(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、少なくとも１つのアッセイステーションを有する基材を備えた装置に関する。前記少なくとも１つのアッセイステーションは、少なくとも１つの第一のアッセイステーションチャネルと少なくとも１つの第二のアッセイステーションチャネルを有し、前記第一及び第二のアッセイステーションチャネルは、各々独立に、前記少なくとも１つのアッセイステーションと連通されている。前記装置は、それぞれ、前記第一及び第二のアッセイステーションチャネルと連通した配置の少なくとも第一及び第二の多目的チャネルを有している。前記第一の多目的チャネルと第一のアッセイステーションチャネルは、試料溶液を伝導できる内部表面特性を有している。前記少なくとも第一の多目的チャネルと連通した少なくとも１つの試料流体注入口と、前記少なくとも第一及び第二の多目的チャネルに連通した少なくとも１つの隔離媒体注入口とが存在する。前記少なくとも１つの第二の多目的チャネルは、前記試料溶液を伝導しない内部表面部分を有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアッセイステーションを有する基材と、
少なくとも１つの第一の多目的チャネル及び少なくとも１つの第二の多目的チャネルの配列とを備え、前記少なくとも１つのアッセイステーションが前記第一及び第二の多目的チャネルの中間位に位置しており且つ液体を通じてこれらのチャネルと連通しており、前記第一の多目的チャネルが試料流体を伝導させる少なくとも１つの特性を有しており、
前記少なくとも第一の多目的チャネルと連通した少なくとも１つの試料流体注入口と、
前記少なくとも第一及び第二の多目的チャネルと連通した少なくとも１つの隔離溶媒注入口とを備え、前記少なくとも１つの第二の多目的チャネルが前記試料流体を伝導させない少なくとも１つの特性を有する、
ことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記流体による連通が、前記第一及び第二の多目的チャネルと連通した少なくとも第一及び第二のアッセイステーションチャネルを介して連通されている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記試料流体を伝導する前記第一の多目的チャネルの特性が内部表面特性及び／又は形状特性のうち少なくとも１つを備え、前記試料流体を伝導させない前記少なくとも１つの第二の多目的チャネルの特性が内部表面部分及び／又は形状特性のうち少なくとも１つを備えたことを特徴とする、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記装置が少なくとも１つのアッセイステーションを密封する密封層をさらに備えたことを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記第一の多目的チャネルの前記内部表面が、試料流体、空気、及び隔離媒体のうち少なくとも１つを貫流させることができることを特徴とする、請求項１乃至４の何れか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記第二の多目的チャネルの前記内部表面が、空気又は隔離媒体のうち少なくとも１つを貫流させることができることを特徴とする、請求項１乃至５の何れか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記アッセイステーション、第一の多目的チャネル、及び第二の多目的チャネルの少なくとも一部が前記基材層中に形成されていることを特徴とする、請求項１乃至６の何れか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記アッセイステーション、第一の多目的チャネル、及び第二の多目的チャネルのうち少なくとも１つの少なくとも一部が前記基材層中に形成されており、前記アッセイステーション、第一の多目的チャネル、及び第二の多目的チャネルのうち少なくとも１つの少なくとも一部が密封層中に形成されていることを特徴とする、請求項４又は請求項４に従属した請求項５乃至７の何れか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記多目的チャネルの前記内部表面と、前記第二のアッセイステーションチャネルと前記第二の多目的チャネルとの交差部に直接隣接した前記第二のアッセイステーションの表面とが、前記試料流体を伝導させないことを特徴とする、請求項２又は請求項２に従属した請求項３乃至７の何れか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記少なくとも第一及び第二の多目的チャネルが、それぞれ、前記複数のアッセイステーションの前記第一及び第二のアッセイステーションチャネルを介して、前記複数のアッセイステーションに連通していることを特徴とする、請求項２又は請求項２に従属した請求項３乃至７の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記複数のアッセイステーションに伝導される前記試料流体溶液による前記複数のアッセイステーションの同時充填又は順次充填のうち少なくとも１つが与えられるように、前記複数のアッセイステーションが配列されていることを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記複数のアッセイステーションを密封するための前記隔離媒体による前記第一及び第二の多目的チャネルの同時充填又は順次充填のうち少なくとも１つが与えられるように、前記複数のアッセイステーションが配列されていることを特徴とする、請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのアッセイステーションの中に、少なくとも１つの反応アッセイ要素が配置されていることを特徴とする、請求項１乃至６の何れか１項に記載の装置。
【請求項１４】
前記試料流体注入口が試料流体調製要素と連通されていることを特徴とする、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の装置。
【請求項１５】
少なくとも１つの試料調製チャンバーと蓋がさらに含まれていることを特徴とする、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
少なくとも１つの前記チャネル中の流体のフローを調節するための少なくとも１つの要素がさらに含まれていることを特徴とする、請求項１乃至１５の何れか１項に記載の装置。
【請求項１７】
フロー促進流体を導入するためのチャンバーがさらに含まれていることを特徴とする、請求項１乃至１６の何れか１項に記載の装置。
【請求項１８】
少なくとも１つの前記チャンバー又は注入口が、前記フロー促進流体を前記試料流体と混合するための混合チャンバーと連通していることを特徴とする、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのアッセイステーションの中に、アッセイ反応の少なくとも１つの成分が予め搭載されていることを特徴とする、請求項１乃至１８の何れか１項に記載の装置。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのアッセイステーションでの前記アッセイ反応の前記少なくとも１つの成分が、少なくとも１つの検出可能な定性的データ又は定量的データを与えることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記アッセイ反応の前記少なくとも１つの成分を有するビーズがさらに含まれていることを特徴とする、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記アッセイ反応の前記少なくとも１つの成分が、前記少なくとも１つのアッセイステーションに固定されていることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２３】
前記試料調製チャンバーがさらに吸収剤を備えたことを特徴とする、請求項１５又は請求項１６に従属した請求項１６乃至２２の何れか１項に記載の装置。
【請求項２４】
前記少なくとも第一及び第二の多目的チャネルのうち少なくとも１つの終末部分と連通している吸収剤が与えられていることを特徴とする、請求項１乃至２２の何れか１項に記載の装置。
【請求項２５】
前記吸収剤が、前記少なくとも第一及び第二の多目的チャネルの終末部分に取り外し可能に取り付けられていることを特徴とする、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのフロー調節要素が、前記試料調製チャンバーと前記少なくとも第一の多目的チャネルとの間に配置されていることを特徴とする、請求項１６又は請求項１６に従属した請求項１７乃至２５の何れか１項に記載の装置。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのフロー調節要素が、前記少なくとも１つのアッセイステーションに隣接して配置されていることを特徴とする、請求項１６又は請求項１６に従属した請求項１７乃至２５の何れか１項に記載の装置。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのアッセイステーションがさらにフロー促進構造から構成されることを特徴とする、請求項１乃至２７の何れか１項に記載の装置。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの第一のアッセイステーションチャネルの前記少なくとも一部が、前記少なくとも第二のアッセイステーションチャネルの少なくとも一部の断面積より小さな断面積を有することを特徴とする、請求項２又は請求項２に従属した請求項３乃至２８の何れか１項に記載の装置。
【請求項３０】
前記第一及び第二の多目的チャネルが、隔離媒体の貫流によって前記複数のアッセイステーションを密封する経路を与えることを特徴とする、請求項１０又は請求項１０に従属した請求項１１乃至２９の何れか１項に記載の装置。
【請求項３１】
前記第一及び第二の多目的チャネルが試料流体及び／又は隔離媒体によって充填された後に、前記少なくとも第一及び第二の多目的チャネルの露出部分が、粘着的、機械的、電気的、又は磁気的に、周囲の大気から固体により密封されることを特徴とする、請求項１又は請求項１に従属した請求項２乃至３０の何れか１項に記載の装置。
【請求項３２】
基材が設けられており、該基材が、
望ましくない成分を試料流体から除去するための試料調製チャンバーと、
前記試料調製チャンバーに流体を通じて連結された試料流体注入口と、
フロー促進流体を受容するためのチャンバー又は注入口と、
前記試料調製チャンバーから、フロー促進流体を受容するための前記チャンバー又は注入口への試料流体のフローを調節するためのフロー調節要素と、
前記チャンバーに流体を通じて連結された少なくとも１つの第一の多目的チャネルと、
少なくとも１つのアッセイステーションと、
前記少なくとも１つのアッセイステーションに連通された前記第一の多目的チャネルと、
前記チャンバーから前記少なくとも１つのアッセイステーションへの流体のフローを隔離し、フローを可能とするための第二のフロー調節要素と、
前記少なくとも１つのアッセイステーションに連結された第一のアッセイステーションチャネルと、
を備えたことを特徴とする、試料流体を分析するための装置。
【請求項３３】
前記試料調製チャンバーが、前記試料調製チャンバーの少なくとも一部を密封する焼結ガラスブロックを備えたことを特徴とする、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記第一の多目的チャネルが試料流体及び／又は隔離媒体によって充填された後に、前記少なくとも第一の多目的チャネルの一部が、粘着的、機械的、電気的、又は磁気的に、周囲の大気から固体により密封されることを特徴とする、請求項３２又は３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記望ましくない成分を吸収するために、吸収剤が前記焼結ガラスブロックに吸着することを特徴とする、請求項３３に記載の装置。
【請求項３６】
密封層が、前記ろ過チャンバー、チャンバー、第一の多目的チャネル、アッセイステーション、第一のアッセイチャネルのうち少なくとも１つを密封することを特徴とする、請求項３２乃至３５の何れか１項に記載の装置。
【請求項３７】
前記環境から前記ろ過チャンバーの少なくとも一部を密封するダイアフラムと、
該ダイアフラムを振動させることにより、溶解緩衝液を攪拌するための振動式アクチュエータと、
がさらに加えられていることを特徴とする、請求項３２乃至３６の何れか１項に記載の装置。
【請求項３８】
前記基材が、（ａ）ガラス、（ｂ）プラスチック、（ｃ）エラストマー、（ｄ）複合材料、（ｅ）シリコン、及び（ｆ）金属のうち少なくとも１つを備えることを特徴とする、請求項３２乃至３７の何れか１項に記載の装置。
【請求項３９】
前記エラストマーがポリジメチルシロキサンを備えることを特徴とする、請求項３８に記載の装置。
【請求項４０】
基材上で反応を行う方法であって、前記基材が少なくとも１つのアッセイステーションと、少なくとも第一及び第二の多目的チャネルの配列とを備え、前記少なくとも１つのアッセイステーションが前記第一及び第二の多目的チャネルの中間位に位置しており且つ液体を通じてこれらのチャネルと連通しており、前記第一の多目的チャネルが試料溶液を伝導させる内部表面特性を有しており、前記少なくとも第一の多目的チャネルと連通した少なくとも１つの試料流体受容領域と、前記少なくとも第一及び第二の多目的チャネルと連通した少なくとも１つの隔離媒体注入口とを備え、前記少なくとも１つの第二の多目的チャネルが前記試料流体を伝導させない少なくとも１つの内部表面部分特性を有し、
前記方法が、
試料流体を取得することと、
少なくとも１つの試料注入口に試料流体を導入することと、
前記少なくとも１つの多目的チャネルを介して、前記少なくとも１つのアッセイステーションを充填することと、
前記少なくとも１つの隔離媒体ポートから、隔離媒体を少なくとも前記第一の多目的チャネルに流入させることと、
前記少なくとも１つのアッセイステーションにおいて少なくとも１つの反応を実行し、前記反応が前記試料流体に関する定性的データ又は定量的データのうち少なくとも１つ与えることと、
を備えた方法。
【請求項４１】
温度調節下で前記少なくとも１つの反応を実行することをさらに含むことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
被検試料から前記試料流体を取得する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記被検試料を少なくとも１つの予備操作に供する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの予備操作を前記基材とは分離して行うことをさらに含むことを特徴とする。請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記基材上又は基材内のうち少なくとも１つにおいて、前記少なくとも１つの予備操作を行うことをさらに含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの定性的データ又は定量的データが、比色分析、蛍光、又は発光結果のうち少なくとも１つを提供することを特徴とする、請求項４０乃至４５の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの予備操作によって、前記少なくとも１つの反応中で使用できる核酸が与えられることを特徴とする、請求項４３乃至４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも１つのアッセイ反応成分を前記少なくとも１つのアッセイステーション中に配置する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４０乃至４７の何れか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの反応を実行する前記工程が核酸増幅を備えたことを特徴とする、請求項４０乃至４８の何れか１項に記載の方法。
【請求項５０】
蛍光を利用して前記少なくとも１つの定性的データ又は定量的データを取得することをさらに含むことを特徴とする、請求項４０乃至４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項５１】
フルオロフォアの結合又はフルオロフォア含有プローブのハイブリダイゼーションのうち少なくとも１つによって前記蛍光が与えられることを特徴とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記定性的データ又は定量的データが、フルオロフォア、酵素、又は結合複合体の成分のうち少なくとも１つで標識されたプローブから得られることを特徴とする、請求項４０乃至４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
隔離媒体によって前記試料流体を置換する工程がさらに含まれることを特徴とする、請求項４０乃至５２の何れか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記隔離媒体を前記少なくとも第一及び第二の多目的チャネル中に順次導入することをさらに含むことを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記隔離媒体が、まず前記少なくとも第一の多目的チャネル中に導入された後に、前記少なくとも第二の多目的チャネル中に導入されることを特徴とする、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
隔離媒体の前記導入によって、前記少なくとも第二の多目的チャネルから空気が押し出され且つ前記少なくとも第一の多目的チャネルから前記試料流体が押し出されて、前記試料流体を含有する前記少なくとも１つのアッセイステーションが隔離されることになることを特徴とする、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも１つのアッセイステーションを照射に曝露する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４９又は請求項５０に従属した請求項５０乃至５６の何れか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記隔離媒体を固化、硬化、及び重合する工程のうち少なくとも１つの工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４０乃至５７の何れか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記第一及び第二の多目的チャネルが試料流体及び／又は隔離媒体によって充填された後に、前記少なくとも第一及び第二の多目的チャネルの露出部分が、粘着的、機械的、又は磁気的に、周囲の大気から固体により密封されることを特徴とする、請求項４０乃至５８の何れか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記少なくとも１つのアッセイステーションを充填する前に、前記流体試料を加熱することをさらに含むことを特徴とする、請求項４０乃至５９の何れか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記試料流体を取得する工程が、試料調製チャンバー中での少なくとも１つの予備操作を含み、前記被検試料を溶解緩衝液、溶出緩衝液、及び洗浄緩衝液に曝して前記試料流体を取得することのうち少なくとも１つを備えたことを特徴とする、請求項４３又は請求項４４に従属した請求項４４乃至６０の何れか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記試料流体にフロー促進流体を添加することをさらに含むことを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記少なくとも１つの予備操作が前記基材上で行われ、前記基材を揺動して、核酸含有被検試料中に含有される核酸が前記試料流体中に進入するのを促進する工程をさらに備えたことを特徴とする、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記基材を揺動させる前記工程が、前記基材及び前記試料調製チャンバー中に含有される試料流体のうち少なくとも１つの共鳴周波数で前記基材を揺動させることによって行われることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記揺動工程が、前記試料調製チャンバー中で電磁気的に磁気ビーズを揺動することによって行われることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ろ過チャンバー中に含有される前記溶出緩衝液を加熱して、熱的勾配によって誘導される対流を生じさせ、より多くの核酸分子を溶液中に進入させることをさらに含むことを特徴とする、請求項６３乃至６５の何れか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記試料調製チャンバー中に含有される前記溶出緩衝液に界面活性剤を添加する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記試料導入口に注入される前に、ホモゲナイズ、消化、及びろ過のうち少なくとも１つを前記被検試料に行うことを特徴とする、請求項４２又は請求項４２に従属した請求項４３乃至６７の何れか１項に記載の方法。
