(57)【要約】ＶＥＧＦ−Ｂは、心筋梗塞後の心筋血管再生に必要であることが示されており、特に虚血性哺乳動物に於ける、新血管形成および／又は動脈形成などの、血管発達を促進又は刺激するための方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体における組織の血管新生を促進する方法であって、その処置を必要とする前記生体に対して、有効血管新生誘導量のＶＥＧＦ−Ｂを投与する工程を有する方法。
【請求項２】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、組換えＶＥＧＦ−Ｂタンパク質の直接注入によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、虚血筋肉組織へのＶＥＧＦ−Ｂタンパク質の大量瞬時投与によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記虚血筋肉組織は心筋である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記虚血筋肉組織は、虚血肢の筋肉である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、浸透圧ポンプを介した持続注入によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、冠内投与によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、静脈内投与によって投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチドの遺伝子移入によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子移入は、裸（ｎａｋｅｄ）ＶＥＧＦ−Ｂ  ＤＮＡの直接注入によって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子移入は、プロモータ配列に操作的に連結したＶＥＧＦ−Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターの注入によって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子移入は、ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質を発現するように操作されたエクソ・ヴィヴォで拡張した内皮前駆細胞の導入によって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子移入は、損傷動脈壁への経皮的アデノウィルス−媒介ＶＥＧＦ−Ｂデリバリーによって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子移入は、アデノウィルスベクター又は、複製欠損レトロウィルスベクターを使用した動脈内遺伝子移入によって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、心筋注入によって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、虚血肢の筋肉への直接注入によって投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体は、冠状動脈疾患による慢性安定狭心症、致命的肢虚血症、慢性静脈性下肢潰瘍、糖尿病性神経障害、出生後動脈不全症、再狭窄、虚血性心血管系疾患、および末期冠状動脈疾患から成るグループから選択される病状を患う、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＥＧＦ−Ｂは、虚血組織の間近への、活性物質を含ませたマイクロペレットの移植によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦ−Ａ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰｌＧＦ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｃ，ＰＤＧＦ−ＤおよびＦＧＦから成るグループから選択される少なくとも1つの別の増殖因子と共に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
新血管形成および／又は動脈形成によって虚血心臓組織の血管新生を刺激する方法であって、前記組織に対して、新血管形成および／又は動脈形成刺激量のＶＥＧＦ−Ｂを投与する工程を有する方法。
【請求項２１】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、虚血心臓組織へのＶＥＧＦ−Ｂタンパク質の大量瞬時投与によって投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、浸透圧ポンプを介した持続注入によって投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＶＥＧＦ−Ｂは、虚血組織の間近への、ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質を含ませたマイクロペレットの移植によって投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
ＶＥＧＦ−Ｂは、プロモータ配列に操作的に連結したＶＥＧＦ−Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むウィルスベクターに虚血組織を接触させることによって投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＶＥＧＦ−Ｂは、前記虚血心臓組織への裸（ｎａｋｅｄ）ＶＥＧＦ−Ｂ  ＤＮＡの直接注入によって投与される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冠状動脈梗塞後において心筋の血管再生を刺激および／又は促進する新しい方法の提供、および、哺乳動物の虚血状態又は循環性の機能不全を、血管新生を刺激又は促進することによって治療する方法の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管発生（vasculogenesis）、即ち、血管の新規（デ・ノボ）形成、と、新血管形成（angiogenesis）、即ち、既存のものからの新しい毛細管の成長、は、胎児発達と、成体の正常な生理機能とにとって極めて重要である[カーメリエ，ピー（Carmeliet, P.），「新血管形成と動脈形成の機構。（Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis.）」Nat Med. 2000 6 (4) 389-95]。これらのプロセスの不全は、血管樹と身体成長の形成障害の結果としての胎児の早期死をもたらす。成体において、異常な新血管形成は、損傷治癒障害、虚血性状態に於ける組織再生不良、メスの生殖系の周期的増殖、および腫瘍発達をもたらす可能性がある[カーメリエ，ピー（Carmeliet P.）およびアール・ケイ・ジェイン（R.K. Jain），「癌およびその他の疾患における新血管形成。（Angiogenesis in cancer and other diseases.）」Nature, 2000 407 (6801) 249-57]。
