(57)【要約】本発明は、哺乳動物（１種または２種以上）における炎症の危険性を減少させることができる組成物を提供する。この組成物は、炎症を処置および／または予防するものと信じられる、α−ＣＨ2−γ−ブチロラクトン（α−ＭＧＢＬ）および／または哺乳動物における酵素活性および／または転写活性を抑制することができる構造的に関連する親の植物化学作用物質を含有する熱処理された（例えば、押出処理された）植物物質を治療有効量で含有する。この点に関し、炎症により発症されるものと信じられる別の病気または疾患の発症の危険性を減少させることができる（例えば、慢性の炎症の場合）。この植物化学作用物質供給源は、単一の植物物質、例えばチコリから誘導することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の植物物質を含有する組成物であって、この植物物質が熱処理されており、また少なくとも１種の酵素活性および／または転写活性を抑制し、これにより哺乳動物における炎症を防止することができる１種または２種以上の植物化学作用物質を含有する、上記組成物。
【請求項２】
治療有効量の熱処理された植物物質を含有する組成物であって、この植物物質が少なくとも１種の酵素活性および／または転写活性を抑制し、これにより哺乳動物における炎症を処置することができる１種または２種以上の植物化学作用物質を含有し、ここでこの植物化学作用物質はα−メチレン−γ−ブチロラクトンを含有する活性フラグメントを包含するセスキテルペンラクトン化合物の有効量を包含する、上記組成物。
【請求項３】
熱処理された植物物質から誘導される活性フラグメントを含有する組成物であって、この活性フラグメントがα−メチレン−γ−ブチロラクトンを包含しており、ここで有効量の当該活性フラグメントは少なくとも１種の酵素活性および／または転写活性を抑制し、これにより哺乳動物における炎症を防止または軽減することができるものである、上記組成物。
【請求項４】
植物物質を少なくとも０．５重量％の量で含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
植物物質が、そのα−メチレン−γ−ブチロラクトンを含有する活性フラグメントを包含するセスキテルピンラクトン化合物を影響量で含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
植物物質がアステラカエ（Ａｓｔｅｒａｃａｅ）植物一族に由来する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
植物物質がコーヒー、大豆、チコリ、レタス、その抽出物、そのパルプおよびその組合せからなる群から選択される植物に由来する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
植物物質がチコリ抽出物を包含する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
植物物質が酸化防止剤、グルコサミン、コンドロイチン硫酸塩、オメガ−３脂肪酸およびその組合せからなる群から選択される食物作用物質をさらに含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
植物化学作用物質がシクロオキシゲナーゼから誘導される少なくとも１種の酵素活性およびＮＦ−ｋＢから誘導される転写活性を抑制することができるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が栄養サプリメント、栄養的に完全な食品、食物製剤、穀物製剤、愛玩動物食餌、および／または医薬および／または食物組成物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
熱処理される植物物質が抽出された植物物質を包含する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
愛玩動物食餌製品であって、
デンプンマトリックス；および
哺乳動物における少なくとも１種の酵素活性および／または転写活性を抑制し、これにより炎症の危険性を減少させることができる植物化学作用物質を含有する熱処理された植物物質の治療有効量；
を含有する、上記食餌製品。
【請求項１４】
熱処理された植物物質が、そのα−メチレン−γ−ブチロラクトンを含有するその活性フラグメントを包含するセスキテルペンラクトン化合物を有効量で含有する、請求項１３に記載の愛玩動物食餌製品。
【請求項１５】
植物物質が請求項４〜１４に記載されている、請求項１３に記載の愛玩動物食餌製品。
【請求項１６】
植物物質を含有する愛玩動物食餌製品であって、アステラカエ（Ａｓｔｅｒａｃａｅ）植物一族に属する植物、チコリ、レタス、コーヒー、大豆、その抽出物、そのパルプおよびその組合せからなる群から選択される熱処理された植物物質に由来するそのα−メチレン−γ−ブチロラクトンを含有する活性フラグメントを包含するセスキテルペンラクトン化合物を有効量で含有する植物物質を炎症の防止または軽減有効量で含有する、上記愛玩動物食餌製品。
【請求項１７】
哺乳動物における炎症発症の危険性を減少させることができる栄養食品の製造方法であって、
植物物質を用意する工程；
この植物物質を処理し、哺乳動物における少なくとも１種の酵素活性および転写活性を抑制することができる１種または２種以上の植物化学作用物質を含有する植物抽出物を生成する工程；および
この植物抽出物および１種または２種以上の食物成分を加工し、少なくとも０．５重量％の植物抽出物を含有する栄養食品を形成する工程；
を包含する、上記製造方法。
【請求項１８】
植物物質が熱処理されており、これによりそのα−メチレン−γ−ブチロラクトンを含有する活性フラグメントを包含するセスキテルペンラクトン化合物を有効量で提供する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
植物物質を押出処理する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
植物物質がコーヒー、大豆、チコリ、レタス、その抽出物、そのパルプおよびその組合せからなる群から選択される植物抽出物から誘導される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
植物抽出物を植物物質の脱脂により加工し、これにより第一植物抽出物を形成し、引続いてこの第一植物抽出物を酢酸エチルにより処理し、酸加水分解を経て植物抽出物を生成させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
植物抽出物が酸化防止剤、グルコサミン、コンドロイチン硫酸塩、オメガ−３脂肪酸およびその組合せからなる群から選択される食物作用物質をさらに含有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物における少なくとも１種の酵素活性および転写活性を抑制することができる植物化学作用物質を包含する植物物質を含有する熱処理された、治療有効量の組成物の炎症の危険性を有する哺乳動物における炎症の危険性を減少させる組成物の製造における使用。
【請求項２４】
哺乳動物における少なくとも１種の酵素活性および転写活性を抑制することができる植物化学作用物質を包含する植物物質を含有する熱処理された植物物質を含有する治療有効量の組成物の骨関節炎の危険性を有する哺乳動物における骨関節炎の危険性を減少させる組成物の製造における使用。
【請求項２５】
哺乳動物における少なくとも１種の酵素活性および転写活性を抑制することができる植物化学作用物質を包含する植物物質を含有する熱処理された植物物質を含有する治療有効量の組成物の自己免疫疾病の危険性を有する哺乳動物の自己免疫疾病の危険性を減少させる組成物の製造における使用。
【請求項２６】
哺乳動物における少なくとも１種の酵素活性および転写活性を抑制することができる植物化学作用物質を包含する植物物質を含有する熱処理された植物物質を含有する治療有効量の組成物の癌の危険性を有する哺乳動物の癌の危険性を減少させる組成物の製造における使用。
