(57)【要約】  本発明は、液体から化合物を分離する方法に関する。その方法は、少なくとも１つの非荷電リガンドを含む分離マトリクスを提供すること、分離しようとする化合物が正荷電状態で存在する液体を提供すること、該マトリクスを該液体と接触させて化合物を吸着させること；および、液体を除去すること、を含む。非荷電リガンドは、四極子または双極子モーメントを有し、化合物とリガンドとの間の陽イオン−π相互作用を可能にする。本発明はまた、該方法における、四極子または双極子モーメントを有する非荷電基を含む分離マトリクスの使用も包含する。
2005512105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの化合物を液体から分離する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの非荷電リガンドを含む分離マトリクスを提供すること；
（ｂ）分離しようとする化合物が正荷電状態で存在する液体を提供すること；
（ｃ）マトリクスへの化合物の吸着が生じるのに十分な期間、該マトリクスを該液体と接触させること；および、
（ｄ）マトリクスから液体を除去すること；
の段階を含み、該非荷電リガンドは、四極子または双極子モーメントを有し、該リガンドへの化合物の吸着は、陽イオン−π相互作用に支配されるものである、方法。
【請求項２】
化合物がタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該タンパク質またはペプチドが１またはそれ以上の塩基性アミノ酸を含むものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
非荷電リガンドの官能基が、芳香族性基、−Ｃ＝Ｃ二重結合またはＣ≡Ｎ三重結合を含む系である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
官能基が、フェニル、または四極子モーメントが本質的に保持されているその官能性誘導体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
リガンドが、官能基を支持体から遠ざけるスペーサーを介して支持体に結合する、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該スペーサーが、分離しようとする化合物と水素結合などにより相互作用する能力を有する１またはそれ以上のさらなる官能性を含み、多様式クロマトグラフィーマトリクスを提供するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｃ）の吸着が低塩濃度条件下で実施される、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
（ｅ）少なくとも１つの化合物を分離マトリクスから溶離すること、
の段階も含む、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
溶離が有機溶液の添加により実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｂ）に従い提供される液体のｐＨと比較してｐＨが高められている液体を使用して、段階（ｅ）が実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィーの方法である、請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｃ）中の吸着がｐＨ＜ｐＩで実施され、段階（ｅ）中の脱着がｐＨ＞ｐＩで実施される、請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
化合物を液体から分離するための、ジビニルベンゼンをベースとするクロマトグラフィーのマトリクスの使用であって、化合物を正荷電状態で液体中に提供し、マトリクス表面上に存在するスチレン基の共役系の近傍にある高電子密度領域への吸着に十分な期間、液体をマトリクスと接触させる、使用。
【請求項１５】
該吸着が低塩濃度条件下で実施される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
分離しようとする化合物がタンパク質またはペプチドであり、好ましくは１またはそれ以上の塩基性アミノ酸を含むものである、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１ないし請求項１３のいずれかに定義の方法で使用するための分離マトリクスであって、１またはそれ以上の官能基が結合する支持体で構成され、官能基が四極子または双極子モーメントを有する非荷電基であり、マトリクスが陽イオン−π相互作用により正荷電物質を吸着する能力を有するものである、分離マトリクス。
【請求項１８】
非荷電基が、フェニル、Ｃ＝Ｃ二重結合またはＣ≡Ｎ三重結合を含む系である、請求項１７に記載の分離マトリクス。
【請求項１９】
官能基を支持体から分離するために１またはそれ以上のスペーサーが導入されており、そのスペーサーが、四極子または双極子モーメントを有する非荷電基と同じ陽イオン性化合物と相互作用する能力のある１またはそれ以上のさらなる官能基を含む、請求項１７ないし請求項１９のいずれかに記載の分離マトリクス。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、分離の分野、特に、液体から化合物を分離する方法に関し、その方法は、所望の化合物をクロマトグラフィーのマトリクスに吸着させる新しい原理に基づく。本発明はまた、かかる方法において有用なマトリクスも包含する。
【０００２】
背景
最も繁用されている分離方法の一つは、クロマトグラフィーである。クロマトグラフィーの用語は、密接に関連する分離方法のファミリーを包含する。クロマトグラフィーを殆どの他の物理化学的分離方法から区別している特徴は、２つの相互に混合不可能な相が接触していることであり、そこでは一方の相が固定され、他方が移動性である。移動相に導入されたサンプル混合物は、一連の相互作用を経る。即ち、移動相によってシステムを通して運ばれながら、何回も固定相と移動相の間で分けられる。相互作用は、サンプル中の成分の物理または化学的特性の差異を利用する。これらの差異は、固定相を含有するカラムを通って移動する移動相の影響下における、個々の成分の移動速度を決定する。分離された成分は、固定相との相互作用に依存して、一定の順序で現れる。遅滞が最小である成分が最初に溶離し、最も強く遅滞させられた物質が最後に溶離する。分離は、サンプル成分がカラムから溶離するときに、１つの成分が隣の溶質の区域との重複を阻止するほど十分に遅滞させられる場合に成立する。
