(57)【要約】融合ペプチドにおいて、合成由来Ｔヘルパー・エピトープであるＰＡＤＲＥ、またはいくつかの破傷風ＴＨエピトープの１つを、ＣＭＶ−ｐｐ６５由来の免疫優性ＨＬＡ  Ａ＊０２０１拘束ＣＴＬエピトープに連結すると、ＨＬＡ  Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスにおいて、頑強な細胞傷害性細胞性免疫応答が引き起こされた。該融合ペプチドは、皮下経路または鼻内経路いずれかによって、生理食塩水溶液中で投与された際、免疫原性である。ＣｐＧ含有一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＯＤＮ）は、アジュバントとして融合ペプチドに添加された際、どちらの経路でも、免疫認識を劇的に上方制御した。ワクシニアウイルス由来の全長ｐｐ６５タンパク質を発現するか、またはワクチンにコードされるＣＴＬエピトープで感作された標的細胞は、免疫動物由来の脾臓エフェクターに認識された。ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮ（ＤＮＡアジュバント）と組み合わせたＴＨ−ＣＴＬエピトープ融合ペプチドは、安全でそして有効な方式の、非経口搬送または粘膜搬送のための有用な戦略に相当し、これは、特に非常に炎症性であるアジュバントが望ましくない、ＨＣＴのドナーまたはレシピエントのワクチン接種などの状況において、感染性疾患の管理または予防に適用可能性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＭＶ  ＣＴＬエピトープ・ペプチドに融合したＴヘルパー・エピトープで構成される融合ペプチドを含んでなる、サイトメガロウイルス・ワクチン。
【請求項２】
前記Ｔヘルパー・エピトープがＰＡＤＲＥである、請求項１のサイトメガロウイルス・ワクチン。
【請求項３】
前記Ｔヘルパー・エピトープが破傷風エピトープである、請求項１のサイトメガロウイルス・ワクチン。
【請求項４】
前記破傷風エピトープが、破傷風重鎖（５９０−６０３）、破傷風重鎖（６１５−６２９）、破傷風重鎖（６３９−６５２）、破傷風重鎖（８３０−８４３）、および破傷風重鎖（９４７−９６７）からなる群より選択される、請求項３のサイトメガロウイルス・ワクチン。
【請求項５】
前記ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＣＴＬエピトープ・ペプチドが、ｐｐ６５１３−２４、ｐｐ６５１８６−１９６、ｐｐ６５１８８−１９５、ｐｐ６５２６５−２７５、ｐｐ６５３６３−３７３、ｐｐ６５３６９−３７９、ｐｐ６５３６７−３７９、ｐｐ６５４９５−５０３およびｐｐ６５４１７−４２６からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかのサイトメガロウイルス・ワクチン。
【請求項６】
前記ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＣＴＬエピトープがｐｐ６５４９５−５０３である、請求項１〜５のいずれかのサイトメガロウイルス・ワクチン。
【請求項７】
ＤＮＡアジュバントをさらに含んでなる、請求項１のサイトメガロウイルス・ワクチン。
【請求項８】
前記ＤＮＡアジュバントが、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれかのサイトメガロウイルス・ワクチン。
【請求項９】
薬学的に許容しうるキャリアーをさらに含んでなる、請求項１のサイトメガロウイルス・ワクチン。
【請求項１０】
ＣＭＶ  ＣＴＬエピトープ・ペプチドに融合したＴヘルパー・エピトープを含んでなる融合ペプチド。
【請求項１１】
前記Ｔヘルパー・エピトープがＰＡＤＲＥである、請求項１０の融合ペプチド。
【請求項１２】
前記Ｔヘルパー・エピトープが破傷風エピトープである、請求項１０の融合ペプチド。
【請求項１３】
ＣＭＶに対して免疫系を修飾する必要がある哺乳動物の免疫系をＣＭＶに対して修飾するための医薬品製造における、請求項１〜８のいずれかのワクチンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］本出願は、米国仮出願第６０／３９１，０８８号、２００２年６月２５日出願の優先権を請求する。
政府の権利の言及
［０００２］本発明は、米国公衆衛生局から、助成金番号ＣＡ  ７７５４４、ＣＡ  ３０２０６−プロジェクト３、Ａ１  ４４３１３、およびＡ１  ４３２６７、ＳＡＩＣ下請契約＃２０ＸＳ１９２Ａのもとで、そしてシティー・オブ・ホープ癌センターへのＣｏｒｅ助成金（ＣＡ  ３３５７２）のもとで、政府の援助を受けて行った。米国国立衛生研究所、米国癌研究所（ＤＴＰ）もまた、本研究を援助した。米国政府は、本発明に一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
１．技術分野
［０００３］本発明は、一般的に、免疫学の分野、そして特にワクチンの分野に関する。本発明の態様にしたがった、アジュバント不含ペプチド・ワクチンは、ヒト・サイトメガロウイルスに対する免疫反応を修飾する。ワクチンは、アジュバントとともに投与可能であり、アジュバントは、好ましくはＤＮＡアジュバントである。
【０００３】
２．背景技術の説明
［０００４］研究者らは、実験モデル系において、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合するエピトープ選択の問題に取り組むため、クラスＩ系のＡ＊０２０１（Ａ２．１）、またはクラスＩＩ系のＤＲ１などのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）アレルを含有するトランスジェニックマウス開発に重点を置いてきた。Ｂｅｒｎｈａｒｄら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１５７−１１６２，１９９８；  Ｒｏｓｌｏｎｉｅｃら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１１３−１１２２，１９９７。これらのモデル系において、研究者らは、免疫学的にヒトと類似で、容易に操作される脊椎動物系において、ワクチンに対する細胞性免疫応答を研究しうる。ヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の免疫優性タンパク質、ＣＭＶ−ｐｐ６５に特異的なＣＴＬエピトープのレパートリーが性質決定されてきている。Ｗｉｌｌｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：７５６９−７５７９，１９９６；  Ｌｏｎｇｍａｔｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５２：１６５−１７３，２００１。ＣＭＶは、固形臓器移植レシピエント、造血細胞移植（ＨＣＴ）レシピエントおよびＨＩＶ患者における重要な日和見感染であり、そして胎児および幼児において、多くの先天的な問題を引き起こすが、ＣＭＶに対して米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が認可するワクチンはいまだにないままである。ＨＬＡ拘束ＣＴＬエピトープは、ワクチンとして有用であるが、これは、ＨＣＴレシピエントがＨＬＡ型決定されており、そしてしたがって、ＨＬＡ拘束エピトープに基づくワクチンに潜在的に応答するとして選択可能であるためである。さらに、ＣＭＶの再活性化およびウイルス血症は、ＨＣＴ後の最初の数ヶ月間、日常的に監視される。したがって、ＨＣＴレシピエントは、療法ワクチンの特性を調べる好適な機会に相当する。Ｎｉｃｈｏｌｓら，Ｂｌｏｏｄ  ９７：８６７−８７４，２００１；  Ｚａｉａら，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ３３９−３５５，２０００；  Ｋｒａｕｓｅら，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １９：１１１１−１１１６，１９９７。
【０００４】
［０００５］ＣＭＶ感染細胞は、感染初期および感染後期両方でｐｐ６５を発現するため、ｐｐ６５は適切なワクチン標的である。Ｇｒｅｆｔｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．  ７３：２９２３−２９３２，１９９２；  Ｒｉｄｄｅｌｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２７９５−２８０４，１９９１。ｐｐ６５ペプチドを取り込むワクチンは、臨床的設定において、ＣＭＶ感染に対して免疫する方法を提供する。ＣＭＶ−ｐｐ６５は、ＨＬＡ  Ａ２．１のヒト由来のＴ細胞、およびＨＬＡ  Ａ２．１導入遺伝子またはキメラ（ヒト／マウス）Ａ２．１／Ｋｂ導入遺伝子を含有するＨ−２ｂバックグラウンドのマウス由来のＴ細胞、どちらによっても認識されるＨＬＡ  Ａ２．１特異的エピトープを含有するため、このペプチド・エピトープ、ｐｐ６５４９５−５０３（配列番号１）がこれらの研究のモデル・クラスＩエピトープである。Ｗｉｌｌｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：７５６９−７５７９，１９９６；  Ｄｉａｍｏｎｄら，Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７５１−１７６７，１９９７；  ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０６：１１３−１２１，２００２。必要なＴＨエピトープに対するアレル特異性の必要性を回避するため、ヒトまたはネズミ・クラスＩＩ  ＭＨＣアレルいずれにも無差別に（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｌｙ）結合する一連のＴＨ配列が、ＣＭＶ−ｐｐ６５  ＨＬＡ  Ａ＊０２０１拘束エピトープと組み合わせて評価されてきている。Ｄｉａｍｏｎｄら，Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７５１−１７６７，１９９７；  ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：７６４−７７９，２０００。