【請求項２７】
植物物質が、アステラカエ（Ａｓｔｅｒａｃａｅ）植物一族に属する植物、コーヒー、大豆、チコリ、レタス、その抽出物、そのパルプおよびその組合せからなる群から選択される植物から誘導される、請求項２３〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
植物化学作用物質が少なくとも１種のシクロオキシゲナーゼに由来する酵素活性およびＮＦ−ｋＢに由来する転写活性を抑制することができるものである、請求項２３〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
植物物質がチコリから誘導される植物抽出物を包含する、請求項２３〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
熱処理された植物物質が、そのα−メチレン−γ−ブチロラクトンを含有する活性フラグメントを包含するセスキテルペンラクトン化合物を有効量で含有する、請求項２３〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
組成物が、熱処理され、またそのα−メチレン−γ−ブチロラクトンを含有する活性フラグメントを包含するセスキテルペンラクトン化合物を有効量で含有する植物物質を少なくとも０．５重量％の量で含有する、請求項２３〜２６のいずれかに記載の使用。
【請求項３２】
治療有効量のα−メチレン−γ−ブチロラクトンもしくはこの化合物を含有するフラグメントまたは抽出物のＣＯＸ−２活性抑制用の栄養組成物または医薬組成物の製造における使用。
【請求項３３】
栄養組成物または医薬組成物が哺乳動物における炎症、骨関節炎または自己免疫疾病もしくは癌の危険性の減少する、請求項３２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、組成物に関する。さらに特に、本発明は熱処理された（例えば、抽出された）植物物質、例えばチコリおよび／またはその抽出物を含有するヒトおよび動物の健康を増進する組成物に関する。この植物物質は、加熱によりその活性フラグメント、例えばα−メチレン−γ−ブチロラクトン（α−ＭＧＢＬ）を生成する、例えば望ましく、また有効な量のセスキテルペンラクトン化合物を含有するアステラカエ（Ａｓｔｅｒａｃａｅ）植物一族、もしくは同一または実質的に同一種の化合物を含有する別種の植物、例えばコーヒーまたは大豆（soja）から誘導される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
哺乳動物の健康増進に対する要求は、疾病の処置および／または防止に対する進行する調査研究および発見を包含し、また包含し続けている。一例として、過敏および不快感は、例えば皮膚炎症、眼炎症、腸炎症などによる哺乳動物における炎症の結果であることができる。さらに、慢性炎症は別の疾病または疾患、例えば骨関節炎、自己免疫疾病、癌などを発症する危険を増加させることができるものと一般に信じられている。この点に関し、炎症は炎症前および炎症性酵素およびレセプターの発現を導く転写因子ＮＦ−ｋＢの増強された転写活性により引き金が引かれるものと一般に理解されている。さらに特に、炎症は哺乳動物における増大された酵素活性、例えばシクロオキシゲナーゼ−１、シクロオキシゲナーゼ−２などを包含するシクロオキシゲナーゼの増大された活性により生じることができる。
【０００３】
一般に、食餌、食物または栄養源が、ヒトおよび動物を疾病に対し保護することができるものと信じられる多くの成分または作用物質を含有することは知られている。一例として、イヌリンおよび種々のフルクトオリゴサッカライドなどのオリゴ糖は前生物的効果、例えばクロストリジゥム ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を包含する病原体の過剰状態において胃腸器官におけるビフィド−およびラクト−細菌の増殖を促進する効果を有することが報告されている。例えば、ギブソン（Gibson）等によるＦｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１１（６），４９１−４９８頁（１９９４年）参照。大部分の報告されている実験はインビトロで行われているが、これらのオリゴ糖はラットおよびヒトの腸において類似の効果を有することが報告されている。この点に関し、オリゴ糖の使用によるビフィド−およびラクト−細菌増殖の促進が動物およびヒトにおいて種々の相違する有益な効果、例えば下痢の予防および／または処置、増加した成長、繁殖に対する改良された効果または健康を増進するその他同様の有益な効果を提供することができることは一般に知られている。
【０００４】
上記したように、ヒトおよび動物における健康を増進するものと信じられるイヌリンまたはその他の食物作用物質は一般に、高濃度のイヌリンを含有する植物、例えばチコリ（chicory）、キクイモ（Jerusalem artichoke）、リーキおよびアスパラガスから精製されることは一般に知られている。この点に関し、植物を代表的に精製するか、または使用前に別段の処理に付し、例えばチコリが典型的に付随する苦味フレーバーを消去するか、または少なくとも最少にして、植物フレーバーを増加させる。例えば、Ｕ．Ｓ．４，８６５，８５２参照。
【０００５】
一般に、精製植物生成物は酸または酵素による加水分解によって製造される。この加水分解物を次いで、採取し、次いで濃縮させ、生体活性作用物質、例えばイヌリンを得る。一例として、ＪＰ６３−３０９１４７は、チコリの茎を粉砕し、これを酸により部分的に加水分解し、次いでこの加水分解物を中和するか、または中和することなく、乾燥させることを開示している。しかしながら、例えばフルクト−オリゴ糖およびイヌリンの精製は、一般に食物製品の価格を格別に高めることができる。従って、このような食物製品の使用は一般に、ヒトおよび動物における特別の食餌または食物製品に制限されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、天然成分、例えば熱処理されたチコリおよび／またはその抽出物を含有し、ヒトおよび動物の嗜好に合い、安価に製造することができ、またヒトおよび動物の健康を増進させることができる組成物に対する要求が存在する。
【発明の効果】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明はヒトおよび動物の健康の増進、特に炎症の防止および／または処置に使用することができる組成物に関する。本発明による組成物は、熱処理された（例えば抽出された）植物供給源、例えばチコリから誘導される１種または２種以上の植物化学作用物質を含有する。
【０００８】
本出願人は、チコリ根抽出物が哺乳動物における酵素活性および／または転写活性、例えばシクロオキシゲナーゼに関連する酵素活性およびＮＦ−ｋＢに関連する転写活性を抑制することができる１種または２種以上の植物化学作用物質を含有することを証明した。本出願人はまた、熱処理された（例えば抽出された）チコリ根抽出物がシクロオキシゲナーゼに対する増強された酵素抑制活性および／またはＮＦ−ｋＢに対する増強された抑制性を有することを証明した。本出願人は熱処理中における活性分子種、すなわちα−メチレン−γ−ブチロラクトン（α−ＭＧＢＬ）の生成と抑制の増強との間の関係を証明した。
【０００９】
この点に関し、このような酵素／転写活性の抑制が哺乳動物における炎症を予防および／または処置することが証明された。炎症プロセスの抑制によって、別の疾病の誘発または異常の誘発、例えば癌（この病気は炎症の結果であると信じられる）（例えば慢性炎症）の危険性を減少させることができる
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的に対し、本発明の或る態様において、栄養組成物が提供される。この組成物は治療有効量の植物物質を含有し、この植物物質は酵素活性を抑制し、これにより哺乳動物における炎症を予防および／または処置することができる酵素活性を抑制することができる１種または２種以上の熱処理された（例えば抽出された）植物化学作用物質を含有する。好ましくは、この植物物質は少なくとも０．５重量％の量を構成する。
