(57)【要約】クラスＩエピトープのヘテロクリティックアナログを、これらのエピトープの３位および／または４位および／または５位および／または６位および／または７位および／または８位および／または９位および／または１０位に保存的、半保存的または非保存的アミノ酸置換を施すことによって調製する。このアナログは、対応する野生型エピトープに対する免疫応答を誘発するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩペプチドエピトープのアナログを含むポリペプチドを産生する方法であって、
前記アナログは前記エピトープと比べて高められた免疫原性を有し、前記方法は、
（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩエピトープを特定するステップであって、
式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、
ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、
ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、
ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となり得るようにｘ＝８〜１１であり、
Ｒ２またはＲ３およびＲｘは、モチーフまたはスーパーモチーフの一次アンカー残基であるステップと、
（ｂ）アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、前記アナログは、Ｒ３および／またはＲ５および／またはＲ７における１つまたは複数の保存的または半保存的アミノ酸置換以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含み、前記１つまたは複数の置換は一次アンカー残基のものではないステップ
とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩエピトープを特定するステップであって、
式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、
ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、
ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、
ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となるようにｘ＝８〜１１であり、
Ｒ２またはＲ３およびＲｘは、モチーフまたはスーパーモチーフの一次アンカー残基であり、
Ｒ３はＩｌｅであるステップと、
（ｂ）アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、前記アナログは、Ｒ３がＭｅｔである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含むステップ
とを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩペプチドエピトープを特定するステップであって、
式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、
ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、
ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、
ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となるようにｘ＝８〜１１であり、
Ｒ２またはＲ３およびＲｘは、モチーフまたはスーパーモチーフの一次アンカー残基であり、
Ｒ７はＴｙｒであるステップと、
（ｂ）アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、前記アナログは、Ｒ７がＨｉｓである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含むステップ
とを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩペプチドエピトープを特定するステップであって、
式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、
ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、
ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、
ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となるようにｘ＝８〜１１であり、
Ｒ２またはＲ３およびＲｘは、モチーフまたはスーパーモチーフの一次アンカー残基であり、
Ｒ７はＴｙｒであるステップと、
（ｂ）アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、前記アナログは、Ｒ７がＭｅｔである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含むステップ
とを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第２のクラスＩエピトープは、特定のＴ細胞に対して第１のクラスＩエピトープに比べて少なくとも約５０％増加した効力を示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１つのみの置換を導入することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記置換は保存的置換であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記置換は半保存的置換であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のクラス１エピトープを含む前記ペプチドは、前記ペプチドがＨＬＡクラスＩ分子によって結合され、かつ細胞障害性Ｔ細胞と接触されたときに、Ｔｈ１とＴｈ２の両方のサイトカインを誘導することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のクラスＩエピトープは、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２からなる群から選択されるスーパーモチーフを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のクラスＩエピトープは、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原、細菌抗原または真菌抗原に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法によって調製される前記第２のクラスＩエピトープを含むペプチド。
【請求項１３】
細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）を請求項９に記載のペプチドと接触させるステップを含むことを特徴とする、免疫応答を誘発する方法。
【請求項１４】
前記接触させるステップを抗原提示細胞の存在下でインビトロで実施することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触させるステップが、前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を対象に投与することによって実施されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１個のペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは、請求項１に記載の方法によって得ることができるクラスＩエピトープを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１７】
前記ペプチドは９〜１５個のアミノ酸を含有することを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８および配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ペプチドはＣＴＬエピトープと混合または結合されていることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドはＨＴＬエピトープと混合または結合されていることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＨＴＬエピトープはｐａｎ−ＤＲ結合分子であることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
さらにリポソームを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２３】
前記エピトープは脂質に結合されていることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
前記エピトープはヘテロポリマーに含まれていることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記エピトープはホモポリマーに含まれていることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記エピトープは、ＨＬＡ重鎖、β２−ミクログロブリンおよびストレプアビジン複合体に結合し、それによって四量体が形成されていることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２７】
さらに抗原提示細胞を含み、前記エピトープは前記抗原提示細胞上または前記抗原提示細胞内にあることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記エピトープは、前記抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合され、それによってＨＬＡ分子に制限された細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）が存在するときに、前記ＣＴＬの受容体は前記ＨＬＡ分子と前記エピトープの複合体に結合することを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗原提示細胞は樹状細胞であることを特徴とする、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
ＨＬＡ分子をさらに含み、前記ペプチドは前記ＨＬＡ分子によって結合されていることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項３１】
標識をさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項３２】
前記標識は、モノクローナル抗体が結合するビオチン、蛍光成分、非哺乳動物の糖、放射標識または小分子であることを特徴とする、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
単位投与量の前記ペプチドおよび薬学的賦形剤を含有するワクチンであることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１に記載の方法によって得ることができる第２のクラスＩエピトープを含む９〜１５アミノ酸のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項３５】
前記ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８および配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるエピトープを含むことを特徴とする、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３６】
前記ヌクレオチド配列を発現するための制御配列をさらに含むことを特徴とする、請求項３２に記載の核酸分子。
【請求項３７】
活性成分として請求項３１に記載の核酸分子を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項３８】
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩペプチドエピトープのアナログを含むポリペプチドを産生する方法であって、
前記アナログは前記エピトープに比べて高められた免疫原性を有し、前記方法は、
（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩエピトープを特定するステップであって、
式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、
ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、
ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、
ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となり得るようにｘ＝８〜１１であり、
Ｒ２およびＲｘは、Ｂ７スーパーモチーフの一次アンカー残基であるステップと、
（ｂ）アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、前記アナログは、Ｒ３および／またはＲ５および／またはＲ７の１つまたは複数が非保存的アミノ酸置換を含む以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含むステップとを含むこと
を特徴とする方法。
【請求項３９】
（ａ）式（Ａ）を含むクラスＩペプチドエピトープを特定するステップであって、
式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、
ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、
ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、
ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となり得るようにｘ＝８〜１１であり、
Ｒ２およびＲｘは、Ｂ７スーパーモチーフの一次アンカー残基であり、
Ｒ７はＴｙｒであるステップと、
アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、前記アナログは、Ｒ７において、ＴｙｒがＧｌｙ、ＧｌｕまたはＡｓｐで置換されている以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含むステップとを含むこと
を特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）ヘテロクリティックアナログＨＬＦＰＹＳＷＹＫ（配列番号１１）
（ｂ）ヘテロクリティックアナログＨＬＦＧＹＳＬＹＫ（配列番号１３）
（ｃ）ヘテロクリティックアナログＨＬＦＧＹＳＭＹＫ（配列番号１４）
（ｄ）ヘテロクリティックアナログＨＬＦＧＹＳＩＹＫ（配列番号１５）
（ｅ）ヘテロクリティックアナログＨＬＦＧＹＳＤＹＫ（配列番号１６）
（ｆ）ヘテロクリティックアナログＨＬＦＧＹＳＧＹＫ（配列番号１７）、および
（ｇ）ヘテロクリティックアナログＨＬＦＧＹＳＣＹＫ（配列番号１８）からなる群から選択される癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の少なくとも１個のヘテロクリティックアナログを含むポリペプチド。
【請求項４１】
ＣＥＡの１個を超えるヘテロクリティックアナログを含むことを特徴とする、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
表７、１３〜１５および１８のＣＥＡエピトープおよびアナログからなる群から選択される少なくとも１個のペプチドを含むことを特徴とする、請求項４０または４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
（ａ）配列番号68の、アミノ酸61〜69；
（ｂ）配列番号68の、アミノ酸61〜70、61〜71、61〜72、61〜73、61〜74、61〜75、61〜76、61〜77、61〜78、61〜79、61〜80、61〜81、61〜82、61〜83、61〜84、61〜85、61〜86、61〜87、61〜88、61〜89、61〜90、61〜91、61〜92、61〜93、61〜94、61〜95、61〜96、61〜97、61〜98、61〜99、61〜100、61〜101、61〜102、61〜103、61〜104、61〜105、61〜106、61〜107、61〜108、61〜109、61〜110、61〜111、61〜112、61〜113、61〜114、61〜115、61〜116、61〜117、61〜118、61〜119、61〜120、61〜121、61〜122、61〜123、61〜124、61〜125、61〜126、61〜127、61〜128、61〜129、61〜130、61〜131、61〜132、61〜133、61〜134、61〜135、61〜136、61〜137、61〜138、61〜139、61〜140、61〜141、61〜142、61〜143、61〜144、61〜145、61〜146、61〜147、61〜148、61〜149、61〜150、61〜151、61〜152、61〜153、61〜154、61〜155、61〜156、61〜157、61〜158、61〜159、61〜160、61〜161、61〜162、61〜163、61〜164、61〜165、61〜166、61〜167、61〜168、61〜169、61〜170、61〜171、61〜172、61〜173、61〜174、61〜175、61〜176、61〜177、61〜178、61〜179、61〜180、61〜181、61〜182、61〜183、61〜184、61〜185、61〜186、61〜187、61〜188、61〜189、61〜190、61〜191、61〜192、61〜193、61〜194、61〜195、61〜196、61〜197、61〜198、61〜199、61〜200、61〜201、61〜202、61〜203、61〜204、61〜205、61〜206、61〜207、61〜208、61〜209、61〜210、61〜211、61〜212、61〜213、61〜214、61〜215、61〜216、61〜217、61〜218、61〜219、61〜220、61〜221、61〜222、61〜223、61〜224、61〜225、61〜226、61〜227、61〜228、61〜229、61〜230、61〜231、61〜232、61〜233、61〜234、61〜235、61〜236、61〜237、61〜238、61〜239、61〜240、61〜241、61〜242、61〜243、61〜244、61〜245、61〜246、61〜247、61〜248、61〜249、61〜250、61〜251、61〜252、61〜253、61〜254、61〜255、61〜256、61〜257、61〜258、61〜259、61〜260、61〜261、61〜262、61〜263、61〜264、61〜265、61〜266、61〜267、61〜268、61〜269、61〜270、61〜271、61〜272、61〜273、61〜274、61〜275、61〜276、61〜277、61〜278、61〜279、61〜280、61〜281、61〜282、61〜283、61〜284、61〜285、61〜286、61〜287、61〜288、61〜289、61〜290、61〜291、61〜292、61〜293、61〜294、61〜295、61〜296、61〜297、61〜298、61〜299、61〜300、61〜301、61〜302、61〜303、61〜304、61〜305、61〜306、61〜307、61〜308、61〜309、61〜310、61〜311、61〜312、61〜313、61〜314、61〜315、61〜316、61〜317、61〜318、61〜319、61〜320、61〜321、61〜322、61〜323、61〜324、61〜325、61〜326、61〜327、61〜328、61〜329、61〜330、61〜331、61〜332、61〜333、61〜334、61〜335、61〜336、61〜337、61〜338、61〜339、61〜340、61〜341、61〜342、61〜343、61〜344、61〜345、61〜346、61〜347、61〜348、61〜349、61〜350、61〜351、61〜352、61〜353、61〜354、61〜355、61〜356、61〜357、61〜358、61〜359、61〜360、61〜361、61〜362、61〜363、61〜364、61〜365、61〜366、61〜367、61〜368、61〜369、61〜370、61〜371、61〜372、61〜373、61〜374、61〜375、61〜376、61〜377、61〜378、61〜379、61〜380、61〜381、61〜382、61〜383、61〜384、61〜385、61〜386、61〜387、61〜388、61〜389、61〜390、61〜391、61〜392、61〜393、61〜394、61〜395、61〜396、61〜397、61〜398、61〜399、61〜400、61〜401、61〜402、61〜403、61〜404、61〜405、61〜406、61〜407、61〜408、61〜409、61〜410、61〜411、61〜412、61〜413、61〜414、61〜415、61〜416、61〜417、61〜418、61〜419、61〜420、61〜421、61〜422、61〜423、61〜424、61〜425、61〜426、61〜427、61〜428、61〜429、61〜430、61〜431、61〜432、61〜433、61〜434、61〜435、61〜436、61〜437、61〜438、61〜439、61〜440、61���441、61〜442、61〜443、61〜444、61〜445、61〜446、61〜447、61〜448、61〜449、61〜450、61〜451、61〜452、61〜453、61〜454、61〜455、61〜456、61〜457、61〜458、61〜459、61〜460、61〜461、61〜462、61〜463、61〜464、61〜465、61〜466、61〜467、61〜468、61〜469、61〜470、61〜471、61〜472、61〜473、61〜474、61〜475、61〜476、61〜477、61〜478、61〜479、61〜480、61〜481、61〜482、61〜483、61〜484、61〜485、61〜486、61〜487、61〜488、61〜489、61〜490、61〜491、61〜492、61〜493、61〜494、61〜495、61〜496、61〜497、61〜498、61〜499、61〜500、61〜501、61〜502、61〜503、61〜504、61〜505、61〜506、61〜507、61〜508、61〜509、61〜510、61〜511、61〜512、61〜513、61〜514、61〜515、61〜516、61〜517、61〜518、61〜519、61〜520、61〜521、61〜522、61〜523、61〜524、61〜525、61〜526、61〜527、61〜528、61〜529、61〜530、61〜531、61〜532、61〜533、61〜534、61〜535、61〜536、61〜537、61〜538、61〜539、61〜540、61〜541、61〜542、61〜543、61〜544、61〜545、61〜546、61〜547、61〜548、61〜549、61〜550、61〜551、61〜552、61〜553、61〜554、61〜555、61〜556、61〜557、61〜558、61〜559、61〜560、61〜561、61〜562、61〜563、61〜564、61〜565、61〜566、61〜567、61〜568、61〜569、61〜570、61〜571、61〜572、61〜573、61〜574、61〜575、61〜576、61〜577、61〜578、61〜579、61〜580、61〜581、61〜582、61〜583、61〜584、61〜585、61〜586、61〜587、61〜588、61〜589、61〜590、61〜591、61〜592、61〜593、61〜594、61〜595、61〜596、61〜597、61〜598、61〜599、61〜600、61〜601、61〜602、61〜603、61〜604、61〜605、61〜606、61〜607、61〜608、61〜609、61〜610、61〜611、61〜612、61〜613、61〜614、61〜615、61〜616、61〜617、61〜618、61〜619、61〜620、61〜621、61〜622、61〜623、61〜624、61〜625、61〜626、61〜627、61〜628、61〜629、61〜630、61〜631、61〜632、61〜633、61〜634、61〜635、61〜636、61〜637、61〜638、61〜639、61〜640、61〜641、61〜642、61〜643、61〜644、61〜645、61〜646、61〜647、61〜648、61〜649、61〜650、61〜651、61〜652、61〜653、61〜654、61〜655、61〜656、61〜657、61〜658、61〜659、61〜660、61〜661、61〜662、61〜663、61〜664、61〜665、61〜666、61〜667、61〜668、61〜669、61〜670、61〜671、61〜672、61〜673、61〜674、61〜675、61676、61〜677、61〜678、61〜679、61〜680、61〜681、61〜682、61〜683、61〜684、61〜685、61〜686、61〜687、61〜688、61〜689、61〜690、61〜691、61〜692、61〜693、61〜694、61〜695、61〜696、61〜697、61〜698、61〜699、61〜700、61〜701、および61〜702；および
（ｃ）配列番号68の、アミノ酸1〜69、2〜69、3〜69、4〜69、5〜69、6〜69、7〜69、8〜69、9〜69、10〜69、11〜69、12〜69、13〜69、14〜69、15〜69、16〜69、17〜69、18〜69、19〜69、20〜69、21〜69、22〜69、23〜69、24〜69、25〜69、26〜69、27〜69、28〜69、29〜69、30〜69、31〜69、32〜69、33〜69、34〜69、35〜69、36〜69、37〜69、38〜69、39〜69、40〜69、41〜69、42〜69、43〜69、44〜69、45〜69、46〜69、47〜69、48〜69、49〜69、50〜69、51〜69、52〜69、53〜69、54〜69、55〜69、56〜69、57〜69、58〜69、59〜69、60〜69
からなる群から選択されるＣＥＡの断片を含むことを特徴とする、請求項４０から４２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４４】
（ａ）ヘテロクリティックアナログＥＹＩＱＬＶＦＧＩ（配列番号２１）、
（ｂ）ヘテロクリティックアナログＥＹＬＥＬＶＦＧＩ（配列番号２２）、
（ｃ）ヘテロクリティックアナログＥＹＬＬＬＶＦＧＩ（配列番号２３）、
（ｄ）ヘテロクリティックアナログＥＹＬＱＬＭＦＧＩ（配列番号２４）、および
（ｅ）ヘテロクリティックアナログＥＹＬＱＬＬＦＧＩ（配列番号２５）からなる群から選択されるメラノーマ抗原２（ＭＡＧＥ２）の少なくとも１個のヘテロクリティックアナログを含むポリペプチド。
【請求項４５】
ＭＡＧＥ２の１個を超えるヘテロクリティックアナログを含むことを特徴とする、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
表７、８、１３〜１５および１８のＭＡＧＥ２エピトープおよびアナログからなる群から選択される少なくとも１個のペプチドを含むことを特徴とする、請求項４４または４５に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
（ａ）配列番号69の、アミノ酸157〜163〜69；
（ｂ）配列番号69の1〜163、2〜163、3〜163、4〜163、5〜163、6〜163、7〜163、8〜163、9〜163、10〜163、11〜163、12〜163、13〜163、14〜163、15〜163、16〜163、17〜163、18〜163、19〜163、20〜163、21〜163、22〜163、23〜163、24〜163、25〜163、26〜163、27〜163、28〜163、29〜163、30〜163、31〜163、32〜163、33〜163、34〜163、35〜163、36〜163、37〜163、38〜163、39〜163、40〜163、41〜163、42〜163、43〜163、44〜163、45〜163、46〜163、47〜163、48〜163、49〜163、50〜163、51〜163、52〜163、53〜163、54〜163、55〜163、56〜163、57〜163、58〜163、59〜163、60〜163、61〜163、62〜163、63〜163、64〜163、65〜163、66〜163、67〜163、68〜163、69〜163、70〜163、71〜163、72〜163、73〜163、74〜163、75〜163、76〜163、77〜163、78〜163、79〜163、80〜163、81〜163、82〜163、83〜163、84〜163、85〜163、86〜163、87〜163、88〜163、89〜163、90〜163、91〜163、92〜163、93〜163、94〜163、95〜163、96〜163、97〜163、98〜163、99〜163、100〜163、101〜163、102〜163、103〜163、104〜163、105〜163、106〜163、107〜163、108〜163、109〜163、110〜163、111〜163、112〜163、113〜163、114〜163、115〜163、116〜163、117〜163、118〜163、119〜163、120〜163、121〜163、122〜163、123〜163、124〜163、125〜163、126〜163、127〜163、128〜163、129〜163、130〜163、131〜163、132〜163、133〜163、134〜163、135〜163、136〜163、137〜163、138〜163、139〜163、140〜163、141〜163、142〜163、143〜163、144〜163、145〜163、146〜163、147〜163、148〜163、149〜163、150〜163、151〜163、152〜163、153〜163、154〜163、155〜163、156〜163；および
（ｃ）配列番号69の、アミノ酸157〜164、165、157〜166、157〜167、157〜168、157〜169、157〜170、157〜171、157〜172、157〜173、157〜174、157〜175、157〜176、157〜177、157〜178、157〜179、157〜180、157〜181、157〜182、157〜183、157〜184、157〜185、157〜186、157〜187、157〜188、157〜189、157〜190、157〜191、157〜192、157〜193、157〜194、157〜195、157〜196、157〜197、157〜198、157〜199、157〜200、157〜201、157〜202、157〜203、157〜204、157〜205、157〜206、157〜207、157〜208、157〜209、157〜210、157〜211、157〜212、157〜213、157〜214、157〜215、157〜216、157〜217、157〜218、157〜219、157〜220、157〜221、157〜222、157〜223、157〜224、157〜225、157〜226、157〜227、157〜228、157〜229、157〜230、157〜231、157〜232、157〜233、157〜234、157〜235、157〜236、157〜237、157〜238、157〜239、157〜240、157〜241、157〜242、157〜243、157〜244、157〜245、157〜246、157〜247、157〜248、157〜249、157〜250、157〜251、157〜252、157〜253、157〜254、157〜255、157〜256、157〜257、157〜258、157〜259、157〜260、157〜261、157〜262、157〜263、157〜264、157〜265、157〜266、157〜267、157〜268、157〜269、157〜270、157〜271、157〜272、157〜273、157〜274、157〜275、157〜276、157〜277、157〜278、157〜279、157〜280、157〜281、157〜282、157〜283、157〜284、157〜285、157〜286、157〜287、157〜288、157〜289、157〜290、157〜291、157〜292、157〜293、157〜294、157〜295、157〜296、157〜297、157〜298、157〜299、157〜300、157〜301、157〜302、157〜303、157〜304、157〜305、157〜306、157〜307、157〜308、157〜309、157〜310、157〜311、157〜312、157〜313、157〜314
からなる群から選択されるＭＡＧＥ２の断片を含むことを特徴とする、請求項４４から４６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４８】
表１３〜１５および１８のｐ５３、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エピトープおよびアナログからなる群から選択される少なくとも１個のペプチドを含むことを特徴とする、請求項４０から４７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４９】
少なくとも１個のＴヘルパーペプチドを含むことを特徴とする、請求項４０から４８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記少なくとも１個のＴヘルパーペプチドの少なくとも１個は、ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（ここで、「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン（配列番号２９）、フェニルアラニン（配列番号３０）またはチロシン（配列番号３１）であり、「ａ」はＤ−アラニンまたはＬ−アラニンである）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
少なくとも１個のスペーサーを含むことを特徴とする、請求項４０から５０のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５２】
少なくとも１個のリーダーを含むことを特徴とする、請求項４０から５１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５３】
請求項４０から５２のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５４】
請求項４０から５２のいずれかに記載の少なくとも１個のポリペプチド、または請求項５３に記載の少なくとも１個のポリヌクレオチド、ならびに賦形剤、アジュバントおよび脂質からなる群から選択される少なくとも１個の成分を含む組成物。
【請求項５５】
請求項４０から５２のいずれかに記載の２つ以上のポリペプチドを含む組成物。
【請求項５６】
請求項５３に記載の２つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項５７】
請求項５５または５６に記載の組成物であって、および賦形剤、およびアジュバント、および脂質からなる群から選択される少なくとも１個の成分を含むことを特徴とする組成物。
【請求項５８】
ＨＬＡ重鎖、β２−ミクログロブリンおよびストレプトアビジンを含むことを特徴とする、請求項５４から５７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５９】
前記ポリペプチドは、前記ＨＬＡ重鎖、β２−ミクログロブリンおよびストレプトアビジンの複合体に結合し、それによって四量体が形成されることを特徴とする、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
抗原提示細胞を含み、前記ポリペプチドは前記抗原提示細胞上または前記抗原提示細胞内にあることを特徴とする、請求項５４から５８のいずれかに記載の組成物。
【請求項６１】
前記ポリペプチドは、前記抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合され、それによってＨＬＡ分子に制限された細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が存在するときに、前記ＣＴＬの受容体は前記ＨＬＡ分子と前記エピトープの複合体に結合することを特徴とする、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
少なくとも１個の制御配列を含むことを特徴とする、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６３】
請求項６２に記載のポリヌクレオチドと、賦形剤、アジュバントおよび脂質からなる群から選択される成分とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所与のＴ細胞に対する刺激能力が増大した、元のペプチドのヘテロクリティックアナログを産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの研究によれば、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）は、免疫系による感染症および癌の根絶に中心的役割を果たしていることが示唆されている（非特許文献１、２）。ＣＴＬは、エピトープを含むペプチドによって刺激されるので、ＣＴＬ応答を刺激するエピトープを利用したワクチンの開発に多大な努力が払われている。ヘテロクリティックアナログと呼ばれる一クラスのエピトープは、ネイティブエピトープが誘導するよりも強力にＴ細胞応答を誘導するので、ワクチン成分として有益である。ヘテロクリティックアナログは、所与の用量に対する応答の増大、または同じ応答を得るのに必要な量の減少によって判定して、特定のＴ細胞に対する刺激能力または効力が増大したペプチドとして定義される。
【０００３】
臨床用途にヘテロクリティックアナログを使用することに伴う利点は以下のとおりである。第１に、ヘテロクリティックアナログは、Ｔ細胞アネルギー状態を逆転させ、寛容化されていない交差反応性Ｔ細胞クローンを活性化し、または「免疫偏向（ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｖｉａｔｏｉｎ）」、すなわち、Ｔｈ１、Ｔｈ２などの産生されるＣＴＬタイプを媒介することによって、寛容性を打破／克服する能力を有する。最近の研究によれば、ヘテロクリティックアナログは、内因的にプロセシングされたエピトープを認識するＣＴＬを誘導できる点で免疫原性である（非特許文献３〜５）。これは、様々な免疫系における研究によって確認されている（非特許文献６〜８）。例えば、Ｚｕｇｅｌ等（Ｚｕｇｅｌ等、上記）の研究によれば、成体マウスにおける免疫優性Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞寛容性は、そのペプチドのヘテロクリティック交差反応性ペプチドアナログによる免疫化によって克服できる。
【０００４】
これは、ＣＴＬエピトープのほとんどが自己抗原から誘導される癌ワクチンの分野では特に重要である。癌に関係する抗原が自己抗原であることが多いという事実のために、これらの抗原に対してすでに寛容性があり、このようなエピトープに対してＴ細胞応答が生じ難くなるという対応した現象が存在する。ヘテロクリティックアナログによる寛容性の打破は、ネズミクラスＩＩ系における最近の研究に見られる（非特許文献７）。この研究では、寛容性を打破することに関する機序は、アネルギーの逆転ではなく、寛容化されていない低親和性クローンの刺激によるものであった。本明細書に示すヘテロクリシティーは、高結合活性のＣＴＬの誘導と関連するので、この違いは重要である。
【０００５】
第２に、ペプチドアナログは、Ｔ細胞からのサイトカイン産生を調節することが示されている（非特許文献９〜１２）。このようなアナログによって誘導される免疫偏向は、特定のサブセットのＴｈ細胞応答の生成が腫瘍退縮と相関する（非特許文献１３、１４）、あるいは自己免疫疾患または感染症の臨床結果に影響を及ぼす（非特許文献１５）いくつかの病態において意味がある。したがって、ヘテロクリティックアナログによる免疫化は、特定のサブセットのエフェクターＴ細胞の誘導によるサイトカイン産生を調節し、それによって疾患の経過を変える能力を表す。
【０００６】
第３に、ヘテロクリティックアナログは、生物学的効力が大きいために治療用量としてかなり少量のペプチドしか必要としないので、薬剤開発に有利である。この特徴は、ある種の製造上の問題および毒性問題を克服するものである。これに関して、メラノーマ患者において抗原特異的Ｔ細胞を産生するＭＡＲＴ−１ペプチドのヘテロクリティックアナログ（非特許文献１６）は、ネイティブエピトープよりも極めて低濃度で活性であることが判明した。ＣＥＡ誘導ＣＡＰ１エピトープのヘテロクリティックアナログに関しても、同様の結果がＳｃｈｌｏｍとその同僚（非特許文献３）によって報告された。しかし、野生型ペプチドに対する並行した前駆体頻度分析またはＴＣＲ結合活性分析は実施されなかった。
【０００７】
特徴の明らかな２つのタイプの癌抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）である。ＣＥＡは、結腸、直腸、すい臓および胃（非特許文献１７）、ならびに乳房の５０％（非特許文献１８）を含めたほとんどのヒト腺癌、および非小細胞肺癌の７０％（非特許文献１９）で過剰発現する１８０ｋＤａの細胞表面および分泌性糖タンパクである。ＣＥＡは、正常な上皮および一部の胎児組織においてもある程度発現される（非特許文献２０）。ＣＥＡは、癌細胞での発現が異常に高いことから、免疫療法の重要な標的である。
【０００８】
ＭＡＧＥは、１９９１年に初めて記述された関連タンパク質の１ファミリーである。Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎと共同研究者は、自発的な腫瘍退縮を示した患者からＣＴＬを単離した後にＭＡＧＥ遺伝子を特定した。これらのＣＴＬは、全員が同じＨＬＡ−Ａ１制限遺伝子（ＨＬＡ−Ａ１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｇｅｎｅ）を発現する他の患者のメラノーマ細胞系ならびに腫瘍系統を認識した（非特許文献２１、２２）。ＭＡＧＥ遺伝子は、転移性メラノーマ（例えば、非特許文献２３参照）、非小細胞肺（非特許文献２４）、胃（非特許文献２５）、肝細胞（非特許文献２６）、腎臓（非特許文献２７）、結腸直腸（非特許文献２８）および食道（非特許文献２９）癌腫、ならびに頭頚部腫瘍（非特許文献３０）、卵巣腫瘍（非特許文献３１、３２）、膀胱腫瘍、および骨肉腫（非特許文献３３）においても発現する。したがって、ＭＡＧＥ２／３も含めてＭＡＧＥは、癌免疫療法の重要な標的である。
【０００９】
したがって、それらの生物学的関連性のために、ＣＥＡエピトープ、ＭＡＧＥエピトープ、他のエピトープなどの所与のエピトープにヘテロクリティック活性を付与するアミノ酸置換を予測および／または特定すること、ならびにこのようなヘテロクリティック活性をもたらす他の置換を予測できることは、極めて有用なはずである。しかし、本開示以前には、例えばＡ３およびＡ２４エピトープまたはＡ２およびＢ７エピトープのこのような置換を予測する簡単な方法はなかった。実際、以前の研究（非特許文献３４、３５）では、ヘテロクリティックエピトープは、メラノーマ細胞から天然の突然変異ペプチドを溶離することによって、あるいはエピトープ中のほぼすべての位置における置換体からなる多数のアナログを系統的にスクリーニングすることによって、偶然に特定された（非特許文献３、３６、３７）。あるいは、ヘテロクリティックアナログは、やはり多数のペプチドの困難な合成とスクリーニングを要するランダムなコンビナトリアルペプチドライブラリをスクリーニングすることによって特定された（非特許文献３８）。ＤＮＡ発現ライブラリのスクリーニングなどの遺伝的手法は、ＣＴＬエピトープおよびアナログを産生する別の方法を提供する（非特許文献３９、４０）。しかし、これらの手法は、産生されるエピトープがともすると少量で複雑であることから問題となり得る。
