(57)【要約】本発明は、単一細胞内の複数のタンパク質の活性化状態をフローサイトメトリーを使用して同時に検出する方法及び組成物を提供する。本発明は更に、単一細胞内の複数のタンパク質の活性を協調的に調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法及び組成物を提供する。前記方法及び組成物を用いて、病的状態の予想又は診断のために、及び病的状態の治療をモニターするために１個の細胞のタンパク質活性化プロフィールを決定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞内の少なくとも第一と第二の活性化できるタンパク質の活性化状態を検出する方法であって、以下の工程、
ａ）前記第一及び前記第二の活性化できるタンパク質を含む細胞の集団を提供する工程、
ｂ）前記細胞集団を、複数の活性化状態特異的抗体と接触させる工程であって、前記複数の活性化状態特異的抗体が、以下のｉ）及びｉｉ）、
ｉ）前記細胞集団内の前記第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合することができる少なくとも１つの第一の活性化状態特異的抗体、及び
ｉｉ）前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合することができる少なくとも１つの第二の活性化状態特異的抗体、
を含む工程、及び
ｃ）フローサイトメトリーを用い、前記細胞集団の単一細胞内で前記第一及び第二の活性化状態特異的抗体の結合を検出する工程であって、前記第一の活性化状態特異的抗体の結合が、前記第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標であり、更に前記第二の活性化状態特異的抗体の結合が、前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第一の活性化できるタンパク質が、キナーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の活性化できるタンパク質が、カスパーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の活性化できるタンパク質が第一のキナーゼであり、更に前記第二の活性化できるタンパク質が、第二のキナーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のキナーゼのアイソフォームが、第一のリン酸化されたキナーゼであり、更に前記第二のキナーゼのアイソフォームが、第二のリン酸化されたキナーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の活性化部位特異的抗体が、前記第一のリン酸化キナーゼと結合し、更に前記第二の活性化部位特異的抗体が 、前記第二のリン酸化キナーゼと結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一の活性化できるタンパク質が、第一のカスパーゼであり、更に前記第二の活性化できるタンパク質が、第二のカスパーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のカスパーゼの前記アイソフォームが第一のプロカスパーゼの切断生成物であり、更に前記第二のカスパーゼの前記アイソフォームが第二のプロカスパーゼの切断生成物である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の活性化部位特異的抗体が、前記第一のカスパーゼの前記アイソフォームと結合する第一の活性化部位特異的抗体及び前記第二のカスパーゼの前記アイソフォームと結合する第二の活性化部位特異的抗体を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
単一細胞内の少なくとも第一の活性化できるタンパク質の活性化状態を検出する方法であって、以下の工程、
ａ）少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質を含む細胞の集団を提供する工程、
ｂ）前記細胞集団を複数の基質と接触させす工程であって、前記複数の基質が、前記細胞集団内の前記第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる少なくとも１つの第一の基質を含む工程、及び
ｃ）フローサイトメトリーを用い、前記細胞集団の単一細胞内の前記第一の基質の修飾を検出する工程であって、前記修飾が前記第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記細胞集団が、更に第二の活性化できるタンパク質を含み、前記複数の基質が、更に、前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる第二の基質を含み、更に工程ｃ）が、フローサイトメトリーを用い、前記細胞集団の単一細胞内の前記第二の基質の修飾を検出することを含み、前記第二の基質の修飾が、前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
単一細胞内の少なくとも第一の活性化できるタンパク質の活性化状態を基準にして前記細胞のタンパク質の活性化状態プロフィールを検出する方法であって、以下の工程、
ａ）少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質を含む細胞集団を提供する工程、
ｂ）前記細胞集団を複数の基質と接触させる工程であって、前記複数の基質が、前記細胞集団内の前記第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる少なくとも１つの第一の基質を含む工程、
ｃ）前記細胞集団を複数の活性化状態特異的抗体と接触させる工程であって、前記活性化状態特異的抗体が、前記細胞集団内の前記第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合することができる少なくとも１つの第一の活性化状態特異的抗体を含む工程、及び
ｄ）フローサイトメトリーを用いて、以下のｉ）及びｉｉ）、
ｉ）前記細胞集団の単一細胞内の前記第一の活性化状態特異的抗体の結合であって、前記第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である結合、及び
ｉｉ）前記単一細胞内の前記第一の基質の修飾であって、前記第一の活性化できるタンパク質の前記特定の活性化状態の指標である前記修飾、
を同時に検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記細胞集団が、更に第二の活性化できるタンパク質を含み、前記複数の基質が、更に前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる第二の基質を含み、更に工程ｄ）が、前記フローサイトメトリーを用い、前記単一細胞内の前記第二の基質の修飾を検出することを含み、前記修飾が、前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の活性化状態特異的抗体が、更に、前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合できる第二の活性化状態特異的抗体を含み、更に工程ｃ）が、フローサイトメトリーを用いて前記細胞集団の前記単一細胞内の前記第二の活性化状態特異的抗体の結合を検出することを含み、前記第二の活性化状態特異的抗体の結合が、前記第二の活性化できるタンパク質の前記特定の活性化状態の指標である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞内の少なくとも第一の活性化できるタンパク質の活性を調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程、
ａ）前記細胞の各々が、少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質、第二の活性化できるタンパク質、及び第三の活性化できるタンパク質を含む細胞集団を提供する工程であって、前記第一の活性化できるタンパク質が、前記第二の活性化できるタンパク質を活性化し、それによって前記第二の活性化できるタンパク質の特定のアイソフォーム（アイソフォーム−２）を形成することができ、更に前記第二の活性化できるタンパク質が、前記第三の活性化できるタンパク質を活性化し、それによって前記第三の活性化できるタンパク質の特定のアイソフォーム（アイソフォーム−３）を形成することができる工程、
ｂ）前記細胞を第二の活性化状態特異的抗体、第三の活性状態特異的抗体及び生体活性候補物質と接触させる工程であって、前記第二の活性化状態特異的抗体が、前記アイソフォーム−２と結合することができ、更に前記第三の活性化状態特異的抗体が、前記アイソフォーム−３と結合することができる工程、
ｃ）蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用い、前記アイソフォーム−２及びアイソフォーム−３の存在を基準にして前記細胞集団の単一細胞を分類する工程、及び
ｄ）前記生体活性候補物質の存在下及び非存在下での前記単一細胞内の前記アイソフォーム−２対前記アイソフォーム−３の比率を決定する工程であって、前記生体活性候補物質の存在下及び非存在下における前記アイソフォーム−２対前記アイソフォーム−３の比率における相違が、前記第一の活性化できるタンパク質の活性を修飾する前記生体活性候補物質の能力の指標である工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記第一の活性化できるタンパク質が、活性惹起物質によって活性化される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一の活性化できるタンパク質が、カスパーゼである請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一の活性化できるタンパク質が、キナーゼである請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記キナーゼが、ＰＩ３Ｋであり、前記第二の活性化できるタンパク質が、ＰＩＰ２であり、前記第三の活性化できるタンパク質が、ＰＩＰ３であり、前記アイソフォーム−２がＰＩＰ４，５ビスホスフェートであり、更に前記アイソフォーム−３が、ＰＩＰ３，４，５である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＩ３Ｋが、増殖因子によって又は細胞表面レセプターの活性化によって活性化される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一の活性化できるタンパク質が、ＩＣＡＭ−２であり、前記活性が、アポトーシスであり、第二の活性化できるタンパク質が、ＰＩＰ２であり、前記第三の活性化できるタンパク質が、ＰＩＰ３であり、前記アイソフォーム−２が、ＰＩＰ４，５ビスホスフェートであり、前記アイソフォーム−３が、ＰＩＰ３，４，５である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程ａ）が、更にＩＣＡＭ−２とＩＣＡＭ−３とのクラスター形成を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の活性化状態特異的抗体が、抗AKT−ホスホ−Ser473、抗AKT−ホスホ−Thr308、抗p44/42 MAPKホスホ−Thr202/Tyr204、抗TYK2ホスホ−Tyr1054/1055、抗p38 MAPKホスホ−Thr180/Tyr182、抗JNK/SAPKホスホ−Thr183/Tyr185、抗ホスホ−チロシン、抗ホスホ−スレオニン、抗ＰＩＰ２及び抗ＰＩＰ３から成る抗体群から選択される少なくとも１つの抗体を含む請求項１〜９及び１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
工程ａ）が、更に、少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質の活性化を誘発する物質と前記細胞集団を接触させる工程を含む請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
工程ａ）が、更に、前記第一及び前記第二の活性化できるタンパク質の少なくとも１つの活性化を誘発する物質と前記細胞集団を接触させることを含む請求項１〜９、１１及び１３〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
工程ａ）が、更に、前記第一、前記第二及び前記第三の活性化できるタンパク質の少なくとも１つの活性化を誘発する物質と前記細胞集団を接触させることを含む請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
更に、前記第一の活性化できるタンパク質の前記活性化状態及び前記第二の活性化できるタンパク質の前記活性化状態を基準にして前記単一細胞を区分する工程を含む請求項１〜９、１１及び１３〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記第一の活性化状態特異的抗体が第一の標識を含み、前記第二の活性化状態特異的抗体が第二の蛍光標識を含み、更に前記分類が蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による請求項１〜９及び１４〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記第一の活性化状態特異的抗体が第一のＦＲＥＴ標識を含み、前記第二の活性化状態特異的抗体が第二のＦＲＥＴ標識を含み、更に前記分類が蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による請求項１〜９及び１４〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記第一の活性化状態特異的抗体がＦＲＥＴ標識を含み、前記第二の活性化状態特異的抗体が一標識を含み、更に前記分類が蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による請求項１〜９及び１４〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
工程ａ）が更に前記細胞を固定することを含む請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願60/304,434号（2001年7月10日出願）及び同60/310,141号（2001年8月2日出願）の継続出願であり、更に前記出願に関して優先権を主張する。
本発明は、米国予防衛生研究所のグラント番号P01-AI39646号、AR44565号、AI35304号、N01-AR-6-2227号及びA1/GF41520-01により米国政府の援助を受けて達成された。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は一般にフローサイトメトリーを使用して蛋白質を検出する分野に関する。より詳細には、本発明は、単一細胞内の多数の蛋白質の活性化状態をフローサイトメトリーを使用し、より具体的には多染フローサイトメトリーを使用して同時に検出することに関する。
【０００２】
発明の背景
蛋白質は細胞の主要成分である。蛋白質の空間的時間的発現パターン及び細胞内分布は、細胞の形状、構造及び機能を決定する。蛋白質は20個の異なるアミノ酸（各々が別個の側鎖及び化学的特性を有する）から組み立てられる。これによって、蛋白質の化学的特性及び前記蛋白質が示す活性に非常な多様性が提供される。
更に、多くの蛋白質は動的な態様で調節され、それによって蛋白質の活性は一定の固有又は外来の指令に反応して変化することができる。調節の形態の１つには調節される蛋白質の共有結合による修飾が含まれる。そのような共有結合による修飾の例は、アミノ酸側鎖におけるヒドロキシル基のリン酸基による置換（リン酸化）である。そのような修飾はしばしば蛋白質活性における変化を伴なう。プロテインキナーゼは固有の蛋白質基質を認識する能力を有し、それらの蛋白質基質上のセリン、スレオニン又はチロシン残基のリン酸化を触媒する。被リン酸化が可能なそのような基質蛋白質はリン蛋白質と称される。いったんリン酸化されると、基質蛋白質は、特異的に前記基質タンパク質を認識するプロテインフォスファターゼによって前記リン酸化された残基をヒドロキシル化残基に戻すことができる。プロテインホスファターゼは、セリン、スレオニン又はチロシン残基上でリン酸基のヒドロキシル基への置換を触媒する。キナーゼとホスファーターゼの作用により、蛋白質は多数の残基上で可逆的にリン酸化され、それによってその活性を調節することができる。
【０００３】
多くのキナーゼ及びホスファターゼが知られており、それらはシグナルトランスダクションにおいて重要な役割を果たしている。多くのキナーゼ及びホスファターゼがリン蛋白質であり、それらのキナーゼ活性及びホスファターゼ活性はリン酸化によって調節される。キナーゼ及びホスファターゼのリン酸化は、しばしば他のタイプ又は同じタイプのキナーゼ及びホスファターゼによって調節される。このようにして、シグナルトランスダクションの調節因子はシグナリング連鎖事象の一部分としてそれ自体調節される。
多くの細胞内キナーゼ及びホスファターゼが、細胞表面でレセプターを刺激する細胞外シグナルに反応してシグナルを変換する。結果として、細胞外シグナルは、受容細胞の多くの蛋白質のリン酸化及び活性化状態における変化を誘発する。例えば、多くのマイトジェンは、細胞の分裂をひき起こすＪＮＫ及びＭＡＰＫを誘発する。別の例として、好中球因子は、ニューロン生存を促進するＡＫＴシグナリング活性を誘発することが示された。更に、多くの疾患（例えば癌）は、多数のシグナリング蛋白質の活性化状態における変化を伴なう。多くの事例において、癌細胞で観察されるシグナリング活性は、非癌細胞の増殖因子刺激シグナリング活性を連想させる。
【０００４】
細胞膜のいくつかの脂質もまたキナーゼの基質である。例えば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、ホスファチジルイノシトール４，５−ジホスフェート（ＰＩＰ２）を特異的に認識し、イノシトール部分の３’位でそのリン酸化を触媒する。ＰＩＰ２は別のキナーゼ、ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（前記はイノシトール部分の４’及び５’位でホスファチジルイノシトールのリン酸化を触媒する）の活性によって生成される。ＰＩ３Ｋは種々の細胞機能を調節し、前記は神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリンレセプター基質１（ＩＲＳ−１）及びＣＤ２８のような増殖因子によって活性化される。ＰＩ３Ｋを活性化する蛋白質の多くがまたＧＴＰアーゼ（もっぱらｒａｓファミリー）を活性化し、ＧＴＰアーゼはそのｐ１１０サブユニットに結合することによって続いてＰＩ３Ｋを活性化する。チロシンがリン酸化されたレセプターからＰＩ３Ｋへの直接経路及びＧＴＰアーゼによるＰＩ３Ｋの活性化は協調的に機能する。ＰＩ３Ｋは、触媒性サブユニット（ｐ１１０）及び調節サブユニットで構成されたヘテロダイマー酵素である。ＰＩ３Ｋのいくつかの調節サブユニット（ｐ85α及びｐ85βを含む）をコードするいくつかの遺伝子が特定された。更に、ｐ85αの多数のスプライス変種が知られている（ｐ55α及びｐ50αを含む）。
キナーゼシグナリング連鎖事象は、細胞内のほとんど全ての重大な決定プロセスにおいて重要な役割を果たすことが認識されている（概説については以下を参照されたい：Cell 100:113-127, 2000）。ある系における固有のシグナルトランスダクション経路の役割の決定は、固有のキナーゼに対する薬理学的阻害剤の出現によって促進された。しかしながら、そのようなキナーゼ（例えばプロテインキナーゼＢ／ＡＫＴ、ｃＪｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ｐ38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ｐ38）、ｐ44／42ＥＲＫ1/2（ＥＲＫ）、ＰＫＡ、ＰＫＣ又はＴＹＫ２）に対する活性のモニタリングは、通常in vitroキナーゼアッセイを必要とし、最近ではイムノブロッティングによってこれら蛋白質のリン酸化状態がリン特異的抗体を用いて決定される。今日まで、希少な細胞亜集団と重要なシグナリング経路のキナーゼの活性化状態との関係を知ることは可能ではなかった。
【０００５】
タンパク質の調節のまた別の形態はペプチド結合のタンパク分解切断を必要とする。ランダムな又は誤誘導タンパク分解切断はタンパク質の活性に有害であろうが、多くのタンパク質は、特定のペプチド結合を認識しこれを切断するプロテアーゼの作用によって活性化される。多くのタンパク質は、特定のペプチド結合のタンパク分解切断に続いて成熟したタンパク質のアイソフォームを生じる前駆体タンパク質又はプロプロテインから誘導される。多くの増殖因子はこのようにして合成されプロセッシングを受け、前記タンパク質の成熟アイソフォームは典型的には前駆体が示さない生物学的な活性をもつ。多くの酵素もまたこのようにして合成されプロセッシングを受け、典型的には前記タンパク質の成熟アイソフォームは酵素的に活性を有し、前記タンパク質の前駆体形は酵素活性を示さない。このタイプの調節は明らかに可逆的ではない。従って、タンパク分解により活性化されたタンパク質の活性を抑制するためには、“脱切断”以外のメカニズムを用いる必要がある。タンパク分解により活性化されるタンパク質の多くが比較的短命なタンパク質であるのはこのような事例である。
タンパク分解により活性化される酵素にはカスパーゼがある。カスパーゼは、プログラムされた細胞死（当業界では“アポトーシス”と称される）を達成させる重要な部類のプロテアーゼである。カスパーゼはほとんどの細胞に構成的に存在し、単鎖プロエンザイムとしてサイトゾルに分布する。これらは、最初のタンパク分解切断によって大カスパーゼサブユニット及び小カスパーゼサブユニットに分割され、更に第二の切断によってＮ末端ドメインを除去されて完全な機能を有するプロテアーゼに活性化される。前記サブユニットは集合して２つの活性部位を有するテトラマーを形成する（Green, Cell 94:695-698, 1998）。
【０００６】
抗体はタンパク質の研究に特に有用である。抗体は特異的に抗原と結合し、特に高い親和性で抗原と結合する糖タンパク質の大きなファミリーである。抗体は定常ドメイン及び可変ドメインを含む。抗体の可変ドメインは抗原と結合する。ポリクローナル抗体は多数の可変領域タイプを含む。モノクローナル抗体はただ１つの可変領域を含み、従ってよりわずかなタンパク質と特異的に結合する蓋然性がいっそう高い。モノクローナル及びポリクローナル抗体は当業界で公知の手段によって日常的に作製され、研究及び治療の両分野で使用するために既知の多くのタンパク質に対して作製されてきた。抗体を用いて、それらが特異的に結合する抗原又はタンパク質の存在を決定することができる。前記アプローチを用いる周知の免疫化学的方法には、ウェスタンブロッティング、免疫沈澱及び酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。
特に抗体を用いて、あるタンパク質の特定のアイソフォームの存在を、特に前記タンパク質の他のアイソフォームに存在しない抗原を前記アイソフォームが保有するとき、又は前記タンパク質の他のアイソフォームに存在しない抗原を前記アイソフォームが欠いているときに決定することができる。従って、前記アイソフォームは同じタンパク質の他のアイソフォームとは抗原的に異なるであろう。抗原的に異なるアイソフォームは共有結合した固有の成分を保有又は欠いているか、又は他のアイソフォームと異なる構成を有し、従って抗原的に区別することができる態様で同じアミノ酸配列を提示することができる。
【０００７】
例えば、ＰＩ３Ｋ活性の決定は、典型的にはＰＩ３Ｋの免疫沈澱及びリン脂質及び標識ＡＴＰを用いるin vitro酵素アッセイを必要とする。最近になって、ホスファチジルイノシトール４，５−ジホスフェート及びホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェートと特異的に結合する抗体が作製された（Molecular Probes, A-21327抗ホスファチジルイノシトール４，５−ジホスフェート、マウスＩｇＭモノクローナル2C11；A-21328抗ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェート、マウスＩｇＭモノクローナルRC6F8）。これらの抗体はＰＩ３Ｋ基質（ＰＩＰ２）及び生成物（ＰＩＰ３）の検出のための有用なツールとして機能し、ＰＩ３Ｋの活性の決定に用いることができる。
タンパク質の発現及び機能に関する生化学的研究では伝統的に１つ又はいくつかのタンパク質に同時に焦点が当てられてきた。これは主に利用可能な研究技術による制約のためであった。正常又は異常な細胞生理は、多数の分子の相互作用に参画する多数のタンパク質の産物であることはよく知られている。治療方法を考案するためには、疾患の基礎となるメカニズムを理解することが望ましい。そのような理解には多数のタンパク質及びそれら分子の経時的な相互作用を考慮することが要求される。これに関して、重要な実験上の障害物の１つは、いかにして多数のタンパク質を単一の実験で分析し、例えば単一のタンパク質サンプルについて又は更に云えば単一細胞についてタンパク質発現プロフィルを決定するかということである。
細胞内でのタンパク質発現の定性的測定の他に、タンパク質発現の定量的測定も所望される。多くのタンパク質が多様な発現レベルで様々に機能することができ、更にタンパク質機能におけるそのような相違は細胞の生理における相違をもたらすことができるということはよく知られている。
【０００８】
あるタンパク質の種々のアイソフォームが異なる活性をもつ場合には、サンプル中のタンパク質の個々のアイソフォームの発現レベルを決定することは極めて有用である。例えば、シグナルトランスダクションに必要なタンパク質は、しばしば２つ又は３つ以上の形態で存在し、シグナリング経路の作用を仲介するシグナルを伝達するのは通常はシグナリングタンパク質の特定の形態である。１つの形態から別の形態への変換は、タンパク質活性の変化によるシグナルのオン又はオフへの切り換えにしばしば用いられる。
更にまた、タンパク質の発現及び機能の研究のために、タンパク質を固相に固定することがしばしば必要である。ウェスタンブロット分析では、問題のタンパク質は電気泳動によってまず分離され、続いてニトロセルロース又はポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜に固定される。タンパク質発現ライブラリーのファージディスプレースクリーニングでは、ファージによって発現された数百万個のタンパク質が膜上に固定される。ウェスタンブロッティング及びファージディスプレースクリーニングの両方で、タンパク質は非共有結合により固定される。続いて、問題のタンパク質をその固有の特性（すなわち抗体との相互作用）により選別する。他のいくつかの応用（例えば免疫沈澱及びアフィニティー精製）では、薬剤（例えば抗体、リガンド）は、それらの第一アミン、スルフヒドリル又は他の反応基を介して固相（例えばアガロースビーズ）に共有結合により結合される。一般には、固定後にもタンパク質は他のタンパク質又はリガンドと反応するそれらの能力を保持している。しかしながら、１つのサンプルから多数のタンパク質を固定したとしても、多数のタンパク質についてのタンパク質の発現、形態及びそのレベルの同時検出に関する問題は残っている。
従って、本発明の目的は上記に記載した問題を克服することである。従って、本発明は、１個の細胞内の複数のタンパク質の活性化状態を同時に検出するためのアプローチを提供する。本アプローチによって、複雑な細胞集団内の不均一性の迅速な検出がタンパク質の活性化状態を基準にして可能になり、前記細胞集団内のタンパク質の活性化状態において相関する変化を示す細胞サブセットの特定が可能になる。更にまた、本アプローチは、細胞の活性又は特性（例えば表面の分子の発現又は細胞の顆粒化度）と単一細胞レベルでのタンパク質の活性化との対比を可能にする。
【０００９】
発明の要旨
上記の目的にしたがえば、本発明は、単一の細胞内の複数の活性化することができるタンパク質の活性化状態をフローサイトメトリーを使用して同時に検出する方法及び組成物を提供する。本発明は更に、単一細胞内の活性化できる複数のタンパク質の活性又は活性化状態を協調的に調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法及び組成物を提供する。前記方法及び組成物を用いて、病的状態の予想又は診断のために、及び病的状態の治療をモニターするために細胞内のタンパク質の活性化プロフィールを決定することができる。更にまた、本発明の方法及び組成物は、場合によって、単一細胞内の活性化できる複数のタンパク質の活性化状態を連続的に検出するために用いることができる。更に、本発明の方法及び組成物は、場合によって、単一タンパク質の活性化状態を検出するために、又は単一タンパク質の活性又は活性化状態を調節するために用いることができる。
本発明は、本発明の方法において有用な細胞集団、単一細胞、細胞溶解物、タンパク質、及び細胞集団、単一細胞、細胞溶解物、タンパク質を含むサンプルを提供する。特に本発明は、活性化できるタンパク質、及び活性化できるタンパク質の特定のアイソフォームと結合する活性化状態特異的抗体を提供する。ある特徴では、活性化状態特異的抗体は標識、好ましくは蛍光標識、より好ましくはＦＲＥＴ標識と結合される。
【００１０】
ある特徴では、本発明は、単一細胞内の少なくとも第一及び第二の活性化できるタンパク質の活性化状態を検出する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：ａ）第一及び第二の活性化できるタンパク質を含む細胞の集団を提供し；ｂ）前記細胞集団を複数の活性化状態特異的抗体と接触させ、ここで前記複数の活性化状態特異的抗体は以下のｉ）及びｉｉ）を含み：ｉ）前記細胞集団の第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合することができる少なくとも１つの第一の活性化状態特異的抗体、及びｉｉ）前記細胞集団の第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合することができる少なくとも１つの第二の活性化状態特異的抗体；更にｃ）フローサイトメトリーを用いて、細胞集団の単一細胞で前記第一及び第二の活性化状態特異的抗体の結合を検出し、ここで前記第一の活性化状態特異的抗体の結合は前記第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標であり、更に前記第二の活性化状態特異的抗体の結合は前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である。
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はキナーゼである。更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はカスパーゼである。
【００１１】
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質は第一のキナーゼであり、更に前記第二の活性化できるタンパク質は第二のキナーゼである。更にまた別の特徴では、前記第一のキナーゼのアイソフォームは第一のリン酸化キナーゼであり、更に前記第二のキナーゼのアイソフォームは第二のリン酸化キナーゼである。別の特徴では、前記第一の活性化部位特異的抗体は前記第一のリン酸化キナーゼと結合し、更に前記第二の活性化部位特異的抗体は前記第二のリン酸化キナーゼと結合する。
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質は第一のカスパーゼであり、更に前記第二の活性化できるタンパク質は第二のカスパーゼである。更にまた別の特徴では、前記第一のカスパーゼのアイソフォームは第一のプロカスパーゼの切断生成物であり、更に前記第二のカスパーゼのアイソフォームは第二のプロカスパーゼの切断生成物である。別の特徴では、前記複数の活性化部位特異的抗体は、第一のカスパーゼのアイソフォームと結合する第一の活性化部位特異的抗体及び第二のカスパーゼのアイソフォームと結合する第二の活性化部位特異的抗体を含む。
【００１２】
また別の特徴では、本発明は、単一細胞内の少なくとも１つの第一の活性化できるタンパク質の活性化状態を検出する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：ａ）少なくとも第一の活性化できるタンパク質を含む細胞の集団を提供し；ｂ）前記細胞集団を複数の基質と接触させ（前記複数の基質は、前記細胞集団の第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる少なくとも１つの第一の基質を含む）；更にｃ）フローサイトメトリーを用いて、前記細胞集団の単一細胞内の前記第一の基質の修飾を検出する（前記修飾は前記第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である）。
更に別の特徴では、前記細胞集団は更に第二の活性化できるタンパク質を含み；前記複数の基質は更に、前記細胞集団内の第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる第二の基質を含み；更に工程ｃ）はフローサイトメトリーを用いて、前記細胞集団の単一細胞内の前記第二の基質の修飾を検出することを含み、ここで、前記第二の基質の修飾は前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である。
【００１３】
別の特徴では、本発明は、単一細胞内の少なくとも第一の活性化できるタンパク質の活性化状態を基準にして前記細胞のタンパク質の活性化状態プロフィールを検出する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：ａ）少なくとも第一の活性化できるタンパク質を含む細胞集団を提供し；ｂ）前記細胞集団を複数の基質と接触させ（前記複数の基質は、前記細胞集団の第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる少なくとも１つの第一の基質を含む）；ｃ）前記細胞集団を複数の活性化状態特異的抗体と接触させ（前記活性化状態特異的抗体は、前記細胞集団内の第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合することができる少なくとも１つの第一の活性化状態特異的抗体を含む）；更にｄ）フローサイトメトリーを用いて以下のｉ）及びｉｉ）を同時に検出する：ｉ）前記細胞集団の単一細胞内の前記第一の活性化状態特異的抗体の結合（前記第一の活性化状態特異的抗体の結合は第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である）及びｉｉ）単一細胞内の第一の基質の修飾（前記修飾は前記第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である）。
更に別の特徴では、前記細胞集団は更に第二の活性化できるタンパク質を含み；前記複数の基質は更に、前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる第二の基質を含み；更に工程ｄ）はフローサイトメトリーを用いて、前記単一細胞内の前記第二の基質の修飾を検出することを含み、ここで、前記修飾は前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である。
【００１４】
更に別の特徴では、前記複数の活性化状態特異的抗体は更に、前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合できる第二の活性化状態特異的抗体を含み；更に工程ｃ）は、フローサイトメトリーを用いて前記細胞集団の前記単一細胞内の前記第二の活性化状態特異的抗体の結合を検出することを含み、ここで、前記第二の活性化状態特異的抗体の結合は前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である。
また別の特徴では、本発明は、細胞内の少なくとも１つの第一の活性化できるタンパク質の活性を調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：ａ）その細胞の各々が少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質、第二の活性化できるタンパク質、及び第三の活性化できるタンパク質を含む細胞集団を提供し（ここで前記第一の活性化できるタンパク質は第二の活性化できるタンパク質を活性化し、それによって前記第二の活性化できるタンパク質の特定のアイソフォーム（アイソフォーム−２）を形成することができ、更に前記第二の活性化できるタンパク質は第三の活性化できるタンパク質を活性化し、それによって前記第三の活性化できるタンパク質の特定のアイソフォーム（アイソフォーム−３）を形成することができる）；ｂ）前記細胞を第二の活性化状態特異的抗体、第三の活性状態特異的抗体及び生体活性候補物質と接触させ（ここで前記第二の活性化状態特異的抗体は前記アイソフォーム−２と結合することができ、更に前記第三の活性化状態特異的抗体は前記アイソフォーム−３と結合することができる）；ｃ）蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用い、前記アイソフォーム−２及びアイソフォーム−３の存在を基準にして前記細胞集団の単一細胞を分類し；更にｄ）生体活性候補物質の存在下及び非存在下で単一細胞内の前記アイソフォーム−２対アイソフォーム−３の比率を決定し、ここで生体活性候補物質の存在下及び非存在下におけるアイソフォーム−２対アイソフォーム−３の比率の相違は、前記第一の活性化できるタンパク質の活性を修飾する前記生体活性候補物質の能力の指標である。
【００１５】
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質は活性惹起物質によって活性化される。
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はカスパーゼである。別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はキナーゼであり、更に別の特徴では、前記キナーゼはＰＩ３Ｋであり、更に別の特徴では、前記ＰＩ３Ｋは増殖因子によって、又は細胞表面レセプターの活性化によって活性化される。
別の特徴では、前記キナーゼはＰＩ３Ｋであり、前記第二の活性化できるタンパク質はＰＩＰ２であり、前記第三の活性化できるタンパク質はＰＩＰ３であり、アイソフォーム−２はＰＩＰ４，５ビスホスフェートであり、更にアイソフォーム−３はＰＩＰ３，４，５である。
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はＩＣＡＭ−２であり、前記活性はアポトーシスであり、前記第二の活性化できるタンパク質はＰＩＰ２であり、前記第三の活性化できるタンパク質はＰＩＰ３であり、前記アイソフォーム−２はＰＩＰ４，５ビスホスフェートであり、更に前記アイソフォーム−３はＰＩＰ３，４，５である。更に別の特徴では、工程ａ）は更にＩＣＡＭ−２とＩＣＡＭ−３とのクラスター形成を含む。
更に別の特徴では、前記複数の活性化状態特異的抗体は、以下から成る抗体群から選択される少なくとも１つの抗体を含む：抗AKT−ホスホ（phospho）−Ser473、抗AKT−ホスホ−Thr308、抗p44/42 MAPKホスホ−Thr202/Tyr204、抗TYK2ホスホ−Tyr1054/1055、抗p38 MAPKホスホ−Thr180/Tyr182、抗JNK/SAPKホスホ−Thr183/Tyr185、抗ホスホ−チロシン、抗ホスホ−スレオニン、抗ＰＩＰ２及び抗ＰＩＰ３。
【００１６】
更に別の特徴では、工程ａ）は更に、少なくとも第一の活性化できるタンパク質の活性化を誘発する物質と細胞集団を接触させることを含む。
更に別の特徴では、工程ａ）は更に、第一及び第二の活性化できるタンパク質の少なくとも１つの活性化を誘発する物質と細胞集団を接触させることを含む。
請求項１５−２２のいずれかに記載の方法では、工程ａ）は更に、第一、第二及び第三の活性化できるタンパク質の少なくとも１つの活性化を誘発する物質と細胞集団を接触させることを含む。
更に別の特徴では、前記方法は更に、第一の活性化できるタンパク質の活性化状態及び第二の活性化できるタンパク質の活性化状態を基準にして細胞を分類することを含む。
更に別の特徴では、第一の活性化状態特異的抗体は第一の標識を含み、第二の活性化状態特異的抗体は第二の蛍光標識を含み、更に前記分類は蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による。
更に別の特徴では、第一の活性化状態特異的抗体は第一のＦＲＥＴ標識を含み、第二の活性化状態特異的抗体は第二のＦＲＥＴ標識を含み、更に前記分類は蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による。
更に別の特徴では、第一の活性化状態特異的抗体はＦＲＥＴ標識を含み、第二の活性化状態特異的抗体は一標識を含み、更に前記分類は蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）による。
更に別の特徴では、工程ａ）は更に細胞を固定することを含む。
更に別の特徴では、細胞は哺乳類細胞である。
【００１７】
発明の詳細な説明
シグナリング系の細胞内アッセイは、シグナリング物質の活性（例えばキナーゼの活性）を基準にして複雑な集団内の機能的細胞亜集団の相関性を知ることができないことで制約を受ける。そのような相関性は、シグナル発生又は病的状態出現時に希少な細胞集団で生じるシグナリング状態における変化を識別するために重要である。本発明は、単一細胞内の複数の活性化できるタンパク質の活性化状態をフローサイトメトリーにより同時に検出する方法及び組成物を提供することによってこれらの問題を解決する。本発明は更に、単一細胞内の複数の活性化できるタンパク質の活性又は活性化状態を協調的に調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法及び組成物を提供する。本方法及び組成物を用いて、病的状態を予測又は診断するために、及び病的状態の治療をモニターするために細胞のタンパク質活性化プロフィールを決定することができる。更にまた、本発明の方法及び組成物を用いて、場合によって単一細胞内の複数の活性化できるタンパク質の活性化状態を連続的に検出することができる。更に、本発明の方法及び組成物を用いて、場合によって単一細胞内のただ１つのタンパク質の活性化状態を検出するか、又はただ１つのタンパク質の活性又は活性化状態を調節することができる。
【００１８】
本発明の方法及び組成物を用いて、サンプル中の任意の特定のタンパク質のアイソフォームを検出することができる（前記アイソフォームは抗原として検出可能で、更に前記サンプル中に存在する前記タンパク質の他のアイソフォームと抗原的に区別できる）。例えば、本明細書に記載するように（例えば実施例を参照されたい）、本発明の活性化状態特異的抗体を本方法で用いて、複雑な細胞集団中のサブセット又は亜集団のそれぞれ別個のシグナリング連鎖事象を特定し、更に存在しえるシグナリング階層におけるタンパク質活性化（例えばキナーゼ活性化）の順序を特定することができる。更にまた、本発明の方法では、フローサイトメトリー（特に多染フローサイトメトリー）の使用によって、単一細胞内のシグナリング経路の多次元的分析及び機能評価が可能になる。
本明細書で用いられるように、“活性化状態特異的抗体”又は“活性化状態抗体”という用語は、対応する特異的な抗原と特異的に結合する抗体を指す。好ましくは、前記対応する特異的な抗原は活性化できるタンパク質の特定のアイソフォームである。また好ましくは、活性化状態特異的抗体の結合は特定の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である。従って、好ましい実施態様では、活性化状態特異的抗体と活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームとの結合は、前記活性化できるタンパク質そのもの、及び前記活性化できるタンパク質の活性化状態の指標である。
【００１９】
好ましい実施態様では、前記活性化状態特異的抗体は、活性化できるタンパク質の標的構造と結合する認識構造を含むペプチドである。当業界では多様な認識構造は周知で、ファージディスプレーライブラリー（例えば以下を参照されたい：Gururaja et al. Chem. Biol. (2000) 7:515-27; Houimel et al. Eur. J. Immunol. (2001) 31:3535-45; Cochran et al. J. Am. Chem. Soc. (2001) 123:625-32; Houimel et al. Int. J. Cancer (2001) 92:748-55、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）を含む当業界で公知の方法によって作製できる。好ましい実施態様では、前記活性化状態特異的抗体は以下の認識構造を含む：SKVILFE---ランダムペプチドループ---SKVILFE。そのような認識構造を有する抗体は特異的な標的構造と高い親和性で結合することができる。更に、本発明の方法で使用するために、前記のような抗体に蛍光発光団を結合させることができる。
種々の認識構造が当業界で公知で（例えば以下を参照されたい：Cochran et al. J. Am. Chem. Soc. (2001) 123:625-32; Boer et al. Blood (2002) 100:467-73、前記文献は各々参照により本明細書に含まれる）、当業界で知られている方法を用いて作製することができる（例えば以下を参照されたい： Boer et al. Blood (2002) 100:467-73; Gualillo et al. Mol. Cell Endocrinol. (2002) 190:83-9、前記文献は各々参照により本明細書に含まれる）。前記方法には例えば、認識構造物、例えば活性化できるタンパク質の標的構造に対して親和性をもつポリマーを製造するコンビケム（combi chem）法が含まれる（例えば以下を参照されたい：Barn et al. J. Comb. Chem. (2001) 3:534-41; Ju et al. Biotechnol. (1999) 64:232-9、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）。別の好ましい実施態様では、前記活性化状態特異的抗体は、特定の活性化できるタンパク質のリン酸化されたアイソフォームとのみ結合し、前記活性化できるタンパク質がリン酸化されていないか又は脱リン酸化された前記活性化できるタンパク質のアイソフォームとは結合しないタンパク質である。別の好ましい実施態様では、前記活性化状態特異的抗体は、細胞内に存在する活性化できるタンパク質のアイソフォームとのみ結合し、細胞外に存在するものとは結合しないタンパク質であり、逆の場合もまた同様である。
好ましい実施態様では、前記認識構造は抗ラミニン単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である（例えば以下を参照されたい：Sanz et al. Gene Therapy (2002) 9:1049-53; Tse et al. J. Mol. Biol. (2002) 317:85-94、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）。
【００２０】
本明細書で用いられるように、“ポリペプチド”及び“タンパク質”という用語は相互に用いることができ、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を指し、前記はタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。タンパク質は天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合、又は合成のペプチド摸倣物から製造することができる。従って、本明細書で用いられる“アミノ酸”又は“ペプチド残基”は天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸の両方を指す。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン及びノルロイシンは本発明ではアミノ酸と考えられる。“アミノ酸”はまた、イミノ酸残基（例えばプロリン及びオキシプロリン）を含む。側鎖は、（Ｒ）又は（Ｓ）構造のどちらでもよい。好ましい実施態様では、アミノ酸は（Ｓ）又はＬ−構造である。天然に存在しない側鎖が用いられる場合、非アミノ酸置換基を用いて、例えばin vivo分解を防止又は遅延させることができる。
【００２１】
本明細書で用いられるように、“活性化できるタンパク質”又は“基質タンパク質”又は“タンパク質基質”とは、固有の生物学的、生化学的又は物理的特性（例えば酵素活性、修飾（例えば翻訳後修飾）又は構造）を有するタンパク質の特定の形態と対応する少なくとも１つのアイソフォーム（及びいくつかの事例では２つ又は３つ以上のアイソフォーム）をもつタンパク質を指す。前記活性化できるタンパク質は、固有の生物学的活性、修飾又は構造に関して活性化又は失活されることができる。特に前記活性化できるタンパク質の“活性化された”又は“活性を有する”形態は、固有の生物学的活性、修飾又は構造を有し、一方、前記活性化できるタンパク質の“失活させられた”又は“活性をもたない”形態は、前記固有の生物学的活性、修飾又は構造をそれぞれもたない（又はより小さな又は低下したレベルの生物学的活性、修飾又は構造を有する）。いくつかの実施態様では、活性又は活性化状態に附随する２つ以上のアイソフォームが存在する。例えば、基質結合のために利用できる“開放”構造に附随するアイソフォーム、第二の“遷移状態”のアイソフォーム及び活性をもたない（例えば活性が阻害されている）アイソフォームが存在しえる。活性化できるタンパク質の例には、リンタンパク質及びリン脂質が含まれるが、ただしこれらに限定されない。活性化できるタンパク質の更に別の例にはキナーゼ、ホスファターゼ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、及び例えばシステイン及びセリンプロテアーゼのようなプロテアーゼ（カスパーゼ、カテプシン及び種々の周知のセリンプロテアーゼを含むが、ただしこれらに限定されない）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましい実施態様では、前記活性化できるタンパク質の前記生物学的、生化学的又は物理的特性（例えば酵素活性、修飾又は構造）は、活性惹起物質によって又は細胞のシグナリング事象によって誘発することができる。活性惹起物質の例には、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ（例えばカスパーゼ）及びホルモンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。細胞シグナリング事象の例には、レセプターのクラスター形成又は同系分子もしくはリガンドの結合が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２２】
本明細書で用いられるように、“アイソフォーム”とは、特定の、更に好ましくは検出可能な生物学的活性、修飾又は構造を有する活性化できるタンパク質の一形態を指す。前記アイソフォームは、活性化できるタンパク質の活性化した（又は活性を有する）形態、又は失活した（又は活性をもたない）形態である。本明細書に記載されるように、好ましい実施態様では、活性化状態特異的抗体と活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームとの結合は、前記活性化できるタンパク質そのものの及び前記活性化できるタンパク質の活性化状態の指標である。好ましい実施態様では、本発明はタンパク質のアイソフォームプロフィールを決定する方法を提供する。前記方法は、活性化された活性化できるタンパク質のアイソフォーム（又は活性化されたアイソフォーム）の存在を決定することを含む。
好ましい実施態様では、活性化されたアイソフォーム又は活性化できるタンパク質の活性化された状態は、固有の又は特定の生物学的、生化学的又は物理的特性（活性化できるタンパク質の少なくとも１つの他の形態が所有しない特性）を有する前記活性化できるタンパク質の一形態である。そのような特性の例には、酵素活性（例えばキナーゼ活性及びプロテアーゼ活性）及びタンパク質結合活性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。従って、そのような固有の又は特定の特性もしくは活性は活性化できるタンパク質の活性化されたアイソフォームに附随している。そのような特性又は活性は本明細書では時に活性化状態の活性と称される。
【００２３】
活性化状態の活性の例は活性化できるタンパク質キナーゼのキナーゼ活性である。本明細書で用いられるように、タンパク質キナーゼとは、活性化されたときにアミノ酸（前記はヒドロキシル基を有する）のリン酸化を触媒することができるタンパク質又はその誘導体を指すであろう。好ましいキナーゼは、セリン、スレオニン及びチロシン残基のリン酸化を触媒することができるものである。キナーゼ活性は、キナーゼによるリン酸化のための基質、キナーゼが利用することができるリン酸塩の供給源を供給し、更にキナーゼの存在下で基質のリン酸化を決定することによって判定することができる。
活性化状態の活性のまた別の例は活性化されたプロテアーゼのプロテアーゼ活性である。本明細書で用いられるように、プロテアーゼは、活性化されたときにアミノ酸配列を含むポリペプチド内のペプチド結合を加水分解することができるタンパク質を指すであろう。好ましいプロテアーゼは、カスパーゼとして知られるシステインプロテアーゼ類である。カスパーゼ活性はカスパーゼの基質を提供し、カスパーゼの存在下で基質の切断を決定することによって判定することができる。本発明の方法を用いてモニターすることができる活性化状態を有する他のシステインプロテアーゼにはカテプシンが含まれるが、ただしこれに限定されない。同様に、本発明の方法を用いてモニターできる更に別の種類のプロテアーゼにはセリンプロテアーゼが含まれ、前記プロテアーゼに関して適切な種々の種類が知られている。
【００２４】
活性化できるタンパク質の活性化されたアイソフォームの抗原性は、活性化できるタンパク質の活性を失ったアイソフォームの抗原性、又は異なる活性化状態のアイソフォームの抗原性とは区別することができる。好ましい実施態様では、タンパク質の活性化されたアイソフォームは、活性を失ったアイソフォームには存在しないエピトープを保有し、その逆もまた同様である。別の好ましい実施態様では、この相違は、タンパク質への成分（例えばホスフェート成分）の共有結合的付加によるものであるか、又はタンパク質切断によるタンパク質の構造的変化によるものであるか、又は別の態様で誘発されたタンパク質における構造的変化（前記変化によって前記タンパク質は同じ配列を抗原的に区別できる態様にさせる）によるものである。別の好ましい実施態様では、そのような構造的変化によって、活性化されたタンパク質アイソフォームは、活性を失ったアイソフォームには存在しない少なくとも１つのエピトープを提示するようになるか、又は活性を失ったアイソフォームに存在する少なくとも１つのエピトープを提示しなくなる。いくつかの実施態様では、識別抗体に対応するエピトープは酵素の活性部位の周辺に集中し、当業界では公知であるが、タンパク質の１つの領域における構造変化は前記タンパク質の別の領域における変化を同様にひき起こす。
【００２５】
そのアイソフォームを抗原的に区別することができる、失活アイソフォーム及び活性化アイソフォームとして存在することができるタンパク質にはキナーゼがある。キナーゼは、セリン、スレオニン又はチロシン残基でタンパク質のリン酸化を触媒する酵素である。大半のキナーゼは、活性調節形態として可逆的にリン酸化されるリンタンパク質である。タンパク質キナーゼは、典型的にはリン酸化された形態（リン酸化アイソフォーム）で酵素活性をもつキナーゼである。
リン酸化されたタンパク質アイソフォームと特異的に結合するが、非リン酸化アイソフォームとは特異的に結合しない多くの抗体（その多くが市販されている、例えば以下を参照されたい：Cell Signaling Technology, www.cellsignal.co.（前記の内容は参照により本明細書に含まれる））が製造されてきた。そのような多くの抗体は、可逆的にリン酸化されるシグナル誘発タンパク質の研究のために製造されてきた。特に、タンパク質キナーゼのリン酸化され活性化されたアイソフォームと特異的に結合する前記のような多くの抗体がこれまでに作製され、それらは本明細書では時にキナーゼ活性化状態抗体と称される。本発明で用いることができる特に好ましい抗体には以下が含まれる：ホスホ−AKTSer473モノクローナル抗4E2、ホスホ−p44/42 MAPキナーゼ（Thr202/Tyr204）モノクローナル抗体、ホスホ−TYK2（Tyr1054/1055）抗体、ホスホ−p38 MAPキナーゼ（Thr180/Tyr182）モノクローナル抗体28B10、ホスホ−PKC−PAN基質抗体、ホスホ−PKA−基質、ホスホ−SAPK/JNK（Thr183/Tyr185）G9モノクローナル抗体、ホスホ−チロシンモノクローナル抗体（P-tyr-100）、-44/42 MAPK、p38 MAPK、JNK/SAPK及びホスホ−AKT−Thr308。
【００２６】
本発明は、あるサンプルについてキナーゼの活性化状態プロフィールを判定する方法を提供する。前記方法は、多数のキナーゼの活性なリン酸化アイソフォームと特異的に結合する多数の抗体を用いて多数のキナーゼの活性化されたアイソフォームの存在を同時に判定することを含む。
失活アイソフォーム及び活性化アイソフォームとして存在することができ、前記アイソフォームが抗原的に区別できるまた別のタンパク質の例はカスパーゼである。カスパーゼは、タンパク質内のペプチド結合の加水分解を触媒するプロテアーゼである。カスパーゼは、タンパク分解活性のないカスパーゼ前駆体であるプロカスパーゼとして合成される。プロカスパーゼはプロテアーゼによって特異的に切断されて活性なカスパーゼを生じる。当業界で知られているように、前記は多様な他のプロテアーゼについても正しいことが判明している。前記にはシステイン及びセリンの両方のプロテアーゼ、例えばカテプシン、組織プラスミノーゲン活性化因子などが含まれ、当業界で周知のようにプロプロテアーゼとして存在することが知られている。
本発明は、あるサンプルについてカスパーゼの活性化状態プロフィールを判定する方法を提供する。前記方法は、多数のカスパーゼと特異的に結合するが前記カスパーゼが誘導された関連するプロカスパーゼとは結合しない多数の抗体を用いて多数のカスパーゼの活性化アイソフォームの存在を同時に判定することを含む。例えば、カスパーゼと特異的に結合するが、前記カスパーゼが誘導されたプロカスパーゼとは特異的に結合しない抗体は本発明の方法で有用である。前記のような抗体が多数市販されている（例えば以下を参照されたい：Cell Signaling Technology, www.cellsignal.co.（前記の内容は参照により本明細書に含まれる））。
【００２７】
キナーゼ活性を判定する更に別の手段が本発明によって提供される。タンパク質キナーゼによって特異的に認識され、それによってリン酸化される基質は公知である。そのようなリン酸化された基質と特異的に結合するが、リン酸化されていない基質とは結合しない抗体（リン基質抗体）を用いて、活性化されたキナーゼがサンプルに存在することを判定できる。
好ましい実施態様では、本発明はあるサンプルについてキナーゼの活性化状態プロフィールを決定する方法を提供する。前記方法は、複数の活性化できるタンパク質を含む細胞の集団を提供し、更に前記細胞を少なくとも１つのリン酸化されていないタンパク質キナーゼの基質と、前記活性化されたキナーゼが存在する場合は前記キナーゼによって基質のリン酸化が提供される条件下で接触させ、リン酸化された基質と特異的に結合するリン基質抗体を用いてリン酸化されたタンパク質キナーゼ基質の存在を判定することを含む。好ましい実施態様では、本発明はあるサンプルについてキナーゼの活性化状態プロフィールを決定する方法を提供する。前記方法は、多数のタンパク質キナーゼ基質、多数のリン基質抗体及び多数の活性化状態抗体を使用し、多数のキナーゼの活性化状態を同時に判定することを含む。
別の実施態様では、本発明は、サンプル中の１つ又は２つ以上のタンパク質キナーゼ及び１つ又は２つ以上のカスパーゼの活性化状態を決定する方法を提供する。前記方法は、ここに提供したそれぞれの活性化状態プロフィールの決定方法を１つにまとめることによって達成される。好ましくは、前記サンプルは細胞の集団、１つの細胞、細胞溶解物又はタンパク質群を含む。
同様に、本発明は、キナーゼ及びプロテアーゼの任意の他の組合せ及び他の全ての組合せ（例えばキナーゼとカスパーゼ、キナーゼとカテプシン、キナーゼとセリンプロテアーゼ、カスパーゼとカテプシンなど）を用いる方法を提供する。
【００２８】
更に別の実施態様では、タンパク質活性化状態プロフィールは、固定した多数の活性化状態抗体を用いて決定される。抗体は、隔離された受容領域を有する不溶性の支持体（例えばマイクロタイタープレート、アレーなど）に拡散しないように結合させることができる。前記不溶性支持体は任意の組成物（前記組成物に前記抗体を結合させることができる）から作製することができ、前記支持体は可溶性物質から容易に分離され、更に別にスクリーニング方法全体に適合する。そのような支持体の表面は密であるか又は多孔質であり、更に任意の都合のよい形状を有することができる。適切な不溶性支持体の例には、マイクロタイタープレート、アレー、膜及びビーズが含まれる。前記は、典型的にはガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、テフロン（登録商標）などから製造される。マイクロタイタープレート及びアレーは、少量の試薬及びサンプルを用いて多数のアッセイを同時に実施できるので特に便利である。いくつかの事例では磁性ビーズなどが含まれる。抗体との個々の結合態様は、試薬及び本発明の方法全体と適合し、前記抗体の活性が維持され、更に前記抗体が拡散されないかぎり重要ではない。好ましい結合方法には、抗体の使用（前記タンパク質が前記支持体と結合したときリガンド結合部位又は活性化配列のいずれも立体的に封鎖しない）、“粘着性”又はイオン性支持体への直接結合、化学的な架橋、前記表面に対する抗体の合成などが含まれる。抗体の結合に続いて、過剰な未結合物質を洗浄によって除去する。サンプル受容領域を続いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又は他の無害なタンパク質もしくは成分とのインキュベーションにより封鎖することができる。
【００２９】
好ましい実施態様では、完全抗体よりもむしろ活性化状態抗体のエピトープ認識フラグメントが用いられる。別の好ましい実施態様では、前記エピトープ認識フラグメントは固定される。別の好ましい実施態様では、前記抗体の軽鎖（エピトープを認識する）が用いられる。軽鎖遺伝子生成物（エピトープを認識する）をコードするリコンビナント核酸を用い、当業界で周知の遺伝子組換え手段によってそのような抗体フラグメントを生成することができる。
ＤＮＡチップと同様なチップを本発明の方法で使用することができる。アレー体及び予め形成したアレー中のチップに核酸をスポットする方法は知られている。更に、タンパク質チップ及び合成方法も知られている。これらの方法及び材料は、予め形成したアレー中のチップに活性化状態抗体を固定するために応用することができる。
好ましい実施態様では、そのようなチップは、多数のキナーゼ活性化状態抗体を含み、前記を用いてサンプルのキナーゼ活性化状態プロフィールを決定することができる。好ましい実施態様ではそのようなサンプルは細胞抽出物である。そのような方法では、活性化キナーゼの検出は当業界で知られているように“サンドイッチアッセイ”によって実施される。簡単に記せば、多数の固定されたキナーゼ活性化状態抗体が同時に多数の活性化キナーゼ（サンプルにそれらが存在する場合）と結合することができる条件下でサンプル（好ましくは細胞抽出物）をチップ上に通す。前記固定された抗体−キナーゼ複合体を場合によって洗浄し、更に、活性化されたキナーゼと特異的に結合することができる失活状態抗体を含む第二の複数の抗体と前記複合体を接触させ、一方前記キナーゼはキナーゼ活性化状態特異的抗体と特異的に結合する。そのような失活状態特異的抗体は、キナーゼ活性化状態特異的抗体によって認識されないエピトープを介して活性化キナーゼと特異的に結合する。失活状態特異的抗体と活性化状態抗体−活性化キナーゼ複合体との結合が判定され、サンプル中の活性化キナーゼの存在が示される。サンドイッチアッセイにおける第二の抗体の結合の判定は多くの多様な方法で実施できることは理解されよう。好ましくは、多数の失活状態特異的抗体は固有の標識を付され、検出が促進される。
また別の実施態様では、チップは多数の失活状態特異的抗体を含む。そのようなチップをサンプル（好ましくは細胞抽出物）と接触させ、更にキナーゼ活性化状態特異的抗体を含む第二の多数の抗体をサンドイッチアッセイで用い、サンプル中の多数の活性化キナーゼの存在を同時に決定する。好ましくは、多数の活性化状態特異的抗体は固有の標識を付されて検出が促進される。
【００３０】
好ましい実施態様では、本発明の方法の１つ又は２つ以上の成分はタグを含む。“タグ”とは、付着された分子（好ましくは基質）の特定又は単離に役立つ付着される分子を指す。例えば、タグは付着用タグでも標識タグでもよい。タグを有する成分は、“タグ−Ｘ”と称され、ここでＸは成分である。好ましくはタグは付着される成分と共有結合される。ある組合せの２つ以上の成分がタグを有するとき、前記タグは特定のために、例えば“タグ１−抗体”、“タグ１−タンパク質”及び“タグ１−基質”のように番号を付される。成分は２つ以上のタグを含むことができる。そのような場合には、各タグは、例えば“タグ１，２−抗体”、“タグ１，２−タンパク質”及び“タグ１，２−基質”のように番号を付される。好ましいタグには、標識、結合対パートナー及び表面基質と結合する分子（又は付着用タグ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。タグがどのように使用されるかによって、多くの分子が２つ以上のタイプのタグとして有用であることは当業者には理解されよう。