或る態様において、この植物物質はアステラカエ（Astracae）植物族または数種の別種の植物、例えばコーヒー、大豆など、もしくはその組合せから誘導される。好ましくは、この植物物質はチコリ、レタス、コーヒー、大豆などから、もしくはその組合せから誘導される。或る態様において、この植物物質はチコリ抽出物である。
【００１１】
組成物は、植物化学作用物質に加えて植物源に由来する別種の食物成分を含有することができる。これらの食物成分は、シクロオキシゲナーゼが付随する酵素活性を抑制することができるいずれか適当な成分を包含することができる。或る態様において、植物化学作用物質に付加される食物成分は、酸化防止剤、グルコサミン、コンドロイチン硫酸塩、オメガ−３脂肪酸、いずれかその他の食物成分およびその組合せを包含する。
本発明はまた、愛玩動物食餌製品を提供する。この愛玩動物食餌製品は、デンプンマトリックス；および有効量の熱処理された（抽出された）植物物質を含有し、この植物物質は酵素活性を抑制し、これにより炎症の危険性を減少させることができる植物化学作用物質を含有する。
【００１２】
本発明によるもう一つの態様において、哺乳動物における炎症誘発の危険性を減少させることができる栄養食品の製造方法が提供される。この方法は、植物物質を用意する工程；この植物物質を熱処理し、哺乳動物における酵素活性および転写活性を抑制することができる１種または２種以上の植物化学作用物質を含有する植物抽出物を生成する工程；およびこの植物抽出物および１種または２種以上の食物成分を加工し、少なくとも１重量％の植物抽出物を含有する栄養食品を形成する工程；を包含する。
好ましくは、植物抽出物は植物物質を脱脂することによって処理し、第一次植物抽出物を生成し、次いでこの第一次植物抽出物を酢酸エチルにより処理し、酸加水分解により植物抽出物を生成する。
【００１３】
本発明はまた、哺乳動物における酵素活性を抑制することができる１種または２種以上の植物化学作用物質を含有する熱処理された、例えば抽出された植物物質の治療有効量を炎症の危険性を有する哺乳動物の炎症の危険性を減少させることを目的とする組成物の製造における使用を提供する。減少された酵素活性に伴い、哺乳動物における炎症の危険性を減少させることができ、これにより炎症の結果から発症することがある別の疾患または疾病、例えば骨関節炎、自己免疫疾病、癌などの危険性を減少させることができる。
本発明の利点は、哺乳動物における炎症誘発の危険性の減少に使用することができる改良された組成物が提供されることにある。この点に関し、この組成物は、酵素活性を抑制することができ、その結果として炎症が処置され、および／または予防されるものと信じられる。
【００１４】
本発明のもう一つの利点は、酵素活性、例えばシクロオキシゲナーゼに関連する酵素活性を抑制することができる１種または２種以上の植物化学作用物質を含有する植物物質を含有する改良された組成物が提供されることにあり、これにより炎症が処置され、および／または予防されるものと信じられる。
本発明のさらにもう一つの利点は、哺乳動物における炎症の危険性を減少させることができる植物物質の酵素抑制物性を保持しながら、組成物の嗜好性を増強することができる植物物質を含有する改良された組成物の製造方法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの利点は、改良された組成物を投与することを包含する哺乳動物における炎症に対する処置および／または予防方法を提供することにある。
本発明のさらなる特徴および利点は、下記本発明の詳細な説明に記載されており、またこれらの説明から明白にされるだろう。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトおよび動物における炎症の効果的な予防および／または処置に使用することができる熱処理された、例えば抽出された天然源、例えば植物物質から誘導される１種または２種以上の植物化学作用物質を少なくとも含有する組成物に関する。
本出願人は、驚くべきことに、熱処理すると、或る種の植物および／またはその植物抽出物、例えばチコリ、植物化学作用物質などが、例えば皮膚炎症、眼炎症、腸炎症、結腸炎症などを包含する炎症の危険性を減少させるものと信じられる哺乳動物のシクロオキシゲナーゼ酵素活性および／またはＮＦ−ｋＢの増強された転写活性の格別の抑制を生じさせることができることを見出した。或る態様において、この酵素活性はシクロオキシゲナーゼ、例えばシクロオキシゲナーゼ−１および／またはシクロオキシゲナーゼ−２に由来する活性である。
【００１７】
本出願人は、熱処理された、例えば抽出された植物抽出物、特にチコリ抽出物がシクロオキシゲナーゼ活性、ならびにＮＦ−ｋＢの転写活性を抑制することができることを試験により証明した。特に、熱処理された（例えば、抽出された）チコリ抽出物は、シクロオキシゲナーゼ−１に対するものと比較し、シクロオキシゲナーゼ−２の抑制に対しさらに増強された効果を有するものと信じられる。すなわち、この種の酵素活性の抑制は哺乳動物における炎症を減少させるものと信じられる。炎症を減少させることによって、炎症、特に慢性レベルの炎症の結果であると信じられる別種の疾病または疾患の危険性を減少させることができるものと信じられる。別種の疾病は、例えば癌、自己免疫疾病、骨関節炎およびその組合せを包含することができる。
【００１８】
上記植物化学作用物質に加え、植物、例えばチコリはまた、前生物学的繊維、例えばイヌリンを包含するオリゴ糖を含有することが知られており、これは癌誘発、特に結腸における癌誘発を減少させるものと信じられる。この点に関し、本出願人は、ヒトおよび動物における癌の予防および／または処置に対する格別の有益性が、前生物学的繊維と酵素活性を抑制し、哺乳動物における炎症、特に当該炎症が処置されない場合、癌、例えば結腸癌を発症させることがある慢性炎症を予防および／または処置することができる植物化学作用物質との組合せにより実現されるものと信じる。
【００１９】
本出願人はまた、本発明の熱処理された（例えば、抽出された）組成物の酵素抑制物性が、本発明に従い製造される組成物の製造期間中にも本質的に影響を受けないことを証明した。一例として、植物抽出物の苦味を減少させ、これによりヒトおよび動物の嗜好性を増強することができる本発明に従いなされた植物物質の精製は、あるとしても、生成された精製生成物の栄養的性質に対してはほとんど作用を及ぼさない。この点に関し、生成された抽出生成物は本質的に粗製植物抽出物、例えばチコリから得ることができる。これによって、生成された生体活性フラクションの製造に必要な植物物質の高価な精製または別段の別の処理の必要性を排除することができる。
【００２０】
本明細書で使用されているものとして、「生体活性作用物質」（bioactive agent）の用語または別の同様な用語、例えば「生体活性フラクション」（bioactive fractions）の用語は、哺乳動物の健康を増強させることができる哺乳動物（１種または２種以上）における生物学的活性、化学的活性または同様の活性を現すことができるいずれかの１種の成分または２種以上の成分を意味する。生体活性作用物質の例は、例えば前生物学的繊維、植物化学作用物質などを包含する。
本明細書で使用されているものとして、「前生物学的」（prebiotic）の用語または「前生物学的繊維」（prebiotic fiber）を包含する別の同様な用語は、哺乳動物における微生物の成長を促進させることができる物質または成分を意味する。
【００２１】
本明細書で使用されているものとして、「植物化学」（phytochemical）の用語または「植物化学物質」（phytochemicals）および「植物化学作用物質」（phytochemical agent）を包含する別の同様な用語は、ヒトおよび／または動物に対し健康上の効果、例えば炎症またはその他同様の疾病の予防および／または処置に有益な効果を付与するものと信じられる植物により産生される全ての化学物質を意味する。
