(57)【要約】本発明は、候補化合物がオーファンＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）のモジュレーターであるか否かを同定する方法に関する。好ましくは、ＧＰＣＲは、ヒトである。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、心筋細胞によって内因的に発現される。ある実施形態では、ＧＰＣＲは、Ｇｉに結合されて、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲの過剰発現が、心筋細胞の生存を促進する。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲの過剰発現が、低酸素／再酸素化誘発性アポトーシスから心筋細胞を救出する。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、鬱血性心不全を有する個体においてダウンレギュレートされる。本発明のアゴニストは、虚血性心疾患（心筋梗塞、心筋梗塞後リモデリング、および鬱血性心不全を含む）の処置のための治療剤として有用であると想起される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物がＲＵＰ４１  ＧＰＣＲのモジュレーターであるか否かを同定する方法であって、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含み、ここで該レセプターは、Ｇタンパク質に結合し、該方法は、以下の工程：
（ａ’）該候補化合物を該レセプターと接触させる工程；
（ｂ’）レセプター機能性が調整されるか否かを決定する工程；
を包含し、ここでレセプター機能性の変化は、該候補化合物が該ＧＰＣＲのモジュレーターであることの指標である、方法。
【請求項２】
候補化合物が心臓保護のモジュレーターであるか否かを同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）該候補化合物をＧＰＣＲと接触させる工程であって、該レセプターは、以下：
（ｉ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｉｉｉ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントを含み、ここで該レセプターは、Ｇタンパク質に結合する、工程；および
（ｂ）レセプター機能性が調整されるか否かを決定する工程；
を包含し、
ここでレセプター機能性の変化は、該候補化合物が心臓保護のモジュレーターであることの指標である、方法。
【請求項３】
前記レセプターは組換え体である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記決定する工程は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、およびＣａ２＋からなる群から選択されるセカンドメッセンジャーのレベルの測定による、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記セカンドメッセンジャーはｃＡＭＰである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｃＡＭＰの細胞内レベルが低下している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記決定する工程は、メラニン保有細胞アッセイの使用による、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記決定する工程は、前記ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳ結合の測定による、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項９】
請求項１または請求項２に記載の方法であって、前記候補化合物により引き起こされる前記レセプターの調整を、該レセプターを該レセプターの既知のモジュレーターと接触させることにより引き起こされる該レセプターの第二の調整に対して比較する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１０】
請求項１または請求項２に記載の方法に従って同定されたモジュレーター。
【請求項１１】
アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、請求項１０に記載のモジュレーター。
【請求項１２】
前記モジュレーターがｃＡＭＰの細胞内レベルを低下させる、請求項１１に記載のモジュレーター。
【請求項１３】
前記モジュレーターがアゴニストである、請求項１１または請求項１２に記載のモジュレーター。
【請求項１４】
ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの活性を調整する方法であって、該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含み、
ここで該レセプターは、Ｇタンパク質に結合し、該方法は、該レセプターを、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のモジュレーターと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１５】
前記接触させる工程は、前記レセプターを含む膜への前記モジュレーターの投与を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触させる工程は、前記レセプターを含む細胞または組織への前記モジュレーターの投与を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触させる工程は、前記レセプターを含む個体への前記モジュレーターの投与を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記個体は、心血管障害の予防または処置の必要があり、該心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、前記個体は、虚血性心疾患の予防または処置の必要があり、該虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される、方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、前記個体が、心血管機能の変化の必要があり、該心血管機能の変化が、以下：
（ａ）心肥大の減少；
（ｂ）心臓駆出量の増大；
（ｃ）心室体積の減少；および
（ｄ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される、方法。
【請求項２１】
心血管機能の変化を必要とする個体において該変化を行う方法であって、該方法が、第２の局面のモジュレーターの治療有効量をＲＵＰ４１  ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはその対立遺伝子改変体を含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記心血管機能の変化が、以下：
（ａ）心肥大の減少；
（ｂ）心臓駆出量の増大；
（ｃ）心室体積の減少；および
（ｄ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
心血管障害の予防または処置の必要のある個体における心血管障害の予防または処置の方法であって、該方法は、第２の局面のモジュレーターの治療有効量をＲＵＰ４１  ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはその対立遺伝子改変体を含む、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される、方法。
【請求項２５】
虚血性心疾患の予防または処置の必要のある個体における虚血性心疾患の予防または処置の方法であって、該方法は、第２の局面のモジュレーターの治療有効量をＲＵＰ４１  ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはその対立遺伝子改変体を含む、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される、方法。
【請求項２７】
組成物を調製する方法であって、該方法は、
ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲのモジュレーターを同定する工程、次いで
キャリアおよび該モジュレーターを混合する工程
を包含し、ここで該モジュレーターは、請求項１または請求項２に記載の方法によって同定可能である、方法。
【請求項２８】
薬学的または生理学的に受容可能な組成物であって、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のモジュレーターを含むか、該モジュレーターから本質的になるか、または該モジュレーターからなる、組成物。
【請求項２９】
心血管機能を変化させる方法であって、該方法は、
該変化の必要のある個体に、請求項２８に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程
を包含し、ここで該心血管機能の変化は、以下：
（ａ）心肥大の減少；
（ｂ）心臓駆出量の増大；
（ｃ）心室体積の減少；および
（ｄ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される、方法。
【請求項３０】
心血管障害を予防または処置する方法であって、該方法は、
該処置の必要のある個体に、請求項２８に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程
を包含し、ここで該心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される、方法。
【請求項３１】
虚血性心疾患を予防または処置する方法であって、該処置の必要のある個体に、請求項２８に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程を包含し、ここで該虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される、方法。
【請求項３２】
個体における心血管障害の予防または処置のための医薬の調製のために、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のモジュレーターを使用する方法であって、ここで該心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される、方法。
【請求項３３】
個体における虚血性心疾患の予防または処置のための医薬の調製のために、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のモジュレーターを使用する方法であって、ここで該虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される、方法。
【請求項３４】
前記個体は哺乳動物である、請求項１７〜２６および２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ノックアウトマウスを作製する方法であって、ここで該ノックアウトマウスに、心血管障害の素因が与えられ、該心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択され、該方法は、
配列番号５に記載のポリペプチドをコードする遺伝子をノックアウトする工程
を包含する、方法。
【請求項３６】
ノックアウトマウスを作製する方法であって、ここで該ノックアウトマウスに、虚血性心疾患の素因が与えられ、該虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択され、該方法は、
配列番号５に記載のポリペプチドをコードする遺伝子をノックアウトする工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３５または請求項３６に記載のノックアウトマウス。
【請求項３８】
候補化合物が、心血管障害または虚血性心疾患の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために、請求項３７に記載のノックアウトマウスを使用する方法。
【請求項３９】
ノックアウトラットを作製する方法であって、ここで該ノックアウトラットに、心血管障害の素因が与えられ、該心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択され、該方法は、
配列番号６に記載のポリヌクレオチドに高いストリンジェンシーでハイブリダイズする遺伝子をノックアウトする工程
を包含する、方法。
【請求項４０】
ノックアウトラットを作製する方法であって、ここで該ノックアウトラットに、虚血性心疾患の素因が与えられ、該虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択され、該方法は、
配列番号６に記載のポリヌクレオチドに高いストリンジェンシーでハイブリダイズする遺伝子をノックアウトする工程
を包含する、方法。
【請求項４１】
請求項３９または請求項４０に記載のノックアウトラット。
【請求項４２】
候補化合物が、心血管障害または虚血性心疾患の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために、請求項４１に記載のノックアウトラットを使用する方法。
【請求項４３】
単離されたラットＲＵＰ４１ポリヌクレオチドまたはその相補体であって、該単離されたラットＲＵＰ４１ポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）配列番号６の少なくとも７５ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６の少なくとも１５０ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６の少なくとも２５０ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６の少なくとも３５０ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチド；および
（ｅ）配列番号６の少なくとも５００ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される、ポリヌクレオチドまたはその相補体。
【請求項４４】
組換えベクターであって、該組換えベクターは、請求項４３に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項４５】
請求項４４に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項４６】
ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物であって、該構築物は、構成的活性型Ｇタンパク質共役型レセプターおよびＧタンパク質を含み、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるＲＵＰ４１ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含む、構築物。
【請求項４７】
候補化合物がＲＵＰ４１  ＧＰＣＲのリガンドであるか否かを同定する方法であって、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含み、該方法が、以下の工程：
（ａ’）該ポリペプチドを、必要に応じて標識される既知のモジュレーターと、該候補化合物の存在下または不在下で接触させる工程；
（ｂ’）該既知のモジュレーターと該ポリペプチドとの間の複合体を検出する工程；および
（ｃ’）該化合物の不在下よりも該化合物の存在下で、該複合体がより少量で形成されるか否かを決定する工程
を包含し、ここで、該決定は、該候補化合物が該レセプターのリガンドであることの指標となる、方法。
【請求項４８】
放射線画像化の方法であって、該方法は、
該放射線画像化を必要とする個体に、請求項２に記載のモジュレーターおよび請求項４７に記載のリガンドからなる群から選択される放射性標識された化合物を提供または投与する工程
を包含する、方法。
【請求項４９】
ヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲについてトランスジェニックである非ヒト哺乳動物であって、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドであって、ここで配列番号２のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンで置換されている、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｄ）配列番号３に記載のポリペプチドであって、ここで配列番号３のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンで置換されている、ポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、哺乳動物。
【請求項５０】
化合物が心臓保護についての効力を有するか否かを同定するために、請求項４９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用する方法であって、該化合物は、請求項２に記載のモジュレーターおよび請求項４７に記載のリガンドからなる群から選択される、方法。
【請求項５１】
ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲのモジュレーターを作製するためのプロセスであって、以下の工程：
（ａ）請求項１または請求項２に記載の方法に従って、該モジュレーターを同定する工程；および
（ｂ）（ａ）において同定されたモジュレーターを合成する工程
を包含する、プロセス。
【請求項５２】
前記モジュレーターが、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５３】
前記モジュレーターは、ｃＡＭＰの細胞内レベルを低下させる、請求項５１に記載のプロセス。
【請求項５４】
前記モジュレーターは、アゴニストである、請求項５２または請求項５３に記載のプロセス。
【請求項５５】
心血管機能の変化に使用するための請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法であって、前記心血管機能の変化が、以下：
（ａ）心肥大の減少；
（ｂ）心臓駆出量の増大；
（ｃ）心室体積の減少；および
（ｄ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される、方法。
【請求項５７】
心血管障害の予防または処置に使用するための請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、前記心血管障害が、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される、方法。
【請求項５９】
虚血性心疾患の予防または処置に使用するための請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のモジュレーター。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記虚血性心疾患が、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、示した日に米国特許商標庁にＵ．Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓメールにて出願した以下の仮出願からの優先権の利益を主張する：米国仮出願番号６０／４００，７７４（２００２年８月１日出願）。前出の出願は、その全体の内容が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、候補化合物がオーファンＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）のモジュレーターであるか否かを同定する方法に関する。好ましくは、ＧＰＣＲはヒトである。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、心筋細胞によって内因的に発現される。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、Ｇｉに結合されて、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲの過剰発現が、心筋細胞の生存を促進する。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲの過剰発現が、低酸素／再酸素化誘発性アポトーシスから心筋細胞を救出する。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲは、鬱血性心不全を有する個体においてダウンレギュレートされる。本発明のアゴニストは、虚血性心疾患（心筋梗塞、心筋梗塞後リモデリング、および鬱血性心不全を含む）の処置のための治療剤として有用であると想起される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（Ａ．虚血性心疾患および鬱血性心不全）
鬱血性心不全（ＣＨＦ）は、ほぼ５００万人の米国人が罹患しており、毎年５００，０００人を超える新たな症例が診断されている。定義によると、ＣＨＦは、心疾患が、心拍出量を低下させ、静脈圧を上昇させ、かつ欠陥心臓の進行性の悪化および成熟前心筋細胞（心筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ））の死を引き起こす分子異常を伴う、臨床症状である（出典；Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｋａｔｚ，ＡＭ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００）。成人心臓では、筋細胞（心筋細胞）の死は、心不全既往歴の必須要素である。なぜなら、失われた細胞は、代わりが効かないからである。一旦心不全の症状になった場合の５年生存率は５０％未満なので、心筋細胞死を促進する分子プロセスを考慮しない心不全の定義は、この症状の主要な臨床特性を見過ごしてしまう。この目的のために、多くのグループによる現行の研究は、筋細胞の死および生存を調節する分子機構およびシグナリング経路に集中している。細胞培養物および小動物の研究により、心筋細胞上のＧタンパク質共役型レセプターが、心臓収縮機能の非常に重要な調節因子であり、また筋細胞の死および生存の調節に関与していることが明確に実証されている［概説について、ＡｄａｍｓおよびＢｒｏｗｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００１）２０：１６２６−１６３４を参照のこと］。しかし、心筋細胞の死を阻害するか、または生存経路を直接的に活性化するように設計された、臨床現場で現在利用可能な薬物はない。マウスおよびラットにおいて近年発表された証拠は、生存経路の活性化［Ｌｅｅら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１４０：４８３１−４０］または心筋細胞死経路の阻害因子［Ｌａｕｇｗｉｔｚら，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ（２００１）１２：２０５１−６３］が心機能および動物生存を有意に改善することを実証する。従って、ヒト心不全の処置のための同様の治療ストラテジーに大いに見込みがあることが明らかである。
【０００４】
（Ｂ．Ｇタンパク質共役型レセプター）
多数のレセプタークラスがヒトにおいて存在するが、断然、最も豊富で治療関連性があるのは、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）クラスによって代表される。ヒトゲノム内には約３０，０００〜４０，０００の遺伝子があると概算されており、これらのうち、約２％がＧＰＣＲをコードすると概算されている。内因性のリガンドが同定されているレセプター（ＧＰＣＲを含む）は、「既知の」レセプターと呼ばれるが、内因性のリガンドが同定されていないリガンドは、「オーファン」レセプターと呼ばれる。
【０００５】
ＧＰＣＲは、薬剤製品の開発のための重要なエリアを代表する：１００の既知のＧＰＣＲのうち約２０のＧＰＣＲから、全処方薬の約６０％が開発された。例えば、１９９９年では、上位１００の商標の処方剤のうち、以下の薬物が、ＧＰＣＲと相互作用する（この薬物に関して処置される主要な疾患および／または障害を括弧内に示す）：
クラリチン（Ｃｌａｒｉｔｉｎ）（登録商標）（アレルギー症）
プロザック（Ｐｒｏｚａｃ）（登録商標）（鬱病）
ヴァソテック（Ｖａｓｏｔｅｃ）（登録商標）（高血圧症）
パキシル（Ｐａｘｉｌ）（登録商標）（鬱病）
ゾロフト（Ｚｏｌｏｆｔ）（登録商標）（鬱病）
ジプレキサ（Ｚｙｐｒｅｘａ）（登録商標）（精神病性障害）
コザール（Ｃｏｚａａｒ）（登録商標）（高血圧）
イミトレックス（Ｉｍｉｔｒｅｘ）（登録商標）（片頭痛）
ザンタック（Ｚａｎｔａｃ）登録商標（逆流）
プロプルシド（Ｐｒｏｐｕｌｓｉｄ）（登録商標）（逆流性疾患）
リスペルダル（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ）（登録商標）（精神分裂病）
セレベント（Ｓｅｒｅｖｅｎｔ）（登録商標）（喘息）
ペプシド（Ｐｅｐｃｉｄ）（登録商標）（逆流）
ガスター（Ｇａｓｔｅｒ）（登録商標）（潰瘍）
アトロベント（Ａｔｒｏｖｅｎｔ）（登録商標）（気管支痙攣）
エフェクサー（Ｅｆｆｅｘｏｒ）（登録商標）（鬱病）
デパコテ（Ｄｅｐａｋｏｔｅ）（登録商標）（癲癇）
カルデュラ（Ｃａｒｄｕｒａ）（登録商標）（前立腺肥大（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ））
アレグラ（Ａｌｌｅｇｒａ）（登録商標）（アレルギー症）
リュープロン（Ｌｕｐｒｏｎ）（登録商標）（前立腺癌）
ゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）（登録商標）（前立腺癌）
ディプリバン（Ｄｉｐｒｉｖａｎ）（登録商標）（感覚脱失）
バスパー（ＢｕＳｐａｒ）（登録商標）（不安）
ヴェントリン（Ｖｅｎｔｏｌｉｎ）（登録商標）（気管支痙攣）
ハイトリン（Ｈｙｔｒｉｎ）（登録商標）（高血圧症）
ウェルブトリン（Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ）（登録商標）（鬱病）
ジルテック（Ｚｙｒｔｅｃ）（登録商標）（鼻炎）
プラヴィックス（Ｐｌａｖｉｘ）（登録商標）（ＭＩ／脳卒中）
トプロール−ＸＬ（Ｔｏｐｒｏｌ−ＸＬ）（登録商標）（高血圧症）
テノルミン（Ｔｅｎｏｒｍｉｎ）（登録商標）（アンギナ）
キサラタン（Ｘａｌａｔａｎ）（登録商標）（（緑内障）
シングレア（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ）（登録商標）（喘息）
ディオバン（Ｄｉｏｖａｎ）（登録商標）（高血圧症）
ハルナール（Ｈａｒｎａｌ）（登録商標）（前立腺過形成）
（Ｍｅｄ  Ａｄ  Ｎｅｗｓ  １９９９  Ｄａｔａ）。
【０００６】
ＧＰＣＲは、共通の構造モチーフを共有し、このモチーフは、７つのαへリックスを形成する２２〜２４の疎水性アミノ酸でなる７つの配列を有し、その各々は膜にまたがる（各範囲は、数で表される（すなわち、膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）など）。これらの膜貫通へリックスは、細胞膜の外部、すなわち「細胞外」側で、膜貫通−２と膜貫通−３との間、膜貫通−４と膜貫通−５との間、および膜貫通−６と膜貫通−７との間のアミノ酸の鎖（これらはそれぞれ、「細胞外」領域１、「細胞外」領域２、および「細胞外」領域３（ＥＣ−１、ＥＣ−２、およびＥＣ−３）と呼ばれる）で連結される。これらの膜貫通へリックスはまた、細胞膜の内部、すなわち「細胞内」側で、膜貫通−１と膜貫通−２との間、膜貫通−３と膜貫通−４との間、および膜貫通−５と膜貫通−６との間のアミノ酸の鎖（これらはそれぞれ、「細胞内」領域１、「細胞内」領域２、および「細胞内」領域３（ＩＣ−１、ＩＣ−２、およびＩＣ−３）と呼ばれる）で連結される。レセプターの「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は、細胞内の細胞内空間にあり、レセプターの「アミノ」（「Ｎ」）末端は、細胞の外側の細胞外空間にある。
【０００７】
一般に、リガンドがレセプターと結合する場合（しばしば、レセプターの「活性化」と呼ばれる）、細胞内領域と細胞内「Ｇタンパク質」との間の結合を促進する、レセプターの構造変化がある。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に関して「無差別」である、すなわち、ＧＰＣＲは、１つより多くのＧタンパク質と相互作用し得ることが報告されている。Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔ．，４３  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９５（１９８８）を参照のこと。他のＧタンパク質も存在するが、現在では、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、およびＧｏが、同定されているＧタンパク質である。Ｇタンパク質とのリガンド活性化ＧＰＣＲの結合が、シグナリングカスケードプロセス（「シグナル伝達」と呼ばれる）を開始させる。正常な条件下では、シグナル伝達は、最終的には、細胞活性化または細胞阻害を生じる。理論に束縛されることを望まないが、ＩＣ−３ループならびにレセプターのカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられる。
【０００８】
生理的条件下で、ＧＰＣＲは、以下の２つの異なる構造の間で平衡して、細胞膜中に存在する：「不活性」状態および「活性」状態。不活性状態のレセプターは、シグナル伝達を開始させる細胞内シグナリング伝達経路に関連することができず、生物学的応答を生じることができない。活性状態へのレセプター構造の変化は、（Ｇタンパク質を介して）伝達経路への関連を可能にし、生物学的応答を生じる。
【０００９】
レセプターは、リガンドまたは化合物（例えば、薬物）によって、活性状態で安定化され得る。近年の発見（レセプターのアミノ酸配列に対する改変を含むがもっぱらこれに限定されない）は、レセプターを活性状態構造に促進し、かつ安定化させるための、リガンドや薬物以外の手段を提供する。これらの手段は、レセプターへのリガンド結合の効果を刺激することにより、レセプターを活性状態で有効に安定化させる。このようなリガンド独立手段による安定化は、「構成的レセプター活性化」と呼ばれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、本明細書中でＲＵＰ４１と称されるオーファンＧＰＣＲに関する。ＲＵＰ４１は、ＧＰＲ２２（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ６６５８１）に関連する。
【００１１】
ＲＵＰ４１は、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ）（心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ））によって内因的に発現される。ヒトＲＵＰ４１の発現プロフィールは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップによって決定され、複組織ドットブロットおよびノーザンブロットによって検証された。ゲノムＤＮＡから増幅されたＲＵＰ４１のラットオルソログの部分コード配列が同定されており、開示されている。ラットＲＵＰ４１ポリヌクレオチド配列のこのフラグメントは、公開されているマウスＲＵＰ４１ポリヌクレオチド配列（ＸＭ＿１３７９９８）に対して９７％同一である。ＲＵＰ４１は、Ｇｉに結合されて、アデニリルシクラーゼの阻害およびｃＡＭＰ生産の抑制を生じることが、本明細書中に開示される。さらに、虚血性心臓および肥厚性心臓の実験モデルにおいて、内因性ＲＵＰ４１レベルの発現が減少していることが、開示される。さらに、ＲＵＰ４１の過剰発現が心筋細胞の生存を促進することが、開示される。ＲＵＰ４１の開示された特性は、ＲＵＰ４１のアゴニストが、心筋細胞アポトーシスと関連した心疾患の処置に有用であると思われることを示している。
【００１２】
一部、本発明は、候補化合物がＲＵＰ４１のモジュレーターであるか否かを同定する方法に関する。他のいくつかの実施形態では、本発明は、ＲＵＰ４１の活性を調整する方法であって、ＲＵＰ４１をＲＵＰ４１のモジュレーターと接触させる工程を包含する、方法に関する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、ｃＡＭＰの細胞内レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、このモジュレーターは、アゴニストである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、当該接触させる工程は、インビトロで起こる。いくつかの実施形態では、ＲＵＰ４１モジュレーターが、心筋細胞アポトーシスの阻害において当該モジュレーターが有効であるか否かを決定する方法において、心筋細胞アポトーシスの細胞培養モデルに導入される。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、ｃＡＭＰの細胞内レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、このモジュレーターは、アゴニストである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、当該接触させる工程は、インビボで起こる。いくつかの実施形態では、ＲＵＰ４１モジュレーターが、虚血性心疾患および心不全に関連した病状を軽くするのに当該モジュレーターが有効であるか否かを決定する方法において、虚血性心疾患および心不全の外科手術モデルを受けているマウスおよびラットに投与される。なお他のいくつかの実施形態では、ＲＵＰ４１モジュレーターが、心臓リモデリングおよび心機能にとって当該モジュレーターが利点を有するか否かを決定する方法において、実験的心筋梗塞に罹患した動物に投与される。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、ｃＡＭＰの細胞内レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、このモジュレーターは、アゴニストである。
【００１５】
ＲＵＰ４１のモジュレーターは、虚血性心疾患（心筋梗塞、心筋梗塞後リモデリング（ｐｏｓｔ−ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）、および鬱血性心不全を含む）の処置のための治療剤として有用であると想起される。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、ｃＡＭＰの細胞内レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、このモジュレーターは、アゴニストである。
【００１６】
ヒトＲＵＰ４１の第一の対立遺伝子のポリヌクレオチド配列およびそのコードされたポリペプチド配列をそれぞれ、配列番号１および配列番号２として配列表（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ）中に提供する（配列番号２のポリペプチドのコード配列は、配列番号１のヌクレオチド２３７−１，５３８に相当する）。ヒトＲＵＰ４１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ６３８１５）の第二の対立遺伝子のアミノ酸配列（これは、配列番号２のアミノ酸４２５位でリジンの代わりにシステインを用いる単一置換を含む）を、配列番号３として提供する（相当するコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ００２３８１のヌクレオチド７９，５５９−８０，８６０として提供される）。マウスＲＵＰ４１のポリヌクレオチド配列およびコードされたポリペプチド配列をそれぞれ、配列番号４および配列番号５として提供する。ラットＲＵＰ４１の部分コード配列を含むポリヌクレオチド配列を、配列番号６として開示する。
【００１７】
第１の局面では、本発明は、候補化合物がＲＵＰ４１  ＧＰＣＲのモジュレーターであるか否かを同定する方法であって、該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含み、ここで該レセプターが、Ｇタンパク質に結合し、該方法が、以下の工程：
（ａ’）該候補化合物を該レセプターと接触させる工程；
（ｂ’）レセプター機能性が調整されるか否かを決定する工程を包含し、ここでレセプター機能性の変化が、該候補化合物が該ＧＰＣＲのモジュレーターであることの指標となる、方法を特徴とする。
【００１８】
本発明はまた、候補化合物が心臓保護のモジュレーターであるか否かを同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）該候補化合物をＧＰＣＲと接触させる工程であって、該レセプターが、以下：
（ｉ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｉｉｉ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含み、ここで該レセプターが、Ｇタンパク質に結合する、工程；および
（ｂ）レセプター機能性が調整されるか否かを決定する工程；
を包含し、
