(57)【要約】本発明により、ペプチドの１つ以上のリガンドを同定および特徴付けるための方法および組成物が提供される。特に、本発明は、目的の結合エレメントに結合されるセンサーを含むファージリガンドセンサーデバイス（ＰＬＳＤ）を提供する。目的の結合エレメントは、少なくとも１つの異種ペプチドをディスプレイするファージを含む。このＰＬＳＤおよびアッセイは、リガンド−ペプチド相互作用を同定および特徴付けることで特定の使用を見出す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）圧電性物質の結晶を含むセンサー；および
ｂ）操作されたファージを含む結合エレメント
を備える、ファージリガンドセンサーデバイスであって、ここで、該結合エレメントが、リガンドに結合し得る、ファージリガンドセンサーデバイス。
【請求項２】
前記ファージが、異種ペプチドを発現するために操作されている、請求項１に記載のファージリガンドセンサーデバイス。
【請求項３】
前記結合エレメントが、ビオチン化脂質の層により前記センサーに結合される、請求項１に記載のファージリガンドセンサーデバイス。
【請求項４】
前記異種ペプチドが、ネイティブなβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列の一部分であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のファージリガンドセンサーデバイス。
【請求項５】
異種ペプチドのリガンドを分析する方法であって：
ａ）ファージリガンドセンサーデバイスをアセンブルする工程；
ｂ）該デバイスをサンプルに曝す工程；および
ｃ）該デバイスからの信号出力を測定する工程を包含し、
ここで、該リガンドの該異種ペプチドへの結合が、該センサーからの信号出力における変化によって検出され得る、方法。
【請求項６】
前記リガンドの前記異種ペプチドへの結合が検出され、そして、ここで、該異種ペプチドに結合している該リガンドの量が定量的に評価される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、液体形態にある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記異種ペプチドが前記リガンドに結合することは既知であり、そして該リカンドが微生物である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが：
ａ）ウイルス；
ｂ）細菌；
ｃ）真菌；および
ｄ）原生動物
からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンドが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌または胞子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガンドが、痘瘡ウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記リガンドが、トキシンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記トキシンが：
ａ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍトキシン；
ｂ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓトキシン；
ｃ）ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＢ；
ｄ）アフラトキシン；および
ｅ）リシン
からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが、空気サンプルである、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドに対する１つ以上のリガンドの親和性を評価する方法であって：
ａ）該ペプチドを同定する工程；
ｂ）該ペプチドの一部分が異種ペプチドとしてファージによって発現されるように該ファージを操作する工程；
ｃ）該ファージをセンサーに結合するように調製する工程；
ｄ）該センサーを該ファージに結合するように調製する工程；
ｅ）該ファージを該センサーに結合する工程；
ｆ）該センサーからの第１の信号出力を測定する工程；
ｇ）該センサーを１つ以上のリガンドに曝す工程；および
ｈ）該センサーからの第２の信号出力を測定し、そして該第２の信号出力を該第１の信号出力と比較する工程
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記センサーをファージに結合するように調製する工程が、前記センサー上にラングミュア・ブロジェット膜を堆積することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記センサーをファージに結合するように調製する工程が、該ファージが前記センサーの表面に直接結合するように、該センサーの表面を掃除することを含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、目的のリガンドの検出のためのセンサーおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多くの適用は、特定の結合性質を有するリガンドまたは分子の検出および同定を必要とする。特定リガンドの結合性質は、適切なセンサーの使用によって検出および特徴付けられ得る。「バイオセンサー」は、文献で報告され、そして分子スクリーニングのための代替モデルを提供する。バイオセンサーは、分析プラットホーム、およびリガンドが結合し得る結合実体から構成される。バイオセンサーによるリガンドの検出は、上記結合実体を結合するリガンド、および測定され得る検出可能な信号を生成する分析プラットホームまたはセンサーを必要とする。分析プラットホームは、リガンドの結合実体との相互作用から生じる、質量、キャパシタンス、抵抗、表面プラズマ共振、反射率干渉などにおける変化を測定する。
【０００３】
バイオセンサー技術における当該分野の現在の状態は、多くのバイオセンサー設計を含む。例えば、米国特許第６，２４１，８６３号（発明者はＭｏｎｂｏｕｑｕｅｔｔｅ）は、酸化還元酵素を基礎にした電流測定バイオセンサーの開発を記載している。米国特許第６，２３９，２５５号は、表面プラスモン共振バイオセンサーを記載している。なお別のバイオセンサーが記載されており、これには、光学的回折のために官能化されたマイクロスフェアを利用するバイオセンサー（米国特許第６，２２１，５７９号）、質量感受性バイオセンサー（米国特許第６，０８７，１８７号）、ハイブリッドバイオセンサー（米国特許第６，０５１，４２２号）、金属酸化物マトリックスバイオセンサー（米国特許第５，９２２，１８３号）、シリコンベースのバイオセンサー（米国特許第５，８７４，０４７号）、固体支持膜バイオセンサー（米国特許第５，８４６，８１４号）、光ファイバー化学発光法バイオセンサー（米国特許第５，７９２，６２１号）などが含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
先に文献で報告されたバイオセンサーは幾分制限されている。なぜなら、これら報告されたデバイスは、低い感度、限られた寿命、および／または長い応答時間を有しているからである。Ｄｅｃｋｅｒら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３３：１５９〜１６５は、ビオチン／ストレプトアビジンカップリングにより固定化されたペプチドフラグメントによるファージ結合を測定するために、９０分より多く必要であることを報告した。Ｈｅｎｇｅｒｅｒら（（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：９５６〜６０、９６２、９６４）は、石英水晶（ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ）マイクロバランス上に固定化された抗原に対する、約１００分の時間定数でのファージ抗体の結合を報告した。これらの長い応答時間は、迅速スクリーニングと適合せず、そして大スケールスクリーニニングを不格好にする。従って、特定のタンパク質を迅速に検出し得るバイオセンサーに対する必要性が残っている。
【０００５】
さらに、報告されたバイオセンサーは、一般に、低特異性および低親和性のような欠点をもっている。いくつかのバイオセンサープラットホームは、結合エレメントとして抗体を利用する。例えば、米国特許第５，９２２，１８３号は、電流測定および電圧測定検知のための、金属酸化物および抗体の薄膜コンポジットの使用を教示している。米国特許第５，８７４，０４７号には、抗体との使用のための多孔性シリコンバイオセンサーが記載されている。米国特許第５，８５８，８０１号には、バイオセンサーまたは免疫センサーにおける使用のためのパターンをもつ複数抗体基板が、複数部位で特異的抗体を吸着することによって調製された。米国特許第５，０３９，６１１号は、ＥＬＩＳＡ型フォーマットにおける表在乳頭嚢腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体の使用を教示する。同時係属中の１９９９年１２月２日に出願された米国特許出願第０９／４５２，９６８号もまた参照のこと。
【０００６】
抗体を基礎にするセンサーは、いくつかの方法で先に用いられたセンサーに対する改良を提示し、そして改良された特異性および親和性を示し得る（例えば、Ｚｉｅｇｌｅｒら（１９９８）、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １３：５３９〜５７１を参照のこと）。しかし、抗体を基礎にするセンサーは、それらの有用性を制限するいくつかの欠点を有し、これには、高いコストおよび短い寿命または種々の環境試験条件またはフィールド試験条件中で実施できないなどが含まれる。さらに、抗体の質は、抗体を産生するために用いられる動物のような、異なる産生変数で変動し得る。抗体の別の欠点は、抗体を基礎にするセンサーで使用のための所望の抗体を生成するために数ヶ月を要し得ることである。
【０００７】
バイオテロリズムの脅威は、迅速に調製され得る特異的で正確なセンサーの必要性を強調している。現在のところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）胞子でのバイオテロリスト攻撃の最も速い認識およびそれに対する応答は、炭疽の臨床的徴候および実験室培養試験に基づき得、これは、終了するために数日を必要とする（Ｉｎｇｌｅｓｂｙら（１９９９）ＪＡＭＡ  ２８１：１７３５〜４５）。従って、迅速に調製される特異的で正確なバイオセンサーに対する必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、結合エレメントに結合した圧電物質センサーを含むファージリガンドセンサーデバイス（「ＰＬＳＤ」）を提供する。結合エレメントは、少なくとも１つの異種ペプチドをディスプレイするランドスケープファージである。本発明は、この結合エレメントに結合するリガンドの検出と特徴付けを可能にする。このように、本発明は、リガンドと結合エレメントとの間の相互作用を検出および調査するためのインビトロアッセイを提供する。従って、本発明は、種々のペプチドに特異的なリガンドの迅速な発見のためのアッセイを提供し、そして広範な範囲の生物学的物質、有機物質、およびその他の材料の検出において使用を見出す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
１つ以上のリガンドを同定および／または評価するための方法および組成物が提供される。特に、ファージリガンドセンサーデバイス（ＰＬＳＤ）、およびファージリガンドセンサーデバイスを用いるアッセイが提供される。このＰＬＳＤは、結合エレメントに結合されたセンサーデバイスを備える。このＰＬＳＤは、結合エレメントと１つ以上のリガンドとの間の相互作用の検出と特徴付けを可能にする。このように、このＰＬＳＤは、特定のペプチドに結合するリガンドを単離および調べるために用いられ得るインビトロアッセイを提供し、そしてそれ故、目的のペプチドに特異的な小分子リガンドの迅速な発見のためのアッセイを提供する。従って、ＰＬＳＤは多くの適用における使用を見出す。例えば、本発明のＰＬＳＤおよびアッセイは、遺伝子および／または薬物治療プロトコールにおいて種々の化合物または分子を標的にするために用いられ得るペプチド特異的分子の単離および同定で有用である。
【００１０】
ＰＬＳＤの結合エレメント成分は、本明細書では「ファージ」または「ランドスケープファージ」とも称される操作された細菌ファージを含む。ファージは、それらの生活環および物理的構造に起因してＰＬＳＤの要求に良好に適合している。Ｍ１３、ｆ１およびｆｄのような繊維状ファージは、糸形状の細菌ウイルスである。これらファージの外側コートは、互いに重複し、ウイルスＤＮＡを収容する管を形成する、数千の主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩの５０残基α−らせんサブユニットから構成される。ｐＩＩＩおよびｐＶＩを含む４つのマイナーなコートタンパク質の各々のいくつかのコピーは、この管状シースの先端部を形成している。
