(57)【要約】本発明は、１種又は複数の野生型ＦＰＶ遺伝子に改変を有する鶏痘ウイルスゲノムに関する。本発明はまた、かかるゲノムを含むウイルス粒子及び目的とするヌクレオチド（ＮＯＩ）を標的細胞に送達するためのその使用に関する。本発明はまた、ワクチン接種法、詳しくは、疾病を治療及び／又は予防するために、初回抗原刺激組成物（第１の非複製ウイルスベクターを含む）と追加免疫組成物（第２の非複製ウイルスベクターを含む）とを患者に投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法であって、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含み、少なくとも１つの組成物が、鶏痘ウイルスから誘導可能なポックスウイルスベクターを含む方法。
【請求項２】
被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法であって、
（ｉ）ＤＮＡワクチンを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを、
被験体に投与するステップを含み、少なくとも１つの組成物が、鶏痘ウイルスから誘導可能なポックスウイルスベクターを含む方法。
【請求項３】
被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法であって、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第３の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを、
被験体に投与するステップを含み、少なくとも１つの組成物が、鶏痘ウイルスから誘導可能なポックスウイルスベクターを含む方法。
【請求項４】
少なくとも１種のベクターがＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記非複製ウイルスベクターの各々がポックスウイルスベクターを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２種のポックスウイルスベクターが異なる属のポックスウイルスから誘導可能である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１種のポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスから誘導可能であり、少なくとも１種のポックスウイルスベクターがオルトポックスウイルスから誘導可能である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ベクターのうちの１種が、以下から選択される鶏痘ウイルスゲノムを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法：
（ｉ）１種又は複数の以下の野生型ＦＰＶ遺伝子の改変型を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７、ＦＰＶ０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０、
（ｉｉ）１種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２２、
（ｉｉｉ）１種又は複数の以下の遺伝子が欠損している、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、  ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０、
（ｉｖ）１種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ２０７、
（ｖ）１種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ２３９、
（ｖｉ）遺伝子ＦＰＶ０９７及びＦＰＶ０９８の融合によって（欠失によって）生じるキメラ遺伝子を有する、鶏痘ウイルスゲノム、
（ｖｉｉ）大きさが２７５ｋｂｐ未満である鶏痘ウイルスゲノム、
（ｖｉｉｉ）配列番号１に示される配列を含む、鶏痘ウイルスゲノム、
（ｉｘ）ＯＲＦ１からＡＣＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣが欠失している配列番号１に示される配列を含む、鶏痘ウイルスゲノム。
【請求項９】
鶏痘ウイルスゲノムがＮＯＩも含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＯＩがポックスウイルスプロモーターの制御下にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＯＩが、ネズミマラリア原虫（Ｐ．  ｂｅｒｇｈｅｉ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．シノモルギ（ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．  ｖｉｖａｘ）、結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）又はＴ．パルバ（ｐａｒｖａ）由来の抗原をコードする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
アビポックスウイルスから誘導可能なウイルスベクターを含む組成物を、追加免疫組成物として投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
アビポックスウイルスから誘導可能なウイルスベクターを含む組成物を、初回抗原刺激組成物として投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
被験体が霊長類である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
被験体がヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
動物用ワクチンにおける、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用。
【請求項１７】
前記動物が哺乳類である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記哺乳類が霊長類である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記霊長類がヒトである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
医薬における、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用。
【請求項２１】
被験体において免疫応答を生起する方法であって、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を、前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項２２】
被験体において既存の免疫応答に追加免疫する方法であって、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を、前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項２３】
１種又は複数の以下の野生型ＦＰＶ遺伝子の改変型を有する、鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７、ＦＰＶ０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。
【請求項２４】
１種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を有する、請求項２３に記載の鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２２。
【請求項２５】
１種又は複数の以下の遺伝子を欠失している、請求項２３又は２４に記載の鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。
【請求項２６】
１種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を有する、請求項１から２５のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ２０７。
【請求項２７】
１種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を有する、請求項１から２６のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ２３９。
【請求項２８】
遺伝子ＦＰＶ０９７及びＦＰＶ０９８の融合によって（欠失によって）生じるキメラ遺伝子を有する、請求項１から２７のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム。
【請求項２９】
大きさが２７５ｋｂｐ未満である、鶏痘ウイルスゲノム。
【請求項３０】
配列番号１に示される配列を含む、請求項１から２９のいずれかに記載の鶏痘ウイルスゲノム。
【請求項３１】
ＮＯＩも含む、請求項１から３０のいずれかに記載のゲノム。
【請求項３２】
ＮＯＩがポックスウイルスプロモーターの制御下にある、請求項３１に記載のゲノム。
【請求項３３】
ＮＯＩが、ネズミマラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、Ｐ．シノモルギ、三日熱マラリア原虫、結核菌又はＴ．パルバ由来の抗原をコードする、請求項３１又は３２に記載のゲノム。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれかに記載のゲノムを含むウイルス粒子。
【請求項３５】
請求項３１から３３のいずれかに記載のゲノムを含み、ＮＯＩを標的細胞へ送達可能なウイルス粒子。
【請求項３６】
請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子を含むワクチン。
【請求項３７】
請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子を含む、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤。
【請求項３８】
（ｉ）請求項３４又は３５に記載の鶏痘ウイルス粒子を含む第１の組成物と、
（ｉｉ）同時、個別又は逐次投与するための第２の組成物
とを含むワクチン接種キット。
【請求項３９】
（ｉ）請求項３４又は３５に記載の鶏痘ウイルス粒子を含む初回抗原刺激組成物と、
（ｉｉ）ワクシニアウイルス粒子を含む追加免疫組成物
とを含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
霊長類にいずれかの順序で逐次投与するための、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含む、ワクチン接種キット。
【請求項４１】
（ｉ）第１の非複製ポックスウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ポックスウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含む、請求項４０に記載のワクチン接種キット。
【請求項４２】
第１の非複製ポックルウイルスベクターがアビポックスウイルスベクターであり、第２の非複製ポックルウイルスベクターがオルトポックスウイルスベクターである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
第１の非複製ポックスウイルスベクターが鶏痘ウイルスベクターである、請求項４１又は４２に記載のキット。
【請求項４４】
第１の非複製ポックスウイルスベクターが請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子であるか、又はそれから誘導可能である、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
第１及び第２の組成物が同一抗原を発現可能である、請求項３８から４４のいずれかに記載のキット。
【請求項４６】
霊長類被験体において既存の免疫応答を追加免疫可能な非複製ウイルスベクターを含む追加免疫組成物。
【請求項４７】
鶏痘ウイルスベクターを含む、請求項４６に記載の追加免疫組成物。
【請求項４８】
請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子であるか、又はそれから誘導可能である、請求項４７に記載の追加免疫組成物。
【請求項４９】
被験体に、請求項３６に記載のワクチン、請求項３７、４６、４７又は４８のいずれかに記載の初回抗原刺激若しくは追加免疫組成物又は請求項３８から４５のいずれかに記載のキットを投与するステップを含む、ワクチン接種法。
【請求項５０】
請求項３６に記載のワクチン、請求項３７、４６、４７又は４８のいずれかに記載の初回抗原刺激若しくは追加免疫組成物又は請求項３８から４５のいずれかに記載のキットの、被験体において疾病を治療及び／又は予防するための医薬の製造における使用。
【請求項５１】
被験体においてＴ細胞免疫応答を生起する、請求項４９に記載の方法、又は請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
疾病が、マラリア、結核又は東海岸熱（Ｅａｓｔ  Ｃｏａｓｔ  Ｆｅｖｅｒ）などの慢性感染であるか、又はそれに起因するものである、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法又は使用。
【請求項５３】
非培養ＣＥＦ細胞の、アビポックスウイルスを増殖させるための使用。
【請求項５４】
アビポックスウイルスが鶏痘ウイルスである、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
ポックスウイルスが請求項３４又は３５に記載のウイルス粒子である、請求項５４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポックスウイルスに関する。詳しくは、本発明は、１種又は複数の野生型ＦＰＶ遺伝子に改変を有する、鶏痘ウイルスゲノム、かかるゲノムを含むウイルス粒子、及び目的とするヌクレオチド（「ＮＯＩ」）を標的細胞に送達するためのその使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、ウイルスベクターを用いるワクチン接種法、詳しくは、２種の異なる非複製ウイルスベクター組成物を用いる異種プライム−ブーストワクチン接種レジメンに関する。
【背景技術】
【０００３】
ポックスウイルス
ポックスウイルスは、これまで外来タンパク質の異種発現用組換えベクターとして利用されてきた。詳しくは、組換えワクシニアウイルスが、哺乳類細胞において遺伝子を一過的に発現させるためのツール及び実験用組換えワクチンベクターとして研究されている（Ｍｏｓｓ、１９９１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３、１１３４１〜８頁及びＭｏｓｓ、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３、１１３４１〜８頁に概説されている）。
【０００４】
その他のポックスウイルスと共通して、ワクシニアウイルスは細胞の細胞質内に存在し、そこでウイルス複製に必要なタンパク質を発現する。したがって、組換えワクシニアは、外来抗原を哺乳類細胞の細胞質に送達することができ、それによって、抗原処理経路への直接アクセスが可能となり、この結果、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子と関連して、細胞表面に抗原由来ペプチドが提示される（Ｍｏｓｓ、１９９１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３、１１３４１〜８頁）。この性質のためにワクシニアは、特に、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を刺激するための組換えワクチンとして有用である。
【０００５】
ワクシニアウイルスの、哺乳類細胞において複製する能力に関して懸念があるため、その臨床使用は制限されており、より安全な代替物が探索されることとなった。これらとしては、ヒト細胞における複製が制限された（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１９９８、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９、１１５９〜６７頁）、弱毒ワクシニアウイルス、例えば、改変ワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）（Ｍｅｙｅｒら、１９９１、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２、１０３１〜８頁、Ｓｕｔｔｅｒ及びＭｏｓｓ、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９、１０８４７〜５１頁、Ｓｕｔｔｅｒら、１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２、１０３２〜４０頁）、哺乳類細胞では増殖しない（Ｓｏｍｏｇｙｉら、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９７、４３９〜４４頁）、アビポックスウイルス、例えば、鶏痘が挙げられる。
【０００６】
トリでは稀に致死性となる、増殖性皮膚病変を引き起こす野生型鶏痘ウイルスは、家畜産業では、商業上の懸念事項である。鶏痘ウイルスに対する弱毒生ワクチンが、トリ細胞でウイルスを複数回継代することによって得られている。家畜病原由来の抗原を発現するこのような弱毒鶏痘ウイルスが、トリに使用するための組換えワクチンとして広く利用されてきた（Ｂｏｙｌｅ及びＨｅｉｎｅ、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７１、３９１〜７頁、Ｐａｏｌｅｔｔｉ、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３、１１３４９〜５３頁に概説されている）。実際、米国では、獣医学で使用するための、ニューカッスル病ウイルス由来の抗原を発現する２種の組換え鶏痘ウイルスが市販されている（Ｐａｏｌｅｔｔｉ、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３、１１３４９〜５３頁）。
【０００７】
アビポックスウイルスは、哺乳類細胞において抗原を発現でき、哺乳類病原に対する保護的免疫応答を誘導できるという知見（Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｏｌｅｔｔｉ、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ  ６、４６６〜８頁、Ｔａｙｌｏｒら、１９９８ａ、Ｖａｃｃｉｎｅ  ６、５０４〜８、Ｔａｙｌｏｒら、１９８８ｂ、Ｖａｃｃｉｎｅ  ６、４９７〜５０３頁）から、哺乳類において使用するワクチンとして、組換え鶏痘ウイルスが開発されることとなった。最も重要なことに、ＨＩＶ由来抗原を発現する組換え鶏痘が、非ヒト霊長類においてワクチンとして効果を発揮している（Ｄａｌｅら、２０００、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ  ２９、２４０〜７頁、Ｋｅｎｔら、１９８８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２、１０１８０〜８頁、Ｋｅｎｔら、２０００、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８、２２５０〜６頁）。さらに、腫瘍関連抗原をコードする組換え鶏痘ワクチンが、動物において評価されており（Ｇｒｏｓｅｎｂａｃｈら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１、４４９７〜５０５頁、Ｉｒｖｉｎｅら、１９９７、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８９、１５９５〜６０１頁、Ｗａｎｇら、１９９５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４、４６８５〜９２頁）、現在ヒト臨床試験を受けている。
【０００８】
大部分の弱毒鶏痘ワクチン株は、そのゲノム組成及び正確な配列の点では十分に定義されていない。実際、いくつかのゲノムは、最近、トリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ）のプロウイルスの感染コピーを保持していることがわかり（Ｈｅｒｔｉｇら、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５、３６７〜７６頁）、これによって組換えベクターとしてのその使用が制限されることもある。
【０００９】
ポックスウイルス由来ベクターのゲノムの大きさには上限がある。ワクシニアに関しては、効率的にパッケージングされ、送達され得る異種配列の最大の大きさは、ゲノムの大きさの１０％であると考えられている。
【００１０】
したがって、哺乳類細胞において複製する能力を欠くが、より特性決定され、Ｔ細胞免疫応答の生起の点でより良好であり、異種ＤＮＡに適応し、送達する能力が改善され、且つ／又は既知の弱毒鶏痘ワクチン株よりも安全性が改善された、改良ベクター系が必要である。
【００１１】
ワクチン接種法
被験体において、疾病を予防及び／又は治療するために免疫応答を刺激するには、当技術分野で公知の多数の方法がある。ワクチンとして用いられる抗原性製剤の例を以下の表（表１）に示す。
【００１２】
【表１】
2005517639.tif 000002
【００１３】
その他の種類の抗原をベースとしない免疫化もあり、これには、受動的免疫化（抗体の直接投与）及び非特異的免疫化（サイトカイン又はサイトカイン阻害剤の投与によるなど）が挙げられる。
【００１４】
これらのアプローチの多くに関する問題は、免疫応答が経時的に弱くなり、その結果、例えば、感染を制御又は根絶するにはもはや有効でなくなることである。
【００１５】
ワクチンが、疾病に対して正しい種類の免疫応答を誘導することが重要である。多数の既知のワクチンは、抗体を作製するのに有用であるが、大きな細胞媒介性免疫応答は誘導しない。いくつかの疾病は、Ｔ細胞免疫応答による予防及び／又は治療に対して特に感受性がある。例えば、細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルス感染から保護するか、それを排除するのに役立ち得る。また、結核、マラリア及びＨ．ピロリ（ｐｙｌｏｒｉ）感染などの疾病の場合には、ＩＦＮγを分泌し得るＣＤ４＋Ｔ細胞の保護的役割に関する証拠がある。
【００１６】
