(57)【要約】本発明は、有効剤としてＨＥＲ３活性の阻害剤、特に抗ＨＥＲ３抗体から成る製薬組成物に関する。更に、この組成物の増殖過剰疾患、特に腫瘍疾患の診断、予防又は治療用の使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効剤としてＨＥＲ３活性の阻害剤及び製薬学的に認容性の基材、希釈剤及び／又は佐剤から成る製薬組成物において、前記阻害剤のＨＥＲ３に対する結合がＨＥＲ３媒介シグナル伝達を減弱させる、組成物。
【請求項２】
シグナル伝達の前記減弱がＨＥＲ３のダウンレギュレーションにより生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
シグナル伝達の前記減弱が実質的に不活性形でのＨＥＲ３の安定化により生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
阻害剤がヒレグリンのＨＥＲ３への結合と拮抗しない、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記阻害剤が抗ＨＥＲ３抗体である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体又はそのフラグメントである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体が組換え抗体又は抗体フラグメントである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
組換え抗体又は抗体フラグメントがキメラ化抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体及びそのフラグメントから選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体が標識付け基又はエフェクター基と結合する、請求項５から８までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
抗体を、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５２７又はＤＳＭ  ＡＣＣ２５１７から産出した抗体１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２、そのフラグメント又はその組換え誘導体から選択する、請求項５から９の組成物。
【請求項１１】
その他の有効剤から成る、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
診断適用のための請求項１から１１までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
治療用適用のための請求項１から１１までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１から１０までのいずれか１項に記載のＨＥＲ３活性の阻害剤の増殖過剰疾患、特に腫瘍疾患の診断、予防又は治療用の薬剤の製造用の使用。
【請求項１５】
前記阻害剤が抗ＨＥＲ３抗体である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
抗体を、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５２７又はＤＳＭ  ＡＣＣ２５１７から産出した抗体１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２、そのフラグメント又はその組換え誘導体から選択する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
乳癌、胃腸癌、膵臓癌、前立腺癌、神経膠腫、メラノーマ又は腫瘍転移生成の診断、予防又は治療用の請求項１４から１６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記疾患が、ＨＥＲ３燐酸化の増加と関連がある、請求項１４から１７までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記疾患が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化の増加と関連がある、請求項１４から１８までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記疾患が、Ｐｌ３−キナーゼ、ｃ−ｊｕｎ−末端キナーゼ、ＡＫＴ、ＥＲＫ２及び／又はＰＹＫ２の活性の増強と関連がある、請求項１４から１９までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
ＨＥＲ３活性阻害剤を必要とする被験者に、有効量の請求項１から１０までのいずれか１項に記載のＨＥＲ３活性阻害剤を投与することから成る、増殖過剰疾患、特に腫瘍疾患の診断、予防又は治療用の方法。
【請求項２２】
前記阻害剤が、抗ＨＥＲ３抗体である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
抗体を、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５２７又はＤＳＭ  ＡＣＣ２５１７から産出した抗体１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２、そのフラグメント又はその組換え誘導体から選択する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記被験者がヒトである、請求項２１から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
候補となる化合物がＨＥＲ３活性を抑制することができるか否かを検定することから成る、増殖過剰疾患、特に腫瘍疾患の診断、予防又は治療用の新規薬剤の同定方法で、この阻害剤のＨＥＲ３への結合がＨＥＲ３媒介シグナル伝達を減弱させる新規薬剤の同定方法。
【請求項２６】
ＨＥＲ３阻害剤又はそれから誘導された化合物が製薬組成物として処方されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ハイブリド−マ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５１７及びこれから誘導される細胞系。
【請求項２８】
ハイブリド−マ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５２７及びこれから誘導される細胞系。
【請求項２９】
