(57)【要約】本発明は、in vitro で培養してもよい新規ケラチノサイト、及び急性及び慢性の創傷治療に使用してもよいプロダクトの製造のためのそれらの好都合な使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化されておらず、かつ、in vitro 細胞培養法により少なくとも150回倍加されていてもよいことを特徴とする、ケラチノサイト。
【請求項２】
包皮の上皮部分から単離された、請求項１に記載のケラチノサイト。
【請求項３】
培養物KC-BI-1(DSM ACC 2514)由来の細胞であるか又はそれら由来のケラチノサイトである、請求項１に記載のケラチノサイト。
【請求項４】
ケラチノサイトが、
a. ウシ胎児血清の不在下において及び／又は
b. 支持細胞の不在下及び／又は
c. 上皮細胞成長因子（EGF）の不在下において
複製され得ない、請求項１〜３のいずれか1項に記載のケラチノサイト。
【請求項５】
ケラチノサイトが、好ましくは不死化されたケラチノサイト、好ましくは細胞株HaCaTと比較して、少しも又は全くテロメラーゼ活性をもっていない、請求項１〜４のいずれか1項に記載のケラチノサイト。
【請求項６】
ケラチノサイトが、少なくとも200回、in vitro 細胞培養方法により複製され得る、請求項１〜５のいずれか1項に記載のケラチノサイト。
【請求項７】
ケラチノサイトが、少なくとも250回、in vitro 細胞培養方法により複製され得る、請求項１〜６のいずれか1項に記載のケラチノサイト。
【請求項８】
ケラチノサイトが、少なくとも300回、in vitro 細胞培養方法により複製され得る、請求項１〜７のいずれか1項に記載のケラチノサイト。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のケラチノサイトでコートされているキャリアからなるプロダクトであって、
a.  キャリアが、ケラチノサイトで部分的にコロニー形成されている；又は
b.  キャリアが、ケラチノサイトで完全にコロニー形成されている、
上記プロダクト。
【請求項１０】
キャリアが、医薬組成物を製造するために使用されてもよい生体適合性キャリア材料である、請求項９に記載のプロダクト。
【請求項１１】
キャリア材料が、疎水性又は親水性の生物分解性の膜である、請求項１０に記載のプロダクト。
【請求項１２】
キャリアが、エステル化されたヒアルロン酸のポリマー、好ましくは所定のジオメトリーの穿孔処理されたポリマーフィルムであり、
a. ここで、ポリマーフィルムは、厚さ10〜500μmであり、10〜1000μmの寸法の穴で穿孔処理され、その穴は所定の一定のサイズであり、かつ規則正しい列を形成し、それらは50〜1000μmの一定のスペースにより互いに離されている、
請求項１０又は１１に記載のプロダクト。
【請求項１３】
キャリア材料が、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、ポリデプシペプチド、ポリエーテルエステル、ポリアミノ酸又はポリホスファゼンであり、
a. 具体的には、ポリ（L-ラクチド）、ポリ（D,L-ラクチド）、ポリ（L-ラクチド-コ-D,L-ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（L-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド-コ-トリメチレン-カーボネート）又はポリ（ジオキサノン）であり、
b. ここで上記ポリマーは、穿孔処理されているか又は
c. 穿孔処理されていないものである、
請求項１０又は１１に記載のプロダクト。
【請求項１４】
ケラチノサイト又はプロダクトが、温度-20℃〜-190℃、好ましくは-60〜-80℃で凍結保存される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のケラチノサイト又は請求項９〜１３のいずれか１項に記載のプロダクトの凍結保存プロセス。
【請求項１５】
請求項１４に記載のプロセスにより処理されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のケラチノサイト又は請求項９〜１３のいずれか１項に記載のケラチノサイト及びキャリアを含むプロダクト。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項１〜８及び１５のいずれか１項に記載のケラチノサイト又は請求項１０〜１３及び１５のいずれか１項に記載のプロダクト。
【請求項１７】
創傷を治療するための、請求項１〜８及び１５のいずれか１項に記載のケラチノサイト又は請求項１０〜１３及び１５のいずれか１項に記載のプロダクトの使用。
【請求項１８】
創傷が、好ましくは火傷及び／又は潰瘍である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
創傷が、好ましくは第２度の火傷である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
創傷が、好ましくは、慢性の、治癒し難い下肢の潰瘍のタイプUlcus cruris、好ましくは、Ulcus cruris venosumである、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