既知のウイルスワクチン接種法では、いくつかの合併症及び副作用を伴うこともある。例えば、天然痘ワクチン接種は、汎発性痘疹、種痘性湿疹、進行性種痘疹並びに神経系及び心臓系の合併症を引き起こすことがある（Ｆｅｅｒｙ（１９７７）Ｍｅｄ  Ｊ．Ａｕｓｔ  ６  １８０〜１８３頁、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら（１９７５）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ５５  ３４２〜７頁）。
【００１７】
したがって、改良ワクチン接種法、特に、最小の副作用しか引き起こさない、免疫系のＴ細胞部門を刺激又は追加免疫可能なものが必要である。
【００１８】
【特許文献１】ＷＯ０２／０６８６５４
【非特許文献１】Ｍｏｓｓ、１９９１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３、１１３４１〜８頁
【非特許文献２】Ｍｏｓｓ、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３、１１３４１〜８頁
【非特許文献３】Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１９９８、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９、１１５９〜６７頁
【非特許文献４】Ｍｅｙｅｒら、１９９１、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２、１０３１〜８頁
【非特許文献５】Ｓｕｔｔｅｒ及びＭｏｓｓ、１９９２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９、１０８４７〜５１頁
【非特許文献６】Ｓｕｔｔｅｒら、１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２、１０３２〜４０頁
【非特許文献７】Ｓｏｍｏｇｙｉら、１９９３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９７、４３９〜４４頁
【非特許文献８】Ｂｏｙｌｅ及びＨｅｉｎｅ、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７１、３９１〜７頁
【非特許文献９】Ｐａｏｌｅｔｔｉ、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３、１１３４９〜５３頁
【非特許文献１０】Ｔａｙｌｏｒ及びＰａｏｌｅｔｔｉ、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ  ６、４６６〜８頁
【非特許文献１１】Ｔａｙｌｏｒら、１９９８ａ、Ｖａｃｃｉｎｅ  ６、５０４〜８頁
【非特許文献１２】Ｔａｙｌｏｒら、１９８８ｂ、Ｖａｃｃｉｎｅ  ６、４９７〜５０３頁
【非特許文献１３】Ｄａｌｅら、２０００、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ  ２９、２４０〜７頁
【非特許文献１４】Ｋｅｎｔら、１９８８、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２、１０１８０〜８頁
【非特許文献１５】Ｋｅｎｔら、２０００、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８、２２５０〜６頁
【非特許文献１６】Ｇｒｏｓｅｎｂａｃｈら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１、４４９７〜５０５頁
【非特許文献１７】Ｉｒｖｉｎｅら、１９９７、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８９、１５９５〜６０１頁
【非特許文献１８】Ｗａｎｇら、１９９５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５４、４６８５〜９２頁
【非特許文献１９】Ｈｅｒｔｉｇら、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５、３６７〜７６頁
【非特許文献２０】Ｆｅｅｒｙ（１９７７）Ｍｅｄ  Ｊ．Ａｕｓｔ  ６  １８０〜１８３頁
【非特許文献２１】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら（１９７５）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ５５  ３４２〜７頁
【非特許文献２２】Ｃｏｕｐａｒら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７９  １５９〜１６７頁
【非特許文献２３】Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７４  ３８１５〜３８３１頁
【非特許文献２４】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（４）３９７〜４０２頁
【非特許文献２５】Ｋｅｎｔら（１９９８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ７２（１２）１０１８０〜８頁
【非特許文献２６】Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（５）：５２６〜５３４頁
【非特許文献２７】Ｋｅｓｔｌｅｒら  １９９９  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０（１０）；１６１９〜３２頁
【非特許文献２８】Ｃｏｆｆｉｎら（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」１９９７  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ編：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  ７５８〜７６３頁
【非特許文献２９】Ｍｕｒｐｈｙら（１９９５）Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｖｉｅｎｎａ  ７９〜８７頁
【非特許文献３０】Ｂｏｙｌｅら（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４２：７３７〜７４８頁
【非特許文献３１】Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４（８）３８１５〜３８３１頁
【非特許文献３２】Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７
【非特許文献３３】Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  ｉｂｉｄ−第１８章
【非特許文献３４】Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．．Ｂｉｏｌ．、４０３〜４１０頁
【非特許文献３５】Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  ｉｂｉｄ、７−５８〜７−６０頁
【非特許文献３６】ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７〜５０頁
【非特許文献３７】ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７〜８頁
【非特許文献３８】ｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
【非特許文献３９】Ｐｏｌｌｉｔｔら（１９９８）１７：５〜９頁
【非特許文献４０】Ｌａｉｄｌａｗら  １９９８  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２  ６７４２頁
【非特許文献４１】Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｙら（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５７：６９〜９１頁
【非特許文献４２】「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（１９９７  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ編  ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  ４４４頁
【非特許文献４３】Ｄａｒｊｉ  Ａら  １９９７  Ｃｅｌｌ  ９１：７６５〜７７５頁
【非特許文献４４】Ｓｔｏｕｔｅ  Ｊ  Ａら  １９９７  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２６：８６９１頁
【非特許文献４５】Ｍａｙｒ及びＭａｌｉｃｋｉ（１９６６）Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄ  １３  １〜３頁
【非特許文献４６】Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、１９９０ａ、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７１、６２１〜８頁
【非特許文献４７】Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、１９９０ｂ、Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２３、３０５〜１６頁
【非特許文献４８】Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９８９、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７０、１４５〜５４頁
【非特許文献４９】Ｑｕｉｎｇｚｈｏｎｇら、１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２、５６９〜７３頁
【非特許文献５０】Ｐｌｅｂａｎｓｋｉら、１９９８、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８、４３４５〜５５頁
【非特許文献５１】Ｒｏｂｓｏｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３５、７９〜８２頁
【非特許文献５２】Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９９７  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５、１２８０〜４頁
【非特許文献５３】Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ、印刷中
【非特許文献５４】非公開の知見、Ｅｒｉｃ  Ｇ．Ｓｈｅｕ
【非特許文献５５】Ｂｒｏｏｋｓら、２００１  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９、２７１４〜７頁
【非特許文献５６】Ｔａｎｇｈｅら、２００１  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９、３０４１〜７頁
【非特許文献５７】Ａｆｏｎｓｏら、（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３８１５〜３８３１頁
【発明の開示】
【００１９】
本発明者らは、弱毒鶏痘ウイルス株（ＦＰ９）の全ゲノム配列を得た。
【００２０】
ＦＰ９は、野生型鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）に存在するいくつかの遺伝子を欠く（又はこれらに改変を有する）。ＦＰ９のゲノムは２６６ｋｂｐであり、これまでにベクター系として記載されているＦＰＶ−Ｍ、鶏痘ワクチン株のゲノムよりも小さい（Ｃｏｕｐａｒら（１９９０）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７９  １５９〜１６７頁）。本発明者らは、ＦＰ９は、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を生起するその能力がＦＰＶ−Ｍよりも優れていることを示した。
【００２１】
したがって、本発明は、１種又は複数の以下の野生型ＦＰＶ遺伝子（Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７４  ３８１５〜３８３１頁による遺伝子命名法）の改変型を含む弱毒鶏痘ウイルスゲノムを提供する：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７／０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。
【００２２】
本発明はまた、１種又は複数の前記遺伝子を改変することを含む、鶏痘を弱毒化する方法を提供する。前記遺伝子は、以下に、より詳細に記載されたように改変されることが好ましい。
【００２３】
本発明はまた、大きさが２７５ｋｂｐ未満である弱毒鶏痘ウイルスゲノムを提供する。ウイルスによって効率的にパッケージングされ得るゲノムの全長には上限がある。ゲノム自身が小さい場合には、より多量の異種配列を保持できる。
【００２４】
好ましい一実施形態では、弱毒鶏痘ウイルスゲノムは、配列番号１に示された配列を含む。
【００２５】
本発明の弱毒鶏痘ゲノムはまた、目的とするヌクレオチド「ＮＯＩ」を含む。「ＮＯＩ」は治療用遺伝子であり得る。
【００２６】
本発明はまた、かかるゲノムを含むウイルス粒子を提供する。ゲノムがＮＯＩを含む場合には、ウイルス粒子がＮＯＩを標的細胞へ送達できることが好ましい。あるいは（又は、さらに）、ウイルス粒子は予め発現されたタンパク質を標的細胞へ到達可能なものであり得る。
【００２７】
本発明はまた、かかるゲノム又はウイルス粒子を含むワクチン、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤を提供する。
【００２８】
本発明はまた、非複製ウイルスベクターを含む追加免疫組成物を提供する。好ましい一実施形態では、組成物は、霊長類において、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧによって初回免疫刺激された免疫応答を追加免疫可能である。
【００２９】
ワクチン接種（及び治療）目的では、免疫応答の発生時には、ワクチンの単回投与よりも複数回投与法がより効果的であることが多い。プライム−ブーストレジメンは同種（同一組成物を２回又は複数回投与する場合）であっても異種であってもよい。
【００３０】
本発明はまた、
（ｉ）ＦＰ９鶏痘ウイルス粒子を含む第１の組成物と、
（ｉｉ）同時、個別又は逐次投与するための第２の組成物
とを含むワクチンキットを提供する。
【００３１】
初回抗原刺激剤又は追加免疫剤のいずれかがＤＮＡワクチンである異種ワクチン接種レジメンにおけるウイルスベクターの使用は、これまでに認められている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（４）３９７〜４０２頁、Ｋｅｎｔら（１９９８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ７２（１２）１０１８０〜８頁、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（５）：５２６〜５３４頁）。
【００３２】
しかし、本発明者らは、まず、２種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種プライムブーストレジメンが、霊長類におけるＴ細胞免疫応答の誘導で驚くべきほどに効果的であることを示した。非複製ベクターの使用により、ウイルスの複製に付随して起こる副作用（天然痘など、前記参照）が避けられる。
【００３３】
したがって、本発明はまた、いずれかの順序で逐次投与するための
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含む、ワクチン接種キットを提供する。
【００３４】
好ましい一実施形態では、ワクチン接種キットは、いずれかの順序で逐次投与するための
（ｉ）第１の非複製ポックスウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ポックスウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含む。
【００３５】
このキットは、疾病を治療及び／又は予防するための霊長類被験体への投与に適したものであり得る。
【００３６】
本発明のキットでは、第１及び第２の組成物が同一抗原を発現可能であることが好ましい。
【００３７】
本発明はまた、被験体にかかるワクチン、初回抗原刺激若しくは追加免疫組成物又はキットを投与するステップを含むワクチン接種法を提供する。かかる投与は被験体においてＴ細胞免疫応答を生起するはずである。
【００３８】
ワクチン接種法は、例えば、慢性感染によって、又はそのために起きた疾病、例えば、ＨＩＶ、マラリア、結核及び東海岸熱を治療又は予防するために使用できる。
【００３９】
本発明の１種又は複数のゲノム、ウイルス粒子、ワクチン、初回抗原刺激剤／組成物、追加免疫剤／組成物、構築物又はキットは、ＨＩＶに関係しているか、又は少なくとも一部はＨＩＶ由来のものであり、したがって、前記ゲノム、ウイルス粒子、ワクチン、初回抗原刺激剤／組成物、追加免疫剤／組成物、構築物又はキットは、ＷＯ０２／０６８６５４（ＰＣＴ／ＣＵ０２／００００１に相当する）に開示されたものではない。詳しくは、本発明は、ＷＯ０２／０６８６５４の実施例１などのＷＯ０２／０６８６５４に記載されたような組換えＣＲ３遺伝子を含まない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
ウイルス及びウイルスベクター
本発明は、非複製ウイルスベクターを用いるワクチン接種レジメンに関する。
【００４１】
当技術分野では、標的細胞の感染を介してＮＯＩを送達できる多数のウイルスベクターが知られている。適した組換えウイルスベクターとしては、それだけには限らないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター又はパルボウイルスベクターが挙げられる（Ｋｅｓｔｌｅｒら  １９９９  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０（１０）：１６１９〜３２頁）。
【００４２】
レトロウイルスの例としては、それだけには限らないが、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉種ウイルス（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）マウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリミエロサイトマトシス（ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ）ウイルス２９（ＭＣ２９）及びトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）が挙げられる。
【００４３】
レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」１９９７  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ編：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  ７５８〜７６３頁）に見ることができる。
【００４４】
ポックスウイルス
好ましい一実施形態では、本発明は、非複製ポックスウイルスベクターを含むワクチン、初回抗原刺激又は追加免疫組成物を提供する。
【００４５】
ポックスウイルスファミリーは２つのサブファミリー、すなわちコードポックスウイルス亜科（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）とエントモポックスウイルス亜科（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｉｎｉａｅ）に分けられる。コードポックスウイルス亜科（脊椎動物のポックスウイルス）としては、オルトポックスウイルス（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、パラポックスウイルス（ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、カリポックスウイルス（ｃａｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、レポリポックスウイルス（ｌｅｐｏｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、スイポックスウイルス（ｓｕｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、モラシポックスウイルス（ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）及びヤタポックスウイルス（ｙａｔａｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）が挙げられる。ポックスウイルス、その構造及び組成、生物学的特性及び抗原性についての総説は、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９５）  Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｖｉｅｎｎａ  ７９〜８７頁に示されている。以下の表（表２）は、ポックスウイルスファミリーの各属内の種のいくつかの例を示す。
【００４６】
【表２】
2005517639.tif 000003
【００４７】
本発明は、いずれかの順序で逐次投与するための
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物
とを含むワクチン接種キットを提供する。
【００４８】
第１及び／又は第２のウイルスベクターは、ポックスウイルスベクターであり得る。
【００４９】
好ましい一実施形態では、本発明は、いずれかの順序で逐次投与するための
（ｉ）第１の非複製ポックスウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ポックスウイルスベクターを含む第２の組成物
を含む、ワクチン接種キットを提供する。
【００５０】
組成物の一方が、最初に投与される「初回抗原刺激」組成物として作用し、もう一方の組成物が、適当な時間間隔（３週間など）後に投与される「追加免疫」組成物として作用し得る。
【００５１】
第１及び第２の非複製ウイルスベクターは、有意な交差反応が起こらないほど十分に異なっているべきである。
【００５２】
