されることなくβ-L-デオキシリボヌクレオシドおよびα-デオキシリボヌクレオシドを含むDNAアイソフォームを包含する。好ましい免疫賦活性部分は本発明によれば、3'修飾を取り入れ、さらに、限定されることなく2'-5'、2'-2'、3'-3'および5'-5'結合を含む、非天然のインターヌクレオシド結合位置を有するヌクレオシドを包含する。
【００６８】
好ましい免疫賦活性部分は本発明によれば、さらに、限定されることなく5-ヒドロキシシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、N4-エチルシトシン、4-チオウラシル、6-チオグアニン、7-デアザグアニン、イノシン、ニトロピロール、C5-プロピニルピリミジン、および、限定されることなく2,6-ジアミノプリンを含むジアミノプリンを包含する修飾された複素環塩基を有するヌクレオシドを含む。
【００６９】
特異的な図によれば、限定されるわけではないが、例えば構造（III)）の免疫賦活性領域においては、N1またはNn位置のメチルホスホネートインターヌクレオシド結合が免疫賦活性部分であり、約2オングストロームから約200オングストロームの長さを持つリンカーであって、X1位置のC2-C18アルキルリンカーが免疫賦活性部分であり、さらにX1位置のβ-L-デオキシリボヌクレオシドが免疫賦活性部分である。
【００７０】
代表的な位置と免疫賦活性部分の構造を表1に示す。特別な位置の免疫賦活性部分としてのリンカーについての言及が、その位置のヌクレオシド残基が、その3'-ヒドロキシル位置において示されたリンカーに置換されて、それによりヌクレオシド残基と3'側の隣接するヌクレオシドの間の修飾されたインターヌクレオシド結合をつくることを意味していることが理解される。
【００７１】
同様に、特別な位置の免疫賦活性部分としての修飾されたインターヌクレオシド結合についての言及が、その位置のヌクレオシド残基が列挙された結合を介して3'側の隣接するヌクレオシドに結合していることを意味する。
【００７２】
【表１】
2005518402.tif 000004
【００７３】
表2は、上流の増強領域を有する免疫賦活性オリゴヌクレオチド中の、代表的な位置と免疫賦活性部分の構造を示す。ここでいう「スペーサー9」とは式-O-(CH2-CH2-O-)n-、式中nが3である、で表されるポリエチレングリコールリンカーをいう。「スペーサー18」とは式-O-(CH2-CH2-O-)n-、式中nが6である、で表されるポリエチレングリコールリンカーをいう。
【００７４】
ここでいう「C2-C18アルキルリンカー」とは式 -O-(CH2)q-O-、式中qは2から18までの整数である、で表されるリンカーである。したがって、「C3リンカー」および「C3アルキルリンカー」は式-O-(CH2)3-O- で表されるリンカーをいう。それぞれ スペーサー9、スペーサー18およびC2-C18アルキルリンカーにおいて、リンカーはホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート結合を介して隣接するヌクレオシドに結合している。
【００７５】
【表２】
2005518402.tif 000005
【００７６】
表3は下流の増強領域を有する免疫賦活性オリゴヌクレオチド中の、代表的な位置と免疫賦活性部分の構造を示す。
【００７７】
【表３】
2005518402.tif 000006
【００７８】
イムノマーは本発明によれば、その３’末端、インターヌクレオシド結合、あるいは機能化された核酸塩基または糖に、非ヌクレオチドリンカーを介して結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。本発明のためには、「非ヌクレオチドリンカー」は共有または非共有結合を介してオリゴヌクレオチドに結合できる部分全てである。好ましくはそのようなリンカーは長さが約2オングストロームから約200オングストロームである。好ましいリンカーのいくつかの例は以下の4組である。非共有結合は、限定されないが、静電相互作用、疎水性相互作用、π-スタッキング(stacking)相互作用および水素結合である。
【００７９】
「非ヌクレオチドリンカー」は、例えば、2つのヌクレオシドの3'-ヒドロキシル基に直接結合する、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエート官能基等の上記のインターヌクレオシド結合を意味しない。本発明の目的のためには、そのような直接の3'-3'結合を「ヌクレオチド結合」と考える。
【００８０】
いくつかの態様においては、非ヌクレオチドリンカーは限定されることなく金粒子を含む金属である。いくつかの他の態様おいては、非ヌクレオチドリンカーは可溶性または不溶性の生物分解性ポリマービーズである。
【００８１】
さらに他の態様おいては、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドへの結合を許容される官能基を有する有機部分である。そのような結合は好ましくは安定な共有結合によるものである。限定されない例として、リンカーは図13に描かれているような、ヌクレオシドのいかなる適切な位置に結合してもよい。いくつかの好ましい態様おいては、リンカーは3'-ヒドロキシルに結合している。そのような態様おいては、好ましくはリンカーは、好ましくはホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、あるいは非ホスフェート結合により3'-ヒドロキシルに結合しているヒドロキシル官能基を含む。
【００８２】
いくつかの態様においては、非ヌクレオチドリンカーは、限定されることなく、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲン、およびオリゴ糖を含む生体分子である。いくつかの態様においては、非ヌクレオチドリンカーは、小分子である。本発明のためには、小分子は1000Daより小さい分子量を有する有機部分である。いくつかの態様においては、小分子は750Daより小さい分子量を有する。
【００８３】
いくつかの態様においては、小分子は、脂肪族あるいは芳香族炭化水素であって、いずれも任意に、オリゴヌクレオチドに結合したあるいはオリゴヌクレオチドに付加された直鎖のいずれかにおいて、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレアおよびチオウレアよりなる群より選択される、1または2以上の官能基を含みうる。小分子は環状、または非環状でありうる。小分子リンカーの例は、限定されないが、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質を含む。しかし、非ヌクレオチドリンカーにおいては、「小分子」はヌクレオシドを含むことを意味しない。
【００８４】
いくつかの態様においては、小分子リンカーは、グリセロールまたはグリセロールホモログ式HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH 式中、o およびp は独立に、1から 約6、1から 約4、または1から 約3までの整数である、で表されるグリセロールまたはグリセロールホモログである。いくつかの態様においては、小分子リンカーは 1, 3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのそのような誘導体は、式中mは 0から 約10、0から 約6、2から 約6または2から 約4までの整数である、化学式HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OHを有する。
【００８５】
いくつかの非ヌクレオチドリンカーは本発明によれば、図1において模式的に描かれているように、2以上のオリゴヌクレオチドの結合を許容する。例えば、小分子リンカーであるグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有結合してもよい3つのヒドロキシル基を有する。それゆえ、いくつかのイムノマーは、本発明によればその3'末端に非ヌクレオチドリンカーが結合した2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかのそのようなイムノマーは、それぞれアクセス可能な5'末端を有する少なくとも2つの免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む。