“標識”とは、直接的に（すなわち一次標識）又は間接的に（すなわち二次標識）検出することができる分子を指す。例えば標識は可視化及び／又は測定可能で、そうでなければその有無を知ることができるように識別することができる。化合物は検出可能なシグナルを提供する標識と直接又は間接的に結合させることができる。前記標識は、例えば放射性同位元素、蛍光物、酵素、抗体、磁性粒子のような粒子、化学発光物質、又は特異的な結合分子などである。特異的な結合分子には対を形成するもの、例えばビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどが含まれる。好ましい標識には、蛍光標識、標識酵素及び放射性同位元素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００３１】
“蛍光標識”とは、その固有の蛍光特性により検出することができる任意の分子を指す。適切な蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイェロー、カスケードブルー（登録商標）、テキサスレッド、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LCレッド640、Cy５、Cy 5.5、LCレッド705及びオレゴングリーンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な光学染料は以下の文献に記載されている：1996 Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland（前記は参照により本明細書に含まれる）。適切な蛍光標識にはまた以下が含まれるがただしこれらに限定されない：緑色蛍光たんぱく質（EGF; Chalfie et al. Science 263(5148):802-805(Feb 11, 1994); 及びEGFP; Clontech-Genbank Accession Number U55762）、青色蛍光タンパク質（BFP; 1. Quantum Biotechnologies, Inc. 1901 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal (Quebec) Cnada H3H 1J9; 2. R.H. Stauber Biotechniques 24(3):462-471(1998); 3. R. Heim & R.Y. Tsien, Curr. Biol. 6:178-182(1996)）、強化黄色蛍光タンパク質（EYFP; 1. Clontech Laboratories, Inc. 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303）、ルシフェラーゼ（Ichiki et al. J. Immunol. 150(12):5408-5417(1993)）、−ガラクトシダーゼ（Nolan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2603-2607 (Apr. 1988)）及びレニラ（WO 92/15673; WO 95/07463; WO 98/14605; WO 98/26277; WO 99/49019; US Patent 5,292,658; US Patent 5,418,155; US Patent 5.683,888; US Patent 5,741,668; US Patent 5,777,079; US Patent 5,804,387; US Patent 5,874,304; US Patent 5,876,995; 及びUS Patent 5,925,558）。上記に引用した全ての文献は参照により本明細書に含まれる。
【００３２】
本発明で使用される特に好ましい標識には以下が含まれる：アレキサ−フルアー染料（Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、 Alexa Fluor 633、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680）カスケードブルー、カスケードイェロー及びＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）（Molecular Probes, Eugene, Oregon）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Pierce, Rockford, Illinois）、Cy５、Cy 5.5、Cy７（Amersham Life Science, Pittsburgh, Pennsylvania）。Cy5PE、Cy5.5PE、Cy7PE、Cy5.5APC、Cy7APCのための縦並び結合プロトコルはwww.drmr.com/abconで見つけることができる。蛍光プローブ結合の定量を算定し標識の程度を決定することができる。染料のスペクトル特性を含むプロトコルはwww.metazoa.com/UPL3419で見つけることができる。
別の好ましい実施態様では、蛍光標識はＧＦＰであり、より好ましくはウミシイタケ（renilla）、プチロサルクス（ptilosarcus）又はオワンクラゲ（aequorea）のＧＦＰである。
好ましい実施態様では、本発明の方法及び組成物で多数の蛍光標識が用いられる。好ましい実施態様では、少なくとも２つの蛍光標識が用いられ、それらは蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）対のメンバーである。
【００３３】
ＦＲＥＴは当業界で公知の現象で、前記現象では１つの蛍光染料の励起は光量子の放出無しに別の蛍光染料に伝達される。ＦＲＥＴ対はドナーの蛍光発光団及びアクセプターの蛍光発光団から成る。ドナーの蛍光放射スペクトルはアクセプターの蛍光吸収スペクトルとオーバーラップしなければならず、更に前記２つの分子は接近している必要がある。ドナーの50％が脱活性化（アクセプターにエネルギーを伝達）するドナーとアクセプター間の距離はフェルスター（Foerster）の半径（Ｒ0）によって表され、前記は典型的には10−100Åである。ＦＲＥＴ対を含む蛍光放射スペクトルの変化を検出することができ、前記変化は近接する（すなわち互いに100Å以内）ＦＲＥＴ対の数の変化を表す。これは典型的には２つの分子の結合又は解離から生じ（前記分子の１方はＦＲＥＴドナーで標識され、他方はＦＲＥＴアクセプターで標識される）、そのような結合はＦＲＥＴ対を接近させる。そのような分子の結合は、アクセプターの蛍光放射の増大及び／又はドナーの蛍光放射の消光をもたらす。
本発明で有用なＦＲＥＴ対（ドナー／アクセプター）にはＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／ＬＣレッド640、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ5.5及びフルオレセイン／ＬＣレッド705が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００３４】
ＦＲＥＴのまた別の特徴では、蛍光ドナー分子及び非蛍光性アクセプター分子（“クェンチャー”）を用いることができる。この場合には、ドナーの蛍光放射は、クェンチャーがドナーの近くから排除されるときに増大し、更に蛍光放射はクェンチャーがドナーの近くにもたらされるときに減少するであろう。有用なクェンチャーにはＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ７及びＱＳＹ33が含まれるが、ただしこれらに限定されない。有用な蛍光ドナー／クェンチャー対にはＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイェロー／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ及びフルオレセイン／ＱＳＹ７染料が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
蛍光消光は標識分子の経時的なモニタリングを可能にし、結合反応の経時的な連続情報を提供することは当業者には理解されよう。
【００３５】
“標識酵素”とは、検出可能な生成物を生じる標識酵素基質の存在下で反応させることができる酵素を指す。本発明で使用される標識酵素にはセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びグルコースオキシダーゼが含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような基質の使用方法は当業界で周知である。標識酵素の存在は、一般に、前記酵素が標識酵素基質との反応を触媒して特定可能な生成物を生じることにより示される。そのような生成物は不透明であるかもしれず（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼとテトラメチルベンゼジンとの反応）、多様な色を示すかもしれない。蛍光反応生成物を生じる他の標識酵素基質（例えばルミノール、ピアスケミカル社（Pierce Chemical Co.）から入手できる）が開発された。標識酵素基質を用いて標識酵素を特定する方法は当業界で周知であり、多くの市販キットが入手可能である。種々の標識酵素の例及び使用方法は以下の文献に記載されている：Savage et al. Previews 247:6-9(1998), Young, J. Virol. Methods 24:227-236(1989)（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
“放射性同位元素”とは任意の放射性分子を指す。本発明で使用される適切な放射性同位元素には、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ及び131Ｉが含まれるが、ただしこれらに限定されない。標識としての放射性同位元素の使用は当業界では周知である。
【００３６】
既に述べたように、標識は間接的に検出することができ、すなわちタグは結合対のパートナーである。“結合対のパートナー”とは、第一及び第二の成分の１つを指し、ここで前記第一及び第二の成分は互いに特異的な結合親和性を有する。本発明で使用される適切な結合対には、抗原／抗体（例えばジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ−抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイェロー／抗ルシファーイェロー及びローダミン／抗ローダミン）、ビオチン／アビド（又はビオチン／ストレプトアビジン）及びカルモデュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモデュリンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。他の適切な結合対にはポリペプチド、例えばＦＬＡＧ−ペプチド（Hopp et al. BioTechnology, 6:1204-1210(1988)）；ＫＴ３エピトープペプチド（Martin et al. Science, 255:192-194(1992)）；チューブリンエピトープペプチド（Skinner et al. J. Biol. Chem., 266:15163-15166(1991)）；及びＴ７遺伝子10タンパク質ペプチドタグ（Lutz-Freyermuth et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)）並びにそれらに対する抗体が含まれる。結合対パートナーは、本明細書で述べるように標識以外の他の目的で用いることができることは当業者には理解されよう。
ある結合対のパートナーはまた別の結合対のパートナーにもなりえることは当業者には理解されるところである。例えば抗原（第一の成分）は第一の抗体（第二の成分）と結合することができ、前記第一の抗体は次に第二の抗体（第三の成分）のための抗原となることができる。前記のような環境は、第一の成分と第三の成分が中間の第二の成分（前記第一及び第三の各々にとって結合対パートナーである）を介して間接的に結合することを可能にすることもまた理解されよう。
【００３７】
結合対パートナーは上記で述べたように標識を含むことができることは当業者には理解されよう。このことは、標識を含む結合パートナーの結合に際してタグが間接的に標識されることを可能にすることもまた理解されよう。まさに前記で述べたように結合対のパートナーであるタグに標識を付着させることを本明細書では“間接標識”と称する。
“表面基質結合分子”又は“付着用タグ”とは、特定の表面基質に対して結合親和性を有する分子を指す。一般に前記基質は、表面に適用され、取り込まれ又は付着させられる結合対の一方である。適切な表面基質結合分子及びそれらの表面基質には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：ポリヒスチジン（ポリ−his）又はポリホスチジングリシン（ポリ−his−gly）タグとニッケル基質；グルタチオンＳトランスフェラーゼタグとその抗体基質（Pierce Chemicalから入手できる）；fluHAタグポリペプチドとその抗体12CA5基質（Field et al. Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165(1988)）；ｃ−ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ10、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ10抗体基質（Evan et al. Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)）；及び単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグとその抗体基質（Paborsky et al. Protein Engineering, 3(6):547-553(1990)）。一般に、本発明で有用な表面結合基質分子には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：ニッケル基質と結合するポリヒスチジン構造物（His−タグ）、抗体を含む表面基質と結合する抗原、アビジン基質と結合するハプテン（例えばビオチン）、及びカルモデュリンを含む表面基質と結合するＣＢＰ。
【００３８】
抗体包埋基質の製造は周知であり、例えば以下を参照されたい：Slinkin et al. Bioconj. Chem. 2:342-348(1991); Torchilin et al. 上掲書; Trubetsukoy et al. Bioconj. Chem. 3:323-327(1992); King et al. Cancer Res. 54:6176-6185(1994); 及びWilbur et al. Bioconjugate Chem. 5:220-235(1994)（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。更に抗原含有タンパク質の付着又は製造は上記に記載した。カルモデュリン包埋基質は市販されており、ＣＢＰ含有タンパク質の製造は下記文献に記載されている：Simcox et al. Strategies 8:40-43(1995)（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
本発明のタグ成分は、前記タグの形態に大きく左右されるが多様な方法で製造できることは当業者には理解されよう。本発明の成分及びタグは好ましくは共有結合によって付着させられる。
タグもまたポリペプチドである場合、遺伝子組換えによるタグ−ポリペプチドの製造は下記で述べる。タグ標識タンパク質の製造は当業界では周知であり、そのような製造のためのキットは市販されている（例えば、Kodak及びSigmaから入手できる）。タグ標識タンパク質の例には、Flag−ポリペプチド及びHis−ポリペプチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない。タグ標識タンパク質の製造及び使用方法は例えば下記Winstonらの文献の他に上記のキットの製品ハンドブックで見つけることができる（Winston et al. Genes and Devel. 13:270-283(1999)、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００３９】
標的分子及び基質のビオチン付加は周知であり、例えば以下を含む多数のビオチン付加試薬が知られている：タンパク質、核酸、炭水化物、カルボン酸のビオチン付加用アミン反応性及びチオール反応性薬剤（例えば以下を参照されたい：Chapter 4. Molecular Probes Catalog, Haugland, 6th Ed. 1996（前記文献は参照により本明細書に含まれる））。ビオチン付加基質は、アビジン又はストレプトアビジンを介してビオチン付加成分に付着させることができる。同様に、多数のハプテン付加試薬も知られている（上掲書）。
タンパク質の放射性同位元素による標識方法は当業界で公知である。例えば、そのような方法は以下の文献で見出される：Ohta et al. Molec. Cell 3:535-541(1999)（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
遺伝子組換えによるタグ含有タンパク質の製造は周知であり、そのようなタンパク質を製造するキットが市販されている。例えばそのようなキット及びその使用は以下に記載されている：Qiaexpress Handbook（Joanne Crowe et al., Qiagen）（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００４０】
化学的反応性を有する基（例えばチオール、アミン、カルボキシルなど）による標識の官能化は当業界では一般的に公知である。好ましい実施態様では、タグは官能化されて共有結合による付着が促進される。共有結合によるタグの付着は直接的でも、リンカーを介してもよい。ある実施態様では、リンカーは比較的短いカップリング成分であり、分子に付着させるために用いられる。カップリング成分は本発明の成分上に直接合成することが可能で、少なくとも１つの官能基を含み、タグの付着を容易にする。また別には、カップリング成分は少なくとも２つの官能基を有し、前記官能基は例えば官能化された成分を官能化されたタグに付着させるために用いられる。更に別の実施態様ではリンカーはポリマーである。この実施態様では、共有結合による付着は直接的に行われるか、又は成分又はタグから前記ポリマーへとカップリング成分を使用して実施される。好ましい実施態様では、共有結合による付着は直接的であり、すなわちリンカーは使用されない。この実施態様では、成分は好ましくは例えばカルボン酸のような官能基を含み、前記は官能化されたタグへの直接付着のために使用される。成分及びタグは多様な態様（上記に挙げたものを含む）で付着させることができることは理解されるところである。好ましい実施態様では、タグはポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に付着される。上記に記載した標識の共有結合による付着は、本発明の実質的に全ての２つの分子の付着に適用されることは当業者には理解されよう。
【００４１】
好ましい実施態様では、上記で概略したように、タグは官能化され共有結合による付着が促進される。従って、極めて多様なタグが市場で入手可能である。前記タグは、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル及びハロゲン化スルホニルを含む官能基を有し、前記のいずれの基も本明細書に記載するようにタグを第二の分子に共有結合により付着させるために用いることができる。タグの官能基の選択は、上記に概略したリンカー又は本発明の成分のどちらかとの付着部位に左右されるであろう。従って、例えばタンパク質のカルボン酸基との直接結合の場合、当業界で知られているように、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いるカルボジイミドの化学反応によるカップリングのために、アミノ改変又はヒドラジン改変タグが用いられるであろう（例えば以下を参照されたい：Molecular Probes Catalog, Set 9及びSet 11, 上掲書；及びPierce 1994 Catalog and Handbook, pp. T-155からT-200（前記両文献は参照により本明細書に含まれる））。ある実施態様では、前記カルボジイミドは先ず初めにタグに付着させられ、前記のようなタグは本明細書に記載したタグの多くについて市場で入手できるものである。
抗体の結合は標準的な方法（http://drmr.com.abcon）を用いるか、又はタンパク質−タンパク質／タンパク質−染料架橋キット（Molecular Probes, Eugene, Oregon）を用いて実施できる。
【００４２】
２つの活性化状態特異的抗体の例を用いれば、“固有に標識される”とは、第一の活性化キナーゼを認識する第一の活性化状態抗体は第一の標識を含み、更に第二の活性化キナーゼを認識する第二の活性化状態抗体は第二の標識を含み、前記第一及び第二の標識は、第一及び第二の抗体を固有に標識することによって検出及び識別することができることを意味する。
失活状態抗体もまた本発明で用いることができる。好ましい実施態様では、失活状態抗体はタンパク質の活性化形及び失活形の両方のエピトープと結合する。そのような抗体を用いてサンプル中の失活タンパク質プラス活性化タンパク質の量を決定できる。別の好ましい実施態様では、失活状態抗体は、タンパク質の失活形には存在するが、タンパク質の活性化形には存在しないエピトープと結合する。そのような抗体を用いて、サンプル中の失活タンパク質の量を決定することができる。両タイプの失活状態抗体を用いて、例えば本明細書に記載するように生体活性候補物質による処理の前後で活性化状態のタンパク質の量の変化が失活状態のタンパク質の量の変化と一致するか否かを決定することができる。例えば、そのような抗体を用いて、活性化タンパク質の増加が失活状態タンパク質の活性化によるものであるのか、又はタンパク質の発現増加によるものであるのか、又はその両方であるのかを決定することができる。
【００４３】
別の好ましい実施態様では、抗体は、フローサイトメトリーでの標準化のために使用されている公知のビーズと類似のビーズを用いて固定される。多数の活性化状態特異的抗体のビーズへの付着は、当業界で公知の方法及び／又は本明細書に記載する方法によって実施できる。そのように結合させたビーズをサンプル（好ましくは細胞抽出物）と、多数の活性化キナーゼが多数の固定された抗体と結合することができる（それらが存在する場合）条件下で接触させることができる。固有に標識された失活状態抗体を含む第二の多数の抗体を前記固定された活性化状態特異的抗体−活性化キナーゼ複合体に添加し、更に前記ビーズを各標識の存在を基準にしてＦＡＣＳによって分類することができる。ここで標識の存在は、対応する第二の抗体の結合及び対応する活性化キナーゼの存在の指標である。
好ましい実施態様では、本発明は、単一細胞についてタンパク質の活性化状態プロフィルを決定する方法を提供する。前記方法は、少なくとも２つのタンパク質の活性化状態を基準にしてＦＡＣＳにより細胞を分類することを含む。活性化状態特異的抗体を用い、タンパク質の活性化状態を基準にして細胞を分類する。
【００４４】
本発明の方法及び組成物で蛍光標識成分を用いるときは、種々のタイプの蛍光モニター系（例えばＦＡＣＳ系）を用いて本発明を実施できることは理解されるところである。好ましくは、ＦＡＣＳ系又は高処理スクリーニングに適した系（例えば96ウェル又はそれを越えるマイクロタイタープレート）が用いられる。蛍光性物質によるアッセイを実施する方法は当業界では周知であり、例えば以下の文献に記載されている：J.R.Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); B. Herman, Resonance energy transfer microscopy, in: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, ed. D.L. Taylor & Y. -L. Wang, San Diego: Academic Press (1989), pp.219-243; N.J. Turro, Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc. (1978), pp.296-361。
サンプル中の蛍光は蛍光測定装置を用いて測定できる。一般には、第一の波長をもつ励起供給源から発する励起放射線は励起装置を通過する。前記励起装置によって励起放射線はサンプルを励起させる。それに反応してサンプル中の蛍光性タンパク質は、前記励起波長とは異なる波長をもつ放射線を放出する。続いて集光装置はサンプルから放出されたものを採集する。前記装置は、スキャンニング中に固有の温度でサンプルを維持するために温度制御装置を含むことができる。ある実施態様では、多軸トランスレーションステージが、種々のウェルが暴露されるように多数のサンプルを保持するマイクロタイタープレートを移動させる。前記多軸トランスレーションステージ、温度制御装置、自動焦点設定装置並びに画像化及びデータ収集に附随する電子装置は、適切なプログラムによって制御されるデジタルコンピュータによって管理することができる。前記コンピュータはまたアッセイ中に収集したデータを表示のために別のフォーマットに変換することができる。
【００４５】
好ましい実施態様ではフローサイトメトリーが蛍光の検出に用いられる。蛍光を検出する他の方法、例えば量子ドット法もまた用いることができる（例えば以下を参照されたい：Goldman et al. J. Am. Chem. Soc. (2002) 124:6378-82; Pathak et al. J. Am. Chem. Soc. (2001) 123:4103-4; Remacle et al. Proc. Natl. Sci. USA (2000) 18:553-8、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）。
好ましい実施態様では、ＦＲＥＴは細胞内のタンパク質の活性化状態をモニターする方法として用いられる。ＦＲＥＴの程度は、励起される構築物に特徴的なスペクトル又は蛍光存続時間によって決定できる。前記は、例えばドナーの発する蛍光シグナルの強さ、アクセプターの蛍光シグナルの強さ、アクセプターの最大発光近くの蛍光の振幅対ドナーの最大発光近くの蛍光の振幅の比、又はドナーの励起状態存続時間を測定することによって決定することができる。例えば、リンカーの切断はドナーの蛍光の強さを増大させ、アクセプターの蛍光の強さを減少させ、アクセプターの蛍光の振幅対ドナーの蛍光の振幅の比を減少させ、更にドナーの励起状態の存続時間を増加させる。
好ましくは、ＦＲＥＴの程度における変化はドナー及びアクセプター成分の蛍光量の比における変化の関数として測定される（前記のプロセスは“レーショニング”（rationing）と称される）。基質の絶対量、励起の強さ及び濁度又はサンプル中の他のバックグラウンドの吸収における変化は、ほぼ平行であるドナー及びアクセプターからの蛍光の強さに影響を与える。従って、２つの発光の強さの比はより劇的で、どちらか一方の強さよりも好ましい切断の測定である。
【００４６】
本明細書に開示する比率測定蛍光レポーター系は、感度の高い検出並びに発現及び非発現単一生細胞の単離を可能にするので、従来のタンパク質完全分析のためのレポーター系よりも優れた利点を有する。好ましい実施態様では、本アッセイ系は、毒性のない非極性蛍光基質（前記は容易にロードされ続いて細胞内に捕捉される）を使用する。同系タンパク質による前記蛍光性基質の修飾は、基質が生成物に変換されるとき蛍光発光を生じる。レポーターの完全情報読出し（readout）は比率測定的であるので、前記の系は、変数（例えば個々の細胞にロードされた基質の量）をコントロールできるという点でレポータータンパク質アッセイの中で類のない系である。安定で検出が容易な細胞内の完全情報読出しは、発現分析前にクローン細胞株の確立を要求しない。この系及び他の類似するフローサイトメトリー分類系を用いて、数百万の生細胞プールから特定のタンパク質活性化プロフィールをもつ細胞を単離することができる。
本発明の方法の検出、分類又は単離工程は蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）技術を必要とするか（この場合ＦＡＣＳは特定の表面マーカーを含む集団から細胞を選別するために用いられる）、又は選別工程は、標的細胞の捕捉及び／又はバックグラウンドの除去のために捕捉支持体として磁性反応性粒子の使用を必要とするであろう。多様なＦＡＣＳ系が当業界で公知で、本発明の方法で使用することができる（例えば以下を参照されたい：WO99/54494（1999年4月16日出願）；U.S.A.N. 20010006787（2001年7月5日出願）、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる）。
【００４７】
好ましい実施態様では、ＦＡＣＳ細胞分類装置（例えばFACSVantage. TM. Cell Sorter, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Calif.）を用いて、細胞のタンパク質活性化プロフィールを基準にして細胞（陽性細胞）を分類し収集することができる。先ず初めに、特定の活性化できる細胞の特定のアイソフォームに対して作製した蛍光標識活性状態特異的抗体と細胞を接触させる。ある実施態様では、細胞を含む液滴を細胞分類装置に通すことによって各細胞上の結合抗体の量が測定される。陽性細胞を含む液滴に電磁的負荷を与えることによって、前記陽性細胞を他の細胞から分離することができる。続いて選別された陽性細胞を滅菌採集容器に収集することができる。前記の細胞分類方法は、例えば前記文献（FACSVantage. Training Manual）の特に3-11から3-28及び10-1から10-17節に詳細に記載されている。
別の実施態様では、陽性細胞は、活性化できるタンパク質のアイソフォームの存在を基準に細胞の磁性分離を用いて分離することができる。そのような分離技術では、陽性であることによって選択されるべき細胞を先ず特異的な結合物質（例えば抗体又は活性化できるタンパク質のアイソフォームと結合する試薬）と接触させる。続いて前記細胞を捕捉粒子（例えば磁性反応性粒子）と接触させる（前記捕捉粒子は特異的な結合物質（前記陽性細胞と結合している）と結合する試薬に結合されている）。続いて細胞−結合物質−粒子複合体を非陽性又は非標識細胞から、例えば磁場を用いて物理的に分離することができる。磁性反応性粒子を用いるときは、陽性又は標識細胞は磁場を用いて容器に保持し、一方陰性細胞は除去することができる。
前記の分離方法及び類似の分離方法は例えば以下の文献に記載されている：Baxter Immunotherapy Isolex training manual。
【００４８】
好ましい実施態様では、単一細胞のためのキナーゼ活性化状態プロフィールを決定する方法が提供される。前記方法は、細胞の集団を提供し、更にＦＡＣＳによって細胞の集団を分類することを含む。好ましくは、少なくとも２つのキナーゼの活性化状態を基準にして分類される。好ましい実施態様では、多数のキナーゼ活性化状態抗体（本明細書では時にキナーゼ活性化状態特異的抗体と称される）を用いて、多数のキナーゼの活性化状態が同時に決定される。特に好ましくは、少なくとも２つ、好ましくは３つ以上、好ましくは以下のキナーゼ活性化状態抗体の全てが使用される：抗AKT−ホスホ−Ser473、抗AKT−ホスホ−Thr308、抗p44/42 MAPKホスホ−Thr202/Tyr204、抗TYK2ホスホ−Tyr1054/1055、抗p38 MAPKホスホ−Thr180/Tyr182、抗JNK/SAPKホスホ−Thr183/Tyr185、抗ホスホ−チロシン、抗ホスホ−スレオニン。
単一細胞内のリン酸化キナーゼの直接検出の他に、本方法は、キナーゼに特異的な基質及びリン基質抗体を本明細書に記載したように用いて、単一細胞内の活性化キナーゼの検出を提供する。好ましい実施態様では、細胞をそのような少なくとも２つの基質と接触させ、更にリン基質と接触させ、続いてＦＡＣＳを用いてキナーゼの活性化を基準に分類する。特に好ましいものは、ＰＫＣ基質ＰＡＮリン基質（前記は、ＰＫＣβIIのSer660と相同なカルボキシ末端残基でリン酸化されたときにのみ、ＰＫＣのα、βＩ、βII及びδアイソフォームのための基質である）と特異的に結合するリン基質抗体、及びＰＫＡリン基質（−３位のアルギニンとともにスレオニンのＰＫＡリン酸化のコンセンサスリン酸化部位）と特異的に結合するリン基質抗体である。
【００４９】
別の好ましい実施態様では、リン酸化キナーゼと特異的に結合するキナーゼ活性化状態抗体、キナーゼに特異的な基質、及びリン基質抗体の組合せを用いて単一細胞のキナーゼ活性化状態のプロフィールが決定される。前記方法は、少なくとも２つのキナーゼの活性化状態を基準に細胞をＦＡＣＳにより分類することを含む。少なくとも２つのキナーゼの活性化は、少なくとも１つのリン酸化基質の測定のために、少なくとも１つのキナーゼ活性化状態抗体及び少なくとも１つのキナーゼに特異的な基質及び少なくとも１つのリン基質抗体を用いて決定される。好ましくは、キナーゼ活性化状態抗体は以下から成る群から選択される：抗AKT−ホスホ−Ser473、抗AKT−ホスホ−Thr308、抗p44/42 MAPKホスホ−Thr202/Tyr204、抗TYK2ホスホ−Tyr1054/1055、抗p38 MAPKホスホ−Thr180/Tyr182、抗JNK/SAPKホスホ−Thr183/Tyr185、抗ホスホ−チロシン、抗ホスホ−スレオニン。好ましくは、リン基質抗体は以下から選択される：ＰＫＣ基質ＰＡＮリン基質（前記は、ＰＫＣβIIのSer660と相同なカルボキシ末端残基でリン酸化されたときにのみ、ＰＫＣのα、βＩ、βII及びδアイソフォームのための基質である）と特異的に結合するリン基質抗体、及びＰＫＡリン基質（−３位のアルギニンとともにスレオニンのＰＫＡリン酸化のコンセンサスリン酸化部位）と特異的に結合するリン基質抗体。
好ましい実施態様では、少なくとも２つのタンパク質、好ましくはキナーゼ及び／又はカスパーゼの活性化状態を基準にしたＦＡＣＳによる細胞分類は、ＦＡＣＳで読み出すことができる他の出力情報、例えば表面マーカーの存在、顆粒性及び細胞サイズと組み合わされて、多数のタンパク質の活性化状態とＦＡＣＳによって単一細胞について測定できる他の細胞の特質との間の相関性が提供される。
【００５０】
理解されるように、本発明はまたシグナルトランスダクションにおけるタンパク質活性化事象の順序付けを提供する。特に、本発明は、単一細胞内の多数のキナーゼの活性化レベルの相関性を基準にしてキナーゼ活性化の階層の構築を可能にする。
本発明はまた、複雑な細胞混合物（例えば末梢血単核細胞）内の相関するタンパク質の活性化、好ましくはキナーゼ活性化を基準にして細胞の亜集団の存在を決定するために用いることができる。これらの亜集団は、異なる分化状態もしくは活性化状態又は異なる細胞系列もしくは亜系列を示しているかもしれない。
細胞間のシグナリングの変動がシグナル変換事象を定性的及び定量的でない状態で隠蔽することがないように、均質な細胞集団がシグナルトランスダクションの研究には要望されることは理解されよう。究極の均質な系は単一細胞である。本発明は、単一細胞でシグナルトランスダクションを分析する方法を提供する。前記方法では、中心的に関与するシグナル誘発タンパク質の活性化状態は失活状態と抗原的に区別される。
これらの方法では、複雑な細胞集団（例えば末梢血単核細胞又は未感作（naive）及び記憶保持（memory）リンパ球）で人工的条件及び刺激付与条件の両方について別個のシグナリング連鎖事象の特定が提供される。
【００５１】
本明細書に提供される方法はまた、個々のキナーゼに特異的な阻害剤の使用を必要とする。本明細書に提供される方法はまた、カスパーゼに特異的な阻害剤の使用を必要とする。本明細書に提供される方法はまた、シグナリング経路の他の薬理学的阻害剤の使用を必要とする。これらの阻害剤は、抗体がタンパク質の活性化されたアイソフォームと特異的に結合することを確認するためのコントロールとして用いることができる。例えば、第二のキナーゼをリン酸化し活性化することが判明しているキナーゼの阻害剤を用いて、第二のキナーゼの活性化を阻害し、抗体が前記第二のキナーゼのリン酸化されたアイソフォームを特異的に認識するか否かを調べることができる。また別には、前記阻害剤を用いて、シグナリング経路及びタンパク質活性における相関関係を特に単一細胞内で更に調べることができる。
好ましい実施態様では、単一細胞についてカスパーゼの活性化状態プロフィールを決定する方法が提供される。前記方法は細胞の集団を提供し、細胞集団をＦＡＣＳによって分類することを含む。好ましくは、細胞は少なくとも１つのカスパーゼの活性化状態を基準にして分離される。好ましい実施態様では、本明細書に記載するカスパーゼ切断生成物の抗体を用いて、少なくとも１つのカスパーゼの活性化状態が決定される。
【００５２】
好ましい実施態様では、キナーゼ活性を調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法が提供される。前記方法は、細胞を生体活性候補物質と接触させ、前記細胞内のキナーゼの活性化をＦＡＣＳによって前記細胞を分類することによって決定することを含む。
好ましい実施態様では、前記方法は、複数の細胞を複数の生体活性候補物質と接触させ、少なくとも１つのキナーゼの活性化を基準にして前記細胞をＦＡＣＳによって分類することを含む。
好ましい実施態様では、カスパーゼ活性を調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法が提供される。前記方法は、細胞を生体活性候補物質と接触させ、前記細胞内のカスパーゼの活性化をＦＡＣＳによって前記細胞を分類することによって決定することを含む。
好ましい実施態様では、前記方法は、複数の細胞を複数の生体活性候補物質と接触させ、少なくとも１つのカスパーゼの活性化を基準にして前記細胞をＦＡＣＳによって分類することを含む。
【００５３】
“生体活性候補物質”、“候補物質”、“調節候補物質”又は“外因性化合物”とは任意の分子、例えばタンパク質、小有機分子、炭水化物（多糖類を含む）、ポリペプチドヌクレオチド、脂質などを指す。一般には、複数のアッセイ混合物を種々の物質濃度で平行して用い、種々の濃度に対して識別できる反応を得ることができる。典型的には、これらの濃度の１つ（すなわち濃度０又は検出レベルより低い濃度）を陰性コントロールとして用いることができる。更に陽性コントロールも用いることができる。
候補物質は多数の化学物質類を包含する。好ましい実施態様では候補物質は小分子である。別の好ましい実施態様では、候補物質は有機分子、特に小有機分子であり、タンパク質との構造的な相互反応（特に水素結合）に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは前記官能基の少なくとも２つを含む。候補物質はしばしば炭素環式又は複素環式構造、及び／又は芳香環もしくはポリ芳香環構造を含み、前記は１つ又は２つ以上の官能基で置換されている。
当業者には理解されように候補物質は多様な供給源から得られ、前記供給源には合成又は天然の化合物ライブラリーが含まれる。当業者には理解されるところであるが、本発明は、任意の調節候補物質ライブラリー（多様な公知の組合せ理論化学型ライブラリーを含む）をスクリーニングするために迅速で容易な方法を提供する。
【００５４】
好ましい実施態様では候補物質は合成化合物である。任意の数の技術を多様な有機化合物及び生体分子のランダム合成及び特定合成のために利用できる。例えばWO94/24314（前記文献は参照により本明細書に含まれる）を参照されたい（前記文献は酵素的方法と同様にランダムな化学的方法を含む新規な化合物の生成方法を考察する）。WO94/24314に記載されているように、本方法の利点の１つは、この方法はアッセイの前に候補物質の性状を知る必要がないということである。本発明の方法を用いることによって、活性化できるタンパク質の活性を調節する（例えば増加又は低下させる）能力について任意の候補物質をスクリーニングすることができる。更に、スプリット合成反応を利用するタグのコーディングにより被検化学物質を本質的に特定することができる。
また別には、好ましい実施態様では、候補物質として、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態をもつ天然の化合物ライブラリーが利用される。前記ライブラリーは入手可能であるか又は容易に製造できる。
更にまた、天然又は合成されたライブラリー及び化合物は、通常の化学的物理的及び生化学的手段により容易に改変される。公知の薬理学的物質を特定の又はランダムな化学的修飾（酵素的改変を含む）に付して構造的類似物を製造することができる。
好ましい実施態様では候補物質にはタンパク質、核酸及び化学物質が含まれる。
【００５５】
好ましい実施態様では、上記に示したように候補物質はタンパク質である。好ましい実施態様では、候補物質は天然に存在するタンパク質、又は天然に存在するタンパク質のフラグメントである。従って、例えばタンパク質を含む細胞抽出物、又はタンパク質性細胞抽出物のランダムもしくは特定消化物を調べることができる（下記で更に完全に記載する）。前記のようにして、原核細胞及び真核細胞のタンパク質ライブラリーを任意の候補物質に対してスクリーニングするために作製することができる。この実施態様で特に好ましいものは、細菌、真菌、ウイルス及び哺乳類タンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、更にヒトのタンパク質ライブラリーが特に好ましい。
好ましい実施態様では、候補物質は約２から約50アミノ酸のペプチドであり、約５から約30アミノ酸が好ましく、約８から約20が特に好ましい。前記ペプチドは、天然に存在するタンパク質の消化物（上記で概略した）、ランダムペプチド、又は“偏向した”ランダムペプチドであろう。“任意抽出”とは、各核酸及びペプチドがそれぞれ本質的にランダムなヌクレオチド及びアミノ酸から成ることを意味する。一般的にはこれらランダムなペプチド（又は核酸、下記で説明する）は化学的に合成されるので、それらは任意のヌクレオチド又はアミノ酸を任意の位置に取り込むことができる。合成プロセスを任意抽出されたタンパク質又は核酸を生成するためにデザインして、配列の全長にわたって可能な組合せの全部又はほとんどを作製し、従ってランダムなタンパク質性の生体活性候補物質ライブラリーを作製できる。
【００５６】
前記ライブラリーは、構造的に十分に多様な任意抽出された物質集団を提供し、確率的に十分な範囲の多様性を達成し、個々の活性化できるタンパク質との相互反応を可能にするはずである。従って、相互反応ライブラリーのメンバーの少なくとも１つが、活性化できるタンパク質又は活性化できるタンパク質を必要とするシグナル変換経路の他の特定の成分と相互反応する構造を有することができるように、相互反応ライブラリーは十分に大きくなければならない。相互反応ライブラリーの必要な絶対サイズを知ることは困難であるが、免疫反応に関してヒントが与えられる。すなわち、１０7−１０8個の異なる抗体の多様性は、ある生物が遭遇する可能性が極めて高い抗原と相互反応するために十分な親和性をもつ少なくとも１つの組合せを提供する。報告されたin vitro選別技術もまた、１０7−１０8のライブラリーサイズが１つの標的に対して親和性をもつ構造物を見出すために十分であることを示した。長さが７から20アミノ酸のペプチドの全ての組合せを含むライブラリー（例えば本明細書で提唱されるもの）は２０7（１０9）から２０20をコードする能力を有する。従って、１０7から１０8の異なる分子を含むライブラリーにより、本方法は、７アミノ酸のための理論的に完全な相互作用ライブラリーの“実際に有効な（working）”サブセット、及び２０20個のライブラリーのための形態を含むサブセットを可能にする。従って、好ましい実施態様では少なくとも１０6、好ましくは少なくとも１０7、より好ましくは少なくとも１０8及び極めて好ましくは少なくとも１０9の異なる配列が本方法で同時に分析される。好ましい方法はライブラリーのサイズ及び多様性を最大にする。
【００５７】
ある実施態様では、前記ライブラリーは完全に任意抽出され、優先的な配列は存在せずいずれの位置にも定常的な配列は存在しない。好ましい実施態様では前記ライブラリーは偏向性を有する。すなわち、配列内のいくつかの位置は定常性を維持するか、又は限定数の可能性の中から選択される。例えば、好ましい実施態様では、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った（小型又は大型）残基の一定の種類の中から任意抽出されるか、又はシステインの創出のため、架橋のため、ＳＨ−３ドメインにプロリン、リン酸化部位にセリン、スレオニン、チロシン又はヒスチジンに偏って、又はプロリンに偏って、などというように様々に任意抽出される。
好ましい実施態様では、前記偏向は、公知の種類の分子と相互作用するペプチド又は核酸に偏向する。例えば、候補物質がペプチドであるとき、細胞内シグナリングの多くは、小さなペプチドドメインにより他のポリペプチドと相互作用するポリペプチドの短い領域を介して実行されることが知られている。例えば、ＨＩＶ−１エンベロープの細胞質ドメインの短い領域は細胞のカルモデュリンの作用を阻害することが以前に示された。Ｆａｓの細胞質ドメインの領域（前記はスズメバチのマストパラン毒素との相同性が示されている）は、致死的アポトーシス又はＧタンパク質誘発機能をもつ短いペプチド領域に限定される。マガイニン（アフリカツメガエル（Xenopus）に由来する天然のペプチド）は強力な抗腫瘍活性及び抗菌活性を有する。タンパク質キナーゼＣイソ酵素（βＰＫＣ）の短いペプチドフラグメントは、刺激後にアフリカツメガエルの卵母細胞でβＰＫＣの核内移動を阻害することが示された。更に短いＳＨ−３標的ペプチドが、ＳＨ−３タンパク質との特異的結合のための擬似基質として用いられた。この領域には文献が多数存在するので、前記はもちろん生物学的活性を有する利用可能なペプチドの簡単なリストである。従って、細胞内シグナル誘発連鎖事象に活性を有する小ペプチドの潜在的能力について多くの先例が存在する。更に、任意の分子の作動薬及び拮抗薬を調節候補物質の偏向抽出の基礎として用いることができる。
【００５８】
従って、多数の分子又はタンパク質ドメインが偏向抽出される調節候補物質の生成のための出発点として適している。共通の機能、構造又は親和性を付与する多数の小分子ドメインが知られている。更にまた、当業界で知られているように、弱いアミノ酸相同性をもつ領域が強い構造的相同性をもつ可能性がある。そのような多数の分子、ドメイン及び／又は対応するコンセンサス配列が知られているが、これらには、ＳＨ−２ドメイン、ＳＨ−３ドメイン、プレックストリン（Pleckstrin）、致死ドメイン、プロテアーゼ切断／認識部位、酵素阻害剤、酵素基質及びTrafが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましい実施態様では調節候補物質はポリペプチドである。別の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは少なくとも４から20のアミノ酸をもつ環式ペプチドである。更に別の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは触媒活性のないポリペプチドである。触媒活性のないポリペプチドの例には、触媒活性のない活性化できるタンパク質、より具体的には触媒活性のないキナーゼ（例えばＰＩ３Ｋ）又はカスパーゼが含まれるが、ただしこれらに限定されない。更に別の特徴では、調節候補物質は活性化できるタンパク質のペプチドフラグメントであり、前記ペプチドフラグメントは、前記活性化できるタンパク質の完全長アミノ酸配列のサブ配列であるアミノ酸配列を含む。
【００５９】
好ましい実施態様では前記候補物質は核酸である。候補物質についていう場合、“核酸”又は“オリゴヌクレオチド”とは、共有結合によって一緒に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含むが、ただしいくつかの事例では下記に概略するように、例えば以下を含むまた別の骨格を有する核酸類似体が含まれる：ホスホロアミド結合（Beaucage et al. Tetrahedron 49(10):1925(1993)及びその中の参考文献；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800(1970); Sprinzl et al. Eur. J. Biochem. 81:579(1977); Letsinger et al. Nucl. Acids Res. 14:3487(1986); Sawai et al. Chem. Lett. 805(1984); Letsinger et al. J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988); Pauwels et al. Chemica Scripta 26:141(1986)）、ホスホロチオエート結合（Mag et al. Nucleic Acids Res. 19:1437(1991); US Patent No. 5,644,048）、ホスホロジチオエート結合（Briu et al. J. Am. Chem. Soc. 111:2321(1989)）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press）、並びにペプチド核酸骨格及び結合（Egholm, J, Am. Chem. Soc. 114:1895(1992); Meier et al. Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008(1992); Nielsen, Nature, 365:566(1993); Carlsson et al. Nature 380:207(1996)）、前記文献は全て参照により本明細書に含まれる。他の核酸類似体には陽性の骨格（Denpcy et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097(1995)）；非イオン性骨格（US Patent Nos. 5,386,023;  5,637,684; 5,602,240; 5,216,141; 4,469,863; Kiedrowshi et al. Chem. Intl. Ed. English 30:423(1991); Letsinger et al. J. Am. Chem. Soc. 110:4470(1988); Letsinger et al. Nucleoside & Nucleotide 13:1597(1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, “ Carbohydrate Modifications in Antisens Research”, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al. Bioorganic & Medical Chem. Lett. 4:395(1994); Jeffs et al. J. Biomolecular NMR 34:17(1994); Tetrahedron Lett. 37:743(1996)）及び非リボース骨格（以下に記載されたものを含む：US Patent Nos. 5,235,033; 5,034,506; 及びChapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, “ Carbohydrate Modifications in Antisens Research”, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook）が含まれる。１つ又は２つ以上の炭素環式糖を含む核酸もまた前記核酸の定義に含まれる（Jenkins et al. Chem. Soc. Rev. (1995) pp169-176）。いくつかの核酸類似体が下記の文献に記載されている：Rawls, C & E News, June 2, 1997 page 35。前記文献の全ては参照により本明細書に含まれる 。リボースリン酸骨格の修飾はまた別の成分（例えば標識）の添加を容易にするため、又は修飾された分子の生理学的環境内での安定性及び半減期を増加させるために実施することができる。
【００６０】
前記核酸類似体のいずれも本発明で有用であることは当業者には理解されよう。更にまた、天然に存在する核酸と類似体の混合物も作製することができる。また別には、種々の核酸類似体の混合物、及び天然に存在する核酸と類似体の混合物も作製できる。特に好ましいものは、ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）である。これらの骨格は中性条件下では実質的に非イオン性であり、天然に存在する核酸の高度に荷電したホスホジエステル骨格と対照的である。
前記核酸は、具体的には一本鎖でも二本鎖でも、又は二本鎖もしくは一本鎖配列の両部分を含んでいてもよい。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡでもｃＤＮＡでもよい）、ＲＮＡ又はハイブリッドでもよい（ハイブリッド核酸はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ及び塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン、ヒポキサタニン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む）の任意の組合せを含む）。本明細書で用いられるように、“ヌクレオシド”という用語は、ヌクレオチド及びヌクレオシド並びにヌクレオチド類似体、並びに修飾ヌクレオシド（例えばアミノ修飾ヌクレオシド）を含む。更に、“ヌクレオシド”は天然に存在しない類似体構造を含む。従って、例えばペプチド核酸の個々の単位（各々は塩基を含む）は本明細書ではヌクレオシドと称される。
【００６１】
タンパク質について上記で一般的に述べたように、核酸候補物質は天然に存在する核酸、ランダムな核酸また“偏向した”ランダムな核酸であろう。例えば、原核細胞又は真核細胞ゲノムの消化物を、タンパク質について上記で概略したように用いることができる。最終的発現生成物が核酸である場合は、少なくとも10、好ましくは少なくとも12、より好ましくは少なくとも15、極めて好ましくは少なくとも21ヌクレオチド位が任意抽出される必要があり、任意抽出が完全でない場合前記より多い位置の任意抽出が好ましい。同様に少なくとも５、好ましくは６、より好ましくは少なくとも７アミノ酸位が任意抽出される必要があり、繰り返せば前記任意抽出が完全に達しない場合は前記より多い位置の任意抽出が好ましい。
好ましい実施態様では、調節候補物質は触媒活性をもたないポリペプチドをコードする変異体ｃＤＮＡである。そのような触媒活性をもたないポリペプチドの例には、触媒活性のない活性化できるタンパク質、及びより具体的には触媒活性のないキナーゼ（例えばＰＩ３Ｋ）又はカスパーゼが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましい実施態様では、調節候補物質はＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又はsiＲＮＡ（小さな抑制性（small inhibitory）ＲＮＡ）である。別の好ましい実施態様では、siＲＮＡは活性化できるタンパク質をコードするＲＮＡを切断する。siＲＮＡは本明細書で述べる方法及び当業界で公知の方法を用いて調製できる。
【００６２】
好ましい実施態様では候補物質は有機成分である。本実施態様では、WO94/24314で一般的に記載されたように、候補物質は化学的に修飾することができる一連の基質から合成される。ここでいう“化学的に修飾”には、酵素反応と同様に伝統的な化学反応も含まれる。一般的に前記基質には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：アルキル基（アルカン、アルケン、アルキン及びヘテロアルキルを含む）、アリール基（アレン及びヘテロアリールを含む）、アルコール、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環式化合物、複素環式化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、β−ラクタム、テトラサイクロン、セファロスポリン及び炭水化物を含む）、ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、コーチゾン、エコジソンなどを含む）、アルカロイド（エルゴット、ヴィンカ、クラレ、ピロリズジン（pyrollizdine）及びマイトマイシンを含む）、有機金属化合物、ヘテロ原子含有化合物、アミノ酸及びヌクレオシド。化学反応（酵素反応を含む）を前記成分で実施して新規な基質又は候補物質を生成し、これを続いて本発明を用いてテストすることができる。
当業者には理解されるところであるが、２つ以上のタイプの候補物質を一度に、例えば本発明の方法で候補物質を一緒にすることによってスクリーニングすることができる。従って、使用される候補物質のライブラリーは、ただ１つのタイプの物質（すなわちペプチド）又は多数のタイプ（ペプチド及び有機物質）を含むことができる。
“一緒にする”とは、公知の方法を用いるか、又は本発明の方法を用いて検出できる活性を促進する条件下で、多様な成分を１つの反応混合物にin vitroで、又は１つの細胞にin vivoで一緒にすることを意味する（前記の促進される活性とは、例えば対応する抗原又は活性化できるタンパク質のアイソフォーム、又は活性化状態への抗体の結合である）。
【００６３】
本明細書に提供されるアッセイの工程の順序は変更することができることは当業者には理解されよう。しかしながらまた、種々の選択肢（化合物、選択される特性又は工程の順序に関する選択肢）が本明細書で提供されるが、一方、前記選択肢はそれぞれ個々に提供され、更に本明細書で提供される他の選択肢とはそれぞれ別個であることは理解されよう。更にまた、アッセイの感受性を高める当業界で明白であり公知である工程は本発明の範囲内に包含される。例えば洗浄工程、封鎖工程などを更に追加することができる。
好ましい実施態様では、反応混合物又は細胞は、96ウェルのプレート又は他の市販の多穴プレートの１つのウェルに収められる。また別の好ましい実施態様では、反応混合物又は細胞はＦＡＣＳ装置内に存在する。本発明で有用な他の多穴プレートには、384ウェルプレート及び1536ウェルプレートが含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明の方法で有用な、反応混合物又は細胞を入れる他の容器も当業者には明白であろう。
活性化できるタンパク質の活性化状態もしくは活性、又はそのような活性化状態もしくは活性の調節を検出するアッセイ成分の添加は、アッセイされる活性に適した条件下で連続的に又は予め定めた順序もしくはグループで実施できる。前記の適切な条件は本明細書に記載され、更に当業界で公知である。更なる手引きは下記に提供される（例えば実施例を参照されたい）。
好ましい実施態様では、本発明の方法は液体を操作する構成成分の使用を含む。前記液体操作系は、任意の数の構成成分を含む自動機械化システムを含むことができる。更に、ここに概略した任意の又は全ての工程を自動化することができる。従って、例えば本システムは完全に又は部分的に自動化できる。
【００６４】
当業者には理解されるところであるが、使用できる多様な構成成分があり、これらには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：１つ又は２つ以上のロボットアーム；マイクロプレートを適切な位置に置くためのプレート操作装置；相互夾雑防止プレートのウェルの蓋を取り外し更にもとに戻すための蓋又はキャップの自動操作装置；使い捨てチップを含むサンプル分配用チップアッセンブリー；サンプル分配用の洗浄可能チップアッセンブリー；96ウェルのローディングブロック；冷却試薬ラック；マイクロタイタープレートピペット置き（場合によって冷却される）；プレート及びチップの積み重ね用タワー；及びコンピュータシステム。
完全に機械化されたシステム又は微量液体システムは、自動液体操作、粒子操作、細胞操作及び微生物操作装置（高処理ピペット操作装置を含む）を含み、スクリーニングの全工程を実施する。これには液体、粒子、細胞及び生物の取り扱い操作が含まれ、例えば吸引、分配、混合、希釈、洗浄、正確に測定した容積の移動、回収、及びピペットチップの廃棄、並びに単一サンプルの吸引物からマルチデリバリーのために同一容積を繰返しピペットで分配することが含まれる。前記の操作は、液体、粒子、細胞及び生物の移動で相互に夾雑することはない。前記装置は、マイクロプレートのサンプルのフィルター、メンブレン、及び／又は娘プレートへの自動複製、高密度の移動、全プレートの段階希釈、及び高性能操作を達成する。
好ましい実施態様では、アッセイの構成成分に対して固有の化学誘導粒子、プレート、カートリッジ、試験管、磁性粒子、又は他の固相マトリックスが用いられる。マイクロプレート、試験管又は任意の固相マトリックスの結合表面は、非極性表面、高度に極性をもつ表面、共有結合を促進する修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質又はペプチドを結合させるアフィニティー媒体、表面固定タンパク質（例えばリコンビナントプロテインＡ又はＧ）、ヌクレオチド樹脂又はコーティングを含み、更に他の親和性マトリックスも本発明で有用である。
【００６５】
好ましい実施態様では、マルチウェルプレート、マルチチューブ、ホルダー、カートリッジ、ミニチューブ、深底ウェルプレート、マイクロフージ（microfuge）チューブ、凍結用バイアル、角底ウェルプレート、フィルター、チップ、光ファイバー、ビーズ、及び他の固相マトリックスのためのプラットフォーム、又は種々の容量をもつプラットフォームは、更に容量を増やすことができるようにアップグレードが可能なモジュール式プラットフォーム上に収納される。前記のモジュール式プラットフォームは変速が可能なオービタルシェーカー、ソースサンプル、サンプル及び試薬の希釈のためのマルチポジションワークデッキ、アッセイプレート、サンプル及び試薬の貯蔵槽、ピペットチップ及び能動洗浄ステーションを含む。
好ましい実施態様では、サーモサイクラー及び温度調節システムを、熱交換器（例えば温度制御ブロック又はプラットフォーム）の温度の安定化に用いて、インキュベートサンプルの０℃から100℃の正確な温度制御を提供する。
好ましい実施態様では、単一磁性プローブもしくはマルチ磁性プローブ、アフィニティプローブを含む相互交換可能ペピットヘッド（シングル又はマルチチャネル）又はピペッターは液体、粒子、細胞及び生物を自動機械により操作する。マルチウェル又はマルチチューブ式磁性分離装置又はプラットフォームは、単一サンプル様式又はマルチサンプル様式で液体、粒子、細胞及び生物を操作する。
いくつかの実施態様では、本装置は検出装置を含み、前記検出装置は標識及びアッセイに応じて多様な種々の検出装置が可能である。好ましい実施態様では、有用な検出装置には、マルチ蛍光チャネルを有する顕微鏡；単波長並びに二重波長のエンドポイント及びカイネティクス性能をもつに蛍光、紫外光及び可視光の分光測定検出を提供するプレート読取装置、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、ルミネセンス、消光、二光量子励起、及び強度再配分；データ及び画像を捕捉し定量可能なフォーマットに変換するＣＣＤカメラ；及びコンピューターワークステーションを含む。
好ましい実施態様では検出はＦＡＣＳによる。別の特徴では、検出は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えば逆相ＨＰＬＣである。更に別の特徴では検出は質量分析法による。
【００６６】
これらの装置は、マルチウェルプレート又はマルチチューブでの細胞培養増殖及び形質転換のため、更に危険な操作のために無菌的薄層流又は換気フード（fume hood）に適合し、又は封入系、内臓系である。生細胞は、経時的な生細胞アッセイのために温度、湿度及びガスが管理された増殖制御条件下で増殖させることができる。細胞の自動形質転換及び自動コロニー採取は所望の細胞の迅速なスクリーニングを容易にできる。
フローサイトメトリー又は毛細管電気泳動様式を磁性又は他のビーズ、粒子、細胞及び生物の個々の捕捉に用いることができる。
融通性をもつハード及びソフトウェアは装置が多数の応用に対して適合することを可能にする。ソフトのプログラムモジュールは方法の新たな作製、改変及び実施を可能にする。システム診断モジュールは、装置のアラインメント、正しい連結及び駆動を可能にする。カスタマイズされたツール、検査室器具、並びに液体、粒子、細胞及び生物の移動パターンは種々の用途での実施を可能にする。データベースは方法及びパラメーターの保存を可能にする。自動機械化インターフェース及びコンピュータインターフェースは装置間の情報のやり取りを可能にする。
好ましい実施態様では、自動機械化装置は、メモリーと一組の入出力装置（例えばキーボード、マウス、モニター、プリンターなど）間で母線を介して情報をやり取りする中央演算ユニットを含む。繰り返せば、下記に概略するように前記は本発明の多重複合装置のためにＣＰＵに付加するか又はＣＰＵの代用とすることができる。中央演算ユニット、メモリー、入出力装置及び母線間の一般的な相互作用は当業界では公知である。従って、実施される実験に応じた多様な種々の手順がＣＰＵメモリーに保存される。
機械化液体操作システムによって任意の数の試薬（緩衝液、試薬、サンプル、洗浄液、アッセイ成分（例えば標識プローブ）などを含む）の利用が可能である。
以下の実施例は、上記に記載した発明の使用態様をより完全に述べるために、更に本発明の種々の特徴を実施するために意図される最良の態様を説明するために役立つ。これらの実施例は全く本発明の範囲を限定するものではなく、説明のために提供されることは理解されよう。本明細書に引用した全ての参考文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
【００６７】
実施例
実施例１
単一細胞における機能的なシグナリング分析：多染フローサイトメトリーを用いる多数のキナーゼ活性の同時測定