創傷が、好ましくは、糖尿病により生じる潰瘍である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２２】
創傷が、好ましくは、褥瘡性潰瘍である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２３】
補足として又は創傷治癒に有益な効果を有する一つ以上の他の物質の使用との関連における、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
他の物質が、親水コロイド包帯剤である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
他の物質が、抗菌物質、例えば
(a) 抗生物質
である、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、in vitro おいて培養してもよい新規ケラチノサイト及び急性及び慢性の創傷治療に使用可能なプロダクトを製造するためのそれらの有益な使用に関する。従って、本発明は、医薬分野、具体的には組織工学による創傷治癒分野に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
同種ケラチノサイトは、創傷、具体的には潰瘍及び／又は火傷の治療に、かなり長い期間にわたり首尾よく使用されてきた(Maier、1993年；Schonfeldら、1993年)。長期間、従来法による治療に抵抗性を示す創傷は、多くの場合、同種ケラチノサイトを使用してうまく治療され得る（Phillips and Gilchrest、1993年； Beeleら、1991年；Leighら、1991年；Lindgrenら、1998年）。まず初めに、同種ケラチノサイトを使用した場合、注目は主に、皮膚置換術、即ち移植表皮の再生に向けられた。しかし、すぐに、治療の成功は身体の自己再上皮化の刺激に主に基づくものであって、創傷における同種細胞移植の「成長」に基づくものではないことが明らかとなった。最近、多くの研究により、移植ケラチノサイトが、創傷において一定の期間のみ残り、その後、臨床的に不可視な方法で身体から除かれることが明らかとなった（Kawaiら、1993年）。従って、身体の自己創傷治癒の刺激は、時空に、同種ケラチノサイトにより、多数の異なる成長因子、サイトカイン、細胞外マトリックス（ECM）、小分子及びプロテアーゼが最適に放出されることにより、主に誘発される（Langら、1996年；Marcussonら、1992年）。放出された因子の複雑性及び数は、治療上の利点が、従来の単独治療、例えば単離成長因子によるものを超えることが確認されている。しかし、再上皮化の主な効果以外に、ケラチノサイトでの治療は、肉芽組織において巨視的及び微視的に検出可能な変化を生み出してもいる（Langら、1996年）。患者に有益な、しばしば記載される他のケラチノサイトの効果は、移植後の顕著な鎮痛作用である（Schonfeldら、1993年）。
【０００３】
創傷治癒のため、未分化な、活発に分化するケラチノサイトを使用することは好都合であり、それは、活発に分化するケラチノサイトが、創傷治癒を促進する複合分泌プロフィールを持つと思われるためである。幹細胞を除いて、未分化ケラチノサイトは、わずか２、３の細胞分化のプロセスの後、in vivoの自然な分化コースにおいて、それらの増殖力を失い、そのプロセスはケラチノサイトのin vitro 培養において、これまで常に観察されてきた（Barrandon and Green、1987年）。従って、創傷治癒に特に好適な、活発に分化するケラチノサイトは、in vitro において、これまで培養されてきただけであり、それは医療目的でのそれらの使用を困難かつ高価にしている。
【０００４】
同種ケラチノサイトは、多層の酵素的脱離細胞凝集体からなる、いわゆる「ケラチノサイトシート」の形態において直接的に、又は、「生物学的活性創傷治癒包帯剤(biologically active wound healing dressing)」というタイトルの下、生体適合性キャリアと一緒に、治療上使用されている。後者は、それらが使用される前に、培養皿の基質からそれらを離す酵素的前処理を必要としないという利点を有する。さらに、ケラチノサイトを培養するためのキャリアとして生体適合性膜を使用すること（EP 0 462 462、US 5,658,331；US 5,693,332； EP 0518 920）は、細胞が自納の(self-contained)細胞凝集体をもはや形成しなくてもよいので、生物学的活性創傷包帯剤を早く製造することを可能にする。既にスブコンフルエントに成長したキャリアを、創傷治療に使用してもよい。すぐに入手可能であること以外に、サブコンフルエント細胞凝集体を使用することは、対応する培養ケラチノサイトがシャープさが低く分化されているという追加的な利点を持ち、従って、創傷治療に好都合である。
ケラチノサイトを、有害な影響なしに、温度-30〜-196℃で、しかし、好ましくは-70〜-90℃で、直接的又は生体適合性キャリア材料と共に、創傷治癒用に凍結保存してもよい（De Lucaら、1992年; Teepeら、1993年）。さらに、このことは、生物学的活性創傷治癒包帯剤の供給をある程度まで維持できるので、それらの治療上の有用性を向上させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術から公知のケラチノサイト及びそれらから製造される生物学的活性創傷治癒包帯剤は、本発明が克服しようとするある種の欠点を有する。従来公知の第一の起源のケラチノサイトにおいて、明らかな不都合は、それらの細胞が、高率の分裂及びそれ故に生物学的活性創傷包帯剤の製造にそれらの安定性を失うことなしに、in vitro 細胞培養プロセスにより2、3の世代の細胞にそれら自体を複製することしか出来ないことである。従来技術によると、当業者は、in vitro 培養により、約103〜104の細胞数を増加することしかできない（Tanczosら、1999年）。