【０００３】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーの増殖因子は、生理学的および病理的新血管形成において最も重要な役割を果たしている。これまで、ＶＥＧＦ−Ａ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−ＤおよびＰｌＧＦを含む５種類のＶＥＧＦファミリーメンバが発見されている[リ，エックス（Li, X.）およびユー・エリクソン（U. Eriksson），「新規なＶＥＧＦファミリーメンバ；ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ。（Novel VEGF family members: VEGF-B, VEGF-C and VEGF-D.）」Int J Biochem Cell Biol, 2001 33(4) 421-6]。それらの中で、ＶＥＧＦ−Ａが最も強力な血管新生因子（angiogenicfactor）であるが、これはその発現の微妙な制御と調節を必要とする。１つのＶＥＧＦ対立遺伝子が欠如しただけでも胚にとって致命的である[カーメリエ，ピー（Carmeliet P.）他，「単一のＶＥＧＦ対立遺伝子が欠如した胚における血管発達異常と致死性。（Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele.）」 Nature, 1996 380 (6573) 435-39；およびファーララ・エヌ（Ferrara N）他，「ＶＥＧＦ遺伝子の標的不活性化によって誘導されるヘテロ接合体胎児の致死性。（Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene.）」Nature, 1996 380 (6573) 439-42]。ＶＥＧＦ−Ａは、四つのレセプタ、ＶＥＧＦＲ−１, ＶＥＧＦＲ−２, ニューロピリン−１とニューロピリン−２、に結合する[ポルトラック，ゼット（Poltorak, Z.），ティ・コーヘン（T. Cohen）およびジー・ノイフェルト（G. Neufeld），「ＶＥＧＦスプライスバリアント、その性質、レセプタ、およびその虚血性疾患の治療のための利用法。（The VEGF splice variants: properties, receptors, and usage for the treatment of ischemic diseases.）」 Herz, 2000 25(2) 126-9]。これらのレセプタを介して、ＶＥＧＦ−Ａは、内皮細胞増殖を促進し、血管透過性を誘導し、単球を化学誘引する。ＶＥＧＦ−Ａ発現は、低酸素状況によって効率的にアップレギュレートされる。その強力な新血管形成能力により、ＶＥＧＦ−Ａは、生理的な新血管形成が必要とされる虚血性疾患に於ける治療に対して潜在的に有用なものとなっている。しかしながら、ＶＥＧＦ−Ａの臨床使用は、その重大な副作用により、妨げられてきた[カーメリエ，ピー（Carmeliet, P.），「VEGF遺伝子療法: 新血管形成又は血管腫形成を刺激するか？（VEGF gene therapy: stimulating angiogensisor angioma-genesis?）」Nat Med, 2000 6(10) 1102-03]。
【０００４】
ＶＥＧＦ−Ｂは、三番目に発見されたＶＥＧＦファミリーのメンバであった（ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃとのあと）[オロフソン・ビー（Olofsson B）他，「血管内皮細胞増殖因子Ｂ、血管内皮細胞の新規な増殖因子。（Vascular endothelial growth factor B, a novel growth factor for endothelial cells.）」米国科学アカデミーの予稿集、1996 93 (6) 2576-81], [グリモンド・エス（Grimmond S）他，「血管内皮増殖因子に関係する新規なヒト遺伝子のクローニングと特徴付け。（Cloning and characterization of a novel human gene related to vascular endothelial growth factor.）」Genome Research, 1996, 6 (2) 124-31]。ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦ−Ａに類似の新血管形成およびその他の特性を有するが、分布され発現される組織においてＶＥＧＦ−Ａと異なる。特に、ＶＥＧＦ−Ｂは、心臓で非常に強く発現され、肺では弱くしか発現されないのに対して、ＶＥＧＦ−Ａの場合はその逆である[オロフソン，ビー（Olofsson, B）他，Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1996 93 2576-2581]。ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、メラノーマ、正常な皮膚、および筋肉におけるＶＥＧＦ−Ｂの存在が示された。このことは、ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｂとが、これらが共に多く組織において同時発現されるという事実にも拘わらず、機能上の相違を有することを示唆するものである。ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子の比較は、ＶＥＧＦ−Ｂの１６７アミノ酸のアイソフォームが、グリコシル化が完全に欠如している唯一のファミリーメンバであることを明らかにしている。遺伝子標的研究によって、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損によって、軽い心臓表現型と、心臓血管系の障害が生じることが示された[ベッローモ（Bellomo）他，Circ Res, 2000 86 E29-35]。
【０００５】
ヒトＶＥＧＦ−Ｂは、細胞レチノイン酸結合タンパク質タイプＩ（ＣＲＡＢＰ−１）と相互作用する可能性のある細胞タンパク質をスクリーニングすることによって、酵母コ-ハイブリッド相互作用トラップ法を使用して単離された。ヒトＶＥＧＦ−ＢとマウスＶＥＧＦ−Ｂとの両方の単離とヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む特徴とが、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７、Ludwig Institute for Cancer Research and The University of Helsinki の米国特許5,840, 693および5,607,918とオロフソン（Olofsson）他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 2576-2581とに詳細に記載されている。ヒトＶＥＧＦ−Ｂのヌクレオチド配列は、GenBank Accession No. U48801にも含まれている。前記国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）、米国特許5,840,693および5,607,918の開示全部をここに参考文献として合体させる。
【０００６】
ＶＥＧＦ−Ｂのヒト遺伝子とマウス遺伝子はほとんど同じであり、共に、約４ｋｂのＤＮＡに渡って延出している。これらの遺伝子は、７つのエクソンからなり、それらのエクソン−イントロン機構は、ＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦ遺伝子のそれに類似している[グリモンド（Grimmond）他，Genome Res, 1996 6 124-131；オロフソン（Olofsson）他，J. Biol. Chem. 1996 271 19310-17；タウンソン（Townson）他，Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996 220 922-928]。
【０００７】
ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦＲ−１に特異的に結合する[オロフソン・ビー（Olofsson B）他，「血管内皮細胞増殖因子Ｂ、血管内皮細胞の新規な増殖因子。」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 (6) 2576-81]およびニューロピリン−１[オロフソン・ビー（Olofsson B）他，「血管内皮細胞増殖因子Ｂ（Ｖｅｇｆ−Ｂ）は、Ｖｅｇｆレセプタ−１に結合し、内皮細胞におけるプラスミノーゲンアクチベータ活性を調節する。（Vascular Endothelial Growth Factor B (Vegf-B) Binds to Vegf Receptor-1 and Regulates Plasminogen Activator Activity In Endothelial Cells.）」Proc Nat’l Acad Sci USA, 1998 95 (20) 11709-14]、コラプシン／セマフォリンに関して以前に同定されたレセプタ[ソーカー，エス（Soker, S.），「細胞遊走および退縮における、ニューロピリン。（Neuropilinin the midst of cell migration and retraction.）」Int J Biochem Cell Biol, 2001 33(4) 433-37]。ＶＥＧＦ−Ｂは、他のＶＥＧＦファミリーメンバと比較して独特の表現パターンを示し、心筋細胞中において最も発現レベルが高く[アーセ，ケイ（Aase K）他，「マウス胎児におけるＶＥＧＦ−Ｂの局在性は、発達中の血管系における該増殖因子のパラクリン的役割を示唆している。