(57)【要約】チアゾリジンジチオン誘導体を使用して哺乳動物の癌、神経変性性疾患、糖尿病、腎疾患、または炎症を治療する方法、およびこの誘導体を含有する薬学的組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の癌を治療するための、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000014
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の使用。
【請求項２】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000015
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項2記載の使用。
【請求項４】
癌が過剰増殖または組織再構築もしくは修復に関連している、請求項3記載の使用。
【請求項５】
癌が、PTPN12、PTPN2、PRKD2、およびGSK3βからなる群より選択される酵素の活性に関連している、請求項4記載の使用。
【請求項６】
式(I)の化合物が式(Ia)
(式中、
pが1であり、
R1が水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R2が水素またはアルキルであり、
R3が-O-または-S-であり、
R4がハロ、ハロアルキルまたはハロアルコキシである)
の化合物である、請求項1〜5のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
哺乳動物の炎症を治療する際に使用するための、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000016
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の使用。
【請求項８】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000017
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項7記載の使用。
【請求項９】
哺乳動物がヒトである、請求項8記載の使用。
【請求項１０】
炎症が過剰増殖または組織再構築もしくは修復に関連している、請求項9記載の使用。
【請求項１１】
炎症が、PTPN12、PTPN2、PRKD2、およびGSK3βからなる群より選択される酵素の活性に関連している、請求項10記載の使用。
【請求項１２】
式(I)の化合物が式(Ia)
(式中、
pが1であり、
R1が水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R2が水素またはアルキルであり、
R3が-O-または-S-であり、
R4がハロ、ハロアルキルまたはハロアルコキシである)
の化合物である、請求項7〜11のいずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
過剰増殖および組織再構築または修復に関連する障害または状態を有する哺乳動物を治療するための、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000018
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の使用。
【請求項１４】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000019
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項13記載の使用。
【請求項１５】
1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000020
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の使用であって、
式(I)の化合物を哺乳動物の細胞に接触させる段階を含み、式(I)の化合物による哺乳動物細胞内のPTPN12、PTPN2、PRKD2、および/またはGSK3βの活性の阻害が可能である使用。
【請求項１６】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000021
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項15記載の使用。
【請求項１７】
哺乳動物細胞をインビトロにおいて治療する、請求項16記載の使用。
【請求項１８】
哺乳動物細胞をインビボにおいて治療する、請求項16記載の使用。
【請求項１９】
活性の阻害により細胞接着が低下する、請求項16記載の使用。
【請求項２０】
活性の阻害により細胞分割が低下する、請求項16記載の使用。
【請求項２１】
活性の阻害により細胞の遊走が低下される、請求項16記載の使用。
【請求項２２】
活性の阻害により腫瘍増殖が制御される、請求項16記載の使用。
【請求項２３】
活性の阻害によりリンパ球の活性化が制御される、請求項16記載の使用。
【請求項２４】
ヒトの癌または炎症を治療する際に有用な薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体と、希釈剤または賦形剤と、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000022
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであるが、
ただし、R1およびR2が共に水素である場合には、Rは未置換チエン-2-イルでありえない)の化合物とを含む薬学的組成物。
【請求項２５】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000023
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項24記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
式(I)の化合物が式(Ia)
(式中、
pが1であり、
R1が水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R2が水素またはアルキルであり、
R3が-O-または-S-であり、
R4がハロ、ハロアルキルまたはハロアルコキシである)
の化合物である、請求項25記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000024
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであるが、
ただし、R1およびR2が共に水素である場合には、Rは未置換フラン-2-イル、3-ニトロフラン-2-イル、4-ニトロフラン-2-イルまたは4-ブロモフラン-2-イルでありえない)の化合物。
【請求項２８】
式(Ia)
2005535593.tif 000025
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項27記載の化合物。
【請求項２９】
治療を必要としている哺乳動物に、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000026
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の治療的に有効な量を投与する段階を含む、哺乳動物の癌を治療する方法。
【請求項３０】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000027
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物がヒトである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
癌が過剰増殖または組織再構築もしくは修復に関連している、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
癌が、PTPN12、PTPN2、PRKD2、およびGSK3βからなる群より選択される酵素の活性に関連している、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
式(I)の化合物が式(Ia)
(式中、
pが1であり、
R1が水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R2が水素またはアルキルであり、
R3が-O-または-S-であり、
R4がハロ、ハロアルキルまたはハロアルコキシである)
の化合物である、請求項29〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
治療を必要としている哺乳動物に、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000028
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の治療的に有効な量を投与する段階を含む、哺乳動物の炎症を治療する方法。
【請求項３６】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000029
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物がヒトである、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
炎症が過剰増殖または組織再構築もしくは修復に関連している、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
炎症が、PTPN12、PTPN2、PRKD2、およびGSK3βからなる群より選択される酵素の活性に関連している、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
式(I)の化合物が式(Ia)
(式中、
pが1であり、
R1が水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R2が水素またはアルキルであり、
R3が-O-または-S-であり、
R4がハロ、ハロアルキルまたはハロアルコキシである)
の化合物である、請求項36〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
過剰増殖および組織再構築または修復に関連する障害または状態を有する哺乳動物を治療する方法であって、障害または状態を有する哺乳動物に、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000030
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の治療的に有効な量を投与する段階を含む方法。
【請求項４２】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000031
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000032