シグナリング系の細胞内アッセイは、キナーゼ活性を基準にして複雑な細胞集団内の機能的な細胞亜集団の相関性を決定することが不可能であるために制約を受けてきた。そのような相関性は、シグナル発生時又は疾患の出現時に希少な細胞集団で生じるシグナリング状態の変化を識別するために重要であろう。本実施例では、本発明の方法及び組成物を用いて、本発明者ら（本明細書では“我々”ともいう）は、マルチパラメーターフローサイトメトリー分析によって複雑な細胞集団内の亜集団で以下のメンバーのキナーゼ活性を同時に検出する能力を示す：マイトジェン活性化タンパク質キナーゼファミリーのメンバー（p38MAPK, p44/42MAPK, JNK/SAPK）、細胞生存経路のメンバー（PKA, AKT/PKB）、Ｔ細胞活性化経路のメンバー（TYK2, PKC）。更に本実施例で、本発明者らは、以下に対する異なるシグナル発生連鎖事象を特定するこれらプローブの有用性を明らかにする：１）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の人工的及び生理学的刺激条件の両刺激条件；２）５つの異なるマーカーによって特定されるヒトの記憶保持リンパ球及び未感作リンパ球サブセットにおけるサイトカイン刺激；及び３）可能なシグナリング階層におけるキナーゼ活性化の順序決定。多染フローサイトメトリーによるキナーゼ活性測定（ＰＦＣ−ＫＡ）によって、シグナリング経路の相互作用の多次元分析は機能的なシグナリング経路の単一細胞レベルでの評価を可能にすることが示された。
【００６８】
序説
複雑な細胞集団（例えば末梢血）における単一細胞レベルでの多数の活性化されたシグナリング経路の研究は以前には不可能であった。マルチパラメーターによるフローサイトメトリー分析は、小さな細胞亜集団（異なる細胞のサブセット、分化又は活性化状態を示す）を細胞表面マーカーを用いて区別することを可能にする。シグナリング経路の下流の活性化は、ｐ−ガラクトシド1,2及びβ−グルクロニダーゼ3に対する酵素活性の細胞内検出を含むレポーター系によって情報を読み出し、特定のプロモーター及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の転写を調べることができる。タンパク質間の相互作用は蛍光共鳴エネルギー伝達及びバイオルミネセンス共鳴エネルギー伝達4,5,6,7の両方法によって決定することができる。これら後者の方法のいずれかでは内因性キナーゼの活性化状態にアクセスできないので、シグナリング系の活性化は、レポータータンパク質の過剰発現を介して決定される。
キナーゼシグナリング連鎖事象は、細胞のほとんど全ての重大な決定プロセスで重要な役割を果たすことが知られている8。ある系における固有のシグナルトランスダクション経路の役割決定は、固有のキナーゼに対する薬理学的阻害剤の出現によって促進されてきた。タンパク質キナーゼB/AKT、c-Jun-N末端キナーゼ（JNK）、p38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（p38）のようなキナーゼの活性、p44/42 ERK1/2（ERK）活性、PKA活性、PKC活性、TYK2活性のモニタリングは通常はin vitroキナーゼアッセイに依存するか、又はより最近ではリン特異的抗体を用いて前記キナーゼのリン酸化状態を決定するイムノブロッティングに依存している。今日まで、重要なシグナリング経路で希少な亜集団とキナーゼの活性化状態との相関性を知ることは不可能であった。11色のフローサイトメトリー9の最近の出現により、我々は生物学的に関連する細胞のサブセットを特定のキナーゼ活性状態を基準に分析することを試みた。
【００６９】
リン特異的モノクローナル抗体、リン基質特異的ポリクローナル抗体及び同系（非リン特異的）キナーゼ抗体を、固有のキナーゼ活性のためのプローブとして発光団（本明細書の表１及び下記表１の説明文参照）と結合させた。前記結合の前に細胞を適切なキナーゼ誘発剤又は特異的なキナーゼ阻害剤（本明細書の表２及び下記表２の説明文参照）で処理し、更に慣用的なウェスタンブロット分析及びキナーゼ活性アッセイに付すことによって各抗体をリン特異性について調べた（図１Ａ）。キナーゼのリン酸化状態に特異性を示した抗体は以下のとおりであった：AKT−ホスホ−Ser473、AKT−ホスホ−Thr308、p44/42 MAPKホスホ−Thr202/Tyr204、TYK2ホスホ−Tyr1054/1055、p38 MAPKホスホ−Thr1BO/Tyr182、ＰＫＣ−ＰＡＮリン基質（前記は、ＰＫＣβ11のSer660と相同なカルボキシ末端残基でリン酸化されたときにのみ、ＰＫＣのα、β１、β11及びδアイソフォームを検出する）、ＰＫＡリン基質（−３位のアルギニンとともにスレオニンのＰＫＡリン酸化のコンセンサスリン酸化部位）、JNK/SAPKホスホ−Thr183/Tyr185、ホスホ−チロシン（p-tyr-100）及びホスホ−スレオニン。全てのキナーゼ活性化状態は、同系キナーゼをリン酸化することが知られている上流のキナーゼに対する特異的な阻害剤を用いて実証した（図１Ａ）。用いた阻害剤は表２に示されている。
【００７０】
24時間の血清枯渇後のＦＡＣＳによる検出を、キナーゼ活性化に特異的な刺激及びキナーゼ選択的阻害剤による阻害の関数として調べた。表１は、本報告で用いたフローサイトメトリー実験のための染色の組合せを示している。使用したキナーゼ選択的活性化剤及び阻害剤は表２に、ＦＡＣＳによるキナーゼ活性は図１Ｂに表示されている。P44/42、AKT、JNK、TYK2、p38及びホスホ−チロシン含有タンパク質のためのキナーゼプローブは、非誘発条件及び誘発条件間でもっとも強いピークの分解を示した。PKC及びPKAのためのキナーゼプローブは、ＦＡＣＳで測定したとき基線蛍光レベルから最も低い判別可能な誘発を示した。このことは、我々が確立した誘発及び染色の条件に左右された結果の可能性があり、また基質モチーフ認識がこれらのプローブについて最適ではないかもしれない。従って、我々は、染色前にサンプルを１つ又は２つ以上のホスファターゼで処理し、ホスホ−ＰＫＣ−ＰＡＮ、ホスホ−ＰＫＡ基質、及びホスホ−ＴＹＫ２のプローブのリン特異性を確認することによって、観察された蛍光は標的タンパク質のリン酸化によるものであることを決定した（図１Ｃ）。図１Ｃは、ホスホ−ＰＫＣ−ＰＡＮ、ホスホ−ＰＫＡ−基質及びホスホ−ＴＹＫ２プローブは、認識についてそれらの各々のリン酸化基質に依存することを明瞭に示した。なぜならば、ホスファターゼ処理は、刺激によって誘発されたリン酸化生成物を認識するそれらの能力を減少させるからである。
【００７１】
これらのプローブが種々のレベルのキナーゼ活性間で識別能力を有することを実証するために、ＦＡＣＳドースレスポンス曲線は、蛍光との相関性が優れたp44/42活性が存在することを明らかにした（図１Ｂ、下段右）。更にまた、ホスホ−p44/42プローブの平均蛍光強度は、ドースレスポンス曲線でのリン酸化p44/42のデンシトメトリー値に関して0.96の相関係数を有し、前記キナーゼプローブがキナーゼ活性の小さな差異を測定することができることを証明した（図1Ｄ）。
これらプローブの生物学的に関連するシグナリング事象を表す能力を示すために、我々は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（潜在的キナーゼ活性についておそらく不均質であろうと考えられる細胞集団）を活性化し、細胞のサブセットが異なるキナーゼ活性化のカイネティクスを示すか否かを調べた。混合培養中の全ＰＢＭＣをＣＤ３及びＣＤ28モノクローナル抗体で刺激し、表面レセプターの生理的Ｔ細胞活性化を摸倣した。また別の刺激形態として、我々はこれらの細胞を人工的なＴ細胞活性化物質、ホルバルミリスチルアセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンで活性化した。細胞サブセットをＣＤ４＋（Ｔ細胞サブセットマーカー）又はＣＤ19＋（Ｂ細胞マーカー）に対してゲートコントロールした。Ｔ細胞及びＢ細胞サブセットを比較して、ある刺激に対してこれら２つの細胞タイプ間における異なるキナーゼ活性プロフィールを見出した。図２Ａは、初代Ｂ及びＴ細胞が、非刺激状態でp38 MAPK及びp44/42 MAPKのキナーゼ活性に関して固有の相違を有し、用いた種々の刺激条件に対して異なる反応をもつことを示している。p38及びp44/42活性の両活性のＴ細胞に対する劇的な相違は、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激及びＣＤ３／ＣＤ28刺激を比較したときに認められ、ＣＤ３／ＣＤ28はｐ38又はｐ44/42経路でＣＤ４＋のＴ細胞の完全な活性化を保証しないことを示唆している。ＣＤ19＋のＢ細胞のある程度の活性化がＣＤ３及びＣＤ28の組合せで観察され、我々は、Ｔ細胞の活性化及びそれらがＢ細胞に対する刺激性サイトカインを生成したためであると考える。また別には他のＴ細胞ヘルパーとＢ細胞との相互作用がＣＤ３及びＣＤ28で観察される活性をもたらしたのかもしれない。
【００７２】
我々はまた細胞株におけるサイトカインに対する異なる反応を調べた。ＣＤ69（初期Ｔ細胞活性化マーカー10、11）を活性化及び非活性化Jurkat細胞間の識別のための表面抗原として用いて、ＣＤ69の発現を種々のＴ細胞刺激物質に対するp44/42活性の関数として表した（図２Ｂ）。ＣＤ３／ＣＤ28刺激をＰＭＡ／イオノマイシン刺激（人工的）と比較したときにキナーゼ活性及びＣＤ69発現で観察された相違は、p44/42 MAPKに関しては他の共働刺激分子が存在し、最適なＴ細胞活性化にそれらが必要であることを示唆しているであろう。更に、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激Jurkat細胞を含む実験によって、ＣＤ69＋細胞でのＴＹＫ２活性の活性化の低下が示された（データは示されていない）。このことは、Ｔ細胞活性化は、細胞を更なる刺激に対して低反応性にする固有の調節メカニズムを誘発することを示唆し、キナーゼプロファイリングプローブはアネルギー応答の研究に用いることが潜在的に可能であることを示しているであろう。
キナーゼ活性のゲートコントロール分析によって得ることができる情報タイプの例として、伝統的なヒストグラム分析及びキナーゼ活性ゲートコントロール分析の両分析を実施し、下記に提示する。培養液中又はＰＭＡ／イオノマイシンで刺激中のJurkat細胞を多数の細胞内キナーゼ活性及びＣＤ69発現について調べた（図２Ｃ）。ＰＫＣ、ｐ38及びp44/42の基礎活性は観察されるが、ＪＮＫ、ｐ38、p44/42、ＰＫＣ及びＰＫＡに対するキナーゼ活性はＰＭＡ／イオノマイシン刺激細胞について劇的に変化する（図２Ｃ）。このことは、ＣＤ69＋のＰＢＭＣについての観察（図２Ｂ）と一致する。従って、無傷の細胞のリン酸化事象をモニターすることによって、活性を他のパラメーター（例えば表面分子発現、細胞サイズ又は細胞の顆粒化）と相関させることができる（前記はキナーゼリン酸化状態の通常の溶解物分析では不可能である）。
【００７３】
細胞のサブセット分析を更に進めるために、我々はJurkat細胞をアニソマイシンで処理し、前記細胞を全ｐ38 MAPK（おそらくｐ38の非リン酸化領域と思われる領域に対する抗体を用いる）について、更にホスホ−ｐ38 MAPKプローブにより調べた。前記アプローチによって、我々はｐ38のリン酸化の変化を追跡できるだけでなく、定常状態レベルを同時に測定することができるであろう。ＦＡＣＳによるキナーゼアッセイは、細胞サイズ（フォワードスキャター）及び細胞形態（サイドスキャター）との相関性の比較分析を可能にするので、我々はリン酸化状態をサイドスキャターのパラメーター（顆粒性の測定）の関数として調べた。細胞の顆粒性は、表面分子の分布、細胞構造及び細胞の構成の関数であり、外側の細胞表面の調節（インテグリンの“インサイド−アウト”シグナリングの分野における事例に共通の現象12,13,14,15）をもたらす内部の細胞シグナルによって影響を受ける。等高線図は、細胞の顆粒性が増したときのｐ38の非リン酸化からリン酸化へのシフトを示している（図２Ｄ）。同様に、p44/42キナーゼ活性の上昇と細胞サイズの増加との間の正の相関関係（フォーワードスキャターパラメーター）が、細胞サイズの関数としてキナーゼ活性をモニターしたときに観察された（データは示されていない）。我々は、ホスホ−ｐ38蛍光染色は判別可能なｐ38非リン染色を犠牲にして生じることを観察した。我々は、前記は活性化状態での非リン特異的プローブの結合の細胞タンパク質による吸蔵の結果と考える（下記参照）。
【００７４】
我々は、ＩＬ−１ａで刺激した全ＰＢＭＣについてｐ38及びp44/42のリン酸化状態とホスホ−ＪＮＫとの相関性を示すことによって３キナーゼのゲートコントロール分析を説明する（図２Ｅ）。ホスホ−ＪＮＫレベルの低い方の端からより高いレベルを示す領域の抜粋は、最初のp44/42のリン酸化を示し、その後に、ＪＮＫのリン酸化強度が増加するにつれてｐ38のリン酸化がこれに続く。従って、細胞内では、より高いＪＮＫ活性化レベルはp44/42からｐ38へのシグナルの明瞭な移動と相関性を有する。リン酸化現象は時間に従って標準化されないが、ＪＮＫリン酸化の関数としてｐ38及びｐ44で観察されるリン酸化シフトは経路の相互作用を示唆し、更に１つのシグナリング連鎖事象が別のシグナリング連鎖事象を活性化する結果を示すことができるかもしれない（これらのシフトに必要な細胞サブセットを決定するための更なる実験が現在進行中である）。ＩＬ−１ｐ刺激ＰＢＭＣでＴＹＫ２活性の関数としてＡＫＴ、ＰＫＡ、ｐ44/42及びｐ38キナーゼ活性を同時にモニターすることによって、キナーゼ連鎖事象は、マルチパラメーター態様で分析した場合それらの活性化状態に対応して順序が決定されることが実証された（図２Ｆ）。ＩＬ−１β刺激に関しては、ｐ38及びp44/42の同時活性化はＴＹＫ２の活性化が検出され始めたときに観察される。しかしながら、検出されるリン酸化ＡＫＴにおけるシフトがより低いレベルのホスホ−ＴＹＫ２及びＰＫＡ基質のＰＫＡリン酸化と相関性を示すとき、ＡＫＴ及びＰＫＡ活性化に関して異なるプロフィールが観察される。５つのキナーゼの同時活性化を空間的に解析できるこれらプローブの有用性はシグナリング経路の全体的な評価を可能にする。更に、集団のサブセットを細胞内キナーゼ活性を基準にして区別することができ、更に多数の表面マーカーを用いることによりこれら集団のサブセットの相関性を表現型について知ることができる。他の固有の刺激に対する個々のシグナリング経路の活性化をこれらキナーゼプローブがスクリーニングすることができるその能力を明らかにするために、我々は、ヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をいくつかの異なるサイトカインで処理した。我々は、ホスホ−キナーゼプローブを用いて反応細胞でのホスホ−キナーゼプロフィールの相関性を多染フローサイトメトリー（11色、13パラメーター）で調べた。
【００７５】
最初の実験では、Ｔ細胞の機能的性状決定は時にドナーによって異なっていた。磁気活性化細胞分類（ＭＡＣＳ）を用い、刺激及び分析前に陰性単離によって休止Ｔ細胞を単離したとき識別できるドナーの多様性は減少した。前記は、おそらく予め存在する活性化Ｔ細胞及びサイトカイン生成の可能性がある他の細胞タイプの枯渇によるものである。図３は、本物の未感作（ＣＤ３+ＣＤ４+ＣＤ８-ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ１１ａdimＣＤ２８+ＣＤ２７+）及び記憶保持（ＣＤ３+ＣＤ４+ＣＤ８-ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ１１ａbrＣＤ２８-ＣＤ２７-）Ｔ細胞の細胞内キナーゼ活性を単離、性状決定及び分析するために用いたプロトコルの工程図を示している。我々は、記憶保持Ｔ細胞とは（非活性化細胞タイプにおいてさえも）対照的に、未感作Ｔ細胞の例えばＣＤ４陽性サブセットでＡＫＴの明瞭な構成的活性化、及び前記より低いＡＫＴ活性化を未感作Ｔ細胞のＣＤ８陽性サブセットで観察した（図３、下段）。他の相違も明白で、非刺激細胞でも同様であり、前記相違にはｐ38リン酸化の相違が含まれる。図４は、ホスホ−キナーゼプロフィールで測定した場合に、未感作及び記憶保持Ｔ細胞のＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−２に対する反応でそれらＴ細胞における機能的相違を特定する、キナーゼアッセイを基準にした多染フローサイトメトリーの能力を示している。興味深いことには、これらサイトカインのいずれによる刺激も、ＣＤ８＋細胞に対してＣＤ４＋未感作細胞ではp44/42のリン酸化の下落をもたらす。前記よりも穏やかな劇的下落がこれら同じ細胞サブセットのＪＮＫ活性において生じる。他のキナーゼプロフィールは影響を受けない。
【００７６】
刺激の結果としてのキナーゼ発現の相違は、典型的には標準的なウェスタンブロット／キナーゼ分析でタンパク質含有量の標準化によるか、又はリン酸化と無関係のキナーゼを認識する標準化用抗体による比較ブロットを泳動させることにより確かめられる。我々は、ＡＫＴ、p44/42 MAPK、ｐ38 MAPK及びJNK/SAPK（標準化用抗体）のための同系非リン特異的蛍光プローブを用いて、活性状態及び失活状態にある複数のキナーゼを同時に評価できるか否かを調べた。非刺激細胞では、p44/42に対する標準化用抗体を用いてわれわれは強力な染色を観察した。ＥＧＦ刺激後全ての細胞がリン酸化されたp44/42を示したが、標準化抗体は陰性集団を明らかにした。前記の結果は、p44/42抗体によって認識される部位への未知のタンパク質によるＥＧＦ誘発結合によるものか、又は抗体結合部位を吸蔵するp44/42分子の構造における変化によるものであろう。ｐ38については、我々は、アニソマイシン刺激後に判別できるｐ38のレベルにおける強い増加（又は標準化抗体認識部位を吸蔵する結合タンパク質の消失）を、ｐ38のリン酸化増加を示す細胞サブセットと同様に観察した。ＪＮＫについては、刺激前に３つの別個の集団が観察され、刺激後には４つの別個の集団が可視化された。
【００７７】
１つの可能性は、前記の図は、JNK/SAPKのｐ46及びｐ54アイソフォームの２つのリン酸化事象、ＪＮＫ又はｐ54アイソフォーム発現の迅速な開始によって連結されるＪＮＫのリン酸化を示しているのであろうということである。ＡＫＴについては、非刺激状態とは異なる２つの別個の細胞集団がJurkat細胞のＰＤＧＦ刺激後に出現した。より高いＡＫＴ蛍光強度を有する細胞集団が一及び二リン酸化状態の両状態で存在した（図５Ａ下段）。ＰＤＧＦ刺激細胞の判別可能なＡＫＴ陰性集団は、ホスホ−thr308及びホスホ−ser473プローブによって検出したとき最少のリン酸化を示した。ＰＤＧＦ刺激の10分以内に全ＡＫＴレベルが急速に低下するということはありえない。なぜならばこれは標準的なウェスタンアッセイ及びキナーゼアッセイでは観察されなかった（図１Ａ参照）からであり、従って我々は、新規なタンパク質がそこに結合したか、又はシグナル誘発構造変化が抗体の結合を妨げたと推測する。
これら後者の結果によって、我々は、観察された亜集団の変化は細胞タンパク質とキナーゼとの結合における変化を示していると考える。従って、標準化用抗体を基準にして細胞内染色を標準化するために複数の抗体を同時に使用することには潜在的な混乱が存在し、このことはそのようなデータの解釈に注意が必要であることの正当性を示す。しかしながら、これらの結果は、同じタンパク質上の異なるエピトープを認識する一連の抗体は、細胞の結合パートナーの存在、それらが標的タンパク質構造上で相互作用するマップを推論し、そのような結合に附随する特定の機能的相関性を引き出すことを可能にするであろう。我々は、複雑な細胞集団で細胞毎に内因性タンパク質に関してタンパク質の相互作用をマッピングすることを可能にする他の技術を知らない。
【００７８】
要約
マルチパラメーターフローサイトメトリーを利用して、我々は、リンパ球サブセットを５つもの細胞内キナーゼ活性のレベルを基準にして区別することができることを明らかにした。本アプローチの能力は、細胞内シグナリング経路の詳細な分析で評価されるだけでなく、フローサイトメトリーによって単一細胞で多数のキナーゼ活性を測定する能力を初めて示すことができた。単一細胞レベルでの機能的シグナリングの詳細な分析は、希少な細胞集団（例えば幹細胞又は幹細胞の原始細胞）に応用することが可能であり、更に一定の細胞サブセットの希少性のためにin vitroでの機能の性状決定のための細胞単離を妨げている多くの系にも広げることができる。これらキナーゼ特異的プローブの応用は以下のとおりである：（１）種々の細胞プロセスの生物学を理解するためにある刺激に対する固有のシグナリングプロフィールを得る、（２）発生、分化又は細胞の発育維持に関して希少細胞集団でシグナリングメカニズムをモニターする、（３）哺乳類細胞内の特定のキナーゼ活性の薬理学的阻害剤について高処理性能をもつＦＡＣＳによるスクリーニングでこれらキナーゼプローブ（及び他のキナーゼプローブ）を利用する潜在的能力、（４）全体的なスケールでキナーゼ活性化連鎖事象を時間的及び空間的に分解する潜在的能力、及び（５）適切な抗体セットを用いて刺激の前後に結合パートナーを推論することができる可能性。他の細胞内キナーゼプローブの開発はシグナリングネットワークの解明に寄与することができ、更に多染フローサイトメトリー（11色、13パラメーター）技術9との組合せによって、免疫系の複雑な細胞シグナルの理解を促進することができるであろう。更にまた、これらプローブの用途を臨床的な応用に拡大し、疾患をもつ患者に由来する細胞の細胞内キナーゼ活性を疾患の進行の診断のためのインジケーターとして測定することができるかもしれない。
【００７９】
実験方法
細胞培養及び初代細胞の単離
Jurkat細胞は、RPMI 1640、10％ＦＣＳ、１％ＰＳＱ（10％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（1000単位／mL及び２mMのＬ−グルタミン、ＰＳＱ））中で維持した。NIH3T3細胞はＤＭＥＭ（ダルベッコー改変イーグル培養液）、10％ドナー仔牛血清、１％ＰＳＱ中で維持した。初代細胞の調製では、単核細胞は健常ドナーの血液（Stanford Blood Bank, Stanford, California）から単離した。ヒト末梢血単球は、全血のフィコール−プラーク密度遠心分離（Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden）及びプラスチック培養皿への粘着による粘着性細胞の除去によって得た。単離した細胞は完全な培溶液中で維持した。磁気活性化細胞分類（MACS, Miltenyl Biotech, Baraisch-Gladbach, Germany）は記載のようにいくつかの実験で用いて、ＣＤ16、ＣＤ14、ＣＤ44、HLA-DR又はＣＤ19ビオチン付加抗体（Dynal, Oslo, Norway）及びストレプトアビジン−磁性ビーズ（Dynal, Oslo, Norway）の組合せを用いて陰性単離によってＣＤ３＋のＴ細胞を濃縮した。使用した化学物質及び生物学的物質は以下のいずれかから得た：Sigma, St. Louis, Missouri; Cell Signaling Technologies, Beverly, Massachusetts; Roche Biochemicals, Indianapolis, Indiana; 又はPeprotech, Rocky Hill, New Jersey: イオノマイシン（１μM、Sigma）、フォルバルミリスチルアセテート（１μM、Sigma）、アニソマイシン（10μM、Sigma）、ＰＤＧＦ10pg／mL又は表示の量（Roche Biochemicals）、ＳＢ203580（10μM、Cell Signaling Technology）、ＬＹ294002（10μM、Cell Signaling Technology）、Ｕ0126（10μM、Cell Signaling Technology）、ビスインドリルマレイミド（Bisindolymaleimeide）II（10μM、Sigma）、カリクリンＡ（10μM、Sigma）、スタウロスポリン（１μM、Sigma）、ジェニステイン（10μM、Sigma）、ＩＬ−２（10pg／mL、Peprotech）、ＩＬ−３（10pg／mL、Peprotech）、ＩＬ−１α（Roche Biochemicals（10pg／mL））、上皮増殖因子（EGF, Roche Biochemicals）、ラムダホスファターゼ及びウシ腸ホスファターゼ（CIP, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts）、CD40L（Dr. Strobl（Department of Molecular Pharmacology, Stanford University）より寄贈）、ＣＤ３（ＯＫＴ３）及びＣＤ28エンドトキシン／アザイド非含有モノクローナル抗体（PharMingen, La Jolla, California）。
【００８０】
血清枯渇のためには、Jurkat細胞に24時間血清を与えず、これをキナーゼ活性に関して非誘発と考えた。キナーゼ活性阻害は、キナーゼ活性化物質で刺激する30分前に適切なキナーゼ阻害剤を用いて実施した。キナーゼ活性化物質又は外因性刺激のいずれかによる刺激は、細胞をフローサイトメトリーのために調製する前に30分間実施した。Jurkat細胞のＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激は１μMで２時間であった。ＰＢＭＣの刺激は11色分析の前に表示サイトカインの10ng／mLで12時間実施した。化学物質はDＭＳＯ（Sigma）に溶解し、非誘発細胞には0.1％のＤＭＳＯ担体をコントロール処置として与えた。図１ＡのサンプルのＵＶ処置は、典型的な組織培養フード内でＵＶ光の下で表示時間インキュベートすることによって実施した。ラムダホスファターゼ処置（1000単位、37℃で15分）及びウシ腸ホスファターゼ処置（CIP、50単位、37℃で15分）は、細胞内染色前にＦＡＣＳ透過処置の後で実施した。
【００８１】
イムノブロッティング
２Ｘ106細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって細胞抽出物を調製した。溶解緩衝液は以下を含む：20ｍMトリス（ｐH7.5）、150ｍMのNaCl、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、１％トリトンX100、2.5ｍMのNa2PO4、１mMβ−グリセロホスフェート、１mMのNa3VO4、１μg／ｍLのロイペプチン、１ｍMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Boehringer Mannheim, Basel, Switzerland。抽出物を14000rpmで５分４℃で遠心し、細胞溶解物（BCAタンパク質アッセイ（Pierce, Rockford）で測定したとき20ｇ）を12％から15％のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、PVDFメンブレンに標準的な方法を用いて移した。使用した抗体はブロットの側に表示されている（Cell Signaling Technologies（Beverly, Massachusetts）から購入）。細胞の処理は適切な場合には表示されている。
【００８２】
キナーゼアッセイ
キナーゼ活性のアッセイプロトコルはAKT、ｐ38、ｐ44/42、JNKについて同様で、代用した使用試薬はそれぞれのキナーゼアッセイについて記載されている。キナーゼ活性のアッセイに使用した全ての試薬はCell Signaling Technologies（Beverly, Massachusetts）から入手した。キナーゼ活性は、それぞれ固定AKT1G1モノクローナル抗体、固定ホスホ−ｐ38MAPKモノクローナル抗体、固定ホスホ−p44/42モノクローナル抗体、又はｃ-Jun融合タンパク質ビーズを用い細胞からキナーゼAKT、ｐ38、p44/42又はJNKを免疫沈澱させることによって検出した。固定されたキナーゼは、それぞれGSK3融合タンパク質、ATF-2融合タンパク質、Elk-1融合タンパク質又はｃ-Jun融合タンパク質ビーズによるキナーゼアッセイで使用した。２Ｘ106のNIH3T3又は２Ｘ106のJurkat細胞をPBSで２回洗浄し、固定キナーゼ抗体又はビーズ（1：200）とともに４℃で2時間穏やかに揺らしながらインキュベートした。免疫複合体を４回細胞溶解緩衝液で洗浄し、40μLのキナーゼ緩衝液（25ｍMトリス（pH7.5）、５ｍMβ−グリセロホスフェート、２mMのDTT、0.1ｍMのNa3VO4、10ｍMのMgCl2）に30℃で30分再懸濁させた。前記キナーゼ緩衝液は、200μMのATP及び１μgの融合タンパク質を補充されていた（JNK活性アッセイは除く、前記ではATPは活性誘発に十分であった）。キナーゼ反応はSDSサンプル緩衝液で５分間煮沸して停止させ、GSK3、ATF、Elk-1又はcJunのリン酸化状態は、リン特異的抗体、ホスホ−GSK3αβ（ser21/9）、ホスホ−Elk-1ser383）、ホスホ−ATF2（thr71）又はホスホ−cJun（ser63）をそれぞれ用いてイムノブロッティングを実施し、ECL検出（Amersham）を用いて可視化することによって検出した。
【００８３】
キナーゼプローブの作製
抗体の共役は標準的方法（http://drmr.com.abcon）を用いて実施するか、又はタンパク質−タンパク質／タンパク質−染料架橋キット（Molecular Probes, Eugene, Oregon）を用いて実施した。リン特異的及び非リン特異的抗体はCell Signaling Technologies（Beverly, Massachusetts）から入手するか、又は表示したとおりであった。共役を実施した抗体は以下のものであった：ホスホ−AKTSer473モノクローナル抗4E2、ホスホ−p44/42 MAPキナーゼ（Thr202/Tyr204）モノクローナル抗体、ホスホ−TYK2（Tyr1054/1055）抗体、ホスホ−p38 MAPキナーゼ（Thr180/Tyr182）モノクローナル抗体28B10、ホスホ−PKC−PAN基質抗体、ホスホ−PKA−基質、ホスホ−SAPK/JNK（Thr183 Tyr185）G9モノクローナル抗体、ホスホ−チロシンモノクローナル抗体（P-tyr-100）、-44/42 MAPK、p38 MAPK、JNK/SAPK及びホスホ−AKT−Thr308。抗TYK2はSanta Cruz Biotechnologies（Santa Cruz, California）から入手した。ホスホ−PYK2（pY402）抗体及びホスホ−FAK（pY397）はBiosource（Carillo, California）から入手した。アレキサ−フルアー染料（Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、 Alexa Fluor 633、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680）、カスケードブルー、カスケードイェロー及びＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）はMolecular Probes（ Eugene, Oregon）から購入した。ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッドはPierce（Rockford, Illinois）から購入した。Cy５、Cy 5.5、Cy７はAmersham Life Science（Pittsburgh, Pennsylvania）から入手した。Cy5PE、Cy5.5PE、Cy7PE、Cy5.5APC、Cy7APCのための縦並び共役プロトコルはwww.drmr.com/abconで見つけることができる。蛍光プローブ共役の定量を算定して標識の程度を決定する。染料のスペクトル特性を含むプロトコルはwww.metazoa.com/UPL3419で見つけることができる。一般的に、使用プローブはタンパク質１moleにつき29moleの蛍光染料を有していた。
【００８４】
フローサイトメトリー及びＦＡＣＳ分析
細胞内及び細胞外染色は初めに記載（www.metezoa.com/UPL3287）されたように実施したが改変されてあった。約１−10Ｘ107個の末梢血単核細胞を磁気活性化細胞分類によって入手し、刺激条件で12時間処理し、フローサイトメトリーのために調製した。表面を20分染色し、更に細胞内染色試薬（詳細は下記参照）のために部分標本に分割した。細胞内染色は、サイトフィクス／サイトパーム（CytoFix/CytoPerm）緩衝液（PharMingen, La Jolla, California）による透過性付与、氷上で細胞内染色30分、及び１％のパラホルムアルデヒドに最終的懸濁により実施した。アイソタイプコントロールマッチ抗体を染色コントロールのために用いた。下記のものの他に表1に挙げた細胞表面マーカーに対する精製抗体はPharMingen（La Jolla, California）から入手するか、又はHerzenberg laboratory（Department of Genetics, Stanford University）で表示の蛍光発光団と共役させた：CD69-APC、CD69-PE、CD4-FITC、CD4-APC、CD4-PE、CD3-APC、CD3-PE、CD3-PERCP、CD19-FITC、CD19-APC。
【００８５】
各血液サンプルについて、ＰＢＭＣを染色組合せ４、５、６（表１）中の全ての試薬（FITC、PE、アレキサ594及びAPCを除く）で染色した。染色細胞を部分標本に分割し、続いてそれぞれ別々に組合せ４、５、６（表１）に示した種々の細胞内カクテルの組合せを用いて染色した。細胞内ＦＡＣＳ染色は穏やかな細胞固定及びそれに続く透過性付与を必要とする。二段階抗体染色プロトコル（一次抗体＋共役二次抗体）を用いて細胞内染色を実施することが可能であったが、最適な結果は一次共役抗体で達成された。更にまた、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）のようなフィコビリタンパク質を含む共役物は、極めて最適な透過性条件を必要とする。これはおそらくフィコビリタンパク質が大きく、更に細胞内表面へのバックグラウンド結合をもたらす可能性があるためである。これらの理由から、アレキサ−フルア染料シリーズを用いて作製したリン特異的プローブを多標識実験に用いた。更に、これらの抗体のリン酸化形を標準的なウェスタンブロットで認識する、他のキナーゼ活性（とりわけホスホ−PYK2、ホスホ−FAK）のために開発したいくつかのリン特異的プローブは、ＦＡＣＳでホスホエピトープを認識する能力を喪失した。これは、抗体によって認識されるエピトープを固定過程が変化させたか、又はタンパク質の天然の形態中のエピトープが抗体認識を妨害されているためのどちらかであろう。徹底した検査の後、我々は、直接的に共役させたリン特異的モノクローナル抗体は一般的に最大のシグナル対ノイズ比を示すことを認めた。
単色及び四色フローサイトメトリーデータ採取をセルクェスト（CELLQuest）ソフトを用いてファックスカリバー（FACSCalibur）マシーン（Beckton Dickinson, San Jose, California）で収集し、フロージョ（Flowjo）ソフト（Tree Star, San Carlos, California）を用いて分析及び提示した。四色以下についてのデータは、106細胞／サンプルを含む３つの別個の実験の代表的なもので、50000例を収集し、カリブライト（Calibrite）ビーズ（Becton Dickinson, San Jose, Califonia）を用いて修正した。11色データ採取は、モフロー（MoFlo）エレクトロニクス（Cytomation, Fort Collins, Colorado）に連結した改変ファックスタープラス（FacstarPlus, Becton Dickison, San Jose, California）で収集した。データはファックスデスク（FACSDesk）ソフトで収集し、フロージョソフトを用いて補正、分析及び提示した。11色フローサイトメトリーのためのデータは最小限200000例を収集した。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
上の表は単色、３色及び４色の組合せを図１及び２Ａ−Ｄに用いたことを示している。これらのための抗体−染料セットは上記の１、２及び３の欄に見出すことができる。抗体−染料の組合せは、実験中に用いたレーザー線によって決定したそれらの励起波長に従って群に分けられている。11色染色組合せ（４、５、６の欄）を用いて、図２Ｅ−Ｆ、３、４及び５のデータが得られた。空白の領域は試薬が用いられなかったことを示している。エチジウムモノアジドブロミド（ＥＭＡ）を用いる条件によって、細胞に透過性を付与する前にＤＮＡへの挿入及び共有結合アダクツの形成によって死細胞を特定した。血清の下敷きをフォーワードスキャター及びサイドスキャターゲートコントロールと同様に用いて、それぞれ死細胞の物理的除及び特定を実施した（図４）。
下の表はこれらの実験で用いたアレキサ蛍光染料プローブを示している。種々のキナーゼを、アレキサ染料で標識した７つの異なるリン特異的抗体の１つ又は２つ以上と共役させた。前記抗体は、前記の色でリン特異的プローブが用いられたことを示すために、上記の表でｐ−プローブとして示されている。それらは、表１の上段で種々の染色で用いられ、マルチパラメーター分析のために相補的染料組合せを可能にする。
表２は、血清枯渇Jurkat細胞で特定のキナーゼ活性を誘発及び阻害するために用いた試薬を示している（Jurkat細胞は文献３、２０−３２に記載されている）。24時間の血清枯渇はバックグラウンドのリン酸化を顕著に減少させた。表示された濃度以外の濃度は適切な場所に示されている（処理プロトコルのための方法の項を参照されたい）。
【００８８】
【表２】
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【００８９】
参考文献
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【００９０】
2005517174.tif 000005
【００９１】
2005517174.tif 000006
【００９２】
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【００９３】
実施例２：ＬＦＡ−１はＴ細胞の活性化及びエフェクター細胞のサイトカイン産生のＴＨ１プロフィールへの偏向に機能的に寄与する
本実施例では、本発明の方法及び組成物を用いて、本発明者ら（本明細書ではまた“我々”と称する）は、ＬＦＡ１のＩＣＡＭ−２による刺激は、免疫表現型、リンタンパク質シグナリング、サイトカイン産生及び転写活性の同時多次元（33パラメーター）評価によって判定したとき、ＣＤ３／ＣＤ28の共働刺激の存在下でヒト未感作Ｔ細胞（ＣＤ３+ＣＤ４+ＣＤ８-ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ２８+ＣＤ２７+ＣＤ１１ａdim）の活性化に機能的に寄与することを示す。可溶性ＩＣＡＭ−２（ｓＩＣＡＭ−２）は、ＬＦＡ−１との相互作用時に、リン酸化及びＬＦＡ−１結合タンパク質（サイトヘシン−１及びＪＡＢ１、前記はp44/42 MAPK経路の活性化及びcJunの活性化をそれぞれ誘発する）を開始した。ｓＩＣＡＭ−２は、ＣＤ３／ＣＤ28刺激と一緒にしたとき、多数の活性キナーゼ（p44/42、p38、JNK MAPK、lck、AKT、PLCg）の急速なカイネティクスを強化し、活性化マーカー、ＣＤ25及びＣＤ69によって決定したときＣＤ３／ＣＤ28刺激の閾値を10000倍低下させた。ＣＤ３／ＣＤ28／ＬＦＡ−1シグナルの統合は、ＮＦ−ｋＢ、Ｃｒｅｂ、Ａｔｆ２、ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｒｅｌの核内分布の増加をもたらす。これらの条件は、ＩＬ−２発現、ＮＦＡＴ、ＮＦ−ｋＢ及びＡＰ−１活性、並びに細胞周期の進行によって測定したときＴ細胞活性化を最適化させた。更にまた、ＣＤ３／ＣＤ28／ＬＦＡ−1の三重刺激は未感作ヒトＴ細胞をＴＨ１表現型に偏向させ、ＣＤ３／ＣＤ28刺激はＴＨ２表現型を優先させた。これらの結果は、ＩＣＡＭ−２とＬＦＡ−１との相互作用は、Ｔ細胞の活性化及び分化に機能的に寄与することができることを示している。
特に、本実施例は、本発明の方法及び組成物による多染フローサイトメトリーは、多数の細胞内キナーゼ活性の同時測定により特定のリンパ球サブセットの迅速な特定を可能にすることを示している。本アプローチは、単一細胞レベルで固有の細胞プロセス（例えばＴ細胞活性化）に関して機能的なシグナリングの情報を提供する。
【００９４】
序文
Ｔ細胞活性化は、抗原レセプター（TCR-CD3）シグナルと共働刺激シグナル（例えばB7／CD28）との統合を含む多段プロセスである（Croft and Dubey, 1997）。抗原特異的TCR-CD3複合体と抗原提示細胞（APC）上の被認識ペプチド−MHC複合体との嵌合がin vivoのＴ細胞活性化に必要である。Ｔ細胞共働刺激表面分子CD28、CD2（LFA-2）及びそれらのAPCカウンターレセプターB7（CD80-86）、CD58（LFA-3）はＴ細胞の活性化を開始させる（Bjorndahl et al. 1989; Cefai et al., 1996; Cerdan et al. 1992; Chambers and Allison, 1999; Lenschow et al. 1996）。Ｔ細胞とAPCとの間の粘着は免疫学的シナプスの形成に必要であり、Ｔ細胞表面分子LFA-1（CD11a/CD18）（de Fougerolls et al. 1991; Dustin et al.1989; Koopman et al. 1992）及び細胞内粘着分子リガンド（ICAM）によって仲介される。
TCR-CD3及びCD28連結に必要なシグナルに関する利用可能なデータが大量に存在するのとは対照的に、Ｔ細胞とAPCとの接触に必要な粘着仲介事象によって生じる特異的なシグナルについては少ししか判明していない。しかしながら、最適なＴ細胞の増殖及びIL-2産生の強化が、Ｔ細胞上の共働刺激レセプターとそれらのAPC上のカウンターリガンドとの間の粘着性相互作用から生じる、TCR-CD3及びCD28以外の刺激を要求するということを示す証拠が存在する（Fine and Kruisbeek, 1991; Salomon and Bluestone, 1998; Simmons, 1995; Starling et al. 1995; Zhang et al. 1997）。Ｔ細胞の活性化を調べるために用いられた昆虫及び線維芽細胞モデル系は、10000倍以上の抗原濃度の増加は未感作CD4+のＴ細胞の増殖又はICAM／LFA-1相互作用の非存在下でのサイトカイン合成を開始させることができないことを明らかにした（Abraham et al. 1999; Ragazzo et al. 2001）。更にまた、ICAM-1／LFA-1相互作用はTCRζ鎖の過剰リン酸化p23形の出現を促進させることがまた観察された（Ragazzo et al. 2001）。これらの観察及び他の観察（TCR-CD3との共同連結で、LFA-1／ICAM相互作用は持続的細胞内カルシウム反応をもたらし、イノシトールリン脂質加水分解を増加させることができる（van Seventer 1982; Wulfing 1998; Rovere 1996））にもかかわらず、LFA-1仲介“共働刺激”シグナルに対する特異的な機能的帰結は完全には理解されていない。更にまた、これら後者の研究は、LFA-1／ICAM相互作用は単により長いTCR嵌合を可能にするという主張を軽視し、むしろLFA-1／ICAM相互作用は単独で重要なシグナリング事象を開始させる能力をもつということを我々に示唆した。
【００９５】
細胞内リンタンパク質を染色する方法の開発によって、我々は多数の活性キナーゼを単一細胞で13次元まで同時にモニターすることが可能になった（Perez and Nolan, 2002）。これを表面の免疫型決定、転写因子の核内プロファイリング及びサイトカインビーズアレイと一緒に利用して、我々は、ヒトの未感作Ｔ細胞（CD3+CD4+CD8-CD62L+CD45RA+CD11adimCD27+CD28+）がCD3／CD28／LFA-1刺激に際して最適に活性化されることを観察した。LFAによる共働刺激はCD3／CD28共働刺激に対して10000倍高い感受性をもたらした。この観察のメカニズムの性状の解明で、我々は、サイトヘシン−１及びLFA-1相互作用タンパク質は、LFA-1刺激に際して放出及びリン酸化され、更に下流のいくつかの転写調節因子の活性化と相関してp44/42 MAPK経路の活性化を仲介することを示す。連関して、JAB1（また別の相互作用LFA-1タンパク質）はLFA-1刺激に際して同様に放出及びリン酸化され、JNK活性の非存在下でc-Junリン酸化をもたらす。CD3、CD28及びLFA-1から始まるシグナリング経路の統合は、NFAT、NF-κB、及びAP-1活性、細胞周期の開始並びにIL-2、CD25及びCD69の発現を強化する多数の経路（MAPK、PKC、Srcキナーゼ及び巣状粘着キナーゼ）の活性化を集中させて仲介機能を果たす。更にまた、CD3／CD28／LFA-1刺激は、CD3／CD28刺激で観察されるTH2表現型と比較したとき、Ｔ細胞分化をTH1表現型に偏向させた。従って、付加的LFA-1シグナルは、Ｔ細胞活性化及びエフェクター細胞分化の両方に機能的に寄与する。
【００９６】
結果
ICAM-2／LFA-1相互作用はJAB1及びサイトヘシン−１の放出及びリン酸化を誘発する
一連のキナーゼプロファイリングの実験で、我々は、膜−ICAM-2の可溶化型（sICAM-2、材料と方法の項参照）はLFA-1の活性化を介してp44/42 MAPKの活性化を誘発することを観察した（Perez and Nolan, 原稿は提示、添付のコピーを参照されたい）（前記の活性化はCD3及びCD28刺激とはカイネティクスが異なっている（データは示されていない））。更にまた、JNK活性の非存在下でLFA-1刺激はc-Junリン酸化を誘発することが観察された（データは示されていない）。従って、我々は、ヒト未感作CD4+Ｔ細胞でICAM-2誘発シグナリングの機能的な相違を調べることにした。
LFA-1刺激はc-Junのリン酸化及び核内移動（CD3／CD28刺激に関する付加的作用）を誘発した（図６Ａ）。特異的な化学的阻害剤SP600125（Bennett et al. 2001）によるJNKの阻害は、単一細胞分析で調べたときsICAM誘発c-Junリン酸化を停止させなかった（図６Ｂ上段）。最近になって、JAB1は、JNK活性の非存在下でc-Junのリン酸化を仲介するLFA-1結合タンパク質として特定された（Bianchi et al. 2000）。α−JAB1抗体（材料と方法の項参照）の細胞内デリバリーはLFA-1誘発c-Junリン酸化を停止させた（図６Ｂ、下段）。Ｔ細胞内のサイトヘシン−１及びJAB-1の両者は、LFA-1刺激に際して膜から移動することが可視化によって明らかになった（図６Ｃ）。人工的に抗JAB1をロードした細胞は刺激の非存在下で膜から移動したJAB1を示し、更にサイトヘシン−１の分布には変化がないことを示した（図６Ｃ）。従って、LFA-1からJAB1の抗体の分裂はLFA-1誘発c-Junリン酸化を阻害し、レセプター−リガンド相互作用が、JAB1を介するc-Junへのレセプターシグナリングに必要であることを示唆した。
【００９７】
我々は、サイトヘシン−１及び／又はJAB1に対する修飾がLFA-1刺激時に生じるか否かを調べた。LFA-1刺激はサイトヘシン−１のスレオニンリン酸化及びJAB1のセリンリン酸化を誘発することが観察された（前記はCD3刺激後には観察されなかった作用である）（図６Ｄ）。我々は、JAB-1又はサイトヘシン−１が先に観察されたように（添付の原稿を参照されたい）LFA-1誘発p44/42 MAPK活性に反応性を有するか否かを、抗体及び／又はそれぞれのタンパク質のシグナリングを機能的に調節するペプチドの細胞内デリバリーを用いることによって調べた。そのＣ末端に対するα−サイトヘシン１抗体の細胞内デリバリーは、LFA-1誘発p44/42 MAPK活性（サイトヘシン−１のＣ末端に一致するペプチドの細胞内デリバリーと共有される特性）を阻害した（図６Ｅ）。α−JAB1又はＩｇＧコントロールの細胞内デリバリーはいずれもLFA-1誘発p44/42 MAPK活性化に影響を与えなかった（図６Ｅ）。対照的に、抗体の細胞内デリバリーは、サイトヘシン−１のＮ末端誘発p44/42 MAPK活性化を誘導した（図６Ｅ）。これらの結果は、サイトヘシン−１のＮ末端はLFA-1と直接相互作用するドメインを含むという観察と合致する（Geiger et al. 2000; Kolanus et al. 1996）。従って、LFA-1からサイトヘシン−１の解離（ここではＮ末端に対する抗体によって誘発された）は、in vivoでのLFA-1／サイトヘシン相互作用の切り離しを生じ、その結果としてp44/42 MAPKを活性化させた。JAB-1に対する抗体の細胞内デリバリーはJAB1結合及びcJunリン酸化に干渉することができ、一方、サイトヘシン−１の対応するＣ末端配列の細胞内デリバリーはLFA-1誘発p44/42 MAPK活性を阻害した。従って、抗体の細胞内デリバリーはタンパク質機能を機能的に調節することができ、別個のシグナリング経路をサイトヘシン−１及びJAB-1（刺激時に固定される２つのLFA-1相互作用タンパク質）と結びつけて考えることが提唱される。
【００９８】
CD3、CD28及びLFA-1シグナリングの統合はCD3／CD28共働刺激によって誘発されるシグナリングを無用にする
我々は、CD3、CD28及びLFA-1刺激に対する多数の活性キナーゼのカイネティクス分析をフローサイトメトリーによって実施した（補充の図６を参照されたい）。活性化速度は調べた個々の刺激について変動する（データは示されていない）ので、我々は、リンタンパク質による分析でCD3／CD28対CD3／CD28／LFA-1の組合せを調べることにした。我々は、精製ヒト未感作CD4Ｔ細胞でCD3／CD28対CD3／CD28／LFA-1刺激によって誘発されるシグナリングタンパク質の別個の分析のために96のリン及び非リン特異的抗体の組合せをスポットすることによりリンタンパク質アレイを開発した（図７Ａ）。初代未感作Ｔ細胞の濃縮は、CD8、CD19、CD16、CD14、HLA-DR及びCD44マーカーを用いてそれぞれ細胞毒性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ及び活性化Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣから除去し磁気活性化細胞分類により実施した。細胞を溶解させた後、等量のタンパク質溶解物をアレキサ532又はアレキサ680で標識し、サンプルをアレイに同時ハイブリダイズさせた。両染料の蛍光強度を蛍光プレート読取装置で読み取り、ログ比をコンピューターで算出し検査した刺激間で識別されるシグナルを得た。両チャンネルの蛍光強度をＸＹ座標グリッドに表した（図７Ａ）。リン酸化における倍数(fold)誘発（ログ比から決定）をカラーコード化して倍数変化を表し（赤の０倍数誘発から緑の５倍数誘発まで）、CD3／CD28及びCD3／CD28／LFA-1刺激について得られた蛍光強度座標図上で表した（図７Ａ）。分析によって２−５倍のリン誘発がとりわけ以下のキナーゼにで特定された：MAPKキナーゼ（p44/42、p38、JNK、raf、mek1/2、mek3/6、rsk、raf）、src関連キナーゼ（src、pyk2）及びインテグリンシグナリングキナーゼ（FAK）（図７Ａ）。これらのキナーゼに対する非リンタンパク質（p44/42 MAPK、p38 MAPK、JNK、mek1/2、mek3/6、rsk、raf、sac、pyk、fak）の内部リファレンスコントロールは0.8から1.5倍の範囲で誘発を示し、検査した終点では顕著な変化は期待されなかった（データは示されていない）。構造タンパク質（アクチニン、アクチン、チューブリン）に対する抗体を用いて、同等量のタンパク質量を確認した（データは示されていない）。これらの結果は、CD3／CD28／FLA-1の三重刺激は、CD3／CD28刺激よりも極めて強く多数のタンパク質（キナーゼ及び転写因子）の全体的なリン酸化を誘発することを示した。
【００９９】
Ｔ細胞活性化は細胞周期の開始及びそれに続く細胞増殖を必要とし、前記はシグナルトランスダクション経路によって誘発される細胞活性の重要な下流での所産である。細胞の増殖及び同時に発生する細胞周期の開始は、ＤＮＡ含有量及びKi-67増殖抗原のためのフローサイトメトリー染色によって測定した。図７Ｃは、＞2n ＤＮＡ含有量及び各抗原Ki-67の発現によって認められるように、CD3／CD28／LFA-1刺激の12時間後に細胞周期が開始することを示している。増殖に附随する抗原Ki-67及びＤＮＡ含有量によって種々の細胞周期相にある細胞が定量化される（Endl et al. 2001）。図７Ｃに示したように、CD3／CD28／LFA-1刺激は、CD3／CD28刺激よりもはるかに高いパーセンテージの細胞をＳ期及びＧ２／Ｍ期に誘導する。従って、より強い細胞周期の開始がCD3／CD28で刺激された細胞よりもCD3／CD28／LFA-1刺激細胞で観察される。
【０１００】
単一細胞での免疫表現型、細胞内シグナリング及び細胞機能の同時評価
我々は、CD3／CD28共働刺激と連係して未感作Ｔ細胞活性化のために惹起されるLFA-1シグナリングの寄与を決定することに興味をもった。下記で明示するように、我々は、磁気活性化細胞分類、13−次元マルチパラメーターフローサイトメトリー（表面免疫表現型決定、活性キナーゼ及びサイトカインの細胞内産生）を分泌サイトカインのプロファイリング（サイトメトリービーズアレイ）及び核内分布転写因子のプロファイリングとともに多重化して、Ｔ細胞活性化及びエフェクター細胞機能の多次元評価を達成した。図８は、機能分析のために多重化した種々の技術の工程図を示している。これらのデータセットは細胞表面レセプターの活性化、細胞内シグナリング及び機能的所産の相関性を知るために相互に参照した。
【０１０１】
初代未感作Ｔ細胞の濃縮は、CD8、CD19、CD16、CD14、HLA-DR及びCD44マーカーを用いてそれぞれ細胞毒性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ及び活性化Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣから除去し磁気活性化細胞分類により実施した（図８）。我々は以下の８つのマーカーを利用して未感作ヒトＴ細胞を特定した：CD3+CD4+CD8-CD45RA+CD62L+CD11adimCD27+CD28+。CD3、CD28及びLFA-1単独及び合同刺激を濃縮非活性化Ｔ細胞で実施した。成熟未感作Ｔ細胞（８つの免疫表現型マーカーで決定）をCD69、CD25及びIL-2発現について13−次元フローサイトメトリーによって同時に分析した（前記のマーカーの発現は活性化Ｔ細胞に限定されるため（Yu et al. 2000; Zola, 2000））。フローサイトメトリーカイネティクス実験は、個々の刺激について調べたとき、シグナリング経路は刺激後0.5−４時間以内にピークに達し更に正常に戻り、更にそれらは調べた各ホスホキナーゼに対して固有であることを特定した（データは示されていない）。我々は、サンプルを刺激後８、12及び24時間で分析し、刺激細胞のリンレベルを調べた。刺激後８時間で、CD3単独刺激はわずかなCD69の活性化及び低レベルのホスホ−p44/42をもたらした（図８、パネルＩ）。CD3／CD28共働刺激はより多くのCD69活性化を誘発したが、ホスホ−p42/44 MAPKのレベルは基線レベルに戻った（図８、パネルII）。しかしながら、未感作Ｔ細胞（CD3+CD4+CD8-CD45RA+CD62L+CD11adimCD27+CD28+）の最適活性化はLAF-1の存在下でCD3／CD28刺激８時間で観察された（図８、パネルIII）。SICAMはいくらかのホスホ−p44/42誘発及び中間体CD69誘発をもたらし、一方、CD28単独刺激はいずれのマーカーの発現も誘発することができなかった（データは示されていない、補充の図７Ａを参照されたい）。この時点で、CD25及びIL-2発現はCD3／CD28刺激について観察されたが、そのレベルはCD3／CD28／LFA-1刺激細胞できわめて高かった（図８、パネルIII）。従って、これらの結果はシグナリングの閾値はCD3、CD28及びLFA-1のための３つの表面仲介シグナル統合の結果であることを示唆した。
【０１０２】
我々は、フローサイトメトリーによってIL-2細胞内誘発並びにCD25及びCD69表面発現を測定して、刺激誘発Ｔ細胞活性化について滴定及びカイネティクス分析を実施した。細胞内IL-2検出の平均蛍光強度（MFI）をコンピュータで処理してMFIstimulated対MFIunstimulatedのログ比を計算し、用いた刺激物質に対する滴定の濃度の関数として図表に表した（一緒にした刺激物質に対する単一及び多様な比の両方について）（図９）。相違を図表に表すために数値範囲に色の濃度勾配を用いた（図９）。６時間刺激で、LFA-1及びCD3／CD28刺激の滴定は細胞内IL-2の産生を増加させ、IL-2産生のための閾値を１：１：１の比のCD3／CD28／LFA-1刺激の0.1μg/mLで示した（図９Ａ、右パネル）。同様なレベルのCD3及びCD28の滴定は、より低レベルの細胞内IL-2検出を示した（図９Ａ、左パネル）。CD3／CD28／LFA-1の0.1μg/ｍLより高いレベルは、IL-2産生のそれに対して刺激濃度で直線反応を示した（図９Ａ）。10μg/ｍLの高さのCD3／CD28の誘発物質レベルでは、CD3／CD28／LFA-1刺激６時間で同じレベルの細胞内IL-2は産生されなかった（図９Ａ）。CD3／CD28／LFA-1の組合せでCD3又はCD28のいずれかの割合を10000倍まで変化させたとき、細胞内IL-2レベルの増加は得られなかった（データは示されていない）。従って、比率測定による滴定分析は、LFA-1シグナルの寄与はCD3又はCD28刺激の増加によって代償できないことを示している。
【０１０３】
６時間刺激では、CD3／CD28共働刺激の場合よりも10000倍低いCD3／CD28／LFA-1刺激がCD69及びCD25の同様な発現に必要であった（図９Ｂ）。CD3／CD28／LFA-1刺激の６時間後に、我々は検出可能な分泌IL-2を観察し、これはCD3／CD28仲介IL-2分泌では最初の検出に12時間を要することと対照的であった（データは示されていない）。刺激後12時間では、CD3／CD28／LFA-1刺激後の細胞外IL-2は細胞内IL-2の顕著な産生によってもたらされ、CD69発現の強化と相関性を示した（図９C）。更にまた、CD25発現は、CD3／CD28／LFA-1刺激Ｔ細胞で48時間まで維持され、CD3／CD28刺激細胞集団で観察された減少とは対照的であった（データは示されていない、補充図７Ｂを参照されたい）。従って、LFA-1刺激はIL-2産生の閾値を克服するために正の方向に寄与し、Ｔ細胞がより効果的に更に顕著に延長された寿命で活性化することを可能にする。
【０１０４】
LFA-1を介する刺激は転写因子の核内移動及び活性に寄与する
転写因子の核内位置決定及び活性化プロフィール決定を単一CD3、CD28及びLFA-1刺激の他にCD3／CD28対CD3／CD28?LFA-1刺激で実施した。
ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて、NFAT、NF-κB及びAP-1活性を確認した。CD3／CD28／LFA-1刺激は、CD3又はCD3／CD28刺激よりもより高い倍数のNFAT、NF-κB及びAP-1転写活性を示した（図10Ａ）。転写因子NF-κB p65、NF-κB p50、ｃＦos、CREB、aft2及びcRelに対するコンセンサス配列をスポットした96ウェルのプレートに、刺激した未感作CD4Ｔ細胞の核抽出物を結合させた。結合した転写因子の検出は標準的なELISA技術で実施した。CD3、CD28及びLFA-1の刺激は核内局在転写因子のそれぞれ別個のプロフィールを誘発した（データは示されていない、補充の図８Ａを参照されたい）。CD3／CD28刺激は、ここで調べた全ての転写因子の核内局在を誘発し、CD3／CD28／LFA-1刺激では幾分より高いレベルで検出された（図５Ｂ）。LFA-1刺激の存在は、CD3／CD28刺激に対して核内局在転写因子レベルの強化でわずかな付加を示した。NFAT活性の滴定実験によって、LFA-1シグナリングはCD3／CD28の濃度増加によって代償されないことが確認され（図10Ｃ）、IL-2の発現と一致する結果であった（図９Ａ参照）。従って、LFA-1シグナリングの付加は、CD3及びCD28の共働刺激のシグナリングを統合し、ここで調べた少なくともＴ細胞の転写活性の遺伝子発現を強化する。
【０１０５】
CD3／CD28の存在下でのLFA-1刺激はＴ細胞分化をTH1表現型に偏向させる
我々は、CD3対CD28及びCD3／CD28対LFA-1刺激の両方について滴定実験を実施し、IL-4及びINFγの細胞内産生をモニターした。活性化Ｔ細胞はTH1又はTH2エフェクターＴ細胞のどちらかに分化し、サイトカイン又は付加刺激によって一方の経路に優先的に誘導される（Asnagli and Murphy, 2001; Moser and Murphy, 2000）。エフェクター細胞はそれらのサイトカイン分泌プロフィールによって特定することができる。TH1細胞は高IFNγ及び低IL-4を特徴とし、一方、TH2細胞は高IL4及び低IFNγを特徴とする（Murphy et al. 2000）。IL-4／IFNγの平均蛍光の比をコンピュータで計算したとき、調べた全ての濃度でLFA-1刺激は低IL-4／IFNγ比を優先的にもたらすことが示された（図11）。これはTH1表現型と一致する。LFA-1刺激の非存在下では、CD3及びCD28の滴定は優先的にTH2表現型を示した。
我々はサイトメトリービーズアレイを用いて、24時間刺激後に未感作Ｔ細胞でIFNγ、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5及びTNFαの分泌を調べた。CD3／CD28の組合せは高レベルのIL-4並びに低レベルのIL-5及びIL-10を提供した。これは、CD3／CD28／LFA-1刺激と対照的で、前記刺激は同様なレベルのIFNγを示したが、IL-4レベルは顕著に低かった（図12）。三重刺激は、24時間ではIL-5及びIL-10のレベルの上昇を示し、IL-2のレベルは同様であった（図12）。いずれの刺激もTNFαレベルの上昇は示さず、この作用は単一刺激細胞では観察されなかった（データは示されていない、補充の図８Ｂを参照されたい）。従って、LFA-1による刺激は、CD3／CD28刺激の存在下でＴ細胞分化をTH1表現型に偏向させる。
【０１０６】
考察
提示した実験は、ICAM-2／LFA-1相互作用はCD3／CD28共働刺激に別個のシグナルを提供し、迅速で最適な未感作Ｔ細胞活性化をもたらすことを示した。更にまた、本実験は、この追加刺激は、CD3及びCD28と一緒になって、更に付加的刺激の非存在下でＴ細胞分化をTH1表現型に偏向させることを示した。Ｔ細胞シグナリングは、未感作環境内の多数の付加的シグナル統合すると予想されるが、前記の発見は、ICAM-2LFA-1シグナリングは未感作Ｔ細胞の成熟において表現型出現の重要な決定因子であるというこ
とを強く示唆する。
Ｔ細胞活性化の開始は細胞対細胞接触（白血球機能抗原１（LFA-1）によって仲介される粘着プロセス）を必要とする。Ｔ細胞接触に中心的に関与する粘着事象は、Ｔ細胞機能を強化できる変換シグナルとしてはこれまでほとんど理解されていない。しかしながら、最適なＴ細胞活性化における粘着仲介事象の重要性についての証拠が増しつつある（Neelson et al. 2000; Somersalo et al. 1995; Wulfing et al. 1998）。昆虫又は線維芽細胞のトランスフェクト細胞を用いるＴ細胞刺激モデル系で、ICAM／LFA-1相互作用がＴ細胞増殖に必要であることが報告された（Damle et al. 1992a; Damle et al. 1993; Damle et al. 1992b; Damle et al. 1992c; Deeths and Mescher, 1999）。ICAM-2はLFA-1の活性形を仲介してカルシウムの流入を誘発することができるので（Prez and Nolanの投稿原稿で性状が決定されている。添付の原稿を参照されたい）、我々は、LFA-1、ICAM-2の通常は表面に結合しているリガンドの可溶化型を用いて未感作Ｔ細胞活性化に対するLFA-1の寄与を調べた。我々はここで、２つのLFA-1結合タンパク質（JAB1及びサイトヘシン１）は放出され、続いてICAM-2結合に際してリン酸化されることを報告する。JAB1及びサイトヘシン１への特異的抗体／ペプチドの細胞内デリバリーを利用して、これらLFA-1相互作用タンパク質は刺激に際して別個のシグナリング経路に配置されることが示された。
【０１０７】
サイトヘシン１は、最近PKCδによってin vivoでリン酸化されることが特定されたグアニン交換因子であり（Dierks et al. 2001）、Ｔ細胞株におけるLFA-1仲介白血球粘着を強化する。最近になって、ある研究によってヘルペスウイルス８型のタンパク質カポシンＡがサイトヘシン１の補充によってシグナリングを仲介することができ、更にサイトヘシン１の変異体（グアニンヌクレオチドの交換が不完全）ではp44/42 MAPKの活性化が不完全であることが確認された（Kliche et al. 2001）。興味深いことに、抗体及びサイトヘシン１のＣ末端（SEC7ドメイン）（前記はスレオニンに対するPKCコンセンサス部位を含む）に対して誘導されたペプチドは、p44/42 MAPKへのサイトヘシン１のシグナリングを阻害する。JAB1（また別のLFA-1インテグリン結合タンパク質）は、配列分析によればPKCセリンコンセンサス部位を含み、細胞培養モデルでcJunのリン酸化及びAP-1活性の仲介物質として特定された（Bianchi et al, 2000）。従って、これらの実験は、JAB1及びサイトヘシン１は未感作CD4Ｔ細胞でのLFA-1刺激時のシグナリングに必要であるという前記直接的観察の傍証となる。
【０１０８】
CD3／CD28刺激とともにLFA-1シグナリング事象を多次元分析することにより、Ｔ細胞の活性化は三重刺激において最適であることが示された。弁別的リンタンパク質分析によってLFA-1シグナリングは多くのシグナリング事象のリン酸化を誘発することが示唆された。CD3／CD28の共働刺激に加えてLFA-1により仲介されるこれらシグナリング事象の統合は、NFAT、NF-κB及びAP-1活性の強化によって実証される。LFA-1シグナリングの存在はIL-2、CD25及びCD69発現のための閾値を低下させ（図９参照）、細胞周期の進行を開始させた。更にまた、核内に移動した転写因子のレベルは、CD3／CD28よりもCD3／CD28／LFA-1刺激で高く、多数のキナーゼ連鎖事象の結果であることを示している。しかしながら、他の転写因子（すなわち、cJun、Creb、Rsk、JNK、p44/42及びelk）のリン酸化もまた観察されたので、転写活性の全体的な分析によって、ここで検査されなかった因子に対するシグナルの統合の重要性が看破されることが期待される（図７Ａ参照）。
