(57)【要約】栄養製品中のタンパク質の消化率のインビトロでの測定方法。前記方法は、インビボでの消化工程を模倣するインビトロ消化工程のために標準化された胃及び腸の酵素を使用する。さらに、消化の特異性をアミノ酸プロフィールによって決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
栄養製品の試料と試薬ブランクを少なくとも１つの酵素で消化すること；
消化過程を終了させること；
前記試料及びブランクに関する複数のアミノ酸の各々の総濃度を測定すること；
前記試料及びブランクに関する総トリプトファン濃度を測定すること；
前記試料及びブランクに関する複数のアミノ酸の各々の可溶性濃度を測定すること；
前記試料及びブランクに関するトリプトファンの可溶性濃度を測定すること；及び
栄養製品の消化された試料中の可溶性アミノ酸のパーセンテージを算定すること
の工程を含む、タンパク質の消化率を決定する方法。
【請求項２】
消化した試料及びブランクの各々を第一部分と第二部分に分けること；
前記試料の第一部分とブランクの第一部分について複数のアミノ酸の各々の総濃度を測定すること；
前記試料の第一部分とブランクの第一部分について総トリプトファン濃度を測定すること；
前記試料の第二部分とブランクの第二部分の各々を液相と固相に分離すること；
前記液相中の複数のアミノ酸の各々の可溶性濃度を測定すること；及び
前記液相中のトリプトファンの可溶性濃度を測定すること
の工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離工程が、酸性化、沈殿、遠心分離、ろ過、及び遠心分離とろ過の組合せから成る群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の可溶性アミノ酸のパーセンテージを算定する工程が、
前記試料及びブランクについて複数のアミノ酸の総濃度とトリプトファン濃度を加算すること；
前記試料とブランクの間で複数のアミノ酸とトリプトファンの総濃度の差を判定すること；
前記試料及びブランクの間で複数のアミノ酸の可溶性濃度とトリプトファン濃度を加算すること；
前記試料とブランクの間で複数のアミノ酸の可溶性濃度とトリプトファン濃度の差を判定すること；
可溶性濃度の差を総濃度の差で除して商を決定すること；及び
前記商に１００を乗じること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記栄養製品が乳児用調合乳である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記消化工程が、ヒト胃腸管の環境を模倣することを意図する１つ以上の酵素を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素が、ペプシン、ペプチダーゼ、パンクレアチンプロテイナーゼ、膵プロテアーゼアミラーゼ、パパイン、トリプシン及びキモトリプシンから成る群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試料を消化する前記工程が、
栄養製品の試料を得ること；
そのｐＨを約４．５に調整すること：
ペプシンを加えること；
前記試料をインキュベートすること；
前記ｐＨを約７．０に上昇させること；
パンクレアチンプロテイナーゼを加えること；及び
前記試料をインキュベートすること
の工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプシンを酵素活性についての米国薬局方基準によって調製する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記パンクレアチンプロテイナーゼを酵素活性についての米国薬局方基準によって調製する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
消化を終了させる前記工程が、煮沸水浴中に試料を浸漬することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記の少なくとも１つの酵素が、酵素活性についての米国薬局方基準によって調製された胃又は腸の酵素である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳児用調合乳タンパク質の消化率を定量するための方法に関する。より詳細には、本発明は、ＵＳＰ消化酵素によってインビトロで消化した乳児用調合乳サンプルの全体及び可溶性部分のアミノ酸プロフィール分析によるタンパク質の消化率の測定に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳児用調合乳は、そのまま使用できる即時使用液体調合乳（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｆｅｅｄ）、濃縮液体及び粉末形態を含む様々な形態で市販されている。乳児用調合乳は、典型的には、調合乳を与えられる乳児が適切な栄養のために適切な量のアミノ酸、特に必須アミノ酸を確実に摂取することを意図するカゼイン及び／又は乳清タンパク質を含有する。食物タンパク質の栄養上の品質を決定する２つの要因は消化率とバイオアベイラビリティーである。典型的には、これらの調合乳はヒトの母乳中で認められるレベルよりも高いレベルのタンパク質を含む。乳児用調合乳は、タンパク質の推定されるより低い消化率を考慮してより高いレベルのタンパク質で製造される。
