(57)【要約】抗炎症薬を調製するためのヒストンデアセチラーゼ酵素阻害活性を有するヒドロキサム酸誘導体の使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗炎症薬の調製のための、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有するヒドロキサム酸誘導体の使用。
【請求項２】
前記誘導体が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシ−３−［３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソ−１−プロペニル］−ベンズアミド（ＣＢＨＡ)およびトリコスタチン（ＴＳＡ）であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記誘導体が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）およびトリコスタチン（ＴＳＡ）から選択されることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
多発性硬化症、クローン病および潰瘍性大腸炎、アテローム硬化症、慢性関節リューマチ、乾癬、脊椎関節症（強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎に関連した関節炎）、エイズに関連する神経障害、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、胸膜炎、急性肝炎および慢性肝炎（ウィルス、バクテリアまたは毒性のいずれか）、急性糸球体腎炎の治療のための薬剤の調製のための請求項１または請求項２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症性医薬の調製のためのヒストンデアセチラーゼの酵素阻害活性を有するヒドロキサム酸誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒストンデアセチラーゼを阻害する、いくつかのヒドロキサム酸の誘導体が公知である。もっとも広く研究されてきたものは、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）（ＳＡＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシ−３−［３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソ−１−プロペニル］−ベンズアミド（ＣＢＨＡ）およびトリコスタチン（ＴＳＡ）である。他の誘導体は、非特許文献１〜８に記載されている。
【０００３】
これらの化合物は抗腫瘍薬として主に研究されてきた。すなわち、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）から単離された抗真菌性抗生物質であるトリコスタチンは、ネズミの赤白血病細胞分化の強力な誘導物質であり（非特許文献９）、一方、ＳＡＨＡおよびＣＢＨＡは、腫瘍細胞分化誘導剤としてＳｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（特許文献１）により研究されてきた。
【０００４】
腫瘍を治療するためのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の治療的な使用は、非特許文献１０および非特許文献１１に記載されている。
【０００５】
ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有する既知のヒドロキサム酸誘導体、特に、トリコスタチンおよびＳＡＨＡは、プロインフラマトリーサイトカイン類の合成を阻害し、従って、これらのサイトカイン類の合成を阻害することにより緩和され得る障害を治療するために使用できることが現在見出されている。炎症および／または自己免疫を基礎とした、このような障害の例は、多発性硬化症、クローン病および潰瘍性大腸炎、アテローム硬化症、慢性関節リューマチ、乾癬、脊椎性関節症（強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎に関連した関節炎）、エイズに関連した神経障害、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、胸膜炎、急性肝炎および慢性肝炎（ウィルス、バクテリアまたは毒性のいずれか）、急性糸球体腎炎、および、大まかに言って全ての炎症要素を伴う障害を含む。
【０００６】
考慮された治療的な使用では、ヒドロキサム酸誘導体は、考慮される障害および問題の化合物の毒性学的特徴に依存して、１日に１回または複数回、１および５００ｍｇの間の範囲の投与量（適切な、経口、非経口、または局所製剤の形態で投与され得る。）で投与される。
【０００７】
【特許文献１】
国際公開第９５／３１９９７号パンフレット
【特許文献２】
欧州特許出願公開第９０１４６５号明細書
【非特許文献１】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,3003-3007, 1998
【非特許文献２】
Tumori, 2001 Nov-Dec,87(6):S12-4
【非特許文献３】
Anticancer Drugs, 2002 Jan, 13(1):1-13
【非特許文献４】
Nature Rev Cancer, 2001 Dec, 1(3):194-202
【非特許文献５】
Curr Opin Oncol, 2001 Nov. 13(6):477-83
【非特許文献６】
Cancer Chemother Pharmacol, 2001, Aug, 48 Suppl 1:S20-6
【非特許文献７】
Cancer Chemother Pharmacol, 2001 Aug, 48 Suppl 1:S17-9
【非特許文献８】
Haematologica, 2001 Sep:86(9):908-17
【非特許文献９】
