(57)【要約】本発明は、限定するものではないが、腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病、狼瘡、高血圧、急性尿細管壊死、尿管の閉塞性疾患、腎癌、及び他の疾患や症候群を含む腎疾患の診断及び治療のために、尿サンプルなどの生体サンプルを分析するための新規な組成、システム、及び方法を含む。好適な実施形態では、本発明は、足細胞や近位尿細管細胞などの、特定の臨床的または科学的な対象の尿管の細胞でのみ発現刷る特定の遺伝子の同定を含む。従って、本発明により、様々な疾患や障害において腎臓や尿管の状態を非侵襲的で迅速かつ正確に分析できる。
2005534892.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎疾患を検出する方法であって、
腎疾患を示す細胞が存在する時のみに哺乳動物尿サンプルに存在する特異的遺伝子の発現について前記尿サンプルをスクリーニングするステップを含み、
前記尿サンプルで検出可能なアルブミンの濃度が０〜３０ｍｇ／ｄｌの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記特異的遺伝子がネフリンのための足細胞遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腎疾患を示す前記細胞が、足細胞及び近位尿細管細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物尿サンプルにおいて足細胞の存在を評価する方法であって、
１または複数の足細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルの前記足細胞で選択的に発現する遺伝子の発現レベルを決定するステップとを含み、
前記尿サンプルで検出可能なアルブミンの濃度が０〜３０ｍｇ／ｄｌの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記決定するステップが、前記尿サンプルの前記足細胞で選択的に発現する遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物尿サンプルにおける足細胞の存在を評価する方法であって、
１または複数の足細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるネフリンのための足細胞遺伝子の発現レベルを決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記決定するステップが、前記尿サンプルにおけるネフリンのための足細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物尿サンプルにおける足細胞の存在を評価する方法であって、
１または複数の足細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるネフリンのための足細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップと、
前記尿サンプルで恒常的に発現する遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記恒常的に発現する遺伝子がβ‐アクチンのための遺伝子であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト尿サンプルにおける足細胞の存在を評価する方法であって、
少なくとも１つの足細胞からの１または複数のＲＮＡ分子を選択的に含むヒト尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるネフリンのための足細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
更に、前記尿サンプルにおけるβ‐アクチンのための遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含み、前記アッセイが、前記１または複数のＲＮＡ分子、１または複数のβ‐アクチン正方向プライマー（配列番号７）、β‐アクチン逆方向プライマー（配列番号８）、またはβ‐アクチンプローブ（配列番号９）を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物尿サンプルにおける近位尿細管細胞の存在を評価する方法であって、
１または複数の近位尿細管細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルの前記近位尿細管細胞で選択的に発現する遺伝子の発現レベルを決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記決定するステップが、前記尿サンプルの前記近位尿細管細胞で選択的に発現する遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物尿サンプルにおける近位尿細管細胞の存在を評価する方法であって、
１または複数の近位尿細管細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるインドハリネズミのための近位尿細管細胞遺伝子の発現レベルを決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記決定するステップが、前記尿サンプルにおけるインドハリネズミのための近位尿細管細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物尿サンプルにおける近位尿細管細胞の存在を評価する方法であって、
１または複数の近位尿細管細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるインドハリネズミのための近位尿細管細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップと、
前記尿サンプルで恒常的に発現する遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記恒常的に発現する遺伝子がβ‐アクチンのための遺伝子であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト尿サンプルにおける近位尿細管細胞の存在を評価する方法であって、
少なくとも１つの近位尿細管細胞からの１または複数のＲＮＡ分子を選択的に含むヒト尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるインドハリネズミのための近位尿細管細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップとを含み、
前記アッセイが、前記１または複数のＲＮＡ分子、１または複数の正方向プライマー（配列番号４）、逆方向プライマー（配列番号５）、及びプローブ（配列番号６）を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
更に、前記尿サンプルにおけるβ‐アクチンのための遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含み、前記アッセイが、前記１または複数のＲＮＡ分子、１または複数のβ‐アクチン正方向プライマー（配列番号７）、β‐アクチン逆方向プライマー（配列番号８）、またはβ‐アクチンプローブ（配列番号９）を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物腎疾患の診断及びその経過を監視する方法であって、
１または複数の足細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルの前記足細胞で選択的に発現する遺伝子の発現レベルを決定するステップとを含み、
前記尿サンプルで検出可能なアルブミンの濃度が０〜３０ｍｇ／ｄｌの範囲であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
更に、前記尿サンプルの前記足細胞で選択的に発現する遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子がネフリンのための足細胞遺伝子であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物腎疾患の診断及びその経過を監視する方法であって、
１または複数の足細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるネフリンのための足細胞遺伝子の発現レベルを決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
更に、前記尿サンプルにおけるネフリンのための足細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物腎疾患の診断及びその経過を監視する方法であって、
１または複数の足細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるネフリンのための足細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップと、
前記尿サンプルにおけるβ‐アクチンのための遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
