(57)【要約】本発明は、交差−β構造、およびこれらの交差−β構造の生物学的役割に関する。透析により細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを調節し、または交差−β構造形成および／または組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）様活性を調節することによるコンホメーション病に伴うプラークを減少させる方法、並びに交差−β構造を可視化することによる診断方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成を調節することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法。
【請求項２】
循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成を増加させることを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法。
【請求項３】
循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成を増加させることができる化合物を供給することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法。
【請求項４】
前記化合物がグルコースである、請求項３に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法。
【請求項５】
循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造を安定化することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法。
【請求項６】
循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成を減少させることを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項７】
循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成を減少させることができる化合物を供給することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項８】
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）様活性を調節することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法。
【請求項９】
ｔＰＡ様活性を増加させることができる化合物を供給することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法。
【請求項１０】
前記化合物が交差−β構造を含んでなる、請求項９に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法。
【請求項１１】
前記化合物が、Ｂ型カルボキシペプチダーゼ活性を阻害することができる、請求項９に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法。
【請求項１２】
前記化合物が、カルボキシペプチダーゼインヒビター（ＣＰＩ）またはＣＰＩ様活性を含んでなる、請求項９または１１に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法。
【請求項１３】
ｔＰＡ様活性を減少させることができる化合物を供給することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項１４】
前記化合物が、タンパク質および／またはその機能的に同等のものおよび／またはその機能的断片である、請求項１３に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、タンパク質および／またはペプチド由来のカルボキシ末端リシンまたはアルギニンを開裂することができるＢ型カルボキシペプチダーゼ、および／またはその機能的に同等のものおよび／または機能的断片を含んでなる、請求項１４に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項１６】
前記化合物が、リシン、アルギニンまたはそれらの機能的に同等のものである、請求項３に記載の細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項１７】
前記化合物が、ｅ−アミノ−カプロン酸またはトラネキサム酸である、請求項１３に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項１８】
交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を調節することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法。
【請求項１９】
交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を減少させることを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項２０】
交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を減少させることができる化合物を供給することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項２１】
前記化合物が、タンパク質、および／またはその機能的に同等のものおよび／またはその機能的断片である、請求項２０に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項２２】
前記タンパク質がフィンガードメインを含んでなる、請求項２１に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項２３】
前記タンパク質が、抗体および／またはその機能的に同等のものおよび／またはその機能的断片を含んでなる、請求項２１に記載の細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法。
【請求項２４】
ｔＰＡ様活性を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性の基質との相互作用を調節することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法。
【請求項２５】
交差−β形成タンパク質の受容体の活性を調節することを含んでなる、細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法。
【請求項２６】
コンホメーション病に伴うプラークを減少させるための、交差−β構造形成を増加させることができる化合物の使用。
【請求項２７】
コンホメーション病に伴うプラークを減少させるための、交差−β構造に結合することができる化合物の使用。
【請求項２８】
交差−β構造を除去するための、交差−β構造に結合することができる化合物の使用。
【請求項２９】
上記化合物が、タンパク質、および／またはその機能的に同等のものおよび／またはその機能的断片である、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記化合物が、ｔＰＡまたはｔＰＡ様活性、および／またはその機能的に同等のものおよび／または機能的断片を含んでなる、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記機能的断片がフィンガードメインを含んでなる、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記タンパク質が、抗体および／またはその機能的に同等のものおよび／または機能的断片である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
コンホメーション病に伴うプラークを減少させるための、ｔＰＡ様活性を増加させることができる化合物の使用。
【請求項３４】
コンホメーション病に伴うプラークを減少させるための、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を増加または安定化させることができる化合物の使用。
【請求項３５】
前記疾患が、アミロイドーシス型疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、出血、血栓症、癌、敗血症および他の炎症性疾患、多発性硬化症、自己免疫疾患、記憶の喪失に関連した疾患またはパーキンソン病、および他のニューロン性疾患（癲癇）である、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
コンホメーション病に伴うプラークの存在を決定するための、交差−β構造エピトープを認識することができる抗体の使用。
【請求項３７】
コンホメーション病に伴うプラークの存在を決定するための、交差−β構造結合ドメインの使用。
【請求項３８】
前記疾患がアルツハイマー病または糖尿病である、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項３９】
改良した１個の交差−β構造結合ドメインまたは複数の交差−β構造結合ドメインを含んでなる、組換えｔＰＡ。
【請求項４０】
請求項３９に記載の組換えｔＰＡを含んでなる、血栓崩壊の治療の方法。
【請求項４１】
フィンガードメインおよび／またはＢ型カルボキシペプチダーゼ活性を含んでなる化合物の有効量を個体に供給することを含んでなる、交差−β構造によって伝達される効果を阻害する方法。
【請求項４２】
交差−β構造によって伝達される効果を局所的に増加させることを含んでなる、細胞毒性およびタンパク質分解を局所的に増加させる方法。
【請求項４３】
交差−β構造および／またはｔＰＡまたはｔＰＡ様活性および／またはＣＰＩまたはＣＰＩ様活性の有効量を供給することを含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
透析によってまたは透析中に行われる、請求項１〜２５または４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜２５または４０〜４４のいずれか一項に記載の方法を行うための分離装置であって、
循環体液をエクス・ビボで輸送するための系を含んでなり、この系は、系に流入し且つ系から上記患者の循環に戻るための、患者の循環に連結するための手段を備えており、かつ、この系は、固相を含んでなり、固相は交差−β構造を結合することができる少なくとも１種類の化合物を含んでなる、分離装置。
【請求項４６】
透析装置である、請求項４５に記載の分離装置。
【請求項４７】
化合物が、交差−β構造に対する抗体、またはその断片または誘導体、ｔＰＡフィンガードメインおよび／またはその機能的に同等のもの、または交差−β構造のマルチリガンド受容体を含んでなる、請求項４５または４６に記載の分離装置。
【請求項４８】
試料中の交差−β構造を検出する方法であって、
試料を交差−β構造に結合することができる化合物と接触させ、交差−β構造を前記化合物へ結合させ、結合によって生成した複合体を検出することを含んでなる、方法。
【請求項４９】
試料が体液に由来する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
体液が血液、血清または液である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
化合物が、交差−β構造、ｔＰＡフィンガードメインおよび／またはその機能的に同等のもの、または交差−β構造のマルチリガンド受容体に対する抗体またはその断片および／または誘導体である、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
化合物を固相に供給する、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４８〜５２のいずれか一項に記載の方法を行うための診断装置であって、
試料容器、試料を交差−β結合化合物と接触させる手段、交差−β結合化合物、および結合した交差−β構造を検出する手段を含んでなる、診断装置。
【請求項５４】
未結合交差−β構造を結合した交差−β構造から分離する手段をさらに含んでなる、請求項５３に記載の診断装置。
【請求項５５】
交差−β化合物を固相に供給する、請求項５３または５４に記載の診断装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生化学、分子生物学、構造生物学および医学の分野に関する。更に詳細には、本発明は、交差−β構造、それらの結合タンパク質、およびそれらの生物学的役割に関する。
【０００２】
緒言
増加しつつある一連の証拠は、球状タンパク質の変性により毒性を生じる可能性があることを示唆している。ｌ変性タンパク質は、部分構造化コンホメーションを採用することによってタンパク質凝集とフィブリル化を開始することができる。このようなフィブリル状凝集体は、様々な種類の組織に（ゆっくりと）蓄積し、様々な退行性疾患に関連している。「アミロイド」という用語は、これらのフィブリル状沈着物を記載するのに用いられる。アミロイドを特徴とする疾患はアミロイドーシスと呼ばれ、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽鎖アミロイドーシス、糖尿病II型、および海綿状脳障害が挙げられる。最近、毒性がミスフォールドタンパク質の固有の特性であることが見出された。本発明によれば、これらのコンホメーション病（conformational disease）についてのこの共通の機構１に関連する。
【０００３】
交差−β構造は、ペプチドまたはタンパク質の二次構造要素である。交差−β構造は、タンパク質の変性、タンパク質分解または変性(unfolding)によって形成することができる。これらの二次構造要素は、典型的にはタンパク質の球状領域には見られない。交差−β構造は、アミロイドフィブリルに見出される。アミロイドペプチドまたはタンパク質は、細胞に対して細胞傷害性である。交差−β構造は、積み重なったβ−シートから構成されている。交差−β構造では、個々のβ−ストランドはフィブリルの長軸に垂直に並んでいるか、またはβ−ストランドが繊維の長軸に平行に並んでいる。交差−β構造におけるβ−シートの積み重なりの方向は、繊維の長軸に垂直である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、本明細書において、タンパク質のグリケーションが交差−β構造の形成も誘発することを報告する。現存する文献情報と組み合わせた本発明者らの結果は、球状タンパク質の変性によって共通構造が誘発されることを示している。従って、本発明は交差−β構造を伴う新規経路を開示し、この経路は「交差−β構造経路」と呼ばれる。この経路は、いわゆるマルチリガンド受容体を包含する幾つかの交差−β構造結合タンパク質からなり、タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスに関与している。本発明者らは、交差−β構造結合モジュールを含む新規な交差−β結合タンパク質の同定も報告する。これらの知見は、交差−β構造経路の同定を支持している。この新規経路の多数の様相の概略を下記に述べる。
【０００５】
例えば、本発明は、タンパク質分解した、変性した、変性した(unfolded)、グリコ(glycated)、酸化した、アセチル化した、あるいは構造的に変化したタンパク質が交差−β構造を有することを開示する。既知の交差−β構造形成タンパク質の例は、アミロイドーシスを引き起こす総てのタンパク質、または疾患に関連したアミロイド沈着に見られるタンパク質であり、例えば、アルツハイマーβ−アミロイド（Ａβ）およびアミリン(Islet Amyloid PolyPeptide; IAPP)であるが、これらに限定されない。本発明は、フィブリン、グリコタンパク質（例えば、グリコアルブミンおよびグリコヘモグロビン）、およびエンドスタチンも交差−β構造を採用することができることを開示する。
【０００６】
本発明は、更にタンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスのシグナルとしての交差−β構造の形成の確認を開示する。
【０００７】
セリンプロテオグリカン組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）は、プラスミノーゲンの開裂を介してプラスミンの形成を誘発する。プラスミンはフィブリンを開裂し、これは血餅のリーシスの際に起こる。マウスのフィブリン分解に本質的なものではないが３；４、ｔＰＡはフィブリン分解におけるその役割について長い間認められてきた５；６。プラスミノーゲンのｔＰＡによる活性化はフィブリンまたはフィブリン断片によって刺激されるが、その前駆体であるフィブリノーゲンによっては刺激されない７−１０。これは、部分的にはｔＰＡのフィブリンへの強力な結合とフィブリノーゲンへの弱い結合によって説明することができる。ｔＰＡの結合および活性化に関与するフィブリンおよびｔＰＡにおける結合部位は、マッピングされており、詳細に研究されている８−２１。しかしながら、ｔＰＡとフィブリンの相互作用についての正確な構造上の基礎は知られていない。フィブリンおよびフィブリン断片の他に、同様にｔＰＡと結合し、ｔＰＡによって伝達されるプラスミン形成を刺激することができる他の多くのタンパク質も報告されている２２−３６。フィブリンおよびフィブリン断片の場合と同様に、これらのｔＰＡについてのリガンドとｔＰＡとの間の（複数の）相互作用の正確な性質は知られていなかった。更に、一次配列相同性を欠いているこれら総てのタンパク質がｔＰＡと結合する理由および仕方が知られていなかった。本発明は、交差−β構造と結合することができるタンパク質としての組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）を開示する。更に、本発明は、交差−β構造結合モジュールとしてのフィンガードメイン（フィブロネクチンＩ型ドメインとも呼ばれる）および他の類似のフィンガードメインを開示する。本発明は、更にこれらのフィンガーに結合するタンパク質が典型的には交差−β構造を形成することができることも開示する。
【０００８】
フィブリンは交差−β構造を含むので、本発明は、交差−β構造の生成が生理学的過程に役割を果たしていることも開示する。本発明は、交差−β構造の生成がシグナル形成経路の一部であり、タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを制御する「交差−β構造経路」である。この経路の不適当な機能は、コンホメーション病３７および／またはアミロイドーシスのような疾患を発現することがある。
【０００９】
本発明は、更に交差−β構造がマルチリガンド受容体のリガンドにおける共通の通性であることを開示する３８。従って、本発明は、マルチリガンド受容体が「交差−β構造経路」に属することを開示する。
【００１０】
交差−β構造の受容体の検討された最良の例はＲＡＧＥ３９−４４である。ＲＡＧＥについてのリガンドの例は、Ａβ、タンパク質−高次グリケーション最終生成物（ＡＧＥ）付加物（グリコ−ＢＳＡなど）、アンホテリンおよびＳ１００である。ＲＡＧＥは、一層大きなファミリーのマルチリガンド受容体の一つであり３８、幾つかの他のを含み、ＣＤ３６などそれらのあるものは交差−β構造を含むタンパク質に結合することが知られている（図１も参照されたい）。現在のところ、これらの受容体への結合に介在するこれらの受容体のリガンドにおける構造または構造類の正確な性質が何であるかは明らかになっていない。本発明者らは、タンパク質のグリケーションが交差−β構造の形成も誘発することを報告する。従って、本発明者らは、これら総ての受容体が望ましくないまたは有害なタンパク質または病原体の分解および除去を扱う機構の一部分を形成していることを開示する。これらの受容体は、感染性病原体または細胞の認識、アポトーシス細胞の認識、およびタンパク質複合体および／または病原体のインターナリゼーションに役割を果たしている。更に、これら総ての受容体は同一または同様の構造である交差−β構造を認識して、望ましくない分子に応答することも開示される。本発明者らは、ｔＰＡが交差−β構造と結合して、ｔＰＡがマルチリガンド受容体ファミリーに属する証拠を提供することを示す。本明細書に開示されるように、ｔＰＡおよび他のマルチリガンド受容体は交差−β構造と結合して、望ましくない生体分子の分解に関与する。この経路におけるプロテアーゼｔＰＡの顕著な役割は、プラスミンの形成を包含するタンパク質分解カスケードを開始するその能力にある。タンパク質分解は、細胞外マトリックス成分の分解とその後の除去に本質的であると思われる。細胞外マトリックスに対するｔＰＡの効果は、例えばインテグリンが介在する過程を介する細胞接着、細胞移行および細胞死に影響を及ぼす。本発明者らの研究に基づいて、本発明者らは少なくとも３種類の他のタンパク質であるＦＸＩＩ（XII因子）としても知られるＦＸＩＩ、肝細胞増殖因子アクチベーター（ＨＧＦａ）、およびフィブロネクチンであって、１個以上のフィンガードメインを含むものも「交差−β構造経路」の部分であることの強力な証拠を提供した。
【００１１】
特に、ＦＸＩＩの役割は、これが固有の凝固経路を活性化するので、重要である。固有経路の活性化、およびそれによる血管作用性ペプチドの形成および他の重要なタンパク質の活性化は、望ましくないタンパク質または病原体の防御および／またはクリアランスの過程に寄与する。「交差−β構造経路」は、多くの方法で調節される。この経路を調節する因子としては、合成および分泌のモジュレーター、並びに活性のモジュレーターが挙げられる。この経路は、多くの生理学的および病理学的過程に関与している。従って、本発明は、更に交差−β構造を形成するタンパク質の受容体の活性を調節することを含んでなる、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法も提供する。交差−β構造形成タンパク質の例としては、ＲＡＧＥ、ＣＤ３６、低密度リポタンパク質関連タンパク質（ＬＲＰ）、スカベンジャー受容体Ｂ−１（ＳＲ−ＢＩ）、ＳＲ−Ａが挙げられる。本発明は、ＦＸＩＩ、ＨＧＦａおよびフィブロネクチンも交差−β構造の受容体であることを開示する。
【００１２】
本発明は、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）が交差−β構造結合タンパク質、マルチリガンド受容体および「交差−β構造経路」の構成因子であることを開示する。本発明は、ｔＰＡが、交差−β構造によって誘発される細胞機能障害および／または細胞毒性に介在していることを開示する。本発明は、ｔＰＡが、プラスミノーゲンの活性化による細胞機能障害および／または毒性に少なくとも部分的に介在していることを開示する。プラスミノーゲンに依存する効果はＢ型カルボキシペプチダーゼ活性Ｂによって阻害され、その結果、交差−β構造経路におけるカルボキシ末端リシン残基の役割が明らかになる。