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の使用であって、
式(I)の化合物を哺乳動物の細胞に投与する段階を含み、式(I)の化合物による哺乳動物細胞内のPTPN12、PTPN2、PRKD2、および/またはGSK3βの活性の阻害が可能である方法。
【請求項４４】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000033
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物細胞をインビトロにおいて治療する、請求項41記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物細胞をインビボにおいて治療する、請求項41記載の方法。
【請求項４７】
活性の阻害により細胞接着が低下する、請求項41記載の方法。
【請求項４８】
活性の阻害により細胞分割が低下する、請求項41記載の方法。
【請求項４９】
活性の阻害により細胞の遊走が低下する、請求項41記載の方法。
【請求項５０】
活性の阻害により腫瘍増殖が制御される、請求項41記載の方法。
【請求項５１】
活性の阻害によりリンパ球の活性化が制御される、請求項41記載の方法。
【請求項５２】
ヒトの癌または炎症を治療する際に有用な薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体と、希釈剤または賦形剤と、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000034
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであるが、
ただし、R1およびR2が共に水素である場合には、Rは未置換チエン-2-イルでありえない)の化合物とを含む薬学的組成物。
【請求項５３】
式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000035
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項52記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
式(I)の化合物が式(Ia)
(式中、
pが1であり、
R1が水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R2が水素またはアルキルであり、
R3が-O-または-S-であり、
R4がハロ、ハロアルキルまたはハロアルコキシである)
の化合物である、請求項53記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000036
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであるが、
ただし、R1およびR2が共に水素である場合には、Rは未置換フラン-2-イル、3-ニトロフラン-2-イル、4-ニトロフラン-2-イルまたは4-ブロモフラン-2-イルでありえない)の化合物。
【請求項５６】
式(Ia)
2005535593.tif 000037
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である、請求項55記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、チアゾリジンジチオン誘導体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質のリン酸化は、細胞の外から核に調節シグナルを搬送するタンパク質を選択的に改変するために細胞が使用する共通の調節機序である。これらの生化学的改変を実施するタンパク質は、プロテインキナーゼおよびプロテインホスファターゼとして既知の酵素群である。それらは、リン酸化の標的とする基質残基によってさらに規定することができる。キナーゼおよびプロテインキナーゼ経路はほとんどの細胞のシグナル伝達に関与しており、その経路の多くはヒト疾患に何らかの役割を果たしている。タンパク質チロシンリン酸化は、細胞接着、有糸分裂誘発、分化および遊走などの生化学的および細胞的事象において細胞外刺激を伝達するための重要な機序である(例えば、Liら、Seminars in Immunology(2000)、12巻、75〜84ページ、およびNeelら、Current Opinion in Cell Biology(1997)、9巻、193〜204ページを参照されたい)。
【０００３】
リン酸化は、成長因子またはホルモンなどの細胞外生物シグナルを介して受容体によって媒介されるシグナル伝達において重要である。例えば、多数の発癌遺伝子はキナーゼまたはホスファターゼ、すなわち、タンパク質のリン酸化もしくは脱リン酸化反応を触媒するまたはリン酸化によって特異的に調節される酵素である。また、キナーゼまたはホスファターゼは、1つ以上の別個のキナーゼまたはホスファターゼによって調節される活性を有し、特異的なシグナリングカスケードを形成することができる。
【０００４】
全てのタンパク質チロシンホスファターゼ(PTPs)は、シグネチャー配列(I/V)HCXXGXX(S/T)によって特徴づけられる保存された触媒領域を有する。このシステインのこの突然変異はPTP活性を完全に消失させるので、このシグネチャー配列に見出されるシステイン残基はPTPsの触媒活性に必須であることを生化学的および導体的検討は証明している。Flint, A. J.ら、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94(1997), 1680〜1685ページを参照されたい。
【０００５】
全てのタンパク質チロシンキナーゼ(PTKs)は、触媒領域内に多数の保存された領域 (Hanks, S. K.ら、「タンパク質キナーゼ6：真核生物タンパク質キナーゼスーパーファミリー：キナーゼ(触媒)領域の構造および分類(Protein kinase 6. The Eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification)」、FASEB J. (1995), 9巻、8号、576〜96ページ) およびキナーゼの特異的な役割に関連する可変領域を有する。このため、キナーゼを阻害する化合物は1つのキナーゼまたは1つのキナーゼ群について選択することができる。
【０００６】
関連技術の説明
PCT公開されている特許出願、国際公開公報第99/61467号(McGill大学)は、細胞遊走および/または接着斑の阻害剤として、PTPN12(PTP-PEST)のシグナル伝達タンパク質領域への結合を妨害する薬剤を記載している。
【０００７】
PCT公開されている特許出願、国際公開公報第00/36111号(McGill大学)は、スクリーニングにPTPN2(TC-PTP)を使用する方法を記載している。
【０００８】
米国特許第6,262,044号(Novo Nordisk)は、ある種のタンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤について記載しており、タンパク質チロシンホスファターゼの発見およびそれらの病態生理学的な役割の詳細な説明を提供している。Olefsky、Jerald M.による米国特許第5,726,027号は、結合タンパク質チロシンホスファターゼ1B(PTPN1)に影響を与えてインスリン受容体をリン酸化する化合物を同定するスクリーニング方法を記載している。
【０００９】
Gorishnii, V. Ya.ら、Farm. Zh. (Kiev)(2001)、2巻、64〜67ページおよびGorishnyi, V. Ya.ら、Farm. Zh. (Kiev)(1995)、4巻、50〜53ページは、炎症を治療する際に有用な4-オキソ-2-チオキソチアゾリジン誘導体を開示している。PCT公開されている特許出願、国際公開公報第00/76988号(Warner-Lambert)は、アミロイド凝集阻害剤としておよびアミロイド沈着を画像化する際に有用な4-オキソ-2-チオキソチアゾリジン誘導体を開示している。欧州特許出願第0 047 109号(Ono Pharmaceuticals)はアルドース還元酵素を阻害する際に有用な4-オキソ-2-チオキソチアゾリジン誘導体を開示している。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、例えば、哺乳動物における過剰増殖性障害、例えば、癌、炎症等を治療する際のある種のチアゾリジンジチオン誘導体の使用に関する。タンパク質リン酸化状態の細胞調節、すなわち、リン酸化修飾酵素、例えば、タンパク質チロシンキナーゼおよびタンパク質チロシンホスファターゼの活性の変更に関連する過剰増殖性障害が特に興味深い。
【００１１】
態様において、本発明の化合物および薬学的組成物を使用して、PTPN12、PTPN2、PRKD2、PTPN1および/またはGSK3βの活性を阻害する。これらの酵素は、細胞タンパク質のリン酸化状態の変更に関連するとされている。
【００１２】
従って、本発明の一局面は、必要としている哺乳動物に、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000002
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の治療的に有効な量を投与する段階を含む、哺乳動物の癌を治療する方法を提供する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、過剰増殖および組織再構築または修復に関連する障害または状態を有する哺乳動物を治療する方法であって、障害または状態を有する哺乳動物に、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000003
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の治療的に有効な量を投与する段階を含む方法を提供する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000004
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルである)
の化合物の使用であって、
式(I)の化合物を哺乳動物の細胞に投与する段階を含み、式(I)の化合物による哺乳動物細胞内のPTPN12、PTPN2、PRKD2、PTPN1、および/またはGSK3βの活性の阻害が可能である方法を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、ヒトの癌または炎症を治療する際に有用な薬学的組成物であって、薬学的に許容される担体と、希釈剤または賦形剤と、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000005
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであるが、