ヒト腎疾患の診断及びその経過を監視する方法であって、
少なくとも１つの足細胞からの１または複数のＲＮＡ分子を選択的に含むヒト尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるネフリンのための足細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
更に、前記尿サンプルにおけるβ‐アクチンのための遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含み、前記アッセイが、前記１または複数のＲＮＡ分子、１または複数のβ‐アクチン正方向プライマー（配列番号７）、β‐アクチン逆方向プライマー（配列番号８）、またはβ‐アクチンプローブ（配列番号９）を含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物腎疾患の診断及びその経過を監視する方法であって、
１または複数の近位尿細管細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルの前記近位尿細管細胞で選択的に発現する遺伝子の発現レベルを決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
前記決定するステップが、前記尿サンプルの前記近位尿細管細胞で選択的に発現する遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物腎疾患の診断及びその経過を監視する方法であって、
１または複数の近位尿細管細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるインドハリネズミのための近位尿細管細胞遺伝子の発現レベルを決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記決定するステップが、前記尿サンプルにおけるインドハリネズミのための近位尿細管細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物腎疾患の診断及びその経過を監視する方法であって、
１または複数の近位尿細管細胞を選択的に含む哺乳動物尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるインドハリネズミのための近位尿細管細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップと、
前記尿サンプルにおけるβ‐アクチンのための遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
ヒト腎疾患の診断及びその経過を監視する方法であって、
少なくとも１つの近位尿細管細胞からの１または複数のＲＮＡ分子を選択的に含むヒト尿サンプルを用意するステップと、
前記尿サンプルにおけるインドハリネズミのための近位尿細管細胞遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップとを含み、
前記アッセイが、前記１または複数のＲＮＡ分子、１または複数の正方向プライマー（配列番号４）、逆方向プライマー（配列番号５）、及びプローブ（配列番号６）を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
更に、前記尿サンプルにおけるβ‐アクチンのための遺伝子の発現レベルを逆転写定量的ＰＣＲアッセイで決定するステップを含み、前記アッセイが、前記１または複数のＲＮＡ分子、１または複数のβ‐アクチン正方向プライマー（配列番号７）、β‐アクチン逆方向プライマー（配列番号８）、またはβ‐アクチンプローブ（配列番号９）を含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
逆転写定量的ＰＣＲアッセイでヒト・インドハリネズミのための近位細尿管細胞遺伝子の発現レベルを評価するための配列番号４からなるプライマー。
【請求項３６】
逆転写定量的ＰＣＲアッセイでヒト・インドハリネズミのための近位細尿管細胞遺伝子の発現レベルを評価するための配列番号５からなるプライマー。
【請求項３７】
逆転写定量的ＰＣＲアッセイでヒト・インドハリネズミのための近位細尿管細胞遺伝子の発現レベルを評価するための配列番号６からなるプローブ。
【請求項３８】
逆転写定量的ＰＣＲアッセイでヒト・β‐アクチンのための遺伝子の発現レベルを評価するための配列番号７からなるプライマー。
【請求項３９】
逆転写定量的ＰＣＲアッセイでヒト・β‐アクチンのための遺伝子の発現レベルを評価するための配列番号８からなるプライマー。
【請求項４０】
逆転写定量的ＰＣＲアッセイでヒト・β‐アクチンのための遺伝子の発現レベルを評価するための配列番号９からなるプローブ。
【請求項４１】
請求項３８、３９、または４０のそれぞれの配列番号７、８、または９を１または複数含む、ヒト尿サンプルにおける足細胞を評価するためのキット。
【請求項４２】
請求項３５、３６、３７、３８、３９、または４０のそれぞれの配列番号４、５、６、７、８、または９を１または複数含む、ヒト尿サンプルにおける近位尿細管細胞を評価するためのキット。
【請求項４３】
請求項３８、３９、または４０のそれぞれの配列番号７、８、または９を１または複数含む、発現したヒト・β‐アクチン遺伝子を評価するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の一部は、ＮＩＨ ＲＯ１ ＣＡ７８８５３の下で米国政府によって部分的に支援された作業中に作成された。米国政府は、本願に一定の権利を有するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、腎臓病の診断及び治療における生体サンプルの分析に関する。詳細には、本発明は、限定するものではないが、腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病、狼瘡、高血圧、急性尿細管壊死（ＡＴＮ）、閉塞性腎疾患、腎癌、及び他の疾患や症候群を含む様々な症状に関連した腎疾患や腎障害を診断するため及び治療効果を監視するための尿サンプルの分析に関する。
【０００３】
発明の背景
患者を治療する医師は、腎臓の状態及び機能を分析する必要がある。糸球体疾患などの疾患の場合、このような分析は、尿に含まれる蛋白（アルブミン）の検出、すなわち腎臓から尿に排出された蛋白量を測定して行われる。しかしながら、異常な検査結果が出る前に多くの腎機能が失われるため、この方法は感度が悪く時期を失したものである。また、尿における蛋白の存在は非特異的な原因が多く、高蛋白尿の検査は多くの患者で偽陽性となることがあり、この方法は不正確である。更に、近位尿細管障害などのある種の腎障害では、通常は利用できる高感度の尿検査が存在しない。代替の分析方法は腎生検であるが、費用がかかり侵襲性であり、出血や感染のリスクによる一定の死亡率を伴う。
【０００４】
足細胞疾患を直接監視するために現在利用できる唯１つの尿検査は、尿に排泄される足細胞の抗体検査であり、実験的に行われているのみである。しかしながら、この検査は、アルブミンが尿に存在する場合にのみ異常となるため、本発明の方法ほど感度が高くない。従って、腎疾患の初期、好ましくは発症直後に腎障害に関連して陽性を示す一般に利用できる検査が要望されている。
【０００５】
本発明は、所定の細胞型の異常な落屑を尿管におけるその細胞固有の遺伝子発現で確認できる、腎臓の状態や機能を示す新規な指標で上記問題を克服する。
【０００６】
従って、他の実施可能な尿検査よりも正確に腎疾患の初期及びその後の段階で腎臓の状態を評価する高感度な方法及び組成が要望されている。
【０００７】
本発明に従って、腎臓に関連した疾患や障害、及び関連指標を診断及び管理するために、新規な組成、システム、及び方法を提供する。本発明において、「腎疾患」及び「腎障害」は置き換え可能であり、腎臓またはその構成部分の構造や機能のあらゆる疾患、症候群、異常、症状、または異常な状態を指す。本発明に従って、特に腎疾患の特定及び治療の監視において、特定の臨床的または科学的な対象の尿管細胞だけで発現する特定の遺伝子をユニークに同定するための方法論を開示する。通常は尿に含まれないが、腎細胞（足細胞または近位尿細管細胞）に影響を及ぼす症状が腎臓にある場合に尿に含まれるこのような腎細胞の検出により、このような症状を検出することが可能である。
【０００８】
一実施形態では、ユニークな方法及び組成により、糸球体足細胞及び／または近位尿細管細胞の存在を検出して、腎疾患の徴候を評価したり、治療のために足細胞及び／または近位尿細管細胞の応答を監視することができる。
【０００９】
本発明に従って、このような細胞の存在を、尿管における目的の特定の細胞（足細胞または近位尿細管細胞）のみで起こる遺伝子発現をスクリーニングして検出する。別の実施形態では、本発明は、尿沈渣中の細胞で発現する遺伝子の分析を含み、様々な疾患や障害における腎臓の状態や機能の非侵襲的で迅速かつ正確な分析を提供する。
【００１０】
更に別の実施形態では、本発明は、尿を用いない非侵襲性の検査で迅速にこのような疾患を診断するための、自然に尿に落屑した細胞における遺伝子発現の分析を含む。一実施形態では、遺伝子発現の検出は、逆転写酵素定量的ＰＣＲ（ＲＴ‐ＱＰＣＲ法）を用いて、足細胞（尿管のこれらの細胞でユニークに発現するネフリン（nephrin）の発現によって）及び近位尿細管細胞（尿管のこれらの細胞でユニークに発現するインドハリネズミ（Indian hedgehog：ＩＨＨ）の発現によって）をユニークに検出する。本発明に従えば、このような指標が蛋白尿よりも疾患の初期に陽性になり、しかもより特異的である。更なる実施形態では、本発明は、目的の細胞での遺伝子発現を検出するための新規なプライマー、プローブ、及びこれらを含むキットを包含する。