【０００３】
乳児用調合乳の研究は、これらの調合乳の製造の間に使用される工程が調合乳中のタンパク質の低い溶解度及び／又は消化率などの栄養上の影響を及ぼすことを明らかにした。例えば、濃縮液体乳児用調合乳及び即時使用液体調合乳を生産するために使用される長時間に及ぶ熱処理は、タンパク質の消化率を低下させることが示されている。熱へ暴露する結果、タンパク質は変性又は凝集し、おそらくその消化率が変化する。高温でのミルクの処理も試験されており、メイラード反応として知られる糖とアミノ酸の反応を上昇させることが示された。これらの反応は、タンパク質分解酵素への接触可能性を制限することによってアミノ酸のバイオアベイラビリティーを低下させることが示されている。
【０００４】
インビボでのタンパク質消化は２段階の工程である。第一段階は、プレ消化酵素ペプシンへのタンパク質の暴露である。第二段階は、膵酵素による加水分解を含む。タンパク質消化産物は速やかに小腸へと運搬され、吸収されるので、インビボでのアミノ酸のアベイラビリティーの評価は困難である。さらに、内因性タンパク質が存在する可能性があり、食品として又は栄養補助食品の形態で摂取されるタンパク質とは異なる速度で消化され、吸収されうる。それ故、タンパク質の消化率のインビトロ分析が開発された。
【０００５】
乳児用調合乳消化率の評価は、酵素加水分解比色定量分析（ＴＮＢＳを使用した加水分解の程度）及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのサイズ排除クロマトグラフィー技法によって実施されてきた。これらのアプローチによって提供される正確度と精密度は、不溶性タンパク質の存在によって及び／又は分光及びクロマトグラフィー干渉によって損なわれる。
【０００６】
乳児用調合乳のインビトロ消化は、プレ消化酵素であるペプシン及びパンクレアチンを用いて実施されてきた。タンパク質の消化率は、ケルダール分析によって測定されるようなインビトロ消化工程後の非タンパク質性窒素（ＮＰＮ）の上昇レベルを測定することによって測定された。しかし、これらの研究で使用された酵素は酵素活性の標準化を含んでおらず、それ故消化において使用された酵素の活性はロットごとに有意に異なる可能性がある。さらに、ケルダール法による窒素分析は消化タンパク質と非消化タンパク質の定量において特異性を欠く。消化されたアミノ酸の種類の特異性は、調合乳を与えられる乳児による必須アミノ酸の消化と吸収をさらに確実にするために、乳児用調合乳を含む栄養製品に必要な配合のためのよりよい手引きを提供する。
【０００７】
消化試験は、消化過程で使用されるペプシン、トリプシン及びキモトリプシンなどのタンパク質の活性レベルを測定するためのアッセイを含んだ。ペプシンの活性は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）可溶性生成物の単位として測定された。トリプシン及びキモトリプシン活性は、特定アミノ酸についての加水分解速度として測定された。使用する酵素の活性レベルを測定することはそのようなアッセイの標準化を改善しうるが、酵素活性を測定する付加的な工程は面倒であり、時間がかかる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
標準化された活性を有する酵素を活用するインビトロでのタンパク質消化率を測定する方法が求められている。さらに、アミノ酸消化率の特異性を提供するそのような方法の結果が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、消化されたタンパク質と総タンパク質（消化及び非消化）の定量の特異性を提供しながら、タンパク質の消化率を測定するための方法を提供する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明の１つの実施態様は、タンパク質の消化率を測定する方法であり、その方法は、栄養製品の試料と試薬ブランクを少なくとも１つの酵素で消化すること；消化過程を終了させること；前記試料及びブランクに関する複数のアミノ酸の各々の総濃度を測定すること；前記試料及びブランクに関する総トリプトファン濃度を測定すること；前記試料及びブランクに関する複数のアミノ酸の各々の可溶性濃度を測定すること；前記試料及びブランクに関するトリプトファンの可溶性濃度を測定すること；及び栄養製品の消化された試料中の可溶性アミノ酸のパーセンテージを算定すること、の工程を含む。
【００１１】
もう１つの実施態様では、本発明は、消化した試料及びブランクの各々を第一部分と第二部分に分けること；前記試料の第一部分とブランクの第一部分について複数のアミノ酸の各々の総濃度を測定すること；前記試料の第一部分とブランクの第一部分について総トリプトファン濃度を測定すること；前記試料の第二部分とブランクの第二部分の各々を液相と固相に分離すること；前記液相中の複数のアミノ酸の各々の可溶性濃度を測定すること；及び前記液相中のトリプトファンの可溶性濃度を測定すること、の工程を含む。
【００１２】
もう１つの実施態様では、前記分離工程は、酸性化、沈殿、遠心分離、ろ過、及び遠心分離とろ過の組合せから成る群より選択される。
【００１３】
もう１つの実施態様では、前記の可溶性アミノ酸のパーセンテージを算定する工程は、前記試料及びブランクについて複数のアミノ酸の総濃度とトリプトファン濃度を加算すること；前記試料とブランクの間での複数のアミノ酸とトリプトファンの総濃度の差を判定すること；前記試料及びブランク中の複数のアミノ酸の可溶性濃度とトリプトファン濃度を加算すること；前記試料とブランクの間での複数のアミノ酸可溶性濃度とトリプトファン濃度の差を判定すること；可溶性濃度の差を総濃度の差で除して商を決定すること；及び前記商に１００を乗じること、を含む。
