(57)【要約】本発明は、化学療法及び／又は放射線療法の効能を増大するための、オリゴヌクレオチドを含有するカチオン性リポソーム製剤の使用に関し、特に、化学療法の効能に対しガン又は腫瘍組織を化学増感する手段としての該リポソームの使用に関する。これは、乳ガン、肺ガン、膵臓ガン、前立腺ガンなどのｒａｓ発現腫瘍の処置の関連で特に利点がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍組織の化学増感方法であって、化学療法剤と、カチオン性脂質、ホスファチジルコリン及びコレステロールからなるカチオン性リポソームであってその中に少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが包埋されたカチオン性リポソームを含む組成物とを投与することを含む、方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ヌクレオチドの範囲のサイズであり、末端ヌクレオチドでのみホスホロチオエート化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ヌクレオチドを含み、その塩基の全てがホスホロチオエート化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ヌクレオチドの範囲のサイズであり、その塩基の全てが、キメラ形態で修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが静脈投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが標的組織に直接投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが、標的組織に向かう動脈血行中に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスＤＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが、式５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号１）を有し、末端塩基のみがホスホロチオエート化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ジメチルジオクタデシルアンモニウム  ブロミド（ＤＤＡＢ）のようなカチオン性脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、及びコレステロールから本質的になり、配列５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号１）であって末端配列のみがホスホロチオエート化されている配列を含むリポソームを含む物質の組成物。
【請求項１１】
ジミリストイル  トリメチル  アンモニウム  プロパン（ＤＭＴＡＰ）のようなカチオン性脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロールから本質的になり、配列５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号１）であって末端配列のみがホスホロチオエート化されている配列を含むリポソームを含む物質の組成物。
【請求項１２】
化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然産物、ホルモン又はアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
化学療法剤が、白金配位錯体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、小分子阻害剤、ペプチド、抗体又はチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
化学療法剤が、エピルビシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、又はパクリタキセルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
化学療法剤が、シスプラチン又はミトキサントロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
化学療法剤が、ゲンシタビンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ガンが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、又は肉腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドが、化学療法剤の前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
幾つかの異なるオリゴヌクレオチドが、化学療法剤の前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが、１より多い化学療法剤の前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、放射線と化学療法剤との組合せの前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
１より多いオリゴヌクレオチドが、放射線と化学療法剤との組合せの前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年３月３０日に出願の米国出願番号第０９／５３８，２４１号の一部継続出願であり、米国出願番号第０９／５３８，２４１号は、１９９９年７月１５日出願の米国出願番号第０９／３５４，１０９号の一部継続出願であり、米国出願番号第０９／３５４，１０９号は、次いで、１９９７年１０月２４日出願の米国出願番号第０８／９５７，３２７号の分割出願であり、米国出願番号第０８／９５７，３２７号は、１９９７年３月２１日出願の仮出願番号第６０／０４１，１９２号への優先権の享受を主張する。これらの出願の全ては、引用により、本明細書中にそれらの内容の全部が含まれるものである。
【０００２】
政府の権利
本研究は、国立衛生研究所からの助成金によって支援された。合衆国政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、腫瘍組織が発現する遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの組合せを含有するカチオン性リポソーム組成物を用いる治療法、好ましくは、化学療法又は化学療法と放射線療法との組合せに対し、腫瘍組織を増感する新規に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ガン治療のための化学療法剤の使用は十分に確立されている。ガンの治療で確立された適用を見出している化学療法剤の例としては、例えば、少し例に挙げると、タモキシフェン、シスプラチン、メトトレキセート、アドリアマイシンが挙げられる。しばしばこのような化学療法剤は、組合せて、即ち、化学療法レジメンの多剤併用療法（ｃｏｃｔａｉｌ）として、そして、他の型の治療、例えば、放射線、手術、又は抗体ベースの治療と組合せて使用される。
化学療法剤は、多数の異なる型のガン、例えば、いくらかの白血病、乳ガン及び前立腺ガンの治療に成功したが、化学療法は問題が多い。例えば、化学療法剤は、しばしば限定数のガンに対してのみ有効である。また、多くの化学療法剤は、非標的組織に毒性を示す。例えば、腎毒性を引き起こしうる。化学療法の別のありふれた問題は、腫瘍組織が、特定の化学療法剤に耐性になりうることである。例えば、一部の腫瘍は、シスプラチンに耐性になることが知られている。
【０００５】
このような問題を緩和するために、化学療法剤を併用投与し、それによって、腫瘍が化学療法レジメンに耐性になる危険性を最小化することが知られている。しかし、この解決策は満足できるものではない。それは、一部の腫瘍が化学療法に耐性になるはずであるという事実を排除しないからである。例えば、細胞毒性を誘発するのに大きな投与量で投与されることを必要とするそのような化学療法剤の有効性をそれが生じる場合にこれは不利点である。非標的組織への全身毒性の危険性が増大するからこれは問題である。また、それ（ｉｆ）は治療費が大きく増大しうる。
【０００６】
腫瘍が電離放射線に耐性になりうることが同様に知られている。例えば、腫瘍の耐性は、とりわけ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｃｏｔ、ｍｏｓ、ｍｙｃなどの特定の腫瘍遺伝子の発現、並びにＰＤＧＦ、ＦＧＦなどの成長因子に関連しうる。
【０００７】
ガンの治療のためのオリゴヌクレオチドの使用、特に、特定のガンが発現する腫瘍遺伝子又は他の遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用も報告されてきた。しかし、アンチセンス療法はまた、有効性を阻害する幾つかの問題、特に、このようなオリゴヌクレオチドはインビボで不安定であり、従って、標的部位、例えば、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞に到達する前に分解されるようになりうるという事実を、アンチセンス療法は受けやすい。
【０００８】
オリゴ（ｏｌｉｏｇｓ）の力価を高める試みには、ホスホジエステル骨格に主に向けられた修飾を有する幾つかのアナログの合成があった。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対し耐性の増大を示すことが示された。オリゴヌクレオチドに対する他の修飾には、細胞取り込みを増大するための、コレステロールなどの親油性部分やポリリシンによる誘導体化があった。あるいは、該分子のポリアニオン性が、メチルホスホネートアナログにおいて除去された。
【０００９】
別の報告されたアプローチには、送達を増大するための、カチオン性リポソームの使用があった。Ｂｅｎｎｅｔら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４：１０２３−１０３３（１９９２）；Ｚｅｌｐｈａｔｉら、Ｊ．Ｌｉｐｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，７（１）：３１−４９（１９９７）；Ｔｈｉｅｒｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９０（３）：９５２−９６０（１９９３）。カチオン性リポソームが、陰性荷電の細胞表面との相互作用を容易にするために、陰性荷電オリゴヌクレオチドの中和のための、並びに、複合体に十分な残余の陽性荷電を与える、十分な荷電を有するに違いないことが広く認められている。（Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７（１）：５１−６１（１９９７））。しかし、従来のカチオン性リポソーム送達システムと関連する問題として、同様に、血清不安定性、非所望の生体分布性、標的非特異性が挙げられ、これはインビボでの効率的な核酸送達のためのその使用の妨げになっている。
そのために、化学耐性腫瘍の治療を改良する方法は、非常に利点があろう。
【発明の開示】
【００１０】
発明の目的及び要旨
本発明の目的は、化学療法の補助剤として、腫瘍組織が発現する遺伝子を標的とする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの投与によって、化学療法の効果に対し腫瘍組織を増感することである。
本発明のより具体的な目的は、血清安定性カチオン性リポソーム送達システムに含まれる少なくとも１つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与によって、化学療法の効果に対し腫瘍組織を増感することであり、ここで、オリゴ含有のカチオン性リポソームは、化学療法の前、間又は後に投与されうる。
本発明のより具体的な目的は、化学療法の効果に対し腫瘍組織を増感するために、カチオン性リポソーム送達システムとして、腫瘍組織が発現する遺伝子を標的とする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、及びコレステロール（ＣＨＯＬ）を含む血清安定性及び標的化能力の増大したリポソームを用いることである。
【００１１】
本発明の別の具体的な目的は、化学増感性のカチオン性リポソーム送達システムとして、腫瘍組織が発現する遺伝子に向かう（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｄｊｕｎｃｔ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを包埋した、カチオン性脂質である１、２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）；ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロール（ＣＨＯＬ）を含むカチオン性リポソームを用いることである。
本発明の別の目的は、化学増感性カチオン性送達システムとして、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−（ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、又は１−［２−（９−（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）−エチル］−２−（８−（Ｚ）  ヘプタデセニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロリド）から選択される少なくとも１つのカチオン性脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロール（ＣＨＯＬ）を含むカチオン性リポソームを用いることである。
【００１２】
本発明の更により具体的な目的は、化学増感性のカチオン性送達システムとして、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）；ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロール（ＣＨＯＬ）を含むカチオン性リポソームであって、それぞれのモル比が０．５〜１．４；２．０〜４．０；０．５〜２．５、より好ましくは、０．７５〜１．２５；３．０〜４．０；１．０〜２．０、最適には約１：３．２：１．６の範囲であるカチオン性リポソーム（さらにまた、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む）を用いることである。
本発明の別の具体的な目的は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びコレステロールを含むカチオン性リポソームであって、それぞれのモル比が０．５〜１．５；２．０〜４．０；０．５〜２．５、より好ましくは、０．７５〜１．２５；３．０〜４．０；１．０〜２．０、最適には約１：３．２：１．６であるカチオン性リポソーム（さらにまた、腫瘍が発現する遺伝子を標的とする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む）から構成される化学増感性製剤を製造することである。
【００１３】
本発明の別の具体的な目的は、特定の化学療法レジメンの効果に対し腫瘍、特に化学耐性腫瘍を増感するために、１つ以上のオリゴヌクレオチドのインビボ送達のためのビヒクルとして、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン、（ＤＯＴＡＰ）  Ｎ−［２，３−（ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、及び１−［２−（９−（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）−エチル］−２−（８（Ｚ）ヘプタデンセニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリウム塩素から選択される少なくとも１つのカチオン性脂質；ホスファチジルコリン及びコレステロールを含むカチオン性リポソームであって、全カチオン性脂質、ホスファチジルコリン及びコレステロールのモル比が、好ましくは、０．５〜１．５；２．０〜４．０；０．５〜２．５、より好ましくは、０．７５〜１．２５；３．０〜４．０；１．０〜２．０、最適には．８〜１．２；３．０〜３．５；１．４〜１．８の範囲であるカチオン性リポソームを使用することである。このオリゴヌクレオチドは、腫瘍組織が発現する遺伝子標的、例えば、腫瘍遺伝子、に対しセンス方向又はアンチセンス方向にありうる。最適には、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、好ましくは、約８〜１００ヌクレオチド、より好ましくは、１５〜４０ヌクレオチドの範囲の血清を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであろう。
【００１４】
本発明の更により具体的な目的は、化学療法の効果に対し、頭頸部ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、乳ガン、肺ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、脳のガン、食道ガン、肉腫、癌腫、骨髄腫、膀胱ガン、肝臓ガン、結腸ガン、陰茎ガン、Ｂ及びＴ細胞リンパ腫、白血病、精巣ガン、骨のガン、及び他の血液のガンを含む固形腫瘍及びガンを化学増感するために、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む主題のカチオン性リポソームを使用することである。
本発明の別の具体的な目的は、化学療法及びまた潜在的に放射線療法の効果に対しガン細胞を増感するために、化学療法及び場合によっては放射線療法の補助剤として、ｒａｓ、ｒａｆ、ｃｏｔ、ｍｏｓ、ｍｙｃ、好ましくは、ｃ−ｒａｆ−１からなる群から好ましくは選択される腫瘍遺伝子又は成長因子ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦの部分に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することである。好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、上述した主題のカチオン性リポソームのカチオン性リポソーム送達システムを用いて投与されよう。該オリゴヌクレオチドに含まれる塩基は、修飾されていてもされていなくてもよく、このようなオリゴヌクレオチドのサイズは、好ましくは、８〜１００ヌクレオチド；より好ましくは、１２〜６０ヌクレオチド；最適には１５〜４０又は１５〜２５ヌクレオチドの範囲であろう。
【００１５】