【請求項６９】
試料流体分析用の装置であって、
基材を備え、該基材は、
試料調製チャンバー、及び流体を通じて連結されたフロー促進流体を受容するためのチャンバー又は注入口と、
前記試料調製チャンバーに流体を通じて連結された被検試料導入口と、
前記試料調製チャンバー及びフロー促進流体を受容するためのチャンバー又は注入口のうち少なくとも１つに流体を通じて連結された少なくとも１つの緩衝液導入口と、
前記試料調製チャンバー又はフロー促進流体を受容するためのチャンバー若しくは注入口に流体を通じて連結された第一の多目的チャネルと、
アッセイステーションと、
前記少なくとも１つのアッセイステーションが第一及び第二の多目的チャネルの中間位に位置しており且つ第一及び第二の多目的チャネルと流体により連通されている、少なくとも第一及び第二の多目的チャネルの配列と、
前記試料調製チャンバー及びフロー促進流体を受容するためのチャンバー若しくは注入口のうち少なくとも１つから前記アッセイステーションへの流体のフローを調節するための少なくとも１つのフロー調節要素と、
前記アッセイステーションに流体を通じて連結された少なくとも１つのアッセイステーションと、
を備えている、装置。
【請求項７０】
前記流体による連通が、前記第一及び第二の多目的チャネルと連通した少なくとも第一及び第二のアッセイステーションチャネルを介して連通されている、請求項６９に記載の装置。
【請求項７１】
前記ろ過チャンバーが、前記試料調製チャンバーの少なくとも一部を密封する焼結ガラスブロックを備えたことを特徴とする、請求項６９又は７０に記載の装置。
【請求項７２】
前記焼結ガラスブロックを通して白血球を濾過するための前記焼結ガラスブロックに吸収剤が吸着していることを特徴とする、請求項７０に記載の装置。
【請求項７３】
密封層が、前記第一の多目的チャネル、アッセイステーション、及び第一のアッセイステーションチャネルのうち少なくとも１つを密封することを特徴とする、請求項７０又は請求項７０に従属した請求項７１乃至７２の何れか１項に記載の装置。
【請求項７４】
前記試料調製チャンバーの少なくとも一部を密封するダイアフラムと、該ダイアフラムを振動させるための振動式アクチュエータとがさらに加えられたことを特徴とする、請求項６９乃至７３の何れか１項に記載の装置。
【請求項７５】
前記基材が、（ａ）ガラス、（ｂ）プラスチック、（ｃ）エラストマー、（ｄ）複合材料、（ｅ）シリコン、及び（ｆ）金属のうち少なくとも１つを備えたことを特徴とする、請求項６９乃至７４の何れか１項に記載の装置。
【請求項７６】
前記エラストマーがポリジメチルシロキサンを含むことを特徴とする、請求項７５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、例えば、疾病を検出診断し、及び／又は増幅された核酸産物を検出し、薬理遺伝学的な測定を行うために用いることができる装置及びアッセイシステムに関する。本装置は、１以上のアッセイステーション又はウェルを有する基材と、該装置を通過する液体のフローが促進されるように配置され且つ前記アッセイステーションが隔離媒体によって密閉されるように設計されたチャネルと、を備える。
【発明の背景】
【０００２】
生化学的検査は、例えば、疾病の有無を検出し、モニタリングするなどの様々なアッセイにとって、益々重要なツールとなっている。例えば、血液型や移植の適合性などの基礎的な医療情報を得るための検査が以前から知られているが、多数の疾病の基礎を成す生化学に対する理解が進んだために、実施可能な検査の数も急激に増大した。このため、病原体の検査、疾病の診断やモニタリング、健康状態の変化の検出やモニタリング、薬物療法のモニタリングなどの様々な分析用途に、数多くの検査が利用できるようになっている。ゲノムデータに加え、化学的成分のコンビナトリアルライブラリーの調製が可能となったことにより、新規薬物の発見が容易となった。
【０００３】
様々な段階の核酸（例えば、ＤＮＡ）分析をマイクロチップなどの単一の装置上で行える「完全なシステム（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）」が以前から望まれていた。ＤＮＡの分離やＰＣＲなどのＤＮＡ分析を迅速且つ同時に実施でき、病気の診断又は発見を可能とする、完全に一体化された高性能システムが必要とされている。「Sanders,  et AL. (2000) Trends in Analytical Chemistry,  19 (6): 364-378」。これまでに、同一チップ上で最大４つの試料を増幅し分析することができるシステムが開示されている。「L.C. Waters,  et al. (1998) Anal. Chem., 70: 5172」。さらに、ＰＣＲを実施するための小さな使い捨ての大量生産装置が報告されている。例えば、米国特許第５，４９７，３９２号を参照。例えば、「Yuen,  et al. (2001) Genome Research 11: 405-412」には、血液試料の調製物や核酸の増幅反応物も一体的に行えるように設計構築されたプレキシグラス製マイクロチップモジュールが記載されている。このマイクロチップモジュールは、マイクロヒーター−クーラーと、ヒトの全血と試薬を輸送するための一連のマイクロチャネルとを備えている。まず、一体型細胞単離−ＰＣＲ（極めて低濃度且つ低効率（すなわち、３−５％）であるが、白血球を保持するゲート状の微小構造物を含有する）の中で、少量の全血から白血球が単離される。赤血球は、微小フィルター中を通過するが、時が経過するにつれて、フィルターを目詰まりさせて、白血球の単離効率を低下させる傾向がある。Ｙｕｅｎらのマイクロチップは、微小温度センサーを用いているので、Ｙｕｅｎらのチップを組み立てるには高価な費用が必要である。
【０００４】
現在では、ＤＮＡの分析にＤＮＡマイクロアレイ装置も利用されている。ｃＤＮＡマイクロアレイとオリゴマイクロアレイという２種類のＤＮＡマイクロアレイ技術が知られている。両技術では、ハイブリダイゼーション反応に基づいて、試料中でのｍＲＮＡの発現を調べる。マイクロアレイを用いたアッセイは取り扱いが煩雑で、終了までに約１日を要し、連続的なバッチ分析を行うために独立の装置が必要となる。迅速な診断は不可能であり、現在のマイクロアレイ装置では、試料の調製をチップ上で一体的に行うことができない
現在のオンチップＤＮＡ分析システムには、さらに欠点があることが最近報告された。かかる欠点には、試料を注入できないこと、ＤＮＡの単離が不良であること、多重ＰＣＲ分析ができないことが含まれる。Ｙｕｅｎら、４００５ページ、右欄。
【０００５】
核酸は、遺伝子発現の調節と制御に機能することによって疾患を引き起こすなどの細胞プロセスに直接的な役割を果たしている。様々な種類の生体プロセスで遺伝情報がどのように機能しているかについて、さらに理解を深めるために、様々なタイプの核酸分析を行うためのハイブリダイゼーション技術が開発されている。ハイブリダイゼーション法は、一般に、制御された条件下で、標的核酸に核酸プローブを結合させることにより、相補的な配列の間でのみハイブリダイゼーションが生じるようにする。ハイブリダイゼーション技術を用いると、遺伝子発現研究や他の様々な種類の分析を実施することが可能となる。例えば、病態には遺伝子発現の変化を伴うことが示されているので、遺伝子発現を調べることは重要である。多くの病態では、遺伝子ＤＮＡのコピー数の変化や転写レベルの変化によって、様々な遺伝子の発現が異なることが特徴となる。ある種の疾病では、あるウイルスの感染は遺伝子発現の上昇を特徴とする。
【０００６】
核酸プローブが付着されたチップは、核酸分析を実施するために使用することができる。プローブは、アッセイステーションなどのチップ上の特定部位に付着させることができる。アッセイステーションは、第一及び第二の多目的チャネルの中間に存在する領域に位置し、アッセイ反応は、下記に詳述されているように行われる。ある種の用途では、アレイの形態で配置されたアッセイステーションがチップに設けられることがある。このようなチップによって、手間のかかる試料の調製と電気泳動による分離が必要なことが多い従来の方法に比べて、分析を手早く実施できる同時並行処理が可能となるので、チップ上のアレイを用いた遺伝学的法は有利である。チップを用いた現行の核酸法には、通例、複雑なチップ外での試料ＤＮＡの単離、ＰＣＲ用の一体型微小ヒーターと微小温度センサーが必要であるため、現行のチップとこれを用いた関連法は、極めて高価で、使い捨てができない。
【０００７】
本発明の目的は、様々な生化学的アッセイをリアルタイムで実施するための複数のアッセイステーションが可能となる、使い捨てのマイクロチップを提供することである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、例えば、被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）の疾病の有無を検出診断し、及び／又は増幅された核酸産物を検出し、又は薬理遺伝学的測定を行うのに有用なマイクロチップ装置とアッセイシステムに関する。前記装置は、１以上のアッセイステーションを有する基材と、試料流体と隔離媒体の導入と流動が促進されるように設計配置されたチャネルと、を備える。前記装置には、一体型の試料調製部分を設けることができ、本発明によって、改善された結果検出システムが提供される。
【０００９】
本発明は、多種類のアッセイを行うことができるマイクロチップ装置に関する。本明細書で使用する「アッセイ」という用語は、試験又は実験によって検査される物質の任意の定性又は定量分析を意味し、タンパク質、抗体、核酸断片のほか、本分野である種のアッセイに一般的に用いられる任意の指示物質又はマーカーなどの物質（これらに限定されるものではない）の不存在を示す反応が含まれる。前記マイクロチップは、一般的には、少なくとも１つのアッセイステーションを備え、各アッセイステーションは第一及び第二のアッセイステーションチャネルと連通させることができる。アッセイステーションと連通された多目的チャネルであって、そこから試料溶液及び／又は隔離媒体を導入し、マイクロチップに誘導するための多目的チャネルも提供される。
【００１０】
本発明の１つの実施形態は、疾病を検出するための装置であって、前記基材の中に組み込まれた基材と、白血球を濾過するように構成することができる試料調製チャンバーと、該試料調製チャンバーに流体を通じて連結されている試料導入口と、前記試料調製チャンバーに流体を通じて連結されている緩衝液導入口と、フロー促進流体チャンバーと、フロー促進流体を格納するための格納チャンバーであって前記フロー促進流体チャンバーに流体を通じて連結されている格納チャンバーと、前記フロー促進流体チャンバーに流体を通じて連結されている試料調製チャンバーと、を備えた装置に関する。さらに、本発明は、前記試料調製チャンバーから前記フロー促進流体チャンバーへの流体のフローを隔離し且つ可能とする隔離装置と、前記フロー促進流体チャンバーに流体を通じて連結された第一の多目的分配チャネルと、少なくとも１つのアッセイステーションと、前記アッセイステーションに流体を通じて連結された第一の多目的チャネルと、前記フロー促進流体チャンバーから一又は複数の前記アッセイステーションへの流体のフローを隔離し且つ可能とする隔離装置と、を備えることができる。さらに、少なくとも１つの緩衝液導入口であって、前記第一の多目的チャネルに流体を通じて連結された緩衝液導入口と、前記アッセイステーションに液体を通じて連結された第二の多目的チャネルと、該第二の多目的チャネルに液体を通じて連結された注入口であって通気を与えることができる注入口と、を設けることもできる。前記試料調製チャンバー、格納チャンバー、フロー促進流体チャンバー、アッセイステーション、及び前記チャネルは、前記基材の内部に組み込んでもよく、所望であれば、環境から遮蔽させることができる。
【００１１】
本発明の別の側面では、前記フロー促進流体チャンバー、付属チャネル、及び格納チャンバーは省略され、これらのチャンバー中で行われる機能は、代わりに、試料調製チャンバー中で行われる。
【００１２】
前述の装置は、病態の有無を検出する本発明の方法を実施するために用いることができる。典型的な方法では、例えば、動物、植物、及びその他の生体（ｌｉｖｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）などの生物（これらに限定されない）などの被験者から得た被検試料中で、病態の有無が検出される。本方法は、（ａ）前記隔離装置を前記隔離位置に置いて、前記アッセイステーション中に特定のＤＮＡ断片を堆積させ、前記アッセイステーションを乾燥させる工程と、（ｂ）密封層を前記アッセイステーションに付与する工程と、（ｃ）生物の血液試料を前記試料導入口の中に注入する工程と、（ｄ）前記緩衝液導入口に洗浄緩衝液を注入して、前記試料調製チャンバー中に前記血液の試料と前記洗浄緩衝液との混合物を形成せしめる工程と、（ｅ）赤血球を白血球から分離させ、前記試料調製チャンバー中に前記白血球を残存させる工程と、（ｆ）前記緩衝液導入口に溶解緩衝液を注入して、ＤＮＡ断片を含有する前記白血球を前記溶解緩衝液中の溶液中に溶解させる工程と、（ｇ）前記試料調製チャンバー中に気体を注入することにより、前記溶解緩衝液を前記フロー促進流体チャンバー中に押し出す工程と、（ｈ）前記化学物質格納チャンバーから前記フロー促進流体チャンバー中に化学物質を拡散させる工程と、（ｉ）前記隔離装置により、ＤＮＡ断片を含有する前記溶解緩衝液を前記第一の多目的チャネル中に流動させ、アッセイステーションに流動させる工程と、（ｊ）前記ＤＮＡ断片を含有する前記溶解緩衝液で前記アッセイステーションが充填された時点を検出する工程と、（ｋ）前記ＤＮＡ断片を
増幅する工程と、（ｌ）前記増幅されたＤＮＡ断片を検出する工程と、を備える。
【００１３】
本発明は、少なくとも１つのアッセイステーションを有する基材を備えた装置であって、前記少なくとも１つのアッセイステーションは少なくとも１つの第一のアッセイステーションチャネルを有し、且つ特定の実施形態では少なくとも１つの第二のアッセイステーションチャネルを有してもよい装置に関する。本明細書において使用するアッセイステーションという用語は、アッセイが行われる領域を意味する。特定の実施形態においては、アッセイステーションは、例えば、隔離媒体によって囲まれた領域を備える。前記第一及び第二のアッセイステーションチャネルは、それぞれ独立に、前記少なくとも１つのアッセイステーションと連通される。前記アッセイステーションと流体を通じて連通されている少なくとも第一及び第二の多目的チャネルの配置が与えられる。前記第一の多目的チャネルと第一のアッセイステーションチャネルは、試料溶液を伝導させ得る内部表面特性を有している。例えば、水性の流体試料を与えるのであれば、前記チャネルは親水性とするか又は親水性となるように処理を施すことができる。特定の実施形態では、とりわけ、異なる相対幾何学的特徴を有するチャネルが連通されている場合には、あるチャネルの形状（幾何学的特徴）により、当該チャネルに伝導的特性又は非伝導的特性が付与される。
【００１４】
少なくとも１つの試料流体注入口は、少なくとも前記第一の多目的チャネルと連通されており、少なくとも１つの隔離媒体注入口は、少なくとも前記第一及び第二の多目的チャネルと連通されている。少なくとも１つの前記第二の多目的チャネルは、前記試料溶液を伝導させない少なくとも１つの内部表面部分を有する。例えば、前記試料流体が水性であれば、前記第二の多目的チャネル内部表面は疎水性であるか、又は疎水性になるように処理が施されているであろう。
【００１５】
前記装置は、少なくとも１つのアッセイステーションを密封する密封層をさらに備えることができる。所望であれば、前記密封層は、前記少なくとも１つのアッセイステーションのみを密封してもよいし、あるいは、基材表面全体を含む前記装置の基材の一部を密封してもよい。
【００１６】
１つの実施形態では、前記第一の多目的チャネルの内部表面は、試料流体、空気、及び隔離媒体のうち少なくとも１つを貫流させることができ、前記第二の多目的チャネルの前記内部表面は、空気又は隔離媒体のうち少なくとも１つを貫流させることができるが、前記試料流体は貫流させない。
【００１７】
本発明の別の実施形態では、前記第二のアッセイステーションチャネルと前記第二の多目的チャネルとの交差部と直接に隣接する前記多目的チャネルの前記内部表面及び／又は前記第二のアッセイステーションチャネルの表面は何れも、前記試料流体を伝導させない。さらに、この実施形態により、試料流体のアッセイステーションへの局在が容易になるとともに、前記アッセイステーションの密封（ｓｅａｌｉｎｇ）と隔離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）も容易となる。
【００１８】
少なくとも第一及び第二の多目的チャネルが、それぞれ、前記複数のアッセイステーションの前記第一及び第二のアッセイステーションチャネルを介して、複数のアッセイステーションと連通されるように、前記基材を構成することができる。前記複数のアッセイステーションは、少なくとも前記第一の多目的チャネルと前記第一のアッセイステーションチャネルを介して前記複数のアッセイステーションに伝導される試料流体溶液によって、前記複数のアッセイステーションに同時又は順次の充填のうち少なくとも１つが為されるように配置される。さらに、前記複数のアッセイステーションは、複数のアッセイステーションを密封するための隔離媒体によって、前記第一及び第二の多目的チャネルに同時又は順次の充填のうち少なくとも１つが為されるように配置することもできる。
【００１９】
前記アッセイステーションの中には、少なくとも１つの反応アッセイ成分を配置することができる。例えば、ＰＣＲを計画しているのであれば、前記反応アッセイ成分は１以上のプライマー及び／又はプローブであり得る。
【００２０】
試料流体注入口は試料流体調製領域と連通させることが可能であり、前記基材には、蓋を有しても又は有しなくてもよい試料調製チャンバーのうち少なくとも１つを設けることができる。前記装置又は基材の中には、前記チャネルの少なくとも１つにおける流体のフローを調節するための少なくとも１つの要素を取り込ませることができる。
【００２１】
前記基材上の前記チャネルにおける試料流体のフローは、フロー促進流体を導入するためのチャンバーを通じて、フロー促進流体を前記試料流体中に導入することによって促進させることができる。
【００２２】
前記チャンバーは、前記フロー促進流体を試料溶液と混合するためのチャンバーと連通させることができる。
【００２３】
さらに、本発明には、本発明の前記基材上で反応を実施する方法が包含される。
【００２４】
典型的な方法は、少なくとも１つの試料注入口に試料流体を導入することと、前記少なくとも１つの多目的チャネルを介して前記少なくとも１つのアッセイステーションと前記第二のアッセイステーションチャネルを充填することと、前記少なくとも１つの隔離媒体注入口から隔離媒体（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉｕｍ）を少なくとも前記第一の多目的チャネルに流入させることと、前記少なくとも１つのアッセイステーションで少なくとも１つの反応を行うこととを備える。前記アッセイステーションでの反応は、少なくとも１つの定性的データ又は定量的データ（例えば、比色分析の結果）を与える。前記少なくとも１つの定性的データ又は定量的データは、フルオロフォア又は蛍光標識されたプローブが少なくとも１つインターカレートされることによって生じ得る蛍光を用いて取得することができる。蛍光を用いる場合には、前記基材中の前記アッセイステーションには、少なくとも１つの励起周波数を照射することができる。前記プローブは、少なくとも１つのフルオロフォア、酵素、又は結合複合体の成分によって標識することができる。本方法の結果、アッセイされている試料流体に関連する少なくとも１つの定性的データ又は定量的データが得られる。典型的には、典型的な定性的データ又は定量的データは、例えば、蛍光共鳴エネルギー転移、ルミネセンス、又は比色変化によって与ることができる。
【００２５】
所望であれば、前記基材上で行われる反応は、例えば、温度循環条件（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）などの温度制御下で実施することができる。前記被検試料は、まず少なくとも１つの予備操作に該被検試料を供することによって前記装置に供給することもできる。この予備操作は、前記基材とは別のところで行ってもよいし、前記基材の上又は内部に存在する少なくとも１つの予備ステーションにおいて行ってもよい。