【００８６】
本発明のイムノマーは便宜的に自動合成装置や、図5および6において模式的に描かれているような、さらには例で述べられているようなホスホルアミダイト法を用いて合成してもよい。いくつかの態様においては、イムノマーは直鎖合成法により合成される（図5参照）。ここでいう「直鎖合成」とは、イムノマーの一方の末端から開始してもう一方の末端へ直線的に進行する合成をいう。直鎖合成は、イムノマーへの（長さ、塩基組成、および／または含まれる化学修飾という点において）同一または同一でないいずれのモノマー単位を取り込むことが許容される。
【００８７】
合成の代替法は、合成が中心のリンカー部分から外側に進む「パラレル合成」である（図6参照）。U. S. Patent No. 5,912,332に述べられているように、リンカーに結合する固体担体はパラレル合成に用いられる。（間隙ガラス担体に結合したホスフェートなど）一般的な固体担体を用いることができる。
【００８８】
イムノマーのパラレル合成は直鎖合成を超えたいくつかの利点がある：(1)パラレル合成では同一のモノマー単位の取り込みが許容される；(2)直鎖合成とちがって、両方（または全て）のモノマー単位が同時に合成されるので、合成ステップの数及び合成に要する時間がモノマー単位のそれと同じである；そして(3)合成ステップの減少は最終イムノマー産物の純度と収率を改善する。
【００８９】
修飾ヌクレオシドが取り込まれている場合はホスホルアミダイト供給者が薦めるように、直鎖合成またはパラレル合成のいずれのプロトコールによる合成の終わりにおいて、イムノマーは濃縮アンモニア液により便宜上脱保護されてもよい。イムノマー産物は好ましくは逆相HPLCにより精製され、脱トリチル化、脱塩および透析される。
【００９０】
表4は本発明による代表的なイムノマーを示す。他のイムノマーは例において述べる。
【００９１】
【表４】
2005518402.tif 000007
【表５】
2005518402.tif 000008
【００９２】
2番目の観点において、本発明は、上記に述べたようなイムノマー、およびアクセス可能な5'末端以外の位置でイムノマーに結合した抗原を含むイムノマー複合体を提供する。いくつかの態様においては、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドに結合している抗原を含む。いくつかの他の態様おいては、抗原はその3'末端以外の位置でオリゴヌクレオチドに結合している。いくつかの態様においては、抗原はワクチン効果を産む。
【００９３】
抗原は、好ましくは病原体に関連する抗原、癌に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、限定されないが動物や小児の病気などの他の病気に関連する抗原、よりなる群から選択される。本発明のためには、「関連する」とは、病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、呼吸器アレルギー、喘息または他の病気を呈している場合には、抗原が存在し、あるいは、 病原体、癌、自己免疫疾患、食物アレルギー、呼吸器アレルギー、喘息または他の病気を呈していない場合には、抗原は存在しないかまたは減少した量存在するかのいずれかであることを意味する。
【００９４】
イムノマーは抗原に共有結合しているか、または、そうでなければ動作可能に結合している。ここでいう「動作可能に結合して」とはイムノマーと抗原の両者の活性を維持している結合全てをいう。そのような動作可能な結合の限定されない例は、同一のリポソームまたはそのような送達媒体あるいは送達剤の一部であるものを含む。イムノマーが抗原に共有結合している態様おいては、そのような共有結合は好ましくは免疫賦活性オリゴヌクレオチドのアクセス可能な5'末端以外の、イムノマーの全ての位置におけるものである。例えば、抗原はインターヌクレオシド結合に結合していてもよく、また、非ヌクレオチドリンカーに結合していてもよい。代わりに、抗原はそれ自体非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００９５】
3番目の観点においては、本発明は、イムノマーまたは本発明によるイムノマー複合体と生理的に許容される担体とを含む薬学的製剤を提供する。ここでいう「生理学的に許容される」とは、イムノマーの効果を阻害せず、細胞、細胞培養、組織、または生物などの生物系に適合する物質をいう。好ましくは、生物系は脊椎動物などの生命体である。
【００９６】
ここでいう「キャリアー」とは、全ての賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、または薬学的製剤における用途の技術においてよく知られた他の物質を含む。賦形剤や希釈剤といったキャリアーの特徴は、特定用途への投与方法に依存するものと理解される。これらの物質を含む薬学的に許容される製剤の調製はRemington's Pharmaceutical. Sciences, 18th Edition, ed. A.Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. に記載されている。
【００９７】
4番目の観点においては、本発明は、脊椎動物において免疫反応を惹起するための方法を提供するものであって、そのような方法は、脊椎動物への本発明によるイムノマーまたはイムノマー複合体への投与を含む。いくつかの態様においては、脊椎動物は哺乳類である。本発明のためには、「哺乳類」とは明確にヒトを含むことを意味する。好ましい態様おいては、イムノマーまたはイムノマー複合体は免疫賦活を必要とする脊椎動物に投与される。
【００９８】
本発明のこの観点による方法において、イムノマーの投与は、限定されることなく、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、を含む適切な経路により、また、遺伝子銃や皮膚パッチにより、あるいは、目薬またはうがい薬の形でなされ得る。イムノマーの治療組成物の投与は、病気の症状または代理マーカーが低減するのに有効な投与量および期間で、既知の方法を用いて行われ得る。全身投与の場合は、治療組成物は好ましくはイムノマーの血中レベルが約０．０００１マイクロモルから約１０マイクロモルに達する十分な濃度で投与される。局所投与のためには、これよりもより一層低い濃度で有効であってもよく、より一層高い濃度で耐容性があってもよい。好ましくは、イムノマーの総投与量の範囲は患者１人１日あたり約０．００１mgから１日体重あたり200mgまでである。１人の１つの病気の治療に、本発明の治療組成物の１または２以上を治療に有効な濃度で、同時にまたは連続的に投与することが望ましい。
【００９９】
ある好ましい態様においては、本発明のイムノマーは、ワクチン、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク、遺伝子治療ベクター、DNAワクチン、および／または免疫反応の特異性または大きさを増強するためのアジュバントを組み合わせて投与される。これらの態様おいては、本発明のイムノマーがさまざまに、アジュバントとして働くことおよび／または直接的な免疫賦活性効果を産むことができる。
【０１００】
イムノマーまたはワクチン、あるいはその両者は、任意にキーホールリンペットヘモシアニン（KLH)、コレラトキシンBサブユニット、または他の免疫原性担体タンパクなどの免疫原性タンパクに結合していてもよい。限定されることなく、フロインド完全アジュバント、KLH、モノホスホリピッドA（MPL)、ミョウバン、およびQS-21、イミキモド、R848またはこれらの組み合わせを含むサポニン、を含むいかなる種々のアジュバントも使うことができる。
【０１０１】
