(57)【要約】一部又は全部損傷した中枢神経の細胞及び／又は他の神経細胞の機能を、回復させるため及び／又は維持するためのβ-アドレナリン受容体拮抗薬の使用について記載した。β２-アドレナリン受容体拮抗薬の使用は、星状細胞の活性化と、神経防護作用の内生過程の開始につながり、そのことは神経細胞の損傷と破壊を減少させることが可能であり、場合により、予防も可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一部又は全部損傷した中枢神経の細胞及び／又は他の神経細胞の機能を回復させるため及び／又は維持するためのβ-アドレナリン受容体拮抗薬の使用方法。
【請求項２】
星状細胞及び／又は内生の保護機能が活性化される若しくは刺激されることを特徴とする請求項１に記載された使用方法。
【請求項３】
前記β-アドレナリン受容体拮抗薬が、クレンブテロール、フォルモテロール、フェノテロール、サルブタモール、オルシプレナリン、イソエタリン、シマテロール、ラクトパミン、レプロテロール、サルメテロール、テルブタリン、それらの異性体、酸付加塩、類似物、前記物質のいずれかの混合物から選ばれることを特徴とする、請求項１又は２に記載された使用方法。
【請求項４】
前記β-アドレナリン受容体拮抗薬を、１日に0.01mgから100mgの量で投薬することを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載された使用方法。
【請求項５】
クレンブテロール、フォルモテロール、フェノテロール及びサルメテロールのような物質が、１日に0.01mgから5mgの量を投薬され、テルブタリンが、１日に1.0mgから30mgの量で、サルブタモールは、１日に1.0mgから50mgの量で、オルシプレナリンとレプロテロールは、1.0mgから100mgの量で、投薬されることを特徴とする請求項４記載の使用方法。
【請求項６】
ドブタミンのようなβ１-アドレナリン受容体拮抗薬を使用することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７】
NMDA抑制因子が使用されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項８】
前記神経細胞変性の病気が、アルツハイマー病、脳血管性痴呆、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン舞踊病、筋萎縮性側索硬化症、レヴィー小体痴呆、脳挫傷、脳震盪といった脳の打撲及び外傷、脳及び脊髄のけが若しくは横断する外傷、脊柱披裂、内耳の病気、例えば耳鳴りの発生に結びつく病気、例えばやや鋭い、慢性の耳鳴り、聴覚の突然の喪失、メニエール病、聴覚の制限、視覚の減少を伴う病気等から選ばれることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載された使用方法。
【請求項９】
前記神経細胞変性の病気が、中毒性脳症、糖尿病脳症、肝性脳症、高血圧脳症、代謝障害によって生じる脳症のような代謝性脳症、例えば酵素病と結びついたもの、内生の障害、腎不全（尿毒症性脳炎）、肝性脳症、水／電解質又は酸／塩基平衡の障害、ミオクロニー幼児脳症（キンスブーンシンドローム）、幼児ポスティクテレカ（postictereca）脳症（ビリルビン脳症）(新生児に起きる脳症)、火傷により生じる（postcombustional）脳症、重金属によって引き起こされる脳症、特に無機及び有機重金属化合物、例えば鉛、水銀、アマルガム、タリウム、ビスマス、アルミニウム、ニッケル及びこれらの化合物のいずれかの混合物、及びそれら金属の合金、アルコールによる中毒性脳症、牛海綿状脳症（BSE）、サプコーティカル（supcortical）進行性脳症(脳の外層の下の脳症)、外傷脳症から選ばれることを特徴とする。請求項１から７のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記化合物が神経細胞変性の病気の予防に使用されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１１】