２種のウイルスベクターは、異なるファミリーに属するウイルス、例えば、ポックスウイルスベクターとアデノウイルスベクター由来のものであってもよい。あるいは、２種のウイルスベクターは、同一ファミリー（ポックスウイルスなど）に属するが、異なる属（ｇｅｎｉ）であるウイルス由来のものであってもよい。例えば、第１の非複製ポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスベクターであり、第２の非複製ポックスウイルスベクターがオルトポックウイルスベクターであってもよい。
【００５３】
２種の非複製ウイルスベクターは、種が十分に異なっていれば、同一属内の異なる種由来のものでさえあってもよい。
【００５４】
各ポックスウイルス属の際立った特徴は、当技術分野では公知であり、例えば、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９５前記）参照。
【００５５】
好ましい一実施形態では、２種の非複製ポックスウイルスベクターのうち一方は鶏痘ウイルスベクター（すなわち、鶏痘（ｆｏｗｌ−ｐｏｘ）由来のもの）である。例えば、鶏痘ウイルスベクターは、本発明のゲノムを含み得る。
【００５６】
非複製性
本発明に用いるウイルスベクターは、被験体の細胞において（例えば、ヒト細胞において）非複製性でなければならない。本明細書において用語「非複製」又は「複製障害」とは、正常な被験体の細胞の大部分において十分な程度までは複製できないことを意味する。非複製性であるか又は複製障害のあるウイルスは、自然にそのようになった場合もあり（すなわち、天然からそのようなものとして単離することができる）、又は人工的に、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの育種によって、又は遺伝子操作、例えば、複製にとって重要な遺伝子の欠失によってそのようになった場合もある。一般に、このようなウイルスが増殖できる、１種又は少数の細胞種がある、例えば、ＣＥＦ細胞である。
【００５７】
一般に、ウイルスの複製は２つの方法で測定する：１）ＤＮＡ合成及び２）ウイルス力価。より正確には、本明細書において用語「非複製」又は「複製障害」とは、ポックスウイルスに適用する場合には、以下の基準のいずれか又は双方を満たすウイルスを意味する：
１）ＭＲＣ−５細胞（ヒト細胞株）において、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株と比較して、ＤＮＡ合成の１ｌｏｇ（１０倍）減少を示す、
２）ＨＥＬＡ細胞（ヒト細胞株）において、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株と比較して、ウイルス力価の２ｌｏｇ減少を示す。
【００５８】
鶏痘ウイルス
前記のように、野生型鶏痘ウイルスは、トリでは増殖性皮膚病変を引き起こす。家畜感染部から集めたかさぶた材料からＦＰＶの屋外単離物を得ることができる（Ｂｏｙｌｅら（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４２：７３７〜７４８頁）。病原性鶏痘ウイルスのゲノム配列は入手可能である（Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４（８）３８１５〜３８３１頁）。
【００５９】
弱毒生ウイルス株は、トリ細胞においてウイルスを複数回継代することによって得ることができる。Ｃｙａｎａｍｉｄ−Ｗｅｂｓｔｅｒｓ  ＰｔＹ、ＬｔｄＡｕｓｔｒａｌｉａから入手可能な、ＦＰＶ  Ｍ（穏やかなワクチン株）及びＦＰＶ  Ｓ（標準ワクチン株）など、鶏痘ウイルスの種々の弱毒ウイルス株が知られている。
【００６０】
ポックスウイルスは、宿主免疫応答から逃れるための進化した戦略を持っており、これには腫瘍壊死因子、ＩＬ−Ｉｐ、インターフェロン（ＩＦＮ）−ｏｃ／及びＩＦＮ−γの可溶性受容体として機能する分泌タンパク質の産生が含まれており、これらは、通常、細胞性サイトカイン受容体（ケモカイン受容体など）の細胞外ドメインと同様の配列を有する。これらのウイルス受容体は、一般に、適切な宿主免疫応答を阻害又は妨害し、その存在は病原性の増加を伴う。
【００６１】
ＦＰＶ遺伝子
鶏痘ウイルスのゲノムは、共有結合された末端ヘアピンを含む単一の二本鎖ＤＮＡ分子からなる。制限エンドヌクレアーゼ切断部位についての基本情報は入手可能である（Ｃｏｕｐａｒら（１９９０）前記）。
【００６２】
米国農務省スタンダードチャレンジ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）（病原性）鶏痘株のゲノムは、配列決定されており、本明細書ではこの株に用いた命名法に従っている（Ａｆｏｎｓｏら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４  ３８１５〜３８３１頁）。この総説にはまた、この鶏痘株の２６０のＯＲＦ（表１）が、その推定構造及び／又は機能及びアクセッション番号とともに列挙されている。
【００６３】
本発明者らは、ＦＰ９（ＨＰ１）の病原性前駆体を、ＦＰ９の配列がこの配列と異なっているすべての位置で配列決定した。この方法により、系統変動に起因する相違及び組織培養継代、適応の間に許容したもの、及び付随する弱毒化が示される。ＦＰ１中の、ＣＥＦ組織培養での継代の間に、ＨＰ１から改変された遺伝子を図２に示す。
【００６４】
本発明の鶏痘ウイルスゲノムは、１種又は複数の以下の野生型遺伝子に改変を含み得る：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７／０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。
【００６５】
用語「改変」とは、野生型配列からの変化（欠失、置換又は付加など）を意味するものとする。
【００６６】
遺伝子がタンパク質をコードする場合には、改変された遺伝子配列は、異なるアミノ酸配列のタンパク質をコードし得る。例えば、このアミノ酸配列は、野生型配列と比較すると、１個又は複数個のアミノ酸欠失、付加又は置換を含み得る。
【００６７】
好ましい一実施形態では、本発明の鶏痘ウイルスゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子に非保存的アミノ酸置換をもたらす改変を含む：
ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７。
【００６８】
あるいは（又は、さらに）、本ゲノムは、１種又は複数の野生型遺伝子にかなりの改変を含み得る。用語「かなりの改変」とは、遺伝子がもはや野生型遺伝子としては機能しないような方法で改変されていることを意味するものとする。例えば、野生型遺伝子がタンパク質をコードする場合には、かなり改変された遺伝子はタンパク質をコードすることができないこともあり、又は野生型タンパク質としては機能することができないタンパク質又は野生型タンパク質として機能する能力が大幅に低下したタンパク質をコードすることもある。
【００６９】
この改変は欠失であり得る。例えば、全遺伝子が欠失されている場合もある。あるいは、改変遺伝子が、その遺伝子の機能をなくすか又は大幅に低下させるのに十分な１種又は複数の部分欠失を含む場合もある。
【００７０】
あるいは、この改変は置換又は付加であり得る。例えば、組換え事象が起こり、ゲノムのどこかの配列部分が遺伝子に組み込まれる（場合によっては、野生型配列がそれに対応して喪失する）よう働く場合もある。
【００７１】
部分欠失、置換又は付加は、「フレームシフト」突然変異を引き起こし、その結果、下流配列の不適当な読み取りをもたらすことがある。あるいは（又は、さらに）、突然変異が停止コドンの生成をもたらし（「終結突然変異」）、その結果、下流配列が無視される場合もある。
【００７２】
突然変異が、停止コドンの除去をもたらし、その結果、２つの遺伝子が融合されることとなりキメラ遺伝子を形成することもある。
【００７３】
好ましい一実施形態では、ゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を含む：
ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２２。
【００７４】
もう１つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子を完全に欠いている：
ＦＰＶＯＯ１、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０。
【００７５】
もう１つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を含む：
ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ２０７。
【００７６】
もう１つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、１種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を含む：
ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ２３９。
【００７７】
もう１つの好ましい一実施形態では、ゲノムは、遺伝子ＦＰＶ０９７とＦＰＶ０９８の融合に（欠失に）起因するキメラ遺伝子を含む。
【００７８】
ゲノムの大きさ
ＦＰＶ−Ｍのゲノムは、３０８ｋｂの領域であると推定されている（Ｃｏｕｐａｒら（１９９０）前記）。ウイルスゲノムが小さいほど、多くの異種ＤＮＡを含むことができる。
【００７９】
本発明の鶏痘ウイルスゲノムは、大きさが２７５ｋｂ未満であることが好ましい。本ゲノムは約２６６ｋｂｐであることがより好ましい。ゲノムの大きさは、異種配列（例えば、「目的とするヌクレオチド」（ＮＯＩ）以下参照）を含まずに考慮される。鶏痘ウイルスをベクター系として使用するために、相同組換えによって、送達する異種配列を鶏痘ゲノムに組み込むことができる。大きさ決定の目的上、かかる組換え事象の前にゲノムの大きさを考慮する。
【００８０】
請求項１に記載の鶏痘ウイルスゲノムは、配列番号１に示された配列を含むことが好ましい。この「配列」は、鶏痘ゲノムが全体として、ベクター系として作用し得る（すなわち、相同組換えによって異種遺伝子を受けとり、ウイルス粒子に組み込まれると、異種遺伝子を標的細胞に送達する）限りは、この配列の相同体を包含するものとする。
【００８１】
相同体
本明細書において用語「相同体」とは、配列番号１に示された配列と、ある程度の相同性を有する核酸配列を意味する。本明細書において用語「相同性」とは、「同一性」と同等と見なすことができる。
【００８２】
これに関連して、相同配列は、主題配列と、少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは、少なくとも９５又は９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むととられる。一般に、相同体は、コードされたタンパク質の機能的部分（活性部位など）をコードする配列を含み、これは主題配列と同一であるが、他の領域では異なり得る。相同性は、類似性（すなわち、類似の化学特性／官能基を有するアミノ酸残基）という用語でも考えることができるが、本発明の範囲では、配列同一性という用語で相同性を表現することが好ましい。
【００８３】
相同性比較は、目測で、より通常は、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ又は複数の配列間の相同性％を計算することができる。
【００８４】
相同性％は、連続配列にわたって計算することができる、すなわち、一方の配列をもう一方の配列とアラインし、一方の配列中の各塩基を、一残基ずつ、もう一方の配列中の対応する塩基と直接比較する。これは「ギャップを入れない」アラインメントと呼ばれている。通常、このようなギャップを入れないアラインメントは、比較的短い数の残基にわたってのみ実施する。
【００８５】
これは極めて単純で一貫した方法であるが、例えば、別の同一の配列対において、ある挿入又は欠失が、続く核酸残基をアラインメントから外させ、そのために、全アラインメントを実施する場合に、相同性％の大きな低下をもたらす可能性を考慮できない。このために、ほとんどの配列比較法は、相同性スコア全体には過度のペナルティーを科さずに、可能性ある挿入及び欠失を考慮する最適アラインメントが得られるように設計されている。これは、局所相同性を最大にしようとして、配列アラインメントに「ギャップ（ｇａｐｓ）」を挿入することによって達成される。
【００８６】
しかし、これらのより複雑な方法では、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）」を割り当て、その結果、同数の同一塩基に対して、２つの比較される配列間のより高い関連性を反映する、できるだけ少ないギャップを含む配列アラインメントが、多数のギャップを含むものよりも高いスコアを達成する。通常、ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ中の各後続残基に対してはより小さなペナルティーを課す、「アファインギャップコスト」を用いる。これが、最も普通に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーによって、当然、より少ないギャップを含む最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティーを改変することができる。しかし、配列比較にこのようなソフトウェアを用いる場合にはデフォルト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合には、核酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに対して−１２であり、各伸長に対しては−４である。
【００８７】
したがって、最大相同性％の計算には、まず、ギャップペナルティーを考慮した、最適アラインメントの作製が必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータープログラムには、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（ウィスコンシン大学、米国、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）がある。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例としては、それだけには限らないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  ｉｂｉｄ−第１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０３〜４１０頁）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールパッケージソフトが挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは双方とも、オフライン及びオンライン検索に使用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  ｉｂｉｄ、７−５８〜７−６０頁参照）。しかし、いくつかの適用には、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを用いることが好ましい。ＢＬＡＳＴ２シークエンスと呼ばれる新しいツールはまた、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較に使用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７〜５０頁、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７〜８頁及びｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【００８８】
同一性という点では、最終相同性％を求めることができるが、アラインメント法自体は、通常、オールオアナッシングの対比較には基づいていない。代わりに、一般に、化学的類似性又は進化距離に基づいて、スコアを各対比較に割り当てるスケール付き類似性スコアマトリックスを用いる。このような通常用いられるマトリックスの例としては、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴプログラムパッケージソフトのデフォルトマトリックスがある。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは一般に、公開デフォルト値か提供されていればカスタム記号比較表のいずれかを用いる（さらなる詳細についてはユーザーマニュアル参照）。いくつかのアプリケーションには、ＧＣＧパッケージに公開デフォルト値を、その他のソフトウェアの場合には、デフォルトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を用いることが好ましい。
【００８９】
ソフトウェアによって最適アラインメントを得れば、相同性％を、好ましくは配列同一性％を計算することが可能である。通常、ソフトウェアはこれを配列比較の一環として行い、数的結果が得られる。
【００９０】
配列はまた、サイレント変化をもたらし、その結果、機能的に同等な物質をもたらす、核酸残基の欠失、挿入又は置換を含み得る。遺伝子がタンパク質をコードする場合には、相同体によってコードされたタンパク質は同一であるか（遺伝暗号の縮重のために）、又は機能的に同等であり得る（例えば、保存的突然変異が配列に現れることがある）。相同体は、配列番号１の遺伝子によってコードされるタンパク質と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有するタンパク質をコードすることが好ましい。
【００９１】
保存的置換は、例えば、以下の表に従って行うことができる。第２列の同一ブロック内の、好ましくは第３列の同一行内のアミノ酸を互いに置換することができる。
【００９２】
2005517639.tif 000004
【００９３】
鶏痘ウイルスベクター
本発明はまた、このような鶏痘ウイルスゲノムを含むウイルス粒子に関する。
【００９４】
ウイルス粒子（又はその一部）は、目的とするヌクレオチド（ＮＯＩ）を標的細胞に送達するためのベクター系として使用できる。この意味では、本明細書において用語「ウイルス粒子」は、ＮＯＩ又は予め発現されたタンパク質を標的細胞に送達可能な粒子（又はその一部）を含むウイルスベクターを含む。ＮＯＩは、当技術分野で公知の方法を用いて相同組換えによってウイルスゲノムに挿入することができる（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（４）３９７〜４０２頁参照）。
【００９５】
ＮＯＩを発現する組換えポックスウイルスの構築には、ＮＯＩの挿入を、ウイルスゲノムの複製に必須でない部位で行うことが必要である。ＦＰ９の適した挿入部位は記載されている（Ｐｏｌｌｉｔｔら（１９９８）  １７：５〜９頁；Ｌａｉｄｌａｗら  １９９８  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２  ６７４２頁）。
【００９６】
予め発現されたタンパク質
本発明の鶏痘ウイルス（又はその一部）を用いて、予め発現されたタンパク質を標的細胞に送達することができる。「予め発現されたタンパク質」とは、標的細胞に到達する前に翻訳されているタンパク質である。例えば、ウイルス粒子が増殖する細胞がタンパク質を発現し、次いでそれがウイルス粒子に組み込まれ得る。
【００９７】
ウイルス粒子が増殖する細胞は、１種又は複数の目的とするタンパク質（ＰＯＩ）を発現するよう操作することができる。細胞が霊長類の細胞（ＣＥＦ細胞など）である場合には、かかるＰＯＩをコードするヌクレオチドを用いて一過的にトランスフェクトすることができる。あるいは、安定にトランスフェクトされた細胞株、例えば、ウズラ細胞株ＱＴ３５を増殖に用いてもよい。
【００９８】
予め発現されたタンパク質はウイルス粒子に組み込まれるよう標的とされることが好ましい。
【００９９】
ＮＯＩ
本発明では、用語ＮＯＩは、適したヌクレオチド配列であればいずれも、例えば、合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、組換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて調製した）、ｃＤＮＡ配列又は部分ゲノムＤＮＡ配列を、それらの組合せも含めて含む。配列はコード配列である必要はない。コード領域である場合には、全コード領域である必要はない。さらに、ＲＮＡ／ＤＮＡ配列はセンス方向である場合も、アンチセンス方向である場合もある。センス方向であることが好ましい。配列はｃＤＮＡを含むか、又はそれから転写されることが好ましい。
【０１００】
ＮＯＩは、目的とするタンパク質（「ＰＯＩ」）をコードし得る。このようにして、ベクター系を用いて、標的細胞に対する外来遺伝子発現の作用を調べられる可能性がある。例えば、鶏痘ウイルス送達系を用いて、標的細胞への特定の作用についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングできる可能性がある。
【０１０１】
ＮＯＩは、標的細胞における遺伝子の発現をブロック又は阻害可能なものであり得る。例えば、ＮＯＩはアンチセンス配列であり得る。アンチセンス技術を用いる遺伝子発現の阻害は十分に公知である。
【０１０２】
ＮＯＩ又はＮＯＩ由来の配列は、標的細胞において特定の遺伝子の発現を「ノックアウト」可能なものであり得る。当技術分野では、いくつかの「ノックアウト」戦略が知られている。例えば、ＮＯＩは、特定の遺伝子の発現を破壊するよう標的細胞のゲノムに組み込み可能なものであり得る。ＮＯＩは、例えば、中途での停止コドンを導入することによって、下流コード配列をフレームから外すことによって、又はコードされたタンパク質の折り畳み能に影響を及ぼすことによって、発現を破壊し得る。
【０１０３】
あるいは、ＮＯＩは、標的細胞における遺伝子の異所性発現を増強又は誘導可能なものであり得る。ＮＯＩ又はそれから導かれる配列は、特定の遺伝子の発現を「ノックイン」可能なものであり得る。
【０１０４】
ベクター送達系によって送達されるＮＯＩは、標的細胞を不死化し得るものであり得る。当技術分野では、いくつかの不死化技術知られている（例えば、Ｋａｔａｋｕｒａ  Ｙら（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５７：６９〜９１頁参照）。
【０１０５】