【００１４】
１つの実施態様では、前記栄養製品は乳児用調合乳である。
【００１５】
１つの実施態様では、前記消化工程は、ヒト胃腸管の環境を模倣することを意図する１つ以上の酵素を使用する。
【００１６】
さらなる実施態様では、前記酵素は、ペプシン、ペプチダーゼ、パンクレアチンプロテイナーゼ、パパイン、トリプシン及びキモトリプシンから成る群より選択される。
【００１７】
さらなる実施態様では、試料を消化する前記工程は、栄養製品の試料を得ること；そのｐＨを約４．５に調整すること：ペプシンを加えること；前記試料をインキュベートすること；前記ｐＨを約７．０に上昇させること；パンクレアチンプロテイナーゼを加えること；及び前記試料をインキュベートすること、の工程を含む。
【００１８】
さらなる実施態様では、消化を終了させる前記工程は、試料を煮沸水浴中に浸漬することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明に従って消化率を測定しうるタンパク質は、栄養製品、栄養補助食品、薬剤又は他の製品を含むがこれらに限定されない、多くの形態でありうる。それらはあらゆる年齢で、例えば乳児、小児又は成人によって使用されうる。新生児期、小児期及び青年期などの急速な成長期にそれらを使用することには特別な意義があると考えられる。本発明に従って消化率を測定しうるタンパク質は、ＦＤＡ法定食品分類：通常食品、特定保健用食品、栄養補助食品及び医療用食品を含むがこれらに限定されない、栄養「媒体又は担体」に組み込むことができる。
【００２０】
栄養製品のためのタンパク質の適切なソースは、乳、ダイズ、コメ、食肉（例えば牛肉）、動物及び野菜（例えばエンドウ豆、ジャガイモ）、卵（卵アルブミン）、ゼラチン、及び魚を含む。適切な無傷タンパク質は、ダイズベース、乳ベース、カゼインタンパク質、乳清タンパク質、コメタンパク質、牛肉コラーゲン、エンドウ豆タンパク質、ジャガイモタンパク質及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。適切なタンパク質加水分解産物は、ダイズタンパク質、カゼインタンパク質加水分解産物、乳清タンパク質加水分解産物、コメタンパク質加水分解産物、ジャガイモタンパク質加水分解産物、魚肉タンパク質加水分解産物、卵アルブミン加水分解産物、ゼラチンタンパク質加水分解産物、動物性及び植物性タンパク質加水分解産物、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。加水分解タンパク質（タンパク質加水分解産物）は、加水分解された又はより短いペプチド断片及びアミノ酸に分解されたタンパク質である。そのような加水分解されたペプチド断片及び遊離アミノ酸はより容易に消化される。最も広い意味で、１つ以上のアミド結合が壊れたときタンパク質は加水分解されたことになる。アミド結合の破壊は、例えば加熱又はせん断により、製造の間に偶発的又は付随的に起こりうる。本発明のために、加水分解タンパク質という用語は、アミド結合を破壊するように加工又は処理されたタンパク質を意味する。意図的な加水分解は、例えば無傷タンパク質を酵素又は酸で処理することによって実施しうる。好ましくは本発明に従った調合乳において使用される加水分解タンパク質は、アミノ窒素（ＡＮ）：総窒素（ＴＮ）の比率が約０．１ＡＮ：１．０ＴＮ〜約０．４ＡＮ：約１．０ＴＮ、好ましくは約０．２５ＡＮ：１．０ＴＮ〜約０．４ＡＮ：約１．０ＴＮまでの範囲であるように加水分解される。（提示するＡＮ：ＴＮ比は加水分解産物タンパク質源だけについてのものであり、最終的な乳児用栄養調合乳製品におけるＡＮ：ＴＮ比ではない。遊離アミノ酸が補助食品として添加されることがあり、報告値を変化させるからである。）タンパク質はまた、遊離アミノ酸の形態でも提供されうる。本発明に従った調合乳は、より栄養的に完全でバランスのとれた調合乳を提供するために、好ましくは様々な遊離アミノ酸を補足する。
【００２１】
アミノ酸はタンパク質生合成の個別構築ブロックである。非必須アミノ酸は、アンモニアと様々な炭素原から体内で合成されるアミノ酸である。非必須アミノ酸は、アラニン（ＡＬＡ）、セリン（ＳＥＲ）、アスパラギン酸（ＡＳＰ）、グルタミン酸（ＧＬＵ）、システイン（ＣＹＳ）、チロシン（ＴＹＲ）、アスパラギン（ＡＳＮ）、プロリン（ＰＲＯ）、グリシン（ＧＬＹ）及びグルタミン（ＧＬＮ）を含む。「ＧＬＸ」の略語はＧＬＵ＋ＧＬＮを表わし、「ＡＳＸ」の略語はＡＳＰ＋ＡＳＮを表わす。
【００２２】
必須アミノ酸もインビボでのタンパク質合成に必要であり、食事ソースから摂取しなければならない。それらは、イソロイシン（ＩＬＥ）、ロイシン（ＬＥＵ）、リシン（ＬＹＳ）、メチオニン（ＭＥＴ）、フェニルアラニン（ＰＨＥ）、トレオニン（ＴＨＲ）、トリプトファン（ＴＲＰ）、バリン（ＶＡＬ）、ヒスチジン（ＨＩＳ）及びアルギニン（ＡＲＧ）（幼若な成育中の動物では必須であるが、成体では必須ではない）を含む。  必須アミノ酸のうちで、トリプトファンは１日摂取必要量が最も低い。
【００２３】