哺乳類の細胞及び人間の細胞の成長及び／又は区別及び／又は保護を促進するための培地媒体のための添加物としての、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞変性の病気の治療のためのβ-アドレナリン受容体拮抗薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の脳は非常に複雑な組織で、100兆以上の神経細胞（＝ニューロン）及び細胞あたり約10,000の結合部（＝シナプス）を備える。脳は、人体上に作用する刺激、思考及び感情、思考活動、学習及び記憶を意識下若しくは無意識に処理する中心の組織である。人間の脳の一番重要な機能は、会話において情報処理をすることである；また、非常に多数の組織の機能の制御中心であり、呼吸、心拍、体温調節を行なう。
【０００３】
多くの病気が神経細胞の死につながり、及び／又はシナプスの減少につながり、脳の機能が制限されることになる。そのような病的な状態の例としては、アルツハイマー病、脳血管性痴呆、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン舞踊病、筋萎縮性側索硬化症、レヴィー小体痴呆、脳挫傷、脳震盪といった脳の打撲及び外傷、脳及び脊髄のけが若しくは横断する外傷、脊柱披裂、内耳の病気、例えば耳鳴りの発生に結びつく病気、例えばやや鋭い、慢性の耳鳴り、聴覚の突然の喪失、メニエール病、聴覚の制限、視覚の減少を伴う病気等がある。臨床上は、この病的な状態の神経防護作用の治療が、まだ確立されていない。症状が治療されるのみで、原因は治療されていない。
【０００４】
通常の治療の目的は、神経細胞の死を防ぐことである。
【０００５】
現在のところ、神経細胞が、損傷から守られ、再生することを可能とする確立された治療法がない。上記疾患の治療に現在行なわれている基本的な要素は、神経細胞の間接的又は二次的な損傷を防ぐことである。例えば血管が塞がれているときに、脳血量を増やしたり、元の状態に戻すことである。しかしながら、仮にあったとしても、このタイプの治療は、急患に対して直ちに行なわれたときに限り有効である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、一部若しくは全部が悪化した細胞の機能の少なくとも一部において、神経細胞を損傷から守り、再生させることができる薬効物質を見出すことを目的とすることに基づく。星状細胞をβ-アドレナリン受容体拮抗薬のような薬効物質で活性化させることは、神経防護作用の内生過程を開始し、そして神経細胞の損傷又は破壊を減少、いくつかの例では予防することが可能になることを見出したのは、驚くべきことである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って本発明は、β-アドレナリン受容体拮抗薬を中枢神経系及び／又は他の神経細胞において一部又は全部損傷した細胞の機能を回復させる及び／又は維持するために用いることに関する。
【０００８】
本発明の目的において、「損傷した細胞」とは、細胞が外的影響により、損傷されている、若しくは細胞中で生じた過程を通しての悪化という意味で、一部又は全部破壊されていることを意味し、体の機能の欠陥と結びついていることもある。「細胞損傷」とは、個別の細胞若しくは細胞種類への損傷及び神経細胞の繊維若しくは束の損傷のいずれも含む。
【０００９】
神経細胞は、中枢神経系の細胞に加えて、脊髄の細胞及び体内に存在するその他の神経細胞を含む。
【００１０】
β-アドレナリン受容体は、特にアドレナリン作用の薬効物質に反応する。本発明で好ましく用いられるβ-アドレナリン受容体拮抗薬は、その良好な活性から、クレンブテロール、フォルモテロール、フェノテロール、サルブタモール、オルシプレナリン、イソエタリン、シマテロール、ラクトパミン、レプロテロール、サルメテロール、テルブタリン、それらの異性体、酸付加塩、類似物、前記物質いずれかの混合物である。
【００１１】
前述のβ-アドレナリン受容体拮抗薬は、いくつかの場合において、公知の薬効物質である。こうして、例えば、クレンブテロールは、アストマのための物質として先行技術において知られている。
【００１２】
実験例によって、例えば、脂肪親和性のβ-アドレナリン受容体拮抗薬は、脳に浸透することが可能で、星状細胞のβ-アドレナリン受容体を刺激することを示すことが可能である。これらの受容体を順に刺激することは、星状細胞の活性化につながり、その結果、成長因子の放出を増大させる。例えばNGFは、神経細胞を損傷から保護することができる。
【００１３】