【００１１】
好適な実施形態の詳細な説明
一実施形態では、本発明は、限定するものではないが、足細胞をマークする１または複数の特異的な遺伝子配列及び近位尿細管細胞をマークする１または複数の特異的な遺伝子配列の同定及び分析を含む。これらの２つタイプの細胞は、例示目的で上記した障害などの様々な腎疾患によって影響を受けることが知られている。本発明では、これらの細胞型のみで発現する遺伝子を検出して、通常は尿に落屑する下部尿管細胞などの他の細胞型での遺伝子発現による混同を緩和する。
【００１２】
このような遺伝子の確認は、高感度の方法を用いなければならない。例えば、感度の低い方法を用いると、ある細胞で発現していないと思われた遺伝子が、実際は低レベル（例えば、その遺伝子を発現するとされる細胞で１％のレベル）で発現していることがある。尿沈渣の殆どの細胞が下部尿管細胞に由来するため、これらの細胞における低レベルの転写が高感度ＲＴ‐ＱＰＣＲ法に干渉して、上部尿管細胞を検出することができる。これとは対照的に、本発明に従えば、例示目的で限定するものではないが、足細胞のネフリン及び近位尿細管細胞のインドハリネズミである、目的の上部尿管細胞のみで発現する遺伝子のユニークな同定が可能である。例えば、疾患の後期では、蛋白尿は、常に異常であり得、足細胞の喪失を防止するようにデザインされた治療に反応しない。この時点で、治療が足細胞尿（podocyturia）の防止に有効な場合は、既に存在している修復不能な足細胞の損傷によって蛋白尿検査が常に異常である時にネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが正常となり得る。
【００１３】
本発明はまた、特定の疾患における目的の細胞の落屑の確認を含む。正常な腎臓が尿沈渣中に足細胞及び近位尿細管細胞を放出しないことを本発明で思いがけず示した。しかしながら、これらの細胞に関係した障害または疾患では、結果的に足細胞または近位尿細管細胞が喪失して尿沈渣に含まれるようになる。つまり、放出された細胞の少なくとも一部が、尿沈渣中に沈降し得る無傷の細胞または細胞の断片として存在する。本発明は、評価、診断、及び治療のためにこの落屑を確認する。
【００１４】
本発明の別の態様に従って、従来の技術に存在するものとは異なる特異的なプローブを提供する。従来の発現分析でも潜在的なプローブの候補を区別することができるが、ＲＴ‐ＱＰＣＲほど高感度の技術を用いていないため、いずれの技術も適切なマーカーを最終的に特定できなかった。例えば、ｇｌｅｐｐ１が尿管の足細胞でのみ発現するとした感度の低い発現技術に基づいて、足細胞に特異的なマーカーの候補としてｇｌｅｐｐ１が有望であると示された。しかしながら、本発明のＲＴ‐ＱＰＣＲ技術により、推測された足細胞での多量の合成に加えて、下部尿管細胞における以前は検出できなかった少量のｇｌｅｐｐ１の転写物が示された。従って、ｇｌｅｐｐ１遺伝子の発現は、足細胞のマーカーとして適していない。これは、少量であるが下部尿管細胞での測定可能な量の遺伝子発現によって混同が起こるためである。これとは対照的に、本発明を用いることにより、ネフリンが足細胞以外の尿管細胞で発現していないことが示され、これにより、尿沈渣におけるネフリンの存在を足細胞尿の代理マーカーとして使用できることが分かった。
【００１５】
同様に、尿細管細胞の多くの潜在的なマーカーが正常な尿沈渣に存在し、下部尿管細胞でこれらの遺伝子が少量発現していることを反映している。感度の低い分析で腎臓の特定の領域のみで発現すると示された候補遺伝子（Ｎ‐アセチル‐β‐Ｄ‐グルコサミニダーゼ、アクアポリン１、ウロモジュリン（uromodulin）、及びＳＬＣ３Ａ１）をスクリーニングする場合にも当てはまる。インドハリネズミは、近位曲尿細管細胞及び近位直尿細管細胞の好適なマーカーであることが見出された。ある実施形態の高感度ＲＴ‐ＱＰＣＲ分析は、正常な患者の多量の尿沈渣中にインドハリネズミが１０−４以上（インドハリネズミ転写物の存在量／β‐アクチン転写物の存在量）のレベルで存在しないことを示した。
【００１６】
一実施形態では、限定するものではないが、本発明は、目的の細胞を確認するために尿沈渣中のリボ核酸（ＲＮＡ）のＲＴ‐ＱＰＣＲ分析も含む。これには、尿沈渣に含まれる目的の細胞の少なくとも一部のＲＮＡがＲＴ‐ＱＰＣＲ産物を生成するのに十分（これまでの技術では十分ではない）でなければならない。従って、本発明のためには、目的の細胞が、無傷のＲＮＡを提供するのに十分な全細胞またはその断片でなければならない。本発明はまた、逆転写を開始できるＲＮＡが単離されたことを確かめるために、広範に転写されるハウスキーピング遺伝子の発現も含む。
【００１７】
好適な実施形態では、限定するものではないが、本発明は、ＲＴ‐ＱＰＣＲ技術を用いて、尿沈渣中の足細胞及び／または近位尿細管細胞の異常な存在をこのような腎臓の細胞に関係した障害のある患者から検出することも含む。しかしながら、当業者であれば、他の技術を用いてそのような遺伝子の発現を検出する本発明の他の実施形態も存在することを理解できよう。従って、本発明の方法を用いることにより、足細胞及び／または近位尿細管細胞が尿沈渣に落屑する患者とそうでない患者とに分けることが臨床的に可能となる。
【００１８】
更に、本発明のＲＴ‐ＱＰＣＲ検査により、腎病変の半量的な分析が可能となる。これにより、非侵襲的に得た尿のみで腎疾患または腎障害の進行を監視するために分子バイオマーカーの使用の可能性が生まれた。異常は、高蛋白尿または異常な腎機能のマーカーを用いて格段に早く判定可能となる。
【００１９】
本発明に従えば、ＲＴ‐ＱＰＣＲを用いたネフリン（足細胞）及びインドハリネズミ（近位尿細管細胞）の高感度検査は、少量の尿のみが必要であり、自然に排泄された尿を使用するため非侵襲的であり、病変した腎臓の現在の状態を反映する。これにより、医師が治療効果を監視することができる。例えば、安定した蛋白尿症であるがネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲでは陰性の糖尿病患者は、一様に治療（ＡＣＥインヒビターまたはアンギオテンシン２受容体アンタゴニスト）の後期の患者である。疾患の初期で本発明を用いると、観察されるネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲの変化から、高蛋白尿及び臨床的に明らかな腎症の後に起こる変化を推定できる。疾患の後期では、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲにより、薬物治療で足細胞の喪失が抑制されている患者を高感度に検出することができる。従って、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲは、高感度に腎臓の異常を検出し、かつ治療の監視を行うことができる。
【００２０】
本発明の実施形態はまた、尿沈渣中の特定のタイプの損傷した腎細胞の存在によってアッセイする腎障害を検出するＲＴ‐ＱＰＣＲ法も含む。従って、本発明は、従来技術を用いた尿中のアルブミンの検出における感度や不正確さの問題を克服した。原（Hara）及び共同研究者達が、尿中の足細胞を検出する免疫学的検査を開発したが、この検査は、既に高蛋白尿である小児患者及び糖尿病患者の異常の検出に限定されている。これとは対照的に、本発明は、上記したように、免疫学的検査よりも早い段階でネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ（足細胞）の異常を示すより高感度のアッセイを含む。
【００２１】
一例として糸球体疾患を含む多くの腎疾患を検出するために、本発明のある実施形態では、尿管での転写が足細胞に限られているネフリン遺伝子を利用することができる。別の実施形態では、尿管での転写が足細胞に限られているあらゆる遺伝子をこの目的に用いることができる。尿沈渣中に足細胞の存在を示す異常な状態には、例えば、糸球体症、ネフローゼ症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、及び高血圧が含まれる。このようなネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲの変化は、足細胞の落屑を招かない非糸球体腎障害では見られない。本発明を用いて得たネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲの検査結果は、腎障害の他の尿マーカーよりも前に異常なレベルを示す。疾患の後期では、ＲＴ‐ＱＰＣＲの異常を伴ってまたは伴わないで高蛋白尿が見られる。このような時点でのネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ検査の陰性は、治療の効果を示し、以前の足細胞の喪失を示す高蛋白尿が見られても足細胞の喪失が止まっている。
【００２２】
急性尿細管壊死や閉塞性疾患などの疾患を検出するために、例えば、尿管での転写が近位尿細管細胞に限られている遺伝子、インドハリネズミを用いる。他の実施形態では、尿管での転写が近位尿細管細胞に限られているあらゆる遺伝子をこの目的に用いることができる。インドハリネズミのデータは、糸球体の喪失時期に相関しない場合が多い糸球体障害の多くの患者での近位尿細管細胞の落屑を示す。この細胞の喪失が糸球体障害の病因において役割があっても、その役割は明確ではないが、この障害に一定の役割を果たし得る因子であることに留意されたい。