【０００６】
これに由来する他の不都合は、in vitro での上記ケラチノサイトの限られた培養能力により、再単離が頻繁に行われ、また複雑雑化されることが必須という事実である；同様に、このことは、得られる複製細胞材料が均一ではなく、故に、それから製造される創傷治癒包帯剤は、おそらく質的に異なっているか又は少なくともそうであるかも知れないということを意味する。
さらなる不都合は、様々なドナー由来のケラチノサイトの再単離が、創傷治癒凝集体のレシピエントへの感染のリスクの増加を構築することである。例えば、HIV又は肝炎のリスクの増加が生じるかもしれない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、増殖力の高いケラチノサイトに関し、それらは、不死化されておらず(not immortalise)、in vitro 細胞培養法により少なくとも150回(times)複製され得るものである。これは、約1044倍の細胞増殖を生じる。対応するケラチノサイトは、創傷治療に好都合な特性をさらに保持する。
本発明によるケラチノサイトは、主に、ドナーから単離され、in vitro において培養可能なケラチノサイトであり、一方、単離及び初期の培養は、例えば、Rheinwald and Green により1975年に記載された方法により、当業者により行われてもよい。
【０００８】
好ましくは、本発明は、包皮(foreskin)の上皮性部分より単離したケラチノサイトに関する。ヒト由来のケラチノサイト、具体的には培養物KC-BI-1のケラチノサイトであって、DSMZ-Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures] GmbH、 Braunschweig、 Germany under Accession Number DSM ACC2514 において2001年6月27日に、ブダぺスト条約による特許手続き（patent proceeding）のために寄託されたものが好ましい。また、本発明は、培養物KC-BI-1(DSM ACC2514)由来のケラチノサイトを包含する。従って、本発明は、最初の培養物KC-BI-1を継代培養(subpassaging)及び／又はスブクローニングすることにより生じる、すべての細胞及び培養物であるか及び／又はそうであってもよい。
【０００９】
本発明のケラチノサイトの培養を、ケラチノサイトKC-BI-1に関する例により記載する（実施例１）。実施例１に明記する複合培地の使用及び支持細胞の使用、好ましくは致死的に照射されたマウス3T3線維芽細胞の使用は、培養に好都合である。ウシ胎児血清の量は、2〜10％であるべきである。支持細胞の調製は、当業者に公知であり、例えば実施例２に記載したプロセスにより行ってもよい。最大コンフルエンス80％での本発明によるケラチノサイトの継代培養が、特に好都合である。ケラチノサイトを、35〜38℃、好ましくは37℃で、相対湿度＞90％、好ましくは95％で、CO2飽和度5〜9％で、培養してもよい。
実施例１に記載したプロセスで、ケラチノサイト、具体的には包皮の上皮部分由来のヒトケラチノサイトに関する集団倍加時間は、１〜２日である（図１）。細胞は、実質的に一定の複製速度での多数の継代に渡り培養され得る（図２）。しかし、本発明は、単にKC-BI-1に制限されるものではなく、むしろ当業者は、請求項１〜８のいずれかに記載のケラチノサイトを用いて、好適な条件下、本発明を行うことが可能である。
【００１０】
本発明に関して「不死化されていない」という表現は、第一に単離されたケラチノサイト及びここで培養されたケラチノサイトが、自然発症的に形質転換されていないこと及び／又は、研究から公知の分子生物学的、化学的又は物理的方法により形質転換されていないことを意味する。後者は、細胞が、例えばウイルス性因子又は配列、化学的変異原性物質を使用するか又は、例えば、照射又は異なるプロセスの組み合わせのいずれかにより処理されていないことを意味する。
また、「不死化されていない」ケラチノサイトとは、形質転換された腫瘍細胞株（Harle-Bachor and Boukamp、1993年）と比較して、又は不死化細胞株、好ましくはHeLa細胞株と比較して、該ケラチノサイトが、テロメラーゼ活性を持たないか又は実質的に弱められたテロメラーゼ活性を持つものを意味する（図３参照）。特に、これは、不死化ケラチノサイト細胞株HaCatと比較した場合にあてはまる。
【００１１】
また、「不死化されていない」という表現は、ケラチノサイトが、例えばウシ胎児血清なしに及び／又は支持細胞なしに及び／又は上皮性成長因子、EGFなしには、不死化されたケラチノサイトができるようには、複製され得ないことを意味する。
しかし、また、「不死化されていない」という表現は、細胞複製が増加する場合、該ケラチノサイトが、それらの特徴的表現型を変えないことを意味する（図４参照）。
