(57)【要約】本発明は、エナンチオマー富化された有機化合物の製造方法に関する。特に本発明は、共役酵素的反応系において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが有機化合物の製造のための１種の酵素により消費され、かつＮＡＤ（Ｐ）Ｈが同時に第２の酵素系により再生される酵素的操作方法に関する。また、本発明により前記のように機能する反応系及び菌体触媒を提案する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エナンチオマー富化された有機化合物を共役酵素反応系において製造するにあたり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費する有機基質の第１の酵素的変換と、Ｌ−リンゴ酸を酸化して酸化ピルビン酸及びＣＯ２とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第２の酵素的変換におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生よりなる方法であって、第２の酵素的変換から形成したピルビン酸を、第１の酵素的変換において基質として利用しないことを特徴とする方法。
【請求項２】
第１の酵素的変換を、アルコールデヒドロゲナーゼ又はアミノ酸デヒドロゲナーゼを使用して進行させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルコールデヒドロゲナーゼとして、ラクトバチルス・ケフィア又はロドコッカス・エリスロポリス由来のＡＤＨを使用し、かつアミノ酸デヒドロゲナーゼとして、ロイシンデヒドロゲナーゼ又はフェニルアラニンデヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｅ．コリ、特にＥ．コリＫ１２由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする請求項１から３までの何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
反応を、水性の単相又は多相の溶剤混合物中で実施することを特徴する請求項１から４までの何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
反応の間の温度が、２０〜４０℃であることを特徴とする請求項１から５までの何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
反応の間のｐＨが、６〜９であることを特徴とする請求項１から６までの何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
エナンチオマー富化された有機化合物を製造するにあたり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費する有機基質の第１の酵素的変換と、Ｌ−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びＣＯ２とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第２の酵素的変換におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生よりなる共役酵素反応系であって、第２の酵素的変換から形成したピルビン酸が、第１の酵素的変換において基質として利用されないことを特徴とする反応系。
【請求項９】
クローニングされた有機基質の変換のための第１の酵素の遺伝子と、クローニングされたリンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子とを有し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費する第１の酵素的変換においてエナンチオマー富化された有機化合物の製造を可能にし、かつＬ−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びＣＯ２とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第２の酵素的変換においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生を可能にする菌体触媒であって、第２の酵素的変換から形成したピルビン酸を第１の酵素的変換において基質として利用されない菌体触媒。
【請求項１０】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子と、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費を伴う有機基質の変換のための酵素の遺伝子とが存在する遺伝子構築物を含有するプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エナンチオマー富化された有機化合物の製造方法に関する。特に本発明は、共役酵素反応系において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが有機化合物製造のための１種の酵素により消費され、かつＮＡＤ（Ｐ）Ｈが同時に第２の酵素系により再生される酵素的操作方法に関する。また、本発明により前記のように機能する反応系、及び有利な菌体触媒又は好適なプラスミドを提案する。
【０００２】
光学活性有機化合物、例えばアルコール又はアミノ酸を生物触媒経路により製造することは、ますます重要性を増してきている。とりわけ、２種のデヒドロゲナーゼを共役させて使用すると共に補因子を再生させることは、これらの化合物、特にアルコール又はアミノ酸の大規模な工業的合成のための経路として明らかになっている（ＤＥ１９７５３３５０号、ＥＰ１１８７５０号）。
【０００３】
【化１】
2005537017.tif 000002
【０００４】
トリメチルピルビン酸の還元的アミノ化においてカンジダ・ボイジニ由来のＮＡＤ依存性ギ酸デヒドロゲナーゼを用いてＮＡＤＨを現場で再生させ、Ｌ−ｔ−ロイシンを得る（ボンマリウスその他著、テトラへドロン  アシンメトリー  １９９５年、６号、２８５１〜２８８８頁（Bommarius et al. Tetrahedron Asymmetry 1995,6,2851-2888）。
【０００５】
水性媒体中で効率的に利用される生物触媒は更に、これらの触媒特性及び効率の他に、多数の合成金属含有触媒と比較すると、金属含有出発物質、特に重金属を含有し、かつ従って毒性の物質の使用を省くことができるという利点を有している。不斉還元の場合における高価かつ更に危険な還元剤、例えばボランの使用をも省くことができる。
【０００６】
今までのところ、これらの系において首尾良く利用されるＦＤＨ、例えばカンジダ・ボイジニ由来のものは、この酵素分類の４〜８Ｕ／ｍｇという比活性が極めて低いという欠点を有している。このことにより高価な酵素を大量に使用することが必要となると共に、このように設計される方法を工業的規模で経済的側面において有利に実施するのが望ましい場合であっても、再循環は装置の観点から困難である。
【０００７】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）は、“リンゴ酸酵素”と呼ばれ、リンゴ酸からピルビン酸への酸化的脱炭酸を触媒する。種々の生物由来の多くのリンゴ酸デヒドロゲナーゼは公知であり、例えば特に高等動物、植物又は微生物由来のものである。４つの類型のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ間で区別がなされ、これらは酵素分類Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７〜１．１．１．４０に分類されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ）。ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの類型に応じて補因子として要求される。
