(57)【要約】H. pyloriの除菌能のあるLactobacillus gasseriに属する乳酸菌を含有することを特徴とするナチュラルチーズおよびそのナチュラルチーズの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Helicobacter pylori除菌能を有するLactobacillus gasseriに属する乳酸菌を含有すること、を特徴とするナチュラルチーズ。
【請求項２】
乳酸菌が低ｐＨ環境に耐性を有する請求項１記載のナチュラルチーズ。
【請求項３】
乳酸菌がLactobacillus gasseri OLL 2716株（FERM BP-6999）もしくはその変異体である請求項１又は２に記載のナチュラルチーズ。
【請求項４】
乳酸菌が１０℃以下、６ヶ月の保存で１０7cfu/g以上生残する請求項１〜３のいずれか１項に記載のナチュラルチーズ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のナチュラルチーズを含有すること、を特徴とする食品。
【請求項６】
カード形成前の乳成分に酵母エキスを添加すること、及び／又は型詰・圧搾後のカードを保温することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のナチュラルチーズの製造方法。
【請求項７】
型詰・圧搾後のカードを冷蔵しないで保温する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
カードを２０℃〜３５℃で１６〜２６時間保温する請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
Helicobacter pylori除菌能を有するLactobacillus gasseriに属する乳酸菌が原乳にスターターとして添加される請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
乳酸菌がLactobacillus gasseri OLL 2716株(FERM BP-6999)もしくはその変異体である請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori:以下、H. pyloriということもある）の除菌及び／又は感染防御効果を有するラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri:以下L. gasseriということもある)を含有するナチュラルチーズに関する。特に、本発明は、６ヶ月以上の長期間、冷蔵で保存した場合にも高濃度のL. gasseri生残菌数を維持するナチュラルチーズに関する。
【背景技術】
【０００２】
１９８３年にWarrenら(Lancet, I. 1273(1983))によって胃内に棲息する細菌としてH. pyloriが発見されて以来、H. pyloriと慢性胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍との関係につき注目されるようになった。最近では、スナネズミにH. pyloriを感染させると発ガン物質の投与なしで胃腺ガンが発生する事実が認められており(Watanabe et al., Gastroenterology,115;642(1988))、胃ガンの起因菌としてもH. pyloriとの関連が指摘されている。また、H. pylori陽性の消化性潰瘍患者に対してH. pyloriの除菌を行うと消化性潰瘍の再発が抑制されることが明らかになりつつあることから、胃内のH. pylori除菌法について種々検討がなされている。
【０００３】
抗生物質を使用しない胃内H. pyloriの除菌を目的に、H. pylori除菌能の高いLactobacillus gasseri OLL 2716株｛本菌株は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−３）、現在の名前および住所は以下の通り。独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託番号FERM BP-6999として2000年1月14日に寄託されている。以下-LG21ともいう｝を用いる方法が提案された（特開2001-143及びEP-1112692-A1）。Lactobacillus gasseri OLL 2716株は、ヒト腸内由来の数多くの乳酸菌のうち、(1)胃酸耐性が高い、(2)低ｐＨ条件下で生育が良好である、(3)H. pyloriのヒト胃癌細胞MKN45付着抑制能が高い、(4)H. pyloriと混合培養した際にH. pylori増殖阻害能が高い、(5)H. pylori感染モデルマウスに投与した際にH. pyloriの除菌能が高い、(6)食品に適用した際に生残性が高く、香味、物性も優れている菌株の選定につき研究を重ねた結果、これらの条件に合致する菌株として見出された。