ここでレセプター機能性の変化が、該候補化合物が心臓保護のモジュレーターであることの指標となる、方法に関する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、当該レセプターは、配列番号２のアミノ酸２−４３３および配列番号３のアミノ酸２−４３３からなる群から選択される当該ポリペプチドフラグメントを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、当該ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲは、内因性である。
【００２１】
ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内であると想起される。
【００２２】
配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１ポリペプチドの哺乳動物オルソログは、本発明の範囲内であると想起される。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物オルソログは、マウスＲＵＰ４１、ラットＲＵＰ４１、ブタＲＵＰ４１、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４１を包含する。
【００２３】
配列番号２、配列番号３、または配列番号５のＲＵＰ４１ポリペプチドに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である改変体ポリペプチドは、本発明の範囲内であると想起される。特にいくつかの実施形態では、ポリペプチド配列相同性は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価され、これは当該分野で周知である［例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−７２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２；これらの開示内容は、その全体が参考として援用される、を参照のこと］。当該改変体ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、および置換を含み得る。配列番号２、配列番号３、または配列番号５のＲＵＰ４１ポリペプチドの構成的活性化バージョンから選択される改変体ポリペプチドは、本発明の範囲内であると想起される。いくつかの実施形態では、当該構成的活性化バージョンのＲＵＰ４１ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンに置換されている、配列番号２または配列番号３のポリペプチドである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、当該ＲＵＰ４１  ＧＲＣＲは、組換え体である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、当該ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲは、１つ以上のエピトープタグを含む。いくつかの実施形態では、当該エピトープタグは血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグである。いくつかの実施形態では、当該エピトープタグはＦＬＡＧエピトープタグである。いくつかの実施形態では、当該エピトープはＶ５エピトープタグである。当該ＨＡ、ＦＬＡＧまたはＶ５エピトープタグを提供するための手順は、当業者に周知である（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。
【００２６】
いくつかの実施形態では、当該Ｇタンパク質は、細胞内ｃＡＭＰのレベルを調整する。いくつかの実施形態では、当該Ｇタンパク質はＧｉである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、当該決定する工程は、メラニン保有細胞アッセイの使用による。いくつかの実施形態では、色素凝集が高くなる。いくつかの実施形態では、色素分散が減少する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、当該決定する工程は、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、およびＣａ２＋からなる群から選択されるセカンドメッセンジャーのレベルの測定による。いくつかの実施形態では、当該セカンドメッセンジャーはｃＡＭＰである。いくつかの実施形態では、ｃＡＭＰのレベルが低下している。いくつかの実施形態では、当該決定する工程は、ＣＡＲＴ−ＴＳＨで共トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞において実施される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、当該決定する工程は、当該ＧＰＣＲを含む膜を用いて実施される。いくつかの実施形態では、当該膜は、ブリンクマンポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ＴＭを用いた細胞のホモジナイゼーションによって作製される。いくつかの実施形態では、当該膜調製物は、当該ポリトロンの各々１０〜２０秒期間の３バーストでのホモジナイゼーションによって作製される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、当該決定する工程は、細胞内ｃＡＭＰレベルの低下によって仲介される活性の測定による。いくつかの実施形態では、当該活性は、細胞生存の促進である。いくつかの実施形態では、当該細胞は、新生児ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）である。いくつかの実施形態では、当該活性は、低酸素／再酸素化誘発性アポトーシスからの細胞救助である。いくつかの実施形態では、当該細胞はＮＲＶＭである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、当該Ｇタンパク質は、キメラＧｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉαサブユニットであり、そして当該決定する工程は、ＩＰ３またはＣａ２＋の測定による。
【００３２】
いくつかの実施形態では、当該決定する工程は、当該ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳ結合の測定による。さらなるいくつかの実施形態では、当該ＧＴＰγＳは、［３５Ｓ］で標識される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、当該接触させる工程は、ＧＰＣＲの既知のリガンドの存在下で実施される。いくつかの実施形態では、当該既知のリガンドは、ＧＰＣＲのアゴニストである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、当該方法は、候補化合物により引き起こされるレセプターの調整を、このレセプターをこのレセプターの既知のモジュレーターと接触させることにより引き起こされるこのレセプターの第二の調整に対して比較する工程をさらに包含する。
【００３５】
第２の局面では、本発明は、第１の局面の方法に従って同定されたＲＵＰ４１  ＧＰＣＲのモジュレーターまたは心臓保護のモジュレーターを特徴とする。
【００３６】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、抗体、または少なくとも１つの結合ドメインを含むその誘導体である。
【００４２】
第３の局面では、本発明は、ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの活性を調整する方法であって、当該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含み、ここで当該レセプターが、Ｇタンパク質に結合し、当該方法が、レセプターを、第２の局面のモジュレーターと接触させる工程を包含する、方法を特徴とする。
【００４３】
いくつかの実施形態では、当該レセプターは、配列番号２のアミノ酸２−４３３および配列番号３のアミノ酸２−４３３からなる群から選択される当該ポリペプチドフラグメントを含む。
【００４４】
ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内であることが想起される。
【００４５】
配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１ポリペプチドの哺乳動物オルソログは、本発明の範囲内であると想起される。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物オルソログは、マウスＲＵＰ４１、ラットＲＵＰ４１、ブタＲＵＰ４１、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４１を包含する。
【００４６】
配列番号２、配列番号３、または配列番号５のＲＵＰ４１ポリペプチドに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である改変体ポリペプチドは、本発明の範囲内であると想起される。特にいくつかの実施形態では、ポリペプチド配列相同性は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価され、これは当該分野で周知である［例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−７２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２；これらの開示内容は、その全体が参考として援用される、を参照のこと］。当該改変体ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、および置換を含み得る。配列番号２、配列番号３、または配列番号５のＲＵＰ４１ポリペプチドの構成的活性化バージョンである改変体ポリペプチドは、本発明の範囲内であると想起される。いくつかの実施形態では、当該構成的活性化バージョンのＲＵＰ４１ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンに置換されている、配列番号２または配列番号３のポリペプチドである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、当該接触させる工程は、レセプターを含む膜へのモジュレーターの投与を包含する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、当該接触させる工程は、レセプターを含む細胞または組織へのモジュレーターの投与を包含する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、当該接触させる工程は、レセプターを含む個体へのモジュレーターの投与を包含する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【００５６】
いくつかの実施形態では、当該方法は、モジュレーターが心血管障害の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために使用され、この心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択され、
この方法は、以下の工程：
（ａ’）当該モジュレーターを心筋細胞アポトーシスの細胞培養モデルに投与する工程；および
（ｂ’）当該アポトーシスが阻害されるか否かを決定する工程であって、当該決定する工程が、以下：
（ｉ）細胞数の測定；
（ｉｉ）ＤＮＡフラグメント化の測定；および
（ｉｉｉ）核染色質濃縮（ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）の測定；
からなる群から選択される測定による、工程を包含し、ここでアポトーシス阻害の決定が、モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、核染色質濃縮の測定が、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を用いて実施される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、当該方法は、モジュレーターが虚血性心疾患の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために使用され、この虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択され、
この方法は、以下の工程：
（ａ’）当該モジュレーターを心筋細胞アポトーシスの細胞培養モデルに投与する工程；および
（ｂ’）当該アポトーシスが阻害されるか否かを決定する工程であって、当該決定する工程が、以下：
（ｉ）細胞数の測定；
（ｉｉ）ＤＮＡフラグメント化の測定；および
（ｉｉｉ）核染色質濃縮（ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）の測定；
からなる群から選択される測定による、工程を包含し、ここでアポトーシス阻害の決定が、モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、核染色質濃縮の測定が、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を用いて実施される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、当該方法は、モジュレーターが心血管障害の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために使用され、この心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択され、
この方法は、以下の工程：
（ａ’）モジュレーターを、心血管障害のマウスまたはラットモデルに投与するまたは投与しない工程；および
（ｂ’）モジュレーターの投与が、以下：
（ｉ）心肥大の減少；
（ｉｉ）心臓駆出量の増大；
（ｉｉｉ）心室体積の減少；および
（ｉｖ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される効果を有するか否かを決定する工程；を包含し、
ここで当該効果の決定が、当該モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、当該方法は、モジュレーターが虚血性心疾患の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために使用され、この虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択され、
この方法は、以下の工程：
（ａ’）モジュレーターを、虚血性心疾患のマウスまたはラットモデルに投与するまたは投与しない工程；および
（ｂ’）モジュレーターの投与が、以下：
（ｉ）心肥大の減少；
（ｉｉ）心臓駆出量の増大；
（ｉｉｉ）心室体積の減少；および
（ｉｖ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される効果を有するか否かを決定する工程；を包含し、
ここで当該効果の決定が、当該モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、当該個体は、心血管障害の予防または処置の必要があり、この心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、当該個体は、虚血性心疾患の予防または処置の必要があり、この虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、当該個体は、心血管機能の変化の必要があり、この心血管機能の変化は、以下：
（ａ）心肥大の減少；
（ｂ）心臓駆出量の増大；
（ｃ）心室体積の減少；および
（ｄ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、当該個体は、心血管障害に対して遺伝的素因を有するマウスまたはラットであり、この心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、当該方法は、モジュレーターが心血管障害の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために使用され、この心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択され、
この方法は、以下の工程：
（ａ’）モジュレーターを、心血管障害に対して遺伝的素因を有する当該マウスまたはラットに投与するまたは投与しない工程；および
（ｂ’）モジュレーターの投与が、以下：
（ｉ）心肥大の減少；
（ｉｉ）心臓駆出量の増大；
（ｉｉｉ）心室体積の減少；および
（ｉｖ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される効果を有するか否かを決定する工程；を包含し、
ここで当該効果の決定が、当該モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、当該個体は、虚血性心疾患に対して遺伝的素因を有するマウスまたはラットであり、この虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、当該方法は、モジュレーターが虚血性心疾患の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために使用され、この虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択され、
この方法は、以下の工程：
（ａ’）モジュレーターを、虚血性心疾患に対して遺伝的素因を有する当該マウスまたはラットに投与するまたは投与しない工程；および
（ｂ’）モジュレーターの投与が、以下：
（ｉ）心肥大の減少；
（ｉｉ）心臓駆出量の増大；
（ｉｉｉ）心室体積の減少；および
（ｉｖ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される効果を有するか否かを決定する工程；を包含し、
ここで当該効果の決定が、当該モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる。
【００６９】
第４の局面では、本発明は、心血管機能の変化を必要とする個体において該変化を行う方法であって、当該方法が、第２の局面のモジュレーターの治療有効量をＲＵＰ４１  ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、当該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはその対立遺伝子改変体を含む、方法を特徴とする。
【００７０】
いくつかの実施形態では、当該心血管機能の変化は、以下：
（ａ）心肥大の減少；
（ｂ）心臓駆出量の増大；
（ｃ）心室体積の減少；および
（ｄ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【００７６】
いくつかの実施形態では、当該接触させる工程は、当該モジュレーターの経口投与によって実施される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【００７８】
第５の局面では、本発明は、その予防または処置の必要のある個体における心血管障害の予防または処置の方法であって、当該方法が、第２の局面のモジュレーターの治療有効量をＲＵＰ４１  ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、当該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはその対立遺伝子改変体を含む、方法を特徴とする。
【００７９】
いくつかの実施形態では、当該心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【００８５】
いくつかの実施形態では、当該接触させる工程は、当該モジュレーターの経口投与によって実施される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【００８７】
第６の局面では、本発明は、その予防または処置の必要のある個体における虚血性心疾患の予防または処置の方法であって、当該方法が、第２の局面のモジュレーターの治療有効量をＲＵＰ４１  ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、当該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはその対立遺伝子改変体を含む、方法を特徴とする。
【００８８】
いくつかの実施形態では、当該虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、当該接触させる工程は、当該モジュレーターの経口投与によって実施される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【００９６】
第７の局面では、本発明は、組成物を調製する方法であって、ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲのモジュレーターを同定する工程および次いでキャリアおよびこのモジュレーターを混合する工程を包含し、ここでこのモジュレーターは、第１の局面の方法によって同定可能である、方法を特徴とする。
【００９７】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、第１の局面の方法によって同定可能な当該モジュレーターは、第１の局面の方法によって同定される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、第２の局面のモジュレーターである。
【０１０４】
第８の局面では、本発明は、薬学的または生理学的に受容可能な組成物であって、第２の局面のモジュレーターを含む、当該モジュレーターから本質的になる、または当該モジュレーターからなる、組成物を特徴とする。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【０１１０】
第９の局面では、本発明は、心血管機能を変化させる方法であって、当該変化の必要のある個体に、第８の局面の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程を包含し、ここで当該心血管機能の変化が、以下：
（ａ）心肥大の減少；
（ｂ）心臓駆出量の増大；
（ｃ）心室体積の減少；および
（ｄ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される、方法を特徴とする。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【０１１２】
第１０の局面では、本発明は、心血管障害を処置する方法であって、当該処置の必要のある個体に、第８の局面の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程を包含し、ここで当該心血管障害が、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される、方法を特徴とする。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【０１１４】
第１１の局面では、本発明は、虚血性心疾患を処置する方法であって、当該処置の必要のある個体に、第８の局面の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を提供または投与する工程を包含し、ここで当該虚血性心疾患が、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される、方法を特徴とする。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【０１１６】
第１２の局面では、本発明は、個体における心血管障害の処置のための医薬の調製のために、第２の局面のモジュレーターを使用する方法を特徴とする。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、当該心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【０１２４】
第１３の局面では、本発明は、個体における虚血性心疾患の処置のための医薬の調製のために、第２の局面のモジュレーターを使用する方法を特徴とする。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、当該虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【０１３２】
第１４の局面では、本発明は、ノックアウトマウスを作製する方法であって、ここで当該ノックアウトマウスが、心血管障害の素因が与えられ、当該心血管障害が、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択され、
当該方法が、配列番号５に記載のポリペプチドをコードする遺伝子をノックアウトする工程を包含する、方法を特徴とする。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、当該ノックアウトは、心筋細胞選択的である。
【０１３４】
第１５の局面では、本発明は、ノックアウトマウスを作製する方法であって、ここで当該ノックアウトマウスが、虚血性心疾患の素因が与えられ、当該虚血性心疾患が、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択され、
該方法が、配列番号５に記載のポリペプチドをコードする遺伝子をノックアウトする工程を包含する、方法を特徴とする。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、当該ノックアウトは、心筋細胞選択的である。
【０１３６】
第１６の局面では、本発明は、第１４または第１５の局面のノックアウトマウスを特徴とする。
【０１３７】
第１７の局面では、本発明は、候補化合物が、心血管障害の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために、第１６の局面のノックアウトマウスを使用する方法であって、当該心血管障害が、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択され、当該方法が、以下の工程：
（ａ’）化合物を、このマウスに投与するまたは投与しない工程；および
（ｂ’）モジュレーターの投与が、以下：
（ｉ）心肥大の減少；
（ｉｉ）心臓駆出量の増大；
（ｉｉｉ）心室体積の減少；および
（ｉｖ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される効果を有するか否かを決定する工程；を包含し、
ここで当該効果の決定が、当該モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる、方法を特徴とする。
【０１３８】
第１８の局面では、本発明は、候補化合物が、虚血性心疾患の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために、第１６の局面のノックアウトマウスを使用する方法であって、当該虚血性心疾患は、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択され、当該方法が、以下の工程：
（ａ’）化合物を、このマウスに投与するまたは投与しない工程；および
（ｂ’）モジュレーターの投与が、以下：
（ｉ）心肥大の減少；
（ｉｉ）心臓駆出量の増大；
（ｉｉｉ）心室体積の減少；および
（ｉｖ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される効果を有するか否かを決定する工程；を包含し、
ここで当該効果の決定が、当該モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる、方法を特徴とする。
【０１３９】
第１９の局面では、本発明は、ノックアウトラットを作製する方法であって、ここで該ノックアウトラットが、心血管障害の素因が与えられ、当該心血管障害が、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択され、
当該方法が、配列番号６に記載のポリヌクレオチドに高いストリンジェンシーでハイブリダイズする遺伝子をノックアウトする工程を包含する、方法を特徴とする。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、当該ノックアウトは、心筋細胞選択的である。
【０１４１】
第２０の局面では、本発明は、ノックアウトラットを作製する方法であって、ここで該ノックアウトラットが、虚血性心疾患の素因が与えられ、当該虚血性心疾患が、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択され、
当該方法が、配列番号６に記載のポリヌクレオチドに高いストリンジェンシーでハイブリダイズする遺伝子をノックアウトする工程を包含する、方法を特徴とする。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、当該ノックアウトは、心筋細胞選択的である。
【０１４３】
第２１の局面では、本発明は、第１９または第２０の局面のノックアウトラットを特徴とする。
【０１４４】
第２２の局面では、本発明は、候補化合物が、心血管障害の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために、第２１の局面のノックアウトラットを使用する方法であって、当該心血管障害が、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択され、当該方法が、以下の工程：
（ａ’）化合物を、このラットに投与するまたは投与しない工程；および
（ｂ’）モジュレーターの投与が、以下：
（ｉ）心肥大の減少；
（ｉｉ）心臓駆出量の増大；
（ｉｉｉ）心室体積の減少；および
（ｉｖ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される効果を有するか否かを決定する工程；を包含し、
ここで当該効果の決定が、当該モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる、方法を特徴とする。
【０１４５】
第２３の局面では、本発明は、候補化合物が、虚血性心疾患の予防または処置について治療効力を有するか否かを同定するために、第２１の局面のノックアウトラットを使用する方法であって、当該虚血性心疾患が、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択され、当該方法が、以下の工程：
（ａ’）化合物を、このラットに投与するまたは投与しない工程；および
（ｂ’）モジュレーターの投与が、以下：
（ｉ）心肥大の減少；
（ｉｉ）心臓駆出量の増大；
（ｉｉｉ）心室体積の減少；および
（ｉｖ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される効果を有するか否かを決定する工程；を包含し、
ここで当該効果の決定が、当該モジュレーターが当該治療効力を有することの指標となる、方法を特徴とする。
【０１４６】
第２４の局面では、本発明は、単離されたラットＲＵＰ４１ポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号６の少なくとも７５ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６の少なくとも１５０ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６の少なくとも２５０ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６の少なくとも３５０ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチド；および
（ｅ）配列番号６の少なくとも５００ヌクレオチドの連続した範囲を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される、ポリヌクレオチドを特徴とする。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、当該連続した範囲は、配列番号６のヌクレオチド５１４位を含まない。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、当該単離されたラットＲＵＰ４１ポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲに対してオルソログである内因性ラットＲＵＰ４１  ＧＰＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むか、当該ヌクレオチド配列から本質的になるか、または当該ヌクレオチド配列からなる。
【０１４９】
上記（ａ）から（ｂ）のいずれか１つのＲＵＰ４１ポリヌクレオチドに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である改変体ポリヌクレオチドは、本発明の範囲内であると想起される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列相同性は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価され、これは当該分野で周知である［例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−７２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２；これらの開示内容は、その全体が参考として援用される、を参照のこと］。このような改変体ポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド欠失、挿入、および置換を含み得る。
【０１５０】
さらなる実施形態では、本発明は、当該単離されたポリヌクレオチドの相補体を特徴とする。
【０１５１】
第２５の局面では、本発明は、組換えベクターであって、当該組換えベクターが、第２４の局面の単離されたポリヌクレオチドを含む、組換えベクターを特徴とする。いくつかの実施形態では、当該組換えベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、当該発現ベクターは、真核生物発現ベクターである。適切な発現ベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、当該組換えベクターは、一過性トランスフェクションまたは安定トランスフェクションの方法において使用される。いくつかの実施形態では、当該組換えベクターは、感染の方法において使用される。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、当該組換えベクターは、ＲＵＰ４１遺伝子を不活性化する方法において使用されるターゲティングベクターである。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、当該組換えベクターは単離される。
【０１５５】
第２６の局面では、本発明は、第２５の局面の組換えベクターを含む原核生物または真核生物宿主細胞を特徴とする。いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、原核生物であり、当該組換えベクターを用いて安定に形質転換される。いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、真核生物であり、当該組換えベクターを用いて一過的にトランスフェクトされる。他のさらなるいくつかの実施形態では、当該宿主細胞は、真核生物であり、当該組換えベクターを用いて安定にトランスフェクトされる。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、真核生物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、およびＣＯＳ−７細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、真核生物であり、より好ましくは、メラニン保有細胞である。他の適切な宿主細胞は、当業者に容易に明らかである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、この宿主細胞が、哺乳動物胚性幹細胞または胚性幹様細胞であり、そして当該組換えベクターが、ＲＵＰ４１遺伝子を不活性化する方法において使用される。いくつかの実施形態では、この宿主細胞が、哺乳動物胚性体細胞であり、そして当該組換えベクターが、ＲＵＰ４１遺伝子を不活性化する方法において使用される。
【０１５８】
さらなる実施形態は、第２４の局面のポリヌクレオチドについて組換え体である原核生物または真核生物宿主細胞を包含する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、単離される。
【０１６０】
第２７の局面では、本発明は、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物であって、当該構築物が、構成的活性型Ｇタンパク質共役型レセプターおよびＧタンパク質を含み、当該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるＲＵＰ４１ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含む、構築物を特徴とする。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、当該レセプターは、配列番号２のアミノ酸２−４３３および配列番号３のアミノ酸２−４３３からなる群から選択される当該ポリペプチドフラグメントを含む。
【０１６２】
ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内であることが想起される。
【０１６３】