本明細書で使用されているものとして、「酵素活性」の用語または「酵素的活性」を包含する別の同様な用語は、哺乳動物における健康に作用するものと信じられるいずれか適当な生物学的、化学的またはその他同様のプロセスで触媒として作用することができるいずれか適当な酵素を意味する。一例として、シクロオキシゲナーゼに関連する酵素活性の抑制は、炎症誘発の危険性を減少させるものと信じられている。
【００２２】
本明細書で使用されているものとして、「熱処理」の用語または別の同様な用語、例えば「抽出」、「抽出する」および「抽出された」の用語は、使用された装置、例えばオーブンまたは抽出機、もしくはその他の処理される物質の温度を高めることができるいずれか同様の装置において標準温度（例えば、摂氏２５度または華氏２７８度）以上に植物源材料および／または植物抽出物を加熱することを意味する。
【００２３】
組成物は、当該組成物を炎症の予防および／または処置に効果的に使用することができるように、いずれか適当で、両立できる種類および量の成分を含有することができる。或る態様において、組成物は１種または２種以上の前生物学的繊維および酵素活性、例えばシクロオキシゲナーゼに関連する酵素活性を抑制することができる植物物質を含有する。これは、炎症の予防および／または処置に責任があるものと信じられる。多くの植物物質、例えばチコリ、レタス、コーヒー、大豆、キクイモ、リーキ、アスパラガス、その抽出物およびその組合せを組成物に効果的に添加することができる。或る態様において、チコリおよび／またはチコリ抽出物が好適である。
【００２４】
植物物質は種々の相違する、適当な手段で処理し、抽出物を生成することができる。一般に、植物物質、例えばチコリ根を粉砕するか、粉末化するか、またはいずれか適当な形態で用意する。この植物物質を次いで、多くの種々の工程でさらに処理し、抽出生成物を生成する。或る態様において、植物物質に対し脱脂処理を行い、植物物質から脂肪が除去された抽出物を生成させる。この脱脂処理は、いずれか適当な種類および量の溶剤（例えばヘキサンを包含する）を用いるいずれか適当な脱脂処理条件下に行うことができる。
或る態様において、この脱脂処理の生成抽出物を酸加水分解によりさらに処理し、本発明の組成物に添加することができるもう一種の植物抽出物を生成することができる。この酸加水分解処理は、適当な種類および量の溶剤（例えば酢酸エチルを包含する）を用いるいずれか適当な処理条件下に行うことができる。
【００２５】
或る態様において、脱脂処理からの抽出物は溶剤抽出法によりさらに処理することができる。この溶剤抽出はいずれか適当な処理条件下およびいずれか適当な量および種類の溶剤の存在下に行うことができる。或る態様において、溶剤は１：１容積比で混合されたメタノール（“ＭｅＯＨ”）と水との溶液を包含する。この溶剤抽出法の生成溶液は、適当な条件下における溶剤の蒸発によりさらに処理することができ、これによりもう一種の抽出物が得られる。別法として、生成溶液は、吸着剤、例えばポリビニルピロリドンなどで処理し、ポリフェノールを捕獲することができる。この吸着剤処理は、いずれか適当な処理条件下に行うことができる。本発明の態様に従う植物抽出物の製造例は、下記で詳細に説明する。
【００２６】
或る態様において、粉砕された植物源材料を熱処理する。本出願人は、この方法で、天然でセスキテルペンラクトン化合物（ＳＱＬｓ）を含有する植物源材料が高度に活性なＣＯＸ２抑制成分、すなわちα−メチレン−γ−ブチロラクトン（α−ＭＧＢＬ）に富むものにされることを証明した。確実なこととして、この分子は別のＳＱＬｓに比較し増大された熱安定性を示す。一例として、この種の分子は、部分的に転写因子ＮＦ−ｋＢとの直接的相互作用およびＤＮＡに対するその結合の抑制により炎症活性を抑制することが証明された。この抑制は、ＮＦ−ｋＢのｐ６５ドメインに存在する正確なアミノ酸Ｃｙｓ38のアルキル化の結果であることが提案された。この抑制は数種の炎症前および炎症レセプターおよび酵素、中でもシクロオキシゲナーゼ−ＩＩの発現の減少をもたらす。一般にＳＱＬｓおよび特にα−ＭＧＢＬは、ＣＯＸ−２活性および／またはその発現を抑制する。本出願人は、α−ＣＨ2−ブチロラクトンがＣＯＸ−２活性を特異的に、また高度の効力をもって抑制することを証明した。
【００２７】
或る態様において、前生物学的繊維（１種または２種以上）および植物化学作用物質（１種または２種以上）は、共通または同一植物材料、例えばチコリから誘導することができる。前記したように、本出願人は、植物、例えばチコリの前生物学的繊維と植物物質源との組合せ効果が増強された化学保護的効果をもたらすことができ、これにより哺乳動物における炎症を処置および／または予防することができるものと信じる。この前生物学的繊維は、例えばイヌリンおよび種々のフルクト−オリゴ糖、大豆オリゴ糖およびその組合せを包含するいずれか適当な量および種類を包含することができる。
【００２８】
植物化学作用物質は、炎症の予防および／または処置に応答するものと信じられるＣＯＸ−ＩＩ酵素活性またはＮＦ−ｋＢ転写活性を抑制することができるようないずれか適当な種類および量で含有させることができる。或る態様において、植物物質の植物化学作用物質は、シクロオキシゲナーゼ活性、例えばシクロオキシゲナーゼ−１および／またはシクロオキシゲナーゼ−２の活性および／またはＮＦ−ｋＢ転写活性を抑制することができる。酵素活性および／または転写活性を抑制することによって、本発明の植物化学作用物質は、例えば慢性炎症を包含する炎症を予防および／または処置することができるものと信じられる。この点に関し、炎症により引き起こされるものと信じられる別の疾病または疾患、例えば癌、骨関節炎、自己免疫疾病の誘発危険性を減少させることができる。
【００２９】
植物化学作用物質に加え、植物源は酵素活性を抑制することができる別種の食物作用物質を含有することがある。或る態様において、この食物作用物質は、酸化防止剤、グルコサミン、コンドロイチン硫酸塩、オメガ−３脂肪酸など、およびその組合せを包含する。
本発明による組成物は種々の相違するおよび適当な形態を包含するものと認識されるべきである。或る態様において、組成物は栄養サプリメント、ヒトおよび／動物用食品、愛玩動物食餌および／または医薬および／または機能食品組成物などを包含することができる。組成物は、いずれか適当な量で食品に添加することができる。或る態様において、食品は、少なくとも０．５重量％、好ましくは約１重量％〜約３０重量％、さらに好ましくは約１重量％〜約２重量％の量で組成物に依存する植物物質を含有する。
【００３０】
もう一つの態様において、活性成分（１種または２種以上）（例えば、α−メチレン−γ−ブチロラクトン、この化合物を含有するフラクションまたは抽出物）を含有する医薬組成物は、経口使用に適するいずれかの形態、例えば錠剤、トローチ、ドロップ、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、硬質または軟質カプセル、もしくはシロップまたはエレキシルの形態であることができる。経口使用用組成物は、医薬組成物の製造にかかわり当技術で公知のいずれかの方法に従い製造することができ、またこのような組成物は甘味剤、風味付与剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１種または２種以上の助剤を含有することができ、これにより医薬として優雅で、味のよい製剤を提供することができる。
【００３１】