【００１１】
ＰＬＳＤの結合エレメントとしての使用のために、ファージは操作されて、野生型または天然のファージコートタンパク質ｐＶＩＩＩよりはむしろ異種ペプチドを産生する。操作されたファージを創製するために、少なくとも１つの短異種コード配列が、改変または異種アミノ酸配列がｐＶＩＩＩサブユニット毎の上にディスプレイされるように、ｐＶＩＩＩ遺伝子中にスプライスされるか、または置換される（操作されたファージからのウイルスシースの約１％のセクションを示す図１を参照のこと）。ｐＶＩＩＩ遺伝子に作製され得る改変の量は、ファージの物理的制限およびＰＬＳＤの要求によってのみ制限され；得られるファージが機能的ＰＬＳＤをアセンブルするために用いられ得る限り、任意の改変が作製され得る。従って、用語「異種ペプチド」は、わずか１つのアミノ酸残基が改変されているｐＶＩＩＩタンパク質を包含する。従って、異種ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２またはそれより多いアミノ酸改変を除くｐＶＩＩＩタンパク質の天然配列を有し得る。用語「異種ペプチド」は、改変されたｐＶＩＩＩ遺伝子が、非改変、または野生型のｐＶＩＩＩアミノ酸残基と、散らばった複数の改変アミノ酸残基を含む実施形態を包含する（実施例２を参照のこと）。改変アミノ酸配列が天然タンパク質に由来するとき、この改変配列は、それが由来する天然アミノ酸配列のほんの小部分、またはフラグメントを意味し得る。このようにして、天然タンパク質の一部分またはフラグメントを含む異種ペプチドは、その天然タンパク質由来であるといい得る。
【００１２】
操作されたファージを創製するための方法および組成物は、当該技術分野では公知である（Ｐｅｔｒｅｎｋｏら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １９（９）：７９７−８０１を参照のこと）。このような操作されたファージにおいて、異種ペプチドは、単一ビリオンのすべてのコートタンパク質またはサブユニット中で同一である。従って、いくつかの実施形態では、アセンブルされたファージウイルスシースは、本質的に図１に描写されるような構造を有しており、ここで、改変アミノ酸は、リガンドが結合し得る「ランドスケープ（景観）」中で野生型アミノ酸とともに散らばっている。この異種ペプチドは、このペプチドを形成するアミノ酸の組成および配列に依存して種々の立体配座に適合し得、そこでいくつかの実施形態では、この異種ペプチドは、ウイルスシースの表面から突出する。
【００１３】
この様式の異種ペプチドを発現する操作されたファージの構造は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）にたとえられ得る。ＣＤＲのように、この異種タンパク質は、高度に可変であり、そしてそれらは、一般に、ウイルス本体に対して隠退を強いられるので、それらは、多くの場合、隣接する野生型残基との相互作用により束縛され、規定された組織「ランドスケープ」を形成し（図１を参照のこと）、これは、これらの操作されたファージを記載する用語「ランドスケープファージ」に至る。さらに、ファージは、多くの異なるリガンドの１つに結合するために、親和性で選択され得る。ＰｅｔｒｅｎｋｏおよびＳｍｉｔｈ（２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３（８）：５８９〜５９２；Ｒｏｍａｎｏｖら（２００１）  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４７：２３９〜２５１を参照のこと。ファージは、それらを、生物学的センサーデバイスおよびこのようなデバイスの特定の適用のための優れた結合エレメントにする多くの性質を有している。例えば、特定のペプチドに結合するファージの親和性選択および増殖は、終了するのにわずか数週間ですみ、これは、代表的には数ヶ月かかる抗体の選択とは対照的である。
【００１４】
ファージはまた、当該技術分野で周知であるような、ファージディスプレイライブラリーを創製するために操作され得る。ファージディスプレイライブラリーは、操作されたファージのコレクションであり、その各々は、改変されたアミノ酸がすべてのコートタンパク質サブユニット上でディスプレイされるように、主要コートタンパク質遺伝子中にスプライスされる短い異種コード配列を含む。ファージディスプレイライブラリーは、全体として、無数の異なるペプチドを一緒に代表し得る。異種コード配列により特定されるペプチドは、（図１に示されるように）ファージまたはビリオンの表面上にディスプレイされる。各ファージクローンは、単一の異種ペプチドの多くのコピーをディスプレイするが、全体としてのライブラリーは、無数のペプチドを一緒に表し得る。ウイルスキャリヤは感染性であるので、ファージは個々にクローン化され得、そして全体ライブラリーまたは個々のクローンのいずれかが、無限に増殖され得る。ファージディスプレイ技法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｓｃｏｔｔ＆Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６〜３９０；Ｓｉｄｈｕ（２００１）Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８（２）：５７〜６３；Ｋｉｓｃｈｅｎｋｏら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４１：２０８〜２１３を参照のこと。ランダムペプチドライブラリーもまた当該分野で公知であり（例えば、Ｂａｒｂａｓ  ３ｄ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４（５）：５２６〜５３０を参照のこと）、そして異なる表面構造をもつ繊維状ファージの無数クローンのライブラリーがＰｅｔｒｅｎｋｏら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １９（９）：７９７〜８０１によって示された。いくつかの米国特許は、ランダムペプチドライブラリーを記載し：米国特許第５，７２３，２８６号（発明者Ｄｏｗｅｒによる）；米国特許第５，２２３，４０９号（発明者Ｌａｄｎｅｒによる）；米国特許第５，４０３，４８４号（発明者Ｌａｄｎｅｒによる）；および米国特許第５，５７１，６９８号（発明者Ｌａｄｎｅｒによる）を含む。
【００１５】
ファージ粒子の表面密度は、３００〜４００ｍ２／ｇであり、これは、恐らく最もよく知られている触媒を超える密度であり、そして、活性炭（ＵＲＬ  ｗｗｗ−ｉｌｐｉ．ｃｏｍ／ｍｓｄｓ／ｒｅｆ／ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｈａｒｃｏａｌ．ｈｔｍｌにおいて入手可能な情報を参照のこと）およびメソ多孔性ジルコニア粒子（ＮｅｘＴｅｃｈ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ；ＵＲＲ  ｗｗｗ．ｆｕｅｌｃｅｌｌｍａｔｅｒｉａｌｓ．ｃｏｍ／ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ−ｚｉｒｃｏｎｉａ−ｃａｔａｌｙｓｔ．ｈｔｍにおいて入手可能な情報を参照のこと）のような良好な吸着剤と良好に競争する。ファージ発現異種ペプチドは、ファージ粒子あたり数千の結合部位の極度に高い多価を提供する。このように、本発明のＰＬＳＤは、優れた結合性質を提供する。さらに、ファージ構造は、異常に強健であって、熱（７０℃まで）、多くの有機溶媒（例えば、アセトニトリル）、尿素（６Ｍまで）、酸、アルカリおよびその他のストレスに耐性である。精製されたファージは、感染性を失うことなく適温で無限に貯蔵され得る。
【００１６】
ビオチン化の特定の方法を選択すること（本明細書において以下にさらに論議される）、およびセンサー上のファージの密度ならびにその他の性質、結合組成物または方法を制御することにより、ファージアレイはアセンブルされ、目的のアッセイのために最適な性質を有し得る。非常に密な直線状のファージアレイ（「ベルベット型」アレイ）を含む結合エレメントは、一価の結合挙動を示す傾向があり、その一方、より密でない、大部分が非直線状のファージアレイ（「フェルト型」アレイ）は、多価結合挙動を示す傾向ある。結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）に起因する結合の親和性を増加するための生物学的システムおよび化学的システムで広く用いられる多価相互作用は、親和性を増大するその他の文脈で有効に用いられている。親和性は、結合価が、一価結合から二価結合に増加する場合、約千倍増加することが示されている（ＫｒａｍｅｒおよびＫａｒｐｅｎ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：７１０〜７１３を参照のこと）。本発明のＰＬＳＤの１つの実施形態で、ＥＬＩＳＡフォーマットにおけるリガンド結合の原子価は１であることが観察され、その一方、ＰＬＳＤへのリガンド結合の原子価は２であることが観察された（実施例４）。驚くべきことに、ファクター２だけの結合価におけるこの増加が親和性において５０倍の増加を生じた。なぜなら、結合定数の値が、ＥＬＩＳＡフォーマットについて３０ｎＭから、ＰＬＳＤについて０．５ｎＭまで増加したからである（実施例４；図９Ａおよび９Ｂ）。従って、本発明のＰＬＳＤは、非常に高い結合親和性を提供する。さらに、結合エレメントの固定化ファージは、ベルベット型層において、０．１Ｍにさえ到達する結合部位の極度に高い濃度を創製し得、その結果、ベルベット型ファージアレイを含む結合エレメントは、１０億までのファクターにより（ＰＬＳＤ表面上の）リガンドの濃度を増大し得る。
【００１７】
バイオセンサーデバイスの結合エレメントとして、高い結合活性を有するファージは、細菌およびウイルスのような多価抗原の不可逆的結合を実際に提供し得る。ＰＬＳＤのここの性質は、大量の液体サンプル、またはバイオセンサー上の液体サンプルの流れ中の極低濃度の微生物の検出に有用であり得る。この性質はまた、例えば、周囲空気のようなガス中に存在するリガンドを検出することで有用であり得、そしてこのようにして、本発明のＰＬＳＤは、例えば、毒性ガスまたは細菌胞子のような空気に含まれる汚染物の検出を提供し得る。
【００１８】
本発明の別の利点は、ファージがＰＬＳＤデバイスにおける使用のために産生され得るという容易さである。繊維状ファージは、細菌細胞培養を用いて効率的かつ簡単に産生され得る。細菌培養からの野生型ファージ粒子の収率は、操作されたファージ粒子は、より低い収率、例えば、操作またはランドスケープファージについては２０ｍｇ／リットルを有する傾向にあるが、通常、３００ｍｇ／リットルに到達する。ファージ粒子は、細胞から、細胞内成分がほぼない状態で分泌され、そしてさらなる精製が、任意のファージに適用可能である簡単なルーチンのステップにより容易に達成される。
【００１９】
従って、本発明は、種々のペプチドに特異的なリガンドの迅速な発見のための組成物およびアッセイを提供し、そして広範な範囲の生物学的材料、有機材料、およびその他の材料の検出における使用を見出す。リガンドは、ＰＬＳＤのランドスケープファージ上にディスプレイされる少なくとも１つの異種ペプチドに特定の測定可能なレベルで結合する任意の化合物、粒子、または生物であり、それによって、本発明のＰＬＳＤによる検出可能な信号を生成する。従って、リガンド結合が検出され、そして本発明のＰＬＳＤを用いて定量され得る。目的のリガンドおよびペプチドは、任意の生物または種から単離または由来し得、これには、哺乳動物、爬虫類、両生類、植物、細菌、ウイルス、アメーバ、リケッチャなどを含むがこれらに限定されるわけではない。
【００２０】
本発明のＰＬＳＤは、例えば、酵素、細菌、ウイルスおよびその他の生物学的剤および／または化合物、または有機剤および／または化合物、ならびに合成剤および／または化合物、または人工剤および／または化合物のようなリガンドを検出することで使用を見出す。ランドスケープファージ上にディイプレイされる異種ペプチドに結合し得る任意のリガンドが、本発明の組成物および方法を用いて検出および評価され得る。１つより多くのリガンドが特定の異種ペプチドに結合し得る。
【００２１】
従って、特定の異種ペプチドに結合するリガンドは、制限されずに、細菌、ウイルス、真菌、および原生動物を含む微生物、ならびに、有機および無機の化学的化合物であり得る。従って、リガンドは、ウイルス、細菌、真菌、プリオン、リケッチャ、アメーバ、ならびに天然毒素および合成毒素である、病原体または有害因子を含み得る。リガンドはまた、例えば、タンパク質、ペプチド、および核酸のような生化学的化合物を含み得る。本明細書で用いられる用語「ウイルス」は、任意のウイルス、例えば、痘瘡ウイルス、黄熱病ウイルス、コレラウイルス、およびエボラウイルス、マルブルクウイルス、およびラッサ熱ウイルスのような出血性熱ウイルスを含む。本明細書で用いられる用語「細菌」は、細菌胞子を包含し、そして、例えば、腺ペスト（例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、肺ペスト、および炭疽（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を引き起こすことが知られるような細菌のような、任意の種の細菌を含む。有害因子および毒素は、制限されないで、リシン、ボツリヌス毒素（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素）、アフラトキシン、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ毒素、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＢのような有機毒素を含む。
