(57)【要約】本発明は、新規な抗真菌化合物である、以下に示される式（Ｉ）の２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートに関する。この化合物は、抗真菌特性を有し、そして標準的な抗真菌剤と比較した場合に、数倍低毒性である。この化合物は、毒性作用が少なく、ヒトにおける全身性および表面性の真菌感染を制御するために有用であり得る。この化合物は、容易に入手可能な植物であるＤａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌから単離される。
2005520861.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１の新規の抗真菌分子、２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−２−イル）−１−メチルエチルペンタノエート：
【化１】
2005520861.tif 000008
【請求項２】
請求項１に記載の新規の抗真菌分子であって、該複素環式分子は、ＴＬＣ、基特異的化学染色、ＵＶ、赤外線、質量および核磁気共鳴分光法のような公知の分析方法、ならびに抗真菌アッセイおよび細胞障害性アッセイのような生物学的アッセイによって特徴付けられ、そして以下の特徴：
ａ）添付の図面の図３に示されるように、ＴＬＣにおける０．２２のＲｆ値；
ｂ）添付の図面の図７に示されるように、ＵＶスペクトルにおける３００ｎｍおよび２０６ｎｍの吸収極大；
ｃ）添付の図面の図８に示されるように、ＩＲ  ＶＭａｘ：３４３４（ＮＨ），３０２４，１７１１（エステル），１６４６（Ｃ＝Ｃ），１５２４，１４２６，１２３０，９３８，７６０ｃｍ−１；
ｄ）添付の図面の図９に示されるように、＋ｖｅ  ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｚ：２３９［Ｍ］＋（Ｃ１４Ｈ２５Ｏ２Ｎ）（１６．３），２１２（１３．２），１７４（１６．２），１２２（３４．２），１０２（９６．４），５８（１００），および５７（１９．２）；ならびに
ｅ）添付の図面の図１１に示されるように、１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  ：δ  ４．１５（１Ｈ，ｍ，Ｃ１’−Ｈ）；３．７５（１Ｈ，ｍ，Ｃ２−Ｈ）；３．１７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ，７．４４Ｈｚ，Ｃ５−ＨａおよびＣ５−ＨａおよびＣ５−Ｈｂ）；２．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４８Ｈｚ，Ｃ２”−Ｈａ）；１．９５（１Ｈ，ｍ，Ｃ２”−Ｈｂ）；１．６２（６Ｈ，ｂｒ，Ｃ６−ＣＨ３およびＣ７−ＣＨ３）；１．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９６Ｈｚ，Ｃ２’−Ｈａ）；１．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，Ｃ２’−Ｈｂ）；１．２５（７Ｈ，ｂｒ，Ｃ１’−ＣＨ３，Ｃ３”−Ｈｂ，Ｃ４”−ＨａおよびＣ４”−Ｈｂ）；０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９６Ｈｚ，Ｃ５”−ＣＨ３）およびＣＯＳＹスペクトル；
を有する、分子。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物であって、該抗真菌分子のＣＴ５０値（すなわち、細胞の５０％に対する細胞傷害性用量）は、添付の図面の図１２に示されるように、８８９．２μｇ／ｍｌである、化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物であって、該抗真菌化合物のＥＤ５０は、添付の図面の図１３に示されるように、１６７．０ｍｇ／ｋｇ体重である、化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物の細胞毒性は、標準的な抗真菌薬より５７．８倍小さい、化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物が、抗真菌剤として使用される、化合物。
【請求項７】
抗真菌剤としての薬学的組成物であって、該組成物は、有効量の化合物、２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−２−イル）−１−メチルエチルペンタノエートを薬学的に受容可能な添加剤およびアジュバンドと共に含む、組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、前記添加剤が、炭水化物、タンパク質、糖および薬学的に受容可能なキャリアからなる群から選択される、組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の組成物であって、前記新規の抗真菌分子の有効用量が、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある、組成物。
【請求項１０】
請求項７に記載の組成物であって、該組成物は、経口投与、腹腔内投与、または任意の他の適切な経路で投与され得る、組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載の組成物であって、該組成物は、錠剤、カプセル剤、シロップ、散剤、軟膏および注射の形態で投与される、組成物。
【請求項１２】
請求項７に記載の組成物であって、該組成物の細胞毒性は、標準的な抗真菌薬より５７．８倍小さい、組成物。
【請求項１３】
請求項７に記載の組成物であって、該組成物は、哺乳動物およびヒトから選択される被験体、好ましくはヒトに投与され得る、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の新規の抗真菌分子の単離のためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
（ｉ）１５〜４５℃の範囲の温度で、粉末状のＤａｔｕｒａ  ｍｅｔａｌ植物材料を、有機溶媒で連続的に抽出する工程；
（ｉｉ）該溶媒を除去して、残渣を得る工程；
（ｉｉｉ）該工程（ｉｉ）で得られた該残渣を、脂肪族炭化水素溶媒で抽出し、続いてクロロホルムで抽出する工程；
（ｉｖ）クロロホルム画分からクロロホルムを除去する工程；
（ｖ）該クロロホルム画分から得られた残渣を、抗真菌活性についてスクリーニングする工程；
（ｖｉ）該抗真菌画分を分離し、そして従来のクロマトグラフィー法によって、活性抗真菌クロロホルム画分から新規の抗真菌リード分子を精製する工程；および
（ｖｉｉ）該工程（ｖｉ）で得られた該リード分子を、抗真菌活性およびその細胞毒性についてアッセイする工程、
を包含する、プロセス。
【請求項１５】
請求項１４に記載のプロセスであって、工程（ｉ）において、抽出のために使用される前記溶媒が、メタノール、エタノール、アセトンおよびクロロホルムから選択される、プロセス。
【請求項１６】
請求項１４に記載のプロセスであって、工程（ｉｉ）において、前記化合物の精製が、カラムクロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行われる、プロセス。
【請求項１７】
請求項１４に記載のプロセスであって、工程（ｖ）において、使用される前記脂肪族炭化水素溶媒が、ペンタン、ヘキサン、石油エーテルおよびヘプタンから選択される、プロセス。
【請求項１８】
請求項１４に記載のプロセスであって、工程（ｖｉ）において、前記新規の化合物の精製が、クロロホルム：アセトン：ジエチルアミン（５．０：４．０：１．０）、クロロホルム：メタノール：ジエチルアミン（８．５：１．５：０．１）、およびクロロホルム：メタノール：ギ酸（８．０：２．０：０．１）、または該有機溶媒の異なる組み合わせから選択される溶媒系を使用する薄層クロマトグラフィーによって行われる、プロセス。
【請求項１９】
請求項１４に記載のプロセスであって、工程（ｖｉ）において、前記新規の化合物の精製が、７０：３０のアセトニトリル：水の溶媒系を使用し、逆相ＲＰ−８カラムを使用するＨＰＬＣによって行われる、プロセス。
【請求項２０】
請求項１４に記載のプロセスであって、工程（ｖｉ）において、純粋な化合物が、強力な抗真菌活性を示す、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、新規な抗真菌分子である式（Ｉ）の２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１−メチルエチルペンタノエートに関する。本発明は特に、植物Ｄａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌから単離された新規な抗真菌リード（ｌｅａｄ）分子に関する。
【０００２】
【化２】
2005520861.tif 000003
本発明の主な有用性は、病原菌によって引き起こされる疾患を処置するための新しい薬物を開発するための、新しいリード分子を提供することである。
