(57)【要約】本発明は、興奮性傷害時間に近接してか、またはそれに続いて、神経細胞中にエリスロポイエチン（ＥＰＯ）の経路を誘導すること；および興奮性傷害時間に近接してか、またはそれに続いて、神経細胞中にインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）の経路を誘導することにより、神経細胞における急性神経保護相乗効果を生じることによって、急性神経保護を提供する方法を提供する。本発明はさらに、興奮性傷害時間に近接してかまたはそれに続いて、神経細胞と、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログとを接触させること；ならびに興奮性傷害時間に近接してかまたはそれに続いて、神経細胞と、ＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログとを接触させることにより、神経細胞における急性神経保護相乗効果を生じることによって、急性神経保護を提供する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性の神経保護を提供する方法であって、以下：
（ａ）興奮性傷害の直前もしくは直後または興奮性傷害の後に、神経細胞を、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはそれらの活性フラグメントもしくはアナログと接触させる工程；および
（ｂ）興奮性傷害の直前もしくは直後または興奮性傷害の後に、該神経細胞を、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）またはそれらの活性フラグメントもしくはアナログと接触させる工程を包含し、それらによって、
該神経細胞において相乗的な急性の神経保護効果を生じる、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記工程（ａ）が、前記神経細胞を、ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯが、ヒトＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記神経細胞を、ヒトＥＰＯと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記工程（ａ）は、前記神経細胞を、ＥＰＯアナログと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログは、以下：
ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；
ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）；
ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；
ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；
ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；および
ＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）
からなる群より選択される、方法。
【請求項７】
前記ＥＰＯアナログが、ペプチド模倣物である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログが、低分子である、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＥＰＯと比べ、ＥＰＯレセプターに対して少なくとも１０倍高い親和性を有している、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらのフラグメントまたはアナログは、オリゴマーである、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記オリゴマーＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログは、二量体である、方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、ここで、前記二量体であるＥＰＯまたはそれらのフラグメントもしくはアナログが、二量体のＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（ＥＭＰ１）（配列番号７）を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＥＰＯよりも長い半減期を有する、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＥＰＯと比較して過剰にグリコシル化されている、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記（ａ）は、前記神経細胞を、ダーベポイエチンと接触する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、前記神経細胞を、可溶性ＥＰＯレセプターと接触させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）は、前記神経細胞を、ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントが、ＩＧＦ−Ｉまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦ−Ｉが、ヒトＩＧＦ−Ｉまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記神経細胞とヒトＩＧＦ−Ｉとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）が、前記神経細胞を、ＩＧＦアナログと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記ＩＧＦアナログが、ペプチド模倣物である、方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法であって、前記ＩＧＦアナログが、低分子である、方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法であって、前記ＩＧＦアナログが、ＩＧＦ−Ｉアナログである、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、前記ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して、ネイティブヒトＩＧＦ−Ｉよりも少なくとも１０倍高い親和性を有している、方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログは、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＢＰ）について改変されている親和性を有する親和性が変更されている、方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＩＧＦよりも長い半減期を有している、方法。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、インビトロである、方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）は、インビボである、方法。
【請求項３０】
被験体の急性の神経学的状態を予防するかまたはその神経学的状態の重篤度を軽減する方法であって、以下：
（ａ）急性外傷の直前もしくは直後または急性外傷の後に、該被験体に、ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログを投与する工程；および
（ｂ）急性外傷の直前もしくは直後または急性外傷の後に、該被験体に、ＩＧＦまたはそれらのフラグメントもしくはアナログを投与する工程
を包含し、それらによって、相乗的な急性の神経保護効果を生じ、急性の神経学的状態を予防するかまたはその神経学的状態の重篤度を軽減する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記急性の神経学的状態が、脳卒中である、方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、前記急性の神経学的状態が、頭部または脊髄の外傷である、方法。
【請求項３３】
請求項３０に記載の方法であって、前記急性の神経学的状態が、癲癇である、方法。
【請求項３４】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）が、ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯが、ヒトＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、ヒトＥＰＯを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）が、ＥＰＯアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログが、
ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；
ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）；
ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；
ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；
ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；および
ＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）．
からなる群より選択される、方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログが、ペプチド模倣物である、方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログが、低分子である、方法。
【請求項４１】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ＥＰＯレセプターに対して、ネイティブヒトＥＰＯと比較して少なくとも１０倍高い親和性を有する、方法。
【請求項４２】
請求項３０に記載の方法であって、ここで前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、オリゴマーである、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、ここで、前記オリゴマーＥＰＯまたはそれらのフラグメントもしくはアナログが、二量体である、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、ここで、前記二量体ＥＰＯまたはそれらのフラグメントもしくはアナログが、二量体のＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含む、方法。
【請求項４５】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブＥＰＯよりも長い半減期を有する、方法。
【請求項４６】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＥＰＯと比較して、過剰にグリコシル化されている、方法。
【請求項４７】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）が、ダーベポイエチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項４８】
請求項３０に記載の方法であって、可溶性ＥＰＯレセプターを投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４９】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）が、ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦが、ＩＧＦ−Ｉまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦ−ＩがヒトＩＧＦ−Ｉまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項５２】
請求項５０に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦ−Ｉが、ヒトＩＧＦ−Ｉである、方法。
【請求項５３】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）が、ＩＧＦアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、前記ＩＧＦアナログが、ペプチド模倣物である、方法。
【請求項５５】
請求項５３に記載の方法であって、前記ＩＧＦアナログが、低分子である、方法。
【請求項５６】
請求項５３に記載の方法であって、前記ＩＧＦアナログが、ＩＧＦ−Ｉアナログである、方法。
【請求項５７】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログは、ネイティブヒトＩＧＦ−Ｉよりも前記ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して少なくとも１０倍の親和性を有する、方法。
【請求項５８】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログは、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＢＰ）について改変された親和性を有する、方法。
【請求項５９】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＩＧＦよりも長い半減期を有している、方法。  
【請求項６０】
被験体の神経学的状態を予防するかまたはその神経学的状態の重篤度を軽減する方法であって、以下：
（ａ）高々、２０００Ｕ／ｋｇの用量でＥＰＯまたはそれらのフラグメントもしくはアナログを該被験体に投与する工程；および
（ｂ）ＩＧＦまたはそれらのフラグメントもしくはアナログを被験体に投与する工程を包含し、それらによって、神経保護を提供して、神経学的状態を予防するかまたは神経学的状態の重篤度を軽減する、方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、前記神経学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、癲癇、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、運動障害、ＨＩＶ関連痴呆、ＨＩＶ関連神経障害、神経因性疼痛、偏頭痛、緑内障、薬物中毒、退薬症状、薬物依存症、鬱病および不安症からなる群より選択される、方法。
【請求項６２】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）が、ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯが、ヒトＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の方法であって、ヒトＥＰＯを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６５】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）がＥＰＯアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法であって、前記ＥＰＯアナログが、以下：
ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；
ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）  ；
ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；
ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；
ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；および
ＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）
からなる群より選択される、方法。
【請求項６７】
請求項６５に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログが、ペプチド模倣物である、方法。
【請求項６８】
請求項６５に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログが、低分子である、方法。
【請求項６９】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、前記ＥＰＯレセプターに対して、ヒトＥＰＯよりも少なくとも１０倍高い親和性を有する、方法。
【請求項７０】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、オリゴマーである、方法。
【請求項７１】
請求項７０に記載の方法であって、ここで、前記オリゴマーＥＰＯまたはそれらのフラグメントもしくはアナログが、二量体である、方法。
【請求項７２】
請求項７１に記載の方法であって、ここで、前記二量体ＥＰＯまたはそれらのフラグメントもしくはアナログが、二量体のＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含む、方法。
【請求項７３】
請求項６０に記載の方法であって、ここで前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＥＰＯよりも長い半減期を有する、方法。
【請求項７４】
請求項６０に記載の方法であって、ここで前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＥＰＯと比較して、過剰にグリコシル化されている、方法。
【請求項７５】
請求項７４に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）が、ダーベポイエチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項７６】
請求項６０に記載の方法であって、可溶性ＥＰＯレセプターを投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７７】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）が、ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項７８】
請求項７７に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦが、ＩＧＦ−Ｉまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項７９】
請求項７８に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦ−ＩがヒトＩＧＦ−Ｉまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項８０】
請求項７９に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦ−Ｉが、ヒトＩＧＦ−Ｉである、方法。
【請求項８１】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）が、ＩＧＦアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項８２】
請求項８１に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦアナログが、ペプチド模倣物である、方法。
【請求項８３】
請求項８１に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦアナログが、低分子である、方法。
【請求項８４】
請求項８１に記載の方法であって、前記ＩＧＦアナログが、ＩＧＦ−Ｉアナログである、方法。
【請求項８５】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、前記ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して、ネイティブヒトＩＧＦ−Ｉよりも、少なくとも１０倍高い親和性を有する、方法。
【請求項８６】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＢＰ）に対する変更された親和性を有している、方法。
【請求項８７】
請求項６０に記載の方法であって、ここで、前記ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＩＧＦよりも長い半減期を有する、方法。
【請求項８８】
被験体の脳神経状態を予防するかまたは脳神経状態の重篤度の軽減する方法であって、以下：
（ａ）ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログを被験体に経鼻的に、高々２０００Ｕ／ｋｇの用量で投与する工程；および
（ｂ）ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログを被験体に経鼻的に、投与する工程
を包含し、それらによって急性の神経保護を提供し、そして、脳神経状態を予防するかまたは脳神経状態の重篤度の軽減する、方法。
【請求項８９】
神経前駆細胞を分化して富化した神経細胞集団を産生する方法であって、以下：
（ａ）ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログと該神経前駆細胞を接触させる工程；および
（ｂ）ＩＧＦまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログと該神経前駆細胞とを接触させる工程
を包含し、それらによって、
該神経前駆細胞を分化させて、少なくとも７０％のニューロンを含む富化した細胞集団を産生する、方法。
【請求項９０】
請求項８９に記載の方法であって、少なくとも８０％のニューロンを含む富化した細胞集団を産生する、方法。
【請求項９１】
請求項８９に記載の方法であって、少なくとも９０％のニューロンを含む富化した細胞集団を産生する、方法。
【請求項９２】
請求項８９に記載の方法であって、前記細胞を被験体に移植する工程をさらに法包含する、方法。
【請求項９３】
請求項９２に記載の方法であって、ここで、前記細胞が、脳、眼および脊髄からなる群より選択される、組織または器官に移植される、方法。
【請求項９４】
被験体における神経学的状態を予防するかまたはその神経学的状態の重篤度を軽減する方法であって、ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログを該被験体の鼻腔内に投与する工程を包含し、それらによって、該神経学的状態を予防するかまたは該神経学的状態の重篤度を軽減する、方法。
【請求項９５】
請求項９４に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、高々、２０００Ｕ／ｋｇの用量で投与される、方法。
【請求項９６】
請求項９４に記載の方法であって、ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントを投与する工程を包含する、方法。
【請求項９７】
請求項９６に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯが、ヒトＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントである、方法。
【請求項９８】
請求項９７に記載の方法であって、ヒトＥＰＯを投与する工程を包含する、方法。
【請求項９９】
請求項９４に記載の方法であって、ＥＰＯアナログを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１００】
請求項９９に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログが、以下：
ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；
ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）；
ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；
ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；
ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；および
ＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）
からなる群より選択される、方法。
【請求項１０１】
請求項９９に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログが、ペプチド模倣物である、方法。
【請求項１０２】
請求項９９に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯアナログが、低分子である、方法。
【請求項１０３】
請求項９４に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブヒトＥＰＯと比較して、ＥＰＯレセプターに対して少なくとも１０倍高い親和性を有する、方法。
【請求項１０４】
請求項９４に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、オリゴマーである、方法。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の方法であって、ここで、前記オリゴマーＥＰＯまたはそれらのフラグメントもしくはアナログが二量体である、方法。
【請求項１０６】
請求項１０５に記載の方法であって、ここで、前記二量体ＥＰＯまたはそれらのフラグメントもしくはアナログが、二量体のＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含む、方法。
【請求項１０７】
請求項９４に記載の方法であって、ここで、前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ネイティブＥＰＯよりも長い半減期を有する、方法。
【請求項１０８】
請求項９４に記載の方法であって、ここで前記ＥＰＯまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログが、ヒトＥＰＯと比較して、過剰にグリコシル化されている、方法。
【請求項１０９】
請求項９４に記載の方法であって、ダーベポイエチンを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１０】
請求項９４に記載の方法であって、可溶性ＥＰＯレセプターを投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１１１】
請求項９４に記載の方法であって、ここで、前記神経学的状態は、急性の神経学的状態である、方法。
【請求項１１２】
請求項９４に記載の方法であって、ここで、前記神経学的状態は、慢性の神経学的状態である、方法。
【請求項１１３】
請求項９４に記載の方法であって、ここで、前記神経学的状態が、脳卒中、頭部または脊髄の外傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、癲癇、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、運動障害、痴呆、ＨＩＶ関連痴呆、前頭側頭型痴呆、ＨＩＶ関連神経障害、慢性疼痛、神経因性疼痛、偏頭痛、緑内障、薬物中毒、退薬症状、薬物依存症、鬱病および不安症からなる群より選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより賞与されたＰ０１  ＨＤ２９５８７、Ｒ０１  ＮＳ４３２４２およびＮＳ４３２４２の下で政府の支持によりなされた。政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、急性および慢性の神経変性状態の予防および処置、ならびにエリスロポイエチンおよびインスリン様増殖因子およびこれらの因子のアナログに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景情報）
種々の重症な神経変性疾患について、有効な治療または治癒は存在しない。例えば、パーキンソン病は、進行性であり、黒質の色素性ドーパミン作動性神経細胞の喪失により特徴付けられる最終的な胎児神経変性障害である。パーキンソン病の症状は、しばしば、Ｌ−ＤＯＰＡ（すなわちドーパミンの直前の前駆体である）の投与によって、病初には管理され得る。しかし、長期にわたるとＬ−ＤＯＰＡ処置の効果の減少が典型的に起こる。プログラム細胞死（アポトーシス）は、この神経変性障害に関連している。
【０００４】
アルツハイマー病において、最も共通の神経変性疾患および最も頻繁な痴呆、記憶の進行性喪失ならびに側頭および頭頂連合皮質の変性は、言語障害および協調の喪失をまねき、そしていくつかの場合、情緒障害をまねく。アルツハイマー病は、何年もかけて次第に進行し、患者は次第に無動性になり、衰弱し、肺炎に罹患しやすくなる。
【０００５】
