(57)【要約】［０３２４］加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）の新規方法が開発されてきている。ＰＡＰでは、３’末端に伸長不能３’−デオキシヌクレオチドを有する、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊を用いることによって、ＤＮＡポリメラーゼによる加ピロリン酸分解および重合を連続してカップリングする。ＰＡＰは、指数関数的増幅用に、または線形増幅用に、適用可能である。稀なアレルに対しては、３’端で正確にマッチするが、野生型アレルに対しては、３’末端またはその近傍でミスマッチを有する、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊を用いることによって、１以上の野生型アレルと混合された稀なアレルの増幅に、ＰＡＰを適用することが可能である。ＰＡＰは、３’末端から１６ヌクレオチドまでの範囲の３’特異的配列におけるミスマッチによって阻害される。ＰＡＰは、野生型アレルの存在下、非常に稀な突然変異アレルの検出特異性を非常に増加させうる。特異性は、加ピロリン酸分解および重合両方から生じ、これは、有意な非特異的増幅が、ＤＮＡポリメラーゼによるミスマッチ加ピロリン酸分解および誤った取り込みの組み合わせを必要とする、非常に稀な事象であるためである。遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼを用いると、ＰＡＰ効率が非常に改善される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を検出する方法であって：
（ａ）核酸に第一のオリゴヌクレオチドＰ＊をアニーリングさせ、ここで第一のオリゴヌクレオチドＰ＊は伸長不能３’端を有し、第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端は加ピロリン酸分解によって除去可能である；
（ｂ）加ピロリン酸分解によって第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端を除去して、ブロッキングされていない第一のオリゴヌクレオチドを産生し；
（ｃ）ブロッキングされていない第一のオリゴヌクレオチドを伸長し；
（ｄ）伸長された第一のオリゴヌクレオチドを検出することによって、核酸の存在を検出する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
核酸ポリメラーゼを用いて加ピロリン酸分解を行う、請求項１の方法。
【請求項３】
核酸ポリメラーゼを用いて伸長を行う、請求項１の方法。
【請求項４】
伸長工程で存在するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が標識を含有し、そして伸長された第一のオリゴヌクレオチド中の標識の存在が検出される、請求項１の方法。
【請求項５】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を反復する、請求項１の方法。
【請求項６】
第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項１の方法。
【請求項７】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
第二のオリゴヌクレオチドを核酸の相補鎖にアニーリングさせる、請求項１の方法。
【請求項９】
第二のオリゴヌクレオチドが、ブロッキングされていない第二のオリゴヌクレオチドである、請求項８の方法。
【請求項１０】
第二のオリゴヌクレオチドを工程（ｃ）で伸長する、請求項９の方法。
【請求項１１】
第二のオリゴヌクレオチドが伸長不能３’端を有する第二のオリゴヌクレオチドＰ＊であり、第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が加ピロリン酸分解によって除去可能である、請求項９の方法。
【請求項１２】
第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端を工程（ｂ）の加ピロリン酸分解によって除去して、ブロッキングされていない第二のオリゴヌクレオチドを産生し、そしてブロッキングされていない第二のオリゴヌクレオチドを工程（ｃ）で伸長する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項１１の方法。
【請求項１４】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、そして第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項１１の方法。
【請求項１６】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
核酸を合成する方法であって：
（ａ）核酸に、伸長不能３’端を有する第一のオリゴヌクレオチドＰ＊をアニーリングさせ、ここで第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端は加ピロリン酸分解によって除去可能である；
（ｂ）加ピロリン酸分解によって、核酸にアニーリングした第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端を除去し；そして
（ｃ）核酸ポリメラーゼを用いて、ブロッキングされていない第一のオリゴヌクレオチドを伸長する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項１８】
工程（ａ）〜（ｃ）を反復する、請求項１７の方法。
【請求項１９】
核酸ポリメラーゼを用いて加ピロリン酸分解および伸長を行う、請求項１７の方法。
【請求項２０】
第二のオリゴヌクレオチドを、前記の第一の鎖の相補体である核酸鎖にアニーリングさせる、請求項１７の方法。
【請求項２１】
第二のオリゴヌクレオチドが、ブロッキングされていない第二のオリゴヌクレオチドである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
第二のオリゴヌクレオチドを工程（ｃ）で伸長する、請求項２１の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）〜（ｃ）を反復する、請求項２２の方法。
【請求項２４】
第二のオリゴヌクレオチドが伸長不能３’端を有する第二のオリゴヌクレオチドＰ＊であり、第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が加ピロリン酸分解によって除去可能である、請求項２０の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）〜（ｃ）を反復する、請求項２４の方法。
【請求項２６】
第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項１７の方法。
【請求項２７】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項２４の方法。
【請求項２９】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項２８の方法。
【請求項３０】
第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、そして第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項２４の方法。
【請求項３１】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項３０の方法。
【請求項３２】
核酸を検出する方法であって：
（ａ）核酸に２つのオリゴヌクレオチドＰ＊をアニーリングさせ、ここで各オリゴヌクレオチドＰ＊は伸長不能３’端を有し、各オリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端は加ピロリン酸分解によって除去可能であり、一方のオリゴヌクレオチドＰ＊ともう一方のオリゴヌクレオチドＰ＊は、それぞれの３’端で、少なくとも１ヌクレオチド重複し、そして一方のオリゴヌクレオチドＰ＊は第一の核酸鎖にアニーリングし、そしてもう一方のオリゴヌクレオチドＰ＊は、第一の核酸鎖の相補体である核酸鎖にアニーリングする；
（ｂ）加ピロリン酸分解によって、アニーリングした第一および第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端を除去して、ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを産生し；
（ｃ）ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを伸長し；そして
（ｄ）伸長されたオリゴヌクレオチドを検出する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項３３】
核酸ポリメラーゼを用いて加ピロリン酸分解を行う、請求項３２の方法。
【請求項３４】
核酸ポリメラーゼを用いて伸長を行う、請求項３２の方法。
【請求項３５】
核酸ポリメラーゼを用いて加ピロリン酸分解および伸長を行う、請求項３２の方法。
【請求項３６】
伸長工程で存在するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が標識を含有し、そして伸長されたオリゴヌクレオチド中の標識の存在が検出される、請求項３２の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を反復する、請求項３２の方法。
【請求項３８】
各オリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項３２の方法。
【請求項３９】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項３８の方法。
【請求項４０】
核酸検出法であって：
（ａ）核酸からテンプレート核酸を合成し；
（ｂ）テンプレート核酸に、伸長不能３’端を有する第一のオリゴヌクレオチドＰ＊をアニーリングさせ、ここで第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端は加ピロリン酸分解によって除去可能である；
（ｃ）加ピロリン酸分解によって、テンプレート核酸にアニーリングした第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端を除去し；そして
（ｄ）ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを伸長する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項４１】
（ｉ）１つの核酸鎖に、配列特異的である第一の相補オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、そして核酸ポリメラーゼを用いて、該核酸鎖上で、前記の第一の相補オリゴヌクレオチドを伸長して、伸長された第一のオリゴヌクレオチドを産生し、そして（ｉｉ）伸長された第一のオリゴヌクレオチドの３’末端に第二のオリゴヌクレオチドを付加して、テンプレート核酸を産生する、請求項４０の方法。
【請求項４２】
連結によって、第二のオリゴヌクレオチドを、伸長された第一の相補オリゴヌクレオチドに付加する、請求項４１の方法。
【請求項４３】
ターミナルトランスフェラーゼ伸長によって、第二の相補オリゴヌクレオチドを、伸長された第一の相補オリゴヌクレオチドに付加する、請求項４１の方法。
【請求項４４】
テンプレート核酸を増幅する工程（ａ１）をさらに含んでなる、請求項４１の方法。
【請求項４５】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
増幅が加ピロリン酸分解活性化重合による、請求項４４の方法。
【請求項４７】
核酸コピーを合成する反応によって、テンプレート核酸を合成する、請求項４０の方法。
【請求項４８】
増幅反応が重合連鎖反応である、請求項４７の方法。
【請求項４９】
増幅反応が加ピロリン酸分解活性化重合反応である、請求項４７の方法。
【請求項５０】
核酸ポリメラーゼを用いて加ピロリン酸分解を行う、請求項４０の方法。
【請求項５１】
核酸ポリメラーゼを用いて伸長を行う、請求項４０の方法。
【請求項５２】
核酸ポリメラーゼを用いて加ピロリン酸分解および伸長を行う、請求項４０の方法。
【請求項５３】
伸長工程で存在するヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が標識を含有し、そして伸長されたオリゴヌクレオチド中の標識の存在が検出される、請求項５２の方法。
【請求項５４】
工程（ａ）〜（ｄ）を反復する、請求項４０の方法。
【請求項５５】
オリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項４０の方法。
【請求項５６】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項５５の方法。
【請求項５７】
工程（ｂ）で、第二のオリゴヌクレオチドをテンプレート核酸にアニーリングさせる、請求項４０の方法。
【請求項５８】
第二のオリゴヌクレオチドが、工程（ｃ）で伸長される、ブロッキングされていない第二のオリゴヌクレオチドである、請求項５７の方法。
【請求項５９】
第二のオリゴヌクレオチドが伸長不能３’端を有する第二のオリゴヌクレオチドＰ＊であり、第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、工程（ｃ）の加ピロリン酸分解によって除去され、ブロッキングされていない第二のオリゴヌクレオチドが産生され、そしてブロッキングされていない第二のオリゴヌクレオチドが工程（ｃ１）で伸長される、請求項５７の方法。
【請求項６０】
第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項５９の方法。
【請求項６１】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項６０の方法。
【請求項６２】
第二のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項５９の方法。
【請求項６３】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項６２の方法。
【請求項６４】
第一のオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端が、核酸ポリメラーゼによって伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって除去可能である、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、請求項５９の方法。
【請求項６５】
ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、３’デオキシヌクレオチド、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）からなる群より選択される、請求項６４の方法。
【請求項６６】
核酸が、切断されている核酸である、請求項４０の方法。
【請求項６７】
核酸が損傷またはニックを有する二本鎖核酸である、請求項４０の方法。
【請求項６８】
核酸テンプレート鎖上で、所望の核酸鎖を合成する、加ピロリン酸分解活性化重合法であって
（ａ）３’末端に伸長不能３’−デオキシヌクレオチドを有し、そしてテンプレート鎖上の対応するヌクレオチドに関してミスマッチを有する、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊を、テンプレート鎖にアニーリングさせ、
（ｂ）ピロホスフェート、および加ピロリン酸分解活性を有し、そして末端３’−デオキシヌクレオチドの除去によってオリゴヌクレオチドＰ＊を活性化する酵素を用いて、生じた二重鎖を加ピロリン酸分解し、そして
（ｃ）４種のヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼの存在下で、テンプレート鎖上、活性化されたオリゴヌクレオチドＰ＊を伸長することによって重合させ、所望の核酸鎖を合成する
ことを連続的に含んでなる、前記方法。
【請求項６９】
（ｄ）テンプレート鎖から工程（ｃ）の所望の核酸鎖を分離し、そして
（ｅ）所望の核酸鎖の所望の増幅レベルが達成されるまで、工程（ａ）〜（ｄ）を反復する
ことによる、所望の核酸鎖の増幅を含む、請求項６８の加ピロリン酸分解活性化重合法。
【請求項７０】
第二のオリゴヌクレオチドの存在下で行う、請求項６９の加ピロリン酸分解活性化重合法であって、工程（ａ）において、第二のオリゴヌクレオチドが、工程（ｄ）の分離された所望の核酸鎖産物にアニーリングし、そして工程（ｃ）には、所望の核酸鎖上で第二のオリゴヌクレオチドを伸長することによって重合させて、核酸テンプレート鎖のコピーを合成することが含まれ、そして工程（ｄ）には、増幅が指数関数的であるように、所望の核酸鎖から、合成された核酸テンプレート鎖を分離することが含まれる、前記方法。
【請求項７１】
活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊およびテンプレート鎖間のミスマッチが、テンプレート上の対応するヌクレオチドに関して生じる、請求項７０の加ピロリン酸分解活性化重合法。
【請求項７２】
工程（ａ）〜（ｃ）を、サーモサイクラー上、２以上の温度段階として、連続して行う、請求項６９の加ピロリン酸分解活性化重合法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
［０００１］本発明は、核酸重合および増幅に関する。特に、本発明は、加ピロリン酸分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ）および重合を連続してカップリングする、核酸増幅の新規でそして一般的な方法に関する。該方法はアレル特異的増幅に適応されてきており、そして野生型アレルの存在下で、非常に稀なアレルを検出する特異性を非常に増加させることも可能である。我々は該方法を加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）と称する。
【０００２】
［０００２］本発明の背景を解明するか、または実施に関してさらなる詳細を提供する、本明細書に用いられる刊行物および他の資料は、本明細書に援用され、そして便宜上、付随する参考文献一覧にそれぞれ集めてある。
【背景技術】
【０００３】
［０００３］細胞の１０％未満に存在する突然変異（すなわち稀なアレル）を検出する多数の方法が開発されてきており、これらには特異的アレルのＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）固定（ｃｌａｍｐｉｎｇ）ブロッカーＰＣＲ、アレル特異的競合的ブロッカーＰＣＲ、ミスマッチ増幅突然変異アッセイ（ＭＡＭＡ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）／ＰＣＲ（ＰａｒｓｏｎｓおよびＨｅｆｌｉｃｈ、１９９７）およびＱＥ−ＰＣＲ（ＲｏｎａｉおよびＭｉｎａｍｏｔｏ、１９９７）が含まれる。これらの方法は：ｉ）稀なアレルを選択的に増幅するか、ｉｉ）豊富な野生型アレルを破壊するか、またはｉｉｉ）野生型アレルから稀なアレルを空間的に分離する。典型的な研究／臨床条件下で達成可能な特異性は１０−３である（ＰａｒｓｏｎｓおよびＨｅｆｌｉｃｈ、１９９７）が、いくつかの刊行物は、より高い検出特異性を報告した（ＰｏｕｒｚａｎｄおよびＣｅｒｕｔｔｉ、１９９３；Ｋｎｏｌｌら、１９９６）。これらの方法は、一般的に、より高い特異性を達成しないか、または日常的な解析に適していない。
【０００４】
［０００４］１０４〜１０９野生型アレル中の１つの突然変異アレルを検出する堅固な方法は、微小残存病変（寛解後の再発またはリンパ節および他の隣接組織における稀な残存癌細胞）の検出および突然変異負荷（正常組織に存在する体細胞突然変異の頻度およびパターン）の測定を含む、多くの適用に好適であろう。高い突然変異負荷を持つ個体は、環境曝露、またはゲノムの完全性を維持するのに必要な何百もの遺伝子のいずれかにおける内因性の欠損によって、癌のリスクが増加している可能性もある。高い突然変異負荷を有することが見出された個体に関しては、突然変異パターンを定義することによって、病因学の手掛かりを得ることも可能である。
【０００５】
［０００５］多くのＤＮＡ配列決定法およびその変型法があり、例えばジデオキシ末端処理および変性ゲル電気泳動を用いるサンガー配列決定法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）、化学的切断および変性ゲル電気泳動を用いるマクサム−ギルバート配列決定法（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９７７）、ＤＮＡポリメラーゼ反応中に放出されたピロホスフェート（ＰＰｉ）を検出するピロ配列決定法（Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８）、およびオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションによる配列決定法（ＳＢＨ）（Ｌｙｓｏｖら、１９８８；ＢａｉｎｓおよびＳｍｉｔｈ、１９８８；Ｄｒｍａｎａｃら、１９８９；Ｋｈｒａｐｋｏら、１９８９；Ｐｅｖｚｎｅｒら、１９８９：Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、１９９２）がある。
【０００６】
［０００６］未知の突然変異に関してスキャンする、ゲルに基づく方法が多くあり、これらには、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）およびジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）のＳＳＣＰハイブリッド法、制限エンドヌクレアーゼ・フィンガープリンティング（ＲＥＦ）、並びに実質的にすべての突然変異−ＳＳＣＰの検出（ＤＯＶ  ＡＭ−Ｓ）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、変性ＨＰＬＣ（ｄＨＰＬＣ）化学的または酵素的切断が含まれる（Ｓａｒｋａｒら、１９９２；ＬｉｕおよびＳｏｍｍｅｒ、１９９５；Ｌｉｕら、１９９９；Ｍｙｅｒｓら、１９８５；Ｃｏｔｔｏｎら、１９８８；Ｌｉｕら、１９９９；Ｂｕｚｉｎら、２０００；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎら、２０００）。ＤＯＶＡＭ−Ｓおよび化学的切断反応は、盲検化解析において、本質的にすべての突然変異を同定することが示されている（Ｂｕｚｉｎら、２０００）。逆相クロマトグラフィーに基づくｄＨＰＬＣもまた、適切な条件下で、本質的にすべての当然変異を同定可能である（Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎら、１９９８；ＯｅｆｎｅｒおよびＵｎｄｅｒｈｉｌｌ、１９９８；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎら、２０００）。より高いスループットを持つ一般的なスキャン法を開発する努力がなされている。
【０００７】
［０００７］ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）は、マイクロアレイ上の未知の突然変異に関してスキャンするかまたは再配列決定するのに適応されてきている（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９９６）。これは熱心な研究がなされる有望な領域でありつづけている。しかし、このアプローチでは、いまだに大部分のマイクロ挿入および欠失を検出することが不可能であり、そして一塩基変化のシグナル対ノイズ比のために、５〜１０％の一ヌクレオチド変化の検出が妨げられている（Ｈａｃｉａ、１９９９）。別のアプローチでも探査を可能にする。
【０００８】
［０００８］哺乳動物遺伝子制御および発生には、ｉｎ  ｖｉｖｏクロマチン構造が重要であることが、ますます明らかになってきている。クロマチン構造の安定な変化はしばしば、メチル化の変化および／またはヒストンアセチル化の変化を伴う。クロマチン構造における体細胞遺伝性変化は、通常、エピジェネティック変化と称され（ＲｕｓｓｏおよびＲｉｇｇｓ、１９９６）、そして現在、癌発生には、エピジェネティック「ミス」またはエピミューテーション（ｅｐｉｍｕｔａｔｉｏｎ）がしばしば重要な寄与要因であることが明らかである（ＪｏｎｅｓおよびＬａｉｒｄ、１９９９）。
【０００９】
［０００９］ｉｎ  ｖｉｖｏクロマチン構造をアッセイするいくつかの方法の１つであり、そして一ヌクレオチドレベルでの解像度を持つ唯一の方法は、連結仲介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）（ＭｕｅｌｌｅｒおよびＷｏｌｄ、１９８９；Ｐｆｅｉｆｅｒら、１９８９）およびその変型法のターミナルトランスフェラーゼ仲介ＰＣＲ（ＴＤ−ＰＣＲ）（ＫｏｍｕｒａおよびＲｉｇｇｓ、１９９８）である。メチル化シトシン残基、結合している転写因子、または配置されているヌクレオソームの位置などの、クロマチン構造の多くの側面が、ＬＭ−ＰＣＲによって決定可能である。ＬＭ−ＰＣＲがあるプライマーセットを用いた場合に、他のものよりよく働くことは容易に明らかである。したがって、クロマチン構造を測定する、より堅固な方法を開発することが望ましい。
【００１０】
［００１０］したがって、ＤＮＡを増幅する代替法、ＤＮＡを配列決定する代替法、およびクロマチン構造を解析する代替法を開発するのが本発明の目的である。この目的は、本明細書に記載するように、新規加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）を使用することによって達成される。ＰＡＰは、ＤＮＡを再配列決定し、そしてクロマチン構造を解析するため、特定のアレルを増幅する特異性を劇的に増進させる潜在能力を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概要
［００１１］本発明は、核酸テンプレート鎖上で、所望の核酸鎖を合成する、加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）法である。該方法は、連続的に行われる以下の工程を含んでなる。
【００１２】
［００１２］（ａ）相補的な活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊を、テンプレート鎖にアニーリングさせる工程。この活性化可能オリゴヌクレオチドは、加ピロリン酸分解によって活性化可能な伸長不能３’末端（以後、伸長不能３’末端または３’伸長不能端または伸長不能３’端と称する）を有する。伸長不能３’末端（または端）は、相補ヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対を形成する能力を有し、そして核酸ポリメラーゼによって伸長されることが可能な３’ＯＨを欠く、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。１つの態様において、伸長不能３’末端は、ジデオキシヌクレオチドなどの、伸長不能３’デオキシヌクレオチドであることも可能である。第二の態様において、伸長不能３’末端は、アシクロヌクレオチドなど、３’ヒドロキシル基を欠く、化学的に修飾されたヌクレオチドであることも可能である。アシクロヌクレオチドでは、ｄＮＭＰに通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖が、２−ヒドロキシエトキシメチル基で置換されている。他の態様において、伸長不能３’末端は、本明細書に記載するような他のブロッカーであることも可能である。１つの態様において、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は、３’末端またはその近傍に、テンプレート鎖上の対応するヌクレオチドにミスマッチするヌクレオチドを持たない。第二の態様において、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は、その３’末端またはそこから１６ヌクレオチド以内に、テンプレート鎖上の対応するヌクレオチドに関するミスマッチを有する。末端３’−デオキシヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドＰ＊がアニーリングする際、テンプレート鎖にハイブリダイズする。
【００１３】
［００１３］（ｂ）ピロホスフェート、および加ピロリン酸分解活性を有する酵素を用いて、アニーリングした活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊を加ピロリン酸分解する工程。これは、ハイブリダイズした伸長不能３’末端の除去によってオリゴヌクレオチドＰ＊を活性化する。
【００１４】
［００１４］（ｃ）４種のヌクレオシド三リン酸またはその類似体および核酸ポリメラーゼの存在下で、テンプレート鎖上、活性化されたオリゴヌクレオチドＰ＊を伸長することによって重合させ、所望の核酸鎖を合成する工程。
【００１５】
［００１５］ＰＡＰ法を適用して、以下のさらなる工程によって所望の核酸鎖を増幅することも可能である。
［００１６］（ｄ）テンプレート鎖から工程（ｃ）の所望の核酸鎖を分離する工程、および
［００１７］（ｅ）所望の核酸鎖の所望の増幅レベルが達成されるまで、工程（ａ）〜（ｄ）を反復する工程。
【００１６】
［００１８］好ましい側面において、上述のようなＰＡＰ法を、アレル特異的増幅（ＰＡＰ−Ａ）に適用する。この適用において、核酸テンプレート鎖は、１つのアレルのセンス鎖またはアンチセンス鎖であり、そして第二のアレルの対応する（センスまたはアンチセンス）核酸鎖（アレル鎖）と混合されて存在する。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は、その３’端またはその近傍に、例えば３’末端から１６ヌクレオチド以内に、アレル鎖の対応するヌクレオチドとミスマッチする、少なくとも１つのヌクレオチドまたは類似体を有する。このミスマッチのため、ＰＡＰ法の工程（ａ）において、オリゴヌクレオチドＰ＊の伸長不能３’末端は、アレル鎖に実質的にハイブリダイズしない。工程（ｂ）において、加ピロリン酸分解は、アレル鎖にアニーリングした活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊から、ハイブリダイズしていない伸長不能３’末端を実質的に除去しない。工程（ｃ）において、オリゴヌクレオチドＰ＊は、アレル鎖上の重合によって、実質的に伸長されない。その結果、テンプレート鎖上で合成される所望の核酸鎖が、アレル鎖上で合成されるいかなる核酸鎖よりも優先的に増幅される。
【００１７】
［００１９］第二の好ましい側面において、上述のＰＡＰ−Ａ法を双方向に行うことも可能である（Ｂｉ−ＰＡＰ−Ａ）。双方向性ＰＡＰ（Ｂｉ−ＰＡＰ）は、好ましくは、３’末端に１ヌクレオチド重複を持つ、２つの相対する加ピロリン酸分解活性化可能オリゴヌクレオチド（Ｐ＊）を用いる、新規設計である。したがって、Ｂｉ−ＰＡＰにおいて、相対する活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊の対を用いて、ＰＡＰ−Ａを行う。下流Ｐ＊および上流Ｐ＊はどちらも、３’末端で目的のヌクレオチドに特異的である（例えばＡ：Ｔ塩基対）。ゲノムＤＮＡからの最初の増幅周期において、定義されないサイズのセグメントを生成する。続く周期において、オリゴヌクレオチドを合わせた長さから１引いた長さに等しいセグメントを指数関数的に増幅する。この設計では、ブロッキングされていない上流からの誤った取り込みによるエラーが排除されるため、非特異的増幅は、より低い頻度でしか起こらない。最も効率的な増幅のため、Ｐ＊は３０〜６０ヌクレオチドであることも可能である。
