(57)【要約】サンプル中の一以上の成分を分離するための装置が開示され、この装置には：（a）通路（2）を有する第一の平面部材（1）であって、この通路に沿ってサンプルを載置し、その成分（群）を等電点にしたがって集束させることができる部材；及び（b）通路（2）をその長さの少なくとも一部に沿って露出し、これにより通路内のサンプル又は成分（群）を露出するための手段が含まれる。通路（2）を露出するための手段には、遮蔽板（7）が挙げられる。また、分子を分析する方法が提供され、この方法には：（a）細長い開放通路（2）を準備し；（b）多数の分子を細長い開放通路（2）内に導入し；（c）細長い開放通路（2）に沿って、等電点にしたがって分子を分離し；（d）細長い開放通路（2）内で分子にアクセスし、それを分析することが含まれる。タンパク質の分析のための、質量分析計、好ましくはMALDI-TOF装置と組み合わせた装置の使用もまた開示されている。
2005517954.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
等電点電気泳動（IEF）モジュールであって：
（a）サンプルを載置し、サンプル中の成分又は成分群を等電点にしたがって集束させる通路を有する第一の平面部材と；
（b）通路をその長さの少なくとも一部に沿って露出し、これにより通路内のサンプル又は成分（群）を露出する手段と、
を備えるモジュール。
【請求項２】
サンプル又は成分（群）を、露出した通路に沿って実質的にそれらが集束した位置でアクセス可能である、請求項１に記載のモジュール。
【請求項３】
通路が、その長さの少なくとも一部に沿って露出している開放通路を備える、請求項１又は２に記載のモジュール。
【請求項４】
通路が、第一の平面部材の表面上に形成された直線状の溝を備える、請求項１、２又は３に記載のモジュール。
【請求項５】
通路が微小通路又は毛細管通路を備える、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項６】
微小通路又は毛細管通路が第一の平面部材上に微細加工されている、請求項５に記載のモジュール。
【請求項７】
通路が、1〜500マイクロメートルの範囲、より好ましくは50〜350マイクロメートルの範囲、より好ましくは50〜350マイクロメートルの範囲、最も好ましくは約150マイクロメートル又は約175マイクロメートルの幅を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項８】
第一の平面部材が、プラスチック、ポリマー、セラミック、ガラス又は複合材からなる群から選択される材料から形成されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項９】
通路の少なくとも一の壁がポリ(メチルメタクリレート)（PMMA）又はポリカーボネートを備える、請求項１〜８のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項１０】
第一の平面部材を被覆又は誘導体化して表面荷電を減少し、これにより電気浸透流（EOF）を最小化する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項１１】
電解質用の液槽を備え、この液槽が通路と電気的に連結している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項１２】
液槽が、第一の平面部材上に通路の各端に隣接して形成される、請求項１１に記載のモジュール。
【請求項１３】
第二の平面部材である蓋をさらに備え、これにより通路内のサンプルの蒸発が減少するようになっている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項１４】
蓋がその内側表面に細長い凹部を備え、この凹部は、蓋を第一の平面部材と合わせたときに通路に含まれるサンプルを実質的に漏出させない位置に配置されている、請求項１３に記載のモジュール。
【請求項１５】
凹部の長さ及び幅が、第一の平面部材の通路と少なくとも同じ大きさである、請求項１４に記載のモジュール。
【請求項１６】
液槽が蓋の上に配置されている、請求項１１又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項１７】
通路と液槽との間に電気的連結のための手段を備え、それによってサンプルと電解質の実質的な混合が防止されるようになっている、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項１８】
前記手段が半透膜、アガロース、又はゲル栓を備え、請求項１７に記載のモジュール。
【請求項１９】
実質的に平行に配向している複数の通路を備える、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項２０】
通路又は通路群が閉鎖通路（閉鎖通路群）を備え、この閉鎖通路（閉鎖通路群）を露出する手段として、この閉鎖通路（閉鎖通路群）の長軸方向の平面に沿って開裂可能な脆いラインが含まれる、請求項１〜１９のいずれかに記載のモジュール。
【請求項２１】
並進台をさらに備え、その上に第一の平面部材が取り付けられる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のモジュール。
【請求項２２】
サンプル中の一以上の成分を分離する装置であって、請求項１〜２１のいずれか１項により特許請求される等電点電気泳動（IEF）モジュール並びに等電点に基づいて集束した成分をそれらの各質量に応じて分離することができるモジュールとともに備える装置。
【請求項２３】
質量分離モジュールが質量分析用のモジュールを備える、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
質量分離モジュールがマトリクス支援レーザ脱離／イオン化質量分析（MALDI-MS）モジュール、好ましくはマトリクス支援レーザ脱離／イオン化-飛行時間（MALDI-TOF）モジュールを備える、請求項２２又は２３に記載の装置。
【請求項２５】
サンプル中の一以上の成分を分離する方法であって：
（a）通路を有する第一の平面部材を含む等電点電気泳動（IEF）モジュールを準備するステップと；
（b）通路にサンプルを載置するステップと；
（c）サンプルの成分又は成分群を、通路に沿って、等電点にしたがって集束するステップと；
（d）通路の長さの少なくとも一部を露出し、これにより通路内のサンプル又は成分（成分群）を露出するステップと；
（e）任意に、等電点電気泳動（IEF）モジュールを電気伝導性の薄膜又は層で被覆するステップと；
（f）任意に、一以上の分離された成分を質量分析、好ましくはMALDI、より好ましくはMALDI-TOFによって分析するステップと；
を含む方法。
【請求項２６】
請求項２〜２１のいずれか１項に規定する一以上の特徴をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（e）開放通路内の一以上の成分にアクセスしこれを分析する操作をさらに含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
該又は各成分を、質量分析、好ましくはMALDI-MS、より好ましくはMALDI-TOF質量分析によって分析する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
サンプルがMALDIマトリクスを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
MALDIマトリクスを等電点電気泳動後のサンプルに添加する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
MALDIマトリクスが、シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、アルファCCA、シナピン酸（SA）、3-ヒドロキシピコリン酸（HPA）、IAA(Na+)、2-(4-ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸HABA(Na+)、ジスラノール(Na+)、レチノイン酸(Na+)、コハク酸、2,6-ジヒドロキシアセトフェノン、フェルラ酸、コーヒー酸、グリセロール及び4-ニトロアニリンからなる群から選択される、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
分子を分析する方法であって：
（a）細長い開放通路を準備するステップと；
（b）複数の分子を細長い開放通路内に導入するステップと；
（c）細長い開放通路に沿って等電点にしたがって分子を分離するステップと；
（d）細長い開放通路内の分子にアクセスしそれを分析するステップと；
を含む方法。
【請求項３３】
分子を等電点電気泳動（IEF）する装置であって、細長い通路を備え、この細長い通路はその少なくとも一部に沿って開放されており、それにより分離した分子にアクセスすることができる装置。
【請求項３４】
CIEF-MALDI装置。
【請求項３５】
請求項１〜２４、３３又は３４のいずれか１項で特許請求されているモジュール又は装置を、分析対象のタンパク質を含むサンプルとともに備えるキット。
【請求項３６】
サンプル中のタンパク質を検出する方法であって：
（a）細長い開放通路を準備するステップと；
（b）サンプルを細長い開放通路内に導入するステップと；
（c）細長い開放通路に沿って、その等電点にしたがってタンパク質を分離するステップと；
（d）細長い開放通路中でタンパク質にアクセスするステップと；
（e）質量分析によってタンパク質を検出するステップと；
を含む方法。
【請求項３７】
タンパク質分析のための、質量分析計、好ましくはMALDI-MSユニット、より好ましくはMALDI-TOFユニットと組み合わせた、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の等電点電気泳動モジュールの使用。
【請求項３８】
プロテオーム分析のための、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
サンプル中の疾患関連タンパク質を検出するための、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の等電点電気泳動モジュールの使用。
【請求項４０】
疾患関連タンパク質を、質量分析計、好ましくはMALDI-MSユニット、より好ましくはMALDI-TOFユニットと組み合わせたモジュールによって検出する、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
個体における疾患の診断方法であって：（a）個体由来の細胞、組織又は器官のサンプルを準備し、それのタンパク質含有抽出物を作成するステップと；（b）請求項１〜２４のいずれか１項に記載のモジュール、請求項２２、２３又は２４に記載の装置、又は請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の方法を用いて、そのサンプル中の疾患関連タンパク質を検出するステップと；を含む方法。
【請求項４２】
毛細管等電点電気泳動（CIEF）装置とMALDI-MS装置、好ましくはMALDI-TOF装置とを連結する手段であって、等電点電気泳動を実行する通路、並びに該通路をその長さの少なくとも一部に沿って露出して通路内のサンプル又は成分（群）を露出する手段、を含む連結手段。
【請求項４３】
開放通路を含む、請求項４２に記載の連結手段。
【請求項４４】
添付図面の図１〜図１２を参照して前述しかつ図示したものと実質的に同じモジュール、装置、方法、キット、使用又は連結手段。
【発明の詳細な説明】
【分野】
【０００１】
本発明は、分子、特に高分子、例えばタンパク質を分離するための装置及び方法に関する。特に、本発明は、タンパク質の荷電に基づく分離を可能にする装置に関する。
【背景】
【０００２】
複合混合物中の分子を分離することが種々の目的のためにしばしば望まれる。例えば、多数のタンパク質が細胞の環境内に存在し、それらの特徴付けを支援するために、これらのタンパク質を互いに分離することが必要となることが多い。種々の分離技術が開発されているが、各分離技術はタンパク質相互をその一以上の相違する性質に基づいて分離するものである。
【０００３】
例えば、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）はタンパク質をそのサイズに応じて分離する。SDS-PAGEでは、タンパク質をSDS緩衝液中で変性及び可溶化し、負電荷を帯びたSDS分子がこのタンパク質に結合するが、この場合、サイズの大きいタンパク質にほど多数の分子が結合するので、電場をかけると、タンパク質はその荷電（したがってサイズ）に応じてポリアクリルアミドゲル中を移動する。電場をオフにすると、タンパク質がゲル内に固定される。SDS-PAGEのような技術は「一次元」分離と称することができるが、その理由は分離がタンパク質の一つの性質（この場合は質量）にのみ基づくからである。
【０００４】
しかし複合混合物の分析では、サンプル中に存在するすべての成分を分離するためには一以上の分離プロセスがしばしば必要となる。このため、二次元（2D）の分離スキームが考案されている。
【０００５】
二次元の分離技術は、分離のためにタンパク質の二つの性質を利用する。分離を行うには、一次元では第一の性質が用いられ、その後、第二次元（この次元は一般に、第一の次元に対して直交的又は垂直的である）では第二の性質が用いられる。絶妙な2Dシステムを構築するには、いくつかの判定基準を検討する必要がある。例えば、その二つの技術におけるそれぞれの分離はできるだけ異なる手段に基づくのが望ましい。そうすれば、2Dデータセットに含まれる重複情報の量が減少する筈である。2D技術は、より高い分解能が得られるので有利である。例えば、質量はわずかしか異ならないが、荷電が異なるいくつかの異なるタンパク質（例えば異なる様式でリン酸化されているタンパク質の場合）はこの技術により分離することができる。
【０００６】