【０００３】
今日知られるクロマトグラフィーの方法は、例えば、固定相と分離しようとする成分との相互作用の性質によって、グループに分類できる。物理的観点では、通常、以下の分子間相互作用の分類を使用する：
−正味荷電を有するイオン間の相互作用；
−永久双極子間の相互作用；
−イオンと、それにより他の分子中に誘導される双極子との相互作用；
−永久双極子と、それにより他の分子中に誘導される双極子との相互作用；
−不活性ガスなどの非極性原子または分子間の相互作用；
−ある分子の核および電子と、他の分子のそれらとの相互作用。
【０００４】
今日までに示唆されたクロマトグラフィーの方法は、１またはそれ以上の当該原理に基づいている。従って、例えば、イオン交換クロマトグラフィーでは、官能基は、反対の電荷の対イオンと不変に結合したイオン性基である。これらの対イオンは、移動相中の同じ符号を有する等価の数の他のイオンと交換され得る。従って、イオン交換クロマトグラフィーは、電荷−電荷相互作用を介する、イオン化されているかまたはイオン化可能な化合物の分析に限定される。しかしながら、イオン交換をベースとする分離は、従来主に高収率の分離成分をもたらすように設計されてきたので、達成される選択性は通常比較的低い。これは、特に、薬物製造などの生成物の高純度が必須である適用に不利である。
【０００５】
代わりに、クロマトグラフィーの方法は、固定相と分離しようとする成分との疎水性相互作用に基づくことができ、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）として知られる。かかる方法は、疎水性固定相と、通常部分的または完全に水性である極性移動相を含む。極性物質は移動相を好み、最初に溶離する。化合物の疎水的性質が増加するにつれ、遅滞は長くなる。一般的に、移動相の極性が低いほど、その溶離剤強度が高くなる。吸着と脱着は、液体の塩濃度を各々上昇または低下させることにより、または、ｐＨを変えることでリガンドおよび／または吸着／脱着しようとする物質の電荷を変えることにより、支持される。ＨＩＣ方法は、例えば、ＷＯ９６００７３５、ＷＯ９６０９１１６およびＵＳ５,６５２,３４８に記載されている。しかしながら、いくつかの例では、ＨＩＣ方法で必要とされる塩が望ましくない。例えば、薬物開発など、生成物の純度が重要な場合である。
【０００６】
やはり疎水性相互作用を利用する、これに代わる方法は、親硫黄性（thiophilic）吸着剤に基づく。例えば、Berna et al, Journal of Chromatography A, 800 (1998), 151-159 を参照されたい。従って、ここでも同様に、高濃度の塩がタイプの異なる分子相互作用を促進でき、それ故に、親硫黄性吸着剤は、上述のＨＩＣ方法のものと類似の目的に最も有用であろう。
【０００７】
クロマトグラフィー方法は、リガンドと、分離しようとする化合物との間の親和性に基づくこともできる。かかる有用な親和性の例は、例えば、抗体−抗原親和性、金属イオン親和性および受容体−リガンド親和性である。従って、親和性をベースとする方法は、非常に特異的な方法であり、結果的に、既製の媒体をより一般的な応用に使用することはできない。
【０００８】
２つまたはそれ以上の公知分離原理の組合せは、混合式（mixed mode）イオン交換剤と称されてきた。例えば、混合式陰イオン交換剤が記載されているＷＯ９７２９８２５ (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）を参照されたい。いくつかの文脈では、この種のイオン交換剤は多様式（multi-mode）イオン交換剤と称される。しかしながら、これらの方法で利用される主要な相互作用は、従来イオン性であった。
【０００９】
最近、高塩リガンド（ＨＳＬ）と称するタイプのリガンドが開示された。例えば、ＷＯ００１１６０５（Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）を参照されたい。全て電荷を有するこれらのリガンドは、混合式陽イオン交換リガンドとして機能できる。そして、これらは高塩濃度に耐えることができ、従ってサンプルの実質的な希釈を要しないので、タンパク質精製などの工業的応用において興味深いと示されてきた。当然、これらの方法は、発酵培養液や細胞溶解物のような、塩濃度が既に高い液体中で生成物が得られる場合に最も有利である。
【００１０】
しかしながら、今日では、分離方法が必要とされる、幅広い範囲の応用がある。例えば、薬物が高い程度までバイオテクノロジー的方法により製造される場合、生物医学分野において高純度の生成物の必要性が十分に認識される。実際に使用される多くの分離スキームは、上記の２つまたはそれ以上の原理の組合せに基づく。そこでは、イオン交換などの一原理に基づく最初の工程由来の生成物は、第２工程に受け渡され、そこで他の原理に基づく分離に付される。従って、各分離原理は、道具箱の中にある１つの有用な道具と見ることができ、そこでは常に新しい道具が必要とされている。従って、上述の公知原理があるにも関わらず、追加物として、即ち、道具箱の中のさらなる道具として使用するための、用途の広がりにより改善された新しい方法の必要性が、依然としてある。
【００１１】
本発明の要旨
従って、本発明の１つの目的は、液体からの化合物の分離方法であって、先行技術の方法と異なる特異性をもたらし得る方法を提供することである。従って、本発明の目的は、既知分離方法の追加物または代替物として役立ち得る、そのような方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、上記のような異なる特性の達成を可能にする、分離マトリクスを提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、本発明による分離マトリクスからの、生体分子などの化合物の非常に有効な溶離を提供することである。
【００１４】
１またはそれ以上の本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に記載した通りに達成できる。本発明のさらなる実施態様および利点は、以下の詳細な説明から明らかになろう。
【００１５】
定義
用語「非荷電」は、本明細書において、非イオン性化合物に使用される。
「芳香族性基」は、本明細書において、（４ｎ＋２）に等しい数（ここで、ｎは正の整数またはゼロである）のπ電子を有する共役炭化水素基を意味する（ヒュッケル則）。この規則は、ｓｐ２−混成炭素原子のみで構成される炭化水素化合物に適用される。ＣＨ＝ＣＨユニットが窒素または硫黄により置換されている上記の基も、用語「芳香族性基」に包含される。