配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１ポリペプチドの哺乳動物オルソログは、本発明の範囲内であると想起される。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物オルソログは、マウスＲＵＰ４１、ラットＲＵＰ４１、ブタＲＵＰ４１、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４１を包含する。
【０１６４】
配列番号２、配列番号３、または配列番号５のＲＵＰ４１ポリペプチドに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である改変体ポリペプチドは、本発明の範囲内であると想起される。特にいくつかの実施形態では、ポリペプチド配列相同性は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価され、これは当該分野で周知である［例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−７２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２；これらの開示内容は、その全体が参考として援用される、を参照のこと］。当該改変体ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、および置換を含み得る。配列番号２、配列番号３、または配列番号５のＲＵＰ４１ポリペプチドの構成的活性化バージョンである改変体ポリペプチドは、本発明の範囲内であると想起される。いくつかの実施形態では、当該構成的活性化バージョンのＲＵＰ４１ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンに置換されている、配列番号２または配列番号３のポリペプチドである。
【０１６５】
第２８の局面では、本発明は、候補化合物がＲＵＰ４１  ＧＰＣＲのリガンドであるか否かを同定する方法であって、当該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｃ）配列番号５に記載のポリペプチド；
からなる群から選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体を含み、当該方法が、以下の工程：
（ａ’）当該レセプターを、このレセプターに対する必要に応じて標識された既知のリガンドと、当該候補化合物の存在または不在下で接触させる工程；
（ｂ’）当該既知のリガンドと当該レセプターとの間の複合体を検出する工程；および
（ｃ’）この候補化合物の不在下よりもこの候補化合物の存在下で、当該複合体がより少量で形成されるか否かを決定する工程
を包含し、ここで、当該決定が、この候補化合物が、当該レセプターのリガンドであることの指標となる、方法を特徴とする。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、当該レセプターは、配列番号２のアミノ酸２−４３３および配列番号３のアミノ酸２−４３３からなる群から選択される当該ポリペプチドフラグメントを含む。
【０１６７】
ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内であることが想起される。
【０１６８】
配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１ポリペプチドの哺乳動物オルソログは、本発明の範囲内であると想起される。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物オルソログは、マウスＲＵＰ４１、ラットＲＵＰ４１、ブタＲＵＰ４１、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４１を包含する。
【０１６９】
配列番号２、配列番号３、または配列番号５のＲＵＰ４１ポリペプチドに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である改変体ポリペプチドは、本発明の範囲内であると想起される。特にいくつかの実施形態では、ポリペプチド配列相同性は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価され、これは当該分野で周知である［例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９０）２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９３）３：２６６−７２；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９７）２５：３３８９−３４０２；これらの開示内容は、その全体が参考として援用される、を参照のこと］。当該改変体ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入、および置換を含み得る。配列番号２、配列番号３、または配列番号５のＲＵＰ４１ポリペプチドの構成的活性化バージョンである改変体ポリペプチドは、本発明の範囲内であると想起される。いくつかの実施形態では、当該構成的活性化バージョンのＲＵＰ４１ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンに置換されている、配列番号２または配列番号３のポリペプチドである。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、レセプターの当該既知のリガンドは、第２の局面のモジュレーターである。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、当該既知のリガンドは、以下：
（ａ）放射性同位体；
（ｂ）酵素；および
（ｃ）蛍光体
からなる群から選択される標識を含む。
【０１７２】
いくつかの好ましい実施形態では、当該標識は、放射性同位体である。いくつかの実施形態では、当該放射性同位体は、３Ｈである。
【０１７３】
第２９の局面では、本発明は、放射線画像化の方法であって、当該放射線画像化を必要とする個体に、放射性標識された化合物を提供または投与する工程を包含し、当該化合物が、第２の局面のモジュレーターおよび第２８の局面のリガンドからなる群から選択される、方法を特徴とする。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、当該個体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、当該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。マウス、ラット、またはヒトがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
【０１７５】
第３０の局面では、本発明は、ヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲについてトランスジェニックである非ヒト哺乳動物を特徴とする。いくつかの実施形態では、当該非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはブタである。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、当該ヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲは、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドであって、ここで配列番号２のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンと置換されている、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｄ）配列番号３に記載のポリペプチドであって、ここで配列番号３のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンと置換されている、ポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【０１７７】
ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内であることが想起される。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ヒトＲＵＰ４１の当該トランスジェニック発現は、心筋細胞選択的である。
【０１７９】
第３１の局面では、本発明は、本発明の化合物が心臓保護についての効力を有するか否かを同定するために、第３０の局面のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、当該非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはブタである。
【０１８１】
当該化合物は、当該化合物を当該トランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、実施例１８のインビボラットモデルにおいて、またはそれに類似したマウスもしくはブタにおけるインビボモデルにおいて、当該投与が、ビヒクルのみが投与された当該トランスジェニック非ヒト哺乳動物よりもＩＳ／ＡＡＲを減少させるかどうかを決定することにより、心臓保護についての治療効力について評価され得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、当該化合物は、当該化合物を当該トランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、当該投与が、以下：
（ａ）心肥大の減少；
（ｂ）心臓駆出量の増大；
（ｃ）心室体積の減少；および
（ｄ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される効果を生じるか否かを決定する（ここで当該効果の決定が、当該化合物が当該治療効力を有することの指標となる）ことにより、心臓保護についての治療効力について評価され得る。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本発明の当該化合物は、第２の局面のモジュレーターである。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本発明の当該化合物は、第３０の局面のリガンドである。
【０１９０】
第３２の局面では、本発明は、ＲＵＰ４１  ＧＰＣＲのモジュレーターを作製するためのプロセスであって、以下の工程：
（ａ）請求項１または請求項２に記載の方法に従って、当該モジュレーターを同定する工程；および
（ｂ）（ａ）において同定されたモジュレーターを合成する工程
を包含する、プロセスを特徴とする。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【０１９６】
第３３の局面では、本発明は、心血管機能の変化に使用するための（ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）第２の局面のモジュレーターを特徴とする。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、当該心血管機能の変化は、以下：
（ａ）心肥大の減少；
（ｂ）心臓駆出量の増大；
（ｃ）心室体積の減少；および
（ｄ）心筋細胞アポトーシスの減少
からなる群から選択される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【０２０３】
第３４の局面では、本発明は、心血管障害の予防または処置に使用するための第２の局面のモジュレーターを特徴とする。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、当該心血管障害は、以下：
（ａ）心拍出量低下；および
（ｂ）静脈圧上昇
からなる群から選択される。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される、
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【０２１０】
第３５の局面では、本発明は、虚血性心疾患の予防または処置に使用するための第２の局面のモジュレーターを特徴とする。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、当該虚血性心疾患が、以下：
（ａ）心筋梗塞；
（ｂ）心筋梗塞後リモデリング；および
（ｃ）鬱血性心不全
からなる群から選択される。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１００μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、および１００μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ〜１０μＭの区間から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、配列番号２または配列番号３のヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲにおいて、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、および１０μＭからなる群から選択される値より小さいＥＣ５０またはＩＣ５０を有する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、細胞内ｃＡＭＰのレベルを低下させる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、選択的である。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、アゴニストである。
【０２１８】
出願人は、本発明の実施形態のいずれかから任意の１つ以上の候補化合物を排除する権利を保持する。出願人はまた、本発明の実施形態のいずれかから任意の１つ以上のモジュレーターを排除する権利もまた保持する。出願人はさらに、本発明の実施形態のいずれかから任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを排除する権利も保持する。出願人はさらに、本発明の実施形態のいずれかから任意の虚血性心疾患または任意の心血管障害または心筋細胞アポトーシスの任意の障害を排除する権利も保持する。
【０２１９】
（詳細な説明）
レセプターに関して展開した科学文献は、レセプターに関して種々の効果を有するリガンドに言及する多数の用語を採用している。明確でかつ一貫性を持たせるために、本発明特許文書を通して以下の定義を使用する。これらの定義がこれらの用語についての他の定義と抵触する範囲で、以下の定義が支配する：
「アゴニスト」は、それらがレセプターに結合する場合に細胞内応答を活性化する物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。いくつかの実施形態では、アゴニストは、それらがレセプターに結合する場合に細胞内応答を活性化する（例えば、膜へのＧＴＰγＳ結合を増強する、または細胞内ｃＡＭＰレベルを低下させる）ことが以前に知られていない物質である。いくつかの実施形態では、アゴニストは、それらがレセプターに結合する場合に脂肪分解を阻害することが以前に知られていない物質である。
【０２２０】
「アロステリックモジュレーター」は、レセプターの機能的活性に影響するが、内因性リガンドをレセプターへの結合から阻害しない物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。アロステリックモジュレーターは、逆アゴニスト、部分アゴニスト、およびアゴニストを包含する。
【０２２１】
本明細書中で使用する「アミノ酸略語」を表Ａに示す：
（表Ａ）
【０２２２】
【表１−１】
2005534319.tif 000002
【０２２３】
【表１−２】
2005534319.tif 000003
「アンタゴニスト」は、アゴニストと同じ部位でレセプターに競合的に結合するが細胞内応答を活性化せず、それにより、アゴニストにより惹起された細胞内応答を阻害し得る物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。アンタゴニストは、アゴニストの不在下ではベースラインの細胞内応答を減少させない。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、それらがレセプターに結合する場合に細胞応答を阻害するようにアゴニストと競合することが以前に知られていない物質である。ここで、例えば、細胞応答は、膜へのＧＴＰγＳ結合または細胞内ｃＡＭＰレベルの低下である。
【０２２４】
「抗体」は、本明細書中では、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を包含することが意図される。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭを包含することがさらに意図される。抗体は、全抗体（単鎖全抗体を含む）、およびそれらの抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦ（ａｂ’）２を含む）を包含する。抗体は、任意の動物起源であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ラクダ、ロバ、ヒツジ、ウマ、またはトリである。好ましくは、抗体は、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄ値である結合親和力を有する。本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって調製され得る。
【０２２５】
「アポトーシス」（プログラム細胞死としても公知）は、細胞内で作動するシグナル伝達系によってその細胞が死亡するようにプログラムされている細胞死の形態をいうために使用される。対して、壊死は、細胞が外在性因子によって殺傷される場合である。
【０２２６】
「候補化合物」は、スクリーニング技術に従う分子（例えば（かつ限定ではない）、化学化合物）を意味する。好ましくは、用語「候補化合物」は、レセプターに対する逆アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニストからなる群から選択される化合物であると公に知られていた化合物を含まず；より好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物において治療効力を有すると以前に確定していた化合物を含まず；そして、最も好ましくは、ヒトにおいて治療有用性を有することが以前に確定していた化合物を含まない。
【０２２７】
「心臓駆出率」は、１回の収縮で左心室から駆出される血液の割合をいうために使用される。例えば、１００ｍｌの血液が左心室中にあって９０ｍｌが収縮の際に駆出される場合、心臓駆出率は９０％である。
【０２２８】
「心肥大」は、心筋（ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ）（心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ））の肥大をいうために使用される。心肥大は、通常（常にではないが）、心筋の上に負荷される血行力学荷重の増大に対する適応応答である。
【０２２９】
「コドン」は、一般に、リン酸基に結合されたヌクレオシド（アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）、およびチミジン（Ｔ））を含み、かつ翻訳された場合にアミノ酸をコードする、３つのヌクレオチド（またはヌクレオチドの等価物）の一揃いを意味する。
【０２３０】
「組成物」は、少なくとも１つの成分を含む物質を意味する；「薬学的組成物」は、組成物の一例である。
【０２３１】
「化合物効力」は、レセプター結合親和力に対してレセプター機能性（すなわち、シグナル伝達経路を活性化／阻害する能力）を阻害または刺激する化合物の能力の測定値を意味する。化合物効力を検出する例示的な手段は、本特許文書の実施例の節に開示される。
【０２３２】
「〜を含む」、「〜から本質的になる」、および「〜からなる」は、本明細書中においては、それらの標準的な意味に従って定義される。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．に記載された規定の意味が、当該分野における規定の意味を支配し、そして規制する控訴裁判所の判例に記載の規定の意味が、Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐに記載の意味を支配する。
【０２３３】
「鬱血性心不全（ＣＨＦ）」は、心臓が血液を効率的に汲み出す能力を失う障害をいう。鬱血性心不全は、老齢になるにつれて、より蔓延する。虚血性心疾患は、鬱血性心不全の最も一般的な原因であり、全ての症例の６０〜７０％を占める。１２ｍｍＨｇより大きい「静脈圧上昇」は、２５秒より大きな循環時間に等価な「心拍出量低下」と同様に、鬱血性心不全についての主要フラミンガム（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）判定基準の１つである。
【０２３４】
「構成的活性型レセプター」は、そのリガンドまたはその化学的等価物へのレセプターの結合を介する以外の手段によって、活性状態で安定化されたレセプターを意味する。構成的活性型レセプターは、内因性または非内因性であり得る。
【０２３５】
「構成的に活性化されたレセプター」は、構成的に活性であるように改変された内因性レセプターを意味する。「ＣＡＲＴ」は、構成的活性化レセプター技術（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の頭字語であり、ＧＰＣＲに接頭辞としてつけて本明細書中で使用される場合、当該接頭辞を付けられたＧＰＣＲは構成的に活性化されたレセプターであると識別することが理解される。
【０２３６】
「構成的レセプター活性化」は、そのリガンドまたはそれらの化学的等価物への結合が存在しないレセプターの活性化を意味する。
【０２３７】
「接触」または「接触する」は、インビトロ系またはインビボ系のいずれであれ、少なくとも２つの部分を一緒にすることを意味する。
【０２３８】
「減少する（ＤＥＣＲＥＡＳＥ）」は、測定可能な量の減少をいうために使用され、用語「減ずる（ｒｅｄｕｃｅ）」、「少なくする（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、「低下する（ｌｏｗｅｒ）」、および「減らす（ｌｅｓｓｅｎ）」と同義で使用される。
【０２３９】
「超音波心臓検査法」は、生存している動物において心臓の構造および機能を測定するために音波を使用する方法をいうために使用される。
【０２４０】
「内因性」は、哺乳動物が天然に生成する物質を意味する。内因性（例えば（かつ限定ではない）用語「レセプター」に関して）とは、そのものが哺乳動物（例えば（かつ限定でない）ヒト）によって天然に生成されることを意味する。内因性は、当該哺乳動物のゲノム内に表される遺伝子の対立遺伝子改変体ならびにそこでコードされた対立遺伝子ポリペプチド改変体を包含することが理解される。対照的に、本文脈において用語「非内因性」とは、そのものが、哺乳動物（例えば（かつ限定ではない）ヒト）によって天然に生成されないことを意味する。例えば（かつ限定ではない）、内因性形態で構成的活性型でないが、操作された場合に構成的活性型になるレセプターは、最も好ましくは、本明細書中において、「非内因性の構成的に活性化されたレセプター」と呼ばれる。両用語とも、「インビボ」系および「インビトロ」系の両方を記載するように使用され得る。例えば（かつ限定ではない）、スクリーニングアプローチでは、この内因性または非内因性のレセプターは、インビトロスクリーニング系に関してであり得る。さらなる例として（かつ限定ではない）、哺乳動物のゲノムが非内因性の構成的に活性化されたレセプターを含むように操作された場合、インビボ系による候補化合物のスクリーニングが実現可能である。
【０２４１】
「発現ベクター」は、本明細書中においては、当該発現ベクターにとって組換え体である適切な宿主細胞におけるクローン化ＤＮＡの転写および転写ｍＲＮＡの翻訳に必要であるＤＮＡ配列として定義される。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択マーカー、制限された数の有用な制限酵素部位、高コピー数能（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ）、および活性プロモーターを含む。転写されるべき当該クローン化ＤＮＡは、当該発現ベクター内で構成的活性型プロモーターまたは条件的活性型プロモーターに作動可能に連結される。例示では（限定ではない）、ｐＣＭＶが発現ベクターである。
【０２４２】
「Ｇタンパク質共役型レセプター融合タンパク質」および「ＧＰＣＲ融合タンパク質」は、本明細書中に開示された本発明の文脈において、各々、少なくとも１つのＧタンパク質、最も好ましくは、このようなＧタンパク質のアルファ（α）サブユニット（これは、ＧＴＰに結合するサブユニットである）に融合された内因性の構成的活性型ＧＰＣＲまたは非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲを含む非内因性タンパク質を意味し、このＧタンパク質は、内因性オーファンＧＰＣＲと天然に結合するＧタンパク質と同じタイプであることが好ましい。例えば（かつ限定ではない）、内因性状態において、Ｇタンパク質「Ｇｓα」が、ＧＰＣＲと結合する優勢Ｇタンパク質である場合、この特定のＧＰＣＲに基づくＧＰＣＲ融合タンパク質は、Ｇｓαに融合されたＧＰＣＲを含む非内因性タンパク質である；以下に記載するようないくつかの状況では、非優勢Ｇタンパク質が、ＧＰＣＲに融合され得る。このＧタンパク質は、構成的活性型ＧＰＣＲのＣ末端に直接融合され得るか、またはこれら２つの間にスペーサーが存在し得る。
【０２４３】
「宿主細胞」は、ベクターをその中に取り込み得る細胞を意味する。この宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得る。いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、真核生物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞、およびＣＯＳ−７細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この宿主細胞は、真核生物であり、より好ましくは、メラニン保有細胞である。
【０２４４】
本明細書中で使用される「処置の必要がある」とは、個体または動物が処置を必要とするか、または処置の利益を得るとの、治療奉仕者（例えば、人の場合、医師、看護士、臨床看護士など；動物（非ヒト哺乳動物を含む）の場合、獣医）によりなされる判断がをいう。この判断は、種々の要因に基づいてなされ、この要因は、治療奉仕者の意見の領域内にあるが、本発明の化合物により処置可能である状態の結果として、その個体または動物が現在病気であるかまたは将来的に病気になるとの認識を含む。
【０２４５】
「静脈圧上昇」は、循環系の衰弱により引き起こされる静脈での血液の貯留に起因して静脈系（静脈）において発生する血圧上昇をいうために使用される。
【０２４６】
本明細書中で使用される「個体」とは、任意の動物（哺乳動物を含む）、好ましくは、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、最も好ましくは、ヒトをいう。
【０２４７】
用語「応答」に関連して「阻害」または「阻害する」とは、化合物の不在下に対して、当該化合物の存在下で応答が減少するまたは妨害されることを意味する。
【０２４８】
「逆アゴニスト」は、レセプターの内因性形態または構成的に活性化された形態のいずれかに結合して、アゴニストの不在下で観察されるレセプターのベースラインの細胞内応答を減少させる物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
【０２４９】
「虚血性心疾患」とは、心臓の組織への酸素の欠乏によって引き起こされる障害をいう。本障害では、心臓の筋肉が罹患され、心臓が適切に汲み上げできなくなる。虚血性心疾患は、米国において最も一般的な心筋症である。
【０２５０】
「単離された」は、その本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合天然環境）から取り出された物質を意味する。例えば、生存している動物中に存在する、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然系中の共存する物質のいくらかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得るのであれば、そのベクターまたは組成物はその天然環境の一部ではないので、これらもなお単離されている。
【０２５１】
「ノックアウトマウス／ラット」は、本明細書中において、組換え手段によって、全ての他の遺伝子は影響を受けずに選択した単一の遺伝子が不活性化されている、または「ノックアウト」されているように操作されたマウスまたはラットを包含することが意図される。
【０２５２】
「既知のレセプター」は、そのレセプターに対して特異的である内因性リガンドが同定されている内因性レセプターを意味する。
【０２５３】
「リガンド」は、天然に存在するレセプターに対して特異的である分子を意味する。
【０２５４】
本明細書中で使用される用語「調整する（ＭＯＤＵＬＡＴＥ）」または「改変する（ＭＯＤＩＦＹ）」は、特定の活性、機能、または分子の量、質、または効果を増大または減少させることをいうことが意図される。
【０２５５】
「心筋梗塞」は、心筋のある領域への酸素の供給が不十分であることによるその領域の損傷または死をいう。心筋梗塞は、冠状動脈（血液および酸素を心筋にもたらす血管）の１つを遮断する血餅によりしばしば引き起こされる。この血餅により、血液および酸素が心臓のその領域に到達することが妨害され、その領域における心臓細胞の死に至る。
【０２５６】
「非オーファンレセプター」とは、同定されたリガンドに特異的な内因性の天然に存在する分子を意味し、ここでレセプターへのリガンドの結合は、細胞内シグナリング経路を活性化する。
【０２５７】
「オーファンレセプター」は、そのレセプターに対して特異的であるリガンドが同定されていない、または既知でない内因性レセプターを意味する。
【０２５８】
「部分アゴニスト」は、完全アゴニストよりも弱い程度／範囲で、それらがレセプターに結合した場合に細胞内応答を活性化させる物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
【０２５９】
「薬学的組成物」は、少なくとも１つの活性成分を含む組成物を意味し、それにより当該組成物は、哺乳動物（例えば（かつ限定ではない）ヒト）において仕様の効果的な結果についての研究に従う。当業者は、活性成分が、当業者の必要性に基づく所望の効果的な結果を有するか否かを決定するために適切な技術を理解し認識する。
【０２６０】
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二重鎖のいずれかの形態での１ヌクレオチドより多くのヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの配列を意味する。本発明のポリヌクレオチドは、任意の公知の方法（合成、組換え、エクスビボ生成、またはそれらの組み合わせを含む）によって、ならびに当該分野で公知の任意の精製方法を使用して、調製され得る。
【０２６１】
「ポリペプチド」は、そのポリマーの長さに関わらず、アミノ酸のポリマーをいう。従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を特定しないし、排除もしない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドは、用語ポリペプチドによって明白に包含される。
【０２６２】
「心筋梗塞後リモデリング（ＰＯＳＴ−ＭＹＯＣＡＲＤＩＡＬ  ＩＮＦＡＲＣＴＩＯＮ  ＲＥＭＯＤＥＬＩＮＧ）」。心筋梗塞のために心筋組織が喪失されることにより、過度の血行力学荷重が持続して心室にかかり続ける。心室肥大は、心臓が荷重の増大を補償する主要な機構の１つを構成する。しかし、血行力学過荷重に直面して心機能（ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）を維持するこの適応の能力は、限りがあり、慢性的に維持された場合、適応不良になる。徐々に、この適応肥大表現型は、肥大した心室が漸進的に拡張し、収縮機能が弱まるにつれて、明白な心不全に移行する。心臓における心筋梗塞に対する適応応答および適応不良応答の既往歴は、「リモデリング」といわれる。
【０２６３】
心筋梗塞後リモデリングに関して、病状の進行に関して情報となる多数のパラメーターがある：
（ａ）心肥大が増大する場合、それは有害である；
（ｂ）心筋細胞アポトーシスが増大する場合、それは有害である；
（ｃ）心臓駆出率が減少する場合、それは有害である；および
（ｄ）心室体積が増大する場合、それは有害である。
駆出率、肥大、および心室拡張の測定は全て、超音波心臓検査法を用いて、生存する動物（ラットおよびマウスを含む）においてなされ得る。代表的には、これらのパラメーターがまず注目される。しかし、関与する病原機構を正確に確認するためには、代表的には、心筋細胞アポトーシスを測定するためにこの動物をさらに屠殺する必要がある。
【０２６４】
「プライマー」は、本明細書中で、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、かつこの標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるために使用される、特定のオリゴヌクレオチド配列を示すために使用される。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素により触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として働く。
【０２６５】
「レセプター機能性」とは、細胞において刺激を受容し、効果を調整するレセプターの正常な作動をいい、これは、遺伝子転写の調節、イオンの流入または流出の調節、触媒反応の遂行、および／またはＧタンパク質による活性の調整を含むがこれらに限定されない。
【０２６６】
「心拍出量低下」は、心臓の心室の各収縮で循環系（動脈）に汲み上げられる血液が少なくなるように、欠陥心臓のポンピング能が低下したことをいうために使用される。
【０２６７】
「セカンドメッセンジャー」は、レセプター活性化の結果として生成される細胞内応答を意味する。セカンドメッセンジャーは、例えば、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、およびＣａ２＋を含み得る。セカンドメッセンジャー応答は、レセプター活性化の決定のために測定され得る。さらに、セカンドメッセンジャー応答は、候補化合物（例えば、逆アゴニスト、部分アゴニスト、アゴニスト、およびアンタゴニストを含む）の直接の同定のために測定され得る。
【０２６８】
「シグナル対ノイズ比」は、活性化、増幅、または刺激に応答して生じたシグナルであって、ここでこのシグナルが、非活性化、非増幅、または非刺激に応答してバックグラウンドノイズまたは基底レベルを上回るものを意味する。
【０２６９】
「スペーサー」は、遺伝子（例えば、目的のＧＰＣＲ）の最後のコドンまたは最後のアミノ酸の後ろで、目的のＧタンパク質の開始コドンまたは出発領域の前に位置する翻訳された数のアミノ酸を意味し、ここでこの翻訳された数のアミノ酸は、目的のＧタンパク質の出発領域とインフレームに配置される。翻訳されたアミノ酸の数は、１、２、３、４などであり得、そして２０までであり得る。
【０２７０】
用語「応答」と関連して「刺激」または「刺激する」は、応答が、化合物の不在下に対して、化合物の存在下で増大することを意味する。
【０２７１】
「被験体」は、霊長類（ヒトおよびヒヒを含むが、これらに限定されない）、ならびにペット動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、ラットおよびマウス）、および家畜動物（例えば、ウマ、ヒツジ、およびウシ）を意味する。
【０２７２】
本明細書中で使用される「治療有効量」とは、研究者、獣医、医師、または他の臨床家によって調べられている組織、系、動物、個体、またはヒトにおいて生物学的または医学的応答を惹起する活性化合物または薬学的薬剤の量をいう。これは、以下の１つ以上を含む：
（１）疾患の予防；例えば、疾患、状態、または障害の素因があり得るが、その疾患の病状または症状をまだ経験も提示もしていない個体における当該疾患、状態、または障害の予防、
（２）疾患の阻害；例えば、疾患、状態、または障害の病状または症状を経験しているかまたは提示している個体における当該疾患、状態、または障害の阻害（すなわち、当該病状および／または症状のさらなる発症の阻止）、および
（３）疾患の改善；例えば、疾患、状態、または障害の病状または症状を経験しているかまたは提示している個体における当該疾患、状態、または障害の改善（すなわち、当該病状および／または症状の逆転）。
【０２７３】
「トランスジェニックマウス／ラット」は、本明細書中において、選択された外来遺伝子、すなわち導入遺伝子をそれ自身の遺伝物質の一部として有するように組換え手段によって操作されたマウスまたはラットを包含することが意図される。
【０２７４】
「心室体積」は、心臓の左心室または右心室の心室の内部寸法の測定値をいうために使用される。欠陥心臓では、心室の拡大がある。
【０２７５】
（Ａ．序文）
以下の節の順序は、提示の効率のために記載され、続く開示または請求項に対する限定であることを意図しておらず、またそのような限定としてみなされるべきでない。
【０２７６】
（Ｂ．候補化合物のスクリーニング）
（１．包括（ｇｅｎｅｒｉｃ）ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術）