【０００３】
（背景技術）
真菌感染に起因する発生率および死亡率は、過去１０年間において上昇しつつあることが認められている（Ｓａｒａｌ，Ｒ．，１９９１，Ｒｅｖ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１３，４８７−４９２．，Ｋｏｌｌ，Ｂ．Ｓ．およびＢｒｏｗｎ，Ａ．Ｅ．１９９３，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１７，Ｓ−３２２−Ｓ−３２６）。これらの種によって引き起こされる感染は、公衆衛生に対して現れる脅威としてますます認識されている。免疫無防備状態の宿主において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａなどによる感染は侵襲性になり、そして身体の感染の最初の部位から他の部位（腸、腎臓、脳などを含む）へと広がる。侵襲性のアスペルギルス症は、５５％の死亡率と関連することが報告されている（Ｄｅｎｎｉｎｇ．Ｄ．Ｗ．およびＳｔｅｖｅｎｓ．Ｄ．Ａ．，１９９０．Ｒｅｖ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，１２．１１４７−１２０１）。骨髄移植のレシピエントにおけるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓに起因する死亡率は、適切な化学療法にもかかわらず８０％程度と高いことが認められた（Ｍｅｙｅｒ．Ｊ．Ｄ．，１９９０．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７（補遺６），１０−１３）。大脳のアスペルギルス症は、急性髄膜炎の症状を示し、そして常に致死的である。Ｃａｎｄｉｄａ種は、ヒトの粘膜皮膚表面の片利共生生物体である。しかし、免疫無防備状態の宿主において、Ｃａｎｄｉｄａは、日和見性の強力な病原体へと発展し得る。これは、他の免疫無防備状態の患者に接触することによって、院内病原体として伝染され得る。
【０００４】
従って、回復不能な損傷を防止するために、これらの真菌感染を初期の段階で診断および処置することが重要である。真菌症の処置について、アゾール、ポリエンおよび他のグループの化学物質に属するいくつかの化合物が、文献において記載されている。しかし、これらの化合物は全て、それら自身の制限を有する。
【０００５】
ポリエンは、最も古く、かつ最も頻繁に処方される抗真菌剤の１つである。アンホテリシンＢは、真菌に対する広範な活性を有することが見出されている重要なポリエン薬物であるが、その治療用量は、重篤な悪寒、熱、嘔吐、生命を脅かす低血圧、および呼吸窮迫に頻繁に関連する。アンホテリシンＢは、腎臓機能不全を生じ（Ａｌｌｅｎｄｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｐ．，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｋ．，Ｄｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．，Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒ，Ｊ．，Ｌｙｍａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｐｉｚｚｏ，Ｐ．Ａ．およびＷａｌｓｈ，Ｔ．Ｊ．１９９４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８，５１８−５２２）、そしてその静脈内投与の必要性が、その主な制限である（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｄ．Ａ．およびＬｅｅ，Ｊ．Ｙ．，１９９７，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，５７，１８５７−１８６２）。その副作用に加えて、真菌種におけるアンホテリシンＢ耐性が報告されている（Ｇｏｋｈａｌｅ，Ｐ．Ｃ．，Ｋｓｈｉｒｓａｇａｒ，Ｎ．Ａ．およびＰａｎｄｙａ，Ｓ．Ｋ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６５（６），４４８−４５４，Ｆｏｒｔｈｅｒｇｉｌｌ，Ａ．Ｗ．およびＭｃＧｏｕｇｈ，Ｄ．Ａ．，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ，５．１５．１−５．１５．１５）。
【０００６】
ナイスタチンは、別の重要な薬物であるが、耐性の発生およびその用量制限毒性によって、この薬物もまた有用性が低い（Ｆｏｒｔｈｅｒｇｉｌｌ  Ａ．Ｗ．およびＭｃＧｏｕｇｈ  Ａ．Ｗ．，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔｓ，５．１５．１−５．１５．１５）。
【０００７】
ケトコナゾール、フルコナゾール、およびイトラコナゾールのような新しいアゾール抗真菌剤は、これらの化合物が真菌感染の予防または処置に対して有用であるかもしれないという希望を与えた。しかし、その肝臓毒性、低血糖特性および真菌の耐性株の発生は、この希望を長期間保つことはできなかった（Ｄｅｎｎｉｎｇ．Ｄ．Ｗ．，Ｔｕｃｋｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｈａｎｓｏｎ，Ｌ．Ｈ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｒ．およびＳｔｅｖｅｎｓ，Ｄ．Ａ．，１９８９，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１４９，２３０１−２３０８）。これらのアゾールは、胃酸の分泌を減少することが報告され、これによって、薬物自体および他の重要な生体分子の吸収が減少する。これらの作用は、生命を脅かし得るレベルまでの体内グルコースの重篤な低下を引き起こし得る。このアゾール誘導体に対する耐性もまた、真菌において報告されている（Ｆｏｒｔｈｅｒｇｉｌｌ  Ａ．Ｗ．およびＭｃＧｏｕｇｈ  Ａ．Ｗ．，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔｓ，５．１５．１−５．１５．１４）。
【０００８】
現在利用可能な抗真菌剤は、そのスペクトルが十分に広くはなく、そしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉを含む真菌に対して一貫して有効であるわけではない。これらの薬物は、本質的に毒性であるかまたは免疫抑制性であるかのいずれかである。さらに、利用可能な薬物の大部分に対する真菌における耐性の発生もまた、報告されている。
【０００９】
上記から、上記に列挙した弱点を取り除く新しい抗真菌剤の開発の必要性が存在することが明らかである。本発明の新規性は、Ｄａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌから新規な抗真菌リード分子を単離および特徴付けするためのプロセスを提供することであり、この新規な抗真菌リード分子は、アンホテリシンＢのような標準的な抗真菌剤と比較して、何倍も低毒性である。
【００１０】
（発明の目的）
本発明の主な目的は、病原菌に対する新しい薬物を開発するための、新規な抗真菌リード化合物である２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートを提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、植物Ｄａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌから、新規な抗真菌リード分子である２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートを単離するためのプロセスを提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、抗真菌剤として、新規な化合物である２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートを試験するための方法を提供することである。
【００１３】
本発明のなお別の目的は、新規な化合物である２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートの、抗真菌剤としての使用を提供することである。
【００１４】
なおさらなる別の目的は、アンホテリシンＢのような標準的な抗真菌剤よりも５７．８倍低毒性である、新規な抗真菌リード分子である２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートを提供することである。