タンパク質の消化率に対する直接干渉は、インビトロ消化後の溶液（可溶性又は消化性部分）中のアミノ酸の種類と濃度及び消化後の固相（非消化性部分）中のアミノ酸の濃度レベルを測定する分析から導くことができる。調合乳に添加するための適切な遊離アミノ酸の例は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、Ｌ−タウリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アルギニン及びＬ−カルニチンを含むが、これらに限定されない。
【００２４】
（ダイズ）
本発明の栄養調合乳の１つの成分はダイズタンパク質である。前述したように、多くのダイズタンパク質源を考慮しうる。ダイズタンパク質はダイズから分離される。ダイズは、その約３８％から４０％がタンパク質である高品質タンパク質の優れたソースである。簡単に述べると（スキームＩに示すように）、ダイズの加工は、脱穀して破砕したダイズから油を抽出して、脱脂されたダイズフレークを残すことを含む。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
脱脂ダイズフレークは、典型的には粉砕して粉にする。アルコール抽出するか又はアルコリン／Ｈ２Ｏ抽出してフレーバー化合物及び糖類を除去し、タンパク質濃縮物を生成する。水で処理して糖類とフレーバー化合物を除去し、沈殿させ、乾燥して、タンパク質単離物を生成する。乳清とタンパク質繊維が前記工程の副産物である。
【００２７】
（栄養製品）
栄養製品は、意図する使用者の年齢と状態によって異なる相対量で、マクロ栄養素、すなわち脂肪、タンパク質及び炭水化物を含み、しばしばビタミン類、ミネラル及び微量ミネラルなどのミクロ栄養素を含有する。「食品」という用語は固体及び液体を包含する。「栄養製品」という用語は、ＦＤＡ法定食品分類：通常食品、特定保健用食品、医療用食品及び乳児用調合乳を含むが、これらに限定されない。「特定保健用食品」は、食事を補助する栄養分を供給することにより又は食事の単独品目として、身体的、生理的、病的状態の理由で存在する特殊な食事上の必要を補充することが意図されている。「医療用食品」は、医師の監督下で経腸的に消費又は投与されるように調合されており、認識されている科学的原理に基づき、特殊な栄養上の必要が医学的評価によって確立されている疾患又は状態の特定食事管理のための食品である。
【００２８】
さらに「栄養補助食品」は、錠剤、カプセル又は液体形態での摂取によって食事を補充することが意図された製品であり、通常食品としてあるいは食事又は治療食の単独品目としての使用のためのものではない。
【００２９】
（乳児用調合乳）
乳児用調合乳は、「乳児用調合乳法（Ｉｎｆａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａｃｔ）」（２１ＵＳＣ  §３５０（ａ）以下参照）の規格及び判定基準に合致する栄養配合物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を指し、ヒト母乳を置き換える又は補充することが意図されている。そのような調合乳は少なくとも３つの異なる形態（粉末、液体濃縮物及び即時使用（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｆｅｅｄ（「ＲＴＦ」）液体）として入手可能であるが、「アズフェド（ａｓ  ｆｅｄ）」ベースで栄養分濃度について言及することが慣例であり、それ故しばしばＲＴＦを説明するが、他の形態も製造者の指示に従って本質的に同じ組成に再構成又は希釈されること、及び当業者は濃縮又は粉末形態についての関連組成を算定できることは明白である。
【００３０】
「標準」又は「満期産児」乳児用調合乳は、月満ちて出産された乳児のための最初の栄養補給としての乳児用調合乳を指す。タンパク質、脂肪及び炭水化物成分は、それぞれ、約８〜１０％、４６〜５０％及び４１〜４４％のカロリーを供給する；カロリー密度は、厳密には約６６０〜約７００ｋｃａｌ／Ｌ（又は１９−２１Ｃａｌ／オンス）、通常６７５〜６８０ｋｃａｌ／Ｌ（２０Ｃａｌ／オンス）の範囲である。脂肪、タンパク質及び炭水化物の間でのカロリー分布は、満期産児の乳児用調合乳の異なる製造者によって多少変動がありうる。ＳＩＭＩＬＡＣ（商品名）（Ｒｏｓｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＥＮＦＡＭＩＬ（商品名）（Ｍｅａｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｓ）及びＧＯＯＤ  ＳＴＡＲＴ（商品名）（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）は満期産児用調合乳の例である。
【００３１】
「栄養強化」調合乳は、「標準」又は「満期産児」調合乳に比べて栄養強化された乳児用調合乳を指す。栄養強化調合乳を区別する主要な規定的特徴はカロリー密度であり、第二の要素はタンパク質の濃度である。例えば、約７００ｋｃａｌ／Ｌ以上のカロリー密度又は約１８ｇ／Ｌ以上のタンパク質濃度を有する調合乳は「栄養強化性」とみなされる。栄養強化性調合乳はまた、典型的にはより高いレベルのカルシウム（例えば約６５０ｍｇ／Ｌ以上）及び／又はリン（例えば約４５０ｍｇ／Ｌ以上）を含有する。栄養強化性調合乳の例は、Ｓｉｍｉｌａｃ  ＮＥＯＳＵＲＥ（商品名）及びＳｉｍｉｌａｃ  Ｓｐｅｃａｉｌ  Ｃａｒｅ（商品名）調合乳を含む。
【００３２】
本発明のタンパク質消化率を測定できる液体及び粉末栄養製品は、一般に当業者に公知の慣用的手法によって製造される。簡単に述べると、３つのスラリーを調製し、混合して、熱処理し、標準化して、噴霧乾燥し（適宜に）、包装して、滅菌する（適宜に）。
