(57)【要約】本発明は、アンギオゲニン、および特にアンギオゲニン−４に関連する病気、特に腸の病気（ただしこれに限定されない）の微生物（抗菌および抗真菌）処置およびその他の治療的処置；新規の腸特異的な、上皮に関連する、微生物により調節されるアンギオゲニンファミリーメンバーに関する。新規のタンパク質、および、医薬スクリーニングにおけるそれらの使用も説明される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
添付の図１で示される配列番号１を含む単離されたポリペプチド、もしくはそれらの対立遺伝子変異体、配列番号１と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、または、これらいずれかの生物学的に活性な断片。
【請求項２】
配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド、または、これらいずれかの生物学的に活性な断片。
【請求項３】
配列番号１または、それらの生物学的に活性な断片を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４４に記載の、配列番号１の断片を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４４に記載の、配列番号１の断片を含むが、ただし最初の５個のアミノ酸が欠失している、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項７】
図２で示される配列番号５の少なくとも一部を含む、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
請求項６または７に記載の核酸を含むプラスミド。
【請求項９】
請求項６または７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載のプラスミド、または請求項９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１１】
腸内で請求項１に記載のポリペプチドの活性に影響を与えることを含む、腸内の血管新生活性の改変を必要とする、ヒトまたは動物の腸内の血管新生活性を改変する方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドまたはそれらのミメティックを腸に投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
投与されたポリペプチドは、請求項４または５に記載のポリペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
動物はアンギオゲニン−４を生産し、その活性は、本発明のポリペプチド、それらのアゴニストまたはミメティックを腸に投与することによって増強される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
アンギオゲニン−４の発現を調節する微生物、または、微生物叢の構成要素により生産されることが同定された化学物質を動物の腸に投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
微生物は、バクテロイデス−シータイオタオミクロンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アンギオゲニン−４の活性は、タンパク質活性のアンタゴニスト、または、タンパク質に結合し不活性化することによってタンパク質活性をブロックする化合物もしくは抗体
を投与することによって減少する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
アンギオゲニン−４の活性は、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ構築物（アンギオゲニン−４のＤＮＡまたはＲＮＡにそれぞれハイブリダイズする）、Ａｎｇ−４ｍＲＮＡを特異的に分解するリボザイム分子、または、Ａｎｇ−４配列に特異的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドを投与することにより減少する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
炎症性の腸疾患の治療または腸感染症の予防もしくは治療を必要とする動物の腸内で、請求項１に記載のポリペプチドのレベルを増加させることにより、炎症性の腸疾患を治療する方法、または、腸感染症を予防もしくは治療する方法。
【請求項２０】
製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて、請求項１に記載のポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストまたはそれらのミメティックを含む医薬組成物。
【請求項２１】
製剤が腸溶コーティングされて提供される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
化合物とマウスのパネート細胞とを接触させること、および、アンギオゲニン−４またはアンギオゲニン−４遺伝子を検出することを含む、パネート細胞の機能を調節する化合物のスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２４】
抗微生物性アンギオゲニンを含むポリペプチド、抗微生物活性を有するそれらの断片もしくは変異体、それらのアゴニストもしくはミメティック、または、内在性アンギオゲニンタンパク質の量または活性を増加させることができる化合物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の細菌感染または真菌感染を治療する方法。
【請求項２５】
抗微生物アンギオゲニンは、図１で示される配列番号１、２、３、４、または４４、４５、４６もしくは４７で示されるものであるか、または、これらいずれかと少なくとも６０％の配列の同一性を有する抗微生物変異体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドは請求項１に記載のポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドは配列番号２または４６のポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドは配列番号４７のポリペプチド、または、抗微生物活性を有するそれらの断片もしくは変異体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
ポリペプチドは配列の１〜６位にあるＮ末端シグナルペプチド配列ＱＤＮＳＲＹが欠失した配列番号４７の断片である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アンギオゲニンはヒトに非経口投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
真菌感染を治療するための、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドは経口投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
腸管の細菌または真菌感染を治療するための、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンギオゲニン、および特にアンギオゲニン−４、すなわち、新規の腸特異的な、上皮に関連する、微生物により調節されるアンギオゲニンファミリーのメンバーに基づく病気、特に腸の病気への微生物を用いた処置およびその他の治療的処置に関する。また、新規のタンパク質、および、医薬のスクリーニングにおけるそれらの使用も説明される。
【背景技術】
【０００２】
本出願人は、これまで、腸の正常な定住菌の一つであるバクテロイデス−シータイオタオミクロンが定着することにより腸で生じる転写の変化の分析を行ってきた。この分析の目的は、正常な腸の機能および／または様々な胃腸疾患の病因において重要な役割を果たす新しい治療標的を同定し、特徴付けることであった（Ｈｏｏｐｅｒ，Ｌ．Ｖ等（２００１年），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：８８１）。
【０００３】