【０００５】
［０００６］最近１０年で、研究者らは、実験ワクチン中、ＣＴＬエピトープまたはＴＨエピトープいずれかに相当するペプチドを搬送する多くの方法を研究してきた。例えば、ペプチドはアジュバント中で乳化されるか、ミョウバンに複合体化されるか、またはリポソーム中に懸濁されてきた。Ｈｉｏｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：４１２−４１８，１９９６；Ｍｏｒａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３６１６−３６２３，１９９８；  Ｐａｒｔｉｄｏｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２０６：１４３−１５１，１９９７。これらの搬送ビヒクルを用いて、マウスにおいて、ウイルス、細菌、および腫瘍抗原に対して、功を奏するエピトープ・ワクチン戦略が開発されてきている。Ｈａｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９４４８−９４５２，１９９１；  Ｓｈｉｒａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５４９−５５６，１９９４。しかし、これらの戦略は大部分、ヒトでの使用に適していない。
【０００６】
［０００７］脂質を用いたペプチドの一次構造修飾は、実験動物およびヒト両方で、広範に研究されてきている。Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３８３−１３９２，１９９７；  Ｍａｒｔｉｎｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３４１６−３４２２，１９９２。Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、ＨＩＶ、および腫瘍抗原に特異的なリポペプチド（脂質化ペプチド）が第１相試験および第２相試験で臨床的に研究されてきているが、穏やかな結果しか得られていない。Ｈｅａｔｈｃｏｔｅら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３０：５３１−５３６，１９９９；  Ｇａｈｅｒｙ−Ｓｅｇａｒｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１６９４−１７０３，２０００；  Ｓｅｔｈら，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  １６：３３７−３４３，２０００。ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した樹状細胞をペプチドに曝露すると、多くの非経口ワクチン接種措置よりも、より有効に細胞性免疫が刺激されることもまた、立証されてきている。Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：６４５１−６４５８，２００１；Ｌｕｄｗｉｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：３８１２−３８１８，１９９８。しかし、ワクチン接種用の安定な小分子製品ははるかにより単純で、そしてしたがって、細胞単離を必要とする方法よりも好ましい。
【０００７】
［０００８］アジュバント、特に油性であるか、またはミコバクテリウム構成要素を含有するアジュバントは、動物で使用可能であるが、多くの場合、ヒト使用には炎症性でありすぎる。大部分のワクチン・プロトコルは、抗原を身体部位に局在させ（「デポ効果」）、そして全身免疫応答経路を誘発する、アジュバントを使用する。フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）などの油性の炎症誘発性アジュバントは、免疫した動物において、潰瘍を引き起こしうる。当該分野には、いくつかのアジュバント組成物（例えば水酸化アルミニウム、リポソーム類またはスクアレン）が知られているが、これらは各々、広い適用可能性を制限する特徴または生化学的特性を有する（例えば刺激物）。実際、ヒト使用には、水酸化アルミニウムのみがＦＤＡに認可されている。したがって、アジュバントなしにワクチンを搬送する方法であって、アジュバントなしでもなお有効である方法が、非常に望ましいであろう。Ｆｒｅｙｔａｇら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３６：２１５−２３６，１９９９；Ｎｅｗｍａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１００１−１００７，１９９７；  Ｗｉｅｄｍａｎｎら，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４：２６５−２７１，１９９１；  Ｂｅｌｙａｋｏｖら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：１３２０−１３２６，２００１。
【０００８】
［０００９］理想的には、ワクチン接種プロトコルは、強い持続する免疫応答を安全に誘発可能でなければならない。さらに、敏感な組織または粘膜が関与するワクチン投与（例えば眼搬送または鼻内搬送）は、組織炎症を誘発するアジュバント（「炎症性アジュバント」）の使用を排除する可能性もある。現在、プロセシングされたＴ細胞エピトープを使用する、有効なＣＭＶワクチンは、入手可能でない。プラスミドＤＮＡワクチンは、大部分、有効でなく、そして生ウイルスは、深刻な安全性の懸念を有する。Ｋｒｉｅｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１２６３１−１２６３６，１９９８；  Ｂｏｙｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１：４７６−４８３，２０００；  Ｂｅｒｇｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７９９−８０８，２００１。
【０００９】
［０００１０］マウスおよび霊長類において、ＤＮＡ  ＣｐＧ  ＳＳ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）アジュバントを用いて、サブユニット・タンパク質ワクチンおよびペプチド・ワクチンの有効性を増進させる代替手段が、報告されてきている。しかし、いくつかの研究によって、ｓｓ−ＯＤＮ、特にＣｐＧモチーフを持つものは、ＴＨ１優性のものに対する免疫応答を歪めることが立証された。Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：８７０−８７６，１９９８；Ｈｏｍｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１５８４−１５９１，２００１。したがって、当該技術分野には、産生および投与が簡単で、アジュバントなしで、そして特に古典的な炎症性アジュバントなしで有効であり、そのうえ頑強な細胞傷害性応答を生じるワクチンに対する必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
［０００１１］したがって、本発明は、ワクチンとして有用なペプチド融合体に関する。これらの融合体は、ＣＭＶ  ＣＴＬエピトープに融合したＴヘルパー（ＴＨ）エピトープを含んでなり、そして異なる経路によって、例えば粘膜経路または皮下経路によって、単独で、または好ましくはＤＮＡアジュバントとともに、いずれかで、投与可能である。
【００１１】
［００１２］本発明の態様は、ＣＭＶ  ＣＴＬエピトープ・ペプチドに融合したＴヘルパー・エピトープで構成される融合ペプチドを含んでなるサイトメガロウイルス・ワクチンを提供する。さらなる態様は、上に論じるような、ＣＭＶ  ＣＴＬエピトープ・ペプチドに融合したＴヘルパー・エピトープを含んでなる融合ペプチド、およびＣＭＶに対する哺乳動物の免疫応答を修飾する方法であって、有効量のワクチンを投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
好ましい態様の詳細な説明
［００２４］本発明の態様は、免疫原性を増進する直接修飾ＣＭＶ抗原であって、アジュバントなしでさえ有効でありうる前記抗原を含む。修飾ペプチドにＤＮＡアジュバントを添加すると、免疫がさらに増進され、そしてまた、鼻内経路などの代替投薬経路も支持される。選択されるＣＴＬおよびＴＨエピトープを共有結合すると、脂質修飾を伴わなくても、有効な免疫原が生成される。これらの非常に可溶性である非脂質化融合ペプチドは、生理食塩水および少量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の溶液中、いかなる慣用経路によっても、例えば非経口経路または鼻内経路によっても投与可能である。ペプチド融合は、免疫原性増進を生じる；構成要素ＣＴＬおよびＴＨエピトープは、アジュバントなしで投与した場合は、単独では不活性である。
【００１３】
［００２５］公表された報告によって、まれな例を除いて、アジュバントまたは脂質化を伴わずにペプチドを皮下投与すると、最適以下の免疫しか誘導されないことが示唆される。Ｓａｕｚｅｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１３３９−１３４５，１９９５；  Ｓｃｈｉｌｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２６４９−２６５４，１９９１。ＰＡＤＲＥ  ＴＨエピトープ・ペプチドまたはＴｅｔ８３０−８４３  ＴＨエピトープ・ペプチドおよびｐｐ６５４９５−５０３  ＣＴＬエピトープ・ペプチドを、通常の（０．９％）生理食塩水中、別個のペプチドとして投与する場合、本明細書に用いるモデルにおいて、免疫応答を得るには、アジュバントが必要である。ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：７５４−７７９，２０００を参照されたい。