Ｇタンパク質レセプターが活性になる場合、これは、Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｏ）に結合し、Ｇタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。次いで、このＧタンパク質は、ＧＴＰアーゼとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解する。それにより、このレセプターは、正常条件下では、非活性化される。しかし、活性化されたレセプターは、ＧＤＰをＧＴＰに交換し続ける。ＧＴＰの加水分解可能でないアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳが、活性化されたレセプターを発現する膜への結合の増強をモニタリングするために使用され得る。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳが、リガンドの不在および存在下で膜へのＧタンパク質結合をモニタリングするために使用され得ることが報告されている。当業者に周知でありかつ利用可能である他の例のうち、このモニタリングの一例が、１９９５年にＴｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉによって報告された。このアッセイ系の好ましい使用は、候補化合物の初期スクリーニング用である。なぜなら、この系は、そのレセプターの細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質に関わらず、全てのＧタンパク質共役型レセプターに包括的に適用可能であるからである。
【０２７７】
（２．特定（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＧＰＣＲスクリーニング技術）
「包括」Ｇタンパク質共役型レセプターアッセイ（すなわち、アゴニストまたは逆アゴニストである化合物を選択するアッセイ）を用いて、候補化合物が一旦同定されれば、いくつかの実施形態では、その化合物がレセプター部位で相互作用したことを確認するさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「包括」アッセイにより同定された化合物は、レセプターに結合しないかもしれず、それよりも、単に細胞内ドメインからＧタンパク質を「脱結合（ｕｎｃｏｕｐｌｅ）」するものであり得る。
【０２７８】
（ａ．Ｇｓ、ＧｚおよびＧｉ）
Ｇｓは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方で、Ｇｉ（およびＧｚおよびＧｏ）は、アデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼは、ＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を触媒する；従って、Ｇｓタンパク質を結合する活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの細胞レベルの増大と関連している。他方で、Ｇｉ（またはＧｚ、Ｇｏ）タンパク質を結合する活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの細胞レベルの減少と関連している。一般的には、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」、Ｃｈｐｔ．８，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ら編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。従って、ｃＡＭＰを検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、レセプターに対する逆アゴニストである（すなわち、このような化合物は、ｃＡＭＰのレベルを減少させる）かどうかを決定するために使用され得る。ｃＡＭＰを測定することについて当該分野で公知の種々のアプローチが使用され得る；いくつかの実施形態では、好ましいアプローチは、ＥＬＩＳＡベースのフォーマットでの抗ｃＡＭＰ抗体の使用に依存する。使用され得る別のタイプのアッセイは、全細胞セカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。遺伝子におけるプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進することにより、遺伝子発現を駆動し、後者タンパク質または転写因子は、次いで、ｃＡＭＰ応答エレメントと呼ばれる特定部位でプロモーターに結合し、遺伝子の発現を駆動する。レポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）の前に複数のｃＡＭＰ応答エレメントを含有するプロモーターを有するレポーター系が、構築され得る。従って、活性化されたＧｓ連結レセプターはｃＡＭＰの蓄積を生じ、このことが、次いで、遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化する。次いで、レポータータンパク質（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）が、標準的な生化学アッセイ（Ｃｈｅｎら、１９９５）を用いて検出され得る。
【０２７９】
（ｂ．ＧｏおよびＧｑ）
ＧｑおよびＧｏは、酵素ホスホリパーゼＣの活性化と関連しており、引き続きこの酵素がリン脂質ＰＩＰ２を加水分解し、以下の２つの細胞内メッセンジャーを放出する：ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）。ＩＰ３の蓄積の増大は、Ｇｑ会合レセプターおよびＧｏ会合レセプターの活性化と関連している。一般的には、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」Ｃｈｐｔ．８，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ら編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。ＩＰ３蓄積を検出するアッセイは、候補化合物が、例えば、Ｇｑ会合レセプターまたはＧｏ会合レセプターに対する逆アゴニストである（すなわち、このような化合物は、ＩＰ３のレベルを減少させる）かどうかを決定するために使用され得る。Ｇｑ会合レセプターはまた、Ｇｑ依存性ホスホリパーゼＣが、ＡＰ１エレメントを含有する遺伝子の活性化を生じるので、ＡＰ１レポーターアッセイを用いて調べられ得る；従って、活性化されたＧｑ会合レセプターは、このような遺伝子の発現の増大の証拠となる。それにより、それに対する逆アゴニストが、このような発現の減少の証拠となり、そしてアゴニストは、このような発現における増大の証拠となる。このような検出のための市販のアッセイが利用可能である。
【０２８０】
（３．ＧＰＣＲ融合タンパク質）
内因性の構成的活性型ＧＰＣＲまたは非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲの使用は、定義により、当該レセプターは、それに結合される内因性リガンドの不在下でさえ活性であるので、逆アゴニストまたはアゴニストの直接的な同定のための候補化合物のスクリーニングにおける使用のために、興味深いスクリーニングの挑戦を提供する。従って、例えば、候補化合物の存在下での非内因性レセプターと、その化合物の不在下での非内因性レセプターとを区別するために、このような区別により、このような化合物が逆アゴニストであるかアゴニストであるか、あるいはこのようなレセプターに対して何の影響もないかに関する理解がなされることを目標として、いくつかの実施形態では、このような区別を増強し得るアプローチを使用することが好ましい。いくつかの実施形態では、好ましいアプローチは、ＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【０２８１】
一般には、非内因性ＧＰＣＲが、上述したアッセイ技術（ならびに当業者に公知の他の技術）を用いて構成的に活性化されたことが一旦決定されれば、内因性ＧＰＣＲと結合する優勢Ｇタンパク質を決定することが可能である。ＧＰＣＲへのＧタンパク質の結合は、評価され得るシグナリング経路を提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物発現系を用いてスクリーニングが行われることが好ましい。なぜなら、このような系は、その中に内因性Ｇタンパク質を有することが予期されるからである。従って、定義により、このような系では、非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲが連続的にシグナルを出す。いくつかの実施形態では、例えば、レセプターに対する逆アゴニストの存在下で、特にスクリーニングの情況において、レセプターが逆アゴニストと接触された場合にそのレセプター間をより容易に区別し得る見込みがより高くなるように、このシグナルが増強されることが好ましい。
【０２８２】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、非内因性ＧＰＣＲとのＧタンパク質結合の効力を増強することが意図される。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ融合タンパク質が、内因性の構成的活性型ＧＰＣＲまたは非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲのいずれかを用いたスクリーニングに好ましい。なぜなら、このようなアプローチは、このようなスクリーニング技術において生成されるシグナルを増強するからである。これは、有意な「シグナル対ノイズ」比を助長することにおいて重要である；このような有意な比は、本明細書中に開示される候補化合物のスクリーニングに好ましい。
【０２８３】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現に有用な構築物の構築は、当業者の範囲内である。市販の発現ベクターおよび系は、研究者の特定の必要性に適合し得る種々のアプローチを提供する。このようなＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の構築における重要な判断基準としては、ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列が共にインフレームにあること（好ましくは、内因性ＧＰＣＲの配列がＧタンパク質配列の上流にある）、およびＧＰＣＲの「停止」コドンが欠失または置換されて、ＧＰＣＲの発現の際に、Ｇタンパク質もまた発現され得るようになることが挙げられるが、これらに限定されない。ＧＰＣＲがＧタンパク質に直接的に連結され得るか、またはこれら二者間にスペーサー残基が存在し得る（好ましくは、約１２以下であるが、この数は当業者に容易に確認され得る）。便宜に基づいて、スペーサーを使用することが好ましい。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の作製前に、非内因性ＧＰＣＲに結合するＧタンパク質が同定されていることが好ましい。同定されているＧタンパク質が本発明の少数しか存在しないため、Ｇタンパク質の配列を含む構築物（すなわち、ユニバーサルＧタンパク質構築物、以下の実施例５（ａ）を参照のこと）がその中に内因性ＧＰＣＲ配列を挿入するために利用可能であることが好ましい；これは、異なる配列を有する種々の異なる内因性ＧＰＣＲの大規模スクリーニングの情況においてさらなる効率を提供する。
【０２８４】
上述のように、Ｇｉ、Ｇｚ、およびＧｏに結合する活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの形成を阻害することが予期され、これらのＧＰＣＲタイプに基づくアッセイを挑戦的なものとする［すなわち、ｃＡＭＰシグナルは活性化の際に減少し、従って、例えば、アゴニスト（これは、このシグナルをさらに減少させる）の直接的な同定を挑戦的なものとする］。本明細書中で開示されるように、これらのレセプタータイプについて、生存シクラーゼベースアッセイを確立する試みで、ＧＰＣＲの内因性のＧタンパク質に基づいていないＧＰＣＲ融合タンパク質を作出することが可能であることが確認されている。従って、例えば、内因性Ｇｉ共役型レセプターは、タンパク質に融合され得る−このような融合構築物は、発現の際に、内因性ＧＰＣＲを、例えば、「天然」Ｇｉタンパク質よりもむしろＧｓと結合するように「駆動」または「強行」し、これにより、シクラーゼベースアッセイが確立され得る。従って、Ｇｉ、Ｇｚ、およびＧｏ共役型レセプターについては、いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲ融合タンパク質が使用され、かつこのアッセイがアデニリルシクラーゼ活性の検出に基づく場合、Ｇｓ（または酵素アデニリルシクラーゼの形成を刺激する等価Ｇタンパク質）を用いて、融合構築物が確立され得ることが好ましい。
【０２８５】
（表Ｂ）
【０２８６】
【表２】
2005534319.tif 000004
Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、またはＧｏタンパク質と融合されたＧｑタンパク質を使用するＧタンパク質融合構築物は、等しく有効である。いくつかの実施形態では、好ましい融合構築物は、以下のようなＧｑタンパク質を用いて成し遂げられ得る。ここでこのＧｑタンパク質では、Ｇタンパク質α−サブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６アミノ酸が欠失され、そしてＧαｑのＣ末端の最後の５アミノ酸が、目的のＧタンパク質のＧαの相当するアミノ酸と置換されている。例えば、融合構築物は、Ｇｉタンパク質と融合されたＧｑ（６アミノ酸欠失）を有し得、「Ｇｑ／Ｇｉ融合構築物」を生じる。この融合構築物は、内因性Ｇｉ共役型レセプターをその非内因性Ｇタンパク質、Ｇｑに結合するように強行し、これにより、セカンドメッセンジャー（例えば、イノシトール三リン酸またはジアシルグリセロール）が、ｃＡＭＰ生成の代わりに測定され得る。
【０２８７】
（４．シグナルエンハンサーＧｓ共役型ＧＰＣＲを用いた標的Ｇｉ共役型ＧＰＣＲの共トランスフェクション（ｃＡＭＰベースアッセイ））
Ｇｉ共役型レセプターは、アデニリルシクラーゼを阻害することが公知であり、従って、ｃＡＭＰ生成のレベルを減少させ、このことにより、ｃＡＭＰレベルの評価を挑戦的なものとし得る。いくつかの実施形態では、活性化の際に優勢にＧｉに結合するレセプターの活性化の指標としてｃＡＭＰの生成の減少を測定するのに有効な技術は、シグナルエンハンサー（例えば、活性化の際にＧｓと優勢に結合する非内因性の構成的に活性化されたレセプター（例えば、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ；以下を参照のこと））を、Ｇｉ連結ＧＰＣＲと共トランスフェクトすることにより、成し遂げられ得る。明らかなように、Ｇｓ共役型レセプターの活性化は、ｃＡＭＰの生成の増大に基づいて決定され得る。Ｇｉ共役型レセプターの活性化は、ｃＡＭＰの生成の減少に至る。従って、共トランスフェクションアプローチは、これらの「反対の」作用を有利に活用することが意図される。例えば、非内因性の構成的に活性化されたＧｓ共役型レセプター（「シグナルエンハンサー」）の発現ベクター単独との共トランスフェクションは、ベースラインのｃＡＭＰシグナルを提供する（すなわち、Ｇｉ共役型レセプターはｃＡＭＰレベルを減少させるが、この「減少」は、構成的に活性化されたＧｓ共役型シグナルエンハンサーによって確立されたｃＡＭＰレベルのかなりの増大に対してである）。次いでシグナルエンハンサーを「標的レセプター」と共トランスフェクトすることにより、Ｇｉ共役型標的レセプターの逆アゴニストは、測定ｃＡＭＰシグナルを増大させ、一方、Ｇｉ共役型標的レセプターのアゴニストは、このシグナルを減少させる。
【０２８８】
このアプローチを用いて直接的に同定された候補化合物は、これらがシグナル増強レセプターを標的としないことを確実にすることが独立して評価されるべきである（これは、共トランスフェクトレセプターに対してスクリーニングする前または後になされ得る）。
【０２８９】
（Ｃ．医薬化学）
（候補化合物）
当該分野で公知の任意の分子が、当該分子が本発明のＧＰＣＲの活性を調整する（増大するまたは減少する）能力について試験され得る。活性を調整する化合物の同定のために、候補化合物は、レセプターを発現する細胞に直接提供され得る。
【０２９０】
本発明のこの実施形態は、レセプターの量または活性を調整する（例えば、阻害する、拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｚｅ）、またはアゴニスト作用する（ａｇｏｎｉｚｅ）分子について化学ライブラリーをスクリーニングするために十分に適合される。この化学ライブラリーは、ペプチドライブラリー、ペプチド模倣物ライブラリー（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、化学合成ライブラリー、組換え体（例えば、ファージディスプレイライブラリー、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリー）、他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどであり得る。本発明のこの実施形態はまた、生物学的材料（血漿および組織抽出物を含むがこれらに限定されない）を含む内因性候補化合物をスクリーニングするため、および生物学的活性を有することが公知の内因性化合物のライブラリーをスクリーニングするために十分に適合される。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、候補化合物の直接同定が、コンビナトリアル化学技術（それにより数千もの化合物がこのような分析のためにランダムに調製される）を介して生じた化合物と共に実施される。この候補化合物は、化学ライブラリーのメンバーであり得る。これは、任意の便宜的な数の個々のメンバー（例えば、数十から数百から数千から数百万の適切な化合物（例えば、ペプチド、ペプトイド、および他のオリゴマー化合物（環状または直鎖状）、および鋳型ベースのより低い分子量の分子（例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、炭素環式化合物および多環式化合物（例えば、ナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、炭水化物誘導体およびアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリル、および複素環（例えば、トリジン、インドール、チアゾリジンなど）））を含み得る。引用した数および列挙した化合物のタイプは例示であるが、限定ではない。好ましい化学ライブラリーは、低分子量の化学化合物および潜在的な治療剤を含む。
【０２９２】
例示の化学ライブラリーは、いくつかの供給源から市販されている（ＡｒＱｕｌｅ，Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ，ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）。いくつかの場合では、これらの化学ライブラリーは、メンバー化合物が付着されている基材上のライブラリーの各メンバーの正体をコードするコンビナトリアル戦略を用いて生成され、これにより有効なモジュレーターである分子の直接かつ即時の同定が可能になる。従って、多くのコンビナトリアルアプローチでは、化合物のプレート上の位置が、その化合物の組成を特定する。また、一例では、１つのプレート位置が、目的の相互作用を含むウェルへの投与によりスクリーニングされ得る化学物質を１〜２０からで有し得る。従って、調整が検出された場合、相互作用する対のプールをだんだん小さくして、調整活性についてアッセイし得る。このような方法により、多くの候補化合物がスクリーニングされ得る。
【０２９３】
使用するのに適切な多くの多様性ライブラリー（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）が当該分野で公知であり、本発明に従って試験される化合物を提供するために使用され得る。あるいは、ライブラリーは、標準的な方法を用いて構築され得る。さらに、より概括的な、構造的に束縛された有機多様性（例えば、非ペプチド）ライブラリーもまた、使用され得る。例示のために、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２を参照のこと）が使用され得る。
【０２９４】
本発明の別の実施形態では、コンビナトリアル化学が、本発明のＧＰＣＲのモジュレーターを同定するために使用され得る。コンビナトリアル化学は数十万もの化合物を含むライブラリーを作出し得、その化合物の多くは構造的に類似し得る。高スループットスクリーニングプログラムが、公知の標的に対する親和力についてこれらの巨大ライブラリーをスクリーニングし得るが、より小規模であるが最大の化学多様性を提供するライブラリーを達成する新規なアプローチが開発されている。（例えば、Ｍａｔｔｅｒ，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１２１９−１２２９を参照のこと）。
【０２９５】
コンビナトリアル化学の１つの方法であるアフィニティフィンガープリンティングは、規定群のタンパク質に対する結合親和力について低分子量分子の別個のライブラリーを試験するために以前、使用された。当該スクリーンにより得られたフィンガープリントは、他のタンパク質または目的のレセプター（本発明では、本発明のレセプター）に対する個々のライブラリーメンバーの親和力を推定するために使用される。このフィンガープリントを、目的のタンパク質と反応することが公知の他の化合物から得られたフィンガープリントと比較し、ライブラリー化合物が同様に反応するか否かを推定する。例えば、複合体またはタンパク質成分との相互作用について大きなライブラリーで全てのリガンドを試験するのではなく、その活性を有することが公知の他の化合物に類似のフィンガープリントを有するリガンドのみが試験され得る。（例えば、以下を参照のこと：Ｋａｕｖａｒら，１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ，１９９５，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．８：２５−２８；およびＫａｕｖａｒ，Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｄ．Ｋｕｒｔｚ．Ｌ．ＳｔａｎｌｃｅｒおよびＪ．Ｈ．Ｓｋｅｒｒｉｔｔ．編者，１９９５，ＡＯＡＣ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，３０５−３１２）。
【０２９６】
（モジュレーターとして同定された候補化合物）
一般に、このようなスクリーニングの結果は、独特のコア構造を有する化合物である；その後、これらの化合物は、好ましいコア構造の周囲でさらなる化学的改変に供せられて、それらの医薬特性をさらに増強させ得る。このような技術は、当業者に公知であり、本特許文書においては詳細には述べない。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、当該同定されたモジュレーターは、生物学的に利用可能である。薬物の経口生物学的利用能（ｏｒａｌ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）の推定のために、当業者に利用可能な多数のコンピューターアプローチが開発されている［Ｏｏｍｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（２００２）１５８７：１１８−２５；Ｃｌａｒｋ  ＆  Ｇｒｏｏｔｅｎｈｕｉｓ，Ｃｕｒｒ  ＯｐｉｎＤｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ（２００２）５：３８２−９０；Ｃｈｅｎｇら，Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ（２００２）２３：１７２−８３；Ｎｏｒｉｎｄｅｒ  ＆  Ｈａｅｂｅｒｌｅｉｎ，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ（２００２）５４：２９１−３１３；Ｍａｔｔｅｒら，Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ（２００１）４：４５３−７５；Ｐｏｄｌｏｇａｒ  ＆  Ｍｕｅｇｇｅ，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（２００１）１：２５７−７５；これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される）。さらに、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）が、薬物の経口投与後の哺乳動物身体（非ヒト霊長類およびヒト身体を含む）内における薬物分布の直接的な測定（経口生物学的利用能の評価を含む）を得るために、多数のグループによって首尾よく用いられている［Ｎｏｄａら，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ（２００３）４４：１０５−８；Ｇｕｌｙａｓら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ（２００２）２９：１０３１−８；Ｋａｎｅｒｖａら，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（１９９９）１４５：７６−８１；これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。また、以下の実施例１９を参照のこと。
【０２９８】
（Ｄ．薬学的組成物）
本発明は、そのような処置（または予防）を必要とする個体への、本発明のモジュレーターの治療有効量の投与による処置（および予防）の方法を提供する［また、例えば、以下を参照のこと：ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１（ＷＯ  ０２／０６６５０５として２００２年８月２９日に公開）；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。好ましい局面では、モジュレーターは精製される。好ましくは、個体は、動物であり、これは、以下のような動物を含むがこれらに限定されない：ウシ、ブタ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウスなど。そして好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【０２９９】
本発明のモジュレーターは、非ヒト動物［以下の実施例を参照のこと］および／またはヒトに、単独で、または薬学的もしくは生理学的に受容可能な組成物中で、投与され得、この組成物は、当業者に周知の技術を用いて適切なキャリアまたは賦形剤と混合される。適切な薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に利用可能である；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，（Ｏｓｌｏら，編）を参照のこと。
【０３００】
薬学的または生理学的に受容可能な組成物は、次いで、治療有効用量で提供される。治療有効用量とは、本明細書中に記載の方法（例示であって限定ではない）によって決定されるような、虚血性心疾患（心筋梗塞、心筋梗塞後リモデリング、および鬱血性心不全を含む）の症状または生理的状態の予防または改善を生じるのに十分なモジュレーター量をいう。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、本明細書中に記載の方法（例示であって限定ではない）によって決定されるような、心血管障害（心拍出量低下および静脈圧上昇を含む）の症状または生理的状態の予防または改善を生じるのに十分なモジュレーター量をいう。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、本明細書中に記載の方法（例示であって限定ではない）によって決定されるような、心血管機能の必要とされる変化（心肥大の減少、心臓駆出量の増大、心室体積の減少、および心筋細胞アポトーシスの減少を含む）を生じるのに十分なモジュレーター量をいう。
【０３０１】
本発明のモジュレーターは、単独で、または他の薬学的もしくは生理学的に受容可能な化合物と合わせて提供され得ることが明らかに考慮される。本発明の障害の処置のための他の化合物は、当該分野で現在周知である。本発明の一局面は、本明細書中に開示された実施形態に従った使用を包含し、１つ以上の以下からなる群から選択される薬剤をさらに含む：カプトプリル、マレイン酸エナラプリル、リニノプリル（ｌｉｎｉｎｏｐｒｉｌ）、ラミプリル、ペリンドプリル、フロセミド、トラセミド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、塩酸アミロライド、スピロノラクトン、アテノロール、ビソプロロール、カルベディロール、酒石酸メトプロロール、およびジゴキシン。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、虚血性心疾患は、心筋梗塞、心筋梗塞後リモデリング、および鬱血性心不全からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、心血管障害は、心拍出量低下および静脈圧上昇からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、心血管機能の必要とされる変化は、心肥大の減少、心臓駆出量の増大、心室体積の減少、および心筋細胞アポトーシスの減少からなる群から選択される。
【０３０３】
（投与経路）
適切な投与経路は、経口、経鼻、直腸、経粘膜または腸内投与、非経口送達（筋内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内、肺内（吸入）または眼内注射を含む）（当該分野で公知の方法を用いる）を含む。他の特に好ましい投与経路は、エアロゾルおよび貯留物処方物（ｄｅｐｏｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）である。発明された医薬の徐放性処方物（特に貯留物）は明らかに意図される。いくつかの実施形態では、投与経路は経口である。
【０３０４】
（組成物／処方物）
本発明に従って使用するための使用される薬学的または生理学的に受容可能な組成物および医薬は、１つ以上の生理学的に受容可能なキャリア（賦形剤および助剤を含む）を用いて従来の方法で処方され得る。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。
【０３０５】
本明細書中に記載の医薬のいくらかは、薬学的または生理学的に受容可能なキャリアおよび本発明の少なくとも１つのモジュレーターを含む。注射のために、本発明の薬剤は、水溶液中に、好ましくは、生理的適合性緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理塩類緩衝液（例えば、リン酸緩衝液または炭酸緩衝液）中に処方され得る。経粘膜投与のために、透過されるべき障壁に適切な浸透剤が処方において使用される。このような浸透剤は、当該分野で一般に知られている。
【０３０６】
経口摂取され得る薬学的または生理学的に受容可能な調製物は、ゼラチン製の押しばめカプセル、ならびにソフト密封カプセル（ｃａｐｔｕｌｓｅ）（ゼラチンおよび可塑材（例えば、グリセロールまたはソルビトール）製）を含む。押しばめカプセルは、充填剤（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）、および／または滑沢剤（例えば、滑石またはステアリン酸マグネシウム）、および必要に応じて安定剤と混合して、活性成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、活性化合物は、適切な液体（例えば、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与のための全処方物は、このような投与に適した投薬量でなければならない。
【０３０７】
経頬投与のために、組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはロゼンジの形態を取り得る。
【０３０８】
吸入投与のために、本発明に従って使用される化合物は、適切な推進ガス（例えば、二酸化炭素）の使用と共に、ネブライザー用に加圧パックからのエアロゾルスプレー提示の形態で便宜的に送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は、バルブを提供することにより決定されて、計量量（ｍｅｔｅｒｅｄ  ａｍｏｕｎｔ）を送達し得る。カプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチン製）（吸入器または注入器において使用される）が処方され得、これは、化合物および適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）の粉末混合物を含有する。
【０３０９】
化合物は、注射（例えば、ボーラス注射または連続注入）による非経口投与のために処方され得る。注射用処方物は、添加した保存剤と共に単位投薬量で提示され得る（例えば、アンプル中または複数投与容器中）。組成物は、水性ビヒクル中で懸濁液、溶液、またはエマルジョンのような形態をとり得、そして処方剤（例えば、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤）を含み得る。
【０３１０】
非経口投与のための薬学的または生理学的に受容可能な処方物は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。水性懸濁液は、懸濁液の粘度を上昇させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。必要に応じて、懸濁液はまた、適切な安定剤または化合物の溶解度を上昇させる薬剤を含有し、高濃度の溶液の調製を可能にし得る。
【０３１１】
あるいは、活性成分は、粉末または凍結乾燥形態であり得、これは、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌の無発熱物質の水）を用いて構成される。
【０３１２】
以前に記載される処方物に加えて、化合物はまた、貯留調製物として処方され得る。このような長期作用処方物は、移植（例えば、皮下もしくは筋内）によってまたは筋内注射によって投与され得る。従って、例えば、化合物は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば、受容可能なオイル中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に、または溶解度の低い（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ  ｓｏｌｕｂｌｅ）誘導体として（例えば、低溶解度塩として）、処方され得る。
【０３１３】
特定の実施形態では、化合物は、制御放出システムを介して送達され得る。１つの実施形態では、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋら，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−５７９）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ，編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ，編，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：８５８−８６３）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）の概説において議論されている。
【０３１４】
さらに、化合物は、徐放システム（例えば、治療剤を含有する固体疎水性ポリマー製半透過性マトリックス）を用いて送達され得る。種々の徐放性材料が確立されており、当業者に周知である。徐放性カプセルは、化学的性質に依存して、数週間から１００日以上まで化合物を放出し得る。
【０３１５】
治療剤の化学的性質および生物学的安定性に依存して、モジュレーター安定化のためのさらなる戦略が使用され得る。
【０３１６】
薬学的または生理学的に受容可能な組成物はまた、適切な固相またはゲル相のキャリアまたは賦形剤を含み得る。このようなキャリアまたは賦形剤の例は、以下を含むがこれらに限定されない：炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓ）誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）。
【０３１７】
（有効用量）
本発明における使用に適切な薬学的または生理学的に受容可能な組成物は、活性成分がそれらの意図された目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を包含する。より詳細には、治療有効量は、処置される被験体の存在する症状の進展を防ぐか、または症状を改善するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に、本明細書中に提供される詳細な開示を考慮して、十分に（ｗｌｌ）当業者の能力内にある。
【０３１８】
本発明の方法に用いられる任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイからまず概算され得る。例えば、用量は、インビトロ系において細胞死保護的であることが示された濃度の点または範囲を包含するかまたは網羅する循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方され得る。［インビトロアッセイおよびインビボ動物モデルについては、以下の実施例を参照のこと。］このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０３１９】
治療有効用量は、患者において症状の改善を生じる化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ５０を決定するため（検定集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（検定集団の５０％が治療的に有効な用量を決定するため））によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０３２０】
これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用する範囲の投薬量を処方する際に使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんど毒性のないかまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される投薬形態および使用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌら，１９７５，「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１を参照のこと）。
【０３２１】
投薬量および投薬間隔は、特定の状況に依存して、本発明の障害を予防または処置するのに十分である、活性化合物の血漿レベルを提供するように、個々に調整され得る。これらの効果を達成するのに必要な投薬量は、個体の特徴および投与経路に依存する。
【０３２２】
投薬間隔はまた、最小有効濃度についての値を用いて決定され得る。化合物は、当節の１０〜９０％の、好ましくは３０〜９９％、最も好ましくは５０〜９０％、最小有効濃度を上回る血漿レベルを維持するレジメンを用いて投与されるべきである。局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効局所濃度は、血漿濃度に関連しないものであり得る。
【０３２３】
投与される組成物の量は、もちろん、処置される被験体、被験体の体重、疾患の重篤度（ｔｈｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｆｆｌｉｃｔｉｏｎ）、投与様式、および指示医の判断に依存する。
【０３２４】
本発明のモジュレーターの量についての好ましい投薬量範囲は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。これは、所望の結果（本発明の虚血性心疾患の予防もしくは処置、本発明の心血管障害の予防もしくは処置、または本発明の心血管機能における必要とされる変化の遂行を含むがこれらに限定されない）を達成するために、一日または定期基準で投与され得る。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投薬量範囲は、０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、これらの一日投薬量は、一日が進行する間に定期的に、少量で送達または投薬され得る。これらの投薬量範囲は、単に好ましい範囲であり、本発明に対して限定することを意図されないことが留意される。
【０３２５】
（Ｅ．処置の方法）
本発明は、とりわけ、虚血性心疾患（心筋梗塞、心筋梗塞後リモデリング、および鬱血性心不全を含む）の予防または処置の方法であって、本発明のモジュレーターを当該処置を必要とする個体に提供する工程を包含する、方法に関する。本発明はまた、とりわけ、心血管障害（心拍出量低下および静脈圧上昇を含む）の予防または処置の方法であって、本発明のモジュレーターを当該処置を必要とする個体に提供する工程を包含する、方法に関する。本発明はまた、心血管機能の必要とされる変化（心肥大の減少、心臓駆出容積の増大、心室体積の減少、および心筋細胞アポトーシスの減少を含む）を行う方法であって、本発明のモジュレーターを当該処置を必要とする個体に提供する工程を包含する、方法に関する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口で生物学的に利用可能である。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、経口摂取される薬学的組成物中で個体に提供される。好ましくは、当該個体は、哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【０３２６】
（Ｆ．他の有用性）
心筋細胞保護的ＲＵＰ４１レセプター機能性を調整（すなわち、増大、減少、または遮断）する因子（ａｇｅｎｔ）は、候補化合物をＲＵＰ４１レセプターと接触させ、そしてＲＵＰ４１レセプター機能性に関するこの候補化合物の効果を決定することにより同定され得る。ＲＵＰ４１レセプターの機能性を調整する化合物の選択性は、ＲＵＰ４１レセプターに関するその効果を、他のレセプターに関するその効果と比較することによって評価され得る。ＲＵＰ４１レセプター機能性を調整する化合物の同定後、このような候補化合物は、それらの活性を確認または定量するために、他のアッセイ（インビボモデルを包含するが、これに限定されない）においてさらに試験され得る。ＲＵＰ４１レセプター機能性のモジュレーターは、正常型または異常型のＲＵＰ４１レセプターの機能性が関与する疾患および生理的状態の処置において治療的に有用である。
【０３２７】
心臓保護のモジュレーターである（すなわち、増大する、減少する、または遮断する）因子は、候補化合物をＲＵＰ４１レセプターと接触させ、そしてＲＵＰ４１レセプター機能性に関するこの候補化合物の効果を決定することにより同定され得る。いくつかの実施形態では、当該心臓保護は、心筋細胞死の防止または減少を包含する。いくつかの実施形態では、当該心筋細胞死は、心筋細胞アポトーシスを包含する。いくつかの実施形態では、当該心臓保護は、虚血に対する心筋保護を包含する。いくつかの実施形態では、当該心臓保護は、梗塞の大きさの減少を包含する。いくつかの実施形態では、当該心臓保護は、虚血後収縮回復の改善（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を包含する。いくつかの実施形態では、当該心臓保護は、悪性虚血誘発性不整脈の抑制を包含する。ＲＵＰ４１レセプターの機能性を調整する化合物の選択性は、ＲＵＰ４１レセプターに関するその効果を、他のレセプターに関するその効果と比較することによって評価され得る。ＲＵＰ４１レセプター機能性を調整する化合物の同定後、このような候補化合物は、それらの活性を確認または定量するために、他のアッセイ（インビボモデルを包含するが、これに限定されない）においてさらに試験され得る。ＲＵＰ４１レセプター機能性のモジュレーターは、正常型または異常型のＲＵＰ４１レセプターの機能性が関与する疾患および生理的状態の処置において治療的に有用である。
【０３２８】
本発明はまた、ＲＵＰ４１のモジュレーターまたはリガンドとして同定された本発明の化合物の放射性同位体標識バージョンに関し、これは、放射線画像化［例えば、以下を参照のこと：Ｌｅｍｓｔｒａら，Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ（２００３）４９：５５−６０；Ｍｙｅｒｓら，Ｊ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９９）１３：３５２−７；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］だけでなく、組織サンプル（ヒトを含む）においてＲＵＰ４１を局在化および定量するための、および放射性同位体標識化合物の阻害結合によりＲＵＰ４１リガンドを同定するためのアッセイ（インビトロおよびインビボの両方）においても有用である。このような放射性同位体標識化合物を包含する新規なＲＵＰ４１アッセイを開発することが、本発明のさらなる目的である。例示のためであって限定ではないが、放射線画像化によるＲＵＰ４１の可視化は、虚血性心疾患（心筋梗塞、心筋梗塞後リモデリング、および鬱血性心不全を含む）に対する危険性のある個体またはその進行を有する個体を同定し得る。
【０３２９】
本発明は、ＲＵＰ４１のモジュレーターまたはリガンドとして同定された本発明の化合物の放射性同位体標識バージョンを包含する。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、化合物の放射性同位体標識バージョンは、１つ以上の原子が、天然において代表的に見出される（すなわち、天然に存在する）原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置換（ｒｅｐｌａｃｅｄまたはｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）されること以外は、その化合物と同一である。本発明の化合物に取り込まれ得る適切な放射性核種は、２Ｈ（ジュウテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉを包含するが、これらに限定されない。当該の放射性標識化合物において取り込まれる放射性核種は、放射性標識化合物の特定の適用に依存する。例えば、インビトロＲＵＰ４１標識および競合アッセイのためには、３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓを取り込む化合物が、一般に、最も有用である。放射性画像化適用のためには、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒまたは７７Ｂｒが、一般に最も有用である。いくつかの実施形態では、放射性核種は、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および８２Ｂｒからなる群から選択される。
【０３３１】
放射性同位体を有機化合物に取り込むための合成方法が、本発明の化合物に適用可能であり、当業者に周知である。これらの合成方法（例えば、標的分子へのトリチウムの活性レベルの取り込み）は、以下の通りである：
Ａ．トリチウムガスでの触媒的還元−この手順は、通常、高い比活性の産物を生じ、ハロゲン化されたまたは不飽和の前駆体を必要とする。
Ｂ．水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）［３Ｈ］での還元−この手順は、割合安価であり、還元性官能基を含有する前駆体（例えば、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなど）を必要とする。
Ｃ．水素化リチウムアルミニウム（Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ａｌｕｍｉｎｕｍ  Ｈｙｄｒｉｄｅ）［３Ｈ］での還元−この手順は、ほぼ理論上の比活性で産物を提供する。これはまた、還元性官能基を含有する前駆体（例えば、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなど）を必要とする。
Ｄ．トリチウムガス曝露標識−この手順は、適切な触媒の存在下で、交換可能なプロトンを含有する前駆体をトリチウムガスに曝露することを包含する。
Ｅ．ヨウ化メチル（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｉｏｄｉｄｅ）［３Ｈ］を用いるＮ−メチル化−この手順は、通常、高い比活性のヨウ化メチル（３Ｈ）で適切な前駆体を処理することにより０−メチルまたはＮ−メチル（３Ｈ）産物を調製するために使用される。この方法は、一般に、より高い非活性（例えば、約７０〜９０Ｃｉ／ｍｍｏｌのような）を可能にする。
【０３３２】
１２５Ｉの活性レベルを標的分子に取り込むための合成方法は、以下を包含する：
Ａ．Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ反応および同様の反応−この手順は、アリールまたはへテロアリールのアミンをジアゾニウム塩（例えば、テトラフルオロホウ酸塩）に、および続いてＮａ１２５Ｉを用いて１２１Ｉ標識化合物に変換する。代表的な手順は、Ｚｈｕ，Ｄ．−Ｇ．および共同研究者によってＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９４３−９４８において報告された。
Ｂ．フェノールのオルト１２１Ｉヨウ素化（Ｉｏｄｉｎａｔｉｏｎ）−この手順は、Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｔ．Ｌ．および共同研究者によりＪ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９９，４２，Ｓ２６４−Ｓ２６６において報告されたように、フェノールのオルト位での１２５Ｉの取り込みを可能にする。
Ｃ．１２５Ｉでのアリールおよびへテロアリールブロミド交換−この方法は、一般に、二工程プロセスである。第一の工程は、トリアルキルスズハライドまたはヘキサアルキルジスズ［例えば、（ＣＨ３）３ＳｎＳｎ（ＣＨ３）３］の存在下で、例えば、Ｐｄ触媒反応［すなわち、Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）４］を用いて、またはアリールまたはへテロアリールのリチウムを通して、アリールまたはへテロアリールブロミドを対応するトリアルキルスズ中間体に変換することである。代表的な手順は、Ｂａｓ，Ｍ．−Ｄ．および共同研究者によってＪ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００１，４４，Ｓ２８０−Ｓ２８２において報告された。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、化合物の放射性同位体標識バージョンは、放射性核種を含む１つ以上の置換基の付加以外は、その化合物と同一である。いくつかのさらなる実施形態では、化合物はポリペプチドである。いくつかのさらなる実施形態では、化合物は、抗体またはそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかのさらなる実施形態では、当該抗体はモノクローナルである。適切な当該放射性核種は、２Ｈ（ジュウテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉを包含するが、これらに限定されない。当該の放射性標識化合物において取り込まれる放射性核種は、放射性標識化合物の特定の適用に依存する。例えば、インビトロＲＵＰ４１標識および競合アッセイのためには、３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓを取り込む化合物が、一般に、最も有用である。放射性画像化適用のためには、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒまたは７７Ｂｒが、一般に最も有用である。いくつかの実施形態では、放射性核種は、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および８２Ｂｒからなる群から選択される。
【０３３４】
放射性核種を含む１つ以上の置換基を付加する方法は、当業者の範囲内であり、以下を包含するが、これらに限定されない：酵素法による［Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｃ  ＪＪ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６９）１１３：２９９−３０５；Ｔｈｏｒｅｌｌ  ＪＩおよびＪｏｈａｎｓｓｏｎ  ＢＧ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（１９６９）２５１：３６３−９；これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］およびまたはクロラミン−Ｔ／ヨードゲン／ヨードビーズ法（Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ／Ｉｏｄｏｇｅｎ／Ｉｏｄｏｂｅａｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）による［Ｈｕｎｔｅｒ  ＷＭおよびＧｒｅｅｎｗｏｏｄ  ＦＣ，Ｎａｔｕｒｅ（１９６２）１９４：４９５−６；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ＦＣら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６３）８９：１１４−２３；これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］放射性同位体ヨウ素の付加。
【０３３５】
開示されたレセプターおよび方法の他の使用は、とりわけ本特許文書の検討に基づいて、当業者に明らかになる。
【０３３６】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の解明の目的のために提示するものであって、限定ではない。特定の核酸およびアミノ酸の配列が本明細書中に開示されるが、当業者は、以下に報告した同じまたは実質的に同様の結果を達成させながらもこれらの配列に対して微調整を行うことができると考えられる。本明細書中に開示した変異アプローチは、このアプローチ頼みではなく、代わりにアルゴリズムアプローチおよびヒトＧＰＣＲのＴＭ６領域内に位置する保存プロリン残基からの位置的距離に基づく。このアプローチが一旦確保されると、当業者は、本明細書中に開示の実質的に同じ結果（すなわち構成的活性化）を達成するようにそれらの微改変を行うことができると考えられる。このような改変アプローチは、本開示の範囲内であるとみなされる。
【０３３７】
以下の実施例は、例示の目的のために提供されるのであって、限定の手段としてではない。当業者は、本明細書中の開示に基づいて等価のアッセイおよび方法を設計し得、それらの全てが本発明の一部をなす。
【０３３８】
種々の発現ベクターが当業者に入手可能であるが、内因性および非内因性の両方のＧＰＣＲの使用の目的のために、いくつかの実施形態では、使用されるベクターはｐＣＭＶであることが好ましい。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定の下に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、１９９８年１０月１３日に寄託された。そのＤＮＡはＡＴＣＣによって試験され、そして生存可能であることが確定された。ＡＴＣＣは、ｐＣＭＶに、以下の寄託番号を指定した：ＡＴＣＣ  ＃２０３３５１）。いくつかの実施形態では、使用されるベクターは、アデノウイルス発現ベクターであることが好ましい。
【０３３９】
本発明のかかる事項に関し、かつ当業者に周知である組換えＤＮＡ技術は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；米国特許番号６，３９９，３７３；およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１（ＷＯ  ０２／０６６５０５として２００２年８月２９日に公開）（これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される）において見い出され得る。
【０３４０】
（実施例１）
（内因性ヒトＲＵＰ４１の全長クローニング）
開示されたヒトＲＵＰ４１を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース情報の使用に基づいて同定した。このデータベースを検索する間に、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ６６５８１のｃＤＮＡクローンを第７染色体由来のヒトゲノム配列として同定した。全長ＲＵＰ４１を、以下のプライマー：
【０３４１】
【化１】
2005534319.tif 000005
および鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲによってクローニングした。増幅を、製造者により提供された緩衝液システムと共にｒＴｔｈポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、０．２５ｍＭの各プライマー、および０．２ｍＭの４つの各々のヌクレオチドを用いて実施した。サイクル条件は、９４℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１．５分間の３０サイクルであった。５’ＰＣＲプライマーをキナーゼ処理し、そして１．３８ｋｂのＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングした。核酸配列については配列番号１を、そして推定アミノ酸配列については配列番号２を参照のこと。
【０３４２】
（実施例２）
（非内因性の構成的に活性化されたヒトＲＵＰ４１の調製）
当業者は、核酸配列の変異のための技術を選択できると、考えられる。以下に示すのは、ヒトＧＰＣＲの非内因性バージョンを作出するために使用されるアプローチである。ＲＵＰ４１について以下に開示した変異は、アルゴリズムアプローチに基づき、これにより、保存されたプロリン（またはそれに代わる内因性の保存的置換）残基（ＴＭ６／ＩＣ３境界近傍のＧＰＣＲのＴＭ６領域に位置する）から１６番目のアミノ酸（ＧＰＣＲのＩＣ３領域に位置する）が変異される（好ましくは、アラニン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンアミノ酸残基に、最も好ましくは、リジンアミノ酸残基に）。
【０３４３】
非内因性の構成的に活性化された全長ヒトＲＵＰ４１は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸３１２位のフェニルアラニン残基のリジンへの変異（Ｆ３１２Ｋ）によって成し遂げる。
【０３４４】
（１．トランスフォーマー部位特異的ＴＭ変異誘発）
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製は、とりわけ、トランスフォーマー部位特異的ＴＭ変異誘発キット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＴＭ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者の指示書に従って用いて、ヒトＧＰＣＲにおいて成し遂げられ得る。２つの変異誘発プライマーを使用し、最も好ましくは、リジン変異を作出するリジン変異誘発オリゴヌクレオチド、および選択マーカーオリゴヌクレオチドである。便宜上、ヒトＧＰＣＲに取り込まれるべきコドン変異もまた、標準型で記す。
【０３４５】
（２．クイックチェンジＴＭ部位特異的ＴＭ変異誘発）
非内因性ヒトＧＰＣＲの調製はまた、クイックチェンジＴＭ部位特異的ＴＭ変異誘発キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＴＭ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、製造者の指示書に従う）を用いることにより成し遂げられ得る。好ましくは、内因性ＧＰＣＲが鋳型として使用され、そして２つの変異誘発プライマーが使用される。同様に、最も好ましくは、リジン変異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチド（キットに含まれる）である。便宜上、新規ヒトＧＰＣＲに取り込まれるコドン変異およびそれぞれのオリゴヌクレオチドを標準型で記す。
【０３４６】
（実施例３）
（レセプター発現）
タンパク質発現のために、種々の細胞が当該分野で利用可能であるが、哺乳動物細胞またはメラニン保有細胞が使用されることが最も好ましい。この主な理由は、実用性に基づく、すなわち、ＧＰＣＲの発現のための、例えば酵母細胞の利用は、おそらくではあるが、このプロトコルに、哺乳動物系に関して進化しているレセプター共役、遺伝機構、および分泌経路を含まないかもしれない（実際、酵母の場合、含まない）非哺乳動物細胞を導入する−従って、非哺乳動物細胞で得られた結果は、使用の可能性はあるが、哺乳動物細胞またはメラニン保有細胞から得られる結果ほど好ましくはない。哺乳動物細胞のうち、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、２９３細胞、および２９３Ｔ細胞が特に好ましいが、使用される特定の哺乳動物細胞は、当業者の特定の必要性に基づき得る。メラニン保有細胞に関しては以下を参照のこと（実施例８を含む）。
【０３４７】
（ａ．一過性トランスフェクション）
１日目に、６×１０６／１０ｃｍ皿の２９３細胞（ウェル）を広げる。２日目に、２つの反応チューブを調製する（各チューブについて従う割合は、プレート当たりである）：チューブＡを、０．５ｍｌ無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中に４μｇ  ＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；レセプターｃＤＮＡを有するｐＣＭＶベクターなど）を混合することにより調製し；チューブＢを、０．５ｍｌ無血清ＤＭＥＭ中に２４μ１リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合することにより調製する。チューブＡおよびＢを倒立（数回）させて混合し、続いて３０〜４５分間室温でインキュベートする。この混合物を、「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。播種した２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて５ｍｌ無血清ＤＭＥＭを添加する。１ｍｌのトランスフェクション混合物を細胞に添加し、続いて３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。このトランスフェクション混合物を吸引により取り出し、続いて１０ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を添加する。細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。４８時間インキュベートした後、細胞を回収し、分析のために使用する。
【０３４８】
（ｂ．安定細胞系）
約１２×１０６の２９３細胞を１５ｃｍ組織培養プレート上に播種する。１０％ウシ胎児血清および１％ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含有するＤＭＥ高グルコース培地（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で増殖させる。２９３細胞播種の２４時間後（またはおよそ８０％集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで）、細胞を、１２μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクトする。この１２μｇのＤＮＡを、６０μ１のリポフェクタミンおよび２ｍＬのＤＭＥ高グルコース培地（無血清）と合わせる。この培地をプレートから吸引し、細胞を無血清培地で１回洗浄する。このＤＮＡ、リポフェクタミン、および培地混合物を、１０ｍＬの無血清培地と共にプレートに添加する。３７℃で４〜５時間インキュベートした後、この培地を吸引し、そして２５ｍｌの血清含有培地を添加する。トランスフェクションの２４時間後、この培地を再度吸引し、そして新鮮な血清含有培地を添加する。トランスフェクションの４８時間後、この培地を吸引し、そしてゲネチシン（Ｇ４１８薬物）を５００μｇ／ｍＬの最終濃度で含有する血清含有培地を添加する。このトランスフェクトされた細胞は、Ｇ４１８耐性遺伝子を含有するポジティブにトランスフェクトされた細胞についての選択を受ける。この培地を、選択が生じるにつれ４〜５日毎に取り替える。選択の間、細胞を増殖させて安定なプールを作製するか、または安定クローン選択のために分割する。
【０３４９】
（実施例４）
（ＧＰＣＲ活性化の決定のためのアッセイ）
ヒトＧＰＣＲの活性化の評価のために、種々のアプローチが利用可能である。以下は、例示的である；当業者は、当業者の必要性に優先的に有利である技術を決定できると、考えられる。
【０３５０】
（１．膜結合アッセイ：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ）
Ｇタンパク質共役型レセプターが活性状態にある場合（リガンド結合または構成的活性化のいずれかの結果として）、このレセプターは、Ｇタンパク質に結合し、ＧＤＰの放出および続いてＧタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。Ｇタンパク質−レセプター複合体のαサブユニットは、ＧＴＰアーゼとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解する。その時点で、通常、このレセプターは非活性化される。活性化されたレセプターは、ＧＤＰをＧＴＰに対して交換し続ける。加水分解可能でないＧＴＰアナログである［３５Ｓ］ＧＴＰγＳは、活性化レセプターを発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合の増強を実証するために使用され得る。活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用いる利点は、以下である：（ａ）全てのＧタンパク質共役型レセプターに対して包括的に利用可能である；（ｂ）膜表面で近位であり、細胞内カスケードに影響する分子を選択する確率が低くなる。
【０３５１】
このアッセイは、Ｇタンパク質共役型レセプターが、関連レセプターを発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合を刺激する能力を利用する。従って、このアッセイは、内因性ＧＰＣＲおよび非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲに対する候補化合物をスクリーニングする直接同定方法において使用され得る。このアッセイは包括的であり、全てのＧタンパク質共役型レセプターでの薬物発見に対する適用を有する。
【０３５２】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１から約２０ｍＭのＭｇＣｌ２（この量は結果の最適化のために調整される（２０ｍＭが好ましい））（ｐＨ７．４）、約０．３から約１．２ｎＭの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（この量は結果の最適化のために調整される（１．２が好ましい））を有する結合緩衝液、および１２．５〜７５μｇ膜タンパク質（この量は最適化のために調整される）および１０μＭ  ＧＤＰ（この量は結果の最適化のために変更され得る）中で、１時間インキュベートされる。次いで、コムギ麦芽凝集素ビーズ（２５μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、そしてこの混合物を室温でさらに３０分インキュベートする。次いで、このチューブを１５００×ｇで、室温で５分間遠心分離し、次いでシンチレーションカウンターで計数する。
【０３５３】
（２．アデニリルシクラーゼ）
フラッシュプレートＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｆｌａｓｈ  ＰｌａｔｅＴＭ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ｋｉｔ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）（細胞ベースアッセイについて設計された）は、粗製原形質膜との使用のために改変され得る。このフラッシュプレートウェルは、シンチラントコーティング（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ  ｃｏａｔｉｎｇ）を含み得、これはまた、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体を含有する。ウェル中に生成されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合についての直接競合によって定量され得る。以下を、レセプターを発現する細胞全体におけるｃＡＭＰレベルの変化の測定のための簡潔なプロトコルとして供する。
【０３５４】
一過性トランスフェクションのおよそ２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を回収する。培地を慎重に吸引して取り除き、捨てる。１０ｍｌのＰＢＳを、各細胞皿に静かに添加し、続いて慎重に吸引する。１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍｌのＰＢＳを、各プレートに添加する。細胞をプレートからピペットで除き、そして細胞懸濁液を５０ｍｌ円錐状遠心分離管に採集する。次いで、細胞を室温で１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを、適当容積のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）中に慎重に再懸濁する。次いで、細胞を血球計を用いて計数し、そしてさらなるＰＢＳを添加し、適当数の細胞（最終容量約５０μｌ／ウェル）を得る。
【０３５５】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）［１１ｍｌ検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー１２５Ｉ  ｃＡＭＰ（５０μｌ）を含む］を製造者の指示書に従って調製および維持する。アッセイ緩衝液（Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ）をスクリーニングのために新たに調製し、これは、５０μ１の刺激緩衝液（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）、３ｕｌの試験化合物（１２μＭ最終アッセイ濃度）、および５０μ細胞を含んだ。アッセイ緩衝液は、使用するまで氷上で保存する。このアッセイを、５０μ１のｃＡＭＰ標準を適当なウェルに添加し、続いて５０ｕｌのＰＢＳＡをＨ−１１のウェルおよびＨ１２のウェルに添加することにより開始する。５０μｌの刺激緩衝液を全てのウェルに添加する。ＤＭＳＯ（または選択された候補化合物）を、３μｌの化合物溶液を分配し得るピンツールを用いて適当なウェルに添加し、最終アッセイ濃度は１２μＭ試験化合物および１００μｌ全アッセイ容積であった。次いで、この細胞をウェルに添加し、そして室温で６０分間インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μｌの検出混合物（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）をウェルに添加する。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートし、続いてＷａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターで計数する。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値を、各アッセイプレート内に含まれたｃＡＭＰ標準曲線から外挿する。
【０３５６】
（３．Ｇｉ共役型標的ＧＰＣＲについての細胞ベースｃＡＭＰ）
ＴＳＨＲは、活性化の際にｃＡＭＰの蓄積を引き起こすＧｓ共役型ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３の変異（すなわち、アラニン残基のイソロイシン残基への変更）により構成的に活性化される。Ｇｉ共役型レセプターは、アデニリルシクラーゼを阻害し、従って、ｃＡＭＰ生成のレベルを減少させることが予期され、これは、ｃＡＭＰレベルの評価を挑戦的なものとし得る。Ｇｉ共役型レセプターの構成的活性化の指標としてのｃＡＭＰの生成の減少を測定するための有効な技術は、最も好ましくは、Ｇｉ連結標的ＧＰＣＲと共に「シグナルエンハンサー」としての非内因性の構成的に活性化されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）（または内因性の構成的活性型Ｇｓ共役型レセプター）を共トランスフェクトすることにより成し遂げられて、ｃＡＭＰのベースラインレベルを確立し得る。Ｇｉ共役型レセプターの非内因性バージョンを作出する際に、標的ＧＰＣＲのこの非内因性バージョンを、次いで、シグナルエンハンサーと共トランスフェクトし、この物質をスクリーニングに使用され得るものとする。本発明者らは、ｃＡＭＰアッセイが使用される場合にシグナルを有効に生成させるために、このようなアプローチを使用する；このアプローチは、好ましくは、Ｇｉ共役型レセプターに対する候補化合物の直接的な同定において使用される。Ｇｉ共役型ＧＰＣＲについて、このアプローチが使用される場合、標的ＧＰＣＲの逆アゴニストがｃＡＭＰシグナルを増大させ、そしてアゴニストがｃＡＭＰシグナルを減少させることが留意される。
【０３５７】
１日目に、２×１０４  ２９３細胞／ウェルを広げる。２日目に、２日目に、２つの反応チューブを調製する（各チューブについて従う割合は、プレート当たりである）：チューブＡを、１．２ｍｌ無血清ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中に哺乳動物細胞にトランスフェクトされた各レセプターＤＮＡ２μｇを、全体で４μｇのＤＮＡ［例えば、ｐＣＭＶベクター；変異ＴＨＳＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）を有するｐＣＭＶベクター；ＴＳＨＲ−Ａ６２３ＩおよびＧＰＣＲなど）で混合することにより調製し；チューブＢを、１．２ｍｌ無血清ＤＭＥＭ中に１２０μ１リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合することにより調製する。次いで、チューブＡおよびＢを倒立（数回）させて混合し、続いて３０〜４５分間室温でインキュベートする。この混合物を、「トランスフェクション混合物」と呼ぶ。播種した２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて１０ｍｌ無血清ＤＭＥＭを添加する。２．４ｍｌのトランスフェクション混合物を細胞に添加し、続いて３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。このトランスフェクション混合物を吸引により取り出し、続いて２５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を添加する。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。２４時間インキュベート後、細胞を回収し、分析のために使用する。
【０３５８】