二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2-D PAGE）はタンパク質分離のための一般的で、現在好まれている技術である（Anderson N.G., Anderson N.L., Electrophoresis 1996; 17, 443-453）。まず平板状ゲルにpH勾配を固定し、その中をタンパク質に等電点電気泳動（IEF）させ、その荷電（pI値）に応じてタンパク質を分離する。この段階は約6-8時間を要するのが普通である。次いで、IEFゲルを勾配ゲルの上に載置し、SDS存在下で電気泳動し、タンパク質をその分子量に基づいて分離する。この分離されたタンパク質は、視覚化のために染色し、目的のバンドを切り出し、プロテアーゼで消化した後、質量分析によるペプチドフィンガープリント法でタンパク質を同定する（Shevchenko, A., Jensen, O.N., Podtelejnikov, A.V., Sagliocco, F., Wilm, M., Vorm, O., Mortensen, P., Boucherie, H., Mann, M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 1996, 93, 14440-14445; Jensen, O.N., Larsen, M.R., Roepstorff, P., PROTEINS 1998,74-89 Suppl. 2）。
【０００７】
2-D PAGEは大規模プロテオミックス分析用に選択される通常の技術であるが、その理由はこの技術がタンパク質分離の分解能が最も高い方法であり、かつ2-Dマップ中のタンパク質パターンがタンパク質の性質、すなわち第一次元における等電点及び第二次元における分子量に相関しているからである。すなわち、2-D マップ中のタンパク質の位置はその化学的及び物理的性質に対応している。これらの性質を利用すれば、タンパク質の同定及び特徴付けが可能でなる。2-D PAGEはヒト血漿タンパク質を分析するために用いられており、タンパク質のpI及び分子量を利用することにより臨床分析における疾患の検出及び診断が可能である（Rasmussen, R.K., Ji, H., Eddes, J.S., Moritz, R.L., Reid, G.E., Simpson, R.J., Dorow, D.S., Electrophoresis 1997, 18, 588-598）。
【０００８】
しかし、2-D PAGEは労働集約的な手順であり、自動化が困難であり、また検出の感度及び機能の範囲に制限がある。仮想的2-Dゲル電気泳動法が最近開発され（Ogorzalek-Loo, R.R., Cavalcoli, J.D., VanBogelen, R.A., Mitchell, C., Loo, J.A., Moldover, B., Andrews, P.C., Anal. Chem. 2001, 73, 4063-4070）、この方法の第二次元では、SDS-PAGE のサイズに基づく分離の代わりに質量分析が用いられる。この技術は2-D PAGEより高感度であることが示されている。しかし、第一次元の分離は依然ポリアクリルアミドゲルで行われるので高処理量を分析する可能性は制限される。
【０００９】
質量分析（MS）は、特異性、感度及び速度が高いので、分子構造の特徴付けには重要な分析技術である（McLafferty, F.W., Science 1981, 214, 280-287）。Fenn, J.B., Mann, M., Meng, C.K., Wong, S.F., Whitehouse, C.M., Science 1989, 246, 64-71に記載のエレクトロスプレーイオン化（ESI）、及びKaras, M., Hillenkamp, F., Anal. Chem. 1988, 60, 2299-2301に記載のマトリクス支援レーザ脱離／イオン化（MALDI）のような技術によって、質量分析の性能は不揮発性で不安的な生体分子の研究にまで大きく拡大した。種々の微小分離技術が開発され、それらが分子の同定のために質量分析と連結している。微小カラム分離が電子噴霧イオン化質量分析と連結しているのが、最も一般的なシステムであり（Tomer, K.B., Chem. Rev. 2001, 101, 297-328）、これは例えば米国特許第5,993,633号に記載されている。他の技術には、例えば、毛細管電気泳動分離からの溶出液をMALDI標的プレート上に析出させる（Minarik M., Foret F., Karger B.L., Electrophoresis 2000, 21, 247-254）等がある。
【００１０】
毛細管ゾーン電気泳動（CZE）では、サンプルを緩衝液に溶解し、このサンプルを分離用の毛細管又は通路の一端に注入する。あるいは、分離用の毛細管又は通路に均一に緩衝溶液を載置し、サンプルを一端に注入する。分離通路に沿って一定電圧をかけると、イオンがそれぞれの電気泳動易動度に対応する速度で移動する。イオン種が異なれば荷電-質量比が異なるので、これらは通路に沿って移動するにつれて分離する。Liuら（2001, Anal. Chem. 73, 2147-2151) は二次元の分離システムを記載しているが、これは毛細管ゾーン電気泳動（CE又はCZE）をMALDIに連結したものである。まず、ガラス微小チップ上に作成された開放微小通路内で分離が行われる。サンプルは通路の一端に導入され、分離される。次いで溶媒の蒸発後に微小チップをMALDI源に移転する。電気泳動及び電気浸透の組み合わせによって第一次元の分離が生じるが、ペプチド及びオリゴ糖は電気浸透により移動することが実証されている。
【００１１】
電気浸透（electroosmosis or electroendosmosis）は大規模な流動現象であり、これは、特にガラス通路での毛細管電気泳動による分離に影響する。毛細管電気泳動中の分析物の速度は、電位によって架される力だけでなく、通路内の浸透流動（EOF）の速度にも依存する。浸透流動が観察されるのは、毛細管内の溶液に電場を架けた際に毛管壁、例えばガラス毛細管壁上に一定の荷電が生じたときである。一般的に帯電部位が発生するのは、溶融シリカの内側表面上にあるシラノール基がイオン化することによる。シラノールは弱酸性であり、pH値が約pH３を超えるとイオン化する。溶液中の水和陽イオンがイオン化SiO-基と結合すると電気二重層、すなわち、表面に接する静的内層（シュテルン層としても知られる）及び可動性の外層（ヘルムホルツ平面とも称される）が形成される。電場をかけると、外層中の水和陽イオンは陰極へ移動し、それと同じ方向に毛細管中に大量の液体が新たに流れる。移動の速度は、電場の強さと毛細管壁の電荷密度に依存する。帯電するシラノール量は媒体pHの関数であるから、EOFの大きさは直接にpHと共に増大し、最後は存在する全てのシラノールが完全に酸化される。電気浸透はWehr, T., Rodriguez-Diaz, R., Zhu, M., Capillary Electrophoresis of Proteins, Marcel Dekker, Inc., New York, 1999にさらに詳細に記載されている。
【００１２】
毛細管等電点電気泳動（CIEF）は、平衡に基づく分離方法であり、担体としての両性電解質が形成するpH勾配に依存する。電場の下に置かれるとタンパク質はそれぞれのpI点にまで移動し、その地点で保持荷電がゼロになり集束する。すなわち分離と濃縮が同時に起こる。毛細管全体に存在した同一のタンパク質は単一のスポットに集束するため、集束ゾーンではタンパク質の濃度が出発溶液に比較し100-500倍増大する。
【００１３】
CIEF後の分離タンパク質は、一点検出技術、例えばレーザ誘発性蛍光及びESI-MSを利用して検出している。しかし、この場合にタンパク質集束ゾーンを管の末端にある検出点を通過するために移動させなければならない（Rodriguez, R., Zhu, M., Wehr, T., J Chromatogr. A 1997, 772, 145-160）。
【００１４】
MALDI、例えばMALDI-MS及びMALDI-TOFは、大きな分子質量の正確な測定及びタンパク質-リガンド相互作用の研究には重要な技術であるが、クロマトグラフィー、特に毛細管電気泳動との巧妙な連結は、未だ首尾良く達成されていない。CIEFとMALDI-MSの連結が問題となる理由は、毛細管内側のタンパク質集束ゾーンに直接アクセスできないからである。すなわち、後に続づくMALDIイオン化のためには、毛細管の内容物を毛細管外に移動させてから、適切な表面に析出させなければならない。この移動段階により分解能は低下し、分析時間が増し、pH勾配が乱される。したがって、結果の再現性は乏しい。
【概要】
【００１５】
本発明の第一の態様では、等電点電気泳動（IEF）モジュールであって、（a）サンプルを載置し、サンプル中の成分又は成分群を等電点にしたがって集束させる通路を有する第一の平面部材；及び（b）通路をその長さの少なくとも一部に沿って露出し、これにより通路内のサンプル又は成分（群）を露出する手段、を備えるモジュールが提供される。
【００１６】
好ましくは、サンプル又は成分（群）は、露出された通路に沿って実質的にそれらが集束した位置でアクセス可能である。好ましくは、通路は開放通路を備え、それがその長さの少なくとも一部に沿って露出されている。  好ましくは、通路は、第一の平面部材の表面上に形成された直線状の溝を備える。
【００１７】
好ましい形態では、通路が微小通路又は毛細管通路を備える。好ましくは、微小通路又は毛細管通路が第一の平面部材上に微細加工されている。
【００１８】
通路は、1-500マイクロメートルの範囲、より好ましくは50-350マイクロメートルの範囲、より好ましくは50-350マイクロメートルの範囲、最も好ましくは約150マイクロメートル又は約175マイクロメートルの幅を有する。
【００１９】
第一の平面部材は、プラスチック、ポリマー、セラミック、ガラス又は複合物からなる群から選択される材料から形成されるとよい。好ましくは、通路の少なくとも一の壁がポリ(メチルメタクリレート)（PMMA）又はポリカーボネートを備える。好ましくは第一の平面部材を被覆又は誘導体化して表面荷電を減少し、これにより電気浸透流（EOF）を最小化する。
【００２０】
モジュールは電解質用の液槽を備え、この液槽は通路と電気的に連結しているとよい。好ましくは、液槽は、第一の平面部材上の通路の各端に隣接して形成されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、モジュールは、第二の平面部材である蓋をさらに備え、これにより通路中のサンプルの蒸発が減少する。好ましくは、蓋はその内側表面に細長い凹部を備え、この凹部は、蓋を第一の平面部材と合わせたときに通路に含まれるサンプルを実質的に漏出させない位置に配置される。
【００２２】
好ましくは、凹部の長さ及び幅は、第一の平面部材の通路と少なくとも同じ大きさである。このような態様では、液槽が蓋上に配備されているのが好ましい。
【００２３】
好ましくは、モジュールは通路と液槽との間に電気的連結のための手段を備え、またそれによってサンプルと電解質の実質的な混合が防止される。この手段は、半透膜、アガロース、アクリルアミド、寒天、又はゲル栓を含むとよい。
【００２４】
非常に好ましい形態では、モジュールは、実質的に平行に配向している複数の通路を含む。
【００２５】
特定の形態では、通路又は通路群は閉鎖通路（群）を備え、この通路（群）を露出する手段は、この通路（群）の長軸方向の平面に沿って開裂可能な脆いラインを備える。
【００２６】
好ましくは、モジュールは並進台をさらに備え、その上に第一の平面部材が取り付けられる。
【００２７】
本発明の第二の態様では、サンプル中の一以上の成分を分離する装置であって、本発明の第一の態様に記載の等電点電気泳動（IEF）モジュール並びに等電点に基づいて集束した成分をそれらの各質量にしたがって分離することができるモジュールとともに、備える装置が提供される。
【００２８】
好ましくは、質量分離モジュールは質量分析のためのモジュールを備える。好ましくは、質量分離モジュールはマトリクス支援レーザ脱離／イオン化質量分析（MALDI-MS）モジュール、好ましくはマトリクス支援レーザ脱離／イオン化−飛行時間型（MALDI-TOF）モジュールを備える。
【００２９】
本発明の第三の態様では、サンプル中の一以上の成分を分離する方法であって：（a）通路を有する第一の平面部材を含む等電点電気泳動（IEF）モジュールを準備するステップと；（b）通路にサンプルを載置するステップと；（c）サンプルの成分又は成分群を、通路に沿って、等電点にしたがって集束させるステップ；（d）通路の長さの少なくとも一部を露出し、これにより通路内のサンプル又は成分（群）を露出するステップと；を含む方法が提供される。
【００３０】
この方法は、本発明の第一の態様の好ましい実施形態に示されている一以上の特徴を含んでよい。
【００３１】
この方法はさらに：（e）開放通路内の一以上の成分にアクセスし、それを分析するステップを含んでよい。好ましくはその成分又はその各成分は、質量分析、好ましくはMALDI-MS、より好ましくはMALDI-TOF質量分析によって分析される。
【００３２】
好ましくは、サンプルはMALDIマトリクスを含む。好ましくは、MALDIマトリクスは等電点電気泳動後のサンプルに添加される。好ましくは、MALDIマトリクスは、シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、アルファCCA、シナピン酸（SA）、3-ヒドロキシピコリン酸（HPA）、IAA(Na+)、2-(4-ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸HABA(Na+)、ジスラノール(Na+)、レチノイン酸(Na+)、コハク酸、2,6-ジヒドロキシアセトフェノン、フェルラ酸、コーヒー酸、グリセロール及び4-ニトロアニリンからなる群から選択される。
【００３３】
本発明の第四の態様では、分子を分析する方法であって；（a）細長い開放通路を準備すること；（b）複数の分子を細長い開放通路内に導入すること；（c）細長い開放通路に沿って等電点にしたがって分子を分離すること；（d）細長い開放通路中で分子にアクセスし、それを分析すること；を含む方法が提供される。