β-アドレナリン受容体拮抗薬は、これらの製薬において慣習的な量を、治療のために投薬される、特に、１日に0.01mgから100mgの量であり、それは特定のβ-アドレナリン受容体拮抗薬に因って、量の好ましい範囲でありうる。クレンブテロール、フォルモテロール、フェノテロール及びサルメテロールのような物質について、１日に0.01mgから5mgの量を投薬された時に、特に良好な神経防護作用効果が得られる。テルブタリンは、１日に1.0mgから30mgの量で、サルブタモールは、１日に1.0mgから50mgの量で、オルシプレナリンとレプロテロールは、1.0mgから100mgの量で、投薬される。
【００１４】
ドブタミンのようなβ１-アドレナリン受容体拮抗薬にとって、星状細胞を活性化することも可能である。こうして、ニューロンの保護が達成される。一つの可能な態様において、本発明に従って用いられるβ-アドレナリン受容体拮抗薬は、β１-及び／又はβ２-アドレナリン受容体拮抗薬の組み合わせによって使用される。
【００１５】
本発明のさらなる可能な態様において、β-アドレナリン受容体拮抗薬は、NMDA抑制因子と組み合わせて用いられる。この場合、追加の若しくは更なる反応の原理が適用される。
【００１６】
NMDA抑制因子としては、例えばアダマンタン誘導体が、様々な病気の治療に頻繁に用いられる公知の化合物である。こうして、例えば、アマンタジン（1-アダマンタナミン）のドーパミン作用性の効果が知られている。
【００１７】
ヨーロッパ特許出願EP392059は、アダマンタン誘導体を脳の虚血の予防及び治療に使用することを開示している。この文献によると、虚血に続いて脳細胞の破壊は、アダマンタン誘導体の使用を通じて、保護的に予防される。その中で、アダマンタン誘導体は、脳の中の神経細胞のNMDA受容体経路のための抑制因子として使用される。
【００１８】
化学式１を有するアダマンタン誘導体は、好ましくは、次の構造を有する。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
式中、R1とR2は同一若しくは異なり、水素若しくは、直鎖あるいは分枝のC1-C6アルキル基若しくは窒素原子を含む、環を構成する原子が５又は６の複素環を表す、R３とR４は同一若しくは異なり、水素若しくは、直鎖又は分枝のC1-C6アルキル基、若しくはC5-C6環状アルキル基若しくはビニル基、R5は、水素、若しくは直鎖又は分枝のC1-C6アルキル基である。
【００２１】
化学式１を有するアダマンタン誘導体は、化学式１により示された化合物の形式で用いられるか、製薬上受け入れられる塩の形式で用いられる。製薬上受け入れられる塩は、好ましくは酸付加塩も含む。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩が挙げられ、塩酸塩が好ましい。
【００２２】
化学式１を有する好ましい化合物は、R1、R2、R4が水素であり、R3及びR5がメチル基及び／又はエチル基である。
特に好ましい化合物は、R1、R2、R4が水素であり、R3及びR5がメチル基若しくはその塩酸塩である。この化合物は、INNメマンティン（memantine）として知られている。
【００２３】
本発明に従って使用されるβ-アドレナリン受容体拮抗薬は、適切であれば、治療に不利に作用しない、若しくは補助する、更なる慣例の薬成分及び慣習的な成分を、製薬で慣習的な調剤形式で、存在させることができる。特に溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、坐薬などの中に、存在させることができる。
【００２４】
リポソーム、ナノソーム、持続放出ペレット等、特別の製剤における使用もまた可能である。それらは、慣習的な方法で投与される、例えば経口で、非経口で、静脈注射で、吸入で、鼻から、直腸から、脳室内に、動脈内に、腹腔内に、及び／又は筋肉注射で、若しくは埋め込みで投与される。投薬の形式は、好ましくは、本発明の薬成分が、損傷した細胞に最も早く到達するように好ましく選択される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に従って使用されるβ-アドレナリン受容体拮抗薬は、神経細胞変性の病気の治療のための薬を生成するのに、特に適している。そのような病気の例は、アルツハイマー病、脳血管性痴呆、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン舞踊病、筋萎縮性側索硬化症、レヴィー小体痴呆、脳挫傷、脳震盪といった脳の打撲及び外傷、脳及び脊髄のけが若しくは横断する外傷、脊柱披裂、内耳の病気、例えば耳鳴りの発生に結びつく病気、例えばやや鋭い、慢性の耳鳴り、聴覚の突然の喪失、メニエール病、聴覚の制限、視覚の減少等が挙げられる。