【００２２】
本発明の組成物および方法で有用であるファージは、目的の異種ペプチドをディスプレイし、そしてそれ故操作されたファージである。操作されたファージは、任意の異種ペプチドを発現するとして生成され、同定され、および単離され得、これは、「目的のペプチド」と称される特定のアミノ酸配列を含み得る。目的のペプチドが特定の細胞型もしくは組織に、または特定の疾患または障害に罹患した組織に特異的である場合、目的のペプチドを発現するファージは、目的の特定のペプチドを結合する化合物を同定および単離するために用いられ得る。このような化合物は、特定の細胞型または組織に化合物を送達するために有用であり得るか、またはそれらは、それら自身、目的のポリペプチドが単離された特定の細胞型または組織を処置することで有用であり得る。このようにして、目的のペプチドは、腫瘍または特定の型の腫瘍のような疾患または障害と主に会合し得る。選択的結合プロトコールに基づき、組織型特異的であるか、または代わりに異なる細胞に結合し得る化合物が決定され得る。同じ様式で、目的のペプチドは種とは独立であり得、すなわち、ペプチドは、任意の種からの同じ組織型または細胞型と会合する。あるいは、これらペプチドは種特異的であり得る。種特異的により、ペプチドが、特定種からの組織細胞（例えば、肝臓または細菌胞子）のような特定のリガンドに特異的であり、そして別の種からの同じ組織細胞に結合しないことが意図される。目的のペプチドは、任意の種から単離され得る。目的の哺乳動物種は、制限されないで、ヒト、ラット、イヌ、チンパンジーなどを含む。
【００２３】
目的のペプチドは、特定の細胞培養、細胞型、組織、発生のステージ、または疾患もしくは障害に特異的であり得るか、あるいは、それらは、特定の細胞型、発生のステージ、または疾患もしくは障害と優先的に会合し得る。目的のペプチドはまた、一般に、１つより多くの組織によるか、もしくは多くの組織により発現され得るか、または多くの組織状態と会合し得る。一旦、目的のペプチドが同定されると、このペプチドに対応するコード配列が決定され得、そして合成ヌクレオチド配列が創製され、ファージ主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩを異種ペプチドで置換する。次いで、このヌクレオチド配列を標準的な技法とともに用い、融合タンパク質を含むランドスケープまたは操作されたファージを生成し、そしてこれらファージを用いて本発明のＰＬＳＤを創製する。例えば、Ｉｖａｎｅｎｋｏｖら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４５１：３６４で修正されたような、「哺乳動物細胞中のファージディスプレイベクターの取り込みと細胞内運命」と題するＩｖａｎｅｎｋｏｖら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４４８：４５０〜６２を参照のこと。
【００２４】
目的のペプチドの同定および単離のための方法は、当該技術分野で利用可能である。このような方法は、ランダムペプチドを発現する細菌ファージ（ファージ）ライブラリーからの選択、ペプチドライブラリー中の天然に存在するＬ−エナンチオマーを単離するためのミラーイメージファージディスプレイなどを含み得る。例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｂａｒｒｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：２９９〜３０５；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１８５４〜１８５７；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４〜３６６；２００１年１２月１１日に発行された米国特許第６，３２９，５０１号、およびその中で引用される参考文献を参照のこと。目的のペプチドはまた、例えば、細胞表面タンパク質の配列を基に、あるいは、本明細書中に参考として援用される同時係属中の出願、２００１年９月５日に出願された出願番号第０９／９４７，１３７号および１９９９年１１月１０日に出願された出願番号第０９／４３８，１５０号中で論議されるようなインビボファージディスプレイスクリーニングにより選択され得る。本明細書に参考として援用される、２００２年２月６日に出願された同時係属中の米国出願第１０／０６８，５７０号もまた参照のこと。従って、目的のペプチドは、インビボファージディスプレイスクリーニング法によって同定される必要はないが、その他の技法または技能を用い、当該技術分野で公知であり得るか、または同定され得るか、または産生され得る。目的のペプチドはまた、ランダムペプチド、すなわち、ランダムなアミノ酸配列をもつペプチドであり得るか、またはアミノ酸配列は設計され得る。
【００２５】
一旦、目的のペプチドまたは異種ペプチドが選択されると、それらは、任意の適切な方法により改変され得る。このような方法は、ランダム変異誘発、および選択されたアミノ酸置換のための化合物の合成を含む。種々の長さのペプチドが構築され得、そして結合親和性に対する影響および試験リガンドの特異性について試験される。本発明の組成物およびアッセイはまた、例えば、当初のペプチドまたは類似のペプチドに強力に結合するファージのような特定のリガンドに対する増加した親和性についてペプチド配列（単数または複数）の改変体を評価するために用いられ得る。
【００２６】
目的のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本発明における使用のために、異種タンパク質、コード領域、またはベクターの構築において用いられる。このような方法は、当該技術分野で公知である（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＰｅｔｒｅｎｋｏ（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９７：３９１〜４１０、およびその中に引用された参考文献を参照のこと）。さらに、発現に必要な、発現カセットの構築、およびプロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどは公知である。ヌクレオチドによって、遺伝子配列、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンス核酸が意図される。本発明のヌクレオチドの構築のための標準的な技法は、当業者に周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のような参考文献中に見出され得る。種々の戦略が、ＤＮＡのフラグメントを連結するために利用可能であり、その選択は、ＤＮＡフラグメントの末端の性質に依存し、そしてこれは、当業者によって容易に決定され、かつ達成され得る。
【００２７】
本発明の結合エレメントである細菌ファージまたは「ファージ」は、上記で論議されたような異種ペプチドについての先行する知識を用いて創製され得、そしてまた、特定の結合性質を有するとしてファージライブラリーから同定され、かつ単離され得る。このような結合性質は、例えば、特定リガンドに結合する能力およびレセプターまたは抗体を結合する能力を含み得る。例えば、Ｂａｒｒｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：２９９〜３０５；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８〜６３８２；およびそれらの中に引用された参考文献を参照のこと。従って、本発明の結合エレメントである細菌ファージは、ランダムまたは部分的にランダムなアミノ酸配列を有する多くのペプチドを利用して構築されたファージディスプレイライブラリーから選択され得る。ファージはまた、複数ラウンドの配列変異誘発および親和性選択の後に創製および選択され得る。例えば、ＴｕｃｋｅｙおよびＮｏｒｅｎ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７０：２４７；Ｃｈｕら（２００２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２３：２５３を参照のこと。
【００２８】
任意のファージが、本発明の結合エレメントとして、それが本発明のＰＬＳＤを創製するために用いられ得、そしてリガンドに結合し得る限り用いられ得る。多様な集団を含むライブラリーを調製する方法はまた、Ｇｏｒｄｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５〜１４０１；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１〜３６０；ＧｏｏｄｍａｎおよびＲｏ、「薬物設計のためのペプチド模倣物」、Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、第１巻、Ｍ．Ｅ．Ｗｏｌｆｆ（編）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９５、８０３〜８６１頁；Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１４：８３〜９２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕａｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に記載され、これら参考文献の各々は、本明細書中に参考として援用される。異種ペプチドおよび／またはランドスケープファージは、必要に応じて、ＰＬＳＤの性能を増大するためにさらに操作または適合され得る。ヌクレオチド、ペプチド、およびファージを操作するための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、ＳｍｉｔｈおよびＰｅｔｒｅｎｋｏ（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９７：３９１〜４１０中に総説される方法を参照のこと。
【００２９】
操作されたファージは、センサーに結合され、本発明のＰＬＳＤを創製する。センサーに結合されるとき、ファージは、リガンドと相互作用し得、そしてこの相互作用がセンサーにより検出される。いくつかの実施形態では、ファージのセンサーへの付着は、主要コートタンパク質のＬｙｓ１０残基のＮ末端アミノ基またはアミノブチル基を用いて達成される。この目的のための架橋剤は、商業的に入手可能であり、そして当業者は、本発明のＰＬＳＤを生成するために、適切な架橋剤または結合組成物の組み合わせを容易に選択し得る。いくつかの実施形態では、センサーは、ファージが結合する１つ以上の層の添加によって調製され、そしてセンサーに結合されるべきファージの調製は、単に、ファージが調製されたセンサーへの添加のために適正な濃度であることを確実にすることを包含する。その他のいくつかの実施形態では、センサーは、清澄化を通じてによって調製され、そしてファージは、ファージ先端部（すなわち、ｐＩＩＩタンパク質）との相互作用により金センサー表面に直接結合される。センサーデバイスへのファージの「ブラシ型」結合には、ストレプトアビジン−結合ペプチドＨＰＱのようなタグペプチドまたはビオチン化部位が、ファージの先端上に位置する主要コートタンパク質ｐＩＩＩ中に操作され得る。次いで、ファージは、ストレプトアビジンでコートされたセンサーデバイスに非共有結合により結合され得る。他の実施形態では、ストレプトアビジン結合「タグ」ペプチドがファージ中に操作される場合、センサーは、ビオチン化されたホスホリピドのラングミュア・ブロジェット膜で調製され得る。このような実施形態では、ＰＬＳＤのアセンブリは、センサーにランドスケープファージを結合するためにストレプトアビジンの添加により達成され得る。ランドスケープファージが、リガンド結合の検出を許容するようにセンサーに付着される限り、任意の結合方法または組成物が用いられ得る。従って、いくつかの実施形態では、センサーは、金でコートされるか、または金コートセンサーが得られ；次いで、このセンサーは、ストレプトアビジンでコートされ、そしてビオチンを経由してランドスケープファージに結合される。あるいは、結合組成物層は、金の層に直接連結されるビオチン化チオールまたはジスルフィド層を含み得；次いで、このビオチン化層がストレプトアビジンに連結され、そしてビオチンを経由してランドスケープファージに結合される。例えば、Ｌｕｐｐａら（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３１４：１〜２６；Ｇａｕら（２００１）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｔｒｏｎｉｃｓ  １６：７４５〜７５５を参照のこと。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＬＳＤの結合エレメントは、ＰＬＳＤ上の各ファージが遺伝的に同一であるように、単一株のファージを含む（ファージ複製の間に生じ得、そして結合エレメントの性能に影響することは予期されない稀な変異を除く）。他の実施形態では、結合エレメントは、複数株のファージを含み、その結果、ファージの各株が、異なる異種ペプチドをディスプレイする。従って、複数株のファージを含む結合エレメントは、１つより多くのリガンドに結合するように設計される。このような実施形態で用いられるファージ株は、センサーの所望の性質を基に選択され、これは、ＰＬＳＤが用いられるべき特定の用途とともに変動し得る。従って、例えば、ＰＬＳＤの結合エレメントは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓに結合することが知られる異種ペプチドを含み得る。このように、本発明のＰＬＳＤは、１つより多くの種々のランドスケープファージで創製され得る；すなわち、ＰＬＳＤは、異なる異種ペプチド、またはファージライブラリーでさえ発現するランドスケープファージの混合物を用いて創製され得る。