【００１３】
本発明は、とりわけ、ｔＰＡと結合するフィブリンおよび他のタンパク質における（複数の）構造、ｔＰＡにおける結合ドメイン、およびこの構造によって制御される（複数の）経路に関する。本発明は、ｔＰＡと結合することができるタンパク質およびペプチドにおける交差−β構造の存在を開示する。本明細書に開示される結果は、交差−β構造の存在と分子がｔＰＡと結合する能力とに強い相関があることを示している。更に、これらの結果は、フィブリンにアミロイド構造が存在することを示している。これは、生理学的条件下では交差−β構造が、以前には認識されていなかった現象を生じることができることを示している。交差−β構造の形成は、これまでは重篤な病理学的異常とのみ関連付けられてきた。ｔＰＡは変性タンパク質と結合し、これは、総てのタンパク質ではないにしても、多数のタンパク質が交差−β構造または（複数の）交差−β様構造を含むコンホメーションを採用することができることを示している。まとめれば、交差−β構造の形成は、望ましくない分子、すなわちミスフォールドタンパク質、アポトーシス細胞または病原体の除去を適性に扱うのに必要な事象の生理学的カスケードを開始しおよび／またはこれに関与するものと思われる。図１は、「交差−β構造経路」の図解表現を示している。この経路は、フィブリン溶解、ニューロンのシナプスネットワークの形成、使用済の、望ましくないおよび／または破壊された（変性）タンパク質のクリアランス、アポトーシスの誘発、およびアポトーシス細胞および病原体のクリアランスなどの幾つかの過程における望ましくない生体分子の除去を調節する。調節が不十分であるかまたは不適当であったり、または不均衡であったりすると、この経路は重篤な疾患を生じることがある。
【００１４】
従って、第一の態様では、本発明は、循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成（および／または交差−β構造によって伝達される活性）を調節することを特徴とする、上記タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法を提供する。
【００１５】
２種類の主要な規則的タンパク質フォールディングパターンがあり、それらはβ−シートおよびα−へリックスとして知られている。逆平行β−シートは、伸びたポリペプチドが前後してそれ自身の上に折り重なるときに形成し、鎖のそれぞれの部分はその直ぐ隣のものと逆方向になっている。これによって、隣接した鎖のペプチド結合を連結する水素結合によって互いに固定された構造が得られる。同じ方向に伸びるポリペプチド鎖の領域は、平行β−シートを形成する。交差−β構造は、層板状β−シートから構成されている。交差−β構造において、個々のβ−ストランドはフィブリルの長軸に垂直に伸び、またはβ−ストランドは繊維の長軸に平行に伸びる。交差−β構造におけるβ−シートの積み重なりの方向は、長い繊維軸に垂直である。本明細書で実験の部に開示されているように、広範囲のタンパク質は交差−β構造を採用することができ、その上、これらの交差−β構造を含んでなるタンパク質は、総てｔＰＡに結合してこれを刺激し、これによって望ましくないまたは損傷しているタンパク質または病原体の破壊を促進することができる。
【００１６】
細胞外タンパク質は、典型的には１個の細胞または複数の細胞の外側に存在するタンパク質として定義される。
【００１７】
タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスは、望ましくないタンパク質、例えば望ましくないおよび／または破壊された（例えば、変性した）タンパク質の分解および除去を包含する。また、フィブリン溶解、ニューロンのシナプスネットワークの形成、使用済の、望ましくないおよび／または破壊された（変性）タンパク質のクリアランス、アポトーシスの誘発、およびアポトーシス細胞および病原体のクリアランスなどの幾つかの過程における望ましくない生体分子の除去も包含する。
【００１８】
「循環中の」という用語は、本明細書では、１個の細胞または複数の細胞の外側の循環、例えば血液の継続的運動として定義されるが、これに限定されない。
【００１９】
更にもう一つの態様では、本発明は、交差−β構造の形成および／または循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造によって伝達される活性を増加させることを特徴とする、上記タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法を提供する。特定のタンパク質の交差−β構造形成の増加により、例えばｔＰＡが活性化され、これが次にプラスミノーゲンの開裂によるプラスミンの形成を誘発し、このようにして分解および／またはタンパク質クリアランスが増加する。
【００２０】
好ましい態様では、本発明は、循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成（および／または交差−β構造によって伝達される活性）を増加することができる化合物を提供することを特徴とする、上記タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを増加する方法を提供する。更に一層好ましい態様では、交差−β構造形成を増加することができる上記化合物はグルコースである。ある種の情況では、グルコースのタンパク質への付加によって、不可逆的な非酵素的グリケーション反応を生じ、主にグルコース分子はタンパク質のリシン残基の遊離アミノ基に結合する。更に、アルギニン残基のＮ−末端および遊離アミノ基は、グリケーションを受けやすい。本明細書の実験の部には、グリケーションによって交差−β構造が形成されることが開示されている。従って、本発明は、循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成を増加することができる化合物を提供することを特徴とする、上記タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを増加する方法を提供する。
【００２１】
タンパク質における交差−β構造形成を増加（または模倣）することができる化合物の他の例は、無極性溶液、尿素（本明細書の実験の部に開示）、イオン（例えば、Ｚｎ２＋）である。しかしながら、例えば変性、低ｐＨ、温度、突然変異、または一般的にはタンパク質修飾（例えば、酸化）により交差−β構造形成を増加しまたは模倣する他の方法もあることは明らかである。
【００２２】
好ましくは交差−β構造を含んでなるタンパク質を分解しおよび／または除去するための上記方法のいずれかによって循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成を増加することを特徴とする、上記タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを増加する方法の他に、交差−β構造から構成されていないタンパク質を分解しおよび／または除去することもできる。これは、例えば、分解および／または除去する必要があるタンパク質またはその附近に交差−β構造を含んでなる化合物およびｔＰＡ様活性を含んでなる化合物を供給することによって達成される。交差−β構造を含んでなる化合物の一例は、フィブリン、または上記交差−β構造を含んでなる断片であり、ｔＰＡ様活性を含んでなる化合物の一例はｔＰＡである。
【００２３】
もう一つの態様では、本発明は、循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成を減少させることを特徴とする上記タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法を提供する。更に好ましくは、本発明は、循環中に含まれる細胞外タンパク質の交差−β構造形成を減少させることができる化合物を提供することを特徴とする上記タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法を提供する。交差−β構造形成の現象は、交差−β構造の形成に関与する基を保護しまたはブロックすることによって達成される。交差−β構造形成を減少させることができる化合物の例は、コンゴレッド、抗体、β−遮断薬（β-breakers）、ホスホネート、ヘパリン、アミノ−グアニジン、またはラミニン４５である。タンパク質での交差−β構造形成を減少させる更にもう一つの方法は、上記タンパク質のグリケーションに関与するグルコース基の除去によるものである。
【００２４】
更にもう一つの態様では、本発明は、ｔＰＡまたはｔＰＡ様活性を調節することを特徴とする細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法を提供する。ｔＰＡは、プラスミノーゲンの開裂によりプラスミンの形成を誘発する。プラスミンはフィブリンを開裂し、これは血餅のリーシス中に起こる。プラスミノーゲンのｔＰＡによる活性化はフィブリンまたはフィブリン断片によって刺激されるが、その前駆体であるフィブリノーゲンによっては刺激されない。「ｔＰＡ様活性」という用語は、本明細書では様々な量の可能性があるプラスミンの形成を誘発することができる化合物および／または他のｔＰＡによって伝達される活性として定義される。好ましくは、ｔＰＡ様活性は、その基質および／または補助因子に対して一層高い活性または親和性を有するように修飾される。これは、例えば、上記ｔＰＡ様活性に交差−β構造を含んでなるタンパク質のの複数の結合ドメインを提供することによって達成される。好ましくは、上記ｔＰＡ様活性は複数のフィンガードメインを備えている。本明細書では、ｔＰＡフィンガードメインおよびフィブロネクチンフィンガードメインの三次元構造４−５は局部電荷密度分布に関して顕著な構造的相同性を示すことを開示する。いずれの構造も、電荷が交互になっている５個のアミノ酸残基の同様な溶媒に暴露したストレッチ(solvent exposed stretch)を含んでおり、ｔＰＡについては、Arg7、Glu9、Arg23、Glu32、Arg30、およびフィブロネクチンについては、Arg83、Glu85、Lys87、Glu89、Arg90であるそれぞれ５番目のフィンガードメインに位置したものである。帯電した残基整列は、フィンガーモジュールの同じ側に位置している。従って、好ましくはｔＰＡ様活性はArgXGlu(X)13Arg(X)8GluXArgまたはArgXGluXLysXGluArgを含んでなる１個以上の追加フィンガードメインを備えている。
【００２５】
ｔＰＡの活性および／またはｔＰＡによって伝達されるプラスミノーゲンの活性化は、フィブリン断片、またはカルボキシ末端にリシンまたはアルギニンを有する他のタンパク質断片への結合によって増加する。カルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）またはトロンビン活性化フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ、カルボキシペプチダーゼＵまたはカルボキシペプチダーゼＲとも呼ばれる）などこれらに限定されないＢ型カルボキシペプチダーゼは、他の場合にはｔＰＡおよび／またはプラスミノーゲンに結合してプラスミン形成を刺激するフィブリン断片のカルボキシ末端リシンおよびアルギニン残基を開裂させる酵素である。
【００２６】
好ましい態様では、本発明は、細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法であって、ｔＰＡ様および／またはｔＰＡによって伝達される活性または複数の活性を増加させることができる化合物を提供することを特徴とする方法を提供する。更に好ましい態様では、本発明は、細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを増加する方法であって、ｔＰＡ様活性を増加することができる化合物を提供し、上記化合物が交差−β構造を含んでなることを特徴とする方法を提供する。もう一つの態様では、本発明は、Ｂ型カルボキシペプチダーゼ活性を阻害することができる化合物を供給することを特徴とする、細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを増加する方法を提供する。更に好ましい態様では、上記化合物はカルボキシペプチダーゼインヒビター（ＣＰＩ）活性を含んでなる。
【００２７】
更にもう一つの態様では、本発明は、ｔＰＡ様活性を減少させることができる化合物を供給することを特徴とする細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法を提供する。更に好ましくは、本発明は、細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法であって、ｔＰＡ様活性またはｔＰＡによって伝達される活性または複数の活性を減少させることができる化合物を提供し、上記化合物がタンパク質、および／またはその機能的に同等なものおよび／または機能的断片であることを特徴とする、方法を提供する。例えば、ｔＰＡ様活性を減少させることができるこのような化合物は、結合し且つ開裂しないｔＰＡのインヒビターまたはｔＰＡの基質である。ｔＰＡ様活性またはｔＰＡによって伝達される活性を減少させることができる化合物の例としては、リシン、アルギニン、ｅ−アミノ−カプロン酸またはトラネキサム酸(tranexamic acid)、セルピン（例えば、ニューロセルピン、ＰＡＩ−１）、ｔＰＡ−Pevabloc、ｔＰＡ様活性またはｔＰＡによって伝達される活性を阻害する抗体、または（複数の）Ｂ型カルボキシペプチダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、リシンを供給することによって、Ｃ末端リシン残基を含んでなるタンパク質のプラスミノーゲンのクリングルドメインへの結合が防止または阻害される。従って、ｔＰＡの活性化が防止または阻害される。好ましくは、ｔＰＡ様活性またはｔＰＡによって伝達される活性または複数の活性を減少させることができる上記化合物は、ｔＰＡ様活性またはｔＰＡによって伝達される活性または複数の活性を減少させ、更に一層好ましくは、ｔＰＡ様活性またはｔＰＡによって伝達される活性または複数の活性は完全に阻害される。
【００２８】
機能的断片および/または機能的に同等なものは、典型的には様々な量の可能性がある同一機能を行うことができる断片および/または同等なものと定義される。例えば、交差-β構造に結合することができる抗体の機能的断片は、上記抗体のＦａｂ’断片である。
【００２９】
更にもう一つの態様では、本発明は、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を調節することを特徴とする細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法を提供する。もう一つの態様では、本発明は、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を減少させることを特徴とする細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法を提供する。このような化合物は、例えば、化学薬品、タンパク質性物質、またはそれらの組合せである。更に好ましい態様では、本発明は、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を減少させることができる化合物を提供することを特徴とする細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法を提供する。更に一層好ましくは、本発明は、本発明による細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法であって、上記化合物がタンパク質、および／またはその機能的に同等なものおよび／または機能的断片であるものを提供する。更に一層好ましくは、上記タンパク質は抗体、および／またはその機能的に同等なものおよび／または機能的断片である。他の例は、コンゴレッドまたはチオフラビンである。本発明は、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を減少させ、上記相互作用が、この相互作用と競合することができる化合物を提供することによって減少することを特徴とする、細胞外タンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスを減少させる方法も提供する。更に詳細には、上記相互作用と競合することができる上記化合物はフィンガードメインを含んでなり、更に一層好ましくは、上記フィンガードメインは、電荷が交互になっている少なくとも５個のアミノ酸残基のストレッチ、例えばＡｒｇＸＧｌｕ(Ｘ)１３Ａｒｇ(Ｘ)８ＧｌｕＸＡｒｇまたはＡｒｇＸＧｌｕＸＬｙｓＸＧｌｕＡｒｇを含んでなる。好ましくは、上記化合物はフィブロネクチン、ＦＸＩＩ、ＨＧＦａまたはｔＰＡである。本発明は、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を増加させることを特徴とする細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを増加させる方法も含んでなることは明らかである。これは、例えば、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を増加させることができる化合物を提供することによって達成される。好ましくは、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を増加させることができる上記化合物は、タンパク質、および／またはその機能的に同等なものおよび／または機能的断片である。例えば、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を安定化する抗体が上記ｔＰＡ様活性を継続的な活性化状態にすると、これによってタンパク質の分解および／またはタンパク質クリアランスが増加する。しかしながら、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用の増加は、例えば��ｔＰＡ様活性を含んでなる上記化合物に（ｔＰＡ、フィブロネクチン、ＦＸＩＩまたはＨＧＦａから得ることができる）他のまたはそれ以上のフィンガードメインを供給することによるまたはＲＡＧＥまたはＣＤ３６などの結合ドメインを包含することによるドメインの交換のように、交差−β構造を含んでなる化合物またはｔＰＡ様活性を含んでなる化合物での突然変異によっても達成されることが分かる。
【００３０】
更にもう一つの態様では、本発明は、ｔＰＡ様活性を含んでなる化合物と上記活性の基質との相互作用を調節することを特徴とする、細胞外タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスを調節する方法を提供する。相互作用を増加または減少させることができる多数の方法があることは明らかである。ｔＰＡ様活性を含んでなる化合物と上記活性の基質との相互作用の増加は、例えば、ｔＰＡ様活性を含んでなる化合物に１回の突然変異または複数の突然変異を行って、ｔＰＡ様活性を有する化合物のその基質に対する親和性を向上させることによって達成される。
【００３１】
更にもう一つの態様では、本発明は、交差−β構造結合ドメインを含んでなる化合物を用いて循環中から交差−β構造を除去する方法を提供する。好ましくは、上記化合物はｔＰＡまたはｔＰＡのフィンガードメインである。本発明は、ＨＧＦａ、ＦＸＩＩおよびフィブロネクチンのフィンガードメインなどこれらに限定されない他の交差−β構造をも含んでなることは明らかである。本発明は、交差−β構造と結合する抗体をも含んでなることは明らかである。
【００３２】
本発明は、コンホメーション病、糖尿病ＩＩ型および／または老化（例えば、アルツハイマー病）に関与する（アミロイド）プラークの形成を予防しまたは減少させ／少なくする新規な方法の使用を開示する。プラークは、典型的には細胞外のフィブリル状タンパク質沈着物（フィブリル状凝集体）として定義され、退行性疾患に特徴的である。成分のアミロイドタンパク質の「本来の」特性は変化することがあり、あるものはイン・ビボで可溶性オリゴマー（例えば、家族性のアミロイド多発性ニューロパシーにおけるトランスチレチン）であり、一方他のものは柔軟なペプチド（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるアミロイド−ｂ）である。例えば、神経変性疾患（ＡＤ、プリオン異常）のコンホメーション病の基本的病因は、異常な病理学的タンパク質のコンホメーション、すなわち正常な細胞および／または循環タンパク質の不溶性のβ構造リッチな集合形態であって、脳に沈着するものへの転換に関係すると考えられる。これらの沈着物は毒性であり、神経障害や死をもたらす。交差−β構造の形成は、重篤な病理学的異常としか関連付けられてこなかった。本発明者らの結果は、ｔＰＡおよび交差−β構造形成タンパク質の他の受容体が変性タンパク質と結合することができることを示しており、多数のタンパク質が交差−βまたは交差−β様構造を含むコンホメーションを採用することができることを示唆している。まとめて考えると、交差−β構造の形成は、望ましくない分子、すなわちミスフォールドタンパク質、アポトーシス細胞または病原体の除去を適性に扱うのに必要な事象の生理学的カスケードを開始しおよび／またはこれに関与する。コンホメーション病に伴うタンパク質において交差−β構造形成を増加することによって、タンパク質分解および／またはタンパク質クリアランスの経路が劣化して、プラークが減少し、または更に好ましくは、上記プラークは完全に除去される。従って、コンホメーション病の影響は少なくなり、または更に好ましくは、完全になくなる。
【００３３】
もう一つの態様では、本発明は、コンホメーション病に伴うプラークを減少させるため、交差−β構造形成を増加させることができる化合物の使用を提供する。もう一つの態様では、本発明は、コンホメーション病に伴うプラークを少なくしおよび／または交差−β構造によって伝達される毒性を抑制するための、交差−β構造に結合することができる化合物の使用を提供する。本発明の好ましい使用では、上記化合物はタンパク質および／またはその機能的に同等のものおよび／または機能的断片であり、更に一層好ましくは、上記タンパク質はｔＰＡ、フィンガードメイン、抗体および／またはその機能的に同等のものおよび／または機能的断片である。このような抗体の例は、４Ｂ５または３Ｈ７である。
【００３４】
更にもう一つの態様では、本発明は、コンホメーション病に伴うプラークを減少させるため、ｔＰＡ様活性を増加することができる化合物の使用を提供する。好ましくは、ｔＰＡ様活性は、その基質および／または補助因子に対して一層高い活性または親和性を有するように修飾される。これは、例えば、上記ｔＰＡ様活性に交差−β構造を含んでなるタンパク質についての複数の結合ドメインを供給することによって達成される。好ましくは、上記結合ドメインはフィンガードメインを含んでなり、更に一層好ましくは、上記フィンガードメインは、電荷が交互になっている少なくとも５個のアミノ酸残基のストレッチ、例えばＡｒｇＸＧｌｕ(Ｘ)１３Ａｒｇ(Ｘ)８ＧｌｕＸＡｒｇまたはＡｒｇＸＧｌｕＸＬｙｓＸＧｌｕＡｒｇを含んでなる。更に一層好ましくは、上記フィンガードメインはフィブロネクチン、ＦＸＩＩ、ＨＧＦａまたはｔＰＡから誘導される。
