(57)【要約】本発明は、癌細胞の診断、画像化および処置のための方法に関する。特に、本発明は、癌細胞上に、正常に分裂する細胞より高密度で現れる腫瘍抑制分子の、癌の診断、画像化、予防および処置における使用に関する。細胞の集団において癌を初期に検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：（１）細胞の集団を提供する工程、（２）該細胞集団を、１つ以上の該細胞のいずれかにおいて、正常に分裂する細胞と比較して増加したＤＵＴＴ１のレベルについてアッセイする工程、を包含する。
2005504307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の集団において癌を初期に検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）細胞の集団を提供する工程
（２）該細胞集団を、１つ以上の該細胞のいずれかにおいて、正常に分裂する細胞と比較して増加したＤＵＴＴ１のレベルについてアッセイする工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
細胞の集団において癌を初期に検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）細胞の集団を提供する工程、
（２）該細胞をアッセイし、そしてＤＵＴＴ１の参照レベルを確立する工程、
（３）診断のための細胞の集団を得る工程
（４）工程３の細胞集団を、ＤＵＴＴ１の参照レベルと比較した場合に、１つ以上の該細胞のいずれかにおいて増加したＤＵＴＴ１のレベルについてアッセイする工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
細胞の集団において癌を診断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（１）細胞の集団を提供する方法
（２）該細胞集団を、１つ以上の該細胞のいずれかにおいて、正常に分裂した細胞と比較して増加したＤＵＴＴ１のレベルについてアッセイする工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
細胞の集団における癌を診断するための方法であって、該方法が、以下の工程：
（１）細胞の集団を提供する方法
（２）該細胞をアッセイし、そしてＤＵＴＴ１の参照レベルを確立する工程、
（３）診断のための細胞の集団を得る工程、
（４）工程３の細胞集団を、ＤＵＴＴ１の参照レベルと比較した場合に、１つ以上の該細胞のいずれかにおいて増加したＤＵＴＴ１のレベルについてアッセイする工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
インビトロでの方法である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が、肺癌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が、ヒト肺癌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記診断のための細胞として、気管支上皮細胞および／または気管支上皮の過形成が挙げられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
癌の診断における、ＤＵＴＴ１結合因子の使用。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の特徴のいずれかを有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
癌細胞を選択的に標識するための方法であって、該方法が、ＤＵＴＴ１結合因子を用いて１つ以上の癌細胞を処理する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記癌細胞が、肺癌細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、ヒト肺癌細胞である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、原発性癌細胞である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌細胞が、転移細胞である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＵＴＴ１結合因子が、以下：抗ＤＵＴＴ１抗体、ＤＵＴＴ１結合ペプチド、およびＤＵＴＴ１に結合する合成低分子からなる群より選択される１つ以上の因子のうちのいずれかである、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＵＴＴ１結合因子が、その検出手段をさらに含むか、または該検出手段と関連している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出手段が、インビボ環境内での癌細胞の検出を可能にする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記インビボ環境が、ヒトの身体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌細胞を選択的に標識する工程における、ＤＵＴＴ１結合因子の使用。
【請求項２１】
前記ＤＵＴＴ１結合因子が、以下：抗ＤＵＴＴ１抗体、ＤＵＴＴ１結合ペプチド、およびＤＵＴＴ１に結合する合成低分子、からなる群より選択される１つ以上の因子のうちのいずれかである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＤＵＴＴ１結合因子が、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の特徴のいずれかを有する、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
癌細胞のインビボでの画像化における、請求項２１から請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
癌細胞を画像化するための方法であって、該方法は、１つ以上のＤＵＴＴ１結合因子を用いて１つ以上の癌細胞を処理する工程を包含し、該ＤＵＴＴ１結合因子が、検出手段をさらに備える、方法。
【請求項２５】
インビボでの癌細胞の画像化のための、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２４または請求項２５に記載の方法であって、以下：ヒト肺癌細胞、ヒト上皮癌細胞、ヒト肉腫細胞、ヒト造血癌細胞からなる群より選択される癌細胞の画像化のための、方法。
【請求項２７】
ＤＵＴＴ１および／またはＤＵＴＴ１結合因子を含む、組成物。
【請求項２８】
癌の予防または処置のための医薬の調製における、ＤＵＴＴ１および／またはＤＵＴＴ１結合因子の使用。
【請求項２９】
請求項２８に記載の、ＤＵＴＴ１結合因子の使用。
【請求項３０】
前記ＤＵＴＴ１結合因子が、ＤＵＴＴ１に対して惹起された抗体である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
肺癌の処置のための医薬の調製における、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
ヒト肺癌の処置のための医薬の調製における、請求項３１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌細胞の診断、画像化、および処置の方法に関する。特に、本発明は、癌の診断、画像化、予防、および処置における、正常に分裂する細胞（ｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌ）よりも癌細胞において高密度で存在する腫瘍関連分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）の染色体位置はしばしば、腫瘍に関連した欠失およびヘテロ接合性対立遺伝子の損失により初めて示唆された。成功したこれらの遺伝子の同定は、しばしばより大きな対立遺伝子損失領域内にマッピングされるはるかに微小でホモ接合的に欠失した領域内からの候補ＴＳＧの単離によるものである（１）。様々な欠失をマッピングする研究は、第３染色体遺伝子座内のいくつかの異なる部位が肺癌の発病および／または進行に関与していることを示唆している。現在の研究として、１５１の肺腫瘍バイオプシーおよび第３染色体における多型遺伝子座の２８のマーカーを保持した細胞株（２）の集中的な研究が挙げられる。ＦＩＳＨ法を用い、３ｐ１２、３ｐ１４および３ｐ２１におけるホモ接合性欠失が、バイオプシー材料において存在することもまた示されている（４）。
【０００３】
これらのホモ接合性欠失内での徹底的な遺伝子調査にもかかわらず、１つの染色体上の遺伝子を取り囲む対立遺伝子損失および残りのホモログの遺伝子における点変異を有する「古典的な」ＴＳＧとして、現れたものはない。しかしながら、腫瘍抑制遺伝子は後生的な機構によって不活性化され得るとしだいに認められつつある（６）。第３染色体のいくつかの遺伝子はこのカテゴリーに分類される。１２３Ｆ２／ＲＡＳＳＦ１遺伝子およびＦＨＩＴ遺伝子のアイソフォームは、肺（および他の器官）腫瘍において低減したまたは異常な発現を有し、腫瘍細胞株へのトランスフェクション後に腫瘍形成能を抑制することが示されているため、特に注目すべきある（６，７）。マウス中のＦｈｉｔ遺伝子の不活性化は、発癌物質で胃に負荷された変異マウスにおいて胃腫瘍および脂線腫瘍の形成を引き起こす（８）。それゆえ、当該分野において他の腫瘍抑制分子を同定する必要性が存在する。そのような分子は、腫瘍の予防および／または処置に有用であり得る。
【０００４】
癌は、規定されたタイプの癌細胞と結合することが知られる薬剤を用いて、細胞試料を処置することにより検出され得る。そのような検出は一般的に脊椎動物からの細胞試料を取り出すことを必要とする。適切な薬剤として抗体などが挙げられる。ある種の癌は画像化（放射線法（例えば、Ｘ線）が最も通常である）によって検出され得る。重要であるにもかかわらず、選択性（すなわち、他の非悪性小結節が検出される）および感度の問題（すなわち、非常に微小な腫瘍細胞、例えば微小転移巣の塊が検出できない）がある。
【０００５】