【０００８】
Ｌ−リンゴ酸からピルビン酸への酸化的脱炭酸反応の不可逆性に基づいて、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用はまた、上記の系において好都合な補因子の再生に関して好適である。ＮＡＤについての再生のためのリンゴ酸デヒドロゲナーゼの使用は、例えばスイエその他による１９９２年からの研究（Ｓ−Ｉ．スイエ、Ｍ．カワゴエ、Ｓ．イヌタ著、カナダ工業化学誌  １９９２年、７０号、３０６〜３１２頁（S.-I. Suye,M.Kawagoe,S.Inuta,Can.J.Chem.Eng.1992,70,306-312）に記載されている。ここでは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼによるＮＡＤＨの再生は、ＮＡＤＨが消費されるアラニンデヒドロゲナーゼによるピルビン酸の還元的アミノ化のために使用されている。ピルビン酸はＬ−リンゴ酸から酸化的脱炭酸により形成され、かつ直ちに次の段階においてアラニンデヒドロゲナーゼにより更に消費される。従って反応液中におけるピルビン酸の濃縮は回避され、このことはまたピルビン酸の化学量論的範囲での量の存在により生ずる酵素のいかなる阻害の問題を解決する。それにもかかわらず、記載されている系は専らアラニンの製造に限定される（またＳ．−Ｉ．スイエ著、発酵生物工学の最近の研究と発展  １９９８年、１号、５５〜６４頁（S.-I. Suye,Recent Res.Devel.Ferment.Bioeng.1998,1,55-64）を参照のこと）。
【０００９】
興味深いことには、技術的に高度な可能性があるにもかかわらず、スイエの研究グループによるこれらの研究を別にして、ケトンの還元又はケト酸の還元的アミノ化の間に酸化された補因子ＮＡＤ＋を再生させるために“リンゴ酸デヒドロゲナーゼ”を使用する更なる研究は記載されていない。
【００１０】
従って本発明の課題は、１種の物質の製造に限定されることがない、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを使用する、上記したように共役酵素反応系により得られるキラル有機化合物、例えばアミノ酸又はアルコールの更なる製造方法を提供することであった。特に、本方法を工業的規模で、特に経済的側面及び環境的側面において有利に利用することが望ましい。
【００１１】
前記課題は、本発明の請求項１の特徴を有する方法により解決される。請求項２から７は、好ましい実施態様に関する。請求項８及び９は、本発明にかかる反応系又は相応して機能する菌体触媒を保護する。請求項１０は、好ましいプラスミドを保護する。
【００１２】
エナンチオマー富化された有機化合物を共役酵素反応系において製造するにあたり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費する有機物質の第１の酵素的変換と、Ｌ−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びＣＯ２とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第２の酵素的変換におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生よりなる方法において、第２の酵素的変換から形成したピルビン酸が第１の酵素的変換において基質として利用されない結果として、前記課題が全く予期されず、但し代わりに実に有利な方法により解決される。例えば、アミノ酸デヒドロゲナーゼと、脱炭酸作用を有するリンゴ酸デヒドロゲナーゼとを一緒に同時に使用することが、交差反応を起こすことなく問題無く可能であるということは、全く驚くべきこととみなすことができる。更に、一次反応の基質及び生成物のリンゴ酸デヒドロゲナーゼに対する阻害作用は見られず、その逆も同様である。特に、副生物として形成されたピルビン酸が、同時に利用されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ自体又はアルコールデヒドロゲナーゼ又はアミノ酸デヒドロゲナーゼに対する阻害作用を有しないことは、有望な特性である。
【００１３】
エナンチオマー富化されたアルコール又はアミノ酸は、有利には本発明にかかる方法を用いて製造される。この場合には、広く知られている安価なアルコールデヒドロゲナーゼ又はアミノ酸デヒドロゲナーゼが、第１の酵素的変換のための酵素として考えられる。原則的に当業者は、基質のスペクトル、当該酵素の安定性及び変換速度といった性質によりこれらを自由に選択する。この起源の公知の酵素は、Ｋ．ドローズ、Ｈ．ヴァルトマン（編）、有機合成における酵素触媒  第３巻、ワイリーＶＣＨ社、ヴァインハイム、２００２年、第１５章（K.Drauz,H.Waldmann(eds.),Enzyme Catalysis in Organic Synthesis,volume III,Wiley-VCH,Weinheim,2002,chapter 15）に記載されている。生物ロドコッカス・エリスロポリス由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓ−ＡＤＨ）又はラクトバチルス・ケフィア（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｒ−ＡＤＨ）（Ｒ．エリスロポリス由来のＡＤＨ：Ｊ．ピータース、Ｔ．ツェリンスキー、Ｍ．−Ｒ．クーラ著、ロドコッカス・エリスロポリスから単離された新規カルボニル還元酵素の精製と特性、生物工学誌  １９９４年、３３号、２８３〜２９２頁（J.Peters,T.Zelinski,M.-R.Kula,Purification and characterizarion of a novel carbonyl reductase silated from Rhodococcus erythropolis,J.Biotechnol.1994,33,283-292））（ラクトバチルス・ケフィア由来のＡＤＨ：Ｃ．Ｗ．ブラッドショウ、Ｗ．フンメル、Ｃ．−Ｈ．ウォン著、ラクトバチルス・ケフィアのアルコールデヒドロゲナーゼ：合成のための有用な触媒、有機化学誌  １９９２年、５７号、１５３２〜１５３６頁（C.W.Bradshaw,W.Hummel,C.-H.Wong, Lactobacillus kefir Alcohol Dehydrogenase: A Useful Catalyst for Synthesis,J.Org.Chem.1992.57,1532-1536））が、特に有利である。好ましいアミノ酸デヒドロゲナーゼに関しては、当業者は、例えばロイシンデヒドロゲナーゼ又はフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（Ａ．ボンマリウス：有機合成における酵素触媒作用（編：Ｋ．ドローズ、Ｈ．ヴァルトマン）第３巻、ワイリーＶＣＨ社、ヴァインハイム、２００２年、第１５．３章（A.Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis（eds.: K.Drauz,H.Waldmann）,volume III,Wiley-VCH,Weinheim,2002,chapter 15.3）を参照とする。
【００１４】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼはまた、当業者に知られている（上記文献又はデュッセルドルフ大学のＳ．ナムニ（S.Naamnieh,University of Duesseldorf）による学位論文、調製項目を参照のこと）。ここではまた、当業者は、その目的のために最も効率的に利用できるデヒドロゲナーゼを選択する。原則的には、利用する他の酵素の反応過程についての障害を引き起こさない程度にＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生させるリンゴ酸デヒドロゲナーゼである。本文中では、Ｅ．コリＫ１２由来の公知のリンゴ酸デヒドロゲナーゼが好ましい。遺伝子の単離及びクローニングは、デュッセルドルフ大学のＳ．ナムニの学位論文に記載されている、調製項目７０頁以下参照のこと。