神経保護治療は、種々の急性および慢性の神経学的状態（発作、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、癲癇および疼痛を含む）にとって求められている。現在の治療は、比較的効果がないか、副作用を伴う。特に、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、高用量で投与される場合、神経保護的であり得る；しかし、このような用量はまた、赤血球の新生を促進し、結果として、血液を「泥状」にし、発作の危険性を高めるような副作用を引き起こす。従って、神経保護を達成するための、非常に高用量の因子に依存しないエリスロポイエチンを用いる新規の方法が必要とされる。本発明は、この必要性を満たし、関連する十分な利点を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、興奮性傷害時間に近接してか、またはそれに続いて、神経細胞中にエリスロポイエチン（ＥＰＯ）の経路を誘導すること；および興奮性傷害時間に近接してか、またはそれに続いて、神経細胞中にインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）の経路を誘導することにより、神経細胞における急性神経保護相乗効果を生じることによって、急性神経保護を提供する方法を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、興奮性傷害時間に近接してかまたはそれに続いて、神経細胞と、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログとを接触させること；ならびに興奮性傷害時間に近接してかまたはそれに続いて、神経細胞と、ＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログとを接触させることにより、神経細胞における急性神経保護相乗効果を生じることによって、急性神経保護を提供する方法を提供する。
【０００８】
エリスロポイエチン、ならびにその活性フラグメントおよびアナログの多くの形態は、本発明の方法において有用であり得る。１つの実施形態において、神経細胞は、ＥＰＯまたはその活性フラグメント（例えば、ヒトＥＰＯまたはその活性フラグメント）と接触される。別の実施形態において、神経細胞は、ＥＰＯアナログ（これらは、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸のＥＰＯアナログであり得るが、これらに限定されない）と接触される。さらなる実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）；ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；またはＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）を含むＥＰＯアナログを用いて実施される。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、ＥＰＯレセプターに対して、ネイティブなヒトＥＰＯよりも少なくとも１０倍高い親和性を有するＥＰＯ、またはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。別の実施形態において、本発明は、オリゴマー（例えば、二量体）であるＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。このようなＥＰＯの二量体形態は、例えば、各単量体がアミノ酸配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含む二量体であり得る。
【００１０】
さらなる実施形態において、本発明は、ネイティブなヒトＥＰＯの半減期よりも長い半減期を有する、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ネイティブなヒトＥＰＯと比べて高グリコシル化された、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。なおさらなる実施形態において、本発明は、神経細胞とダルベポイエチン（Ｄａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎ）とを接触させることによって実施される。本発明の任意の実施形態において、可溶性ＥＰＯレセプターは、例えば、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログの半減期を延長させるために、必要に応じて含まれ得る。
【００１１】
ＩＧＦならびにその活性フラグメントおよびアナログの種々の形態もまた、本発明において有用である。１つの実施形態において、本発明は、神経細胞と、ＩＧＦまたはその活性フラグメント（例えば、ＩＧＦ−Ｉまたはその活性フラグメント）とを接触させることによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、神経細胞と、ヒトＩＧＦ−Ｉまたはその活性フラグメントとを接触させることによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ＩＧＦアナログ（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸のＩＧＦアナログ（これらは、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸のＩＧＦ−Ｉアナログを含み得るが、これらに限定されない））を用いて実施される。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して、ネイティブなヒトＩＧＦ−Ｉよりも少なくとも１０倍高い親和性を有するＩＧＦ、またはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＢＰ）に対する変更された親和性を有するＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。なおさらなる実施形態において、本発明は、ネイティブなヒトＩＧＦ−Ｉの半減期よりも長い半減期を有する、ＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。本発明の方法において、２つの接触工程が、インビトロまたはインビボで実施され得、そしてさらに、同時または任意の順序で実施され得る。
【００１３】
急性損傷時間に近接してかまたはそれに続いて、被験体にＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログとを投与する工程；ならびに急性損傷時間に近接してかまたはそれに続いて、この被験体にＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログと投与する工程によって、被験体における急性神経学的状態を回避するか、またはその重症度を減少させる方法もまた、本明細書中で提供され、それによって、急性神経保護相乗効果を生じ、急性神経学的状態を回避するか、またはその重症度を減少させる。このような急性神経学的状態は、発作、首または脊髄の外傷、あるいは癲癇発作であり得るが、これらに限定されない。
【００１４】
急性神経学的状態を回避するか、またはその重症度を減少させるために、本発明の方法が、例えば、ＥＰＯ、またはその活性なフラグメント（例えば、ヒトＥＰＯまたはその活性なフラグメント）を用いて実施され得る。本発明の方法はまた、ＥＰＯアナログを用いて実施され得、これらは、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸のアナログであり得るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明は、以下のアミノ酸配列の１つを含むＥＰＯアナログを用いて実施される：ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）；ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；またはＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明は、ＥＰＯレセプターに対して、ネイティブなヒトＥＰＯよりも少なくとも１０倍高い親和性を有するＥＰＯ、またはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。別の実施形態において、本発明は、オリゴマー（例えば、二量体）であるＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。本発明の方法は、例えば、各単量体がアミノ酸配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含むＥＰＯの二量体形態を用いて実施され得る。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、ネイティブなヒトＥＰＯの半減期よりも長い半減期を有する、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。このようなＥＰＯの形態は、ネイティブなヒトＥＰＯと比べて高グリコシル化され得、さらに、例えば、ダルベポイエチンであり得る。本発明の方法はまた、被験体に可溶性ＥＰＯレセプターを投与する工程を必要に応じて包含する。
【００１７】
種々の形態のＩＧＦならびにその活性なフラグメントおよびアナログは、本発明において有用である。１つの実施形態において、本発明は、ＩＧＦまたはその活性なフラグメント（例えば、ＩＧＦ−Ｉまたはその活性なフラグメント）を投与することによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ヒトＩＧＦ−Ｉまたはその活性なフラグメントを投与する工程によって実施される。本発明はまた、ＩＧＦアナログ（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸のアナログ（多様なＩＧＦ−Ｉアナログを含むが、これらに限定されない）を投与する工程によって実施され得る。
【００１８】
１つの実施形態において、急性神経学的状態を回避するか、またはその重症度を減少させるための本発明の方法は、ＩＧＦレセプターに対してネイティブなヒトＩＧＦ−Ｉよりも少なくとも１０倍高い親和性を有する、ＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。別の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ結合タンパク質に対する変更された親和性を有するＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ネイティブなヒトＩＧＦの半減期よりも長い半減期を有するＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを用いて実施される。本発明の方法において、ＥＰＯおよびＩＧＦ、またはその活性なフラグメントもしくはアナログは、同じかまたは異なる薬学的組成物において、同時または任意の順序で投与され得る。
【００１９】
本発明によって提供されるのはまた、被験体にＥＰＯあるいはその活性フラグメントまたはアナログを、ほぼ２０００Ｕ／ｋｇの用量で投与することによって、被験体の神経学的状態を回避するかまたはその重症度を減少させる方法であり、；ならびに、被験体に、ＩＧＦあるいはその活性フラグメントまたはアナログを投与し、それにより神経保護を与え、神経系の状態を回避するかまたはその重症度を減少させる方法である。このＥＰＯおよびＩＧＦ、あるいはその活性フラグメントまたはアナログは、同一または異なる薬学的組成物において、同時にまたは任意の順序で、被験体に投与され得る。種々の急性または慢性の神経学的状態（アルツハイマー病；パーキンソン病；ハンティングトン病；てんかん；筋萎縮性側索硬化症；多発性硬化症；運動障害；ＨＩＶに関連した痴呆；ＨＩＶに関連した神経障害；黄斑変性および光誘発性網膜変性（例えば、光受容体変性）を含む網膜変性；神経障害性疼痛；偏頭痛；緑内障；薬物嗜癖；薬物離脱状態；薬物依存症およびうつ病または不安が挙げられるが、これらに制限しない）は、本発明の方法に従って処理され得る。
【００２０】
種々の形態のＥＰＯならびに活性フラグメントおよびそのアナログは、本発明の方法に従って、神経学的状態を回避するかまたはその重症度を減少させるのに有用である。例として、本発明は、ＥＰＯまたはその活性フラグメント（例えば、ヒトＥＰＯまたはその活性フラグメント）を用いて実施され得る。本発明の方法はまた、ＥＰＯアナログ（ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸のアナログであり得るが、これらに制限しない）を用いて実施され得る。特定の実施形態において、本発明は、以下のアミノ酸配列の１つを含有するＥＰＯアナログを用いて実施される：（ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）；ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；またはＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）。
【００２１】
１つの実施形態において、神経学的状態を回避するかまたはその重症度を減少させるための本発明の方法は、ネイティブヒトＥＰＯよりも、ＥＰＯレセプターに対して、少なくとも１０倍高い親和性を有する、ＥＰＯあるいはその活性フラグメントまたはアナログを用いて実施される。別の実施形態において、本発明は、オリゴマー（例えば、２量体）であるＥＰＯあるいはその活性フラグメントまたはアナログを用いて実施される。例えば、本発明は、各モノマーが、アミノ酸配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含有する２量体の形態のＥＰＯを用いて実施され得る。さらなる実施形態において、本発明は、ネイティブヒトＥＰＯの半減期よりも長い半減期を有するＥＰＯあるいはその活性フラグメントまたはアナログを用いて実施される。そのようなＥＰＯの形態は、本発明は、ネイティブヒトＥＰＯと比較して高グリコシ化され得、例えば、ダルベポイエチン（Ｄａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎ）であり得る。さらに、本発明の方法は、必要に応じて、被験体に溶解性のＥＰＯレセプターを投与する工程を包含する。
【００２２】
種々の形態のＩＧＦならびにその活性フラグメントおよびアナログはまた、本発明において有用である。１つの実施形態において、本発明は、ＩＧＦあるいはその活性フラグメントまたはアナログ（例えば、ＩＧＦ−Ｉまたはその活性フラグメント）を投与することによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ヒトＩＧＦ−Ｉまたはその活性フラグメントを投与することによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ＩＧＦアナログ（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸アナログ（種々のＩＧＦ−Ｉアナログを含むが、これらに制限しない））を用いて実施される。
【００２３】
１つの実施形態において、神経学的状態を回避するかまたはその重症度を減少させるための本発明の方法は、ネイティブヒトＩＧＦ−Ｉよりも、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して、少なくとも１０倍高い親和性を有する、ＩＧＦあるいはその活性フラグメントまたはアナログを用いて実施される。別の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ結合タンパク質に対して変更された親和性を有する、ＩＧＦあるいはその活性フラグメントまたはアナログを用いて実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ネイティブヒトＩＧＦの半減期よりも長い半減期を有する、ＩＧＦあるいはその活性フラグメントまたはアナログを用いて実施される。
【００２４】
本発明はまた、被験者にＥＰＯあるいその活性フラグメントまたはアナログを、ほぼ２０００Ｕ／ｋｇの用量で経鼻的に投与することによって、被験体の大脳神経学的状態を回避するかまたはその重症度を減少させる方法を提供し；そして、ＩＧＦあるいはその活性フラグメントまたはアナログを、被験者に経鼻的に投与することによって、急性の神経保護を与え、その神経学的状態を回避するかまたはその重症度を減少させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、エリスロポエチンおよびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）が共に、いずれかの因子が単独で媒介するよりも急速な神経保護を媒介し、このことが、ＥＰＯおよびＩＧＦ組み合わせ処理が、急性の神経状態（例えば、脳卒中、外傷および発作）において神経保護を提供することに有用であり得ることを示す、という驚くべき発見に関する。本発明はまた、共に、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉが、アポトーシスを減少させるように協同して、減少した濃度で増強した神経保護を提供し、このことが、減少した濃度のＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉが、急性および慢性の神経障害（例えば、限定なしに、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、緑内障、ＨＩＶ関連痴呆、多発性硬化症、パーキンソン病、および神経障害性の痛み）を処置することにおいて有用であり得ることを示す、という驚くべき発見に関する。
【００２６】
本明細書中の実施例Ｉに開示されるように、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの同時投与の神経保護効果を、興奮性傷害であるＮＭＤＡに曝露されたラット初代大脳皮質培養物において、ＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉでの別個の処理と比較した。ニューロンのアポトーシスを、アポトーシスの指標であり、かつニューロン特異的標識、すなわち微小管結合タンパク質−２（ＭＡＰ２）であるＴＵＮＥＬ反応性について、ＮＭＤＡ傷害の１６時間後に二重標識法によって定量した。図３に示されるように、ＮＭＤＡへの２０分間という短い曝露は、ＭＡＰ２標識化ニューロンの７６±７％において、アポトーシスの出現およびＴＵＮＥＬ反応性を生じた。ＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）またはＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）のいずれか単独での３時間のプレインキュベーションは、ニューロンのアポトーシスを有意に減弱した（ｐ＜０．０５）；しかし、ＮＭＤＡ傷害時に別個にＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉでニューロンを処理すると、細胞死を有意に減少させなかった（図３を参照のこと）。対照的に、ＮＭＤＡ曝露時におけるＩＧＦ−Ｉと一緒のＥＰＯの適用は、共にニューロンのアポトーシスを約７６％から約３５％まで減少させたという、２つの因子の間の相乗効果を明らかにした。図９にさらに示されるように、組み合わせＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ処理は、ＮＭＤＡ曝露と同時に適用された場合、またはＮＭＤＡ曝露の１時間後、２時間後または３時間後に適用された場合に、アポトーシスを劇的に減少させた。これらの結果は、ＩＧＦ−ＩおよびＥＰＯが協同し、いずれかの因子が他方の非存在下で媒介するよりも急速な神経保護を媒介することを実証する。
【００２７】
本明細書中の実施例ＩＩＡにさらに開示されるように、ラット大脳皮質ニューロンを、特異的なＰＩ３キナーゼインヒビターであるＬＹ２９４００２（１０μＭ）の存在下または非存在下で、ＥＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、またはＩＧＦ−Ｉと組み合わせたＥＰＯ（ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ）と共に、３時間プレインキュベーションした。図４に示される結果は、ＬＹ２９４００２が、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉのいずれか単独または組み合わせの神経保護効果を消滅させた（ｐ＜０．０５）が、それ自体は大脳皮質培養物におけるニューロンのアポトーシスを引き起こさなかったか、またはＮＭＤＡによって誘導されるアポトーシスの量を増加させなかったことを実証する。このことは、ＰＩ３キナーゼ活性が、ＥＰＯ媒介性神経保護およびＩＧＦ−Ｉ媒介性神経保護のために必要であることを示す。さらに、ＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉのいずれかでの別個の処理は、時間依存的な様式で、ＰＩ３キナーゼのｐ８５調節サブユニットのリン酸化を誘導した；ＩＧＦ−Ｉインキュベーションは、１０分後にｐ８５サブユニットの最大のリン酸化を生じ、そしてＥＰＯ誘導性リン酸化を、２０〜３０分後に観察した（実施例ＩＩＢ；図５Ａ）。ｐ８５調節サブユニットのリン酸化が、触媒性サブユニットの放出を導くことによってＰＩ３キナーゼを活性化することが公知であることを考慮すると、これらの結果は、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの両方がＰＩ３キナーゼを活性化することを示す。
【００２８】
本明細書中の実施例ＩＩＩに開示されるように、神経細胞のＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉ処理は、３’リン脂質のＰＩ３キナーゼ媒介性産物の下流で活性化されるキナーゼであるＡｋｔキナーゼを、協同的に活性化し得る。Ａｋｔキナーゼは、２つの重要な部位（セリン−４７３およびトレオニン−３０８）でリン酸化される。図６Ａに示されるように、ＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉ単独での３時間のインキュベーションは、ホスホセリン−４７３Ａｋｔの増加によって証明されるように中程度のＡｋｔ活性化を生じたが、最大限に有効な濃度のＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉを一緒に用いる同時インキュベーションは、ホスホセリン−４７３Ａｋｔのより大きな増加を生じた。さらに、ドミナントネガティブなＡｋｔ（ｄｎ−Ａｋｔ）を発現しかつＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉと共にインキュベートされた大脳皮質培養物は、非感染培養物または野生型Ａｋｔ（ｗｔ−Ａｋｔ；ｐ＜０．０１）で感染された培養物と比較して、有意に高いレベルのＮＭＤＡ誘導性のニューロンのアポトーシスを示した。要約して述べると、これらの結果は、Ａｋｔセリン−４７３リン酸化が、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの組み合わせによって相乗的に誘導されること、およびＡｋｔリン酸化および活性化が、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ組み合わせ処理によって媒介される神経保護において役割を果たすことを示す。
【００２９】
実施例ＶＡに開示される結果は、ＩＧＦ−Ｉと組み合わせたＥＰＯでの処理が、活性形態のカスパーゼ−３の存在下で、大脳皮質培養物におけるＮＭＤＡ誘導性神経毒性を妨げることを示す。特に、この結果は、ＮＭＤＡ曝露およびＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ処理後のニューロンの延長された生存が、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ神経保護が少なくとも部分的に、ＮＭＤＡ傷害の１６時間以内のニューロンのアポトーシスと代表的に関連する初期のカスパーゼ−３活性化の下流で生じることを示した、ということを示す。さらに、図８Ａに示されるように、組み合わせＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ処理は、長期ニューロン生存を生じた。
【００３０】
本明細書中の実施例ＶＣに開示されるように、培養物を、ＥＰＯ、ＩＧＦ−ＩおよびＮＭＤＡと共にインキュベートし、そして活性形態のカスパーゼ−３の免疫沈降後、免疫沈降物を、カスパーゼ−３活性を阻害するように機能する抗アポトーシスタンパク質であるＸＩＡＰの存在について、調べた。図８Ｂは、活性なカスパーゼ−３が培養されるニューロン中のＸＩＡＰと会合したこと、ならびにＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉを用いる処理が、活性なカスパーゼ−３と会合されるＸＩＡＰの相対的な量を増加したことを示し、これは、ＸＩＡＰに会合する活性形態のカスパーゼ−３のネガティブな調節と一致する。さらに、カスパーゼ−３のタンパク質分解活性は、組み合わせＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ処理によって調節された。図８Ｄに示されるように、ＮＭＤＡ曝露は、増大したＤＥＶＤ基質の切断によって示されるように、増加したカスパーゼ−３のタンパク質分解活性を生じたが、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉを用いる同時適用または３時間のプレインキュベーションは、カスパーゼ−３様活性におけるＮＭＤＡ誘導性増加を減少させた。このカスパーゼ−３活性の減少は、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉと共にプレインキュベートされた培養物において、ドミナントネガティブＡｋｔでの感染によって部分的に阻害された。このことは、Ａｋｔがニューロンのカスパーゼ−３のタンパク質分解活性を調節することにおいて、役割を果たし得ることを実証した（図８Ｄを参照のこと）。
【００３１】
さらに、図８Ｅに示されるように、組み合わせＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉ処理によってもたらされる延長した生存は、混合大脳皮質培養物中に存在する非神経細胞を必要としなかった。上記の結果をまとめると、この実験は、組み合わせＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉ処理が、ニューロンに固有のシグナル伝達経路によって、カスパーゼ−３活性化のニューロン生存下流を促進することを実証する。
【００３２】
これらの発見に基づいて、本発明は、興奮性傷害時の寸前またはその後に神経細胞におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）経路を誘導する工程；興奮性傷害時の寸前またはその後に神経細胞におけるインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）経路を誘導する工程によって、急性の神経保護を提供する方法を提供し、それによって、神経細胞における相乗的な急性の神経保護効果を生じる。
【００３３】
本発明は、興奮性傷害時の寸前またはその後に神経細胞をＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログと接触させる工程；および興奮性傷害時の寸前またはすぐ後に神経細胞をＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログと接触させる工程によって、急性の細胞保護を提供する方法を提供し、それによって、神経細胞における相乗的な急性の神経保護効果を生じる。
【００３４】
エリスロポイエチンの多くの形態、ならびにその活性フラグメントおよびアナログが、本発明の方法において有用であり得る。１つの実施形態において、神経細胞は、ＥＰＯまたはその活性フラグメント（例えば、ヒトＥＰＯまたはその活性フラグメント）と接触される。別の実施形態において、神経細胞は、ＥＰＯアナログ（限定なしに、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸ＥＰＯアナログであり得る）と接触される。さらなる実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）；ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；またはＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）を含むＥＰＯアナログを用いて、実行される。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、ＥＰＯ、またはその活性なフラグメントもしくはアナログにより実施され、これらは、ネイティブのヒトＥＰＯよりＥＰＯレセプターに対して少なくとも１０倍高い親和性を有する。別の実施形態において、本発明は、ＥＰＯ、またはその活性なフラグメントもしくはアナログにより実施され、これは、オリゴマー（例えば、二量体）である。例として、ＥＰＯのこのような二量体形態は、各単量体がアミノ酸配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含む二量体であり得る。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明は、ＥＰＯ、またはその活性なフラグメントもしくはアナログにより実施され、これは、ネイティブのヒトＥＰＯより長い半減期を有する。さらなる実施形態において、本発明は、ＥＰＯ、またはその活性なフラグメントもしくはアナログにより実施され、これは、ネイティブのヒトＥＰＯと比較して非常にグリコシル化されている。なおさらなる実施形態において、本発明は、神経細胞とＤａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎとを接触させることによって実施される。本発明の任意の実施形態において、可溶性ＥＰＯレセプターが必要に応じて含まれて、例えば、ＥＰＯまたはその活性なフラグメントもしくはアナログの半減期を増加させ得る。
【００３７】