【００１６】
「四極子」モーメントを有する基は、「二重双極子」を意味すると理解される。別の言い方をすれば、四極子モーメントを有する基は、その中に存在する２個の双極子が互いに打ち消しあうので、双極子モーメントを持たない。
【００１７】
用語「陽イオン−π相互作用」は、ある文脈では、「π−陽イオン相互作用」と呼ばれ、共役二重結合などの二重結合の近傍に形成される電子密度の高い領域と、正荷電イオン、即ち陽イオンとの間に現れる相互作用を意味する。一般に、このタイプの相互作用は、密集したπ軌道に由来する局所的な高電子密度を有する化合物に関わる。単純な基本型の芳香族系では、陽イオン−π相互作用は、静電気的条件により最も強く影響を受け、芳香環の大型の永久四極子モーメントと陽イオンの相互作用を含むことが最近示された。陽イオン−π相互作用の研究が主に陽イオンの芳香族系への結合に焦点を当ててきたとはいえ、陽イオン−π相互作用は、それらに限定されない−それは、「陽イオン−π芳香族」相互作用ではない。エチレン、アセチレンおよび他の単純な系は、陽イオン相互作用に関与すると十分に予想され、そして記述されている（例えば、Ma, J. C., et al., Chem. Rev. 97 (1997) 1303-1324 参照）。
【００１８】
用語「生体分子」は、生体の分子の略称であり、タンパク質やポリペプチドなどの有機分子および化合物、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、プラスミド、ウイルス、細胞、核などの細胞小器官、微生物などを含む。「生体分子」は、融合タンパク質などの、組換え的に操作される有機分子または化合物でもあり得る。
【００１９】
図面の簡単な説明
図１は、正荷電溶質と、局所的な高電子密度を有する化合物との間の、起こり得る相互作用を図解する。
図２は、市販の Phenyl SepharoseTM Fast Flow マトリクス (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) のリガンド構造を図解する。
図３は、市販の Butyl SepharoseTM Fast Flow マトリクス (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) のリガンド構造を図解する。
図４は、表１（実験の部）に記載の、Phenyl SepharoseTM Fast Flow を充填したカラム（ＨＲ５／５カラム）へのＢＳＡの適用を示す。
図５は、表１（実験の部）に記載の、Phenyl SepharoseTM Fast Flow を充填したカラム（ＨＲ５／５カラム）へのＩｇＧの適用を示す。
図６は、表１（実験の部）に記載の、SepharoseTM 6 Fast Flow を充填したカラム（ＨＲ５／５カラム）へのＩｇＧの適用を示す。
図７は、表１（実験の部）に記載の、Butyl SepharoseTM Fast Flow を充填したカラム（ＨＲ５／５カラム）へのＩｇＧの適用を示す。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、液体からの化合物の分離方法である。その方法は、
（ａ）少なくとも１つの非荷電リガンドを含む分離マトリクスを提供すること；
（ｂ）分離しようとする化合物が正荷電状態で存在する液体を提供すること；
（ｃ）マトリクスへの化合物の吸着が生じるのに十分な期間、該マトリクスを該液体と接触させること；および、
（ｄ）マトリクスから液体を除去すること；
の段階を含み、該非荷電リガンドは、四極子または双極子モーメントを有し、該リガンドへの化合物の吸着は、陽イオン−π相互作用に支配されるものである。
【００２１】
ある実施態様では、分離しようとする化合物は、適切なｐＨ条件下で陽イオンであり得る、生体分子などの有機分子である。従って、化合物は、正荷電したタンパク質またはペプチドであり得る。特定の実施態様では、該タンパク質またはペプチドは、１またはそれ以上の塩基性アミノ酸、即ち、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）および／またはヒスチジン（Ｈｉｓ）、を含む。他の実施態様では、化合物は、比較的少数の芳香族性アミノ酸を含むか、または全く含まない、タンパク質またはペプチドである。あるいは、化合物は、プラスミド、動物または植物細胞などの細胞、細胞小器官、微生物、ウイルスなどであり得る。
【００２２】
有利な実施態様では、本方法の目的は、高純度の生体分子を提供することであり、特に、純度への要求が極度に高くなり得る医学分野での使用を意図する生体分子を提供することである。最適な結果のために、本発明による新規方法を、従来のクロマトグラフィー方法と有利に組み合わせる。代わりの実施態様では、所望の生成物は液体であり、そこからある特定の望まれない成分（例えば、毒性化合物など）を除去する。従って、別の実施態様では、分離しようとする化合物は、カリウム、ナトリウムなどの無機物質である。
【００２３】
段階（ｂ）では、液体のｐＨを、分離しようとする化合物が正荷電される値に合わせる必要があり得る。該液体は、分離しようとする化合物が陽イオンとして存在し得るいかなる適する液体でもあり得、例えば、水性溶液、緩衝液、発酵過程に由来する培養液などである。従って、分離しようとする化合物は、液体中で陽イオンとして提供される。いくつかの場合では、より多くの正電荷を導入することにより、化合物の正味荷電を増加させるのが有利であり得る。従って、ある実施態様では、分離しようとする化合物は、例えば、１またはそれ以上のヒスチジン（Ｈｉｓ）タグなどの正荷電タンパク質タグを導入することにより、１またはそれ以上の付加的正電荷を含むように改変される。Ｈｉｓタグは当業者に周知であり、かかる改変は、常套方法によって実施できる。結果的に、本方法は、本来陽イオン性ではない化合物の分離にも有用であり、その場合、上記方法は、そのような正のタグを導入する段階により先行される。
【００２４】