（Localization of VEGF-B in the mouse embryo suggests a paracrinerole of the growth factor in the developing vasculature.）」Developmental Dynamics, 1999 215(1) 12-25]、これに対してＶＥＧＦＲ−１は、隣接する内皮細胞に発現され[アーセ，ケイ（Aase K）他，「マウス胎児における、ＶＥＧＦ−Ｂの局在性は、発達中の血管系における該増殖因子のパラクリン的役割を示唆している。」Developmental Dynamics, 1999 215(1) 12-25]、そしてニューロピリン−１（ＮＰ−１）は、発達中の内皮細胞と心筋との両方に発現される[マキネン・ティ（Makinen T）他，「ニューロピリン−１に対する血管内皮増殖因子Ｂの種々のスプライスおよび蛋白分解アイソフォームの結合の相違。（Differential binding of vascular endothelial growth factor B splice and proteolyticisoforms to neuropilin-1.）」Journal of Biological Chemistry, 1999 274(30) 21217-22；およびキツカワ・ティ（Kitsukawa T）他，「キメラマウスにおける膜タンパク質、ニューロピリンの過剰発現は、心臓血管系、神経系、および肢における異常を引き起こす。（Overexpression of a membrane protein, neuropilin, in chimeric mice causes anomalies in the cardiovascular system, nervous system and limbs.）」Development, 1995 121(12) 4309-18]。ＶＥＧＦ−Ｂとそのレセプタの時間−空間的発現パターンは、心臓に於けるＶＥＧＦ−Ｂのオートクリン的役割とパラクリン的役割の両方を示唆している[マキネン・ティ（Makinen T）他，「ニューロピリン−１に対する血管内皮増殖因子Ｂの種々のスプライスおよび蛋白分解アイソフォームの結合の相違」J. Biol. Chem., 1999 274(30) 21217-22]。ＶＥＧＦ−Ｂは、共発現される時ＶＥＧＦ−Ａとヘテロダイマー化する[オロフソン・ビー（Olofsson B）他，「血管内皮細胞増殖因子Ｂ（Ｖｅｇｆ−Ｂ）、新規の内皮細胞増殖因子。」 Proc Nat’l Acad Sci USA, 1996 93 (6) 2576-81]。スプライシングの異なる２つのＶＥＧＦ−Ｂアイソフォーム、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６とＶＥＧＦ−Ｂ１６７、が存在し、前者のアイソフォームがＶＥＧＦ−Ｂ転写物全体の約８０％を占める[リ，エックス（Li, X.）他，Growth Factor 2001 19 49-59]。これら二つのポリペプチドは、それらのカルボキシ末端が異なり、ニューロピリン-1に対する異なる結合能力を示す[マキネン（Makinen）他，J. Biol. Chem. 1999 274 (30) 21217-22]。更に、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６は自由に分泌されるのに対して、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７は細胞会合されて分泌され、このことは、これら２つのタンパク質の機能的特質が異なっているかもしれないことを示唆している。両アイソフォームは、細胞外マトリックス  テネイシンＸに結合し、ＶＥＧＦ−レセプタ−１（ＶＥＧＦＲ−１）を介して内皮細胞増殖を刺激する[イクタ・ティ（Ikuta, T.），エイチ・アリガ（H. Ariga），およびケイ・マツモト（K. Matsumoto），「細胞外マトリックス  テネイシンＸは、血管内皮増殖因子Ｂとの組み合わせで、内皮細胞増殖を増大させる（Extracellular matrix tenascin-X in combination with vascular endothelial growth factor B enhances endothelial cell proliferation.）」Genes Cells, 2000 5 (11) 913-927]。
【０００８】
ＶＥＧＦ−Ｂが欠如したマウスにおける毛細管密度は正常なマウスと同じである。しかし、遺伝子標的化研究によって、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損は、ＰＱ間隔の延長と、冠状動脈血管系の損傷とによって特徴付けられる心房伝導異常を引き起こすことが示された[アーセ・ケイ（Aase K.）他，Circulation 2001 104 358-64; WO98/36052およびベッローモ・ディ（Bellomo D.）他，「血管内皮細胞増殖因子−Ｂ遺伝子（Ｖｅｇｆｂ）が欠如したマウスは、心臓が小さく、冠状動脈血管系の機能障害と、心臓虚血からの回復障害を有する。（Mice lacking the vascular endothelial growth factor-B gene (Vegfb) have smaller hearts, dysfunctional coronary vasculature, and impaired recovery from cardiac ischemia.）」Circulation Research, 2000 86 (2) E29-E35]。従って、蓄積されたデータは、ＶＥＧＦ−Ｂが、心血管系の生理学的状態と病理的状態との両方において重要な役割を有することを示唆している。
【０００９】
ＶＥＧＦ−Ｂは、更に、腫瘍の発達にも関連しているかもしれない。ＶＥＧＦ−ＢｍＲＮＡは、多くの腫瘍と、大半の腫瘍細胞ラインにおいて検出することができる[ガニンガム，エス・ピー（Gunningham, S.P.）他，「ヒトの原発乳がんにおけるＶＥＧＦ−Ｂ発現は、リンパ節転移に関連するが、新血管形成には関連していない。（VEGF-B expression in human primary breast cancers is associated with lymph node metastasis but not angiogenesis.）」J. Pathol, 2001 193(3) 325-32；アンドレ，ティ（Andre, T.）他，「ヒトの結腸粘膜の腫瘍形成進行におけるＶｅｇｆ，Ｖｅｇｆ−Ｂ，Ｖｅｇｆ−ＣおよびそれらのレセプタＫＤＲ，ＦＬＴ−１およびＦＬＴ−４。（Vegf, Vegf-B,Vegf-C and their receptors KDR, FLT-1 and FLT-4 during the neoplasticprogression of human colonic mucosa.）」Int J Cancer, 2000 86(2) 174-81；エッガート，エイ（Eggert, A.）他，「血管新生因子の高レベル発現は、ヒト神経芽細胞腫の発達した腫瘍期に関連している。（High-level expression of angiogenic factors is associated with advanced tumor stage in human neuroblastomas.）」Clin Cancer Res, 2000 6(5) 1900-08；ニキ・ティ（Niki, T.）他，「肺アデノカルシノーマにおける血管内皮細胞増殖因子Ａ，Ｂ，ＣおよびＤの発現と、リンパ節状態に対するそれらの関係。（Expression of vascular endothelial growth factors A, B, C, and D and their relationships to lymph node status in lung adenocarcinoma.）」 Clin Cancer Res, 2000 6(6) 2431-9；およびサルヴェン・ピー（Salven P）他，「血管内皮細胞増殖因子Ｖｅｇｆ−ＢおよびＶｅｇｆ−Ｃは、ヒト腫瘍に発現される（Vascular Endothelial Growth Factors Vegf-B and Vegf-C Are Expressed In Human Tumors.）」Am. J. Pathology, 1998 153 (1) 103-108]。ＶＥＧＦ−Ｂ発現は、卵巣上皮腫瘍の腫瘍関連マクロファージにおいて特にアップレギュレーションされる[ソウター・エイチ（Sowter H.）他，「卵巣上皮腫瘍における血管内皮細胞増殖因子ファミリーの発現と局在性。（Expression and Localization Of the Vascular Endothelial Growth Factor Family In Ovarian Epithelial Tumors.）」Laboratory Invest. 1997 77 (6) 607-14]および腎臓細胞癌腫[ガニンガム，エス・ピー（Gunningham, S. P.）他，「腎臓細胞癌腫における血管内皮細胞増殖因子Ｂおよび血管内皮細胞増殖因子Ｃの発現、フォン  ヒッペル  リンドウ遺伝子および低酸素状況による調節。（Vascular endothelial growth factor-B and vascular endothelial growth factor-C expression in renal cell carcinomas: regulation by the von Hippel-Lindaugene and hypoxia.）」Cancer Res. 2001 61(7) 3206-11]。