【００３５】
更にもう一つの態様では、本発明は、交差−β構造を除去するための、交差−β構造に結合することができる化合物の使用を提供する。好ましくは、上記化合物は、タンパク質および／またはその機能的に同等のものおよび／または機能的断片である。更に好ましくは、上記化合物は、ｔＰＡまたはｔＰＡ様活性、および／またはその機能的に同等のものおよび／または機能的断片を含んでなる。更に一層好ましくは、上記機能的断片はフィンガードメインを含んでなる。好ましくは、上記フィンガードメインは、電荷が交互になっている少なくとも５個のアミノ酸残基のストレッチ、例えばＡｒｇＸＧｌｕ(Ｘ)１３Ａｒｇ(Ｘ)８ＧｌｕＸＡｒｇまたはＡｒｇＸＧｌｕＸＬｙｓＸＧｌｕＡｒｇを含んでなる。更に一層好ましくは、上記フィンガードメインは、フィブロネクチン、ＦＸＩＩ、ＨＧＦａまたはｔＰＡから誘導される。もう一つの好ましい態様では、上記タンパク質は、抗体および／またはその機能的に同等のものおよび／または機能的断片である。この使用により、本発明は、例えば循環から、好ましくは体外透析により交差−β構造を含んでなるタンパク質を除去するための治療方法などを提供する。例えば、敗血症の患者に、例えば、好ましくは固定化したフィンガードメインを備えた手段により上記患者の血液を透析することによるこの使用を行う。例えば、このフィンガードメインを、キャリヤー、または上記透析に用いたチューブの内側に結合することができる。この方法では、総ての交差−β構造を含んでなるタンパク質は上記患者の血流から除去され、これによって上記患者から上記交差−β構造を含んでなるタンパク質によって引き起こされる負の効果が軽減される。フィンガードメインを含んでなる化合物の他に、抗体またはコンゴレッドのような他の交差−β構造に結合する化合物を用いることもできる。また、この使用を腎臓患者の血液透析に応用できることは明らかである。
【００３６】
更にもう一つの態様では、本発明は、コンホメーション病に伴うプラークを減少させるための、交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を増加しまたは安定させることができる化合物の使用を提供する。交差−β構造を含んでなる化合物とｔＰＡ様活性を含んでなる化合物との相互作用を増加しまたは安定させることができる化合物の例は、本明細書に示されている。好ましくは、本発明による使用であって、上記コンホメーション病がアルツハイマー病または糖尿病であるものを提供する。本発明は、コンホメーション病に伴うプラークを減少し／少なくするための使用を提供するだけでなく、上記疾患の攻撃を抑制することもでき、更に好ましくは、完全に予防することもできることは明らかである。本発明によって予防および／または治療することができる疾患の例は、コンホメーション病、アミロイドーシス型疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、出血、血栓症、癌、敗血症および他の炎症性疾患、多発性硬化症、自己免疫疾患、記憶の喪失に関連した疾患またはパーキンソン病、および他のニューロン性疾患（癲癇）である。
【００３７】
もう一つの態様では、本発明は、コンホメーション病に伴うプラークの存在を決定するための交差−β構造エピトープを認識することができる抗体の使用を提供する。更にもう一つの態様では、本発明は、コンホメーション病に伴うプラークの存在を決定するための、交差−β構造結合ドメイン（好ましくは、例えばｔＰＡ由来のフィンガードメイン）の使用を提供する。
【００３８】
本発明のこれらの使用は、新たな診断手段を提供する。本発明により、初めて一般的なβ構造エピトープが開示され、且つ診断分析法が上記交差−β構造の存在に基づくものとすることができた。このような使用は、コンホメーション病、またはアルツハイマーや糖尿病のようなアミロイド形成に関連した疾患の診断的同定に特に有用である。この診断的使用は、総てのアミロイドーシス型疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、出血、癌、敗血症および他の炎症性疾患、多発性硬化症、自己免疫疾患、記憶の喪失に関連した疾患またはパーキンソン病、および他のニューロン性疾患（癲癇）のような交差−β構造形成を伴う他の疾患にも有用である。例えば、（例えば、ｔＰＡの）フィンガードメインを用いて、これに標識（放射性、蛍光性など）を供給することができる。次に、この標識したフィンガードメインをイン・ビトロまたはイン・ビボで交差−β構造を含んでなるタンパク質の検出に用いることによって、コンホメーション病に伴うプラークの存在を決定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ分析法を用いて患者の敗血症の量を決定することができ、またはコンホメーション病に伴うプラークの存在を突き止めることができる。
【００３９】
更にもう一つの態様では、本発明は、１個の改良された交差−β構造結合ドメインまたは複数の交差−β構造結合ドメインを含んでなる組換えｔＰＡを提供する。好ましくは、上記ｔＰＡは、複数の場合によっては様々なフィンガードメインを備えている。１個の改良された交差−β構造結合ドメインまたは複数の交差−β構造結合ドメインを含んでなる組換えｔＰＡは、様々な目的に用いられる。例えば、血栓崩壊の改良治療、または交差−β構造を含んでなるタンパク質の循環からの除去を必要としている患者の循環から交差−β構造を含んでなるタンパク質を除去する方法で用いられる。１個の改良された交差−β構造結合ドメインまたは複数の交差−β構造結合ドメインを含んでなる組換えｔＰＡのもう一つの使用は、診断分析法、例えばＢＳＥ検出キットまたは像形成実験における使用である。１個の改良された交差−β構造結合ドメインまたは複数の交差−β構造結合ドメインを含んでなる組換えｔＰＡを用いるこの像形成は、例えばアポトーシスの検出に有用である。例えば、放射能標識したｔＰＡに限定されないが、標識ｔＰＡを個体に接種した後、体内における上記標識ｔＰＡを検出して、局在化する。１個の改良された交差−β構造結合ドメインまたは複数の交差−β構造結合ドメインを含んでなる上記組換えｔＰＡは、治療目的にも有用であることは明らかである。
【００４０】
本発明は、交差−β構造が身体のある部分、例えば、脳に存在するときには有害であり且つ交差−β構造とｔＰＡの結合によって損傷が引き起こされることを明らかにしているので、フィンガードメインを含んでなるタンパク質の有効量を供給してｔＰＡについての交差−β構造の結合部位をブロックすることを含んでなる交差−β構造によって伝達される効果を阻害する方法を提供する。上記の交差−β構造によって伝達される効果は、Ｂ型カルボキシペプチダーゼ活性の有効量を供給してｔＰＡ活性を抑制することによって更に減少させることができる。
【００４１】
もう一つの態様では、局所的な交差−β構造によって伝達される効果を、腫瘍に対して用いることができる。この効果に対して、交差−β構造および／または交差−β構造誘発化合物の有効量をｔＰＡまたはｔＰＡ様活性を有する化合物、および／またはＣＰＩまたはＣＰＩ様活性を有する化合物と共に局所投与することを含んでなる局所的細胞毒性および／またはフィブリン溶解を増加させる目的で、交差−β構造によって伝達される効果を局所的に誘発させる。
【００４２】
本発明は、もう一つの態様では、エクス・ビボ、例えば、透析によって行う本発明による方法を提供する。この態様によれば、患者の循環体液（血液）を身体の外側の系に導いて、循環から交差−β構造を除去する。好ましくは、このような系は、入口と出口で対循環に連結されたフロースルー系である。交差−β構造は、本明細書で以前に定義したように、交差−β結合化合物に結合することによって除去される。いかなる要素も系からの交差−β結合化合物を患者の循環に導くようになっていないことが極めて重要である。好ましい系は、その理由からとりわけ透析系である。本発明は、上記の方法を行うための装置も提供する。例えば、本発明は、本発明による方法を行うための分離装置を提供し、上記装置は循環体液をエクス・ビボで輸送する系を含んでなり、上記系は、系に流入し且つ系から上記患者の循環に戻るための、患者の循環に連結するための手段を備えており、上記系は、固相を含んでなり、上記固相は交差−β構造を結合することができる少なくとも１種類の化合物を含んでなる。交差−β構造を結合するための化合物は、本明細書に開示されている。好ましい装置は透析装置である。
【００４３】
本発明は、試料中の交差−β構造の検出方法も提供する。このような試料は、組織試料、生験材料など、体液試料、例えば、血液、血清、体液、ＣＳＦ、尿などでよい。従って、本発明は、試料を交差−β構造と結合することができる化合物と接触させ、交差−β構造を上記化合物に結合させ、結合によって形成した複合体を検出することを含んでなる、試料中の交差−β構造を検出する方法を提供する。
【００４４】
交差−β結合化合物は、本明細書で上記に定義されている。複合体またはその構成成分の１つは、抗体または他の特異結合化合物、その他の交差−β結合化合物などを伴う任意の通常の手段によって検出することができる。検出は、上記複合体、または上記複合体の結合パートナーまたはその構成成分を標識することによる、または複合体対未結合材料の物理的または化学的パラメーターの変化を測定することによる直接的なものであることができる。これは、標識を備えた化合物を更に結合することによる間接的なものであることもできる。標識は、放射性標識、酵素、蛍光分子などでよい。
【００４５】
本発明は、上記診断法を行うための装置も提供する。例えば、本発明は、試料容器、上記試料を交差−β結合化合物と接触させる手段、交差−β結合化合物、および結合した交差−β構造を検出する手段を含んでなる、本発明による方法を行うための診断装置を提供する。好ましくは、この装置は、未結合交差−β構造を結合した交差−β構造から分離する手段を含んでなる。これは、典型的には固相上で交差−β結合化合物を提供することによって行うことができる。
【発明の具体的説明】
【００４６】
本発明は、（ｉ）「交差−β構造経路」の同定、（ii）交差−β構造受容体としてのマルチリガンド受容体の同定、（iii）交差−β結合モジュールとしてのフィンガードメインの同定、および（iv）「交差−β構造経路」の一部としてのｔＰＡ、ＦＸＩＩ、ＨＧＦａおよびフィブロネクチンなどのフィンガー含有タンパク質の同定を開示する。
【００４７】
本発明は、交差−β構造と結合することが以前は知られていなかった化合物も提供する。
【００４８】
本明細書に開示されるように、本発明は、交差−β構造の過剰形成に関連した疾患の検出および治療のための化合物および方法を提供する。このような疾患としては、アルツハイマー病および他の種類のアミロイドーシスなど既知のコンホメーション病が挙げられる。しかしながら、本発明は、交差−β構造の過剰形成に関連していることが知られていない他の疾患も交差−β構造の過剰形成によって引き起こされることも開示する。このような疾患としては、アテローム性動脈硬化症、敗血症、散在性血管内凝固症候群、溶血性尿毒症症候群、子癇前症、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患、血栓症および癌が挙げられる。
【００４９】
本発明によれば、この化合物は交差−β構造結合分子であり、好ましくはフィンガードメイン、または１個以上のフィンガードメインを含む分子であるか、または１個以上のフィンガードメインのペプチド様類似体である。この化合物は、交差−β構造に向けられた抗体またはその機能的断片であることもできる。
【００５０】
本発明によれば、上記化合物はマルチリガンド受容体またはその断片であってもよい。上記化合物は、例えば、ＲＡＧＥ、ＣＤ３６、低密度リポタンパク質関連タンパク質（ＬＲＰ）、スカベンジャー受容体Ｂ−１（ＳＲ−ＢＩ）、ＳＲ−Ａ、またはこれらのタンパク質の１つの断片であってもよい。
【００５１】
フィンガードメイン、フィンガー含有分子、または抗体は、ヒト、マウス、ラット、または任意の他の種由来のものであってもよい。
【００５２】
本発明によれば、それぞれのタンパク質のアミノ酸は、ペプチドの親和性、効力、バイオアベイラビリティーおよび／または半減期を増加／減少することができる他のアミノ酸によって置き換えることができる。変更としては、通常の置換（酸−酸、バルキー−バルキーなど）、Ｄ−アミノ酸の導入、ペプチドを環状にすることなどが挙げられる。
【００５３】
更に、本発明は、
１）  交差−β構造の存在を検出、
２）  アミロイドフィブリルの形成を抑制、
３）  交差−β構造によって誘発される毒性を調節、
４）  循環から交差−β構造含有分子を除去
するための化合物および方法を提供する。
【００５４】
本発明は、試料溶液における交差−β構造を測定するための分析法を調製する方法を提供する。
【００５５】
本発明は、組織試料または生体細胞または動物から得られる他の試料における交差−β構造を検出する方法を提供する。
【００５６】
本発明は、交差−β構造フィブリル形成を抑制する組成物を調製するための化合物および方法を提供する。
【００５７】
本発明は、交差−β構造によって誘発される毒性を調節する組成物を調製するための化合物および方法を提供する。
【００５８】
略号：Ａβ，β−アミロイドペプチド；ＡＤ，アルツハイマー病；ＡＧＥ，高次グリケーション最終生成物；ＣｐＢ，カルボキシペプチダーゼＢ；ＣＯＩ（カルボキシペプチダーゼインヒビター）；ＥＬＩＳＡ，酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ＦＮ，フィブロネクチン；ＦＸＩＩ，ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）；ＨＧＦａ，肝細胞増殖因子アクチベーター；ＩＡＰＰ，ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド；ＰＣＲ，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ＲＡＧＥ，ＡＧＥの受容体；ｔＰＡ，組織型プラスミノーゲンアクチベーター。
【００５９】
本発明は、交差−β構造の過剰形成に関連した疾患の検出および治療のための化合物および方法を提供する。
【００６０】
交差−β構造は、Ａβフィブリルの一部または別のアミロイドフィブリルの一部であることができる。交差−β構造は、変性タンパク質に存在することもできる。
【００６１】
本発明は、交差−β構造を検出する方法を提供する。一態様では、交差−β構造結合化合物、好ましくはフィンガードメインまたは１個以上のフィンガードメインを含んでなる分子を固体表面、好ましくはマイクロタイタープレートに結合または固定させる。この態様に有用な固体表面は、当業者には知られているであろう。例えば、固体表面の一態様は、ビーズ、カラム、プラスチック皿、プラスチックプレート、顕微鏡スライド、ナイロン膜などである。（ブロックした後、）表面を試料と共にインキュベーションする。（未結合試料を除去した後、）交差−β構造を含んでなる結合分子を続いて第二の交差−β構造結合化合物、好ましくは抗交差−β構造抗体またはフィンガーモジュールを含む分子を用いて検出する。第二の交差−β構造化合物を、標識、好ましくはペルオキシダーゼのような酵素に結合する。検出可能な標識は、蛍光標識、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性原子、常磁性イオン、および化学発光標識であってもよい。酵素または放射性同位体のような部分を有する化学的、酵素的または他の適当な手段のような共有結合的手段によって標識することもできる。本発明の上記化合物の一部を検出可能なマーカー物質（例えば、１２５Ｉで放射能標識またはビオチン化）と会合させることによって標識し、固形組織、および血液、脳脊髄液、尿などのような体液試料での化合物またはその受容体を有する細胞またはその誘導体の検出および定量に有用な試薬を提供することができる。このような試料としては、組織培養に用いられる血清または組織培養に用いられる培地を挙げることもできる。
【００６２】
もう一つの態様では、固体表面は凝集試験などの微小球であることができる。
【００６３】
一態様では、フィンガーモジュールを含む化合物を用いて、試料を染色する。好ましくは、化合物を、タンパク質、ペプチド、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合させる。あるいは、化合物を標識にカップリングさせる。検出可能な標識は、蛍光標識、ビオチン、ジゴキシゲニン、放射性原子、常磁性イオン、および化学発光標識であってもよい。酵素または放射性同位体のような部分を有する化学的、酵素的または他の適当な手段のような共有結合的手段によって標識することもできる。本発明の上記化合物の一部を検出可能なマーカー物質（例えば、１２５Ｉ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉで放射能標識またはビオチン化）と会合させることによって標識し、固形組織、および血液、脳脊髄液または尿のような体液試料での化合物またはその受容体を有する細胞またはその誘導体の検出および定量に有用な試薬を提供することができる。化合物を試料と共にインキュベーションし、洗浄後に、好ましくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのような融合タンパク質またはポリペプチドに対する抗体で可視化する。
【００６４】
一態様では、上記試料はコンホメーション病のまたはコンホメーション病に罹っていることが予想される患者の組織である。あるいは、組織は動物由来のものであるか、またはイン・ビトロで培養した細胞由来のものである。
【００６５】
本発明の方法は、新規な診断手段を提供する。本発明により、初めて一般的なβ構造エピトープが開示され、且つ診断分析法が上記交差−β構造の存在に基づくものとすることができた。このような使用は、コンホメーション病、またはアルツハイマーや糖尿病のようなアミロイド形成に関連した疾患の診断的同定に特に有用である。この診断的使用は、総てのアミロイドーシス型疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、出血、癌、敗血症および他の炎症性疾患、多発性硬化症、自己免疫疾患、記憶の喪失に関連した疾患またはパーキンソン病、および他のニューロン性疾患（癲癇）のような交差−β構造形成を伴う他の疾患にも有用である。例えば、（例えば、ｔＰＡの）フィンガードメインを用いて、これに標識（放射性、蛍光性など）を供給することができる。次に、この標識したフィンガードメインをイン・ビトロまたはイン・ビボで交差−β構造を含んでなるタンパク質の検出に用いることによって、コンホメーション病に伴うプラークの存在を決定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ分析法を用いて患者の敗血症の量を決定することができ、またはコンホメーション病に伴うプラークの存在を突き止めることができる。
【００６６】
もう一つの態様では、本発明は、アミロイドフィブリルの形成を抑制しまたは交差−β構造によって誘発される毒性を調節する方法を提供する。化合物は交差−β結合モジュール、好ましくはフィンガードメイン、フィンガードメインを含む分子、ペプチド様類似体、および／または抗交差−β構造抗体、および／またはマルチリガンド受容体またはその断片である。
【００６７】
本発明によれば、フィブリル形成を阻害することによって、フィブリルの負荷量が減少する。
【００６８】
フィブリル形成の阻害または交差−β構造毒性の調節によって、細胞死を調節することもできる。細胞は任意の細胞であることができるが、好ましくはニューロン細胞、内皮細胞、または腫瘍細胞である。細胞は、ヒト細胞または任意の他の種由来の細胞であることができる。
【００６９】
細胞は、典型的には患者に存在することがある。化合物を投与する患者は、哺乳類、または好ましくはヒトでよい。
【００７０】
患者は、アミロイドーシス、他のコンホメーション病、プリオン疾患、慢性腎不全および／または透析関連のアミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、自己免疫疾患に罹っていることがあり、または患者は肥満であることがある。患者は、炎症、慢性関節リウマチ、糖尿病、網膜症、敗血症、散在性血管内凝固症候群、溶血性尿毒症症候群、および／または子癇前症に罹っていることもある。本発明の方法で治療または予防することができる疾患としては、糖尿病、アルツハイマー病、老化、腎不全、高脂血症性アテローム性動脈硬化症、ニューロン性細胞毒性、ダウン症候群、頭部外傷に関連した痴呆、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、アミロイドーシス自己免疫疾患、炎症、腫瘍、癌、男性不能、創傷治癒、歯周病、ニューロパシー、網膜症、ネフロパシー、またはニューロン変性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明による化合物の投与は、常時であってもまたは一定期間であってもよい。化合物は、時間毎、日毎、週毎、月毎に（例えば、時間放出形態で）送達することができ、または一回送達として送達することもできる。送達は、連続的、例えば、静脈内送達であってもよい。
【００７２】
キャリヤーを用いることができる。キャリヤーは希釈剤、エアゾール、水溶液、非水溶液、または固形キャリヤーでよい。本発明は、治療上有効量のポリペプチド組成物または化合物を適当な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリヤーと共に含む医薬組成物も提供する。このような組成物は液体、または凍結乾燥したあるいは他の方法で乾燥した処方物であることができ、様々な緩衝剤含量（例えば、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防止するためのアルブミンまたはゼラチンのような添加剤、洗剤（例えば、Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質(bulking substances)または毒性調節剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、化合物に対するポリエチレングリコールのようなポリマーの共有的結合、金蔵イオンとの複合体形成、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのようなポリマー化合物の粒状製剤中または上への、またはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層または多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト上への化合物の組込みが挙げられる。
【００７３】