ベクター送達系によって送達されるＮＯＩは、選抜のために又はマーカー目的で使用できる。例えば、ＮＯＩは選抜遺伝子、又はマーカー遺伝子であり得る。レトロウイルスベクターでは、多数の種々の選択マーカーが上手く用いられている。これらは「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」（１９９７  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ編  ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  ４４４頁）に概説されており、それだけには限らないが、それぞれＧ４１８及びハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌のネオマイシン及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、メトトレキセートに対する耐性を付与する突然変異マウスジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、細胞をマイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、キサンチンを含有する培地で増殖可能にする細菌のｇｐｔ遺伝子、細胞をヒスチジンを含まないがヒスチジノールを含有する培地で増殖可能にする細菌ｈｉｓＤ遺伝子、種々の薬物に対する耐性を付与する多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）及びピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）又はフレオマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）に対する耐性を付与する、細菌の遺伝子が挙げられる。これらのマーカーのすべては、優性選抜可能であり、これらの遺伝子を発現するほとんどの細胞の化学選抜が可能となる。
【０１０６】
しかし、好ましい一実施形態では、ＮＯＩは、治療作用を有するタンパク質を有するか、又はそれをコードし得る。例えば、ベクター送達系によって送達されるＮＯＩは、遺伝子自身が治療作用を惹起可能なものであり得る、又は治療作用を惹起可能である産物をコードすることができるという意味で、治療用遺伝子であり得る。
【０１０７】
ＮＯＩは、例えば、以下のもののうちの１種であるか、又はコードすることができる：サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、人工的に作り出された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、酵素、免疫同時刺激分子、免疫調節性分子、アンチセンスＲＮＡ、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ突然変異体、毒素、条件毒素、抗原、腫瘍サプレッサータンパク質及び増殖タンパク質、膜タンパク質、血管作動性タンパク質及びペプチド、抗ウイルス性タンパク質及びリボザイム、並びにそれらの誘導体（関連レポーター群を含むものなど）。
【０１０８】
好ましい一実施形態では、ＮＯＩは、疾病関連抗原をコード可能なものである。鶏痘ベクターに関しては、抗原に対する曝露によって、抗原に対する免疫応答を誘発又は追加免疫でき、その結果、既存の又はその後のチャレンジがより効果的に扱われる。
【０１０９】
抗原の性質は疾病に応じて変わる。疾病が生物又は感染性病原体（細菌、ウイルス、原生動物、プリオン）によって起こる場合には、抗原はこの生物又は病原体から誘導可能であり得る。疾病が腫瘍によって起こる場合には、抗原はＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ０１、癌精巣抗原又はオンコジーン若しくは産物などの腫瘍関連抗原であることが好ましい。
【０１１０】
疾病関連抗原は、１種又は複数のＴ細胞エピトープを含むことが好ましい。抗原は、疾病を引き起こす生物由来の完全タンパク質（結核菌由来のＡｎｔｉｇｅｎ８５Ａなど）を含むことができる。あるいは、抗原は、疾病を引き起こす生物由来の１種又は複数のタンパク質由来のＴ細胞エピトープの鎖を含むこともある。この例として、熱帯熱マラリア原虫由来のＭＥＰｆＴｒａｐポリペプチドがあり、これは熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ遺伝子と融合している、熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰとＰｂ９エピトープ由来のＴ細胞エピトープの鎖を含む。
【０１１１】
本発明に従って鶏痘構築物を作製するには、プラスミドｐＥＦＬ又はその誘導体、好ましくはプラスミドｐＥＦＬ２９を用いることが好ましい。ｐＥＦＬ２９は、相同な領域を含み、これによってＯＲＦ１でＦＰ９に組み込むことができる。これによってＯＲＦ−１は破壊されるが、欠失させるわけではない。プラスミドは３個の遺伝子ｌａｃＡ、ｌａｃＹ及びｌａｃＺをゲノムに付加する。この破壊は挿入であり、いくつかのヌクレオチドが欠失する。ｐＥＦＬ２９から欠失される鶏痘Ｏｒｆ１遺伝子塩基は以下の通りである（大文字）：
ＡｇａｇａｔｃｃｃｇｃｃａｇａｃｇｇｇｇａａｃｃｔｇｇｇｔｃａａｃｇＡＣＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣｔｇｃｇｔａｔｇｇａｔａｔｇｇｔｃｔｃｃｇ
ｔｇｔｔｇｔｔａｃｇｔｃａａｇａｇａｔｇｔａｔｔｃｇ
ワクチン
本発明のゲノム及び／又は粒子は、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法に使用できる。
【０１１２】
例えば、ゲノム及び／又は粒子は、予防又は治療目的で被験体に投与するワクチンに使用できる。ワクチンはまたアジュバントも含むことができる（以下参照）。
【０１１３】
複数回投与ワクチン接種（治療又は疾病予防のための）は、単回投与よりも効果的であることが多いことがわかっている。複数回投与ワクチン接種プログラムは、同一組成物の反復投与又は２種若しくは複数の異なる組成物の１回若しくは複数の投与を含み得る。
【０１１４】
同種ワクチン接種プログラム用に、本発明は、反復投与を容易にする方法で提供されるワクチンを含むワクチンパックを提供する。例えば、パックには、患者に注射されるよう準備ができている適切な用量のワクチンを含む複数のバイアルを含めることができる。ワクチンが経口投与される場合には、用量は丸剤又はカプセル剤として存在することができる。
【０１１５】
異種ワクチン接種プログラム用には、通常、患者に最初に投与される「初回抗原投与」組成物と、いくらか後に投与される「追加免疫」組成物がある。本発明のゲノム及び／又はウイルス粒子は、初回抗原投与組成物及び／又は追加免疫組成物に使用できる。
【０１１６】
いくつかの他の組成物を、異種ワクチン接種プログラムに使用できる。本発明のゲノム／粒子がＮＯＩ（場合によって、ＰＯＩをコード可能である）を含む場合には、他の組成物は、同一のＮＯＩ又はＰＯＩを含むことが好ましい。他の組成物としては、「裸のＤＮＡ」、非ウイルスベクター系及び他のウイルスベクター系が挙げられる。
【０１１７】
裸のＤＮＡ（又はＲＮＡ）は、線状であっても環状（例えば、プラスミド）であってもよい。リポソームなどの担体中で、又は遊離型で提供される場合もある。
【０１１８】
初回抗原刺激組成物に使用するための、適した非ウイルスベクターとしては、リポペプチドとして知られる脂質が末端に付加されたペプチド、融合タンパク質としてか化学結合によってのいずれかでＫＬＨなどの担体タンパク質と融合しているペプチド、アジュバントを含む完全抗原、及びその他の類似の系が挙げられる。
【０１１９】
ウイルスベクター系を用いる場合には、異なるウイルス由来のもの（すなわち、鶏痘ではない）であれば交差反応を最小にするのに有利であり得る。ベクターは別のアビポックスウイルス由来のもの、又は異なる属のポックスウイルス由来のもの（表２に示されるような）であってもよい。ＭＶＡ又はＮＶＹＡＣなどの弱毒ワクチンベクター系が特に好ましい。その他の適したウイルスベクターとしては、非ポックスウイルスに基づいたベクター、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）がある。適した細菌ベクターとしては、組換えＢＣＧ及び組換えサルモネラ及びプラスミドＤＮＡで形質転換されたサルモネラが挙げられる（Ｄａｒｊｉ  Ａら  １９９７  Ｃｅｌｌ  ９１：７６５〜７７５頁）。
【０１２０】
異種ワクチンプログラムには、本発明は、
（ｉ）鶏痘ウイルス粒子を含む第１の組成物と、
（ｉｉ）同時、個別又は逐次投与するための第２の組成物。
とを含むワクチン接種キットを提供する。
【０１２１】
異種ワクチン接種レジメン
本発明はまた、概ね、２種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種ワクチン接種レジメンに関する。
【０１２２】
本発明者らは、まず、２種の異なる非複製ウイルスベクターを用いる異種プライム−ブーストレジメンが、霊長類被験体において免疫応答を生じさせるのに効率的であることを示した。
【０１２３】
詳しくは、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物
とを、いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。
【０１２４】
被験体が哺乳類であることが好ましく、被験体が霊長類であることがより好ましく、被験体がヒトであることが最も好ましい。
【０１２５】
好ましい一実施形態では、第１及び／又は第２の組成物はポックスウイルスベクターである。
【０１２６】
したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ポックスウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ポックスウイルスベクターを含む第２の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。
【０１２７】
もう１つの態様では、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物とを、
いずれかの順序で被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法に関する。
【０１２８】
もう１つの態様では、本発明は、
（ｉ）ＤＮＡワクチンを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。
【０１２９】
もう１つの態様では、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第３の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物
とを被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。
【０１３０】
もう１つの態様では、本発明は、組成物のうちの少なくとも１つがポックスウイルスベクターを含む前記の方法に関する。
【０１３１】
もう１つの態様では、本発明は、前記非複製ウイルスベクターがポックスウイルスベクターを含む前記の方法に関する。
【０１３２】
もう１つの態様では、本発明は、少なくとも２種のポックスウイルスベクターが、異なる属のポックスウイルスベクターから誘導可能である前記の方法に関する。
【０１３３】
もう１つの態様では、本発明は、少なくとも１種のポックスウイルスベクターがアビポックスウイルスから誘導可能であり、少なくとも１種のポックスウイルスベクターがオルトポックスウイルスから誘導可能である、前記の方法に関する。
【０１３４】
もう１つの態様では、本発明は、少なくとも１種のベクターが鶏痘ウイルスから誘導可能である前記の方法に関する。
【０１３５】
もう１つの態様では、本発明は、少なくとも１種のベクターがＦＰ９であるか、それから誘導可能である、前記の方法に関する。
【０１３６】
もう１つの態様では、本発明は、ベクターのうちの１種が、以下から選択される鶏痘ウイルスゲノムを含む、前記の方法に関する：
（ｉ）１種又は複数の以下の野生型ＦＰＶ遺伝子の改変型を含む鶏痘ゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ０１８、ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０６３、ＦＰＶ０６６、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ０９３、ＦＰＶ０９７、ＦＰＶ０９８、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１２７、ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ１９１、ＦＰＶ２０７、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２２２、ＦＰＶ２３９、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０、
（ｉｉ）１種又は複数の以下の遺伝子に部分欠失を含む鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ１５８、ＦＰＶ２１９、ＦＰＶ２２２、
（ｉｉｉ）１種又は複数の以下の遺伝子を欠く鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ００１、ＦＰＶ１２４、ＦＰＶ１２５、ＦＰＶ１５９、ＦＰＶ１６０、ＦＰＶ２２０、ＦＰＶ２２１、ＦＰＶ２４１、ＦＰＶ２４２、ＦＰＶ２４３、ＦＰＶ２４４、ＦＰＶ２４５、ＦＰＶ２４６、ＦＰＶ２４７、ＦＰＶ２６０、
（ｉｖ）１種又は複数の以下の遺伝子にフレームシフト突然変異を含む鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０５４、ＦＰＶ０７０、ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ１１５、ＦＰＶ１９０、ＦＰＶ２０７、
（ｖ）１種又は複数の以下の遺伝子に終結突然変異を含む鶏痘ウイルスゲノム：
ＦＰＶ０７１、ＦＰＶ２３９、
（ｖｉ）遺伝子ＦＰＶ０９７及びＦＰＶ０９８の融合によって（欠失によって）生じたキメラ遺伝子を含む鶏痘ウイルスゲノム、
（ｖｉｉ）大きさが２７５ｋｂｐ未満である鶏痘ウイルスゲノム、
（ｖｉｉｉ）配列番号１に示される配列を含む鶏痘ウイルスゲノム、
（ｉｘ）ＯＲＦ１からＡＣＴＧＧＴＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣが欠失した配列番号１に示される配列を含む鶏痘ウイルスゲノム。
【０１３７】
もう１つの態様では、本発明は、鶏痘ウイルスゲノムがまたＮＯＩも含む、前記の方法に関する。
【０１３８】
もう１つの態様では、本発明は、ＮＯＩがポックスウイルスプロモーターの制御下にある、前記の方法に関する。
【０１３９】
もう１つの態様では、本発明は、ＮＯＩがネズミマラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、Ｐ．シノモルギ、三日熱マラリア原虫、結核菌又はＴ．パルバ由来の抗原をコードする、前記の方法に関する。
【０１４０】
もう１つの態様では、本発明は、アビポックスウイルス由来のウイルスベクターを含む組成物を追加免疫組成物として投与する、前記の方法に関する。
【０１４１】
もう１つの態様では、本発明は、アビポックスウイルス由来のウイルスベクターを含む組成物を初回抗原刺激組成物として投与する、前記の方法に関する。
【０１４２】
もう１つの態様では、本発明は被験体が霊長類である、前記の方法に関する。
【０１４３】
もう１つの態様では、本発明は被験体がヒトである、前記の方法に関する。
【０１４４】
もう１つの態様では、本発明は動物用ワクチンにおける、ＦＰ９であるか、それから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用に関する。
【０１４５】
もう１つの態様では、本発明は前記動物が哺乳類である、前記のような使用に関する。
【０１４６】
もう１つの態様では、本発明は前記哺乳類が霊長類である、前記のような使用に関する。
【０１４７】
もう１つの態様では、本発明は、前記霊長類がヒトである、前記のような使用に関する。
【０１４８】
もう１つの態様では、本発明は、医薬における、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターの使用に関する。
【０１４９】
もう１つの態様では、本発明は、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を被験体に投与することを含む、被験体において免疫応答を生起する方法に関する。
【０１５０】
もう１つの態様では、本発明は、ＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能である非複製ウイルスベクターを含む組成物を被験体に投与することを含む、被験体において既存の免疫応答を追加免疫する方法に関する。
【０１５１】
被験体は霊長類、特に、ヒトであることが好ましい。
【０１５２】
ベクターは、異なる属のポックスウイルスから誘導可能であることが好ましい。詳しくは、一方はアビポックスウイルスから、他方はオルトポックスウイルスから誘導可能であり得る（表２参照）。
【０１５３】
組成物の一方が、アビポックスウイルスから誘導可能なベクターを含む場合には、この組成物は追加免疫組成物として投与することが好ましい。
【０１５４】
好ましい一実施形態では、ベクターのうちの１種が、鶏痘ウイルスから誘導可能である。ベクターのうちの１種がＦＰ９であるか、又はそれから誘導可能であることがより好ましい。例えば、ベクターのうちの１種は、本発明の第１の態様の鶏痘ウイルスゲノムを含み得る。高度に好ましい一実施形態では、ベクターは配列番号１に示される配列を含むゲノムを含む。
【０１５５】
疾病がマラリアである場合には、ＦＰ９又はＦＰ９由来ベクターを、初回抗原刺激として用いることが好ましい。
【０１５６】
疾病が結核である場合には、ＦＰ９又はＦＰ９由来ベクターを、追加免疫として用いることが好ましい。
【０１５７】
第１及び第２の組成物が、同一抗原を発現可能であることが好ましい。
【０１５８】
第１及び第２の組成物は、一緒に、又は別個に販売するために個別に詰められていてもよい。
【０１５９】
キットは、投与前に組成物の一方又は双方と混合するための他の成分（希釈剤、担体、アジュバントなど−以下参照）を含み得る。
【０１６０】
キットはまた、ワクチン接種プロトコールに関する取扱説明書を含み得る。
【０１６１】
追加免疫組成物
本発明者らは、本発明の非複製ウイルスベクターは、抗原に対する既存の免疫応答の追加免疫で有効であることを示した。詳しくは、本発明者らは、まず、非複製ウイルスを用いて、マウスにおいて及び霊長類においてウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧによって、並びにヒトなどの霊長類のメラノーマによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できることを示した。
【０１６２】
既存の免疫応答は、ワクチンによって生じたものであり得る。いくつかの異なる種類のワクチンが開発されており、当技術分野では公知であり、これらとしては、生存生物、無傷の非生存生物、細胞成分断片、トキソイド、ＤＮＡをベースにしたワクチン及び抗イディオタイプが挙げられる（表１参照）。高度に好ましい一実施形態では、既存の応答は弱毒生存病原体、例えば、ＢＣＧによって生じたものである。
【０１６３】
本発明は、被験体において既存の免疫応答を追加免疫可能な非複製ウイルスベクターを含む追加免疫組成物を提供する。
【０１６４】
被験体は霊長類であることが好ましい。
【０１６５】
ウイルスベクターはポックスウイルスベクターであることが好ましい。例えば、ウイルスベクターは本発明の第１の態様のゲノムを含み得る。
【０１６６】
３重及び多重レジメン
本発明はまた、一般に、異なる非複製ウイルスベクターを用いる、多重異種ワクチン接種レジメン、例えば、３重異種レジメンに関する。
【０１６７】
したがって、本発明は、被験体に３種の異種組成物を投与することを含む３重レジメンを提供する。前記の３種の組成物は、各々がその近接する組成物とは異なることが好ましい。例えば、第１の組成物がＸを含む場合には、第２の組成物はＸとは異なることが好ましい。この実施形態では、第３の組成物が第１の組成物と類似又は同一であり得ることが可能であることは明らかである。３種の組成物すべてが互いに異なっていることが好ましい。
【０１６８】
一実施形態では、組成物のうちの１種は、ＤＮＡワクチンなどのＤＮＡをベースとする組成物であり得る。少なくとも第２の及び第３の組成物が、非複製ウイルスベクターを含むことが好ましい。
【０１６９】
したがって、本発明は、
（ｉ）ＤＮＡワクチンを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。
【０１７０】
好ましい一実施形態では、本発明は、
（ｉ）第１の非複製ウイルスベクターを含む第１の組成物と、
（ｉｉ）第２の非複製ウイルスベクターを含む第２の組成物と、
（ｉｉｉ）第３の非複製ウイルスベクターを含む第３の組成物とを
被験体に投与するステップを含む、被験体において疾病を治療及び／又は予防する方法を提供する。
【０１７１】
好ましい一実施形態では、第１と第２の組成物は異種であり、第２と第３の組成物が異種である。第１及び第２及び第３の組成物が異種であることがより好ましい。前記組成物が、前記組成物のウイルスベクター成分に関して異種であることが最も好ましい。例えば、一治療レジメンは、ｐＤＮＡ初回抗原刺激とそれに続く組換えＭＶＡ追加免疫とそれに続く組換えＦＰ９追加免疫とそれに続く組換えアデノウイルス追加免疫などを含み得る。これらの治療／免疫化サイクルは、治療的設定において治療的Ｔ細胞応答を持続するために反復することができることが有利である。
【０１７２】
本発明の３重異種レジメンには、３種又は複数の異なるウイルスベクターを用いることが好ましい。
【０１７３】
高度に好ましい一実施形態では、免疫化は以下のベクター：ＤＮＡ−ＦＰ９−ＭＶＡ−アデノウイルス−組換えヘルペスをいずれかの順序で用いて実施する。各ベクターが同一抗原を発現することが好ましい。ベクターは、ＤＮＡ−ＦＰ９−ＭＶＡ−アデノウイルス−組換えヘルペスの順序で投与することが好ましい。
【０１７４】
さらに好ましい免疫化順序及び免疫化レジメンとしては、ＤＮＡ−ＦＰ９−ＭＶＡ及びＤＮＡ−ＭＶＡ−ＦＰ９がある。
【０１７５】
ベクターは、異なる属のポックスウイルスから誘導可能であることが好ましい。詳しくは、１種はアビポックスウイルスから誘導可能であり、もう１種はオルトポックスウイルスから誘導可能であり得る（表２参照）。
【０１７６】
好ましい一実施形態では、ベクターのうちの１種は鶏痘ウイルスから誘導可能である。例えば、ベクターのうちの１種は、本発明の第１の態様の鶏痘ウイルスゲノムを含み得る。高度に好ましい一実施形態では、ベクターは、配列番号１に示される配列を含むゲノムを含む。
【０１７７】
第１及び第２及び第３の組成物が同一抗原を発現可能であることが好ましい。
【０１７８】
実施例１２（例えば、図１１−ＤＤＦＭ）は、３重レジメンの有効性を実証する。
【０１７９】
被験体は霊長類、特に、ヒトであることが好ましい。
【０１８０】
第１及び第２及び第３の組成物は、一緒に、又は別個に販売するために個別にパッケージされていてもよい。
【０１８１】
キットは、投与前に１種又は複数の組成物と混合するための他の成分（希釈剤、担体、アジュバントなど−以下参照）を含み得る。
【０１８２】
キットはまた、ワクチン接種プロトコールに関する取扱説明書を含み得る。
【０１８３】
Ｔ細胞応答
本ワクチン接種法又はプログラムは、被験体においてＴ細胞免疫応答を生起するはずである。
【０１８４】