本発明のこの観点の目的のためには、「組み合わせて」とは同じ患者における同じ病気の治療中を意味し、イムノマーおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントを、数日間隔を上限とした時間的間隔を経るのと同様に同時投与を含むいかなる順序で投与することを含む。そのような組み合わせた治療はまた、イムノマーの投与のみおよび／またはワクチン単独、および／またはアジュバント単独以外のものを含んでもよい。イムノマーおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は同じまたは異なる経路によってもよい。
【０１０２】
本発明のこの観点による方法は免疫系のモデル研究に有用である。本方法はまた、ヒトまたは動物の予防的または治療的処置にも有用である。例えば、本方法は小児や脊椎動物のワクチンの応用に有用である。
【０１０３】
5番目の観点においては、本発明は、病気や疾患を罹患している患者を治療上処置するための方法を提供するものであって、前記方法は、イムノマーや本発明によるイムノマー複合体の患者への投与を含む。種々の態様において、治療されるべき前記病気や疾患は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、アレルギー、喘息、あるいは病原体によって引き起こされる病気である。病原体とは、バクテリア、寄生虫、真菌、ウイルス、ウイロイド、およびプリオンを含む。投与は本発明の４番目の観点における記載のように行われる。
【０１０４】
本発明のためには、「アレルギー」は、限定されることなく、食物アレルギーおよび気道アレルギーを含む。気道炎症とは、限定されることなく、喘息を含む。ここでいう「自己免疫疾患」とは「自己」のタンパクが免疫系に攻撃を受ける疾患をいう。そのような語には自己免疫喘息を含む。
【０１０５】
本発明のこの観点による方法のいずれにおいても、イムノマーまたはイムノマー複合体は、病気を治療するのに有効な他のいかなる薬剤またはイムノマーの免疫賦活性効果を減少させる条件と組み合わせて投与されうる。例えば、癌の治療においては、イムノマーまたはイムノマー複合体が化学療法化合物と組み合わせて投与されうることを意味する。
【０１０６】
以下の実施例は、本発明の好ましい態様をさらに述べるためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
【０１０７】
実施例１：免疫修飾部分を含むオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、図５に要約されている直鎖合成法またはパラレル合成法に従って、自動ＤＮＡ合成装置を用いて１μmolスケールで合成した。（Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham,MA)。
【０１０８】
デオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイトはアプライドバイオシステム(Foster City, CA)から得た。1',2'-ジデオキシリボースホスホルアミダイト、プロピル-I-ホスホルアミダイト、2-デオキシウリジンホスホルアミダイト、1,3-ビス-[5-(4,4'-ジメトキシトリチル)ペンチルアミジル]-2-プロパノールホスホルアミダイトおよびメチルホスホルアミダイトはグレンリサーチ(Sterling, VA)から得た。β-L-2'-デオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイト、α-2'-デオキシリボヌクレオシドホスホルアミダイト、モノ-DMT-グリセロールホスホルアミダイトおよびジ-DMT-グリセロールホスホルアミダイト は ChemGenes (Ashland, MA)から得た。(4-アミノブチル)-1,3-プロパンジオールホスホルアミダイトはクロンテックから得た(Palo Alto, CA)。アラビノシチジンホスホルアミダイト、アラビノグアノシン, アラビノチミジンおよびアラビノウリジンはリライアブルファーマシューティカル(St. Louis, MO). アラビノグアノシンホスホルアミダイト、アラビノチミジンホスホルアミダイトおよびアラビノウリジンホスホルアミダイトはハイブリドン(Cambridge, MA) により合成された(Noronha et al. (2000) Biochem., 39: 7050-7062)。
【０１０９】
全てのヌクレオシドホスホルアミダイトは31Pおよび1HNMRスペクトルによって特徴づけられる。修飾されたヌクレオシドは通常のカップリングサイクルを用いて特異的位置に取り込ませた。合成後、オリゴヌクレオチドは濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相HPLCにより精製し、続いて透析した。ナトリウム塩の形として精製されたオリゴヌクレオチドは使用前に凍結乾燥した。純度はCGEおよびMALDI-TOF MSにより試験した。
【０１１０】
実施例２：脾臓細胞増殖の解析
脾細胞増殖のインビトロ(in vitro)解析は過去に記載された標準的方法により行った。( 例えば Zhao et al., Biochem Pharma 51: 173- 182(1996)参照). 結果を図8Aに示す。これらの結果は、高濃度において、２つのアクセス可能な５’末端を持つイムノマー６は、アクセス可能な５’末端を持たないイムノマー５または１つのアクセス可能な５’末端を持つオリゴヌクレオチド４よりも、より大きな脾細胞増殖を起こす結果となっていることを示す。イムノマー6は、また、ポジティブコントロールのLPSよりもより大きな脾細胞増殖を引き起こしている。 
【０１１１】
実施例３：インビボ（in vivo)脾腫アッセイ
インビトロの結果のインビボモデルへの応用性を試すために、選んだオリゴヌクレオチドをマウスに投与し、脾腫の程度を免疫賦活活性のレベルを指標として測定した。 5mg/kgの用量を一回 BALB/cマウス (雌、4-6週齢、Harlan Sprague Dawley Inc, Baltic, CT)に腹腔内投与した。オリゴヌクレオチド投与から７２時間後にマウスを犠牲にし、脾臓を取り出してその重さを量った。その結果を図8Bに示す。これらの結果は、２つのアクセス可能な５’末端を持つイムノマー６が、オリゴヌクレオチド４またはイムノマー５よりも、はるかに大きな免疫賦活効果を有することを示す。
【０１１２】
実施例４：サイトカイン解析
脊椎動物の細胞、好ましくはBALB/cマウスの脾臓細胞またはヒトPBMC、におけるIL-12およびIL-6の分泌をサンドイッチELISAにより測定した。サイトカイン抗体およびサイトカインスタンダードを含む必要な試薬はファーミンゲン（San Diego, CA）から購入した。ELISA プレート (Costar)は PBSN 緩衝液(PBS/0.05% アジドナトリウム, pH 9.6)中 5μg/mLの濃度の適切な抗体と４℃で一晩でインキュベートし、それからPBS/1 % BSA で37℃ にて 30分間ブロッキングした。細胞培養上清およびサイトカインスタンダードはPBS/10% FBSで適切に希釈し、トリプリケートでプレートに加え、２５℃にて２時間インキュベートした。
【０１１３】
プレートを1μg/mLの濃度の適切なビオチン標識された抗体でオーバーレイし、２５℃にて1.5時間インキュベートした。プレートはその後PBS-T 緩衝液(PBS/0.05% Tween 20)で十分に洗って、ストレプトアビジンが結合したペルオキシダーゼ(シグマ, St. Louis, MO)を加えた後、さらに２５℃にて1.5時間インキュベートした。 プレートは Sure BlueTM (Kirkegaard and Perry) クロモジェニック試薬を用いて発色し、反応はストップソルーション(Kirkegaard and Perry)を加えることにより終了させた。色の変化を Ceres 900 HDI 分光光度計(Bio-Tek Instruments)で測定した。その結果を下の表５Aに示す。
【０１１４】