請求項２７及び２８の細胞系により産出された抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効剤としてＨＥＲ３活性の阻害剤、特に抗ＨＥＲ３抗体から成る製薬組成物に関する。更に、この組成物の増殖過剰疾患、特に腫瘍疾患の診断、予防又は治療用の使用を開示する。
【０００２】
プロテインチロシンキナーゼは、細胞増殖及び分化を調節するシグナル伝達過程を媒介する酵素として公知である。受容体プロテインチロシンキナーゼは、リガンド刺激チロシンを介して基質の燐酸化に働く。ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３とも称する）は、受容体プロテインチロシンキナーゼの表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）サブファミリーの一員である（Ｐｌｏｗｍａｎその他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７（１９９０）、４９０５〜４９０９；Ｋｒａｕｓその他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６（１９８９）、９１９３〜９１９７及びＫｒａｕｓその他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（１９９３）、２９００〜２９０４）。
【０００３】
ＨＥＲ３は、種々のタイプの癌、例えば乳癌、胃腸癌及び膵臓癌で、過剰発現すると判明している。ＨＥＲ３が、受容体プロテインチロシンキナーゼのＥＧＦＲサブファミリーのもうひとつの成員であるＨＥＲ２と一緒に共発現すると、活性へテロ二量体シグナル複合体が形成される。
【０００４】
ＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体（Ｒａｊｋｕｍａｒその他、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ７０（１９９４）、４５９〜４５６）は、ＨＥＲ３を発現する細胞系の足場非依存性増殖に対して拮抗作用を有した。他方では、ＵＳ特許５９６８５１１（ＷＯ９７／３５８８５に相応）に記載の抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体のヒレグリン誘発形成を減弱させると報告されている。しかし、このような活性はＨＥＲ３とのヒレグリン結合を増加させる抗体に関してのみ実証されるにすぎない。従って、もしあるとして、どのタイプの抗ＨＥＲ３抗体が治療適用に使用可能であるのかは明らかでない。
【０００５】
Ｖａｄｌａｍｕｄｉその他（Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ１８（１９９９）、３０５〜３１４）は、ＨＥＲ２受容体によるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）経路の調節を記載している。ＣＯＸ−２の特異性阻害剤が、結腸直腸癌細胞の細胞分裂促進性及び浸潤性作用を抑制することができると判明した。更に、モノクローナル抗ＨＥＲ３抗体を用いる培養により、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体レベルは減少するが、ＣＯＸ−２発現は部分的に減少するにすぎないことが判明した。
【０００６】
ＷＯ  ００／３１０４８には、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ４のような受容体チロシンキナーゼの阻害剤として作用するキナゾリン誘導体が開示されている。しかしＨＥＲ３の阻害剤は開示されていない。
【０００７】
ＷＯ  ００／７８３４７には、ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−３へテロ二量体形成を阻止又は減弱させることから成る、細胞増殖抑止又は抑制法が開示されている。例えばこの薬剤は、抗ＨＥＲ２細胞外ドメイン抗体と抗ＨＥＲ３抗体、例えばＮｅｏｍａｒｋｅｒｓ販売のＨＥＲ３抗体Ｈ３．１０５．５の組み合わせであってよい。しかし、所望の治療効果を得るためにどのタイプの抗ＨＥＲ３抗体が必要とされるのかは明らかでない。
【０００８】
ＵＳ特許５８０４３９６には、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３又はＨＥＲ２／ＨＥＲ４又はＨＥＲ３／ＨＥＲ４ヘテロ二量体によるシグナル伝達の抑制の活性化に有効な薬剤の分析工程から成る、増殖障害の治療用の薬剤の同定方法が記載されている。特異的なＨＥＲ３阻害剤は開示されていない。
【０００９】
我々は、ヘルセプチン、ＨＥＲ２に対する拮抗モノクローナル抗体の生物学的特性をＨＥＲ３抗体と比較した、即ち（ｉ）ＨＥＲ３のヒレグリン結合部に対向する、α−ＨＥＲ３−ＥＣＤ、ハツカネズミのモノクローナル抗体ＩｇＧ１、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃０５−４７１、（ｉｉ）我々の研究所からの抗体１Ｂ４Ｃ３及び（ｉｉｉ）同じく我々の研究所からの抗体２Ｄ１０２を、異なるＨＥＲ２：ＨＥＲ３比を発現する浸潤性乳癌細胞系ＭＣＲ−７（ＤＫＦＺ  ハイデルベルク）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３２）及びＭＤＡ−ＭＢ２３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）中で比較した。乳癌細胞系をα／β−ヒレグリン（α／β−ＨＲＧ）刺激の前に抗ＨＥＲ３抗体で前処理すると、ヘルセプチンと対照的に、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３チロシン燐酸化含分が減少したという証拠が得られる。更に、抗ＨＥＲ３抗体はＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化を排除し、Ｐｌ３−キナーゼのｐ８５サブユニット及びアダプタープロテインＳＨＣのＨＥＲ３との複合体形成も減少させ、その結果、各々Ｐｌ３−キナーゼ及びｃ−ｊｕｎ−末端キナーゼ活性（ＪＮＫ）が減少する。ヘルセプチンに比して、抗ＨＥＲ３抗体は、α／β−ＨＲＧ刺激後の細胞外シグナル制御キナーゼ２（ＥＲＫ２）をダウンレギュレーションすることも可能であった。更に我々は、抗ＨＥＲ３抗体で前処置後の乳癌細胞系の遊走性及び増殖性の有意な減少を実証する。我々のデータは、抗ＨＥＲ３抗体がＨＲＧ刺激後のシグナル伝達過程を減弱する力がヘルセプチンより強いことを明らかに示す。更に、特異的な癌タイプ、例えばメラノーマでは、抗ＨＥＲ３抗体は遊走性及び増殖性を減少させるために有効であるが、抗ＨＥＲ２抗体は有意な効果を全く示さない。これらのデータは、ＨＥＲ３及びそのヘテロ二量体化相手による過シグナル化を特徴とする、乳癌及びその他の悪性腫瘍の治療に、抗ＨＥＲ３抗体又はその他のＨＥＲ３阻害剤が非常に有効であることを実証する。