【０１０９】
LFA-1インテグリンシグナリングの結果には、動的に強化される未感作Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞活性化のための刺激の閾値の低下、及びＴ細胞のTH1表現型への明白な偏向（低IL-4及び高IFNγレベルによって決定される）が含まれる。重要なことには、構成的に活性なLFA-1を発現する細胞株は閾値未満の刺激に反応し（Kaplan et al. 2000; Damle et al. 1993）、LFA-1／ICAM相互作用の抑制はTH2サイトカインの産生を高めることが明らかにされた（Salomon and Bluestone, 1998）。従って、これらの結果は、LFA-1はその粘着性特性の他にＴ細胞活性化において活発な役割を果たすという、ここに提供した証拠と一致する。これらの観察を基にして、LFA-1ノックアウトマウスでは免疫反応が障害されるだけでなく、炎症反応を克服する能力又はTH1反応をクリアランスのために必要とされる感染から回復する能力が不完全であろう。CD18ノックアウトマウス、LFA-1のβ2インテグリンを利用する実験は、実際、遅延型過敏（DHT）炎症モデル（Grabbe et al. 2002）で反応の障害が、末梢免疫反応の誘発不全（Scharffetter-Kochanek et al. 1998）と同様に示される。従って、LFA-1はin vivoのTH1反応のために重要である。
【０１１０】
結論すれば、LFA-1は多数の別個のアッセイによって示されるとおり未感作Ｔ細胞の機能性に顕著に寄与する。きわめて重要なことには、LFA-1はCD3／CD28共働刺激の能力を高めＴ細胞の成熟を可能にする（前記成熟はCD69／CD25発現、IL-2分泌及び細胞周期のＳ＋Ｇ２／Ｍ期への進行によって決定された）。一定の環境下では、前記はまた、TH1サイトカインの発現強化によって測定されるような決定の実行に寄与するように思われる。これらの出来事を下敷きに、我々は前記の結果は多数の転写因子及びキナーゼ（例えばP44/42）（これら遺伝子の発現で役割を果たすことが知られているもの）の刺激と相関性があると考えた。小分子によるLFA-1の阻害はまたネズミの種々の炎症モデルで有効性を示した（ただし、これらの観察に対する分子的メカニズムは不明のままである）。小分子のLFA-1拮抗物質、BIX642はtrans-vivoのＤＴＨモデル（Winquist et al. 2001）でDTH反応を抑制した。最近、経口投与のLFA-1阻害剤（LFA703）は腹膜炎で炎症性反応を抑制した（Weitz-Schmidt et al. 2001）。更にまた白血球粘着不全（LAD）患者（前記疾患では、CD18は変異しているか又は消失している）は重篤で反復性の細菌感染を示し（Hogg et al. 1999; Lipnick et al. 1996）、更にまたLAD罹患小児では緑濃菌感染の危険性が増す（Pollard et al. 2001）（緑濃菌感染は典型的にはTH1反応によって排除される（Fruh et al. 1995; Moser et al. 2002））。従って、LAD患者及びLFA-1ノックアウトマウスの両方で報告された臨床症状は、Ｔ細胞活性化及びエフェクター細胞分化についてここで明らかにしたLFA-1シグナリングの役割の生理学的重要性を実証している。我々の目下の研究によって、我々は、LFA-1シグナリングが重要な免疫細胞調節事象に更に関与しているであろうと予測する。
【０１１１】
材料と方法
免疫学的試薬及び化学試薬
以下のリン抗体（ｐ−Ａｂ）をCell Signaling Technologies（CST）から入手した：p-Raf1(Ser259)、p-MEK1/2(Ser217/221)、p-p44/42 MAPKキナーゼ(Thr202/Tyr204)、p-p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204) mAb、p-Elk-1(Ser383)、p-p38 MAPKキナーゼ(Thr180/Tyr182)、p-cJun(S63)、上記タンパク質に対する非リン特異的抗体もまたCSTから入手した。抗Ki-67mAb（Transduction Laboratories）、全ての表面抗体、サイトカイン抗体及びアイソタイプコントロールはPharMingenから入手した：FITC／PE／PerCp／APC上のCD3、CD4、CD8、CD69、CD25、IL-2、IL-4、IFNγ。アレキサ−フルア染料（350、430、482、532、546、568、594、633、660、680）、カスケードブルー、カスケードイェロー及びＲ−フィコエリスリン（PE）はMolecular Probes（Eugene, Oregon）から購入した。ＦＩＴＣ及びテキサスレッドはPierce（Rockford, Illinois）から購入した。Cy５、Cy 5.5、Cy７はAmersham Life Science（Pittsburgh, Pennsylvania）から入手した。Cy5PE、Cy5.5PE、Cy7PE、Cy5.5APC、Cy7APCのための縦並び共役プロトコルはwww.drmr.com/abconで見つけることができる。CD62L、CD28、CD27、CD45RA、CD11a、CD3、CD4、CD8、IL-2、IL-4、IFNγに対する抗体（PharMigen）は、必要に応じてFITC、PE、Cy5PE、Cy5.5PE、Cy7PE、Cy5.5APC、Cy7APC、カスケードブルー、カスケードイェロー又はアレキサフルア染料と結合させた。蛍光プローブ結合を定量して標識の程度を決定する。染料のスペクトル特性を含むプロトコルはwww.metazoa.com/UPL3419で見つけることができる。一般的に、使用したアレキサ結合物はタンパク質１moleにつき２−12moleの蛍光染料を含んでいた。以下の抗体は種々の販売業者から入手した：CD102-FITC（Research Diagnosis）、抗ウサギIgG（CST）、抗マウス／ウサギアレキサ488／568／633（Molecular Probes）、抗JAB1、抗サイトヘシン−１Ｃ末端サイトヘシン１−ペプチド及び抗マウスIgG HRP（Santa Cruz Biotechnologies）。使用タンパク質試薬及び化学試薬：DMSO、フォーボルミリスチル化アセテート（PMA）イオノマイシン、フィトへマグルチニン、ヨウ化プロピジウム（PI）RNAアーゼ（Sigma）、U0126、PD98059、SB600125（Calbiochem）、抗CD3（OKT3, NA/EN）及び抗CD28 mAb（NA/NE, PharMingen）。ICAM-2-FCはGenzymeから購入した。
【０１１２】
細胞培養及び初代細胞の単離
JurkatＴ細胞は、RPMI 1640、10％ＦＣＳ、１％ＰＳＱで維持した。細胞は５％ＣＯ2／37℃で湿潤なインキュベーターで維持し、リン分析のためには12時間血清を枯渇させた。初代細胞の調製では、単核細胞は健常ドナーの血液（Stanford Blood Bank, Stanford, California）から単離した。ヒト末梢血単球は、全血のフィコール−プラーク密度遠心分離（Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden）及びプラスチック培養皿への粘着によって得た。単離した細胞は完全な培溶液中で維持した。磁気活性化細胞分類によって、ＣＤ16、ＣＤ14、ＣＤ44、HLA-DR、CD9又はＣＤ19ビオチン付加抗体（Dynal, Oslo, Norway）及びストレプトアビジン−磁性ビーズ（Dynal, Oslo, Norway）の組合せを用いて陰性単離によって未感作ＣＤ４Ｔ細胞を濃縮した。
【０１１３】
免疫沈澱及びイムノブロッティング
細胞抽出物は、２Ｘ106細胞（表示のように処理）を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって細胞抽出物を調製した。溶解緩衝液は以下を含む：20ｍMトリス（ｐH7.5）、150ｍMのNaCl、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、１％トリトンX100、2.5ｍMのNa2PO4、１mMβ−グリセロホスフェート、１mMのNa3VO4、１μg/ｍLのロイペプチン、１ｍMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Boehringer Mannheim）。抽出物を14000rpm（５分、４℃）で遠心し、10μg（BCAタンパク質アッセイ（Pierce））を標準的な方法を用いてイムノブロットに付した。免疫沈澱（IP）は、プロテインＡ／G＋アガロースビーズによって予備清澄化を実施し、一次抗体（１時間）、プロテインＡ／Ｇ＋アガロースビーズ（１時間）でインキュベートし、更に溶解緩衝液で４回洗浄した。ブロットは表示の抗体とインキュベートし、ECL（Amersham）で現像した。
【０１１４】
キナーゼアッセイ
キナーゼ活性のアッセイプロトコルはAKT、ｐ38、ｐ44/42、JNKについて同様で、代用した使用試薬はそれぞれのキナーゼアッセイについて記載されている。キナーゼ活性のアッセイに使用した全ての試薬はCell Signaling Technologies（Beverly, Massachusetts）から入手した。キナーゼ活性は、それぞれ固定AKT1G1モノクローナル抗体、固定ホスホ−ｐ38MAPKモノクローナル抗体、固定ホスホ−p44/42モノクローナル抗体、又はｃ-Jun融合タンパク質ビーズを用い細胞からキナーゼAKT、ｐ38、p44/42又はJNKを免疫沈澱させることによって検出した。固定されたキナーゼは、それぞれGSK3融合タンパク質、ATF-2融合タンパク質、Elk-1融合タンパク質又はｃ-Jun融合タンパク質ビーズによるキナーゼアッセイで使用した。２Ｘ106のNIH3T3又は２Ｘ106のJurkat細胞をPBSで２回洗浄し、固定キナーゼ抗体又はビーズ（1：200）とともに４℃で2時間穏やかに揺らしながらインキュベートした。免疫複合体を４回細胞溶解緩衝液で洗浄し、40μLのキナーゼ緩衝液（25ｍMトリス（pH7.5）、５ｍMβ−グリセロホスフェート、２mMのDTT、0.1ｍMのNa3VO4、10ｍMのMgCl2）に30℃で30分再懸濁させた。前記キナーゼ緩衝液は、200μMのATP及び１μgの融合タンパク質を補充されていた（JNK活性アッセイは除く、前記ではATPは活性誘発に十分であった）。キナーゼ反応はSDSサンプル緩衝液で５分間煮沸して停止させ、GSK3、ATF、Elk-1又はcJunのリン酸化状態は、リン特異的抗体、ホスホ−GSK3αβ（ser21/9）、ホスホ−Elk-1ser383）、ホスホ−ATF2（thr71）又はホスホ−cJun（ser63）をそれぞれ用いてイムノブロッティングを実施し、ECL検出（Amersham）を用いて可視化することによって検出した。
【０１１５】
フローサイトメトリー及びＦＡＣＳ分析
細胞内及び細胞外染色はリン染色について記載されたように（Perez and Nolan, 2002）実施した。約１−10Ｘ107個の末梢血単核細胞（非活性化CD4+Ｔ細胞）を磁気活性化細胞分類（陰性単離）によって入手し、刺激条件で表示の時間処理してフローサイトメトリー用に調製した。ブレファルディンＡ（10μM）を細胞内サイトカインの検出のために６時間（又は表示の時間）添加した。アイソタイプコントロールマッチ抗体を染色コントロールのために用いた。カイネティクス分析はシンクロナイズさせた96ウェルで実施し、記載（Perez and Nolan, 投稿）に従って直接固定した。四色以下のフローサイトメトリーデータ捕捉はセルクェスト（CELLQuest）ソフトを用いてファックスカリバー（FACSCalibur）マシーン（Beckton Dickinson, San Jose, California）で収集し、フロージョ（FlowJo）ソフト（Tree Star, San Carlos, California）を用いて分析及び表示した。四色以下についてのデータは、106細胞／サンプルを含む３つのそれぞれ別個の実験の典型例で、50000事象を収集し手動で計算した。11色データ捕捉は、モーフロー（MoFlo）エレクトロニクス（Cytomation, Fort Collins, Colorado）に連結した改変ファックスタープラス（FacstarPlus, Becton Dickison, San Jose, California）で収集した。データはファックスデスク（FACSDesk）ソフトで収集し、フロージョソフトを用いて補正、分析及び表示した。11色フローサイトメトリーのためのデータは最小限200000事象を収集した。サイトメトリービーズアレイ（CBA）はPharMingenから得た。細胞内フローサイトメトリー測定の比率は以下の等式（式中、ＭＦＩは平均蛍光強度である）から算出した：Ｌｏｇ［（ＭＦＩexperimental−ＭＦＩisotype mAb）／（ＭＦＩcontrol−ＭＦＩisotypemAb）］。続いて２つの選択した色の濃度を数値で明示して高低を表現し、適切な場合には表示した。
【０１１６】
リンタンパク質アレイ
プロテインＡ被覆96ウェルプレートをリン特異的及び非リン特異的抗体（１μg/mL）で１時間被覆した。プレートを２回PBSで洗浄し、更に製造元（Pierce）の推奨にしたがい抗体をヂスクシミジルコハク酸エステルと共有結合により共役させた。プレートを３回（PBS）洗浄し、４％のBSAでブロックした（PBS中で30分）。刺激したCD4+の未感作Ｔ細胞から得たタンパク質サンプルを定量し、同等量をスクシミジルエステル反応性アレキサ532又は680染料と0.1Ｍの重炭酸ナトリウム（pH8.0）中で結合させた。１時間後反応を停止させ（100μLの１Ｍトリス（pH8.0））、セントリコンYM-10スピンカラムで洗浄した。標識したタンパク質サンプルをPBST（＋１％BSA）に再懸濁した。プレートを30μgのアレキサ532及びアレキサ680結合タンパク質サンプルで１時間、25℃でハイブリダイズさせた。プレートをPBST（PBS、0.1％トウィーン-20）で３回、PBSで３回洗浄した。
蛍光強度をジェミニ（Gemini）Xs（Molecular Devices）マシーンを用いて検出し、誘発倍数をCD3／ＣＤ28／LFA-1とCD3／CD28刺激の平均蛍光強度（MFI）のログ比としてコンピュータで以下の等式から算出した：
Ｌｏｇ[（ＭＦＩCD3/CD28/LFA）／（ＭＦＩCD3/CD28）]
【０１１７】
核内転写因子のプロファイリング
NF-κB p50、NF-κB p65、c-Rel、c-Fos、CREB及びATF2のコンセンサス配列のためにスポットしたマーキュリートランスファクター（Mercury TransFactor）キット（Clontech）を用いて１Ｘ107の刺激CD4＋未感作Ｔ細胞（製造元に推奨に従って調製）の核抽出物由来の転写因子とハイブリダイズさせた。DNA複合体への結合タンパク質の検出は標準的ELISA法によって実施した。
レーザー走査共焦点顕微鏡法
細胞を表示のように処理し、ポリ−Ｌ−リジン（Sigma）被覆滅菌カバースリップ（10mg/mL、30分）に穏やかに遠心することによって粘着させ（1000rpm、10分）、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.4）で２回洗浄し、2.7％のパラホルムアルデヒド（PBS中）で固定した。フローサイトメトリーのために細胞を記載のように染色した（４％FCS中で、0.1mg/mLで一次染色、1：1000希釈で二次染色、間で洗浄工程あり）。染色したカバースリップをガラススライドに長期抗退色試薬（Prolong Antifade reagent, Molecular Probes）を用いてマウントし、ツァイスのレーザー走査共焦点顕微鏡510で可視化した。ツァイスLSM510ソフトを用いて画像を得て、アドーブフォトショップ（Adobe Photoshop）6.0を用いてコンパイルした。
抗体／ペプチドの細胞内デリバリー
スピンダイアリーシス（セントリコンYM-100スピンカラム）によって抗体をPBSに緩衝液交換し、１：20の割合のヒュ−ジーン（Fugene; Roche）中で30分混合した。リポソーム／抗体複合体を血清非含有媒体中で １Ｘ105の細胞と１時間混合した。細胞を２回洗浄し（RPMI／４％FCS）、２−４時間以内に細胞アッセイに用いた。FACS分析によるIgG−FITCのトランスフェクション効率は30−40％であった。
レポーター遺伝子アッセイ
Jurkat細胞に５μgのNF-κB駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子（S. Kinoshita（Stanford University）より贈与）又はAP-1駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子（J.F. Fortin（Stanford University）より贈与）をヒュージーン（Fugene）６試薬（Boehringer Mannheim）を用いてトランスフェクトした。NFAT−ルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞はJ.F. Fortin（Stanford University）より贈与された。トランスフェクション後24時間で細胞を表示のように37℃で６時間刺激した。ルシフェラーゼ活性を１Ｘ104の細胞溶解物（Promega）で分析した。
【０１１８】
参考文献
2005517174.tif 000008
【０１１９】
2005517174.tif 000009
【０１２０】
2005517174.tif 000010
【０１２１】
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【０１２２】
2005517174.tif 000012
【０１２３】
実施例３：ICAM／LFA-1はp44/42 MAPKをPYK2及びSYKを介して活性化する
本実施例では、本発明の方法及び組成物を用いて、本発明者ら（ここではまた“我々”と称する）は、白血球機能抗原１（LFA-1）はICAM-2との嵌合に際してRAS／RAF／MEK／MAPKカスケードを活性化させることが見出されたことを示す。シグナリング経路の詳細な分析によって、RICAM-2／LFA-1相互作用はPYK2及びSYKチロシンキナーゼの両方に依存することが明らかにされた。PYK2及びSYKは両方とも、ICAM-2との相互反応後にのみLFA-1と結合することが見いだされた。生化学的分析及び共焦点顕微鏡検査によって明らかにされたように、それらはPKK2及びSYKの附随するリン酸化とともに迅速に細胞質膜に再配分される。化学的遺伝学的アプローチによって、LFA-1仲介シグナルはPYK2をリン酸化し、続いてシグナルはSYKに中継されるがPCK及びPLCｙ活性を条件とする。更にまた、ICAM-2+細胞とLFA-1+細胞との細胞対細胞接触によって、LFA-1発現細胞でp44/42 MAPK経路のトランスアクチベーションが開始され、同時にAKT細胞生存経路がICAM-2提示細胞で活性化される。前記はマルチパラメーターフローサイトメトリーによって単一細胞キナーゼプロファイリングによって決定された。これらの結果は、固有のトランスシグナリング事象が、ICAM-2及びLFA-1の相互作用によって仲介される細胞粘着事象に際して生じることを強調し、結果として生じるプロセス（例えば細胞粘着とＴ細胞活性化）におけるICAM相互作用の重要性を示唆する。
【０１２４】
序説
白血球の仲介機能は、それら白血球が標的組織上のリガンドの粘着分子認識により適切な組織の小区画に局在することができる能力に大きく左右される。異常な細胞環境への白血球の誘導は、細胞性プロセス、例えば血液凝塊形成（Bowes et al. 1995; Nagaoka et al. 2000; Schleef et al. 2001）、免疫監視（Patarroyo and Makgoba, 1989; Plate et al. 2000）、炎症性反応（Chihara et al. 2000; Cid et al. 2000; Krull et al. 1999; Zhang et al. 1999）、血管形成（Griffoen et al. 1998; Melder et al. 1996; Patey et al. 1996; Radisavljevic et al. 2000; Verkarre et al. 1999）及び細胞遊走（All et al. 2000; Sans et al. 2001）できわめて重要である。白血球の標的への誘導及び粘着は、主として１つから複数のインテグリンサブユニット及びそれらの細胞間粘着分子（ICAM）−１、−２、−３、−４、−５リガンドによって仲介される（Douglas et al. 2000; Kruger et al. 2001; Sixt et al. 2001; Tian et al. 2000; van den Berg et al. 2001; Wang and Springer, 1998）。α及びβインテグリンサブユニットはヘテロダイマー型ICAMレセプター、例えば白血球機能抗原−1（LFA-1、CD11a／CD18又はLβB2）、MAC-1（マクロファージレセプター１、CD11β／CD18又はMβB2）、CD11c／CD18（αXβB2又はp150，95）及び最近特定されたCD11d／CD18（αDβB2）を形成する（Binnerts and van Kooyk, 1999; de Fougerolles et al. 1995; Gahmberg et al. 1998; Hayflick et al. 1998; Hermand et al. 2000）。ICAMは、カドヘリン、インテグリン及びセレクティングを含む粘着分子サブクラスである、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ICAMは細胞のタイプによって異なる分布を示し、このことはそれらの多様な機能を反映していると考えられている。更にまた、ICAMは種々の炎症性サイトカインによって弁別的に誘発される（Hayflick et al. 1998; Simmons, 1995; Somersalo, 1996）。ICAM分子は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、赤血球細胞、マクロファージを含む類リンパ系列で発現され（Hayflick et al. 1998）、更に血管内皮細胞サブセット（Grifffioen et al. 1996）及びニューロン（Tian et al. 2000）でも発現される。
【０１２５】
細胞粘着タンパク質の結合又は増大はどちらも、例えば特に以下のような種々の免疫病態で実証されているとおり有害であり致死的である：白血球粘着不全Ｉ型（LAD I）、アレルギー性脳脊髄炎、腫瘍脈管形成、血管透過性疾患、高血圧、重症敗血症／敗血症ショック、腫瘍転移及び骨粗しょう症（Allende et al. 2000; Angelopoulou et al. 1999; Collins et al. 2000; Etzioni and Tonetti, 2000; Ghaisa et al. 2000; Kiarash et al. 2001; Lalancette et al. 2000; Schnitzler et al. 1999; Tanaka et al. 2000; Weigand et al. 1999）。上記の免疫病態に対するインテグリンの変異又は欠落との相関性を知るために広範囲の研究が白血球細胞表面分子に関して実施されてきたが、ICAMがどの程度これらの疾患の進行に影響するかは明らかではない（Graig et al. 2000）。ICAM仲介細胞対細胞接触（Gottlieb et al. 2000）及び可溶性ICAM分子の不規則な産生が強く示されるメカニズムに中心的に関与するメカニズムの解明は治療的に重要であることを示す証拠が増えつつある（De Vita et al. 1998; Guo et al. 2000; Salmaggi et al. 1999）。ペプチド及びモノクローナル抗体によるLFA-1／ICAM相互作用の遮断は、例えばＴ細胞活性化（Tibbetts et al. 2000）、器官移植拒絶減少及び種々の粘着関連疾患のようなプロセスの抑制で有効であることが証明されつつある（Gottlieb et al. 2000; Storck et al. 1994; Sun et al. 2000）。従って、ICAM分子及びそれらのリガンドは重要な免疫調節物質と認識されつつある。
【０１２６】
我々は、ICAM-2はプロサバイバルシグナルをヒトＢ細胞上のクラスター形成表面に誘引し、FAS及びTNF誘発アポトーシスに対して防御させることを示した。同様に、ICAM-1は細胞内シグナルを細胞外マトリックスに伝達し（Pluskota and D'Souza, 2000）、ICAMレセプター又はICAM分子が欠落しているマウスは機能的な免疫系に異常をもつことが示された（Ding et al. 1999; Gerwin et al. 1999; Igietseme et al. 1999; Schneeberg et al. 200; van Den Engel et al. 2000）。ICAM（１−４）及びLFA-1の結晶学的、分子的及び変異体分析は、オーバーラップしているが同一ではない結合領域が存在することを示唆した（Casasnovas et al. 1998; Casasnovas et al. 1999; Casasnovas et al. 1997; Edwards et al. 1998; Kotovuori et al. 1999 [Hermand, 2000 #145]）。更にまた、ICAM-1はLFA-1との結合にダイマー形成を要求するということ（ICAM-2又は3は要求しない）は、ICAM及びLFA-1を中心とする分子の相互作用の相違を示唆し、別個のICAM分子に対してそれぞれ異なる細胞性反応を可能にするであろう（Casasnovas et al. 1998; Miller et al. 1995; Reilly et al. 1995）。最後に、ICAM結合インテグリンヘテロダイマーレセプターのレパートリー及びその後のシグナリングは十分には調べられていない。
【０１２７】
ヒトICAM-2及び生化学的に精製された可溶性ICAM-2を発現させるためにレトロウイルスにより形質導入した両NIH3T3を利用して、我々は、Ｔ細胞でLFA-1とICAM-2との相互作用はRAS／RAF／MEK／ERK経路（p44/42マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ、MAPK）の活性化を誘発することを明らかにした。LFA-1a（CD11a）又はp2インテグリン（CD18）に対するモノクローナル抗体はp44/42 MAPKの活性化を阻害した。前記シグナルはZAP-70、Src、Fak及びLckに左右されなかった。なぜならば、ICAM-2／LFA-1相互作用の関数としてリン酸化が観察されなかったからである。ICAM-2／LFA-1誘発p44/42 MAPK活性は、プロリン富裕チロシンキナーゼ２（PYK2）及び脾臓チロシンキナーゼ（SYK）（Srcファミリーのノンレセプターチロシンキナーゼのメンバー）に依存し、更にp44/42活性は、特異的な薬理学的阻害剤ピセアタンノール（piceatannol）及びチロフォスチンA9でそれぞれ停止させられた。共焦点顕微鏡法は、LFA-1とICAM-2との嵌合に際して細胞膜上へのPYK2及びSYKの両者の再分布が生じること、及びこの相互作用によってPYK2のリン酸化が生じることを明らかにした。更にまた、PYK2及びSYKはICAM-2との嵌合後にのみ一緒に免疫沈澱され、リガンド誘発構造変化が前記相互作用に必要であることを示している。
【０１２８】
LFA-1対PYK2／SYK活性化に必要な潜在的なキナーゼをスクリーニングするためのホスホ−チロシンタンパク質ELISAの開発によって、PYK2のリン酸化を誘発するLFA-1連結、それに続くPCK及びPLCｙに依存するSYKリン酸化が確認された。ICAM-2結合タンパク質の生化学的精製によって、B2インテグリンだけでなくp1及びp133インテグリンもまたICAM-2と相互作用できることが確認され、このことは、p1又はp3インテグリンサブユニットを含むまた別のヘテロダイマーレセプターがICAMのために存在し、それぞれ異なる細胞性反応がレセプターサブユニット発現レベルで強く調節されることを示した。最近、他のインテグリンヘテロダイマーレセプターがp2インテグリンレセプターの活性に影響を与えることが示され、協調的な細胞粘着は細胞内シグナリング又は調節レベルを補足する可能異性を示した（May et al. 2000）。混合集団実験における細胞内キナーゼ活性の同時測定によって、ICAM-2過剰発現線維芽細胞をLFA-1過剰発現Ｔ細胞と一緒にしたとき、AKT経路の活性化はICAM-2発現細胞で優先的に認められ、一方、p44/42 MAPK（ERK1/2）経路の活性化はLFA-1発現Ｔ細胞で優先的に認められることが示された。ICAM-2／LFA-1相互作用のこのトランス刺激作用は更に別の共働刺激分子に依存しない。なぜならばICAM2−／−線維芽細胞はAKT又はp44/42 MAPKのいずれの活性かももたらさないからである。これらの結果は以前には不明であったLFA-1のシグナリングメカニズムを説明し、細胞粘着及びＴ細胞活性化におけるその役割を示唆する。
【０１２９】
結果
ICAM-2のクラスター形成はRAF／MEK／ERK経路を活性化する
レトロウイルスによって形質転換させたNIH3T3を用いてヒトICAM-2を過剰発現させる以前の実験は、PKB/AKTに依存し、更にその細胞内C末端を介して仲介されるICAM-2誘発シグナリングの詳細な分析を可能にした。前記実験では、モノクローナル抗体による表面発現ICAM-2分子のクラスター形成は、それぞれ異なる別個のRAF／MEK／ERKマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（p44/42 MAPK）の活性化を明示した（前記活性化はP13K阻害剤の存在下で停止しない（データは示されていない））。ICAM-2の細胞外部分はMAPK活性の誘発に十分であった。なぜならば、ICAM-2のＣ末端切断短縮分子（ICAM-AC）及び完全長ICAM-2の両分子が、細胞表面にクラスターを形成したときp44/42 MAPKの活性化を誘発したからである。別の実験で、ICAM2-DC分子は、ICAM-2に特徴的であるPI3K／AKT細胞内シグナルの変換をもたらすことができなかった。ヒトICAM-2及びICAM2-ACの発現は細胞膜に誘導されることがフローサイトメトリーで証明され（図１３Ａ）、更にウェスタンブロット分析によってJurkat細胞の内因性ICAM-2タンパク質と類似の電気泳動移動度を示すことが確認された（図１３Ｂ）。NIH3T3線維芽細胞はネズミのICAM-3レベルを発現しないが、低レベルのネズミICAM-1及びICAM-2は発現する。しかしながら、レトロウイルスによって強制されるエコトピックなヒトICAM-2の発現は、定量的フローサイトメトリーで測定したとき内因性レベルより５倍高いことが見出された。
【０１３０】
ICAM-2のクラスター形成は、各キナーゼのそれぞれの活性なリン酸化状態についてイムノブロッティングによって調べたとき、NIH3T3細胞でRAF／MEK／ERKカスケード（p44/42 MAPK経路）の活性化を時間の関数として開始させた（図１３Ｃ）。予測したとおり、ERKキナーゼ活性はEIk-1のリン酸化をもたらした。EIk-1リン酸化はその活性化と核内移動のために十分であることが示された（Wang and Prywes, 2000）。ついでにいえば、転写活性をもつ他のp44/42 MAPK活性化タンパク質、すなわちRsk-1（図１３C）及びCREB（データは示されていない）もまたICAM-2のクラスター形成の関数としてリン酸化された。P44/42 MAPKのICAM-2誘発リン酸化はキナーゼ活性アッセイによって確認され、ICAM-2及びICAM2-AC形質導入線維芽細胞の両方に存在し、更に架橋されたときには内因性ICAM-2によってJurkat細胞にも存在した（図１３Ｄ）。更にまた、JNK、p38 MAPKの活性化、又はMEK3／6又はMEK4／7の活性はICAM-2の架橋の後では観察されなかった（データは示されていない）。細胞内フローサイトメトリーによる切端形ICAM-ACの発現（図１３Ａ参照）及び細胞内シグナル誘発能力の明白な喪失の確認によって、我々は、観察されたp44/42 MAPK活性は表面結合ICAM-2相互作用タンパク質によるものであると考えた（下記で考察）。
【０１３１】
ICAM-2誘発p44/42 MAPK活性は増殖カイネティクスを減弱させ、細胞の接触抑制を増大させる
P44/42 MAPKファミリーは、細胞の増殖、生存及び分化を調節する多様な細胞プロセスで重要である（Chang and Karin, 2000）。いくつかのアッセイを用いて、p44/42 MAPK仲介事象を評価した。細胞周期の分析を実施して、ICAM-2誘発p44/42 MAPK活性が細胞周期の再エントリーを開始できるか否かを調べた。ICAM-2、ICAM2-ΔC、ベクターコントロール及び種々の細胞タイプで血清を72時間枯渇させ、化学物質の非存在下で細胞をシンクロナイズさせた。続いてモノクローナル抗体を用いて細胞をICAM-2に対して架橋し、18時間後に分析した。Ｓ期の細胞のパーセンテージはICAM-2架橋に続いて増加した（図１４Ａ）。細胞周期の再エントリーはICAM-2ACできわめて明瞭であった（ベクターコントロール及びICAM-2細胞と比較して）。細胞周期の再エントリーの継続刺激は、増殖抑制シグナルを覆すために十分で、しばしば接触抑制によって増殖を停止させる能力を失い、癌性細胞の転移拡散を示す細胞事例である。ICAM-2及びICAM2-ACは、ICAM-2のクラスター形成に際してp44/42 MAPK活性を示したので、我々は、p44/42 MAPK経路の構成的活性化は潜在的に増殖カイネティクスを強化し、その結果細胞周期の再エントリーが観察され、前記は接触抑制機構を逃れるために十分であろうと解釈した。これについて、我々は、細胞密度の関数として細胞呼吸をモニターし、誘発された増殖停止の程度を（もし存在するとして）接触抑制により測定することによって調べた。我々は、接触抑制は粘着細胞の増殖抑制を誘発し、従って細胞密度が増加するにつれて細胞呼吸の減少を誘発すると予測した。ベクターコントロール細胞（陰性コントロール）は、Jurkat細胞（接触抑制することができない浮遊細胞）及び293T細胞（接触抑制することができない形質転換線維芽細胞）と比較したとき、高い細胞密度で細胞呼吸の低下を示した（図14Ｂ）。ICAM-2及びICAM2-ΔC発現細胞は両細胞とも高い細胞密度でベクターコントロールよりも高い細胞呼吸を示した（図14Ｂ）。これらの観察にもかかわらず、トップアーガー形質転換アッセイを用いたときICAM-2及びICAM2-ΔC発現細胞は形質転換細胞（接触抑制を喪失した細胞の特性）であるとは認められず、更に、ヌードマウスの皮下に移植したとき腫瘍を形成しなかった（データは示されていない）。前記にもかかわらず、ICAM-2及びICAM2-ΔC発現細胞の両細胞ともベクターコントロール細胞よりも増殖カイネティクスの強化を示した（図14C）。ICAM2-ΔC構築物はp44/42 MAPK活性を誘引し、ベクターコントロールと比較して強力な細胞の再エントリーを開始させることができたので、このことはICAM-2表面相互作用タンパク質はp44/42 MAPKの活性化に必要であることを示唆した。P44/42 MAPK誘発作用は、ICAM-2がC末端細胞骨格相互作用から遊離されたときに強化されるという観察（図14Ａ）は、ICAM表面タンパク質のシグナルトランスダクションの細胞骨格仲介調節に対する潜在的な役割を示している（Heiska et al. 1998; Heiska et al. 1996; van Kooyk et al. 1999）。
【０１３２】
ICAM-2はβインテグリン１，２及び３と相互作用する
ICAM-2の可溶形を用いて、ICAM-2の細胞表面と結合する能力を実証した。完全長のICAM-2をICAM-2形質導入細胞溶解物から免疫的に除き、FITCと結合させた（図15Ａ）。前記ICAM-2−FITCプローブを用いてNIH3T3線維芽細胞、Jurkat細胞及びBaF3プロＢ細胞の表面を染色した（図14Ｂ）。前記は、ICAM-2はこれら細胞上の少なくともその正常なリガンドパートナー、B2インテグリンと結合するであろうという推定に基づいている。細胞のプロテアーゼ（トリプシン）との予備処理によってICAM-2−FITC結合は劇的に低下し、ICAM-2は表面結合タンパク質と結合することが示唆された。ICAM-2−FITCプローブは、NIH3T3線維芽細胞（LFA-1αの発現を欠く細胞株）上でβ2インテグリンに対する抗体と部分的に競合することが見出された（データは示されていない）。ICAM2−FITC結合はエピフルオレセンス蛍光顕微鏡法によって確認され、定量が可能であり、更に競合アッセイで非標識コントロールを抑制した（データは示されていない）。ICAM2−FITC結合は、LFA-1αの発現を欠く前記細胞の他にNIH3T3で抗β2インテグリン抗体により完全には抑制されないので、ICAM-2と結合するまた別の分子がこれら細胞の表面に存在することが示唆された。
【０１３３】
二カラムアフィニティークロマトグラフィーによるアプローチを用いて、ICAM-2と結合することができる表面結合標的分子を調べた。ICAM-2、ICAM2-AC及びベクターコントロール細胞表面タンパク質をビオチン付加し、ICAM-2共役固相でアフィニティークロマトグラフィーに付し、続いてストレプトアビジンアガロース支持体を通過させた。表面で発現され（ビオチン付加）更にICAM-2と結合するタンパク質を特定するためには二カラム系が好ましい。最終的なタンパク質溶出物を、イムノブロッティング技術によるビオチン付加、及びファーウェスタンアプローチでのICAM2−FITCプローブの使用によるICAM-2相互作用について調べた（図15Ａ）。112、95、67キロダルトン（ｋDa）のタンパク質バンドをゲルから溶出させ、MALDI-MSによって配列を決定した。表面タンパク質のビオチン付加は溶出タンパク質（及び生成されたペプチド配列フラグメント）の直接分析と干渉し、前記分子はいくつかの表面結合レセプターに対して相同性を有するRGDドメインを含むことを示唆した。しかしながら、生成されたペプチドフラグメントからは明瞭な単一のタンパク質を特定することはできなかった。従って、我々は、ICAM-2がβ2インテグリンと結合することが示されるならば、インテグリン結合パートナーについて調べることにした。最後の二カラム溶出物のイムノブロッティングによって、β1、β2及びβ3インテグリンは表面発現（ビオチン付加）され、更にICAM-2相互作用性であることが確認された（図15C）。β4、β5及びβ6インテグリンは最後の二カラム溶出物のイムノブロッティングで特定されなかった（データは示されていない）。逆カラム系（すなわちストレプトアビジン−アガロース支持体、続いてICAM-2アフィニティーカラム）を更に実施して、β1、β2及びβ3インテグリン免疫沈澱でのICAM-2イムノブロットは上記の結果を確認した（データは示されていない）。更に別のインテグリン、β4、β5、β6、α5及びα1はICAM-2と一緒に免疫沈澱することが認められなかった（データは示されていない）。更にまた、発現されたICAM-2タンパク質はICAM-2結合固相と相互作用せず、ICAM-2は、少なくともここで用いた非還元条件下ではダイマーを形成する可能性は疑わしくなった（データは示されていない）。
【０１３４】
モノクローナル抗体（ｍAｂ）による遮断実験を用いて、ICAM-2誘発p44/42 MAPK活性化に対するインテグリン結合パートナーの寄与を確認した。ICAM-2のクラスター形成の前にICAM-2、ICAM2-AC及びベクターコントロール細胞をβ1、β2及びβ3インテグリンに対するｍAbで予備処理することによって、β2インテグリンの吸蔵がICAM-2誘発p44/42 MAPK活性を阻害することが示された（図15C）。β1及びβ3に対するｍAｂを用いることによって、p44/42 MAPK活性の部分的阻害及び誘発の両方で観察されるという予期しない結果が観察された（下記考察に記載）。従って、β1及びβ3インテグリンについての抗体遮断実験で観察された相違は、実験の性質が所与のものと仮定するとICAM-2／インテグリン遮断又はインテグリン誘発シグナリングとの間で違いを見出すことはできず、更なる探求は実施されなかった。しかしながら、前記実験はβインテグリンの抗体ブロックはICAM-2誘発p44/42 MAPK活性を停止させるために十分であることは確かに示している。細胞外ドメインを介するICAM-2クラスター形成はp44/42 MAPK活性をICAM-2形質導入細胞集団で誘発し、β2インテグリンモノクローナル抗体によってブロックされたので、ICAM2-AC分子は同じ細胞でβ2インテグリンと相互作用することができると示唆された。従って、これら２つの分子の表面相互作用はβ2インテグリンを介してp44/42 MAPK活性を仲介した。興味深いことに、ICAM2の天然のレセプター、白血球機能抗原−1（LFA-1）は、β2及びαLインテグリン（CD1１a）で構成されたα、βヘテロダイマーレセプターである（Kaplan et al. 2000）。従って、我々は、ICAM-2p44/42 MAPK活性化をJurkatＴ細胞（前記細胞は低レベルのLFA-１レセプターサブユニットを発現する）で生化学的に精製した可溶性ICAM-2タンパク質を用いて調べることにした。Jurkat細胞の可溶性ICAM-2による処理によって、p44/42 MAPKのリン酸化及び活性が誘発され、更に前記はβ2及びαLインテグリンの両方に対するモノクローナル抗体によってブロックされ（図15F）、ICAM-2／LFA-1相互作用はLFA-1発現細胞でp44/42 MAPKの活性化を仲介することができることを示唆している。
【０１３５】
ICAM-2／LFA-1の嵌合はPYK2及びSYKを介してp44/42 MAPK活性を誘発する
LFA-1からRaf（更に続いてp44/42 MAPK）へのシグナル伝達に必要な上流のキナーゼを特定するために、一連のキナーゼ阻害剤のスクリーニングを実施した。チロフォスチンA9及びピセアタンノール（プロリン−チロシンキナーゼ２（PYK2）の特異的阻害剤）及び脾臓−チロシンキナーゼ（SYK）は、それぞれRafのICAM-2誘発活性化更に続いてp44/42 MAPKを停止させた（図16A）（Avdi et al. 2001; Fuortes et al. 1999）。p38 MAPKを含む他のタンパク質キナーゼ及びsrc関連チロシンキナーゼの２つのメンバー、p56Lck及びSrcは、ICAM-2p44/42 MAPK活性をブロックするこれらキナーゼの特異的な薬理学的阻害剤としての能力を欠いていることから関与しないことが判明した。更にまた、Ｔ細胞活性化に必要な免疫沈澱させたチロシンキナーゼ（すなわちLAT及びZAP-70）、並びにインテグリンシグナリングに必要なチロシンキナーゼ、FAK及びSrcのホスホチロシン残基のイムノブロッティングは、ICAM-2／LFA-1仲介シグナルにこれらキナーゼの関与を示さなかった（データは示されていない）。しかしながら、p44/42 MAPKのICAM-2／LFA-1活性化はグアノシン三リン酸に依存し、Rasの関与が暗示された（データは示されていない）。
【０１３６】
p44/42 MAPKの活性化は、ICAM-2とLFA-1が嵌合したときに開始するICAM-2／LFA-1相互作用の関数であることは明らかであった。粘着分子のレセプターは、細胞内シグナリングを発生させるために活性化工程を必要とすることが報告された（前記活性化工程は、通常は、その対応するリガンドに対するレセプターのアビディティー及び／又は親和性の変化、又はヘテロダイマーの結合を含む場合はその形成の変化をもたらす）(van Kooyk et al. 1999)。前記の報告によって我々は、ICAM-2とLFA-1の接触が、その後に続くPYK2又はSYKの結合をSH2／GRB／Ras依存経路を介してp44/42 MAPKにシグナルを伝達させる“活性化状態”を誘発するか否かを調べることを急務とした。我々は処理に続いてp44/42 MAPK経路の最終的な活性化を観察したので、LFA-1の活性化のためにホルバルエステルによる典型的な外因性処理を用いることはできなかった。従って、PYK2及びSYKとLFA-1、β2及びaLインテグリンのサブユニットとの相互作用を可溶性ICAM-2及び種々のＴ細胞活性化刺激の関数として同時免疫沈澱によって調べた。β2及びαLインテグリンのいずれのチロシンリン酸化も調べた刺激のいずれの関数としても観察されなかった（データは示されていない）。β2及びαLインテグリンとの結合は、可溶性ICAM-2との処理後にのみ観察され、非刺激細胞では観察されなかった（図16B）。このことは、LFA-1レセプターの形成は、リガンド誘発によるapサブユニットの補充によって仲介されるリガンド誘発事象によって開始されることを示唆した。LFA-1レセプターの統合は、β2及びαLインテグリン間の相互作用の強化をもたらす可溶性ICAM-2の他に種々のＴ細胞刺激因子による処理によって安定化されることが見出された。
【０１３７】
SYKとαLインテグリンとの相互作用は非刺激状態で存在し、β2インテグリンとの同時結合による刺激状態で減弱した。このことは、ICAM-2によって誘発されるβ2及びαLインテグリンの相互作用はSYKの活性化をもたらすことを示唆した（SYKの活性化はLFA-1のリガンド結合におけるアビディティーの変化を報告した実験によって提唱されたようにLFA-1の形成を進行させる構造的変化から生じるプロセスである）。PYK2はβ2インテグリンとの弱い結合を示し（前記結合はICAM-2刺激に際して強化される相互作用）、更にICAM-2刺激が提供された後でaLと相互作用を示しただけであった（図16B）。刺激の関数としてのPYK2及びSYKとLFA-1との結合の一時的カイネティクスの正確な分子的詳細は解明されていないが、前記のデータは、ICAM-2は、β2及びαLインテグリンの補充によってそのLFA-1レセプターの形成を誘発することができることを示唆しているであろう。我々は、“活性化”LFA-1は、直接的な物理的接触又は結合部位の露出（PYK2又はSYKの結合を順次可能にする）のいずれかによってPYK2及びSYKに伝達される構造的変化を誘発すると仮定する。
【０１３８】
LFA-1のリガンド誘発構造変化が報告されたが（Kotovuori et al. 1999; van Kooyk and Figdor, 2000）、LFA-1と固有の細胞内シグナリングメカニズムとのつながりを欠いている。更にまた、PYK2及びSYKとβ2インテグリンとの結合の相互同時免疫沈澱は、１つ又は２つ以上の刺激の存在下で最大であることが観察された（図16B）。PYK2及びSYK2はともに、LFA-1発現細胞で時間の関数としてICAM-2に反応してリン酸化されることが見出された。PYK2のチロシン残基tyr402（自己リン酸化部位）及びtyr881（SH2結合部位）のリン酸化は、それぞれのリン酸化残基についてイムノブロッティングによって判定したときICAM-2結合LFA-1によって誘発された。これによって、PYK2のリン酸化はICAM-2誘発LFA-1活性化によって仲介されることが確認された（図16C）。
共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて、PYK2及びSYKの細胞分布を調べ、更にJurkat細胞を可溶性ICAM-2で処理した後それらの各々の分布及び／又はリン酸化を調べた。ICAM-2／LFA-1の相互作用に際してPYK2及びSYKの両者の細胞内再分布が、細胞質に拡散したPYK2及び細胞質膜に局在したSYKとして観察された（図17、パネルC及びL）。PYK2のリン酸化は、PYK2に対するリン特異的抗体によりチロシン402で検出されたとおり、ICAM-2刺激が提供された後にのみ細胞質膜で観察された（図17、パネルF及びI）。ICAM-2とLFA-1との相互作用によるPYK2の細胞質膜への補充はPYK2のリン酸化をもたらした（なぜならばPYK2のリン酸化はICAM-2刺激の非存在下では観察されなかったからである）。どの特異的な事象が、リガンドとの相互作用に際してLFA-1へのPYK2又はSYKの補充を仲介するのかは明らかではない。現時点では、我々は、LFA-1へのリガンド誘発構造変化によってPYK2及びSYKとの相互作用のためのタンパク質結合部位が露出されると仮説をたてている。
【０１３９】
ICAM-2／LFA-1相互作用は両方の接触細胞に別個のシグナルを伝達する
LFA-1及びICAM-2は、白血球の細胞粘着で、以下を含む極めて重要なプロセスに関連していた：リンパ球のトラフィッキング（Etienne-Manneville et al. 2000; Sato et al. 2000; Sigal et al. 2000）、Ｔ細胞：抗原提示細胞の接触の安定化（Hwang et al. 2000; Neeson et al. 2000）、転移による拡散（Dosquet et al. 1997; Griffoen et al. 1996; Griffoen et al. 1996; Regidor et al. 1998; Tang and Honn, 1994）及び器官移植拒絶（Rentsch et al. 2000）。ICAM-2／LFA-1相互作用の欠損に附随する疾患の重篤性を考慮して、我々は、ICAM-2及びLFA-1を利用する細胞対細胞接触に際して開始されるシグナリングメカニズムを理解すべきである。前記の考えに従って、我々は、とりわけAKT及びp44/42 MAPKに特異的なキナーゼプローブを開発し、個々の細胞内のキナーゼ活性を同時にモニターした。これらのプローブはリン酸化されたAKTser473及びリン酸化されたp44/42 MAPK（Thr202/Tyr204）をフローサイトメトリーで検出し、更にイムノブロッティング及びキナーゼ活性アッセイによって、これらの残基のリン酸化はそれぞれのキナーゼ活性と相関することが見出された。特異的な細胞タイプのマーカーと一緒になってこれらのプローブは、我々が、不均質な細胞混合実験でサイトメトリーによってシグナリング経路の活性化について調べることを可能にした。
【０１４０】
レトロウイルスにより形質導入することによってNIH3T3細胞を操作してヒトICAM-2を過剰発現させ、JurkatＴ細胞への提示細胞として用いた。NIH3T3は共働刺激分子CD86及びCD80の発現を欠き、更にフローサイトメトリーで判定したとき低レベルのネズミICAM-1及び3を発現する（データは示されていない）。前記作製したICAM-2過剰発現細胞は、定量式フローサイトメトリーで測定したときベクターコントロール細胞と比較して106倍の表面ヒトICAM-2タンパク質を提示する。ICAM-2細胞及びベクターコントロール細胞をJurkatＴ細胞と混合し、Ｔ細胞マーカーCD3及びCD4の表面染色によりフローサイトメトリーのために、更にリン酸化p44/42及びAKTの細胞内検出のために調製した。図18は、CD4及びCD3マーカーによって区別した、ICAM-2（CD3＋CD4−）及びJurkat細胞（CD3+CD4−）の両細胞のFACSグラフを示している。フォワード及びスキャター電圧は経験的に決定し、線維芽細胞の自家蛍光を示す両細胞集団の可視化を可能にした。AKT及びp44/42に対する細胞内キナーゼ活性は異なる細胞集団に起因する２つの識別可能なピークを示し、単一ピークは均質なコントロール集団でのみ観察された（データは示されていない）。AKThigh活性は主にCD3／CD4二重陰性細胞で観察され、一方ERKhigh活性は主としてCD3／CD4二重陽性細胞で観察される。従って、提示細胞と白血球間でのICAM-2／LFA-1相互作用は。それぞれの各細胞でAKT及びp44/42を活性化する。
【０１４１】
考察
ここに示した結果は以下を示している：（１）ICAM-2／LFA-1相互作用はLFA-1発現細胞でp44/42 MAPKカスケードを活性化させ、aL及び02インテグリンの両者に対する抗体によってブロックすることができる、（２）LFA-1はリガンド結合に際してシグナルをPYK2及びSYKに伝達する、（３）ICAM-2／LFA-1嵌合はICAM-2発現細胞でAKTを、LFA-1発現細胞でp44/42を活性化させ、細胞対細胞接触に際して接触細胞をそれぞれ協調的にトランススティミュレートする。
我々は以前に、ICAM-2は線維芽細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞をアポトーシスから保護するPKB／AKT経路を細胞内で活性化することができることを示した。最近、ICAM-1とフィブリノゲンとの相互作用はERK1/2を活性化し、内皮細胞の生存を調節することができることが示された（Pluskota and D'Souza, 2000）。従って、ICAMはLFA-1の嵌合に際してそれらのホスト細胞に固有のシグナルをトランスデュースすることができる。ICAMは免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるので、広範囲の研究がそれらの細胞対細胞接触における粘着性特性及びリンパ球の再循環について集中した（EtienneManneville et al. 2000; Geijtenbeek et al. 2000; Gerwin et al. 1999）。これは部分的には、ICAM及び炎症性サイトカインの存在時のそれらの減少によって示される細胞の固有発現パターンによるものである（McLaughlin et al. 1999; Wolf et al. 2001）。例えば、ICAM-1は低レベルで発現され、更に白血球、内皮細胞、線維芽細胞及び樹状突起細胞上の炎症性サイトカインによってアップレギュレートされる。前記はICAM-2と対照的で、ICAM-2は白血球、内皮細胞及び血小板で構成的に発現され（Staunton et al. 1989; Xu et al. 1996）、更に多くのリンパ球増殖性疾患で過剰に発現される（Eichelmann et al. 1992; Molica et al. 1996）。
【０１４２】
ICAMに属すると考えられる粘着特性には、細胞遊走（Ding et al. 1999; Nagaoka et al. 2000; Somersalo, 1996）、リンパ球トラフィッキング（Devine et al. 1996; Geljtenbeek et al. 2000; Jutila 1992）、Ｔ細胞と抗原提示細胞（APC）との間の相互作用のアヴィディティーの強化（Kotovuori etal., 1999; van Kooyk and Figdor, 2000; vanCompernolle et al. 2001; Wulfing et al., 1998）が含まれ、更にウイルス感染に寄与する（Belle and Rossmann, 1999; Hioe et al. 2001; Nagaoka et al. 2000; Shigeta, 1998）。これら粘着の役割は部分的にはインテグリンに属する役割とオーバーラップする（インテグリンはαβヘテロダイマーのトランスメンブレンタンパク質の別個のスーパーファミリーであり、粘着／遊走及び増殖／分化の細胞プロセスに必須である（Geginat et al. 1999））。インテグリンは、遊走特性に加えて、インテグリン仲介Ｔ細胞同時刺激で（Gaglia et al. 2000; Goldstein et al. 2000）、細胞外マトリックス（ECM）を必要とする相互作用でそれ自体シグナルトランスデューサーとして機能することが今や明瞭になりつつある。19スーパーファミリーのためのシグナルトランスダクションはほとんど不明のままで、関心の大半は、インテグリン、セクレチン、カドヘリンファミリータンパク質を含む他の細胞粘着分子に注がれていた（Braga, 1999; Elangbam et al. 1997; Gonzalez-Amaro and Sanchez-Madrid, 1999）。更にまた、ICAM類、ICAM-1（CD54）、ICAM-2（CD102）、ICAM-3（CD50）の他に、白血球抗原としてそれらのCD番号によってより一般的に知られているインテグリンサブセット、β1（CD29）、β2（CD18）、β3（CD61）、β4（CD104）、α1−6（それぞれCD49a−f）は、これら分子はリンパ球集団において機能的成果を有する特異的なシグナリングの役割をもつかもしれないことを間接的に示唆している。
【０１４３】
LFA-1／ICAM-2相互作用を必要とする下流のシグナリング経路の詳細な分析により、前記はPYK2及びSYKの両者に依存することが見出された。PYK2（CAK-B又はRAFTKとしても知られている）は巣状粘着キナーゼファミリーの第二のメンバーであり、多くのタイプの細胞表面レセプター（インテグリン、サイトカイン、免疫レセプター、ストレス刺激及びPKC活性化を含む）によって活性化される（Avraham et al. 2000; Hauck et al. 2000）。最近になって、PYK2のリン酸化はＢ細胞でのLFA-1／ICAM-1相互作用によって仲介されるホモタイプ粘着に附随し（MaDonald et al. 2000）、更に骨髄系細胞でβ1及びβ3インテグリンによって正の方向に調節されることが暗示された（Litvak et al. 2000; Miura et al. 2000; van Seventer et al. 1998）。β2インテグリンによるPYK2の正の調節は、マクロファージの細胞分散及び遊走に関して（Duong and Rodan, 2000）及び好中球でのアポトーシス誘発に関して（Avdi et al. 2001）報告された。更にまた、PYK2の活性化は好酸球のFcεRIシグナリングでSYKの下流で生じることが記載された（Okazaki et al. 1997）。従って最近、PYK2は粘着仲介事象が細胞内で伝達されるときの重要なシグナリング分子とみなされつつある。
【０１４４】
SYKは、αIIIβ3インサイドアウトシグナリングのシグナル伝達において必須である脾臓の非レセプターチロシンキナーゼであり（Saci et al. 2000）、FcεRIシグナリングで役割を果たし（Jabril-Cuenod et al. 1996）、更にインテグリン仲介シグナリングによってリン酸化される（Miller et al. 1999; Moores et al. 2000）。PYK2及びSYKの両者のリン酸化事象を示す多くの報告が与えられたとすると、これらの事象は、以下のように刺激条件によって分類され、種々の細胞タイプ間で弁別的な結果を示すことができる：（１）Ｂ細胞シグナリングに関してβインテグリンを必要とするシグナリング（Babe et al. 2001; Li et al. 2001）；（２）細胞遊走及び侵入に関してβ2インテグリンを必要とする事象；（３）免疫レセプターCD2及びCD28によって誘発される活性化（Fukai et al. 2000; Tsuchida et al. 1999）。ここで我々は、同時免疫沈澱及び共焦点顕微鏡法の両方法で判定したとき、PYK2及びSYK2は、JurkatＴ細胞でLFA-1とICAM-2とが相互作用するときLFA-1成分、aL及びβ2と結合し、ICAM-2／LFA-1相互作用は細胞質膜でPKY2のリン酸化を仲介することが明らかになったことを報告する。更にまた、我々は、PYK2及びSYK2がともにICAM-2／LFA-1誘発シグナルをRaf（RAF／MEK／ERKカスケードにおける上流のキナーゼ）に伝達する際に必要であることを報告した最初のグループである（前記は特定の薬理学的阻害剤、ピセアタンノール及びトリフォスチンA9をJurkatＴ細胞で使用することによって決定した）。PYK2及びSYK相互作用は、PC12細胞でのGプロテイン結合MAPK活性で（Dikic et al. 1996）、及びHL40細胞の活性化で（Miura et al. 2000）報告され、細胞内プロセスにおけるPYK及びSYK相互作用の観察と一致する。
【０１４５】
RAF／MEK／ERKカスケードの活性化をICAM-2のクラスター形成誘発当たりの時間の関数としてモニターした。P44/42 MAPK活性のβ2及びαLインテグリンに対するモノクローナル抗体による遮断は、ICAM-2誘発活性は部分的に細胞表面上のこれらインテグリンの相互作用によって仲介されることを示した。他のβインテグリン（すなわちβ1及びβ3）に対するモノクローナル抗体処理はベクターコントロール細胞でp44/42 MAPK活性を誘発したので、前記は、用いた線維芽細胞株でのこれら固有のインテグリンによるp44/42 MAPK活性化に対する一般的な役割を提唱することができるであろう（なぜならば前記はJurkat細胞では観察されなかった）。β1及びβ3ｍAｂ処理の結果は、ICAM-2及びICAM2-ΔC発現NIH3T3に対する少なくとも３つの可能な解釈によって説明することができる：（１）部分的ICAM-2／パートナーの抑制；（２）抗体クラスター形成による部分的なインテグリン活性化；（３）１及び２の組合せ。βインテグリン１及び３はＧタンパク質を介してRasと相互作用することが報告され、粘着細胞株におけるp44/42 MAPK活性をもたらす細胞粘着／ECMシグナルトランスダクション経路との関連が示された（Yokosaki et al. 1996; Zhu et al. 1999）。興味深いことには、β1インテグリンは最近p44/42 MAPK活性及びそれに続く細胞周期への再エントリーとの関連が示された（Qiang et al. 2000）。更にまた、細胞外マトリックス付着によって開始されるインテグリンのクラス-形成は、抗体のクラスター形成によって観察されたように固有のシグナルを開始させることができる（Chen et al. 1996; Hotchin and Hall, 1995）。
【０１４６】
優性ネガティブRasを含む実験は、Ｔ細胞レセプターによってひき起こされるICAM-1依存粘着に対する反応でp44/42 MAPKとともにβ2インテグリンの関連を示した（O'Rourke et al. 1998）。ここで我々は、p44/42 MAPK活性はICAM-2とLFA-1との相互作用によるものであることを観察した。ただし両観察は互いに排除しあうものではなく、低親和性をもつICAM-1／LFA-1相互作用が共働刺激条件（細胞対細胞接触プロセスでＴ細胞レセプターを介して得られるような条件）によって強化されるというメカニズムを提唱することができるであろう。P44/42 MAPK活性のICAM-2誘発LFA-1活性化はJurkatＴ細胞で可溶性ICAM-2分子によって確認され、続いてLFA-1レセプターサブユニットに対する抗体によってブロックされた。従って、LFA-1は、そのリガンドICAM-2との結合後にp44/42 MAPKに対するシグナルを開始することができる。ICAK-1及びICAM-3もまたLFA-1と結合するが、更なる実験によってLFA-1誘発シグナルをその全ての同系リガンドの結合に普遍化し、更に他のICAM-2レセプター（例えばDC-SIGN）のためのシグナリング経路を説明することが可能になるであろう。
【０１４７】
別個の細胞集団でキナーゼ活性をモニターする細胞内キナーゼプローブの開発によって、我々は、細胞対細胞接触におけるp44/42 MAPK及びAKTの活性化をそれぞれLFA-1及びICAM-2発現細胞で決定することができた。細胞接触に際して開始するシグナリング事象のこれらの禁止は、参集する細胞タイプの各々で別個であるだけでなく、粘着仲介事象がほとんど不明であった固有のシグナリング事象を伝達する可能性があることを示している。LFA-1／ICAM-2の嵌合におけるp44/42 MAPK及びAKT活性の検出は、粘着分子の分解から生じる可能性がある重大な影響の例証である。これは主としてp44/42 MAPK及びAKTが成長、増殖及び生存経路に必要な中心的な２つのキナーゼであることによる（Chang and Karin, 2001; Datta et al. 1999）。ここに提示した実験は、粘着／標的誘導の役割を厳密に果たすというインテグリンと白血球抗原の標準的な分離に問題を提起し、ICAM-2とLFA-1の遭遇に際して異なるシグナリングメカニズムが両相互作用細胞で開始されることを例証した。in vivoでのICAM仲介粘着の役割を解明することによって、機能的に関連する細胞プロセス、例えばＴ細胞の活性化、血管形成及び転移による拡散におけるそれらの役割について根源的な知識が得られるであろう。
【０１４８】
材料と方法
免疫学的試薬及び化学試薬
以下の抗体をCell Signaling Technologies（CST）から入手した：ホスホ−Raf1(Ser259)ポリクローナル、ホスホ−MEK1/2(Ser217/221)ポリクローナル、ホスホ−p44/42 MAPキナーゼ(Thr202/Tyr204)、ホスホ−p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204) モノクローナル、ホスホ−p90RSK(Ser381)ポリクローナル、ホスホ−Elk-1(Ser383)ポリクローナル、ホスホ−p38 MAPキナーゼ(Thr180/Tyr182)ポリクローナル、固定ホスホ−p44/42(Thr202/Tyr204)モノクローナル、ホスホ−SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)ポリクローナル、ホスホ−DREB(Ser133)ポリクローナル、ホスホ−SEK1/MKK4(Thr261)ポリクローナル、ホスホ−Jun(S63)ポリクローナル、ホスホ−MKK3/MKK6(Ser189/207)ポリクローナル、ホスホ−AKTSer473モノクローナル。上記タンパク質に対する非リン特異的抗体もまたCSTから入手した。以下の抗体はTransduction Laboratoriesから入手した：抗β1モノクローナル、抗β2モノクローナル、抗β3モノクローナル、抗αLモノクローナル、抗α4モノクローナル、抗α5モノクローナル、抗α6モノクローナル、抗LFA-1モノクローナル、抗α5モノクローナル、抗α1モノクローナル、抗α4モノクローナル、抗PYK2、抗SYK、抗CD3。以下の抗体は種々の販売業者から入手した：ICAM-2モノクローナル（IC2/2 Research Diagnostics）、ICAM-2 C末端ポリクローナル（Santa Cruz Biotechnollogies; SCBT）、抗PYK2p402（Biosource）、抗ホスホチロシン−FITC（CST）、CD3-APC（PharMingen）、CD4PerCP（PharMingen）、CD80-PE（PharMingen）、CD86-FITC（PharMingen）、CD54PE（PharMingen）、CD50（PharMingen）、CD102-FITC（Resear Diagnostics）、抗ウサギIgG HRP結合物（CST）、抗マウスIgG HRP結合物（SCBT）、抗マウスIgG FITC結合物（PharMingen）、抗ウサギ-PE結合物（PharMingen）、抗ヤギローダミン結合物（SCBT）、抗マウスアレキサフルア488結合物（Molecular Probes）、抗ウサギアレキサフルア488結合物（Molecular Probes）、抗ウサギアレキサフルア568結合物（Molecular Probes）、抗ラットIgG（PharMingen）。