【００２６】
前記少なくとも１つの予備操作は、例えば、前記基材上の前記アッセイステーション中で実施すべき反応に使用できる核酸を与えることができる。
【００２７】
さらに、前記少なくとも１つのアッセイステーション中に、少なくとも１つのアッセイ反応成分を配列又は配置してもよい。病原性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）、疾病、特定の表現型、又は個体間若しくは種間変異若しくは差異と関連した核酸配列の変異の検出が、前記反応によって与えられることもある。このような核酸配列中の変異には、一塩基多型（ＳＮＰ）、タンデムリピート、挿入及び／又は欠失などがある。
【００２８】
実施可能な前記少なくとも１つの反応には核酸増幅工程が含まれ、このケースでは、アッセイ反応成分に一又は複数のプライマーを含めてもよいかもしれない。
【００２９】
本発明の方法では、隔離媒体によって前記多目的チャネル中の試料流体を置換することによって、前記アッセイステーションの密封又は隔離が行われる。前記隔離媒体は、少なくとも前記第一及び第二の多目的チャネルの中に連続して導入してもよいし、少なくとも前記第一の多目的チャネル中にまず導入した後に、少なくとも前記第二の多目的チャネル中に導入してもよい。前記隔離媒体は、典型的には、前記試料流体とは反対の性質を有する物質、すなわち、前記試料流体と実質的に混和しない物質である。
【００３０】
隔離媒体の導入によって、前記少なくとも第二の多目的チャネルからは空気が追い出され（ｐｕｒｇｅ）、前記少なくとも第一の多目的チャネルからは前記試料流体が追い出されるので、前記試料隔離を含有する前記少なくとも１つのアッセイステーションが隔離される。前記隔離媒体が固化可能な場合には、本方法は、前記隔離媒体を固化、硬化、重合させる工程のうち少なくとも１つを備える。
【００３１】
本発明の具体的な実施形態は、使い捨て可能な試料調製一体型マイクロ流体装置(sample-preparation integrated microfluidic device)及びこのような装置を用いた方法に関するが、これらに限定されるものではない。本発明の前記装置と方法によって、生体試料中の疾病のリスクを迅速に検出及び／又は評価するために核酸（例えば、ＤＮＡ）を分析することが容易となる。本発明の前記装置は、例えば、遺伝子フィンガープリンティング等の薬理遺伝学的な測定のために増幅された核酸産物を検出するのに用いることができる。本明細書において、「検出する」又は「検出」又は「検出している」という用語は、被験者の被検試料が少なくとも１つの疾病関連核酸を含有していると診断又は示唆することを意味する。「装置」とは、核酸を輸送し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の核酸増幅を実施するために必要な要素を組み込んだチップを意味する。前記装置には、例えば、ヒトの血液試料から白血球を捕捉できるサイズにした要素であって、チップ上での核酸の単離に必要な要素（マイクロフィルター等）を必要に応じて組み込んでもよい。本発明によれば、ＤＮＡ分子は、被検試料（例えば、生体試料）から迅速に分析することができる。１つの実施形態では、前記装置に一度付与すれば、前記被検試料はアッセイされ、疾病の有無を診断し又は疾病を発症するリスクを評価する。本発明によって用いられる「被検試料」には、動物組織と血液が含まれる。被検試料は、全血であることが好ましい。１つの実施形態では、被験者から得た組織ホモジネート又は血液試料が、本発明の前記アッセイシステム中で検査される。本発明の装置と方法によって被検試料をアッセイする場合、組織試料をホモゲナイズし、消化し、ろ過して固体の破片を除去し、本発明の装置にかけることができる溶液中のＤＮＡを取得するのが慣例である。
【００３２】
例えば、感染性病原体（ウイルス、細菌、真菌、プロトゾア、微生物等）又は癌性腫瘍の存在は、フルオレセイン等の蛍光分子で予め標識されたウイルス特異的プライマー又はｃＤＮＡ又は断片を与えることによって検出することができる。被検試料ＤＮＡは、前記装置を通って前記プライマーに導かれ、被検試料が発症ウイルスを含有していれば、ＰＣＲの後に、そこで蛍光シグナルが生じるであろう。
【００３３】
本発明の生体被検試料は、静脈穿刺又は組織生検等の周知の技術を用いて、被験者から取得される。ヒト以外の動物（例えば、家畜）から生体被検試料を取得する場合には、家畜処理場から血液と組織試料を取得するのが一般的である。実施する実施形態に応じて、被検化合物を与えてもよいし（例えば、注入する）、あるいは、必要に応じて、溶液中に遊離させてもよい。本発明で想定している動物には、例えば、ヒト、爬虫類、家畜、鳥類、イヌやネコ等の飼い慣らされたペットが含まれる。好ましい動物は、ヒトである。
【００３４】
本発明によれば、前記装置は、様々なチャネルサイズ（すなわち、長さ、幅、高さ、直径）を有し得る実験室チップ(lab-on-a-chip)である。例えば、前記多目的チャネルは、約１ｍｍから約５００ｍｍの長さ、約２ｍｍから約１０ｍｍの幅、約０．５ｍｍから約１０ｍｍの厚さを有することができる。前記アッセイステーションチャネルも同様のサイズを有することができ、典型的な長さは約０．０１ｍｍから約５０ｍｍである。試料調製領域は、約５ｍｍから約１００ｍｍの長さ及び幅とし、約．５ｍｍから約１０ｍｍの高さとすることができる。前記装置は、１以上の試料導入注入口と、１以上のチャンバーと、（流体のフローを収容するサイズである）１以上の相互に接続されたチャネル（チャネル全体又はチャネルの一部の表面は、本来的に疎水性若しくは親水性とするか、又は疎水性物質若しくは親水性物質で処理するかを選択できる）と、核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）を増幅するための１以上のアッセイステーションとを含有することができる。前記装置は、シリカで誘導体化された表面等の少なくとも１つの核酸吸着性表面も含有することが好ましい。あるいは、前記装置は、被検試料から白血球を分離するための膜フィルターを少なくとも１つ含有してもよい。１つの実施形態では、実質的に直ちに検出結果を得るために、生体被検試料を抽出した後に前記装置上で本発明の方法が実施される。「実質的に直ちに」とは、約５分から約２時間で結果が得られることを意味する。後に加工（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）が所望されるのであれば、別の実施形態では、本発明は、チップ外で試料を前処理し、被検試料を保存しておくことも想定している。フローセルソーティング装置又は遠心装置等から被検試料を取得する場合には、一般に、前処理が用いられる。ＤＮＡ又はＲＮＡの試料調製プロトコールは、「Sambrook et. al.,  Molecular Cloning,  A Laboratory Manual,  2nd edition」に記載されており、及び／又は、ＤＮＡを結合するカラム／膜を用いた、Ｑｉａｇｅｎ、Ｗｈａｔｍａｎ等のキットを用いて行うことができる。
【００３５】
前処理を行う場合、その後の増幅を阻害し又は産物の蛍光分析を妨害する可能性がある非核酸分子は除去する。本発明の装置とは分離されたモジュラー式であり得る装置の中で、前処理を行うのが慣例である。本発明の装置と結合され及び／又は流体を通じて連結されることが想定される前処理モジュールは、スタンドアローンモジュールである。スタンドアローンモジュールは、本発明の装置の試料注入口２に接続可能な液体搬送チューブによって連結される。
【００３６】
好ましくは、前処理は、チップ上（ｏｎ−ｃｈｉｐ）で行われる。本発明においては、被検試料を前処理するために、体液（血液、便、唾液（ｓｐｕｔｕｍ）、吸引液、スワッブを含む）、ホモゲナイズされた組織試料（髪、口腔スワッブ、生検、吸引液、生物体そのもの）、環境試料（表面スワッブ、食物、水／液体）等の未精製試料中に存在する他の生体巨大分子や小分子からＤＮＡ及び／又はＲＮＡを分離させる。これらの試料は、濃縮し半精製することもできる。例えば、本発明では、バフィーコートの遠心分離を行った後の白血球、インビトロで培養した細胞、及びフローソーティング後に得られた細胞の濃縮又は半精製集団が想定されている。例えば、２１Ｇ−２８Ｇサイズの針等の細い針から固体試料を吸引するという標準操作によって、大きな断片を崩壊させるために、前処理がチップ外（ｏｆｆ−ｃｈｉｐ）で行われる。試料の加工を直ちに行うことができないのであれば、ＤＮＡ又はＲＮＡの分解を阻止するために、前記試料は、例えば、グアニジウムイソチオシアネート等の標準的な化学物質中に保存することができる。
【００３７】
本発明の側面に従えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡは被検試料から単離される。ＤＮＡ及び／又はＲＮＡは、例えば、グアニジウムイソチオシアネート、水に溶かしてＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ７．２に調整したＮＨ４Ｃｌ、等の適切な緩衝液の存在下で、マイクロデバイス上に固定された誘導体化シリカ表面上に吸着させる。核酸は、静電的電荷のために表面に付着する。本発明が想定する吸着性表面には、フィルター付きチャンバー中に保有された粒子ビーズ（ガラスビーズ）、磁場によってチャンバー中に固定化された常磁性粒子、イオン電荷特性に基づいて液体を通過させる膜又はフィルターが含まれる。
【００３８】
固定化又は捕捉された核酸は、望ましくない細胞片や巨大分子を除去するために洗浄するのが慣例である。次いで、順方向のフロー又は逆流により、中性ｐＨの緩衝液（水を含む）を用いて、表面及び／又は核酸の電荷を変化させることによって、ＤＮＡ／ＲＮＡを溶出する。試料導入、洗浄、溶出のための流体の流動は、受動又は能動バルブ及びポンプ、陰圧吸引又は陽圧を用いて行う。好ましくは、シリンジポンプ、手動シリンジ、蠕動式ポンプ、又は真空ポンプ等の１以上のポンプを用いて、被検試料を前記装置の中に導入する。
【００３９】
本発明の１つの側面によれば、核酸は、アッセイステーションにおいて増幅される。検出部と画像を取得するための適切な光学装置とを有するデジタルカメラを用いて、ウェル中の試料から放射される特定波長の光を検出することができる。最小限の増幅後工程を行わずに又は行って、直接且つ同時検出を行うのに十分な量になるまで、核酸を選択的に増幅する。
【００４０】
本発明が想定する増幅反応には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、又は等温性増幅反応が含まれる。ある実施形態では、主増幅工程の前に、ＲＮＡ標的を増幅するための逆転写工程（逆転写を行うことができる酵素を用いる）を行う。別の実施形態では、逆転写工程は、ＤＮＡ増幅工程と組み合わされる。
【００４１】
本発明によれば、酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＮＴＰ、蛍光色素、界面活性剤、塩、及び緩衝液等の増幅反応用の慣用試薬とともに、核酸をアッセイステーション中に導入する。別の実施形態では、幾つかの試薬（特に、プライマー及び／又はプローブ）をアッセイステーションに予め付与して、乾燥させてもよい。加えた試料／試薬液体ミックスと接触すると、これらの試薬は可溶化されるであろう。試料／試薬の混合後に、１以上のチャネルを通じて、ミネラルオイル、ワックス等の特徴的な不混和相にある第二の液体をチップに添加することも可能である。前記不混和性液体は、アッセイステーションへの流体のアクセスを「封鎖（ｓｅａｌ  ｏｆｆ）」し、アッセイステーションの内容物が隣接するアッセイステーションの内容物と望ましくない混合を起こさないように物理的な障壁として機能するであろう。
【００４２】
本発明の前記装置上に位置するアッセイステーションは、二次元又は三次元に、高密度で配列（ａｒｒａｙ）させることができ、それぞれ、典型的には、約１ｐｌ乃至約５０μｌの容量を有する。本発明は、約１０乃至約５０，０００アッセイステーション中に存在する核酸を同時に増幅し、検出することができる。本発明では、各アッセイステーションを個別に温度調節することも想定されている。好ましい実施形態では、前記アッセイステーションには、共通の温度パラメータが与えられる。共通の温度パラメータを用いると、増幅反応のデザイン、又は試薬の濃度を変動させることによって、単一の温度条件になるように、各アッセイステーション中の反応を最適化することが可能となる。例えば、所定の温度群（例えば、９５℃で変性、５０−６０℃でプライマーのアニーリング、７２℃の伸長工程あり又はなし）を循環させることによって、増幅反応を行い得る。好ましくは、増幅反応は、定常温度（例えば、６０℃）で、等温的に実施される。
【００４３】
本発明によれば、ＤＮＡ増幅による産物は、増幅されたＤＮＡ産物の存在下で特異的に放射される蛍光を検出することによって、インシチュで均一に検出される。例えば、エチジウムブロミド又はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の二本鎖ＤＮＡと結合したときに、蛍光を特異的に発するフルオロフォアを用いて、検出が為される。あるいは、蛍光共鳴エネルギー転移を使用し、１又は２個のフルオロフォア標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、特異的なＤＮＡ配列を検出することができる。ある実施形態では、増幅プロセスの完了後に前記検出工程を行ってもよい。別の実施形態では、個別の温度循環の後に、検出工程を実施してもよい。さらに別の実施形態では、前記検出工程は、等温性反応の中間時点で、検出工程を行うこともできる。増幅された核酸の検出は、入射ＵＶその他の適切な波長の光のチップ外光源からの励起と放射された波長のチップ外検出装置を用いるデジタルカメラによって行われる。増幅されたＤＮＡ産物の検出結果は、実験中に増幅サイクルゼロの時点で得られた蛍光放射を読み取ることによって実験的に決定された増幅前ベースラインに対して比較される。あるいは、同一のアッセイステーションに存在する異なる蛍光プローブに対して又は異なるアッセイステーションの反応から得られるプローブを用いて、増幅前ベースラインを決定する。
【００４４】
本発明の方法は何れも、前記装置上で行うことが好ましい。前記実験室チップ装置には、例えば、生体試料中のウイルス又は細菌ＤＮＡの存在を検出し、疾病のリスクを評価するのに必要な要素が一体化されて全て含まれている。このため、本発明では、ＤＮＡの定量的測定と定性的測定の両方を用いて、被験者が疾病又は症状を有するリスクを評価できると考えられる。例えば、被検試料中にＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＤＮＡが存在すれば、被験者が炭疽病を引き起こす細菌に曝露され、当該細菌に関連する疾病を有するリスクがある可能性が示唆される。逆に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  のＤＮＡが被検試料中に存在しなければ、被験者は当該細菌に関連する疾病を有していないことが示唆される。
【００４５】
本発明によれば、現在知られている又は将来発見される感染性細菌又はウイルス疾患をいくつでも被検試料中に素早く検出することができる。本発明によって検出できるこのような疾病には、炭疽病、天然痘、レジオネラ症、ＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型肝炎、結核症、マラリアが含まれるが、これらに限定されるものではない。別の側面では、本発明によって、癌、白血病、サラセミア、喘息、アレルギー、連鎖球菌性咽頭炎（ｓｔｒｅｐ  ｔｈｒｏａｔ）又は咽頭痛（ｓｏｒｅ  ｔｈｒｏａｔ）、食中毒、子供と成人の近視、ニパウイルス感染症、及び性感染症を検出できる。
【００４６】
本発明は、被検試料中の薬を検出することもできる。本発明の本側面は、例えば、迅速な薬物スクリーニングのために、ある組織中に薬物が存在することを測定するために、薬効の評価のために用いることができる。本発明のさらに別の側面では、遺伝子組換え食品の検出及び遺伝子フィンガープリンティングが行われる。例えば、遺伝子組換え食品に関連する用途では、前記チップは、食物中に人工的に導入された遺伝子をＰＣＲによって検出することになろう。遺伝子フィンガープリンティングに関する用途では、前記チップは、個体間（ヒト、植物、及び動物）のＤＮＡ配列の変動をＰＣＲによって分析することになろう。
【００４７】
前記チップ装置及び流体ネットワークは、ガラスエッチング、プラスチック加熱エンボス加工、プラスチック射出成形、樹脂注型、レーザー切断、ステレオリソグラフィー、フォトリソグラフィー、ＬＩＧＡプロセス、ＣＮＣ機械加工光硬化、又は金属成形技術等の既存の微細加工技術によって、マイクロスケールレベルで製造し、開放チャネル等の開放構造及びアッセイステーションを有するチップを成形させることができる。開放チャネル及びアッセイステーションは、次いで、密封し、カバーフィルム又はプレートにより閉鎖させ得る。
【００４８】
前記チャネルの大きさは、典型的には、１μｍから１０ｍｍの範囲であり得る。従って、微細加工（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）は一つの選択肢にすぎず、チップ１００を製造するための唯一の手段というわけではない。コンピュータ数値制御（ＣＮＣ）機械加工、金属成形、プラスチック射出成形、又は加熱エンボス加工等のより一般的なその他の技術も、製作に使用することができる。
【図面の詳細な説明】
【００４９】
図１と図２には、基材３６の上に構築されている、試料流体調製領域を有するチップ装置１００の典型的な微細構造が示されている。基材３６は、ガラス、プラスチック、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のエラストマー、金属、セラミック、又は複合材料のような適切な素材から作製することができる。チャネル及びアッセイステーションを提供するために、例えば、ガラス基材に対して、様々な標準的ガラス化学エッチング技術を用いることができる。基材３６を与えるために（金属粉末の充填物を加えた又は加えない）プラスチックを用いるのであれば、本分野で公知である、エンボス加工金型を用いた加熱エンボス加工、プラスチック射出成形、樹脂注型（ｒｅｓｉｎ  ｃａｓｔｉｎｇ）、レーザー切断、ステレオリソグラフィー、フォトリソグラフィー、ＬＩＧＡプロセス、ＣＮＣ機械加工光硬化、及びプラスチック化学エッチング技術を使用することができる。ＬＩＧＡプロセスは、典型的には、ポリメチルメタクリル酸（ＰＭＭＡ）等のレジスト構造でのシンクロトロン放射を行い、前記構造を露光し、前記構造を化学的に現像して、レジスト構造のパターンに基づいたマイクロ金型を得ることを備える。金属粉末充填は、例えば、基材３６がプラスチックで構成されている場合に、熱の伝導を向上させるために用いることができる。エラストマーの基材を使用するのであれば、複製（固体微小構造化金型上である種のエラストマーを硬化させる）と成形技術を使用することができる。さらに、シリコンやシリコンをベースとした化合物を用いて、基材３６を作製することもできる。次いで、基材３６は密封層４０で密封され得る（上面図には図示されていない）。密封するのであれば、アッセイステーション２６の一部のみを密封したり、あるいは、それぞれ、アッセイステーションチャネル２４、２８、及び／又は第一及び／又は第二の多目的チャネル３０と２２と併せて、アッセイステーション２６を密封するなどの様々な構成の密封を与えることができる。前記密封層は、熱的ボンディング、静電的ボンディング、粘着的ボンディングを含む（これらに限定されない）ボンディングプロセスによって、通常、チャンバー６及び全ての注入口と排出口を除き、前記チャネルと一又は複数のアッセイステーションを密封するプラスチックフィルムである。前記密封層４０は、ガラスプレート又はプラスチックプレート又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の他の素材からなってもよい。
【００５０】
特定の実施形態では、前記密封層４０は、ゴム、エラストマー、ゲル、及び／又はバルブ／蓋（機械的及び／又は電気的及び／又は磁気的及び／又は化学的手段で開けることができ、被覆されたアッセイステーション２６の中に、例えば、シリンジを導入して、アッセイステーション２６の中に、例えば、特定のアッセイ反応成分を付与することができる）等の自己回復／密封タイプの材料から構成することもできる。シリンジを除去すると、密封層は、自動的に密封されるであろう。しかし、特定の実施形態では、自己回復／密封タイプの素材は使用されないことがある。
【００５１】
前記アッセイステーション又はその一部と様々なチャネルの製造は、基材３６又は密封層４０のうち何れか１つのみに限定する必要はない。例えば、アッセイステーション構造の一部を基材３６又は密封層４０の上に形成し、チャネル構造の一部を密封層又は基材の上に作製してもよい。密封層４０と基材３６をボンディングさせた後、基材３６と密封層４０の上／中に設けられた様々な要素の一部が、適切な配置でまとめられ、完全なチャネルその他の構造を与える。
【００５２】