特に、発酵乳を調製した際の製造特性（保存性、風味、物性）に優れていることから、発酵乳の形態で投与することが望ましい。よって、乳酸菌の有する抗菌力を利用してH. pyloriの除菌を行うことは、副作用を伴わず手軽で有効な手段といえるが、発酵乳という食品の性質上、品質保持期限は２週間前後と比較的短く、又２週間保存後の菌数は保存前の約半分に減少し、長期間の保存にあまり適しているとはいえなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、H. pyloriの除菌能およびH. pyloriの感染防御能の高いL. gasseriを長期間保存中も高い菌数で生残させ、且つ、違和感なく通常の食生活で摂取することが可能な食品を提供することにある。
【０００５】
即ち、本発明は、以下の（１）から（１０）に関する。
（１）Helicobacter pylori除菌能を有するLactobacillus gasseriに属する乳酸菌を含有すること、を特徴とするナチュラルチーズ。
（２）乳酸菌が低ｐＨ環境に耐性を有する（１）記載のナチュラルチーズ。
（３）乳酸菌がLactobacillus gasseri OLL 2716株(FERM BP-6999)もしくはその変異体である（１）又は（２）に記載のナチュラルチーズ。
（４）乳酸菌が１０℃以下、６ヶ月の保存で１０７cfu/g以上生残する（１）〜（３）のいずれか１項に記載のナチュラルチーズ。
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のナチュラルチーズを含有すること、を特徴とする食品。
（６）カード形成前の乳成分に酵母エキスを添加すること、及び／又は型詰・圧搾後のカードを保温することを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１項に記載のナチュラルチーズの製造方法。
（７）型詰・圧搾後のカードを冷蔵しないで保温する（６）に記載の方法。
（８）カードを２０℃〜３５℃で１６〜２６時間保温する（６）または（７）記載の方法。
（９）Helicobacter pylori除菌能を有するLactobacillus gasseriに属する乳酸菌が原乳にスターターとして添加される（６）〜（８）のいずれか1項に記載の方法。
（１０）乳酸菌がLactobacillus gasseri OLL 2716株(FERM BP-6999)もしくはその変異体である（６）〜（９）のいずれか1項に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
記載中、パーセント（％）は特に断りが無い限り、重量％を表す。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、H. pyloriの除菌能およびH. pyloriに対して感染防御能のあるL. gasseri OLL 2716株生菌をナチュラルチーズの形態で保持するという新規な構成を採用することで、ナチュラルチーズ中でL. gasseriが十分量生育し、長期間にわたって高濃度に生残することを見出した。しかも、通常用いるチーズの製造工程に、酵母エキスを添加する工程及び／又は、型詰・圧搾後にチーズカードを保温する工程を加えることで、意外にも、チーズ中のL. gasseriがチーズ用乳酸菌より優位に生育し、生残することを初めて発見した。よって、本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００７】
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明におけるナチュラルチーズは、チェダーチーズ、ゴーダチ−ズ、エダムチーズ、ストリングチーズ、モザレラチーズ等の固形状のハードタイプもしくはセミハードタイプのナチュラルチーズが好適である。
【０００８】
本発明のナチュラルチーズ製造に用いられる原乳は、チーズ製造に通常用いられる原乳から選ばれ、例として、牛、ヤギ、羊、水牛、馬およびヤクなどの哺乳類の乳、クリーム、脱脂乳、部分脱脂乳、全脂乳、濃縮乳、濃縮脱脂乳、脱脂乳等を水に溶解して得た還元乳、ホエイ等の乳由来物その他が含まれ、単独もしくは組み合わせて用いられる。
【０００９】
本発明のナチュラルチーズはH. pyloriの除菌能を有するLactobacillus gasseri（以下、「本発明のL. gasseri」とする）に属する乳酸菌を含む。本発明のL. gasseriは、H. pyloriの除菌能を有し、好ましくは高いH. pyloriの除菌能を有する。H. pyloriの除菌能とは、L. gasseriがH. pyloriの生育を阻害することであり、好ましくは、L. gasseriがH. pyloriの生存する胃に投与された場合に、H. pyloriの残存数が測定可能限界である１×１０3コロニー形成単位（以下「cfu」とする）以下に減ることである。