しかし、フラッシュプレートＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｆｌａｓｈ  ＰｌａｔｅＴＭ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ｋｉｔ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）（細胞ベースアッセイについて設計された）は、当業者の必要性に依存して、粗製原形質膜との使用のために改変され得る。このフラッシュプレートウェルは、シンチラントコーティング（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ  ｃｏａｔｉｎｇ）を含み、これはまた、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体を含有する。ウェル中に生成されたｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ抗体への放射性ｃＡＭＰトレーサーの結合についての直接競合により定量され得る。以下を、レセプターを発現する細胞全体におけるｃＡＭＰレベルの変化の測定のための簡潔なプロトコルとして供する。
【０３５９】
一過性トランスフェクションのおよそ２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を回収する。培地を慎重に吸引して取り除き、捨てる。１０ｍｌのＰＢＳを、各細胞皿に静かに添加し、続いて慎重に吸引する。１ｍｌのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍｌのＰＢＳを、各プレートに添加する。細胞をプレートからピペットで除き、そして細胞懸濁液を５０ｍｌ円錐状遠心分離管に採集する。次いで、細胞を室温で１，１００ｒｐｍで５分間遠心分離する。細胞ペレットを、適当容積のＰＢＳ（約３ｍｌ／プレート）中に慎重に再懸濁する。次いで、細胞を血球計を用いて計数し、そしてさらなるＰＢＳを添加し、適当数の細胞（最終容量約５０μｌ／ウェル）を得る。
【０３６０】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍｌ検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー１２５Ｉ  ｃＡＭＰ（５０μｌ）を含む）を製造者の指示書に従って調製および維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために新たに調製し、これは、５０μ１の刺激緩衝液、３μｌの試験化合物（１２μＭ最終アッセイ濃度）、および５０μ細胞を含んだ。アッセイ緩衝液は、使用するまで氷上で保存され得る。このアッセイを、５０μ１のｃＡＭＰ標準を適当なウェルに添加し、続いて５０μｌのＰＢＳＡをＨ−１１のウェルおよびＨ１２のウェルに添加することにより開始し得る。５０μｌの刺激緩衝液を全てのウェルに添加する。選択された化合物（例えば、ＴＳＨ）を、３μｌの化合物溶液を分配し得るピンツールを用いて適当なウェルに添加し、最終アッセイ濃度は１２μＭ試験化合物および１００μｌ全アッセイ容積である。次いで、この細胞をウェルに添加し、そして室温で６０分間インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μｌの検出混合物（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ）をウェルに添加する。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートし、続いてＷａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターで計数した。次いで、ｃＡＭＰ／ウェルの値を、各アッセイプレート内に含まれるｃＡＭＰ標準曲線から外挿する。
【０３６１】
（４．レポーターベースアッセイ）
（ａ．ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｓ会合レセプター））
２９３細胞および２９３Ｔ細胞を、１ウェル当たり２×１０４細胞の密度で９６ウェルプレート上に広げ、そして後日、製造者の指示書に従ってリポフェクタミン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。ＤＮＡ／脂質混合物を、以下のようにして、各６ウェルトランスフェクションのために調製する：１００μｌのＤＭＥＭ中２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μｌのＤＭＥＭ中の２μ１の脂質と静かに混合した（この２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは、８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド２００ｎｇ、内因性レセプターまたは非内因性レセプターを含むｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単独５０ｎｇ、およびＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中ＧＰＲＳ）１０ｎｇからなった）。この８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを、以下のようにして調製した：ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌを、ラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）においてＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位でクローニングすることにより得た。８コピーのｃＡＭＰ応答エレメントをアデノウイルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８（７  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８８３（１９９６）を参照のこと）からＰＣＲにより得、そしてＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクターにＫｐｎ−ＢｇｌＶ部位でクローニングし、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターを生じさせた。この８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドを、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得られるルシフェラーゼ遺伝子とＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位で置換することにより生成した。室温で３０分のインキュベーションの後、このＤＮＡ／脂質混合物を４００μｌのＤＭＥＭで希釈し、そして１００μ１の希釈混合物を各ウェルに添加した。１０％ＦＣＳを有する１００μｌのＤＭＥＭを、細胞培養インキュベーター中に４時間のインキュベーション後に、各ウェルに添加する。後日、トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＣＳを有する２００μｌ／ウェルのＤＭＥＭで交換する。８時間後、ＰＢＳで１回洗浄した後、このウェルを、フェノールレッドを含まない１００μｌ／ウェルのＤＭＥＭで交換する。翌日、ルシフェラーゼ活性を、ＬｕｃＬｉｔｅＴＭレポーター遺伝子アッセイキット（ＬｕｃＬｉｔｅＴＭ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）（Ｐａｃｋａｒｄ）を製造者の指示書に従って使用して測定し、そして１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭシンチレーションおよびルミネセンスカウンター（１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（Ｗａｌｌａｃ）で読み取る。
【０３６２】
（ｂ．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ会合レセプター））
Ｇｑ刺激を検出する方法は、それらのプロモーター中にＡＰ１エレメントを含有する遺伝子の活性化を引き起こすＧｑ依存性ホスホリパーゼＣの公知の特性に依存する。ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ  ＡＰ−１シス−レポーティングシステム（ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ  ＡＰ−１  ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＃２１９０７３）が、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関して上述したプロトコルに従って（但し、リン酸カルシウム沈降物の成分が４１０ｎｇ  ｐＡＰｌ−Ｌｕｃ、８０ｎｇ  ｐＣＭＶ−レセプター発現プラスミド、および２０ｎｇ  ＣＭＶ−ＳＥＡＰであったことを除いて）使用され得る。
【０３６３】
（ｃ．ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ会合レセプター））
Ｇｑ刺激を検出する１つの方法は、それらのプロモーター中に血清応答因子を含有する遺伝子の活性化を引き起こすＧｑ依存性ホスホリパーゼＣの公知の特性に依存する。ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ  ＳＲＦ−Ｌｕｃ−レポーティングシステム（ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ  ＳＲＦ−Ｌｕｃ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が、例えばＣＯＳ７細胞においてＧｑ共役型活性についてアッセイするために使用され得る。哺乳動物トランスフェクションＴＭキット（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＴＭ  Ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＃  ２００２８５）を製造者の指示書に従って用いて、系のプラスミド成分および内因性または非内因性ＧＰＣＲをコードする示した発現プラスミドで、細胞をトランスフェクトする。簡潔には、４１０ｎｇ  ＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇ  ｐＣＭＶ−レセプター発現プラスミドおよび２０ｎｇ  ＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌アルカリホスファターゼ発現プラスミド；アルカリホスファターゼ活性を、トランスフェクトした細胞の培地中で測定し、サンプル間のトランスフェクション効率における変動について調節する）を、製造者の指示書に従ってリン酸カルシウム沈降物中で合わせる。沈降物の半分を、９６ウェルプレート中で３ウェルにわたって等しく分配し、２４時間、無血清培地中の細胞上に維持する。最後の５時間、示したとおり、細胞を１μＭ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎとインキュベートする。次いで、細胞を溶解し、ＬｕｃｌｉｔｅＴＭ  Ｋｉｔ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＃  ６０１６９１１）および「Ｔｒｉｌｕｘ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」液体シンチレーションルミネセンスカウンター（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（Ｗａｌｌａｃ）を製造者の指示書に従って使用してルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍＴＭ  ２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて分析され得る。
【０３６４】
（細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ（Ｇｑ会合レセプター））
１日目に、レセプター（内因性および／または非内因性）を含む細胞を、２４ウェルプレート上に播種し得る（通常、１×１０５細胞／ウェル（この数は最適化され得る））。２日目に、５０μｌ無血清ＤＭＥＭ／ウェル中ＤＮＡ０．２５μｇおよび５０μｌ無血清ＤＭＥＭ／ウェル中２μ１リポフェクタミンをまず混合することによりトランスフェクトし得る。この溶液を静かに混合し、室温で１５〜３０分間インキュベートする。細胞を０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄し、そして４００μｌの無血清培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に添加する。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で３〜４時間インキュベートし、次いで、このトランスフェクション培地を取り出し、１ｍｌ／ウェルの正規増殖培地と交換する。３日目に、細胞を３Ｈ−ミオイノシトールで標識する。簡潔には、培地を取り出し、細胞を０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄する。次いで、０．５ｍｌイノシトール非含有／無血清培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）をウェルにつき添加し、０．２５μＣｉの３Ｈ−ミオイノシトール／ウェルとし、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１６〜１８時間（ｏ／ｎ）インキュベートする。４日目に、細胞を０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄し、０．４５ｍｌのアッセイ培地（イノシトール非含有／無血清培地１０μＭパルギリン１０ｍＭ塩化リチウムを含む）または０．４ｍｌのアッセイ培地および５０μｌの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を１０μｌの最終濃度に添加する。次いで、細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を０．５ｍｌ  ＰＢＳで洗浄し、そして２００μｌの新鮮／氷冷停止溶液（１Ｍ  ＫＯＨ；１８ｍＭ  Ｎａ−ホウ酸塩；３．８ｍＭ  ＥＤＴＡ）をウェルにつき添加する。この溶液を５〜１０分間または細胞を溶解するまで氷上に保持し、次いで、２００μｌの新鮮／氷冷中和溶液（７．５％  ＨＣＬ）により中和する。次いで、この溶解物を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、そして１ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２）をチューブにつき添加する。この溶液を１５秒間ボルテックスにかけ、上の相を、Ｂｉｏｒａｄ  ＡＧ１−Ｘ８ＴＭアニオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）に適用する。まず、この樹脂を１：１．２５（Ｗ／Ｖ）で水で洗浄し、そして上の相の０．９ｍｌをカラム上に流す。このカラムを１０ｍｌの５ｍＭミオイノシトールおよび１０ｍｌの５ｍＭ  Ｎａ−ホウ酸塩／６０ｍＭ  Ｎａ−ギ酸塩で洗浄する。イノシトール三リン酸を、２ｍｌの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムで、１０ｍｌのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアル中に溶出させる。カラムを、１０ｍｌの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムで洗浄することにより再生し、ｄｄ  Ｈ２Ｏで２回リンスし、そして水中で４℃で保存する。
【０３６５】
（実施例５）
（融合タンパク質調製）
（ａ．ＧＰＣＲ：Ｇｓ融合構築物）
構成的活性型ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計を、以下のように成し遂げた：ラットＧタンパク質Ｇｓα（長形；Ｉｔｏｈ，Ｈ．ら，８３  ＰＮＡＳ  ３７７６（１９８６））の５’末端および３’末端の両方を、そこにＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）配列を含むように操作した。正確な配列（隣接するＨｉｎｄＩＩＩ配列を含む）の確認後、配列全体を、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｖ７９５−２０）に、そのベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてサブクローニングすることにより両方向ではめ込んだ。Ｇｓα配列の正確な向きを、ｐｃＤＮＡ３．１（−）へのサブクローニング後に決定した。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ配列でラットＧｓα遺伝子を含有する改変ｐｃＤＮＡ３．１（−）を検証した；このベクターは、いまや、「ユニバーサル」Ｇｓαタンパク質ベクターとして入手可能であった。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に種々の周知の制限部位を含み、従って、Ｇｓタンパク質の上流に、内因性の構成的活性型ＧＰＣＲのコード配列を挿入する能力を有利に提供する。この同じアプローチは、他の「ユニバーサル」Ｇタンパク質ベクターを作出するために使用され得、もちろん、当業者に公知の他の市販または専売のベクターは使用され得る−重要な判断基準は、ＧＰＣＲの配列が、Ｇタンパク質の配列の上流にあり、かつこれとインフレームであることである。
【０３６６】
（ｂ．Ｇｑ（６アミノ酸欠失）／Ｇｉ融合構築物）
Ｇｑ（ｄｅｌ）／Ｇｉ融合構築物の設計は、以下のように成し遂げられ得る：Ｎ末端の６アミノ酸（Ｇαｑサブユニットのアミノ酸２位から７位（ＴＬＥＳＩＭの配列を有する））が欠失され、そしてＣ末端の５アミノ酸（ＥＹＮＬＶの配列を有する）がＧαｉタンパク質の対応するアミノ酸（ＤＣＧＬＦの配列を有する）と置換される。この融合構築物は、以下のプライマー：
【０３６７】
【化２】
2005534319.tif 000006
および鋳型としてプラスミド６３３１３（Ｐｌａｓｍｉｄ  ６３３１３）（これは、血球凝集素タグと共にマウスＧαｑ野生型バージョンを含む）を用いるＰＣＲによって得られる。小文字のヌクレオチドは、スペーサーとして含まれる。
【０３６８】
ＴａｑＰｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＰｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が、以下のサイクル（ステップ２から４を３５回繰り返す）による増幅のために使用される：９５℃で２分；９５℃で２０秒；５６℃で２０秒；７２℃で２分；および７２℃で７分。このＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ）（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定する。融合構築物の配列を含むＴＯＰＯクローンからの挿入片を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位で二段階クローニングプロセスによって両方向にはめ込む。また、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５６２５（２００２年９月６日にＷ００２０６８６００として公開、この開示内容は本明細書によってその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０３６９】
（実施例６）
（プロトコル：逆アゴニストおよびアゴニストの直接同定）
（Ａ．［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ）
いくつかの実施形態では、内因性ＧＰＣＲが、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストとしての候補化合物の直接同定のために使用される。いくつかの実施形態では、内因性の構成的活性型ＧＰＣＲまたは非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲが、例えば、逆アゴニストまたはアゴニストとしての候補化合物の直接同定のために使用される。いくつかの実施形態では、内因性の構成的活性型ＧＰＣＲまたは非内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲを含むＧＰＣＲ融合タンパク質が、例えば、逆アゴニストとしての候補化合物の直接同定のために使用される。当該実施形態では、以下のアッセイプロトコルを、当該直接同定のために提供する。
【０３７０】
（膜調製）
いくつかの実施形態では、目的の、かつ候補化合物（例えば、逆アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニストとしての）の直接同定に使用するＧＰＣＲ／融合タンパク質を含む膜を、好ましくは、以下のように調製する。
【０３７１】
（ａ．材料）
「膜掻き取り緩衝液（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｒａｐｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）」は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡで構成される（ｐＨ７．４）；「膜洗浄緩衝液（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）」は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡで構成される（ｐＨ７．４）；「結合緩衝液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で構成される（ｐＨ７．４）。
【０３７２】
（ｂ．手順）
全ての材料をこの手順を通して氷上で保持する。まず、培地を細胞のコンフルエントな単層から吸引し、続いて１０ｍｌ冷ＰＢＳでリンスし、続いて吸引する。その後、５ｍｌの膜掻き取り緩衝液を添加して細胞を掻き取る；この後に、細胞抽出物を５０ｍｌ遠心分離管に移す（４℃で１７分間２０，０００ｒｐｍで遠心分離する）。その後、上清を吸引し、そしてペレットを３０ｍｌ膜洗浄緩衝液中に再懸濁し、続いて４℃で１７分間２０，０００ｒｐｍで遠心分離する。次いで、上清を吸引し、そしてペレットを結合緩衝液中に再懸濁する。次いで、これをＢｒｉｎｋｍａｎ  ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）（全ての材料が懸濁するまで１５〜２０秒バースト）を用いてホモジナイズする。これを、本明細書中で「膜タンパク質（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）」という。
【０３７３】
（ブラッドフォードタンパク質アッセイ）
ホモジナイゼーション後、膜のタンパク質濃度をブラッドフォードタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）を用いて決定する（タンパク質は、、約１．５ｍｇ／ｍｌに希釈し、アリコートに分け、そして後の使用のために凍結し得る（−８０℃）；凍結した場合、使用のためのプロトコルは以下の通りである：アッセイの日に、凍結した膜タンパク質を室温で解凍し、続いてボルテックスにかけ、次いで約５〜１０秒間約１２×１，０００ｒｐｍでＰｏｌｙｔｒｏｎでホモジナイズする；多重調製のために、ホモジナイザーは、異なる調製物のホモジナイゼーションの間に完全に清浄されるべきであることに留意した）。
【０３７４】
（ａ．材料）
結合緩衝液（上記の通り）；ブラッドフォード染料試薬（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）；ブラッドフォードタンパク質標準（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）を、製造者の指示書（Ｂｉｏｒａｄ，ｃａｔ．ｎｏ．５００−０００６）に従って使用する。
【０３７５】
（ｂ．手順）
二連のチューブを調製し、一方は膜を含み、そして一方はコントロール「ブランク」とする。各々は、８００μｌ結合緩衝液を含んだ。その後、１０μｌのブラッドフォードタンパク質標準（１ｍｇ／ｍｌ）を各チューブに添加し、次いで、１０μｌの膜タンパク質を１つのチューブに添加する（ブランクには添加しない）。その後、２００μ１のブラッドフォード染料試薬を各チューブに添加し、次いで各々をボルテックスにかける。５分後、これらチューブを再度ボルテックスにかけ、そしてその中の材料をキュベットに移す。次いで、これらキュベットをＣＥＣＩＬ  ３０４１分光光度計を用いて５９５の波長で読み取る。
【０３７６】
（直接同定アッセイ）
（ａ．材料）
ＧＤＰ緩衝液（ＧＤＰ  Ｂｕｆｆｅｒ）は、３７．５ｍｌ結合緩衝液および２ｍｇ  ＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｇ−７１２７）からなり、続いて結合緩衝液中の一連の希釈により０．２μＭ  ＧＤＰを得た（各ウェル中のＧＤＰ最終濃度は０．１μＭ  ＧＤＰであった）；候補化合物を含む各ウェルは、最終容積２００μｌを有し、１００μ１  ＧＤＰ緩衝液（最終濃度０．１μＭ  ＧＤＰ）、５０μｌ膜タンパク質（結合緩衝液中）、および５０μｌ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）（結合緩衝液中）（２．５μｌ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ／１０ｍｌ結合緩衝液）からなる。
【０３７７】
（ｂ．手順）
候補化合物を、好ましくは、９６ウェルプレートフォーマットを用いて、スクリーニングする（これらは、−８０℃で凍結され得る）。膜タンパク質（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（またはコントロールとして、ＧＰＣＲ融合タンパク質を除く発現ベクターを有する膜）を、懸濁されるまで、短時間、ホモジナイズする。次いで、上述のブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて、タンパク質濃度を決定する。次いで、膜タンパク質（およびコントロール）を結合緩衝液中０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇ／ウェル）。その後、１００μｌＧＤＰ緩衝液をＷａｌｌａｃ  ＳｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐＴＭ（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに添加した。次いで、５ｕｌピンツールを使用し、５μｌの候補化合物をこのようなウェルに移す（すなわち、２００μｌの総アッセイ容量中の５μｌは、候補化合物の最終スクリーニング濃度が１０μＭであるように、１：４０比である）。再度、コンタミネーションを避けるため、各移転工程後、ピンツールを３つのレザバー（水（１×）を含むレザバー、エタノール（１×）を含むレザバー、および水（２×）を含むレザバー）中でリンスしなければならない−過度の液体は、各リンス後にツールから振り落とし、ペーパーおよびキムワイプでふき取るべきである。その後、５０μｌの膜タンパク質を各ウェル（ＧＰＣＲ融合タンパク質を有さない膜を含むコントロールウェルもまた使用した）に添加し、そして室温で５〜１０分間プレインキュベートする。その後、結合緩衝液中［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）５０μｌを各ウェルに添加し、続いて室温で６０分間振盪器上でインキュベートさせる（本実施例では、再度、プレートを箔で覆った）。次いで、本アッセイを、プレートを２２℃で１５分間４０００ｒｐｍで遠心させることにより停止する。次いで、このプレートを、８チャンネルマニフォールドで吸引し、プレートカバーで密閉する。次いで、このプレートを、セッティング「Ｐｒｏｔ．＃３７」を（製造者の指示書に従って）用いてＷａｌｌａｃ  １４５０上で読み取る。
【０３７８】
（Ｂ．サイクリックＡＭＰアッセイ）
候補化合物を、例えば、逆アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニストとして、直接同定するための別のアッセイアプローチは、シクラーゼベースのアッセイを使用することにより成し遂げられる。直接同定に加えて、このアッセイアプローチが、上記の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアプローチからの結果の確証を提供する独立したアプローチとして使用され得る。
【０３７９】
好ましくは、改変型フラッシュプレートＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｆｌａｓｈ  ＰｌａｔｅＴＭ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ  ｋｉｔ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＰ００４Ａ）が、以下のプロトコルに従って、内因性または構成的活性型のＧＰＣＲに対する逆アゴニストおよびアゴニストとしての候補化合物を直接同定するために使用される。
【０３８０】
トランスフェクションの約３日後に、トランスフェクトされた細胞を採集する。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中で懸濁細胞をホモジナイズすることにより、膜を調製する。ホモジナイゼーションを、約１０秒間、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭを用いて氷上で実施する。得られたホモジネートを、４℃で１５分間４９，０００×ｇで遠心分離する。次いで、得られたペレットを、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液中に再懸濁し、１０秒間ホモジナイズし、続いて４℃で１５分間４９，０００×ｇで遠心分離する。次いで、得られたペレットを、使用するまで−８０℃で保存する。直接同定スクリーニングの日に、膜ペレットを室温でゆっくりと解かし、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中に再懸濁し、０．６０ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を得る（再懸濁した膜は、使用するまで氷上に置いておく）。
【０３８１】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液［１１ｍｌ検出緩衝液に対して２μＣｉのトレーサー１２５Ｉ  ｃＡＭＰ（１００μｌ）を含む］を、製造者の指示書に従って調製および維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために新たに調製し、これは、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ユニット／ｍｌ  クレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５０μＭ  ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。次いで、アッセイ緩衝液を、使用するまで氷上に保存する。
【０３８２】
候補化合物（凍結している場合、室温で解かす）を、４０μｌ膜タンパク質（３０μｇ／ウェル）および５０μｌのアッセイ緩衝液と共に、好ましくは、９６ウェルプレートウェル（３μｌ／ウェル；１２μＭ最終アッセイ濃度）に添加する。次いで、この混合物を、穏やかに振盪させながら、室温で３０分間インキュベートする。
【０３８３】
インキュベーション後、１００μｌの検出緩衝液を各ウェルに添加し、続いて２〜２４時間インキュベートする。次いで、プレートを「Ｐｒｏｔ．＃３１」を（製造者の指示書に従って）用いてＷａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭプレート読み取り器で計数する。
【０３８４】
例示のためであって限定はしないが、代表的なスクリーニングアッセイプレート（９６ウェルフォーマット）の結果を図１に示す。各棒は、各ウェル中で異なる化合物についての結果を示し、「標的レセプター」は、内因性の構成的活性型Ｇｓ共役型ＧＰＣＲのＧｓα融合タンパク質構築物である。図１に示した代表的な結果はまた、各プレートの平均結果（「ｍ」）に基づく標準偏差を提供し、そして一次スクリーンからの「リード」としての逆アゴニストの選択について平均＋２任意優先度（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、応答％を少なくとも平均プレート応答だけ減少させる（−２標準偏差）候補化合物の選択を包含する。逆に、一次スクリーンからの「リード」としてのアゴニストの選択についての任意優先度は、応答％を少なくとも平均プレート応答だけ増大させる（＋２標準偏差）候補化合物の選択を包含する  これらの選択プロセスに基づいて、以下のウェル中の候補化合物はそれぞれ、ウェルＡ２、ウェルＧ９中で当該内因性ＧＰＣＲに対する推定の逆アゴニスト（化合物Ａ）およびアゴニスト（化合物Ｂ）として直接同定された。図１を参照のこと。明確にするため以下のことが留意される：これらの化合物は、このＧＰＣＲについての内因性リガンドに関するいかなる知識も有することなく直接同定された。化合物結合親和力ではなくレセプター機能に基づくアッセイ技術に集中することにより、本発明者らは、このレセプターの機能的活性を減少させ得る化合物（化合物Ａ）ならびにレセプターの機能的活性を増大させ得る化合物（化合物Ｂ）を確かめ得る。
【０３８５】
（実施例７）
（細胞内カルシウム濃度の測定のための蛍光測定画像化プレート読取器（ＦＬＩＰＲ）アッセイ）
それぞれのクローン系からの標的レセプター（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（実験）で安定にトランスフェクトされた細胞およびｐＣＭＶ（陰性コントロール）で安定にトランスフェクトされた細胞を、翌日、アッセイのために、完全培地（ＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを有する）を含んだポリ−Ｄ−リジン前処理した９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃３５６６４０）中に、５．５×１０４細胞／ウェルで播種する。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，＃Ｆ１４２０２）インキュベーション緩衝液ストックを調製するために、１ｍｇ  Ｆｌｕｏ４−ＡＭを４６７μｌ  ＤＭＳＯおよび４６７μｌ  プルオロニック酸（Ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，＃Ｐ３０００）中に溶解し、１ｍＭストック溶液を得、これは、１ヶ月間−２０℃で保存され得る。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは、蛍光カルシウム指標染料である。
【０３８６】
候補化合物を、洗浄緩衝液（１×  ＨＢＳＳ／２．５ｍＭ  プロブニシド（Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中で調製する。
【０３８７】
アッセイの時に、培地をウェルから除去し、そして細胞を１００μｌの４μＭ  Ｆｌｕｏ４−ＡＭ／２．５ｍＭ  プロブニシド（Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ’）（Ｓｉｇｍａ，＃Ｐ８７６１）／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／完全培地（ｐＨ７．４）に播種する。３７℃／５％ＣＯ２でのインキュベーションを６０分間進行させる。
【０３８８】
１時間のインキュベーション後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーション緩衝液を除去し、そして細胞を、１００μｌ洗浄緩衝液で２回洗浄する。各ウェルに、１００μｌ洗浄緩衝液を入れておく。このプレートを、３７℃／５％ＣＯ２で６０分間インキュベーターに戻す。
【０３８９】
ＦＬＩＰＲ（蛍光測定画像化プレート読取器（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を、３０秒目に５０μｌ候補化合物を添加し、さらなる１５０秒間に候補化合物によって誘発された細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）の一過性の変化を記録するようにプログラムする。ＦＬＩＰＲソフトウェアを使用してアゴニスト活性を決定するために、総蛍光変化計数を使用する。この機器ソフトウェアは、ゼロ点で等価の開始読取を得るように蛍光読取を標準化する。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、標的レセプターを含む細胞は、混交のＧα１５／１６またはキメラＧｑ／Ｇｉαユニットをさらに含む。
【０３９１】
前出は、安定にトランスフェクトされた細胞を用いるアゴニスト活性のためのＦＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者は、アンタゴニスト活性を特徴付けるためにこのアッセイを容易に改変し得る。当該当業者はまた、代替的に、一過的にトランスフェクトされた細胞が使用され得ることもまた容易に認識する。
【０３９２】
（実施例８）
（メラニン保有細胞技術）