装置１００の実施形態は、少なくとも１つのフロー調節要素を含んでもよい。フロー調節要素には、例えば、使用者の要望や流体のフローを制御／調節する必要性に応じて、例えば、チャネルや合流点を含む装置の実質的に任意の部分に設けることができる様々なバルブ、ゲート、障害（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）が含まれる。
【００５３】
アッセイステーション２６は、任意の数又はタイプ／クラスのアッセイ反応のうち少なくとも１つの成分を備えることができる。この少なくとも１つ成分には、例えば、核酸、プローブ、プライマー、抗体、細胞、アッセイ塩（ａｓｓａｙｉｎｇ  ｓａｌｔ）、触媒、レポーター、消光物質、酵素、タンパク質、ペプチド、薬物、小分子、及びフルオロフォアが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに別の例には、分子のコンビナトリアルライブラリー、ペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、又はアプタマーライブラリーから得られた合成分子が含まれる。アッセイ反応の前記少なくとも１つの成分は、キャリアを介して少なくとも１つのアッセイステーション２６の中に配置してもよい。キャリアのごく一例には、水溶液、溶媒、及びゲルが含まれるが、これらに限定されない。前記少なくとも１つのアッセイステーション２６の中に少なくとも１つの成分を堆積させるためのキャリア（例えば、噴霧又はインクジェット堆積）として、空気及び気体を考えることもできる。このように用いられる一又は複数の担体は、例えば、蒸発によって取り除けるように適合させてもよい。オーブン、ランプ、レーザー、フォースエア（ｆｏｒｃｅ  ａｉｒ）等のキャリアを取り除くその他の方法も、当業者に周知である。例えば、プローブ及び／又は細胞等の前記少なくとも１つの成分は、共有結合及び／又は吸収によって、アッセイステーション２６の内部表面に結合させてもよい。
【００５４】
密封層４０の結合の前に、ＰＣＲ等の増幅反応を前記アッセイステーション２６の中で実行すべき場合には、手動で又は液体分注ロボットによって、基材３６上の各アッセイステーション２６の中に増幅すべき核酸断片及び／又は一又は複数のプライマーを堆積させてもよい。次いで、アッセイステーション２６を乾燥させ、密封層４０を追加する前に、反応成分のキャリアを取り除く。特定の実施形態では、アッセイステーション２６を乾燥させる前に密封層を追加してもよいし、幾つかの実施形態では、前記ステーションを乾燥させる必要がないこともある。他の実施形態では、アッセイを実行する間に加えられた密封層４０を有することもある。自己回復／密封層が用いられる場合には、アッセイステーション２６が試料流体５６で充填された後に、プローブ／プライマーを加えてもよい。
【００５５】
増幅すべき核酸断片には、標準的な方法を用いて、当業者が一般的に採取できるＤＮＡ又はＲＮＡ断片、ｃＤＮＡ、核酸プライマー及び／又はプローブが含まれるが、これらに限定されない。例えば、本発明において有用なＤＮＡ断片は、市販のＤＮＡ合成機の中で予め組み立てることができる。前記アッセイステーションは、本発明の教示に従って、風乾してもよい。乾燥は、室温、大気圧下で行うことができる。アッセイステーションの数に応じて、乾燥には、約１０分から約５時間を要することがある。好ましくは、前記アッセイステーションは約２時間で乾燥される。
【００５６】
好ましくは、毛管力によって液体のフローを増大させるために、基材３６と密封層４０は何れも、親水性表面を有する。典型的な親水性基材３６はガラスである。プラスチック等の本来疎水性である物質には、希釈したフッ化水素酸又は硫酸を用いてプラスチックを処理することにより、前記物質を親水性物質に転換させることができる。本発明によって想定されている疎水性物質の表面特性を改変するための別の方法は、疎水性物質（例えば、プラスチック）に親水性ポリマー溶液を加えるか、又は界面活性剤を加えることである。
【００５７】
例えば、当業者であれば、表面、特に、例えば、プラズマ処理又はコーティング等のマイクロ流体用途に使用すべき表面を処理／修飾するための多数の様々な方法に習熟している。一例として、親水性表面を有することを一般に特徴とするガラスには、表面又は表面の一部が代わりに疎水性特性を有するように処理を施してもよい。使用者の好みの応じた構成の装置を提供するために、このような処理を用い、本発明の教示に従って、一定の特性（例えば、湿潤特性等）を有する装置及び／又は装置１００の部分を提供してもよい。様々なチャネル及びステーションの表面は、例えば、所望される表面特性の配置を与えるために、全体的に、差次的に、又は任意の組合せで処理された表面を有する様々な部分（すなわち、基材、密封層）を有することができる。
【００５８】
例えば、図１の２２、２０、及び３０等のチャネルは、所望のパターンを有するデザインされたマスクを用いるフォトリソグラフィーによるパターン形成の後に、例えば、スライドグラス上のフッ化水素（ＨＦ）酸によって化学的にエッチングすることができる。まず、約７０％の硫酸と過酸化水素の約３０％水溶液（約３０％Ｈ２Ｏ２）との新たに調製した混合物中に、エッチングしたスライドを約１００℃で約１０分間浸漬させる。次いで、それぞれ水道水を数回をかけた後、脱イオン化水をかけて、前記スライドを完全にすすぐ。この工程の間、例えば、スライドのすべての部分が完全に湿潤されるかどうか、スライドをチェックし、疎水性部分が残存していないかチェックする。もちろん、それらの領域の表面特性を変化させることを使用者が望まなければ、前記スライドの一又は複数の部分に処理を施さなくてもよい。上記の例では、親水性のガラス表面が得られる。
【００５９】
プラスチック基材上に親水性表面を得るための典型的な方法では、例えば、ポリ（メチルメタクリル酸）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリプロピレン、ポリエチレン等の親水性物質を使用して、プラスチック表面を処理することができる。親水性物質には、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリル酸等の本分野で公知のものが含まれる。例えば、ＰＥＩ溶液をコートし又はまぶし、次いで、０．５乃至１時間、オーブン中で乾燥させることによって、以前には疎水性であったプラスチック基材に、親水性表面が与えられる。
【００６０】
チャネル２２及びチャネル２４の一部に疎水性表面を得るためには、以下の工程が用いられる。
【００６１】
一旦処理してから、使用直前まで、脱イオン化水中に、きれいなスライドを保存する。典型的には、使用する前に、約１−２時間、約１００℃、大気圧で、これらをオーブン中にて乾燥する。何らかの前駆体化学物質を使用する場合には、乾燥洗浄された前記物質の表面に、約１時間、ＵＶ−Ｏ３酸化をさらに照射して、最後に残った微量の混入物質を除去し、自己組織化単層膜（ＳＡＭ）の品質を向上させる。（例えば、オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）等の長鎖アルキルトリクロロシランのような）前駆体分子が、適切な溶媒（例えば、ヘキサン、ヘキサデカン等）中において、約１０％濃度の比で新たに調製される。次いで、例えば、室温で、約１５−２０分間硬化させるために、一定の割り当てられた領域中にこれらをまぶすか又は噴霧する。３Ｍが製造しているＥＧＣ−１７００等のフッ素系アクリル酸ポリマーを用いる場合には、約１．５％の酢酸を用いて前記コーティング溶液を新たに調製し、約８０乃至約１００℃で、約３０分間、最終処理された被コーティングスライドをオーブンで硬化することが必要である。このようにして、パターンが形成された親水性表面（ガラス）と疎水性表面（処理を施されたガラス）が得られる。これは、基材の表面特性を改変するための当業者に公知である多数の典型的方法の１つにすぎない。
【００６２】
典型的には、チャネル５を介して、被検試料注入口２が試料調製チャンバー６に流体を通じて連結されるように、被検試料（例えば、全血）用の被検試料注入口２は基材３６の上方表面と垂直に接続される。典型的には、チャネル７を介して、緩衝液注入口４が試料調製チャンバー６に流体を通じて連結されるように、緩衝液注入口４も基材３６の上方表面に垂直に接続される。例えば、焼結ガラスブロック３１から全血試料、溶解緩衝液、及び洗浄緩衝液の混合物を抽出するために、吸収剤５及び／又は真空ポンプ等の真空吸引手段が付与された焼結ガラスブロック３１によって、試料調製チャンバー６は、下方表面の少なくとも一部が密封されている。
【００６３】
試料調製チャンバー６の中に挿入されている焼結ガラス粉末３１のブロックは、多孔性ガラスとも称される。典型的な孔のサイズは、約１μｍから約５００μｍの範囲である。焼結ガラスブロック３１は、試料調製チャンバー６の下方部分を占めており、典型的には、僅かなサイズの差によって（すなわち、ガラスブロック３１のサイズは、試料調製チャンバー６のサイズより僅かに大きい）、チャンバー６の内部に強固に固定される。粘着性物質を用いて、試料調製チャンバー６の内部にガラスブロック３１を固定することもできる。
【００６４】
ガラスブロック３１の下に真空が作出される（すなわち、吸収剤５による液体吸収）ことによって、試料、洗浄緩衝液、及び溶解緩衝液がガラスブロック３１から抽出される。溶出緩衝液を試料調製チャンバー６の中に注入する。溶出緩衝液は、ガラスブロック３１の中に浸透し、ガラスブロック３１の表面からＤＮＡ分子を放出する。次いで、試料調製チャンバー６の中に含有された溶出緩衝液中にＤＮＡ分子が拡散する（又は循環流による）。従って、この時点で、溶出緩衝液はＤＮＡ分子を含有する。また、引き続きＰＣＲ反応及びＰＣＲ産物の蛍光検出を行うために必要とされる他の化学物質を、この時点で、溶出緩衝液に加えてもよい。
【００６５】
別の実施形態では、細胞を溶解するために、溶解緩衝液を使用又は添加する必要はない。代わりに、熱を用いて細胞を溶解する。試料調製チャンバー６の中に残存している時点で、又はアッセイステーションの中に導いた時点で、細胞を溶解温度まで加熱して、そこで溶解させることができる。特定の実施形態では、各アッセイチャンバー２６において個別にサーマルサイクリングを行うために、小型加熱機と温度センサーを各アッセイステーション２６中に組み込んでもよい。さらに、試料流体中の溶質（例えば、ＤＮＡ）の濃度を増加させるために、熱を用いて、ある量の溶出緩衝液を蒸発させてもよい。この蒸発工程は、例えば、試料調製領域７８又は各アッセイステーション２６において実施することができ、この場合、前記密封層４０は、例えば、気体透過性であるが、液体透過性ではないようにすることができる。
【００６６】
別の実施形態では、様々な電気化学的センサー並びに電気及び電子工学センサーを、各アッセイステーション２６中に組み込むことができる。この実施形態を用いると、前記アッセイステーション内でアッセイを実施した結果、電気化学を基礎とした検出／データが使用者に与えられる。データは、電気伝導度、抵抗、当業者に公知である、電気化学的検出を用いた実験で典型的なその他の指標の変化の形態であり得る。
【００６７】
本発明によって提供される装置及び方法は、数多くの様々なアッセイ／反応に利用できる。例えば、必要とされる酵素、蛍光色素、デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＮＴＰ、界面活性剤、及びその他の化学物質や緩衝液を全て、緩衝液注入口４を通じて試料調製チャンバー６に添加することができる。溶出効率を増大させることが必要であれば、ダイアフラム４８を押さえるために、振動式アクチュエータ３４を用いて典型的には垂直に振動させることにより、前記試料調製チャンバー６の中の溶出緩衝液を攪拌し、より多くのＤＮＡ分子がガラスブロック３１から放出され、試料調製チャンバー６を占めている溶出緩衝液の中に進入するようにすることができる。
【００６８】
緩衝液注入口４を完全に閉鎖して被検試料注入口２から、流体（例えば、ガス又はオイル）を試料調製チャンバー６に注入してもよいし、あるいは、溶出緩衝液で充填されるまで、緩衝液注入口を開放したまま通気孔として機能させながら、被検試料注入口２から注入してもよい。前記流体は、放出されたＤＮＡ分子を含有する溶出緩衝液を追い出し、典型的なフロー調節要素（疎水性バルブ８）を開放させるので、試料溶液とフロー促進流体とを混合するための当初空であるチャンバーの中に溶出緩衝液が進入することが可能となり、ここで、溶出緩衝液がチャンバー１２を充填する。前記バルブ８は、機械、電気、空気圧、磁気式等の様々な他の手段によって操作されるバルブタイプとすることもできる。この時点では、主液体分配チャネル２０への入り口に配置された疎水性バルブ１８によって、前記溶出緩衝液はチャンバー１２を出ることができない。この場合にも、流体の供給は、加圧等の慣用技術によって行うことができる。
【００６９】
チャンバー１２中の緩衝液がアッセイステーションに流出する前に、チャンバー１２を以下の目的に使用することもできる。（１）チャンバー１２から流出する緩衝液を計量する（すなわち、チャンバー１２の容量を適切に選択することによってチャンバー１２から流出する緩衝液の容量を調節する）、（２）緩衝液がチャンバー１２から流出する前に、前記ＤＮＡの分布が均質化するまでの間、緩衝液を保持する、（３）先述したように、緩衝液中の水の一部を蒸発させることによって、チャンバー１２中のＤＮＡ濃度を増加させる。アッセイステーション２６に流れる緩衝液中のＤＮＡ濃度が増加すると、ＤＮＡ検出の感度と特異性が増大する。
【００７０】
ある実施形態では、拡散チャネル１４を通じてチャンバー１２に放出されるフロー促進流体（ＦＰＦ）を導入するために、チャンバー１６が与えられる。適切なフロー促進化学物質には、へパリン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化セチルトリメチル（ＣＴＡＢ）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＮＰ−４０、及び、その後のＤＮＡ増幅と検出化学反応を阻害せず且つ検出光励起下で蛍光を発しない他の任意の界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＦＰＦがチャンバー１２中に拡散すると、チャンバー１２の中に濃度勾配が確立されるであろう。
【００７１】
特定の実施形態では、１以上の主試料流体チャネル２０は、少なくとも１つの第一の多目的チャネル３０に流体を通じて連結されており、多目的チャネル３０は、少なくとも１つのアッセイステーションチャネル２８及び少なくとも１つのアッセイステーション２６と連通されている。ＤＮＡを含有する前記試料流体中のＦＰＦの化学濃度が臨界値に達するにつれて、疎水性バルブ１８の表面上にある試料流体の液体湿潤が十分大きくなり、前記緩衝液は、バルブ１８を通じて、チャンバー１２から主試料流体チャネルに流入し、さらに、第一の多目的チャネル３０、第一のアッセイステーションチャネル２８、及びアッセイステーション２６の流入する。本実施形態では、液体を前進させる表面張力によって生成された毛管圧によってフローが引き起こされる。このような表面張力は、試料流体とチップの固体表面の間にある接触領域（すなわち、チャネル２０、３０、２８、及びアッセイステーション２６の表面）に生成される。ＦＰＦを添加すると、表面張力が十分低下するので、バルブ１８を通じて前記試料流体が流動し、他の全てのチャネルとアッセイステーション中に移動する。
【００７２】
この毛管圧によるフローの間に、チャネル２０、３０、２８及びアッセイステーション２６が試料流体で充填されるように、アッセイステーション２６と第二の多目的チャネル２２とに流体を介して連結された少なくとも１つの第二のアッセイチャネル２４を通じて、チャネル２０、３０、２８、及びアッセイステーション２６中の空気容量が試料流体によって少なくとも追い出される。全てのアッセイステーション２６が試料流体によって確実に充填されるように、チャンバー１２の容積容量は、少なくともチャンネル２０、３０、２８及びアッセイステーション２６の合計容積以上になるように設計される。
【００７３】
前記試料流体が第二の多目的チャネル２２に流入するのを防ぐために、以下の措置を講ずることができる。（１）前記第二のアッセイチャネル２４の内部に、バルブを取り付けることができる。このようなバルブは、機械、気圧、又は電磁気等の動作手段によって動作させることができる。（２）少なくとも１つの第二のアッセイチャネル２４の内部に多孔性物質を設置して、試料流体のフローは遮断するが、空気は第二の多目的チャネル２２の中に通気するようにすることができる。（３）前記第二のアッセイチャネル２４の少なくとも一部を疎水性物質の層で被覆して、試料流体のフローは遮断するが、空気は第二の多目的チャネル２２の中に通気するようにする。前記疎水性物質には、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）（ＳＢＳ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリプロピレン、ＯＴＳ、フッ素系アクリル酸ポリマー（３Ｍ製造のＥＧＣ−１７００など）、又はエポキシ樹脂が典型的に含まれ得るが、これらに限定されるものではない。例えば、ＳＢＳを有機溶媒中に溶解させて溶液を形成させ、これをガラス又はプラスチック表面上に与え、乾燥により極めて薄いフィルムを得ることができる。ガラス又はプラスチック表面上にエポキシ樹脂を直接滴下させて、紫外線（ＵＶ）硬化又は加熱により薄いフィルムを形成させることも可能である。（４）前記試料流体が第二のアッセイチャネル２４を占有するが、第二の多目的チャネル２２の中に進入することはできず、第二の多目的チャネル２２の中に空気を追い出すことができるように、前記疎水性物質は、少なくとも１つの第二の多目的チャネル２２を被覆する。
【００７４】
特定の実施形態では、試料流体５６のフローが第二の多目的チャネル２２の中に進入しないようにするために、典型的には図１７に図示されているように（このタイプの構成例の側断面図を図示している）、第二の多目的チャネル２２の幅／直径は第二のアッセイチャネル２４の幅／直径より大きくなるようにする。
【００７５】
試料流体５６のフローを停止させ且つ第二の多目的チャネル２２に進入しないようにするためには、アッセイチャネル２４の末端近くを大幅に拡大させるのが有効であり、これは急激に拡大するように作製してもよい。様々なチャネルの間に図示された線は、説明のためだけに記されているものであり、前記例示の図面における様々なチャネルとその空間的関係を図解的に示している。
【００７６】
オクタデシルトリクロロシラン（ＯＴＳ）を用いる場合には、適切な溶媒（例えば、ヘキサン、ヘキサデカン等）中に約１０％濃度の比率で新たに調製することが好ましい。この後、例えば、室温で約１５−２０分間にわたって硬化させるために、一定の割り振られた領域中に前記溶液をまぶす（ｂｒｕｓｈ）か又は噴霧する。このようにして、疎水性表面が得られる。３Ｍ製造のＥＧＣ−１７００等のフッ素系アクリル酸ポリマーを用いる場合には、前記コーティング溶液は、約１．５％の酢酸を用いて新たに調製され、例えば、約８０℃乃至約１００℃で約３０分間、被覆された完成スライドをオーブンの中で硬化させるのが好ましい。
【００７７】
デジタルカメラ３２は、全てのアッセイステーション２６が試料流体によって充填される時点を検出する。前記デジタルカメラは、電荷結合素子（ＣＣＤ）検出部と画像を取り込むための考え得る全てのタイプの適切な光学機器とを備えたカメラであり得る。アッセイステーション２６中の液体から放射される特定波長の光のみが、フィルターを通過して、（前記カメラによって検出すべき）前記検出部に到達できるように、光学フィルターは、前記カメラの検出部の前に配置される。
【００７８】
全てのアッセイステーション２６が充填された時点で、以下に一例を挙げた手段、すなわち、例えば、電気浸透ポンピング、陽圧加圧（シリンジによる注入等）、毛細管流動、エレクトロウェッティング、サーモキャピラリーフロー（ｔｈｅｒｍｏｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｆｌｏｗ）、及び／又は真空吸引のうち任意のものを用いることによって、それぞれ、第一及び第二の多目的チャネル３０及び２２に流体を通じて連絡している注入口４２、４４、４６、及び２１から選択した組合せを通じ、隔離媒体５４を導入してもよい。前記多目的チャネルの上に密封層４０を与えない実施形態では、例えば、注入（ｃａｓｔｉｎｇ）及び／又はロボットによる分配によって、隔離媒体を堆積させてもよく、これにより、前記第一の多目的チャネル３０から試料流体５６が追い出されるであろう。隔離媒体のチャネル３０及び２２への充填は、順次に行ってもよいし、同時に行ってもよく、前記第一の多目的チャネルからまず試料流体を追い出す隔離媒体を注入口から導入した後、続いて、空気を追い出すために前記第二の多目的チャネルの中に隔離媒体を導入することによって行われるのが通例である。
【００７９】