従って、本発明は、自然自体が生命の分子を組み立てるのに利用しているこの種の非共有結合力、即ち、陽イオン−π相互作用として知られる、正荷電化合物の非荷電リガンドへの結合を、分離において初めて利用する。相互作用部位（例えば芳香族性基）は、電位が最も負であるその中心を、本質的に覆っているであろう。分離の文脈では新規であるこの結合原理は、後述の実験の部で例示説明する通り、有効なクロマトグラフィーの分離を可能にするほど十分に強いことが予想外に示された。本願の発明者らは特定の理論に縛られることを望まないが、例えばフェニル基により得られる結合エネルギーの実質的な部分は、静電気的であると考えられる。陽イオン−π相互作用により得られるエネルギーの他の成分は、四極子または双極子モーメントを有する非荷電基の分極性、芳香族性基の誘導された双極子と陽イオンのそのような相互作用を反映し得る。分散力を伴う供与体−受容体力も含まれ得る。本発明について本質的な要素は、四極子または双極子モーメントが電子の豊富な領域、即ち高電子密度の領域を生じさせることであり、その特性は、陽イオン性化合物を結合するのに十分であることが今回示された。
【００２５】
上述のように、本方法で利用される吸着は、陽イオン−π相互作用に支配される。ある実施態様では、このことは、吸着が少なくとも約２０％、例えば、３０％または５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、陽イオン−π相互作用に基づくことを意味する。特定の実施態様では、得られる吸着は、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、陽イオン−π相互作用に基づく。しかしながら、上記の数字は、リガンド−分離しようとする化合物の相互作用に言及するものであり、従って、後述の官能基を含むスペーサーの使用により得られるいかなる付加的相互作用も含むものではないことが留意される。
【００２６】
このように、陽イオン−π相互作用は幅広い文脈で記載されてきたが、以前の研究は、例えば、焦点が生物特異性に当てられるタンパク質の分野におけるものであった。最近、Gallivan, J. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96 (1999) 9459-9464 は、陽イオン−π相互作用が水性媒体中でかなり強いだけでなく、タンパク質においても共通して見いだされることを示した。しかしながら、この最近の研究は、生物学的経路におけるもののような、分子相互作用に焦点を当てた。本発明は、そのような陽イオン−π相互作用を分離の目的で、例えばクロマトグラフィーにおいて、利用することを初めて示唆する。従って、本明細書では、低導電条件下で非荷電リガンドを使用して、陽イオン性生体分子を液体から分離できることが示される。別の言い方をすれば、本発明は、非荷電疎水性リガンドを親水性の流儀で利用する。本方法では低イオン強度が使用されるので、この原理は、以前に示唆されたＨＩＣ方法と異なる。
【００２７】
本方法のある実施態様では、四極子または双極子モーメントを有する非荷電リガンドの官能基は、芳香族性基、−Ｃ＝Ｃ二重結合またはＣ≡Ｎ三重結合を含む、共役系などの系である。従って、リガンドは、フェニル、シクロペンタジエン、フラン、チオフェン、トルエン、アニソール、スチレン、アセトフェノン、ナフタレンおよびアントラセンからなる群から選択し得るか、または、陽イオンを結合するために必要な電子密度を依然として示す、それらのいかなる誘導体でもあり得る。あるいは、リガンドは、ピリジンやピロールなどの窒素含有分子を含み得るが、酸性ｐＨ範囲では、窒素が、陽イオンの分離しようとする化合物への結合を妨害できる正電荷を示すので、そのようなリガンドはあまり好ましくない。リガンドは、１またはそれ以上のそのような系の組合せでもあり得、陽イオンの結合をしやすくする空間的配置に設計し得る。最も有利な場合では、そのような異なるリガンドを、それらの相加的効果をもたらすために組合せることができる。従って、本方法の有利な実施態様は、フェニルまたは四極子モーメントが本質的に保持されているその官能性誘導体を利用する。本文脈では、用語「官能性の」は、高電子密度領域を介して正荷電化合物に結合する能力を表す。加えて、官能基の陽イオン結合特性に負の影響を全く与えないか、または少ししか与えない、いかなる置換基も存在し得る。しかしながら、陽イオン交換におけるリガンドとしての官能基の特性を実験的に試験することにより、本来の結合特性を改善するある種の置換基が見いだされ得る。例として、特定の置換基は、特異的生体分子へのさらなる水素結合に参加し得る。そのような修飾リガンドは、当然上記の用語誘導体に含まれ、本発明に包含される。なぜなら、そのような日常的な試験は、クロマトグラフィーにおいて陽イオン−π相互作用を使用する一般原理が一度知られると、さらなる発明的技能を必要としないからである。従って、本方法で使用されるリガンドは、上記定義の官能基を含むより大きい分子であり得、電子吸引または電子供与特性のある置換基の使用は、各々の特定目的用の方法の設計を可能にできる。さらに、１つの分離マトリクスを、双極子または四極子モーメントを有する１つ以上の非荷電基で、例えば芳香族性および非芳香族性官能基の混合物で、構成し得る。
【００２８】
本方法のある実施態様では、リガンドは、官能基を支持体から分離するスペーサーも含み得る。特定の実施態様では、該スペーサーは、分離しようとする化合物と水素結合などにより相互作用する能力を有する１またはそれ以上のさらなる官能性を含み、多様式クロマトグラフィーマトリクスを提供する。エクステンダー、リンカーまたはアームと表示されることもあるそのようなスペーサー分子は、様々なクロマトグラフィー操作に関する文献に記載されてきた。従って、当業者により容易に選択され得る。例えば、Johansson et al in Journal of Chromatography, 403 (1987) 85-98: "Determination of the leakage from..."を参照されたい。
【００２９】
上記のようにスペーサーに結合していることもある非荷電化合物の形態の官能で構成されるリガンドを、周知技術に従って支持体に結合させる。かかる支持体は、多孔性または非多孔性のビーズまたは粒子またはモノリスまたは膜（連続的マトリクス）の形態であり得る。ビーズ／粒子の形状は、球状または不規則的であり得る。支持体の素材は、例えば、デキストラン製の多糖類ゲル（Sephadex（登録商標）、Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden）、アガロース（SepharoseTM、Amersham Biosciences AB, Uppsala Sweden）、スターチ、セルロース（Sephacel, Amersham Biosciences AB, Uppsala Sweden）、シリカ、スチレン−ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）（SOURCE（登録商標）、Amersham Bioscienses AB, Uppsala, Sweden）、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどであり得る。あるいは、マトリクスは、逆相懸濁ゲル形成 (例えば、S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964) を参照）または懸濁重合 (例えば、"Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988) を参照）などの標準的方法に従い製造する。