本発明の更により具体的な目的は、化学療法の補助剤として、好ましくはカチオン性リポソームに包埋された、５’−ＧＴＧ−ＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’及び／又は５’−ＣＣＴＧＴＡＴＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴ−ＧＡＴＧＣＡＧＣ−３’を含むオリゴヌクレオチドを投与することである。本発明の別の具体的な目的は、化学療法剤の投与の前、同時、又は後で、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、好ましくは、腫瘍が発現する表面又は内部の抗原又は腫瘍遺伝子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むカチオン性リポソームの投与によって、化学療法剤（単数又は複数）に対し腫瘍組織を化学増感することである。
より具体的な実施態様では、カチオン性リポソーム送達システムは、ｒａｆアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、治療されるガンは前立腺ガンであり、化学療法は、前立腺ガンに対し有効であるレジメンであろう。
本発明の別の具体的な実施態様では、オリゴヌクレオチドは、化学修飾（例えば、ホスホロチオエート化）されよう。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、化学療法レジメンの効果に対し腫瘍を増感するために、腫瘍、例えば、固形腫瘍が発現する遺伝子を標的とする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むカチオン性リポソーム製剤の使用に関する。以前の出願で（下記の引用により本明細書に含まれる）、新規カチオン性リポソーム送達システムは、腫瘍細胞を放射線療法の効果に対してより感受性にすることを本発明者らは示した。本出願は、その発見の延長である。この同じカチオン性リポソーム送達システムが、腫瘍細胞を化学療法により感受性にすることが現在見出されたからである。それに基づき、本発明は、化学療法の効果に対し腫瘍組織を化学増感するために、ホスファチジルコリン（ＰＣ）とコレステロール（ＣＨＯＬ）と組合せて、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、Ｎ−２，３−（ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、１−［２−（９（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）−エチル］−２−（８（Ｚ）  ヘプタデセニル）−３−（２−ヒドロキシエチル）−イミダゾリニウムクロライド、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）からなる群から選択される少なくとも１つのカチオン性脂質から好ましくは構成されるカチオン性リポソーム（少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む）の使用に関する。好ましくは、カチオン性脂質：ホスファチジルコリン：コレステロールのモル比は、０．５〜２．５：２．０〜４．０：０．５〜０．５〜２．５、より好ましくは、．７〜１．５：２．５〜３．５及び１．０〜２．０、最適には０．８〜１．２：３．０〜３．６及び１．４〜１．８の範囲であろう。
【００１７】
カチオン性脂質：ホスファチジルコリン：コレステロールの特に好適なモル比は、約１：３．２：１．６である。主題のカチオン性リポソームは、公知の方法で製造できる。好適方法は、下記の実施例に記載される。本質的に、このような方法は、溶媒（例えば、クロロホルム又はメタノール）への脂質の溶解、蒸発乾固、低温での水和、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中活性剤（例えば、オリゴヌクレオチド）の添加、激しいボルテックスと音波処置、及び非包埋のオリゴの除去を含む。これらの方法は、高い捕捉効率（９０％以上）を提供することが見出された。生じたリポソームによって包埋されたオリゴは、例えば、４℃で保存でき、その後、使用できる。例えば、リポソームで包埋されたオリゴの場合、リポソームは少なくとも約２週間保存できる。
【００１８】
本発明のカチオン性リポソームは、所望のオリゴヌクレオチド、及び場合によっては、他の活性剤、例えば、ペプチドもしくはタンパク質（例えば、抗体、成長因子、サイトカイン、酵素  ホルモン、レセプター又はフラグメント）、薬物もしくは化学療法剤、放射性核種、オリゴ糖、フルオロフォア、又は診断薬（放射性核種、検出可能な酵素又はフルオロフォアなど）を包埋するのに使用される。好適な実施態様では、主題のカチオン性リポソームは、化学療法によって治療される腫瘍が特異的に発現する遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを包埋するのに使用されよう。更により好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｒａｆなどの腫瘍遺伝子と結合しよう。
【００１９】
実施例で示すように、本発明のカチオン性リポソームは、高い包埋効率を提供し、長時間（即ち、８時間以上）血漿中での分解からオリゴヌクレオチドを保護し、標的細胞に有効に送達され、インタクトなオリゴヌクレオチドの細胞内利用性を高め、化学療法や放射線療法の効果を非常に有効に高めることが見出された。
【００２０】
また、本明細書の実施例で示すように、カチオン性リポソーム送達システムのために含んでいる主題のオリゴは、化学療法や放射線の効果に耐性である腫瘍を含む腫瘍組織に対する電離放射線や化学療法の効果を高める。その考えで縛られることを望まないが、主題のカチオン性送達システムは、標的組織、即ち、オリゴが標的とする遺伝子を発現する腫瘍にオリゴを非常に有効に送達し、これは遺伝子の発現を阻害することを、本発明は仮説としてもつ。代わって、これは化学療法及び／又は放射線療法の効果に、これらの細胞をより感受性にすると考えられる。１つの仮説は、これはアポトーシスに細胞をより感受性にする細胞に対する効果を有することである。好ましくは、オリゴは、インビボでの安定性を高めるために修飾塩基を含もう。しかし、修飾塩基（例えば、ホスホロチオエート修飾オリゴなどのホスホロチオエート骨格への修飾、親油性修飾オリゴ（例えば、コレステロール又はポリ−Ｌ−リシン））を含む、又は含まないオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００２１】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、ｒａｆ、ｒａｓ、ｃｏｔ、ｍｏｓ、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｅｒｂ−２などの腫瘍遺伝子又はウイルス遺伝子の一部に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドであろう、そして、ガンの発症や進行に関与する遺伝子の発現を阻害しよう。好適な実施態様では、これらのリポソームによって包埋されたオリゴヌクレオチドは、化学療法及び場合によっては放射線療法に耐性なガンを治療するのに使用されよう。注意されるべきは、オリゴヌクレオチド以外の活性剤の組み込みがオリゴ／カチオン性送達システムに対し有害な効果を有しないならば、カチオン性リポソームは、オリゴヌクレオチド以外の活性剤も含みうる。種々の異なる治療レジメンによってガンを治療することが十分に確立されているので、このように考えられる。あるいは、別の活性剤が利用されるならば、それは裸形態で、又は異なる送達システムを用いて、投与されうる。
見出されたように、オリゴ／カチオン性送達は、化学療法又は放射線の前、同時、及び／又は後に投与されうる。
【００２２】
また、主題のリポソームは、ペプチド、例えば、ハプテン性ペプチド、タンパク質、抗体  ホルモン、成長因子とそのフラグメント、化学療法剤、放射性核種、オリゴ糖、レクチン、レセプター、サイトカインもしくはモノカイン、抗腫瘍剤、及び他の活性剤を包埋するのに使用されうる。その例には、例示として、インターロイキン、インターフェロン（α、β、γ）、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、メトトレキセート、シスプラチン、ドキソルビシン、ダオノルビシン、線維芽細胞成長因子、及び血小板由来成長因子が挙げられる。
放射性核種の例には、例示として、イットリウム、インジウム、ヨウ素の放射活性種が挙げられる。
【００２３】
主題のリポソームに包埋される活性剤の量は、最大で、包埋後のリポソーム安定性を維持する量であろう。オリゴヌクレオチドの場合、オリゴヌクレオチド量は、約０．１〜１，０００μｇオリゴ／脂質ｍｇ、より好ましくは、約１〜１００μｇオリゴ／脂質ｍｇ、最適には約１０〜５０μｇオリゴ／脂質ｍｇの範囲であろう。
しかし、この量は、異なる活性剤により異なり得る。主題のリポソームは、グルコースや生理食塩水  リン酸緩衝化生理食塩水などの医薬として許容できる担体と組合せて投与されよう。また、リポソームは、医薬品の製剤化でしばしば使用される保存剤、乳化剤、又は界面活性剤を含みうる。
【００２４】
主題の活性剤含有リポソームは、異なる方法で投与されうる。投与の全身及び非全身方法が適切である。このような方法として、注射（筋肉内、動脈内、腹腔内、静脈内、腫瘍内もしくは他の部位特異的注射、クモ膜下、吸入（ｉｎｈａｌａｔｏｒｉｅｓ）、経口投与及び局所方法が挙げられる。投与の好適方法として、投与の腫瘍内方法と静脈内方法が挙げられる。
【００２５】
投与有効量は、包埋された薬剤、治療する疾患もしくは状態、治療する患者、他の治療、及び他の公知の因子に依存しよう。オリゴヌクレオチドの場合、局所的投与量は、約０．１〜約５００μｇの範囲のものであろう。典型的には、約０．１μｇ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲のオリゴ又は他の薬剤の血清濃度が生じる量が投与されよう。
【００２６】
考察されるように、驚くべきことに、放射線療法、化学療法の補助剤として使用されるとき、オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、放射線療法や化学療法の効果を高めることが見出された。例えば、ｒａｆなどの腫瘍遺伝子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学療法や放射線療法に対する腫瘍細胞の感受性を高め、それによって有効性を高めるために使用できる。これにより縛られることを望まないが、このようなオリゴヌクレオチドは、溶解又はアポトーシス（プログラムされた細胞死）に、腫瘍細胞をより感受性にしうるという理論が立てられる。
具体的には、これは、ｒａｆアンチセンスオリゴヌクレオチドで示された。本発明のこの実施態様では、ｒａｆなどの腫瘍遺伝子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学療法及び／又は電離放射線療法の前、同時、又は直後に、リポソーム包埋形態で好ましくは投与されよう。
【００２７】
放射線療法を含む本発明の組合せにおいて、照射は、公知の方法、例えば、［Ｍｃｓ］照射、又は腫瘍部位に照射を送達する他の適切なデバイスの使用によって行われよう。照射量は、腫瘍退行又は寛解を起こすのに十分な量であろう。結果によって実証されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び放射線もしくは化学療法の併用は、腫瘍寛解に対し、特に放射線に耐性な腫瘍に対し、相乗効果を有することが見出された。それ故、本発明は、以前の療法よりも、放射線又は化学療法の低投与量の使用を可能としうる。しかし、勿論、放射線又は化学療法の量は、患者の状態、体重、他の療法などを含む因子に依存しよう。適切な放射線投与量及び治療レジメンの選択は、当業者の範囲内に十分にある。
【００２８】
投与されるオリゴヌクレオチドのサイズは、好ましくは、１００ヌクレオチド以下、より好ましくは、４０ヌクレオチド以下、又は約８〜４０ヌクレオチド、より好ましくは、約１５〜４０ヌクレオチド、又は１５〜２５ヌクレオチドであろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドの大きさは、インビボ投与時に、その発現が腫瘍増殖、転移又はアポトーシスに関与する遺伝子、又は腫瘍細胞を放射線療法に感受性にする遺伝子を混乱させることによって、抗腫瘍効果が生じるようなものである。
【００２９】
本発明は、任意の化学療法又は化学療法の組合せと共に主題のオリゴ／カチオン性リポソーム送達システムの使用を包含する（化学療法又は化学療法の組合せの有効性は、それによって高められる）。好ましくは、オリゴ／カチオン性リポソーム送達システムは、例えば、特定の化学療法剤の長期間投与の結果として、化学療法に耐性である腫瘍を治療するのに使用されよう。
【００３０】
特に、実施例で示すように、本発明のカチオン性リポソーム製剤に含まれる幾つかのオリゴヌクレオチドの投与は、ヒト前立腺ガンやヒト膵臓ガンのマウス腫瘍モデルで多数の異なる化学療法剤の有効性を増大させることが幾つかの腫瘍モデルで観察された。有効性の増大は、リポソーム組成物のみ又は化学療法剤のみによって処置される動物に対し、また特に、対照に対し、腫瘍体積の減少及び腫瘍増殖阻止を基に示された。これは、幾つかの異なる化学療法剤、エピルビシン、ミトキサントロン、シスプラチン、ジェムザール、及びゲンシタビンＨＣｌについて示された。これらの結果は、図２３〜２６に含まれる。
【００３１】
これらの結果に基づき、主題のオリゴ含有カチオン性リポソーム組成物は、例示すると、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アポトーシス誘導剤  白金配位錯体  天然産物、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、レセプターアゴニストとレセプターアンタゴニスト、アントラセンジオン、置換尿素（ａｒｅａ）  メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｃａｌ）抑制剤、小分子阻害剤、ペプチド、抗体と抗体フラグメント、酵素阻害剤及びチロシンキナーゼ阻害剤などのものを含む、単独又は組合せの他の化学療法剤を高める手段として使用できることが予期される。
このような化学療法剤の具体的な例として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、アドリアマイシン、タモキシフェン、トレミフェン、シスプラチン、エピルビシン、ドセタキサール、パクリタトール、ジェムザール、ゲンシタビシンＨＣｌ、ミクソタントロン、及びガンの治療に有用な他の公知の化学療法剤が挙げられる。
【００３２】
クレームされた併用療法が有用であるガンの例として、転移したものを含めて固形腫瘍及び非固形腫瘍が挙げられる。治療法は、前ガン病巣から進行した段階のガンまでの範囲のいずれの段階のガンにも使用できる。具体的な例として、前立腺ガン、膵臓ガン、乳ガン、Ｂ及びＴ細胞白血病、リンパ腫、骨のガン、頭頸部ガン、胃ガン、膀胱ガン、食道ガン、肺ガン（例えば、大細胞、小細胞）  卵巣ガン、精巣ガン、骨髄腫、肉腫、癌腫、脳のガン、及びその他が挙げられる。
【００３３】
好適な実施態様では、治療されるガンとして、ヒト膵臓ガンもしくはヒト前立腺ガンなどのｒａｆ発現腫瘍が挙げられ、そして、化学療法剤として、シスプラチン、ミクソタントロン、エピルビシン、ゲンシタビシン、又はジェムザールが挙げられる。
【００３４】
投与される化学療法剤の量及びレジメンは一般的には、単独で又は他の化学療法剤と組合せて投与されるとき、特定の化学療法剤にとって通常であるようなものであろう。例えば、このような投与量は、特定の化学療法剤に依存して（そして、もし他の療法と組合せられるならば）、約０．００００１ｇ／ｋｇ体重から約１〜５ｇ／ｋｇ体重までの範囲でありうる。化学療法剤は、本発明のオリゴ／カチオン性リポソーム組成物の投与の前、同時、又は後、投与されよう。好ましくは、化学療法剤は、リポソーム組成物の後に投与されよう。主題のカチオン性組成物は、アポトーシスに腫瘍細胞をより感受性にするという理論が立てられる。しかし、本発明者らは、その考えに縛られることを望まない。
【００３５】
カチオン性リポソーム組成物及び化学療法剤は典型的には、非経口で、例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、又はクモ膜下注射によって投与されよう。組成物は一般的には、担体又は賦形剤、例えば、緩衝化生理食塩水を含もう。
また、化学療法剤は、他の療法、例えば、とりわけ、又は上記の、放射線、放射免疫治療（ｒａｄｉｏｍｍｏｔｈｅｒａｐｙ）（ＲＩＴ）、治療用酵素、ホルモン療法、手術と組合せて使用できる。
【実施例】
【００３６】
実施例１
材料及び方法
オリゴデオキシリボヌクレオチド
ヒトｃ−ｒｎｆ−１  ｃＤＮＡの翻訳開始部位に向けられたオリゴデオキシリボヌクレオチド配列は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  ８７５０  ＤＮＡ合成機でベータ−シアノエチルホスホルアミダイト化学を用いて、ｓｔｒａｎｄ  Ｌａｂｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）のＬで合成した。センス（ＡＴＧ−Ｓ）とアンチセンス（ＡＴＧ−ＡＳ）ｒａｆ  ＯＤＮ配列は、それぞれ５’−ＧＣＡＴ−ＣＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣ−３’及び５’−ＧＴＧ−ＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’であった。各端の１つの末端塩基結合を、硫化剤として３Ｈ−１，２−ベンゾ−ジチオール−３−１，  １，１−ジオキシドを用いて、ホスホロチオエート基に修飾した。オリゴは、１５μｍスケールで合成し、逆相クロマトグラフィーカラムで精製した。品質管理のために、各オリゴ調製物の小アリコートを、３２Ｐ末端標識し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２０％アクリルアミド及び５％ビス）、次いで、標識産物のデンシトメトリースキャンで可視化した。
【００３７】
５’−フルオロセイン標識ＡＴＧ−ＡＳ／Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮの合成のために、３’及び５’塩基結合は、上記のようにして、ホスホロチオエート基に修飾した。フルオロセインホスホルアミダイト（１−ジメトキシトリイルオキシ−２−（Ｎ−チオウレア−（ジ−Ｏ−ピバロイル−フルオレセイン）−４−アミノブチルプロピル−３−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホル−アミダイト）を、最後の３回の合成サイクルの間に５’末端に連結した。連結は、アセトニトリル中フルオレセインアミダイト０．１Ｍ溶液０．２５ｍｌとアセトニトリル中テトラゾール０．４５Ｍ溶液０．２５ｍｌの同時添加と１５分のインキュベーションからなっていた。合成後、室温で２４時間、３０％水酸化アンモニウム１．０ｍｌ中で、ＯＤＮを脱保護し、支持体から切断した。脱保護の間、フルオレセイン標識を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いて合成したときと同じ構造に修飾した。精製は、標準逆相クロマトグラフィーカートリッジを用いて行った。精製ＯＤＮは、２０％アセトニトリル１．０ｍｌでカートリッジから溶出し、乾燥し、水に再懸濁した。