【００１８】
［００２０］ＰＡＰ法を用いて、ＲＮＡまたはＤＮＡいずれかを増幅することも可能である。ＤＮＡを増幅するのに用いる際、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は２’−デオキシオリゴヌクレオチドであることも可能であり、伸長不能３’末端は、例えば２’，３’−ジデオキシヌクレオチドまたはアシクロヌクレオチド、あるいは本明細書に記載するような他のブロッカーであることも可能であり、４種のヌクレオシド三リン酸は２’−デオキシヌクレオシド三リン酸またはその類似体であり、そして核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。工程（ｃ）で用いるＤＮＡポリメラーゼはまた、工程（ｂ）で用いる加ピロリン酸分解活性を有する酵素でもあることも可能である。加ピロリン酸分解活性を有する好ましいＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性Ｔｆｌ、Ｔａｑ、並びにＡｍｐｌｉＴａｑＦｓおよびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭなどの遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼである。これらの遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼは、突然変異Ｆ６６７Ｙまたは活性部位での同等の突然変異を有する。ＡｍｐｌｉＴａｑＦｓおよびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭなどの遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼの使用は、ＰＡＰの有効性を非常に改善する。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊が３’ジデオキシヌクレオチドまたはアシクロヌクレオチドである場合、これらのファミリーＩ  ＤＮＡポリメラーゼが使用可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊がアシクロヌクレオチドである場合、ファミリーＩＩ始原菌（ａｒｃｈａｅｏｎ）ＤＮＡポリメラーゼもまた使用可能である。こうしたポリメラーゼの例には、限定されるわけではないが、Ｖｅｎｔ（エキソ−）およびＰｆｕ（エキソ−）が含まれる。これらのポリメラーゼは、３’アシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊を効率的に増幅する。２以上のポリメラーゼを１つの反応で使用することもまた可能である。テンプレートがＲＮＡである場合、核酸ポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、またはその変異体であることも可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊はリボヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドであることも可能である。伸長不能３’末端は３’デオキシリボヌクレオチドまたはアシクロヌクレオチドであることも可能である。４種のヌクレオシド三リン酸は、リボヌクレオシド三リン酸、２’デオキシヌクレオシド三リン酸またはその類似体であることも可能である。便宜上、続く説明ではＤＮＡをテンプレートとして用いる。しかし、本側面に記載するように、ＲＮＡもまた含まれる。
【００１９】
［００２１］ＰＡＰ法による増幅は、線形または指数関数的であることも可能である。線形増幅は、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊が、用いられる唯一の相補オリゴヌクレオチドである場合に得られる。指数関数的増幅は、所望の核酸鎖に相補的である、Ｐ＊であることも可能な第二の相対するオリゴヌクレオチドが存在する場合に得られる。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊および第二のオリゴヌクレオチドは、増幅の標的とされる領域に隣接する。工程（ａ）において、第二のオリゴヌクレオチドは、工程（ｄ）の分離された所望の核酸鎖産物にアニーリングする。工程（ｃ）において、重合は、所望の核酸鎖上で、第二のオリゴヌクレオチドを伸長し、核酸テンプレート鎖のコピーを合成する。工程（ｄ）において、合成された核酸テンプレート鎖を、所望の核酸鎖から分離する。所望のレベルの指数関数的増幅が達成されるまで、工程（ａ）〜（ｄ）を反復する。
【００２０】
［００２２］ＰＡＰ法において、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊およびテンプレート鎖の間のミスマッチは、Ｐ＊の３’末端またはＰ＊の３’末端から１６ヌクレオチド以内で、Ｐ＊の３’特異的下位配列においてミスマッチが生じるならば、実質的な増幅をまったく生じない。Ｐ＊の３’特異的下位配列において、こうしたミスマッチに対する増幅が欠けていることによって、一塩基置換の解像度で、４０億の異なる、そして特異的なオリゴヌクレオチドが提供される。
【００２１】
［００２３］好ましい側面において、１以上の野生型アレルを含有する混合物において、稀な突然変異アレルを指数関数的に増幅するため、ＰＡＰ法を用いる。アレル鎖を分離して、一本鎖核酸を提供し、そして次いで、以下の工程を連続して行う。
【００２２】
［００２４］（ａ）各アレルのセンス鎖またはアンチセンス鎖に、伸長不能３’末端を有する相補的活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ＊をアニーリングさせる工程。伸長不能３’末端は、例えば伸長不能２’，３’−ジデオキシヌクレオチドまたはアシクロヌクレオチドであることも可能である。Ｐ＊は、その３’末端またはその近傍に、突然変異鎖上の対応する２’−デオキシヌクレオチドにミスマッチする２’−デオキシヌクレオチドを持たないが、その３’末端またはその近傍に、野生型鎖上の対応する２’−デオキシヌクレオチドにミスマッチする２’−デオキシヌクレオチドを少なくとも１つ持つ。その結果、オリゴヌクレオチドＰ＊をアニーリングさせた際、伸長不能３’末端は、突然変異鎖にハイブリダイズするが、野生型鎖にはハイブリダイズしない。同時に、各アレルの逆平行鎖に相補的な第二の２’−デオキシオリゴヌクレオチドを逆平行鎖にアニーリングさせる。活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ＊および第二の２’−デオキシオリゴヌクレオチドは、増幅しようとする遺伝子領域に隣接する。
【００２３】
［００２５］（ｂ）ピロホスフェート、および加ピロリン酸分解活性を有する酵素を用いて、突然変異鎖にアニーリングした活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ＊を加ピロリン酸分解する工程。この工程は、ハイブリダイズした伸長不能３’末端の除去によって、突然変異鎖にアニーリングした２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ＊を活性化する。ハイブリダイズしていない伸長不能３’末端は加ピロリン酸分解によって実質的に除去されないため、この工程は、２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ＊が突然変異鎖にアニーリングした際、２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ＊を実質的に活性化しない。
【００２４】
［００２６］（ｃ）４種のヌクレオシド三リン酸またはその類似体およびＤＮＡポリメラーゼの存在下で、突然変異鎖上、活性化されたオリゴヌクレオチドＰ＊を伸長し、そして突然変異体および野生型両方の逆平行鎖上、第二の２’−デオキシオリゴヌクレオチドを伸長することによって重合させる工程。
【００２５】
［００２７］（ｄ）工程（ｃ）の伸長産物を分離する工程；
［００２８］（ｅ）突然変異アレルの所望の増幅レベルが達成されるまで、工程（ａ）〜（ｄ）を反復する工程。
【００２６】
［００２９］活性化可能２’−デオキシオリゴヌクレオチドＰ＊をアレルのアンチセンス鎖にアニーリングさせ、そして第二の２’−デオキシオリゴヌクレオチドをセンス鎖にアニーリングさせるか、またはその逆にする。
【００２７】
［００３０］ＰＡＰの工程（ａ）〜（ｃ）を、サーモサイクラー上、２以上の温度段階として、連続して行うか、またはサーモサイクラー上、１つの温度段階として行うことも可能である。
【００２８】
［００３１］ヌクレオシド三リン酸および２’−デオキシヌクレオシド三リン酸またはその化学的修飾型を、ＰＡＰによる多数のヌクレオチド伸長の基質として使用可能であり、すなわち１つのヌクレオチドを取り込む際、伸長中の鎖をさらに伸長させることも可能である。２’，３’−ジデオキシヌクレオチド三リン酸、その化学的修飾型、アシクロヌクレオチド、またはさらなる伸長のターミネーターである他のブロッキングされたヌクレオチドを一ヌクレオチド伸長に使用可能である。存在する場合、オリゴヌクレオチドＰ＊の３’末端ジデオキシヌクレオチドと区別するため、放射能または色素で、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸を標識することも可能である。ヌクレオシド三リン酸または２’−デオキシヌクレオチド三リン酸またはその類似体、および２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸またはその類似体の混合物もまた使用可能である。
【００２９】
［００３２］ＰＡＰをＤＮＡ配列決定の新規方法において使用することも可能である。ＰＡＰでは、Ｐ＊、伸長不能３’末端を含有するオリゴヌクレオチドを用いることによって、ＤＮＡポリメラーゼによる加ピロリン酸分解および重合を連続してカップリングする。伸長不能３’末端は、例えば、伸長不能３’−デオキシヌクレオチドまたはアシクロヌクレオチドであることも可能である。この原理は、ＰＡＰの特異性に、そして次に、３’特異的下位配列の塩基対形成特異性に基づく。３’特異的下位配列のこの特性を適用して、未知の配列変異体をスキャンするかまたは再配列決定して、新規にＤＮＡ配列を決定し、２つのＤＮＡ配列を比較し、そして大規模に遺伝子発現プロファイリングを監視することも可能である。これらの方法においては、Ｐ＊アレイが可能である。すなわち、Ｐ＊の各々を個々のドットまたは固体支持体上に固定し、こうして、すべてのＰＡＰ反応が平行にプロセシングされるのを可能にする。
【００３０】
［００３３］したがって、１つの側面において、以下の工程を連続して行うことによって、あらかじめ決定された配列内の未知の配列変異体をスキャンするかまたは再配列決定するため、ＰＡＰ法を用いる。
【００３１】
［００３４］（ａ）ハイブリダイズするテンプレート鎖に十分に相補的な４つの活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊の多数のセットと、核酸のテンプレート鎖を、ハイブリダイゼーション条件下で混合する工程。各セット内で、テンプレート鎖が伸長不能３’末端に相補的な場合、伸長不能３’末端がテンプレート鎖にハイブリダイズするように、異なる伸長不能３’末端を有する点で、オリゴヌクレオチドＰ＊は互いに異なる。セットの番号は、配列中のヌクレオチド番号に対応する。伸長不能３’末端は、例えば伸長不能３’−デオキシヌクレオチドまたはアシクロヌクレオチドであることも可能である。
【００３２】
［００３５］（ｂ）生じた二重鎖Ｐ＊を、ピロホスフェート、および加ピロリン酸分解活性を有する酵素で処理し、テンプレート鎖にハイブリダイズした伸長不能３’末端を有するオリゴヌクレオチドＰ＊のみを、加ピロリン酸分解によって活性化する工程。
【００３３】
［００３６］（ｃ）４種のヌクレオシド三リン酸またはその類似体および核酸ポリメラーゼの存在下、テンプレート鎖上の活性化されたオリゴヌクレオチドＰ＊を伸長することによって重合させる工程。
【００３４】
［００３７］（ｄ）テンプレート鎖から工程（ｃ）で合成された核酸鎖を分離する工程。
［００３８］（ｅ）所望の増幅レベルが達成されるまで、工程（ａ）〜（ｄ）を反復する工程、および
［００３９］（ｆ）増幅を生じるオリゴヌクレオチドＰ＊の重複を解析することによって、核酸配列を順序正しく配置する工程。
【００３５】
［００４０］第二の側面において、以下の工程を連続して行うことによって、核酸の配列を新規に決定するため、ＰＡＰ法を用いる。
［００４１］（ａ）多数の活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊と、核酸のテンプレート鎖を、ハイブリダイゼーション条件下で混合する工程。すべてのオリゴヌクレオチドＰ＊は、テンプレートと同じ数ｎのヌクレオチドを有し、そして集合的に、ｎヌクレオチドを有するすべてのありうる配列を構成する。すべてのオリゴヌクレオチドＰ＊は、伸長不能３’末端を有する。伸長不能３’末端は、例えば伸長不能３’−デオキシヌクレオチドまたはアシクロヌクレオチドであることも可能である。十分に相補的なオリゴヌクレオチドＰ＊は、いずれも、テンプレート鎖にハイブリダイズするであろう。伸長不能３’末端は、テンプレート鎖が３’末端に対応する位で相補的である場合にのみ、テンプレート鎖にハイブリダイズするであろう。
【００３６】
［００４２］（ｂ）生じた二重鎖Ｐ＊を、ピロホスフェート、および加ピロリン酸分解活性を有する酵素で処理し、ハイブリダイズした伸長不能３’末端の加ピロリン酸分解によって、テンプレート鎖にハイブリダイズした伸長不能３’末端を有するオリゴヌクレオチドＰ＊のみを活性化する工程。
【００３７】
［００４３］（ｃ）４種のヌクレオシド三リン酸またはその類似体および核酸ポリメラーゼの存在下、テンプレート鎖上の活性化されたオリゴヌクレオチドＰ＊を伸長することによって重合させる工程。
【００３８】
［００４４］（ｄ）テンプレート鎖から工程（ｃ）で合成された核酸鎖を分離する工程。
［００４５］（ｅ）所望の増幅レベルが達成されるまで、工程（ａ）〜（ｄ）を反復する工程、および
［００４６］（ｆ）増幅を生じるオリゴヌクレオチドＰ＊の配列を決定し、次いでこれらのオリゴヌクレオチドの重複を解析することによって、核酸配列を順序正しく配置する工程。
【００３９】
［００４７］ＰＡＰはまた、以下の工程を連続して行うことによって、連結仲介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）と同じように、クロマチン構造を研究するのにも使用可能である。ＬＭ−ＰＡＰは、一次ヌクレオチド配列の決定、シトシンメチル化パターン、ＤＮＡ損傷形成および修復、並びにｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質−ＤＮＡフットプリントに用いられてきている（Ｄａｉら、２０００；ＭｕｅｌｌｅｒおよびＷｏｌｄ、１９８９；Ｐｆｅｉｆｅｒら、１９８９；Ｐｆｅｉｆｅｒら、１９９９；ＢｅｃｋｅｒおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、１９９３）。連結仲介ＰＡＰ（ＬＭ−ＰＡＰ）は、切断、プライマー伸長、リンカー連結、およびＰＡＰを伴い、染色体のメチル化状態などのｉｎ  ｖｉｖｏクロマチン構造の解析に、そしてＬＭ−ＰＣＲと同様の他の核酸解析に適用可能である。
【００４０】
［００４８］ＬＭ−ＰＡＰの性質は、連結反応によるか、またはターミナルトランスフェラーゼを用いた伸長によるなどで、ＰＡＰ前にテンプレートを合成することである。ＰＡＰはいかなる種類のＰＡＰであることも可能であり：１つのＰ＊のみを用いても、少なくとも１つがＰ＊である２つの相対するオリゴヌクレオチドを用いても、Ｂｉ−ＰＡＰ、マッチＰＡＰ、ミスマッチＰＡＰなどであってもよい。したがって、最も単純な場合、ＬＭ−ＰＡＰは、あらかじめ合成したテンプレートに対するＰＡＰの適用である。ＬＭ−ＰＡＰは工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）によって、工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）によって、工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）によって、または工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）によって、実行可能であり、工程は以下のとおりである。
【００４１】
［００４９］（ｉ）切断が化学的、酵素的、または天然に生じて、核酸鎖を「破壊」する。核酸は、通常、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生された損傷またはニックを有することが可能なゲノムＤＮＡである。
【００４２】
［００５０］（ｉｉ）オリゴヌクレオチドＰ１は遺伝子特異的であり、そしてその伸長には：１）テンプレート鎖に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ；２）ヌクレオシド三リン酸またはその類似体および核酸ポリメラーゼの存在下、テンプレート鎖上でオリゴヌクレオチドを伸長し、この伸長がテンプレート鎖上の切断部位で「脱線する（ｒｕｎ  ｏｆｆ）」ことが含まれる。工程１）および２）を反復することも可能である。
【００４３】
［００５１］プライマー伸長の代わりにＰ＊伸長を行うことも可能であり、ここで１つのみの活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊を用いて、上記ＰＡＰを行う。
［００５２］（ｉｉｉ）リンカー連結工程には、合成された核酸鎖の３’末端へのリンカーの連結が含まれる。テンプレート非依存性重合であり、そして合成された核酸鎖の３’末端に余分な核酸配列が付加されるターミナルトランスフェラーゼ伸長を、リンカー連結工程の代わりに行うことも可能である。
【００４４】
［００５３］（ｉｖ）第二の遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（Ｐ２）を、リンカーに特異的な、またはターミナルトランスフェラーゼによって付加された配列に特異的なオリゴヌクレオチドとともに用いて、ＰＣＲを行う。
【００４５】
［００５４］（ｖ）第三の遺伝子特異的Ｐ＊（Ｐ３）を用いて、ＰＣＲが生成した断片を検出する。１つの活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊のみを用いて、ＰＡＰ法を適用する。活性化されたオリゴヌクレオチドＰ＊の伸長は、ＩＶで生成したテンプレート鎖の端で「脱線する」。ＰＡＰ法をアレル特異的方式で適用することも可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は、テンプレート鎖に相補的でない１以上のヌクレオチドを含有することも可能である。Ｐ＊の非相補的ヌクレオチド（単数または複数）が、Ｐ＊の３’末端に位置することも可能である。
【００４６】
［００５５］（ｖｉ）工程（ｉｖ）および（ｖ）の代わりに、少なくとも１つが活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊である２つの相対するオリゴヌクレオチドを用いたＰＡＰ法も適用可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊（Ｐ３）は遺伝子特異的である。第二のオリゴヌクレオチドは、リンカーに特異的であるか、またはターミナルトランスフェラーゼによって付加された配列に特異的である。第二のオリゴヌクレオチドは、別の活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊であることも、または普通のオリゴヌクレオチドであることも可能である。アレル特異的方式でＰＡＰ法を適用することも可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊（Ｐ３）は、テンプレート鎖に相補的でない、１以上のヌクレオチドを含有することも可能である。Ｐ＊の非相補的ヌクレオチド（単数または複数）が、Ｐ＊（Ｐ３）の３’末端に位置することも可能である。
【００４７】
［００５６］次いで、通常、第三の遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（Ｐ３）を用いて、ＰＣＲで生成された断片を標識し、そしてその視覚化を可能にする。Ｐ３は、５’末端で３２Ｐ標識されるか、またはより最近は、ＩＲＤ７００またはＩＲＤ８００（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｉｎｃ．）などの近赤外蛍光色素で標識される（Ｄａｉら、２０００）。
【００４８】
［００５７］ＰＡＰを用いて、標的核酸を検出することも可能である。１つの態様において、この方法は以下の工程を伴う：
［００５８］（ａ）核酸含有試料にオリゴヌクレオチドＰ＊を添加する工程、ここでオリゴヌクレオチドＰ＊は伸長不能３’末端を有し、オリゴヌクレオチドＰ＊の３’末端残基は加ピロリン酸分解によって除去可能であり、そしてオリゴヌクレオチドＰ＊は、試料に存在する標的核酸の実質的な相補鎖にアニーリングする；
［００５９］（ｂ）標的核酸の実質的な相補鎖にアニーリングしたオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端を、加ピロリン酸分解によって除去して、オリゴヌクレオチドＰ＊を非ブロッキング化し、ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを産生する工程；および
［００６０］（ｃ）標的核酸の存在を検出する工程、ここで標的核酸の配列は、オリゴヌクレオチドＰ＊の配列と実質的に相補的である。
【００４９】
［００６１］第一の態様の方法は、検出工程の前に：（ｂ１）核酸ポリメラーゼを用いて、ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを伸長して、伸長されたオリゴヌクレオチドを産生する工程をさらに含むことも可能である。該方法はまた、３’伸長不能末端を持ってもまたは持たなくてもよい第二のオリゴヌクレオチドの添加も含むことも可能である。第二のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の実質的な相補鎖にアニーリングすることも可能であるし、または標的核酸の実質的な相補鎖の相補体にアニーリングすることも可能である。
【００５０】
［００６２］核酸を検出するための第二の態様において、方法は以下の工程を伴う：
［００６３］（ａ）核酸含有試料に２つのオリゴヌクレオチドＰ＊を添加する工程、ここで各オリゴヌクレオチドＰ＊は伸長不能３’末端を有し、オリゴヌクレオチドＰ＊の３’末端残基は加ピロリン酸分解によって除去可能であり、一方のオリゴヌクレオチドＰ＊ともう一方のオリゴヌクレオチドＰ＊は、それぞれの３’端で、少なくとも１ヌクレオチド重複し、そして一方のオリゴヌクレオチドＰ＊は、試料に存在する標的核酸の実質的な相補鎖にアニーリングし、そしてもう一方のオリゴヌクレオチドＰ＊は、標的核酸の実質的な相補鎖の相補体にアニーリングする；
［００６４］（ｂ）標的核酸にアニーリングしたオリゴヌクレオチドＰ＊の３’伸長不能末端を、加ピロリン酸分解によって除去して、オリゴヌクレオチドＰ＊を非ブロッキング化し、ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを産生する工程；および
［００６５］（ｃ）標的核酸の存在を検出する工程、ここで標的核酸の配列は、オリゴヌクレオチドＰ＊の配列に実質的に相補的である。
【００５１】
［００６６］第二の態様の方法は、検出工程の前に：（ｂ１）核酸ポリメラーゼを用いて、ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを伸長して、伸長されたオリゴヌクレオチドを産生する工程をさらに含むことも可能である。
【００５２】
［００６７］１つの態様において、オリゴヌクレオチドＰ＊の非ブロッキング化を検出することによって、工程（ｃ）の核酸の検出を行う。１つの側面において、オリゴヌクレオチドＰ＊の３’末端残基に含有される標識の欠失によって、非ブロッキング化を検出する。第二の側面において、伸長または連結が可能な３’末端残基上の３’ＯＨの存在を検出することによって、非ブロッキング化を検出する。この側面において、ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを伸長することによって、またはブロッキングされていないオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに連結することによって、検出する。第二の態様において、伸長されたオリゴヌクレオチドを検出することによって、工程（ｃ）の核酸の検出を行う。１つの側面において、伸長されたオリゴヌクレオチド中の標識の存在によって、伸長されたオリゴヌクレオチドを検出する。標識は、伸長工程に用いるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の一部である。第二の側面において、伸長されたオリゴヌクレオチドをゲル電気泳動によって検出する。第三の側面において、色素またはスペクトル物質の結合または取り込みによって、伸長されたオリゴヌクレオチドを検出する。
【００５３】
［００６８］Ｐ＊オリゴヌクレオチドは、増幅しようとする特異的配列各々の異なる鎖に「実質的に相補的」であるように選択する。したがって、Ｐ＊オリゴヌクレオチド配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドセグメントをＰ＊オリゴヌクレオチドの５’端に付着させ、残りのＰ＊オリゴヌクレオチド配列を鎖に相補的にすることも可能である。あるいは、Ｐ＊オリゴヌクレオチド配列が、増幅しようとする鎖の配列にハイブリダイズし、そして他のＰ＊オリゴヌクレオチドの伸長産物を合成するためのテンプレートを形成するのに十分な相補性を有するならば、非相補的塩基またはより長い配列をＰ＊オリゴヌクレオチド内に散らばせることも可能である。オリゴヌクレオチドＰ＊に実質的に相補的である核酸配列を検出する能力は、高いウイルス負荷で見られるものなど、多数の突然変異の検出に特に有用であり、この場合、ウイルスの存在を検出することが重要であり、そして必ずしもウイルスの正確な核酸配列を得ることは必要でない。この方法はまた、完全に相補的な核酸を検出することも可能である。
【００５４】
［００６９］本発明はまた、ＰＡＰの他の修飾も含む。
［００７０］・活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は、３’末端に加えて、他の位でも、ブロッキングされたヌクレオチドを含有可能である。
【００５５】
［００７１］・内部をブロッキングするヌクレオチドの導入は、増幅およびＰＡＰ間にインターフェイスを生じ、これによってＰＡＰがより高い忠実度で非指数関数的方式（例えば二次または幾何学的方式）で増幅することが可能になり、すなわちポリメラーゼが作るエラーが増殖不能になるであろう。
【００５６】
［００７２］・活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は、３’ブロッキングされたヌクレオチドとともに、伸長可能な修飾ヌクレオチドを含有することも可能である。したがって、５’末端から３’末端のどこででも、ブロッキングされたまたはブロッキングされていない修飾ヌクレオチドがあることも可能である。
【００５７】
［００７３］・マッチしたプライマーよりもミスマッチしたプライマーを加ピロリン酸分解するポリメラーゼを用いて、稀な突然変異を検出することも可能であり、この場合、３’末端でミスマッチしたＰ＊が活性化され、そして伸長される。
【００５８】
［００７４］・ミスマッチはＰ＊の活性化を阻害するため、稀な突然変異の検出は、オリゴヌクレオチドに沿って、どこにもミスマッチがないことに基づく。
［００７５］・活性化は、３’エキソヌクレアーゼなどの別の機構によって起こることも可能である。３’エキソヌクレアーゼは、３’端にミスマッチがあるかどうかを弁別するため、マッチしたプライマーまたはミスマッチしたプライマーに特異性を有する可能性もある。３’エキソヌクレアーゼはどちらの方式でも使用可能である。該酵素がミスマッチを好む場合、上述のように使用可能であるが、一般的でない突然変異を検出する能力は、活性化に関するある程度の特異性に依存するだろうし、とはいえ、特異性は、部分的に、内部のミスマッチに由来する可能性もある。
【００５９】
［００７６］・ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によって伸長反応を実行可能であり、テンプレートはＤＮＡまたはＲＮＡであることも可能であり、そしてオリゴヌクレオチドＰ＊はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡヘテロマーであることも可能である。
【００６０】
［００７７］・異なるポリメラーゼによって加ピロリン酸分解および伸長を行うことも可能である。例えば、Ｐ＊は、加ピロリン酸分解ポリメラーゼによって伸長不能であるが、別のポリメラーゼによって伸長可能である、末端直前（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）が修飾されたオリゴヌクレオチドを含むことも可能である。１つの例は、３’ジデオキシであり、これはＤＮＡポリメラーゼによって加ピロリン酸分解可能であるが、末端直前の位にリボヌクレオチドが存在すると、ＲＮＡポリメラーゼによる伸長を必要とするであろう。
【００６１】
［００７８］・ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、ＲＮＡＨまたは制限酵素などの核酸代謝酵素によって活性化される不活性オリゴヌクレオチドとして、ＰＡＰを一般化することも可能である。
【００６２】
［００７９］・メチラーゼは、ゲノムＤＮＡ中のメチル基の存在または非存在を検出するであろう。メチラーゼは、ポリメラーゼをテンプレートに押し戻す一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｎｇ）増幅とカップリングさせることも可能である。
【００６３】
［００８０］・３’端がジデオキシであり、そして末端直前のいくつかのヌクレオチドがリボであるＰ＊を、所望の特定の突然変異由来のタンパク質産物を差別的に作成するツールとして、または発現が特定の配列の存在に関連するタンパク質産物を作成するツールとして、使用可能である。３’端で突然変異に正確にマッチすれば、加ピロリン酸分解は、Ｐ＊を活性化するであろう。次いで、活性化されたオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ生成の基質となる。次いで、ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳して、タンパク質産物を産生することも可能である。
【００６４】
［００８１］・ＰＡＰ（ＰＡＰ、Ｂｉ−ＰＡＰ、マッチまたはミスマッチＰＡＰ、単一ＰＡＰ、多重ＰＡＰ等）を定量化に使用可能である。増幅産物の収量は、投入テンプレートの量と、定量的に関連する。関連は、比例的または別の形式である可能性もある。
【００６５】
［００８２］・ＰＡＰでは、産物は、線形、指数関数的、または別の方式で集積可能である。
【課題を解決するための手段】
【００６６】
発明の詳細な説明
［０１１１］本明細書において、以下の用語を用いる。
［０１１２］加ピロリン酸分解：ピロホスフェート（ＰＰｉ）の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼによって、ヌクレオチド鎖から３’ヌクレオチドを除去して、ヌクレオチド三リン酸を生成すること。これは重合反応の逆である。
【００６７】
［０１１３］ＰＡＰ：加ピロリン酸分解活性化重合。ＰＡＰは、１つのＰ＊を用いることも可能であり、または少なくとも１つがＰ＊である２つの相対するオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
【００６８】