ただし、R1およびR2が共に水素である場合には、Rは未置換チエン-2-イルでありえない)の化合物とを含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、1つの立体異性体、立体異性体の混合物もしくは立体異性体のラセミ混合物として、または溶媒和化合物もしくは多形として、または薬学的に許容される塩としての、式(I)
2005535593.tif 000006
(式中、
Rはヘテロシクリルであり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであるが、
ただし、R1およびR2が共に水素である場合には、Rは未置換フラン-2-イル、3-ニトロフラン-2-イル、4-ニトロフラン-2-イルまたは4-ブロモフラン-2-イルでありえない)の化合物を提供する。
【００１７】
本発明の別の局面においては、癌または炎症を治療するための、本発明の化合物および/または薬学的組成物の使用を提供する。
【００１８】
本発明の別の局面においては、結腸または結腸直腸癌を治療する際に使用するための化合物および/または薬学的組成物を提供する。
【００１９】
本発明の別の局面においては、PTPN12、PTPN2、PTPN1、PRKD2またはGSK3β発現に関連する障害を治療するための医薬品を製造する際の本発明の化合物および/または薬学的組成物の使用。
【００２０】
本発明の別の局面においては、過剰増殖、組織再構築および/または組織修復に関連する障害を治療するための化合物および/または薬学的組成物の使用を提供する。
【００２１】
本発明の別の局面においては、糖尿病を治療するためまたは糖尿病を治療するための医薬品を製造する際の本発明の化合物および/または薬学的組成物の使用を提供する。
【００２２】
本発明の別の局面においては、PTPN12、PTPN2、PRKD2、またはGSK3β発現に関連する障害を治療するための化合物および/または薬学的組成物の使用を提供する。
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において使用する単数形「1つの(a、an)」および「その(the)」は、内容が明らかに相でないことを示さない限り、複数の言及を含む。例えば、「1つの化合物」はこのような化合物の1つ以上をいうが、「その酵素」は特定の酵素並びに他のファミリーメンバーおよび当業者に既知の等価物を含む。特に明記されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において、以下の用語は示す意味を有する。
【００２４】
「アルキル」は、炭素原子および水素原子だけからなり、不飽和を含まず、炭素原子数1〜8であり、単結合によって分子の残りと結合している直鎖状または分岐鎖状炭化水素鎖基、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、1-メチルエチル(イソプロピル)、n-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルエチル(t-ブチル)等をいう。本明細書において特に具体的に記載されていない限り、アルキル基は、選択的に、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、アルキルチオ、-N=N-O-R7、-N(R6)2、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-C(O)R6、N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)OR6、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)(式中、各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、各R7は、水素、アルキルまたはアラルキルである)によって置換されていてもよい。本明細書において特に具体的に記載されていない限り、置換されたアルキル基を含有する、以下に規定する基については、置換はアルキル基の任意の炭素に生じうることが理解される。
【００２５】
「アルケニル」は、炭素原子および水素原子だけからなり、少なくとも1つの二重結合を含み、炭素原子数2〜8であり、単結合または二重結合によって分子の残りに結合している直鎖状または分岐鎖状炭化水素鎖基、例えば、エテニル、プロパ-1-エニル(prop-1-enyl)、ブタ-1-エニル(but-1-enyl)、ペンタ-1-エニル(pent-1-enyl)、ペンタ-1,4-ジエニル等をいう。本明細書において特に具体的に記載されていない限り、アルケニル基は、選択的に、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、アルキルチオ、シクロアルキル、-N(R6)2、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)OR6、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)(式中、各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールである)によって置換されていてもよい。本明細書において特に具体的に記載されていない限り、置換されたアルケニル基を含有する、以下に規定する基については、置換はアルケニル基の任意の炭素に生じうることが理解される。
【００２６】
「アリール」はフェニルまたはナフチル基をいう。本明細書において特に具体的に記載されていない限り、「アリール」または(「アラルキル」などの)接頭辞「アラ(ar)」は、選択的に、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、アルキルチオ、シクロアルキル、-N(R6)2、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)OR6、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である) または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)(式中、各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールである)からなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されたアリール基を含むことを意味する。
【００２７】
「アラルキル」は、式-RaRbの基(式中、Raは上記に規定するアルキル基であり、Rbは上記に規定する1つ以上のアリール基である)、例えば、ベンジル、ジフェニルメチル等をいう。アリール基は、選択的に、上記のように置換されていてもよい。
【００２８】
「アラルケニル」は、式-RcRbの基(式中、Rcは上記に規定するアルケニル基であり、Rbは上記に規定する1つ以上のアリール基である)、例えば、3-フェニルプロパ-1-エニル等をいう。アリール基およびアルケニル基は、選択的に、上記に規定するように置換されていてもよい。
【００２９】
「アルキレン」および「アルキレン鎖」は、炭素および水素だけからなり、不飽和を含まず、炭素原子数1〜8の直鎖状または分岐鎖状2価炭化水素鎖、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、n-ブチレン等をいう。アルキレン鎖は、選択的に、アリール、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、アルキルチオ、シクロアルキル、-N(R6)2、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)OR6、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である) または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)(式中、各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールである)からなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよい。アルキレン鎖は、鎖内の任意の2つの炭素を介して分子の残りに結合されていてもよい。
【００３０】
「アルケニレン鎖」は、炭素および水素だけからなり、少なくとも1つの二重結合を含み、炭素原子数2〜8の直鎖状または分岐鎖状2価炭化水素鎖、例えば、エテニレン、プロパ-1-エニレン(prop-1-enylene)、ブタ-1-エニレン(but-1-enylene)、ペンタ-1-エニレン(pent-1-enylene)、ヘキサ-1,4-ジエニレン等をいう。アルケニレン鎖は、選択的に、アリール、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、アルキルチオ、シクロアルキル、-N(R6)2、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)OR6、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である) または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)(式中、各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールである)からなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されていてもよい。アルケニレン鎖は鎖内の任意の2つの炭素を介して分子の残りに結合されていてもよい。
【００３１】
「シクロアルキル」は、炭素原子および水素原子だけからなり、炭素原子数3〜10で、飽和されており、単結合によって分子の残りに結合されている安定な1価単環式または二環式炭化水素基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、デカリニル等をいう。本明細書において特に具体的に記載されていない限り、「シクロアルキル」は、選択的に、アルキル、アリール、アラルキル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、アルキルチオ、シクロアルキル、-N(R6)2、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、-N(R6)C(O)OR6、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である) または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)(式中、各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールである)からなる群より選択される1つ以上の置換基で置換されているシクロアルキル基を含むことを意味する。
【００３２】
「シクロアルキルアルキル」は、式-RaRd(式中、Raは上記に規定するアルキル基であり、Rdは上記に規定するシクロアルキル基である)の基をいう。アルキル基およびシクロアルキル基は、選択的に、上記に規定するように置換されていてもよい。
【００３３】