本発明による化合物の投与は、病変内、腹腔内、筋肉内または静脈内注射、輸液、リポソームによって介在される送達、局所的、髄腔内、歯肉嚢、直腸、気管支内、鼻内、口腔、目または耳への送達を含んでなることがある。もう一つの態様では、投与としては、気管支内投与、肛門、髄腔内投与、または経皮送達が挙げられる。
【００７４】
本発明によれば、化合物は、時間毎、日毎、週毎、月毎、年毎に投与することができる。もう一つの態様では、化合物の有効量は約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００７５】
本発明による化合物は、薬剤を経時的に持続放出するカプセルにより局所的に送達することができる。制御または持続放出組成物としては、親油性ディーポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油性物）での処方物が挙げられる。本発明には、ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）でコーティングした粒状組成物、および組織特異的受容体、リガンドまたは抗原に対する抗体にカップリングしたまたは組織特異的受容体のリガンドにカップリングした薬剤も挙げられる。本発明の組成物の他の態様は、非経口、肺、鼻および口腔などの様々な投与経路に保護コーティング、プロテアーゼインヒビターまたは浸透増進剤のような粒状形態で組込む。
【００７６】
本発明による化合物の有効量は、好ましくは１ｎｇ／ｋｇ体重−約１ｇ／ｋｇ体重である。実際的な有効量は、化合物の大きさおよび組成物の特性に基づいて変化する。
【００７７】
ｔＰＡの活性および／またはｔＰＡによって伝達されるプラスミノーゲンの活性化は、フィブリン断片、またはカルボキシ末端にリシンまたはアルギニンを有する他のタンパク質断片への結合によって増加する。カルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）またはトロンビン活性化フィブリン溶解インヒビター（ＴＡＦＩ、カルボキシペプチダーゼＵまたはカルボキシペプチダーゼＲとも呼ばれる）などこれらに限定されないＢ型カルボキシペプチダーゼは、他の場合にはｔＰＡおよび／またはプラスミノーゲンに結合してプラスミン形成を刺激するフィブリン断片のカルボキシ末端リシンおよびアルギニン残基を開裂させる酵素である。
【００７８】
本発明は、交差−β構造が、例えば脳のような身体のある部分に存在するときには有害であり交差−β構造がｔＰＡと結合することによって損傷が生じることを明らかにしたので、フィンガードメインを含んでなるタンパク質の有効量を供給して交差−β構造のｔＰＡに対する結合部位をブロックすることを特徴とする、交差−β構造によって伝達される効果を抑制する方法を提供する。上記の交差−β構造によって伝達される効果は、Ｂ型カルボキシペプチダーゼ活性の有効量を供給してｔＰＡ活性を抑制することによって更に少なくすることができる。
【００７９】
本発明は、交差-β構造に結合して交差−β構造を除去することができる化合物の使用を提供する。上記化合物は交差−β結合分子であり、好ましくはタンパク質および／またはその機能的に同等なものおよび／または機能的断片である。更に好ましくは、上記化合物は、フィンガードメイン、またはフィンガードメイン含有分子またはその機能的に同等なものおよび／または機能的断片を含んでなる。更に一層好ましくは、上記フィンガードメインは、フィブロネクチン、ＦＸＩＩ、ＨＧＦａまたはｔＰＡから誘導される。本発明は、交差−β構造説け都合する抗体をも含んでなることは明らかである。もう一つの好ましい態様では、上記タンパク質は、抗体、および／またはその機能的に同等のものおよび／または機能的断片である。この使用により、本発明は、例えば循環から好ましくは体外透析により交差−β構造を含んでなるタンパク質を除去するための治療方法などを提供する。例えば、敗血症の患者に、例えば好ましくは固定化したフィンガードメインを備える手段によって上記患者の血液を透析することによる上記使用を行う。例えば、上記フィンガードメインを固体表面または上記透析に用いたチューブの内側に結合することができた。この方法で、総ての交差−β構造を含んでなるタンパク質が上記患者の血流から除去され、これによって上記患者の上記の交差−β構造を含んでなるタンパク質によって引き起こされる負の効果が緩和される。フィンガードメインを含んでなる化合物の他に、抗体または可溶性のマルチリガンド受容体のような他の交差−β構造結合化合物を用いることもできる。上記使用は、腎患者の血液透析に応用できることも明らかである。
【００８０】
本明細書で用いられる「フィンガー」とは、図１４に概略を示した基準を満足する配列を包含する。この配列は、明瞭な空間を空けて４個のシステイン残基を含む約５０アミノ酸を包含する。好ましくは、ｔＰＡ、ＦＸＩＩ、ＨＧＦａまたはフィブロネクチンのフィンガードメインが用いられる。あるいは、「フィンガー」は、ポリペプチド類似体または三次元的コンホメーションを有することなどによる同様な機能を有するペプチド様のものであってもよい。このような類似体が改良された特性を有することもあり得る。
【実施例】
【００８１】
実験
試薬
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）画分Ｖ  ｐＨ７．０およびＤ−グルコース−６−リン酸二ナトリウム（ｇ６ｐ）、Ｄ，Ｌ−グリセルアルデヒド、およびニワトリ卵白リゾチームはＩＣＮ製であった(Aurora, Ohio, 米国)。ウサギ抗−組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）  ３８５Ｒおよびマウス抗−組換えｔＰＡ  ３７４ＢはAmerican Diagnostica (Veenendaal, オランダ)から購入した。抗−ラミニン（Ｌ９３９３）はSigma製であった。ブタ抗−ウサギ免疫グロブリン／ＨＲＰ（ＳＷＡＲＰＯ）およびウサギ抗−マウス免疫グロブリン／ＨＲＰ（ＲＡＭＰＯ）はDAKO Diagnostics B.V.（オランダ）製であった。Alteplase（組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター，ｔＰＡ）はBoehringer-Ingelheim (ドイツ)から入手した。クリングル２と触媒ドメインだけを含む組換え突然変異体ｔＰＡ（Ｋ２Ｐ−ｔＰＡ）であるReteplase(Rapilysin)は、Roche, Hertfordshire,英国から入手し、ブタ膵臓カルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）はRoche, Mannheim, ドイツ製であった。カルボキシペプチダーゼインヒビター（ＣＰＩ）はCalbiochem(La Jolla, CA, 米国)製であった。Tween20は、Merck-Schuchardt(Hohenbrunn, ドイツ)から購入した。コンゴレッドはAldrich(Milwaukee, WI, 米国)製であった。Thioflavin Tおよび凍結乾燥したヒトヘモグロビン（Ｈｂ）はSigma (St. Louis, MO, 米国)製であった。凍結乾燥したヒトフィブリノーゲンはKordia (Leiden, オランダ)製であった。発色性プラスミン基質Ｓ−２２５１はChromogenix (Milan, イタリア)から購入した。オリゴヌクレオチドは、Sigma-Genosys (英国)から購入した。ホウ素ガラス毛細管(0.5 mm φ)は、Mueller(Berlin, ドイツ)製であった。
【００８２】
合成ペプチド
上記のヒトアルツハイマーペプチドに存在するアミノ酸を含むペプチドＡβ（１−４０）、（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ）、フィブリンペプチド８５（またはＦＰ１３）（ＫＲＬＥＶＤＩＤＩＫＩＲＳ）、８６（またはＦＰ１２）（ＫＲＬＥＶＤＩＤＩＫＩＲ）および８７（またはＦＰ１０）（ＫＲＬＥＶＤＩＤＩＫ）、ヒトフィブリン（フィブリノーゲン）に由来、およびランゲルハンス島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）ペプチドまたは誘導体（ｆｌ−ｈＩＡＰＰ： ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴＮＶＧＳＮＴＹ，ΔｈＩＡＰＰ（ＳＮＮＦＧＡＩＬＳＳ）、ΔｍＩＡＰＰ（ＳＮＮＬＧＰＶＬＰＰ）は、Pepscan, Inc.(オランダ)またはthe Netherlands Cancer Institute (NCI, Amsterdam, オランダ)のペプチド合成施設から入手した。ペプチドをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解して１ｍｇ／ｍｌの最終濃度とし、室温（ＲＴ）で３週間保管し、フィブリルを形成させた。この期間中に、懸濁液を毎週２回攪拌した。３週間後、懸濁液を４℃で保管した。ＮＣＩ製の凍結乾燥したＡβ（１−４０）を、同様の方法で交差−β構造を形成させた。交差−β構造の形成を適時にコンゴレッド結合および偏光での緑色複屈折の検査によって追跡した。
【００８３】
コンゴレッド結合およびフィブリン血餅のThioflavin T蛍光
Thioflavin T蛍光測定のため、１ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンを２Ｕ／ｍｌのＩＩａ因子と共に１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５０μＭチオフラビンＴ中で３７℃でインキュベーションした。血餅のバックグラウンド蛍光をThioflavin Tの非存在下で記録し、Thioflavin Tのバックグラウンド蛍光をＩＩａ因子の非存在下で測定した。蛍光は、Sarstedt REF67.754キュベットを用いてHitachi F-4500蛍光分光光度計（Ltd.,Tokyo,日本）で測定した。装置の設定値：  励起４３５ｎｍ（スリット幅１０ｎｍ）、発光４８５ｎｍ（スリット幅１０ｎｍ）、ＰＭＴ電圧９５０Ｖ、測定時間１０”、遅延０”。コンゴレッド結合の検出のため、フィブリン血餅を上記のようにして室温で形成した（Thioflavin Tは、緩衝液では省いた）。血餅をコンゴレッド溶液と共にインキュベーションして、製造業者の勧める方法に従って洗浄した（Sigma Diagnostics,MO,米国）。血餅を、偏光下で分析した。
【００８４】
グリコアルブミン、ヘモグロビン（Ｈｂ）およびリゾチームの最初の調製
高次グリケーション最終生成物で修飾したウシ血清アルブミン（アルブミン−ｇ６ｐ）の調製のため、アルブミン１００ｍｇ／ｍｌを１Ｍ  ｇ６ｐおよび０．０５％ｍ／ｖ  ＮａＮ３を含むＰＢＳと共に３７℃にて暗所でインキュベーションした。１つのアルブミン溶液を２週間グリケーションを行い、別のバッチのアルブミンは４週間グリケーションを行った。グリケーションは、残りのバッチの一部では２３週間まで延長した。ヒトＨｂ  ５ｍｇ／ｍｌを、１Ｍ ｇ６ｐおよび０．０５％ｍ／ｖ  ＮａＮ３を含むＰＢＳと共に３７℃にて１０週間インキュベーションした。更に、５０ｍｇ／ｍｌのＨｂ溶液を、同じ緩衝液で８週間インキュベーションした。グリセルアルデヒドで修飾したアルブミン（アルブミン−グリセルアルデヒド）、およびニワトリ卵白リゾチーム（リゾチーム−グリセルアルデヒド）の濾過殺菌したタンパク質溶液１５ｍｇ／ｍｌを、１０ｍＭグリセルアルデヒドを含むＰＢＳと共に２週間インキュベーションした。コントロールでは、ｇ６ｐまたはグリセルアルデヒドを、溶液で省いた。インキュベーションの後、アルブミンおよびリゾチーム溶液を蒸留水に対して十分に透析した後、−２０℃で保管した。タンパク質濃度を、高次タンパク質分析試薬ＡＤＶ０１（Cytoskeleton, Denver,CO,米国）を用いて決定した。グリケーションは、高次グリケーション最終生成物からの固有蛍光シグナルを励起波長３８０ｎｍ、発光波長４３５ｎｍで測定することによって確かめた。
【００８５】
グリケーションを伴う他の実験
アルブミン-AGEの調製のため、１００ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（画分Ｖ，カタログ番号；Ａ−７９０６，熱ショックによる初期分画化，純度：９８％（電気泳動），残りのほとんどはグロブリン, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 米国）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．８ｍＭリン酸二水素カリウム、ｐＨ７．３）、１Ｍ  Ｄ−グルコース−６−リン酸二ナトリウム塩水和物（乾燥）（ICN, Aurora, Ohio,米国）、および０．０５％（ｍ／ｖ）ＮａＮ３と共に３７℃で暗所にてインキュベーションした。ウシアルブミンは、８３個の潜在的なグリケーション部位を有する（５９個のリシン、および２３アルギニン残基、Ｎ末端）．アルブミンを、２週間（アルブミン−ＡＧＥ：２）、４週間（アルブミン−ＡＧＥ：４）、または２３週間（アルブミン−ＡＧＥ：２３）グリケーションした。コントロールでは、ｇ６ｐを省いた。インキュベーションの後、溶液を蒸留水に対して十分に透析した後、４℃で保管した。タンパク質濃度は、高次タンパク質分析試薬ＡＤＶ０１（Cytoskeleton,CO,米国）で決定した。あるいは、アルブミンを、１Ｍ  ｇ６ｐ、２５０ｍＭ  ＤＬ−グリセルアルデヒド（ICN, Aurora,Ohio,米国）／１００ｍＭ  ＮａＣＮＢＥ３、１Ｍβ−Ｄ−（−）−フルクトース（ICN,Aurora,Ohio,米国）、１Ｍ  Ｄ（＋）−グルコース（BDH, Poole,英国）、５００ｍＭグリオキシル酸一水和物（ICN, Aurora,Ohio,米国）／１００ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３、および相当するＰＢＳおよびＰＢＳ／ＮａＣＮＢＨ３緩衝液コントロールと共に８６週間インキュベーションした。グリケーションは、（ｉ）濃い褐色染色の観察、（ii）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上のマルチマーの存在、（iii）ＡＧＥ特異抗体ｍｏａｂ抗−アルブミン−ｇ６ｐ  ４Ｂ５４６とｐｏａｂ抗フィブロネクチン−ｇ６ｐ（Ph. De Groot/I. Bobbink, UMC Utrecht;未公表データ）の結合の分析、および（iv）ＡＧＥ由来の固有蛍光シグナルの測定（励起波長３８０ｎｍ、発光波長４４５ｎｍ）によって確かめた。アルブミンコントロールの自己蛍光シグナルはアルブミン−ＡＧＥについて測定したシグナルの４％未満であり、バックグラウンド補正に用いた。
【００８６】
ヒト赤血球からＨｂの単離
ヒトＨｂは、３名の健常人と１６名の糖尿病患者のＥＤＴＡで血液凝固防止した血液の赤血球から単離した。全血１００μｌを生理食塩水（１５４ｍＭ  ＮａＣｌ）５ｍｌで希釈し、細胞を緩やかに分離し、生理塩５ｍｌに再懸濁した。室温で１６時間インキュベーションした後、細胞を再度分離した。ペレット状細胞に０．１Ｍホウ酸，ｐＨ６．５，２ｍｌを加えてリーシスした後、細胞細片を分離した。上清を集めて、−２０℃で保管した。
【００８７】
グリコＨｂ濃度の決定
健常人ドナーまたは糖尿病患者のＥＤＴＡ−血液中のグリコヘモグロビンまたはＨｂＡｌｃとも呼ばれるグリコＨｂの濃度を、溶血した全血を用いる比濁分析的阻害イムノアッセイを用いて、製造業者の推奨に従って（Roche Diagnostics, Mannheim, ドイツ）決定した。標準偏差は、測定したＨｂＡｌｃ濃度の２．３％である。
【００８８】
コンゴレッドのグリコアルブミンへの結合
コンゴレッドの、炭水化物であるグルコース、フルクトースおよびグルコース−６−リン酸、または炭水化物誘導体であるグリセルアルデヒドおよびグリオキシル酸を用いて８６週間グリコアルブミン−ＡＧＥへの結合を、風乾試料を用いて試験した。このため、５μｇアルブミンをガラスカバースリップに塗布して、風乾した。試料をコンゴレッドとインキュベーションした後、製造業者の推奨に従って洗浄した（Sigma Diagnostics, St Louis, MO,米国）。それぞれ５９６ｎｍおよび６２０ｎｍの励起および発光波長を用い、Leica DMIRBE蛍光顕微鏡（Rijswijk, オランダ）で撮影を行った。
【００８９】
エンドスタチン製剤
エンドスタチンは、本質的に文献記載の方法でEscherichia coliから精製した。４７簡単に説明すれば、エンドスタチンを発現するＢ１２１．ＤＥ３細菌を８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１０ｍＭイミダゾールおよび１０ｍＭβ−メルカプト−エタノールを含む緩衝液でリーシスした。Ｎｉ２＋−アガロース上で精製した後、タンパク質試料をＨ２Ｏに対して十分に透析した。透析中に、エンドスタチンは微細な白色固形物として沈澱する。この材料の一部を後で使用するために−８０℃で保管するか、または凍結乾燥の後に保管した。酵母株Pichia pastorisで産生した可溶性エンドスタチンは、Dr. Kim Lee Sim（ＥntreMed, Inc., Rockville, MA）の厚意により提供された。エンドスタチン凝集体は、下記のようにして可溶性エンドスタチンから調製した。可溶性の酵母エンドスタチンを８Ｍ尿素中で一晩透析した後、Ｈ２Ｏに対して３回透析を行った。細菌性エンドスタチンと同様に、酵母エンドスタチンは、微細な白色固形物として沈澱する。
【００９０】
コンゴレッド染色
凍結乾燥した細菌性エンドスタチンを０．１％ギ酸（ＦＡ）またはジメチルスルホキシドに再懸濁し、ガラス毛細管に集めた。溶媒を蒸発させ、生成するエンドスタチン材料を製造業者のプロトコールに従ってコンゴレッド（Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, 米国）で染色した。
【００９１】
円偏光二色性
ペプチドおよびタンパク質溶液（１００μｇ／ｍｌ、Ｈ２Ｏ中）のＵＶ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、ＪＡＳＣＯ  Ｊ−８１０  ＣＤ分光偏光計（Tokyo,日本）で測定した。フィブリンペプチド８５、８６、８７、またはアルブミン、グリコアルブミンおよびヒトＡｐ（１６−２２）について、それぞれ１９０−２４０ｎｍまたは１９０−２５０ｎｍの５または１０回の単回測定の平均吸収スペクトルを測定する。Ａβ（１６−２２）のＣＤスペクトルを、ポジティブコントロールとして測定した。Ａβ（１６−２２）をＨ２Ｏ４５中でインキュベーションすると、容易に交差−β構造を有するアミロイドフィブリルコンホメーションを採用する。存在する二次構造要素のアルブミンおよびＡｐ（１６−２２）の相対比率は、ｋ２ｄソフトウェア４８を用いて推計した。
【００９２】
繊維のＸ線回折
エンドスタチン凝集体を０．１％ＦＡ中で可溶化し、凍結乾燥したフィブリンペプチドをＨ２Ｏに溶解し、グリコアルブミンを水に対して十分に透析した。試料をガラス毛細血管に集めた。次に、溶媒を数日間かけて蒸発させた。乾燥試料を含む毛細管を、Ｎｏｎｉｕｓ・カッパー・ＣＣＤ回折計（Bruker-Nonius, Delft, オランダ）に入れた。散乱を、ＣＣＤ領域検出器上で黒鉛モノクロメーターで密封チューブＭｏＫα線を用いて１６時間測定した。空気およびガラス毛細管壁からの散乱を、社内ソフトウェアを用いて差し引いた（VIEW/EVAL, Dept. of Crystal- and Structural Chemistry, Utrecht University, オランダ）。
【００９３】
透過型電子顕微鏡法
エンドスタチン、ヘモグロビンおよびアルブミン試料を、炭素コーティングしたコロジオンフィルムで被覆した４００メッシュ標本グリッドに塗布した。５分後、液滴を濾紙で除去し、調製物を１％メチルセルロースおよび１％酢酸ウラシルで染色した。Ｈ２Ｏで洗浄した後、試料を一連の等級付けしたのＥｔＯＨとヘキサメチルジシラザンで脱水した。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像を、ＪＥＭ−１２００ＥＸ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，日本）上で６０ｋＶで記録した。
【００９４】
固相酵素免疫検定法：ｔＰＡのグリコアルブミン、ＨｂおよびＡβ（１−４０）への結合
ｔＰＡのアルブミン−ｇ６ｐ（４週間および２３週間インキュベーション）、アルブミン−グリセルアルデヒド、コントロールアルブミン、ヒトＨｂ−ｇ６ｐ（１０週間インキュベーション）、Ｈｂコントロール、またはＡβ（１−４０）への結合を、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）の装備を用いて試験した。アルブミン−ｇ６ｐおよびコントロールアルブミン（２．５μｇ／ｍｌ、コート緩衝液中、５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．６、０．０２％ｍ／ｖ  ＮａＮ３、５０μｌ／ウェル）を、９６穴タンパク質イモビライザー（Immobilizer）プレート（Exiqon, Vedbaek, デンマーク）に室温で１時間固定した。Ａβ（ｌ−４０）（１０μｇ／ｍｌ、コート緩衝液中）を、９６穴タンパク質イモビライザープレート（Exiqon, Vedbaek, デンマーク）に室温で７５分間固定した。コントロールウェルを、コート緩衝液のみと共にインキュベーションした。ＰＢＳ／０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０  ２００μｌを用いる線上段階の後、プレートを振盪しながらＰＢＳ／１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０  ３００μｌで室温にて２時間ブロックした。その後の総てのインキュベーションは、振盪を行いながら、ＰＢＳ／０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０中で、ウェル当たり５０μｌの容量を用いて室温にて１時間行った。それぞれのインキュベーションの後、ウェルをＰＢＳ／０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０  ２００μｌで５回洗浄した。ｆｌ．ｔＰＡまたはＫ２−Ｐ  ｔＰＡの増加量を、コーティングを施したウェルおよびコントロールウェルに３回加えた。抗体３８５Ｒおよび続いてＳＷＡＲＰＯ、または抗体３７４Ｂおよび続いてＲＡＭＰＯを１μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加えた。結合したペルオキシダーゼを標識した抗体を、オルトフェニレンジアミン８ｍｇおよび０．０１７５％ｖ／ｖ Ｈ２Ｏ２を５０ｍＭクエン酸／１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ５．０  ２０ｍｌ中に含む溶液１００μｌを用いて可視化した。染色は、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液５０μｌを加えて停止した。吸光度を、Ｖｍａｘ動力学的マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, 米国）上で４９０ｎｍで読み取った。競合実験は、ｔＰＡ ２０または４０ｎＭを用いて、それぞれアルブミン−ｇ６ｐまたはＡβ（１−４０）およびコンゴレッドをＰＢＳ／０．０８％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０／２％ｖ／ｖ  ＥｔＯＨに溶解したものの増加量を用いて行った。