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、新規な抗真菌化合物である、以下に示される式（Ｉ）の２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートに関する。この化合物は、抗真菌特性を有し、そして標準的な抗真菌剤と比較した場合に、数倍低毒性である。この化合物は、毒性作用が少なく、ヒトにおける全身性および表面性の真菌感染を制御するために有用であり得る。この化合物は、容易に入手可能な植物であるＤａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌから単離される。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
従って、本発明は、新規な抗真菌分子である、式（Ｉ）の２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートを提供する。
【００１７】
【化３】
2005520861.tif 000004
１つの実施形態において、この活性な抗真菌リード分子の特徴付けは、ＴＬＣ、基特異的化学的染色、ＵＶ、赤外、質量および核磁気共鳴分光法のような公知の分析方法、ならびに抗真菌アッセイおよび細胞傷害性アッセイのような生物学的アッセイによって行われる。
【００１８】
本発明のなお別の実施形態において、新規な抗真菌リード分子である２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートは、Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬を使用する基特異的化学的染色によって示されるような複素環式アルカロイドであり、そして以下の特徴を有する：
ＴＬＣで０．２２のＲｆ値（図３）、
ＵＶスペクトルにおいて、３００ｎｍおよび２０６ｎｍで吸収極大（図７）、
ＩＲ  ＶＭａｘ：３４３４（ＮＨ），３０２４，１７１１（エステル），１６４６（Ｃ＝Ｃ），１５２４，１４２６，１２３０，９３８，７６０ｃｍ−１（図８）、
＋ｖｅ  ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｚ：２３９［Ｍ］＋（Ｃ１４Ｈ２５Ｏ２Ｎ）（１６．３），２１２（１３．２），１７４（１６．２），１２２（３４．２），１０２（９６．４），５８（１００），および５７（１９．２）（図９）、
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ４．１５（１Ｈ，ｍ，Ｃ１’−Ｈ），３．７５（１Ｈ，ｍ，Ｃ２−Ｈ），３．１７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ，７．４４Ｈｚ，Ｃ５−ＨａおよびＣ５−ＨａおよびＣ５−Ｈｂ），２．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４８Ｈｚ，Ｃ２”−Ｈａ），１．９５（１Ｈ，ｍ，Ｃ２”−Ｈｂ），１．６２（６Ｈ，ｂｒ，Ｃ６−ＣＨ３およびＣ７−ＣＨ３），１．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９６Ｈｚ，Ｃ２’−Ｈａ），１．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，Ｃ２’−Ｈｂ），１．２５（７Ｈ，ｂｒ，Ｃ１’−ＣＨ３，Ｃ３”−Ｈａ，Ｃ３”−Ｈｂ，Ｃ４”−ＨａおよびＣ４”−Ｈｂ），０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９６Ｈｚ，Ｃ５”−ＣＨ３）ならびにＣＯＳＹスペクトル（図１１）。
【００１９】
この新規な抗真菌リード分子の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、それぞれ、ディスク拡散アッセイ（ｄｉｓｃ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によれば５．０μｇ／ディスク（図５）、および胞子発芽の阻害パーセントによれば８７．５μｇ／ｍｌ（図６）である。
【００２０】
この抗真菌分子の、細胞の５０％に対して細胞傷害性である用量（ＣＴ５０値）は、８８９．２μｇ／ｍｌである（図１２）。
【００２１】
この抗真菌化合物についてのＥＤ５０は、１６７．０−ｍｇ／ｋｇ体重である（図１３）。
【００２２】
この被験体に対する抗真菌有効用量は、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である（表３）。
【００２３】
別の実施形態において、この新規な抗真菌化合物は、標準的な抗真菌剤よりも５７．８倍低細胞傷害性である。
【００２４】
さらなる実施形態において、処置方法が提供され、ここで、この被験体の５０％の生存に有効な２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１−メチルエチルペンタノエートの用量（ＥＤ５０）は、１６７．０ｍｇ／ｋｇ体重である（図１３）。
【００２５】
なお別の実施形態において、この被験体に対する抗真菌化合物２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−ｙｌ）−１’−メチルエチルペンタノエートの保護的なインビボ有効用量は、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である（表３）。
【００２６】
本発明のなお別の実施形態は、薬学的に受容可能な添加剤およびアジュバントと共に、受容可能量の上記化合物２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートを含む薬学的組成物を提供する。
【００２７】
なお別の実施形態では、この受容可能な添加剤は、薬学的に受容可能なキャリアである栄養分の群から選択される。
【００２８】
なお別の実施形態では、この新規な抗真菌分子は、錠剤、カプセル剤、シロップ、散剤、ゲル、軟膏および注射の形態で使用され得る。
【００２９】
なお別の実施形態は、１００〜４００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で有効量の新規分子を含む、薬学的に受容可能な組成物を提供することである。
【００３０】
なおさらなる別の実施形態において、この被験体における真菌感染の処置のための方法が提供され、この方法は、経口、経鼻、静脈内、腹腔内、筋肉内などの経路を介して、有効量の２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートを投与する工程を包含する。
【００３１】
１つの実施形態において、２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートの有効用量は、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であり得る。
【００３２】
本発明のもう１つの実施形態は、植物Ｄａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌからの、新規抗真菌化合物２−（３，４ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートの単離のためのプロセスに関し、このプロセスは、（ｉ）粉末化したＤａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌ植物材料を、１５〜４５℃の温度範囲で、有機溶媒を用いて連続抽出する工程、（ｉｉ）この溶媒を除去して残渣を得る工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の残渣を脂肪族炭化水素溶媒を用いて抽出し、次にクロロホルムを用いて抽出する工程、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）のクロロホルム画分からクロロホルムを除去する工程、（ｖ）クロロホルム画分から得られた工程（ｉｖ）の残渣を、抗カビ活性についてスクリーニングする工程、（ｖｉ）活性抗カビクロロホルム画分から、従来のクロマトグラフィー方法を採用することにより、新規抗真菌リード（ｌｅａｄ）分子を単離および精製する工程、および（ｖｉｉ）この純粋リード分子を、抗真菌活性およびその細胞傷害性についてアッセイする工程を包含する。
【００３３】
本発明のもう１つの実施形態では、抽出に用いる溶媒は、アルコール溶媒、ケトン溶媒および／またはハロゲン化炭化水素からなる群から選択される。
【００３４】
本発明のなお別の実施形態では、抽出に用いる溶媒は、好ましくは、メタノール、エタノール、アセトンおよびクロロホルムからなる群から選択される。
【００３５】
本発明のなお別の実施形態では、用いる脂肪族炭化水素溶媒は、ヘキサン、石油エーテルから選択される。
【００３６】
なお別の実施形態では、化合物は、カラムクロマトグラフィーまたは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることにより精製される。
【００３７】
本発明のなお別の実施形態では、新規化合物の精製は、クロロホルム：アセトン：ジメチルアミン（５．０：４．０：１．０）、クロロホルム：メタノール：ジメチルアミン（８．５：１．５：０．１）およびクロロホルム：メタノール：ギ酸（８．０：２．０：０．１）または上記これら有機溶媒の異なる組み合わせから選択される溶媒系を用いる薄層クロマトグラフィーにより実施され得る。