【００２６】
本発明の更なる態様において、β-アドレナリン受容体拮抗薬は、脳症により一部若しくは全部が損傷した中枢神経系の細胞、及び／又は他の神経細胞の機能を修復し、及び／又は維持するために使用される。脳症とは、脳内の病的な非炎症の変化の一つであり、変化する神経の及び／又は精神の症状を伴う。
【００２７】
β-アドレナリン受容体拮抗薬を用いて本発明に従って治療されることのできる脳症の例は、中毒性脳症、糖尿病脳症、肝性脳症、高血圧脳症、代謝障害によって生じる脳症のような代謝性脳症、例えば酵素病と結びついたもの、内生の障害、腎不全（尿毒症性脳炎）、肝性脳症、水／電解質又は酸／塩基平衡の障害、ミオクロニー幼児脳症（キンスブーンシンドローム）、幼児ポスティクテレカ（postictereca）脳症（ビリルビン脳症）(新生児に起きる脳症)、火傷により生じる（postcombustional）脳症、重金属によって引き起こされる脳症、特に無機及び有機重金属化合物、例えば鉛、水銀、アマルガム、タリウム、ビスマス、アルミニウム、ニッケル及びこれらの化合物のいずれかの混合物、及びそれら金属の合金、アルコールによる中毒性脳症、牛海綿状脳症（BSE）、サプコーティカル（supcortical）進行性脳症(脳の外層下の脳症)、外傷脳症が挙げられる。
【００２８】
本発明の更なる態様において、本発明に従って使用した化合物が、上記病気の予防に用いられる。
【００２９】
本発明の更なる態様において、本発明によって使用された化合物は、哺乳類の細胞及び人間の細胞の成長及び／又は区別及び／又は保護を促進するための培地媒体のための添加物として使用される。
【実施例１】
【００３０】
・  星状細胞の活性化
星状細胞の第一の培地は、生まれてから２４時間以内の、新生児のフィッシャー症候群３４４ネズミの脳の皮層の組織から得られた。脳を無菌状態で、頭蓋から取り出し解剖された。皮層の組織（外皮）が単離された、そして細胞が細い網目の金網を通して分離された。細胞は、細胞培地瓶に入れられ、血清含有DMEM溶液（子牛の胎児の血清とペニシリン／ストレプトマイシン混合物含有）中で、細胞が融合されるまで培養された。
【００３１】
乏突起膠細胞及び小膠細胞が冷緩衝液で洗浄することによって除かれた。融合した星状細胞は、トリプシン溶液を用いて培地瓶の底から分離され、ペトリ皿のカバースリップ上に、20000細胞／cm2の密度で蒔かれ、細胞が再び融合するまで、セラム含有媒体中で培養された。融合の２日後、媒体を血清を含まない媒体と交換し、２４時間後、媒体を同様に血清を含まない媒体と交換した。媒体の二回目の交換後の２４時間後、サルメテロールが加えられた。
【００３２】
処置の６時間後、星状細胞は形態的な変化を記録するため、顕微鏡で２００倍に拡大し、写真を撮った（図１／７）。図は処理の開始から６時間後の星状細胞を示す。活性化されたものに対する対照中の多角形の、低い屈折の平らな細胞からの変化は、サルメテロールで処理したグループ中の星状の屈折した星状細胞とは、明らかにはっきりしていた。
【実施例２】
【００３３】
・  培養されたネズミ海馬ニューロン中のNGFの誘導
ニューロンと星状細胞をそれぞれ５０％の割合で含む第一の混合培地は、生まれてから２４時間以内の、新生児のフィッシャー症候群３４４ネズミの脳の海馬から得られた。海馬は、無菌の状態で、ネズミの脳から単離され、パパイン溶液中で短い間培養した後、ガラスピペットを用いて慎重に粉砕して粉にした。こうして分離された細胞は、３５mmのペトリ皿に、３×１０５の細胞の密度で蒔かれ、血清含有媒体中で培養された（１０％NU-血清を含むMEMとペニシリン／ストレプトマイシン混合物）。
【００３４】
培養の２日後、星状細胞の成長を抑制するため、シトシンアラビノフラノサイドを２４時間媒体中に入れた。３日から４日毎に、媒体は新鮮な血清含有媒体と交換した。１４日培養後、媒体は血清を含まない媒体と交換した、そしてさらに２４時間後、クレンブテロールが加えられた。クレンブテロールを用いた培養を開始して４時間後、培地媒体は回収された。媒体中のNGF含有量は、標準化された酵素結合免疫反応（ELISA）によって、決定された。