【００１０】
本発明のL. gasseriは低ｐＨ耐性であることが好ましい。特に、胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の発症および再発を防ぐために、ナチュラルチーズの形で本発明のL. gasseriの生菌を投与した場合、本発明のL. gasseriは、ヒトやそれ以外の動物の胃内環境において、高胃酸耐性であり、低ｐＨ条件下で良く生育し、H. pyloriを除菌可能で、宿主をH. pyloriの感染から防御する。同様に、ヒトの胃腸内の酸性環境に耐えるために、通常の乳酸菌の至適ｐＨは６〜７であるが、本発明のL. gasseriはｐＨ２からｐＨ７の酸性環境に耐性があるべきである。本発明のL. gasseriがｐＨ５〜７のチーズ中で生存し、成長することが確認されている。さらに、本発明のL. gasseriは好ましくは、経口投与した場合に高い生菌数を示し、チーズグラム数あたりに１０7cfu、さらに好ましくはチーズグラム数あたりに１０9cfu含まれる。
【００１１】
本願の乳酸菌として、好ましくは、L. gasseri OLL2716(FERM BP-6999)が用いられる。さらに、L. gasseri OLL2716(FERM BP-6999)の変異株もH. pyloriの除菌能があり、ヒトおよびヒト以外の動物に有毒でない限り、本願の乳酸菌に含まれる。変異株は、L. gasseri OLL2716(FERM BP-6999)を、紫外線、X線および放射線照射、変異物質（ニトロソグアニジン、アクリジン染料など）を用いた化学処置などの適切な変異処置を施すことによって、また、ヌクレオチドの欠失や置換などや、自然突然変異などによって作られる。
【００１２】
本発明のナチュラルチーズを１０℃以下で６ヶ月保存した場合、本発明のL. gasseriは生菌数でチーズグラム数あたり１０7cfu以上であり、特に生育が良い。本発明のナチュラルチーズは、好ましくは１０℃以下、より好ましくは２℃から１０℃で熟成のために保存し、必要に応じて嫌気条件下で冷蔵する。熟成の時間は、チーズの種類によって決定される。また、型詰・圧搾終了後、チーズのカードの保温の日から６ヶ月が数えられる。当然のことながら、１０℃以下で６ヶ月以上保存した場合に、チーズグラム数あたりに１０7cfu以上L. gasseri生菌数を持つナチュラル・チーズも本発明に含まれる。さらに、本発明のL. gasseriは安全性の面では何ら問題が無いため、最大生菌数については特に限定されない。
【００１３】
一般に、ナチュラルチーズの製造には、原乳の標準化、殺菌等の前処理、カードの製造、これに引き続く仕上げ作業と、すべてのタイプのチーズに共通する工程がある。チーズの種類によって、スターターの種類や発酵条件、カードの処理や加塩・貯蔵法など異なる場合もあるが、本発明のナチュラルチーズにおいては、好ましくはL. gasseriがL. gasseriスターターとして添加されること、チーズ用乳酸菌スターターに、L. gasseriスターターを併用すること、さらには各種のチーズに適した通常の工程に加え、カード形成前に乳成分に酵母エキスを添加し、及び／又は型詰・圧搾後のチーズカードを保温する工程を含むことを特徴とする。カード形成前の乳成分は、カードが形成されない限り、上記の原乳でも良いし、いかなる添加物を含んでも良い。
【００１４】
L. gasseriスターターは、上記の通り、H. pylori除菌効果を有するL. gasseriに属する乳酸菌であり、中でも最も望ましいのはL. gasseri OLL 2716株である(FERM BP-6999)。
【００１５】
L. gasseri OLL 2716株(FERM BP-6999)は、ストックカルチャーからマザースターター、バルクスターターと複数の段階を経て調製する方法と、マザースターターの調製工程を経ずに直接バルクスターター用もしくは製品製造用に接種する高菌数の濃縮スターター(凍結品又は凍結乾燥品)の利用が可能である。
【００１６】
L．gasseriスターターの原乳への添加量は、用途(予防、保健、又は治療)と製造条件に応じて適宜定めることができる。H. pylori除菌を目的とする場合には、１日あたりのナチュラルチーズの摂取量で、最終的に１０9cfu(9.0log cfu)程度の生菌を摂取することが望ましい。よって、１日に、ヒトあるいはヒト以外の動物にとって、ナチュラルチーズ摂取量に対し、これに相当する生菌数が含有するように、L．gasseriスターターの原乳への添加量を決めればよい。本発明の実施例に記載の方法によって調製されるL．gasseriスターターおよび乳酸菌スターターは、L．gasseri生菌数および乳酸菌生菌数が最終濃度１０6〜１０7cfuになるように、それぞれ、原乳１ｋｇに対して、好ましくは０．５〜５％、より好ましくは１％添加される。L．gasseriスターターは冷却の工程の後、早く添加されるほど、よりL．gasseri生菌数が増えるので、すぐに乳成分に添加されることが望ましい。