【００３４】
本発明の第五の態様では、分子を等電点電気泳動（IEF）する装置であって、細長い通路を備え、この細長い通路はその少なくとも一部に沿って開放されており、分離された分子にそこからアクセスすることができる装置が提供される。
【００３５】
第六の態様では、本発明はCIEF-MALDI装置を提供する。
【００３６】
本発明の第七の態様では、上記モジュール又は装置を、分析対象のタンパク質を含むサンプルとともに備えるキットが提供される。
【００３７】
本発明の第八の態様では、タンパク質分析のための、質量分析計、好ましくはMALDI-MSユニット、より好ましくはMALDI-TOFユニットと組み合わせた、上記等電点電気泳動モジュールの使用が提供される。好ましくは、このような使用はプロテオーム分析用である。
【００３８】
本発明の第九の態様では、毛細管等電点電気泳動（CIEF）装置及びMALDI-MS装置、好ましくはMALDI-TOF装置を連結する手段であって、等電点電気泳動を実行する通路、並びに該通路をその長さの少なくとも一部に沿って露出し、これにより通路内のサンプル又は成分（群）を露出する手段、を備える連結手段（interfacing means）が提供される。
【００３９】
好ましくは、この連結手段は開放通路を備える。
【００４０】
本発明の実施では、特に記載しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA及び免疫学の通常技術が使用され、これらは当業者の技能の範囲内にある。このような技術は文献中で説明されている。例えば、J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, JohnWiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J.M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M.J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Prictical Approach, Irl Press;及び、D.M.J. Lilley and J.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press を参照のこと。2-D PAGE技術の広範なレビュー、及びプロテオーム分析におけるその応用は、Andrew J. Link, 2-D Proteome Analysis Protocols, Vol. 112, Humana Press ISBN: 0896035247によって提供されている。これらの一般的なテキストは引用により本明細書に援用される。
【詳細な説明】
【００４１】
本発明者らは、等電点電気泳動を用いてタンパク質を分離するモジュール／装置であって、質量分析、特に、MALDI質量分析（MALD-MS）との容易な連結に適合するモジュール／装置を開示する。特に、このモジュールはMALDI-TOFとの容易な連結に適合する。特に、本発明者らのモジュール／装置では、第一次元では電荷を用い（等電点電気泳動）、第二次元では質量（MALDI、好ましくはMALDI-TOF）を用いる2D分離が採用される。
【００４２】
本明細書に記載される装置／モジュール及び方法は、サンプル中の成分、特にサンプル中のタンパク質成分を通路に沿って迅速かつ正確に集束させ、これらにアクセスすることを可能にする。これは、通路をその長さの少なくとも一部、好ましくはその長さの全部又は実質的な全部に沿って露出する手段を提供することによって達成される。このような装置及び方法の具体的な実施形態は、以下にさらに詳細に記載されている。通路は「開放性」である実施形態が好ましく、これにより、微小通路に沿って任意の標的タンパク質にランダムにアクセスすることができる。標的タンパク質は抽出可能であり、またその場で分析しもよい。標的タンパク質は、分析のために例えば、通路又は微小通路を質量分析装置と連結（接続）することによって取り出してもよい。特定のMS装置、例えばMALDI又はMALDI-TOFの使用が好ましい。
【００４３】
すなわち、本明細書に記載のモジュール、装置及び方法により、サンプル中の成分を検出し、特にその成分又はその各成分の一以上の性質を測定することができる。好ましい実施形態では、本明細書に記載のモジュール、装置及び方法は、プロテオーム分析、すなわち細胞のタンパク質成分を分析するのに使用される。本明細書に記載のモジュール、装置及び方法はまた、個体由来のサンプル中の一以上の疾患関連タンパク質を検出するために適当に使用してよい。このような検出は疾患の診断として、又は疾患の診断を決定する手段として使用することができる。
【００４４】
［サンプル及び成分］
本明細書に記載の方法及び装置は、成分混合物の典型的なサンプルから、一以上の成分を分離するのに適する。サンプルは、何百又は何千の成分を含む複合混合物であってよい。成分は性質が均一であってよいが、むしろ均一でないのが好ましい。好ましい側面では、二以上の成分を一以上の性質、例えば荷電、質量、等によって識別してよい。
【００４５】
すなわち、本発明者らのモジュール又は装置を用いる等電点電気泳動に適したサンプルには、種々のタイプが挙げられる。特に、本発明者らの方法及び装置は、複合サンプル、例えば細胞抽出物の分離及び分析に適する。細胞及び組織抽出物は当分野に既知の任意の手段によって調製してよい。
【００４６】
サンプルには、単純分子、複合物分子、又はこれらの任意の混合物が挙げられる。これらには、タンパク質、炭水化物、核酸、DNA、RNA、等を挙げてよい。好ましくは、サンプルの少なくとも一つの成分は両性分子、例えばタンパク質を含んでよい。
【００４７】
サンプルは、一以上の以下のものを含んでよい：タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド、cDNA、ゲノムDNA、人工又は天然の染色体（例えば酵母人工染色体）又はその部分、RNA、例えばmRNA、tRNA、rRNA又はリボザイム、又はペプチド核酸（PNA）；ウイルス又はウイルス様粒子；ヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はその合成類自体、これらは修飾又は非修飾であってよい；アミノ酸又はその類似体、これらは修飾又は非修飾であってよい；非ペプチド（例えば、ステロイド）ホルモン；プロテオグリカン；脂質；又は炭水化物、等。
【００４８】
［タンパク質含有サンプル］
本発明者らの方法及び装置を使用して、任意のサンプル、特にタンパク質含有サンプルを分析してよい。好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法及び装置は、タンパク質含有サンプルを分離するのに適する。等電点にしたがって集束及び／又は分析された分子にはタンパク質が含有されるのが好ましい。
【００４９】
タンパク質は好ましくは、ヒトタンパク質、又は動物タンパク質、哺乳類タンパク質又は細菌又は他の微生物タンパク質であってよい。タンパク質は、天然タンパク質又は変性タンパク質であってよい。これらは、野生型タンパク質又は変異タンパク質であってよく、天然又は人工の別に関係しない。これらには、翻訳後修飾体、例えば、ADPリボシル化体、ユビキチン結合体、糖鎖形成体、プレニル化体（脂肪族アシル化体）、セントリン化体、リン酸化体、等の任意の一以上を含んでよい。タンパク質は一以上の翻訳後修飾基、例えばメチル基、リン酸基、ユビキチン基、グリコシル基、脂肪族アシル基、セントリン又はADPのリボシル部分を含んでよい。このような修飾体は例えば、WO00/50896、WO00/50635、WO00/50631、WO00/50630及びGB2342652に記載されている。このタンパク質はイソ型であってもよく、特にサンプルは一以上のタンパク質イソ型を含んでよい。
【００５０】
このタンパク質は、組換え技術により発現されたタンパク質を含んでよい。組換えタンパク質を製造する方法、発現方法、ベクター、及び発現に適した宿主は当分野に周知である。
【００５１】
［疾患関連タンパク質］
好ましい実施形態では、検出又は分析されるタンパク質又はタンパク質群には疾患関連タンパク質が含まれる。この用語は、そのタンパク質が個体の細胞、組織又は器官中に存在することにより、その細胞、組織又は器官が疾患状態にあることを示すものを意味する。好ましい側面として、このタンパク質は病理学的症状のフラッグ又はマーカーである。このタンパク質は、疾患状態の原因物質であっても、あるいはいかなる原因作用も有さなくてもよい。このタンパク質は疾患の「下流の」指標であってもよい。疾患関連タンパク質により、個体に疾患又は疾患に対する感受性が存在することが示されてもよい。
【００５２】
疾患関連タンパク質自身が検出される必要はなく、それをコードする任意の核酸、例えば疾患関連DNA、-mRNA、-遺伝子、-対立遺伝子、等が検出されてもよいことは理解される。
【００５３】
疾患には、ヒト又は動物に影響する任意の既知の疾患が含まれてよい。この疾患には、特に感染、例えば細菌、真菌、原虫及びウイルスの感染、特にHIV-1又はHIV-2によって引き起こされる感染；疼痛；癌；糖尿病、肥満；摂食障害；過食症；喘息；パーキンソン病；血栓症；急性心不全；低血圧；高血圧；勃起機能障害；尿貯留；代謝性骨疾患、例えば骨粗鬆症（osteoporisis）及び大理石骨病；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；関節リウマチ；炎症性腸疾患；被刺激性腸症候群 良性前立腺肥大；及び精神病性及び神経学的障害、例えば不安、精神分裂病、躁鬱病、譫妄、痴呆、深刻な精神遅滞及び運動障害、例えばハンチントン病又はギレス・デラ・トゥーレット症候群を挙げてよい。炎症性疾患、例えば乾癬、ざ瘡、湿疹、等もまた含まれる。
【００５４】
好ましい疾患には、先進国の人々を苦しめあるいは脅かす疾患、例えばAIDS、癌、アルツハイマー病、パーキンソン、CJD、等が含まれる。
【００５５】
特定疾患に関する疾患関連タンパク質は、あらかじめ判っているタンパク質（すなわち、既知の疾患関連タンパク質）であってよく、あるいは未知であってもよい。後者の場合、本明細書中に記載される方法、装置及びモジュールを適当に利用して、その未知の疾患関連タンパク質を決定してもよい。
【００５６】
サンプルは、罹患している個体から採取され、記載のように分離及び分析される。一以上のプロファイルを作成してよい；そのプロファイルには例えば、等電点電気泳動プロファイル（種々タンパク質の通路に沿った配列）、又は好ましくは質量分析プロファイルを含めてよい。質量分析プロファイルには、疾患サンプル中に存在するタンパク質の分子量に関する情報が含まれる。疾患プロファイルは次いで、正常な（すなわち罹患していない）個体から作成される関連のプロファイルと比較する。
【００５７】
プロファイルに何かの差異があれば、正常個体と罹患個体のタンパク質組成に差異があることが示される。このような差異から、疾患に関するマーカーが得られ、推定する疾患関連タンパク質として用いてよい。これらが別の個体において記載のように検出されれば、疾患又はそれに対する感受性の存在を決定してよい。
【００５８】
本明細書中に記載される方法及び装置を用いて、細胞中、器官中、等でこのような疾患関連タンパク質が検出されれば、この疾患の診断の補助に使用してよい。特定の疾患に関しては、このような検出はその疾患の直接の診断として用いてよい。その後、問題の個体又は患者に対して適切な処置を施こせばよい。
【００５９】
［等電点電気泳動］
このモジュールでは、通路、好ましくは狭い通路に沿った等電点電気泳動を利用する。
【００６０】
「等電点電気泳動」の語は、IEF又は電気泳動としても既知であり、この語が意味する技術の望ましい理解によれば、ｐHが陰極から陽極へ増大する（安定な）pH勾配上に電場を架すと、等電点の異なる溶質群はこの電場内でそれぞれに固定バンドを形成するということである。pH勾配の最も簡便な作り方は、分子量が低く等電点が少しずつ異なる担体両性電解質群の混合物溶液を電気分解すると、各担体は電場内でそれぞれの等電点領域に移動しそこに留まるので、これによるのが好ましい。
【００６１】
さらに詳細には、等電点電気泳動（IEF）は、電気泳動の技術であって、緩衝溶液にpH勾配を与えて電場をかけると、生物学的材料は大部分が両性であるので集束する。両性生体材料、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、ウイルス、及びある生細胞は、酸性媒体中では正の電荷を帯び、塩基性媒体中では負の電荷を帯びる。IEFの過程でこれらの材料はあらかじめ確立されたpH勾配の中をそれぞれの等電点まで移動し、その点で正味の荷電が0になり、安定な狭いゾーンを形成する。等電点電気泳動によれば非常に高分解能のバンドが得られる。この理由は、両性生体材料は拡散又は流体運動によりそれぞれの等電点から離れてはいるが、pH勾配と電場が架かるとその組み合わせ作用により元に戻されるからである。その結果、この集束過程でサンプルは比較的安定なバンドの中に精製され、濃縮されるのである。
【００６２】
等電点電気泳動は電気泳動のプロセスである。「電気泳動による」分離とは、正味の荷電を有する粒子又は高分子が移動し、この移動が電場によって影響されることを言う。すなわち、本明細書に記載の装置及び方法において使用する電気泳動による分離には、例えばゲル（例えばポリアクリルアミド、アガロース及びそれらの組み合わせ）を充填した通路内で行われる分離、ならびにその溶液中で行われる分離が挙げられる。この分離は溶液中で行われるのが好ましい。
【００６３】
本明細書で用いる「等電点」又はpIの語の望ましい理解によれば、電場の中でタンパク質又は他の両性電解質の易動度がゼロとなる溶液のpH；したがってタンパク質又は他の両性電解質の正味の電荷がゼロ、すなわち電荷なし、又はこの両性電解質分子に結合している何かの外来イオンによる電荷を含めて正電荷と負電荷の数が等しくなるpHを意味する。等電点のpH値は、溶液中に存在する、水素及び水酸化物イオン以外の他のイオンに依存してもよい。等電点はまた、「等電pH」（IEP又はIpH）としても知られている。
【００６４】