「ハロ」は、ブロモ、クロロ、フルオロまたはヨードをいう。
【００３４】
「ハロアルキル」は、上記に規定する1つ以上のハロ基によって置換されている、上記に規定するアルキル基、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、1-フルオロメチル-2-フルオロエチル、3-ブロモ-2-フルオロプロピル、1-ブロモメチル-2-ブロモメチル等をいう。
【００３５】
「ハロアルコキシ」は、式-ORc(式中、Rcは上記に規定するハロアルキル基である)の基、例えば、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリクロロメトキシ、2,2,2-トリフルオロエトキシ、1-フルオロメチル-2-フルオロエトキシ、3-ブロモ-2-フルオロプロポキシ、1-ブロモメチル-2-ブロモエトキシ等をいう。
【００３６】
「ヘテロシクリル」は、炭素原子および窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される1〜5のヘテロ原子からなる安定な3〜15員環基をいう。本発明の目的のためには、ヘテロシクリル基は、融合または架橋環系を含んでもよく、ヘテロシクリル基の窒素、炭素または硫黄原子は選択的に酸化されていてもよく、窒素原子は選択的に四級化されていてもよく、ヘテロシクリル基は芳香族であってもまたは部分的もしくは完全に飽和されていてもよい単環式、二環式または三環式環系であってもよい。ヘテロシクリル基は、分子の残りの任意のヘテロ原子に結合されていなくてもよい。このようなヘテロシクリル基の例には、アゼピニル、アクリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル(ベンゾチオフェニル)、ベンゾトリアゾリル、カルバゾリル、シンノリル、デカヒドロイソキノリル、ジオキソラニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、インドリジニル、イソキサゾリル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、2-オキソピペラジニル、2-オキソピペリジニル、2-オキソピロリジニル、2-オキソアゼピニル、オキソゾリル、オキサゾリジニル、オキシラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、4-ピペリドニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリジニル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、キヌクリジニル、イソキノリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、テトラヒドロフリル、トリアジニル、テトラヒドロピラニル、チエニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、およびチアモルホリニルスロホンが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において特に具体的に記載されていない限り、「ヘテロシクリル」という用語は、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R5-N=N-O-R7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-C(O)R6、-N(R6)C(O)O(R6)2、-OC(O)N(R6)2、N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である) 、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキル(式中、各R5、R6およびR7は、発明の開示に上記に規定するようである)からなる群より選択される1つ以上の置換基で選択的に置換されている上記に規定するヘテロシクリル基を含むことが意味される。
【００３７】
「ヘテロシクリルアルキル」は、式-RaRe(式中、Raは上記に規定するアルキル基であり、Reは上記に規定するヘテロシクリル基であり、ヘテロシクリルが含窒素ヘテロシクリルである場合には、ヘテロシクリルはアルキル基の窒素原子に結合されていてもよい)の基である。ヘテロシクリル基は、選択的に、上記に規定するように置換されていてもよい。
【００３８】
本明細書において使用する「市販品を購入可能である」化合物は、アクロス・オーガニクス(Acros Organics)(Pittsburgh、PA)、アルドリッチ・ケミカル(Aldrich Chemical)(Milwaukee、WI、シグマ・ケミカル(Sigma Chemical)およびフルカ(Fluka)を含む)、Apinケミカルズ社(Apin Chemicals Ltd.)(Milton Park、U.K.)、アボカド・リサーチ(Avocado Research)(Lancashire、U.K.)、BDH社(BDH Inc.)(Tronto、Canada)、バイオネット(Bionet)(Cornwall、U.K.)、ケムサービス社(Chemservice Inc.)(West Chester、PA)、クレセント・ケミカル社(Crescent Chemical Co.)(Hauppauge、NY)、 イーストン・オーガニック・コダック・ケミカルズ(Eastman Organic Chemicals)、イーストン・コダック社(Eastman Kodak Company)(Rochester、NY)、フィッシャー・サイエンティフィック社(Fisher Scientific Co.)(Pittsburgh、PA)、ファイソンズ・ケミカルズ(Fisons Chemicals)(Leicestershire、UK)、フロンティア・サイエンティフィック(Frontier Scientific)(Logan、UT)、ICNバイオメディカルズ社(ICN Biomedicals, Inc.)(Costa Mesa、 CA)、キー・オーガニクス(Key Organics)(Comwall、U.K.)、ランカスター・シンセシス(Lancaster Synthesis)(Windham、NH)、メイブリッジ・ケミカル社(Maybridge Chemical Co. Ltd.)(Cornwall、U.K.)、パリッシュ・ケミカル社(Parish Chemical Co.)(Orem、UT)、ファルツ&バウアー社(Pfaltz & Bauer, Inc.)(Waterbury、 CN)、ポリオーガニックス(Polyorganix)(Houston、TX)、ピアス・ケミカル社(Pierce Chemical Co.)(Rockford、IL)、リーデル・デ・ヘン社(Riedel de Haen AG)(Hannover、Germany)、スペクトラム・クオリティー・プロダクト社(Spectrum Quality Product, Inc.)(New Brunswick、NJ)、TCIアメリカ(TCI America)(Portland、OR)、トランス・ワールド・ケミカルズ社(Trans World Chemicals, Inc.)(Rockville、MD)、および和光純薬USA社(Wako Chemicals USA, Inc.)(Richmond、VA)を含む標準的な市販元から入手することができる。
【００３９】
本明細書において使用する合成段階を実施するための「好適な条件」は本明細書に明白に提供されるかまたは合成有機化学に使用する方法に関する文献を参照することによって識別することができる。本発明の化合物を製造するために有用な反応物質の合成を詳細に記載している上記の参照文献および専門書も、本発明による合成段階を実施するのに好適な条件を提供している。
【００４０】
本明細書において使用する「当業者に既知の方法」は、種々の参照文献およびデータベースによって同定することができる。本発明の化合物を製造する際に有用な反応物質の合成を詳細に記載するまたは製造を記載している文献に言及している好適な参照文献および専門書には、例えば、合成有機化学(Synthetic Organic Chemistry)」、JohnWiley & Sons,Inc.、New York、S. R. Sandlerら、「有機官能基製造(Organic Functional Group Preparations)」、第2版、Academic Press、New York、1983年、H. O. House、「最新合成反応(Modern Synthetic Reactions)」、第2版、W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park、Calif. 1972年、T. L. Gilchrist、「ヘテロ環状化学(Heterocyclic Chemistry)」、第2版、John Wiley & Sons、New York、1992年、J. March、「最新有機化学：反応、機序および構造(Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure)、第4版、Wiley-Interscience、New York、1992年が挙げられる。具体的で、類似の反応物質はまた、ほとんどの公共の図書館および大学の図書館において利用可能な米国化学協会(American Chemical Society)のケミカルアブストラクトサービス(Chemical Abstract Service)によって作製された既知の化学物質インデックスによっておよびオンラインデータベース(the American Chemical Society、 Washington、D. C.、詳細はwww.acs.orgにコンタクトすることができる)によって同定することができる。既知であるが、カタログで市販されていない化学物質は、特注化学合成企業によって製造することができ、標準的な化学供給企業の多く(例えば、上記に掲載するもの)は特注合成サービスを提供している。
【００４１】
「プロドラッグ」は、生理的条件下または加溶媒分解によって本発明の生物学的に活性な化合物に変換されうる化合物を示すことが意味される。従って、「プロドラッグ」という用語は、薬学的に許容される本発明の化合物の代謝的前駆体をいう。プロドラッグは、必要としている被験者に投与するときには不活性であってもよいが、インビボにおいて本発明の活性な化合物に変換される。プロドラッグは、典型的には、例えば、血中における加水分解によって迅速に変換されて本発明の親化合物を生ずる。プロドラッグ化合物は、哺乳動物生物内での溶解性、組織適合性または放出の遅延という利点を提供することが多い(Bundgard, H、「プロドラッグの設計(Design of Prodrugs)」(1985年)、7〜9ページ、21〜24ページ(Elsevier、Amsterdam)を参照されたい)。
【００４２】
プロドラッグに関する考察は、共に全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている、Higuchi, T.ら、「新規送達システムとしてのプロドラッグ(Pro-drugs as Novel Delivery Systems)、A. C. S. シンポジウムシリーズ、14巻および薬剤設計における生物可逆的担体(Bioreversible Carriers in Drug Design)、American Pharmaceutical Association and Pergamon Press、1987年に提供されている。