【００２３】
ある実施形態では、本発明は、処置済みの尿沈渣細胞からのＲＮＡを室温で安定させる単純な保存プロトコルを含む。尿サンプルは、非侵襲的に得ることができ、注意すれば簡単に保存することができる。次いで、少量の尿サンプルを周囲温度で中央施設に輸送し、そこで高感度ＲＴ‐ＱＰＣＲ分析が行われる。尿サンプルを受け取って１日以内に結果が得られ、その結果が医師に報告される。
【００２４】
例
ＲＮＡの単離
全ての尿サンプルを集めるためにインフォームド・コンセントを得る。サンプルは、自然に排泄された約３〜４０ｍｌの尿である。この目的に使用する尿は、新鮮な尿または凍結された尿である。この尿を、８，０００回転／分で１０分間、遠心分離機にかけた。上清を別の容器に移し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ＋２．７ｍＭ ＫＣｌ＋４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４＋１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で１回洗浄し、再び遠心分離機にかけ、空気穿孔ペレット（air-drilled pellet）を少量の２回蒸留水に再懸濁し、分割して−８０℃で凍結させた。
【００２５】
本発明を用いて、尿沈渣細胞のＲＮＡを検出した。体内では、尿は膀胱に約３７℃で数時間留まってから排泄される。その後、尿は医療施設で数時間、室温で放置される。次に、尿沈渣を遠心分離機にかけ、ＲＮＡｌａｔｅｒ（アンビオン社（Ambion））またはＳＴＧバッファー（マサチューセッツ州ローウェルのバイオトロニクス社（Biotronics, Lowell MA））で処理して、ＲＮＡ分解酵素を不活化させた。自然排泄から１２時間以内に尿サンプルを得た場合、尿ＲＮＡはＲＴ‐ＱＰＣＲを行うのに一様に十分に無傷である。室温で数日保存された尿は、ＲＮＡが変性したサンプル（基準β‐アクチンマーカーのＲＴ‐ＱＰＣＲが起きない）の割合が相当である。つまり、サンプルは医療施設を出てからすぐに処理して、ＲＮＡの大きさがＲＴ‐ＱＰＣＲを行うのに不適切にならないようにするべきである。次いで、例えば、バイオトロニクス社の尿沈渣ＲＮＡ単離キットを用いるバイオトロニクス社のＲＮＡ単離プロトコルなどの当分野で周知の方法でＲＮＡを単離した。
【００２６】
プライマー及びプローブ
ある実施形態のＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ反応で用いるヒト・ネフリンのプライマー及びプローブは以下のものを含む。
過剰プライマー：配列番号１（エキソン２３とエキソン２４の接合部に位置する）
制限プライマー：配列番号２（エキソン２２に位置する）
ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒプローブ：配列番号３（エキソン２３に位置する）
【００２７】
ある実施形態のＴａｑＭａｎ反応に用いるヒト・インドハリネズミのプライマー及びプローブは以下のものを含む。
インドハリネズミ正方向プライマー：配列番号４
インドハリネズミ逆方向プライマー：配列番号５
インドハリネズミ‐ＴａｑＭａｎプローブ：配列番号６、一実施形態では、この配列の５’側に６ＦＡＭ‐、３’側に‐ＴＡＭＲＡが付いている（配列番号６）。
【００２８】
ある実施形態のＴａｑＭａｎ反応に用いるヒト・β‐アクチンのプライマー及びプローブは以下のものを含む。
β‐アクチン正方向プライマー：配列番号７
β‐アクチン逆方向プライマー：配列番号８
β‐アクチン‐ＴａｑＭａｎプローブ：配列番号９、一実施形態では、この配列の５’側に６ＦＡＭ‐、３’側に‐ＴＡＭＲＡが付いている（配列番号９）。
【００２９】
本発明の他の態様では、ここに開示した本発明の方法で目的の細胞を検出するために用いる、１または複数のこれらの新規なプライマーまたはプローブが容器などに入ったキットを提供する。
【００３０】
ある実施形態では、限定するものではないが、本発明は、米国特許第４，９６５，１８８号及び同第５，０７９，３５２号に開示さているＰＣＲ法、及び／または米国特許第５，２１０，０１５号に開示されているＴａｑＭａｎ ＲＴ‐ＱＰＣＲ法を含む。これらの特許文献に言及することを以って、それらの内容の全てを本明細書の一部とする。ある実施形態では、限定するものではないが、本発明は、米国特許第４，９６５，１８８号及び同第５，０７９，３５２号に開示さているＰＣＲ法、及び／または米国特許第５，３４８，８５３号及び同第５，５６７，５８３号に開示されているＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ ＲＴ‐ＱＰＣＲ法を含む。これらの特許文献に言及することを以って、それらの内容の全てを本明細書の一部とする。
【００３１】
ＴａｑＭａｎアッセイの原理
ＴａｑＭａｎアッセイは既に開示されており、当分野で周知である（図１Ａ及び図１Ｂを参照）。このアッセイは、ＰＣＲの成功で、２つのプライマー間の配列に相同な蛍光標識したオリゴヌクレオチドのＴａｑ仲介エキソヌクレアーゼ消化による蛍光信号が生成される原理に基づいている。起こるＰＣＲの量に直接依存する消化の程度は、エネルギー伝達の減少による蛍光の増大の測定により直接かつ正確に定量することができる。この測定により、初期のゲノム配列のコピー数の決定に必要なＰＣＲ反応の指数関数段階での検出が可能となる。
【００３２】
ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒアッセイの原理
様々な疾患における足細胞の尿への落屑を測定するには、ＴａｑＭａｎシステムは感度または特異性が十分はないため、このように要求が高い場合はＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒアッセイを用いた。
【００３３】
ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒアッセイ(図２）は、蛍光エネルギー伝達の減少を用いて二本鎖オリゴヌクレオチドのＰＣＲによる分裂を測定する原理（ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ）に基づいている。二本鎖オリゴヌクレオチドの２本の鎖を、ドナー・フルオロフォア及びアクセプター・フルオロフォアで改変した。ＰＣＲの不在による自然の二本鎖の状態では、フルオロフォア（ドナーがフルオレセイン、レセプターがテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ））間のエネルギー伝達が十分であり、フルオレセインの励起周波数で刺激された後のテキサスレッドの放射周波数での蛍光信号が大きい。ＰＣＲが鎖の変位によって二本鎖オリゴヌクレオチドを分裂させ、エネルギー伝達が減少する（２つのフルオロフォア間の距離の６乗に反比例して変化する）。生じるＰＣＲの量に直接依存する分裂の程度は、エネルギー伝達の減少による蛍光の低下を測定することで直接かつ正確に定量することができる。ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒシステムは、２つに分かれるＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒプライマーとプローブ配列がＰＣＲに積極的に参加する単一分子であるため、ＴａｑＭａｎシステムよりも本質的に高感度である。比較すると、ＴａｑＭａｎのプローブ配列は、エネルギー伝達仲介蛍光現象の発生についてハイブリダイゼーションに受動的に依存する。従って、ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒシステムはＴａｑＭａｎシステムよりも高感度である。
【００３４】
ＲＮＡのみと反応するハウスキーピング遺伝子プローブ
恒常的に発現される遺伝子、β‐アクチンのプローブを用いて、ＲＮＡを尿沈渣から用意できるかを検証する。プローブは、転写された配列を特徴付けるスプライス配列を認識するように合成されるが、このようなプローブは、本当の遺伝子とプロセス型偽遺伝子とを区別することができない。このため、迅速なＲＮＡ抽出によく見られるゲノムＤＮＡ汚染が、プロセス型偽遺伝子をもつ恒常的に発現する遺伝子に対して偽陽性を生じさせる。実際に転写された配列のみを検出するためには、１つのプライマーが主としてＴ残基のストレッチからなるポリ（Ａ）ｃＤＮＡ特異的方法を用いる。このＴ残基のストレッチが、転写物に特有のポリアデニル化尾部にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドの３’末端の３つのヌクレオチドは、プライマーのポリＡ尾部へのスタッタリング（suttering）を防止するメッセージに相補的である。このセットは、ゲノムＤＮＡに無視できる効率（全ＲＮＡで得た信号の０．１％以下）で反応するため、転写配列とゲノムＤＮＡとを区別するために用いることができる。
【００３５】
Ａ．足細胞
腎生検を除けば、足細胞の喪失による腎疾患の初期の診断は、通常は尿に排泄される蛋白（すなわちアルブミン）の上昇に基づいて間接的に行われる。しかしながら、この検査は、尿へのアルブミンの排泄に影響を与える因子が多数存在するため非特異的である。更に、この検査が異常になるには、残りの足細胞の平坦化が正常な障壁を形成するのに不十分で蛋白が尿に漏れる点まで足細胞が著しく喪失する必要がある。足細胞は、腎臓が最大の大きさに達すると複製しなくなるため、腎機能の低下を初期に防止するためにこのような細胞の喪失を検出することが特に重要である。