これらの問題点を克服することを試みるため、腫瘍の画像を入手するための別の方法が評価されつつある。長年の間、腫瘍特定抗原が探求されたが、一般的に固体腫瘍では発見されていない。腫瘍標的は、価値がある腫瘍によって排他的に発現される必要のないことが明らかとなりつつある。必要とされるのは、その腫瘍が周囲の細胞と比較して、細胞表面抗原を過剰発現することである。
【０００６】
最近、シグマ受容体結合ベンズアミドは、ヒト前立腺腫瘍のための診断の際および治療剤として使用されている（２７）。この研究では、非常に高密度のシグマ受容体がアンドロゲン非依存性ヒト前立腺腫瘍細胞株（ＤＵ−１４５）上に発現されることが見出された。放射標識されたベンズアミドおよび放射標識されていないベンズアミドの両方は、ヌードマウスに異種移植されたヒト前立腺腫瘍細胞と選択的におよび高い親和力で結合することが示された。試験された３種の化合物のすべてが血液プールからの素早いクリアランス、ならびに腫瘍における高い取り込みおよび保持を示した。それらはまた、２つの異なるヒト前線立癌細胞株において、細胞コロニー生成の投与量依存性阻害を示した。従って、当該分野において、さらなる細胞表面分子（それらの細胞表面密度は、正常に分裂する細胞と癌細胞を比較したときに異なる）を同定する必要性が残ったままである。そのような分子の同定は癌の画像化および／または診断の際に有用である。
【０００７】
これまで、本発明者らは、ＳＣＬＣ株（Ｕ２０２０）における３ｐ１２−１３の大きなホモ接合性欠失を記載した。この領域の物理的マップの構築後、ＣｐＧ島マッピングを用いて遺伝子の位置を同定した（９）。ＤＵＴＴ１（Ｕ２０２０内で欠失される）と名付けられた１つのそのような遺伝子は２つの他の腫瘍細胞株においてより小さなホモ接合性欠失内にマッピングすることが見出された（９）。ＤＵＴＴ１／ＲＯＢＯ１遺伝子は、広く哺乳動物において発現され、ＮＣＡＭファミリーのドメイン構造を有する受容体をコードする（１３）。ＮＩＨ−Ｈ２１９Ｘを含むいくつかの肺癌細胞株は、これまでに、ＤＵＴＴ１をコードする遺伝子内において１つ以上の欠失を保有し、それ故肺癌においてＤＵＴＴＩが関与することが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、従来技術の問題点の克服に着手した。特に、本発明者らは、肺腫瘍生成の開始または進行の役目を果す１以上の分子の同定に着手した。さらに、本発明者らは、癌細胞の画像化、診断、予防および／または処置の方法を確立することに着手した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明者らは、驚くべきことに、腫瘍抑制タンパク質ＤＵＴＴ１のレベルが癌細胞（上皮癌（前浸潤がん細胞）を含む）には高く、非癌性上皮（例えば、気管支上皮）には低いことを発見した。さらに、無視し得るタンパク質が上皮幹細胞にて検出される。これは驚くべき発見であり、そして本発明者らが示してきたような（本明細書（図１から４）に記載したように）予想と相反し、細胞内（特に肺を含む細胞）のＤＵＴＴ１の機能的活動の減少は、肺細胞において気管支上皮の肥厚化の出現をもたらす。
【００１０】
第１の局面において、本発明は以下の工程を包含する、細胞集団癌の早期検出のための方法を提供する：
（１）細胞集団を提供する工程。
（２）それらの細胞のうち１つ以上のいずれかにおいて、正常に分裂する細胞と比較して、ＤＵＴＴ１の増加レベルについて、その細胞集団をアッセイする工程。
【００１１】
従って、第２の側面において、本発明は、以下の工程を包含する、細胞集団における癌の早期検出のための方法を提供する：
（１）細胞集団を提供する工程。
（２）それらの細胞をアッセイし、ＤＵＴＴ１の参照レベルを確立する工程。
（３）診断のための細胞集団を得る工程。
（４）上記ＤＵＴＴ１の参照レベルと比較したときに、それらの細胞のうち１つ以上のいずれかにおいてＤＵＴＴ１の増加レベルについて、工程３の上記細胞集団をアッセイする工程。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は以下の工程を包含する細胞集団における癌の診断のための方法を提供する：
（１）細胞集団を提供する工程。
（２）それらの細胞のうち１つ以上のいずれかにおいて、正常に分裂する細胞と比較して、ＤＵＴＴ１の増加レベルについて上記細胞集団をアッセイする工程。
【００１３】
従って、なお、さらなる局面において、本発明は、以下の工程を包含する、細胞集団の癌診断のための方法を提供する：
（１）細胞集団を提供する工程。
（２）それらの細胞をアッセイし、ＤＵＴＴ１の参照レベルを確立する工程。
（３）診断のための細胞集団を得る工程。
（４）ＤＵＴＴ１の参照レベルと比較したとき、それらの細胞のうち１つ以上のいずれかにおいてＤＵＴＴ１の増加レベルについて、工程３の上記細胞集団をアッセイする工程。
【００１４】
本明細に定義されている「癌」の一般的な特徴として、細胞が終わりのない複製をする能力,接触阻害の喪失、侵襲性および転移能力が挙げられる。つまり、その細胞が制御不可能な様式で分裂し、それ自身の天然の境界を認識し得ないとき、その癌細胞は、身体の他の部分に広がる能力を獲得する。１つ以上の細胞の核酸の変異は、癌の発生に関与する。しばしば、１つより多数の核酸変異または他の異常な細胞事象が腫瘍（異常な分裂する細胞の束）の発達が必要とされる。すなわち、腫瘍形成は、複数シグナル事象である。本発明の文脈において、癌細胞はネイティブの環境において正常に振る舞う細胞と比較した場合の異常細胞分裂、異常接触阻害、異常細胞分化、組織に浸潤する細胞の能力、および転移能力のいずれかの特徴を示すいかなる細胞をも含む。それゆえ、本発明の文脈において「癌細胞」の定義は、それらが上記の必須の特性を１つ以上有する限り、この範囲内に、腫瘍細胞および腫瘍形成前の細胞を含む。さらに、本発明に従って、用語癌細胞は、転移性細胞を含む。
【００１５】
本発明の方法は多くの形態の癌の診断および／または検出に適している。特に、癌は、上皮癌、肉腫、およびリンパ腫からなる群より選択される１以上であり得る。本発明の上記の２局面の好ましい実施形態において、癌は、肺癌であり、有利にはヒト肺癌である。有利には診断のための細胞として、気管支上皮細胞および／または上皮の気管肥厚化、および／またはリンパ節から得た細胞が挙げられる。好ましくは、この方法はインビトロ方法である。
【００１６】
本発明の文脈において、用語、癌の「早期検出」とは、患者における１種以上の癌の臨床徴候の発生以前の癌の検出を意味する。癌の臨床徴候は当該分野において公知であり、腫瘍の形成および転移を含む。癌の早期検出。
【００１７】
当業者は、工程（１）および（３）の細胞集団が同一集団であり得ると認識する。実際に、工程（１）から（４）は同時にまたは別々に実施され得る。あるいは、いくつかの工程は、同時に実施され得、そして他の工程は別々に実施され得る。
【００１８】
ＤＵＴＴ１の参照レベルは、抗ＤＵＴＴ１抗体、ＤＵＴＴ１結合ペプチドおよびＤＵＴＴ１と結合した低分子からなる群より選択される１つ以上の因子を用いて確立され得る。有利には、ＤＵＴＴ１抗体が使用される。これらの因子を用いてＤＵＴＴ１レベルを測定する適切な方法は、当業者にとって、公知であり、本明細書において記載されている。
【００１９】
さらに、またはあるいは、ＤＵＴＴ１結合因子は細胞集団と結合され得、同じ細胞集団内の癌細胞および非癌細胞を直接比較することによりＤＵＴＴ１参照レベルが確立され得る。これは、癌細胞および周囲の正常に分裂する細胞中におけるタンパク質レベルが容易かつ同時に比較され得ること、およびＤＵＴＴ１レベルの定量測定は必要とされないという利点を有する。正常な細胞と比較して、増加したレベルのＤＵＴＴ１結合因子と結合する細胞は容易に識別される。
【００２０】
有利には、ＤＵＴＴ１結合因子はそれらの検出のための手段を含むか、またはそれと関与する。適切な手段は、天然に存在する分子または合成分子であり得、そして当業者に公知であり、本明細書に記載されている。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、癌の診断におけるＤＵＴＴ１結合剤の使用を提供する。
【００２２】
本発明に従う使用は、多くの形態の癌の診断に適切である。特に、この癌は、上皮癌、肉腫およびリンパ腫からなる群から選択される１つ以上であり得る。本発明の上記の２つの局面の好ましい実施形態において、癌は肺癌であり、ヒト肺癌が都合がよい。有利なことには、診断のための細胞としては、気管支の上皮細胞および／または気管支の上皮の肥厚、ならびに／あるいはリンパ節由来の細胞が挙げられる。好ましくは、この方法は、インビトロの方法である。
【００２３】
診断のための適切なＤＵＴＴ１結合剤は、本明細書中に記載されるとおりである。好ましくは、このＤＵＴＴ１結合剤は、ＤＵＴＴ１に対して惹起された抗体である。
【００２４】
腫瘍抑制因子ＤＵＴＴ１のレベルが、非癌細胞よりもインサイチュで癌腫細胞を含む癌細胞において高いという驚くべき発見に起因して、ＤＵＴＴ１結合剤は、癌細胞を画像化または可視化する方法として使用され得る。
【００２５】
従って、さらなる局面において、本発明は、ＤＵＴＴ１結合剤を用いて１つ以上の癌細胞を処置する工程を包含する、癌細胞の選択的標識のための方法を提供する。
【００２６】
なおさらなる局面において、本発明は、癌細胞の選択的標識におけるＤＵＴＴ１結合剤の使用を提供する。
【００２７】
選択的標識に適切な細胞としては、ＤＵＴＴ１を好ましくは高いレベルで発現する任意の細胞が挙げられる。適切な細胞としては、上皮癌細胞、肉腫細胞およびリンパ腫細胞が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、この細胞は肺癌細胞であり、好ましくはヒト肺癌細胞である。適切には、癌細胞は、転移性細胞および／または原発性癌細胞である。
【００２８】
有利なことには、この方法は、以下からなる群から選択される癌細胞の選択的標識のための方法である：ヒト癌細胞、ヒト上皮癌細胞、ヒト肉腫細胞、ヒト造血細胞。
【００２９】
適切なＤＵＴＴ１結合剤は、本明細書中に記載されるとおりである。
【００３０】
本発明の文脈において用語「標識（標識する）」は、薬剤を細胞に選択的に結合させることを意味する（この場合、癌細胞に対してであり、正常に分裂する細胞に対してではない）。有利なことには、標識剤は、標識の検出を可能にする手段を含むか、そのような手段と会合している。適切な手段としては、本明細書中に記載されるように、蛍光剤、リン光剤または放射性薬剤が挙げられる。当業者は、この列挙が排他的であることは意図されないということを認識する。標識化細胞を検出するための適切な手段は、標識化細胞が、インビトロまたはインビボの何れで検出されるかによって変化する。適切なインビトロ方法としては、オートラジオグラフィーおよび蛍光検出またはリン光検出が挙げられるが、これらに限定されない。適切なインビボ方法としては、核磁気共鳴、オートラジオグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、他の適切な方法を知っている。この方法において、本発明のこの局面の方法は、癌細胞、好ましくは転移性癌細胞をインビボで画像化するために使用され得る。有利なことには、この方法は、ヒト癌細胞の画像化のために使用される。最も好ましくは、この方法は、ヒト癌細胞を画像化するために使用され、このヒト癌細胞は、原発性癌細胞または患者の体内の転移性細胞であり得る。