【００３８】
本発明のなお別の実施形態では、新規化合物の精製は、逆相ＲＰ−８カラムを用い、アセトニトリル：水が７０：３０の溶媒系を用いるＨＰＬＣにより実施れされ得る。
【００３９】
本発明のなお別の実施形態では、活性抗真菌リード分子の特徴付けは、ＴＬＣ、グループ染色試薬、赤外、紫外、質量および核磁気共鳴スペクトル法、ならびに抗カビおよび細胞傷害性アッセイなどの生物学的アッセイを用いるような、公知の分析方法により実施される。
【００４０】
なお別の実施形態では、本発明は、抗真菌剤として、新規化合物（２−（３，４ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエート）の試験の方法を提供する。
【００４１】
本発明に対するなお別の実施形態では、抗カビ活性は、微生物ブロス希釈（ＭＤ）、ディスク拡散（ＤＤ）および胞子発芽阻害（ＳＧＩ）のような公知の方法により、各精製工程後に試験され得る。
【００４２】
（化合物の精製）
本発明は、新規抗真菌分子２−（３，４ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエート、その単離のためのプロセスを提供する。これは、特に、天然の供給源からの新規抗真菌リード分子の単離に関する。
【００４３】
（ｉ）メタノール抽出物の調製
植物材料Ｄａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌ（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）を、鉄道の駅Ｋｉｓｈａｎｇａｎｊ、Ｄｅｌｈｉ、Ｉｎｄｉａの周囲近傍から４月／５月の月の間に収集した。証明用サンプルが保存されている、Ｈａｍｄａｒｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉが、植物材料の同定を確認した。新たに採集された植物材料を、良く換気された囲いの中の陰で乾燥した。乾燥した材料を粉末にし、そしてメタノールで抽出した。メタノールを用いた４サイクルの抽出の後得られたすべての抽出物をプールし、そしてＷａｔｅｒｂａｔｈ  Ｂ−４８０（Ｂｕｃｈｉ）に取り付けたＲｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−１１４（Ｂｕｃｈｉ）中、４５℃で減圧下エバポレートし、乾燥した。得られた残渣を、使用するまで４℃で貯蔵した。メタノール抽出物を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種に対して、その抗真菌活性を調べた。抗真菌活性を有する抽出物を、活性抗真菌成分の単離のためのさらなる分画に供した。
【００４４】
（ｉｉ）Ｄａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌのメタノール抽出物の分画
粗メタノール調製物の成分を、わずかに改変したＨａｒｂｏｕｒｎｅの方法（Ｈａｒｂｏｕｒｎｅ  Ｊ．Ｂ．、１９９７、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、１−５頁）により分画した。メタノール抽出物を、ヘキサン、クロロホルムおよびアセトンでそれぞれ連続的に抽出した。メタノール抽出物を、最初、ヘキサンで４回抽出した。ヘキサンの４つの抽出物のすべてをプールし、そして溶媒をＲｏｔａｖａｐｏｕｒ  Ｒ−１１４（Ｂｕｃｈｉ）を利用してエバポレートさせた。乾燥画分を収集し、そしてさらなる使用まで４℃に保った。ヘキサンを用いた抽出の後の残渣を、クロロホルムおよびアセトンで４回段階的に抽出し、各場合において、クロロホルムおよびアセトン画分を得た。残り物の残渣を最後にメタノールに溶解した。溶媒をエバポレートし、そして乾燥画分を回収した。全ての画分を適正にラベルし、そしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの病原性の種を用いてそれらの抗真菌活性について調べた。クロロホルム画分が活性であることが見出され、それ故、それを、カラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーによりさらに細分画した。
【００４５】
（ｉｉｉ）カラムクロマトグラフィー
クロロホルム画分を、シリカゲルカラムを用いる改変カラムクロマトグラフィーにより細分画した。シリカゲルはヘキサン中に懸濁し、そして１．２５×３５ｃｍサイズのガラスカラムに充填した。クロロホルム抽出物のスラリーを調製し、そして予め平衡化したシリカゲル（６０−１２０μ）カラムの頂部上にロードした。クロロホルム画分の成分を、１００ｍｌのクロロホルムを用い、１．０ｍｌ／分の流速で、次いで、１００：０〜０：１００の範囲の異なる比のクロロホルム：メタノールで溶出した。全ての細画分をＴＬＣで分析した。類似のプロフィールのＲｆ値を示す細画分をプールし、そして減圧して乾燥した。各細画分の抗真菌活性を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉの病原性の株を用いて試験した。抗真菌能力を示した細画分を、純粋活性成分を同定および分離するために薄層クロマトグラフィーにさらに供した。
【００４６】
（ｉｖ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
活性抗真菌カラム画分を、Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ｐｌａｔｅ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋカタログ番号１．０５５５４、Ｆ２５４）上にスポットし、そして３つの異なる溶媒系、すなわち、クロロホルム：アセトン：ジエチルアミン（５．０：４．０：１．０）、クロロホルム：メタノール：ジエチルアミン（８．５：１．５：０．１）およびクロロホルム：メタノール：ギ酸（８．０：２．０：０．１）を用いるＴＬＣに供した。プレート上のバンドを、２５４ｎｍおよび３６６ｎｍでＵＶ光を用い、そしてクロロパラチネート、ドラゲンドルフ試薬およびヨウ素で噴霧することにより可視化した。異なるバンド中の成分を掻き取り、そして抗真菌活性について調べた。分取用ＴＬＣを、本発明者らの目的の活性成分を得るために実施した。
【００４７】
（ｖ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
調製ＴＬＣから得られた化合物ＰＣ−１の純度を、ＲＰ−８カラム（Ｍｅｒｃｋ）を用いるＨＰＬＣにより分析した。逆層ＨＰＬＣを、７０部のアセトニトリル：３０部の水の溶媒系を等組成で（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）用いて実施した。ロードする前に、試験試料は、ポアサイズのメンブレンを通過させた。０．２２μ濾過した試料の５．０μｌを、室温で予め平衡化したＨＰＬＣカラム上にロードした。流速は、１．０ｍｌ／分で維持した。
【００４８】
（特徴付け研究）
（ｉ）構造解析
化合物の特徴付けを、化学的方法によるクラス同定、化合物の誘導体化、精製化合物の融点、紫外線スペクトル（図７）、赤外線スペクトル（図８）、マススペクトル（図９）、核磁気共鳴スペクトル（図１０）およびＣＯＳＹ（図１１）のような種々の技法を用いて実施した。新規化合物に関して得られたスペクトルデータの詳細は、先に記載したようである。
【００４９】
（抗真菌活性アッセイ）
粗製の、メタノール抽出物、細画分および精製化合物のような、種々の画分の抗真菌活性を、真菌の病原性株を用いる、微生物ブロス希釈、ディスク拡散および胞子発芽阻害アッセイにより研究した。
【００５０】
（ｉ）病原体
真菌の病原性株は、Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖａｌｌａｂｈｂｈａｉ  Ｐａｔｅｌ  Ｃｈｅｓｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄｅｌｈｉから得た。すべての株を、サブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）デキストロース寒天上３７℃で増殖させた。これら培養物からの分生子を収穫し、そしてサブローマルトースブロス中に懸濁した。分生子の数を血球計を用いて計数し、そして懸濁物中のそれらの数を実験の必要に応じて調節した。
【００５１】
（ｉｉ）微生物ブロス希釈アッセイ
種々の画分または精製成分に対する真菌の抗真菌感受性を、微生物ブロス希釈方法（Ｆｏｒｔｈｅｒｇｉｌｌ  Ａ．Ｗ．およびＭｃＧｏｕｇｈ  Ａ．Ｗ．、１９９５、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ、５．１５．１−５．１５．１５）によりアッセイした。真菌胞子を、９６時間培養物から回収し、そしてそれらの数を１×１０６／ｍｌに調節した。サブローデキストロース培地を、ガラス中の２回蒸留した水に溶解し、そして１５分間１０ｐｓｉでオートクレーブした。９０μｌの培地を細胞培養プレートのウェル中に添加した。異なる濃度の抽出物、画分または精製化合物を２連のウェル中に調製し、そして次にウェルに１０μｌの胞子懸濁物を接種した。これらプレートを、３７℃でインキュベートし、そして４８時間後の真菌菌糸の成長を顕微鏡で調べた。活性は、成長があった場合−ｖｅで、そして真菌の任意の成長なくして培地が清澄に見えたとき＋ｖｅで表した。