また、「不死化されていない」とは、ヌードマウス、好ましくはBALB/cへの移植後、該ケラチノサイトが、通常の分化プロフィール(profile)を示すことを意味する。ここで「通常の分化ポテンシャル(potential)」とは、最終的に分化されるケラチノサイトへの発展、及び自己ケラチノサイトと同様の方法において角質層同様、上部基底表皮層（suprabasal epidermal layers）を形成する能力を意味する。
【００１２】
また、本発明は、不死化されておらず、かつin vitro 細胞培養法により少なくとも200回(times)複製され得るケラチノサイトに関する。さらに、本発明は、不死化されておらず、in vitro 細胞培養法により少なくとも250回複製され得るケラチノサイトに関する。また、本発明は、不死化されておらず、かつin vitro 細胞培養法により少なくとも300回複製され得るケラチノサイトに関する。
本発明は、該ケラチノサイトが、たった一人のドナー又はわずか数人のドナーから複製されることを好都合にも可能にする。一つの提供(donation)から出発して、例えば1044細胞が150細胞複製後に製造され、250細胞複製後に1077細胞が、また300細胞複製後に1090細胞が製造されてもよい。従って、本発明は、一定の立証可能な品質の生物学的活性創傷治癒凝集体の調製のために、標準化された多量の細胞材料を製造することを最初に可能にする。対応する量の標準化された細胞材料を、例えば、凍結保存された細胞バンクから出発して複製してもよく、それは、本発明の特性を有するケラチノサイトから次々に製造されたものである。
【００１３】
生物学的活性創傷治癒包帯剤を製造するための出発物質として、標準化された細胞材料を使用することにより、ケラチノサイトの単離が数ドナー、好ましくは１ドナーに制限される場合、可能なレシピエントに対する感染のリスクも減少する。
従って、本発明は、現在、これまで公知の単に制限されたケラチノサイトの継代からなる、深刻な不都合を克服する。
さらに、本発明は、本発明によるケラチノサイトでコートしたキャリアからなるプロダクトに関する。本発明の目的において「コートした」とは、キャリアの表面が、本発明のケラチノサイトで部分的又は全体的にコロニー形成されていることを意味する。部分的にコロニー形成されたキャリアは、キャリアが創傷治療に使用され得る前に、短い培養時間が必要とされる場合に、特に好適である。
【００１４】
本発明の目的のための好適なキャリアは、それが医薬組成物を製造するために使用されてもよい生体適合性キャリア材料であることを特徴とする。例えば、WO91/13638 に記載された疎水性の生体適合性キャリア材料を使用してもよい。しかし、主に親水性のキャリア材料を使用することも可能である。
本発明の好ましい態様は、エステル化されたヒアルロン酸のポリマーからなるキャリア材料を使用することを含む。特に好ましい態様において、エステル化されたヒアルロン酸のポリマーが使用され、それは所定のジオメトリーの穿孔処理されたポリマーフィルムからなる。ポリマーフィルムは、厚さ10〜500μmであり、例えば10〜1000μm の寸法の穴で穿孔処理され、その穴は所定の一定のサイズであり、かつ規則正しい列を形成し、それらは50〜1000μm の一定のスペースにより互いに離されている。この種のフィルムは、EP 0 462 426 に記載されている。穿孔処理されたキャリア材料は、特に好適であり、それは、それらが生物学的活性創傷包帯剤が創傷上に特定の方向に置かれることを必要としないからである。実施例３は、一例として、本発明のケラチノサイトによりコロニー形成された、所定のジオメトリーのエステル化ヒアルロン酸の穿孔処理されたキャリアマトリックスを調製する方法を記載している。そのキャリアマトリックスは、Messrs Fidia Advanced Biopolymers Ltd.、アーバノ温泉、イタリアにより製造される製品であり、それは製品名「レーザースキン(Laserskin)」としてドイツにおいて市販されている。
【００１５】
ケラチノサイトと関連して、生物学的活性創傷包帯剤を製造するためのこのキャリア材料の特に好ましい適性は、動物モデル(Lamら、1999年)及びヒト（Harrisら、1999年）において既に示されている。上皮細胞の改善された移動及び分化以外は、ヒアルロン酸エステルからなるマトリックスは、血管形成及びコラーゲン産生にプラスの効果を有する。しかし、マトリックスとしてヒアルロン酸エステルを現在使用する創傷包帯剤は、ケラチノサイト及び線維芽細胞から得られる複雑な構造の自己ケラチノサイト及び／又は皮膚相当物でコートされる。したがって、それらは、上記従来技術の不都合を受ける。これらの不都合は、本発明の好都合な同種ケラチノサイトの使用により特に克服されるかも知れない。
【００１６】
本発明の他の好ましい態様は、本発明によるケラチノサイトを、再吸収可能なポリマーと一緒に含むプロダクトに関し、それらは、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアンハイドライド、ポリオルトエステル、ポリデプシペプチド、ポリエーテルエステル、ポリアミノ酸又はポリホスファゼン、特にポリ（L-ラクチド）、ポリ（D,L-ラクチド）、ポリ（L-ラクチド-コ-D,L-ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（L-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド-コ-トリメチレン-カーボネート）又はポリ（ジオキサノン）からなる。これらのポリマーは、穿孔処理されているもの及び穿孔処理されていないものの両方である。