従って、前記隔離媒体５４は、第一及び第二の多目的チャネル３０及び２２を完全に充填する。前記隔離媒体５４は、溶出緩衝液が浸透しないように選択される。すなわち、緩衝液は媒体５４の中に拡散することができない。前記隔離媒体５４は、典型的には、蝋、熱硬化性蝋、オイル、相変化プラスチック（ｐｈａｓｅ−ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｐｌａｓｔｉｃｓ）、熱硬化可能なポリマー液体、シアノアクリル酸及びその誘導体、二液型エポキシ（ｔｗｏ−ｐａｒｔ  ｅｐｏｘｙ）、又は紫外（ＵＶ）若しくは可視光で硬化可能なポリマー液体、及び熱溶解性物質（例えば、グルー・ガンに通例用いられているもの等）であり得る。さらに、典型的な隔離媒体５４には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー等の熱硬化性ポリマー、並びに他のシリコーンエラストマー及び液体シリコーン前駆体が含まれるが、これらに限定されない。硬化活性温度は、約４０℃を超える温度であり得る。
【００８０】
ポリアクリル酸やその誘導体、ポリウレタン前駆体やその誘導体等の典型的な紫外線（ＵＶ）硬化可能隔離媒体５４を用いることもできる。ＵＶ又はその他の適切な照射源には、例えば、一又は複数のレンズによって、多目的チャネル２２及び／又は３０上に焦点を当てたＵＶランプ、多目的チャネル２２及び／又は３０の領域がＵＶに曝露されるように適切なくり抜き部位を有するマスクを着けた後に露出状態を保っている、多目的チャネル２２及び／又は３０の領域上に照射するＵＶランプが含まれる。さらに、多目的チャネル２２及び／又は３０を含有する隔離媒体５４上に導かれ得る局所照射源には、光ファイバー等の局所ＵＶ源も含まれ得る
さらに別の典型的な隔離媒体５４は、例えば、溶媒の蒸発により固化する任意の接着剤も含むことができる。このような隔離媒体５４を用いる場合には、密封層４０及び／又は基材の中に、適切な通気穴及び／又はスロット等の準備を与えてもよい。通気穴及び／又はスロットは、例えば、多目的チャネルを覆う密封層４０の領域中に設けることができる。
【００８１】
隔離媒体５４は、水及び／又は水性液体（界面活性剤を含有する水及び／又は水性液体を含む）と実質的に混和しないことが好ましい。隔離媒体５４は、非透過性及び／又は（アッセイを妨害しないと思われる波長又は強度の）蛍光放射性のものとすることができ、低い粘度を有し得る。
【００８２】
多目的チャネル２２／３０の導入及び充填後に、隔離媒体５４が液体の形態のままで残存している実施形態においては、例えば、固化可能な封止剤６７（例えば、蝋、熱融解粘着性液体、ポリマー液体、エラストマー）を堆積させて、多目的チャネル２２と３０中の外気と流体（試料流体５６及び／又は隔離媒体５４等）との間に存在する全ての界面を密封する。キャップ、蓋、バルブ等の他の密封構造も、気液界面を密封するために用いることができ、固化可能な封止剤６７及びキャップ、蓋、及びバルブは、１００℃付近までの温度に耐え得ることが好ましい。封止剤６７及び／又は他の密封構造によって、アッセイステーション中の液体／流体が一定容量となるので、蒸気の発生や、ＰＣＲ中における、例えば、温度上昇時に起こる他の任意の配分（ｒａｔｉｏｎ）が抑えられる。固化可能な封止剤６７は、ロボット、手動、及び、マイクロ流体の分野において公知であるその他の分注手段によって堆積させることができる。
【００８３】
さらに別の実施形態では、アッセイステーションからの蒸発を最小限に抑えるために、アッセイステーション中に試料流体５６を誘導した後に、オイル／蝋タイプの隔離媒体５４に代えて、前記多目的チャネルの中には、大気若しくは飽和湿度の空気、又は他の任意の飽和湿度の蒸気を導入配置してもよい。第一の多目的チャネル３０から試料流体５６を追い出すために、大気若しくは飽和湿度の空気又は他の任意の飽和湿度の蒸気を用いてもよい。
【００８４】
さらに、別の実施形態では、アッセイステーションからの試料流体の蒸発を最小限に抑えるために、試料流体５６の蒸発温度が上昇するように、囲い５１４の内部に配置するときには、分子分析装置等の分析の間に、前記チップ１００に大気圧を超える圧力をかけてもよい。
【００８５】
本実施形態では、前記アッセイステーションアレイ中の隣接するアッセイステーションにＤＮＡ又はその他の化学物質が拡散しないように、各アッセイステーション２６の中に含有された試料流体中のＤＮＡ又はその他の化学物質は、アッセイステーション２６、第一のアッセイステーションチャネル２８、第二のアッセイチャネル２４のドメイン内に隔離される。隔離媒体５４の隔離特性は、１００℃付近の温度まで維持される。ＰＣＲプロセスの最高温度は９５℃なので、その後のＤＮＡ増幅工程において、交差汚染は起こらない。隔離媒体５４の注入は、電気浸透、注入による陽圧加圧、キャピラリーフローエレクトロウェッティング、サーモキャピラリーフロー、又は真空吸引等の慣用技術によって行うことができる。
【００８６】
さらに、アッセイステーション２６に、例えば、標識プローブその他の望ましくない反応成分が非特異的に結合したものなど、少なくとも１つの望ましくない反応成分を洗い流すために、洗浄工程を付加してもよい。これは、例えば、アッセイステーション２６の内部表面に強固に結合されたプローブ／マーカー分子が用いられ、目的の分子（例えば、ＤＮＡ）にも結合する実施形態において用いることができる。アッセイ反応が完了すると、アッセイ反応の非特異的成分を洗い流すために、洗浄工程（多目的チャネル及びアッセイステーション及びチャネルの中に、（例えば、真空又は圧力によって）洗浄緩衝液を導入することから構成される）が行われる。アッセイチャンバー２６の表面に結合しているマーカー／プローブは後に残され、次いで、マーカー／プローブに結合した目的の分子の有無をアッセイする。
【００８７】
各アッセイステーション２６は、蛍光色素を含有することができる。デジタルカメラ３２は、蛍光色素から発せられる白色光及び／又は蛍光発光画像をともに捉える。前記チャンバー、チャネル、及びアッセイステーション（すなわち、流体区画とチャネル）が基材３６の表面下に組み込まれておらず、外気に曝されている場合には、流体区画並びにチャネル２０、３０、２８及びアッセイステーション２６の全ての上方表面に前記密封層４０を与えてもよい。密封層４０は、好ましくは、試料調製チャンバー６に被検試料を加える前に、前記基材に結合させるべきである。試料調製チャンバー６、注入口２、４及び２１、４２、４４、４６の入り口には、密封層４０を与えなくてもよい。用いるアッセイプロトコールとそれに伴う温度に応じて、密封層４０は、チャネル２４及び／又は２２の上方表面から省略することもできる。特定の実施形態では、密封層４０によってチャネルとアッセイステーションを外気から密封して、キャピラリーフローを増大させ、注入又は真空による液体の流動を可能としてもよい。前記密封層４０は、熱的ボンディング、静電的ボンディング、機械的ジョインティング（ｊｏｉｎｔｉｎｇ）、粘着的ボンディングを含む（これらに限定されない）ボンディング工程によって、試料調製チャンバー６と全ての導入用注入口以外は、チャネルとアッセイステーションを密封するプラスチックフィルムであるのが一般的である。前記密封層は、少なくとも１つのガラスプレート、プラスチックプレート、熱可塑性物質（ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃ）、エラストマー、プラスチックフィルム、及び熱によって活性化される接着剤のうち少なくとも１つから構成することもできる。さらに、基材と同じ素材で密封層を構成してもよい。密封層４０と基材３６は、ＵＶやその他の波長（可視スペクトルの波長を含む）を透過し、実験の測定／結果を妨害する蛍光を発しないことが好ましい。
【００８８】
さらに別の実施形態では、密封層４０には、様々な位置に穴／通気孔を設けてもよい。例えば、前記密封層中に存在する少なくとも１つの穴は、例えば、チャネル又は廃棄物貯蔵タンク等の様々な領域上の位置（穴を複数設ける場合には複数の位置）に設けてもよい。さらに、密封層４０は、気体透過性物質によって作製してもよいと考えられる。これにより、例えば、装置１００から液状流体が失われるのを防ぐ障壁を与えながら、流体を放出させることが可能となるであろう。このような密封層が設けられる場合には、通気穴によって、流体や様々な媒体を様々なチャネル中に流動できるようにする必要はないかもしれない。
【００８９】
前記チャネル２０、３０、２８、２４、及び２２の幅は、典型的には、約１μｍから約５ｍｍの範囲とすることが可能であり、前記チャネルの深さは、典型的には、約１μｍから約１ｍｍの範囲とすることが可能である。前記アッセイステーション２６の幅又は直径は、典型的には、約１μｍから約１０ｍｍの範囲とすることができ、深さは、典型的には、約１μｍから約１ｍｍの範囲とすることができる。各種チャネル２０、３０、２８、２４、及び２２の表面湿潤特性と寸法は、他のタイプのチャネルと異ならせることができる。前記構造物は全て、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）技術、コンピュータ数値制御ＣＮＣ機械加工、レーザー機械加工、放電機械加工（ＥＤＭ）、化学エッチング、射出成形、加熱エンボス加工、又は打抜き加工等の方法を用いて製造することができる。
【００９０】
各アッセイステーション２６には、先述したように、ＤＮＡ増幅に必要とされる温熱条件を与えてもよい。このような温熱条件には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に必要とされるサーマルサイクリングが含まれる。
【００９１】
さらに、本発明の別の実施形態では、被検試料注入口２又は緩衝液注入口４を通じて試料調製チャンバー６中の溶出緩衝液にＦＰＦを添加して、アッセイステーション２６の中にフローを動かすことができる。この場合には、チャンバー１２、チャネル１４、及びチャンバー１６は不要である。このチップデザインは、図３と図４に示されている。ここでは、図１及び図２に示されているバルブ１８の機能をバルブ８が果たしている。他の全て点で、チップ１００のデザイン及び試料の調製と分析の動作方法は、図１及び図２に示されているものと同一である。従って、さらなる論述は行わない。
【００９２】
また、チップ表面（全チャネルと全アッセイステーションの表面）が親水性であれば、チップ操作のいかなる段階においても、ＦＰＦを使用する必要は全くない。この場合には、試料流体が水性なので、バルブ８を開放すれば、試料流体は全てのチャネルとアッセイステーション中に単独で流入することができる。バルブ８とバルブ１８はともに、任意の手段（例えば、機械、電気、磁気、化学、又は気圧）によって操作することができる。
【００９３】
特定の実施形態では、前記装置には試料調製領域を設けなくてもよく、この場合、試料流体の調製は、「チップ外（ｏｆｆ−ｃｈｉｐ）」で行われる。従って、図５Ａ−Ｅに図示されているような典型的構成を与えることができる。図５Ａでは、基材３６は、第一のアッセイチャネル２８と第二のアッセイチャネル２４とが連通した少なくとも１つのアッセイステーション２６を有している。さらに、隔離媒体注入口４２は、第二の多目的チャネル２２と連通するように設けられている。さらに、典型的な試料溶液注入口２１も、第一の多目的チャネル３０と連通するように設けられている。図５Ａの実施形態では、貯蔵タンク４５は、第一の多目的チャネル３０と第二の多目的チャネル２２とに連通するように描かれている。２組のアッセイステーション、アッセイステーションチャネルと多目的チャネルしか示されていないが、あらゆる個数の複数の組を設けてもよい。さらに、先述した特定の実施形態のように、特定の領域上に密封層４０を設けることもできる（図５Ａ−Ｅは上面図なので、図示されていない）。典型的な構成には、例えば、実行すべきアッセイのタイプや基材３６とともに用いられるであろう流体の特性に応じて、アッセイステーション２６のみをカバーし又は多目的チャネルの一方又は両方も合わせてカバーする密封層４０が含まれる。
【００９４】
幾つかの実施形態では、第一のアッセイチャネル２８は、図５Ａ−Ｅに示されているように、前記第二のアッセイチャネル２４より小さな断面積を有する。これにより、アッセイステーション２６に進入する試料流体５６の速度及び／又はフローが減少するため、アッセイステーション２６への試料流体５６の進入によって空気が置換されて、第二のアッセイチャンバーチャネル２４を通じて、第二の多目的チャネル２２の中に導かれる。試料流体５６がアッセイステーション２６に流入し、最終的にはアッセイステーションチャネル２４に流入するので、これにより、エアポケットが形成されてアッセイステーション２６内に閉じ込められる可能性が減少する。
【００９５】
本明細書では、環状の切断面形状／外形を有するように、第一のアッセイステーションチャネル２８が典型的に図示されているが、試料流体５６が第一の多目的チャネル３０に流出するのを最小限に抑えるためにフローを制限する任意の形状を該チャネルは有することができる。
【００９６】
図５Ｂでは、第二の多目的チャネル２２に隣接する第二のアッセイステーションチャネル２４の部分５０には、試料溶液５６のフローを伝導しない表面特性を付与することができる。例えば、第二の多目的チャネル２２は、疎水性表面を有することができ、あるいは疎水性表面を与えるように処理することができる。本実施形態では、試料溶液５６が水溶液であれば、該試料溶液５６は、試料溶液注入口２１を通じてアッセイステーション２６及び第一の多目的チャネル３０に流入する（本例では、親水性の表面特性を有する）。同様に、第一のアッセイチャネル２８及びアッセイステーション２６の表面も、例えば、親水性表面を有する。試料溶液５６は、第二の多目的チャネル２２に流動し、第二の多目的チャネル２２の疎水性表面特性のために、又は（図１７に図示されている実施形態の場合のように）第二のアッセイチャネル２４から第二の多目的チャネル２２に向けてチャネルの直径が突如増大しているために停止する。図示されているように、第二のアッセイチャネル２４の部分５０も、疎水性表面特性を有することができ、試料流体５６のフローは、例えば図５Ｂ、Ｃに示されているようにこの地点で停止する。
【００９７】
図５Ｂ、Ｃに図示されている実施形態では、貯蔵タンク４５には、吸収剤５を付与してもよい。吸収剤５は、セルロースをベースとした材料又は合成材料、ポリアクリルアミドゲル、粒子、及び多孔性材料のうち少なくとも何れか１つから構成され得る。貯蔵タンク４５は、密封層４０によって密封してもよいし、大気に対して開放されていてもよい。さらに特定の実施形態では、図５Ｂ（上面図）に示されているように、密封層４０によって吸収剤５をカバーする場合には、。流体のフローが様々なチャネル中に生じ得るように、通気孔５２を設けてもよい。さらに、ここでは、貯蔵タンク４５と吸収剤５が、多目的チャネルの複数の終末部分と連通できるのに十分なサイズを有するように描かれているが、多目的チャネルの終末部分は、専ら貯蔵タンク及び／又は吸収剤５と連通し、他の全ての多目的チャネルとは連通しないようにすることも想定される。
【００９８】
アッセイステーション２６を密封するためには、隔離媒体５４を第一の多目的導管３０に流入させる。隔離媒体５４は、様々な方法及び本発明の様々な実施形態に従って導入することができる。例えば、隔離媒体５４は、隔離媒体注入口２１を介して第一の多目的チャネル３０に導入することができる。特定の実施形態では、例えば、図１及び３並びに図５Ａ−Ｅでは、隔離媒体注入口２１は、図５Ａに示されているように、試料液体注入口２１及び隔離媒体用の注入口として二重又は多重の役割を果たすことができる。他の実施形態、例えば図１に示されている実施形態では、二重目的を果たさずに、空気と隔離媒体５４のフローを伝導する第二の多目的チャネル２２への注入口である一又は複数の注入口４２を介して、隔離媒体５４が導入され得る。先述したように、隔離媒体５４は、アッセイステーション２６を密封する役割を果たすだけでなく、例えば、第一の多目的チャネル３０から試料流体５６を置換する役割も果たす。図５Ａに例示されているように、置換された試料流体５６は貯蔵タンク４５（密封層４０で密封してもよいし、密封しなくてもよい、あるいは吸収剤５を含有してもよいし、含有しなくてもよい）に流動し得る。
【００９９】
これまでに記載した置換によって、第一の多目的チャネル３０から試料流体５６の流出が起こる。しかし、前記第二の多目的チャネル２２の中に隔離流体５４を与えることによって、さらなる置換を行ってもよく、この場合には、隔離流体５４は試料流体５６を置換せず、空気を置換する。本実施形態においては、第二の多目的チャネル２２の表面は、例えば、本来的に疎水性であるか又は処理を施すことによって疎水性とし得るので、領域５０で試料流体のフローを停止させるように作用することを思い出していただきたい。隔離媒体５４を前記第二の多目的チャネルに導入すると、その中の空気は置換されるので、アッセイステーション２６又は複数のアッセイステーション２６が前記隔離流体５４によって密封される。これによって、あるアッセイステーションの内容物が蒸発して、別のアッセイステーションの内容物と交差汚染する懸念がなくなる。
【０１００】
典型的な第二の多目的チャネル２２に隔離媒体５４を導入し得る方法は数多く存在する。図５Ｃに図示された実施形態によれば、隔離媒体５４は注入口２１を介して導入され、流動し、試料流体５６を前記第一の多目的チャネルから貯蔵タンク４５の中に移動させる。図示されているように、これにより、アッセイステーション２６の下方部分が部分的に密封されることになる。次いで、隔離流体を吸収剤５の中に流入させた後、矢印で記されているように、第二の多目的チャネル２２と連通した状態にし、前記第二の多目的チャネル２２に流入させて、その中の空気を置換し、アッセイステーション２６の上方部分を密封するので、一又は複数の前記アッセイステーション２６が完全に密封される。本実施形態では、例えば、図５Ｄに示されているように、注入口４２は通気孔として働き、第二の多目的チャネル２２の中に隔離流体を導入するための入り口としては働かないであろう。
【０１０１】
図５Ｄには、前記多目的チャネルと連通させることができる、着脱可能な吸収剤５要素が図示されている。ここでは、吸収剤５が過剰な試料流体５６を取り込み、過剰な隔離媒体５４を取り込む場合もある。さらに、吸収剤５を付与することによって、各第一の多目的チャネル中に存在する試料流体５６の列上に別の「引っ張り」力（ｐｕｌｌｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ）を与えて、一又は複数のアッセイステーション２６の充填を加速させることもできる。図５Ｄでは、隔離媒体５４が注入口２１と４２を介して導入される。図５Ｅでは、アッセイステーションは密封され、吸収剤５が除去されているので、その中に過剰な試料流体が含有されている。先述したように、吸収剤５は、隔離媒体５４をその中に吸収してもよい。
【０１０２】
別の実施形態によって、チップの中に複数の試料流体５６を導入することもできる。典型的な構成が図１８に図示されている。ここでは、共通の第二の多目的チャネル２２が複数のアッセイステーションと連通された状態で設けられている。例えば、図示されているように（３０及び３０’）、該複数のアッセイステーションは、試料流体５６（相互に異なるものであってもよい）をその中に導入することができる複数の独立した第一の多目的チャネルと連通させることができる。これによって、１つの装置上で複数の試料流体／異なる試料流体をアッセイ／検査できるようになる。
【０１０３】
図６Ａ−Ｃには、別の実施形態が描かれている。本実施形態では、一又は複数のアッセイステーション２６に、密封層４０の中に形成された通気穴６６が設けられている（図６Ａには図示されていない、上面図）。図６Ｂ（典型図６Ａの側面図）には、これがさらに明瞭に示されている。ここでは、アッセイステーション通気穴６６は、大気に開放された状態で図示されている。支持体６２は、少なくとも前記アッセイステーション通気穴６６の上に配置され且つ間隙６４を画する隔離媒体プラットフォーム６０を支持するために与えられている。先述した実施形態のように、試料流体５６は第一の多目的チャネル３０の中に導入され、第一のアッセイチャネル２８を介してアッセイステーション２６に流動し、これを充填する。ここでは、第二の多目的アッセイチャネルに流動させることに代えて、図６Ｂに示されているように、試料流体５６は、アッセイステーション２６（又は複数のアッセイステーション２６）とともにアッセイステーション通気穴６６を充填している。続いて、隔離媒体５４は、前述のように、第一の多目的チャネル中の試料流体５６を置換する。しかし、ここでは、隔離媒体５４は間隙６４に導入されている。隔離媒体５４は流動して、図６Ｃに進行状態で示されているように、隔離媒体プラットフォーム６０と密封層４０によって画された間隙６４中を充填する。図６Ｄには、図６Ｃの垂直断面図によって、かかる充填と密封のプロセスが描かれている。図６Ｅには、アッセイステーション中の試料流体が隔離媒体５４によって密封される地点の典型的な実施形態が描かれている。
【０１０４】
固化しない隔離媒体５４が用いられ、隔離媒体５４が固化しない実施形態では、図６Ｆに側面図で描かれているように、全ての流体路（チャネル及び注入口）を密封して大気から隔離するために、例えば、全ての周囲の隔離媒体プラットフォーム６０と全ての排出口及び注入口２１の中に固化可能な封止剤６７を堆積させてもよい。このため、これにより、一定容量の液体（例えば、試料流体５６と隔離媒体５４）がチップ１００の内部に形成されて、ＰＣＲやその他の反応中に温度が上昇したときに蒸気が生成されるのを抑える。封止剤６７は、例えば、蝋、熱溶解組成物、粘着性液体、ポリマー液体、エラストマーの形態とすることができる。さらに、かかる固体封止剤の効果は、キャップ、蓋、及び／又はバルブを任意の好ましい組合せで用いることによっても達成することができる。固化可能な封止剤６７、キャップ、蓋、及び／又はバルブは、最高約１００℃の温度に耐えることが好ましい。