ヒト末梢血単核細胞(PBMCs) は健常ボランティアの末梢血からFicoll-Paque 密度勾配遠心(Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)により単離した。簡単には、 ヘパリン処置した血液をコニカル遠心管中のHistopaque-1077 (等量)に重層し、400 x g で30 分間室温にて遠心した。単核細胞を含んでいる柔らかい層を注意深く取り、250 x g で 10 分間遠心することにより、等張のリン酸緩衝液(PBS)で2回洗った。得られた細胞の沈殿をその後L-グルタミンを含むRPMI 1640 培地(メディアテック, Herndon, VA)に再懸濁して、 10%の 熱失活させたFCSとペニシリン−ストレプトマイシン(100U/ml)を補充した。細胞は24ウェルプレート中にて１X 106 cells/ml/wellで、オリゴヌクレオチド存在下または非存在下で、異なる時間培養した。培養の終了時に、上清を集めて、IL-6(BD Pharmingen, San Diego, CA)、IL-10 (BD Pharmingen)、IL-12 (BioSource International, Camarillo, CA)、IFN-α(BioSource International) および-γ(BD Pharmingen) 、およびTNF-α(BD Pharmingen) を含む種々のサイトカインを分析するまで−70℃で凍結保存した。その結果を下の表５に示す。
【０１１５】
全ての場合において、細胞培養上清中のIL-12およびIL-6の濃度は、それぞれIL-12およびIL-6と同じ実験条件下で書かれた検量線から計算した。 細胞培養上清中のIL-10、 IFN-γおよびTNF-αの濃度は、それぞれIL-10、IFN-γおよびTNF-αと同じ実験条件下で書かれた検量線から計算した。
【０１１６】
【表６】
2005518402.tif 000009
【０１１７】
【表７】
2005518402.tif 000010
通常の字体はホスホロチオエート結合を表し；イタリックの字体はホスホジエステル結合を表す。
【０１１８】
【化３】
2005518402.tif 000011
【０１１９】
さらに、図７A-Cに示された結果は、２つのアクセス可能な５’末端を持つオリゴヌクレオチド２が、それぞれアクセス可能な５’末端を１つ持つまたは持たないオリゴヌクレオチド１または３よりも低濃度で、IL-12およびIL-6 を上昇させるがIL-10を上昇させないことを示す。
【０１２０】
実施例５：イムノマーの免疫賦活活性における連鎖の長さの効果
オリゴヌクレオチド鎖の長さの効果を調べるため、各連鎖中に18、14、11および8ヌクレオチドを含むイムノマーを合成し、BALB/cマウスの脾臓細胞培養におけるサイトカインIL-12およびIL-6 の分泌の誘導能によって測定して、免疫賦活活性を調べた（表6-8）。本実施例および全てのこれより後の実施例において、サイトカインの分析は実施例４の記載にしたがってBALB/cマウスの脾臓細胞培養で行った。
【０１２１】
【表８】
2005518402.tif 000012
【０１２２】
【表９】
2005518402.tif 000013
【０１２３】
【表１０】
2005518402.tif 000014
【０１２４】
これらの結果は、オリゴヌクレオチド鎖の長さが18-merから7-merへ短くなるほど、イムノマーの免疫賦活活性が増加することを示唆している。6-merまたは5-merのオリゴヌクレオチド鎖長を有するイムノマーは、１つの5'末端を有する18-merのオリゴヌクレオチドと比べて、同等の免疫賦活活性を示した。しかし、6-merまたは5-merのオリゴヌクレオチド鎖長を有するイムノマーは、リンカーが約２オングストロームから２００オングストロームまでの長さである場合には、増加した免疫賦活活性を有する。
【０１２５】
実施例６：非天然ピリミジンまたは非天然プリンヌクレオシドを含むイムノマーの免疫賦活活性
表9-11に示すように、免疫賦活活性は、免疫賦活性ジヌクレオチドモチーフ中に非天然ピリミジンヌクレオシドまたは非天然プリンヌクレオシドを有する種々の長さのイムノマーについて維持されていた。
【０１２６】
【表１１】
2005518402.tif 000015
【０１２７】
【表１２】
2005518402.tif 000016
【０１２８】
【表１３】
2005518402.tif 000017
【０１２９】
実施例７：免疫賦活活性におけるリンカーの効果
２つのオリゴヌクレオチドに結合したリンカーの長さの効果を調べるため、同じオリゴヌクレオチドを含むが、異なるリンカーを含むイムノマーを合成し、免疫賦活活性をテストした。表１２に示した結果は、リンカーの長さがイムノマーの免疫賦活活性において役割を果たしていることを示唆している。 最も優れた免疫賦活効果はC3-からC6-アルキルリンカーまたは、分散されたリン酸の電荷を有する無塩基リンカー で得られた。  
【０１３０】
【表１４】
2005518402.tif 000018
【０１３１】
実施例８：免疫賦活活性におけるオリゴヌクレオチド骨格の効果
一般的に、天然ホスホジエステル骨格を含む免疫賦活オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート骨格を有する同じ長さのオリゴヌクレオチドよりも免疫賦活性が低い。これは、一部には、実験条件下でホスホジエステルオリゴヌクレオチドが急速に分解されるからである。オリゴヌクレオチドの分解は、まず3'末端からオリゴヌクレオチドを切断する3'-エキソヌクレアーゼによる。本実施例のイムノマーは、フリーの3'末端を含まない。そのため、ホスホジエステル骨格を持つイムノマーは、実験条件下でそれに相当する単量体オリゴヌクレオチドよりも長い半減期を有することになり、したがって改善された免疫賦活活性を示すことになる。表１３に示した結果は、この効果を示し、イムノマー84および85が、BALB/cマウス脾臓細胞培養におけるサイトカイン誘導によって決定した免疫賦活活性を示している。
【０１３２】
【表１５】
2005518402.tif 000019
【０１３３】
実施例９：イムノマー73-92の合成
オリゴヌクレオチドは自動DNA合成装置を用いて１μモルスケールで合成した(Expedite 8909 PerSeptive Biosystems)。デオキシヌクレオシドホスホルアミダイトは アプライドバイオシステムズ(Foster City, CA)から入手した。 7-デアザ-2'-デオキシグアノシンホスホルアミダイトはグレンリサーチ(Sterling Virginia)より入手した。1, 3-ビス-DMT-グリセロール-CPG はケムジーン(Ashland, MA)から入手した。修飾されたヌクレオシドは通常のカップリングサイクルを用いて特異的位置に取り込ませた。合成後、オリゴヌクレオチドは、濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相HPLCにより精製し、続いて透析した。ナトリウム塩の形として精製されたオリゴヌクレオチドは使用前に凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドの純度はCGEおよびMALDI-TOF MS (BrukerProflex 111 MALDI-TOF Mass spectrometer)により検査した。
【０１３４】
実施例１１：イムノマーの安定性
オリゴヌクレオチドは10%ウシ血清を含むPBS中、37℃で 4、24または48時間インキュベートした。インタクトオリゴヌクレオチドはキャピラリーゲル電気泳動により測定した。 その結果を表14に示す。
【０１３５】
【表１６】
2005518402.tif 000020
【０１３６】
実施例１２：免疫賦活活性におけるアクセス可能な5'末端の効果
BALB/cマウス(4-8週齢) の脾臓細胞をRPMI 完全培地中で培養した。マウスマクロファージ様細胞であるJ774 (American Type Culture Collection,Rockville, MD) は 、10% (v/v)FCS および抗生物質(ペニシリンG/ストレプトマイシン100IU/mL)とを補充したダルベッコ修飾イーグル培地中で培養した。他の全ての培養試薬は メディアテック(Gaithersburg, MD)より購入した。. 