【００３０】
ある実施態様では、支持体を最初に製造し、次いで、周知方法に従って、双極子または四極子モーメントを有する本発明の非荷電基で被覆する。この種のリガンドは、陽イオン−π相互作用が利用される分離方法において有用な表面を与えるために、キャピラリーカラム、チップ、コンパクトディスク（ＣＤ）などの他の表面を被覆するのにも使用できる。
【００３１】
本発明の他の新規態様は、Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden から販売されている SOURCE（登録商標）などのジビニルベンゼンマトリクスをクロマトグラフィーで直接使用することである。この態様では、マトリクス表面上に存在するスチレン基の近傍に形成される高電子密度領域が、リガンドの官能基を提供する。従って、本方法で使用されるリガンドの製造は、分離マトリクスを製作するようにして実施できる。上述のＤＶＢベースのマトリクスは、従来、例えばエピクロルヒドリンによる活性化とそれに続く官能基の結合により、その表面に適切な修飾をした後で使用されてきた。当然、新規マトリクスは、クロマトグラフィーまたは同様の分離方法における固定相として直接的に有用なマトリクスを提供するために、他の出発物質から製造することもできる。そのような新規マトリクスは、双極子または四極子モーメントを有する上記の非荷電基の１またはそれ以上を示すことができる。従って、他の実施態様では、分離マトリクスは、例えば常套の乳化技法により、直接的に製造できる。
【００３２】
段階（ｃ）、即ち、吸着段階は、低イオン強度で適切に実施できる。使用する液体の性質、および、ことさらその中の水の割合は、後述するように、分離支持体に依存して決定される。本明細書では、用語「低イオン強度」は、ＨＩＣ方法で使用するには低すぎるイオン強度に相応することが、理解されるべきである。かかる低イオン強度の例は、例えば、約０.１Ｍなどの、＜０.２Ｍである。従って、本方法は非常に低い塩強度条件下で、さらなる塩を添加せずに使用できるので、この分離原理はＨＩＣと異なる。例えば、本発明は、塩がより少なく存在するので、総合的にＨＩＣ方法よりも清浄または純粋な最終生成物もたらす分離を可能にする。
【００３３】
ある実施態様では、本方法は、
（ｅ）吸着した化合物を溶離すること、の段階も含む。これは、ｐＨを高めることを含む、ｐＨ勾配／段階により、都合よく実施される。従って、分離しようとする化合物の電荷がより低い正電荷に向かって変化し、続いてだんだんと負に荷電するように、溶離剤のｐＨを段階的に変化させる。分離マトリクスに１以上の化合物が吸着した場合、異なる化合物がそれらの各々の組成によって異なる電荷で溶離し、１またはそれ以上の所望の化合物が他の化合物から容易に分離される。特定の実施態様では、段階（ｃ）中の吸着はｐＨ＜ｐＩで実施され、段階（ｅ）中の化合物の脱着はｐＨ＞ｐＩで実施される。当業者に公知のように、ｐＩは、化合物の等電点の尺度であり、当該化合物の正味荷電が０であるｐＨとして定義される。
【００３４】
有利な実施態様では、溶離は、ＥｔＯＨ、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＣＮ、ＤＭＦ、イソプロパノールなどの有機溶媒の添加により実施される。この実施態様では、分離しようとする化合物を確実に負電荷のものにするために、ｐＨを合わせる。
【００３５】
本文脈では、各リガンドについて、リガンドが非荷電である範囲内でｐＨ域を定義できることを理解すべきである。従って、吸着過程は、リガンドの官能基が非荷電である条件下で実行するが、脱着および溶離については、リガンドが荷電し、従って化合物をはじくように、条件を変更できる。
【００３６】
溶離の前に、場合により洗浄工程を含める。その洗浄は、当業者に周知のいかなる適する緩衝液をも利用し得る。吸着および脱着および場合による洗浄について上記した段階は、周知技法に従い、常套かつ市販の装置を使用して、当業者により容易に実施される。
【００３７】
都合のよいことに、本方法は、クロマトグラフィー方法として実行され、従って、段階（ｂ）および（ｃ）は、同時に実施される。即ち、常套のクロマトグラフィーの条件により制御しながら、液体をクロマトグラフィーのカラムの一端に添加し、他端から出るようにする。液体をカラムの上部または底部で添加することができ、その場合、操作は伸張床（expanded bed）条件下で実行する。あるいは、例えば遠心力の使用により、分離マトリクスを本質的に水平に通過させることができる。そのときは、分離マトリクスは、カラム中に、充填床（packed bed）形態、伸張床形態、または他のいかなる常套に使用される形態でも存在できる。様々な体裁のクロマトグラフィーが当分野で知られており、当業者は適する条件を容易に選択できる。あるいは、本方法は、容器中に存在するマトリクスに液体を加える、常套のバッチ式操作として実施し得る。場合により注意深く撹拌しながら、吸着を起こさせ、適切な期間の後で例えば濾過により液体を除去する。バッチ式操作は、長期に渡って使用されてきた。そして、長い吸着時間が求められる場合など、ある種の事例で好まれ得る。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、上記定義の方法で使用するための、１またはそれ以上の官能基が結合した支持体で構成される分離マトリクスである。その官能基は、四極子または双極子モーメントを有する非荷電基であり、そのマトリクスは、陽イオン−π相互作用により正荷電した物質を吸着する能力を有する。好ましい実施態様では、非荷電基は、芳香族性基、Ｃ＝Ｃ二重結合またはＣ≡Ｎ三重結合を含む、共役系などの系である。有利な実施態様では、非荷電基は、フェニル基、または上記のように四極子モーメントが本質的に保持されているその誘導体である。陽イオン性化合物を吸着するのに十分な電子密度を有する有用な非荷電基に関するさらなる詳細は、上記の通りである。
【００３９】