Cancer Res. 47, 3288-3691, 1987
【非特許文献１０】
Anticancer Res. 20, 1471-1486, 2000
【非特許文献１１】
Exp. Opin. Invest. Drugs 8(10), 1611-1621, 1999
【非特許文献１２】
J. Biol. Chem. 1990; 265(18):10232-10237
【非特許文献１３】
Science, 1998; 281:1001-1005
【非特許文献１４】
Dinarello C. A. and Moldawer L. L. Proinflammatory and anti-inflammatory cytokines in rheumatoid arthritis. A primer for clinicians. 2nd Edition, Amgen Inc., 2000
【非特許文献１５】
Immunopharmacol. 1992; 14(6):1045-1050
【非特許文献１６】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000), 97, 2367-2372
【非特許文献１７】
Am. J. Physiol. Cell Physiol. (2001), 280, C441-C450
【非特許文献１８】
Gastroenterology, 1990, 98, :694
【非特許文献１９】
J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001, 296:99-105
【非特許文献２０】
Lab. Invest., 1993, 69:238-249
【非特許文献２１】
Lechner et al., Biochim Biophys. Acta 1996, 1296, 181-188
【非特許文献２２】
Moreira A. L. et al., J. Exp. Med. 1993, 177, 1657-1680
【０００８】
次の実施例は、より詳細に本発明を説明する。
【実施例１】
【０００９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるサイトカイン産生の阻害
リポ多糖（ＬＰＳ）でのリンパ球の処理は、ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＦＮγのような種々のプロインフラマトリーサイトカイン類の産生を誘発する（非特許文献１２、非特許文献１３）。
【００１０】
ＳＡＨＡおよびＴＳＡの影響は、ＬＰＳで刺激された健康なボランティア（２〜６のドナー）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるサイトカイン産生について化合物の阻害効果を評価することにより研究されてきた。
【００１１】
健康なボランティアからの末梢血または軟膜のサンプルを使用した。フィコール・ハイパーク法を使用する密度勾配に基づく遠心分離により、そのサンプルを分離し、このように得られたＰＢＭＣｓを９６−ウェルの皿（５００，０００細胞／ウェル）の中に接種し、種々の用量でＳＡＨＡまたはＴＳＡと共に６０分間インキュベートし、次いで化合物の存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５からのＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で、２４時間刺激した。処理の最後に、プロインフラマトリーサイトカイン類ＴＮＦα、ＩＬ−１βを、特異的な市販の抗体を用いて電気化学発光アッセイ（ＥＣＬ）により測定した。
【００１２】
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）を商業的に入手可能なＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。
【００１３】
サイトカインＩＦＮγは、プロインフラマトリーサイトカイン類、特にＩＬ−１２およびＩＬ−１８によるＴリンパ球の刺激の後にＴリンパ球により産生される（非特許文献１４）。
【００１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＩＬ−１２およびＩＬ−１８でＰＢＭＣｓを刺激することにより誘発されたＩＦＮγ合成に関するＳＡＨＡおよびＴＳＡの影響をこの基準で評価した。丸底の９６−ｗｅｌｌの皿（５００，０００細胞／皿）中に、ＰＢＭＣｓを接種し、６０分間、種々の用量でＳＡＨＡまたはＴＳＡと共にインキュベートした。最後に、組換えＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）および組換えＩＬ−１８（２０ｎｇ／ｍｌ）の同時の添加により、細胞を化合物の存在下で４８時間刺激した。産生されたＩＦＮγの量を市販のＥＬＩＳＡアッセイで決定した。
【００１５】
ＳＡＨＡおよびＴＳＡの種々の用量の影響を、処理されていない対照細胞と比較された問題のサイトカインの産生の百分率阻害として測定した。細胞成長（ＩＣ５０）の５０％阻害を誘発することを可能にする濃度を線形回帰により決定した。
結果を、以下の表にまとめた。
【００１６】
【表１】
2005506320.tif 000002
【００１７】
これらの結果は、ＳＡＨＡおよびＴＳＡが、ナノモルの範囲（５０〜２００ｎＭ）のＩＣ５０で、ＬＰＳによって誘発される全ての炎症性サイトカインの合成を阻害することを明確に示している。
【００１８】
また、ＳＡＨＡおよびＴＳＡは、Ｔリンパ球細胞によるＩＦＮγの合成を阻害する。これは、使用される刺激がその細胞系に特異的なＩＬ−１２およびＩＬ−１８の組み合わせであった場合に、ＳＡＨＡおよびＴＳＡの有効性（ＩＣ５０はそれぞれ７４０ｎＭおよび４９０ｎＭ）により実証される。
【実施例２】
【００１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカイン産生の阻害
実験動物に対するＬＰＳの全身投与は、早くて、大規模なプロインフラマトリーサイトカイン類の産生を誘発することが知られている（非特許文献１５）。
【００２０】