【００１０】
急性および慢性心筋虚血症は、工業化社会において、冠状動脈血栓症によって引き起こされる主用な罹病および死亡原因である[ヴァーベラ・エフ（Varbella, F.）他，「初期の急性心筋虚血症における亜急性左心室自由壁破裂。二つのケースの臨床報告と文献の考察。（Subacute left ventricular free-wall rupture in early course of acute myocardial infarction. Clinical report of two cases and review of the literature.）」G Ital Cardiol, 1999 29 (2) 163-70]。心梗塞直後における酸素欠乏は、梗塞した領域の細胞死、その後の、正常な収縮能力の必要を補償するための残存する生存可能な心筋細胞の肥大を引き起こす[ヘイマンズ・エス（Heymans S），「プラスミノーゲンアクチベーター又はマトリックスメタロプロイテナーゼの阻害は、心臓破裂を防止するが、治癒的血管新生を阻害し、心不全を引き起こす。（Inhibition of plasminogen activators or matrix metalloproteinases prevents cardiac rupture but impairs therapeutic angiogenesis and causes cardiac failure.）」Nat. Med., 1999 5(10) 1135-42]。梗塞した左心室壁の血液によって、梗塞後に再灌流を促進することにより、肥大した生存可能な筋細胞のアポトーシスと病的な心室のリモデリングを防止することによって、早期死亡率と、その後の心不全を大幅に減少させることができる[ダルリンプル−ヘイ，エム・ジェイ（Dalrymple-Hay, M. J.）他，「梗塞後の心室中隔破裂。（Postinfarctionventricular septal rupture）」；the Wessexexperience, Seminar Thorac CardiovascSurg, 1998 10 (2) 111-16]。
【００１１】
新血管形成を促進することは、たとえば、血管新生が、組織又は臓器移植後、等のような、確立又は拡張されるべき状況、或いは、冠状動脈疾患や閉塞性血栓性血管炎等におけるような、組織梗塞又は動脈狭窄における側副循環の確立を刺激する状況において望ましい。血管新生プロセスは、高度に複雑であり、細胞周期における内皮細胞の維持、細胞外マトリックスの分解、周囲組織の遊走および浸潤、そして最後に、管の形成を含む。あまりにも多くの病理的プロセスにおいて血管新生が非常に重要な役割を果たしていることから、血管新生を促進する因子を開発する必要がある。
【００１２】
ＶＥＧＦ−ＡやＦＧＦ−２等の増殖因子の投与が、虚血性心疾患および肢障害の治療の為の可能なアプローチと見なされてきた。しかしながら、ＶＥＧＦ血管新生による動物実験と初期臨床試験とは共に重大な問題に遭遇した[カーメリエ（Carmeliet），Nat Med, 2000 61102-3；ヤンコポロス（Yancopoulos）他，Nature, 2000 407 242-8；ヴァイッコラ（Veikkola）他，Semin Cancer Biol 1999 9 211-20；ドゥヴォラック（Dvorak）他，Semin Perinatol 2000 24 75-8；リー（Lee）他，Circulation, 2000 102 898-901]。ＶＥＧＦ−Ａ刺激された微小血管は、腫瘍に見られるものに非常に類似して、無秩序で、類洞状で、膨張されている[リー（Lee）他，Circulation 2000 102 898-901；およびスプリンガー（Springer）他，Mol. Cell 1998 2 549-599]。更に、これらの血管は、通常、漏出性で、灌流不良で、蛇行し、破裂し、退行する可能性が高い。従って、これらの血管が、心筋の虚血状態を改善する能力は限られている。更に、ＶＥＧＦ−Ａ（血管透過性因子としても知られている）によって誘導された血管の漏出によって、心不全を引き起こす心臓浮腫が生じる可能性がある。心筋中における未制御のＶＥＧＦ−Ａ発現によって、更に、血管腫の発達又は、機能血管ではなく遠位の臓器における微小転移巣の増殖が引き起こされる可能性もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、従来技術において達成された臨床治療法および予防法にはいくつかの進歩があるが、不十分な又は異常な梗塞後の血管再生が、いまだに、その他の点では生存可能な心筋の死の主要な原因であり、これによって、進行性の梗塞部拡張と、線維性置換、そして、最終的には心不全が生じる。従って、最小の毒性で、正常な梗塞後血管再生を促進する治療剤がいまだに求められており、新しい血管新生因子と、新血管形成治療のための新しい方法がいまだに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の課題は、冠状動脈梗塞後において心筋の血管再生を刺激および／又は促進する新しい方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の課題は、哺乳動物の虚血状態又は循環性の機能不全を、血管発生を刺激又は促進することによって治療する方法を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
これらおよびその他の課題は、本発明の第一態様において、生体の組織の血管新生を促進する方法であって、そのような治療を必要とする前記生体に、ＶＥＧＦ−Ｂ又は、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログを、有効量投与する工程を有する方法、の提供によって達成される。
【００１７】
本発明の他の側面において、課題は、虚血組織の血管新生を刺激する方法であって、ＶＥＧＦ−Ｂ又は、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログを、有効新血管形成刺激量投与する工程を有する方法、の提供によって達成される。
【００１８】
本発明の別の態様において、前記課題は、動脈形成（anteriogenesis）、又は、既存の筋肉性（muscularized）動脈、即ち、側副血管、の拡張、を刺激する方法の提供によって達成される。
【００１９】
本発明のこれらの課題は、又、本発明の更に別の態様において、それを必要とする哺乳動物の血管新生を刺激する方法であって、前記哺乳動物に対して、治療的有効量のＶＥＧＦ−Ｂ、又は、新血管形成激活性を有するそのフラグメント又はアナログ、を投与する工程を有する方法の提供によっても達成される。
【００２０】
ここでの使用において、「血管新生（vascularization）」という用語は、毛細管の新血管形成、又は、動脈形成、あるいはこれらの両方による、新しい血管の発生、又は、既存の血管の拡張、を含む総称的意味に使用される。
【００２１】
梗塞後の虚血性疾患は、血液流の減少の結果としての灌流障害による。これらの問題は、梗塞領域に血液を再潅流することによって軽減することができる。梗塞領域における大半の血管および心筋細胞は、死に、線維芽細胞によって置き換えられて瘢痕組織を形成するので、これは、梗塞領域の新しい血管に依存する血液流の増加によってのみ達成されることが可能である。従って、梗塞心筋の有効な血管再生によって、アポトーシス等を防止することにより、早期死亡率と、その後の心不全を大幅に減少させることができる。
【００２２】