【０１３７】
IL-12およびIL-6のELISA。BALB/cマウス脾臓細胞またはJ774細胞を、24-ウェルディッシュに、 それぞれ、5x106 または１X 106 細胞/mLの密度で播種した。CpG DNAを TE 緩衝液(10 mM Tris-HCI, pH 7.5, 1 mM EDTA) に溶解し、最終濃度が0.03、0. 1、 0.3、1. 0、3.0または10.0μg/mL になるようにマウス脾臓細胞培養に加え、および、1. 0、3. 0または10.0μg/mL になるようにJ774 細胞培養に加えた。その後細胞を37℃で24時間培養し、その上清をELISA分析のために集めた。実験は各濃度についてトリプリケートで２回または３回行った。 
【０１３８】
IL-12 およびIL-6 の分泌はサンドイッチELISAにより測定した。サイトカイン抗体およびサイトカインスタンダードを含む必要な試薬はファーミンゲン（San Diego, CA）から購入した。ELISA プレート (Costar)は PBSN 緩衝液(PBS/0.05% アジドナトリウム, pH 9.6)中 5μg/mLの濃度の適切な抗体と４℃で一晩でインキュベートし、それからPBS/1 % BSA で37℃ にて 30分間ブロッキングした。細胞培養上清およびサイトカインスタンダードはPBS/1%BSAで適切に希釈し、トリプリケートでプレートに加え、２５℃にて２時間インキュベートした。プレートを洗い、1μg/mLの濃度の適切なビオチン標識された抗体とインキュベートし、２５℃にて1.5時間インキュベートした。プレートはPBS/0.05% Tween 20で十分に洗って、ストレプトアビジンが結合したペルオキシダーゼ(シグマ)を加えた後、さらに２５℃にて1.5時間インキュベートした。プレートは Sure BlueTM (Kirkegaard and Perry) クロモジェニック試薬を用いて発色し、反応はストップソルーション(Kirkegaard and Perry)を加えることにより終了させた。色の変化を Ceres 900 HDI 分光光度計(Bio-Tek Instruments)で測定した。細胞培養中のIL-12およびIL-6の濃度は、それぞれIL-12およびIL-6と同じ実験条件下で描かれた検量線により算出した。
その結果を表15に示す。
【０１３９】
【表１７】
2005518402.tif 000021
【０１４０】
【化４】
2005518402.tif 000022
【０１４１】
【表１８】
2005518402.tif 000023
【０１４２】
総合すれば、本結果はCpG  DNAのアクセス可能な５’末端が至適免疫賦活活性に必要であり、ホスホロチオエート、モノヌクレオチド、またはジヌクレオチドなどの小さな基は、免疫賦活活性に関与する受容体や因子へのCpG  DNAの５’末端のアクセスしやすさを効率的に阻害しないことを示唆する。しかし、フルオレセインと同じか、 それより大きな分子のCpG  DNAの５’末端への結合は免疫賦活活性を抑制しうる。これらの結果は、CpG  DNA-抗体／ワクチン／モノクローナル抗体（mAb)複合体の免疫賦活活性の研究に直接的な影響を与える。ワクチンやmAbなどの大きな分子のCpG  DNAの５’末端への結合は、CpG DNAの免疫賦活活性を次善にし得る。CpG  DNAの３’末端への機能性リガンドの結合は、増加したヌクレアーゼの安定性だけでなくインビボの増加した免疫賦活性にも貢献する。
【０１４３】
実施例１３：サイトカイン分泌におけるリンカーの効果
下記のオリゴヌクレオチドを本研究のために合成した。各修飾されたオリゴヌクレオチドはイムノマー中に取り込まれうる。
【０１４４】
【表１９】
2005518402.tif 000024
【表２０】
2005518402.tif 000025
【０１４５】
免疫賦活活性の増強のための至適なリンカーサイズを評価するため、BALB/cマウス脾臓細胞培養における修飾されたCpG  DNA によるIL-12およびIL-6の分泌を測定した。全てのCpG  DNAは濃度依存的なIL-12およびIL-6の分泌を引き起こした。表１５は、もとのCpG DNAと比較して、5'-フランキング配列中、CpGジヌクレオチドへ5番目のヌクレオチドの位置にリンカーを有する116、119、126、130および134という、選択されたCpG DNAの１μg/mL の濃度で得られたデータを示す。C2-(1)、C3- (2)、およびC4-リンカー(3)を含むCpG DNAは、もとのCpG DNA 4のそれと同様のIL-12産生の分泌を引き起こした。C6およびC9-リンカー (4および5)を 5'-フランキング配列中のCpGジヌクレオチドから5番目のヌクレオチドの位置に含むCpG DNAは、もとのCpG DNAよりもより低いレベルのIL-12分泌を誘導しており（図１５）、C4-リンカーよりも長いリンカーの置換は、IL-12のより低いレベルの誘導を引き起こす結果となることを示唆している。リンカーを有する全ての５つのCpG  DNAは、もとのCpG DNAよりも、２または３倍高いIL-6の分泌を引き起こした。これらのCpG DNA中のリンカーの存在は、リンカーを有さないCpG DNAに比べて、IL-6の誘導に有意な効果を示した。しかしながら、我々はIL-6の分泌における長さ依存的なリンカーの効果は観察できなかった。
【０１４６】
エチレングリコールーリンカーを含むCpG DNAの免疫賦活活性における効果を調べるため、我々は、それぞれ、CpGジヌクレオチドへの5'-フランキング配列中の５番目のヌクレオチドの位置、および、3'-フランキング配列中の４番目のヌクレオチドの位置に、トリエチレングリコール-リンカー(6)が取り込まれたCpG DNA137および138を合成した。同様に、CpG DNAs139および140は、それぞれ、CpGジヌクレオチドへの5'-または3'-フランキング配列中にヘキサエチレングリコール-リンカー(７)を含む。全ての４つの修飾されたCpG DNA(137-140)は、調べた濃度範囲(0.03-10.0μg/mL)の範囲にわたり濃度依存的なサイトカイン産生を引き起こした（データは示していない）。
【０１４７】
CpG DNAs137-140 の0.3μg/mLの濃度で誘導されたサイトカインの濃度を表18に示す。 5'フランキング配列中にエチレングリコール-リンカーを有するCpG DNA137および139は、もとのCpG DNA4よりも、IL-12(2106±143 および2066±153 pg/mL)およびIL-6(2362±166および2507±66 pg/mL)のより高い濃度の分泌を引き起こした（表18）。同じ濃度において、137および139は、もとのCpG  DNAよりもわずかに低い濃度のIL-10 の分泌を引き起こした（表18）。3'フランキング配列中により短いエチレングリコール-リンカー（６）を有するCpG DNA138は、もとのCpG  DNAと同様のIL-12の分泌を引き起こしたが、IL-6およびIL-10 の濃度は有意に低かった（表18）。より長いエチレングリコールリンカー(7)を有するCpG DNA 140は、 もとのCpG DNAと比べて、試験した全ての３つのサイトカインについて有意により低い濃度で誘導された（表18）。
【０１４８】