【０１０５】
図６Ｇに転じると、別の典型的な構成が図示されている。ここでは、隔離媒体プラットフォーム６０は用いられておらず、アッセイステーション通気穴６６は、アッセイステーションチャネル２４上の典型位置に移動されている。ある種の実施形態では、全ての流体路を隔離し、先に詳述したように、大気から一定量の流体を供給することにより、流体（例えば、アッセイステーション中の試料流体５６）の混合を最少限に抑え及び／又は喪失させるために、固化可能な封止剤６７を密封層４０（この上面図には示されていない）の上に直接配置して、アッセイステーション排気穴６６及び排出口と注入口２１を覆ってもよい。特定の実施形態では、試料流体５６と隔離流体５４の充填順序は逆転させてもよい。
【０１０６】
図７Ａ１−７Ｃ４には、充填を行う際の典型的な手順が描かれている。これらの例では、第一の多目的チャネル３０、第一及び第二のアッセイチャネル２８及び２４、並びにアッセイステーション２６は親水性の表面特性を有しているが、第二の多目的チャネルは２２は疎水性表面を有している。特定の実施形態では、多目的チャネル２２の上部に位置する密封層４０の少なくとも一部は疎水性表面を有している。
【０１０７】
図７Ａ−１から７Ａ−４には、典型的なフロー及び充填順序が描かれている。ここでは、試料流体５６は第一の多目的チャネル３０の中に導入され、第一の多目的チャネル３０、第一のアッセイステーションチャネル２８、及びアッセイステーション２６の中を流動して、これらのチャネルを充填し、第二のアッセイステーションチャネル２４に流入し、第二の多目的チャネル２２に隣接して停止する。続いて、図７Ｂ１から７Ｂ４に示されているように、隔離流体５４が、第一の多目的チャネル３０の中に導入され、試料流体５６を置換するが、第二の多目的チャネル２２（この例では、疎水性）と第二のアッセイステーションチャネル２４（親水性）との表面特性が異なるために、試料流体５６は第二の多目的チャネル２２の中には流入しない。このため、前記第一のアッセイステーションチャネル２８中の試料流体５６と前記第一の多目的チャネル３０中の隔離媒体５４との間に存在する界面によって、前記アッセイステーション２６の単離と部分的な密封が達成される。
【０１０８】
図７Ｃ１から７Ｃ４では、第二の多目的チャネル２２に導入された隔離媒体５４がチャネル２２の中を流れて、その中の空気を置換している。第二の多目的チャネル２２の中を隔離媒体５４が流れることによって、前記複数のアッセイステーションの密封が完結する。先述したように、隔離媒体５４と試料流体５６は、実質的に互いに混和しないので、例えば、図７Ｃ−４に示されているように、両者が出会う地点が密封状態となる。多目的チャネル２２及び３０に導入された後に隔離媒体５４が固化しない特定の実施形態では、例えば、前記多目的チャネルの注入口／排出口を密閉するために固体の密栓を用いてもよい。このような固体の障壁により、温度が上昇したときに試料流体５６の気化又は膨張が阻止される。
【０１０９】
図７Ａ１−７Ｃ−４には、まず複数のアッセイステーションとアッセイステーションチャネルに試料流体５６が充填された後に、隔離媒体で密封されるという典型的な手順が図示されているが、この手順が、前記少なくとも１つのアッセイステーション２６を充填し得る唯一の手順というわけではない。図７Ｄ１−２では、あるアッセイステーション（及びアッセイチャネル）は密封されているが、他のアッセイステーション（及びアッセイチャネル）は様々な充填段階及び密封段階にあるように、複数のアッセイステーションを充填することができる。例えば、図７Ｄ２では、一番左のアッセイステーション２６とアッセイチャネルは既に試料溶液５６が充填され密封されているが、隣接したアッセイステーションとアッセイチャネルは充填されているが、隔離媒体５４によって一部が密閉されているにすぎない。これらの様々な典型的順序は、典型的には、第一及び第二の多目的チャネル中に隔離媒体５４を導入するタイミングによって、達成することができる。さらに、多目的チャネル中の流速を調節するために、異なるフロー特性を有するタイプの異なった隔離媒体５４を前記第一及び第二の多目的チャネル２２及び３０中に、それぞれ別異に与えてもよい。さらに、表面エネルギー及び隔離媒体５４との相互作用を変化させる、異なる表面処理を用いて、例えば、流速を調節してもよい。
【０１１０】
上記の充填及び密封の順序に加えて、多目的チャネル中への隔離媒体５４の充填を逆転させてもよい。この例では、上記のように、試料流体５６が導入され、一又は複数のアッセイステーション２６が充填される。続いて、隔離媒体５４が前記多目的チャネルのうちの１つに導入された後、硬化及び／又は重合及び／又は固化されて、例えば、固化された隔離媒体によって一方側が密封されたアッセイステーションを得る。引き続き、（最初に導入された隔離媒体５４と同一の組成又は異なる組成を有する）隔離媒体５４が反対側の多目的チャネル中に導かれ、続いて、硬化／及び／又は重合／固化され得る。かかる順序で試料流体５６と隔離媒体５４を充填すると、極めて粘度の高い隔離媒体を使用できる。アッセイステーションとチャネルには試料流体５４が既に充填されており、実質的に密封された固体の多目的チャネルが一方側に隣接しているので、二番目に与えられる隔離媒体５４に対する力又は圧力を増加させて、前記第二の隔離媒体５４を前記第二の多目的チャネル中に導入することができるが、試料流体がアッセイステーション２６及びアッセイチャネル２４、２８中に残存しているので、置換はされない。これによって、流動させるために加圧が必要なことがある極めて粘度の高い隔離媒体が使用できる。
【０１１１】
ここで図８に転じると、典型的な分析システムが示されている。本例は、例えば、ＰＣＲ等の蛍光を基礎としたアッセイを用いるときに特に有用である。標的ＤＮＡを増幅している間に又は増幅が終了した時点で、各アッセイステーション２６中に含有されている蛍光色素を励起するために必要とされる波長スペクトルを有する励起光源５００をチップ１００の一部又は全部に照射する。励起光５０２は光フィルター５０４を通過し、ここで、光学ハーフミラー５０６によって反射される。反射された光５０８は、透明ウインドウ５１２を通過し、アッセイステーション上に到達する。温度調節のために、囲い５１４でチップ１００全体が囲まれている。温度調節は、チップ１００と向き合った流体操作システム５１８と共同で、温度調節システム５１６によって行われる。囲い５１４には、温度調節システム５１６と流体操作システム５１８も入っている。
【０１１２】
チップ１００が光源５００によって照射されると、アッセイステーション２６の全部又は一部から生じた蛍光放射映像５２０が、カメラ３２のカメラレンズ５２２によって検出される。映像光５２０は、カメラレンズ５２２に到達する前に、他の光を全てカットして蛍光色素から放射された狭いスペクトルの光のみが通過しカメラレンズ５２２に到達するようにするフィルター５１０を通過する。図２と図４ではチップ１００の上にカメラ３２が図示されているが、カメラ３２はチップ１００の上又は下の何れに設置してもよい。図８に示されているように、ＤＮＡをＰＣＲ増幅する場合、各サーマルサイクルの終了時に又は増幅工程が完全に完了した後に、検出を行ってもよい。各アッセイステーションの存在する箇所で、前記映像の蛍光放射強度、放射映像の形状と位置、及び放射強度が解析される。画像化、データ取得、及びデータ処理は全て、コネクター５２６によってカメラ３２に接続され且つコネクター５２８によって温度調節システム５１６に接続され且つコネクター５３０によって流体操作システム５１８に接続されたハードウェア制御コンピュータ５２４によって制御される。
【０１１３】
図９と１０には、分析システムの様々な構成要素の典型的な配置が記されている。図９には、フルオロフォアの励起スペクトル中に励起周波数を含み得る光線が少なくとも１つのアッセイステーションを横又は底から照射する（構成要素にはＡ、Ｂ、Ｃの表記が付記されている）システムの図式的ブロック図が示されている。光源５３０Ａから励起光線として放射された光はビームコリメータ５３２Ａとフィルター５３４を通過した後、少なくとも１つのアッセイステーションを有するチップ１００上に到達する。前記少なくとも１つのアッセイステーション由来の蛍光放射は、光捕捉体５４２Ａと５２４Ｂ及びフィルター５４４によってオプティカルセンサー５４６に結像される。比例積分微分（ＰＩＤ）制御されたサーマルサイクリング装置５３８と二次元移動式ステージ５３６は、マイクロコントローラサブシステム５５０に、次いでメインコンピュータ５４８に接続されている。
【０１１４】
図１０には、光線が少なくとも１つのアッセイステーションを上から照射するシステムの図式的ブロック図が示されている。光源５３０Ｄから励起光線として放射された光がビームコリメータ５３２Ｄを通過し、フィルター５３４Ｄの進行方向が二色性ミラー５４１によって転換せられ、チップ１００に到達する。少なくとも１つのアッセイステーションから発せられた蛍光放射は、光捕捉体５４２Ｂとフィルター５４４によってオプティカルセンサー５４６に結像される。ＰＩＤ制御されたサーマルサイクリング装置５３８と二次元移動式ステージ５３６は、マイクロコントローラサブシステム５５０に、次いでメインコンピュータ５４８に接続されている。
【０１１５】
図８−１０では、５００及び５３０の光源は、レーザー、ＬＥＤ（ＬＥＤアレイ）、又はランプ（連続波（ＣＷ）又はパルス）とすることができる。ビームコリメータ５３２は、光源５３０から発せられた出力光を平行化（ｃｏｌｌｉｍａｔｅ）することが好ましい。ビームコリメータ５３２は、例えば、平凸レンズとすることができ、あるいは、レンズ等の複数の光学部品を組み合わせてもよいし、又はレンズを光ファイバーと組み合わせてもよい。光がビームコリメータ５３２を通過すると、フィルター５４４とともに励起波長を選別し、ある種の色素（例えば、蛍光標識）に対する励起波長及び発光波長バンドセレクターの対を構成するフィルター５３４によってフィルターにかけられる。フィルター５３４は、色素のピーク励起波長に等しいカットオフ波長を有する単一のショートパスフィルターとすることができる。ショートパスフィルターと干渉フィルターを組み合わせた一対のショートパスフィルターを用いることが好ましい。フィルター５４４は、色素のピーク発光波長に等しいカットオフ波長を有する単一のロングパスフィルターとしてもよいし、あるいは、色素のピーク発光波長に等しい中央波長を有する干渉フィルターとしてもよい。
【０１１６】
ある実施形態が図示された図１１Ａ及びＢに移ると、試料調製領域７８が基材３６の上に設けられており、液体により試料流体チャネル２０と連通させることができる。試料調製領域７８は、実施すべきアッセイのタイプに応じて決まる要素から構成され得る。従って、ある実施形態では、核酸単離要素７９と蓋７４を有する試料調製チャンバー６を備えることができる。蓋７４は、注入口７２及び７０と連通されたフロー調節要素８２を有してもよい。注入口７２と７０のうち何れかが、それぞれ溶解溶液、緩衝溶液、溶出溶液等の様々な溶液を受容するように構成することもできるし、あるいは、一方の注入口から試料調製チャンバー６の中に緩衝液を含む様々な流体を導入できるように設置することもできる。核酸単離要素７９は、例えば、本分野において公知である核酸結合膜、ガラスブロック、磁気粒子、又はシリカビーズによって構成することができる。例えば、プランジャーによって、又は８０及び８１に例示されているようなスラスト運動又はプランジング運動を行うプランジャー又は任意の機械部品によって変形させることができる柔軟部９０を密封層４０に設けてもよい。密封層の柔軟部９０の中に押し下げられると、チャネル２０又は廃棄チャネル８４へのフローを停止／妨害することができ、あるいは、フローを停止／妨害させてあるチャネルから別のチャネルに流体のフローを導くようにすることができる。
【０１１７】
図１１ＡとＢの実施形態では、チップ中に残存した洗浄緩衝液を空気により追い出すための空気ポンプを用い、バルブにより調節される「フィッシュポンプ」によって吹き込むことができる。
【０１１８】
さらに、洗浄緩衝液と溶出緩衝液の空気ポンピングは、バルブによって調節される「フィッシュポンプ」によって吹き込むこともできる。
【０１１９】
典型的には、試料の調製は、図１１ＡとＢに示された実施形態に対する以下の典型的な工程から構成され得る。例えば、ＰＣＲ実験／アッセイをチップ上で実施すべきときには、核酸をその中に有する溶液を、蓋７４を取り去った試料調製チャンバー６の中に入れることができる。続いて、蓋７４を試料調製チャンバー６に戻し、プランジャーバルブ８１を閉じ且つプランジャーバルブ８０を開放した状態で試料調製チャンバー６の中に洗浄緩衝液を導入し、例えば、陽圧又は真空によって、前記洗浄緩衝液を廃棄タンクに誘導する。次に、試料調製チャンバー６とチャネル８８内に残存している洗浄緩衝液を、廃棄チャネル８４を通じて廃棄タンク（図示せず）の中に追い出すために（又は残存している緩衝液を廃棄物中に真空吸引するために）、チップ注入口８６から空気をポンプ供給してもよい。これにより、核酸単離要素７９に核酸が結合する。
【０１２０】
核酸単離要素７９から核酸を溶出するためには、プランジャーバルブ８０と８１を閉鎖し且つ通気のためにチップ注入口８６を開放しながら、試料調製チャンバー６の中に所定量の溶出緩衝液を導入する。試料調製チャンバー６の中に空気が送り込まれると、核酸単離要素７９を通じて、全ての溶出剤をチャネル８８の中に押し出すことができる。次いで、チップ注入口８６を介してＰＣＲ反応混合物（例えば、ｄＮＴＰ、緩衝液、及びポリメラーゼを含む）を溶出溶液に加え、溶出溶液と混合させ（この段階で核酸を含有することになる）、試料流体を得ることができる。最終工程では、試料調製チャンバー６及び／又は注入口８６にオイルを添加し、プランジャーバルブ８０を閉鎖し且つプランジャーバルブ８１を開放して、試料流体チャネル２０を介して、溶出された核酸を有する試料流体とＰＣＲミックスとをアッセイステーションに導くことができる。前記試料流体は、例えば毛管力によって少なくとも１つのアッセイステーションにも流れるので、気圧又は液体圧を加える必要はないであろう。
【０１２１】
本発明に使用することができるアッセイステーションは、様々な構成をとることができる。図１２では、アッセイステーションの中央部にフロー促進構造が設けられている。これらは、複数の節（ｎｏｄｅ）３７から構成させることができる。これらの典型的な構造により、試料流体５６のアッセイチャンバーへのフローも促進させ、アッセイチャンバー内に泡が生じるのを防ぐ。基材３６若しくは密封層４０又は両方の上に形成することができる柱（ｃｏｌｕｍｎ）及び／又は隆起によって、フロー促進構造を構成してもよい。図１３には、第二のアッセイチャネル導管内に形成することができる流体通気チャネル１１０が図示されている。これらのチャネルは、アッセイステーション中への進入速度が速すぎて、矢印で図示されているように、アッセイステーション２６の側壁に沿って移動することがある試料流体５６の流れを変えるのに役立つ。第二のアッセイチャネル２４への入り口で試料流体５６（アッセイステーション２６の側壁に沿って走行することがある）が合流し、泡を生じるのを防ぐために、代わりに、泡を生じずにアッセイステーション２６の中にいわば遅れた試料流体の先頭を充填させつつ、第二のアッセイチャネル２４の中に試料流体を流入させてもよいであろう。
【０１２２】
図１４には、アッセイステーション２６の別の実施形態が図示されている。本実施形態では、第二のアッセイチャネル２４には、勾配付与部１１２が隣接している。勾配付与部１１２によって、第二の多目的チャネル２２が隔離媒体５４で完全に充填されることにより、流体が急な９０°の角度を過ぎるにつれて形成されることがある泡の生成を減らすとともに、製造が容易になる。第一に、疎水性等の所望の特性を付与するために、第二の多目的チャネル２２が処理された表面を有する場合には、施された前記処理（コーティングの付与等）に第二の多目的チャネル２２が曝されるように、基材３６の上にマスクをかぶせるのが通例である。しかし、施した処理が第二の多目的チャネル２２のみに与えられるようにするためには、第二のアッセイチャネル２４の上に正確にマスクを配置させなくてもよいことがある。例えば、マスクの敷設が正確でなく、第二のアッセイチャネル２４に隣接する領域上にコーティングの一部が付与されても、第二のアッセイチャネル２４中への試料流体５６のフロー、充填、最終的な停止に悪影響を与えないように、勾配１１２によって、表面処理の付与に対する耐性が増加する。さらに、このような勾配付与部を設けると、第二の多目的チャネル２２を通じた隔離媒体５４のフローが改善され、第二の多目的チャネル２２中での気体の入れ換えが制御されて円滑になり、第二のアッセイチャネル２４と第二の多目的チャネル２２とが（例えば、図１２に図示されているような）急な角で合流したときに泡が発生する可能性を減少させる。
【０１２３】
図１５には、伸長された第一のアッセイチャネル２８を有するさらに別のアッセイステーション２６が図示されている。この構成では、このようなアッセイステーションに流入し充填する試料流体５６に、アッセイステーション内で試料流体を加熱した結果、あるアッセイステーションから別のアッセイステーションに試料流体のフローを生じさせることがある対流が起こらない。これは、第一のアッセイチャネル２８によって与えられる長い遠回りの経路が、例えば前記アッセイステーションから流出し、前記第一の多目的チャネル３０に流入する試料流体５６のフローを遅くするためである。ある種の反応条件下では、アッセイステーションとチャネルを多目的チャネルから密封するために隔離流体が不要なことさえある。
【０１２４】
図１６には、少なくとも第一及び第二の多目的チャネルが配列されている、別の典型的なアッセイステーション２６の構成が図示されている。少なくとも１つのアッセイステーション２６は、第一及び第二の多目的チャネルの中間位置に配置されており、液体を通じてこれらのチャネルと連通している。ここでは、第一の多目的チャネル３０は、試料流体の伝導を可能とする内部表面特性を有しているのに対して、第二の多目的チャネル２２は、試料流体を伝導させない疎水性の表面特性を有していてもよい。前記力／表面特性は、試料流体５６をはじき、アッセイステーション２６中に保持するのに十分な強さを有する。アッセイステーションチャネル２４と２８は、他のチャネルと同じく、円形、半円形、又は他の横断面形状の他に、三角、楕円、菱形の切断面構造等の他の典型構造を有してもよい。
【０１２５】
疾病を検出し、又は疾病のリスクを評価する本発明の方法は、以下の典型的工程を備える。例えば、動物由来の全血の被検試料を被験者から取得する。分析の前に、チップ装置１００上にある各アッセイステーションには、特異的プローブとプライマーのうち少なくとも１つを蓄積させることができ、各アッセイステーションは乾燥される。従って、チップ１００上の全アッセイステーション２６中に、少なくとも１つのＤＮＡプローブ及び／又はプライマーが存在する。各アッセイステーション２６は、少なくとも１つのプローブ又はプライマーを含有している（アッセイの中には（例えば、ＦＲＥＴ）、２つのプライマーと１又は２つの蛍光色素標識プローブが必要なものも存在する）。
【０１２６】
前記被験者から取得した一定量の全血被検試料を、例えば、注入によって、前記装置上に与える。前記装置に加える血液試料の量は、充填すべきアッセイステーションの数を基にして、当業者が決定することができる。但し、一般的には、付与される血液の量は、チップ上に設けられたアッセイステーションを完全に充填するのに十分な量であると思われる。典型的には、約０．０１μｌ乃至約１０ｍｌの試料が、本発明の方法を実施するのに十分であろう。「付与（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」又は「付与された（ａｐｐｌｉｅｄ）」とは、注入、電気浸透、加圧、又は真空手段を含む慣用手段によって、試料を装置に与えることを意味する。
【０１２７】
気体及び／又は液体は、緩衝液注入口４を完全に閉鎖しながら被検試料注入口２を介して試料調製チャンバー６の中に注入するか、緩衝液注入口４が充填されるまで緩衝液注入口４を当初開放しておき、後に閉鎖して、放出されたＤＮＡ分子を含有する溶出緩衝液を追い出し、空のチャンバー１２の中に前記緩衝液を押し入れて、チャンバー１２を完全に充填させる。本発明の方法に適した気体及び／又は液体の例には、空気、二酸化炭素、窒素、アルゴン、又はオイル等のパージ液（ｐｕｒｇｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ）が含まれるが、これらに限定されない。次いで、拡散チャネル１４を通じて、チャンバー１６中のフロー促進流体（ＦＰＦ、ｆｌｏｗ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｆｌｕｉｄ）がチャンバー１２中に放出される。緩衝液（ここでは試料流体）中に含有されるＤＮＡはチャネル２０に流入し、さらに、第一の多目的チャネル３０、第一のアッセイステーションチャネル２８、及びアッセイステーション２６に流入する。