ヒトおよびマウスの重要な遺伝子操作可能な消化管内共生生物であるバクテロイデス−シータイオタオミクロンが無菌ＮＭＲＩマウスに定着する前と後の遺伝子発現を包括的に評価するためのアプローチには、アフィメトリックス社のジーンチップを用いた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本出願人は、アンギオゲニンファミリーの特定のメンバーが、腸で、より具体的には上皮のパネート細胞系で特異的に発現することを見出した。結果として、それにより様々な治療適用を生み出すことが可能であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第一の局面は、添付の図１で示される配列番号１を含む単離されたポリペプチド、もしくはそれらの対立遺伝子変異体、もしくは、配列番号１と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、または、これらいずれかの生物学的に活性な断片を提供することである。
【０００６】
用語「ポリペプチド」は、タンパク質などのペプチドを意味する。「対立遺伝子変異体」は、マウスゲノムにおいて配列番号１のタンパク質をコードする遺伝子と同じ遺伝子座に見出される遺伝子の代替型によりコードされるタンパク質を意味する。
【０００７】
特定の実施態様において、本発明は、添付の図１で示される配列番号１のポリペプチド、もしくは、配列番号１と、少なくとも８５％、適切には少なくとも９０％、より適切には少なくとも９５％、さらにより適切には少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、または、これらいずれかの生物学的に活性な断片を提供する。
【０００８】
配列の同一性は、任意の既知のアルゴリズムを用いて推定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ  Ｐアルゴリズムまたはリップマン−ピアソンのアルゴリズムを、Ｋｔｕｐｌｅ：２、ギャップペナルティー：４、ギャップレングスペナルティー:１２、標準ＰＡＭ
スコアリングマトリックスと一緒に用いて同一性を測定することができる（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．およびＰｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ.，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｓｅａｒｃｈｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５年，第２２７巻，１４３５〜１４４１）。
【０００９】
本願明細書で用いられる用語「断片」は、後述するような望ましい生物活性を有する所定のアミノ酸配列の任意の部分を意味する。断片は、適切には、基本の配列の少なくとも１０個、好ましくは少なくとも５０個の連続したアミノ酸を含む。
【００１０】
本願明細書で用いられる用語「生物活性」は、この場合、タンパク質が有する後述する活性のいずれか一つ、例えば抗微生物活性または血管新生活性を意味し、これら活性は、任意の慣用的な方法、例えば下記の実施例で後述する方法を用いて試験することができる。抗微生物活性の例としては、抗菌活性および抗真菌活性が挙げられる。血管新生活性とは、脈管形成、すなわち血管の発達を刺激するタンパク質の能力である。
【００１１】
特に、本発明は、配列番号１のタンパク質を提供する。このタンパク質はアンギオゲニン−４と指定されており、それをコードする遺伝子はＡｎｇ４である。Ａｎｇ４ｍＲＮＡは、このタンパク質をコードする。配列番号１は全長タンパク質を示し、一方、配列番号４４は、成熟タンパク質を示し、従って配列番号４４は、特に好ましい断片を示す。配列番号４４は、予想されるＮ末端シグナルペプチド配列を含む。配列番号１のタンパク質のさらなる特定の断片は、配列番号４４の断片であり、この断片は、Ｎ末端シグナルペプチド配列が欠失している。このＮ末端シグナルペプチド配列は、配列番号４４の最初の５個のアミノ酸ＱＮＥＲＹを含み、これは図１Ａにおいて下線で示される。
【００１２】
配列番号１のタンパク質はマウスのタンパク質であり、マウスの腸で特異的に発現する。この配列は、他の哺乳動物から相同タンパク質を見つけることを目的としたプローブおよびプライマーを設計するのに用いることができ、少なくとも８５％の同一性を有する相同タンパク質は、本発明の特定の実施態様を形成する。このようなタンパク質は、以下、類似体と称する。
【００１３】
類似体はまた、標的の種、特にヒトの小腸の手術標本からのパネート細胞、腺窩上皮の上部、および絨毛上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を行うことにより同定することもできる。特にｑＲＴ−ＰＣＲは、ヒトアンギオゲニン、および、ヒトゲノムに存在し、腸で発現されることが知られているＲＮアーゼスーパーファミリーの様々なメンバーを分析する（このような腸のＲＮアーゼは、インシリコで利用可能なデータベースの検索で、または、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いたヒトサンプルの直接的な分析により同定することができる）。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は、上述の本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。このような核酸は、上述の類似体を同定するのに用いることができる。加えて、このような核酸は、組換えＤＮＡ技術を用いた本発明のタンパク質などのポリペプチド生産に用いることもできる。例えば、このような核酸は、細胞（例えば大腸菌のような原核細胞）を形質転換させるのに用いることができるプラスミドまたはベクターに組み込むことができ、そして該細胞は続いてタンパク質を発現させる。配列番号１をコードする核酸の詳細な例は、図２の配列番号５、または図３の配列番号４８で示される。
【００１５】
アンギオゲニン−４は、特定の種の微生物に対する抗微生物剤としての効果を有する。アンギオゲニン−４は、生得的な宿主側防御／腸の上皮バリア機能の構成要素であると考えられている。それゆえに、アンギオゲニン−４は、腸感染症、または、パネート細胞が過形成される炎症性の腸疾患に適応するための宿主反応の予防または治療において役割を有する可能性があり、従って、このような状態を治療するのに用いることができる。
【００１６】
消化管内共生生物、例えばバクテロイデス−シータイオタオミクロンは、マウス消化管において血管新生を調節することが示されている。この調節は、パネート細胞に依存する
。パネート細胞における遺伝子発現のジーンチッププロファイリングでは、既知の血管新生因子のどれも同定することができなかった。しかしながら、確立された血管新生活性を有するタンパク質ファミリーメンバーであるＡｎｇ４は、パネート細胞で特異的に発現される。その上、消化管の微生物によるＡｎｇ４の誘導は、血管新生の誘導と同時に起こる（Ｔ．Ｓ．Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ等，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．（２００２年）９９，１５４５１〜１５４５５）。
【００１７】
従って、さらなる局面において、本発明は、腸内で本発明のポリペプチドの活性に影響を与えることを含む、腸内の血管新生活性の改変を必要とする動物において腸内の血管新生活性を改変する方法を含む。血管新生活性のレベル、特にアンギオゲニン−４タンパク質のレベルを改変することにより影響を受ける可能性のある機能としては、栄養吸収、運動性、および成長（例えば腸の切除に対する適応反応）が挙げられる。また、上皮に基づく血管新生因子は、虚血性発作または放射線治療に対する反応（胃腸症候群）に関与するか、または、結腸直腸の腫瘍形成の病因に関与すると考えられる。
【００１８】
抗微生物活性または血管新生活性レベルを変えることは、様々な方法で達成することができる。例えば、アンギオゲニン−４を生産しない動物において、本発明のポリペプチドまたはミメティックを腸に投与することにより活性を誘導することができる。特に、投与されるポリペプチドは、アンギオゲニン−４、または、血管新生活性を有するそれらの断片であり、特に配列番号４４の成熟タンパク質であり、これは場合によりＮ末端シグナル配列を欠失している。
【００１９】