【００１４】
［００２６］免疫原性を増加させるため、本発明は、両方のエピトープが融合されて単一ペプチドを生成しているワクチンを提供する。評価される最初の融合ペプチド配列は、ＴＨエピトープＰＡＤＲＥおよびｐｐ６５４９５−５０３  ＣＴＬエピトープを含有し、表Ｉにおいて、Ｋ２５Ｖと称される。標準的アルゴリズムによって、Ｋ２５Ｖの有意な疎水性は膜会合を増進し、そして細胞性タンパク質分解経路に進入可能であることが示唆される。Ｔｓｕｎｏｄａら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １７６７５−６８５，１９９９を参照されたい。
【００１５】
［００２７］３つの代替ＴＨエピトープ各々を、ＣＭＶ−ｐｐ６５由来の免疫優性ＣＴＬエピトープ（ＨＬＡ  Ａ２．１）とともに融合させると、有効な融合ペプチド・ワクチンが産生され、この活性は、ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮアジュバントによって、さらに増大された。当該技術分野に知られるいかなるＴヘルパー・エピトープも、本発明で使用可能であり、例えばＢ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス−１、ＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＴヘルパー・エピトープ、または破傷風トキソイド重鎖由来の他のエピトープが使用可能であるが、表Ｉに示す、３つの典型的なエピトープが好ましい。他の好適なＴヘルパー・エピトープには、破傷風重鎖由来の以下のペプチド：５９０−６０３、６１５−６２９、６３９−６５２、８３０−８４３および９４７−９６７が含まれる。ＣＭＶ  ＣＴＬエピトープが当該技術分野に知られる。しかし、これらのいずれも本発明で使用可能であるが、以下のペプチド・エピトープ：Ａ＊１１０１（ｐｐ６５１３−２４）；Ｂ＊０７０２（ｐｐ６５４１７−４２６またはｐｐ６５２６５−２７５）；Ａ＊０１０１（ｐｐ６５３６３−３７３）；Ａ＊２４０２（ｐｐ６５３６９−３７９）；Ｂ＊３５０２（ｐｐ６５１８８−１９５）；ｐｐ６５１８６−１９６；およびｐｐ６５３６７−３７９が好ましい。ＣＭＶ  ＣＴＬエピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ｐｐ６５４９５−５０３；配列番号１）が最も好ましい。ＨＬＡ  Ａ＊１１０１／Ｋｂを発現するトランスジェニックマウスは、ＣＭＶ−ｐｐ６５由来のＨＬＡ  Ａ＊１１０１拘束エピトープ、およびＴＨエピトープ、ＰＡＤＲＥ、または破傷風由来ＴＨエピトープいずれかを組み合わせた融合ペプチドを認識した。
【００１６】
［００２８］融合ペプチドに対する応答は、ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮによって増大され、鼻内投与された場合、強力な全身性免疫応答を生じた。理論に縛られることは望ましくないが、粘膜投与はペプチドのプロセシングを促進すると考えられる。ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮは、いくつかの異なる種類の融合ペプチドと相乗的な応答を生じる。表Ｉは、３つの典型的な融合ペプチドの配列を提供する。融合ペプチド部分、ＰＡＤＲＥ、Ｔｅｔ８３０−８４３、Ｔｅｔ６３９−６５２およびＣＭＶ  ＣＴＬエピトープの考察に関しては、それぞれ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１−７６１，１９９４；  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１３８３−１３９２，１９７７；  Ｒｅｅｃｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６１７５−６１８４，１９９３；およびＬｏｎｇｍａｔｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５２：１６５−１７３，２００１を参照されたい。非ＣｐＧ型ＤＮＡアジュバントは、これらのアッセイにおいて、ペプチド単独のものを最小限に越える、さらなるＣＴＬ刺激能しか持たなかった。ｐｐ６５４９５−５０３エピトープ特異的ＣＤ８リンパ球に結合するＨＬＡ四量体試薬を用いて、融合ペプチドおよびＤＮＡアジュバントでの免疫後、刺激されたＣＴＬの数を測定することも可能である。クロム遊離アッセイによって測定される細胞傷害活性は、エピトープ特異的ＨＬＡ四量体試薬によって検出されるＣＤ８リンパ球の絶対頻度と相関しうる。この種の免疫応答解析を用いて、ＨＬＴまたは固形臓器移植などの臨床適用において、ペプチド・ワクチンが免疫系を刺激する能力を評価可能である。
【００１７】
表Ｉ．  ＣＭＶワクチン・ペプチドの一次構造（Ｘ＝シクロヘキシルアラニン）
【００１８】
【表１】
2005535627.tif 000002
【００１９】
［００２９］ＨＣＴレシピエント用の療法ＣＭＶワクチンは、再構成期（免疫不適格（ｉｍｍｕｎｏ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）の時間枠）中のＣＭＶ免疫を修飾して、ＣＭＶ疾患を発展させるリスクの増加と戦うよう機能する。本発明の背景において、ＣＭＶに対する免疫応答の修飾は、１以上のＣＭＶエピトープに対する細胞性応答および／または体液性応答（そして好ましくは両方）の強度を変化させることを意味する。したがって、有効量のワクチンは、問題の抗原に対する免疫応答を修飾する量である。用語、免疫原性は、したがって、その物質に対する免疫応答を修飾可能な物質を指す。ワクチンの背景において、ＣＴＬ記憶の永続性が重要である。免疫適格トランスジェニックマウスにおいて、６ヵ月後、Ｋ２５Ｖ（表Ｉ）を含んでなる二脂質化ワクチンに対する元来の応答レベルの５０％が検出された（データ未提示）。最近の証拠によって、ＣＭＶ抗原血症が、ＣＭＶ特異的ＣＴＬの頻度を後押しする（ＨＬＡ四量体によって監視した際）ことが示唆される。Ｔ−ヘルプ応答の延長は、ＣＭＶ特異的ＣＴＬの維持と関連する。Ｇｒａｔａｍａら，  Ｂｌｏｏｄ  ９８：１３５８−１３６４，２００１；  Ｃｗｙｎａｒｓｋｉら，Ｂｌｏｏｄ  ９７：１２３２−１２４０，２００１；  Ｗａｌｔｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３：１０３８−１０４４，１９９５；  Ｅｉｎｓｅｌｅら，Ｂｌｏｏｄ  ９９：３９１６−３９２２，２００２。ＣＭＶに感染した患者と対照的に、トランスジェニックマウスは、応答を維持する抗原供給源を持たず、したがってヒトをペプチド免疫した後には、さらに長続きする応答が生じうるであろう。本発明の融合ペプチドに対するＣＤ４応答は、該融合ペプチドをリコール抗原として用いた際、かなりの度合いである（Ｓ．Ｉ．＞１０）。連結したＴＨおよびＣＴＬエピトープは、強力な抗原である。非コグネイト（ｎｏｎ−ｃｏｇｎａｔｅ）ＣＤ４  ＴＨもまた、ＣＭＶ特異的ＣＴＬを維持する際に好適であるかどうかは、以前には決定されていない。
【００２０】
［００３０］非修飾全長ｐｐ６５は、エピトープ特異的ネズミＣＴＬに効率的に認識されなかったため、ｐｐ６５を修飾して、分解を増進した。プロセシングされた最小ペプチド（例えばｐｐ６５４９５−５０３）が提供された際に、Ｔ２  ＴＡＰ陰性標的がよく認識されるため、外見上、抗原プロセシングＴＡＰ陽性抗原提示細胞に関連する輸送体は、十分なＣＴＬエピトープを生成しない。これは、非修飾全長タンパク質のプロセシングが不十分である結果であるか、または内因性ＭＨＣクラスＩ分子に比較して、トランスジェニックマウス細胞上に見られる細胞表面ＨＬＡ  Ａ２．１が１０倍少ない結果である可能性もある。
【００２１】
［００３１］Ｎ末端アルギニン残基置換とカップリングさせたｐｐ６５のユビキチン化（Ｕｂ−Ｒ−修飾）は、タンパク質のＴ１／２を２０分未満に減少させ、このＴ１／２変化は、５０倍以上である非修飾ｐｐ６５に比較される。これはＵｂ−Ｒ−ｐｐ６５Ｖａｃに感染させた標的が、融合ペプチドで免疫後、ネズミＣＴＬに認識されるのに十分なコグネイトＣＴＬエピトープを提示する、より高い能力を有することを説明可能である。さらに、ｐｐ６５を認識する、５つの異なるハプロタイプのヒトＣＴＬクローンは、非修飾ｐｐ６５Ｖａｃに比較して、Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５Ｖａｃに感染させた場合、より効率的に標的を溶解した。
【００２２】
［００３２］この報告は、臨床設定において、皮下免疫または粘膜（例えば鼻内）免疫が実行可能であることを示す。ペプチドおよびＣｐＧ  ＤＮＡがどちらも、特に他の油性アジュバントまたはミコバクテリウムに基づくアジュバントに比較して、限定された毒性しか持たないため、ＨＣＴドナーなどの個体は、これらの調製物を用いた免疫を容易に許容して、移植前に、ＣＭＶ−ｐｐ６５特異的記憶ＣＴＬ応答を増幅する。成熟Ｔ細胞の通常の「混入」がある、免疫ドナー由来のＴ細胞が豊富な骨髄を注入すると、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞が提供される（養子免疫療法）。しかし、レシピエントにおいて、幹細胞または骨髄いずれかとともに移植したドナーＴ細胞が、ＣＭＶ疾患に対して保護する長さは測定されておらず、特に移植片対宿主疾患のステロイド治療の背景においては測定されていない。抗ウイルス化学療法の副作用が排除されるであろうため、ガンシクロビル予防法および／または療法の代用ワクチン接種は、ＨＣＴまたは臓器移植後の生存を改善しうる。ガンシクロビルの免疫抑制特性によって引き起こされる免疫再構成の遅延が排除されるであろうため、後期ＣＭＶ疾患の発生率もまた減少しうる。