【００４３】
「プロドラッグ」という用語ははまた、哺乳動物被験者にこのようなプロドラッグを投与するとき、インビボにおいて本発明の活性な化合物を放出する共有結合されている任意の担体を含むことも意味している。本発明の化合物のプロドラッグは、修飾が通常の操作またはインビボにおいて本発明の親化合物に切断されるような方法で、本発明の化合物に存在する官能基を修飾することによって製造することができる。プロドラッグは、本発明の化合物のプロドラッグを哺乳動物被験者に投与するとき、切断してそれぞれ、遊離のヒドロキシ基、遊離のアミノ基または遊離のメルカプト基を形成する任意の基にヒドロキシ基、アミノ基またはメルカプト基が結合されている本発明の化合物を含む。プロドラッグの例には、本発明の化合物のアルコールおよびアミン官能基のアセテート、ホルメートおよびベンゾエート誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
「安定な化合物」および「安定な構造」は、反応混合物から有用な精製程度まで単離する段階および有効な治療薬への製剤化する段階中に分解されない程度に頑強である化合物を示すことが意味される。
【００４５】
「哺乳動物」には、ヒトおよびネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ等などの家畜が挙げられる。
【００４６】
「選択的な」または「選択的に」とは、その後に説明される状況の事象は生じても、生じなくてもよいことおよびその説明は事象または状況が生じる例および生じない例を含むことを意味する。例えば、「選択的に置換されているアリール」とは、アリール基が置換されていてもよいことおよびその説明は、置換されているアリール基および置換のないアリール基の両方を含むことを意味する。
【００４７】
「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」には、米国食品医薬品局によってヒトまたは家畜に使用することが許容可能であると承認されている任意の補助剤、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料/着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、等張剤、溶媒または乳化剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
「薬学的に許容される塩」は酸添加塩および塩基添加塩の両方を含む。
【００４９】
「薬学的に許容される酸添加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持しており、生物学的またはそれ以外にも望ましくない影響は示さず、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、および酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等の有機酸を用いて形成されるような塩をいう。
【００５０】
「薬学的に許容される塩基添加塩」とは、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持しており、生物学的またはそれ以外にも望ましくない影響は示さないような塩をいう。このような塩は、遊離酸に無機塩基または有機塩基を添加することによって製造される。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩等が挙げられるが、これらに限定されない。有機塩基から誘導される塩には、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2-ジメチルアミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン(hydrabamine)、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N-エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等などの、一級、二級、および三級アミン、天然型置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、並びに塩基イオン交換樹脂の塩が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい有機塩基はイソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。
【００５１】
「PTPN12」は、非受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ12のヒトゲノム国際機構(Human Genome Organization(HUGO))命名規約委員会(Nomenclature Committee)の名称をいう。PTPN12はPTP-PESTおよびPTPG1としても既知である。コード配列はGenBankでアクセスでき、M93425、Yangら、(1993) J. Biol. Chem. 268(9), 6622-6628によって開示されている。
【００５２】
「PTPN2」は、非受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ2のヒトゲノム国際機構(Human Genome Organization(HUGO))命名規約委員会(Nomenclature Committee)の名称をいう。PTPN2はTC-PTPおよびT細胞-PTPとしても既知である。PTPN2のコード配列はGenBankでアクセスでき、M25393、Coolら、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (14), 5257-5261に記載されている。
【００５３】
「PTP1」は、非受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ1のヒトゲノム国際機構(Human Genome Organization(HUGO))命名規約委員会(Nomenclature Committee)の名称をいう。PTPN1はまたPTP1Bとしても既知である。
【００５４】
PRKD2は、ヒトセリンスレオニンタンパク質キナーゼである、タンパク質キナーゼD2のヒトゲノム国際機構(Human Genome Organization(HUGO))命名規約委員会(Nomenclature Committee)の名称をいう。PRKD2はまたPKD2またはHSPC187としても既知である。遺伝子配列はGenBank(アクセッション番号NM_016457)でアクセスでき、Sturanyら、 J. Biol. Chem. (2001)、276巻、3310〜3318ページに概説されている。
【００５５】
GSK3βは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3βのヒトゲノム国際機構(Human Genome Organization(HUGO))命名規約委員会(Nomenclature Committee)の名称をいう。グリコーゲン-シンターゼキナーゼβは、最初は、StambolicおよびWoodgett(Biochem. J. (1994)、303巻、701〜704ページ)によって肝臓癌細胞系統Hep G2 cDNAライブラリーからクローニングされた。
【００５６】
「インスリン抵抗性」には、糖尿病、高血糖、およびインスリン受容体(IR)の遺伝子に関連する他の障害が挙げられる。
【００５７】
「治療的に有効な量」とは、哺乳動物、好ましくはヒトに投与するとき、哺乳動物の癌、炎症、神経疾患、または腎疾患の以下に規定する治療を実施するのに十分である式(I)の化合物のその量をいう。「治療的に有効な量」を構成する式(I)の化合物の量は、化合物、状態およびその重症度、治療対象の哺乳動物の年齢に応じて変化するが、当業者の知識および本明細書の開示を考慮して当業者が通常決定することができる。
【００５８】
本明細書において使用する「治療する」または「治療」とは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて本明細書に開示する過剰増殖性疾患の治療を含み、
(i)哺乳動物が癌、炎症、糖尿病、神経系疾患または腎疾患状態に罹患しやすい素因があるが、その状態を有するとまだ診断されていない場合に、このような哺乳動物においてその状態が発生しないように予防すること、
(ii) 癌、炎症、糖尿病、神経系疾患または腎疾患を阻止する、すなわち、その発症を停止すること、または
(iii) 癌、炎症、糖尿病、神経系疾患または腎疾患を軽減する、すなわち、その状態の寛解をもたらすこと
が挙げられる。
【００５９】
式(I)の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩は1つ以上の非対称中心を含有してもよく、従って、全体的な立体化学に関して、アミノ酸の(R)-もしくは(S)-または(D)-もしくは(L)-として規定することができるエナンチオマー、ジアステレオマーおよび他の立体異性体を生じてもよい。本発明はこのような可能な全ての異性体並びにそれらのラセミ体および光学的に純粋な形態を含むことを意味する。光学的に活性な(+)および(-)、(R)-および(S)-、または(D)-および(L)-異性体はキラル出発材料またはキラル試薬を使用して製造してもまたは逆相HPLCなどの従来の技法を使用して分割してもよい。本明細書に記載する化合物がオレフィン系二重結合または他の幾何学的な非対称中心を含有する場合および特に明記しない限り、本発明の化合物はEおよびZ幾何学的異性体を含むことが意図されている。同様に、全ての互変異性体も含まれることが意図されている。
【００６０】
式(I)の化合物について本明細書において使用する命名は、I.U.P.A.C.命名法の改良型であり、本発明の化合物は本チアゾリジンジチオン部分の誘導体として明細書において命名される。
【００６１】
使用方法
本発明は、過剰増殖状態を治療する際において本発明の概要に前述した式(I)の化合物および式(I)の化合物を含有する薬学的組成物を使用する方法に関する。従って、本明細書に開示する方法は、このような治療を必要としている被験者に投与するとき、過剰増殖および組織再構築または修復に関連する障害および生理学的状態を治療する際に有用である。タンパク質リン酸化状態の細胞調節、すなわち、リン酸化修飾酵素、例えば、タンパク質チロシンキナーゼおよびタンパク質チロシンホスファターゼの活性の変更に関連する過剰増殖性障害が特に興味深い。
【００６２】
本発明の一局面において、本発明の化合物および薬学的組成物は、PTPN12、PTPN2、PTPN1、PRKD2、および/またはGSK3βの活性を阻害する。これらの酵素は、細胞タンパク質のリン酸化状態の変更に関連するとされている。
【００６３】