【００１５】
原則的に、本発明にかかる方法は純水溶液中で実施できる。しかしながら、例えば水溶性が不十分な基質に関しては、反応を最適化するために、水溶性有機溶剤を任意の所望の割合で水溶液に添加することも可能である。考えられるそのような溶剤は、特にエチレングリコール、ＤＭＥ又はグリセロールである。しかしながら、水相を有する多相系、特に２相系は、更にまた本発明にかかる方法のための溶剤混合物として機能できる。水溶性ではない所定の溶剤の使用については、既に以下に証明済みである（ＤＥ１０２３３１０７号）。この文献でのこの点に関する記載はまた、本明細書においても適宜当てはまるものである。
【００１６】
原則的に、当業者は反応の間の温度を自由に選択する。当業者は、好ましくは生成物をできる限り高い収率で、できる限り高い純度で、できる限り短時間で得ようとする。更に、利用する酵素は利用温度下で十分に安定であり、かつ反応はできる限り高いエナンチオ選択性を伴って進行することが望ましい。好熱性生物由来の酵素の使用に関しては、全般的に１００℃の温度が反応の温度範囲の上限を示しうる。−１５℃は、確かに水系の下限として好適である。有利には１０〜６０℃、特に好ましくは２０〜４０℃の温度間隔が設定されることが望ましい。
【００１７】
反応の間のｐＨは、当業者により酵素の安定性及び変換速度に基づいて決定され、かつ本発明にかかる方法のために適宜調節される。Ｅ．コリ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼについては、最適ｐＨが＞１０であることが判明している。一般的に、酵素に好ましいｐＨ５〜１１の範囲が選択される。好ましくは５．５〜１０．０、特に６．０〜９．０のｐＨ範囲であってよい。
【００１８】
本発明はまた、エナンチオマー富化された有機化合物を製造するにあたり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費する有機基質の第１の酵素的変換と、Ｌ−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びＣＯ２とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第２の酵素的変換におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生よりなる共役酵素反応系であって、第２の酵素的変換から形成したピルビン酸を、第１の酵素的変換において基質として利用しない反応系を提供する。本発明にかかる方法に関して既に挙げたものと同様の有利かつ好ましい実施態様は、原則的に本反応系に当てはまる。本反応系は、有利には例えば回分操作及び連続操作の両方で操作できる、攪拌槽、攪拌槽のカスケード又は膜反応器中で利用する。本発明に関しては、膜反応器は、触媒が該反応器中に封入されている一方で、低分子量の物質が該反応器に供給されるか又は該反応器から出ることができる任意の反応容器を意味するとして理解される。ここでは膜は反応領域中に直接的に組み込まれていてよく、又はその外部で別個の濾過モジュール内に導入してよく、その際には反応溶液は該濾過モジュールを連続的に又は断続的に通過して流れ、かつ滞留生成物は反応器中を再循環する。好適な実施態様は、特にＷＯ９８／２２４１５号及びヴァンドレイその他著、１９９８年の年鑑、プロセス工学と化学工学、ＶＤＩ社、１５１頁以下参照（Wandrey et al.in Yearbook 1998,Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI p.151）；ヴァンドレイその他著、有機金属化合物を用いる応用均一系触媒作用、第２巻、ＶＣＨ社、１９９６年、８３２頁以下参照（Wandrey et al. in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds,vol.2,VCH 1996,p. 832）；クラーグルその他著、応用化学  １９９６年、６号、６８４頁以下参照（Kragl et al.,Angew.Chem.1996,6,684）に記載されている。バッチ操作及び半連続操作の他に、ここではこの装置において可能な連続操作を十字流濾過様式（図３）又は全量濾過（図２）において所望されるように実施できる。両方の変法は、原則的に先行技術に記載されている（生物分離のための工学プロセス、編：Ｌ．Ｒ．ヴェターレイ、ハインマン、１９９４年、１３５〜１６５頁（Engineering Processes for Bioseparations,ed.:L.R.Weatherley,Heinemann,1994,135-165）；ヴァンドレイその他著、テトラヘドロン  アシンメトリー  １９９９年、１０号、９２３〜９２８頁（Wandrey et al.,Tetrahedron Asymmetry 1999,10,923-928））。
【００１９】
本発明はまた、クローニングされた有機基質の変換のための第１の酵素の遺伝子と、クローニングされたリンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子とを有し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費する第１の酵素的変換においてエナンチオマー富化された有機化合物の製造を可能にし、かつＬ−リンゴ酸を酸化してピルビン酸及びＣＯ２とするリンゴ酸デヒドロゲナーゼによる第２の酵素的変換においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生を可能にする菌体触媒であって、第２の酵素的変換から形成したピルビン酸が、第１の酵素的変換において基質として利用されない菌体触媒を提供する。本発明にかかる菌体触媒は、好ましくはアミノ酸デヒドロゲナーゼ活性又はアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素（ポリペプチド）と、特に上記の生物に由来するリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素とを有する。使用できる微生物は、原則的にこの目的のために当業者にとって考えられる全種の生物、例えば酵母、例えばハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチアの種、又はサッカロセミス・セレビシエ、原核生物、例えばＥ．コリ又はバチルス・ズブチルス若しくは真核生物、例えば哺乳動物細胞又は昆虫細胞である。この目的のためには、好ましくはＥ．コリ株を使用するのが望ましい。以下のものが極めて特に好ましい：Ｅ．コリＸＬ１  Ｂｌｕｅ、ＮＭ５２２、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＲＲ１、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０−又はＨＢ１０１。ＤＥ１０１５５９２８号に挙げられているものと同様の生物は、好ましくは宿主生物として利用される。そのような生物の利点は、両方のポリペプチド系が同時に発現することであり、このことは本発明にかかる反応のために培養されるべき組換え生物が１種のみであることを意味する。ポリペプチドの発現をこれらの変換速度に関して調整させるために、相応のコーディング核酸配列を種々のコピー数を有する種々のプラスミドに提供してよく、及び／又は種々の効力のプロモーターを核酸配列の種々の強度の発現のために使用してもよい。そのように調整された酵素系においては、有利には中間化合物の蓄積が生ずることがなく、かつ当該反応は最適な総括速度で進行できる。しかしながら、このことは当業者に十分に知られている（ゲリッセン，Ｇ．；ピオンテック，Ｍ．；ダレムス，Ｕ．；イェンツェロスキー，Ｖ．；ガヴァガン，Ｊ．Ｗ．；ディコシモ，Ｒ．；アントン，Ｄ．Ｌ．；ヤノビッチ，Ｚ．Ａ．