【００２３】
［００３３］ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮは、融合ペプチドの活性をさらに増大させ、免疫中に投与する量を低下させつつ、有効性を維持する、安全な手段を提供する。該配合物を用いた際に予期される副作用は限定されているため、健康な成人、小児、固形臓器移植または造血移植いずれかのレシピエント、あるいは他のリスクにある個体に、該融合ペプチドをワクチン接種可能である。初回ワクチン接種に適したワクチン・ペプチド用量は、約５０μｇ〜約１００ｍｇ、そして好ましくは約１ｍｇ〜約２５ｍｇである。追加免疫は、望ましい場合、同じ用量またはより低い用量で投与可能であり、そして一般的に、約２〜約８週、または好ましくは約４週の間隔で投与される。１〜４回の間のいずれかの追加免疫が投与可能である。
【００２４】
［００３４］ワクチンは薬学業に知られるいかなる方式でも配合可能であり、アジュバントを含まない配合が含まれるが、好ましくはＤＮＡアジュバントを含有する。好ましいＤＮＡアジュバントは、その開示が本明細書に援用される、Ｋｒｅｉｇら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：１５−２４，２００１およびＫｒｉｅｇ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：７０９−７６０，２００２に記載されるようなＣｐＧモチーフを含有する。他のＤＮＡアジュバントもまた使用可能であり、例えばメチル化ＣｐＧモチーフを含有しない細菌ＤＮＡおよび他の有機体ＤＮＡが使用可能である。最も好ましいのは、ホスホロチオエート置換を有する合成ＤＮＡ型であるが、ホスホジエステル連結もまた可能であり、しかし多くの状況においては、ホスホジエステル連結は、分解に対して、より安定でない。好ましいＤＮＡアジュバントには、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号８；ＣｐＧ  ＯＤＮ  １８２６）、５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴ−３’（配列番号９；ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６）、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ７９０９、５’−ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１０；ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２２１６）が含まれ、いずれの合成ＤＮＡ配列も、１８〜２５ヌクレオチド配列中、１〜１０ヌクレオチド離れ、そして少なくとも２回反復する、２以上のＣｐＧモチーフを含有し、該配列は、好ましくはホスホロチオエート連結、または最小限のホスホジエステル連結を含有する。アゴニストとしてＴｏｌｌ様受容体９と相互作用するＣｐＧ  ＤＮＡ配列はいずれも、好ましい配列である。
【００２５】
［００３５］ワクチン配合物には、好ましくは、用いる投与経路に適した、薬学的に許容しうるキャリアーが含まれる。使用可能なキャリアーの例には、生理食塩水、少量のＤＭＳＯ（例えば３０％以下）を含む生理食塩水、水、適合しうる油またはリン酸緩衝生理食塩水、熱ショックタンパク質、並びに抗原提示細胞または樹状細胞に抗原が取り込まれるのを可能にする、抗原のデポ効果を促進する、タンパク質部分または脂質部分が含まれる。こうした配合物は、当該技術分野に周知であり、そして投与経路に応じて修飾可能であり、投与経路には、粘膜経路（例えば鼻内経路、頬側経路、直腸経路、膣経路、舌下経路等）、経皮経路、皮下経路、皮内経路、腹腔内経路、筋内経路、または既知の方法いずれかが含まれうる。
【００２６】
［００３６］本発明の態様は、例えばＨＣＴの背景において、ＣＭＶ感染に対する療法ワクチンの合理的アプローチを遂行するペプチド構造および搬送機構の精緻化を提供する。適切にマッチし、そして造血幹細胞移植の候補として臨床的に許容しうるドナーは、レシピエントへの幹細胞注入を開始する５週間前、３週間前、および１週間前に、ＣｐＧ  ＤＮＡを伴い、または伴わず、融合ペプチド・ワクチンを３回注射されるであろう。移植ドナーは、しばしば、幹細胞の量を増加させるため、顆粒球−コロニー刺激因子を投与される；しかし、我々は、この処置がＴ細胞レパートリーに影響を及ぼさないことを見出した。体重７０ｋｇのレシピエントは、幹細胞注入の一部として、０．５７〜５．７ｘ１０８  ＣＭＶ特異的Ｔ細胞を投与されると予期しうる。レシピエントは、一般的に、第２８日に追加免疫として、移植後に１回注射を投与される。ＣＭＶ血液感染および疾患とともに、処置に関連する罹患率およびＣＭＶ特異的細胞性免疫応答の他の徴候に関して、レシピエントを追跡する。ガンシクロビルで治療されていない個体は、ガンシクロビル療法を必要とするのに十分なＣＭＶウイルス血症を発展させていないため、ワクチンが功を奏したと見なす。
【００２７】
［００３７］表Ｉに示すｐｐ６５４９５−５０３ペプチドを用いたヒトＰＢＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の結果によって、ｐｐ６５４９５−５０３が、先にＣＭＶに曝露された個体由来の細胞において、ＣＴＬ前駆体（ＣＴＬｐ）記憶応答を刺激することが確認される。Ｄｉａｍｏｎｄら，Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７５１−１７６７，１９９７；  Ｌａ  Ｒｏｓａら，Ｂｌｏｏｄ  ９７：１７７６−１７８６，２００１；  Ｖｉｌｌａｃｒｅｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８４：２５６−２６７，２００１を参照されたい。トランスジェニックＨＬＡ  Ａ２．１マウスモデルを評価して、先にウイルスに曝露されていなくても、ペプチドが新規にＣＴＬｐを刺激することもまた可能であるかどうかを試験した。ＩＦＡ中のＰＡＤＲＥ  ＴＨエピトープで同時免疫されていたトランスジェニックマウスは、ｐｐ６５４９５−５０３  ＣＴＬエピトープに対して向けられる、頑強なＣＴＬ応答を示した。Ｄｉａｍｏｎｄら，Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７５１−１７６７，１９９７；  Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１−７６１，１９９４。
【００２８】
［００３８］これらの研究で用いた、ネズミ相同体でヒトα３ドメインを置換することによって修飾したＨＬＡ導入遺伝子（Ａ２／Ｋｂ）を発現するマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を用いて、これらの結果が確認された。ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：７６４−７７９，２０００を参照されたい。ｐｐ６５４９５−５０３特異的ＣＴＬ刺激は、フロイントの不完全アジュバントなどのアジュバントと組み合わせた、ＴＨペプチド同時免疫に依存するが、破傷風由来のものまたはＰＡＤＲＥを含む、いくつかの異なるＴＨエピトープが同等によく働く。ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：７６４−７７９，２０００。
【００２９】
［００３９］トランスジェニックＨＬＡ  Ａ２．１／Ｋｂマウスにおける抗原プロセシングがまた、全長タンパク質の背景においても、ｐｐ６５４９５−５０３エピトープの認識を可能にするかどうかを示すことが残っていた。ＣＭＶ特異的Ｔ細胞クローンによるヒト抗原提示細胞の認識を引き起こすことが先に示されている、組換えＣＭＶ  ｐｐ６５（ｐｐ６５Ｖａｃ）を発現するワクシニアウイルスに、トランスジェニックマウスを感染させた。Ｄｉａｍｏｎｄら，  Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７５１−１７６７，１９９７。感染マウス由来の脾臓細胞は、ＣＴＬエピトープ、ｐｐ６５４９５−５０３でパルス処理したヒトＴ２標的細胞を認識した（データ未提示）。Ｌｏｎｇｍａｔｅら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５２：１６５−１７３，２００１を参照されたい。したがって、ｐｐ６５特異的ＣＴＬエピトープは、全長ｐｐ６５タンパク質の内因性プロセシングによって、トランスジェニックマウスにおいて、特異的に認識される。このトランスジェニックマウスモデルは、当該技術分野において、臨床設定のヒトにおける結果を予測する結果を提供するとよく認識されている。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
免疫原構築
［００４０］Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ４３２（米国カリフォルニア州フォスターシティー）装置を用いた標準的固相Ｆ−Ｍｏｃ法によって、ｐｐ６５４９５−５０３（配列番号１）、ＰＡＤＲＥ  ＴＨエピトープおよび破傷風（Ｔｅｔ）ＴＨエピトープ（ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：７６４−７７９，２０００およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１−７６１，１９９４、どちらの開示も本明細書に援用される）を調製した。既知の方法にしたがって、標準的ＨＰＬＣ法によってペプチドを精製し（９０％以上）、そしてマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）（Ｋｒａｔｏｓ、ニューヨーク州チェスナッツリッジ）によって、ペプチドの分子量を確認した。Ｌａ  Ｒｏｓａら，  Ｂｌｏｏｄ  ９７：１７７６−１７８６，２００１を参照されたい。介入開発への迅速アクセス（Ｒａｐｉｄ  Ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＲＡＩＤ））プログラム（ＤＴＰ、ＮＣＩ）の援助のもと、９０％以上の純度で、Ｋ２５Ｖ、ＰＡＭ−Ｋ２５Ｖ、ジＰＡＭ−Ｋ２５Ｖ、およびＫＴｅｔ８３０Ｖ（表Ｉ）が入手可能となった。Ｔｅｔ６３９Ｖ（配列番号７）は、Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州ラホヤ）に合成された。フロイントの不完全アジュバントを、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【００３１】