Ｔ細胞免疫応答の性質は、細胞上の細胞表面マーカーの発現に基づいて特性決定することができる。一般に、Ｔ細胞は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ５又はＣＤ７（ヒトのみ）の存在によって検出することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞は、その補助受容体発現によって区別することができる（例えば、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８モノクローナル抗体によって）。
【０１８５】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される場合に抗原を認識し、ＣＤ８＋はＭＨＣクラスＩ分子によって提示される場合に認識するので、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、それらが反応する抗原提示細胞に基づいて区別することもできる。
【０１８６】
特定の標的抗原内に、１種又は複数のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープと１種又は複数のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープがある場合もある。特定のエピトープがすでに特性決定されている場合には、これを用いて、例えば、特定のエピトープを認識するＴ細胞サブセットの特異的刺激に基づいてＴ細胞の２種のサブタイプ間を区別することができる。
【０１８７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、そのサイトカイン分泌プロフィールに基づいて細分することもできる。ＴＨ１サブセット（「炎症性ＣＤ４Ｔ細胞」として知られることもある）は、ＩＬ−２及びＩＦＮγを特徴的に分泌し、細胞傷害性及び局所炎症反応と関連しているいくつかの機能を媒介する。ＴＨ１細胞は、マクロファージを活性化することができ、細胞媒介性免疫を導く。ＴＨ２サブセット（「ヘルパーＣＤ４Ｔ細胞」として知られることもある）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１０を特徴的に分泌し、Ｂ細胞を増殖し、抗体を産生するよう（体液性免疫）刺激することにおいて役割を有すると考えられている。
【０１８８】
ＴＨ１及びＴＨ２細胞はまた、エフェクター分子を特徴的に発現する。ＴＨ１細胞は膜結合型ＴＮＦを発現し、ＴＨ２細胞はＢ細胞上にＣＤ４０と結合するＣＤ４０リガンドを発現する。
【０１８９】
したがって、細胞免疫応答の種類は、例えば、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳｃａｎ）を用いて容易に決定することができる。
【０１９０】
標的抗原
標的抗原は、標的疾病に特有のものであり得る。疾病が、感染性病原体によって起こる感染性疾病である場合には、標的抗原は感染性病原体から誘導可能なものであり得る。
【０１９１】
標的抗原は、疾病の感染後に免疫系によって認識される抗原であり得る。あるいは、抗原は、通常は、免疫系には「見えない」ものであり、その結果、本方法が非生理学的Ｔ細胞応答を誘導する場合もある。これは、別の攻撃路を開くことができるために、疾病によって誘発された免疫応答が有効でない（例えば、感染の排除に成功しない）疾病では有用であり得る。
【０１９２】
好ましい乳癌抗原には、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、ＣＥＡがある。
【０１９３】
好ましい結腸癌抗原：ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１２、突然変異体Ｐ５３。
【０１９４】
好ましい脳癌抗原：ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６及びＥ７。
【０１９５】
好ましいＥＢＶ誘導性Ｂ及びＴ細胞リンパ腫抗原：ＢＢＮＡ１及び２、ＬＭＰ１。
【０１９６】
好ましい腎臓癌抗原：ＨＥＲ−２ｎｅｕ、ＲＡＧＥ、ＭＵＣ−１。
【０１９７】
好ましいＨＰＶ抗原には、ウイルスタンパク質Ｅ１−８、Ｌ１及びＬ２がある。
【０１９８】
好ましいＨＳＶ抗原には、ウイルスタンパク質ｇＭ、ｇＨ、ｇＫ、ＧＧ、ｇＤがある。
【０１９９】
好ましいＨＢＶ抗原には、ウイルスタンパク質小、中及び大表面抗原、コア抗原、ポリメラーゼがある。
【０２００】
好ましいＨＣＶタンパク質には、ウイルスタンパク質コアタンパク質、エンベロープタンパク質、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５領域がある。
【０２０１】
抗原は、腫瘍抗原、例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３又はＮＹ−ＥＳＯであり得る。
【０２０２】
抗原は、自己抗原、例えば、チロシナーゼであり得る。
【０２０３】
本発明の好ましい一実施形態では、抗原は結核菌から誘導可能である。例えば、抗原はＥＳＡＴ６又はＭＰＴ６３であり得る。
【０２０４】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、抗原は、マラリア関連病原体熱帯熱マラリア原虫から誘導可能である。
【０２０５】
本発明の組成物は、２種以上の抗原由来のＴ細胞エピトープを含み得る。例えば、本組成物は、同一の疾病と関連している２種又は複数の抗原由来の１種又は複数のＴ細胞エピトープを含み得る。２種又は複数の抗原は、同一の病原性生物から誘導可能であり得る。
【０２０６】
あるいは、本組成物は、種々の供給源由来のエピトープを含み得る。例えば、実施例に記載したＭＥ−ＴＲＡＰインサートは、熱帯熱マラリア原虫、破傷風トキソイド、結核菌及びウシ型結核菌由来のＴ細胞エピトープを含む。
【０２０７】
標的疾病
本発明の方法は、いくつかの疾病、特に、Ｔ細胞媒介性免疫応答に感受性のあるものの治療及び／又は予防に有用である。
【０２０８】
詳しくは、本発明の方法は、慢性感染症、特に、持続性潜在性感染症であるか、又はそれから起こる疾病の治療及び／又は予防に有用である。
【０２０９】
適した疾病の網羅するものではないリストとして、結核、ＨＩＶ、マラリア、Ｈ．ピロリ、インフルエンザ、肝炎、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヘルペスウイルス誘導性疾病及び他のウイルス感染、ライ病、トキソプラズマなどの非マラリア原虫寄生虫、並びに腫瘍及び／又は癌などの種々の悪性のもの、原虫：マラリア、特に、熱帯熱マラリア原虫及び三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ、タイレリアパルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ）、トリパノソマスクルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｓ  ｃｒｕｚｉ）によって起こる感染症、結核及びライ病などの放線菌によって起こる感染症、肺炎クラミジア及びヘリコバクターピロリなどの細菌によって起こる感染症、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＲＳＶ、インフルエンザウイルスなどのウイルスによって起こる感染症並びに腎臓癌、結腸直腸癌、肺癌、皮膚癌（メラノーマ）、肝臓癌、卵巣癌、精巣癌、膵臓癌、子宮癌、前立腺癌、胃癌、頭頸部癌、頸部癌、乳癌及び種々のリンパ腫などの種々の悪性のもの、並びにＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、マラリア、結核、ＨＰＶ感染及び疾病、ＨＳＶ感染及び疾病、ＣＭＶ感染及び疾病、ＥＢｖ感染及び疾病、レーシュマニア症、リステリア症、タイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）、ＨＴＬＶ感染及び疾病、肺炎球菌病、ブドウ球菌病、肺癌、乳癌、結腸癌、メラノーマ、骨髄腫、リンパ腫、腎細胞癌腫が挙げられる。
【０２１０】
本発明の方法は、結核、マラリア及び東海岸熱から保護するためのワクチン接種法において特に有用である。
【０２１１】
本明細書に記載した組成物は、治療用又は予防用ワクチンとして使用できる。予防的免疫化と治療的免疫化のどちらがより適当であるかは、通常、疾病の性質に応じて変わる。例えば、癌は、診断される前よりもむしろ治療的に免疫化され、抗マラリアワクチンは、必ずしもそうではないが、予防薬として用いられることが好ましいと予想される。
【０２１２】
医薬組成物／ワクチン
本発明はまた、ワクチン、初回抗原刺激剤又は追加免疫剤などの医薬組成物に関する。
【０２１３】
医薬組成物はまた、例えば、製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含むことができる。製薬上の担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準的な薬務に関連して選択することができる。
【０２１４】
詳しくは、ＤＮＡプラスミドベクターを含む組成物は、アジュバントとして作用するよう、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、又はそれをコードするプラスミドを含むことができ、ポリペプチドの形でＧＭ−ＣＳＦを用いると有益な作用が見られる。ＱＳ２１又はＳＢＡＳ２などのアジュバント（Ｓｔｏｕｔｅ  Ｊ  Ａら  １９９７  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２６：８６９１頁）は、タンパク質、ペプチド又は核酸とともに使用してＴ細胞応答の誘導を増強することができる。
【０２１５】
本発明の医薬組成物では、組成物は、何らかの適した結合剤、滑沢剤、沈殿防止剤、被覆剤又は可溶化剤と混合することもできる。
【０２１６】
医薬組成物は獣医学（すなわち、動物）利用のためのであっても、ヒト利用のためのものであってもよい。獣医学利用としては、組成物は、例えば、哺乳類（特に、ウシ）又はトリを治療するために使用できる。
【０２１７】
被験体は哺乳類被験体、特に、霊長類（例えば、ヒト）又は有蹄動物（例えば、ウシ）被験体であることが好ましい。
【０２１８】
投与
一般に、本発明の組成物の治療上有効な皮内又は筋内日用量は、１０５〜１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）に及ぶことが多い。
【０２１９】
通常、医師又は獣医が、個々の患者に最も適した実際の投与量を決定し、これは特定の患者の年齢、体重及び応答によって変わる。前記投与量は平均的な場合の典型的なものである。もちろん、より高い又はより低い投与量がふさわしい個々の例があり得、そのようなものも本発明の範囲内にある。
【０２２０】
コードポックスウイルス亜科のメンバーの伝染は、エアゾールによって起こり得る（Ｍｕｒｐｈｙら（１９９５）前記）。本発明の組成物はまた、被験体が吸入するためのエアゾールによって投与することができる。本発明の組成物はまた、注射、例えば、皮内及び／又は筋内注射によって投与できることが好都合である。さらに、組成物は、適したデバイン（ｄｅｖｉｎｅ）を用いて皮膚又はその他の組織に投与できる（例えば、「遺伝子銃」又は類似物を用いて）。
【０２２１】
必要に応じて、本医薬組成物はまた、座剤又はペッサリーの形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布剤の形で局所的に、皮膚パッチを用いて、デンプン又は乳糖などの賦形剤を含有する錠剤、又はカプセル剤若しくは卵型剤の形で、単独又は賦形剤と混合して経口的に、又は矯味矯臭剤若しくは着色剤を含有するエリキシル、溶液又は懸濁液の形で投与でき、あるいはそれらは非経口的に、例えば、海綿体内に、静脈内若しくは皮下注射することもできる。非経口投与には、本組成物は、その他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖を含むことができる滅菌水溶液の形で用いることが最良であり得る。頬側又は舌下投与には、本組成物は、従来法で製剤できる錠剤又はトローチ剤の形で投与できる。
【０２２２】
本発明の組成物を徐放性製剤で投与することも可能である。
【０２２３】
ポックスウイルス増殖法
野生型及び組換えポックスウイルスを培養ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることは公知である。驚くべきことに、本発明者らは、非培養ＣＥＦを用いることによって、アビポックスウイルスについて、プラーク形成及びウイルス収率の大幅な改善を得ることができるということを見出した。
【０２２４】
本発明は、アビポックスウウイルスを増殖させるための非培養ＣＥＦ細胞の使用を提供する。
【０２２５】
アビポックスウイルスは鶏痘ウイルス、特に、本発明の第１の態様の鶏痘ゲノムを含むものであることが好ましい。
【０２２６】
用語「非培養」とは、細胞が培養において何らかの有意な程度まで増殖する前に用いられることを示すよう用いられる。細胞が集団中の細胞数が二倍になるには不十分な時間の間培養されていることが好ましい。
【０２２７】
定期的に継代し増殖培地を補充することによって、一次培養ＣＥＦ細胞を最大１ヶ月間維持することは通常の手順である。本発明の非培養ＣＥＦ細胞は継代せずに用いられなければならない。
【０２２８】
一次非培養ＣＥＦは、新しく調製したＣＥＦを、増殖させずにコンフルエント単層とするのに十分な濃度で組織培養皿に入れることによって得ることができる。次いで、プレートを、プレーティングしてから２４時間以内に用いることが好ましい。
【０２２９】
本発明を、単に例示目的で、以下の実施例でさらに記載する。
【実施例１】
【０２３０】
鶏痘株ＦＰ９の産生及び特性決定
鶏痘ＦＰ９は、病原性野生型鶏痘ＨＰ−１株から、組織培養でニワトリ胚線維芽細胞によって４３８回継代することによって得（Ｍａｙｒ及びＭａｌｉｃｋｉ（１９６６）Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄ  １３  １〜３頁）、次いで、プラーク精製した。
【０２３１】
Ｆｐ９のゲノムは十分に配列決定されており（配列番号１）、注解されている（図１）。ＦＰ９は、ＲＥＶプロウイルスを含まない。ＦＰ９のゲノムは２６６ｋｂｐで、ＦＰＶ−Ｍの推定される大きさ（３００ｋｂｐより大きい）よりも幾分か小さい。
【実施例２】
【０２３２】
組換えＦＰ９及びＦＰＶ−Ｍによって生起される免疫応答の比較
組換えＦＰ９が、組換え抗原に対するＴ細胞応答を生起するその能力においてＦＰＶ−Ｍに対して優れているかどうかを調べるために、ネズミマラリア原虫スポロゾイト周囲の表面タンパク質（ＰｂＣＳＰ）を、相同組換えによって、両ウイルスのゲノムの末端６．８ｋｂｐＢａｍＨＩ断片（Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、１９９０ａ、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７１、６２１〜８頁、Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、１９９０ｂ、Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２３、３０５〜１６頁、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９８９、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７０、１４５〜５４頁）に挿入した（Ｑｕｉｎｇｚｈｏｎｇら、１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２、５６９〜７３頁）。両組換えウイルスでは、ワクシニアｐ７．５初期−後期プロモーターを用いて挿入した遺伝子を発現させた。ＰｂＣＳＰタンパク質は、Ｈ−２Ｋｄ拘束性９アミノ酸ペプチドのエピトープを含み、これはＢａｌｂ／ｃマウスでは肝臓段階のネズミマラリア原虫感染に対して保護的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導できる（Ｐｌｅｂａｎｓｋｉら、１９９８、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８、４３４５〜５５頁、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４、３９７〜４０２頁）。驚くべきことに、ＰｂＣＳＰ遺伝子をコードするＦＰ９（ＦＰ９ＰｂＣＳＰ）は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＣＳＰ遺伝子をコードするＦＰＶ−Ｍ（ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰ）によって生起されたものよりもかなり高いＣＤ８＋媒介性Ｔ細胞応答を生起した。ただし、両ウイルスともウイルス抗原に対してかなりのＴ細胞応答を誘導した。（図３）。
【０２３３】
方法
雌のＢａｌｂ／ｃマウスを１×１０６ＰＦＵのＦＰ９又はＦＰＶ−Ｍ単独又はネズミマラリア原虫ＣＳＰ（ＰｂＣＳＰ）を発現するものを用いて静脈内注射により免疫化した。免疫化の７日後、脾細胞において生起されたＴ細胞免疫応答を、ＩＦＮγＥＬＳＰＯＴアッセイを用いて測定した。組換え抗原、ＰｂＣＳＰに対する応答を、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｐｂ９エピトープ（ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される）を用いて測定した。陽性対照として、全ウイルスに対するＴ細胞応答を、免疫脾細胞を鶏痘ウイルスに感染したものに曝露することによって測定した。図１のカラムは、１００万個の脾細胞当たりの平均ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）±群当たり４個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
【実施例３】
【０２３４】
ＦＰ９ＰｂＣＳＰを用いるプライム−ブースト免疫化レジメン及びネズミマラリア原虫に対する保護的免疫応答の誘導
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、ＦＰ９ＰｂＣＳＰによって生起されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、ＤＮＡワクチン及びＰｂＣＳＰ抗原をコードするＭＶＡによって生起されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答との比較（図４）により、組換えＦＰ９によって生起された応答は、組換えＭＶＡによって生起されたものよりも低いが、ＤＮＡワクチンによって生起されたものよりもかなり高いということが示された。それにもかかわらず、ＦＰ９ＰｂＣＳＰは、ＤＮＡワクチンによって初回抗原刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を追加免疫し、並びに、ＭＶＡＰｂＣＳＰと組合せて初回抗原刺激剤又は追加免疫剤として作用した（図５）。注目に値すべきことに、ＦＰ９ＰｂＣＳＰを用いる初回抗原刺激と、それに続くＭＶＡＰｂＣＳＰを用いる追加免疫は、その他の同種又は異種プライム−ブースト免疫化レジメンよりも相当に高レベルの、ネズミマラリア原虫スポロゾイトを用いたチャレンジからの保護を誘導した。
【０２３５】
【表３】
2005517639.tif 000005
【０２３６】
方法
雌のＢａｌｂ／ｃマウスを１×１０６ＰＦＵのＦＰ９ＰｂＣＳＰ（ＦＰ９）又はＭＶＡＰｂＣＳＰ（ＭＶＡ）を用いて静脈内注射により、又は５０μｇのｐＳＧ２ＰｂＣＳＰ（ＤＮＡ）を用いて筋内注射により免疫化し、２週間後、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ又はＭＶＡＰｂＣＳＰのいずれかを用いて追加免疫した。ＰｂＣＳＰに対する応答を、追加免疫の１４日後にＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｐｂ９エピトープを用いて測定した。カラムは、１００万個の脾細胞当たりの平均ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）±群当たり３個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
【０２３７】
追加免疫の２週間後、動物を２０００個のネズミマラリア原虫スポロゾイトを用いて静脈注射によってチャレンジし、続いて、チャレンジ後６〜１４日、血液段階感染の間モニターした（表２）。結果は４実験を累積したものである。
【実施例４】
【０２３８】
種々の外来組換え抗原及びエピトープの鎖をコードするＦＰ９ウイルスの構築
ＦＰ９を組換え抗原を送達するための一般的な系として使用できることを証明するために、原核生物及び真核生物双方を起源とする全抗原をコードする遺伝子並びにポリエピトープ及びポリタンパク質融合物をコードする合成遺伝子を、相同組換えによってＦＰ９のゲノムに挿入した（表４）。これらの遺伝子は、構造が大きく異なり、種々の異なる病原体に由来する抗原をコードする。表４に列挙した各組換えＦＰ９誘導体は、高濃度までニワトリ胚線維芽細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖させてあり、このことはそれらが生存可能であり、且つ、安定していることを示す。組換えウイルスのすべてで、ワクシニアｐ７．５初期−後期プロモーターを用いてコードされた抗原を発現させた。コードされた抗原は、これを調べたすべての場合で発現されることがわかった（表４）。これにはこれらの構築物のうち最大のもの、６種の融合マラリア抗原として発現されるポリタンパク質をコードする９．９ｋｂｐの合成遺伝子を含むＦＰ９Ｌ３ＳＥＰＴＬが含まれる。
【０２３９】
【表４】
2005517639.tif 000006
【実施例５】
【０２４０】
ＦＰ９による熱帯熱マラリア原虫抗原に対するＴ細胞免疫応答の誘導
熱帯熱ＴＲＡＰ遺伝子（Ｒｏｂｓｏｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３５、７９〜８２頁）と融合している熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰ由来のＴ細胞エピトープ及びＰｂ９エピトープの鎖（Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９９７  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５、１２８０〜４頁）を含むＭＥＰｆＴｒａｐポリペプチドを、ヒトにおける熱帯熱マラリアに対するワクチン接種用抗原として開発した。ＭＥＰｆＴｒａｐをコードするＦＰ９を構築し（表４）、Ｂａｌｂ／ｃマウスで実施した力価試験でＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生起することを示した（１０７±２０個  ＩＦＮγスポット形成細胞／１００万個脾細胞）。
【実施例６】
【０２４１】
ＦＰ９による、結核菌の抗原８５Ａに対するＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ誘導免疫応答の誘導