種々の形態のＩＧＦならびにその活性なフラグメントおよびアナログはまた、本発明において有用である。１つの実施形態において、本発明は、例えば、神経細胞とＩＧＦまたはその活性なフラグメント（例えば、ＩＧＦ−Ｉまたはその活性なフラグメント）とを接触させることによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、神経細胞とヒトＩＧＦ−Ｉまたはその活性なフラグメントとを接触させることによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸ＩＧＦアナログのようなＩＧＦアナログ（限定されることなく、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子および核酸ＩＧＦ−Ｉアナログが挙げられる）により実施される。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、ＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログにより実施され、これらは、ネイティブのヒトＩＧＦ−ＩよりＩＧＦ−Ｉレセプターに対して少なくとも１０倍高い親和性を有する。さらなる実施形態において、本発明は、ＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログにより実施され、これらは、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＢＰ）に対して変化した親和性を有する。なおさらなる実施形態において、本発明は、ＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログにより実施され、これらは、ネイティブのヒトＩＧＦ−Ｉの半減期より長い半減期を有する。本発明の方法において、上記２つの接触工程は、インビトロまたはインビボで実施され得、さらに、同時か、または任意の順序で実施され得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ）」は、神経細胞（ｎｅｒｖｅ  ｃｅｌｌ）を意味し、神経分化の１つ以上のマーカーを含むことによって部分的に特徴付けられる。このようなマーカーは、例えば、神経フィラメント（ＮｅｕＮまたはＭＡＰ２）であり得る。神経細胞はさらに一般的に、神経細胞様プロセスを含むとして特徴付けられる。
【００４０】
本発明の方法は、神経細胞において相乗作用の急性神経保護効果を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「急性神経保護効果」は、神経細胞死または変質を減少させるように機能する迅速な効果を意味する。急性神経保護効果は、一般的に、数分〜約数時間のうちに生じる。従って、「急性神経保護効果」を生成する医薬は、興奮性の傷害（例えば、卒中、外傷または発作など）のときより前に神経細胞と共にプレインキュベートされる必要はない。急性神経保護効果は、神経細胞アポトーシスを減少するように迅速に機能し得る。
【００４１】
アポトーシス性細胞死の程度は、当該分野で周知の種々のアッセイによって決定され得る。このような方法としては、アポトーシスの１つ以上の形態学的特徴（例えば、圧縮または丸くなった形態学、細胞質の縮小および水疱、細胞器官の構造（ミトコンドリアを含む）の保存、クロマチンの圧縮および移動）の存在を決定するための光学顕微鏡が挙げられる。アポトーシス性細胞の割合はまた、圧縮された細胞の形態学と組み合わせて、末端デオキシトランスフェラーゼ媒介性（ＴｄＴ）ｄＵＴＰビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）を使用してアポトーシス活性を評価することによって決定され得る（Ｇａｖｒｉｅｌら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１９：４９３（１９９２）；Ｇｏｒｃｚｙｃａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１：６３９（１９９２）；Ｓｔｕｄｚｉｎｓｋｉ（編），Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５））。ＡｐｏｐＴａｇＴＭ（ＯＮＣＯＲ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）は、ジゴキシゲニン標識を使用するアポトーシス細胞の同定のための市販のキットである。さらに、アポトーシス細胞は、アガロースゲル電気泳動（Ｓｔｕｄｚｉｎｓｋｉ，前出，１９９５；Ｇｏｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：３１４（１９９４））を使用して、またはＤＮＡフィルター溶出形態学を使用し、アポトーシス関連ＤＮＡ断片化を検出して（Ｂｅｒｔｒａｎｄら，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌ．３４：１３８（１９９５））、特徴的なヌクレオソームＤＮＡフラグメントを検出することによって同定され得る。当業者は、アポトーシスについてのこれらのアッセイまたは他のアッセイが、当該分野で慣用的な方法論を使用して実施され得ることを理解する。
【００４２】
用語「相乗作用」は、急性神経保護効果を参照して本明細書中で使用される場合、特定の用量のＥＰＯ、またはその活性なフラグメントもしくはアナログと、特定の用量のＩＧＦ、またはその活性なフラグメントもしくはアナログとを組み合わせることによって達成される急性神経保護効果を意味し、これは、同じ用量のＥＰＯ、またはその活性なフラグメントもしくはアナログおよび同じ用量のＩＧＦ、またはその活性なフラグメントもしくはアナログによる個々の処置から確保されるさらなる急性神経保護効果より有意に高い。特定の実施形態において、相乗作用急性神経保護効果は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上、神経細胞死を減少させる。
【００４３】
急性神経保護を提供するための本発明の方法において、神経細胞は、興奮性の傷害のときに近いか、またはそれに続いてＥＰＯまたはその活性なフラグメントもしくはアナログおよびＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログと接触される。本明細書中で使用される場合、用語「興奮性の傷害のときに近いか、またはそれに続く」は、処置または接触が、卒中、外傷、発作、中毒または他の興奮性傷害後の任意のときに生じることを意味するか、または処置または接触が、興奮性の傷害のときよりおおよそ１時間前に生じることを意味する。一般的に、神経細胞は、およそ障害のときから約４８時間後にＥＰＯおよびＩＧＦと接触され、例えば、傷害の３０分〜８時間後に接触され得る。１つの実施形態において、ＥＰＯおよびＩＧＦ接触工程は、興奮性の傷害後３０分以内に生じる。別の実施形態において、ＥＰＯおよびＩＧＦ接触工程は、興奮性の傷害後１時間以内に生じる。さらなる実施形態において、ＥＰＯおよびＩＧＦ接触工程は、興奮性の傷害後最初の２時間以内、興奮性の傷害後最初の３時間以内、興奮性の傷害後最初の１２時間以内、または興奮性の傷害後最初の２４時間以内に生じる。
【００４４】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、主要な増殖因子であり、赤血球前駆細胞の増殖および分化を誘導し、インターロイキン２〜７、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、成長ホルモンおよびレプチンを誘導するサイトカインファミリーのメンバーである（ＫｏｕｒｙおよびＢｏｎｄｕｒａｎｔ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３０：６７３−６７４（１９９２））。
【００４５】
ＥＰＯがそのレセプターに結合すると、その細胞表面上でのリガンド媒介性レセプター二量化によってシグナル伝達を誘発する。ＥＰＯレセプターの細胞外ドメインの膜近位部分へのシステイン残基を導入し、その細胞表面上でのジスルフィド結合レセプター二量体を生じる点変位は、構成的に活性である。このようなレセプターは、ＥＰＯ依存性細胞株の細胞増殖およびホルモンの非存在下でのＥＰＯの他の生物学的効果をもたらす（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：６４７−６４９（１９９０）；Ｗａｔｏｗｉｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８９：２１４０−２１４４（１９９２）；およびＷａｔｏｗｉｃｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：３５３９−３５４９（１９９４））。マウスにおけるこれらの構成的ＥＰＯレセプターの発現により、シグナル伝達経路の制御されない活性化を介する赤白血病を生じる（ＬｏｎｇｍｏｒｅおよびＬｏｄｉｓｈ，Ｃｅｌｌ  ６７：１０８９−１１０２（１９９１）；Ｌｏｎｇｍｏｒｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２２６６−２２７７（１９９４））。ＥＰＯレセプター活性化は、その次の二量化機構に従うことが示されており、より親和性の低い部位２への第２のレセプターの結合に先立ち、ＥＰＯ上の高親和性部位１に結合する（Ｍａｔｔｈｅｗｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９３：９４７１−９４７６（１９９６））。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「エリスロポエチン」は、「ＥＰＯ」と同義であり、実質的に、天然に存在するヒトＥＰＯまたはそのホモログのアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。本発明において有用なＥＰＯとしては、ヒトＥＰＯおよび他の霊長類のＥＰＯ、哺乳動物ＥＰＯ（例えば、ウシ、ブタ、ネズミおよびラット）ホモログならびに他の脊椎動物ホモログ（例えば、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏホモログ）が挙げられる。従って、用語ＥＰＯは、種のホモログ、選択的スプライシング形態、アイソタイプおよびグリコシル化改変体ならびに図１に示されるような成熟ヒトＥＰＯ配列（配列番号３）の前駆体を包含する。ＥＰＯは、一般的に、天然に存在する成熟ヒトＥＰＯ（配列番号３）の配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号３と、例えば、９０％または９５％以上のアミノ酸同一性を有し得る。
【００４７】
グリコシル化パターンが変化する種々の形態のエリスロポエチンが市販されており、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＥＰＯＧＥＮ（Ａｍｇｅｎ；Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）；ＥＰＯＧＩＮ（Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）；ＥＰＯＭＡＸ（Ｅｌａｎｅｘ；Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）；ＥＰＲＥＸ（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ；Ｂｅｅｒｓｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）；ＮＥＯＲＥＣＯＲＭＯＮおよびＲＥＣＯＲＭＯＮ（Ｒｏｃｈｅ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＰＲＯＣＲＩＴ（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）；種々の形態のＥＰＯもまた、ＥＰＯＥＴＩＮ  ＡＬＦＡ，ＥＰＯＥＴＩＮ  ＢＥＴＡおよびＥＰＯＥＴＩＮ  ＯＭＥＧＡとして一般的に入手可能である。従って、本発明において有用なＥＰＯは、市販のもので得ることができるか、または種々の周知の方法（限定されないが、天然の供給源からの精製、組換え発現、またはペプチド合成もしくは化学合成が挙げられる）によって得ることができることが理解される。
【００４８】
本発明の方法は、所望される場合、「ＥＰＯアナログ」により実施され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＥＰＯアナログ」は、エリスロポエチンレセプターの発現、活性または細胞内シグナル伝達を誘導または増強し、インスリン様増殖因子と組み合わせて、ニューロンにおいて相乗作用の急性神経保護効果を生成する分子を意味する。このようなアナログとしては、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、リボザイム、核酸分子、オリゴヌクレオチド、オリゴ多糖類、細胞、ファージもしくはウイルス、またはこれらの組み合わせであり得る。以下にさらに記載されるように、本発明において有用なＥＰＯアナログは、なお限定されないが、以下を包含する：エリスロポエチン模倣ペプチド（ＥＭＰ）；環状分子（例えば、環状ペプチドまたはペプチド模倣物）；二量体およびオリゴマーのＥＰＯアナログ；血漿半減期が増加したアナログ；抗ＥＰＯレセプター抗体；ＥＰＯレセプターの二量化を誘導する低分子薬物；ＥＰＯの非常にグリコシル化された形態；ＥＰＯをコードする核酸分子；ならびにＥＰＯレセプターの構成的形態。用語ＥＰＯアナログは、上記のＥＰＯの活性フラグメントを含むことが理解される。
【００４９】
ＥＰＯアナログは、アミノ酸配列ＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）の少なくとも１つのコピーを含む、エリスロポエチン模倣ペプチド（ＥＭＰ）であり得る（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：４５８−４６３（１９９６））。１つの実施形態において、ＥＰＯアナログは、ＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰの２つ以上のコピーを含む（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎ．１５：１２６１−１２６５（１９９７））。別の実施形態において、ＥＰＯアナログは、配列ＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり、環状部分は、下線で示される。エリスロポエチン模倣ペプチドは、当該分野で公知であり、表１に示されるように、以下が挙げられる：ＥＭＰ１（配列番号７）、ＥＭＰ２（配列番号８）、ＥＭＰ３（配列番号９）、ＥＭＰ４（配列番号１０）、ＥＭＰ５（配列番号１１）およびＡＦ１１１５４（配列番号１２）。環状ペプチドおよびペプチド模倣物およびジスルフィド結合ペプチドおよびペプチド模倣物を含む、さらなる環状分子もまた、本発明において有用なＥＰＯアナログであり得る。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
組換えヒトＥＰＯは、過剰の加熱の際に二量体を形成し、これは、例えば、Ｄｅｒｂｙら，前出，１９９６によって記載されるように、システイン−７およびシステイン−１６１が関与する分子間ジスルフィド結合形成に基づく。従って、エリスロポエチンのオリゴマー形態、ならびにそのオリゴマーＥＰＯフラグメントおよびアナログは、本発明において有用であり得る。一般的に、ＤｅＰａｏｌｉｓら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８４：１２８０−１２８４（１９９５），およびＤｅｒｂｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４７：２０１−２０８（１９９６）を参照のこと。
【００５２】
本発明において有用なＥＰＯのオリゴマー形態またはその活性なフラグメントもしくはアナログとしては、二量体および三量体、ならびにより高次の多量体形態が挙げられる。ＥＰＯのオリゴマー形態は、ＥＰＯまたはその活性なフラグメントもしくはアナログの２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、５０以上、１００以上、２００以上、５００以上、または１０００以上のコピーを含み得る。例として、化学的架橋剤、合成ペプチド化学、ファージディスプレイおよびビオチンタグ化ＥＰＯとストレプトアビジンとの結合体が、オリゴマーＥＰＯアナログを生成するにあたって有用であり得る。二量体および三量体のＥＰＯアナログは、ヘテロ二官能性架橋試薬を用いて、例えば、エリスロポエチンモノマーの第１のプールを化学的に修飾して、遊離スルフヒドリル残基を含むようにし、このプールをマレイミド基を含む第２のプールと混合することによって、形成され得、このオリゴマーＥＰＯは、その後、例えば、Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉら，前出，１９９８によって記載されるように、サイズ排除ＨＰＬＣによって精製され得る。
【００５３】
ネイティブヒトエリスロポエチンは、約４〜１３時間という比較的短い血清半減期を有する一方、より大きな分子量サイズを有するＥＰＯアナログは、低下したクリアランス速度、従って、増大した血清生存およびインビボでの生物学的活性を有し得る。従って、ＥＰＯアナログ（ＥＰＯ、そのフラグメントもしくはアナログのオリゴマー形態を含む）の分子量が高くなるほど、ネイティブのモノマーヒトＥＰＯの血清半減期と比較して、増大した血清半減期を示し得る（Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１１８４−１１８８（１９９８））。ＥＰＯのオリゴマー形態は、例えば、少なくとも１５時間、１８時間、２１時間、２４時間、４８時間、７２時間または９６時間の半減期を有し得る。当業者は、所望であれば、可溶性ＥＰＯレセプターが、ネイティブエリスロポエチンまたはその活性フラグメントもしくはアナログの半減期を増すため、従って治療価値を増すために含まれ得ることを認識する。
【００５４】
上記で議論されるように、ＥＰＯのＥＰＯレセプターへの結合は、増殖因子レセプターおよびサイトカインレセプターについて共通しているように、レセプター二量体化を生じる。ＥＰＯレセプターの二量体化は、ＥＰＯに特徴的な生物学的応答を誘導するに十分であり得る。従って、本発明においてＥＰＯアナログは、ＥＰＯレセプターの二量体化を促進し得る。一実施形態において、本発明は、ＥＰＯアナログを用いて実施される。このアナログは、エリスロポエチンレセプターの細胞外ドメインに結合し、レセプター二量体化を促進する多価抗体（例えば、二価モノクローナル抗体）である。このような二価抗ＥＰＯレセプター抗体は、例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｂｌｏｏｄ  ８９：４７３−４８２（１９９７）、およびＥｌｌｉｏｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２４６９１−２４６９７（１９９６）において記載されるように、ＥＰＯ活性を模倣することが示されている。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに少なくとも約１×１０−５ＭのＥＰＯレセプターに対する結合活性を保持している抗体のポリペプチドフラグメントを含む。当業者は、抗ＥＰＯレセプター抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント）が、ＥＰＯレセプターに対する結合活性を保持し得、従って、本明細書中で使用される場合、用語抗体の定義内にこれらのフラグメントが含まれることを理解する。この用語抗体はまた、ＥＰＯレセプターを特異的に結合する、最小で１つのＶＨおよび１つのＶＬドメインを含む、天然に存在しない抗体およびフラグメント（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体および単鎖抗体）を包含する。このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築され得るか、組換え生成され得るか、または例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）によって記載されるように、可変性重鎖および可変性軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。
【００５６】
種々の二価抗体は、本発明において有用であり、これらの抗体としては、天然に存在するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体ＭｏＡｂ３４（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，前出，１９９７）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；およびＥ．ｃｏｌｉにおいてアセンブリされた二価完全抗体の機能的アナログである「ミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）」）が挙げられるが、これらに限定されない。ミニ抗体は、二量体化ドメインにヒンジ領域（例えば、マウスＩｇＧ３ロングアッパーヒンジ（ｌｏｎｇ  ｕｐｐｅｒ  ｈｉｎｇｅ）を介して連結された２つのｓｃＦｖフラグメントを含む。有用な二量体化ドメインは、ヘリックス−ターン−ヘリックス束（ｄＨＬＸ；例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，前出，１９９５を参照のこと）として配置されるアンチパラレル両親媒性ヘリックスを含む。当業者は、慣用的なアッセイを使用して、二価抗体ＥＰＯアナログについてスクリーニングし得る。一次スクリーニングは、例えば、固定化ＥＰＯレセプター細胞外ドメイン（ＥＰＯｂｐ）を用いたＥＬＩＳＡであり得、ＥＰＯアゴニスト活性についての二次スクリーニングは、例えば、ＥＰＯレセプターを安定に発現する細胞株を使用するチミジン取り込み増殖アッセイ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，前出，１９９７）であり得る。
【００５７】
抗ＥＰＯレセプター抗体は、例えば、免疫原であるＥＰＯレセプター融合タンパク質またはＥＰＯレセプター細胞外ドメインの部分をコードする合成ペプチドとして使用して調製され得る。当業者は、精製ＥＰＯレセプターまたはその細胞外ドメイン（合成ペプチドのようなペプチド部分を含む）が、組換え生成され得、免疫原として使用され得ることを理解する。さらに、ＥＰＯレセプターの非免疫原性フラグメントまたは合成ペプチドが、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）によって記載されるような周知の方法によって、キャリア分子（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））にハプテンを結合することによって免疫原性にされ得る。
【００５８】
ＥＰＯアナログはまた、ＥＰＯレセプター二量体化を誘導し得、天然に存在するエリスロポエチンの１以上の生物学的活性を模倣し得る低分子薬物であり得る。低分子ＥＰＯアナログは、例えば、ポリアミドアミノ−オクタ−４−ヒドロキシメチルベンズアミド支持体に化学的リンカーを介して結合された例えば、８つのコピーのＮ−３−［２−（４−ビフェニル）−６−クロロ−５−メチル］インドイル−アセチル−Ｌ−リジンメチルエステルを含み得、Ｑｕｒｅｓｈｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９６：１２１５６−１２１６１（１９９９）に記載されるように調製され得る。さらなる低分子ＥＰＯアナログは、例えば、可溶性ＥＰＯレセプターの二量体化を誘導し得る分子について化合物ライブラリーをスクリーニングすることによって、慣用的に同定され得る。二量体化に都合の良いアッセイは、ＥＰＯレセプターの細胞外ドメインである標識組換えＥＰＯ結合タンパク質（ｒＥＢＰ）の試験化合物の存在下でプレートに固定化された非標識ｒＥＭＰに対する保持についてアッセイすることを包含する（Ｑｕｒｅｓｈｉら，前出，１９９９を参照のこと）。
【００５９】
ネイティブ  エリスロポエチンは、多量にグリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から調製されたＥＰＯは、３つのＮ結合型およびＯ結合型グリコシル化部位を有し、その平均糖質含有量は約４０％である。ネイティブＥＰＯにおいて、糖質は、安定性、生合成、先端分泌（ａｐｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）および生物学的活性において重要な役割を果たす。特に、グリコシル化は、コンホメーションの安定性およびＥＰＯの可溶性の両方を増大させるようであるが、コンホメーションは、影響を受けない。従って、ＥＰＯアナログはまた、ネイティブヒトＥＰＯと比較して、過剰グリコシル化されているＥＰＯの形態であり得る。このようなアナログは、当該分野で公知であり、このアナログとしては、Ｄａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
ＥＰＯアナログはまた、エリスロポエチンまたはその活性フラグメントもしくはアナログをコードする核酸分子であり得る。ヒトＥＰＯの例示的な核酸アナログは、配列番号１（図１を参照のこと）として本明細書中で提供される。当業者は、ＥＰＯの活性フラグメントまたはＥＰＯのペプチドアナログ（例えば、本明細書中上記のもの）をコードする核酸分子がまた、本発明の方法において有用なＥＰＯアナログであり得ることを理解する。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語核酸分子とは、共有結合（例えば、ホスホジエステル結合、チオエステル結合、またはヌクレオチドの連結について有用かつ有効であるような当該分野で公知の種々の他の結合のいずれか）によって連結されている２以上のヌクレオチドの任意のポリマーを意味する。核酸分子は、直鎖状、環状またはスーパーコイル状であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。
【００６２】
核酸ＥＰＯアナログ（センス核酸分子またはアンチセンス核酸分子またはオリゴヌクレオチドを含む）はまた、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはホスホチオエート結合（これらは、ヌクレアーゼによる分解から保護する）を含み得る。リボース残基の２’−炭素原子に結合した、通常のヒドロキシル基の代わりに２−メチル基を含むリボヌクレオチドは、酵素分解および化学分解に対して耐性である、天然に存在しないＲＮＡ分子の一例である。天然に存在しない有機分子の他の例としては、２’−アミノピリミジンを含むＲＮＡが挙げられ、このようなＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡと比較して、ヒト血清中で１０００倍以上安定である（Ｌｉｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５２２９−５２３４（１９９４）；およびＪｅｌｌｉｎｅｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２（１９９５）を参照のこと）。
【００６３】
さらなるヌクレオチドアナログもまた、当該分野で周知であり、例えば、ＥＰＯアナログにおいて有用であり得る。例えば、リボース残基上に２’−Ｏ−メチルプリン置換ならびに３’末端および５’末端に短いホスホロチオエートキャップを含むＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼに対して高められた耐性を示す（Ｇｒｅｅｎら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６８３−６９５（１９９５））。同様に、２’−アミノ−２’−デオキシピリミジンまたは２’−フルオロ−２’−デオキシピリミジンを含むＲＮＡは、ヌクレアーゼ活性にあまり影響を受けない（Ｐａｇｒａｔｉｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３（１９９７））。さらに、Ｌ−ＲＮＡ（これは、天然に存在するＤ−ＲＮＡの立体異性体である）は、ヌクレアーゼ活性に対して耐性である（Ｎｏｌｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１１１６−１１１９（１９９６））；Ｋｌｏｂｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１１１２−１１１５（１９９６））。このようなＲＮＡ分子およびこれらを生成する方法は、当該分野で周知かつ慣用的である（ＥａｔｏｎおよびＰｉｅｋｅｒｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：８３７−８６３（１９９５）を参照のこと）。ホスホロチオエート連結したオリゴデオキシヌクレオチドを含むＤＮＡ分子は、ヌクレアーゼ耐性であり、有用なＥＰＯアナログであり得る（Ｒｅｅｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：６５６５−６５７０（１９９０））。ホスホジエステル結合のホスホロチオエート−３’ヒドロキシプロピルアミン改変もまた、ヌクレアーゼ変性に対するＤＮＡ分子の感受性を低下させる（Ｔａｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：９７７−９８６（１９９４）を参照のこと）。さらに、チミジンは、５−（１−ペンチニル）−２’−デオキシウリジン（ｄｅｏｘｏｒｉｄｉｎｅ）で置換され得る（Ｌａｔｈａｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２８１７−２８２２  （１９９４）を参照のこと）。
【００６４】
ウイルスベクターは、本発明の方法において神経細胞または神経前駆細胞に核酸アナログを導入するために特に有用であり得る。このようなベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）およびヘルペスウイルスベクター（例えば、ＫａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗｙ，Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９５）；Cｈａｎｇ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９５）を参照のこと）が挙げられる。レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクターは、例えば、恒久的な発現のために有用であり得、アデノウイルスおよびヘルペスウイルスは、数ヶ月から約１年持続する一過性の発現を達成するために使用され得る。恒久的発現および一過性発現の両方が本発明の方法において有用であり得ることが理解される。
【００６５】