【００３３】
（液体製品）
炭水化物／ミネラルスラリーを、先ず水を攪拌しながら高温に加熱することによって調製する。次にミネラルを加える。ミネラルは、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム、ヨウ化カリウム及び微量ミネラルプレミックスを含みうるが、これらに限定されない。ラクトース、トウモロコシシロップ固体、スクロース及び／又はマルトデキストリンの１種以上のような炭水化物源を水に溶解し、それによって炭水化物溶液を生成する。ダイズ多糖類などの食物繊維源も添加しうる。完成した炭水化物／ミネラルスラリーは、他のスラリーと混合するまで、好ましくは約１２時間以内、高温で攪拌下に保持する。
【００３４】
基礎となる油混合物を一緒に混合して加熱することにより、油スラリーを調製する。基礎油混合物は、典型的にはダイズ、ヤシ、ヤシオレイン、高オレイン酸ベニバナ油又はヒマワリ油及び中鎖トリグリセリドの何らかの組み合わせを含む。モノグリセリド、ジグリセリド、ダイズモノグリセリド、ジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル及びダイズレシチンなどの乳化剤が使用しうる。油溶性ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ（天然Ｒ，Ｒ，Ｒ形態又は合成）及びＫのいずれか又はすべてを個別に又はプレミックスの一部として添加しうる。インビボで抗酸化薬として機能することができるβカロテンも、カラゲナンなどの安定剤と同様に添加しうる。本発明にとって重要な特定ＬＣＰを含む油（例えばＤＨＡ及びＡＡ）を油スラリーに添加することができる。これらのＬＣＰは容易に分解して腐敗油になるので、注意しなければならない。完成した油スラリーは、他のスラリーと混合するまで、好ましくは約１２時間以内、攪拌下に保持する。
【００３５】
水スラリー中のタンパク質を、先ず水を攪拌しながら適切な高温に加熱することによって調製する。次にタンパク質源を攪拌しながら水に加える。典型的には、このタンパク質源は無傷又は加水分解乳タンパク質（例えば乳清、カゼイン）、無傷又は加水分解植物性タンパク質（例えばダイズ）、遊離アミノ酸及びそれらの混合物である。一般に、あらゆる既知のアミノ窒素源が本発明において使用できる。完成したタンパク質スラリーは、他のスラリーと混合するまで、好ましくは約２時間以内、高温で攪拌下に保持する。あるいは、一部のタンパク質は、水中タンパク質ではなく脂肪中タンパク質エマルションに混合しうる。
【００３６】
水中タンパク質及び炭水化物／ミネラルスラリーを攪拌しながら一緒に混合し、生じた混合スラリーを高温に保持する。少し時間をおいた後（例えば２−３分間）、油スラリーを攪拌しながら前工程からの混合スラリーに加える。油性混合物に添加する代わりに、ＬＣＰ油を、タンパク質、炭水化物／ミネラル及び油スラリーを合わせて生成された混合物に直接加えることができる。
【００３７】
すべての成分が完全に混合するまで十分に攪拌した後、完成した混合物のｐＨを所望範囲に調整する。次に混合スラリーを脱気、超高温熱処理、乳化及び均質化に供し、その後冷蔵温度に冷却する。好ましくは上記工程が完了した後、品質管理のための適切な分析試験を実施する。品質管理試験の分析結果に基づき、適切な量の水を攪拌しながら希釈のためにバッチに加える。
【００３８】
水溶性ビタミンと微量ミネラル（セレン酸ナトリウムを含む）を含むビタミン溶液を調製し、攪拌しながら、処理したスラリー混合物に加える。ヌクレオチドを含む別の溶液を調製し、同じく攪拌しながら、処理した混合スラリーに加える。
【００３９】
最終生成物のｐＨを、最適製品安定性を達成するように再び調整してもよい。次に、完成した製品を適切な金属、ガラス又はプラスチック容器に充填し、従来のテクノロジーを用いて最後の滅菌に供する。あるいは、液体製品を無菌的に滅菌して、プラスチック容器に充填することができる。
【００４０】
（粉末製品）
炭水化物／ミネラルスラリーを液体製品の製造について前述したように調製する。
【００４１】
油スラリーは、以下の点を除いて液体製品の製造について前述したように調製する：１）乳化剤（モノグリセリド、ジグリセリド、レシチン）及び安定剤（カラゲナン）は、典型的には粉末には添加しない、２）βカロテンに加えて、その後の噴霧乾燥工程の際中に製品の酸化品質を維持するのを助けるために、混合トコフェロール及びパルミチン酸アスコルビルなどの他の抗酸化剤を添加することができる、及び３）ＬＣＰを、油スラリーにではなく、前記スラリーを混合した後に添加する。
【００４２】
水中タンパク質スラリーを液体製品の製造について前述したように調製する。
【００４３】
炭水化物／ミネラルスラリー、水中タンパク質スラリー及び油スラリーを、液体製品の製造について前述したのと同様に、一緒に混合する。完成した混合物のｐＨを調整した後、ＬＣＰを攪拌しながら混合スラリーに加える。望ましくは、混合物が均質化の直前に一定速度で導管を通過するときにＬＣＰをゆっくりと計量して製品に加える（インライン混合）。
【００４４】
脱気、超高温熱処理、乳化及び均質化後、より効率的な噴霧乾燥を促進するため混合物の固体レベルを高めるように、処理した混合物を蒸発させてもよい。次に混合物を予熱機と高圧ポンプに通し、従来の噴霧乾燥テクノロジーを用いて噴霧乾燥する。噴霧乾燥した粉末を塊状にしてもよく、その後で真空、窒素又は他の不活性環境下で金属又はプラスチック缶あるいはホイル／ラミネートパウチに包装する。