トリエチレングリコール-リンカー(6)はC9-リンカー(5)のそれと同様の鎖長を有するが、トリエチレングリコール-リンカーを含むCpG DNAは、脾臓細胞培養におけるサイトカイン分泌の誘導により決定したところ、C9-リンカーを含むCpG  DNAよりも、より良い免疫賦活活性を有していた。これらの結果は、より長いアルキル−リンカー（4および５）を含むCpG  DNAで観察されたより低い免疫賦活活性は、その増加した長さではなく、その疎水性と関係しているかもしれないことを示唆している。この結果により、我々は、免疫賦活活性における疎水性官能基を含む分枝アルキル−リンカーの置換を調べることになった。
【０１４９】
【表２１】
2005518402.tif 000026
【０１５０】
免疫賦活活性における分枝アルキルリンカーを含むCpG DNAの効果を調べるため、ヒドロキシル（８）またはアミン（９）官能基を含む２つの分枝アルキルリンカーをもとのCpG DNA４に取り込ませ、その結果できた修飾されたCpG DNA（150-154-  表１９）の免疫賦活活性における効果を調べた。BALB/cマウスの脾臓細胞培養（増殖）およびインビボ（脾腫）において、異なるヌクレオチドの位置にアミノリンカー９を含むCpG DNA150-154 で得られたデータを表１９に示す。
【０１５１】
【表２２】
2005518402.tif 000027
【０１５２】
もとのCpG DNA 4 は 0. 1μg/mLの濃度で 3. 7±0. 8 の増殖率を示した。同じ濃度で、アミノリンカー９を異なる位置に含む修飾されたCpG DNA 151-154は、もとのCpG DNAよりも高い脾臓細胞増殖を引き起こした（表１９）。他のリンカーで観察されたように、置換がCpGジヌクレオチドに隣接して配置される場合は（１５０）、もとのCpG DNAと比べてより低い増殖が認められ、CpGジヌクレオチドに隣接したリンカーの置換の配置は、免疫賦活活性に不利な効果をもたらすことがさらに確認される。一般的に、5'-フランキング配列中の2'-デオキシリボヌクレオシド をアミノリンカーに置換すると（151および152）、3'−フランキング配列中の置換(153および154)で見出されるよりも高い脾臓細胞増殖をもたらす。同様の結果が脾腫分析においても観察されており（表１９）、脾臓細胞培養で観察された結果が確認されている。グリセロールリンカーを含む修飾されたCpG DNA(8)は、アミノリンカー（９）を含む修飾されたCpG DNAで観察されたのと同じかわずかにより高い免疫賦活活性を示した（データは示していない）。
【０１５３】
リンカー８および９を含むCpG DNAの免疫賦活効果を比べるため、我々は、5'フランキング配列中に置換があるCpG DNA145および152を選んで BALB/cマウスの脾臓細胞培養におけるサイトカインIL-12およびIL-6の誘導能を分析した。CpG DNA145および152のいずれも濃度依存的なサイトカイン分泌を引き起こした。図４はもとのCpG DNA4と比べて、マウス脾臓細胞培養における0.3μg/mLの濃度での145および152によって誘導されるIL- 12およびIL-6の濃度を示す。いずれのCpG DNAも、CpG DNA4よりもより高い濃度のIL- 12およびIL-6を誘導した。グリセロールリンカー（８）を含むCpG DNAはアミノリンカー（９）を含むCpG DNAよりもわずかに高い濃度のサイトカイン（特にIL-12)が誘導された（図１６）。これらの結果により、疎水基を含むリンカーは、CpG DNAの免疫賦活活性にとってより好ましいことがさらに確認された。
【０１５４】
我々は、CpG DNAにおける多数のリンカーの置換について２つの異なる観点を調べた。一連の実験において、我々は、ヌクレオチド配列の長さを13-merに固定して、5'末端に１から５つのC3-リンカー（２）置換基を取り込ませた（120-124)。これらの修飾されたCpG DNAにより、我々は、リンカーの長さの増加における効果を、溶解性の問題が起きることなく、研究することができた。２つ目の一連の実験において、我々は、免疫賦活活性における付加的効果があるかどうかを研究するため、５’フランキング配列中のCpGジヌクレオチドに隣接した位置に同じリンカー置換基（３、４または５）を２つ取り込ませた。
【０１５５】
修飾されたCpG DNAについて、もとのCpG DNA 4と比較したBALB/cマウス脾臓細胞培養におけるサイトカイン産生の誘導能を調べた。全ての CpG DNAは濃度依存的にサイトカイン産生を誘導した。CpG DNAが1.0μg/mLの濃度で得られたデータを表２０に示す。この分析では、もとのCpG DNA 4 は、１μg/mLの濃度で、967±28 pg/mLのIL-12、 1593±94.pg/mLのIL-6、および14±6pg/mLのlL-10の分泌を誘導した。表20において表されたデータは、リンカー置換基の数が減少するにつれ、IL-12の誘導が減少することをことを示唆している。しかし、 CpG DNA123および124によるIL-12の分泌のより低い濃度の誘導はCpG DNAの長さがより短いことの結果となりうる。修飾されていない15-ヌクレオチドより短いCpG DNAを用いた我々の研究は、わずかな免疫賦活活性を示した（データには示していない）。長さもリンカー置換基の数も、IL-6の分泌にほとんど影響を与えない。IL-10の分泌はリンカー置換基によって増加したが、これらのCpG DNAによる全体的なIL-10の分泌は最小であった。
【０１５６】
5’−フランキング配列中の４番目および５番目の位置に2つのリンカー置換基(リンカー3-127；リンカー-4-131；リンカー-5-135)を含むCpG DNA、および対応する５’が短く切断されたものである、それぞれ、128、132および136を、BALB/cマウス脾臓培養細胞におけるサイトカイン分泌の誘導能を調べた。1.0μg/mLの濃度におけるIL-12およびIL-6の濃度を図17に示す。図17に表された結果は、免疫賦活活性が、取りこまれたリンカーの種類に依存することを示唆している。４番目および５番目のヌクレオチドのC4-リンカー3による置換(CpG DNA 127)は、もとのCpG DNA 4と比べてサイトカインの分泌に僅かな影響を与えており、これらの位置における核酸塩基および糖環は受容体の認識および/または結合に必要でないことを示唆している。
【０１５７】
リンカー置換基を超えたヌクレオチドの欠失(CpG DNA 128)は、CpG DNA4および127よりも高いIL-12およびIL-6分泌を引き起こす。期待していたように、2つのC6−リンカー(4)の置換は、もとのCpG DNA4により誘導されるよりもよりも低いIL-12の分泌およびもとのCpG DNA4により誘導されるのと同様なIL-6の分泌という結果になった。５’が短く切断されたCpG DNA132はCpG DNA131よりもより高いサイトカイン分泌を誘導した。2つのC9- リンカー(5)を有するCpG DNA 135 および136は、わずかなサイトカイン分泌を誘導し、上記のような同じリンカーを含むモノ−置換 CpG DNAで得られた結果を確認できた。
【０１５８】
実施例14：サイトカイン誘導におけるホスホジエステル結合の効果
イムノマーにより惹起されるサイトカイン誘導におけるホスホジエステル結合の効果を調べるため、下記の分子を合成した。
【０１５９】
【表２３】
2005518402.tif 000028
【０１６０】
PS-CpG DNA 4 (表21)は、 PO-CpG DNA 155をコントロールとして、マウスにおいて免疫反応を惹起することを見出した（データには示していない）。PO-イムノマー 156および157は、それぞれ、グリセリルリンカーであるXを介してその3'末端に結合した、2つの同一の、もとのCpG DNA 155を短く切断したコピー を含む（表21）。 156および157 はそれぞれ、14塩基の同じオリゴヌクレオチドセグメントを含むが、157の5'末端は2つのC3−リンカーであるYの付加により修飾されている（表21）。4、155-157 の全てのオリゴヌクレオチドは、マウス免疫系を活性化するのが知られいてる'GACGTT'という6量体モチーフを含む。