錠剤は、錠剤の製造に適する無毒性の医薬上で許容される賦形剤、例えば不活性稀釈剤、顆粒化剤、崩壊剤および滑剤と混合されている活性成分（１種または２種以上）を含有する。錠剤は未コーティングであることができ、またはこれらは胃腸器官における崩壊および吸収を遅延させるための公知の技術に従いコーティングすることができ、これにより長期間にわたる持続的作用を得ることができる。経口使用用製剤はまた、活性成分が不活性固体稀釈剤と混合されている硬質ゼラチンカプセルとして、または活性成分が水または油性媒質中に混合されている軟質ゼラチンカプセルとして提供することもできる。水性懸濁液は水性懸濁液の製造に適する賦形剤、例えば懸濁剤、分散または湿潤剤、保存剤、着色剤、風味付与剤および甘味剤と混合されている活性成分を含有する。水の添加による水性懸濁液の製造に適する分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１種または２種以上の保存剤と混合されている活性成分（１種または２種以上）を提供する。追加の賦形剤、例えば甘味剤、風味付与剤および着色剤を存在させることもできる。
【００３２】
或る態様において、本発明は愛玩動物食餌製品を提供し、この製品はデンプンマトリックスおよび有効量の植物物質を含有する。この植物物質は前生物学的繊維および哺乳動物の健康を増進させるための、例えば炎症を予防および／または処置するための１種の酵素または複数種の酵素活性を抑制することができる植物化学作用物質を含有する。本発明による愛玩動物食餌製品はいずれか適当な数、種類および量の成分を含有することができ、また適当な方法で処理し、所望の製品形態に成形することができる。
或る態様において、本発明は或る量の植物物質を含有するゼラチン化された穀物製品を包含する。この植物物質は少なくとも、前生物学的繊維および哺乳動物の健康を増進させるものと信じられる哺乳動物における酵素活性を抑制することができる植物化学作用物質の供給源を含有する。
【００３３】
或る態様において、植物は乾燥材料に基づき少なくとも約０．２５重量％のイヌリンを提供するのに充分な量でイヌリンを含有する。使用される植物物質は、いずれか適当な供給源、例えば多量のイヌリンを含有するチコリ、レタス、コーヒー、大豆、キクイモ、リーキ、オニオン、ヤコーン（yacon）、アスパラガスおよびこれらの植物の混合物であることができる。或る態様において、チコリおよびキクイモは好適である。或る態様において、植物物質は少なくとも５０重量％のイヌリンを含有する。取り扱いが容易であることから、植物物質は好ましくは、乾燥された、粉砕されたまたは粉末化された形態である。以下で説明するように、この処理には、乾燥され、粉砕されたチコリおよび／またはその抽出物が用いられる。しかしながら、いずれか適当な植物物質をいずれか適当な形態で使用することができ、またいずれか適当な量で穀物製品に添加することができる。
【００３４】
以下で説明するように、ゼラチン化された穀物製品中に含有される残りの成分は、ゼラチン化穀物製品に慣用されるいずれか適当な成分であることができる。通常、これらの成分はデンプン供給源およびタンパク質供給源を包含する。適当なデンプン供給源は、例えばトウモロコシ、米、小麦、ビート、大麦、オーツ、大豆などの穀類およびその混合物である。適当なタンパク質供給源はいずれか適当な動物または野菜タンパク質供給源から選択することができる。この例には、肉食物、骨食物、魚肉、大豆タンパク質コンセントレート、乳タンパク質、グルテンなどが包含される。デンプン供給源およびタンパク質供給源の選択はほとんど、動物またはヒトの栄養上の要求、嗜好上の考慮、生成される穀物製品の種類またはその他同様の考慮によって決定される。種々の別の成分、例えば糖、塩、スパイス、調味料、ビタミン類、ミネラル類、風味付与剤、脂肪などを所望により、ゼラチン化された穀物製品中に配合することもできる。
【００３５】
ゼラチン化穀物製品は、所望により、多くの相違する方法で製造することができる。しかしながら、乾燥した穀物製品の場合、この製品の特に適する製造方法は押し出し加工法である。この方法は、当技術で周知のとおりに行うことができる。一例として、一つの適当な方法において、原料混合物をプレコンディショナーに供給する。この原料混合物は主として、デンプン供給源、タンパク質供給源およびチコリなどの植物物質からなる。或る態様において、チコリは原材料の少なくとも約１重量％、好ましくは少なくとも約２重量％を構成する。或る態様において、原材料中の植物物質の量は約１０重量％〜約２０重量％の範囲、好ましくは約１０重量％である。
【００３６】
プレコンディショナーにおいて、水または水蒸気、もしくはその両方を原材料中に混入する。原材料を湿潤させるのに充分な量の水または水蒸気を原材料混合物に混入する。所望により、この原材料の温度はプレコンディショナー内で約６０℃〜約９０℃重量に維持することができる。適当なプレコンディショナーはＵＳ４，７５２，１３９に記載されている。プレコンディショナーの使用が必須ではないことを認識すべきである。
【００３７】
プレコンディショナーを通過した湿潤原材料を次いで、押出機に供給する。この押出機はいずれか適当な一軸スクリュー型または二軸スクリュー型の加熱押出機であることができる。適当な押出機は、Wenger Manufacturing Inc.,Clextral SA Buhler AGなどから入手することができる。この押出機の通過期間中に、湿潤原材料は加熱帯域を通過し、ここで機械的せん断に付され、また加熱される。或る態様において、湿潤原材料は、約１５０℃までの最高温度に加熱され、次いで形成帯域に送られる。この形成帯域のケージ圧力は、所望に応じて約３００ｋＰａ〜約１０ＭＰａである。所望により、水または水蒸気、もしくはその両方を加熱帯域に導入することができる。押出機通過期間中に、湿潤原材料のデンプン供給源はゼラチン化され、主としてデンプン、タンパク質および植物物質、例えばチコリからなるゼラチン化マトリックス構造体が得られる。
【００３８】
押出機を通過したゼラチン化されたマトリックスを次いで、適当なダイ、例えばＥＰ０６６５０５１に記載されているようなダイに強制的に通す。ダイの口形に相当する横断面形態を有する成型押出物をダイから分離する。押出機の条件および使用されるデンプン供給源に応じ、成型された押出物はより大きい程度に、またはより少ない程度に膨張される。この成型された押出物を次いで、ブレードを用いて小片に切断する。各小片を次いで、乾燥させ、次いで所望により、保護剤または風味付与剤により、もしくはその両方によりコーティングする。冷却後、これらの小片を適当な包装中に充填する。別法として、各小片はフレーク状に成形し、次いで乾燥させることもできる。
【００３９】
使用される成分に応じ、ゼラチン化された穀物製品は、愛玩動物食餌として使用するのに適する乾燥したキブル（kibble）、朝食用シリアルに使用するのに適する膨張された小片、朝食用シリアルに使用するのに適するフレークなどの形態であることができる。
水と穀物製品の成分とを一緒に混合することによって、例えばプレコンディショナーで混合することによって、乾燥穀物製品を製造することもできる。湿った混合物を次いで、例えば成型ロールによって、所望の形状に成形することができる。成形された混合物を次いで、オーブン内でいずれか適当な温度で焼き上げることができる。或る態様において、この温度は、適当な焼き上げ時間中、約２２０℃〜約２８０℃の範囲である。或る態様において、焼き上げ時間は、約１０分間〜約１時間の範囲である。この乾燥された穀物製品は焼き上げられたビスケットの外観を有する。
【００４０】
缶入り愛玩動物用食餌に使用することができる擬似肉製品を生成することが望まれる場合、いずれか適当な方法を用いることができる。一例として、この方法は、ＵＳ４，７８１，９３９および同５，１３２，１３７に記載されている方法を包含することができる。これらの方法において、タンパク質供給源、特に肉材料は乳化させる。この肉材料は、例えば哺乳動物、家禽類および魚類の筋肉または骨格肉、および心臓、肝臓、腎臓、舌などの魚類または肉副生成物を包含する動物タンパク質のいずれか適当な供給源であることができる。所望により、植物性タンパク質供給源もまた、含有させることができる。正確な組成は価格および所望の風味に従い選択することができる。乳化はいずれか適当な装置で行うことができる。
【００４１】
このエマルジョンにチコリを添加する。また、所望または必要に応じ、追加のタンパク質をエマルジョンに添加することができる。追加のタンパク質は上記のようないずれかのタンパク質供給源であることができる。正確な選択は、利用性、価格および嗜好性に応じる。追加のタンパク質は、いずれか適量で添加することができる。或る態様において、追加のタンパク質は、約５重量％〜約３５重量％の範囲の量で添加することができる。