【００３１】
ＰＬＳＤは、圧電物質センサーを含み得る。いくつかの実施形態では、公称５ＭＨｚの振動周波数をもつＡＴ−カット平面状水晶を含む音波センサーが用いられる。このような音波デバイス（ＡＷＤ）に適した水晶は、商業的に入手可能である（例えば、Ｍａｘｔｅｋ、Ｉｎｃ．）。水晶またはセンサーには電極が提供され、例えば、水晶には、振動回路への電気的接続のために、水晶の両側面上に配置された環状の金電極が提供され得る。いくつかの実施形態では、質量感受性センサーが用いられ；あるいは、他のセンサーが、それらがリガンド結合を検出し、そしてその結合に応答して変化する信号出力を提供し得る限り用いられ得る。結合と信号出力の直接の相関関係は、所望の結果が得られる限り必要ではない。従って、結合が生じるとき、センサーの異なる物理的性質および電気化学的性質；質量；自由エネルギー；電荷およびコンダクタンスのような電気的性質；蛍光、発光、吸着、散乱、および屈折のような光学的性質が変化し得る。従って、適切なセンサーは、電気化学的センサー、熱量測定センサー、および光学的センサーを含む。例えば、Ｌｕｐｐａら（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３１４：１〜２６を参照のこと。当業者は、本発明のアッセイの異なる適用のために、異なる感度および出力をもつセンサーが用いられ得ることを認識する。従って、例えば、いくつかの適用では、好適なＰＬＳＤは、結合の変化を高解像度で定量し得、その一方、その他の適用には、ＰＬＳＤは、高親和性結合の存在または不在のみの検出を必要とする。
【００３２】
いくつかの実施形態では、５ＭＨｚの作動周波数を有するＭａｘｔｅｋ７４０センサー用いられる。当業者は、ＰＬＳＤシステムの最高の感度に対応する作動周波数が、リガントが結合するとき、センサーの共振周波数における変化を最適化するために同定され得ることを認識する。任意の適切なデバイスが、センサーからの信号出力をモニターするために用いられ得、例えば、ＨＰ４１９５Ａ  Ｎｅｔｗｏｒｋ／Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）が用いられ得る。このアナライザーデバイスは、周波数のセット範囲を走査し、そして各周波数における信号性質を測定する。特定のファージ／リガンド組み合わせについて最適周波数が見出された後、この周波数は、結合の高感度測定のための作動周波数として用い得る；有用周波数は、ほぼ、２ＭＨｚと１５０ＭＨｚとの間である。
【００３３】
センサーは、得られるＰＬＳＤがリガンド結合を検出し得る限り、任意の適切な組成物および方法によりファージに結合または連結され得る。いくつかの実施形態では、センサーを調製する工程は、センサーが清澄であり、そしてファージに結合され得る準備ができていることを確実にすることを単に包含し得る（一般に、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ（１９９９）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照のこと）。少なくとも１つの組成物がセンサー表面に添加される場合、このセンサーは、結合組成物層を含むといわれる。例えば、ビオチン化脂質のラングミュア・ブロジェット膜がセンサーに添加され得る。ラングミュア・ブロジェット膜は、少なくとも１つの単層から形成される。単層は、水性溶液の空気／水界面で形成する、少なくとも１つの両親媒性化合物または両親媒性組成物の１分子厚さの膜である。この単層中の各分子は、同じ配向で整列され、疎水性ドメインが空気に面し、そして親水性ドメインが水性溶液に面している。この単層の圧縮は、空気／水界面における単層を通って基質を通過することによって、基質に移り得る、並んだ二次元固体の形成を生じる。基質に移った単層は、ラングミュア・ブロジェット膜、またはＬＢ膜と称される。ラングミュア・ブロジェット技術の総説については、Ｇａｉｎｅｓ、Ｇ．Ｌ．Ｊｒ．（１９６６）Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ａｔ  Ｌｉｑｕｉｄ−Ｇａｓ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｚａｓａｄｚｉｎｓｋｉら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１７２６〜１７３３；Ｕｌｌｍａｎ（１９９１）Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｌｍｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ；およびＲｏｂｅｒｔｓ（１９９０）Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ  Ｆｉｌｍｓ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；これらの内容は、本明細書に参考として援用される、を参照のこと。
【００３４】
単層は、代表的には、脂質、脂肪酸および脂肪酸誘導体、脂質可溶性ビタミン、コレステロール、クロロフィル、バリノマイシンのような有機分子、およびポリビニルアセテートおよびポリメチルメタクリレートのようなポリマーから構成される。単層はまた、多くの他の両親媒性化合物によって形成され得；従って、多くの両親媒性化合物が、本発明の単層を形成するために用いられ得る。このような化合物は、少なくとも１４の炭素原子を有する脂質を含む。例は、ステアリン酸およびヘキサデカン酸を含む。単層を形成するその他の化合物は、制限されないで、その内容が参考として援用される、Ｇａｉｎｅｓ、Ｇ．Ｌ．Ｊｒ．（１９６６）Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  Ｌｉｑｕｉｄ−Ｇａｓ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載のような化合物を含む。
【００３５】
脂質単層堆積は、当該技術分野で公知であり、そしてその全体が参考として本明細書中に援用される、１９９９年１２月２日に出願された同時係属中の出願０９／４５２，９６８に記載される方法により実施され得る。ラングミュア・ブロジェット（ＬＢ）膜バランスは、例えば、ＫＳＶ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｆｉｎｌａｎｄから商業的に入手可能であり、そして提供者の指示書に従って操作される。
【００３６】
ラングミュア・ブロジェット膜は、ラングミュア・ブロジェット技法を用いてセンサーの表面上に単層を連続的に移すことにより形成される。いくつかの実施形態では、ビオチン化脂質溶液が、ヘキサン溶液として、水性サブフェーズ上に拡げられる。次いで、単層は、圧縮され、そして垂直膜堆積が実施される。ＬＢ膜堆積において、複数の単層が、空気／液体界面に堆積された単分子膜を通じてセンサーを連続的に浸すことによりセンサーに添加され得る。ＬＢ膜は、このようにして、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはより多い単層の添加により形成され得、最終のラングミュア・ブロジェット膜を創製する。
【００３７】
ラングミュア・ブロジェット膜を創製するために用いられた単層は、揮発性有機溶媒の支援なくして形成され得る。例えば、１９９９年１２月２日に出願された同時係属中の出願０９／４５２，９６８を参照のこと。ＬＢ膜を形成するための多くの方法は、ヘキサンのような揮発性有機溶媒中で単層に形成されるべき化合物の溶解を必要とする。この有機溶媒は、水性溶液から別の相を形成し、そして水相中の単層成分の溶解を防ぐように機能する。水性溶液の空気／液体界面で混合物を拡散した後、溶媒を蒸発させ、界面に単層を残す。しかし、このような実施形態では、有機溶媒は、単層成分を損傷し得、そしてバックグラウンドレベルの非特異的結合に寄与する所望されない残渣を残す。従って、いくつかの実施形態では、１９９９年１２月２日に出願された同時係属中の出願０９／４５２，９６８に提示される有機溶媒の支援なしに形成される単層が、本発明のＰＬＳＤに改良された性質を提供する。いくつかの実施形態では、ランドスケープファージがホスホリピドに共有結合または連結され；これらのホスホリピドを含むベシクルが、次いで、単層およびＬＢ膜を創製するために用いられ、本発明のＰＬＳＤを作製する。このような実施形態では、ファージのセンサーへの結合は、センサー上でこのようなＬＢ膜の形成により達成され得、そしてストレプトアビジンおよびビオチン相互作用を経由する結合は必ずしも必要ではない。このようなセンサーは、金メッキされ得るか、またはその他の物質でコートされ、ＬＢ膜のセンサーへの接着を容易にする。
【００３８】
本明細書で用いられる「単層」は、少なくとも１つの両親媒性化合物または組成物の１分子厚さ膜をいう。本明細書で用いられる「圧電性」は、機械的な力が付与されるとき電圧を生成するか、または電圧が提供されるとき機械的な力を生成する能力をいう。この相互交換の関係は、圧電性効果と称される。圧電性水晶中の対称の中心の不在は、圧電性効果に必要である。対称の中心を欠く２１のクラスの水晶のうち、１つのクラスを除くすべてが圧電性である。例えば、石英水晶（ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ）は圧電性水晶である。
【００３９】
ＬＢ膜を形成するさらなる方法が当業者に公知であり、そしてＵｌｌｍａｎ（１９９１）Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｌｍｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ；およびＲｏｂｅｒｔｓ（１９９０）Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ  Ｆｉｌｍｓ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；それらの内容は、本明細書中に参考として援用される、に記載されている。
【００４０】
一旦、ＰＬＳＤが、ファージをセンサーに結合することにより調製されると、信号出力が、ＰＬＳＤを創製するために用いられた水晶またはセンサーと適合する任意の適切なデバイスによって測定され得る。多くのこのようなデバイスが当該技術分野で公知であり、そして商業的に入手可能である。いくつかの実施形態では、測定は、５ＭＧｚで０．５Ｈｚの周波数解像度をもつＰＭ−７４０Ｍａｘｔｅｋプレーティングモニターを用いて実施される。「信号出力」により、リガンドの結合に応答して変化し、そして適切なデバイスにより検出またはモニターされ得るセンサーの任意の性質が意図される。デバイスの信号出力は、パーソナルコンピューターおよび適切なデータ獲得カードおよびソフトウェアを用いて記録および分析され得る。いくつかの実施形態では、共振周波数は、水晶の質量とともに、それがリガンドのセンサーとの相互作用に起因して変化するので変化する。Ｍａｘｔｅｋデバイスからの電圧出力は、石英水晶センサーの共振周波数に直接関連するので、共振周波数および／または電圧における変化は、次いで、リガンドの目的のペプチドへの結合をモニターするために用いられ得る。周波数および電圧における変化は、非特異的結合が十分に低いと仮定して、リガンドの濃度に比例する。一旦調製されると、ＰＬＳＤは、複数のアッセイのために用いられ得、そして一日、数日、一週間、一月、数ヶ月、６ヶ月まで、一年、またはより長く機能的なままであり得る。
【００４１】