好ましくは、本明細書に記載のモジュール中での等電点電気泳動は、電気浸透流が減少しているか、あるいは好ましくは存在しない状態で行われる。これを達成するために適切な基板を用いてもよく、以下にさらに詳細に説明する。
【００６５】
［等電点電気泳動（IEF）モジュール］
等電点電気泳動モジュールには、通路を有する（一般に平面形状の）基板が含まれる。本明細書に記載の等電点電気泳動モジュールはまた、「カートリッジ」と称されることもあり、等電点電気泳動の技術及びモジュールは「CIEF」（毛細管等電点電気泳動）と称されることもある。
【００６６】
［通路］
通路は、一般に細長く、好ましくは直線状である。通路の構成は管状であってよいが、その全長の少なくとも一部に沿って開放されているのが好ましい。好ましくは、通路はその長さの実質的に全部に沿って開放され、その結果基板上で断面が溝状又は上が開いた通路の形状をしている。
【００６７】
通路の寸法は一般に、マイクロメートル範囲のオーダーである。これらは例えば、微小毛細管の寸法に対応する。微小毛細管又は毛細管とは、狭くて直径の小さい管、好ましくは液体、例えば水に対して毛細管効果を発揮可能な管を意味する。任意の毛細管、例えばガラス毛細管（以下に記載されるように適切に修飾したもの）又はプラスチック毛細管は、開放露出が可能で分離成分へのアクセスが可能であれば、本明細書に記載の目的のための通路の代わりに使用可能であると理解される。
【００６８】
好ましくは、通路は例えば、幅、深さ又は直径が1〜500マイクロメートルの範囲、好ましくは50〜350マイクロメートルの範囲の長さ寸法である。しかし、好ましい実施形態では、通路の（好ましくは幅）長さ寸法は100〜250マイクロメートルの範囲、又は50〜350マイクロメートルの範囲である。非常に好ましい実施形態では、通路の（好ましくは幅）長さ寸法は約127マイクロメートル又は約150マイクロメートル又は約175マイクロメートル、最も好ましくは約175マイクロメートルである。通路が開放している箇所では、通路の深さは一般にその幅より大きい。
【００６９】
通路は基板から刻んでもよく、あるいはモジュールを、適当な鋳型による既知の成形技術を用いて、通路付きで成形してもよい。通路は、例えばレーザによる刻み込みを用いて基板上に焼成させてもよい。張力をかけた適当なワイヤ、例えば白金ワイヤを（好ましくはそれに電流を通すことによって）加熱して使用し、通路を融出してもよい。通路は、基板から溝として刻まれるのが好ましい。当分野で既知の機械加工技術がこの目的のために使用可能である。好ましい実施形態では、通路は基板から掘られ、通路の壁（又は少なくとも一方の壁）がその基板材料から構成される。
【００７０】
非常に好ましい実施形態では、複数（多数）の通路が基板上に配列される。好ましい実施形態では、通路又は通路群は、基板のレーザエッチング、レーザ切除、射出成形又はエンボス加工によって形成される。
【００７１】
用語「レーザエッチング」には、レーザ光を用いて基板の表面から材料を除去する、基板の任意の表面処理が含まれるものとする。したがって「レーザエッチング」には、レーザエッチングだけでなく、レーザ機械加工、レーザ切除、等が含まれる。用語「レーザ切除」を使用した場合は、適当な基板中、高エネルギー光子レーザ、例えばエキサイマーレーザを用いて特徴構造を切除する機械加工プロセスを言う。エキサイマーレーザは、例えばF.sub.2、ArF、KrCl、KrF、又はXeCl型であり得る。
【００７２】
用語「射出成形」は、測定量の溶融プラスチック又はセラミック基板を金型（又は鋳型）内へ射出することにより、プラスチック又は非プラスチック性セラミックの形状を成形するためのプロセスを言うために使用される。本発明の一実施形態では、微量分析装置は射出成形を用いて作成してよい。
【００７３】
用語「エンボス加工」は、エンボス加工用金型を既存の工程前素材のポリマー、金属又はセラミックと接触させることにより、ポリマー、金属又はセラミックの形状を成形するためのプロセスを表すために用いられる。エンボス加工用金型と既存の工程前素材の材料の間に制御された力を加え、エンボス加工用金型によって決定されるパターン及び形状が既存の工程前素材のポリマー、金属又はセラミックに押し込まれる。用語「加熱エンボス加工」を使用した場合は、エンボス加工用金型を、加熱された既存の工程前素材のポリマー、金属、又はセラミックと接触させることにより、ポリマー、金属、又はセラミックの形状を成形するためのプロセスを言う。既存の工程前素材の材料を加熱し、エンボス加工用金型及び既存の工程前素材の間に制御された力を加えると、エンボス加工用金型に応じた形になる。得られたポリマー、金属又はセラミックの形状を冷却し、次いでエンボス加工用金型からはずす。
【００７４】
［開放通路］
等電点電気泳動モジュールには、通路をその長さの少なくとも一部に沿って露出するための手段が含まれる。このように通路を露出すると、通路内のサンプル又は成分（群）は露出され、好ましくはMALDI分析のためにアクセス可能になる。非常に好ましい実施形態では、通路は「開放」通路であり、この語は、通路の長さの少なくとも一部、好ましくは相当な部分が、閉鎖又は遮蔽されていないことを意味する。換言すれば、このような好ましい実施形態では、通路の形状は長い上側が開放している。この開放部分の幅は、すくなくとも通路の内容物、例えばサンプル、及び好ましくは分離され集束したサンプルの成分、例えばタンパク質にアクセスするのに必要な程度であるのが望ましい。  好ましくは、開放部分の長さは、集束した成分又はタンパク質の全部又は実質的な全部に及ぶ。
【００７５】
しかし、開放手段を伴っていれば、閉鎖通路も使用してよいことは理解される。例えば、閉鎖毛細管に開裂ポイントがあり、縦部分に分割できれば、等電点電気泳動用に使用してよい。さらにまた、毛細管は、それぞれ溝のある２つの平面部材を合わせて形成させてもよい。等電点電気泳動をこの毛細管通路内で行い、次にこの平面部材を分離し、集束タンパク質にアクセスしてもよい。
【００７６】
［基板］
基板は、等電点電気泳動に適した任意の材料、例えば、プラスチック、ポリマー、セラミック、ガラス又は複合材料で形成させてよく、当分野では既知である。一般に、基板としての使用に適している非伝導性材料はどれでもよい。
【００７７】
基板は一般に細長く、好ましくは長方形であってよい。任意のサイズの基板を使用することができるが、本明細書中で用いる用語「基板」は、好ましくは、所望の小型化した表面構成を有するように微細加工、例えばドライエッチング、ウェットエッチング、レーザエッチング、成形又はエンボス加工可能な任意の材料を表す。さらに、微細構造は、材料を付加して基板の表面上に形成でき、例えばポリマー通路は、光画像化ポリイミドを用いてガラス基板の表面上に形成できる。好ましくは、基板は、基板の表面内の、表面上の、及び／又は表面を貫く構成を形成するように微細加工が可能である。このような好ましい構成には、以下にさらに詳細に説明する通路が含まれる。
【００７８】
基板は、ポリマー、セラミック、ガラス、金属、それらの複合物、それらの積層物、等であり得る。「複合物」とは、異種材料群からなる組成物を意味する。複合物は、ブロック複合物、例えばA-B-Aブロック複合物、A-B-Cブロック複合物、等であってよい。また、複合物は不均質な、すなわちこの場合、材料群は別個であるか、あるいは分離相であり、又は均質な異種材料群の組み合わせであってよい。本明細書中で用いる用語「複合物」には、「積層（物）」複合物を含む。「積層物」とは、同一又は異種材料のいくつかの異種結合層から形成される複合材料を言う。他の好ましい複合物基板には、ポリマー積層物、ポリマー-金属積層物、例えば銅被覆性ポリマー、金属中セラミック又は金属中ポリマー複合物が含まれる。
【００７９】
装置の要素には通路（群）を含むプレートが挙げられこれに限定されないが、要素は基板から構成されてもよい。さらに、装置中に存在する蓋又はカバープレートも基板から構成されてよい。
【００８０】
特に好ましい基板は、電気浸透流（EOF）が低いものである。例えば、表面の基が実質的に電荷を帯びない材料、例えばプラスチックはこの目的に適している。帯電表面基を有する材料もまた使用可能であるが、好ましさは小さい。
【００８１】
ガラス毛細管通路では、例えば、電場をかけると強い電気浸透流（EOF）が発生するが、他方、ほとんどのプラスチック基板には、イオン化可能な化学官能基は多数ないので、電気浸透流（EOF）は非常に弱い（Soper, S.A., Ford, S.M., Qi, S., McCarley, R.L., Kelly, K., Murphy, M.C., Anal. Chem. 2000, 72, 642A-651A）。EOFは、毛細管ゾーン電気泳動時の、微小通路内で化学物質を移動させるための重要な推進力である。しかし、架けた電場下で担体両性電解質に安定なpH勾配を形成させるためには、本明細書に記載の毛細管等電点電気泳動中でのEOFは排除しなければならない（Wehr, T., Rodriguez-Diaz, R., Zhu, M., Capillary Electrophoresis of Proteins, Marcel Dekker, Inc., New York, 1999）。プラスチック基板には一般にイオン化可能な化学官能基が多数ないので（たとえ存在するとしても）電気浸透流は弱い。したがって、プラスチック基板は基板として好ましい。
【００８２】
帯電表面基を有する材料、例えばガラスを用いる場合には、EOFを減少するために化学修飾により表面荷電を減少するのが好ましい。したがって、ガラス及び他の同様の基板表面は、表面荷電を減少させるために、表面処理、誘導体化、又は被覆するのが好ましい。CIEFの毛細管通路を被覆するために用いられる任意の材料はこの目的のために使用してよく、例えばアクリルアミド、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、テフロン及びポリビニルアルコールが挙げられる。
【００８３】
用語「表面処理」には、好ましくは誘導体化又は被覆が含まれるが、分離時にサンプルと接触する基板表面、好ましくは通路の一以上の壁に調製又は修飾を行い、それにより装置の分離特性が変更され、あるいは高められることを言う。電気浸透流が減少するように装置の特性を高めるのは好ましい。したがって、本明細書中で用いる「表面処理」には：物理的表面吸着；処理基板の表面上の官能基に対する（例えば縮合ポリマー上のアミン、ヒドロキシル又はカルボン酸基に対する）選択部分の共有結合；表面を被覆する方法、例えば（例えば媒体に界面活性剤を添加することによる）処理表面の動的不活性化、処理基板の表面へのポリマー移植（例えばポリスチレン又はジビニル-ベンゼン）及び材料の薄膜析出が含まれる。
【００８４】
種々の材料で被覆するプロトコルを以下に記載する。アクリルアミドコーティングには、毛細管又は通路を0.5M NaOHで30分間洗浄し、次いで水で10分間洗浄する。この毛細管又は通路を次いで0.1M HClで5分間洗浄し、その後、水で30分間洗浄する。50:50容量の水：アセトン中に5マイクロリットル/mlガンマ-メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランの溶液を調製し、この中で毛細管又は通路を１時間洗浄する。この毛細管又は通路を、4%(w/w) アクリルアミド、0.04%(v/v) N, N, N, N-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）及び0.5mg/mL過硫酸アンモニウム溶液で30分間洗浄する。最後に、毛細管又は通路を、水で洗浄し、次いで窒素をこの中に通して乾燥する。
【００８５】
ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、又はポリビニルアルコールコーティングでは、これらの化学物質の任意の一つをサンプル中に添加することにより、等電点電気泳動中の動的コーティングを達成できる。別法として、（適当な化学物質の）1-5%溶液で毛細管を洗浄すれば、毛細管又は通路はあらかじめコーティングされる。次いで毛細管又は通路を乾燥窒素で清浄にする。次いで140-160℃に加熱することによりコーティングの薄層が毛細管上に固定される。
【００８６】
上記プロトコルは、毛細管又は通路自身に対して実行してよいが、通路付きの基板全体をこの目的のために処理することは可能であり、より簡便であることは理解される。
【００８７】
ガラス基板を用いる場合には、微細加工技術、例えば微小電子産業では一般に知られている技術を使用して、ガラス基板上に通路を刻むか、あるいはエッチングしてよい。ポリマー基板もまた、微細加工技術を施すことが可能であり、このような技術は、Becker, H., Gaertner, C., Electrophoresis 2002, 21, 12-26に詳細に記載されている。例えば、プラスチック装置は、射出成形、レーザ切除、刻み込み又は加熱エンボス加工から作成できる。このような加工技術により、安価な方法での大量生産用に装置を高速で複製することができる。その結果、医学的診断及びスクリーニング分野において一回だけ使用して使い捨てる装置が使用できるようになる。
【００８８】
非常に好ましい実施形態では、基板はポリ(メチルメタクリレート)（PMMA）又はポリカーボネート製であり、通路の少なくとも一方の壁がこの材料を含む。
【００８９】
［担体両性電解質］
担体両性電解質は、種々の酸性と塩基性の両方の緩衝基を組み込んだ合成ポリマーの不均質混合物である。両性電解質分子の正味の電荷は、環境のpH及び特定分子上に具体的に混在している酸性基と塩基性基の数及びpKに依存する。等電点電気泳動（IEF）では、担体両性電解質を通路内に導入する。電場を架けていなければ、担体両性電解質はランダムに分配されているので、ゲルマトリクスの至る所で均一なpH、すなわちpH3-10の勾配を形成する場合には約pH 7が確立している。
【００９０】
通常は陽極（＋）の酸性電極溶液及び陰極（−）の塩基性電極溶液を介して通路を縦断する電場をかけると、正味の電荷を持った担体両性電解質は全て移動を開始する。pI値が低く正味の電荷が負の担体は陽極へ向かって移動し、pI値が高く正味の電荷が正の担体は陰極へ向かって移動し、正味の電荷がない（中性）担体は移動しない。極端なpI値を伴う両性電解質ほど、対応する電極溶液により近く移動可能であり、その後、自分のpIに等しいpHに滴定される。このようにしてpH勾配は移動性担体両性電解質によって確立される。平衡時、ゲル中の任意の点のpHは、その点の可溶性担体両性電解質の平均pIによって決定される。同時に、荷電又は中性の分子、例えばサンプル中のタンパク質成分もまた自分のpI点にまで移動し集束する。