以下のタンパク質試薬及び化学試薬を用いた：ストレプトアビジン−FITC（SCBT）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）（Pierce）、R-フィコエリスリン（Molecular Probes）、アレキサ488（Molecular Probes）、アレキサフルア546（Molecular Probes）、Elk-1融合タンパク質（CST）、p42MAPキナーゼ（Erk2）（CST）、チロホスチンA9（Calbiochem）、チロホスチン18（Calbiochem）、SB203580（CST）、ハービマイシンA（Sigma）、エモジン（Sigma）、ピセアタンノール（Calbiochem）、ジェニステイン（Sigma）、ホルバルミリスチル化アセテート（PMA）（Sigma）、イオノマイシン（Sigma）、ヨウ化プロピジウム（PI）（Sigma）、RNASE（Sigma）、MTT（Sigma）、ストレプトアビジン−アガロース（SCBT）。
【０１４９】
細胞培養及びｃDNA単離及びレトロウイルスによる形質導入
完全長のICAM2ｃDNAをJurkatのｃDNAで作製したレトロウイルスｃDNAライブラリーから入手し、レトロウイルスPBM-Z-INバックボーンのBamHI／Sal1部位でクローニングした。ICAM2-ACはPCRで生成し、BaMHI／Sal1部位でクローニングした。ICAM-2又はICAM2-ACを含むレトロウイルス構築物を用いて、NIH3T3ネズミ線維芽細胞を形質導入した。NIH3T3は、DMEM、10％DCS、１％PSQ（ダルベッコー改変イーグル培養液、10％ドナー仔牛血清、１％ペニシリンストレプトマイシン（1000単位／mL及び2mMのL-グルタミンPSQ）中で維持した。JurkatＴ細胞は、RPMI-1640、10％FCS、１％PSQで維持した。BaF3プロＢ細胞は、RPMI-1640、10％FCS、１％PSQ、400U/mLのIL-3（Peprotech）中で維持した。HL60骨髄白血病細胞はOpti-Mem1、10％FCS、１％PSQで維持した。293Ｔヒト線維芽細胞は、DMEM、10％FCS、１％PSQで維持した。細胞は５％CO2／37℃加湿インキュベーターで維持した。形質導入細胞は500 １μg/ｍLのG418（Sigma）で維持し、構築物の適切な発現は、表示したようにウェスタンブロット及び完全長のICAM-2及びICAM2-ACの分析によって確認した。ベクターコントロールは表示したようにｐBMN-Z-IN（空ベクター）の形質導入から成る。ｐBMN-Z-INの感染頻度は、３つの別々のウイルス形質導入について48％±10であった。タンパク質発現についてフローサイトメトリーにより日常的にモニターしたとき、持続的なネオマイシン選別は、均質なICAM-2、ICAM2-AC又はコントロールベクター集団を生じた。
【０１５０】
架橋
抗体架橋実験はマウス抗ICAM-2モノクローナル抗体を用いて実施した（前記抗体は10μg/ｍLでＮ末端領域（細胞外ドメイン）（IC2/2 Research Diagnostics）を認識した）。スピン透析（Biorad）を用いて、アジ化物含有抗体（0.01％）の緩衝液をリン酸緩衝食塩水（pH7.4）と交換した。抗マウスIgG（Sigma）を架橋実験のコントロール抗体として用いた。106の表示した細胞の血清を３時間又は４時間それぞれ枯渇させた。細胞をICAM-2（10μg/ｍL）又はマウスIgG（10μg/ｍL）のどちらかと一緒に表示した時間37℃でインキュベートした。時間は、シグナリング経路の大半を減弱させるために血清枯渇後に開始するか、又は表示のとおりであった。細胞抽出物を作製し、免疫沈澱又はイムノブロッティングのどちらかを実施した。
細胞増殖アッセイ
細胞周期の分析は記載のように実施し（http://www.metazoa.com/upl2072）、更にフローサイトメトリーによって分析した。細胞の呼吸は代謝インジケーター染料、３−（４，５−シメチルチアゾチ２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）によって決定した（http://www.metazoa.com/upl2102）（Sigma）。
【０１５１】
アフィニティークロマトグラフィー、ICAM-2−FITCプローブの作製及び表面タンパク質のビオチン付加
ICAM-2、ICAM2-ΔC及びベクターコントロールの表面タンパク質を、製造元の推奨に従ってスルホ−NHS−LC−ビオチン（Pierce）を用いてビオチン付加し、フローサイトメトリー及びウェスタンブロット技術によって確認した（データは示されていない）。製造元の指示に従って、抗ICAM2 Ｃ末端抗体をアフィ−プレップ（Affi-Prep）10固相（Biorad）に結合させることによってICAM-2固相を合成した。抗ICAM-2固相を用いて、レトロウイルスによって形質導入したICAM-2発現NIH3T3細胞からICAM-2を単離し、十分に洗浄し、製造元の推奨に従ってビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（Pierce）で化学的に架橋することによって抗体／タンパク質複合体を安定化させた。低／高pH溶液で交互に洗浄して夾雑タンパク質及び／又は化学物質を除去した。固相をイムノブロット技術によってヒトICAM-2カップリングについてテストした（データは示されていない）。ICAM-2固相はＣ末端（抗体を介して）によって固定ICAM-2分子の方向を揃え、細胞外Ｎ末端が自由に通過物質と相互作用することを可能にした（詳細については材料と方法の項を参照されたい）。
【０１５２】
続いて細胞溶解物をカラムに通し、初めに100、250、500及び１mMのNaCl（トリス、pH6.8）の上昇を用いてグラディエント溶出工程を実施して結合タンパク質を溶出させた。二重カラム系ではICAM-2固相を用い、結合タンパク質を500ｍMのNaCl（トリス、pH6.8）で溶出し、濃縮し（セントリコン３ｋDaカットオフ）、透析膜を用いてPBS（pH7.4）中で一晩透析し（３ｋDaカットオフ）、ストレプトアビジンアガロースによってビオチン付加タンパク質を減耗させた。更なる方法は下記に記載する免疫沈澱プロトコルと同様である。前記方法で残った相互作用タンパク質をSDS-PAGE緩衝液中で還元し、５分間煮沸してSDS-PAGE分析を実施した。出現バンドをゲルから溶出させ、MALDI-MSによってタンパク質の配列決定を実施した。相互作用タンパク質そのものの確認は、イムノブロットで表示したようにモノクローナル抗体を用いて実施した。ICAM-2−FITCの作製は、ICAM-2を免疫的方法で減耗させ、抗体複合物を4.5MのNaCl（トリス、pH6.8）で取り出し、濃縮し透析し、更に製造元の推奨に従ってNHS−フルオレセイン（Pierce）と化学的に結合させた。ICAM-2−FITCプローブは0.1％のアジ化物を含むPBSで保存した、
【０１５３】
フローサイトメトリー
細胞内及び細胞外染色は記載されたように（http://www.metazoa.com/UPL3287）実施した。AKT及びp44/42 MAPK活性のための細胞内プローブは、抗AKTser473モノクローナル抗体又は抗p44/42ホスホ（Thr202/Tyr204）モノクローナル抗体（Cell Signaling Technology）を、それぞれアレキサ568染料又はアレキサフルア488（Molecular Probes）にアレキサフルアタンパク質結合キット（Molecular Probes）を用いて結合させて作製した。リン特異性はウェスタンブロッティング及びFACS分析によって、AKT活性に対しては多様なPI3Kの活性化物質（血小板由来増殖因子）及び阻害剤（LY294002）、並びにp44/42 MAPK活性については上皮増殖因子及びMEK1/2阻害剤U0126（CST）に対して調べた（データは示されていない）。ホスホ−AKTser473アレキサ568及びホスホ−-44/42-アレキサ488による細胞内染色は、刺激したとき及び刺激前に阻害したとき、Jurkat細胞内のAKT活性及びp44/42 MAPK活性を反映した。定量的FACS分析は記載されたように実施した（Davis et al. 1998; Lyer et al. 1998; Lenkei et al. 1998）。
【０１５４】
簡単に記せば、R-フィコエリスリン（PE）（Molecular Probes）をタンパク質架橋キット（Molecular Probes）の製造元の推奨に従って表示の抗体と結合させ、化学量論的適切性を調べ（データは示されていない）、QuantiBRITE-PEビーズ（BD Systems）を用いて定量した。定量的カリブレーション曲線は既知量のPE分子／ビーズを有するQuantiBRITE-PEビーズ（BD Systems）を用いて作製した。直線回帰分析を以下の等式を用いて実施した：log10（PE蛍光）＝勾配*log10（PE分子／ビーズ）＋切片。PEの蛍光はPEチャネルの相乗平均を得ることによって決定される。定量は、PKと直接結合させた抗体についてのみ有効である。飽和量の抗体を用い、更に十分に洗浄することによって全表面抗原の結合が担保される。氷上でのサンプル調製は抗体の内在化を減少させる。未知の細胞集団に対する細胞の表面抗原は、カリブレーション曲線を用いてPEの相乗平均をコンピュータで処理して決定される。定量FACS分析は表面抗原の発現について概算を提供する。抗体の結合価は使用したモノクローナル抗体について調べられていないので、グラフの数字は相対的表面分子数を表し絶対数ではない。フローサイトメトリー分析はBD FACSCaliburマシーンで実施し、FlowJoソフト（Tree Star）を用いて分析した。CellQuestは、定量的フローサイトメトリー及びQuantiBRITE-PEビーズの直線回帰分析のために用いた。フローサイトメトリーのデータは、106細胞／分析サンプルを含む３つのそれぞれ別個の実験の代表的なものである。50000事象を集めるか、又は別に記載したようにカリブライトビーズ（BD systems）を用いて修正した。棒線グラフに示したデータは３通りの実験の平均値（棒線）±SDとして表されている。
【０１５５】
共焦点顕微鏡法
表示のようにJurkat細胞を処理し、ポリ−Ｌ−リジン（Sigma）被覆滅菌カバースリップ（10mg/mL、30分）に穏やかに遠心することによって粘着させ（1000rpm、10分）、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.4）で２回洗浄し、2.7％のパラホルムアルデヒド（PBS中）で固定した。細胞を５分間0.1％のサポニン（PBS中）で透過性にし、PBSで２回洗浄し、４％のウシ血清アルブミン（BSA、PBS中）でブロックし、更に以下のように抗体とインキュベートした：0.1mg/mLで一次染色、１％のBSA中で1：1000希釈で二次染色、その間に数回の洗浄工程を含む）。使用した一次抗体は以下のとおり：抗PYK2モノクローナル、抗SYKポリクローナル、抗PYKptyr402モノクローナル、抗SYKポリクローナル、ホスホ−チロシン−FITC。使用した二次抗体は以下のとおり：抗マウスアレキサ488、抗ウサギアレキサ488、抗ウサギアレキサ568。染色したカバースリップをガラススライドに長期抗退色試薬（Prolong Antifade reagent, Molecular Probes）を用いてマウントし、Molecular Dynamics Multiprobe 2010共焦点レーザー走査顕微鏡で可視化した。画像は、アドーブフォトショップ（Adobe Photoshop）6.0を用いてコンパイルした。
【０１５６】
MAPKキナーゼアッセイ
MAPK活性は、細胞から活性を有するリン酸化p44/42を免疫沈澱させて検出し、更にElｋ-1融合タンパク質（Cell Signaling Technologies; CST）によるキナーゼアッセイで用いた。NIH3T3又はJurkat細胞を固定したホスホ−p44/42モノクローナル抗体（ｍAｂ）（1:200、CST）と４℃で２時間穏やかに揺らしながらインキュベートした。免疫複合体を４回細胞溶解緩衝液で洗浄し、40μLのキナーゼ緩衝液（25mMトリス（pH7.5）、５mMβ−グリセロールホスフェート、２mMのDTT、0.1mMのNa3VO4、10mMのMgCl2）に再懸濁し、200μMのATP及び1μgのElk-1融合タンパク質（CST）を30分30℃で補充した。キナーゼ反応はSDSサンプル緩衝液で停止させ、5分間煮沸した。Elk-1のリン酸化状態は免疫沈澱で検出し、ECL検出（Amersham）を用いて可視化した。イムノブロットは、各々３回繰り返した３つのそれぞれ別個のウイルス形質導入細胞集団の典型例である（ｎ＝９）。MAPK活性は、リン特異的抗体を用いたイムノブロッティングによるMAPKのリン酸化によって実証した。
【０１５７】
免疫沈澱及びイムノブロッティング
細胞抽出物は、２Ｘ106細胞（表示のように処理）を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって調製した。溶解緩衝液は以下を含む：20ｍMトリス（ｐH7.5）、150ｍMのNaCl、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、１％トリトンX100、2.5ｍMのNa2PO4、１mMβ−グリセロールホスフェート、１mMのNa3VO4、１μg/ｍLのロイペプチン、１ｍMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Boehringer Mannheim）。抽出物を14000rpm（５分、４℃）で遠心し、細胞溶解物（BCAタンパク質アッセイ（Pierce）で決定したとき20μg）を、標準的な方法を用いて15％のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、更にPNDFメンブレンに移した。免疫沈澱（IP）は、プロテインＡ／Gプラスアガロースビーズ（Santa Cruz Biotechnologies; SCBT）によって予備清澄化した。IPは、一次抗体（１時間）、プロテインＡ／Ｇプラスアガロースビーズ（１時間）でインキュベートし、更に溶解緩衝液で４回洗浄した。ブロットは表示した抗体でインキュベートし、ECL（Amersham）で現像した。蛍光ブロットは、コダックデジタルイメージステーション440Cステーション上で可視化した。イムノブロットを剥がし、再度（表示のように）プローブで調べた。前記はストリッピング緩衝液（62.5mMトリス（pH6.8）、10％SDS、１％β-メルカプトエタノール）を用い55℃で30分インキュベートし、更に完全なイムノブロットプロトコールを繰り返すことによって実施した。
【０１５８】
参考文献
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７２】
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【０１７３】
実施例４
免疫細胞生存：PKB／AKT経路の細胞内粘着分子−２（ICAM-2）の活性
本実施例では、本発明の方法及び組成物を用い、本発明者ら（ここでは“我々”とも称する）は、機能的遺伝子のスクリーニングでレトロウイルスｃDNAを用いて細胞内粘着分子−２（ICAM-2）（粘着分子のイムノグロブリンファミリーのメンバー）を、種々の細胞タイプにおけるアポトーシスのいくつかの活性物質及び誘発セッティングの強力な阻害剤として特定した。抗アポトーシス作用を、PI3K／AKT経路の活性化に対して調べた。エズリンのICAM-2誘発チロシンリン酸化はPI3キナーゼを膜に補充し、更にホスファチジルイノシトール３，４，５の生成、PDK-1活性、AKTのメンブレントランスロケーション及び活性化、並びにそれに続くAKT標的（BAD、GSK3、FKHR及びAFX）のリン酸化をもたらす。ICAM-2仲介生存機能は、Srcの薬理学的阻害剤（ハービマイシンA）、Rho依存キナーゼの同阻害剤（Y-27632）、ホスホイノシチド消長の同阻害剤（Psi-テクトリゲニン）及びPI3期ナーゼの同阻害剤（ウォルトマンニン及びLY294002）によって停止させられ、AKT及びその下流のエフェクターの活性化は、ICAM-2誘発エズリン活性化によるPI3Kの細胞質膜への補充に依存することを示している。初代CD19+細胞は、ICAM-2のクラスター形成に続くTNFa及びFas仲介アポトーシスから保護され、細胞内AKTキナーゼ活性及びホスファチジルイノシトールレベルを単一細胞の直接フローサイトメトリー測定で検出したとき、AKT活性及びホスファチジルイノシトール３，４，５（PIP3）の上昇を示した。ICAM-2とその天然のレセプター、LFA-1との嵌合は、抗体架橋のそれと同様なAKT活性を誘発した。この細胞生存シグナルは、初代Ｂ細胞のICAM-3によってのみ共有され、ICAM-1、CD43及びCD44とは共有されない。このことは、エズリンの結合又はLFA-1との相互作用は、ICAM-2で観察された細胞生存シグナルの開始のために十分ではないことを示している。これらの結果によって、Ｂ細胞リンパ腫におけるICAM-2の過剰発現及びICAM-2が種々の免疫的シナプスにおいて細胞対細胞接触で細胞内コミュニケーションのシグナルを生じるメカニズムの両方についての説明を提供する可能性がある、新規な生存シグナリング機能はICAM-2によるものと考えられる。
【０１７４】
序説
細胞増殖又はプログラムされた細胞死に細胞を拘束するものは、直近の環境、例えば細胞外マトリックス（ECM）との相互作用、細胞対細胞接触からコミュニケートされるか、又は内分泌因子もしくはパラクリン因子を介したより離れた部位からコミュニケートされる生存及び致死シグナルのバランスである（Ruoslahti and Reed, 1994）。生存経路は、アポトーシスが器官発生の決定に重要な役割を果たす初期発生時に機能すると提唱され（Raff, 1992）、更に免疫系の成熟でも重要である。抗体形成細胞のクローン選別及びメモリーＢ細胞の維持は、細胞生存経路の活性化を必要とする極めて重要なプロセスである。同様に、生存シグナルの欠如はアノイキスの現象で実証され、この場合上皮細胞は、ECM付着がブロックされるときアポトーシスを受ける（Frisch and Ruoslahti, 1997）。ECM生存シグナルはおそらくインテグリンのクラスター形成を介して細胞表面レセプターの活性化によって仲介され、細胞／細胞−マトリックス相互作用の特異性に寄与し、更にECM−インテグリンシグナリングの脱調節は足場非依存性増殖をもたらす（Hulleman and Boonstra, 2001）。細胞死と拮抗することができるか、又は増殖抑制プログラムを覆すことができる分子と類似の分子を類リンパ球で特定することは、リンパ系疾患で間違って進行し、おそらく転移による分散に寄与する細胞の本質的な生存プログラムの理解に極めて重要であろう。
【０１７５】
細胞粘着に必要な分子の機能についての性状決定は、ECM−生存シグナルに寄与するインテグリン及びカドヘリンによってもたらされると考えられるシグナルトランスダクションに集中した（de Fougerolles et al. 2000; Schneller, 2001; Shinohara et al. 2001）。免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーの粘着分子は潜在的なシグナリング分子としてこれまで広く見渡されてきた。ICAM-2（CD102）は細胞表面タンパク質のIgスーパーファミリーのメンバーであり、LFA-1（CD11a/CD18）及びMAC-1（CD11b/CD18）への白血球結合を仲介する（van Kooyk and Figdor, 2000）。組織内の白血球補充に必要な細胞表面粘着メンバーとして、ICAM-2は、Ｔ及びＢリンパ球、単球、血小板及び初期CD34+造血原始細胞を含むほとんどの白血球上に低レベルで発現される（de Fougerolles et al. 1991; Diacovo et al. 1994; Nortamo et al. 1991）。更に、ICAM-2の構成的発現は全ての血管内皮細胞上で観察された（de Fougerolles et al. 1991）。ICAM-2の発現パターンを基に、ICAM-2はリンパ球の再循環、トラフィッキング及び血管外遊出に中心的に関与すると考えられた。ICAM-2欠損マウスは、好酸球のトラフィッキングは炎症反応で増大するということを示すことによってこの考えを支持する（Gerwin et al. 1999）。驚くべきことに、前記の表現型は、ICAM-2が発現される細胞タイプを考慮すると比較的軽度である。ICAM-2が果たす役割は微妙なものであるか、又は他の経路に関して余分であると考えられている。従って、ICAM-2欠損マウスはICAM-2の役割を十分には明らかにしておらず、ICAM-2が機能するメカニズムの更なる性状決定の必要性が正当化される。
【０１７６】
ICAM-2の仮定的な役割とは対照的に、ICAM-2がリンパ腫の内皮細胞及びＢ細胞型慢性リンパ性白血病（B-CLL）患者のCD5+Ｂ細胞の両方で強く発現されるという発見は驚くべきものである（Molica et al. 1996; Renkonen et al. 1992）。リンパ系増殖疾患は必然的に粘着依存性を抑制する（粘着の低下は転移による拡散が生じる主要な手段の１つである）。しかしながら、患者から得られた大きなＢ細胞リンパ腫の最近の遺伝子発現プロファイリングはICAM-2の発現増加を示した（Alizadeh et al. 2000）。ICAM-2は染色体17q23-25にマッピングされるただ1つのICAM（１−５）である（Sansom et al. 1991）。染色体17q23-25は、ゲノムの不安定性に関連するセグメントであり、最近種々の癌において高度な異常を示すセグメントとして特定された（Dion et al. 2000; Dobo et al. 1995; Russell et al. 2000; Sugai et al. 2000）。これらの観察にもかかわらず、リンパ系疾患の症状の進行におけるICAM-2の役割及び分子としての性状決定は強調されなかった。
【０１７７】
我々は、アポトーシスの調節に必要であり、悪性表現型において増大される遺伝子を特定するために遺伝子スクリーニングを考案した。ヒト類リンパ細胞株（Jurkat）レトロウイルスベクターｃDNAを形質導入した細胞を抗アポトーシス表現型についてスクリーニングした。１つのｃDNAが再現可能な抗アポトーシス活性を表現型トランスファーアッセイで示した。このｃDNAは完全長の細胞内粘着分子−２（ICAM-2）をコードした。我々はここで、ICAM-2シグナルの機能的特徴は、その内因性レセプター（白血球機能抗原−１（LFA-1））との連結及び相互作用に際して細胞生存シグナルを仲介する能力であることを示す。ICAM-2はPI3K／AKT経路（Srcチロシンリン酸化及びRho−キナーゼ依存スレオニンリン酸化によるエズリン活性化を条件とする）の活性化によってアポトーシスをブロックするために十分な生存シグナルを仲介する。エズリン活性化は類リンパ細胞の細胞膜にPI3Kを補充し、それによってPI3K／AKT経路の活性化を開始させる。更にまた、細胞内AKT及びPI3K活性をフローサイトメトリーにより測定するためのプローブの開発によって、ヒト末梢血単球（PBMC）でICAM-2のクラスター形成の関数としてキナーゼ活性を同時に測定することが可能になった。マルチパラメーターFACS分析によって、ICAM-2クラスター形成はCD19+の初代ヒト細胞でホスファチジルイノシトール３，4，５の産生及びAKT活性、続いてFas及びTNFa仲介アポトーシスからの保護をもたらすことが確認された。興味深いことには、PI3K／AKT経路の活性化はICAM-3と共有されるが、ICAM-1、CD43、CD44とは共有されず、このことは、エズリンと結合することができるこの19の粘着分子間に分子的相違が存在することを示している（Serrador et al. 1997; Yonemura and Tsukita, 1999）。ICAM-2とその内因性レセプター、LFA-1との結合はAKT活性を誘発することが認められ、ICAM-2／LFA-1相互作用はPI3K／AKT経路を活性化することができることを示している。これらの観察は、細胞生存の仲介におけるICAM-2の二相型の機能的役割を示している。ICAM-2の過剰発現は抗アポトーシスの表現型を付与し、ICAM-2の不適切な発現は、腫瘍の進行及び転移による分散をもたらす、累積的過程における抗アポトーシス表現型に重大な影響を及ぼす可能性を示唆している。前記の発見はまた、細胞対細胞接触時のLFA-1との嵌合に際してSrc／Rho-キナーゼ／エズリン／PI3K／PDK-1／AKT及び下流のエフェクターを含むシグナリング経路におけるICAM-2の新規で明白な役割を強調している（他のICAM-2相互作用（例えばICAM-2／DC-SIGN及びICAM-2／Mac-1）での役割も示唆される）。
【０１７８】
結果
抗アポトーシス機能アッセイでのトロウイルスｃDNAライブラリーのスクリーニング
我々は、アポトーシスシグナリングを変更し、抗アポトーシス分子をコードするｃDNAをスクリーニングするためにレトロウイルスライブラリーによる研究手法を考案した（図19A）。レシピエントの非悪性細胞（線維芽細胞）で悪性細胞タイプ（JurkatＴ細胞白血病）由来のｃDNAを抗アポトーシス機能についてスクリーニングした。アポトーシスは、スタウロスポリン（STP、植物由来キナーゼ阻害アルカロイドであり、ほとんどの細胞タイプでカスケード依存細胞死の強力な誘発物質である）で誘発された。偶発的バックグラウンドを制限し、一方アポトーシス死の程度を最大にする誘発条件を決定した（出発細胞約104個のSTP処理擬似ライブラリーコントロールで最少バックグラウンドは生存細胞1個）。107個のNIH3T3線維芽細胞をJurkat細胞に由来するレトロウイルスｃDNAライブラリーで、組み込み数を細胞当たり１回に制限するために感染頻度40％で感染させた。LacZ-又はBcl2を発現するコントロールのレトロウイルスを調製し、同様な数のNIH3T3細胞に感染させた。アポトーシスは形質導入細胞培養でスタウロスポリン処理によって誘発し、続いて細胞を回復させた（図19A）。生存細胞クローンを増やし、再培養し、スタウロスポリンで再処理した。生存集団で発現されたｃDNAのコンプレキシティーをRT-PCRで評価した。主要ないくつかのバンドが３回選別後に観察された（図19B）。
複製能をもつモロニ−ネズミ白血病ウイルス（MMLV）を前記濃縮細胞集団に適用した。組み込み及びMMLVタンパク質の発現に際して、ライブラリーに由来する定住レトロウイルス構築物が感染性ビリオンに一緒にパッケージされ、未感作標的NIH3T3細胞に移された。続いてスタウロスポリン選別プロセスを再度適用した。このようにして、本物の表現型誘発クローンを１／バックグラウンドの割合で濃縮する（詳細は材料と方法の項を参照されたい）。一緒にプールしたライブラリーのうち３つがPCR後に特異的なバンドの濃縮を示した（図19B、レーン１及び２）。いくつかのバンドはPCRクローニングによってレスキューされ、これらバンドのうち１つの配列を決定して完全長のICAM-2ｃDNAをコードすることが明らかにされた（Staunton et al. 1989）。ICAM-2はそのインテグリンカウンターレセプターであるLFA-1との相互作用を介して白血球の粘着を調節する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（de Fougerolles et al. 1991; Simmons, 1995）。
【０１７９】
ICAM-2は生存シグナルを仲介する
内部リボソームエントリーサイト（IRES）をネオマイシン耐性遺伝子の上流に含むレトロウイルスベクターでICAM-2ｃDNAをクローニングした。NIH3T3線維芽細胞にICAM-2遺伝子を発現することができるレトロウイルスを、適切なコントロールベクター、pBMN-Z-IN（ベクターコントロール）及びpBMN-Z-IN-GFP（GFPベクターコントロール）とともに感染させた。ｐBMN-Z-IN-ICAM-2構築物を感染させたネオマイシン選別NIH3T3線維芽細胞（ICAM-2細胞と称する）での60ｋDのICAM-2の発現は、免疫ブロッティング（図19C）、フローサイトメトリー（図19D3A）及び免疫沈澱（図22A）で確認した。発現されたICAM-2タンパク質はJurkat細胞由来の天然のタンパク質と一緒に泳動した（データは示されていない）。
スタウロスポリン処理は細胞内の因子排除（factor-withdrawal）に類似し（Raff, 1992）、他のキナーゼと較べとりわけPKC、PKA及びPKGをナノモル濃度で阻害することによってアポトーシスを誘発する（Meggio et al. 1995）。NIH3T3細胞におけるICAM-2発現は、アネキシン−V結合アッセイ（図20A）、濃縮核カウント（図20B）及びBrdU TUNELアッセイ（データは示されていない、補充図19A−Bを参照されたい）によって判定したとき、スタウロスポリン処理によって誘発されるアポトーシスの程度を制限し、スクリーニングで表現型によりクローンが選別されたことが確認された。興味深いことには、全てのアポトーシスの形態が過剰発現によって阻害されたわけではなかった。ICAM-2過剰発現JurkatＴ細胞は、スタウリスポリン誘発アポトーシスの阻害とは対照的に、Fasレセプターに対するモノクローナル抗体の一連の濃度範囲でアポトーシスを阻害しなかった（図19E、パネル２−３、下記で詳述する）。
【０１８０】
ICAM-2発現とリンパ増殖性疾患、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ-CLL）との相関性の報告（Molica et al. 1996）によって、我々は、マウスプレＢ細胞株である70Z/3でのICAM-2の抗アポトーシス活性のテストを急いだ。ICAM-2発現は、70Z/3細胞におけるスタウロスポリン誘発アポトーシスを阻害した（図20B）。スタウロスポリンは因子排除に類似することが示されたと仮定して、我々はICAM-2発現が因子依存細胞を因子排除から保護する能力を調べた。IL-3依存プロＢ細胞株のBaF3でのICAM-2の発現は、IL-3枯渇の後アポトーシスの開始を遅らせた（図20B）。更にまた、我々は、抗Fas抗体で処理することにより誘発したアポトーシスからBaF3細胞をレスキューするICAM-2の能力を調べた。ICAM-2は、これらの細胞のFas経路を介してアポトーシスの強力な抑制を示した（図20B）。これらの結果は、Bcl2による形質導入コントロールと同程度であるか又はそれより優れているので、前記の明白な作用はアポトーシス又はレトロウイルス形質導入に対する穏やかな作用によるものとすることはできない（図20B、データは示されていない）。しかしながら、ICAM過剰発現JurkatＴ細胞はFas誘発アポトーシスから保護されなかったが、スタウロスポリン誘発アポトーシスからは保護されたので、ICAM-2の異所性発現のために抗アポトーシス作用には細胞特異性が存在する。最近、高処理プロテオーム（proteome）分析によって、Jurkat細胞ではFas誘発アポトーシスは12の細胞骨格タンパク質の急速な破壊をもたらし、種々のシャペロンタンパク質及び細胞骨格構造タンパク質のリン酸化状態を変化させ、スタウロスポリン誘発アポトーシスよりも更に“アグレッシブ”な細胞死の形態を示すことが確認された（Gerner et al. 2000）。
従って、種々の細胞死誘発物質はJurkat細胞で固有の生理学的特徴を有し、観察された相違が支持される（Johnson et al. 2000）。しかしながら、我々は後でICAM-2の二相性機能についての証拠を提供する。前記証拠では、Jurkat細胞の内因性ICAM-2の連結は、Fas誘発アポトーシスの阻止に十分であり、過剰発現はこの細胞タイプで生存を開始するためには不十分であることを示唆している（下記で説明する）。
【０１８１】
最初のスクリーニングは線維芽細胞で実施し、従って、ICAM-2の抗アポトーシス作用はそのリンパ球特異的インテグリンリガンド、LFA-1（CD11a／CD18）を介して仲介されたとは考えにくい（なぜならば、NIH3T3はLFA-1を発現しない（データは示されていない））。類リンパ細胞でのこの可能性を調べるために、我々は、ICAM-2の細胞外ドメイン欠失（AN）型を調製し、それをBaF3細胞で調べた。細胞質ドメインの発現は完全な抗アポトーシス作用を付与するために十分であった（図20B）。このことは、ICAM-2の細胞質ドメインは、異所性に過剰発現されたとき生存シグナルを提供し、更におそらくレセプター架橋を模倣することによってその作用を表すことを示している。ICAMファミリーの細胞質ドメインを介するシグナリングはほとんど理解されていないので、我々は、ICAM-2がアポトーシス耐性を付与するシグナリング経路を特定することを試みた。ICAM-2の生存機能は膜−細胞骨格リンカータンパク質結合モチーフ上にマッピングされる。ICAM-2は粘着分子と考えられ、リンカータンパク質、a-アクチニン及びエズリン（前記はともにICAM-2の細胞質ドメインと結合する）によってアクチン細胞骨格と互いに連結されることが示された（Heiska et al. 1996; Helamder et al. 1996）。ICAM-2の抗アポトーシスシグナル仲介におけるa-アクチニンの潜在的役割を評価するために、a-アクチニン認識配列をin vitroでa-アクチニンと結合することができないスクランブル配列に変更した（Heiska et al. 1996）。ICAM-2、C末端欠失変異体（ICAM2-AC）及び変異a-アクチニン結合モチーフ含有完全長ICAM-2タンパク質（ICAM2Cスクランブル）をコードするレトロウイルス構築物を用いて、NIH3T3細胞に形質導入した（図20C）。天然のＮ末端をもつICAM-2のみを認識するICAM-2モノクローナル抗体（IC2/2）を用いて、感染細胞をFACSで分類した（de Fougerolles et al. 1991）。前記の方法によって、ICAM-2、ICAM2-AC又はICAM2-C-スクランブルタンパク質は適切に折り畳まれ、細胞質膜の外側面に誘導されることが確認された。エトポシド（また別のNIH3T3細胞の強力なアポトーシス誘発物質）処理及びスタウロスポリン処理の両処理に続いて、ICAM-2変異体発現NIH3T3細胞を生存についてアッセイした。ICAM-2はNIH3T3細胞に強力な長期の生存を付与し、更に、ICAM-2の末端欠失（ICAM2-AC）が細胞で発現されたとき生存シグナルは失われた（図20C）。ICAM-2の細胞質テールのa-アクチニン結合部位の変異もまた、エトポシド又はスタウロスポリン処理に対する防御を提供しなかった。ICAM-2の末端内のモチーフはa-アクチニン結合部位と特定されたが、最近の研究で、細胞質ドメインの陽性荷電アミノ酸クラスターもまたエズリン（エズリン／ラジキシン／モエシン（ERM）細胞質リンカータンパク質ファミリーのメンバー）と相互作用することができることが示された（Yonemura et al. 1998）。a-アクチニン及びエズリンはともに完全長ICAM-2とのみ同時免疫沈澱されるが、a-アクチニンと比較して、エズリン結合タンパク質の量に顕著な相違が観察され（図22A）、これら細胞骨格リンカータンパク質は必要であるが、抗アポローシスシグナルを弁別的に伝達するのであろうという説明が支持される。これら細胞質リンカータンパク質の各々の活性工程を阻止するようにデザインした実験によって、類線維芽細胞と類リンパ球細胞タイプ間の相違、及び抗アポトーシスシグナル伝達のためにa-アクチニン及び／又はエズリンが要求されることの相違が説明された（詳細は下記）。
【０１８２】
ICAM-2はPI3K／AKTキナーゼを介してシグナルを発する
多くの粘着分子を介する生存シグナルはPI3キナーゼを必要とするので（Frisch and Ruoslahti, 1997; Khwaja et al. 1997）、我々は、ICAM-2の抗アポトーシスシグナルでこの経路の役割を調べた。ICAM-2発現BaF3細胞のPI3キナーゼ阻害剤、ウォルトマンニンによる予備処理によってICAM-2仲介アポトーシス作用は阻止され（図21A、左パネル）、ICAM-2生存シグナリングカスケードにおけるPI3キナーゼの関与が示唆された。前記の条件下で、賦形剤処理ICAM-2発現BaF3細胞はスタウロスポリン誘発アポトーシスに耐性を示した。同様に、ICAM-2形質導入NIH3T3のLY294002による処理は、アネキシン−V結合及びBrdU TUNELアッセイによりフローサイトメトリーを用いて判定したときICAM-2の抗アポトーシス作用を停止させた（図21A、データは示されていない、補充図19を参照されたい）。抗アポトーシス作用は、p44/42 MAPKに対する阻害剤（U0126及びPD98059）、p38 MAPKに対する阻害剤（SB203580）、PCKイソ酵素に対する阻害剤（ビスインドリルマレイミドI及び11）、又はPKAに対する阻害剤（H-89）では停止せず、前記シグナルトランスダクション経路におけるこれら酵素の関与を排除した（データは示されていない）。
【０１８３】
我々は共焦点顕微鏡法を利用して、PI3K、AKT、PI3Kのp85調節サブユニット及びエズリンの細胞内分布を可視化した。我々は、PI3K及びAKTの両者がICAM-2細胞の外側辺縁に集中することを観察した（図21B）。エズリン及びp85サブユニットは、ベクターコントロールに比較してICAM-2細胞でより広範囲に一緒に分布することが見出された（図21C）。ICAM-2の過剰発現はPI3K及びAKTの分布を増大させ、それらの対応する活性化に必要な膜での分布が促進された（補充図20A）。a-アクチニン又はエズリンのどちらかが存在しないとき、ICAM-2との直接的なPI3K相互作用は観察されなかったので、α−アクチニン及びエズリンをICAM-2で同時免疫沈澱させ（図22A）、続いてPI3K相互作用について調べた（データは示されていない）。
単一細胞でのホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸（PIP3）及びホスファチジルイノシトール4,5二リン酸（PIP2）検出の開発によって、無傷の細胞内でのPIP3／PIP2レベルを評価し、PI3K及びPI4K／PLCy1キナーゼ活性を示すことが可能になった（Perez and Nolan, 原稿準備中）。ベクターコントロールでのPIP3の非同調的産生に対して、ICAM-2細胞は均一に高レベルのPIP3を提示し、更に血清枯渇及びLY294002とのインキュベーションによって抑制された（図22B）。PIP3の産生は、プレックストリン（pleckstrin）ドメイン含有タンパク質（例えばAKT）の細胞質膜への補充のための二次的メッセンジャーとして機能し、更に他のもの、すなわちホスファチジルイノシトール依存キナーゼ（PDK-1及びPDK-2）を活性化させるために機能する（Blume-Jensen and Hunter, 2000）。ICAM-2細胞でのPIP3の産生は、活性なPI3Kで予測されたようにAKTの分布パターンと対応していた。
【０１８４】
PI3キナーゼは、その下流のエフェクターAKT（PKB）キナーゼを介してアポトーシスを調節することが知られている（Downward, 1998）。AKTキナーゼは、種々のアポトーシス刺激（スタウロスポリンを含む）の下流で強力な抗アポトーシス作用を有する（Marte and Downward, 1997）（データは示されていない）。我々は、ICAM2細胞のPDK-1キナーゼ活性を調べ、ベクターコントロールと比較してPDK-1活性が上昇しているのを見出した（図22C）。この作用はICAM-2細胞で検出されるPIP3のレベルの増加を反映した。なぜならば、PIP3はLY294002とのインキュベーションによって抑制され、更にY27632（Rho-関連タンパク質キナーゼの特異的な薬理学的阻害剤）ではより軽度に抑制されたからである。ICAM-2細胞の細胞質ゾル／膜の分画によって、ベクターコントロールでのAKTの細胞質局在に対してAKTの膜局在が確認され（図22D）、AKT分布の共焦点顕微鏡検査と一致した。ICAM-2発現線維芽細胞はAKT活性化レベルの上昇を示し、これはICAM-AC又は擬似形質導入細胞では認められなかった（図22D）。我々は更に、このICAM-2依存AKTキナーゼ活性の上昇は、STP処理後に維持されることを両キナーゼアッセイによって、更にser473及びthr308の両者のリン酸化の確認によって確かめた（図22E）。AKTキナーゼの標的はプロアポトーシスBch2ファミリーのメンバー、BADである。前記はセリン112及び136のリン酸化によって通常は不活性な状態で維持され、14-3-3に結合している。アポトーシスの誘発に際して、BADはser112及びser136の両者で脱リン酸化され、Bc1-2とダイマーを形成する。結果として、Bck2／Bcl-XLの平衡がシフトしてBcl-XLの遊離を促進し、チトクロームCの放出及びアポトーシスを仲介する（Datta et al. 2000）。BADは、ICAM2-AC形質導入及び擬似形質導入NIH3T3細胞のスタウロスポリン処理後に脱リン酸化され、アポトーシスの誘発が同時に生じるが（図22F）、ICAM-2発現はBADのリン酸化を維持し（図22F）、AKTキナーゼ活性の保持と一致する（図22E）。
【０１８５】
BADそれ自体は多くのシグナルトランスダクション経路に組み込まれ、同様な結果をもたらすことができる。前記は互いに別個にリン酸化される３つのリン酸化部位を有する：ser112は活性なp90Rsk1によって仲介され、ser136は活性なAKTによって仲介され、ser155は活性なPKA及び活性なp90Rsk１の両者によって仲介される。ICAM-2及びBADser112のリン酸化と関連するその役割は他の場所に記載されるであろう（Perez and Nolan、原稿準備中）。BADser115のリン酸化は認められなかった（データは示されていない）。抗アポトーシスシグナルは、抗アポトーシスタンパク質、Bch2及びBcl-XLに対して明白な作用をほとんど示さず（図22E）、カスパーゼ阻害タンパク質、細胞周期調節物質、Bc1-2又は更に別の細胞生存プログラムを使用する抗アポトーシス経路とは無関係であることが判明した（データは示されていない）。このことは、典型的な抗アポトーシス経路は生存シグナルを仲介しないことを示した（データは示されていない）。抗アポトーシスシグナリングに必要とされるAKTキナーゼのまた別の標的、GSK3は、ICAM-2発現NIH3T3でリン酸化されることが見出された。前記はおそらく抗アポトーシス作用に寄与するであろう（図22F、下段）。更に別のAKT基質、すなわちp70S6K及びFKHRもまたアポトーシス誘発ICAM-2細胞で、切断カスパーゼ生成物の検出の低下に加えてリン酸化されることが見いだされた（データは示されていない）。
【０１８６】
ICAM-2の架橋によって、抗アポトーシスシグナルの提供における内因性ICAM-2の役割が確認される
線維芽細胞における活性化AKTのICAM-2依存上昇はリガンドとの相互作用とは無関係である。前記は、ICAM-2ΔNはアポトーシスから細胞を保護し、ICAM2-ΔCはAKTを活性化できないという事実によって決定された。このことは、表面ICAM-2分子のオリゴマー形成（粘着分子のごく一般的な作用態様である）によって発動されるシグナリングメカニズムを示唆している。表面オリゴマーはそれらの細胞質ドメイン内に相互作用部位を創出し、シグナリング分子を補充して膜基部での相互作用に参画させることができるであろう。定量的FACS分析によって、細胞表面上のICAM-2分子の密度は細胞タイプ間で大きく変動することが示され（図23A、添付文書参照、定量方法の詳細については実験方法の項を参照されたい）、先に記載されたように多様な発現パターンと相関性を示す（de fougerolles et al. 1991）。リンパ球でのICAM-2の基礎発現レベルは、ICAM-2表面分子の数で決定したときレトロウイルスベクターによる強制発現の１／100から１／10000未満であった。我々は、抗体架橋はICAM-2とそのレセプターとの相互作用に匹敵できると説明し、従って架橋されたとき内因性ICAM-2が過剰発現系で観察されたような表現型を付与できるか否かを調べようとした。
【０１８７】
我々は、内因性Jurkat細胞ICAM-2表面分子をモノクローナル抗体で架橋し（クラスターを形成させ）、PI3K／AKT経路の活性化をアッセイした。エズリンは、ICAM-2との同時免疫沈澱によって検出したときICAM-2架橋の関数として結合してチロシンがリン酸化される（図23B）。このことは、エズリンはICAM-2のC末端と相互作用するために膜に移動することを示唆している。その後で、エズリンはICAM-2との相互作用に際してチロシンがリン酸化され（同時免疫沈澱で時間的遅れが検出される）、リン酸化は膜基部のタンパク質チロシンキナーゼによって仲介されることを示した（なぜならば、ICAM-2はチロシンキナーゼ活性を欠いているからである（データは示されていない））。エズリンのチロシンリン酸化及び同時に生じるp85との結合はICAM-2架橋の関数として観察され、エズリンのスレオニンリン酸化は顕著に強化されたが（図23D）、その作用はa-アクチニンと共有されなかった（データは示されていない）。
ICAM-2連結の関数としてエズリンのチロシンをリン酸化することができる上流のキナーゼを特定するために、我々は、ホスホチロシンタンパク質によるELISAを開発し、公知の種々のタンパク質キナーゼ阻害剤によってin vivoでのエズリンのチロシンリン酸化阻害についてスクリーニングした（Perez and Nolan, 原稿準備中）。スクリーニングした阻害剤のうち、ハービマイシンＡ（srcチロシンキナーゼファミリーメンバーであるsrc及びp62yesの強力な阻害剤（Haas et al. 2000; Schieven et al. 1992））は、ジェニステインと比較してエズリンのチロシンリン酸化を阻害することが見出された（ジェニステインは一般的なチロシンキナーゼ阻害剤として機能した）（図23C）。驚くべきことには、我々はまた、ROCK（Rho依存セリン／スレオニンキナーゼ）の阻害剤（Y-27632）、GTPアーゼの阻害剤、及びホスホイノシチド代謝回転の阻害剤（Psi-テクトリゲニン）がエズリンのチロシンリン酸化を阻害し、PKCイソ酵素阻害剤、ビスインドリルマレイミドI及びIIは小さな影響しか与えないことを見出した。チロシン残基のリン酸化を検出するスクリーニングのデザインを与えられたと仮定して、我々は、Rho依存プロセスの活性化は、エズリンチロシンがsrcによってリン酸化されるための前提条件であろうと推測した（以下で詳述する）。
【０１８８】
JurkatＴ細胞の表面でのICAM‐2の連結はPDK-1を誘発し（図23E）、更に付随的にPI3K及びAKTの膜への局在を誘発した（図23F）。AKT活性化に続いて、AKTser473及びAKTthr308の二重リン酸化、更にAKT基質、BAD、GSK3、FKHR及びAFXのリン酸化が時間の関数としてJurkatＴ細胞でのICAM-2架橋に続いた（図24A）。異なる細胞タイプ、プロＢ細胞（前記はまた低レベルのICAM-2内因性発現を示し、更にICAM-2の形質導入に際して抗アポトーシス表現型を示す（図20B））上のICAM‐2の架橋は、同様にAKTを活性化し、AKT基質であるBAD及びFKHRを時間依存態様でリン酸化した（図24B）。ICAM-2架橋は、JurkatＴ細胞をスタウロスポリン誘発アポトーシスから保護することが見出され、PI3Ｋ／AKT経路の活性化の結果を証明した（図24C）。LY294002とのインキュベーションによって、JurkatＴ細胞及びBaF3細胞上でICAM-2を架橋することによって開始したアポトーシス作用が停止した（データは示されていない）。
【０１８９】
我々は、ICAM-2の過剰発現は、JurkatＴ細胞におけるFas誘発アポトーシスを阻止するために十分ではないことを観察した（図19E、20C）。反対に、しかし必ずしも矛盾するわけではないが、我々は、JurkatＴ細胞での内因性ICAM-2の架橋はFas誘発アポトーシスに対して効果的な防御を示し、更にGTPγS、Psi-テクトリゲニン、Y-27632及びハービマイシンA（これらはエズリンのチロシンリン酸化を阻止することが確認された阻害剤である）の存在下で停止されることを観察した（図24D）。これらの観察は、抗体架橋によるICAM-2のクラスター形成は細胞生存シグナルを付与するために必要であり、更にこの細胞タイプにおけるICAM-2の過剰発現はFas誘発アポトーシスを阻止するために十分ではないことを示唆している。更にまた短縮ICAM-2が類リンパ球で化合物（GTPγS、Psi-テクトリゲニン、Y-27632及びハービマイシンA）によって誘発した細胞生存シグナルは、ICAM-2過剰発現NIH3T3細胞タイプで観察された穏やかな作用とは対照的である（データは示されていない、補充図20Bを参照されたい）。このことは、エズリンは類リンパ球におけるICAM-2及びPI3K間の支配的なリンカーであることを示唆している。なぜならば前記の化合物はエズリンの活性化に影響を与えるがa-アクチンには影響を与えないからである（Freeman et al. 2000; Izaguirre et al. 1999; Morishige et al. 2001; Nakamura et al. 2000）。前記は、JurkatのICAM-2架橋を経たPI3Kとエズリンが優先的に同時免疫沈澱し、より低い度合いでa-アクチンと免疫沈澱することによって立証された。ただしPI3Kは類線維芽細胞ではエズリンとa-アクチンの両者と相互同時免疫沈澱を示した（図22C参照）。更に、我々は、ICAM-2過剰発現類線維芽細胞は細胞骨格構造の活動を鈍らせ、類リンパ球細胞における活動的細胞骨格構造の要求とは対照的に、その生存シグナルの維持のために前記活動の増大を要求することを観察した（補充図面21A−Cを参照されたい）。従って、ICAM-2連結及びICAM2過剰発現は、種々の起源の細胞においてPI３K／AKT経路を活性化するそれらの態様の分子的相違を示している。
【０１９０】
ICAM-2はPI3K／AKT活性化を介してTNFα及びFas誘発アポトーシスからCD19+初代Ｂ細胞を防御し、ICAM‐1、ICAM-3、CD43及びCD44とは全く異なる
AKT活性についての結果は再現性があったが、我々は全血由来細胞についてのウェスタンブロット分析／キナーゼ活性アッセイに関しては満足していなかったので、下記に述べるフローサイトメトリーによるAKT活性の単一細胞分析の新規な方法を開発した（Prez and Nolan、投稿中、添付の原稿を参照されたい）。我々はまた、ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸及びホスファチジルイノシトール4,5二リン酸（単一細胞内でのリン脂質の代謝回転、PI3K及びPI4K／PLCｙの活性をそれぞれ反映する）検出のためのFACSによる方法も開発した（Prez and Nolan、原稿準備中）。我々は、FACSによるAKTキナーゼアッセイ及びFACSによるPIP3及びPIP2測定を用い、in vivoでのICAM-2に対する生理学的な関連を調べた。TNFa及び抗Fasモノクローナル抗体による処理の前にヒトPBMCをICAM-2で架橋した。処理したPBMCをフローサイトメトリーに付し、CD4（Ｔ細胞マーカー）及びＣＤ19（Ｂ細胞マーカー）の免疫表現型によってゲートコントロールし、続いてAKT活性及びアポトーシスについてマルチパラメーターFACSによってアッセイした。細胞内AKTキナーゼ活性の測定は、FACSで検出可能なAKT上のAKT-ホスホser473リン酸化部位に対するリン特異的蛍光プローブの開発によって達成された（Prez and Nolan、投稿中）。CD4+のＴ細胞及びＣＤ19＋のＢ細胞はともに、ICAM‐2がクラスターを形成したときにAKT活性を示し、誘発されたAKT活性は優先的にＢ細胞をFas及びTNF-a誘発アポトーシスから防御した（図25A）。CD4+Ｔ細胞では明白な抗アポトーシス作用は認められなかったが、これは、おそらく我々が用いた条件下ではこれらＴ細胞はFas又はTNF-aによってアポトーシスが強力に誘発されず、IL‐2又はPMA／イオノマイシンの前処理を要求するという事実によるためであろう（データは示されていない）。初代Ｂ細胞におけるアポトーシスからの防御は、セリン473でのAKTリン酸化と完全に相関し、Fas及びTNF-a誘発アポトーシスに対するAKTの保護作用におけるこの標的セリンについて以前に示した役割が確認された。FACSによるAKTのキナーゼ活性測定によって、異なるリンパ球集団の固有の活性化プロフィールを評価することが可能になり、そのような細胞集団の予備分類でしばしば観察される機能的増強が回避できるようになった（データは示されていない）。違いは、ICAM-2を他のエズリン結合表面分子（すなわちICAM-1、3、CD43及びCD44）と比較したときに認められた。PIP3及びPIP2のFACSによる測定によって、ICAM-2がPIP3／PIP2の比を増加させることが確認され、PI3K活性と一致した（図25B）。ICAM-3はPIP3及びPIP2の両者を増加させ、ICAM-1によるホスホイノシチドレベルには影響を与えないことが見出された（図25B）。しかしながら、ICAM-2、３、CD44及びCD43はCD4+及びCD19+の初代細胞でAKTを様々な程度で活性化することが見出されたが（図25B、下段）、ICAM-2及びICAM3のみが、CD19＋のＢ細胞でTNFa誘発アポトーシス（図25C）及びFas誘発アポトーシス（データは示されていない）を効果的に阻止し、ICAM-3、CD44及びCD43の機能的に異なる特性を示唆した。ICAM-2の抗アポトーシス作用は、CD19＋ヒトＢ細胞でPsi-テクトリゲニン及びY-27632とインキュベートすることによって停止し（図25E）、初代ヒト細胞におけるRhoキナーゼ及びホスホイノシチド依存性が立証された。GTPγSローディング条件及びハービマイシンAによるインキュベーションは理由は不明であるが初代細胞でアポトーシスを誘発した（データは示されていない）。従って、ICAM-2オリゴマー形成は、PI3‐キナーゼの膜への明瞭な補充をもたらし、PIP3の産生及びそれに続くAKTキナーゼの活性化を生じ、Jurkat細胞、BaF3プロＢ細胞及びヒト初代類リンパ球細胞で強力なアポトーシス抑制を開始させる。
【０１９１】
ICAM-2とその天然のレセプターLFA-1との相互作用はAKTを活性化させる
我々は、その天然のレセプター、LFA-1との相互作用によるICAM-2のオリゴマー形成が、抗体架橋実験によって説明されたようにPI3K／AKT経路の活性化のために十分であるか否かをテストすることを決定した。我々は、オーバーレイアッセイを開発した。前記アッセイでは、LFA-1＋のJurkat細胞へのICAM-2提示細胞としてICAM-2をレトロウイルスにより形質導入したNIH3T3細胞を用いて、これら２つの細胞集団の混合がICAM-2発現細胞でのAKT活性化を誘発するか否かを調べた。ICAM-2細胞とLY294002との予備インキュベーションによって、これら細胞内でのICAM-2過剰発現の結果として固有のAKT活性が停止された。長期間のPI3K阻害は不可逆的な阻害をもたらすかもしれないということを仮定して、オーバーレイアッセイは、前記化合物のIC50に近い濃度（２μM）でPI3Kを１時間ブロックした後でICAM-2細胞のAKT活性を特定するようにデザインした。前記の時間及び濃度はコントロール実験でAKT活性を阻止し、更にICAM-2架橋に際して誘発可能であることが判明した（データは示されていない）。前記オーバーレイアッセイは、免疫表現型マーカーとともに、最近我々が開発したFACSによるAKTアッセイを利用し、不均一な混合物中のどの特定の細胞がAKTキナーゼ活性を提示するかを特定する。Jurkat細胞は低レベルのLFA-1を発現し、検出可能なMac-1は発現しない（前記はICAM-2の２つの内因性レセプターである）（データは示されていない）。ICAM-2細胞は完全長のヒトICAM-2を発現し、前記のNIH3T3由来細胞は低レベルのマウスICAM-1、-2を発現し、検出可能レベルのマウスICAM-3は発現せず（データは示されていない）、種及びヒトICAM-2対ネズミICAM-1、-2の化学量論比を考えるならば、これらとヒトLFA-1との相互作用は顕著なものではないと考えられる（図23C、データは示されていない）。我々は、モノクローナル抗体とのインキュベーションによってJurkat表面のLFA-1及びMac-1タンパク質をブロックする前に混合する条件下でJurkat細胞をベクターコントロール及びICAM2細胞と混合した。ICAM-2細胞はサイズの相違とCD4Ｔ細胞マーカーが存在しないことによって特定した。我々は、LFA-1陽性Jurkat細胞のインキュベーションはICAM-2発現細胞でAKTを活性化し、Jurkat細胞のLFA-1モノクローナル抗体による前処理は、ベクターコントロール細胞と混合したJurkatと比較して抑制されることを観察した（図25E、不均一な類リンパ球集団での類似の実験に関する添付の原稿を参照されたい）。
【０１９２】
Jurkat細胞のMac-1モノクローナル抗体との前処理もまた、ICAM-2発現細胞のAKT活性化を阻害し、これらヘテロダイマーレセプターによるICAM-2のオリゴマー形成にはLFA-1及びMac-1の間に共通のβ2-インテグリンサブユニットが必要であることを示唆した。なぜならば、ICAM-2誘発シグナルは我々の条件では一過性のPI3Kの抑制を克服しなければならないので、我々は、AKTの激しい活性化を観察することを期待せず、むしろLFA+のJurkat細胞の存在下でAKTの活性化が誘発され、LFA-1モノクローナル抗体によって阻害されるか否か細胞毎の分析をあてにした。LFA-1及びMac-1の活性化状態を立証するためにはICAM-2のオリゴマー形成の他に更なる実験が必要であるが、前記のデータは、レセプター誘発ICAM-2オリゴマー形成はICAM-2の細胞内PI3K／AKTシグナルの活性化のために十分であり、細胞対細胞接触におけるシグナリング分子としてのICAM-2の生理学的役割に寄与することを示唆している。Wulfingらは、細胞対細胞接触に際してICAM-1の表面クラスター形成を可視化し、LFAはICAM-2による細胞内シグナリングに必要なICAMの表面オリゴマー形成を誘発することができるということを支持した（Wulfing and Davis, 1998; Wulfing et al. 1998）。別個の実験で、我々はWulfingらのＴ細胞／Ｂ細胞混合条件を採用して、FACSによるキナーゼアッセイによって白血球混合反応で同時に測定されるICAM2 AKTシグナルの活性化及びLFA-1仲介p44/42 MAPKの二重活性化を見出し（Prez and Nolan、投稿中）、ICAM-2／LFA-1接触時のin vivoシグナリングの役割が更に支持された。
【０１９３】
考察
細胞生存シグナルを仲介するICAM-2のモデル
我々の結果は、多様な細胞タイプにおけるICAM-2の異所性発現、及び類リンパ球細胞（CD19＋の初代Ｂ細胞を含む）での内因性ICAM-2の連結は生存シグナルを開始させることができることを示した。ICAM-2誘発AKT活性化は、細胞を化学物質（スタウロスポリン及びエトプシド）及び生理学的（TNFa及びFasリガンド）アポトーシス誘発物質に対して耐性にさせることができる生存シグナルであり、更に、エズリン活性化、チロシンリン酸化事象（srcチロシンキナーゼ及びRho-依存セリン／スレオニンキナーゼの両者を要求する）に依存する。これは、細胞質膜へのPI3Kの補充、PIP3産生及びそれに続くAKTの活性化をもたらす（前記は多様な細胞生存シグナルを下流の標的のリン酸化を介して開始させることができる）。
重要な膜−細胞骨格リンカータンパク質、a-アクチニン及びエズリンとの相互作用は同時免疫沈澱実験によって示されたが、我々は、これらリンカータンパク質の類線維芽細胞及び類リンパ球細胞タイプでのICAM-2生存シグナルの伝達についての依存性の明白な相違を観察した。ICAM-2の抗アポトーシス作用は、a-アクチニンと結合することが知られている21アミノ酸細胞質ドメインに左右された。特に、α−アクチニンはp85SH3−ドメインを介してPI3キナーゼと直接相互作用することが示され（Shibasaki et al. 1994）、ICAM-2を過剰発現する形質導入NIH3T3中のPI3Kと同時免疫沈澱し、更にICAM-2架橋Jurkat細胞中のPI3Kと結合することが見出された（図24E）。我々はα−アクチニンのリン酸化は観察しなかったが（データは示されていない）、ICAM-2の架橋の関数としてエズリンのリン酸化を確かに観察し（図23B）、ICAM-2誘発エズリン活性化メカニズムが提唱された。
【０１９４】
ICAM-2細胞質ドメインはエズリンと結合することが見出された。エズリンは、膜−細胞骨格リンカータンパク質のエズリン／ラジキシン／モエシン（ERM）ファミリーのメンバーであり（Helander et al. 1996）、我々の実験では（図22A）α−アクチニンと対照的にICAM-2と顕著に結合した。ERM−タンパク質は、膜−細胞質リンケージを促進することによって細胞の形態、粘着及び増殖を調節し（Tsukita and Yobeura, 1997）、更に腫瘍抑制因子、マーリン／シュワンノミンを包含して神経線維芽種症II型での関与が示唆される。更に、エズリン及び他のERMタンパク質は種々の疾患で粘着分子の分布の調節についてそれらの関与が示唆されている（Ichikawa et al. 1998; Stokowski and Cox, 2000; Turunen et al. 1998; Vinores et al. 1995）。興味深いことに、エズリン過剰発現はICAM-2のクラスター形成を誘発することが示され（Helander et al. 1996）、不適切な表面タンパク質のクラスター形成及びそれに続くシグナリングはERMタンパク質に強く影響されることが示唆された。相互に排他的な経路によるICAM-2／エズリンのタンパク質化学量論の調節崩壊が同様な細胞生存能力を付与することができるか否かを結論するためには更なる実験が必要である。
【０１９５】
最近、エズリンは、PI3-キナーゼとの直接相互作用及びそれに続くAKT活性化を介して上皮細胞で粘着依存生存を仲介することが報告された（Gautreau et al. 1999）。ここで我々は、ICAM-2のクラスター形成は、JurkatＴ細胞でｐ85及びPI3の結合に附随して、エズリンチロシンのリン酸化を誘発し、更にスレオニンリン酸化を強化することを報告する（図23Ｄ及び24Ｅ）。これは、PI3Kを細胞質膜へ移動させ（図23Ｆ）、PIP3の産生を開始させるために十分であった。後者は初代細胞内で単一細胞分析によって直接測定するか（図25Ｂ）、又はPDK-1活性分析により間接的に測定された（図23E）。PI3K／AKTの膜局在化、PIP3産生、エズリンリン酸化及びPDK-1活性はまたICAM-2過剰発現形質導入NIH３T3細胞でも観察されたが、ICAM-2クラスター形成によって誘発されるエズリンチロシンのリン酸化の重大な作用、並びにもっぱらJurkat細胞でのY-27632及びハービマイシンAによるICAM-2の抗アポトーシス作用の抑制（図23D及び24D）によって、我々は、ICAM-2はRho-依存エズリン活性化を介して細胞生存シグナルを仲介することを提唱した（補充図20Bを参照されたい）。前記は続いてPI3Kの膜への補充を開始し、生じたPIP3はPDK-1及びAKT活性を誘発したのであろう。我々は、ICAM-2のC‐末端中の陽性荷電アミノ酸クラスターへのエズリンの結合増加は、抗体のクラスター形成及びLFA-1相互作用によって誘発されるように、おそらくICAM-2のオリゴマー形成によって強化されると推測する（なぜならば、我々はICAM-2のチロシンリン酸化を検出しなかったからである）。前記は、なぜエズリンは過剰発現モデルで強力にICAM-2と結合するが、内因性レベルのICAM-2のクラスター形成に際してはICAM-2との結合が観察されるだけであるかについてのメカニズムの説明を提供するであろう。
【０１９６】
エズリンの活性化メカニズムに焦点を合わせた現時点の研究では、種々の細胞タイプ間での多様な相違が報告されている。エズリンについては二段階活性化プロセスが提唱されている（Bretscher et al. 2000）。ERMタンパク質は、Gto-N末端相互作用によって仲介される休止閉鎖構造内に存在すると考えられている（Bretscher et al. 1997; Gary and Bretscher, 1995）。スレオニン（及びおそらくはセリン残基）のリン酸化に際して（Bretscher, 1989; Simons et al. 1998）、構造的変化がC末端内のF-アクチン結合部位及びＮ末端内の表面タンパク質相互作用部位を暴露させる（Bretscher et al. 2000）。RhoGDI（Rho-GDP-解離阻害剤）は、活性化ERMタンパク質とのみ結合することが観察され（Takahashi et al. 1998）、Rho／RhoGDIの解離はRhoキナーゼの活性化の前提条件であることが示唆された（Straw et al. 1998; Yasui et al. 1998）。RhoGDIの解離は、ROCKを含むRho依存経路の活性化のための前提条件であり、GTPからGDPへの変換に左右される。
【０１９７】
小型のGTP結合タンパク質の上流の調節物質として、及び下流の調節物質としてのエズリンの機能についての証拠が存在し、分子的要件及び種々の細胞タイプでの活性化系の管理の説明を提供している（Kosako et al. 2000; Kotani et al.1997; Mackay et al. 1997; Matsui et al. 1998; Shaw et al. 1998）。本明細書で用いた系で、我々は、ICAM-2の抗アポトーシス作用はY-27632及びGTPγSによって停止することを観察し、Rho‐依存キナーゼ及びGTPはICAM-2シグナルのPI3Kへの伝達に必要であることが示唆された。更に、src／p62yesの阻害物質は同様にICAM-2誘発チロシンリン酸化に拮抗した。我々は、PCKイソ酵素に対する依存性を認めず（なぜならば、PKCイソ酵素阻害剤、ビスインドリルマレイミドI、ビスインドリルマレイミドII及びスタウロスポリンはICAM-2誘発生存シグナルを停止させなかった）、他の研究者らが報告したエズリンのPCKα及びPCKθ依存スレオニンリン酸化はこの系では極めて小さな寄与を与えるだけであると提唱する（Ng et al. 2001; Pietromonaco et al. 1998）。我々は、確かにICAM-2架橋の関数としてエズリンのスレオニンリン酸化の増加を観察したが（図23D）、0時点でのその存在及びエズリンのチロシンリン酸化の誘発倍数で観察された相違のゆえに、我々は、スレオニンリン酸化状態は、エズリンチロシンは前記活性に寄与するが、エズリンのチロシンリン酸化はICAM-2生存シグナルの伝達に必要であると確信している。