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９４／２０１２７号
【特許文献２】国際公開第９４／０３２０５号
【特許文献３】２００１年６月１４日に発行された国際公開第０１／４２２７０号
【特許文献４】米国特許第５，７３６，１４２号明細書
【特許文献５】国際公開第０１／４７５４１号
【特許文献６】ＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４
【特許文献７】米国特許出願第０９／３１１，７８４号明細書
【特許文献８】国際公開第９７／３１１５号
【特許文献９】米国特許第４，７２２，８４８号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，５８０，８５９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，５８９，４６６号明細書
【特許文献１２】米国特許出願第０８／８２０，３６０号明細書
【特許文献１３】米国特許出願第０８／１９７，４８４号明細書
【特許文献１４】米国特許出願第０８／４６４，２３４号明細書
【特許文献１５】国際公開第９５／０７７０７号
【特許文献１６】国際公開第９３／２４６４０号
【特許文献１７】米国特許第５，２７９，８３３号明細書
【特許文献１８】国際公開第９１／０６３０９号
【特許文献１９】米国特許第５，２０４，２５３号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，８０４，５６６号明細書
【特許文献２１】米国特許第５，７３９，１１８号明細書
【特許文献２２】米国特許第５，７３６，５２４号明細書
【特許文献２３】米国特許第５，６７９，６４７号明細書
【特許文献２４】国際公開第９８／０４７２０号
【特許文献２５】米国特許第５，９２２，６８７号明細書
【特許文献２６】米国特許第４，２３５，８７１号明細書
【特許文献２７】米国特許第４，５０１，７２８号明細書
【特許文献２８】米国特許第４，８３７，０２８号明細書
【特許文献２９】米国特許第５，０１９，３６９号明細書
【非特許文献１】Byrne et al., J. Immunol. 51: 682 (1984)
【非特許文献２】McMichael et al., N. England J. Med., 309: 13 (1983)
【非特許文献３】Zaremba et al., Cancer Research, 57: 4570 (1997)
【非特許文献４】Rivoltoni et al., Cancer Research, 59: 301 (1999)
【非特許文献５】Selby et al., 162 (2): 669 (1999)
【非特許文献６】Zugel et al., J. Immunol., 161: 1705 (1998)
【非特許文献７】Wang et al., J. Exp. Med., 190: 983 (1999)
【非特許文献８】Men et al., J. Immunol., 162: 3566, (1999)
【非特許文献９】Pfeiffer et al., J. Exp. Med., 181: 1569 (1995)
【非特許文献１０】Tao et al., J. Immunol., 158: 4237 (1997)
【非特許文献１１】Salazar et al., Int. J. Cancer 85 (6): 829-38 (2000)
【非特許文献１２】Nicholson et al., Int. Immunol. 12 (2): 205-13 (2000)
【非特許文献１３】Zitvogel et al., J. Exp. Med., 183: 87 (1996)
【非特許文献１４】Celluzzi et al., J. Exp. Med. 183: 283 (1996)
【非特許文献１５】Romagnani et al., Annu. Rev. Immunol., 12: 227-57 (1994)
【非特許文献１６】Rivoltini et al., Cancer Research 59: 301 (1999)
【非特許文献１７】Muraro et al., Cancer Res. 45: 5769-5780, 1985
【非特許文献１８】Steward et al., Cancer (Phila) 33: 1246-1252, 1974
【非特許文献１９】Vincent et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 66: 320-328, 1978
【非特許文献２０】Thompson et al., J. Clin. Lab. Anal. 5: 344-366, 1991
【非特許文献２１】van der Bruggen et al., Science 254: 1643-1647, 1991
【非特許文献２２】DePlaen et al., Immunogenetics 40: 360-369, 1994
【非特許文献２３】Brasseur et al., Int. J. Cancer 63: 375-380, 1995
【非特許文献２４】Weynants et al., Int. J. Cancer 56: 826-829, 1994
【非特許文献２５】Inoue et al., Gastroenterology 109: 1522-1525, 1995
【非特許文献２６】Chen et al., Liver 19: 110-114, 1999
【非特許文献２７】Yamanaka et al., Human Pathol. 24: 1127-1134, 1998
【非特許文献２８】Mori et al., Ann. Surg. 224: 183-188, 1996
【非特許文献２９】Quillien et al., Anticancer Res. 17: 387-391, 1997
【非特許文献３０】Lett et al., Acta Otolaryngol. 116: 633-639, 1996
【非特許文献３１】Gillespie et al., Br J. Cancer 78: 816-821, 1998
【非特許文献３２】Yamada et al., Int. J. Cancer 64: 388-393, 1995
【非特許文献３３】Sudo et al., J. Orthop. Res. 15: 128-132, 1997
【非特許文献３４】Selby et al., J. Immunol., 162 (2): 669 (1999)
【非特許文献３５】Skipper et al., J. Exp. Med. 183: 527 (1996)
【非特許文献３６】Loftus et al., Cancer Research 58: 2433 (1998)
【非特許文献３７】Blake et al., J. Exp. Med. 18: 121 (1996)
【非特許文献３８】Pinilla et al., Current Opinion in Immunology 11: 193-202 (1999)
【非特許文献３９】Boon et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 337-65 (1994)
【非特許文献４０】Gavin et al., Eur. J. Immunol. 24 (9): 2124-33 (1994)
【非特許文献４１】McMichael et al., N. England J. Med. 309: 13 (1983)
【非特許文献４２】Zugel et al., J. Immunol. 161: 1705 (1998)
【非特許文献４３】Valmori et al., J. Immunol. 160: 1750-1758 (1998)
【非特許文献４４】Parkhurst et al., J. Immunol. 157: 2539 (1996)
【非特許文献４５】Ruppert et al., Cell 74: 929 (1993)
【非特許文献４６】Madden, Annu. Rev. Immunol. 13: 587-622 (1995)
【非特許文献４７】Valmori et al., J. Immunol. 160: 1750 (1998)
【非特許文献４８】Davis et al., Annu. Rev. Immunol. 16: 523 (1998)
【非特許文献４９】Kersh et al., J. Exp. Med. 184: 1259 (1996)
【非特許文献５０】Evavold et al., J. Immunol. 148: 347 (1992)
【非特許文献５１】Alam et al., Immunity 10: 227 (1999)
【非特許文献５２】Hampl et al., Immunity 7: 379-85 (1997)
【非特許文献５３】Zaremba et al., Cancer Research 57: 4570 (1997)
【非特許文献５４】Dressel et al., J. Immunol. 159: 4943 (1997)
【非特許文献５５】Kawashima et al., Human Immunology 59: 1-14 (1998)
【非特許文献５６】Ishioka et al., J. Immunol. 162 (7): 3915-25 (1999)
【非特許文献５７】Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 11993-11997 (1995)
【非特許文献５８】Theobald et al., J. Exp. Med., 185 (5): 833-841 (1997)
【非特許文献５９】Stites et al., IMMUNOLOGY, 8TH ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994)
【非特許文献６０】Verhoef et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11: 291 (1986)
【非特許文献６１】Stewart & Young, SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2D. ED., Pierce Chemical Co., 1984
【非特許文献６２】Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)
【非特許文献６３】Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981)
【非特許文献６４】Ishioka et al., J. Immunol. 162: 3915-3925, 1999
【非特許文献６５】An, L., and Whitton, J. L., J. Virol. 71: 2292, 1997
【非特許文献６６】Thomson, S. A. et al., J. Immunol. 157: 822, 1996
【非特許文献６７】Whitton, J. L. et al., J. Virol. 67: 348, 1993
【非特許文献６８】Hanke, R. et al., Vaccine 16: 426, 1998
【非特許文献６９】Lathe (1985, J. Mol. Biol. 183: 1-12)
【非特許文献７０】Stover et al., Nature 351: 456-460 (1991)
【非特許文献７１】Rosenberg et al., Science 278: 1447-1450
【非特許文献７２】Mannino & Gould-Fogerite, Bio Techniques 6 (7): 682 (1988)
【非特許文献７３】Felgner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987)
【非特許文献７４】Deres et al., Nature 342: 561, 1989
【非特許文献７５】Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95: 341, 1995
【非特許文献７６】Eldridge et al., Molec. Immunol. 28: 287-294, 1991
【非特許文献７７】Alonso et al., Vaccine 12: 299-306, 1994
【非特許文献７８】Jones et al., Vaccine 13: 675-681, 1995
【非特許文献７９】Takahashi et al., Nature 344: 873-875, 1990
【非特許文献８０】Hu et al., Clin Exp Immunol. 113: 235-243, 1998
【非特許文献８１】Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5409-5413, 1988
【非特許文献８２】Tam, J. P., J. Immunol. Methods 196: 17-32, 1996
【非特許文献８３】Perkus, M. E. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996
【非特許文献８４】Chakrabarti, S. et al., Nature 320: 535, 1986
【非特許文献８５】Hu, S. L. et al., Nature 320: 537, 1986
【非特許文献８６】Kieny, M. -P. et al., AIDS Bio/Technology 4: 790, 1986
【非特許文献８７】Top, F. H. et al., J. Infect. Dis. 124: 148, 1971
【非特許文献８８】Chanda, P. K. et al., Virology 175: 535, 1990
【非特許文献８９】Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods. 192: 25, 1996
【非特許文献９０】Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30: 16, 1993
【非特許文献９１】Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7: 649, 1995)
【非特許文献９２】Warren, H. S., Vogel, F. R., and Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4: 369, 1986
【非特許文献９３】Gupta, R. K. et al., Vaccine 11: 293, 1993
【非特許文献９４】Reddy, R. et al., J. Immunol. 148: 1585, 1992
【非特許文献９５】Rock, K. L., Immunol. Today 17: 131, 1996
【非特許文献９６】Ulmer, J. B. et al., Science 259: 1745, 1993
【非特許文献９７】Robinson, H. L., Hunt, L. A., and Webster, R. G., Vaccine 11: 957, 1993
【非特許文献９８】Shiver, J. W. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996
【非特許文献９９】Cease, K. B., and Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12: 923, 1994
【非特許文献１００】Wolff et al., Science 247: 1465 (1990)
【非特許文献１０１】Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980)
【非特許文献１０２】Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985
【非特許文献１０３】Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998
【非特許文献１０４】Altman et al., Science 174: 94-96, 1996
【非特許文献１０５】Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997
【非特許文献１０６】Penna et al., J. Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991
【非特許文献１０７】CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Antibodies A Laboratory Manual, Wiley/Greene, NY
【非特許文献１０８】Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
【非特許文献１０９】DiBrino, M. et al., J. Immunol. 151: 5930, 1993
【非特許文献１１０】DiBrino, M. et al., J. Immunol. 152: 620, 1994
【非特許文献１１１】Kondo, A. et al., Immunogenetics 45: 249, 1997
【非特許文献１１２】Falk et al., Nature 351: 290-296, 1991
【非特許文献１１３】Hunt et al., Science 255: 1261-1263, 1992
【非特許文献１１４】Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-3587, 1992
【非特許文献１１５】Ruppert et al., Cell 74: 929-937, 1993
【非特許文献１１６】Fruci et al., Human Immunol. 38: 187-192, 1993
【非特許文献１１７】Tanigaki et al., Human Immunol. 39: 155-162, 1994
【非特許文献１１８】Del Guercio et al., J. Immunol. 154: 685-693, 1995
【非特許文献１１９】Kast et al., J. Immunol. 152: 3904-3912, 1994
【非特許文献１２０】Sidney et al., Hum. Immunol. 45: 79, 1996
【非特許文献１２１】Sette and Sidney, Immunogenetics, 50: 201-212, 1999
【非特許文献１２２】Sidney et al., J. Immunol. 154: 247, 1995
【非特許文献１２３】Barber et al., Curr. Biol. 5: 179, 1995
【非特許文献１２４】Hill et al., Nature 360: 434, 1992
【非特許文献１２５】Rammensee et al., Immunogenetics 41: 178, 1995
【非特許文献１２６】Sidney et al., Immunol. Today 17: 261, 1996
【非特許文献１２７】Kubo et al., J. Immunol. 152: 3913, 1994
【非特許文献１２８】Hunt et al., Science 255: 1261-1263, March 6, 1992
【非特許文献１２９】DiBrino et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 1508, 1993
【非特許文献１３０】Kubo et al., J. Immunol. 152: 3913-3924, 1994
【非特許文献１３１】Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 2217-2221, 1993
【非特許文献１３２】Kondo et al., J. Immunol. 155: 4307-4312, 1995
【非特許文献１３３】Altman, J. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10330, 1993
【非特許文献１３４】Altman, J. D. et al., Science 274: 94, 1996
【非特許文献１３５】Lalvani, A. et al., J. Exp. Med. 186: 859, 1997
【非特許文献１３６】Dunbar, P. R. et al., Curr. Biol. 8: 413, 1998
【非特許文献１３７】Murali-Krishna, K. et al., Immunity 8: 177, 1998
【非特許文献１３８】Alexander, J. et al., Immunity 1: 751-761, 1994
【非特許文献１３９】McKinney et al., Journal of Immunological Methods 237: 105-117 (2000)
【非特許文献１４０】Kawashima, I. et al., Human Immunol. (1998) 59: 1
【非特許文献１４１】Ishioka, G. et al., J. Immunol. (1999) 162: 3915
【非特許文献１４２】Epimmune, unpublished data
【非特許文献１４３】Ruppert, J. et al., Cell (1993)74: 929
【非特許文献１４４】Dayhoff, M. O. et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, suppl. 3. (1978) M. O. Dayhoff, ed., National Biomedical Research Foundation, Washington DC, p. 345
【非特許文献１４５】Creighton, T. E., Proteins: structures and molecular properties (1993) (2nd edition) W. H. Freeman and Company, NY
【非特許文献１４６】http://prowl.rockefeller.edu/aainfo/pam250.html
【非特許文献１４７】Cornette, J. et al., J. Mol. Biol. (1987) 195: 659
【非特許文献１４８】Kyte, J. and R. F. Doolittle, J. Mol. Biol. (1982) 157: 105
【非特許文献１４９】Fauchere, J. and V. Pliska, Eur. J. Med. Chem. (1983) 18: 369
【非特許文献１５０】Zamyatnin, A. A., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. (1984) 13: 145
【非特許文献１５１】Zamyatnin, A. A., Prog. Biophys. Mol. Biol. (1972) 24: 107
【非特許文献１５２】Vitiello, A. et al., J. Exp. Med. (1991) 173: 1007
【非特許文献１５３】Boon, T. et al., Ann. Rev. Immunol. (1994) 12: 337
【非特許文献１５４】Sette, A. et al., Mol. Immunol. (1994) 31: 813
【非特許文献１５５】McKinney, D. et al., J. Immunol. Methods (2000) 237: 105
【非特許文献１５６】Murali-Krishna, K. et al., Immunity 8: 177, 1998
【非特許文献１５７】Lewis, J. J., et al., Int. J. Cancer (2000) 87: 391
【非特許文献１５８】Theobald et al., 92 (26): 11993 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、対応する野生型エピトープよりも免疫応答を生じる能力が高いエピトープを含むペプチドを調製する方法を提供する。得られる「ヘテロクリティックアナログ」は、標的細胞上に表示された抗原によって特徴付けられるウイルス性疾患、癌、および他の病気を治療する免疫学的組成物に有用である。
【００１２】
本発明者らは、Ａ２エピトープのヘテロクリティックアナログ、およびこのようなＡ２ヘテロクリティックアナログを調製する法則を開発した。しかし、本発明以前には、Ａ３、Ａ２４またはＢ７エピトープに対するこのような法則またはアナログは開発されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、一態様においては、本発明は、エピトープ、例えばＢ７エピトープを含むペプチドの免疫原性を高める方法を対象とする。この方法は、ｉ）第１のクラスＩエピトープを含むペプチドを用意するステップであって、前記エピトープが、アミノ末端およびカルボキシル末端および少なくとも１個の一次アンカー残基を有するアミノ酸配列を含むか、または前記アミノ酸配列から本質的になり、このエピトープのアミノ酸残基に連続した番号が付けられて、このエピトープのアミノ末端に最も近い一次アンカー残基が２位または３位であるステップと、ｉｉ）このエピトープのアミノ末端とカルボキシル末端の間の３位および／または５位および／または７位の位置（これらの位置は、一次アンカー残基を含まない。）の１つまたは複数の保存的または半保存的置換を導入し、それによって第１のクラスＩエピトープより免疫原性の高い第２のクラスＩエピトープを含むペプチドを構築するステップを含む。
【００１４】
別の態様においては、Ｂ７スーパーファミリーエピトープの場合、本発明は、Ｂ７スーパーファミリーエピトープを含むペプチドの免疫原性を高める方法を対象とする。この方法は、ｉ）Ｂ７スーパーファミリーエピトープである、第１のクラスＩエピトープを含むペプチドを用意するステップであって、前記エピトープが、アミノ末端およびカルボキシル末端および少なくとも１個の一次アンカー残基を有するアミノ酸配列から本質的になり、このエピトープのアミノ酸残基に連続した番号が付けられて、このエピトープのアミノ末端に最も近い一次アンカー残基が２位であるステップと、ｉｉ）このエピトープのアミノ末端とカルボキシル末端の間の３位および／または５位および／または７位に１つまたは複数の保存的、半保存的または非保存的置換を導入し、それによって第１のクラスＩエピトープよりも免疫原性の高いＢ７スーパーファミリーエピトープである第２のクラスＩエピトープを含むペプチドを構築するステップとを含む。
【００１５】
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープよりも高い免疫原性を有するＭＨＣクラスＩエピトープアナログを含むポリペプチドを産生する方法に関する。この方法は、（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩエピトープを特定するステップであって、式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、ＲｘはＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となりうるようにｘ＝８〜１１であり、Ｒ２またはＲ３およびＲｘはモチーフまたはスーパーモチーフの一次アンカー残基であるステップと、（ｂ）アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、Ｒ３および／またはＲ５および／またはＲ７における１つまたは複数の保存的または半保存的アミノ酸置換以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を前記アナログが含み、前記１つまたは複数の置換が一次アンカー残基のものではないステップとを含む。
【００１６】
一部の態様においては、前記アナログは、Ｒ３が前記モチーフまたはスーパーモチーフのアンカー残基でなければＭｅｔである以外は、前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００１７】
一部の態様においては、前記アナログは、Ｒ５がＭｅｔである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００１８】
一部の態様においては、前記アナログは、Ｒ７がＭｅｔである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００１９】
一部の態様においては、式（Ａ）においてＲ３はＩｌｅであり、前記アナログは、Ｒ３がＭｅｔである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００２０】
一部の態様においては、式（Ａ）においてＲ３はＬｙｓであり、前記アナログは、Ｒ３がＨｉｓまたはＬｅｕである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００２１】
一部の態様においては、式（Ａ）においてＲ５はＶａｌであり、前記アナログは、Ｒ５がＨｉｓである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００２２】
一部の態様においては、式（Ａ）においてＲ５はＬｅｕであり、前記アナログは、Ｒ５がＩｌｅである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００２３】
一部の態様においては、式（Ａ）においてＲ５はＶａｌであり、前記アナログは、Ｒ５がＩｌｅまたはＰｈｅである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００２４】
一部の態様においては、式（Ａ）においてＲ７はＨｉｓであり、前記アナログは、Ｒ７がＴｒｐである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００２５】
一部の態様においては、式（Ａ）においてＲ７はＡｌａであり、前記アナログは、Ｒ７がＰｒｏである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００２６】
一部の態様においては、式（Ａ）においてＲ７はＴｙｒであり、前記アナログは、Ｒ７がＨｉｓまたはＭｅｔである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００２７】
別の態様においては、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープよりも高い免疫原性を有するＭＨＣクラスＩエピトープアナログを含むポリペプチドを産生する方法に関する。この方法は、（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩエピトープを特定するステップであって、式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となりうるようにｘ＝８〜１１であり、Ｒ２またはＲ３およびＲｘはモチーフまたはスーパーモチーフの一次アンカー残基であるステップと、（ｂ）アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、前記アナログがＲ３および／またはＲ５および／またはＲ７における１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含むステップとを含む。
【００２８】
したがって、一部の態様においては、式（Ａ）においてＲ７はＴｙｒであり、前記アナログは、Ｒ７がＧｌｙ、ＧｌｕまたはＡｓｐである以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含む。
【００２９】
上記第２のクラスＩエピトープは、一般に、「ヘテロクリティックアナログ」または「アナログ」と呼ばれる。
【００３０】
好ましい実施形態においては、ヘテロクリティックアナログは、対応する野生型クラスＩエピトープよりも特定のＴ細胞に対する効力が少なくとも約５０％増加する。このアナログは、１つのみの置換を含むことができ、あるいは２つまたは３つの置換を含むことができ、この置換は、保存的でもまたは半保存的でもよく、またはＢ７スーパーファミリーエピトープの場合には非保存的でもよい。ヘテロクリティックアナログは、ＨＬＡクラスＩ分子に結合し、関連する細胞障害性Ｔ細胞と接触したときに、Ｔｈ１とＴｈ２の両方のサイトカインを誘導することができる。好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２からなる群から選択されるＨＬＡスーパーモチーフを含み、より好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ２スーパーモチーフまたはＢ７スーパーモチーフを含み、最も好ましくは、Ａ２．１モチーフ（例えば、Ａ＊０２０１）、またはＢ７モチーフ（例えば、Ｂ＊０７０２モチーフ）を含む。
【００３１】
クラスＩエピトープは、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原、細菌抗原または真菌抗原由来とすることができる。
【００３２】
スーパーモチーフはＡ１とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＳのいずれかであり、ＲｘはＦ、ＷまたはＹである。
【００３３】
スーパーモチーフはＡ２とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱであり、ＲｘはＩ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＬである。
【００３４】
スーパーモチーフはＡ２．１とすることができ、Ｒ２は一次アンカーであり、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｑ、Ｉ、ＡまたはＴであり、ＲｘはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＡまたはＴである。
【００３５】
スーパーモチーフはＡ３とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｖ、Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｔ、ＬまたはＩであり、ＲｘはＲまたはＫである。
【００３６】
スーパーモチーフはＡ２４とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｙ、ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、ＭまたはＴであり、ＲｘはＦ、Ｉ、Ｙ、Ｗ、ＬまたはＭである。
【００３７】
スーパーモチーフはＢ７とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｐであり、ＲｘはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、ＹまたはＡである。
【００３８】
別の態様においては、本発明は、例えば、Ａ３またはＡ２４エピトープを含むペプチドの免疫原性を高める方法を対象とする。この方法は、ｉ）クラスＩエピトープを含むペプチドを用意するステップであって、前記エピトープが、アミノ末端およびカルボキシル末端および少なくとも１個の一次アンカー残基を有するアミノ酸配列を含み、このエピトープのアミノ酸残基は連続した番号が付けられて、このエピトープのアミノ末端に最も近い一次アンカー残基が２位にあるステップと、ｉｉ）このエピトープのアミノ末端とカルボキシル末端の間の３位および／または４位および／または５位および／または６位および／または７位に、１つまたは複数の保存的、半保存的または非保存的置換を導入するステップとを含む。
【００３９】
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープよりも高い免疫原性を有するＭＨＣクラスＩエピトープアナログを含むポリペプチドを産生する方法に関する。この方法は、（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩエピトープを特定するステップであって、式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となりうるようにｘ＝８〜１１であり、Ｒ２またはＲ３およびＲｘはモチーフまたはスーパーモチーフの一次アンカー残基であるステップと、（ｂ）アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、前記アナログが、Ｒ３および／またはＲ４および／またはＲ５および／またはＲ６および／またはＲ７における１つまたは複数の保存的、半保存的、または非保存的アミノ酸置換以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含むステップとを含む。
【００４０】
一部の実施形態においては、ヘテロクリティックアナログは、対応する野生型クラスＩエピトープよりも特定のＴ細胞に対する効力が少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％増加する。好ましい実施形態においては、ヘテロクリティックアナログは、対応する野生型クラスＩエピトープよりも特定のＴ細胞に対する効力が少なくとも約５０％増加する。極めて好ましい実施形態においては、ヘテロクリティックアナログは、対応する野生型クラスＩエピトープよりも特定のＴ細胞に対する効力が、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％（すなわち、少なくとも約２倍）、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、または少なくとも約１０００％（すなわち、少なくとも約１０倍）増加する。
【００４１】
アナログは、１つのみの置換を含むことができ、または２つ、３つもしくは４つの置換を含むことができ、この置換は保存的でも、半保存的でも、または非保存的でもよい。ヘテロクリティックアナログは、ＨＬＡクラスＩ分子に結合し、関連する細胞障害性Ｔ細胞に接触すると、Ｔｈ１とＴｈ２の両方のサイトカインを誘導することができる。本発明の一実施形態においては、クラスＩエピトープは、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２からなる群から選択されるＨＬＡスーパーモチーフを含む。別の実施形態においては、クラスＩエピトープは、Ａ２もしくはＢ７スーパーモチーフ、またはＡ３もしくはＡ２４スーパーモチーフを含む。さらに別の実施形態においては、クラスＩエピトープは、Ａ２モチーフ（例えば、Ａ＊０２０１モチーフ）、Ａ３モチーフ（例えば、Ａ＊０３０１モチーフ）、Ａ２４モチーフ（例えば、Ａ＊２４０２モチーフ）、またはＢ７モチーフ（例えば、Ｂ＊０７０２モチーフ）を含む。
【００４２】
クラスＩエピトープは、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＥＡまたはＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１１およびＭＡＧＥ−Ａ１０）、寄生虫抗原、細菌抗原または真菌抗原由来とすることができる。エピトープは、ＣＥＡまたはＭＡＧＥ２に由来することが好ましい。
【００４３】
本発明は、あらかじめ選択されたクラスＩペプチドエピトープに対するヒト細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する方法も提供する。この方法は、上記ヘテロクリティックアナログを用意するステップと、ヒトＣＴＬをヘテロクリティックアナログと接触させるステップとを含む。
【００４４】
一部の態様においては、この接触ステップをインビトロで実施する。一部の態様においては、この接触ステップを、ヘテロクリティックアナログポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子を対象に投与することによって実施する。
【００４５】
本発明は、上記方法によって産生されるアナログポリペプチドも提供する。したがって、本発明は、本明細書の方法によって得ることができるアナログを含む「アナログポリペプチド」、あるいはこのアナログからなる「アナログポリペプチド」を提供する。特に、このようなアナログポリペプチドは、配列番号２、３、５、６、８、９、１１〜１９、２１〜２５、４４〜４８、５０、５１、５３、５４、５６、５８、５９および６１〜６６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるアナログを含むことが好ましい。アナログポリペプチドは、９〜２０個のアミノ酸、好ましくは９〜１６個のアミノ酸、より好ましくは９〜１５個のアミノ酸を含むことができるが、合計で９、１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸のみしか含まなくてもよい。この定義されたヘテロクリティックアナログエピトープは、同じエピトープ（例えば、アナログ）のホモポリマー、またはこのような様々なエピトープ（例えば、アナログ）を含むヘテロポリマー、あるいは野生型エピトープと組み合わされたヘテロクリティックアナログエピトープである、より長鎖のポリペプチドもしくはタンパク質に含まれていてもよい。これらのペプチドおよびタンパク質を、医薬品用途に設計される組成物に入れることができる。
【００４６】
ヘテロクリティックアナログエピトープを含むアナログポリペプチドを他の成分と組み合わせて、その免疫応答誘発活性をさらに高めまたは調節することができる。これらの追加成分を共有結合させることも、非共有結合的に混合物に含ませるともできる。
【００４７】
したがって、アナログポリペプチドは、Ｔヘルパーペプチド、スペーサーまたはリンカー、担体を含むことができ、脂質に連結することができ、および／または１個もしくは複数のエピトープ、または１個もしくは複数の追加のアナログ、または１個もしくは複数の追加のアミノ酸を含むことができる。
【００４８】
また、ヘテロクリティックアナログポリペプチドは混合することができ、またはＣＴＬエピトープに連結することができ、あるいは特にＨＴＬエピトープがｐａｎ−ＤＲ結合分子である場合、ＨＴＬエピトープに連結することができる。したがって、本発明は、ＣＴＬエピトープおよび／またはｐａｎ−ＤＲエピトープなどのＨＴＬエピトープに連結されたアナログを含むアナログポリペプチド、あるいは前記アナログからなるアナログポリペプチドを含み、アナログおよびＣＴＬエピトープおよび／またはｐａｎ−ＤＲエピトープなどのＨＴＬエピトープを含むアナログポリペプチドを含む組成物、および／またはアナログおよびＣＴＬエピトープおよび／またはｐａｎ−ＤＲエピトープなどのＨＴＬエピトープからなるアナログポリペプチドを含む組成物も含む。
【００４９】
ヘテロクリティックアナログポリペプチドを含有する組成物は、さらに、リポソームを含むことができ、アナログポリペプチドはリポソーム上またはリポソーム内にあり、あるいはアナログポリペプチドは脂質に結合することができる。この組成物は、ＨＬＡ重鎖、β２−ミクログロブリンおよびストレプトアビジンを含むことができ、これらは複合体を形成していてもよく、ヘテロクリティックアナログポリペプチドは、前記複合体に結合することができ、それによって四量体が形成される。この組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むことができ、アナログポリペプチドはそのＡＰＣ上またはＡＰＣ内に存在することができ、および／またはアナログポリペプチドは、ＡＰＣ上のＨＬＡ分子に結合することができる。したがって、そのＨＬＡ分子に限定されたＣＴＬが存在するときには、そのＣＴＬの受容体は、そのＨＬＡ分子とアナログポリペプチドの複合体に結合することができる。ＡＰＣは樹状細胞とすることができる。この組成物は、ＨＬＡ分子を含むこともでき、アナログポリペプチドにＨＬＡ分子が結合することができる。この組成物は、標識、例えば、ビオチン、蛍光成分（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ）、非哺乳動物の糖、放射性標識、またはモノクローナル抗体に結合可能な小分子を含むことができる。この組成物は、適切な希釈剤および／または賦形剤を含むことができる。
【００５０】
上記組成物は、予防、治療、診断および予後の目的に有用である。例えば、この組成物は、対応する野生型エピトープに対する免疫応答を誘発させるのに有用である。有効成分のヘテロクリティックアナログポリペプチドは、単位剤形に入れることができる。対象を治療するのに有用な組成物は、必要に応じて、その発現を制御する配列を含めて、上記アナログポリペプチドをコードする核酸分子を含むこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
１．概説−アナログ