【００１７】
以下、チェダーチーズを例に、本発明のナチュラルチーズの製造法について具体的に説明する。
代表的なチェダーチーズの製造法として、次の方法が知られている。(1)原乳を標準化し、殺菌後、冷却する、(2)乳酸菌スターターを(1)で得られた原乳に添加し、混合する、(3)塩化カルシウム、レンネットを(2)で得られた混合物に添加し、乳を凝固させ、カードを形成させる、(4)(3)で得られたカードをカッティングしホエイを排除する、(5)カードをチェダーリング・ミリングし乾塩を添加し撹拌する、(6)カードを成型し真空包装し熟成する。
【００１８】
本発明に係わるナチュラルチーズを、上記方法に基づいて製造した場合、一例として以下のように製造可能である。(1)原乳４０ｋｇを6３℃で３０分殺菌後、３２℃まで冷却した後、(2)チーズ用乳酸菌スターター（Lactobacillus lactis subsp.lactis)、L. gasseriスターター各々４００ｇを(1)で得られた原乳に添加し、(3)塩化カルシウム４ｇ、レンネット０．１ｇを(2)で得られた混合物に添加後45分静置し、(4)得られたカードを幅約８ｍｍにカッティングし２０分撹拌後、４０分で４０℃まで温め、６０分撹拌後、５分沈降させ、１５分間ホエイを排除し、(5)２時間チェダーリングした後、親指大にミリングし塩を８０ｇ加え、(6)カードを２ｋｇサイズで２個に型詰し、２時間圧搾し、真空包装し熟成させる。その際、カード形成前に(1)〜(3)の工程のいずれかに酵母エキスを添加し、及び／又は(6)の型詰・圧搾後にカードを保温することが特に好ましい。
【００１９】
以下、本発明の一例として、上記チーズ用乳酸菌とL. gasseriのバルクスターターの調製法を記載する。まず、チーズ用乳酸菌のいずれかの菌株及びL. gasseriの保存菌をそれぞれ酵母エキス入り１０％脱脂粉乳培地で３代賦活培養する。その後、チーズ用乳酸菌スターターは１０％脱脂粉乳培地に１％接種し、L. gasseriスターターは０．１％酵母エキス入り１０％脱脂粉乳培地に１％接種し、前者は２５℃１６時間、後者は３５℃２４時間培養することで、それぞれのバルクスターターが調製できる。
【００２０】
また、ナチュラルチーズ中のL. gasseriをチーズ用乳酸菌より優位に生育させるには、予め酵母エキスをカード圧搾前に、添加しておくことが好ましく、カード形成前に乳成分に添加しておくことがより好ましい。酵母エキスの添加量は、乳成分１リットルあたり、好ましくは0.05〜0.2％、より好ましくは0.08〜0.15％である。酵母エキスとしては、「酵母エキス」の製品分類で売られているいかなる製品でも使用可能である。例えば、アサヒビール株式会社製の「meast P2G」が利用可能である。
【００２１】
さらに、型詰・圧搾後のカードを保温することで、ナチュラルチーズ中のL. gasseriの生残性を高めることができる。保温は、好ましくは、例えば、型詰・圧搾直後に冷却しないことによって行われる。さらに、温度は20〜35℃で16〜26時間、好ましくは、22〜28℃で19〜24時間である。
【００２２】
本発明のナチュラルチーズ中の型詰・圧搾前のL. gasseriは、好ましくは、ナチュラルチーズ１グラムあたりの生菌数で、１０8〜１０9cfuであり、L. gasseriの生菌数が型詰・圧搾中、変わらない。
【００２３】
ナチュラルチーズの製造にあたって、食塩がチーズ・カードへの添加、チーズの表面への添加および食塩水へのブライニングによって添加される。ブライニングが保温に加えて行われるとき、保温の工程に続いて、ブライニングの工程を行うことが可能である。例えば、ゴーダチーズの場合、工程は以下の通りである。(1)カードの形成、(2)型詰、(3)圧搾、(4)カードの保温、(5)ブライニングによる食塩の添加、(6)保存である。ナチュラルチーズの食塩含量もL. gasseriの生残性に影響を与える。L. gasseriの生残性は食塩濃度が高いと制限されるため、チーズ１グラムあたり、食塩含量は３％以下、望ましくは２％以下が適当である。
【００２４】
同様に、L. gasseriの生残性は酸素の存在で制限されるため、チーズを熟成、保存するにあたっては真空包装、又は不活性ガス置換包装、もしくはワックス、プラスチック・フィルム等で表面をシールすることが望ましい。
【００２５】
本発明のナチュラルチーズはチーズに添加可能な食品や液体、甘味剤、酸味剤、香味料、香辛料、香料、ビタミン、その他のチーズに添加可能な食品添加物などを含んでも良い。
【００２６】
こうして得られる製品は、チーズ中にL. gasseriが十分量生育し、且つ、熟成や保存後もL. gasseriが高濃度に生残するため、本発明により、H. pylori除菌性効果のあるチーズを得ることができる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例、試験例を挙げてさらに詳しく説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