【００３１】
適切なＤＵＴＴ１結合剤としては、以下からなる群から選択される任意の１つ以上が挙げられる：抗ＤＵＴＴ１抗体、ＤＵＴＴ１結合ペプチドおよびＤＵＴＴ１に結合する低分子。有利なことには、ＤＵＴＴ１抗体が使用される。
【００３２】
さらなる局面において、本発明は、１つ以上のＤＵＴＴ１結合剤で１つ以上の癌細胞を処理する工程（ここで、このＤＵＴＴ１結合剤は検出手段をさらに含む）を包含する、癌細胞を画像化するための方法を提供する。
【００３３】
本発明の文脈において、用語「画像化」は、癌細胞の２次元または３次元の画像（ｐｉｃｔｕｒｅ）／画像（ｉｍａｇｅ）の作製をいう。画像化が、インビボ環境内で実行される場合、そのインビボの環境内（好ましくは、確立されるべきヒトの身体内）で癌細胞の相対位置が認められ得る。前侵襲性（ｐｒｅ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）癌細胞を含む肺癌細胞において見出される高密度のＤＵＴＴ１に起因して、高いシグナル対ノイズ比が達成され得、高感度の画像化を可能にする。このような高いシグナル対ノイズ比は、小束の癌細胞（すなわち、転移性細胞）の検出において、特に重要である。当業者は、この方法がまた、原発性癌細胞の画像化においても使用されることを理解する。
【００３４】
好ましくは、この方法は、癌細胞のインビボでの画像化のための方法である。より好ましくは、これは、ヒト癌細胞の画像化のための方法である。有利なことには、この方法は、ヒト上皮癌細胞、ヒト肉腫細胞、ヒト造血性癌細胞からなる群から選択される癌細胞を画像化するための方法である。
【００３５】
なおさらなる局面において、本発明は、ＤＵＴＴ１またはその結合剤を含む組成物を提供する。
【００３６】
なおさらなる局面において、本発明は、１つ以上のＤＵＴＴ１結合剤を用いて細胞を処理する工程を包含する、１つ以上のＤＵＴＴ１結合剤を内在化させるための方法を提供する。
【００３７】
本発明の文脈において、用語「処理（処置）」は、１つ以上の細胞をＤＵＴＴ１結合剤と接触させるプロセスをいう。細胞を「処理」するための適切な方法は、その手順がインビボまたはインビトロの何れで実行されるかに依存し、そして本明細書中に記載される。本発明のこの局面の好ましい実施形態において、この方法はインビボで生じる。
【００３８】
本明細書中で定義される場合、用語「内在化」は、１つ以上の分子を細胞の内部に運ぶことを意味する。有利なことには、これは、１つ以上の分子を細胞の細胞質中に運ぶことを記載する。この場合において、少なくとも１つの分子は、ＤＵＴＴ１結合剤である。適切なＤＵＴＴ１結合剤が、本明細書中に記載される。
【００３９】
本発明の方法に従うＤＵＴＴ１結合剤での処理に適切な細胞は、ＤＵＴＴ１を発現する任意の細胞を含む。適切な細胞としては、上皮細胞が挙げられる。当業者は、他の適切な細胞型を知っている。
【００４０】
適切なＤＵＴＴ１結合剤が、本明細書中に記載される。有利なことには、ＤＵＴＴ１結合剤は、ＤＵＴＴ１に対して惹起された抗体である。好ましくは、これはモノクローナル抗体である。
【００４１】
最後な局面において、本発明は、ＤＵＴＴ１の使用、および／または癌の予防もしくは処置のための医薬の調製におけるＤＵＴＴ１の結合剤を提供する。
【００４２】
本発明のこの局面の１つの実施形態において、その使用は、肺癌の処置である。本発明のこの局面のさらなる実施形態において、その使用は、上皮癌の処置である。なおさらなる実施形態において、その使用は、肉腫の処置である。さらなる好ましい実施形態において、その使用は、リンパ腫の処置である。
【００４３】
（定義）
「癌」の一般的な特徴としては、無限の複製を引き起こす癌細胞の能力、接触阻止の欠如、侵襲性および転移能力が挙げられる、すなわち、細胞が制御不能な状態で分裂し、その細胞自体の自然の境界を認識できない場合、その癌細胞は、身体の他の領域に広がる能力を得る。１つ以上の細胞の核酸内の変異が、癌の発症に関与する。しばしば、１つより多い核酸変異または他の異常細胞内事象は、腫瘍（異常に分裂した細胞の塊）の発達に必要とされ、これは、腫瘍形成が複数シグナル事象であるということである。本発明の脈絡において、癌細胞は、以下の特徴の任意の１つ以上を示す任意の細胞を含む：天然の環境で正常な挙動をする細胞と比較して異常な細胞分裂、異常な接触阻止、異常な細胞分化、組織に侵入する細胞の能力、および転移能力。従って、本発明の脈絡における「癌細胞」の定義は、腫瘍細胞が上に列挙した要求性の特徴の１つ以上を有する限り、その範囲内に腫瘍細胞を含み、また腫瘍形成の前の細胞も含む。さらに、本発明に従って、癌細胞という用語は、転移性細胞を含む。
【００４４】
「腫瘍抑制分子」は、その１つの機能が腫瘍形成の抑制である分子である。特定の癌は、例えば、変異抑制遺伝子（ｐ５３およびＲＢ）と関連することが明らかとなっている。しかし、上に示したように、しばしば１つより多い異常な（ａｂｈｅｒｅｎｔ）細胞成分またはシグナルが、癌の進行を開始および／または引き起こすために必要とされる。
【００４５】
「気管支上皮過形成」。肺の気道は、サイズの降順に、気管支、細気管支そして肺胞である。気管支とは、最初の２つのことを指す。肺は、間葉細胞および気道に並ぶ上皮細胞からなる。過形成とは、過剰な増殖を意味する。上皮は、通常、一層の厚い細胞シートであるが、過形成を引き起こした場合、それは、肥厚し、そして無秩序となる。従って、本明細書中で定義される場合、気管支上皮過形成は、肺の主な気道に並ぶ細胞層における乱れた細胞形態である。過形成のこの形態は、肺（またはその他の）癌の初期段階と関連し、そして本明細書中で定義される場合、用語「癌」とは、その範囲内に気管支上皮過形成を含む。
【００４６】
本発明の脈絡における「細胞の特異的標識」は、細胞への標識化剤の選択的／特異的結合を意味する。すなわち、標識化剤が細胞集団に曝露される場合、特定の特徴を示す細胞のみが標識化剤に結合する。一般的に、この特徴としては特定の細胞表面の特徴の存在（例えば、標識化剤に結合する表面抗原の存在）が挙げられる。
【００４７】
「抗体」（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）またはフラグメント（例えば、ＦＡｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｖに連結するジスルフィド、ｓｃＦｖ、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）は、抗体を天然に産生する任意の種由来であるか、または組換えＤＮＡ技術によって作製されたものである；血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマトランスフェクト体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ）、酵母または細菌から単離されたものである。
【００４８】
（発明の詳細な説明）
（一般技術）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリッド形成法技術および生化学）に通常理解されるのと同じ意味を有する。標準的な技術は、分子学的方法、遺伝学的方法および生化学的方法（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（これらは、参考として本明細書中で援用される）を参照のこと）および化学的方法について使用される。さらに、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ．，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙが、標準的な免疫学的技術について言及されている。
【００４９】
（脊椎動物における癌の診断方法）
第１の局面において、本発明は、細胞の集団における癌の初期診断方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（１）細胞の集団を提供する工程
（２）正常に分裂する細胞と比較して、１つ以上の任意のこれらの細胞におけるＤＵＴＴ１の増加レベルについて、細胞集団をアッセイする工程。
【００５０】
第２の局面において、本発明は、細胞の集団における癌の初期診断方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（１）細胞の集団を提供する工程
（２）これらの細胞をアッセイし、ＤＵＴＴ１の参照レベルを確立する工程、
（３）診断のための細胞の集団を得る工程、
（４）ＤＵＴＴ１の参照レベルと比較した場合の、１つ以上の任意のこれらの細胞におけるＤＵＴＴ１の増加レベルについて、工程３の細胞集団をアッセイする工程。
【００５１】
さらなる局面において、本発明は、細胞の集団における癌の診断方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：
（１）細胞の集団を提供する工程
（２）正常に分裂する細胞と比較して、１つ以上の任意のこれらの細胞におけるＤＵＴＴ１の増加レベルについて、細胞集団をアッセイする工程。
【００５２】
なおさらなる局面において、本発明は、細胞の集団における癌の診断方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（１）細胞の集団を提供する工程
（２）これらの細胞をアッセイし、ＤＵＴＴ１の参照レベルを確立する工程、
（３）診断のための細胞の集団を得る工程、
（４）ＤＵＴＴ１の参照レベルと比較した場合の、１つ以上の任意のこれらの細胞におけるＤＵＴＴ１の増加レベルについて、工程３の細胞集団をアッセイする工程。
【００５３】
（（Ａ）診断のための細胞）
細胞サンプルは、当業者によく知られている方法を使用して、処置のために脊椎動物から得られる。小さな脊椎動物の場合、その動物は犠牲にされ得、そして診断のためにその組織が抽出され得る。組織片は、当業者によく知られる方法を使用して調製され得る。
【００５４】