ＶＥＧＦ−Ｂによる血管発生又は新血管形成治療の候補状態としては、特に、（１）血管造影的に実証された冠状動脈疾患による慢性安定狭心症を有する患者[カーメリエ・ピー（Carmeliet P）およびコレン・ディ（Collen D.）新血管形成および心血管疾患におけるトランスジェニックマウスモデル[Review], J. Pathology, 2000 190 (3) 387-405]；（２）致命的肢虚血又は慢性静脈性下肢潰瘍を有する患者；（３）糖尿病性神経障害を患う患者[シュラッツベルガー，ピー（Schratzberger, P.）他，ＶＥＧＦ遺伝子移入による実験的糖尿病性神経障害の回復。J. Clin Invest, 2001 107 (9) 1083-92；およびシュラツベルガー，ピー（Schratzberger, P.）他，虚血性末梢神経障害に対するＶＥＧＦ遺伝子移入の好ましい作用、Nat Med, 2000 6 (4) 405-12.]；（４）出生後動脈不全症を有する患者；（５）バルーン血管形成術後の再狭窄を有する患者[カーメリエ・ピー（Carmeliet P），ムーンズ・エル（Moons L）およびコレン・ディ（Collen D），新血管形成、動脈狭窄、アテローム性動脈硬化症、および鬱血のマウスモデル[Review], CardiovasRes, 1998 39 (1) 8-33；およびバウムガルトナー，アイ（Baumgartner, I.）およびアイスナー，ジェイ・エム（Isner, J. M.），心血管系における体細胞遺伝子療法, Annu Rev Physiol, 2001 63 427-50]；（６）虚血性心血管系疾患を有する患者[カーメリエ・ピー（Carmeliet P）他，血管内皮細胞増殖因子アイソフォームＶＥＧＦ(１６４)とＶＥＧＦ(１８８)とが欠損したマウスにおける心筋新血管形成の障害と虚血性心筋症、Nat Med, 1995 5 (5) 495-502およびシモンズ・エム（Simons M.）他，冠状動脈新血管形成の臨床試験、その課題、問題、コンセンサス；An expert panel summary, Circulation, 2000 102 (11) E73-86；および（７）末期冠状動脈疾患を有する患者[レハム，アール・アール（Leham, R J），シモンズ・エム（Simons, M）およびセルケ，エフ（Sellke, F），冠状動脈疾患における新血管形成のための遺伝子移入, Annu Rev Med, 2001 52 485-502]。
【００２３】
本発明に拠れば、血管発生又は新血管形成によって軽減可能な虚血症又はその他の状態を患う患者に対して、有効血管発生促進又は新血管形成刺激量のＶＥＧＦ−Ｂを投与することに使用可能な多くの方法がある。ＶＥＧＦ−Ｂ投与は、組換えタンパク質として、又は、裸（naked）ＤＮＡとして、又は、ベクター中での遺伝子移入、のいずれかによって行うことができる[コルノフスキー・アール（Kornowski R），フックス・エス（Fuchs S），レオン・エムビー（Leon MB），エプスタイン・エスイー（Epstein SE），治療的心筋新血管形成を達成するためのデリバリー戦略, Circulation, 2000 101 (4) 454-8；シモンズ・エム（Simons M.）Bonow RO, Chronos NA, Cohen DJ,Giordano FJ, ハモンド・エイチケイ（Hammond HK）他，冠状動脈血管新生の臨床試験、その課題、問題、コンセンサス; An expert panel summary, Circulation, 2000 102 (11) E73-86; およびアイスナー・ジェイエム（Isner JM），アサハラ・ティ（Asahara T），出生後新生血管新生（neovascularization）のための治療戦略としての新血管形成と血管発生, J Clin Invest, 1999 103 (9) 1231-36]。もしも望まれるのであれば、調節可能なベクターをオザワ（Ozawa）他，Annu Rev Pharmacol. & Toxicol, 2000 40 295-317に記載されているように使用してもよい。
【００２４】
たとえば、ＶＥＧＦ−Ｂは、ヴェール，ピー・アール（Vale, P.R.）他，慢性心筋虚血症における治療的新血管形成のためのｐｈＶＥＧＦ（１６５）遺伝子移入の効力を評価するための左心室の電気機械的マッピング, Circulation, 2000 102 965-74に概略されている手順に従って、慢性心筋虚血症を有する患者において外科手術中にＶＥＧＦ−Ｂをコードする裸（naked）プラスミドＤＮＡの直接心筋注入によって投与することができる。
【００２５】
ＶＥＧＦ−Ｂは、又、小開胸術による、ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質の直接心筋注入によっても投与することができる。好ましくは、それは、１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、５μｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．２から２ｍｇ／ｋｇの大量瞬時投与量として投与される。持続注入も、たとえば、ヘイマン（Heyman）他，Nat Med, 1999 5 1135-152に記載されているように浸透圧ミニポンプによって、使用することができる。又、その場合には、薬剤を、５〜２０μｇ／ｋｇ／分、好ましくは、７〜１５μｇ／ｋｇ／分の投与量で注入することができる。
【００２６】
或いは、ＶＥＧＦ−Ｂは、カテーテルを利用した心筋ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子移入によっても投与することができる。この技術において、２７ゲージのニードルを備える、操縦可能で、偏向可能な８Ｆカテーテルを左心室心筋へと経皮的に送り込む。２００μｇ／ｋｇの全投与量を、虚血性心筋へ６回の注入によって投与する（全量で６．０ｍＬ）。注入は、ＮＯＧＡ左心室電気機械式マッピングによって案内される。ヴェール，ピー・アール（Vale, P. R.）他，慢性心筋虚血症を有する患者における左心室電気機械式マッピングを使用した治療用新血管形成のためのカテーテル利用心筋遺伝子移入の、ランダム、単盲検試験、プラセボ対象予備試験（pilot study）, Circulation, 2001 103 (17) 2138-43を参照。
【００２７】
ＶＥＧＦ−Ｂ投与のもう1つの可能性は、シモヴィック，ディ（Simovic, D.）他，致命的肢虚血症患者における筋肉内ｐｈＶＥＧＦ１６５遺伝子移入後の慢性虚血性神経障害の改善, Arch Neurol, 2001 58 (5) 761-68、に記載されている手続きに従った、ＶＥＧＦ−Ｂプラスミドの虚血性肢の筋肉への注入である。
【００２８】
有効なＶＥＧＦ−Ｂ投与のための更に別の方法は、バウムガルトナー・アイ（Baumgartner I）およびアイスナー・ジェイエム（Isner JM），心臓血管系の体細胞遺伝子療法、Annu Rev Physiol, 2001 63 427-50に記載されている、アデノウィルスおよび複製欠損レトロウィルスを使用したＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の動脈内遺伝子移入によるものである。
【００２９】
ＶＥＧＦ−Ｂ投与のための更に別の可能性は、ポスト，エム・ジェイ（Post, M.J.）他，タンパク質製剤を使用した心臓病学における治療的新血管形成, CardiovascRes, 2001 49 522-31に記載の手順に従った、組換えＶＥＧＦ−Ｂタンパク質の冠内および静脈内投与によるものである。
【００３０】
更に別の可能性は、カワモト，エイ（Kawamoto, A.）他，心筋虚血症のためのエクソ・ヴィヴォ（ex vivo）で拡張した内皮前駆細胞の治療的可能性, Circulation, 2001 103 (5) 634-37に記載の心筋新血管発生のためにＶＥＧＦ−Ｂを発現するように構成されたエクソ・ヴィヴォで拡張した内皮前駆細胞（ＥＰＣ）を使用することである。
【００３１】
ＶＥＧＦ−Ｂを投与するために利用可能な更に別の技術は、損傷したアテローム性ステント動脈の動脈壁に対する経皮的アデノウィルス媒介ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子デリバリーである。たとえば、メイラード，エル（Maillard, L.）他，二重損傷した（double-injured）アテローム性ステント  ラビット腸骨動脈の動脈壁に対する経皮的アデノウィルス媒介Ｇａｘ遺伝子デリバリーの効果、Gene Ther, 2000 7 (16) 1353-61；およびラハム・アールジェイ（Laham RJ），シモンズ・エム（Simons M），およびセルケ・ピー（Sellke P），冠状動脈疾患における新血管形成のための遺伝子移入, Annu Rev Med, 2001 52 485-502、を参照。
【００３２】