アンギオゲニン−４が産生される場合には、本発明のポリペプチド、またはそれらのアゴニストまたはミメティックを腸に投与することにより活性を増強することができる。
【００２０】
これは、例えば、本発明のポリペプチド、アゴニストまたはミメティックを腸に送達する製剤を処方することにより達成することができる。例えば、このような製剤は、胃酸耐性であるが腸内のよりアルカリ性の環境で溶解し、そこでタンパク質を放出させることができる腸溶コーティングでコーティングすることができる。
【００２１】
加えて、アンギオゲニン−４の発現は、微生物叢の構成要素（例えばバクテロイデス−シータイオタオミクロン）により調節されることが知られており、それゆえにこのような有機体または微生物叢の構成要素により生産されることが同定された化学物質（例えば微生物のリポ多糖体（ＬＰＳ））を投与することは、アンギオゲニン−４レベルを高めるのに有効である可能性がある。
【００２２】
しかしながら、アンギオゲニン−４が産生される場合には、望ましい治療効果を達成するために活性レベルを低下させてもよい。腸におけるアンギオゲニン−４レベルの低下は、タンパク質活性のアンタゴニスト、または、アンギオゲニン−４に結合してそれを失活させることによりタンパク質活性をブロックする化合物または抗体を投与することにより達成することができる。血管新生活性レベルの低下は、例えば、腸ガンの治療において望ましく、または栄養吸収、運動性もしくは成長または上記で列挙したその他の機能を抑制することが望ましい状態の治療において望ましい。
【００２３】
本発明に係る遺伝子の知見により、例えばアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの使用により、インビボでの遺伝子発現を調節することが可能である。特定の遺伝子（例えば本発明において同定されたＡｎｇ４）の発現レベルを阻害または減少させる一つの治療的手段は、アンチセンス療法の使用である。アンチセンス療法は、アンチセンス核酸分子を利用するものであり、このアンチセンス核酸分子は、特異的なｍＲＮＡ配列をミラーとして、タンパク質産生をブロックするように設計されたＤＮＡまたはＲＮＡの合成セグメント（「オリゴヌクレオチド」）である。一度形成されると、ｍＲＮＡは、細胞のタンパク質産生「工場」であるリボソームに結合し、そこで効果的にＲＮＡ配列が読み取られ、遺伝子により指令される特異的なタンパク質分子が製造される。アンチセンス分子が細胞に送達される場合（例えば野生型オリゴヌクレオチドとして、または、適切なアンチセンス発現ベクターにより）、アンチセンス分子の配列が標的の塩基配列に相補的になるように設計されているため、アンチセンス分子はメッセンジャーＲＮＡに結合する。２つの鎖が一旦結合すると、ｍＲＮＡはコードされたタンパク質のリボソームでの製造を指令しなくなり、細胞の酵素により急速に破壊され、それによりアンチセンスオリゴヌクレオチドが解放され、ｍＲＮＡの他の同一なメッセンジャー鎖を探し不能化することができる。
【００２４】
本願明細書において示されるＡｎｇ４遺伝子およびｍＲＮＡ配列の知見を用いれば、当業者は、適切なアンチセンス核酸療法用の分子を設計し、それらを必要に応じて投与することができる。
【００２５】
治療上の可能性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、よく確立された技術を用いて実験的に決定することができる。哺乳動物細胞で本発明のＡｎｇ４遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を可能にするための、アンチセンス発現構築物の一例は、例えばｐＲＥＰ１０ベクター（インビトロジェン社）を用いて容易に構築することができる。転写物は、このタイプの構築物でトランスフェクトされた細胞における遺伝子の翻訳を阻害すると考えられている。アンチセンス転写物は、野生型遺伝子の転写の翻訳を阻害するのに有効であり、本願明細書で説明された効果（例えば組織生理機能の調節）の誘導を可能にする。Ａｎｇ４遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの部分に相補的でありハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、治療的に用いることが考えられる。１９９７年６月１７日に発行された米国特許第５,６３９,５９５号「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ」では、インビボで活性を示すオリゴヌクレオチド配列を同定する方法が十分に説明されており、参照により本願明細書に加入する。Ａｎｇ４遺伝子配列に由来するランダムオリゴヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、細胞に形質転換される。次にこの細胞を、所望のオリゴヌクレオチド活性から生じる表現型について検定される。所望の表現型を有する細胞が同定されたら、所望の活性を有するオリゴヌクレオチドの配列を同定することができる。同定は、ベクターを回収することにより、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行い、挿入された核酸物質を含む領域を配列解析することにより達成することができる。アンチセンス分子をアンチセンス療法用に合成することができる。これらアンチセンス分子は、ＤＮＡ、適切なＤＮＡ誘導体、例えばホスホロチオエートまたはメチルホスホネート、ＲＮＡ、適切なＲＮＡ誘導体、例えば２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ、またはその他のオリゴヌクレオチドミメティックが可能である。１９９７年７月２９日に発行された米国特許第５,６５２,３５５号「Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ」、および、１９９７年７月２９日に発行された米国特許第５,６５２,３５６号「Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」では、生理学的に安定なアンチセンス分子の合成および効果が説明されており、参照により加入する。アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化により、または、アンチセンス配列を含むベクターから発現させることにより細胞に導入することができる。上述したように、いくつかのＲＮＡの安定な形態は、ベクターを用いずに直接投与することができる長い半減期を有することが当業界既知であるため、アンチセンス核酸分子はＲＮＡとして提供することもできる。加えて、ＤＮＡ構築物は、リポソーム、受容体が介在するトランスフェクションおよびその他の当業界既知の方法により細胞に送達することもできる。
【００２６】
標的遺伝子と共同作用するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、標準的な分子生物学的および／または上述の化学合成により、慣用の手段を用いて製造することができる。必要
に応じて、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、インビボで分解しないように、または、細胞膜の通過が容易になるように化学修飾してもよく、および／または、ｍＲＮＡを不活性化することができる物質、例えばリボザイムをそれらに連結させてもよく、本発明にはこのような構築物も含まれる。アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、Ａｎｇ４遺伝子産物の生産が過剰調節または過少調節されたことに関連するヒトの病気または障害の治療において利用可能である。
【００２７】