【００９１】
担体両性電解質を通路内に導入し、電場を架けてpH勾配を形成してもよい。別法として、あるいはさらに加えて、担体両性電解質をサンプル中に混合し、担体両性電解質を含有するサンプルを通路内に導入する。
【００９２】
電気力の影響下で、pH勾配は担体両性電解質によって確立され、タンパク質種は自身の等電点に移動し、集束（濃縮）する。電気力のこの集束効果は、ゾーン中のタンパク質濃度勾配に直接比例する拡散によって妨害される。実際には、ゾーン内へのタンパク質の電気運動輸送がゾーン外への拡散と厳密に均衡する状態で定常状態が確立される。
【００９３】
多数の担体両性電解質混合物が入手可能であり、これらは種々のpH勾配を提供する。  最適なpH勾配は実験の目的に依存する。スクリーニング用には、（pH 3-10又はそれと同様の）広い間隔範囲を用いるのがよい。間隔の狭いpH範囲は、慎重なpI測定に、あるいは非常に類似したpI点を有するタンパク質を分析する場合に有用である。一般に、勾配が浅いほど集束時間が長く拡散バンドが多くなるため、必要以上に狭い勾配は使用しないのが望ましい。pH勾配を選択する場合、製造元が述べている間隔は概算でしかあり得ないことを知っておくべきである。得られる厳密な勾配は、多くの要因、例えば電解質溶液の選択、勾配媒体（PAA又はアガロース）、電気泳動時間等に依存する。
【００９４】
担体両性電解質を含まないCIEFが示されており（Huang, T., Wu, X-Z., Pawliszyn, J., Anal. Chem. 2000, 72, 4758-4761）、本明細書中に記載の等電点電気泳動技術では、Huang及びPawliszynに記載の方法を用いることができる。さらに、通路中のpH勾配は、酸性又は塩基性両性電解質分子を開放通路の表面に固定することによっても作成できることが理解される。これはRosengren, A., Bjellqvist, B., Gasparic, V., 米国特許第4130470号, 1978に詳細に記載されている。しかし、担体両性電解質の使用が好ましい。
【００９５】
本明細書に記載のモジュール及び装置を用いる等電点電気泳動に使用してもよい担体両性電解質は、Pharmalyte 3-10又はBioRad 3-10である。これは、典型的に0.8%〜4%又はそれ以上、好ましくは約1%で用いることができる。担体両性電解質は米国特許第4,131,534号に詳細に記載されている。
【００９６】
グリセロールはIEFに関する通常の添加物であり、タンパク質濃度がそのpI点付近で増大した場合にタンパク質の沈殿をこれによって防止することができる。グリセロールはタンパク質イオン化用の赤外（IR）MALDIマトリクスでもある。グリセロールの使用はIR-MALDI-MSと連結された等電点電気泳動技術において好ましい。
【００９７】
［質量分析］
（MALDI-MS及び-TOFを記載するこの段落及び次の段落のテキストはThe Scientist 13 [12]: 18, Jun. 07, 1999の論文から書き換えてある）。
【００９８】
本明細書中に記載の方法は典型的には、第一次元のIEFを使用する分離、及び第二次元の質量による分離を使用する。質量の分離は、好ましくは、質量分析によって行われる。IEFモジュールは、好ましくは、第二次元の分離及び検出用の質量分析計に連結されている。
【００９９】
質量分析（MS）系は典型的に、エネルギーを架けて標的分子を粉砕及びイオン化する構成要素、及びその結果を分析する構成要素とを使用する。典型的に、分子は電子ビーム、高エネルギーイオン、又はレーザでの衝撃によってイオン化される。イオン化によりいくつかのサンプル分子は荷電するが、それらはそのままであるか、又は崩壊して種々の帯電及び中性粒子になる。イオンは質量分析計の中で静電場又は磁場によって加速され、検出器への屈折又は飛行時間によって分離される。15.999 Daの酸素及び同様なサイズで16.021 DaのNH2イオンを識別できる質量分析計がある。質量精度は一般に百万分率（ppm）で示されるが、〜100-200 ppmの質量精度を要求するシステムは多数ある。質量分析計の設計での考慮事項のレビューはBruneeによって提供されている（1987, International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, 76: 125-237）。
【０１００】
質量分析計では、２つのタイプのイオン検出器が典型的に使用される：電子増倍管及び微小通路プレート。  両技術はイオン検出によく適しているが、電子増倍管（これは数層の帯電ダイノードからなる）の方が高いイオン流に対して安定であると考えられる。
【０１０１】
最初の広く入手可能なMS用構成には、電子ビームイオン化源、走査四重極質量フィルタ、及びマルチダイノードイオン検出器が含まれ、これは主に比較的小さい分子の分析に適していた。比較的大きい分子（〜10 kDaまでのタンパク質及びペプチドを含む）を操作可能な部分に粉砕する高速原子衝撃（FAB）イオン化源が設計されて初めて、MSがタンパク質研究に有用になった。FABは不活性ガス粒子の高エネルギー（5-10 keV）流を使用してサンプルを「衝撃的にイオン化する」。標的をイオン化する効率が比較的乏しいことによる制約はあるが、これによりイオン化粒子自身が分裂してイオン化し検出器に衝突することによりバックグラウンドは高くなる。
【０１０２】
電子噴霧イオン化（ESI）によりタンパク質質量の範囲は~100 kDaまで増大した。四重極及び磁場ESI MSは非常に価値あるツールとなった。ESIでは高い電場が使用されて標的分析物の溶液がエアロゾル化し；その液滴が細分断して遂にはそれらの中に単一の分析物分子が含まれ、それに残留電荷が保持される。ESIによって作成されたイオンは複数の電荷を保持することがよくあり、機器及び目的に応じてこれは利点にも問題にもなり得る。FABもESIもともに、大量の又は固形支持体上のサンプルを処理するのには適さない。
【０１０３】
タンパク質に関し、ESI MSは多くの点で、ハンマーとしてのMALDI及び検出器としての飛行時間質量分析計管によって取って代わられている。本明細書に記載の方法及び装置は、好ましくは、第二次元の分離及び検出用にMALDI質量分析計を使用する。
【０１０４】
［マトリクス支援レーザ脱離／イオン化（MALDI）］
マトリクス支援レーザ脱離／イオン化-飛行時間（MALDI-TOF）質量分析は、高分子分析用、特にタンパク質用のツールである。MALDI-TOFは、タンパク質及び核酸の配列、構造、純度、不均一性、切断、翻訳後修飾、及び他の分子の特性であって、時折他の手段では解明が困難な特性を識別可能である。MALDIは、Chapman, J.R., Mass Spectrometry of Proteins and Peptides, 2001, Humana Press, Dass, C., Principles and practice of biological mass spectrometry, 2001, John Wiley & Sons, James, P., Proteome research: mass spectrometry, 2001, Springer, Kellner, R., F. Lottspeich, and H.E. Meyer, Microcharacterization of Proteins, 2nd Ed, 1999, Wiley-VCH, Kinter, M., and N.E. Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, 2000, Wiley Interscience 及び Siuzdak, G., Mass Spectrometry for Biotechnology, 1996, Academic Pressに詳細に記載されている。
【０１０５】
MALDIは、レーザ光のパルスを使用して、分析物を固相から脱離して直接にイオン化ガス状態にする。パルスレーザは1988年以前からタンパク質のイオン化に使用されていたが、タンパク質が光吸収するのでこの技術には制約があった。分析物のレーザ脱離及びイオン化用の金属粉末マトリクスが、1987年にKoichi Tanaka及び共同研究者らによって初めて提唱された（K. Tanaka et al., Shimadzu Corp., Kyoto, Japan, "Proceedings of the 2nd Japan-China Joint Symposium on Mass Spectrometry," 185, 1987）。
【０１０６】
有機光活性化合物を用いる比較的通常のMALDI法は、1988年にMichael Karas及びFranz Hillenkampによって発表され（M. Karas, F. Hillenkamp,"Laser desorption of proteins with molecular masses exceeding 10,000 Daltons," Analytical Chemistry, 60: 2299, 1988）、より最近ではRonald Beavis及びBrian Chaitによってレビューされている（R.C. Beavis, B. Chait, "Matrix assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins," Methods in Enzymology, 270: 519, 1996）。
【０１０７】
MALDIでは、タンパク質は、光活性化合物、例えばゲンチシン酸、4-HCCA（アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸）、又はジスラノールとの共結晶化によって媒体又はマトリクス中に包埋される。紫外レーザとともに使用するための典型的なマトリクスは、レーザ波長を強く吸収する発色団を有する芳香族酸である。マトリクスが振動励起によって活性化可能である場合には他のレーザ波長、特に中間赤外範囲が可能であり；この場合には種々のマトリクス化合物を使用する必要がある。MALDIマトリクスは、多数の必要条件、すなわち単離の分析物を（例えば共結晶化によって）包埋可能であること、分析物に適合する溶媒に可溶性であること、減圧で安定であること、レーザ波長を吸収できること、レーザ照射を受けて分析物を同時脱離させること、ならびに分析物のイオン化を促進すること、を同時に満たさなければならない。
【０１０８】
マトリクス化合物は、光を吸収し、そのエネルギーを利用して包埋されているタンパク質分子を追い出してこれをイオン化する。タンパク質は脱離時に断片化されないため、しばしばMALDIは「ソフト」イオン化技術と称される。MALDIに適したマトリクス化合物のリストは広範であり、これには、シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、アルファCCA、シナピン酸（SA）、3-ヒドロキシピコリン酸（HPA）、IAA（Na+ ）、2-(4-ヒドロキシフェニルアゾ)安息香酸 HABA（Na+）、ジスラノール（Na+）、レチノイン酸（Na+）、コハク酸、2,6-ジヒドロキシアセトフェノン、フェルラ酸、コーヒー酸、グリセロール及び4-ニトロアニリンが挙げられる。好ましくは、マトリクスは等電点電気泳動後の乾燥サンプルに添加される。別法として、あるいはさらに加えて、マトリクスが等電点電気泳動時にも存在するようにサンプルに添加してもよい。
【０１０９】
他の選択も可能であるが、ほとんどのMALDI技術での典型的な照射エネルギーは約20 mJ cm-2であり、窒素レーザ（337 nm）又は、周波数が355 nmに三重化又は266 nmに四重化されるQ-スイッチネオジム：イットリウム-アルミニウム-ガーネット（Nd-YAG）レーザを使用する。長い波長ほど容易に吸収されないため、タンパク質研究には好都合である。
【０１１０】
磁場型及び四重極型の質量分析計の動作は、イオン化したサンプルの流れを真空管に沿って静電場又は磁場に向けて加速し、静電場又は磁場によって粒子を運動量又は質量-電荷比（m/z）に基づいて屈折又は濾過することである。MS検出器の良い概説はBrunee（1987, International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, 76: 125-237）に見ることができる。
【０１１１】
飛行時間質量分析（TOF MS）では、イオン化された分析物分子及び断片は、静電場中で加速されると、共通の運動エネルギーを得る。初期の運動エネルギーがすべてのイオンにおいて同一であれば、軽いイオンほど速く移動し、同一の運動量を有する重いイオンほど遅く移動する。イオン化された粒子は飛行時間管の一端から入るが、この管には一般に自由飛行用の長い中空の管があり、他方の端でイオンが検出器に到達するとその数が飛行時間に応じて記録される。すべてのイオンが同一の電荷を有すると仮定すると、最も軽いイオンが最初に検出器に到達し、最も重いものが最後に到達する。全体の質量スペクトルは一般にイオン流動対時間として１秒を要せずに記録される。
【０１１２】
TOFを作動させるには、イオン源からイオンが離れる時点を精密に制御し規定しなければならない。これまでMALDIイオン化技術は四重極イオン型及び磁場型の質量分析計に連結してきたが、最近は飛行時間管との組み合わせが最も一般的である。その理由は、イオン化が起こると自動的に開始パルスが時計に提供されるからである。短時間のレーザパルスがあると、TOF MSに対するMALDIの対応は格別好適になる。一般に飛行管の長さは2メートルあるので、飛行時間は〜100 msとなり、これはナノ秒のレーザパルスより何千倍も長い。
【０１１３】