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（２０〜２２グラム）を、示された種々の用量でＳＡＨＡで経口的に処理し、次いで、６０分後にＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５からのＬＰＳ（３０ｍｇ／Ｋｇ腹膜内に）で処理した。エンドトキシン投与後９０分に、血液サンプルを全ての処理された動物（１０動物／グループ）から採取し、サイトカイン類を市販のＥＬＩＳＡアッセイで測定した。
【００２１】
結果を以下の表に示し、問題のサイトカイン産生の百分率阻害として表した。
【００２２】
【表２】
2005506320.tif 000003
【００２３】
上記の結果は、ＳＡＨＡが経口で活性であり、用量依存の範囲では、エンドトキシンを投与することによってマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで誘発されるプロインフラマトリーサイトカイン合成を阻害できることを示しており、このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られた結果を裏付ける。
【実施例３】
【００２４】
ＣｏｎＡで誘発される肝臓損傷
非特許文献１６に記載されるように、Ｃ５７Ｂ１６マウスに水ビヒクルまたはＳＡＨＡのいずれかをｉ．ｐ．注射し、１時間後にＣｏｎＡをｉ．ｖ．注射した。２４時間後に、血清アミノ−アラニントランスフェラーゼを測定した。
【００２５】
ＣｏｎＡの静脈内注射は、１２〜２４時間以内に肝細胞の死をもたらし、アラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のような肝酵素の血清レベルを顕著に高める。ＣｏｎＡの１時間前に、１回の投与量のＳＡＨＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．で与えて前処理したマウスにおいて、血清ＡＬＴの２４時間のレベル（平均±標準誤差）は、ビヒクル処理されたマウス（グループ当たりｎ＝６）における１５．１９０±２．５８０と比較して８．１４４±２．０９１ユニット／リットルであった。
【実施例４】
【００２６】
マウス腹腔マクロファージからの一酸化窒素の生成
Ｃ５７ＢＬｙ６マウスに、滅菌したチオグリコレート液（ｂｒｏｔｈ）１ｍｌをｉ．ｐ．注射し、５日後に殺し、マクロファージを、腹膜腔への氷冷したＰＢＳ１０ｍｌの点滴注入を使用して単離した。細胞を遠心分離機にかけ（３５０×ｇ）、３ｍｌの赤血球溶解剤を１０分間で加えた。
【００２７】
５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ７ミリリットルを加え、細胞を４℃で遠心分離にかけた。ｍｌあたり１００万でＤＭＥＭ中に細胞を再懸濁し、０．５ｍｌを４８ウェルプレートのウェルへ加えた。ＳＡＨＡを３７℃において６０分間加え、次いでＴＮＦ−αとＩＦＮ−γの組み合わせで刺激した。非特許文献１７に記載されるように、２４時間後、グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬を使用して上清のＮＯレベルを決定した。
【００２８】
図１に示すように、ＳＡＨＡはＮＯ生成を阻害した。すなわち、２００ｎＭで５０％の減少があった（Ｐ，０．０５）。８０および８５％の更なる減少が４００および８００ｎＭでそれぞれ観測された。
【実施例５】
【００２９】
培養された単球によるＩＬ−１２産生の阻害
静脈血を同意している成人から得て、フィコール・ハイパーク法で分離した。ＰＢＭＣの画分を洗浄し、ｍｌあたり５００万の細胞に調整した。５００マイクロリットルを、２４ウェルの平底プレートの各ウェルへ等分し、ＳＡＨＡ１００ｍｌを加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。細胞をＬＰＳ、可溶性ＯＫＴ３、またはサイトカインで刺激し、３７℃で２４時間または４８時間後に上清を除去し、サイトカインアッセイ用に凍結した。単球を、パーコール法で遠心分離することにより単離し、洗浄し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに懸濁し、次いでペトリパーム（Ｐｅｔｒｉｐｅｒｍ）テフロンコート培養皿（Ｓｉｇｍａ）に、ｍｌあたり２００万細胞で等分した。ヒトＩＬ−１２（ｐ７０）用のＥＬＩＳＡをエンドゲン（Ｅｎｄｏｇｅｎ）（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から購入した。
【００３０】
図２に示されるように、非接着性のヒトの単球中でＬＰＳ／ＩＦＮ−γで誘発されたＩＬ−１２産生に関して用量依存性の減少があった。２００ｎＭで減少は５５％（Ｐ，０．０１）であり、４００ｎＭで８６％（Ｐ，０．００１）であった。
【実施例６】
【００３１】
デキストランで誘発される大腸炎
２０〜２２ｇの体重のメス、８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｂｏｒ，ＭＥ）をこの試験に使用した。この動物を、制御された温度および１２時間の昼／夜のリズムの部屋に収容した。マウスは、標準マウス用餌ペレットを随意に与えられ、ボトルに供給された生水を自由に利用でき、マウスが実験に使用される前に、少なくとも７日その状態に順応させた。マウスは、イソフルラン麻酔（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ）の下で、頸部の脱臼により殺された。
【００３２】
マウスには、滅菌した蒸留水に溶解された３．５％デキストランサルフェートナトリウム（ＤＳＳ；分子量４０ｋＤａ；ＩＣＮ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を第１日〜第５日、続いて５日間の観察期間で随意に与えた。ＳＡＨＡは、実験の間（１日〜１０日）、１日に１度、全容積２００μｌおよび１０ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）の濃度で経口的に投与（ｐ．ｏ．）した。対照マウスは、水を自由に利用することができ、１０日間、１日に１度、ＳＡＨＡ（１０ｍｇ／ｋｇＢＷ）または水のいずれかをｐ．ｏ．で投与された。