本発明は、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するヘテロクリティックアナログを設計する方法、およびそのようなアナログを含むポリペプチド、またはそのようなアナログからなるポリペプチドを産生する方法に関する。本発明は、ポリペプチド自体、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。ヘテロクリティックアナログによる免疫化は、腫瘍に対するワクチン接種のより有効で効率的な戦略であり、有効なＣＴＬの産生が困難であることがこれまでに判明している場合には特にそうである。
【００５２】
本明細書に記載する「ヘテロクリティックアナログ」とは、所与の用量に対する応答の増大によって、または相同のクラスＩペプチドと同じ応答を得るのに必要な量の減少によって判定して、特定のＴ細胞に対する効力の増大をもたらす、１、２、３または４アミノ酸置換されたエピトープである。本発明の方法は、あらゆるクラスＩペプチド、特にヒト癌および前癌状態に関連するクラスＩペプチド、ならびにウイルス、細菌、真菌、原虫寄生体などの病原体に由来するクラスＩペプチドを改変するのに有用である。
【００５３】
ヘテロクリシティー現象が、特定のクラスＩペプチドに結合するＨＬＡ分子全体に当てはまることは重要である。例えば、Ａ２スーパーモチーフを有するヘテロクリティックアナログペプチドは、ＨＬＡスーパータイプ（例えば、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７など；表５参照）中のすべてのＨＬＡ分子にヘテロクリティックである。同様に、Ａ３スーパーモチーフを有するヘテロクリティックアナログペプチドは、ＨＬＡスーパータイプ（例えば、Ａ＊０３０１、Ａ＊１１０１、Ａ＊３１０１、Ａ＊６８０１など、表５参照）中のすべてのＨＬＡ分子にヘテロクリティックである。Ａ２４スーパーモチーフを有するヘテロクリティックアナログペプチドは、ＨＬＡスーパータイプ（例えば、Ａ＊２３０１、Ａ＊２４０２、Ａ＊３００１など、表５参照）中のすべてのＨＬＡ分子にヘテロクリティックである。また、Ｂ７スーパーモチーフを有するヘテロクリティックアナログペプチドは、ＨＬＡスーパータイプ（例えば、Ｂ＊０７０２、Ｂ＊０７０３、Ｂ＊０７０４、Ｂ＊０７０５、Ｂ＊１５０８、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊３５０２、Ｂ＊３５０３、Ｂ＊３５０３、Ｂ＊３５０４、Ｂ＊３５０５、Ｂ＊３５０６、Ｂ＊３５０７、Ｂ＊３５０８、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５１０２、Ｂ＊５１０３、Ｂ＊５１０４、Ｂ＊５１０５、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１、Ｂ＊５５０２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊５６０２、Ｂ＊６７０１、Ｂ＊７８０１など、表５参照）中のすべてのＨＬＡ分子にヘテロクリティックである。したがって、異なる配列モチーフ（例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８、Ｂ６２など）を有するヘテロクリティックアナログペプチドは、それらの特定のＨＬＡスーパーファミリー内のすべてのＨＬＡ分子に、より強力な免疫応答を誘導させる。
【００５４】
本発明者らは、対応する野生型エピトープに対する免疫応答を高めるある種のＨＬＡスーパータイプに対するヘテロクリティックアナログの設計を支配する特異的法則を見出した。これらの法則は、任意のクラスＩ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子に結合するモチーフまたはスーパーモチーフを有するエピトープに対して適用可能である。したがって、これらの法則を使用することによって、あらゆる「野生型」または「ネイティブ」クラスＩエピトープの免疫原性を高めることが可能である。
【００５５】
手短に述べると、Ａ２スーパーファミリーエピトープの場合、この法則によれば、野生型クラスＩエピトープは、このエピトープの３位および／または５位および／または７位の保存的または半保存的アミノ酸を置換することによって改変される。Ｂ７スーパーファミリーエピトープの場合、この法則によれば、野生型クラスＩエピトープは、このエピトープの３位および／または５位および／または７位の保存的または半保存的または非保存的アミノ酸を置換することによって改変される。置換される保存的、半保存的または非保存的アミノ酸の性質は、以下の調製Ｂの記述によって規定され、その結果を表２に要約する。したがって、表２を調べることによって、これらの位置における適切な置換候補を決定することができる。表２に示したように、表の上端に示すアミノ酸の各々は、残りの１９個の遺伝子コードされたアミノ酸と数値によって規定された関係を有する。指数が小さいほど、保存性は高くなる。同じアミノ酸には１．０の類似度が割り当てられる。最も異なるアミノ酸には２０に近い類似度が割り当てられる。調製Ｂに示す方法を使用して、遺伝子コードされていないアミノ酸にも類似度指数を割り当てることができ、任意の天然アミノ酸を保存的または半保存的（または非保存的）として分類することができる。
【００５６】
本発明者らは、先に確立した法則に従わない新規なＡ３およびＡ２４スーパーファミリーアナログ、すなわち、ヘテロクリティックアナログを特定した。このようなアナログを表６の配列番号１１〜１９および２１〜２５に示す。驚くべきことに、これらのアナログは、エピトープの３位および／または７位における保存的または半保存的置換に加えて、エピトープの４位および／または６位における保存的または非保存的置換を含む。
【００５７】
特に、本発明者らは、（表６に示す）Ａ３スーパーファミリーエピトープＣＥＡ．６１（配列番号１０）のアナログを特定した。Ａ２およびＢ７ヘテロクリティックエピトープとは異なり、Ａ３スーパーファミリーエピトープのヘテロクリティックアナログは、ペプチドの中間の奇数位置（位置７）と偶数位置（位置４）の両方に置換を導入することによって産生させることができた。ＣＥＡ．６１エピトープの位置４における置換は保存的または非保存的（Ｇ→ＰまたはＩ）（配列番号１１〜１２）であり、一方、位置７における置換は保存的、半保存的または非保存的（Ｗ→Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｄ、Ｇ、ＣまたはＮ）（配列番号１３〜１９）であった。
【００５８】
本発明者らは、（表６に示す）Ａ２４スーパーファミリーエピトープＭＡＧＥ２．１５６（配列番号２０）のアナログも特定した。Ａ３スーパーファミリーエピトープ同様、Ａ２４スーパーファミリーエピトープのヘテロクリティックアナログも、ペプチドの中間の偶数と奇数位置に置換を導入することによって産生させることができた。これらの置換は、保存的（３位Ｌ→Ｉ、４位Ｑ→Ｅ、６位Ｖ→ＭまたはＬ）または非保存的（４位Ｑ→Ｌ）（配列番号２１〜２５）であった。したがって、偶数位置における置換が、ＭＡＧＥ２．１５６エピトープに対するヘテロクリティックアナログをもたらし得るという観察結果は、Ａ３スーパーファミリーエピトープの場合に観察されたものと置換パターンが部分的に重複することを示している。
【００５９】
本発明のヘテロクリティックアナログペプチドは、対象の免疫系が寛容化された抗原に対する免疫応答を誘導するのに特に有用である。ヒト対象が特に好ましいが、この方法は、ＨＬＡを発現する実験用トランスジェニックマウスなどの他の哺乳動物にも、これらの対象に対応するＨＬＡモチーフを考慮することによって適用することができる。
【００６０】
寛容性とは、抗原への過去の暴露によって誘導される特異的免疫非反応性を意味する。寛容性は、患者が寛容である特定のクラスＩペプチドエピトープを特定し、本発明の方法によってペプチドエピトープ配列を改変し、寛容化されたエピトープ（抗原）に交差反応する免疫応答を誘導することによって克服することができる。寛容性を克服することは、例えば、対象の免疫系がウイルス関連抗原または腫瘍関連抗原に寛容であるときに特に望ましい。腫瘍関連抗原は、細胞形質転換の結果、自己タンパク質を過剰発現することが多い。
【００６１】
ヘテロクリティックを設計する法則を決定するために、いくつかの異なるＣＴＬ系を、数群のアナログに対する反応性についてスクリーニングした。一次ＭＨＣアンカーを変えずに、Ｔ細胞刺激能力を改変することができた。
【００６２】
野生型エピトープは、上皮細胞癌において特異的に上方制御され、かつ免疫原性であることが判明している自己抗原に由来する腫瘍エピトープを含む。ＨＩＶおよびＨＢＶのポリメラーゼ遺伝子に由来するウイルスエピトープなど、使用されるウイルスエピトープも、同様に免疫原性であることが判明している。
【００６３】
本明細書に記載する法則は、ヘテロクリティックアナログを設計する基礎を提供し、法則がない場合に要求されるスクリーニングを大幅に削減し、エピトープを利用した癌ワクチンおよび感染症ワクチンを設計するのに極めて有用である。
【００６４】
以下に示す実施例では、スクリーニングされた（本明細書に開示するヘテロクリシティー法則に適合する）全アナログの１７％は、ヘテロクリティックであった（１６／９５）。これは、２つの理由から重要である。第１に、ヘテロクリティック置換法則に従うアナログを使用することによって、ヘテロクリティックの検出効率が２．２％から１７％に上昇した。第２に、合成する必要があるペプチドの数が約１００アナログ／エピトープから約１５アナログ／エピトープに劇的に減少し、プロセスの費用効果が高くなり、ハイスループットに適するようになる。本発明のヘテロクリティック置換法則を適用することによって、ヘテロクリティックアナログを産生する効率は、０．２％（２３３個のＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２アナログのスクリーニングから４個を特定）から３３％（９個の予測されたアナログのスクリーニングによって３個を特定）にほぼ１００から１０００倍増加した。初期アッセイにおいて潜在的なヘテロクリティック活性を示した６個のアナログのうち４個しかさらに分析しなかったので、この３３％という頻度は著しく過小評価しているかも知れない。
【００６５】
過去の研究によれば、ヘテロクリティックアナログによるＴ細胞応答の調節には、ＴＣＲ接触残基が関与している（例えば、非特許文献１、１６、４１、４２参照）。しかし、現在の研究ではこれは確認されていない。アナログの結合分析によれば、大多数のケース（８０％）でＭＨＣ結合が変化して向上または悪化した。ＨＬＡ−Ａ２結合を試験した１３個のアナログのうち、１０個のアナログのＭＨＣ結合が変化し、アナログ６個の結合性は野生型ペプチドよりも向上し、アナログ４個の結合性は野生型よりも悪化したが、それでも生物学的応答は実質的に増加した。
【００６６】
ＭＨＣ結合を強化するために一次ＭＨＣアンカー残基を改変した研究もある（この手法は、アナログを産生するためにいくつかのグループによって使用された（非特許文献９、４３、４４）。一次ＴＣＲ接触残基または一次ＭＨＣアンカー残基を変化させずに、生物学的応答が増大することがこの研究で認められた。応答の増大はＭＨＣ結合の変化によって媒介されたので、この効果は、二次アンカーの位置を変えることによってもたらされると仮定される。これを支持するさらなる証拠は、ＨＬＡ−Ａ２．１およびＨＬＡ−Ｂ７のヘテロクリティック置換がペプチドの中間の奇数位置（３、５、７）で起こるという知見から来る。これらの位置のすべて、特に３、５および７位は、ＨＬＡ−Ａ２分子に結合する二次アンカーの位置であることが判明している（非特許文献４５、４６）。これらの位置のうち２箇所（３および７）は、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合する二次アンカーの位置であることがいくつかのグループによって示された（非特許文献４５、４６）。
【００６７】
このような二次アンカー位置の変化は、Ｔ細胞認識の差となり得る（非特許文献４７、４８）。しかし、これらの研究においては、Ｔ細胞認識の差はＭＨＣ結合の変化と関連し、ヘテロクリシティーの獲得に関わるアミノ酸置換の種類に対する法則は規定されなかった。二次アンカーの変化からＴ細胞認識の変化へのこのような変換が起こる機序は、現在不明である。しかし、いくつかのモデルから、二次アンカー位置の残基がＭＨＣに結合する方法の変化は、ＴＣＲ接触残基の配向の変化または柔軟性の増大をもたらし、ＴＣＲに対するこれらのアナログの結合を強化することが示唆されている（非特許文献４９〜５２）。また、過去のいくつかの研究によれば、ヘテロクリティックアナログによるＴ細胞応答の調節には、一次ＴＣＲ接触残基が直接関与することが暗示される（非特許文献３６、５３、５４）。しかし、この知見は、現在の系統的な分析によって裏付けられていない。本研究で特定されたアナログに対するＴ細胞認識の向上は、ＭＨＣ結合能の増加によるものである可能性は低いが、結合性の増大は、１番目のアンカー位置が最適化されたアナログの場合に、重要な役割を果たす可能性が高い。本研究は、ヘテロクリティックアナログが、ＴＣＲまたはＭＨＣ結合能の著しい変化ではなくコンホメーションのわずかな変化によって産生される可能性が最も高いことを示唆している。
【００６８】
Ｔｈ１またはＴｈ２サイトカインの産生の調節に差異は認められなかった。その代わりに、本データからは、ヘテロクリティックアナログが、増加の大きさおよび動力学は異なり得るが、Ｔｈ１とＴｈ２の両方の応答生成を増大させることが示唆された。実際に、いくつかのグループ（非特許文献１２、４４）は、最近、ペプチドアナログによるこのような全体の刺激について報告した。これは、アナログによって誘導される強いＴＣＲシグナルに起因し得るが、このような全体の刺激の機序はまだ未解明である。
【００６９】
関連する腫瘍モデル、または自己抗原に対する寛容性が存在するモデルを用いて、ヘテロクリティックアナログのインビボでの効力を評価する。結果的に、ヘテロクリティックアナログによる免疫化は、有効なＣＴＬの産生が困難であることがこれまでに判明している場合に、腫瘍に対するワクチン接種のより有効で効率的な戦略であることが判明した。
【００７０】
出願人らは、１組の実験において、癌およびウイルス起源のいくつかの異なるＨＬＡ−Ａ２．１制限ＣＴＬエピトープ（ＨＬＡ−Ａ２．１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＴＬ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）のヘテロクリティックアナログを特定した。関連する野生型エピトープを表１に示す。これらのエピトープはすべて、本発明者らの初期の報告では免疫原性であることが判明している（非特許文献５５、５６）。初期の実験においては、２３３個のＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２ＣＴＬエピトープのアナログの抗原性が検討された。特定された４個のヘテロクリティックアナログの性質から、ヘテロクリティック置換に３、５および７位における保存的置換が含まれることが示唆された。この仮説は、３個の追加のエピトープＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶＰｏｌ．４７６およびＨＢＶＰｏｌ．４５５を含めたその後の研究において検討された。こうして特定されたヘテロクリティックアナログのすべてが、提案した法則、すなわち、ヘテロクリティックアナログが３、５および／または７位の保存的または半保存的置換を伴うという法則に従った。
【００７１】
癌免疫療法におけるヘテロクリティックアナログの臨床応用により近似させるために、ネズミエピトープｐ５３．２６１も改変した。このエピトープに対する部分的なＴ細胞寛容状態が報告されている（非特許文献５７、５８）。９個の予測されたｐ５３．２６１アナログのうち４個は、ネイティブペプチドによって誘導されるＣＴＬ応答よりも強いアナログ特異的ＣＴＬ応答をインビボで誘導することが見出された。より重要なことには、ヘテロクリティックアナログによる免疫化によって生じるＣＴＬの交差反応性を分析したときに、３個のｐ５３．２６１アナログが、ネイティブｐ５３．２６１エピトープに強力に反応するＣＴＬを誘導した。最後に、ヒトＣＴＬに対するこれらの知見の関連性を、ＭＡＧＥ３．１１２エピトープのヘテロクリティックアナログがヒトＴ細胞に対して免疫原性であることをインビトロで示すことによって取り扱った。得られたＣＴＬは、腫瘍細胞系の形の自然にプロセシングされた野生型抗原を認識することができる。
【００７２】
本明細書に示す研究によれば、試験したすべてのエピトープに対してヘテロクリティックアナログが特定され、ヘテロクリシティーは全体的な現象である。また、本出願によれば、インビボで免疫化した後、（初期の研究に記載のような）Ｔ細胞クローン集団とＴ細胞バルク集団の両方においてヘテロクリティックアナログを検出することが可能である。さらに、本明細書では、（ＨＬＡ  Ａ２．１系と他のクラスＩスーパーモチーフの両方の）ヘテロクリシティーは、ヘテロクリシティーの合理的な予測を可能にする別個の構造的特徴を伴うことを示す。
【００７３】
さらに、ｐ５３．２６１ヘテロクリティックアナログは、より大きな結合活性を有するＣＴＬを誘導し、野生型ペプチドによって誘導されるよりも多数（前駆体頻度）のこれらの細胞も誘導することを示す。ヘテロクリティックＣＴＬのインビボでの誘導と、Ｔ細胞寛容性を打破するためのその応用とを示す。
【００７４】
ヘテロクリティックアナログは、インビボでの免疫化後に特定のＴ細胞バルク集団を産生させるのに有効であった。複数のＴＣＲ遺伝子からのＴＣＲを有するポリクローナル応答は、臨床現場における病態の寛解により効果的である。最後に、野生型エピトープに対して強力な交差反応結合活性を有するＣＴＬの前駆体頻度を増加させることができることは、通常は免疫系に寛容であるエピトープに対して有効なＣＴＬ応答が必要とされる場合に重要である。
【００７５】
出願人らは、別の組の実験において、（表１に示す）Ｂ７スーパーファミリーエピトープＭＡＧＥ２．１７０のヘテロクリティックアナログを特定した。Ａ２ヘテロクリティックエピトープ同様、Ｂ７スーパーファミリーエピトープのヘテロクリティックアナログは、ペプチドの中間の奇数位置（位置７）に置換を導入することによって産生することができた。ＭＡＧＥ２．１７０エピトープに対する置換の性質は、ネイティブ残基と比べて保存的／半保存的（Ｙ→ＨおよびＹ→Ｍ置換）または非保存的（Ｙ→Ｅ、Ｙ→ＧおよびＹ→Ｄ置換）であった（表８）。したがって、非保存的置換が、ＭＡＧＥ２．１７０ＣＴＬエピトープに対するヘテロクリティックアナログをもたらし得るという観察結果は、Ａ２スーパーファミリーエピトープの場合に観察されたものと置換パターンが部分的に重複することを示している。
【００７６】
２．定義
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えば、非特許文献５９を参照されたい）。
【００７７】
特定のアミノ酸配列において、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与した、またはＴ細胞に関連した１セットのアミノ酸残基であり、これらの残基は、ＨＬＡに関連して提示されるときに、Ｔ細胞受容体タンパク質による認識に必要である。インビトロまたはインビボの免疫系環境においては、エピトープは、一次、二次および三次ペプチド構造、電荷などの、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体またはＨＬＡ分子によって認識される部位を協力して形成する分子の総合的特徴を表すものである。「エピトープ」は、ＣＴＬエピトープとＨＴＬエピトープの両方を意味する。
【００７８】
「クラスＩエピトープ」または「ＣＴＬエピトープ」とは、クラスＩ  ＨＬＡ分子に結合するペプチドを意味する。本明細書に記述するように、クラスＩエピトープは、一般に、約８から約１３アミノ酸長であり、８、９、１０、１１、１２または１３アミノ酸長とすることができる。ＨＬＡ分子への結合は、２個の一次アンカー残基によって主に制御され、そのうち１個はエピトープのカルボキシル末端にあり、もう１個は２位または３位にある。結合は、１個または複数の二次アンカー残基によっても促進され得る。読者の便宜のため、様々な一次ＨＬＡクラスＩ結合アンカーを表３に示す。アンカーのパターンを「モチーフ」と称する。「スーパーモチーフ」は、２個以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子によって共有される結合特異性を有するペプチドである。スーパーモチーフを有するペプチドは、２個以上のＨＬＡ抗原によって、（本明細書に定義する）高親和性または中親和性で認識されることが好ましい。クラスＩスーパーモチーフの例は、例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２である（「クラスＩモチーフ」の項および表３〜５を参照されたい）。
【００７９】
スーパーモチーフはＡ１とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＳであり、ＲｘはＦ、ＷまたはＹである。
【００８０】
スーパーモチーフはＡ２とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱであり、ＲｘはＩ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＬである。
【００８１】
スーパーモチーフはＡ２．１とすることができ、Ｒ２は一次アンカーであり、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｑ、Ｉ、ＡまたはＴであり、ＲｘはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＡまたはＴである。
【００８２】
スーパーモチーフはＡ３とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｖ、Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｔ、ＬまたはＩとすることができ、ＲｘはＲまたはＫである。
【００８３】
スーパーモチーフはＡ２４とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、ＭまたはＴであり、ＲｘはＦ、Ｉ、Ｙ、Ｗ、ＬまたはＭである。
【００８４】
スーパーモチーフはＢ７とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｐであり、ＲｘはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、ＹまたはＡである。
【００８５】
一実施形態においては、スーパーモチーフはＡ２またはＢ７である。
【００８６】
別の実施形態においては、スーパーモチーフはＡ３またはＡ２４である。
【００８７】
クラスＩエピトープは、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＥＡまたはＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１１およびＭＡＧＥ−Ａ１０）、寄生虫抗原、細菌抗原または真菌抗原由来とすることができる。
【００８８】
適切な腫瘍関連抗原の例は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、メラノーマ抗原ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ならびにＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＧ−３、ＤＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ１８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＢＲＣＡ２、ＮＹ−ＬＵ−１、ＮＹ−ＬＵ−７、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳ、ＫＩＡＡ−２−５、ＳＣＣ、ｐ５３、ｐ７３、ＣＥＡ、Ｈｅｒ  ２／ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ２、ｇｐ７５／ＴＲＰｌ、カリクレイン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＴ１−１、β−カテニン、ＰＲＡＭＥ、テロメラーゼ、ＦＡＫ、サイクリンＤ１タンパク質、ＮＯＥＹ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＳＡＲＴ−１、ＣＡＰＢ、ＨＰＶＥ７、ｐ１５、葉酸受容体ＣＤＣ２７、ＰＡＧＥ−１およびＰＡＧＥ−４である。適切な感染症関連抗原の例は、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン・バーウイルス抗原、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）抗原およびヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）を含む。適切な真菌抗原の例は、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコックスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシドイデス（Ｃｏｃｃｉｄｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルスフミガーティス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｉｓ）に由来する抗原を含む。適切な原虫寄生体抗原の例は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を含めたプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、レーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種などに由来する抗原を含む。
【００８９】
本開示を通して、「結合データ」結果を、多くの場合「ＩＣ５０」として示す。ＩＣ５０は、結合アッセイにおいて、基準ペプチドの５０％の結合阻害が認められるペプチド濃度である。アッセイが行われる条件（すなわち、限られたＨＬＡタンパク質濃度および標識ペプチド濃度）では、これらの値はＫｄ値に近い。結合性を決定するアッセイは、例えば、参照により本明細書に援用する（特許文献１、２）に詳細に記載されている。ＩＣ５０値は、アッセイ条件が変われば、また、使用する特定の試薬（例えば、ＨＬＡ試料など）に応じて、しばしば大きく変わり得ることに留意されたい。例えば、過剰濃度のＨＬＡ分子は、所与のリガンドの見かけのＩＣ５０測定値を増加させる。別法では、基準ペプチドを基準として結合性を表す。個々のアッセイの感度は高くも低くもなるので、試験ペプチドのＩＣ５０はいくらか変化するが、基準ペプチドを基準とした結合性はさほど変わらない。例えば、基準ペプチドのＩＣ５０が１０倍になるような条件下でのアッセイにおいては、試験ペプチドのＩＣ５０値も約１０倍になる。したがって、あいまいさを回避するために、ペプチドが良好な、中程度の、弱い、または劣るバインダーであるかどうかの評価は、一般に、標準ペプチドのＩＣ５０に対するそのＩＣ５０に基づいている。結合性は、当分野で既知の他のアッセイシステムを使用しても求めることができる。
【００９０】
「カルボキシルまたはＣ末端」と称するエピトープ中の残基位置は、以下に定義する従来の命名法によって示されるペプチドのカルボキシル末端に最も近いエピトープ末端にある残基位置を指す。エピトープの「Ｃ末端」は、ペプチドまたはポリペプチドの末端に実際に対応しても、しなくてもよい。
【００９１】
「Ｎ末端」または「アミノ末端位置」と称するエピトープ中の残基位置は、以下に定義する従来の命名法によって示されるペプチドのＮ末端に最も近いエピトープの末端にある残基位置を指す。エピトープの「Ｎ末端」は、ペプチドまたはポリペプチドの末端に実際に対応しても、しなくてもよい。
【００９２】
「コンピュータ」または「コンピュータシステム」は、一般に、プロセッサ；例えば、ハードドライブ、ディスクドライブ、テープドライブなどの少なくとも１個の情報記憶装置／検索装置；例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、マイクロフォンなどの少なくとも１個の入力装置；ディスプレイ構造などを備える。さらに、コンピュータは、ネットワークと接続された通信チャネルを含むこともできる。このようなコンピュータは、上述のもの以上に備えることもできるし、上述のもの以下を備えることもできる。
【００９３】
本明細書に記載する「ヘテロクリティックアナログ」とは、所与の用量に対する応答の増大によって、または相同の（「野生型」）クラスＩエピトープと同じ応答を得るのに必要な量の減少によって判定して、特定のＴ細胞に対する効力の増大をもたらす、１、２、３または４アミノ酸置換されたエピトープである。本発明の方法は、あらゆるクラスＩエピトープ、特にヒト癌および前癌状態に関連するクラスＩエピトープ、ならびにウイルス、細菌、真菌、原虫寄生体などの病原体に由来するクラスＩエピトープを改変するのに有用である。ヘテロクリティックアナログを、本明細書では「アナログ」とも称する。
【００９４】
好ましい実施形態においては、ヘテロクリティックアナログは、対応する野生型クラスＩエピトープよりも特定のＴ細胞に対する効力が少なくとも約５０％高い。このアナログは、１つのみの置換を含むことができ、または２つ、３つもしくは４つの置換を含むことができ、この置換は、保存的でも、半保存的でも、非保存的でもよい。ヘテロクリティックアナログは、ＨＬＡクラスＩ分子に結合し、関連する細胞障害性Ｔ細胞に接触すると、Ｔｈ１とＴｈ２の両方のサイトカインを誘導することができる。好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２からなる群から選択されるＨＬＡスーパーモチーフを含み、より好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ２もしくはＢ７スーパーモチーフまたはＡ３もしくはＡ２４スーパーモチーフを含み、最も好ましくは、Ａ２モチーフ（例えば、Ａ＊０２０１モチーフ）、Ａ３モチーフ（例えば、Ａ＊０３０１モチーフ）、Ａ２４モチーフ（例えば、Ａ＊２４０２モチーフ）、またはＢ７モチーフ（例えば、Ｂ＊０７０２）を含む。
【００９５】
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープよりも高い免疫原性を有するＭＨＣクラスＩエピトープアナログを含むポリペプチドを産生する方法に関する。この方法は、（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩエピトープを特定するステップであって、式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となるようにｘ＝８〜１１であり、Ｒ２またはＲ３およびＲｘはモチーフまたはスーパーモチーフの一次アンカー残基であるステップと、（ｂ）アナログを含むポリペプチドを産生するステップであって、Ｒ３および／またはＲ４および／またはＲ５および／またはＲ６および／またはＲ７および／またはＲ８および／またはＲ９および／またはＲ１０における１つまたは複数の保存的、半保存的または非保存的アミノ酸置換以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を前記アナログが含み、一部の実施形態においては前記１つまたは複数の置換が一次アンカー残基のものではないステップとを含む。
【００９６】
本明細書で使用する「保存」もしくは「保存的」、「半保存」もしくは「半保存的」、または「非保存」もしくは「非保存的」であるアミノ酸を、調製Ｂによって定義し、表２に示す。
【００９７】
ＨＬＡクラスＩ分子に関して本明細書で使用する「高親和性」とは、ＩＣ５０またはＫＤ値が５０ｎＭ以下の結合として定義され、「中間の親和性」は、ＩＣ５０またはＫＤ値が約５０〜約５００ｎＭの結合である。ＨＬＡクラスＩＩ分子との結合に関する「高親和性」とは、ＩＣ５０またはＫＤ値が１００ｎＭ以下の結合として定義され、「中間の親和性」は、ＩＣ５０またはＫＤ値が約１００〜約１０００ｎＭの結合である。
【００９８】
本発明は、上記方法によって産生されるアナログポリペプチドも提供する。したがって、本発明は、本明細書の方法によって得ることができるアナログを含む「アナログポリペプチド」、または前記アナログからなる「アナログポリペプチド」を提供する。このようなアナログポリペプチドを、本明細書ではアナログ「タンパク質」および「ペプチド」とも称し、他の等価な句によって呼ぶこともある。特に、このようなアナログポリペプチドは、配列番号２、３、５、６、８、９、１１〜１９、２１〜２５、４４〜４８、５０、５１、５３、５４、５６、５８、５９および６１〜６６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるアナログを含むことが好ましい。これらのアナログペプチドおよびタンパク質を、一部の実施形態においては医薬品用途に設計される組成物に入れることができる。
【００９９】
「アナログポリペプチド」とは、本明細書に記載するあらゆる形のアナログタンパク質およびポリペプチドを意味する。アナログポリペプチドは、任意の適切な方法によって調製することができる。このようなポリペプチドは、単離された天然のポリペプチド、組換えにより産生されたポリペプチド、合成により産生されたポリペプチド、またはこれらの方法を併用して産生されたポリペプチドを含む。このようなポリペプチドを調製する手段は、当分野ではよく知られている。
【０１００】
本発明は、本発明のアナログポリペプチドをコードするアナログポリヌクレオチドも提供する。したがって、本発明は、本明細書の方法によって得ることができるアナログをコードする核酸を含む「アナログポリヌクレオチド」、または前記核酸からなる「アナログポリヌクレオチド」を提供する。このようなアナログポリヌクレオチドを、本明細書ではアナログ「核酸分子」とも称し、他の等価な句によって呼ぶこともある。特に、このようなアナログポリヌクレオチドは、配列番号２、３、５、６、８、９、１１〜１９、２１〜２５、４４〜４８、５０、５１、５３、５４、５６、５８、５９および６１〜６６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるアナログをコードする核酸を含むことが好ましい。これらのアナログポリヌクレオチドは、一部の実施形態においては医薬品用途に設計される組成物に入れることができる。
【０１０１】
「アナログポリヌクレオチド」とは、本明細書に記載するあらゆる形のアナログポリヌクレオチドを意味する。アナログポリヌクレオチドは、任意の適切な方法によって調製することができる。このようなポリヌクレオチドは、単離された天然のポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、またはこれらの方法を併用して産生されたポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドを調製する手段は、当分野ではよく理解されている。
【０１０２】
「単離された」または「生物学的に純粋な」という語句は、自然の状態でその材料に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。したがって、本発明によって単離されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、それらの本来の環境においてそのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに通常付随する材料を含まない。
【０１０３】
「ＨＴＬエピトープ」または「Ｔヘルパーエピトープ」または「クラスＩＩペプチド」とは、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子に結合するペプチドを意味する。ＨＴＬエピトープは、一般に約６から約２５アミノ酸長の対立遺伝子特異的クラスＩＩモチーフを含むペプチドである。このようなペプチドは、ＨＬＡ分子に結合しＨＴＬ応答を誘導する。すなわち、ＨＴＬエピトープは、適切なＨＬＡクラスＩＩ分子に結合することができ、その後ヘルパーＴ細胞応答を誘発する。
【０１０４】
「Ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチド」（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチド、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、ＨＴＬエピトープの一種であり、２個以上のＨＬＡクラスＩＩ  ＤＲ分子に結合する分子ファミリーの１つである。ＰＡＤＲＥ（登録商標）分子ファミリーを規定するパターンは、ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフの通りであると考えられる。ＰＡＤＲＥ（登録商標）分子中に存在するこのパターンを含むペプチドは、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、ヒトヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答をインビトロおよびインビボで刺激する。
【０１０５】
「組成物」は、本発明の１個または複数のアナログポリペプチドおよび／またはアナログポリヌクレオチドと、賦形剤、希釈剤、非アナログポリペプチド（例えば、ＣＴＬエピトープ、ｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドなどのＨＴＬエピトープを含むポリペプチド、および／または担体など）、このような非アナログポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、脂質、リポソームなどの他の成分と、本明細書に記載する他の成分とを含有する。本発明による組成物には、１個または複数のアナログポリペプチドおよび／またはアナログポリヌクレオチド；１個または複数のアナログおよび１個または複数のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープ；および／またはこのようなペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸、例えば、ポリエピトピープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）のアナログポリペプチドをコードするミニ遺伝子のカクテルのような多数の実施形態がある。
【０１０６】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、場合によっては、脂質化、標的配列または他の配列の追加などによって改変することができる。本発明のポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと混合して、または結合させて、細胞障害性リンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進させることができる。
【０１０７】
「薬剤として許容される」とは、一般に、無毒、不活性および／または生理学的に適合する組成物を指す。
【０１０８】
本明細書で使用する「ワクチン」は、本発明の１個または複数のアナログポリペプチドおよび／またはアナログポリヌクレオチドを含有する、薬剤として許容される組成物を指す。組成物、特にワクチンは、ペプチドパルスした抗原提示細胞、例えば、樹状細胞を含むこともできる。
【０１０９】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【０１１０】
３．Ａ２、Ａ３、Ａ２４およびＢ７アナログおよび調製方法
本発明は、対応する類似の野生型エピトープよりも高い免疫応答を起こし得るエピトープを含むペプチドを調製する方法を提供する。得られる「ヘテロクリティックアナログ」は、標的細胞上に表示された抗原によって特徴付けられるウイルス性疾患、癌、および他の病気を治療するための免疫学的組成物に有用である。
【０１１１】
したがって、一態様においては、本発明は、エピトープを含むペプチドの免疫原性を高める方法を対象とする。この方法は、ｉ）クラスＩエピトープを含むペプチドを用意するステップであって、前記エピトープがアミノ末端およびカルボキシル末端および少なくとも１個の一次アンカー残基を有するアミノ酸配列を含み、このエピトープのアミノ酸残基に連続した番号が付けられ、このエピトープのアミノ末端に最も近い一次アンカー残基が２位または３位にあるステップと、ｉｉ）このエピトープのアミノ末端とカルボキシル末端の間の、一次アンカー残基を含まない３位および／または４位および／または５位および／または６位および／または７位に、１個または複数の保存的、半保存的または非保存的置換を導入するステップとを含む。
【０１１２】
好ましい実施形態においては、ヘテロクリティックアナログは、対応する野生型クラスＩエピトープよりも、特定のＴ細胞に対する効力が少なくとも約５０％高い。より好ましい実施形態においては、ヘテロクリティックアナログは、１／１０以下の用量で野生型ペプチドと同等のＣＴＬ応答（すなわちＩＦＮγ放出）を刺激する。
【０１１３】
このアナログは、１つのみの置換を含むことができ、または２つ、３つもしくは４つの置換を含むことができ、この置換は、保存的でも、半保存的でも、非保存的でもよい。ヘテロクリティックアナログは、ＨＬＡクラスＩ分子に結合し、関連する細胞障害性Ｔ細胞に接触すると、Ｔｈ１とＴｈ２の両方のサイトカインを誘導することができる。好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２からなる群から選択されるＨＬＡスーパーモチーフを含み、より好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ２もしくはＢ７スーパーモチーフまたはＡ３もしくはＡ２４スーパーモチーフを含み、最も好ましくは、Ａ２モチーフ（例えば、Ａ＊０２０１モチーフ）、Ａ３モチーフ（例えば、Ａ＊０３０１モチーフ）、Ａ２４モチーフ（例えば、Ａ＊２４０２モチーフ）、またはＢ７モチーフ（例えば、Ｂ＊０７０２）を含む（下記「クラスＩモチーフ」項、および表３〜５を参照されたい）。
【０１１４】
対応する「野生型」エピトープとして働くクラスＩエピトープは、任意のタンパク質源に由来することができる。例えば、クラスＩペプチドは、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原、細菌抗原または真菌抗原から得ることができる。クラスＩエピトープは、ウイルス抗原（例えば、ＨＢＶまたはＨＩＶ）、腫瘍関連抗原（例えば、ＣＥＡまたはＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１１、ＭＡＧＥ−Ａ１０またはｐ５３）、寄生虫抗原、細菌抗原または真菌抗原に由来することができる。野生型エピトープは、上皮細胞癌において特異的に上方制御され、免疫原性であることが判明している自己抗原に由来する腫瘍エピトープを含む。ＨＩＶおよびＨＢＶのポリメラーゼ遺伝子に由来するウイルスエピトープなどの使用ウイルスエピトープも、同様に免疫原性であることが判明している。
【０１１５】
したがって、いくつかの潜在的な抗原由来のエピトープに基づくヘテロクリティックアナログを本発明に使用することができる。適切な腫瘍関連抗原の例は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、メラノーマ抗原ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ならびにＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＧ−３、ＤＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ１８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＢＲＣＡ２、ＮＹ−ＬＵ−１、ＮＹ−ＬＵ−７、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳ、ＫＩＡＡ−２−５、ＳＣＣ、ｐ５３、ｐ７３、ＣＥＡ、Ｈｅｒ  ２／ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ２、ｇｐ７５／ＴＲＰｌ、カリクレイン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＴ１−１、β−カテニン、ＰＲＡＭＥ、テロメラーゼ、ＦＡＫ、サイクリンＤ１タンパク質、ＮＯＥＹ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＳＡＲＴ−１、ＣＡＰＢ、ＨＰＶＥ７、ｐ１５、葉酸受容体ＣＤＣ２７、ＰＡＧＥ−１およびＰＡＧＥ−４を含む。適切な感染症関連抗原の例は、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン・バーウイルス抗原、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）抗原およびヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）を含む。適切な真菌抗原の例は、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコックスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシドイデス（Ｃｏｃｃｉｄｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルスフミガーティス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｉｓ）に由来する抗原を含む。適切な原虫寄生体抗原の例は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を含めたプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、レーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種などに由来する抗原である。