【００９５】
ＥＬＩＳＡ：ｔＰＡのアルブミン−ＡＧＥへの結合
交差−β構造マーカーｔＰＡのアルブミン−ＡＧＥへの結合を、ＥＬＩＳＡ装置を用いて試験した。本発明者らは、ｔＰＡがプロトタイプアミロイドペプチドヒトＡβ（ｌ−４０）およびヒトＩＡＰＰ４９（本明細書）へ結合することを示した。従って、本発明者らは、これら２種類のペプチドへ結合するｔＰＡをポジティブコントロールとして用いた。８６週間のグリケーション試料およびコントロールを、Greinerマイクロロン・プレート（microlon plates）（カタログ番号655092, Greiner, Frickenhausen, ドイツ）にコーティングした。ウェルは、Superblock（Pierce, Rockford, IL, 米国）でブロックした。それに続く総てのインキュベーションは、ＰＢＳ／０．１％(v/v) Ｔｗｅｅｎ２０中で、５０μｌ／ウェルの容量で、振盪を行いながら室温で１時間行った。インキュベーションの後、ウェルを３００μｌのＰＢＳ／０．１％(v/v) Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。増加濃度のｔＰＡを、コーティングしたウェル並びにコントロールウェルに３回加えた。８６週間インキュベーションした試料のｔＰＡインキュベーション中に、少なくとも１２３，０００倍モル過剰量のε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ，１０ｍＭ）を溶液に加えた。εＡＣＡはリシン類似物であり、ｔＰＡのそのクリングル２ドメイン５０を介するアルブミンへの潜在的結合を回避する目的で用いられる。モノクローナル抗体３７４ｂ（American Diagnostica, Instrumentation laboratory, Breda, オランダ）、および続いてＲＡＭＰＯ（Dako diagnostics, Glostrup,  デンマーク）を、０．３μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加えた。結合したペルオキシダーゼ標識抗体を、５０ｍＭクエン酸／０．０１７５％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含む１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ５．０  ２０ｍｌに８ｍｇのオルトフェニレンジアミンを含む溶液１００μｌを用いて可視化した。染色は、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液５０μｌを加えて停止した。吸光度をＶｍａｘ動力学的マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, 米国）上で４９０ｎｍで読み取った。コーティングを行っていないコントロールウェルからのバックグラウンドシグナルを、相当するコーティングを施したウェルから差し引いた。
【００９６】
最初に、グリコアルブミンおよびリゾチームのチオフラビンＴ蛍光、およびｔＰＡ。蛍光測定のため、アルブミン−ｇ６ｐ ５００ｎＭ、アルブミン− グリセルアルデヒド、コントロールアルブミン、リゾチーム−グリセルアルデヒド、またはコントロールリゾチームを、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ，ｐＨ９中で増加量のチオフラビンＴとインキュベーションした。ブランクの読みには、同一のチオフラビンＴの希釈範囲をタンパク質なしで調製し、またはチオフラビンＴをタンパク質溶液で省いた。試料は３個調製した。
【００９７】
チオフラビンＴ蛍光
他の実験の蛍光測定では、アルブミン−ｇ６ｐ：２、アルブミン−ｇ６ｐ：４、アルブミン−ｇ６ｐ：２３およびコントロールを５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ，ｐＨ９に溶解したものを、アミロイド交差−β構造のまま５１である増加量のＴｈＴ（Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, ドイツ）とインキュベーションした。アルブミン− ＡＧＥ：４濃度は１７５ｎＭであり、他のタンパク質濃度は５００ｎＭであった。８６週間のグリケーション試料の蛍光測定のため、１４０ｎＭのタンパク質を固定濃度の２０μＭ  ＴｈＴと共にインキュベーションした。蛍光は、室温で１時間インキュベーションした後、Hitachi F-4500蛍光分光光度計（Ltd., Tokyo,日本）上で３回測定した。励起および発光治療は、それぞれ４３５ｎｍ（スリット幅１０ｎｍ）および４８５ｎｍ（スリット幅１０ｎｍ）であった。緩衝液およびＴｈＴなしの溶液からのバックグラウンドシグナルを、ＴｈＴとインキュベーションしたタンパク質溶液での相当する測定値から差し引いた。
【００９８】
蛍光：チオフラビンＴとｔＰＡのアルブミン−ｇ６ｐへの競合結合
４３０ｎＭアルブミン−ｇ６ｐおよび１９μＭチオフラビンＴを、増加濃度のｔＰＡと共に室温で１時間インキュベーションした。ブランクの読みには、アルブミン−ｇ６ｐを省いた。試料は、５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ ｐＨ９中で４回調製した。発光測定は、上記の通りに行った。
【００９９】
吸光度：チオフラビンＴとｔＰＡのアルブミン−ｇ６ｐへの競合結合
アルブミン−ｇ６ｐ（５００ｎＭ）およびチオフラビンＴ（１０μＭ）を、増加量のｔＰＡと共に５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ ｐＨ９中で室温にて１時間インキュベーションした。吸光度測定は、４２０ｎｍのアルブミン−ｇ６ｐチオフラビンＴ吸光度最大値で行った。試料は４回調製した。ブランクの読みには、アルブミン−ｇ６ｐを溶液から省いた。吸光度は、Pharmacia Biotech Ultrospec 3000 UV／可視分光光度計（Cambridge,英国）上で石英セル中で読み取った。
【０１００】
プラスミノーゲン活性化分析法
プラスミノーゲン（２００μｇ／ｍｌ）を、補助因子（５μＭのエンドスタチン、Ａβ（ｌ−４０）、またはフィブリン由来のペプチド８５、８６および８７の一つ）の存在下または非存在下でｔＰＡ（２００ｐＭ）と共にインキュベーションした。所定の時間間隔で試料を採取し、反応を５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭεＡＣＡを含む緩衝液で停止した。試料を集めた後、発色性プラスミン基質Ｓ−２２５１を加え、プラスミン活性を分光光度計で３７℃にて動的に決定した。
【０１０１】
Ｎ１Ｅ−１１５細胞培養および分化
ＮＩＥ−１１５マウス神経芽腫細胞は、抗生物質を補足した５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で常法により培養した５２。細胞は、有糸分裂後ニューロンに分化した。細胞を２０μｇ／ｍｌのプラスミノーゲンの存在下または非存在下にて５０μｇ／ｍｌのＣｐＢの存在下または非存在下でＡβ（５０μｇ／ｍｌ）に２４時間暴露した。細胞を写真撮影し、計数して、培地に４ｘ試料緩衝液（２５０ｍＭトリス  ｐＨ６．８，８％ＳＤＳ，１０％グリセロール，１００ｍＭＤＴＴ，０．０１％ｗ／ｖブロモフェノールブルー）を加えてリーシスした。接着および浮遊（乾燥および／または死んでいると思われる）細胞並びに培地を含む溶解生成物を、プラスミノーゲンおよびプラスミン、並びにラミニンの存在についてプラスミノーゲン（MoAb 3642, American Diagnostics）、ラミニン（PoAb L9393, Sigma）に対する特異抗体を用いるウェスタンブロット分析によって分析を行った。
【０１０２】
ヒトＸＩＩ因子の交差−β構造フォールドを有するアミロイドペプチドおよびタンパク質への結合
本発明者らは、ヒトＦＸＩＩ（Calbiochem, La Jolla, CA, 米国，カタログ番号233490）のアミロイド（ポリ）ペプチドへの結合を試験した。プロトタイプアミロイドペプチドヒトアミロイド−β（１−４０）（ｈＡβ（１−４０））およびヒトフィブリン断片α１４７−１５９ＦＰ１３、およびグルコース−６−リン酸グリケーションしたウシアルブミン（アルブミン−高次グリケーション最終生成物（ＡＧＥ））およびグルコース−６−リン酸グリケーションしたヒトヘモグロビン（ＨｂＡＧＥ）であって、総て交差−β構造を有するもの、並びにネガティブコントロールであるマウスΔランゲルハンス島アミロイドポリペプチド（ΔｍＩＡＰＰ）、アルブミンコントロールおよびＨｂコントロールであって、総てアミロイド特異構造を書いているものをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、一連の濃度のヒトＸＩＩ因子を積層した。ＦＸＩＩの結合は、ウサギポリクローナル抗−ＦＸＩＩ抗体（Calbiochem, La Jolla, CA, 米国，カタログ番号233504）およびペルオキシダーゼ標識ブタ抗−ウサギＩｇＧを用いて検出した。ウェルは、３回コーティングした。ＦＸＩＩ結合緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１１ｍＭ Ｄ−グルコース、４ｍＭ  ＫＣ１、１ｍｇ／ｍｏｌアルブミン、５０μＭ  ＺｎＣｌ２、０．０２％（ｍ／ｖ）ＮａＮ３、および１０ｍＭε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）からなっていた。リシン類似物εＡＣＡを加えて、ＦＸＩＩクリングルドメインを介する交差−β構造へのＦＸＩＩの推定的結合を回避した。更に、ＦＸＩＩのｈＡβ（１−４０）およびプロトタイプアミロイドヒトアミリン断片ｈΔＩＡＰＰをドットブロット分析を用いて試験した。交差−β構造を含むペプチド１０μｇ、並びにネガティブコントロールペプチドｍΔＩＡＰＰおよびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、メタノール活性化ニトロセルロースに２回スポットした。次いで、スポットを２ｎＭ  ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩ緩衝液またはＦＸＩＩ緩衝液のみ、抗ＦＸＩＩ抗体、およびＳＷＡＲＰＯと共にインキュベーションした。ＦＸＩＩの結合は、強化ルミノール試薬（PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, 米国）とインキュベーションしたときの化学発光によって可視化した。交差−β構造フォールド４９を有するポリペプチドへ結合する能力について知られているＦＸＩＩおよびｔＰＡがアミロイド（ポリ）ペプチド上の積層結合部位に結合するかどうかを試験するため、競合的ＥＬＩＳＡを行った。コーティングしたｈＡβ（１−４０）またはアミロイドアルブミン−ＡＧＥを、一連の濃度のヒト組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター（Ａｃｔｉｌｙｓｅ（商標），完全長ｔＰＡ）またはＲｅｔｅｐｌａｓｅ（商標）（Ｋ２Ｐ−ｔＰＡ）の存在下にて２．５ｎＭまたは１５ｎＭ  ＦＸＩＩ／結合緩衝液を用いてインキュベーションした。Reteplaseは、切頭型のｔＰＡであって、第二のクリングルドメインとプロテアーゼドメインからなっている。ｆ．ｌ．ｔＰＡ−およびＫ２Ｐ−ｔＰＡ濃度は、最大でｈＡβ（１−４０）へ結合するｔＰＡのｋＤの１３５倍（５０ｎＭ）またはアルブミン−ＡＧＥへ結合するｔＰＡのｋＤの１５０倍（１ｎＭ）であった。
【０１０３】
クローニングの手順
プロペプチド（残基Met35-Arg1）およびＢｇ１ＩＩ制限部位が先行する残基Ser1-Ser50であるヒトｔＰＡのアミノ末端フィンガードメイン（Ｆ）のクローニングは、ＰＣＲおよび標準的組換えＤＮＡ手法を用いて行った。簡単に説明すれば、プロペプチド−フィンガー領域を、ｔＰＡを鋳型としてコードするｃＤＮＡを含むプラスミンＺｐｌ７５３  １ｎｇを用いるＰＣＲによって増幅した。用いたオリゴヌクレオチドは、それぞれＳａｌＩ−またはＮｏｔＩ制限部位（下線部）を含んでなる下記の通りのものであった。
【化１】
2005537254.tif 000002
ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化した発現ベクターｐＭＴ２−ＧＳＴ５４中でクローニングした。その結果、ＳａｌＩ制限部位、ｔＰＡのフィンガードメインのコード配列、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩ制限部位、トロンビン開裂部位（ＴＣＳ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含む構築物が生成する。この構築物の適当な配列を、配列分析によって確かめた。同様にして、ｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦドメインからなる構築物を調製した。次に、これらの構築物を、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）（Promega, Madison, WI,米国）中でＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ連結した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ｔＰＡプロペプチド−ＢｇｌＩＩ−Ｆ−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−ＴＣＳ−ＧＳＴ−ＥｃｏＲＩ構築物を、ｔＰＡＫ１、Ｆ−ＥＧＦ−Ｋ１、ＥＧＦ、並びにヒト肝細胞増殖因子アクチベーターＦおよびＦ−ＥＧＦ、ヒトＸＩＩ  Ｆ因子およびＦ−ＥＧＦ、およびヒトフィブロネクチンＦ４、Ｆ５、Ｆ４−５およびＦ１０−１２を含む構築物の調製のクローニングカセットとして用いた。次いで、構築物をｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Invitrogen, Breda, オランダ）中でＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで連結した。更に、ＧＳＴタグのみを、ｔＰＡプロペプチドが先行したｐｃＤＮＡ３にクローニングした。構築物に用いたプライマーは、下記の通りであった：
【化２】
2005537254.tif 000003
2005537254.tif 000004
2005537254.tif 000005
【０１０４】
２９３Ｔ細胞におけるｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴの一過性発現
最初に、２９３Ｔ細胞を、５％ｖ／ｖウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグアニジンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen, Scotland, 英国）で１５％のコンフルエンシーまで増殖した。細胞を、製造業者の推奨に従ってFugene-6を用いて一過的にトランスフェクションした（Roche, IN, 米国）。ｔＰＡ断片を含むｐＭＴ２−ｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴ、または受容体様タンパク質チロシンホスファターゼμ（ＲＰＴＰμ）５４の細胞外ドメインを含むコントロールプラスミドｐＭＴ２−ＲＰＴＰμ−ＧＳＴをトランスフェクションし、培地を４８時間のトランスフェクションの後に回収した。２９３Ｔ培地でのｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴおよびＲＰＴＰμ−ＧＳＴの発現を、イムノブロッティングによって証明した。集めた試料を、２ｘ試料緩衝液を加えた後、ＳＤＳ−ＰＡＡゲル上で展開した。膜を１％ミルク（Nutricia）でブロックし、最初にモノクローナル抗−ＧＳＴ抗体２Ｆ３５４および二番目にＨＲＰ接合ウサギ抗−マウスＩｇＧ（ＲＡＭＰＯ）とインキュベーションした。ブロットを、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences, MA, 米国）を用いて展開した。
【０１０５】
ＢＨＫ細胞におけるフィンガー構築物の安定発現
仔ハムスター腎細胞を、５％ｖ／ｖウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびグアニジンを補足したＤＭＥＭ／ＮＵＴ混合Ｆ−１２（ＨＡＭ）培地（Invitrogen，英国）で１％のコンフルエンシーまで播種した。細胞を、Ｃａ３（ＰＯ４）２−ＤＮＡ沈澱法を用いて、安定にトランスフェクションした。２４時間後、培地に１ｍｇ／ｍｌゲネティシン（geneticin）Ｇ−４１８硫酸塩（Gibco，英国）を補足した。Ｇ−４１８を含む培地を１０日間に数回新しくして、死細胞を除去した。その後、安定な単一コロニーを新たな培養フラスコに移して、細胞をコンフルエンシーまで増殖させた。次に、構築物の発現をイムノブロッティングによって立証した。集めた試料を、２ｘ試料緩衝液を加えた後にＳＤＳ−ＰＡＡゲル上で展開した。ゲルは、ニトロセルロース膜上でブロッティングした。膜を、１．５％ｍ／ｖＢＳＡを含む５％ミルク（Nutricia）中でブロックし、最初にモノクローナル抗−ＧＳＴ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 米国，カタログ番号Z-5）および二番目にＨＲＰ接合ウサギ抗−マウスＩｇＧ（ＲＡＭＰＯ）とインキュベーションした。ブロットを、Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus（PerkinElmer Life Sciences, MA, 米国）を用いて展開した。安定なクローンを、以後２５０μｇ／ｍｌのＧ−４１８の存在下で増殖させた。プルダウン実験のために、目的とする構築物を産生する安定なクローンの５％ＦＣＳを有するコンディショニングした培地を用いた。精製のため、ｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴの安定なクローンの細胞を三層の培養フラスコに移して、０．５％v/v Ultroser G（ITK Diagnostics, Uithoorn,  オランダ）を含む培地で増殖させた。培地は、３または４日毎に新しくした。ＴＰＡ Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴは、Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences, Uppsala, スウェーデン）カラム上で培地から単離して、１００ｍＭ還元グルタチオン（Roche Diagnostics, Mannheim, ドイツ）で溶出した。
構築物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クーマシー染色またはウェスタンブロット法によってチェックした。これらの分析から、幾らかのＧＳＴが調製物中に存在することは明らかである。精製したｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴをＰＢＳに対して透析し、−２０℃で保管した。
【０１０６】
ＧＳＴで標識したｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴおよびＲＰＴＰμ−ＧＳＴの精製
培地をNanosep １０ＫΩ遠心分離装置（Pall Gelman Laboratory, MI, 米国）を用いて２０倍に濃縮し、製造業者の推奨に従ってSepharose 4Bにカップリングしたグルタチオンと共にインキュベーションした（Pharmacia Biotech, Uppsala, スウェーデン）と共にインキュベーションした。結合した構築物をＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中１０ｍＭグルタチオンで溶出した。構築物を、使用前に−２０℃で保管した。
【０１０７】
アミロイドプロダウン
ＧＳＴで標識したｔＰＡ Ｆ、Ｆ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、Ｋ１、Ｆ−ＥＧＦ−Ｋ１、ＦＸＩＩ  Ｆ、ＨＧＦａ  Ｆ、Ｆｎ  Ｆ４、Ｆｎ  Ｆ５、Ｆｎ  Ｆ４−５およびＧＳＴを発現するＢＨＫ細胞のコンディショニングした培地を用いて、アミロイド結合分析を行った。最初に、構築物を、ウェスタンブロット法を用いてほぼ等濃度に調整した。組換え断片の定性的結合は、「プルダウン」分析法を用いて評価した。この目的のため、組換えによって作製した断片をＡβまたはＩＡＰＰフィブリルと共にインキュベーションした。これらのペプチドは不溶性繊維を形成するので、未結合タンパク質は遠心分離によって繊維から容易に除去することができる。結合断片を含むペレットは、続いて水で数回洗浄した。結合断片をＳＤＳ−試料緩衝液中で可溶化し、ＰＡＧＥによって分析し、上清画分および出発材料中の未結合タンパク質も同様に処理した。ゲルを、抗−ＧＳＴ抗体Ｚ−５を用いるイムノブロッティングを用いて分析する。
【０１０８】
ｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴを用いるアミロイドＥＬＩＳＡ
精製したｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴ組換えタンパク質の親和性を画定するため、固定化アミロイド（ポリ）ペプチドおよび非アミロイドコントロールΔｍＩＡＰＰを用いてＥＬＩＳＡを行った。Ａβ、ＦＰ１３、ＩＡＰＰまたはΔｍＩＡＰＰ  ２５μｇ／ｍｌを、Ｅｘｉｑｏｎペプチド固定化プレート上で固定した。過剰のεＡＣＡの存在下にて一連の濃度のｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴをウェルに加えて、抗−ＧＳＴ抗体Ｚ−５を用いて結合を分析した。コントロールとして、ＧＳＴ（Sigma-Aldrich, St. Louis,MO, 米国，カタログ番号G-5663）を同じ濃度で用いた。
【０１０９】
免疫組織化学：ｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦのヒトＡＤ脳への結合