抗原８５Ａ（Ａｇ８５Ａ）は、結核菌由来の主要な分泌及び保護抗原である。まず、結核菌由来のＡｇ８５ＡをコードするＦＰ９によって生起された免疫応答をＢａｌｂ／ｃマウスで測定した（図６）。抗原８５Ａは、２０個のアミノ酸のＨ−２ｄＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドエピトープ（ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される）と９個のアミノ酸のＨ−２ｄＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープ（ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される）とを含む（Ｈｕｙｇｅｎら、１９９４）。ＦＰ９Ａｇ８５Ａを用いる免疫化によって、Ａｇ８５Ａに対するＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方が誘導され、このことは、ＦＰ９がマウスにおいて、コードされた抗原に対するＣＤ４＋並びにＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す。さらなる実験では、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）において、ＦＰ９Ａｇ８５Ａが、ＭＶＡ８５Ａを用いる免疫化によって誘導されたＴ細胞応答の相当な追加免疫を誘導することがわかった（図７）。
【０２４２】
方法
雌のＢａｌｂ／ｃマウスを１×１０７ＰＦＵの結核菌由来の抗原８５Ａをコードする組換えＦＰ９（ＦＰ９Ａｇ８５Ａ）を用いて、又は比較用に、１×１０６ＰＦＵの同一抗原をコードするＭＶＡを用いて静脈内免疫化を施した。８５Ａに対する応答を、免疫化の６日後にＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｐ１５エピトープ（ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される）及びＭＨＣクラスＩ拘束性Ｐ１１エピトープ（ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される）を用いて測定した。カラムは、１００万個の脾細胞当たりの平均ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）±群当たり３個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
【０２４３】
抗原８５Ａをコードする組換えＭＶＡ（ＭＶＡ８５Ａ）を用いて２回免疫化した雄のアカゲザルを、２１及び２６週後に５×１０８ＰＦＵのＦＰ９Ａｇ８５Ａを用いて追加免疫した（↓）。Ａｇ８５Ａに対する応答を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、Ａｇ８５Ａポリペプチドのアミノ酸配列にわたるオーバーラップペプチドのプールを用いて末梢血モノヌクレオサイト（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｃｙｔｅｓ）（ＰＢＭＣ）で測定した。曲線は、４プールのペプチドの、１００万個のＰＢＭＣ当たりの平均ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）を表す。
【実施例７】
【０２４４】
ＦＰ９及びＭＶＡは、ウイルス抗原に対する交差反応性Ｔ細胞を生起しない
様々であるが同一でないウイルスベクターを用いるプライム−ブースト免疫化が、組換え抗原に対するＴ細胞応答の増強を生起することを示唆する証拠がある（Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ、印刷中）。最近の証拠により、ウイルスベクターに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、初回抗原刺激剤及び追加免疫剤として同一組換えウイルスを用いる場合には、追加免疫を阻害することが示唆されている（非公開の知見、Ｅｒｉｃ  Ｇ．Ｓｈｅｕ）。ＦＰ９ＰｂＣＳＰを用いて免疫化されたマウス由来の免疫脾細胞は、ＭＶＡに感染したナイーブ細胞に曝露した場合にはＩＦＮγを産生しないが、ＦＰ９に感染した細胞に曝露した場合には産生する（図８）。逆に、ＭＶＡＰｂＣＳＰ免疫脾細胞は、ＭＶＡに感染したナイーブ細胞を認識するがＦＰ９ではそうではない（図８）。これにもかかわらず、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ免疫脾細胞をＭＶＡＰｂＣＳＰに感染した脾細胞に曝露すると、又はその逆、ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞応答を観察することができる（図８）。合わせて考えると、これらの結果は、組換えＦＰ９及び組換えＭＶＡが、両ウイルス由来の抗原と交差反応するＴ細胞を生起することなく、コードされた抗原に対するＴ細胞応答を生起することを示す。
【０２４５】
さらなる予備的結果も、非複製カナリア痘ウイルスも、ＭＶＡと交差反応しないことが示す。したがって、一般に、アビポックスウイルス及びオルトポックスウイルスは、交差反応性Ｔ細胞を生起しない可能性があり、これにより、これらは同一のワクチン接種レジメンにおいて初回抗原刺激剤又は追加免疫剤として適したものとなる。
【０２４６】
方法
Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγ  ｅｌｉｓｐｏｔは、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ又はＭＶＡＰｂＣＳＰのいずれかを用いる静脈内免疫化の１４日後にマウスから単離した脾細胞において、ＰｂＣＳＰ及びウイルス抗原に対して応答する。ＩＦＮγ応答は、免疫化した動物から単離した脾細胞を、Ｐｂ９ペプチドを用いてパルスしたナイーブな脾細胞又はＦＰ９、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ、ＭＶＡ又はＭＶＡＰｂＣＳＰに感染したものに曝露することによって測定した。カラム（図８）は、群当たり３個体のマウスの、１００万個の脾細胞当たりのＩＦＮγスポット形成細胞（ｓｆｃ）の平均数±標準誤差を表す。
【実施例８】
【０２４７】
アビポックスウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖
野生型及び組換えポックスウイルスは、通常、培養ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）でｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖させる。本発明者らの研究室での、培養ＣＥＦ単層に感染させることによって組換えＦＰ９を増殖させる最初の試みでは、一貫性のないウイルスプラーク形成及び低いウイルス収率が認められた（表５）。対照的に、同様の培養ＣＥＦの感染後に、ＭＶＡの良好なプラーク形成及び一貫した高収率が認められた（表５）。新たに調製したＣＥＦを、増殖させずにコンフルエント単層を得るのに十分な濃度で組織培養皿に入れることによって、一次「非培養」ＣＥＦを得ることができる。本発明者らは、ＦＰ９及び組換えＦＰ９が、一次「非培養」ＣＥＦの単層の感染後に目に見えるウイルスプラークを形成し、ウイルスの良好な収率が得られることを見出した（表５）。同様に、本発明者らによって、一次「非培養」ＣＥＦを用いて、弱毒化カナリア痘ウイルス、ＡＬＶＡＣのプラーク形成及び高収率が得られている。
【０２４８】
これらの研究をまとめると、アビポックスウイルスは、増殖必要条件の点では、ＭＶＡ及びおそらくはその他のオルトポックスウイルスよりも選好性であるということが示唆される。理論に拘束されようとは思わないが、本発明者らは、ＣＥＦ内でのアビポックスウイルスの複製には、ＣＥＦがｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養されると失われる特定の宿主分子が必要であると考えている。対照的に、一般に、ＭＶＡ及びおそらくはオルトポックスウイルスは、この宿主分子を複製に必要としない。この知見の主な結果は、一次非培養ＣＥＦが、多量の組換えアビポックスウイルスの生産に必要とされることが多いということである。したがって、実際、第１相臨床試験用の組換えＦＰ９の大規模生産は、「非培養」ＣＥＦを用いてのみ達成されている。
【０２４９】
【表５】
2005517639.tif 000007
【実施例９】
【０２５０】
ヒトボランティアにおけるＦＰ９による熱帯熱マラリア原虫マラリアに対する保護的免疫応答の誘導
ＦＰ９ＭＥＰｆＴｒａｐの第１相臨床試験（実施例５参照）：
健常な成人のボランティアを、３×１０７ＰＦＵを上回るＦＰ９ＭＥＰｆＴｒａｐを用いて２回免疫化し、続いて、同容量のＭＶＡＭＥＰｆＴｒａｐを用いて追加免疫した。５人の免疫化したボランティアのうち２人が、病原性熱帯熱マラリア原虫マラリアに感染した雌のハマダラカ（ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉｉ  ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ）に刺されることによるチャレンジから保護された。
【０２５１】
対照的に、同一実験で、５人のマラリアナイーブなボランティアのうち４人は、熱帯熱マラリア原虫マラリアに屈した。したがって、まず、ヒトボランティアの組換え非複製ウイルスを用いる異種プライム−ブースト免疫化により、感染性疾病に対する保護的免疫応答を生起できることを証明すること。
【０２５２】
保護は、ポックスウイルス免疫化が肝臓における熱帯熱マラリア原虫感染を防ぐことを証明する、ボランティアが血液段階マラリアを発症しないことによって測定した。
【０２５３】
実験ではまた、ＭＥＰｆＴｒａｐポリペプチドに対して生起されたＴ細胞応答によって媒介されると思われるが、保護の機序も調べている。
【実施例１０】
【０２５４】
マラリアが風土病である領域における臨床試験
第１相試験
組換えＦＰ９とＭＶＡとを用いる異種プライム−ブースト免疫化レジメンが、マラリアに曝露された集団において免疫応答を追加免疫できるかどうかを調べるために、ＭＥＰｆＴｒａｐ分子をコードする構築物を用いる第１相臨床試験をガンビアで実施した。
【０２５５】
成人ボランティア（約１２人）を、ＦＰ９ＭＥＰｆＴｒａｐ構築物を用いて２回免疫化し、単回用量のＭＶＡＭＥＰｆＴｒａｐを用いて追加免疫した。血中Ｔ細胞及び抗体免疫応答を測定し、この研究の主な目的は、組換え非複製ポックスウイルスを用いる免疫化が、自然感染によって初回抗原刺激された既存の抗マラリア応答を追加免疫するかどうかを調べることである。
【０２５６】
第２ｂ相試験
第２ｂ相試験はガンビア人の成人で、同一免疫化レジメンを用いて実施されている。
【０２５７】
ボランティアは、マラリアシーズン（６月〜１２月）にわたって実施される試験の過程のあいだ、免疫応答の増強及び血液段階感染の証拠についてモニターされている。
【０２５８】
さらなる試験
さらなる第１相試験も、結核菌及びＨＩＶに対してワクチン接種するために適当な組換えＦＰ９及びＭＶＡを用いて、ガンビアで２００２年の間実施されている。両試験は、それぞれの病原体に感染しているボランティアを用いて実施され、ＦＰ９及び２種の非複製ウイルスを用いる異種プライム−ブースト免疫化レジメン双方の、治療用ワクチンとして働く能力を評価している。
【０２５９】
このようにして、本発明のワクチン接種が保護的応答を生じさせ、且つ／又は増強することが証明される。
【実施例１１】
【０２６０】
非複製組換えポックスウイルスを用いる、ウシ結核菌ＢＣＧによって初回抗原刺激されたＡｇ８５Ａに対するＴ細胞応答の追加免疫
ウシ結核菌ＢＣＧは、結核菌によって起こる結核に対するワクチンとして発展途上国中で子供に広く投与されている。重症幼児期型の結核に対して有効であるが、成人型の疾病に対するウシ結核菌ＢＣＧの保護的効力はかなり可変性であり、時間が経つと薄れると考えられている。Ａｇ８５Ａはウシ結核菌ＢＣＧ及び結核菌双方の主要な分泌抗原であるので、ウシ結核菌ＢＣＧ免疫化によってＡｇ８５Ａに対して生起された免疫応答を追加免疫することは、このワクチンの成人結核に対する保護的効力を増強するための確かな戦略である。この戦略は、他者によってマウスモデルにおいて、組換えＡｇ８５Ａタンパク質を用いて（Ｂｒｏｏｋｓら、２００１  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９、２７１４〜７頁）又はこの抗原をコードするＤＮＡワクチンを用いて（Ｔａｎｇｈｅら、２００１  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９、３０４１〜７頁）追加免疫することによって実施されている。
【０２６１】
ＦＰ９Ａｇ８５Ａは、ＭＶＡ８５Ａを用いた免疫化によって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できるという知見に基づいて、本発明らは、ポックスウイルス構築物が、ウシ結核菌ＢＣＧによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫できるかどうかを調べようとした。Ｂａｌｂ／ｃマウスで実施した予備実験では、ウシ結核菌ＢＣＧを用いた免疫化によって初回抗原刺激されたＡｇ８５Ａ  ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方とも追加免疫できることが示された（図９）。アカゲザルを用いて実施したさらなる実験によって、皮内又はエアゾール経路のいずれかによるウシ結核菌ＢＣＧを用いた免疫化が、Ａｇ８５Ａに対するＴ細胞応答を誘導することが示された。ウシ結核菌ＢＣＧの投与後早期にＭＶＡ８５Ａを用いて追加免疫することにより、ＰＰＤ及びＡｇ８５Ａタンパク質に対する免疫応答の、可変性で短命の増強が生起された。しかし、ＦＰ９Ａｇ８５Ａを用いたその後の追加免疫は、これらのタンパク質に対する（図１０）、並びにＡｇ８５Ａタンパク質配列にわたるペプチドプールに対するＴ細胞免疫応答を大きく増強した。さらなる実験は、免疫化された動物において生起されたＴ細胞応答の性質及び位置を測定する。
【０２６２】
これらの実験は、マウスにおいて及び霊長類において、非複製ウイルスを、ウシ結核菌ＢＣＧによって初回抗原刺激された免疫応答を追加免疫するために使用できるという第１の例を提供する。さらに、それらにより、非複製ポックスウイルスは、ヒトにおいて結核筋による持続性潜在性感染症に対する治療用ワクチンとして有効であり得るという概念が確立される。
【０２６３】
方法
Ｂａｌｂ／ｃマウスをウシ結核菌ＢＣＧを用いて皮内（ｉ．ｄ．）で免疫化し、１２週後に１×１０６ＰＦＵのＭＶＡ８５Ａを用いて皮内で追加免疫した。対照動物はウシ結核菌ＢＣＧ又はＭＶＡ８５Ａ単独を用いて免疫化した。Ｔ細胞免疫応答は、免疫化の１２日後にＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＰ１５（ＣＤ４＋）及びＰ１１（ＣＤ８＋）エピトープを用いて、ＰＰＤ及びＡｇ８５Ａに対して測定した。カラム（図９）は、１００万個の脾細胞当たりの平均ＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）±群当たり３個体のマウスの平均の標準誤差を表す。
【０２６４】
雄のアカゲザルを、ＢＣＧを用いて皮内又はエアゾール送達のいずれかで免疫化し、５×１０８ＰＦＵの組換えＭＶＡ８５Ａを用いて２回及び５×１０８ＰＦＵのＦＰ９Ａｇ８５Ａを用いて２回追加免疫した。Ａｇ８５Ａに対する応答を、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、精製Ａｇ８５Ａ、組換えＡｇ８５Ｂ（Ａｇ８５Ａと約８０％の相同性を共有する）又は結核菌由来の精製タンパク質（ＰＰＤ）を用いて末梢血モノヌクレオサイト（ＰＢＭＣ）で測定した。曲線（図１０）は、単一の動物の１００万個のＰＢＭＣ当たりのＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）を表す。
【実施例１２】
【０２６５】
鶏痘は有効なブーストである
３人の健常なマラリアナイーブなヒトボランティアを以下の通りに免疫化した：
０週に２ｍｇのＤＮＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰ筋内、
３週（２１日目）に再度２ｍｇの同一ワクチン筋内、
７週に１×１０８ｐｆｕのＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰ皮内、及び
１１週に１．５×１０８ｐｆｕのＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰ皮内。
【０２６６】
ＰＢＭＣにおいてＥＬＩＳＰＯＴによって測定された平均応答を図１１に示す。
【０２６７】
ＭＥ応答は、大部分はＣＤ８Ｔ細胞エピトープに対するものである。Ｔ９９６応答はＴＲＡＰの同種株に対するものであり、３Ｄ７応答はＴＲＡＰの異種株に対するものである。
【０２６８】
ＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰがＤＮＡによって初回抗原刺激されたＴ細胞応答を追加免疫することは明らかである。ＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰを用いたさらなる免疫化が、ＤＤＦレジメンによって誘導された応答を増強することも明らかである。
【０２６９】
ＦＰ９が、ヒト霊長類においてＴ細胞応答に対する有効なブーストを提供することもさらに証明される。
【０２７０】
ヒト霊長類におけるＤＮＡ、次いでＦＰ９、次いでＭＶＡを用いる三重免疫化レジメン（ＤＤＦＭ）の有効性もまた証明される。
【実施例１３】
【０２７１】
鶏痘は有効なプライムである
マラリアナイーブなヒトボランティアを、ＦＰ９−ＭＶＡプライム−ブーストレジメンを用いて以下の通りに免疫化した：
この実施例では、２つのコホートがあり、一方は５人のワクチン接種された人であり、もう一方は１２人のワクチン接種された人である。
【０２７２】
ＦＦＭレジメン
０日目に、ＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰを１×１０８ｐｆｕで皮内投与した
２１日目に、ＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰを１×１０８ｐｆｕで皮内投与した
４９日目に、ＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰを１．５×１０８ｐｆｕの用量で皮内投与した。
【０２７３】
すべてのボランティア及び非ワクチン接種対照を、感染性蚊が刺すことによって３Ｄ７株熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを投与してチャレンジした。
【０２７４】
第１のコホートでは、２／５のＦＦＭワクチン接種された人が感染から十分に保護された。このレベルの保護は、種々の時点で同様にチャレンジされた２４プールの非ワクチン接種対照とは有意に異なり（Ｐ＜０．０５、カイ二乗検定）、すべての対照が感染した。
【０２７５】
保護された、２人のワクチン接種された人が６ヶ月後に再チャレンジされたが、１人は依然として十分に保護されていた。
【０２７６】
第２のコホートでは１１人のボランティアが同じようにチャレンジされたが、これらのワクチンにより、パテントマラリア寄生虫血症が対照ワクチンよりもかなり遅くに発生した（Ｐ＜０．０５）。
【０２７７】
図１２は、寄生虫は末梢血中では４８時間毎に８倍に増殖すると仮定して算出した、ワクチン接種に起因する肝臓段階寄生虫の減少を示す。「後期ＦＦＭ」群は、２人の再チャレンジを受けた人（前記参照）を表し、さらなるボランティアはまず、ワクチン接種の５ヶ月後にチャレンジされた（ＦＦＭ群は最後のワクチン接種の１３〜５０日後にチャレンジされた）。
【０２７８】
ＦＰ９を用いる単回の初回抗原刺激免疫化のみを投与された４人のワクチン接種を受けた人（「ＦＭ」）の結果も示す。ワクチン及び非ワクチン接種チャレンジ対照における、寄生虫血症に対する時間のログランク検定カプランマイヤー解析から危険率有意水準を算出する。
【０２７９】
全体として、ＦＦＭワクチンでは、対照と比べて高度に有意な保護が認められた（Ｐ＜０．０１）。
【０２８０】
ＤＤＭＦレジメン（４週間間隔で２ｍｇ筋内の２回のＤＮＡ投与と、それに続く３〜４週間後の１．５×１０８ＭＶＡ  ＭＥ．ＴＲＡＰと、それに続く３〜４週間後の１．０×１０８ＦＰ９−ＭＥ．ＴＲＡＰ）を用いて免疫化した４人の個人もまた、有意に保護された（Ｐ＜０．０５）。
【０２８１】
したがって、ＦＰ９などの鶏痘は、本発明の方法において有効なプライム並びに有効なブーストであるということが証明される。
【実施例１４】
【０２８２】
高用量免疫化レジメンの臨床試験
高用量プライム−ブーストレジメンを、マラリア感染に長期間曝露されていた地方のガンビア人の成人男性で調べた。
【０２８３】
２８人の被験者をＭＥ．ＴＲＡＰワクチンを用いて、以下に示したレジメンの一方に従って免疫化した（群当たり１４人の被験者／レジメン）：
１）ＤＤＭレジメン
３〜４週間隔で２回（ＤＤＭ）又は３回（ＤＤＤＭ）投与するＤＮＡ（２ｍｇ筋内）と、それに続くＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰ１．５×１０８皮内（ＤＤＭ群−図１３ではＤＤＭ及びＤＤＤＭワクチン亜群は、これらの間に有意差がないのでまとめられている）
【０２８４】
２）ＦＦＭレジメン
３週間隔で２回投与するＦＰ９（１×１０８皮内）と、それに続くＭＶＡ−ＭＥ．ＴＲＡＰ１．５×１０８皮内（ＦＦＭ群）。
【０２８５】
データは図１３に示されている。
【０２８６】
両群とも、ワクチン接種の前にマラリアＭＥ．ＴＲＡＰインサートに対してＴ細胞応答を示した。これらの応答は、ＤＮＡ免疫化よりもＦＰ９免疫化によって追加免疫され（ＤＤ＋７日とＦＦ＋７日を比較）、このことは、ＦＰ９免疫化がヒト霊長類において自然に初回抗原刺激されたＴ細胞応答を追加免疫することを示す。
【０２８７】
ＤＤＭとＦＦＭレジメンは双方とも、マラリアに自然に曝露されているこれらのボランティア被験体において高レベル（＞２５０／１００万個）Ｔ細胞応答を誘導した。
【０２８８】
プライム−ブーストレジメン（ＤＤＭ及びＦＦＭ）は、これらの個体におけるＴ細胞応答が自然マラリア感染によって初回抗原刺激されていても、ＦＰ９単独及びＭＶＡ単独よりも免疫原性であるということが証明される。
【０２８９】
誘導された応答は、良好なマラリア株交差反応性を示す−ＴＲＡＰのワクチン株（Ｔ９９６）と３Ｄ７非ワクチン株に対する応答の大きさは同等であることも証明される。
【０２９０】
同一ＦＦＭレジメンを用いて免疫化した１１人のヒト霊長類ボランティアにおいて同程度の免疫原性が認められた（図１４参照）。
【０２９１】
したがって、本発明による被験者の処置によって、被験者に保護的免疫応答が生じることが証明される。
【実施例１５】
【０２９２】
霊長類におけるＴＢ抗原に対する免疫化
結核に対するプライム−ブースト免疫化の潜在的に可能な保護効力を評価するために、以下の研究では、霊長類において組換えＦＰ９を追加免疫剤として使用することを実施した。
【０２９３】
この実施例では、霊長類は、マカク属のサル、天然に結核菌に対して感受性のある動物である。