【０１１６】
本発明のいくつかの好ましい態様においては、クラスＩペプチドは、対象の免疫系が、寛容、すなわち、過去の抗原暴露によって誘導された特異的免疫非反応性を示した抗原に由来する。
【０１１７】
本発明の法則を適用する野生型配列として使用して、対応するヘテロクリティックアナログを構築することができるエピトープは、任意のクラスＩエピトープ、好ましくはＡ２、Ａ３、Ａ２４またはＢ７エピトープに対応することを見出すことができる。上述した抗原などの任意所望の抗原の場合、特定のクラスＩ対立遺伝子に付随するモチーフを指針として使用して、抗原のアミノ酸配列中のこのようなエピトープが存在する位置を決定することができる。この決定は、目視または、好ましくは、コンピュータ技術および関連ソフトウェアを用いて実施することができる。したがって、例えば、Ａ３スーパーモチーフが、例えば、２位のバリンおよびＣ末端のアルギニンを含むことがわかれば、任意所望の抗原のアミノ酸配列を、このモチーフを有するエピトープについて調べることができる。次いで、そのエピトープを本発明の法則によって改変して、所望のアナログを得ることができる。
【０１１８】
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのアナログを産生する方法に関する。このアナログは、このエピトープよりも高い免疫原性を有する。この方法は、（ａ）式（Ａ）を含むＭＨＣクラスＩエピトープを特定するステップであって、式（Ａ）はＲｎ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−．．．．．Ｒｘであり、ＲｎはＮ末端アミノ酸であり、ＲｘはＣ末端アミノ酸であり、ＲｘがＲｎから、８番目から１１番目のアミノ酸残基となるようにｘ＝８〜１１であり、Ｒ２およびＲｘはモチーフまたはスーパーモチーフの一次アンカー残基であるステップと、（ｂ）アナログを産生するステップであって、このアナログが、Ｒ３および／またはＲ４および／またはＲ５および／またはＲ６および／またはＲ７における１つまたは複数の保存的、半保存的または非保存的アミノ酸置換以外は前記式（Ａ）と同一の式（Ｂ）を含み、一部の実施形態においては前記１つまたは複数の置換が一次アンカー残基のものではないステップとを含む。
【０１１９】
スーパーモチーフはＡ１とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｔ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＭまたはＳであり、ＲｘはＦ、ＷまたはＹである。モチーフはＡ１モチーフ（例えば、Ａ＊０１０１モチーフなど、「クラスＩモチーフ」および表３〜５を参照されたい）とすることができる。
【０１２０】
スーパーモチーフはＡ２とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱであり、ＲｘはＩ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＬである。モチーフはＡ２モチーフ（例えば、Ａ＊０２０２モチーフなど、「クラスＩモチーフ」および表３〜５を参照されたい）とすることができる。
【０１２１】
スーパーモチーフはＡ２．１とすることができ、Ｒ２は一次アンカーであり、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｑ、Ｉ、ＡまたはＴであり、ＲｘはＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＡまたはＴである。モチーフはＡ２．１モチーフ（例えば、Ａ＊０２０１モチーフなど、「クラスＩモチーフ」および表３〜５を参照されたい）とすることができる。
【０１２２】
スーパーモチーフはＡ３とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｖ、Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｔ、ＬまたはＩであり、ＲｘはＲまたはＫである。モチーフは、Ａ３モチーフ（例えば、Ａ＊０３０１モチーフなど、「クラスＩモチーフ」および表３〜５を参照されたい）とすることができる。
【０１２３】
スーパーモチーフはＡ２４とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、ＭまたはＴであり、ＲｘはＦ、Ｉ、Ｙ、Ｗ、ＬまたはＭである。モチーフは、Ａ２４モチーフ（例えば、Ａ＊２４０２モチーフなど、「クラスＩモチーフ」および表３〜５を参照されたい）とすることができる。
【０１２４】
スーパーモチーフはＢ７とすることができ、Ｒ２は一次アンカー残基であり、Ｐであり、ＲｘはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ、Ｗ、ＹまたはＡである。モチーフは、Ｂ７モチーフ（例えば、Ｂ＊０７０２モチーフなど、「クラスＩモチーフ」および表３〜５を参照されたい）とすることができる。
【０１２５】
好ましい実施形態においては、スーパーモチーフまたはモチーフはＡ３であり、式（Ｂ）は、Ｒ４が保存的または非保存的アミノ酸で置換されている以外は式（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、Ｒ４はＰまたはＩで置換されている。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ４はＧであり、式（Ｂ）は、Ｒ４が保存的または非保存的アミノ酸で置換されている以外は（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ４はＧであり、式（Ｂ）は、Ｒ４がＰまたはＩである以外は（Ａ）と同一であり。好ましい実施形態においては、エピトープはＣＥＡ．６１であり、アナログは配列番号１１および１２から選択される。
【０１２６】
好ましい実施形態においては、スーパーモチーフまたはモチーフはＡ３であり、式（Ｂ）は、Ｒ７が保存的、半保存的または非保存的アミノ酸で置換されている以外は式（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、Ｒ７は、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｄ、Ｇ、ＣまたはＮで置換されている。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ７はＷであり、式（Ｂ）は、Ｒ７が保存的、半保存的または非保存的アミノ酸で置換されている以外は（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ７はＷであり、式（Ｂ）は、Ｒ７がＬ、Ｍ、Ｉ、Ｄ、Ｇ、ＣまたはＮである以外は（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、エピトープはＣＥＡ．６１であり、アナログは配列番号１３〜１９から選択される。
【０１２７】
好ましい実施形態においては、スーパーモチーフまたはモチーフはＡ２４であり、式（Ｂ）は、Ｒ３が保存的アミノ酸で置換されている以外は式（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、Ｒ３はＩで置換されている。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ３はＬであり、式（Ｂ）は、Ｒ３が、保存的アミノ酸で置換されている以外は（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ３はＬであり、式（Ｂ）は、Ｒ３がＩである以外は（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、エピトープはＭＡＧＥ２．１５６であり、アナログは配列番号２１である。
【０１２８】
好ましい実施形態においては、スーパーモチーフまたはモチーフはＡ２４であり、式（Ｂ）は、Ｒ４が保存的または非保存的アミノ酸で置換されている以外は式（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、Ｒ４はＥまたはＬで置換されている。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ４はＱであり、式（Ｂ）は、Ｒ４が保存的または非保存的アミノ酸で置換されている以外は（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ４はＱであり、式（Ｂ）は、Ｒ４がＥまたはＬである以外は（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、エピトープはＭＡＧＥ２．１５６であり、アナログは配列番号２２および２３から選択される。
【０１２９】
好ましい実施形態においては、スーパーモチーフまたはモチーフはＡ２４であり、式（Ｂ）は、Ｒ６が保存的アミノ酸で置換されている以外は式（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、Ｒ６は、ＭまたはＬで置換されている。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ６はＶであり、式（Ｂ）は、Ｒ６が保存的アミノ酸で置換されている以外は（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、式（Ａ）のＲ６はＶであり、式（Ｂ）は、Ｒ６がＭまたはＬである以外は（Ａ）と同一である。好ましい実施形態においては、エピトープはＭＡＧＥ２．１５６であり、アナログは配列番号２４および２５から選択される。
【０１３０】
したがって、本発明は、上記アナログ、上記アナログの各々を含むアナログポリペプチド、または上記アナログの各々からなるアナログポリペプチド、ならびに前記アナログおよびアナログポリペプチドの各々をコードするポリヌクレオチドを産生する方法を含む。本発明は、さらに以下に記述するように、アナログ、アナログポリペプチドおよびアナログポリヌクレオチドそれら自体も含む。
【０１３１】
４．アナログポリペプチドおよびアナログポリヌクレオチドおよび調製方法
上記のように、「アナログポリペプチド」は、アナログを含み、またはアナログからなり、本発明の一部でもある。好ましいアナログは、上記項に示されている。
【０１３２】
アナログポリペプチドは、９〜２０個のアミノ酸、好ましくは９〜１６個のアミノ酸、より好ましくは９〜１５個のアミノ酸を含むことができるが、合計で９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のアミノ酸のみしか含まないこともできる。ある実施形態においては、ポリペプチドは、２５０個以下のアミノ酸、２２５個以下のアミノ酸、２００個以下のアミノ酸、１７５個以下のアミノ酸、１５０個以下のアミノ酸、１２５個以下のアミノ酸、１００個以下のアミノ酸、７５個以下のアミノ酸、５０個以下のアミノ酸、４０個以下のアミノ酸、３５個以下のアミノ酸、３０個以下のアミノ酸、２５個以下のアミノ酸、２０個以下のアミノ酸、１５個以下のアミノ酸、あるいは１４、１３、１２、１１、１０、９または８個のアミノ酸を含むことができる。
【０１３３】
別の実施形態においては、アナログポリペプチドは、少なくとも９〜２０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも９〜１６個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも９〜１５個のアミノ酸を含むことができるが、合計で少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個のアミノ酸を含むこともできる。ある実施形態においては、ポリペプチドは、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも２２５個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも１７５個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも１２５個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、または少なくとも１４個、少なくとも１３個、少なくとも１２個、少なくとも１１個、少なくとも１０個、少なくとも９個、または少なくとも８個のアミノ酸を含むことができる。
【０１３４】
可能であれば、本発明のアナログポリペプチドを長さ約８から約１３アミノ酸残基（すなわち、８、９、１０、１１、１２または１３）、しばしば８から１１アミノ酸残基、好ましくは９から１０アミノ酸残基に最適化することが望ましいこともある。アナログポリペプチドは、関連するＨＬＡ分子に結合する内因的にプロセシングされた病原体由来エピトープまたは腫瘍細胞エピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３、−Ａ２４または−Ｂ７）に見合ったサイズであることが好ましいが、本発明のアナログを含むポリペプチドの特定および調製は、本明細書に記載する他の技術を使用しても実施することができる。
【０１３５】
アナログポリペプチドは、ヘテロクリティックアナログを含む完全長抗原（例えば、ＣＥＡまたはＭＡＧＥ２）またはその断片を含むことができ、あるいはヘテロクリティックアナログを含む完全長抗原（例えば、ＣＥＡまたはＭＡＧＥ２）またはその断片からなることができる。完全長抗原の断片は、残基約１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００または１０１から抗原ＣＥＡもしくはＭＡＧＥ２（例えば、配列番号６８および６９）（表９）のＣ末端までの断片とすることができる。さらに、断片は、約８、９、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００または２５０アミノ酸長とすることができる。この状況における「約」は、どちらかの極端または両極端において、いくつか（５、４、３、２または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さい、特に列挙した範囲または長さを含む。ある実施形態においては、本発明のポリペプチドの長さには、例えば、４０アミノ酸以下、３５アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、または１４、１３、１２、１１、１０、９または８アミノ酸の制限がある。したがって、アナログポリペプチドは、完全長抗原の１個または複数の断片を含むことができ、この断片はアナログを含む。
【０１３６】
アナログポリペプチドは、（ａ）配列番号68のアミノ酸61〜69；（ｂ）配列番号68のアミノ酸61〜70、61〜71、61〜72、61〜73、61〜74、61〜75、61〜76、61〜77、61〜78、61〜79、61〜80、61〜81、61〜82、61〜83、61〜84、61〜85、61〜86、61〜87、61〜88、61〜89、61〜90、61〜91、61〜92、61〜93、61〜94、61〜95、61〜96、61〜97、61〜98、61〜99、61〜100、61〜101、61〜102、61〜103、61〜104、61〜105、61〜106、61〜107、61〜108、61〜109、61〜110、61〜111、61〜112、61〜113、61〜114、61〜115、61〜116、61〜117、61〜118、61〜119、61〜120、61〜121、61〜122、61〜123、61〜124、61〜125、61〜126、61〜127、61〜128、61〜129、61〜130、61〜131、61〜132、61〜133、61〜134、61〜135、61〜136、61〜137、61〜138、61〜139、61〜140、61〜141、61〜142、61〜143、61〜144、61〜145、61〜146、61〜147、61〜148、61〜149、61〜150、61〜151、61〜152、61〜153、61〜154、61〜155、61〜156、61〜157、61〜158、61〜159、61〜160、61〜161、61〜162、61〜163、61〜164、61〜165、61〜166、61〜167、61〜168、61〜169、61〜170、61〜171、61〜172、61〜173、61〜174、61〜175、61〜176、61〜177、61〜178、61〜179、61〜180、61〜181、61〜182、61〜183、61〜184、61〜185、61〜186、61〜187、61〜188、61〜189、61〜190、61〜191、61〜192、61〜193、61〜194、61〜195、61〜196、61〜197、61〜198、61〜199、61〜200、61〜201、61〜202、61〜203、61〜204、61〜205、61〜206、61〜207、61〜208、61〜209、61〜210、61〜211、61〜212、61〜213、61〜214、61〜215、61〜216、61〜217、61〜218、61〜219、61〜220、61〜221、61〜222、61〜223、61〜224、61〜225、61〜226、61〜227、61〜228、61〜229、61〜230、61〜231、61〜232、61〜233、61〜234、61〜235、61〜236、61〜237、61〜238、61〜239、61〜240、61〜241、61〜242、61〜243、61〜244、61〜245、61〜246、61〜247、61〜248、61〜249、61〜250、61〜251、61〜252、61〜253、61〜254、61〜255、61〜256、61〜257、61〜258、61〜259、61〜260、61〜261、61〜262、61〜263、61〜264、61〜265、61〜266、61〜267、61〜268、61〜269、61〜270、61〜271、61〜272、61〜273、61〜274、61〜275、61〜276、61〜277、61〜278、61〜279、61〜280、61〜281、61〜282、61〜283、61〜284、61〜285、61〜286、61〜287、61〜288、61〜289、61〜290、61〜291、61〜292、61〜293、61〜294、61〜295、61〜296、61〜297、61〜298、61〜299、61〜300、61〜301、61〜302、61〜303、61〜304、61〜305、61〜306、61〜307、61〜308、61〜309、61〜310、61〜311、61〜312、61〜313、61〜314、61〜315、61〜316、61〜317、61〜318、61〜319、61〜320、61〜321、61〜322、61〜323、61〜324、61〜325、61〜326、61〜327、61〜328、61〜329、61〜330、61〜331、61〜332、61〜333、61〜334、61〜335、61〜336、61〜337、61〜338、61〜339、61〜340、61〜341、61〜342、61〜343、61〜344、61〜345、61〜346、61〜347、61〜348、61〜349、61〜350、61〜351、61〜352、61〜353、61〜354、61〜355、61〜356、61〜357、61〜358、61〜359、61〜360、61〜361、61〜362、61〜363、61〜364、61〜365、61〜366、61〜367、61〜368、61〜369、61〜370、61〜371、61〜372、61〜373、61〜374、61〜375、61〜376、61〜377、61〜378、61〜379、61〜380、61〜381、61〜382、61〜383、61〜384、61〜385、61〜386、61〜387、61〜388、61〜389、61〜390、61〜391、61〜392、61〜393、61〜394、61〜395、61〜396、61〜397、61〜398、61〜399、61〜400、61〜401、61〜402、61〜403、61〜404、61〜405、61〜406、61〜407、61〜408、61〜409、61〜410、61〜411、61〜412、61〜413、61〜414、61〜415、61〜416、61〜417、61〜418、61〜419、61〜420、61〜421、61〜422、61〜423、61〜424、61〜425、61〜426、61〜427、61〜428、61〜429、61〜430、61〜431、61〜432、61〜433��61〜434、61〜435、61〜436、61〜437、61〜438、61〜439、61〜440、61〜441、61〜442、61〜443、61〜444、61〜445、61〜446、61〜447、61〜448、61〜449、61〜450、61〜451、61〜452、61〜453、61〜454、61〜455、61〜456、61〜457、61〜458、61〜459、61〜460、61〜461、61〜462、61〜463、61〜464、61〜465、61〜466、61〜467、61〜468、61〜469、61〜470、61〜471、61〜472、61〜473、61〜474、61〜475、61〜476、61〜477、61〜478、61〜479、61〜480、61〜481、61〜482、61〜483、61〜484、61〜485、61〜486、61〜487、61〜488、61〜489、61〜490、61〜491、61〜492、61〜493、61〜494、61〜495、61〜496、61〜497、61〜498、61〜499、61〜500、61〜501、61〜502、61〜503、61〜504、61〜505、61〜506、61〜507、61〜508、61〜509、61〜510、61〜511、61〜512、61〜513、61〜514、61〜515、61〜516、61〜517、61〜518、61〜519、61〜520、61〜521、61〜522、61〜523、61〜524、61〜525、61〜526、61〜527、61〜528、61〜529、61〜530、61〜531、61〜532、61〜533、61〜534、61〜535、61〜536、61〜537、61〜538、61〜539、61〜540、61〜541、61〜542、61〜543、61〜544、61〜545、61〜546、61〜547、61〜548、61〜549、61〜550、61〜551、61〜552、61〜553、61〜554、61〜555、61〜556、61〜557、61〜558、61〜559、61〜560、61〜561、61〜562、61〜563、61〜564、61〜565、61〜566、61〜567、61〜568、61〜569、61〜570、61〜571、61〜572、61〜573、61〜574、61〜575、61〜576、61〜577、61〜578、61〜579、61〜580、61〜581、61〜582、61〜583、61〜584、61〜585、61〜586、61〜587、61〜588、61〜589、61〜590、61〜591、61〜592、61〜593、61〜594、61〜595、61〜596、61〜597、61〜598、61〜599、61〜600、61〜601、61〜602、61〜603、61〜604、61〜605、61〜606、61〜607、61〜608、61〜609、61〜610、61〜611、61〜612、61〜613、61〜614、61〜615、61〜616、61〜617、61〜618、61〜619、61〜620、61〜621、61〜622、61〜623、61〜624、61〜625、61〜626、61〜627、61〜628、61〜629、61〜630、61〜631、61〜632、61〜633、61〜634、61〜635、61〜636、61〜637、61〜638、61〜639、61〜640、61〜641、61〜642、61〜643、61〜644、61〜645、61〜646、61〜647、61〜648、61〜649、61〜650、61〜651、61〜652、61〜653、61〜654、61〜655、61〜656、61〜657、61〜658、61〜659、61〜660、61〜661、61〜662、61〜663、61〜664、61〜665、61〜666、61〜667、61〜668、61〜669、61〜670、61〜671、61〜672、61〜673、61〜674、61〜675、61〜676、61〜677、61〜678、61〜679、61〜680、61〜681、61〜682、61〜683、61〜684、61〜685、61〜686、61〜687、61〜688、61〜689、61〜690、61〜691、61〜692、61〜693、61〜694、61〜695、61〜696、61〜697、61〜698、61〜699、61〜700、61〜701、および61〜702；（ｃ）配列番号68のアミノ酸1〜69、2〜69、3〜69、4〜69、5〜69、6〜69、7〜69、8〜69、9〜69、10〜69、11〜69、12〜69、13〜69、14〜69、15〜69、16〜69、17〜69、18〜69、19〜69、20〜69、21〜69、22〜69、23〜69、24〜69、25〜69、26〜69、27〜69、28〜69、29〜69、30〜69、31〜69、32〜69、33〜69、34〜69、35〜69、36〜69、37〜69、38〜69、39〜69、40〜69、41〜69、42〜69、43〜69、44〜69、45〜69、46〜69、47〜69、48〜69、49〜69、50〜69、51〜69、52〜69、53〜69、54〜69、55〜69、56〜69、57〜69、58〜69、59〜69、60〜69からなる群から選択されるＣＥＡの断片を含むことができ、またはその断片からなることができる。このような断片は、例えば、表６の少なくとも１個のＣＥＡ．６１アナログ（配列番号１１〜１９）を含むことができ、または表６の少なくとも１個のＣＥＡ．６１アナログ（配列番号１１〜１９）に融合することができる。
【０１３７】
アナログポリペプチドは、（ａ）配列番号69のアミノ酸157〜163；（ｂ）1〜163、2〜163、3〜163、4〜163、5〜163、6〜163、7〜163、8〜163、9〜163、10〜163、11〜163、12〜163、13〜163、14〜163、15〜163、16〜163、17〜163、18〜163、19〜163、20〜163、21〜163、22〜163、23〜163、24〜163、25〜163、26〜163、27〜163、28〜163、29〜163、30〜163、31〜163、32〜163、33〜163、34〜163、35〜163、36〜163、37〜163、38〜163、39〜163、40〜163、41〜163、42〜163、43〜163、44〜163、45〜163、46〜163、47〜163、48〜163、49〜163、50〜163、51〜163、52〜163、53〜163、54〜163、55〜163、56〜163、57〜163、58〜163、59〜163、60〜163、61〜163、62〜163、63〜163、64〜163、65〜163、66〜163、67〜163、68〜163、69〜163、70〜163、71〜163、72〜163、73〜163、74〜163、75〜163、76〜163、77〜163、78〜163、79〜163、80〜163、81〜163、82〜163、83〜163、84〜163、85〜163、86〜163、87〜163、88〜163、89〜163、90〜163、91〜163、92〜163、93〜163、94〜163、95〜163、96〜163、97〜163、98〜163、99〜163、100〜163、101〜163、102〜163、103〜163、104〜163、105〜163、106〜163、107〜163、108〜163、109〜163、110〜163、111〜163、112〜163、113〜163、114〜163、115〜163、116〜163、117〜163、118〜163、119〜163、120〜163、121〜163、122〜163、123〜163、124〜163、125〜163、126〜163、127〜163、128〜163、129〜163、130〜163、131〜163、132〜163、133〜163、134〜163、135〜163、136〜163、137〜163、138〜163、139〜163、140〜163、141〜163、142〜163、143〜163、144〜163、145〜163、146〜163、147〜163、148〜163、149〜163、150〜163、151〜163、152〜163、153〜163、154〜163、155〜163、156〜163；および（ｃ）配列番号69のアミノ酸157〜164、165、157〜166、157〜167、157〜168、157〜169、157〜170、157〜171、157〜172、157〜173、157〜174、157〜175、157〜176、157〜177、157〜178、157〜179、157〜180、157〜181、157〜182、157〜183、157〜184、157〜185、157〜186、157〜187、157〜188、157〜189、157〜190、157〜191、157〜192、157〜193、157〜194、157〜195、157〜196、157〜197、157〜198、157〜199、157〜200、157〜201、157〜202、157〜203、157〜204、157〜205、157〜206、157〜207、157〜208、157〜209、157〜210、157〜211、157〜212、157〜213、157〜214、157〜215、157〜216、157〜217、157〜218、157〜219、157〜220、157〜221、157〜222、157〜223、157〜224、157〜225、157〜226、157〜227、157〜228、157〜229、157〜230、157〜231、157〜232、157〜233、157〜234、157〜235、157〜236、157〜237、157〜238、157〜239、157〜240、157〜241、157〜242、157〜243、157〜244、157〜245、157〜246、157〜247、157〜248、157〜249、157〜250、157〜251、157〜252、157〜253、157〜254、157〜255、157〜256、157〜257、157〜258、157〜259、157〜260、157〜261、157〜262、157〜263、157〜264、157〜265、157〜266、157〜267、157〜268、157〜269、157〜270、157〜271、157〜272、157〜273、157〜274、157〜275、157〜276、157〜277、157〜278、157〜279、157〜280、157〜281、157〜282、157〜283、157〜284、157〜285、157〜286、157〜287、157〜288、157〜289、157〜290、157〜291、157〜292、157〜293、157〜294、157〜295、157〜296、157〜297、157〜298、157〜299、157〜300、157〜301、157〜302、157〜303、157〜304、157〜305、157〜306、157〜307、157〜308、157〜309、157〜310、157〜311、157〜312、157〜313、157〜314からなる群から選択されるＭＡＧＥ２の断片を含むことができ、またはその断片からなることができる。このような断片は、例えば、表６の少なくとも１個のＭＡＧＥ２．１５６アナログ（配列番号２１〜２５）を含むことができ、または表６の少なくとも１個のＣＥＡ．６１アナログ��配列番号２１〜２５）に融合することができる。
【０１３８】
一部の実施形態においては、高濃度のクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む抗原領域（「エピトープリッチ」領域）を特定することが好ましい。このような領域は、一般に、それが１アミノ酸長当たり多数のエピトープを含むことに基づいて選択される。エピトープリッチ領域である好ましい断片は、ＣＥＡ（配列番号６８）のアミノ酸６００〜７００、およびＭＡＧＥ２（配列番号６９）のアミノ酸１５７〜２８２を含む。完全長抗原の断片を含むアナログポリペプチドは、このような領域を含むことも、このような領域からなることもできる。
【０１３９】
エピトープは入れ子状態でまたは重複状態で存在することができ、例えば、１０アミノ酸長断片は２個の９アミノ酸長エピトープおよび１個の１０アミノ酸長エピトープを含むことができ、細胞内プロセシングによって各エピトープはＨＬＡ分子に曝され、このような断片を投与すると、各エピトープにＨＬＡ分子を結合させることができることを理解されたい。このようなエピトープの少なくとも１個は、本発明によって改変されてアナログとなる。このより大きな、好ましくはマルチエピトープの、アナログを含むポリペプチドを、合成、組換え、または自然源からの切断によって産生させることができる。
【０１４０】
アナログポリペプチドは、１個のアナログのホモポリマー、または少なくとも２個のアナログを含むヘテロポリマー、またはアナログと１個または複数のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープと組み合わせたアナログを含むヘテロポリマーのような融合タンパク質とすることもできる。一部の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、複数のアナログ、アナログと複数のエピトープ、またはポリエピトピックアナログポリペプチドのような複数のアナログプラス複数のエピトープを含む。
【０１４１】
アナログポリペプチドは、第１のアナログと、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０個の他の（異なる）（例えば、第２の、第３の、第４の、第５の、．．．第１５１の）アナログ、および／または、アナログと、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０個の（例えば、第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、．．．第１５０の）ＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープとを含むことができる。
【０１４２】
このような追加のアナログおよび／またはエピトープは、第１のアナログと同じ抗原に由来してもよいし、または異なる抗原に由来してもよい。したがって、例えば、第１のアナログがＡ３エピトープＣＥＡ．６１に由来する（例えば、アナログが配列番号１１〜１９の１個である）場合、追加のアナログは、ＣＥＡ．６１由来の異なるアナログでもよいし、またはＣＥＡ．６９１由来のアナログ（例えば、配列番号２〜３の１個または複数）でもよいし、またはＣＥＡ由来の任意の他のアナログでもよい。同様に、追加のエピトープを、ＣＥＡ由来の任意のＣＴＬまたはＨＴＬエピトープ、好ましくは表１３〜１５および１８のエピトープの１個とすることができる。別の例として、アナログがＡ２４エピトープＭＡＧＥ２．１５６に由来する（例えば、アナログが配列番号２１〜２５の１個である）場合、追加のアナログは、ＭＡＧＥ２．１５６由来の異なるアナログでもよいし、またはＭＡＧＥ２．１５７由来のアナログでもよいし、追加のエピトープは、ＭＡＧＥ２由来の任意のエピトープでもよい。ＭＡＧＥ２に由来する好ましいエピトープの例を表１３〜１５および１８に列挙する。追加のアナログは、一次アンカーアナログ、例えば、（特許文献３）に開示されたアナログ、または表１３〜１５および１８に記載のアナログとすることができる。
【０１４３】
あるいは、例えば、第１のアナログがＣＥＡ．６１に由来する（例えば、配列番号１１〜１９の１個）場合、追加のアナログまたはエピトープ（ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ）は、異なる腫瘍関連抗原および／または感染症抗原および／または原虫寄生体抗原および／または真菌抗原などの非ＣＥＡ抗原に由来することができる。
【０１４４】
腫瘍関連抗原は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、メラノーマ抗原ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ならびにＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＧ−３、ＤＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ１８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＢＲＣＡ２、ＮＹ−ＬＵ−１、ＮＹ−ＬＵ−７、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳ、ＫＩＡＡ−２−５、ＳＣＣ、ｐ５３、ｐ７３、ＣＥＡ、Ｈｅｒ  ２／ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ２、ｇｐ７５／ＴＲＰｌ、カリクレイン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＴ１−１、β−カテニン、ＰＲＡＭＥ、テロメラーゼ、ＦＡＫ、サイクリンＤ１タンパク質、ＮＯＥＹ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＳＡＲＴ−１、ＣＡＰＢ、ＨＰＶＥ７、ｐ１５、葉酸受容体ＣＤＣ２７、ＰＡＧＥ−１、ＰＡＧＥ−４などである。表１２を参照されたい。感染症関連抗原は、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン・バーウイルス抗原、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）抗原およびヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）などである。真菌抗原は、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコックスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、コクシドイデス（Ｃｏｃｃｉｄｏｉｄｅｓ）種、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）種およびアスペルギルスフミガーティス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｉｓ）に由来する抗原などである。原虫寄生体抗原は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を含めたプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、レーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種などに由来する抗原である。
【０１４５】
あるいは、アナログポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０個の同じアナログのコピー、例えば、ホモポリマーを含むことができる。
【０１４６】
１個または複数のアナログおよび／またはエピトープを、例えば、表面活性剤、例えば、脂質を添加して改変することができ、または例えば、アセチル化など化学的に改変することができる。さらに、ポリペプチド中の結合は、ペプチド結合以外、例えば、共有結合、エステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合などとすることができる。
【０１４７】
アナログポリペプチドは、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソイド、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸のようなポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質など当分野で周知の担体などの担体を含むことができる。例えば、表１０〜１１を参照されたい。
【０１４８】
一部の実施形態においては、アナログポリペプチドは、標的抗原に対する中和抗体およびまたはヘルパーＴ細胞応答を誘導または促進する成分を含むことができる。そのようなポリペプチドの好ましい実施形態は、ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープなどのクラスＩＩエピトープを含む（下記「Ｔヘルパーエピトープ」項を参照されたい）。好ましいｐａｎ−ＤＲ結合エピトープは、（例えば、特許文献４に記載された）ＰＡＤＲＥ（登録商標）（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）分子である。
【０１４９】
アナログポリペプチドは、１個または複数のスペーサーまたはリンカーを含むことができる。スペーサーを含むとき、スペーサーは、通常、少なくとも１個または２個の残基、より一般的には３個から６個の残基、時折１０個以上の残基、例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０個、さらにそれ以上の残基である。このようなスペーサーまたはリンカーは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、アミノ酸模倣物、および下記アミノ酸のような他の非天然アミノ酸を含むことができる。スペーサーまたはリンカーは、ペプチドの相互連結、エピトープおよび／またはアナログの相互連結、エピトープおよび／またはアナログとＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープの連結、担体またはより大きなペプチドなどの非アナログポリペプチドとの結合、アナログポリペプチドの物理的または化学的性質の改変などを容易にするために提供されうる。Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐなどのアミノ酸は、ポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端に導入することができ、および／またはその内部に導入することができる。スペーサーは、一般に、生理的条件下では実質的に不変であるアミノ酸、アミノ酸模倣物のような、１個または複数の比較的小さな中性分子を含む。スペーサーは、一般に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または、非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の、他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペーサーに求められることは、同じ残基から構成されてもよいこと、または１個もしくは複数の異なる残基から構成されてもよいこと、したがってホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーでよいことを理解されたい。したがって、スペーサーは、２個以上のＡｌａ残基または２個以上のＧｌｙ残基を含むことができ、あるいはＡｌａ残基とＧｌｙ残基の両方を含むことができる。
【０１５０】
スペーサーは、アナログポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にあってもよいし、アナログ、ＣＴＬエピトープ、ＨＴＬエピトープ、担体、アミノ酸および抗原性断片を互いに連結または結合させるように内部にあってもよい。マルチエピトープポリペプチド中のクラスＩ  ＨＬＡエピトープに隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）スペーサーは、好ましくは、１〜約８個のアミノ酸長である。マルチエピトープポリペプチド中のクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープに隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）スペーサーは、好ましくは５、６、７以上のアミノ酸長、より好ましくは５または６アミノ酸長である。
【０１５１】