【００４２】
所望または必要な場合、脂肪をまた、エマルジョンに添加することができる。通常、エマルジョン中の脂肪の量は処理を促進させ、また許容される製品を得るために制御しなければならない。しかしながら、肉材料は所望量の脂肪を充分に含有することから、調整は不必要であることもある。代表的に、この段階で、エマルジョンは約２５重量％の最高脂肪レベルを含有する。或る態様において、エマルジョン中の脂肪量は約５重量％〜１５重量％、さらに好ましくは約７重量％〜約１２重量％の範囲である。エマルジョン内のタンパク質対脂肪の容積比は、好ましくは約１：１〜約７：１である。添加する場合、この脂肪はいずれか適当な動物性脂肪、例えば獣脂であることができ、または植物性脂肪であることができる。
【００４３】
追加の成分、例えば糖、スパイス、調味剤、風味付与剤、ミネラル類などをまた、エマルジョンに添加することができる。或る態様において、使用される追加の成分の量は、ゼラチン化された穀物製品の約１重量％〜約５重量％の範囲である。
水をまた添加し、エマルジョンに約４５重量％〜８０重量％の水分を付与することができる。肉材料に充分な水分が存在する場合、水の添加は不必要である。
【００４４】
混合後、エマルジョンは減圧押出機、または類似の脱気装置に通し、エマルジョンを脱気すると好ましい。この処理は、別段で生成されるエマルジョン生成物の分解を生じさせることがある空気を除去し、またその肉状外観を減少させる。エマルジョンは次いで、エマルジョンミルに通し、ここでエマルジョンを急速な機械的加熱およびせん断に付す。いずれか適当なエマルジョンミルを使用することができ、例えばＵ．Ｓ．５，１３２，１３７に記載のエマルジョンミルが包含される。その他の適当なエマルジョンミルは、ＴＲＩＧＯＮＡＬの登録商品名で市販されており、Ｓｉｅｆｅｒ Ｍｅｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ ＧｍｂＫ ＆ Ｃｏ． ＫＧ，Ｂａｈｎｈｏｆｓｔｒａｓｓｅ １１４，Ｐｏｓｔｆａｃｈ １０１００８．，Ｖｅｌｂｅｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手することができる。
【００４５】
エマルジョンの温度は、エマルジョンミル内で数秒間にわたり所望の凝固温度にまで高めることができる。或る態様において、この凝固温度は約１００℃〜約１２０℃の範囲である。或る態様において、この温度は、Ｕ．Ｓ．５，１３２，１３７に記載されているように、約４５℃〜約７５℃の範囲である。一般に、エマルジョンミルで発生される機械的エネルギイは、エマルジョンを所望の温度に高めるのに充分であるが、これは過熱水蒸気の射出により補助することができる。
【００４６】
エマルジョンミルを離れる加熱されたエマルジョンは、保持管に移すことができる。この保持管において、加熱されたエマルジョンは保持管に沿ってゆっくりと移動しながら凝固する。加熱されたエマルジョンの保持管内における滞在時間は、エマルジョンが保持管の出口で硬いエマルジョン生成物に凝固されるのに充分な時間である。この保持管を離れる硬いエマルジョン生成物は次いで、切断機に移し、ここで愛玩動物食餌として使用するのに適する大きさの小片、例えばチャンクに切断する。これらのチャンクは肉の外観およびテキスチャーを有する。このチャンクは所望により、フレーク形成処理に付すことができる。チャンクはまた、グレーピー中チャンク型の生成物に製剤化することもできる。チャンク生成用の別の方法は公知であり、例えば食餌混合物の押出処理、食餌混合物の水蒸気オーブン中での加熱処理および加熱された押出生成物のチャンクへの切断を使用することができる。
【００４７】
ミートローフ形態の缶入り愛玩動物食餌の生成が望まれる場合、適当な肉材料を乳化し、肉エマルジョンを生成させることによって、肉バターを生成することができる。肉材料は、いずれか適当な肉供給源、例えば上記の供給源であることができる。ガム、例えばカッパカラゲナン（kappacarrageenan）、イナゴマメガム、グアガム、キサンタンガムなどを包含する適当なゲル化剤を肉エマルジョンに添加することができる。或る態様において、約２重量％よりも多くないガムを使用する。所望の植物物質、例えばチコリを次いで、肉エマルジョンに添加する。
【００４８】
糖、塩、スパイス、調味料、風味付与剤、ミネラル類などの追加の成分をまた、肉エマルジョンに添加することができる。使用する追加成分の量は好ましくは、これらが肉バターの約０．２５重量％〜約５重量％までを構成するようにすると好ましい。水をまた、肉エマルジョンに添加し、約７０重量％〜約８５重量％の水を付与することができる。肉材料中に充分な水分が存在する場合、水の添加は不必要である。
この肉エマルジョンは次いで、ミキサー−加熱機内で約６５℃以上の温度に加熱する。所望により、肉バター中に水蒸気を注入することができる。加熱された肉エマルジョンは次いで、再度、エマルジョン化し、ローフバターを生成し、このローフバターは次いで、缶に充填するまで、約６０℃以上の温度に維持する。
【００４９】
ゼラチン化された穀物製品は、上記の方法に限らず、いずれか適当な方法により製造することができる。別種のオリゴ糖、例えばフルクトオリゴ糖および大豆オリゴ糖をまた、ゼラチン化された穀物製品に含有させることもできる。大豆オリゴ糖は大豆汁またはその他適当な大豆供給源の形態で添加することができる。
穀物製品は、例えば乾燥した、半湿潤した、および湿潤した形態を包含するいずれか適当な形態であることができる。しかしながら、穀物製品を構成するマトリックスはゼラチン化し、植物物質中に存在することがあるセスキテルペン化合物を分離または分解させなければならない。本発明の穀物製品はヒトおよび／または動物消費用に製造することができることは認識されるべきである。
一例として、またこれに制限されないものとして、本発明の態様に従い製造される愛玩動物食餌製品の例を以下に示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
例１：乾燥愛玩動物餌
原材料は、トウモロコシ約５８重量％、トウモロコシグルテン約６重量％、肉および肉汁約２３重量％、乾燥チコリおよび残りを構成する量の塩、ビタミン類およびミネラル類からなる。乾燥チコリは、本発明の態様に従い製造されたチコリ抽出物の形態であり、約５％またはそれ以下の量で添加する。この原材料を次いで、プレコンディショナーに供給し、次いで湿潤させる。湿潤された原材料を次いで、押出−加熱機に供給し、ゼラチン化する。押出機を離れる際に、このゼラチン化されたマトリックスをダイに強制的に通し、押出し、押出生成物を形成する。この押出生成物を、イヌの餌として適する小片に切断し、約１１０℃で約２０分間かけて乾燥させ、次いで冷却させ、ペレットを形成する。使用される脂肪混合物または脂肪および油分の一部分または全部は、最後の段階で、例えばコーティング処理として付加することができる。
チコリの添加は、例えば前述の炎症の予防および／または処置によって愛玩動物の健康を増強させることができる。
【００５１】
例２：乾燥愛玩動物餌
例１の乾燥愛玩動物餌と同様にして、乾燥愛玩動物餌を製造する。この餌は、当該乾燥愛玩動物餌のネコに対する嗜好性の増強に典型的に付随する追加の成分をさらに含有する。前記のように、添加されたチコリは、酵素活性を抑制することができ、例えば炎症の処置および／または予防によって、動物の健康を増強させるものと信じられる。
【００５２】
例３：乾燥愛玩動物餌
原材料は、トウモロコシ約５８重量％、トウモロコシグルテン約６重量％、鶏肉汁約２３重量％、乾燥チコリおよび残りを構成する量の塩、ビタミン類およびミネラル類からなる。チコリは、約５％またはそれ以下の量で添加する。前記したように、チコリの添加は、例えば前述の炎症の予防および／または処置によって愛玩動物の健康を増強させることができる。
【００５３】