【０２９４】
オランダの生物医学霊長類センター（ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｃｅｎｔｒｅ）（ＢＰＲＣ）で３個体のカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を、ＢＣＧを用いて皮内で免疫化し、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａを８週間後に皮内投与し、さらに４週間後にＦＰ９−Ａｇ８５Ａを皮内投与した。対応する３個体の他のマカク属のサルは、ＢＣＧ単独を用いて免疫化した。最終免疫化の４週間後、これらすべてのマカク属のサル及び免疫化していないマカク属のサルを、結核菌の多量気管内投与（１０００ＣＦＵ）でチャレンジした。動物は２８週間観察し、イムノアッセイを実施し、動物をチャレンジ後２８週で犠牲にし、剖検を実施した。
【０２９５】
剖検時に、免疫化していないマカク属のサルはすべて、結核の巨視的証拠があり、１／３のＢＣＧを用いて免疫化したマカク属のサルには結核の巨視的証拠がなく、２／３のＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９を用いて免疫化したマカク属のサルには結核の証拠がなかった。
【０２９６】
ＰＰＤ及びＥＳＡＴ−６を放線菌抗原として用いるチャレンジ後のＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９を用いて免疫化した動物において、チャレンジ対照よりもかなり低い応答が示された。
【０２９７】
ＰＰＤを放線菌抗原として用いるチャレンジ後インターフェロンγＥＬＩＳＡアッセイにより、ＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９を用いて免疫化した動物において、ＢＣＧ単独で、又はアジュバント単独（対照動物）で免疫化したチャレンジ対照よりもかなり低い応答が示され、このことは、これらのＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９プライム−ブーストされたマカク属のサルは、結核から極めて大きく保護されたという考えをサポートするものである（図１８）。図は、カニクイザルの気管内結核菌チャレンジ後種々の週でのＰＰＤに対する平均インターフェロンγ応答を示す。ＢＣＧ−ＭＶＡ−ＦＰ９動物は、ＰＰＤに対して最低の免疫応答を有し、このことにより、チャレンジ後の最小の結核菌複製、ひいては最大度の保護が示される。ＥＳＡＴ６を抗原として同様のデータを得た。
【０２９８】
したがって、本発明に従ってプライム−ブースト免疫化されたマカク属のサルなどの霊長類は、結核から極めて大きく保護されていることが証明される。
【実施例１６】
【０２９９】
ＦＰ９株は、ＣＤ８Ｔ細胞応答の初回抗原刺激及び追加免疫では、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）のＦＰＶ−Ｍより強力である。
【０３００】
目的：ＦＰ９ＰｂＣＳＰが、ＭＶＡＰｂＣＳＰと臨床上関連のある経路によって、プライム／ブーストレジメンで投与された場合に、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰと比べて抗原特異的Ｔ細胞応答の増強を生起するかどうかを調べること。
【０３０１】
方法
雌のＢＡＬＢ／ｃ（６〜８週齢）を、ＦＰＰｂＣＳＰ、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰ又はＭＶＡ  ＰｂＣＳＰを用いて皮内で免疫化し、２週間後に同様の方法で追加免疫した。ウイルスは発熱物質を含まないＰＢＳで２×１０７ＰＦＵ／ｍｌに希釈し、本願の実施例１及び２に記載したように特性決定し、２５ｕｌをマウスの各耳に両側注射することによって皮内投与した。免疫化の１４日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、ＰｂＣＳＰのＰｂ９エピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を、以下に記載したようにＩＦＮγアッセイを用いて測定した。
【０３０２】
マウスＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴプロトコール
Ａ．材料
ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ  ＡＬＰキットＭａｂｔｅｃｈ３３２１−２Ａ
６００μｇ  抗ＩＦＮγ精製Ｍａｂ  ＡＮ１８
５０μｇ  抗ＩＮＦγビオチン化Ｍａｂ  Ｒ４６Ａ２
５０μｌ  ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ
完全αＭＥＭ培地
５００ｍｌ  ＭＥＭα改変Ｓｉｇｍａ  Ｍ−４５２６
５０ｍｌ  ＦＣＳ［１０％］Ｓｉｇｍａ  Ｆ−２４４２
５ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシン［１００Ｕペニシリン１００μｇストレプトマイシン］Ｓｉｇｍａ  Ｐ−０７８１
１０ｍｌ  Ｌ−グルタミン［４ｍＭ］Ｓｉｇｍａ  Ｇ−７５１３
５００μｌ  ２−メルカプトエタノール［５０μｍ］Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ３１３５０−０１０
ＡＣＫバッファー
８．２９ｇ  ＮＨ４Ｃｌ［０．１５Ｍ］（Ｓｉｇｍａ  Ａ−４５１４）
１ｇ  ＫＨＣＯ３［１ｍＭ］（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−９１４４）
３７．２ｍｇ  Ｎａ２ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  ＥＤ２ＳＳ）
８００ｍｌ  ミリＱ水
ｐＨをＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ−７６５３）で７．２〜７．４に調製
水を加えて１０００ｍｌとし、オートクレーブ処理
呈色バッファー：
ＢｉｏＲａｄ  ＡＰコンジュゲート基質キット（１７０−６４３２）
１プレートにつき：
５ｍｌ  脱イオン水
２００μｌの２５×バッファー
５０μｌ  試薬Ａ
５０μｌ  試薬Ｂ
十分に混合し直ちに用いる
プロトコール
１．プレートの調製：
１．１  プレートのコーティング：ＭＡＩＰマルチスクリーンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＩＰＳ４５１０）をラット抗マウスＩＦＮγ（Ｍａｂ  ＡＮ１８）抗体でコーティングする。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ  Ｐ−３８１３）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、ウェルあたり５０μｌをＭＡＩＰプレートに加える。加湿されたチャンバー内で４℃で一晩インキュベートする。
【０３０３】
１．２  プレートのブロッキング：コーティング抗体を振り捨て、マルチチャンネルピペットを用いて、プレートをウェル当たり１５０μｌの滅菌ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−３８１３）で１回洗浄する。ＰＢＳを振り捨て、ウェル当たり１００μｌの完全α−ＭＥＭ培地を加え、室温で１＋時間インキュベートする。この段階ではプレートを滅菌状態で維持することが重要である。
【０３０４】
２．脾細胞調製：
２．１  個々の脾臓を、２ｍｌのＰＢＳ中でペトリ皿に入れた細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ３５２３５０）中の１０ｍｌシリンジのプランジャーで粉砕し、５ｍｌのＰＢＳを加え、ピペッティングすることによって脾細胞を懸濁し、５０ｍｌの試験管に移す。さらに１０ｍｌのＰＢＳで細胞濾過器及び皿をすすぎ、５０ｍｌの試験管に加える。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
【０３０５】
２．２  上清を除去し、試験管をタッピングすることによって細胞を再懸濁し、５ｍｌのＡＣＫバッファーを加え、反転することによって混合する。室温でわずか５分間インキュベートする。２５ｍｌのＰＢＳを加え、反転することによって混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
【０３０６】
２．３  上清を除去し、試験管をタッピングすることによってペレットを再懸濁し、１０ｍｌのＰＢＳを加え、ボルテックス処理する。改良型ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）血球計算器を用い、０．４％トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−８１５４）で１：１０希釈することによって計数する。Ｅｌｉｓｐｏｔに必要な量をアリコートとし、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、適当な容量の完全αＭＥＭ培地中でボルテックス処理することによって再懸濁して１０００万個細胞／ｍｌの濃度とする。
【０３０７】
３．プレート配置：
2005517639.tif 000008
2005517639.tif 000009
【０３０８】
注意：プレートレイアウトは、特定の実験の必要に応じてオペレーターによって選択できる。
【０３０９】
３．１  ブロッキング培地をプレートから振り捨て、３、４、７、８、１１及び１２列に５０μｌの完全αＭＥＭ培地を加える。
【０３１０】
３．２  ２連で、１５０μｌの脾細胞を２、６及び１０列に加える（プレート当たり最大１２サンプル）。
【０３１１】
３．３  ５０μｌの脾細胞を２、６及び１０列から採取し、１、５及び９列にそれぞれ移す：これらは負の対照ウェルである。
【０３１２】
３．４  ５０μｌを２、６及び１０列から採取して３、７及び１１列に入れ、十分に混合し、５０μｌを４、９及び１２列に移すことによって各サンプルを段階希釈する。希釈の最終列をよく混合した後５０μｌ廃棄する。
【０３１３】
３．５  試験ペプチド及び対照ペプチドを、所望の最終濃度の２倍に、１０００万個／完全α−ＭＥＭ培地１ｍｌで未処理の脾細胞に加える。５０μｌの対照ペプチド及び標的細胞を、１、５及び９列に加える。５０μｌの試験ペプチド及び標的細胞を残りの列に加える。
【０３１４】
３．６  ３７℃で１８〜２０時間インキュベートする。
【０３１５】
４．アッセイの発現
４．１  プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ  Ｐ１３７９）を含有するＰＢＳで２回、蒸留水で１回、及びＰＢＳＴで２回洗浄する。
【０３１６】
４．２  ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した、５０μｌ／ウェルのビオチン化ラット抗マウスインターフェロンγを加える。室温で２時間インキュベートする。
【０３１７】
４．３  プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、次いで、ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した、５０μｌのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を加える。室温で１時間インキュベートする。
【０３１８】
４．４  プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの呈色バッファーを加える。
【０３１９】
４．５  室温で、スポットが発現するまで（約１０分）インキュベートする。プレートを水道水で十分に洗浄し、プラスチックの底部を剥がし、ペーパータオル上で一晩乾燥させる。
【０３２０】
結果
結果は抗原特異的ＩＦＮγスポット形成細胞／１００万個脾細胞（ｓｆｃ／１００万個）の数として算出した。マイクロソフトエクセル２０００を用いて、スチューデントのＴ検定（等しい分散を仮定する２サンプル）によって群間の相違を調べた。
【０３２１】
ＦＰ９ＰｂＣＳＰは、初回抗原刺激剤として（Ｐ＝０．００２）又は追加免疫剤として（Ｐ＝０．００４）ＭＶＡＰｂＣＳＰと併用した場合に、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰと比べて有意に増強されたＰｂＣＳＰに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を生起した（図１５）。興味深いことに、ＦＰ９ＰｂＣＳＰを用いて初回抗原刺激されており、ＭＶＡＰｂＣＳＰを用いて追加免疫された群とその逆の間に有意な相違はなかった。
【０３２２】
したがって、ＦＰ９ＰｂＣＳＰは、初回抗原刺激剤及び／又は追加免疫剤としてＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰよりも強力であり、組換えＭＶＡと併用した初回抗原刺激剤又は追加免疫剤としては同程度に強力であることを証明した。
【実施例１７】
【０３２３】
組換えＦＰ９はウイルス疾病から保護する
目的
組換えＦＰ９を単独で又はプライム／ブーストレジメンで用いた免疫化が、ウイルス及び腫瘍抗原由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞応答を生起するかどうかを調べること。
【０３２４】
方法
リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原及びマウス腫瘍（Ｐ８１５及びＣＴ２６）抗原由来の、特性決定されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋拘束性エピトープからなる新規ポリペプチドをコードする４４０ｂｐの合成遺伝子（ＭＥ１）を、以下の通りに合成した：
ＭＥ１モデルエピトープ鎖：
慢性感染（ＬＣＭＶ）及び癌（Ｐ８１５／ＣＴ２６）のマウスモデルにおいて関連のある、腫瘍及びウイルスエピトープをコードするＴ細胞エピトープ鎖を以下に示すように作製した。
【０３２５】
2005517639.tif 000010
【０３２６】
潜在的に可能な免疫競合を避けるために、ＬＣＭＶ由来エピトープはＨ−２ｂ拘束性とし、癌エピトープはＨ−２ｄ拘束性とする。エピトープの順序はＨ−２ｄとＨ−２ｂ間で交代にする。
【０３２７】
エピトープ鎖配列
エピトープを示すもの：
クローニング部位Ｋｏｚａｋ  Ｍ［ＧＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶＥＦＤ］［ＫＡＶＹＮＦＡＴＣＧＩ］［ＬＰＹＬＧＷＬＶＦ］［ＦＱＰＱＮＧＱＦＩ］［ＧＹＣＧＬＲＧＴＧＶ］［ＳＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬ］［ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ］［ＹＴＶＫＹＰＮＬ］［ＴＰＨＰＡＲＩＧＬ］［ＣＳＡＮＮＳＨＨＹＩ］［ＳＧＥＧＷＰＹＩＡＣＲＴＳＩＶＧＲＡＷＥ］［ＤＡＰＩＹＴＮＶ］［ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ］ＡＡ（停止シグナル）
アミノ酸鎖：
ＭＧＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶＥＦＤＫＡＶＹＮＦＡＴＣＧＩＬＰＹＬＧＷＬＶＦＦＱＰＱＮＧＱＦＩＧＹＣＧＬＲＧＴＧＶＳＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬＳＰＳＹＡＹＨＱＦＹＴＶＫＹＰＮＬＴＰＨＰＡＲＩＧＬＣＳＡＮＮＳＨＨＹＩＳＧＥＧＷＰＹＩＡＣＲＴＳＩＶＧＲＡＷＥＤＡＰＩＹＴＮＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡＡ
フランキングヌクレオチド及びアミノ酸
ＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ．．．
ＭＧＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶＥＦＤＫＡＶＹＮＦＡＴＣＧＩＬ
ＰＹＬＧＷＬＶＦＦＱＰＱＮＧＱＦＩＧＹＣＧＬＲＧＴＧＶＳＧＶＥＮＰＧＧＹＣＬＳＰＳＹＡＹＨＱＦＹＴＶＫＹＰＮＬＴＰ
ＨＰＡＲＩＧＬＣＳＡＮＮＳＨＨＹＩＳＧＥＧＷＰＹＩＡＣＲＴＳＩＶＧＲＡＷＥＤＡＰＩ
．．．ＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣ
ＹＴＮＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡＡ
エピトープ鎖はＡｐａＩもＡｓｃＩ標的配列も含まない。
【０３２８】
エピトープ鎖は、ポックスウイルス初期遺伝子転写終結配列、ＴＴＴＴＴＮＴを含まない。
【０３２９】
ベクター製造
ＭＥ１エピトープ鎖をＤＮＡワクチンベクター（ＰＳＧ２）及び鶏痘シャトルベクターｐＥＦＬ２９に連結した。次いで、プラスミドｐＥＦＬ２９．ＭＥ１を、確立された方法に従ってＦＰ９の染色体に組換え、ＦＰ９．ＭＥ１を構築した。
【０３３０】
次いで、このウイルスを、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で増殖させ、３０％ショ糖クッションを通して遠心分離することによって大量精製した。ウイルスの力価を、確立された方法にしたがって、ＣＥＦで滴定し、Ｘ−ｇａｌで染色することによって確認した。ウイルスは、発熱物質を含まないＰＢＳに１×１０７ＰＦＵ／ｍｌに懸濁することによって免疫化用に調製した。プラスミドＰＳＧ２．ＭＥ１は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｉｇａカラムを用いて大量精製し、発熱物質を含まないＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。
【０３３１】
雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス（６〜８週齢）を、ＰＳＧ２．ＭＥ１又は無関係なエピトープ鎖を含む対照プラスミドｐＳＧ２．Ｍｅｌ３を用いて筋内（ｉｍ．）で免疫化した。ウイルスＦＰ９．ＭＥ１及び空の対照ウイルスＦＰ９．ＥＦＬ２９を、尾の静脈に１×１０６ＰＦＵの用量で静脈内（ｉｖ．）投与した。動物を、免疫化の２週間後に追加免疫した。追加免疫の１４日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、ＬＣＭＶ、Ｐ８１５、ＣＴ２６及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を、実施例１６に記載したようなＩＦＮγアッセイを用いて測定した。
【０３３２】
結果は、抗原特異的ＩＦＮγスポット形成細胞／１００万個の脾細胞（ｓｆｃ／１００万個）として算出した。群間の相違は、マイクロソフトエクセル２０００を用いてスチューデントのＴ検定（等しい分散を仮定する２サンプル）及びＡＮＯＶＡによって調べた。
【０３３３】
実験設計及び結果
ウイルスと腫瘍エピトープ間の競合を避けるために、ＭＥ１は、Ｈ−２ｂハプロタイプマウスに特徴的なＬＣＭＶ抗原由来のエピトープと、Ｈ−２ｄハプロタイプマウスに特徴的な腫瘍抗原由来のものとをコードする。したがって、ＦＰ９．ＭＥ１の、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを生起する能力を、表６に記載したようにＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｄ）マウス双方で調べた。これらの実験の結果を表６に示す。
【０３３４】
【表６】
2005517639.tif 000011
【０３３５】
実験１及び２を平行して実施した。各群には４個体の６〜８週齢の雌のマウスを含めた。ワクチンは、方法に記載した通りに投与し、初回抗原刺激と追加免疫は１４〜１６日離れている。Ｔ細胞応答は、実施例１６におけるようなＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ＬＣＭＶ、腫瘍及び前記のモデルエピトープを用いて測定した。結果は、ＬＣＭＶ及び腫瘍由来エピトープに対する累積応答に関し、これはマウスマラリア及び結核モデルを用いた知見に基づいている。
【実施例１８】
【０３３６】
組換え体ＦＰ９は癌から保護する
目的
マウスにおいて、ＦＰ９．ＭＥ１を単独で又はｐＳＧ２．ＭＥ１とともにプライム／ブーストレジメンで用いた免疫化が、ＣＴ２６腫瘍チャレンジに対する保護的免疫応答を生起するかどうかを調べること。したがって、組換えＦＰ９が、癌から保護する抗原特異的Ｔ細胞応答を生起できることを概ね証明すること。
【０３３７】
方法
雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス（６〜８週齢）に、ｐＳＧ２．ＭＥ１、ＦＰ９．ＭＥ１又は前記のような対照構築物ｐＳＧ．Ｍｅｌ３及びＦＰ９．ＥＦＬ２９を用いて注射する。動物に免疫化の２週間後に追加免疫を行う。追加免疫の１４日後、マウスの左脇腹に、以下の通りに５×１０５個ＣＴ２６腫瘍細胞を用いて皮下（ｓｃ．）注射することによってチャレンジする。
【０３３８】
ＣＴ２６腫瘍の皮下増殖
いくつかの実験上の問題は、皮下に移植した測定可能な充実腫瘍塊を用いることで最良に対処される。ＣＴ２６細胞はこの実験アプローチを受け入れられる。従来の野生型ＣＴ２６細胞は、皮下空間では横方向拡大様式で増殖するが、高度にトランスフェクト可能な変異体、ＣＴ２６は、おそらくは接着性の増加と関連して、より緻密な腫瘍塊として良好に増殖し、これによって測定値がより再現性のあるものとなる。
【０３３９】
材料
ＣＴ２６細胞
１０％（ｗ／ｖ）ＦＣＳを含む完全ＤＭＥＭ培地
滅菌ＰＢＳ
ＢＡＬＢ／ｃマウス、６〜８週齢
１ｍｌ滅菌使い捨てシリンジ
１６−Ｇ及び２５−Ｇのニードル
ノギス
細胞を計数するためのさらなる試薬及び装置。
【０３４０】
１．１０％ＦＣＳを含む完全ＤＭＥＭ培地でＣＴ２６細胞を培養する。
【０３４１】
２．細胞を回収し、２００×ｇ、室温で５分間遠心分離することによってＰＢＳで２回すすぐ。
【０３４２】
３．細胞を計数し、ＰＢＳに２×１０７個細胞／ｍｌで再懸濁する。懸濁液を１ｍｌシリンジに移し、次いで１６−Ｇニードルを２５−Ｇニードルに変更する。
【０３４３】
４．５０μｌ／マウスを皮下注射することによってＢＡＬＢ／ｃマウスに播種する。
【０３４４】
穏やかにタッピングし、反転することによって、注射の直前にシリンジ中で細胞が確実に均一に再懸濁されるようにする。
【０３４５】
所与の条件により１０６個の腫瘍細胞が移植されることとなる。２×１０５〜１×１０７個細胞の細胞濃度を用いることに成功した。
【０３４６】
５．手順は１人のオペレーターによって迅速に達成することができる。マウスを左手に持ち、首筋を最初の２本の指の間に入れ、尾を掌と４番目の指で挟む。右手は、シリンジを持ち、ニードルをマウスの左脇腹の皮膚のみを通して挿入する。手段としてのシリンジとニードルを用いながら、皮膚をマウスの体から離して穏やかに持ち上げ、確実にニードルの先が皮下空間にあるようにしなければならない。その時に初めて５０μｌ容量を押し出す。
【０３４７】
マウスを、少なくとも週に２回、腫瘍増殖について調べるために、及び全身の健康状態を評価するために調査する。腫瘍が現れれば、ノギスを用いて最長及び最短寸法を測定及び記録する。