核酸分子を神経細胞または神経前駆細胞に導入するための種々の技術は、当該分野で公知である。このような方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクチン、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性もしくはポリリジン媒介性のトランスフェクション、および抗体、グラミシジンＳ、抗ウイルスエンベロープもしくは他の細胞内キャリア（例えば、ＴＡＴ）への結合体化が挙げられる。Ｃｉｂｅｌｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６４２−６４６（１９９８）；ＬａｍｂおよびＧｅａｒｈａｒｔ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．５：３４２−３４８（１９９５）；Ｃｈｏｉ（米国特許第６，０６９，０１０号）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｐｐ９．１６．４−９．１６．１１（２０００）を参照のこと。
【００６６】
エリスロポエチンの生物学的効果はまた、本発明の方法に従って急性の神経保護利益を生じ得る別のＥＰＯアナログである、構成的に活性なＥＰＯレセプターにより模倣され得る。本明細書中で使用する場合、用語「構成的ＥＰＯレセプター」は、「構成的に活性なＥＰＯレセプター」と類義語であり、ネイティブのヒトエリスロポエチンレセプターと構造的類似性を有し、ネイティブＥＰＯレセプターの１つ以上のホルモン依存性生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。このような構成的ＥＰＯレセプターは、修飾された二量体界面を有し得、その結果、このレセプターは、リガンドの非存在下で二量体化する。１つの実施形態において、構成的ＥＰＯレセプターは、１２９位にアルギニンからシステインへの変異を有し、ＥＰＯの非存在下でジスルフィド結合ホモ二量体を形成するネイティブヒトＥＰＯレセプターの改変体である。他の実施形態において、構成的ＥＰＯレセプターは、二量体界面に１つ以上の天然では存在しないシステインを含むネイティブＥＰＯレセプターの改変体である（例えば、Ｗａｔｏｗｉｃｈら，前出，１９９２；Ｗａｔｏｗｉｃｈら，前出，１９９４；およびＬｏｎｇｍｏｒｅら，前出，１９９４を参照のこと）。
【００６７】
ＥＰＯアナログはまた、ＥＰＯレセプターの細胞内シグナル伝達カスケードを誘導または増強する分子であり得る。シグナルは、ＥＰＯリガンドの結合後に開始され、レセプターの二量体化を生じる。ＪＡＫ２は自己リン酸化され、そしてその後、ＥＰＯレセプターおよびＳＴＡＴタンパク質をリン酸化し、これらは次いで遊離して核に移動し、転写を活性化する。さらに、ＪＡＫ２とＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路との間のクロストーク（ｃｒｏｓｓ  ｔａｌｋ）、ならびにＡｋｔおよびｂｃｌ−ＸＬのアップレギュレーションは、神経保護を誘導し得る（ＤｉｇｉｃａｙｌｉｏｇｌｕおよびＬｉｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１２：６４１−６４７（２００１））。造血細胞ホスファターゼ（ＨＣＰ）（ＳＨＰ１またはＰＴＰ１Ｃとしても公知）は、リン酸化されたＥＰＯレセプターに結合してＪＡＫ２を脱リン酸化し、それによって、ＥＰＯレセプター細胞内経路のネガティブレギュレーターとして作用する。従って、ＥＰＯアナログはまた、ＨＣＰのインヒビター（例えば、ＨＣＰアンチセンス分子）であり得る。ＨＣＰインヒビターは当該分野で公知であり、慣用的な方法（Ｂａｒｂｏｎｅら，Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１４［Ｓｕｐｐｌ．２］：８０−８４（１９９９））によりさらに同定され得る。
【００６８】
天然に存在するヒトＩＧＦ−Ｉ（ソマトメディンＣとしても公知）は、７０アミノ酸のホルモンである。ＩＧＦ−Ｉは、プロインシュリンと約４３％のアミノ酸相同性を有する塩基性ペプチド（ｐＩ  ８．４）である。天然に存在するＩＧＦ−ＩＩは、ネイティブＩＧＦ−Ｉと６０％のアミノ酸相同性を有する、比較的中性のペプチド（ｐＩ  ６．４）である。
【００６９】
成熟ヒトＩＧＦ−Ｉの配列（配列番号６）は、当該分野で公知であり、そして図２に示されている（Ｒｏｔｗｅｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４８２８−４８３２（１９８６）；およびＪａｎｓｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：６０９−６１１（１９８３））。成熟ヒトＩＧＦ−Ｉを構成する７０アミノ酸は、４つの基本ドメインに分割される。ＩＧＦ−Ｉの最初の２９残基は、インシュリンのＢ鎖と強い類似性を有し、従って、「Ｂドメイン」と呼ばれている。同様に、ＩＧＦ−Ｉの残基４２〜４６は、インシュリンＡ鎖と相同であり、その結果、「Ａドメイン」と呼ばれている。ＢドメインとＡドメインとの間の介在部（残基３０〜４１）は、「Ｃドメイン」であり；カルボキシ末端７アミノ酸（残基６３〜７０）は、「Ｄドメイン」として公知である。
【００７０】
ヒトＩＧＦ−ＩのコアのＮＭＲ分解構造は、インシュリンに対する顕著な類似性を示しており（Ｃｏｏｋｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：５４８４−５４９１（１９９１））、そしてＩＧＦ−Ｉは、インシュリンレセプターに結合することが知られている（ＩＧＦ  Ｉ型レセプターへの結合よりも低い親和性であるが）。このモデルと一致して、ＩＧＦ−ＩのＣドメインおよびＤドメインは、「フラップ」し得、インシュリンに保存されているレセプター結合間隙（ｃｌｅｆｔ）に隣接し、かつ１型レセプターへの特異的結合に寄与する。変異誘発実験は、Ｂドメインのカルボキシ末端伸長領域の残基およびＢドメインに近接するＣドメインの残基がレセプター結合に関与すること、およびチロシン２４および３１が、特異的レセプター相互作用に関与することを明らかにした。
【００７１】
大部分の他の増殖因子と異なり、ＩＧＦは、循環中に高濃度で存在する；しかし比較的小画分のみが「遊離」形態または非結合形態で利用可能である。高分子量であり、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する高い結合能を有する特定の結合タンパク質は、キャリアタンパク質として作用し、ＩＧＦ機能を調節する（Ｈｏｌｌｙら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．１１８：７−１８（１９８８））。血液中のほとんどのＩＧＦは、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦＢＰ−３、および「酸不安定サブユニット」（ＡＬＳ）として公知のタンパク質から構成される非共有結合三元複合体の一部として循環する。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、用語「インシュリン様増殖因子」は、「ＩＧＦ」の類義語であり、天然に存在するヒトＩＧＦ−Ｉもしくは天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩまたはこれらのタンパク質のうちの１つのホモログのアミノ酸配列を実質的に有するポリペプチドを意味する。本発明において有用なインシュリン様増殖因子としては、ヒトおよび他の霊長類のＩＧＦ、哺乳動物ＩＧＦ（例えば、ウシ、ブタ、マウス、およびラットホモログ）、および他の脊椎動物ホモログ（例えば、ニワトリおよびＤａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏホモログ）が挙げられる。従って、用語ＩＧＦは、図２に示される成熟ヒトＩＧＦ−Ｉ配列の種ホモログ、選択的スプライシング形態、アイソタイプ改変体、および前駆体、ならびに成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの種ホモログ、選択的スプライシング形態、アイソタイプ改変体、および前駆体を含む。ＩＧＦ−Ｉは、一般的に、天然に存在する成熟ヒトＩＧＦ−Ｉの配列（配列番号６）に対して少なくとも約８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する（例えば、配列番号６と９０％または９５％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有し得る）。同様に、ＩＧＦ−ＩＩは、一般的に、天然に存在する成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する（成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩと９０％または９５％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有し得る）。本発明において有用なＩＧＦは種々の周知の方法（天然源からの精製、組み換え発現、およびペプチド合成または化学合成が挙げられるがこれらに限定されない）によって獲得され得ることが理解される。例として、ＩＧＦ−Ｉは、融合ペプチドとして細菌において調製され得、その後、融合産物は、例えば、米国特許第５，７０８，１３４号に記載されるように切断される。
【００７３】
ＩＧＦの活性フラグメントもまた、本発明において有用であり得る。活性フラグメントは、全長ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの一部に対応するアミノ酸配列を有し、かつＥＰＯと協調して急性の神経保護効果を生じる能力を保持する。本発明において有用なＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性フラグメントとしては、類似の活性を有するフラグメントまたは、天然に存在する全長ＩＧＦと比較して改善された活性もしくは安定性を有するフラグメントが挙げられる。非限定的な例として、このような活性フラグメントは、ＩＧＦ−Ｉの最初の１〜５アミノ末端残基を欠損し得る。ネイティブのＮ末端残基Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕを欠損したＤｅｓｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ  ＩＧＦ−Ｉは、全長ＩＧＦ−Ｉについて必要とされるレベルよりも４〜５０倍低い濃度でタンパク質合成およびＤＮＡ合成を刺激する。ウシまたはブタのＩＧＦ−ＩのＮ末端から１〜５アミノ酸を消去することもまた、増強された能力を生じる。ＩＧＦ−Ｉのこれらおよび他の活性フラグメントは、本発明の方法において用途を見出す。
【００７４】
本発明の方法は、所望の場合、「ＩＧＦアナログ」を用いて実施され得る。本明細書中で使用する場合、用語「ＩＧＦアナログ」は、１型インシュリン様増殖因子レセプターの発現、活性、または細胞内シグナル伝達を誘導または増強し、ＥＰＯと合わさって、神経において相乗作用的な急性の神経保護効果を生じる分子を意味する。このようなＩＧＦアナログは、限定することなく、タンパク質、ペプチド模倣物、低分子、リボザイム、核酸分子、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、細胞、ファージもしくはウイルス、またはそれらの組み合わせであり得る。用語ＩＧＦアナログは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性フラグメントを含むことが理解される。
【００７５】
ＩＧＦアナログとしては、ネイティブヒトＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと比較して改善された特性（例えば、そのアナログの商業的製造を容易にする特性）を有する分子；改善された能力、サイズ、安定性、もしくは可溶性を有する分子；またはより望ましい薬学的処方物を提供する分子が挙げられる。非限定的な例として、より活性なＩＧＦアナログは、例えば、ＩＧＦとそのレセプター、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＢＰ）またはヘパリンとの相互作用に影響を与える改変により生成され得る。
【００７６】
ＩＧＦアナログは、例えば、Ａｐｐｌｅｂａｕｍら（米国特許第４，８７６，２４２号に記載されるように、ＩＧＦ活性を保持するが、１つ以上の血清成分に対する親和性の減少した分子であり得る。このようなアナログは、Ｉ型ＩＧＦレセプターにおいて、ＩＧＦ−Ｉと等しい能力を有し得、そして例えば、ヒトＩＧＦ−Ｉと比較して５〜１０倍の活性の増加を示し得る。例として、ＩＧＦアナログは、ヒトＩＧＦ−Ｉの最初の１６残基の代わりにヒトインシュリンのＢ鎖の最初の１７残基を含むヒトＩＧＦ−Ｉの７１アミノ酸アナログ、またはネイティブＩＧＦ配列の代わりにインシュリンの一部を組み込んだ別のアナログであり得る（ＣａｓｃｉｅｒｉおよびＢａｙｎｅ，ＬｅＲｏｉｔｈ  ａｎｄ  Ｒａｉｚａｄａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４もまた参照のこと）。ＩＧＦアナログはまた、天然に存在しないアミノ末端配列を有するペプチドまたはペプチド模倣アナログであり得る。Ｂａｌｌａｒｄら（米国特許第５，４７０，８２８号および同第５，１６４，３７０号）は、ＩＧＦ−ＩにおいてＧｌｕ３の置換を有するＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩにおいてＧｌｕ５およびＧｌｕ６の置換を有するＩＧＦ−ＩＩアナログを記載する。１つ以上のグルタミン酸残基が、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓ（これらに限定されない）と置換され得る。所望の場合、取り囲むＧｌｙ、Ｐｒｏ、またはＴｈｒ残基のうちの少なくとも１つがまた、ＩＧＦアナログに存在しない。
【００７７】
天然に存在するＩＧＦが単一鎖の分子であるが、ＩＧＦアナログは、２つ以上の鎖を有し得る。２鎖ＩＧＦアナログとしては、ＢドメインおよびＣドメインを含む第１鎖ならびにＡドメインを含む第２鎖で構成されるジスルフィド結合したヘテロ二量体が挙げられる。このような２鎖ＩＧＦアナログは、Ｃドメインが最初の８、１０、または１２残基の欠失を含み、ネイティブＩＧＦ−Ｉと比較して増加したＩＧＦ−Ｉ活性を有し得るＩＧＦ−Ｉアナログであり得る（例えば、米国特許第５，６２２，９３２号を参照のこと）。
【００７８】
ＩＧＦ経路はまた、ＩＧＦの活性濃度を増加させる（例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩとそれらの結合タンパク質の１つとの相互作用を阻害するが、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩとＩ型ＩＧＦレセプターとの相互作用を阻害しないことにより）分子を用いて誘導され得る。このようなＩＧＦアナログは、単独で、あるいは、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩまたはそれらの活性フラグメントもしくはアナログと組み合わせて使用され得る。間接的アゴニストとして作用するＩＧＦ結合タンパク質の小さいアンタゴニスト模倣物であり得るこのようなＩＧＦアナログとしては、表２に示されるようなペプチドおよびペプチド模倣物が挙げられる。これらの分子は、例えば、米国特許第６，２５１，８６５号およびＬｏｗｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：８８７０−８８７８（１９９８）に記載されるように、当該分野で周知である。
【００７９】
【表２】
2005534650.tif 000003
【００８０】
本発明において有用なさらなるＩＧＦアナログとしては、ＬＲ３ＩＧＦ−Ｉ（これは、３位のＧｌｕのＡｒｇ置換および１３残基のアミノ酸伸長を含む（Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：２１３−２２３（１９９２）））ならびに［Ｌｅｕ２４］または［Ｌｅｕ２４］［Ａｒｇ３１］を含む形態（Ｂａｙｎｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５６４８−１５６５２（１９９０）；Ｓｅｉｇｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ  ６：１５７−１６３（２０００））および臭化シアンの適用による産生を単純化するＶａｌ５９ＩＧＦ−Ｉアナログ（Ｕｅｄａら，米国特許第４，７４５，１７９号）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
ＩＧＦアナログはまた、例えば、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩをコードする核酸分子、またはそれらの活性なフラグメントもしくはアナログであり得る。ヒトＩＧＦ−Ｉの例示的な核酸アナログは、本明細書中で配列番号４と提供される。当業者は、ＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩの活性フラグメント、またはそれらのペプチドアナログ（例えば、本明細書中上記のペプチドアナログ）をコードする核酸分子もまた、本発明の方法において有用なＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの核酸アナログであり得ることを理解する。
【００８２】
さらなるＩＧＦアナログは、所望の場合、慣用的な方法によって同定され得る。一例として、キナーゼレセプター活性化アッセイ（ＫＩＲＡ）は、ヒト型Ｉ  ＩＧＦ−Ｉレセプターの活性化を測定し、それによってＬｏｗｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：８８７０−８８７８（１９９８）によって記載される通りのＩＧＦアナログを同定するために用いられ得る。手短に述べると、ヒトＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ−ＨＴＢ  ２２）（これは、ＩＧＦおよびインスリンレセプターを発現する）を、５０／５０のＦ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）を含む９６ウェルプレートにおいて５％  ＣＯ２中３７℃にて一晩増殖させる。上清をデカントし、試験化合物または組換えヒトＩＧＦ−Ｉ標準のいずれかを含む刺激培地（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび２．０％  ＢＳＡを含む５０／５０のＦ１２／ＤＭＥＭ）を添加する。３７℃にて１５分間の刺激後、上清をデカントし、そして細胞を溶解する。溶解産物を、ポリクローナルの抗ＩＧＦ−Ｉレセプター（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でコーティングした免疫吸着プレートに移し、そしてＢＳＡでブロッキングする。室温にて２時間のインキュベーションの後、未結合のレセプターを洗浄により除去し、そして結合したレセプターを、ビオチン化抗体４Ｇ１０（抗ホスホチロシン）により検出し、続いてＨＲＰ結合体化デキストラン−ストレプトアビジンおよびテトラメチルベンジジン基質溶液で発色させた。生成物の吸光度は、６５０ｎｍを参照として４５０ｎｍで読み取られる。
【００８３】
本発明において有用なＥＰＯまたはＩＧＦアナログはまた、二機能性分子（例えば、ＥＰＯおよびＩＧＦの活性を有する二機能性ペプチド）であり得る。ＥＰＯおよびＩＧＦの両方の活性を有する、このようなキメラＥＰＯ／ＩＧＦペプチドが、さらなるＥＰＯもしくはＩＧＦ、またはそれらの活性なフラグメントもしくはアナログの不存在下で、あるいは、所望の場合、ＥＰＯもしくはＩＧＦの一方もしくは両方またはそれらの活性なフラグメントもしくはアナログとの組み合わせで、本発明の方法において用いられえることが理解される。従って、多くの場合には、本発明の方法は、神経細胞を含むことによりまたは２つの因子（ＥＰＯおよびＩＧＦ）の組み合わせを投与することにより実施されるが、本発明の方法はまた、神経細胞を、個々のＥＰＯタンパク質およびＩＧＦタンパク質またはそれらの活性なフラグメントもしくはアナログの代わりに単一の二機能性アナログと接触させることにより、またはこれらを被験体に投与することにより、実施され得る。１つの実施形態では、本発明は、神経細胞を、神経細胞への取り込み後に個々のＥＰＯアナログおよびＩＧＦアナログへと切断されるＥＰＯ／ＩＧＦ二機能性アナログと接触させることにより実施される。別の実施形態では、本発明は、ＥＰＯ／ＩＧＦ二機能性アナログ（これは、投与後に切断されて、個々のＥＰＯアナログおよびＩＧＦアナログが生成される）を被験体に投与することにより実施される。
【００８４】
ペプチドアナログは、周知の方法論によって、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を利用して合成され得る。Ｂｏｃアミノ酸樹脂および他の試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよび他の商業的供給源から入手され得る。二重カップルプロトコルおよび無水酢酸キャッピングを用いた連続的Ｂｏｃ化学は、所望のＢｏｃ−アミノ酸−４−（オキシメチル）フェニルアセトアミドメチル［ＰＡＭ］樹脂に適用され得る。アスパラギン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン、α−ｐ−ヒドロキシフェニル）酢酸、β−ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸（β−ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸およびｐ−ヒドロキシフェノキシ酢酸は、予め形成されたヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いてカップリングされ得る。他の残基は、ジシクロカルボジアミド（ＤＣＣ）とともに予め形成された対称無水物を用いて便利にカップリングされ得る。組換えホルモンならびにその活性なフラグメントおよびアナログもまた、例えば、米国特許第５，１０４，７９６号および米国特許第５，０８４，３８４号（米国特許第５，６２２，９３２号もまた参照のこと）に記載される通り、原核生物宿主細胞、酵母、もしくは他の真核生物宿主細胞における方法を用いて調製され得る。組換え形態のＥＰＯまたはＩＧＦは、融合タンパク質として調製され得、そしてシグナル配列のようなさらなる異種配列を含み得ることが理解される。
【００８５】
本発明はまた、被験体に、急性傷害の時点に近いかまたはその後に、ＥＰＯまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを投与し、そして急性傷害の時点に近いかまたはその後にＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログをこの被験体に投与し、それにより、急性神経保護の相乗効果を提供して急性の神経学的状態を予防または急性の神経学的状態の重篤度を低減することにより、被験体における急性の神経学的状態を予防するかまたは急性の神経学的状態の重篤度を低減する方法を提供する。このような急性の神経学的状態は、発作、頭部外傷もしくは脊髄外傷、または痙攣であり得るがこれらに限定されない。
【００８６】
急性の神経学的状態を予防するかまたは急性の神経学的状態の重篤度を低減するための本発明の方法は、例えば、ＥＰＯまたはその活性なフラグメント（例えば、ヒトＥＰＯまたはその活性なフラグメント）を用いて実施され得る。本発明の方法はまた、ＥＰＯアナログ（これは、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸アナログであり得るがこれらに限定されない）を用いて実施され得る。特定の実施形態では、本発明は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含むＥＰＯアナログを用いて実施される：ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）；ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；またはＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）。
【００８７】
１つの実施形態では、本発明は、ネイティブなヒトＥＰＯよりも少なくとも１０倍高いＥＰＯレセプター親和性を有する、ＥＰＯまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを用いて実施される。別の実施形態では、本発明は、オリゴマー（例えば、ダイマー）である、ＥＰＯまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを用いて実施される。一例として、本発明の方法は、各モノマーがアミノ酸配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含む、ダイマー形態のＥＰＯを用いて実施され得る。さらなる実施形態では、本発明は、ネイティブなヒトＥＰＯの半減期よりも長い半減期を有する、ＥＰＯまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを用いて実施される。このような形態のＥＰＯは、ネイティブなヒトＥＰＯと比較した場合、過度にグリコシル化（ｈｙｐｅｒ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）され得、そして例えば、ダーベポイエチン（Ｄａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎ）であり得る。本発明の方法はまた、可溶性ＥＰＯレセプターを被験体に投与する工程を必要に応じて含む。
【００８８】
種々の形態のＩＧＦおよびその活性なフラグメントおよびアナログは、本発明において有用である。１つの実施形態では、本発明は、ＩＧＦまたはその活性なフラグメント（例えば、ＩＧＦ−Ｉまたはその活性なフラグメント）を投与することにより実施される。さらなる実施形態では、本発明は、ヒトＩＧＦ−Ｉまたはその活性なフラグメントを投与することにより実施される。本発明はまた、ＩＧＦアナログ（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸アナログ（種々のＩＧＦ−Ｉアナログが挙げられるがこれらに限定されない））を投与することにより実施され得る。
【００８９】
１つの実施形態では、急性の神経学的状態を予防するためかまたは急性の神経学的状態の重篤度を低減するための本発明の方法は、ネイティブのヒトＩＧＦ−Ｉよりも少なくとも１０倍高いＩＧＦ−Ｉレセプター親和性を有する、ＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを用いて実施される。別の実施形態では、本発明は、改変されたＩＧＦ結合タンパク質親和性を有する、ＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを用いて実施される。さらなる実施形態では、本発明は、ネイティブなヒトＩＧＦの半減期よりも長い半減期を有する、ＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを用いて実施される。本発明の方法では、ＥＰＯおよびＩＧＦ、またはそれらの活性なフラグメントもしくはアナログは、同時に、または任意の順番で、および同じ薬学的組成物中でまたは異なる薬学的組成物中で、投与され得る。
【００９０】
本明細書中で用いられる場合、用語「被験体」とは、ニューロンを含む任意の動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、霊長類またはヒトのような哺乳動物）を意味する。被験体は代表的に、急性もしくは慢性の神経学的状態を罹患しているか、または神経学的状態を発症する危険性が高い。
【００９１】
本明細書中で用いられる場合、用語「急性の神経学的状態」とは、短い経過および比較的短い経過を有する、任意の神経学的障害または神経学的疾患を意味する。非限定的な例として、「急性の神経学的状態」は、脳卒中に関連した脳虚血；低酸素；無酸素；一酸化炭素中毒、マンガン中毒もしくはシアン化物中毒；低血糖；周産期窒息；臨死溺水；神経系に対する機械的外傷（例えば、頭部または脊髄に対する外傷）；癲癇発作；心停止；または例えば、冠状バイパス手術に関連した脳窒息であり得る。急性の神経学的状態は一般に、慢性の神経学的状態（ここでは、神経学的状態が、比較的長い持続時間（例えば、数ヶ月または数年）のものである）とは区別される。
【００９２】
本発明によってまた提供されるのは、ＥＰＯまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを多くとも２０００Ｕ／ｋｇの用量で被験体に投与し、そしてＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログをこの被験体に投与し、それにより、神経保護を提供し、そして神経学的状態を予防するかまたは神経学的状態の重篤度を低減することによって、被験体における神経学的状態を予防するかまたは神経学的状態の重篤度を低減する方法である。このＥＰＯおよびＩＧＦ、またはそれらの活性なフラグメントまたはアナログは、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、脳室内投与、髄腔内投与、経鼻投与、硝子体内（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ）投与および経強膜（ｔｒａｎｓｃｌｅｒａｌ）投与が挙げられるがこれらに限定されない、種々の投与経路のいずれかを用いて、同時に、または任意の順番で、および同じ薬学的組成物中でまたは異なる薬学的組成物中で、投与され得る。種々の急性および慢性の神経学的状態（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ＨＩＶ関連痴呆、緑内障、癲癇、光誘発性網膜変性（例えば、光受容体変性、黄斑変性）および疼痛が挙げられるがこれらに限定されない）は、本発明の方法に従って処置され得る。
【００９３】
本発明はまた、ＥＰＯまたはその活性なフラグメントもしくはアナログを多くとも２０００Ｕ／ｋｇの用量で被験体に経鼻投与し、そしてＩＧＦまたはその活性なフラグメントもしくはアナログをこの被験体に経鼻投与し、それにより、急性の神経保護を提供し、そしてこの神経学的状態を予防するかまたはこの神経学的状態の重篤度を低減することによって、被験体における脳の神経学的状態を予防するかまたは脳の神経学的状態の重篤度を軽減する方法を提供する。
【００９４】