本発明の化合物および薬学的組成物は、細胞分割を妨害することによって腫瘍の増殖を阻止するために並びに細胞接着および細胞遊走を抑制することによって炎症を低下するために、癌または病理学的炎症を有する被験者に投与される。また、本発明の方法は、タンパク尿に関連する糸球体疾患において有足細胞の正常な足突起構造の修復に関連して使用することができる(Reiser, J.ら、Rapid Communication, Kidney Int. (2000), 57巻、5号、2035〜2042)。
【００６４】
本発明の化合物および薬学的組成物は、PTPN2またはPTPN1による影響を受けるインスリン受容体媒介性の過程を遮断するために、糖尿病患者に投与される(Galic, S.、Klinger-hofmann, M.、Fodero-Tavoletti, MTら、Mol Cell Biol (2003), 23巻、6号、2096〜2108ページ；Elchbly, M.、Payette, P.、Michaliszyn, E.ら、Science (1999) 283巻、5407号、1544〜8ページ)。
【００６５】
本発明の方法は予防的に(すなわち、関心対象の障害が発生するのを予防するために)または治療的に(すなわち、障害を阻止または軽減するために)使用することができる。本明細書において使用する「治療する」という用語は、疾患の予防および既存の状態の治療の両方をいうために使用される。症状の治療は、例えば、腫瘍再増殖を予防するために、転移性増殖を予防するために、循環器系手術に関連する再狭窄を軽減するために、炎症および関連する組織損傷に至る細胞遊走を予防または低下するために、明白な疾患が発症する前に本発明の化合物および薬学的組成物を投与することによって達成される。または、本発明の化合物および薬学的組成物は、患者の臨床症状を安定させることによってまたは改善することによって進行中の疾患を治療するために必要としている被験者に投与することができる。
【００６６】
被験者または患者は、任意の哺乳動物種のもの、例えば、霊長類、特にヒト、マウス、ラットおよびハムスターを含むげっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ等であってもよい。動物モデルは実験検討のために興味深く、ヒト疾患を治療するためのモデルとなる。
【００６７】
過剰増殖性障害は、一般的な集団の同じ種類の細胞および/または早期段階の患者から得られる同じ種類の細胞に生じるものと比較して過剰な細胞増殖をいう。この用語は悪性および非悪性細胞増殖を示す。このような障害は1つ以上のサブセットの細胞が過剰な細胞増殖を示し、形態学的だけでなく遺伝子型的にも周囲の組織と異なることが多いと思われる。過剰な細胞増殖は、一般集団を参照することによっておよび/または例えば、特定の患者を患者の生涯の早期時点において参照することによって判定することができる。過剰増殖細胞障害は異なる種類の動物およびヒトにおいて生じ、罹患細胞に応じて異なる身体的発現を生じうる。
【００６８】
過剰増殖細胞障害には、癌、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、ステント内狭窄、血管移植片再狭窄等などの血管増殖障害、線維性障害、乾癬、炎症性障害、例えば、関節炎等、糸球体腎炎、子宮内膜症、黄斑変性性障害、前立腺肥大および脂肪腫などの良性増殖性障害および自己免疫性障害が挙げられる。特に関心対象の癌には、癌腫、例えば、結腸癌、前立腺癌、乳癌、黒色腫、乳管癌、子宮体癌、胃癌、異形成口腔粘膜癌、浸潤性口腔癌、非小細胞肺癌、移行性および扁平上皮性の膀胱癌等、神経系の悪性腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、神経膠腫等、血液系の悪性腫瘍、例えば、小児急性白血病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、悪性皮膚T細胞、菌状息肉腫、非MF皮膚T細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、多T細胞皮膚リンパ組織過形成、類天疱瘡、円板状エリテマトーデス、扁平苔癬等、肉腫、黒色腫、腺腫、乳頭腫などの良性病変等が挙げられる。
【００６９】
リン酸化修飾酵素の活性の変更に関連しうる他の過剰増殖性障害には、平滑筋細胞および/または炎症細胞が血管の内膜層内に増殖および/または遊走してその血管の血流を制限する種々の状態、すなわち、新生内膜閉塞病変が挙げられる。関心対象の閉塞性血管状態には、アテローム性動脈硬化症、移植後の移植片冠動脈血管疾患、静脈移植片再狭窄、人工血管吻合部周辺狭窄、血管形成またはステント留置後再狭窄等が挙げられる。
【００７０】
生殖組織の過剰増殖および/または組織再構築または修復が見られる障害および状態、例えば、子宮癌、精巣癌および卵巣癌、子宮内膜症、子宮頚部の扁平および腺上皮癌等は、本発明の化合物および薬学的組成物を投与することによって細胞数が低下する。関心対象の他の障害および状態は、表皮過剰増殖、組織再構築および修復に関連する。例えば、乾癬の慢性皮膚炎症は肥厚性表皮ケラチノサイトに関連する。
【００７１】
関心対象の他の障害には、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、強皮症、全身エリテマトーデス、シェーグレン症候群、アトピー性皮膚炎、喘息およびアレルギーを含むが、これらに限定されない炎症性障害および自己免疫状態が挙げられる。治療に感受性を示す標的細胞には、自己免疫反応の誘発に関与する細胞および自己免疫発作または炎症事象の影響を受けている細胞またはそれに応答する細胞が挙げられ、リンパ球および線維芽細胞が挙げられる。
【００７２】
本発明による治療に対する特定の細胞の感受性はインビトロ試験によって判定することができる。典型的には、作用剤が細胞死を誘導するまたは遊走を阻止できる程度に十分な時間にわたって、通常約1時間〜1週間細胞培養物を種々の濃度の本発明の化合物と合わせる。インビトロ試験は、生検試料の細胞培養物を使用することができる。
【００７３】
用量は投与様式、具体的な障害、患者の状態等に応じて変わる。典型的には、治療量は、標的組織の望ましくない細胞集団を実質的に低下するが、患者の生存度を維持するのに十分である。治療は、一般に、疾患の臨床発現が実質的に低下する、例えば、少なくとも約50%低下するまで継続され、関連組織において望ましくない細胞の活動が本質的に検出されなくなるまで継続することができる。
【００７４】
式(I)の化合物はタンパク質チロシンホスファターゼ、例えば、PTPN12およびPTPN2によって媒介されるシグナル伝達経路の特異的な阻害並びに他の調節化合物のためのハイスループットスクリーニングにおける「陽性対照」としての使用も見出すことができる。特に、本発明は、癌、糖尿病またはPTPN12、PTPN2、PRKD2、および/またはGSK3β活性に関連する炎症を治療する際に式(I)の化合物およびこのような化合物を含有する薬学的組成物を使用する方法に関する。
【００７５】
PTPN12はC末端にプロリンリッチモチーフを有し、SH3ドメインを有する接着斑関連タンパク質である、p130casに結合する。正常な細胞では、p130casは、fakおよびsrcキナーゼのインテグリン依存的活性化により高度にリン酸化されている。このリン酸化は、特に、アクチンフィラメントを再構築する一連のチロシン依存的シグナル伝達を可能にすると思われる。細胞の細胞骨格、移動および変形におけるインテグリンシグナル伝達の重要性のために、p130casに対するPTPN12の作用は哺乳動物の発生およびいくつかの生理病態学的事象において劇的な結果をもたらしうる。細胞の遊走過程は哺乳動物の胚の適切な発生に重大である。成体の生物では、細胞遊走は線維芽細胞および内皮細胞による創傷領域の浸潤並びにリンパ球および好中球の炎症部位への転移のような事象において重要な役割を果たす。癌では、腫瘍細胞も、循環系に達し、生物全体に分散するためには遊走する必要がある。Takekawa, M.ら、FEBS Lett. (1994), 339巻、222〜228ページは、癌細胞におけるPTPN12の異常な転写物を開示している。線維芽細胞の運動性に対するPTPN12レベルの影響はGartonら、(1999) J. Biol. Chem. 274(6): 3811〜3818に記載されている。Davidsonら(2001) EMBO. J. 20(13): 3414〜26はPTPN12と炎症の関連を考察している。腎臓におけるPTPN12と有足細胞調節の関係はReiser, Jら、Rapid Communication, Kidney Int. (2000年), 57巻、5号、2035〜2042に記載されている。
【００７６】
PTPN12は、細胞外シグナルおよび細胞周期チェックポイントに対する応答としてこのような重要な細胞の活動のシグナル伝達経路に関与する。PTPN12の阻害は、種々の病理学的または臨床状態に関連する、これらのシグナル伝達経路に介入する手段(例えば、細胞外シグナルの影響を遮断することによって)を提供する。PTPN12は細胞接着、細胞分割および細胞遊走に関連し、従って癌および炎症に関与する。
【００７７】
特に関心対象の別のPTPはPTPN2である。PTPN2はT細胞タンパク質チロシンホスファターゼ(TC-PTP)としても既知であり、Coolら、Proc. Natl. Acad. Sci. (1989年)、86巻、5257〜5261ページによって最初に同定された。PTPN2は、別のスプライシングによって形成される2つの形態：TC48(PTP-S4)と呼ばれる48kDaの小胞体(ER)結合型およびTC45(PTP-S2)と呼ばれる45-kDaの核型として存在する。PTPN2は造血および免疫機能の両方において重要な役割を果たす。PTPN2 -/-マウスは、骨髄(BM)、B細胞リンパ球新生(lymphopoeisis)および赤血球新生の特異的な欠損並びにT細胞およびB細胞機能の障害を示して、3〜5週齢に死亡することをYou-Tenら、J. Exp. Med. (1997年)、186巻、5号、683〜693は見出した。B. M.移植実験は、ホモ接合体の造血不全は幹細胞欠損によるのではなく、間質細胞欠損によることを証明した。
【００７８】
PTPN2は癌の進行および転移に何らかの作用を果たしうる。Mitra, S. K.らExp. Cell Res. 15(2001年)、270巻、1号、32〜44ページは、優性阻害型突然変異型PTPN2による足場非依存性細胞増殖、接着およびサイクリンD1遺伝子発現の阻害を証明した。PyF細胞における突然変異型PTPN2の発現は軟寒天における足場非依存性増殖を強力に阻害するが、液体培養における増殖に大きな影響を与えなかった。ヌードマウスにおける腫瘍形成も突然変異型PTPN2の存在によって低下した。
【００７９】
PTPN2はアポトーシスに何らかの作用を果たし、癌治療のためまたは癌治療カクテルの一成分として有用な標的となる。PTPN2の過剰発現は、アポトーシスに典型的な核分断化を誘導することをZsigmond, E.ら、FEBS Lett. (1999年)、453巻、3号、308〜312ページは見出した。また、PTPN2は、NF-κB経路を介して細胞周期の早期G1期に進行する際に活性となると思われる(Ibarra-Sanches, M. J.ら、Oncogene (2001年)、20巻、34号、4728〜39ページ)。PTPN2の阻害は、炎症、癌の進行および転移などのPTPN2活性に関連する状態を治療する際に有用である。