【００３５】
この目的のために、多孔の皿の孔は、NGF抗体で覆われ、様々なグループの媒体を用いて個々の孔で培養された。孔中の媒体由来のNGF結合は、こうして、それからβ-ガラクトシダーゼ-共役NGF抗体を用いて、培養された。続いてクロロフェノール赤β-ガラクトシダーゼを赤染料にするβ-ガラクトシダーゼが触媒する変換がされ、そのことは測光によって測定された。
【００３６】
標準プロットを作成するため、試料に加えて、NGFの標準溶液が測定された。試料中のNGFの量は、標準のプロットから決定された（図２／７）。
【実施例３】
【００３７】
・  生体外でのクレンブテロールの神経防護作用
ネズミ海馬からの第一混合培地を、実施例２に述べられているように準備し、１４日培養後、媒体を血清を含まない媒体に交換した。媒体を交換して２４時間後、アドレナリン受容体拮抗薬プロプラノロールは、媒体に加えられた。更に２０分後、β２-アドレナリン受容体拮抗薬クレンブテロールが加えられ、細胞は４時間培養された。
【００３８】
海馬細胞の姉妹培地は、このようにして扱われ、賦形剤、プロプラノロール又はクレンブテロールのみを受けた。４時間後、媒体は交換され、細胞は血清を含まない媒体でL-グルタメート（１mM）を用いて、１時間培養された。媒体はその後、グルタメートを培地から除去する代わりに、再び血清を含まない媒体と交換された。プロプラノロール及びクレンブテロールは媒体を交換するたびに再び新鮮なものを加えられ、グルタメート処理の間、そしてその後１８時間まで存在した。グルタメートの損傷後１８時間、細胞は、トリパンブルー溶液を用いて培養され、固定された。そして損傷し、青く染められたニューロンは、顕微鏡で２００×の倍率で量を測定された（図３／７）。
【実施例４】
【００３９】
・  ネズミの脳虚血モデルにおけるクレンブテロールの脳防護効果
雄のロングエバンスネズミの中大脳動脈（MCA）を永続的に閉塞することにより、皮層の組織（外皮）に虚血を引き起こした。麻酔（３０：７０の酸素／亜酸化窒素混合物中に１．５％のハロタン）吸入下、外科手術が行なわれた。深い麻酔の下、左の側頭筋を目と耳の間で切開した。こうして露出された頭蓋が立体顕微鏡制御の下、穿孔手術を受けた。
【００４０】
硬膜が除去され、MCAが二極の電気凝固法により３ヶ所で硬化させられた。側頭筋中の傷は、食事を摂るための筋肉の機能を保持するために、閉じられる。ネズミの体温は手術中、暖めた下敷きにより３７±０．５℃に調節され、手術後更に２時間加熱ランプの助けを借りて３０℃の周囲の温度に安定に保つ。
【００４１】
手術の間、更に、生理学上のパラメータ（血圧、血漿グルコースレベル、動脈のpH、二酸化炭素及び酸素の分圧）がモニターされ、記録された。MCAを閉じて７日後、脳を取り去り、冷凍する。冷凍かんな（kryomicrotome）は０．５ミリの長さで、脳の冠状断面（２０μM）を準備するために用いられた。脳の部分は、その後、クレシルバイオレットで染められ、すぐに、梗塞はわずかに着色し、健康な組織と区別することができた。
【００４２】
個々の部分の梗塞域が測定され、梗塞の体積が連続した部分の領域と決まった長さの値から計算された。クレンブテロールは、さまざまな薬でMCAの閉塞３時間前に、腹腔内に投与された（図４／７）。
【実施例５】
【００４３】
・  生体外でのサルメテロールの神経防護作用
ネズミ海馬からの第一混合培地を、実施例２に述べられているように準備し、１４日培養後、媒体を血清を含まない媒体に交換した。媒体を交換して２４時間後、β-アドレナリン受容体拮抗薬サルメテロールが加えられ、細胞を４時間培養した。海馬細胞の姉妹培地は、こうして、賦形剤のみ、又はサルメテロールのみを受け、処理された。
【００４４】
４時間後、媒体は交換され、細胞は血清を含まない媒体でL-グルタミン（１mM）を用いて１時間培養された。媒体は、グルタメートを培地から除去する代わりに、再び血清を含まない媒体と交換された。サルメテロールは再び新鮮なものを、媒体の交換の度に加えられ、グルタメート処理の間、そしてその後１８時間まで媒体中に存在した。グルタメートによる損傷の１８時間後、細胞は、トリパンブルーの溶液で培養し、固定された。そして、損傷し、青く染められたニューロンは、２００倍の顕微鏡で量を計られた（図５／７）。
【００４５】