【００５２】
（ｉｉｉ）ディスク拡散アッセイ
ディスク拡散試験を、Ｉｎｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（Ｉｎｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、１９９６、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ９、Ａ１０１−Ａ１１０頁）に記載の方法のように、１０ｃｍ直径の（Ｔａｒｓｏｎｓ）放射線照射滅菌ペトリ皿中で実施した。サブローデキストロース培地を、２倍のガラス蒸留した水に溶解し、そして１５分間１０ｐｓｉでオートクレーブした。それを、４５℃まで冷却し、そして２０．０ｍｌを各ペトリ皿に注いだ。１．０ｍｌの分生子懸濁物中の１×１０６の分生子を、サブローマルトースブロス中に調製し、そして寒天プレートの表面に重層した。異なる濃度の試料を、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙番号から直径が５．０ｍｍの殺菌ディスク上に含浸した。このディスクを、既に真菌胞子を接種した寒天プレートの表面上に置いた。このプレートを、３７℃でインキュベートし、そして、ディスクの周りにもしあれば、４８時間目に阻害の領域について調べた。阻害の領域の直径は、スケールを補助にして測定した。６．０ｍｍ直径の阻害の領域を作った濃度を、最小阻止濃度と考えた。アンホテリシンＢを、アッセイにおける標準コントロール薬物として用いた。任意の試料なしであるが当量の溶媒を含浸したさらなるコントロールディスクもまた用いた。試験を、活性を確実にするために植物の種々の試験調製物を用いて３〜５回繰り返した。
【００５３】
（ｉｖ）標準曲線の調製
標準曲線をＩｎｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ（Ｉｎｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、１９９６、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ９、Ａ１０１−Ａ１１０頁）に記載の方法に従って調製した。
【００５４】
（ｖ）胞子発芽阻害アッセイ
改変された胞子発芽阻害アッセイを、先に記載のように（Ｓｕｒｅｄｅｒ  Ｐ．およびＪａｎａｉａｈ  Ｃ．、１９８７、Ｉｎｄ．Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｂｉｏｌ．、２５、２３３−２３４）実施した。真菌種を、サブローデキストロース寒天プレート上，３７℃で９６時間で増殖させた。プレートから分生子を収穫し、そしてそれらの均一な懸濁物を、サブローデキストロースブロス中に調製した。分生子を計数し、そして懸濁物中のそれらの数を１×１０４／ｍｌに調節した。標準の薬物アンホテリシンＢおよび試験試料を、最初、最小量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、次いで、サブローデキストロース培地で希釈した。９０μｌの培養培地中の種々の濃度の試験試料を、２倍希釈法により、９６ウェルの平底微小培養プレート（Ｎｕｎｃ）中に調製した。これらウェルは、各濃度について３連で調製した。次いで、各ウェルに、１００±５胞子を含む１０μｌの胞子懸濁物を接種した。プレートを、３７℃で１０時間インキュベートし、そして次に倒立顕微鏡（Ｎｉｃｋｏｎ  Ｄｉｐｈｏｔ）下、胞子発芽について調べた。発芽および非発芽胞子の数を計数した。胞子発芽阻害パーセント（ＰＳＧＩ）を、以下の式を用いて算出した
ＰＳＧＩ＝１００−（薬物処理ウェル中で発芽した胞子の数／コントロールウェル中で発芽した胞子の数）×１００
（インビトロ細胞傷害性評価）
活性分子のインビトロ細胞傷害性は、ＲＡＷ細胞を用いるＭＴＴアッセイ（Ｍｏｓｓｍａｎ、Ｔ．、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５、５５−６３）により研究した。
【００５５】
（細胞培養：）
ＲＡＷ細胞のストック培養は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｕｎｅから得た。細胞は、グルタミン（２．３ｇｍ／Ｌ）、仔牛血清（１０％ｖ／ｖ）およびゲンタマイシン（５０．０ｍｇ／Ｌ）を補填したＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃で、Ｎｕａｉｒ  ＩＲ  Ａｕｔｏｆｌｏｗ水ジャケット式二酸化炭素インキュベーター中に維持した。
【００５６】
（試料調製：）
化合物のストック溶液を、２．５ｍｇの精製化合物を最小量のＤＭＳＯ中に溶解し、そして次に２倍の蒸留水で希釈して最終容量を１．０ｍｌにすることにより調製した。１２５０．０μｇ／ｍｌ〜１９．５μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度を細胞傷害性アッセイで試験した。
【００５７】
（細胞傷害性アッセイ：）
細胞を、フラスコから、コンフルエンシーな対数増殖期で回収した。細胞の均一懸濁物を、２．０ｍｌの培養培地中に調製した。懸濁物中の細胞の数を、血球計を用いて計数し、そして細胞懸濁物を、１ｍｌあたり５×１０７生存細胞を得るような様式で希釈した。細胞の生存率を、トリパンブルー排除試験でチェックした。細胞傷害性アッセイは、９６ウェル平底組織培養プレート（Ｎｕｎｃ  Ｎｕｎｃｌｏｎ）中で実施した。１００．０μｌ容量中の細胞（５×１０６）を各ウェル中に接種した。このプレートを、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の雰囲気中で８時間インキュベートした。ウェルを、細胞の単層の形成について顕微鏡により調べた。１２５０．０μｇ／ｍｌ〜１９．５μｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度の化合物ＰＣ−１（メテラトロピニルエステル）を細胞の単層に添加した。＋ｖｅのコントロールウェルでは、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓから得た、既知の細胞傷害性タンパク質を用いた。ＺｎＳＯ４（８．０ｍｇ／Ｌ）を、別のセットのウェルにおける別の＋ｖｅ傷害性物質として用いた。ネガティブコントロールウェルでは、当量の溶媒を用いた。試験化合物の各濃度についは二連のウェルを用いた。プレートは、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２インキュベーター中、一晩インキュベートした（１２時間）。培地を、ウェルから、プレートをひっくり返すことにより、浮遊死滅細胞とともに取り除いた。従って、プレートの表面に固着した生存細胞のみが、ウェル中に残った。細胞を、４０．０μｌの２．５％色素ＭＴＴで染色した。ウェルに色素を添加した後、プレートを、３７℃で５％ＣＯ２中に１時間保った。この組織培養プレートを、インキュベーターから取り出し、そして全ての色素を吸引した。生存細胞のみが、色素を取り込んだ。細胞を、１００．０μｌのイソプロパノール−ＨＣｌをウェルに添加することにより溶解した。細胞の溶解の後、プレートを、プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて５４０ｎｍで読み取った。
【００５８】
（結果の解釈：）
化合物の傷害性を、−ｖｅコントロール試料で得られた傷害性に対する百分率として表した。細胞傷害性％は、以下で与えられる式を用いて算出した。
細胞傷害性％＝（（−ｖｅコントロールにおけるＯＤ−試験におけるＯＤ）／−ｖｅコントロールにおけるＯＤ）×１００
（ＰＣ−１のインビボの効き目）
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ感染に対する化合物のインビボの効き目は、各１５−２０ｇの体重のいずれかの性の６−８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスで研究した。Ｄｉｘｏｎら（１９８９）により記載されるアスペルギルス症のマウスモデルを、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのインビボ感染に対する化合物の影響を研究するために用いた。
【００５９】
動物を、殺菌床材上のマイクロバリアケージ中に収容し、そして水および餌を自由摂取させた。マウスを６群に分け、そして各群は、８−１０動物を含んでいた。マウスを、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓで実験的に感染した。分生子を用いた感染の３日前、マウスに、４００．０μｌのＰＢＳ中のコルチゾンアセテートの３用量（２５０．０ｍｇ／ｋｇ／日）を皮下注射した。感染の日、各マウスに、分生子懸濁物の単一小滴の鼻点滴注入法により２×１０７分生子を投与した。このモデルの動物は、侵襲的アルペルギルス症を発症し、そして全ての感染動物は、４−６日内に死亡した。