あるいは、リボザイム分子は、インビボでＡｎｇ４ｍＲＮＡを分解および破壊するように設計することもできる。リボザイムは、極めて特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ＲＮＡの少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を有するハイブリダイズ領域と、標的ＲＮＡを認識し分解するように適応された触媒領域とを含む。ハイブリダイズ領域は、好ましくは、少なくとも９個のヌクレオチドを含む。このようなリボザイムの設計、構築および使用は、当業界周知であり、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈにおいてより詳細に説明されている（Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５〜５９１，１９８８年）。その他の代替法として、Ａｎｇ４遺伝子の５’領域とハイブリダイズして三重らせん構造を形成するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いてＡｎｇ４遺伝子の転写をブロックまたは減少させてもよい。その他の代替法として、プラスミドベクターにクローニングされたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチドまたは短い（１８〜２５ｂｐ）ＲＮＡｉＡｎｇ４配列を設計し、二本鎖化したＲＮＡを哺乳動物細胞に導入し、Ａｎｇ４メッセンジャーＲＮＡ分解を阻害および／または分解に至らせることができる。Ａｎｇ４のＲＮＡｉ分子は、アデニン／アデニン（ＡＡ）または少なくとも（いずれかの塩基、すなわちＡ、Ｕ、ＣまたはＧ）Ａ＊＊＊で始まり、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の塩基対の二本鎖化したＲＮＡ分子を含みうるものであり（好ましい塩基対長さは２１個）、２個のヌクレオチドからなる３’オーバーハングまたは４５〜５０ｍｅｒのＲＮＡ分子を形成するヘアピンを有する個々のＡｎｇ４配列に特異的でありうる。このような小さい阻害ＲＮＡ分子の設計、構築および使用は当業界周知であり、以下でより詳細に説明されている：Ｅｌｂａｓｈｉｒ等（Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４〜４９８，２００１年）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ等（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１５：１８８〜２００，２００１年）；Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．等（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１４：４５５７〜４５６５，２００１年）；Ｍａｓｔｅｒｓ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：８０１２〜８０１７，２００１年）；および、Ｔｕｓｃｈｌ等（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１３：３１９１〜３１９７，１９９９年）。
【００２８】
アゴニストもしくはアンタゴニストまたは遮断化合物の同定は、標準的な方法を用いて行うことができる。
アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば適切に設計された機能分析により同定することができる。試験化合物、例えばコンビナトリアルライブラリーからの試験化合物もしくはその他の化合物、またはペプチドコレクションを上記タンパク質を発現する細胞に施すことができる。これら細胞を、アンギオゲニン−４の存在を示す生物活性（例えば抗微生物活性または血管新生活性）に関して分析することができる。活性の増加は、化合物がアゴニストとして作用していることを示し、活性の減少は化合物がアンタゴニストであることを示しうる。
【００２９】
ミメティックは、タンパク質に関して知られている構造的情報およびその他の情報を用いて特定の標的に適合するように合理的に設計された低分子物質である。ペプチドミメティックは活性ペプチドに基づいているが、ペプチド結合の数は減少している。
【００３０】
本発明のポリペプチドまたはそれをコードする核酸は、医薬スクリーニングに用いることができる。特に、アンギオゲニン−４遺伝子は、消化管内共生生物の存在に対する強健
で信頼性の高いレポーターであることがわかっている。それゆえに、その産生は、パネート細胞の機能を調節する化合物をスクリーニングすることにより測定することができる。
【００３１】
アンギオゲニン−４またはその他のアンギオゲニン−４ｍＲＮＡの検出は、慣用の方法を用いて行うことができる。例えばアンギオゲニン−４遺伝子は、プローブまたはプライマーを用いて検出することができる。タンパク質は、例えばアンギオゲニン−４に特異的に結合する抗体を用いたイムノアッセイにより検出することができる。このような抗体は、新規であり、本発明のさらなる局面を形成する。
【００３２】
本願明細書で用いられる用語「抗体」は、完全抗体またはそれらの断片、例えばＦ(ａ
ｂ)2、Ｆａｂ、ＦＶ、ＶＨもしくはＶＫ断片、単鎖抗体、多量体の単一特異的な抗体もしくはそれらの断片、または、二重特異性または多重特異的抗体もしくはそれらの断片を意味するものとする。これらのタイプの抗体誘導体およびそれらの頭字語はいずれも当業者周知である。
【００３３】
このような本発明の局面において用いられる抗体は、アンギオゲニン−４タンパク質／ポリペプチドを用いて製造することができる。
標識された抗体の製造方法および検出方法は周知である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１３巻，Ｂｕｒｄｅｎ  Ｒ等編集，エルゼビア社，アムステルダム（１９８４年））。用語「抗体」は、実質的に同種の集合体であるモノクローナル抗体、および、異種の集合体であるポリクローナル抗体の両方を含む。この用語はまた、特に、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含む。
【００３４】
特異的な抗原に対するモノクローナル抗体は、当業者既知の方法により、例えばハイブリドーマ細胞、ファージディスプレイライブラリーまたはその他の方法により得ることができる。モノクローナル抗体は、特に、ヒト、ウサギまたはラット由来でありうる。ヒトモノクローナル抗体の生産に関しては、ハイブリドーマ細胞を免疫化動物（例えばウサギ）からの脾臓細胞と腫瘍細胞とを融合することによって製造しうる。続いて、適切な分泌性のハイブリドーマ細胞を選択することができる（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５〜４９７（１９７５年）；Ｃｏｌｅ等の「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．第７７頁〜第９６頁（１９８５年））。このような抗体は、任意の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、および、それらの任意のサブクラスであり得る。
【００３５】
ポリクローナル抗体は、動物（例えばウサギ、ラット、ヤギ、ウマ、ヒツジなど）の免疫化により生産することができる（例えば実施例３を参照）。
げっ歯類の抗体は、当業界既知の技術により組換えＤＮＡ技術を用いてヒト化することができる。あるいは、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片を、当業界既知の技術を用いて本発明のポリペプチドに対して製造することもできる（Ｈｕｓｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１２７５〜１２８１（１９８９年））。このようにして製造された抗体は、多数の用途を有し、これは当業界の熟練した分子生物学者または免疫学者にはよく知られている。このような用途としては、これらに限定されないが、酵素発現のモニター、酵素活性を測定するための分析の開発、および、治療剤としての用途が挙げられる。酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）が当業界周知であり、試験サンプル中でアンギオゲニン−４タンパク質またはそれらのポリペプチド断片を検出するのに特に適切である。
【００３６】
特定の局面において、本発明は、本発明のタンパク質、特にアンギオゲニン−４タンパ
ク質のレベルをそれらを必要とする動物の腸内で増加させることによって、炎症性の腸疾患を治療する方法、または、腸感染症を予防および／または治療する方法を提供する。同様に、この方法は、腸に到達するような形態で上記タンパク質を投与することによって、または上記で概説したその他の方法によって達成することができる。
【００３７】