あるいは、診断のための細胞は、生検（脊椎動物（好ましくは生きたままの）からの少量の組織の切除）を実施することによって得られ得る。
【００５５】
（（Ｂ）ＤＵＴＴ１の参照レベルの確立）
細胞抽出物のノーザンブロットおよびウェスタンブロット、それに続くＤＵＴＴ１に結合する試薬によるハイブリッド形成法のような技術が、ＤＵＴＴ１レベルの測定に使用され得る。ＤＵＴＴ１に結合する試薬としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ＤＵＴＴ１結合ペプチドおよびＤＵＴＴ１に結合する低分子が挙げられる。さらに、またはあるいは、ＤＵＴＴ１結合剤は、細胞集団に結合し得、そしてＤＵＴＴ１の参照レベルは、同じ細胞集団内の癌性細胞および非癌性細胞と直接的に比較することによって確立される。これは、癌細胞中のタンパク質レベルおよび周囲の正常に分裂する細胞が容易にそして同時に比較され得、そしてＤＵＴＴ１レベルの定量的な測定がなされる必要がないという利点を有する。
【００５６】
（（Ｂｉ）ＤＵＴＴ１結合剤）
（（ａ）抗体およびペプチド）
ＤＵＴＴ１に対して惹起された抗体、およびＤＵＴＴ１ペプチドは、標準的な実験室技術を使用して調製され得る。組換えタンパク質または天然の供給源由来のタンパク質のいずれかを使用して、抗体が作製され得る。例えば、タンパク質（または「免疫原」）は、サル、ヤギ、ウサギまたはマウスのような哺乳動物動物をチャレンジするために投与される。得られた抗体はポリクローナル血清として回収され得るか、またはチャレンジされた動物由来の抗体産生細胞は不死化され得（例えば、ハイブリドーマを生成するための不死化融合パートナーとの融合によって）、次いで、この細胞はモノクローナル抗体を産生する。
【００５７】
（ポリクローナル抗体）
抗原タンパク質は、単独で使用されるかまたはその免疫原性を増加させるために従来のキャリアと結合されて使用され得、そして上記のようにペプチド−キャリア結合体に対する抗血清が動物中に生じる。キャリアタンパク質へのペプチドの結合および免疫化は、Ｄｙｍｅｃｋｉら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：４８１５に記載されるように実施され得る。血清は、ＥＬＩＳＡまたは代替的なドットもしくはスポットブロットによってタンパク質抗原に対してタイタ−される（ｔｉｔｅｒ）（ＢｏｅｒｓｍａおよびＶａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５１：３１７）。この血清は、ＥＬＩＳＡ、続いて、例えば、Ｇｒｅｅｎら（１９８２）Ｃｅｌｌ，２８：４７７の手順によって適切なペプチドと強く反応することが示される。
【００５８】
（モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体の調製技術は周知であり、そしてモノクローナル抗体は、任意の候補抗原（好ましくはキャリアに結合する抗原）を使用して、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ，２９４，２７８に記載されるように調整され得る。モノクローナル抗体は、典型的には、ハイブリドーマ組織培養物、またはハイブリドーマ組織が導入された動物から得られる腹水から得られる。それにもかかわらず、モノクローナル抗体は、タンパク質「に対して惹起される」またはタンパク質「によって誘導される」と記載され得る。
【００５９】
惹起した後に、モノクローナル抗体は、任意の多くの手段によって機能および特異性について試験される。類似の手順がまた、ファージディスプレイまたは他のインビトロ選択技術によって産生された組換え抗体を試験するのに使用され得る。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（またはポリクローナル血清）は、同様に、免疫原に結合する抗体についてスクリーニングされ得る。特に好ましい免疫検査としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロットおよび免疫沈降（Ｖｏｌｌｅｒ，（１９７８）Ｄｉａｇｎｏｉｓｔｕｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ，２：１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｖｏｌｌｅｒら（１９７８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，３１：５０７；米国再発行特許第３１，００６号；英国特許第２，０１９，４０８号；Ｂｕｔｌｅｒ（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：４８２；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編），（１９８０）Ｅｎｚｙｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬを参照のこと）または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ  １９８６，１〜５頁、４６〜４９頁および６８〜７８頁）が挙げられ、免疫原性である免疫原への抗体の結合を検出するための全ては、このような検出を容易にするために標識されなければならない。抗体分子を標識する技術は、当業者に周知である（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１〜７２６頁を参照のこと）。
【００６０】
（（Ｂｉｉ）ＲＮＡ（ノーザン）ブロッティングおよびウェスタン（抗体）ブロッティング）
ノーザンブロッティングおよびウェスタンブロッティングは、当業者によく知られており、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）に詳述されている方法を用いて実施され得る。
【００６１】
（（Ｃ）ＤＵＴＴ１結合剤への結合について組織サンプルのアッセイ）
組織サンプルは、当業者によく知られた方法を用いて調製され得、そしてＤＵＴＴ１は、上で参照される試薬のいずれかを用いて検出され得る。代表的なプロトコルの例は、下に詳述される：
組織または全胚を、ＰＢＳ緩衝液中の４％のパラホルムアルデヒドで少なくとも２４時間固定し、パラフィン包埋し、そして４ｍｍの切片を生じるように加工処理した。切片を再びパラフィン処理し、そして内因性のペルオキシドをクエンチした。ブロッキング後、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１を、ＤＵＴＴ１に対して惹起されたポリクローナル抗血清、続いて、ビオチン結合したロバの抗ウサギ二次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  ＵＳＡ）、および製造業者のプロトコル通りにＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＵＳＡ）を使用した増幅を用いて検出した。陽性染色を、ニッケル増強ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）を用いて検出し、そしてＦａｓｔ  Ｒｅｄを用いて対比染色した。スライドを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄをマウントした培地でマウントした。染色を免疫化ペプチドの抗血清とのプレインキュベーションによってブロックした。切片を、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）により染色した。
【００６２】
ＤＵＴＴ１結合剤が診断に使用される場合、このＤＵＴＴ１結合剤の機能的部分は、通常、シンチグラフィ研究のための放射性原子（例えば、テクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）またはヨウ素−１２３（１２３Ｉ））を含み、そしてそれらからなる。
【００６３】
（癌細胞の選択的標識化）
さらなる局面において、本発明は、癌細胞の選択的標識化のための、１つ以上の癌細胞をＤＵＴＴ１結合剤を用いて処理する工程を包含する方法を提供する。
【００６４】
本発明に従って、用語「標識化（ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）」は、正常に分裂している細胞に対してではなく、癌細胞に対するこの場合において、薬剤の細胞への選択的結合を意味する。有利には、この標識化薬剤は、標識の検出を可能にするような薬剤を含むか、またはその薬剤と結合している。適切なもの（ｍｅａｎｓ）としては、蛍光剤、リン光剤、または放射性薬剤、あるいは放射線不透過性（ｒａｄｉｏｏｐａｑｕｅ）分子または放射線不透過性薬剤（例えば、胚または細胞塊の中で容易に視覚化される金属粒子）が挙げられる。
【００６５】
適切な癌細胞（特に、肺癌細胞）の標識化薬剤としては、本明細書中で定義されるようなＤＵＴＴ１に対して惹起された抗体、ＤＵＴＴ１結合ペプチド、および／またはレセプターへの天然リガンドの結合を最小化する低分子アゴニストが挙げられる。
【００６６】
免疫染色技術およびＦＡＣＳ技術が、特に指向される。適切な蛍光体は、当該分野で公知得であり、そして免疫グロブリン分子の合成中にその中に結合部位を組み込むことによって、免疫グロブリン分子に結合される化学蛍光体および蛍光ポリペプチドが挙げられる。
【００６７】
好ましくは、この蛍光体は、蛍光タンパク質であり、これは、有利には、ＧＦＰまたはその変異体である。ＧＦＰおよびその変異体は、免疫グロブリンまたは標的分子と一緒に、当該分野で周知の方法に従う融合ポリペプチドとしての発現によって、合成され得る。例えば、転写単位は、所望のＧＦＰおよび免疫グロブリンまたは標的のインフレーム融合体（ｆｕｓｉｏｎ）として構築され、そして上記に記載のベクター中に、便利なＰＣＲクローニング技術およびライゲーション技術を用いて挿入され得る。
【００６８】
抗体は、シグナルを生じ得る任意の薬剤を用いて標識され得る。このシグナルは、任意の検出可能なシグナル（例えば、検出可能な遺伝子産物の発現の誘導）であり得る。検出可能な遺伝子産物の例としては、生物発光ポリペプチド（例えば、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ）、特定のアッセイによって検出可能なポリペプチド（例えば、β−ガラクトシダーゼおよびＣＡＴ）、ならびに宿主細胞の増殖特性を調節するポリペプチド（例えば、ＨＩＳ３のような、代謝に必要とされる酵素）、あるいは抗生物質耐性遺伝子（例えば、Ｇ４１８）が挙げられる。本発明の好ましい局面において、このシグナルは、細胞表面で検出可能である。例えば、このシグナルは、細胞外部から検出可能であり、そしてＦＡＣＳまたは他の光学識別技術によって細胞識別を可能にする、発光シグナルまたは蛍光シグナルであり得る。