また、本発明は、本発明によるケラチノサイトを、-20℃〜-196℃、好ましくは-180℃より低い温度で凍結保存する方法に関する。そのケラチノサイトは、当業者に公知の標準的な方法により凍結できる。特に、DMSOを凍結保護物質として使用してもよい。また、他の凍結保護物質、例えば、グリセロール、ヒドロキシエチルスターチ又はその二つの組み合わせ、及びこれらとDMSOの組み合わせを使用することも可能である。好適な方法は、WO 96/24018、US 5,891,617 又はUS 5,298,417 に、例として記載されている。
【００１７】
また、本発明は、本発明によるケラチノサイトでコートされたキャリアの凍結保存に関し、それは、それらの対応するキャリアを有するケラチノサイトが、-20℃〜-196℃、好ましくは-60℃〜-80℃で凍結保存されることを特徴とする。凍結保存の利点は、多量に得られるプロダクトが貯蔵可能であり、従って臨床使用の前のランダムサンプリングにより品質の均一性を試験できることである。最終的に、貯蔵は、創傷治癒凝集体を医療目的に短時日の予告で入手可能なことを確実にする。
本発明によるプロダクトに好適な凍結保護物質は、ヒドロキシエチルスターチであり、例えば、濃度7〜13％（w/w）である。しかし、DMSO又はグリセロール、及び様々な凍結保護物質、具体的にはヒドロキシエチルスターチ、DMSO及び／又はグリセロールの組み合わせを使用することも可能である。また、凍結保護物質としてトレハロースを使用することも可能である。
【００１８】
37℃から-5〜-10℃へ、好ましくは-6〜-8℃へ、2〜5分以内に、温度を急速に低下させた後、キャリア及び本発明によるケラチノサイトを含むプロダクトは、好適な温度において、15〜30分、好ましくは23〜26分平衡にされる。その後、プロダクトを冷凍速度＜1℃/分、好ましくは0.2〜0.6℃/分、最も好ましくは0.4℃/分で、例えば-60〜-80℃に冷却される。
一例として、実施例４に、KC-BI-1でコートされたヒアルロン酸エステルのキャリアマトリックスの冷凍保存について記載している。しかし、他の凍結保存方法、例えばWO 95/707611、WO 96/24018、EP 0 296 475 に記載された方法も使用可能である;このリストは網羅的とみなされるべきではなく、生体適合性キャリア及びケラチノサイトからなるプロダクトを凍結保存する方法が、当技術分野の現在の状態の一部であることを単に示している。
【００１９】
また、本発明は、ここに記載された本発明によるケラチノサイト及び／又は上記ケラチノサイト及びここに記載されたキャリアのプロダクトの医薬使用、具体的には創傷を治療するためのそれらの使用に関する。本発明の一つの態様は、本発明によるケラチノサイト及び／又は該ケラチノサイト及びキャリアのプロダクトを、火傷及び／又は潰瘍の治療に使用することからなる。治療してもよい火傷は、好ましくは第２度の火傷であり、一方、潰瘍は、好ましくは、治癒し難い下肢の慢性潰瘍のタイプUlcus cruris、好ましくは、Ulcus cruris venosum 又は、糖尿病性潰瘍及び褥瘡性潰瘍である。
医薬用途としては、該ケラチノサイト及び／又は本発明のケラチノサイト及びキャリアからなるプロダクトを、創傷治癒に有益な効果を有する当技術分野に公知の従来の治療法と組み合わせて及び／又は補足的に使用することが挙げられる。このことは、創傷治癒に有益な効果を有する、一つ以上の物質を組み合わせ及び／又は補足的に使用することを意味する。Ulcus cruris venosum の親水コロイド包帯剤での補足的及び／又は組み合わせ治療及び／又は抗菌物質の追加的使用、例えば抗生物質の投与について言及されてもよい。
【００２０】
また、本発明は、本発明によるケラチノサイト及び／又は生体適合性キャリア及び該ケラチノサイトのプロダクトに関し、それらは、創傷を治療するため、具体的には火傷及び／又は潰瘍を治療するため、例えば、第２度の火傷、Ulcus cruris (venosum)、糖尿病性潰瘍又は褥瘡の治療のための医薬用プロダクトを製造するためのものである。
さらに、本発明は、これらの創傷の治療プロセスに関し、ここでこのプロセスは、本発明によるケラチノサイト及び／又はケラチノサイト及びキャリアを含む本発明のプロダクトが、治療されるべき創傷に置かれることを特徴とする。ケラチノサイト及びプロダクトは、新鮮又は凍結保存後のいずれかにおいて使用してもよい。創傷を治療する対応する方法は、実施例５に記載した。
【実施例１】
【００２１】
例として培養物KC-BI-1(DSM ACC2514)を採用する、本発明のケラチノサイトの培養プロセス
１．材料
ケラチノサイトKC-BI-1；照射した３Ｔ３−マウス線維芽細胞（支持細胞、調製に関して実施例２を参照）；細胞培養培地 K/1(比較のために以下を参照されたい)；EDTA(0.02％)；トリプシン/EDTA(0.05％/0.01％)；細胞培養フラスコ（T-フラスコ）: 25cm2、80 cm2、175cm2
【００２２】
２．細胞の解凍
2.1  支持細胞の解凍
細胞を急速解凍し、予熱したK/1培地5〜10mlに置いた。対応する量の支持細胞(feeder cells)を好適な細胞培養フラスコに移行し、K/1培地を補給した：
25cm2Ｔ−フラスコ    0.5×106細胞    最終培地量：5〜6ml
80cm2Ｔ−フラスコ    1.5×106細胞    最終培地量：20ml