実施例１
L. gasseri 入りチェダーチーズの調製法
L. gasseri OLL 2716株(FERM BP-6999)及び市販チーズ用混合乳酸菌（Hansen社O-180)をそれぞれ１０％脱脂粉乳培地に１％ずつ接種し、L. gasseriは３７℃で１７時間、O-180は２５℃で１７時間培養してバルクスターターを調製した。次に７３℃１５秒殺菌した牛乳100kgを３０℃に調整し、上記L. gasseriおよびO-180バルクスターターを各々１％接種し、以下常法により縦、横約30cm、高さ約10cmのチェダーチーズ10kgを製造した。このチェダーチーズをエバールコート・ナイロンポリエチレンフィルム（三菱樹脂社製）で真空包装して５℃、および１０℃で保存した。各工程におけるL. gasseri菌数とその他の菌数、及び製造翌日から１ヵ月後との６ヶ月間における菌数を下記細菌検査法に基づいて測定した（表１、表２）以下、実施する細菌検査は、何れも同様の方法で行った。なお、チェダーチーズの菌数測定部位は、中心部と表面部（表面から５ｍｍまでの厚さの部分）とした。
【００２８】
その結果、L. gasseriは最大５×１０8cfu/g(8.7 log cfu/g)まで増加し、３ヶ月まで（５℃保存の場合）、あるいは１ヶ月まで（１０℃保存の場合）、１０8cfu/g（8.0 log cfu/g）以上の菌数を維持した。６ヶ月保存後でも５℃保存、１０℃保存いずれの場合も１０7cfu/g（7.0 log cfu/g）以上の菌数が生残していた（表２、図１）。即ち、１回のチーズ摂取量を１０ｇ程度とし、１０gを１包装単位（１個）とすれば、製造後３ヶ月経過時の最大菌数は２×１０9cfu/個（9.3 log cfu/個）、６ヶ月経過後は、最大４×１０8cfu/個（8.6 log cfu/個）であることから、１０ｇ程度のチーズを摂取するだけでも、H. pylori除菌及び／又はH. pyloriの感染防御を目的とした場合に十分な菌数を維持できることが確認された。チェダーチーズの成分は水分42％、脂肪28％、たんぱく質26％、食塩0.9％であり、わずかな塩味と酸味があった。熟成後はわずかな苦みがあったが、特に大きな問題ではなかった（表３）。
【００２９】
細菌検査方法
・培地：BL寒天培地(栄研化学)6gを水100mlに溶解し、オートクレーブにて121℃15分滅菌後、約50℃に冷却し、これに馬脱繊維血液(日本バイオテスト)を5％濃度になるよう無菌的に添加し、混合後シャーレに分注して平板を作成し、菌数測定に使用した。
・希釈方法：チーズ試料は10倍量の2％第2リン酸ナトリウム溶液でカードを溶解した後生理食塩水で希釈し、チーズ以外の試料は直接生理食塩水で希釈して必要な濃度とし、上記の馬脱繊維血液入りBL平板培地に0.1ml塗布して、35℃3日間好気条件下で培養してL. gasseri生菌数およびその他の菌数を測定した。
・計測：
（１）L. gasseri：正円〜やや不規則形、茶褐色、ラフ型の大型コロニーをL. gasseriとして分別計測した。
（２）その他の菌：その他の菌は概ねやや隆起した茶褐色、スムース型の小型コロニーであった。その他の菌はL. gasseri以外の菌数の合計で表示した。
【００３０】
【表１】
2005522202.tif 000002
【００３１】
【表２】
2005522202.tif 000003
【００３２】
【表３】
2005522202.tif 000004
【００３３】
実施例２
L. gasseri入りゴーダチーズの調製法１
L. gasseri OLL 2716株及び市販チーズ用混合乳酸菌(Hansen社CHN-01)をそれぞれ10％脱脂粉乳培地に1％ずつ接種し、L. gasseriは37℃で、CHN-01は25℃でそれぞれ17時間培養してバルクスターターを調製した。次に73℃15秒殺菌した部分脱脂乳(SNF8.5％、FAT3％)100kgを32℃に調整し、L. gasseriおよびCHN-01バルクスターターを各々１％接種し、以下常法により縦、横約30cm、高さ約10cmのゴーダチーズ10kgを製造した。各工程における菌数量は表４の通りであり、得られたゴーダチーズの成分は水分43％、脂肪24％、たんぱく質25％、食塩1.7％であった。このゴーダチーズをエバールコート・ナイロンポリエチレンフィルムで真空包装して5℃、および10℃で保存し、包装翌日から1ヶ月ごとに6ヶ月間L. gasseri菌数とその他の菌数を測定した。ゴーダチーズの場合もL．gasseriは最大6×108cfu/g(8.8log cfu/g)まで増加し、チーズの中心部では108cfu /g(8.0 log cfu/g)以上の菌数を3ヶ月（10℃保存の場合）あるいは6ヶ月（5℃保存の場合）、維持した。10℃、6ヶ月保存後で107cfu/g(7.0 log cfu/g)以上の菌数を維持した。表面部(表面から厚さ5mmまで)では菌数が減少するのが早く、1ヶ月で107 cfu/g(7.0 log cfu/g)に低下し、6ヶ月後には106 cfu/g以下(6.0log cfu/g)となった(表５、図２)。ゴーダチーズとしての風味は特に問題なかった（表６）。