結合アッセイを実施するための方法および組成物において、（１）ランドスケープファージの高い表面密度；（２）高い特異性の相互作用および低レベルの非特異的結合；（３）相互作用パートナーの接近可能性；および（４）検知システムの安定性を有することが所望される。本発明のＰＬＳＤは、従前に知られたデバイスを超える改良された性質を示し、これには、より低い閾値の検出、増加した結合の強度および大いに増加した感度が含まれる。さらに、ＰＬＳＤは、例えば、全細菌または胞子または植物花粉のような、非常に大きな粒子を結合する能力を示す。特定の条件下では、ＰＬＳＤはまた、検出のより低い閾値に寄与する結合の相乗効果を示す。本発明は、操作のいずれの特定の機構によっても拘束されないが、これらの利点は、ファージウイルスコート表面上に４，０００異種ペプチドまでディスプレイし得る、ファージの多価から由来すると考えられる。
【００４２】
ＰＬＳＤは、代表的には、リガンドを含み得る溶液をＰＬＳＤ上に重層することにより１つ以上のリガンドに曝される。ＰＬＳＤはまた、ガスにも曝され得る。例えば、ＰＬＳＤは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（ＢＡＳ）の胞子のような空気中にある汚染物である有害因子および毒素の検出のために周囲空気に曝され得る。他の実施形態では、精製または部分精製されたリガンドの溶液が、定量または評価のためにＰＬＳＤに曝され得る。従って、任意のサンプルを、サンプルの形態がＰＬＳＤへの曝露と適合する限り、ＰＬＳＤに曝すことによってアッセイし得る。精製または部分精製されたリガンド溶液により、溶液を作製するために用いられたリガンドが、細胞成分が実質的になく、そして約３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％（重量による）より少ない汚染物質を有するリガンドの調製物を含むことが意図される。
【００４３】
リガンドの検出のために、本発明のＰＬＳＤは、サンプルからリガンドを単離および／または濃縮するデバイス（単数または複数）とともに用いられ得る。従って、ＰＬＳＤは、例えば、空気中にある炭疽胞子のような特定リガンドの存在の連続モニタリング、検出および／または警告を許容するために、他のデバイスと構成され得る（実施例２を参照のこと）。
【００４４】
異種ペプチドのリガンドを同定するためのアッセイを提供することに加え、当業者は、本発明が多くの適用を有することを認識する。例えば、本発明は、特定の異種ペプチドと相互作用しない溶液および組成物を同定するためのアッセイおよび組成物を提供する。従って、本発明は、ポジティブおよびネガティブアッセイの両方、ならびに、種々の適用、例えば、特定の性質を有し得るペプチドまたはペプチド部分を設計するために用いられ得る定量的結合アッセイを提供する。このようにして、リガンドはまた、異種ペプチドとのそれらの相互作用または相互作用の欠如のために有用であり得る化合物または組成物であり得る。例えば、リガンドは、１つの異種ペプチドに結合するが、他とは結合しない薬学的化合物であって、特定の細胞型の細胞表面マーカーに結合するが、他には結合しないことを示す化合物であり得る。
【００４５】
以下の実施例は、本発明を限定するよりはむしろ、例示することを意図している。
【実施例】
【００４６】
（実験）
（実施例１：β−ガラクトシダーゼの検出のためのＰＬＳＤ）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのβ−ガラクトシダーゼは、同じ１，０２３残基ポリペプチドのテトラマータンパク質であり、１７．５−１３．５−９ｎｍの分子寸法をもつ。このタンパク質および小ハプテンに結合するファージを、ＰｅｔｒｅｎｋｏおよびＳｍｉｔｈ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１３：５８９〜５９２に記載のようなファージディスプレイライブラリーから単離した。ファージの抗原への結合は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により確認し、そこでは、ファージは、ＥＬＩＳＡウェルのプラスチック表面上に固定化し、そして溶液中でそれらの抗原と反応させた（ＰｅｔｒｅｎｋｏおよびＳｍｉｔｈ、同上を参照のこと）。このファージは、市販の試薬および標準的な手順を用いてビオチン化した（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬからの２００２年のカタログを参照のこと）。
【００４７】
デバイスのセンサー成分を調製するため、５ＭＨｚの公称振動周波数をもつＡＴ−カット平面状石英水晶を、Ｍａｘｔｅｋ、Ｉｎｃ．から購入した。環状の金電極を、振動回路への電気的接続のために、この水晶センサーの両側面上に配置した。マイクロバランスおよびセンサーを、良好に特徴付けられたステアリン酸単層の堆積により校正した。センサー表面上のステアリン酸単層の増加する数の堆積は、質量の直線状増加を生じた。水晶センサー上のステアリン酸の単一の単層の堆積は、（３８ｍＮｍ−１移入表面圧力に対して）２．６×１０−７ｇ／ｃｍ２の質量を付加した。この値は、凝縮状態にあるステアリン酸単層の分子面積に基づく理論的推定値と良好に一致した。この状態で、分子あたりの面積は約２０Å２である（単一のアルキル鎖について；Ｕｌｍａｎ（１９９１）、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｌｍｓ  ｆｒｏｍ  Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ  ｔｏ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照のこと）。１ｃｍ２の単層中のステアリン酸分子の数は、１×１０１６／２０＝５×１０１４である。１つのステアリン酸分子の質量は、２８４ｇ／モル／６．０２３×１０２３分子／モル＝４．７２×１０−２２ｇである。次に、単一の単層の質量は、５×１０１４×４．７２×１０−２２ｇ＝２．４×１０−７ｇであり、これは、得られた実験値２．６×１０−７と良好に匹敵する。
【００４８】
ファージに結合すべきセンサーを調製するために、ホスホリピド（Ｎ（ビオチノイル）−１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）を含む単層を、ラングミュア・ブロジェット技法を用いて音波センサーの金表面上に移し、ビオチン化センサー表面を創製した。多層は、水−空気界面に堆積した単分子膜を通じてセンサーを連続的に浸漬することにより得た。ファージは、図２に示されるようなＰＬＳＤを創製するために、分子の自己アセンブリにより、ストレプトアビジン中間体を経由してホスホリピドと結合した。
【００４９】
脂質単層の堆積は、ラングミュア・ブロジェット（ＬＢ）膜バランスＫＳＶ  ２２００ＬＢ（ＫＳＶ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて実施した。この完全にコンピューター化したシステムは、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ型表面バランス（範囲０〜１００ｍＮ／ｍ；感度０．０５ｍＮ／ｍ）、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）トラフ（４５×１５ｃｍ２）、可変速度モーター駆動Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）バリア（０〜２００ｍｍ／分）、および層流フードを備える。トラフは、２００ｋｇの大理石テーブル上に取り付けた。振動制御は、ゴムのショック吸収剤を挿入することにより、および分離したベンチ上に層流フードを取り付けることによって提供された。表面圧力は、周囲４ｃｍの砂吹き機で磨かれた白金プレートの使用によりモニターした。水性サブフェーズの温度（２０℃±０．１℃）は、空気／液体界面のすぐ下に位置決めされたサーミスタにより測定し、そしてトラフ底部の石英管コイルを通る水循環により制御された。
【００５０】
脂質溶液を、２％エタノールを含むヘキサン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）として水性サブフェーズ上に拡散した（Ｉｔｏら（１９８９）Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ  １８０：１〜１３）。実験に用いた水性サブフェーズは、脱イオン化２回蒸留水（ｐＨ７．４）で作製された、５５ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ｍＭ  ３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を含む溶液であった。拡散の後、単層を、１９℃で１０分間平衡化および安定化させた。単層を、次いで、３０ｍｍ／分の速度で圧縮し、そして垂直膜堆積を、４．５ｍｍ／分の垂直速度、および２５ｍＮ／ｍの一定表面圧力で実施した。このようにして、石英水晶の金表面上に１１の単層を移した。ＬＢ技法により堆積した単層および多層は、合理的に安定であった（Ｐａｔｈｉｒａｎａら（２０００）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １５：１３５〜１４１を参照のこと）。
【００５１】
次いで、ＰＬＳＤを、ビオチン／ストレプトアビジン結合の「分子アセンブリ」を用いてアセンブルした。ストレプトアビジンは、以下のように、（ビオチン化脂質でカバーされた）センサー上にビオチン化ファージを固定化するために添加された。センサーを、０．０１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンを含むサブフェーズ溶液で２時間処理し、次いで、蒸留水ですすぎ、そして周囲空気中で２分間乾燥した。センサーを、次に、０．００１ｍｇ／ｍｌでビオチン化ファージを含むサブフェーズ溶液に２時間曝し、そして次に上記のように再びリンスして乾燥した。必要であれば、これらの工程の後に、ビオチンを含むサブフェーズ溶液を用いるブロッキング工程が続き得、自然にビオチン化したタンパク質のセンサーへの非特異的結合を防ぐ。次いで、各々調製されたＰＬＳＤは、個々のペトリ皿中に配置され、そして４℃で貯蔵された。この実施例で記載される試験は、ＰＬＳＤのアセンブルの２４時間以内に実施された。
【００５２】
結合測定は、５ＭＨｚで０．５Ｈｚの周波数解像度をもつＰＭ−７００  Ｍａｘｔｅｋプレーティングモニターを用いて実施した。このＭａｘｔｅｋデバイスの電圧出力が記録され、そして記録はオフラインで分析された。このＭａｘｔｅｋデバイスからの電圧出力は、石英水晶センサーの共振周波数に直接関連する。この石英水晶センサーの共振周波数における変化は、センサー表面へのβ−ガラクトシダーゼの結合をモニターするために用いられた。観察された変化は、表面流体媒体近傍のＬＢ膜の粘弾性変化およびβ−ガラクトシダーゼの結合にともなう質量変化の両方に起因していると仮定される。
【００５３】
結合測定のために、このＰＬＳＤを、サンプルの送達の直前に機器のプローブアーム中に位置決めした。記録を開始した直後に、１０００μｌのＰＢＳを、ピペットでＰＬＳＤ表面に送達し、そして電圧を４〜８分間記録した。次に、ＰＢＳをプラスチックピペットチップで注意深く取り除き、そして新たな記録を開始した。溶液中のβ−ガラクトシダーゼの異なる希釈物を、センサーに逐次的に添加し、そして各添加の後に同じ測定手順を続けた。各実験は、２〜４回繰り返し、そしてすべてのサンプルの温度は、約２５℃であった。収集されたデータは記憶され、そしてオフラインで分析した。センサー表面上の占領ファージ（Ｙ）および遊離ファージ（１−Ｙ）の比は、
ｌｏｇ（Ｙ／（１−Ｙ））＝ｌｏｇＫｂ＋ｎｌｏｇ［Ｃ］      ［１］
として決定され得、ここで、Ｋｂは、会合結合定数、Ｃは、β−ガラクトシダーゼ濃度、そしてｎは単一のファージに結合した分子の数である。ｌｏｇ［Ｃ］に対する、等式（１）の左手側のプロットは、Ｈｉｌｌプロットとして知られる（Ｋｕｃｈｅｌ＆Ｒａｌｓｔｏｎ（１９８８）Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。Ｈｉｌｌプロットは、傾きからのｎ、縦軸切片からのＫｂ、およびＹ＝１−Ｙのときの点におけるＥＣ５０の推定値を与える。
【００５４】
結合測定から得られたデータは図３に示される。上記のように、これらのデータは、異なる濃度のβ−ガラクトシダーゼ溶液にセンサーを曝すことにより得られた。最も希薄で始まり、そして最も濃縮で終わる、β−ガラクトシダーゼ溶液の逐次的付与は、各適用で電圧の上昇を示し、ＰＬＳＤにさらなる物質が結合したことを示す。各β−ガラクトシダーゼ濃度について、センサー信号は、１００秒またはそれより短い内に、その濃度に対応する定常状態値に接近した。応答曲線は、速い反応時間、定常状態の到達、および低い非特異的結合により区別される。
【００５５】
図４は、β−ガラクトシダーゼの相対濃度の関数としてプロットされたＰＬＳＤからの定常状態出力センサー電圧の平均値を示す。この結合用量応答曲線は、代表的なシグモイド形状を有し、そして信号は、約６００ｎＭのβ−ガラクトシダーゼ濃度で飽和した。対応するＨｉｌｌプロットを図５に示す。Ｈｉｌｌプロット等式から算出された結合パラメーターは以下の通りであった：Ｈｉｉ係数、２．１±０．１；解離定数、１．７±０．５ｎＭ；最大応答、０．６５±０．１９；最大結合、１３０±３０Ｎｇ／ｃｍ２。
【００５６】