ポリペプチド中のスペーサー数、スペーサー中のアミノ酸数、およびスペーサーのアミノ酸組成は、エピトーププロセシングを最適化し、および／または結合エピトープ（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を最少化するように選択することができる。スペーサーは、エピトーププロセシングと結合モチーフ（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｔｉｆ）を同時に最適化することによって選択されることが好ましい。エピトーププロセシングを最適化するのに適切なアミノ酸は、（特許文献５）に記載されている。また、構築体中の結合エピトープ数を最少化するのに適切なアミノ酸のスペース配置は、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＨＬＡの場合、（特許文献５）に記載されている。例えば、クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープに隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）スペーサーは、好ましくは、一般に一次アンカー残基であることが知られていないＧ、Ｐおよび／またはＮ残基を含む（例えば、特許文献６参照）。クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープに隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）のに特に好ましいスペーサーは、交互のＧ残基とＰ残基、例えば、（ＧＰ）ｎ、（ＰＧ）ｎ、（ＧＰ）ｎＧ、（ＰＧ）ｎＰなどを含む。ここで、ｎは、１〜１０の整数、好ましくは２または約２である。このようなスペーサーの具体例はＧＰＧＰＧである。好ましいスペーサー、特にクラスＩ  ＨＬＡエピトープに好ましいスペーサーは、１個、２個、３個以上の連続したアラニン（Ａ）残基を含む。
【０１５２】
一部のマルチエピトープポリペプチドにおいては、各スペーサーが同じアミノ酸配列を含むことで十分である。同じアミノ酸配列をコードする２個のスペーサー核酸を含むマルチエピトープポリヌクレオチドにおいては、これらのスペーサーをコードするスペーサー核酸は、同じヌクレオチド配列でも異なるヌクレオチド配列でもよい。異なるヌクレオチド配列は、マルチエピトープポリヌクレオチドを細胞に挿入したときに、意図しない組換え現象の可能性を低下させるのに好ましいことがある。
【０１５３】
別のマルチエピトープポリペプチドにおいては、１個または複数のスペーサーは、異なるアミノ酸配列を含むことができる。マルチエピトープポリペプチド中のスペーサーの多くは同じアミノ酸配列を有することができるが、１個、２個、３個、４個、５個以上のスペーサーが異なるアミノ酸配列を有することもでき、マルチエピトープポリペプチド中のスペーサーのすべてが異なるアミノ酸配列を有することも可能である。同様に、マルチエピトープポリヌクレオチド中のスペーサー核酸の多くは、同じアミノ酸配列をコードすることができるが、１個、２個、３個、４個、５個以上のスペーサー核酸が異なるアミノ酸配列をコードすることもでき、マルチエピトープポリヌクレオチド中のスペーサー核酸のすべてが異なるアミノ酸配列をコードすることもできる。スペーサー核酸は、特許文献５に記載されているように、スペーサー配列がエピトーププロセシングを最大にするかどうか、および／または結合エピトープを最少にするかどうかを判定することによって、スペーサー核酸が隣接する（ｆｌａｎｋ）エピトープ核酸に対して最適化することができる。構築体がエピトーププロセシングおよび結合モチーフについて最適化されているかどうかを判定するコンピュータ支援方法、ならびにインビトロおよびインビボでの実験室法は、特許文献５に記載されている。
【０１５４】
本発明のアナログポリペプチドは、得られたポリペプチドの物理的性質（例えば、安定性または溶解性）を改変する置換を含むことができる。例えば、アナログポリペプチドは、システイン（Ｃ）をα−アミノ酪酸で置換することによって改変することができる。システインは、その化学的性質のために、ジスルフィド架橋を形成しやすく、結合能を減少させるのに十分な程度にペプチド構造を変化させる。Ｃをα−アミノ酪酸で置換することはこの問題を改善するだけでなく、結合性および交差結合（ｃｒｏｓｓｂｉｎｄｉｎｇ）性を実際に向上させる場合もある。α−アミノ酪酸によるシステインの置換は、ペプチドエピトープの任意の残基において、すなわちアンカー位置でも非アンカー位置でも起こり得る。
【０１５５】
アナログポリペプチドは、人工アミノ酸、および／または表面活性分子の付加、例えば、脂質化、アセチル化、グリコシル化、ビオチニル化、ホスホリル化などの化学修飾を含むことができる。
【０１５６】
様々なアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸を含む改変ポリペプチドは、インビボで高い安定性を示す傾向にあるので特に有用である。このようなアナログポリペプチドは、貯蔵寿命または製造性も改善されていることがある。より具体的には、決定的な効果を示さない（ｎｏｎ−ｃｒｉｔｉｃａｌ）アミノ酸は、Ｌ−α−アミノ酸などのタンパク質中に天然に存在するアミノ酸、またはそれらのＤ−異性体に限定される必要はなく、アミノ酸模倣物、例えば、Ｄ−またはＬ−ナフィルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−またはＬ−２−チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−１、−２、３−または４−ピレネイルアラニン（ｐｙｒｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−３チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ρ−フルオロフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ρ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ρ−メトキシビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；Ｄ−またはＬ−アルキルアラニンなどの非天然アミノ酸も同様に含むことができる。ここで、アルキル基は、置換または非置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−イソチル（ｉｓｏｔｙｌ）、イソペンチルまたは非酸性アミノ酸とすることができる。非天然アミノ酸の芳香環は、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香環を含む。
【０１５７】
ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法によって評価することができる。例えば、ペプチダーゼ、およびヒトプラズマ、血清などの様々な生物学的媒体を使用して、安定性が試験されている。例えば、非特許文献６０を参照されたい。本発明のペプチドの半減期は、好都合には、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイによって決定される。その手順は、一般に、以下のとおりである。プールしたヒト血清（ＡＢ型、非加熱不活性化）を使用前に遠心分離して脱脂する。次いで、この血清を、ＲＰＭＩ−１６４０または他の適切な組織培地で２５％に希釈する。所定の時間間隔で、少量の反応溶液を取り出し、６％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）水溶液またはエタノールに添加する。濁った反応試料を１５分間冷却し（４℃）、次いで遠心して沈降血清タンパク質をペレット化する。次いで、ペプチドの有無を、逆相ＨＰＬＣにより安定性特異的なクロマトグラフィー条件下で判定する。
【０１５８】
本発明によるアナログポリペプチドは、中性（無電荷）の形でも、塩の形でもよい。本発明によるポリペプチドは、グリコシル化、側鎖の酸化、ホスホリル化などの改変を含まないか、あるいは改変が本明細書に記載するポリペプチドまたはアナログの生物活性を損なわないという条件である限りこれらの改変を含む。
【０１５９】
本発明のポリペプチドは、多種多様の方法によって調製することができる。本発明によるポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成によって合成して、あるいは自然発生の腫瘍、病原体生物などの自然源から調製することができる。アナログポリペプチドは、個々に、またはポリエピトープポリペプチドとして合成することができる。アナログポリペプチドは、他の天然の宿主細胞タンパク質およびその断片を実質的に含まないことが好ましいが、一部の実施形態においては、アナログポリペプチドを、合成によって天然の断片または粒子と複合体形成させることができる。
【０１６０】
アナログポリペプチドは、サイズが比較的短い場合、従来の技術によって溶液中または固体担体上で合成することができる。様々な自動合成装置が市販されており、既知の手順に従って使用することができる。（例えば、非特許文献６１参照）。また、個々のアナログおよびエピトープを、化学連結によって結合させて、依然として本発明の範囲内にある、より大きなアナログポリペプチドを産生させることができる。
【０１６１】
あるいは、アナログポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換または形質移入し、発現に適切な条件下で培養する組換えＤＮＡ技術を使用することができる。これらの手順は、一般に、非特許文献６２に概略記載されているように当分野では既知である。したがって、本発明の組換えポリペプチドを使用して、適切なＴ細胞アナログを提供することができる。
【０１６２】
アナログポリペプチドのヌクレオチドコード配列は、化学技術、例えば、非特許文献６３のリン酸トリエステル法によって合成することができる。アナログポリヌクレオチドは、野生型エピトープをコードする核酸塩基を適切な所望の核酸塩基で単に置換することによって調製することができる。次いで、コード配列を適切なリンカーの形で供給し、当分野で一般に利用可能な発現ベクターに連結し、そのベクターを使用して適切な宿主を形質転換して所望の融合タンパク質を産生させる。多くのこのようなベクターおよび適切な宿主系が現在利用可能である。
【０１６３】
ポリペプチドを発現させるために、コード配列に、作動可能に結合された開始コドン、終止コドン、プロモーター領域、ターミネーター領域、および通常は所望の細胞宿主における発現用の発現ベクターをもたらす複製システムが与えられる。例えば、細菌宿主に適合するプロモーター配列を、所望のコード配列を挿入するのに好都合な制限酵素切断部位を含むプラスミドに入れる。得られた発現ベクターは、適切な細菌宿主に形質転換される。適切なベクターおよび制御配列を利用して、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞宿主も使用できることは言うまでもない。
【０１６４】
また、１個または複数のアナログポリペプチドをコードする核酸も、本発明の一部である。当業者に認識されるように、様々な核酸が、遺伝コードの冗長性のために、同じポリペプチドをコードする。これらの核酸の各々は、本発明の範囲内にある。本発明のこの実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、ある実施形態においては、ＤＮＡとＲＮＡの組合せを含む。本発明によるポリペプチドをコードするあらゆる核酸が、本発明の範囲内であることを理解されたい。
【０１６５】
本発明のポリペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、１個または複数のアナログおよびエピトープを含むポリペプチドをコードするミニ遺伝子構築体を使用するものである。
【０１６６】
マルチエピトープミニ遺伝子などのアナログポリヌクレオチドの使用は、以下、および、例えば、同時係属中の特許文献７、非特許文献６４〜６８に記載されている。例えば、アナログをコードするマルチエピトープＤＮＡプラスミドなどのポリヌクレオチド、ＴＡＡの複数の領域に由来するスーパーモチーフおよび／またはモチーフを含むエピトープ（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰおよびｈＫ２）、ＰＡＤＲＥ（登録商標）汎用ヘルパーＴ細胞エピトープなどのｐａｎ−ＤＲ結合ペプチド、および小胞体転位シグナル（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）配列を操作することができる。上記項に記載したように、アナログポリペプチド／ポリヌクレオチドは、他のＴＡＡに由来するエピトープを含む／コードすることもできる。
【０１６７】
例えば、ヒト細胞における発現用に選択されたアナログおよび／またはエピトープをコードするミニ遺伝子などのＤＮＡ配列を作製するために、そのアナログおよび／またはエピトープのアミノ酸配列を逆に翻訳することができる。ヒトコドン使用表を用いて、各アミノ酸に対するコドンの選択を手引きすることができる。例えば、非特許文献６９、特許文献８を参照されたい。これらのアナログ／エピトープをコードするＤＮＡ配列は直接接合させることができ、その結果、翻訳されると、連続ポリペプチド配列が生成される。発現および／または免疫原性を最適化するために、追加の要素をポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）設計に組み込むことができる。逆に翻訳され、ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）配列に含まれ得るアナログ以外のアミノ酸配列の例は、ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、ユビキチン結合シグナル配列、および／または小胞体ターゲティングシグナルである。また、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、アナログ、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープに隣接する合成隣（ｆｌａｎｋｉｎｇ）接配列（例えば、ポリアラニン）または天然隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列を入れることによって改善することができる。アナログおよび／またはエピトープを含むこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
【０１６８】
ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）配列は、ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってＤＮＡに変換することができる。重複オリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）を、周知の技術を用いて適切な条件下で合成し、ホスホリル化し、精製し、アニールすることができる。オリゴヌクレオチドの両末端を、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることができる。次いで、アナログポリペプチドをコードするこの合成ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）を、所望の発現ベクターにクローン化することができる。
【０１６９】
治療上のまたは予防的な免疫化のために、本発明のポリペプチドをウイルスベクターまたは細菌ベクターによって発現させることもできる。発現ベクターの例は、ワクシニア、鶏痘などの弱毒ウイルス宿主である。この手法の例として、ワクシニアウイルスをベクターとして使用して、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させる。組換えワクシニアウイルスは、腫瘍を有する宿主に導入すると、ポリペプチドを発現し、それによって宿主ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発する。免疫化プロトコルに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、特許文献９に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメットゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ））である。ＢＣＧベクターは、非特許文献７０に記載されている。本発明のポリペプチドの治療投与または免疫化に有用な多種多様の他のベクター、例えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、解毒炭疽毒素ベクターなどが、本明細書の記述から当業者には明白なはずである。
【０１７０】
当業者に周知の標準制御配列をベクターに入れて標的細胞中での発現を確実にすることが好ましい。下流にアナログポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）挿入のためのクローニング部位を有するプロモーター、効率的転写終結のためのポリアデニレーションシグナル、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）などいくつかのベクター要素が望ましい。多数のプロモーター、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターをこの目的で使用することができる。他の適切なプロモーター配列については、例えば、特許文献１０、１１を参照されたい。
【０１７１】
ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）発現および免疫原性を最適化する追加のベクター改変が望ましい場合がある。いくつかのケースでは、イントロンが効率的遺伝子発現に必要とされ、１個または複数の合成イントロンまたは天然イントロンを、ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）の転写領域に組み込むことができる。ｍＲＮＡ安定化配列および複製用配列を哺乳動物の細胞に入れることも、ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）発現を高めるために考慮することができる。
【０１７２】
発現ベクターを選択した後、ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）を、プロモーター下流のポリリンカー領域にクローン化する。このプラスミドを、適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換され、標準技術を用いてＤＮＡを調製する。ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）の配向およびＤＮＡ配列、ならびにベクター中の他のすべての要素を、制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列分析によって確認する。正確なプラスミドを取り込んだ細菌細胞を、マスター細胞バンクおよび運用細胞バンクとして保存することができる。
【０１７３】
また、ＩＳＳ、ＣｐＧなどの免疫活性化配列が、ＤＮＡワクチンの免疫原性においてある役割を果たしていると考えられる。これらの配列は、所望であれば、免疫原性を高めるためにベクター中のポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）コード配列の外側に入れることができる。
【０１７４】
一部の実施形態においては、ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）によってコードされたアナログポリペプチドと（免疫原性を高める、または抑えるために含まれる）第２のタンパク質の両方の産生を可能にするビ−シストロン性（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターを使用することができる。同時発現された場合に、免疫応答を有利に高めることができるタンパク質またはポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、共刺激分子、またはＨＴＬ応答についてはｐａｎ−ＤＲ結合タンパク質（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチド、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が含まれる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内ターゲティングシグナルに結合し、発現ＣＴＬエピトープから別個に発現することができる。これによって、ＣＴＬエピトープの細胞区画とは異なる細胞区画にＨＴＬエピトープを誘導することが可能である。必要であれば、これによって、ＨＬＡクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効率的な参加を促進し、それによってＨＴＬの誘導を改善することができる。ＨＴＬまたはＣＴＬ誘導とは対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答の特異的減少が、ある種の疾患では有利なこともある。
【０１７５】
治療量のプラスミドＤＮＡを、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発酵させ、その後精製することによって産生することができる。周知の技術によって、運用細胞バンクからの各一定分量を使用して増殖培地を接種し、振とうフラスコまたはバイオリアクター中で飽和まで増殖させる。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給されている固相アニオン交換樹脂などの標準バイオ分離技術を用いて精製することができる。必要であれば、スーパーコイルＤＮＡを、ゲル電気泳動などの方法を用いて開環状ＤＮＡおよび線状ＤＮＡから単離することができる。
【０１７６】
Ｔヘルパーエピトープ
アナログポリペプチドを改変して、血清半減期の改善など所望の性質を与え、または免疫原性を高めることができる。
【０１７７】
例えば、アナログポリペプチドのＣＴＬ活性誘導能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１個のエピトープを含む配列にアナログポリペプチドを連結し、あるいはアナログポリペプチドをその配列とともに同時投与することによって高めることができる。ＴヘルパーエピトープをＣＴＬエピトープと併用して免疫原性を高めることは、例えば、同時係属中の特許文献１２〜１４に記載されている。
【０１７８】
アナログまたはアナログポリペプチドは、Ｔヘルパーペプチドに直接連結することができるが、アナログポリペプチドとＨＴＬエピトープは、上記項に記載したものなどのスペーサーまたはリンカーによって連結することができる。アナログポリペプチドは、アナログのアミノ末端またはカルボキシ末端において直接またはスペーサーを介してＴヘルパーエピトープに連結することができる。アナログポリペプチドまたはＴヘルパーペプチドのアミノ末端はアシル化することができる。
【０１７９】
ある種の実施形態においては、該Ｔヘルパーペプチドは、大多数の集団に存在するＴヘルパー細胞によって認識されるＴヘルパーペプチドである。これは、ＨＬＡクラスＩＩ分子の多く、大部分、またはすべてに結合するアミノ酸配列を選択することによって実施することができる。これらは、「緩いＨＬＡ制限（ｌｏｏｓｅｌｙ  ＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）」または「無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」Ｔヘルパー配列として知られる。無差別Ｔヘルパーペプチドの例は、８３０〜８４３位の破傷風トキソイドなどの抗原由来の配列（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ）（配列番号２６）、３７８〜３９８位の熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）（ＣＳ）タンパク質（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ）（配列番号２７）、および１１６位の連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）１８ｋＤタンパク質（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ）（配列番号２８）を含む。他の例には、ＤＲ  １−４−７スーパーモチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを有するペプチドが含まれる。
【０１８０】
あるいは、緩いＨＬＡ制限様式でＴヘルパーリンパ球を刺激することが可能な合成ペプチドを、天然には存在しないアミノ酸配列を使用して調製することが可能である（例えば、特許文献１５参照）。Ｐａｎ−ＤＲ−結合エピトープと呼ばれるこれらの合成Ｔヘルパーペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチド、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に最も好ましく結合するように設計されている。例えば、式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａを有するｐａｎ−ＤＲ−結合エピトープペプチド（「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン（配列番号２９）、フェニルアラニン（配列番号３０）またはチロシン（配列番号３１）であり、「ａ」は、Ｄ−アラニンまたはＬ−アラニンである）は、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、ほとんどの個体に由来するＴヘルパーリンパ球の応答を、その個体のＨＬＡタイプにかかわらず刺激することが見出された。別のｐａｎ−ＤＲ結合エピトープは、すべての「Ｌ」天然アミノ酸を含み、エピトープをコードする核酸の形で提供することができる。
【０１８１】
ＨＴＬエピトープは、それらの生物学的諸特性を変えるように改変することもできる。例えば、Ｄ−アミノ酸を入れてプロテアーゼに対するそれらの耐性を増大させ、したがってそれらの血清半減期を延ばすようにＨＴＬエピトープを改変することができる。また、ＨＴＬエピトープを、脂質、タンパク質、炭水化物などの他の分子と複合体形成させて、その生物活性を高めることができる。例えば、Ｔヘルパーペプチドを、アミノ末端またはカルボキシ末端において１個または複数のパルミチン酸鎖と複合体形成させることができる。
【０１８２】
アナログおよびエピトープおよび他の成分の選択
ワクチンに使用するポリエピトープ組成物に入れる多数のアナログおよびエピトープを選択するとき、あるいはワクチンに入れる個別のエピトープおよび／またはミニ遺伝子などの核酸によってコードされる個別のエピトープを選択するために、以下の原理を利用することが好ましい。以下の原理の各々は、この選択をするために調和がとられていることが好ましい。所与のワクチン組成物に組み込まれる複数のエピトープは、エピトープが由来するネイティブ抗原の配列中で隣接することができるが、隣接しなくともよい。
【０１８３】
１）投与後に腫瘍クリアランスと相関することが認められている免疫応答を模倣するエピトープを選択する。ＨＬＡクラスＩの場合、これには、少なくとも１個の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する３〜４個のエピトープが含まれる。ＨＬＡクラスＩＩの場合、類似の原理が採用され、少なくとも１個のＴＡＡからやはり３〜４個のエピトープを選択する（例えば、非特許文献７１参照）。１個のＴＡＡに由来するエピトープを、１個または複数の追加のＴＡＡに由来するエピトープと併用して、頻繁に発現されるＴＡＡの発現パターンを変える腫瘍を標的とするワクチンを製造することができる。
【０１８４】
２）免疫原性と相関することが証明されている必要な結合親和性、すなわち、ＨＬＡクラスＩの場合は、５００ｎＭ以下、しばしば２００ｎＭ以下のＩＣ５０、クラスＩＩの場合は１０００ｎＭ以下のＩＣ５０を有するエピトープを選択する。
【０１８５】
３）広範な集団に適用される十分なスーパーモチーフを含むペプチド、または十分な対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドを選択する。例えば、少なくとも８０％の集団に適用されることが好ましい。当分野で既知の統計評価であるモンテカルロ分析を使用して、適用される集団の幅または重複性を評価することができる。
【０１８６】
４）癌関連抗原からエピトープを選択するときには、患者がネイティブエピトープに対しては寛容になっている恐れがあるので、アナログを選択することが有用な場合が多い。感染症関連抗原に対するエピトープを選択するときには、ネイティブまたはアナログエピトープのどちらかを選択することが好ましい。
【０１８７】
５）「入れ子状態エピトープ」と称するエピトープは特に関連がある。入れ子状態エピトープは、少なくとも２個のエピトープが所与のペプチド配列内で重複する場合に発生する。入れ子状態ペプチド配列は、ＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩの両方のエピトープを含むことができる。入れ子状態エピトープを用意するときには、一般的な目的は、１配列当たり最多のエピトープを提供することにある。したがって、回避すべき態様は、ペプチドのアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシ末端エピトープのカルボキシ末端よりも長いペプチドを提供することである。入れ子状態エピトープを含む配列のようなマルチエピトープ配列を用意するときには、病理学的諸特性または他の有害な生物学的諸特性を持たないことを確認するために配列をスクリーニングすることが一般に重要である。
【０１８８】
６）ポリエピトープタンパク質を作製する場合、またはポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）を作製するときには、目的は、対象とするエピトープを含む最小のペプチドを産生することである。この原理は、入れ子状態エピトープを含むペプチドを選択するときに採用した原理と同じではないにしろ類似している。しかし、人工ポリエピトープペプチドでは、最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間に任意のスペーサー配列を組み込む必要性と調和が取られている。例えば、スペーサーアミノ酸残基を導入して結合エピトープ（免疫系によって認識され、標的抗原中に存在せず、エピトープを人為的に近接させることによってのみ作製されるエピトープ）を回避することができ、またはエピトープ間の切断を促進し、それによってエピトープ提示を増強することができる。結合エピトープは、レシピエントがこの非ネイティブエピトープに対する免疫応答を生じる恐れがあるので、一般に、回避すべきである。「優性なエピトープ」である結合エピトープは特に重大である。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少または抑制されるような強い免疫応答をもたらし得る。
【０１８９】
複数のエピトープを同時にもたらすいくつかの異なる手法が利用可能である。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である。ミニ遺伝子などのアナログポリペプチドまたはポリヌクレオチドに入れるアナログおよびエピトープは、上述した指針に従って選択されることが好ましい。
【０１９０】
マルチエピトープミニ遺伝子などのアナログポリペプチドまたはポリヌクレオチドの免疫原性をトランスジェニックマウスで試験して、試験アナログ／エピトープに対するＣＴＬの誘導応答の大きさを評価することができる。また、アナログポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのインビボでの免疫原性を、アナログポリヌクレオチドを形質移入した標的細胞に対する特定のＣＴＬ系のインビトロでの応答と相関させることができる。
【０１９１】
したがって、これらの実験から、アナログポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）が、（１）ＣＴＬ応答を生じること、および（２）誘導されたＣＴＬが、コードされたアナログおよびまたはエピトープを発現する細胞を認識したことに役立つことを示すことができる。
【０１９２】
精製プラスミドＤＮＡを、様々な処方を用いて注射用に調製することができる。このうち最も簡単な処方は、無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥ＤＮＡを復元するものである。「裸のＤＮＡ」として知られるこの手法は、現在、臨床試験における筋肉内（ＩＭ）投与に使用中である。ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）ワクチンの免疫療法効果を最大にするために、精製プラスミドＤＮＡを処方する別の方法が求められている。様々な方法が記述されており、新しい技術が利用可能になるかもしれない。陽イオン性脂質、糖脂質および膜融合リポソームを、処方に使用することもできる（例えば、特許文献１６によって記載されているように；非特許文献７２、７３；特許文献１７、１８参照）。また、保護的相互作用的非縮合性（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ，ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ，ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）化合物（ＰＩＮＣ）として総称されるペプチドおよび化合物も、精製プラスミドＤＮＡに複合化して、安定性、筋肉内分散、特定のタイプの器官または細胞への輸送のような変数に影響を及ぼし得る。
【０１９３】
標的細胞感作を、機能アッセイとして、アナログポリペプチド、あるいはポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）によってコードされたアナログおよび／またはエピトープの発現およびＨＬＡクラスＩ提示に使用することができる。例えば、プラスミドＤＮＡを、標準ＣＴＬクロム放出アッセイ用標的として適切である哺乳動物細胞系に導入する。使用する形質移入方法は、最終処方に依存する。エレクトロポレーションを「裸の」ＤＮＡに使用することができるのに対して、陽イオン性脂質はインビトロでの直接の形質移入を可能にする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時形質移入し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して形質移入細胞を濃縮することができる。次いで、これらの細胞をクロム−５１（５１Ｃｒ）標識し、エピトープ特異的ＣＴＬ系に対する標的細胞として使用する。５１Ｃｒ放出によって検出される細胞溶解は、ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）によってコードされたＣＴＬエピトープの産生とＨＬＡ提示の両方を示している。ＨＴＬエピトープの発現を、ＨＴＬ活性を評価するアッセイを使用して類似の方法で評価することができる。
【０１９４】
インビボでの免疫原性は、ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）処方の機能試験の第２の手法である。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスをＤＮＡ産物で免疫する。投与用量および投与経路は、処方に依存し得る（例えば、ＤＮＡのＰＢＳ溶液の場合はＩＭ、脂質複合ＤＮＡの場合は腹腔内（ＩＰ））。免疫化から２１日後に、脾細胞を採取し、各試験エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激する。ＣＴＬエフェクター細胞の場合、その後、ペプチドを加えた５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解のアッセイを標準技術により実施する。ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）によってコードされたエピトープに対応するペプチドエピトープを加えたＨＬＡによって感作された標的細胞の溶解は、インビボでＣＴＬを誘導するＤＮＡワクチンの機能を実証するものである。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、トランスジェニックマウスにおいて類似の方法で評価される。
【０１９５】
別法では、核酸を、皮内、例えば、注射、または例えば、特許文献１９に記載された弾道送達によって投与することができる。この技術を用いて、ＤＮＡのみで構成される粒子を投与する。さらに別の実施形態においては、金粒子などの粒子にＤＮＡを付着させることができる。
【０１９６】
ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）を、当分野で周知の他の細菌送達系またはウイルス送達系を用いて送達することもできる。例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築体を、ワクシニアなどのウイルスベクターに組み込むことができる。
【０１９７】
４．組成物
本発明の組成物は、２個以上の本発明のアナログポリペプチドおよび／またはアナログポリヌクレオチド、ならびに場合によっては他の成分を含有することができ、あるいは組成物は、本発明の１個のアナログポリペプチドまたは１個のポリヌクレオチドおよび他の成分を含有することができる。追加成分としては、賦形剤、希釈剤、非アナログポリペプチド（例えば、ＣＴＬエピトープ、および／またはｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドなどのＨＴＬエピトープを含むポリペプチド、および／または担体）、このような非アナログポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、脂質、リポソーム、ならびに本明細書に記載する他の成分などがある。本発明による組成物には、１個または複数のアナログポリペプチドおよび／またはアナログポリヌクレオチド；１個または複数のアナログおよび１個または複数のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープ；および／またはこのようなペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸、例えば、ポリエピトープのアナログポリペプチドをコードするミニ遺伝子のカクテルなど多数の実施形態がある。
【０１９８】
組成物は、１個または複数の本発明のアナログポリペプチド（またはミニ遺伝子などのアナログポリヌクレオチド）と、本明細書で上述した１個または複数の他の成分とを含むことができる。「１個または複数」とは、１〜１５０の任意の単位整数全体を指し、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０個のアナログポリペプチド、アナログポリヌクレオチド、または他の成分を指す。
【０１９９】
本発明の組成物は、非アナログポリペプチドを含むことができる。非アナログポリペプチドは担体を含む。本発明の組成物とともに使用することができる担体は当分野で周知であり、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などである。非アナログポリペプチドは、免疫原性を高める、または抑えることができるタンパク質も含む。免疫応答を有利に高めることができる非アナログタンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、共刺激分子、ｐａｎ−ＤＲ結合タンパク質（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチド、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）などのＨＴＬエピトープである。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内ターゲティングシグナルに結合することができる。必要であれば、これは、ＨＬＡクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効率的な移行を容易にし、それによってＨＴＬの誘導を改善することができる。免疫応答を抑制することができる非アナログタンパク質としては、例えば、ＴＧＦ−βが含まれる。
【０２００】
これらの組成物は、水、または食塩水、好ましくはリン酸緩衝食塩水などの生理学的に耐えられる（すなわち、許容される）希釈剤を含有することができる。これらの組成物は、一般に、アジュバントも含む。フロイントの不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバンなどのアジュバントは、当分野で周知の材料例である。
【０２０１】
一部の実施形態においては、細胞障害性リンパ球を初回抗原刺激する少なくとも１個の成分を本発明の組成物に入れることが望ましい場合がある。脂質は、ウイルス抗原に対してＣＴＬをインビボで初回抗原刺激可能な薬剤として知られている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−およびα−アミノ基に結合し、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどの１個または複数のリンキング残基を介して、免疫原性ペプチドに連結することができる。次いで、脂質化ペプチドを、ミセルまたは粒子中に直接投与することができ、あるいはリポソーム中に組み込むことができ、あるいはアジュバント、例えば、フロイントの不完全アジュバント中に乳化させることができる。好ましい組成物は、リンケージ、例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒを介して、ポリペプチドのアミノ末端に結合しているＬｙｓのε−およびα−アミノ基に結合したパルミチン酸を含む。
【０２０２】
脂質によるＣＴＬ応答の初回抗原刺激の別の例は、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（ｔｒｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｓ−ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ−ｓｅｒｉｎｅ）（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）リポタンパク質を使用して、適切なペプチドに共有結合するときに、ウイルス特異的ＣＴＬを初回抗原刺激することができる（例えば、非特許文献７４参照）。例えば、本発明のポリペプチドはＰ３ＣＳＳに結合することができ、このリポペプチドを個体に投与して、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に初回抗原刺激することができる。さらに、中和抗体の誘導も、Ｐ３ＣＳＳ複合エピトープで初回抗原刺激することができるので、２種類のこのような組成物を組み合わせて、体液性と細胞性の両方の応答をより有効に誘発させることができる。
【０２０３】
アミノ酸をペプチド末端に付加させることによってＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドを改変して、ペプチドが相互に容易に連結し、担体またはより大きなペプチドに結合し、ペプチドまたはオリゴペプチドなどの物性または化学的諸特性を改変することもできる。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸を、ペプチドまたはオリゴペプチド、特にクラスＩペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端に導入することができる。しかし、ＣＴＬエピトープのカルボキシ末端の改変は、ペプチドの結合特性を変える場合もあることに注意すべきである。また、ペプチド配列またはオリゴペプチド配列は、末端ＮＨ２のアシル化、例えば、アルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）またはチオグリコリルのアセチル化、末端カルボキシルのアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンなどによって改変されて自然の配列とは異なり得る。ある場合には、これらの改変によって、担体または他の分子に対する連結部位を設けることができる。
【０２０４】