【００３６】
本発明の態様に従って、足細胞特異的に尿管の足細胞で選択的に発現する遺伝子が尿沈渣に異常に存在することを検出して、足細胞の喪失を高感度に検出する。これを実証するために、尿管での転写が足細胞のみで起こる遺伝子ネフリンを用いた。従って、発明は、足細胞に影響を及ぼす腎障害に対する初期の影響をスクリーニングする迅速で非侵襲的な方法を含む。
【００３７】
ＲＴ‐ＱＰＣＲによるネフリン検出の感度を、慢性疾患である糖尿病の発症後、決められた時間に尿の蛋白（アルブミン）の存在と比較した。ネフリンについてのアッセイの感度を、足細胞特異的マーカーであるポドカリキシン（podocalyxin）の存在についての抗体検査とも比較した。
【００３８】
足細胞のネフリンマーカー
尿管での発現が足細胞特異的であると思われていた遺伝子が多数あった。このような配列を用いて、ｇｌｅｐｐ１及びネフリンの両方と共にＴａｑＭａｎ ＲＴ‐ＱＰＣＲ分析を用いた。複数のプローブを作製した。これらのプローブは、正常なサンプルでは信号を生成しないか、或いはバックグランド信号を生成した。しかしながら、特異的な信号は得られず、尿沈渣の全ＲＮＡにおけるこれらの遺伝子の存在量が極めて少ないことを反映した。なぜなら、たとえ糸球体疾患の場合であっても、足細胞は尿沈渣の細胞のごく一部であるためである。
【００３９】
より高感度なＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒシステムでのｇｒｅｐｐ１の検査により、正常な個人の尿に個々の量のｇｒｅｐｐ１を示すという予期していなかった結果が得られた。ラット尿管組織の特定部位からのＲＮＡに対するラットＴａｑＭａｎ ｇｌｅｐｐ１プローブを用いて、低レベルであるが測定可能なｇｌｅｐｐ１の転写を膀胱細胞で検出した。このレベルの転写は、殆どの従来の分析で検出するには低過ぎるが（糸球体で約１％のレベル）、落屑細胞の殆どが膀胱に由来するため尿沈渣の高感度ＲＴ‐ＱＰＣＲ分析に干渉する。
【００４０】
尿管における選択的単離ための足細胞の次の候補プローブはネフリンである。ネフリンは、足細胞の構造タンパク質であり、足細胞を分離するスリット膜を閉じるために用いられる分子である。ラット尿管組織の特定部位からのＲＮＡに対するラットＴａｑＭａｎプローブを用いて、ネフリンの転写を糸球体のみで観察した。このラットの解剖学的検査に加えて、エキソン２２と２３、及びエキソン２３と２４のそれぞれが３ｋｂ以上のイントロン配列で分離されているという事実から、ゲノム配列との交差反応の可能性を排除するようにヒト・ネフリン・プローブを作製した。ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒセットがこれら３つのエキソンに跨り、ヒトゲノムＤＮＡとの検出可能な反応は見られなかった。従って、ある実施形態では、本発明のために高感度かつ特異的なＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒネフリンプローブを作製した。
【００４１】
表１に、このネフリンプローブでは偽陽性が現れなかったことが示されている。プレート間アッセイ及びプレート内アッセイの両方が、ネフリンｍＲＮＡが正常な個人の尿沈渣に存在しないことを示した。加えて、正常な４０人からの２００以上の正常な尿沈渣の検査では、尿沈渣アッセイ（５ｍｌの尿の沈渣に一致）当たりネフリンｍＲＮＡ分子が２Ｅ＋００（＝２×１００＝２）を越える陽性が示されなかった。
【００４２】
ＲＮＡの分解による偽陽性の可能性についても評価した。β‐アクチンプローブを備えたＲＮＡ調製物を、質の高いＲＮＡが調製されたかを確認するために定期的に監視した。この品質管理は必要であるが、ネフリンｍＲＮＡの特定の分解または足細胞の脱分化によりネフリンが発現されなくなったかは示さなかった。このようなｇｌｅｐｐ１の脱分化は、局所分節性糸球体硬化症すなわち微小病変症または先天性ネフローゼの糸球体の足細胞で起こることが実証されている。しかしながら、全てのこのような疾患である実施形態のＲＴ‐ＱＰＣＲ検査でネフリンが検出されると、ネフリンを発現しない足細胞がこの技術に有意な問題である可能性が低くなる。
【００４３】
足細胞は通常、尿沈渣に分泌されないことを見出した。従って、尿沈渣アリコット当たり５を越えるネフリンｍＲＮＡの絶対数は異常と見なすことができる。正常なサンプルは２を超える値ではないが、腎容量及び腎臓が尿を濃縮する能力について多くの未知な点があるため、値５を安全な限界点として用いた。これが腎臓の濃縮能力を補うものではないが、通常は尿沈渣に存在しない僅かな数の細胞すなわち足細胞の存在を標準化する方法がないため、標準化を行うのは困難である。実際に、足細胞の落屑が時間のみで変化する場合、尿濃縮マーカー（クレアチニンなど）に対する標準化は適当でないであろう。好都合なことに、実質的に全てのネフリンの存在は異常である。
【００４４】
しかしながら、クレアチニンに対する標準化は一般的に行われているため、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲの値も、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲを実施した時に同じ尿のアリコットからの９６のサンプルで得たクレアチニン濃度で除して標準化した。このような標準化の後、９６のサンプルの内２つのサンプルのみが、初めの診断から開きがあった（ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ／尿クレアチニンの正常値と異常値との差、５×１０−２ｄｌ／ｍｇを切り捨て点として経験的に導いた）。更に、予期していたように、２種類の分析で開きがあったサンプルの両方が、ＲＴ‐ＱＰＣＲ値の境界線上であった。クレアチニン濃度は、桁がずれるほど変化することは殆どないが、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲの絶対値は数桁にわたって変化する。従って、ある実施形態のＡｍｌｉＳｅｎｓｏｒ技術は、データがクレアチニンに対する標準化の有無にかかわらず優れた特異性を示す。
【００４５】
小児腎疾患におけるＲＴ‐ＱＰＣＲ分析、ｕ‐足細胞、及び高蛋白尿の比較
表２に、尿におけるネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ、ポドカリキシン（podocalyxin）についてのｕ‐足細胞分析、及びアルブミンの存在が全て一致していないことが例示されている。尿におけるｕ‐足細胞及びアルブミンの分析は、日本でＭ．原博士が実施した。これらの分析に加えて、尿沈渣の一部をＲＮＡｌａｔｅｒ（キアゲン社（Qiagen））で処理した。ＲＮＡｌａｔｅｒ処理サンプルを室温で日本からミシガン州に輸送した。尿沈渣は、ミシガン州で、ＲＮＡｌａｔｅｒ処理細胞を遠心分離機にかけ、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、バイオトロニクス・プロトコル（前出）でＲＮＡを単離した。β‐アクチンプローブを用いたＴａｑＭａｎ ＲＴ‐ＱＰＣＲ分析で示されているように、ＰＣＲ品質のＲＮＡをルーチン業務で得た。
【００４６】
小児腎疾患の場合の尿アルブミン、ｕ‐足細胞数、及びネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲのレベルを比較した（表２）。ｕ‐足細胞数が異常な場合は全て、高蛋白尿が見られた（表２）。これとは対照的に、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが異常な多数の患者で、高蛋白尿または異常なｕ‐足細胞数が見られなかった（異常に高いｕ‐足細胞数のサンプルが異常な高蛋白尿サンプルのサブセットを構成する）。これらの分析により、小児腎疾患において、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲの異常が、ｕ‐足細胞数または高蛋白尿が異常でなくても起こることが実証された。従って、これらのネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常が、他の尿検査で検出されなかった患者群にも存在する。ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが相当な患者が高蛋白尿でないことは、高蛋白尿になっていない初期の患者から得たサンプルに一致する。
【００４７】
ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常が腎疾患に特異的
表３は、腎疾患に対するネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常の特異性を実証する。検査した多くの小児糸球体疾患では、少なくとも１つの尿沈渣がネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常を示した。これは、尿沈渣のネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲに関連した多数の小児糸球体疾患を示す表３に例示されている。対照的に、糸球体疾患ではない患者の検査では、尿沈渣にネフリンが全く存在しないことが示された。予想していたとおり、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲは腎移植に無関係である。このような異常の１つであるシスチン症は、蛋白尿を示したがネフリンの異常は示さなかった。これは、この疾患における糸球体ではなく尿細管起源の蛋白尿に一致し、尿の異常な蛋白は、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常を本質的に引き起こさない。