共生細菌によるＡｎｇ４の誘導は、他の腸の殺菌性タンパク質をコードする遺伝子とは区別される特性である。小腸は、主にパネート細胞でデフェンシンファミリーメンバーを複数発現する。デフェンシンｍＲＮＡレベルは、無菌マウスおよび慣用的に飼育したマウスの腸におけるのと類似している（Ｋ．Ｐｕｔｓｅｐ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，４０４７８（２０００年））。加えて、我々が以前に行ったＤＮＡマイクロアレイ研究では、無菌マウスでバクテロイデス−シータイオタオミクロンが定着した後、腸のデフェンシンｍＲＮＡ発現の増加は見られなかった（Ｌ．Ｖ．Ｈｏｏｐｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９１，８８１（２００１年）。
【００３８】
共生細菌は、適応性の腸の免疫反応の正常な発達に寄与する（Ｇ．Ｌ．Ｔａｌｈａｍ等，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７，１９９２（１９９９年）。しかしながら、定住微生物が生得的な粘膜防御の発現に影響するかどうか、またはどのように影響するかについてはほとんど知られていない。本願明細書で示された結果によれば、選択的な殺菌性を有するパネート細胞の低分子量タンパク質の、微生物叢の構成要素による発現／分泌の調節に関与するこれまで認識されていなかったメカニズムの存在が示される。離乳期における殺菌性タンパク質の微生物による調節は、発達中の微生物叢の組成を定める優れた方法であり、Ａｎｇ遺伝子発現および殺菌活性の両方が微生物特異性を有する場合、このようなシステムには明確なフィードバック因子が存在する。一度安定した群集が確立されれば、腸は、管腔の微生物抗原の複合体レパートリーに対する免疫炎症性反応の変動を防いで、その微生物叢との安定した関係を維持しなければならない。共生生物にＡｎｇ４のような分子の発現を誘導させることの利点は、細菌の上皮への接近が制限されること、その幹細胞の分裂速度や移行期の増殖する細胞群（transit amplifying population）の厳しいコントロールが重要であるような「神聖な場所（ｓａｃｒｅｄ  ｓｐａｃｅｓ）」（特に腺窩）において細胞性免疫反応の活性化の変化が低減されること、および、「反応性の低い（ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）」状態（Ａ．Ｓ．Ｎｅｉｓｈ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９，１５６０（２０００年））が長続きすることである。共生細菌により分泌された殺菌性タンパク質（例えばＡｎｇ４）発現が維持されることは、腸病原体が消化管の生態系へ侵入することを防ぐために微生物叢が提供する「コロニー形成バリア」の分子相互関係を示す。
【００３９】
その上、アンギオゲニン−４、および、アンギオゲニンファミリーのその他のメンバーが抗微生物活性を有すること、それゆえに、腸内で、またさらに全身的に、これらのタンパク質のレベルが増加することで望ましい抗菌効果を生じ得ることがわかった。
【００４０】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物における細菌感染または真菌感染を治療する方法を提供し、該方法は、抗微生物性アンギオゲニン、抗微生物活性を有するそれらの断片もしくは変異体、それらのアゴニストもしくはミメティック、または、内在性アンギオゲニンタンパク質の量または活性を増加させることができる化合物を哺乳動物に投与することを含む。
【００４１】
アンギオゲニンは、血管の発達の刺激に関与するタンパク質クラスである。例としては、図１Ｂで示される配列番号４７のヒトアンギオゲニン、および、マウスアンギオゲニンが挙げられる。これらは、高度に保存された一連のタンパク質であり、一般的に、図１で示される配列番号１、２、３、４、または、４４、４５、４６もしくは４７と少なくとも６０％の配列の同一性を有する。
【００４２】
本願明細書で用いられる用語「変異体」は、塩基配列が異なる抗微生物性ポリペプチドを意味し、この塩基配列から、配列中の１またはそれ以上のアミノ酸がその他のアミノ酸で置換された変異体が得られる。アミノ酸置換は、アミノ酸がほぼ類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換された「保存的」なものであるとみなすことができる。非保存的な置換は、アミノ酸が異なるタイプのアミノ酸で置換されることである。大まかに言えば、多くの非保存的な置換により、ポリペプチドの生物活性が改変される可能性がある。適切には、変異体は、塩基配列と、少なくとも６０％の配列の同一性、好ましくは少なくとも７５％の配列の同一性、およびより好ましくは少なくとも９０％の配列の同一性を有する。
【００４３】
この場合の配列の同一性は、例えば上述したＢＬＡＳＴ  Ｐアルゴリズムまたはリップマン−ピアソンアルゴリズムを用いて判断することができる。
【００４４】
特定の実施態様において、アンギオゲニンは、本発明のタンパク質であり、例えば上述したアンギオゲニン−４であるが、本発明においては、アンギオゲニンファミリーのその他のメンバー、特に配列番号２または４６のＡｎｇ１または配列番号４７のｈＡｎｇも有用であり得る。
特に好ましい実施態様において、アンギオゲニンは、配列番号４７のｈＡｎｇ、または、抗微生物活性を有するそれらの断片もしくは変異体である。特定の配列番号４７の断片は、配列の最初に見いだされるＮ末端シグナルペプチド配列ＱＤＮＳＲＹを欠失している。配列番号４７の微生物的に活性なそれらの断片を用いる利点は、タンパク質がヒト由来であり、それゆえに全身投与しても免疫反応を起こしにくいことである。
【００４５】
一般的に、アンギオゲニンまたはそれらの誘導体は、抗微生物治療を必要とするヒトまたは動物に投与され得る。アンギオゲニンまたはそれらの誘導体は、慣用の方法で、例えば当業界で認められた医薬組成物の形態で、例えば経口投与または局所投与することができる。ヒト由来のアンギオゲニンまたはそれらの誘導体はまた、非経口投与することもできる。
【００４６】
本願明細書で用いられる用語「誘導体」は、上述の生物学的に活性な断片または変異体、および、アゴニストまたはミメティック、または、内在性アンギオゲニンタンパク質の量または活性を増加させることができる化合物を含む。
【００４７】
これらは全身感染を治療するのに用いることができるが、特にこれらタンパク質は腸管の腸感染症を治療するのに用いることもできる。それゆえに、治療計画は、前述したように腸内でタンパク質のレベルを上昇させることを含み得る。
【００４８】
〔図面の説明〕
図１Ａは、マウスアンギオゲニンファミリーメンバーのアミノ酸配列（配列番号１〜４）の配列アライメントを説明し、図１Ｂは、成熟ヒトアンギオゲニン配列（配列番号４７）と比較したこれら配列のいくつかの成熟タンパク質配列（配列番号４４〜４６）を示す。
図２は、マウスアンギオゲニン−４およびアンギオゲニン−３のヌクレオチド配列をアライメント（それぞれ配列番号５および６）で示す。
図３は、マウスアンギオゲニンファミリーメンバーに特異的なプライマーの位置を示す。
図４は、アンギオゲニン−４ｍＲＮＡの組織分布を説明するグラフ、および、アガロースゲル分析の結果である。
図５は、アンギオゲニン−１ｍＲＮＡの組織分布を説明するグラフである。
図６は、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析に基づくアンギオゲニン−３ｍＲＮＡの組織分布を説明するグラフである。
図７は、アンギオゲニン関連タンパク質遺伝子発現の非存在を示すＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
図８は、小腸におけるアンギオゲニン−４発現の微生物による調節実験の結果を示す一連のグラフである。
図９は、生後発育中のアンギオゲニン−４発現の調節を示すグラフである。
図１０は、小腸におけるアンギオゲニン−４発現の細胞内の位置、すなわち腺窩の基底から単離された細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示すブロックグラフである。
図１１は、マウスおよびヒトアンギオゲニンに関する殺菌性および殺真菌性の分析の結果を示す。
図１２は、Ａｎｇ４発現が正常な腸内細菌により誘導されることを示す実験結果を示す。
【００４９】
〔発明の詳細な説明〕
実施例１
１０ｄの定着が、公開されたアンギオゲニン−３配列から設計されたアフィメトリックス社設計のプローブセットにより検出されたｍＲＮＡの回腸での発現が１１倍増加したことに関連するという観察結果から、我々は、マウスアンギオゲニン−３の３’末端および５’末端に特異的なプライマーを設計した。このプライマーは、以下の通りである：