述べた値は、平均であり、グループ当たり５から６培地の標準的偏りである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；及び＊＊＊ｐ＜０．００１は、グルタミン処理の対照と比較した（相違の分析、シェッフ（Scheffe）試験）。
【実施例６】
【００４６】
・  生体内でのサルメテロールの神経防護作用
脳虚血の病巣は、ネズミの中大脳動脈を縛ることで、生成した。雄のNMRIネズミ（２６ｇから３１ｇ、グループ当たり１０匹から１２匹）が実験に用いられた。動物達は、トリブロモメタノール（６００mg／kg）を腹腔内に注射することで麻酔された。
【００４７】
外科の分野で、左の目と耳の間を２cmの長さで切開した、側頭筋を焼灼器で除いた、そして中大脳動脈を露出するために、鋭いドリルで骨を取り除いた。この動脈と２本の末梢の枝分かれは、永久的に塞がれた。切開の間、ネズミの体温は測定され、赤外線加熱ランプにより３７+/-１℃で一定に保たれた。切開の後、更に２時間、周囲の温度が３０℃の状態に置かれた。
【００４８】
梗塞域を決定するために、ネズミは中大脳動脈を塞いだ後４８時間、再びトリブロモエタノールで麻酔され、１．５％の強い中性の赤溶液を染み込ませた（０．５mlを腹腔内に）。このことにより、赤に染み込まされた脳組織と、色がないままの梗塞域が明らかになった。単離された脳は、少なくとも２４時間４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐH７．４）に置き、その後、脳の表面の染められていない領域（梗塞域）が、コンピューターによって測定された（NIHイメージソフトウェア）。
【００４９】
サルメテロールは、０．９％の食塩水に溶解され、手術の５時間前に、腹腔内に注射された。対照グループ内の動物は、０．９％の食塩水のみ与えられる（図６／７）。平均と、グループ当たり１５から１６匹の標準的偏りの値である。対照に比較して、＊ｐ＜０．０５である（相違の分析、ダンカン（Duncan）試験）。
【実施例７】
【００５０】
・  生体内でのクレンブテロールとメマンティンの神経防護作用
脳虚血の病巣は、ネズミの中大脳動脈を縛ることで、生成した。雄のNMRIネズミ（２６ｇから３１ｇ、グループ当たり１０匹から１２匹）が実験に用いられた。動物達は、トリブロモメタノール（６００mg／kg）を腹腔内に注射することで麻酔された。
【００５１】
外科の分野で、左の目と耳の間を２cmの長さで切開した、側頭筋を焼灼器で除いた、そして中大脳動脈を露出するために、鋭いドリルで骨を取り除いた。この動脈と２本の末梢の枝分かれは、永久的に塞がれた。切開の間、ネズミの体温は測定され、赤外線加熱ランプにより３７+/-１℃で一定に保たれた。切開の後、更に２時間、周囲の温度が３０℃の状態に置かれた。
【００５２】
梗塞域を決定するために、ネズミは中大脳動脈を塞いだ後４８時間、再びトリブロモエタノールで麻酔され、１．５％の強い中性の赤溶液を染み込ませた（０．５mlを腹腔内に）。このことにより、赤に染み込まされた脳組織と、色がないままの梗塞域が明らかになった。単離された脳は、少なくとも２４時間４％ホルムアルデヒド緩衝液（ｐH７．４）に置き、その後、脳の表面の染められていない領域（梗塞域）が、コンピューターによって測定された（NIHイメージソフトウェア）。
【００５３】
調べるための２つの薬、メマンティンとクレンブテロールは、注射のために０．９％の食塩水に溶解された。メマンティン（２０mg／kg）は、手術の３０分前に、クレンブテロールは、手術の２時間後に、腹腔内に注射された。対照グループ内の動物は、０．９％の食塩水のみ与えられた（図７／７）。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】星状細胞の活性化
【図２】培養されたネズミ海馬ニューロン中のNGFの誘導
【図３】生体外でのクレンブテロールの神経防護作用
【図４】ネズミの脳虚血モデルにおけるクレンブテロールの脳防護効果
【図５】生体外でのサルメテロールの神経防護作用
【図６】生体内でのサルメテロールの神経防護作用
【図７】生体内でのクレンブテロールとメマンティンの神経防護作用
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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