本発明の好適態様において、治癒的有効投与量のＶＥＧＦ−Ｂが、虚血組織、たとえば、心臓又は周辺筋肉組織への、活性物質の大量瞬時投与注射によって投与される。前記有効投与量は、前記虚血対象体の体重と状態、および、治療されるべき虚血状態の性質、に応じて変化する。所与の対象体と状態のために適当な投与量を決定することは当業者の技量範囲内であると考えられる。
【００３３】
本発明の更に別の態様において、ＶＥＧＦ−Ｂは、患者が機能的血管網を自分で維持できるようになるまで、たとえば浸透圧ミニポンプを使用して、持続デリバリーによって投与される。
【００３４】
本発明の範囲内の更に別の好適な態様において、ＶＥＧＦ−Ｂは、虚血対象体に対して、虚血組織を、プロモータ配列に操作的に連結されたＶＥＧＦ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列を含むアデノウィルスベクター等のウィルス性ベクターと接触させることによって、効果的に投与される。
【００３５】
ＶＥＧＦ−Ｂは、更に、虚血組織の直接近傍に、活性物質を含んだマイクロペレットを移植することによっても有効に投与可能である。
【００３６】
所望の場合には、ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦ−Ａ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰｌＧＦ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｃ，ＰＤＧＥ−ＤおよびＦＧＦから成るグループから選択される少なくとも１つの別の増殖因子と共に投与することができる。
【００３７】
前記活性ＶＥＧＦ−Ｂ物質は、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７および／又はＶＥＧＦ−Ｂ１８６アイソフォーム、又は、血管再生、新血管形成および／又は動脈形成を刺激および／又は促進する能力を有するそのフラグメント又はアナログ、を有するものとすることができる[オロフソン・ビー（Olofsson B）他，血管内皮細胞増殖因子Ｂ（Ｖｅｇｆ−Ｂ）は、Ｖｅｇｆレセプタ−１に結合し、内皮細胞におけるプラスミノーゲンアクチベーター活性を調節する, Proc Nat’l Acad Sci USA, 1998 95 (20) 11709-14]。活性アナログは、ＢＬＡＳＴ分析による測定で、天然のＶＥＧＦ−Ｂポリヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、特に好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性、そして、更に好ましくは、少なくとも９８％の配列同一性、を有するべきである。
【００３８】
ここでの使用において、「ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質」という用語は、公知のＶＥＧＦ−Ｂ１６７およびＶＥＧＦ−Ｂ１８６ポリペプチドアイソフォームのみならず、ＶＥＧＦ−Ｂの血管発生刺激活性を有するそのフラグメント又はアナログ、更に、ＶＥＧＦ−Ｂ又は血管発生活性を有するそのフラグメント又はアナログをコードするポリヌクレオチド、を指す。前記ポリヌクレオチドは、裸（naked）状態、又はベクター又はリポソーム内に含まれたものとすることができる。前記活性物質は、典型的には、ＶＥＧＦ−Ｂを特徴付けるアミノ酸配列Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys（ここで、Xaaは、任意のアミノ酸であってよい）を含む。
【００３９】
同類置換、挿入、欠失、を有するが、依然、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を維持するポリペプチドも、当然、本発明の範囲に含まれるものと理解される。当業者には、たとえば、部位特異的変異、又は、特異的酵素的切断およびライゲーションの使用等の、そのようなポリペプチドを作り出すために容易に利用可能な方法は周知であろう。当業者は、又、ペプチド類似（peptidomimetic）化合物、又は単数又は複数のアミノ酸残基が、非自然発生アミノ酸又はアミノ酸アナログによって置き換えられた化合物が、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性の要求される側面を保持することができることも周知であろう。そのような化合物は、公知の方法によって容易に製造、テストすることができ、それらも又、本発明の範囲に含まれる。
【００４０】
更に、ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｂとで起こることが知られているように、選択的スプライシングから得られるＶＥＧＦ−Ｂポリペプチドの可能なバリアント型、およびＶＥＧＦ−Ｂをコードする核酸配列の自然発生対立遺伝子バリアントも、本発明の範囲に含まれる。対立遺伝子バリアントは周知であって、単数又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、付加を有するが、それによって、コードされるポリペプチドの機能に実質的な変化が起こらない、代替形態又は核酸配列を指す。
【００４１】
ＶＥＧＦ−Ｂのそのようなバリアント型は、改変のために、ＶＥＧＦ−Ｂポリペプチドの非必須部分を標的化することによって調製することができる。これらの非必須領域は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの増殖因子の強力に保存される領域の外部に位置するものと予想される。特に、ＶＥＧＦ−Ｂを含めて、ＶＥＧＦファミリーの増殖因子は、ダイマーであり、ＶＥＧＦ−Ａ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰｌＧＦ，ＰＤＧＡ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂは、Ｎ末端ドメイン、即ち、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ様ドメインにおいて８つのシステイン残基の完全な保存を示す[オロフソン（Olofsson）他，Proc. Natl Acad Sci USA, 1996 93 2576-2581；ヨウコフ（Joukov）他，EMBO J., 1996 15 290-298]。これらのシステインは、分子内、分子間ジスルフィド結合に関係していると考えられる。更に、Ｃ末端ドメインには、更に強力に、但し完全ではないが、保存されたシステイン残基が存在する。分子内ジスルフィド結合によって形成される、各サブユニットのループ１，２および３は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子に対するレセプタへの結合に関連している[アンダーソン（Andersson）他，Growth Factors, 1995 12 159-64]。
【００４２】
当業者は、単数又は複数のシステインが保存されていないレセプタ結合ＶＥＧＦ−Ｂアナログが知られていることから、例外もあるかもしれないが、大半の場合、これらのシステイン残基が、すべての提案されるバリアント型において保存されるはずであることを周知である。同様に、当業者は、ループ１，２および３に存在する活性部位も、保存されるはずである、と理解するであろう。前記分子のその他の領域は、生物的機能に関して重要度が低いものと予測され、従って、改変のための適当な標的を提供するものとなる。改変ポリペプチドが、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を示す能力を有するか否かは、内皮細胞増殖アッセイなどの標準的な活性アッセイ手順によって容易にテストすることができる。
【００４３】
本発明の別実施例において、タンパク質分解部位が、ＶＥＧＦ−Ａ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｃ，ＰＤＧＦ−Ｄ又はＰｌＧＦの活性化モノマーと、ＶＥＧＦ−Ａ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｃ，ＰＤＧＦ−Ｄ又はＰｌＧＦの活性化モノマーにダイマー化し、このモノマーを一過的に不活性にする変異ＣＵＢドメイン結合との間に挿入される。このタンパク質分解部位に対する特異的プロテアーゼ（単数又は複数）の追加によって、前記ＣＵＢドメインが切断され、それによって、活性化ダイマーを遊離し、このダイマーがその対応のレセプタに結合することができる。このようにして、活性化ダイマーの制御された遊離が可能とされる。
【００４４】
好ましくは、アミノ酸置換が使用される場合、この置換は同類のものとされる、即ち、１のアミノ酸が、類似のサイズで類似の電荷特性を有するものによって置き換えられる。
【００４５】