［０１１４］Ｐ＊：加ピロリン酸分解によって活性化可能な伸長不能３’末端（または端）を持つオリゴヌクレオチド。
［０１１５］ＰＡＰ−Ａ：稀な突然変異の検出に使用可能な、ＰＡＰに基づくアレル特異的増幅（図１）。
【００６９】
［０１１６］Ｂｉ−ＰＡＰ−Ａ：３’末端に少なくとも１ヌクレオチド重複を持つ、相対するＰ＊の対を用いて行う、すなわち双方向性のＰＡＰ−Ａ（図２）。
［０１１７］ＰＡＰ−Ｒ：既知の配列内の未知の突然変異の検出のための、ＰＡＰに基づく再配列決定（図３および４）。
【００７０】
［０１１８］ＬＭ−ＰＡＰ：連結仲介ＰＡＰ。ＬＭ−ＰＡＰの性質は、連結反応によるか、またはターミナルトランスフェラーゼを用いた伸長によるなどで、ＰＡＰ前にテンプレートを合成することである。
【００７１】
［０１１９］ＬＭ−ＰＣＲ：連結仲介ＰＣＲ（図５）。
［０１２０］ＧＶまたはＡＶアレル：本明細書において、モデル系として用いた、ドーパミンＤ１受容体遺伝子の一般的な多型のアレル（本明細書において、Ｇ０またはＡ０アレルとも称する）。
【００７２】
［０１２１］線形ＰＡＰ：線形産物集積のための１つのＰ＊のみを用いるＰＡＰ。
［０１２２］指数関数的ＰＡＰ：指数関数的産物集積のためであり、そして少なくとも１つがＰ＊である、２つの相対するオリゴヌクレオチドを用いたＰＡＰ。
【００７３】
［０１２３］ノイズ比（％）：マッチ産物に対するミスマッチ産物の相対収量。ＰＡＰの特異的シグナルは、１０％未満のノイズ比と定義される。
［０１２４］ＰＡＳＡ：特異的アレルのＰＣＲ増幅（アレル特異的ＰＣＲまたはＡＲＭＳとしても知られる）。
【００７４】
［０１２５］再配列決定：未知の突然変異のスキャンおよび既知の配列内の正確な配列変化の決定。再配列決定は、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）配列決定とは区別される。
［０１２６］突然変異負荷：組織内の体細胞突然変異の頻度およびパターン。
【００７５】
［０１２７］微小残存病変：例えばリンパ節および他の隣接組織における稀な残存癌細胞または寛解後の早期再発。
［０１２８］伸長不能３’末端（または端）：伸長不能であるが、加ピロリン酸分解によって活性化可能である、オリゴヌクレオチドＰ＊の３’末端（または端）のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体。伸長不能３’末端（または端）の例には、限定されるわけではないが、２’３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）が含まれる。
【００７６】
［０１２９］単一ＰＡＰ：１つの反応試験管中または固体支持体上の１つのＰＡＰ（ＰＡＰ、Ｂｉ−ＰＡＰ、マッチまたはミスマッチＰＡＰ等）。
［０１３０］多重ＰＡＰ：１つの反応試験管中または固体支持体、例えばマイクロアレイ上の、１より多いＰＡＰ（ＰＡＰ、Ｂｉ−ＰＡＰ、マッチまたはミスマッチＰＡＰ等）。
【００７７】
［０１３１］マッチＰＡＰ：Ｐ＊およびテンプレート間にマッチを有するＰＡＰ。
［０１３２］ミスマッチＰＡＰ：Ｐ＊およびテンプレート間にミスマッチを有するＰＡＰ。
【００７８】
［０１３３］入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＡＰ：テンプレート核酸上で、１つの対が第二の対の内部に位置する、２以上の対のＰ＊を用いるＰＡＰ。
［０１３４］ホットスタートＰＡＰ：変性温度に近づくまで、本質的な反応構成要素が引き留められている（ｗｉｔｈｈｅｌｄ）ＰＡＰ（Ｃｈａｒｏら、１９９２；Ｋｅｌｌｏｇｇら、１９９４；Ｍｕｌｌｉｓ、１９９１；Ｄ’Ａｑｕｉｌａら、１９９１）。本質的な反応構成要素は、例えば中和抗体をポリメラーゼに結合させるか、ワックス中で、ポリマーまたはＭｇＣｌ２のような構成要素を隔離するか、ポリメラーゼを化学的に修飾して高温でインキュベーションされるまで活性化を妨げるか、あるいはワックスによって構成要素を分離することによって、引き留め可能である。
【００７９】
［０１３５］一部切除増幅：非指数関数的方式、例えば二次または幾何学的方式で、２つのキメラオリゴヌクレオチドに渡って増幅し、そして元来のテンプレートから３周期以下の複製である、一部切除末端産物を生じる増幅法（Ｌｉｕら、２００２）。
【００８０】
［０１３６］反応性３’ＯＨ：は、核酸ポリメラーゼによって伸長されるかまたはオリゴヌクレオチドに連結されることが可能な３’ＯＨである。
［０１３７］核酸増幅に必須のＤＮＡポリメラーゼは、以下の反応のいくつかまたはすべてを触媒する：ｉ）デオキシヌクレオチド三リン酸またはその類似体の重合；ｉｉ）ピロホスフェート（ＰＰ）の存在下での二重鎖ＤＮＡの加ピロリン酸分解、［ｄＮＭＰ］ｎ＋ｘ［ＰＰｉ］．．．［ｄＮＭＰ］ｎ−ｘ＋ｘ［ｄＮＴＰ］；ｉｉｉ）３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（ＰＰｉを必要としない）、およびｉｖ）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性（ＤｕｅｔｃｈｅｒおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ、１９６９；ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、１９９２）。ＴａｑおよびＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼに関しては、重合活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が報告されている（Ｃｈｉｅｎら、１９７６；Ｋａｌｅｄｉｎら、１９８１；Ｌｏｎｇｌｅｙら、１９９０）。Ｔ７  ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭおよびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ  ＤＮＡポリメラーゼに関しては、加ピロリン酸分解は、サンガー配列決定反応において、特定のジデオキシヌクレオチド末端セグメントの分解を導く可能性もある（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９０；Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｏｒｎら、１９９７）。
【００８１】
［０１３８］ＰＰｉは、通常の生理学的条件下で、ピロホスファターゼによって分解されるため、加ピロリン酸分解は、一般的に、非常に重要でない。しかし、ＰＰｉがｉｎ  ｖｉｔｒｏで高濃度に存在する場合、加ピロリン酸分解は重要である可能性もある。３’末端ジデオキシヌクレオチドを持つオリゴヌクレオチドでは、加ピロリン酸分解のみが可能である。ジデオキシヌクレオチドがひとたび除去されたら、活性化されたオリゴヌクレオチドを、重合によって伸長することが可能である。
【００８２】
［０１３９］加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）は、核酸から多様な情報を取り出す新規アプローチを提供する。ＰＡＰの非常に優れた特異性は、２つの反応を連続してカップリングすることによる。ＰＡＰは、３’末端ブロッキングされたオリゴヌクレオチド（Ｐ＊）の加ピロリン酸分解による活性化、その後、活性化されたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ重合による伸長を伴う。操作上、ＰＡＰは、直接伸長可能な通常のオリゴヌクレオチドの代わりに、活性化可能オリゴヌクレオチド（Ｐ＊）の使用を伴う。Ｐ＊の例には、不活性ジデオキシ末端オリゴヌクレオチドＰ＊、またはアシクロヌクレオチドなどの、３’ヒドロキシル基を欠く不活性化学的修飾ヌクレオチド、または伸長不能ヌクレオチド末端オリゴヌクレオチドＰ＊を有するものが含まれる。糖の環が欠けているアシクロヌクレオチド（アシクロＮＴＰ）は、ＤＮＡ配列決定中、鎖ターミネーターとして作用することが知られる（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７；Ｔｒａｉｎｏｒ、１９９６；ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ、２００２）。Ｐ＊の活性化は、オリゴヌクレオチド全長に渡って、ミスマッチによって阻害される。５’末端から２ヌクレオチドのミスマッチであっても、ＰＡＰ増幅を阻害する。
【００８３】
［０１４０］加ピロリン酸分解によるＰ＊の活性化は、Ｐ＊の全長に渡って、非常な特異性を提供する。増進した特異性を用いて、稀な既知の突然変異を検出し、再配列決定によって未知の突然変異を解明し、新規配列決定によって未知の配列を決定し、遺伝子発現レベルを測定し、２つの配列を比較し、そしてクロマチン構造のｉｎ  ｖｉｖｏ解析の特異性を増加させることも可能である。マイクロアレイに基づくプログラム可能光化学オリゴヌクレオチド合成およびＰＡＰは、相乗的な技術である。したがって、マイクロアレイに基づく迅速な再配列決定、新規配列決定、遺伝子発現プロファイリングおよびＳＮＰ検出のため、増進した特異性を使用することが可能である。
【００８４】
［０１４１］ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素的核酸増幅のいくつかの方法が開発されてきており、そしてこうした方法を適応させて、既知の配列変異体を検出することも可能である。これらには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら、１９８５；Ｓａｉｋｉら、１９８８）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、１９９８；Ｂａｒａｎｙ、１９９１）および回転周期増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）（Ｂａｎｅｒら、１９９８；Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８）が含まれる。本明細書において、我々は、加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）を記載し、このアプローチは、ＰＣＲアレル特異的増幅の特異性を劇的に増進する潜在能力を有する（Ｓｏｍｍｅｒら、１９８９）。ＰＡＰは、多くの点で、ＰＣＲを用いた修正と異なる：ｉ）Ｐ＊オリゴヌクレオチドは３’末端でブロッキングされており、そして加ピロリン酸分解によって活性化されなければならず、ｉｉ）加ピロリン酸分解および重合は、各増幅に関して、連続してカップリングされており、ｉｉｉ）線形増幅では１つのＰ＊を、または指数関数的増幅では２つのオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＡＰを行うことも可能であり、ｉｖ）増幅にはＰＰｉが必要であり、ｖ）有意な非特異的増幅は、ミスマッチ加ピロリン酸分解および誤った取り込みのエラーを連続してカップリングすることを必要とするであろう。
【００８５】
［０１４２］ＰＡＳＡに比較したＰＡＰの特異性増進は、加ピロリン酸分解および重合を連続してカップリングすることによって、提供される。有意な非特異的増幅は、ＤＮＡポリメラーゼによるミスマッチ加ピロリン酸分解および誤った取り込みを必要とする、非常に稀な事象である。例えば、本明細書に記載するように、ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｄ１ドーパミン受容体遺伝子のヌクレオチド２２９のＧアレルを検出した。３’末端にｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＧまたはｄｄＣいずれかを持つＰ＊を合成した。３’末端ジデオキシヌクレオチドは、重合による直接伸長を阻害するが、Ｐ＊がＧアレルの相補鎖に特異的にハイブリダイズした際、ピロホスフェート（ＰＰｉ）の存在下で、加ピロリン酸分解によって除去可能である。活性化されたオリゴヌクレオチドを、５’−３’方向で、重合によって伸長することが可能である。
【００８６】
［０１４３］加ピロリン酸分解後の重合を用いて、ＰＡＳＡの特異性を増加させることも可能であるという証拠が存在する。ＰＡＰを用いた有意な非特異的増幅は、２種類のエラー、すなわちミスマッチ加ピロリン酸分解および誤った取り込みの連続したカップリングを必要とする（図１）。ミスマッチ加ピロリン酸分解の率は、正しい３’デオキシヌクレオチドに比較した３’ミスマッチデオキシヌクレオチドの相対除去率として表される。ミスマッチ加ピロリン酸分解の率は、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼでは１０−５未満である（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、１９９２；Ｗｏｎｇら、１９９１）。重合によって置換突然変異を生成する、誤った取り込みの率を、正しいｄＮＭＰに対する誤ったｄＮＭＰの取り込み率として表すと、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼでは１０−５、そして大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩでは１０−４と報告された（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、１９９２；Ｗｏｎｇら、１９９１；Ｂｅｂｅｎｅｋら、１９９０）。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ欠損突然変異体および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで、同様の結果が報告された（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、１９９２；Ｗｏｎｇら、１９９１；Ｂｅｂｅｎｅｋら、１９９０；ＥｃｋｅｒｔおよびＫｕｎｋｅｌ、１９９０）。
【００８７】
［０１４４］ＰＡＰは、核酸テンプレート鎖上で所望の核酸鎖を合成する方法である。ＰＡＰでは、加ピロリン酸分解活性化可能オリゴヌクレオチド（Ｐ＊）を用いて、核酸増幅に関して、加ピロリン酸分解および重合を連続してカップリングする。Ｐ＊は、Ｎヌクレオチドまたはその類似体で構成されるオリゴヌクレオチドであり、そして３’末端に３’，５’ジデオキシヌクレオチドなどの伸長不能ヌクレオチドまたはその類似体を有する。テンプレート鎖上に実質的にハイブリダイズした際、Ｐ＊は、ＤＮＡポリメラーゼによって、３’末端ヌクレオチドまたはその類似体から直接は伸長不能であり、加ピロリン酸分解によって、Ｐ＊の３’末端ヌクレオチドまたはその類似体を除去して、そして次いで、活性化されたオリゴヌクレオチド（＜Ｎ）をテンプレート上で伸長することが可能である。
【００８８】
［０１４５］該方法は、連続して行われる以下の工程を含んでなる。
［０１４６］テンプレート鎖に、実質的に相補的な活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊をアニーリングさせる工程。この活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は、３’末端に、伸長不能ヌクレオチドまたはその類似体を有する。
【００８９】
［０１４７］（ｂ）ピロホスフェート、および加ピロリン酸分解活性を有する酵素を用いて、アニーリングした活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊を加ピロリン酸分解する工程。これは、３’末端伸長不能ヌクレオチドまたはその類似体の除去によってオリゴヌクレオチドＰ＊を活性化する。
【００９０】
［０１４８］（ｃ）ヌクレオシド三リン酸またはその類似体および核酸ポリメラーゼの存在下で、テンプレート鎖上、活性化されたオリゴヌクレオチドＰ＊を伸長することによって重合させ、所望の核酸鎖を合成する工程。
【００９１】
［０１４９］ＰＡＰ法を適用して、以下のさらなる工程によって所望の核酸鎖を増幅することも可能である。
［０１５０］（ｄ）テンプレート鎖から工程（Ｃ）の所望の核酸鎖を分離する工程、および
［０１５１］（ｅ）所望の核酸鎖の所望の増幅レベルが達成されるまで、工程（Ａ）〜（Ｄ）を反復する工程。
【００９２】
［０１５２］上記のＰＡＰ法をアレル特異的増幅に適用可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は、テンプレート鎖に相補的でない１以上のヌクレオチドを有する。Ｐ＊の非相補的ヌクレオチド（単数または複数）が、Ｐ＊の３’末端に位置することも可能である。上記工程（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）は実質的には起こりえない。その結果、所望の核酸鎖は、実質的に少なくしか合成されない。
【００９３】
［０１５３］上記ＰＡＰ法を１つの活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊のみを用いても適用可能である。（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）を反復して、所望の核酸鎖の所望の増幅レベルを線形に達成しうる。アニーリング領域外の標的とされる核酸領域は、異なるサイズまたは異なる配列背景のものであることも可能であり、したがって合成される核酸鎖は、異なるサイズまたは異なる配列背景のものである。
【００９４】
［０１５４］上記ＰＡＰ法は、少なくとも１つが活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊である２つの相対するオリゴヌクレオチドを用いても適用可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊および第二のオリゴヌクレオチドは、核酸領域の増幅のため、標的とされる。工程（ａ）〜（ｃ）は、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊に起こる。第二のオリゴヌクレオチドは、もう一方のテンプレート鎖に実質的に相補的である。第二のオリゴヌクレオチドが別の活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊である場合、工程（ａ）〜（ｃ）が起こる。第二のオリゴヌクレオチドが普通の伸長可能オリゴヌクレオチドである場合、工程（ａ）および（ｃ）が起こる：（修正ａ）テンプレート鎖にアニーリングさせる工程、次いで（修正ｃ）ヌクレオシド三リン酸またはその類似体および核酸ポリメラーゼの存在下で、テンプレート鎖上、オリゴヌクレオチドを伸長することによって重合させ、所望の核酸鎖を合成する工程。（ｅ）所望の核酸鎖の所望の増幅レベルが、例えば指数関数的に、達成されうるまで、工程（ａ）〜（ｄ）、または工程（ａ）、（ｃ）および（ｄ）を反復する工程。２つの相対するオリゴヌクレオチドの２つのアニーリング領域間にある標的とされる核酸領域は、異なるサイズまたは異なる配列背景のものであることも可能であり、したがって合成される核酸鎖は、異なるサイズまたは異なる配列背景のものである。
【００９５】
［０１５５］ＬＭ−ＰＡＰは、切断、プライマー伸長、リンカー連結、およびＰＡＰを伴い、染色体のメチル化状態などのｉｎ  ｖｉｖｏクロマチン構造の解析に適用可能である。
【００９６】
［０１５６］ＬＭ−ＰＡＰは工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）によって、工程（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）によって、工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）によって、または工程（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖｉ）によって、実行可能であり、工程は以下のとおりである。
【００９７】
［０１５７］切断が化学的、酵素的、または天然に生じて、核酸鎖を「破壊」する。核酸は、通常、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生された損傷またはニックを有することも可能なゲノムＤＮＡである。
【００９８】
［０１５８］（ｉｉ）プライマーＰ１は遺伝子特異的であり、そしてその伸長には：１）テンプレート鎖に実質的に相補的なプライマーをアニーリングさせ；２）ヌクレオシド三リン酸またはその類似体および核酸ポリメラーゼの存在下、テンプレート鎖上でプライマーを伸長し、この伸長がテンプレート鎖上の切断部位で「脱線する」ことが含まれる。工程１）および２）を反復することも可能である。
【００９９】
［０１５９］プライマー伸長の代わりにＰ＊伸長を行うことも可能である（１つのみの活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊を用いた上記ＰＡＰ）。
［０１６０］（ｉｉｉ）リンカー連結工程には、合成された核酸鎖の３’末端へのリンカーの連結が含まれる。テンプレート非依存性重合であり、そして合成された核酸鎖の３’末端に余分な核酸配列が付加されるターミナルトランスフェラーゼ伸長を、リンカー連結工程の代わりに行うことも可能である。
【０１００】
［０１６１］（ｉｖ）第二の遺伝子特異的プライマー（Ｐ２）を、リンカーに特異的な、またはターミナルトランスフェラーゼによって付加された配列に特異的なプライマーとともに用いて、ＰＣＲを行う。
【０１０１】
［０１６２］（ｖ）第三の遺伝子特異的Ｐ＊（Ｐ３）を用いて、ＰＣＲが生成した断片を検出する。１つの活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊のみを用いて、ＰＡＰ法を適用する。活性化されたオリゴヌクレオチドＰ＊の伸長は、工程（ｉｖ）で生成したテンプレート鎖の端で「脱線する（ｒｕｎ  ｏｆｆ）」。ＰＡＰ法をアレル特異的方式で適用することも可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊は、テンプレート鎖に相補的でない１以上のヌクレオチドを含有することも可能である。Ｐ＊の非相補的ヌクレオチド（単数または複数）が、Ｐ＊の３’末端に位置することも可能である。
【０１０２】
［０１６３］（ｖｉ）工程（ｉｖ）および（ｖ）の代わりに、少なくとも１つが活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊である２つの相対するオリゴヌクレオチドを用いたＰＡＰ法も適用可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊（Ｐ３）は遺伝子特異的である。第二のオリゴヌクレオチドは、リンカーに特異的であるか、またはターミナルトランスフェラーゼによって付加された配列に特異的である。第二のオリゴヌクレオチドは、別の活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊であることも、または普通のプライマーであることも可能である。アレル特異的方式でＰＡＰ法を適用することも可能である。活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊（Ｐ３）は、テンプレート鎖に相補的でない、１以上のヌクレオチドを含有することも可能である。Ｐ＊の非相補的ヌクレオチド（単数または複数）は、Ｐ＊（Ｐ３）の３’末端に位置することも可能である。
【０１０３】
［０１６４］図１は、アレル特異的ＰＡＰ（ＰＡＰ−Ａ）による、稀な突然変異の検出を示す。ＰＡＰ−Ａは、３’ジデオキシ末端（Ｐ＊）を持つアレル特異的オリゴヌクレオチドが、加ピロリン酸分解および重合の連続したカップリングを可能にするため、非常に高い特異性で稀なアレルを検出可能である。例えば、アレル特異的オリゴヌクレオチドが、稀な「Ｔ」アレルにマッチする３’ジデオキシ末端（Ｐ＊）を有する場合、ジデオキシヌクレオチドの加ピロリン酸分解的除去によって活性化が起こり、そして続いて重合が起こる（状況Ａ）。加ピロリン酸分解による活性化は、野生型「Ｃ」アレルとのように、３’末端でミスマッチがある場合、通常、起こらない（状況Ｂ）。稀に、加ピロリン酸分解は、ミスマッチ部位で起こる（概算頻度１０−５）が、活性化されたオリゴヌクレオチドが伸長されて、野生型配列が生じる（状況Ｃ）。ミスマッチ加ピロリン酸分解が起こり、テンプレートＤＮＡ中、Ｃに相対してＡを挿入するポリメラーゼエラーが起こる場合、効率的な増幅を支持する産物が生成される（状況Ｄ）。ポリメラーゼ突然変異とカップリングしたミスマッチ加ピロリン酸分解の頻度は、１０−５ｘ３ｘ１０−６＝３ｘ１０−１１と概算される。
【０１０４】
［０１６５］ＰＡＰは、３ｘ１０−１１の特異性を有しうる。この潜在能力に近づくには、混乱させるエラー原因を排除する設計が必要である。例えば、ブロッキングされていない上流オリゴヌクレオチドからの伸長エラーは、目的の突然変異を持つ産物を生成しうる。ＴａｑＦＳの誤った取り込みの率がヌクレオチドあたり約１０−５であり、そして３つの誤った取り込みのうち１つのみが目的の突然変異を生じる場合、エラー率は約３．３ｘ１０−６である。校正機能を含有するポリメラーゼは、特定の突然変異あたり３ｘ１０−７のエラー率を有する可能性がある。エラー率がより低いポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体は特異性をさらに改善するであろう。
【０１０５】
［０１６６］１つのアプローチは線形ＰＡＰを利用する。線形ＰＡＰ−Ａは、蛍光または放射標識ｄｄＮＴＰの存在下で、Ｐ＊のみを用いて、４０周期行うことも可能である。Ｐ＊が活性化されると、定義されたサイズの標識末端産物が生成されるであろう。線形ＰＡＰ−Ａは、元来のゲノムＤＮＡのみを利用し、そしてブロッキングされていない上流プライマーの伸長からの誤った取り込みによるエラーを排除する利点を有する。しかし、増幅レベルが周期数より大きくないため、検出の感度は限定される。ラムダファージなどの単純なゲノムでは、１０−６の検出特異性が可能である。線形ＰＡＰ−Ａの特異性は、ブロッキングされていない伸長可能オリゴヌクレオチドが存在しないことに、決定的に依存する。１０−６の堅固な特異性を達成するためには、ブロッキングされていない伸長可能オリゴヌクレオチドは、１０−７で存在しなければならない。これは、ゲル精製したＰ＊（我々の現在のプロトコルでは、約９９．９９％純粋）を３’−５’エキソヌクレアーゼで処理して、ブロッキングされていない分子を分解して、その後、ゲル電気泳動によって再精製することによって、達成可能である。
【０１０６】
［０１６７］第二のアプローチは、双方向性ＰＡＰ−Ａ（Ｂｉ−ＰＡＰ−Ａ；図２）である。Ｂｉ−ＰＡＰ−Ａでは、下流および上流両方のオリゴヌクレオチドが、目的のヌクレオチドに特異的なＰ＊である。Ｐ＊は、３’末端で１ヌクレオチド重複する。この設計は、ブロッキングされていない上流オリゴヌクレオチドからの伸長エラーを排除する。この設計は、ジデオキシ末端が付加されていない少量の活性混入オリゴヌクレオチド（我々の現在のプロトコルでは、約０．０１％）によって、限定されないはずであり、これは、生成される産物が対照のものであり、そして続く周期で効率的な増幅の基質でないためである。
【０１０７】
［０１６８］Ｂｉ−ＰＡＰ−Ａは、プライマー二量体のサイズの産物を生成する。しかし、これは、続く周期において、目的の突然変異を持つテンプレートＤＮＡが、増幅の効率的な基質となる産物を生成するのに必要な中間体である点で、慣用的な意味でのプライマー二量体ではない。双方向性ＰＡＰ−Ａは、特異性の重要な障壁を排除し、そして１０−９の特異性に達する潜在能力を有する。
【０１０８】
［０１６９］図２に示すように、下流および上流両方のＰ＊は、３’末端で目的のヌクレオチドに特異的である（この例ではＡ：Ｔ塩基対）。ゲノムＤＮＡからの増幅の最初の周期において、定義されないサイズのセグメントが生成されるであろう。続く周期において、オリゴヌクレオチドを合わせた長さから１引いた長さに等しいセグメントが指数関数的に増幅されるであろう。この設計によって、３ｘ１０−６のエラー率で、Ｇ：Ｃ野生型テンプレートからＡ：Ｔテンプレートを生成可能な、ブロッキングされていない上流オリゴヌクレオチドからの誤った取り込みのエラーが排除されるため、非特異的増幅は、より低い頻度で起きる。Ｐ＊は、最も効率的な増幅のため、３０〜６０ヌクレオチドであることも可能である。状況Ａは、稀なＡ：Ｔアレルを持つテンプレートが効率的に増幅されるであろうことを示す。上流および下流両方のＰ＊は効率的に増幅される。状況Ｂは、ＤＮＡテンプレートが野生型Ｇ：Ｃ配列を含有する場合、下流または上流いずれのＰ＊も実質的に活性化されないであろうことを示す。
【０１０９】
［０１７０］迅速再配列決定は、癌および他の複雑な疾患に罹りやすくする遺伝子の解明を促進するであろう。ＰＡＰの特異性は、再配列決定に役立つ。Ｐ＊は、柔軟なデジタルマイクロミラーアレイを用いて、マイクロアレイ上で光化学合成されることも可能である。
【０１１０】
［０１７１］固定ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのマイクロアレイは、ｉｎ  ｓｉｔｕ光駆動（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）コンビナトリアル合成または慣用的合成いずれで製造することも可能である（Ｒａｍｓａｙ、１９９８；ＭａｒｓｈａｌｌおよびＨｏｄｇｓｏｎ、１９９８に概説）。大規模な平行解析を行うことも可能である。オリゴヌクレオチドの光化学合成は、アドレス可能オリゴヌクレオチドマイクロアレイのコンビナトリアル平行合成のための強力な手段である（Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎら、１９９９；ＬｅＰｒｏｕｓｔら、２０００）。各チップに対する多数のフォトリソグラフマスクに対する、この柔軟な代替法は、マスクがないアレイの合成装置を利用し、コンピュータ上でバーチャルマスクが生成される。これらのバーチャルマスクはデジタルマイクロミラーアレイにリレーされる。１：１反射画像系によって、バーチャルマスクの紫外画像がガラス支持体の活性表面上に産生される。このガラス支持体を、ＤＮＡ合成装置に連結されたフローセル反応チャンバーにマウントする。光曝露後、プログラムされた化学カップリング周期が起こる。さらなるバーチャルマスクを用いて該方法を反復することによって、所望の配列を持つオリゴヌクレオチドマイクロアレイを合成することが可能である。Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎらに開発された原型は、１６平方ミクロンに７６，０００を越えるフィーチャーを含有するオリゴヌクレオチドマイクロアレイを合成した。
【０１１１】
［０１７２］プログラム可能光化学オリゴヌクレオチド合成とデジタルミラーおよびＰ＊のオリゴヌクレオチド伸長を組み合わせることによって、高スループットで、そして自動化された再配列決定法が可能になる。ＰＡＰ−Ｒは、冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が高いため、実質的に１００％の一塩基置換および他の小さい配列変異体も検出可能である；いくつかの重複Ｐ＊オリゴヌクレオチドに渡るミスマッチは、重複Ｐ＊のクラスターの活性化を妨げるであろう。再配列決定のための１つの戦略を図３および４に示す。図３は、プログラム可能光化学オリゴヌクレオチドを用いて、マイクロアレイ上で行うＰＡＰ−Ｒの概略図を示す：ＰＡＰは、未知の突然変異を検出する再配列決定に使用可能である。このマイクロアレイ上で、野生型テンプレートを示す。野生型テンプレートにしたがってＰ＊を設計する。突然変異と重複するＰ＊は、ほとんどまたはまったくシグナルを生じず、「低」ＰＡＰシグナルと示した。
【０１１２】