本分離マトリクスの有利な実施態様では、スペーサー分子を導入し、官能基を支持体から遠ざける。かかるスペーサーは、例えば、官能基が、タンパク質などの比較的大きい化合物に、結合能力を乱すことなく結合するのを促進する。特に有利な実施態様では、スペーサー分子は、双極子または四極子モーメントを有する非荷電基と同じ化合物と相互作用する能力のある１またはそれ以上のさらなる官能基を含む。有用なスペーサー分子に関するさらなる詳細は、上記の通りである。
【００４０】
本発明による分離マトリクス中に存在するリガンドの密度は、後述の実験の部で示す通り、変動できる。高密度は、通常高い結合能力をもたらすので、通常、それが望ましい。しかしながら、これは、経験または単純な日常的試験に基づき、方法の目的に応じて当業者が選択できる変数である。この目的のために重大な要件は、例えば、分離しようとする化合物のサイズ、使用するリガンドの空間的配置、それがカラムまたはバッチ式の方法のいずれであるのか、である。
【００４１】
ある実施態様では、本分離マトリクスは、タンパク質またはペプチドの分離などの陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて使用するためのものである。従って、上記の双極子または四極子モーメントを有する非荷電基は、上述の陽イオン−π相互作用により、陽イオンに結合する能力を有する。この原理は、イオン交換などの分離操作で使用するために以前に示唆されたことがなく、該相互作用がこの目的のために十分なほど強いことは、全く予想されなかった。
【００４２】
上記から明らかな通り、本分離マトリクスは、上記定義の方法において使用するためのものである。従って、例示的実施態様では、本発明は、アガロースビーズが、陽イオン−π相互作用によりタンパク質などの陽イオンに結合する能力のある非荷電フェニル基と共に提供される、クロマトグラフィーの分離マトリクスに関する。好ましくは、フェニル基は、例えば１またはそれ以上のヒドロキシ基が結合したアルキル鎖などの、適するスペーサーを介してアガロースに結合する。
【００４３】
図面の詳細な説明  図１は、正荷電溶質と、局所的な高電子密度を有する化合物との間の、起こり得る相互作用を、芳香族リガンドで示して図解する。
図２は、市販の Phenyl SepharoseTM Fast Flow マトリクス (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) のリガンド構造を図解する。
図３は、市販の Butyl SepharoseTM Fast Flow マトリクス (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) のリガンド構造を図解する。
図４は、表１に記載の、Phenyl SepharoseTM Fast Flow を充填したカラム（ＨＲ５／５カラム）へのＢＳＡの適用を示す（リガンド密度＝４０μｍｏｌ／ｍＬゲル）。この図は、移動相のｐＨをｐＨ７.５に上げることにより、吸着したＢＳＡの脱着を達成できることを示す。ＢＳＡのｐＩ値は、５.１である。従って、ＢＳＡはｐＨ７.５で負に荷電するので、フェニルリガンドに引きつけられない。
【００４４】
図５は、表１に記載の、Phenyl SepharoseTM Fast Flow を充填したカラム（ＨＲ５／５カラム）へのＩｇＧの適用を示す（リガンド密度＝４０μｍｏｌ／ｍＬゲル）。この図は、移動相のｐＨをｐＨ７.５に上げることにより、吸着したＩｇＧの脱着を達成できることを示す。ＩｇＧのｐＩ値は、約６である。従って、ＩｇＧはｐＨ７.５で負に荷電するので、フェニルリガンドに引きつけられない。
図６は、表１に記載の、SepharoseTM 6 Fast Flow を充填したカラム（ＨＲ５／５カラム）へのＩｇＧの適用を示す。ＩｇＧは塩基性マトリクスに吸着されないことがわかる。
図７は、表１に記載の、Butyl SepharoseTM Fast Flow を充填したカラム（ＨＲ５／５カラム）へのＩｇＧの適用を示す（リガンド密度＝５０μｍｏｌ／ｍＬゲル）。この図は、少量のＩｇＧがButyl SepharoseTM Fast Flow に吸着でき、貫流交換容量（breakthrough capacity）が２ｍｇ／ｍＬゲルに相応することを示す。しかしながら、ブチルリガンドは四極子モーメントを有さないので、陽イオン−π相互作用はＩｇＧの吸着原因ではあり得ない。
【００４５】
実験の部
以下、実施例を用いて本発明を例示説明する。提示する実験では、フェニルを代表的な非荷電基として使用するが、四極子または双極子モーメントを有する他のいかなる非荷電基も、本発明に従う分離方法において同様の特性を示すと予想できることを、理解すべきである。従って、実施例は、添付の特許請求の範囲により定義される本願の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本願で示した全参照文献を、出典明示により本明細書の一部とする。
【００４６】
機能試験
陽イオン−π相互作用を生体分子の分離に使用できることを証明するために、異なる正荷電タンパク質を、ビーズ状のアガロースマトリクスである SepharoseTM 6 Fast Flow に結合させた非荷電リガンド（フェニル）で構成される分離媒体に吸着させた（図２）。このリガンドは、四極子モーメントを有する。
【００４７】
２つの異なるリガンド密度、即ち、２０μｍｏｌ／ｍＬゲルおよび４０μｍｏｌ／ｍＬゲル、の Phenyl SepharoseTM Fast Flow を試験した。媒体の製造の簡単な説明について、合成操作の項を参照されたい。
【００４８】
吸着の後、試験タンパク質が負に荷電する条件で、脱着を達成する。分離操作は、以下の通りである。媒体をカラムに充填し、カラムを通してタンパク質溶液を送り込むことにより、タンパク質をアプライした。次いで、カラムを洗浄し、非吸着タンパク質を溶離させた。洗浄段階の後、吸着したタンパク質を脱着した。吸着および脱着の両段階を、移動相として使用した緩衝液に追加の塩を添加せずに実施したことに留意すべきである（下記参照）。
【００４９】
媒体を１.０ｍｌ ＨＲ５／５カラムに充填し、２０カラム容量のＡ緩衝液（２５ｍＭ酢酸緩衝液；ｐＨ４.０）で平衡化した。カラムにアプライしたタンパク質溶液は、３.２ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４.１ｍｇ／ｍＬヒト免疫グロブリン、４.９ｍｇ／ｍＬリゾチーム、３.１ｍｇ／ｍＬリボヌクレアーゼＡ、１.３ｍｇ／ｍＬアルドラーゼ、３.１ｍｇ／ｍＬチトクロムＣまたは３.８ｍｇ／ｍｌラクトフェリンであった。全タンパク質をＡ緩衝液に溶解した。緩衝液Ａによる平衡化の後、これらの溶液１０ｍｌを流速１００ｃｍ／時（０.３２ｍＬ／分）でカラムを通して送りこんだ。貫流交換容量は、最大ＵＶ検出シグナル（２８０ｎｍ）の１０％で評価した。最大ＵＶシグナルは、試験溶液を検出器に直接送り込むことにより判断した。最大吸光度（Ｑｂ１０）の１０％での貫流交換容量は、式：