【００３８】
カチオン性リポソームの製造
カチオン性脂質である１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）から購入した。ブランクリポソームは、３種のカチオン性脂質の１つ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）をモル比１：３．２：１．６で用い製造した。モル比１：３．２：１．６でＤＤＡＢ、ＰＣ及びＣＨＯＬを用い、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ及びＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮを製造した。要約すると、クロロホルム又はメタノールに溶解した脂質を、回転真空エバポレーターを用い、丸底フラスコ中で蒸発乾固した。乾燥脂質フィルムを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中１．０ｍｇ／ｍｌのＯＤＮ  １ｍｌを加えることによって、４℃で一晩、水和した。フィルムを激しいボルテックスによって分散し、リポソーム懸濁液を浴型音波器（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，  Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で５分間音波処置した。ＯＤＮと脂質との比は、３０μｇＯＤＮ／脂質ｍｇであった。非包埋ＯＤＮを、リポソームを洗浄し、ＰＢＳ中３０分間、２５０００ｇで３回の遠心分離によって除去した。ＯＤＮ包埋効率は、調製物のアリコートのシンチレーションカウントによって求めた（調製物中、微量の３２Ｐ末端標識ＯＤＮを過剰の非標識ＯＤＮに加えた）。リポソームに包埋されたＯＤＮは４℃で保存し、製造２週間以内に使用した。ブランクリポソームは、ＯＤＮの非存在下、正確に上記のようにして製造した。
【００３９】
細胞培養
ＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞は、放射線療法の全過程が失敗した患者の喉頭扁平上皮細胞癌から樹立した。４３  腫瘍細胞は、２０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で単層として増殖させた。
【００４０】
細胞内ｒａｆ  ＯＤＮ取り込み及び安定性アッセイ
対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ細胞を、２０％ＦＢＳ含有培地の６ウエルプレート（１ウエル当たり１×１０６細胞）中に播種した。翌日、細胞を、１％ＦＢＳ含有培地にスイッチし、１０μＭ  ３２Ｐ標識ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ又はＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（１×１０６ｃ．ｐ．ｍ．／ｍｌ）と共に３７℃でインキュベートした。種々の間隔のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処置し、遠心分離した。細胞ペレットをＰＢＳで２回濯ぎ、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）中に再懸濁し、次いで、ＰＢＳで再度洗浄した。この処置によって、膜結合ＯＤＮは剥がれ、残存放射活性を、ＯＤＮの細胞内レベルの代表値として解釈した。次いで、細胞ペレットを１％ＳＤＳに溶解し、細胞内放射活性を、液体シンチレーションカウントによって求めた。
ＯＤＮ安定性研究については、細胞を播種し、１％ＦＢＳ含有培地中、３７℃で４時間、１０μＭ  ３２Ｐ標識ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ又はＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（１×１０６ｃ．ｐ．ｍ．／ｍｌ）とインキュベートした。ＯＤＮとのこの最初のインキュベーション後、細胞を３回ＰＢＳで洗浄し、２０％ＦＢＳ含有培地にスイッチした。種々の時間インキュベーションを続け、次いで、トリプシン処置し、ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを、３７℃、２ｎ間、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、ｐＨ７．４に溶解した。ＯＤＮを、フェノール：クロロホルムで抽出し、水分画を集め、アリコートをシンチレーションカウントで分析した。サンプルは、経時の可能性のあるＯＤＮ流出を補正するために、等しい放射活性について正規化し、次いで、１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル、オートラジオグラフィーを行った。
【００４１】
ｒａｆ  ＯＤＮの薬理学的傾向の研究
雄性Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ，ＵＳＡ；１０〜１２週齢）を、認可された方法に従って、ジョージタウン大学のＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで維持し、自由にプリナ飼料と水を与えた。マウスに、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ又はＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの３０ｍｇ／ｋｇを、尾静脈から静脈注射した。注射後、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間で、各群の１匹の動物から、麻酔下、眼窩後方洞からヘパリン処理チューブに血液を抜き取り、頸部脱臼によって殺した。血液は直ちに４℃、１０分間、３００ｇで遠心分離し、血漿を分離した。肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺を素早く切除し、氷冷正常生理食塩水で濯いだ。血漿と器官は、更なる分析まで、−７０℃で保存した。
アンチセンスｒａｆ  ＯＤＮは、フェノール−クロロホルム抽出法を用いて血漿サンプルから、そしてＤＮＡ抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて組織から、単離した。ｒａｆ  ＯＤＮ濃度標準品を、ブランク血漿又はブランク組織サンプル中にＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの既知量を加え、次いで、上記のように抽出を行って調製した。抽出物を、２０％ポリアクリルアミド／３Ｍ尿素ゲル上にロードし、ＴＢＥ緩衝液中で電気泳動した。ゲルを、１時間、２０Ｖで０．５倍のＴＢＥ緩衝液中、ナイロンメンブランに電気ブロットし、ブロットを、一晩、３０℃でＱｕｉｃｋｈｙｂ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中３２Ｐ標識センスプローブ（ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ）でプローブした。放射標識プローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いたγ−３２−Ｐ−ＡＴＰによるＡＴＧ−Ｓ’ｒａｆ  ＯＤＮの５’末端標識、及び、Ｃｈｒｏｍａ  Ｓｐｉｎ−１０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）での精製によって作製した。全てのバンドの飽和を確保するために、１０〜５０倍過剰のプローブを用いた。コンピュータプログラム（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、オートラジオグラフをスキャンし、種々のサンプル中のＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの量を、標準品と比較して計算した。
【００４２】
Ｓ／ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮのインビボ送達
対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ細胞を、温和な麻酔下、雄性Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの両側の脇腹領域に皮下注射した（２×１０６細胞）。ＯＤＮ処置開始前に、腫瘍を平均腫瘍体積１１５ｍｍ３まで増殖させた。２つの処置経路をたどった：静脈内及び腫瘍内。静脈内送達に関し、マウスを無作為に６群に分けた。各群の３匹のマウスは、５日間、１日当たり６ｍｇ／ｋｇの投与量で、尾静脈を介しボーラス注入によって静脈内に、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ、ＡＴＧ−ＡＳ、ＡＴＧ−Ｓ、ブランクリポソーム、又は正常生理食塩水を受けた。最後の処置後２４時間でマウスを殺し、器官と腫瘍組織を素早く切除し、氷冷正常生理食塩水で濯ぎ、−７０℃で保存した。
腫瘍内送達に関し、マウスを、無作為に３群に分けた。１つの群の３匹のマウスは、７日間、毎日、４ｍｇ／ｋｇのＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮを右脇腹に、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮを左脇腹に、腫瘍内注射を受けた。２つの対照群（１群当たり３匹のマウス）は、正常生理食塩水又はブランクリポソームを受けた。最後の処置後２４時間でマウスを殺し、腫瘍組織を切除し、氷冷正常生理食塩水で素早く濯ぎ、−７０℃で保存した。
【００４３】
Ｒａｆ−１免疫沈澱及びイムノブロッティングアッセイ
インビトロ実験に関し、対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ細胞を、１％ＦＢＳ含有培地中で、種々の投与量と時間間隔で、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ又はブランクリポソームに曝した。インキュベーション後、細胞を、５００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１％  ＮＰ−４０、１０％グリセロール、５ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、２０μｇ／ｍｌロイペプチンを含有する緩衝液に溶解した。ライゼートを、２０分、１６０００ｇの遠心分離で清澄にし、タンパク質濃度を求めた（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）。タンパク質含量に関し正規化した全細胞ライゼートを、プロテインＡ−アガロースが結合した、ヒトＲａｆ−１  ｐ７４の１２カルボキシ（ｃａｒｂｏｓｙ）末端アミノ酸に対するウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、Ｒａｆ−１の免疫沈澱のために使用した。免疫沈澱物を、細胞溶解緩衝液、０．５Ｍ  ＬｉＣｌ  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４で順次洗浄した。免疫複合体を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液で煮沸し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いで、ポリクローナル抗Ｒａｆ−１抗体によるイムノブロッティング、製造業者のプロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ，ＵＳＡ）に基づきＥＣＬ試薬を用いたＲａｆ−１の検出を行った。コンピュータソフトウェアプログラム（Ｉｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，ＵＳＡ）を用いて、Ｒａｆ−１タンパク質発現を定量化した。
インビボ発現研究に関し、腫瘍組織及び器官は、ポリトロンホモジナイザー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて、細胞溶解緩衝液中でホモジナイズした。Ｒａｆ−１発現を、上記のように、免疫沈澱とイムノブロッティングによって組織ホモジネートで分析した。
【００４４】
Ｒａｆ−１プロテインキナーゼ活性アッセイ
対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ細胞を、１％ＦＢＳ含有培地中、８時間、１０μＭ  ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ又はブランクリポソームで処置した。細胞を、上記のように溶解し、タンパク質含量に関し正規化したライゼートを、４℃で一晩、アガロースが結合した抗Ｒａｆ−１抗体で免疫沈澱した。Ｒａｆ−１ホスホトランスフェラーゼ活性を、上記のように２１、３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ塩化マンガン、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰ及び２０μＣｉ［λ−３２Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有するキナーゼ緩衝液中、その生理的基質であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＫＫ１）３２を用いて、インビトロでアッセイした。放射標識反応産物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、オートラジオグラフした。ＭＫＫ１バンドは、Ｉｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、定量化した。
【００４５】
放射線生存投与量応答アッセイ
適当数のＳＱ−２０Ｂ細胞を、２０％ＦＢＳ含有培地中、二連のＴ−２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に播種し、３７℃で８時間、接着させた。培地を、１％ＦＢＳ含有培地で置き換え、細胞を、照射前６時間、１０μＭ  ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ、１０μＭ  ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ又は１０μＭブランクリポソームに曝した。照射は、１３７ＣＳガンマ照射器（ＪＬ  Ｓｈｅｐａｒｄ  ＭＡＲＫ  Ｉ照射器）と線量割合１１４ｃＧｙ／分を用いて行った。細胞を、全線量１Ｇｙ、３Ｇｙ、５Ｇｙ及び１３Ｇｙで照射し、次いで、２時間インキュベートした。次いで、全てのフラスコの培地を、２０％ＦＢＳ含有培地で置換し、インキュベーションを、７〜１０日間続けた。生存コロニーを、固定し、メタノール中０．５％メチレンブルー及び０．１３％石炭酸フクシンで染色した。５０以上の細胞を含むコロニーをスコア化し、データを、コンピュータ作製の、放射線生存応答の単一ヒット多重標的及び線形−２次モデルに適合させた４４。
【００４６】
実験結果
ｒａｆ  ＯＤＮのＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＤＡＢリポソーム製剤は非毒性である
カチオン性リポソームを、材料及び方法で記載したように、モル比１：３．２：１．５の、３種のカチオン性脂質（ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ及びＤＭＴＡＰ）の１つ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、及びコレステロール（ＣＨＯＬ）の組合せを用いて製造した。最初に、放射性標識アンチセンス（ＡＴＧ−ＡＳ）又はセンス（ＡＴＧ−Ｓ）  ｒａｆ  ＯＤＮの微量が、最初のＯＤＮに加えられた調製物のアリコートのシンチレーションカウントによって、リポソームのＯＤＮ捕捉効率を本発明者らは求めた。ＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＤＡＢ製剤は、最大のＯＤＮ捕捉効率を与えた（＞９０％、ｎ＝１０）。ＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＯＴＡＰ及びＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＭＴＡＰリポソームは、非常に細胞毒性であると分かった。従って、以下の実験は、リポソームのＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＤＡＢ製剤を用いて行った。
フルオレセイン標識ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮを用いるフルオレセイン画像解析を行い、リポソーム中へのＯＤＮの包埋を可視化した。比較的大きい（図７）及び小さいリポソーム（２ミクロン未満、データは示さず）を含む非均一サイズ集団のリポソームが得られた。一般的に、リポソームは小さな凝集物を形成する傾向を示したが、それは温和な振盪によって容易に分散できた。ＯＤＮは、脂質二重層と水性空間に分布するように思われた。細胞生存に対するブランクリポソーム（ＢＬ）、リポソーム包埋アンチセンス（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）及びセンス（ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ）ｒａｆ  ＯＤＮの効果を、次に本発明者らは比較した。ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ／Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮの１０．０μＭ以下に相当する濃度でブランクリポソームは、クローン原性生存及びトリパンブルー色素排除法によって測定して、非毒性であった（データは示さず）。しかし、２０μＭ超の投与量でブランクリポソームは細胞毒性を示し、従って、１０μＭ以下の投与量を、以下のインビトロ研究で用いた。インビボ研究に関し、マウスを、２週間、１日投与量６ｍｇ／ｋｇブランクリポソームで静脈内（ｉ．ｖ．）処置し、次いで、次の３０日間、モニターした。体重減少又は不快感の徴候は認められず、このリポソーム製剤は、インビボで非毒性であることを示した。
【００４７】
リポソーム包埋化は、インビトロでのｒａｆ  ＯＤＮ取り込み、及びインビトロとインビボの安定性を高める