［００４１］先に記載された（Ｌｉｐｆｏｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２３４０−２３４４，１９９７；Ｋｒｉｅｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９，１９９５）、２つのＣｐＧモチーフ（下線）を含有する免疫刺激性合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）１８２６（５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ３’；配列番号８）は、Ａｌｐｈａ  ＤＮＡ（カナダ・ケベック州モントリオール）によって、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート主鎖を持つように合成された。ＯＤＮのナトリウム塩を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、５ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、そして５０μｌアリコットとして−２０℃で保存した。注射前に、生理食塩水で、ＤＮＡアジュバントを希釈した。
【００３２】
（実施例２）
組換えワクシニアウイルス構築物
［００４２］ヒト・ユビキチン（Ｕｂ）遺伝子（ＴｏｂｅｒｙおよびＳｉｌｉｃｉａｎｏ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：９０９−９２０，１９９７）を、以下のプライマー対：５’プライマーＡ：ＣＡＧＴＣＡＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＣＣ（配列番号１１）および３’プライマーＢ：ＧＧＡＣＡＡＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＴＡＣＣＣＣＣＣＣＴＣＡＡＧＣＧＣＡＧＧＡＣ（配列番号１２）を用いて増幅した。ＨＣＭＶ（ＡＤ１６９）ｐｐ６５遺伝子を、以下のプライマー対：５’プライマーＣ：ＧＴＣＣＴＧＣＧＣＴＴＧＡＧＧＧＧＧＧＧＴＡＧＧＧＡＧＴＣＧＣＧＣＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＴＣＣ（配列番号１３）および３’プライマーＤ：ＣＣＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＧＧＧＣＧＴＣ（配列番号１４）を用いて増幅した。プライマーＢおよびＣは、互いに相補的であるのみでなく、ｐｐ６５のアミノ末端で、メチオニン（ＡＴＧ）と交換してアルギニン・コドン（ＡＧＧ）を含有するように設計した。プライマー対ＡおよびＤを用いたＰＣＲによって、Ｕｂ遺伝子（２７１ｂｐ）およびＨＣＭＶ  ｐｐ６５遺伝子ＰＣＲ産物（１６８０ｂｐ）をともに融合させて、Ｕｂ−（Ｒ）−ｐｐ６５融合遺伝子を生成した。ＰＣＲ反応条件は、９４℃５分間が１周期；９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間が５周期、その後、９４℃１分間、６０℃１分間および７２℃４分間が２０周期であった。生じた１９２６ｂｐ  Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５融合遺伝子産物をゲル精製し、そしてＮｈｅＩ部位およびＫｐｎＩ部位を用いてｐＳＣ１１挿入プラスミドにクローニングして、Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５−ｐＳＣ１１を生成した。Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３４０３−３４０９，１９８５。制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定によって、構築物を確認した。Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５−ｐＳＣ１１プラスミドをＶＶ感染Ｈｕ  ＴＫ−細胞にトランスフェクションすることによって、Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５組換えワクシニアウイルス（Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５Ｖａｃ）を生成した。既知の方法にしたがって、β−ガラクトシダーゼに対する基質（ＢｌｕｏｇａｌＴＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の有色反応およびＢｒｄＵに対する耐性によって、Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５Ｖａｃを３周期分、同時にスクリーニングし、そして選択した。Ｄｉａｍｏｎｄら，Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７５１−１７６７，１９９７。先に記載されるようなウェスタンブロットによって、ｐｐ６５の発現を検出した。Ｙａｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１６２８−１６３５，２００１を参照されたい。
【００３３】
（実施例３）
Ｋ２５Ｖ融合ペプチドの用量反応性
［００４３］本研究全体で用いたＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスは、標準的な病原体不含条件下で飼育され、そして維持された。ＢＢ７．２モノクローナル抗体を用いて、個々のマウス由来の脾臓細胞をフローサイトメトリー解析することによって、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂ分子の発現を日常的に確認した。ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄら，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：７６４−７７９，２０００を参照されたい。
【００３４】
［００４４］６週〜９週齢のトランスジェニックマウス群を、ｓｓ−ＯＤＮを伴い合成ペプチドで、またはｓｓ−ＯＤＮを伴わずに合成ペプチドで、あるいはワクシニアウイルスで免疫した。１ｍｌツベルクリン・シリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．、米国ニュージャージー州フランクリンレークス）を用いて、皮下経路へ向けて、尾の付け根に麻酔なしで、ＤＭＳＯを含む生理食塩水溶液１００μｌ体積中、ワクシニアウイルス（１０７ｐｆｕ）または合成ペプチドを注射した。鼻内投与のため、処置前に、３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内ケタミン／キシラジン・カクテル（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で、マウスを麻酔した。生理食塩水溶液中、ｓｓ−ＯＤＮを伴う、または伴わない合成ペプチド、総量３０μｌ（１５μｌ／鼻孔）を、ピペットを用いて投与した。いくつかの場合、トランスジェニックマウスを、同じ合成ペプチド／ＤＮＡの組み合わせで、２週間後に追加免疫した。
【００３５】
［００４５］免疫１２日後、脾臓を無菌的に取り除き、そして既知の方法にしたがって、無菌ナイロンメッシュを通じて、臓器を漉す（ｔｅａｓｉｎｇ）ことによって、脾臓単細胞懸濁物を産生した。適切なＣＭＶ−ＣＴＬエピトープを装填した同系抗原提示細胞で１回または２回、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで脾臓細胞を刺激した。Ｄｉａｍｏｎｄらの方法（Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７５１−１７６７，１９９７）を以下のように修飾した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激用の刺激因子細胞は、２ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で、２５μｇ／ｍｌリポ多糖（Ｓｉｇｍａ）および７μｇ／ｍｌ硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を用いて、３日間前処理した、同系未処置（ｎａｉｖｅ）脾臓細胞であった。Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：６７１−６７８，１９９７を参照されたい。リポ多糖芽細胞（２５ｘ１０６細胞／１００μｌ）を、３７℃  ５％  ＣＯ２インキュベーター中で４時間、ＣＭＶ  ＣＴＬエピトープ融合ペプチド１００μＭで刺激した。免疫したマウスの各群から脾臓をプールし、そして１０％  Ｔ−ＳｔｉｍＴＭ培養補助剤（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を含有する２ｍｌ培地中、脾臓懸濁物（３ｘ１０６細胞）を、１０６  γ照射（２４００ｒａｄ、Ｉｓｏｍｅｄｉｘ  Ｍｏｄｅｌ  １９  Ｇａｍｍａｔｏｒ、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｃａｎａｄａ、ニュージャージー州パーシッパニー）したペプチド装填芽細胞と７〜８日間、共培養した。