【００１０】
従って、本発明は、有効剤として特異的タイプのＨＥＲ３活性阻害剤及び製薬的に認容性の基材、希釈剤及び／又は佐剤から成る製薬組成物に関する。本発明のＨＥＲ阻害剤は、ＨＥＲ３への阻害剤の結合がＨＥＲ３媒介シグナル伝達を減弱させることを特徴とする。態様の一つでは、ＨＥＲ３媒介シグナル伝達の減弱を、ＨＥＲ３のダウンレグレーションにより引き起こしてもよく、細胞表面からのＨＥＲ３分子の少なくとも部分的な消失を生じる。本発明のもう一つの態様では、ＨＥＲ３媒介シグナル伝達の減弱を、細胞表面上のＨＥＲ３の実質的に不活性形、即ち安定化されてない形に比して低いシグナル伝達を生じる形に安定化することによって引き起こすことができる。
【００１１】
本発明の阻害剤は、ヒレグリンのＨＥＲ３への結合に、特にヒレグリンのＨＥＲ３への結合を減少させることによって、影響を及ぼすことができる。しかしもう一つの態様では、阻害剤はヒレグリンのＨＥＲ３への結合と拮抗しない。
【００１２】
有利な態様では、阻害剤は抗ＨＥＲ３抗体である。有利には、抗体はＨＥＲ３の細胞外ドメインに対向する。しかし、その他のＨＥＲ３阻害剤、特に低い分子量の阻害剤、例えばペプチド又は有機化合物を使用することもできる。
【００１３】
本発明によれば用語“抗体”は、所望の活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種の抗体から生成される多特異的抗体（例えば二特異的抗体）及び抗体フラグメントを含む。
【００１４】
抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒその他（Ｎａｔｕｒｅ２５６（１９７５）、４９５）により記載されているようなハイブリドーマ法又は組換えＤＮＡ法（例えばＵＳ特許４８１６５６７参照）により得られるモノクローナル抗体であってよい。モノクローナル抗体は、Ｃｌａｃｋｓｏｎその他（Ｎａｔｕｒｅ３５２（１９９１）、６２４〜６２８）及びＭａｒｋｓその他（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）、５８１〜５９７）に記載の方法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。抗体はＩｇＭ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であってよい。
【００１５】
抗体フラグメントは、抗体の部分、通常は抗原結合又は無傷の抗体の種々の領域から成る。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、単鎖抗体分子及び多特異的抗体フラグメントが含まれる。
【００１６】
特に、抗体は、組換え抗体又は抗体フラグメント、更に特にはキメラ抗体又はそのフラグメント（Ｍｏｒｒｉｓｏｎその他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１（１９８４）、６８５１〜６８５５）、ヒト化抗体（Ｊｏｎｅｓその他、Ｎａｔｕｒｅ３２１（１９８６）、５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎその他、Ｎａｔｕｒｅ３３２（１９８８）、３２３〜３２９及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（１９９２）、５９３〜５９６）、単鎖Ｆｖ抗体（Ｐｌｕｅｃｋｔｕｈｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ、ＥＤＳ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）２６９〜３１５頁）及びダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒその他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（１９９３）、６４４４〜６４４８）から選択することができる。
【００１７】
特に有利な態様では、抗体は、ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５２７又はＤＳＭ  ＡＣＣ  ２５１７から産出した抗体１Ｂ４Ｃ３（ＩｇＧ２ａ）及び２Ｄ１Ｄ１２（ＩｇＧ１）、又はそのフラグメント又はその組換え誘導体から選択する。１Ｂ４Ｃ３は、ＨＥＲ３の内面化を起こす抗体であり、２Ｄ１Ｄ１２は、ＨＥＲ３の安定化を起こす抗体である。抗体、例えばキメラ抗体又はヒト化抗体又はそのフラグメントが更に有利であり、これらは、例えばＨＥＲ３上の同じエピトープと結合することによって、沈降ハイブリドーマ細胞系によって産出した抗体と比較して実質的に同じ生物学的活性（例えば実施例に記載したように）を有する。ハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２５１７は、２００１年７月２４日のＢｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ    Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、３８１２４Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託した。抗体１Ｂ４Ｃ３を産出するハイブリドーマ細胞系ＤＳＭ  ＡＣＣ２５２７はＤＳＭＺで２００１年８月７日に寄託した。
【００１８】
本発明の抗体は、特に診断適用のために標識付け基と結合していてよい。好適な標識付け基、例えば放射性基、蛍光基又はその他の標識付け基の例は、当業界で公知である。更に、特に治療適用のために抗体は、エフェクター基、例えば細胞毒性基、例えば放射性基、毒素又はその他の当業界で公知のエフェクター基と結合していてよい。
【００１９】
もう一つの有利な態様では、阻害剤は、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン又はアンチカリンのような非抗体誘導結合タンパク質から選択してもよい（Ｓｋｅｒｒａ、“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇ．１３（２０００）、１６７〜１８７及びそこに記載の文献）。
【００２０】