［０１７３］図４は、ＧからＡへの突然変異を検出するための、固体支持体に基づく、例えばマイクロアレイに基づく再配列決定の例を示す。一塩基伸長の基質として、４種の異なる色素で標識したｄｄＮＴＰを用いて、線形ＰＡＰを行う。Ｐ＊は、オリゴヌクレオチドの３’領域内の１６ヌクレオチドの特異的領域を有する。例では、ホモ接合体またはヘミ接合体ＤＮＡテンプレートを利用する。野生型配列のセンス鎖上の各ヌクレオチド位で、３’末端の４種のｄｄＮＭＰ以外は同一の配列を持つ、４つのＰ＊のセットを合成する。３’末端にｄｄＡを持つＰ＊は、Ｇ−Ａ突然変異の部位でＰＡＰシグナルを生成する。突然変異はまた、続く重複するＰ＊の１５セットに対して、ＰＡＰシグナルを持たない１５塩基「ギャップ」も生成する。ヘテロ接合体突然変異では、ｄｄＡおよびｄｄＧを持つＰ＊がＰＡＰシグナルを提供する。ヘテロ接合体突然変異はまた、５０％シグナル強度の１５塩基「ギャップ」も生成する（これに１００％強度のシグナルが隣接する）。ヘテロ接合体試料に冗長性を付加するには、アンチセンスＰ＊が利用可能である（未提示）。２セットのＰ＊を組み合わせることによって、未知の一塩基置換を決定することも可能である。小さい欠失および挿入を検出し、そして位置決定することも可能である。
【０１１３】
［０１７４］マイクロアレイあたり１００，０００オリゴヌクレオチドを用いて、下流方向および上流方向から、約１２ｋｂを再配列決定可能である。実質的にすべての突然変異を検出するには、標準的なＧｅｎｉｏｍ（登録商標）装置ソフトウェアを追加する必要がある。野生型配列では、シグナル強度は多様でありうる。特定のオリゴヌクレオチドは、二次構造および他の要因のため、より弱いシグナルを生じるであろう。野生型試料からのシグナルのパターンは、既定の配列変化によって生成されるパターンからは、確実に区別されるはずである。予備的データによって、ほぼすべてのミスマッチが活性化を劇的に阻害するであろうことが示唆される。一塩基ミスマッチが有意に少量であり、活性化が実質的に阻害されないとしても、冗長性のため、突然変異は野生型から確実に区別可能である。
【０１１４】
［０１７５］ｉｎ  ｖｉｖｏクロマチン構造が哺乳動物遺伝子制御および発生に非常に重要であることがますます明らかになってきている。クロマチン構造の安定した変化は、しばしば、メチル化の変化および／またはヒストンアセチル化の変化を伴う。クロマチン構造における体細胞遺伝可能変化は、一般的にエピジェネティック変化と呼ばれ（ＲｕｓｓｏおよびＲｉｇｇｓ、１９９６）、そしてエピジェネティック「ミス」またはエピミューテーションは、しばしば、癌の発生に寄与する重要な要因であることが現在明らかである（ＪｏｎｅｓおよびＬａｉｒｄ、１９９９）。
【０１１５】
［０１７６］ｉｎ  ｖｉｖｏクロマチン構造をアッセイするいくつかの方法の１つであり、そして単一ヌクレオチドレベルでの解像度を持つ唯一の方法は、連結仲介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）（ＭｕｅｌｌｅｒおよびＷｏｌｄ、１９８９；Ｐｆｅｉｆｅｒら、１９８９）である。ＬＭ−ＰＣＲは、クロマチン構造、メチル化、およびＤＮＡ損傷を評価するのに用いられてきている。図５はＬＭ−ＰＣＲの概略図を示し、ここで出発ＤＮＡ中のＤＮＡ損傷を小さいひし形で示す。ＬＭ−ＰＣＲは、切断、プライマー伸長、リンカー連結およびＰＣＲ増幅を伴う。ＬＭ−ＰＡＰは、活性化可能オリゴヌクレオチドＰ＊を用いることを除いて、ＬＭ−ＰＣＲと同様である。
【０１１６】
［０１７７］ＬＭ−ＰＣＲは、重要な技術であることが立証されており、現在までに１００を越える公表された研究に用いられてきている（Ｐｆｅｉｆｅｒら、１９９９）。メチル化シトシン残基、結合している転写因子、または配置されているヌクレオソームの位置などの、クロマチン構造の多くの側面が、ＬＭ−ＰＣＲによって決定可能である。重要なことに、損なわれておらず、そして最小限しか撹乱されていない細胞において、構造が決定される。例えば、ＵＶ光−フットプリンティングは、ペトリ皿中で組織培養細胞をＵＶ照射し、ＤＮＡを直ちに抽出し、そしてＬＭ−ＰＣＲを行って、その形成が転写因子の結合に影響を受けるチミジン二量体の位置を決定することによって行われる。
【０１１７】
［０１７８］アレル特異的ＬＭ−ＰＡＰを適用して、ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化のレベルを定量的に決定することも可能である。現在、ＬＭ−ＰＣＲのバックグラウンドのため、メチル化レベルの確実な概算が限定されている。一般的に、０％、５０％および１００％のメチル化が決定可能であるとみなされるが、より細かい段階的変化の区別は信頼性がない。ＬＭ−ＰＡＰのバックグラウンドが顕著に減少すると、０％、２０％、４０％、６０％、８０％、および１００％のメチル化標準を確実に区別することも可能になる。アレル特異的ＬＭ−ＰＡＰを利用して、インプリンティングされた領域のメチル化レベルを調べるか、または雌において、不活性Ｘ染色体遺伝子に対する活性Ｘ染色体遺伝子のメチル化レベルを調べることが特に興味深いだろう。ＬＭ−ＰＡＰが、クロマチン構造を調べるのに必要な技術および経験を減少させ、それによって、より多くの実験室で、クロマチン構造解析が容易になるであろうと予期される。
【０１１８】
［０１７９］ＬＭ−ＰＡＰは多様な適用を有する。アレル特異的ＰＡＰを利用して、インプリンティングされた遺伝子の示差的メチル化およびクロマチン構造を調べるか、または雌において、不活性Ｘ染色体遺伝子に対する活性Ｘ染色体遺伝子の示差的メチル化およびクロマチン構造を調べることが特に興味深いだろう。さらに、突然変異誘発物質、ＤＮＡ損傷、および突然変異誘発間の関係を調べることも可能である。
【０１１９】
［０１８０］ＰＡＰにおいて、上述し、そして本明細書に例示するように、加ピロリン酸分解活性化可能オリゴヌクレオチドを用いることによって、ＤＮＡポリメラーゼによる加ピロリン酸分解および重合を連続してカップリングする。ＰＡＰ配列決定において、原理は、ＰＡＰの特異性に、そして次に３’特異的下位配列の塩基対形成特異性に基づく。３’特異的下位配列のこの特性を適用して、未知の配列変異体をスキャンし、新規にＤＮＡ配列を決定し、２つのＤＮＡ配列を比較し、そして遺伝子発現プロファイリングを監視することも可能である。
【０１２０】
［０１８１］ＰＡＰは、１つのＰ＊および１つの相対するブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを用いたＰＡＰにおいて、Ｐ＊に沿ったミスマッチに非常に感受性である。ＰＡＰの特異性はまた、Ｐ＊の長さおよびミスマッチによっても影響を受ける。Ｐ＊のアレル特異的ヌクレオチドが３’末端にある場合、特異的アレルのみが増幅され、そして特異性はＰ＊の長さには関連しない。アレル特異的ヌクレオチドがＰ＊の３’末端にない場合、特異性はＰ＊の長さに関連する。２６量体のＰ＊は、３ヌクレオチドの３’特異的下位配列を有し、この領域内で、いかなるミスマッチも増幅を阻害する。１８量体は、１６ヌクレオチドの３’特異的下位配列を有する。
【０１２１】
［０１８２］Ｂｉ−ＰＡＰは、ＰＡＰの１つの型である。２つの相対するＰ＊を持つＢｉ−ＰＡＰにおいて、各Ｐ＊は、それ自体の３’下位配列を有し、すなわちこの領域内で、いかなるミスマッチもＢｉ−ＰＡＰの増幅を阻害する。例えば、Ｐ＊対のアレル特異的ヌクレオチドが３’末端にある場合、たとえＰ＊の長さが４０、３５または３０ヌクレオチドであっても、特異的アレルのみが増幅された。対の特異的下位配列の長さは、Ｐ＊対を加算して１引いたものである。
【０１２２】
［０１８３］対の特異的下位配列の長さは、各Ｐ＊の配列背景およびサイズ、３’末端伸長不能ヌクレオチドの種類、テンプレート配列、ＤＮＡポリメラーゼ、イオンなどの他の構成要素、並びに周期条件によって影響を受ける可能性もある。テンプレートが反復配列を含有するか、または均一のポリマーがＰ＊対の長さより長く続く場合、Ｐ＊は係留のための特異性を失う可能性もある。
【０１２３】
［０１８４］再配列決定は、未知の突然変異を検出するための既知の領域の配列決定である。Ｂｉ−ＰＡＰの対の特異的下位配列の特性を適用して、未知の配列変異体をスキャンするか、または平行方式で、あらかじめ決定された配列を再配列決定することも可能である。
【０１２４】
［０１８５］Ｂｉ−ＰＡＰ再配列決定を、図２２、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ａおよび２３Ｂに示す。簡潔には、野生型配列を決定し、そして種類および位置を含めて、いかなる一塩基置換も決定することが可能である。未知の小さい欠失および挿入を検出し、そして位置決定することも可能である。特定の種類の欠失または挿入を同定するため、対応するＢｉ−ＰＡＰを追加することが可能である。突然変異位置に関する情報を提供しうるフィンガープリンティングでは、より少ない数のＢｉ−ＰＡＰを使用することも可能である。
【０１２５】
［０１８６］Ｂｉ−ＰＡＰ新規ＤＮＡ配列決定の概念は、Ｐ＊対の完全なセットの対の特異的下位配列を使用して、新規配列における対の特異的下位配列の存在を同定する。
［０１８７］マイクロアレイ上のＢｉ−ＰＡＰ新規ＤＮＡ配列決定を図２５に示す。簡潔には、該方法はまず、Ｐ＊対を用いたＢｉ−ＰＡＰ増幅物をすべて収集し、そして次いで、対の特異的下位配列を順序付けることによって、この収集物から未知のＤＮＡ配列を再構築する。
【０１２６】
［０１８８］２つのＤＮＡ配列が同一であるかまたは異なるかを知るために、これらを比較するため、Ｐ＊対の特異的下位配列の不完全なセットを用いることによって、Ｐ＊対の数を減少させる単純な方法がある。これらを特定の順序に配置することによって、染色体位置とともに配列を同定することが可能である。
【０１２７】
［０１８９］遺伝子発現プロファイリングを監視するため、６ｘ１０４〜１０５までの転写物が発現され、そして正確な配列の詳細が不要な場合、Ｂｉ−ＰＡＰを適用可能である。遺伝子中の特有のモチーフを特異的に増幅可能なＰ＊対のセットを、Ｂｉ−ＰＡＰ用に設計可能である。
【０１２８】
［０１９０］Ｂｉ−ＰＡＰの塩基対形成特異性のこの特性を適用して、未知の配列変異体をスキャンし、新規にＤＮＡ配列を決定し、２つのＤＮＡ配列を比較し、そして遺伝子発現プロファイリングを監視することも可能である。Ｂｉ−ＰＡＰアレイが可能である。２つの相対するＰ＊の各対を固体支持体、例えばマイクロアレイ上の個々の点に固定し、こうしてＢｉ−ＰＡＰ反応がすべて平行してプロセシングされることを可能にしてもよい。
【０１２９】
［０１９１］ＰＡＰでは、活性化可能オリゴヌクレオチドは、加ピロリン酸分解によって活性化可能な伸長不能３’末端（以後、伸長不能３’末端と称する）を有する。テンプレート鎖とハイブリダイズ可能であり、３’末端ヌクレオチドが加ピロリン酸分解によって除去可能であり、そして活性化されたオリゴヌクレオチドが伸長可能であるならば、いかなる３’末端伸長不能オリゴヌクレオチドも使用可能である。伸長不能３’末端の例には、限定されるわけではないが、ジデオキシヌクレオチドなどの伸長不能３’デオキシヌクレオチド、またはアシクロヌクレオチドなどの、３’ヒドロキシル基を欠く化学的に修飾されたヌクレオチドが含まれる。アシクロヌクレオチドでは、通常ｄＮＭＰに存在する２’−デオキシリボフラノシル糖が、２−ヒドロキシエトキシメチル基で置換されている。
【０１３０】
［０１９２］別のブロッキング剤は、完全なマッチに対する加ピロリン酸分解の選択度を増加させ、それによって稀な突然変異を検出するＰＡＰの選択度をさらに増進させることも可能である。最後に、別のブロッキング剤は、より安価であるかまたはより容易に自動化可能であり、それによってＰＡＰの費用効率を改善し、そしてＰＡＰマイクロアレイに基づく再配列決定を促進することも可能である。
【０１３１】
［０１９３］さらに、ジデオキシヌクレオチドでブロッキングされていないＰ＊は、ＰＡＰに使用可能なＤＮＡポリメラーゼの選択を拡張する。本明細書に立証するように、３’末端伸長不能オリゴヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドまたはアシクロヌクレオチドを含有する場合、ファミリーＩのポリメラーゼをＰＡＰに使用することも可能である。３’末端伸長不能オリゴヌクレオチドがアシクロヌクレオチドを含有する場合、ファミリーＩＩのポリメラーゼをＰＡＰに使用することも可能である。
【実施例】
【０１３２】
実施例
［０１９４］本発明は、ＰＡＰを用いてヒトＤ１ドーパミン受容体遺伝子内の多型部位における既知の突然変異を同定可能であることを例示する、以下の実施例から理解されるであろう。ジデオキシオリゴヌクレオチド配列、アシクロヌクレオチド配列、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＰｉ濃度、アレル特異的テンプレート、ｐＨ、およびｄＮＴＰ濃度の影響を調べた。原理を立証するため、実施例に報告する実験を行った。以下の実施例は、例示のため提供され、そしていかなる方式でも本発明を限定することを意図しない。当該技術分野に周知の標準技術またはそれらの文書に具体的に記載される技術を利用した。
【０１３３】
（実施例１）
ＰＣＲによるテンプレートの調製
［０１９５］２つのプライマー（Ｔ＝５’ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ３’（配列番号１）およびＵ＝５’ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＡＴＡ３’（配列番号２））を用いたＰＣＲによって、ヒトＤ１ドーパミン受容体遺伝子の６４０ｂｐ領域を増幅した（図６Ａ）。ＴＵ：ＵＴ二重鎖産物はＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ５５７６０のヌクレオチド３３〜６７２に渡り、そしてＧ＋Ｃ含量は５５．３％である。よく生じるＡからＧへの多型は、ヌクレオチド２２９に位置し、Ｇ／Ｇ、Ａ／ＡおよびＧ／Ａの３つの遺伝子型を生じる（Ｌｉｕら、１９９５）。ＰＣＲ混合物は、５０μｌの体積を含有する：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２００μＭの４種のｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、各０．１μＭのプライマー、２％ＤＭＳＯ、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびＧ／Ｇホモ接合体、Ａ／Ａホモ接合体またはＧ／Ａヘテロ接合体由来の２５０ｎｇのゲノムＤＮＡ。周期条件には：９５℃１５秒間の変性、５５℃３０秒間のアニーリング、および７２℃１分間の伸長で、全部で３５周期が含まれた（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ系９６００）。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）１００微量濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ）上で３回保持することによって、プライマーおよび他の小分子から、ＰＣＲ産物をおよそ１０，０００倍精製した。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、回収されたＰＣＲ産物の量を測定した。
【０１３４】
３’−ジデオキシヌクレオチドを付加することによるＰ＊の合成
［０１９６］ホープ市ＤＮＡ／ＲＮＡ化学研究室において、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８９０９合成装置（Ｆｒａｍｉｎｓｈａｍ）によってデオキシヌクレオチドオリゴヌクレオチドを合成し、そしてｏｌｉｇｏｐｕｒｅカートリッジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）によって精製した。ターミナルトランスフェラーゼによって３’末端ジデオキシヌクレオチドを付加した。混合物は、４０μｌの総体積を含有した：２００ｍＭカコジル酸カリウム、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（２５℃でｐＨ６．６）、２．５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、０．２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、４０００ｐＭのオリゴヌクレオチド、２．５ｍＭ  ２’３’−ｄｄＮＴＰ（ｄｄＮＴＰに対する３’−ＯＨ末端のモル比は１：２５であった）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１２５Ｕのターミナルトランスフェラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。反応を３７℃で１時間インキュベーションし、そして次いで、最終濃度５ｍＭでＥＤＴＡを添加することによって停止した。ブタノールを用いることによって脱塩した後、ＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ホウ酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中の分離用７Ｍ尿素／２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってジデオキシオリゴヌクレオチドを精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、回収されたＰ＊の量を測定した。
【０１３５】
［０１９７］少量の末端処理されていないオリゴヌクレオチドが、加ピロリン酸分解の非特異性を生じるであろうため、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって、５’末端で各ジデオキシオリゴヌクレオチドを３２Ｐ標識し、そして次いで、７Ｍ尿素／２０％ポリアクリルアミドゲルを通じて電気泳動した。ゲルを過剰曝露しても、Ｐ＊産物のみが可視であった（データ未提示）。９９．９９％より多いＰ＊が３’末端にジデオキシヌクレオチドを含有したと概算される。
【０１３６】
加ピロリン酸分解活性化重合
［０１９８］オリゴヌクレオチドＰ＊およびＵを用いるＰＡＰ、または１つのＰ＊のみを用いるＰＡＰによって、ＴＵ：ＵＴ二重鎖テンプレート内の４６９ｂｐ領域を増幅した（表１および図６Ａ）。ＰＵ：ＵＰ二重鎖産物は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ５５７６０のヌクレオチド２０４〜６７２に対応し、そしてＧ＋Ｃ含量は５５．６％である。言及しない限り、ＰＡＰ反応混合物は、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼでは、２５μｌの総体積を含有した：７５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各４０μＭの４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）、０．２μＭ  Ｐ＊、０．０５μＭ  Ｕオリゴヌクレオチド、３００μＭ  Ｎａ４ＰＰｉ（２０ＭＭストック溶液をＨＣｌでｐＨ８．０に調整した）、１μＣｉの［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｎｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、１ＵのＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および２ｎｇのＴＵ：ＵＴ。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでは、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を除いて、反応混合物は同じであった。ＰＣＲおよび他の対照の混合物は、添加するプライマーを除いて、同じであった。周期条件には：９４℃１５秒間、５５℃１分間、および１分間で傾斜をつけて７２℃に上昇させ、そして７２℃２分間、全部で１５周期が含まれた。
【０１３７】
表１
ＰＡＰに用いたオリゴヌクレオチド
【０１３８】
【表１】
2005525121.tif 000002
【０１３９】
ａＤ１の３’末端にＧジデオキシヌクレオチドを付加することによって、Ｄ１Ｇ＊を産生した。＊＝３’末端のジデオキシヌクレオチド。
ｂＴは３’末端がＴデオキシヌクレオチドであることを意味し、そしてＧ＊は３’末端がＧジデオキシヌクレオチドであることを意味する。太い大文字ＧおよびＡは、それぞれ、ＧアレルおよびＡアレルに対応するＧ塩基およびＡ塩基である。５’末端の第一の塩基は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ５５７６０のヌクレオチド２０８に対応する。
【０１４０】
ｃ３’末端塩基はデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドであり、そしてテンプレートの相補鎖上の対応する塩基と、マッチ（する）またはミスマッチ（しない）を生成する。
【０１４１】
ｄアレル特異的ヌクレオチドはＧまたはＡであり、そして３’末端までの距離を：０＝３’末端、＋１＝３’末端から１塩基下流、−１＝３’末端から１塩基上流、−２＝３’末端から２塩基上流、および−３＝３’末端から３塩基上流と指定する。
【０１４２】
ｅオリゴヌクレオチドのＴｍは、１Ｍ  ＮａＣｌで、４℃ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２℃ｘ（Ｔ＋Ａ）と概算された（ＭｉｙａｄａおよびＷａｌｌａｃｅ、１９８７）。
ｆＵおよび１つのＰ＊を用いた増幅または１つのＰ＊のみを用いた増幅。
【０１４３】
［０１９９］標準的な２％アガロースゲルを通じて反応を電気泳動した。ＣＣＤカメラ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  １０００）によるＵＶ写真のため、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーのため、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴＴＭ  ＡＲフィルムに供した。
【０１４４】
制限消化
［０２００］３つの制限エンドヌクレアーゼ、ＡｃｉＩ（５’Ｃ▼ＣＧＣ３’／３’ＧＧＣ▲Ｇ５’）、ＥａｅＩ（５’Ｐｙ▼ＧＧＣＣＰｕ３’／３’ＰｕＣＣＧＧ▲Ｐｙ５’）およびＥｃｏ０１０９Ｉ（５’ＰｕＧ▼ＧＮＣＣＰｙ３’／３’ＰｙＣＣＮＧ▲ＧＰｕ５’）は各々、ＰＵ：ＵＰ二重鎖内に制限部位を有する。Ｄ５Ｇ＊およびＵを用いたＰＡＰによって、Ｇ／Ｇアレルを増幅し；Ｄ１およびＵを用いたＰＣＲ増幅を対照として用いた。４０μｌのＰＡＰ反応および２μｌのＰＣＲ反応をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）１００微量濃縮装置で精製し、そして濃縮し、そして制限エンドヌクレアーゼ：１ｘＮＥ緩衝液３中、２．５ＵのＡｃｉＩ；または１ｘＮＥ緩衝液１中、３ＵのＥａｅＩ；またはＢＳＡを含むＮＥ緩衝液４中の３０ＵのＥｃｏ０１０９Ｉ（上記の酵素および緩衝液はすべてＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓからのもの）によって産物を消化した。１０μｌの反応物を、３７℃で２時間インキュベーションした。消化反応物を、上述のように、標準的２％アガロースゲルを通じて電気泳動した。
【０１４５】
ＰＡＰの原理
［０２０１］ＴｆｌおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、加ピロリン酸分解活性を含有することが示された。Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを利用して、Ｄ１ドーパミン受容体遺伝子のヌクレオチド２２９でＧアレルを検出した（Ｌｉｕら、１９９５）（図６Ａ）。ｄｄＧまたはｄｄＡいずれかを用いて、３’末端でＰ＊を合成した（表１を参照されたい）。３’末端ジデオキシヌクレオチドは、重合による直接伸長を阻害するが、Ｐ＊がＧアレルの相補鎖と特異的にハイブリダイズする場合、ピロホスフェート（ＰＰｉ）の存在下で、加ピロリン酸分解によって除去可能である。分解されたオリゴヌクレオチドは、５’−３’方向の重合によって伸長可能である（図６Ｂおよび６Ｃ）。
【０１４６】
［０２０２］ＰＡＳＡに比較したＰＡＰの特異性増進は、加ピロリン酸分解および重合を連続してカップリングすることによって、提供される。有意な非特異的増幅は、ＤＮＡポリメラーゼによるミスマッチ加ピロリン酸分解および誤った取り込みを必要とし、非常に稀な事象である（図７）。
【０１４７】
Ｄ５Ｇ＊およびＤ３Ｇ＊を用いた特異的増幅
［０２０３］２つのオリゴヌクレオチド（Ｐ＊およびＵ）、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、並びにＧ／ＧおよびＡ／ＡアレルのＤＮＡテンプレートを用いてＰＡＰを行った。多数のＰ＊を試験した（表１）。Ｄ５Ｇ＊（アレル特異的ヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドが３’末端に同時局在する）およびＤ３Ｇ＊（アレル特異的ヌクレオチドは、３’末端から２塩基である）は、ＰＰｉの存在下で、Ｇアレルを特異的に増幅した（図８Ａ）。ＰＰｉを添加しないと、Ｄ５Ｇ＊で特異的な産物はまったく観察されず、添加したＰＰｉがＰＡＰに必須の構成要素であることが示された（図８Ｂ、レーン６および１５）。Ｄ３Ｇ＊を用いるレーン４中、およびＤ４Ｇ＊を用いるレーン５中に、かすかな産物が観察された（図８Ｂ）（以下を参照されたい）。
【０１４８】
ｐＨ、［ＰＰｉ］および［ｄＮＴＰ］および酵素の影響
［０２０４］上記パラメータ各々を調べた。ＰＡＰは、７．４〜７．７の間のｐＨ、２００μＭ〜４００μＭの間の［ＰＰｉ］、および２５μＭ〜５０μＭの間の［ｄＮＴＰ］で最も効率的であった（表２）。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼをＴｆｌの代わりに用いることが可能であり、効率は同様であった（表２）。
【０１４９】
表２
ＰＡＰに影響を及ぼすパラメータ
【０１５０】
【表２】
2005525121.tif 000003
【０１５１】
ａ示した因子を除いて、材料および方法に記載する条件下で、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、Ｇ／Ｇアレルを増幅した。
ｂＰＡＰ効率は：−、特異的産物（単数または複数）なし；±、非常に弱い特異的産物（単数または複数）；＋、弱い特異的産物（単数または複数）；＋＋、中程度の特異的産物（単数または複数）；＋＋＋、強い特異的産物（単数または複数）；＋＋＋＋、非常に強い特異的産物（単数または複数）と示される。
【０１５２】
ｃ示した濃度を変化させたが、他のものは２００μＭで維持した。
特異的産物の同一性
［０２０５］特異的産物の同一性を確認するため、制限エンドヌクレアーゼ消化を行った（図９）。３つの制限エンドヌクレアーゼＡｃｉＩ、ＥａｅＩおよびＥｃｏ０１０９は各々、ＰＵ：ＵＰ二重鎖に制限部位を有する。期待される制限断片が見出された。Ｄ３Ｇ＊およびＵを用いても、同様の結果が観察された。
【０１５３】
［０２０６］Ｄ５Ｇ＊およびＵを用いたＰＡＰの特異的産物は、アガロースゲル上に２つの特異的バンド、すなわちＰＵ：ＵＰおよびＵＰを明らかにし；これは、我々の増幅条件下では、ＵがＤ５Ｇ＊より効率的であるためであった。これを確認するため、先のように、Ｄ５Ｇ＊およびＵとともにＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＡＰによって、Ｇ／Ｇアレルを増幅した。産物を変性し、そして変性ポリアクリルアミドゲルを通じて電気泳動した。一本鎖型で１つの特異的バンドのみが観察され、特異的ＰＡＰ産物が二重鎖および一本鎖セグメントを含有することが示される。Ｄ３Ｇ＊およびＵを用いても同じ結果が観察された。
【０１５４】
線形ＰＡＰ
［０２０７］ＰＰｉの存在下、Ｇ／ＧおよびＡ／Ａアレルから、１つのＰ＊のみを用いた線形増幅のため、ＰＡＰを行った。Ｄ３Ｇ＊およびＤ５Ｇ＊で、ＰＡＰの特異的産物が得られたが、他のＰ＊では得られなかった（図１０、レーン４および６）。Ｐ＊の効率は、オリゴヌクレオチドのサイズ、３’末端ジデオキシヌクレオチド、およびアレル特異的ヌクレオチドの位置によって影響を受けた。
【０１５５】
［０２０８］図６Ａ〜６ＣはＰＡＰの概略図を示す。図６Ａ。２つのオリゴヌクレオチドＰ＊およびＵ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ピロホスフェートおよび［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰを用いて、二重鎖ＤＮＡテンプレートＴＵ：ＵＴを増幅する。Ｐ＊＝加ピロリン酸分解活性化可能オリゴヌクレオチド。この例では、Ｐ＊はＤ５Ｇ＊であり、そしてＴＵ：ＵＴはドーパミンＤ１受容体遺伝子の６４０ｂｐセグメントである。図６Ｂ。Ｄ５Ｇ＊は、３’末端にＧジデオキシヌクレオチドを有し、そして３’末端のＧアレルの相補鎖に特異的であるが、Ａアレルにはミスマッチする（表１）。加ピロリン酸分解によってジデオキシＧを除去し、その後、各増幅のため重合する。図６Ｃ。Ｇ／Ｇ、Ａ／ＡおよびＧ／Ａ遺伝子型由来のＰＡＰのオートラジオグラム。Ｇアレルが存在するとき、４６９塩基（二重鎖ＰＵ：ＵＰおよび過剰なアンチセンス鎖ＵＰ）の放射標識特異的産物が産生され、これは、Ｔｆｌポリメラーゼによる加ピロリン酸分解率が低いことによって、オリゴヌクレオチドＵがオリゴヌクレオチドＰ＊よりはるかに効率が高いことが暗示されるためである。より長い期間電気泳動を行うと、ＵＰからＰＵ：ＵＰが分離される。ＵＴおよびＵＴ：ＴＵの他の産物を示す。ＴＵ：ＵＴが、非放射標識ＴＵの元来のテンプレートと放射標識された過剰なＵＴのアニーリングから得られることに注目されたい。Ｄ３Ｇ＊およびＵを用いた、Ｇ／Ｇ、Ａ／ＡおよびＧ／Ａ遺伝子型からのＰＡＰもまた行って、そして同様の結果を得た。
【０１５６】
［０２０９］図７Ａ〜７Ｂは、Ｄ５Ｇ＊を用いたＰＡＰの特異性増進を示す。ＰＡＰが、ＧアレルおよびＡアレルのテンプレートプールを指数関数的に増幅する特異性を、ＰＡＳＡのものに比較する。図７Ａ。ＰＡＳＡの特異的増幅は、プライマーがＧアレルにマッチする際、プライマー伸長の効率が高いことに由来する。非特異的増幅は、Ａアレルからのミスマッチ伸長から生じる。これが起こると、さらなる増幅のために効率的な基質が生じる。矢印の太さおよび位置は、各周期での増幅効率を表す。図７Ｂ。ＧアレルからのＰＡＰの特異的増幅が高い効率で起こる。２種類の非特異的増幅がＡアレルから生じる：（ｉ）続く増幅のための効率的なテンプレートではないＡ：Ｔホモ二重鎖ＰＵ：ＵＰ産物を生じるミスマッチ加ピロリン酸分解によって、低い効率で非特異的増幅が生じうる：（ｉｉ）Ｇ：Ｔヘテロ−二重鎖ＰＵ：ＵＰ産物を生じる、ミスマッチ加ピロリン酸分解および誤った取り込み両方によって、非常に低い効率で非特異的増幅が生じうるが、ひとたびこれが起こると、続く増幅のための効率的なテンプレートを提供する。Ｄ５Ｇ＊のみを用いたＰＡＰによる線形増幅に関して、非特異的増幅の同様の傾向が示唆される。Ｄ３Ｇ＊のように、Ｐ＊のアレル特異的ヌクレオチドが、３’末端近傍にあるが、３’末端になくてもよいことに注目すべきである。その場合、ＰＡＰの非特異的増幅は、ミスマッチ加ピロリン酸分解およびミスマッチ伸長両方を必要とする。ＰＡＰのどちらの変型もＰＡＳＡより高い特異性を有するはずであるが、３’末端ジデオキシヌクレオチドがまた、アレル特異的ヌクレオチドでもある場合、最高の特異性が予測される。
【０１５７】
［０２１０］図８Ａ〜８Ｂは、Ｄ５Ｇ＊およびＤ３Ｇ＊を用いた特異的増幅を示す。指数関数的増幅のため、２つのオリゴヌクレオチドとともに添加されたＰＰｉの存在下（図８Ａ）または非存在下（図８Ｂ）で、ＰＡＰを行った。オリゴヌクレオチドを表１に列挙する。Ｕのみを用いた伸長対照は、ＴＵ：ＵＴおよびＵＴの位置を同定する。Ｄ１を用いた伸長対照は、ＰＵの位置を同定する。Ｄ１およびＵのＰＣＲ対照は、ＰＵ：ＵＰおよびＰＵ：ＵＴの位置を同定する。他のレーンに比較して、Ｄ１を用いた伸長反応およびＰＣＲ反応の場合、２０％のみを装填する。
【０１５８】