【００３６】
［００４６］いくつかの異なるペプチド濃度で、９９％生理食塩水／１．０％  ＤＭＳＯ（ＮＳＤ）中、Ｋ２５Ｖをトランスジェニックマウスに皮下投与することによって、用量−反応を研究した。結果を図１に示す。Ｋ２５Ｖを９０％生理食塩水／１０％  ＤＭＳＯに５ｍＭで溶解し、そして生理食塩水中で希釈して、図１のＸ軸に示したペプチド量を搬送した。トランスジェニックＨＬＡ  Ａ２．１／Ｋｂ（Ｎ＝６（１５０ｎｍｏｌ）、１４（１００ｎｍｏｌ）、８（５０ｎｍｏｌ）、および２（１０ｎｍｏｌおよび２５ｎｍｏｌ））マウスを、ペプチドで、そしてさらなるアジュバントなしで、尾の付け根に１回皮下免疫した。２週間後、脾臓を採取し、そして上述のように、脾臓細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。標的は、特異的ペプチド（ｐｐ６５４９５−５０３、黒塗り記号）および非特異的ペプチド（ｐ５３１４９−１５７、白抜き記号）を装填したＴ２細胞であった。評価したマウスすべてで、各エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）の平均および標準誤差を計算し、そして有意なｐ値を示す。ＣＴＬ活性は、１０〜１５０ナノモルの間で、用量依存的な方式で減少した（対照ペプチドに比較してｐ＜０．００１）。対照的に、ＴＨエピトープおよびＣＴＬエピトープの混合物での免疫は、融合ペプチドと同じ条件下で注射した際、不活性であった（データ未提示）。
【００３７】
（実施例４）
クロム遊離アッセイ
［００４７］１回または２回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後、標準的な４時間クロム遊離アッセイによって、細胞培養物の細胞傷害活性を測定した。ＨＬＡ  Ａ２．１／Ｋｂマウスにおけるペプチド特異的応答を測定するため、Ｔ２細胞（ＴＡＰ不全ヒト細胞株、ＷｅｉおよびＣｒｅｓｓｗｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：４４３−４４６，１９９２を参照されたい）を、１０μＭの適切なペプチド、または同等の濃度の関連しない対照合成配列で、１時間パルス処理した。公表されるプロトコルにしたがって、感染効率３のワクシニアウイルスに一晩感染させた、Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ  Ａ２．１トランスフェクタント（Ｄｉａｍｏｎｄら，Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７５１−１７６７，１９９７）またはＨＬＡ  Ａ２．１（Ｌａ  Ｒｏｓａら，Ｂｌｏｏｄ  ９７：１７７６−１７８６，２００１）ＥＢＶ−ＬＣＬ、いずれかを用いて、ウイルスにコードされるＣＭＶ  ｐｐ６５の認識を評価した。３７℃水槽中、標的細胞を２００μＣｉのＮａ５１ＣｒＯ４（ＩＣＮ、カリフォルニア州コスタメサ）で１時間標識し、徹底的に洗浄し、そして２０００標的細胞／ウェルの濃度で９６ウェル丸底プレートに蒔いた。Ｌａ  Ｒｏｓａら，Ｂｌｏｏｄ  ９７：１７７６−１７８６，２００１に記載されるように、Ｃｏｂｒａ  ＩＩＴＭオートγカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ、米国イリノイ州ダウナーズグローブ）を用いて、上清の放射能を測定し、そして特異的溶解パーセントを決定した。測定は３つ組で行い、そしてアッセイデータは、自発的な遊離が＜３０％であった場合のみ、考慮の対象とした。実験測定の平均および標準偏差が、平均の＜１５％であった場合、結果を報告した。スチューデントＴ検定を用い、ＳｉｇｍａＰｌｏｔＴＭおよびＳｉｇｍａＳｔａｔＴＭソフトウェア（ＳＰＳＳ、イリノイ州シカゴ）を用いて、非特異的ペプチドに対して、特異的ペプチドを用いたＣＴＬ活性の比較、あるいはアッセイ内の異なる条件の比較を行った。０．０５以下のＰ値を有意と見なした。
【００３８】
（実施例５）
融合ペプチド免疫後のγ−ＩＦＮ検出
［００４８］ＩＦＮ−γ遊離は、ワクチンまたはワクチン候補に刺激されたＴＨ１応答の信頼しうる指標である。トランスジェニックＨＬＡ  Ａ２／Ｋｂマウスを１００ｎｍｏｌのＫ２５Ｖで免疫した。１回または２回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後、脾臓細胞培養物の上清中のＩＦＮ−γ遊離を定量化した。既知の方法を用いたＥＬＩＳＡによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した培養上清中のＩＦＮ−γ分泌を測定した。対の捕捉モノクローナル抗体（抗−ＩＦＮ−γ  Ｒ４−６Ａ２）および検出モノクローナル抗体（抗ＩＦＮ−γビオチン化ＸＭＧ１．２）を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴから得た。Ｖｉｌｌａｃｒｅｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８４：２５６−２６７，２００１を参照されたい。トランスジェニックマウスに、実施例３に記載するようなＫ２５Ｖ融合ペプチド１００ｎｍｏｌをワクチン接種し、そして２週間後、さらに１００ｎｍｏｌの同一ペプチドで追加免疫した。２週間後、マウス（Ｎ＝８）を屠殺し、脾臓を取り除き、そして１回（黒塗りの円）または２回（白抜きのひし形）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激し、その後、実施例４に記載するようにクロム遊離アッセイを行った。細胞傷害性の結果を図２Ａに提示する。
【００３９】
［００４９］値は、ペプチド感作Ｔ２細胞の特異的（ｐｐ６５４９５−５０３）細胞傷害性から非特異的（ｐ５３１４９−１５７）細胞傷害性を減じたものに相当する。１回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、穏やかなＩＦＮ−γ遊離およびそれに対応する細胞傷害性を生じ（図２Ｂ）、一方、２回目のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激は、ＩＦＮ−γシグナルおよび細胞傷害性を劇的に改善した。図２Ａ、２Ｂを参照されたい。したがって、Ｋ２５Ｖ融合ペプチドは、最小限のＤＭＳＯを含む生理食塩水中で、好ましい可溶性および活性特性を有する。
【００４０】
［００５０］上述のように免疫したマウス由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激培養物（黒塗りの円、１回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激；白抜きのひし形、２回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激）から培地のアリコット（２００μｌ）を、示した時点で抜き取り、そしてＥＬＩＳＡによって、未希釈液由来のＩＦＮ−γタンパク質を測定した。組換えＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、標準曲線を準備した。各試料を２つ組で試験した。ＩＦＮ−γタンパク質標準（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、アッセイの検出限界は、７０ｐｇ／ｍｌと確立された。
【００４１】
（実施例６）
細胞蛍光解析
［００５１］ＮＩＡＩＤ四量体コア施設（ｗｗｗ．ｅｍｏｒ．ｅｄｕ／ＷＨＳＣ／ＴＥＴＲＡＭＥＲ）に用いられる方法に些細な修飾を加えて、ＨＬＡ−Ａ２  ＣＭＶｐｐ６５４９５−５０３四量体試薬を再フォールディングし、そして精製した。ベクターｐＨＮ１にクローニングしたＨＬＡ−Ａ２重鎖およびベータ−２−ミクログロブリン（β１、Ｍ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＡ９０で発現し、そしてＣＭＶ  ｐｐ６５４９５−５０３  ＣＴＬエピトープとともに再フォールディングした。Ｖｉｌｌａｃｒｅｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８４：２５６−２６７，２００１を参照されたい。酵素ＢｉｒＡ（Ａｖｉｄｉｔｙ  Ｉｎｃ．、米国コロラド州デンバー）を用いて、再フォールディングしたＨＬＡ−Ａ２／β１Ｍ／ペプチド複合体をビオチン化し、そしてその後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００ゲルろ過カラムを、そしてその後ＭｏｎｏＱイオン交換カラムを用いる、ＦＰＬＣクロマトグラフィーによって精製した。精製したビオチン化ＨＬＡ−Ａ２／β１Ｍ／ペプチド複合体を、ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に、またはストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州ユージーン）にコンジュゲート化した。典型的には、５０〜１００μｌ体積のＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中、５０万〜１００万の細胞を染色するのに、０．５μｇの四量体を用いて、標識を２０分間行った。その後、細胞を洗浄し、そしてＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメーター（米国ニュージャージー州フランクリンレークス）上で解析した。前方散乱および側方散乱に基づいてリンパ球ゲートを設定し、そして最低３０，０００のゲート化事象を捕捉した。四分類（ｑｕａｄｒａｎｔｓ）は陰性対照に基づいて設定した。四量体陽性細胞の数を総リンパ球集団の割合として表した。