更に本出願は、ＨＥＲ３活性の阻害剤（ここで前記阻害剤のＨＥＲ３に対する結合はＨＥＲ３媒介シグナル伝達を減弱させる）の増殖過剰疾患、特に腫瘍疾患、例えば乳癌、胃腸癌、膵臓癌、前立腺癌、神経膠種、メラノーマ又はその他のＨＥＲＴ３発現又は過剰発現癌又は腫瘍転移生成の診断、予防及び／又は治療用の使用に関する。これらの疾患は、ＨＥＲ３シグナル伝達の増加と関連し、付随するＨＥＲ３発現又はＨＥＲ２発現の欠如と関連しうる。特に、この疾患は増加したＨＥＲ３燐酸化及び／又は増加したＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体化及び／又は増加したＰｌ３キナーゼ活性及び／又は増加したｃ−ｊｕｎ末端キナーゼ活性及び／又はＡＫＴ活性及び／又は増加したＥＲＫ２活性及び／又はＰＹＫ２活性と関連する。
【００２１】
意外にも本発明のＨＥＲ３阻害剤、特に抗ＨＥＲ３抗体が、ＨＥＲ２阻害剤、例えばヘルセプチンより有意に高いシグナル伝達過程減弱力を示すことが判明した。特にメラノーマ細胞中で、ＨＥＲ２はメラノーマ細胞により発現されるにも拘わらず、ヘルセプチンは有意な作用を示さないが、抗ＨＥＲ３抗体は有効であった。
【００２２】
有利には本発明のＨＥＲ３阻害剤は、下記の特性の少なくとも一つを発揮する：
−ヒレグリン（ｐ８５）のトランス活性化されたＨＥＲ３との会合の減弱、有利にはｐ８５のＨＥＲ３との結合の実質的に完全な抑制、
−ＧＲＢ２のＨＥＲ２との結合、ＨＥＲ２のＨＥＲ３との結合及び／又はＧＲＢ２のＳＨＣとの会合の抑制、
−受容体チロシン燐酸化の抑制、
−ＡＫＴ燐酸化の抑制、
−特に乳癌及びメラノーマにおける腫瘍浸潤の減弱、
−ＰＹＫ２チロシン燐酸化の抑制及び
−ＥＲＫ２燐酸化の抑制。
【００２３】
更に、本発明は増殖過剰疾患、特に腫瘍疾患の診断、予防又は治療法に関し、これはそれが必要な患者、例えばヒトに、有効量のＨＥＲ３活性の阻害剤を適用することから成り、その際、このＨＥＲ３に対する阻害剤はＨＥＲ３媒介シグナル伝達を減弱する。
【００２４】
ＨＥＲ３阻害剤、特に抗ＨＥＲ３抗体は、有効剤を生理学的に認容性の基材、希釈剤及び／又は佐剤と混合することによって、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されているような、例えば乾燥凍結調剤、水溶液、分散液又は固体製剤、例えば錠剤、糖衣錠又はカプセルの形で製造することができる。
【００２５】
調剤は１種以上の有効化合物、例えばその他の受容体プロテインチロシンキナーゼ、例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ４又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤を含有することもできる。その代わりにか又は付加的に、組成物は細胞障害剤、例えばドキソルビシン、シスプラチン又はカルボプラチン又はサイトカインから成ることができる。
【００２６】
本発明の阻害剤は、例えば標的細胞に対するＨＥＲ３の発現及び／又は活性を測定するために、診断用適用にも好適である。このような診断適用は公知方法で実施することができる。
【００２７】
治療すべき疾患のタイプ及び重度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの抗体をヒトの患者に、例えば１回以上に分けて投与するか又は連続注入により投与することができる。一般的な一日の用量は、前記した要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲で変動してよい。治療すべき症状に応じて、数日以上の反復適用に関しては、治療は疾患症状の所望の抑制が生じるまで続ける。
【００２８】
更に本発明を下記図及び実施例につき詳説する：
実施例
１．モノクローナル抗体α−ＨＥＲ３ＥＣＤは、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２の受容体チロシン燐酸化を減弱させる
乳癌細胞系ＭＣＦ−７（ＤＫＦＺ−ハイデルベルク）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３２）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）をそれらのＨＥＲ２：ＨＥＲ３の異なる比及びそれらの固有の遊走性に基づき選択したが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１が最も浸潤性細胞系である。α−ＨＥＲ３ＥＣＤ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃０５−４７１）の機能性役割をトラスツズマブ（ヘルセプチン）と比較して評価するために、ヒレグリン（ＨＲＧ）刺激前に細胞を各々α−ＨＥＲＥＣＤ及びＨＣで前処理し、受容体−免疫沈降試験を行い、抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ）でプローブした（図１）。我々のデータは、α−ＨＥＲ３ＥＣＤを用いる前処理がＭＣＦ−７（図１ａ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１ｃ）でα−ＨＲＧ刺激後にＨＥＲ３及びＨＥＲ２のチロシン燐酸化含分を実質的に減少させたが、逆にＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図１ｂ）でＨＥＲ３チロシン燐酸化を増加させたことを示す。チロシル−燐酸化受容体含分は劇的に減少したにも拘わらず、ＨＥＲ２とＨＥＲ３間の会合は、α−ＨＥＲ３ＥＣＤで更に増強した（図１ａ、ｂ中央上部パネルライン４及び８）。対照的に、ＨＣは、全細胞系でＨＲＧの存在でか又はその不在下で、受容体チロシル−燐酸化をアップレギュレートし、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２の会合を促進した（図１ａ、ｂ、ｃ上部パネルレーン３、７、１１及び１５）。α−ＨＲＧに対して反応しないＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の場合には、β−ＨＲＧを刺激として使用した。
２．α−ＨＥＲ３ＥＣＤはＳＨＣ及びＰｌ３−ＫのＨＥＲ３との会合及びＧＲＢ２のＨＥＲ２との会合を排除する