【００４５】
これらの製造工程のいずれかに関する変法は当業者に既知であるか又は当業者には容易に明白である。本発明はいかなる特定製造方法にも限定されることを意図しない。ここで言及するすべての米国特許のテキスト全体が参考として本明細書中に援用されている。
【００４６】
（胃及び腸の酵素）
ここで述べるインビトロ消化に使用する酵素を米国薬局方基準に従って生産した。酵素の活性は、それ故、ロットを通じて一貫している。米国薬局方（ＵＳＰ）は、医薬品及び他の健康管理テクノロジーの品質を保証するよう技術水準の基準を確立することによって公衆衛生を促進する非政府組織である。これらの基準は市民参画（パブリックインボルブメント）の過程によって開発され、世界中で受け入れられている。
【００４７】
ＵＳＰによって開発された基準は、連邦食品医薬品化粧品法（２１Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３２１以下参照）で認められている、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ−ＮＦ）の中で公表されている。
【００４８】
ここで述べる方法での使用に適する酵素は、ペプシン、ペプチダーゼ、パンクレアチンプロテイナーゼ、パパイン、トリプシン及びキモトリプシンを含むが、これらに限定されない。
【００４９】
（インビトロタンパク質消化）
インビボでの消化工程を正確に再現することは困難である。しかし、インビボで存在するいくつかの条件はインビトロで再現することができる。インビトロ消化率アッセイはできるだけインビボの条件に近い条件下で実施すべきである。例えば、消化系のｐＨ及び酵素をインビトロ消化工程に組み込むべきである。同様に、インビトロ消化は、タンパク質が消化管内に存在する時間に相当する期間とすべきである。以下で述べるインビトロ消化工程は、幼若乳児の胃及び腸酵素のｐＨ及び構成を模倣する。インビトロ消化の時間も、食物が幼若乳児の消化管を通過するのに必要な時間を模倣する。栄養製品のタンパク質消化物を以下の手順によって調製した。
【００５０】
一定容量の即時使用栄養製品を入手すること、粉末の再構成又は液体濃縮物の希釈により、栄養製品の試料８０ｍＬを調製する。懸濁液を定量的に１００ｍＬメスフラスコに移し、水で１００ｍＬに希釈する。（懸濁液は、１００ｍＬメスフラスコが約１．６２５ｇのタンパク質を含むように、及び２０ｍＬねじキャップバイアルにピペットで分注したアリコートが約０．１６２５ｇのタンパク質を含むように調製しなければならない。アッセイ結果の質は、ある程度まで、酵素対試料タンパク質の一定比の使用に依存する。）
希釈した試料１０ｍＬを２０ｍＬねじキャップバイアルにピペットで分注する。
【００５１】
１Ｍ塩酸で１０ｍＬアリコートのｐＨを４．５に調整する。
【００５２】
ＵＳＰペプシン３２ｍｇ（米国薬局方、１２６０１  Ｔｗｉｎｂｒｏｏｋ  Ｐａｒｋｗａｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２）を加え、攪拌してペプシンを完全に懸濁させる。
【００５３】
バイアル中３７℃で３０分間インキュベートする。
【００５４】
０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３でｐＨを７．０に上昇させる。
【００５５】
０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３中２５ｍｇ／ｍＬのＵＳＰ膵プロテアーゼアミラーゼ（米国薬局方、１２６０１  Ｔｗｉｎｂｒｏｏｋ  Ｐａｒｋｗａｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２）の新鮮調製懸濁液３．０ｍＬを加える。攪拌して酵素を完全に懸濁させる。
【００５６】
バイアルを３７℃で６０分間インキュベートする。
【００５７】
バイアルを煮沸水浴に４分間液浸する。室温に冷却する。
【００５８】
生じた消化物を、移動を助けるために水を使用して、風袋を量った２５ｍＬメスフラスコに定量的に移す。フラスコ中の消化物を水で希釈し、重量を記録する。
【００５９】
消化試料中の生じたアミノ酸の総量と可溶性部分を算定するのに使用するために、栄養試料と平行して試薬ブランクを消化する。
【００６０】
アミノ酸プロフィールとトリプトファン濃度を測定するために消化物の別々のアリコートを採取した。しかし、アミノ酸プロフィールとトリプトファン濃度を同じ消化物アリコートから測定する場合は、分離工程は必要ない。
【００６１】
（アミノ酸プロフィール）
総アミノ酸プロフィールについて試験する前に、消化物１００μＬをピペットによって風袋を量った２ｍＬアンプルに移し、重量を記録した。６Ｍ  ＨＣｌ  ２．０ｍＬを加え、アンプルを窒素ブランケット下に置いて、密封し、１１０℃で２２時間加熱した。次に消化物を蒸発乾燥させ、Ｎａ−Ｓ緩衝液２ｍＬに再懸濁した。Ｇｅｌｍａｎ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（０．４５μｍ、Ｇｅｌｍａｎ  Ｐ／Ｎ  ４４９７）に通して再懸濁液をろ過した。
【００６２】