【００４２】
（実施例７）
ＣｐＧ  ｓｓＯＤＮを伴う融合ペプチドの免疫原性
［００５２］Ｋ２５Ｖ（実施例３におけるように調製）を、ＮＳＤ中、＃１８２６と称するＣｐＧ含有ｓｓ−ＯＤＮ（２５μｇ）と混合した。ペプチドの用量力価決定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）をセットアップし、生理食塩水で希釈することによって、一定の体積を維持した。以下の群のトランスジェニックマウス（Ｎ＝６（１００ｎｍｏｌ）、１０（５０ｎｍｏｌ）、２（２５ｎｍｏｌ））に、１００マイクロリットルのペプチド／２５μｇ  ｓｓ−ＯＤＮ溶液を１回皮下注射した。２週間後、脾臓を取り除き、そして実施例３に記載するように、１回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を行った。実施例４に記載するようなクロム遊離アッセイによって、ＣＭＶ特異的細胞の細胞傷害性が立証された。図３を参照されたい。ｐｐ６５４９５−５０３細胞傷害性を黒塗り記号で表し、そしてｐ５３１４９−１５７（対照ペプチド）特異性を白抜き記号で表す。標的および細胞傷害性の計算は、実施例３に記載するのと同じであった。ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮを伴わずに免疫し、１回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）増幅のみを行ったマウスと比較すると（図２Ａ）、５０ｎｍｏｌまたは１００ｎｍｏｌ融合ペプチドいずれかと組み合わせた際、ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮの存在下で、ペプチド特異的認識の実質的な上方制御がある。図３を参照されたい。非ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮ（＃１９８２）を用いた場合、ｓｓ−ＯＤＮの劇的な効果は観察されない（図６を参照されたい）。
【００４３】
（実施例８）
融合ペプチドの一部としての破傷風ＴＨエピトープは、強力な細胞傷害性応答を仲介する
［００５３］ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮの効果を、どちらも破傷風由来の無差別なＴＨエピトープを含有する、２つの他の融合ペプチド（表Ｉを参照されたい）と組み合わせてもまた、調べた。ｓｓ−ＯＤＮを伴い（図４、白抜きのひし形）、そして伴わず（図４、黒塗りの円）、ＫＴｅｔ８３０Ｖ融合ペプチドを皮下注射によって投与し、そして実施例８に記載するように、ＣＴＬ応答を評価した。５０ｎｍｏｌ（図４）または１００ｎｍｏｌ（データ未提示）いずれかでマウスに投与したＫＴｅｔ８３０Ｖは、ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮアジュバントを伴わないと、活発なＣＴＬ応答を刺激不能であった。Ｔｅｔ６３９Ｖと称する別の破傷風ＴＨエピトープでも類似の効果が観察されたが、ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮの効果はそれほど劇的ではなかった（図５）。図５では、データは、融合ペプチドがＴｅｔ６３９Ｖ（表Ｉを参照されたい）であり、そして記号が５０ｎｍｏｌのペプチド単独（黒塗りの円）または２５μｇ  ｓｓ−ＯＤＮ  ＃１８２６を伴うもの（白抜きのひし形）に相当することを除いて、図４と同じ条件下の結果に相当する（Ｎ＝４）。疎水性の標準的測定によって、Ｔｅｔ６３９がＰＡＤＲＥと同様に疎水性であるが、Ｔｅｔ８３０はより親水性であることが示される。ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２，１９８２；  ＳｗｅｅｔおよびＥｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７１：４７９−４８８，１９８３。データによって、いくつかのＴＨエピトープはＰＡＤＲＥの代わりに使用可能であるが、ＣＴＬ刺激活性一般およびＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮが機能を上方制御する能力のどちらにも、疎水性の度合いが重要でありうることが示される。
【００４４】
（実施例９）
ＨＬＡ  Ａ２．１四量体試薬を用いた免疫強度解析
［００５４］ＨＬＡ四量体は、ＣＴＬ頻度を評価する独立の手段である。これらは、限界希釈またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養法に頼ることなく、ペプチド特異的ＣＴＬの頻度の定量的な直接測定値を提供する。Ｖｉｌｌａｃｒｅｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８４：２５６−２６７．２００１；  Ａｌｔｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６，１９９６；  Ａｐｐａｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：６３−７４，２０００を参照されたい。ヒトＰＢＭＣとともに特異的に働く、同じ四量体調製物は、ヒトｐ５３  ＨＬＡ  Ａ２．１  ＣＴＬエピトープに関して最近示されたように、マウス脾臓からｐｐ６５４９５−５０３特異的Ｔ細胞を識別する。Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５９６−６０２，２０００を参照されたい。ここで、３群のトランスジェニックマウスを、５０ｎｍｏｌ  Ｋ２５Ｖで皮下免疫し、そして対照とともに同一組成物で（非ＣｐＧ；図６、黒塗りの三角形）、またはＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮとともに同一組成物で（図６、黒塗りのひし形）、あるいは同一組成物単独で（図６、黒塗りの円）、追加免疫した。１４日後に脾臓を採取し、そして１回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を行った。クロム遊離アッセイの条件および特異的細胞傷害性の計算は、実施例５に記載するとおりであった。追加免疫の細胞傷害性データを図６に示す。一次免疫の結果は、図２Ａおよび図３に示すものと一致する。融合ペプチドは認識され、そしてＤＮＡアジュバントと独立に細胞傷害性を生じたが、ｓｓ−ＯＤＮ、特にＣｐＧ含有ＤＮＡは活性を上方制御した。アジュバント効果は、第二のワクチン投与後、最も明らかであった。
【００４５】
［００５５］ＦＩＴＣ−ＣＤ８で視覚化した、フィコエリトリン（ＰＥ）−ＨＬＡ四量体二色フローサイトメトリーを、トランスジェニックマウス３群すべてに関して図７に示す。図７Ａ〜７Ｃ（特異的ＨＬＡ四量体ｐｐ６５４９５−５０３）または図７Ｄ〜７Ｆ（非特異的ＨＬＡ四量体ｐｐ６５１４９−１５７）を参照されたい。各プロフィールに関して、右上の四分類にある細胞の割合を示す。各ヒストグラムに関して、２万の事象を収集し、そして電気的なゲートを用いて、小さいリンパ球サイズ範囲に属さない細胞を除外した。染色されたＴ細胞および細胞傷害性のレベルはよく相関した。非特異的ＨＬＡ四量体でのバックグラウンド染色がかすかであることから、相互作用の特異性が示される。
【００４６】
（実施例１０）
Ｋ２５Ｖワクチンの粘膜投与
［００５６］脾臓リンパ球を用いて、融合ペプチドの粘膜免疫を行い、この投与経路が全身性免疫を生じるかどうかを評価した。遊離ペプチドは、一般的に、粘膜経路から導入された際、有効な免疫原ではなかった。しかし、ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮは、粘膜投与した際、タンパク質免疫原を用いて、有効なアジュバントでありうる。Ｈｏｍｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１５８４−１５９１，２００１；  ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：３７５９−３７６８，２００１を参照されたい。実施例４に記載するように、Ｋ２５Ｖを、単独で、またはＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮと混合して、トランスジェニックＨＬＡ  Ａ２．１／Ｋｂマウスに鼻内投与した（１５μｌを麻酔下で各鼻孔に導入し、総量３０μｌ／マウスを導入した）。図８は、示した免疫原で１回免疫し、そして２週間後に屠殺したマウス由来の脾臓細胞の細胞傷害性を示す。図９は、示した免疫原で２回免疫し、そして３週間後に屠殺したマウス由来の脾臓細胞の細胞傷害性を示す。実施例４に記載するように、すべての脾臓細胞を７日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に供し、そしてその後、皮下免疫に関して記載するように、クロム遊離によって細胞傷害性に関してアッセイした（実施例５を参照されたい）。ＤＮＡの２５ｎｍｏｌまたは５０ｎｍｏｌ用量が、ＣＴＬを刺激するのに有効であった。ＤＮＡを含まない１００ナノモル用量が、ある程度の活性を示した（図９を参照されたい）。皮下経路（図２Ａを参照されたい）と対照的に、鼻内経路によって搬送されるペプチドの活性は、ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮに驚くべき依存性を示す。
【００４７】
（実施例１１）
融合ペプチドは、内因性にプロセシングされたｐｐ６５タンパク質のＣＴＬ認識を導く