本発明の別の実施形態は、表面プラスモン共振（ＳＰＲ）センサーである改良されたセンサープラットホームを提供する。ＳＰＲセンサーは、生体認識特徴付けにおける認識されたツールである（ＭａｌｍｂｏｒｇおよびＯｈｌｉｎ（１９９９）Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ｏｆ  ＢｉｏＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４：１６３〜１７３）。ＰＬＳＤを、結合エレメントとしてβ−ガラクトシダーゼに対して選択されたファージ、およびＳＰＲセンサーを用いて構築した。このＰＬＳＤは、β−ガラクトシダーゼに対し、強力な結合を示した（図１０）。このＳＰＲ技法は、液体の流れ中に対するファージのＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子のリアルタイム結合をモニターするために最適化され得る（例えば、実施例６を参照のこと）。
【００５７】
（実施例２．操作されたファージライブラリーの構築）
大（１０９クローン）ファージライブラリーを、縮重コード配列を、ｐＶＩＩＩコートタンパク質遺伝子の開始中にスプライシングすること、野生型コドン２−４を置換することにより構築した（Ｐｅｔｒｅｎｋｏら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９：７９７〜８０１）。用いたこの縮重コード配列に、以下の表１で下線を引いている：
【００５８】
【表１】
2005535870.tif 000002
このＤＮＡ配列において、各Ｎは、４つのすべてのヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ）の等しい頻度を表し、その一方、Ｋは、ＧおよびＴの等しい頻度を表す。この改変の結果として、操作されたファージにおけるすべてのｐＶＩＩＩサブユニットは、野生型ｐＶＩＩＩサブユニットより５アミノ酸長く、そして８アミノ酸の「ランダム」配列、またはオクタマー（上記のＸ８）をディスプレイした。任意の単一クローンにおいて、このランダムオクタマーは、粒子毎に同じであったが、大部分のクローン毎は、異なるランダムオクタマーをディスプレイした。このオクタマーは、表面のかなりの割合を占領して、ビリオンの外側の周りに規則的に整列していると考えられる。
【００５９】
ランダムノナマー（９マー）を用いて別のライブラリーを構築した。このライブラリーでは、主要コートタンパク質の位置５にあるアスパラギン酸Ｄ（表１を参照のこと）がまた欠失され、そしてこの欠失領域を、ランダムノナマーで補充した。さらに、ｆ８−αライブラリーを、１０８クローンを含めて構築した。このライブラリーでは、主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩは、以下の表２に示されるように、ｐＶＩＩＩタンパク質の位置１２〜１３、１５〜１７および１９に置換されたランダムアミノ酸を有していた。
【００６０】
【表２】
2005535870.tif 000003
ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を意味する。これらのライブラリーの創製によって示されるように、当業者は、ランダム化された異種ペプチドで種々のファージライブラリーを容易に設計および創製し得る。
【００６１】
（実施例３：特定のリガンドを結合するファージの選択）
ＰＬＳＤを創製するために選択されたモデルリガンドは：ストレプトアビジン（細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉから）、アビジン（鶏卵白から）およびβ−ガラクトシダーゼ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であった。各タンパク質を、３５−ｍｍポリスチレンのペトリ皿の表面に吸着し、そしてファージライブラリーに曝した。非結合のファージを洗い流し、そして結合ファージを酸緩衝液で溶出し、そして感染する新鮮細菌宿主細胞により増幅した。３ラウンドの選択の後、個々のファージクローンを増殖し、そして部分的に配列決定してディスプレイされた異種ペプチドのアミノ酸配列を決定した。選択されたファージをさらに酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により特徴付け、そこでは、ファージをＥＬＩＳＡウェルのプラスチック表面上に固定化し、そして溶液相中のリガンドと反応させた。ノイトラビジンとストレプトアビジンとを、アルカリホスファターゼで標識し、その一方β−ガラクシトダーゼは標識しなかった。データ（図６にグラフにした）は、選択されたペプチドへの各リガンドの特異的用量依存性結合を示す。阻害ＥＬＩＳＡは、非固定化ペプチド担持ファージが、それらの個々のリガンドへの結合について固定化ファージと競合することを確証した。
【００６２】
選択されたファージの配列分析は、リガンドが結合し得る、ファージによってディスプレイされた異種ペプチドの「モチーフ」またはコンセンサス配列を示した。ストレプトアビジン結合モチーフＶＰ（Ｅ／Ｄ）（Ｇ／Ｓ）ＡＦＸＸ（ここで６０％のＸはＳまたはＴ）は、ノイトラビジン結合性モチーフＶＰＥ（Ｆ／Ｙ）ＸＸＸＸ（ここで３４％のＸはＳおよびＴである）に際立って類似している。しかし、結合は、強力に種特異的であることが示された：ストレプトアビジンで選択されたファージは、ノイトラビジンを結合せず、そして逆もまた真実であった。２つの異なるグループの異種ペプチドが、コンセンサスモチーフＥＫＴＬＡＹＸＱおよび（Ｄ／Ｅ）ＴＦＡ（Ｋ／Ｒ／ｘ）ＸＸＸ（ここで（Ｋ／Ｒ／ｘ）とマークされた位置は、＞５０％の塩基性ＫおよびＲ残基を有する）で、β−ガラクシトダーゼ結合ファージ上でディスプレイされた。これら２つのグループからのファージは、β−ガラクシトダーゼへの結合について互いに競合し、そしてそれ故、恐らくリガンド上のすぐ隣に結合する。
【００６３】
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子を結合するファージの選択）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの獣医学ワクチン株改変体（「Ｓｔｅｒｎｅ」株）を得た。胞子結合ファージをファージライブラリーから選択し、ここでは、約１０億クローンの各々が、ファージの表面上に主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩに融合した特有のランダムオクタマーペプチドを有していた（Ｐｅｔｒｅｎｋｏら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９：７９７−８０１；Ｐｅｔｒｅｎｋｏら（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３：５８９−５９２）。
【００６４】
２つの異なるスキームの親和性選択を用いた。１番目では、胞子結合ファージを遠心分離により沈殿し、洗浄し、そして温和な酸で溶出し、そしてＥ．ｃｏｌｉ細胞を感染した。感染細胞を、テトラサイクリンおよびカナマイシン（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを殺すが、ファージが感染したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞は殺さない抗生物質）を含む培地中で増殖させた。このファージのサブグループを増殖し、そして次のラウンドの選択に用いた。４ラウンドの増幅および選択の後、これらファージを溶出し、そして単離されたクローンのように増殖させた。次いで、ファージＤＮＡを配列決定し、異種ペプチドの構造を決定した：
【００６５】
【表３】
2005535870.tif 000004
選択されたファージが胞子に結合したことを確証するために、結合アッセイを実施し、そこでは、各ファージクローンの１０９ｃｆｕ（コロニー形成単位）が、１０８のＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子と個々に混合された。ペレットを洗浄し、そして上記のように酸で溶出し、そしてファージ回収率を測定した。異なるクローンの回収率は、胞子不在で約３％の回収率のコントロールレベルに対し、２０〜２９％の範囲であった。しかし、選択実験に関連しないファージを用いる回収率コントロールは、４ｌｏｇを超えるより低い回収率のレベルを示した。これらの結果は、胞子との共沈殿によるファージ選択が胞子を結合するファージを、そしてまた遠心分離により沈殿する傾向のファージを選択したことを示す。
【００６６】
選択手順における結合特異性を増加するために、別のプロトコールを用いた。このプロトコールは、固定化胞子へのファージの親和性吸着に基づく。このプロトコールでは、ファージライブラリーを、マイクロタイター皿のウェル上の固定化された胞子とインキュベートした。非結合ファージを洗い流し、そして結合ファージを温和な酸で溶出し、そして細菌細胞中で増殖させた。４ラウンドの選択の後、最終のサブライブラリーからのファージを個々のクローンとして増殖させ、そして配列決定した。このプロトコールで選択された異種ペプチドを表３に提示する。これらのペプチドは、共沈殿プロトコール中で単離されたペプチドとは異なり、それらのＮ末端にいくつかの共通特徴を有している。
【００６７】
次いで、ファージ捕獲ＥＬＩＳＡを、胞子結合候補ファージのさらなるスクリーニングのために用いた。このアッセイでは、胞子をマイクロタイター皿のウェル上に固定化し、そして選択されたファージ候補と反応した。皿の大規模な洗浄の後、結合ファージを、ビオチン化抗ファージ抗体、アルカリホスファターゼ−ストレプトアビジン結合体（ＡＰＳＡ）およびｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）との継続的反応を経由して定量した。発色反応の動力学は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋリーダーを用いて測定した。結果は、選択されたクローンの約半分が、一貫して、コントロール野生型ファージより高い信号を与えることを示した。
【００６８】
最も有望なファージ候補を直接ＥＬＩＳＡによりさらに特徴付け、そこでは、ファージを、マイクロタイター皿のウェルに固定化し、そして溶液中の胞子と反応させた。ファージに結合した胞子を、抗Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子モノクローナル抗体、アルカリホスファターゼと結合したヤギ抗マウス抗体およびＰＮＰＰとの継続的反応で検出した。図７は、ＥＬＩＳＡを用いて選択されたクローンの１つでの胞子の検出を示す。選択されたクローンとコントロールベクターファージｆ８−５の結合プロフィールにおける差異は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子とのそれらの相互作用の高い特異性を反映している。
【００６９】
ファージ由来プローブの選択性を調査するために、胞子／抗胞子抗体／抗マウス抗体の複合サンドイッチがビオチン化胞子によって置換されるＥＬＩＳＡフォーマットを利用した。胞子は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ−ＴＭＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｒｏｃｈｆｏｒｄ、ＩＬ）でビオチン化し、大規模に洗浄し、そしてマイクロタイター皿のウェル上に固定化されたファージプローブとインキュベートした。胞子−ファージ複合体を、ストレプトアビジンと複合体化したアルカリホスファターゼ（ＡＰＳＡ）およびｐ−ニトロ−フェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）との反応により検出した。結果は、図８に示される。
【００７０】
（実施例４：ＰＬＳＤは、匹敵するＥＬＩＳＡより高い結合定数を示す）
厚さ剪断モード（ＴＳＭ）水晶音波センサー（Ｉｖｎｉｔｓｋｉら（１９９９）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １４：５９９〜６２４に総説がある）を、β−ガラクシトダーゼの検出のためのＰＬＳＤのセンサー成分として選択した。ビオチン化ホスホリピドを含む単層を、ラングミュア・ブロジェット技法を用いて音波センサーの金表面上に移した。ビオチン化ファージを、分子自己アセンブリによるストレプトアビジン中間体を経由してホスホリピド層と結合し、ＰＬＳＤを創製した。実験は、ＴＭ−４００  Ｍａｘｔｅｋ厚さモニターを５ＭＨｚで０．０５Ｈｚの周波数解像度で用いて実施した。
【００７１】