組成物は、例えば、リポペプチド（例えば、非特許文献７５参照）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフェアに封入されたポリペプチド（例えば、非特許文献７６〜７８参照）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれるポリペプチド（例えば、非特許文献７９、８０参照）、多重抗原性ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、非特許文献８１、８２参照）、多価ペプチドとして処方されたポリペプチド；弾道送達系に使用するためのポリペプチド、一般的に結晶化されたポリペプチド、ウイルス送達ベクター（非特許文献８３〜８８）、ウイルス起源または合成起源の粒子（例えば、非特許文献８９〜９１参照）、アジュバント（非特許文献９２、９３）、リポソーム（非特許文献９４、９５）、あるいは裸のｃＤＮＡまたは粒子に吸収されたｃＤＮＡ（非特許文献９０、９６〜９９）も含むことができる。Ａｖａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のものなどの受容体媒介ターゲティングとしても知られる毒素標的送達技術も使用することができる。
【０２０５】
本発明による組成物の別の実施形態は、１個または複数の本発明によるポリペプチドを含む抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、樹状細胞など「専門の」抗原提示細胞とすることができる。抗原提示細胞は、当分野で既知の手段または決定される手段によって、本発明のポリペプチドを含むことができる。このような手段は、核酸の弾道送達などの核酸投与、またはベクター、例えば、ウイルスベクターによる核酸送達を含めた当分野の他の核酸投与技術によって、１個または複数の個々のアナログポリペプチドを樹状細胞に間欠的に投与すること（ｐｕｌｓｉｎｇ）を含む。
【０２０６】
５．ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび組成物の投与
ワクチン、および免疫を生じるのに有効な量の本明細書に記載する１個または複数のアナログポリペプチドまたはアナログポリヌクレオチドを含有するワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。適切な免疫原性のポリペプチドを定義した後、それらを分類し、本明細書では「ワクチン」組成物と称する様々な手段によって送達する。この開示を通して記述する組成物を、ワクチンとして使用することができる。
【０２０７】
このようなワクチン組成物は、例えば、リポペプチド（例えば、非特許文献７５参照）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフェアに封入されたペプチド組成物（例えば、非特許文献７６〜７８参照）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれるペプチド組成物（例えば、非特許文献７９、８０参照）、多重抗原性ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、非特許文献８１、８２参照）、多価ペプチドとして処方されたポリペプチド；弾道送達系に使用されるペプチド、一般的に結晶化されたペプチド、ウイルス送達ベクター（非特許文献８３〜８８）、ウイルス起源または合成起源の粒子（例えば、非特許文献８９〜９１参照）、アジュバント（非特許文献９２、９３）、リポソーム（非特許文献９４、９５）、あるいは裸のｃＤＮＡまたは粒子に吸収されたｃＤＮＡ（非特許文献９０、９６〜９９）も含むことができる。Ａｖａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のものなどの受容体媒介ターゲティングとしても知られる毒素標的送達技術も使用することができる。
【０２０８】
本発明のワクチンは、核酸を媒介とする様式を含む。１個または複数の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、患者に投与することもできる。この手法は、例えば、（非特許文献１００）および（特許文献１０、１１、２０〜２４）に記載されており、以下により詳細に記述する。ＤＮＡを用いた送達技術の例は、「裸のＤＮＡ」、促進（ブピビカイン（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ）、ポリマー、ペプチド媒介）送達、陽イオン性脂質複合体、および粒子媒介（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例えば、特許文献２５参照）である。
【０２０９】
治療上のまたは予防的な免疫化のために、本発明のポリペプチドをウイルスベクターまたは細菌ベクターによって発現させることもできる。発現ベクターの例は、ワクシニア、鶏痘などの弱毒ウイルス宿主である。この手法の例として、ワクシニアウイルスをベクターとして使用して、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させる。組換えワクシニアウイルスは、腫瘍を有する宿主に導入すると、免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発する。免疫化手順に有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、特許文献９に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメットゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ））である。ＢＣＧベクターは、非特許文献７０に記載されている。本発明のポリペプチドの治療投与または免疫化に有用な多種多様の他のベクター、例えば、アデノおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、解毒炭疽毒素ベクターなどが、本明細書の記述から当業者には明白なはずである。
【０２１０】
また、上述したように、本発明による組成物およびワクチンは、１個または複数の特許請求したポリペプチドの組成物を包含する。アナログ、またはアナログをコードするポリヌクレオチドを個々にワクチンに入れることができる。あるいは、アナログを含むポリペプチドは、同じアナログの複数のコピーを含むホモポリマーとして、あるいは様々なアナログおよび／またはエピトープ（ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ）のヘテロポリマーとして存在することができる。このようなポリペプチドをコードするアナログポリヌクレオチドを含むワクチンも本発明に含まれる。ポリマーは、免疫学的反応が高い利点を有し、ポリマーが様々なアナログ、または様々なアナログとエピトープを使用して構成される場合には、免疫応答の標的となる病原体生物または腫瘍関連ペプチドの様々な抗原決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘発するさらなる能力を有する。この組成物は、天然に存在する抗原領域とすることができ、あるいは、例えば、組換えまたは化学合成によって調製することができる。
【０２１１】
本発明のワクチンとともに使用することができる担体は、当分野で周知であり、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などである。これらのワクチンは、水、または食塩水、好ましくはリン酸緩衝食塩水などの生理学的に耐えられる（すなわち、許容される）希釈剤を含有することができる。これらのワクチンは、一般に、アジュバントも含む。フロイントの不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバンなどのアジュバントは、当分野で周知の材料例である。また、本明細書に開示するように、本発明のポリペプチドをトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの脂質と複合化することによって、ＣＴＬ応答を初回抗原刺激することができる。
【０２１２】
本発明のポリペプチドは、リンパ組織などの特定の組織を標的としてペプチドを送達するのに役立つ、または感染細胞を選択的に標的とするのに役立つ、ならびにペプチド組成物の半減期を延長するのに役立つリポソームを介して投与することもできる。リポソームとしては、エマルジョン、泡、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散液、膜状層などがある。これらの調製物においては、送達すべきペプチドを、単体で、あるいはＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体などのリンパ球中で優勢な受容体に結合する分子、または他の治療組成物もしくは免疫原性組成物とともにリポソームの一部として組み込む。したがって、本発明の所望のペプチドを充填した、または本発明の所望のペプチドで装飾したリポソームをリンパ球部位に誘導し、次いで、リポソームはペプチド組成物を送達することができる。本発明に使用されるリポソームは、小胞を形成する標準的な脂質から形成され、一般に、中性リン脂質、負に帯電したリン脂質、コレステロールなどのステロールなどである。脂質の選択は、一般に、例えば、リポソームサイズ、酸性下での不安定性、および血流中でのリポソームの安定性を考慮してなされる。リポソームの調製には、例えば、（非特許文献１０１）、および（特許文献２６〜２９）に記載された様々な方法が利用可能である。
【０２１３】
免疫系細胞を標的にする場合、リポソームに組み込まれるリガンドには、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体またはその断片がある。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、とりわけ、投与方式、送達されるペプチド、および治療する疾患の段階によって変わる用量で、静脈内、局在、局所などに投与することができる。
【０２１４】
固体組成物の場合、従来の無毒の固体担体を使用することができる。これには、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。経口投与の場合、薬剤として許容される無毒の組成物は、先に列挙した担体などの通常使用される賦形剤のいずれか、および一般に１０〜９５％の活性成分、すなわち、本発明の１個または複数のペプチドを、より好ましくは２５％〜７５％の濃度で混合することによって形成される。
【０２１５】
エアゾール剤投与の場合、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤および噴霧剤とともに微細に分割されて供給される。ペプチドの典型的な割合は０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１％〜１０％である。界面活性剤は無毒でなければならないのは言うまでもなく、好ましくは噴霧剤に可溶である。このような薬剤の代表的なものは、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）酸、オレイン酸などの６個から２２個の炭素原子を含む脂肪酸と脂肪族多価アルコールのエステルもしくは部分エステル、またはその環状無水物である。混合グリセリド、天然グリセリドなどの混合エステルを使用することができる。界面活性剤は、この組成物の０．１％〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５％を占める。この組成物の残りは、通常は噴霧剤である。担体は、所望に応じて、例えば、鼻腔内送達用のレシチンのように含むこともできる。
【０２１６】
本発明によるポリペプチドまたはポリヌクレオチド組成物を用いて、注射、エアゾール、経口、経皮、経粘膜、胸膜内、鞘内、または他の適切な経路によって免疫化すると、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な多量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することによってワクチンに応答する。したがって、宿主は、その後の感染に対して少なくとも部分的に免疫化され、または進行中の慢性感染の進展に少なくとも部分的に抵抗性を示し、または抗原が腫瘍関連であったときに少なくとも何らかの治療上の利点を得る。
【０２１７】
一部の実施形態においては、本発明のヘテロクリティックアナログペプチドを、目的とする標的抗原に対して中和抗体およびまたはヘルパーＴ細胞応答を誘発または促進する成分と組み合わせることが望ましいこともある。そのような組成物の好ましい実施形態は、本発明によるクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを含む。そのような組成物の別の実施形態は、本発明によるクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピトープと、ＰＡＤＲＥ（登録商標）（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）分子（例えば、特許文献４に記載された）などのｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドを含む。
【０２１８】
本発明のワクチンは、本発明のペプチドを提示するビヒクルとして樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）も含むことができる。ワクチン組成物は、樹状細胞の動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）および収集後にインビトロで作製することができ、それによって樹状細胞の装荷がインビトロで起こる。例えば、樹状細胞には、例えば、本発明によるポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）が形質移入され、またはペプチドが間欠的に投与される（ｐｕｌｓｅｄ）。次いで、この樹状細胞を患者に投与してインビボで免疫応答を誘発させることができる。
【０２１９】
ＤＮＡベースまたはペプチドベースのワクチン組成物は、樹状細胞をインビボで装荷する樹状細胞の動員と組み合わせて、インビボで投与することもできる。
【０２２０】
本発明によるワクチン組成物の一実施形態は、好ましくはエピトープを有するペプチドのカクテルの一部として、アナログポリペプチドを、患者の血液から得たＰＢＭＣ、またはそれから単離されたＤＣに生体外投与することを含む。ＤＣの採取を促進する、Ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ（商標）タンパク質（Ｍｏｎｓａｎｔｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４などの医薬品化合物を使用することができる。ＤＣにペプチドを間欠投与後、患者に再注入する前に、このＤＣを洗浄して未結合のペプチドを除去する。この実施形態においては、ワクチンは、ＨＬＡ分子と複合化された間欠投与ペプチドエピトープをその表面で提示する、ペプチドを間欠投与したＤＣを含む。
【０２２１】
このＤＣに、ペプチドのカクテルを生体外で間欠投与することができる。このペプチドの一部は、目的とする１個または複数の抗原に対するＣＴＬ応答を刺激する。場合によっては、ＰＡＤＲＥ（登録商標）ファミリー分子などのヘルパーＴ細胞ペプチドを加えて、ＣＴＬ応答を促進することができる。
【０２２２】
６．癌患者における投与
本発明のポリペプチド、アナログポリヌクレオチド、組成物、およびワクチンは、一般に、癌治療に使用される。本発明のポリペプチドを含有するワクチン組成物は、一般に、１個または複数の抗原の発現に関連する悪性腫瘍を有する癌患者に投与される。あるいは、ワクチン組成物を、癌に罹り易い個体または癌を発症するリスクのある個体に投与することができる。
【０２２３】
アナログポリペプチドは、直接に、またはリポソームなどの薬剤を使用して送達することができる。さらに、アナログポリペプチドは、弾道送達によって送達することもでき、この場合ポリペプチドは一般に結晶である。
【０２２４】
治療用途においては、ポリペプチドおよび／またはアナログポリヌクレオチドを、腫瘍抗原に有効なＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発し、かつ症状および／または合併症を治癒または少なくとも部分的に抑止または遅延させるのに十分な量で患者に投与する。これを実施するのに適正な量を「治療有効用量」と定義する。この使用に有効な量は、例えば、投与する特定の組成物、投与方法、治療する疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。
【０２２５】
上述したように、アナログポリペプチドは、ＨＬＡ分子によって提示され、アナログが含むエピトープに特異的なＣＴＬと接触すると免疫応答を誘導する。ポリペプチド（またはそれをコードするアナログポリヌクレオチド）は、個々に、または混合物、または組成物として投与することができる。ポリペプチドをＣＴＬと接触させる方法は、本発明では重要ではない。例えば、ポリペプチドを、インビボでもインビトロでもＣＴＬと接触させることができる。接触がインビボで起こる場合、ポリペプチド自体を患者に投与することができ、あるいは他のビヒクル、例えば、（例えば、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクター中の）アナログポリヌクレオチド、リポソームなどを本明細書に記載するように使用することができる。
【０２２６】
ポリペプチドをインビトロで接触させるときには、ワクチン剤は、ポリペプチドを抗原提示細胞にインビトロで間欠的に投与することによって、または抗原提示細胞に本発明のポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）を形質移入することによって誘導された細胞、例えば、ペプチドを間欠投与した樹状細胞、またはＴＡＡ特異的ＣＴＬの集団を含むことができる。その後、このような細胞集団の治療有効用量を患者に投与する。
【０２２７】
治療用途の場合、投与は、一般に、癌の最初の診断で開始すべきである。これに続けて、少なくとも症状が実質的に軽減するまで、およびその後の期間追加投与する。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（すなわち、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）、ＴＡＡ特異的ＣＴＬまたは間欠投与された樹状細胞などの実施形態を含め、ただしこれらだけに限定されない）は、疾患の段階または患者の健康状態に応じて変わり得る。例えば、ＴＡＡ特異的ＣＴＬを含むワクチンは、疾患が進行した患者における腫瘍細胞を死滅させるのに別の実施形態よりも有効なことがある。
【０２２８】
同様に、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を生体外で誘発させるために抗原性ペプチドを使用する。得られたＣＴＬまたはＨＴＬ細胞を使用して、他の従来の治療形式には応答しない患者、または本発明による治療用ワクチンペプチドまたは核酸には応答しない患者における腫瘍を治療することができる。特定の腫瘍関連抗原に対する生体外でのＣＴＬまたはＨＴＬ応答を、患者のＣＴＬまたはＨＴＬ前駆細胞、または遺伝的に適合したＣＴＬまたはＨＴＬ前駆細胞を、樹状細胞、適切な免疫原性ペプチドなどの抗原提示細胞源とともに組織培養でインキュベートすることによって誘導する。適切なインキュベーション時間（一般に約７〜２８日）で、前駆細胞が活性化されてエフェクター細胞になった後、その細胞を患者に注入して戻すと、その特異的標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破壊し（ＣＴＬ）、またはその破壊を促進する（ＨＴＬ）。形質移入された樹状細胞を抗原提示細胞として使用することもできる。
【０２２９】
本発明のワクチン組成物を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどの免疫アジュバントとの併用も含めて、癌に使用される他の治療と組み合わせて使用することもできる。
【０２３０】
本発明のワクチン組成物は、手術などの治療と組み合わせて治療に使用することもできる。一例は、患者が原発性腫瘍を除去する手術を受け、次いでワクチンを使用して再発および／または転移を遅延または防止する場合である。
【０２３１】
感受性の高い個体、例えば、遺伝的に前立腺腫瘍を発症しやすいと診断された個体が、癌の診断前に特定される場合、本組成物は彼らを標的とすることができ、したがって、より大きな集団に投与しなければならない必要性が最小限に抑えられる。
【０２３２】
初期の治療免疫化に要する投与量は、一般に、低い方の値が約１、５、５０、５００または１，０００μｇであり、高い方の値が約１０，０００、２０，０００、３０，０００または５０，０００μｇである単位投与量の範囲である。ヒトに対する投与量は、一般に、７０キログラムの患者につき約５００μｇから約５０，０００μｇである。初期投与後に既定の間隔、例えば、４週間から６カ月で追加投与することが必要な場合もあり、患者を有効に治療するために長期間必要になる場合もある。患者の血液から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって判断される患者の応答および状態に応じ、追加投与計画に従って約１．０μｇから約５０，０００μｇの追加免疫用量のペプチドを数週から数カ月にわたって投与することもできる。
【０２３３】
ＤＮＡを使用して免疫応答を誘導するとき、ＤＮＡは裸のＤＮＡまたは処方されたＤＮＡとして、一般に、約１〜５ｍｇ（例えば、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ）の用量で、または「遺伝子銃」による弾道送達によって、一般に約１０〜１００μｇの用量で投与される。このＤＮＡは、様々なコンホメーション、例えば、線状、環状などで送達することができる。本発明によるエピトープをコードする核酸を含む様々なウイルスベクターも、一般に裸のＤＮＡと同じ用量範囲（例えば、約１〜５ｍｇ）を用いて首尾よく使用することができた。
【０２３４】
投与は、少なくとも臨床症状または臨床検査によって、腫瘍が消滅した、または腫瘍細胞の負荷が実質的に軽減されたことが示されるまで継続すべきであり、その後の期間も継続すべきである。投与量、投与経路および投与スケジュールは、当分野で既知の方法に従って調節される。
【０２３５】
ある実施形態においては、本発明のポリペプチド、アナログポリヌクレオチドおよび組成物を、重篤な病態、すなわち、生命にかかわる、または生命にかかわる恐れがある状況で使用する。このような場合には、本発明の好ましい組成物中の外来物質が最少量に抑えられ、ポリペプチドが比較的無毒であることから、記載したこれらの投与量よりもかなり過剰のこれらのポリペプチド組成物を投与することが可能であり、治療医師が望ましいと感じることがある。
【０２３６】
本発明のワクチン組成物を、予防薬として使用することもできる。例えば、この組成物を、前立腺癌を発症するリスクのある個体に投与することができる。一般に、初期の予防的な免疫化に要する投与量は、低い方の値が約１、５、５０、５００または１，０００μｇであり、高い方の値が約１０，０００、２０，０００、３０，０００または５０，０００μｇである単位投与量の範囲である。ヒトに対する投与量は、一般に、７０キログラムの患者につき約５００μｇから約５０，０００μｇである。その後、ワクチンの初期投与から約４週間から６カ月の既定の間隔で投与される約１．０μｇから約５０，０００μｇの用量のペプチドで追加投与する。ワクチンの免疫原性は、患者の血液試料から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって評価することができる。
【０２３７】
治療用の薬剤組成物は、非経口、局所、経口、鞘内または局所投与に向けられたものである。薬剤組成物は、非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）、例えば、静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与されることが好ましい。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁された免疫原性ポリペプチドの溶液を含む非経口投与組成物を提供する。例えば、水、緩衝水、０．８％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など様々な水性担体を使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができ、または滅菌フィルターによって滅菌することができる。得られた水溶液を、そのまま使用するために包装することができ、または凍結乾燥することができる。凍結乾燥調製物は、投与前に無菌溶液に混合される。本組成物は、ｐＨ調節および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤、防腐剤などの生理的条件に近づけるのに必要な薬剤として許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含有することができる。
【０２３８】
医薬品製剤中の本発明のポリペプチドまたはアナログの濃度は、大きく変わり、すなわち、約０．１％重量未満から、通常約２重量％または少なくとも約２重量％、２０重量％から５０重量％またはそれ以上の程度まで変わり、選択した特定の投与方式に従って主として流体体積、粘度などによって選択される。
【０２３９】
ヒト単位用量剤形のポリペプチドＢまたはポリヌクレオチド組成物は、一般に、ヒト単位用量の許容される担体、好ましくは水性担体を含む薬剤組成物に含まれ、このような組成物をヒトに投与するのに使用されることが当業者によって知られているある体積の流体中に溶解して投与される（例えば、非特許文献１０２参照）。
【０２４０】
７．診断薬としてのアナログエピトープの使用、および免疫応答を評価するためのアナログエピトープの使用
本発明の一実施形態においては、本明細書に記載するヘテロクリティックアナログポリペプチドを試薬として使用して免疫応答を評価する。評価される免疫応答は、試薬として使用されるアナログポリペプチドを認識し、これに結合する抗原特異性ＣＴＬを誘導することができる任意の薬剤を免疫原として使用して誘導される。ポリペプチドを免疫原として使用する必要はない。このような分析に使用されるアッセイシステムは、細胞内リンホカイン用四量体染色、およびインターフェロン放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどの比較的最近の開発技術を含む。
【０２４１】
例えば、本発明のポリペプチドを四量体染色アッセイに使用して、腫瘍細胞抗原または免疫原への暴露後の抗原特異性ＣＴＬの有無について末梢血単核球を評価する。ＨＬＡ−四量体複合体を使用して、抗原特異性ＣＴＬを直接可視化し（例えば、非特許文献１０３、１０４参照）、末梢血単核球試料中の抗原特異性ＣＴＬ集団の頻度を測定する。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下のとおりに生成される。ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下で再び折り畳まれて３分子複合体を産生する。この複合体は、重鎖のカルボキシ末端の前もってタンパク質中に作られた部位がビオチン化されている。次いで、ストレプトアビジンを添加することによって、四量体の形成が誘発される。蛍光標識ストレプトアビジンによって、四量体を使用して、抗原特異性細胞を染色することができる。次いで、この細胞を、例えば、フローサイトメトリーによって特定することができる。このような分析を、診断または予後のために使用することができる。この手順によって特定された細胞を治療に使用することもできる。
【０２４２】
本発明のポリペプチドは、免疫復活応答を評価する試薬としても使用される（例えば、非特許文献１０５、１０６参照）。例えば、癌患者からのＰＢＭＣ試料を、特異的ペプチドを用いて抗原特異性ＣＴＬの有無について分析する。単核細胞を含有する血液試料を、ＰＢＭＣを培養し、その細胞を本発明のペプチドで刺激することによって評価することができる。適切な培養期間後、増殖した細胞集団の、例えば、ＣＴＬ活性を分析することができる。
【０２４３】
本ポリペプチドは、ワクチンの効力を評価する試薬としても使用される。免疫原をワクチン接種した患者から得たＰＢＭＣを、例えば、上記方法のいずれかを用いて分析する。この患者のＨＬＡタイプを決定し、この患者の対立遺伝子特異的分子を認識するアナログポリペプチドを分析に使用する。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣ試料中のエピトープ特異的ＣＴＬの有無によって示される。
【０２４４】
本発明のポリペプチドは、当分野で周知の技術を用いて抗体を作製するためにも使用される（例えば、非特許文献１０７、１０８参照）。この抗体は、癌を診断する試薬またはモニターする試薬として有用な場合がある。そのような抗体としては、ＨＬＡ分子に関連するペプチドを認識する抗体、すなわち、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体などがある。
【０２４５】
８．キット
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド組成物を、ワクチン投与の説明書とともにキットの形で提供することができる。一般に、このキットは、容器に入った、好ましくは単位剤形の所望のポリペプチド組成物、および投与説明書を含む。別のキットは、容器に入った、好ましくは単位剤形の本発明の所望の核酸を含むポリヌクレオチド（例えば、ミニ遺伝子）構築体、および投与説明書を含む。ＩＬ−２、ＩＬ−１２などのリンホカインもこのキットに入れることができる。望ましいこともある他のキット成分は、例えば、無菌シリンジ、追加投与製剤などを含む。
【０２４６】
ヘテロクリティックアナログを使用して、免疫応答を首尾よく誘導することができた。このようなアナログを用いた免疫応答は、様々な形のアナログを投与することによって誘導された。ペプチド系アナログ製剤を投与すると、細胞上に発現される空のＨＬＡ分子へのアナログの直接装荷、アナログの内在化、およびＨＬＡクラスＩ経路を介したプロセシングによって免疫応答が誘導された。いずれの現象でも、このアナログを発現するＨＬＡ分子は、次いでＣＴＬ応答と相互作用し、ＣＴＬ応答を誘導することができた。
【０２４７】
したがって、本発明による組成物は、この開示を通して記述するいくつかの形で存在する。本発明によるこれらの形の組成物の各々の実施形態は、免疫応答を首尾よく誘導することができる。キットは、これらの組成物のいずれかを含むことができる。
【０２４８】
９．クラスＩモチーフ
過去数年で、ＨＬＡクラスＩ分子の大部分を、各々がほとんど重複するペプチド結合レパートリーと、主要なペプチド結合ポケットのコンセンサス構造とを特徴とする比較的少数のスーパータイプに分類できることを示す証拠が蓄積された。したがって、本発明のペプチドは、いくつかのＨＬＡ特異的アミノ酸モチーフ（例えば、表３〜４参照）のいずれか１個によって特定され、またはモチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ抗原、スーパーモチーフに結合する能力に対応するかどうかで特定される。特定のアミノ酸スーパーモチーフを有するペプチドに結合するＨＬＡ分子は、ＨＬＡ「スーパータイプ」と総称される。
【０２４９】
読者の便宜のため、表３〜４に要約した下記ペプチドモチーフおよびスーパーモチーフは、本発明によるアナログポリペプチドの特定および使用の指針となるものである。これによって、本明細書に示す法則を構築体アナログに適用するために、下記例に示したものとは異なる様々なクラスＩモチーフに対応する野生型エピトープ候補、または下記の、ただし異なる抗原のモチーフを有するエピトープの特定が可能になる。
【０２５０】
ヘテロクリティックアナログを、ペプチドが属するモチーフまたはスーパーモチーフに無関係に、本発明の方法によってペプチドから設計することができる。以下に詳述するＨＬＡクラスＩペプチドエピトープスーパーモチーフおよびモチーフの一次アンカー残基を表３に要約する。表４に示すＨＬＡクラスＩモチーフは、ここに特許請求する本発明に最も関連するものである。ＨＬＡクラスＩスーパータイプファミリーを含む対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を表５に列挙する。幾つかの場合には、ペプチドエピトープがモチーフとスーパーモチーフの両方に記載されている。特定のモチーフとそれぞれのスーパーモチーフの関係を、個々のモチーフについて記述して示す。
【０２５１】
ｉ．ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフは、エピトープの２位の小さな（ＴまたはＳ）または疎水性（Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）一次アンカー残基、およびＣ末端位置の芳香族（Ｙ、ＦまたはＷ）一次アンカー残基がペプチドリガンド中に存在することを特徴とする。Ａ１スーパーモチーフ（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーは、少なくともＡ＊０１０１、Ａ＊２６０１、Ａ＊２６０２、Ａ＊２５０１およびＡ＊３２０１を含む（例えば、非特許文献１０９〜１１１参照）。Ａ１スーパーファミリーのメンバーであることが予測される別の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を表５に示す。
【０２５２】
ｉｉ．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ
対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１分子の一次アンカー特異性（例えば、非特許文献１１２〜１１５参照）、およびＨＬＡ−Ａ２および−Ａ２８分子中の交差反応性結合が記述された。（関連データの総説は、例えば、非特許文献１１６〜１１９参照。）これらの一次アンカー残基は、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを規定する。ペプチドリガンド中のＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフの存在は、いくつかの異なるＨＬＡ−Ａ２および−Ａ２８分子を結合する能力に対応する。ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、エピトープの２位の一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱ、およびＣ末端位置の一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを含むペプチドリガンドを含む。
【０２５３】
対応するＨＬＡ分子ファミリー（すなわち、これらのペプチドに結合するＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくともＡ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊０２０９、Ａ＊０２１４、Ａ＊６８０２およびＡ＊６９０１から構成される。Ａ２スーパーファミリーのメンバーであることが予測される別の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を表５に示す。
【０２５４】
ｉｉｉ．ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフは、ペプチドリガンド中のエピトープの２位に一次アンカーとしてＡ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳまたはＴが存在し、Ｃ末端位置、例えば９量体の９位に正に帯電した残基ＲまたはＫが存在することを特徴とする（例えば、非特許文献１２０参照）。Ａ３スーパーモチーフに結合する対応するＨＬＡ分子ファミリーの例示的なメンバー（ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）は、少なくともＡ＊０３０１、Ａ＊１１０１、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１を含む。Ａ３スーパータイプのメンバーであることが予測される別の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を表５に示す。
【０２５５】
ｉｖ．ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフは、エピトープの２位の一次アンカーとして芳香族（Ｆ、ＷまたはＹ）残基または疎水性脂肪族（Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＴ）残基、およびＣ末端位置の一次アンカーとしてＹ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、ＩまたはＭがペプチドリガンド中に存在することを特徴とする（例えば、非特許文献１２１参照）。Ａ２４スーパーモチーフに結合する対応するＨＬＡ分子ファミリー（すなわち、Ａ２４スーパータイプ）としては、少なくともＡ＊２４０２、Ａ＊３００１およびＡ＊２３０１が含まれる。Ａ２４スーパータイプのメンバーであることが予測される別の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を表５に示す。
【０２５６】
ｖ．ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフは、エピトープの２位の一次アンカーとしてプロリンを有するペプチド、およびＣ末端位置の一次アンカーとして疎水性または脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、ＷまたはＹ）を特徴とする。Ｂ７スーパーモチーフに結合する対応するＨＬＡ分子ファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）は、Ｂ＊０７０２、Ｂ＊０７０３、Ｂ＊０７０４、Ｂ＊０７０５、Ｂ＊１５０８、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊３５０２、Ｂ＊３５０３、Ｂ＊３５０４、Ｂ＊３５０５、Ｂ＊３５０６、Ｂ＊３５０７、Ｂ＊３５０８、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５１０２、Ｂ＊５１０３、Ｂ＊５１０４、Ｂ＊５１０５、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１、Ｂ＊５５０２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊５６０２、Ｂ＊６７０１およびＢ＊７８０１を含めた少なくとも２６個のＨＬＡ−Ｂタンパク質を含む（関連するデータの総説は、例えば、非特許文献１２２〜１２５参照）。Ｂ７スーパータイプのメンバーであることが予測される別の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を表５に示す。
【０２５７】
ｖｉ．ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフは、エピトープの２位の一次アンカーとして正に帯電した（Ｒ、ＨまたはＫ）残基、およびＣ末端位置の一次アンカーとして疎水性（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、ＡまたはＶ）残基がペプチドリガンド中に存在することを特徴とする（例えば、非特許文献１２１参照）。Ｂ２７スーパーモチーフに結合する対応するＨＬＡ分子ファミリーの例示的なメンバー（すなわち、ｔｈｅ  Ｂ２７スーパータイプ）としては、少なくともＢ＊１４０１、Ｂ＊１４０２、Ｂ＊１５０９、Ｂ＊２７０２、Ｂ＊２７０３、Ｂ＊２７０４、Ｂ＊２７０５、Ｂ＊２７０６、Ｂ＊３８０１、Ｂ＊３９０１、Ｂ＊３９０２およびＢ＊７３０１が含まれる。Ｂ２７スーパータイプのメンバーであることが予測される別の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を表５に示す。
【０２５８】
ｖｉｉ．ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフは、エピトープの２位の一次アンカーとして負に帯電した（ＤまたはＥ）残基、およびＣ末端位置の一次アンカーとして疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＶまたはＡ）がペプチドリガンド中に存在することを特徴とする（例えば、非特許文献１２６参照）。Ｂ４４スーパーモチーフに結合する対応するＨＬＡ分子ファミリーの例示的なメンバー（すなわち、Ｂ４４スーパータイプ）としては、少なくともＢ＊１８０１、Ｂ＊１８０２、Ｂ＊３７０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０２、Ｂ＊４４０３およびＢ＊４００６が含まれる。
【０２５９】
ｖｉｉｉ．ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフは、エピトープの２位の一次アンカー残基として小さな脂肪族残基（Ａ、ＳまたはＴ）、およびＣ末端位置の一次アンカー残基として芳香族または疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡ）がペプチドリガンド中に存在することを特徴とする（関連するデータの総説は、例えば、非特許文献１２１参照）。Ｂ５８スーパーモチーフに結合する対応するＨＬＡ分子ファミリーの例示的なメンバー（すなわち、Ｂ５８スーパータイプ）としては、少なくともＢ＊１５１６、Ｂ＊１５１７、Ｂ＊５７０１、Ｂ＊５７０２およびＢ＊５８０１が含まれる。Ｂ５８スーパータイプのメンバーであることが予測される別の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を表５に示す。
【０２６０】
ｉｘ．ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフは、エピトープの２位の一次アンカーとして極性脂肪族残基Ｑまたは疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｖ、Ｍ、ＩまたはＰ）、およびＣ末端位置の一次アンカーとして疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、ＬまたはＡ）がペプチドリガンド中に存在することを特徴とする（例えば、非特許文献１２１参照）。Ｂ６２スーパーモチーフに結合する対応するＨＬＡ分子ファミリーの例示的なメンバー（すなわち、Ｂ６２スーパータイプ）としては、少なくともＢ＊１５０１、Ｂ＊１５０２、Ｂ＊１５１３およびＢ５２０１が含まれる。Ｂ６２スーパータイプのメンバーであることが予測される別の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を表５に示す。
【０２６１】
ｘ．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ
ＨＬＡ−Ａ１モチーフは、エピトープの２位の一次アンカー残基としてＴ、ＳまたはＭがペプチドリガンド中に存在し、Ｃ末端位置の一次アンカー残基としてＹが存在することを特徴とする。別の対立遺伝子特異的Ａ１モチーフは、２位ではなく３位の一次アンカー残基を特徴とする。このモチーフは、エピトープの３位の一次アンカー残基としてＤ、Ｅ、ＡまたはＳが存在し、Ｃ末端位置の一次アンカー残基としてＹが存在することを特徴とする（関連するデータの総説は、例えば、非特許文献１１０、１１１、１２７参照）。
【０２６２】
ｘｉ．ＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフ
ＨＬＡ−Ａ２＊０２０１モチーフは、９残基ペプチドの２位の一次アンカー残基としてＬまたはＭ、およびＣ末端位置の一次アンカー残基としてＬまたはＶがペプチドリガンド中に存在することを特徴とすることが決定され（例えば、非特許文献１１２参照）、さらに、９アミノ酸ペプチドの２位にＩ、Ｃ末端位置にＩまたはＡを含むことが見出された（例えば、非特許文献１１４、１２８参照）。Ａ＊０２０１対立遺伝子特異的モチーフは、エピトープの２位の一次アンカー残基としてＶ、Ａ、ＴまたはＱ、およびＣ末端位置の一次アンカー残基としてＭまたはＴをさらに含むことも本発明者らによって特定された（例えば、非特許文献１１９参照）。したがって、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフは、エピトープの２位の一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱ、およびＣ末端位置の一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有するペプチドリガンドを含む。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフの一次アンカー位置を特徴づける許容される好ましい残基は、Ａ２スーパーモチーフを記述する残基と同一である。