【００４８】
糖尿病における腎障害の分析時間の比較
Ｉ型糖尿病は発症時期を決定することができる。Ｉ型糖尿病の発症時期は明確である。更に、Ｉ型糖尿病では、腎疾患が臨床的に明らかになるまで何年もかかる。従って、この疾患の発症の後に起こる異常を決定して経時変化を作成することができる。ＩＩ型糖尿病の正確な発症時期は本質的にあいまいであるが、ＩＩ型糖尿病についても同様に分析することができる。
【００４９】
表４に、糖尿病の診断から１０年以内は、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常が高蛋白尿よりも割合が高いことが示されている。これは、診断後の初期では、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ検査が蛋白尿やｕ‐足細胞の検査よりも感度が良いことを示している。表４‐表６のデータを組み合わせると、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常が高蛋白尿が起こるよりも早い段階で明らかになることが分かる。ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常の多くの糖尿病患者の血圧は正常であるため、表４‐表６の異常は単に高血圧によるものではない（表７）。
【００５０】
糖尿病疾患の初期では、ＲＴ‐ＱＰＣＲ異常を示す患者の多くの尿沈渣に高蛋白尿が見られない。つまり、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが足細胞に特異的であって、蛋白尿が起こる前の疾患の初期で高感度に検出できるため、ＲＴ‐ＱＰＣＲが腎障害のマーカーとして有用である。違いは、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが足細胞の現在の状態をアッセイするのに対して、高蛋白尿は足細胞の喪失の影響を測定する。要するに、Ｉ型糖尿病の一時的な連続現象は、異常なネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ、蛋白尿、そして顕性腎疾患と続く。
【００５１】
電子顕微鏡法で、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常が識別できない疾患の後期に足細胞が残存することが実証された。これを裏付ける複数の可能性を以下に示す。
【００５２】
１．落屑した足細胞は、脱分化してネフリンＲＮＡを発現しなくなる可能性がある。このようなｇｌｅｐｐ１の発現の欠損は、疾患によって脱分化したある種の足細胞に見られる。
【００５３】
２．疾患の後期に落屑する足細胞は何れも、ＲＴ‐ＱＰＣＲに十分な質の高いＲＮＡを含むほど十分に生存可能に維持されない可能性がある。β‐アクチン分析は、尿沈渣ＲＮＡが十分に無傷でＲＴ‐ＱＰＣＲが可能であることを確認にするために定期的に実施されるが、足細胞のＲＮＡが十分に無傷でＲＴ‐ＱＰＣＲが可能であることを保証するものではない。
【００５４】
測定可能なネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲをもつ疾患の後期の多くの患者の所見からこれら２つの可能性は低い。
【００５５】
３．最も可能性の高い治療は、連続的な足細胞の喪失を効果的に防止することである。従って、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲは無視できる。尿中のアルブミンの上昇は、修復可能な範囲を超えて古い足細胞を腎臓が喪失した結果として起こると思われる。実際に、約５０％以上の足細胞が喪失した場合、喪失した足細胞を補うために残りの足細胞が十分に平坦化して恒久的な蛋白尿が起こる。この高蛋白尿は、足細胞の喪失がなくても観察できるため、継続していた足細胞の喪失が止まったような場合はネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲを無視できる。
【００５６】
第３の可能性は、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが正常で高蛋白尿の患者の全てが血圧を低下させるため及び足細胞の損傷を減少させるために薬物治療を受けているという事実によって支持される。表５に例示されているように、疾患の後期で蛋白尿が常に異常となるが、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲにより足細胞尿（podocyturia）を確認することができる。薬物（ＡＣＥインヒビターまたはアンジオテンシン２受容体遮断薬）治療を受けている高蛋白尿のＩ型糖尿病患者を１８症例検査した。このうち８症例ではネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが正常に低く、薬物治療で足細胞喪失が効果的に抑制されていることを示唆している。残りの１０症例では、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常が未だ見られ、薬物治療で足細胞喪失が効果的に抑制されてないことを示唆している。ＩＩ型糖尿病で同じ現象が見られた。薬物治療を受けている８人の高蛋白尿患者のうち４人で、正常に低いネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲの値が見られた。このデータは、如何にネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが薬物治療の有効性を決定するのに有効であるかを実証している。低いネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲの症例は、更なる足細胞の喪失が薬物治療により抑制されていることを示している。治療が足細胞の更なる喪失を抑制しているという仮説に一致し、たとえ電子顕微鏡法により足細胞が残っていると示されても、この時点でネフリンｍＲＮＡが尿沈渣の細胞では検出されないであろう。低いネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲの症例は、薬物治療が更なる足細胞の喪失を抑制していることを示している。
【００５７】
発症の時期の特定は、Ｉ型糖尿病よりもＩＩ型糖尿病でより困難である。これは、なぜネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲと高蛋白尿との境界の時間がＩ型糖尿病と比べＩＩ型糖尿病で長くないことで説明がつくであろう。ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常は、終期段階の腎疾患（ＥＳＲＤ）に進む前の大多数の患者で見られ、Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病の高感度分析によって無症状の腎疾患の患者が多いことが示された。
【００５８】
経時分析（表６）は、糖尿病に関連した腎疾患が以前の認識よりも多い可能性を示唆している。検査した半数以上の患者で、少なくとも１つの尿沈渣にネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常（ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ＞５Ｅ＋００）が見られた。全ての尿沈渣が、恒常的に発現するβ‐アクチンプローブに対して陽性であるため、正常なサンプル（ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ＜５Ｅ＋００）が足細胞尿の非存在を示す可能性が高い。もしそうであれば、表６のデータは、足細胞尿が断続的であり、糖尿病では一般的な現象であることを示している。もしそうであれば、腎臓の状態及び治療に対する反応を監視するために、糖尿病の間に尿沈渣のＲＴ‐ＱＰＣＲを長期に亘って監視する必要がある。
【００５９】
従って、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ検査を臨床的に使用できる可能性が少なくとも２つある。疾患の初期では、他の検査の前にネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが異常になり、初期の腎疾患を高感度に検出できる可能性がある。治療中の疾患の後期では、高蛋白尿が存在する時にネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが正常であり得、足細胞の喪失が、高蛋白尿になる永久型の疾患である必要がないという事実を示している。この結果、高蛋白尿が永久的に異常である疾患の後期で、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲにより、治療で足細胞喪失が有効に抑制いされているか否かを決定できるはずである。
【００６０】
高血圧及び全身性エリテマトーデス
これらの疾患の両方で、足細胞の異常が見られる（表７‐表８）。ここでも、終期段階の腎疾患（ＥＳＲＤ）がこの足細胞喪失に続いて起こる可能性が高い。尿沈渣がネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常である患者が多数存在し、これにより、このような疾患に足細胞が関与すると推定できる。