ＥＬＩＳＡプレートおよびＰＬＳＤに固定化されたファージに対するβ−ガラクシトダーゼの用量依存性結合を比較する実験は、複合体の親和性が、ファージ固定化の様式および分析プラットホームのタイプ：ＥＬＩＳＡでは３０ｎＭ、およびＴＳＭ石英センサーでは０．６ｎＭに依存することを示した（図９Ａを参照のこと）。０．６ｎＭの解離定数は、ファージディスプレイライブラリーから単離された抗体について見出されたものと良好に匹敵した（Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０９〜１４）。親和性における差異は、結合曲線のＨｉｌｌ提示により示されるような、β−ガラクシトダーゼとのファージの一価（ＥＬＩＳＡ）対二価（ＰＬＳＤ）相互作用に起因し得る（図９Ｂ；Ｃｏｎｎｏｒｓ（１９８７）Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ：Ｔｈｅ  Ｍｅｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））。ファージの結合は極めて特異的であった。なぜなら、応答が、β−ガラクシトダーゼを２．２×１０１２ｖｉｒ／ｍｌの遊離ファージと予備インキュベートした場合、８５％減少したからである。ファージのβ−ガラクシトダーゼへの結合はまた、非常に選択的であった。なぜなら、β−ガラクシトダーゼとのインキュベーション溶液中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１０００倍過剰の存在がＥＬＩＳＡ中の信号を相当に変化させず、そしてＰＬＳＤ信号をわずか４０％低減したからである。
【００７２】
（実施例５：親和性選択ＰＬＳＤの迅速生産）
本発明のＰＬＳＤは、例えば、標的レセプターおよび生物学的脅威因子（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＰｅｔｒｅｎｋｏ（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖ．９７：３９１〜４１０を参照のこと）のような、標的リガンドを検出するために容易に産生され得る。特定の細菌種に特異的に結合するファージ（「種特異的」ファージ）は、ディスプレイされたペプチドのレパートリーをもつ、異なるファージディスプレイライブラリーから選択される（例えば、Ｐｅｔｒｅｎｋｏら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９：７９７〜８０１；Ｋｏｕｚｍｉｔｃｈｅｖａら（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８：１５０〜１６０を参照のこと）。初期の候補ファージプローブは、ＥＬＩＳＡにより得られ、かつスクリーニングされ、最高の親和性および選択性をもつ最良の候補を見出す。必要であれば、増加した親和性と選択性をもつクローンを、初期候補ファージ結合体の変異誘発によるか、または新たなランドスケープライブラリーとシャフリングすることによって調製された「二次」ファージライブラリーから選択する。シャフリングは、当該技術分野で周知の技法である。例えば、ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：２８４〜２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：２５９〜２６４を参照のこと。
【００７３】
病原性細菌の非毒性株を、ファージを選択することで用い得る。例えば、毒性の獣医学ワクチン株であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ｓｔｅｒｎｅは、栄養細胞でカプセル産生に必要な遺伝子を保持するプラスミドｐＸＯ２を含まないが、病原性Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ株で共通のすべての抗原性マーカーを有する。それは、マウスの特定の系統（例えば、Ａ／Ｊマウス）を殺し得るが、ヒトおよび大部分の他の哺乳動物には有害ではない。ファージプローブおよびセンサーは、病原性Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ  Ａｉｍ株に対し、適切な施設内（例えば、ＢＳＬ３）で試験され得る。
【００７４】
（親和性選択）
固定化ＢＡＳ（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子）を、約１０１１ビリオンを含むファージライブラリーの一部分とインキュベートする（各ファージクローンの約１００粒子が混合物中に存在する）。ライブラリーからの非結合ファージを洗い流し、そして結合ファージを温和な酸で溶出する。各ラウンドの選択は、ファージ集団中のＢＡＳ結合体の部分を１００〜１０００倍濃縮する。複数ラウンドの選択を、「入来」ファージの「結果」（すなわち、選択または溶出）ファージに対する比として算出されるファージ集団の濃縮をモニターしながら実施する。通常、親和性選択は、結合ファージの０．１〜１％の単離に至る。各ライブラリーからの選択されたファージ（総数約１０００）の９６のクローンを増殖させ、そしてＢＡＳへの結合をＥＬＩＳＡにより試験する。
【００７５】
（ＢＡＳ結合ファージのスクリーニング）
結合ファージクローンを、最初、ファージ捕獲ＥＬＩＳＡを用いて特徴付ける。ＢＡＳ（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子）を、マイクロタイター皿のウェル上に吸収する。ファージクローンを、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細菌Ｋ９１ＢＫ中で増殖させ、遠心分離による細胞の分離の後、上澄懸濁物として濃縮することなく固定化ＢＡＳをカバーするために用いる。プレートを洗浄した後、ビオチン化抗ファージＩｇＧをウェル中に充填する。最終的に、結合ファージを、洗浄ウェル中に、アルカリホスファターゼのストレプトアビジンとの結合体（ＡＰＳＡ）を、そしてインキュベーションおよび大規模洗浄の後、発色基質ＡＰ−ｏ−ニトロフェニルホスフェートを添加することにより同定する。プレートを、ＥＬＸ４０５洗浄機上で洗浄し、そして光学密度の増加の動力学を、ＥＬＩＳＡリーダーＥＬ８０８（ＢｉｏＴｅｋ）上で測定する。
【００７６】
ファージ捕獲ＥＬＩＳＡにより同定された候補ファージを、２０ｍｌの感染された細菌中で増殖させ、精製し、そして間接ＥＬＩＳＡにおいて可能なプローブとして試験する。この逆のフォーマットでは、捕獲ファージが、ウェルに固定化され、そしてマウス抗ＢＡＳ抗体が、結合種を検出するために用いられ得る。最終的に、結合種は、アルカリホスファターゼと結合体化したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で確認される。
【００７７】
ファージの選択性は、別の細菌種（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉなど）の非ビオチン化胞子あり、またはなしの直接ＥＬＩＳＡフォーマット中で、ビオチン化Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子をファージと反応することにより評価され得る。試験されたファージがＢＡＳに選択的でない場合、ＥＬＩＳＡ信号は、ビオチン化プローブと非ビオチン化プローブの競合に起因して低下する。ＥＬＩＳＡ信号が非ＢＡＳプローブの存在下で変化しない場合、ファージのＢＡＳとの相互作用は選択的であると考えられる。ファージ結合体は、４リットルスケールで増殖され、精製され、そしてバイオセンサーにおけるプローブとして用いられる。
【００７８】
当業者は、特定のファージによる標的結合の親和性および選択性が、変異誘発および改良された性質をもつファージのスクリーニングのような、当該技術分野で慣用的な技法により増大され得ることを認識する。改良された結合性質をもつファージを得る１つの方法は、選択された初期候補を新規ランドスケープライブラリーと混合し、そして細菌Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を同時感染し、初期リードペプチドとこの新規ライブラリーから得られたランダムペプチドの混合物でカバーしたファージのコレクションを得ることを含む。改良されたファージの選択のために、新規ライブラリーは、クロラムフェニコール耐性遺伝子を宿すファージを含む。組換えファージは、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールの両方の存在下で増殖する細胞から得られる。この「二次」ライブラリーは、潜在的により良好な結合性質をもつファージの豊富な供給源である。
【００７９】
別のアプローチでは、親和性選択されたファージは、Ｋｕｎｋｅｌ改変法（Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）；Ｗｅｉｓｓら（２０００）を参照のこと）を用いて広範に変異誘発され、これは、異種ペプチドのサブ部分上で実施され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、変異ＤＮＡの混合物で形質転換され、ペプチドの新規レパートリーをもつ新規「サブライブラリー」を得る。このサブライブラリーは、よりストリンジェントな条件下で、より良好な結合性質を有するファージの選択のために用いられる。本質的に、この「ファージ変異」プロセスは、数桁抗体の親和性を増大する効率的な抗体成熟の天然プロセスを模倣する。
【００８０】
ファージ結合体が、Ｂａｃｉｌｌｕｓの異なる種に共通である胞子リガンドに対して選択されることが起こり得る。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの種特異的リガンドに対し指向されるより選択的なファージプローブを単離するために、種々のアプローチが採用され得、これには、ライブラリー枯渇およびレセプターブロッキングのようなアプローチが含まれる。ライブラリー枯渇アプローチでは、ファージライブラリーは、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに結合するファージと交差反応し得るＢａｃｉｌｌｕｓ種の胞子に対してスクリーニングされ、そして異なるＢａｃｉｌｌｕｓ種と交差反応する「非選択的」ファージをライブラリーから分離する。交差反応性ファージの分離の後、ライブラリーの残りを、上記のように、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに結合するファージの選択に用いる。
【００８１】
レセプターブロッキングアプローチでは、親和性選択されたファージを再構築してそれらのテトラサイクリン耐性遺伝子を欠失する。ＴｅｔＲマーカーをなくしているこれらのファージは、それらのリガンドをブロックし、そしてライブラリーが標的リガンドに曝されるとき、リガンドをブロックするためにライブラリーと混合される。改変されたファージは、感染性であるが、テトラサイクリンを含む培地中ではＥ．ｃｏｌｉ細胞の生育を支持することができず、その一方、ライブラリーからのクローンは、テトラサイクリン含有培地中で生育を支持し得る。この戦略を用い、その胞子上の新たな代わりのレセプターを標的とするファージクローンが選択される。選択およびブロッキング工程の改変は、胞子上の異なるレセプターを認識するプローブを単離するために用いられ得る。
【００８２】
（実施例６：空気中の汚染物の検出）
ＰＬＳＤは、別のデバイスと構成されて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｈｔｈｒａｃｉｓ（「炭疽」）胞子の存在について、空気サンプルの連続的モニタリングを可能にする。ＰＬＳＤは、空気またはガスサンプルを評価するために用いられ得るが、検知システムを創製するためのＰＬＳＤのその他のデバイスとの組み合わせは、検出の感度を増大し得る。
【００８３】
ＳｐｉｎＣｏｎ（登録商標）空気−対−液体濃縮機（Ｓｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ；Ｃａｇｅら（１９９６）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ、Ａｓｔｈｍａ、＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７７：４０１〜４０６もまた参照のこと）は、空気から粒子物質を分離し、そして液体ストリーム中にこの粒子物質を捕獲する。このＳｐｉｎＣｏｎ（登録商標）の出力ストリームは、代表的には、ＰＣＲおよび細胞培養のようなアッセイで分析されるが、検知システムを創製するために、このＳｐｉｎＣｏｎ（登録商標）デバイスを、ＳｐｉｎＣｏｎ（登録商標）からの流体が、ＰＬＳＤの表面を横切り、そして炭疽胞子の存在について連続的にモニターするようにする。本発明のＰＬＳＤとのＳｐｉｎＣｏｎ（登録商標）のこの構成は、空気サンプルの連続的なリアルタイムモニタリングを提供する。
【００８４】
このＰＬＳＤは、炭疽胞子に結合する能力についてファージライブラリーから選択されるファージの結合エレメントを含む。これらのファージは、本明細書の他の場所に記載のような変異誘発および親和性成熟でＰＬＳＤにおける使用のために改良されている。酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）中で炭疽胞子に最良の結合を示すファージは、操作されてそれらのＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ結合ドメインをなくし、そして次にＰＬＳＤを創製するために用いられる。ファージは、小型化プラスモン表面共振または音波共振器のいずれかの表面上に固定化する。炭疽胞子の検出の特異性および選択性を、非関連胞子、タンパク質およびその他のバイオポリマーと混合した炭疽胞子を用いて評価する。
【００８５】
（実施例７：特製ＰＬＳＤの生産）