可溶性アミノ酸プロフィールについて試験する前に、消化物１０ｍＬをピペットによって風袋を量った（ｔａｒｅｄ）５０ｍＬ遠心分離管に移した。２４％トリクロロ酢酸１０ｍＬを加え、管にふたをして、十分に混合した。管の内容物の重量を記録した。管と内容物を３０００倍重力で３０分間遠心分離し、次にその液体をＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．４１紙でろ過した。ろ液２００μＬをピペットによって風袋を量った２ｍＬアンプルに移し、試料の重量を記録した。総アミノ酸の試験に関しては、６Ｍ  ＨＣｌ  ２．０ｍＬを加え、窒素ブランケット下に置いて、密封し、１１０℃で２２時間加熱した。次に消化物を蒸発乾燥させ、Ｎａ−Ｓ緩衝液２ｍＬに再懸濁した。Ｇｅｌｍａｎ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（０．４５μｍ、Ｇｅｌｍａｎ  Ｐ／Ｎ  ４４９７）に通して再懸濁液をろ過した。
【００６３】
可溶性アミノ酸と総アミノ酸プロフィールを同じ消化物アリコートから測定する場合は、分離工程（遠心分離など）は必要ない。
【００６４】
タンパク質を酸加水分解によってそれらの成分アミノ酸に加水分解し、酸加水分解産物を自動アミノ酸分析器（Ｍｏｄｅｌ  ６３００  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって試験した。前記分析器は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して個々のアミノ酸を分離し、ニンヒドリンでのポストカラム誘導体化によってアミノ酸誘導体を生成して、次にそれらを検出し、比色計によって定量する。
【００６５】
（トリプトファンの定量）
トリプトファンの定量は、参考としてここに援用されている、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｓ，Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ  １９９２年１１月−１２月、７５（６）：１１１２−９の中でＳ．Ｅ．Ｇａｒｃｉａ及びＪ．Ｈ．Ｂａｘｔｅｒが述べた方法によって実施した。
【００６６】
総タンパク質のトリプトファン定量のために、消化物３．０ｍＬを５０ｍＬメスフラスコに移した。プロナーゼ溶液１．０ｍＬ（０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５中１．７ｍｇ／ｍＬ）を加え、ｐＨ７．５の緩衝液で容量を５０ｍＬに希釈した。次に５０ｍＬ溶液を５０℃で６時間インキュベートした。その後ＨＰＬＣ法によってトリプトファンを定量した。
【００６７】
可溶性タンパク質のトリプトファン定量のために、可溶性アミノ酸定量のために調製したろ液６．０ｍＬをピペットによって５０ｍＬビーカーに移した。０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５  ３０ｍＬを加えた。４５％水酸化カリウム溶液を用いてｐＨを７．５に調整した。総タンパク質についてのトリプトファンの試験に関しては、プロナーゼ溶液１．０ｍＬ（０．０５Ｍ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５中１．７ｍｇ／ｍＬ）を加え、ｐＨ７．５の緩衝液で容量を５０ｍＬに希釈した。次に５０ｍＬ溶液を５０℃で６時間インキュベートした。その後ＨＰＬＣ法によってトリプトファンを定量した。
【００６８】
（トリプトファン定量のためのＨＰＬＣシステム）
カラム：ＹＭＣ  ＯＤＳ−ＡＱ、４．６×２５０ｍｍ、１２０Ａ、５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ  ＃ＡＱ１２Ｓ０５２５４６ＷＴ。
【００６９】
移動相Ａ：０．０２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４９００ｍＬ、アセトニトリル１００ｍＬ；Ｈ３ＰＯ４によりｐＨ３．１。
【００７０】
移動相Ｂ：実験水（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｗａｔｅｒ）２００ｍＬ、アセトニトリル８００ｍＬ。
【００７１】
流速：０．５ｍＬ／分。
【００７２】
温度：２０℃。
【００７３】
検出：２８０ｎｍ、２１４ｎｍの紫外線。
【００７４】
注入量：１０μＬ。
【００７５】
分析時間：５０分。
【００７６】
溶出プログラム：０％Ｂを０−５分、０−２５％Ｂを５−３４分、２５−１００％Ｂを３４−３５分、１００％Ｂを３５−３７分、１００−０％Ｂを３７−３８分。
【００７７】
標準溶液：実験水中約２８ｍｇ／Ｌ（高標準）、約１４ｍｇ／Ｌ（中標準）及び約７ｍｇ／Ｌ（低標準）のＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＰＰＤ  Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ。
【００７８】
（タンパク質消化率の算定）
試薬ブランク総タンパク質に関するアミノ酸プロフィール濃度とトリプトファン濃度を加算する。この値を「ＲＴ」と称する。
【００７９】
試薬ブランク可溶性タンパク質に関するアミノ酸プロフィール濃度とトリプトファン濃度を加算する。この値を「ＲＳ」と称する。
【００８０】
試料消化物総タンパク質について得たアミノ酸プロフィール濃度とトリプトファン濃度を加算する。この値を「ＩＴ」と称する。
【００８１】
試料消化物可溶性タンパク質について得たアミノ酸プロフィール濃度とトリプトファン濃度を加算する。この値を「ＩＳ」と称する。
【００８２】
タンパク質消化率を以下のように算定する：