遊離ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの２％未満が、低血清（１％）存在下、１００μＭ濃度に曝されたとき、６時間でＳＱ−２０Ｂ細胞により取り込まれ、最大取り込みは、処置後１２時間で約４％であることを本発明者らは以前に示した。本研究では、リポソーム包埋化が、腫瘍細胞でＯＤＮの取り込みと安定性を高めるかを本発明者らは尋ねた。１％血清の存在下、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの細胞取り込みの動力学を図８に示す。ＯＤＮの細胞内レベルは、経時で増加し、インキュベーション後８時間でプラトーに到達した。全適用ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（１０μＭ）の約１３％が細胞に取り込まれた。これらの結果は、腫瘍細胞を、遊離ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮと比べて１０倍低い濃度のＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮで処置したとき、ＯＤＮの細胞内レベルの有意な増加を達成したことを示している。
ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの細胞内安定性を試験するために、４時間放射標識ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（１０μＭ）での細胞の最初の処置後、種々の時間で３２Ｐ標識ＯＤＮを回収した。ＯＤＮの完全性は、材料及び方法で記載したように、変性ゲル電気泳動によって求めた。インタクトなｒａｆ  ＯＤＮ（１５マー）が同定され、分解は、２４時間まで観察されなかった（図８Ｂ  Ｉｇｎｅ）。対照的に、遊離ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの等モル濃度で処置した細胞は、全ての時点で検出可能なＯＤＮを示さなかった（データは示さず）。他の研究では、１５マーＯＤＮは、比較的高いレベルの血清（１５％ＦＢＳ）を含有する培地で２４時間のＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮのインキュベーション後、インタクトであった（データは示さず）。これらの結果は、リポソーム包埋化は、血清ヌクレアーゼ誘導分解からｒａｆ  ＯＤＮを保護することを示唆している。
【００４８】
ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの血漿薬物動態を図３に示す。ｉ．ｖ．投与後、６．３９μｇ／ｍｌのピーク血漿濃度が達成され、インタクトであった。ＯＤＮは２４時間まで検出できた。ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの血漿濃度の減少は、ｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌパターンに従い、最初の半減期（ｔｌ／２β）は、２４．５分で、最後の半減期ｔｌ／２βは、１１．３６時間であった。ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの血漿濃度−時間曲線下の面積は５．９９μｇ．時間／ｍｌであり、全身クリアランスは７５．９４ｍｌ／分／ｋｇであり、分布容積は７４．６７  ｌ／ｋｇであった。対照的に、インタクトで遊離のＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮは、５分でのみ検出でき、血漿濃度は、９．７５μｇ／ｍｌであった。これらの知見は、インビトロの知見と一致し、遊離ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮは、血漿中で急速に分解されるが、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮは、２４時間までの間、循環中に存在することを示唆している。
ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの組織分布を、図４に示す。インタクトなＯＤＮは、４８時間まで検査された全ての器官で検出された（図４ａ）。遊離ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの投与後、インタクトなＯＤＮは、種々の器官で５分でのみ観察され、次いで、分解産物（１５マー未満）が見られた（データは示さず）。担体無しに送達された、完全ホスホロチオエート化ＯＤＮ（Ｓ−オリゴ）の薬物動態プロフィールの以前の報告は、肝臓と腎臓は、ＯＤＮ蓄積の優先的部位であることを示唆している。本発明者らのデータはこれらの研究と一致するが、リポソーム送達が、肝臓と腎臓を含む特定の組織へのＯＤＮのターゲティングを容易にしたかもしれないという可能性も残されている。本知見は、３’と５’の塩基結合のみがホスホロチオエート化されたｒａｆ  ＯＤＮは急速に分解され、リポソーム包埋化は、少なくとも４８時間、種々の器官でＯＤＮ安定性を維持する有効なアプローチであることを示唆している。
【００４９】
リポソーム包埋化ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮは、インビトロでＲａｆ−ａ発現及び活性を阻害する。
時間経過実験により、Ｒａｆ−１タンパク質発現の最大阻害（５２．３±５．７％、約７４ｋＤａ）は、１０μＭ  ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮとの細胞のインキュベーション後８時間で起こったことを明らかにした（図５ａ）。ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（ＡＳ）の阻害効果は、２４時間まで観察された（４５．６±９．８％）。Ｒａｆ−１タンパク質のレベルは、対照未処置細胞（Ｃ）、ブランクリポソーム処置細胞（ＢＬ）、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置細胞（Ｓ）で同等であり（図５ａ）、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮは、ＳＱ−２０Ｂ細胞でＲａｆ−１タンパク質発現を特異的に阻害することを示した。投与量−応答研究は、Ｒａｆ−１発現の３５．９４±１６．８％及び５２．３±５．７％の阻害は、それぞれ５μＭと１０μＭのＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮによる８時間の細胞処置後、起こったことを示した（図５ｂ）。
その生理的基質であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＫＫ１）を用いて、Ｒａｆ−１プロテインキナーゼの酵素活性に対するＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの効果を本発明者らは試験した３２。Ｒａｆ−１プロテインキナーゼ活性は、対照、未処置細胞、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置細胞（１０μＭ、８時間）で同等であった。Ｒａｆ−１タンパク質発現の阻害のレベルと一致して、Ｒａｆ−１プロテインキナーゼのインビトロホスホトランスフェラーゼ活性は、対照細胞と比較して、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置細胞で阻害された（１０μＭ、８時間；６２．６±９．０％）（図６）。
【００５０】
リポソーム包埋化ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮは、インビボでＲａｆ−１発現を阻害する
Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスで、Ｒａｆ−１発現の内因性レベルは、異なる正常組織で異なり、発現レベルは少なくなる順で、肺＞肝臓＞脾臓＞心臓＞腎臓であることが見出された（データは示さず）。興味深いことに、抗Ｒａｆ−１抗体は、腎臓でのみ２つのタンパク質バンド（約７４ｋＤａと約５５ｋＤａ）を認識した。小さい方のフラグメントが、マウス腎臓でのＲａｆ−１のタンパク質分解産物であるかどうかは不明である（図７）。マウスとヒトのｃ−ｒａｆ−１  ｃＤＮＡは、翻訳開始領域で保存ヌクレオチド配列を共有する（Ｌｅｓｚｅｋ  Ｗｏｚｎｏｗｓｋｉ、私信）。従って、正常マウス組織でのＲａｆ−１発現に対するＡＴＧ−ＡＳ／Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮの効果を本発明者らは試験した。遊離ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮのｉ．ｖ．投与後（５日間、１日につき６ｍｇ／ｋｇ）、Ｒａｆ−１発現の阻害は、正常組織で観察されなかった（データは示さず）。しかし、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮではなく、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮのｉ．ｖ．投与（５日間、１日につき６ｍｇ／ｋｇ）により、肝臓（５１．６±１７．４％；ｎ＝３）と腎臓（４２．２±１１．０％；ｎ＝３）でＲａｆ−１（約７４ｋＤａ）の有意な阻害が導かれた（図７）。ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ関連のＲａｆ−１阻害は、心臓と肺では起こらなかった（ｎ＝３，データは示さず）。これらの知見は、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの正常組織傾向プロフィールと一致し、心臓と肺と比較して肝臓と腎臓にＯＤＮの比較的高い蓄積を示した（図４ｂ）。肝臓と腎臓でのＲａｆ−１阻害が、これらの器官に対するいずれかの感知できる毒性と関連するかはまだ不明である。
【００５１】
驚くべきことに、  ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮによるｉ．ｖ．処置により、ＳＱ−２０８腫瘍異種移植片でのＲａｆ−１発現に対する可変の効果が生じ、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置腫瘍異種移植片と比較して３７．６〜５７．６％の範囲の阻害レベルであった（ｎ＝３）（図７）。これを、灌流の乏しい腫瘍部位へのＯＤＮの送達を妨げる、異なる異種移植片での腫瘍血管系の差異によるものと本発明者らは解釈する。遊離ＡＴＧ−ＡＳ／Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ（Ｓ）、ブランドリポソーム、又は正常生理食塩水（Ｃ）による静脈内処置は、未処置対照と比べて、腫瘍組織でのＲａｆ−１発現に効果を有さなかった。ｉ．ｖ．処置後観察されたＲａｆ−１阻害のレベルの変動により、Ｒａｆ−１発現に対するＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ又はＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮの腫瘍内投与の効果を研究することを本発明者らはうながされた。図８に示す結果は、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮと比べて、ＬＥ−ＡＴＦ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮによる腫瘍内処置後、ＳＱ−２０Ｂ腫瘍異種移植片でのＲａｆ−１タンパク質発現の有意な阻害を示す（６０．３±５．４％；１１−３）。一緒に考えて、これらのデータは、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮは、インビボで配列特異的様式でＲａｆ−１発現を阻害することを示している。
【００５２】
リポソーム包埋化ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮによって処置されたＳＱ−２０Ｂ細胞は放射線感受性である。ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ、又はブランクリポソームに曝されたＳＱ−２０Ｂ細胞の放射線生存線量応答を表１に示す。ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ／ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ又はブランクリポソームで処置した細胞のプレーティング効率は同等である（表１）。単一ヒット、多重標的（標的モデル）及び線形−２次関数モデル（ＬＱ）は、細胞の放射線生存を解析するのに最も一般的に使用される。標的モデルは、パラメーターＤ０及びｆｌに基づく。Ｄ０は、生存曲線の末端傾斜の逆数であり、ｆｌは、縦軸へのこの傾斜の外挿である。Ｄ０値が大きい程、細胞は、放射線誘導細胞殺滅に耐性である。別のパラメーターＤｑは、末端傾斜線が横軸を横切るとき、生存曲線の肩部（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）の測定値である。ＬＱモデルは、２つの主要なパラメーターを有する：α、低線量で放射線応答を特徴づける線形成分；β、高線量で応答を特徴づける二次成分。α値が大きい程、細胞は放射線に感受性になる。モデルフリーパラメーターＤは、平均不活化線量といわれ、線形座標にプロットされた生存曲線下面積を示す。クローン原性細胞生存データは、放射線生存応答の単一ヒット多重標的及び線形−二次モデルにコンピュータフィッティングされた。ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮによる処置後、ＳＱ−２０Ｂ細胞の、放射線生物学的パラメーターＤ、Ｄ０及びＤ０の値で観察された有意な減少は、Ｒａｆ−１プロテインキナーゼのアンチセンス配列特異的阻害と放射線感受性との間の良き連関を示唆する。平均不活化線量の比に基づき、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置（１０μｍ）の線量修飾係数（ＤＭＦ）は約１．６であった。これらのデータは有意である。なぜなら、遊離ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの１０倍高い濃度が、ＳＱ−２０Ｂ細胞の放射線増感の同等のレベルを達成するのに必要であるからである（ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ、１００μｍ；ＤＭＦ約１．４）
【００５３】
【表１】
2005517721.tif 000002
【００５４】
適当数の細胞を、材料及び方法で説明したように、各実験での１投与当たり二連のＴ−２５フラスコに播種した。ブランクリポソーム処置、ＬＥ−ＡＴＧ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置の細胞のプレーティング効率は、それぞれ６５〜７９％、５２〜８３％及び５９〜９０％であった。
種々のパラメーターの複合値は、ＬＥ−ＡＴＧ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置細胞を用いて行われた３つの実験と、ブランクリポソーム処置細胞を用いて行われた２つの実験から得た。
【００５５】
解析
上記結果は、本発明のカチオン性リポソーム製剤（ＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＤＡＢ）は幾つかの利点を有することを示した。具体的には、ＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＤＡＢリポソーム製剤は、非毒性であると分かり、高いＯＤＮ包埋化効率を与えた。
これらのカチオン性リポソームは、アンチセンスオリゴを安全かつ有効に輸送する適切なビヒクルであることを示す幾つかのインビボパラメーターを本発明者らは同定した。蛍光顕微鏡に基づき、オリゴは脂質二重層の内側に捕捉されうるように思われる（図１）。脂質シート又はチューブ内へのプラスミドＤＮＡの包埋化を示した最初の報告を本知見は拡張する。血漿と組織のレベルを同時に測定することによって、オリゴのリポソーム包埋化は、血漿での分解からこれらの比較的小さなＤＮＡ断片を保護し、その組織蓄積を容易にすることも本発明者らは示す（図３と４）。リポソームによってインビボで保持される循環アンチセンスｒａｆオリゴは、少なくとも２４時間インタクトであるが、遊離オリゴは、５分後に検出できなかった。これらのデータは、３’と５’末端で２つの末端ホスホロチオエート結合のみを有するホスホジエステルオリゴは、非ブロックのホスホジエステルオリゴと似ており、これらのオリゴは、血液から急速に消え、殆ど組織蓄積を示さないということを示す以前の報告と一致している。本発明者らのリポソーム調製物でのコレステロールと共でのＰＣの使用は、循環でのオリゴの長時間保持及びオリゴの組織傾向や安定性を容易にしたかもしれないという仮説が立てられる。
【００５６】
粒子サイズは、リポソームの生体分布や細胞侵入経路に主要な役割をもつことが示されてきた。大きなリポソームは、細網内皮系に主に分布し、他の組織では無視できる一方、小さなリポソームは他の器官に局在化する。更に、不均一サイズ分布の多層ベシクルのクリアランスは、二相パターンに従う。大きなリポソームは急速クリアランスをもち、小さなリポソームは、遅い速度のクリアランスをもつ。オリゴヌクレオチド含有のカチオン性リポソームの生体分布に関しては限定された情報しか得られない。Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒと共同研究者たちは、直径約２．０ミクロンのカチオン性リポソームと複合体形成したオリゴヌクレオチドは、一時的に肺に取り込まれ、次に肝臓に急速に分布することを以前に報告した。最近の研究は、エンドサイトーシスは、カチオン性リポソームを介するオリゴヌクレオチドの送達の主要経路であることを示した。本発明者らのリポソーム製剤は大きいリポソームと小さいリポソームの両方からなった。上記考えと一致して、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮのクリアランスは、二相パターンに従い、肝臓に優先的に分布することを本発明者らは示す。
【００５７】
リポソーム包埋化アンチセンスｒａｆオリゴは非毒性であって、配列特異的様式でインビトロとインビボでＲａｆ−１発現を阻害した（図５〜８と表１）。ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ投与の静脈内及び腫瘍内経路により、ＳＱ−２０Ｂ腫瘍組織でＲａｆ−１発現の有意な阻害が生じたことは注目すべきことであり、全身と局所の投与の両方に関し、この化合物の潜在的適用性を示唆している。更に、リポソーム包埋化アンチセンスｒａｆオリゴで処置された腫瘍細胞は、対照細胞と比べて放射線感受性であった（表１）。より最近、Ｄｒ．Ｂｒｅｔｔ  Ｍｏｎｉａ（ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）との共同研究で、ＳＱ−２０Ｂ腫瘍異種移植片モデルでのリポソーム包埋化アンチセンスｒａｆオリゴ（５１３２）の放射線増感効果を示すように、実験が開始された。胸腺欠損マウスで今までに得られたインビボデータは有望である（Ｇｏｋｈａｌｅら、未発表データ）。本結果は、放射線と組合せてＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮのリポソーム送達は、ガン、特に標準放射線療法に耐性であるガンの治療の有効な遺伝子ターゲティングアプローチでありうることを示唆する。