メラニン保有細胞は、下等脊椎動物で見い出される皮膚細胞である。それらは、メラノソームと呼ばれる色素沈着小器官を含む。メラニン保有細胞は、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）活性化の際に微小管網に沿ってこれらのメラノソームを再分布させ得る。この色素運動の結果は、細胞の明白な明化または暗化である。メラニン保有細胞では、Ｇｉ共役型レセプターの活性化から生じる細胞内ｃＡＭＰのレベルの減少により、メラノソームが細胞の中心に移動し、色の劇的な明化を生じる。Ｇｓ共役型レセプターの活性化後に次いでｃＡＭＰレベルが上がると、メラノソームが再分散され、そして細胞は再度暗くなる。Ｇｑ共役型レセプターの活性化から生じるジアシルグリセロールのレベルの増大もまた、この再分散を誘発し得る。さらに、この技術はまた、特定のレセプターチロシンキナーゼの研究に適応される。メラニン保有細胞の応答は、数分のレセプター活性化の間に起こり、単純で強い色の変化を生じる。この応答は、通常の吸光度マイクロプレート読取器または適度なビデオ画像化システムを用いて容易に検出され得る。他の皮膚細胞とは違い、メラニン保有細胞は、神経堤に由来し、シグナリングタンパク質の完全補体を発現するようである。特に、この細胞は、極度に広範な範囲のＧタンパク質を発現し、そのためほとんど全てのＧＰＣＲを機能的に発現し得る。
【０３９３】
メラニン保有細胞は、ＧＰＣＲに対して化合物（天然リガンドを含む）を同定するために使用され得る。この方法は、特定の刺激に応答してそれらの色素を分散させ得るかまたは凝集させ得る色素細胞系の試験細胞を導入し、そしてＧＣＰＲをコードする外因性クローンを発現させることにより、実施され得る。ＧＰＣＲの活性化が色素分散を誘発する場合、刺激（例えば、メラトニン）により、色素が試験細胞内で凝集される色素沈着の初期段階が生じる。しかし、ＧＰＣＲの活性化が色素凝集を誘発する場合、刺激で細胞を刺激することにより、色素が分散される色素沈着の初期段階が生じる。次いで、この試験細胞を、化学化合物と接触させ、そして細胞における色素沈着が色素沈着の初期段階から変化したか否かを決定する。ＧＰＣＲに結合する候補化合物（リガンドを含むがこれらに限定されない）に起因する細胞中の色素の分散はペトリ皿上で暗くなり、細胞中の色素の凝集は明るくなる。
【０３９４】
材料および方法は、米国特許番号５，４６２，８５６および米国特許番号６，０５１，３８６の開示内容に従う。これらの特許の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【０３９５】
細胞を９６ウェルプレート中に播種する（１プレート当たり１レセプター）。トランスフェクションの４８時間後、各プレート上の細胞の半分を１０ｎＭメラトニンで処理する。メラトニンは、メラニン保有細胞で内因性Ｇｉ共役型レセプターを活性化させ、細胞にそれらの色素を凝集させる。細胞の残りの半分を、無血清培地０．７×Ｌ−１５（Ｇｉｂｃｏ）に移す。１時間後、無血清培地中の細胞は、色素分散状態になるが、メラトニン処理細胞は、色素凝集状態である。この時点で、細胞を候補化合物の用量応答（ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で処理する。播種したＧＰＣＲが候補化合物に結合する場合、メラニン保有細胞は化合物に応答して変色を受けると予期される。レセプターがＧｓまたはＧｑのいずれかの共役型レセプターであり、かつ候補化合物がアゴニストである場合、メラトニン凝集メラニン保有細胞は色素分散を受ける。逆に、レセプターがＧｉ共役型レセプターであり、かつ候補化合物がアゴニストである場合、色素分散細胞が用量依存性色素凝集を受けると予期される。
【０３９６】
（実施例９）
（ヒトＲＵＰ４１の組織分布）
（Ａ．アフィメトリックス遺伝子チップ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＧＥＮＥＣＨＩＰ）（登録商標）技術）
遺伝子チップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）（登録商標）技術を用いてＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）の発現レベルをモニタリングする、オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイの設計および製造のために、アミノ酸配列をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘに提出した。また、このマイクロアレイ上には、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｄからのヒト脳組織を特徴付けたプローブまたは市販により得たプローブもまた存在した。製造者の指示書に従って、ＲＮＡサンプルを増幅させ、標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせ、データ分析した。
【０３９７】
ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いて、ヒトＲＵＰ４１の発現プロフィールを問合せした（ｉｎｔｔｅｒｏｇｅｔｅ）。図２Ａを参照のこと。図２Ａは、種々の組織におけるヒトＲＵＰ４１の発現レベルを表すプロットである。このプロットを調べると、脳および心臓においてＲＵＰ４１が発現されることを示す。脳を除いた組織では、ＲＵＰ４１は、心臓によって選択的に発現される。ＲＵＰ４１の選択的発現は、ＲＵＰ４１のモジュレーターによる潜在的に望ましくない副作用の機会を減らすことができる。
【０３９８】
ドットブロットからの結果（図２Ｂ）およびノーザンブロットからの結果（図２Ｃ）は、ＧｅｎｅＣｈｉｐからの結果と一致する。
【０３９９】
（Ｂ．ＲＴ−ＰＣＲ）
ヒトＲＵＰ４１の発現を質問するために、ＲＴ−ＰＣＲを適用した。使用したオリゴヌクレオチドは、ＲＵＰ４１特異的であり、そしてｃＤＮＡを鋳型として使用した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、製造者の指示書に従って４０μｌ反応での増幅のために使用した。ＰＣＲ条件は、９６℃で２分間、続いて９６℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で２分間を３０サイクル、続いて７２℃で１０分間であった。ＲＴ−ＰＣＲ産物を分析するために、反応物の２０μｌを１．５％アガロースゲル上に載せた。
【０４００】
５’ＰＣＲプライマーは、以下の配列を有する：
【０４０１】
【化３】
2005534319.tif 000007
（配列番号１１）。
【０４０２】
３’ＰＣＲプライマーは、以下の配列を有する：
【０４０３】
【化４】
2005534319.tif 000008
（配列番号１２）。
【０４０４】
増幅されたＤＮＡフラグメントは、３９０塩基対の大きさである。
【０４０５】
例示のために、ヒトＲＵＰ４１についてのＲＴ−ＰＣＲを、以下、図７に示す。ここでは、鬱血性心不全を有する患者由来の心臓組織におけるＲＵＰ４１の発現を、正常心機能を有する患者由来の心臓組織におけるＲＵＰ４１の発現と比較する。
【０４０６】
当業者は、マウスＲＵＰ４１およびラットＲＵＰ４１についても同様にＲＴ−ＰＣＲを実施できると、考えられる。
【０４０７】
（Ｃ．ノーザンブロット）
ヒトＲＵＰ４１発現のノーザンブロット分析を、当業者に周知の手順によって実施した。配列番号１のヌクレオチド１，１０４−１，５３８に対応するヒトＲＵＰ４１コード領域フラグメントをプローブとして使用した。
【０４０８】
（実施例１０）
（インサイチュハイブリダイゼーション：成体ラット心臓におけるＲＵＰ４１発現）
インサイチュハイブリダイゼーションは、成体ラット心臓における広範な心筋発現を実証した（図３）。アンチセンスＲＵＰ４１放射性標識プローブは、心臓の全心室においてＲＵＰ４１発現を検出する。アンチセンスコントロール（ＧＡＰＤＨ）プローブおよび心房特異的（心房性ナトリウム利尿因子、ＡＮＦ）プローブをさらなる切片で使用し、心臓切片のプローブ標識の特異性を実証した。
【０４０９】
（インサイチュハイブリダイゼーション）
固定した心臓組織を、５０：５０混合のＯＣＴ：Ａｑｕａ  Ｍｏｕｎｔ（ＶＷＲ，＃４１７９９−００８，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）中に包埋し、ドライアイス／エタノール中に凍結した。このブロックを、凍結切片化まで−８０℃で保存し、凍結切片化時に、１０ミクロンの連続した切片を調製した。凍結切片化後、この組織切片を、密封したスライド箱中に−２０℃で保存した。
【０４１０】
配列番号６のラットＲＵＰ４１ポリヌクレオチドを、ＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にＳＰ６プロモーターとＴ７プロモーターとを両側とした部位でサブクローニングした。配列番号６のポリヌクレオチドに相補的な［３５Ｓ］−放射性標識アンチセンスラットＲＵＰ４１  ｍＲＮＡプローブを、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＲｉｂｏＰｒｏｂｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（＃Ｐ１４６０；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを本質的に製造者の指示書に従って用いて調製した。コントロールの放射性標識センスプローブを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを同様に用いて調製した。
【０４１１】
固定した組織切片を解かし、室温での一連の固定後インキュベーション（ＰＢＳで３分間；１０％ホルマリンで１０分間；ＰＢＳで１０分間；およびＰＢＳで１０分間）にすぐに供した。
【０４１２】
次いで、組織切片を、透過処理およびアセチル化に供した。このために、組織切片を３７℃で１０分間プロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）（０．００１％  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中））とインキュベートし、続いて、室温で５分間水で洗浄した。次いで、組織切片を、トリエタノールアミン緩衝液（０．１Ｍ  ＴＥＡ、ｐＨ８．０）と室温で５分間インキュベートし、続いて、２．５％無水酢酸（０．１Ｍ  ＴＥＡ  ｐＨ８．０中）と室温で５分間インキュベートした。次いで、組織切片を、室温で２時間、２×ＳＳＣ；５０％エタノール；９５％エタノール；および１００％エタノールの各々とインキュベートした。次いで、組織切片を、翌日のハイブリダイゼーションまで風乾し、乾燥下に置いた。
【０４１３】
組織切片のハイブリダイゼーションを、一切片当たり８０〜１００μｌの容量の０．４７Ｍ  ＮａＣｌ、５４％ホルムアミド中で６０℃で２０時間実施した。放射性標識したプローブを１×１０７ｃｐｍ／ｍｌで使用した。次いで、組織切片を、４×ＳＳＣで４回、各回室温で１０分間洗浄した。ハイブリダイズしていないプローブを３７℃で３０分間のＲＮａｓｅ  Ａ（２０μｇ／ｍｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ  ８．０中）とのインキュベーションで消化した。次いで、組織切片を、２×ＳＳＣで２回、各回室温で５分間、洗浄し、続いて１×ＳＳＣで、室温で１０分間洗浄し、続いて０．５×ＳＳＣで、室温で１０分間洗浄した。次いで、組織切片を、０．１×ＳＳＣで、６５℃で３０分間洗浄し、続いて０．１×ＳＳＣで、室温で５分間洗浄し、アルコール中で脱水した。
【０４１４】
次いで、ハイブリダイゼーションを受けた組織切片をＸ線フィルムに露出し、ＲＵＰ４１ハイブリダイゼージョンシグナルをオートラジオグラフィーにより可視化した。このために、組織切片を、１日間、４日間、次いで１週間、Ｂｉｏｍａｘ  ＭＲフィルムに露出した。オートラジオグラフィー後、組織切片を、ＮＴＢ−２液体エマルジョン（ＶＷＲ，＃ＩＢ１６５４４３３，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を用いてエマルジョン浸漬した。エマルジョン浸漬した組織切片を、１週間エマルジョンに曝露し、次いで展開させた。展開後、組織切片を、ビスベンズイミド（０．００１％（ＰＢＳ中））で対比染色しカバーガラスをかぶせた。組織切片を、暗視野集光レンズ（銀染は白く見える）およびＤＡＰＩフィルターキューブ（蛍光ビスベンズイミド対比染色を観察するため）を用いて写真撮影した。
【０４１５】
ＧＡＰＤＨおよび心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）の部分ラット配列から生成したプローブを放射性標識し、ハイブリダイズするのに同一の方法を使用した。
【０４１６】
（実施例１１）
（肥大新生児ラット心室筋細胞におけるＲＵＰ４１のダウンレギュレーション）
新生児ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を、以前に記載された通りに調製した［Ａｄａｍｓ，ＪＷら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１：１１７９−８６；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。簡潔には、１〜２日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット仔から心臓を得、この心臓をコラゲナーゼで消化し、そして筋細胞をＰｅｒｃｏｌｌ勾配を通過させることにより精製した。細胞を、１％ゼラチンでプレコーティングした組織培養皿上に播種し、４：１  ＤＭＥＭ／１９９培地（ｍｅｄｉｕｍ−１９９）（１０％ウマ血清、５％  ウシ胎児血清、および抗生物質（１００ユニット／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充）中で一晩維持した。プレート培地中で１８時間後、筋細胞を維持培地（ＤＭＥＭ／１９９培地（ｍｅｄｉｕｍ  １９９）＋抗生物質）で洗浄し、死細胞およびデブリを除去し、そして実験の期間中、維持培地を補給した。
【０４１７】
図４Ａ。ＲＴ−ＰＣＲは、２４時間無血清条件下で維持した新生児ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）におけるＲＵＰ４１転写物の発現を実証した。ＲＵＰ４１転写物レベルは、フェニレフリン（ＰＥ）または新生児ウシ血清（ＮＣＳ）を培地に添加して２４時間後に劇的に低下し、そしてこれは、肥大表現型に相関する。フェニレフリンを１００μＭで使用した（＋２μＭでβアドレナリンレセプターを遮断し、それによりαアドレナリンレセプターの選択的活性化を可能にする）。新生児ウシ血清を１０％で使用した。Ｇ３ＰＤＨ  ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ反応のために使用される鋳型が等しいレベルであること、およびゲルローディングのコンシステンシー（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を実証した。
【０４１８】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
上述のＮＲＶＭから単離した総ＲＮＡを、製造者の指示書に従ってＰＣＲキット（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）のＲＴを使用する逆転写ＤＮＡ（ＲＴ−ＤＮＡ）の生成のための鋳型として使用した。ＲＵＰ４１発現を、ＰＣＲによりＲＴ−ＤＮＡサンプルにおいて検出した。ＰＣＲ条件は、９６℃で２分間、続いて９６℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１０分間の３０サイクル、続いて７２℃で１０分間であった。ＲＴ−ＰＣＲ産物を分析するために、反応物の２０μｌを１．５％アガロースゲル上に載せた。
【０４１９】
５’ＰＣＲプライマーは、以下の配列を有する：
【０４２０】
【化５】
2005534319.tif 000009
（配列番号１１）。
【０４２１】
３’ＰＣＲプライマーは、以下の配列を有する：
【０４２２】
【化６】
2005534319.tif 000010
（配列番号１２）。
【０４２３】
増幅されたＤＮＡフラグメントは、３９０塩基対の大きさである。
【０４２４】
図４Ｂ。ノーザンブロットは、肥大因子（フェニレフリン（ＰＥ）、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）、および新生児ウシ血清（ＮＣＳ）を含む）で２４時間処理した後のＮＲＶＭにおけるＲＵＰ４１  ｍＲＮＡ発現のレベルの減少を実証した。フェニレフリンを１００μＭで使用した（＋２μＭでβアドレナリンレセプターを遮断し、それによりαアドレナリンレセプターの選択的活性化を可能にする）。ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸を１００ｎＭで使用した。プロスタグランジンＦ２αを１μＭで使用した。新生児ウシ血清を１０％で使用した。心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）（これは、心筋細胞肥大の遺伝子マーカーである）は、全ての肥大刺激に応答してアップレギュレートされる。２８Ｓ  ｒＲＮＡのメチレンブルー染色は、ＲＮＡの完全性および等しいローディングを実証する。
【０４２５】
（ノーザンブロット分析）
以前に記載されるように、１〜２日齢ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を単離し、培養皿に播種した。種々の処理後、総ＲＮＡを、製造者の指示書に従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離した。１５μｇの総ＲＮＡを、ホルムアルデヒド含有アガロースゲル上で電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写させた。配列番号６のヌクレオチド５３−４８８に相当するラットＲＵＰ４１コード領域フラグメントを、ノーザンブロット分析のためのプローブとして使用した。３２Ｐ−標識したプローブを標準的な方法を用いて生成し、５５℃で膜にハイブリダイズさせた。膜を高いストリンジェンシーで洗浄し、２〜４日間、−８０℃でＸ線フィルムに露出した。
【０４２６】
（実施例１２）
（圧負荷肥大に罹患したマウス心臓におけるＲＵＰ４１のダウンレギュレーション）
図５上。ＲＵＰ４１  ｍＲＮＡは、圧負荷誘発性心肥大のインビボマウスモデルにおいてダウンレギュレートされた。７日間、横大動脈狭窄（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ａｏｒｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）に罹患したマウス（ＴＡＣ）または偽手術マウス（偽）の左心室から単離した総ＲＮＡに対して、ノーザンブロット分析を実施した。ＡＮＦ発現の増大は、ＴＡＣ心臓における真の肥大応答の形成を実証する。２８Ｓ  ｒＲＮＡのメチレンブルー染色は、ＲＮＡの完全性および等しいローディングを実証する。配列番号４のヌクレオチド７７５−１，２６９に相当するマウスＲＵＰ４１コード領域フラグメントを、ノーザンブロット分析のためのプローブとして使用した。３２Ｐ−標識したプローブを標準的な方法を用いて生成し、５５℃で膜にハイブリダイズさせた。膜を高いストリンジェンシーで洗浄し、２〜４日間、−８０℃でＸ線フィルムに露出した。
【０４２７】
図５下。ＲＵＰ４１シグナルをデンシトメトリーで分析し、２８Ｓ  ｒＲＮＡシグナルに対して標準化した。＊６つの偽サンプルおよび６つのＴＡＣサンプルのＡＮＯＶＡ統計学的解析は、Ｐ＜０．００００５でＲＵＰ４１  ｍＲＮＡの有意な減少を実証した。
【０４２８】
（横大動脈狭窄（ＴＡＣ））
マウスにおける横大動脈の外科的狭窄を以前に記載される通りに実施した（Ｒｏｃｋｍａｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９１  Ｓｅｐ  １５；８８（１８）：８２７７−８１）。簡潔には、８週齢マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）をケタミンおよびキシラジンの混合物で麻酔した。解剖顕微鏡下で、顕微手術技術によって、正中頚部切開を行い、気管および頚動脈を露出させた。気管内挿管の成功後に、カニューレを、０．２ｍＬの一回換気量および１１０／分の呼吸数で酸素補給する従量式げっ歯類人工呼吸器（ｖｏｌｕｍｅ  ｃｕｙｌｃｅｄ  ｒｏｄｅｎｔ  ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｒ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に接続した。胸腔を小切開を通して左上胸骨縁で２番目の肋間隙に入れ、２７ゲージ針で７−０ナイロン縫合糸結紮を行うことにより大動脈狭窄を実施し、針を除去すると直径がだんだん狭くなって０．４ｍｍとなり、６５〜７０％の再現可能な横大動脈狭窄（ＴＡＣ）を生じた。大動脈絞扼後に、気胸を瀉出し、動物から抜管し、元に戻した。
【０４２９】
（実施例１３）
（低酸素に罹患したＮＲＶＭにおけるＲＵＰ４１のダウンレギュレーション）
ノーザンブロットは、ＲＵＰ４１  ｍＲＮＡレベルが６時間、低酸素に罹患したＮＲＶＭから単離した総ＲＮＡにおいて減少することを実証した（図６）。ＲＵＰ４１  ｍＲＮＡレベルは、低酸素後の２４時間の再酸素化の後（Ｈ６／Ｒ２４）に、コントロール（酸素正常状態）レベルに戻る。ｃ−ｆｏｓ発現の増大（低酸素（Ｈｙｐｏｘｉａ）−６）は、低酸素状態に対する筋細胞ストレス応答を実証する。２８Ｓ  ｒＲＮＡのメチレンブルー染色は、ＲＮＡの完全性および等しいローディングを実証する。配列番号６のヌクレオチド５３−４８８に相当するラットＲＵＰ４１コード領域フラグメントを、ノーザンブロット分析のためのプローブとして使用した。３２Ｐ−標識したプローブを標準的な方法を用いて生成し、５５℃で膜にハイブリダイズさせた。膜を高いストリンジェンシーで洗浄し、２〜４日間、−８０℃でＸ線フィルムに露出した。
【０４３０】
ＮＲＶＭの低酸素処理は、Ｖａｎ  Ｈｅｕｇｔｅｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ（１９９４）２６：１５１３−２４（この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される）に記載される。簡潔には、９５％Ｎ２および５％Ｃ０２を注入した気密インキュベーターを用いて、低酸素を達成した。示した時間の低酸素処理後、細胞をチャンバーから周囲空気に移し、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を補給した。また、以下の実施例１７も参照のこと。
【０４３１】
（実施例１４）
（鬱血性心不全を有するヒトにおけるＲＵＰ４１のダウンレギュレーション）
図７Ａ。ヒト心臓から単離した総ＲＮＡに対して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＵＰ４１転写物レベルは、正常心機能（正常）を有する患者に比較して、鬱血性心不全（ＣＨＦ）を有する患者由来のＲＮＡで減少している。ヒトＧＡＰＤＨプライマーを、鋳型濃度およびローディングコンシステンシーについての内部コントロールとして各ＰＣＲ反応に添加した。
【０４３２】
図７Ｂ。＊ＡＮＯＶＡ統計学的分析は、ｐ＜０．０５で正常に対してＣＨＦ患者においてＲＵＰ４１転写物の有意な減少を実証する。心筋梗塞（ＭＩ）を有する患者におけるＲＵＰ４１転写物レベルは、正常心臓と差異がない。
（ヒト心疾患サンプル）
ＲＴ−ＰＣＲ（上述を参照のこと）を、商業的（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ）に得られた正常心機能、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、および心筋梗塞（ＭＩ）を有すると診断されたヒト患者の検死で採取された心臓由来の総ＲＮＡから実施した。ＲＵＰ４１発現の相対レベルを、ＧＡＰＤＨ内部コントロールに対して標準化した後、各群において決定した。
【０４３３】
（実施例１５）
（ＲＵＰ４１はＣＯＳ−７細胞においてＧｉと結合する）
図８上。ＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＭＶ−ＨＡＲＵＰ４１（ＨＡ−ＲＵＰ４１）またはｐＣＭＶ−ＨＡバックボーン（ＣＭＶ）、および構成的活性型Ｇｓ共役型甲状腺刺激ホルモンレセプター（ｐＣＭＶ−ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）で共トランスフェクトした。［ＨＡＲＵＰ４１は、血球凝集素（ＨＡ）タグ化ＲＵＰ４１に相当する。］さらに、ＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター構築物を共トランスフェクトし、百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在または不在下でｃＡＭＰ活性化経路の活性を決定した。ＣＡＲＴ−ＴＳＨＲおよびＨＡＲＵＰ４１を共発現する細胞におけるルシフェラーゼレポーター活性は、ＣＡＲＴ−ＴＳＨＲおよびｐＣＭＶ−ＨＡコントロールを共発現する細胞における活性より低かった。このことは、ＲＵＰ４１がＧｉに結合していることを示唆する。ＰＴＸ処理したＲＵＰ４１によるｃＡＭＰ減少の阻害は、このレセプターのＧｉ結合を確証する。
【０４３４】
図８下。ＣＯＳ−７細胞を、百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在または不在下でｐＣＭＶ−ＨＡ（ＣＭＶ）またはｐＣＭＶ−ＨＡＲＵＰ４１（ＲＵＰ４１）構築物でトランスフェクトした。フォルスコリン（１ｕＭ）刺激によるｃＡＭＰレベルの増大は、ＲＵＰ４１の発現によって阻害された。ＰＴＸ処理したＲＵＰ４１によるｃＡＭＰ減少の阻害は、このレセプターのＧｉ結合を確証する。
【０４３５】
ＲＵＰ４１ベクター構築−
配列番号３のヒトＲＵＰ４１ポリペプチドのアミノ酸２−４３３をコードするポリヌクレオチドを、一過性トランスフェクション発現研究のためにｐＣＭＶ−ＨＡに連結した。
【０４３６】
一過性トランスフェクション
ＤＮＡのトランスフェクションを、５’−ＨＡタグ化ＲＵＰ４１発現構築物（ＨＡ−ｐＣＭＶＲＵＰ４１）を用いて実施した。簡潔には、ＨＡ−ｐＣＭＶＲＵＰ４１を、製造者の指示書（Ｒｏｃｈｅ）に従ってＦｕｇｅｎｅ−６トランスフェクション試薬を用いて、チャンバースライド上に播種したＣＯＳ−７細胞またはＨＥＫ細胞にトランスフェクトした。５’−ＨＡタグ化ＧＰＲ（オーファンＧＰＣＲ；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ００７２２３）およびＨＡ−ｐＣＭＶベクターを、コントロールとして、ＣＯＳ−７細胞およびＨＥＫ細胞にトランスフェクトした。
【０４３７】
ｃＡＭＰ測定
ＲＵＰ４１発現プラスミドでのＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＴＸを有するまたは有しない無血清培地と３７℃で１８時間インキュベートし、その後、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅアッセイ（ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ  ａｓｓａｙ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）のために細胞を採集した。製造者の指示書に従って、ｃＡＭＰレベルを検出した。
【０４３８】
ＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ｐＣＭＶＲＵＰ４１およびＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ発現プラスミドでＣＯＳ−７細胞の共トランスフェクションの２４時間後（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ：ＲＵＰ４１（またはＣＭＶ）のＤＮＡ比＝１：７（ｗ／ｗ））。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＴＸを有するまたは有しない無血清培地と３７℃で１８時間インキュベートし、その後、製造者の指示書に従ってＬｕｃＬｉｔｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙキット（ＬｕｃＬｉｔｅ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いてＣＲＥレポーターアッセイ検出を行った。
【０４３９】
（実施例１６）
（ＲＵＰ４１のアデノウイルス媒介過剰発現はＮＲＶＭの生存を促進する）
図９Ａ。ＮＲＶＭを、一細胞当たりプラーク形成単位（ＰＦＵ）でのウイルス価により規定された種々の感染多重度のＲＵＰ４１をコードする組換えアデノウイルス（ＡｄＲＵＰ４１）で処理した。アデノウイルス感染の２４時間後、総ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析を使用して、ウイルス発現ＲＵＰ４１のレベルを決定した。５０ＰＦＵ／細胞で、ＲＵＰ４１発現が検出可能であったが、高レベルの発現は、１００ＰＦＵ／細胞で示された。
【０４４０】
図９Ｂ。１００ＰＦＵ／細胞のＡｄＲＵＰ４１で４８時間感染したＮＲＶＭは、無血清培地中で細胞生存の増大を実証した。ＮＲＶＭを、テキサスレッド結合体化ファロイジンおよびヘキスト３３３４２で共染色した。
【０４４１】
（ＲＵＰ４１ベクター構築）
アデノウイルス実験のために、配列番号３のヒトＲＵＰ４１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）にサブクローニングし、その後、組換えアデノウイルスＲＵＰ４１（ＡｄＲＵＰ４１）を生成した。
【０４４２】
（アデノウイルス感染）
アデノウイルスベクターでのＮＲＶＭの感染を、以前に記載の通りに実施した［Ａｄａｍｓ  ＪＷら，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（２０００）８７：１１８０−７；その開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。簡潔には、ＮＲＶＭを、血清の存在下で一晩、ラミニンコーティングした（３．５ｍｇ／ｃｍ）チャンバースライド（Ｎｕｎｃ）上で培養し、洗浄し、そしてアデノウイルス感染前に無血清培地中でさらに８時間インキュベートした。最適な感染多重度（ＭＯＩ）は、０．１〜５００ＰＦＵ／細胞の用量範囲にわたって一細胞当たり５０〜１００プラーク形成単位（ＰＦＵ）であると決定された。５０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩは、ＡｄＲＵＰ４１またはＧＦＰをコードするコントロールアデノウイルス（ＡｄＧＦＰ）のいずれかでの感染後最初の４８時間の間にいかなる細胞傷害もなく、９５％より高い感染効率を生じた（このコントロールウイルスで感染したＮＲＶＭにおけるＧＦＰ発現によって決定）。
【０４４３】
（実施例１７）
（ＲＵＰ４１の過剰発現は  低酸素／再酸素化誘発性アポトーシスからＮＲＶＭを救出する）
オリゴヌクレオソームＤＮＡフラグメント化（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ａｋａラダー化（ａｋａ  ｌａｄｄｅｒｉｎｇ））の分析は、低酸素（８時間）後の再酸素化（２４時間）が、１００ＰＦＵ／細胞でコントロール（ＡｄＧＦＰ）アデノウイルスに感染したＮＲＶＭ（Ｈ８／Ｎ２４）においてアポトーシスの増大を刺激することを実証した。しかし、配列番号３のヒトＲＵＰ４１ポリペプチドのアデノウイルス媒介過剰発現（１００ＰＦＵ／細胞）は、血清枯渇（ｎｏｒｍｏｘ）および低酸素後再酸素化（Ｈ８／Ｎ２４）により誘発されるＤＮＡフラグメント化のレベルを減少させる（図１０）。
【０４４４】
（低酸素／再酸素化）
単離されたＮＲＶＭを、血清（１０％ＦＢＳ、５％ＨＳ）の存在下で一晩培養し、次いで低酸素処理の前に２４時間、この培地を無血清培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ）と置換した。低酸素を、９５％Ｎ２および５％Ｃ０２を注入した気密インキュベーターを用いて達成した［Ｖａｎ  Ｈｅｕｇｔｅｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ（１９９４）２６：１５１３−２４，この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。示した時間の低酸素処理後、細胞をチャンバーから周囲空気に移し、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を補給した。
【０４４５】
（ＤＮＡフラグメント化）
製造者の指示書（Ｇｅｎｔｒａ）に従ってＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キット（ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を用いて、ＮＲＶＭからＤＮＡを単離した。２％アガロース上で等量のＤＮＡを分離し、そして紫外光下で臭化エチジウムでの染色により、フラグメント化を検出した。
【０４４６】
（実施例１８）
（心臓保護）
本発明のモジュレーターは、Ｆｒｙｅｒらのインビボラットモデル［Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（１９９９）８４：８４６−５１；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］を用いて心臓保護的であることが示され得る。当該モジュレーターを、腹腔内注射によって投与する。好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、以下からなる群から選択される：０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ；１．０ｍｇ／ｋｇ；３．０ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ；３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ。プラセボ群にビヒクルのみを投与する。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターはアゴニストである。
【０４４７】
雄Ｗｉｓｔａｒラット（３５０〜４５０ｇ）を、本研究の全ての相のために使用する。当該モジュレーターまたは生理食塩水を、腹腔内注射によって、外科的プロトコルの１時間、１２時間、２４時間、４８時間、または７２時間前に、ラットに投与する。続けて、チオブタバルビタールナトリウム（Ｉｎａｃｔｉｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与を介して、ラットを麻酔する。気管切開を実施し、そして気管に、げっ歯類人工呼吸器（モデルＣＩＶ−１０１（ｍｏｄｅｌＣＩＶ−１０１），Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，またはモデル６８３（ｍｏｄｅｌ  ６８３），Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に接続したカニューレを挿管する。ラットを、１分当たり６０〜６５息で０２を補給した室内空気で人工呼吸する。５〜１０ｍｍ  Ｈ２０の呼気終末陽圧を維持することにより、無気肺を防ぐ。動脈ｐＨ、ＰＣＯ２、およびＰＯ２を、血液ガスシステム（ＡＶＬ  ９９５ｐＨ／血液ガス分析器（ＡＶＬ  ９９５ｐＨ／ｂｌｏｏｄ  ｇａｓ  ａｎａｌｙｚｅｒ），ＡＶＬ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により、コントロール、１５分の閉塞、ならびに６０分および１２０分の再灌流でモニターし、そして呼吸数および／または一回換気量を調整することにより正常な生理的範囲（ｐＨ７．３５〜７．４５；ＰＣＯ２  ２５〜４０ｍｍＨｇ；およびＰＯ２  ８０〜１１０ｍｍＨｇ）内に維持する。加熱パッドの使用により体温を３８℃に維持し、そして動脈血ｐＨを正常な生理的レベル内に維持するのに必要とされるだけ重炭酸イオンを静脈内投与する。
【０４４８】
Ｇｒａｓｓ（モデル７（ｍｏｄｅｌ  ７））ポリグラフに接続したＧｏｕｌｄ  ＰＥ５０またはＧｏｕｌｄ  ＰＥ２３圧力変換器を介して血圧および心拍数を測定するために、右頚動脈にカニューレ挿入する。生理食塩水、重炭酸イオン、および薬物注入のために、右頚静脈にカニューレ挿入する。左開胸を５番目の肋間隙で実施し、次いで心嚢切開および左心耳の調整を行い、左冠状動脈の位置をあらわにする。結紮糸（６−０プロレン）を左心耳のすぐ下の領域から左心室の右側部分に、冠状動脈の下で通す。縫合糸の両端部をプロピレン管に通し、スネアを形成する。張り詰めた縫合糸の両端部を引っ張り、止血鉗子でそのスネア（ｄｎａｒｅ）を心外膜（ｅｐｉｃａｒｉｄａｌ）表面上で締めることにより、冠状動脈を閉塞させる。心外膜チアノーゼおよび続く血圧低下により冠状動脈閉塞を検証する。止血鉗子を外し、スネアを緩めることによって心臓の再灌流を開始し、心外膜充血応答を可視化することによってこの再灌流を確認する。実験プロトコルを開始する前に、心拍数および血圧を安定にする。
【０４４９】
ラットを指定の実験群に無作為に分ける。３０分の限局性虚血および２時間の再灌流（Ｉ／Ｒ）の２４時間前に、生理食塩水を、コントロールラットに投与する。当該モジュレーターにより誘発された急性心臓保護を示すために、当該モジュレーターを長期の虚血性傷害の１時間前に投与する。急性虚血性傷害に対する遅延性心臓保護を示すために、当該モジュレーターを、Ｉ／Ｒの１２時間前または２４時間前のいずれかで指定用量で投与する。当該モジュレーターをまた、Ｉ／Ｒの４８時間前または７２時間前のいずれかで指定用量で投与する。
【０４５０】