【０１６１】
PO-イムノマーのヌクレアーゼに対する安定性は、CpG DNA 4、155-157を10% ウシ血清(FBS) (熱により不活性化していない）を含む細胞培養培地中で37℃ で4、24および48時間インキュベートすることによって評価した。反応液中に残っているインタクトCpG DNAはCGEにより測定した。図18 A-D は10% FBS中24時間インキュベートしたCpG DNA4、155-157のヌクレアーゼ切断のプロファイルを示す。各時間で残っている全長CpG DNAの量が図18Eに示されている。期待していたように、もとのPS-CpG DNA 4は血清ヌクレアーゼに対して最も抵抗性であった。4の18-mer の約５５% が48時間インキュベーション後も分解されずに残っていた。
【０１６２】
対照的に、同じ実験条件下で４時間後には、全長PO-イムノマー 155の約5%しか残っておらず、ホスホジエステル結合を含むDNAは急速に分解されることが確認された。期待していたように、PO-イムノマー156および157 は両方とも、155よりも血清ヌクレアーゼに抵抗性であった。４時間後、155は約5%が損なわれていなかったのに比べ、156および157のそれぞれ約62%および73%が損なわれていなかった(図18 E)。48時間後でさえも、156および157のそれぞれ約23%および37% が分解されずに残っていた。 3'-3'-結合した PO-イムノマーが血清ヌクレアーゼに対してより安定であるのを示したのと同様に、これらの研究は5'末端の化学修飾がヌクレアーゼに対する安定性をさらに増加しうることを示している。
【０１６３】
CpG DNAの免疫賦活活性は、BALB/c およびC3H/HeJマウスの脾臓細胞培養において、分泌されたサイトカインIL-12およびIL-6 の濃度を測定することによって研究されてきた。全てのCpG DNAは、BALB/cマウスの脾臓細胞培養において濃度依存的なサイトカイン分泌を誘導した(図19)。3μg/mLにおいて、PS-CpG DNA 4は、IL-12およびIL-6をそれぞれ2656±256および12234±1180 pg/mL 誘導した。もとのPO-CpG DNA155は、10μg/mLの濃度を除き、バックグラウンドを超えてサイトカイン濃度を上昇させることはなかった。この結果はヌクレアーゼ安定性分析の結果を矛盾しない。一方で、PO-イムノマー156および 157 は、BALB/cマウスの脾臓細胞培養において、IL-12 およびIL-6 の両方の分泌を引き起こした。
【０１６４】
図19に表された結果は、PS-およびPO-CpG DNAのサイトカイン誘導プロファイルにおいて明らかな違いを示している。PO-イムノマー156および157は、BALB/cマウスの脾臓細胞培養において、PS-CpG DNA 4よりも高濃度のIL-12を誘導した(図19A)。一方で、それらは、3μg/mLの濃度まではごくわずかな量のIL-6を産生した(図19B)。高濃度においても(10μg/mL)、PO-イムノマー156は PS-CpG DNA4よりもIL-6を有意に低く誘導した。PO-イムノマー157の5'末端におけるC3リンカーの存在は、156に比べて、わずかに高い濃度のIL-6の分泌をもたらした。
【０１６５】
しかし、重要なことに、 PO-イムノマー157により産生されたIL-6の濃度は、PS CpG DNA 4により誘導されるそれよりもはるかに低かった。図19Aの挿入図は、3μg/mLの濃度において分泌されたIL-6に対するIL-12の比を示している。IL-12の分泌増加に加えて、PO-イムノマー156および157は、BALB/cマウスの脾臓細胞培養において、PS-CpG DNA 4に比べて、IFN-γをより高濃度に誘導した(データには示していない)。
【０１６６】
BALB/cマウスの脾臓細胞培養においてPO-およびPS-CpG DNAにより誘導された異なるサイトカインのプロファイルは、我々にC3H/HeJ マウス脾臓細胞培養(LPS 低感受性株)におけるCpG DNAのサイトカイン誘導のパターンを研究させることになった。この分析で調べられた全ての３つのCpG DNAは濃度依存的なサイトカイン分泌を惹起した(図20AおよびB)。PO-CpG DNA 155 はBALB/cマウスの脾臓細胞培養においてサイトカイン分泌を惹起しなかったので、C3H/HeJ脾臓細胞培養においてさらに調べることはしなかった。PO-イムノマー156および157 は、PS-CpG DNA 4よりもより高いIL-12 産生を誘導した(図20A)。しかし、3μg/mLの濃度までは、いずれもIL-6産生を誘導しなかった。 調べた最も高濃度(10μg/mL)においては、いずれもPS-CpG DNA 4よりも有意により低いIL-6 を誘導した(図 20B)。分泌されたIL-6に対するIL-12の比は、PSおよびPO CpG DNAのサイトカイン分泌プロファイルを区別するように計算されている (Fig. 20A挿入図)。さらに、C3H/HeJ 脾臓細胞培養の結果は、CpG DNAにより観察された作用がLPSの汚染によるものでないことを示唆している。
【０１６７】
PS-CpG DNAは、インビボで強力な抗癌活性を引き起こすことが示されている。PO-CpG DNAは、インビトロ分析において、より優れたヌクレアーゼ安定性を示し、より高い濃度のIL-12およびIFN-γ分泌を惹起するので、 我々はPO-イムノマーのこれらの好ましい性質がインビボでの抗癌活性を改善するかどうか調べることに興味があった。我々は、PO-イムノマー157 を、野生型p53を発現するMCF-7乳癌細胞または変異型p53を発現するDU-145前立腺癌細胞の腫瘍移植を受けたヌードマウスに、１日おきに0.5 mg/kgの用量で皮下投与した。PO-イムノマー157は、生理食塩水を投与したコントロールと比べて、15日目にはMCF-7腫瘍の増殖を57% 阻害した(図21A)。また34日目においてDU-145腫瘍の増殖も52% 阻害した(図21 B)。 これらの抗癌研究は提案された設計のPO-イムノマーがインビボで強力な抗癌活性を示すことを示唆している。
【０１６８】
実施例２２：短いイムノマー
サイトカイン誘導における短いイムノマーの効果を調べるため、下記のイムノマーを用いた。 これらの結果は、セグメントあたり５ヌクレオチドの短さのイムノマーがサイトカイン産生の誘導において効果的であることを示している。
【０１６９】
【表２４】
2005518402.tif 000029
【０１７０】
均等
本発明は、明確さおよび理解のためにいくらか詳細に記載されているが、本発明および付加した請求項の実際の範囲を逸脱することなく、形式および詳細において種々の変更がされうることは、本開示を読めば当業者により理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】本発明の代表的なイムノマーを模式的に図示したものである。
【図２】いくつかの本発明の代表的なイムノマーを表す。
【図３】本発明のイムノマーの直鎖合成に適した一連の代表的な小分子リンカーを表す。
【図４】本発明のイムノマーのパラレル合成に適した一連の代表的な小分子リンカーを表す。
【図５】本発明のイムノマーの直鎖合成の合成模式図である。DMTr = 4, 4'-ジメトキシトリチル ; CE = シアノエチル.