次ぎにα−ＨＥＲ３ＥＣＤが、ＨＥＲ３の公知基質、即ち、各々ＭＡＰＫカスケード活性化及び脂質シグナリングに関与するエフェクタータンパク質である、ＳＨＣ及びホスファチジル−３−ＯＨ−キナーゼ（Ｐｌ３−Ｋ）に対する作用を有するか否か調べた。従って、ＳＨＣ及びＰｌ３−Ｋを前記の実験条件下で免疫沈降させ、これらエフェクターのチロシン燐酸化を評価した。図２で明らかなように、α−ＨＥＲ３ＥＣＤは細胞系ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４８６でＳＨＣのチロシン燐酸化を減弱させた（図２ａ、ｂレーン１３を１６と比較）。興味深いことには、ＳＨＣの会合は、ＭＣＦ−７細胞で減弱されたが、ＭＤＡ−ＭＢ−４８６では、α−ＨＥＲ３ＥＣＤはＨＥＲ３のＳＨＣとの結合の増加を生じる。Ｐｌ３−Ｋの調節サブユニットの免疫沈降は実質的に同じ結果を生じた。チロシン燐酸化ＨＥＲ３のＰｌ３−Ｋへの結合は、ＭＣＦ−７で排除されたが、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８では増加が観察された（図１ｂ、２ｂ）。しかし、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるα−ＨＥＲ３ＥＣＤを用いる前処理によりＳＨＣ及びＰｌ３−ＫのＨＥＲ３への結合の増加が生じるが、ＨＣは再び全細胞系でクロスリンキング特性を示した。ＳＨＣは、ＨＲＧ刺激後にアダプター分子ＧＲＢ２と会合するので、ＳＨＣの減少したチロシル−燐酸化をＧＲＢ２結合を測定することによって調べた（図２ｃ）。従って、ＭＣＦ−７細胞でＧＳＴ−プルダウン分析をＧＳＴ−ＧＲＢ２融合及び前記したものと同じ実験方法を用いて行った。確かにＳＨＣの減少したチロシル−燐酸化の結果、ＧＲＢ２のＳＨＣに対する強力に減少した結合（図２ｃ下部パネル、比較レーン５及び８）及びそのＨＥＲ２との会合の完全な抑制（図２ｃ、中央パネル、比較レーン５及び８）が生じた。これらのデータは、α−ＨＥＲ３ＥＣＤが、ＭＣＦ−７でＨＥＲ３に対するＳＨＣ及びＰｌ３−Ｋ結合を抑制するが、反対にＭＤＡ−ＭＢ−４６８では両方のタンパク質がＨＥＲ３の燐酸化状態とは無関係にＨＥＲ３と会合したことを明らかに示す。
３．α−ＨＥＲ３ＥＣＤはＪＮＫ１及びＰｌ３−Ｋ活性をダウンレギュレートする
アダプタープロテインＳＨＣは、各々ＥＲＫ２及びＪＮＫを活性化する、増殖因子受容体の下部ＭＡＰＫシグナリング経路を媒介する。α−ＨＥＲ３ＥＣＤのＥＲＫ２及びＪＮＫに対する作用を調べるために、ＭＣＦ−７及びＭＢ−４６８で同じ実験条件下でＭＡＰＫキナーゼアッセイを行った。全細胞系でＪＮＫ活性の強力な減少が観察されたが、ＪＮＫに対するＨＣの同等の効果はＭＣＦ−７でのみ検出されたにすぎない（図３ａ）。ＥＲＫ２活性はα−ＨＥＲ３ＥＣＤにより僅かではあるが有意に減少したが、ＨＣはＥＲＫ２活性に対して全く作用を有さなかった（データ未記載）。癌浸潤におけるＰｌ３−Ｋの関連が最近実証されたので、我々はＰｌ３−Ｋ活性に対するα−ＨＥＲ３ＥＣＤの抑制特性を調べ、Ｐｌ３−Ｋアッセイを行った（図３）。ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４８６でＰｌ３−Ｋ活性はＨＲＧ処理細胞に比して強力に減少した（図３ａ、ｂ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４８６でＨＣはα−ＨＥＲ３ＥＣＤよりＰｌ３−Ｋ活性に対してより多大な作用を有した。これらのデータは、α−ＨＥＲ３ＥＣＤが、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４８６細胞で、各々ＪＮＫ及びＰｌ３−Ｋ活性をダウンレギュレートすることを示唆する。
４．α−ＨＥＲ３ＥＣＤはＨＥＲ３のエンドサイトーシスのダウンレギュレーションを増強する
ＨＥＲ２及びＨＥＲ３は、ＨＲＧ刺激後に細胞内取込され、再循環される。我々は、ＨＥＲ３チロシル−燐酸化のα−ＨＥＲ３ＥＣＤ媒介抑制が促進されたエンドサイトーシスに起因するかを確証したいと考えた。洞察するために、ＭＣＦ−７細胞を用いる時間経過を各々α−ＨＥＲ３ＥＣＤ又はＨＲＧの不在又は存在で行い、次いでＨＲＧを用いて刺激した（図４）。次いでＨＥＲ３を膜タンパク質のビオチニル化後に免疫沈降させた。ＨＥＲ３がα−ＨＥＲ３ＥＣＤで前処理後に急速に細胞内取込されることが観察された（図４ｂ上部パネル）。ＨＲＧを細胞に適用することによって同様の効果が得られたが、２時間後にＨＥＲ３は膜に戻され、３時間後に再び細胞内取込された点は異なっていた。対照として全細胞溶解物（ＷＣＬ）をＰＹで調べた（図４ｂ下部パネル）。チロシル燐酸化タンパク質の含分が３時間後に減少したＨＲＧ処理細胞と比較して、ＨＥＲ３のエンドサイトーシスの促進がα−ＨＥＲ３ＥＣＤを用いた前処理の１時間後に起こった。α−ＨＥＲ３ＥＣＤをＨＣと比較するために、我々は同じ実験をＨＣ及び免疫沈降ＨＥＲ２を用いて行った（図４ａ上部パネル）。著しいことには、ＨＲＧは迅速なエンドサイトーシスを生じるが、ＨＥＲ２はどの時点でもＨＣを用いる前処理後に細胞内取込はされなかった。細胞内取込された受容体及び全細胞溶解物（抗ホスソチロシン（ＰＹ）を用いてプルーブした）を比較する場合に、ホスホチロシン含分はα−ＨＥＲ３ＥＣＤで減少したが、ＨＣでは減少しなかった（図４ｂ下部パネル）。我々のデータは、α−ＨＥＲ３ＥＣＤが促進されたエンドサイトーシスにより迅速にＨＥＲ３をダウンレギュレートし、従って細胞をＨＲＧ刺激に対して無反応にすることを示す。
５．α−ＨＥＲ３ＥＣＤは乳癌細胞系の遊走性及び増殖性を抑制する
乳癌細胞の遊走性及び増殖性に対するα−ＨＥＲ３ＥＣＤの生物学的機能を評価するために、α−ＨＥＲ３ＥＣＤの存在又は不在でＢｒｄＵ−取込アッセイを行い、ＨＲＧで刺激した。α−ＨＥＲ３ＥＣＤを用いる前処理は、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８で増殖を各々２８．７±６．１８％及び２１．１±７．６２％減少させた。ＨＣはこれらの細胞系で全く作用を有さなかった（データ未記載）が、観察された増殖の抑制はＥＲＫ２アッセイと相関した。更に、乳癌細胞系の遊走性に対するα−ＨＥＲ３ＥＣＤの作用を調べるために、α−ＨＥＲ３ＥＣＤの存在又は不在でＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４８６を用いて走化性試験を行った。ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８で各々５９．１％（Ｐ＝０．０１８）及び５５．４％（Ｐ＝０．００００５）の遊走性の強力な減弱が観察された。更に、遊走性はＭＤＡ−ＭＢ２３１でも３５％抑制されたが、有意性はもっと僅かであった（Ｐ＝０．０６）。我々のデータから、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８における増殖及び遊走性に対するα−ＨＥＲ３ＥＣＤの抑制作用が明らかに示される。
６．ＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体の産出