175cm2Ｔ−フラスコ   3.5×106細胞    最終培地量：50ml
支持細胞を即時に又は24時間以内に使用してもよい。
【００２３】
2.2  ケラチノサイトの解凍
細胞を急速解凍し、予熱したK/1培地5〜10mlに置いた。対応する量の細胞を、支持細胞をすでに含有する細胞培養フラスコに加え、新鮮な培地を補給した：
25cm2Ｔ−フラスコ    0.15×106細胞；最終培地量：6〜10mL
80cm2Ｔ−フラスコ    0.4×106細胞;最終培地量:20mL
175cm2Ｔ−フラスコ   1×106細胞；最終培地量：50mL
【００２４】
3.0  培養
細胞を35〜39℃、好ましくは37℃でインキュベートした。相対湿度は、＞90％、好ましくは95％であり、CO2濃度は、5〜9％である。ケラチノサイトを最大コンフルエンス80％で継代培養した。
【００２５】
これに関して、細胞培養上清を廃棄した。支持細胞を、0.02％EDTA(2〜10ml)で2回すすぎ、5〜10分、37℃でインキュベートし、その後それをタッピングすること（又はそれを振ること）により細胞培養フラスコからはがした。その後、ケラチノサイトをトリプシン/EDTA(0.05％/0.01％、1〜6ml)で、5〜10分、37℃で処理し、タッピングすることにより注意深くはがした。必要に応じて、残存する細胞を、細胞スパーテルを使用して注意深くこすり落とした。トリプシン/EDTA溶液をK/1培地を添加することにより中和し、ピペットで注意深く上下させることにより細胞を分離した。細胞を、2.2に明記した細胞膜に播種した。細胞培養培地K/1を3日目及びその後2日ごとに交換した。
【００２６】
4.0 K/1培地の調製
すべての成分及び原液を、表1に示した配列において、次々と合わせた。混合物をWFI(注射用蒸留水)で合計１リットルにした。その後、pHをNaOH又はHClで7.0〜7.2に調整した。モル浸透圧濃度は、320〜400mOsm/kgにすべきである。最終的に、培地K/1を無菌ろ過した。
【００２７】
4.1  原液の調整
トリヨードチロニン
トリヨードチロニン13.6mgを 0.1 NaOH 1mlに溶解し、PBS 99mlをそれらに加えた。最終溶液を、PBS中、1:100で希釈した。この溶液１mlは、培地１リットル当たりに必要とされる。
EGF
EGF 1mgをWFI 100mlに溶解した。この溶液1mlは、培地1リットル当たりに必要とされる。
rh-インシュリン（pH＜4.0でのみ可溶性）
rh-インシュリン5gを、WFI 0.9Lに加え、6M HClでpHを2.5に調整した。rh-インシュリンを溶解した後、1M NaOHでpHを8.0に調整した。混合物を、WFIで１リットルにした。この溶液１mlは、培地１リットル当たりに必要とされる。
【００２８】
4.2  培地の組成
2005505392.tif 000002
【００２９】
しかし、また、細胞を、新鮮な生検材料から、例えば包皮の上皮性部分から培養してもよい。未分化、増殖性ケラチノサイトの第一の単離を、Rheinwald及びGreen により1975年に記載された方法を用いて行ってもよい。
使用した支持細胞は、例えば、実施例２に記載した細胞であってもよい。また、他の致死的な線維芽細胞、好ましくは他のマウス線維芽細胞、最も好ましくは細胞株3T3の子孫を使用することも考えられる。
【実施例２】
【００３０】
ケラチノサイトを培養するための照射3T3支持細胞の調製
１．材料
マウス3T3 線維芽細胞（例えばATCC CCL 92、3T3-スイスアルビノ、接触阻害した線維芽細胞）であって、American Type Culture Collection(ATCC)、10801 ブールバード大学、マナッサス、VA、USA、から得てもよいもの、DMEM+10％ウシ胎児血清（FCS）;PBS;0.2％トリプシン溶液；0.04％EDTA溶液；細胞培養フラスコ（T-フラスコ）：25cm2、80cm2、175 cm2
【００３１】
２．細胞の解凍
細胞を急速解凍し、予熱した培地5〜10mlに加えた。DMSO-含有培地を遠心分離の後に除去した。その細胞を培地5〜10mlに懸濁した。細胞数を測定した後、細胞を、103〜104細胞/cm2密度において好適な細胞培養フラスコに播種した。それらを35〜39℃、好ましくは37℃でインキュベートした。相対湿度は、＞90％、好ましくは95％であり、CO2濃度は5〜9％である。
３．細胞の培養
細胞を成長に関して毎日検査した。細胞密度は、最大コンフルエンスの70〜80％を超えるべきではない。継代培養を、必要に応じて2〜4日毎に行った。このために、培地を廃棄し、細胞を、好適な量のEDTA及びトリプシンの1:2混合物（0.5〜5ml）で洗った。その後、剥離した細胞を培地3.5〜20ml中にとった。細胞を密度103〜104細胞/cm2で再び播種した。
【００３２】
４．支持細胞の照射
支持細胞を、約60Gy(137Cs源において6000rad)の量で照射した。
照射及び非照射の両方の細胞は、標準法を使用して液体窒素中で凍結保存し、長期間貯蔵することができる。
【実施例３】
【００３３】
キャリアマトリックス、この場合レーザースキン(Laserskin)を、培養物KC-BI-1(DSM ACC2514)由来のケラチノサイトでコーティングする方法
本発明による生物学的活性創傷治癒包帯剤の調製は、例としてここに記載される。ここに記載される創傷治癒包帯剤は、本発明によるケラチノサイトKC-BI-1、及びレーザースキン、ヒアルロン酸エステルの生物学的再吸収性（bioreabsorbable）キャリアマトリックスからなる。