【００５８】
実施例２
材料及び方法
細胞培養
ＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞を、２０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で単層として増殖させた。
【００５９】
オリゴデオキシリボヌクレオチド
ヒトｃ−ｒａｆ−１  ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に対応する２０マーホスホロチオエートアンチセンスＯＤＮ（ＩＳＩＳ  ５１３２／５１３２：５’−ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＣＴＧ−ＴＧＡ−ＣＡＴ−ＧＣＡ−ＴＴ−３’）と７塩基ミスマッチのホスホロチオエートアンチセンスＯＤＮ（ＩＳＩＳ  １０３５３／１０３５３；５’−ＴＣＣ−ＣＧＣ−ＧＣＡ−ＣＴＴ−ＧＡＴ−ＧＣＡ−ＴＴ−３’）を設計し、以前に記載されたように（Ｍｏｎｉａら、１９９６ａ，ｂ）合成した。２０マー  ホスホロチオエートセンスＯＤＮ（５’−ＡＴＴ−ＧＣＡ−ＴＧＴ−ＣＡＣ−ＡＧＧ−ＣＧＧ−ＧＡ−３’）を、以前に記載されたように（Ｓｏｌｄａｔｅｎｋｏｖら、１９９７）、Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ  Ｌａｂｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で合成した。
【００６０】
カチオン性リポソームの製造
ＯＤＮを、以前に記載されたように（Ｇｏｋｈａｌｅら、１９９７）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ホスファチジルコリン及びコレステロール（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）をモル比１：３，２：１，６で用いて製造されたカチオン性リポソームに包埋した。要約すると、クロロホルム又はメタノールに溶解した脂質を、回転真空エバポレーターを用い、丸底フラスコ中で蒸発乾固した。乾燥脂質フィルムを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中１．０ｍｇ／ｍｌで５１３２／１０３５３を加えることによって、４℃で一晩、水和した。フィルムを、激しいボルテックスによって分散し、リポソーム懸濁液を、浴型音波器（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）中で５分間音波処置した。ＯＤＮ／脂質の比は、３０μｇＯＤＮ／脂質ｍｇであり、９０％超の包埋化効率が得られた。リポソームに包埋したＯＤＮ（ＬＥ−５１３２／ＬＥ−１０３５３）は４℃で保存し、１週間以内に使用した。ブランクリポソーム（ＢＬ）を、ＯＤＮの非存在下、正確に記載したようにして製造した。
【００６１】
Ｒａｆ−１免疫沈澱及びイムノブロッティングアッセイ
インビトロ発現研究に関し、１日目、対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ細胞を、６時間、１％ＦＢＳ含有培地中ＬＥ−５１３２，５１３２，ＬＥ−１０３５３，又はＢＬの種々の濃度に曝した。次いで、細胞を、２０％ＦＢＳ含有培地で洗浄し、リポソームを除去し、２０％ＦＢＳ含有培地でのインキュベーションを、ＬＥ−５１３２及び５１３２処置群では５１３２の存在下、そしてＬＥ−１０３５３群では１０３５３の存在下、一晩（１８時間）続けた。２日目、細胞を新鮮な３０％ＦＢＳで濯ぎ、次いで、更に２４時間、１日目のように処置スケジュールの第２のコースを行った。この方法は、ＬＥ−５１３２の細胞の最小暴露を与えた（１２時間）。次いで、細胞を、５００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐｈ７．２）、１％ＮＰ−４０、１０％グリセロール、５ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、２０μｇ／ｍｌロイペプチンを含有する緩衝液に溶解した。ライゼートを、２０分間、１６，０００ｇの遠心分離で清澄にし、タンパク質濃度を求めた（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。タンパク質含量に関し正規化した全細胞ライゼートを、プロテインＡ−アガロース結合の、ヒトＲａｆ−１  ｐ７４の１２カルボキシ末端アミノ酸に対するウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて、Ｒａｆ−１の免疫沈澱のために使用した。免疫沈澱物は、細胞溶解緩衝液、０．５Ｍ  ＬｉＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で順次洗浄した。免疫複合体を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で煮沸し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。その後、ポリクローナル抗Ｒａｆ−１抗体によるイムノブロッティング、製造業者のプロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に基づきＥＣＬ試薬を用いてＲａｆ−１の検出を行った。コンピュータソフトウェアプログラムＩｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、Ｒａｆ−１タンパク質レベルを定量化した。
インビボ発現研究に関し、腫瘍組織は、ポリトロンホモジナイザー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を用いて、細胞溶解緩衝液中でホモジナイズした。Ｒａｆ−１発現を、上記のように、免疫沈澱とイムノブロッティングによって組織ホモジネートで分析した。
【００６２】
インビトロ凝固アッセイ
凝固、アッセイは、ＬＥ−５１３２又は５１３２の既知濃度を含む正常ヒト血漿を用いて行った。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を、血漿サンプルにＡＰＴＴ試薬（オラジックアシッド（ｏｌｌａｇｉｃ  ａｃｉｄ）活性化剤を含むウサギ脳セファリン抽出物）（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、次いで、製造業者の推奨（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従ってクロット形成を開始するために塩化カルシウムの添加の後、測定した。
可視クロットを形成するのに必要な時間を手動で記録した。
【００６３】
薬物動態研究
雄性Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（ｍｉｃｓ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を、認可された方法に従って、ジョージタウン大学のｔｈｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅで維持し、自由にプリナ飼料と水を与えた。マウスに、ＰＢＳ中に処方したＬＥ−５１３２又は５１３２の３０ｍｇ／ｋｇを、尾静脈を介しｉ．ｖ．注射した。注射後、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間で、動物から、麻酔下、眼窩後方洞からヘパリン処理チューブに血液を抜き取り、頸部脱臼によって殺した。血液を直ちに４℃で１０分間、３００ｇで遠心分離し、血漿を分離した。肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺を素早く切除し、氷冷正常生理食塩水で濯いだ。血漿と器官を、更なる分析まで、−７０℃で保存した。
血漿と組織のサンプル中のアンチセンスｒａｆ  ＯＤＮ濃度を、本発明者らが前に記載したように（Ｇｏｋｈａｌｅら、１９９７）検出した。要約すると、ＯＤＮを、フェノール−クロロホルム抽出法を用いて血漿サンプルから、そしてＤＮＡ抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて組織から、単離した。ｒａｆ  ＯＤＮ濃度標準品を、ブランク血漿サンプル又はブランク組織サンプル中に５１３２の既知量を加え、次いで、上記のように抽出を行って調製した。抽出物を、２０％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上にロードし、ＴＢＥ緩衝液中で電気泳動した。ゲルを、１時間、２０Ｖで０．５倍のＴＢＥ緩衝液中、ナイロンメンブランに電気ブロットし、ブロットを、一晩、３０℃でＱｕｉｃｋｈｙｂ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中［３２Ｐ］標識センスｒａｆ  ＯＤＮプローブでプローブした。全てのバンドの飽和を確保するために、１０〜５０倍過剰のプローブを用いた。コンピュータプログラム（Ｉｍａｇｅ−Ｑｕａｎｔソフトウェア）を用い、オートラジオグラフをスキャンし、サンプル中のアンチセンスｒａｆ  ＯＤＮの量を、標準品と比較して計算した。
【００６４】
インビボＬＥ−５１３２処置及び照射方法：抗腫瘍有効性研究設計
対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ細胞を、温和な麻酔下、雄性Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの左脇腹領域にｓ．ｃ．を注射した（２×１００細胞）。処置の開始前に、平均腫瘍体積ほぼ７２〜９４ｍｍ３まで腫瘍を増殖させた。腫瘍体積は、３主軸（ａ，ｂ，ｃ）のキャリパー測定から求め、楕円体積（πａｂｃ／６）の近似であるａｂｃ／２を用いて計算した。
【００６５】
各実験に関し、腫瘍担持マウスを異なる処置群に無作為に分けた（１群当たり５〜７匹）。マウスのＯＤＮ群は、合計１２〜１８日、１日当たり又は隔日に６〜１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、又は両方の方法によって、ＬＥ−５１３２をｉ．ｖ．で受けた。ＩＲ群の腫瘍を、［１３７ＣＳ］照射器を用いて照射した（Ｊ．Ｊ．Ｓｈｅｐａｒｄ  Ｍａｒｋ  Ｉ）。動物拘束及び正常組織の遮蔽は、特殊形態の２．５ｃｍ厚さの鉛遮蔽の後に搭載されたヒンジ式半円筒プラスチックチャンバー内で行った。腫瘍担持後肢は、チャンバーの穴から突出し、照射に曝される１．６ｍｍ  Ｐｌｅｘｉｇｌａｓプラットフォーム上に肢をテーピングすることにより搭載した。ＴＬＤ線量測定を用い、実験照射条件、及びカスタムメードで組織等価なマウス模型（ｐｈａｎｔｏｍ）を使い、前もって腫瘍の中央及びマウス身体への平均線量割合を求めた。線量分布を、幾匹かのマウスで確認した。１８日間まで１日当たり３．８Ｇｙで２．３７Ｇｙ／分の線量割合で、腫瘍に照射を行った。全身の線量は、腫瘍線量の５％未満（０．１９Ｇｙ／日）であった。どのマウスでも、実験継続中に胃腸問題は認められなかった。動物の併用処置群は、０日にＬＥ−５１３２を受け、１〜６日と、８、１０、１２日に、３〜４時間の間隔でＬＥ−５１３２とＩＲを受けた。更に、この群は、７、９、１１、１３〜１８日にＩＲだけを受けた。２つの対照群のうち、１つは、ＬＥ−３１３２（ＢＬ）と同じ投与スケジュールでＢＬを受け、他方は、未処置であった（Ｃ）。腫瘍体積を、１週に１度又は２度、そして最終処置後１２〜２７日間モニターした。
腫瘍体積を、最初の腫瘍体積（０日、投与の第１日）のパーセントとして計算し、平均腫瘍体積±ＳＥをプロットした。分散解析（１方向ＡＮＯＶＡ）を行って、最終処置後１２日で観察された腫瘍体積の変化の統計的有意性を求めた。
【００６６】
組織病理学
腫瘍組織を、最後の処置後２４時間で代表的処置群から切除し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン切片を、ヘマトキシリン／コシン染色後、顕微鏡で解析した。断片化クロマチンを含むアポトーシス細胞などの組織学的変化は、光学顕微鏡（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）下でスコア化した。１フィールド当たり約１００個の細胞をもった１０個のフィールドを、各処置群でスコア化した。
【００６７】
実験結果
ＬＥ−５１３２は、インビトロでＲａｆ−１発現を阻害する
Ｒａｆ−１発現のアンチセンスＯＤＮ配列特異的阻害を確立するために、ＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞を、５１３２、ＬＥ−５１３２、７個の塩基ミスマッチのＬＥ−１０３５３で処置した（図９Ａ）。以前に、５１３２によるＲａｆ−１のインビトロ阻害は、リポフェクチンを必要とすることが示されている（Ｍｏｎｉａら、１９９６ａ）。それと一致して、５１３２は、細胞培養で無効であると分かった（図９Ａ、レーン４と６）。Ｒａｆ−１タンパク質のレベルの有意な低下が、インビトロで、５１３２処置と比較してＬＥ−５１３２で観察された（図９Ｂ、０．５μＭ  ＬＥ−５１３２  ＬＥ−５１３２、７１．３±２２．５％；１．０μＭ  ＬＥ−５１３２、７９．６％±１６．７％）。リポソーム包埋化ミスマッチアンチセンスＯＤＮ（ＬＥ−１０３５３）は、未処置又はＢＬ処置細胞と同等のＲａｆ−１発現を示した（図９Ａ、レーン７〜９）。一緒に考えると、これらのデータは、ＳＱ−２０Ｂ細胞でのＬＥ−５１３２のアンチセンス配列特異的力価を確立する。
【００６８】
ＬＥ−５１３２は、インビトロで凝固に影響しない
ＯＤＮを安全かつ有効に送達するための、カチオン性リポソームの臨床適用に向けてのステップとして、正常ヒト血漿を用いて、凝固時間に対する５１３２及びＬＥ−５１３２の効果を本発明者らは比較した。正常ヒト血漿への５１３２の添加は、クロッティング時間の濃度依存性延長をもたらした（図１０）。ＡＰＴＴの約９５％及び１９７．５％の増加が、それぞれ５１３２の１００μｇ／ｍｌ及び２００μｇ／ｍｌの存在下、インビトロで観察された一方、ＡＰＴＴの僅かな増加のみが、ＬＥ−５１３２（１００μｇ／ｍｌ，１３％；２００μｇ／ｌ，１４．５％）で観察された。同一濃度範囲のＢＬは、ＡＰＴＴに影響を示さなかった（データは示さず）。
【００６９】
リポソーム包埋化は、５１３２の薬物動態を高める
ＬＥ−５１３２又は５１３２の単回ｉ．ｖ．ボーラス投与後、薬物動態パラメーターを得た。図１１ＡとＢに示されるように、インタクトなＯＤＮは、両方の場合で少なくとも８時間まで、血漿で検出できた。ＯＤＮ投与後５分でのピーク血漿濃度は、ＬＥ−５１３２と５１３２に関しそれぞれ、２８．５μｇ／ｍｌと１３．５μｇ／ｍｌであった。ＬＥ−５１３２と５１３２の血漿濃度の減少は、ｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌパターンに従い、最初の分布半減期（ｔ１／２β）はそれぞれ、３４．分と２１．６分であった。ＬＥ−５１３２と５１３２での最終半減期（ｔ１／２β）は、それぞれ１４．５時間と４．３時間であった。表２に示すように、血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、５１３２と比べてＬＥ−５１３２では５．８倍高く、インタクトなＯＤＮのクリアランス速度は、ＬＥ−５１３２と比較して５１３２では高かった。
【００７０】
ＬＥ−５１３２と５１３２の正常組織分布プロフィールを、図１２でＡＵＣの関数として示す。どちらの処置後でも、インタクトなＯＤＮは、検査した器官で４８時間まで検出できた（データは示さず）。しかし、ＬＥ−５１３２の組織分布は、遊離のホスホロチオエート化ＯＤＮである５１３２とは異なっていた。５１３２投与と比較して、ＬＥ−５１３２投与後、インタクトなＯＤＮの有意に高いレベルが、肝臓（１８．４倍）と脾臓（３１倍）で測定できた。僅かに高いＯＤＮレベルが、遊離ＯＤＮと比較して、ＯＤＮのリポソーム送達を介し他の器官で認められた（心臓３倍；肺１．５倍）。興味深いことに、腎臓でのインタクトなＯＤＮのレベルは、ＬＥ−５１３２では低かった（０．７７倍）。行われた更なる研究は、５１３２処置と比較して、ＬＥ−５１３２処置後、ＳＱ−２０Ｂ腫瘍組織で適度に高いＯＤＮレベルを示した（１．４倍）。
【００７１】
ＬＥ−５１３２はＳＱ−２０Ｂ腫瘍増殖を阻害する
図１３に示すように、ＬＥ−５１３２の抗腫瘍効果は、処置開始後１週間以内に観察され、平均腫瘍体積は、次の処置過程の間、減少し続けた。処置の最終日（１９日）、ＬＥ−５１３２とＢＬ群でそれぞれ、最初の体積（０日、１００％）の４２．０％±５．５％と２９０．６％±２６．６％であった。ＬＥ−５１３２群の腫瘍体積は、最後の投与後６〜１０日内に最初の体積に到達した。処置後全ての時点で、ＬＥ−５１３２群とＢＬ群で、腫瘍体積の顕著な差異が認められた。研究は３０日で終わり、その時点で、ＢＬ群の平均腫瘍体積は、ＬＥ−５１３２群のそれより約３．４倍大きかった。
【００７２】
他の研究では、ＬＥ−５１３２と５１３２の抗腫瘍効能を本発明者らは比較した。ＬＥ−５１３２又は５１３２（１０ｍｇ／ｋｇ）を、最初の７日間毎日、腫瘍担持マウスにｉ．ｖ．投与し、続いて、隔日に３回の更なる投与を行った。対照群は、ＢＬで同様の処置を受けるか、又は全く処置されなかった（Ｃ）。腫瘍体積を、合計３５日間モニターした。０日（１００％）と比較して３５日の平均腫瘍体積は、ＢＬ，４２７．８％±３２．５％；Ｃ，４０５．３％±２６．８％；５１３２，１５９．６％±１０．０％；ＬＥ−５１３２，１０５．３％±６．３％であった。ＡＮＯＶＡを行い、３５日で種々のカテゴリーでの平均腫瘍体積の差異の有意性を求めた。腫瘍増殖パターンは、ＢＬ及びＣ対照群で同等であった。５１３２群とＬＥ−５１３２群は、ＢＬ群及びＣ群に対し有意な抗腫瘍活性を示した（ｎ＝５，ｐ＜０．０００１）。しかし、ＬＥ−５１３２群は、５１３２に対しより大きな抗腫瘍活性を示した（ｎ＝５，ｐ＜０．００１）。これらのデータは、リポソーム包埋化形態での５１３２の、比較的増加した血漿、正常組織、および腫瘍のレベルと一致する。
【００７３】
ＬＥ−５１３２は、インビボでＲａｆ−１発現を阻害する
相対的Ｒａｆ−１タンパク質レベルを、ＬＥ−５１３２±ＩＲ又はＢＬに曝されたマウスのＳＱ−２０Ｂ腫瘍組織で測定した（図１４）。
【００７４】
【表２】
2005517721.tif 000003
【００７５】
ＬＥ−５１３２群では、Ｒａｆ−１発現は、それぞれ７日と１４日に、ＢＬ群（１００％）と比較して３５．５％±１３．４％及び２７．７％±１３．３％であると分かった。Ｒａｆ−１発現の阻害はまた、ＬＥ−５１３２とＩＲの組合せで処置したマウスでＳＱ−２０Ｂ腫瘍で認められた。ＩＲ処置だけでは、未処置又はＢＬ対照と比較してＲａｆ−１発現を変化させなかった（図１４）。