【００８０】
PTPN2アイソフォームTC45およびTC48はインスリン受容体シグナル伝達に関連しても検討されており、結果は、インスリン受容体はPTPN2の基質として作用することができることおよびPTPN2とIRの相互作用によりインビボにおいてインスリン誘導性シグナル伝達を下方制御することができることを示唆している(Galic, S.、Klingler-hofmann, M.、Fodero-Tavoletti, MTら、Mol Cell Biol (2003年)、23巻、6号、2096〜2108ページ)。
【００８１】
PTPN1活性はインスリン抵抗性および糖尿病、高血糖並びにインスリン受容体(IR)シグナル伝達に関連する他の障害に関連する(Elchebly, M、Payette, P.、MIchalyszyn, E.ら、Science (1999年)、283巻、5407号、1544〜8ページ)。PTPN1の低下は、例えば、インスリン依存性代謝シグナル伝達を増加し、インスリン感受性を改善するのに十分である(Gum, R. J.、Gaede, L. L.、Koterski, S. L.ら、Diabetes (2003) 52(1): 21-8)。PTPN1は過剰発現すると、インスリン抵抗性に何らかの役割を果たす(Ahmad, F.ら、(1997) J. Clin. Invest. 100: 449〜458)。
【００８２】
特に関心対象の別のタンパク質チロシンキナーゼは、PRKD2としても既知のタンパク質キナーゼD2である。PRKD2はヒトセリンスレオニンタンパク質キナーゼ遺伝子である(GenBankアクセッション番号NM_016457、Sturanyら、 J. Biol. Chem. (2001年)、276巻、3310〜3318ページ)。タンパク質配列はN末端に2つのシステインリッチモチーフ、プレクストリン相同ドメインおよびセリンタンパク質キナーゼの特徴的な配列モチーフ全てを含有する触媒ドメインを含有する。それは、特に2本鎖ジンクフィンガー様システインリッチモチーフ、プレクストリン相同ドメインおよびタンパク質キナーゼドメインにおいてセリンスレオニンタンパク質キナーゼPKD/PKCμおよびPKCに最も強い相同性を示す。PRKD2のmRNAはヒトおよびマウス組織において広範に発現される。腫瘍のmRNAから調製したプローブのドットブロット分析は、PRKD2の発現がヒト腫瘍の臨床試料において常に上方制御されていることを示した。数多くの腫瘍の種類の遺伝子発現のかなりの増加は他の研究者によって観察されている(Suら、Cancer Research (2001年)、61巻、7388〜7393ページ)。PRKD2阻害剤はある種の癌を治療する際に有効である。
【００８３】
本発明に関連して関心対象の3番目のPTKは、リン酸化作用および不活性化作用のあるグリコーゲンシンターゼとして最初に同定されたプロリン特異的セリン-スレオニンキナーゼであるグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3)である。2つのアイソフォーム、α(GSK3A、606784)およびβは高い程度のアミノ酸相同性を示す(Stambolic, V.ら、「セリン9リン酸化を介する無傷細胞におけるグリコーゲンシンターゼキナーゼ3βのマイトジェン不活性化(Mitogen inactivation of glycogen synthase kinase-3 beta in intact cells via serine 9 phosphorylation)」、Biochem. J. (1994年)、303巻、701〜704ページ)。GSK3βはエネルギー代謝、神経細胞発生および生体パターン形成に関与する(Plyte, S. E.ら、「グリコーゲンシンターゼキナーゼ3：腫瘍形成および発生における機能(Glycogen synthase kinase-3: functions in oncogenesis and development)」、Biochim. Biophys. Acta (1992年)、1114巻、147〜162ページ)。
【００８４】
Lucasらは、成獣期の脳のGSK3βを過剰発現するマウスを作出した(Lucas, J. J.ら、「GSK-3-β条件付き遺伝子導入マウスにおける核βカテニンの低下、tau高リン酸化および神経変性(Decreased nuclear beta-catenin, tau hyperphosphorylation and neurodegeneration in GSK-3-beta conditional transgenic mice)」、EMBO J. (2001年)、20巻、27〜39ページ)。これらのマウスは海馬神経における核β-カテニン(116806)のレベルの低下およびtau(157140)の高リン酸を示し、後者はtauのプレタングル様細胞体樹状突起局在化を生じた。反応性星状細胞増加症および小膠細胞症も神経ストレスおよび細胞死を示し、TUNELアッセイ法によって確認された。Lucasらは、GSK3βのインビボにおける過剰発現が神経変性をもたらすと結論づけており、これらのマウスは、GSK3βの調節欠如とアルツハーマー病の病因との関連性を検討する動物モデルとして使用することができることを示唆した。
【００８５】
本発明の一態様において、過剰増殖障害を治療する際の式(I)の化合物およびこのような化合物を含有する薬学的組成物を使用する方法を提供する。従って、本明細書に開示されている方法は、このような治療を必要としている被験者に投与するとき、過剰増殖および組織再構築または修復に関連する障害および生理学的状態を治療する際に有用である。本発明の化合物および薬学的組成物は、細胞分割を妨害することによって腫瘍の増殖を阻止するために並びに細胞接着および細胞遊走を阻害することによって炎症を低下するために、癌または病理学的炎症を有する被験者に投与される。また、本発明の方法は、タンパク質尿に関連する糸球体疾患において有足細胞の正常な足突起構造の修復 (Reiser, J.ら、Rapid Communication, Kidney Int. (2000年)、57巻、5号、2035〜2042ページ) または糖尿病の症状の軽減(Galic, S.、Klingler-hofmann, M.、Fodero-Tavoletti, MTら、Mol Cell Biol (2003年)、23巻、6号、2096〜2108ページ；Elchebly, M.、Payette, P.、Michaliszyn, E.ら、Science(1999年)、283巻、5407号、1544〜8ページ)に関連して使用することができる。
【００８６】
式(I)の化合物は、酵素に作用する阻害剤の生化学的酵素親和性を使用してホスファターゼを単離および/または精製するための親和性試薬としての使用も見出すことができる。化合物は基質またはゲルに結合される。次いで、結合後の支持体を使用して、選択的に部分的に精製されていてもよい試料混合物、例えば、細胞溶解液から、化合物に結合する酵素を分離する。非特異的結合を最小にする条件下において、試料混合物を化合物が結合している支持体に接触させる。当技術分野において既知の方法には、カラム、ゲル、キャピラリー等が挙げられる。未結合のタンパク質は樹脂から遊離して洗浄され、次いで、結合しているタンパク質が好適な緩衝液中に溶出される。
【００８７】
式(I)の化合物はまた、シグナル伝達または本願に掲載されている臨床障害のいずれかを検討するための試薬およびハイスループットスクリーニングにおける陽性対照として使用するための試薬としても有用となりうる。
【００８８】
本発明の化合物および薬学的組成物の投与
純粋な形態または適当な薬学的組成物の形態の本発明の化合物または薬学的に許容される塩の投与は、同様の有用性を供給する薬剤の許容されている投与様式のいずれかにより実施することができる。本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物を薬学的に許容される適当な担体、希釈剤または賦形剤とあわせることによって調製することができ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、座剤、注射剤、吸入剤、ゲル、マイクロスフェアおよびエアゾールなどの固体、半固体、液体または気体の形態の製剤に製剤化することができる。このような薬学的組成物を投与する典型的な経路には、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、直腸、膣および鼻腔内が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用する非経口という用語は皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技法を含む。本発明の薬学的組成物は、患者に化合物を投与した結果、含有されている作用成分が生物学的に利用可能となりうるように製剤化される。被験者または患者に投与される組成物は1つ以上の投与単位の形態をとり、例えば、錠剤は単回投与単位であり、エアゾール形態の本発明の化合物の容器は、複数の投与単位を保持することができる。このような剤形を調製する実際の方法は既知であるかまたは当業者に明らかであり、例えば、「Remingtonの薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」、第18版(Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania、1990年)を参照されたい。投与される組成物は、任意の事象において、本発明の教示内容により過剰増殖および組織再構築または修復に関連する障害または状態を治療するために、本発明の化合物または薬学的に許容される塩の治療的に有効な量を含有する。
【００８９】
本発明の薬学的組成物は固体または液体の形態であってもよい。一局面において、担体は、本発明の組成物が、例えば、錠剤または粉末の形態であるように粒状である。担体は液体であってもよく、組成物は、例えば、経口シロップ、注射用液体または例えば、吸入投与に有用なエアゾールである。
【００９０】
経口投与が意図されている場合には、薬学的組成物は、好ましくは、固体または液体の形態であり、半固体、半液体、懸濁液およびゲル形態は、固体または液体として本明細書において考慮されている形態に含まれる。
【００９１】
経口投与のための固体組成物として、薬学的組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠、ピル、カプセル、チューイングガム、ウェハー等の形態に製剤化することができる。このような固体組成物は、典型的には、1種以上の不活性希釈剤または食用担体を含有する。また、以下の1種以上が含有されてもよい：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤、デンプン、ラクトースまたはデキストリンなどの賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Primogel(商標)、トウモロコシデンプン等などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはSterotex(商標)などの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーなどの矯味矯臭剤および着色剤。