【０２６３】
ｘｉｉ．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ
ＨＬＡ−Ａ３モチーフは、エピトープの２位の一次アンカー残基としてＬ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、ＧまたはＤがペプチドリガンド中に存在し、Ｃ末端位置の一次アンカー残基としてＫ、Ｙ、Ｒ、Ｈ、ＦまたはＡが存在することを特徴とする（例えば、非特許文献１２９、１３０参照）。
【０２６４】
ｘｉｉｉ．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ
ＨＬＡ−Ａｌｌモチーフは、エピトープの２位の一次アンカー残基としてＶ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、ＤまたはＦ、およびＣ末端位置の一次アンカー残基としてＫ、Ｒ、ＹまたはＨがペプチドリガンド中に存在することを特徴とする（例えば、非特許文献１３０、１３１参照）。
【０２６５】
ｘｉｖ．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ
ＨＬＡ−Ａ２４モチーフは、エピトープの２位の一次アンカー残基としてＹ、Ｆ、ＷまたはＭ、およびＣ末端位置の一次アンカー残基としてＦ、Ｌ、ＩまたはＷがペプチドリガンド中に存在することを特徴とする（例えば、非特許文献１３０、１３２参照）。
【０２６６】
１０．Ｔ細胞応答検出アッセイ
本発明のヘテロクリティックアナログを合成した後、それがＴ細胞応答を誘発する能力について試験することができる。ヘテロクリティックアナログなどのモチーフを有するペプチドの調製および評価は、（特許文献１、２）に記載されている。手短に述べると、特定の抗原由来のエピトープを含むペプチドを合成し、それが適切なＨＬＡタンパク質に結合できる能力について試験する。これらのアッセイは、精製ＨＬＡクラスＩ分子への本発明のペプチドの結合を、放射ヨウ素標識基準ペプチドの結合に関連して評価することを含む。あるいは、空の（すなわち、その中にペプチドを欠く）クラスＩ分子を発現する細胞を、免疫蛍光染色法およびフロー微小蛍光定量法（ｆｌｏｗ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）によってそのペプチド結合を評価することができる。ペプチド結合を評価するために使用することができる他のアッセイとしては、ペプチド依存的クラスＩアセンブリーアッセイおよび／またはペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害などが含まれる。一般に５００ｎＭ以下の親和性でクラスＩ分子に結合するペプチドを、感染個体または免疫個体に由来するＣＴＬに対する標的として役立つかどうか、ならびに選択された疾患関連標的細胞と反応可能なＣＴＬ集団を生ずることができるインビトロまたはインビボでの一次ＣＴＬ応答を誘発できるかどうかさらに評価する。
【０２６７】
Ｔ細胞応答を検出するのに利用される従来のアッセイには、増殖アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ、直接的な細胞毒性アッセイ、限界希釈アッセイなどがある。このようなアッセイは、ヘテロクリティックアナログペプチドによる免疫応答の誘発を、（例えば、ヘテロクリティックアナログ配列のもとになった）非ヘテロクリティックアナログクラスＩペプチドによって誘発される応答と比較するのに有用である。例えば、ペプチドとともにインキュベートされた抗原提示細胞が、応答細胞集団中でＣＴＬ応答を誘発する能力について評価することができる。抗原提示細胞は、末梢血単核球、樹状細胞などの正常細胞とすることができる。あるいは、内部プロセシングされたペプチドをクラスＩ分子に装荷する能力を欠き、かつ適切なヒトクラスＩ遺伝子を形質移入された突然変異非ヒト哺乳動物細胞系を使用して、ペプチドがインビトロで一次ＣＴＬ応答を誘発できるかどうかを試験することができる。
【０２６８】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＣＴＬ前駆体の応答細胞源として使用することができる。適切な抗原提示細胞をペプチドとともにインキュベートし、その後、ペプチドが装荷された抗原提示細胞を応答細胞集団とともに最適培養条件下でインキュベートする。特異的ペプチドを間欠投与した標的と、内因的にプロセシングされた形の、そのペプチド配列が由来する抗原を発現する標的細胞との両方の放射標識標的細胞を死滅させるＣＴＬの存在について、その培養物を評価することによって、陽性のＣＴＬ活性化が決定できる。
【０２６９】
また、フルオレセイン標識ＨＬＡ四量体複合体で染色することによって、抗原特異性Ｔ細胞を直接定量することができる方法が発明された（非特許文献１３３、１３４）。他の比較的最近の開発技術としては、細胞内リンホカイン染色、およびインターフェロンγ放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイが含まれる。四量体染色、細胞内リンホカイン染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイはすべて、従来のアッセイよりも少なくとも１０倍感度が高いと考えられる（非特許文献１３５〜１３７）。
【０２７０】
所望であれば、ＨＴＬ活性化を、Ｔ細胞増殖、リンホカイン、例えば、ＩＬ−２の分泌などの当分野で既知の技術を用いても評価することができる（例えば、非特許文献１３８参照）。
【０２７１】
あるいは、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化を使用して、ペプチドエピトープの免疫原性を決定することができる。ヒトＡ２．１、Ａ１１（さらにこれを使用してＨＬＡ−Ａ３エピトープを分析することができる）およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含めて、いくつかのトランスジェニックマウスモデルの特性が明らかになり、他のモデル（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４のトランスジェニックマウス）も開発されつつある。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルも開発された。他のＨＬＡ対立遺伝子を有する別のトランスジェニックマウスモデルも必要に応じて作製することができる。これらのマウスをフロイントの不完全アジュバントに乳化されたペプチドで免疫し、得られたＴ細胞を、ペプチドを間欠投与した標的細胞および適切な遺伝子を形質移入した標的細胞を認識するそれらの能力について試験することができる。ＣＴＬ応答は、上述した細胞毒性アッセイを用いて分析することができる。同様に、ＨＴＬ応答を、Ｔ細胞増殖、リンホカイン分泌のようなアッセイを用いて分析することができる。
【０２７２】
本発明のヘテロクリティックアナログは、Ｔｈ１とＴｈ２の両方のサイトカイン応答を誘発することが多い。したがって、ヘテロクリティック候補を、あらかじめ選択したクラスＩペプチドと比較する１つの方法は、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの誘発を試験することである。あらかじめ選択したクラスＩペプチドは、一般に、ヘテロクリティックアナログが由来するペプチドであり、またはそのようなペプチドが存在しない場合には、その候補に最も類似したクラスＩペプチドである。本発明のヘテロクリティックアナログは、一般に、Ｔｈ１とＴｈ２の両方のサイトカイン応答を誘発するが、そのレベルは、そのアナログが由来するクラスＩペプチドよりはるかに高い。例えば、所与のヘテロクリティックアナログは、そのアナログが由来する野生型ペプチドに比較して１０倍またはそれよりも低い用量で、同一レベルのＴｈ１またはＴｈ２サイトカイン（５０から１００ｐｇ／ｍｌ）を刺激する。さらに、クラスＩペプチドが、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答のどちらかのみ、または主としてどちらかを誘発する場合、ヘテロクリティックアナログはＴｈ１とＴｈ２の両方の応答を誘発することができる。Ｔｈ１サイトカインとしては、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−３がある。Ｔｈ２サイトカインとしては、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０がある。サイトカインの産生は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫学的定量方法を用いて測定することができる。例えば、非特許文献１３９を参照されたい。
【実施例】
【０２７３】
調製Ａ
ペプチド合成およびペプチドアナログの産生
これらの実施例に使用するペプチドを表１に示す。腫瘍関連抗原に由来する野生型ヒトＣＴＬエピトープのすべてが、ヒトおよびトランスジェニックマウス系において免疫原性を示した（非特許文献１４０〜１４２）。
【０２７４】
最初にヘテロクリティック活性を試験するペプチドは、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖｉｃｔｏｒ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって合成された。さらなる生物学的特性決定を必要とするペプチドは、従来の方法（非特許文献１４３）によってＥｐｉｍｍｕｎｅで合成され、その純度は分析用逆相ＨＰＬＣで決定して通常＞９５％であった。後者のペプチドの素性を質量スペクトル分析によって確認した。
【０２７５】
調製Ｂ
単一のアミノ酸置換を選択するスキーム
表２は、任意の所与のアミノ酸対の間で割り当てられた類似度である。これによって、所与のアミノ酸置換を、保存的、半保存的または非保存的置換として特徴づけることができた。
【０２７６】
アミノ酸対の間の類似度を、各アミノ酸対に対して、以下に示すようにＰＡＭ２５０の順位係数評点（ｒａｎｋ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｃｏｒｅｓ）、疎水性および側鎖体積を平均して定量した。この表は、これらの複合順位の平均値に基づいて、各対が保存、半保存または非保存であることを示している。
【０２７７】
Ｄａｙｈｏｆｆ  ＰＡＭ２５０評点（非特許文献１４４〜１４６）は、一般に利用されているタンパク質配列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）評点マトリックスであり、規定された時間枠内での許容される点突然変異（ＰＡＭ）の百分率を測定するものである。これらの突然変異の頻度は、ランダムな突然変異の確率から予想されるものとは異なり、おそらくは、置換に関与するアミノ酸対の物理的および化学類似度の程度を反映している。他の類似度測定値と標準化できるアミノ酸類似度評点を得るために、ＰＡＭ２５０評点を順位値に変換した。順位値１は、許容される突然変異である確率が最も高いことを示す。
【０２７８】
２０個の天然アミノ酸の相対的疎水性（非特許文献１４７）を表す最も一般に利用されている尺度は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（非特許文献１４８）、ならびにＦａｕｃｈｅｒｅおよびＰｌｉｓｋａ（非特許文献１４９）によって実験データに基づいて開発されたものである。Ｋｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの尺度は、個々のアミノ酸のＨ２Ｏ／有機溶媒分配を測定するものである。これは、折り畳まれたタンパク質中のアミノ酸の位置を考慮するので、タンパク質の状態における固有の疎水性を最も正確に示すことができる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ／Ｐｌｉｓｋａの尺度は、Ｎ−アセチルアミノ酸アミドのオクタノール／Ｈ２Ｏ分配を測定するものであり、変性タンパク質および／または小さな合成ペプチドにおける疎水性を最も正確に示す。疎水性評点を得るために、各アミノ酸残基を、Ｋｙｔｅ／ＤｏｏｌｉｔｔｌｅおよびＦａｕｃｈｅｒｅ／Ｐｌｉｓｋａの両方の疎水性尺度で順位付けした。２つの尺度の平均順位を計算し、各対の疎水性の平均差を計算した。
【０２７９】
最後に、アミノ酸側鎖体積を計算するために、１分子または１グラムのアミノ酸残基を添加した後の水の体積増加に注目することによって得られた溶液中の部分体積を考慮した（非特許文献１５０、１５１）。２０個の天然アミノ酸の可能な各対の部分体積の絶対的な差を計算し順位付けした。順位１は体積が最も類似した残基を示し、２０は最も異なる残基を示す。
【０２８０】
調製Ｃ
アッセイ用材料
１．ＡＰＣ系
ＨＬＡ−Ａ２．１に関連したペプチドを提示する細胞系を以下のとおり調製した。
【０２８１】
．２２１Ａ２．１細胞系を、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃなしの突然変異ＥＢＶ形質転換ヒトＢリンパ芽球状細胞系３Ａ４−７２１．２２１にＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子を形質移入することによって産生させた（非特許文献１４０）。細胞系ＧＭ３１０７をＡＰＣとして使用してＢ７  ＣＴＬ応答を測定した。
【０２８２】
Ｍｅｔｈ  Ａ細胞、メチルコラントレンによって誘導された肉腫、およびジャーカット細胞系にＨＬＡ−Ａ２．１を形質移入して腫瘍細胞系を調製するか、またはＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂ導入遺伝子形質移入を、他で記載された方法（非特許文献１５２）により実施した。ＨＬＡ型の決定したメラノーマ細胞系６２４ｍｅｌ（Ａ２．１＋、ＭＡＧＥ＋）と８８８ｍｅｌ（Ａ２．１−、ＭＡＧＥ−）の組合せを、Ｙ．ＫａｗａｋａｍｉおよびＳ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の好意によって得て、それらを用いて内因的にプロセシングされたＭＡＧＥ３エピトープの提示を測定した（非特許文献１５３）。このメラノーマ細胞系を１００ＩＵ／ｍｌのヒトＩＦＮ−γ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で４８時間３７℃で処理してからＡＰＣとして使用した。
【０２８３】
この試験におけるすべての細胞を、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および１０％（ｖ／ｖ）熱失活ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で増殖させた。
【０２８４】
２．ヒトＰＢＭＣからのＣＴＬのインビトロでの誘導およびヒトＣＴＬ系の派生
ＭＡＧＥ３．１１２、ＭＡＧＥ２．１７０、および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）エピトープＣＥＡ．６９１に対してペプチド特異的ＣＴＬ系を産生するために、正常者から得たＰＢＭＣをインビトロで繰り返し上記ペプチドで刺激した（非特許文献１４０）。手短に述べると、ペプチドを間欠投与した樹状細胞（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４中で培養したことによって接着ＰＢＭＣと区別される）を、４８ウェルプレート中で抗体被覆ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ａ．Ｓ．、Ｏｓｌｏ、ＮｏｒｗａｙまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いてポジティブ選択することによって得た自己ＣＤ８＋Ｔ細胞と同時培養した。ＩＬ２、ＩＬ７およびＩＬ１０の存在下で７日間培養した後、各ＰＢＭＣ培養物（ウェル）を、ペプチドを間欠投与した接着ＰＢＭＣを用いてインビトロで再刺激した。次いで、培養物のＣＴＬ活性を、ペプチドの存在下または非存在下で、．２２１Ａ２．１腫瘍ＡＰＣ（Ａ２エピトープ）またはＧＭ３１０７腫瘍細胞（Ｂ７エピトープ）で刺激した後にＩＦＮ−γ産生を測定することによって試験した。ＣＴＬ系を、ペプチドを間欠投与した接着ＰＢＭＣを用いてさらにインビトロで刺激することによって、ペプチド特異的ＩＦＮ−γ応答を示すＰＢＭＣ培養物から発達させた。
【０２８５】
３．ネズミＣＴＬ系
エピトープＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５およびＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６ペプチドに対するＣＴＬ系を、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂｘｓトランスジェニックマウスにおいて、別に記載されたＤＮＡ免疫化（非特許文献１４１）によって産生させた。ＨＬＡ−Ａ２．１／ＫｂｘｓおよびＨＬＡ−Ａ２．１／ＫｂｘｄトランスジェニックマウスはＥｐｉｍｍｕｎｅで飼育された。これらの系統は、Ｃ５７ＢＬ／６を背景に産生されたＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニック系統（非特許文献１５２）と、それぞれＳＪＬまたはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）とを交雑させたＦ１世代に相当する。ＭＡＧＥ２．１５７エピトープに対するＣＴＬ系は、８〜１２週齢のＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂｘｓマウスをペプチド５０μｇ、およびＩＦＡに乳化したＨＢＶコア．１２８ＴｈエピトープＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ（配列番号３４）１４０μｇを尾の付け根に皮下注射して免疫し、初回抗原刺激した脾細胞をペプチドで繰り返しインビトロで再刺激しすることによって産生させた。
【０２８６】
調製Ｄ
アッセイ方法
１．ＨＬＡ−Ａ２．１またはＨＬＡ−Ｂ７分子のペプチド結合親和性の測定
ＨＬＡ−Ａ２．１と放射標識標準ペプチドの結合性に対する、所与の試験ペプチドによって誘導される競合レベルを決定することによって、ＨＬＡ−Ａ２．１に対する試験ペプチドの結合性を測定した。ＭＨＣ結合放射能の割合をゲルろ過によって決定し、標識標準ペプチドの結合の５０％を阻害する試験ペプチド濃度（ＩＣ５０）を計算した（非特許文献１４３、１５４）。標準ペプチドは、ＨＢＶコア．１８エピトープ（配列ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ）（配列番号３５）であった。類似のアッセイを実施して、精製ＨＬＡ−Ｂ７（Ｂ＊０７０２）分子に対するペプチドの結合親和性を決定した。後者のアッセイでは、放射標識標準ペプチドは、ＳＳ  ５−１３ａ（Ｌ７→Ｙ）ペプチド（配列ＡＰＲＴＬＶＹＬＬ）（配列番号３６）であった。
【０２８７】
２．ＣＴＬによるネズミおよびヒトＩＦＮ−γ、ＩＬ−５およびＩＬ−１０産生の測定
ｉｎ  ｓｉｔｕ捕獲ＥＬＩＳＡを使用してＣＴＬからのＩＦＮ−γ放出を測定した（非特許文献１５５）。手短に述べると、抗マウスＩＦＮ−γ（クローンＲ４−６Ａ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）または抗ヒトＩＦＮ−γｍＡｂ（クローンＮＩＢ４２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をあらかじめ塗布したＥＬＩＳＡグレード９６ウェル平底ウェル中でＡＰＣおよびペプチドを用いてＣＴＬを刺激した。細胞を培養した後、ウェルを洗浄し、ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ（クローンＸＭＧ１．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）または抗ヒトＩＦＮ−γ（クローン４Ｓ．Ｂ３、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ｍＡｂを添加し、その後酵素複合ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）および３，３'，５，５'テトラメチルベンジジン基質（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質キット、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を添加して発達させた。各ウェルの吸光度をＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ  ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。各ウェル中で産生されたＩＦＮ−γレベルを、同じアッセイで作成したマウスまたはヒトＩＦＮ−γ標準曲線から外挿して決定した。
【０２８８】
培養上清中のネズミおよびヒトＩＬ−５およびＩＬ−１０を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて測定した。定量サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を使用するこれらのアッセイを製造者の手順に従って実施した。
【０２８９】
３．生体外でＣＴＬ応答を測定する酵素様イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを標準手順に従って実施した（非特許文献１５６、１５７）。手短に述べると、９６ウェルの平底ニトロセルロースプレート（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ、クローンＲ４−６Ａ２）でコーティングし、終夜４℃でインキュベートした。プレートを、ＰＢＳで洗浄後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地を用いて３７℃で１時間ブロックした。磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）によって単離された４×１０５個の脾臓ＣＤ８＋細胞、および１０μｇ／ｍｌのペプチドを間欠投与した５×１０４個のＪｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋｂ細胞を各ウェルに添加し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で２０時間細胞をインキュベートした。インキュベーション後、このプレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いて徹底的に洗浄し、ビオチン化抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ、クローンＸＭＧ１．２）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。次いで、プレートを（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）ＰＢＳおよびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅキット；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で４回洗浄した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、その後１×ＰＢＳでさらに３回洗浄した。ＡＥＣ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１００μｌを添加してスポットを成長させた。この反応を４〜６分後に流水下で停止させた。コンピュータ支援画像分析（Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴリーダー、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてスポットを計数した。正味スポット数／１０６ＣＤ８＋細胞を以下のとおり計算した：［（関連するペプチドに対するスポット数）−（無関係な対照ペプチドに対するスポット数）］×２．５。
【０２９０】
（実施例１）
ヘテロクリティック活性によるペプチドアナログのスクリーニング
ヘテロクリティックを設計する法則を決定するために、いくつかの異なるＣＴＬ系を、一群のアナログに対する反応性によってスクリーニングした。Ｔ細胞刺激能力の改変を、一次ＭＨＣアンカーを変えずに実現した。
【０２９１】
野生型エピトープは、上皮細胞癌において特異的に上方制御され、かつ免疫原性であることが判明している自己抗原に由来する腫瘍エピトープを含む。ＨＩＶおよびＨＢＶのポリメラーゼ遺伝子に由来するウイルスエピトープなど、使用されるウイルスエピトープも、同様に免疫原性であることが判明した。
【０２９２】
本明細書に記載する法則は、ヘテロクリティックアナログを設計する基礎を提供し、法則がなければ必要となるスクリーニングを大幅に削減し、エピトープを利用した癌ワクチンおよび感染症ワクチンを設計するのに極めて有用である。
【０２９３】
以下に示す実施例の一部において、スクリーニングされた（本明細書に開示するヘテロクリシティー法則に適合する）全アナログの１７％は、ヘテロクリティックであった（１６／９５）。これは、２つの理由から重要である。第１に、ヘテロクリティック置換法則に従うアナログを使用することによって、ヘテロクリティックの検出効率が２．２％から１７％に上昇した。第２に、合成する必要があるペプチドの数が約１００アナログ／エピトープから約１５アナログ／エピトープに劇的に減少し、プロセスの費用効果が高くなり、ハイスループットに適するようになる。本発明のヘテロクリティック置換法則を適用することによって、ヘテロクリティックアナログを産生する効率は、０．２％（２３３個のＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２アナログのスクリーニングから４個を特定）から３３％（９個の予測されたアナログのスクリーニングによって３個を特定）にほぼ１００から１０００倍増加した。初期アッセイにおいて潜在的なヘテロクリティック活性を示した６個のアナログのうち４個しかさらに分析しなかったので、この３３％という頻度は著しく過小評価しているかも知れない。
【０２９４】
要約すると、出願人らは、１組の実験において、癌起源のいくつかの異なるＨＬＡ−Ａ２．１およびＢ７制限ＣＴＬエピトープのヘテロクリティックアナログを特定した。関連する野生型エピトープおよびアナログを表１に示す。これらのエピトープはすべて、本発明者らの初期の報告では免疫原性であることが判明している（非特許文献５５、５６）。初期の実験においては、２３３個のＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２ＣＴＬエピトープアナログの抗原性を検討した。特定された４個のヘテロクリティックアナログの性質から、ヘテロクリティック置換が３、５および７位における保存的置換を含むことが示唆された。この仮説は、３個の追加のエピトープＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶＰｏｌ．４７６およびＨＢＶＰｏｌ．４５５を含めたその続きの研究において検討された。こうして特定されたヘテロクリティックアナログのすべてが、提案した法則、すなわち、ヘテロクリティックアナログが３、５および／または７位の保存的または半保存的置換を伴うという法則に従った。
【０２９５】
癌免疫療法におけるヘテロクリティックアナログの臨床応用により近似させるために、ネズミエピトープｐ５３．２６１も改変した。このエピトープに対する部分的なＴ細胞寛容状態が報告されている（非特許文献５７、５８）。９個の予測されたｐ５３．２６１アナログのうち４個は、ネイティブペプチドによって誘導されるＣＴＬ応答よりも強いアナログ特異的ＣＴＬ応答をインビボで誘導することが見出された。より重要なことには、ヘテロクリティックアナログによる免疫化によって生じるＣＴＬの交差反応性を分析したときに、３個のｐ５３．２６１アナログが、ネイティブｐ５３．２６１エピトープに強力に反応するＣＴＬを誘導した。最後に、ヒトＣＴＬに対するこれらの知見の関連性を、ＭＡＧＥ３．１１２エピトープのヘテロクリティックアナログがヒトＴ細胞に対して免疫原性であることをインビトロで示すことによって取り扱った。得られたＣＴＬは、腫瘍細胞系の形で自然にプロセシングされた野生型抗原を認識することができる。
【０２９６】
本明細書に示す研究によれば、試験したすべてのエピトープに対してヘテロクリティックアナログが特定され、ヘテロクリシティーは全体的な現象であることが実証される。また、本出願は、インビボで免疫化した後、（初期の研究で記載された）Ｔ細胞クローン集団とＴ細胞バルク集団の両方においてヘテロクリティックアナログを検出することが可能であることを示している。さらに、本明細書では、（ＨＬＡ  Ａ２．１系と他のクラスＩスーパーモチーフの両方の）ヘテロクリシティーは、ヘテロクリシティーの合理的な予測を可能にする別個の構造的特徴を伴うことを示す。
【０２９７】
ヘテロクリティックアナログは、インビボでの免疫化後に特定のＴ細胞バルク集団を生じさせるのに有効であった。複数のＴＣＲ遺伝子からのＴＣＲを有するポリクローナル応答は、臨床現場における病態の寛解により効果的である。最後に、野生型エピトープに対して強力な交差反応結合活性を有するＣＴＬの前駆体頻度を増加させることができることは、有効なＣＴＬ応答が、通常は免疫系に寛容であるエピトープに対して必要とされる場合に重要である。
【０２９８】
出願人らは、別の組の実験において、（表１に示す）Ｂ７スーパーファミリーエピトープＭＡＧＥ２．１７０のヘテロクリティックアナログを特定した。Ａ２ヘテロクリティックエピトープ同様、Ｂ７スーパーファミリーエピトープのヘテロクリティックアナログは、ペプチドの中間の奇数位置（位置７）に置換を導入することによって産生することができた。ＭＡＧＥ２．１７０エピトープの置換の性質は、ネイティブ残基と比べて保存的／半保存的（Ｙ→ＨおよびＹ→Ｍ置換）または非保存的（Ｙ→Ｅ、Ｙ→ＧおよびＹ→Ｄ置換）であった（表２）。したがって、非保存的置換が、ＭＡＧＥ２．１７０ＣＴＬエピトープに対するヘテロクリティックアナログをもたらし得るという観察結果は、Ａ２スーパーファミリーエピトープの場合に観察されたものと置換パターンが部分的に重複することを示している。
【０２９９】
Ｔｈ１またはＴｈ２サイトカインの産生の調節に差異は認められなかった。その代わりに、本データからは、ヘテロクリティックアナログが、増加の大きさおよび動力学は異なり得るが、Ｔｈ１とＴｈ２の両方の応答生成を増大させることが示唆された。実際に、いくつかのグループ（非特許文献１２、４４参照）は、最近、ペプチドアナログによるこのような全体の刺激について報告した。これは、アナログによって誘導される強いＴＣＲシグナルに起因し得るが、このような全体の刺激の機序はまだ未解明である。
【０３００】
関連する腫瘍モデル、または自己抗原に対する寛容性が存在するモデルを用いて、ヘテロクリティックアナログのインビボでの効力を評価する。結果的に、ヘテロクリティックアナログによる免疫化は、有効なＣＴＬの産生が困難であることがこれまでに判明している場合に、腫瘍に対するワクチン接種のより有効で効率的な戦略であることが判明した。
【０３０１】
（実施例２）
ヘテロクリティック活性によるペプチドアナログのスクリーニング
Ａ．ＩＦＮ−γ放出の増大に関連するＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２アナログの特定
アナログをスクリーニングする前に、ＣＴＬ系からのＩＦＮ−γ産生のペプチド用量滴定を、広範な野生型ペプチドの用量にわたって実施した。．２２１Ａ２．１腫瘍細胞に可変用量のペプチドを間欠的に投与し、次いで１０５個のペプチドを装荷した細胞を、同一数のネズミまたはヒトＣＴＬとともに培養した。３７℃で２４時間（ネズミ）または４８時間（ヒト）のインキュベーション後に、ＣＴＬによって放出されるＩＦＮ−γレベルをｉｎ  ｓｉｔｕ捕獲ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。用量滴定曲線を求めた後、野生型ペプチドに対する活性がほとんど検出不可能な場合、最適以下のペプチド用量を選択して、一群のペプチドアナログの抗原性をスクリーニングした。ネズミおよびヒトＣＴＬ系のすべての場合で、この最適以下の用量は０．１〜１μｇ／ｍｌであった。ネズミＣＴＬ系は、第３のドメインにネズミＨ−２Ｋｂ配列を含むＨＬＡ分子を発現するＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂｘｓトランスジェニックマウスにおいて産生されるが、すべてが、ネイティブＨＬＡ−Ａ２．１分子を発現するＡＰＣ上に提示されるペプチドに応答したことに留意されたい。
【０３０２】
ペプチドアナログのスクリーニングの場合、上述したように、選択された最適以下の用量で各アナログを．２２１Ａ２．１細胞に間欠的に投与し、ペプチドを装荷されたＡＰＣをＣＴＬとともに培養した。次いで、野生型ペプチドよりも大きなＣＴＬ応答を誘導するアナログを選択して、さらに特性を解析した。これらのアナログの特性を、上述した同一の条件下で野生型エピトープと並行してペプチド用量滴定を実施することによって解析した。
【０３０３】
ＨＬＡ−Ａ２．１制限ＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２エピトープに特異的なＣＴＬ系は、調製Ｃに記載したように、ペプチドを装荷された樹状細胞または接着性単球でヒトＰＢＭＣを繰り返しインビトロで再刺激することによって誘導された。
【０３０４】
合計で１１７種類のＣＥＡ．６９１および１１６種類のＭＡＧＥ３．１１２アナログを、各残基を１７種類の異なる単一アミノ酸で系統的に置換することによって産生させた。ＣＥＡ．６９１は、ＩＭＩＧＶＬＶＧＶ（配列番号１）であり、ＭＡＧＥ３．１１２はＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（配列番号４）である。残基Ｃｙｓ、ＴｒｐおよびＭｅｔは、一般に、それが保存的変化に対応しない限り、回避された。置換は、主要なＭＨＣアンカー位置の２位およびＣ末端以外のペプチド中のすべての位置に導入された。
【０３０５】
次いで、これらのアナログの抗原性をインビトロで試験した。上述したように、各ＣＴＬ系での予備的な用量滴定実験を実施して、野生型ペプチドに応答したＩＦＮ−γ産生がほとんど検出不可能である抗原濃度を求めた。次いで、この最適以下の濃度を各エピトープに対するアナログペプチドのすべての抗原性分析に引き続き使用して、Ｔ細胞刺激能力の増加を伴うアナログを特定した。このような抗原性分析の結果を図１に示す。図１Ａに示すように、最適未満の１００ｎｇ／ｍｌ用量の野生型ＣＥＡ．６９１ペプチドは、ほんのわずかなＩＦＮ−γ（＜５０ｐｇ／ウェル）しか産生しなかった。これに対し、同じ用量で、いくつかのＣＥＡ．６９１アナログ（Ｍ３、Ｌ４、Ｐ４、Ｈ５、Ｌ５、Ｈ６、Ｔ６およびＩ７）は、１５０から３５０ｐｇ／ウェルの検出可能なレベルのＩＦＮ−γ産生を誘導した。図１Ｂに示すように、１００ｎｇ／ｍｌのＭＡＧＥ３．１１２特異的ＣＴＬ系野生型ペプチドは、１００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの放出を誘導したのに対し、２つのアナログ（Ｉ５およびＷ７）は、３００ｐｇ／ウェルを超えるレベルのＩＦＮ−γの誘導を伴った。
【０３０６】
１００ｐｇ／ウェルを超えるＩＦＮ−γを刺激したすべてのＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２アナログを選択してさらに特性を解析し、完全な用量滴定を実施してヘテロクリティックアナログを特定した。ヘテロクリティックアナログは、野生型ペプチドよりも１０倍またはそれより低いペプチド濃度でかなりのＩＦＮ−γ放出（＞１００ｐｇ／ウェル）を刺激するアナログである。ＣＥＡ．６９１エピトープの場合、２個の異なるアナログ、Ｍ３（配列番号２）およびＨ５（配列番号３）、を特定した。図１Ｃに示すように、エピトープＣＥＡ．６９１の場合、野生型ペプチドは、１から１００μｇ／ｍｌ用量範囲において検出可能なかなりのＩＦＮ−γシグナルを生じたが、アナログＭ３およびＨ５は、０．０１ｎｇ／ｍｌもの少量のペプチドでかなりの放出を刺激した。これらの判定基準によって、これらの２個のＣＥＡ．６９１アナログは、ＩＦＮ−γ放出の点でその未改変野生型対応物よりもモル基準で１００，０００倍強力である。
【０３０７】
同様に、ＭＡＧＥ３．１１２エピトープの場合、２個のヘテロクリティックアナログＩ５およびＷ７を特定した。図１Ｄに示すように、かなりのＩＦＮ−γ放出には１μｇ／ｍｌの野生型ペプチド濃度が必要であるのに対し、同じ応答を刺激するには０．１ｎｇ／ｍｌのＩ５（配列番号５）またはＷ７（配列番号６）アナログが必要であった。これは、野生型ペプチドの１００，０００倍を超える生物活性の増大に相当する。
【０３０８】
一般に、エピトープの３位および／または５位および／または７位における保存的または半保存的アミノ酸を用いた置換によりヘテロクリティックアナログを産生する野生型クラスＩエピトープの改変は、対応する野生型エピトープに対する免疫応答を高める。これらのヘテロクリティックアナログは、用量応答のシフトをもたらしただけでなく、ＣＴＬを刺激して野生型ペプチドよりも高いレベルのＩＦＮ−γを産生した。その結果、アナログに対する応答で到達した最大の用量応答（プラトー）は、未改変抗原に対して得られた応答よりも極めて高かった。
【０３０９】
（実施例３）
さらなるヘテロクリティックアナログの特定
Ａ３スーパーファミリーエピトープＣＥＡ．６１（ＨＬＦＧＹＳＷＹＫ、配列番号１０）およびＡ２４スーパーファミリーエピトープＭＡＧＥ２．１５６（ＥＹＬＱＬＶＦＧＩ、配列番号２０）のヘテロクリティックアナログの作製に類似の戦略を採用した。表６に、ＣＥＡ．６１およびＭＡＧＥ２．１５６に対して作製したヘテロクリティックアナログの一覧を示す。始めに、応答細胞系によるＩＦＮ−γ産生が野生型ペプチドの２倍を超えるかどうかによってアナログをスクリーニングした。アナログのすべてに対する応答が２倍未満の場合、アナログをケース・バイ・ケースでスクリーニングした。
【０３１０】
試験したＣＥＡ．６１エピトープの６７個の異なるアナログを分析した結果、野生型ペプチドの１００から１００，０００倍低い用量でＩＦＮ−γ応答を刺激する８個のヘテロクリティックアナログ、Ｐ４（配列番号１１）、Ｌ７（配列番号１３）、Ｍ７（配列番号１４）、Ｉ７（配列番号１５）、Ｄ７（配列番号１６）、Ｇ７（配列番号１７）、Ｃ７（配列番号１８）およびＮ７（配列番号１９）を特定した（図２Ｂ〜２Ｃおよび３Ｂ）。これらのアナログは、ペプチドの偶数位置と奇数位置（位置４および７）の両方で、本質的に保存的、半保存的または非保存的である置換を有した。
【０３１１】
試験したＭＡＧＥ２．１５６エピトープの７１個の異なるアナログを分析した結果、野生型ペプチドの１００から１００，０００倍低い用量でＩＦＮ−γ応答を刺激する５個のヘテロクリティックアナログ、Ｉ３（配列番号２１）Ｅ４（配列番号２２）、Ｌ４（配列番号２３）、Ｍ６（配列番号２４）およびＬ６（配列番号２５）を特定した（図４Ｂおよび５Ｂ）。これらのアナログは、ペプチドの偶数位置と奇数位置（位置３、４および６）の両方で、本質的に保存的または非保存的である置換を有した。
【０３１２】
また、調製Ｂおよび表２に記載したアミノ酸保存度割り当て（ｃｏｎｓｅｒｖａｎｃｙ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ）を用いて、３個のエピトープの各々において３、５、７のエピトープ位置、ならびに１、４、６のエピトープ位置に５個の保存的アミノ酸置換および５個の非保存的アミノ酸置換を含む８５個の異なるアナログの一群を合成した。これらのアナログのヘテロクリシティーを、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂｘｓトランスジェニックマウスにおいて産生されたネズミＣＴＬ系を用い、実施例１のＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２エピトープの場合に記述した戦略と類似した実験戦略に従って試験した。マウス系の作製と維持に関連した技術的容易さのために、ヒトＣＴＬ系の代わりにＨＬＡトランスジェニックマウスに由来するネズミＣＴＬ系を使用した。ＭＡＧＥ２．１５７の結果を図６に示す。
【０３１３】
試験したＭＡＧＥ２．１５７エピトープの８５個の異なるアナログを分析した結果、野生型ペプチドの１００から１００，０００倍低い用量でＩＦＮ−γ応答を刺激する２個のヘテロクリティックアナログＩ５（配列番号８）およびＦ５（配列番号９）を特定した（図７Ａ）。これらのアナログはともに、ペプチドの中央の奇数位置（位置５）で、本質的に保存的または半保存的である置換を有した。
【０３１４】
したがって、腫瘍エピトープＭＡＧＥ２．１５７に対する８５個のアナログから得られたデータは、実施例１に示すＭＡＧＥ３．１１２およびＣＥＡ．６９１エピトープの分析結果と一致した。
【０３１５】
（実施例４）
ヘテロクリティックアナログによって誘導されるリンホカインプロファイル
ヘテロクリティックアナログは、Ｔ細胞からのサイトカイン産生を異なって活性化することがこれまでに判明している。一部のアナログは、Ｔ細胞を特異的に活性化してＴｈ１サイトカインを産生するのに対して、別のアナログはＴｈ２サイトカインの産生を優先的に活性化する。本発明のヘテロクリティックアナログに関連するリンホカイン放出パターンを検討するために、ＣＴＬ系からのＴｈ２サイトカインＩＬ−１０の産生を、ＩＦＮ−γ産生と比較した。ＭＡＧＥ２．１５７エピトープを使用した代表的なデータを図７Ａおよび７Ｂに示す。
【０３１６】
図７Ａおよび７Ｂに、ＭＡＧＥ２．１５７アナログによって誘導されたリンホカインプロファイルを示す。アナログＩ５もしくはＦ５、または野生型（ＷＴ）ペプチドを間欠投与した．２２１Ａ２．１標的に対する応答においてＭＡＧＥ２．１５７特異的ＣＴＬによって産生されるＩＦＮ−γ（Ａ）およびＩＬ−１０（Ｂ）を、いくつかの異なる用量にわたって測定した。点線は、ＩＦＮ−γ（１００ｐｇ／ウェル）またはＩＬ１０（５０ｐｇ／ｍｌ）の有意レベルを示す。図７Ａに示すように、ＭＡＧＥ２．１５７のＦ５およびＩ５アナログは、野生型ペプチドよりもそれぞれ１００または１０，０００倍低い濃度でかなりのレベルのＩＦＮ−γ産生を誘導した。さらに、これらのアナログは、野生型ペプチドよりも１０または１００倍低いペプチド濃度でかなりのＩＬ−１０産生も誘導した。
【０３１７】
同じ傾向を示す別のエピトープＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５のデータを図１３Ａおよび１３Ｂに示す。アナログＰ７または野生型（ＷＴ）ペプチドに対する応答でＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５ＣＴＬから放出されるＩＦＮγ（Ａ）またはＩＬ１０（Ｂ）をいくつかの異なるペプチド用量にわたって示す。ここでも、ＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５のＰ７アナログは、野生型ペプチドよりも１００倍低いペプチド濃度でかなりのレベルのＩＦＮγ（図１３Ａ）およびＩＬ１０（図１３Ｂ）を誘導した。試験したすべてのヘテロクリティックアナログのＴｈ２サイトカイン誘導について要約したデータ（表７）も考慮すると、ほとんどのヘテロクリティックアナログは、Ｔｈ１とＴｈ２の両方のサイトカインの産生増大を刺激する。
【０３１８】
（実施例５）
ヘテロクリティックアナログのＨＬＡ−Ａ２．１結合親和性
観測されたＣＴＬ系による認識の向上が、アナログエピトープのＭＨＣ結合能が偶然増大したためではないことを確認するために、すべてのヘテロクリティックアナログのＭＨＣ結合親和性を、精製ＨＬＡ−Ａ２．１分子を利用してインビトロで測定し、調製Ｄに記載したそれらの未改変野生型対応物と比較した。
【０３１９】
表６に要約したように、３個のアナログ（ＭＡＧＥ３．１１２  Ｗ７、ＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６  Ｈ３およびＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６  Ｌ３）は、野生型ペプチドよりも４倍以上高い親和性でＨＬＡ−Ａ２．１に結合し、２個のアナログ（ＭＡＧＥ２．１５７  Ｉ５、ＭＡＧＥ２．１５７  Ｆ５）は、より低い親和性で結合した。残りの４個のヘテロクリティックアナログＭＡＧＥ３．１１２  Ｉ５、ＣＥＡ．６９１  Ｍ３、ＣＥＡ．６９１  Ｈ５およびＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５  Ｐ７は、ＨＬＡ−Ａ２．１結合能がほとんどまたはまったく変化しなかった。これらのデータをまとめると、結合性の増大とヘテロクリシティーの間には相関がないことが示唆される。
【０３２０】
（実施例６）
ヘテロクリティックアナログは、腫瘍細胞を認識可能なヒトＣＴＬをインビトロで誘導する