【００７６】
ＬＥ＝５１３２は腫瘍の放射線増感剤である
ＳＱ−２０Ｂ細胞を、放射線療法の失敗後の腫瘍から樹立し、ＬＥ−５１３２処置は、処置過程中、腫瘍増殖阻害を引き起こしたので、この相対的に放射線耐性の腫瘍の増殖の制御が、ＬＥ−５１３２とＩＲ処置の組合せによって達成できるかどうかを本発明者らは尋ねた。ＬＥ−５１３２（１０ｍｇ／ｋｇ）を、１２日にわたって（０日〜１２日）１０回投与した。この処置は、最後の投与（１９日）後最大１週間、対照群のマウス（未処置及びＢＬ）と比較して腫瘍増殖阻害を引き起こした。この後、腫瘍体積の着実な増加が起こった（図１５Ａ）。ＩＲ（３．８Ｇｙ／日）を、１８日間毎日与えた。この群では、平均腫瘍体積の穏当な低下が、２６日までに観察された（最初の体積の１４．９％±７．１％）（図７Ａ）。その後、腫瘍は増殖し、３〜７日の次内に最初の体積に到達した。ＬＥ−５１３２とＩＲ処置の組合せは、２６日までに平均腫瘍体積の有意な減少を引き起こした（最初の体積の５７．９％±８．０％）。３０日までに、最初の体積（１００％，０日）と比較して平均腫瘍体積は、ＬＥ−５１３２，１２２．５％±１３．８％；ＩＲ，１１３．８％±１７．６％；ＬＥ−５１３２＋ＩＲ，４３．５％±２．９％；ＬＢ／未処置対照，３７０．８％±１５．６％であった（図１５）。ＬＥ−５１３２群とＩＲ群の両方は、ＢＬ及び未処置群に対し有意な腫瘍増殖阻害を示した（ｐ＜０．００１）。統計学的解析は、腫瘍体積の差は、ＬＥ−５１３２群に対しＩＲでは有意ではなかったことを示した。非常に重要なことだが、ＬＥ−５１３２＋ＩＲ群は、ＬＥ−５１３２、ＩＲ、ＢＬ、未処置群に対し有意に大きな抗腫瘍活性を示した（ｐ＜０．００１）（図１５Ｂ）。
【００７７】
ＬＥ−５１３２及びＩＲ処置の組合せは、インビボでアポトーシスの有意な増加を引き起こす
種々の処置群の代表的腫瘍を、組織病理学的試験の最後の処置の２４時間後、切除した。壊死細胞とアポトーシス細胞の両方が、未処置群と比較してＬＥ−５１３２又はＩＲ群で見られた。更に、インタクトな核を含む生細胞の一部のクローン再増殖がＩＲ群で観察された（データは示さず）。非常に断片化された核を含むアポトーシス細胞の割合は、単一剤又は未処置対照群と比較してＬＥ−５１３２＋ＩＲ群ではかなり大きかった（図１６）。異なる群でスコア化したアポトーシス細胞／生細胞の相対数の比は、Ｃ，０．０６  ＬＥ−５１３２，０．６４；ＩＲ，０．７２；ＬＥ−５１３２＋ＩＲ，２．４６であった。
【００７８】
考察
アンチセンスＯＤＮ治療剤は、増殖又は生存のシグナルの配列特異的阻害により抗ガン剤の有効性を増大する新規なアプローチである。本発明者らの知識では、この報告は、動物腫瘍モデルで放射線増感剤又は化学増感剤として、十分にキャラクタライズされたアンチセンスＯＤＮの有効性の第１の証拠を提供する。ＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞は、放射線療法の全過程で成功しなかった患者の喉頭扁平上皮細胞癌から樹立した。放射線又はアンチセンスＯＤＮ処置単独では、ＳＱ−２０Ｂ腫瘍増殖の一過性の阻害を引き起こしたが腫瘍退行は引き起こさなかった一方、アンチセンスｒａｆ  ＯＤＮと放射線処置の組合せにより、処置後、少なくとも２７日間、持続した腫瘍退行が生じた（図１３と図１５）。これらのデータは、細胞増殖と生存におけるＲａｆ−１の役割を支持し、新規インビボ放射線増感剤としてアンチセンスｒａｄ  ＯＤＮを確立する。
【００７９】
ＳＱ−２０Ｂ細胞と腫瘍のＬＥ−５１３２処置後のＲａｆ−１タンパク質発現の有意な阻害を本発明者らは見出し、ＬＥ−５１３２は、インビトロとインビボで生物活性化合物であることが示唆された（図９と１４）。５１３２配列は、マウスで保存されないヒトｃ−ｒａｆ−１の３’ＵＴＲに相当するので、正常マウス組織でのＲａｆ−１の阻害は研究できなかった。以前の研究では、他の潜在的な毒性効果のうち、ＰＳ−ＯＤＮ処置は、クロッティング時間の投与量依存性延長と関連する傷つけを引き起こすことが示されている。５１３２を含むＰＳ−ＯＤＮの補体及び凝固の効果は、投与レジメンを変更することによって避けることができた。本発明者らの結果は、５１３２（ＬＥ−５１３２）のリポソーム包埋化は、凝固時間の変化を防止することを示している（図１０）。また、ＯＤＮのリポソーム送達は、血液学的変化と補体活性化を含む、ＰＳ−ＯＤＮの他の配列非依存的副作用の多くを緩和しうる。５１３２のリポソーム製剤の血漿濃度と大部分の組織レベルでの有意な上昇が、遊離の５１３２と比較して観察された（図１１と１２と表２）。これと一致して、ＬＥ−５１３２の抗腫瘍力価は、５１３２のそれより有意に高いことが見出された。一緒に考えると、これらのデータは、リポソーム包埋化は、インビボでＯＤＮ輸送の効力ある方法であることを示唆している。
【００８０】
Ｒａｆ−１発現の阻害がＩＲ誘導細胞毒性を増大させる機構ははっきりとしない。抗アポトーシス又は生存因子としてのＲａｆ−１の役割は、成長因子欠乏造血細胞とｖ−ａｂｌ−形質転換ＮＩＨ／３Ｔ３細胞で証明されている（Ｔｒｏｐｐｍａｉｒら、１９９２；Ｗａｎｇら、１９９６，Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒら、１９９７）。幾つかの報告は、細胞死と細胞生存シグナルとの間のバランスは、遺伝毒性または非遺伝毒性ストレスに曝された細胞の運命を決定することを示している。ＩＲは、Ｒａｆ−１プロテインキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、転写因子ＡＰ−１とＮＫ−κＢを含む種々の型のシグナル分子を活性化することが示されている（Ｋａｓｉｄ及びＳｕｙ，１９９８でレビューされている）。１つの可能性は、Ｒａｆ−１は、照射細胞に防御的役割を有しうるということである。ＩＲ又はＬＥ−５１３２とＩＲとの組合せによって処置したＳＱ−２０Ｂ細胞で、Ｂｃｌ−２ファミリーのプロアポトーシスメンバーであるＢａｘタンパク質のレベルの増加を本発明者らは観察した（データは示さず）。放射線誘導性Ｂａｘ発現は、アポトーシスと相関していた（Ｚｈａｎら、１９９４）。更に、組織病理的検査は、ＬＥ−５１３２、ＩＲ、又は未処置対照群と比較して、ＬＥ−５１３２＋ＩＲ処置群でアポトーシスの指標である、フラグメント化クロマチンを含有する腫瘍細胞の有意な割合を示した（図１６）。それらのデータは、Ｒａｆ−１は、照射細胞で、抗アポトーシスシグナル経路を促進するのに役立ちうることを示唆している。次いで、アンチセンスｒａｆ  ＯＤＮによるＲａｆ−１の阻害は、腫瘍の放射線耐性の逆転を含むＩＲ−応答性プロアポトーシスシグナルの実質的効果を生じよう。
【００８１】
実施例３
材料及び方法
ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬリポソームの製造
モル比１：３．２：１．６の１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）：ホスファチジルコリン（ＰＣ）：コレステロール（ＣＨＯＬ）を有するリポソームであって、その中に抗腫瘍ｒａｆオリゴヌクレオチド（ＡＴＧ−ＡＳ）を包埋化したリポソームは、以前に記載したのと実質的に同じ方法を用いて製造した。
【００８２】
インビトロ結果
Ａ）ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬから構成されるリポソームに包埋化されたアンチセンスｒａｆオリゴデオキシリボヌクレオチドの細胞取り込みの増大
投与量−応答取り込み実験：ＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞を、放射標識（３２Ｐ−γＡＴＰ）と、リポソーム包埋化形態（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）又は遊離形態（ＡＴＧ−ＡＳ）の示された投与量の非標識アンチセンスｒａｆオリゴヌクレオチド（ＡＴＧ−ＡＳ）との混合物とインキュベートした（図１７）。処置は、１％血清含有培地中で３７℃、４時間続いた。インキュベーション後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン処置で剥離し、遠心分離で集めた。細胞ペレットをＰＢＳで２度洗浄し、次いで、細胞を、１％ドデシル硫酸ナトリウムに溶解した。細胞によって取り込まれたＡＴＧ−ＡＳの量の指標である細胞内放射活性を、液体シンチレーションカウントによって測定した。図１７に示すデータは、ＡＴＧ−ＡＳと比べて、試験した全ての投与量でＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳの細胞内取り込みの有意な増加を示す。
【００８３】
時間経過取り込み実験：ＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞を、放射標識（３２Ｐ−γＡＴＰ）と、リポソーム包埋化形態（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）又は遊離形態（ＡＴＧ−ＡＳ）の４μＭの非標識アンチセンスｒａｆオリゴヌクレオチド（ＡＴＧ−ＡＳ）との混合物とインキュベートした。処置は、１％血清含有培地中で３７℃で示された時間続いた（図１８）。インキュベーション後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン処置で剥離し、遠心分離で集めた。細胞ペレットをＰＢＳで２度洗浄し、次いで、細胞を、１％ドデシル硫酸ナトリウムに溶解した。細胞によって取り込まれたＡＴＧ−ＡＳの量の指標である細胞内放射活性は、液体シンチレーションカウントによって測定した。図１８に示すデータは、ＡＴＧ−ＡＳと比べて、試験した全ての時点（１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、１６時間、２４時間）でＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳの細胞内蓄積の有意な増加を示す。
【００８４】
Ｂ．ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬから構成されるリポソームに包埋化されたアンチセンスｒａｆオリゴデオキシリボヌクレオチドの細胞内安定性
安定性試験：ＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞を、放射標識（３２Ｐ−γＡＴＰ）と、リポソーム包埋化形態（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）（図１９、レーン１）又は遊離形態（ＡＴＧ−ＡＳ）（図１９、レーン２）の１０μＭの非標識アンチセンスｒａｆオリゴヌクレオチド（ＡＴＧ−ＡＳ）との混合物とインキュベートした。処置は、１％血清含有培地中で３７℃で４時間続いた。インキュベーション後直ぐに、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン処置で剥離し、遠心分離で集めた。細胞ペレットをＰＢＳで２度洗浄し、次いで、細胞を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、ｐＨ７．４に３７℃で２時間溶解した。オリゴをフェノール：クロロホルムで抽出し、水分画を集めた。サンプルを、等しい放射活性に関し正規化し、変性ゲル電気泳動（１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素）、次いで、オートラジオグラフィーによって解析した。図１９に示すデータは、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳで処置された細胞におけるインタクトなＡＴＧ−ＡＳオリゴヌクレオチド（レーン１）及びＡＴＧ−ＡＳで処置された細胞におけるこのオリゴの分解形態（レーン２）を示す。これらのデータは、ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬリポソーム製剤への包埋化は、オリゴの分解を阻害することを示唆している。
【００８５】
安定性実験：ＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞を、放射標識（３２Ｐ−γＡＴＰ）と、リポソーム包埋化形態（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）の１０μＭの非標識アンチセンスｒａｆオリゴヌクレオチド（ＡＴＧ−ＡＳ）との混合物とインキュベートした。処置は、１％血清含有培地中で３７℃で４時間続いた。インキュベーション後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、インキュベーションを、２０％血清含有培地中で更に１時間続けた。細胞をトリプシン処置で剥離し、遠心分離で集めた。細胞ペレットをＰＢＳで２度洗浄し、次いで、細胞を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、ｐＨ７．４に３７℃で２時間溶解した。オリゴをフェノール：クロロホルムで抽出し、水分画を集めた。サンプルを、等しい放射活性に関し正規化し、変性ゲル電気泳動（１５％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素）、次いで、オートラジオグラフィーによって解析した。図２０に示すデータは、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳで処置された細胞でのインタクトなＡＴＧ−ＡＳオリゴヌクレオチド（レーン１）を示す。放射標識対照ＡＴＧ−ＡＳ標準をレーン２に示す。これらのデータは、ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬリポソーム製剤へのオリゴヌクレオチドの包埋化は、オリゴを保護し、インタクトなオリゴの細胞内利用性を高めることを更に示唆している。
【００８６】
インビボ結果
インビボデータ
ＣＤ２Ｆ１マウスでのＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬから構成されるリポソームの安全性研究：ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬから構成されるカチオン性リポソームの安全性を求めるために、０、１、３、４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６日に、これらのリポソームを、雄性ＣＤ２Ｆ１マウスに静脈注射した（ｎ＝５、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇオリゴ濃度に等しい全脂質）。５匹の動物のうち２匹を、病理のために１８日で供死し、動物の残りを３１日に供死した。研究中ずっと、群の体重をモニターした。図２１に示すように、全ての動物は処置を生き残り、この研究の予定された終結前に体重増加を示した。
【００８７】
ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬから構成されるリポソームに包埋化されたアンチセンスｒａｆオリゴデオキシリボヌクレオチドの安全性：ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬから構成され、アンチセンスｒａｆオリゴ（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）を包埋化しているカチオン性リポソームの安全性を求めるために、０、１、３、４、６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６日に、アンチセンスｒａｆオリゴを含むリポソームを、雄性ＣＤ２Ｆ１マウスに静脈注射した（ｎ＝５、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇオリゴ濃度）。５匹の動物のうち２匹を、病理検査のために１８日で供死し、動物の残りを３１日に供死した。研究中ずっと、群の体重をモニターした。図２２に示すように、全ての動物は処置を生き残り、体重増加を示した。これらのデータは、ＤＭＴＡＰ、ＰＣ、ＣＨＯＬから構成されるＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ組成物であってその中にアンチセンスｒａｆオリゴデオキシリボヌクレオチドを包埋化したＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ組成物は安全であることを示している。
【００８８】
実施例４
ヒト前立腺ガンモデルでのＲａｆアンチセンスＶｉｇｏ及び化学療法の使用
本実施例は、ヒト前立腺ガン（ＰＣ−３）異種移植片を担持する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスでシスプラチンと組合せてのＬｅｒａｆ  Ａｏｎの抗腫瘍有効性に関する。雄性胸腺欠損マウスに、１動物当たり、０．２ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水中５×１０６ＰＣ−３細胞を皮下（ｓ．ｃ）接種した。腫瘍増殖を、腫瘍体積が６０ｍｍ３〜１００ｍｍ３になるまで、１週間に２度モニターした。動物を、上記５つの処置群に無作為に分けた（ｎ＝８）。マウスを、尾静脈を介し、記載した投与量で静脈内処置し、腫瘍サイズを１週間に２度モニターした。示した値は平均±ｓ．ｄ．である。図２３に示すように、オリゴ／カチオン性リポソーム製剤は、対照と比べて、腫瘍体積減少によって示されるように、シスプラチンの有効性をかなり増強した（ｐｏｔｅｎｔａｔｅｄ）。
【００８９】
実施例５
幾つかのヒト前立腺ガンの動物モデルでの、化学療法剤とのＲａｆアンチセンスオリゴの使用
エピルビシンと組合せてのＬＥｒａｆ  ＡＯＮの抗腫瘍有効性を、ヒト前立腺ガン（ＰＣ−３）異種移植片を担持する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスで評価した。雄性胸腺欠損マウスに、１動物当たり、０．２ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水中５×１０６ＰＣ−３細胞をｓ．ｃ．接種した。腫瘍増殖を、腫瘍体積が６０ｍｍ３〜１００ｍｍ３になるまで、１週間に２度モニターした。動物を、上記５つの処置群に無作為に分けた（ｎ＝６）。マウスを、尾静脈を介し、記載した投与量で静脈内処置し、腫瘍サイズを１週間に２度モニターした。示した値は平均±ｓ．ｄ．である。図２４に示すように、オリゴ／カチオン性システムは、化学療法、特にエピルビシン化学療法の効力を再び増強した。
【００９０】
実施例６
ヒト前立腺ガンの動物モデルでの、抗化学療法剤とのＲａｆアンチセンスオリゴの使用
ミトキサントロンと組合せてのＬＥｒａｆ  ＡＯＮの抗腫瘍有効性を、ヒト前立腺ガン（ＰＣ−３）異種移植片を担持する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスで研究した。雄性胸腺欠損マウスに、１動物当たり、０．２ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水中５×１０６ＰＣ−３細胞をｓ．ｃ．接種した。腫瘍増殖を、腫瘍体積が６０ｍｍ３〜１００ｍｍ３になるまで、１週間に２度モニターした。動物を、上記５つの処置群に無作為に分けた（ｎ＝６）。マウスを、尾静脈を介し、記載した投与量で静脈内処置し、腫瘍サイズを、１週間に２度モニターした。示した値は平均±ｓ．ｄ．である。図２５に示すように、この例の化学療法剤ミトキサントロンの有効性は、オリゴ／カチオン性製剤によって再び増強された。