【０１９８】
更にまた、エズリンのチロシン残基Y353をフェニルアラニンに置換する（Y353F）位置特異的突然変異誘発は、上皮細胞でのPI3Kの結合を停止させることを示し（Gautreau et al. 1999）、Y353のリン酸化に必要なキナーゼはエズリンのPI3K／AKT経路を活性化するエズリンの主要な調節物質である可能性を示唆した。更に別のチロシン残基（Y154及びY353）が、チロシンキナーゼ活性を有するいくつかの蛋白質メンバー（すなわち血小板由来増殖因子レセプター（PDGF-R）、上皮増殖因子レセプター（EGF-R3）及び肝細胞増殖因子（HGF））によってリン酸化されることが観察されたが、両チロシン残基を欠く変異体はなお、チロシンがリン酸化され、シグナリング特性が種々に増強されることが観察された（Bretscher et al. 2000; Crepaldi et al. 1997; Jiang et al. 1995）。前記は、間接的にエズリンの多数のチロシンリン酸化部位は種々の細胞でそれぞれ異なる固有のシグナリング特性を有することを示唆し、いかにしてエズリンが、主要なシグナリング分子と直接的に相互作用するか又はアダプター分子を介して間接的に作用することにより種々のシグナルを統合し、それぞれ別個に反応するかの可能な説明を示している。特定のチロシン残基のリン酸化に反応できる蛋白質キナーゼの特定についてはまだ矛盾が残っているが、Y353のチロシンリン酸化についての予備的実験はin vitroではsrc及びp62yesが指摘された（Dumenil et al. 2000; Moller et al. 1994）。我々は、ハービマイシンA（src及びp62yesの両者の阻害物質）の存在下ではin vivoでエズリンチロシンリン酸化が除去されるのを観察し、更なる実験が、これら２つのsrcファミリーたんぱく質のチロシンキナーゼ間の識別並びにY353及び他の潜在的な部位での固有のリン酸化の識別のために必要である。
【０１９９】
我々のデータは、src／p62yesのによるエズリンのリン酸化をもたらすROCKはエズリンの活性化に中心的に関与することを示唆している（なぜならば、Y-27362（特異的なROCKの阻害剤）とのインキュベーションはエズリンのチロシンリン酸化を停止させる）。我々は、エズリンのスレオニンリン酸化（前記は最初に提示したが）はICAM-2連結に際して強化されることを観察した。前記は、エズリンのチロシンリン酸化（図23D参照）及びRho‐依存プロセス阻害剤の存在下でのその停止と対照的であった（図23C参照）。前記はエズリンのsrc／p62yesによるチロシンリン酸化はRho‐依存スレオニンリン酸化の上流に存在することを示唆しているが、ICAM-2のオリゴマー形成によって誘発されるエズリン活性化の一時的カイネティクスを最終的に明らかにするためには更なる実験が必要である。Rho‐依存キナーゼ及びホスホイノシチドのためのICAM-2 PI3K／AKT生存シグナルの要件はJurkat細胞及び初代Ｂ細胞では明瞭であるが（図24Ｄ、26Ｃ）、これらの要件の拘束性はICAM-2過剰発現細胞ではより少なく（データは示されていない、補充図20Bを参照されたい）、ICAM-2過剰発現細胞とICAM-2クラスターにより誘発されたPI3K／AKT経路の活性化との間の相違を表している。
【０２００】
PI3K／AKTシグナリング系は、細胞外刺激（増殖因子、サイトカインの他に細胞外マトリックスへの粘着を含む）の普遍的仲介物質である（Downward, 1998）。AKTの活性化は、２つの部位（PDK-1によるスレオニン308及び未特定PDK-2によるセリン473）のリン酸化に依存する（Downward, 1998）。AKTのアミノ末端はプレックストリン相同性（PH）ドメインを含む。前記はPI3Kのリン脂質生成物に直接結合すると考えられている。前記の結合によってAKTが膜に補充され、それによって構造的変化が誘発されてスレオニン308及びセリン473でそれぞれPDKI及びPDKIIによってリン酸化が可能になる（Alessi et al. 1996）。続いて二重にリン酸化されたAKTは活性をもち、多数の下流のエフェクターをリン酸化させて細胞生存に寄与する。前記エフェクターには、本明細書で解明されたものはさておき、ヒトカスパーゼ９及びeNOS（内皮細胞）（血管内皮の脈管形成を促進する（Cardon et al. 1998; Kureishi et al. 2000））が含まれる。AKTの過活性は多数の疾患で観察され（Haas-Kogan et al. 1998; Kulik et al. 1997; Shan et al. 2000; Wick et al. 1999）、従ってAKT活性化メカニズムの解明は治療的に重要であろう。ここで我々は、ICAM-2誘発AKTキナーゼ活性化は、BAD、GSK3、FKHR及びAFX（前記はいずれも細胞生存の促進に寄与することができる（Brunet et al. 1999; Graff et al. 2000; Pap and Cooper, 1998; Zha et al. 1996））のリン酸化によって検出されるようにいくつかの下流のエフェクターの活性化をもたらすことを示す。これらの観察は、ICAM-2活性化は多様な細胞で極めて強力な抗アポトーシスシグナルをもたらすという予想を支持する。一般的なPI3Kの活性化は多様な癌及び主要モデルで一般的に観察されるので、PI3K／AKT生存経路の主要な調節は上流の活性化事象に依存することは明らかである（Blume-Jensen and Hunter, 2001; Roymans and Slegers, 2001）。ICAM-2のPI3K／AKT経路の活性化の説明はグラフによって図25Fに示されているが、分子的メカニズムの相違が、上記で触れたようにICAM-2／エズリン及びICAM-2／α−アクチニンの境界面に存在するかもしれない。
【０２０１】
ここに示したデータは、ICAM-2過剰発現モデルとICAM-2クラスター形成モデルの細胞生存シグナルの間には分子的な相違が存在することを示し、更に前記のプロセスは細胞タイプに左右される可能性を示唆している。ICAM-2過剰発現によって、及びICAM-2クラスター形成によって仲介される抗アポトーシス作用は、不適切なICAM-2発現はアポトーシス刺激に耐性を付与することを示すが、より重要なことにはICAM-2のオリゴマー形成はLFA-1保持細胞との接触に際して細胞生存シグナルを開始させることができることを示している。ICAM-2によるこのPI3K／AKT経路の活性化は、細胞がアポトーシスになりやすい環境にある場合は抗アポトーシスシグナルとして、又は細胞対細胞接触によって仲介される細胞生存シグナルと考えることができる。粘着分子として、ICAM-2は、そのレセプターLFA-1との相互作用を介してリンパ球の再循環における役割及びＴ細胞：Ｂ細胞の接触の強化及び安定化における役割を有していた（Damel et al. 1992; Douglas et al. 2000）。ここで、我々は、粘着分子としての特性の他に、ICAM-2はLFA-1との嵌合によって細胞表面でクラスターを形成したとき細胞内シグナルを伝達する能力を有すると提唱する。ICAM-2のクラスター形成の意義には以下の２つの要素がある：（１）その過剰発現により、ICAM-2は、アポトーシスによって細胞死の運命をもつ細胞をアポトーシス耐性に導くことができる；（２）ICAM-2のレセプター仲介嵌合は、LFA-1保持細胞と嵌合する細胞に細胞の生存選択性を仲介することができる（前記は免疫学的シナプスで生じるプロセスである）（Prez and Nolan、原稿準備中）。我々は、抗体架橋又はその天然のレセプターであるLFA-1との嵌合によって誘発されるICAM-2のクラスター形成は、ICAM-2細胞がLFA-1発現細胞と接触したときにのみ開始される調節可能な細胞生存を提供すると推測する。そのような細胞対細胞接触はＴ細胞の活性化に機能的に必要であり（Prez and Nolan、原稿準備中）、他のICAM-2／レセプター相互作用、例えば最近報告されたリンパ球の血管外遊出におけるICAM-2／DC-SIGN相互作用及びICAM-2／LFA-1強化HIV感染／伝達における相互作用で重要であろう（Barbeau et al. 1998; Butini et al. 1994; Geijtenbeek et al. 2000; Hioe et al. 2001）。従って、ICAM-2には弁別的な生理学的役割が存在するであろう。ICAM-2はB-CLL患者由来のCD5+Ｂ細胞で（Molica et al. 1996）、更に患者から得られた大きなＢ細胞リンパ腫（Alizadeh et al. 2000）で強く発現されることが報告されたので、ICAM-2の過剰発現は腫瘍の薬剤耐性及び細胞増殖性疾患（例えばＢ細胞の慢性リンパ球性白血病（B-CLL）をもたらすであろう。前記の観察は、報告された研究と合わせて、ICAM-2又は他の粘着分子はある種の白血病で役割をもつ可能性を示唆している。正常な線維芽細胞では、ICAM-2仲介PI3K活性化は、リンパ球の血管外遊走の他に、おそらく好酸球の内皮細胞貫通遊走を調節し（Gerwin et al. 1999）、潜在的には（DC-SIGNを介して）樹状細胞の内皮貫通遊走を調節することができるであろう（Geijtenbeek et al. 2000）（前記は２つの枢要な細胞接触依存プロセスである）。
【０２０２】
我々の結果は、ICAM-2の過剰発現及びクラスター形成は、細胞株及び初代Ｂ細胞で抗アポトーシスシグナルを提供し、それら細胞をTNFa及びFasリガンドによって誘発される生理的な致死プログラムに対して耐性にすることができることを明らかにする。ICAM-3、CD43及びCD44は単一細胞分析で判定されたように初代細胞でAKT活性を誘発したが、ICAM-2及びICAM-3のみがFas及びTNFaに対してアポトーシスを阻止することができ、CD44及びCD43は実際には細胞死を永続させた。ICAM-3架橋はAKT活性化の一時的な遅延の他にPIP2産生を強化し（データは示されていない）、前記作用はICAM-2架橋と異なり、ICAM-3は他のシグナリング経路に影響を与えることを示唆している。驚くべきことには、ICAM-1は実施した実験ではICAM-2とは完全に異なっていた。これらの観察は、同じERM蛋白質と結合し、少なくとも１つの共有するレセプターと相互作用することができる粘着分子について分子的な相違が細胞内シグナリングにおいて存在することを示している。興味深いことには、炎症性サイトカインは抗原提示細胞（APC）上でICAM-2の発現を調節することができること、及び樹状細胞の成熟はICAM-3の発現をアップレギュレートすることができることが報告され（Maki et al. 1998; McLaughlin et al. 1998; McLaughlin et al. 1999; Ohh and Taki, 1996）、観察されたICAM-2とICAM-3の類似性はin vivoで機能的に類似する役割をもつ可能性を示唆している。ここに提示した実験は、以前に認識されていなかった機能がICAM-2に帰することを示している。ICAM-2は、多様な細胞株及びヒト初代細胞で抗アポトーシス表現型を誘発するだけでなく、異所的及び内在的に細胞生存シグナルを示すという発見は、脱調節及び誘発クラスター形成はおそらく抗アポトーシス表現型に大きく貢献し、腫瘍の進行及び／又は細胞生存をもたらすことを示唆している。
粘着分子の普遍的な阻止による癌細胞の粘着をブロックする抗転移アプローチの開発は、そのような薬剤の開発は、細胞対細胞接触相互作用（例えばICAM／LFA-1によって仲介されるもの）に依存する正常な生理学的プロセスで有害な作用をもつ可能性があるために注意が必要であることを正当化する。従って、ICAM-2又は他の粘着分子の発現、分布及び活性化の調節に関与する経路は、抗腫瘍療法の開発のための、更に潜在的な免疫抑制剤としてのまた別の標的となろう。
【０２０３】
実験方法
抗体及び化学物質
以下の抗体をCell Signaling Technologies（Beverly, MA）から入手した：抗ホスホ−AKT−Ser473ｍAｂ、抗ホスホ−AKT−thr308、抗AKT、抗ホスホ−FKHR、抗FKHR、抗ホスホ−Gsk3 alp21、抗切断PARP、抗切断カスパーゼ９、抗切断カスパーゼ３、抗切断カスパーゼ７、抗カスパーゼ９、抗カスパーゼ７、抗pAFX、抗PARP、抗BAD、抗BADser112、抗BADser136、抗ホスホ−BADser155、抗ウサギ−HRP。抗ICAM2 IC2/2 mAb、抗ICAM−2−FITC mAb（IC2/2）はResearch Diagnostics（Flanders, NJ）から購入した。抗ICAM-2 N末端、抗ICAM-2 C末端、抗a-アクチニン、抗Bcl2、抗Bclx/s、抗p27、抗p21、抗ｃFLIP、抗MYC、抗p53、抗NFKB、抗IKKα、抗Ikkβ、抗ホスホ−チロシン、抗ホスホ−スレオニン、抗マウスIgG−HRP、抗ヤギ−HRP、アネキシンV−ビオチンはSanta Cruz Biotechnologies（Santa Cruz, CA）から購入した。抗エズリンｍAｂ、抗PI3KはTransduction Laboratories（San Diego, CA）から購入した。抗PDK−ホスホ−セリン、抗PDK−ホスホ−スレオニン、Y-27362、U0126、ビスインドリルマレミドI及びII、psi−テクトリゲニン、エトプシド、PD98059、LY294002、TNFα、IL-2はCalbiochem（San Diego, CA）から購入した。スタウロスポリン、ウォルトマンニン、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、GTPγSはSigma（St. Louis, MO）から購入した。抗マウスアレキサフルア568、抗ウサギアレキサフルア488、抗マウスアレキサフルア488、抗ウサギアレキサフルア568、プロロングアンチフェード（Prolong antifade）、アネキシン633、アネキシン488、ストレプトアビジンアレキサフルア488、ストレプトアビジンアレキサフルア633、抗ホスホイノシチド3,4,5三リン酸、抗ホスホイノシチド4,5二リン酸はMolecular Probes（Eugene, OR）から購入した。アネキシンV−FITC、抗ウサギPE、抗マウス−FITC、抗ヤギFITC、抗ヤギテキサスレッド、ストレプトアビジン−PEはBD Biosciences（San Jose, CA）から購入した。CD4−APC、CD19−PerCP、抗ICAM-1、抗ICAM-3、抗CD43、抗CD44、抗LFA-1、抗Mac-1はPharMingen（San Diego, CA）から購入した。更に別の試薬は適切な場所に記載される。
【０２０４】
レトロウイルスｃDNAスクリーニング
レトロウイルスの産生及び感染は記載に従って実施した（Kitamura et al. 1995; Onishi et al. 1996; Rayner and Gonda, 1994）。ｃDNAライブラリーはJurkat Ｔ細胞からpBabe-Sベクターで調製した（Hitoshi et al. 1998）。前記ライブラリー（2ｘ106一次形質転換体）を用いて約107のPHOENIX-Eパッケージング細胞にトランスフェクトした。ｐBMN-LacZコントロールベクターを1：10の割合で前記ライブラリーに加えトランスフェクション／感染効率をモニターした。ウイルス上清を採集し、約107の指数関数増殖期のNIH3Ｔ3細胞に感染させた。感染後48時間で細胞を分割しβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。ライブラリーにより形質導入したNIH3T3細胞を合流度（confluency）約25％で播種し、24時間後に培養液を1μMのスタウロスポリン（STP）を含むDMEMに交換した。24時間処理した後、前記STP含有培養液を完全なDMEM／ドナーウシ血清と交換した。生存細胞を約80％の合流度に到達させた（７日）。生存細胞を更に２ラウンド記載したように再処理した。
表現型トランスファーアッセイ
ライブラリー感染生存細胞の部分標本にモロニーネズミ白血病ウイルス（T. Kinsella (Stanford)より贈与）を重感染させた。重感染細胞を２週間継代してヘルパーウイルスを効率的に拡散させた。未感作NIH3T3細胞をウイルス上清で感染させ、48時間発現させた。続いて再感染細胞を上記で述べたようにスタウロスポリンで処理した。生存細胞を７日間培養し、RT-PCRによってトランスファーについて分析した。
プロウイルスｃDNA挿入物のRT-PCRクローニング及び構築物の作製
RNAは酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法によって記載のように（Chomczynski and Sacchi, 1987）調製した。ｃDNAは４μgの熱変性全RNAから50μLの反応容積で作製し（Primega, Madison, WI）、42℃及び55℃で45分インキュベートした。ｃDNA反応生成物（５μL）を50μLのPCR反応ミックス（Perkin-Elmer, Foster City, CA）で95℃／30秒；55℃／60秒；72℃／２分で25サイクル増幅させた（プライマー：5'-GATCCTCCCTTTATCCAG；5'-GAATGAAAGACCCCACCTGT）。完全長のICAM2ｃDNAをレトロウイルスベクターｐBM-Z-IN骨格（Kinoshita et al. 1998）のBamHI／Sal１部位でクローニングした。ICAM2-ΔC、ICAM2-ΔN及びICAM2-C末端スクランブルをPCRで作製し、BamHI／Sal１部位でクローニングした。
【０２０５】
細胞培養及び初代細胞の調製
NIH3T3ネズミ線維芽細胞は、DMEM、10％DCS、１％PSQ（ダルベッコー改変イーグル培養液、10％ドナー仔牛血清、１％ペニシリンストレプトマイシン（1000単位／mL及び2mMのL-グルタミンPSQ）中で維持した。JurkatＴ細胞及びCH27形質転換Ｂ細胞は、RPMI-1640、10％FCS、１％PSQで維持した。BaF3プロＢ細胞は、RPMI-1640、10％FCS、１％PSQ、400U/mLのIL-3（Peprotech）中で維持した。70Z/3プレＢ細胞はRPMI-1640、10％FCS、１％PSQ、50μmのβ-メルカプトエタノール中で維持した。HL60骨髄白血病細胞はOpti-Mem I、10％FCS、１％PSQで維持した。293Ｔヒト線維芽細胞は、DMEM、10％FCS、１％PSQで維持した。細胞は５％CO2／37℃加湿インキュベーターで維持した。形質導入細胞は500 １μg/ｍLのG418（Sigma）で維持し、構築物の適切な発現は、表示したようにウェスタンブロット及び完全長のICAM-2、ICAM-2ΔC、ICAM-ΔNのFACS分析によって確認した。スタウロスポリン処理は特に表示がないかぎり１μMで24時間であった。LY294002処理は、以後の全ての処理の前に10μMで30分実施した。ウォルトマンニン処理は100ｎMで24時間であった。化学物質はDMSOに溶解させ（溶媒希釈について最終的に１：1000であった）、ベクターコントロールは陰性コントロールとして１％のDMSOとともにインキュベートした。ベクターコントロールは表示したようにｐBMN-Z-IN（空ベクター）の形質導入又はｐBMN-Z-IN-GFPから成る。ｐBMN-Z-IN-GFPの感染頻度は、３つの別々のウイルス形質導入について48％±10であった。タンパク質発現についてフローサイトメトリーにより日常的にモニターしたとき、持続的なネオマイシン選別によって、均質なICAM-2、ICAM2-ΔCICAM-ΔN又はコントロールベクター集団が得られた。初代細胞の調製の場合、単核細胞はヒトの末梢血からフィコール−プラーク密度遠心分離及び粘着プラスチック培養皿上での粘着細胞の排除によって単離した。単離細胞は完全培養液で維持し、CD4、CD3、CD19、及びICAM-2発現についてFACSによって分析した。
【０２０６】
架橋
抗体架橋実験は、10μg／ｍLでＮ末端領域（細胞外ドメイン）を認識する、抗ICAM-1、抗ICAM-2、抗ICAM-3、抗CD43又は抗CD44のｍAbを用いて実施した。スピン透析（Biorad）を用いて、アジ化物含有抗体（0.01％）の緩衝液をリン酸緩衝食塩水（pH7.4）と交換した。抗マウスIgG（Sigma）を架橋実験のコントロール抗体として用いた。１ｘ106のJurkat、１ｘ106のBaF3又は１ｘ107のPBMC細胞の血清をそれぞれ３時間枯渇させた（PBMCを除く）。細胞をいずれかのｍAb（10μg/ｍL）又はマウスIgG（10μg/ｍL）で表示した時間37℃でインキュベートした。時間は、シグナリング経路の大半を減弱させるために血清枯渇後に開始するか、又は表示のとおりであった。血清枯渇４時間では、カスパーゼ３活性、細胞周期分析、アネキシンV／PI染色によって調べたときアポトーシスの生化学的開始は認められなかった（データは示されていない）。細胞抽出物を作製し、免疫沈澱又はイムノブロッティングのどちらかを実施した。初代細胞をアポトーシス処理に付し、続いてフローサイトメトリーのために調製した。GTPγSは、細胞に適用する前に25℃で30分ヒュージーン（Fugene, Roche Biochemicals）と１：４のモル比で予備インキュベーションすることにより細胞透過性にした。放射能標識／蛍光性三リン酸のリポゾーム仲介デリバリーによって高度にチャージされた分子種の大量の細胞内取り込みが達成された（Perez, O,D、未発表データ）。
【０２０７】
アポトーシスアッセイ
アポトーシスは、濃縮核、フローサイトメトリーによるアネキシン-V結合、又は表示に従ってフローサイトメトリーによるTUNEL BrdU染色の計測のいずれかによって決定した。アポトーシスは以下のいずれかで誘発した：適切な実験で表示に従ってスタウロスポリン（１μｍ）、抗マウスFas（５μg/mL, Santa Cruz Biotechnology (SCB)）、抗マウスFas（５μg/ｍL Jo2 Biomed）又は抗ヒトFas（10ng/mL CH11 Kamiya Biomedical）による処理、IL-3排除（24時間又は表示のとおり）。濃縮核の計測の場合、NIH3T3細胞をガラスのカバースリップに増殖させ、アポトーシスについて調べた。浮遊細胞は、25μMのアクリジンオレンジ／25μMの臭化エチジウム又は５μg／ｍLのヘキスト33342（Molecular Probes, Eugene, OR）による核染色によって分析した。アポトーシスは、報告されたように（Jacobson and Raff, 1995）特徴的な濃縮核の存在によって確認された。少なくとも５つの個々の視野を写真撮影し、ツァイスアキシオスコープ（axioscope）蛍光顕微鏡を用いて計数した。生存アッセイの場合、106のNIH3T3細胞を10cmの皿に播種し、37℃で一晩培養した。前記細胞を１μMのスタウロスポリンで24時間処理した。前記細胞を洗浄し完全培養液で24時間培養した。細胞をトリプシン処理し、生細胞をトリパンブルー染色の後で計数した。未処理細胞は処理時に計数した。％生存は、（処理後の生細胞の数）／（処理前の生細胞の数）を表す。FACSによるアネキシン-V-FITC／PI染色は記載のように実施した（PharMingen）。TUNELアッセイはアポトーシスBrdUキット（Promega）の製造元の記載に従って実施した。フローサイトメトリーのデータ採取は、BrdU（10,000事象採集）及び濃縮核カウントの両者についてスタウロスポリン処理（1μM）後24時間、アネキシン-V結合（100,000事象採集）についてスタウロスポリン処理後12時間で実施した。アネキシン-V陽性細胞は処理後24時間で膜の抵抗性は減弱（compromised）しているであろう。フローサイトメトリー分析はCELLクェストを用いてBD FACSカリバー（FACSCalibur）で実施し、フロージョ（FlowJo, Tree Star）ソフトを用いて分析した。
【０２０８】
キナーゼアッセイ
PDK-1活性はPDK-1免疫沈澱キナーゼアッセイキット（Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY）によって製造元の推奨に従って決定した。簡単に記せば、PDK-1を１ｘ106の処理細胞から免疫沈澱させ、不活化SGK酵素とともにインキュベートし、SGKペプチド基質への（γ−32P）ATPの取り込みをシンチレーション計測で測定した。PI3K活性は開発したPI3K FACSによるアッセイによって検出した（下記参照）。AKT活性は細胞からAKT1を免疫沈澱させ、GSK3融合タンパク質（CST）によるキナーゼアッセイを用いて検出した。２ｘ106のNIH3T3、２ｘ106のJurkat又は５ｘ105のBaF3細胞を、固定したAKT 1G1モノクローナル抗体（ｍAb）（1：200、CST）とともに４℃で穏やかに揺らしながら２時間インキュベートした。免疫複合体を細胞溶解緩衝液で４回洗浄し、40μLの200μMのATP及び１μgのGSK-3融合蛋白質（CST）を補充したキナーゼ緩衝液（25ｍMトリス（pH7.5）、５ｍMのp-グリセロホスフェート、２mMのDTT、0.1ｍMのNa3VO4、10ｍMのMgCl2）に30℃で30分再懸濁した。キナーゼ反応は、SDSサンプル緩衝液で停止させ、5分間煮沸した。GS3Kのリン酸化状態は免疫ブロッティングによって検出し、ECL検出（Amersham）を用いて可視化した。イムノブロットは３つのそれぞれ別個にウイルスによって形質導入した細胞集団のそれぞれ３回繰り返した典型例である（ｎ＝９）。AKT活性は、ser473及びthr308に対するリン特異的抗体（NEB）を用いてイムノブロッティングによりAKTのリン酸化によって実証した。キナーゼアッセイは、少なくとも３つのそれぞれ別個の測定の典型例で、標準偏差が適切に表されている。
【０２０９】
細胞の分画、免疫沈澱及びイムノブロッティング
トリトンX-100分画を記載に従って実施した（参考文献xxx）。細胞抽出物は、２Ｘ106細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって調製した。溶解緩衝液は以下を含む：20ｍMトリス（ｐH7.5）、150ｍMのNaCl、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、１％トリトンX100、2.5ｍMのNa2PO4、１mMβ−グリセロールホスフェート、１mMのNa3VO4、１μg/ｍLのロイペプチン、１ｍMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Boehringer Mannheim）。抽出物を14000rpm（５分、４℃）で遠心し、細胞溶解物（BCAタンパク質アッセイ（Pierce）で決定したとき20μg）を、標準的な方法を用いて12％又は15％のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、更にPVDFメンブレンに移した。免疫沈澱は、プロテインＡ／Gプラスアガロースビーズ（SBC）によって予備清澄化した。IPは、一次抗体で１時間又は一晩、プロテインＡ／Ｇプラスアガロースビーズで１時間インキュベートし、更に溶解緩衝液で４回洗浄した。ブロットは表示した抗体でインキュベートした。以下の二次抗体を用い：抗ウサギHRP（1：5000、NEB）、抗マウスHRP又は抗ヤギHRP（1：5000、SBC）、ECL検出（Amersham）、又はコダックデジタルサイエンス440Cステーションで可視化した。ブロットは少なくとも３つのそれぞれ別個の実験の典型例である。
【０２１０】
フローサイトメトリー及びＦＡＣＳ分析
細胞内及び細胞外染色は表示した抗体を用いて記載（www.metezoa.com/UPL3287）されたように実施した。AKT活性のための細胞内プローブは、抗AKTser473モノクローナル抗体（Cell Signaling Technology）をアレキサ568染料（Molecular Probes）にアレキサ568タンパク質結合キット（Molecular Probes）を用いて結合させて作製した。リン特異性はウェスタンブロッティング及びFACS分析によって、多様なPI3Kの活性化物質及び阻害剤に対して調べた（データは示されていない、Perez and Nolan、投稿中）。ホスホ−AKTser473アレキサ568による細胞内染色は、NIHT3T細胞を血小板由来増殖因子で刺激したとき及び刺激前にLY294002で阻害したときAKTキナーゼ活性を表した。ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸及びホスファチジルイノシトール4,5二リン酸に対する細胞内プローブは、PIP3又はPIP2に対するｍAbをアレキサフルア488又はアレキサフルア633にアレキサ568タンパク質結合キット（Molecular Probes）を用いて結合させて作製した。PIP3及びPIP2のFACS測定はPI3K及びPI4Kキナーゼ活性を反映していた（Perez and Nolan、原稿準備中）。定量的FACS分析は記載されたように実施した（Davis et al. 1998; Lyer et al. 1998; Lenkei et al. 1998）。簡単に記せば、R-フィコエリスリン（PE）（Molecular Probes）をタンパク質架橋キット（Molecular Probes）の製造元の推奨に従って抗ICAM2 N末端モノクローナル抗体（Research Diagnostics IC2/2）と結合させ、化学量論的適切性を調べ（データは示されていない）、Quantibrite-PEビーズ（BD Systems）を用いて定量した。定量的カリブレーション曲線は既知量のPE分子／ビーズを含むQuantibrite-PEビーズを用いて作製した。直線回帰分析を以下の等式を用いて実施した：log10（PE蛍光）＝勾配*log10（PE分子／ビーズ）＋切片。PEの蛍光はPEチャネルの相乗平均を得ることによって決定される。定量は、PKと直接結合させた抗体についてのみ有効である。飽和量の抗体を用い、更に十分に洗浄することによって全表面抗原の結合が担保される。氷上でのサンプル調製は抗体の内在化を減少させる。未知の細胞集団に対する細胞の表面抗原は、カリブレーション曲線を用いてPEの相乗平均をコンピュータで処理して決定される。定量FACS分析は表面抗原の発現について概算を提供する。抗体の結合価は使用したモノクローナル抗体について調べられていないので、グラフの数字は相対的表面分子数を表し絶対数ではない。フローサイトメトリー分析はBD FACSCaliburマシーンで実施し、FlowJoソフト（Tree Star）を用いて分析した。CellQuestは、定量的フローサイトメトリー及びQuantibrite-PEビーズの直線回帰分析のために用いた。フローサイトメトリーのデータは、106細胞／分析サンプルによる３つのそれぞれ別個の実験の典型例である。100,000事象を収集するか、又は別に記載したようにカリブライトビーズ（BD systems）を用いて修正した。棒線グラフに示したデータは３通りの実験の平均値（棒線）±SDとして表されている。
【０２１１】
レーザー走査共焦点顕微鏡法
細胞をカバースリップ上で増殖させ、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.4）で２回洗浄し、2.7％のパラホルムアルデヒド（PBS中）で固定した。細胞を0.1％のトリトンX-100で5分間透過性にし、PBSで２回洗浄し、４％のウシ血清アルブミン（BSA、PBS中）でブロックし、以下のように抗体とインキュベートした（１％BSA中で、0.1mg/mLで一次抗体、1：1000希釈で二次抗体、間で数回の洗浄工程）。染色したカバースリップをガラススライドに長期抗退色試薬（Prolong Antifade reagent, Molecular Probes）を用いてマウントし、Molecular Dynamics Multiprobe 2010共焦点レーザー走査顕微鏡で可視化した。画像はアドーブフォトショップ（Adobe Photoshop）6.0を用いてコンパイルした。
【０２１２】
参考文献
2005517174.tif 000028
【０２１３】
2005517174.tif 000029
【０２１４】
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【０２１５】
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【０２１６】
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【０２１７】
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【０２１８】
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【０２１９】
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【０２２０】
実施例５
細胞内粘着分子−２（ICAM-2）によるPKB／AKT依存細胞生存の活性化
本実施例では、本発明の方法及び組成物により、本発明者ら（ここではまた“我々”と称する）は、レトロウイルスｃDNAライブラリーを用いた機能的な遺伝子スクリーニングによって、いくつかのアポトーシス活性化物質の強力な阻害剤として、細胞内粘着分子−２（ICAM-2）（粘着分子の免疫グロブリンファミリーのメンバー）を特定した。ICAM-2の発現はいくつかの細胞タイプでアポトーシスの開始及び誘発設定を阻止した。ICAM-2の抗アポトーシス作用はPI3K／AKT経路の活性化にマップされ、前記に続くBAD、GSK3及びFKHRのリン酸化をもたらした。ICAM-2の細胞生存シグナルは、カスパーゼ阻害タンパク質、細胞周期調節因子又はBcl-2による抗アポトーシス経路とは関係がないことが判明した。前記生存機能は、ICAM-2の細胞質テール（膜細胞骨格リンカータンパク質、α−アクチニン及びエズリンが結合した領域）に依存していた。ICAM-2仲介生存機能はPI3キナーゼの２つの薬理学的阻害剤、ウォルトマンニン及びLY294002によって停止し、AKT及びその下流のエフェクターの活性化がPI3Kの細胞質膜への補充に依存することが示唆された。BaF3プロＢ細胞及びJurkatＴ細胞上の内因性ICAM-2のクラスター形成は、AKTキナーゼ活性並びに下流のエフェクターBAD、GSK3、FKHR及びAFXを刺激し、異所性発現の結果と一致した。CD4+及びCD19+の初代細胞は、ICAM-2のクラスター形成に続いてTNFα及びFas仲介アポトーシスから保護され、細胞内AKTキナーゼ活性の直接単一細胞フローサイトメトリーによる測定により検出されたようにAKT活性の上昇を示した。これらの結果はICAM-2の新規な生存シグナリング機能に帰せられ、前記機能は、Ｂ細胞におけるICAM-2の過剰発現の役割、及びICAM-2が種々の重要な細胞タイプで細胞内コミュニケーションのシグナルを発するメカニズムの両方についての説明を提供するかもしれない。
【０２２１】
序説
細胞のホメオスタシスは、厳密に調節されている増殖とアポトーシスのバランスによって達成される。アポトーシスは、とりわけ、DNA損傷、増殖因子喪失、レセプター仲介致死シグナルを含む多数の事象によって又は生体異物による誘発によって開始される細胞死の明瞭に識別される一形態である。アポトーシスのシグナリング経路の調節は主に細胞のその環境を探知する能力によって管理される。細胞のアポトーシス死は、多様な細胞に致死メカニズムを開始させる別個のアポトーシス刺激により多くの経路によって発生する。例えば、化学的に誘発されるアポトーシスはチトクロームCの放出及びカスパーゼ９の活性化により発生する（Budihardjo et al. 1999）。レセプター誘発アポトーシス（Fas／TNFα）はカスパーゼ８の活性化を介して仲介され（Holmstrom and Eriksson, 2000; Kruidering and Evan, 2000; Rath and Aggarwal, 1999; Schneider and Tschopp, 2000）、ミトコンドリアに関係なく作動することができる（Gottlieb, 2000; Kroemer, 1999; Kuida, 2000）。カスパーゼ８も９もともにエフェクターカスパーゼ３及び7に集中して、アポトーシスの特質を仲介する（Earnshaw et al. 1999; Grutter, 2000）。
【０２２２】
細胞の増殖又はプログラムされた細胞死の細胞による実行は、直近の環境、例えば細胞外マトリックス（ECM）との相互作用、細胞対細胞接触から伝達されるか、又は内分泌因子もしくはパラクリン因子を介したより離れた部位からコミュニケートされる生存及び致死シグナルのバランスである（Ruoslahti and Reed, 1994）。生存経路は、アポトーシスが器官発生の決定に重要な役割を果たす初期発生時に機能すると提唱される（Raff, 1992）。同様に、生存シグナルの欠如はアノイキスの現象において実証され、この場合上皮細胞は、ECM付着が阻止されるときアポトーシスを受ける（Frisch and Ruoslahti, 1997）。ECM生存シグナルはおそらくインテグリンのクラスター形成を介して細胞表面レセプターの活性化によって仲介され、細胞対細胞／細胞対マトリックス相互作用の特異性に寄与し、正当でない細胞遊走を防止する。ＥＣＭ相互作用は粘着細胞での増殖因子のシグナリングのために要求される（Hulleman and Boonstra, 2001）。ECM−インテグリンシグナリングの脱調節は足場非依存性増殖をもたらし、悪性度と相関性を示す。従って、ＥＣＭシグナリングの脱調節は、アポトーシス刺激に対して細胞を脱感作し、異質な環境及び不利な条件下での細胞の細胞の生存を可能にする悪性表現型に寄与することができることは明白である。
【０２２３】
細胞粘着に必要な分子の機能についての性状決定は、インテグリン及びカドヘリンに帰すると考えられるシグナルトランスダクション経路に集中した（de Fougerolles et al. 2000; Schneller, 2001; Shinohara et al. 2001）。免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーの粘着分子は潜在的なシグナリング分子としてこれまで広く見渡されてきた。ICAM-2（CD102）は細胞表面タンパク質のIgスーパーファミリーのメンバーであり、LFA-1（CD11a/CD18）及びMAC-1（CD11b/CD18）への白血球結合を仲介する（前記の発現は白血球に限定される）（van Kooyk and Figdor, 2000）。組織内の白血球補充に必要な細胞表面粘着メンバーとして、ICAM-2は、Ｔ及びＢリンパ球、単球、血小板及び初期CD34+造血原始細胞を含むほとんどの白血球上に低レベルで発現される（de Fougerolles et al. 1991; Diacovo et al. 1994; Nortamo et al. 1991）。更に、ICAM-2の構成的発現は全ての血管内皮細胞上で観察された（de Fougerolles et al. 1991）。ICAM-2の発現パターンを基に、ICAM-2はリンパ球の再循環に中心的に関与すると考えられた。ICAM-2欠損マウスは、好酸球のトラフィッキングは炎症反応で増大するということを示すことによってこの考えを支持する（Gerwin et al. 1999）。驚くべきことに、前記の表現型は、ICAM-2が発現される細胞タイプの範囲を考慮すると比較的軽度である。ICAM-2が果たす役割は微妙なものであるか、又は他の経路に関して余分であると考えられている。従って、ICAM-2欠損マウスはICAM-2の役割を十分には明らかにしておらず、ICAM-2が機能するメカニズムの更なる性状決定の必要性が正当化される。
【０２２４】
粘着分子としてのICAM-2の仮定的な役割とは対照的に、ICAM-2がリンパ腫の内皮細胞及びＢ細胞型慢性リンパ性白血病（B-CLL）患者のCD5+Ｂ細胞の両方で強く発現されるという発見は驚くべきものである（Molica et al. 1996; Renkonen et al. 1992）。リンパ系増殖疾患は必然的に粘着依存性を抑制する（粘着の低下は転移による拡散が生じる主要な手段の１つである）。しかしながら、患者から得られた大きなＢ細胞リンパ腫の最近の遺伝子発現プロファイリングはICAM-2の発現増加を示した（Alizadeh et al. 2000）。興味深いことには、ICAM-2は染色体17q23-25にマッピングされるただ1つのICAM（１−５）である（Sansom et al. 1991）。染色体17q23-25は、ゲノムの不安定性に関連するセグメントであり、最近種々の癌において高度な異常を示すセグメントとして特定された（Dion et al. 2000; Dobo et al. 1995; Russell et al. 2000; Sugai et al. 2000）。これらの観察にもかかわらず、リンパ系疾患の症状の進行におけるICAM-2の役割及び分子としての性状決定は強調されなかった。
【０２２５】
我々は、アポトーシスの調節に必要であり、悪性表現型において増大される遺伝子を特定するために遺伝子スクリーニングを考案した。ヒト形質転換Ｔ細胞（Jurkat）レトロウイルスベクターｃDNAライブラリーを形質導入した細胞を抗アポトーシス表現型についてスクリーニングした。１つのｃDNAが再現可能な抗アポトーシス活性を表現型トランスファーアッセイで示した。このｃDNAは完全長の細胞内粘着分子−２（ICAM-2）をコードした。我々はここで、ICAM-2は抗アポトーシス作用を形質導入することができるものと確認したことを示す。ICAM-2の機能の性状決定によって、ICAM-2はPI3K／AKT経路の活性化によってアポトーシスをブロックするために十分な生存シグナルを仲介することが明らかになった。更にまた、細胞内AKT及びPI3K活性をフローサイトメトリーにより測定するためのプローブの開発によって、ヒト末梢血単球（PBMC）でICAM-2のクラスター形成の関数としてAKT活性を同時に測定することが可能になった。マルチパラメーターFACS分析によって、ICAM-2クラスター形成はCD4+及びCD19+の初代ヒト細胞でAKT活性を、続いてFas及びTNFα仲介アポトーシスからの保護をもたらすことが確認された。これらの観察によって、ICAM-2はPI3K／AKT細胞生存経路の活性化によって細胞の生存を仲介する役割を有することが確認される。これらの発見は、ICAM-2の不適切な発現は、腫瘍の進行及び転移による分散をもたらす、累積的過程において抗アポトーシス表現型に重大な影響を及ぼす可能性を示唆している。前記の発見はまた、AKT及び下流のエフェクターを含むシグナリング経路におけるICAM-2の明瞭な役割を強調している。
【０２２６】
結果
抗アポトーシス機能アッセイにおけるレトロウイルスｃDNAのスクリーニング
アポトーシスシグナリングを変更する遺伝子を特定するために、我々は、抗アポトーシス分子をコードするｃDNAをスクリーニングするためのレトロウイルスライブラリーによる解決手法を考案した（図26A）。悪性細胞タイプ（JurkatＴ細胞白血病）由来のｃDNAを、レシピエントの非悪性細胞（線維芽細胞）での抗アポトーシス機能についてスクリーニングした。アポトーシスは、スタウロスポリン（STP、植物由来のキナーゼ阻害性アルカロイドであり、ほとんどの細胞タイプでカスケード依存細胞死の強力な誘発物質である）で誘発された。偶発的バックグラウンドレベルを制限し、一方アポトーシス死の程度を最大にする誘発条件を決定した（出発細胞約104個のSTP処理擬似ライブラリーコントロールで最少バックグラウンドは生存細胞1個）。107個のNIH3T3線維芽細胞をJurkat細胞に由来するレトロウイルスｃDNAライブラリーで、組み込み数を細胞当たり１回に制限するために感染頻度40％で感染させた。LacZ-又はBcl2を発現するコントロールのレトロウイルスを調製し、同様な数のNIH3T3細胞に感染させた。アポトーシスは形質導入細胞培養でスタウロスポリン処理によって誘発し、続いて細胞を回復させた（図26A）。生存細胞クローンを増やし、再培養し、スタウロスポリンで再処理した。生存集団で発現されたｃDNAのコンプレキシティーをRT-PCRで評価した。主要ないくつかのバンドが３回選別後に観察された（図26B）。
複製能をもつモロニ−ネズミ白血病ウイルス（MMLV）を前記濃縮細胞集団に適用した。組み込み及びMMLVタンパク質の発現に際して、ライブラリーに由来する定住レトロウイルス構築物が感染性ビリオンに一緒にパッケージされ、未感作標的NIH3T3細胞に移された。続いてスタウロスポリン選別プロセスを再度適用した。このようにして、本物の表現型誘発クローンを１／バックグラウンドの割合で濃縮する（詳細は材料と方法の項を参照されたい）。一緒にプールしたライブラリーのうち３つがPCR後に特異的なバンドの濃縮を示した（図26B、レーン１及び２）。いくつかのバンドはPCRクローニングによってレスキューされ、これらバンドのうち１つの配列を決定して完全長のICAM-2ｃDNAをコードすることが明らかにされた（Staunton et al. 1989）。ICAM-2はそのインテグリンカウンターレセプターであるLFA-1との相互作用を介して白血球の粘着を調節する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（de Fougerolles et al. 1991; Simmons, 1995）。
【０２２７】
ICAM-2は生存シグナルを仲介する
内部リボソームエントリーサイト（IRES）をネオマイシン耐性遺伝子の上流に含むレトロウイルスベクター（pBMN-Z-IN）でICAM-2ｃDNAをクローニングした。NIH3T3線維芽細胞にICAM-2遺伝子を発現することができるレトロウイルスを、適切なコントロールベクター、pBMN-Z-IN（ベクターコントロール）及びpBMN-Z-IN-GFP（GFPベクターコントロール）とともに感染させた。ｐBMN-Z-IN-ICAM-2構築物を感染させたネオマイシン選別NIH3T3線維芽細胞（ICAM-2細胞と称する）での60ｋDのICAM-2の発現は、免疫ブロッティング（図27A）、フローサイトメトリー（図27B、28B）及び免疫沈澱（図28C）で確認した。発現されたICAM-2タンパク質はJurkat細胞由来の天然のタンパク質と一緒に泳動した（データは示されていない）。
スタウロスポリン処理は細胞内の因子排除（factor-withdrawal）に類似すると考えられ（Raff, 1992）、アポトーシスを誘発する。NIH3T3細胞におけるICAM-2発現は、アネキシン−V結合アッセイ（図27E）及びBrdU TUNELアッセイ（図29B）とともに核濃縮計測（図27C、27D）によって判定したとき、スタウロスポリン処理によって誘発されるアポトーシスの程度を制限し、スクリーニングで表現型によってクローンが選別されたことが確認された。興味深いことには、全てのアポトーシスの形態が抑制されたわけではなかった。ICAM-2過剰発現JurkatＴ細胞のFas誘発アポトーシスは、Fasレセプターに対するモノクローナル抗体の一連の濃度範囲で抑制されなかった（図27C、パネル３）。
【０２２８】
ICAM-2発現とリンパ増殖性疾患、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ-CLL）との相関性の報告（Molica et al. 1996）によって、我々は、マウスプレＢ細胞株である70Z/3でのICAM-2の抗アポトーシス活性のテストを急いだ。ICAM-2発現は、70Z/3細胞におけるスタウロスポリン誘発アポトーシスを抑制した（図28A）。スタウロスポリンは因子排除に類似すると仮定して、我々はICAM-2発現が因子依存細胞を因子排除から保護する能力を調べた。IL-3依存プロＢ細胞株のBaF3でのICAM-2の発現は、IL-3枯渇の後アポトーシスの開始を遅らせた（図28A）。更にまた、我々は、抗Fas抗体で処理することにより誘発したアポトーシスからBaF3細胞をレスキューするICAM-2の能力を調べた。ICAM-2は、これらの細胞でFas経路を介してアポトーシスの強力な阻害を示した（図28A）。これらの結果は、Bck2の形質導入コントロールと同程度であるか又はそれより優れており、従って前記の明白な作用はアポトーシスに対する穏やかな作用によるものとすることはできない（データは示されていない）。しかしながら、ICAM過剰発現JurkatＴ細胞はFas誘発アポトーシスから保護されなかった（図27C）が、スタウロスポリン誘発アポトーシスからは保護された（図28A）ので、抗アポトーシス作用には細胞特性が存在する。最近、高処理プロテオーム（proteome）分析によって、Jurkat細胞ではFas誘発アポトーシスは12の細胞骨格タンパク質の急速な破壊をもたらし、種々のシャペロンタンパク質及び細胞骨格構造タンパク質のリン酸化状態を変化させ、スタウロスポリン誘発アポトーシスよりも更に“アグレッシブ”な細胞死の形態を示すことが確認された（Gerner et al. 2000）。従って、異なる細胞死誘発物質はJurkat細胞で固有の生理学的特徴を有し、観察された相違が支持される。更にエフェクターカスパーゼは化学的に誘発されたアポトーシスではなくてもよいことが示された（Johnson et al. 2000）。
最初のスクリーニングは線維芽細胞で実施し、従って、ICAM-2の抗アポトーシス作用はそのリンパ球特異的インテグリンリガンド、LFA-1（CD11a／CD18）を介して仲介されたとは考えにくい。この可能性を調べるために、我々は、ICAM-2の細胞外ドメイン欠失（ΔN）型を調製し、それをBaF3細胞で調べた。細胞質ドメインの発現は完全な抗アポトーシス作用を付与するために十分であった（図28A）。このことは、ICAM-2の細胞質ドメインは、異所性に過剰発現されたとき生存シグナルを提供し、更におそらくレセプター架橋を模倣することによってその作用を示すことが示唆される。ICAMファミリーの細胞質ドメインを介するシグナリングはほとんど理解されていないので、我々は、ICAM-2がアポトーシス耐性を付与するシグナリング経路を特定することを試みた。
【０２２９】
ICAM-2の生存機能は膜−細胞骨格リンカータンパク質結合モチーフに存在する
ICAM-2は粘着分子と考えられ、リンカータンパク質、α−アクチニン及びエズリン（前記はICAM-2の細胞質ドメインと結合する）によってアクチン細胞骨格と互いに連結されることが示された（Heiska et al. 1996; Helamder et al. 1996）。ICAM-2の抗アポトーシスシグナル仲介におけるα−アクチニンの潜在的役割を評価するために、α−アクチニン認識配列をin vitroでα−アクチニンと結合することができないスクランブル配列に変化させた（Heiska et al. 1996）。ICAM-2、C末端欠失変異体（ICAM2-ΔC）及び変異α−アクチニン結合モチーフを含む完全長ICAM-2タンパク質（ICAM2Cスクランブル）をコードするレトロウイルス構築物を用いてNIH3T3細胞に形質導入した（図28B）。
天然のＮ末端ICAM-2のみを認識するICAM-2モノクローナル抗体（IC2/2）を用いて、感染細胞をFACSで分類した（de Fougerolles et al. 1991）。前記の方法によって、ICAM-2、ICAM2-ΔC又はICAM2-C-スクランブルタンパク質は適切に折り畳まれ、細胞質膜の外側面に誘導されることが確認された。エトポシド（また別の強力なNIH3T3細胞のアポトーシス誘発物質）処理及びスタウロスポリン処理の両処理の後で、ICAM-2変異体発現NIH3T3細胞を生存についてアッセイした。ICAM-2はNIH3T3細胞に強力な長期の生存を付与し、更に、ICAM-2のC末端欠失（ICAM2-ΔC）が細胞で発現されたとき生存シグナルは失われた（図28B）。ICAM-2の細胞質テールのα−アクチニン結合部位の変異もまた、エトポシド又はスタウロスポリン処理に対する防御を全く提供しなかった。更にまた、α−アクチニン及びエズリンはともに完全長ICAM-2とのみ同時免疫沈澱されるが、これら細胞骨格リンカータンパク質は抗アポトーシスシグナルの伝達に必要であったという説明を支持している。
【０２３０】
ICAM-2はAKTキナーゼを介してシグナルを発する
多くの粘着分子を介する生存シグナリングはPI3キナーゼを必要とするので（Frisch and Ruoslahti, 1997; Khwaja et al. 1997）、我々は、ICAM-2の抗アポトーシスシグナルでこの経路の役割を調べた。ICAM-2発現BaF3細胞のPI3キナーゼ阻害剤、ウォルトマンニンによる予備処理によってICAM-2仲介アポトーシス作用は阻止され（図29A）、ICAM-2生存シグナリングカスケードにおけるPI3キナーゼの関与が示唆された。前記の条件下で、賦形剤処理ICAM-2発現BaF3細胞はスタウロスポリン誘発アポトーシスに耐性を示した。同様に、ICAM-2形質導入NIH3T3のLY294002による処理は、アネキシン−V結合及びBrdU TUNELアッセイの両者によりフローサイトメトリーを用いて判定したときICAM-2の抗アポトーシス作用を停止させた（図29A、29B、フローサイトメトリーグラフについては添付書類を参照されたい）。
PI3キナーゼは、その下流のエフェクターAKT（PKB）キナーゼを介してアポトーシスを調節することが知られている（Downward, 1998）。AKTキナーゼは、種々のアポトーシス刺激（スタウロスポリンを含む）の下流で強力な抗アポトーシス作用を有する（Marte and Downward, 1997）（データは示されていない）。我々は、AKTキナーゼについてICAM-2発現線維芽細胞を調べた。ICAM-2を発現しているNIH3T3線維芽細胞はAKT活性化レベルの上昇を示した（図30A）。このAKTキナーゼ活性の上昇は、ICAM2-ΔC又は擬似形質導入細胞では観察されなかった。我々は更に、活性化AKTにおけるこのICAM-2依存上昇は、STP処理後に維持されることを両キナーゼアッセイによって、更にser473及びthr308の両者のリン酸化の確認によって実証した（図30A）。AKTキナーゼの標的はプロアポトーシスBch2ファミリーのメンバー、BADである。BADはセリン112及び136のリン酸化によって通常は不活性な状態で維持され、14-3-3に結合している。アポトーシスの誘発に際して、BADはser112及びser136の両者で脱リン酸化され、Bc1-2とダイマーを形成する。結果として、BcL2／Bcl-XLの平衡がシフトしてBCL-XLの遊離を促進し、チトクロームCの放出及びアポトーシスを仲介する（Datta et al. 2000）。BADは、ICAM2-ΔC形質導入及び擬似形質導入NIH3T3細胞のスタウロスポリン処理後に脱リン酸化され、アポトーシスの誘発が同時に生じる（図30B）。しかしながら、ICAM-2発現はBADのリン酸化の維持をもたらし（図30B）、AKTキナーゼ活性の保持と一致する（図30A）。
【０２３１】
BADは３つのリン酸化部位を有する：活性なp90Rsk1によって仲介されるser112、活性なAKTによって仲介されるser136、活性なPKA及び活性なp90Rsk１の両者によって仲介されるser155。ICAM-2及びBADser112のリン酸化に関連するその役割は他の場所で説明されるであろう（Perez and Nolan、原稿準備中）。BADser115のリン酸化は観察されなかった（データは示されていない）。抗アポトーシスシグナリングに必要とされるAKTキナーゼのまた別の標的、GSK3は、ICAM-2発現NIH3T3でリン酸化されることが見出され、おそらく抗アポトーシス作用に寄与するであろう（図30B、下段）。抗アポトーシスシグナルは、抗アポトーシスタンパク質、Bc1-2及びBCI-XLに対し明白な作用をもたず、典型的な抗アポトーシス経路は生存シグナルを仲介しないことを示した（図30C）。
【０２３２】
ICAM-2の架橋によって、抗アポトーシスシグナルの提供における内因性ICAM-2の役割が確認される
線維芽細胞における活性化AKTレベルのICAM-2依存上昇はリガンドとの相互作用とは無関係である。前記は、ICAM-2ΔNはアポトーシスから細胞を保護し、ICAM2-ΔCはAKTを活性化できないという事実によって決定された。このことは、表面ICAM-2分子のオリゴマー形成（粘着分子のごく一般的な作用態様である）によって発動されるシグナリングメカニズムを示唆している。表面オリゴマーはそれらの細胞質ドメイン内に相互作用部位を創出し、シグナリング分子を補充して膜基部での相互作用に参画させることができるであろう。定量的FACS分析によって、細胞表面上のICAM-2分子の密度は細胞タイプ間で大きく変動することが示され（図30D、定量方法については添付文書を参照されたい；詳細については実験方法の項を参照されたい）、先に記載されたように多様な発現パターンと相関性を示す（de fougerolles et al. 1991）。リンパ球でのICAM-2の基礎発現レベルは、ICAM-2表面分子の数で決定したときレトロウイルスベクターによる強制発現の１／100から１／10000未満であった。我々は、従って架橋されたとき内因性ICAM-2が上記で観察された表現型を付与できるか否かを調べることにした。
【０２３３】
この仮説を生理学的状況でテストするために、我々は、プロＢ細胞の内因性ICAM-2表面分子をモノクローナル抗体で架橋し（クラスターを形成させ）、標的としてGSK3を用いてAKTキナーゼ活性の活性化をアッセイした。我々は、BaF3細胞は低い内因性ICAM-2レベル（図30D）及びICAM-2の形質導入に際して抗アポトーシス表現型を示す（図28A）ので最初BaF3細胞を選択した。図3１Aに示すように、基礎AKT活性はアイソタイプのコントロール血清とのインキュベーションによって影響されない。対照的に、AKTキナーゼ活性は抗ICAM-2の添加後15分で3.5倍に増加し、続いてBAD ser136、AKT ser473 thr308及びFKHRのリン酸化をもたらした。AKTキナーゼ活性のこのレベルは、以下のBaF3細胞のIGF-1処理で測定された活性と一致する（A. Bartels and J.B.L. 未発表の結果）。AKT活性の結果は再現性があったが、我々はウェスタンブロット分析には不満足で、従って下記に述べるように、フローサイトメトリーによるAKT活性の単一細胞分析のために新規な方法を開発した（Perez and Nolan、投稿中、添付の原稿を参照されたい）。異なる細胞タイプ（Jurkat細胞）上の架橋ICAM-2はまた、アネキシン-V及びヨウ化プロピジウム染色のフローサイトメトリーで調べたとき（図31B−C）、スタウロスポリン誘発アポトーシスに対して保護作用を示した。AKTのリン酸化及び活性化は15分以内に観察された。続いてAKTの標的GSK3及びFKHRが時間依存態様でICAM-2の架橋によってリン酸化された（図31D）。LY294002とのインキュベーションは、JurkatＴ細胞及びBaF3細胞で架橋ICAM-2によって開始される抗アポトーシス作用を停止させた（データは示されていない）。
【０２３４】
ICAM-2抗体のクラスター形成が、アポトーシスプログラムの誘発後にアポトーシス機構に打ち勝つことができる細胞生存シグナルを開始させることができるか否かを知ることは興味深いことであった。これを調べるために、JurkatＴ細胞を1時間スタウロスポリンで処理してアポトーシスプログラムを開始させ、続いてICAM-2抗体のクラスター形成による生存に対してチャレンジした。アポトーシス開始の特徴は、PARPの切断、カスパーゼ９の切断、及びエフェクターカスパーゼ３及び７の切断によって検出されるようにスタウロスポリン処理の1時間後に明白であった（図31E）。興味深いことには、これら切断に関するアポトーシス指標の検出は、ICAM-2クラスター形成が時間の関数としてAKT活性を刺激するにつれ減少した（図31E−F）。これは、スタウロスポリンで処理されたがICAM-2架橋は実施されなかった細胞では観察されなかった（データは示されていない）。ICAM-2のクラスター形成は、スタウロスポリン誘発致死シグナルの存在下で、AKTリン酸化及びAKT活性の増加によって検出されるようにこれらの純正な細胞生存シグナルを開始させた。更にまた、BADリン酸化もまたこれらのチャレンジＴ細胞でICAM-2クラスター形成に続き、PI3K／AKT経路の活性化はアポトーシスプログラムを打ち負かすために十分であることを示した。
【０２３５】
in vivoでのICAM-2誘発AKT活性に対する生理学的関連を知るために、ヒトPBMCをTNFα及び抗Fasモノクローナル抗体で処理する前にICAM-2で架橋した。処理PBMCをCD4及びCD19の免疫表現型によりゲートコントロールし、続いてmuHi-パラメーターFACSによってAKT活性及びアポトーシスについてアッセイした。細胞内AKTキナーゼ活性の測定は、FACSによって検出可能な、AKT上のAKT−ホスホser473リン酸化部位に対するリン特異的蛍光プローブを開発することにより達成した（Perez and Nolan, 投稿中）。ICAM-2＋／CD4+のＴ細胞もICAM-2+／CD19+のＢ細胞もともに、ICAM-2がクラスターを形成したときにAKT活性を示した（図32A）。ICAM-2誘発AKT活性はFas及びTNFα誘発アポトーシスからＢ細胞を保護した（図32B）。CD4+のＴ細胞に対する抗アポトーシス作用はほとんど認められず（図32B）、おそらくこれらのＴ細胞では、我々の条件ではFas又はTNFαによってアポトーシスが強力に誘発されなかったためであろう。初代Ｂ細胞におけるアポトーシスの防御は、セリン473におけるAKTのリン酸化と完璧に相関し、Fas及びTNFα誘発アポトーシスに対するAKTの防御作用におけるこの標的セリンに対する先の役割が確認された。従って、ICAM-2のオリゴマー形成はPI3キナーゼの明瞭な膜への補充及びそれに続くAKTキナーゼの活性化をもたらし、その結果JurkatＴ細胞、BaF3プロＢ細胞並びにヒトの初代Ｔ及びＢ細胞で強力なアポトーシス抑制が生じる。
考察
細胞生存シグナルを仲介するICAM-2のモデル
我々の結果は、CD19+の初代Ｂ細胞と同様に多様な細胞タイプにおける内因性ICAM-2の異所性発現又は架橋は、細胞に対し生存シグナルを開始させることができることを示した。ICAM-2誘発AKT活性化は、細胞を化学物質（スタウロスポリン及びエトポシド）及び生理学的（TNFα及びFasリガンド）アポトーシス誘発物質に対して耐性にさせることができる生存シグナルである。ICAM-2はα−アクチニン及びエズリンと同時免疫沈澱し、重要な膜−細胞骨格リンカータンパク質との相互作用を明らかにした。ICAM-2の抗アポトーシス作用は、α-アクチニンと結合することが知られている21アミノ酸細胞質ドメインに依存した。特に、α−アクチニンはp85SH3‐ドメインを介してPI3キナーゼと直接相互作用することが示された（Shibasaki et al. 1994）。更にまた、ICAM-2細胞質ドメインは、膜−細胞骨格リンカータンパク質のエズリン／ラジキシン／モエシン（ERM）ファミリーのメンバーと結合する（Helander et al. 1996）。ERM−タンパク質は、膜−細胞質リンケージを促進することによって細胞の形態、粘着及び増殖を調節し（Tsukita and Yobeura, 1997）、更に腫瘍抑制因子、マーリン／シュワンノミンを包含して神経線維芽種症II型での関与が示唆される。更に、エズリン及び他のERMタンパク質は種々の疾患で粘着分子の分布の調節についてそれらの関与が示唆されている（Ichikawa et al. 1998; Stokowski and Cox, 2000; Turunen et al. 1998; Vinores et al. 1995）。最近、粘着依存生存は、PI3-キナーゼとの直接相互作用及びそれに続くAKT活性化を介して上皮細胞でエズリンによって仲介されることが報告された（Gautreau et al. 1999）。興味深いことに、ICAM-2のクラスター形成はエズリンの過剰発現によって誘発され、不適切な表面タンパク質のクラスター形成及びそれに続くシグナリングはERMタンパク質によって強力な影響を受けることが示唆された。従って、我々は、ICAM-2細胞質ドメインは、膜−細胞骨格リンカータンパク質（例えばα‐アクチニン及び／又はエズリン）と相互作用し、PI3キナーゼの膜への補充と活性化、更にそれに続くAKTキナーゼ仲介生存活性をもたらすことを提唱する。
【０２３６】
PI3K／AKTシグナリング系は、細胞外刺激（増殖因子、サイトカインの他に細胞外マトリックスへの粘着を含む）の普遍的仲介物質である（Downward, 1998）。AKTの活性化は、２つの部位、スレオニン308及びセリン473のリン酸化に依存する（Downward, 1998）。AKTのアミノ末端は、PI3Kのリン脂質生成物に直接結合すると考えられるプレックストリン相同性ドメインを含む。前記の結合によってAKTが膜に補充され、それによって構造的変化が誘発されてスレオニン308及びセリン473でそれぞれPDKI及びPDKIIによってリン酸化が可能になる（Alessi et al. 1996）。続いて二重にリン酸化されたAKTは活性をもち、多数の下流のエフェクターをリン酸化させることができる。AKTが細胞死を抑制すると考えられるまた別の態様は、ミトコンドリアのチトクロームCの放出を防止することによるものである（Kennedy et al. 1999）。ICAM-2のクラスター形成によって誘発されるAKTキナーゼの活性化は、BAD、GSK3、FKHR及びAFXのリン酸化によって検出されるようにいくつかの下流エフェクターの活性化をもたらした。ser-136でのBADのリン酸化はBCL-XLの代わりに14-3-3への結合をもたらし（Zha et al. 1996）、Bc1-2ファミリーメンバーの平衡をシフトさせて細胞の生存を促進する。GSK3活性は、PI3Kの抑制から生じるアポトーシスに必要であることが示された（Pap and Cooper, 1998）。GSK3のリン酸化はその活性を抑制し、従って抗アポトーシスシグナルを提供するであろう。FKHRのリン酸化は、核へ移動してFKHR依存転写を開始させるその能力を抑制する。核内では、脱リン酸化されたFKHRは標的遺伝子（例えばある種の細胞のFasリガンド）を誘発し、アポトーシスを始動させる（Brunet et al. 1999）。AFXのリン酸化は、p27（細胞周期阻害物質）の転写活性を抑制する（Graff et al. 2000） 。更に、AKTは、カスパーゼ９（ヒトカスパーゼ９）をリン酸化し不活化する能力、eNOS（内皮細胞）をリン酸化し血管内皮の血管形成を促進する能力、及び潜在的な他の基質をリン酸化する能力を有する（Cardone et al. 1998; Kureishi et al. 2000）。AKTの過活性は多数の疾患で観察された（Haas-Kogan et al. 1998）（Kulik et al. 1997; Shan et al. 2000; Wick et al. 1999）。これらのデータは全て、ICAM-2の活性化は極めて強力な抗アポトーシスシグナルを細胞内で生じることを予測させるであろう。ICAM-2とPI3K／AKT経路との相互作用のモデルは図23Cに示されている。