ＡＤに冒されたヒトのパラフィン脳切片は、Slootweg教授（Dept. of Pathology, UMC Utrecht）の厚意により送られた。切片を、一連のキシレン−エタノールで脱パラフィン化した。内在性ペルオキシダーゼを、メタノール／１．５％Ｈ２Ｏ２で１５分間ブロックした。Ｈ２Ｏで洗浄した後、切片を未希釈ギ酸と共に１０分間インキュベーションした後、ＰＢＳ中で５分間インキュベーションした。切片を、１０％  ＨＰＳ／ＰＢＳ中で１５分間ブロックした。切片を、ＰＢＳ／０．３％ ＢＳＡ中で７ｎＭ  ｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴまたはＧＳＴに２時間暴露した。ＰＢＳで３回洗浄した後、切片に２００ｎｇ／ｍｌの抗−ＧＳＴ抗体Ｚ−５を１時間積層した。洗浄後、使用準備のできたヤギ抗−ウサギPowervision（Immunologic, Duiven, オランダ，カタログ番号DPVR-55AP）を適用して、１時間インキュベーションした。洗浄後、切片を３，３’−ジアミノベンジジン（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, 米国，カタログ番号D-5905）で１０分間染色した後、ヘマトキシリン染色を１０秒間行った。Ｈ２Ｏで洗浄した後、切片を製造業者の推奨に従ってコンゴレッドと共にインキュベーションした（Sigma Diagnostics, St Louis, MO, 米国）。切片をキシレンで洗浄し、D.P.X. Mounting Medium(Nustain, Nottingham, 英国）で固定した。切片の分析は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩＲＢＥ蛍光顕微鏡（Rijswijk, オランダ）上で行った。コンゴレッドの蛍光は、励起波長５９６ｎｍおよび発光波長６２０ｎｍを用いて分析した。
【０１１０】
ＥＬＩＳＡ：tPA-F-GSTおよびRPTPμ-GSTのヒトAb(1-40)およびグリコアルブミンへの結合
ｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴおよびＲＰＴＰμ−ＧＳＴの繊維状アミロイドヒトＡβ（１−４０）およびアルブミン−ｇ６ｐへの結合を、ＥＬＩＳＡで分析した。簡単に説明すれば、ヒトＡβ（１−４０）、アルブミン−ｇ６ｐまたは緩衝液のみを、それぞれペプチドI  イモビライザーまたはタンパク質I イモビライザーにコーティングした。ウェルを精製したＧＳＴで標識した構築物またはコントロール培地と共にインキュベーションし、結合を一次抗−ＧＳＴモノクローナル抗体２Ｆ３およびＲＡＭＰＯを用いて検出した。ウェルはまた、１０ｍＭ  ｅＡＣＡの存在下にて５００ｎＭ  ｔＰＡと共にインキュベーションした。次に、ｔＰＡの結合は、クリングル２ドメインに位置したリシル結合部位から独立している。ｔＰＡの結合を、一次抗体３７４ＢおよびＲＡＭＰＯを用いて測定した。実験は、３回行う、コーティングを行っていないウェルのブランク読みを差し引いた。
【０１１１】
抗−ＡＧＥ抗体
グルコース−６−リン酸でグリケーションしたウシ血清アルブミンに対する抗体を、標準的免疫機構を用いてウサギで誘導した。２週間グリケーションしたアルブミン−ＡＧＥ（Prof. Dr. Ph. G. de Groot/Dr. I. Bobbink; 未公表データ）で免役した後、抗−ＡＧＥ１を得た。抗体を、Protein Gカラムを用いて血清から精製した。抗−ＡＧＥ２を、Davids Biotechnologie (Regensburg, ドイツ）によって展開した。アルブミン−ＡＧＥ：２３で免役した後、抗体をＥＭＤ−Ｅｐｏｘｙ活性化ビーズ（Merck, Darmstadt, ドイツ）に接合したヒトＡβ（１−４０）上でアフィニティー精製した。ポリクローナルマウス抗−ＡＧＥ抗体は、アルブミン−ＡＧＥ：２３およびヒトＡβ（１−４０）で９：１のモル比で免役した後に得た。ポリクローナル血清は、標準的免疫手順を用いて得て、これはAcademic Biomedical Cluster Hybridoma Facility (Utrecht University, オランダ）によって行った。次に、モノクローナルは、標準的手順を用いて生成した。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡ：アミロイドペプチドまたはグリコタンパク質のタンパク質−ＡＧＥおよびアミロイドフィブリルへの結合
ＥＬＩＳＡのため、アミロイド化合物を、上記と同様にして、Ｅｘｉｑｏｎペプチドまたはタンパク質イモビライザー(Vedbaek, デンマーク）に固定した。抗−ＡＧＥ抗体および市販の抗−Ａβ（ｌ−４２） H-43(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 米国）を、０．１％  ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで希釈した。ウサギ抗−ヒトビトロネクチンＫ９２３４はDr. H. de Boer (UMC Utrecht)の厚意により提供を受け、ネガティブコントロールとして用いた。マウスポリクローナル抗−アルブミン−ＡＧＥ／Ａβを用いるＥＬＩＳＡのため、関連のないタンパク質に対して誘導された抗体を含むコントロール血清を用いた。マウスポリクローナル抗−アルブミン−ＡＧＥ／Ａβの結合は、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０中の血清の希釈系列を用いて行った。ＩＡＰＰとの競合結合分析のために、抗−ＡＧＥ１を様々な濃度のＩＡＰＰとインキュベーションした。ＩＡＰＰフィブリルを分離し、上清をＡβをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウェルに３回塗布した。マルチリガンド交差−β構造結合セリンプロテアーゼｔＰＡを用いる競合結合分析は、若干異なる方法で行った。コーティングしたＡβおよびＩＡＰＰにｋＤに関連した抗−ＡＧＥ１または抗−Ａβ（ｌ−４２）Ｈ−４３濃度を一連の濃度のｔＰＡと共に積層した。１０７−１０４倍モル過剰量のリシン類似物εＡＣＡ（１０ｍＭ）が結合緩衝液に存在し、ｔＰＡのＡβおよびＩＡＰＰのリシン残基への結合を回避し、これはアミロイド構造の存在とは独立していた。
【０１１３】
アミロイドペプチドおよびウサギ抗−ＡＧＥ１抗体を用いるプルダウン分析法
抗−ＡＧＥ１を、Ａβ（１６−２２）、Ａβ（１−４０）およびＩＡＰＰのアミロイド凝集体と共にインキュベーションした。遠心分離の後、ペレットを非還元性試料緩衝液（１．５％（ｍ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０１％（ｍ／ｖ）ブロモフェノールブルー、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ６．８）に溶解したＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。アミロイドフィブリルをペレット化の後、上清を２ｘ試料緩衝液で１：１に希釈した。試料をポリアクリルアミドゲルに適用して、ウェスタンブロット法の後、抗−ＡＧＥ１をＳＷＡＲＰＯで検出した。
【０１１４】
ＡＤに冒されたヒト脳の切片におけるアミロイドプラークへの抗−ＡＧＥ２の結合の免疫組織化学的分析
Ａβカラム上でアフィニティー精製したウサギ抗−ＡＧＥ２を用いて、ＡＤに罹っているヒトの脳切片におけるアミロイドプラークに対する結合特性を分析した。手順は、本質的に上記の通りに行った。１１μｇ／ｍｌの抗−ＡＧＥ２のタンパク質−ＡＧＥ付加物または脳切片におけるヒトアルブミンへの終局的な結合を回避するため、３００ｎＭのｇ６ｐ−グリケーションジペプチドＧｌｙ−Ｌｙｓを０．３％ｍ／ｖ  ＢＳＡと共に結合緩衝液に加えた。免疫組織化学的染色の後、切片をコンゴレッドで染色した。
【０１１５】
溶液中のアミロイドアルブミン−ＡＧＥの検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
溶液中でのアミロイド交差−β構造を検出するため、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた。Actilyse tPAを、９６穴タンパク質イモビライザープレート（Exiqon, Vedbaek, デンマーク）のウェルに１０μｇ／ｍｌの濃度で固定した。一連の濃度のアルブミン−ＡＧＥ：２３およびアルブミン−コントロール：２３をｔＰＡをコーティングしたウェル並びにコーティングしていないコントロールウェルに加えた。アミロイド構造の結合は、１μｇ／ｍｌの抗−Ａβ（１−４２）Ｈ−４３（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, ＣＡ，米国）、続いて０．３μｇ／ｍｌのＳＷＡＲＰＯと共にインキュベーションした後に、オルト−フェニレン−ジアミン／Ｈ２Ｏ２／Ｈ２ＳＯ４染色によって検出した。
【０１１６】
結果
１．  交差−β構造は、フィブリンおよびフィブリン由来の合成ペプチドに存在する。
本発明者らは、フィブリン血餅がコンゴレッドで染色し（図示せず）チオフラビンＴ蛍光を示し（図２Ａ）、フィブリン血餅におけるアミロイド構造の存在を示していることを明らかにした。コンゴレッド染色（図示せず）、円偏光二色性測定およびＸ線回折分析を用いて、本発明者らは、フィブリンの配列から誘導される合成ペプチドが交差−β構造を採用していることを示す（図２Ｂ，Ｃ）。これらのペプチドは、以前にｔＰＡ−結合とｔＰＡ活性化特性１８を有することが見出された。これらのペプチドにおける交差−β構造の存在により、ｔＰＡによって伝達されるプラスミノーゲン活性化を刺激する能力と相関することを見出した（図２Ｄ）。
【０１１７】
結論において、これらのデータは交差−β構造の形成のための生理学的出現／関連性の証拠、およびｔＰＡのフィブリンへの結合におけるこの構造要素の役割を提供する。
【０１１８】
２．  Ａβは交差−β構造を含み、プラスミン（プラスミノーゲン）とｔＰＡを結合し、プラスミノーゲン活性化を刺激し、マトリックス分解を誘発し、プラスミノーゲンによって増加し且つＣｐＢによって阻害される細胞脱着を誘発する。
ｔＰＡ、プラスミノーゲンおよびプラスミンがＡβと結合するかどうかを試験するため、固相結合分析法を行った。Ａβをプラスチック製の９６穴プレートにコーティングし、ペプチドのプラスミン（プラスミノーゲン）またはｔＰＡへの結合を、コーティングしたペプチドに増加濃度のｔＰＡ、プラスミノーゲンまたはプラスミンを積層することによって評価した。結合は、ＥＬＩＳＡを行うことによってプラスミン（プラスミノーゲン）またはｔＰＡに対する特異抗体を用いて評価した。図３Ａは、ｔＰＡがＡβにフィブリンに結合するｔＰＡのＫｄと同様の約７ｎＭのＫｄで結合することを示す。対照的に、プラスミノーゲンのＡβへの検出可能な結合は見られなかった（図３Ｂ）。しかしながら、活性化プラスミノーゲン（プラスミン）はＡβに結合し、４７ｎＭのＫｄで結合する。（活性な）プラスミンはＡβに結合するが、（不活性）プラスミノーゲンはＡβに結合しないという事実は、プラスミン活性、従って遊離リシンの生成はプラスミンのＡβへの結合に重要であることを示唆している。これを試験するため、リシン類似物であるε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）を用いてプラスミンおよびｔＰＡのその存在におけるＡβへの結合を試験した。本発明者らは、プラスミンのＡβへの結合はεＡＣＡの存在下で完全に廃止されることを示す（図３Ｄ）。対照的に、εＡＣＡはｔＰＡ−Ａβ相互作用に対して効果がない（図３Ｃ）。従って、プラスミンは、恐らくは（複数の）リシン結合クリングルドメインを介してインキュベーション期間中に生成した遊離リシンに結合すると結論される。これと協力して、フィブリン中の遊離リシンへのプラスミノーゲンクリングルドメインのＫｄは、Ａβに対するプラスミンの結合のためのＫｄに類似している。
【０１１９】
Ａβの非存在下および存在下におけるプラスミノーゲン活性化の動態を検討した。Kingston et al.２４によって公表されているように、ＡβはｔＰＡによるプラスミノーゲンの活性化を強く刺激することが分かっている（図４Ａ）。しかしながら、本発明者らは、反応が一次速度論よりは二次速度論的に進行することを見出している。本発明者らは、反応中の遊離リシンの生成がこの現象を引き起こすことの可能性を考察した（下記参照）。ｔＰＡによって伝達されるプラスミノーゲン生成は、虚血または興奮毒性アミノ酸によって引き起こされるニューロン性細胞死に関与していた。最新のデータは、プラスミンがＡβを分解することができ、それによってＡβ毒性を防止することができることを示唆している５６；５７。本発明者らは、Ａβを分化したＮ１Ｅ−１１５細胞の培養物に加えて４８時間後に、細胞の大半は死滅して、マトリックスから脱着していることを見出した（図示せず）。Ａβと共に加えると、プラスミン（１００ｎＭまで）はＡβによって誘発される細胞脱着を緩和することができなかった。１００ｎＭのプラスミンと共にＡβの予備インキュベーションを延長しても、Ａβによって誘発される細胞脱着には影響しなかった（図４Ｂ）。従って、本発明者らは、プラスミン生成がＡβによって誘発される細胞脱着および生存を阻害するよりは増強することができることの可能性を考慮した。これを試験するため、ＮＩＥ−１１５細胞をＡβの最適下限濃度および低濃度のプラスミノーゲンに２４時間暴露した。Ａβの非存在下では、プラスミノーゲンは細胞接着に全く影響しない（図４Ｃ）。しかしながら、プラスミノーゲンは、Ａβによって誘発される細胞脱着に劇的な増進効果を有する。Ａβによって誘発される細胞脱着を増進するのに必要なプラスミノーゲンの最低レベル（１０−２０μｇ／ｍｌ）は、ヒト血漿で見られるレベルよりかなり下回る（２５０μｇ／ｍｌ）。細胞外マトリックス分子ラミニンのプラスミンによって伝達される分解は、ニューロン脱着および虚血脳の細胞死に先行する。本発明者らは、Ａβによって刺激されたプラスミン生成によってラミニンが分解するかどうかを試験した。細胞脱着は、細胞外マトリックスタンパク質ラミニンの分解を伴った（図４Ｄ）。
【０１２０】
本発明者らは、Ａβによって刺激されるプラスミン形成中の遊離リシンの生成が、観察された二次速度論に関与することの可能性を考察した。これを試験するため、Ｃ末端リシンおよびアルギニン残基を開裂する酵素であるカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）と、ＣｐＢ−インヒビター  ＣＰＩを使用した。図５Ａは、ＣｐＢの存在下では、プラスミンの生成は著しく減少することを示している。更に、この効果は、ＣＰＩとの同時インキュベーションによって完全になくなるように、ＣｐＢ活性に依存している。図５Ａは、ＣｐＢがＡβによって刺激されるプラスミン生成を完全になくするのではなく、反応が遅い一次速度論で進行することも示している。これらのデータは、反応中の遊離リシンの（プラスミンによって伝達される）生成が、恐らくはプラスミノーゲンとｔＰＡ結合をそれらのそれぞれのクリングルドメインとの相互作用を介して支持することによる効率的なＡβによって刺激されるプラスミン生成に本質的であることを示唆している。Ｃ末端リシンの生成に対する同様な依存性は、効率的なフィブリンによって伝達されるプラスミン生成について示されている５８。これらの結果は、Ａβによって刺激されるプラスミン形成がイン・ビトロではカルボキシペプチダーゼＢによって調節されることを示している。従って、細胞脱着がプラスミン生成の結果であるときには、ＣｐＢはＡβによって誘発される細胞脱着および／または生育力に影響することがある。本発明者らは、プラスミノーゲンおよびＡβによって誘発される細胞脱着はＣｐＢと同時インキュベーションすることによって完全に予防されることを示している（図５Ｂ，Ｃ）。これは、いずれも培地中および細胞上でのＡβによって刺激されるプラスミン形成の完全な阻害を伴う（図５Ｄ）。
【０１２１】
３．  エンドスタチンは交差−β構造を含んでなるアミロイドフィブリルを形成することができる。
コンゴレッド染色（図示せず）、Ｘ線回折分析およびＴＥＭを用いて、Escherichia coli並びにPichia pastors由来のエンドスタチン凝集体における交差−β構造の存在およびエンドスタチンがアミロイドフィブリルを形成する能力を示した（図６Ａ−Ｂ）。細菌性エンドスタチンは４．７オングストローム（水素結合距離）並びに１０−１１オングストローム（シート間距離）で反射線を生じることを見出した。反射線は、反対回折核で最大強度を示す。水素結合繰り返し距離が４．７オングストロームの繊維軸は、軸方向の毛細管軸に沿って配向されている。これは、１０−１１オングストロームのシート間距離がこれらの水素結合に直交していることを意味する。これは、タンパク質が交差−β構造を有する交差−βシートコンホメーションであることと一致する。球状タンパク質の分子内βシートは、この方法で配列されている回折パターンを生じることができない。バックグラウンド散乱の量から、タンパク質のごく一部だけが交差−β構造形成に参加していることになる。本発明者らは、エンドスタチンにおける交差−β構造の存在がｔＰＡによって伝達されるプラスミノーゲン活性化を刺激する能力と相関し（図６Ｃ）、且つニューロン細胞死と相関する（図６Ｄ）ことを見出した。
【０１２２】
本明細書において、本発明者らは、エンドスタチンが示唆した公差−β経路を刺激することができる変性タンパク質の一例であることを示した。
【０１２３】
４．  ＩＡＰＰはｔＰＡと結合し、ｔＰＡによって伝達されるプラスミノーゲン活性化を刺激する。
ＩＡＰＰのアミロイド沈着物は、糖尿病ＩＩ型患者の膵臓で形成される５９。ＩＡＰＰはイン・ビトロで細胞死を引き起こすことができ、従ってイン・ビボで見られるβ細胞の破壊に寄与し、これによりインスリン産生が不十分となると考えられる。ＩＡＰＰは、交差−β構造を含んでなるフィブリルを形成する６０。
【０１２４】
ＩＡＰＰがｔＰＡによって伝達されるプラスミノーゲン活性化を刺激することができるかどうかを試験した（図７）。実際に、Ａβと同様に、ＩＡＰＰはｔＰＡによるプラスミンの形成を増進することができる。
【０１２５】
５．  グリコアルブミンはチオフラビンＴおよびｔＰＡと結合し、交差−β構造を含んでなるアミロイドフィブリルとして凝集する。
幾つかのタンパク質のグリケーションによって、これらのタンパク質がｔＰＡと結合する能力を誘発しまたは増加することができ、且つｔＰＡによって伝達されるプラスミン形成を刺激することができる２２；６１。本発明者らは、ｇ６ｐを用いるアルブミンのグリケーションがアルブミンに対する高親和性ｔＰＡ結合を与えるだけでなく（図８Ａ）、チオフラビンＴに結合することもできるようになることを示す（図８Ｃ）。ｔＰＡの結合は、コンゴレッドと競合することができる（図８Ｂ）。更に、チオフラビンＴのグリコアルブミンへの結合をｔＰＡと競合させることができる（図８Ｄ，Ｅ）。コンゴレッドおよび／またはチオフラビンＴとｔＰＡが競合するという事実は、それらが同一のまたは重複している結合部位を有することを示している。
【０１２６】
ｇ６ｐで修飾したアルブミン製剤のＴＥＭを用いる分析は、４週間インキュベーションした後、非晶質のアルブミン凝集体が形成され（図８Ｇ）、これはβ−シートにおけるアルブミンアミノ酸残基の７％の存在を示すＣＤスペクトルを示していることが明らかになった（表１）。２３週間までインキュベーションを延長したところ、長さが約５００ｎｍであり、直径が約５０−１００ｎｍの範囲の高次シート様繊維構造に転換した（図８Ｈ）。これらの繊維は、ＣＤ分光偏光法で分析したところ、１９％のβ−シートまで増加した（表Ｉ）。同じ方法でグリケーションした異なるバッチからアルブミンは、２週間のインキュベーション後には繊維状凝集体の束を既に示したが（図８Ｉ）、β−シート含量の増加はＣＤ分光偏光法では検出されない（表Ｉ）。それぞれの束において、約１０本の分離した線状の幅が３−５ｎｍであり長さが２００−３００ｎｍの繊維を同定することができる。それぞれの束の最上部では、直径が約５ｎｍの規則的に分布したスポットが見られる。これらのスポットは、繊維に結合しているあるいは部分的に繊維に組込まれている球状アルブミン分子によって説明することができる。凝集体はコントロールアルブミンには存在せず（図示せず）、β−シートはＣＤ分光偏光法を用いて測定されなかった（表Ｉ）。２および２３週間のグリケーションの後に得られる繊維構造も同様にチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の蛍光を増進するが、４週間後に得られた非晶質沈澱では蛍光シグナルはほとんど増加しなかった。
【０１２７】
Ｘ線繊維回折分析では、アルブミン−ｇ６ｐ（２３週間）がかなりの量の結晶性繊維を含んでなるが（図８Ｊ，Ｌ）、アルブミン−ｇ６ｐ（２週間）およびアルブミン−ｇ６ｐ（４週間）の回折パターンは、アルブミンコントロール（図８Ｋ）について得たパターンと極めて類似した非晶質の沈澱した球状タンパク質から生じる特徴を示すことが分かった。アルブミン−ｇ６ｐ（２３週間）については、４．７オングストロームの繰り返しはβ−シートのβ−ストランド間の特徴的な水素結合距離に相当する。２．３および３．３オングストロームの繰り返しは、４．７オングストロームの繰り返しに直交する好ましい配向を有する（図８Ｍ）。２．３および３．３オングストロームの繰り返しを合わせると、繊維軸は６．８オングストロームの繰り返しを有する水素結合の方向に直交して配向されていることが示唆される。この大きさは２個のペプチド結合の長さに相当し、β−ストランドが繊維軸に平行になっていることを示す。これは、アルブミン−ｇ６ｐ（２３週間）構造が水素結合した鎖のパックされたβ−シートからなる交差−β構造から構成されていることを示唆する（図８Ｎ）。同様な配向は、ＰｒＰｃ６２の最初に予測されたα−へリックス領域のアミロイドフィブリルで見られる。ａ−軸が９．４オングストロームであるかあるいは４．７オングストロームであり、ｃ−軸が６．８オングストロームであるときには、２．５および６．０オングストロームの繰り返しは単に（h k 1）として示すことができる。これは、高次のｂ−軸繰り返しが内部β−シート距離に相当することを示している。ａ−軸およびｃ−軸がそれぞれ４．７または９．４オングストロームおよび６．８オングストロームでは、強い３．８オングストロームの繰り返しは（2 0 1）または（1 0 1）として示される。総ての観察を考慮すれば、アルブミン−ｇ６ｐ繊維（２３週間）はアミロイドフィブリルに特徴的な交差−β構造によって構成されていることは明らかである。
【０１２８】
これらの結果は、糖残基と共にインキュベーションおよび／または修飾することにより、ｔＰＡ結合を支持することができるアルブミン中の交差−β構造が形成されることを示している。
【０１２９】
６．  ヘモグロビンのグリケーションによりｔＰＡ結合およびフィブリル形成が誘発される。
ヒトヘモグロビンのｇ６ｐとのインキュベーションにより、高親和性ｔＰＡ結合が生じた（図９Ａ）。フィブリルを含む非晶質の凝集体Ｈｂ−ｇ６ｐ付加物がＴＥＭで観察されたが（図９Ｂ）、コントロールＨｂは凝集しなかった（図示せず）。糖尿病患者のヒトＨｂは、１２．４％を上回るＨｂがグリケーションされると、フィブリル状凝集体を形成する傾向を有する（表ＩＩ）。
【０１３０】
７．  アミロイドアルブミンは元の炭水化物（誘導体）とは無関係に形成される。