ここでの使用において、「同類置換」という用語は、アミノ酸の、他の生物学的に類似の残基による置換をいう。同類置換の具体例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、メチオニンなどの１つの疎水性残基の別の残基による置換、たとえば、アルギニンのリジンとの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換、グルタミンのアスパラギンとの置換、のような極性残基の別の残基による置換等、がある。互いに置換可能な天然の親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、がある。「同類置換」という用語は、又、置換されない親のアミノ酸の代わりに、置換されたアミノ酸を使用することも含む。
【００４６】
従って、本発明のコンテクストにおいて、同類置換は、当該技術において、１のアミノ酸の、類似特性を有する別のアミノ酸との置換として認識されると理解されるべきである。同類置換の具体例をＷＯ９７／０９４３３からの下記の表１に示す。
【００４７】
【表１】
2005505510.tif 000002
【００４８】
或いは、同類アミノ酸は、下記の表２に示されているように、レーニンガー（Lehninger）[Biochemistry, 第２版、Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975）, pp.71-77]に記載されているようにグループ分けすることができる。
【００４９】
【表２】
2005505510.tif 000003
【００５０】
同類置換の具体例も次の表３に示す。
【００５１】
【表３】
2005505510.tif 000004
【００５２】
望ましい場合、本発明のＶＥＧＦ−Ｂタンパク質は、たとえば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、或いは、本発明のペプチドの、酸添加塩、アミド、エステル、特に、Ｃ末端エステル、および、Ｎ−アシル誘導体の形成によって改変することができる。これらのタンパク質は、又、他の成分と共有結合又は非共有結合複合体を形成することによって、ペプチド誘導体を形成するように改変することも可能である。共有結合複合体は、化学成分を、前記ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖上の官能基、又は、Ｎ又はＣ末端、において結合することによって調製することができる。
【００５３】
具体的には、前記ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質は、非限定的に、放射標識、蛍光標識、酵素（たとえば、比色定量又は蛍光測定反応を触媒するもの）、基質、固体マトリクス、又はキャリア（たとえば、ビオチン又はアビジン）を含む、レポーター基に共役結合させることができる、と予想される。
【００５４】
ＶＥＧＦ−Ｂアナログの具体例は、ここに参考文献として合体させるＷＯ９８／２８６２１と、オロフソン（Olofsson）他，Proc. Nat’l. Acad. Sci, USA, 1998 95 11709-11714とに記載されている。
【００５５】
本発明の臨床的用途としては、診断用途、組織又は臓器移植に於ける新血管形成の加速、損傷治療又は結合組織発達の刺激、又は、組織梗塞、または、冠状動脈疾患などの動脈狭窄症における側副循環の確立、が含まれる。
【００５６】
ＶＥＧＦ−Ｂ投与には重大な副作用が無いことは、種々のプロモータの存在下でＶＥＧＦ−Ｂを過剰発現するトランスジェニックマウスが、なんら明白な異常を示さないという事実によって示される。このことから、ＶＥＧＦ−Ｂの治療用投与からの副作用は最小限と予測することができる、と結論付けることができる。その不利な副作用が無いことにより、ＶＥＧＦ−Ｂは、非常に初期段階の虚血状態で適宜投与することが可能である。
【００５７】
図面の簡単な説明
本発明を、虚血状態の心筋の血管新生の促進に於けるＶＥＧＦ−Ｂの活性を示す実験を参照して以下詳述する。これらの実験の結果は、添付の図面に図示される。
【００５８】
図１（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、野生型（ＷＴ）とＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）マウスとにおけるトロンボモジュリン染色によって可視化されたマウス心臓の梗塞後血管再生を示す顕微鏡写真である。
【００５９】
図２は、図１（ａ）および（ｂ）からの正常（ＷＴ）およびＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）マウスの梗塞領域における血管再生血管密度を示すグラフである。
【００６０】
図３（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、野生型（ＷＴ）とＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）マウスとにおける平滑筋アルファ−アクチン染色によって可視化されたマウス心臓の梗塞後血管再生を示す顕微鏡写真である。
【００６１】
図４は、図３（ａ）および（ｂ）からの正常（ＷＴ）およびＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）マウスの梗塞領域における血管再生血管密度を示すグラフである。
【００６２】
（実施例）
例１：心臓梗塞後の血管再生におけるＶＥＧＦ−Ｂの役割
手順
麻酔後の８週齢の正常なマウスとＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスを使用した左前下行（ＬＡＤ）冠状動脈の結紮によって、慢性心筋虚血状態を作り出す。前記ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスは、公開国際出願WO98/36052に記載されている。検証（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）前、野生型（正常）とノックアウト（ＶＥＧＦ−Ｂ欠損）との両方の毛細管密度は同じであった。ＬＡＤ結紮の７日後、梗塞した心臓を固定し、収集した。これらの梗塞心臓を、長手方向（６ｍ）に切断した。ヘマトキシリン＆エオシンおよび免疫組織化学染色を、マーカーとして、内皮細胞用にはトロンボモジュリンを、そして平滑筋細胞用には平滑筋アルファ−アクチンを使用して行った。トロンボモジュリンに対する抗体は、ベルギーのLeuven大学のEd Conway博士から入手した。平滑筋細胞アルファ−アクチンに対する抗体は市販購入した（ＤＡＫＯ，Ｘ０９１０，デンマーク）。梗塞面積と血管密度を、Ｑｕａｎｔｉｎｅｔ  Ｑ６００画像分析システム（Leica、ブリュッセル、ベルギー）を使用して算出した。データを、ステューデントのＴ検定を使用して分析した。
【００６３】
結果
ＬＡＤ結紮の７日後、梗塞領域における血管密度を、マーカーとして、トロンボモジュリン（ＴＭ）と平滑筋アルファ−アクチンとを使用して計算した。これらの結果を、それぞれ、図１（ａ），（ｂ）および図３（ａ），（ｂ）に示し、更に、図２および図４にグラフ化している。
【００６４】
図１（ａ）および（ｂ）は、梗塞後の野生型（ＷＴ）およびＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）の心臓におけるトロンボモジュリン染色を図示している。内皮細胞用マーカー、トロンボモジュリンは、血管の管腔をライニングする内皮細胞を染色している。野生型心臓（ＷＴ）の梗塞領域において、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損のもの（ＫＯ）と比較して大きさの異なる血管のよりはっきりとした染色がある。
【００６５】
図２から理解されるように、マーカーとしてトロンボモジュリンを使用して、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスの総血管密度は、平均（Ｐ＜０．０１，ｎ＝９）で、正常マウスのそれの約６３%であった。血管を三種類のグループに分類したとき、大型、中型および小型の血管は、すべてのグループにおいて同じ欠損を示した（ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウス：１８．６±３．１大血管／ｍｍ２、３４．８±８．５中血管／ｍｍ２、７５±２０．３小血管／ｍｍ２；正常マウス：３０．６±８．５大血管／ｍｍ２、５４．９±１３．４中血管／ｍｍ２、１１７．７±２０．８小血管／ｍｍ２；各グループｎ＝９，全グループＰ＜０．０５）。
【００６６】