この原材料混合物をプレコンディショナーに供給し、次いで湿潤させる。湿潤された原材料を次いで、押出−加熱機に供給し、ゼラチン化する。押出機を離れる際に、このゼラチン化されたマトリックスをダイに強制的に通し、押出し、押出生成物を形成する。この押出生成物を、ネコの餌として適する小片に切断し、約１１０℃で約２０分間かけて乾燥させ、次いで冷却させ、ペレットを形成する。この段階で、１種または２種以上のバクトバシラス種（Lactobacillus species）、例えばバクトバシラス ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）ＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ Ｉ−２４４９）、バクトバシラス アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５３）、およびエンテロコッカス ファエシウム（Enterococcus faecium）ＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）の凍結乾燥粉末をペレットに添加する。ネコが約１．０Ｅ＋０７〜約１．０Ｅ＋９ｃｆｕ／日を毎日取り入れるのに相当するのに充分な量の当該粉末をペレットに付加する。この点に関し、この粉末の一部分はペレットの初期塊中に混入し、次いで袋に入れる。当該粉末の第二の部分を測量し，次いで脂質担体と混合し、次いでペレットの第二の塊上に噴霧する。このコーティングを５０〜６０℃で数分間かけて充分に乾燥させた後、このペレットを袋に入れる。
【００５４】
例４：缶入り愛玩動物餌およびサプリメント
家禽類肉、ブタ肺およびウシ肝臓（粉砕）約７３％、小麦粉約１６％、染料約２％、ビタミン類および無機塩から混合物を製造する。この混合物を１２℃で乳化させ、次いでプディングの形態に押出す。このエマルジョンに本発明の態様に従い製造された抽出物の形態のチコリを約５％またはそれ以下の量で添加する。このエマルジョンを次いで、９０℃で加熱処理する。３０℃に冷却させ、次いでチャンクに切断する。このチャンク約４５％を、水約９８％、染料約１％およびグアガム約１％から生成された原料約５５％と混合する。このチャンクおよび原料混合物を鉛缶に充填し、次いで１２５℃において約４０分間かけて殺菌する。
【００５５】
使用前に、愛玩動物食餌と混合する前生物学的サプリメントとして、下記ラクトバシラス種の菌種を包装したサシェ形態の追加の包装物を用意する：バクトバシラス ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）ＮＣＣ２５８３（ＣＮＣＭ Ｉ−２４４９）、バクトバシラス アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＮＣＣ２６２８（ＣＮＣＭ Ｉ−２４５３）、およびエンテロコッカス ファエシウム（Enterococcus faecium）ＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）。このサプリメントの対応する一日摂取量は、愛玩動物の種類、例えばネコまたはイヌ、および愛玩動物の肉体的因子、例えば体重に応じ、約１０６−１０12ｃｆｕ／日からである。このサプリメントは、給食指示書とともに、缶に取り外し可能に添付する。
一例として、これらに制限されないものとして、下記詳細な説明として具体的試験を行い、本発明の効果を証明する。
【００５６】
インビトロ試験 １
本発明者は、多くの具体的試験を行い、本発明の有益な効果を証明した。一般に、ヒト結腸癌細胞培養物を調製し、種々の量のチコリ抽出物を用い約４８時間かけて処理し、シクロオキシゲナーゼ活性にかかわるチコリの効果を評価した。この調製法および具体的試験方法、ならびに結果を下記で詳細に検討する。
【００５７】
細胞培養物の調製
結腸癌細胞系ＨＴ−２９は、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（American Type Culture Collection）から入手し、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％、ゲンタマイシン（gentamicin）２５ｍｇ／ｍｌを補給したＭｃＣｏｙ´ｓ ５Ａ培地において培養した。ＨＴ−２９細胞を、下記に詳細に説明するように、本発明の態様に従い製造された一連の種々のチコリ抽出物で処置した。
【００５８】
チコリ抽出物の調製
４種の相違するチコリ抽出物、すなわち抽出物Ａ−Ｄを、本発明の態様に従い調製した。最初に、粉末形態に粉砕したチコリの試料４０グラム（ｇ）および１０ｇをそれぞれ、０．５ｍｍの篩に通した。これらの試料を次いで、ヘキサンと約３０分間にわたり室温で混合することによって、脂肪分を除去する処理を試料に対して行った。ヘキサン６００ミリリットル（ｍｌ）を篩に通したチコリ試料４０ｇに添加し、また１５０ｍｌを篩に通した試料１０ｇに添加した。ヘキサンを約５０℃で減圧下に蒸発させ、抽出物Ａを生成した。
【００５９】
抽出物Ｂは、下記のとおりに調製した：最初に、粉砕したチコリ粉末４０ｇを前述のように脱脂した。この脱脂した試料を沸騰浴中で酸、例えばＨＣｌ３００ｍｌ中で２０分かけて加水分解した。冷却させ、次いで遠心処理した後（８０００ｒｐｍ、５分間、１０℃）、この溶液を溶剤、例えばＭＥＲＣＫなどから市販されている酢酸エチル１５０ｍｌにより抽出した。溶剤を蒸発させ、乾燥させた。減圧下、約５０℃において、無水硫酸ナトリウム上でさらに乾燥させた後、抽出物Ｂを生成した。
【００６０】
抽出物ＣおよびＤは次のとおりにして調製した：粉砕したチコリ粉末試料１０ｇを前記のとおりに脱脂した。この脱脂した粉末の第二の部分を溶媒／水混合物、例えば１：１容積比のＭｅＯＨおよび水、約２５０ｍｌにより抽出した。この抽出は室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）で撹拌しながら約３０分間かけて行った。遠心処理後、この溶液を２等分に分けた。この溶液の第一の部分に対しては、有機溶剤を減圧下に約５０℃で蒸発させた。残留する水性相を凍結乾燥させ、抽出物Ｃを生成した。
上記溶液の第二の部分は、ポリビニルピロリドン約２ｇにより撹拌しながら約３０分かけて処理し、ポリフェノールを捕獲した。吸着剤は濾過、遠心分離などにより分離した。有機溶剤を減圧下に約５０℃で蒸発させた。残留する水性相を凍結乾燥させ。抽出物Ｄを生成した。
【００６１】
ＰＧＥ２産生の測定
種々のチコリ抽出物、すなわち抽出物Ａ−ＤのＰＧＥ２生合成に対する効果をヒト結腸細胞系ＨＴ−２９で評価した。ＰＧＥ２の生合成は、シクロオキシゲナーゼなどの酵素活性レベルの示唆を与える。すなわち、シクロオキシゲナーゼは、例えばアラキドン酸からのＰＧＥ２生成に対する触媒として作用することができることが一般に知られている。従って、この試験により、下記のようにシクロオキシゲナーゼの酵素活性に対するチコリ抽出物の効果を評価することができる。
【００６２】
細胞を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびアラキドン酸１０μＭを補給したそれらの培地で４８時間かけて増殖させた。チコリ抽出物を次いで、これらの培地に、２１時間または１５時間かけて５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。もう一つの一組の細胞試料を、上記のとおりにＨＴ−２９にチコリ抽出物Ｂを添加し、次いで腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）１０ｎｇ／ｍｌの存在下に６時間にわたり共インキュベートすることによって調製した。ＴＮＦの添加は炎症を刺激するものと一般に信じられている。
【００６３】