【００６０】
（マウスに対する実験感染のためのＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの接種調製物：）  Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（１９０／９６）単離株を、サブローデキストロース寒天プレート上、３７℃で４日間増殖させた。分生子を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて培養プレートから集め、そしてこの懸濁物を、滅菌ガラスウールを通じて濾過した。この分生子を、２０００ｒｐｍの遠心分離によりペレット化し、そしてＰＢＳ、ｐＨ７．２中に再懸濁した。分生子の数を計数し、そして１×１０８分生子／ｍｌに調節した。分生子の生存率を、懸濁物の希釈物をサブローデキストロース寒天上にプレートすることにより決定した。
【００６１】
Ｄ．ｍｅｔｅｌから単離された精製化合物（メテラトロピニルエステル）を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓで実験的に感染したマウスに、０．０、２５．０、５０．０、１００．０、２００．０および４００．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度で経口投与した。
【００６２】
（処置）
６つの異なる群における、化合物を用いる動物（コルチゾン処置し、そしてチャレンジした）の投薬を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子を用いたチャレンジの後、３０分以内に開始した。
【００６３】
群Ｉ：マウスを、化合物（２５．０ｍｇ／ｋｇ／日）の７用量を用いて、経口処置した。
【００６４】
群ＩＩ：Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ分生子に感染した動物に、５０．０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物を７日間、経口で与えた。
【００６５】
群ＩＩＩ：この群の動物に、化合物（１００．０ｍｇ／ｋｇ／日）の７経口用量を与えた。
【００６６】
群ＩＶ：動物のこの群に、化合物（２００．０ｍｇ／ｋｇ／日）の７経口用量を与えた。
【００６７】
群Ｖ：この群の動物を、化合物（４００．０ｍｇ／ｋｇ／日）の７用量を用いて、７日の期間にわたり経口処置した。
【００６８】
群ＶＩ：この群の動物をコントロールとして用い、そして４００μｌのＰＢＳを含む溶媒の７用量を用いて、経口処置した。
【００６９】
（生存率：）
動物を、適切な標識をしたケージ内に収容し、体重減少および致死率について密に監視した。１０日の期間にわたる生存率を計算し、そして生存動物における真菌負荷量を決定した（ＣｌｅｍｏｎｓおよびＳｔｅｖｅｎｓ，１９９４）。２５．０ｍｇ／体重１ｋｇ、５０．０ｍｇ／体重１ｋｇ、１００．０ｍｇ／体重１ｋｇ、２００．０ｍｇ／体重１ｋｇ、および４００．０ｍｇ／体重１ｋｇの用量を用いて処置した動物のうち、それぞれ、１０匹のうち１匹（１０％）、８匹のうち１匹（１２．５％）、９匹のうち３匹（３３．３％）、９匹のうち４匹（４４．４％）、および１０匹のうち８匹（８０％）が、１０日目まで生存した。
【００７０】
（コロニー形成単位の定量：）
マウスを、定常的に監視し、そして１０日までに、瀕死になったマウス、死にかけているマウス、または生存しているマウスを屠殺した。死亡したマウスに対して解剖を行い、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量のためにそれらの器官を取り出した。これらのマウスの肺、肝臓、および腎臓を、無菌的に取り出し、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に置き、そしてテフロン（登録商標）の乳棒と乳鉢でホモジナイズした。器官ホモジネートの１０倍希釈物を、０．０５％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００を含むサブローデキストロース寒天上にプレートして、これらの動物におけるＣＦＵを決定した。ｔｒｉｔｏｎＸ−１００は、コロニーのサイズを制限し、従って、コロニーの計数を非常に容易にした（Ｆｒｏｓｃｏ，１９９２）。３７℃にて４８時間のインキュベーションの後、コロニーを計数し、そして結果を、１器官あたりのＣＦＵとして表した。
【００７１】
生存時間および種々の器官における真菌負荷量を示すＣＦＵは、インビボでの化合物の予防的効果を評価すると考えられた。
【００７２】
以下の実施例は、本発明の例示の手段として提供され、そして本発明の範囲の限定と解釈されるべきではない。
【００７３】
（実施例１）
（抽出および分画）
植物Ｄａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌ（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）の気生部分を、４月に、Ｄｅｌｈｉ（Ｉｎｄｉａ）周辺の地域から収集した。証明用のサンプルが保存されているＨａｍｄａｒｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ）が、植物性材料の同定を確認した。収集された新鮮な植物性材料を十分に換気された暗室で乾燥し、４００ｇの乾燥材料を、そして各々のサイクルにおいて、５００ｍｌのメタ−ノールで抽出した。４サイクルの抽出の後に得られた抽出物の全てをプールし、そして減圧下でエバポレートして乾燥させた。２５ｇｍの残渣を得、そして使用するまで４℃で保存した。
【００７４】
メタノール抽出物を、ヘキサン、クロロホルム、そしてアセトンで連続抽出した。メタノール抽出物を、初めにヘキサンで４回抽出した。ヘキサンの４つの抽出物の全てをプールし、そして溶媒をエバポレートした。乾燥したヘキサン画分を収集し、そして使用するまで４℃で保管した。ヘキサンでの抽出の後の残渣を、クロロホルムおよびアセトンを逐次的に用いて４回抽出した（各々の場合において、クロロホルム画分およびアセトン画分をそれぞれ得た）。残った残渣を、メタノールに完全に溶解した。乾燥した画分を、それらの抗真菌活性について試験した。これらの画分は、胞子発芽阻害アッセイおよびディスク拡散（ｄｉｓｃ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）アッセイにおいて、それぞれ、１５００μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ディスクの濃度まで、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの増殖を阻害しなかったので、不活性とみなした。Ｄａｔｕｒａ  ｍｅｔｅｌのクロロホルム画分は、胞子発芽阻害アッセイにおいて１００％の胞子の発芽を阻害した１２５０μｇ／ｍｌの濃度、および有意な活性の阻害の領域を生じた２５．０μｇ／ディスクの濃度で活性であることが見出された。従って、この画分を、種々のクロマトグラフィー法を用いて活性成分を同定および精製するために、さらに用いた。
【００７５】
（実施例２）
（活性化合物の精製）
クロロホルム画分を、上記のように、改変したカラムクロマトグラフィー法により細分画した。上記の画分を、ＴＬＣにより分析し、そして類似のスポットを示したものをプールし、そして減圧下で乾燥して細画分を得た。総計１５個の細画分を得た。このようにして得られた各細画分の抗真菌活性を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの病原性株を用いて試験した。細画分の１０番と１１番は、強力な抗真菌活性を示し、そしてこれらを、さらに、純粋な活性成分を分離するために分取用薄層クロマトグラフィーに供した。
【００７６】
シリカゲルプレート（カタログ番号１．０５５５４、Ｆ２５４）を、Ｅ．Ｍｅｒｃｋから購入し、そしてＴＬＣを行うために用いた。カラムクロマトグラフ活性のある細画分を、プレート上にスポットし、そして３つの異なる溶媒系（すなわち、クロロホルム：アセトン：ジエチルアミン（５．０：４．０：１．０）、クロロホルム：メタノール：ジエチルアミン（８．５：１．５：０．１）、およびクロロホルム：メタノール：ジエチルギ酸（８．０：２．０：０．１））を用いる展開に供した。プレート上のバンドを、２５４ｎｍおよび３６６ｎｍのＵＶ光を用いて、そしてクロロパラチネート（ｃｈｌｏｒｏｐａｌａｔｉｎａｔｅ）、Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬、およびヨウ素をスプレーすることによって可視化た。クロロホルム：メタノール：ジエチルギ酸（８．０：２．０：０．１）の溶媒系を用いて分離した、３つの異なる主要なバンドの成分（それぞれ、０．１４、０．２２、および０．３７のＲｆ値を有する）（図１）を掻き取り、そして抗真菌活性について試験した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓに対して効力を有した化合物を、０．２２のＲｆ値を有するバンドから回収した。この化合物を、分取用ＴＬＣを繰り返すことにより精製し、そしてその抗真菌活性について試験した。活性化合物は、Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ試薬に対して陽性に反応し、それによりこの化合物のアルカロイドの性質が示された。