【００３４】
【表４】
2005522202.tif 000005
【００３５】
【表５】
2005522202.tif 000006
【００３６】
【表６】
2005522202.tif 000007
【００３７】
実施例３
L. gasseriが増強されたゴーダチーズの調製法２
L. gasseri  OLL 2716株を0.1％酵母エキス(Difco)入り10％脱脂粉乳培地に、市販チーズ用乳酸菌Lactococcus lactis subsp. lactis(Hansen社CHN-01から単離)を10％脱脂粉乳培地に１％になるよう接種し、L. gasseriは37℃で24時間、L. lactisは25℃で17時間培養してそれぞれバルクスターターを調製した。次に73℃15秒殺菌した部分脱脂乳（SNF8.5％、FAT3％)20kgを32℃に調整し、L. gasseriおよびL. lactisバルクスターターを各々1％接種し、さらに酵母エキス20gを添加した。以下常法によりチーズカードを製造し、プレス後、型枠に入れたまま室温25℃の部屋で24時間保温後、型枠からチーズを取り出して10℃の20％食塩水に24時間浸漬し、直径約20cm、高さ約8cmの車輪状のゴーダチーズ2kgを製造した。各工程におけるL. gasseri菌数とその他の菌数は表７の通りである。このゴーダチーズをエバールコート・ナイロンポリエチレンフィルムで真空包装して５℃、および10℃で保存し、包装翌日から1ヶ月ごとに6ヶ月間L. gasseri菌数とその他の菌数を測定した。
【００３８】
その結果、L．gasseriは製造日から著しく増殖し、L. gasseri入りチーズの中心部では6ヶ月間108cfu/g(8.0log cfu/g)以上の菌数が維持されることが確認された(表８、図３)。また、製造日当日では、L．gasseri、その他の菌ともにほぼ同じ菌数であったが、翌日からL. gasseriのみ増殖し、製造後3ヶ月経過後も、その他の菌と比較してL. gasseriの菌数が高く維持されていることがわかった。即ち、実施例2のゴーダチーズの製造工程に、カード製造前に酵母エキスを添加しプレス後得られたカードを保温することで、L. gasseriの生育が増強されることが確認された。得られたゴーダチーズの成分は水分40％、脂肪26％、たんぱく質26％、食塩1.5％であった。風味については、特に問題なかった(表９)。
【００３９】
【表７】
2005522202.tif 000008
【００４０】
【表８】
2005522202.tif 000009
【００４１】
【表９】
2005522202.tif 000010
【００４２】
実施例４
L. gasseri入りストリングチーズの調製法
実施例3で得た食塩水浸漬前のチーズカード2kgを、製造翌日に１辺2cmの立方体に刻み、金属製の目の細かい網籠に入れ、60℃の湯水10kgに5分間浸漬した。チーズを湯水から取り出し、手でもみ込んでカードを結着させ、円柱状に整形した後、左右に引っ張り、直径3cmの円柱状のカードを得た。これを直ちに2℃の20％食塩水に1時間浸漬して組織を固定し、繊維性のあるチーズ(ストリングチーズ)を製造した。この繊維性のあるチーズをエバールコート・ナイロンポリエチレンフィルムで真空包装し、包装の翌日から1ヶ月ごとに3ヶ月間L. gasseri菌数とその他の菌数を測定した。L. gasseriは製造翌日から3ヶ月間108cfu/g(8.0 log cfu/g)以上の菌数を維持することが確認された(図４)。風味、繊維性共に良好であった(表１０)。
【００４３】
【表１０】
2005522202.tif 000011
【００４４】
実施例５
L. gasseri入りチーズの抗H. pylori効果
実施例3で調製し、エバールコート・ナイロンポリエチレンフィルムで真空包装後、５℃で５ヶ月保存したL. gasseri入りチーズ5gに生理食塩水45gを添加して、ブレンダー（商品名：ラボ・ブレンダー400、A.J. Seward社製）でよく混合した。当該混合液5mlをpH６に調整したBrucella broth 50ml, FCS（ウシ胎児血清）2.5mlおよび別途培養したH. pylori培養液5mlを添加し、37℃で微好気条件下で培養した。対照として、L. gasseriを添加せずに作製し、同様に保管したゴーダチーズを用いた実験も行った。培養開始0, 24, 48時間後のH. pyloriおよびL. gasseriの菌数を測定した。その結果、L. gasseri入りチーズを添加して培養した場合、48時間後にはH. pyloriは検出限界以下に減少した（図５）。
【００４５】
試験例１