次ぎに、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＨＥＲ３の細胞外部分のヒト組換え融合タンパク質及びＣ−末端Ｈｉｓ−Ｔａｇで免疫化して、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに対するハツカネズミモノクローナル抗体を産出した（ＨＥＲ３−６ｘＨｉｓ−ＣＴ）。免疫原は、ＨＥＫ細胞でトランスフェクション、Ｇ４１８を用いる選択及びにカセットの安定な発現によって得た；最高発現レベルを有するクローンの細胞培養上澄み液を集め、タンパク質を硫酸アンモニウム沈殿、透析及び次いで金属イオンアフィニティークロマトグラフィー後に精製した（Ｎｉ−ＮＴＡ）。品質保証は、ウェスタンブロッド法により行った（データ未記載）。免疫化は製造業者プロトコルによりＨＥＲ３−６ｘＨｉｓ−ＣＴ２２μｇの腹膜内注射により行った（Ｑｉａｇｅｎ  ＩｍｍｕｎＥａｓｙ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）。モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞系は標準方法を使用して産出した。
７．ＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体は、そのタンパク質バックボーンと優先的に結合し、ＨＥＲ３のエンドサイトーシス過程に対して異なる作用を有する
我々は、ＦＡＣＳ分析によりＭＣＦ−７細胞の細胞表面上の特異的天然ＨＥＲ３を認識する３種のモノクローナル抗体を確認した（データ未記載）。１Ｂ４Ｃ２及び１Ｂ４Ｃ３はＩｇＧ２ａイソタイプ抗体であり、２Ｄ１Ｄ１２はＩｇＧ１イソタイプ抗体である。ＥＧＦＲファミリーのその他の成員との交差反応性は検出されなかった（データ未記載）。次いで、抗体がＨＥＲ３のグリコシル化構造と結合するのか又はタンパク質バックボーンと結合するのか及びこれが受容体のエンドサイトーシス調節に対してどんな結果をもたらしうるのかを調べたいと考えた。従って、ＭＣＦ−７細胞を、細胞表面タンパク質のＮ−リンクしたグリコシル化を抑制するとして公知である抗生物質ツニカマイシンの存在又は不在で１６時間前処置した。細胞を溶解後、ＨＥＲ３をモノクローナル抗体２Ｆ１２（ＨＥＲ３の細胞内部分に対向する）、α−ＨＥＲ３ＥＣＤ（ＨＥＲ３の細胞外部分）、１Ｂ４Ｃ２、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２と一緒に免疫沈降させた。我々のデータは、α−ＨＥＲ３ＥＣＤ、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２は全てＨＥＲ３のタンパク質バックボーンと優先的に結合するが、１Ｂ４Ｃ３はＨＥＲ３のグリコシル化形とも親和性を有することを示す（図６Ａ）。
【００２９】
ＨＥＲ３のエンドサイトーシス過程に対する１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２の作用を調べるために、我々は時間経過試験を行ったが、その際、ＭＣＦ−７細胞を種々の時間の間各々１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２と一緒培養した。細胞表面タンパク質をビオチニル化し、ＨＥＲ３の細胞外ドメインに対する抗体を用いて沈降させ、ストレプタビジンに対してプローブした。１Ｂ４Ｃ３は、α−ＨＥＲ３ＥＣＤと同様にＨＥＲ３のエンドサイトーシスを促進するが、２Ｄ１Ｄ１２は安定化し、従って細胞表面にＨＥＲ３を蓄積したことが観察された（図６Ｂ）。
８．モノクローナル抗体１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２は、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２の下流シグナルを抑制する
次ぎに、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２がＨＥＲ２及びＨＥＲ３基質ＳＨＣのチロシン燐酸化を抑制することができるか否かを調べた。ＧＲＢ２はＨＲＧ−刺激ＨＥＲ２と結合し、ＳＨＣと同様に遊走シグナルをＭＡＰＫ経路に伝達するので、ＳＨＣを免疫沈降させ、並行して前処理してないか又は抗体で前処理し、次いでＨＲＧで刺激したＭＣＦ−７細胞でＧＳＴ−ＧＲＢ２プルダウンを実施した（図６Ｃ）。この実験は、両方の抗体がＳＨＣのチロシン燐酸化及びＧＲＢ２とＳＨＣの会合を抑制することを示す。更に、抗体はＳＨＣとＨＥＲ３の会合及びＨＥＲ２及びＨＥＲ３間のヘテロ二量体化を抑制する。これらのデータは、２Ｄ１Ｄ１２が１Ｂ４Ｃ３より強力な抑制作用を有するが、下流シグナリングが１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２によって抑制されることを示す。
９．モノクローナル抗体２Ｄ１Ｄ１２は、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＺＲ−７５−１及びメラノーマ細胞系Ｍｅｌ  Ｇｅｒｌａｃｈの増殖を抑制する
次ぎに、二つの乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２９）、ＺＲ−７５−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５００）及びメラノーマ細胞系Ｍｅｌ  Ｇｅｒｌａｃｈ（Ｋｌｉｎｉｋｕｍ  Ｇｒｏｓｓｈａｄｅｒｎ、ミュンヒェン）の生物学的活性の研究に着手する。この細胞系は、ヌードマウスにおけるそれらの腫瘍形成性及びそれらの高いＨＥＲ３発現レベルにより選択した。ＨＥＲ３はメラノサイト並びに稀突起膠細胞の発現に非常に重要であるので、メラノーマ細胞はＨＥＲ３を過剰発現させることを記載しておくべきである。１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２は遊走性シグナルを排除し、その結果癌細胞の増殖性を抑制するという我々の仮説を検証するために、ＢｒｄＵ−取込みアッセイを抗体の存在又は不在下で行った（図７）。増殖は全細胞系で２Ｄ１Ｄ１２により強力に減少したが、１Ｂ４Ｃ３はＭｅｌ  Ｇｅｒｌａｃｈで抑制作用を有したにすぎない。総括すると、我々のデータは、ＨＥＲ３に対するモノクローナル抗体が、癌に対する治療の新たな武器と見なすことが出来るという最初の証拠となる。
【００３０】
抗体１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２を産出するハイブリドーマ細胞系は、各々２００１年８月７日及び２００１年７月２４日にＤＳＭＺに寄託した。
１０．ＨＥＲ３抗体のシグナル伝達に対する作用