【００８３】
【数１】
2005537008.tif 000003
【００８４】
ここで引用する、公表文献、特許出願及び特許を含むすべての参考文献は、各々の参考文献が参考としてここに援用されていることを個別に及び特定して指示され、その全体がここに記述されているかのごとくに同じように参考としてここに援用されている。
【００８５】
本発明の説明の中で（特に特許請求の範囲において）「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の使用は、本文中で特に異なる記載がない限り又は文脈上明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。本文中の数値の範囲の言及は、本文中で特に異なる指示がない限り、単にその範囲内に属する各々別々の数値を個別に言及することの速記的方法として用いることを意図しており、各々別々の数値はそれが本文中で個別に列記されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。ここで述べるすべての方法は、本文中で特に異なる指示がない限り又は文脈上明らかに矛盾しない限り、いかなる適切な順序でも実施することができる。ここで提供するあらゆる例及び例示的言語（例えば「のような」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、異なる特許請求が為されていない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施にとって必須であることが特許請求されていないいかなる要素も指示すると解釈されるべきではない。
【００８６】
一部の潜在的利点及び目的をここで明白に特定したが、本発明の一部の実施態様は、明白に特定された利点及び目的の全部又はいずれかを提供しない場合があることは了解されるべきである。
【００８７】
本発明を実施するための本発明者に既知の最良の方法を含む、本発明の好ましい実施態様をここで述べる。言うまでもなく、それらの好ましい実施態様の変法は、前記の説明を一読すれば当業者には明白となる。本発明者は当業者がそのような変法を適宜に用いることを期待しており、また本発明者は、本発明がここで特定して述べるのとは異なるように実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法令で認められるときは、付属の特許請求の範囲において言及される事項のすべての修正及び等価物を包含する。さらに、そのすべての可能な変法における前述した要素のいかなる組合せも、本文中で特に異なる記載がない限り又は文脈上明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【００８８】
（実施例）
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、言うまでもなく、いかなる意味においても本発明の範囲を限定する解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００８９】
３つの粉末Ａｒｌａ乳清タンパク質加水分解産物（ＷＰＨ）、Ａｒｌａ  ＷＰＨ  Ａｌｔｅｒｎａｔｅｓ１、２及び３をＡｒｌａ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ａｍｂａ  Ｎｒ．Ｖｉｕｍ  ＤＫ−６９２０  Ｖｉｄｅｂａｅｋ  Ｄｅｎｍａｒｋより入手した。約１．６２５ｇのタンパク質を含む、再構成した粉末ＷＰＨ８０ｍＬ及び同じく約１．６２５ｇのタンパク質を含む、再構成したＮｅｓｔｌｅ  ＧＯＯＤ  ＳＴＡＲＴ（商品名）８０ｍＬを、試薬ブランクと共にここで述べる方法に従ってインビトロで消化した。ここで述べるように総消化物及び消化物の可溶性部分に関してアミノ酸プロフィール及びトリプトファン濃度を測定した。アミノ酸プロフィールを表１に示す。タンパク質消化率の比較を表２に示す。
【００９０】
【表２】
2005537008.tif 000004
2005537008.tif 000005
【００９１】
【表３】
2005537008.tif 000006
【００９２】
ＷＰＨ消化率は乳児用調合乳の製造工程によって低下しうるので、この栄養製品の消化率に関する決定的な結論は乳児用調合乳の比較からより良く導かれる。
【実施例２】
【００９３】
鉄分の少ないＳＩＭＩＬＡＣ（商標）の３つの試料及びＮｅｓｔｌｅ  ＧＯＯＤ  ＳＴＡＲＴ（商品名）粉末の３つの試料を各々水で再構成し、各々の再構成物８０ｍＬは約１．６２５ｇのタンパク質を含んだ。調合乳試量を試薬ブランクと共にここで述べる方法に従ってインビトロで消化した。先に述べたインビトロ消化工程は、ｐＨ、存在する酵素及び消化時間のパラメータに関して幼若乳児の消化系を模倣する。ここで述べるように総消化物及び消化物の可溶性部分に関してアミノ酸プロフィール及びトリプトファン濃度を測定した。アミノ酸プロフィールの一例を表３に示す。本文中で述べたようにタンパク質消化率の算定を実施した。タンパク質消化率の比較を表４に示す。
【００９４】
【表４】
2005537008.tif 000007
2005537008.tif 000008
【００９５】
【数２】
2005537008.tif 000009
【００９６】
【表５】
2005537008.tif 000010
【国際調査報告】
2005537008.tif 000011
2005537008.tif 000012