［０２１１］図９は、制限エンドヌクレアーゼ消化を示す。ＰＡＰの特異性を示すため、図８に示す実験由来の試料を、ＡｃｉＩ、ＥａｅＩおよびＥｃｏ０１０９Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化した。各酵素は、ＰＵ：ＵＰ内に制限部位を有する。Ｄ５Ｇ＊およびＵを用いたＰＡＰはＧ／Ｇアレルを増幅し、そしてＤ１およびＵを用いたＰＣＲ反応の５％を対照として使用した。ＡｃｉＩはＰＵ：ＵＰから２３６ｂｐおよび２３３ｂｐ断片を生じ、そしてＴＵ：ＵＴから４０７ｂｐおよび２３３ｂｐ断片を生じる。ＥａｅＩはＰＵ：ＵＰから２８９ｂｐおよび１８０ｂｐ断片を生じ、そしてＴＵ：ＵＴから４６０ｂｐおよび１８０ｂｐ断片を生じる。Ｅｃｏ０１０９ＩはＰＵ：ＵＰから３４８ｂｐおよび１２１ｂｐ断片を生じ、そしてＴＵ：ＵＴから１０７ｂｐ、４１２ｂｐおよび１２１ｂｐ断片を生じる。矢印は、ＰＵ：ＵＰから期待される消化産物を示す。
【０１５９】
［０２１２］図１０は線形ＰＡＰを示す。添加されたＰＰｉの存在下で、１つのＰ＊のみを用いてＰＡＰを行った。他のレーンに比較して、Ｄ１を用いた反応の場合、２０％を装填した（レーン１および１０）。なし＝添加したオリゴヌクレオチドなし。
【０１６０】
Ｄ５Ｇ＊を用いたＰＡＰの特異性増進
［０２１３］実施例１は、加ピロリン酸分解後の重合を用いて、ＰＡＳＡの特異性を増加させうる証拠を提供する。有意な非特異的増幅は、２種類のエラーの連続したカップリングを必要とする（図７）。３’末端でミスマッチデオキシヌクレオチドを除去する、ミスマッチ加ピロリン酸分解の率は、正しいｄＮＭＰに対する誤ったｄＮＭＰの除去率として表すと、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼでは１０−５未満であると報告された（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、１９９２；Ｗｏｎｇら、１９９１）。重合によって置換突然変異を生成する、誤った取り込みの率は、正しいｄＮＭＰに対する誤ったｄＮＭＰの取り込み率として表すと、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼでは１０−５、そして大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩでは１０−４であると報告された（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、１９９２；Ｗｏｎｇら、１９９１；Ｂｅｂｅｎｅｋら、１９９０）。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ欠損突然変異体、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩでも、同様の結果が報告された（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、１９９２；Ｗｏｎｇら、１９９１；ＥｃｋｅｒｔおよびＫｕｎｋｅｌ、１９９０）。（ｉ）Ｄ５Ｇ＊を用いたＰＡＰにおける非特異的増幅による特異性は、ｄｄＮＭＰのミスマッチ加ピロリン酸分解の率がｄＮＭＰと同じであるならば、周期あたり１０−５と概算される。（ｉｉ）非特異的増幅による特異性は、ミスマッチ加ピロリン酸分解および誤った取り込みが連続してカップリングされている場合、３．３ｘ１０−１１と概算される。
【０１６１】
ＰＡＰの本質的な構成要素
［０２１４］ＴｆｌまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを利用してＧ／ＧおよびＡ／Ａアレルを増幅することによって、各Ｐ＊を試験した。特異的増幅には、ＰＰｉおよびアレル特異的テンプレートの存在が必要である。さらに、増幅効率は、オリゴヌクレオチドのサイズ、３’末端ジデオキシヌクレオチド、Ｐ＊の３’末端に比較したアレル特異的ヌクレオチドの位置に影響を受ける。
【０１６２】
［０２１５］Ｄ１Ｇ＊およびＤ２Ｇ＊がなぜ特異的シグナルを生じないかは明らかでないが、これはＰ＊およびテンプレート間の二重鎖の閾値安定性に関連する可能性がある。３’末端にＡジデオキシヌクレオチドを含有するＤ６Ａ＊は、特異的シグナルを生じず、これは重合によるｄｄＮＴＰの異なる取り込み効率と関連している可能性もある。大腸菌ＤＮＡ  ポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびΔＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、他のｄｄＮＴＰよりもｄｄＧＴＰをより効率的に取り込む（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７；ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５；Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｏｒｎら、１９９７）。ｄｄＮＴＰ取り込み率はまた、テンプレート配列に応じて多様でもあり、そしてある塩基では他のものに比較して１０倍高い可能性もある（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）。別の可能性は、Ｄ６Ａ＊が、より短いサイズであり、より低いＴｍを持つことである。
【０１６３】
［０２１６］添加されるＰＰｉがないＰＡＰにおいて、Ｄ３Ｇ＊およびＤ４Ｇ＊を用いて、非常にかすかな偽シグナルが生成された（図８Ｂ）。１つの可能性は、オリゴヌクレオチド二量体が形成され、そして副重合（ｂｙ−ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によって「エンド−」ＰＰｉが放出されてＵＴを生成した後の周期で、Ｐ＊の非特異的加ピロリン酸分解を誘発しうることである。３’末端の分解されたＤ３Ｇ＊およびＤ４Ｇ＊は、偽シグナルとしてハイブリダイズし、そして伸長することが可能である。Ｄ３Ｇ＊およびＤ４Ｇ＊を用いると、オリゴヌクレオチド二量体が観察された。Ｄ３Ｇ＊での別の可能性は、「エンド−」ＰＰｉが放出された後の周期で、特異的加ピロリン酸分解が生じうることである。第三の可能性は、３’末端にＧジデオキシヌクレオチドが完全に付加されていない、最小のＤ３およびＤ４が、Ｄ３Ｇ＊およびＤ４Ｇ＊に混入したことである。
【０１６４】
他の技術との比較
［０２１７］ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素的に核酸を増幅するいくつかの方法が開発されてきており、そして既知の配列変異体を検出するのに適応させることも可能である。これらには、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら、１９８５；Ｓａｉｋｉら、１９８８）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９８８；Ｂａｒａｎｙ、１９９１）および回転周期増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８；Ｂａｎｅｒら、１９９８）が含まれる。ＰＡＰは多くの点で異なる：ｉ）各増幅で、加ピロリン酸分解および重合を連続してカップリングし、ｉｉ）ＰＡＰのためのジデオキシオリゴヌクレオチドが少なくとも１つある。アシクロヌクレオチドなど、３’末端で３’−ヒドロキシル基を欠く、他の化学的に修飾されたヌクレオチドが同じ機能を果たしうる（以下の実施例１２を参照されたい）、ｉｉｉ）一方の形式は線形増幅用であり、そして他方は指数関数増幅用であり、ｉｖ）増幅にはＰＰｉが必要であり、ｖ）有意な非特異的増幅は、ミスマッチ加ピロリン酸分解および誤った取り込み両方を必要とし、ｖｉ）ＰＡＰは既知の点突然変異を検出可能であり、そして野生型アレルから、非常に稀な突然変異アレルを検出する特異性を、非常に増加させることが可能である。
【０１６５】
［０２１８］機構の基礎は、特異性が増加した増幅のため、２以上の反応を連続してカップリングすることである。ＰＡＰの重要な構成要素は、加ピロリン酸分解活性化可能オリゴヌクレオチドである。これらの実験において、ブロッキングされた３’末端はジデオキシヌクレオチドであるが、加ピロリン酸分解に感受性である、いかなる伸長不能ヌクレオチドでも、原理的には代用可能である。実際、ミスマッチより５’でオリゴヌクレオチドを切断する酵素はいずれも、加ピロリン酸分解活性化と同じ機能を果たしうる。例えば、メチル化認識配列を含むブロッキングされたオリゴヌクレオチド（ＧｍＡＴＣなど）を、非メチル化認識配列を持つ標的にアニーリングさせると、制限エンドヌクレアーゼ（ＤｐｎＩなど）は、メチル化部位のみを切断可能であり、そしてしたがって伸長のため、オリゴヌクレオチドを活性化することが可能である。ミスマッチが切断部位より５’に位置する場合、有意な非特異的増幅は、ミスマッチ切断および誤った取り込みの連続したカップリングを必要とし、これは稀な事象である。活性化可能オリゴヌクレオチドはまた、「ミニ配列決定」プライマー伸長とも組み合わせ可能である。これは、一塩基変化の検出のためのより特異的なアッセイを提供する可能性があり、特異性が問題になりうるチップ技術に特に受け入れられる可能性がある（Ｓｙｖａｎｅｎ、１９９９）。ＰＡＰが線形形式で起こりうることの立証（図１０）は、このアプローチの実現可能性を支持する。
【０１６６】
［０２１９］ヌクレオシド三リン酸および２’−デオキシヌクレオシド三リン酸またはその化学的修飾型を、ＰＡＰによる多数のヌクレオチドの伸長の基質として使用可能であり、すなわち１つのヌクレオチドが取り込まれるとき、伸長中の鎖をさらに伸長することが可能である。さらなる伸長のターミネーターである、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸またはその化学的修飾型は、一ヌクレオチド伸長に使用可能である。オリゴヌクレオチドＰ＊の３’末端ジデオキシヌクレオチドから区別するため、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸を放射能または蛍光色素で標識することも可能である。ヌクレオシド三リン酸または２’−デオキシヌクレオチド三リン酸および２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物もまた、使用可能である。
【０１６７】
［０２２０］ＰＡＰでは、特定の核酸配列を含有する核酸をテンプレートとして用いることによって、その核酸配列を産生する。核酸が２つの鎖を含有する場合、テンプレートとして用いる前に、別個の工程として、または同時に、核酸の鎖を分離することが必要である。鎖分離はまた、物理的、化学的または酵素的手段を含む他の適切な方法いずれかによっても達成可能である。
【０１６８】
［０２２１］元来の核酸または核酸の混合物から、１つより多い特異的産物を産生することが望ましい場合、適切な数の異なるオリゴヌクレオチドを利用する。例えば、２つの異なる特異的産物を指数関数的に産生しようとする場合、４つのオリゴヌクレオチドを利用する。オリゴヌクレオチドのうち２つ（Ｐ＊は１以上）は、特定の核酸配列の１つに特異的であり、そして他方の２つのオリゴヌクレオチド（Ｐ＊は１以上）は、第二の特定の核酸配列に特異的である。この方式で、本方法によって、２つの異なる特異的配列各々を指数関数的に産生することも可能である。
【０１６９】
［０２２２］ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であることも可能であり、比較的純粋な種であることも、または核酸混合物の構成要素であることも可能であり、そして直鎖または環状であることも可能である。単数または複数の核酸を、いかなる供給源から得ることも可能であり、例えばプラスミド、クローニングしたＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは細菌、酵母、ウイルス、および植物または動物などのより高次の生物を含む、いかなる供給源由来の天然ＤＮＡまたはＲＮＡから得ることも可能である。ＤＮＡまたはＲＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載されるものなどの多様な技術によって、血液、絨毛膜絨毛または羊膜細胞などの組織材料から抽出可能である。
【０１７０】
［０２２３］Ｐ＊オリゴヌクレオチドは、増幅しようとする特定の配列各々の異なる鎖に「実質的に相補的」であるように選択される。したがって、Ｐ＊オリゴヌクレオチド配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドセグメントをＰ＊オリゴヌクレオチドの５’端に付着させ、残りのＰ＊オリゴヌクレオチド配列を鎖に相補的にすることも可能である。あるいは、Ｐ＊オリゴヌクレオチド配列が、増幅しようとする鎖の配列にハイブリダイズし、そして他のＰ＊オリゴヌクレオチドの伸長産物を合成するためのテンプレートを形成するのに十分な相補性を有するならば、非相補的塩基またはより長い配列をＰ＊オリゴヌクレオチドに散らばせることも可能である。請求項において、本明細書に論じるように、用語「相補的」は「実質的に相補的」を意味すると理解すべきである。
【０１７１】
［０２２４］本方法によって、いかなる特定の核酸配列も産生可能である。２つのオリゴヌクレオチドが、配列に沿って相対的な位置で所望の配列の異なる鎖にハイブリダイズ可能であるように、十分に詳細に、配列両端の十分な数の塩基がわかってさえいればよい。配列両端の塩基に関してわかっていることが多ければ、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの特異性が高くなり、そしてしたがって、プロセスの効率がよりよくなる。用語、オリゴヌクレオチドは、以後、増幅しようとするセグメントの末端配列（単数または複数）に関する情報にある程度あいまいさがある場合は特に、１より多いオリゴヌクレオチドを指すと理解されるであろう。
【０１７２】
［０２２５］各工程後に新たな試薬を添加する場合、本発明を段階的な方式で行うことも可能であり、またはすべての試薬を最初の工程で添加する場合、同時に行うことが可能であり、または既定の工程数の後に新鮮な試薬を添加する場合、部分的に段階的に、そして部分的に同時に、行うことも可能である。鎖分離工程に酵素的手段を用いる場合、同時法を利用可能である。同時法では、反応混合物は、鎖分離酵素（例えばヘリカーゼ）、ＡＴＰなどの、鎖を分離する酵素に適したエネルギー供給源を含有することも可能である。さらなる物質を必要に応じて添加することも可能である。
【０１７３】
［０２２６］核酸ポリメラーゼは、増幅を達成するよう機能するいかなる化合物または系であることも可能である。この目的に適した酵素には、例えばＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたはその変異体、逆転写酵素またはその変異体、および他の遺伝子操作型が含まれる。逆反応および順反応間の関係に基づいて、ＤＮＡポリメラーゼは、ｄｄＮＴＰを効率的に（ｄＮＴＰに比較して）、そして均一に（４種のｄｄＮＴＰ間を比較して）取り込む場合、Ｐ＊活性化可能オリゴヌクレオチドに対して、高い、そして均質な加ピロリン酸分解活性を有すると予測される。すべてのＤＮＡポリメラーゼのうち、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅなどの遺伝子操作型が、将来、最高となる可能性もある（Ｖａｎｄｅｒ  Ｈｏｒｎら、１９９７）。一般的に、合成は、各オリゴヌクレオチドの３’端で開始され、そしてテンプレート鎖上を５’方向に進行するであろう。しかし、５’端で合成を開始し、そしてもう一方の方向に進行する誘導剤もまた、上述のようなＰＡＰ法に用いることも可能である。
【０１７４】
（実施例２）
ＰＣＲによるテンプレートの調製
［０２２７］２つのプライマー（Ｔ＝５’ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ３’（配列番号１）およびＵ＝５’ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＡＴＡ３’（配列番号２））を用いたＰＣＲによって、ヒトＤ１ドーパミン受容体遺伝子の６４０ｂｐ領域を増幅した。ＴＵ：ＵＴ二重鎖産物はＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ５５７６０のヌクレオチド３３〜６７２に渡り、そして産物のＧ＋Ｃ含量は５５％である。よく生じるＡからＧの多型は、ヌクレオチド２２９に位置し、Ｇ／Ｇ、Ａ／ＡおよびＧ／Ａの３つの遺伝子型を生じる。ＰＣＲ体積は５０μｌである：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２００μＭの４種のｄＮＴＰ、各０．１μＭのプライマー、２％ＤＭＳＯ、１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびＧ／Ｇホモ接合体、Ａ／Ａホモ接合体またはＧ／Ａヘテロ接合体由来の２５０ｎｇのゲノムＤＮＡ。周期条件には：ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ系９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた、９４℃１５秒間の変性、５５℃３０秒間のアニーリング、および７２℃１分間の伸長で、全部で３５周期が含まれた。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｓ  １００微量濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ）上で３回保持することによって、プライマーおよび他の小分子から、ＰＣＲ産物をおよそ１０，０００倍精製した。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、回収されたＰＣＲ産物の量を測定した。
【０１７５】
３’ジデオキシヌクレオチドを付加することによるＰ＊の合成
［０２２８］ホープ市ＤＮＡ／ＲＮＡ化学研究室において、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８９０９合成装置（Ｆｒａｍｉｎｓｈａｍ）によってデオキシヌクレオチドオリゴヌクレオチドを合成し、そしてｏｌｉｇｏｐｕｒｅカートリッジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）によって精製した。ターミナルトランスフェラーゼによって３’末端ジデオキシヌクレオチドを付加した。混合物は、３０μｌの総体積を含有した：１００ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）、２．０ｍＭ  ＣｏＣｌ２、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、２５００ｐＭのオリゴヌクレオチド、２ｍＭ  ２’，３’−ｄｄＮＴＰ（ｄｄＮＴＰに対する３’−ＯＨ末端のモル比は１：２４であった）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１００Ｕのターミナルトランスフェラーゼ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）。反応を３７℃で４時間インキュベーションし、そして次いで、最終濃度５ｍＭでＥＤＴＡを添加することによって停止した。Ｃｅｎｔｒｉ−ｓｐｉｎＴＭカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて脱塩した後、ＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ホウ酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中の分離用７Ｍ尿素／２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＰ＊を精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、回収されたＰ＊の量を測定した。
【０１７６】
［０２２９］少量の末端処理されていないオリゴヌクレオチドが、加ピロリン酸分解の非特異性を生じるであろうため、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって、５’末端で各Ｐ＊を３２Ｐ標識し、そして次いで、７Ｍ尿素／２０％ポリアクリルアミドゲルを通じて電気泳動した。ゲルを過剰曝露しても、Ｐ＊産物のみが可視であった。９９．９９％より多いＰ＊が３’末端にジデオキシヌクレオチドを含有したと概算される。Ｐ＊の純度は、ｐＨ８．３で、ＰＣＲ産物またはＰＡＰ産物が存在しないことによって支持された。
【０１７７】
加ピロリン酸分解活性化重合
［０２３０］オリゴヌクレオチドＰ＊およびＵを用いるＰＡＰ、またはＰ＊のみを用いるＰＡＰによって、ＴＵ：ＵＴ二重鎖テンプレート内の４４５〜４６９ｂｐの領域を増幅した。ＰＵ：ＵＰ二重鎖産物は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ５５７６０のヌクレオチド２０４〜２２８から６７２に対応し、そしてＧ＋Ｃ含量は５６％である。ＰＡＰ反応混合物は、２５μｌの総体積を含有した：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各１００μＭの４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）、０．１μＭ  Ｐ＊、０．１μＭ  Ｕオリゴヌクレオチド（ＴＣＡＴＡＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＴＡ（配列番号２））、３００μＭ  Ｎａ４ＰＰｉ、２％ＤＭＳＯ、１μＣｉの［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、１ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）または各０．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＦＳおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および１０ｎｇのＴＵ：ＵＴ。８Ｕ  ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）または４Ｕ  ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅに、０．５Ｕ  Ｔａｑおよび２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えた以外は同一の条件下で、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅもまた試験した。周期条件には：９４℃１０秒間の変性、６０℃１分間（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅでは５５℃）のアニーリング、および７２℃２分間の伸長、全部で１５周期が含まれた。
【０１７８】
［０２３１］標準的な２％アガロースゲルを通じて反応を電気泳動した。ＣＣＤカメラ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  １０００）およびＭｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）ソフトウェアによるＵＶ写真のため、ゲルをエチジウムブロミドで染色し、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーのため、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴＴＭ  ＡＲフィルムに供した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）とともにＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒを用いて、ＰＣＲバンドのピクセル総数から、ランダムユニットとして示されるバックグラウンドを引いたものとして、ＰＡＰ収量を定量化した。
【０１７９】
ＰＡＰ効率増進
［０２３２］実施例１において、天然ＴｆｌまたはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、３’末端にｄｄＧを持つＰ＊のみが増幅された。ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳおよびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐ＊の３’末端のいかなる種類のジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＭＰ、ｄｄＴＭＰ、ｄｄＧＭＰまたはｄｄＣＭＰ）もはるかに少なくしか区別せず、はるかにより高いＰＡＰ効率を達成することが見出された。例えば、ドーパミンＤ１受容体遺伝子の１８量体であるが、３’末端にｄｄＧＭＰおよびｄｄＡＭＰを有する、Ｐ＊（２１２）１８Ｇ０およびＰ＊（２１２）１８Ａ０（表３）は、それぞれ、ＧアレルおよびＡアレルを特異的に増幅した。その収量比は１．４（図１１Ｂのレーン９と１１を比較されたい）であり、そしてしたがって、Ｐ＊（２１２）１８Ｇ０は、Ｐ＊（２１２）１８Ａ０より、周期あたり４％、より効率的であると概算される。別のＰ＊（２２８）２６Ａ−２４＝５’ＴＡＧＧＡＡＣＴＴＧＧＧＧＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＣＣＣ＊３’（配列番号１２）は、３’末端にｄｄＣＭＰを持つ２６量体であるが、３’末端にｄｄＣＭＰを持たないプライマーと同程度に効率的に増幅され、そして収量は、ＴｆｌまたはＴａｑを用いたものと比較して、１，０００倍増加すると概算された。さらに、ＰＡＰは、ヒトゲノムＤＮＡから直接、セグメントを増幅した。
【０１８０】
表３
Ｐ＊の長さおよびミスマッチに影響を受けるＰＡＰ特異性
【０１８１】
【表３】
2005525121.tif 000004
【０１８２】
ａＰ＊（２０４）２６Ｇ０は、３’末端にＧジデオキシヌクレオチドを持つＰ＊である。「０」は、アレル特異的塩基が３’末端にあることを意味する。５’末端の第一の塩基は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ５５７６０のヌクレオチド２０４に対応する。その長さは２６塩基である。
【０１８３】
ｂ太字のＧまたはＡは、ＧアレルまたはＡアレル特異的塩基であり、そして下線の塩基は、設計されたミスマッチである。
ｃアレル特異的塩基までの３’末端からの距離：「０」＝３’末端、−３＝３’末端から３塩基。
【０１８４】
ｄオリゴヌクレオチドのＴｍは、１Ｍ  ＮａＣｌで、４℃ｘ（Ｇ＋Ｃ）＋２℃ｘ（Ｔ＋Ａ）と概算された。各Ｐ＊の長さは１８塩基である。
ｅＰＡＰのノイズ比（％）は、同一のＰ＊による特異的アレル産物に対する非特異的アレル産物の相対収量、または同一テンプレートを用いることによる、天然型に対する、指定された突然変異Ｐ＊の相対収量と定義される。特異的シグナルを＜１０％ノイズ比とする。
【０１８５】
［０２３３］ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳは、天然Ｔａｑに比較して、２つの突然変異を有する。５’ヌクレアーゼドメイン中の１つの突然変異は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を排除し、そして第二の突然変異Ｆ６６７Ｙは、活性部位中にある（ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、１９９９）。ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅは、活性部位に同じ突然変異Ｆ６６７Ｙを有するが、５’−３’エキソヌクレアーゼドメインに欠失がある（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｎら、１９９７）。これらは取り込みに関してｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰを区別しない。逆反応であるｄｄＮＭＰの加ピロリン酸分解は、はるかにより高く、そしてこれらの酵素によってより区別されないと推定される。用いるＡｍｐｌｉＴａｑＦＳまたはＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼはいずれも、ＰＡＰ効率を減少させるように、反応において、ＰＰｉを加水分解可能である、熱安定性ピロホスファターゼを含有するように配合された（製造者の取扱説明書）が、我々の条件下では、ＰＡＰはなお増幅された。ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳおよびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼは、混入ピロホスファターゼを含まない純粋な型でよりよく働くであろう。
【０１８６】
Ｐ＊の３’特異的下位配列
［０２３４］ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳを用いて、異なる長さおよびミスマッチを持つ、多様なＰ＊を調べた（表３）。ＰＡＰ効率に対する長さおよびミスマッチの影響を、同一テンプレート由来の異なる長さの２つのＰ＊間の相対収量（％）として表し（図１２）、これは、長さが各々２〜４塩基少ないと、０．０％〜２０１．５％で多様であった。ＰＡＰの特異性もまた、Ｐ＊の長さおよびミスマッチに影響を受ける（表３）。ノイズ比（％）は、マッチ産物に対するミスマッチ産物の相対収量と定義され、そして特異的シグナルは、＜１０％ノイズ比でスコアされる。Ｐ＊のアレル特異的塩基が３’末端にある場合、特異的アレルのみが増幅され、そして特異性はＰ＊の長さには関連しなかった（図１２Ａ）。アレル特異的塩基がＰ＊の３’末端にない場合、特異性はＰ＊の長さに関連した。３’末端から１５塩基までの、１８量体Ｐ＊における非３’末端ミスマッチはいずれも、増幅を引き起こさなかった（図１２Ｂ〜１２Ｅ）が、２６量体Ｐ＊における２つのこうしたミスマッチであっても、非特異的増幅を引き起こした。
【０１８７】
［０２３５］異なる位のアレル特異的塩基に渡る、「スタック化」Ｐ＊を用いて、１８量体をさらに調べた（図１３および表４）。ノイズ比（％）は０．０％〜７．１％で多様であった。３’特異的下位配列の長さは、１３塩基以上であった。
【０１８８】
表４
異なって配置されたＰ＊のＰＡＰ特異性
【０１８９】
【表４】
2005525121.tif 000005
【０１９０】
ａ２つのオリゴヌクレオチドを用いたＰＡＰ、または１つのＰ＊を用いた線形ＰＡＰによる、ＧテンプレートおよびＡテンプレートからの増幅。ＰＡＰのノイズ比（％）は、特異的アレル産物に対する、非特異的アレル産物の相対収量である。
【０１９１】
［０２３６］異なる位でＧアレルとマッチするＰ＊およびミスマッチするＰ＊を用いることによって、同様の結果を得た（表５）。１つのミスマッチを含むノイズ比は、０．８％〜５．６％の間で多様であった。３’特異的下位配列の長さは、１６塩基以上であった。２つのミスマッチを用いたノイズ比は０％であった（図１４のレーン２とレーン１０〜１５を比較されたい）。
【０１９２】
表５
異なってミスマッチするＰ＊を用いたＰＡＰの特異性
【０１９３】
【表５】
2005525121.tif 000006
【０１９４】
ａＧアレルとのマッチまたはミスマッチ。
ｂノイズ比（％）は、ミスマッチＰ＊およびＰ＊（２１２）１８Ｇ０とＧアレル特異的テンプレートの間の相対収量である。
【０１９５】
［０２３７］１８量体Ｐ＊のみを用いて線形ＰＡＰを調べ、そしてより高い特異性が観察され、ノイズ比はより低かった（表４および５）。線形ＰＡＰは、すべての非特異的産物が、出発テンプレートから生じる、異なる機構経路を取り、３’末端ミスマッチＰ＊を用いるミスマッチ加ピロリン酸分解、または非３’末端ミスマッチＰ＊を用いるミスマッチ加ピロリン酸分解およびミスマッチ伸長両方を必要とする。
【０１９６】
［０２３８］３’末端にｄｄＮＭＰを付加することなく、１７量体プライマーを用いて、ＰＡＳＡを行った（表４および５を参照されたい）。ミスマッチ１７量体プライマーは、ミスマッチが３’末端から６塩基と同程度に近い場合、３０％ノイズ比で非特異的産物を強く増幅し、より短い３’特異的下位配列を示した。別の研究で、先に、同様の結果が報告された（Ｓａｒｋａｒら、１９９０）。