著（１９９６年）、生物触媒としての組換えハンゼヌラ・ポリモルファ、ホウレンソウグリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）及びＳ．セレビジエカタラーゼＴ（ＣＴＴ１）遺伝子の同時発現、応用微生物工学、４６号、４６〜５４頁(Gellissen, G.; Piontek,M.; Dahlems, U. ; Jenzelewski, V.; Gavagan, J.W.; DiCosimo, R.; Anton, D.L.; Janowicz, Z.A.(1996), Recombinant Hansenula polymorpha as a biocatalyst.Coexpression of the spinach glycollate oxidase (GO) and the S.cerevisiae catalase T(CTT1) gene, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 46-54)；ファーヴィック，Ｍ．；ロンドン，Ｍ．；ドーメン，Ｊ．；ダレムス，Ｕ．；ゲリッセン，Ｇ．；ストラッサー，Ａ．Ｗ．著；ＤＥ１９９２０７１２号（Farwick,M.; London, M.; Dohmen, J.; Dahlems, U.; Gellissen, G.; Strasser, A.W.; DE19920712））。本発明にかかる菌体触媒が場合により、本発明にかかる反���において形成されたピルビン酸を更に代謝し、ともかくこれを栄養源として使用することは極めて特に有利である。このように設計された菌体触媒は、ピルビン酸が反応の副生物としては得られず、かつ従ってまたピルビン酸を更なる工程段階において実際に所望されるキラル生成物から除去する必要がないということをも意味する。菌体触媒の製造は、原則的に当業者に知られている手段により実施できる（サムブルーク，Ｊ．；フリッチュ，Ｅ．Ｆ．及びマニアティス，Ｔ．著（１９８９年）、分子クローニング：実験室用取扱説明書、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（Sambrook,J.;Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular Cloning:a laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）；バルバス，Ｐ．及びボリヴァー，Ｆ．著（１９９０年）、Ｅ．コリにおける発現プラスミドベクターの設計と構築、酵素学的研究法、１８５号、１４〜３７頁（Balbas,P.and Bolivar,F.(1990),Design and construction of expression plasmid vectors in E.coli,Methods Enzymol.185,14-37）；ロドリゲス，Ｒ．Ｌ．及びデンハルト，Ｄ．Ｔ（編）（１９９８年）、ベクター：分子クローニングベクターとその使用に関する研究、２０５〜２２５頁、バターワース社、ストーンハム（Rodriguez,R.L. and Denhardt,D.T(eds)(1998),Vectors:a survey of molecular cloning vectors and their uses,205-225,Butterworth,Stoneham）。一般的操作（ＰＣＲ、クローニング、発現等）に関しては、以下の文献及び該文献での引用物をも参照にできる：Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、３／２０００及びその引用文献；トリグリア  Ｔ．；ピーターソン，Ｍ．Ｇ．及びケンプ，Ｄ．Ｊ．著（１９８８年）、公知配列の境界外部にあるＤＮＡセグメントのインビトロ増幅操作、核酸研究、１６号、８１８６頁（Triglia T.;Peterson,M.G. and Kemp,D.J.(1988),A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences,Nucleic Acids Res.16,8186）；サムブルーク，Ｊ．；フリッチュ，Ｅ．Ｆ．及びマニアティス，Ｔ．著（１９８９年）、分子クローニング：実験室用取扱説明書、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（Sambrook,J.;Fritsch,E.F. and Maniatis, T.(1989), Moleculer cloning:a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）；ロドリゲス，Ｒ．Ｌ．及びデンハルト，Ｄ．Ｔ（編）（１９８８年）、ベクター：分子クローニングベクターとその使用に関する研究、バターワース社、ストーンハム（Rodriguez, R.L.and Denhardt, D.T(eds)(1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworth, Stoneham）。
【００２０】
本発明はまた、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの遺伝子と、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費を伴う有機基質の変換のための酵素の遺伝子とが存在する遺伝子構築物を含有するプラスミドを提供する。考えられる起源のプラスミド又はベクターは、原則的にこの目的のために当業者に利用可能な全ての実施態様となる。そのようなプラスミド及びベクターは、例えばスチュディエ（Studier）ら（スチュディエ，Ｗ．Ｆ．；ローゼンバーク  Ａ．Ｈ．；ダン  Ｊ．Ｊ．；デュベンドロフ  Ｊ．Ｗ．；著（１９９０年）、クローニングされた遺伝子の直接的発現のためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用、酵素学的研究法、１８５号、６１〜８９頁（Studier,W.F.;Rosenberg A.H.;Dunn J.J.;Dubendroff J.W.;(1990),Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol.185,61-89））又はＮｏｖａｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社又はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ社の冊子に見出すことができる。更なる好ましいプラスミド及びベクターは：グローヴァー，Ｄ．Ｍ．著（１９８５年）、ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ、第１〜３巻、ＩＲＬ出版社、オックスフォード（Glover,D.M.(1985),DNA cloning: A Practical Approach,vol.I-III,IRL Press Ltd.,Oxford）；ロドリゲス，Ｒ．Ｌ．及びデンハルト，Ｄ．Ｔ（編）（１９８８年）、ベクター：分子クローニングベクターとその使用に関する研究、１７９〜２０４頁、バターワース社、ストーンハム（Rodriguez,R.L. and Denhardt,D.T(eds)(1988),Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham）；ゲッデル，Ｄ．Ｖ．著（１９９０年）、異種遺伝子発現系、酵素学的研究法、１８５号、３〜７頁（Goeddel,D.V.(1990),Systems for heterologous gene expression,Methods Enzymol.185,3-7）；サムブルーク，Ｊ．；フリッチュ，Ｅ．Ｆ．及びマニアティス，Ｔ．著（１９８９年）、分子クローニング：実験室用取扱説明書、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク（Sambrook,J.;Fritsch,E.F. and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning: a laboratory manual,2ｎｄ ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York）に見出すことができる。