種々の形態のＥＰＯならびにそれらの活性なフラグメントおよびアナログは、本発明の方法に従って神経学的状態の重篤度を予防するかまたはこの神経学的状態の重篤度を軽減するために有用である。一例として、本発明はまた、ＥＰＯまたはその活性なフラグメント（例えば、ヒトＥＰＯまたはその活性なフラグメント）を用いて実施され得る。本発明の方法はまた、ＥＰＯアナログ（これは、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸アナログであり得るがこれらに限定されない）を用いて実施され得る。特定の実施形態では、本発明は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含むＥＰＯアナログを用いて実施される：ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）；ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）；ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）；ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）；ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）；またはＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）。
【００９５】
１つの実施形態において、神経学的状態の重篤度を予防するかまたは神経学的状態の重篤度を低減するための本発明の方法は、ＥＰＯレセプターに対して、ネイティブのヒトＥＰＯより少なくとも１０倍高い親和性を有するＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。別の実施形態において、本発明は、オリゴマー（例えば、ダイマー）であるＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。本発明は、例えば、各モノマーが、アミノ酸配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含むＥＰＯのダイマー形態を用いて実施され得る。さらなる実施形態において、本発明は、ネイティブのヒトＥＰＯの半減期より長い半減期を有するＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。このような形態のＥＰＯは、ネイティブのヒトＥＰＯと比較して過剰グリコシル化（ｈｙｐｅｒ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）され得、さらに例えば、Ｄａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎであり得る。本発明の方法は、さらに必要に応じて、被験体へと可溶性ＥＰＯレセプターを投与する工程を包含する。
【００９６】
種々の形態のＩＧＦならびにその活性フラグメントおよびアナログもまた、本発明において有用である。１つの実施形態において、本発明は、ＩＧＦまたはその活性フラグメント（例えば、ＩＧＦ−Ｉまたはその活性フラグメント）を投与することによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ヒトＩＧＦ−Ｉまたはその活性フラグメントを投与することによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸アナログ（種々のＩＧＦ−Ｉアナログが挙げられるが、これらに限定されない）のようなＩＧＦアナログを投与することによって実施される。
【００９７】
１つの実施形態において、神経学的状態の重篤度を予防するかまたは神経学的状態の重篤度を低減するための本発明の方法は、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して、ネイティブのヒトＩＧＦ−Ｉより少なくとも１０倍高い親和性を有するＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。別の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ結合タンパク質に対して変化した親和性を有するＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。さらなる実施形態において、本発明は、ネイティブのヒトＩＧＦの半減期より長い半減期を有するＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログを用いて実施される。
【００９８】
用語「神経学的状態」は、本明細書中で使用される場合、全ての急性および慢性の神経学的状態を包含する。従って、神経学的状態は、以下を包含するが、これらに制限されない：低酸素−虚血（発作）；頭または脊髄の損傷；てんかん；パーキンソン病、ハンティングトン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症または多発性硬化症のような神経学的障害；緑内障、光受容体変性のような光誘導性網膜変性、および黄斑変性のような視覚的神経障害；色素性網膜炎のような光受容体変性の障害；脳炎のような代謝、ミトコンドリアおよび感染性の脳の異常；ならびに神経障害性疼痛（Ｌｉｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：６１３（１９９４））。慢性神経障害状態は、以下を包含する：アルツハイマー病、ハンティングトン病のような神経変性疾患；色素性網膜炎および光誘導性網膜変性のような光受容体変性の障害；網膜の黄斑変性；前頭側頭骨痴呆およびＨＩＶ関連痴呆（後天性免疫不全症候群痴呆複合体）を含む痴呆の形態；カウザルギーまたは疼痛性末梢神経障害および他の慢性疼痛症候群のような神経障害性疼痛症候群；オリーブ橋小脳萎縮；パーキンソン病；振せん麻痺；筋萎縮性側索硬化症；ミトコンドリア異常および他の生理化学的障害（例えば、ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥＲＲＦ、レーバー症候群、ヴェルニッケ脳障害、レット症候群、ホモシスチン尿症、過剰ホモシスチン血症（ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｉａ）、高プロリン血症、非ケトン性高グリシン血症、ヒドロキシ酪酸アミン酸尿症、亜硫酸オキシダーゼ欠損症、脊髄索状変性、鉛脳障害；肝性脳障害、ツレット症候群；薬物嗜癖、薬物耐性、薬物依存性；ならびにうつ病または不安症候群。
【００９９】
被験体における神経学的状態の重篤度を予防するかまたは神経学的状態の重篤度を低減するための本発明の方法は、ＩＧＦ−ＩのようなＩＧＦとともに投与される場合、ＥＰＯが、以前に観察されたよりもかなり低い用量で神経保護性であり得るという発見に一部基づいている。従って、本発明の方法は、多くて２０００Ｕ／ｋｇの用量のＥＰＯ、またはその活性フラグメントもしくはアナログを投与することによって実施される。特定の実施形態において、本発明は、多くて１５００Ｕ／ｋｇ、１０００Ｕ／ｋｇ、７５０Ｕ／ｋｇ、５００Ｕ／ｋｇ、２５０Ｕ／ｋｇ、１００Ｕ／ｋｇ、９０Ｕ／ｋｇ、８０Ｕ／ｋｇ、７０Ｕ／ｋｇ、６０Ｕ／ｋｇ、５０Ｕ／ｋｇ、４０Ｕ／ｋｇ、３０Ｕ／ｋｇ、２０Ｕ／ｋｇ、１０Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ、２．５Ｕ／ｋｇまたは１Ｕ／ｋｇの用量のＥＰＯまたはそのフラグメントもしくはアナログを投与することによって実施される。さらなる実施形態において、本発明は、多くて、２０００Ｕ／ｋｇ／日、１５００Ｕ／ｋｇ／日、１０００Ｕ／ｋｇ／日、７５０Ｕ／ｋｇ／日、５００Ｕ／ｋｇ／日、２５０Ｕ／ｋｇ／日、１００Ｕ／ｋｇ／日、９０Ｕ／ｋｇ／日、８０Ｕ／ｋｇ／日、７０Ｕ／ｋｇ／日、６０Ｕ／ｋｇ／日、５０Ｕ／ｋｇ／日、４０Ｕ／ｋｇ／日、３０Ｕ／ｋｇ／日、２０Ｕ／ｋｇ／日、１０Ｕ／ｋｇ／日、５Ｕ／ｋｇ／日、２．５Ｕ／ｋｇ／日または１Ｕ／ｋｇ／日のＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを投与することによって実施される。なおさらなる実施形態において、被験体における神経学的状態の重篤度を予防するかまたは神経学的状態の重篤度を低減するための本発明の方法は、０．５Ｕ／ｋｇ／日〜２００Ｕ／ｋｇ／日、０．５Ｕ／ｋｇ／日〜１００Ｕ／ｋｇ／日、０．５Ｕ／ｋｇ／日〜５０Ｕ／ｋｇ／日、０．５Ｕ／ｋｇ／日〜２５Ｕ／ｋｇ／日、０．５Ｕ／ｋｇ／日〜１５／ｋｇ／日、０．５Ｕ／ｋｇ／日〜１０／ｋｇ／日、０．５Ｕ／ｋｇ／日〜５Ｕ／ｋｇ／日、１Ｕ／ｋｇ／日〜２００Ｕ／ｋｇ／日、１Ｕ／ｋｇ／日〜１００Ｕ／ｋｇ／日、１Ｕ／ｋｇ／日〜５０Ｕ／ｋｇ／日、１Ｕ／ｋｇ／日〜２５Ｕ／ｋｇ／日、１Ｕ／ｋｇ／日〜１５Ｕ／ｋｇ／日、１Ｕ／ｋｇ／日〜１０Ｕ／ｋｇ／日、１Ｕ／ｋｇ／日〜５Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜２００Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜１００Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜５０Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜２５Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜１５Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜１０Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜５Ｕ／ｋｇ／日、３Ｕ／ｋｇ／日〜２００Ｕ／ｋｇ／日、３Ｕ／ｋｇ／日〜１００Ｕ／ｋｇ／日、３Ｕ／ｋｇ／日〜５０Ｕ／ｋｇ／日、３Ｕ／ｋｇ／日〜２５Ｕ／ｋｇ／日、３Ｕ／ｋｇ／日〜１５Ｕ／ｋｇ／日、３Ｕ／ｋｇ／日〜１０Ｕ／ｋｇ／日、３Ｕ／ｋｇ／日〜５Ｕ／ｋｇ／日、５Ｕ／ｋｇ／日〜２００Ｕ／ｋｇ／日、５Ｕ／ｋｇ／日〜１００Ｕ／ｋｇ／日、５Ｕ／ｋｇ／日〜５０Ｕ／ｋｇ／日、５Ｕ／ｋｇ／日〜２５Ｕ／ｋｇ／日、５Ｕ／ｋｇ／日〜１５Ｕ／ｋｇ／日、または５Ｕ／ｋｇ／日〜１０Ｕ／ｋｇ／日の範囲で、ＥＰＯまたはそのフラグメントもしくはアナログを投与することによって実施される。なおさらなる実施形態において、被験体における神経学的状態の重篤度を予防するかまたは神経学的状態の重篤度を低減するための本発明の方法は、３Ｕ／ｋｇ／日、５Ｕ／ｋｇ／日、１０Ｕ／ｋｇ／日、１５Ｕ／ｋｇ／日、２０Ｕ／ｋｇ／日または２５Ｕ／ｋｇ／日で、ＥＰＯまたはそのフラグメントもしくはアナログを投与することによって実施される。世界保健機構によって規定されそして本明細書中で使用されるＥＰＯの単位は、ＥＰＯ活性の１．２国際単位と等価である。
【０１００】
本発明の方法は、被験体に、ＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログを投与する工程をさらに包含する。このようなＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログは、一般的に、０．５ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｎｇ／ｋｇ／日で、被験体に投与される。特定の実施形態において、本発明の方法は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、またはこれらの因子の１つのアナログの活性フラグメントのようなＩＧＦを、１ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、１ｎｇ／ｋｇ／日〜２５０ｎｇ／ｋｇ／日、１ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、１ｎｇ／ｋｇ／日〜５０ｎｇ／ｋｇ／日、１ｎｇ／ｋｇ／日〜２０ｎｇ／ｋｇ／日、１ｎｇ／ｋｇ／日〜１０ｎｇ／ｋｇ／日、５ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、５ｎｇ／ｋｇ／日〜２５０ｎｇ／ｋｇ／日、５ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、５ｎｇ／ｋｇ／日〜５０ｎｇ／ｋｇ／日、５ｎｇ／ｋｇ／日〜２０ｎｇ／ｋｇ／日、５ｎｇ／ｋｇ／日〜１０ｎｇ／ｋｇ／日、１０ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、１０ｎｇ／ｋｇ／日〜２５０ｎｇ／ｋｇ／日、１０ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、１０ｎｇ／ｋｇ／日〜５０ｎｇ／ｋｇ／日、１０ｎｇ／ｋｇ／日〜２０ｎｇ／ｋｇ／日、２０ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、２０ｎｇ／ｋｇ／日〜２５０ｎｇ／ｋｇ／日、２０ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、２０ｎｇ／ｋｇ／日〜５０ｎｇ／ｋｇ／日、３０ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、３０ｎｇ／ｋｇ／日〜２５０ｎｇ／ｋｇ／日、３０ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｎｇ／ｋｇ／日、３０ｎｇ／ｋｇ／日〜５０ｎｇ／ｋｇ／日、５０ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、５０ｎｇ／ｋｇ／日〜２５０ｎｇ／ｋｇ／日または５０ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｎｇ／ｋｇ／日の範囲で、投与することによって実施される。他の実施形態において、本発明の方法は、５ｎｇ／ｋｇ／日、１０ｎｇ／ｋｇ／日、２０ｎｇ／ｋｇ／日、２５ｎｇ／ｋｇ／日、３０ｎｇ／ｋｇ／日、または５０ｎｇ／ｋｇ／日のＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログを投与することによって実施される。
【０１０１】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、１ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｎｇ／ｋｇ／日、５ｎｇ／ｋｇ／日〜２００ｎｇ／ｋｇ／日、または１０ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｎｇ／ｋｇ／日の範囲で投与されるＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログと組み合わせて、ＥＰＯ、またはその活性フラグメントもしくはアナログを、１Ｕ／ｋｇ／日〜１００Ｕ／ｋｇ／日、１〜５０Ｕ／ｋｇ／日、１Ｕ／ｋｇ／日〜１５Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜１００Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜５０Ｕ／ｋｇ／日、２Ｕ／ｋｇ／日〜１５Ｕ／ｋｇ／日、３Ｕ／ｋｇ／日〜１００Ｕ／ｋｇ／日、３Ｕ／ｋｇ／日〜５０Ｕ／ｋｇ／日、または３Ｕ／ｋｇ／日〜１５Ｕ／ｋｇ／日の範囲で投与することによって実施される。
【０１０２】
ＥＰＯ、またはその活性フラグメントもしくはアナログ、およびＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログの投与は、一般的に、薬学的組成物で、被験体に投与される。ＥＰＯおよびＩＧＦは、同じかまたは別々の薬学的組成物で投与され得、そしてさらに同時にまたは任意の順序で、同じかまたは異なる投与経路で投与され得ることが理解される。本発明において有用な薬学的組成物は、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログ、あるいはＩＧＦまたはその活性フラグメントもしくはアナログ、あるいは両方を、それぞれ、例えば、約０．０００１％〜約０．１％（重量／容積）の濃度範囲で含むが、２０００Ｕ／ｋｇのＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを超えない。本発明の方法において有用な薬学的組成物は、さらに、鼻内投与に適切な組成物を含む薬学的組成物を調製するために当該分野で周知の賦形剤を含有し得る。本発明において有用な薬学的組成物としては、アルブミンのようなキャリアタンパク質を含有する組成物が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例として、本発明の薬学的組成物は、約０．１％〜０．４％のキャリアタンパク質（例えば、アルブミン）を含み得る。
【０１０３】
薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア（投与された場合に、実質的に長期または永久的に有害な影響を有さない任意のキャリアである）を含む。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、水（例えば、蒸留水または脱イオン水）；生理食塩水；および他の水性媒体が挙げられるが、これらに限定されない。活性成分は、可溶であり得るかまたは適切なキャリア中で懸濁液として送達され得ることが理解される。
【０１０４】
保存剤または張度調整剤は、所望の場合、本発明において有用な薬学的組成物中に含まれ得る。有用な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、および硝酸フェニル水銀が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用な張度調整剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムのような塩、マンニトールまたはグリセリン、および他の薬学的に受容可能な張度調整剤が挙げられる。
【０１０５】
ｐＨを調整するための種々の緩衝液および手段は、得られる調製物は、薬学的に受容可能であるという条件で、本発明において有用な薬学的組成物を調製するために使用され得る。このような緩衝液としては、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液およびホウ酸塩緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。酸または塩基が、必要な場合、組成物のｐＨを調整するために使用され得ることが理解される。本発明において有用な薬学的に受容可能な酸化防止剤としては、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソール、およびブチル化ヒドロキシトルエンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
種々の投与経路が、投与されるポリペプチドまたはアナログのサイズおよび特性、ならびに処置される被験体の病歴、危険因子および症状に一部依存して、本発明において有用であり得る。本発明の方法に適切な投与経路としては、全身投与および局所投与の両方が挙げられる。特定の実施形態において、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログは、経口投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、硝子体内投与、経強膜（ｔｒａｎｓｃｌｅｒａｌ）投与、鼻内投与、髄腔内投与または硬膜外投与、あるいは大脳脳室（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射、または脳室内に外科的に挿入されたシャントによって投与される。さらなる実施形態において、ＩＧＦ−Ｉまたはその活性フラグメントもしくはアナログは、経口的、静脈内的、鼻内的、髄腔内的、硬膜外的、あるいは脳室注射または脳室内に外科的に挿入されたシャントによって投与される。
【０１０７】
本発明の方法において有用な投与経路としては、制限なしに、経口送達、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮拡散および電気泳動、局所的点眼および軟膏、眼周囲および結膜下注射を含む眼内部の注射、局所的に移植された徐放性デバイス（生物学的に侵食され得る（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）移植物またはレザバベースの移植物）を含む徐放性送達デバイスが挙げられる。本発明において有用な移植物は一般的に、より長い時間にわたって、移植された薬学的組成物を放出することが理解される。
【０１０８】
鼻腔内投与は、脳に影響する神経学的状態の重篤度を予防するかまたは低減するための本発明の方法において有用であり得る。このような状態としては、脳虚血、脳卒中、低酸素症または無酸素症、頭部への力学的な外傷、ＨＩＶ関連痴呆（ＡＩＤｓ痴呆複合症）、アルツハイマー病またはパーキンソン病、および薬物中毒、薬物耐性および薬物依存性ならびに上に記載したかもしくは当該分野で公知の脳に影響する他の神経障害が挙げられるが、なおこれらに限定されない。１つの実施形態では、ＥＰＯのペプチドまたはペプチド模倣アナログを送達するために、鼻腔内投与が使用される。別の実施形態では、ＩＧＦ−Ｉのペプチドまたはペプチド模倣アナログを送達するために、鼻腔内投与が使用される。さらなる実施形態では、ＥＰＯのペプチドもしくはペプチド模倣アナログおよびＩＧＦ−Ｉのペプチドもしくはペプチド模倣アナログを送達するために、鼻腔内投与が使用される。さらなる実施形態では、鼻腔内に投与されるＥＰＯのペプチドもしくはペプチド模倣アナログは、５０残基、４０残基、３０残基、２５残基、２０残基、１５残基、１２残基もしくは１０残基までの長さを有する。なおさらなる実施形態では、鼻腔内に投与されるＩＧＦのペプチドもしくはペプチド模倣アナログは、５０残基、４０残基、３０残基、２５残基、２０残基、１５残基、１２残基もしくは１０残基までの長さを有する。
【０１０９】
ＥＰＯもしくはＩＧＦ−Ｉまたはこれらの因子の１つのペプチドもしくはペプチド模倣物の鼻腔内投与は、血液脳関門を回避し得、それによって、治療薬剤を脳に送達し得る。例として、Ｌｉｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒ．Ｓｃｉ  １８７：９１〜９７（２００１）は、組換えヒトＩＧＦ−Ｉは、鼻腔内に投与された場合に、局所的な大脳虚血性損傷に対して防御し得ることを示した。鼻腔内投与は、各鼻腔に所望の活性成分を含有する液体物質を吹きつけるために、慣用的な方法（例えば、Ｒｈｉｎｕｌｅ（Ｆｅｒｒｉｎｇ；Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して）により達成され得る（Ｐｉｅｔｒｏｗｓｋｙら、Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．３９：３３２〜２４０（１９９６））。Ｒｈｉｎｕｌｅは、所定の０．２ｍｌの体積の液体物質を鼻腔内に送達することを可能にするチップを一方の端に有する小さい、可撓性のチューブである。点鼻薬（Ｌｉｕら、前出、２００１）の使用を含めた鼻腔内投与のさらなる手段も本発明の方法に包含される。ＥＰＯ、ＩＧＦ−Ｉまたはその両方の鼻腔内処方物は、慣用的な方法により調製され得る。例として、ＩＧＦ−Ｉの鼻腔内処方物は、０．１〜１０％のＩＧＦ−Ｉおよび０．０５重量％〜２．０重量％のカルボキシビニルポリマーを含有し得る。
【０１１０】
本発明の方法のいずれもが、以下でさらに記載するように、神経細胞または神経前駆細胞で、治療的に有用である遺伝子産物をコードする１つ以上の核酸分子を発現させる工程をさらに包含し得る。例として、パーキンソン病の処置について、神経細胞または神経前駆細胞は例えば、カテコールアミン酵素チロシンヒドロキシラーゼをコードする核酸分子を発現し得、それによって、脳内移植でのドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ活性を増強する（Ｊｉａｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：４５０（１９９３）、また、Ｄｈａｗａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１５０９（１９９１）ならびにＢａｒｒおよびＬｅｉｄｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１５０７（１９９１）を参照のこと。）。同様に、アルツハイマー病の処置に関しては、神経細胞または神経前駆細胞は、神経発育因子をコードする核酸分子を発現し得、それによって、アルツハイマー病で代表的に失われるコリン作用性ニューロンの細胞生存を促進する（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１５７５〜１５７８（１９８８））。類似の様式で、難治性疼痛に関する神経障害性疾患の処置のためにエンケファリンを発現させるように神経細胞または神経前駆細胞が操作され得る。当業者は、これらおよび他の組合せが、本発明の方法に含まれることを認識する。
【０１１１】
神経細胞または神経前駆細胞はさらに、１つ以上の抗アポトーシス遺伝子産物（Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬ）ならびにアポトーシスのインヒビター（ＩＡＰ）ファミリーのメンバー（例えば、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、ＸＩＡＰまたはＮＩＡＰ）を制限なく含む）を発現するように、操作され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１８：５１（１９９７）、Ｇｒｏｓｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１８９９〜１９１１（１９９９）およびＤｅｖｅｒａｕｘおよびＲｅｅｄ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２３９〜２５２（１９９９））。
【０１１２】
本発明の任意の方法において、神経細胞または神経前駆細胞は、必要に応じて、細胞生存を促進するために処置され得る。１つの実施形態では、成熟神経細胞は、ｐ３８インヒビターで処理される。別の実施形態では、神経細胞もしくは神経前駆細胞は、カスパーゼ活性を阻害するために、処理される。種々のカスパーゼインヒビター（例えば、核酸、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物および非ペプチドインヒビター（例えば、当該分野で公知の低分子薬剤）が、本発明において有用である。本明細書で使用される場合、用語「カスパーセインヒビター」とは、１つ以上のカスパーゼに結合し、その活性を阻害する任意の分子を意味する。本発明の方法において有用なカスパーゼインヒビターは一般的に、細胞透過性であり、かつインビボで阻害活性を有し、ウイルス遺伝子産物および細胞遺伝子産物ならびに合成インヒビター（例えば、合成低分子）を含む（Ｅｋｅｒｔら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６：１０８１〜１０８６（１９９９））。
【０１１３】
カスパーゼインヒビターは、一般的な（非選択的な）カスパーゼインヒビターであり得るか、または選択的カスパーゼインヒビターであり得る。選択的インヒビターは、非カスパーゼシステインプロテアーゼまたは非カスパーゼセリンプロテアーゼを阻害しないインヒビターである。非選択的カスパーゼインヒビターはまた、１つ以上の非カスパーゼプロテアーゼインヒビターを阻害し、これには、例えば、システインプロテアーゼインヒビターであるヨードアセトアミドが挙げられる。カスパーゼインヒビターはまた、１つ以上の特異的カスパーゼに対して選択的であり得る。カスパーゼインヒビターは、カスパーゼ−３もしくはカスパーゼ−７またはこれらの組合せを選択的に阻害し得、例えば、本明細書で開示されたかまたは当該分野で公知である、ＥＰＯもしくはＩＧＦの任意の形態またはこれらの活性フラグメントもしくはアナログと組合され得る。カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７に対する選択的カスパーゼインヒビターとしては、非ペプチドインヒビター（例えば、イサチンスルホンアミド）が挙げられる（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１６００７〜１６０１４（２０００）を参照のこと）。選択的カスパーゼインヒビターはまた、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７もしくはカスパーゼ−８またはこれらの任意の組合せに対して選択的であり得、そして、例えば、任意の形態のＥＰＯおよびＩＧＦと組合せられ得る。
【０１１４】
カスパーゼインヒビターは、例えば、カスパーゼ−１および−８を阻害するサイトカイン反応修飾物質Ａ（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ａ）（ＣｒｍＡ）ポリペプチド、またはコード核酸分子、あるいはカスパーゼ−１、−３、−６、−７、−８および−１０を阻害するが、非カスパーゼシステインプロテアーゼもしくはセリンプロテアーゼを阻害しないｐ３５バキュロウイルスタンパク質、またはコード核酸分子であり得る（Ｃｌｅｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１３８８〜１３９０（１９９１））。カスパーゼインヒビターはまた、アポトーシスタンパク質のインヒビター（ＩＡＰ）であり得るかまたはコード核酸分子であり得る。本発明の方法におけるカスパーゼインヒビターとして有用なＩＡＰとしては、ＸＩＡＰおよびサバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）が挙げられる。
【０１１５】
カスパーゼインヒビターはまた、合成カスパーゼインヒビター（例えば、１つ以上のカスパーゼの可逆性もしくは不可逆性競合インヒビターとして作用する偽基質）であり得る。活性部位模倣ペプチドケトンは、例えば、選択的カスパーゼインヒビターとして有用である。このようなカスパーゼインヒビターとしては、例えば、ベンジルカルボニル（ｚ）−ＶＡＤ−フルオロメチルケトン（ｆｍｋ）、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ／クロロメチルケトン（ＣＭＫ）、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ／ｃｍｋおよびｚ−Ｄ−ｃｍｋが挙げられる。さらなるカスパーゼインヒビターとしては、ハロメチルケトン結合ペプチド  ＹＶＡＤ、Ａｃ−ＷＥＨＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ、ｔ−ブトキシカルボニル−ＩＥＴＤ−ＣＨＯおよびｔ−ブトキシカルボニル−ＡＥＶＤ−ＣＨＯが挙げられる（Ｅｋｅｒｔら、前出、１９９９）。当業者は、これらおよび当該分野で公知の他のカスパーゼインヒビターが、本発明の方法に有用であることを理解する。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８１０〜８１６（２０００）；ＷＯ  ００／５５１１４およびＧａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３２６０８〜３２６１３（１９９８）を参照のこと。