上記の観察から、アルブミンの−ＮＨ２基のｇ６ｐによる修飾によって、アミロイド交差−β構造の形成が誘発されることは明らかである。本発明者らが検討した次の疑問は、球状アルブミンのアミロイドフォールドへのリフォールディングの誘発がｇ６ｐの制限特性であるかどうか、またはアミロイド形成がＡＧＥ形成に用いた元の炭水化物または炭水化物誘導体とは無関係に起こるかどうかであった。アルブミン溶液を、１Ｍ  ｇ６ｐ、２５０ｍＭ ＤＬ−グリセルアルデヒド／１００ｍＭ  ＮａＣＮＢＨ３、１Ｍβ−Ｄ−（−）−フルクトース、１Ｍ  Ｄ（＋）−グルコース、５００ｍＭグリオキシル酸／１００ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３、および相当するＰＢＳおよびＰＢＳ／ＮａＣＮＢＨ３緩衝液コントロールと共に３７℃で８６週間インキュベーションした。グリセルアルデヒドおよびグリオキシル酸は、メイラード反応におけるＡＧＥの前駆体である炭水化物誘導体である６３；６４。８６週間後に、アルブミン−  グリセルアルデヒドおよびアルブミン−フルクトースは淡黄／褐色懸濁液となった。コントロールは無色の透明溶液であった。アルブミン−グルコースおよびアルブミン−グリオキシル酸は透明な単黄−淡褐色溶液であった。アルブミン−ｇ６ｐ：８６は、透明な暗褐色溶液であった。ＡＧＥ形成は、ＡＧＥに特異的な励起／発光波長（図示せず）、ｍｏａｂ抗−ＡＧＥ４Ｂ５の結合（図示せず）およびｐｏａｂ抗−ＡＧＥの結合（図示せず）を用いる自己蛍光測定によって確かめた。予想されたように、アルブミン−グリオキシル酸は（主として）非蛍光性カルボキシメチル−リシン（ＣＭＬ）付加物が形成されるという事実によって自己蛍光シグナルを示さなかった６３。
【０１３１】
上記のＡＧＥ−特異抗体の自己蛍光データおよび結合は、様々な炭水化物および炭水化物誘導体を同様なＡＧＥ構造にすることができることを示している。ＡＧＥ形成の出発点としてｇ６ｐを用いて、アルブミンは、ＡβおよびＩＡＰＰの十分に検討されたフィブリルで観察されるものと同様のアミロイド特性を採用したことを示した。従って、代替炭水化物および誘導体を用いて得たアルブミン−ＡＧＥ付加物におけるアミロイド構造の存在について試験した。本発明者らは、アルブミン−ＡＧＥ−ＴｈＴ溶液（図１０Ｊ）および風乾したアルブミン−ＡＧＥ製剤であって、コンゴレッドとインキュベーションしたものの蛍光を測定した（図１０Ａ−Ｉ）。アルブミンをグリセルアルデヒド、グルコースまたはフルクトースとインキュベーションしたところ、ＴｈＴの蛍光シグナルが増加した（図１０Ｊ）。ＴｈＴおよび緩衝液のバックグラウンドシグナルを差し引いた後、特異的なアミロイド−ＴｈＴ蛍光は、アルブミン−グリオキシル酸および緩衝液コントロールについて測定されなかった。  アルブミン−ｇ６ｐ、アルブミン−グリセルアルデヒドおよびアルブミン−フルクトースは、ＡβおよびＩＡＰＰのシグナルと類似のコンゴレッド蛍光シグナルを生じた（図１０Ｃ−Ｅ，Ｇ−Ｈ）。アルブミン−グルコースでは、蛍光沈澱の均一に分布したパターンが観察された（図１０Ｆ）。アルブミン−グリオキシル酸および緩衝液コントロールでは、染色はほとんど見られなかった（図１０Ａ−Ｂ，Ｉ）。これらのＴｈＴおよびコンゴレッド蛍光データは、アルブミン−ｇ６ｐの他に、アルブミン−グリセルアルデヒド、アルブミン−グルコースおよびアルブミン−フルクトースはアミロイド様特性を有することを示している。これらの知見を更に実証するため、ＥＬＩＳＡでのアミロイド特異的セリンプロテアーゼｔＰＡの結合について試験した。酵素は、アルブミン−ｇ６ｐ、アルブミン−グリセルアルデヒド、アルブミン−グルコースおよびアルブミン−フルクトース（図１０Ｋ−Ｌ）、および上記のように、ポジティブコントロールＡβおよびＩＡＰＰに特異的に結合した４９。アルブミン−グリオキシル酸および緩衝液コントロールについては、ｔＰＡ結合は見られない。
【０１３２】
ＴｈＴ、コンゴレッドおよびｔＰＡデータから、アルブミンにおけるアミロイド特性の誘発はｇ６ｐ唯一の特性ではないことは明らかである。明らかに、ｇ６ｐ、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒドなどを含んでなる炭水化物および炭水化物誘導体のスペクトルは、アルブミンに共有結合したときに球状の元のフォールドからアミロイド交差−β構造フォールドへの転換を引き起こす能力を有する。
【０１３３】
８．  Ａβへのコンゴレッド結合およびｔＰＡ結合の分析
ＡβはｔＰＡおよびコンゴレッドに結合することができることは明らかにされている。本発明者らは、ｔＰＡのＡβへの結合をコンゴレッドと競合させることができることを示す（図１１）。これらの結果は、Ａβ、フィブリンおよびグリコアルブミンの構造は類似しており、ｔＰＡへの結合を伝達することができるという本発明者らの知見を支持している。
【０１３４】
９．  ヒトＦＸＩＩの交差−β構造フォールドを含むアミロイドペプチドおよびタンパク質への結合
図１２のグラフは、ＦＸＩＩが、試験した総てのアミロイド化合物に特異的に結合することを示している。ｈＡβ（１−４０）、ＦＰ１３、アルブミン−ＡＧＥおよびＨｂ−ＡＧＥについてのｋＤは、それぞれ約２、１１、８および０．５ｎＭである。競合的ＦＸＩＩ−ｔＰＡ  ＥＬＩＳＡを用いて得たデータは、ｔＰＡがＦＸＩＩのアミロイド（ポリ）ペプチドへの結合を効率的に阻害することを示している（図１２）。これらのデータから、ＦＸＩＩおよびｆ．ｌ．ｔＰＡはｈＡβ（１−４０）上の結合部位の重複について競合していると結論した。Ｋ２Ｐ−ｔＰＡは、ＦＸＩＩ結合を阻害しない。ＦＸＩＩのアルブミン−ＡＧＥへの結合も、ｈＡβ（１−４０）について観察されたのと同様に、ｔＰＡによって効果的に廃止されるが、Ｋ２Ｐ−ｔＰＡによっては廃止されない。これは、ＦＸＩＩが同様にしてｈＡβ（１−４０）およびアルブミン−ＡＧＥに結合することができることを示している。更に、これらのデータは、ｔＰＡの最初の３個のドメイン（フィンガー、ＥＧＦ様、クリングル１）が、ＦＸＩＩとアミロイドｈＡβ（１−４０）またはアルブミン−ＡＧＥとの相互作用に対するｆ．ｌ．ｔＰＡの阻害効果に関与していると思われることを示している。ドットブロット分析法を用いて、ＦＸＩＩのスポットしたアミロイドｈΔＩＡＰＰおよびｈＡβ（１−４０）への結合を試験した。ネガティブコントロールＰＢＳおよびｍΔＩＡＰＰについては、ＦＸＩＩの結合は見られなかった（図１２）しかしながら、ＦＸＩＩは、初期の報告６５と一致してｈＡβ（１−４０）並びにｈΔＩＡＰＰと特異的に結合した（図１２）。これらのデータは、図１２Ａ−Ｆに示されたＥＬＩＳＡデータと共に、ＦＸＩＩがアミノ酸配列相同性を共有しないポリペプチドに結合することができ、これによって交差−β構造フォールドを共有することを示唆している。これは、アミロイド特異的フォールドを含むｔＰＡとポリペプチドの相互作用についての本発明者らの最新のデータと一致している。
【０１３５】
１０．  ｔＰＡの交差−β構造を含んでなる分子であるＡβおよびグリコアルブミンへの結合は、フィンガードメインを含むｔＰＡにおけるＮ末端領域の存在が必要である。
ｔＰＡの幾つかのドメインは、フィブリンまたはフィブリン断片への結合を伝達することが示されている１２；５３；６６；６７。しかしながら、ｔＰＡのどのドメインがＡβまたは他の交差−β構造を含む分子への結合にとって必要であるかは知られていない。本発明者らは、レテプラーゼと呼ばれ、Ｎ末端フィンガー、ＥＧＦおよびクリングル１ドメイン（Ｋ２−ｔＰＡ）を欠いている突然変異ｔＰＡが交差−β構造を含んでなる分子と結合することができないことを示す（図１３Ａ，Ｂ）。これらの結果は、Ｎ末端領域がｔＰＡのフィブリルを含んでなる交差−β構造への結合に必要であることを示唆している。
【０１３６】
ｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴおよびＲＰＴＰ−ＧＳＴの発現および精製
ＧＳＴで標識した構築物ｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴおよびＲＰＴＰμ−ＧＳＴ（コントロール）を、Sepharose ４Ｂビーズにカップリングしたグルタチオンを用いて２９３Ｔ培地から精製したところ、それぞれ約３５ｋＤａおよび１５０ｋＤａの単一バンドを生じた（図示せず）。培地で用いたＦＣＳに由来する微量のＢＳＡも、存在した。
【０１３７】
ＥＬＩＳＡ：  ｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴおよびＲＰＴＰ−ＧＳＴのヒトＡβ（ｌ−４０）およびグリコアルブミンへの結合
ＥＬＩＳＡにおいて、コントロールｔＰＡは、過剰のεＡＣＡの存在下でヒトＡβ（１−４０）およびアルブミン−ｇ６ｐへ結合した（図１３Ｃ）これは、用いた分析法では、ｔＰＡは繊維状アミロイドにクリングル２から独立して結合することができることを示している。ｔＰＡ−ＦドメインはヒトＡβ（１−４０）およびアルブミン−ｇ６ｐに結合したが、ＲＰＴμ−ＧＳＴでは結合は見られなかった。従って、ｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴで見られた結合は特異的であり、ＧＳＴタグに由来しない。この結果は、ｔＰＡフィンガードメインを交差−β構造ｄアミロイドフィブリルへの結合についての性質によってデザインされた特異的ドメインとして示している。
【０１３８】
ヒトｔＰＡのＦ、Ｆ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、Ｆ−ＥＧＦ−Ｋ１およびＫ１断片のｐｃＤＮＡ３におけるｃＤＮＡ構築物を調製した。Ｃ末端のＧＳＴタグを有する組換えタンパク質をＢＨＫ細胞で発現させ、培地に分泌させた。ＧＳＴタグのみを発現するＢＨＫ細胞からの培地を、コントロールとして用いた。コンディショニングした培地をＡβおよびＩＡＰＰフィブリルを用いるプルダウン分析の後にウェスタンブロット分析に用いた。Ａβへの効率的結合は、フィンガードメインを含む３種類総てのｔＰＡ突然変異体、すなわちＦ−ＧＳＴ、Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴおよびＦ−ＥＧＦ−Ｋ１−ＧＳＴについて明らかである（図１３Ｄ）。Ｋ１−ＧＳＴおよびＥＧＦ−ＧＳＴ構築物並びにＧＳＴタグのみＡβインキュベーションの後に上清に留まる。同様なパターンは、ＩＡＰＰプルダウンの後に得られた（図示せず）。
【０１３９】
精製したｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴ、組換えf.l.Actilyse ｔＰＡおよびＧＳＴコントロールの固定アミロイドＡβ、アミロイドフィブリン断片α１４８−１６０ＦＰ１３、アミロイドＩＡＰＰ、および非アミロイドｍΔＩＡＰＰコントロールへの結合を調製した（図１３Ｅ−Ｇ）。完全長ｔＰＡおよびｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴは、３種類総てのアミロイドペプチドに結合し、Ａβｋａについては、ｔＰＡおよびＦ−ＥＧＦに対してはそれぞれ２および２ｎＭであり、ＦＰ１３に対しては５および２ｎＭであり、ＩＡＰＰについては２および１３ｎＭである。非アミロイドｍΔＩＡＰＰに対する結合は見られなかった（図１３Ｅ）。ＧＳＴはＦＰ１３およびＩＡＰＰに結合しないが、Ａβに対しては幾らかの結合が検出される。これは、プルダウン分析法においてＡβに結合したＧＳＴの小画分を反映している可能性がある（図１３Ｄ）。
【０１４０】
免疫組織化学分析を用いて、精製した組換えｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴ構築物のＡＤに冒されたヒト脳のパラフィン切片への結合を試験した。アミロイド沈着の存在は、標準的手法を用いてDept. of Pathology (UMC Utrecht)によって確かめた。本発明者らの実験では、これらのアミロイド沈着はコンゴレッド蛍光を用いて確認した（図１３Ｉ，Ｋ，Ｍ）。図１３ＨおよびＩ、および図１３ＪおよびＫにおいて、コンゴレッド結合にポジティブな領域はｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴ結合についてポジティブな領域と一致することが明らかに分かる。ＧＳＴによるコントロール染色は、タグのみの特異結合を示さない（図１３Ｌ−Ｍ）。
【０１４１】
現在のところ、配列および構造的相同性に基づいて、ｔＰＡの隣のタンパク質１以上のフィンガードメイン、すなわちＨＧＦａ（１個のＦドメイン）、ＦＸＩＩ（１個のＦドメイン、Ｆｎ（６個のＦドメインの１個のストレッチ、３個のＦドメインの２個のストレッチ）を含むものが知られている。上記の結果から、ｔＰＡのＦドメインはｔＰＡのアミロイド（ポリ）ペプチドへの結合において重要な役割を果たしていると結論した。フィンガードメインは一般的な交差−β構造結合モジュールであることができると仮定した。現在のところ、４個のタンパク質ｔＰＡ、ＦＸＩＩ、ＨＧＦａおよびフィブロネクチンは、フィンガーモティーフを含むことが知られている。図１４Ａは、それぞれのタンパク質におけるフィンガーモジュールの局在化を略記している。図１４Ｂは、これらの４種類のタンパク質におけるフィンガードメインのヒトアミノ酸配列の整列を示す。図１４Ｃは、ｔＰＡのフィンガードメイン、およびフィブロネクチンの第四および第五のフィンガードメインの三次元構造を図解表現したものを示す。フィンガードメインが一般的にはアミロイドを結合するという仮定を試験するため、ＨＧＦａおよびＦＸＩＩのＦドメイン、並びにＦｎの第四および第五のＦドメインであって、フィブリンに結合する能力について知られているものをクローニングした６８。プルダウン分析法を用いて、Ｆｎ Ｆ４−ＧＳＴおよびＦｎ  Ｆ４−５−ＧＳＴ、並びにＦＸＩＩＦ−ＧＳＴおよびＨＧＦａ  Ｆ−ＧＳＴが特異的にＡβ（図１３ Ｍ−Ｎ）およびＩＡＰＰ（図示せず）に特異的に結合することを示す。Ｆｎ  Ｆ５−ＧＳＴは幾分かＡβに結合するが、これは培地から余り効率的にではなく抽出され、アミロイドペレットの洗浄手続き中に部分的に放出されると思われる（図１３Ｍ）。ポジティブコントロールｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴの抽出後には、構築物は培地に残っていなかったが、ネガティブコントロールＧＳＴはペレット画分には検出されなかった（図示せず）。これらのデータは、アミロイド（ポリ）ペプチドへの結合はｔＰＡ  Ｆドメインのユニークな能力ではなく、試験を行ったＦドメインの更に一般的な特性であることを示している。更に、これらのデータは、図１３Ａ，ＨおよびShibayama et al.６５によって示されるように、ＦＸＩＩのアミロイド（ポリ）ペプチドへの観察された結合はＦドメインによって調節されることを示している。
【０１４２】
１１．  ｔＰＡのアミロイド結合ドメイン
ｔＰＡのフィンガードメインは、フィブリンへの高親和性結合に重要であることが示されているｌ２；  ６６。レテプラーゼ（Ｋ２−Ｐ  ｔＰＡ）およびＦ−ｔＰＡ、Ｆ−ＥＧＦ−ｔＰＡおよびＦ−ＥＧＦ−Ｋ１−ｔＰＡを用いる本発明の結果は、フィブリン以外の刺激因子への結合におけるｔＰＡのＮ末端フィンガードメインの重要な役割を示している。個々までは、これら総ての因子はコンゴレッドと結合し、交差−β構造を含む。更に、フィブリンについてのフィブロネクチンの結合部位は、フィンガードメインタンデムＦ４−Ｆ５に対してマッピングされている６８。フィブリン断片ＦＣＢ２の存在下における完全長ｔＰＡによるプラスミノーゲン活性化はフィブロネクチンによって阻害することができることが示されている６９。まとめて考えると、これらの観察は、ｔＰＡとフィブロネクチンがフィブリン上の同一または重複結合部位についてフィンガードメインによって競合することを示唆している。本発明者らのデータは、ＦｎのＦ４−５ドメインがアミロイドＡβに結合することを示している。
【０１４３】
１２．  抗−ＡＧＥ抗体のアミロイド（ポリ）ペプチドへの結合、および抗−Ａβのタンパク質−ＡＧＥ付加物への結合
最近、O'Nuallain and Wetzel７０は、アミロイドの特徴を有するペプチドに対して誘発された抗体は、アミノ酸配列には関係なく同様なアミロイド特性を有する任意の他のペプチドに結合することができることを示した。これらのデータ、および組織型プラスミノーゲンアクチベーターおよびＸＩＩ因子は、アミロイド特異的交差−β構造フォールドを共有する配列に関係のないポリペプチドのファミリーに結合することができるという本発明者らの観察に基づいて、一層広汎なクラスのタンパク質が特異的アミノ酸残基によって構成された線形またはコンホメーションエピトープに対するよりはこの構造単位に対する親和性を示すことができると仮定した。この仮定により、アミロイド交差−β構造フォールドを含むアルブミン−ＡＧＥに対して誘発された抗体が、この交差−β構造フォールドを有する任意の（ポリ）ペプチドに対して広範囲の特異性をも示すかどうかという疑問を刺激した。
【０１４４】
ＥＬＩＳＡ装置では、ｇ６ｐ−グリコアルブミン−ＡＧＥに対して誘発されたα−ＡＧＥ１はアミロイドアルブミン−ＡＧＥ：２３（Ｋｄ＝６６ｎＭ）およびＨｂ−ＡＧＥ：３２（Ｋｄ＝２０ｎＭ）、並びにＡβ（１−４０）（Ｋｄ＝４８１ｎＭ）およびＩＡＰＰ（Ｋｄ＝１８ｎＭ）に結合する（図１５Ａ−Ｃ）。ネガティブコントロールは、ＩＡＰＰについて非グリコアルブミンおよびＨｂ、非アミロイドペプチドマウスΔＩＡＰＰ、およびＡβについてポリクローナル抗−ヒトビトロネクチン抗体α−ｈＶｎＫ９２３４であった。α−ＡＧＥ１の同一画分がＩＡＰＰおよびＡβに結合するかどうかを試験するために、抗体をＩＡＰＰフィブリルで予備インキュベーションした後、フィブリルをα−ＡＧＥ１の可能なアミロイド結合画分と共にペレット化した。上清に残ったα−ＡＧＥ１のＡβ（ｌ−４０）への結合は減少した（図１５Ｄ）。これは、α−ＡＧＥ１の同一画分がＩＡＰＰおよびＡβ（１−４０）に結合することを示している。プルダウン分析法を用いて、抗−ＡＧＥ１のアミロイドペプチドへの結合を別の方法で評価した。抗−ＡＧＥ１溶液をアミロイドフィブリルＡβ（１６−２２）（図１５Ｅ；レーン１−２）、Ａβ（ｌ−４０）（図１５Ｅ；レーン４−５）、およびＩＡＰＰ（図１５Ｅ；レーン６−７）を用いてインキュベーションし、次にアミロイドフィブリルをペレット化した後、上清をＡβ（１６−２２）によってα−ＡＧＥ１を完全に欠失した。ＩＡＰＰでは、抗体の約５０％がアミロイド画分に見出されたが、Ａβ（１−４０）では抗体は余りペレット化しない。相補的方法で得られたこれらのデータは、抗−ＡＧＥ１がアルブミン−ＡＧＥ：２３とのアミノ酸配列相同性を共有しないアミロイドペプチドに結合することができ、これにより交差−β構造フォールドを共有することも示している。更に、ｔＰＡのアミロイドペプチドへの結合が抗−ＡＧＥ１の結合を阻害するという観察は、ｔＰＡのような抗−ＡＧＥ１が交差−β構造フォールドへ結合することも示している（図１５Ｆ−Ｇ）。ｔＰＡが抗−ＡＧＥ１のＡβへの結合をＩＡＰＰで見られる減少より少ない程度で減少させるという観察は、ＩＡＰＰと比較したときにコーティングしたＡβ上の抗−ＡＧＥＩ結合部位の数が一層多いこと（図１５Ｂ−Ｃ参照）、およびＥｘｉｑｏｎ  ＥＬＩＳＡプレートを用いるときにＡβ（ｋＤ＝４６ｎＭ）についてよりＩＡＰＰ（ｋＤ＝６ｎＭ）についてｔＰＡの親和性が一層高いことと推定的に関連付けられる（図示せず）。結合データは一緒になって、抗−ＡＧＥ１をマルチリガンド交差−β構造結合タンパク質のクラスのものと確認する交差−β構造フォールドを有する（ポリ）ペプチドには関係なく、抗−ＡＧＥ１がアミロイドフォールドに結合することを示唆している。
【０１４５】
抗−ＡＧＥ１を用いて得た上記の結果に基づいて、市販のウサギ抗−ヒトＡβ（１−４２）Ｈ−４３が、アミロイド特性を有していても関連のないアミノ酸配列を有する任意の（ポリ）ペプチドに対して広範囲の特異性も示すかどうかを試験した。実際に、ＥＬＩＳＡにより、Ｈ−４３はＡβ（１−４０）に結合するだけでなく、ＩＡＰＰおよびアルブミン−ＡＧＥにも結合することを示すことができた（図１５Ｈ）。更に、Ｈ−４３の固定ＩＡＰＰへの結合は、ｔＰＡによって効果的に減少した（図１５Ｉ）。これらの観察結果は一緒になって、抗−Ａβ（１−４２）Ｈ−４３が、マルチリガンド交差−β構造結合タンパク質ｔＰＡと同様の方法で、他のアミロイドに結合することができることを示している。
【０１４６】
ポリクローナルマウス抗−アルブミン−ＡＧＥ／Ａβを用いるＥＬＩＳＡは、抗体がこれらの抗原に結合するだけでなく、固定に用いたもの以外の他のアミロイドペプチドに特異的に結合することを示している（図１５Ｊ−Ｌ）。ウサギ抗−ＡＧＥ１抗体および抗−Ａβ（１−４２）Ｈ−４３と同様に、抗−アルブミン−ＡＧＥ／Ａβは、アミノ酸配列には関係なく、試験したアミロイドペプチドに対して親和性を示す。これは、マウス抗−アルブミン−ＡＧＥ／Ａβもマルチリガンドアミロイド結合抗体であることを示唆している。
【０１４７】
抗−ＡＧＥ１、抗−Ａβ（ｌ−４２）Ｈ−４３および抗−アルブミン−ＡＧＥ／Ａβのアミロイド結合特性に基づいて、アルブミン−ＡＧＥ：２３に対して誘発される抗−ＡＧＥ２のアミロイド結合画分をカラムに不可逆的にカップリングしたＡβフィブリルを用いて精製した。この画分を、アルツハイマー病に冒されているヒト脳切片の免疫組織化学的分析に用いた。図１５Ｍでは、抗体が、図１５Ｎに示されるコンゴレッド蛍光によって示される球状アミロイド沈着物に特異的に結合することが明らかに分かる。
【０１４８】
抗−アミロイドおよび抗−ＡＧＥ抗体が、交差−β構造フォールドが存在する限り、広範囲の配列的に関係のない（ポリ）ペプチドに対する親和性を示すという知見は、O'Nuallain and Wetzel７０およびKayed et al.７１によって最近に公表されたデータと一致する。文献における幾つかの古い報告から、抗−交差−β抗体を得ることができることを精選することができる。例えば、フィブリンおよびＡβに対するおよびＡβおよびヘモグロビンに対する交差反応性抗体が記載されている７２；  ７３。本発明者らは、本明細書において、フィブリノーゲンとヘモグロビン−ＡＧＥが交差−β構造フォールドを有し、これが抗−Ａβ抗体について観察された交差反応性が実際にＡβ、フィブリノーゲンおよびヘモグロビンでの同様な構造的エピトープへの抗−交差−β構造抗体の結合であることを示唆していることを示した。
【０１４９】
ポリクローナル抗−ＡＧＥおよびアミロイド抗体での結果に基づいて、本発明者らは、抗−交差−β構造抗体を得ることができると仮定した。従って、本発明者らは、グリコＢＳＡおよびＡβで免役したマウスの脾臓と骨髄腫細胞を融合させた。次に、ハイブリドーマによって産生した抗体のグリコヘモグロビンおよびＩＡＰＰへの結合を検討することによって潜在的な抗−交差−β構造抗体を選択した。この手順を用いて、グリコヘモグロビン並びに交差−β構造を含む幾つかのペプチドを認識するモノクローナル抗体３Ｈ７を単離した（図１６）。グリケーションしていないヘモグロビン、またはアミロイドフィブリル（ｍΔＩＡＰＰ）を形成しない合成ペプチドへは、結合は見られなかった。
【０１５０】
１３．  サンドイッチＥＬＩＳＡ：溶液からのアミロイド構造の探索