一般にTOF機器での質量範囲は、使用する検出器の技術によって制約される。m/zの高いイオンは非常に遅く移動することになり、通常の検出器では非常に不十分にしか検出されない。GSG Analytical Instrumentsの未来型MALDI-TOF分光計のような機器では、MALDI-TOFの質量範囲は1,000, 000 Da以上に拡がっている。この理由は高m/z粒子をより効率的に捕捉する二段階検出器及び分解能を増大させる高速（1GHz）デジタイザの支援による。したがって、このような機器は本明細書に記載の方法及び装置での高分子量物質の検出に使用するのに好ましい。
【０１１４】
最も単純なTOF機器の形状は直線状であり、検出器は飛行管の末端に設置される；これは現在入手可能なMALDI-TOF機器の典型的な構成である。
【０１１５】
サンプルの脱離とイオン化の間に、分析物粒子は、加速プロセスによって与えられたエネルギー及び小さいが変わり易い運動エネルギーにより、タンパク質マトリクスの共結晶表面から離れることができる。この運動エネルギーが変わり易いために、その効果として特定分析物断片の質量対電荷比はある小さい時間範囲にわたって「不鮮明化」し、信号対雑音比が減少し、分析物バンドが広くなる。しかしこれは2つの方法で大部分排除される。第一はタイムラグ収束ないし遅延抽出であり、すなわち、新たに形成されたイオンを低電圧（一般に1 keV程度）パルスによりタンパク質マトリクスの共結晶表面に引き付けて置き、次に主要加速パルス（一般に20-30 keV）をかける。ほとんどの機器は現在この構成要素を組み込んでいる。タイムラグ収束ないし遅延抽出については、W.C. Wiley, I.H. McLaren, Review of Scientific Instruments, 26: 1150-7, 1955及びB. Spengler, R.J. Cotter, "Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 Daltons by pulsed ion extraction time of flight analysis," Analytical Chemistry, 62: 793-6, 1990にさらに詳細に記載されている。
【０１１６】
イオンバンドを収束させる第二の方法は、飛行管の末端にリフレクトロンを加え、検出器（群）を移動してTOFの配置を変更することである。リフレクトロン又は「イオン鏡」は、一連の静電場と磁場からなり、制御された方式でイオンを収集し、方向転換させる。すなわち、特定のm/zを共有するイオンがリフレクトロン鏡に近づくと減速し、収束してより密な小さい束になるが、次いではじかれ、ある角度で飛行管の第二ステージの末端にある検出器へ向かうか、あるいは同じ管を逆戻りしてイオン源付近に設置された検出器へ向かう。多数の適用例では、リフレクトロンに基づくTOF管によるシグナルは、初期運動エネルギーの相違による効果を減少させることにより切れ味が鋭くなる。
【０１１７】
リフレクトロンは効率的にTOFの自由飛行経路を--ほぼ二倍に--増加させるため、分解能を増大し、したがって質量精度が上昇する。またリフレクトロン技術によって、イオンの分子構造の研究がポストソースディケイ法を介して可能になった。すなわち、イオン化された断片は飛行管中でさらに分解し、その二次産物により元のイオンの構造に関する追加情報が得られる。ポストソースディケイ法での検出から得られる情報は直列型MS（MS/MS）によって得られる情報と類似しており、この場合、イオンは質量分析計を通過後に意図的に再断片化され、この二次断片化産物を第二の質量分析計で検査する。
【０１１８】
リフレクトロンに基づくMALDI-TOF機器の例には、ComstockのRTOF-260機器があり、これは同社LTOF-160のリフレクトロンに基づくバージョンである。PerSeptive Biosystems (PE Biosystemsの一部門)はVoyager DE（登録商標）ワークステーション、4700 TOF/TOF及びVoyager DE-PROを提供している。
【０１１９】
Micromass 及び KoreはそれぞれTofSpec-2E及びR-500 TOF MSを生産している。Micromass 製のM@LDIもまた使用可能である。
【０１２０】
Bruker Daltonicsが提供するいくつかのリフレクトロンシステムには、高性能研究用のカスタマイズ可能なREFLEX IIIシステム及びBIFLEX IIIシステム、Autoflex及びUltraflexが含まれ、これらもまた使用可能である。
【０１２１】
リフレクトロンに基づく機器、例えば、島津グループの会社であるKratos Analytical製 Kompact DISCOVERY及びKompact SEQもまた使用可能である。Kratosのリフレクトロンは、段又は層をなした直線状の磁場ではなく、曲線状の磁場を組み込んだ設計である。通常のイオン反射の配置では、多数のポストソースディケイイオンが「時間-収束からはずれ」、これにより失われる。ほとんどの機器は約10パーセントの範囲のポストソースディケイ粒子しか収集できず、種々の収集ポイントでの反復実験を必要とする。しかし曲線状の磁場によりラスタリングやスキャンニングをしなくても1レーザパルスから全範囲のポストソースディケイ産物を収集することができるので、連続実験からデータを収集する必要はない。島津はまた、AXIMA-CFR-plus及びAXIMA-QITを生産している。
【０１２２】
マルチサンプルを標的にする方式はユーザにとってますます重要になっており、多数の会社がその提供を開始している。例えば、Thermo BioAnalysisの一部門であるBioMolecular Instrumentsは最近、Dynamoを導入し、これは高度に自動化され、サンプルを直接モニタリングするため、イオン化チャンバーにビデオカメラが組み込まれている。Bruker REFLEX III及びBIFLEX IIIの両機器はBrukerのSCOUT 384自動化サンプラーとの統合を提供する。SCOUT 384は、標準マイクロタイタープレート形式及び4 mm精度の X-Yポジショナーを使用して、1,536個までのサンプルに由来のデータを自動取得する。
【０１２３】
MALDI-TOF分析計以外の他のMALDI質量分析計が使用可能であることは理解される。例えば、FTMS （Fourier Transform Mass Spectrometers）もまた使用可能であり、あるいは本明細書中に記載のモジュールと組み合わせることができる。
【０１２４】
［具体的な実施形態］
以後、添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態を説明するが、ここでは終始同じ数字は同じ要素を表す。本明細書に提示の説明中で使用する用語は、その合理的に最も広義に解釈されるものとする。この解釈は本発明のある具体的な好ましい実施形態の詳細な説明と組み合わせて用いる場合も同じである。このことは本明細書で使用するいくつかの特別用語に関して以下にさらに強調される。読者が何か限定的に解釈したいとする用語は、本明細書でそのように明確にかつ具体的に規定する。
【０１２５】
図１Ａ及び１Ｂは、第一の実施形態であって一個の微小通路を有する等電点電気泳動モジュールを示す。モジュールには、一般に平面形状の基板1があり、これはポリ(メチルメタクリレート)（PMMA）又はポリカーボネートで作られている。基板1には90 mm x 30 mm x 3 mmの寸法を有する一片のPMMAプレートが挙げられる。通路2は、この実施形態では開放通路であり、これは基板から刻まれ、構築され、あるいはエッチングされる。液槽3及び4は基板から機械加工され、これらは通路の両端に配置され、電解質（陽極液及び陰極液）を保持している。液槽3、4はアガロース栓31によって開放通路から離れている。アガロース栓は液槽及び通路の境界に配置され、これにより電解質溶液と通路内容物（典型的には分離すべきサンプル、以下参照）の間の電気伝導性が維持されている。しかし、通路内容物と液槽との間の混合はアガロース栓の存在によって防止されている。混合はまた、ゲル栓、例えばアクリルアミドゲル栓又は寒天ゲル栓又は任意の他の適当なゲル栓であって、混合を防止するが電気を伝導するものを使用して防止してもよい。混合は、例えばグリセロールを添加してサンプルの粘性を増大させることによって防止してもよい。別法では、あるいはサンプルの粘性を増大させる上に更に、電解質、又は陽極液及び陰極液の一方又は両者の粘性を増大させてもよい。例えばメチルセルロースをその電解質又は各電解質（群）に添加してもよい。
【０１２６】
混合の程度が最小であれば、アガロース又はゲルの栓の存在は随意であることが理解される。例えば、通路が液槽と合流する領域に更に狭いプロファイルがあればよい；この狭い部分によって対流は実質的に減少し、したがって通路と液槽の成分間の混合は減少する。
【０１２７】
図４Ａ〜図４Ｃは、第二の実施形態であって複数の通路2を有する等電点電気泳動モジュールを示す。この実施形態の各通路は、単一通路の実施形態について上に記載したと同様に作成することができる。好ましい実施形態では、通路は互いに平行、又は実質的に平行である。通路はそれぞれ、自身に連結された個別の液槽3、4を有してよく、あるいは好ましくは、通路は、すべての通路が共有する共通の液槽3、4と両端で連結していてもよい。上記のように、各通路には好ましくは両端にアガロースゲル又は栓があり、液槽の電解質内容物との混合を減少しているのが好ましい。
【０１２８】
通路又は微小通路2の形状又はプロファイルは種々可能である；実際、等電点電気泳動を促進し、一方の端が開放している任意のプロファイルを使用してよい。個々の通路プロファイルの例は、図２Ａ〜図２Ｄに示される。すなわち、通路2は、底が平らで壁が真直ぐなので、平らなU型である（図２Ａ）。通路２は、プロファイルが曲線状又は弓状又は凸状で壁が真直ぐ、したがって典型的なU型（図２Ｂ）であってもよい。また通路2は、壁が曲線状で底面が真直ぐ（図２Ｃ）、あるいは壁が実質的に曲線状で、曲線状の「V」型（図２Ｄ）であってもよい。真直ぐな壁を有する図２Ｄのプロファイルの変形、すなわち真直ぐな「V」型を用いてもよい。これらの各ケースでは、通路は基板1から刻まれ、エッチングされ、あるいは彫られてよい。図４Ｂは、第二の実施形態の装置におけるモジュールのプロファイルを示し、基板1上に複数の通路2が示されている。
【０１２９】
上記第一及び第二の実施形態では、液槽3、4は通路と同じ基板上に提供されており、すなわちこれらは「シス配置で」提供されている。
【０１３０】
しかし、モジュール又は装置の別の実施形態では、液槽は通路と同一の基板上に位置しない。むしろ、これらは別の蓋又は遮蔽板（cover plate）7上に提供されており、それは第三の実施形態に関する図５Ａ〜図５Ｃに示される。図５Ｂ及び図５Ｃからわかるように、分離した遮蔽板又は蓋7に液槽3、4が保持されている。液槽3及び4は管状のコンパートメントとして提供されてよく、これに電解質を収納することができる。これらの形状は、例えば円錐形又は円錐末端を有する円柱形であってもよい。図５Ａ〜図５Ｃに示される実施形態では、電解質液槽はマイクロピペットから加工され、約10μmのとがった先端がある。図５Ｃ、図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、これらは遮蔽板に結合している。このような実施形態では、液槽3、4は「トランス配置で」提供されていると言うことができる。
【０１３１】
このマイクロピペットの先端にはアガロースゲルの薄層が充填されており、電解質とサンプルの混合を防止する一方、イオンが接合部を介して移動するのを可能にしている。図５Ｃ、図６Ａ及び図６Ｂからわかるように、液槽3、4の遠位部分は蓋7を横切って伸びており、蓋を基板1上に設置すると、通路2の対応する端に嵌合する。この目的のために蓋7上には適当なサイズの孔が適切な位置に開けられており、それによって液槽3、4が所定の位置に保持される。
【０１３２】
蓋又は遮蔽板7及び基板1にはさらに、ガイド手段71が含まれていてよく、図５Ａ、図５Ｂ、図７Ａ及び図７Ｂに示されるように蓋7がベース又は基板1にかぶさるように誘導する。このガイド手段は例えば蓋7及び基板1上の合わせ印でもよく、あるいは好ましくは、物理的ガイド手段、例えば杭と穴の配置、さねと溝の配置、等であってもよい。好ましくは、蓋7に穴71があり、ベース又は基板1には杭又は支柱71がある（あるいはその逆でもよい）。ガイド手段により、基板と蓋の正確な配列が可能になり、通路及び凹部がそれらの正しい位置に嵌合し、電解質液槽の出口が通路に配向される。好ましくは、ガイド手段71は蓋及び基板上に非対称に配置されており、その結果これら二つは一つの方向でのみ嵌合可能となる。
【０１３３】
遮蔽板7は、好ましくは完全に平らではなく、特に通路又は通路群と接する点では平らではない。この理由は、遮蔽板が完全に平らであると、微小通路2中のサンプルは遮蔽板に接触し、通路から二つの板のすき間に毛細管作用により拡散するからである。したがって、好ましい実施形態では、蓋又は遮蔽板7には一つ以上の溝又は凹部8、好ましくは存在する通路と同数の凹部が一表面（すなわち蓋が設置されている場合には微小通路に接する表面）上にある。この溝又は凹部、又は各溝又は凹部は、蓋を第一の平面部材に合わせたときに、通路内のサンプルが実質的に漏出しないように配置される。好ましくは、凹部又は凹部（群）の長さ及び幅は、第一の平面部材の一通路又は各通路と大きさが少なくとも同じである。溝は微小通路に対応する反対側の遮蔽板上に機械加工してよく、サンプルがすき間から拡散するのを防止する。遮蔽板7上の凹部8の配置は、図６Ａ（蓋は開放してある）及び図６Ｂ（蓋は閉じている）に示してある。
【０１３４】
図７Ａ〜図７Ｃは第四の実施形態の等電点電気泳動モジュールを示し、これは通路2が複数あることを除き、第三の実施形態と同一である。この実施形態の各通路は、単一通路の実施形態に関して上に記載したと同じに加工してよい。好ましい実施形態では、通路は互いに平行、又は実質的に平行である。通路用の液槽3、4は、上記のように、別の蓋又は遮蔽板7上に配置される。各液槽には、好ましくは、アガロースゲル又は栓があり、液槽の電解質内容物と通路の内容物との間の混合を防止又は減少させる。蓋7上の複数の液槽3、4及び凹部又は溝8の配置を示すプロファイルは、複数の通路2がある基板1とともに図８Ａ（蓋は開放してある）及び図８Ｂ（蓋は閉じている）に示してある。
【０１３５】