【０１２８】
デジタルカメラ３２は、アッセイステイション２６が全て緩衝液で充填される時間を検出する。隔離媒体５４は、少なくとも１つのポート４４、４６を通じて、チャネル３０と２２の中に注入されて、多目的チャネルを完全に充填する。この場合にも、隔離媒体５４は、典型的には、蝋（ｗａｘ）、オイル、相変化プラスチック、熱硬化可能なポリマー液体、又は紫外線（ＵＶ）硬化可能なポリマー液体であり得る。前記隔離媒体は、予め加熱しておくことにより、約１００℃を超える高温に保たれるか、及び／又は前記チップ１００は高温環境中に置かれる。典型的には、隔離媒体が蝋である場合、蝋のような媒質は固相状態では流動しないので、一定の温度まで蝋を予め加熱する。しかし、熱硬化可能な樹脂やＵＶ硬化可能な樹脂等の他の材料は室温で液状なので、これらの材料は予め加熱する必要がない。全てのアッセイステーションはサーマルサイクラーの中に置かれ、公知の方法に従ってＰＣＲに供される。例えば、「Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology,  Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience,  John Wiley & Sons,  New York, 1995」を参照されたい（参考文献として、本明細書に援用される）。ＤＮＡ増幅に引き続き、各アッセイステーション２６中に含有される蛍光色素（例えば、フルオレセイン）を励起させるのに必要とされる波長スペクトラムを有する励起光源によって、少なくとも前記装置の一部を照射する。照射を行うと、カメラ３２が各アッセイステーション２６に由来する蛍光発光画像を検出する。各アッセイステーション２６に位置する蛍光発光強度、蛍光画像の形状と位置、各アッセイステーション中の画像の発光強度について蛍光発光画像を解析する。
【０１２９】
前記分析装置の主要構成要素は、蛍光発光検出カメラと、例えば、〒４３０−８５８７  日本国静岡県浜松市砂山町３２５−６の浜松から市販されている関連光学機器である。前記カメラと光学系は、液体／試料を注入するための液体操作システムとともに、囲いの中に設置されている。前記分析装置は、ＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅に必要とされるサーマルサイクリングを実施するための温度調節システムも有する。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例には、試料を調製し、被検試料からＤＮＡを抽出する典型的な方法が記されており、図１−４に典型例が示してある。
【０１３１】
工程１  試料を注入する
被検試料注入口２から試料調製チャンバー６に、試料、例えば、被検試料（例えば、全血）を注入する。本工程における注入は、加圧、キャピラリーポンピング、又は真空吸引（ガラスブロック３１の下を真空状態にするのが一般的である）などを用いて行うことができる。
【０１３２】
工程２  細胞の溶解と多孔性ガラスブロック３１へのＤＮＡの結合
注入口４から試料調製チャンバー６の中に細胞溶解緩衝液を注入する。細胞溶解緩衝液は、試料中の赤血球と白血球をともに溶解し、白血球からＤＮＡ分子が放出されて、試料調製チャンバー６の中に含有される溶解緩衝液中で懸濁される。
【０１３３】
本発明が想定する細胞溶解緩衝液の一例を記す。
【０１３４】
（１）赤血球を溶解する場合（緩衝液Ａ）：
（ｉ）５００ｍｌの水の中に４．１５ｇのＮＨ４Ｃｌを溶かし、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ７．２に調整する
（ｉｉ）２．０６ｇのＴｒｉｓ塩基を１００ｍｌの水に溶かして、ｐＨ７．２に調整された別の原液を作製する
（ｉ）と（ｉｉ）を９：１の容量比で混合する
（２）白血球を溶解する場合（緩衝液Ｂ）：６Ｍ  ＧｕＳＣＮ（グアジニンイソチオシアネート）と１０ｍＭ  ＥＤＴＡ
上記緩衝液「Ａ」と「Ｂ」は、同時に添加してもよいし、「Ｂ」の前に「Ａ」を加える又は「Ａ」の前に「Ｂ」を加える、というように順次添加してもよい。
【０１３５】
本発明が想定する別の溶解緩衝液は、
（１０ｍＭ  ＴＥ、ｐＨ６．７中の）６Ｍ  ＧｕＨＣｌ（グアジニン（ｇｕａｄｉｎｉｎｅ）塩酸）を用いて、１部の１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１０部に希釈したものである。
【０１３６】
試料調製チャンバー６に注入する前に、試料を溶解緩衝液と混合してもよい。試料調製チャンバー６中の溶解された全血サンプルは（溶解緩衝液とともに）、吸収剤５による吸収作用又は真空によって、ガラスブロック３１を通じて吸引される。ガラスブロック３１は試料中に含有されているＤＮＡを誘引することができるので、溶解された試料がガラスブロック３１を通過する間に、溶解された試料中のＤＮＡ分子はガラスブロック３１の表面に結合する。
【０１３７】
溶解された試料と溶解緩衝液をガラスブロック３１中に通すための上記吸収手段及び真空手段に加えて、以下の手段、すなわち、試料と溶解緩衝液をブロック３１にポンプ注入するための陽圧加圧（シリンジポンプによって生み出された陽圧加圧等）又は電気浸透ポンピングを用いることもできる。
【０１３８】
前記ガラスブロック３１は、ガラスファイバーマット若しくはフロス、ガラス粉末、セルロースファイバーマットなどの非ガラス材、又はＤＮＡ分子を誘引する処理された表面を有する磁気粒子などの他のフィルター材と交換してもよい。前記ガラスブロック３１は、フィルター材を組み合わせて作製することも可能である。前記フィルター材上の前記ＤＮＡ誘引機構は、例えば、静電的な誘引の形態とすることができ、あるいは、前記フィルター材の上に予め固定化しておいた他の分子にＤＮＡを誘引させる形態とすることもできる。
【０１３９】
工程３  チャンバー２とガラスブロック３１の洗浄
緩衝液注入口４を通じて試料調製チャンバー６に洗浄緩衝液を注入し、吸収剤５による吸収又は真空作用によって、ガラスブロック３１の中に洗浄緩衝液を入れる。洗浄緩衝液を流すと、ガラスブロック３１に結合した前記ＤＮＡ分子は残存するが、試料調製チャンバー６とガラスブロック３１中の細胞細片やタンパク質を含むその他の物質は全て、ガラスブロック３１の下にある排水管（吸収体５自体を排水管としてもよい）に流し去られる。本洗浄工程が終了すると、続いて使用するために、単離されたＤＮＡ分子のみが集められる。
【０１４０】
本発明が想定する洗浄緩衝液の一例は、以下のとおりである。２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、混合物のｐＨを７．５に調整し、１：１．４の容積比で（例えば、１００ｍｌの緩衝液に４０ｍｌのエタノールを加える）、９５％  エタノールにより混合物を希釈する。本発明で想定している別の洗浄緩衝液は、８０％  イソプロパノールである。
【０１４１】
洗浄緩衝液をガラスブロック３１中に導入するための上記吸収手段及び真空手段に加えて、以下の手段、すなわち、洗浄緩衝液をブロック３１にポンプ注入するための陽圧加圧（シリンジポンプによって生み出されたもの等）又は電気浸透ポンピングを用いることもできる。
【０１４２】
工程４  ガラスブロック３１からのＤＮＡの溶出
ガラスブロック３１を乾燥した後、緩衝液注入口４を通じて試料調製チャンバー６の中に溶出緩衝液を注入して、試料調製チャンバー６を完全に占有する。乾燥は、自然乾燥等の方法によって、又は周囲の温度を上昇させることによって、又は熱風を吹き付けることによって行われる。典型的には、乾燥時間は、数秒から数分である。溶出緩衝液の注入は、ガラスブロック３１を通じて試料調製チャンバー６の中に緩衝液を注入することによって行うこともできる（「ボトムアップ」、すなわち、ガラスブロック３１から上方向に注入する）。
【０１４３】
前記溶出緩衝液は、誘引されたＤＮＡ分子をガラスブロック３１から放出させることができ、放出されたＤＮＡ分子は、ガラスブロック３１上にある試料調製チャンバー６中に含有された溶出緩衝液の中に懸濁された状態となる。溶出緩衝液の一例は、加圧滅菌した水である。溶出緩衝液の別の例は、１０ｍＭ  ＴＥ、ｐＨ８．４である。
【０１４４】
溶出効率を増大させるために、振動式アクチュエータ３４はダイアフラム４８を押圧して試料調製チャンバー６とガラスブロック３１の中の溶出緩衝液を攪拌し、より多くのＤＮＡ分子がガラスブロック３１から放出され、溶出緩衝液に入るようにする。
【０１４５】
本発明では、前記ガラスブロック３１を、約５分間、溶出緩衝液中に浸すことも想定されている。
【０１４６】
溶出緩衝液には、その後の分析のために他の化学物質を含有させてもよいし、化学物質を追加してもよい（このように追加される化学物質は、このような化学物質を溶出緩衝液と予め混合した後に、続いて、被検試料注入口２及び／又は緩衝液注入口４から混合物を試料調製チャンバー６に加えることによって添加することができる）。追加すべき化学物質として想定されているものには、ＤＮＡを増幅するための酵素、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）(Roche Molecular Systems, Inc., Somerville, NJ)、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎの原理に基づいてＤＮＡ分子を蛍光検出するための蛍光色素、並びにＤＮＡ増幅及び蛍光検出を行うために必要とされる他の任意の化学物質が含まれる。本工程における注入は、加圧、キャピラリーポンピング、真空吸引等によって行うことができる。
【０１４７】
図１に示されているごとく、溶出緩衝液がチャンネル１０の注入口に到達できるように、溶出緩衝液の量は、試料調製チャンバー６を完全に占有させるべきである。バルブ８が存在しているので、この操作工程中には、溶出緩衝液は試料調製チャンバー６の中に留まっている。
【０１４８】
チャンバー６の範囲外に溶出緩衝液が移動すると、引き続き分析を行うＤＮＡ分子が失われることになるので、可能な限りこれを防止するように努めなければならない。（とりわけ、吸収体５を不用意に接触させることは避けなければならない）。
【０１４９】
ＤＮＡ分子が溶出緩衝液全体に拡散する速度を増大させ、且つ緩衝液中へのＤＮＡ分子の均一な分布を促進させるために、代わりに、以下の方法を使用してもよい。すなわち、上述のように、ダイアフラム４８に対して作用するアクチュエータ３４によって、緩衝液を攪拌し；振動装置を作用させて、１以上の振動数で（とりわけ、（１）チップ全体と（２）試料調製チャンバー６の中に含有される溶出緩衝液の共鳴周波数で）基材３６（チップ）全体を揺動（ａｇｉｔａｔｅ）させ；試料調製チャンバー６中に不均一に含有されている緩衝液を加熱して、熱勾配によって誘導された緩衝液の流れ（すなわち、強制対流）を試料調製チャンバー６内部に生じさせ；試料調製チャンバー６の中に含有された緩衝液に界面活性剤を添加して、ＤＮＡ分子がガラスブロック３１から放出され易くするか、又は緩衝液中に磁気ビーズ又は線維を添加し、電磁気アクチュエータを用いて前記緩衝液を攪拌して、ガラスブロック３１からＤＮＡを放出され易くする。
【０１５０】
上記の何れの工程においても、被検試料注入口２と緩衝液注入口４は互換的に用いることが可能であるし、あるいは、本発明の方法を実施するために、単一ポート（すなわち、被検試料注入口２又は緩衝液注入口４）を用いることもできる。
【０１５１】
前記の記述は、概ね、ＰＣＲや他の増幅アッセイを対象にしたが、本発明は、これらに限定されるものではない。本発明の装置と方法は、ホモジニアスアッセイを含む数多くの様々なアッセイを実施するために利用することもできる。前記チップ上で実施することができるホモジニアスアッセイは、ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ａｐｔａｍｅｒ（核酸をベースとする）アッセイ、タンパク質／抗体をベースとするアッセイ、及び細胞をベースとするアッセイという３つの一般的なカテゴリーに分類することができる。典型的なアッセイと成分は、以下に記されている。
【０１５２】
ＤＮＡ／ＲＮＡ／アプタマー（核酸をベースとする）の実施形態では、０．１×ＴＥ緩衝液中のプライマーとプローブを、例えば、アッセイステーション２６の中に局在／配置させた後、凍結乾燥した。少なくとも１つのアッセイステーション内に少なくとも１つの反応成分を固定化するには、例えば、ビーズ、ゲル、又は膜に固定化してもよい。試料流体調製物は、（プライマーとプローブなしの）ＰＣＲ反応混合物中にＤＮＡ又はＲＮＡを放出し、１又は複数の第一の多目的チャネル３０を介して、混合物全体がアッセイステーション中に流入する。再水和されると、プライマーとプローブがＰＣＲに、あるいは、特に指定されていれる場合にはＲＴ−ＰＣＲ反応に加わる。
【０１５３】
産物の検出は、例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎによる検出、又は通常の非ＦＲＥＴ  ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ、ＥｔＢｒ検出又は他のインターカレータ（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＴＯＴＯ色素群、例えば、Ｔｏｔｏ−１、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１）を利用することによって行うことができるが、これらに限定されない。ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅のリアルタイムデータが、各サイクルの間に収集され、次いで、ベースラインから差し引かれる。
【０１５４】
典型的なＤＮＡベースのアッセイでは、増幅と検出の方法として、ＰＣＲ、等温性増幅法、例えば、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ、ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などのほか、上述のように、ＦＲＥＴ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ等を用いたリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ローリングサークル複製、及びライゲーション等を備えてもよい。
【０１５５】
本発明の教示に従って実施されることがある以下のアッセイは何れも、典型例にすぎず、限定を意図したものではない。
【０１５６】
＜ＤＮＡベースのアッセイ＞：
例１：アッセイステーション（直径約０，５−１ｍｍ）中でＳｙｂｒｇｒｅｅｎを用いたＰＣＲアッセイ、チップ厚＝約２ｍｍ
ＰＣＲミックス：１μｌの１０×Ｐｔ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ緩衝液、０．８μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各々１μｌずつの１０μＭ  ストックトリプトファン水酸化酵素、フォワードプライマー（５’−ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＴＡＴ  ＧＡＴ  ＴＡ−３’）とリバースプライマー（５’−ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＧＣＡ  Ｇ−３’）、１μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１μｌのｌ０ｎｇ／μｌ  ヒトゲノムＤＮＡ、０．５μｌの１０％  ＢＳＡ、０．５μｌの６０×ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ、１μｌの５Ｕ／μｌ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び２．２μｌの水。対照では、Ｔａｑポリメラーゼが存在しない点を除いて、上記成分と同一である。
【０１５７】
ＰＣＲ条件：ホットスタート９６℃−１分、９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−３０秒、７２℃−５分を３０サイクル、１２℃で放置。ＰＣＲは、インサイチュＰＣＲアルファモジュールを備えたＭＪ  ＰＣＲサーモサイクラー（ＰＴＣ−２００）中で行った。ＰＣＲの後に、各像につき同じ露光時間を用いて、デジタル画像を捕捉するためにコンピュータに接続されたＬｅｉｃａの蛍光顕微鏡下でチップ１００を観察した。結果は、対照反応と比較して、ヒトトリプトファン水酸化酵素遺伝子断片が明確に増幅されていることを示していた。
【０１５８】
例２：Plesiomonas shigelloides（ヒトの胃腸炎を引き起こすグラム陰性細菌）由来の２３Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ−ＦＲＥＴによる検出。参考文献：「J. P. Loh and Eric P. H. Yap, Rapid cycle Real-Time PCR, Methods and Applications, Microbiology and Food analysis, U. Reischl et. al.(Eds.), Springer, pp 161-171」。
【０１５９】
ＰＣＲミックス：ｌμｌの１０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ緩衝液、ｌμｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰ、各０．３μＬの１０μＭ  ストックフォワードプライマー（５’−ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＧＡＡ  ＣＡＣ  ＣＴＡ−３’）とリバースプライマー（５’−ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＧＧＡ  ＴＡＧ  ＣＡＣ−３’）、ｌμｌの２０μＭ  ストック蛍光プローブ（５’−ＬＣＲｅｄ６４０−ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＴＴＡ  ＡＧＧ  ＣＴＡ  ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  Ｃ−３’−リン酸）、ｌμｌの５μｇ／μｌ  ＢＳＡ、１．６μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｌμｌの１０×Ｓｙｂｒｇｒｅｅｎ、０．１μｌの５μ／μｌ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ｔａｑ、２μｌの水、及びＰ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＤＮＡを含有する１．５μｌの試料。
【０１６０】
ＰＣＲ条件ホットスタート：９５℃−１分、７０サイクルの９０℃−０秒、７０℃−４秒、７２℃−５秒。
【０１６１】
一塩基多型の検出：対立遺伝子特異的ＰＣＲ、色素標識オリゴヌクレオチドライゲーション（ＤＯＬ）、ＰＣＲ−ＯＬＡ−ＦＲＥＴ（オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ）、ＬＣＲ−ＯＬＡ−ＦＲＥＴ、対立遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎアッセイなど。
【０１６２】
例３：色素標識オリゴヌクレオチドライゲーション（ＤＯＬ、ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）アッセイとは、ＤＮＡ配列を増幅するためにＰＣＲを使用し、次いで、ＦＲＥＴとともにＯＬＡ（すなわち、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ）を用いてポストＰＣＲ  ＳＮＰ検出（ＰＣＲ−ＯＬＡ−ＦＲＥＴ）を行うアッセイである。ＯＬＡアッセイでは、ＳＮＰを検出するために３つのプローブを用いる。１つの共通なドナープローブはＦＡＭ（５−カルボキシ−フルオレセイン）で標識され、他方の対立遺伝子特異的なアクセプタープローブはＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）又はＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ８，Ｎ８，−テトラメチル−６−カルボキシローダミン）で標識される。アクセプタープローブの５’に位置する一致したヌクレオチドと一致していないヌクレオチドを識別するために、耐熱性リガーゼが用いられた。参考文献：「Ｘ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｍａｙ；８（５）：５４９−５６」。
【０１６３】
β−ｏ−サラセミアの原因遺伝子であるβ−グロビン遺伝子のコドン３９Ｃ／Ｔ変異を検出するためのＤＯＬアッセイ。アッセイステーション中でプライマーとプローブを凍結乾燥し、上記の様々なチャネルを介して、試料調製部分から得られたＤＮＡを前記アッセイステーション中に注入する。