ＯＲＦ［フォワードプライマー（５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む）：
５’−ＣＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＧ（配列番号７）；
リバースプライマー（５’末端にＸｂａＩ部位を含む）：
５’−ＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＧＧＡＣＴＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＧＡＡＧ（配列番号８）。
【００５０】
これらプライマーを共にＲＴ−ＰＣＲに用いて、前無菌ＮＭＲＩマウスの回腸から調製されたＲＮＡから４３８ｂｐの配列を増幅した。これらマウスに、同じ近交系に属する慣用的に飼育した動物から回収した完全な回腸／盲腸の微生物叢を１０ｄの間定着させた。我々は、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＧＥＸ−ＫＧにサブクローニングし、それをベクター特異的プライマーを用いて配列解析した。
【００５１】
驚くべきことに、ＯＲＦのヌクレオチド配列は、マウスアンギオゲニン−３のＯＦＲと９０％の同一性しか有していなかった。ＰＣＲ反応で用いられたプライマー配列（アンギオゲニン−３に特異的）を産物に組み込んだため、我々は、５’−および３’−ＲＡＣＥを用いて、（ａ）この新規のアンギオゲニンのＯＲＦの５’および３’末端の正確な配列を得て、（ｂ）そのｍＲＮＡの５’−および３’−非翻訳領域を特徴付けた。その結果から、アンギオゲニン−３ｍＲＮＡと８８．３％のヌクレオチド配列の同一性しか有さないことがわかった。
【００５２】
アンギオゲニン−４タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、アンギオゲニン−３配列と並べられて、下記の図２においてそれぞれ配列番号５および６として示される。
【００５３】
アンギオゲニン−４は、その他の３つのマウスアンギオゲニンファミリーメンバーと７４〜８１％のアミノ酸配列同一性を有する（図１）。アンギオゲニン−４の５’および３’非翻訳領域が、アンギオゲニン−３ｍＲＮＡの対応する領域と密接に関連することがわかった（図２）。
【００５４】
続いて、様々なマウスアンギオゲニンｍＲＮＡの組織分布の比較分析を行った。慣用的
に飼育した成体の（１２〜１４週齢）雄および雌ＮＭＲＩマウスから回収された組織（２５の組織／マウス）から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。各遺伝子発現の相対レベルを定量するため、我々は、４つのマウスアンギオゲニンファミリーメンバーそれぞれに特異的なプライマーセットを設計し（図３；表１）、それらをＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎに基づくリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析に用いた。
【００５５】
【表１】
2005518195.tif 000002
【００５６】
注目すべきことに、アンギオゲニン−４ｍＲＮＡは、腸に限定されており、十二指腸から直腸にわたり発現する（図４）。その一方で、アンギオゲニン−１発現は、肝臓、肺、および膵臓で最も高く（図５）、一方、アンギオゲニン−３は主に肝臓、肺、膵臓、および前立腺で発現される（図６）。アンギオゲニン関連タンパク質のｍＲＮＡは、ＰＣＲを４０サイクル行った後で観察したがいずれの組織においても検出不可能であった（図７）。
【００５７】
従って、極めて限定的なアンギオゲニン−４発現の腸特異的なパターンは、マウスアンギオゲニンファミリーメンバーのなかでも独特である。
【００５８】
これらの発見により、腸内では、アンギオゲニン−３よりむしろアンギオゲニン−４発現が微生物により調節されていることが示された。この仮説を直接的に検証するために、アンギオゲニン−４特異的なプライマーおよびｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、無菌ＮＭＲＩマウス、および、通常通り発育したＮＭＲＩ動物から回収した回腸／盲腸の微生物叢を１０ｄの間定着させた無菌マウスの小腸の長さに沿ってアンギオゲニン−４ｍＲＮＡレベルを比較した。対比較により、アンギオゲニン−４発現は、定着させたマウスの空腸で最も高く、通常のマウス（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、この領域において、アンギオゲニン−４発現の最大１７倍の増加を誘導することがわかった（図８）。無菌ＮＭＲＩマウスの、バクテロイデス−シータイオタオミクロンの１０ｄの間の単独定着により、匹敵するアンギオゲニン−４発現の誘導が生じた（データは示さず）。
【００５９】
生後発育中のアンギオゲニン−４発現の調節は、その微生物による調節と一致する
続いて、生後５日目（Ｐ５）〜３０日目（Ｐ３０）の無菌マウスおよび慣用的に飼育したＮＭＲＩマウス（ｎ＝３匹のマウス／時点／群）におけるアンギオゲニン−４発現の発達パターンを評価した（図９）。アンギオゲニン−４転写の相対レベルは、両方のマウス群においてＰ２０までは相対的に低いままであった。この時点の後、無菌動物において発現がわずかに上昇した（２〜３倍）。その一方で、アンギオゲニン−４発現は、慣用的に飼育した動物においてＰ１５〜Ｐ３０の間に２０倍を超えて増加した。これら結果は、アンギオゲニン−４は、授乳／離乳の移り変わりの際に誘導され、消化管の微生物叢におけ
る主要な変化と一致することを示す。また、生後の無菌マウスにおいてアンギオゲニン−４誘導がないことは、微生物叢の構成要素は、腸内でのアンギオゲニン−４発現の調節において重要な役割を果たすという結論とも一致する。
【００６０】
アンギオゲニン−４の細胞局在化
細胞由来のアンギオゲニンタンパク質発現の上述したレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）／ｑＲＴ−ＰＣＲ研究（実施例２）では、アンギオゲニン−３とアンギオゲニン−４との両方を認識するプライマー、および、採取された腺窩上皮、絨毛上皮、または絨毛の中心からの間充組織集合体から単離されたＲＮＡを用いた。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析によれば、微生物により調節される「アンギオゲニン」は、リーベルキューン陰窩の基底に位置する上皮細胞で生産されることが示された（Ｈｏｏｐｅｒ等，２００１年）。
【００６１】
アンギオゲニン−４発現はパネート細胞で起こるという仮説を検証するため、我々は、ＬＣＭを用いて、（ａ）弱力化したジフテリア毒素Ａ断片（ｔｏｘ１７６）で処理したパネート細胞系を切除した無菌成体（１２週齢）トランスジェニックマウス（ＣＲ２−ｔｏｘ１７６マウス）（Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ等，１９９７年）、および、（ｂ）それらの年齢および性別が一致する無菌の正常な同腹子から、空腸の腺窩の基底に位置する細胞を単離した。アンギオゲニン−４特異的プライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲから、正常なマウスの腺窩の基底の上皮細胞から精製したＲＮＡにおいては、アンギオゲニン−４ｍＲＮＡレベルはＣＲ２−ｔｏｘ１７６同腹子と比べて１０倍高いことがわかった（図１０）。
【００６２】
慣用的に飼育したＮＭＲＩマウスを用いて追跡調査した。３種の細胞プール；パネート細胞のみ、上部の腺窩および絨毛からの上皮細胞（パネート細胞を除いた分画）、ならびに、絨毛の中心および腺窩近縁の領域から採取された間充織、をＬＣＭで回収した。アンギオゲニン−４ｍＲＮＡの分布は、Ｍｏｍ−１遺伝子座の産物であるホスホリパーゼＡ２、および周知のパネート細胞に特異的な遺伝子産物の分布と密接に類似していた（データは示さず）。
ｑＲＴ−ＰＣＲ研究で用いられた追加のプライマーを表２に示す。
【００６３】
【表２】
2005518195.tif 000003
【００６４】
実施例２
機能分析のためのアンギオゲニン（例えばアンギオゲニン−４）の発現および精製
ｐＥＴ３ａに基づく発現ベクターを大腸菌でアンギオゲニン−４およびアンギオゲニン−１を発現するように構築した（ポジティブコントロール）。特に、マウスＡｎｇ１、マウスＡｎｇ４、およびヒトＡｎｇをコードしたＯＲＦ（ａｄｄ  ｒｅｆ）を、成体マウスの肝臓、成体マウスの小腸の中間（空腸）、およびヒト小腸からそれぞれ得られたｃＤＮＡ、および、遺伝子特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅した（表３を参照）。