【０１１６】
本明細書に開示されるように、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログは、鼻腔内投与の後、血液脳関門を通過し得、それにより、好ましくない全身作用（例えば、ヘマトクリットの増加）を回避し得る。特に、鼻腔内に適用され、放射標識されたＥＰＯは、嗅覚組織に移動し、吻側遊走流（ｒｏｓｔｒａｌ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒｅａｍ）（ＲＭＳ）で観察される。さらに、オートラジオグラフィーは、放射標識されたエリスロポエチンが、鼻腔内に適用された場合、脳組織に蓄積したことを示した。これらの結果は、鼻腔内投与が、エリスロポエチンを送達するために使用され得、その活性フラグメントおよびアナログを、吻側遊走流によって脳に送達するために使用され得ることを示す。これらの結果はさらに、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログの鼻腔内投与が、慢性的な全身性エリスロポエチン投与に付随する副作用を回避しながら神経症状（例えば、脳卒中または神経変性症状）を処置するために有用であり得ることを示す。
【０１１７】
従って、本発明は、被験体に、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを鼻腔内投与し、それによって神経症状の重篤度を予防するかまたは低減することによって、被験体の神経症状の重篤度を予防するかまたは低減する方法を提供する。１つの実施形態において、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログは、最大で２０００Ｕ／ｋｇの用量で投与される。
【０１１８】
エリスロポエチンの種々の形態ならびにその活性フラグメントおよびアナログが、本発明の方法で、鼻腔内に投与され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ＥＰＯまたはその活性フラグメントの鼻腔内投与により（例えば、ヒトＥＰＯもしくはその活性フラグメントの鼻腔内投与により）実行される。別の実施形態において、本発明の方法は、ＥＰＯアナログ（これは、制限なしに、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または核酸ＥＰＯアナログ）の鼻腔内投与により実行される。さらなる実施形態では、本発明の方法は、アミノ酸配列ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）、ＧＧＤＹＨＣＲＭＧＰＬＴＷＶＣＫＰＬＧＧ（配列番号８）、ＧＧＶＹＡＣＲＭＧＰＩＴＷＶＣＳＰＬＧＧ（配列番号９）、ＶＧＮＹＭＣＨＦＧＰＩＴＷＶＣＲＰＧＧＧ（配列番号１０）、ＧＧＬＹＬＣＲＦＧＰＶＴＷＤＣＧＹＫＧＧ（配列番号１１）またはＧＧＣＲＩＧＰＩＴＷＶＣＧＧ（配列番号１２）を含むＥＰＯアナログの鼻腔内投与により実行される。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明の方法は、ＥＰＯレセプターに対して、天然のヒトＥＰＯより少なくとも１０倍高い親和性を有するＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはそのアナログの鼻腔内投与により実行される。別の実施形態において、本発明の方法は、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはそのアナログ（これらは、オリゴマー（例えば、二量体のオリゴマー）である）の鼻腔内投与により実行され得る。例として、このようなＥＰＯの二量体形態は、それぞれの単量体がアミノ酸配列  ＧＧＴＹＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫＰＱＧＧ（配列番号７）を含む二量体であり得る。さらなる実施形態では、本発明は、天然のヒトＥＰＯの半減期より長い半減期を有するＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはそのアナログあるいは天然のヒトＥＰＯと比較して高グリコシル化したＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはそのアナログ（例えば、Ｄａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎ）を用いて実施される。ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはそのアナログの鼻腔内投与に関する本発明の任意の実施形態では、例えばＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはそのアナログの半減期を延長するために、可溶性ＥＰＯレセプターが必要に応じて含まれ得る。
【０１２０】
任意の種々の急性および慢性の神経性状態は、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログを本発明の方法で経鼻投与することより処置され得ることが理解される。このような神経性状態としては、例えば、発作および神経変性障害が挙げられる。ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログの経鼻投与に依存する本発明の方法は、神経性状態（例えば、限定されないが、発作、頭および脊髄の外傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、運動障害、痴呆、ＨＩＶ関連痴呆、前側頭部痴呆、ＨＩＶ関連神経障害、慢性疼痛、神経障害性疼痛、偏頭痛、緑内障、薬物添加、薬物の停止、薬物依存、鬱および不安症）の重篤度を予防または低減するために有用であり得る。当業者は、これらおよび他の急性および慢性の神経性状態が、本発明の方法に従って、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログの経鼻投与によって処置され得ることを理解する。
【０１２１】
鼻腔内投与は、ＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログが、賦活薬もしくはＲｈｉｎｕｅｌｅのような機械的デバイス（Ｐｉｅｔｒｏｗｓｋｙら、前出、１９９６）を用いてか、または用いずに、鼻腔を介して導入される任意の方法によって達成され得る。当業者は、他の経鼻処方物（Ｓｈｉｍｏｄａら（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１８．７３４−７３９（１９９５））に記載されるようなポリマーおよび処方物を含む）がそうであり得るように、点鼻薬が経鼻投与に有用であり得ることを理解する。
【０１２２】
本発明はまた、神経前駆細胞をＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログに接触させることによって、神経前駆細胞を分化させ、富化された神経細胞集団を産生させる方法、および、神経前駆細胞をＩＧＦ−Ｉまたはその活性フラグメントもしくはアナログに接触させ、それによって、神経前駆細胞を分化させて、少なくとも７０％のニューロンを含む富化された細胞集団を産生する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも８０％のニューロン、少なくとも９０％のニューロン、または少なくとも９５％のニューロンを含む富化された細胞集団を産生する。所望の場合、神経前駆細胞は、さらに分化誘導剤（例えば、レチノイン酸）と接触させられ得る。特定の実施形態において、本発明は、最大２０００  Ｕ／ｍｌ、１５００  Ｕ／ｍｌ、１０００  Ｕ／ｍｌ、７５０  Ｕ／ｍｌ、５００  Ｕ／ｍｌ、２５０  Ｕ／ｍｌ、１００  Ｕ／ｍｌまたは５０  Ｕ／ｍｌの濃度のＥＰＯまたはその活性フラグメントもしくはアナログと神経前駆細胞を接触させることによって実施される。
【０１２３】
本発明の方法において有用な神経前駆細胞は、例えば、ヒト幹細胞、胚性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）；または造血性神経前駆細胞（例えば、ヒト造血性幹細胞）であり得る。本発明の方法において有用な神経前駆細胞はまた、限定されないが、ＣＤ１３３陽性（ＡＣ１３３陽性）；ＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陽性；ＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陰性；ＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陰性／ＣＤ４５陰性；ＣＤ３４陰性／ＣＤ３８陰性／Ｌｉｎ陰性またはＣＤ３４陽性／ＣＤ３８陰性／Ｌｉｎ陰性／Ｔｈｙ−１陰性のヒト神経前駆細胞から選択され得る。
【０１２４】
神経前駆細胞を分化させるための本発明の方法は、さらに、ＭＥＦ２ポリペプチドまたはその活性フラグメントをコードする核酸分子を、神経前駆細胞に導入する工程を包含し得る。このようなＭＥＦ２ポリペプチドは、例えば、ヒトＭＥＦ２Ｃまたはその活性フラグメントであり得、そしてさらに、所望の場合、恒常的に活性なＭＥＦ２ポリペプチド（例えば、ＭＥＦ２／ＶＰ１６融合タンパク質）または、ＭＥＦ２のトランス活性化ドメインに１つ以上のセリン／スレオニンからアスパラギン酸／グルタミン酸への置換を含む恒常的に活性なＭＥＦ２ポリペプチドであり得る。本発明の方法はまた、所望の場合、カスパーゼ活性を阻害するか、保護因子（例えば、ミノサイクリンまたは別のテトラサイクリン誘導体）で処置するか、または、例えば、神経前駆細胞中でＢｃｌ−ＸＬファミリーメンバーを発現させて、引き続く移植の間の生存を延長する工程を包含し得る。
【０１２５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＭＥＦ２ポリペプチド」は、転写活性因子としての活性に加えて、ＭＥＦ２  ＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドを意味し、実質的にＭＥＦ２Ａ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＥＦ２ＣまたはＭＥＦ２Ｄのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。従って、ＭＥＦ２ポリペプチドは、例えば、実質的に、ヒトＭＥＦ２Ａ；ヒトＭＥＦ２Ｂ；ヒトＭＥＦ２Ｃ；またはヒトＭＥＦ２Ｄのアミノ酸配列を有し得る。ＭＥＦ２ポリペプチドは、ＭＡＤＳドメイン、ＭＥＦ２ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。ＭＥＦ２ポリペプチドのＭＡＤＳドメインとＭＥＦ２ドメインが天然に存在するＭＥＦ２ポリペプチド（例えば、ヒトＭＥＦ２Ｃ）のＭＡＤＳドメインおよびＭＥＦ２ドメインと構造が類似する一方、ＭＥＦ２ポリペプチドの転写活性化ドメインは構造的には無関係であり得、例えば、合成の転写活性化ドメインまたは、例えば、ＶＰ１６もしくはＧＡＬ４由来の異種の転写活性化ドメインであり得ることが理解される。当業者は、ＭＥＦ２  ＤＮＡ結合活性と転写活性を保持するＭＥＦ２ポリペプチドのフラグメントがまた、本発明の方法において有用であり得ることを理解する。
【０１２６】
用語「ＭＥＦ２ポリペプチド」は、天然に存在するヒトＭＥＦ２Ａポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号  ＮＭ  ００５５８７）、天然に存在するヒトＭＥＦ２Ｂポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号  ＮＭ  ００５９１９）、天然に存在するヒトＭＥＦ２Ｃポリペプチド  （ＧｅｎＢａｎｋ登録番号  Ｌ０８８９５）、または天然に存在するヒトＭＥＦ２Ｄポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号  ＮＭ  ００５９２０）の配列を有するポリペプチドを包含し、そして、実質的に、これらのポリペプチドのうちの１つと類似するアミノ酸配列を有する関連ポリペプチドを包含することが意図される。このような関連ポリペプチドは、代表的に、ｈＭＥＦ２Ａ、ｈＭＥＦ２Ｂ、ｈＭＥＦ２ＣまたはｈＭＥＦ２Ｄに対して、他のＭＡＤＳボックスタンパク質（例えば、血清応答因子（ＳＲＦ））より高い配列類似性を示し、ヒトのＭＥＦ２Ａ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＥＦ２ＣおよびＭＥＦ２Ｄの種ホモログ（例えば、霊長類、マウス、ラットおよびＤ．ｒｅｒｉｏのホモログ）、選択的スプライシング形態およびアイソタイプ改変体を含む。
【０１２７】
ＭＥＦ２経路の誘導はまた、ＭＥＦ２ポリペプチドの増加した発現もしくは活性を生じる低分子であるか、または、ＭＥＦ２機能の模倣物であるＭＥＦ２活性化因子を用いて達成され得る。ＭＥＦ２活性化因子は、１つ以上のＭＥＦ２ポリペプチドの増加した発現もしくは活性を生じ得、例えば、ＭＥＦ２Ａ、ＭＥＦ２ＢまたはＭＥＦ２Ｄの発現もしくは活性に影響を及ぼすことなく、ＭＥＦ２Ｃの発現もしくは活性の増加を生じ得る。このようなＭＥＦ２活性化因子は、有機化学物質、薬物、核酸分子、ペプチド、ペプチド模倣物、ポリペプチドまたは他の天然に存在するか、天然には存在しない有機分子であり得、そして、例えば、ＭＥＦ２模倣物であり得る。例示的なＭＥＦ２活性化因子は、ＭＥＦ２発現をアップレギュレートする転写因子であり、ＭＥＦ２インヒビターへの結合に競合する分子（例えば、Ｃａｂｉｎ１、ヒストンデアセチラーゼインヒビター（ＶＸ−５６３（Ｖｅｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含むがこれらに限定されない）、およびＭＥＦ２ポリペプチドを活性化するキナーゼ（例えば、ｐ３８α））である。ＭＥＦ２活性化因子が、本明細書中で開示される本発明の方法のいずれにおいても有用であり得ることが理解される。
【０１２８】
種々の分化誘導剤（例えば、レチノイン酸が挙げられる）が、必要に応じて本発明の方法において有用であり、そして、本発明の方法において有用な他の分化誘導剤としては、神経栄養性因子３、上皮増殖因子、ＩＧＦ−Ｉ、血小板由来増殖因子および、ｃＡＭＰを増加させる他の因子が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２９】
神経細胞を分化させるための本発明の方法は、必要に応じて、ＥＰＯおよびＩＧＦ経路を誘導するように処理された細胞を被験体に移植する工程を包含する。本発明の方法において、細胞は、例えば、脳、眼（網膜）または神経の損傷または障害の後には脊髄に移植され得る。従って、ＥＰＯおよびＩＧＦ経路を誘導するように処理された細胞は、例えば、発作または神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病；ハンチントン病；筋萎縮性側索硬化症；パーキンソン病；てんかん、脳または脊髄の外傷；多発性硬化症；視神経障害（例えば、緑内障、黄斑変性症、または光誘発網膜変性症（例えば、光受容体変性症））；中枢神経系の感染；脳を冒す多系統萎縮症；あるいは、別の急性または慢性の神経変性状態の危険を有する被験体に移植され得る。移植の際に、細胞は、分化し始めるか、または、分化を継続して、保護された神経細胞を含む細胞集団を産生する。
【０１３０】
細胞は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５．１４１０−１４１２（１９９９）に記載され、Ｄｕｎｎｅｔｔら、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５３：７５７−７７６（１９９７）にまとめられているように、ニューロンを移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）または「移植（ｇｒａｆｔ）」するための周知の方法を用いて、例えば、眼、脳または脊髄内に、被験体に移植され得る。例えば、シクロスポリンＡ処置を用いて、拒絶を予防または改善するための方法がまた、当該分野で公知である。
【０１３１】
当業者は、ＥＰＯ経路を誘導する工程、ＩＧＦ経路を誘導する工程、そして、必要に応じて、神経前駆細胞を分化誘導剤に接触される工程が、任意の順序で、または、同時に実施され得ることを理解する。ＥＰＯ経路およびＩＧＦ経路が誘導されている神経前駆集団が、神経前駆細胞の神経細胞への分化の前、分化の間または分化の後に被験体に移植され得ることが、さらに理解される。１つの実施形態において、細胞は、分化の前または分化の間に移植される。細胞が分化の前に移植される場合、適切な環境の合図の存在に起因して、神経環境が細胞を所望の神経細胞型へと駆動し得る。上記を鑑みて、分化はインビトロもしくはインビボで生じ得るか、または、部分的にインビトロで、そして部分的にインビボで生じ得ることが明らかである。
【０１３２】
神経細胞に関して本明細書中で使用される場合、用語「保護された」は、ＥＰＯ経路およびＩＧＦ経路が誘導されていないか、またはこれらの経路が少ない程度に誘導されている細胞よりも、損傷、アポトーシスまたは細胞死に対して抵抗性である細胞を意味する。従って、保護された神経細胞を含む集団は、「保護された」神経細胞を含まない集団と比べて、減少したアポトーシスを示し得る。アポトーシスの程度を決定するためのアッセイは、上記のように、当該分野で公知である。
【０１３３】
本発明の方法が、保護された神経細胞を含み、そして、細胞集団の大部分が神経性である集団を産生するために使用され得ることが理解される。例えば、本発明の方法は、例えば、少なくとも５０％の神経細胞を含む細胞集団を産生するために使用され得る。他の実施形態において、産生される集団は、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多い神経細胞を含む。神経細胞の比率は、１つ以上の特徴的な神経マーカー（例えば、ＮｅｕＮ、神経フィラメントまたはＭＡＰ２の存在）についてアッセイすることによって決定され得る。
【０１３４】
神経前駆細胞を分化させるための本発明の方法は、所望の場合、神経前駆細胞を分化誘導剤に接触させる工程を包含し得る。本明細書中で使用される場合、用語「分化誘導剤」は、天然に存在するか、または合成のサイトカイン、増殖因子または神経前駆細胞に１つ以上の神経細胞の特徴を持たせるか、または増強する他の化合物を意味する。本発明において有用な分化誘導剤は、例えば、レチノイン酸（例えば、全てトランスのレチノイン酸；神経栄養性因子３（ＮＴ３）；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ＥＰＯ；ＩＧＦ−Ｉ；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）またはこれらの因子の２つ以上の組み合せであり得る。例えば、ＥＧＦ、ＩＧＦ−ＩおよびＰＤＧＦは、分化誘導剤として一緒に使用され得る。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）または、前駆細胞の分化を増強する別の因子が、必要に応じて、分化誘導剤（例えば、ＥＧＦ、ＩＧＦ−ＩおよびＰＤＧＦ）での処理の前に使用され得る。当業者は、所望の場合、脳由来の神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）のような１つ以上の因子がまた、神経細胞生存を促進するために添加され得ることを理解する。神経前駆細胞はまた、分化を促進する１つ以上の因子（例えば、ＭＥＦ２、ｎｅｕｒｏＤ、ｎｅｕｒｏＤ２、ｎｅｕｒｏＤ３、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ１、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３、ＭＡＴＨ１またはＭＡＴＨ２（Ｌｅｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．７：１３−２０（１９９７））が挙げられる）を発現させるために操作され得る。このような因子は、外因性の分化誘導剤の適用の代わりにか、または、それに加えて発現され得る。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、用語「神経前駆細胞」とは、ニューロンではないが、適切な条件下でニューロンに分化し得る任意の細胞を意味する。神経前駆細胞は、多能性または単能性であり得、幹細胞、前駆細胞、始原細胞または樹立細胞であり得る。幹細胞のような神経前駆細胞は、一般に、これらがニューロンマーカー（例えば、核タンパク質ＮｅｕＮ、神経フィラメントおよび微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２））ならびに成熟ニューロンに特徴的なニューロン様プロセスを欠くという点で、ニューロンと区別され得る。位置実施形態において、神経前駆細胞は、始原細胞であり、これは、生物に直接由来し、かつ培養物中で制限された増殖能を有する細胞について、当該分野で周知である。
【０１３６】
本発明で有用な神経前駆細胞は、多能性または単能性であり得る。本明細書中で神経前駆細胞に関して使用される場合、用語「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」とは、「多潜在能力（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」と同義語であり、２つ以上の別個の系統（ニューロン系統を含む）に分化し得る神経前駆細胞を意味する。一般に、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）陽性細胞である多能性神経前駆細胞（例えば、幹細胞)は、一般にＨｕ陽性細胞である単能性前駆細胞と区別される。ネスチンおよびＨｕの発現は、例えば、十分に確立された免疫細胞化学的方法によって決定され得る。多能性神経前駆細胞は、少なくとも３つ以上、４つ以上、または５つ以上の別個の系統（ニューロン系統を含む）に分化し得る。
【０１３７】
本明細書中で使用される場合、用語「幹細胞」とは、適切な条件下で分化して、全ての細胞系統を生じ得る多能性細胞型を意味する。したがって、幹細胞は、神経細胞、造血細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、生殖細胞および全ての他の細胞系統に分化する。幹細胞は、胚性幹細胞であり得る。用語「造血幹細胞」が使用される場合、この用語は、造血系統に方向付けられているが、造血系統の全ての細胞に分化し得る細胞を指すことが理解される。
【０１３８】
本明細書中で使用される場合、用語「胚性幹細胞」は、「ＥＳ細胞」と同義語であり、分化して全ての細胞系統を生じ得る胚に由来する多能性細胞型を意味する。ヒト胚性幹細胞を示す細胞マーカーの例としては、Ｏｃｔ−４転写因子、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ  １−６０およびＧＣＴＭ−２エピトープが挙げられる。分化神経細胞を示す細胞マーカーの例としては、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９−４０４（２０００）；ＧｈｏｓｈおよびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎｅｕｒｏｎ  １５：８９−１０３（１９９５）；Ｂａｉｎら，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：３４２−３５７（１９９５）（１９９５）；ならびにＷｉｌｌｉａｍｓら，Ｎｅｕｒｏｎ  １８：５５３−５６２（１９９７）に記載されるように、神経フィラメントタンパク質、β−チューブリン、Ｍａｐ２Ａ＋ｂ、シナプトフィシン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、ＴｕＪ１、ＳＮＡＰ  ２５、転写因子Ｂｒｎ−３およびＧＡＢＡＡα２レセプターサブユニットが挙げられる。
【０１３９】
本発明の方法において有用な胚性幹細胞は、種々の供給源から得られ得る。胚性幹細胞は、例えば、マウス、ウシ、霊長類およびヒトから、当該分野で周知の方法によって得られ得る。例として、マウス胚細胞は、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７５１４−７５１７（１９９１）、またはＢａｉｎら，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：３４２−３５７（１９９５）に記載されるようにして、マウスから単離され得る。簡単に述べると、２段階細胞胚を、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの注射後約４５時間で、授精雌性マウスから単離する。２つの分割球を電気インパルスによって融合し、そして４細胞期に達するまで、Ｍ１６培地中で培養する。ＥＳ細胞を、ゼラチン被覆組織培養フラスコで、高グルコースおよび１ｍＭ  グルタミン（ＢＲＬ）（１０％ウシ胎仔血清、１０％  仔ウシ血清、ヌクレオシド、１０００単位／ｍｌ  白血病抑制因子、および０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを補充）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地)中で増殖させる。
【０１４０】
胚性幹細胞はまた、Ｔｈｏｍｓｏｎ（米国特許第５，８４３，７８０号）に記載されるように、霊長類から単離され得る。簡単に述べると、胚盤胞を、授精した雌性サルから、排卵開始の６〜８日後に取り出し、プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理して、透明帯、ウサギ抗アカゲザル脾臓細胞抗血清およびモルモット相補体（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を取り出し、そしてＤＭＥＭ中で洗浄する。内部細胞塊（ＩＣＭ）をピペットを用いて、溶解した胚盤胞から取り出し、そしてマウスγ線照射胚性繊維芽細胞上にプレーティングする。７〜２１日後、このＩＣＭ由来する塊を、マイクロピペットを用いて取り出し、０．０５％  トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および１％  ニワトリ血清で処理し、そして胚フィーダー細胞上に再びプレーティングする。ＥＳ形態（核  対  細胞質の高い比、および高い核小体を有する小型のコロニーによって特徴付けられる）を示すコロニーを継代する。これらのＥＳ細胞を、例えば、トリプシン処理、または培養物が密になる場合には、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水に１〜２週間おきに曝露することによって、分裂させる。
【０１４１】
胚性幹様細胞はまた、Ｃｉｂｅｌｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６４２−６４６（１９８８）に記載されるように、ウシから単離され得る。簡単に述べると、卵母細胞を、新たに屠殺したウシから取り出し、そして成熟培地Ｍ１１９（Ｇｉｂｃｏ）、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５μｇ／ｍｌウシロイチン化（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン（Ｎｏｂ１）および１０μｇ／ｍｌ  ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）中に、３８．５℃で２２時間置く。続いて、卵母細胞を、インビトロで授精させ、そしてこれらが胚盤胞期に達するまで、マウス胚性繊維芽細胞フィーダー層およびＣＲ２上で、６ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡと共に培養する。２２ゲージ針を用いて透明帯および栄養膜を機械的に取り出すことによって、ＥＳ細胞を胚盤胞から単離し、そして１週間、マウス胚性繊維芽細胞フィーダー層下に置く。培養物が密になった場合、残りの細胞塊の小さいコロニーを取り出し、そしてγ線照射したマウス胚繊維芽細胞フィーダー層上で培養する。
【０１４２】
胚幹細胞はまた、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（前出）２０００に記載されるように、ヒト胚盤胞から単離され得る。簡単に述べると、授精した卵母細胞を、胚盤胞期まで培養し、そして透明帯をプロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）で消化する。内部細胞塊を、抗ヒト血清抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いる免疫手術、およびモルモット相補体（ＢＲＬ）への曝露によって取り出し、そしてＤＭＥＭ（ＢＲＬ）（２０％  ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１％  非必須アミノ酸、２ｍＭ  グルタミン、５０単位ｒ／ｍｌ  ペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ＢＲＬ）、ならびに２，０００単位／ｍｌ  組換え白血病抑制因子を補充）中、マイトマイシンＣ有糸分裂不活性化マウス胚フィーダー細胞層上で培養する。細胞塊を、マイクロピペットを用いて取り出し、そして６〜８日おきに、新たなフィーダー層上に再びプレーティングする。
【０１４３】
ヒト幹細胞は、例えば、臍帯血から単離され得、この臍帯血は、始原細胞を多く含み、そしてＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陽性集団を含む。これらの細胞は、当該分野で周知の方法（例えば、Ｍｉｌｔｉｎｙｌ  ＭＡＣＳシステム）によって効率的に単離され得る。所望の場合、このＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陽性集団は、Ｆｌｔ３Ｌ＋ＴＰＯとともにインビトロで培養することによって増殖し、長期培養ポテンシャルにおいて１６０倍程度の増加、および神経前駆細胞の数において、２×１０６倍の増加を生じ得る。
【０１４４】