【０１９７】
［０２３９］要約すると、Ｐ＊（１つの長さ）は２つの下位配列を有する：３’特異的下位配列（ｎ＝３’特異的下位配列の塩基数、１以下）は特異性を決定し、すなわちこの領域内で、テンプレートの相補鎖に対するいかなるミスマッチも、実質的な増幅を生じない；そして５’エンハンサー下位配列（ｍ＝５’エンハンサー下位配列の塩基数、０以上）は増幅効率を増進する。ＰＡＰ特異性は、３’特異的下位配列の塩基対形成特異性、加ピロリン酸分解特異性および重合特異性とともに決定される。したがって、３’特異的下位配列の塩基対形成特異性は、ＰＡＰ特異性の最低必要条件である。
【０１９８】
［０２４０］Ｐ＊の３’特異的下位配列の長さは、Ｐ＊の配列背景およびサイズ、３’末端ジデオキシヌクレオチドの種類、テンプレート配列、ＤＮＡポリメラーゼ、イオンなどの他の構成要素、および周期条件によって、影響を受ける可能性もある。テンプレートが、１より多い反復配列または１より長い均一ポリマー走行を含有する場合、Ｐ＊は係留のための特異性を失う。Ｐ＊の３’特異的下位配列の長さは、Ｐ＊の配列背景およびサイズ、３’末端ジデオキシヌクレオチドの種類、テンプレート配列、ＤＮＡポリメラーゼ、イオンなどの他の構成要素、および周期条件によって、影響を受ける可能性もある。テンプレートが、１より多い反復配列または１より長い均一ポリマー走行を含有する場合、Ｐ＊は係留のための特異性を失う。
【０１９９】
未知の配列変異体のスキャンまたは再配列決定
［０２４１］Ｐ＊の３’特異的下位配列の特性を適用して、平行した方式で、未知の配列変異体のスキャンまたはあらかじめ決定された配列の再配列決定を行うことも可能である。あらかじめ決定された配列の相補鎖上の各ヌクレオチドに、１８量体などの４つの下流Ｐ＊によってクエリーを行い（図１１）、この下流Ｐ＊は、３’末端で、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＴＭＰ、ｄｄＧＭＰまたはｄｄＣＭＰいずれかが野生型配列および３つのありうる一塩基置換に対応することを除いて、同一の配列を有する。Ｘ塩基の相補鎖をスキャンするＰ＊の数は、４およびＸの乗算であり、これは指数関数的ＰＡＰまたは線形ＰＡＰいずれにも適している。４つの下流Ｐ＊は、３’末端のｄｄＡＭＰ、ｄｄＴＭＰ、ｄｄＧＭＰおよびｄｄＣＭＰが、４つの蛍光色素によるなど、区別のため異なって標識されている場合、単一の点上に固定することさえ可能である。こうして、増幅シグナルは、加ピロリン酸分解によって、ｄｄＮＭＰがＰ＊から除去される際、各色素の強度減少によって表されうる。線形ＰＡＰの１つの利点は、区別のため異なる色素で標識された４種のｄｄＮＴＰを一塩基伸長の基質として使用可能であることである。
【０２００】
［０２４２］簡潔には、野生型配列に対応するすべてのＰ＊のみが特異的に増幅される場合、重複を解析することによって、野生型配列を順序正しく配置することも可能である。３’末端で一塩基置換を持つＰ＊は、ヘミ点突然変異またはホモ点突然変異の位置で増幅される。突然変異はまた、ＰＡＰシグナルがない「ギャップ」も生成し、これはいくつかの連続するヌクレオチドの領域に渡る。一塩基置換では、ギャップサイズ（塩基）＋１＝３’特異的下位配列の長さである。
【０２０１】
［０２４３］さらに、我々はまた、上流Ｐ＊の第二のセットを設計することによって、センス鎖をスキャンすることも可能である。２セットのＰ＊の組み合わせによって、ヘテロ接合体においてさえ、未知の一塩基置換を決定可能である。未知の小さい欠失および挿入を検出し、そして位置決定することも可能である。特定の種類の欠失または挿入を同定するため、対応するＰ＊を付加することも可能である。突然変異位の情報を提供することが可能なフィンガープリンティングには、ｎ倍まで、Ｐ＊の数を減少させるため、２つの連続するＰ＊のスタックする領域が、アレイ上の３’特異的下位配列より短い単純なスタッキング方式がある。
【０２０２】
新規ＤＮＡ配列決定
［０２４４］ＰＡＰによる新規ＤＮＡ配列決定の概念は、Ｐ＊のすべてのありうる３’特異的下位配列を用いて、新規配列の３’特異的下位配列の存在を同定することである。Ｐ＊の３’特異的下位配列の完全なセットは４ｎである。３’特異的下位配列は各々、４ｍの５’エンハンサー下位配列の完全なサブセットを有する。例えば、３’特異的下位配列としての１６量体および５’エンハンサー下位配列としての２量体の完全なセットは、（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）Ｎ１６＝４１８と示すことも可能である。
【０２０３】
［０２４５］簡潔には、方法はまず、特異的ＰＡＰ増幅のすべてのリストを決定し、そして次いで、ワトソン−クリック塩基対形成規則を用いることにより、既定の長さを持つ、３’特異的下位配列を順序付けることによって、このリストから未知のＤＮＡ相補配列を再構築する。
【０２０４】
［０２４６］どこであっても、Ｐ＊の既定の３’特異的下位配列が２回以上遭遇されると、アセンブリプロセスは中断される。最大配列決定の長さに影響を及ぼす要因の１つは、３’特異的下位配列の長さである。既定の長さを持つ３’特異的下位配列の完全なセットによって、明確に再構築可能な無作為配列の長さは、おおよそ、完全なセット中の３’特異的配列の数の平方根であり、既定の３’特異的下位配列が、いずれも２回以上遭遇されない可能性は５０％以上である。６５，５３６種ある、３’特異的下位配列の８量体は、２００塩基までの範囲で有用であるようである。１００万種より多い１０量体は、１キロ塩基までの新規配列を解析可能である。３’特異的下位配列としての１６量体を含有する１８量体Ｐ＊は、その完全なセットがＰ＊の４１８であり、最大７７，３３２塩基を配列決定可能である。
【０２０５】
［０２４７］隣接する既知の配列がある場合、２つのオリゴヌクレオチドを用いたＰＡＰのため、相対するオリゴヌクレオチドを設計する。最大配列決定の長さは、主に、相対するオリゴヌクレオチドに限定されるが、Ｐ＊の３’特異的下位配列の長さに限定されず、条件的新規ＤＮＡ配列決定と称される。
【０２０６】
ＰＡＰの他の適用
［０２４８］同一かまたは異なっているかを調べるため、２つのＤＮＡ配列を比較するフィンガープリンティングでは、３’特異的下位配列の不完全なセットを用いることによってＰ＊の数を減少させる、単純な方法がある。これらを特定の順序に配置することによって、染色体位置とともに配列を同定することが可能である。ヒトゲノムには３ｘ１０９ｂｐ  ＤＮＡがあることを考慮すると、特異性を増加させるために、１つのＰ＊のみを用いるＰＡＰより、２つのオリゴヌクレオチドを用いるＰＡＰが好ましい。
【０２０７】
［０２４９］遺伝子発現プロファイリングを監視するため、６ｘ１０４〜１０５転写物が発現され、そして正確な配列の詳細が不要である場合、１つのＰ＊のみを用いるＰＡＰが適用可能であり、そして遺伝子中でユニークなモチーフを同定する、全長２２量体までのＰ＊のセットを設計することも可能である。２つの各Ｐ＊間で、３’末端で少なくとも１つの配列相異があるか、または非３’末端で２以上の配列相異がある。
【０２０８】
ハイブリダイゼーションによる、配列との比較
［０２５０］オリゴヌクレオチドを用いることによるＳＢＨにおいて、ハイブリダイゼーション、および重複部分を通じて陽性にハイブリダイズするプローブのアセンブリによってＤＮＡ配列を決定する。固定試料上の単一オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、最適ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、非常に特異的になりうることがずっと以前から知られており（Ｗａｌｌａｃｅら、１９７９）、したがって、単一内部ミスマッチを含有するものから、完全なハイブリッドを区別することが可能である。アレイ中のオリゴヌクレオチドは、長さ１１〜２０ヌクレオチドであり、そして中央に７〜９塩基の特異的領域を有し、ミスマッチハイブリダイゼーションによって、非特異的シグナルが生成される。標準的ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、マッチおよびミスマッチ間の二重鎖安定性はまた、末端ミスマッチおよび隣接配列によって影響を受ける（Ｄｒｍａｎａｃら、１９８９；Ｋｈｒａｐｋｏら、１９８９；Ｇｉｎｏｔ、１９９７）。
【０２０９】
［０２５１］いくつかの方法でＳＨＢを酵素で修飾することも可能である（ＭｉｙａｄａおよびＷａｌｌａｃｅ、１９８７；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９９６）。ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長は、相補鎖にマッチする場合のみ、塩基を１つずつ取り込む。リガーゼは同様の必要条件を有する：２つのオリゴヌクレオチドは、連結位でどちらもテンプレートに相補的であるならば、酵素的に連結可能である。
【０２１０】
［０２５２］図１１Ａ〜１１Ｂは、ＰＡＰ効率の増進を示す。図１１Ａ。二重鎖ＴＵ：ＵＴテンプレートから２つのオリゴヌクレオチドＰ＊およびＵを用いて、ＰＡＰが増幅される。４つのＰ＊は各々、３’末端に、ｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＧおよびｄｄＣを有する。３’末端塩基は、ＧアレルまたはＡアレルの相補鎖に特異的であるか、またはマッチしないかいずれかである。図１１Ｂ。ヒト・ドーパミン受容体遺伝子のＧ／Ｇ、Ａ／ＡおよびＧ／Ａ遺伝子型由来のＰＡＰのオートラジオグラム。４６１ｂｐの放射標識特異的産物（二重鎖ＰＵ：ＵＰおよび過剰なアンチセンス鎖ＵＰ）が産生される。他の副産物ＵＴおよびＵＴ：ＴＵを示す。ＴＵ：ＵＴが、元来の非放射標識ＴＵテンプレートと過剰な放射標識ＵＴのアニーリングに由来することに注目されたい。
【０２１１】
［０２５３］図１２Ａ〜１２Ｅは、ＰＡＰ効率に対するＰ＊の長さおよびミスマッチの影響を示す。Ｐ＊およびＵオリゴヌクレオチドを用いてＰＡＰを増幅した（表３を参照されたい）。図１２Ａ〜１２Ｅの各々で、Ｐ＊はサンプルの３’末端を有するが、異なる長さである。図１２Ａ。レーン１〜４で、Ｐ＊はマッチし、そしてＧアレルを増幅した。レーン５〜８で、Ｐ＊は３’末端でミスマッチしたが、Ａアレルを増幅した。図１２Ｂ。レーン９〜１２で、Ｐ＊はマッチし、そしてＧアレルを増幅した。レーン１３〜１６で、Ｐ＊は３’末端から−１２塩基でミスマッチしたが、Ａアレルを増幅した。図１２Ｃ。レーン１７〜２０で、Ｐ＊はマッチし、そしてＡアレルを増幅した。レーン２１〜２４で、Ｐ＊は３’末端から−２塩基でミスマッチしたが、Ｇアレルを増幅した。図１２Ｄ。レーン２５〜２８で、Ｐ＊は３’末端から−９塩基でミスマッチしたが、Ａアレルを増幅した。図１２Ｅ。レーン２９〜３２で、Ｐ＊は３’末端から−１５塩基でミスマッチしたが、Ａアレルを増幅した。１つのレーン（Ｌｎ）の前のレーン（Ｌｎ−１）に対する収量比として、長さの影響を示す。シグナルがバックグラウンドと同じかまたはそれに近いため、レーン５〜８では、長さの影響を示さなかった。
【０２１２】
［０２５４］図１３は、異なる配置のＰ＊でのＰＡＰ特異性を示す。ＰＡＰは、Ｐ＊およびＵオリゴヌクレオチドで増幅された（表４を参照されたい）。Ｐ＊は、レーン２〜７で、Ｇアレルにマッチし、そして該アレルを増幅したが、レーン９〜１５で、Ａアレルにミスマッチし、そして該アレルを増幅した。レーン１および９は、Ｄ１（２１２）１７量体およびＵを用いたＰＣＲ対照であった。レーン８および１６は、Ｕのみを用いた伸長対照であった。
【０２１３】
［０２５５］図１４は、異なってミスマッチするＰ＊のＰＡＰ特異性を示す。ＰＡＰは、Ｐ＊およびＵオリゴヌクレオチドで増幅された（表５を参照されたい）。レーン２〜７において、Ｐ＊は、マッチまたは１ミスマッチで、Ｇアレルを増幅した。レーン９〜１５において、Ｐ＊は、１または２ミスマッチで、Ａを増幅した。レーン１および９は、Ｄ１（２１２）１７量体およびＵを用いたＰＣＲ対照であった。レーン８および１６は、Ｕのみを用いた伸長対照であった。
【０２１４】
（実施例３）
ゲノムＤＮＡからのＰＡＰ増幅
［０２５６］本実施例は、ゲノムＤＮＡからのＰＡＰ直接増幅を例示する。本実施例に用いるオリゴヌクレオチドを以下に列挙する。レーン番号は、図１５のレーンを指す。
【０２１５】
［０２５７］０．１μＭ濃度中の下流オリゴヌクレオチドは：
【０２１６】
【化１】
2005525121.tif 000007
【０２１７】
である。
［０２５８］０．１μＭ濃度中の相対する上流オリゴヌクレオチドは：Ｄ１（４２０）２４Ｕ  ５’ＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣ３’（配列番号４８）であり、各下流オリゴヌクレオチドと対形成した。詳細に関しては、表３の脚注を参照されたい。
【０２１８】
［０２５９］他の構成要素は、以下を除いて、実施例２と同じであった：３０周期を用いることによって、２５μｌ反応あたり、各０．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＦＳおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および１００ｎｇのヘテロ接合体Ｇ／Ａアレル・ゲノムＤＮＡを用いた。
【０２１９】
［０２６０］ＰＡＰ産物サイズは１９３ｂｐ〜２１８ｂｐの範囲である。ゲル上に１つの二重鎖産物および１つの一本鎖産物が観察され、混入熱安定性ピロホスファターゼによって加水分解されたＰＰｉの排出が示された。
【０２２０】
（実施例４）
ＬＭ−ＰＣＲおよびＬＭ−ＰＡＰの特異性の比較
［０２６１］ＬＭ−ＰＣＲプロトコルには、ヒト・ドーパミンＤ１受容体遺伝子モデル系における、プライマー伸長、リンカー連結、ＰＣＲ増幅、および指示された標識が含まれる（図１６）。プライマー伸長（Ｐ１プライマー＝５’ＴＴＧＣＣＡＣＴＣＡＡＧＣＧＧＴＣＣＴＣＴＣＡＴ３’（配列番号４９））の最初の１０周期でＶｅｎｔＲ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いたことを除いて、本質的に記載されるように（Ｐｆｅｉｆｅｒら、１９９９）、ＵＶ処理したゲノムＤＮＡ試料に対して、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を添加して、ＬＭ−ＰＣＲを行った（このプロトコルは、ＴＤ−ＰＣＲとして知られる）。温度周期は、９５℃１分間、６３℃３分間、および７２℃３分間であった。シグナルを増進するため、ターミナルトランスフェラーゼをプロトコルに添加し、そしてＬＭ−ＰＣＲのこの変型をＴＤ−ＰＣＲと呼ぶ。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）テール付加の前に、Ｄｙｎａｂｅａｄを用いて、標的ＤＮＡ分子を濃縮した。製造者に記載されるように、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ系３（ＢＭＢ）を用いて、ＰＣＲを行った（Ｐ２プライマー＝５’ＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣ３’（配列番号５０））。直接標識を行う前に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、ＰＣＲ産物を精製した。３２Ｐ標識プライマー：
【０２２１】
【化２】
2005525121.tif 000008
【０２２２】
とともに、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いた直接標識に、清浄化したＰＣＲ産物の一部を用いた。
［０２６２］ＰＡＰによる直接標識工程をのぞいて、アレル特異的ＰＣＲとして、ＬＭ−ＰＡＰを行った（図１６Ａ）。３２Ｐ標識プライマー：
【０２２３】
【化３】
2005525121.tif 000009
【０２２４】
とともに、１０μｌ体積中（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各１００μＭのｄＮＴＰ、０．１μＭ  Ｐ＊、３００μＭ  Ｎａ４ＰＰｉ、２％ＤＭＳＯ、各０．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＦＳおよびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））のＰＡＰ反応条件を用いた直接標識に、精製ＰＣＲ産物を用いた。周期条件は、総数８周期または１６周期で、９４℃１０秒間；６０℃１分間、および７２℃２分間であった。ＬＭ−ＰＡＰは、ＬＭ−ＰＣＲより、劇的により特異的であった。ドーパミンＤ１遺伝子を用いた最初のデータによって、ＬＭ−ＰＣＲとともに同一のブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを用いた場合より、ＬＭ−ＰＡＰではバックグラウンドがより低いことが示される。また、非常に高いＧＣリッチ領域（７０％）を持つ遺伝子、ＰＧＫ遺伝子を用いて、ＬＭ−ＰＡＰを行うことも可能である（図１６Ｂ）。
【０２２５】
［０２６３］図１６Ａは、アレル特異的ＬＭ−ＰＡＰおよびアレル特異的ＬＭ−ＰＣＲの比較を用いたドーパミンＤ１受容体遺伝子のＵＶフットプリンティングを示す。Ｐ＊を用いたＬＭ−ＰＡＰと、同一の配列でブロッキングされていないプライマーを用いたＬＭ−ＰＣＲの直接比較によって、２つのアレルがＬＭ−ＰＡＰでは区別可能であるが、ＬＭ−ＰＣＲでは区別不能であることが示される。どちらの方法も、ＵＶで処理されない（Ｃ）か、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理された（Ｔ）か、またはｉｎ  ｖｉｖｏ処理された（Ｖ）、ＨＦ−１６  ＤＮＡを用いて行った。３２Ｐ標識プライマーＰ３Ａ＊（レーン７〜９および１３〜１５）およびＰ３Ｇ＊（レーン１０〜１２および１６〜１８）を伴うＰＡＰ条件を用いた直接標識反応（レーン７〜１８）を、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳおよびＡｍｐｌｉＴａｑで８周期および１６周期行った。ＬＭ−ＰＣＲでは、ＡｍｐｌｉＴａｑ（レーン１〜６）および３２Ｐ標識プライマーＰ３Ａ（レーン１〜３）およびＰ３Ｇ（レーン４〜６）を用いて、直接標識反応を８周期行った。ＬＭ−ＰＡＰのアレルプライマーＰ＊、Ｐ３Ａ＊およびＰ３Ｇ＊は明らかに２つのアレルを区別し、一方、同一配列のブロッキングされていないアレルプライマーＰ３ＡおよびＰ３Ｇは、ＬＭ−ＰＣＲによってアレルを区別することが不能であった。
【０２２６】
［０２６４］図１６Ｂは、ｐｇＫ遺伝子のＵＶフットプリンティングを示す。ＰＧＫに対するＬＭ−ＰＡＰ法は、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼをプライマー伸長に用いるとともに、７−デアザ−ｄＧＴＰ／ｄＧＴＰが３：１の比であったことを除いて、ドーパミンＤ１受容体に対するものと、本質的に同一であった。温度周期は９５℃１分間、６０℃２分間、および７６℃３分間であった。やはりデアザｄＧＴＰを用いて、９７℃１分間、６０℃２分間、７６℃３分間で、Ｖｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ工程を行った。２５μｌ体積中（５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ６．９５、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０μＭ  ｄＮＴＰ、１５０μＭ  Ｎａ４ＰＰｉ、４％ＤＭＳＯ、および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼ）のＰＡＰ反応条件を用いて、３２Ｐ  Ｐ３Ｇ＊およびＰ３Ｃ＊プライマーでの直接標識に、精製ＰＣＲ産物を用いた。周期条件は、９４℃１５秒間、６０℃３０秒間、および７２℃１分間を１０周期であった。
【０２２７】
（実施例５）
１０４〜１０５テンプレート中の１つの突然変異を検出するためのＰＡＰ−Ａの最適化
［２６５］１μｇのラムダファージＤＮＡは、２ｘ１０１０コピーのテンプレートを含有する。１部分の突然変異体ｌａｃＩテンプレートを１０４〜１０５部分の対照ＤＮＡテンプレート、例えば野生型ｌａｃＩと混合することによって、ＰＡＰの特異性を決定する。ＰＡＰ−Ａの特異性は、ポリメラーゼのエラー率、Ｐ＊の純度（現在の精製プロトコルでは＜２ｘ１０−４）および抽出プロセスにおけるＤＮＡテンプレート損傷の可能性の関数である。酵素種および濃度、並びにｄＮＴＰ、ＰＰｉ、Ｍｇ＋＋またはＭｎ＋＋などの他の構成要素の濃度を試験することによって、ＰＡＰの収量および特異性を最適化する。ＤＮＡポリメラーゼなどの抗体が活性化する酵素を用いた、室温でのホットスタートＰＡＰを用いて、誤った増幅を排除することも可能である。
【０２２８】
［０２６６］哺乳動物における自発的突然変異を研究するモデル系として、実験室で用いられる、野生型および突然変異体ラムダファージＤＮＡを、感染した大腸菌ＳＣＳ−８細胞（Ｎｉｓｈｉｎｏら、１９９６）から調製する。高忠実性条件下でラムダファージを増殖させ、そしてＤＮＡ損傷が低率である条件下で、注意しながらＤＮＡを単離する（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅマニュアル）（Ｎｉｓｈｉｎｏら、１９９６；Ｈｉｌｌら、１９９９）。
【０２２９】
［２６７］突然変異体には、２種のトランジション、４種のトランスバージョン、および一塩基ヌクレオチド欠失の各々の１例が含まれる。各突然変異に特異的なＰ＊を合成する。これらのＤＮＡテンプレートを再構築実験に用いて、この中で、突然変異ＤＮＡを野生型ＤＮＡ中に連続希釈する。スパイク処理した試料を用いて、ＰＡＰ−Ａを最適化する。ＴａｑＦＳ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ、およびＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ  Ｅｘｃｅｌ  ＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いた収量および特異性に基づいて、最も堅固なポリメラーゼを選択する。熱周期パラメータ、オリゴヌクレオチドの長さ、およびＰＰｉ、ｄＮＴＰおよびＭｇ＋＋またはＭｎ＋＋の試薬濃度を含む、反応の他の構成要素を体系的に最適化する。ＳＳＣＰゲル上のオートラジオグラフィーまたは蛍光を用いて、ＰＡＰ産物収量の定量的検出を達成する。これらのデータは、ＰＡＰ−ＲおよびＬＭ−ＰＡＰの最適化に役立つ（以下）。これらの多様なパラメータの最適化は、１０４〜１０５中１部分の特異性を生じる。
【０２３０】
［０２６８］ヒト突然変異体ゲノムＤＮＡテンプレートと１０４までの野生型テンプレートを混合することによって、ヒト因子ＩＸ遺伝子中の突然変異検出に関してもまた、最適化条件を試験する。ラムダ実験でのように、適切に設計したオリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏ５ソフトウェアを用いる）を４０周期用いて指数関数的ＰＡＰを行い、そしてオートラジオグラフィーによって、または蛍光検出によって、強いシグナルを獲得する。
【０２３１】
（実施例６）
ＰＡＰ−Ｒの最適化
［０２６９］モデル系において、Ｐ＊に沿ってミスマッチがあると活性化が阻害され、ミスマッチが５’端から２ヌクレオチドであった場合でさえも、活性化が阻害された（図１４）。５’末端が２、６、９、および１２ヌクレオチド下流に移動している、Ｐ＊の１８量体のさらなるセットもまた、活性化の阻害を示した（図１３）。さらに、２０量体および２２量体もまた、一ヌクレオチドミスマッチでの阻害を示す（図１２）。これらの知見を拡大適用し、そして再配列決定の堅固な方法の基礎を築くため、一塩基ミスマッチの位置およびＰ＊の活性化の関係をさらに解析する。
【０２３２】
［０２７０］ヒトにおける生殖細胞系列突然変異の分子疫学に関する先の研究から、血友病患者および家族由来の１，０００を越えるＤＮＡ試料が確かめられているため、因子ＩＸ遺伝子をモデル系として用いる（Ｓｏｍｍｅｒ、１９９５；Ｋｅｔｔｅｒｌｉｎｇら、１９９９）。ヒト因子ＩＸ遺伝子のエクソンＢおよびエクソンＨの２つの２０ヌクレオチド領域をモデル系として用いる。８つの異なる一塩基突然変異が利用可能な、ヌクレオチド６４６０〜６４７９（５’ＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣ３’（配列番号５５；Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、１９８５））のエクソンＢの領域を設計する。エクソンＨの領域は、異なる位での７つの突然変異が利用可能な、ヌクレオチド３０８４５〜３０８６４（５’ＧＡＡＣＡＴＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＧ３’（配列番号５６））である。野生型領域ＢおよびＨと同一のＰ＊が合成されるであろう。一ヌクレオチドミスマッチを除いて、同一のＰ＊を合成する。
【０２３３】
［０２７１］野生型因子ＩＸ配列を最初の研究に用いる。野生型配列にマッチするか、またはオリゴヌクレオチド配列の５’に近い３分の１内の選択される部位でミスマッチする、いくつかのＰ＊は、オリゴヌクレオチドの最適な長さを評価するパイロット実験を行うのに有用である。ポリメラーゼおよび反応条件の影響が評価可能である。
【０２３４】
［０２７２］予備的データから、１８量体以上が最適なサイズであるようである。また、２５量体または３０量体であっても最適である可能性もある。本実施例には、２０量体が最適なサイズであると仮定される。野生型Ｐ＊、およびエクソンＢの位置領域の各ヌクレオチドで、ありうる一塩基ミスマッチの１つを持つ２０のＰ＊を合成する。これらのＰ＊のうち８つは、血友病Ｂ患者の突然変異に完全にマッチする。陽性対照として、適切な突然変異ＤＮＡ試料を用いた際に、これらのＰ＊が効率的に活性化することが示される。指数関数的ＰＡＰおよび線形ＰＡＰを行って、そしてノイズ比を決定する。線形ＰＡＰのノイズ比は一般的により低く、そしてこれを用いる。
【０２３５】
［０２７３］別の配列背景において、予備的データを確認するため、エクソンＨで同様の実験を行う。エクソンＨの領域において７つの突然変異を盲検方式で解析し、正確なマッチを検出するかどうかを決定する。Ｐ＊活性化に対するミスマッチの位置またはミスマッチの種類の影響を決定する。異なるポリメラーゼ、反応温度、および他の反応条件の影響もまた決定可能である。別のセットの２０のＰ＊は、３’末端から１２〜２０ヌクレオチドのミスマッチ由来の、さらなるデータを提供する。
【０２３６】
（実施例７）
ＬＭ−ＰＡＰの最適化
［０２７４］ヒト・ドーパミンＤ１受容体遺伝子およびマウスＰｇｋｌ遺伝子をモデル系として用いて、ＬＭ−ＰＡＰまたはＬＭ−ＰＣＲを利用する場合のクロマチン構造の解析を比較する。ドーパミンＤ１受容体遺伝子は上述されている。Ｘ染色体不活性化は、初期胚発生段階で起こる。雌性細胞中の２つのアレルが異なる発現状態を維持するため、これは、遺伝子制御の研究に好適な系である。Ｐｇｋｌは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）をコードするＸ染色体連鎖ハウスキーピング遺伝子である。ＰＧＫは、解糖に重要な酵素であり、そして該遺伝子は、雌性体細胞の不活性Ｘ染色体（Ｘｉ）および雄性生殖細胞における以外は、いつでも活性であると期待される。
【０２３７】
［０２７５］予備的データによって、クロマチン構造が先に解析されていない遺伝子であるドーパミンＤ１受容体遺伝子において、ＬＭ−ＰＣＲに比較してＬＭ−ＰＡＰを用いると特異性に劇的な増進が示される（図１６Ａ）。本実施例では、ＬＭ−ＰＡＰおよびＬＭ−ＰＣＲを行う。ＬＭ−ＰＣＲプロフィールを生じる３つのオリゴヌクレオチドセットおよびＰｇｋｌ（および他のＸ染色体遺伝子）において許容しえないバックグラウンドを持つＬＭ−ＰＣＲプロフィールを生じる７つのプライマーセットを用いて、ＬＭ−ＰＡＰとＬＭ−ＰＣＲを比較する。同一配列のデオキシ末端およびジデオキシ末端オリゴヌクレオチドを利用して、それぞれ、ＬＭ−ＰＡＰおよびＬＭ−ＰＣＲを行う。ＰｈｏｓｈｏＩｍａｇｅｒによって、バックグラウンドに比較したシグナルレベルもまた定量化する。平均シグナル対ノイズ比を決定する。ＰＡＰ−ＡおよびＰＡＰ−Ｒを用いた解析からの最適化データはまた、ＬＭ−ＰＡＰプロトコルにおいても、有用である。シグナル対ノイズ比がさらに減少可能であるかどうかを決定するため、２つの領域に関してＬＭ−ＰＡＰを最適化する。
【０２３８】
（実施例８）
アレル特異的ＬＭ−ＰＡＰの最適化
［０２７６］コード領域および非コード領域両方のｐｇｋｌａおよび１ｂ遺伝子の多型部位が報告されている（Ｂｏｅｒら、１９９０）。これらを用いて、アレル特異的Ｐ＊を設計する。１つのアレル特異的オリゴヌクレオチドを、Ｐｇｋ１遺伝子から前向きに選択し、そして１つを、ドーパミンＤ１受容体遺伝子から前向きに選択する。同一配列のブロッキングされたオリゴヌクレオチドおよびブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを合成し、そしてそれぞれ、アレル特異的ＬＭ−ＰＡＰおよびＬＭ−ＰＣＲを行う。シグナル対ノイズ比を定量化し、そして比較する。
【０２３９】
（実施例９）
マイクロアレイ上のＰＡＰ−Ｒ
［０２７７］最初の実験は、上述のように、エクソンＢおよびＨの２つの２０ヌクレオチド領域に重点を置くであろう。ＰＡＰ−Ｒの実験設計は、例えばＧｅｎｉｏｍ（登録商標）装置を用いたマイクロアレイ上のＰ＊オリゴヌクレオチドのデジタル光指示合成を用いたことを除いて、上述の実験と類似である。因子ＩＸ遺伝子のエクソンＢおよびＨの２０ｂｐ領域の野生型に、そしてすべての一塩基ミスマッチに相補的な、総数１６０のオリゴヌクレオチドを合成する。陽性対照として、因子ＩＸ遺伝子の隣接する１６０ｂｐ領域に正確にマッチする、登録されたものから各々１ヌクレオチドずれていく１６０オリゴヌクレオチドを合成する。野生型および突然変異体試料から、ゲノムＤＮＡを増幅し、オリゴヌクレオチドにアニーリングさせ、そして蛍光ジデオキシターミネーターを用いて、プライマー伸長を行う。固体支持体に関してプロトコルを最適化する。因子ＩＸの２つの２０ｂｐヌクレオチド領域にミスマッチするオリゴヌクレオチドの、すべてでないとしてもほとんどが、あるとしてもわずかなシグナルしか生じず、一方、１６０の対照オリゴヌクレオチドの大部分が強いシグナルを生じるように、プライマーの長さ、利用する酵素および反応条件の調整を行う。
【０２４０】
［０２７８］再配列決定のための１つの戦略を図３および４に示す。あらかじめ決定した配列の相補鎖の各ヌクレオチドに、２０量体などの４つの下流Ｐ＊によってクエリーを行い、この下流Ｐ＊は、３’末端が、ｄｄＡ、ｄｄＴ、ｄｄＧまたはｄｄＣいずれかであることを除いて、同一の配列を有する。１ｋｂセグメントでは、下流方向に、４，０００のＰ＊が必要である。第二のセットの実験では、因子ＩＸ遺伝子のエクソンＢおよびＨを再配列決定する。これらの領域内に異なる突然変異を持つ、２００を越える患者由来の試料が、解析のため利用可能である。盲検解析によって、偽陽性および偽陰性を評価する。多くの突然変異に関して、ヘテロ接合体女性試料が利用可能である。残りの男性患者試料では、野生型または第二の突然変異試料を用いた１対１の混合実験は、それぞれ、同等のヘテロ接合体または合成ヘテロ接合体を生じる。続いて、機能的に重要な可能性があるすべての領域（推定上のプロモーター領域、コード領域、およびスプライシング接合部）を再配列決定する（２．２ｋｂ）。６００を越える独立の突然変異が利用可能であるため、すべての配列変化の９９％より多くが同定されるかどうかを決定することが可能である（十年に渡って、直接配列決定によって、これらの試料の配列変化が決定されている）。
【０２４１】
［０２７９］３’末端に一塩基置換を持つＰ＊は、ヘミ接合体またはホモ接合体点突然変異の位でシグナルを生成する。突然変異はまた、いくつかの連続するヌクレオチドの領域に渡る、ＰＡＰシグナルがない「ギャップ」も生成する。一塩基置換が生じる場合、ギャップサイズ（ヌクレオチド）＋１＝３’特異的下位配列の長さ（図３および４）である。
【０２４２】