上記プロトコルの完了時に、冠状動脈を閉塞し、そして頚静脈を介して投与したパテントブルー染料を用いた陰性染色によって危険領域（ａｒｅａ  ａｔ  ｒｉｓｋ）（ＡＡＲ）を決定する。１５％ＫＣｌ溶液でラットを安楽死させる。心臓を摘出し、残りの組織から左心室を解剖し、続いて６つの薄横断片に切断する。これにより、ＡＡＲ（続けてピンクになる）に対して正常領域（青色に染色）の描写が可能になる。ＡＡＲを非虚血領域から切り出し、この組織を別々のバイアル中に置き、１．０％  ２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染料（１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中）と３７℃で１５分間インキュベートする。ＴＴＣは生存組織および非生存組織の指示薬である。ＴＴＣは、生存心筋中に存在するデヒドロゲナーゼ酵素によって還元され、ホルマザン沈降物を生じ、これは深紅色になるが、梗塞した領域は灰色のままである｛Ｋｌｅｉｎら，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ［Ｐａｔｈｏｌ  Ａｎａｔ］（１９８１）３９３：２８７−９７｝。組織を１０％ホルムアルデヒドのバイアル中に一晩保存し、解剖顕微鏡（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の照明下で梗塞した心筋をＡＡＲから解剖する。梗塞サイズ（ＩＳ）、ＡＡＲ、および左心室重量（ＬＶ）を重量分析により決定する。ＡＡＲは、ＬＶのパーセントとして表され（ＡＡＲ／ＬＶ）、そしてＩＳは、ＡＡＲのパーセントとして表される（ＩＳ／ＡＡＲ）。
【０４５１】
ラットは、重度の低血圧（＜３０ｍｍＨｇ  収縮期血圧）を呈するか、または代謝性アシドーシスまたはアルカローシスのために正常生理的範囲内での十分な血液ガス値が維持できない場合、データ分析から除外する。
【０４５２】
全ての値を平均ＳＥＭとして表す。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、血行力学、ＩＳ、およびＡＡＲについて群間で有意差が存在するか否かを決定する。有意差は、Ｐ＜０．０５で決定する。ＩＳ／ＡＡＲの減少が心臓保護の指標である。
【０４５３】
（実施例１９）
（経口生物学的利用能）
経口生物学的利用能を直接的に評価するための物理化学分析アプローチが当業者に周知であり、かつ使用され得る［例えば、限定されずに、以下を参照のこと：Ｗｏｎｇ  ＰＣら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ（２００２）２０：１３７−５２；およびＢｕｃｈａｎ  Ｐら，Ｈｅａｄａｃｈｅ（２００２）Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ５４−６２；これら各々の開示内容は、本明細書によってその全体が援用される］。さらなる例示のためであって限定ではないが、当該代替分析アプローチは、液体クロマトグラフィー直列質量分析器を含み得る［Ｃｈａｖｅｚ−Ｅｎｇ  ＣＭら，Ｊ  ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ（２００２）７６７：１１７−２９；Ｊｅｔｔｅｒ  Ａら，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００２）７１：２１−９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＪＪら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９９９）３９：１１５５−６１；およびＢａｒｒｉｓｈ  Ａら，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ（１９９６）１０：１０３３−７；その各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。
【０４５４】
陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）が、薬物の経口投与後の哺乳動物身体における薬物分布（経口生物学的利用能を含む）の直接測定を得るために、首尾よく使用されている［Ｇｕｌｙａｓら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ（２００２）２９：１０３１−８；その開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。
【０４５５】
あるいは、本発明のモジュレーターの経口生物学的利用能は、例えば、実施例１８のラットモデルによるようにして（例示のためであって限定ではない）展開したインビボデータに基づいて決定され得る。モジュレーターは、０．１ｍｇｋｇ−１〜１００ｍｇｋｇ−１の範囲の用量で経口胃管栄養によって投与される。モジュレーターの経口投与は、心臓保護を付与することが示される。モジュレーターの効果は、用量依存性であることが示され、腹腔内投与後の効果に匹敵する。経口投与によるＩＳ／ＡＡＲの半最大減少を達成するのに必要なモジュレーターの用量を、腹腔内投与によるＩＳ／ＡＡＲの半最大減少を達成するのに必要なモジュレーターの用量に比較する。例示のために、当該経口用量が当該腹腔内用量の２倍である場合、モジュレーターの経口生物学的利用能は５０％であるとみなされる。より一般には、当該経口用量がθｍｇｋｇ−１であり、当該腹腔内用量がρｍｇｋｇ−１である場合、モジュレーターの百分率としての経口生物学的利用能は、［（ρ／θ）×１００］であるとみなされる。
【０４５６】
本発明のモジュレーターの経口生物学的利用能の決定が、例示の目的で（限定ではない）ここに示したもの以外のインビボ動物モデルを用いて実施され得ることは、当業者に容易に明らかである。また、当該経口生物学的利用能についての生物活性読み出しが、ＩＳ／ＡＡＲ以外のパラメーターであり得ることは、当業者に容易に明らかである。参照投与経路が、腹腔内以外であり得ることは、容易に想起される。いくつかの実施形態では、当該参照投与経路は静脈内であり得る。
【０４５７】
いくつかの実施形態では、本発明のモジュレーターの経口生物学的利用能は、腹腔内注射に対して、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％である。
【０４５８】
（実施例２０）
（ヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの発現を含むトランスジェニックマウス／ラット／ブタ）
本発明はまた、ヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの発現を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する方法および組成物を提供し、該レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のポリペプチドであって、ここで配列番号２のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンと置換されている、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３に記載のポリペプチド；および
（ｄ）配列番号３に記載のポリペプチドであって、ここで配列番号３のアミノ酸３１２位のフェニルアラニンがリジンと置換されている、ポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含む。
【０４５９】
いくつかの実施形態では、当該非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、またはブタである。
【０４６０】
トランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、およびブタ）を作製する方法は当業者に周知であり、そして任意の方法が本発明において使用され得る。簡潔には、トランスジェニック哺乳動物は、例えば、ヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチド（「トランスジーン」）で多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞）をトランスフェクトすることにより、生成され得る。次いで、首尾よく形質転換されたＥＳ細胞を早期段階胚中に導入し得、次いで、この胚を同じ種の哺乳動物の子宮に移植する。特定の場合、形質転換された（「トランスジェニック」）細胞は、得られた動物の生殖細胞系の一部を含み、そして当該生殖細胞系においてトランスジェニック細胞を含む成体動物を他の動物に交配し得、それにより最終的にトランスジェニック動物を生じ、この動物は、細胞の各々中にトランスジーンを有し、それらの子孫の各々にトランスジーンを安定に伝達し得る。ポリヌクレオチドを導入する他の方法は、使用され得る。例えば、マイクロインジェクションを介してヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを受精卵または早期段階胚に導入する。あるいは、トランスジーンは、トランスジーンを含むレトロウイルスによる接合体の感染により、動物に導入され得る［Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７６）７３：１２６０−４］。トランスジェニック哺乳動物を作製する方法は、例えば、以下に記載されている：Ｗａｌｌら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９２）４９：１１３−２０；Ｈｏｇａｎら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（１９８６）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｏｓｔａら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ（１９９９）１３：１７６２−７３；ＷＯ  ９１／０８２１６；米国特許番号４，７３６，８６６；および米国特許番号６，５０４，０８０；これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。
【０４６１】
いくつかの実施形態では、当該ヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲ発現は心筋細胞選択的である。いくつかの実施形態では、当該ヒトＲＵＰ４１  ＧＰＣＲの当該心筋細胞選択的発現は、αミオシン重鎖プロモーターによって付与される［Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ  Ａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９１）２６６：２４６１３−２０；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。
【０４６２】
（実施例２１）
（心臓保護のトランスジェニックインビボ動物モデル）
本発明の化合物は、実施例２０に記載のトランスジェニックインビボ動物モデルを用いて心臓保護について効力を有することが示され得る。いくつかの実施形態では、当該動物はマウス、ラット、またはブタである。
【０４６３】
当該化合物は、当該化合物を当該トランスジェニック動物に投与し、当該投与が、ビヒクルのみを投与した当該トランスジェニック動物に対して、実施例１８のインビボラットモデルまたはそれに類似したマウスもしくはブタにおけるインビボモデルにおいてＩＳ／ＡＡＲの減少を生じるかどうかを決定することにより、心臓保護についての効力について評価され得る。
【０４６４】
好ましい実施形態では、当該化合物は、本発明のモジュレーターである。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターは、ｃＡＭＰの細胞内レベルを低下させる。いくつかの実施形態では、当該モジュレーターはアゴニストである。いくつかの実施形態では、当該化合物は、腹腔内注射によって投与される。好ましい用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は、以下からなる群から選択される：０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ；１．０ｍｇ／ｋｇ；３．０ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ；３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ。ビヒクルのみをプラセボ群に投与する。いくつかの実施形態では、当該用量が毎日投与される。いくつかの実施形態では、当該用量が、１週、２週、３週、および３週からなる群から選択される期間、投与される。この投与経路、これらの投薬量範囲、この用量投与頻度、およびこの用量投与期間は、本発明の例示であって限定ではないことが意図されることが留意される。
【０４６５】
（実施例２２）
（ＲＵＰ４１遺伝子のノックアウトを含むマウス／ラット／ブタ）
（マウス）
好ましいＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端に、以下を含む：（ａ）第一ヌクレオチド配列であって、これは、マウスＲＵＰ４１ゲノム配列中に含まれる；（ｂ）陽性選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）のマーカー）を含むヌクレオチド配列；および（ｃ）第二ヌクレオチド配列であって、これは、マウスＲＵＰ４１ゲノム配列中に含まれ、そして第一のマウスＲＵＰ４１ヌクレオチド配列（ａ）の下流のゲノム上に位置する。マウスＲＵＰ４１ゲノム配列は、当業者に周知の方法を用いて単離される（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される）。マウスＲＵＰ４１ゲノム配列の当該単離のためのプローブは、マウスＲＵＰ４１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに由来し、ここで当該ｃＤＮＡは、マウス心臓、肺、または脂肪組織由来のｍＲＮＡを鋳型として使用して得られ得る。
【０４６６】
好ましい実施形態では、このＤＮＡ構築物はまた陰性選択マーカーを含み、このマーカーは、ヌクレオチド配列（ａ）の上流または配列（ｃ）の下流に位置する。好ましくは、この陰性選択マーカーは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子［Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ（１９８６）４４：４１９−２８］、ハイグロマイシンβ遺伝子［Ｔｅ  Ｒｉｅｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：６４９−５１］、ｈｐｒｔ遺伝子［Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｕｇｔら，Ｇｅｎｅ（１９９１）１０５：２６３−７；Ｒｅｉｄら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：４２９９−４３０３］、またはジフテリア毒素Ａフラグメント（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）（Ｄｔ−Ａ）遺伝子［Ｎａｄａ  ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９３）７３：１１２５−３５；Ｙａｇｉら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：９９１８−９９２２］を含み、これらの文献の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される。好ましくは、陽性（前出では「ｎｅｇａｔｉｖｅ」ですが、この部分は「ｐｏｓｉｔｉｖｅ」です）選択マーカーは、マウスＲＵＰ４１エキソン配列内に位置し、これによりマウスＲＵＰ４１ポリペプチドをコードする配列を中断する。これらの置換ベクターは、例えば、以下により記載される：Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ（１９８６）４４：４１９−２８；Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ（１９８７）５１：５０３−１２；Ｍａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６：３４８−５２；Ｋｏｌｌｅｒら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１０：７０５−３０；および米国特許番号５，６３１，１５３；これらの開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【０４６７】
第一のヌクレオチド配列（ａ）および第二のヌクレオチド配列（ｃ）は、マウスＲＵＰ４１調節配列、イントロン配列、エキソン配列、または調節配列および／もしくはイントロン配列および／もしくはエキソン配列を含む配列内に無差別に（ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ）位置し得る。ヌクレオチド配列（ａ）およびヌクレオチド配列（ｃ）のサイズは、１〜５０ｋｂ、好ましくは１〜１０ｋｂ、より好ましくは２〜６ｋｂ、および最も好ましくは２〜４ｋｂの範囲である。
【０４６８】
選択された遺伝子のノックアウトを含むマウスを製造する方法は、当業者に周知であり、そして広範な遺伝子を首尾よく不活性化するために使用されてきた。
【０４６９】
（ラット）
ラットについての遺伝子ターゲティング技術は、マウスほど確固としたものではなく、活発な関心のある領域である。１つのアプローチは、ラット胚性幹細胞（ＥＳＣ）様細胞においてラットＲＵＰ４１遺伝子を不活性化し、次いで、不活性化したラットＲＵＰ４１遺伝子を有する細胞を、二細胞胚の融合後に生じたラット胚盤胞に注入することである［Ｋｒｉｖｏｋｈａｒｃｈｅｎｋｏら，Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ（２００２）６１：４６０−５］。
【０４７０】
ラット遺伝子は、配列番号６のラットＲＵＰ４１ポリヌクレオチドを用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でラットゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより同定する。全長または本質的に全長のラットＲＵＰ４１ｃＤＮＡを、同様の条件下でラット心臓または脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより同定する。ストリンジェントな核酸ハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知である［Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，ら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ］。
【０４７１】
代替のアプローチは、ラットＥＳＣ様細胞においてラットＲＵＰ４１遺伝子を不活性化し、次いで不活性化したラットＲＵＰ４１遺伝子を有するラットＥＳＣ様細胞の核を脱核した卵母細胞に移入することである［Ｓａｔｏ  Ｋら，Ｈｕｍ  Ｃｅｌｌ（２００１）１４：３０１−４；ＷａｌｃａｙａｍａおよびＹａｎａｇｉｍａｃｈｉ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（１９９９）１０：２５３−８；ＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒおよびＪａｅｎｉｓｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１５：１０３５−８；Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（２００２）１８７：２４１−８；これらの開示内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される］。
【０４７２】
マウスについて記載の方法に類似または代替の方法［また、例えば、以下を参照のこと：Ｚａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３）２１：６４５−５１；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］は、ＲＵＰ４１遺伝子のノックアウトを含むラットを作製するために使用され得る。
【０４７３】
（ブタ）
類似または代替の方法が、ＲＵＰ４１遺伝子のノックアウトを含むブタを作製するために使用され得る［例えば、以下を参照のこと：Ｌａｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９５：１０８９−１０９２；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。
【０４７４】
Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ系：
（ＲＵＰ４１遺伝子の心筋細胞選択的ノックアウトを含むマウス／ラット／ブタ）
（マウス）
これらの新規なＤＮＡ構築物は、Ｐ１相の部位特異的組換え系を使用する。Ｐ１相は、Ｃｒｅと呼ばれるリコンビナーゼを有し、これは、３４塩基対のｌｏｘＰ部位と相互作用する。ｌｏｘＰ部位は、８ｂｐ保存配列で分離される１３ｂｐの２つのパリンドローム配列で構成される［Ｈｏｅｓｓ  ＲＨら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８６）１４：２２８７−３００；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。同一の向きを有する２つのｌｏｘＰ部位間のＣｒｅ酵素による組換えは、ＤＮＡフラグメントの欠失を生じる。
【０４７５】
相同組換え技術と合わせて使用されるＣｒｅ−ｌｏｘＰ系は、最初にＧｕらによって記載されている［Ｇｕ  Ｈら，Ｃｅｌｌ（１９９３）７３：１１５５−６４；Ｇｕ  Ｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６５：１０３−６；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。簡潔には、ゲノムの標的とした位置に挿入されるべき目的のヌクレオチド配列は、少なくとも２つのｌｏｘＰ部位を有し、これは、同じ向きで、かつ組換えゲノムから切り出されるべきヌクレオチド配列のそれぞれの末端に位置する。この切り出し事象は、組換え細胞宿主の核内のリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）酵素の存在を必要とする。リコンビナーゼ酵素は、（ａ）組換え細胞宿主を、この酵素を含む培養培地中でインキュベートすること（Ｃｒｅ酵素を直接所望の細胞に注入することにより（例えば、細胞への酵素のリポフェクションにより））（例えば、Ｂａｕｂｏｎｉｓらに記載される通り［Ｂａｕｂｏｎｉｓ  ＷおよびＳａｕｅｒ  Ｂ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９３）２１：２０２５−９；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］）；（ｂ）組換え細胞宿主において機能的であるプロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅコード配列を含むベクターで細胞宿主をトランスフェクトすること（このプロモーターは必要に応じて誘導性であり、当該ベクターは組換え細胞宿主に導入される）（例えば、以下に記載される通り：Ｇｕら［Ｇｕ  Ｈら，Ｃｅｌｌ（１９９３）７３：１１５５−６４；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］およびＳａｕｅｒら［Ｓａｕｅｒ  ＢおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８８）８５：５１６６−７０；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］）；（ｃ）組換え細胞宿主において機能的であるプロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅコード配列を含むポリヌクレオチドを、細胞宿主のゲノムに導入すること（このプロモーターは必要に応じて誘導性であり、そして当該ポリヌクレオチドは、ランダム挿入事象または相同組換え事象のいずれかによって細胞宿主のゲノム中に挿入される）（例えば、Ｇｕらに記載される通り［Ｇｕ  Ｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６５：１０３−６；これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］）のいずれかにより、所望の時間でもたらされ得る。
【０４７６】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いるベクターおよび方法は、例えば、Ｚｏｕら（１９９４）；Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ  Ｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４：１００６６−７０；Ｃｈｅｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３：１２５２−６；Ｃｈｅｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９８）１２５：１９４３−９；（これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される）によって記載される。
【０４７７】
本発明の好ましい実施形態では、Ｃｒｅは、上記戦略（ｃ）によって細胞宿主のゲノムに導入され、ここで当該プロモーターは心筋細胞選択性であり、そして（ｌｏｘＰを両側として；「ｆｌｏｘ化した（ｆｌｏｘｅｄ）」）マウスＲＵＰ４１ゲノム配列の心筋細胞選択的破壊を生じる。いくつかの実施形態では、当該心筋細胞選択的プロモーターは、ミオシン軽鎖２（ｍｌｃ−２ｖ）の心室特異的イソ型のものである［Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ  Ｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４：１００６６−７０；Ｃｈｅｎら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３：１２５２−６；これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。内因性ｍｌｃ−２ｖ遺伝子座にＣｒｅリコンビナーゼコード配列の挿入を含むトランスジェニックマウス（「ｍｌｅ−２ｖ  ｃｒｅノックインマウス」）が記載されている［Ｃｈｅｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９８）１２５：１９４３−９；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。選択された遺伝子をｆｌｏｘ化する（ｆｌｏｘｉｎｇ）方法は、当業者の範囲内である［例えば、Ｃｈｅｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９８）１２５：１９４３−９を参照のこと］。
【０４７８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＲＵＰ４１遺伝子の心筋細胞特異的ノックアウトを含むマウスを作製する方法であって、ｆｌｏｘ化したＲＵＰ４１遺伝子とｍｌｃ−２  ｃｒｅ対立遺伝子（前出）を交雑する工程を包含する、方法を特徴とする。
【０４７９】
ＲＵＰ４１遺伝子の心筋細胞選択的ノックアウトを含むマウスを作製する他の方法は、当業者に周知である；例えば、以下を参照のこと：Ｋｕｈｎ．ＲおよびＴｏｒｒｅｓ  ＲＭ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００２）１８０：１７５−２０４；Ｓａｕｅｒ  Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８）１４：３８１−９２；Ｇｕｔｓｔｅｉｎ  ＤＥら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）８８：３３３；Ｍｉｎａｍｉｎｏ  Ｔら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）８８：５８７；およびＢｅｘ  Ａら，Ｊ  Ｕｒｏｌ（２００２）１６８：２６４１−２６４４；これらの各々の開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【０４８０】
（ラット）
類似または代替［例えば、以下を参照のこと：Ｚａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３）２１：６４５−５１；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］の方法が、ＲＵＰ４１遺伝子の心筋細胞ノックアウトを含むラットを作製するために使用され得る。
【０４８１】
（ブタ）
類似または代替の方法がＲＵＰ４１遺伝子の心筋細胞選択的ノックアウトを含むブタを作製するために使用され得る［例えば以下を参照のこと：Ｌａｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９５：１０８９−１０９２；この開示内容は、本明細書によってその全体が参考として援用される］。
【０４８２】
本出願を通して、種々の刊行物、特許、および公開特許出願を引用する。本出願で参照したこれらの刊行物、特許、および公開特許出願の開示内容は、本明細書によってその全体が本開示に参考として援用される。当業者の範囲内である、開示発明の改変および拡張は、上記開示および続く請求の範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０４８３】
【図１】例示のためであって限定ではないが、図１は、「標的レセプター」に対する候補化合物の一次スクリーンからの結果を示し、ここでこのレセプターは、内因性の構成的活性型Ｇｓ共役型ＧＰＣＲのＧｓα融合タンパク質である。「化合物Ａ」の結果は、ウェルＡ２に提供される。「化合物Ｂ」の結果は、ウェルＧ９に提供される。
【図２】Ａ。マイクロアレイ分析を慣用の高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いてヒト組織サンプルで行った。このアレイは、ＲＵＰ４１の遺伝子発現レベルをモニタリングするプローブを含む。ヒストグラムは、プロファイリングした組織の各々におけるＲＵＰ４１の二連測定の相対的発現レベル（平均差異）および標準誤差を示す。各組織は、そのそれぞれの棒線の上の縦書きの文言で表される。このヒストグラムプロットを調べると、ヒト脳および心臓においてＲＵＰ４１が発現していることを示す。Ｂ。ヒト複組織ドットブロットは、成人および胎児の心臓組織におけるＲＵＰ４１  ｍＲＮＡの高レベル発現を実証する。ＲＵＰ４１  ｍＲＮＡ発現はまた、種々の局所脳組織において検出可能である。Ｃ。ヒト複組織ノーザンブロットは、心臓および脳におけるＲＵＰ４１  ｍＲＮＡの高レベル発現を実証する。
【図３】インサイチュハイブリダイゼーションは、成体ラット心臓におけるＲＵＰ４１の広範な心筋発現を実証する。アンチセンスＲＵＰ４１放射性標識プローブは、心臓の全室においてＲＵＰ４１を検出する。アンチセンスコントロール（ＧＡＰＤＨ）および心房特異的（心房ナトリウム利尿因子、ＡＮＦ）プローブをさらなる切片で使用し、心臓切片のプローブ標識の特異性を実証した。
【図４】Ａ．ＲＴ−ＰＣＲは、無血清条件下で２４時間維持した新生児ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）におけるＲＵＰ４１転写物の発現を実証する。ＲＵＰ４１転写物レベルは、フェニレフリン（ＰＥ）または新生児ウシ血清（ＮＣＳ）を培地に添加して２４時間後に劇的に低下し、そしてこれは、肥大表現型に相関する。Ｇ３ＰＤＨ  ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ反応のために使用される鋳型が等しいレベルであること、およびゲルローディングのコンシステンシーを実証する。Ｂ．ノーザンブロットは、肥大因子（フェニレフリン（ＰＥ）、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ）、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）、および新生児ウシ血清（ＮＣＳ）を含む）で２４時間処理した後のＮＲＶＭにおけるＲＵＰ４１  ｍＲＮＡ発現のレベルの減少を実証する。心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）（これは、心筋細胞肥大の遺伝子マーカーである）は、全ての肥大刺激に応答してアップレギュレートされる。２８Ｓ  ｒＲＮＡのメチレンブルー染色は、ＲＮＡの完全性および等しいローディングを実証する。
【図５】上。ＲＵＰ４１  ｍＲＮＡは、圧負荷誘発性心肥大のインビボマウスモデルにおいてダウンレギュレートされる。７日間、横大動脈狭窄（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ａｏｒｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）に罹患したマウス（ＴＡＣ）または偽手術マウス（偽）の左心室から単離した総ＲＮＡに対して、ノーザンブロット分析を実施した。ＡＮＦ発現の増大は、ＴＡＣ心臓における真の肥大応答の形成を実証する。２８Ｓ  ｒＲＮＡのメチレンブルー染色は、ＲＮＡの完全性および等しいローディングを実証する。下。ＲＵＰ４１シグナルをデンシトメトリーで分析し、２８Ｓ  ｒＲＮＡシグナルに対して標準化した。＊６つの偽サンプルおよび６つのＴＡＣサンプルのＡＮＯＶＡ統計学的解析は、Ｐ＜０．００００５でＲＵＰ４１  ｍＲＮＡの有意な減少を実証した。
【図６】ノーザンブロットは、ＲＵＰ４１  ｍＲＮＡレベルが６時間、低酸素に罹患したＮＲＶＭから単離した総ＲＮＡにおいて減少することを実証する。ＲＵＰ４１  ｍＲＮＡレベルは、低酸素後の２４時間の再酸素化の後（Ｈ６／Ｒ２４）に、コントロール（酸素正常状態）レベルに戻る。ｃ−ｆｏｓ発現の増大（低酸素（Ｈｙｐｏｘｉａ）−６）は、低酸素状態に対する筋細胞ストレス応答を実証する。２８Ｓ  ｒＲＮＡのメチレンブルー染色は、ＲＮＡの完全性および等しいローディングを実証する。
【図７】Ａ。ヒト心臓から単離した総ＲＮＡに対して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＵＰ４１転写物レベルは、正常心機能（正常）を有する患者に比較して、鬱血性心不全（ＣＨＦ）を有する患者由来のＲＮＡで減少している。ヒトＧＡＰＤＨプライマーを、鋳型濃度およびローディングコンシステンシーについての内部コントロールとして各ＰＣＲ反応に添加した。Ｂ。＊ＡＮＯＶＡ統計学的分析は、ｐ＜０．０５で正常に対してＣＨＦ患者においてＲＵＰ４１転写物の有意な減少を実証する。心筋梗塞（ＭＩ）を有する患者におけるＲＵＰ４１転写物レベルは、正常心臓と差異がない。
【図８】上。ＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＭＶ−ＨＡＲＵＰ４１（ＨＡ−ＲＵＰ４１）またはｐＣＭＶ−ＨＡバックボーン（ＣＭＶ）、および構成的活性型Ｇｓ共役型甲状腺刺激ホルモンレセプター（ｐＣＭＶ−ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）で共トランスフェクトした。［ＨＡＲＵＰ４１は、血球凝集素（ＨＡ）タグ化ＲＵＰ４１に相当する。］さらに、ＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター構築物を共トランスフェクトし、百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在または不在下でｃＡＭＰ活性化経路の活性を決定した。ＣＡＲＴ−ＴＳＨＲおよびＨＡＲＵＰ４１を共発現する細胞におけるルシフェラーゼレポーター活性は、ＣＡＲＴ−ＴＳＨＲおよびｐＣＭＶ−ＨＡコントロールを共発現する細胞における活性より低かった。このことは、ＲＵＰ４１がＧｉに結合していることを示唆する。ＰＴＸ処理したＲＵＰ４１によるｃＡＭＰ減少の阻害は、このレセプターのＧｉ結合を確証する。  下。ＣＯＳ−７細胞を、百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在または不在下でｐＣＭＶ−ＨＡ（ＣＭＶ）またはｐＣＭＶ−ＨＡＲＵＰ４１（ＲＵＰ４１）構築物でトランスフェクトした。フォルスコリン（１ｕＭ）刺激によるｃＡＭＰレベルの増大は、ＲＵＰ４１の発現によって阻害された。ＰＴＸ処理したＲＵＰ４１によるｃＡＭＰ減少の阻害は、このレセプターのＧｉ結合を確証する。
【図９】Ａ。ＮＲＶＭを、一細胞当たりプラーク形成単位（ＰＦＵ）でのウイルス価により規定された種々の感染多重度のＲＵＰ４１をコードする組換えアデノウイルス（ＡｄＲＵＰ４１）で処理した。アデノウイルス感染の２４時間後、総ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析を使用して、ウイルス発現ＲＵＰ４１のレベルを決定した。５０ＰＦＵ／細胞で、ＲＵＰ４１発現が検出可能であったが、高レベルの発現は、１００ＰＦＵ／細胞で示された。Ｂ。１００ＰＦＵ／細胞のＡｄＲＵＰ４１で４８時間感染したＮＲＶＭは、無血清培地中で細胞生存の増大を実証した。ＮＲＶＭを、テキサスレッド結合体化ファロイジンおよびヘキスト３３３４２で共染色した。
【図１０】オリゴヌクレオソームＤＮＡフラグメント化（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ａｋａラダー化（ａｋａ  ｌａｄｄｅｒｉｎｇ））の分析は、低酸素（８時間）後の再酸素化（２４時間）が、１００ＰＦＵ／細胞でコントロール（ＡｄＧＦＰ）アデノウイルスに感染したＮＲＶＭ（Ｈ８／Ｎ２４）においてアポトーシスの増大を刺激することを実証する。しかし、配列番号３のヒトＲＵＰ４１ポリペプチドのアデノウイルス媒介過剰発現（１００ＰＦＵ／細胞）は、血清枯渇（ｎｏｒｍｏｘ）および低酸素後再酸素化（Ｈ８／Ｎ２４）により誘発されるＤＮＡフラグメント化のレベルを減少させる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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