【００３４】
しかし、本発明は、ここに記載された組み合わせに制限されるものではない。むしろ、請求項１〜８に記された新規特性を有するいずれかのケラチノサイトをコーティングのために使用してもよい。
また、医薬組成物を製造するために使用してもよい生体適合性キャリア材料であることを条件として、他の好適なキャリアマトリックスを使用することも可能である。例えば、WO91/13638に記載されたような疎水性生体適合性キャリア材料を使用してもよい。しかし、さらに、主に親水性の特性を持ったキャリア材料を使用することも可能である。
【００３５】
本発明の他の好ましい態様は、本発明のケラチノサイトを、再吸収性ポリマーであって、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアンハイドライド（polyanhydride）、ポリオルトエステル、ポリデプシペプチド、ポリエーテルエステル、ポリアミノ酸又はポリホスファジン(polyphosphazenes)、具体的にはポリ(L-ラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド）、ポリ(L-ラクチド-コ-D,L-ラクチド)、ポリ（グリコリド）、ポリ(L-ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ(L-ラクチド-コ-トリメチレン-カーボネート)又はポリ(ジオキサノン)からなるものと一緒に使用すること及び、該ポリマーからなる穿孔処理フィルムを使用することを含む。
【００３６】
１．材料
K/1培地（実施例１を参照）；PBS、0.04％EDTA(PBSで0.02％に希釈)；トリプシン/EDTA(0.05％/0.01％)；滅菌ルー皿（T 25cm2、T 80cm2、T 175cm2）、144×21ペトリ皿(表面積145cm2)中のレーザースキン（Messrs. Fidia Advanced Biopolymers srl, アーバノ温泉、イタリア）；3T3支持細胞；本発明によるケラチノサイト、例えばKC-BI-1。
２．生物学的活性創傷治癒包帯剤の培養
2.1  材料
実施例２に記載した、照射した支持細胞、例えばマウス3T3線維芽細胞；ストックからの発明によるケラチノサイト；ペトリ皿中の8.5cm×8.5cm 片のレーザースキン（最終プロダクト）；K/2培地
【００３７】
2.2 3T3支持細胞の播種
実施例２により製造した支持細胞を、播種密度約15,000〜25,000細胞/cm2（3×106細胞/ペトリ皿におおよそ対応する）において、レーザースキンに置いた。その後、そのペトリ皿を35〜37℃で、相対湿度＞90％で、5〜11％CO2、好ましくは7〜9％で、37℃のインキュベータ中において、インキュベートした。ケラチノサイトを、同日又は遅くとも翌日(24時間後)のいずれかにおいて支持細胞菌叢に播種した。
【００３８】
2.3  ケラチノサイトの播種及び培養
生物学的活性創傷治癒包帯剤は、本発明によるケラチノサイトで製造することができる。ケラチノサイトの継代培養は、例えば、以下のように行ってもよい：
サブコンフルエント培養物を0.02％EDTAで一度すすいだ（80cm2ルー皿：8mL；175cm2ルー皿：10ml）。その後、支持細胞を0.02％EDTAで、5〜10分、37℃でインキュベートし（80cm2ルー皿：8mL；175cm2ルー皿：10ml）、注意深く振ることによりはがした。
ケラチノサイトを、トリプシン/EDTA(0.05％/0.01％)で実施例１のように溶解し（80cm2ルー皿：2〜3mL；175cm2ルー皿：5〜6ml）、その後細胞培養培地（80cm2ルー皿：7〜8mL；175cm2ルー皿：14〜15ml）にとり、注意深くピペットで上下させることにより分離させた。
【００３９】
本発明によるケラチノサイトを、支持細胞で提供されるレーザースキンフィルムに、播種密度約15,000〜25,000細胞/cm2（3×106細胞/ペトリ皿におおよそ対応する）で適用した。その後、細胞を30〜100％コンフルエント、好ましくは80〜100％コンフルエントまで、35〜39℃、好ましくは37℃でインキュベートした。相対湿度は＞90％、好ましくは95％であり、CO2濃度は5〜9％であった。
【実施例４】
【００４０】
本発明による生物学的活性創傷治癒包帯剤の凍結保存方法
ケラチノサイトを、キャリアマトリックスに30〜100％、好ましくは80〜100％でコロニー形成した後、本発明のプロダクトを、好適な容器、例えばヒートシール可能なPPバッグにおいて、制御条件下で凍結してもよい。このことを行うために、培養培地を注意深く移動させ、K/2寒剤20mlにより2〜6℃で、置換した。その後、そのプロダクトを滅菌条件化で包装し、以下の方法により凍結した：
温度を-5〜-10℃、好ましくは-6〜-8℃に、2〜5分以内に急速に低下させた後、プロダクトを対応する温度で、15〜30分、好ましくは23〜25分間、平衡にさせた。その後、プロダクトをある温度、例えば-60〜-80℃に、凍結速度＜1℃/分、好ましくは0.2〜0.6℃/分、最も好ましくは0.4℃/分で冷却した。プロダクトを-60〜-80℃で貯蔵した。
K/2寒剤：
ヒドロキシエチルスターチ7〜13％(w/w)と混合したK/1成長培地（実施例１参照）。
【実施例５】
【００４１】
創傷（例として静脈性下腿潰瘍を扱う）を被覆するために本発明によるケラチノサイトでコロニー形成したキャリアマトリックスの使用例