本発明にかかる核酸を含有する遺伝子構築物を宿主生物内で特に好ましい方法でクローニングできるプラスミドは：ｐＵＣ１８（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）、ｐＫＫ−１７７−３Ｈ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）、ｐＢＴａｃ２（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ｐＫＫ−２３３−３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）又はｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）である。プラスミドｐｋｋ／ｐｈｅ／ｍａｌｉ（図５）は、本文中において有利である。このプラスミド及び相応の組換え微生物の調製は、デュッセルドルフ大学のＳ．ナムニによる学位論文に記載されている、調製項目７０頁以下参照のこと。
【００２１】
使用については、本発明にかかる方法の当該ポリペプチドは、均一に精製された化合物又は組換え方法により調製された酵素のような自由な形態で使用できる。これらのポリペプチドは更にまた、インタクトな寄生生物の構成成分として又は任意の所望の程度まで精製された、宿主生物の破砕された細胞塊と組み合わせて利用することもできる。また、酵素を固定化した形態で使用することも可能である（シャルマ  Ｂ．Ｐ．；ベイリー  Ｌ．Ｆ．及びメッシング  Ｒ．Ａ．著（１９８２年）、固定化生体材料−技術と使用、応用化学  ９４号、８３６〜８５２頁（Sharma B.P.;Bailey L.F.and Messing R.A.(1982),Immobilisierte Biomaterialiern-Techniken und Anwendungen,Angew.Chem.94,836-852）。固定化は、有利には凍結乾燥により実施する（パラドッカー，Ｖ．Ｍ．；ドーディック，Ｊ．Ｓ．著（１９９４年）、ほぼ無水の有機溶剤中に溶解したα−キモトリプシンの水様の活動性、アメリカ化学協会誌  １１６号、５００９〜５０１０頁（Paradkar,V.M.;Dordick,J.S.(1994),Aqueous-Like Activity of α-Chymotrypsin Dissolved in Nearly Anhydrous Organic Solvents,J.Am.Chem.Soc.116,5009-5010）；モリ，Ｔ．；オカハタ，Ｙ．著（１９９７年）、均一な有機溶剤中における有効なグリコシル転移触媒としての脂質被覆の配糖体加水分解酵素の多様性、テトラヘドロン  レタース  ３８号、１９７１〜１９７４頁（Mori,T.;Okahata,Y.(1997), A variety of lipi-coated glycoside hydrolases as effective glycosyl transfer catalysts in homogeneous organic solvents,Tetrahedron Lett.38,1971-1974）；オタミリ，Ｍ．；アドレクルーツ，Ｐ．；マティアソン，Ｂ．著（１９９２年）、酵素を活性形態でトルエン中に可溶化させる手段としてのキモトリプシンとエチルセルロースとの複合体形成、生物触媒  ６号、２９１〜３０５頁（Otamiri,M.;Adlercreutz,P.;Matthiasson,B.(1992),Complex formation between chymotrypsin and ethyl cellulose as a means to solubilize the enzyme in active form in toluene,Biocatalysis 6,291-305）。界面活性物質、例えばＡｅｒｏｓｏｌ  ＯＴ又はポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＢｒｉｊ５２（ジエチレングリコールモノセチルエーテル）（カミヤ，Ｎ．；オカザキ，Ｓ．−Ｙ．；ゴトウ，Ｍ．著（１９９７年）、無水ベンゼン中における触媒として活性な界面活性剤−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体、生物工学技術  １１号、３７５〜３７８頁（Kamiya,N.;Okazaki,S.-Y.;Goto,M.(1997), Surfactant-horseradish peroxidase complex catalytically active in anhydrous benzene,Biotechnol.Tech.11,375-378）の存在下における凍結乾燥が、極めて特に好ましい。Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（Ｒ）、特にＥｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ（Ｒ）又はＥｕｐｅｒｇｉｔ  ２５０Ｌ（Ｒ）（Ｒｏｅｈｍ社製）（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ．ＲＴＭ．Ｃ、酵素の固定化用担体の工業的可能性、カシャルスキー−カツィア，Ｅ．；クレマー，Ｄ．Ｍ．著  分子触媒Ｂ誌：酵素（２０００年）、１０号（１〜３）、１５７〜１７６頁（Eupergit.RTM.C,a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential.Katchalski-Katzir,E.;Kraemer,D.M.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic (2000),10(1-3),157-176）上での固定化が、殊に好ましい。Ｎｉ−ＮＴＡ上にＨｉｓタグ（ヘキサ−ヒスチジン）が追加されたポリペプチドを結合させて固定化することは、同様に好ましい（ポリヒスチジンアフィニティータグを使用するタンパク質精製、ボーンホースト，ジョシュア  Ａ．；ファルケ，���ョセフ  Ｊ．著  酵素学研究法（２０００年）、３２６号、２４５〜２５４頁（Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.Bornhorst,Joshua A.;Falke,Joseph J.Methods in Enzymology(2000),326,245-254）。また、ＣＬＥＣとしての使用が考えられる（セント．クレア，Ｎ．；ワン，Ｙ．−Ｆ．；マルゴリン，Ａ．Ｌ．著（２０００年）、アルコールデヒドロゲナーゼの補因子結合の架橋酵素結晶（ＣＬＥＣ）、応用化学国際版  ３９号、３８０〜３８３頁（St.Clair,N.;Wang,Y.-F.;Margolin,A.L.(2000),Cofactor-bound cross-linked enzyme crystals(CLEC) of alcohol dehydrogenase,Angew.Chem.Int.Ed.39,380-383）。これらの手段により、有機溶剤のために不安定になるポリペプチドから、水性溶剤と有機溶剤との混合物中で又は完全に有機媒質中で機能できるものを生成させることが可能である。
【００２２】
本発明にかかる方法は、Ｅ．コリ由来のＭＤＨとＮＡＤ依存性ロイシンデヒドロゲナーゼ（バチルス・セレウス由来のＬｅｕＤＨ；Ｓｉｇｍａ社製）とが共役するように実施できる。ＬｅｕＤＨは、ＮＡＤＨを消費しながら、脂肪族ケト酸、例えばケトイソカプロン酸から相応のＬ−アミノ酸、例えばＬ−ロイシンへの還元的アミノ化を触媒する（式（１））。
【００２３】
【化２】
2005537017.tif 000003
【００２４】
反応経過はＨＰＬＣによりモニタリングした。結果は、ＭＤＨの代わりにＦＤＨを用いた同様の変換と比較した以下の第１表から見られる。