【００６１】
腎癌
癌は、正常に付着しない細胞増殖に関係する。その結果、腎癌では、正常な尿沈渣では見られない腎細胞の落屑が起こる場合がある。ＲＮＡｌａｔｅｒで処理した２２のこのような尿沈渣を、フランスのストラスブルグ（Strasboug）の医師ピエール・オウデ（Dr. Pieer Oudet）から入手した。この尿沈渣のうち２１で、ネフリンの異常な存在が観察された。この結果は、ネフリンを発現する腎細胞の脱分化及び／または足細胞尿を用いて腎癌を検出できることを示している。従って、本発明は、ネフリン転写についての尿沈渣の非侵襲的な検査によって腎癌を診断し、かつ治療に対するその反応を監視する新規な有用な方法を含む。ここでも、足細胞特異的な転写物の高感度検出が必要である。
【００６２】
ネフリンと足細胞尿は相互に関連しない
ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲと足細胞尿は相互に関連しない（尿の全蛋白／クレアチニンまたはアルブミン／クレアチニンによって測定）。正常なサンプルではこれらの測定値は何れも変化しないため、これらの正の値は全て異常を示している。この相互関連の欠如が、２つの技術が異なった性状を測定することを実証している。ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが、尿沈渣中の足細胞特異的遺伝子、ネフリンの存在を決定して足細胞の現在の喪失を評価する。有意な足細胞の喪失が蛋白尿が検出可能となる前に起こるはずであるため、ＲＴ‐ＱＰＣＲ検査が蛋白尿の前に異常となるのは驚くことではない。ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが検出できない時に尿の蛋白損失を継続して示すサンプルは、足細胞の損失は止まっているが以前の足細胞の損失により相当な異常が残っている患者のものであると推定できる。この結果、たとえ継続した足細胞の喪失がなくても、慢性蛋白尿になる血流と尿流の永久的な連通が存在する。
【００６３】
ある実施形態のネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲは、足細胞に影響を与える疾患の非侵襲的な監視を実現する。ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲは、尿管の足細胞のみで発現する遺伝子に集中して、足細胞の疾患をスクリーニングするようにデザインされている。ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ検査の断続性は、高蛋白尿の所見が経時変化する高蛋白尿検査を思い出させる。実際に、高蛋白尿は、長期に亘ってに研究した糖尿病患者で正常に戻ることがある。このような所見は、Ｉ型糖尿病の大多数の患者がその糖尿病による腎障害があり、その一部のみが終期段階の腎疾患（ＥＳＲＤ）に進むという仮定に一致している。しかしながら、持続性の高蛋白尿の患者が腎症になる危険があるため、高蛋白尿のアッセイは依然として有用である。ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ検査とアルブミン尿検査とを組み合わせることにより、腎疾患の進行及びその治療の段階をより正確に診断することができる。
【００６４】
要するに、本発明のネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ検査（またはその類似検査）は、足細胞に影響を与えている疾患の初期の影響の検出と、治療に対する足細胞の反応の監視の両方に有用なはずである。
【００６５】
Ｂ．近位尿細管細胞
近位尿細管のマーカーとしてのインドハリネズミ
腎臓の様々な構造学的部分に対する複数の分子マーカーを研究した。このような分子マーカーには、近位曲尿細管及び近位直尿細管のインドハリネズミ、近位尿細管のｎ‐アセチルβ‐Ｄ‐グルコサミニダーゼ、近位尿細管及び下行細脚細胞（descending thin limb cells）のアクアポリン１、近位曲尿細管及び近位直尿細管のＳＬＣ３Ａ１、及び遠位尿細管のウロモジュリン（uromodulin）がある。これらのプローブのＴａｑＭａｎ分析により、正常では著しいバックグラウンド（下部尿管細胞の発現による）がないヒトの唯一のプローブがインドハリネズミプローブであることが示された。これは、アプリオリに知ることができなかった。ネフリンと同様に、４０もの正常コントロール尿沈渣で実施した。これにより、異常値＞１０−４が、インドハリネズミのＲＴ‐ＱＰＣＲ／β‐アクチンのＲＴ‐ＱＰＣＲ（表９）の比が正常なコントロールでは起こらないことが示された。高感度ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒシステムを必要とする少数の足細胞が尿沈渣に落屑したネフリンの場合とは異なり、インドハリネズミ遺伝子の発現についてのＴａｑＭａｎ分析で近位尿管細胞の落屑を検出した。限られた数の高度に特殊化した足細胞が腎臓が完全に成長すると積極的に複製しないため、稀な足細胞と豊富な近位尿細管細胞のこの量的な差は納得できる。対照的に、より豊富な近位尿細管細胞は成人しても複製することができる。
【００６６】
近位尿細管細胞の異常は、β‐アクチンコントロール信号に対する比と定義し、尿沈渣内に排泄される近位尿細管細胞の割合を反映する。こ標準化する必要性は、少量のインドハリネズミ転写物が正常で排泄されるという事実を反映している。従って、正常では実質的に信号が検出されないネフリンの場合とは異なり、正常でも測定可能なインドハリネズミの信号が存在し得る。正常の定義（インドハリネズミのＲＴ‐ＱＰＣＲ／β‐アクチンのＲＴ‐ＱＰＣＲの比が＜１０−４）はどうしてもある程度の異常を含むため、安全な基準を用いて誤った異常信号が実質的に生成されないようにする。４０の正常コントロールサンプルの中で、インドハリネズミのＲＴ‐ＱＰＣＲ／β‐アクチンのＲＴ‐ＱＰＣＲの比が１０−４よりも大きい値を示したものはない。
【００６７】
閉塞性障害
尿細管疾患が、閉塞性障害の病因に重要な役割を果たす。閉塞性障害の場合、尿細管疾患で近位尿細管細胞の尿内への落屑が見られる（インドハリネズミｍＲＮＡの存在でアッセイした）。尿沈渣ＲＮＡ中で足細胞マーカーであるネフリンの発現が見られない時には、有意な足細胞成分が観察されなかった（表９）。インドハリネズミのＲＴ‐ＱＰＣＲ検査は、近位尿細管細胞を現在喪失していない閉塞障害患者と近位尿細管細胞を現在喪失している閉塞障害患者とを区別できるため特に有用である（表１０Ａ）。表１０Ｂに、経時アッセイによって所定の患者で得た値が示されている。全ての尿沈渣が十分に保存されていることが、β‐アクチン標準を用いたＲＴ−ＱＰＣＲで確認された。異常な値の断続性は、腎臓に対する影響が変動していることを示唆している。連続する継続的な異常の存在は、腎臓に影響を与える疾患が継続して存在することを示唆している。
【００６８】
ある症例では、近位尿細管細胞が元の病変腎臓または移植した腎臓の何れに由来するかが明らかではないが、本発明は、閉塞性疾患での近位尿細管細胞の落屑を監視する高感度で非侵襲的な方法を含む。
【００６９】
急性尿細管壊死
急性尿細管壊死（ＡＴＮ）は、様々な病態で観察され、生命にかかわることがある。この障害の初期の診断を行って特定の治療を決定するのが有利である。この障害の根底にある近位尿細管疾患を高感度に検出する自然排泄された尿の非侵襲的な検査は、この障害を監視する理想的な方法である。トリパンブルーを排除する生存近位尿細管細胞の尿への落屑がこの障害で確認された。これは、近位尿細管特異的遺伝子産物であるインドハリネズミについてのＲＴ‐ＱＰＣＲでこのような近位尿細管細胞を検出する理論的根拠を支える。
【００７０】
尿沈渣のＲＴ‐ＱＰＣＲを、インドハリネズミのＴａｑＭａｎプローブを用いて急性尿細管壊死（ＡＴＮ）の問題に適用した（表１１）。従って、尿沈渣への近位尿細管細胞の落屑の半量的な測定（インドハリネズミのＲＴ‐ＱＰＣＲ／恒常的に発現する遺伝子であるβ‐アクチンのＲＴ‐ＱＰＣＲの比から得た）がこの障害を検出するのに有用である。表１１に示されているように、ＲＴ‐ＱＰＣＲを用いて急性尿細管壊死の存在及びその重症度を検出することができる。表１１に示されている全ての患者にＡＴＮと共存する尿障害が起こった。しかしながら、実際にどの患者がＡＴＮで、どの患者が他の障害であるか分からない。近位尿細管細胞を排泄しＡＴＮをもつ尿にインドハリネズミが存在する患者は、ＡＴＮと共存する症状があるがこの障害のない患者から確実に区別される。従って、尿におけるインドハリネズミの存在は、ＡＴＮの存在及びそれに続くＡＴＮの治療のためにスクリーニングする方法を表わす。
【００７１】
糸球体病理学に関連する様々な腎障害におけるインドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲ異常
インドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲが腎臓に対する主な障害の影響を反映するＡＴＮ及び閉塞障害に加えて、インドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲが、腎臓に対する主な影響が糸球体であると考えられる様々な障害で上昇し得る。具体的には、この中には、糸球体病理学を反映する糸球体腎炎（glomerulonephritidies）やネフローゼ症候群などの非閉塞性腎障害、糖尿病、高血圧、及び狼瘡が含まれる。この方法を用いて、これらの障害の全てにおいて、足細胞特異的な遺伝子であるネフリンの存在を尿沈渣で検出した。これらの障害の主な糸球体の影響にもかかわらず、近位尿細管の影響も顕著であった。これらの障害で近位細尿管細胞に対する影響があることがＲＴ‐ＱＰＣＲアッセイで確認された（表１２‐表１３）。