１．新たに製造した創傷治癒包帯剤の運搬
ケラチノサイトが、レーザースキン上で30〜100％、好ましくは80〜100％コンフルエンスに成長した後、培養物を好適な量、好ましくは30mlのK/3運搬培地で、1回以上すすいだ。生物学的活性創傷治癒包帯剤を好適な量、好ましくは20mlのK/3運搬培地に移動した。ペトリ皿の上部空間をCO2 5〜10％の空気混合物で一時的にガス処理し、接着テープ、例えばパラフィルムでシールし、運搬箱においてクリニックに直ちに運んだ。
K/3運搬培地：
ウシ胎児血清（FCS）なしの成長培地K/1（実施例１参照）。しかし、単純な生理学的生理食塩水、例えば、ホスフェート-ボレートをベースとしたもの、例えばPBS、又はHEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸)又はMES([2-N-モルホリノ]エタンスルホン酸)をベースとしたものを使用することも可能である。
【００４２】
２．凍結保存した創傷治癒包帯剤の運搬
一般的に、凍結保存した創傷治癒包帯剤を、ドライアイス上においてクリニックに供給してもよい。しかし、他の運搬形態も、創傷治癒包帯剤が-60℃より低い温度で運搬されることを条件に、可能である。
凍結保存した創傷治癒包帯剤は直ちに解凍される。その後、寒剤を取り除き、包帯剤をK/3運搬培地（上記参照）又は、他の好適な生理的溶液、例えばリンゲル液で、1回以上すすいだ。
【００４３】
３．治療的使用
その後、包帯剤を創傷に置いた。穿孔処理されていないキャリアマトリックスを使用する時、創傷治癒包帯剤は、創傷に面した細胞に正しく置かれなければならない。ケラチノサイトがキャリアの両側にコロニー形成することを可能にする穿孔処理されたキャリア（たとえばレーザースキン）を使用することは、本発明の創傷治癒包帯剤が、治療されるべき創傷上に特定の方向において置かれなくてもよいことを意味する。治療の成功により、処置を何度も繰り返してもよい。
【実施例６】
【００４４】
ケラチノサイト細胞KC-BI-1(DSM ACC2514)の遺伝的キャラクタリゼーション
KC-BI-1細胞を、上記の本発明の方法を用いて、継代数に渡って継代培養した。その後、継代4、13及び121からの細胞を、遺伝分析し、15の異なる座位の長さ多形性を調査した（CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX及びvWA）。分析は、当技術分野に公知の方法を使用して行った。このため、対応する対立遺伝子を、Messrs Promega(マンハイム、ドイツ)により製造された、父系性を決定するための試験（Poewer Plex（登録商標）16 System）を使用して、製造業者指示に従って、増幅した。対立遺伝子は、フラグメント長さを測定することにより同定してもよい（長さ標準ILS 600は上記キットの一部である）。集団における対立遺伝子配列のデータは、対応する表に見出すことができる。
分析は、分析されたすべての細胞継代に関するすべての座位において、すべての対立遺伝子の一致を示した。従って、そのデータは、KC-BI-1細胞を遺伝的に分類することを可能にした。分類の確立＞99.999％が、対立遺伝子配列から決定された。
【００４５】
2005505392.tif 000003
【００４６】
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【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】培養時間を関数とするケラチノサイトKC-BI-1の細胞複製を示す。
培養期間94日に渡るケラチノサイトKC-BI-1の細胞複製数（CPD=累積集団倍加）を示している。観察期間の94日以内に、細胞はおおよそ75回倍加した。これは、細胞複製当たり、平均倍加時間1.25日、10日当たり12.5に相当する。
【図２】10ヶ月間に渡るケラチノサイトKC-BI-1の倍加を示す。
細胞継代１〜67を関数として、集団倍加（PD）を示す、10ヶ月に渡るケラチノサイトKC-BI-1の細胞複製を示している。
【図３】相対的テロメラーゼ活性の測定結果を示す。
継代1、12、18、40及び57後のケラチノサイトKC-BI-1の相対的テロメラーゼ活性を、細胞株HeLaの活性と比較して示している。図は、不死化された細胞株HeLaと比較して、ケラチノサイトKC-BI-1に関して、ほとんどないか又はほんのわずかなテロメラーゼ活性を示している。
【図４】継代5及び60の後のケラチノサイトKC-BI-1の形態を示す。
光学顕微鏡で観察した場合、ケラチノサイトKC-BI-1は、細胞継代5（培養時間25日）と細胞継代60（培養時間300日）との間に、形態学的差異を示さなかった。
【図１】
2005505392.tif 000004
【図２】
2005505392.tif 000005
【図３】
2005505392.tif 000006
【図４】
2005505392.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2005505392.tif 000008
2005505392.tif 000009
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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