【０２３７】
ICAM-2過剰発現によって、及びICAM-2クラスター形成によって仲介される抗アポトーシス作用は、不適切なICAM-2発現は抗アポトーシス表現型に寄与することを示唆している。粘着分子として、ICAM-2はリンパ球の再循環における役割をもち、更にそのレセプターLFA-1との相互作用を介してＴ細胞：Ｂ細胞の接触の強化及び安定化における役割を示した（Damel et al. 1992; Douglas et al. 2000）。ここで、我々は、粘着分子の特性をもつということに加えて、ICAM-2は、細胞表面でクラスターを形成したとき細胞内シグナルを伝達することができると提唱する。ICAM-2のクラスター形成の意義は、（癌におけるその過剰発現のために、又はレセプター仲介嵌合により）、さもなくばアポトーシスによって死に至るべき細胞を生存に導くことであろう。前記によって腫瘍の薬剤耐性及び細胞増殖性疾患、例えばＢ細胞の慢性リンパ球性白血病（B-CLL）がもたらされるであろう。例えば、ICAM-2は、B-CLL患者のCD5+Ｂ細胞で（Molica et al. 2000）、更に患者に由来する大きなＢ細胞リンパ腫で（Alizadeh et al. 2000）強く発現されることが報告され、ICAM-2又は他の粘着分子はある種の白血病で役割をもつことが示唆された。正常な細胞では、ICAM-2仲介PI3K活性化はおそらく好酸球の内皮細胞貫通遊走を調節し（Gerwin et al. 1999）、潜在的には（DC-SIGNを介して）樹状細胞の内皮貫通遊走を調節することができるであろう（Geijtenbeek et al. 2000）。
【０２３８】
我々の結果は、ICAM-2の過剰発現及びクラスター形成はＢ細胞で抗アポトーシスシグナルを提供し、前記細胞をTNFa及びFasリガンドによって誘発される２つの生理的な致死プログラムに対して耐性にすることができることを示している。特に、ICAM-2の発現は多くの組織培養細胞株でそれらの対応する正常型と比較したときアップレギュレーとされ、ex vivoで細胞は細胞生存シグナルを開始させる必要があることが示唆される（de Fougerolles et al. 1991）。ここに提示した実験は、以前に認識されていなかった機能がICAM-2によるものであることを示している。ICAM-2は、多様な細胞株及びヒト初代細胞で抗アポトーシス表現型を誘発するだけでなく、異所的及び内在的に細胞生存シグナルを示すという発見は、脱調節又は誘発クラスター形成はおそらく腫瘍の進行をもたらす抗アポトーシス表現型に大きく貢献することを示唆している。従って、ICAM-2の発現及び調節又は他の粘着分子の調節に関与する経路は、抗腫瘍療法の開発で重要であろう。
【０２３９】
実験方法
レトロウイルスｃDNAスクリーニング
レトロウイルスの産生及び感染は記載に従って実施した（Kitamura et al. 1995; Onishi et al. 1996; Rayner and Gonda, 1994）。ｃDNAライブラリーはJurkat Ｔ細胞からpBabe-Sベクターで調製した（Hitoshi et al. 1998）。前記ライブラリー（2ｘ106一次形質転換体）を用いて約107のPHOENIX-Eパッケージング細胞にトランスフェクトした。ｐBMN-LacZコントロールベクターを1：10の割合で前記ライブラリーに加えトランスフェクション／感染効率をモニターした。ウイルス上清を採集し、約107の指数関数増殖期のNIH3Ｔ3細胞に感染させた。感染後48時間で細胞を分割しβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。ライブラリーにより形質導入したNIH3T3細胞を合流度約25％で播種し、24時間後に培養液を1μMのスタウロスポリン（STP; Sigma, St. Louis, MO）を含むDMEMに交換した。24時間処理した後、前記STP含有培養液を完全なDMEM／10％ドナーウシ血清と交換した。生存細胞を約80％の合流度に到達させた（７日）。生存細胞を前記に記載したように更に２ラウンド再処理した。
表現型トランスファーアッセイ
ライブラリー感染生存細胞の部分標本にモロニーネズミ白血病ウイルス（T. Kinsella (Stanford)より贈与）を重感染させた。重感染細胞を２週間継代してヘルパーウイルスを効率的に拡散させた。未感作NIH3T3細胞をウイルス上清で感染させ、48時間発現させた。続いて再感染細胞を上記で述べたようにスタウロスポリンで処理した。生存細胞を７日間培養し、RT-PCRによってトランスファーについて分析した。
プロウイルスｃDNA挿入物のRT-PCRクローニング及び構築物の作製
RNAは酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法によって記載のように（Chomczynski and Sacchi, 1987）調製した。ｃDNAは４μgの熱変性全RNAから50μLの反応容積で作製し（Primega, Madison, WI）、42℃及び55℃で45分インキュベートした。ｃDNA反応生成物（５μL）を50μLのPCR反応ミックス（Perkin-Elmer, Foster City, CA）で95℃／30秒；55℃／60秒；72℃／２分で25サイクル増幅させた（プライマー：5'-GATCCTCCCTTTATCCAG；5'-GAATGAAAGACCCCACCTGT）。完全長のICAM2ｃDNAをレトロウイルスベクターｐBM-Z-IN骨格（Kinoshita et al. 1998）のBamHI／Sal１部位でクローニングした。ICAM2-AC、ICAM2-AN及びICAM2-C末端スクランブルをPCRで作製し、BamHI／Sal１部位でクローニングした。
【０２４０】
細胞培養及び初代細胞の調製
NIH3T3ネズミ線維芽細胞は、DMEM、10％DCS、１％PSQ（ダルベッコー改変イーグル培養液、10％ドナー仔牛血清、１％ペニシリンストレプトマイシン（1000単位／mL及び2mMのL-グルタミンPSQ）中で維持した。JurkatＴ細胞及びCH27形質転換Ｂ細胞は、RPMI-1640、10％FCS、１％PSQで維持した。BaF3プロＢ細胞は、RPMI-1640、10％FCS、１％PSQ、400U/mLのIL-3（Peprotech）中で維持した。70Z/3プレＢ細胞はRPMI-1640、10％FCS、１％PSQ、50μmのβ-メルカプトエタノール中で維持した。HL60骨髄白血病細胞はOpti-Mem I、10％FCS、１％PSQで維持した。293Tヒト線維芽細胞は、DMEM、10％FCS、１％PSQで維持した。細胞は５％CO2／37℃加湿インキュベーターで維持した。形質導入細胞は500 １μg/ｍLのG418（Sigma）で維持し、構築物の適切な発現は、表示したように完全長のICAM-2、ICAM-2ΔC、ICAM-ΔNのウェスタンブロット及びFACS分析によって確認した。スタウロスポリン（Sigma）処理は特に表示がないかぎり１μMで24時間であった。LY294002処理は、以後の全ての処理の前に10μMで30分実施した。ウォルトマンニン（Sigma）処理は100ｎMで24時間であった。化学物質はDMSOに溶解させ（溶媒希釈について最終的に１：1000であった）、ベクターコントロールは陰性コントロールとして１％のDMSOとともにインキュベートした。ベクターコントロールは表示したようにｐBMN-Z-IN（空ベクター）の形質導入又はｐBMN-Z-IN-GFP（http://www.stanford.edu/group/nolan/plasmid_maps/pmaps.html）から成る。ｐBMN-Z-IN-GFPの感染頻度は、３つの別々のウイルス形質導入について48％±10であった。タンパク質発現についてフローサイトメトリーにより日常的にモニターしたとき、持続的なネオマイシン選別によって、均質なICAM-2、ICAM2-ΔC、ICAM-ΔN又はコントロールベクター集団が得られた。初代細胞の調製の場合、単核細胞はヒトの末梢血からフィコール−プラーク密度遠心分離及び粘着プラスチック培養皿上での粘着細胞の排除によって単離した。単離細胞は完全培養液で維持し、CD4、CD3、CD19、及びICAM-2発現についてFACSによって分析した。
【０２４１】
架橋
抗体架橋実験は、10μg／ｍLでＮ末端領域（細胞外ドメイン）を認識する、マウス抗ICAM-2モノクローナル抗体を用いて実施した。スピン透析（Biorad）を用いて、アジ化物含有抗体（0.01％）の緩衝液をリン酸緩衝食塩水（pH7.4）と交換した。抗マウスIgG（Sigma）を架橋実験のコントロール抗体として用いた。106のJurkat又はBaF3細胞の血清をそれぞれ３時間又は４時間枯渇させた。細胞をICAM-2又はマウスIgG（10μg/ｍL）で37℃で表示した時間インキュベートした。時間は、シグナリング経路の大半を減弱させるために血清枯渇後に開始するか、又は表示のとおりであった。血清枯渇３又は４時間では、カスパーゼ３活性、細胞周期分析、アネキシンV／PI染色によって調べたときアポトーシスの生化学的開始は認められなかった（データは示されていない）。細胞抽出物を作製し、免疫沈澱又はイムノブロッティングのどちらかを実施した。初代細胞のICAM-2クラスター形成は、FITC結合抗ヒトICAM-2（IC2/2 Research Diagnostics）を用いて実施した。その後のICAM-2の染色によってICAM2のクラスター形成及びシグナルトランスダクションが生じた。
【０２４２】
アポトーシスアッセイ
アポトーシスは、表示に従って、濃縮核、フローサイトメトリーによるアネキシン-V結合又はフローサイトメトリーによるTUNEL BrdU染色の計測のいずれかによって決定した。アポトーシスは以下のいずれかによって誘発した：適切な実験での表示に従ってスタウロスポリン（１μM）、抗マウスFas（５μg/mL, Santa Cruz Biotechnology (SCB)）、抗マウスFas（５μg/ｍL Jo2 Biomed）又は抗ヒトFas（10ng/mL CH11 Kamiya Biomedical）による処理、IL-3排除（24時間又は表示のとおり）。濃縮核の計測の場合、NIH3T3細胞をガラスのカバースリップに増殖させ、アポトーシスについて調べた。浮遊細胞は、25μMのアクリジンオレンジ／25μMの臭化エチジウム又は５μg／ｍLのヘキスト33342（Molecular Probes, Eugene, OR）による核染色によって分析した。アポトーシスは、報告されたように（Jacobson and Raff, 1995）特徴的な濃縮核の存在によって確認された。少なくとも５つの個々の視野を写真撮影し、ツァイスアキシオスコープ蛍光顕微鏡を用いて計数した。生存アッセイの場合、106のNIH3T3細胞を10cmの皿に播種し、37℃で一晩インキュベートした。前記細胞を１μMのスタウロスポリンで24時間処理した。前記細胞を洗浄し完全培養液で24時間培養した。細胞をトリプシン処理し、生細胞をトリパンブルー染色の後で計数した。未処理細胞は前記処理時に計数した。％生存は、（処理後の生細胞の数）／（処理前の生細胞の数）を表す。FACSによるアネキシン-V-FITC（SCB）／PI（Clontech）染色は記載のように実施した（PharMingen）。TUNELアッセイはアポトーシスBrdUキット（Promega）の製造元の記載に従って実施した。フローサイトメトリーのデータ採取は、BrdU（10,000事象採集）及び濃縮核カウントの両者についてスタウロスポリン処理（1μM）後24時間、アネキシン-V結合（100,000事象採集）についてスタウロスポリン処理後12時間で実施した。アネキシン-V陽性細胞は処理後24時間で膜の抵抗性は減弱（compromised）しているであろう。フローサイトメトリー分析はCELLQuestを用いてBD FACSCaliburマシーンで実施し、フロージョソフト（Tree Star）を用いて分析した。
【０２４３】
AKTキナーゼアッセイ
AKT活性は細胞からAKT1を免疫沈澱させて検出し、GSK3融合タンパク質（NEB）によるキナーゼアッセイで用いた。２ｘ106のNIH3T3、２ｘ106のJurkat又は５ｘ105のBaF3細胞を、固定したAKT 1G1モノクローナル抗体（ｍAb）（1：200、NEB）とともに４℃で穏やかに揺らしながら２時間インキュベートした。免疫複合体を細胞溶解緩衝液で４回洗浄し、200μMのATP及び１μgのGSK-3融合蛋白質（CST）を補充した40μLのキナーゼ緩衝液（25ｍMトリス（pH7.5）、５ｍMのβ-グリセロホスフェート、２mMのDTT、0.1ｍMのNa3VO4、10ｍMのMgCl2）に30℃で30分再懸濁した。キナーゼ反応は、SDSサンプル緩衝液で停止させ、5分間煮沸し、GS3Kのリン酸化状態は免疫ブロッティングによって検出し、ECL検出（Amersham）を用いて可視化した。イムノブロットは３つのそれぞれ別個にウイルスによって形質導入した細胞集団のそれぞれ３回繰り返した典型例である（ｎ＝９）。AKT活性は、ser473及びthr308に対するリン特異的抗体（NEB）を用いてイムノブロッティングによりAKTのリン酸化によって実証した。
【０２４４】
免疫沈澱及びイムノブロッティング
細胞抽出物は、２ｘ106細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって調製した。溶解緩衝液は以下を含む：20ｍMトリス（ｐH7.5）、150ｍMのNaCl、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、１％トリトンX-100、2.5ｍMのNa2PO4、１mMβ−グリセロホスフェート、１mMのNa3VO4、１μg/ｍLのロイペプチン、１ｍMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Boehringer Mannheim）。抽出物を14000rpm（５分、４℃）で遠心し、細胞溶解物（BCAタンパク質アッセイ（Pierce）によって測定したとき20μg）を標準的な方法を用いて12％又は15％のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、PVDFメンブレンに移した。免疫沈澱物は、プロテインＡ／G＋アガロースビーズ（SBC）によって予備清澄化を実施した。IPを一次抗体で１時間又は一晩、プロテインＡ／Ｇ＋アガロースビーズで１時間インキュベートし、更に溶解緩衝液で４回洗浄した。ブロットは以下の抗体とインキュベートした：ICAM-2 N末端（1:500、SBC）、抗ICAM C末端（1:500、SBC）、抗ICAM2 IC2/2 mAb（1:500、BD Biosciences）、抗α-アクチニン（1:500、SBC）、抗エズリンmAb（1:500、Transduction Laboratories）、抗Bcl2（1:500、SBC）、抗p27（1:500、SBC）、抗p21（1:500、SBC）、抗ｃFLIP（1:500、SBC）、抗ホスホ‐AKT-Ser473（1:1000、NEB）、抗ホスホ‐AKT‐thr308（1:1000、NEB）、抗AKT（1:1000、NEB）、抗ホスホ‐BADser155（1:1000、NEB）、抗FKHR（1:1000wb、1:200 IP NEB）、抗ホスホ‐FKHR（1:1000、NEB）、抗ホスホ‐Gsk3α/021（1:500、NEB）、抗切断PARP（1:1000、NEB）、抗切断カスパーゼ9（1:1000、NEB）、抗切断カスパーゼ３（1:1000、NEB）、抗切断カスパーゼ７（1:1000、NEB）、抗ｐAFX（1:1000、NEB）、抗カスパーゼ９（1:1000、NEB）、抗カスパーゼ７（1:1000、NEB）、抗PARP（1:1000、NEB）。BADリン酸化は全BADを免疫沈澱させ（1:200、NEB）、BADリン酸化検出キット（NEB）の製造元の推奨に従って、抗BADser112（1:1000、NEB）及び抗BADser136（1:1000、NEB）でイムノブロットを実施することによって決定した。使用した二次抗体は以下のとおりである：抗ウサギHRP（1:5000、NEB）、抗マウスHRP又は抗ヤギHRP（1:5000、SBC）。更にECL検出（Amersham）又はコダックデジタルサイエンス440Cステーションを用いて可視化した。ブロットは少なくとも３つの別個の実験の典型例である。
【０２４５】
フローサイトメトリー及びＦＡＣＳ分析
細胞内及び細胞外染色は記載（www.metezoa.com/UPL3287）されたように実施した。使用した抗体は以下のとおりである：抗ICAM2 N末端（SBC）、抗ICAM N末端（SBC）、抗ICAM2 FITC mAb（BD Biosciences）、アネキシン-V-FITC（BD、Biosciences）、アネキシン‐V-ビオチン（SBC）、PI（Clontech）。使用した二次抗体は以下のとおりである：抗ウサギPE（BD Biosciences）、抗マウス‐FITC（BD Biosciences）、抗ウサギFITC（PharMingen）、抗ヤギFITC（BD Biosciences）、抗ヤギテキサスレッド（BD Biosciences）、ストレプトアビジン‐PE（BD Biosciences）、ストレプトアビジン‐FITC（BD Biosciences）、抗ヒトCD4-APC（PharMingen）、抗ヒトCD19-PerCP（PharMingen）、抗ヒトICAM2-FITC（Research Diagnostics IC2/2）。AKT活性のための細胞内プローブは、抗AKTser473モノクローナル抗体（Cell Signaling Technology）をアレキサ568染料（Molecular Probes）にアレキサ568タンパク質結合キット（Molecular Probes）を用いて結合させて作製した。リン特異性はウェスタンブロッティング及びFACS分析によって、多様なPI3Kの活性化物質及び阻害剤に対して調べた（データは示されていない）。ホスホ−AKTser473アレキサ568による細胞内染色は、NIHT3T細胞を血小板由来増殖因子（Sigma）で刺激したとき及び刺激前にLY294002で阻害したときAKTキナーゼ活性を反映した。定量的FACS分析は記載されたように実施した（Davis et al. 1998; Lyer et al. 1998; Lenkei et al. 1998）。簡単に記せば、R-フィコエリスリン（PE）（Molecular Probes）をタンパク質架橋キット（Molecular Probes）の製造元の推奨に従って抗ICAM2 N末端モノクローナル抗体（Research Diagnostics IC2/2）と結合させ、化学量論的適切性を調べ（データは示されていない）、Quantibrite-PEビーズ（BD Systems）を用いて定量した。定量的カリブレーション曲線は既知量のPE分子／ビーズを含むQuantibrite-PEビーズを用いて作製した。直線回帰分析を以下の等式を用いて実施した：log10（PE蛍光）＝勾配*log10（PE分子／ビーズ）＋切片。PEの蛍光はPEチャネルの相乗平均を得ることによって決定される。定量は、PKと直接結合させた抗体についてのみ有効である。飽和量の抗体を用い、更に十分に洗浄することによって全表面抗原の結合が担保される。氷上でのサンプル調製は抗体の内在化を減少させる。未知の細胞集団に対する細胞の表面抗原は、カリブレーション曲線を用いてPEの相乗平均をコンピュータで処理して決定される。定量FACS分析は表面抗原の発現について概算を提供する。抗体の結合価は使用したモノクローナル抗体について調べられていないので、グラフの数字は相対的表面分子数を表し絶対数ではない。フローサイトメトリー分析はBD FACSCaliburマシーンで実施し、FlowJoソフト（Tree Star）を用いて分析した。CellQuestは、定量的フローサイトメトリー及びQuantibrite-PEビーズの直線回帰分析のために用いた。フローサイトメトリーのデータは、106細胞／分析サンプルによる３つのそれぞれ別個の実験の典型例である。100,000事象を収集するか、又は別に記載したようにカリブライトビーズ（BD systems）を用いて修正した。棒線グラフに示したデータは３通りの実験の平均値（棒線）±SDとして表されている。
【０２４６】
参考文献
2005517174.tif 000036
【０２４７】
2005517174.tif 000037
【０２４８】
2005517174.tif 000038
【０２４９】
2005517174.tif 000039
【０２５０】
2005517174.tif 000040
【０２５１】
2005517174.tif 000041
【０２５２】
2005517174.tif 000042
【０２５３】
2005517174.tif 000043
【０２５４】
実施例６
ヒトCD56+CD8+Ｔ細胞の細胞毒性に必要なICAM-2（CD102）シグナリング事象
本実施例では、本発明の方法及び組成物を用いて本発明者ら（ここではまた“我々”と称する）は、白血球機能抗原−１（LFA-1）は免疫細胞シナプスの形成に必須であり、種々の自己免疫疾患の病理において役割をもつことを示す。本実施例では本発明の方法及び組成物を用いて、本発明者らは、ICAM-2は、微小管及びアクチン細胞骨格の両者によるレセプターのクラスター形成及び活性化につながるLFA-1シグナルトランスダクション経路を誘発することを示す。ICAM-2は、単一細胞分析によって測定したとき21.7pM／細胞結合親和性を示した。ICAM-2／LFA-1の嵌合は、PKCの活性化及びアクチンと微小管細胞骨格の両者の再編成を誘発した。前記の事象は、活性なLFA-1を介する細胞毒性Ｔ細胞エフェクター−標的細胞結合に際して、p44/42 MAPK経路のSyk依存活性化をもたらした。ICAM-2は、ヒトCD56+CD8+パーフォリン放出及びその結果としての標的白血病細胞に対する細胞毒性を仲介する。他のICAM類と比較して、ICAM-3はICAM-2の作用にもっとも類似し、ICAM-1と類似しない。IL-2予備活性化ヒトPBMCでは、CD56+CD8med集団のパーフォリン放出の仲介はICAM-2＞ICAM-3＞＞ICAM-1であった。全てのICAM類は、CD56+CD8high集団でパーフォリン及びグランザイムAの低下に寄与した。これらの結果によって、サブセット特異的細胞毒性Ｔ細胞免疫におけるICAM-2／LFA-1の固有の機能的帰結が確認された。
【０２５５】
序説
白血球機能抗原−１（LFA-1）は、白血球の粘着に必要なα、βヘテロダイマーインテグリンである（van Kooyk and Figdor, 2000）。現時点で、LFA-1はリンパ球粘着に参画し、免疫学的シナプスの形成（Dustin and Shaw, 1999）並びにリンパ球の血管外遊出及び再循環（Volkov et al. 2001）で主要な役割をもつことはよく知られている。LFA-1粘着は細胞内粘着分子（ICAM）−１、−２及び３リガンドによって管理されている（van Kooyk and Figdor, 2000）。白血球粘着不全症（LAD）（LFA-1インテグリンの変異又は欠損を示す症状）の患者は、重篤な再発性細菌感染及び全体的免疫障害を示す（Bunting et al. 2002）。前記臨床症状の中で特に、LFA-1ノックアウトマウスは、LFA-1が養子免疫療法における腫瘍退縮の仲介で潜在的な役割を果たすことができることを示唆した（Mukai et al. 1999; Nishimura et al. 1999）。前記の研究は、遺伝的にリンパ球粘着分子と免疫機能障害とを結びつけたが、これら疾患の免疫病理を仲介する分子の詳細はほとんど理解されていない。
LFA-1の研究は最初 インテグリンの粘着の役割に向けられていた。LFA-1インテグリンの活性化及びレセプターのクラスター形成の生理的プロセスはどのように相互に関連し更にリガンド結合に際して細胞シグナルに変換されるかは明らかではない。これらの事象が存在しない場合、どのようにしてLADの破壊的な作用及びLFA-1ノックアウトマウスでの免疫障害反応がもたらされるのかはよく理解されていない。我々は、従ってICAM−LFA-1の相互反応モデルの分子的詳細を解明し、細胞対細胞接触で開始するLFA-1のシグナリングメカニズムを理解しようとした。可溶性ICAM-2による処理時のLFA-1レセプターの動的変化をモニターするためにマルチパラメーター単一細胞分析を利用し、我々は、アクチン及び微小管の両者によってICAM-2粘着がLFA-1の活性化及びクラスター形成と結びつけられることを見出した。微小管細胞骨格は、マルチパラメーターフローサイトメトリーで測定されるようにLFA-1の構造変化（活性化）（LFA-1のクラスター形成が進行する事象）を強制した。前記誘発されたLFA-1の活性化はp44/42マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK；RAF／MEK／ERK）経路の活性化（Pyk2及びSykキナーゼ活性の両者に依存する事象）をもたらす。
本発明者らは、細胞毒性Ｔ細胞と標的白血病細胞との間の粘着（細胞対細胞接触を必要とする事象）におけるICAM-2仲介LFA-1活性化についての分子的詳細を研究した。ヒトCD56+CD8+Ｔ細胞のICAM-2刺激は、白血病細胞のパーフォリン／グランザイム−A仲介細胞毒性を誘発することができた。この誘導細胞死は、ICAM-3及び前記よりも少ない程度でICAM-1、他の２つのLFA-1リガンドによって分担された。これらの結果はICAM-2／LFA-1誘導細胞毒性Ｔリンパ球免疫のためのシグナリングメカニズムの特徴を示し、腫瘍によるICAM-2及びおそらくはICAM-3の分泌は誘導細胞毒性Ｔ細胞免疫反応を回避させる可能なメカニズムを示唆する。
【０２５６】
結果
リコンビナントICAM-2はLFA-1仲介粘着を促進する
本発明者らは、Jurkat細胞株モデルを実験系として選択し、先ず初めにLFA-1シグナリングメカニズムを分析し、続いてヒトＴ細胞での発見を実証した。生化学的に精製したICAM-2タンパク質を調製し、他のリガンドの非存在下でICAM-2／LFA-1相互作用を調べた（補充図33A−Bを参照されたい）。我々は、レトロウイルスで形質導入したNHI3T3細胞から免疫親和性クロマトグラフィー及びそれに続くゲルろ過を用いてヒトICAM-2を精製し、それをNSOネズミミエローマ細胞で産生されたICAM2−FC融合タンパク質と比較した。これらのネズミ系哺乳類発現系は、それらがICAM-2の生物活性型を産生するということから選択された。ICAM2−FCタンパク質の生化学的分析は、融合タンパク質の予想される分子量と一致し（76ｋD、図33A）、精製ヒトICAM-2は72から74ｋDの分子量を示した（図33A）。このサイズは、JurkatＴ細胞から精製した75ｋＤのICAM-2と類似していた（データは示されていない）。
本発明者らはFITC結合ICAM-2（ICAM2−FITC）を作製し、LFA-1レセプターの動的変化をフローサイトメトリー及びレーザー走査共焦点顕微鏡検査（LSCM）によって調べた（補充図33Cを参照されたい）。我々は、ICAM2−FITCの結合カイネティクスを単一細胞でモニターすることによって、LFA-1レセプターのリガンド結合について調べた。最初の150秒で低結合が観察され、それに対して750秒まで増加が続き、その後一定になった（図33B、中央パネル）。対照的に、α‐LFA-1抗体は、初めの50から100秒で最初の結合を示し、800秒まで均衡を保った（図33B、下パネル）。PMA処理によるLFA-1の予備活性化（McDowall et al. 1998）によって、ICAM-2の即時結合が示された（図33C、上パネル）。150秒後に徐々にICAM-2が結合するのは、何らかの結合誘発事象（α‐LFA-1又はPMA活性化LFA-1を用いたときには観察されない特質）の後で、LFA-1とそのICAM-2リガンドとの結合の強化が生じることを示唆した（図33B）。ICAM2−FITCの結合はトリプシン処理細胞では観察されず（データは示されていない）、LFA-1に対する抗体によってブロックされた（下記で説明する）。従って、時間の関数としてICAM-2リガンドの結合の増加があるようで、標的細胞上に誘発される結合部位が存在することが示唆された。
【０２５７】
ICAM-2結合集団のフローサイトメトリー分析によって、アクチン細胞骨格及び温度の両者に対する依存性が示された。ICAM-2粘着は４℃に対して37℃で強化された（図33C）。アクチン脱重合剤サイトカリシンDによる予備処理は２つのICAM-2結合集団を37℃及び４℃の両方で明らかにし、α‐LFA-1で観察された結合現象とは対照的であった（図33C）。ICAM2−FITCの飽和は37℃で４℃より容易に観察された（データは示されていない、補充図33Dを参照されたい）。ICAM-2の単一細胞結合親和性の測定は、細胞当たりのICAM2−FITC結合百分率をコンピュータで計算して得た（図33D）。曲線適合分析によって、解離定数は0.21±0.07μM／104細胞であることが示された（図33D）。この値は21.7pM／細胞に等しく、細胞表面LFA-1の生理学的状況内でICAM-2について報告された最初のリガンド結合測定を示している。従って、ICAM-2リガンド結合の定量的単一細胞分析によって生理学的温度での強力な結合が示唆される。
【０２５８】
可溶性ICAM-2はLFA-1のクラスター形成及び細胞骨格の分極化を誘発する
本発明者らは、LFAの嵌合が細胞骨格構造を変化させるか否かを調べ、ICAM-2刺激に際してアクチン及び微小管の両細胞骨格の再編成を観察した（図34A）。本発明者らは細胞骨格構造をフローサイトメトリーでモニターし、ICAM-2結合時にアクチン及び微小管の構成が同時に変化するのを観察した（図34B）。前記の作用は脱重合化と一致する。ICAM-2処理は１分以内のLFA-1の迅速なクラスター形成を誘発した（多数のクラスター形成事象が５分で生じる）（図34C、左パネル）。ICAM2−FITCリガンドを用いて細胞表面を可視化することによって、ICAM-2リガンドはLFA-1レセプターのクラスター形成を誘発することが示された（図34C、左パネル）。このクラスター形成事象はノンブロッキングβ２インテグリン抗体（クローンCTB104）を用いてある程度の同時局在を示した（図34C、右パネル）。従って、我々は、ICAM-2とLFA-1の結合は、LFA-1／ICAM-2複合体の再編成をもたらすシグナルを誘発すると推測した。我々は従って、アクチン／微小管細胞骨格で観察される変化との関係で前記の推測を調べることにした。
本発明者らは、ICAM-2結合時のLFA-1レセプターの動的変化をフローサイトメトリーによって調べ、LFA-1活性化とクラスター形成との相関性をみた。我々は、FACSCaliburマシーンで二重識別子（doublet discriminator）モジュールを用いて、単一細胞のレーザー励起時の分散及び集中蛍光パルス（FFP）間を識別した。４℃に対して37℃でのICAM-2のインキュベーションはFFPの現象を示した（前記はサイトカリシンD処理に際して大きく強化される作用である）（図34D）。ICAM2−FITCの表面結合を蛍光の強度でモニターし、蛍光パルス（FP）の飛行時間（time of flight, TOF）に対して標準化した。TOFはレーザー励起細胞面積と比例するので、我々は、ICAM2−FITCの強度／TOFの値をLFA-1のクラスター形成のための定量的評価と解釈した。前記の値をICAM-2刺激に対する時間の関数としてコンピュータで計算したとき（図34E）、前記時間はLSCMで観察されるクラスター形成事象の増加と比例している（図34C）。
【０２５９】
ICAM-2の粘着は微小管細胞骨格によって調節されるLFA-1の構造変化を誘発する
ICAM-2の粘着強化及びLFA-1クラスター形成の誘発は、ICAM-2リガンドに対する全体的なアビディティーの増加を反映しているが、前記は必ずしもLFA-1の活性化状態（高親和性状態）を反映しているわけではない（McDowall et al. 1998）。LFA-1活性化に際して構造変化によってmAb24抗体によって認識されるエピトープが露出される（Neeson et al. 2000）。ｍAｂ24−アレキサフルア633結合物を用いてICAM-2刺激時のLFA-1の活性化状態をフローサイトメトリーで調べた。非刺激細胞はｍAb24の結合を示さず、PMA処理により観察された誘発とは対照的であった（図34F）。ICAM-2刺激細胞は、活性なLFA-1で二形態性集団を示した（サイトカリシンによって減弱された作用である）（図34F）。微小管破壊剤（ノコダゾール及びタキソール）による処理は、ICAM-2刺激に際してLFA-1の完全な活性化をもたらした（図34F）。対照的に、サイトカリシンDによるアクチン細胞骨格の破壊はICAM-2誘発LFA-1活性化を減少させたが、LFA-1レセプターのクラスター形成及びそれに続くICAM-2結合は強化された（図34D参照）。従って、アクチン及び微小管細胞骨格ネットワークはLFA-1の活性及びアビディティーに弁別的に衝撃を与える。
【０２６０】
本発明者らは、ICAM-2刺激／時間の関数としてLFA-1の活性化及びクラスター形成をフローサイトメトリーによって同時にモニターした。ｍAb24抗体の平均蛍光をLFA-1クラスター形成値と相関させることによって、LFA-1活性化は30秒以内にLFA-1のクラスター形成を進行させ、ｍAb24抗体の顕著な結合増加があるが、クラスター形成の増加は軽度であることが示された。しかしながら、更に30秒後から30分ではmAb24の相対的結合はいくぶん増加するが、クラスター形成値には顕著な増加があった（図34G）。従って、これらの結果は、ICAM-2リガンド誘発LFA−1活性化の後にLFA-1のクラスター形成が続くことを示唆している。
本発明者らは、細胞をPKC阻害剤（ビスインドリルマレミドI（BIMI））で処理することによって、ｍAb24の結合を用いて測定したときICAM-2誘発LFA-1活性化が抑制されることを観察した（図35A）。ICAM2−FITCの結合によって測定したとき、ICAM-2の粘着は影響を受けなかった（図35A）。このことは、リガンドで誘発されるレセプター構造変化は細胞内キナーゼに左右されることを示唆した。興味深いことに、ICAM-2はカルシウムの流入を誘発した（カルシウムはPKC活性化に必要な成分である）（データは示されていない）。従って、これらの観察は、ICAM-2リガンドによって誘発されるｍAb24のネオエピトープの露出は、PKC依存細胞内シグナリング事象の引き金となることを提唱している。我々は、ICAM-2とLFA-1との結合によって生じる下流のシグナリングの結果を調べることにした。
【０２６１】
ICAM-2はLFA-1を介してp44/42 MAPK活性を誘発する
フローサイトメトリーによるキナーゼのプロファイリング実験を実施して、ICAM-2刺激時のＰＫＣ活性化の下流のシグナリング経路を特定した。ICAM-2による処理によってP44/42 MAPKのリン酸化及び活性化の両者が誘発された（図35B−D）。ICAM−2の力価は、単一細胞のフローサイトメトリー分析で判定したときP44/42 MAPKのリン酸化と相関性を示し（図35B、上パネル）、キナーゼ活性分析と一致する結果であった（図35C）。αL及びβ２インテグリンに対するmAbの力価はICAM-2結合と競合し、従って誘発P44/42 MAPKリン酸化を減少させた（図35B、下パネル）。前記の抑制は、β1、β3、αM又はαXインテグリンに対するmAbによる予備処理後には観察されず（図35C）、ICAM-2／LFA-1相互作用はP44/42 MAPK活性化を仲介していたことを示した。
【０２６２】
PKC、PYK2及びSYKの活性化はP44/42 MAPK活性のICAM-2／LFA-1による誘発のために必要である
本発明者らは、フローサイトメトリーによるP44/42 MAPKキナーゼ抑制プロファイリング及び活性化プロファイリングを実施し、LFA-1シグナリングに必要な成分を特定しようとした。PKC阻害剤（BIMI）、細胞骨格破壊剤（サイトカリシンD、タキソール、ノコダゾール）及びEDTAによる二価陽イオンの封鎖は、ICAM-2誘発P44/42 MAPKシグナルを減少させて（図35D）、LFA-1のリガンド誘発事象が、アクチン−微小管細胞骨格によってシグナルトランスダクションに機械的に連結されていることを示唆した。LFA-1からP44/42 MAPKへのシグナル伝達に必要な上流のキナーゼを特定するために、一連のキナーゼ阻害剤を用いて、ICAM-2誘発P44/42 MAPK活性を停止させるそれらの能力について調べた（補充表１及び補充図34を参照されたい）。一方、ハービマイシンA及びエモジン（src及びp56lckの阻害剤）は作用を示さなかった。チロフォスチンA9及びピセアタンノール（それぞれプロリン−チロシンキナーゼ２（Pyk2）及び脾臓チロシンキナーゼ（Syk）の特異的阻害剤）（Avdi et al. 2001; Furtes et al. 1999）は、ICAM-2で誘発されるP44/42 MAPK及びその上流のアクチベーターRaf-1の活性化を停止させた（図36A）。
本発明者らは、Pyk2及びSykがβ2インテグリンと相互作用するか否かを調べた。Pyk2及びSykは、ICAM-2の処理に際してリン酸化され、更にβ2インテグリンと同時免疫沈澱して（図36B）、Pyk2及びSykは膜へ移動することが示唆された（補充図35もまた参照されたい）。前記は、ICAM-2刺激に際して時間の関数としてPyk2及びSykと同時に発生した（図36B−C）。PKCα／βII及びPyk2のリン酸化は1分で検出され、続いてSykのリン酸化が５分で生じた（データは示されていない、補充図36）。上記の結果を総合すると、ICAM-2によって付与されるLFA-1シグナリングメカニズムは少なくともPKCによって開始され、Pyk2及びSykによってP44/42 MAPK経路に伝えられることが示唆された。
【０２６３】
LFA-1はエフェクター−標的細胞粘着に必要であり、更にヒト細胞毒性Ｔ細胞の活性化を促進する
LFA-1はリンパ球間の粘着（いくつかの免疫学的シナプスで生じるプロセス）に必要であるので、我々は、生理学的状況でのICAM-2／LFA-1相互作用に関係する分子的事象の解明に興味をもった。クラスターを形成したICAM-2の局所分布は、発現レベルに関係なくナチュラルキラー細胞が細胞毒性を開始する効果的な標的構造であると提唱されている（Helander et al. 1996）。我々は先ず、FACSによるエフェクター−標的殺細胞アッセイを用い、種々のエフェクター：標的細胞比の刺激ヒトPBMCによる処理でHL60白血病細胞の標的細胞溶解を定量的にモニターした。標的細胞溶解のフローサイトメトリーによる検出は、標準的なクロム放出アッセイよりも感度が高いことが報告された（Lecoeur et al. 2001）。我々は、HL60細胞を蛍光染料CFSEで標識し、標準的なエフェクター−標的細胞によるアッセイでフローサイトメトリーによって細胞量をモニターした。可溶性ICAM-2はIL-2の存在下で標的細胞溶解を開始することができたが、IL-2の非存在下では開始することができなかった（図37A）。IL-2予備活性化細胞では、ICAM-1及びICAM-3は、ICAM-2とは対照的に強力な細胞毒性反応を開始させなかった（図37B）。
【０２６４】
ナチュラルキラー細胞（NK）は不均一集団（すなわち特異的細胞毒性Ｔリンパ球（CTL、その中のC8+サブセットを含む）、NK細胞（CD16+及びその中のサブセット）及びCD4+TH1細胞（Biron and Brossay, 2001））を含むので、我々はICAM-2が特定のヒトNK細胞サブセットに固有であるか否かを決定した。我々はフローサイトメトリーの多次元ゲートコントロール能力を利用し、ヒトPBMCで観察される細胞溶解活性に寄与している別個の細胞集団を特定した。我々はまた、フローサイトメトリーによってパーフォリン及びグランザイム‐Aの細胞内レベルをモニターした（前記２つのタンパク質はこれらの集団内のNK細胞による細胞溶解を仲介する）。我々は、CD8及びCD56表面染色によってヒトPBMC内の６つの異なる集団を特定し（図38、パネルI）、これらのサブセットで以後の全ての細胞内機能アッセイについてゲートコントロールを実施した（図38A、パネルII−V）。我々は、ICAM-1、ICAM-2及びICAM-3可溶性リガンド並びにHL60標的細胞の存在下でエフェクター−標的細胞毒性アッセイを実施した。我々は、刺激後に集団内サブセット頻度に顕著な変化を認めなかった（図38A、パネルI）。CD56+CD8low集団は、ICAM-1、-2又は3による刺激に際して細胞内パーフォリン又はグランザイム‐Aに顕著な変化を示さなかった（図38A、パネルII）。CD56+CD8med集団は、ICAM-2及びICAM-3に対してパーフォリン陰性集団の頻度にわずかな増加（1.5から２倍）を示した（21.5％ICAM-2＞19.8％ICAM-3＞13.7％ICAM-1）（図38A、パネルIII）。CD56+CD8high集団は、非刺激と比較してICAM-1、-2、-3刺激についてグランザイム‐A及びパーフォリンの両者の低下を示し、ICAM-1（4.12％）又はICAM-3（3.07％）と比較してICAM-2ではグランザイム‐A陰性集団の顕著な低下（58.3％）が示された（図38A、パネルIV）。CD56-CD8highはまた全てのICAM刺激によってグランザイム‐A及びパーフォリンの両者の低下を示した（図38A、パネルV）。CD56-CD8-集団内のサブセットはポジティブな態様で特定することはできないので、それらは分析から省いた。
【０２６５】
非刺激細胞と比較してCD56CD8サブセットのパーフォリン及びグランザイム‐Aの細胞内の量を定量することによってもまた、下記で証拠が提供されるようにICAM類についての類似点及び相違点が確認された。ICAM-2及びICAM-3は、ICAM-１より強力にグランザイム‐A及びパーフォリンの低下を仲介した（図38B−C）。更にまた、IL-2予備活性化細胞でICAM刺激に関して相違が認められた：ICAM-2＞ICAM-3＞＞ICAM-1の順で特にCD56+CD8med/high集団でパーフォリンの低下が示された（図38B）。ICAM-2及びICAM-3はまた、パーフォリンの低下をCD56+CD8lowで誘発したが、しかしながらICAM-2はIL-2による予備活性化を必要とした（図38B）。ICAM-2＞ICAM-3＞ICAM-1＞非刺激の順で、CD8highサブセットではより低レベルのグランザイム‐Aが検出された（図38C）。IL-2予備活性化の存在下で、全てのICAM類はCD56+CD8high/med集団でグランザイム‐Aの放出を誘発し、ICAM-2によって特に低下した（図38C）。CD56+CD8low集団ではグランザイム‐Aについて特に顕著な変化は認められなかった（図38C）。これらの相違は種々のエフェクター−標的細胞比（50:1、25:1、12.5:1）で同様であった（データは示されていない）。従って、CD56CD8サブセットで細胞溶解活性刺激についてICAM-1、-2及び3で類似及び相違が存在する。３つのICAM類は全てCD56-CD8high集団でパーフォリン放出を仲介した。ICAM-2及びICAM-3は、CD56+CD8high集団及びCD56+CD8med集団でパーフォリン／グランザイム‐A放出の仲介でもっとも類似していた。
【０２６６】
我々は、CD56+CD8+細胞（CD8med及びCD8highサブセットの両者）に焦点を合わせ、Syk、p44/42 MAPKの阻害又は細胞骨格の破壊が、エフェクター−標的（Ｅ：Ｔ）細胞結合物に有害な影響を与えるか否かをフローサイトメトリーによる結合物形成アッセイ（Morgan et al. 2001）によって調べた。細胞骨格のアクチン及び微小管の破壊はＥ：Ｔ結合物形成を強化し（図39A）、前記薬剤による破壊はLFA-1活性化を強化するという先の結果と一致した。ピセアタンノールによるSkyの阻害は結合物形成を抑制し、一方、PD98059によるp44/42 MAPKの阻害は結合形成を抑制しなかった（図39A）。これらの結果は、Sky活性はエフェクター−標的細胞のLFA-1粘着に必要であることを示唆し、Sky／ZAP-70は同じ細胞上でのLFA-1活性化にLFA-1が必要であるということを示す報告と一致する（Soede et al. 1999）。p44/42MAPKはＥ：Ｔ結合物形成に必要ではないようであった。活性なLFA-1及びp44/42の細胞内活性化のモニタリングによって、ICAM-2で刺激されたときこれら２つのマーカーのCD56+CD8+細胞における時間依存相関性が示された（図39B）。
【０２６７】
考察
本報告では以下の事柄が観察された：（１）ICAM-2は、外因性活性化物質（例えばサイトカイン又はTCRシグナリング）の非存在下で、LFA-1のクラスター形成、活性化及び細胞骨格の再編成を誘発することができる；（２）LFA-1は、リガンド結合に際して、PKC、Pyk2及びSykを必要とするp44/42 MAPK経路にシグナルを伝達する；更に（３）LFA-1レセプターの動的変化は、アクチン及び微小管の両細胞骨格ネットワークによってシグナルトランスダクションに機械的に連結されている。これら分子的事象の生理学的な結果は、パーフォリン及びグランザイム‐Aによって仲介されるCD56+CD8+Ｔ細胞細胞毒性の引き金となり、前記細胞毒性はICAM-2及びICAM-3によって大半が共有されるが、ICAM-1はこれを共有しなかった。
β2インテグリンシグナリングメカニズムは実験系に応じて変動し、細胞の形態及び運動性における粘着性役割の中心に据えられている（Dib, 2000）。β2インテグリンシグナリングは、とりわけパキシリン、vav及びGTPアーゼ活性化タンパク質のチロシンリン酸化を介して細胞骨格の再編成に中心的に関与することが示された（Fuortes et al. 1994; Zheng et al. 1996）。LFA-1仲介白血球粘着に集中した研究は、LFA-1アビディティーにおけるPKCの調節的役割を示し（Bleijs et al. 2001; Hedman and Lundgren, 1992）、TCRシグナリングはLFA-1を活性化できることを明示した（Peterson et al. 2001）。更にまた、ケモカインは、TCRシグナリングが存在しないとき、リンパ球／内皮接触時にLFA-1の活性化因子として機能することができることが示された（Constantin et al. 2000）。外部刺激（ケモカイン）又は内部刺激（TCR又は共働刺激分子）の非存在下で、LFA-1インテグリンの粘着、クラスター形成及び活性化がどのようにして細胞内シグナリング事象と結び合わされるかは明らかではなかった。
【０２６８】
ICAM-2の最初のIgドメイン（P1、アミノ酸21−42）の合成ペプチドは高濃度（62μM）でLFA-1仲介粘着を誘発することができる（前記の粘着はバルク細胞粘着アッセイ（bulk cellular adhesion assay）での48倍低いICAM-2可溶性タンパク質濃度（1.3μM）に匹敵した（Kotovuori et al. 1999））。しかしながら、P1結合は活性なLFA01構造を誘発せず、カルシウム流入も誘発しなかった（Kotovuori et al. 1999）。一方、完全長のICAM-2の結合は活性なLFA-1（図34D参照）及びカルシウム流入事象をもたらした（データは示されていない）。算出されたICAM-2アフィニティー、217±66ｎM（104細胞当たり）は、高度技術で作製されたLFA-1の“活性を有する”ロックされたIドメインのBIAコア分析を用いて報告された605±55ｎMKDとは対照的である（Shimaoka et al. 2001）。ここで報告したICAM-2に対する親和性は生理的状況内の単一細胞解析を利用している（精製又は遺伝子工学的に作製したLFA-1を用いた特別なものである）。タンパク質濃度に対してペプチド濃度で観察された相違は、おそらくペプチド合成時の不純物及び／又は内因性ICAM-2にとって天然の炭水化物成分のためであろう。前記炭水化物成分はそのほぼ66kDの分子量の30ｋD以上を構成し、LFA-1へのICAM-2の結合を適合させるために必要であると提唱されている（Casanovas et al. 1997; de Fougerolles et al. 1991）。
【０２６９】
我々は、ICAM-2リガンドで誘発したときのLFA-1レセプターの活性化及びクラスター形成におけるアクチン及び微小管細胞骨格の役割をマルチパラメーターフローサイトメトリーによって調べた。アクチン細胞骨格の破壊はLFA-1のクラスター形成及びICAM-2の結合を強化し、アクチン細胞骨格はLFA-1の運動性を制約するという先の研究を裏付けた（Lub et al. 1997）。興味深いことには、アクチンの脱重合化はICAM-2誘発LFA-1活性化を停止させた。対照的に、ノコダゾール及びタキソールによる微小管の破壊は、ｍAｂによって認識されるネオエピトープの露出によって決定されたとおり、いずれもLFA-1の活性化を強化した。最近、微小管の脱重合化は、マクロファージ細胞株でβ2の側方運動性を高めることが報告され（Zhou et al. 2001）、従って、微小管はリガンド結合に際して（LFA-1活性化エピトープの露出に必要な）構造変化を調節することは考えられることである。これらの観察は、アクチン−微小管細胞骨格は、リガンド結合に際してLFA-1の高アビディティー及び高アフィニティー状態の両状態を調節することを示唆している。我々は、LFA-1シグナルトランスダクションは、テストした全ての細胞骨格破壊剤（サイトカリシンD、ノコダゾール及びタキソール）の存在下で停止することを観察し、LFA-1レセプターは細胞骨格によってシグナルトランスダクション機構に連結されていることが示された。従って、LFA-1の高アビディティー及び高アフィニティー状態の機械的な連結の解除は、前記2つの状態を調節／仲介する細胞内事象がLFA-1インテグリン−細胞骨格接合部に存在し、リガンド結合に際して細胞内シグナリングタンパク質にLFA-1レセプターの動的変化を伝達することを示唆している。
【０２７０】
いくつかの化学的阻害剤のスクリーニングを考案し、LFA-1からp44/42 MAPKシグナリング事象に必要なタンパク質を特定した。Pyk2及びSykの両者がp44/42 MAPK経路の活性化に必要であり、ICAM-2結合に際してPKC活性化に依存することが確認された。Pyk2のリン酸化は、Ｂ細胞におけるLFA-1／ICAM-1相互作用によって仲介されるホモタイプ粘着に附随していた（McDonald et al. 2000）。更にまた、Pyk2活性化は、他のモデル系でp44/42 MAPK活性に必要であることが示された（Barsacchi et al. 1999; Lev et al. 1995）。SykはαIIIβ3シグナリングで必須のチロシンキナーゼであり（Saci et al. 2000）、更にFcεRIシグナリングをras／MAPK経路に連結する（Jabril-Cuenod et al. 1996）。Sykの阻害又は除去（薬理学的手段であれ（ピセアタンノールによる阻害を介する）、生化学的手段であれ（優性ネガティブSyk）、又は遺伝的手段であれ（Syk-/-マウス））は、天然の細胞毒性を抑制する（Brumbaugh et al. 1997; Colucci et al. 1999）。従って、Syk（NK細胞機能に重要であることが示されたキナーゼ）に対するLFA-1活性化シグナリングは、表面インテグリンの活性化とエフェクター細胞機能との間の生化学的連結を提供する。
【０２７１】
本発明者らは、Raf-1へのICAM-2誘発LFA-1シグナリングにおいてPyk2及びSykはともに重要であることを明示した（Raf-1はp44/42 MAPK（RAF／MEK／ERK）カスケードの上流のキナーゼである）。p44/42 MAPKの阻害はCD56+CD8+細胞結合の発生を妨げなかった。免疫蛍光分析によって、NK白血病細胞株YTのp44/42 MAPK阻害剤、PD98059による処理は、エフェクター−標的細胞接触部位へのパーフォリンの再分布を抑制することが示された（Wei et al. 1998）。更にまた、p44/42 MAPK経路は、ナチュラルキラー細胞における細胞毒性の調節に重要であることが示された（Jiang et al. 2000）。従って、p44/42 MAPK経路（LFA-1／ICAM-2結合に際して活性になることがここで明示された）は、少なくともパーフォリン下流のエキソサイトーシスに関係があることが示された。従って、ICAM-2によって誘発されるLFA-1シグナリング経路は、ヒトCD56+CD8+細胞毒性Ｔ細胞集団でエフェクター−標的細胞粘着事象及び細胞溶解機構の活性化の両方にマップされるシグナリング接合部を含む。これらの結果は、細胞溶解メカニズムに関するLFA-1インテグリン粘着の機能的結果の直接的な証拠を提供する。
我々はまた、エフェクター−標的細胞結合でパーフォリン及びグランザイム‐Aの放出によって実証されたように（前記の作用はICAM-1と対照的であった）、ICAM-2は細胞溶解活性の仲介でICAM-3と類似することを観察した。我々は、ICAM-2とICAM-3の細胞内シグナリングメカニズム（ICAM-1のそれとはまた異なっている）の類似性を以前に観察した（Perez et al. 2002）。しかしながら、高い細胞溶解活性がバルクPBMCで観察されたので、前記の結果は細胞毒性能力をもつ未確認の他のサブセットをICAM-2が刺激する可能性を排除できない（図37参照）。
【０２７２】
細胞毒性Ｔ細胞についての以前の研究によって、LFA-1／ICAM相互作用の遮断はエフェクター−標的細胞粘着を阻害することが立証され、従って前記遮断はまたNK細胞の細胞溶解活性を阻止すると結論された（Donskov et al. 1996; Krensky et al. 1984; Matsumoto et al. 2000）。LFA-1-/-マウス由来のNK細胞の機能に関する実験によって、LFA-1粘着はIL-2活性化NK殺細胞に必要であること（Matsumoto et al. 2000）、更にまたLFA-1-/-CD8+Ｔ細胞はＴ細胞活性化及びエフェクター機能について不完全であることが明らかにされた（Shier et al. 1999）。興味深いことには、NK細胞の細胞毒性はLAD患者由来のNK細胞で不完全である（Shibuya et al. 1999）。つい最近、細胞毒性Ｔリンパ球の誘導殺細胞は、微小管編成中心（microtubule-organizing center; MTOC）のCTL標的部位のLFA-1への分極化を必要とすることが示された（Kuhn and Poenie, 2002）（前記はLFA-1は厳密な粘着以外の機能的役割をもつ可能性を示している）。
【０２７３】
結論として、我々は、ICAM-2は、LFA-1リガンドとしてLFA-1レセプターの活性化及びクラスター形成（微小管及びアクチン細胞骨格を順次分極化させp44/42 MAPK経路を活性化させる事象）を仲介することができる。これらの事象は、CD56+CD8+Ｔ細胞のエフェクター−標的細胞結合、及びパーフォリン／グランザイムＡ仲介細胞溶解活性に必要であることが見出された。前記の作用はICAM-3と共有された。ここで報告したLFA-1レセプターの動的変化及び細胞内シグナリングを支配するメカニズムは、LFA-1シグナリングは、粘着に関する役割の他にもCD56+CD8+細胞溶解活性に機能的に寄与することを示唆している。不適切なMTOCの局在は、CD8+腫瘍浸潤Ｔ細胞における溶解性顆粒のエキソサイトーシスを阻害し、それによってネズミの腫瘍モデルにおけるCTL反応に必要なパーフォリン仲介細胞溶解活性を停止させることが示された（Radoja et al. 2001b）。皮肉なことに、欠損CD8+腫瘍浸潤Ｔ細胞はin vitroで効果的に殺細胞を仲介することができ（Radoja et al. 2001a）、腫瘍仲介抑制メカニズムが腫瘍内のミクロの環境に存在することが示唆された。可溶性ICAM(１及び３)の産生は癌患者及び自己免疫患者由来の血清で観察されたが、ただし分析はICAM-2にまで拡大されなかった（Bloom et al. 2002）。可溶性ICAM-2レベルが白血病患者で増加し、化学療法に際して減少することを指摘した報告が１つだけある（Mustjoki et al. 2001）。これらの観察の因果関係は不明である。ここに提示した研究に関して、表面ICAM-2の異常調節又は可溶性ICAM-2の分泌のどちらかによって、エフェクター−標的細胞部位でCD56+CD8+細胞溶解活性が不完全に惹起されるか又は阻止され、腫瘍がＴ細胞溶解を回避することができると考えるのは当を得ているであろう。他のインテグリンリガンドとの相互作用におけるICAM-2の他の特異的な役割によって、エフェクター：標的細胞との境界面から広がる事象の更なる理解が得られるであろう。
【０２７４】
材料と方法
免疫学試薬及び化学試薬
β1、β2、β3、β4、β5、β6、α1、α4、α5、αL、LFA-1、Pyk2、Syk、Mac-1、ICAM-1及びICAM-3に対するｍAｂ（PharMingen）。CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD45直接結合物（FITC／PE／PERCP／APC／ビオチン）、グランザイム‐A‐FITC（PharMingen）。パーフォリン‐CY5及びCD8-CY5PE（Herzenberg Laboratory, Stanford Universityから贈与）。ICAM-2 mAb及びICAM-2-FITC（IC2/2 Research Diagnostics）。抗ホスホPYK2（Y402）、抗ホスホ‐p44/42（pT185Py187）（Biosource）。抗ホスホPKCα／β（Thr638）、抗ホスホ‐Syk（Tyr525/526）、抗ホスホRaf1（Ser259）（Cell Signaling Technologies）。使用タンパク質及び化学試薬：フルオレセインイソチオシアネート（FITC）（Pierce）、アレキサフルア染料シリーズ488、546、568、633、タキソール‐アレキサ546、ファロイジン‐アレキサ633及びCFSE（Molecular Probes）、チロフォスチンA9及び18、SB203580、ピセアタンノール、ビスインドリルマレイミドI及びII、ハービマイシンA（Calbiochem）。エモジン、ジェニステイン、DMSO、PMA、PHA、スタウロスポリン、イオノマイシン、ヨウ化プロピオジウム、サイトカリシンD（Sigma）、タンパク質A／Gアガロース（SCBT）、リコンビナントヒトIL-2（Roche）、リコンビナントヒトICAM1-FC、ICAM2-FC、ICAM3-FC（Genzyme）、マウス及びウサギIgGに対する二次抗体（Santa Cruz）、擬似処理は以下から成った：マウスIgG（抗体の場合）、１％BSA（タンパク質の場合）、又は0.001％DMSO賦形剤（化学物質の場合）。
【０２７５】
細胞培養
NIH3T3細胞は、DMEM、10％DCS、１％PSQ（ダルベッコー改変イーグル培養液、10％ドナー仔牛血清、１％ペニシリンストレプトマイシン（1000単位／mL及び2mMのL-グルタミンPSQ）中で維持した。JurkatＴ細胞は、RPMI-1640、10％FCS、１％PSQ中で１ｘ105細胞／ｍLで維持し、全ての機能アッセイのために血清は12時間枯渇させた。細胞は５％CO2／37℃加湿インキュベーターで維持した。ヒト末梢血単球は、健常なドナーの全血（Stanford Blood Bank）のフィコール−プラーク密度遠心分離（Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden）によって得た。磁気活性化細胞分類を用い、表示の実験のために未感作CD8+Ｔ細胞の陰性単離を実施した（Dynal, Oslo, Norway）。
【０２７６】
可溶性ICAM-2の作製並びにICAM-2‐FITC及びICAM2-ビーズの合成
完全長のICAM2 cDNAをJurkat細胞から入手し、記載のように（Perez et al. 2002）レトロウイルスベクターｐBM-Z-INのBamHI／Sal1部位でクローニングした。ヒトICAM2をレトロウイルス感染によりNIH3T3細胞で過剰発現させ、免疫親和性クロマトグラフィーによって採集した。二段階溶解法を用いてICAM-2をアフィニティー精製し、続いて抗ICAM-2固相で精製した。細胞を緩衝液Ａで５分間４℃で溶解させ、続いて50％（v/v）の緩衝液Ｂ（緩衝液Ａプラス１％トリトンX-100）で30分間４℃で透過性にした。緩衝液Ａは以下を含む：20ｍMトリス（ｐH7.5）、150ｍMのNaCl、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、0.1％NP40、2.5ｍMのNa2PO4、１mMβ−グリセロホスフェート、１mMのNa3VO4、１μg/ｍLのロイペプチン、１ｍMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Boehringer Mannheim）。そのC末端に対する抗ICAM-2pAb（４mg、Santa Cruz）を製造元の推奨にしたがいアフィ‐ゲル（Affi-Gel） Hz活性化支持体（Biorad）と結合させた。前記支持体はFc領域を介してIg分子を結合させ、より高い抗原結合性能をもたらす。採集した上清のバッチ溶解を実施し（４℃、２時間）、緩衝液C（0.1％トゥイーン‐20、PBS（pH7.4））で４回洗浄した。ICAM-2タンパク質を4.5MのNaCl（トリス、pH6.8）で溶出させ、一晩透析し（PBS（pH7.4）、0.001％アジ化物、0.01％グリセロール、４℃）、サイズ排除スピンクロマトグラフィーを用いて濃縮し、0.01％グリセロールを用いて安定化させた。
抗ICAM-2固相を緩衝液Cで再平衡化させて0.01％のチメロソールで保存し、３回まで再使用した。純度はクーマシーゲルで調べたとき98％を越えていた。サイズ排除クロマトグラフィーでより高分子量の凝集物は除去され、精製ICAM-2の非変性ゲル電気泳動で観察されなかった。前記の方法で20mgを精製し、本実験に使用した。ICAM2-FITCの合成は、NHS-フルオレセイン（Pierce）への化学的結合により実施し、未反応染料はゲルろ過によって除去した。ICAM2-FITCプローブは、フローサイトメトリーで判定したとき、トリプシン処理Jurkat細胞に組み入れられることはなく、またLFA-1抗体クローン（TS1/22又はTS1/18（Developmental Hybridoma Studies Bank）又は非標識ICAM-2タンパク質でブロックしたとき前記細胞と結合することもない。ICAM2-FITCの結合はβ2インテグリンクローン（CT104, Santa Cruz）によって阻止されなかった。精製ICAM-2は、NSOネズミミエローマ細胞（Genzyme）から精製されたリコンビナントICAM-2FC融合タンパク質に匹敵した。ICAM-1FC及びICAM-3FCもまたNSO細胞（Genzayme）から精製した。タンパク質は14,000RPMで５分使用前に遠心した。１mgのICAM-2タンパク質を製造元（Dynal）の推奨に従って２ｘ108のエポキシ活性化ビーズと結合させた。総計２μgのICAM-2を含む４ｘ105のビーズを表示のように使用した。ゲルの画像化はVersaDocマシーン（Biorad）で実施し、クォンティティワン（Quantity One）定量化ソフトを用いて分析した。
【０２７７】
フローサイトメトリー
細胞内及び細胞外染色は記載（Perez and Nolan, 2002）したように実施した。活性なキナーゼのための細胞内プローブは、リン特異的抗体をアレキサフルア染料シリーズと記載したように結合させて作製し、リン−タンパク質最適化条件で使用した（perez and Nolan, 2002）。カイネティクス分析は、37℃に維持した時間同期化96ウェルで固定緩衝液を直接適用することによって実施した。細胞内アクチン及び微小管染色は、ファロイジン−アレキサ633及びタキソール−アレキサ546染料（Molecular Probes）を用いて実施した。粘着とクラスター形成分析は、本文に記載したようにICAM2-FITCを用いて実施した。LFA-1活性化は、mAb24−アレキサ633又はｍAb−アレキサ546結合物のいずれかによって調べ、37℃で表面染色を実施した。フローサイトメトリーデータは、106細胞／サンプルによる３つの別個の実験の典型例である。10−50,000事象を収集し、FACSCaliburマシーンで手動により目盛り修正を実施した。棒グラフで示したデータは相乗平均蛍光強度（MFI）として表し、アイソタイプコントロールで標準化した。ログ比は、非刺激細胞のMFIに対する刺激細胞のMFIと定義される。データはフロージョ（Flowjo）ソフト（Treestar）を用いて分析した。
【０２７８】
単一細胞ICAM-2結合測定
ICAM2-FITC結合パーセンテージは100*（（MFIexp−MFIctl）／（MFIfinal−MFIctl））として表し、式中、MFIexpは実験濃度の平均蛍光強度に等しく、MFIctlは非染色細胞の平均蛍光強度に等しく、MFIfinalは結合が飽和した最終濃度の平均蛍光強度に等しい。サンプルは図に示した最終濃度で30分37℃で50μLの染色媒体（def RPMI, 4%FCS）中でインキュベートし、500μLのPBS（pH7.4、1mMのEDTAを含む）で１回洗浄し、100μLの１％パラホルムアルデヒドに再懸濁した。染色条件の希釈率及び72.1ｋDの分子量をモル濃度の決定に用いた。染色緩衝液は、2.4mMのカルシウム及び２mMのマグネシウムを含んでいた。データは、カレイダグラフ（Kaleidagraph）ソフトを用いて等式、Ｖ＝Ｖmax［Ｓ］／（Ｋm＋［Ｓ］）に適合させた。式中、Ｖは結合％であり、［Ｓ］はICAM2-FITC濃度であり、Kmはミハエリス−メンテンの結合定数である。
【０２７９】
レーザー走査共焦点顕微鏡法
Jurkat細胞を表示のように処理し、ポリ-L-リジン（Sigma）被覆滅菌カバースリップに穏やかに遠心することにより（1000rpm、10分）付着させ（１mg/ｍL、30分）、リン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.4）で２回洗浄し、2.7％パラホルムアルデヒド（PBS）で固定した。細胞をPBS中の0.1％トリトンX-100（５分）で透過性にし、PBSで２回洗浄し、４％のFCSでブロックし、更に表示のように抗体又は細胞内染色に付した。染色したカバースリップをマウントし、ツァイスレーザー走査共焦点顕微鏡510を用いて観察した。
免疫沈澱、イムノブロッティング及びキナーゼアッセイ