【０１６４】
ＰＣＲ−ライゲーションミックス：２μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｐｈ  ８．０、２μｌの６５ｍＭ  ＭｇＣ１２、２μｌの０．５Ｍ  ＫＣ１、２μｌの１０ｍＭ  ＮＡＤ、２μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、ｌμｌの各  ５０μＭ  ストックＰＣＲフォワードプライマー（５’−ＣＡＴ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＧＧＧ−３’）とリバースプライマー（５’−ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＧＧ−３’）、ｌμｌの４μＭ  ＦＡＭ標識ドナープローブ（５’−ＦＡＭ−ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＣＣ−３’）、ｌμｌの４μＭ  Ｒｏｘ標識アクセプタープローブ（５’−リン酸−ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＡＧ  Ｔ−３’−ＲＯＸ）、１μｌの５μＭ  ＴＡＭＲＡ標識アクセプタープローブ（５’リン酸−ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＧＡＧ  ＴＣ−３’−ＴＡＭＲＡ）、３０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、０．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ−ＦＳ  ポリメラーゼ、１．５ユニットのＡｍｐｌｉｇａｓｅ  ＤＮＡリガーゼ、及び水（２０μｌになるように）。
【０１６５】
ＰＣＲライゲーション条件：変性９５℃−２分、９５℃−１５秒、１．５分をかけて徐々に６５℃まで温度を下げて６５℃−３０秒を１０サイクル、次いで、９５℃−１５秒、６５℃−３０秒を３０サイクル、９５℃−１５秒、４５℃−１．５分で２５サイクルを用いてライゲーション。
【０１６６】
＜ＲＮＡベースのアッセイ＞：
例１：増幅と検出：ＩＩ型デングウイルスのＲＴ−ＰＣＲ−ＦＲＥＴによる検出。参考文献：「Ｂ．  Ｈ  Ｔａｎ，  Ｅ．  Ｓｅｅ，  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｌｉｍ  ａｎｄ  Ｅｒｉｃ  Ｐ．  Ｈ．  Ｙａｐ，  Ｒａｐｉｄ  ｃｙｃｌｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｕ．  Ｒｅｉｓｃｈｌ  ｅｔ．  ａｌ．  （Ｅｄｓ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ｐｐ  ２４１−２５１」。
【０１６７】
ＲＴ−ＰＣＲミックス：２μｌの５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、ｌμｌの３ｍＭ  ｄＮＴＰ、ｌμｌの５μｇ／μｌ  ＢＳＡ、１μｌの２５ｍＭ  ＭｎＯＡｃ、各０．５μｌの９μＭ  ストックフォワードプライマー（５’；−ＣＣＴ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＡＡＴ  ＣＧＧ  Ｇ−３’）とリバースプライマー（５’−ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＡＴＡ  Ｇ−３’）、及び０．５μｌの４μＭ  ストックプローブ（５’−ＬＣＲｅｄ６４０−ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＧＣ−３’−リン酸）、０．５μｌの２０×ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ、０．５μｌの５ｕ／μｌ  Ｔｔｈポリメラーゼ、１．５μｌの水、１０μｌの最終容量となるように添加したウイルスＲＮＡ。
【０１６８】
ＲＴ−ＰＣＲの条件：ＲＴ−５０℃で１５分、変性９５℃−５分、９５℃−０秒と５５℃−７秒を８サイクル、８７℃−０秒、５５℃−７秒を５０サイクル。
【０１６９】
＜アプタマーベースのアッセイ＞：
アプタマーとは、標的タンパク質、リガンド（脂質、炭水化物、代謝物など）と相互作用する合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はペプチド配列（元の状態のままの場合もあり、あるいは修飾が施されている場合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、チオリン酸化されたＤＮＡ等）もある）である。例えば、色素（例えば、ＴＡＭＲＡ）で標識されたアプタマーを合成し、アッセイチャンバー２６又は複数のチャンバー中に点在させ、凍結乾燥することができる。次いで、上記の方法を用いて、アッセイステーション中に標的タンパク質／抗原を導入することができる。次いで、蛍光偏光を用いて、結合対のうちの１つが蛍光色素で標識されていれば、アプタマー／タンパク質の結合をスクリーニングすることができる。
【０１７０】
タンパク質／抗体ベースのアッセイ
病原体（例えば、オープンサンドイッチＥＬＩＳＡ）、タンパク質が豊富な相互作用、薬物スクリーニングを検出するために、本発明の教示に従って、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）などのタンパク質／抗体アッセイを用いることができる。
【０１７１】
これらの典型的な実施形態では、抗体又はタンパク質は、ＦＲＥＴ色素の対、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）タンパク質、蛍光色素−消光色素の組合せ、β−ｇａｌ再編成アッセイタンパク質断片で標識し、１×ＰＢＳ中に溶解させ、スポッティングし、アッセイステーション中で凍結乾燥させることができる。試料流体調製物は、様々な濃度（例えば、０．０５％  Ｔｗ−２０や１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）の界面活性剤（例えば，Ｔｗ−２０又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を加えた又は加えないＰＢＳ又はＴＢＳ緩衝液中にタンパク質又はその他の抗原を放出し、これらは、上記のチャネルを介してアッセイステーションに流入する。再水和されると、前記抗体又はタンパク質対は、ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴ、蛍光消光、又はβ−ｇａｌ再編成に加わり、蛍光、比色分析、又は高感度化学発光（ＥＣＬ）シグナルを生じることができる。
【０１７２】
例１：抗体−抗原蛍光消光アッセイ：抗体をＯＧ−５１４（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ  ５１４カルボン酸、スクシンイミジルエステル）で標識し、抗原（ペプチド、タンパク質、細胞全体、炭水化物、アプタマー等）をＱＳＹ−７（ＱＳＹ−７カルボン酸、サクシニミジルエステル）で標識した。蛍光消光は、ＯＧ−５１４蛍光の検出を阻止又は抑制した。標識された抗体−抗原複合体をアッセイステーション中で凍結乾燥した。試料流体調製物は、様々な濃度（例えば、０．０５％  Ｔｗ−２０及び１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）の界面活性剤（例えば，Ｔｗ−２０又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を加えた又は加えないＰＢＳ又はＴＢＳ中にタンパク質又はその他の抗原を放出し、チャネルを介してアッセイステーションに流入する。前記アッセイステーション中で再水和されると、前記標識された抗体−抗原複合体は、未標識抗原との競合反応に加わる。未標識抗原との競合によって、ＯＧ−５１４標識抗体（その蛍光は、約５２８−５３０ｎｍで検出される）が放出される。
【０１７３】
例２：ダブルサンドイッチ抗体ＦＲＥＴ
ＣＤ８−α鎖の２つの非競合的エピトープに対する２つのモノクローナル抗体を用いた。一方のモノクローナル抗体は色素フィコエリトリン（ＰＥ）で標識し、他方のモノクローナル抗体はアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識した。
【０１７４】
励起光をＰＥに当てるとＰＲＥＴが観察されたが、その効率は１０％にすぎなかった。参考文献：「Batard P., et. al., Cytometry 2002 Jun 1 ; 48 (2): 97-105」。スクアライン色素（Ｓｑ６３５及びＳｑ６６０）などの近赤外ＦＲＥＴ色素対を用いることによって、ＦＲＥＴの効率が向上する場合がある。参考文献：Oswald B. et al.,Analytical Biochemistry 280,272-277(2000)。
【０１７５】
例３：架橋抗原によって誘導された組換え抗体軽鎖と重鎖の再会合（オープンサンドイッチアッセイ）。
【０１７６】
組換え抗体抗ＨＥＬ（ニワトリ卵リゾチーム）断片の重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）を、それぞれ、フルオレセインのスクシンイミドエステルとローダミン−Ｘで標識した。ＶＨとＶＬ相互の親和性が弱いために会合とＦＲＥＴは妨げられるが、例えば約４℃の低温下且つ抗原の存在下では、ＶＨとＶＬの相互作用は安定化されるため、ＦＲＥＴが生じた。４９０ｎｍで励起すると、１−１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度でＨＥＬ（抗原）の量を増加させながら混合物に添加したときに、５２０ｎｍの蛍光が著しく減少し、６０５ｎｍの蛍光が増加するのが観察された。参考文献：Ueda H et al.,Biotechniques 1999 Oct;27(4):738-42。
【０１７７】
上記方法は、以下のように改変して用いることもできる。フルオレセインやローダミン等の蛍光色素による標識に代えて、ＶＨ−Ｒｌｕｃ（Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）とVL-EYFP(Enhance Yellow fluorescence Protein)のキメラタンパク質を構築する。Ｒｌｕｃの基質セレンテラジンの存在下では、光（４７５ｎｍ）の放出を伴う化学発光が観察されるが、ＢＲＥＴ（生物発光蛍光エネルギー転移）は観察されない。しかし、低温下（例えば、約４℃）且つ抗原（ＨＥＬ）の存在下では、ＶＨとＶＬの相互作用が安定化されるために、ＢＲＥＴが起こり、ＥＹＦＰの蛍光が５２５ｎｍで検出される。参考文献：Arai R, et. al.,Anal Biochem.2001 Feb 1;289(1):77-81。
【０１７８】
前記第一の方法のさらに別の改変法は、以下のとおりである。フルオレセインやローダミン等の蛍光色素で標識する代わりに、チオレドキシン（Ｔｒｘ）融合タンパク質タンパク質、Ｔｒｘ−ＶＨ−ＥＢＦＰ(enhance blue fluorescent protein)とＴｒｘ−ＶＬ−ＥＧＦＰ(enhance green fluorescence protein)を構築する。Ｔｒｘは、発現されたタンパク質の溶解度を増加させた。抗原ＨＥＬの存在下で、ＦＲＥＴが生じた。参考文献：Arai R., et.al.,Protein Eng. 2000 May;13(5)369-76。
本発明の装置と方法は、プロテオミクス研究／アッセイを構築するために使用することもできる。タンパク質−タンパク質相互作用は、細胞プロセス（例えば、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子の二量体化による転写の制御、例えば、リガンドが結合したときに細胞シグナル伝達を生じる上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体の二量体化）を制御するための重要な機序である。
【０１７９】
前記装置を用いると、候補タンパク質、すなわち改変型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）との融合タンパク質として発現される「プレイ（ｐｒｅｙ）」は、例えば、アッセイステーションの中で凍結乾燥されるか、あるいは、アッセイステーション内のハイドロゲル中に埋め込むことができる。標的、すなわち、改変型青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）との融合タンパク質として発現される「ベイト（ｂａｉｔ）」は、上記チャネルを通じてアッセイステーション中に導入される。タンパク質−タンパク質相互作用は、本分野において公知であるように、例えば、ＦＲＥＴ活性又は他の検出法を活性化する。
【０１８０】
細胞をベースとしたアッセイ：
本発明は、薬物のスクリーニングや毒性学的アッセイ用途に用いることもできる。当業者に公知であるように、ＦＲＥＴやその他の検出方法を基礎とした多数の薬物スクリーニング法を用いることができる。
【０１８１】
例えば、本発明の教示に従って、毒物学的アッセイを実施することができる。アッセイステーションには、コンビナトリアルケミカル、又はペプチドライブラリー、アプタマーライブラリー等から得られた合成小分子が予め搭載される。アッセイステーションには、所定の細胞種（チップの試料調製部分から（但し、このようにして与えられている場合）、又は組織培養物、増殖培地から回収されたものであり得る）が導かれる。生死を判定する蛍光色素を与えることもできる。数日後、顕微鏡を用いた観察によって、予め搭載された前記供与成分に曝露された細胞が死滅しているのか、なお生存しているのか、あるいは、アッセイステーション中に加えた予め搭載された前記アッセイ成分によって他の何らかの影響を受けているのかが明らかとなるであろう。
【０１８２】
薬物スクリーニングの場合、検査すべき薬物の標的（例えば、異なる蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ）が融合されたマルチサブユニット受容体、ヘテロ二量体化又はホモ二量体化するタンパク質パートナー）を発現するように、細胞に改変操作を施すことができる。合成リガンドの結合、小分子、又は抗体によって、受容体若しくはタンパク質が自己会合若しくは自己架橋され又はそれらのサブユニットに会合若しくは架橋が引き起こされると、前記蛍光タンパク質対が集結され、例えば、ＦＲＥＴが起こり、又はβ−ｇａｌ再編成が生じ得る。逆に、合成リガンド、小分子、アプタマー等によってホモ二量体化若しくはヘテロ二量体化又はマルチサブユニットタンパク質複合体が崩壊すると、ＦＲＥＴシグナルの減少が引き起こされ得る。
【０１８３】
前記小分子は、化学構造に応じて、細胞中に拡散することができる。このように、標的タンパク質は表面タンパク質である必要はないが、例えば、グルココルチコイドの存在下でホモ二量体化するグルココルチコイド受容体等の細胞内タンパク質又は受容体とすることができる。
【０１８４】
前記小分子、リガンド、アプタマー等は、コンビケムライブラリー、ペプチド合成機、ファージライブラリー等から得ることができ、まず、アッセイステーション中にスポッティングした後、凍結乾燥される。次いで、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）対に融合された薬物標的タンパク質により改変加工された細胞が、上記のように、細胞培地中で、チャネルを介してアッセイステーション２６の中に導入される。約３７℃で細胞を薬物候補とともにインキュベートすると、例えば、ＦＲＥＴをもたらすタンパク質−タンパク質相互作用が引き起こされることがあり、あるいは、タンパク質の相互作用が破壊されるとＦＲＥＴが減少するであろう。
【０１８５】
本発明の薬物スクリーニング用途では、細胞をベースとしたアッセイ及び／又はタンパク質アッセイを用いることができる。このようなスクリーニング用途では、野生型細胞集団のうち少なくとも１つと組換え分子を発現している細胞集団のうち少なくとも１つとが、本発明の教示に従って、例えば、少なくとも１つの前記アッセイステーション中に導入される。
【０１８６】
ＰＣＲ用の蛍光プローブを２つ用いるＦＲＥＴアッセイの他に、ＰＣＲ−Ｔａｑｍａｎアッセイは蛍光消光を利用するが、この場合には、プローブが消光物質とドナーの両方で標識されている。増幅されるＤＮＡ断片にハイブリダイズされると、前記プライマーから下流に広がるＴａｑポリメラーゼの５’から３’方向へのエキソヌクレアーゼ活性によって、前記プローブは消化される。プローブが消化されると、ドナーが消光物質から分離されることによって、ドナー色素から生じる蛍光シグナルの増加が検出可能となる。等温性増幅アッセイでは、比色分析による検出をβ−ｇａｌ再編成アッセイと組み合わせて使用できる可能性がある。使用可能なその他の典型的アッセイ手法には、蛍光偏光が含まれる。この場合、例えば、ＰＣＲ産物中に小さな蛍光ｄＮＴＰが取り込まれ、その結果、回転が低下して、ＰＣＲ混合物と生成され得る産物とが入ったアッセイステーション２６に当てられた光の偏光解消に対する効果が減少し、引き続き、検出が行われる。
【０１８７】
以上、具体的な実施形態を参照しながら本発明を説明してきた。当業者であれば、前述の記載に照らして、別の実施形態に容易に想到することができるであろう。添付の特許請求の範囲とそれらの完全な範囲の均等物以外に、本発明を限定することを意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、本発明の教示に係る典型的な試料調製一体型（ＳＰＩ、sample prepartaion integrated）チップの上方表面の平面図である。
【図２】図２は、図１の典型的チップの側面図である。
【図３】図３は、本発明の別の実施形態に係る別の試料調製一体型（ＳＰＩ）チップの上方表面の平面図である。
【図４】図４は、図３の典型的チップの側面図である。
【図５−１】図５Ａは、本発明の教示に係る典型的なマイクロ流体チップの平面図である。図５Ｂは、別の典型的なマイクロ流体チップの平面図である。図５Ｃは、本発明の教示に係る典型的なマイクロ流体チップであって、その中に試料流体と隔離媒体が配置されたチップのさらに別の図である。
【図５−２】図５Ｄは、試料流体と隔離媒体と着脱可能な吸収剤を有する典型的なマイクロ流体チップの別の実施形態である。図５Ｅは、隔離媒体がその中に配置され、複数のアッセイステーション中の密封試料流体及び過剰な試料流体を有する吸収剤が除去された図５Ｄのチップを図示している。
【図６−１】図６Ａ〜Ｃは、本発明の教示に基づいて作製され、別の密封配置を与えるマイクロ流体チップの別の典型的な実施形態を示している。
【図６−２】図６Ｄ〜Ｅは、本発明の教示に基づいて作製され、別の密封配置を与えるマイクロ流体チップの別の典型的な実施形態を示している。
【図６−３】図６Ｆは、本発明の別の側面に係る別の典型的な密封配置を示している。図６Ｇは、本発明の教示に基づいて作製された別の典型的なマイクロ流体チップを図示している。
【図７Ａ】図７Ａ−１〜図７Ａ−４は、試料流体を用いて複数のアッセイステーションを充填する典型的な順序を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂ−１〜図７Ｂ−４は、隔離媒体による試料流体の置換と複数のアッセイステーションの一方側の密封を示している。
【図７Ｃ】図７Ｃ−１〜図７Ｃ−４は、隔離媒体による複数のアッセイステーションの別側面の密封を示している。
【図７Ｄ】図７Ｄ−１〜２は、複数のアッセイステーションを充填し密封する別の典型的な順序を示している。
【図８】図８は、本発明の教示に係る典型的な分析装置システムを示している。
【図９】図９は、本発明に従って用いることができる別の分析装置システムを示している。
【図１０】図１０は、本発明に従って用いることができる別の典型的な配置を図示している。
【図１１】図１１Ａは、典型的な試料流体調製領域を示している。図１１Ｂは、図１１Ａの試料流体調製領域の上方平面図である。
【図１２】図１２は、典型的なフロー促進構造を有するアッセイステーションの上面図を図示している。
【図１３】図１３は、典型的なアッセイステーション構造の典型的な流体排出チャネルを示している。
【図１４】図１４は、ある実施形態に従って設けられることがある典型的な勾配部を示している。
【図１５】図１５は、アッセイステーションの別の典型的な実施形態を示している。
【図１６】図１６は、本発明の教示に係るアッセイステーションのさらに別の典型的な実施形態を図示している。
【図１７】図１７は、本発明の教示に係るチャネルの典型的構造の側断面図である。
【図１８】図１８は、本発明の教示に係る複数試料の検査を行うためのチャネルの別の典型的実施形態である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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