第三及び第四の実施形態での蓋の使用は、これにより通路又は通路群中のサンプルの蒸発が減少するので有利である。蒸発が特に問題となる理由は、通路内のサンプルは容量は小さいのに表面領域は大きいからである。蓋はサンプル上の雰囲気を湿性に維持し、乾固を防止する。さらに、カバーが存在することにより、二酸化炭素が空気からサンプル中に溶解し、確立しているpH勾配を乱すことも防止される。
【０１３６】
しかし、カバーの存在が絶対に必要なわけではなく、他の手段を使用して乾燥及びpHの乱れを制御してもよいことは理解される。例えば、開放通路を有する実施形態一及び二での等電点電気泳動は、制御された雰囲気、特に蒸発を促進しない湿度（すなわち高い湿度-高い相対湿度）の雰囲気中で行ってよい。すなわち、湿度制御チャンバーを用いてよい。さらにまた、制御する雰囲気から二酸化炭素を除去してもよい。この目的のために、単純な気密チャンバーを用いてよく；このチャンバーは二酸化炭素除去剤、例えばアルカリ金属の水酸化物（NaOH 、KOH）又はアルカリ金属の水酸化物（Ca (OH)2）、又は他の化学物質、例えばNaCO3、等を含有してよい。このチャンバーは、高い湿度を維持するために、噴霧器又は、単に水源を含んでいてもよい。
【０１３７】
さらにまた、別法として、蒸発は減少するために、例えば冷却によってサンプル中の溶媒の蒸気圧を減少してもよい。この目的のために、モジュール又は基板の温度、又はその周囲の温度を減少させてよい。この目的で、カートリッジ又はモジュールを氷浴に浸しておいたアルミニウムブロックに取り付ける。温度はまたカートリッジ又はモジュールを熱電性冷却器上に取り付けることによって制御可能である。
【０１３８】
モジュールでの等電点電気泳動に当たり、陽極液及び陰極液は液槽内に導入される。  1.5%メチルセルロース中の100 mM水酸化カリウムが陰極液として用いられ、1.5%メチルセルロース中の 50 mMリン酸が陽極液として用いられる。サンプル、例えば細胞抽出物のようなタンパク質含有サンプルを通路内に導入する。このモジュール及び装置は、細胞、組織、又は器官サンプル中のタンパク質の分離及び分析のために特に有用であるため、このような細胞性サンプル中のタンパク質の分離に基づいて以下の説明をする。
【０１３９】
サンプル中には、当分野に既知で上に記載した担体両性電解質が含有されていてよい。次に約500V〜5kVの電圧を液槽3及び4内に導入してある電極を介して通路2にかける。この目的のために、モジュール又は装置には電源（示していない）があってもよく、これにより二点、好ましくは電極3、4間に電位を発生させることができる。電源は、好ましくはDC電源であり、これは電気泳動装置での使用に関して当分野では既知である。例には、BioRad製の PowerPac Basic電源、PowerPac 3000電源、PowerPac 1000 電源、PowerPac 200 電源及びPowerPac 300電源が挙げられるが、これらに限定されない。他の適した電源には、Thermo EC（Thermo Savant/Thermo EC Holbrook, NY, United States）製のEC105 電源、EC135-90 電源、EC250-90 電源、EC4000P 昇温型高電圧電源、 EC570-90 電源、EC600-90 高電圧電源、EC6000-90高電圧電源、EC PRO6000 電源、EC1000-90 電源が挙げられる。
【０１４０】
電源は電線を用いて電極3、4に連結することができる。電源にはさらに、制御手段が含まれていてよく、これにより操作者は種々のパラメータを制御することができる。例えば制御手段により、操作者は電位差（電圧）を変更することができる。制御手段により電流、例えば通路を流れる電流の調節を可能にしてもよい。電圧及び電流の制御は、それによってジュール加熱量（電圧x電流）の調節が可能になるので有利である。
【０１４１】
上に詳細に記載したように、通路に沿って電圧をかけることにより、通路に沿ってpH勾配が形成される。次いで分子、タンパク質又はサンプルの他の成分が通路に沿って移動し、それぞれのpI点に応じた点で集束する。すなわち、成分の等電点での分離及び集束が通路に沿って起こる。
【０１４２】
電圧は、集束を可能にするのに適当な時間、例えば約5分かける。集束電流が低下して一定値になったら、タンパク質が狭いゾーンに集束したと判断される。続いて、毛細管通路に沿って架けている電圧を次第に増大させると、集束ゾーンは密になる。複数の通路を含むモジュールを使用（例えば上記実施形態二及び四）すると、多数の異なるサンプルを同時に処理することができるので、有利である。また、タンパク質の移動及び集束は適当な染色を利用してモニターしてもよい。
【０１４３】
タンパク質を分離した後は、サンプルを乾燥し、このサンプルの分離成分、例えばタンパク質を、それらが集束した地点で保持する。サンプル中の溶媒を除去する適当な手段を使用してもよく、例えば温空気、好ましくは乾燥空気の流れをモジュールに加える。またこの目的で、凍結乾燥、真空乾燥又は冷凍乾燥を使用してもよい。通路に沿って電圧を架すと、ジュール熱が生じるので溶媒の蒸発に使用してもよい。通路は開放されているので、「凍結した」タンパク質にはそのままの位置でアクセスすることができ、次いで任意の適当な手段によって分析してよい。好ましい実施形態では、質量分析技術、例えばMALDI-TOFを用いてタンパク質を分析する。この目的で、上に記載のように、MALDIマトリクスをサンプルに添加してよい。別法では、通路で乾燥した集束タンパク質に対してこれを適用してもよい。
【０１４４】
等電点電気泳動モジュールは、MALDI-MSの実行前に、種々の手段によって電気伝導性の薄膜又は層で被覆してもよいし、しなくてもよい。伝導性の被覆は、金属性又は伝導性の層の真空蒸着、又は層状の伝導性材料の塗装、又は伝導性接着テープの使用、又は他の方法によって達成してよい。ただし好ましい実施形態では、等電点電気泳動モジュールには伝導性被膜を全く被覆しない。
【０１４５】
次いで等電点電気泳動モジュール（例えば通路を含む基板）を、MALDI操作用の標準MALDIプレートに取り付ける。すなわちカートリッジを、MALDIイオン化源の並進台、例えばX-Y並進台に取り付ければよい。等電点電気泳動モジュールをMALDIプレート上に直接取り付けてもよく、あるいは等電点電気泳動微小通路をMALDIプレート上に直接加工してもよく、あるいはアダプタをMALDIプレート上に加工してそれに等電点電気泳動モジュールを取り付けてもよい。図３は（及び図４Ｃもまた）、平面の基板及び通路を含むモジュールの横断面を示しているが、台又はアダプタ5上に取り付けられている。アダプタ5はまた、図１０に描写されている。次いで、MALDIレーザ6の焦点を通路又は微小通路の中心に合わせ、レーザ6を横切るようにMALDIプレートをゆっくり移動する。この間レーザビーム6は通路の中心位置に保たれる。並進台を移動して、開放通路全体を連続的にレーザの焦点スポットに持って行ってもよい。MALDIレーザ6によってタンパク質をイオン化し、上に詳細に記載したように、飛行時間（TOF）又は他の手段を用いて分析する。MALDI源由来のタンパク質分子のイオンは、タンパク質の同定のために、ポストソースディケイ又は衝突活性化解離によって断片化してもよい。
【０１４６】
非常に好ましい実施形態では、開放通路中のタンパク質サンプルは、平行方式で分離するのが好ましく、この場合、複数の微小通路をカートリッジ上に構築する。このような実施形態は第二及び第四の実施形態であり、これは図４Ａ〜図４Ｃ及び図７Ａ〜図７Ｃに示してある。
【０１４７】
平行CIEF分離の所要時間は5分未満が可能である。第二次元でのタンパク質の検出には、MSイオン化源領域中のレーザ焦点上で通路を走査することが必要である。MALDIイオン化に関して通路をどれくらい高速で移動させることができるかは、脱離／イオン化レーザの繰り返し速度に依存する。MALDIで通常使用される窒素レーザは、10-20 Hzで正常に作動する。しかし、ダイオード-ポンプ固体レーザは数kHzの繰り返し速度で作動可能であり、したがって好ましい。すなわち、このような好ましい実施形態では、このようなレーザを用いて通路全体を完全に走査するには数分以内で完了することができる。我々の装置を用いればpI点と分子量によるタンパク質の分離及び特徴化が高処理かつ高感度で達成されるので、臨床応用に当たってのサンプル消費は最小となる。
【０１４８】
タンパク質のイオン化プロセスは、不純物及び塩により大きく抑制される可能性がある。MALDI-MS分析前に開放通路CIEFによってサンプル各成分を分離しておけば、他のサンプル成分が同一スポットに存在することによるシグナル抑制の可能性は小さくなる。架けた電場の影響でイオンは分離通路の外へ移動してしまうので、サンプル中の塩（カチオン及びアニオン）の効果は小さくなる。レーザの焦点を小さいスポットにすると、高い空間的分解能が得られるので、僅か数マイクロメートル程度のサンプルでも分析することができる。したがって、毛細管等電点電気泳動によるタンパク質の高分解能分離は、レーザ脱離／イオン化による第二次元分離にそのまま持ち越すことができる。本明細書に記載の開放通路CIEF-MALDIでは、集束したタンパク質が狭い通路内の小さなスポット上に濃縮されるため、高い感度を呈することが期待される
【０１４９】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに説明するが、これは例示のためにすぎない。
【実施例】
【０１５０】
［実施例１．材料及び試薬］
ポリ(メチルメタクリレート)（PMMA）は地元の供給元（Swees Engineering Co. (PTE) Ltd.）から購入する。ミオグロビン、グリセロール、ファーマライト（pharmalyte）、メチルセルロースはSigma Chemicalsから注文する。すべての他の化学物質はAldrich Chemicalsから入手する。すべての溶液はNanopure水システムによって精製された水を用いて調製する。白金線はFine Metal Cropによって供給される。
【０１５１】
［実施例２．開放微小通路の作成］
PMMAプレート片、横90 mm、縦30 mm及び厚さ3 mmを原料のプラスチックプレートからカットする。直径0.005インチ及び0. 007インチの白金線を用いて、プラスチック基板に通路を刻む。末端をワイヤの張力弓にクランプすることにより長さ約150 mmの白金線を伸ばしてぴんと張る。PMMA及びガラスプレートでこの白金線をサンドイッチし、これを二つのアルミニウムブロックの間に共にクランプする。クランプをきつく締めてアルミニウムブロックに圧力を架けながら、白金線に電流を通してこれを赤熱する。組立物を完全に冷却したら、クランプを解放し、白金線をプラスチックから引き出すと通路が現れる。
【０１５２】
一つの設計では、通路の末端に電解質液槽用の穴を開ける。別の設計では、遮蔽板を用いて電気泳動中の開放微小通路をすっかり覆い、蒸発及びサンプル溶液への二酸化炭素吸収を最小にする。遮蔽板は、標準的な機械加工法を用いてPMMAから加工した。
【０１５３】
［実施例３．開放通路毛細管等電点電気泳動］
ミオグロビンを本方法の開発用モデルタンパク質として用いるが、これはミオグロビンが褐色系の色を有し、ヒトの眼で検出可能であるからである。0.02μg/μlミオグロビン、1% Pharmalyte 3-10の濃度でサンプルを調製する。マイクロピペットにより約5μlのサンプルを開放微小通路に投入する。サンプルは毛細管作用により微小通路内に一様に拡がる。
【０１５４】
1.5%メチルセルロース中の100 mM水酸化カリウムを陰極液として用い、1.5%メチルセルロース中の50 mMリン酸を陽極液として用いる。メチルセルロースは電解質の粘性を大きく増大する。図１〜図４及び図５〜図８に示されるように、等電点電気泳動では二つの異なる設計を用いる。
【０１５５】
第一の設計（例えば図４を参照のこと）では、開放微小通路の末端の二つの液槽に電解質をそれぞれ充填する。微小通路中のサンプルと液槽中の電解質は、液槽と微小通路の境界に配置したアガロースゲルによって分離されている。電解質及びアガロースゲルの高い粘性により、電気泳動中にサンプルが電解質と混合するのを防止する一方、アガロースゲルを介するイオンの通過は可能にしておく。電気接触用に白金線を液槽に装着する。
【０１５６】
第二の設計（例えば図７を参照のこと）では、微小通路を遮蔽板ですっかり覆い、電解質液槽を加工マイクロピペットで作成する。図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、マイクロピペットを保持するように遮蔽板に二つの穴を開け、マイクロピペットを遮蔽板に装着する。
【０１５７】
マイクロピペットの先端は直径約10μmであり、微小通路に向かって下向きに配向する。マイクロピペットの先端にアガロースゲルの薄層を充填し、電解質及びサンプルの混合を防止する一方、接合部を介するイオンの移動は可能にしておく。マイクロピペットから作成した液槽に粘性の高い陰極液及び陽極液を充填する。電流を電解質溶液に浸された白金線を介して通す。
【０１５８】
通路を通過する電流に応じて、電圧を、初めの500 Vから電気泳動の最終段階では5 kVに変化させる。電気泳動の進行はNikon D-100デジタルカメラを用いて写真を記録してモニターする。
【０１５９】
図９は、0.007インチ幅（175マイクロメートル）のPMMA開放通路内でのミオグロビンのIEFの進行を示す。この写真はデジタルカメラを用いて記録したものである。集束電流が一定値に低下するので、タンパク質が狭いゾーンに集束したのが判る。その後、微小通路にかける電圧を次第に増大させて、集束ゾーンを緊密にする。さらに、ジュール加熱を増大させ、微小通路内の溶媒を蒸発させ、次に電圧負荷を終了すると、集束した乾燥タンパク質が移動しなくなる。
【０１６０】
より簡便なのは「開放系」で電気泳動を実行することであり、この場合、基本的にカートリッジは大気に開放される。しかし、いくつかの実験では、カートリッジを取り巻く雰囲気、特に湿度及び二酸化炭素濃度を制御することが有利であることを我々は発見した。環境を制御しなければ、サンプルは乾固する可能性がある。さらに、空気中の二酸化炭素が徐々にサンプル溶液中に溶解する可能性があり、これはpH勾配を乱し、おそらく分離の分解能を減少させる。サンプルを長時間空気中に放置すると、サンプル中に溶解する二酸化炭素の量は高くなり、pH勾配は完全に崩壊する筈である。また、使用する環境の湿度及びCO2を制御することに加えて、適切な緩衝液を使用して外部要因のpH効果を小さくすることもできる。