【００６９】
蛍光標識された抗体の光学的検出に基づく、光学免疫センサー技術の使用が、好ましい。免疫センサーは、生化学的検出器であり、相補種の結合を検出するシグナルトランスデューサに結合する抗原または抗体種を含む（Ｒａｂｂａｎｙら、１９９４  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ２２：３０７−３４６；Ｍｏｒｇａｎら、１９９６  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１９３−２０９）。このような相補種の例としては、抗原Ｚｉｆ  ２６８および抗−Ｚｉｆ  ２６８抗体が挙げられる。免疫センサーは、血清または全血のような複合サンプル中に存在する、抗体、抗原またはハプテンの量の定量的な測定を生じる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  １９９１  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ６：１８３−１９１）。この免疫センサーの感度は、これらの測定を、速さおよび精度が必要とされる状況に理想的にする（Ｒａｂｂａｎｙら、１９９４  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  ２２：３０７−３４６）。
【００７０】
免疫センサーを用いた検出技術としては、免疫相互作用の、電気化学的検出、圧電検出または光学的検出が挙げられる（Ｇｈｉｎｄｉｌｉｓら、１９９８  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  １：１１３−１３１）。間接的な免疫センサーは、例えば、蛍光またはルミネッセンスによる結合後に検出される、別々に標識された種を使用する（Ｍｏｒｇａｎら、１９９６  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１９３−２０９）。直接的な免疫センサーは、潜在的な差異、電流、耐性、質量、熱または光学的特性の変化による結合を検出する（Ｍｏｒｇａｎら、１９９６  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１９３−２０９）。間接的な免疫センサーは、ＧＦＰおよびその変異体（ＷＯ  ９７／２８２６１を参照のこと）のような非特異的結合に起因する小数の問題に直面し得る（Ａｔｔｒｉｄｇｅら、１９９１  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｏｎ  ６：２０１−２１４；Ｍｏｒｇａｎら、１９９６  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１９３−２０９）。
【００７１】
（癌細胞の画像化）
癌細胞の画像化のための方法は、１つ以上の癌細胞を１つ以上のＤＵＴＴ１結合剤で処置する工程を包含し、ここで、このＤＵＴＴ１結合剤はさらに、検出手段を含む。
【００７２】
インビボ環境内、好ましくはヒト身体内に存在する場合、本明細書中で定義されるような適切な検出手段としては、本明細書中で定義されるような特定の標識化薬剤の成分に結合する場合か、または本明細書中で定義されるような特定の標識化薬剤の成分を形成する場合に容易に検出され得る分子／薬剤が挙げられる。
【００７３】
（（１）放射活性分子の放出）
適切な放射活性薬剤／放射活性分子の例としては、テクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）またはヨウ素−１２３（１２３Ｉ）が挙げられる。次いで、腫瘍は、当業者に公知の方法を用いて放射活性粒子の放出を検出することによって、容易に可視化され得る。
【００７４】
（（２）核磁気共鳴（ＮＭＲ）／磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））
検出分子／検出試薬（例えば、ヨウ素−１２３、ヨウ素−３１３、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マグネシウムまたは鉄）は、ＮＭＲを用いて癌細胞の視覚化を可能にする。このことは、全身のスキャンニングが実施され得る利点を有する。
【００７５】
（（３）陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ））
この方法は、陽子を放出する、短期間活性なアイソトープが使用される点で標準の核磁気共鳴画像法と異なる。次いでこの陽子は、正常組織の電子と相互作用して、次いで、非常に感度の高い陽子射出断層撮影カメラを用いて検出され得る５１１ＫｅＶフォトン対を生じる。
【００７６】
ＰＥＴにおける使用のための適切な検出手段としては、１１ＣメチオニンおよびＦＤＧが挙げられる。ＰＥＴを使用するための手順およびプロトコルの概要は、当業者によく知られている。
【００７７】
（ＤＵＴＴ１および／またはＤＵＴＴ１結合剤のさらなる使用）
最後の局面において、本発明は、癌の予防または処置のための医薬の調製におけるＤＵＴＴ１および／またはその結合剤の使用を提供する。
【００７８】
ＤＵＴＴ１および／またはその結合剤の治療的使用および予防的使用は、受容哺乳動物（例えば、ヒト）への上記物の投与を含む。
【００７９】
実質的に純粋なＤＵＴＴ１および／または少なくとも９０〜９５％相同性のその結合剤が、哺乳動物への投与に好ましく、そして特にその哺乳動物がヒトである場合、９８〜９９％またはそれより高い相同性が、薬学的使用に最も好ましい。一旦、部分的にかまたは所望される場合均質に精製されると、ＤＵＴＴ１および／またはその結合剤は、診断的にかまたは治療的に（体外を含む）、または当業者に公知の方法を用いるアッセイ手順の開発または実施において、使用され得る。
【００８０】
ＤＵＴＴ１およびその結合剤は、癌関連疾患の処置において有効であり得る。本発明は、本発明に従って、有効量のＤＵＴＴ１またはＤＵＴＴ１結合剤を用いて癌関連疾患を処置する方法を含む。本発明のＤＵＴＴ１およびＤＵＴＴ１結合剤は、当業者に公知の処方方法を用いて、薬学的に受容可能な組成物中で単離されかつ実質的に精製されたタンパク質およびタンパク質フラグメントとして提供され得る。これらの組成物は、標準経路によって投与され得る。これらの標準経路としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：経口経路、直腸経路、眼経路（硝子体内または海綿内を含む）、鼻経路、局所的経路（頬および舌下を含む）、子宮内経路、腟経路または非経口経路（皮下、腹腔内、筋内、静脈内、真皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外を含む）、経皮内経路、腹腔内経路、頭蓋内経路、脳室内経路、大脳内経路、鞘膜内経路、子宮内経路、あるいは非経口経路（例えば、静脈内、脊髄内、皮下または筋内）。
【００８１】
このＤＵＴＴ１およびＤＵＴＴ１結合剤は、単位投薬形態で便利に提示され得、そして便利な薬学的技術によって調製され得る。このような技術は、活性成分と薬学的キャリアまたは薬学的賦形剤を結合させる工程を包含する。概して、この処方物は、均一でかつ本質的に活性な成分と、液体キャリアまたは微細に分割された固形キャリアあるいはその両方とを結合させ、次いで、必要な場合、生成物を成形することによって調製される。
【００８２】
さらに、本発明のＤＵＴＴ１およびＤＵＴＴ１結合剤は、生分解性ポリマー中に組み込まれ、化合物の徐放を可能にし得、このポリマーは、薬物送達が所望される周辺（例えば、腫瘍部位）に移植されるか、またはＤＵＴＴ１結合剤またはＤＵＴＴ１フラグメントが全身に徐放されるように移植される。この生分解性ポリマーおよびそれらの使用は、例えば、Ｂｒｅｍら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １９９１  ７４：４４１−４４６）に詳細に記載される。浸透圧性ミニポンプはまた、高濃度のＤＵＴＴ１またはその結合剤（そのフラグメントを含む）の制御された放出を、カニューレを介して目的部位に（例えば、転移増殖内またはその腫瘍への血管供給内に直接）提供するために使用され得る。
【００８３】
本発明のＤＵＴＴ１およびＤＵＴＴ１結合剤は、所望の位置への送達を最大にするように設計された様式にて、注入される細胞傷害性薬剤に結合され得る。例えば、リシン結合高親和性ＤＵＴＴ１、および／またはその結合剤は、カニューレを介して標的部位に供給する血管中へと送達されるか、または標的に直接送達される。このような薬剤はまた、制御された様式にて、注入カニューレに結合した浸透圧ポンプを介して送達される。
【００８４】
好ましい単位投薬量の処方物は、投与される成分の１日の用量、単位または１日の部分用量（本明細書中の上記のような）またはその適切な画分を含む、処方物である。（特に上記の）成分に加えて、本発明の処方物は、当該処方物の型を顧慮して、当該分野において慣習的な他の薬剤を含み得ることが理解されるべきである。
【００８５】
ＤＵＴＴ１またはその結合剤は、希釈剤およびキャリア（例えば、等張性生理食塩水（静脈内投与である場合））の標準の滅菌した発熱性でない処方物中で、任意の適切な方法で通常は非経口的に（例えば、静脈内または腹腔内）投与され得る。一旦ＤＵＴＴ１または結合剤が標的細胞に結合し、そして（必要である場合）血流から取り除かれ（これらは、代表的におよそ１日かかる）た場合、そのプロドラッグが通常単一注入用量として投与されるか、または腫瘍が画像化される。必要とされる場合、ＤＵＴＴ１またはＤＵＴＴ１結合剤が免疫原性であり得るので、シクロスポリンまたはいくつかの他の免疫抑制剤が、より長い処置期間提供するように投与され得る（しかし、通常これは必要でない）。
【００８６】
結合体の腫瘍／正常組織比は（少なくとも静脈内送達後で）約４〜６日後最も高く、一方、ここで、この時間で腫瘍に結合したＤＵＴＴ１結合剤またはフラグメントの絶対的な量は、１ｇあたりの注射した用量のパーセントの点ではより、早い時間よりも低いのでＤＵＴＴ１結合剤および／またはそのフラグメントの投与の間のタイミングは、非発明方法で最適にされ得る。
【００８７】