図３（ａ）および（ｂ）は、梗塞後の野生型（ＷＴ）およびＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）心臓の平滑筋細胞アルファ−アクチン染色の結果を図示している。平滑筋細胞マーカー、平滑筋細胞アルファ−アクチンは、血管を包囲する平滑筋細胞を染色している。野生型（ＷＴ）の梗塞領域において、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損のもの（ＫＯ）と比較して大きさの異なる血管のよりはっきりとした染色がある。
【００６７】
図４におけるグラフから理解されるように、組織切片を血管平滑筋細胞用の平滑筋アルファ−アクチンによって染色した時、前記ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスは、以前のテストにおいて観察された心臓梗塞後の同じ血管再生欠陥を示した。ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスの総血管密度は、正常マウスのそれの僅か６１％（Ｐ＜０．０１，ｎ＝９）であった。サイズの異なる血管は、同じ結果を示した（ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウス：５．５±１．３大血管／ｍｍ２、８．０±２．０中血管／ｍｍ２、１３．８±８．３小血管／ｍｍ２；正常マウス：７．７±１．９大血管／ｍｍ２、１４．０±４．８中血管／ｍｍ２、２２．７±７．２小血管／ｍｍ２；各グループｎ＝９，全グループＰ＜０．０５）。
【００６８】
このように、これらのテストデータは、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損が心臓梗塞後の血管再生の障害を引き起こすことを明白に示している。従って、ＶＥＧＦ−Ｂの存在が、心臓梗塞後の血管再生に必要であり、心臓虚血症の場合には、治癒的有効量のＶＥＧＦ−Ｂを投与することによって代償的な血管発達を刺激又は促進することができる。
【００６９】
例２：ＶＥＧＦ−Ｂの新血管形成活性
ＶＥＧＦ−Ｂの新血管形成活性を、マウス角膜モデルの使用、および、Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14389-14394, 1998に記載されている手順に従ったトリ漿尿膜テストで行う。
【００７０】
例３：ＶＥＧＦ−Ｂによる新血管形成の誘導
虚血組織における新血管形成を誘導するＶＥＧＦ−Ｂの能力を、Witzenbichler et al., Am. J. Pathol. 153: 381-394, 1998に記載されている手順に従ってテストする。
【００７１】
例４：ＶＥＧＦ−Ｂを含む組換えアデノウィルスベクターの産生
ヒトＶＥＧＦ−Ｂ１６７をコードするｃＤＮＡを、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子のストロングエンハンサ／プロモータと、バクテリアプラスミドｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡのＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ゴメス−フォリックス・エイ（Gomez-Foix A.）他(1992) J. Biol. Chem. 267, 25129およびヤンセンス・エス・ピー（Janssens S.P.）他(1996) J. Clin. Invest. 98 (2)317）との間にクローニングした。前記プラスミドは、複製起点を含むタイプ５のアデノウィルスのＥ１Ａ欠失配列、パッケージング（packaging）シグナルと、ポリリンカーをも含んでいた。組換えアデノウィルスを、Ｅ１Ａ形質変換ヒト胚網膜（９１１）細胞中でのコトランスフェクション後の、前記全長アデノウィルスゲノムを含むバクテリアプラスミド、ｐＪＭ１７，との同種組換えによって産生した。感染９１１細胞から単離されたビリオンＤＮＡ中のＶＥＧＦ−Ｂ  ｃＤＮＡの存在をＰＣＲ分析によって確認した。ＶＥＧＦ−Ｂを含むウィルス分離株（ＡｄＣＭＶ．ＶＥＧＦ−Ｂ）を、コンフルエントな９１１細胞上で増幅し、細胞変性効果の出現後、単離、沈殿し、非連続ＣｓＣｌグラジェントによって濃縮した。ウィルス力価を、９１１細胞の単層の、組換えアデノウィルスの連続希釈物との感染によって測定した。イン・ヴィヴォ研究のために、３ｘ１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＶＥＧＦ−Ｂ又はコントロールＲＲ５アデノウィルスを、各マウス毎に静脈内注射した。
【００７２】
例５：アデノウィルスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子移入による新血管形成の誘導
心筋虚血症を誘発させるために、例１に記載したのと同様に、野生型（ＷＴ）マウスに左前下行冠状動脈結紮を行った。その後、１１匹の実験動物のグループを、各マウス当たり例４の３ｘ１０９  ｐｆｕ  ＡｄＣＭＶ．ｈＶＥＧＦ−Ｂで静脈内処理した。ネガティブコントロールとして、別グループの１３匹の動物を、各マウス当たり３ｘ１０９  ｐｆｕのＡｄＲＲ５ウィルスで処理した。梗塞部の血管再生を、冠状動脈の結紮の７日後以内に梗塞領域ｍｍ２当たりの血管の数を計数することによって測定した。その結果を以下の表４に図示する。
【００７３】
【表４】
2005505510.tif 000005
【００７４】
これらの結果は、ウィルスベクターにおけるＶＥＧＦ−Ｂ  ＤＮＡでの遺伝子治療処理によって、前記ネガティブコントロールと比較して梗塞領域に於ける血管再生が増加したことを明白に示している。
【００７５】
例６：組換えＶＥＧＦ−Ｂの投与による新血管形成の誘導
心筋虚血症を誘発させるために、例１に記載したのと同様に、野生型（ＷＴ）マウスに左前下行冠状動脈結紮を行った。その後、５匹の実験動物のグループを、オーストラリア、メルボルンのAmrad Corporation Limiltedによって供給されている組換えヒトＶＥＧＦ−Ｂ１６７（ｒ  ＶＥＧＦ−Ｂ１６７）を含有する溶液によって処理した。組換えヒトＶＥＧＦ−Ｂを含有するこの溶液は、各マウスの背中に対して皮下移植された浸透圧ミニポンプを介して投与された。タンパク質は細胞外空間へと漏出し、血液中に再吸収される。前記組換えＶＥＧＦ−Ｂは、各週、各マウスに対して、活性物質の１０マイクログラムのレートで投与された。ネガティブコントロールとして、第２グループの５匹の動物を、同量の生理食塩水によって処理した。梗塞部の血管再生を、冠状動脈の結紮の７日後以内に梗塞領域ｍｍ２当たりの血管の数を計数することによって測定した。その結果を以下の表５に図示する。
【００７６】
【表５】
2005505510.tif 000006
【００７７】
これらの結果は、組換えＶＥＧＦ−Ｂ１６７の投与よって、前記ネガティブコントロールと比較して梗塞領域に於ける血管再生が増加したことを明白に示している。
【００７８】
以上の説明および例は、単に本発明を例示するために記載されたものであって限定的なものとして意図されたものではない。当業者は本発明の意図および実体を含むここに開示された実施例の改変に想到するであろうから、本発明は、添付の請求項の範囲内に属するすべてのバリエーションおよびその均等物を含むように広く解釈されるべきである。
【００７９】
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【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、野生型（ＷＴ）とＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）マウスとにおけるトロンボモジュリン染色によって可視化されたマウス心臓の梗塞後血管再生を示す顕微鏡写真である。
【図２】図２は、図１（ａ）および（ｂ）からの正常（ＷＴ）およびＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）マウスの梗塞領域における血管再生血管密度を示すグラフである。
【図３】図３（ａ）および（ｂ）は、それぞれ、野生型（ＷＴ）とＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）マウスとにおける平滑筋アルファ−アクチン染色によって可視化されたマウス心臓の梗塞後血管再生を示す顕微鏡写真である。
【図４】図３（ａ）および（ｂ）からの正常（ＷＴ）およびＶＥＧＦ−Ｂ欠損（ＫＯ）マウスの梗塞領域における血管再生血管密度を示すグラフである。
【図２】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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