【０１６１】
これらの実験では、我々は制御した環境中に開放毛細管通路を有するPMMAカートリッジを設置し、「閉鎖系」を作成した。このように制御した環境では、湿度（相対湿度）及び二酸化炭素の量を具体的に制御することができる。「開放」環境での分離は満足なものであったが、我々は湿度を制御し及び二酸化炭素を含まない雰囲気を用いると結果は更に良好となることを知った。
【０１６２】
［実施例４．MALDI-MSへの連結］
MALDI-MS実験は、線形モードで作動するBruker Daltonics Autoflex MALDI飛行時間質量分析計（TOF-MS）で行う。
【０１６３】
図３、図４Ｃ、図５Ｃ、図７Ｃ及び図１０に示されるように、アダプタを加工してプラスチックCIEFカートリッジを標準Bruker MALDIサンプルプレート上に固定する。1%酢酸を含むアセトニトリル中の飽和シナピン酸を微小通路内の乾燥サンプルの上に添加する。マトリクスをいくつかの少量にわけて徐々に微小通路に加え、集束ゾーンの劣化及び広がりを防ぐ。
【０１６４】
次いで溶媒を室温で空気に露出することにより蒸発させる。アセトニトリルの蒸気圧は非常に低いので、空気への露出により溶媒を蒸発させることができる。
【０１６５】
溶媒の蒸発後、カートリッジを標準Bruker Daltonics MALDIプレート上のアダプタに載せる（図１０）。遅延イオン抽出を伴うMALDIを、337 nm波長で作動する通常の窒素レーザを用いて実行する。MALDIレーザの焦点を微小通路の中心に合わせ、レーザを横切るようにMALDIプレートをゆっくり動かし、この間レーザを微小通路の中心に保つ。
【０１６６】
図１１に示されるように、PMMA通路の集束ゾーン由来のミオグロビンシグナルには、標準ステンレス鋼MALDIプレートに直接投入したサンプルに匹敵する分解能及び感受性がある。担体両性電解質はミオグロビンのイオン化に影響しなかった。
【０１６７】
別法として、少量のグリセロール（1-2%）をサンプルに混合した後に、微小通路内に載置してもよい。タンパク質濃度がそのpI点付近で増大したときにタンパク質が沈殿するのをグリセロールによって防止することができる。等電点電気泳動後、冷凍乾燥によるか、あるいはジュール加熱用の印加電圧を増大することによって溶媒を蒸発させることができる。蒸気圧の低いグリセロール、担体両性電解質及びタンパク質は通路内に留まり、その後、グリセロールは良好なIR MALDIマトリクスであるから、IR MALDI-MS用のIRレーザを照射すればタンパク質をイオン化することができる（Siegel, M.M., Tabei, K., Kunz, A., Hollander, I.J., Hamann, P.R., Bell, D.H, Berkenkamp, S., Hillenkamp, F., Anal. Chem. 1997, 69, 2716-2726）。
【０１６８】
［実施例5．肝タンパク質の分離］
以下のプロトコルを用いてブタ肝臓からタンパク質を抽出する。ブタ肝臓を2倍容量の脱イオン水と混合し、ブレンダーを用いてホモジナイズする。超音波処理器を用いて細胞を溶解する。この混合物を遠心分離し、上清を脱イオン水で二回希釈し、さらに精製せずに開放通路CIEF用に用いる。開放通路CIEFは基本的には実施例３に記載のように実行し、MALDI分離は基本的に実施例４に記載のように実行してよい。
【０１６９】
ブタ肝タンパク質の開放通路CIEFの結果は図１２ＡA及び図１２Ｂに示される。図１２Ｂは図１２Ａの拡大部分を示す。分離されたタンパク質を表す三つの褐色スポットが定規の位置8付近に観察され、これは矢印で示される。定規の位置により、通路の具体的に対応する領域の概算pIが判る；すなわち、本明細中に記載の方法及びモジュール／装置により、複合肝臓抽出物から類似のあるいは接近したpI値を有する三つの可視タンパク質が分離されることがわかる。
【０１７０】
この三つのスポットは肝臓抽出物中に存在するタンパク質の三つのみを表し、これらは眼で視ることができるものである。言うまでもなく、肝臓抽出物は多数の他のタンパク質を含み、それらは本明細書に記載の等電点電気泳動モジュール及び方法によって分離されている。
【０１７１】
［他の態様］
図４Ａは本発明の一実施形態の上面図を示す。多数の開放微小毛細管通路（2）は基板（1）上にエッチング又は構築される。二つの電解質液槽（3及び4）はサンプル基板上にエッチング又は構築される。一方の液槽は微小毛細管通路の一端に接し、他方は微小毛細管通路の他端に接する。開放毛細管通路の二つの端はそれぞれ二つの液槽に、それらの境界にある狭い通路、半透膜又はゲルを介して連結されているが、サンプルと陽極液又は陰極液の混合は防止されている。液槽は陽極及び陰極の溶液用である。基板は任意の非伝導性材料、例えばポリマー、セラミック、ガラス、又は複合材料が可能である。図４Ｂは複数の開放微小毛細管通路（2）の横断面を示す。通路の横断面は長方形に限定されず、任意の形状が可能である。種々のタンパク質サンプルのそれぞれが固有の通路内に載置される。電位を陽極液と陰極液の間にかけると、タンパク質はこの電場の下で自身のpI点へ移動する。分離されたタンパク質は、開放通路の上でMALDIレーザを用いて直接イオン化できるので、このタンパク質を移動することはない。分離されたタンパク質を移動する代わりに、CIEFカートリッジ全体を並進台に載せ、この並進台の移動によりタンパク質をMALDIレーザスポットに持ってくる。結果として、CIEFを用いて達成可能な高い分解能は、検出プロセスの中にそのまま持ち越される。さらに、多数の開放毛細管通路はCIEFカートリッジ上で構築可能であり、その通路数は一定ではなく、カートリッジが保持可能な限り多数である。したがって高処理化に適用するために、多数のサンプルを平行に分離することができる。
【０１７２】
CIEF分離は担体両性電解質を用いて、あるいは用いずに、行うことができる。一実施形態では、pH勾配はいくつかの酸性及び塩基性の化合物を毛細管壁に固定することによって形成できる。MALDIマトリクス、例えばグリセロール（0-50%）は、CIEF分離前にタンパク質サンプルに添加される。この例では、グリセロールはタンパク質のイオン化用の赤外MALDIマトリクスとして働き、これはまた、集束ゾーンでのタンパク質の沈殿を防止し、電気浸透流を最小化する。CIEF分離後、CIEFカートリッジを急速冷却してサンプルを凍結することにより、分離ゾーンの移動を防止する。次いでこのカートリッジを真空チャンバーに入れ、サンプルを凍結乾燥し、すなわち氷を気化させる。MOC-CIEFカートリッジに残留するのは、蒸気圧の低い化合物、すなわち主に分離されたタンパク質及びMALDIマトリクス、例えばグリセロールである。このカートリッジは次いで、MALDIイオン化源の並進台に載せられる。図４Ｃは、MALDI源中のXY-並進台（5）上に取り付けられた複数の開放通路（2）毛細管等電点電気泳動カートリッジ（1）の横断面を示す。MALDIレーザの焦点が開放毛細管通路の一つのスポットに合わせられ、タンパク質がイオン化される。並進台は開放通路の全体がレーザ焦点スポットに連続的に照射されるように動かされる。これにより二次元のタンパク質分離及び分析が達成できる。MALDI源由来のタンパク質分子イオンは、タンパク質の同定のために、ポストソースディケイ又は衝突活性化解離によって断片化することができる。
【０１７３】
本明細書に記載の各出願及び特許、及び上記各出願及び特許中に引用又は参照される各文献、これは各出願及び特許の出願経過中のもの（「出願引用文献」）を含む、及び各出願及び特許中及び任意の出願引用文献中で引用又は記載されている任意の製品に関する任意の製造元の指示書又はカタログは、引用により本明細書中に編入される。さらにまた、このテキスト中で引用されるすべての文献、及びこのテキスト中で引用される文献中で引用又は参照されるすべての文献、及びこのテキスト中で引用又は記載される任意の製品に関する任意の製造元の指示書又はカタログは、引用により本明細書中に編入される。
【０１７４】
上記本発明の方法及びシステムの種々の修飾及び変更は、本発明の範囲及び思想から逸脱することなく、当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に結び付けて説明してきたが、特許請求されている発明はこのような特定実施形態に不当に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際、本発明を実施するために記載した実施形態の種々の改変例が、バイオ分析化学、又は分子生物学、又は関連分野の当業者には明らかであり、これらは特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】「シス配置の」（すなわち開放通路と同一基板上の）液槽を伴う単一の開放通路を含む、本明細書に記載の第一の実施形態の分離装置の平面図を示す図である。1：基板、2：開放通路、3及び4：陽極液槽及び陰極液槽（電解質液槽）、31：アガロースゲル栓。  図１Ｂは、図１Ａに示される分離装置の実施形態の長軸方向の断面を示す図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、  単一の開放通路を含む分離装置の実施形態の横軸方向の断面を示す図であり、開放通路の種々の形状が示されている。図２Ａは直線状の壁及び底面を有する通路を示す。図２Ｂは直線状の壁及び曲線状の底面を有する「U」型通路を示す。図２Ｃは曲線状の壁及び直線状の底面を有する「U」型通路を示す。図２Ｄは曲線状の壁及び曲線上の底面を有する「U」型通路を示す。
【図３】台上に取り付けられた、図１Ａに示される分離装置の実施形態の長軸方向の断面を示す図である。台は例えば、MALDI用XY-並進台を含んでよい。5：台、6：レーザビーム。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、一体化した液槽を伴う複数の開放通路を含む、本明細書中に記載の第二の実施形態の分離装置を示す図である。図４Ａは分離装置の平面図を示し、図４Ｂは分離装置の横軸方向の断面を示す。図４Ｃは台、例えばMALDI用XY-並進台に取り付けられた分離装置の長軸方向の断面を示す。符号1、2、3、31、4、5、6は図１Ａ及び図３の説明に記載される通りである。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、単一の開放通路及び「トランス配置の」（すなわち開放通路と同一の基板上にない）液槽を含む、本明細書中に記載の第三の実施形態の分離装置を示す図である。図５Ａ：蓋が外されている分離装置の平面図。図５Ｂ：蓋が置かれている装置の平面図。7：蓋、8：蓋の凹部、輪郭（破線）で示される。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、図５の第三の実施形態の液槽面に沿った横断面を示す図である。図６Ａ：開放状態の立体配置で、蓋は外されている。図６Ｂ：閉鎖状態の立体配置で、蓋は置かれている。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃは、複数の開放通路と液槽とを「トランス配置」で含み、液槽は開放通路とは別の板上にある、本明細書中に記載の第四の実施形態の分離装置を示す図である。図７Ａ：蓋が外されている分離装置の平面図。図７Ｂ：蓋で覆われている分離装置の平面図。蓋の凹部（8）は輪郭で示されている。
【図８】図８Ａと図８Ｂは、図７の第四の実施形態の液槽面に沿った横断面を示す図である。図８Ａ：開放状態の立体配置で、蓋は外されている。図８Ｂ：閉鎖状態の立体配置で、蓋は置かれている。
【図９】ミオグロビンの等電点電気泳動を示す複合写真である。一番上のレーン：t = 0、一番下のレーン：t = 実験の最後。矢印は時間方向を示す。
【図１０】MALDIサンプルプレートに連結するアダプタの上に取り付けられた分離装置を示す写真である。9：アダプタ。
【図１１】分離装置内の集束ゾーン由来のミオグロビンのMALDI TOF-MSを示すグラフである。X-軸：質量-荷電（m/z）比、Y-軸：強度。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、ブタの全肝臓のタンパク質の分離を示す写真である。図１２Ａ：目視可能な集束タンパク質（矢印）がある開放通路で、隣接する定規はスケールを示し、これの目的はpI値を概算することである。図１２Ｂ：図１２Ａの拡大図であり、矢印で示す約8cmの位置に三つの目視可能なタンパク質スポットが示されている。
【図１Ａ】
2005517954.tif 000003
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
2005517954.tif 000009
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2005517954.tif 000011
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2005517954.tif 000015
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2005517954.tif 000019
【図７Ｃ】
2005517954.tif 000020
【図８Ａ】
2005517954.tif 000021
【図８Ｂ】
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【図９】
2005517954.tif 000023
【図１０】
2005517954.tif 000024
【図１１】
2005517954.tif 000025
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2005517954.tif 000027
【国際調査報告】
2005517954.tif 000028
2005517954.tif 000029
2005517954.tif 000030
2005517954.tif 000031