ラングミュア・ブロジェット（ＬＢ）技法を、音波センサーへのファージの固定化の方法として用いる。ＬＢ膜は、膜厚さ、および、堆積されて、分子の感度および特異的認識性質を保存する分子アーキテクチャーの正確な制御を提供する（Ｐａｔｈｉｒａｎａら（２０００）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １５：１３５〜４１；参考としてその全体が本明細書中に援用される、１９９９年１２月２日に出願された、同時係属中の米国出願第０９／４５２，９６８号もまた参照のこと）。
【００８６】
候補ファージは、改造または操作されてＥ．ｃｏｌｉ結合部位を取り除き、そしてインビボビオチン化部位（Ｂｅｃｋｅｔｔら、１９９９）を導入する。ファージを、インビボおよび／またはインビトロでビオチン化し、そしてビオチン／ストレプトアビジン結合を用いてセンサーに固定化される。インビボでビオチン化されるファージは、それらの先端がビオチン化され、その一方、インビロトでビオチン化されるファージは、粒子の本体に沿ってランダムに分布した多くのビオチン残基を有する。あるいは、ファージは、センサーの金表面上に直接堆積される。ビオチチン化、およびセンサー上のファージの密度を制御する特定の方法を選択することにより、目的のアッセイに最適な性質を有するファージアレイがアセンブルされ得る。非常に密な直線状のファージアレイ（「ベルベット型」アレイ）を含む結合エレメントは、一価結合挙動を示す傾向にあり、その一方、より密でない、非直線状のファージアレイ（「フェルト型」アレイ）は、多価結合挙動を示す傾向にある。
【００８７】
ファージｆｄｔｅｔの非感染性変異体ｆＫＮ１６は、Ｅ．ｃｏｌｉ培養から高収率のファージ粒子を提供することが示されている（Ｎｅｌｓｏｎら（１９８１）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０８：３３８〜５０）。このｆｎＫＮ１６変異は、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩ中のドメインＤ１−Ｄ２の欠失である。ファージｆＫＮ１６からの野生型または非改変ドメインＤ３をコードするＤＮＡフラグメントを、利用可能な制限部位および従来のクローニング技法を用いて選択されたファージのＤＮＡ中にトランスファーする。ペプチドビオチン化基質（Ｂｅｃｋｅｔｔら（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８：９２１〜９２９）を、次いで、部位特異的変異誘発を用いて改変ｐＩＩＩ遺伝子中に導入する。
【００８８】
ファージを、当該分野で公知の技法を用いてバイオセンサーの金表面上に固定化する。１つのアプローチでは、センサーを、ビオチン化ＬＢ膜、ストレプトアビジン、およびビオチン化ファージで連続的にカバーし、ファージに、変動する三次元コンフォメーションを採用させ、それ故、純粋な「フェルト型」から純粋な「ベルベット型」までの範囲のアレイを形成する。ビオチン化ファージはまた、ノイトラビジンでコートされた金センサー表面上に固定化され得る。ファージのコンフォメーションは、走査顕微鏡および原子間力顕微鏡で確認され得る（１９９９年１２月２日に出願された同時係属中の米国出願第０９／４５２，９６８号をまた参照のこと）。
【００８９】
音波デバイス（ＡＷＤ）測定を、ＰＭ−７４０  Ｍａｘｔｅｋプレーティングモニターを用い、５ＭＨｚで０．０５Ｈｚの周波数解像度で実施する。石英水晶センサーの共振周波数に直接関連する電圧出力で記録し、そしてオフラインで分析する。石英水晶センサーの共振周波数における変化は、分析物のセンサー表面への結合を示す。例えば、小フローセルを備えた小型の完全一体型ＳＰＲデバイスである、ＳｐｒｅｅｔａＴＭセンサー（Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）のような任意の適切なセンサーを、表面プラスモン共振（ＳＰＲ）測定のために用い得る。リガンドの検出の特異性および選択性が調査される；例えば、ＢＡＳの結合が、非関連タンパク質と混合されたＢａｃｉｌｌｕｓの種々の種を用いて調査される。胞子結合データは、Ｈｉｌｌプロット分析で分析され得る（例えば、Ｃｏｎｎｏｒｓ（１９８７）Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ：Ｔｈｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。
【００９０】
（実施例８：リガンドの同定）
特定のファージに結合するリガンドは、ＬｎＣＡＰ癌細胞上のファージ結合レセプターの同定について最近開発されたアプローチを用いて同定された（Ｒｏｍａｎｏｖら（２００１）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４７：２３９〜２５１）。前立腺癌細胞に結合する親和性選択されたファージを、架橋剤で処理し、ファージを、低速遠心分離によりペレットされた水溶性樹脂に変換した（Ｓｍｉｔｈら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１５：１５１〜１６１）。リガンドを含むことが既知であるサンプルを、ＮＨＳ非浸透ビオチン化試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で処理し、サンプル中のタンパク質を標識した。架橋されたファージを、ビオチン化サンプルとインキュベートし、そして次に結合した標識タンパク質とともに沈殿させた。タンパク質を温和な酸で溶出し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼで標識し、そしてＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で検出した。このプロトコールを用い、前立腺癌細胞からの３９キロダルトンタンパク質を、前立腺癌細胞結合ファージに結合するとして同定し、そして配列決定されている。このファージ結合リガンドの同定は、バイオセンサー検出の合理化のために重要であり、そしてまた保護的ワクチンまたは薬物を開発することで使用を見出す。
【００９１】
本明細書中で述べられたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当業者のレベルの指標である。すべての刊行物および特許出願は、本明細書中に、各刊行物または特許出願が詳細かつ個々に示されて参考として援用されるのと同じ程度まで、参考として援用される。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態を例示かつ記載してきたが、種々の変更が、本発明の思想および範囲から逸脱することなくその中でなされ得ることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、ランドスケープファージの分子モデルを示し、ここで、異種オクタマーペプチド（黒）は、野生型ファージアミノ酸（灰）のバックグラウンドに対してディスプレイされている。
【図２】図２は、ファージリガンドセンサーデバイス（ＰＬＳＤ）の実施形態の概略図を示す。ファージ結合エレメントは、ストレプトアビジンを含む結合組成物層を経由してセンサーに結合される。示されるこの実施形態では、ビオチン化脂質を含むラングミュア・ブロジェット膜が、センサー上に堆積されている。さらに、ランドスケープファージがビオチン化されている。ストレプトアビジンの添加は、分子の自己アセンブリを生じ、それによってこのランドスケープファージがセンサーに結合される。
【図３】図３は、ＰＬＳＤセンサーから得られる代表的な応答曲線を示す。この特定の例では、ＰＬＳＤの結合エレメントは、β−ガラクトシダーゼへの結合によって親和性で選択されたファージから構成される（実施例１を参照のこと）。このＰＬＳＤを、次いで、ＰＢＳ中の異なる濃度のβ−ガラクトシダーゼに曝した。β−ガラクトシダーゼを含まないＰＢＳを対照として用いた。ボルトで測定されたセンサーの応答が時間の関数として示されている。各ラインは、溶液にセンサーを曝す間に、１秒に１回とられたデータ点を示す。応答（ボルト）は、水平軸上の時間（秒）の関数として左の垂直軸上に示される；右の数値は、各ラインに対応するβ−ガラクトシダーゼ濃度（ナノモル濃度）を示す。
【図４】図４は、β−ガラクトシダーゼの相対濃度（ナノモル濃度）の関数として、実施例１のＰＬＳＤからの定常状態出力センサー電圧の用量応答プロットを示す。黒四角は、定常状態出力センサー電圧の平均値を示す；棒は、標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表す。実験値は、（図３に例示されるような）応答曲線の定常状態レベルの各々の約２００のデータ点を平均することにより得、そしてβ−ガラクトシダーゼなしのＰＢＳに対する電圧応答の平均値に対して補正した。平滑なカーブは、実験データに対してシグモイド状で適合した（χ２＝０．１９９、Ｒ２＝０．９９）。
【図５】図５は、ヒル（Ｈｉｌｌ）プロットを示す（実施例１を参照のこと）。センサー表面上の占領されたβ−ガラクトシダーゼ分子と遊離のβ−ガラクトシダーゼ分子との比が、β−ガラクトシダーゼ濃度（ナノモル濃度）の関数として示される。黒四角は、実験データを示し、そして直線は、等式［１］の最小二乗適合を示す。ヒル係数は２．１であり、そしてＫＤは１．７ナノモル濃度であった。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡ結果を示し、ここでは、３つのモデルリガンド（アルカリホスファターゼ標識ノイトラビジンおよびストレプトアビジン、ならびに非標識β−ガラクトシダーゼ）を、固定化されたペプチドを担持するファージと直接反応させた；データは、各抗原のその選択されたペプチド（実施例３を参照のこと）への特異的用量依存性結合を示す。各結合曲線は、試験されているファージにより担持された異種ペプチドの改変されたアミノ酸配列で標識されている（Ｖ０＝ベクターコントロール）。ＥＬＩＳＡ信号（ｍＯＤ／分）は、リガンド濃度（上の２つのパネルについてマイクログラム／ｍｌ；下のパネルについてナノモル濃度）の関数として示される。上のパネルは、リガンドノイトラビジンで単離されたファージの結果を示し；真中のパネルは、リガンドストレプトアビジンで単離されたファージの結果を示し；そして下のパネルは、リガンドβ−ガラクトシダーゼで単離されたファージの結果を示す。
【図７】図７は、選択されたファージクローンの１つ（実施例３を参照のこと）を用いた胞子の検出の直接ＥＬＩＳＡ結果を示す。ＥＬＩＳＡ信号（ｍＯＤ／分）は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子濃度（粒子／ｍｌ）の関数として示される。選択されたファージクローン（黒菱形）およびコントロールベクターファージｆ８−５（白三角）の結合プロフィールの差異は、相互作用の高い特異性を示す。
【図８】図８は、選択されたファージ（実施例３を参照のこと）を評価するための異なるＥＬＩＳＡフォーマットの結果を示す。ＥＬＩＳＡ信号（ｍＯＤ／分）は、ビオチン化胞子濃度（粒子／ｍｌ）の関数として示される。図７に示される実験について観察されるように、選択されたファージクローン（黒菱形）およびコントロールベクターファージｆ８−５（白三角）の結合プロフィールの差異は、相互作用の高い特異性を示す。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡプレートに固定化され、そしてＴＳＭ水晶センサーとのＰＬＳＤの結合エレメントとしてのファージへのβ−ガラクトシダーゼの用量依存性結合を比較する実験の結果を示す。図９Ａでは、相対ＥＬＩＳＡ信号は、β−ガラクトシダーゼ濃度（ナノモル濃度）の関数として示される。結果は、ファージ−リガンド複合体の親和性が、ファージ固定化の様式および分析プラットホームのタイプに依存することを示した：ＥＬＩＳＡについて３０ｎＭ（丸）およびＰＬＳＤについて０．６ｎＭ（四角）。図９Ｂは、結合曲線のヒル表現を示す（Ｙ／１−Ｙは、β−ガラクトシダーゼ濃度（ナノモル濃度）の関数として示される）。ファージバイオセンサーへのリガンドの観察された結合価（四角）は２．１４であり、その一方、ＥＬＩＳＡフォーマットについて（丸）観察された結合価は１．０２であった。親和性における差異（図９Ａ）は、β−ガラクトシダーゼリガンドとのファージの一価相互作用（ＥＬＩＳＡ）  対  二価相互作用（ＰＬＳＤ）に起因し得る。
【図１０】図１０は、結合エレメントとしてのβ−ガラクトシダーゼおよびＳＰＲセンサーに対する選択されたファージを用いてアセンブルされたＰＬＳＤからの出力を示す（実施例１を参照のこと）。このＰＬＳＤは、β−ガラクトシダーゼへの強力な結合を示した。屈折率が、時間（秒）の関数としてグラフにされている。矢印は、β−ガラクトシダーゼにセンサーを曝したことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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2005535870.tif 000014
【図１０】
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【国際調査報告】
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