【００２５】
第１表：共役され、補酵素の再生を伴うバッチ中におけるＭＤＨ及びＦＤＨによるＬ−ロイシンの形成の比較（ＨＰＬＣ）。それぞれの場合において、１０ｍＭのケトイソカプロン酸と、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）による再生のために１００ｍＭのＬ−リンゴ酸を又はギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）による再生のために１００ｍＭのギ酸を利用した。
【００２６】
【表１】
2005537017.tif 000004
【００２７】
また、アルコールデヒドロゲナーゼとリンゴ酸デヒドロゲナーゼとを組み合わせて使用することについても調査した。Ｅ．コリ由来のＭＤＨと、ロドコッカス・エリスロポリス由来のＮＡＤ依存性Ｓ特異性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＲＥ−ＡＤＨ；ＤＥ１０２１８６８９号）とを共役させる。ここでは、ＭＤＨの有用性を、式４によるケトン（ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン＝ｐＣＡｐ）の還元により試験する。
【００２８】
【化３】
2005537017.tif 000005
【００２９】
第２表：時間の関数としての、ケトンのｐ−Ｃｌ−アセトフェノン（１０ｍＭ使用）の減少と、酵素的に形成されたアルコールのｐ−Ｃｌ−フェニルエタノール（１００％、１０ｍＭに相当）の増加。
【００３０】
【表２】
2005537017.tif 000006
【００３１】
エナンチオマー富化された又はエナンチオマー富化というのは、混合物中で光学対掌体の一方がその他方と一緒に＞５０％にのぼり存在しているという事実を説明するものである。
【００３２】
示される構造は、１つの立体中心が存在すれば、考えられる２種のエナンチオマーに符号し、１つ以上の立体中心が分子中に存在すれば、これらは考えられる全種のジアステレオマーに符号し、かつ１種のジアステレオマーに関しては、当該化合物についてその範囲内で考えられる２種のエナンチオマーに符号する。
【００３３】
生物カンジダ・ボイジニは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ３２１９５の番号下で寄託されており、一般に入手できる。
【００３４】
本明細書中で言及した先行技術文献はまた、開示に含まれるものとみなす。
【００３５】
図面の簡単な説明：
図２は、全量濾過用の膜反応器を示す。基質１をポンプ２により、膜５を収容する反応器領域３内に移送させる。攪拌子を用いて作動させる反応器領域内には、溶剤の他に、触媒４、生成物６及び未反応の基質１が存在する。低分子量物６を、主として膜５により濾別する。
【００３６】
図３は、十字流濾過用の膜反応器を示す。ここでは、基質７をポンプ８により撹拌反応器領域内に移送させ、その際に該領域には同様に溶剤、触媒９及び生成物１４が存在する。存在してよい熱交換器１２を介して十字流濾過セル１５内に導びかれる溶剤流を、ポンプ１６により設定する。ここでは、低分子量の生成物１４を膜１３により取り出す。次いで、高分子量の触媒９を溶剤流と一緒に、適すれば再び熱交換器１２を介し、適すればバルブ１１を介して反応器１０内に戻す。
【実施例】
【００３７】
実施例１：
ここで使用するＥ．コリＫ１２由来のＭＤＨの製造については、デュッセルドルフ大学のＳ．ナムニによる学位論文、調製項目７０頁以下参照のこと。
【００３８】
Ｅ．コリ由来のＭＤＨの精製及び生物化学的特性：
ａ）精製
Ｅ．コリの粗抽出物（発現株：Ｅ．コリ派生物ＪＭ１０５）からの組換えＭＤＨの精製を、精製プロトコールにより実施した（ストルス  Ｌ．，及びドネリー  Ｍ．Ｉ．著（１９９７年）、エッセリシア・コリ変異体内におけるＮＡＤ（＋）依存性リンゴ酸酵素の過剰発現によるコハク酸の製造、応用環境微生物学  ６３号：２６９５〜２７０１頁（Stols L.,and Donnelly M.I.(1997).Production of succinic acid through overexpression of NAD(+)-dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant. Appl Environ Microbiol 63:2695-701）。最初に組換え細菌細胞を、ガラスビーズを用いる粉砕により破砕した（破砕用緩衝液はトリス／ＨＣｌ  １００ｍＭ  ｐＨ７．５）。次いで、Ｑ−セファロースによる精製段階を実施した。Ｑ−セファロースによる精製の後に、約７．３Ｕ／ｍｇのＭＤＨの比活性を測定することができた。この酵素を更なるクロマトグラフィー段階、ヒドロキシアパタイト及びフェニルセファロースにより精製することによりＭＤＨを均一に精製することができ、その際、比活性は１３３Ｕ／ｍｇであった。
【００３９】
第３表：Ｅ．コリ由来の組換えＭＤＨの精製の概要。
【００４０】
【表３】
2005537017.tif 000007
【００４１】
ｂ）生物化学的特性
Ｋｍ値
Ｌ−リンゴ酸については０．２９ｍＭのＫｍ値が測定され、かつ補酵素ＮＡＤ＋については０．１４ｍＭのＫｍ値が測定された。両方のＫｍ値は、＜１ｍＭという低い範囲にあり、かつこれらは、２種の基質が酵素により良好な親和性を伴って認識されることを示す。これら２つの値は、ＭＤＨをＮＡＤＨの再生のために使用できることを示唆する。
【００４２】
最適ｐＨ（図１）
ＭＤＨは、１１以上という比較的高いｐＨ値で最大の活性を示す。それにもかかわらず、低ｐＨ値での活性の降下は比較的小さく、例えばｐＨ８．０では７２％の活性が、ｐＨ７．０では６７％の活性が依然として存在する。
【００４３】
最適温度
ＭＤＨの最適温度は、約５５℃である（図４）。
【００４４】
実施例２：
ａ）ロイシンデヒドロゲナーゼとリンゴ酸デヒドロゲナーゼとの共役
Ｅ．コリ由来のＭＤＨとＮＡＤ依存性ロイシンデヒドロゲナーゼ（バチルス・セレウス由来のＬｅｕＤＨ；Ｓｉｇｍａ社製）とを共役させる。ＬｅｕＤＨは、ＮＡＤＨを消費しながら、脂肪族ケト酸、例えばケトイソカプロン酸から、相応のＬ−アミノ酸、例えばＬ−ロイシンへの還元的アミノ化を触媒する。
【００４５】
試験用バッチ（全量１ｍｌ；特に記載が無い限り、原液の濃度を括弧内に示す）：
５２６μｌのヘペス緩衝液（２００ｍＭヘペス、ｐＨ８．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する）；１４３μｌの硫酸アンモニウム溶液（試験物中５００ｍＭ）；１００μｌのケトイソカプロン酸（１００ｍＭ）；２０μｌのＮＡＤ＋（５０ｍＭ）；２００μｌのＬ−リンゴ酸（５００ｍＭ、Ｎａ塩、ヘペス緩衝液に溶解、ｐＨ８．５）；１μｌのＬｅｕＤＨ（試験物中０．５Ｕ）；１０μｌのＭＤＨ（試験物中１．５Ｕ；部分精製品）。
【００４６】
試験用バッチを３０℃でインキュベートし、かつ０、１０、３０、６０及び１２０分後に試料を採り出し（５０μｌ；エッペンドルフ反応容器）、かつ３分間にわたり９５℃で加熱し、反応を停止する。変性したタンパク質を１０分間にわたり１３０００ｒｐｍで遠心分離（エッペンドルフベンチ型遠心機）することにより除去し、かつオルト−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いて誘導体化した後に上清をＨＰＬＣにより分析する。
【００４７】
ＯＰＡ（＝オルト−フタルジアルデヒド）を用いる誘導体化：
１４０μｌのホウ酸Ｎａ緩衝液（１００ｍＭ；ｐＨ１０．４）；４０μｌの試料又は標準物；２０μｌのＯＰＡ／ＩＢＬＣ試薬（＝オルト−フタルジアルデヒド／Ｎ−イソブチリル−Ｌ−システイン）。この反応溶液２０μｌをＨＰＬＣ分析のために注入する。
【００４８】
ＨＰＬＣ分析：
結果については第１表を参照のこと：
【００４９】
ｂ）比較実験：ロイシンデヒドロゲナーゼとギ酸デヒドロゲナーゼとの共役
同時に実施した比較用バッチにおいては、上記と同様の成分を使用し、但しリンゴ酸デヒドロゲナーゼの代わりに０．５Ｕのギ酸デヒドロゲナーゼ（カンジダ・ボイジニ由来のＦＤＨ；Ｓｉｇｍａ社製）を利用し、かつ１００ｍＭのＬ−リンゴ酸の代わりに１００ｍＭのギ酸を再生用基質として使用した。