従って、ＤＵＴＴ１結合剤および／またはそのフラグメントの投与の間の最適な間隔は、ピーク腫瘍濃度と、腫瘍組織と正常組織との間の最良の分布比との間の折衷点である。ＤＵＴＴ１結合剤またはそのフラグメントの投薬量は、通常の基準に従って医師によって選択される。少なくともβ−グルコシダーゼおよび毒性プロドラッグとしての静脈内アミグダリンのような標的酵素を使用する方法の場合、身体の表面積の１平方メートルあたり０．１〜１０．０ｇの１〜５０日用量、好ましくは１．０〜５．０ｇ／ｍ２がおそらく適切である。経口治療について、１日あたりの３回用量０．０５〜１０．０ｇ、好ましくは１．０〜５．０ｇを１〜５０日間が、適切であり得る。ＤＵＴＴ１結合剤またはそのフラグメントの投薬量は、通常の基準に従って特に腫瘍の型段階および位置ならびに患者の体重に関連して同様に選択される。処置の持続時間は、ＤＵＴＴ１結合剤またはそのフラグメントに対する任意の免疫反応の速度および程度に部分的に依存する。
【００８８】
腫瘍の選択的破壊のために化合物中に使用される場合、ＤＵＴＴ１結合剤またはそのフラグメントの機能的部分は、非常に放射性の原子（例えば、ヨウ素−１３１、レニウム−１８６、レニウム−１８８、イットリウム−９０またはリード−２１２）（これらは、十分なエネルギーを放射し、近接の細胞を破壊する）または細胞傷害性化合物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｉｃｉｎ）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）を含み得る。
【００８９】
放射性検出薬剤または他の検出薬剤は、公知の方法においてＤＵＴＴ１結合剤および／またはそのフラグメントに取り込まれ得る。例えば、ＤＵＴＴ１結合ペプチドは、生合成され得るか、または適切なアミノ酸前駆体（例えば、水素に代わってフルオリン−１９を含む）を用いる化学的アミノ酸合成によって合成され得る。標識（例えば、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈおよび１１１Ｉｎ）は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合され得る。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を使用して、ヨウ素−１２３を取り込み得る。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）は、詳細に他の方法を記載する。
【００９０】
ＤＵＴＴ１結合剤および／またはそのフラグメントの有効量を含む薬学的組成物は、癌関連障害の予防、抑制または処置において使用され得る。このような障害としては、限定されないが以下が挙げられる：固形腫瘍；白血病のような造血腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫）；慢性関節リウマチ；乾癬；眼性脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス；オースラー−ウェーバー症候群；心筋新脈管形成；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；創傷顆粒化；冠状（ｃｏｒｏｒｎａｙ）側副枝；大脳側副枝；動静脈機能不全；虚血性四肢新脈管形成；血管新生緑内障；水晶体後線維増殖症；糖尿病性新生血管形成；ヘリコバクター（ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ）関連疾患、骨折、脈管形成、造血、排卵、月経および胎盤形成。
【００９１】
本出願において、用語「予防」は、疾患の誘発前に防御組成物を投与することを含む。「抑制」は、疾患の誘発事象の後（しかし臨床的出現の前）の、その防御組成物の投与をいう。「処置」は、疾患の症状が顕著になった後、防御組成物を投与することを含む。
【００９２】
本発明は、以下の実施例において例示の目的のためのみにさらに記載され、この実施例は、本発明を限定することは決してない。
【実施例】
【００９３】
（実施例）
（実施例１）
（マウスＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１  ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列決定およびコンティーグアセンブリ）
マウスの脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した）およびマウスの１３．５日齢の胚ｃＤＮＡライブラリー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した）を、ヒトＤＵＴＴ１／ＲＯＢＯ１  ｃＤＮＡクローンでスクリーニングした。ポジティブのｃＤＮＡクローンを配列決定し、そして重複させてＧｅｎｂａｎｋデータベースに入力されたコンティグ地図を作製した。全ての配列決定反応をＳａｎｇｅｒジデオキシ鎖末端方法を用いて、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅバージョン２キット（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＢ）を使用して行った。ｃＤＮＡクローンの配列を、独立して確認した（Ｏｓｗｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．，Ｌａｂ  ５００５，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ）。
【００９４】
（実施例２）
（Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウスの作製（図１を参照のこと））
Ｅ１４  ＴＧ２ａ  ＥＳ細胞ＤＮＡのゲノムライブラリーを、λ２００１中にクローン化し、そしてエクソン２に対応するマウスＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１  ｃＤＮＡクローンを用いてスクリーニングし、そしてポジティブなクローンを精製しそしてサブクローン化した。マウスＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１遺伝子のエクソン２を含む８．０ｋｂのＳａｃＩフラグメントを、標的化ベクターの構築のために使用した。野生型ｎｅｏ配列（１７）に対して補正されたｎｅｏ発現カセット（１６）（ｐＭＣ１−ｎｅｏポリ［Ａ］）を使用して、Ｄｕｔｔ１遺伝子のエクソン２をコードする配列に広がる０．７ｋｂのゲノムＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩフラグメントを置換した。この置換配列は、５’側での４．４ｋｂのゲノム配列および３’側での１．４ｋｂのゲノム配列に隣接した。チミジンキナーゼ遺伝子発現カセット（１８）を、長い方の相同性アームの５’側にある唯一のＸｂａＩ部位に連結した。最終的なベクターを、エレクトロポレーションのためにＨｉｎｄＩＩＩを用いて線状化した。ＣＣＢ  ＥＳ細胞をマウスの胚フィーダー上で維持した。２５μｇのＨｉｎｄＩＩＩ消化標的化ベクターＤＮＡを使用して、１×１０７個ＣＣＢ  ＥＳ細胞をエレクトロポレーションした。４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ）および２．５Ｍのガンシクロビル選択で生き残った細胞クローン由来のＳａｃＩ消化ゲノムＤＮＡを、サザンブロット分析に供した。ポジティブに標的化されたクローンを、ＳａｃＩで切断したゲノムＤＮＡに対して５’側の０．７ｋｂ  ＢａｍＨＩフラグメント内部プローブおよび相同性配列に対して外側の０．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩプローブを用いて確認した。２つの独立したクローン由来のＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来胚盤胞に注射するために使用した。胚盤胞を、偽妊娠した雌に移入し、キメラの子孫を非野ネズミ色バックグラウンド上の野ネズミ色の存在によって検出した。キメラの雄をＣ５７ＢＬ／６の雌と交尾させ、ＥＳ細胞由来子孫を作製した。それらの遺伝子型を、尾のＤＮＡのサザンブロット分析によって確認した。遺伝子標的化事象についてヘテロ接合性（すなわち、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１遺伝子のエクソン２の欠損を有する）マウスを異種交配させホモ接合体を作製する。
【００９５】
（実施例３）
（ＲＮＡ分析）
全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて種々の組織から調製した。逆転写反応を、０．５μｇのランダムヘキサマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．３；５０ｍＭ  ＫＣＩ；２．０ｍＭジチオスレイトール；５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；それぞれ１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；１単位／μＬのＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼインヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および１０単位／μｇのＳＵＰＥＲ  ＲＴ（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を含む、２０μＬ中の全ＲＮＡ（５μｇ）に対して行った。それぞれのＲＴ反応は、４２℃にて４０分間であった。ＲＴ産物を５倍希釈し、そしてＰＣＲによって増幅した（９５℃で１分間変性、５５℃で１分間アニーリングおよび７２℃で１分間伸長、の３０サイクル）。使用したプライマーは以下であった：エクソン１順方向
【００９６】
【化１】
2005504307.tif 000003
、エクソン２逆方向
【００９７】
【化２】
2005504307.tif 000004
、エクソン３逆方向
【００９８】
【化３】
2005504307.tif 000005
。その産物を、アガロースゲル上での電気泳動後に可視化した。
【００９９】
（実施例４）
（ウェスタンブロット）