【図６】本発明のイムノマーのパラレル合成の合成模式図である。DMTr = 4, 4'-ジメトキシトリチル ; CE = シアノエチル.
【図７Ａ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、イムノマー1-3によるIL-12の誘導のグラフ図である。これらのデータは、アクセス可能な5'末端を持つイムノマー２は単量体のオリゴ1 よりも IL-12をより強く誘導し、また、アクセス可能な5'末端を持たないイムノマー3はオリゴ1 と比べて等しいかまたはより弱い免疫刺激しか起こすことができないことを示唆している。
【図７Ｂ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、イムノマー1-3によるIL-6の誘導のグラフ図である（上から下）。これらのデータは、アクセス可能な5'末端を持つイムノマー２は単量体のオリゴ1 よりも IL-6をより強く誘導し、また、アクセス可能な5'末端を持たないイムノマー3はオリゴ1 と比べて等しいかまたはより弱い免疫刺激しか起こすことができないことを示唆している。
【図７Ｃ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、イムノマー1-3によるIL-10の誘導のグラフ図である（上から下）。
【図８Ａ】それぞれ到達不可能な5'末端およびアクセス可能な5'末端を持つイムノマー5および6の異なる濃度による、培養系におけるBALB/cマウス脾臓細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図８Ｂ】CpGモチーフの5'フランキング配列に免疫原性化学修飾を有するイムノマー4-6によるBALB/cマウスの脾臓拡張のグラフ図である。この場合もやはり アクセス可能な5'末端を持つイムノマー6は、アクセス可能な5'末端を持たないイムノマー5および単量体のオリゴ4 と比べてより脾臓拡張を増大しうる。
【図９Ａ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4およびイムノマー７および８によるIL-12誘導のグラフ図である。
【図９Ｂ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4およびイムノマー７および８によるIL-6誘導のグラフ図である。
【図９Ｃ】BALB/cマウスの脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4およびイムノマー７および８によるIL-10誘導のグラフ図である。
【図１０Ａ】BALB/cマウスの脾臓細胞培養における、イムノマー14、15および16による細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図１０Ｂ】BALB/cマウスの脾臓細胞培養における、異なる濃度のイムノマー14および16によるIL-12による細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図１０Ｃ】BALB/cマウスの脾臓細胞培養における、異なる濃度のイムノマー14および16によるIL-6による細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図１１Ａ】BALB/cマウス脾臓細胞の培養における、オリゴ4および17とイムノマー19および20による細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図１１Ｂ】BALB/cマウス脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4および17とイムノマー19および20によるIL-12による細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図１１Ｃ】BALB/cマウス脾臓細胞の培養における、異なる濃度のオリゴ4および17とイムノマー19および20によるIL-6による細胞増殖誘導のグラフ図である。
【図１２】オリゴヌクレオチド4とイムノマー14、23および24を用いたBALB/cマウス脾臓拡張のグラフ図である。
【図１３】オリゴヌクレオチドの3'末端ヌクレオシドの模式図であり、非ヌクレオチド結合は核酸塩基、3'または2'の位置で、ヌクレオシドに取り付け得ることを示す。
【図１４】例13において用いられる化学的置換基を示す。
【図１５】例13において修飾されたオリゴヌクレオチドを用いて得られたサイトカインのプロファイルを示す。
【図１６】アミノリンカーと比較したグリセロールリンカーによる相対的なサイトカインの誘導を示す。
【図１７】種々のリンカーとリンカーの組み合わせによる相対的なサイトカインの誘導を示す。
【図１８】A-Eは種々のPSおよびPOイムノマーとオリゴヌクレオチドの相対的なヌクレアーゼ抵抗性を示す。
【図１９】BALB/cマウス脾臓細胞の培養における、PSイムノマーと比較したPOイムノマーの相対的なサイトカインの誘導を示す。
【図２０】C3H/Hejマウス脾臓細胞の培養における、PSイムノマーと比較したPOイムノマーの相対的なサイトカインの誘導を示す。
【図２１】C3H/Hejマウス脾臓細胞の培養における、イムノマー高濃度での、PSイムノマーと比較したPOイムノマーの相対的なサイトカインの誘導を示す。
【図１】
2005518402.tif 000033
【図２】
2005518402.tif 000034
【図３】
2005518402.tif 000035
【図４】
2005518402.tif 000036
【図５】
2005518402.tif 000037
【図６】
2005518402.tif 000038
【図７Ａ】
2005518402.tif 000039
【図７Ｂ】
2005518402.tif 000040
【図７Ｃ】
2005518402.tif 000041
【図８Ａ】
2005518402.tif 000042
【図８Ｂ】
2005518402.tif 000043
【図９Ａ】
2005518402.tif 000044
【図９Ｂ】
2005518402.tif 000045
【図９Ｃ】
2005518402.tif 000046
【図１０Ａ】
2005518402.tif 000047
【図１０Ｂ】
2005518402.tif 000048
【図１０Ｃ】
2005518402.tif 000049
【図１１Ａ】
2005518402.tif 000050
【図１１Ｂ】
2005518402.tif 000051
【図１１Ｃ】
2005518402.tif 000052
【図１２】
2005518402.tif 000053
【図１３】
2005518402.tif 000054
【図１４】
2005518402.tif 000055
【図１５】
2005518402.tif 000056
【図１６】
2005518402.tif 000057
【図１７】
2005518402.tif 000058
【図１８】
2005518402.tif 000059
【図１９】
2005518402.tif 000060
【図２０】
2005518402.tif 000061
【図２１】
2005518402.tif 000062
【国際調査報告】
2005518402.tif 000063
2005518402.tif 000064
2005518402.tif 000065
2005518402.tif 000066