【００７７】
分取用ＴＬＣから得た化合物の純度を、ＲＰ−８カラム（Ｍｅｒｃｋ）を用いてＨＰＬＣにより分析した。逆相ＨＰＬＣをアセトニトリル：水（７０：３０）の溶媒系を用いて定組成で行った。サンプルを、ローディングの前に０．２２μの孔径の膜に通過させた。総計５．０μｌのサンプルを、周辺温度で予め平衡化カラムにロードした。流速を、１．０ｍｌ／分に維持した。ＴＬＣにより精製した化合物のＨＰＬＣプロフィールは、２つのピーク（ピークＩおよびピークＩＩ）を示し、ピークＩおよびピークＩＩは、それぞれ、１．９１分および２．７１分の保持時間を有していた（図２）。これらの２つの対応するピーク（それぞれ、１．８８分および２．８４分の保持時間）は、カラムクロマトグラフィーから得られた活性な細画分のＨＰＬＣプロフィールにもまた存在した。活性なカラムの細画分は、１．３１分、１．８８分、２．８４分、３．８２分、および４．３５分の保持時間にそれぞれ対応する、５つの主要なピークを有した。ＴＬＣにおける溶媒系を変更して、部分的に精製した化合物のさらなる精製を行った。クロロホルム：メタノール：ジエチルアミン（８．５：１．５：０．１）から構成される溶媒系は、０．４２のＲｆを有する活性分子を含む混合物を分離した（図３）。ＨＰＬＣにおける化合物の保持時間は、１．９分の周辺であることが見出され、そしてこれは、種々の実行において９７％〜１００％の純度を示した（図４）。この化合物物の保持時間は、クロマトグラフ活性の細画分およびその精製した形態の両方と同じままであった。
【００７８】
（実施例３）
（微生物ブロス（ｍｉｃｒｏｂｒｏｔｈ）希釈アッセイによる純粋な化合物の抗真菌活性）
精製した化合物に対する真菌の抗真菌感受性を、微生物ブロス希釈法によりアッセイした。２１．８７〜３５０μｇ／ｍｌの範囲にわたる異なる濃度の精製した化合物を、二重希釈法によって二連のウェルで調製した。試験を上記のように行った。この化合物の抗真菌活性を表１に表す。化合物のＭＩＣが、８７．５μｇ／ｍｌであることを見出した。化合物のこの濃度で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの３つの種はいずれも、ウェル中で目に見える増殖を示さなかった。
【００７９】
（表１：４８時間後のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．に対する化合物の活性）
【００８０】
【表１】
2005520861.tif 000005
（実施例４）
（ディスク拡散アッセイによる純粋な化合物の抗真菌活性）
ディスク拡散試験を、発明の詳細な説明の節に記載されるように行った。アンフォテリシンＢ  １．２５μｇ／ディスクを、陽性コントロール標準薬物としてアッセイに用いた。等量の溶媒を含浸させたさらなるディスクをまた、陰性コントロールとしてアッセイに用いた（図５）。化合物のＭＩＣは、５μｇ／ディスクであることを観察した。なぜならば、５μｇ／ディスクの濃度が、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、およびＡ．ｎｉｇｅｒに対して、それぞれ、６．２５ｍｍ、６．１５ｍｍ、および６．４ｍｍの平均直径を有する阻害の領域を生じたからである（表２）。
【００８１】
（表２：ディスク拡散法による化合物の抗真菌活性）
【００８２】
【表２】
2005520861.tif 000006
（実施例５）
（化合物の抗真菌活性とアンフォテリシンＢの抗真菌活性との比較）
化合物の能力を、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓに対する標準的な薬物としてアンフォテリシンＢを用いて構築した標準曲線を利用して決定した。標準曲線を、Ｉｎｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａに提供される方法に従って用意した。最も低い値および最も高い値と共に阻害の領域の直径の正確な値を決定した。これらの値を半対数紙にプロットして標準曲線を用意した。化合物について得られた阻害の領域の直径の値を、標準曲線に当てはめ、そしてアンフォテリシンＢと等価な効果を生じる、対応する用量を決定して、化合物の能力を見出した（図６）。
【００８３】
１０μｇ／ディスクの濃度の化合物は、２．６７μｇのアンフォテリシンＢにより生じる阻害の領域の直径に等しい直径を生じた。これらの観察は、この化合物が、アンフォテリシンＢと比較した場合、１／３．７４の能力であったことを示したが、より重要なことに、これは新規のリード化合物である。
【００８４】
（実施例６）
（胞子発芽阻害アッセイによる純粋な化合物の抗真菌活性）
胞子発芽阻害アッセイを、化合物の活性を評価するために行った。９０μｌの培養培地中で、２１．８７５〜７００μｇ／ｍｌの範囲にわたる種々の濃度の化合物を、二重希釈法により調製した。ウェルに１０μｌの胞子懸濁液を接種して、そして３７℃にて１０時間インキュベートした。発芽した胞子および発芽していない胞子の数を計数し、そして胞子発芽阻害の割合（ＰＳＧＩ）を計算した。胞子発芽の割合は、化合物の用量が増加するにつれて減少した。化合物のＭＩＣが、８７．５μｇ／ｍｌであることを見出した（図７）。
【００８５】
（実施例７）
（細胞傷害性）
化合物ＰＣ−１のインビトロでの細胞傷害性を、上記のように、ＲＡＷ細胞を種々の濃度のＰＣ−１と共にインキュベートして、そしてＭＴＴアッセイにより細胞傷害性の程度を測定することによって調査した。３１２．５μｇ／ｍｌまでの化合物の濃度は、細胞に対して完全に非毒性であった。高用量の化合物は、可変の毒性を生じた。１２５０．０μｇ／ｍｌの濃度の化合物は、７５．９５％の細胞に対して毒性であった。細胞傷害性の割合を、化合物の対数濃度に対してプロットして、５０％の細胞に対して毒性であった濃度（ＣＴ５０）を見出した。この化合物のＣＴ５０は、８８９．２μｇ／ｍｌであることを見出した（図１２）。
【００８６】
（実施例８）
（化合物の構造の解明）
化合物の全てのスペクトルおよび化学分析の情報を相関させて、本出願人らは、この化合物の特徴付けを実施した。
【００８７】
（ｉ）  ＵＶスペクトル分析データ
化合物ＰＣ−１（すなわち、メテラトロピニル（ｍｅｔｅｌａｔｒｏｐｉｎｙｌ）エステル）は、ＵＶスペクトルにおいて２つの極大（それぞれ、λｍａｘ３００ｎｍおよび２０６ｎｍ、ならびに０．２５０および１．６７６の吸光度を有した）を示した。ＵＶスペクトルにおける２０６ｎｍの突出した極大は、エステル基の存在に起因し得る。ケトンについてのλｍａｘは、２０８ｎｍであるか、または２０８ｎｍよりもわずかに高いことが示されている。従って、２０６ｎｍでのピークは、ＰＣ−１におけるエステル基の存在を示唆した。
【００８８】
（ｉｉ）  ＩＲスペクトル分析データ
ＩＲスペクトルは、アミノ基（３４３４ｃｍ−１）、エステル基（１７１１ｃｍ−１、１２３０ｃｍ−１）、および１６４６ｃｍ−１の不飽和（基）についての吸収バンドを示した（図８）。
【００８９】
（ｉｉｉ）  マススペクトル分析データ
化合物の分子量は、そのＦＡＢマススペクトルを基準として２３９．２であることが見出され、そしてピークの強度は、２０％であることが見出された。マススペクトルにおけるｍ／ｚ２３９．２（２０）のピーク強度を基準として行った計算により、分子ＰＣ−１中の１３．８（＝１４）炭素原子の存在が示された（Ｆｕｒｎｉｓｓら、１９８９；Ｋｅｍｐ，１９９１）。ＰＣ−１の化学分析およびマススペクトルは、この化合物において、少なくとも１つの窒素原子および２つの酸素原子の存在を示した。従って、化学式が化合物ＰＣ−１について誘導され、Ｃ１４Ｈ２５Ｏ２Ｎであることが判明した。窒素ルールもまた、この分子における単一の窒素原子の存在を支持した。この化学式から誘導される分子量は、２３９．１８８であり、これは、実際に、マススペクトルにより示されるものと同じであった。化合物のマススペクトルは、Ｃ１−Ｃ２、およびＯＣ−Ｏの分裂に起因して、生じたｍ／ｚ５８のベースピークを示した。このことは、トロパン環の第２の性質を示唆する。ｍ／ｚ１０２の突出したイオンピークは、ペンタン酸部分（Ｃ５Ｈ１０Ｏ２＋）の形成に起因して生じた。Ｃ１−Ｃ２結合の切断は、ｍ／ｚ５７のイオンピーク（Ｃ４Ｈ９＋）の形成を生じた（図９）。
【００９０】
（ｉｖ）  ＮＭＲスペクトル分析データ