【００９１】
実施例７
リポソーム捕捉ｒａｆアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＬＥｒａｆＡＯＮ）とジェムザール（ＮＤＣ０００２−７５０１−０１，ゲンシタビンＨＣｌ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の組合せの抗腫瘍有効性を、ヒト膵臓癌異種移植片（Ｃｏｌｏ３５７）を担持する胸腺欠損マウスで評価した。胸腺欠損マウスに、約１．０×１０６Ｃｏｌｏ３５７ヒト膵臓ガン細胞を接種した。腫瘍体積を、５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３のサイズにならせた。腫瘍担持マウスは、５つの処置カテゴリーに無作為に分けた（ｎ＝５）。ＬＥｒａｆＡＯＮ製剤を、前に記載されたように製造した（Ｇｏｋｈａｌｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４，１２８９−１２９９，１９９７；及びＧｏｋｈａｌｅら、準備中の原稿）＞抗ガン剤ジェムザール（２００ｍｇバイアル）は、ジョージタウン大学病院の腫瘍学薬局から購入し、正常生理食塩水に再構成した（１２．５ｍｇ／ｍｌ）。ＬＥｒａｆＡＯＮ（２５．０ｍｇ／ｋｇ）又はジェムザール（７５．０ｍｇ／ｋｇ）を、記載された日に静脈注射した。腫瘍体積を１週間に２度測定し、種々の処置群の腫瘍サイズ（％最初）をプロットした。この図に示すように、単剤処置群（ＬＥｒａｆＡＯＮ及びジェムザール）又は対照群（Ｎ．Ｓ．正常生理食塩水、ＢＬ，ブランクリポソーム）と比べて、併用処置群（ＬＥｒａｆＡＯＮ＋ジェムザール）では、有意な腫瘍増殖阻害が認められた。値が示すのは平均±ｓ．ｄ．である。結果は、カチオン性／オリゴシステムは、化学療法剤の抗腫瘍有効性を増強したことを再び示している。
【００９２】
実施例８
ヒト膵臓ガン動物モデルにおけるアンチセンスＲａｆオリゴ及び化学療法の使用
リポソーム捕捉ｒａｆアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＬＥｒａｆＡＯＮ）とジェムザール（ＮＤＣ０００２−７５０１−０１，ゲンシタビンＨＣｌ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の組合せの抗腫瘍有効性を、ヒト膵臓癌異種移植片（Ａｓｐｃ−１）を担持する胸腺欠損マウスで評価した。胸腺欠損マウスに、約２．５×１０６Ａｓｐｃ−１ヒト膵臓ガン細胞を接種した。腫瘍体積を、５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３のサイズにならせた。腫瘍担持マウスを、５つの処置カテゴリーに無作為に分けた（ｎ＝５）。ＬＥｒａｆＡＯＮ製剤を、前に記載されたように製造した（Ｇｏｋｈａｌｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４，１２８９−１２９９，１９９７；及びＧｏｋｈａｌｅら、準備中の原稿）。抗ガン剤ジェムザール（２００ｍｇバイアル）は、ジョージタウン大学病院の腫瘍学薬局から購入し、正常生理食塩水に再構成した（１２．５ｍｇ／ｍｌ）。ＬＥｒａｆＡＯＮ（２５．０ｍｇ／ｋｇ）又はジェムザール（１００．０ｍｇ／ｋｇ）を、記載された日に静脈注射した。腫瘍体積を１週間に２度測定し、種々の処置群の腫瘍サイズ（％最初）をプロットした。この図に示すように、単剤処置群（ＬＥｒａｆＡＯＮ及びジェムザール）又は対照群（Ｎ．Ｓ．正常生理食塩水、ＢＬ，ブランクリポソーム）と比べて、併用処置群（ＬＥｒａｆＡＯＮ＋ジェムザール）では、有意な腫瘍増殖阻害が認められた。示した値は平均±ｓ．ｄ．である。図２６Ｂに示すように、投与した化学療法剤（ジェムザール及びゲンシタビンＨＣｌ）の抗腫瘍活性は、オリゴ／カチオン性リポソーム処置の結果として再び増大された。
【００９３】
結論
実施例４〜８の結果は明らかに、化学療法の効果、特に、化学療法に耐性な腫瘍の処置は、本発明のカチオン性リポソーム製剤に含まれる、腫瘍が発現する遺伝子、例えば、ｒａｆなどの腫瘍遺伝子、を標的とするオリゴの投与によって増強できることを証明している。この有効性は、種々の異なる化学療法剤の単独又は併用に関し、並びに異なるガンに関し、示されたので、この増強は、種々の異なるガン、特に、化学療法又は放射線療法に耐性なガンで、そして種々の異なる化学療法剤単独又は併用とともに観察されることを期待するのは合理的である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
図面の詳細な説明
【図１】ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮのリポソーム包埋化。５’−フルオレセイン標識ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮを、実験方法で説明のようにリポソーム（ＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＤＡＢ）に包埋した。ブランクリポソーム（ａ）の明視野顕微鏡法、並びにブランクリポソーム（ｂ）とフルオレセイン標識ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ  （Ｃ−Ｈ）を含むリポソームの蛍光顕微鏡法を示す。
【図２】（ａ）ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの細胞取り込みの時間的経過。ＳＱ−２０Ｂ細胞を、実験方法に記載したように、３２Ｐ−５’末端標識ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮと過剰の非標識ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（１０μＭ）とともに示した時間インキュベートした。結果は、２つの独立の実験（各々は２連でなされた）からの平均±ｓ．ｄである。（ｂ）ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの細胞内安定性。細胞を、１時間、３２Ｐ−末端標識ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮと過剰の非標識ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（１％ＦＢＳ含有培地中１０μＭ）とともにインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで、インキュベーションを、２０％ＦＢＳ含有培地で、０時間（レーン２）、２時間（レーン３）、８時間（レーン４）、１２時間（レーン５）、２４時間（レーン６）続けた。細胞を溶解し、様々なサンプル中のＯＤＮを実験方法に説明したように、変性ゲル電気泳動によって解析した。レーン２、放射標識対照ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ；１５マー、ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ；キシレンシアノール（ＸＣ）及びブロモフェノールブルー（ＢＰ）の移動を示す。
【図３】ＬＥ−ＡＴＣ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの血漿濃度−時間プロフィール。３０ｍｇ／ｋｇ  ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（最上部パネル）又はＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（中央パネル）を、Ｂａｌｂ／ｄｎｕ／ｎｕマウスにｉ．ｅ．投与した。実験方法で説明したように、血液サンプルを、注射後、示された時間に眼窩後方洞から集め、血漿サンプル中のＯＤＮを抽出し、変性ゲル電気泳動によって解析した。Ｓｔ  ブランク血漿に既知量のＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮをスパイクすることによって調製した標準。最上部パネル：サンプルを、電気泳動前に次のように希釈した：レーン１、１２倍；レーン２と３、４倍；レーン４と５、３．３倍；レーン６、２倍；ライン７、１．４倍；レーン８、１．３倍；レーン９、１倍。Ｓｔレーンは、ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの０．２５、０．５及び１．０μｇ／ｍｌを示す。標準サンプルの１．０μｇ／ｍｌはＯＤＮの１８．４μｇに相当する。２４時間の期間にわたってＯＤＮ濃度を測定するために、更なる標準（１．４〜２超のｌｏｇ範囲）を用いた（データは示さず）。中央パネル：サンプルを、次のように、ロード前に希釈した：レーン１、４倍；ライン２と３、２倍；レーン４と５と６、１倍；レーン７、０．７５倍；レーン８と０、０．６倍。Ｓｔレーンは、ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの０．１２５、０．２５、０．５μｇ／ｍｌを示し、標準サンプルの０．５μｇ／ｍｌは、ＯＤＮの６．９ｎｇに相当する。最下部パネル：最上部パネルで示したＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの血漿濃度−時間曲線。定量化データは、既知濃度の標準サンプルとの比較と、次いでロードに使用したサンプル希釈因子に対する正規化を基に計算した。
【図４】ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの組織分布プロフィール。組織サンプルを、３０ｍｇ／ｋｇ  ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮのｉ．ｖ．投与後の示された時間に集めた。実験方法で説明したように、ＯＤＮは、ホモジナイズされた組織から抽出し、３２Ｐ標識ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮでプローブした。（ａ）肝臓と腎臓からの代表的オートラジオグラフ、（ｂ）３０ｍｇ／ｋｇ  ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの投与量がｉ．ｖ．投与された後の示された時間での異なる組織でのＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ濃度。定量化データは、既知濃度の標準サンプルとの比較と、次いで、集めた器官の重量に対する正規化を基に計算した。
【図５】ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｄ  ＯＤＮによるＲａｆ−１タンパク質発現の阻害の特異性。（ａ）時間的経過解析。対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ細胞を、１％ＦＢＳ含有培地で、示された時間、１０μｍのＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ（ＡＳ）又はＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｄ  ＯＤＮ（Ｓ）で処置した。未処置対照細胞（Ｃ）又はブランクリポソーム（１０μｍ）で処置した細胞は、８時間、１％ＦＢＳ含有培地に同時にスイッチした。全細胞ライゼートを、全タンパク質含量に関し正規化し、アガロース結合のポリクローナル抗Ｒａｆ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で免疫沈澱した。実験方法で記載したように、免疫複合体を、ポリクローナル抗ＲＡＦ−１抗体でイムノブロッティングした（最上部）。３つの独立の実験からの結果を定量化し、データを、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置細胞中のＲａｆ−１のレベルに対し表す（最下部）。（ｂ）投与量−応答解析。対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞を、１％ＦＢＳ含有培地で、８時間、示された濃度のＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（ＡＳ）又はＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ（Ｓ）で処置した。正規化細胞ライゼートを、ＲＡＦ−１発現に関し解析した（最上部）。３つの独立の実験からの定量化データを、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置細胞中のＲａｆ−１のレベルに対し表す（最下部）。
【図６】ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮによるＲａｆ−１プロテインキナーゼ活性の阻害。対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ細胞を、１％ＦＢＳ含有培地で、８時間、１２０μｍのＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（ＡＳ）又は１０μｍのＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ（Ｓ）で処置した。対照細胞（Ｃ）は、８時間、１％ＦＢＳ含有培地に同時にスイッチした。全細胞ライゼートを、タンパク質含量に関し正規化し、実験方法に記載したように、Ｒａｆ−１ホスホトランスフェラーゼ活性を、その生理的基質であるＭＫＫ１を用いて、インビトロでアッセイした。放射標識反応産物を、電気泳動によって分離し、オートラジオグラフした（挿入図）。２つの独立の実験（各々は二連でなされた）からの定量化データを、ＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置細胞に対しＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ処置細胞でのＲａｆ−１酵素活性として表す。
【図７】正常組織と腫瘍組織でのＲａｆ−１発現に対する（ｏｕｒ）ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの静脈内投与の効果。Ｒａｆ−１発現を、５連続日の間、ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（ＡＳ）又はＬＥ−ＡＴＣ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ（Ｓ）の６ｍｇ／ｋｇ１日投与量のｉ．ｖ．注射後、Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの肝臓、腎臓、及びＳＱ−２０Ｂ腫瘍異種移植片で試験した。対照マウス（Ｃ）は正常生理食塩水を受けた。免疫沈澱とイムノブロッティングによって、タンパク質含量に関し正規化したライゼートにおけるＲａｆ−１発現を示す代表的データ（最上部）。定量化データを、３匹のマウスからの平均±ｓ．ｄとして示す（最下部）。
【図８】ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮの腫瘍内投与による、ＳＱ−２０Ｂ腫瘍異種移植片でのＲａｆ−１タンパク質発現の阻害：実験方法で説明したように、各動物は、７日間、１日４ｍｇ／ｋｇの投与量で、右脇腹にＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ  ｒａｆ  ＯＤＮ（ＡＳ）及び左脇腹にＬＥ−ＡＴＧ−Ｓ  ｒａｆ  ＯＤＮ（Ｓ）の腫瘍内注射を受けた。２匹の代表的動物からの右（ＡＳ）と左（Ｓ）腫瘍異種移植片でのＲａｆ−１発現を示す（挿入図）。示される定量化データは、３匹の代表的マウスからの平均±ｓ．ｄ．である。
【図９】ＳＱ−２０Ｂ細胞でのＲａｆ−１発現のアンチセンス配列特異的阻害。（Ａ）対数増殖中のＳＱ−２０Ｂ細胞を、材料及び方法で記載したように、示されたＯＤＮ濃度のＬＥ−５１３２（レーン３、５、１０）、５１３２（レーン４と６）、又はＬＥ−１０３５３（レーン９）で処置した。対照細胞は、未処置である（レーン１と７）か又は１μＭブランクリポソーム（ＢＬ）で処置された（レーン２と８）。全細胞ライゼートを、全タンパク質含量に関し正規化し、アガロース結合の、ポリクローナル抗Ｒａｆ−１抗体で免疫沈澱した。免疫複合体は、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ポリクローナル抗Ｒａｆ−１抗体でイムノブロッティングした。（Ｂ）３つの独立の実験からのデータを定量化し、未処置細胞でのＲａｆ−１のレベルに対し表す。
【図１０】凝固時間に対するＬＥ−５１３２の効果。正常ヒト血漿を、示された濃度のＬＥ−５１３２又は５１３２と混合するか又は未処置のままで、３７℃、１分間、ＡＰＴＴ試薬（アレルギー酸（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｃｉｄ）活性化剤を有する精製されたウサギ脳セファリン抽出物）とインキュベートした。凝固反応を、塩化カルシウムを加えることによって開始し、可視のクロットを形成するのに必要な時間を、秒で手動で記録する。データは、３つの実験から平均＝ＳＤを表す。
【図１１】ＬＥ−５１３２と５１３２の血漿濃度−時間プロフィール；３０ｍｇ／ｋｇ  ＬＥ−５１３２又は５１３２を、Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスにｉ．ｖ．投与した。血液サンプルを、注射後示された時間で眼窩後方洞から集め、記載したように、血漿サンプル中のＯＤＮを抽出し、変性ゲル電気泳動によって解析した。Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、ブランク血漿に既知量の５１３２をスパイクすることによって調製した標準品。（Ａ）サンプルを、電気泳動前に次のように希釈した：レーン１．１５倍；レーン２、１０倍；レーン３と４、５倍；レーン５、１倍；レーン６〜９、０．８倍。（Ｂ）サンプルを、電気泳動前に次のように希釈した：レーン１、１５倍；レーン２、１０倍；レーン３と４、５倍；レーン５、１倍；レーン６〜９、０．８倍。Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３は、それぞれ、５１３２の０．２５、０．５、１．０μｇ／ｍｌを表す。標準サンプルの１．０μｇ／ｍｌは、ＯＤＮ２０ｎｇに対応する。（Ｃ）ＬＥ−５１３２と５１３２の血漿濃度−時間曲線。定量化データを、既知濃度の標準サンプルとの比較に基づき計算し、次いで、ロードに使用したサンプル希釈因子に対して正規化した。