【０３４８】
これらの２つの測定値の平均により、そのマウスのその時点での平均腫瘍直径が得られる。
【０３４９】
腫瘍はまず、移植の１週間後には触診できる。測定値は０．５ｍｍ近くになっているはずである。
【０３５０】
マウスは、腫瘍発達の証拠についてチャレンジ後２週間観察し、その後犠牲にし、解剖する。腫瘍の大きさは、腫瘍の長さと幅を測定し、次いで、これらの測定値の平均をとることによって求める。ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ  Ｉｎｓｔａｔを用いて、フィッシャーの精密検定によって求められる腫瘍発生率の相違について、及びスチューデントのＴ検定（等しくない分散を仮定する２サンプル）を用いて腫瘍の大きさの相違について統計解析を実施する。
【０３５１】
実験設計及び予想される結果
ＣＴ２６は、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の結腸癌腫細胞株である。ＤＴ２６は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、皮下注射の約１週間後に充実腫瘍を形成する。ＭＥ１エピトープ鎖は、ＣＴ２６腫瘍によって発現される（前記参照）、ＭｕＬＶｇｐ７０エンベロープタンパク質由来の保護的ＣＤ８＋拘束性エピトープを含む。ｐＳＧ２．ＭＥ１とそれに続いてＦＰ９．ＭＥ１を用いるプライム／ブースト免疫化レジメンは、このエピロープに対して増強されたＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を生起するので（前記参照）、本発明者らは、この免疫化レジメンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにいおてＣＴ２６チャレンジからの保護を生起するということを示した。表７は結果を示す。
【０３５２】
【表７】
2005517639.tif 000012
【０３５３】
１２ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、１４日離して、示したように初回抗原刺激及び追加免疫する。追加免疫の１４日後、動物をＣＴ２６細胞を用いて左脇腹に皮下注射することによってチャレンジする。動物は２週間観察し、次いで、解剖し、腫瘍の存在及び大きさを方法に記載したように測定する。
【０３５４】
表は１６で示された免疫原性データに基づいた腫瘍発生率を示す。各群の平均の腫瘍の大きさの相違も予測されるが、表には示していない。
【実施例１９】
【０３５５】
組換えＦＰ９は、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）から保護する
目的：マウスにおいて、ＦＰ９．ＭＥ１を単独で又はＰＳＧ２．ＭＥ１とともにプライムブーストレジメンで用いた免疫化が、ＬＣＭＶチャレンジに対する保護的免疫応答を生起するかどうかを調べること。
【０３５６】
これにより、組換えＦＰ９が、本発明に従って用いた場合に、ウイルス感染から保護する抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生起できることが証明される。
【０３５７】
方法
雌のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス（６〜８週齢）に、ＰＳＧ２．ＭＥ１、ＦＰ９．ＭＥ１又は前記のような対照構築物ｐＳＧ２．Ｍｅｌ３及びＦＰ９．ＥＦＬ２９を用いて注射した。動物には免疫化の２週間後に追加免疫を行った。追加免疫の１４日後、群当たり６個体の動物を２×１０５ＰＦＵ  ＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（穏やかな感染）を用いて腹腔内（ｉｐ．）注射することによって、また６個体の動物を２×１０６ＰＦＵ  ＬＣＭＶクローン１３（重症感染）を用いてｉｖ．でチャレンジした。
【０３５８】
ＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇを用いてチャレンジした動物は、チャレンジの３日後に犠牲にし、ＬＣＭＶクローン１３を用いてチャレンジしたものはチャレンジの７日後に犠牲にした。
【０３５９】
チャレンジされた動物の脾臓中のウイルス含量を以下の通りに測定する：
ＬＣＭＶの滴定のためのプラークアッセイ
１．  ３ｍｌの培地中の３×１０５個のベロ細胞をアリコートとし、６ウェルプレートの各ウェルに入れ、５％ＣＯ２下、コンフルエント単層を形成するまで３７℃で一晩培養する。
【０３６０】
２．  １：１００（１０μｌサンプル＋１ｍｌ培地）で出発して、その後１０倍希釈（１００μｌ＋９００μｌ培地）を作製し、氷上で試験サンプルの段階希釈を作製する。
【０３６１】
３．  ベロ細胞から培地を除去し（単層を破損しないよう注意しながら）、ウェル当たり５００μｌの希釈した試験サンプルを加える。培地のみを加えたウェルを負の対照として、アッセイ当たり少なくとも１つ含める。プレートを、５％ＣＯ２下３７℃で１時間インキュベートしてウイルス感染させる。
【０３６２】
４．  各ウェルを３〜４ｍｌの、１％アガロース水溶液と１０％ＦＢＳを含有する２×１９９培地の１：１混合物で覆う。プレートをホイルに包み、５％ＣＯ２インキュベーター下３７℃で６日間培養する。
【０３６３】
５．  固定及び染色する。
【０３６４】
エクセル２０００を用いて、カイ二乗検定によって求められる感染の発生率の相違について、及びスチューデントのＴ検定（等しい分散を仮定する２サンプル）を用いて求められるウイルス含量の相違について統計解析を実施した。両側Ｐ値をすべての場合に求めた。
【０３６５】
結果
ＬＣＭＶは十分に特性決定されたウイルスであり、マウスにおいて慢性及び急性感染を引き起こす。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ株は、穏やかな、自己回復性感染を引き起こし、他方、クローン１３株は、慢性感染に発達し得る重症感染を引き起こす。ＭＥ１エピトープ株は、ＬＣＭＶ由来の２種のＣＤ４＋エピトープといくつかのＣＤ８＋拘束性エピトープ（前記参照）を含むよう設計し、それらのうちのいくつかはＬＣＭＶ感染に対して保護的であると特性決定されている。ＦＰ９．ＭＥ１を用いるプライム／ブースト免疫化は、ＭＥ１中のＬＣＭＶエピトープに対する有意に増強されたＴ細胞応答を生起するので（図１７）、この免疫化レジメンは、ＬＣＭＶのＡｒｍｓｔｒｏｎｇ及びクローン１３株の双方を用いるチャレンジに対して保護的効力を示す。表８は結果を示す。
【０３６６】
【表８】
2005517639.tif 000013
【０３６７】
１２個体のＣ５７ＢＬ／６マウスの群を、１４日間離して、示した通りに初回抗原刺激及び追加免疫する。追加免疫の１４日後、群当たり６個体の動物を、ＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（穏やかな感染）及びＬＣＭＶクローン１３（重症感染）を用いて方法に記載した通りにチャレンジする。このアッセイの検出限界は１０００ｐｆｕ／器官（ｌｏｇ１０３．００）である。
【０３６８】
群Ａ、Ｂ及びＣのウイルス含量は、群当たり６個体を用いる結果に基づいている。Ｄ、Ｅ及びＦのウイルス含量は、図１７に示される免疫原性結果に基づいている。
【０３６９】
図１５は、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰ及びＭＶＡＰｂＣＳＰを用いる異種プライム／ブースト免疫化後の抗原特異的免疫応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＦＰ９ＰｂＣＳＰ（ＦＰ９）、ＦＰＶ−ＭＰｂＣＳＰ（ＦＰＶ−Ｍ）又はＭＶＡＰｂＣＳＰを用いて両側の耳に皮内で免疫化し、１４日後同様の方法で異種追加免疫した。ブースター免疫化の１４日後、ＰｂＣＳＰのＰｂ９エピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を、脾細胞においてＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて測定した。カラムは、平均抗原特異的ＩＦＮγｓｆｃ／１００万個脾細胞±群当たり４個体のマウスの１標準偏差を表す。Ｐ値は、マイクロソフトエクセル２０００を用いて、等しい分散を仮定するスチューデントのＴ検定によって求めた。
【実施例２０】
【０３７０】
ウェブスターの弱毒鶏痘はＦＰ９とは異なっている
この実施例では、既存の鶏痘ベクターと比較したＦＰ９の独特の特性が証明される。ＦＰ９の遺伝子組成を前記のように調べ、既存のポックスベクター「ウェブスター」と比較する。データを表９に示す。
【０３７１】
欠失
ＦＰ９には、病原性ＵＳ  ＦＰＶ配列（ＦＰＶ  ＵＳ；Ａｆｏｎｓｏら、２０００）と比べて２５の欠失が認められた。これらのうち６はＵＳとヨーロッパ系統間の相違であり、１９は継代（及び付随する弱毒化）の間に生じ、これが最終的にＦＰ９をもたらした。
【０３７２】
１９の継代特異的欠失遺伝子座のうち、１５をウェブスター（ＦＰＶ−Ｍ）で調べたところ、すべてがＦＰＶＵＳと同一であるがＦＰ９のものとは異なる配列を示す。
【０３７３】
挿入
同様に、１５の挿入がＦＰ９とＦＰＶ  ＵＳを区別する。これらのうち、５は継代及び弱毒化の間に生じた。
【０３７４】
これら５つのうち１つの継代特異的挿入遺伝子座をウェブスターで調べたところ、ＦＰＶ  ＵＳと同一であるが、ＦＰ９とは異なる配列を示す。
【０３７５】
塩基置換
７７の一塩基置換によって、ＦＰ９はＦＰＶ  ＵＳと区別される。これらのうち、２５は継代及び弱毒化の間に生じた。
【０３７６】
これら２５のうち１１の継代特異的置換部位をウェブスターで調べたところ、すべての場合で、ＦＰＶ  ＵＳと同一であるが、ＦＰ９とは異なる配列を有している。したがって、ＨＰ１にも認められる別のＦＰ９突然変異は系統特異的突然変異であり、ウェブスターではＦＰＶ  ＵＳと同一である。
【０３７７】
したがって、ウェブスター弱毒化ワクチンは、ＦＰ９とは明らかに遺伝的に区別される。
【０３７８】
【表９Ａ】
2005517639.tif 000014
【０３７９】
【表９Ｂ】
2005517639.tif 000015
【０３８０】
【表９Ｃ】
2005517639.tif 000016
【０３８１】
【表９Ｄ】
2005517639.tif 000017
【実施例２１】
【０３８２】
組換えＦＰ９は、ウイルス及び腫瘍由来エピトープに対するＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答を生起する
目的
実施例１７に加え、この実施例では、組換えＦＰ９を単独で又はプライム／ブーストレジメンで用いた免疫化が、ウイルス及び腫瘍抗原由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞応答を生起するかどうかをさらに調べる。
【０３８３】
方法
リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原及びマウス腫瘍（Ｐ８１５及びＣＴ２６）抗原由来の、特性決定されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋拘束性エピトープからなる新規ポリペプチド（ＭＥ１）をコードする４４０ｂｐの合成遺伝子を合成した（前記参照）。ＭＥ１をＤＮＡワクチンベクター（ＰＳＧ２）及び鶏痘シャトルベクターｐＥＦＬ２９に連結した。次いで、プラスミドｐＥＦＬ２９．ＭＥ１を、確立された方法に従ってＦＰ９の染色体に組換え、ＦＰ９．ＭＥ１を構築した。次いで、このウイルスを、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で増殖させ、３０％ショ糖クッションを通して遠心分離することによって大量精製した。ウイルスの力価は、確立された方法にしたがって、ＣＥＦで滴定し、Ｘ−ｇａｌで染色することによって確認した。ウイルスは、発熱物質を含まないＰＢＳに１×１０７ＰＦＵ／ｍｌに懸濁することによって免疫化用に調製した。プラスミドｐＳＧ２．ＭＥ１は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｉｇａカラムを用いて大量精製し、発熱物質を含まないＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。
【０３８４】
雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）又はＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス（６〜８週齢）を、５０μｇのｐＳＧ２．ＭＥ１又は無関係なエピトープ鎖を含む対照プラスミドｐＳＧ２．Ｍｅｌ３を用いて筋内（ｉｍ．）で免疫化した。ウイルスＦＰ９．ＭＥ１及び空の対照ウイルスＦＰ９．ＥＦＬ２９を、尾の静脈に１×１０６ＰＦＵの用量で静脈内（ｉｖ．）投与した。動物は免疫化の１４〜１５日後に追加免疫した。追加免疫の１４〜１５日後、マウスを頸部脱臼によって犠牲にし、ＬＣＭＶ、Ｐ８１５、ＣＴ２６及びβ−ガラクトシダーゼ由来の対照エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を、前記のようにＩＦＮγアッセイを用いて測定した。結果は、抗原特異的ＩＦＮγスポット形成細胞／１００万個の脾細胞（ｓｆｃ／１００万個）として算出した。群間の相違は、マイクロソフトエクセル２０００を用い、スチューデントのＴ検定（等しくない分散を仮定する２サンプル）によって調べた。片側Ｐ値をすべての場合で得る。
【０３８５】
結果
ウイルスと腫瘍エピトープ間の競合を避けるために、ＭＥ１は、Ｈ−２ｂハプロタイプマウスに特徴的なＬＣＭＶ抗原由来のエピトープと、Ｈ−２ｄハプロタイプマウスに特徴的な腫瘍抗原由来のものとをコードする（別表ＩＩ）。したがって、ＦＰ９．ＭＥ１の、免疫応答を生起する能力を、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）及びＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｄ）マウスで調べた。
【０３８６】
ｐＳＧ２．ＭＥ１及び／又はＦＰ９．ＭＥ１を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、腫瘍エピトープ（Ｈ−２ｄ）に対してＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞を生起した（図１６）が、ＬＣＭＶエピトープ（Ｈ−２ｂ）に対しては生起しなかった。ｐＳＧ２．ＭＥ１／ＦＰ９．ＭＥ１を用いた異種プライム／ブースト免疫化後に、腫瘍エピトープに対して生起されたＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞の総度数は、他の異種又は同種免疫化レジメンよりも有意に高かった（Ｐ＜０．００４）（図１６）。その他のレジメンを用いた免疫化は、対照構築物を用いた免疫化よりも有意に高いＴ細胞応答を生起したが、互いには有意に異ならなかった（Ｐ＞０．０５）。ｐＳＧ２．ＭＥ１／ＦＰ９．ＭＥ１を用いたプライム／ブースト免疫化が、ＣＴ２６由来のイムノドミナントエピトープ、Ｐ８１５由来のＭＳＲエピトープ及びβ−ガラクトシダーゼ由来のモデルＬｄ−拘束性エピトープに対して相当なＴ細胞応答を生起したことが重要である。これらのエピトープの中で、ＣＴ２６エピトープに対する応答が最も大きく、この実験に用いたＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイの検出限界（２０００ｓｆｃ／１００万個）を超えていた。これらの結果は、ｐＳＧ２．ＭＥ１／ＦＰ９．ＭＥ１を用いるプライム／ブースト免疫化は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＣＴ２６結腸癌腫に対する保護的免疫応答を生起すると思われるということを示す（前記参照）。
【０３８７】
ｐＳＧ２．ＭＥ１及び／又はＦＰ９．ＭＥ１を用いたＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫化は、ＬＣＭＶエピトープ（Ｈ−２ｂ）に対してＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞を生起したが、腫瘍エピトープ（Ｈ−２ｂ）に対しては生起しなかった（図１７）。ｐＳＧ２．ＭＥ１／ＦＰ９．ＭＥ１を用いたプライム／ブースト免疫化によって、ＬＣＭＶエピトープに対して生起されたＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞の総度数は、ＦＰ９．ＭＥ１単独又はｐＳＧ２．ＭＥ１単独を用いた同種免疫化によって生起されたものよりも有意に高かった（Ｐ＝０．００３）。興味深いことに。ｐＳＧ２．ＭＥ１及びＦＰ９．ＭＥ１を用いる異種プライム／ブースト免疫化レジメンは、ｐＳＧ２．ＭＥ１及びＦＰ９．ＭＥ１を単独で用いる同種免疫化レジメンと比べて、ドミナント及びサブドミナントとして特性決定されたＣＤ８＋エピトープに対する、及びＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されるものに対する大幅に増強された免疫応答を生起した。したがって、このプライム／ブースト免疫化レジメンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＬＣＭＶ感染に対して、同種プライム／ブースト免疫化レジメンよりも有効であると思われる（前記参照）。
【０３８８】
前記の明細書に記載したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。当業者であれば、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することのない、本発明の記載した方法及び系の種々の改変及び変法は明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求された本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、化学、生物学又は関連分野の当業者には自明である、記載した本発明の実施様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０３８９】
【図１】注釈をつけたＦＰ９のゲノム。
【図２】ＨＰ１由来のＣＥＦ組織培養の継代中に、ＦＰ９において改変された遺伝子を示す表である。
【図３】組換えＦＰ９及びＦＰＶ−Ｍによって生起されたＴ細胞免疫応答の比較を示す図である。
【図４】組換えＦＰ９、ＭＶＡ及びＰｂＳＣＰをコードするＤＮＡワクチンによって生起されたＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の比較を示す図である。
【図５】鶏痘ＦＰ９を、異種プライム−ブースト免疫化レジメンにおいて初回抗原刺激剤及び追加免疫剤の双方として使用できることを示す図である。
【図６】鶏痘ＦＰ９が、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて結核菌Ａｇ８５Ａに対するＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方を生起し得ることを示す図である。
【図７】鶏痘ＦＰ９が、非ヒト霊長類において結核菌Ａｇ８５Ａに対するＴ細胞免疫応答を生起することを示す図である。
【図８】ＦＰ９及びＭＶＡウイルス抗原に対するｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す図である。
【図９】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、ウシ結核菌ＢＣＧを用いたエアゾール又は粘膜初回抗原刺激及びＭＶＡ８５Ａを用いた追加免疫後のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す図である。
【図１０】アカゲザルにおける、ウシ結核菌ＢＣＧを用いたエアゾール又は粘膜初回抗原刺激とＭＶＡ８５Ａ及びＦＰＡｇ８５Ａを用いた追加免疫後のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ応答を示す図である。
【図１１】棒グラフである。
【図１２】棒グラフである。
【図１３】２つの棒グラフである。
【図１４】グラフである。
【図１５】棒グラフである。
【図１６】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ｐＳＧ２．ＭＥ１及びＦＰ９．ＭＥ１を用いたプライム／ブースト免疫化後の特異的免疫応答を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ｐＳＧ２．ＭＥ１（ＤＮＡ）を用いて筋内注射で、又はＦＰ９．ＭＥ１（ＦＰ９）を用いて静脈注射で免疫化し、１５日後に同様の方法で追加免疫した。対照動物は、無関係な抗原をコードする同一のベクターを用いて免疫化した。追加免疫による免疫化の１３日後、脾細胞においてＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて腫瘍エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を測定した。カラムは、各群につき４個体のマウスの抗原特異的ＩＦＮγｓｆｃ／脾細胞１００万個±１標準偏差を表す。図Ａは、合計エピトープ特異的応答及び植物性血球凝集素（ＰＨＡ）に対して生起された応答を示し、図Ｂは、個々のエピトープに対する応答を示す。
【図１７】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、ｐＳＧ２．ＭＥ１及びＦＰ９．ＭＥ１を用いるプライム／ブースト免疫化後の特異的免疫応答を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ｐＳＧ２．ＭＥ１（ＤＮＡ）を用いて筋肉注射で、又はＦＰ９．ＭＥ１を用いて静脈注射で免疫化し、１４日後に同様の方法で追加免疫した。対照動物は、無関係な抗原をコードする同一のベクターを用いて免疫化した。追加免疫による免疫化の１３日後、脾細胞においてＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて腫瘍エピトープに対して生起されたＴ細胞応答を測定した。カラムは、各群につき４個体のマウスの抗原特異的ＩＦＮγｓｆｃ／脾細胞１００万個±１標準偏差を表す。図Ａは、合計エピトープ特異的応答及び各群の陽性対照として植物性血球凝集素（ＰＨＡ）に対して生起された応答を示し、図Ｂは、個々のエピトープに対する応答を示す。Ｂの凡例は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるイムノドミナントな（ＤＯＭ）エピトープ及びサブドミナントな（ＳＵＢ）エピトープ、並びにＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４）によって認識されるものを示す。
【図１８】カニクイザルの、気管内結核菌投与後、種々の週でのＰＰＤの平均インターフェロンγ応答を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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