【００５０】
結果については第１表を参照のこと。
【００５１】
実施例３：ＭＤＨとアルコールデヒドロゲナーゼとの共役：
Ｅ．コリ（発現株：Ｅ．コリ派生物ＪＭ１０５）由来のＭＤＨと、ロドコッカス・エリスロポリス由来のＮＡＤ依存性Ｓ特異性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＲＥ−ＡＤＨ）とを共役させる。ここでは、ＭＤＨの有用性をケトン（ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン）の還元により試験する。
【００５２】
試験用バッチ（全量１ｍｌ；特に記載が無い限り、原液の濃度を括弧内に示す）：
６７８．７μｌのヘペス緩衝液（１００ｍＭヘペス、ｐＨ８．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する）；１．３μｌのｐ−Ｃｌ−アセトフェノン（試験物中１０ｍＭ）；２０μｌのＮＡＤ＋（５０ｍＭ）；２００μｌのＬ−リンゴ酸（５００ｍＭ、Ｎａ塩、ヘペス緩衝液に溶解、ｐＨ８．５）；１５μｌのＲＥ−ＡＤＨ（試験物中１Ｕ）；８５μｌのＭＤＨ（試験物中１Ｕ；部分精製品）。
【００５３】
試験用バッチを３０℃でインキュベートし、かつ０、１０、２０、３０及び６０分後に、試料（５０μｌ）を採り出し、１００μｌのエチルアセテートを添加し、かつ上相をガスクロマトグラフィーにより、アルコールのｐ−Ｃｌ−フェニルエタノールの形成について分析する。
【００５４】
結果については第２表を参照のこと。
【００５５】
実施例４：異種発現用の発現ベクターの構築
増幅される断片の配列に基づいて、制限切断部位とリボソーム結合部位のコドンとが統合されたプライマーを構築した。組換えｐＵＣ１８からのリンゴ酸デヒドロゲナーゼの増幅後に、このＰＣＲ断片を組換えｒｅｃＰｈｅ−ｐＫＫ−２２３−３発現ベクター中に、ＰｈｅＤＨ配列の後部にＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限切断部位でクローニングした（図８−菌体変換によるＬ−Ｐｈｅ合成のための異種発現用プラスミドの構築物）。
【００５６】
ＰＣＲ：
５’順方向：Ｎ’−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ−ｐｓｔ
５’ＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＡＴＧＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＡＡ  ３’
濃度１００ピコモル／μｌ
５’逆方向：Ｃ’−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ−Ｈｉｎ
５’ＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＡＣＧＧＣＧＧＴＡＧＴＣ  ３’
濃度１００ピコモル／μｌ
【００５７】
第４表：組換えｐＵＣ１８プラスミドからのリンゴ酸デヒドロゲナーゼの増幅のためのＰＣＲプロトコール。テンプレートＤＮＡの濃度を変えた。
【００５８】
【表４】
2005537017.tif 000008
【００５９】
１サイクルの構成：
変性段階：９４℃
アニーリング段階：５９℃
増幅段階：７２℃
【００６０】
クローニング：
組換えプラスミドの新たな構築物（図５）により、コンピテントＥ．コリ細胞ＪＭ１０５又はＨＢ１０１を形質転換した。
【００６１】
標準的な形質転換をハナハン（Hanahan）のプロトコール（ハナハン  Ｄ．著（１９８３年）、プラスミドを用いるエッセリシア・コリの形質転換に関する研究、分子生物学誌  １６６号：５５７〜５８０頁（Hanahan D,(1983).Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.J Mol Biol 166:557-80.）により実施した。このために、１００〜２００μｌのコンピテントＥ．コリ細胞を氷上で溶かし、かつライゲーション用バッチからのＤＮＡ４０ｎｇを添加した。プラスミドと細胞との懸濁液を３０分間にわたり氷上で冷却し、かつ次いで４２℃で９０秒にわたり加熱し、かつ直ちに再び氷上で冷却した。３００μｌのＬＢ培地を添加した後に、再生のために細胞を約４５分間にわたり３７℃でインキュベートした。次いで、この培養物２００μｌを、抗生物質を含有するＬＢプレート上に全て平板培養し、３７℃でオーバーナイトでインキュベートした。
【００６２】
リボソーム結合部位と一緒にリンゴ酸デヒドロゲナーゼの３’側からＰｈｅＤＨまでをＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ切断部位でクローニングすると、２種の酵素を同時に発現させることができた。注：これらの細胞の実験用調製物についての更なる詳細な情報は：デュッセルドルフ大学のＳ．ナムニの学位論文、調製項目に記載される。
【００６３】
実施例５：ＰｈｅＤＨとリンゴ酸デヒドロゲナーゼの同時発現
ポジティブクローンのうち、その幾つかを発現のために選択した。特定のクローンの個々のコロニーを、５ｍｌのＬＢａｍｐ培地に植え替え、かつＯＤ５８０＝０．６に達した後に、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。この誘導はオーバーナイトで実施し、かつ回収した細胞を超音波を用いて破砕した。
【００６４】
組換え株ＨＢ１０１は、１００Ｕ／ｍｌのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性及び同様に１３０Ｕ／ｍｌのＰｈｅＤＨ活性を示す。組換え株ＪＭ１０５のこれら２種の酵素の活性は明らかに高く、リンゴ酸デヒドロゲナーゼについては、〜６００Ｕ／ｍｌ、かつＰｈｅＤＨについては、〜１２００Ｕ／ｍｌである。
【００６５】
これら２種の組換え株を、１０ｌの発酵槽内で培養し、かつこれらの２種の酵素の活性を測定した。
【００６６】
第５表：ＬＢ培地を有する１０ｌの発酵槽内において回分発酵時に発現した酵素の活性の測定。
【００６７】
【表５】
2005537017.tif 000009
【００６８】
表示データから、Ｅ．コリ株ＪＭ１０５が両方の酵素について顕著に良好な活性を示すことが見られるので、更なる全ての実験をこの株を用いて実施した。
【００６９】
実施例６：活性の最適化
得られた粗抽出物の最大限の活性を利用可能とするために、幾つかのパラメータを調査し、かつ変化させた。
【００７０】
異種発現された２種の酵素は、最良の安定性の特性を異なる条件下で示す。両方の酵素についての同じ系における最適の特性を測定するのは興味深いことであった。以下の実験は、この事実に基づいて実施した。
【００７１】
ａ）破砕用緩衝液の最適化
１ｇの細胞ＪＭ１０５を、ＢＳＡ（１．５ｇ／ｌ）を３０％で有する／有さない０．１Ｍのトリス又は０．１ＭのＫｐｉ緩衝液中で破砕した。この破砕を、超音波を用いて連続７０サイクルにわたり実施した。この緩衝液の他に、１．５ｇ／ｌのＢＳＡを酵素の安定化のために添加した。
【００７２】
第６表：破砕用緩衝液の作用時における活性の比較。
【００７３】
【表６】
2005537017.tif 000010
【００７４】
ＢＳＡを添加すると、両方の場合において活性が増加する。破砕用緩衝液はまた、活性に影響を及ぼした。ここでは、個々の酵素により好適な破砕用緩衝液が異なることが見られた。Ｋｐｉ緩衝液は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼよりもＰｈｅＤＨについてより好適であるが、Ｋｐｉ緩衝液中のリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性の低下は比較的小さいので、組換え細胞をこの緩衝液中で異種発現の後に引き続いて破砕した。
【００７５】
ｂ）安定性を調査するための破砕の継続時間