L. gasseriの耐塩性試験
試験管に食塩濃度２〜１０％になるように調製した１０％脱脂粉乳培地（オートクレーブ後に食塩と混合）を入れ、L. gasseri OLL 2716株を２×１０7cfu/gになるように植菌し、３５℃２４時間静置培養後、菌数を測定した。食塩２％では問題なく増殖し、３〜４％では僅かに増菌する。５％ではほぼ静菌状態であり、６％以上で菌数が減少した。これをチーズ中の食塩／水分（Ｓ／Ｍ）で換算するとチーズの塩分０．５％では問題なく増菌、１％ではやや増菌、１．２５％では静菌、１．５％以上では減少ということになる。したがって、ブライン加塩するゴーダチーズは食塩含量が２％を越えない範囲となるよう調整することが好ましいことが確認された（図６）。
【００４６】
試験例２
酸性条件下での各種菌株の生育
３７℃で１８時間、MRS培地を用いて２度賦活培養した各種の乳酸菌１０μlを、0.2％塩化ナトリウムおよび0.35％ペプシン（1：5000、東京化成工業株式会社）を溶かしてpH4.0に調整した変法MRS培地に植菌し、37℃で好気培養した。各培地の濁度（OD650）を、培養開始直後、及び、培養開始9時間後に測定し、濁度の増加量（ΔOD650）を求めた。
この方法で、低ｐＨ領域における人工的に合成された胃液に対する耐性の高い株の生育性について試験した。その結果、L. gasseri OLL2716株とL. gasseri No.6株の生育性が高く、最も生育したのはL. gasseri OLL2716株であった。
結果を図７に示す。
【００４７】
試験例３
H. pylori感染マウスにおける乳酸菌の効果
無菌マウス(BALB/c)にH. pylori NCTC 11637株を1×109 cfu/mouse、一日一回、三日間にわたり、経口投与した。H. pylori投与4週間後に、H. pylori感染マウスに、L. gasseri OLL2716株、L. gasseri No.6株およびL. salivarius WB1004株をそれぞれ1×109 cfu/mouse1週目から7週目まで、一週間に一度経口投与した。乳酸菌投与から8週間後、胃内のH. pylori量を測定し、血清における抗H. pylori抗体価を測定した。
【００４８】
乳酸菌投与から８週間後、H. pylori単独投与の対照マウスにおける胃内のH. pyloriを、胃の内容物に対して1×105 cfu/g検出したのに対し、L. gasseri OLL2716株及びL. salivarius株をそれぞれ投与したマウスにおけるH. pylori量は、検出限界以下に減少した（胃の内容物に対して1×103 cfu/g）。血清における抗H. pylori抗体価は、L. gasseri OLL2716株を投与したマウスにおいて最も低かった。
【００４９】
よって、胃がH. pyloriに感染したマウスにおいて、L. gasseri OLL2716株が、H. pyloriに対する除菌能が最も高いことが観察された。
結果は図８および図９に示される。
【００５０】
本発明を詳細にまた特定の実施態様に関して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。ここに引用されるすべての文献は、全体として取り込まれる。
【００５１】
本出願は、2002年4月12日出願の日本特許出願（特願2002−111083）、2002年7月23日出願の日本特許出願（特願2002−213338）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、H. pylori除菌能が高く、低ｐH環境に耐性を有し、生残性が高いL. gasseriに属する乳酸菌を含有するナチュラルチーズを得ることができる。このナチュラルチーズにおいては、L. gasseri生菌を長期間保持できる。さらに、一般のナチュラルチーズと同様、そのまま経口投与に供すことができることから、健常者はもとより、乳幼児、老齢者、病弱者、病後の人等も長期間にわたって摂取することができ、胃炎や胃潰瘍等に特に優れた予防及び／又は治療効果を奏する。
【００５３】
前述したように、チーズ製造や保存において、標準的なチーズの製造条件や保存条件をとることで、L. gasseri菌数を十分量維持することも可能である。さらに、この製造工程に、酵母エキスを添加する工程、型詰・圧搾後のチーズカードを保温する工程を加えることで、L. gasseriの増殖活性、生残性が一層増強され、他の乳酸菌と比較してL. gasseriが優位に増殖し、この菌数を長期にわたって維持することが可能となることから、少量の食品摂取量でL. gasseriの必要菌数を十分量摂取することができる点においても、非常に有用な発明といえる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】L. gasseri入りチェダーチーズの菌数変化を示す（実施例１）。
【図２】L. gasseri入りゴーダチーズの菌数変化を示す（実施例２）。