Ｑｂ１０％＝（ＴＲ１０％−ＴＲＤ）ｘＣ／Ｖｃ
式中、ＴＲ１０％は、最大吸光度の１０％の保持時間（分）、ＴＲＤは、システムの空隙容量時間（分）、Ｃは、ＢＳＡ濃度（３.２ｍｇ／ｍＬ）、そしてＶｃは、カラム容積（ｍＬ）である、
に従って算出した。
【００５０】
吸着したタンパク質を、２０％（ｖ／ｖ）エタノールを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.５）を使用して脱着した。脱着後、カラムを１.０Ｍ ＮａＯＨで清浄にし、使用後の媒体にタンパク質が吸着したままになっていないことを確実にした。クロマトグラフィーの操作を下記表１にまとめる。
【００５１】
全実験は、UNICORNTM 3.1 ソフトウェア (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden）を備えたAKTATM エクスプローラー１００クロマトグラフィーシステム (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden）を使用して、室温で実施した。
【００５２】
Phenyl SepharoseTM Fast Flow の合成方法
使用した２つの Phenyl SepharoseTM Fast Flow 媒体は、Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden から市販されている２つの媒体である。フェニルグリシジルエーテルと SepharoseTM 6 Fast Flow との反応を介して、両媒体を製造する。
【００５３】
結果と考察
タンパク質の安定性に貢献する非共有結合相互作用の中で、水性媒体中に完全に曝されたときに特異的かつ強いものは少ない。しかしながら、水性環境中で特異的かつ強い可能性のある、１つの比較的正当に評価されていない非共有結合力、即ち、陽イオン−π相互作用がある。最近の研究は、陽イオン−π相互作用は水性媒体中でかなり強いだけでなく、タンパク質構造中に共通して見いだされることを示した（Gallivan, J. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96 (1999) 9459-9464）。静電学的観点では、陽イオン−π相互作用において支配的な成分は、芳香環のπ電子雲により創生される四極子へ向かう、正荷電分子の引力である (Minoux, H. et al., J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 10366-10372）。
【００５４】
図４および５は、ＢＳＡおよびＩｇＧが、酸性条件（ｐＨ４.０）で Phenyl SepharoseTM Fast Flow に吸着できることを図解する。正荷電タンパク質と非荷電リガンドとの間の静電気的相互作用を強めるために、緩衝液成分以外の追加の塩を移動相に添加しない。ＢＳＡおよびＩｇＧの貫流交換容量（Ｑｂ１０％）は、各々１７および９.４ｍｇ／ｍｌであると測定された。図４および５はまた、移動相のｐＨをｐＨ７.５に高めることにより、吸着したＢＳＡおよびＩｇＧの脱着を達成できることも示す。ＢＳＡおよびＩｇＧのｐＩ値は、各々５.１および約６である。従って、ＢＳＡおよびＩｇＧは、ｐＨ７.５で負に荷電するので、フェニルリガンドに引き付けられない。溶離ピークを僅かに鋭くするために、吸着緩衝液にエタノール（２０％Ｖ／Ｖ）を添加する。
【００５５】
ＩｇＧの貫流交換容量は、リガンド密度の低い（リガンド密度２０μｍｏｌ／ｍＬ）Phenyl SepharoseTM Fast Flow についても試験した。この媒体について得られたＩｇＧのＱｂ１０％値は、５.５ｍｇ／ｍＬであった。高置換Phenyl SepharoseTM Fast Flow（リガンド密度４０μｍｏｌ／ｍＬ）についてのＩｇＧのＱｂ１０％値は、９.４ｍｇ／ｍＬであった。このことは、貫流交換容量がリガンド密度に伴い上昇することを示す。
【００５６】
リガンドのみがサンプル分子と相互作用し、アガロースのベースマトリクスはしていないことを証明するために、SepharoseTM 6 Fast Flow (リガンドがビーズ状のアガロースマトリクスに全く結合していない）を充填したカラムにＩｇＧをアプライした。図６によると、ＩｇＧがベースマトリクスの SepharoseTM 6 Fast Flow に吸着されないことがわかる。
【００５７】
Phenyl SepharoseTM Fast Flow の場合の陽イオン−π相互作用の重要性を証明するために、ブチルリガンドをベースとする媒体にＩｇＧが吸着できるか否かも試験した（図３）。Butyl SepharoseTM Fast Flow は、Amersham Biosciences AB から市販されている媒体であり、５０μｍｏｌ／ｍＬゲルに相当するブチルリガンド密度を有する。
【００５８】
図７は、少量のＩｇＧが Butyl SepharoseTM Fast Flow に吸着できること、および貫流交換容量が２ｍｇ／ｍＬゲルに相当することを示す。ブチルリガンドは四極子モーメントを有さないので、陽イオン−π相互作用は、ＩｇＧ吸着の原因ではあり得ない。しかしながら、Butyl SepharoseTM Fast Flow についての貫流交換容量は、Phenyl SepharoseTM Fast Flow（リガンド密度４０μｍｏｌ／ｍＬゲル）で観察される交換容量の２５％以下である。これらの結果は、ＩｇＧとフェニルリガンドとの間の力は、陽イオン−π相互作用によるものだけではないことを示す。しかしながら、陽イオン−π相互作用は、高い貫流交換容量を得るのに最も重要である。
【００５９】
この分離技法の１つの利点は、選択性であろう。なぜなら、陽イオン−π相互作用は、自然が生命の分子を組み立てるのに使用する重要な結合力であることが、今や明白であるからである (Ma, J. C., et al., Chem. Rev. 97 (1997) 1303-1324）。このことを試験するために、７つの異なるタンパク質の貫流交換容量を Phenyl SepharoseTM Fast Flow で測定した。下記表２が示すのは、異なるタンパク質のＱｂ１０値における大きな多様性こそが、この新しい分離原理で高い選択性を達成できることを明確に示すことである。
【００６０】