［００５７］ウイルス発現されたｐｐ６５の認識を評価する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを設計した。ＨＬＡ  Ａ２．１を安定して発現するヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（ＪＡ２．１）を、ワクシニアウイルス中で発現されるｐｐ６５に感染させた。ペプチド装填Ｔ２標的と対照的に、ウイルスに感染させた標的は、認識成功のため、ＴＡＰ依存性タンパク質プロセシングを後押しする。Ｗｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：４４３−４４６，１９９２。Ｋ２５Ｖでの反復（５回）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（図１、１００ｎｍｏｌ）後、図１に示すＫ２５Ｖ免疫に由来するバルク脾臓細胞培養物を用いて、ｐｐ６５Ｖａｃの認識有効性を評価した。ＣＲＡ標的（ＪＡ２．１  Ｔ細胞）を、Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５Ｖａｃ（黒塗りの円）、ｐｐ６５Ｖａｃ（黒塗りの正方形）またはＵｂ−Ｒ−ＩＥＶａｃ（黒塗りの三角形）を発現する、感染効率３のワクシニアウイルスに１６時間感染させるか、あるいはペプチドでパルス処理した（データ未提示）。バルク細胞株を用いた場合（図１０）、ｐｐ６５Ｖａｃ感染標的の認識はほとんどないことが観察されたが、ｐｐ６５４９５−５０３装填ＪＡ２．１（データ未提示）は、Ｔ２細胞のもの（図１、１００ｎｍｏｌ）に匹敵して認識された。ヒトｐｐ６５特異的ＣＴＬは、ｐｐ６５Ｖａｃ感染標的を非常に効率的に認識する。Ｄｉａｍｏｎｄら，Ｂｌｏｏｄ  ９０：１７５１−１７６７，１９９７。ＶＶ感染標的に関して、非特異的溶解が示され（Ｕｂ−Ｒ−ＩＥＶａｃ、黒塗りの三角形）、そしてこれは、ペプチド装填Ｔ２細胞に関しては、＜５％であった（データ未提示）。エラーバーは、異なる日に行った４つの別個の実験の平均を示す。Ｈ−２  Ｉａ発現を欠く、二重ノックアウトトランスジェニックマウスは、ＨＬＡ  Ａ２．１／拘束抗原のより高い認識を促進した。Ｕｒｅｔａ−Ｖｉｄａｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：２５５５−２５６０，１９９９。Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙおよび共同研究者に記載されるＮ端ルールモデルにしたがって、ｐｐ６５タンパク質の不安定型を設計した。ＴｏｂｅｒｙおよびＳｉｌｉｃｉａｎｏ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：９０９−９２０，１９９７；  Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１２１４２−１２１３９，１９９６；  ＲｏｃｋおよびＧｏｌｄｂｅｒｇ，１７：７３９−７７９，１９９９を参照されたい。ユビキチン化ｐｐ６５（Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５Ｖａｃ）に感染させたＪＡ２．１細胞が標的である場合、未修飾ｐｐ６５に比較して、有意な細胞溶解反応が検出可能である（図１０）。ｐｐ６５に対する応答の特異性は確認されており；ＣＭＶ由来の非特異的ユビキチン化タンパク質は、最小限にしか認識されなかった（図１０）。
【００４８】
［００５８］融合ペプチドによって刺激されたＣＴＬが、全長ｐｐ６５を認識可能であるかどうかを評価するため、５０ｎｍｏｌ  Ｔｅｔ６３９Ｖを単独で、または２５μｇ  ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮとともに、皮下投与した。単回一次免疫後、脾臓細胞に対して、クロム遊離アッセイを行った。標的は、実施例３に記載するような、Ｕｂ−Ｒ−ｐｐ６５Ｖａｃ（黒塗りの円または三角形）、またはＵｂ−Ｒ−ＩＥＶａｃ（黒塗りの正方形およびひし形）に感染させたＪＡ２．１  Ｔ細胞いずれかであった。予期されるように、ペプチド特異的応答は、どちらの調製でも、１回の免疫後に容易に測定された（図５）が、内因性にプロセシングされたｐｐ６５の認識もまた、明らかであり、そしてＤＮＡを含有する調製物で、より顕著であった（図１１）。これによって、皮下搬送された融合ペプチドが、プロセシングされた全長ｐｐ６５を認識するＣＴＬを刺激することが確認される。５０ｎｍｏｌ  Ｋ２５Ｖおよび２５μｇまたは１０μｇ  ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮを皮下投与または鼻内投与すると、類似の結果が得られた（データ未提示）。ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮの添加は、図１１に示すように、全長ｐｐ６５の認識に大きな影響を有した。鼻内投与後も、１００ｎｍｏｌ  Ｋ２５Ｖが優れたペプチド特異的応答を生じるが、全長ｐｐ６５Ｖａｃの認識を検出するには、同時投与されるＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮが必要であったため、この影響はまた、鼻内投与後にも見られた（データ未提示）。
【００４９】
参考文献
【００５０】
【化１】
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【００５１】
【化２】
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【００５２】
【化３】
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【００５３】
【化４】
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【００５４】
【化５】
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【００５５】
【化６】
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【００５６】
【化７】
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【００５７】
【化８】
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【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】［００１３］図１は、示したＫ２５Ｖペプチド（ＫＳＳＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号５）の用量で免疫した脾臓細胞に関する細胞傷害性データを提供する。
【図２】［００１４］図２は、１回または２回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）後の免疫脾臓細胞に関する、細胞傷害性（２Ａ）およびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）産生（２Ｂ）データを提供する。
【図３】［００１５］図３は、ＣｐＧ含有ｓｓ−ＯＤＮ（ＤＮＡアジュバント）を伴い、Ｋ２５Ｖペプチドの用量で免疫した脾臓細胞に関する細胞傷害性データを提供する。
【図４】［００１６］図４は、ｓｓ−ＯＤＮ（ＤＮＡアジュバント）を伴い、および伴わず、ＫＴｅｔ８３０Ｖ融合ペプチド（ＫＳＳＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＡＡＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号６）で免疫した脾臓細胞に関する比較細胞傷害性データを示す。
【図５】［００１７］図５は、ｓｓ−ＯＤＮ（ＤＮＡアジュバント）を伴い、および伴わず、ＫＴｅｔ６３９Ｖ融合ペプチド（ＶＳＴＩＶＰＹＩＧＰＡＬＮＩＡＡＡＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号７）で免疫した脾臓細胞に関する比較細胞傷害性データを示す。
【図６】［００１８］図６は、ＣｐＧ不含ｓｓ−ＯＤＮまたはＣｐＧ含有ｓｓ−ＯＤＮを伴い、Ｋ２５Ｖ融合ペプチドで免疫した脾臓細胞に関する細胞傷害性データを提供する。
【図７】［００１９］図７は、図６に記載するように免疫した脾臓細胞に関するフローサイトメトリーの結果を提供する。
【図８】［００２０］図８は、示した免疫原で１回免疫した脾臓細胞に関する細胞傷害性データを示す。
【図９】［００２１］図９は、示した免疫原で２回免疫した脾臓細胞に関する細胞傷害性データを示す。
【図１０】［００２２］図１０は、Ｋ２５Ｖで反復して（５回）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激した後の、図１に記載するＫ２５Ｖ免疫由来のバルク脾臓細胞培養に関する細胞傷害性データを示す。標的細胞を、示した融合ペプチドを発現するワクシニアウイルスに感染させた。
【図１１】［００２３］図１１は、示した抗原を発現する標的に対して、５０ｎｍｏｌ  Ｔｅｔ６３９Ｖ単独で、または２５μｇ  ＣｐＧ  ｓｓ−ＯＤＮとともに免疫した脾臓細胞に関する細胞傷害性データを示す。
【配列表】
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2005535627.tif 000014
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005535627.tif 000020
【図７】
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【図８】
2005535627.tif 000022
【図９】
2005535627.tif 000023
【図１０】
2005535627.tif 000024
【図１１】
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【国際調査報告】
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