タンパク質溶解物を、記載（１９）のように、９Ｍ尿素、７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５および０．１５Ｍ  βメルカプトエタノールから構成される溶解緩衝液を用いて調製した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。ウェスタンブロッティングについて、５０μｇのタンパク質溶解物を１０％ポリアクリルアミド上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてニトロセルロース膜（ＢｉｏＴｒａｃｅ；Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写した。転写を、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により評価した。フィルターを、ＤＵＴＴｌ／ＲＯＢＯｌ（ＣＹＥＲＧＥＤＮＮＥＥＬＥＥＴＥＳ）のＣ末端ペプチドに対して惹起された、ポリクローナル抗血清とインキュベートしついでＨＲＰ結合体化マウス抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートし、そして増強した化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって可視化した。
【０１００】
（実施例５）
（組織学的分析および免疫組織化学）
組織または胚全体を、ＰＢＳ緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで少なくとも２４時間固定し、パラフィンを包埋し、そして加工して５μｍの切片を得た。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ  ＆  Ｅ）で染色した。免疫組織化学について、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１を、上記のポリクローナル抗血清を用いて、ついでロバビオチン結合体化抗ウサギ二次抗体およびＣｙ−３結合体化ストレプトアビジンを用いて検出した。スライドを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入媒体を用いて封入した。界面活性剤プロテインＣを、市販されている抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を用いて、次いでロバビオチン結合体化抗ヤギ二次抗体およびＣｙ−３結合体化ストレプトアビジンを用いて検出した。
【０１０１】
（実施例６）
（Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１変異体マウスの産生）
Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１遺伝子を、マウスにおいてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を用いるエキソン２の標的化置換により破壊し、第１の免疫グロブリンドメイン（図１Ａ）をコードできない変異体型の遺伝子を生成する（図１Ａ）。これは、ヒト肺癌細胞株ＮＩＨ−Ｈ２１９Ｘ（９）において検出される短縮型ＤＵＴＴ１／ＲＯＢＯ１転写物を正確に再現する。トランスフェクションの後、Ｇ４１８耐性胚性幹細胞（ＥＳ）クローン由来のＤＮＡを、ターゲッティング構築物の範囲内のプローブ（ａ）（図１Ｂ）および相同的組み込みの外側にあるプローブ（ｂ）を用いるハイブリダイゼーションによって、正しく標的化されたクローンを同定するためにサザンブロッティングにより分析した。このような２つのクローンを、未分化胚芽細胞の中に注入し、そして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとのキメラ品種を得た。子孫に由来するテイルＤＮＡを、その生殖細胞系において遺伝子の変異体形態を保有するマウスを同定するためにサザンブロッティングによりスクリーニングした（図１Ｃ）。ヘテロ接合体を、ホモ接合の子孫を生成するために同系交配した。Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウス由来の転写物において、エキソン１配列およびエキソン３配列が連続し、そしてエキソン２が存在しないことを確認するために、ＲＴ−ＰＣＲを使用した（結果は示さない）。
【０１０２】
（実施例７）
（変異体マウスおよび正常マウスにおけるＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１タンパク質）
ウエスタンブロッティングにより検査されたホモ接合の子孫に由来する全ての組織において（マウス胚およびマウス新生仔）、得られたタンパク質は、野生型の器官において検出されたレベルの約半分に減少していた（図２Ａ）。このＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１タンパク質は、エキソン２にコードされる第１の免疫グロブリンドメインの欠失に起因して、２０ｋＤａだけ短い（図２Ａ）。免疫組織化学を、ヒトＤＵＴＴ１／ＲＯＢＯ１（Ｃｌａｒｋ，ＫＪ，ＪＸ，ＥＨおよびＰＨＲ、未公表の観察）（これは、マウスタンパク質を認識する）のＣ末端に対して惹起されたポリクローナル抗体を使用して実施した。この免疫組織化学によって、気管支内層上皮細胞において高いレベルにてこのタンパク質を検出したが、隣接する間葉および肺胞内層細胞においては、低いかまたは検出不可能であった（図２Ｂ）。
【０１０３】
（実施例８）
（呼吸性不全に起因してＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウスは出生時にて高頻度で致死となる）
Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１欠損についてヘテロ接合のマウスは、期待された頻度にて生まれ、明らかに異常な表現型を持たない。出生時には、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウスは、摂食ができず（図３）、分娩時の呼吸において不活性であり、そしてほぼ３分の２（２２／３６）がはじめの２４時間以内に死ぬ。検死において、肺は、しばしば暗赤色であり（図３）、そして固定液の中に沈んだ（このことは不十分な膨張を示唆する）。固定およびＨ＆Ｅ染色に続き、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウス由来の肺およびその正常な同腹子を、比較した。Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−新生仔マウス由来の肺の最も著しい特徴は、末端空隙のサイズの減少を生じる増加した間葉の細胞性である（図４Ｄ）；肺胞中隔は、数が減り、そして野生型同腹子においてよりも厚かった（図４Ｃ）；細気管支は、不揃いの断面を有した（図４Ｄ）。全体の外見は、０．５〜１．０日の発育の遅れと一致した。生まれる前に異常な表現型が存在しているかどうかを決定するために、Ｅ１５．５および１８．５日齢の肺を、同様に検査した。この結果は、異常な肺の形態が、既に１５．５日目に構築されていることを示した（図４ＡおよびＢ）。
【０１０４】
（実施例９）
（Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウスにおける他の表現型の変化についての調査）
出生時に死ぬ全てのマウス新生仔を、その異常な肺に加えて、巨視的な異常性について検査した。横隔膜ヘルニアを患う３匹のマウスを除いては、何も見つからなかった。心臓、腎臓および筋肉を、巨視的に調査したが、異常な組織像は、検出されなかった。軸索の移動に管理されるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｒｏｂｏの機能、ならびにマウス新生仔の脳（図２Ａ）および胎児の脳（Ｃｌａｒｋ、ＫＪ，ＪＸ，ＥＨおよびＰＨＲ、未公表の観察結果）におけるタンパク質の高い発現レベルを考慮して、変異体マウスの脳および脊髄を、検査した。Ｅ１２．５胚およびＥ１５．５胚由来の脊髄の横軸の連続切片を、脊髄の底板の下に横たわる複側交連の肥厚についてＨ＆Ｅ染色によって検査した。しかし、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−と正常な胚との間に違いは見出されなかった（結果は示さない）。
【０１０５】
（実施例１０）
（出生時に生存しているＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウスにおける気管支上皮過形成の発生）
本発明者らの結果は、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１標的化生殖細胞系の変異（これは、ＮＣＩＨ２１９Ｘ肺腫瘍細胞株において見出される天然に生じる体細胞変異に匹敵する）が、肺の発生において重大な効果を有することを示す。いくつかのホモ接合マウスを成体まで生存させ、そして交配可能とする（３９％）。生後初めの２４時間を越えて生き残るＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウスは、正常に発育するようであったが、３週齢以後の年齢で病的状態の兆候を共通に示した。検死および組織試験に続き、気管支上皮過形成を、共通の特徴として観察した。いくつかの肺において、乳頭状過形成が、気管支樹の全体を通して見られ（図４ＦおよびＨ）、正常な成体マウスの気管支上皮の均一な立方体様の外見と対照的であった（図４ＥおよびＧ）。ごくまれに、増加した上皮細胞層、巨大な多形性の核および縮小した細胞質により特徴付けられる病巣の形成異常が、観察された（図４Ｉ）。従って、肺全体の形態学における相違は、出生後生き残っているホモ接合体ほど明確ではないが、特定の気管支上皮の変更は、これらのマウスにおいて明確である。
【０１０６】
（実施例１１）
（可溶性Ｆａｂの産生および精製）
可溶性Ｆａｂを、Ｒｏｏｖｅｒｓら（１９９８）によって記載されるように生成した。培養物を、ＦａｂをｐＣＥＳ１に有するＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１（Ｋ１２，Ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏ），ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，ｈｓｄＤ５／Ｆ’  ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡ＋Ｂ＋，ｌａｃ１ｑ，ｌａｃＺＤＭ１５）を用いてインキュベートした。個々の細胞クローンを、選別し、そしてＭａｒｋｓら（１９９１）によって記載されるようなイソプロピル−β−１−チオガラクトピラノシダーゼ（ＩＰＴＧ）を用いる上流のＬａｃＺプロモーターの活性化により、可溶性Ｆａｂの産生を誘導した。