ＭＡＧＥ３．１１２ペプチドまたはこのエピトープの１５およびＷ７アナログに対して、調製Ｃに記載したように、ＰＢＭＣから一次ＣＴＬを誘導することによって、ＭＡＧＥ３．１１２のヘテロクリティックアナログの免疫原性も試験した。２ラウンドのインビトロでの刺激後、４８ウェル中のＰＢＭＣ培養物は、ペプチドの存在下または非存在下で．２２１−Ａ２．１ＡＰＣで刺激した後の正味のＩＦＮ−γ産生が＞１００ｐｇ／ウェルであり産生がバックグラウンドの少なくとも２倍である場合、ＣＴＬ誘導に対して正の評点が与えられた。
【０３２１】
ヒト腫瘍抗原に対する本発明者らの観測の生理学的関連性を強調するために、本発明者らは、ＭＡＧＥ３．１１２エピトープのヘテロクリティックアナログが、一次インビトロ誘導系においてヒトＣＴＬを誘導できるかどうか試験した。正常ドナーからの新しい未処置のヒトＰＢＭＣを、先に記載されたように野生型またはアナログで繰り返しインビトロで刺激した（非特許文献１４０）。ペプチド特異的ＣＴＬ応答を、野生型ペプチド（図８Ａ）またはＩ５（図８Ｂ）およびＷ７アナログ（図８Ｃ）で刺激した培養物中で検出した。手短に述べると、．２２１Ａ２．１細胞に、１０μｇ／ｍｌのＷＴペプチド（図８Ａ）、Ｉ５（図８Ｂ）アナログまたはＷ７アナログ（図８Ｃ）を終夜間欠的に投与した。４８ウェルプレートの個々のウェル中で増殖したＣＴＬによるＩＦＮ−γ産生を、ペプチドの存在下または非存在下で．２２１Ａ２．１細胞に対して試験し、あるいは内因性エピトープ陰性の８８８ｍｅｌおよび内因性エピトープ陽性の６２４ｍｅｌ腫瘍細胞系に対して試験した。陽性のペプチド特異的ＣＴＬ応答を示すウェルのみを示す。
【０３２２】
より重要なことには、これらのアナログを用いて誘導された培養物は、内因的にプロセシングされ野生型配列を提示する６２４ｍｅｌ腫瘍細胞系を認識した。これは、ヘテロクリティックアナログが、腫瘍細胞によって提示され、内因的に産生される野生型ペプチドを認識する生理学的に関連するヒトＣＴＬを誘導することができ、この現象がヒトおよびトランスジェニックマウス系の両方に関連することを示している。
【０３２３】
（実施例７）
Ｂ７スーパーファミリーＣＴＬエピトープＭＡＧＥ２．１７０のヘテロクリティックアナログの特定
ＨＬＡ−Ａ２以外のＨＬＡスーパータイプファミリーに対する本発明の適用をよりよく定義するために、Ｂ７スーパーファミリーエピトープＭＡＧＥ２．１７０（配列ＶＰＩＳＨＬＹＩＬ）（配列番号４３）のアナログを合成し、前述したＡ２スーパーファミリーエピトープの場合と類似した方法でスクリーニングした。すべての非アンカー位置における保存的／半保存的および非保存的置換からなるＭＡＧＥ２．１７０エピトープアナログの一群を、野生型エピトープに対して産生されたヒトＣＴＬ系を用いて、２つの最適以下のペプチド用量でスクリーニングした。前述したように、このスクリーニングアッセイは、野生型ペプチドよりも強いＣＴＬ応答を誘導するあらゆるヘ潜在的なテロクリティックアナログを特定するのに役立つ。
【０３２４】
図９Ａ〜９Ｂに示すように、Ｈ、Ｍ、Ｅ、ＧまたはＤ残基で７位が置換されたアナログは、０．０１μｇ／ｍｌ用量で試験すると野生型ペプチドよりも大きなＩＦＮ−γ応答を刺激した。これらの５個のアナログの刺激能力を、同じ野生型エピトープ特異的ＣＴＬ系を用いてペプチド用量滴定によってさらに分析すると、これらすべてが野生型エピトープよりも＞１０倍低い用量で同一レベルのＩＦＮ−γ産生（例えば、２００ｐｇ／ウェル）を刺激する強いヘテロクリティック活性を示し、アナログによって刺激される応答の程度は、いくつかのペプチド用量において野生型エピトープの２倍を超えた（図１０）。
【０３２５】
ＭＡＧＥ２．１７０アナログのヘテロクリティック活性が、ＭＨＣ結合活性の増減と相関するかどうかを明らかにするために、精製ＨＬＡ−Ｂ７分子に対するＨ７、Ｍ７、Ｅ７、Ｇ７およびＤ７アナログの結合親和性を、野生型エピトープと比較して決定した。表８に示す結果は、５個のＭＡＧＥ２．１７０アナログのうち４個が野生型ペプチドの２倍の範囲内の結合親和性を示し、アナログのＭＨＣ結合性とヘテロクリシティーに相関がないことを示している。第５のエピトープＭＡＧＥ２．１７０  Ｄ７は、野生型ペプチドに比べて結合性において＞１００倍の増加を示し、したがって、このアナログで認められたヘテロクリティック活性をＭＨＣ結合性の向上で説明することはできなかった。
【０３２６】
要約すると、これらの結果によれば、単一のアミノ酸置換を導入することによってＢ７スーパーファミリーエピトープからヘテロクリティックアナログを産生することができ、置換パターンは、Ａ２ヘテロクリティックエピトープと類似性および相違を示した。Ａ２ヘテロクリティックエピトープ同様、Ｂ７スーパーファミリーエピトープＭＡＧＥ２．１７０のヘテロクリティックアナログも、ペプチドの中間の奇数位置（７位）に置換を導入することによって産生させることができた。ＭＡＧＥ２．１７０エピトープの置換の性質は、ネイティブ残基と比較して保存的／半保存的（Ｙ→ＨおよびＹ→Ｍ置換）または非保存的（Ｙ→Ｅ、Ｙ→ＧおよびＹ→Ｄ置換）であった（表８）。したがって、非保存的置換がＭＡＧＥ２．１７０  ＣＴＬエピトープのヘテロクリティックアナログをもたらし得るという観察結果は、Ａ２スーパーファミリーエピトープで観察されたものと置換パターンが部分的に重複することを示している。
【０３２７】
（実施例８）
ＨＬＡ  Ｂ７スーパーファミリーメンバー上のＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフに由来するヘテロクリティックアナログの合成および分析
ヘテロクリティック置換法則をさらに有効にするために、追加の試験を、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ内の配列を有するペプチドに由来するヘテロクリティックアナログを用いて実施する。例えば、このアナログは、インビボでの免疫原性について試験されうる。
【０３２８】
この試験のため、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフを有するペプチドＡＰＲＴＬＶＹＬＬ（配列番号３６）エピトープを選択し合成する。９量体ペプチドの３、５および７位における３つの保存的／半保存的置換からなるアナログの一群を、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２／Ｋｂトランスジェニックマウスにおいて、免疫原性について試験する。この一群は、ＡＰＥＴＬＶＹＬＬ（配列番号３７）、ＡＰＲＴＷＶＹＬＬ（配列番号３８）およびＡＰＲＴＬＶＰＬＬ（配列番号３９）を含み、半保存的変化に対応するのはそれぞれ第３、第５および第７の位置である。
【０３２９】
上述のアナログで免疫されたマウスからのＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γ産生の誘導について試験する。このＩＦＮ−γ産生は、一般に、野生型ペプチド（例えば、ＡＰＲＴＬＶＹＬＬ）（配列番号３６）を用いて誘導および再刺激されたものよりもはるかに低いペプチド濃度で起こる。これらの結果は、本発明者らの予測されたヘテロクリティックアナログが、野生型ペプチド自体よりも大きな結合活性のＣＴＬを誘導することにおいて、より強力であることを示している。
【０３３０】
一般に、野生型ペプチドを用いて免疫し再刺激された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを５〜１０μｇ／ｍｌのペプチド用量で誘導するのに対し、上記アナログで免疫され、野生型ペプチドを用いてインビトロで刺激され試験された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを誘導するのに、野生型ペプチドよりも、それぞれ１０倍、１００倍、さらには１０００倍低い用量しか必要としない。
【０３３１】
Ｂ７スーパーファミリーを含む他のＨＬＡ分子に対してヘテロクリティック置換法則をさらに有効にするために、ペプチドＡＰＥＴＬＶＹＬＬ（配列番号３７）、ＡＰＲＴＷＶＹＬＬ（配列番号３８）およびＡＰＲＴＬＶＰＬＬ（配列番号３９）のインビボでの免疫原性を、以下のヒトＨＬＡ分子の１つを発現するトランスジェニックマウスにおいて試験する：Ｂ＊０７０２、Ｂ＊０７０３、Ｂ＊０７０４、Ｂ＊０７０５、Ｂ＊１５０８、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊３５０２、Ｂ＊３５０３、Ｂ＊３５０３、Ｂ＊３５０４、Ｂ＊３５０５、Ｂ＊３５０６、Ｂ＊３５０７、Ｂ＊３５０８、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５１０２、Ｂ＊５１０３、Ｂ＊５１０４、Ｂ＊５１０５、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１、Ｂ＊５５０２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊５６０２、Ｂ＊６７０１およびＢ＊７８０１。
【０３３２】
上述のアナログで免疫されたマウスからのＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γ産生の誘導について試験する。このＩＦＮ−γ産生は、一般に、野生型ペプチド（例えば、ＡＰＲＴＬＶＹＬＬ）（配列番号３６）を用いて誘導および再刺激されたものよりもはるかに低いペプチド濃度で起こる。これらの結果は、本発明者らの予測されたヘテロクリティックアナログが、野生型ペプチド自体よりも大きな結合活性のＣＴＬを誘導することにおいて、より強力であることを示している。
【０３３３】
一般に、野生型ペプチドを用いて免疫し再刺激された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを５〜１０μｇ／ｍｌのペプチド用量で誘導するのに対し、上記アナログで免疫され、野生型ペプチドを用いてインビトロで刺激され試験された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを誘導するのに、野生型ペプチドよりも、それぞれ１０倍、１００倍、さらには１０００倍低い用量しか必要としない。
【０３３４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた前駆体頻度分析
野生型ペプチドに対する交差反応性ＣＴＬが、アナログで免疫されたマウスにおいて産生されることを確認するために、アナログまたは野生型ペプチドで免疫し、インビトロでさらにＣＴＬを増殖させない脾臓からＣＤ８＋細胞を単離する。この材料から、野生型またはアナログに対して反応性であるＣＴＬの前駆体頻度をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定する。野生型ペプチドに対して反応性であるＣＴＬの前駆体頻度は、一般に、アナログの前駆体頻度よりもかなり低い。
【０３３５】
ヘテロクリティックアナログは、エピトープを認識することができるヒトＣＴＬをインビトロで誘導することができる
ヘテロクリティックアナログを、一次インビトロ誘導系におけるＣＴＬの誘導に対して分析することができる。正常ドナーからの新しい未処置のヒトＰＢＭＣを、前述した４８ウェルプレート中で野生型またはアナログを用いてインビトロで繰り返し刺激する。次いで、ペプチド特異的ＣＴＬ応答を、野生型ペプチドまたはヘテロクリティックアナログで刺激した培養物中で検出する。これらのアナログによって誘導された培養物は、内因的にプロセシングされ野生型配列を提示する標的を認識することができる。これは、ヘテロクリティックアナログが、細胞上に発現され、内因的に産生される野生型ペプチドを認識する生理学的に関連するヒトＣＴＬを誘導することができ、この現象がヒトおよびトランスジェニックマウス系の両方に関連することを示している。
【０３３６】
（実施例９）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーファミリー上のＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフに由来するヘテロクリティックアナログの合成および分析
ヘテロクリティック置換法則をさらに有効にするために、追加の試験を、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ内の配列を有するペプチドに由来するヘテロクリティックアナログを用いて実施する。例えば、このアナログは、インビボでの免疫原性について試験されうる。
【０３３７】
この試験のため、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフを有するペプチドＫＶＦＰＹＡＬＩＮＫ（配列番号３３）エピトープを選択し合成する。９量体ペプチドの３、５および７位における３つの保存的／半保存的置換からなる配列番号３３のアナログの一群の免疫原性を、ＨＬＡ−Ａ＊３１０１／Ｋｂトランスジェニックマウスにおいて試験する。この一群は、ＫＶＨＰＹＡＬＩＮＫ（配列番号４０）、ＫＶＦＰＱＡＬＩＮＫ（配列番号４１）およびＫＶＦＰＹＡＫＩＮＫ（配列番号４２）を含み、それぞれ第３、第５および第７の位置における半保存的変化に対応する。
【０３３８】
上述のアナログで免疫されたマウスからのＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γ産生の誘導に対して試験する。このＩＦＮ−γ産生は、一般に、野生型ペプチド（例えば、ＫＶＦＰＹＡＬＩＮＫ）（配列番号３３）を用いて誘導および再刺激されたものよりもはるかに低いペプチド濃度で起こる。これらの結果は、本発明者らの予測されたヘテロクリティックアナログが、野生型ペプチド自体よりも、野生型に対して大きな結合活性のＣＴＬを誘導することにおいてより強力であることを示している。
【０３３９】
一般に、野生型ペプチドを用いて免疫し再刺激された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを５〜１０μｇ／ｍｌのペプチド用量で誘導するのに対し、上記アナログで免疫され、野生型ペプチドを用いてインビトロで刺激され試験された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを誘導するのに、野生型ペプチドよりも、それぞれ１０倍、１００倍、さらには１０００倍低い用量しか必要としない。
【０３４０】
Ａ３スーパーファミリーを含む他のＨＬＡ分子に対してヘテロクリティック置換法則をさらに有効にするために、ペプチドＫＶＨＰＹＡＬＩＮＫ（配列番号４０）、ＫＶＦＰＱＡＬＩＮＫ（配列番号４１）およびＫＶＦＰＹＡＫＩＮＫ（配列番号４２）のインビボでの免疫原性を、以下のヒトＨＬＡ分子の１個を発現するトランスジェニックマウスにおいて試験する：Ａ＊０３０１、Ａ＊１１０１、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１。
【０３４１】
上述のアナログで免疫されたマウスからのＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γ産生の誘導に対して試験する。このＩＦＮ−γ産生は、一般に、野生型ペプチド（例えば、ＫＶＦＰＹＡＬＩＮＫ）（配列番号３３）を用いて誘導および再刺激されたものよりもはるかに低いペプチド濃度で起こる。これらの結果は、本発明者らの予測されたヘテロクリティックアナログが、野生型ペプチド自体よりも大きな結合活性のＣＴＬを誘導することにおいて、より強力であることを示している。
【０３４２】
一般に、野生型ペプチドを用いて免疫し再刺激された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを５〜１０μｇ／ｍｌのペプチド用量で誘導するのに対し、上記アナログで免疫され、野生型ペプチドを用いてインビトロで刺激され試験された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを誘導するのに、野生型ペプチドよりも、それぞれ１０倍、１００倍、さらには１０００倍低い用量しか必要としない。
【０３４３】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた前駆体頻度分析
野生型ペプチドに対する交差反応性ＣＴＬが、アナログで免疫されたマウスにおいて産生されることを確認するために、アナログまたは野生型ペプチドで免疫し、インビトロでさらにＣＴＬを増殖させない脾臓からＣＤ８＋細胞を単離する。この材料から、野生型またはアナログに対して反応性であるＣＴＬの前駆体頻度をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定する。野生型ペプチドに対して反応性のＣＴＬの前駆体頻度は、一般に、アナログの前駆体頻度よりもかなり低い。
【０３４４】
ヘテロクリティックアナログは、エピトープを認識することができるヒトＣＴＬをインビトロで誘導することができる
ヘテロクリティックアナログを、一次インビトロ誘導系におけるＣＴＬの誘導に対して分析することができる。正常ドナーからの新しい未処置のヒトＰＢＭＣを、前述した４８ウェルプレート中で野生型またはアナログを用いてインビトロで繰り返し刺激する。次いで、ペプチド特異的ＣＴＬ応答を、野生型ペプチドまたはヘテロクリティックアナログで刺激した培養物中で検出する。これらのアナログによって誘導された培養物は、内因的にプロセシングされ野生型配列を提示する標的を認識する。これは、ヘテロクリティックアナログが、細胞上に発現され、内因的に産生される野生型ペプチドを認識する生理学的に関連するヒトＣＴＬを誘導し、この現象がヒトおよびトランスジェニックマウス系の両方に関連することを示している。
【０３４５】
（実施例１０）
追加のヘテロクリティックアナログの特定
３個の追加のＡ２．１制限エピトープ、ＭＡＧＥ２．１５７  ＹＬＱＬＶＦＧＩＥＶ、配列番号７腫瘍エピトープ、およびウイルス抗原からの２個のエピトープＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５、ＧＬＳＲＹＶＡＲＬ（配列番号５５）およびＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６  ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号５７）を分析した。これらのエピトープのすべてが、ＣＴＬに対して免疫原性であることがこれまでに示されている。
【０３４６】
調製Ｂおよび表２に記載したアミノ酸保存割り当てを用いて、３個のエピトープの各々において３、５、７のエピトープ位置、ならびに１、４、６のエピトープ位置に５個の保存的アミノ酸置換および５個の非保存的アミノ酸置換を含む２４０個の異なるアナログの一群を合成した。これらのアナログのヘテロクリシティーを、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂｘｓトランスジェニックマウスにおいて産生されたネズミＣＴＬ系を用い、実施例１のＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２エピトープの場合に記述した戦略と類似した実験戦略に従って試験した。マウス系の作製と維持に関連した技術的容易さのために、ヒトＣＴＬ系の代わりにＨＬＡトランスジェニックマウスに由来するネズミＣＴＬ系を使用した。
【０３４７】
結果を図６（ＭＡＧＥ２．１５７）、図１１（ＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５）、および図１２ＢのＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６の対応する用量滴定プロファイルとともに図１２Ａ（ＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６）に示す。
【０３４８】
試験したＭＡＧＥ２．１５７エピトープの合計８５個の異なるアナログを分析した結果、野生型ペプチドよりも１００倍から１００，０００倍低い用量でＩＦＮ−γ応答を刺激する２個のヘテロクリティックアナログＩ５（配列番号８）およびＦ５（配列番号９）を特定した（表１）。これらのアナログはともに、ペプチドの中央の奇数位置（５位）で、本質的に保存的または半保存的である置換を有した。
【０３４９】
ＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６エピトープの場合、スクリーニングした７８個の異なるアナログのうち、２個がヘテロクリティック活性を有することが確認された（Ｈ３（配列番号５８）およびＬ３（配列番号５９））（表１）。両方のアナログは、ペプチドの中央の奇数位置に保存的または半保存的置換を有した。試験した７７個のうちＨＩＶ  Ｐｏｌ．４５５エピトープの１個のヘテロクリティックアナログが特定された。このアナログは、ペプチド（配列番号５６）の７位に保存的置換（Ｐ）を有した（表１）。追加のＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６アナログを調製し試験する（ＩＬＩＥＰＶＨＧＶ）（配列番号６７）。
【０３５０】
したがって、腫瘍およびウイルス起源の３個の追加のエピトープ（ＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６およびＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５）に対する２４０個のアナログから得られたデータは、実施例１に示すＭＡＧＥ３．１１２およびＣＥＡ．６９１エピトープの分析結果と一致した。
【０３５１】
ヘテロクリシティー分析を、２個のｐ５３エピトープについても実施した。１個のエピトープｐ５３．１４９Ｍ２、ＳＭＰＰＰＧＴＲＶ（配列番号４９）は、ＭＨＣ結合性を高めるメチオニン残基置換を有するヒトｐ５３エピトープの固定されたアンカーアナログである。第２のエピトープｐ５３  Ｍｕ．１８４、ＧＬＡＰＰＱＨＬＩＲＶ（配列番号５２）は、マウスとヒトの間で完全に保存されている配列を有する（例えば、非特許文献１５８参照）。
【０３５２】
ｐ５３．１４９Ｍ２に対して実施された用量滴定分析は、１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌ用量範囲において最適および最適以下の応答を示した。ｐ５３．１４９Ｍ２の７６個のアナログの一群（各位置における５個の保存的および５個の非保存的置換）をスクリーニングし、わずか２個のアナログＣ１（配列番号５０）およびＰ７（配列番号５１）が、両方とも、最適以下の用量において１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを放出することが明らかとなった、図１４。さらに分析すると、両方のアナログが、野生型ペプチドよりも１０倍低い濃度でかなりのＩＦＮγ産生を誘導した。また、Ｃ１アナログは、１００倍低いペプチド濃度で十分なレベルのＩＬ１０も誘導した、図１５Ａ〜１５Ｂ。
【０３５３】
ｐ５３ｍｕ．１８４エピトープの場合、ペプチドの最適および最適以下のレベルがそれぞれ５００ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌであることが用量滴定分析実施後に決定された。６３個の保存的および半保存的置換アナログの一群の免疫原性を試験した。免疫原性の高い２個のアナログ、すなわちＴ３（配列番号５３）およびＴ３，Ｅ６（配列番号５４）が見出された。図１６および図１７を参照されたい。
【０３５４】
（実施例１１）
ネズミｐ５３．２６１エピトープに対するアナログの予測および免疫原性
免疫原性をインビボで試験するために、ＨＬＡ−Ａ２．１制限ネズミｐ５３．２６１エピトープを使用した。というのは、このエピトープに対するＣＴＬ応答が、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスにおいて部分的に寛容化されていることが示されたからである。これによって、予測されたヘテロクリティックアナログがＴ細胞寛容性をインビボで打破できるかどうかの分析が可能になる。これまでヘテロクリティックアナログは、野生型エピトープに対して産生されたＣＴＬ系を用いたインビトロでのスクリーニングによって検出されたが、本発明者らは、置換法則によって特定され、野生型エピトープに対してヘテロクリティックであるアナログがインビボでＣＴＬを潜在的に誘導できると論理的に考えたが、これは寛容な腫瘍関連エピトープに対するワクチンを設計するための興味深い応用である。
【０３５５】
ＩＦＡ中のｐ５３．２６１エピトープ（ＬＬＧＲＤＳＦＥＶ）（配列番号６０）５０μｇまたはその予測アナログと、ＨＢＶコア．１２８ヘルパーエピトープ１４０μｇとでマウスを同時免疫することによって、ｐ５３．２６１予測アナログの免疫原性をＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂｘｄトランスジェニックマウスにおいて試験した。１１日後、初回抗原刺激した脾臓細胞を回収し、１０μｇ／ｍｌのペプチドを間欠的に投与した、照射をうけた同系のＬＰＳ活性化脾臓細胞とともにインビトロで培養した。培養１０日後、ＩＬ２源としてＣｏｎ  Ａ馴化培地の存在下で、ペプチドを間欠投与したＬＰＳ芽球でＣＴＬを再刺激した（非特許文献１４１）。予測アナログで免疫したマウスからの脾臓細胞を、（野生型抗原に応答するＣＴＬの交差反応性、結合活性および前駆体頻度を求めるための）野生型ペプチドと（アナログに応答するＣＴＬの結合活性および前駆体頻度を求めるための）それぞれの免疫化アナログの両方に対してインビトロで刺激した。すべての短期ＣＴＬバルク集団のペプチド特異性を、Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２．１腫瘍細胞をＡＰＣとして用いて、インビトロでの第２の再刺激から５日後にＩＦＮγ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。あるいは、免疫された動物から新たに単離した脾臓細胞について、ＥｌｉｓｐｏｔアッセイによってＣＴＬ応答を実施した。
【０３５６】
９量体ペプチドの３、５および７位の３つの保存的または半保存的置換からなる９個のｐ５３．２６１エピトープアナログの一群の免疫原性をＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂｘｄトランスジェニックマウスにおいて試験した。９個のアナログの各々でマウスを免疫化し、初回抗原刺激した脾細胞をそれぞれの免疫アナログとともにインビトロで増殖させると、インビボで誘導し、インビトロで野生型ペプチドとともに発達させたＣＴＬよりもはるかに低いペプチド濃度で１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ産生によって特徴付けられるＣＴＬ応答をする６個のアナログ（Ｌ７、Ｄ３、Ｈ７、Ｈ３、Ｎ５、Ｇ５）が特定された。
【０３５７】
ＷＴペプチドまたは示したアナログで免疫されたマウスから得た脾臓細胞を、対応する免疫ペプチド（図１８Ａ、Ｂ）またはＷＴペプチド（図１８Ｃ、Ｄ）を用いてインビトロで刺激した。次いで、これらのＣＴＬによるＩＦＮγ放出を、免疫ペプチド（図１８Ａ、Ｂ）またはＷＴペプチド（図１８Ｃ、Ｄ）を間欠的に投与した標的に対して所定用量範囲にわたって測定した。１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ放出を点線で示す。これらの結果は、かなりの割合のアナログが、野生型ペプチド自体によって誘導されるものより高い結合活性のＣＴＬを誘導することを示している。
【０３５８】
これらのヘテロクリティックアナログで初回抗原刺激されたＣＴＬの野生型ペプチドに対する交差反応性を図１８Ｃおよび図１８Ｄに示す。野生型ペプチドで免疫され再刺激された動物から得られたＣＴＬは、０．１〜１０μｇ／ｍｌのペプチド用量で１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導したが、アナログＬ７、Ｈ３およびＤ３で免疫され、野生型ペプチドを用いてインビトロで刺激され試験された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを誘導するのに、野生型ペプチドよりも、それぞれ１０倍、１００倍または１０００倍低い用量しか必要としない（図１８Ｃ）。これは、６つのケースのうち３つで、野生型抗原に対する部分的なＣＴＬ寛容性が存在する場合に、予測されたヘテロクリティックアナログが、野生型ペプチドに対して反応性であるＣＴＬを誘導するのに１０〜１０００倍活性／効力が大きいことを示唆している。
【０３５９】
（実施例１２）
野生型との交差反応性
Ｄ３およびＨ３アナログによって誘導されたＣＴＬの交差反応性も、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂを形質移入したｐ５３を発現するＭｅｔｈ  Ａ腫瘍細胞クローンによって自然にプロセシングされた野生型エピトープに対して試験した。野生型エピトープのヘテロクリティックであるｐ５３．２６１アナログによって産生されたＣＴＬは、Ｍｅｔｈ  Ａ／Ａ２．１Ｋｂ腫瘍細胞によって提示される内因的にプロセシングされたｐ５３．２６１エピトープに応答することが見出された。
【０３６０】
ＣＴＬ集団（１０５個／ウェル）を、２．５×１０４個のＭｅｔｈ  Ａ腫瘍細胞またはＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂを形質移入したＭｅｔｈ  Ａクローンとともに培養して、ＩＦＮγ放出をｉｎ  ｓｉｔｕ  ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図１９に示すように、ｐ５３．２６１エピトープのＤ３とＨ３の両方のアナログに対して生成されたＣＴＬ系は、Ｍｅｔｈ  Ａ／Ａ２．１Ｋｂ腫瘍細胞クローンによって発現される内因性エピトープに応答するが、親のＨＬＡ−Ａ２．１陰性Ｍｅｔｈ  Ａ腫瘍細胞系には応答しない。
【０３６１】
（実施例１３）
Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによる前駆体頻度分析
野生型ペプチドに対する交差反応性ＣＴＬが、アナログで免疫されたマウスにおいて産生されることを確認するために、アナログまたは野生型ペプチドで免疫し、インビトロでさらにＣＴＬを発達させないマウスの脾臓細胞からＣＤ８＋細胞を単離し、野生型またはアナログに対して反応性であるＣＴＬの前駆体頻度をＥｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて決定した。
【０３６２】
ＷＴペプチド、またはＤ３、Ｈ３、Ｌ７およびＨ７アナログで免疫されたマウスから単離されたＣＤ８＋細胞が、ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてＷＴペプチドで刺激したときにＩＦＮγを放出するかどうか分析した。図２０は、野生型ペプチドで免疫されたマウスにおける野生型ペプチド反応性ＣＴＬの前駆体頻度は１／６６，０００（１５スポット／１０６）であったが、予測アナログで免疫されたマウスにおける野生型ペプチド反応性細胞の前駆体頻度はアナログＤ３、Ｈ３およびＬ７では約１／１５，０００（６０〜７５スポット／１０６細胞）であり、アナログＨ７では１／８３，０００（１２スポット／１０６）であったことを示している。これは、野生型反応性細胞が、４個のアナログのうち３個で免疫されたマウスにおいて、ネイティブペプチドで免疫されたマウスの４倍高い頻度で現れることを示している。この知見は重要である。というのは、これは、インビボで初回抗原刺激されたＣＴＬのインビトロでの発達が回避されるより直接的なアッセイシステムを用いて、ヘテロクリティックアナログによるインビボでの免疫化が、野生型ペプチドに対して反応性であるより多数のＣＴＬを実際に誘導することを意味するからである。
【０３６３】
（実施例１４）
ＨＬＡ  Ａ２スーパーファミリーメンバー上のＨＬＡ−Ａ２．１スーパーモチーフに由来するヘテロクリティックアナログの合成および分析
Ａ２スーパーファミリー内の他のＨＬＡ分子に対してヘテロクリティック置換法則をさらに有効にするために、３、５および７位における３つの保存的／半保存的置換からなる上述した９個のｐ５３．２６１エピトープアナログの一群の免疫原性を、以下のヒトＨＬＡ分子の１つを発現するトランスジェニックマウスにおいてインビボで試験する：Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊０２０９、Ａ＊０２１４、Ａ＊６８０２およびＡ＊６９０１。
【０３６４】
上述のアナログで免疫されたマウスからのＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ産生の誘導について試験する。このＩＦＮγ産生は、一般に、野生型ペプチド（例えば、ｐ５３．２６１エピトープ）を用いて誘導され刺激されたものよりもはるかに低いペプチド濃度で起こる。これらの結果は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログが、野生型ペプチド自体よりも、ネイティブ野生型エピトープに対して高い結合活性のＣＴＬを誘導することにおいて強力であることを示している。
【０３６５】
一般に、野生型ペプチドで免疫され再刺激された動物から得られるＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌのペプチド用量で１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するのに対し、上記アナログで免疫され、野生型ペプチドを用いてインビトロで刺激され試験された動物から得られるＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮ−γを誘導するのに、野生型ペプチドよりも、それぞれ１０倍、１００倍、さらには１０００倍低い用量しか必要としない。
【０３６６】
本明細書に記載する実施例および実施形態は説明のためにのみあり、それらに照らして様々な改変形態または変更形態が当業者に示唆され、それらは本願の精神および範囲、ならびに添付した特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。本明細書に引用するすべての刊行物、特許および特許出願を参照によりそれらの全体を本明細書に援用する。
【０３６７】
【表１−１】
2005522212.tif 000002
【０３６８】
【表１−２】
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【０３６９】
【表２−１】
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【０３７０】
【表２−２】
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【０３７１】
【表３】
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【０３７２】
【表４】
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【０３７３】
【表５】
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【０３７４】
【表６】
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【０３７５】
【表７】
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【０３７６】
【表８】
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【０３７７】
【表９】
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【０３７８】
【表１０】
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【０３７９】
【表１１】
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【０３８０】
【表１２−１】
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【０３８１】
【表１２−２】
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【０３８２】
【表１３】
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【０３８３】
【表１４】
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【０３８４】
【表１５】
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【０３８５】
【表１６】
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【０３８６】
【表１７】
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【０３８７】
【表１８】
2005522212.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【０３８８】
【図１Ａ】ＣＥＡ．６９１アナログの一群を、対応するＣＴＬによってＩＦＮ−γ産生を誘導することができるかどうか試験した結果のグラフである。
【図１Ｂ】ＭＡＧＥ３．１１２アナログの一群を、対応するＣＴＬによってＩＦＮ−γ産生を誘導することができるかどうか試験した結果のグラフである。
【図１Ｃ】ＣＥＡ．６９１ヘテロクリティックアナログの対応する用量反応曲線である。
【図１Ｄ】ＭＡＧＥ３．１１２ヘテロクリティックアナログの対応する用量反応曲線である。
【図２Ａ】ＣＥＡ．６１エピトープアナログの一群の一次スクリーニング結果を示すグラフである。Ｐ４、Ｗ４、Ｉ４およびＫ１アナログは、野生型ペプチドよりも刺激活性が高いことを示している。
【図２Ｂ】２つのＣＴＬ系を刺激するアナログの能力を示すグラフである。ドナーｘ６６２中で産生される２つのＣＴＬ系をさらに試験すると、Ｐ４アナログのみが、野生型ペプチドに比べて＞１０倍低いペプチド用量で同等のＩＦＮ−γ産生を刺激した。
【図２Ｃ】２つのＣＴＬ系を刺激するアナログの能力を示すグラフである。ドナーｘ６６２中で産生される２つのＣＴＬ系をさらに試験すると、Ｐ４アナログのみが、野生型ペプチドに比べて＞１０倍低いペプチド用量で同等のＩＦＮ−γ産生を刺激した。
【図３Ａ】ＣＥＡ．６１エピトープアナログの一群の一次スクリーニング結果を示すグラフである。Ｙ３、Ｌ７、Ｍ７、Ｉ７、Ｄ７、Ｇ７、Ｃ７、Ｙ７およびＮ７アナログは、野生型ペプチドよりも刺激活性が高いことを示している。
【図３Ｂ】アナログのＣＴＬ刺激能力を示すグラフである。さらに試験すると、Ｌ７、Ｍ７、Ｉ７、Ｄ７、Ｇ７およびＣ７アナログは、野生型ペプチドに比べて＞１０倍低いペプチド用量で同等のＩＦＮ−γ産生を刺激した。
【図４Ａ】ＭＡＧＥ２．１５６エピトープアナログの一群の一次スクリーニング結果を示すグラフである。Ｔ１、Ｙ１、Ｉ３、Ｅ４およびＬ４アナログは、野生型ペプチドよりも刺激活性が高いことを示している。
【図４Ｂ】アナログのＣＴＬ刺激能力を示すグラフである。これらのアナログをさらに試験すると、Ｉ３およびＥ４アナログが、野生型ペプチドに比べて＞１０倍低いペプチド用量で同等のＩＦＮ−γ産生を刺激した。
【図５Ａ】ＭＡＧＥ２．１５６エピトープアナログの一群の一次スクリーニング結果を示すグラフである。Ｉ３、Ｌ４、Ｌ６およびＭ６アナログは、野生型ペプチドよりも刺激活性が高いことを示している。
【図５Ｂ】アナログのＣＴＬ刺激能力を示すグラフである。これらのアナログを２つのＣＴＬ系についてさらに試験すると、Ｌ４、Ｌ６およびＭ６アナログが、野生型ペプチドに比べて＞１０倍低いペプチド用量で同等のＩＦＮ−γ産生を刺激した。
【図５Ｃ】アナログのＣＴＬ刺激能力を示すグラフである。これらのアナログを２つのＣＴＬ系についてさらに試験すると、Ｌ４、Ｌ６およびＭ６アナログが、野生型ペプチドに比べて＞１０倍低いペプチド用量で同等のＩＦＮ−γ産生を刺激した。
【図６】ＭＡＧＥ２．１５７エピトープアナログの一群の一次スクリーニング結果を示すグラフである。Ｉ５およびＦ５アナログは、野生型ペプチドよりも刺激活性が高いことを示している。
【図７Ａ】適切なＣＴＬからＩＦＮγ産生またはＩＬ−１０産生を誘導する能力に関して、野生型と比較したＭＡＧＥ２．１５７ヘテロクリティックアナログの用量反応曲線である。
【図７Ｂ】適切なＣＴＬからＩＦＮγ産生またはＩＬ−１０産生を誘導する能力に関して、野生型と比較したＭＡＧＥ２．１５７ヘテロクリティックアナログの用量反応曲線である。
【図８Ａ】ＭＡＧＥ３．１１２の様々なヘテロクリティックアナログを用いた内因性ペプチドに対するＣＴＬ活性刺激の結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】ＭＡＧＥ３．１１２の様々なヘテロクリティックアナログを用いた内因性ペプチドに対するＣＴＬ活性刺激の結果を示すグラフである。
【図８Ｃ】ＭＡＧＥ３．１１２の様々なヘテロクリティックアナログを用いた内因性ペプチドに対するＣＴＬ活性刺激の結果を示すグラフである。
【図９Ａ】適切なＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生に関して、エピトープＭＡＧＥ２．１７０の潜在的ヘテロクリティックアナログの一群を試験した結果を示すグラフである。
【図９Ｂ】適切なＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生に関して、エピトープＭＡＧＥ２．１７０の潜在的ヘテロクリティックアナログの一群を試験した結果を示すグラフである。
【図１０】ＩＦＮ−γを誘導する能力に関して、野生型と比較したＭＡＧＥ２．１７０のヘテロクリティックアナログの用量反応曲線である。
【図１１】対応するＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ産生の誘導能力に関して、ＨＢＶＰｏｌ．４５５エピトープアナログのアナログの一群を試験した結果を示すグラフである。
【図１２Ａ】対応するＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ産生の誘導能力に関して、ＨＩＶＰｏｌ．４７６エピトープアナログのアナログの一群を試験した結果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】結果の良好なＨＩＶＰｏｌ．４７６アナログに対する用量反応曲線を示すグラフである。
【図１３Ａ】適切なＣＴＬにおいてＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０を産生するＨＢＶＰｏｌ．４５５の野生型およびヘテロクリティックアナログに対する用量反応曲線である。
【図１３Ｂ】適切なＣＴＬにおいてＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０を産生するＨＢＶＰｏｌ．４５５の野生型およびヘテロクリティックアナログに対する用量反応曲線である。
【図１４】適切なＣＴＬからのＩＦＮ−γ産生に関して、エピトープｐ５３．１４９Ｍ２の潜在的ヘテロクリティックアナログの一群を試験した結果を示すグラフである。
【図１５Ａ】結果の良好なｐ５３．１４９Ｍ２のヘテロクリティックアナログによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０産生に対する用量反応曲線を示すグラフである。
【図１５Ｂ】結果の良好なｐ５３．１４９Ｍ２のヘテロクリティックアナログによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０産生に対する用量反応曲線を示すグラフである。
【図１６】ＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ産生に関して、ｐ５３．Ｍｕ１８４エピトープの潜在的アナログの一群を試験した結果を示すグラフである。
【図１７】ＩＦＮ−γ産生に関して、ｐ５３．Ｍｕ１８４の野生型と結果の良好な２つのヘテロクリティックアナログの用量反応曲線を示すグラフである。
【図１８Ａ】対応する野生型エピトープに関して、ヘテロクリティックアナログの交差反応性を示すグラフである。ＩＦＮ−γ産生量を、刺激に用いた免疫ペプチド濃度の関数としてプロットした。
【図１８Ｂ】対応する野生型エピトープに関して、ヘテロクリティックアナログの交差反応性を示すグラフである。ＩＦＮ−γ産生量を、刺激に用いた免疫ペプチド濃度の関数としてプロットした。
【図１８Ｃ】対応する野生型エピトープに関して、ヘテロクリティックアナログの交差反応性を示すグラフである。初期のＣＴＬ誘導に使用したヘテロクリティックアナログに対して、野生型エピトープを刺激薬として用いたときの対応する結果を示す。
【図１８Ｄ】対応する野生型エピトープに関して、ヘテロクリティックアナログの交差反応性を示すグラフである。初期のＣＴＬ誘導に使用したヘテロクリティックアナログに対して、野生型エピトープを刺激薬として用いたときの対応する結果を示す。
【図１９】ｐ５３．２６１およびそのヘテロクリティックアナログによる刺激に対して放出されるＩＦＮ−γ量を示すグラフである。
【図２０】様々なｐ５３．２６１ヘテロクリティックアナログに対するＥＬＩＳＰＯＴ結果を示すグラフである。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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