【００６５】
【表３】
2005518195.tif 000004
【００６６】
得られたアンプリコンはシグナル配列の代わりにＭｅｔコドンを含み、５’ＮｄｅＩおよび３’ＢａｍＨＩ部位を組み込んでいた。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＥＴ３ａ（インビトロジェン）にクローニングし、配列解析した。
【００６７】
次に、組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１−コドンプラス（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞（ストラタジーン）に導入した。中期対数期の培養物で、製造元（ストラタジーン）が開発したプロトコールを用いて、０.５ｍＭイソプロピルチオガラクトシドでタンパク質発現を
誘導した。その後、細胞を遠心分離（６５００×ｇ）で回収し、０.１容量の１００μｇ
／ｍｌリゾチームを含むＩＢ緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭの
ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に分散し、音波破砕で破壊した。
【００６８】
予備実験によれば、ＩＰＴＧで誘導した後、各アンギオゲニンが封入体に局在することが示された。この特徴は、アンギオゲニンファミリーメンバーに共通する特性である。
【００６９】
封入体を遠心分離（１０,０００×ｇ）で回収し、ＩＢ緩衝液で２回洗浄し、７Ｍグア
ニジン−ＨＣｌ、０.１５Ｍ還元グルタチオン、０.１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、および２ｍＭのＥＤＴＡに可溶化した。アンギオゲニンをリフォールディングし、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した（Ｓ２）。各タンパク質調製物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端配列解析で推定した。ＲＮアーゼ活性（Ｓ３）を測定し、タンパク質が適切にリフォールディングされたかを調べた。アンギオゲニンを１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.２）に対して透析した。
適切なフォールディングは、溶解性およびＲＮアーゼ活性（アンギオゲニンに共通する特徴）の分析により推定することができた。
【００７０】
実施例３
ポリクローナル抗体の生産
精製アンギオゲニン−４を用いて、ウサギでポリクローナル抗体を生産した。この抗体は他のアンギオゲニンを認識する可能性もあるが、アンギオゲニン−４は腸上皮で生産される唯一のアンギオゲニンであるため、これら抗体は、パネート細胞におけるその輸送を調査するのに極めて有用であると考えられる（下記参照）。
【００７１】
実施例４
血管新生活性の分析
血管新生活性の標準的な生物学的分析は、ヒヨコの漿尿膜を用いた。様々な量の精製アンギオゲニン−１（ポジティブコントロール）またはアンギオゲニン−４を、膜および新しい血管形成に適用し、単盲検法で評点した。
【００７２】
数種のマウスモデルにおいて、新規のフルオロクロムで標識された血管撮影分析を用いて、腺窩近縁および絨毛の血管ネットワークの三次元再構築を行うことも可能である（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｈ．等（１９９８年）Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓ．５５：１７９，Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ  Ｔ．Ｓ.，Ｈｏｏｐｅｒ  Ｌ．Ｖ．およびＧｏｒｄｏ
ｎ  Ｊ．Ｉ（２００２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９９，１５４５１〜１５４５５）。この分析において、フルオレセインを結合させた高分子量のデキストランまたはローダミンＢ標識されたゼラチンのいずれかの溶液で心室潅流したマウスから回収された厚さ１２０μｍの腸切片を用いた共焦点レーザー顕微鏡検査法が用いた。以下の２つの比較群を作製した：（ａ）成体無菌ＦＶＢ／Ｎ  ＣＲ２−ｔｏｘ１７６トランスジェニックと、正常な同腹子との対（すなわち、それぞれ空腸の腺窩にパネート細胞を有する動物と有さない動物）；（ｂ）成体無菌ＮＭＲＩマウスと、未分画の回腸／盲腸の微生物叢を１０ｄおよび３５ｄの間で定着させた年齢および性別が一致する前無菌動物との対。
【００７３】
実施例５
静菌活性または殺菌活性の分析
慣用的な方法を用いて精製アンギオゲニン−４を殺菌活性に関して分析した。例えば、これらを正常な腸内細菌叢のメンバー（例えば、大腸菌、バクテロイデス−シータイオタオミクロン、クロストリジウム属、乳酸菌属）、様々な腸の病原体（例えば、サルモネラ−チフィムリウム、シゲラ−フレキシネル、カンピロバクター−ジェジュニ）と共にインキュベートした。適切には、既知の殺菌活性を有するＲＮアーゼをポジティブコントロールとして用いた（ヒト好酸球陽イオンタンパク質，Ｌｅｈｒｅｒ，Ｒ．Ｉ．等（１９８９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２，４４２８〜４４３４）。
【００７４】
実施例２で説明したように得られた精製アンギオゲニン−４を数種のグラム陽性およびグラム陰性の腸の病原体および共生生物に対する殺菌活性に関して分析した。増大する濃度の精製Ａｎｇ４で処理した後に残存するコロニー形成単位（ＣＦＵ）のパーセンテージを測定し、図１１Ａに示す。細菌を中期対数期まで増殖させ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.２）に再懸濁した。最初の細菌濃度は、１０5〜１０6ＣＦＵ／ｍｌの範
囲であった。３７℃で２時間インキュベートした後、生育可能な細菌を希釈プレーティング法で定量した。分析は三回で行った。平均値±ＳＤをプロットし、図１１（Ａ）に示す。精製ｈＡｎｇ、Ａｎｇ１、およびＡｎｇ４の、（Ｂ）エンテロコッカス−フェカーリス（ＡＴＣＣ２９２１２）、（Ｃ）リステリア−モノサイトゲネス（ＥＧＤ−ｅ株；Ｐ．Ｇｌａｓｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９４，８４９（２００１年）、（Ｄ）カンジダ−アルビカンス、および（Ｅ）ストレプトコッカス−ニューモニエに対する殺菌活性の比較も示す。
【００７５】
対数期のエンテロコッカス−フェカーリスまたはリステリア−モノサイトゲネス（いずれもグラム陽性の病原体）のコロニー形成単位数は、１μＭのＡｎｇ４で２時間処理した後、＞９９％に低下した（図１１Ａ）。１μＭのＡｎｇ４を用いたところ、腸の共生生物であるバクテロイデス−シータイオタオミクロンの感受性は低下し、生育可能な有機体の数は３０％減少した（平均±１ＳＤ）。その他のグラム陰性の共生生物である大腸菌Ｋ１２は、１０μＭのＡｎｇ４に耐性であった（図１１Ａ）。大腸菌Ｋ１２はリステリア−モノサイトゲネスと近い遺伝的関係を有するが（上述のＧｌａｓｅｒ等）、リステリア−イノキュアは最大１０μＭの濃度でＡｎｇ４耐性であることから（図１１Ａ）、種特異的な特徴により、この宿主由来の抗菌タンパク質に対する感受性または耐性が調節されることが強調された。
【００７６】
ほぼ同量の免疫活性リゾチームおよびＡｎｇ４をパネート細胞分泌顆粒で検出した（示さず）。インビボで、他のパネート細胞顆粒タンパク質の分泌と同様のレベルでＡｎｇ４が腺窩内腔に分泌されるとすれば（Ｔ．Ａｙａｂｅ等，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１，１１３（２０００年）、Ｄ．Ｇｈｏｓｈ等，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，５８３（２００２年））、その腺窩中の推定濃度（＞１ｍＭ）は、エンテロコッカス−フェカーリスまたはリステリア−モノサイトゲネスを殺すのに必要な濃度より１０００倍高いと考えられる（図１１Ａ，Ｅ）。
【００７７】