本発明で有用なヒト神経前駆細胞としては、ヒト胚幹細胞、ヒト造血幹細胞および成体ヒト血液からまたは新生児の臍帯血から単離された他の神経前駆細胞が挙げられる。神経前駆細胞集団は、例えば、ＣＤ１３３（ＡＣ１３３）陽性／ＣＤ３４陽性またはＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陰性の神経前駆細胞中に多く含まれ得る。このような富化された神経前駆細胞は、例えば、磁気細胞分離装置、傾向励起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）、または以下でさらに記載されるような当該分野で周知の関連の方法を用いて単離され得る。ヒト幹細胞のような神経前駆細胞のインビトロ増殖は、所望の場合、１つ以上の以下の因子：ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ｆｌｔ３Ｌ、ＬＩＦ、ＩＬ−１１、ＴＧＦ−β、ＴＰＯおよびｂＦＧＦ（これらは例えば、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＮＭ）およびＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から市販されている）の存在下で実施され得ることがさらに理解される。増殖のための種々のプロトコールおよび特定の因子の有用な濃度は、当該分野で周知である。
【０１４５】
ヒト神経前駆細胞は、例えば、末梢血から得られ得る。ドナーは、組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）（例えば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ａｍｇｅｎ；Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ））、または組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）（例えば、Ｌｅｕｋｉｎｅ（Ｉｍｍｕｎｅｘ；Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ））、あるいはこれら両方で処理され得る。ヒト神経前駆細胞は、ＣＤ３４＋、Ｔｈｙ−／ｄｉｍ、ＣＤ３８−として特徴付けられる始原細胞であり得、これは所望ならば、長期培養ポテンシャルを増加するようにＧ−ＤＳＦまたはＢＭ−ＣＳＦで処理されたドナーから得られ得る。アフェレーシスは、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせでの処理の４〜５日後に、白血球を収集するために使用され得、一般に、体重１ｋｇあたり４×１０６個のＣＤ３４陽性細胞を生じる。
【０１４６】
Ｃｅｌｌｐｒｏ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）から市販されるＣｅｐｒａｔｅ  ＳＣ免疫親和性カラムを使用して、ＣＤ１３３陽性神経前駆細胞集団を単離し得る。所望の細胞集団は、カラムマトリクスに結合したビオチン結合体化抗体を介してこのカラムマトリクスに結合し、そして機械的振盪によって遊離される。Ｃｅｐｒａｔｅ  ＳＣ免疫親和性を使用して、１６〜９９％の純度を有する約５０％のＣＤ３４陽性細胞を得ることができる。ＣＤ１３３陽性ヒト神経前駆細胞はまた、例えば、Ｉｓｏｌｅｘ  ３００磁気細胞分離装置（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を使用して単離され得、これはマウスモノクローナルＩｇＧ１抗体および抗マウスＩｇＧ１抗体で被覆した磁気ビーズを基にるす。ペプチダーゼ処理による前駆細胞の放出は、３３〜１００％の純度を有する約５０％のＣＤ３４陽性細胞を生じる。
【０１４７】
ヒト幹細胞および他の神経前駆細胞を単離するためのさらなる当該分野で受け入れられた手順としては、磁気細胞分離システム（ＭＡＣＳ）（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）から市販）、および蛍光励起細胞分離法装置（ＦＡＣＳ）が挙げられる。ＭＡＣＳ分析分離システムにおいて、二次抗体で被覆された小さい磁気ビーズが一次抗体で処理した細胞に結合し、そして強力な磁石によって強常磁性マトリクスカラムに保持される。細胞は、磁石の解放によって放出されて、所望の細胞の５０％より上の回収率および９０％より上の純度を与える。蛍光励起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）は、周知の方法であり、それにより細胞は、蛍光体結合体化抗体の結合によって選択されて、回収された幹細胞または他の神経前駆細胞の９０％より上の純度を与える。所望の場合、単離された幹細胞または他の神経前駆細胞は、例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６８２−６８６（１９９９）に記載されるように、当該分野で周知の方法を使用して、致死量以下で照射された非肥満性糖尿病／重篤な複合型免疫不全（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウスの骨髄を再構築（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）する能力についてアッセイされ得る。
【０１４８】
ヒトＣＤ３４陰性骨髄細胞（例えば、ＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陰性細胞またはＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陰性／Ｌｉｎ陰性細胞）は、本発明の方法において有用であり得る。このような細胞は、例えば、ＣＤ３４陰性／Ｌｉｎ陰性細胞であり得、これは間質細胞の特徴を有し得、かつ致死量以下の照射後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄を再構築し得る。特定のマーカーが富化した神経前駆細胞集団を調製する方法は、当該分野で周知である。例として、ＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陽性造血幹細胞および他の神経前駆細胞が、Ｙｉｎら，Ｂｌｏｏｄ  ９０：５００２−５０１２（１９９７）；に記載されるようにして調製され得；ＣＤ１３３陽性／ＣＤ３４陰性／ＣＤ４５陰性神経前駆細胞は、例えば、Ｕｃｈｉｄａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９７：１４７２０−１４７２５（２０００）に記載されるようにして調製され得；そしてＣＤ３４陰性／ＣＤ３８陰性／Ｌｉｎ陰性性ヒト造血幹細胞およびＣＤ３４陰性／ＣＤ３８陰性／Ｌｉｎ陰性／Ｔｈｙ−１陰性造血幹細胞は、例えば、Ｂｈａｔｉａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１０３８−１０４５（１９９８）に記載されるようにして調製され得る。
【０１４９】
本発明の方法において、胚幹細胞のような神経前駆細胞は、ニューロン経路に沿ったこの細胞の分化を誘導するために、分化剤と接触され得る。細胞の増殖によって、胚肝細胞を高密度まで分化するための方法は、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら，前出、２０００に記載される。マイトジェン（例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の存在下で、最初に増殖させ、次いで、ｂＦＧＦを除去することにより、増殖したＣＤＳ細胞を分化させる方法は、Ｊｏｈｅら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：３１２９−３１４０（１９９６）に記載される。増殖因子の添加による神経発生の誘導は、Ｊｏｈｅら，前出，１９９６に記載されるように、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢ）をｂＦＧＦの非存在下で投与して達成され得る。ニューロン分化の誘導はまた、繊維芽細胞増殖因子−２の除去、その後のインシュリン様増殖因子−１、ヘパリンまたはニューロトロフィン−３の添加（Ｂｒｏｏｋｅｒら，Ｊ．Ｎｅｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５９：３３２−３４１（２０００）およびＧｈｏｓｈおよびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎｅｕｒｏｎ  １５：８９−１０３（１９９５）に記載）；血小板増殖因子の添加（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｎｅｕｒｏｎ  １８：５５３−５６２（１９９７）に記載）；インシュリン様増殖因子−１の、単独または脳由来神経栄養因子と組合わせての添加（ＡｒｓｅｎｉｊｅｖｉｃおよびＷｅｉｓｓ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：２１１８−２１２８（１９９８）に記載）；ならびにレチノイン酸への曝露（Ｂａｉｎら，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：３４２−３５７（１９９５）に記載）によって達成され得る。
【０１５０】
以下の実施例は、本発明を限定するのではなく、例示することを意図する。
【実施例】
【０１５１】
（実施例Ｉ）
（ＩＧＦ−Ｉと組合わせたＥＰＯによるＭＮＤＡ誘導性神経毒性の改善は、神経毒性傷害前のプレインキュベートを必要としない）
本実施例は、神経毒性障害時におけるＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの同時適用が、ＭＮＤＡに曝露されたラット始原大脳皮質培養物における成熟ニューロンのアポトーシスを効果的に減少させることを実証する。
【０１５２】
ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの投与の神経保護効果を、ラット始原大脳皮質培養物におけるＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉでの個々の処理と比較した。この培養物を２００μｌＭのＮＭＤＡと共に２０分間インキュベートすることにより、以前に報告されたように（Ｂｏｎｆｏｃｏら，前出，１９９５）、混合ニューロン／グリア培養物中のニューロンにおいてのみ、死が誘導された。
【０１５３】
ニューロンのアポトーシスを、ＴＵＮＥＬ反応性（これは集中した形態と共に、アポトーシスを示す）についての二重標識、およびニューロン特異的タンパク質微小管結合タンパク質−２（ＭＡＰ２）によって、ＮＭＤＡ傷害の１６時間後に定量した。図３に示されるように、ＮＭＤＡへの２０分間の軽い曝露は、７６±７％のＭＡＰ２標識ニューロンにおいて、アポトーシスの出現およびＴＵＮＥＬ反応性を生じた。全ＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）またはＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）の単独と共に３時間プレインキュベートすることにより、ニューロンアポトーシスは有意に減じられた（ｐ＜０．０５）。アッセイされたＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの用量は、用量応答曲線から以前に決定されているように（Ｈｅｃｋら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：９８２８−９８３５（１９９９）；ならびにＤｉｇｉｃａｙｌｉｏｇｌｕおよびＬｉｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４１２：６４１−６４７（２００１））、これらの因子の最大有効濃度を現わす。ＮＭＤＡ曝露なしでのＩＧＦ−ＩまたはＥＰＯとのコントロールインキュベーションは、ニューロンの生存度に影響を与えなかった。
【０１５４】
予期されるように、ＮＭＤＡ傷害時における個々のＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉでのニューロンの処理は、細胞死を有意には減少しなかった（図３を参照のこと）。対照的に、ＮＭＤＡ曝露時にＩＧＦ−Ｉと共にＩＰＯを適用することは、単独または一緒にのいずれかで両方の因子と共に３時間プレインキュベートした場合とほぼ同程度、アポトーシスの予防において有効であった。特に、ニューロンアポトーシスにおける適度（５〜１０％）の減少は、ＥＰＯ単独またはＩＧＦ−Ｉ単独のいずれかにおいて観察され、一方、５０％のニューロンアポトーシスは、ＮＭＤＡ傷害時におけるＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの併用処理を用いた場合に抑制された。これらの結果は、ＩＧＦ−ＩおよびＥＰＯによって活性化されるシグナル伝達経路が、いずれかの因子が他方の非存在下で媒介するよりも迅速な神経保護を粗億進するために終結することを示す。これらの結果はさらに、ＩＧＦ−ＩおよびＥＰＯが協働して急性の神経保護を媒介することを示す。
【０１５５】
これらの実験について、混合ニューロン／グリア大脳皮質培養物を、以前に記載されるようにして調製した（Ｂｏｎｆｏｃｏら，前出，１９９５；Ｌｅｅら，Ｎｅｕｒｏｎ  ８：１０８７−１０９９（１９９２）；およびＬｉｐｔｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：６２６−６３２（１９９３））。簡単に述べると、胚日数１６のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット由来の皮質組織を、０．５％のトリプシン中で分離させ、そして血清含有培地中３５ｍｍ培養皿あたり１０５細胞の密度で、ポリ−Ｌ−リジン被覆カバーガラス上にプレーティングした。実験で使用する前に、大脳皮質ニューロンを３７℃、５％  ＣＯ２で、少なくとも１７日間維持し、ＮＭＤＡレセプターを完全に発現指せた（Ｌｅｉら，前出，１９９２；およびＬｉｐｔｏｎら，前出，１９９３）。
【０１５６】
ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉのインキュベーションを、実質的に以下のようにして実施した。ヒト組換えＥＰＯ（Ａｍｇｅｎから購入）（Ｅｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｆａ，２０００ＩＵ／ｍｌ）を、細胞培養培地中で希釈して、最終濃度５〜１０Ｕ／ｍｌにした。インシュリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を細胞培養培地中で希釈して、最終濃度５０〜１００ｇ／ｍｌにした。
【０１５７】
ＮＭＤＡのインキュベーションを以下のようにして実施した。大脳皮質培養物を、名目上Ｍｇ２＋を含まない平衡化塩溶液（ＥＢＳＳ）中２００μｌＭのＮＭＤＡ（１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２および５μＭ  グリシンを含む)に２０分間曝露した。ＮＭＤＡ曝露の後、培養物をＥＢＳＳで洗浄し、次いで、０．２μＭ  Ａｃｒｏｄｉｓｋフィルター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ｍａ）で濾過して活性化された小膠細胞を除去した組織培養馴化培地に配置した。示される場合、ＥＰＯ、ＩＧＦ−ＩまたはＥＰＯとＩＧＦ−Ｉの両方をこの馴化培地に加えた。
【０１５８】
アポトーシスを起こした神経細胞の検出を、本質的に以下のように実施した。実験的インキュベーション後、大脳皮質培養物を、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．７ｍＭ  第一リン酸ナトリウム、９．１ｍＭ第二リン酸ナトリウム）で固定し、そして１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で透過処理した。アポトーシス細胞を、アポトーシス検出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いるＴＵＮＥＬを使用して、凝縮した形態によって同定した。培養物を、ＦＩＴＳ標識化１２−ｄＵＴＰを使用して製造業者のプロトコルに従って標識し、ＤＮＡ鎖破壊を可視化した。
【０１５９】
大脳皮質培養物における神経細胞アポトーシスを特に評価するために、神経細胞を、ＮＭＤＡ損傷１６時間後にＴＵＮＥＬ反応性およびＭＡＰ２について二重標識した。ＭＡＰ−２染色を、基本的に、Ｂｕｄｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９７：６１６１−６１６６（２０００）に記載されるように実施した。アポトーシスを神経細胞を、カメラおよびデコンヴォルーションについてのソフトウェアを備えたＺｅｉｓｓ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ顕微鏡（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ；  Ｄｅｎｖｅｒ，  ＣＯ）を用いて同定した。
【０１６０】
（実施例ＩＩ）
（ＰＩ３−キナーゼは、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉによる神経保護効果について調節される）
本実施例は、ＰＩ３キナーゼが、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの神経保護効果を媒介する役割を担い得ることを実証する。
【０１６１】
ＰＩ３−キナーゼは、ＩＧＦ−ＩおよびＥＰＯのシグナル伝達に関連する（Ｍａｙｅｕｘら、前出、１９９３；Ｋｅｒｍｅｒら、前出、２０００；およびＤａｍｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２３４０２−２３４０８（１９９５））。ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの神経保護効果におけるＰＩ３−キナーゼの役割を解明するために、ラット大脳皮質神経細胞を、１０μＭ  ＬＹ２９４００２、特異的Ｐ１３−キナーゼインヒビターの存在下または非存在下において、ＩＧＦ−Ｉ（ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ）と組み合せて、ＥＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、またはＥＰＯとともに３時間プレインキュベートした。図４に示されるように、ＮＭＤＡ曝露（２００μＭ  ＮＭＤＡおよび５μＭグリシン、２０分間）から生じた神経細胞アポトーシスは、ＥＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、またはＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉとともにプレインキュベーションした細胞において減少した。図４においてさらに示されるように、ＬＹ２９４００２は、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉのいずれか単独か、もしくはそれらの組み合わせの神経保護効果をなくす（ｐ＜０．０５）が、大脳皮質培養物における神経細胞アポトーシスを起こしもせず、ＮＭＤＡにより誘導されたアポトーシスの量を増加させもしなかった。これらの結果は、ＰＩ３−キナーゼ活性がＥＰＯ媒介性神経保護およびＩＧＦ−Ｉ媒介性神経保護にとって必要であることを示す。
【０１６２】
ＰＩ３キナーゼ阻害について、上記のように、培養物を調製し、そしてＮＭＤＡ単独と共に、またはＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉのそれぞれと共に、またはＩＧＦ−Ｉと組合わせたＥＰＯと共にインキュベートした。ＰＩ３キナーゼ活性を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ）に溶解され、示される増殖因子の添加の３０分前にこの培養物に添加された、１０μＭ  ＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、薬理学的に阻害した。ニューロンアポトーシスを、上記のように、ＴＵＮＥＬ陽性でもあるＭＡＰ２陽性細胞の割合を決定することによって、ＮＭＤＡ適用の１６時間後にアッセイした。
【０１６３】
ＰＩ３キナーゼを、ｐ８５調節サブユニットのリン酸化（これは触媒性サブユニットの抄出を誘導する）によって活性化する（Ｐｌｅｉｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：１６０９−１６１２（１９９４））。ＥＰＯがＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットのリン酸化を誘導するか、ＩＧＦ−Ｉがこれを誘導するかを決定するために、ラット大脳皮質培養物を、ＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉで１０、２０または３０分間処理し、これらの培養物由来のタンパク質溶解物を、ホスホ−ｐ８５の存在についてイムノブロッティングすることによって分析した。図５Ｂに示されるように（上側および下側のパネル）、両方の因子が、ｐ８５リン酸化を時間依存性の様式で誘導した。しかし、ＩＧＦ−Ｉのインキュベーションは、１０分後にＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットの最大のリン酸化を生じ、一方、ＥＰＯ誘導性のリン酸化は、２０〜３０分後に観察された。等しいタンパク質負荷を、二次抗体を用いて全ｐ８５の量を分析することによって確認した。これらの結果は、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉが、ＰＩ３キナーゼのｐ８５調節サブユニットのリン酸化を誘導し、ＩＧＦ−Ｉの活性化がより迅速に生じることを示す。
【０１６４】
マウスインターロイキン−３依存性細胞株ＤＡ−３において、リガンド型ＥＰＯレセプター（ＥＰＯ−Ｒ）は、ＰＩ３キナーゼと直接会合することが示されている（Ｄａｍｅｎら、前出、１９９５；Ｈｅら、Ｂｌｏｏｄ  ８２：１６０９−０６１２（１９９３））。ＥＰＯレセプターへのＥＰＯの結合が始原ニューロンにおけるＰＩ３−キナーゼ／ＥＰＯ−Ｒ相互作用を促進するか否かを決定するために、ＥＰＯ−Ｒ複合体を、大脳皮質培養溶解物（これは未処理であるか、またはＥＰＯで５分または１９分間処理されている）から免疫沈降した。免疫沈降タンパク質のブロットを、ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットを認識する抗体を用いてプローブし（図５Ａ、上）、そして等しいタンパク質負荷を、抗ＥＰＯ−Ｒ抗体を用いるプロービングによって確認した（図５Ａ、下）。図５Ｂに示されるように、ＥＰＯとの軽いインキュベーション（５〜１０分間）は、ＥＰＯ−ＲとＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットとの間の会合を促進した。しかし、ＥＰＯが存在しない場合、非常に低いレベルのｐ８５／ＥＰＯ−Ｒ複合体しか検出されなかった。これらの結果は、ニューロンＥＰＯ−Ｒへのリガンドの結合が、ＰＩＥキナーゼとこのレセプターとの会合を促進すること、ならびにこの会合がＰＩ３キナーゼのリン酸化および活性化を生じ得ることを示す（ＳｃｈｅｉｄおよびＷｏｏｄｇｅｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：７６０−７６８（２００１））。
【０１６５】
イムノブロッティングまたは免疫沈降のための全細胞抽出物の調製を、本質的に以下のように行った。培養物を、冷ＰＢＳで簡単に洗浄した。氷冷した溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．１ｍＭＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  オルト−バナジン酸塩、０．１％  デオキシコール酸塩）の添加後、細胞を、培養皿から掻き取った。溶解液を、マイクロ遠心チューブに移し、４℃で１５秒間ボルテックスし、４℃で２０分間、１４０００×ｇで遠心分離して精製した。タンパク質濃度を、ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して決定した。
【０１６６】
イムノブロッティングを、以下のように実行した。全タンパク質（３０ｍｇ）を、ＭＯＰＳ電極緩衝液を使用して、還元条件下で１０％  ＮｕＰａｇｅ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上で分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に、３時間、電気ブロットした。非特異結合を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．５）中５％無脂肪乾燥乳との室温で１時間のインキュベーションによって、ブロックした。ブロック後、ブロットを、ブロッキング緩衝液で希釈した適切な一次抗体と共に、４℃で一晩インキュベートした。抗ＥＰＯ−Ｒ（Ｒ  ＆  Ｄ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を、１：２００の希釈で使用し、抗ｐ８５（Ｕｐｓｔａｔｅ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を１：４００の希釈で使用した。一次抗体インキュベーションの後、膜を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水で、１０分間、３回交換して洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，１：４００）と共に、室温で１時間インキュベートし、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有のＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水で再び洗浄した。ブロットを、Ａｍｅｒｓｈａｍから購入した増強化学発光キットを用いて現像し、そしてＸ線フィルムに曝した。
【０１６７】
事前精製した（ｐｒｅｃｌｅａｒｅｄ）全細胞溶解物を使用して、免疫沈降を行った。この溶解物を２μｇの抗ＥＰＯ−Ｒ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）と共に室温で１時間インキュベートし、次に、タンパク質Ａ／Ｇ−セファロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を添加した。免疫沈降を、上述のようにＳＤＳゲル上で行い、そして適切な抗体でプローブした。ローディングコントロールとして、ブロットを剥がして、示した一次抗体および適切な二次抗体で再プローブした。
【０１６８】
（実施例ＩＩＩ）
（ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとは、ＡＫＴを活性化することにおいて協働する）
この実施例は、Ａｋｔキナーゼが、神経細胞において、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとによって協調的に活性化され得ることを実証する。
【０１６９】
Ａｋｔ−キナーゼは、３’リン脂質のＰＩ３−キナーゼ−媒介性産生の下流で活性化される。ホスホジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェートの産生への応答において、Ａｋｔは、２つの重要な部位、すなわち、セリン−４７３およびトレオニン−３０８（Ｒｕｓｓｅｌｌら，Ｎｕｅｒｏｂｉｏｌ．３６：４５５−４６７（１９９８）；ＳｃｈｅｉｄおよびＷｏｏｄｇｅｔｔ，前出，２００１）で、リン酸化される。
【０１７０】
Ａｋｔキナーゼの潜在的な活性化を評価するため、大脳皮質培養物を、ＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉに３時間曝し、そしてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからの抗ホスホＡｋｔ（抗ｐＡｋｔ）抗体および抗Ａｋｔ抗体を１：２０００希釈で用いて、上述のように免疫ブロットした。ＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉとの３時間のインキュベーションは、穏やかなＡｋｔ活性化をもたらした。このことは、ウエスタンブロッティングにより、増加したホスホ−セリン−４７３  Ａｋｔ検出によって証明された（図６Ａ）。ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの共インキュベーションは、ホスホ−セリン−４７３  Ａｋｔをずっと大幅に増加した。さらに、ＮＭＤＡへの２０分の暴露により、Ａｋｔリン酸化の構成的レベルが低下したが、これは、ＥＰＯをＩＧＦ−Ｉと共に用いたＡｋｔリン酸化を阻害しなかった。総Ａｋｔ（抗Ａｋｔ抗体で再プローブすることにより測定した）は、ＥＰＯ／ＩＧＦ−ＩまたはＮＭＤＡのどちらの添加によっても変化しなかった。まとめると、これらの結果は、Ａｋｔのセリン−４７３におけるリン酸化は、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせにより、相乗的に誘導されることを示す。
【０１７１】
上述のように、ラット大脳皮質培養物は、神経細胞および膠細胞の混合物を含む。抗リン酸化Ａｋｔ（セリン−４７３）での二重免疫蛍光標識およびニューロン特異的ＭＡＰ２抗体は、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ処理に応答したＡｋｔ活性化が、主にニューロンにおいて起こることを実証した。ＥＰＯをＩＧＦ−Ｉと共に用いて処理してＮＭＤＡに曝した大脳皮質培養物において、ホスホ−Ａｋｔ標識の上昇が存在し、これは、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉのみで処理した培養物において観察された上昇と類似した。これらの結果は、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉが、神経細胞において、相乗して活性化Ａｋｔを産生することを実証した。
【０１７２】