【０１０７】
（ＥＬＩＳＡ）
個々の選択されたクローンから結合するＦａｂを同定するために、可溶性Ｆａｂを使用するＥＬＩＳＡを、精製された、組換えＤＵＴＴ１について実施した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、１μｇ  ｍｌ−１  ＤＵＴＴ１を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて、一晩被覆し、ＰＢＳ−Ｔ［ＰＢＳ，０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］で３回、ＰＢＳで３回洗浄し、そして２％  ＭＰＢＳ［２％（ｗ／ｖ）Ｍａｒｖｅｌ−スキムミルク粉末−を含むＰＢＳ］を用いて１時間室温（ＲＴ）でブロックした。ブロッキングの後、誘導された細菌の上清を加え［２％ＭＢＳ中の５０％（ｖ／ｖ）］、そして１．５時間、室温にてインキュベートした。結合した抗体フラグメントを、さらなる抗体［２％ＭＰＢＳ中の５０％（ｖ／ｖ）ハイブリドーマ上清］、ペルオキシダーゼ結合型ウサギ抗マウス免疫グロブリン［Ｄａｋｏ，Ｇｌｕｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ；２％  ＭＰＢＳ中の０．１％（ｖ／ｖ）］を用いて検出し、そしてトリメチルベンジジン（ＴＭＢ）および過酸化水素を用いて染色した。光学密度を、４５０ｎｍで測定した。このアッセイは、Ｒｏｏｖｅｒｓらによって詳細に記載されている（１９９８  同書）。
【０１０８】
（競合ＥＬＩＳＡ）
競合ＥＬＩＳＡのために、可溶性Ｆａｂ抗体フラグメントのＤＵＴＴ１結合を、過剰な全長マウスのモノクローナル抗体の存在下において検出した。
【０１０９】
（特異性ＥＬＩＳＡ）
アッセイを、上記のように実施したが、ウェルは、抗原（例えば、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ）、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中のＨｅｎ  Ｅｇｇ  Ｗｈｉｔｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中の１０μｇ／ｍｌ  Ｔｅｔａｎｕｓ  ＴｏｘｏｉｄおよびＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌ  ＥＧＰ−２）を用いて被覆した。
【０１１０】
（実施例１２）
（ポリクローナル抗体および免疫組織化学）
Ｚｅｎｅｃａ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＫ）のＤＵＴＴ１／ＲＯＢＯ１（ＣＹＥＲＧＥＤＮＮＥＥＬＥＥＴＥＳ）のＣ末端ペプチドに対するポリクローナル抗血清を、ラットにおいて惹起した。この抗血清は、ＤＵＴＴ１発現ベクターまたはＲＯＢＯ１発現ベクターのいずれかを用いて形質転換された細胞において約１９０ｋＤａのバンドを特異的に認識した。抗血清を含む免疫化ペプチドのプレインキュベーションにより、染色をブロックした。
【０１１１】
胚の組織または全体を、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ緩衝液中で少なくとも２４時間固定し、パラフィン包埋およびパラフィン処理により４マイクロメートルの切片を得た。切片のパラフィンを除き（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｓｅ）、そして内因性の過酸化物をクエンチングした（ｑｕｅｎｃｈ）。ブロッキングの後、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１を、上記のようにポリクローナル抗血清に続き、ロバのビオチン結合体化抗ウサギ２次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  ＵＳＡ）を使用して検出し、そして製造業者のマニュアルに従ってＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＵＳＡ）を用いる増幅を続けた。ポジティブ染色を、ニッケル増強ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）を使用して検出し、そして、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄを使用して対比染色した。スライドを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤を使用して取り付けた。染色を、抗血清を使用する免疫化ペプチドについてのプレインキュベーションにより遮断した。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色した。
【０１１２】
上記の明細書において記載された全ての出版物は、参考として本明細書中に援用される。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、特定の実施形態との関連で記載されているが、特許請求の範囲における本発明は、そのような特許請求の範囲に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。事実、本発明を実施するための記載された様式での種々の改変は、分子生物学または関連する分野の当業者に明らかであることが、特許請求の範囲において意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１遺伝子の標的化変異。Ａ；標的化遺伝子座、および標的化構築物および変異対立遺伝子のゲノム構造。黒いボックスは、エキソン２を表す。フラグメントａおよびｂは、下の（Ｂ）で使用されるハイブリダイゼーションプローブである。外側の点線は、相同性組換えのために使用されるフラグメントを示す。Ｅ（ＥｃｏＲＩ）、Ｓ（ＳａｃＩ）、Ｂ（ＢａｍＨＩ）。Ｂ；標的化構築物をＥＳ細胞中にトランスフェクトした後、Ｓａｃ１消化ＤＮＡを、Ｇ４１８耐性ＥＳ（＋／−）およびコントロールＥＳ細胞（＋／＋）から調製し、そしてサザンブロット分析によって分析した。このフィルターを、プローブ［ａ］（３’末端で相同組換えの部位に隣接する）およびプローブ［ｂ］（相同組込みの外部）とハイブリダイズさせた（示していない）。正確な相同性組換えを示す２つのクローン（すなわち、野生型（６．９ｋｂ）と変異（７．３ｋｂ）対立遺伝子の両方）を、芽細胞に注入し、そして生じたキメラ（ｃｈｉｍａｅｒａ）をＣ５７ＢＬ／６マウスと交雑して生殖細胞系に変異対立遺伝子を伝達させた（結果は示していない）。Ｃ；最後に、生殖細胞系伝達を伴なうマウスＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１＋／−を異種交配させて、標的化変異についてホモ接合体（−／−）の子孫を得た。この異種交配からの子孫由来のＳａｃ１で消化されたテイルＤＮＡ（ｔａｉｌ  ＤＮＡ）を、プローブ［ａ］を用いたサザンブロッティングによってスクリーニングした。
【図２】Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１タンパク質分析（２４）。Ａ、Ｃ末端のＤＵＴＴ１／ＲＯＢＯ１ペプチドに対して惹起された抗血清を用いて野生型（＋／＋）およびＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−（−／−）１５日胚からの示される器官から単離したタンパク質のウェスタンブロット分析。Ｂ、パラホルムアルデヒドで固定された正常な新生児肺の４μｍの断面図の位相差画像（２００倍）。Ｃ、（Ａ）の抗ペプチド抗血清を用いて、（Ｂ）と同じ切片に適用されたＣｙ−３−ＴＳＡ増幅システム（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた気管支上皮における、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１タンパク質の免疫組織化学による検出（２００倍）。
【図３】野生型マウスおよびＤｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウスの大きな形態学的表現型。野生型マウスおよびその肺は、（＋／＋）の下に示され、これと比較して、Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウスおよびその肺は、（−／−）の下に示される。
【図４】Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−マウスおよび野生型同腹仔の肺の組織学的分析。パラ−ホルムアルデヒドで固定された４μｍの肺組織切片を、Ｈ＆Ｅ染色し、そして撮影した。Ａ；野生型肺、Ｅ１５．５日胚（×４００倍）、Ｂ；Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−肺、１５．５日胚（×４００倍）、Ｃ；野生型新生児肺（×１００倍）、Ｄ；Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−新生児肺（×１００倍）（矢印は気管支を示す）、Ｅ；野生型成体肺（×１００倍）、Ｆ；Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−成体肺（×１００倍）、Ｇ；野生型成体肺（×４００倍）、Ｈ；Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−成体肺（×４００倍）、Ｉ；Ｄｕｔｔ１／Ｒｏｂｏ１−／−成体肺（×４００倍）、矢印によって病巣の形成異常が示される。マウスの集団を、２つの独立したＥＳクローンから確立し：これらは両方とも識別不可能な異常な肺の病状を与えた。
【図５】ホルマリンで固定された肺のヒト扁平細胞癌腫の切片における抗ペプチド抗体を用いたＤＵＴＴ１／ＲＯＢＯ１タンパク質の免疫組織化学による検出。
【図６】ホルマリンで固定されたヒト正常気管支上皮の切片における抗ペプチド抗体を用いたＤＵＴＴ１／ＲＯＢＯ１タンパク質の免疫組織化学による検出。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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