［０２８０］より高いＧ＋Ｃ含量（５５％）を持つ試料を解析するため、ｌａｃＩ遺伝子中の突然変異を利用する。Ｂｉｇ  Ｂｌｕｅ（登録商標）トランスジェニックマウス突然変異検出系由来のこれらの突然変異は、この系では６，０００を越える突然変異が利用可能であるため、突然変異の９９．９％以上を検出する戦略の定義を容易にする能力を有する。ロボット装置の補助で、相当する領域を解析する。さらに、３０〜７５％のＧ＋Ｃ含量を持つ他の遺伝子において、数百の突然変異または多型が、解析のために利用可能である。配列のメガ塩基をスキャンする必要がある条件下で、性能を試験するため、ジストロフィン遺伝子が特に受け入れられる。９０のセグメントがロボット装置で増幅されるこの遺伝子では，実質的にすべての配列変異体が、ＤＯＶＡＭ−Ｓ後のＤＮＡ配列決定によって、定義されている。多くの分子疫学的適用および分子診断適用が、実質的に１００％の突然変異を検出する再配列決定から利益を得るため、これは好都合である。
【０２４３】
（実施例１０）
ヒトおよびマウスゲノムＤＮＡからのＰＡＰ直接増幅
［０２８１］２つのＰ＊、Ｐ１＊（配列番号４５、Ｇアレル特異的）またはＰ２＊（配列番号４７、Ａアレル特異的）および上流のブロッキングされていないプライマー（Ｕ；配列番号４８）各々を用いてＰＡＰを行い、Ｄ１ドーパミン遺伝子の１８０ｂｐセグメントを増幅した。Ｐ＊は３’末端にｄｄＣおよびｄｄＧを含む２６量体である。１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを３５周期増幅し、その後、２％ゲル電気泳動した。ＰＡＰ反応混合物は、総体積２５μｌを含有した：５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（２５℃でｐＨ６．９）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各４０μＭの４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）、０．１μＭ  Ｕ、１５０μＭ  Ｎａ４ＰＰｉ、２％ＤＭＳＯ、０．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＦＳポリメラーゼ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、および１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ。周期条件は、９４℃１５秒間、６５℃３０秒間、および７２℃１分間であった。図１７Ａは、Ｄ１ドーパミン遺伝子のＰＡＰ増幅の結果を示す。レーン２および５において、Ｐ１＊は、３’末端から２４ヌクレオチドでＡアレルテンプレートに特異的であり、したがってＧ／ＧおよびＡ／Ａ遺伝子型間にはほとんどまたはまったく区別がない。レーン３および６において、Ｐ２＊は、３’末端から２ヌクレオチドでＡアレルテンプレートに特異的であり、したがって、Ａ／Ａ遺伝子型の特異的増幅がある。レーン１および５はＰＣＲ対照である。レーン４および８は、Ｐ＊を含まない陰性対照である。レーンＭはｃｐｘ  ＤＮＡ／ＨＡＥＩＶマーカー１２０ｎｇである。
【０２４４】
［０２８２］マウスゲノムＤＮＡから直接の、３つのＢｉ−ＰＡＰアッセイを試験した。３’末端でジデオキシヌクレオチドブロッカーを含有する２つのＰ＊を用いて、Ｂｉ−ＰＡＰを行い、ｌａｃＩ遺伝子の８０ｂｐセグメントを増幅した。Ｐ＊は野生型テンプレートに特異的であり、そして長さ４０〜４２ヌクレオチドである。３つのＢｉ−ＰＡＰアッセイ各々で、１ヌクレオチド重複する２つの相対するＰ＊を用い、３５周期を用いて、ｌａｃＩ遺伝子の４００コピーを増幅した。Ｐ＊の配列は以下のとおりである：
【０２４５】
【化４】
2005525121.tif 000010
【０２４６】
［０２８３］ＰＡＰ反応混合物は、総体積２５μｌを含有した：５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（２５℃でｐＨ６．９）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各４０μＭの４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）、０．１μＭ  Ｕ、１５０μＭ  Ｎａ４ＰＰｉ、４％ＤＭＳＯ、１．０ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＦＳポリメラーゼ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および４００コピーのマウスゲノムＤＮＡ。周期条件は、９４℃１５秒間、６５℃３０秒間、および７２℃１分間であった。２％アガロースゲル上で、取り込まれなかったＰ＊を、Ｂｉ−ＰＡＰ産物からよく分離した。二量体はまったく見られなかった。図１７Ｂは、これらのＢｉ−ＰＡＰアッセイからの結果を示す。レーン１、３および５では、野生型テンプレートが増幅される。レーン２、４および６は、マウスゲノムＤＮＡを含まない陰性対照である。
【０２４７】
［０２４８］３つのＰＡＰアッセイは、ヒトゲノムＤＮＡからＤ１受容体遺伝子の１８０ｂｐセグメントを直接増幅し、ＰＡＰ産物の強いシグナルを生じた。２６量体Ｐ＊のアレル特異性は、ミスマッチが３’末端から２ヌクレオチドにある場合、維持されるが、ミスマッチが３’末端から２４ヌクレオチドであると、アレル特異性が失われる。３つのＢｉ−ＰＡＰアッセイは、マウスゲノムＤＮＡからｌａｃＩ遺伝子の４００コピーと同程度に少ないものも直接増幅した。Ｐ＊オリゴヌクレオチドは、３’末端でブロッキングされた、異なるデオキシヌクレオチドを有し、そしてすべて効率的に活性化可能である。過剰なヒトＤＮＡの添加は、マウスゲノムＤＮＡにおいて、ｌａｃＩ遺伝子の増幅に影響を及ぼさなかった。Ｂｉ−ＰＡＰの産物は、取り込まれていないＰ＊から容易に区別された。Ｐ＊は活性化のため、３’末端に、長く、そして完全にマッチした領域を必要とするため、二量体を形成しない。
【０２４８】
（実施例１１）
アシクロヌクレオチドおよび多様なポリメラーゼを用いたＰＡＰ
λファージＤＮＡテンプレート
［０２８５］挿入された大腸菌の野生型ｌａｃＩ遺伝子を含有する野生型λファージＤＮＡテンプレート（Ｋｏｈｌｅｒら、１９９１）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）にしたがって、ＳＣＳ−８大腸菌細胞に形質転換したλファージプラークから、突然変異体λファージＤＮＡテンプレートを調製した。該テンプレートは、ｌａｃＩ遺伝子のヌクレオチド３６９にＴからＧの突然変異を含有した。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、λファージＤＮＡの量を測定した。
【０２４９】
３’末端にアシクロヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを付加することによるＰ＊の合成
［０２８６］ターミナルトランスフェラーゼによって、３’末端アシクロヌクレオチドまたは３’末端ジデオキシヌクレオチドをデオキシヌクレオチドオリゴヌクレオチドに付加した。混合物は、総体積２５μｌを含有した：１００ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）、２．０ｍＭ  ＣｏＣｌ２、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｎＭのオリゴヌクレオチド、２．４ｍＭアシクロＮＴＰ（アシクロＮＴＰに対する３’−ＯＨ末端のモル比は１：３０であった）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、または２．４ｍＭ  ２’，３’−ｄｄＮＴＰ（ｄｄＮＴＰに対する３’−ＯＨ末端のモル比は１：３０であった）（Ｒｏｃｈｅ）、１００Ｕのターミナルトランスフェラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。反応を３７℃で６時間インキュベーションし、そして次いで、最終濃度５ｍＭでＥＤＴＡを添加することによって停止した。Ｃｅｎｔｒｉ−ｓｐｉｎ−２０カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて脱塩した後、３０ｍＭトリエタノールアミン／トリシン緩衝液（２５℃でｐＨ７．９）を用いて分離用７Ｍ尿素／１８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＰ＊を精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２；Ｌｉｕら、１９９９ｂ）。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、回収されたＰ＊の量を測定した。
【０２５０】
［０２８７］少量の末端処理されていないオリゴヌクレオチドが、予期されぬＰＣＲ増幅を生じるであろうため、加ピロリン酸分解が阻害されるｐＨ８．３で、ＰＣＲ産物が存在しないことによって、Ｐ＊の純度を試験した。９９．９９％より多いＰ＊が３’末端にアシクロヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを含有したと概算される。
【０２５１】
ＰＡＰ増幅
［０２８８］それぞれ、Ｐ＊１およびＯ１，Ｐ＊２およびＯ２、並びにＰ＊１およびＰ２＊を用いたＰＡＰを調べた（図１８Ａおよび表６）。Ｐ＊は長さ３０または３５ヌクレオチドであり、そして３’末端にアシクロヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを含有した。
【０２５２】
表６
オリゴヌクレオチドのリスト
【０２５３】
【表６】
2005525121.tif 000011
【０２５４】
ａ大腸菌のｌａｃＩ遺伝子における転写物の第一のヌクレオチドの位置をヌクレオチド１位と指定する（Ｆａｒａｂａｕｇｈ、１９７８）。Ｐ＊１、Ｐ＊＝加ピロリン酸分解活性化可能オリゴヌクレオチドの例として、３’末端アシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊または３’末端ジデオキシヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊であることが可能である。（３４０）３０Ｄ＝Ｐ＊の５’端が３４０で始まり、長さが３０ヌクレオチドであり、そして方向が下流である（すなわち転写方向である）。増幅される断片の正確なサイズおよび位置は、説明的な名前から知ることが可能である。３０量体Ｐ＊を上に示す。３５量体Ｐ＊は３０量体Ｐ＊と３’末端が共通であり、そして５’末端が５ヌクレオチド長い。
【０２５５】
［０２８９］ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＡＰ反応混合物は、総体積２５μｌを含有した：５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（２５℃でｐＨ６．９）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各５０μＭの４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）、各０．１μＭのオリゴヌクレオチド、１５０μＭ  Ｎａ４ＰＰｉ、４％ＤＭＳＯ、１ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．１ｎｇのλファージＤＮＡテンプレート。周期条件は、９２℃１０秒間、６５℃３０秒間、および７２℃１分間で、全部で３０周期であった。第一の周期前に、９２℃１分間の変性工程を追加した。
【０２５６】
［０２９０］Ｖｅｎｔ（エキソ−）またはＰｆｕ（エキソ−）を用いたＰＡＰ反応混合物は、総体積２５μｌを含有した：１０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（２５℃でｐＨ７．１９）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ３、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各５０μＭの４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）、各０．１μＭのオリゴヌクレオチド、１５０μＭ  Ｎａ４ＰＰｉ、４％ＤＭＳＯ、１ＵのＶｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）またはＰｆｕ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、０．１ｎｇのλファージＤＮＡテンプレート。周期条件は、９４℃１５秒間、６０℃３０秒間、および７２℃１分間で、全部で３０周期であった。第一の周期前に、９４℃１分間の変性工程を追加した。
【０２５７】
［０２９１］標準的２％アガロースゲルを通じて、産物を電気泳動した。ＣＣＤカメラ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  １０００）によるＵＶ写真のため、エチジウムブロミドでゲルを染色した。
【０２５８】
［０２９２］上述のように、遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＦＳ（ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、１９９９）は、ＰＡＰの効率を非常に改善した。３’末端ジデオキシヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊は、ピロホスフェート（ＰＰｉ）およびアレルテンプレートの相補鎖の存在下で、３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去する加ピロリン酸分解によって活性化可能である。次いで、活性化されたＰ＊をＤＮＡ重合によって伸長可能である。
【０２５９】
［０２９３］ｌａｃＩ遺伝子を含有するλファージＤＮＡをモデル系として用いることによって、３’アシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊を用いてＰＡＰを行った。Ｐ＊１およびＰ＊２は、それぞれ、同じ突然変異に対して下流および上流のブロッキングされたオリゴヌクレオチドである（図１８Ａおよび表６）。Ｐ＊１およびＰ＊２は、それぞれ、その３’末端にアシクロＧＭＰおよびアシクロＣＭＰを有する。加ピロリン酸分解が阻害されている場合、ｐＨ８．３で添加するピロホスフェートがないと、増幅産物は存在せず、Ｐ＊１およびＰ＊２が直接伸長可能でなかったことが示される。
【０２６０】
［０２９４］Ｐ＊１およびＰ＊２は、突然変異テンプレートに特異的であるが、３’末端で野生型テンプレートにミスマッチする。１つのアシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊および１つの相対するブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを用いたＰＡＰによって、そして３’末端アシクロヌクレオチドでブロッキングされた２つの相対するＰ＊を用いたＰＡＰ（図１８のレーン１および２）によって、アシクロヌクレオチドでブロッキングされた２つの相対するＰ＊（２つの相対するＰ＊が３’末端で１ヌクレオチド重複している、ＰＡＰの特別な型）を用いて（図１８のレーン３）、突然変異テンプレートが効率的に増幅された。しかし、３’末端のミスマッチのため、野生型テンプレートからは産物がまったく生じず、特異性が示された（図１８Ｂのレーン５〜７）。３’ジデオキシヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊を用いたＰＡＰも同様の結果を示した（図１８Ｂのレーン９〜１６）。直接配列決定解析によって、増幅された産物が正しい配列であることが確認された。Ｐ＊の長さの影響もまた試験した。３０量体Ｐ＊と末端が共通であり、そして５’末端が５ヌクレオチド分長い３５量体Ｐ＊で同様の結果を得た（図１８Ｃ）。３’末端で野生型配列に特異的な他のＰ＊（アシクロＴＭＰおよびｄｄＴＭＰを持つ）もまた試験し、同様の結果を得た。
【０２６１】
［０２９５］上記のモデル系を用いて、ファミリーＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼＶｅｎｔ（エキソ−）およびＰｆｕ（エキソ−）を試験した。アシクロヌクレオチドブロッカーおよび３’末端での完全マッチを用いると、１つのＰ＊および１つの相対するブロッキングされていないオリゴヌクレオチドを用いたＰＡＰ（図１８Ｄおよび１８Ｅのレーン１および２）によって、そしてＰ＊１およびＰ＊２の２つの相対するＰ＊を用いたＰＡＰ（２つの相対するＰ＊が３’末端で１ヌクレオチド重複する、ＰＡＰの特別な型）（図１８Ｄおよび１８Ｅのレーン３）によって、突然変異テンプレートが効率的に増幅された。しかし、Ｐ＊１およびＰ＊２が３’末端で野生型テンプレートにミスマッチするため、野生型テンプレートからは産物がまったく生じず、特異性が示された（図１８Ｄおよび１８Ｅのレーン５〜７）。３’ジデオキシヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊を用いると、Ｖｅｎｔ（エキソ−）およびＰｆｕ（エキソ−）ポリメラーゼは、増幅不能であった（図１８Ｄおよび１８Ｅのレーン９〜１６）。直接配列決定解析によって、Ｐ＊１／Ｏ１およびＰ＊２／Ｏ２産物が正しい配列であることが確認された。遺伝子操作されたファミリーＩＩの始原菌ＤＮＡポリメラーゼであるＡｃｙｃｌｏＰｏｌ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて同様の結果を得た。Ｖｅｎｔ（エキソ−）およびＰｆｕ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼが、なぜ３’ジデオキシリボヌクレオチドブロッカーを区別するのかは明らかでない。
【０２６２】
他のブロッカー
［０２９６］これらの結果は、サンガー配列決定で用いる２つのターミネーターをＰＡＰのブロッカーとして使用可能であることを立証する。ターミネーターはまた、ＡＩＤＳなどのウイルス疾病の療法、および癌療法としても記載されてきており、例えば３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）がある。ＤＮＡポリメラーゼは、その三リン酸型を合成鎖に取り込むことが可能であり、そして取り込みは伸長の終結を引き起こす（ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ、１９９９；Ｃｈｅｎｇら、１９８７；Ｓｔ．Ｃｌａｉｒら、１９８７；ＵｅｎｏおよびＭｉｔｓｕｙａ、１９９７）。３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）および２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置した場合、ＨＩＶ逆転写酵素またはその変異体による加ピロリン酸分解によって、除去可能である（Ａｒｉｏｎら、１９９８；Ｇｏｔｔｅら、２０００；Ｍｅｙｅｒら、２０００；Ｕｒｂａｎら、２００１）。これらの結果は、多様な種類のブロッカーに対する、そしてＲＮＡテンプレートに対するＰＡＰの適用を示す。
【０２６３】
［０２９７］要約すると、ＴａｑＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼを用いると、３’アシクロヌクレオチドおよび３’ジデオキシヌクレオチドブロッカーで、そしてＶｅｎｔ（エキソ−）およびＰｆｕ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いると、アシクロヌクレオチドブロッカーでのみ、効率的に、そして特異的に、ＰＡＰ増幅が起こった。３’末端ヌクレオチドを加ピロリン酸分解によって除去可能であり、そして活性化されたオリゴヌクレオチドが伸長可能であるならば、他の３’末端伸長不能オリゴヌクレオチドおよび他のＤＮＡポリメラーゼも使用可能である。
【０２６４】
（実施例１２）
Ｂｉ−ＰＡＰによる非常に稀なアレルの検出
λファージＤＮＡテンプレート
［０２９８］挿入された大腸菌の野生型ｌａｃＩ遺伝子を含有する野生型λファージＤＮＡテンプレート（Ｋｏｈｌｅｒら、１９９１）をＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）にしたがって、ＳＣＳ−８大腸菌細胞に形質転換したλファージプラークから、３つの突然変異λファージＤＮＡテンプレートを調製した。これらは、それぞれ、ｌａｃＩ遺伝子中、ヌクレオチド１９０位でＡからＴの突然変異、ヌクレオチド３６９でＴからＧの突然変異、そしてヌクレオチド３６９でＴからＣの突然変異を含有する。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、λファージＤＮＡの量を測定した。
【０２６５】
３’ジデオキシヌクレオチドを付加することによるＰ＊の合成
［０２９９］ターミナルトランスフェラーゼによって、オリゴデオキシヌクレオチドに３’末端ジデオキシヌクレオチドを付加した。混合物は、２５μｌの総体積を含有した：１００ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）、２．０ｍＭ  ＣｏＣｌ２、０．２ｍＭ  ＤＴＴ、２ｎＭのオリゴヌクレオチド、２．４ｍＭ  ２’，３’−ｄｄＮＴＰ（ｄｄＮＴＰに対する３’−ＯＨ末端のモル比は１：３０であった）（Ｒｏｃｈｅ）、１００Ｕのターミナルトランスフェラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。反応を３７℃で６時間インキュベーションし、そして次いで、最終濃度５ｍＭでＥＤＴＡを添加することによって停止した。Ｃｅｎｔｒｉ−ｓｐｉｎ−２０カラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いて脱塩した後、３０ｍＭトリエタノールアミン／トリシン緩衝液（２５℃でｐＨ７．９）を用いて分離用７Ｍ尿素／１６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＰ＊を精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２、Ｌｉｕら、１９９９ｂ）。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、回収されたＰ＊の量を測定した。
【０２６６】
［０３００］少量の末端処理されていないオリゴヌクレオチドが、予期されぬＰＣＲ増幅を生じるであろうため、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって、５’末端でＰ＊を３２Ｐ標識し、そして次いで、７Ｍ尿素／２０％ポリアクリルアミドゲルを通じて電気泳動した。ゲルを過剰曝露しても、Ｐ＊産物のみが可視であった。９９．９９％より多いＰ＊が３’末端にジデオキシヌクレオチドを含有したと概算される。Ｐ＊の純度は、加ピロリン酸分解が阻害されるｐＨ８．３で、ＰＣＲ産物が存在しないことによって支持された。
【０２６７】
ＰＡＰ増幅
［０３０１］ｌａｃＩ遺伝子のヌクレオチド１９０およびヌクレオチド３６９のＢｉ−ＰＡＰアッセイを調べた。３６９位の上流のＰ＊が４２ヌクレオチドであることを除いて、Ｐ＊は４０ヌクレオチドであった。各Ｐ＊は、３’末端に配列特異的ヌクレオチドを含有した。ＰＡＰ反応混合物は、２５μｌの総体積を含有した：５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（２５℃でｐＨ６．９）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各４０μＭの４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）、各０．１μＭのＰ＊、１５０μＭ  Ｎａ４ＰＰｉ、４％ＤＭＳＯ、１μＣｉの［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、１ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２０００コピーのλファージＤＮＡテンプレート、または別の箇所に記載したもの。周期条件は、９２℃６秒間、６８℃２０秒間、および７２℃２０秒間で、全部で３５周期であった。第一の周期前に、９２℃１分間の変性工程を追加した。
【０２６８】
［０３０２］標準的２．５％アガロースゲルを通じて、産物を電気泳動し、そしてＣＣＤカメラ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  １０００）によるＵＶ写真のため、エチジウムブロミドでゲルを染色した。
【０２６９】
［０３０３］突然変異産物を、同じサイズの野生型産物から区別するため、非変性ＳＳＣＰゲル電気泳動を行った（Ｏｒｉｔａら、１９８９）。２倍体積の装填緩衝液（７Ｍ尿素および５０％ホルムアミド）と反応物を混合し、煮沸し、そして氷上で迅速に冷却した。混合反応物１０μｌ中の産物を、３０ｍＭエタノールアミン／Ｃａｐｓｃｏ緩衝液（ｐＨ９．６）（Ｌｉｕら、１９９９ｂ）を用い、８％非変性ＰＡＧＥ−ＰＬＵＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ）ゲルを通じて４℃で電気泳動した。ゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーのため、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴＴＭ  ＡＲフィルムに曝露した。各増幅産物から３つまたは４つのバンドがゲル上に見られた。上の１つまたは２つのバンドは、かなりの量の増幅産物が存在した結果、電気泳動中、変性一本鎖セグメントがハイブリダイゼーションしたために二重染色されたＤＮＡであった。増幅産物の濃度が増加すると、上部バンドの強度がさらに増加する。
【０２７０】
高効率ＰＡＰ増幅
［０３０４］遺伝子操作されたＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＦＳは、ＰＡＰの効率を非常に改善した。劇的により高い効率のため、ＰＡＰの条件をさらに最適化し、数コピーのλファージＤＮＡまたはヒトゲノムＤＮＡテンプレートから、ＰＡＰが直接増幅することを可能にした。反応構成要素および熱周期措置を最適化し、最適化には、：ｉ）ｄＮＴＰに対するＰＰｉ比を本質的に一定に維持しながら、ＰＰｉ濃度を減少させること、ｉｉ）低ｐＨ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５℃でｐＨ６．９）の使用、ｉｉｉ）（ＮＨ４）２ＳＯ３の添加、ｉｖ）ＴａｑＦＳ量の増加、およびｖ）より高いアニーリング温度が含まれる。
【０２７１】
Ｂｉ−ＰＡＰ
［０３０５］ＰＡＰは３．３ｘ１０１１：１の選択度を有しうる（図１９）。この潜在能力に近づくには、混乱させるエラー原因を排除する設計が必要である。λ  ＤＮＡのｌａｃＩ遺伝子のＡ１９０Ｔ突然変異をモデル系として用いる。１つの下流Ｐ＊および１つのブロッキングされていない上流オリゴヌクレオチドを伴うＰＡＰにおいて、ブロッキングされていない上流オリゴヌクレオチドからの伸長エラーは、目的の稀な突然変異を生成する可能性があり、したがって、選択度を減少させる可能性がある。ＴａｑＦＳの誤った取り込みの率が、取り込まれるヌクレオチドあたり１０−４であり、そしてありうる３つの誤った取り込みのうち１つが、新たに合成される上流鎖上にＡ→Ｔの突然変異を生成するならば、副次的な悪影響のため、選択度が、３．３ｘ１０−５に減少する。この限界を取り除くため、Ｂｉ−ＰＡＰが開発された（図２０Ａ）。Ｂｉ−ＰＡＰでは、下流および上流オリゴヌクレオチドがどちらも、３’末端で目的のヌクレオチドに特異的なＰ＊である。Ｐ＊は３’末端で１ヌクレオチド重複する。
【０２７２】
［０３０６］Ｂｉ−ＰＡＰは、テンプレートとしてｌａｃＩ遺伝子を含有するλファージＤＮＡを用いて、ヌクレオチド１９０位で効率的にそして特異的に増幅した（図２０Ｂ）。ヒトゲノムＤＮＡの添加は、増幅に影響を及ぼさなかった。Ｂｉ−ＰＡＰの７９ｂｐ産物は、取り込まれていないＰ＊から容易に区別された。Ｐ＊は活性化のため、３’末端に完全にマッチした領域を必要とするため、二量体を形成しなかった。ヌクレオチド３６９位で同様の結果が観察された。直接配列決定解析によって、増幅された産物が正しい配列であることが確認された。
【０２７３】
Ｂｉ−ＰＡＰの感度および選択度
［０３０７］Ｂｉ−ＰＡＰが非常に高い選択度を持つことを立証するため、Ｂｉ−ＰＡＰ反応に、１０１０コピーより多いＤＮＡテンプレートを用いた。λ  ＤＮＡ  １μｇは２ｘ１０１０ベクターゲノムを含有するが、ヒトゲノムＤＮＡ  １μｇは３．３ｘ１０５ゲノムしか含有しないため、大腸菌のｌａｃＩ遺伝子を含有するλ  ＤＮＡをモデル系として選択した。この実験室において、野生型λ  ＤＮＡが混入している可能性を回避するため、突然変異Ｐ＊を用いた突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイを選択して野生型λ  ＤＮＡを増幅した。λファージプラークに感染した大腸菌を調べることによって、野生型λ  ＤＮＡにおけるｌａｃＩ遺伝子の自発的突然変異の相対頻度は、１０−９未満と概算される。
【０２７４】
［０３０８］対応する突然変異λ  ＤＮＡを用いた３つの突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイを用いて、Ｂｉ−ＰＡＰの感度および選択度を調べた（定義に関しては表７の脚注を参照されたい）。各突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイに関して、４つの力価測定実験を行った（図２１Ａ〜２１Ｃ）。実験Ｉは、どのくらい多くの突然変異Ｐ＊が野生型ＤＮＡテンプレートを「許容」しうるかを試験した（すなわち検出可能突然変異産物を生じない野生型テンプレートの最大コピー数）。野生型λ  ＤＮＡを２ｘ１０１０コピー〜２ｘ１０６コピーまで力価決定した。最大許容度は、３つの突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイに関して、それぞれ、２ｘ１０９〜２ｘ１０１０、２ｘ１０７〜２ｘ１０８、および２ｘ１０７〜２ｘ１０８であった（図２１Ａ〜２１Ｃ）。実験ＩＩは、Ｂｉ−ＰＡＰの感度を試験した。突然変異λ  ＤＮＡを２ｘ１０３〜０コピーまで力価決定した。感度に対する最大許容度（実験Ｉ）の比が選択度である。多量の野生型テンプレートの存在下（実験ＩＩＩ）または多量のヒトゲノムＤＮＡの存在下（実験ＩＶ）で実験ＩＩを繰り返したが、影響はなかった（図２１Ａ；Ｔ３６９ＧおよびＴ３６９Ｃに関してはデータ未提示）。テンプレートコピー数とともに、用量反応を観察した。
【０２７５】
表７
３つの突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイの要約ａ
【０２７６】
【表７】
2005525121.tif 000012
【０２７７】
ａ３つの突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイの各々において、３’末端で１ヌクレオチド重複した２つの相対するＰ＊を用いた。Ｐ＊は長さ４０〜４２ヌクレオチドである。これらは
【０２７８】
【化５】
2005525121.tif 000013
【０２７９】
である。
ｂｌａｃＩ遺伝子において転写物の第一のヌクレオチドの位をヌクレオチド１位と指定する（Ｆａｒａｂａｕｇｈ、１９７８）。Ｐ＊の３’ヌクレオチドは、示される位に位置し、そして対応する突然変異に相補的である。
【０２８０】
ｃ感度は、突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイを用いた際、検出可能な突然変異産物を生成する突然変異テンプレートの最少コピー数と定義される。感度は、実験ＩＩで決定された（図２１Ａ〜２１Ｃ）。
【０２８１】
ｄ選択度は、突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイを用いた際、産物が検出可能な突然変異テンプレートの最少コピー数に対する、産物が検出不能な野生型テンプレートの最大コピー数の比である。
【０２８２】