リン酸化Ａｋｔおよびニューロン特異的マーカーＭＡＰ２の二重免疫蛍光染色を、以下のように実行した。大脳皮質細胞を、氷冷した４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ中で４℃で１０分間固定し、ＰＢＳ中で３回リンスし、そして１％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ中で室温で１０分間透明化処理した。リン酸化Ａｋｔを、１：１０００で希釈した特定のポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とのインキュベーションにより検出し、次いで、１：１２５の希釈のＦＩＴＣ結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で検出した。ＭＡＰ２に対する一次抗体（Ｓｉｇｍａ）およびＴｅｘａｓ−Ｒｅｄと結合した二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ；Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用することにより、ニューロンを同定した。
【０１７３】
（実施例ＩＶ）
（Ａｋｔキナーゼは、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの神経防護作用を媒介する際に役割を果たし得る）
この実施例は、Ａｋｔのドミナントネガティブ形態によるＡｋｔ活性の阻害が、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの神経保護作用を低下することを示す
ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達経路におけるＡｋｔの役割を、ドミナントネガティブＡｋｔ構築物（ｄｎ−Ａｋｔ）を使用して分析した。ここで、重要なリン酸化部位が変異されている（ＦｕｊｉｏおよびＷａｌｓｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１６３４９−１６３５４（１９９９））。大脳皮質培養物を、ｄｎ−Ａｋｔをコードするアデノウイルスベクター（ＦｕｊｉｏおよびＷａｌｓｈ，前出，１９９９）で感染させ、そしてＮＭＤＡのみの効果についてアッセイするか、またはＥＰＯをＩＧＦ−Ｉと共に用いた処理をも行った培養物における効果についてアッセイした。コントロールとして、大脳皮質培養物を、平行して、野生型Ａｋｔ（ｗｔ−Ａｋｔ）をコードするアデノウイルスで感染させた。図７において示すように、ドミナントネガティブＡｋｔまたは野生型Ａｋｔのどちらかでの３６時間の感染は、ニューロンの生存度に有意の効果を有さなかった。ｗｔ−Ａｋｔの過剰発現もまた、ＮＭＤＡに曝された培養物の、ＮＭＤＡ−誘導性アポトーシスまたはＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ媒介性−神経保護において、有意の効果を有さなかった。さらに、ｄｎ−Ａｋｔの過剰発現は、ＮＤＭＡ曝露の結果としてのニューロンアポトーシスに影響しなかった。しかし、ｄｎ−Ａｋｔを発現し、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉと共にインキュベートした大脳皮質培養物は、非感染培養物またはｗｔ−Ａｋｔ感染培養物と比較して、ＮＭＤＡ誘導性ニューロンアポトーシスの有意に高いレベルを示した（ｐ＜０．０１）。ｗｔ−Ａｋｔの過剰発現は、２：１（ｗｔ−Ａｋｔ：ｄｎ−Ａｋｔ）のモル濃度過剰比で同時感染させた場合、ｄｎ−Ａｋｔ発現の前アポトーシス効果を抑止した。このことは、ｄｎ−Ａｋｔ感染細胞において見られる増加したニューロンアポトーシスは、非特異的発現よりもむしろ、ｄｎ−Ａｋｔの特異的発現からもたらされることを示す。つまり、これらの結果は、Ａｋｔリン酸化およびＡｋｔ活性化は、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせにより媒介される神経保護において役割を果たすことを示す。
【０１７４】
上で示した培養物は、調製し、ＮＭＤＡ、ＥＰＯ、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉと組み合わせたＥＰＯで処理し、アポトーシスニューロンの割合を、上述のようにＴＵＮＥＬを形態学およびＭＡＰ−２反応性と共に用いて、決定した。血球凝集素（ＨＡ）タグ化した、リン酸化不能な、Ａｋｔのドミナント−ネガティブ変異体を発現するアデノウイルスベクター（ＦｕｊｉｏおよびＷａｌｓｈ，前出，１９９９）を、Ｄｒ．Ｋ．Ｗａｌｓｈから得た。感染を、１０の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＨＡタグ化野生型Ａｋｔを、コントロールとして使用して実行した。アデノウイルスへの４時間の曝露の後、一次ニューロンを、フィルター濾過事前調整培地において２４〜３６時間培養し、その後、実験に用いた。ウイルスＡｋｔ構築物の発現を、モノクローナル抗ＨＡ抗体（１：１００，Ｒｏｃｈｅ；Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で免疫蛍光標識することにより、確認した。
【０１７５】
（実施例Ｖ）
（ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ処理は、ＮＭＤＡ誘導性カスパーゼ−３活性化を妨げない）
この実施例は、ＥＰＯをＩＧＦ−Ｉと組み合わせた処理は、活性型カスパーゼ−３の存在下で、ＮＭＤＡ誘導性神経毒性を妨げることを実証し、このことは、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ媒介性神経保護が、カスパーゼ−３の下流で起こることを示す。
【０１７６】
興奮毒性用量のＮＭＤＡに短時間曝した大脳皮質培養物において、ミトコンドリアシトクロムｃが放出され、その後、内因性カスパーゼ経路が活性化される（Ｂｕｄｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：６１６１−６１６６（２０００）；ＹｕａｎおよびＹａｎｋｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８０２−８０９（２０００））。構成的活性型Ａｋｔは、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−３の下流のシトクロムｃ放出を妨げ（Ｚｈｏｕら，前出，２０００）、このことは、Ａｋｔが、内因性カスパーゼカスケードを調節する重要な因子であることを示す（Ｋｅｒｍｅｒら，前出，２０００もまた、参照のこと）。
【０１７７】
カスパーゼ活性化の際のＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉインキュベーションを、ＮＭＤＡ傷害後、大脳皮質細胞において分析した。大脳皮質培養物を、ＥＰＯのＩＧＦ−Ｉと併用した同時投与を行うかまたは行わずにＮＭＤＡに曝露し、そして培養物を、ＮＭＤＡ曝露の６時間後、１２時間後、１６時間後、または４８時間後に固定した。カスパーゼ−３活性化を、カスパーゼ−３の活性型のみを認識する抗体を使用した免疫検出によって評価した。結果は、多くのＭＡＰ２標識化ニューロンが、その縮合核において、ＮＭＤＡ曝露の１６時間後の速さでカスパーゼ−３活性型を発現し、そしてＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ処理は、ＮＭＤＡによるカスパーゼ−３の初期活性化を妨げないことを示した。しかし、ＥＰＯ−ＩＧＦ−Ｉ処理したニューロンは、活性型カスパーゼ−３に対する免疫応答性の低下を示し、そのプロセスにおいて、ＭＡＰ２標識を失わなかった。処理後のニューロンの生存度の延長は、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせによって媒介される神経保護が、少なくとも一部、代表的にＮＭＤＡ傷害の１６時間以内のニューロンアポトーシスに関連する初期カスパーゼ−３活性化の下流で生じることを意味する（Ｔｅｎｎｅｔｉら，前出，１９９８，Ｂｕｄｄら，前出，２０００）。
【０１７８】
これらの実験について、ニューロンリッチな大脳皮質培養物を、それらが固定されるまで、ＮＭＤＡ曝露の時間（２０分について２００μＭ）、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉ（それぞれ１０Ｕ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ）に連続的に曝露した。免疫蛍光アッセイを上記のように行い、１：１００希釈を使用して、活性カスパーゼ３を発現するニューロンを、カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の切断形態について特異的なモノクローナル抗ＭＡＰ２抗体およびポリクローナル抗体を用いて二重標的化することによって同定した。
【０１７９】
延長した神経保護効果がＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合せ処理によって媒介されるか否かを決定するために、生存している大脳皮質ニューロンの数を、ＮＭＤＡ曝露後、種々の間隔で測定した。生存可能なＭＡＰ２ポジティブ細胞の全数をアッセイし、より長い生存時間に見られる第２の壊死の効果を回避した（Ｂｏｎｆｏｃｏら、前出、１９９５）。図８Ａに示されるように、ＮＭＤＡのみの曝露は、生存するニューロンの数の劇的な減少を生じた。ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合せた適用は、ＮＭＤＡ曝露の６時間後、１２時間後、１６時間後および４８時間後での神経細胞死を防止した。これらの結果は、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉが、いずれかの因子単独で観察されるよりも、延長したＮＭＤＡ曝露の後の長期の神経細胞の生存を支持することを証明する。
【０１８０】
一次培養物を調製し、そして上記のようにＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉを含むか含まないＮＭＤＡとインキュベートした。神経細胞の生存を、全数のＭＡＰ２ポジティブ細胞としてアッセイし、第２の壊死の見分けのつかない効果を避けた。この第２の壊死は、より遅い時点で起こり得、そしてアポトーシス細胞の数を混乱させる（Ｂｏｎｆｏｃｏら、前出、１９９５）。
【０１８１】
混合した大脳皮質培養物において、ＥＰＯは、ＸＩＡＰおよびｃ−ＩＡＰ（カスパーゼ３タンパク質分解活性を阻害し得る２つの関連する因子）の発現を誘導することが公知である（ＤｉｇｉｃａｙｌｉｏｇｌｕおよびＬｉｐｔｏｎ，前出，２００１；およびＨｏｌｃｉｋおよびＫｏｒｎｅｌｕｋ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：５５０−５５６（２００１））。ここで、大脳皮質培養物を、ＸＩＡＰと活性カスパーゼ３との会合に対するＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合せ処理の効果について分析した。培養物を、ＥＰＯ、ＩＧＦ−ＩおよびＮＭＤＡとインキュベートし、そしてカスパーゼ３の活性形態の免疫沈降の後、免疫沈殿物を、ウェスタンブロッティングを使用してＸＩＡＰの存在についてプローブした。図８Ａに示されるように、活性カスパーゼ３を、培養したニューロン中でＸＩＡＰと会合させ、そしてＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉでの処理は、活性カスパーゼ３と会合したＸＩＡＰの相対量を増加した。特に、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉで１６時間処理した培養物において、濃度測定分析は、活性カスパーゼ３に結合するＸＩＡＰの２．５〜３倍の量の増加を示したが（図８Ｃ参照）、ＮＭＤＡ曝露単独はまた、活性カスパーゼ３と会合したＸＩＡＰの適度に増加した量を生成した。ニューロンにおける活性カスパーゼ３／ＸＩＡＰ複合体の存在は、タンパク質分解的な切断によるカスパーゼ３の活性化の後、活性化形態が、ＸＩＡＰとの会合によってネガティブに調節され得ることを示す。
【０１８２】
カスパーゼ３のタンパク質分解活性に対する組み合せたＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ処理の効果を研究するために、タンパク質溶解物を、ＮＭＡＤ曝露の１６時間後の大脳皮質培養物から調製し、そしてカスパーゼ３活性を、蛍光カスパーゼ３基質（ＤＥＶＤ−７−アミノ−４−トリフルオロメチル−クマリン（ＤＥＶＤ−ＡＦＣ））を使用してアッセイした。図８Ｄは、溶解物中のＸＩＡＰの基本レベルの存在にもかかわらず、ＮＭＤＡ曝露は、ＤＥＶＤ切断の増加を生じたことを証明した。ＩＧＦ−Ｉと組み合せたＥＰＯの同時の適用またはＩＧＦ−Ｉと組み合せたＥＰＯとの３時間のプレインキュベーションは、ＸＩＡＰ発現の増加により、カスパーゼ３様活性のＮＭＤＡ誘導増加を減少させた。従って、カスパーゼ３活性の減少は、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉと共にプレインキュベートした培養物におけるｄｎ−Ａｋｔの感染によって特に阻害された（図８Ｄ）。これらの結果は、Ａｋｔが神経細胞カスパーゼ３のタンパク質分解活性の調節において役割を果し得ることを示す。
【０１８３】
これらの実験を行うために、大脳皮質培養物を、上記のように、ＮＭＤＡまたはＥＰＯとＩＧＦ−Ｉに曝露するか、またはＮＭＤＡおよびＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉに連続的に曝露した。培養溶解物の免疫沈降を、上記のように、安全性を事前に保証した（ｐｒｅｃｌｅａｒ）全細胞溶解物を使用して行い、１：１００希釈のカスパーゼ３の切断形態を特異的に認識する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と室温にて１時間インキュベートし、次いで、プロテインＡ／Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを添加し、そして免疫沈降した。この免疫沈降物を、電気泳動によって分離し、そしてニトロセルロース膜に転写し、これを１：２００希釈の抗ＸＩＡＰ抗体を用いてブロットした（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。
【０１８４】
カスパーゼ３（ＤＥＶＤ）切断アッセイを、上記のように行った。手短に言えば、大脳皮質培養物を、冷却した緩衝液（１０％スクロース、０．１％ＣＨＡＰＳ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む）に溶解した。細胞タンパク質抽出物（２００μｇ）を、３０分間３７℃にて、８０μＭのカスパーゼ３ペプチド基質ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，ＣＡ）と共にインキュベートした。カスパーゼ３活性によって放出された遊離の蛍光性ＡＦＣを、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ２蛍光計で、４００ｎｍ  励起および５０５ｎｍ発光で測定した。
【０１８５】
ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合せた処理によって影響された延長した生存が、混合した大脳皮質培養物中の非神経細胞によって媒介されるか否かを決定するために、一次培養物を、非神経細胞の増殖を阻害する条件下で増殖した。図８Ｅに示されるように、相対的に純粋な神経細胞培養物をまた、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合せ処理によってＮＭＤＡ誘導アポトーシスから保護した。これらの結果は、非神経細胞が、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合せ処理の神経保護の利益に必要でないことを示す。まとめると、これらの結果は、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合せ処理が、ニューロン特有のシグナル伝達経路によってカスパーゼ３活性に続く神経細胞の生存を促進することを示す。
【０１８６】
相対的に純粋な神経細胞培養物を、混合した神経細胞／グリア培養物の調製と同じ様式であるが、以下の改変を用いてラット皮質から調製した。培養培地を、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｂ２７補充物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む）でプレーティングした２日後に再配置した。次いで、この培養物を、さらに１５〜１６日間維持した；この培養物は、９５％より多いニューロンから構成された（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２９９６−３００６（１９９９））。
【０１８７】
上で提供された括弧または他の方法中の、全ての学術論文、参考文献および特許引用物は、以前に述べられていてもいなくても、それらの全体において本明細書中に参考として援用される。
【０１８８】
本発明は、上記の実施例に参照を用いて記載されるが、種々の改変は、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】図１は、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。（Ａ）ヒトＥＰＯ（Ｇｅｎｂａｎｋ  受託番号  Ｘ０２１５７，バージョン  Ｘ０２１５７．１）のヌクレオチド配列（配列番号１）。コード配列は、成熟ＥＰＯをコード配列番号１のヌクレオチド２６３〜７６３を含む、配列番号１のヌクレオチド１８２〜７６３を示す。（Ｂ）ヒトＥＰＯの対応するアミノ酸配列（配列番号２）。残基１〜２７は、シグナル配列を作り、残基２８〜１９３は、成熟ヒトＥＰＯを構成する。（Ｃ）成熟ヒトＥＰＯのアミノ酸配列（配列番号３）。
【図２】図２は、ヒトインシュリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の核酸配列および対応するアミノ酸配列を示す。（Ａ）ヒトＩＧＦ−Ｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ  受託番号  Ｘ００１７３，バージョン  Ｘ００１７３．１）のヌクレオチド配列（配列番号４）。コード配列は、配列番号４のヌクレオチド１２〜４７３を示す。（Ｂ）ヒトＩＧＦ−Ｉの対応するアミノ酸配列（配列番号５）。残基１〜２１は、シグナル配列を構成し；残基２２〜４８は、プロペプチドを構成し；残基４９〜１８は、成熟ＩＧＦ−Ｉを構成し；残基１１９〜１５３は、カルボキシ末端プロペプチドを構成する（ドメインＥ）。（Ｃ）成熟ヒトＩＧＦ−Ｉ（配列番号６）は、図式的に示される。
【図３】図３は、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの同時投与が、脳内のＮＭＤＡレセプター、グルタミン酸レセプターに作用する興奮毒Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）によって、誘発された神経細胞のアポトーシスを改善することを示す。このレセプターの過剰刺激は、過剰のＣａ２＋の流入、続くフリーラジカル（一酸化窒素および活性酸素種）の形成を可能にすることによって、幅広い急性神経障害または慢性神経障害を、少なくとも一部において媒介する。培養されたラット大脳皮質細胞を、ＮＭＤＡ（２００μｌＭ）とともに２０分間インキュベートした（アポトーシスを起こした神経細胞死を誘発すると公知である範例である）（Ｂｏｎｆｏｃｏ  ら、ＰＮＡＳ  ９２：７１６２−７１６６（１９９５）；Ｂｕｄｄら、ＰＡＮＡＳ  ９７：６１６１−６１６６（２０００））。ＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）およびＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、ＮＭＤＡ曝露の３時間前または曝露と同時に適用した。アポトーシスを起こした神経細胞を、ＮＭＤＡ曝露の１６時間後にＴＵＮＥＬで同時標識した、ＭＡＰ２陽性細胞のパーセンテージで表す。この図および以下の図において、結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３〜５）である。ｐ＜０．００５  ＮＭＤＡに対するＡＮＯＶＡ（＊）またはＮＭＤＡおよびＥＰＯまたはＩＧＦ−Ｉの同時添加に対するＡＮＯＶＡ（†）。
【図４】図４は、ＰＩ３キナーゼの阻害が、組み合わせたＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉ処理による抗アポトーシス効果を無効にすることを示す。大脳皮質培養物を、３時間ＥＰＯ、ＩＧＦ−Ｉ、またはＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉとともにインキュベートする（このとき細胞は、ＮＭＤＡ曝露に供した）前に、１０μＭ  ＬＹ２９４００２（灰色の棒）に３０分間さらした。神経細胞のアポトーシスは、ＴＵＮＥＬ陽性でもあるＭＡＰ２陽性細胞のパーセンテージを決定することによって、ＮＭＤＡ曝露の１６時間後に評価した。＊、ｐ＜０．０５または†、ｐ＜０．０１  同処理およびＬＹ２９４００２に対するＡＮＯＶＡ。
【図５】図５は、ＰＩ３キナーゼを介する、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの各シグナルを示す。（Ａ）ＥＰＯを用いた処理は、ＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットとＥＰＯ−Ｒとの結合を引き起こす。大脳皮質細胞を、５Ｕ／ｍｌまたは１０Ｕ／ｍｌのＥＰＯを用いて、３０分間刺激した。ＥＰＯ−Ｒを、全細胞の溶解産物から免疫沈降し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。次いで、このブロットを、抗ＥＰＯ−Ｒ抗体を用いてプローブし、ストリップし、抗ｐ８５抗体を用いて再ブロットした。（Ｂ）大脳皮質細胞を、示された時間の間、ＥＰＯ（５Ｕ／ｍｌ、上方パネル）またはＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ、下方パネル）を用いて刺激した。全細胞の溶解物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で泳動し；ブロットを、抗ホスホｐ８５抗体を用いてプローブし、ストリップし、次いで抗ｐ８５抗体を用いて再プローブした。
【図６】図６は、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせ処理が、Ａｋｔリン酸化を引き起こすことを示す。混合させたラットの神経細胞／グリア大脳皮質培養物を、ＮＭＤＡ（２００μＭ）の同時適用をともなうか、あるいはともなわずにＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉの両方を用いて、２０分間処理した。血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）（１００μｌ／ｍｌ）を用いて１０分間にわたって刺激したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、陽性のコントロールとして扱った。３時間後、細胞を溶解し、全細胞溶解産物を、抗ホスホ−Ａｋｔ抗体を用いて、免疫ブロット分析にかけ；このブロットを除去し、抗Ａｋｔ抗体を用いて、再プローブした。
【図７】図７は、Ａｋｔが、ＥＰＯとＩＧＦ−Ｉとの組み合わせ処理によって媒介される神経保護に寄与することを示す。大脳皮質培養物を、Ａｋｔの野生型（ｗｔ）形態またはドミナントネガティブ（ｄｎ）形態をコードするアデノウイルスベクターに、４時間さらした。他の培養物を、ｗｔ  Ａｋｔおよびｄｎ  Ａｋｔを用いて、１：１または２：１のモル比（ｗｔ−Ａｋｔ：ｄｎ−Ａｋｔ）で同時感染させた。３６時間後、細胞を、ＮＭＤＡ（２００μＭ）の同時適用をともなうか、あるいはともなわずにＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉの両方とともにインキュベートした。さらに１６時間後、ＴＵＮＥＬに対して陽性に染色した細胞（アポトーシスを起こした細胞を同定するため）およびＭＡＰ２（神経細胞を特異的に同定するため）を、アポトーシスを起こした神経細胞として数えた。＊、ｐ＜０．０５  ＥＰＯ／ＩＧＦ−ＩおよびＮＭＤＡに対するＡＮＯＶＡ；†、ｐ＜０．０１  ｗｔ−Ａｋｔを有するか、または有さないＥＰＯ／ＩＧＦ−ＩおよびＮＭＤＡに対するＡＮＯＶＡ。
【図８】図８は、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉを用いる組み合わせ処理が、カスパーゼ活性化の長期ニューロン生存ダウンストリームを促進することを示す。（Ａ）２００μＭ  ＮＭＤＡに２０分間曝露した後の、混合神経膠細胞培養物におけるニューロンの生存（黒い棒）。ＮＭＤＡ曝露時のＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ処理（それぞれ、１０Ｕ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ）は、ニューロン生存を傷害後４８時間まで促進した（白い棒；＊，ｐ＜０．０５）。（Ｂ）大脳皮質培養物を、ＮＭＤＡまたはＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉに曝露するか、あるいはＥＰＯ／ＩＧＦ−ＩおよびＮＭＤＡに同時に曝露した。培養溶解物を、活性な形態のカスパーゼ−３と特異的に反応性な抗体を用いて、免疫沈降に供した。免疫沈降物を、電気泳動法によって分離し、そしてニトロセルロース膜に移した。ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉ（ＮＭＤＡ曝露をするかまたはＮＭＤＡ曝露しない）は、活性カスパーゼ−３に関連するＸＩＡＰの量の増加を導いた。（Ｃ）アポトーシスのタンパク質インヒビターであるＸＩＡＰの濃度測定は、活性カスパーゼ−３に結合したＸＩＡＰの量の２．５〜３倍の増加を明らかにした。（Ｄ）カスパーゼ−３様活性は、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉによって減少される。ラットの大脳皮質細胞を、ドミナントネガティブなＡｋｔ（ｄｎ−Ａｋｔ）をコードするアデノウイルスベクターまたはコントロールのベクターで感染させた。３６時間後、培養物を、ＥＰＯ（１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＧＦ−Ｉ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉと共にインキュベートした。細胞を、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉインキュベーションの後またはＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉインキュベーションと同時に、２００μＭ  ＮＭＤＡに３時間曝露した。細胞溶解物におけるカスパーゼ活性を、ＮＭＤＡ曝露の１６時間後に評価し、その活性はコントロールレベルに対するパーセント増加として表される相対的ＤＥＶＤアーゼ活性として示される。（Ｅ）ニューロン富化培養物を、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉと共にまたはＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉなしに、ＮＭＤＡ傷害（２００μＭで２０分間）に曝露し、そして示される時点でニューロンの生存を評価した。非神経細胞の非存在下でさえ、ＥＰＯ／ＩＧＦ−Ｉは、ＮＭＤＡに曝露した後に長期ニューロン生存を促進することにおいて、同等に有効であった。
【図９】図９は、以下のＮＭＤＡ曝露が数時間適用される場合、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉを用いる組み合わせ処理が、ニューロン生存を促進することにおいて有効であり得ることを示す。細胞を、上記のようにＮＭＤＡに曝露し、そして１０Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯおよび１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−Ｉで、ＮＭＤＡ曝露の３時間前または１時間前に処理したか、またはＮＭＤＡ曝露時に、あるいはＮＭＤＡ曝露の１時間後、２時間後、３時間後または５時間後に処理した。アポトーシスニューロンのパーセンテージを、上記のように決定した。
【図１０】図１０は、ＥＰＯおよびＩＧＦ−Ｉが一緒の方が、別個に使用される場合よりも、ニューロンのアポトーシスを減少させることにおいて有効であることを示す。細胞を、上記のように２００μＭ  ＮＭＤＡに曝露し、そしてＥＰＯ単独で、ＩＧＦ−Ｉ単独で、または様々な濃度のＩＧＦ−Ｉと組み合わせたＥＰＯで、同時に処理した。インキュベーション１：０．５Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯおよび１ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（単独でまたは組み合わせて）。インキュベーション２：１．０Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（単独でまたは組み合わせて）。インキュベーション３：２．０Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（単独でまたは組み合わせて）。インキュベーション４：５．０Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯおよび５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（単独でまたは組み合わせて）。インキュベーション５：１０Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯおよび２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（単独でまたは組み合わせて）。インキュベーション６：２０Ｕ／ｍｌ  ＥＰＯおよび４００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１（単独でまたは組み合わせて）。アポトーシスニューロンのパーセンテージを、ＮＭＤＡ曝露の１８時間後に上記のように決定した。インキュベーション３、４および５は、各々サイトカイン単独での処理と有意に異なる（ｐ＜０．０２）ＥＰＯ／ＩＧＦの組み合わせの結果を生じた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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