【００７２】
表１２‐表１３に、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲとインドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲが、様々な既知の糸球体障害（糖尿病、高血圧、狼瘡、及び小児腎臓病患者の糸球体障害）の所定時期でしばしば一致しないことが例示されている。これらの異常の経時変化を調べるために、慢性障害である糖尿病を用いた。なぜなら、糖尿病の発症が急であり、特にＩ型糖尿病は記録が容易であるからである。しかしながら、糖尿病の腎障害は、臨床的に明らかになるまで進行するのに何年もかかる。表１２に、診断後の最初の１０年は、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ異常とインドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲ異常が高蛋白尿よりも頻繁に見られることが例示されている。しかしながら、たとえ同じ患者であっても、足細胞の発生と近位尿細管異常の間に不一致が存在する（表１３Ａ）。また、インドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲ異常と高アルブミン白尿との間にも不一致が存在する（表１３Ｂ）。表１２‐表１３のデータを組み合わせると、ネフリン及び／またはインドハリネズミのＲＴ‐ＱＰＣＲ異常が、疾患における高蛋白尿の発生よりも早期に起こることが分かる。ＲＴ‐ＱＰＣＲ異常の糖尿病患者の多くで、血圧異常が見られるため、表１２‐表１３の異常は単に高血圧によるものではない（表７）。
【００７３】
高蛋白尿でネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲが正常であり得るという所見と同様に、高蛋白尿でインドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲも正常であり得る。ここでも、高蛋白尿により、血流と尿流との足細胞障壁の完全性に対する長期に亘る損傷を測定でき、インドハリネズミ／β‐アクチンＲＴ−ＱＰＣＲにより近位尿細管細胞の急激な喪失を測定できる。
【００７４】
ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ、インドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲ、及び高蛋白尿（全蛋白／クレアチニンまたはアルブミン／クレアチニンによって測定）が相互に関連するかを確かめるべく、十分な数のＩ型糖尿病の分析を実施した。相互関連は見られず、これらの測定値は依存関係にない。正常ではこれらの測定値は何れも陽性ではなく、これらの測定値が陽性であることは異常を示すことに留意されたい。驚くべきことに、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ及びインドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲの測定値は、検査した全ての疾患で互いに独立していた（表９）。同じ患者の経時分析により、所定の患者が時間によって異常が異なる（データは不図示）ことを証明できることに留意されたい。時間によって同じ患者で高蛋白尿が変化し得るという所見から、糖尿病、高血圧、及び狼瘡の腎臓への影響を調べる際の尿検査利用の複雑さが理解できよう。しかしながら、尿検査は、これらの障害の腎臓に対する影響を本質的に強力かつ非侵襲的に検査できる。近位尿細管の障害は、初期の糖尿病及び局所分節性糸球体硬化症で現れ、表９にその存在の直接的な証拠が示されている。
【００７５】
要約すると、本発明は、尿沈渣の検査によって腎臓の足細胞異常及び近位尿細管異常の両方を検出するための新規な方法、システム、及び組成を含む。ある実施形態では、足細胞及び／または近位尿細管細胞の検出は、足細胞及び／または近位尿細管細胞でユニークに転写される遺伝子の転写物のスクリーニングにより行うことができる。本発明は、足細胞及び／または近位尿細管細胞の落屑がこのような細胞に影響を与える様々な障害で起こるが、正常では起こらないという予期していなかった発見を含む。更に、落屑した細胞型の分子の同定を、足細胞特異的遺伝子または近位尿細管細胞特異的遺伝子であるため尿管起源の足細胞または近位尿細管細胞で選択的に発現する遺伝子の転写物のスクリーニングにより行うことができる。本発明の以前には、これら２つの事実は知られていなかった。限定するものではないが、本発明の好適な実施形態は、これを達成するためにネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲ及びインドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲを用いる。
【００７６】
本発明は、足細胞特異的遺伝子（ネフリン）または近位尿細管細胞特異的遺伝子（インドハリネズミ）についてのＲＴ‐ＱＰＣＲを用いたスクリーニングを含む。このような遺伝子転写物を検出して尿に落屑する腎細胞を同定する概念は本発明の新規な部分である。この方法は、保存されたＲＮＡの高感度分析を行う前に尿沈渣細胞（またはその断片）の尿ＲＮＡを保存できて初めて実現可能である。現在用いられているように、ある実施形態では、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲで足細胞異常を検出でき、インドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲで近位尿細管細胞の異常を検出できる。従って、ネフリンＲＴ‐ＱＰＣＲは、様々な障害の足細胞に対する影響を決定する有用な方法である。インドハリネズミＲＴ‐ＱＰＣＲは、閉塞性疾患または急性尿細管壊死の近位尿細管に対する影響を決定する有用な方法である。
【００７７】
本発明の好適な実施形態を開示してきたが、当業者であれば、一定の変更形態が本発明の開示内容の範囲であることを理解できよう。また、本発明の範囲及び内容を決定するために添付の特許請求の範囲を検討すべきである。加えて、本発明の方法及び組成は、様々な実施形態の形にすることができるが、少数の実施形態をここに開示した。当業者であれば、本発明の概念から逸脱しない他の実施形態が存在することを理解できよう。従って、開示した実施形態は単に例示目的であって限定することが目的ではない。
【００７８】
配列番号リスト
配列番号１： 5’-GCCCCGAGGGTCCTGAAGGTG-3’
配列番号２： 5’-TGGACTGGCTGACAAAGGGACCCAG-3’
配列番号３： 5’-TACTGGAGAACCTGAAGACCAGCTGCC-3’
配列番号４： 5’-CAATTACAATCCAGACATCATCTTCAA-3’
配列番号５： 5’-CGAGATAGCCAGCGAGTTCAG-3’
配列番号６： 5’-CATGACCCAGCGCTGCAAGGAC-3’
配列番号７： 5’-AACTTGAGATGTATGAAGGCTTTTGG-3’
配列番号８： 5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAG-3’
配列番号９： 5’-CAACTGGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGCCCT-3’
【００７９】
【表１】
2005534892.tif 000003
【００８０】
【表２】
2005534892.tif 000004
【００８１】
【表３】
2005534892.tif 000005
【００８２】
【表４】
2005534892.tif 000006
【００８３】
【表５】
2005534892.tif 000007
【００８４】
【表６】
2005534892.tif 000008
【００８５】
【表７】
2005534892.tif 000009
【００８６】
【表８】
2005534892.tif 000010
【００８７】
【表９】
2005534892.tif 000011
【００８８】
【表１０Ａ】
2005534892.tif 000012
【００８９】
【表１０Ｂ】
2005534892.tif 000013
【００９０】
【表１１】
2005534892.tif 000014
【００９１】
【表１２】
2005534892.tif 000015
【００９２】
【表１３】
2005534892.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１Ａ】ＴａｑＭａｎアッセイにおけるステップの一実施形態を示す図である。
【図１Ｂ】ＴａｑＭａｎアッセイにおけるステップの一実施形態を示す図である。
【図２】ＡｍｐｌｉＳｅｎｏｓｒアッセイにおけるステップの一実施形態を示す図である。
【図３】限定目的ではない本発明の一実施形態におけるステップのフローチャートである。
【図１Ａ】
2005534892.tif 000017
【図１Ｂ】
2005534892.tif 000018
【図２】
2005534892.tif 000019
【図３】
2005534892.tif 000020
【配列表】
2005534892000001.app