細胞培養物中のＰＧＥ２の量を次いで、ＰＧＥ２モノクローナル酵素イムノアッセイキット（PGE2 Monoclonal Enzyme Immunoassay Kit）（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用い製造業者の指示に従い測定した。短略すると、培地２５μｌまたは５０μｌを一連の稀釈ＰＧＥ２標準試料とともに、相当する量のアセチルコリンエステラーゼ標識付けしたトレーサーおよびＰＧＥ２抗血清と混合し、次いで室温で１８時間にわたりインキュベートした。ウエルを空にし、次いで緩衝液で洗浄した後、アセチルコリンエステラーゼ用基質を含有するエルマン（Ellman）試薬２００μｌを添加した。酵素反応は室温において１時間かけて緩慢振盪器内で行った。結果はマイクロプレートリーダーを用い４１５ｎｍで測定し、タンパク質マイクログラムに標準化した。
【００６４】
この試験結果は、前記のとおりに酢酸エチルを用いて製造されたチコリ抽出物Ｂが測定されたＰＧＥ２の量の減少により証明されるように、シクロオキシゲナーゼ活性の抑制に対し最も際立った効果を有していたことを示した。一般に、シクロオキシゲナーゼ活性の減少は、チコリ抽出物の量の増加に従いさらに増強された。さらにまた、この試験結果は、チコリ抽出物Ｂが、ＴＮＦを含有していないＨＴ−２９細胞系に比較し、ＴＮＦを含有するＨＴ−２９細胞系においてシクロオキシゲナーゼ活性の抑制にかかわりさらに増強された効果を有していたことを示した。このことは、シクロオキシゲナーゼ活性の抑制が、シクロオキシゲナーゼ−１に比較し、シクロオキシゲナーゼ−２の特異的抑制に対しさらに影響を及ぼすことができることを示唆している。この結果を、表１に示す。
【００６５】
【表１】
2005535632.tif 000002
＊TNF−アルファによる酵素活性の刺激は、１０倍であった。
表１．ＨＴ−２９細胞におけるＰＧＥ−２合成に対する酢酸エチルによるチコリ抽出物の効果
【００６６】
インビトロ試験２
１．ＰＧＥ−２合成に対するα−ＣＨ2−γ−ブチロラクトンの抑制効果
本発明者は、アルファ−メチレン−ガンマ−ブチロラクトンの抗炎症効果を証明するために、類似の具体的試験を行った。一般に、アルファ−メチレン−ガンマ−ブチロラクトンによるＰＧＥ２合成の抑制は、ＴＮＦ−アルファにより刺激されたＨＴ２９細胞で証明されている。この目的のために、細胞を培養し、アラキドン酸（１０マイクロリットル）およびウシ血清アルブミン（０．０１％）を補給されているＭｃ Ｃｏｙ´ｓ ５Ａ培地に通した。細胞を、ＴＮＦ−アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有させて２１時間、またはＴＮＦ−アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ）による刺激を伴うことなく６時間にわたり、下記の用量のアルファ−メチレン−ガンマ−ブチロラクトン（メタノール中に溶解）により：１５、３０、６０ｍｉｃｒｏＭ、または溶剤単独により処理した。ＰＧＥ２分析は培地試料においてエリサ(Elisa)試験を用いて行った。
【００６７】
【表２】
2005535632.tif 000003
表２：ＴＮＦ−αを用いて、または用いることなくα−ＣＨ2−γ−ブチロラクトンにより処理されたＨＴ２９細胞における培地中のＰＧＥ２濃度、ｐｇ／ｍｌ
【００６８】
２．ＣＯＸ−２発現に対するα−ＣＨ2−γ−ブチロラクトンの抑制効果
ウエスタンブロッティング分析：ＨＴ２９細胞（ＰＧＥ−２測定にかかわり上記のとおりに処理された細胞、すなわちＴＮＦ−アルファの存在または不存在下に、およびα−ＣＨ2−γ−ブチロラクトンで処理したか、または処理していないＨＴ２９細胞）を、細胞溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス(Tris)ＨＣｌ（ｐＨ８）、１％ツイーン（Tween）２０、ＥＤＴＡ（ｐＨ８）１ｍＭ、プロテアーゼ阻害剤、ＰＥＦＡ（Merck）、ＤＥＴＣ（Aldrich））により処理することによって調製した。このライゼートを５秒間にわたり超音波処理し、次いで１００００ｇで５分間かけて遠心処理した。ウシ血清アルブミンを用いて標準化されたブラッドフォード（Bradford）法により、タンパク質濃度を測定した。
【００６９】
全細胞抽出物（２５μｇ）を、ロムリ（Laemmli）試料緩衝液中で沸騰させ、次いで不連続ポリアクリルアミドゲルシステムを用いる１０％ゲル上においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解させた。非特異性結合部位は、ツイーン−２０ ０．１％を含有する５％乾燥乳−リン酸塩緩衝塩類溶液中で当該膜を４℃において一夜かけてインキュベートすることによってブロックした。
ブロットは、ヤギポリクローナル抗ＣＯＸ−２およびまたＣＯＸ−１抗体（Ｃ−２０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の５％乳−ＰＳＢ中の１：１０００稀釈中で室温において１時間にわたりハイブリッド化し、次いで１％乳−ＰＢＳ中で１時間にわたり洗浄した。
【００７０】
引続いて、ブロットを共役結合された二次ロバ抗ヤギ抗体ホースラディシュペルオキシダーゼにより検知した。１時間の洗浄後、この複合体をＥＣＬウエスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。
これらの結果は図１に示されている。
【００７１】
３．α−ＣＨ2−γ−ブチロラクトンによるＣＯＸ−２活性の特異的抑制
Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ ＳｔｒｅｓｓＸｐｒｅｓｓ（登録商品名）シクロオキシゲナーゼ活性キットは、種々の生物学的液体中のシクロオキシゲナーゼＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の特異的測定方法を提供する。このキットは、特異的化学発光性基質（芳香族炭化水素分子）を使用し、ＣＯＸ酵素の過酸化活性を検出するものである。特異的化合物（α−ＣＨ2−γ−ブチロラクトンおよびＮＳ−９３８、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙからの特異的ＣＯＸ−２抑制剤、両方ともにメタノール中に溶解）により抑制した後、シクロオキシゲナーゼの直接残留活性を、化学発光性基質およびアラキドン酸（５０μＭ）の添加によって測定した。光の発射が直ちに始まり、３０秒後に、化学発光シグナル（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ−ＲＬＵ）が３０秒後に測定された（Ｉｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ Ｔｅｃａｎ）。発射された光の量はＣＯＸ活性に直接に比例する。
この試験において、α−ＣＨ2−γ−ブチロラクトンは、対照化合物ＮＳ−３９８によって達成されるように、特異的に、かつ高い効力をもってＣＯＸ−２活性を抑制することが見出された。これらの結果を表３に示す。
【００７２】
【表３】
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表３：シクロオキシゲナーゼ活性（ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２）の測定
【００７３】
本明細書に記載されている現時点で好適な態様に対する種々の変更および修正は当業者にとって明白であると理解されるべきである。このような変更および修正は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、またその意図する利点を減じることなくなすことができる。従って、このような変更および修正は添付特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、本発明の態様に従うＨＴ２９細胞におけるＣＯＸ−２発現に対するα−ＣＨ2−γ−ブチロラクトンによる抑制を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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