【図１２】濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）の関数としてＬＥ−５１３２／５１３２の正常組織薬物動態。組織サンプルを、図１１のように、３０ｍｇ／ｋｇ  ＬＥ−５１３２又は５１３２の投与後０と４８時間との間で集めた。ＯＤＮを、ホモジナイズされた組織から抽出し、（３２Ｐ）標識センスｒａｆ  ＯＤＮでプローブ操作した。定量化解析を、既知濃度の標準サンプルとの比較に基づき行い、次いで、集めた器官の重量に対して正規化した。
【図１３】ＳＷ−２０Ｂ腫瘍増殖に対するＬＥ−５１３２の効果。ＳＱ−２０Ｂ腫瘍細胞（２×１０６）を、各雄性Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの左脇腹領域にａ．ｃ．注射した。１０〜１２週齢。腫瘍異種移植片を、平均腫瘍体積９４±６．４ｍｍ３まで増殖させ、動物は２つの処置群に無作為に分けた。０日は、処置の第１日を表す。マウスに、最初の７日間は、毎日１回、６ｍｇ／ｋｇ  ＬＥ−５１３２又はブランクリポソーム（ＢＬ）をｉ．ｖ．で与え、次いで、矢で示すように、隔日に６回の更なる投与量を与えた。動物は、３０日に殺した。示したデータは、１群当たり５〜７動物の平均±ＳＥである。
【図１４】ＳＱ−２０Ｂ腫瘍でのＲａｆ−１タンパク質レベルに対するＬＥ−５１３２の効果。（Ａ）腫瘍担持マウスを、図７の説明文で説明したように、ＬＥ−５１３２（ｉ．ｖ．，１０ｍｇ／ｋｇ）又はＩＲ（３．８Ｇｙ／日）又は両方で処置した。種々の処置群を代表する腫瘍を、処置の７日（レーン１と２）及び１４日（レーン３〜８）に切除した。Ｒａｆ−１発現を、タンパク質含量に関し正規化した組織ホモジネートにおける免疫沈澱、次いでイムノブロッティングによって検出した。レーン１、未処置対照；レーン２と（ｎｄ）３、ＢＬ；レーン４、ＩＲ；レーン５と６、ＬＥ−５１３２；レーン７と８、ＬＥ−５１３２＋ＩＲ。（Ｂ）示した定量化データは、２匹の動物からの平均±ＳＥである。
【図１５】ＳＱ−２０Ｂ腫瘍増殖に対するＬＥ−５１３２及び電離放射線の効果。（Ａ）記載したように、ＳＱ−２０Ｂ腫瘍異種移植片を、雄性Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスで増殖させた。平均腫瘍体積７２．０±４．３ｍｍ３を担持する動物を、５つの処置群に無作為に分けた。０日は、処置の第１日を示す。マウスを、示した日数、ＬＥ−５１３２  １０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．（ＬＥ−５１３２）、１日に１回の３．８Ｇｙの電離放射線（ＩＲ）、又はこれらの２つの処置の併用（ＬＥ−５１３２＋ＩＲ）で処置した。対照群はブランクリポソーム（ＢＬ）を受けたか未処置（Ｃ）であった。動物は４５日に殺した。示したデータは、１群当たり５〜７動物の平均±ＳＥである。（Ｂ）３０日に異なる処置群での平均腫瘍体積の何倍かの変化。示したデータは、２つの独立の実験からの平均±ＳＥである。１実験当たり１群当たり５〜７匹の動物。＝ｐ＜０．００１
【図１６】ＳＱ−２０Ｂ腫瘍の組織病理。最終処置後２４時間で腫瘍を切除した。未処置腫瘍（Ａ）、ＬＥ−５１３２（Ｂ）、ＩＲ（Ｃ）、又はＬＥ−５１３２＋ＩＲ（Ｄ）で処置した腫瘍の組織病理の例を示す。２５０倍。
【図１７】遊離（ＡＴＧ−ＡＪＣ）又はリポソーム（ＤＭＴＡＰ＝ＰＣ＝ＣＨＯＬ）包埋形態（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）での非標識アンチセンスｒａｆオリゴ（ＡＴＧ−ＡＳ）を用いる投与量−応答取り込み実験のインビトロ結果を含む。
【図１８】遊離（ＡＴＧ−ＡＳ）又はリポソーム包埋（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）ｒａｆオリゴヌクレオチドを用いての、ＳＱ−２０Ｂ腫瘍（ｔｉｍｅｒ）細胞での時間的経過取り込み実験の結果を含む。
【図１９】遊離（ＡＴＧ−ＡＳ）又はリポソーム包埋（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）μｍでのｒａｆオリゴヌクレオチドの安定性を比較する安定性実験の半分を含む。
【図２０】遊離ｒａｆオリゴヌクレオチド（ＡＴＧ−ＡＳ）又はリポソーム包埋（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）の安定性を比較する別の安定性実験の結果を含む。
【図２１】ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬリポソームをｉ．ｖ．投与されたマウス／ＣＤ２Ｆ１の生存データを含む。
【図２２】ＤＭＴＡＰ：ＰＣ：ＣＨＯＬリポソーム中のｒａｆオリゴヌクレオチド（ＬＥ−ＡＴＧ−ＡＳ）を投与されたマウスＣＤ２Ｆ１マウスからの生存データを含む。
【図２３】ヒト前立腺ガン（ＰＣ−３）異種移植片担持の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスでの、シスプラチンと組合わせてのＬＥｒａｆ  Ａｏｎの抗腫瘍有効性。雄性胸腺欠損マウスに、１動物当たり、０．２ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水中５×１０６ＰＣ−３細胞を皮下接種（ｓ．ｃ．）した。腫瘍体積が６０ｍｍ３〜１００ｍｍ３になるまで、腫瘍増殖を１週間に２度モニターした。動物を、上記５つの処置群に無作為に分けた（ｎ＝８）。マウスを、尾静脈を介し示された投与量で静脈内処置し、腫瘍サイズを、１週間に２度モニターした。示した値は平均±ｓ．ｄ．である。
【図２４】ヒト前立腺ガン（ＰＣ−３）異種移植片を担持する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスでの、エピルビシンと組合せてのＬＥｒａｆ  ＡＯＮの抗腫瘍有効性。雄性胸腺欠損マウスに、１動物当たり０．２ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水中５×１０６ＰＣ−３細胞をｓ．ｃ．接種した。腫瘍増殖を、腫瘍体積が６０ｍｍ３〜１００ｍｍ３になるまで、１週間に２度モニターした。動物を、上記５つの処置群に無作為に分けた（ｎ＝６）。マウスを、尾静脈を介し、記載した投与量で静脈内処置し、腫瘍サイズを、１週間に２度モニターした。示した値は平均±ｓ．ｄ．である。
【図２５】ヒト前立腺ガン（ＰＣ−３）異種移植片を担持する胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスでの、ミトキサントロンと組合せてのＬＥｒａｆ  ＡＯＮの抗腫瘍有効性。雄性胸腺欠損マウスに、１動物当たり、０．２ｍｌリン酸緩衝化生理食塩水中５×１０６ＰＣ−３細胞をｓ．ｃ．接種した。腫瘍増殖を、腫瘍体積が６０ｍｍ３〜１００ｍｍ３になるまで、１週間に２度モニターした。動物を、上記５つの処置群に無作為に分けた（ｎ＝５）。マウスを、尾静脈を介し、記載した投与量で静脈内処置し、腫瘍サイズを、１週間に２度モニターした。示した値は平均±ｓ．ｄ．である。
【図２６Ａ】ヒト膵臓癌異種移植片（Ｃｏｌｏ３５７）を担持する胸腺欠損マウスでの、リポソーム捕捉ｒａｆアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＬＥｒａｆＡＯＮ）とジェムザール（ＮＤＣ０００２＋７５０１＋０１，ゲンシタビンＨＣｌ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の併用の抗腫瘍有効性。胸腺欠損マウスに、約１．０×１０６Ｃｏｌｏ３５７ヒト膵臓癌細胞を接種した。腫瘍体積が、５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３のサイズに達するまでおいた。腫瘍担持マウスを、５つの処置カテゴリーに無作為に分けた（ｎ＝５）。ＬＥｒａｆＡＯＮ製剤を、以前に記載されたように製造した（Ｇｏｋｈａｌｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４，１２８９−１２９９，１９９７；及びＧｏｋｈａｌｅら、準備中の原稿）。抗ガン剤ジェムザール（２００ｍｇバイアル）は、ジョージタウン大学病院の腫瘍学薬局から購入し、正常生理食塩水に再構成した（１２．５ｍｇ／ｍｌ）。ＬＥｒａｆＡＯＮ（２５．０ｍｇ／ｋｇ）又はジェムザール（７５０ｍｇ／ｋｇ）は、記載された日に静脈注射した。腫瘍体積を１週間に２度測定し、種々の処置群の腫瘍サイズ（最初の％）をプロットした。この図に示すように、単剤処置群（ＬＥｒａｆＡＯＮ及びジェムザール）又は対照群（Ｎ．Ｓ．正常生理食塩水、ＢＬ  ブランクリポソーム）と比べて、併用処置群（ＬＥｒａｆＡＯＮ＋ジェムザール）では、有意な腫瘍増殖阻止が認められた。示した値は平均±ｓ．ｄ．である。
【図２６Ｂ】ヒト膵臓癌異種移植片（Ａｓｐｃ−１）を担持する胸腺欠損マウスでの、リポソーム捕捉ｒａｆアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＬＥｒａｆＡＯＮ）とジェムザール（ＮＤＣ００２＋７５０１＋０１，ゲンシタビンＨＣｌ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎ）の併用の抗腫瘍有効性。胸腺欠損マウスに、約２．５×１０６Ａｓｐｃ−１ヒト膵臓ガン細胞を接種した。腫瘍体積が、５０ｍｍ３〜１００ｍｍ３のサイズに達するまでおいた。腫瘍担持マウスは、５つの処置カテゴリーに無作為に分けた（ｎ＝５）。ＬＥｒａｆＡＯＮ製剤は、以前に記載されたように製造した（Ｇｏｋｈａｌｅら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４，１２８９−１２９９，１９９７；及びＧｏｋｈａｌｅら、準備中の原稿）。抗ガン剤ジェムザール（２００ｍｇバイアル）は、ジョージタウン大学病院の腫瘍学薬局から購入し、正常生理食塩水に再構成した（１２．５ｍｇ／ｍｌ）。ＬＥｒａｆＡＯＮ（２５．０ｍｇ／ｋｇ）又はジェムザール（１００．０ｍｇ／ｋｇ）は、記載された日に静脈注射した。腫瘍体積を１週間に２度測定し、種々の処置群の腫瘍サイズ（最初の％）をプロットした。この図に示すように、単一薬剤処置群（ＬＥｒａｆＡＯＮ）及びジェムザール）又は対照群（Ｎ．Ｓ．正常生理食塩水、ＢＬ  ブランクリポソーム）と比べて、併用処置群（ＬＥｒａｆＡＯＮ＋ジェムザール）では、有意な腫瘍増殖阻止が認められた。示した値は平均±である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月17日(2004.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン性組織の化学増感方法であって、化学療法剤と、カチオン性脂質、ホスファチジルコリン及びコレステロールを含むカチオン性リポソームであってその中に少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが包埋されたカチオン性リポソームを含む組成物とを、該ガン性組織に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記リポソームが、カチオン性脂質、ホスファチジルコリン及びコレステロールからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが約１００以下のヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、１０〜４０ヌクレオチドの範囲のサイズである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが末端ヌクレオチドのみでホスホロチオエート化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドの塩基のすべてがホスホロチオエート化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドの塩基のすべてがキメラ形態で修飾されている、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスＤＮＡである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが式５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号１）を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドの末端塩基のみがホスホロチオエート化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が静脈内投与される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が標的組織に直接投与される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が標的組織への動脈血行中に投与される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然産物、ホルモン又はアンタゴニストである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
化学療法剤が、白金配位錯体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、小分子阻害剤、ペプチド、抗体、又はチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
化学療法剤が、エピルビシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、又はパクリタキセルである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
化学療法剤が、シスプラチン又はミトキサントロンである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
化学療法剤がゲンシタビンである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ガンが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫又は肉腫である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが化学療法剤の前又は後に投与される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
幾つかの異なるオリゴヌクレオチドが化学療法剤の前又は後に投与される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが１より多い化学療法剤の前又は後に投与される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチドが放射線と化学療法剤との組合せの前又は後に投与される、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
１より多いオリゴヌクレオチドが放射線と化学療法剤との組合せの前又は後に投与される、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが約１００以下のヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドが１０〜４０ヌクレオチドのサイズの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドが末端ヌクレオチドのみでホスホロチオエート化されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドの塩基のすべてがホスホロチオエート化されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
オリゴヌクレオチドの塩基のすべてがキメラ形態で修飾されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドがアンチセンスＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドが式５’−ＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＣ−３’（配列番号１）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチドの末端塩基のみがホスホロチオエート化されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が静脈内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が標的組織に直接投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が標的組織への動脈血行中に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然産物、ホルモン又はアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
化学療法剤が、白金配位錯体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、小分子阻害剤、ペプチド、抗体、又はチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
化学療法剤が、エピルビシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、又はパクリタキセルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
化学療法剤が、シスプラチン又はミトキサントロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
化学療法剤がゲンシタビンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
ガンが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫又は肉腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドが化学療法剤の前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
幾つかの異なるオリゴヌクレオチドが化学療法剤の前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
オリゴヌクレオチドが１より多い化学療法剤の前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチドが放射線と化学療法剤との組合せの前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
１より多いオリゴヌクレオチドが放射線と化学療法剤との組合せの前又は後に投与される、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2005517721.tif 000031
2005517721.tif 000032