また、破砕の継続時間についても調査し、かつこの操作の間にわたる酵素の安定性についての臨界点を測定した。これらのデータから、最適な破砕の継続時間を得ることができた（図９−超音波により種々の時間で破砕した後のＰｈｅＤＨ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの安定性測定。細胞を、６０及び３０秒の処理の後に中間的に３０秒にわたり冷却した。
【００７６】
以下の懸濁液をこの実験のために使用した：
１ｇ    組換え細胞（ＪＭ１０５）
３ｍｌ  Ｋｐｉ緩衝液０．１Ｍ
【００７７】
超音波を用いた細胞の長い処理の間に、ＰｈｅＤＨの活性は劇的に低下する一方で、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性は保持される。従って、１ｇの組換えＥ．コリＪＭ１０５を２５％破砕する理想的な破砕条件は、４×３０秒の超音波処理と氷浴中での３×３０秒の中間的な冷却である。
【００７８】
超音波を用いた長い処理の間に試料を加熱すると、酵素を変性させることができる。この実験においてタンパク質の量を測定し、かつ該量は以下に見られる。
【００７９】
第７表：種々の時間で破砕した後の発現した２種の酵素、即ちＰｈｅＤＨ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼのタンパク質定量。細胞を、６０及び３０秒の処理の後に３０秒にわたり中間的に冷却した。
【００８０】
【表７】
2005537017.tif 000011
【００８１】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼを均一に精製すると、４６６Ｕ／ｍｇの比活性を実現することが可能であった。この精製段階を第８表にまとめた。
【００８２】
第８表：組換えリンゴ酸デヒドロゲナーゼの精製。
【００８３】
【表８】
2005537017.tif 000012
【００８４】
ｃ）Ｋｍ値の測定
ＫＭ値を、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの基質及び補酵素について測定した。このＫＭ値は、均一な又は部分的に精製された組換えリンゴ酸デヒドロゲナーゼ試料について測定した。
Ｌ−リンゴ酸：０．２９ｍＭ
ＮＡＤ＋      ０．１４ｍＭ
【００８５】
実施例７：Ｌ−フェニルアラニン合成と補酵素ＮＡＤＨ再生との共役
共役反応の重要な要因は、２種の酵素の最適ｐＨ及び熱安定性である。酵素の安定性の他に、更なる要因、例えば種々の基質の酵素に対する影響がその役割を担う。
【００８６】
最適ｐＨに関しては、速度論的研究を行い、かつ合成のｐＨ依存性を測定した。ｐＨの増加に伴う活性の増加が図１０から見られ、２種の酵素が最も高い活性を示していないが補酵素は安定したままであるｐＨ８．０を、補酵素の安定性の理由のために合成用に選択する（図１０−リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びＰｈｅＤＨの最適ｐＨ。ｐＨが増加するにつれて、２種の酵素の活性は増加する。測定を部分精製された酵素を用いて実施した。フェニルアラニンデヒドロゲナーゼについては、還元的アミノ化を測定した）。
【００８７】
共役酵素反応についての第２の要因は、２種の酵素が比較的長時間にわたり安定したままである好適な温度である。従って、更なる実験を実施して最適温度を決定した（図１１−最適温度。測定をｐＨ８．５、かつ０．１Ｍヘペス緩衝液中で実施した）。
【００８８】
図１１から見られるように、両方の酵素の最適温度は５０℃である。３０℃で測定した活性は、６０％にすぎない。
【００８９】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼは４５℃で比較的長時間にわたり安定である。しかしながら、ＰｈｅＤＨがこの温度値で不安定になるので、比較的長時間にわたる両方の酵素及び補酵素の安定性を保証できるように、合成を３０℃で実施した。
【００９０】
酵素はこれらの最適な活性を、特定の好適な緩衝液中で達成する。２種の酵素を、２種の異なる緩衝液を用いて、それぞれの場合において反応用バッチ中で試験した（第９表）。
【００９１】
第９表：種々の反応用緩衝液中におけるＰｈｅＤＨ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性の比較。これらの活性は、最適物についての百分率で見られる。
【００９２】
【表９】
2005537017.tif 000013
【００９３】
ヘペス緩衝液中のＰｈｅＤＨの活性はそれほど低下しないので、共役酵素反応をこの緩衝液中で実施した。
【００９４】
緩衝液、ｐＨ及び温度値を決定すると、補因子（ＮＡＤＨ）の再生を伴う共役酵素反応によるフェニルアラニンの合成のための好適な条件及び媒質を選択することができた。
【００９５】
３０ｍＭのフェニルピルビン酸、１００ｍＭの硫酸アンモニウム、１００ｍＭのヘペス緩衝液、７０ｍＭのＬ−リンゴ酸、２ｍＭのＮＡＤ＋、２ｍＭのＭｇ２＋、２５ＵのＰｈｅＤＨ（部分精製品）及び３０Ｕのリンゴ酸デヒドロゲナーゼを利用した。試料をＨＰＬＣにより分析する。合成を数時間にわたりモニタリングした。４時間後に、利用した基質であるフェニルピルベートの約５０％がＬ−フェニルアラニンに変換された（図１２−Ｌ−Ｐｈｅについての速度論の形成。Ｌ−Ｐｈｅの形成を現場で実施した）。
【００９６】
実施例８：菌体変換
以下の培地を、菌体変換用の標準バッチとして使用した：
０．１Ｍ              ヘペス緩衝液（ｐＨ８．０）
４０ｍＭ              フェニルピルビン酸
０．１Ｍ              Ｌ−リンゴ酸
０．１Ｍ              硫酸アンモニウム
２ｍＭ                ＭｇＣｌ２
【００９７】
変換を３０℃で、かつ１ｇの組換えＥ．コリ細胞を用いて実施した。形成されたフェニルアラニンをＨＰＬＣにより検出した（図６）。
【００９８】
組換えＥ．コリ細胞によるＬ−Ｐｈｅの形成を２０時間にわたりモニタリングし、かつ収率を測定した（図７）。
【００９９】
２０時間にわたるインキュベーションの後では、形成された生成物Ｌ−Ｐｈｅの代謝を検出できなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】ＭＤＨの最適ｐＨを示す。
【図２】全量濾過用の膜反応器を示す。
【図３】十字流濾過用の膜反応器を示す。
【図４】ＭＤＨの最適温度を示す。
【図５】プラスミドｐｋｋ／ｐｈｅ／ｍａｌｉを示す。
【図６】組換えＥ．コリ細胞により形成されたフェニルアラニンのＨＰＬＣによる検出を示す。
【図７】組換えＥ．コリ細胞により形成されたＬ−Ｐｈｅの収率を示す。
【図８】菌体変換によるＬ−Ｐｈｅ合成のための異種発現用プラスミドの構築物を示す。
【図９】超音波により種々の時間で破砕した後のＰｈｅＤＨ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼの安定性を示す。
【図１０】リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びＰｈｅＤＨの最適ｐＨを示す。
【図１１】リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びＰｈｅＤＨの最適温度を示す。
【図１２】Ｌ−Ｐｈｅについての速度論の形成を示す。
【符号の説明】
【０１０１】
１  基質、  ２  ポンプ、  ３  反応器領域、  ４  触媒、  ５  膜、  ６  生成物、  ７  基質、  ８  ポンプ、  ９  触媒、  １０  反応器、  １１  バルブ、  １２  熱交換器、  １３  膜、  １４  生成物、  １５  十字流濾過セル、  １６  ポンプ
【図１】
2005537017.tif 000014
【図２】
2005537017.tif 000015
【図３】
2005537017.tif 000016
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2005537017000001.app
【国際調査報告】
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