溶液状のアミロイドアルブミン−ＡＧＥ：２３を積層したコーティングｔＰＡでのサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた後、広範囲の抗−Ａβ（１−４２）Ｈ−４３を検出し（図１７）、溶液状のタンパク質を含む交差−β構造を検出することができた。
【０１５１】
ｔＰＡフィンガードメイン７４；７５およびフィブロネクチンフィンガードメイン４−５７５；７６の三次元構造は局所的電荷密度分布に関して著しい構造的相同性を示すことが本明細書で開示されている。いずれの構造も、電荷が交互する５個のアミノ酸残基の同様な溶媒に暴露したストレッチを含み、ｔＰＡについては、Ａｒｇ７、Ｇｌｕ９、Ａｒｇ２３、Ｇｌｕ３２、Ａｒｇ３０であり、フィブロネクチンについては、Ａｒｇ８３、Ｇｌｕ８５、Ｌｙｓ８７、Ｇｌｕ８９、Ａｒｇ９０がそれぞれ第五のフィンガードメインに位置している。帯電した残基整列は、フィンガーモジュールの同じ側に位置している。これらの整列は、フィブリン結合に本質的である。
【０１５２】
本発明者らの観察、結果、および本明細書で開示した同様なものに基づいて、ｔＰＡについて同じ結合部位がｔＰＡと結合し、活性化する総てのタンパク質に存在することになり、且つこの結合部位が交差−β構造を含んでなることを示す。
【０１５３】
一緒にまとめると、本発明者らのデータは、交差−β構造は、発生がきっちりと調節されており且つ発現により正常な生理学的応答、すなわち望ましくない生体分子の除去が誘発される生理学的に関連のある四次構造要素であることを示している。本発明者らの知る限りでは、望ましくない生体分子の除去のために「交差−β構造経路」と呼ぶ一般的系の存在は、本明細書で初めて開示されたものである。本発明者らの結果は、この機構が自然にとって基本的なものであり、多くの生理学的仮定を制御し、損傷の誘発からまたは役に立たないまたは変性した生体分子から生体を保護することを示している。どのような手段によってであれ制御されなくなれば、この系は重大な問題を引き起こす可能性がある。一方、適性に用いられれば、この系は、腫瘍細胞などのような特異的なターゲット細胞において細胞死を誘発するのに応用することができる。
【０１５４】
【表１】
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【０１５５】
【表２】
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【０１５６】
参考文献
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】「交差−β構造経路」の図解表現。  交差−β構造は多数のタンパク質に見出されている（１）。交差−β構造の形成は幾つかの生理学的または病理学的条件によって引き起こされ、続いて事象のカスケード「交差−β構造経路」を開始する。所定のタンパク質内で交差−β構造の形成を引き起こしまたは調節する因子としては、１）タンパク質の物理化学特性、２）タンパク質分解、３）交差結合、酸化、ホスホリル化、グリコシル化、およびグリケーションなどの調節された翻訳後修飾、４）グルコース、および５）  亜鉛が挙げられる。タンパク質の配列内のある種の突然変異は、交差−β構造を採用し且つアミロイドフィブリルを形成するタンパク質の能力を増加することが知られている。これらの突然変異は、アミロイドーシスの遺伝形態、例えばＡＤに見られることが多い。本発明は、交差−β構造を採用することができるタンパク質の多数の新規な例を開示する。  幾つかのタンパク質は、交差−β含有タンパク質と結合することが知られている（２）。これらのタンパク質は、交差−β構造の形成によって引き起こされる本明細書に開示したシグナルカスケード（「交差−β構造経路」）の一部である。「交差−β構造経路」は、多くの方法で調節される（３，４，５）。この経路を調節する因子としては、ＮＯレギュレーターなど合成および分泌の調節因子、並びにプロテアーゼインヒビターなど活性の調節因子が挙げられる。経路は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、アミロイドーシス、出血、炎症、多発性硬化症、パーキンソン病、敗血症、溶血性尿毒症症候群など、これらに限定されない多くの生理学的および病理学的過程に関与している（７）。長期相乗作用におけるｔＰＡについて確立された役割を考慮すれば、「交差−β構造経路」も学習に関与することがある。
【図２】フィブリンの交差−β構造  （Ａ）フィブリン血餅のチオフラビンＴ蛍光。フィブリン血餅をチオフラビンＴの存在下で形成し、蛍光を所定の時点で記録した。緩衝液、チオフラビンＴ、およびチオフラビンＴの非存在下で形成した血餅のバックグラウンド蛍光を差し引いた。（Ｂ）フィブリン由来のペプチド８５、８６および８７の円偏光二色性分析。楕円率（Ｄｇ．ｃｍ２／ｄｍｏｌ）を、波長（ｎｍ）に対してプロットした。ＣＤスペクトルは、ペプチド８５および８６がβ−シートを含むが、ペプチド８７は含まないことを示している。（Ｃ）ペプチド８５のＸ線繊維回折分析は、ペプチドが交差−β−シートを形成することを示している。（Ｄ）フィブリンペプチド８５、８６および８７を用いるプラスミノーゲン活性化分析。ペプチド８５および８６はいずれも交差−β構造を含み、ｔＰＡによるプラスミンの形成を刺激するが、ペプチド８７は交差−β構造を欠き、プラスミンの形成を刺激しない。
【図３】ｔＰＡ、プラスミノーゲンおよびプラスミンのＡβへの結合  Ａβをプラスチック製の９６穴プレートにコーティングした。（Ａ）ｔＰＡまたは（Ｂ）プラスミン（プラスミノーゲン）の増加濃度により、固定ペプチドに結合させた。ｔＰＡおよびプラスミン（プラスミノーゲン）を十分に洗浄した後、結合を抗−ｔＰＡおよび抗−プラスミノーゲン抗体を用いて固相酵素免疫検定法によって評価した。５０ｍＭε−アミノカプロン酸（ε−ＡＣＡ）の存在下における（Ｃ）ｔＰＡおよび（Ｄ）プラスミンのＡβへの結合をＡおよびＢと同様に評価した。
【図４】ＡβによるｔＰＡによって伝達されるプラスミン形成の刺激、およびプラスミノーゲンおよびＡβによる細胞脱着の刺激。（Ａ）プラスミノーゲン（２００μｇ／ｍｌ）およびｔＰＡ（２００ｐＭ）を、Ａβ（５μＭ）またはコントロール緩衝液とインキュベーションした。試料を所定の時点に反応混合物から採取し、プラスミン活性を４０５ｎｍにおける発色性プラスミン基質Ｓ−２２５１の転換によって測定した。（Ｂ）Ｎ１Ｅ−１１５細胞を分化して、２５μＭのＡβの存在下または非存在下で所定濃度のプラスミンを受け取った。４８時間後に、死細胞を洗浄除去し、残りの接着細胞をメチレンブルーで染色した。プラスミンは、Ａβによって誘導される細胞脱着を防止することができない。（Ｃ）Ｎ１Ｅ−１１５細胞を分化して、１０μＭのＡβの存在下または非存在下で所定濃度のプラスミンを受け取った。次に、２４時間後に、細胞脱着を評価した。Ａβまたはプラスミノーゲンのみでは細胞接着に影響しないが、療法とも添加するとかなりの細胞脱着を引き起こす。（Ｄ）プラスミン形成およびラミニン分解の免疫ブロット分析。分化したＮ１Ｅ−１１５細胞を、添加したプラスミノーゲンの非存在下または存在下にてＡβ（１０μＭ）でまたはなしで処理した。Ａβの添加により、プラスミンが形成され（最下欄）、ラミニンが分解する（最上欄）。
【図５】カルボキシペプチダーゼＢはＡβによって刺激されたｔＰＡによって伝達されるプラスミン形成および細胞脱着を阻害する。  （Ａ）プラスミノーゲン（２００μｇ／ｍｌ）およびｔＰＡ（２００ｐＭ）を、Ａβ（５μＭ）またはコントロール緩衝液と共にインキュベーションした。試料を所定の時点に反応混合物から採取し、プラスミン活性を４０５ｎｍでの発色性プラスミン基質Ｓ−２２５１の転換によって測定した。反応は、５０μｇ／ｍｌのカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ）の非存在下または存在下、および３．５μＭのカルボキシペプチダーゼインヒビター（ＣＰＩ）の非存在下または存在下にて行った。ＣｐＢは、Ａによって刺激されたプラスミン形成を大幅に減衰する。  （Ｂ）Ｎ１Ｅ−１１５細胞を分化し、上記のようにＡβ（１０μＭ）、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ，２０μｇ／ｍｌ）、および／またはＣｐＢ（１μＭ）で処理した。２４時間後に、細胞を写真撮影した。  （Ｃ）次に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、残っている細胞をメチレンブルー染色によって接着細胞の百分率として定量した。  （Ｄ）細胞を、（Ｂ）および（Ｃ）と同様に処理し、培地と細胞画分を集め、抗−プラスミン（プラスミノーゲン）抗体を用いてウェスタンブロット法によって分析した。Ａβは、ＣｐＢによって阻害されるプラスミン形成を刺激する。
【図６】エンドスタチンは交差−β構造を含んでなるフィブリルを形成することができ且つプラスミノーゲン活性化を刺激する。  （Ａ）ＴＥＭは、エンドスタチンフィブリルの形成を示す。  （Ｂ）Ｘ線分析は、沈澱した（沈澱）エンドスタチンにおける交差−β構造の存在を示している。  （Ｃ）プラスミノーゲン活性化分析は、ｔＰＡによって伝達されるプラスミン形成に対する交差−β構造を含むエンドスタチンの刺激活性を示している。Ａβを比較のために示す。  （Ｄ）エンドスタチンの分析は、メチレンブルー染色により細胞死を誘発した。沈澱形態のみが効率的に細胞死を誘発することができることが分かる。直接的細胞死は、十分なグルコースの存在下で保護されるが細胞脱着は保護されない。緩衝液沈澱は、コントロール緩衝液を示している。
【図７】ＩＡＰＰはｔＰＡによって伝達されるプラスミノーゲン活性化を刺激する。  完全長（ｆｌ−ｈＩＡＰＰ）および切頭アミロイドコア（Ａ−ｈＩＡＰＰ）は、ｔＰＡによって伝達されるプラスミノーゲン活性化を刺激するが、マウスＩＡＰＰ（Δ−ｍＩＡＰＰ）は刺激しない。
【図８ａ】グリコアルブミン：チオフラビンＴおよびｔＰＡ結合、ＴＥＭ像、Ｘ線繊維回折。  （Ａ）ｔＰＡのアルブミン−ｇ６ｐへの結合を示すＥＬＩＳＡ。  （Ｂ）ＥＬＩＳＡを用いて測定したコンゴレッドによるｔＰＡ結合のアルブミン−ｇ６ｐへの競合。  （Ｃ）チオフラビンＴのアルブミン−ｇ６ｐへの結合の蛍光測定であり、２、４または２３週間インキュベーションしたもの。  （Ｄ）４３０ｎＭのアルブミン−ｇ６ｐを１９μＭのチオフラビンＴ  と共にインキュベーションしたときに得られる蛍光シグナルのｔＰＡによる阻害。  （Ｅ）４２０ｎｍでの分光光度分析は、ｔＰＡの量の増加により、５００ｎＭのアルブミン−ｇ６ｐを１０μＭのチオフラビンＴと共にインキュベーションしたときに得られる特異的吸光度が減少する。
【図８ｂ】グリコアルブミン：チオフラビンＴおよびｔＰＡ結合、ＴＥＭ像、Ｘ線繊維回折。  （Ｇ）４週間グリケーションを行ったアルブミン−ｇ６ｐの非晶質沈澱を示す電子顕微鏡写真。  （Ｈ）２３週間インキュベーションしたアルブミン−ｇ６ｐのフィブリル状凝集体の束。  （Ｉ）２週間グリケーションを行ったアルブミン−ｇ６ｐ。  （Ｊ）アルブミン−ｇ６ｐのＸ線散乱（２３週間）。散乱強度は線形尺度でカラーコード化されており、白−灰−黒の順に減少する。非晶質のコントロールアルブミンからの散乱、並びに毛細管ガラス壁および空気からの散乱を差し引く。ｄ−スペーシングおよび繊維軸の方向を与え、好ましい配向を矢印で示す。  （Ｋ）アルブミンコントロールおよびアルブミン−ｇ６ｐ（２３週間）の放射状掃引。  （Ｌ）皮脂溶質沈澱アルブミンのバックグラウンド散乱を差し引いた後の、繊維状構造から生じる繰り返しを示すアルブミン−ｇ６ｐ（２３週間）の放射状掃引。ｄ−スペーシング（オングストローム）を、ピーク上に示す。  （Ｍ）所定のｄ−スペーシングに相当する２θ散乱角の接線方向掃引。この掃引は、個々のβ−シート内の水素結合距離に相当する４．７オングストロームの繰り返し、および６オングストロームの繰り返しが、繊維軸に平行に走る２．３オングストロームの繰り返しに垂直に配向していることを示す。  （Ｎ）アルブミン−ｇ６ｐ（２３週間）アミロイドフィブリルにおける交差−β構造の配向の図解表現。
【図９】ヒトヘモグロビンのフィブリル形成。  （Ａ）ｔＰＡのイン・ビトロでのグリコＨｂ−ｇ６ｐへの結合。  （Ｂ）非晶質および繊維状に集合しているイン・ビトロでグリコＨｂを示す電子顕微鏡写真。
【図１０】アルブミン−ＡＧＥのアミロイド特性はグリケーションに用いられる炭水化物または炭水化物誘導体には関係なく導入される。  （Ａ−Ｉ）風乾したアルブミン製剤のコンゴレッド蛍光。蛍光は、緩衝液（Ａ）、または緩衝液およびＮａＣＮＢＨ３（Ｂ）、ヒトＩＡＰＰのアミロイドコアペプチド（Ｃ）、Ａβ（Ｄ）とインキュベーションしたアルブミン、ｇ６ｐ（Ｅ）、グルコース（Ｆ）、フルクトース（Ｇ）、グリセルアルデヒド（Ｈ）、およびグリオキシル酸（Ｉ）とインキュベーションしたアルブミンを用いて測定した。（Ｊ）チオフラビンＴ−アミロイド蛍光は、所定のアルブミン製剤を含む溶液で測定した。（Ｋ−Ｌ）アミロイド結合セリンプロテアーゼｔＰＡのアルブミン製剤への結合は、ＥＬＩＳＡ装置を用いて分析した。（Ｋ）では、ｔＰＡのアルブミン−グルコース、−フルクトース、−グリセルアルデヒド、−グリオキシル酸、およびアルブミン−緩衝液コントロールへの結合を示す。（Ｌ）では、ｔＰＡのポジティブコントロールであるアルブミン−ｇ６ｐ、ＡβおよびＩＡＰＰへの結合、並びにコントロール緩衝液とインキュベーションしたアルブミンへの結合を示す。
【図１１】Ａβへのコンゴレッド−およびｔＰＡ結合の分析。  （Ａ）ＥＬＩＳＡを用いて測定したｔＰＡの固定Ａβへの結合。（Ｂ）ｔＰＡのＡβへの結合に対するコンゴレッドの増加濃度の影響。ＥＬＩＳＡでは、１０μｇ／ｍｌのＡβ（１−４０）をコーティングし、４０ｎＭのｔＰＡおよび０−１００μＭのコンゴレッドと共にインキュベーションした。
【図１２】交差−β構造フォールドを含むアミロイドペプチドおよびタンパク質へのヒトＦＸＩＩの結合。  （Ａ−Ｂ）  ＦＸＩＩの、プロトタイプアミロイドペプチドｈＡβ（１−４０）およびヒトフィブリン断片αｌ４７−ｌ５９ＦＰ１３、およびアルブミン−ＡＧＥおよびＨｂ−ＡＧＥであって、いずれも交差−β構造を含むものに対する結合を、ＥＬＩＳＡで試験した。ＦＸＩＩは、ネガティブコントロールであるマウスΔランゲルハンス島アミロイドポリペプチド（ＡｍＩＡＰＰ）、アルブミン−コントロールおよびＨｂ−コントロールであって、３種類がいずれもアミロイド特異的構造を欠いているものには結合しない。ｈＡβ（１−４０）、ＦＰ１３、アルブミン−ＡＧＥおよびＨｂ−ＡＧＥについてのｋＤは、それぞれ約２、１１、８および０．５ｎＭである。（Ｃ−Ｄ）コーティングしたｈＡβ（１−４０）を、一連の濃度のヒト組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター（Ａｃｔｉｌｙｓｅ（商標），完全長ｔＰＡ）、またはＲｅｔｅｐｌａｓｅ（商標）（Ｋ２Ｐ−ｔＰＡ）の存在下で、結合緩衝液中２．５ｎＭ  ＦＸＩＩと共にインキュベーションした。ｆ．ｌ．ｔＰＡ−およびＫ２Ｐ−ｔＰＡ濃度は、最大でｔＰＡのｈＡβ（１−４０）（５０ｎＭ）への結合についてのｋＤの１３５倍であった。（Ｅ−Ｆ）  コーティングしたアミロイドアルブミン−ＡＧＥを、一連の濃度のｆ．ｌ．ｔＰＡまたはＫ２Ｐ−ｔＰＡの存在下にて、結合緩衝液中１５ｎＭのＦＸＩＩとインキュベーションした。ｔＰＡ濃度は、最大でｔＰＡのアルブミンＡＧＥ（１ｎＭ）への結合についてのｋＤの１５０倍であった。（Ｇ）  ＦＸＩＩのｈＡβ（１−４０）およびプロトタイプアミロイドヒトアミリン断片ｈＡＩＡＰＰへの結合を、ドットブロット分析を用いて試験した。交差−β構造を含むペプチド、並びにネガティブコントロールペプチドｍΔＩＡＰＰおよびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０μｇを、２回ずつスポットした。ＦＸＩＩは、ｈＡβ（１−４０）並びにｈΔＩＡＰＰに特異的に結合した。
【図１３ａ】フィンガードメインはアミロイド（ポリ）ペプチドに結合する。  （Ａ）ｔＰＡおよびＫ２−Ｐ  ｔＰＡのアルブミン−ｇ６ｐへの結合。（Ｂ）ｔＰＡおよびＫ２−Ｐ  ｔＰＡのＡｒｓ（１−４０）への結合。検出に用いたｔＰＡ抗体は、ｔＰＡとＫ２−Ｐ−ｔＰＡを同じ親和性で認識する（図示せず）。（Ｃ）ｔＰＡ−Ｆ−ＧＳＴおよびｔＰＡの固定Ａβ（ｌ−４０）およびアルブミン−ｇ６ｐへの結合。コントロールＲＰＴＰμ−ＧＳＴは、Ａβまたはアルブミン−ｇ６ｐと結合しない。（Ｄ）不溶性ＡβフィブリルおよびｔＰＡドメインを用いるプルダウン分析。Ｃ末端ＧＳＴタグを有するｔＰＡ  Ｆ、Ｆ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、Ｆ−ＥＧＦ−Ｋ１およびＫ１並びにタグのみを発現する安定にトランスフェクションした細胞系からのコンディショニングしたＢＨＫ培地を用いた。「コントロール」はプルダウン前の培地、「Ａβ」はプルダウン後の洗浄したアミロイドＡβペレット、「Ｓｕｐ」はＡβで抽出後の培地。試料を、ウサギ抗−ＧＳＴ抗体Ｚ−５を用いてウェスタンブロット法で分析した。（Ｅ−Ｇ）ｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴおよびｆ．ｌ．組換えｔＰＡのアミロイドＡβ（Ｅ）、ＦＰ１３（Ｆ）およびＩＡＰＰ（Ｇ）への結合を示すＥＬＩＳＡ。ｍΔＩＡＰＰを、非アミロイドネガティブコントロール（Ｅ）としてコーティングした。ペプチドをＥＬＩＳＡプレートに固定し、一連の濃度のｔＰＡおよびＦ−ＥＧＦ−ＧＳＴで積層した。ＧＳＴは、ネガティブコントロールとして用いた。結合は、ウサギ抗−ＧＳＴ抗体Ｚ−５を用いて検出した。
【図１３ｂ】フィンガードメインはアミロイド（ポリ）ペプチドに結合する。  （Ｈ−Ｍ）ＡＤに冒されたヒトの脳のアミロイド沈着物に対するｔＰＡ  ＦＥＧＦ−ＧＳＴの結合の免疫組織化学的分析。脳切片に、ｔＰＡ  Ｆ−ＥＧＦ−ＧＳＴ（Ｈ，Ｊ）またはネガティブコントロールＧＳＴ（Ｌ）を積層した。同じ切片をコンゴレッドとインキュベーションして（Ｉ，  Ｋ，  Ｍ）、アミロイド沈着物の位置を確認した。（Ｎ−Ｏ）不溶性Ａβフィブリルおよびフィンガードメインを用いるプルダウン分析。Ｃ末端ＧＳＴタグを有する組換えＦドメインを、安定にトランスフェクションしたＢＨＫ細胞によって発現させた。「コントロール」はプルダウン前の培地、「Ａβ」はプルダウン後の洗浄したアミロイドＡβペレット、「Ｓｕｐ」はＡβで抽出後の培地。試料を、ウサギ抗−ＧＳＴ抗体Ｚ−５を用いてウェスタンブロット法で分析した。
【図１４Ａ】フィンガーモジュール。  （Ａ）ｔＰＡ、ＸＩＩ因子、ＨＧＦａおよびフィブロネクチンにおけるフィンガードメインの位置の図解表現。（Ｂ）それぞれのタンパク質のフィンガードメインのアミノ酸配列の整列。（Ｃ）ｔＰＡフィンガードメイン、およびＦＮの第四および第五のフィンガードメインペプチド主鎖を表したもの。保存されるジスルフィド結合を、ボールと棒で示す。
【図１４Ｂ】フィンガーモジュール。  （Ｂ）それぞれのタンパク質のフィンガードメインのアミノ酸配列の整列。
【図１４Ｃ】フィンガーモジュール。  （Ｃ）ｔＰＡフィンガードメイン、およびＦＮの第四および第五のフィンガードメインペプチド主鎖を表したもの。保存されるジスルフィド結合を、ボールと棒で示す。
【図１５ａ】アミロイドペプチドに対して誘発した抗体はグリコタンパク質と交差反応し、逆もまた起こる。  （Ａ−Ｃ）固定したｇ６ｐ−グリコアルブミン−ＡＧＥ：２３およびＨｂ−ＡＧＥでのＥＬＩＳＡ。それらの非グリケーションコントロール（Ａ）、Ａβ（ｌ−４０）（Ｂ）、およびＩＡＰＰおよびｍΔＩＡＰＰ（Ｃ）。ＡβＥＬＩＳＡについては、ポリクローナル抗−ヒトビトロネクチン抗体α−ｈＶｎ  Ｋ９２３４を、ネガティブコントロールとして用いた。（Ｄ）α−ＡＧＥ１をＩＡＰＰフィブリルと予備インキュベーションした後のＥＬＩＳＡプレート上でのα−ＡＧＥ１の固定Ａβ（１−４０）への結合。（Ｅ）抗−ＡＧＥ１抗体と、Ａβ（１６−２２）（レーン１−２）、Ａβ（１−４０）（レーン４−５）およびＩＡＰＰ（レーン６−７）のアミロイドフィブリルを用いるプルダウン分析。フィブリルをペレット化して、洗浄した後、試料を非還元性試料緩衝液中で煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ｓ＝アミロイド抽出後の上清、ｐ＝抽出後のアミロイドペレット、ｍ＝分子マーカー。（Ｆ−Ｇ）ＥＬＩＳＡ装置では、固定Ａβ（ｌ−４０）（Ｆ）およびＩＡＰＰ（Ｇ）を、ｔＰＡおよびそれぞれ２５０または１８ｎＭのα−ＡＧＥ１（Ｈ）と同時インキュベーションする。ＥＬＩＳＡ装置では、α−Ａ（１−４２）Ｈ−４３の固定ポジティブコントロールＡβ（１−４０）、およびＩＡＰＰおよびアルブミン−ＡＧＥ：２３への結合を試験する。アルブミン−コントロール：２３およびｍΔＩＡＰＰを、ネガティブコントロールとして用いる。（Ｉ）一連の濃度のｔＰＡの存在下でＥＬＩＳＡプレート上に固定したＩＡＰＰへの１００ｎＭα−Ａβ（１−４２）Ｈ−４３の結合。
【図１５ｂ】アミロイドペプチドに対して誘発した抗体はグリコタンパク質と交差反応し、逆もまた起こる。  （Ｊ−Ｋ）  アルブミン−ＡＧＥ：２３およびＡβ（１−４０）（比９：１）（「ｐｏａｂ抗−アミロイド」）に対して誘発されたマウス血清中のポリクローナル抗体およびコントロールタンパク質（「コントロール血清」）に対して誘発されたポリクローナル抗体の固定ＩＡＰＰ（Ｊ）およびアルブミン−ＡＧＥ：２３（Ｋ）への結合を示すＥＬＩＳＡ。血清は、０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ中で希釈した。（Ｌ）マウスｐｏａｂ抗−アミロイド血清のアミロイドＡβ（１−４０）、ｈΔＩＡＰＰおよびフィブリン断片α１４８−１６０ＦＰ１３への結合を示すＥＬＩＳＡ。関連のないタンパク質に対して誘導された抗体を含むコントロール血清、緩衝液、および固定した非アミロイドｍΔＩＡＰＰおよびフィブリン断片α１４８−１５７ＦＰ１０を、ネガティブコントロールとして用いた。（Ｍ）  ＡＤに冒されたヒト脳の切片における球状のアミロイドプラーク（矢印）へのウサギ抗−ＡＧＥ２の結合の免疫組織化学的分析。倍率４００ｘ。（Ｎ）同じ切片のコンゴレッド蛍光
【図１６】モノクローナル抗−交差−β構造抗体３Ｈ７はグリコヘモグロビン、Ａβ、ＩＡＰＰおよびＦＰ１３を検出する。  マウスモノクローナル抗−交差−β構造抗体３Ｈ７の（Ａ）グリコヘモグロビン対コントロールの未グリコヘモグロビン、または（Ｂ）Ａβ、ｈＩＡＰＰ、ΔｍＩＡＰＰおよびフィブリン断片α１４８−１６０ＦＰ１３に対する結合を示すＥＬＩＳＡ。
【図１７】溶液中のアミロイドアルブミン−ＡＧＥまたはアミロイドヘモグロビンの検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ  Exiqonタンパク質イモビライザー上の固定した組換えｔＰＡに、所定濃度のアルブミン−ＡＧＥ：２３溶液またはアルブミン−コントロール：２３溶液を積層した。次に、結合したアミロイド構造を、抗−Ａβ（１−４２）Ｈ−４３（Ａ）で検出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１４Ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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