Ａｎｇ１およびｈＡｎｇは感染に対する急性期反応の際に血流中で見出されるため、それらが感染に対する全身性の生得的な反応のメディエーターとして機能し得るかどうかを確かめるため、Ａｎｇ１およびｈＡｎｇを調査した（Ｋ．Ａ．Ｏｌｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｖｅｒｓｅｌｉｓ，Ｊ．Ｗ．Ｆｅｔｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｌｏｐｎｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４２，４８０（１９９８年））。エンテロコッカス−フェカーリスおよびリステリア−モノサイトゲネスに対するＡｎｇ４により示される有効な殺菌活性とは異なり、いずれの細菌種もＡｎｇ１およびｈＡｎｇに対して耐性であった（図１１Ｂ，Ｃ）。しかしながらヒトにおいて全身性の感染を引き起こす２つの生物は、Ａｎｇ１およびｈＡｎｇに対して感受性であった。カンジダ−アルビカンスは、日和見性の真菌病原体であるが、７０ｎＭのＡｎｇ１およびｈＡｎｇ（それらの血清レベルに匹敵する濃度）に晒して２時間後に９７％および＞９９％のＣＦＵ減少を示した。
【００７８】
同様に、２μＭのＡｎｇ１またはｈＡｎｇにより、ストレプトコッカス−ニューモニエ（一般的に肺炎や敗血症を引き起こすグラム陽性の病原体）の生存能力が＞９９％に減少した。これら病原体のいずれも、Ａｎｇ４に対する感受性が極めて低かった（図１１Ｄ，Ｅ）。従って、マウスＡｎｇ１およびｈＡｎｇは、７７％のアミノ酸配列同一性を共有しており、感染に対する全身性の生得的な宿主側防御のこれまで認識されていなかった構成要素であると考えられる。
【００７９】
実施例６
マウスの結腸およびヒト消化管のＬＣＭ研究
成体マウスの結腸（パネート細胞が欠失している）において、ＬＣＭを用いて細胞由来のアンギオゲニン−４を同定した。３つの領域：最も下の３分の１の腺窩、残り上部の３分の２の腺窩、および、表面上皮のカフ（ｃｕｆｆ）（絨毛の結腸相同体）から、細胞を切り取った。次に、成体無菌および慣用的に飼育したＮＭＲＩマウスを実験に用いた（ただしその他の種も有用である）。アンギオゲニン１、３、および４に特異的なプライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲで発現を分析した。アンギオゲニン−４が腺窩上皮で検出される唯一のアンギオゲニンであるため、実施例３で述べたように作製された抗体を発現の細胞パターンのさらなる分析に用いることができる。
【００８０】
ＬＣＭ／ｑＲＴ−ＰＣＲはまた、ＡｐｃMin／＋マウスにおけるアンギオゲニン−４発
現を比較し、対比させるのに用いることもでき、腺腫および隣接する正常な外見の上皮からのＲＮＡを分析することもできる。
【００８１】
特に、いくつかの観察によれば、Ａｎｇｒ４発現は、インビボで、腸の微生物叢の構成要素により調節されることが示された。年齢および性別が一致する慣用的に飼育した動物の小腸遠位部および盲腸から回収された未分画の微生物叢の、成体無菌ＮＭＲＩマウスにおける１０ｄの間の定着により、小腸のあらゆる部分でＡｎｇ４ｍＲＮＡ濃度の増加が引
き起こされる。無菌マウスまたは定着マウス（Ｌ．Ｖ．Ｈｏｏｐｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９１，８８１（２００１年））からの小腸を１６個の等しいセグメントに分割し、各セグメントにおいてＡｎｇ４ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した（三回の分析；平均値±ＳＤをプロット、この反応は、バクテロイデス−シータイオタオミクロンの単独定着で総括され、Ａｎｇ４発現は、少なくとも１種の微生物叢の通常のメンバーにより増強されることが示される（図１２Ａ））。結果を図１２Ａに示すが、これは３つの独立した実験のうちの代表的なものである。
【００８２】
ｑＲＴ−ＰＣＲ研究によれば、定着によりＡｎｇ４の増強が示されたが、顕微解剖されたパネート細胞におけるｓＰＬＡ2ｍＲＮＡ発現は示されなかった。バクテロイデス−シ
ータイオタオミクロンが単独定着したマウスおよび通常のマウスから回収された、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションされたパネート細胞におけるＡｎｇ４ｍＲＮＡの細菌性の誘導を確認した（例えば、図１２Ｃ）。その一方で、ｓＰＬＡ2ｍＲＮＡレベルは影響を受けておらず（図１２Ｃ）、これは、Ａｎｇ４発現の微生物依存性の増加は、パネート細胞分泌顆粒タンパク質をコードする遺伝子の一般的な誘導の一部ではないことを示す。
【００８３】
小腸のセグメント９から単離された総細胞性タンパク質２５μｇの免疫ブロット分析を行った。ブロットを抗Ａｎｇでプロービングし、続いてストリップし、抗β−アクチンで再プロービングしたところ、バクテロイデス−シータイオタオミクロンを定着させたマウスにおいてＡｎｇ４タンパク質レベルの増加を示した。この増加は、そのｍＲＮＡの上昇と対応している（図１２Ｂ）。完全な腸遠位部の微生物叢を１０ｄで定着させたマウスの腸内では、Ａｎｇ４タンパク質の劇的な増加は観察されなかった（図１２Ｂ；定着の密度は、ＣＰＵにより測定したところ、２つの動物群において同等であったことに留意すること）。この違いは、Ａｎｇ４発現の翻訳調節または翻訳後調節、または、バクテロイデス−シータイオタオミクロンが単独定着した腸と比べて、通常の腸（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）において強化されたパネート細胞の脱顆粒化によるものと考えられる。
【００８４】
生後発育中のＡｎｇ４発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析により、その微生物による調節を支持する追加の証拠が得られた。プールされた小腸中央部のＲＮＡで分析を行った（ｎ＝３匹のマウス／時点）。全てのｑＲＴ−ＰＣＲ測定は、三回で行われた。
【００８５】
Ａｎｇ４ｍＲＮＡのレベルは、慣用的に飼育したが無菌ではない離乳期（生後１７〜２８日）のＮＭＲＩマウスの小腸で顕著に上昇した（図１２Ｄ）。離乳は、消化管の微生物叢の組成における劇的な変化に関連し、すなわち、グラム陽性および陰性の通性嫌気性菌の存在度が低下し、グラム陰性の偏性嫌気性菌が優勢になる（Ｄ．Ｃ．Ｓａｖａｇｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１，１０７（１９７７年））。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】Ａは、マウスアンギオゲニンファミリーメンバーのアミノ酸配列（配列番号１〜４）の配列アライメントを説明し、Ｂは、成熟ヒトアンギオゲニン配列（配列番号４７）と比較したこれら配列のいくつかの成熟タンパク質配列（配列番号４４〜４６）を示す。
【図２】マウスアンギオゲニン−４およびアンギオゲニン−３のヌクレオチド配列をアライメント（それぞれ配列番号５および６）で示す。
【図３】マウスアンギオゲニンファミリーメンバーに特異的なプライマーの位置を示す。
【図４】アンギオゲニン−４ｍＲＮＡの組織分布を説明するグラフ、および、アガロースゲル分析の結果である。
【図５】アンギオゲニン−１ｍＲＮＡの組織分布を説明するグラフである。
【図６】リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ分析に基づくアンギオゲニン−３ｍＲＮＡの組織分布を説明するグラフである。
【図７】アンギオゲニン関連タンパク質遺伝子発現の非存在を示すＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【図８】小腸におけるアンギオゲニン−４発現の微生物による調節実験の結果を示す一連のグラフである。
【図９】生後発育中のアンギオゲニン−４発現の調節を示すグラフである。
【図１０】小腸におけるアンギオゲニン−４発現の細胞内の位置、すなわち腺窩の基底から単離された細胞のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示すブロックグラフである。
【図１１】マウスおよびヒトアンギオゲニンに関する殺菌性および殺真菌性の分析の結果を示す。
【図１２】Ａｎｇ４発現が正常な腸内細菌により誘導されることを示す実験結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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