細胞抽出物は、２ｘ106細胞（表示のように処理）を氷冷ＰＢＳで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって調製した。溶解緩衝液は以下を含む：20ｍMトリス（ｐH7.5）、150ｍMのNaCl、１ｍMのEDTA、１ｍMのEGTA、１％トリトンX-100、2.5ｍMのNa2PO4、１mMβ−グリセロホスフェート、１mMのNa3VO4、１μg/ｍLのロイペプチン、１ｍMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Boehringer Mannheim）。抽出物を14000rpm（５分、４℃）で遠心し、10−20μg（BCAタンパク質アッセイ（Pierce）によって測定）を標準的な方法でイムノブロッティングに付した。免疫沈澱物（IP）は、プロテインＡ／G＋アガロースビーズ（SBC）によって予備清澄化し、一次抗体で１時間、プロテインＡ／Ｇ＋アガロースビーズで１時間インキュベートし、更に溶解緩衝液で４回洗浄した。ブロットを表示の抗体とインキュベートし、更にECL（Amersham）を用いて現像した。免疫ブロットのストリッピング及び（表示のような）プローブによる再検査は、ストリッピング緩衝液（62.5mMのトリス（pH6.8）、10％SDS、１％β-メルカプトエタノール）でインキュベートすることによって実施した（30分、55℃）。MAPK活性は、p44/42 MAPKキナーゼキットによって製造元（Cell Signaling Technologies）の推奨に従って検出した。
【０２８０】
細胞溶解活性、パーフォリン放出アッセイ及び結合物形成アッセイ
標的細胞溶解は、フローサイトメトリーによるCFSE標識HL60細胞の検出によって測定した。HL60細胞を１μgのCFSEで標識した（30分、37℃）。標的を２回洗浄し、擬似処理、IL-2活性化（100U/ｍL）、CD3／CD28活性化（１μg/mL）処理を施すか、又はICAM2ビーズもしくは可溶性ICAM-1、-2もしくは-3で処理し（10μg/ｍL、30分、37℃）、その後104標的細胞／ウェルで96ウェルの丸底プレートに播種した。CTLを50：1、25：1、及び12.5：１のE:T比で添加し、37℃で4時間インキュベートした。続いて細胞をマルチパラメーターフローサイトメトリー及び細胞内パーフォリン染色のために処理した。特異的溶解％を以下の等式から算出した：％特異的溶解＝100−100ｘ（実験のHL60カイント／全コントロールHL60カウント）。HL60カウントはCFSE蛍光によって検出した。パーフォリンの％は以下の等式から算出した：％パーフォリン＝100ｘ［（実験のパーフォリンMFI−アイソタイプｍAbのMFI）／（全パーフォリンMFI−アイソタイプｍABのMFI）］。MFIはフローサイトメトリーによる細胞内検出の平均蛍光強度を指す。細胞結合は、記載（Morgan et al. 2001）のようにフローサイトメトリーで決定した。化学物質による阻害は、表示した刺激の前に表示した化合物（10μM、30分、37℃）で実施した。全ての実験は３回づつ実施した。
【０２８１】
参考文献
2005517174.tif 000044
【０２８２】
2005517174.tif 000045
【０２８３】
2005517174.tif 000046
【０２８４】
2005517174.tif 000047
【０２８５】
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【０２８６】
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【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１】リン特異的抗体はキナーゼ活性と相関性を有することを示す実験結果である。  Ａ）i)p44/42、ii)p38、iii)JNK/SAPK、iv)AKTser473/AKTthr308、v)TYK2、vi)PKA-基質、及びvii)PKC-PAN基質に対するリン特異的抗体を、固有のキナーゼ誘発条件及び阻害条件によってリン特異性について調べた。キナーゼの誘発条件は経路の特異的阻害剤と同様に示されている。既知の基質に対する活性を示すキナーゼの能力が各リン−ウェスタンセットの下に示されている。AKT、p38、SAPK、JNK、p44/42及びTYK2のための非リン特異的抗体は、存在する全キナーゼを反映する。キナーゼ活性は、対応するキナーゼのリン酸化を誘発し、更にリン特異的抗体で検出したときキナーゼのリン酸化状態と相関することが判明した条件下で測定された。ホスホ−PKA基質及びホスホ−PKC−PAN基質の抗体の性質が与えられているならば、直接的キナーゼ活性は測定されないであろう。使用した条件では一般的なPKC及びPKAの活性化が判定された。なぜならば、両抗体は、それぞれの対応するキナーゼ基質の認識モチーフのリン酸化形を有する多数のPKC及びPKA標的を認識するからである。AKT、p44/42、p38及びJNKキナーゼのためのイムノブロット／キナーゼアッセイはNIH3T3で実施され、TYK2、PKC及びPKAについてはJurkat細胞で実施された（処理条件に関する詳細は材料及び方法の項を参照されたい）。  Ｂ）表２に示したとおり誘発条件の前にキナーゼ誘発剤（誘発）又はキナーゼ阻害剤（阻害）でJurkat細胞を処理した。細胞を細胞内FACS染色のために処理し、リン特異的抗体−蛍光発光団Log蛍光によって図に示したようにキナーゼ活性について分析した。上書きしたグラフはそれぞれ増加又は減少したキナーゼ活性のシフトを示している。右下の図は、ホスホ−ERK活性によって測定したEGF処理の用量反応曲線を示す（0.001、0.01、0.1、1.0、10μg/ｍL）。使用した阻害剤及び活性化剤は以下のとおりであった：p44/42（ERK1/2）は上皮増殖因子（EGF）で活性化され、MEK1/2阻害剤、U012621-23*で抑制された；AKT活性化は培養液及び血小板由来増殖因子の添加によって実施され、PI3Kキナーゼ阻害剤、LY29400220*とインキュベートすることにより抑制された；JNKはアニソマイシン29*で活性化され、スタウロスポリンで抑制された；p38 MAPKはアニソマイシン29*で活性化され、化合物SB20358024,29*で抑制された；PKAはフォルバル12ミリスチル化13−アセテート（PMA）で活性化し、リン検出は、タンパク質ホスファターゼ阻害剤カリクリンＡ25*とのインキュベーションによって可能にした；PKCはイオノマイシン（IO）によって活性化され、ビスインドリルマレミドII26,27*を用いて抑制された；TYK2活性はインターフェロンγ（IFNγ）によって誘発され、普遍的チロシンキナーゼ阻害剤、ジェニステイン28,3*を用いて抑制された。*については対応する文献番号及び実施例１の“参考文献”の引用を参照されたい。  Ｃ）TYK2、PKA及びPKC基質プローブはリン特異的である。細胞内染色前のラムダフォスファターゼによる刺激サンプルの処理（上記に記載）は、ホスホ−TYK2及びホスホ−PKA基質プローブによる検出を低下させた。リン酸化PKC基質の検出低下には、ウシ腸ホスファターゼによる細胞の処理がラムダホスファターゼに加えて必要であった。  Ｄ）p44/42のリン酸化はフローサイトメトリーで測定したとき平均蛍光強度と相関性を示した。��ン特異的検出及びホスホ−p44/42キナーゼプローブによる平均蛍光強度（MFI）の両方法で測定したp44/42リン酸化の半定量分析が示されている。Jurkat細胞を表示の濃度で30分EGFの用量反応曲線に付し、リン特異的抗体によるイムノブロッティング、及び開発したp44/42キナーゼプローブによるフローサイトメトリーの両方法で分析した。YエラーバーはMFI値の標準偏差である。Ｘエラーバーは非刺激コントロールに対するリン酸化の％の標準偏差である。値は３回の別個の実験の典型例である。記載されていないエラーバーはデータに隠れている。
【図２】多次元分析が種々の刺激で誘発されるシグナリングネットワークに対する理解を提供することを示す実験結果である。  Ａ）CD4＋及びCD19＋リンパ球サブセット内の弁別的キナーゼ活性を示す。PBMCを表示した刺激で1時間処理し、フローサイトメトリーによる細胞内キナーゼリン酸化状態の判定のために処理した。過剰反応及び過小反応の両反応が種々の刺激によりCD4＋のp44/42活性について観察できる。  Ｂ）CD69によって測定されるＴ細胞活性化は、CD3／CD28及びPMA／イオノマイシン刺激に対して弁別的なp44/42キナーゼ活性を示す。刺激条件は図に示されている。  Ｃ）人工的Ｔ細胞刺激で測定された多数のキナーゼ活性を示す。培養液中のJurkat細胞及びPMA／イオノマイシン（IO）処理細胞を、フローサイトメトリーによる細胞内キナーゼリン酸化状態の測定のために処理した。CD69発現はＴ細胞活性化の指標として機能する。Ｘ軸はlog蛍光値を示し、Ｙ軸は相対的細胞数を示す。  Ｄ）細胞の顆粒化の関数としてのp38のリン酸化を示す。リン酸及び非リン酸化p38の同時測定によって、細胞の顆粒性が増加するにつれて非リン酸化p38からリン酸化p38へのシフトが実証される（サイドスキャターパラメーター内の陰影棒によって示される）。  Ｅ）JNK活性の関数としてのp44/42及びp38キナーゼ活性の３−パラメーター分析によってシグナリングクロストークの潜在的マッピングが示される。PBMCをIL-1αで処理し、JNK、p44/42及びp38活性をフローサイトメトリーで同時に測定した。ホスホ−JNK／SAPKグラフの陰影棒はJNK活性化の強度を示している）。  Ｆ）IL-1β処理PBMCにおけるTYK2活性の関数としてのAKT、p38、PKA及びp44/42活性の５−パラメーター分析を示す。TYK2活性の開始時点では４つのキナーゼ活性のいずれも検出できない。P38、p44/42及びAKT活性の同調活性化がTYK2の極めて高いレベルで観察される。PKA活性は極めて高いレベルのP38及びp44/42活性で観察される。
【図３】休止Ｔ細胞の単離、調製及び多染フローサイトメトリーによる分析の工程図を示す（11色、13パラメータ）。  リンパ球の単離はフィコール−プラークグラディエントによって実施し、粘着細胞を排除した。フローサイトメトリーグラフは典型的なリンパ球のゲートコントロール及びCD3集団の存在を示す。磁気活性化細胞分類は活性化Ｔ細胞、NK細胞を排除し、マクロファージ及びＢ細胞が残存し、休止Ｔ細胞が濃縮される。濃縮集団を刺激前に調べ、CD4+及びCD8＋細胞の存在を確認する。IL-1α、IL-1β又はIL-2への刺激を実施し、表１に示した染色を用いて細胞をフローサイトメトリーのために処理した。時には、いくつかの表面マーカーのダウンレギュレーションがある種の刺激に対して観察され、主要分子、すなわちCD3、CD4、CD8のレセプターのダウンレギュレーションによって提示される（前記は刺激処理の前にこれらマーカーのフローサイトメトリーを比較したときに明白である）。５つの識別マーカーによるメモリー細胞及び未感作細胞のゲートコントロールの例はCD4＋及びCD8＋Ｔ細胞の両細胞について示されている。CD45RAゲートの適切な配置は文献（De Rosa et al.）に従って実施し、CD4＋及びCD8＋集団で別々に実施した。識別マーカーによるマルチゲートコントロールによって未感作細胞及びメモリー細胞を特定した後、細胞内キナーゼ活性を決定した。キナーゼプロフィールをCD11aマーカーに対してグラフに表したが、それらは全ての未感作及びメモリーマーカーについてゲートコントロールされた。多数のキナーゼ活性の評価は２つの11色実験を一緒にすることによって可能になった。
【図４】多染フローサイトメトリーを用い、特にリンパ球でシグナリングプロフィールを容易に識別できることを示す実験結果である。直接比較するために、未感作(naive)及びメモリーＴ細胞キナーゼプロフィールが重ねあわされる。閾値依存キナーゼ活性化を含むメカニズムがキナーゼリン酸化アプローチで認められるが、CD8＋の未感作細胞ではLog10蛍光強度（図２の阻害剤／誘発剤実験から明らかにされる値）を超えることはない。過小反応がIL-1αCD4＋の未感作細胞について認められる。
【図５】フローサイトメトリーにより活性キナーゼ及び非活性キナーゼの両者をモニターした実験結果を示す。Ａ）p44/42、p38、AKT、TYK2及びJNKに対するリン特異的及び非リン特異的プローブによって、それぞれのキナーゼがその天然の状態で検出される。Jurkat細胞を以下のように処理した：AKT活性はPDGFで刺激した；MAPK活性はEGFで刺激した；p38及びJNK活性はアニソマイシンで刺激した；前記の全ての活性は10分間刺激され、表２に示した濃度でそれぞれのキナーゼの最初の活性化が誘発された。与えられた刺激に際して、ホスホ−p44/42、ホスホ−p38、ホスホ−AKTser473、及びホスホ−AKTthr308は、それらの非リン特異的カウンターパートに対して異なる集団を検出した。AKT陽性細胞をゲートコントロールして、図に表示したようにAKTser473リン酸化及びAKTthr308リン酸化についてグラフに表した。全ての非リン特異的キナーゼについて非刺激細胞を比較のために適切に表示した。
【図６】LFA-1刺激が、ヒト未感作CD4＋Ｔ細胞でJAB1及びサイトヘシン-１の放出及びリン酸化を誘発することを示す実験結果である。Ａ）CD3、CD28及びｓICAM-2（５μg/ｍL、30分）で刺激した細胞の核抽出物のホスホ−ｃJunイムノブロット；Ｂ）α−JAB1、IgGトランスフェクト細胞及び非トランスフェクト細胞におけるホスホ−ｃJun（S63）の単一細胞分析。中央蛍光強度は±SDを示している。Ｃ）非刺激（図Ａ−C）、LFA-1刺激（ｓICAM-25μg/ｍL）（図Ｄ−Ｆ）及びα-JAB1トランスフェクト細胞（Ｇ−Ｉ）におけるJAB1及びサイトヘシン-１の共焦点顕微鏡検査。図Ｇ−Ｉはα-JAB1抗体で染色されなかった。Ｄ）非刺激細胞、ｓICAM-2及びCD3（５μg/ｍL、30分）細胞をホスホセリン及びホスホ−スレオニンで免疫染色し、続いてブロットを剥ぎ取り、それぞれα-JAB1及びα-サイトヘシン-１に対して染色した。Ｅ）IgG、α-JAB1、α-サイトヘシン-１N末端、α-サイトヘシン-１C末端及びC末端サイトヘシン-1ペプチドをトランスフェクトしたｓICAM-2刺激（５μg/ｍL、30分）細胞におけるホスホ−p44/42（T202/Y204）のフローサイトメトリーによる検出。〔補充図６〕Ａ）ホスホ−p38（T180/Y182）、ホスホ−AKT（S473）、ホスホ−Lck（S158）、ホスホ−mek1/2（S217/221）、ホスホ−elk（S38）のCD3、CD28及びLFA-1刺激のフローサイトメトリーによるカイネティクス分析を示す実験結果である。我々は、CD3又はLFA-1刺激よりもはるかに強く、CD28刺激によってホスホ−AKT、ホスホ−p38及びホスホmek1/2が誘発されることを観察した。これらの報告は、CD28刺激によるこれらの経路の活性化を提唱する最近の発見と一致する（Kane et al. 2001; Li et al. 2001）。我々は、ホスホ−lckはLFA-1刺激中にCD3及びCD28刺激に対してそれぞれ弁別的に誘発されることを観察した。Elk-1のリン酸化はCD3及びCD28刺激によって付与され、LFA-1刺激では程度が弱かった。
【図７】リンタンパク質抗体アレーによりヒト未感作Ｔ細胞におけるCD3／CD28／LFA-1シグナリングを示す実験結果である。Ａ）CD3／CD28刺激未感作CD4＋Ｔ細胞に対する、CD3／CD28／FLA-1の弁別的リンタンパク質プロフィール。蛍光リンタンパク質アレーの比率は以下の等式から算出した：Log［（MFICD3/CD28/LFA）／（MFICD3/CD28）］（材料と方法の項を参照されたい）。リン酸化倍数は色の強度を基準にして表され、緑色は強、赤色は弱に対応する。Ｂ）CD3、CD28及びｓICAM-2で刺激したCD4＋Ｔ細胞の細胞周期アッセイ。G0、G1、S＋G2／M期の細胞周期にある細胞を、Ki-67及びDNA含有量の発現について二重染色して決定した。低いKi-67シグナルはG0期の細胞と考えられ、２ｎのDNAをもちKi-67＋のシグナルはG1期の細胞と考えられ、２ｎのDNAをもちKi-67+のシグナルはＳ期又はＧ2／Ｍ期と考えられた。〔補充図７〕図７に続いて、CD3／ｓICAM-2の組合せと同様に、ｓICAM-2及びCD28の個々の刺激に対しても細胞が未感作ゲートコントロールCD4＋Ｔ細胞（５つの識別マーカーによって示されたとおり）であることを示す実験結果である。Ｂ）刺激24時間後及び48時間後のCD25の発現。
【図８】未感作CD4＋Ｔ細胞の多次元分析を示す工程図である。磁気細胞分類、13パラメーターフローサイトメトリー、転写因子プロファイリング及びサイトカインビーズアレイを複合的に組み合わせて、免疫表現型をもつ未感作ヒトCD4＋Ｔ細胞（CD3+CD4+CD8-CD45RA+CD62L+CD11ａdimCD27+CD28+）に対する刺激の影響を決定した。サイトカイン及びリンタンパク質の細胞内レベルは、図に示したように表面表現型／活性化マーカーと相関性を示した。〔補充図８〕CD3、CD28及びLFA-1刺激の転写因子プロファイリング及びサイトメトリービーズアレイを示す実験結果である。Ａ）刺激細胞の核抽出物を調製し、p65、p50、cFos、creb、atf2及びcRelのコンセンサス配列で被覆した96ウェルプレートとハイブリダイズさせた。結合タンパク質は標準的ELISA法を用いて検出した。CD3刺激は低レベルのNF-κBサブユニットp65及びp50を示し、cFos、cRel、CREBは検出不能レベルであった。前記の作用はLFA-1刺激と同様であった。しかしながら、CD3刺激単独は、CD28及びLFA-1刺激よりも高レベルのaft2を示した。CD28単独は低レベルのNF-κBp65及びp50サブユニットを示し、CREBレベルは上昇した。LFA-1刺激はかすかに高いレベルのNF-κBp65サブユニット及びｃRelを示した。Ｂ）CD3／CD28及びCD3／CD28／LFA-1刺激（10μg/ｍL、16時間）に対する分泌IFNγ、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5及びTNFαのためのサイトメトリービーズアレイ（CBA）。数値はリコンビナントサイトカインを用いた標準曲線に対してコンピュータで処理し、更に同時に処理細胞の上清についても測定した。CD3及びLFA-1単独刺激単独のサイトカイン分泌の測定では顕著なサイトカイン分泌は示されなかったが、CD28刺激はIL-4及びIL-5のレベル上昇を示し、IFNγは低レベルであった。
【図９】細胞内IL-2並びに表面CD25及びCD69マーカーによってモニターしたＴ細胞の活性化を示す実験結果である。Ａ）LFA-１刺激と対比させたCD3／CD28刺激又はCD28刺激と対比させたCD3刺激（６時間）の滴定でのIL-2の細胞内検出。平均蛍光強度は目に見えるアレイとして示されている。非刺激、CD3／CD28／LFA-1（0.001μg/ｍL、1:1:1）刺激及びCD3／CD28（10μg/ｍL、）刺激のCD4Ｔ細胞におけるCD69及びCD25発現の二変量分析。Ｃ）非刺激、CD3／CD28及びCD3／CD28／LFA-1刺激の12時間後のCD69発現及び細胞内IL-2検出の二変量グラフ。
【図１０】転写因子の核内分布及び活性のプロファイリングを示す実験結果である。Ａ）NFAT-ルシフェラーゼ、NF-κB-ルシフェラーゼ及びAP-1-ルシフェラーゼをトランスフェクトしたJurkat細胞のレポーター遺伝子アッセイ。CD3、CD3／CD28及びCD3／CD28／LFA-1刺激を実施し（６時間、10μg/ｍL）、ルシフェラーゼ活性の倍数をグラフに表した。Ｂ）CD3、CD28及びLFA-1刺激（10μg/mL、12時間）に対応する転写因子（図中に表示）の核内プロフィール。プレートに被覆した転写因子特異的コンセンサス配列DNAと核抽出物（５μg/ｍL）をハイブリダイズさせ、ELISAで検出した。数値を陰性コントロールに対して標準化し、655nmの吸収単位として表示した。CD3／CD28及びCD3／CD28／ｓICAM-2刺激細胞の核内プロフィール（上記に記載したとおり）。Ｃ）上記に記載したCD3／CD28及びCD3／CD28／LFA-1滴定（図中に表示）に対するNFAT-ルシフェラーゼレポーター活性。
【図１１】ヒト未感作CD4Ｔ細胞におけるIL-4及びIFNγ細胞内産生を示す実験結果である。CD3対CD28及びCD3／CD28対LFA-1刺激における滴定で刺激後６時間のIFNγ及びIL-4の細胞内レベル。平均蛍光値は非刺激に対して標準化し、IL-4／IFNγのLog比はコンピュータで計算し、強度等高線図として表した。強度レベルはレンジインジケーター（右）で示されている。
【図１２】CD3／CD28及びCD3／CD28／LFA-1刺激（10μg/ｍL、16時間）に対する分泌IFNγ、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5及びTNFαのためのサイトメトリービーズアレイ（CBA）を示す実験結果である。数値は、リコンビナントサイトカインを用いた標準曲線に対してコンピュータで処理し、更にCBAアレイ（PharMingen製）を使用して処理細胞上清でも同時に測定した。
【図１３】p44/42 MAPKカスケード活性化NIH3T3における異所性ICAM-2のクラスター形成を示す実験結果である。Ａ）ICAM-2及びICAM2-ACレトロウイルス発現ベクターは細胞表面に誘導される。ICAM-2及びICAM2-ACを形質導入したNIH３T3の細胞質膜への誘導は、対応する末端に対する特異的抗ヒト抗体を用いたフローサイトメトリーによって実証された。Ｂ）ウェスタンブロットによってICAM-2及びICAM2-AC発現を実証し、Jurkat細胞の内因性ICAM-2と比較した。Ｃ）p44/42 MAPKカスケードは表面ICAM-2のクラスター形成に際して開始する。血清枯渇を実施したICAM-2細胞を抗ヒトICAM-2モノクローナル抗体により表示した時間ICAM-2架橋（10μg/ｍL）を実施した。細胞溶解物を採集し、標準的な電気泳動及びイムノブロッティングを実施した。RAF、MEK、p44/42（ERK1/2）、Elk-1及びRsk1のリン特異的抗体を用いてリン酸化タンパク質を検出した。続いてブロットを剥がし、それぞれ対応するキナーゼについて標準化抗体（非リン特異的抗体）をプローブとして用いて調べた。Ｄ）ICAM-2クラスター形成は、p44/42 MAPKキナーゼ活性アッセイで判定したとき、p44/42 MAPK活性を誘発する。血清枯渇細胞をICAM-2に対して架橋し（10μg/ｍL、30分）、p44/42 MAPK活性について調べた。陽性及び陰性表示レーンは内部MAPKキナーゼコントロールを示し、コントロールIgGは誘発条件に対する陰性コントロールとして機能する。
【図１４】p44/42 MAPK活性は増殖カイネティクスの強化を仲介することを示す実験結果である。Ａ）細胞周期の再エントリーはICAM-2のクラスター形成に際して開始した。細胞を72時間血清枯渇に付して化学物質の非存在下で細胞を同期化させ、続いてICAM-2の架橋を実施し（10μg/ｍL、18時間）、フローサイトメトリーによって細胞周期を分析した。エラーバーは３回の実験の標準偏差を示す。特定の細胞周期に対するゲートコントロールが左に表示されている。Ｂ）MTT細胞生存性アッセイで測定したとき、接触抑制は細胞周期の停止を誘発した。表示の細胞タイプを、表示のように細胞密度を増加させながら96ウェルプレートに播種し、MTT試薬とともに細胞をインキュベートして細胞呼吸を測定した。最初の２時間の定着時間後、４時間してから580nmで吸収を測定することにより生成物の検出を実施した。エラーバーは３回の実験の標準偏差を示す。Ｃ）細胞密度による時間に対する増殖カイネティクスのモニタリング。表示の細胞タイプを104細胞で播種し、表示した時間で標準的なクローンアッセイを実施して細胞密度をモニターした。エラーバーは３回の実験の標準偏差を示す。
【図１５】ICAM-2は表面β1、β2及びβ3インテグリンと結合することを示す実験結果である。Ａ）アフィニティークロマトグラフィーによってICAM-2が相互作用するいくつかの表面タンパク質が検出される。形質転換NIH3T3からICAM-2を免疫的に取り出し、FITCと化学的に結合させることによってICAM2-FITCプローブを作製し（第一及び第二図）、抗ICAM2によるイムノブロット及び蛍光標識によって調べた。標識プローブとしてICAM2-FITCを用いたファーウェスタン技術によって、96及び16ｋDの相互作用タンパク質バンドがICAM-2溶解物で検出される（第三図）。ICAM-2及びベクターコントロール細胞の表面タンパク質をビオチン付加し、構築ICAM-2結合固相及びストレプトアビジン−アガロース支持体を利用するアフィニティークロマトグラフィー二重カラム系に付した。ICAM-2と相互作用し、更に表面で発現される（ストレプトアビジン‐FITCで検出されるビオチン付加物）いくつかのタンパク質バンドが特定された（第四図）。Ｂ）ICAM-2可溶性タンパク質は細胞表面と結合する。ICAM2-FITCプローブを用いて、NIH3T3、Jurkat及びBaF3細胞を標識し、フローサイトメトリーで検出した。細胞のトリプシンによる前処理によってICAM2-FITC結合は減弱した（右図）。Ｃ）ICAM-2はβ1、β2及びβ3インテグリンと相互作用する。ICAM-2固相からの最終溶出及びその後でストレプトアビジン−アガロースカラムを通過させたものをモノクローナル抗体を用いてβインテグリンに対してイムノブロットを実施した。β1、β2及びβ3の検出は、MALDLMS分析の質量分析の読みによって確認された。Ｄ）β2インテグリンとのICAM-2相互作用はp44/42 MAPKキナーゼ活性を誘発する。β1、β2及びβ3インテグリンは、ICAM-2、ICAM2-AC及びベクターコントロール細胞のICAM-2架橋の前に血清枯渇細胞でモノクローナル抗体を用いてブロックされた。Ｅ）定量的フローサイトメトリーによるインテグリンプロフィールの評価。α5、αL、β1、β2、β3、β4モノクローナル抗体をフィコエリスリン（PE）と結合させ、QuantiBRiTE PEビーズを用いてフローサイトメトリーで定量した（材料と方法の項を参照されたい）。標準抗原濃度曲線の関数として蛍光シグナルを直線回帰分析に付すことによって、細胞当たりの表面分子の数の定量が可能になった。エラーバーは3回の実験の標準偏差を示している。Ｆ）可溶性ICAM-2はp44/42 MAPKリン酸化を誘発し、その活性はαLインテグリンに対する抗体によって阻止される。ICAM-2可溶性タンパク質を血清枯渇Jurkat細胞で表示の濃度で、αLに対するモノクローナル抗体の予備処理の存在下又は非存在下でインキュベートした（mAｂ封鎖実験と同様）。リン−p44/42 MAPK（左）及びp44/42 MAPK（右）活性アッセイのイムノブロットが示されている。
【図１６】ICAM-2／LFA-1相互作用はPYK2及びSYKによって伝達されることを示す実験結果である。Src関連キナーゼに対する種々の薬理学的阻害剤を用いる阻害剤スクリーニングによって、PYK2及びSYKはICAM-2誘発シグナルをPaf及びp44/42 MAPKキナーゼに伝達するために必要であることが確認された。血清枯渇細胞をICAM-2架橋（10μg/ｍL、30分）前に10μMの表示化合物で30分処理し、リン特異的抗体を用い標準的なイムノブロット法でRaf及びp44/42 MAPKのリン酸化について調べた。0.1％のDMSOに溶解させたコントロールIgGは陰性コントロールとして機能した。ブロットは、3回の実験の典型例である。Ｂ）LFA-1サブユニットとのSYK及びPYKの相互作用はICAM-2との相互作用に際して強化される。同時免疫沈澱実験を実施して、αL及びβ2インテグリンを免疫沈澱させ、表示した刺激の関数として30分SYK及びPYKの存在に対してイムノブロットを実施した（抗体は10μg/ｍLで使用し、化合物は１μMで使用し、コントロール19は陰性コントロールとして機能した）。相互同時免疫沈澱によって、PYK及びSYKとβ2インテグリンとの結合が確認された（下図）。Ｃ）PYK2は、ICAM-2の存在下又は更なる刺激でリン酸化される。前記は抗ホスホチロシン免疫沈澱及びそれに続くPYK2に対するイムノブロットで判定された。
【図１７】共焦点顕微鏡検査によって、ICAM-2とLFA-1との相互作用及びそれに続くPYK2のリン酸化の後で、Jurkat細胞でPYK2及びSYKが表面膜に再配分されることが示された実験結果である。Jurkat細胞を可溶性ICAM-2タンパク質（10μg/ｍL）又はウシ血清アルブミン（非刺激、10μg/ｍL）で10分間処理し、更に共焦点顕微鏡検査のために処理した（材料と方法の項参照）。細胞をPYK2、SYK2及びリン酸化PYK2のチロシン402（PYK2ｐTyr402と称する）を染色した。図Ａ−Ｆは非刺激細胞を示し、図Ｇ−ＬはICAM-2処理細胞を示す。矢印は、PYK2及びSYKの細胞内分布における顕著な相違を示すために表示されている。スケールバー（μｍ）は図の左下の隅に示されている。分布の相違を明確にするために図Ｇ−Ｌは高倍率で示されている。
【図１８】フローサイトメトリーによるキナーゼアッセイで判定したとき細胞対細胞接触は、LFA-1発現細胞でp44/42 MAPK活性を、ICAM-2発現細胞でAKT活性を開始させる。Ａ）Jurkat細胞及びレトロウイルスにより形質導入したICAM-2細胞を30分間混合し、CD3及びCD4表面マーカーについて表面染色を実施し、ホスホ−p44/42 MAPK及びホスホ−AKTについて細胞内染色を蛍光結合リン特異的モノクローナル抗体を用いて実施した（材料と方法の項を参照されたい）。蛍光Log強度について判定したとき、高及び低リン酸化AKT並びにp44/42 MAPK集団についてゲートコントロールすることによって、CD3及びCD4表面マーカーを分析することができた。グラフはホスホ−AKTser473又はホスホ−p44/42に対するCD3を示しているが、CD4についても同様である。Ｂ）シグナリング経路のモデルは細胞内ICAM-2／LFA-1相互作用に際して開始した。LFA-1は、ICAM-2との嵌合に際してRAF／MEK／MAPKカスケードを活性化する（前記はPYK2及びSYKにより仲介される）。ICAM-2発現細胞は、ICAM-2が細胞表面でクラスターを形成するときAKT生存経路を活性化させる。
【図１９】スタウロスポリン誘発アポトーシスに対する抗アポトーシス分子のレトロウイルスライブラリーによるスクリーニングによってICAM-2が確認されたことを示す実験結果である。Ａ）ｃDNAライブラリースクリーニングの模式図。107のNIH3T3細胞をJurkatＴ細胞レトロウイルスｃDNAライブラリーに感染させ、スタウロスポリン（１μM）で24時間処理してアポトーシスを誘発した（Stolzenberg et al. 2000）。生存クローンを1週間増殖させ、３回反復選別を実施した。どのウイルス組み込み細胞が抗アポトーシス機能をコードしているかを決定するために、表現型トランスファーアッセイを実施した。生存細胞集団の部分標本を完全なモロニー白血病ウイルス（MMLV）に感染させた。これによって複製欠損ウイルスベクタープロウイルスがレスキューされ、感染性粒子が生成される。NIH3T3細胞をこのレスキューされたウイルスベクターに感染させ、スタウロスポリンで処理して、抗アポトーシス表現型を確認した。Ｂ）スタウロスポリン誘発アポトーシススクリーニングで生き残った集団の複合度。RT-PCRを実施し、生存集団の複合度を調べた。生存集団（１°）はいくつかの明瞭なバンドを示しトランスファー後集団（２°）は単一バンドを示した。Mは分子量マーカーである。陰性コントロールベクター（LacZ）（最初にライブラリーに10％で添加された）は検出できなかった。一方、別個に感染させたBcl-2-発現ベクターは容易に検出された。Ｃ）感染NIH3T3のICAM-2をコードするレトロウイルスベクターのウェスタンブロット分析。Ｄ）ICAM-2を発現するレトロウイルスベクターは異所性に表面ICAM-2を発現する。右図：BaF3プロＢ細胞をICAM-2発現レトロウイルスベクター構築物又はベクターコントロールで感染させ、内因性又は発現されたICAM-2表面発現レベルをフローサイトメトリーでアッセイした。左図：内因性ICAM-2発現のためにHUVEC細胞を染色しフローサイトメトリーでアッセイした。Ｅ）ICAM-2を形質導入したNIH3T3及びJurkatＴ細胞のスタウロスポリン処理又は抗Fas抗体処理24時間に対する用量反応曲線。白四角：ICAM-2発現細胞。黒四角：ベクターのみを発現するコントロール細胞。スタウロスポリン又は抗Fasモノクローナル抗体が存在しない各培養のアポトーシス細胞の割合は３％未満であった。アポトーシス細胞の割合は、３つの培養の平均（棒線）±SDで表した。
【図２０】ICAM-2の過剰発現は抗アポトーシス表現型に様々に影響する。Ａ）スタウロスポリン誘発アポトーシスに対するICAM-2の作用はアネキシンＶ結合アッセイによって判定した。ICAM-2発現NIH3T3及びベクターコントロールNIH3T3をスタウロスポリンの存在下（1μM、24時間）又は非存在下でアネキシン結合アッセイに付した。DMSO賦形剤は陰性コントロールとして機能した。スタウロスポリンが存在しない各培養のアポトーシス細胞の割合は５±1.2％であった。Ｂ）種々のアポトーシス誘発剤の環境下でのJurkat、NIH3T3、70Z/3及びBaF3細胞におけるICAM-2過剰発現の作用。感染細胞を表示のようにスタウロスポリン（1μM）、抗Fas抗体（5μg/ｍL）又はIL-3枯渇で24時間処理し、記載（Jacobson and Raff, 1995）に従ってアポプトーシスについて判定した。細胞をICAM-2、ICAM2-AN、ベクターコントロール又はBch2をコードするレトロウイルス構築物に感染させ、表示のようにアポトーシスを誘発した（24時間、70Z/3細胞：0.2μMのSTP、４時間）。アポトーシス細胞の割合は、３つの培養の平均（棒線）±SDで表わされている。Ｃ）生存には8-アクチニン結合部位が要求される。ICAM-2（野生型配列）（赤線）；ICAM2AC（細胞質ドメイン欠失）（緑線）；ICAM2Cスクランブル（α‐アクチニン結合部位がスクランブルされたかん全長配列）（青線）を抗ICAM2-FITCモノクローナル抗体（IC2/2）によってFACS分類し、エトポシド（100μM、24時間）とともにインキュベートした。生存細胞をエトポシド処理に続いて24時間の回復期間の後で数えた。生存細胞の割合は、３つの培養の平均（棒線）±SDで表わされている。
【図２１】ICAM-2の抗アポトーシス作用にPI3キナーゼが必要であることを示す実験結果である。Ａ）PI3Kの薬理学的阻害剤はICAM-2の抗アポトーシス作用を停止させる。ICAM-2又はベクターを形質導入したBaF3細胞に100nMのウォルトマンニンを24時間添加（白棒）又は非添加したもの（黒棒）にスタウロスポリン処理を実施した（左の棒グラフ）。アポトーシスは核染色及び蛍光顕微鏡検査（左の棒グラフ）並びにアネキシンV結合アッセイ（右の棒グラフ）によって判定した。スタウロスポリンを添加されない各培養のアポトーシス細胞の割合は８±２％であった。アポトーシス細胞の割合は、３つの培養の平均（棒線）±SDで表わされている。ICAM-2、ICAM2-AC又はベクターを形質導入したNIH3T3に10μMのLY294002を24時間添加したもの又は非添加のものにスタウロスポリン処理を実施した（右の棒グラフ）。アポトーシス細胞の割合は、３つの培養の平均（棒線）±SDで表わされている。Ｂ）ICAM-2（上）又はベクターコントロール細胞（下）おけるPI3K（緑）及びAKT（赤）の分布を示す共焦点画像。Ｃ）ICAM-2（上）又はベクターコントロール細胞（下）おけるエズリン（赤）及びPI3Kのp85サブユニット（緑）の分布を示す共焦点画像。
【図２２】ICAM-2シグナルがホスファチジルイノシトール3,4,5トリホスフェート産生、PDK-1及びAKT活性化、並びにそれに続くAKTの下流のエフェクターのリン酸化をもたらすことを示す実験結果である。Ａ）ICAM-2はα‐アクチニン及びエズリンと相互作用する。ICAM-2、ICAM2-AC又はコントロール細胞をICAM-2に対して免疫沈澱させ、α‐アクチニン又はエズリンのどちらかについてイムノブロットを実施した。コントロール溶解物の免疫沈澱は実施せず、検出される相互作用タンパク質のための陽性コントロールとした。Ｂ）ICAM-2細胞は高レベルのホスファチジルイノシトール3,4,5トリホスフェートを示した。ICAM-2及びコントロール細胞を血清枯渇させ（48時間）、LY294002（10μM、24時間）で処理するか、又は培養液で培養し、フローサイトメトリーによるホスファチジルイノシトール3,4,5トリホスフェートの細胞内検出のために処理した。Ｃ）PDK-1 キナーゼレベルはICAM-2細胞で上昇し、Y-27632によって部分的に阻害された。表示の化合物（10μM、1時間）とともにインキュベートした細胞からPDK-1キナーゼを免疫沈澱させ、不活性なSGK酵素及びペプチド基質との免疫キナーゼ反応に付した。[γ32P]ATPのペプチド基質へのリン転移をシンチレーション計測により検出し、カウント／分（CPM）として提示した。Ｄ）ICAM-2及びコントロール細胞の膜／細胞質ゾルにおけるAKTのイムノブロット及びAKTキナーゼ活性。Ｅ）AKTキナーゼレベル及びセリン473及びスレオニン308の二重リン酸化はスタウロスポリン存在下でICAM-2細胞で維持される。Ｆ）AKTキナーゼ基質BAD及びGSK3はスタウロスポリン処理の後ICAM-2発現細胞でリン酸化されたままである。DMSO賦形剤（−）又は１μMのスタウロスポリン（＋）で処理されたICAM-2、ICAM2‐AC及びコントロールベクター細胞に由来する抽出物を表示のようにイムノブロッティングによりBAD及びGSK3リン酸化についてアッセイした。
【図２３】内因性ICAM-2の連結はエズリンのチロシンリン酸化及びPI3Kの膜への補充を誘発し、PDK-1及びAKTキナーゼ活性をもたらすことを示す実験結果である。Ａ）ICAM-2の発現レベルは種々の起源の細胞株間で変動する。定量的フローサイトメトリー分析を実施して、形質転換及び非転換線維芽細胞、Ｔ細胞及び種々のＢ細胞分化状態のリンパ球、並びに骨髄細胞系列の間でICAM-2表面分子の数を判定した（詳細については材料と方法の項を参照されたい）。表面分子数／細胞は３つの実験の平均（棒線）±SDとして表される。Ｂ）内因性ICAM-2の架橋はエズリンのチロシンリン酸化を誘発し、ICAM-2の相互作用を強化する。Jurkat細胞でICAM-2を表示の時間モノクローナル抗体で架橋し、表示のように免疫沈澱／イムノブロッティングに付した。Ｃ）src及びRho依存キナーゼの化学的阻害剤によるエズリンホスホチロシンの阻害。Ｄ）ICAM-2の関数としてのエズリンリン酸化及びPI3Kp85サブユニットとの相互作用の強化。上記のように決定した。Ｅ）上記に記載したようなICAM-2の関数としてのPDK-1の活性。Ｆ）PI3K及びAKTはICAM-2連結の関数として膜に分布する。ICAM-2連結Jurkat細胞で膜／細胞質ゾル分画を時間の関数として実施し、PI3K及びAKTについてイムノブロッティングを実施した。
【図２４】内因性ICAM-2の連結はリンパ球でAKT活性化を誘発し、細胞生存を付与する。Ａ）ICAM-2架橋はJurkat細胞でAKT活性を、続いてGSK3、FKHR及びAFXのリン酸化を時間の関数として誘発した。血清枯渇Jurkat細胞をアイソタイプコントロール又は抗ヒトICAM-2（10μg／ｍL）とともに表示の時間インキュベートした。AKTキナーゼ活性は記載したように決定した。免疫ブロット分析によってAKTの二重リン酸化、FKHR及びGSK3のリン酸化、並びにBADリン酸化がICAM-2架橋の関数として確認された。Ｂ）ICAM-2の架橋はBaF3プレＢ細胞でAKT活性を誘発する。Ｃ）スタウロスポリン（１μＭ、６時間）処理JurkatＴ細胞でのICAM-2のクラスター形成は、フローサイトメトリーアネキシンV結合アッセイで測定したときアポトーシスの低下を示す。スタウロスポリン（＋）又はDMSO賦形剤（−）で処理する前に、ICAM-2モノクローナル抗体（10μg/ｍL）を30分間用いて106のJurkat細胞でICAM-2を架橋した。アポトーシスはアネキシンV結合アッセイを用いてフローサイトメトリーで測定した。Ｄ）ICAM-2生存シグナルは、GTPγS、Psi-テクトリゲニン、Y-27632及びハービマイシンAの存在下で停止する。Jurkat細胞をICAM-2（10μg/ｍL、1時間）との架橋前に表示の阻害剤（10μM、1時間）とインキュベートし、更に抗Fas（50ng/mL、18時間）で処理した。細胞をアネキシンV結合アッセイによってアポトーシスについて判定した。Ｅ）ICAM-2架橋はエズリンとPI3Kとの結合を誘発する。ICAM-2、ベクターコントロール、Jurkat及びICAM-2（10μg/ｍL、15分）架橋Jurkat細胞を免疫沈澱に付し、更にその後表示のようにイムノブロットに付した。
【図２５】ICAM-2の連結はAKT活性を誘発し、初代Ｂ細胞をアポトーシスから保護する。Ａ）ヒト末梢血単球をアポトーシスに付す前にICAM-2（10μg/ｍL、45分）で架橋した。アポトーシスはTNFα（200ng/mL）＋シクロヘキシミド（1μg／ｍL）及び抗Fas抗体（10ng/mL CH11）で12時間処理することによって実施した。マルチパラメーターFACS分析は、CD4＋及びCD19＋の集団におけるICAM-2誘発AKT活性はアポトーシスから保護すること示した（最低で80,000個のCD19＋細胞を得るために１ｘ106の事象を収集した）。Ｂ）PBMCをICAM-1、-2、-3、CD43又はCD44（10μg／ｍL、45分）に対して架橋し、ホスファチジルイノシトール3,4,5トリホスフェート、ホスファチジルイノシトール4,5ビホスフェートのホスファチジルイノシトール検出、又はフローサイトメトリーによるホスホ‐AKTser473検出に付した。細胞サブセットをゲートコントロールし、表示のように提示させた。Ｃ）上記に記載したように、アポトーシスの誘発前にPBMCをICAM-1、-2、-3、CD43又はCD44（10μg／ｍL、45分）について架橋した。アポトーシスはフローサイトメトリーでアネキシンV結合によって測定し、CD19＋細胞についてゲートコントロールした。Ｄ）上記に記載したようにアポトーシスの誘発前に、阻害化合物、Psi-テクトリゲニン及びY-27632（10μM、30分）の存在下及び非存在下でPBMCをICAM-2について架橋した。アポトーシスはアネキシンV結合アッセイによって測定した。Ｅ）LFA-1オーバーレイアッセイ。LY294002（２μM、１時間）で処理した後で、LFA-1及びJurkat細胞をベクターコントロール発現細胞又はICAM-2発現細胞上に重層した。ICAM-2又はベクターコントロール上に重層する前に、いくつかのJurkatサンプルをLFA-1又はMac-1に対するモノクローナル抗体（５μg/ｍL、30分）で処理した。細胞を37℃で30分混合し、続いてフローサイトメトリーに付した。Jurkat細胞をゲートコントロールし、ホスホ‐AKTSer473 ICAM-2細胞の表示された分析から取り出した。Ｆ）ICAM-2仲介細胞生存シグナルモデル。ICAM-2オリゴマー形成は、src／Rho依存メカニズムを介してエズリンを補充し、これをリン酸化する。その結果、エズリンとPI3Kのp85調節性サブユニットとの相互作用を介してPI3Kの膜への補充が達成される。PI3Kの膜への移動によって、PDK-1が活性化され、そのPHドメインとの結合によりAKTを細胞質膜へ補充するホスファチジルイノシトール3,4,5トリホスフェートが生成される。細胞質ゾルAKTの膜への移動によってPDK1/2はAKTをser473及びthr308でリン酸化することができ、AKTを活性化させる。その後、AKTは下流のエフェクター、GSK3、BAD、FKHR（及び細胞タイプに応じて他のエフェクター）をリン酸化する。これらのエフェクターのリン酸化は単独でアポトーシスを阻止するか、又は協調的に生存シグナルを生成する。
【図２６】スタウロスポリン誘発アポトーシスに対する抗アポトーシス分子のレトロウイルスライブラリースクリーニングを示す実験結果である。Ａ）ｃDNAライブラリースクリーニングの模式図である。107のNIH3T3をJurkatＴ細胞レトロウイルスｃDNAライブラリーに感染させ、スタウロスポリン（１μM）で24時間処理してアポトーシスを誘発した（Stolzenberg et al. 2000）。生存クローンを１週間増殖させ、反復選別を３回実施した。どのウイルス組み込み細胞が抗アポトーシス機能をコードしたかを決定するために、表現型トランスファーアッセイを実施した。生存細胞集団の部分標本を完全なモロニーネズミ白血病ウイルス（MMLV）に感染させ、複製が不完全なウイルスベクターのプロウイルスをレスキューして感染性粒子を生成させた。NIH3T3細胞を前記レスキューしたウイルスベクターに感染させ、スタウロスポリンで処理して抗アポトーシス表現型を確認した。Ｂ）スタウロスポリン誘発アポトーシススクリーニングで生き残った集団の複合度。RT-PCRを実施して生存集団の複合度を判定した。生存集団（１°）はいくつかの明瞭なバンドを示し、トランスファー後集団（２°）は単一バンドを示した。Mは分子量マーカーである。陰性コントロールベクター（LacZ）（最初にライブラリーに10％で添加された）は検出できなかった。一方、別個に感染させたBcl-2-発現ベクターは容易に検出された。
【図２７】ICAM-2の過剰発現はスタウロスポリン誘発アポトーシスを阻害することを示す実験結果である。Ａ）感染NIH3T3でICAM-2をコードするレトロウイルスベクターのウェスタンブロット分析を示す。Ｂ）ICAM-2をコードするレトロウイルスベクターは表面ICAM-2を異所性に発現する。右図：BaF3プロＢ細胞をICAM-2をコードするレトロウイルスベクター構築物又はベクターコントロールに感染させ、内因性又は後天的発現ICAM-2の表面発現レベルをフローサイトメトリーでアッセイした。左図：内因性ICAM-2発現を調べるために染色したHUVEC細胞のフローサイトメトリーによるアッセイ。Ｃ）ICAM-2を形質導入したNIH3T3及びJurkatＴ細胞のスタウロスポリン又は抗Fas抗体の24時間処理に対する用量反応曲線。白四角：ICAM-2発現細胞。黒四角：ベクターのみを発現するコントロール細胞。スタウロスポリン又は抗Fasモノクローナル抗体が存在しない各培養のアポトーシス細胞の割合は３％未満であった。アポトーシス細胞の百分率は３つの培養の平均（棒線）±SDとして表されている。Ｄ）陰性コントロールのNIH3T3ベクターコントロール（−STP）、陽性コントロールのNIH3T3ベクターコントロール（＋STP）及びICAM-2発現NIH3T3の濃縮核。核をヘキスト（５μg/ｍL）及びアクリジンオレンジ（25μM）及びに臭化エチジウム（25μM）で染色した。挿入図は細胞死（橙色）又は細胞生存度（緑色）の程度を示している。Ｅ）スタウロスポリン誘発アポトーシスに対するICAM-2の作用をアネキシンV結合アッセイによって判定した。ICAM-2発現NIH3T3及びベクターコントロールNIH3T3をスタウロスポリンの存在下（1μM、24時間）又は非存在下でアネキシンV結合アッセイに付した。DMSO賦形剤は陰性コントロールとして機能した。スタウロスポリンが存在しない各培養のアポトーシス細胞の割合は５±1.2％であった。
【図２８】ICAM-2は抗アポトーシス作用を仲介することを示す実験結果である。Ａ）種々のアポトーシス誘発剤存在下におけるJurkat、NIH3T3、70Z/３及びBaF3細胞でのICAM-2過剰発現の作用。表示のようにスタウロスポリン（1μM）、抗Fas抗体（5μg/ｍL）、又は24時間のIL-3枯渇処理を感染細胞で実施し、記載に従って（Jacobson and Raff, 1995）アポトーシスを判定した。JurkatＴ細胞をICAM-2をコードするレトロウイルス構築物又はベクターコントロールに感染させた。マウスプレＢ-70Z/3細胞をICAM-2をコードするレトロウイルス構築物又はベクターコントロールに感染させ、スタウロスポリン（0.2μＭ）で４時間処理してアポトーシスについて調べた。IL-3依存BaF3細胞をICAM-2、ICAM2-ΔC又はBcl2をコードするレトロウイルス構築物に感染させた。アポトーシスを誘発するために、細胞をIL-3欠乏培養液で24時間維持した。ICAM-2又はインフレーム欠損細胞外ドメインをコードするレトロウイルスを発現するBaF3細胞を抗マウスFasで24時間処理し、細胞死を判定した。アポトーシス細胞の百分率は３つの培養の平均（棒線）±SDとして表されている。Ｂ）α‐アクチニン結合部位は生存に必要である。NIH3T3細胞にICAM‐2をコードするレトロウイルス構築物を形質導入した：ICAM-2、野生型（赤線）；ICAM-2ΔC、細胞質ドメイン欠失（緑線）；ICAM-2Cスクランブル、α‐アクチニン結合部位がスクランブルされている完全長の配列（青線）。天然のタンパク質を認識する蛍光色素を結合させた抗ICAM-2モノクローナル抗体（IC2/2）で形質導入細胞を標識した。続いて細胞をFACS（MoFlo, Cytomation, Ft. Collins, CO）で精製した。分類した細胞を培養し、続いて前記細胞を100μMのエトポシドで24時間チャレンジした。薬剤を除去した後、生存細胞を24時間回復させ、生存細胞数を数えた。生存細胞の百分率は３つの培養の平均（棒線）±SDとして表されている。Ｃ）α‐アクチニン及びエズリンは両者ともICAM-2と同時免疫沈澱し、ICAM-2のＣ末端と相互作用する。ICAM-2、ICAM2-ΔC及びベクターコントロールを形質導入したNIH3T3からICAM-2を免疫沈澱させ、免疫沈澱物をSDS-PAGEで分解させ、α‐アクチニン、エズリン及びICAM-2についてイムノブロットを実施した。
【図２９】PI3Kの薬理学的阻害剤はICAM-2の抗アポトーシス作用を停止させることを示す実験結果である。Ａ）ICAM-2の抗アポトーシス作用はウォルトマンニン及びLY294002の両薬剤に感受性を示す。ICAM-2又はベクターを形質導入したBaF3細胞を100ｎMのウォルトマンニンの存在下（白抜き）また非存在下（黒塗り）でスタウロスポリン（1μM）で24時間処理した。アポトーシスは核染色と蛍光顕微鏡検査により（左棒グラフ）及びアネキシンV結合アッセイ（右棒グラフ）により判定した。スタウロスポリンが存在しない各培養のアポトーシス細胞の割合は８±２％であった。アポトーシス細胞の割合は３つの培養の平均（棒線）±SDで表わされている。ICAM-2、ICAM2-ΔC又はベクターを形質導入したNIH3T3を10μMのLY294002の存在下また非存在下でスタウロスポリン（1μM）で24時間処理した。DMSO賦形剤は陰性コントロールとして機能した。アポトーシス細胞の百分率は３つの培養の平均（棒線）±SDで表わされている。Ｂ）ICAM-2発現NIH3T3細胞は、PI3K阻害剤（LY294002）の存在下でアポトーシスに対して感受性を示す。BrdU TUNELアッセイを、スタウロスポリン（1μM）又はLY294002（10μM）で処理した、ICAM-2、ICAM2-ΔC及びコントロールベクター形質導入NIH3T3細胞で実施した。アポトーシス細胞の百分率は３つの培養の平均（棒線）±SDで表わされている。
【図３０】ICAM-2はAKTキナーゼ活性並びにBAD及びGSKのリン酸化を誘発することを示す実験結果である。Ａ）AKTキナーゼレベル並びにセリン473及びスレオニン308における二重リン酸化はICAM-2発現細胞で上昇し、スタウロスポリンの存在下で維持される。AKTキナーゼを、スタウロスポリンの存在下（1μMのスタウロスポリン（＋））又は非存在下で（DMSO賦形剤（−））、ICAM-2、ICAM2-ΔC及びコントロールベクター（ｐBMN-Z-IN-GFP）を発現するNIH3T3線維芽細胞から免疫沈澱させた。リン酸化GSKは抗ホスホ‐GSK特異的イムノブロッティングによって特定した。Ｂ）AKTキナーゼ基質BAD、FKHR及びGSK3はICAM-2発現細胞ではスタウロスポリン処理後もリン酸化されたままであった。DMSO賦形剤処理（−）又は１μMのスタウロスポリン処理（＋）したICAM-2、ICAM2-ΔC及びコントロールベクター発現NIH3T3線維芽細胞から得た抽出物をBAD及びGSK3のリン酸化についてアッセイし、更にBAD又はGSK3を免疫沈澱させ、ホスホ‐BAD又はホスホ‐GSK3特異的抗体でイムノブロッティングを実施した。Ｃ）ICAM-2の抗アポトーシス作用は、イムノブロッティングで判定したとき、Bcl2又はBcl-XL/Sに依存しなかった。ICAM-2又はICAM2-ΔCを形質導入したNIH3T3をDMSO賦形剤（−）又は1μMスタウロスポリン（＋）で24時間処理し、イムノブロッティングによってBcl2及びBcl-XL/Sの発現についてアッセイした。Ｄ）ICAM-2の発現レベルは種々の起源の細胞株間で変動する。定量的フローサイトメトリー分析を実施して、形質転換線維芽細胞及び非転換線維芽細胞、Ｔ細胞及び種々のＢ細胞分化状態のリンパ球、及び骨髄細胞系列間でICAM-2表面分子の数を調べた。相乗平均蛍光値の目盛り修正を、既知量のフィコエリスリン分子で標識したビーズの相乗平均蛍光値から得た標準曲線に対して実施した（詳細については実験方法の項を参照されたい）。表面分子数／細胞は３回の実験の平均（棒線）±SDとして表わされている。
【図３１】内因性ICAM-2の架橋はBaF3Ｂ細胞でAKTの活性化を誘発し、Jurkat細胞をアポトーシスから保護することを示す実験結果である。Ａ）抗ICAM-2モノクローナル抗体によるICAM-2の架橋はAKT活性を誘発した。血清枯渇BaF3プレＢ細胞を正常ラットIgG2（アイソタイプコントロール）又は抗マウスICAM-2のいずれかとともに10μg/ｍLで表示の時間インキュベートした。AKTキナーゼ活性は記載したように測定した。イムノブロット分析を実施して、AKTの二重リン酸化、FKHRリン酸化及びBADリン酸化をICAM-2の架橋の関数として確認した。アイソタイプコントロールはAKTリン酸化又はFKHRもしくはBADのリン酸化を誘発しなかった（データは示されていない）。Ｂ）スタウロスポリン（１μMで６時間）処理JurkatＴ細胞上のICAM-2のクラスター形成は、フローサイトメトリーアネキシンV結合アッセイで測定したときアポプトーシスの低下を示す。スタウロスポリン処理（＋）又はDMSO賦形剤処理（−）前に、抗ICAM-2モノクローナル抗体（10μg/ｍL）で30分ICAM-2を106のJurkatＴ細胞上で架橋した。アポトーシスはアネキシンV結合アッセイ（100,000事象を収集）を用いてフローサイトメトリーで測定した。Ｃ）JurkatＴ細胞上でのICAM-2の架橋はスタウロスポリン処理における細胞死のパーセンテージを減少させる。細胞死の百分率は３つの培養の平均（棒線）±SDで表わされている。Ｄ）ICAM-2の架橋はJurkatＴ細胞でAKT活性を誘発し、続いて時間の関数としてGSK3、FKHR、AFXのリン酸化を誘発する。106のJurkatＴ細胞をスタウロスポリン（1μM）で1時間処理して（（＋）で表示）アポトーシスを誘発した。スタウロスポリン誘発アポトーシスから1時間して、ICAM-2を抗ICAM-2モノクローナル抗体（10μg/ｍL）を用いて表示の時間架橋した。切断カスパーゼの減少はアイソタイプコントロール（10μg/ｍL）では観察されなかった（データは示されていない）。Ｆ）ICAM-2架橋はAKT活性を、続いてBADのリン酸化を誘発し、スタウロスポリンによるアポトーシスの誘発を凌駕するために十分である。Jurkat細胞を上記に記載したように処理した。AKT活性をAKTキナーゼアッセイによって測定し、AKTの二重リン酸化は、ser473及びthr308に対するホスホ‐特異的抗体でイムノブロッティングによって決定した。BADリン酸化は、BADの免疫沈澱を実施し、続いて（ser112及びser136に対する）リン特異的抗体によるイムノブロッティイングによって検出された。アイソタイプコントロール（10μg/ｍg）はAKT活性化を発生させなかった（データは示されていない）。
【図３２】ヒト初代CD4＋及びCD19＋のTNFα及びFas誘発アポトーシスに対する耐性はICAM-2架橋に続く活性なAKTによって仲介される。Ａ）ヒト末梢血単球をICAM-2クラスター形成に続くAKT活性について、モノクローナル抗体（中央の図）又は抗ICAM-2標識抗体（下図）を用い、続いてCD4もしくはCD19マーカーでゲートコントロールすることによってアッセイした（50,000事象を収集）。Ｂ）ヒト末梢血単球をICAM-2（10μg/ｍL、45分）に対して架橋し、その後TNFα（200ng/mL）＋シクロヘキシミド（1μg/ｍL）及び抗Fas抗体（10ng/mL CH11）で12時間処理してアポトーシスに付した。マルチパラメーターFACS分析で、CD4＋及びCD19＋集団のICAM-2誘発AKT活性はアポトーシスから保護することが示される。（１ｘ106の事象を収集し、最低限80,000個のCD19＋細胞を得た）。Ｃ）ICAM-2仲介抗アポトーシスシグナリングモデル。ICAM-2は細胞内リンカータンパク質α‐アクチニン及びエズリンと結合し、前記はPI3Kを細胞膜に補充する。PI3Kはリン酸イノシトールを生成し、前記はAKTのPHドメインに結合することによってAKTを細胞膜に補充する。細胞質ゾルのAKTの膜への移動によってPDK1/2はAKTをそのser473及びthr308でリン酸化してAKTを活性化できる。AKTは続いて下流のエフェクター、GSK3、BAD、FKHR（及び細胞タイプに応じておそらくは他のエフェクター）をリン酸化する。これらのエフェクターのリン酸化は単独でアポトーシスを阻止するか、又は協調的に生存シグナルを生成することができる。
【図３３】可溶性のICAM-2の結合はLFA-1のクラスター形成及び細胞骨格の分極を誘発する。Ａ）レトロウイルスにより形質導入したNIH3T3から得られた精製ヒトICAM-2（材料と方法の項を参照されたい）を純度、サイズ及び凝集塊の形成について非変性ゲル電気泳動及びゲルろ過によって調べた。２つの別個の調製物に由来する精製ICAM-2及びNSO細胞に由来するICAM-2の分析。分子量標準物からの相対的泳動距離を用いて分子量を計算した。濃度は標準物として段階希釈したBSAを用いて決定した。分子量及び濃度は図中に提示されている。Ｂ）時間の関数としてのICAM-2リガンドの細胞表面への結合。５ｘ106の非刺激及びPMA刺激（1μg/ｍL、30分）JurkatＴ細胞をICAM2-FITC又はLFA1-FITC抗体（1μg/ｍL）とともにインキュベートし、時間依存フローサイトメトリーを実施した。ゲートコントロールした均質な細胞集団の平均蛍光強度をグラフに表した。流速を200から300細胞／秒に維持し、蛍光強度値を10ミリ秒間隔で1200秒間捕捉した。Ｃ）サイトカリシンD処理（10μM、30分）Jurkat細胞上での37℃及び４℃におけるICAM2-FITC及びα‐LFA1-FITC表面結合のフローサイトメトリー分析。Ｄ）104細胞当たりのICAM2-FITC結合の曲線適合分析。Jurkat細胞をICAM2-FITCとともに37℃で30分、50μLの容積中で表示の濃度でインキュベートした。細胞を１回洗浄し、104細胞の平均蛍光強度（MFI）について分析した。ICAM2-FITC結合パーセントを以下の等式から算出した：100ｘ［（MFI[x]−MFIunstained）／（MFI[saturated]−MFIunstained）］。式中、[x]はICAM2-FITC濃度であり、[saturated]は結合が飽和した濃度である。数値は等式Ｙ＝ｍ１*Ｍ０／（ｍ２＋Ｍ０）に適合させた（材料と方法の項を参照されたい）。
【図３４】ICAM-2によって誘発されるLFA-1のクラスター形成、活性化及びアクチン／微小管再編成の同時検出を示す。Ａ）Jurkat細胞におけるICAM-2刺激（10μg/ｍL、30分）時のアクチン及び微小管構造の共焦点顕微鏡検査。アクチンをファロイジン−アレキサ633で染色し、チューブリンをタキソール−アレキサ546で染色した。挿入図は対応する処理の拡大細胞像を示す。Ｂ）上記に記載したアクチン及び微小管のフローサイトメトリー染色。Ｃ）左：ICAM2-FITC（1μg/ｍL、時間は表示）の表面分布の局所蛍光分析。色の濃度勾配は、高い（赤）蛍光強度値及び低い（青）蛍光強度値を示している。右：ICAM2-FITCの表面結合（10μg/ｍL、30分）及び抗β2‐アレキサ568（クローンCTB104）の共焦点顕微鏡検査。Ｄ）サイトカリシンD処理Jurkat細胞の37℃及び４℃におけるICAM2-FITCの表面結合（蛍光強度）及び表面分布（蛍光パルス）のフローサイトメトリーによる染色。Ｅ）本文記載のICAM2-FITC蛍光強度／飛行時間（time of flight）／細胞のための値。Ｆ）mAb24‐アレキサフルア633によるLFA-1活性化のためのフローサイトメトリー染色。ICAM-2刺激（10μg/ｍL、30分）前に表示の刺激（10μM、30分）、PMA（1μg/ｍL）を付与。染色は37℃で実施。Ｇ）mAB24-633の平均蛍光強度（MFI）値及びICAM-2クラスター形成値は、時間の関数として上記のようにコンピュータで算出した。
【図３５】LFA-1相互作用を介するICAM-2誘発p44/42 MAPKの活性化を示す実験結果である。Ａ）（上記のような）処理Jurkat細胞におけるICAM2-FITCの平均蛍光強度（MFI）値及びmAb24‐アレキサ633のMFI値（LFA-1活性化）。コントロールの非刺激値及び／又は化合物予備処理値を差し引いた。Ｂ）上図：Jurkat細胞におけるICAM-2用量の関数としての細胞内ホスホ−p44/42 MAPKのフローサイトメトリーによる検出（材料と方法の項を参照されたい）。平均蛍光強度（MFI）値±標準偏差（SD）をグラフに表した。下図：ICAM-2処理Jurkat細胞を上記のように細胞内ホスホ−p44/42 MAPKについて染色した。β2及びαLインテグリン（10μg/ｍＬ、10分）に対してmAbを表示のようにICAM-2処理前に滴定し、MFI±SDをグラフに表した。Ｃ）ICAM-2誘発p44/42 MAPK活性は、p44/42 MAPKキナーゼアッセイによって判定したとき、β2及びαLインテグリン抗体によって阻止される。誘発及び阻害条件は上記に記載したとおりである。活性なリコンビナントp44/42 MAPKは陽性内部コントロールとして機能する（“＋”で表示）。Ｄ）化学物質（10μM）、EDTA（1mM）の存在下、又はPMA、イオノマイシン及びICAM-2刺激（上記に表示したとおり）時のフローサイトメトリーによる細胞内ホスホ−p44/42 MAPKの阻害プロフィール及び活性化プロフィール。MFI値±SDがグラフに表されている。
【図３６】ICAM-2誘発Pyk2及びSykのリン酸化並びにβ2インテグリン結合を示す実験結果である。Ａ）チロシンキナーゼ阻害剤によるホスホ−raf及びホスホ−p44/42のイムノブロット阻害プロフィール。１ｘ106の細胞を表示の化合物（10μM、30分）で処理し、続いてICAM-2（10μg/ｍL、30分）で刺激した。細胞溶解物をホスホ−raf及びホスホ−p44/42についてイムノブロットを実施した。化合物単独では検出可能なリン酸化は検出されなかった。Ｂ）Pyk2及びSykは、ICAM-2刺激に際してリン酸化され、β2インテグリンで同時免疫沈澱される。リン特異性はホスホ−PykpY402及びホスホ−syk（Tyr525/526）抗体によって決定された。Ｃ）単位時間に対するICAM-2刺激の関数としてのPKCα／β、Pyk2及びSykのリン酸化状態のカイネティクス分析。上記のように細胞を処理した。リン特異的PKCα／βII（Thr638）及び以下の抗体を使用した：Pyk2及びSykを先ず免疫沈澱させ、抗ホスホチロシン抗体（PY20）をプローブとして調べ、ブロットを剥ぎ取り、続いて表示の非リン特異的抗体をプローブとして調べた。イムノブロットは３つの実験の典型例である。
【図３７】ICAM-2はIL-2活性化ヒトPBMCで細胞毒性リンパ球活性を誘発することを示す実験結果である。Ａ）PBMCを、IL-2の存在下でICAM-2（10μg/ｍL）で12時間処理し、続いてCFSEで標識した標的HL60細胞とともに50:1のE:T比で４時間インキュベートした。残存するHL60細胞をフローサイトメトリーで定量する。Ｂ）PBMCをIL-2（100U/mL、12時間）で処理し、更にICAM-1、-2又は3FCタンパク質（10μg/ｍL）で処理し、上記のように細胞毒性アッセイで使用した。結果は4回の別個の実験の典型例である。
【図３８】ICAM-2は、CD56+CD8+細胞毒性リンパ球サブセットのパーフォリン及びグランザイムの放出においてICAM-1及びICAM-3とは相違を有することことを示す実験結果である。IL-2活性化PBMCを擬似処理（IgG）、ICAM-1、ICAM-2又はICAM-3で（FC融合タンパク質で10μg/ｍL）12時間処理し、その後で標的HL60細胞とともに50:1のE:T比で４時間インキュベートした。続いて細胞を、CD8-CY5PE、CD56-PE表面染色、並びにパーフォリン‐CY5及びグランザイムA-FITC細胞内染色によるフローサイトメトリーのために処理した。図版Iに示したように細胞をCD56+CD8low、CD56+CD8med、CD56+CD8high、CD56-CD8-、CD56-CD8highのためにゲートコントロールし、更に適切なゲート内集団頻度のためにゲートコントロールした。図版IIからVは、パーフォリン及びグランザイムAについてLog蛍光強度を表示したゲートコントロールサブセット集団である。結果は３つの別個の実験の典型例であり、25:1及び12.5:1のE:T比の場合（データは示されていない）と類似していた。手動による目盛り修正を実施した。Ｂ）CD56CD8集団サブセットを（表示のように）ゲートコントロールし、ICAM-1、-2、-3刺激細胞の細胞内パーフォリンについて表示されている。パーフォリンの百分率は以下の等式から算出された：100ｘ［（MFIexperimental−MFIisotype mAb）／（MFIcontrol−MFIisotype mAb）］。式中、MFIは平均蛍光強度である。非刺激細胞をコントロールとして用いた。Ｃ）細胞内グランザイムA値を計算し、上記のように表示した。
【図３９】ICAM-2誘発LFA-1仲介p44/42 MAPKはヒトCD56+CD8+細胞でLFA-1活性化と相関性を有することを示す実験結果である。Ａ）CFSE標識HL60細胞とCD56+CD8+細胞との結合の形成。結合物フローサイトメトリーアッセイを表示の化学物質（10μM、30分）で処理したPBMCで実施し、その後でICAM-2（10μg/ｍL、30分）で処理した。CFSE標識HL60細胞を25:1のE:T比で５分インキュベートし、１％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて細胞をCD8及びCD56抗体で免疫標識し、CD8+CD56+細胞集団についてゲートコントロールを実施し、更に全HL60細胞に対してHL60蛍光のパーセントを得た。Ｂ）IL-2活性化PBMCをICAM-2（10μg/ｍL、30分）で処理するか、又は擬似処理（IgG）し、活性‐LFA-1（mAb24‐アレキサ633）、ホスホ-p44/42-Ax488、CD8-CY5PE及びCD56-PEのために染色した。CD56+CD8+細胞集団をゲートコントロールし、ホスホ-p44/42と対比させて活性なLFA-1を表示した。mAb24‐Ax633及びホスホ-p44/42-Ax488の平均蛍光強度（MFI）をコンピュータで計算し、上記に記載したように時間に対して表示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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