［０３０９］ヌクレオチド１９０位および３６９位間の選択度のおよそ１００倍の相異は：ｉ）野生型λ  ＤＮＡにおける１０−７〜１０−８の頻度の３６０位での自発的突然変異の存在、ｉｉ）Ｐ＊オリゴヌクレオチドの不純物、ｉｉｉ）３’末端での完全なマッチに対する加ピロリン酸分解の特異性、および正しいヌクレオチドを取り込むＤＮＡポリメラーゼの忠実性が配列背景と関連しており、ＩＩ型非特異的増幅が１０−７〜１０−８の頻度で起こる可能性もあることに由来しうる。後者の場合、選択度の１００倍の相異は、加ピロリン酸分解特異性の１０倍の相異、および配列背景でのＤＮＡポリメラーゼ忠実性の１０倍の相異から生じうる。
【０２８３】
［０３１０］大腸菌におけるλファージの自発的突然変異率は、遺伝子座間で多様であり、取り込まれるヌクレオチドあたり、平均１０−９〜１０−１１である。実施例Ｉに見られる、増幅されたシグナルは、稀な自発的突然変異によって引き起こされた可能性がある。
［０３１１］ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドは、Ｐ＊には検出されなかったが、ジデオキシ末端が付加されていない、ブロッキングされていないオリゴヌクレオチドがＰ＊に混入して、不純物により副反応が起こる可能性がある。しかし、生成される産物は、特異的突然変異よりも野生型である可能性がはるかにより高いため（３．３ｘ１０５：１）、この選択度は、少量のブロッキングされていないオリゴヌクレオチドによって、ひどくは限定されない可能性がある。
【０２８４】
［０３１２］要約すると、Ｂｉ−ＰＡＰは、非常に高い感度および選択度を有する。Ｂｉ−ＰＡＰは、野生型アレル２ｘ１０９までのコピー数から、一塩基置換を持つ稀な突然変異アレル２コピーを選択的に検出することも可能である。Ｂｉ−ＰＡＰは、目的のいかなる稀なアレルも検出する、単純で迅速な自動化可能な方法である。
【０２８５】
（実施例１３）
Ｂｉ−ＰＡＰによるマウス組織における突然変異負荷の測定
材料および方法
［０３１３］１０日齢〜２５ヶ月齢のマウスの肝臓、心臓、脂肪組織、大脳および小脳を迅速凍結し、そして使用するまで液体窒素下に保存した。Ｂｉｇ  Ｂｌｕｅプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ取り扱い説明書マニュアル）にしたがって、ＤＮＡを抽出した。簡潔には、組織をホモジナイズし、そしてプロテイナーゼＫで消化した。ゲノムＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈殿した。ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解し、そして４℃で保存した。２６０ｎｍのＵＶ吸光度によって、マウスゲノムＤＮＡの量を測定した。
【０２８６】
［０３１４］ｌａｃＩ遺伝子のＴ３６９Ｇの突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイ（アッセイＢ：ジデオキシヌクレオチドでブロッキングされ、３’末端で１ヌクレオチド重複した、２つの相対するＰ＊が：
【０２８７】
【化６】
2005525121.tif 000014
【０２８８】
である）を、ｉ）別に記載しない限り、反応が、マウスゲノムＤＮＡ（サイズ〜２０ｋｂ）２μｇを含有し；ｉｉ）他の構成要素を添加する前に、２０μｌ（１．２５ｘＨＥＰＥＳ緩衝液、５％ＤＭＳＯ、ＭｇＣｌ２不含）中のマウスＤＮＡを１００℃で２分間加熱し、そして氷上で迅速に冷却し；ｉｉｉ）第一の周期前に９５℃１分間の変性工程を追加し；ｉｖ）変性工程が９５℃１０秒間であったことを除いて、上述のように行った。
【０２８９】
［０３１５］２５μｌ反応物のうち１０μｌを、１０μｌの変性装填緩衝液と混合し、煮沸し、そして氷上で迅速に冷却した。室温で、９０ｍＭ  ＴＢＥ緩衝液を用いて、８％  ７Ｍ尿素／ＰＡＧＥゲルを通じて産物を電気泳動した。ゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーのため、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＯＭＡＴＴＭ  ＡＲフィルムに曝露した。
【０２９０】
結果および考察
［０３１６］トランスジェニックマウス突然変異検出系によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで自発的突然変異または誘導された突然変異の頻度およびパターンを決定することが可能である。Ｂｉｇ  Ｂｌｕｅ（登録商標）系は、突然変異標的として、大腸菌ｌａｃＩ遺伝子を含有する、染色体に組み込まれたλファージＤＮＡを宿するトランスジェニックマウスを用いる（ＧｒｏｓｓｅｎおよびＶｉｊｇ、１９９３；Ｇｏｓｓｅｎら、１９８９；Ｋｏｈｌｅｒら、１９９０）。ｌａｃＩ遺伝子は、４０のタンデム反復されたλ  ＤＮＡ中、各マウス二倍体ゲノム内に組み込まれている。
【０２９１】
［０３１７］トランスジェニックマウス組織からゲノムＤＮＡを単離し、そしてこれをλパッケージング抽出物と混合することによって、Ｂｉｇ  Ｂｌｕｅ（登録商標）突然変異検出系アッセイを行う。パッケージングされたλファージは大腸菌を感染させることが可能である。Ｘ−ｇａｌ基質の存在下で、ｌａｃＩ突然変異体は、無色野生型プラークの背景上に青いプラークを生じさせる。観察された突然変異体は、マウスから圧倒的多数で得られる（Ｈｉｌｌら、１９９９）。円形の青いプラークの数をプラーク総数で割ることによって、突然変異体頻度を決定する。この実験室において、５０００の配列決定された突然変異体プラークのうち、多様な年齢、性別、および処置からスクリーニングした、総数１４９ｘ１０６プラーク中、３１のＴ３６９Ｇ突然変異体が見出された（頻度＝２．１ｘ１０−７）。
【０２９２】
［０３１８］哺乳動物細胞において、非常に稀な突然変異を測定するためのＢｉ−ＰＡＰの有用性を評価するため、Ｂｉｇ  Ｂｌｕｅマウス由来のゲノムＤＮＡにおいて、Ｔ３６９Ｇ突然変異を解析した。ｌａｃＩ遺伝子を総数１．２ｘ１０７コピー含有する２５μｌ反応物において、２μｇのマウスゲノムＤＮＡを増幅した。Ｔ３６９Ｇに関する突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイ（アッセイＢ）を１８試料に関して二つ組で行った（図２６Ａ）。同様の数の試料を用いて、３つのカテゴリーの結果を定義した：１）６つの試料は２回陽性であった（５、１１〜１５）、２）７つの試料は１回陽性であった（１、３、６、９、１６〜１８）、そして３）５つの試料は２回陰性であった（２、４、７、８、１０）。
【０２９３】
［０３１９］各カテゴリーの２つの試料をさらに調べた（図２６Ｂ〜２６Ｃ、表８）。カテゴリー１において、最も強い増幅シグナルを持つ、２つの試料５および１２（図２６Ａ）に関して、さらなる定量化のため、マウスゲノムＤＮＡの０．５μｇへの４倍希釈および０．１２５μｇへの１６倍希釈を行った（図２６Ｂ）。各試料のＴ３６９Ｇ突然変異体頻度を概算すると、６つの試料間で３７０倍の範囲で多様であった（表８）。２．９ｘ１０−７のＴ３６９Ｇ突然変異体平均頻度は、Ｂｉｇ  Ｂｌｕｅ（登録商標）突然変異検出系を用いて４ｘ１０７プラークから測定された２．１ｘ１０−７のＴ３６９Ｇ突然変異体平均頻度の５０％以内であり、そしてこの突然変異を直接配列決定によって確認した。
【０２９４】
表８
Ｂｉ−ＰＡＰによって測定された体細胞突然変異体頻度
【０２９５】
【表８】
2005525121.tif 000015
【０２９６】
ａ図２６Ａを参照されたい。
ｂ反応総数に比較したＴ３６９Ｇ突然変異の陽性シグナル数の比。
ｃ突然変異体がポワソン分布にしたがって反応物中に分布し、そして１以上の突然変異体が反応物中にある場合、増幅が陽性であり、そして突然変異体が反応物中にない場合、陰性であると仮定する式（反応あたりの突然変異体がゼロである頻度＝ｅ−ｘ、ｘは反応あたりの突然変異体の平均数）を用いて、反応あたりのＴ３６９Ｇ突然変異体の平均数を概算する。
【０２９７】
ｄ突然変異体がポワソン分布にしたがってマウスゲノムＤＮＡ中に分布し、そして１以上の突然変異体が検出において陽性であると仮定して、反応あたりのマウスゲノム中のｌａｃＩ遺伝子のＴ３６９Ｇ突然変異体の頻度を概算する。２μｇのｌａｃ１＋マウスゲノムＤＮＡがｌａｃＩ遺伝子を〜１．２ｘ１０７コピー含有すると仮定して、試料１２および５の各々に関して、総数〜６．０ｘ１０６コピーのｌａｃＩ遺伝子を概算に用い、そして試料３、９、７および１０の各々に関して、〜２．９ｘ１０８コピーを用いる。
【０２９８】
［０３２０］２５ヶ月齢の５匹のマウスの肝臓において、突然変異体頻度の３７０倍の変動が観察された。この大きな変動は、テンプレート１コピーを増幅するのが困難なためである可能性もある。この問題に取り組むため、各々の解析を少なくとも２回反復し、同様の結果を得た。例えば、試料９において、２μｇのＤＮＡを用いた１４反応のうち７つが、１つの実験において陽性であり、４つのこうした反応のうち３つが別の実験で陽性であり、そして４つのこうした反応のうち２つが、第三の実験において陽性であった。試料７に関しては、８つの反応のうち１つが陽性であり、そして１４の反応のうち１つが陽性であった。陽性反応から再増幅した後、産物を配列決定して、Ｔ３６９Ｇ突然変異を確認した。さらに、陽性対照（〜１０コピーのＴ３６９Ｇを含む、２μｇのｌａｃＩ＋マウスＤＮＡ）および陰性対照（ｌａｃＩ標的を含まないマウスゲノムＤＮＡ、すなわちｌａｃＩ−マウスＤＮＡ）を行った。さらなる陽性対照として、反応あたりの突然変異λ  ＤＮＡのコピー数が、ｌａｃ１−ゲノムＤＮＡキャリアーの存在下で、２倍連続希釈されている、再構築実験を行った。１コピーと同程度に低いコピー数のテンプレートから、再現可能な増幅が立証された（図２６Ｂ、２６Ｃ）。
【０２９９】
［０３２１］遡及的にみると、マウス間のＴ３６９Ｇ突然変異体頻度は、過剰に分散されており、超ポワソン分布（ｈｙｐｅｒ−Ｐｏｉｓｓｏｎ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示す（Ｎｉｓｈｉｎｏら、１９９６；Ｐｉｅｇｏｒｓｃｈら、１９９４）ため、６匹のマウス間で観察されたＴ３６９Ｇ突然変異体の頻度の３７０倍の変動は、驚くべきことでない可能性もある。６匹のマウス間で、Ｂｉｇ  Ｂｌｕｅ（登録商標）突然変異検出系によってアッセイされる総突然変異体頻度における動物間変動は、３〜４倍である可能性もあり、１または数匹のマウスにおいて、有意な創始者効果（ｆｏｕｎｄｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ）があった。変動は、２ｘ１０−５〜８ｘ１０−５の範囲である可能性もあり、これは１，０００を越える、異なる突然変異の合計である。ここで、Ｔ３６９Ｇ突然変異のみをアッセイする。シグナルの大部分は、二重鎖突然変異テンプレートから生じると予期される（Ｈｉｌｌら、１９９９）が、ＤＮＡ複製またはＤＮＡ修復から主に得られる、分離されていないミスマッチ中間体もまた、シグナルを生じるであろうことに注目すべきである。したがって、感度の物理的限界は、実際、反応あたりの二重鎖ＤＮＡ分子の半分である。
【０３００】
［０３２２］結論として、我々は、Ｂｉ−ＰＡＰが、アッセイに応じて、１０−７〜１０−９と同等に低い頻度の非常に稀な突然変異を解析可能であることを立証する。Ｂｉ−ＰＡＰは、哺乳動物ゲノムＤＮＡから直接、体細胞突然変異１コピーを検出可能であることを示す。アッセイ間変動は、アッセイ感度における遺伝子座特異的多様性、または試料中のアッセイされた突然変異体の頻度を反映しうる。これらの可能性間を区別するのに、より多くの研究が必要である。哺乳動物ＤＮＡでは、巨大なゲノムサイズによって、テンプレートのコピー数が限定される。２μｇのゲノムＤＮＡは、６００，０００マウス一倍体ゲノムしか含有しないが、なお反応物は粘性である。Ｂｉｇ  ＢｌｕｅマウスゲノムＤＮＡの我々の解析は、一倍体ゲノムあたり２０コピーのｌａｃＩ遺伝子によって促進された。ヒトにおける突然変異負荷を測定するため、粘性を減少させる（例えば超音波処理によってＤＮＡを小さいセグメントに剪断する）ことによって、１つの反応あたりのゲノムＤＮＡを少なくとも３倍増加させることも可能であり、そして反応体積を１００μｌに拡大することによって、さらに４倍増加させうる。ヒトゲノムＤＮＡ中の突然変異負荷は、実質的に同一の配列のセグメントを解析することによって、容易になる可能性もあり、例えば血友病Ａにおける一般的なインバージョン突然変異（Ｌａｋｉｃｈら、１９９３）に関与する、９９＋％の配列同一性を持つ、ヒトＸ染色体上の３つの９．６ｋｂセグメントがある。線虫（Ｃ−ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、およびヒト・ミトコンドリアゲノムまたは慢性ウイルス感染（例えばＢ型肝炎）を含む、より複雑でないゲノムもまた、このプロトコルで解析可能であるはずである。
【０３０１】
［０３２３］本発明は、本発明の好ましい態様の詳細に言及することによって、本特許出願中に開示されているが、該開示が限定する意味でなく、例示することを意図するのを理解すべきであり、これは、本発明の精神および付随する請求項の範囲内で、当業者には変更が容易に思い浮かぶであろうことを意図するためである。
【０３０２】
参考文献一覧
【０３０３】
【表９】
2005525121.tif 000016
【０３０４】
【表１０】
2005525121.tif 000017
【０３０５】
【表１１】
2005525121.tif 000018
【０３０６】
【表１２】
2005525121.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】［００８３］図１は、アレル特異的ＰＡＰ（ＰＡＰ−Ａ）による、稀な突然変異検出の概略図を示す。
【図２】［００８４］図２は、双方向性ＰＡＰ−Ａ（Ｂｉ−ＰＡＰ−Ａ）の概略図を示す。
【図３】［００８５］図３は、プログラム可能光化学オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ上で行った、ＰＡＰに基づく再配列決定（ＰＡＰ−Ｒ）の概略図を示す。
【図４】［００８６］図４は、ＧからＡへの突然変異を検出する、マイクロアレイに基づく再配列決定の概略図を示す。
【図５】［００８７］図５は、連結仲介ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）の概略図を示す。
【図６】［００８８］図６Ａおよび６Ｂは、Ｄ１ドーパミン受容体遺伝子のヌクレオチド２２９でＧアレルを検出するためのＰＡＰの使用を例示する概略図である。本明細書の実施例１に詳細に該方法を記載する。  ［００８９］図６Ｃは、ヒト・ドーパミン受容体遺伝子のＧ／Ｇ、Ａ／ＡおよびＧ／Ａ遺伝子型からのＰＡＰのオートラジオグラムである。
【図７】［００９０］図７Ａおよび７Ｂは、ＰＡＳＡに比較してＰＡＰの特異性が増進していることを例示する図解である。
【図８Ａ】［００９１］図８Ａは、本明細書の実施例１で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本明細書の実施例１で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図９】［００９２］図９は、本明細書の実施例１で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１０】［００９３］図１０は、本明細書の実施例１で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１１】［００９４］図１１Ａは、ＰＡＰ効率の増進を例示する概略図である。  ［００９５］図１１Ｂは、ヒト・ドーパミン受容体遺伝子のＧ／Ｇ、Ａ／ＡおよびＧ／Ａ遺伝子型からのＰＡＰのオートラジオグラムである。
【図１２Ａ】［００９６］図１２Ａは、本明細書の実施例２で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本明細書の実施例２で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、本明細書の実施例２で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、本明細書の実施例２で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、本明細書の実施例２で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１３】［００９７］図１３は、本明細書の実施例２で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１４】［００９８］図１４は、本明細書の実施例２で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１５】［００９９］図１５は、本明細書の実施例３で得た試料の電気泳動結果を示すオートラジオグラムである。
【図１６】［０１００］図１６Ａ〜１６Ｂは、ＬＭ−ＰＡＰによるＵＶフットプリンティングを示す。図１６Ａは、ドーパミンＤ１受容体遺伝子に関して、アレル特異的ＬＭ−ＰＡＰ対アレル特異的ＬＭ−ＰＣＲを示す。図１６Ｂは、ｐｇｋ遺伝子に関するＬＭ−ＰＡＰを示す。
【図１７】［０１０１］図１７Ａ〜１７Ｂは、それぞれＰＡＰおよびＢｉ−ＰＡＰを用いた、ヒト（図１７Ａ）およびマウス（図１７Ｂ）ゲノムＤＮＡからのＰＡＰ直接増幅を示す。
【図１８Ａ】［０１０２］図１８Ａは、３’末端アシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊を用いたＰＡＰ増幅を示す。図１８Ａ：モデル：ｌａｃＩ遺伝子の二重鎖ＤＮＡテンプレートを示す。突然変異テンプレートは、ｌａｃＩ遺伝子のヌクレオチド３６９位でＧを含有し、一方、野生型テンプレートは、ヌクレオチド３６９位でＴを含有する。Ｐ＊＝加ピロリン酸分解活性化可能オリゴヌクレオチド。Ｐ＊は、３’末端にアシクロＮＭＰまたはｄｄＮＭＰを有する。Ｐ＊は、３’末端で、突然変異テンプレートに特異的であるが、野生型テンプレートにミスマッチする（表６）。Ｏ＝オリゴヌクレオチド。それぞれ、Ｐ＊１およびＯ１、Ｐ＊２およびＯ２、またはＰ＊１およびＰ＊２を用いてＰＡＰを行った。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、３’末端アシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊を用いたＰＡＰ増幅を示す。図１８Ｂ：３０量体のＰ＊を用いたＰＡＰ：Ｐ＊は、３’末端で、突然変異テンプレートに特異的であるが、野生型テンプレートにミスマッチする。レーン１〜８では、３’末端アシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊が存在する。レーン９〜１６では、比較のため、３’末端ジデオキシヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊が存在する。レーン１〜４および９〜１２では、突然変異テンプレートを用いる。レーン５〜８および１３〜１６では、野生型テンプレートを用いる。ＰＡＰ産物およびＰ＊を、そのサイズとともに示す。レーンＭは、φＸ１７４−ＰＵＣ１９／ＨａｅＩＩＩ  ＤＮＡマーカー１２０ｎｇである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、３’末端アシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊を用いたＰＡＰ増幅を示す。図１８Ｃ：３５量体Ｐ＊を用いたＰＡＰ：実験は、３’末端が３０量体Ｐ＊と共通であり、そして５’末端が５ヌクレオチド長い３５量体Ｐ＊を用いたことを除いて、図１８Ｂと同一である。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、３’末端アシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊を用いたＰＡＰ増幅を示す。図１８Ｄ：Ｖｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼを用いたＰＡＰ。実験は、Ｖｅｎｔ（エキソ−）を用いたことを除いて、図１８Ｂと同一である。
【図１８Ｅ】図１８Ｅは、３’末端アシクロヌクレオチドでブロッキングされたＰ＊を用いたＰＡＰ増幅を示す。図１８Ｅ：Ｐｆｕ（エキソ−）ポリメラーゼを用いたＰＡＰ。実験は、Ｐｆｕ（エキソ−）を用いたことを除いて、図１９Ｂと同一である。
【図１９】［０１０３］図１９は、ＰＡＰが、多量の野生型テンプレート中、稀な突然変異を検出する、高い選択度を有することを示す。ヌクレオチド１９０位の例において、突然変異特異的Ｐ＊は、３’末端で、突然変異Ａテンプレートにマッチするが、野生型Ｔテンプレートにミスマッチする。特異的でそして効率的な増幅を太い矢印で示す。突然変異Ａテンプレートにハイブリダイズさせた際、Ｐ＊は３’末端ジデオキシヌクレオチドから直接は伸長不能であり、加ピロリン酸分解によって３’末端ｄｄＴＭＰが除去されなければならず、そして次いで活性化されたオリゴヌクレオチドが効率的に伸長される。Ｔテンプレート由来の２種の非特異的増幅をＩ型およびＩＩ型と示す。ミスマッチ加ピロリン酸分解が起こって、続く周期のテンプレートとして効率的な増幅を支持しないであろう野生型産物を生成する場合、非特異的増幅はほとんど生じない（Ｉ型）（エラーを細い矢印で示し、そしてエラーは１０−５と同程度に低い頻度と概算される）。ミスマッチ加ピロリン酸分解および誤った取り込みの両方が非常に稀に起こって、突然変異産物が生じる場合（ＩＩ型）（エラーを細い矢印で示し、そしてエラーは３．３ｘ１０−１１と同程度に低いカップリング頻度と概算される）。ひとたびエラーが起これば、続く周期で、突然変異産物は指数関数的に増幅されることが可能であり、そしてしたがって、これは選択度を決定する。
【図２０Ａ】［０１０４］図２０ＡはＢｉ−ＰＡＰ増幅を示す。図２０Ａ：稀な突然変異を検出するＢｉ−ＰＡＰの概略図。ヌクレオチド１９０に関して２つの突然変異Ｐ＊を用いた突然変異特異的アッセイを示す。下流および上流Ｐ＊は、それぞれ、３’末端にジデオキシＴおよびジデオキシＡを含有する。これらは、３’末端で、ヌクレオチド１９０のＴ：Ａアレルに特異的である（右側）が、Ａ：Ｔ野生型アレルにミスマッチしている（左側）。Ｐ＊は長さ４０ヌクレオチドであり、そして３’末端で１ヌクレオチド重複する。左側では、ミスマッチのため、野生型テンプレートから実質的な産物は生成されない。右側では、突然変異テンプレートから、突然変異産物が効率的に産生される。
【図２０Ｂ】図２０ＢはＢｉ−ＰＡＰ増幅を示す。図２０Ｂ：λ  ＤＮＡからのＢｉ−ＰＡＰ直接増幅。ヌクレオチド１９０での野生型および突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイ各々を用いて、λ  ＤＮＡからｌａｃＩ遺伝子の７９ｂｐセグメントを増幅した。レーン１〜３の野生型アッセイでは、２つの野生型Ｐ＊は、それぞれ、３’末端ｄｄＡおよびｄｄＴを有する。レーン４〜６およびレーン７〜９の突然変異特異的アッセイでは、２つの突然変異Ｐ＊は、それぞれ、３’末端に、ｄｄＴおよびｄｄＡを持つ。レーン１、４、および７では、各反応に２０００コピーの野生型テンプレートを添加した。レーン２、５、および８では、各反応に２０００コピーの突然変異テンプレートを添加した。レーン３、６、および９では、テンプレートをまったく添加しなかった。レーン７〜９では、２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡをキャリアーとして添加した。産物およびＰ＊を示す。レーンＭは、φＸ１７４−ＰＵＣ１９／ＨａｅＩＩＩ  ＤＮＡマーカー１２０ｎｇである。
【図２１Ａ】［０１０５］図２１Ａは、Ｂｉ−ＰＡＰの感度および選択度に関するテンプレートの力価決定を示す。実験Ｉでは、突然変異Ｐ＊を用いて、野生型テンプレートを増幅し、突然変異産物を生成した。実験ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶでは、突然変異テンプレートを増幅して、突然変異産物を生成した。図２１Ａ：Ａ１９０Ｔに関する突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイ。実験Ｉにおいて、野生型λ  ＤＮＡのコピー数をレーン１〜５に示す。レーン６は、ＤＮＡを含まない陰性対照である。実験ＩＩにおいて、突然変異λ  ＤＮＡのコピー数をレーン７〜１１に示す。レーン１１（０．２コピー）は、コピー数の希釈が正確であることを補助する、陰性対照である。レーン１２は、ＤＮＡを含まない陰性対照である。実験ＩＩＩにおいて、野生型λ  ＤＮＡ  ２ｘ１０９コピーの存在下での突然変異λ  ＤＮＡのコピー数をレーン１３〜１７に示す。レーン１８は、野生型λ  ＤＮＡしか含まない陰性対照である。実験ＩＶにおいて、１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡの存在下での突然変異λ  ＤＮＡのコピー数をレーン１９〜２３に示す。レーン２４は、ヒトゲノムＤＮＡしか含まない陰性対照である。レーン「Ｃ野生型」は、野生型Ｐ＊を用いて、２０００コピーの野生型λ  ＤＮＡを増幅した野生型産物対照である。レーン「Ｃ突然変異」は、突然変異Ｐ＊を用いて、２０００コピーの突然変異λ  ＤＮＡを増幅した突然変異産物対照である。ユニークな移動度の野生型および突然変異産物を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、Ｂｉ−ＰＡＰの感度および選択度に関するテンプレートの力価決定を示す。実験Ｉでは、突然変異Ｐ＊を用いて、野生型テンプレートを増幅し、突然変異産物を生成した。実験ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶでは、突然変異テンプレートを増幅して、突然変異産物を生成した。図２１Ｂ：Ｔ３６９Ｇに関する突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイ。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、Ｂｉ−ＰＡＰの感度および選択度に関するテンプレートの力価決定を示す。実験Ｉでは、突然変異Ｐ＊を用いて、野生型テンプレートを増幅し、突然変異産物を生成した。実験ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶでは、突然変異テンプレートを増幅して、突然変異産物を生成した。図２１Ｃ：Ｔ３６９Ｃに関する突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰアッセイ。
【図２２】［０１０６］図２２は、Ｂｉ−ＰＡＰ再配列決定のためのＰ＊マイクロアレイの設計を示す。Ｂｉ−ＰＡＰを再配列決定に用いて、マイクロアレイ上の既知の領域において、未知の突然変異を検出することも可能である。野生型テンプレートにしたがってＰ＊を設計する。各Ｂｉ−ＰＡＰの２つの相対するＰ＊をマイクロアレイスポットに係留する。各対の矢印は、１つのヌクレオチド位に対する４つのＢｉ−ＰＡＰに相当する。テンプレート上に突然変異が示され、そしてこれは６つの重複したＰ＊に渡る。マイクロアレイ上、多くのＢｉ−ＰＡＰを平行してプロセシングすることも可能である。
【図２３Ａ】［０１０７］図２３ＡはＢｉ−ＰＡＰ再配列決定の概略図を示す。図２３Ａ：野生型配列の検出。これはマイクロアレイを詳しく見たものである。野生型配列にしたがって、Ｐ＊を設計する。ヌクレオチドＡの位で、４対のＰ＊を用いて４つのＢｉ−ＰＡＰを合成する。４つの下流Ｐ＊は、３’末端で、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＴＭＰ、ｄｄＧＭＰまたはｄｄＣＭＰいずれかが野生型配列および３つのありうる一塩基置換に対応することを除いて、同一配列を有する。４つの対応する上流Ｐ＊は、３’末端がｄｄＴＭＰ、ｄｄＡＭＰ、ｄｄＣＭＰまたはｄｄＧＭＰいずれかであることを除いて、同一配列を有する。各対のＰ＊は、３’末端で、１ヌクレオチド重複を有する。次のヌクレオチドＣ上で、別の４対のＰ＊が合成される（未提示）。野生型試料を添加した場合、野生型Ｂｉ−ＰＡＰのみが、蛍光標識された特異的産物を生成する。この方式で、１ｋｂ領域をスキャンするには、８０００のＰ＊を必要とする。
【図２３Ｂ】図２３ＢはＢｉ−ＰＡＰ再配列決定の概略図を示す。図２３Ｂ：ＡからＴの突然変異の検出。突然変異ヌクレオチドＴ上で、突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰが突然変異産物を生成する。次のヌクレオチドＧ上では、Ｐ＊の各対が１または２のミスマッチを含有するため、Ｂｉ−ＰＡＰの産物はまったく生成されない（未提示）。
【図２４Ａ】［０１０８］図２４Ａは、Ｂｉ−ＰＡＰ再配列決定マイクロアレイを示す。図２４Ａ：野生型配列の検出。野生型配列にしたがって、各ヌクレオチド位に関して４対のＰ＊を設計する。各対のＰ＊は下流方向および上流方向であり、そして３’末端に、重複し、そして相補的な１つのヌクレオチドを有する。野生型Ｐ＊対は、各ヌクレオチド位上で特異的に増幅される。野生型Ｐ＊対のすべてが特異的に増幅される場合、野生型配列を決定可能である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、Ｂｉ−ＰＡＰ再配列決定マイクロアレイを示す。図２４Ｂ：ＡからＴへの突然変異の検出。突然変異テンプレートを用いると、突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰが増幅される。突然変異特異的Ｂｉ−ＰＡＰによって集中するＢｉ−ＰＡＰシグナルがないウィンドウがあり、そして両側に３つの連続するヌクレオチドがある。対の特異的下位配列は、長さ７ヌクレオチドと推測される。ヘテロ接合体突然変異であったとしても、いかなる未知の一塩基置換も決定可能である。また、小さい欠失および挿入を検出し、そして位置決定することも可能である。
【図２５】［０１０９］図２５は、マイクロアレイ上のＰＡＰ新規配列決定を示す。ＰＡＰはまた、未知の領域の新規ＤＮＡ配列決定にも使用可能である。対の特異的下位配列は、長さ１５ヌクレオチドと推測される。対の特異的下位配列の完全なセットのＰ＊対は、既知のアドレスを持つマイクロアレイ上にある。未知のＤＮＡ試料を添加した後、Ｂｉ−ＰＡＰを行う。すべての増幅されたＢ−ＰＡＰ産物を収集し、そして次いで、一ヌクレオチド重複によって、増幅されたＰ＊対の対の特異的下位配列をアセンブリする。こうして未知の相補配列を再構築する。
【図２６】［０１１０］図２６Ａ〜２６Ｃは、体細胞突然変異の検出を示す。図２６Ａ：ｌａｃ１＋トランスジェニックマウスの１８のゲノムＤＮＡ試料を選択した。アッセイＢを用いて、各試料２μｇのゲノムＤＮＡを増幅して、Ｔ３６９Ｇ突然変異を２回検出した。試料１〜１０は、２５ヶ月齢マウスの肝臓由来である。試料１１〜１４は、６ヶ月齢マウスの心臓（試料１１、１３および１４）および脂肪（試料１２）由来である。試料１５〜１８は１０日齢マウスの脳由来である。Ｐ＝突然変異λ  ＤＮＡを増幅した陽性対照、Ｎ＝ＤＮＡを含まない陰性対照、＋＝増幅産物、−＝産物なし。図２６Ｂ：アッセイＢを行った。レーン１１〜１２、１３〜１６および１７〜２０では、各反応において、それぞれ、試料１２のｌａｃ１＋マウスゲノムＤＮＡ  ２μｇ、０．５μｇおよび０．１２５μｇを用いた。レーン１〜１０は対照であり；２倍連続希釈によって、反応あたりの突然変異λ  ＤＮＡのコピー数を再構築した。レーン１〜１０および１３〜２０では、各反応はまた、１μｇのｌａｃ１−マウスゲノムＤＮＡキャリアーも含有した。ｓｓ＝一本鎖、ｄｓ＝二本鎖。図２６Ｃ：アッセイＢを行った。レーン１１〜１４では、各反応で、試料３のｌａｃ１＋マウスゲノムＤＮＡ  ２μｇを用いた。レーン１５〜１８では、各反応で、試料９のｌａｃ１＋マウスゲノムＤＮＡ  ２μｇを用いた。レーン１〜１０は対照であり；反応あたりの突然変異λ  ＤＮＡのコピー数を示す。各対照反応はまた、１μｇのｌａｃ１−マウスゲノムＤＮＡキャリアーも含有した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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