１ＨＮＭＲスペクトルは、δ４．１５および３．７５の多重線（それぞれ、−ＣＨ−Ｏ−プロトンおよび−Ｎ−ＣＨプロトンに帰属した）を示した。δ３．１７の二重の二重線は、−Ｎ−ＣＨプロトンに帰属した。３．１７の三重線は、−Ｎ−ＣＨ２プロトンに帰属した。１つのプロトンのδ２．３１の三重線およびδ１．９５の多重線を、各々、−Ｃ−ＣＨ２プロトンに帰属する。δ１．６２の広範な６つのプロトンシグナルは、ジヒドロピロール環の３位および４位に結合した−ＣＨ３基のプロトンに帰属される。２つの、δ１．３５および１．４２の各１つのプロトンの二重線は、ジヒドロピロール環の２位の結合した−ＣＨ２プロトンに帰属される。広範なシグナルの７つのプロトンは、２ｘ−ＣＨ２（各々、ペンタン酸側鎖のプロトン、−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ３基の−ＣＨ３（３つのプロトン））に帰属され、そして３つのプロトンについてのδ０．８７の三重線は、ペンタノイル酸の末端−ＣＨ３基に帰属される。δ４．１５を超えるシグナルの欠如は、この分子における四置換されたオレフィン結合を示唆した。１ＨＮＭＲスペクトルにおけるδ２．０とδ３．０との間のシグナルの欠如に起因して、エンド窒素原子に連結したメチル基の存在を得た。１Ｈ−１Ｈ２Ｄ  ＣＯＳＹスペクトルにおいて、ジヒドロピロール環の水素原子間の関係を確立させた（図１１）。
【００９１】
これらの証拠に基づいて、分子の構造が、２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１−メチルエチルペンタノエートであると解明した。
【００９２】
２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２−イル）−１−メチルエチルペンタノエートとして、本研究において同定された分子であるＰＣ−１は、新規のトロピン誘導体であり、そして植物性の供給源または合成の供給源からのこの分子の存在は、初めて報告される。これは、新規の抗カビ性薬物の開発のためのリード化合物として有用な、新規の抗真菌化合物である。アンフォテリシンＢおよびそのリポソーム誘導体（選り抜きの薬物）のＣＴ５０は、４．０〜６４．０μｇ／ｍｌの範囲にあることが報告されている（Ｚａｇｅｒ，Ｒ．Ａ．，２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．，２，２３８）。新規の化合物のＣＴ５０値は、８８９．２μｇ／ｍｌであり、このことは、この化合物が、アンフォテリシンＢよりも細胞障害性が非常に低いことを示した。
【００９３】
（実施例９）
（インビボ効果）
どちらかの性別の、体重１５〜２０ｇの６〜８週齢のＢａｌ／Ｃマウスを、滅菌した床敷きのマイクロバリアケージ内で、自由に水および食餌を与えて飼育した。これらの動物を、各グループが８〜１０匹のマウスを含むように、６グループに分けた。アスペルギルス症に対するＰＣ−１の効果を、５つの用量レベルで研究した。種々の用量の化合物を、２×１０７胞子のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓであらかじめチャレンジしたこれらの動物に経口投与し、この動物は化合物で処置した動物の生存率を示した。２５．０、５０．０、１００．０、２００．０および４００．０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で処置した動物のうち、それぞれ、１０分の１（１０％）、８分の１（１２．５％）、９分の３（３３．３％）、９分の４（４４．４）、および１０分の８（８０％）が、１０日目まで生存した。
【００９４】
処置した動物の生存率％は、用量と共に増加し、それにより保護効果は用量依存性であることが示される。生存率％のプロビット値を、片対数紙に、化合物ＰＣ−１の用量の対数に対してプロットして、動物の５０％に保護を与えるのに必要な有効用量（ＥＤ５０）を決定した。化合物ＰＣ−１のＥＤ５０は、１６７．０ｍｇ／ｋｇ体重であることが見出された（図１３）。
【００９５】
（実施例１０）
（コロニー形成単位の定量）
マウスを、絶えず観察し続け、そして衰弱したマウス、死亡したマウス、または１０日目まで生存したマウスを屠殺した。死亡したマウスの検死を行い、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量のために、それらの器官を取り出した。このマウスの肺、肝臓および腎臓を無菌的に取り出し、滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に入れ、そしてテフロン（登録商標）の乳棒と乳鉢でホモジナイズした。これらの動物におけるＣＦＵを、１０倍希釈の器官ホモジネートを、０．０５％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するサブローデキストロース寒天にプレートすることによって、決定した。このｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、コロニーのサイズを制限し、従って、コロニーの計数を非常に容易にした（Ｆｒｏｓｃｏ，１９９２）。３７℃で４８時間インキュベートした後、コロニーを計数し、そして結果を、ＣＦＵ／器官として表した。
【００９６】
種々の器官における真菌負荷を示す生存時間およびＣＦＵは、化合物、２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−２−イル）−１−メチルエチルペンタノエートのインビボ保護効果を評価すると考えられた。
【００９７】
研究の間に死亡したかまたは衰弱した動物、または１０日目まで生存した動物の器官における真菌負荷を決定した。これらの動物の肺、肝臓および腎臓を単離し、ホモジナイズし、そしてこのホモジネートを使用して、サブローデキストロース寒天プレート上で病原体を培養した。真菌のコロニーを計数し、そしてコロニー形成単位（ＣＦＵ）／器官として表した。表３は、異なる器官におけるＣＦＵの数を示す。
【００９８】
２５．０および５０．０ｍｇ／ｋｇ体重の用量は、肺組織において、ＣＦＵに対するいずれの効果も有さなかった。しかし、保護効果は、より高用量で処置した動物において観察された。４００ｍｇ／ｋｇ体重の用量のＰＣ−１は、コントロールと比較して有意にコロニー数を減少させた。この差異は、統計的に有意（ｐ＜０．００１）であることが見出された。肝臓は、真菌の最も小さな負荷を有することが見出され、そして肝臓においては、ＣＦＵに対する化合物の非常に小さな効果しか存在しなかった。腎臓は、感染に対してより感受性である様である。なぜなら、コントロール動物の腎臓において、および２５．０または５０．０ｍｇ／ｋｇ体重の化合物で処置した動物において、最大数のＣＦＵが検出されたからである。しかし、１００．０〜４００．０ｍｇ／ｋｇ体重の精製した抗真菌化合物、２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−２−イル）−１−メチルエチルペンタノエートで処置した動物において、ＣＦＵの数が有意に減少した（表３）。
【００９９】
（表３）
種々の用量の精製した抗真菌化合物、２−（３，４−ジメチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロル−２−イル）−１’−メチルエチルペンタノエートで処置したマウスにおけるコロニー形成単位
【０１００】
【表３】
2005520861.tif 000007
本発明の主な利点は、以下である：
（ｉ）本発明は、新規の抗真菌リード化合物を提供する。
（ｉｉ）この新規の分子は、ヒトの種々の真菌性疾患を処置するための新規の薬剤を開発するために使用され得る。
（ｉｉｉ）本発明はまた、この新規の抗真菌化合物を、植物のＤａｔｕｒａ  ｍｅｔａｌから、単離、精製および特徴付けするための方法を提供する。
（ｉｖ）この新規の分子の毒性は、市場で入手可能な抗真菌薬のいくつかよりも小さい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、活性なカラム細画分および精製した化合物のＴＬＣパターンを示すプレートの写真である。
【図２】
図２は、ＴＬＣ精製した化合物のＨＰＣＬプロフィールである。
【図３】
図３は、ＨＰＬＣ精製した化合物のＴＬＣの写真である。
【図４】
図４は、精製した化合物のＨＰＬＣプロフィールである。
【図５】
図５は、精製した化合物によるＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの増殖の阻害である。
【図６】
図６は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種に対する化合物による、胞子発芽の阻害パーセントを示すグラフである。
【図７】
図７は、化合物のＵＶスペクトルである。
【図８】
図８は、化合物のＩＲスペクトルである。
【図９】
図９は、化合物の質量スペクトルである。
【図１０】
図１０は、化合物のＮＭＲスペクトルである。
【図１１】
図１１は、化合物のＣＯＳＹスペクトルである。
【図１２】
図１２は、化合物の細胞傷害性のパーセントである。
【図１３】
図１３は、ＰＣ−１での処置後に、動物の５０％を保護するのに必要とされる用量（ＥＤ５０）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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