【図３】L. gasseri増菌ゴーダチーズの菌数変化を示す（実施例３）。
【図４】L. gasseri入りストリングチーズの菌数変化を示す（実施例４）。
【図５】L. gasseri入りチーズの抗H. pylori効果を示す（実施例５）。■及び△は、L. gasseri入りチーズとH. pyloriを混合培養した際の、H. pylori及びL. gasseriの生菌数をそれぞれ示す。また◆は、L. gasseri非添加チーズとH. pyloriを混合培養した際（対照）の、H. pyloriの生菌数を示す。
【図６】L. gasseriの耐塩性を示す（試験例１）。
【図７】酸性条件下での種々の乳酸菌の生育を示す（試験例２）。
【図８】H. pyloriの胃内の残存数を示す（試験例３）。
【図９】抗H. pylori抗体価を示す（試験例３）。
【図１】
2005522202.tif 000012
【図２】
2005522202.tif 000013
【図３】
2005522202.tif 000014
【図４】
2005522202.tif 000015
【図５】
2005522202.tif 000016
【図６】
2005522202.tif 000017
【図７】
2005522202.tif 000018
【図８】
2005522202.tif 000019
【図９】
2005522202.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月30日(2003.12.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
【表７】
2005522202.tif 000021
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005522202.tif 000022
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2005522202.tif 000023
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2005522202.tif 000024
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2005522202.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月21日(2004.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
カード形成前の乳成分に酵母エキスを添加することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のナチュラルチーズの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
即ち、本発明は、以下の（１）から（１０）に関する。
（１）Helicobacter pylori除菌能を有するLactobacillus gasseriに属する乳酸菌を含有すること、を特徴とするナチュラルチーズ。
（２）乳酸菌が低ｐＨ環境に耐性を有する（１）記載のナチュラルチーズ。
（３）乳酸菌がLactobacillus gasseri OLL 2716株(FERM BP-6999)もしくはその変異体である（１）又は（２）に記載のナチュラルチーズ。
（４）乳酸菌が１０℃以下、６ヶ月の保存で１０7cfu/g以上生残する（１）〜（３）のいずれか１項に記載のナチュラルチーズ。
（５）（１）〜（４）のいずれか１項に記載のナチュラルチーズを含有すること、を特徴とする食品。
（６）カード形成前の乳成分に酵母エキスを添加することを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１項に記載のナチュラルチーズの製造方法。
（７） 型詰・圧搾後のカードを冷蔵しないで保温する（６）に記載の方法。
（８）カードを２０℃〜３５℃で１６〜２６時間保温する（６）または（７）記載の方法。
（９）Helicobacter pylori除菌能を有するLactobacillus gasseriに属する乳酸菌が原乳にスターターとして添加される（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）乳酸菌がLactobacillus gasseri OLL 2716株(FERM BP-6999)もしくはその変異体である（６）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
【表４】
2005522202.tif 000026
【国際調査報告】
2005522202.tif 000027
2005522202.tif 000028
2005522202.tif 000029