【００３３】
体重、潜血または経直腸的な肉眼的（ｇｒｏｓｓ）血液の存在、および便の堅さを毎日測定した。プロトコルを知らされていない２人の研究者が臨床スコア（第１表）を評価した。体重損失が１日目と比較して＜１％は、０ポイントとして数えられ、１％から＜５％までの体重損失は１ポイントとして、５％から＜９．９％までは２ポイントとして、１０から２０％までは３ポイントとして、そして２０％より大きいものは４ポイントとして数えた。便の堅さについて、０ポイントは十分に形をなしているペレット状のもの（形のあるもの）に与えられ、２ポイントは肛門にこびりつかないペースト状およびなかば形のある糞（やわらかい）に与えられ、肛門にこびりつく液状の糞（下痢）に４ポイントが与えられた。出血には、潜血試験（ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ）で血液がないときは０ポイント、陽性の潜血試験に対して２ポイント、および著しい出血に対して４ポイントのスコアをつけた。これらのスコア（体重、便の堅さ、直腸出血）を合算し、３で割り、０（健康）から４（最大活性の大腸炎）までの範囲にわたる総臨床スコアを得た。
【００３４】
死後（１０日目に）、全ての結腸を盲腸から肛門まで取り除き、結腸の長さを炎症の間接的なマーカーとして測定した。以前に記載したように（非特許文献１８、１９）、ＤＳＳで誘発された大腸炎が直腸の短縮に関連づけられるので、直腸の長さは、本モデルにおける信頼できるパラメーターであることが示されている。
【００３５】
次の第１表〜第６表に報告された結果から、ＳＡＨＡが、デキストランで誘発された大腸炎、すなわちヒトの炎症性腸疾患の有効で確立されたモデルを効果的に抑制することは明白である。
【００３６】
【表３】
2005506320.tif 000004
【００３７】
【表４】
2005506320.tif 000005
【００３８】
【表５】
2005506320.tif 000006
【００３９】
【表６】
2005506320.tif 000007
【００４０】
【表７】
2005506320.tif 000008
【００４１】
【表８】
2005506320.tif 000009
【実施例７】
【００４２】
非特許文献２１および２２にそれぞれ記載された方法に従って、特許文献２に開示された一連のヒドロキサム酸誘導体を、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）およびＴＮＦα阻害試験にかけた。
【００４３】
次の表に詳述された結果は、ＴＮＦａの合成を阻害するこれらの化合物の能力とこれらのＨＤＡＣ活性の阻害との間に線形的な相関が存在することを示す。
【００４４】
【表９】
2005506320.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例４の結果を表すグラフである
【図２】実施例５の結果を表すグラフである
【図１】
2005506320.tif 000011
【図２】
2005506320.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2005506320.tif 000013
2005506320.tif 000014
2005506320.tif 000015
2005506320.tif 000016
2005506320.tif 000017
2005506320.tif 000018
2005506320.tif 000019
2005506320.tif 000020
2005506320.tif 000021
2005506320.tif 000022
2005506320.tif 000023
2005506320.tif 000024
2005506320.tif 000025
2005506320.tif 000026
2005506320.tif 000027
2005506320.tif 000028
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506320.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成15年9月19日(2003.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロインフラマトリーサイトカイン類の合成を阻害する医薬の調製のための、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有するヒドロキサム酸誘導体の使用。
【請求項２】
前記誘導体が、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシ−３−［３−（ヒドロキシアミノ）−３−オキソ−１−プロペニル］−ベンズアミド（ＣＢＨＡ)およびトリコスタチン（ＴＳＡ）から選択されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記医薬が経口、非経口、または局所製剤の形態であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
多発性硬化症、クローン病および潰瘍性大腸炎、アテローム硬化症、慢性関節リューマチ、乾癬、脊椎関節症（強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎に関連した関節炎）、エイズに関連する神経障害、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支炎、胸膜炎、急性肝炎および慢性肝炎（ウィルス、バクテリアまたは毒性のいずれか）、急性糸球体腎炎の治療のための薬剤の調製のための請求項１または請求項２に記載の使用。
【国際調査報告】
2005506320.tif 000030
2005506320.tif 000031
2005506320.tif 000032
2005506320.tif 000033