１０．１．方法
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳはＡＴＣＣ（ＨＴＢ−１２９）から入手し、Ｍｅｌ−ＪｕｓｏはＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｖｅ（ＣＬＳ）（０２８２−ＨＵ）から入手した。ＧＳＴ−ｐ８５（ａ．ａ３３３〜４３０）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから入手した。ＧＳＴ−ＧＲＢ２は、前記したようにして精製した。Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ（Ｐ−Ｓｅｒ４７３）はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から入手した。ＨＥＲ２抗体は、ハイブリドーマ培養上澄み液から、記載したようにして精製した（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０４６３）。ＧＳＴ−プルダウンアッセイのために、バイトプロテイン１．２５μｇを使用した。ＢｒｄＵ−取込及び浸潤アッセイを前記したようにして行った。試験は全て少なくとも２回実施した。
１０．２．結果及び討論
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ及びＭｅｌ−ＪｕｓｏにおけるＨＥＲ２及びＨＥＲ３受容体の表面発現を試験するために、付加的にそれらの発現レベルをＦＡＣＳ分析により測定した（図８Ａ、Ｂ）。我々はこれらの細胞系でＨＥＲ２及びＨＥＲ３発現を観察し、どのＨＥＲ３抗体がヒレグリン（ＨＲＧ）媒介シグナル伝達に対して作用するのかによって分子機構の詳細な分析を続けた。従って、ヒトの乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ及びメラノーマ細胞系Ｍｅｌ−ＪｕｓｏでＧＳＴ−プルダウンアッセイを実施した。休止期細胞をＨＥＲ３抗体１Ｂ４Ｃ３、２Ｄ１Ｄ１２、対照抗−ＨＥＲ２抗体及びＰｌ（３）Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で前処理し、次いでβ−ＨＲＧで刺激した。細胞溶解後、タンパク質レベルは正常化し、ＨＥＲ３は６個の潜在的ｐ８５結合部を有するので、バイトとしてＧＳＴ−ｐ８５（ａ．ａ３３３〜４３０）を用いるＧＳＴ−プルダウンアッセイを実施した。ホスホチロシン（ＰＹ）に対するウェスタンブロットにより、抗−ＨＥＲ２及び１Ｂ４Ｃ３が同じようにトランス活性化されたＨＥＲ３とのｐ８５会合を減少させるが、ＬＹ２９４００２（マイナスの対照）はＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓでｐ８５結合に対して抑制作用を有さないことが分かる（図８Ｃ）。しかし２Ｄ１Ｄ１２はＭＤＡ−ＭＢ−４３５ＳでＨＥＲ３とｐ８５の結合をほぼ完全に排除する（図８Ｃ）。
【００３１】
ヒトメラノーマ細胞系Ｍｅｌ−Ｊｕｓｏで、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２は同様にＨＥＲ３とのｐ８５の会合を減少させるが、抗ＨＥＲ２は、ｐ８５の受容体会合のより著しい減少を発揮する（図８Ｄ）。再びＬＹ２９４００２はｐ８５結合に対して抑制作用を全く示さなかった（図８Ｄ）。更に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓで１２５ｋＤａ及び６６ｋＤＡでホスホチロシンブロットで若干著しいチロシン燐酸化帯及びＭｅｌ−Ｊｕｓｏで１２５ｋＤＡで主要な帯のみを観察した。Ｐｌ（３）Ｋはフォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）と物理的に会合することが公知であり、従って我々はブロットをＦＡＫ抗体で再プローブした（図８Ｃ、Ｄ下部パネル）。我々のデータは、両方の細胞系で２Ｄ１Ｄ１２及びＰｌ（３）Ｋ阻害剤ＬＹ２９４０００２がｐ８５とのＦＡＫ会合を排除したことを示す。ブロットのＨＥＲ２及びＨＥＲ３抗体を用いる再プローブにより、補足ＨＥＲ３の量の減少及びそのＨＥＲ２とのヘテロ二量体化の減少が確認された（図８Ｃ、Ｄ中央パネル）。総括すると、我々のデータは、ＨＥＲ３及びＨＥＲ２抗体は受容体チロシン燐酸化レベルを減少させるにも拘らず、受容体関連エフェクタータンパク質の二次レベルでの異なる応答を調節することができることを示す。
【００３２】
ＧＲＢ２は直接ＨＥＲ２と結合するだけであり、ＨＥＲ３に関しては間接的にＳＨＣを介して結合するので、我々は付加的にバイトとしてＧＳＴ−ＧＲＢ２を用いるＧＳＴ−プル−ダウン試験を同じ試験条件及び前記のヒト腫瘍細胞で実施した（図９Ａ、Ｂ）。我々は、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２は１６０及び１８５ｋＤａ間の受容体チロシン燐酸化を減少させるが、ＬＹ２９４００２は抑制作用を全く有さないことを観察した（図９Ａ、Ｂ上部パネル）。しかし細胞の抗ＨＥＲ２抗体を用いる前処理により、受容体のチロシン燐酸化の増加が引き起こされ、これは更にβ−ＨＲＧで増強することができた。ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＳＨＣ抗体を用いる再プローブは、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２が実質的にＨＥＲ２とのＧＲＢ２結合及びＨＥＲ３とのその間接的会合（図９Ａ、Ｂ中央パネル）並びにＳＨＣとのその会合（図９Ａ、Ｂ下部パネル）を両方の細胞系で抑制することを示す。他方では、抗ＨＥＲ２抗体はＨＥＲ２及びＳＨＣに対するＧＲＢ２結合を増加させる。
【００３３】
抗体媒介下流シグナリングを更に洞察するために、前記試験の全細胞溶解（ＷＣＬ）を分析した（図１０）。全細胞タンパク質のホスホプロテイン含分を調べた時に、両方の細胞系で抗ＨＥＲ２は構造的に受容体を活性化したが、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２は受容体のチロシン燐酸化を抑制したことを観察した（図１０Ａ上部パネル）。ここでもＬＹ２９４００２は作用を有さなかった。
【００３４】
ＨＲＳがマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を活性化して、細胞増殖、細胞存続及び種々の遺伝子の転写増強を生じることが確立される。ＨＥＲ２及びＨＥＲ３抗体のＨＲＧ誘発ＭＡＰＫ活性に対する作用を調べるために、ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ及びＭｅｌ−Ｊｕｓｏ全細胞抽出の免疫ブロットをホスホ−ＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）抗体を用いてプローブした（図１０）。ＭＡＰＫ  ＥＲＫ１／２（ｐ４４／ｐ４２）の燐酸化によって、受容体の活性化にも拘わらず、抗ＨＥＲ２はＥＲＫ１燐酸化を僅かに減弱させたが、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２はＥＲＫ１燐酸化に対して抑制作用を全く有さかったことが判明した（図１０Ａ中央パネル）。更にブロットを再プローブすることによって、同じ量の荷重タンパク質が確認された（図１０Ａ下部パネル）。
【００３５】
更に、Ｐｌ（３）Ｋの下流標的であり、細胞生存の重要な役割を演じるＡＫＴの活性化状態を調べた。抗ＨＥＲ２、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２がＭｅｌ−Ｊｕｓｏメラノーマ細胞でＡＫＴ燐酸化を著しく抑制したことを観察した（図１０Ｂ上部パネル）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ乳癌細胞で、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の抗体が両方ともＡＫＴ燐酸化を有意に減弱させた（図１０Ｃ）。ＬＹ２９４００２を陽性対照として使用した。この観察は、活性化されたＡＫＴの著しく増加した発現を有する乳癌患者は遠隔転移で再発し易く、そのため臨床結果が悪くなるので非常に重要である（Ｐｒｅｚ−Ｔｅｎｏｒｉｏ  Ｇその他、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、８６、５４０〜５４５（２００２）。
【００３６】
モノクローナル抗体１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２は、乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ及びメラノーマ細胞系Ｍｅｌ−Ｊｕｓｏの増殖及び遊走を抑制する。
【００３７】
細胞周期プログレッション及び腫瘍浸潤に対する１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２の抑制機能を評価するために、ＢｒｄＵ−取込み及び浸潤アッセイを行った（図１１）。
【００３８】
２Ｄ１Ｄ１２を用いて前処理したＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ及びＭｅｌ−Ｊｕｓｏ細胞でβ−ＨＲＧ刺激ＢｒｄＵ−取込みの明らかな減少が見られた（図１１Ａ）。浸潤アッセイにより、抗ＨＥＲ３抗体２Ｄ１Ｄ１２及び１Ｂ４Ｃ３が、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ乳癌及びＭｅｌ−Ｊｕｓｏメラノーマ細胞の浸潤を実質的に減らしたことが明らかになった。意外にも、ＨＥＲ２抗体４Ｄ５はＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓの抑制を示したに過ぎず、メラノーマ細胞系Ｍｅｌ−Ｊｕｓｏでは、受容体が細胞表面で発現したが、抑制は示さなかった（図１１Ｂ、Ｃ及び図８Ａ、Ｂ）。我々の結果は、抗ＨＥＲ３抗体の乳癌及びメラノーマ治療用の使用を示唆する。
【００３９】
モノクローナル抗体２Ｄ１ｄ１２は、ＰＹＫ２のヒレグリン刺激燐酸化を抑制する。
【００４０】
我々は、細胞内チロシンキナーゼＰＹＫ２が関与し、ＨＥＲ３により燐酸化されることを前に実証したが、これはＰＫＹ２がＨＥＲ３のメディエーターとして作用することを示す。これと一致して、ドミナントネガティブＰＹＫ２は、神経膠腫細胞のＨＲＧ媒介浸潤を抑制した。従って、ＨＲＧ誘発ＰＹＫ２チロシン燐酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の作用を調べることにした。我々は休止期のＳＦ７６７ヒト神経膠腫細胞を抗ＨＥＲ２、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２で前処理し、次いで細胞をα−ＨＲＧで刺激した。溶解及び等タンパク質量に関して標準化後、ＰＹＫ２を免疫沈降させ、ホスホチロシンに対してブロットした（ＰＹ）。抗ＨＥＲ２及び１Ｂ４Ｃ３はＰＹＫ２のチロシン燐酸化に対して抑制作用を有さなかったが、２Ｄ１Ｄ１２はＰＹＫ２チロシン燐酸化を著しく減弱させた（図１２Ａ）。従って、抗ＨＥＲ３抗体はＰＹＫ２のＨＲＧ誘発チロシン燐酸化に有効である。
【００４１】
ＷＣＬのホスホ−ＥＲＫ抗体を用いる免疫ブロットをプローブすることによって、細胞を抗ＨＥＲ２、１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２で前処理することによってα−ＨＲＧ活性ＥＲＫ２燐酸化を抑制したことを観察した（図１２Ｂ中央パネル）。ＥＲＫ抗体を用いて再プローブすることによって、荷重タンパク質の等量が確認された（図１２Ｂ下部パネル）。ここでも我々のデータは、ＨＥＲ３抗体がＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、Ｍｅｌ−Ｊｕｓｏ及びＳＦ７６７で、ＨＲＧ媒介シグナリング現象をダウンレギュレートすることを示す。更に、我々の分析は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３のエクトドメインに対抗する抗体が分化シグナリングを調節し、下流エフェクタータンパク質の明らかな応答を引き起こすことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】受容体−免疫試験の結果を表す図である。（実施例１）
【図２】受容体−免疫試験の結果を表す図である。（実施例２）
【図３】Ｐｌ３−Ｋアッセイの図である。（実施例３）
【図４】受容体−免疫試験の結果を表す図である。（実施例４）
【図５】受容体−免疫試験の結果を表す図である。
【図６】受容体−免疫試験の結果を表す図である。（実施例７、８）
【図７】増殖アッセイの結果を表す図である。（実施例９）
【図８】補足データを表す図である。（実施例１０）
【図９】補足データを表す図である。（実施例１０）
【図１０】補足データを表す図である。（実施例１０）
【図１１】補足データを表す図である。（実施例１０）
【図１２】補足データを表す図である。（実施例１０）
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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