表１：陽イオン−π相互作用に関するクロマトグラフィーの操作
【表１】
2005512105.tif 000003
ａ提示した数字には、異なる段階が示されている。
ｂカラムにアプライしたタンパク質溶液は、２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４.０）に溶解した、３.２ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４.１ｍｇ／ｍＬヒト免疫グロブリン、４.９ｍｇ／ｍＬリゾチーム、３.１ｍｇ／ｍＬリボヌクレアーゼＡ、１.３ｍｇ／ｍＬアルドラーゼ、３.１ｍｇ／ｍＬチトクロムＣまたは３.８ｍｇ／ｍｌラクトフェリンであった。
【００６１】
表２：Phenyl SepharoseTM Fast Flow（リガンド密度４０μｍｏｌ／ｍＬゲル）における７つの異なるタンパク質の貫流交換容量（Ｑｂ１０）
【表２】
2005512105.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、正荷電溶質と、局所的な高電子密度を有する化合物との間の、起こり得る相互作用を図解する。
【図２】図２は、市販の Phenyl SepharoseTM Fast Flow マトリクスのリガンド構造を図解する。
【図３】図３は、市販の Butyl SepharoseTM Fast Flow マトリクスのリガンド構造を図解する。
【図４】図４は、表１に記載の、Phenyl SepharoseTM Fast Flow を充填したカラムへのＢＳＡの適用を示す。
【図５】図５は、表１に記載の、Phenyl SepharoseTM Fast Flow を充填したカラムへのＩｇＧの適用を示す。
【図６】図６は、表１に記載の、SepharoseTM 6 Fast Flow を充填したカラムへのＩｇＧの適用を示す。
【図７】図７は、表１に記載の、Butyl SepharoseTM Fast Flow を充填したカラムへのＩｇＧの適用を示す。
【図１】
2005512105.tif 000005
【図２】
2005512105.tif 000006
【図３】
2005512105.tif 000007
【図４】
2005512105.tif 000008
【図５】
2005512105.tif 000009
【図６】
2005512105.tif 000010
【図７】
2005512105.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月21日(2004.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの化合物を液体から分離する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの非荷電リガンドを含む分離マトリクスを提供すること；
（ｂ）分離しようとする化合物が正荷電状態で存在する液体を提供すること；
（ｃ）マトリクスへの化合物の吸着が生じるのに十分な期間、該マトリクスを該液体と接触させること；および、
（ｄ）マトリクスから液体を除去すること；
の段階を含み、該非荷電リガンドは、四極子または双極子モーメントを有し、該リガンドへの化合物の吸着は、陽イオン−π相互作用に支配されるものである、方法。
【請求項２】
化合物がタンパク質またはペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該タンパク質またはペプチドが１またはそれ以上の塩基性アミノ酸を含むものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
非荷電リガンドの官能基が、芳香族性基、−Ｃ＝Ｃ二重結合またはＣ≡Ｎ三重結合を含む系である、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
官能基が、フェニル、または四極子モーメントが本質的に保持されているその官能性誘導体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
リガンドが、官能基を支持体から遠ざけるスペーサーを介して支持体に結合する、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該スペーサーが、分離しようとする化合物と水素結合などにより相互作用する能力を有する１またはそれ以上のさらなる官能性を含み、多様式クロマトグラフィーマトリクスを提供するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｃ）の吸着が低塩濃度条件下で実施される、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
（ｅ）少なくとも１つの化合物を分離マトリクスから溶離すること、
の段階も含む、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
溶離が有機溶液の添加により実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｂ）に従い提供される液体のｐＨと比較してｐＨが高められている液体を使用して、段階（ｅ）が実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
クロマトグラフィーの方法である、請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｃ）中の吸着がｐＨ＜ｐＩで実施され、段階（ｅ）中の脱着がｐＨ＞ｐＩで実施される、請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
化合物を液体から分離するための、ジビニルベンゼンをベースとするクロマトグラフィーのマトリクスの使用であって、化合物を正荷電状態で液体中に提供し、マトリクス表面上に存在するスチレン基の共役系の近傍にある高電子密度領域への吸着に十分な期間、液体をマトリクスと接触させる、使用。
【請求項１５】
該吸着が低塩濃度条件下で実施される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
分離しようとする化合物がタンパク質またはペプチドであり、好ましくは１またはそれ以上の塩基性アミノ酸を含むものである、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
【国際調査報告】
2005512105.tif 000012
2005512105.tif 000013