【００９２】
本発明の薬学的組成物がカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態である場合には、本発明の薬学的組成物は、上記の種類の物質以外に、ポリエチレングリコールまたは脂肪酸などの液体担体を含有してもよい。
【００９３】
本発明の薬学的組成物は、液体、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは懸濁液の形態であってもよい。液体は、2つの例として経口投与用または注射による送達用であってもよい。経口投与が意図されている場合には、好ましい組成物は、本発明の化合物以外に、甘味剤、保存剤、染料/着色剤および風味増強剤の1種以上を含有する。注射によって投与することが意図されている組成物では、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤および等張剤の1種以上を含んでもよい。
【００９４】
本発明の液体の薬学的組成物は、溶液、懸濁液または他の同様の形態であるかどうかにかかわらず、以下の補助剤の1種以上を含んでもよい：注射用の水などの滅菌希釈液、食塩液、好ましくは生理食塩液、リンガー液、等張塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体として作用することができる合成モノまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒などの不揮発性油、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調節する薬剤。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与バイアルに封入されてもよい。生理食塩液は好ましい補助剤である。注射用薬学的組成物は、好ましくは滅菌されている。
【００９５】
非経口または経口投与が意図されている本発明の液体薬学的組成物は、好適な用量が得られるような量の本発明の化合物を含有しなければならない。典型的には、この量は組成物中に少なくとも0.01%の本発明の化合物である。経口投与が意図されている場合には、この量は、組成物の重量の0.1〜約70%と変化してもよい。好ましい経口薬学的組成物は、本発明の化合物を約4%〜約50%含有する。本発明による好ましい薬学的組成物および製剤は、非経口投与単位が本発明の化合物を0.01〜1重量%含有するように調製される。
【００９６】
本発明の薬学的組成物は局所投与が意図されてもよく、この場合には、担体は、好適には、溶液、エマルジョン、軟膏またはゲル基剤を含んでもよい。基剤は、例えば、以下の1種以上を含んでもよい：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜂蝋、鉱物油、水およびアルコールなどの希釈剤並びに乳化剤および安定剤。増粘剤が局所投与用の薬学的組成物に含有されてもよい。経皮投与が意図されている場合には、本発明の組成物は経皮パッチまたはイオントフォレーシス装置を含んでもよい。局所製剤は、約0.1〜約10%w/v(単位容量あたりの重量)の濃度の本発明の化合物を含有してもよい。
【００９７】
本発明の薬学的組成物は、直腸で融解して薬物を放出する、例えば、座剤の形態で直腸投与が意図されてもよい。直腸投与用の組成物は、好適な刺激性のない賦形剤として油性基剤を含有してもよい。このような基剤には、ラノリン、カカオ脂およびポリエチレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明の薬学的組成物は、固体または液体の投与単位の物理的形態を変更する種々の物質を含んでもよい。例えば、本発明の組成物は、作用成分の周囲にコーティングシェルを形成する物質を含んでもよい。コーティングシェルを形成する物質は典型的には不活性であり、例えば、糖、シェラックおよび他の腸溶コーティング剤から選択することができる。または、作用成分はゼラチンカプセルに封入されてもよい。
【００９９】
固体または液体形態の本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物に結合し、化合物を送達する際に助けとなる物質を含んでもよい。この能力において作用を発揮することができる好適な物質には、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、タンパク質またはリポソームが挙げられる。
【０１００】
本発明の薬学的組成物は、エアゾールとして投与することができる投与単位からなってもよい。エアゾールという用語は、コロイド性のものから加圧パッケージからなるシステムまでの種々のシステムを示すために使用される。送達は、液化もしくは加圧した気体または作用成分を分注する好適なポンプシステムによってもよい。本発明の化合物のエアゾールは、作用成分を送達するために、単相、二相または三相系で送達されてもよい。エアゾールの送達は必要な容器、アクチベーター、弁、サブ容器等を含み、一体としてキットを形成してもよい。当業者は、必要以上の実験を行うことなく、好ましいエアゾールを決定することができる。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物は、固体、液体または気体の形態にかかわらず、哺乳動物の癌または炎症、特に過剰増殖および組織再構築または修復に関連する癌または炎症を治療する際に使用される1つ以上の既知の薬剤を含有することができる。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物は、薬学分野において既知の方法によって調製することができる。例えば、注射によって投与することが意図されている薬学的組成物は、溶液を形成するために本発明の化合物を水と合わせることによって調製することができる。均一な溶液または懸濁液の形成を容易にするために界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤は、水性送達系への化合物の溶解または均一な懸濁化を容易にするために、本発明の化合物と非共有結合的に相互作用する化合物である。
【０１０３】
本発明の化合物または薬学的に許容される塩は、使用する具体的な化合物の作用、化合物の代謝的安定性および作用時間、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食餌、投与様式および時間、排泄速度、薬物の併用、特定の障害または状態の重症度並びに治療を受けている被験者を含む種々の因子に応じて変化する治療的に有効な量が投与される。一般に、治療的に有効な1日量は、1日あたり約0.1 mg〜約20 mg/体重1 kgの本発明の化合物または薬学的に許容される塩であり、好ましくは1日あたり約0.1 mg〜約10 mg/体重1 kgであり、最も好ましくは1日あたり約0.1 mg〜約7.5 mg/体重1 kgである。
【０１０４】
発明の好ましい態様
発明の開示に前述した種々の方法のうち、好ましい方法は、式(I)の化合物が式(Ia)
2005535593.tif 000007
(式中、
pは0〜3であり、
R1は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ハロアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、-R5-O-R6、-R5-N(R6)2、-R5-C(O)OR6、-R5-C(O)N(R6)2、-R5-N=N-OR7、または-R5-N(R6)C(O)OR7であり、
R2は、水素、アルキル、アラルキル、アリール、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロシクリルアルキルであり、
R3は-O-または-S-であり、
各R4は、独立に、アルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ニトロ、シアノ、-R8-N=N-OR7、-OR6、-C(O)OR6、-C(O)N(R6)2、-N(R6)2、-N(R6)C(O)R6、-N(R6)C(O)OR7、-S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、-S(O)tN(R6)2(式中、tは0〜2である)、-C(O)R6、-N(R6)C(O)N(R6)2、-OC(O)N(R6)2、または-N(R6)S(O)tR6(式中、tは0〜2である)、ヘテロシクリルおよびヘテロシクリルアルキルからなる群より選択され、
各R5は、独立に、選択的に置換された直鎖状または分岐鎖状アルキレンまたはアルケニレン鎖であり、
各R6は、独立に、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アラルキルまたはアリールであり、
各R7は、独立に、水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R8は、直接結合または選択的に置換された直鎖状もしくは分岐鎖状アルキレンもしくはアルケニレン鎖である)
の化合物である方法である。
【０１０５】
これらの好ましい方法のうち、好ましい方法のグループは、哺乳動物がヒトである哺乳動物の癌、糖尿病または炎症を治療するための方法のグループである。この好ましいグループのうち、好ましい方法のサブグループは、癌または炎症が過剰増殖または組織再構築または修復に関連するサブグループである。この好ましいサブグループのうち、好ましい方法のクラスは、癌または炎症が、PTPN12、PTPN2、PRKD2、およびGSK3βからなる群より選択される酵素の活性に関連するクラスである。
【０１０６】
上記の方法のこの好ましいグループ、サブグループおよびクラスのうち、好ましい方法のサブクラスは、式(Ia)の化合物が式(Ia)
(式中、
pが1であり、
R1が水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R2が水素またはアルキルであり、
R3が-O-または-S-であり、
R4がハロ、ハロアルキルまたはハロアルコキシである)
の化合物であるサブクラスである。
【０１０７】
上記の本発明の好ましい方法のうち、別の好ましい方法のグループは、哺乳動物細胞をインビトロにおいて治療する、哺乳動物の細胞を式(I)の化合物で治療する方法のグループである。これらの好ましい方法の別の好ましいグループは、哺乳動物の細胞をインビボにおいて治療する、哺乳動物細胞を式(Ia)の化合物で治療する方法のグループである。これらの好ましい方法の別の好ましいグループは、PTPN12、PTPN2、PRKD2、および/またはGSK3βの活性の阻害により細胞接着が低下する、哺乳動物の細胞を式(Ia)の化合物で治療する方法のグループである。これらの好ましい方法のこれらの別の好ましいグループは、PTPN12、PTPN2、PRKD2、および/またはGSK3βの活性の阻害により細胞分割が低下する、哺乳動物の細胞を式(Ia)の化合物で治療する方法のグループである。これらの好ましい方法のこれらの別の好ましいグループは、PTPN12、PTPN2、PRKD2、および/またはGSK3βの活性の阻害により細胞の遊走が低下する、哺乳動物の細胞を式(Ia)の化合物で治療する方法のグループである。これらの好ましい方法のこれらの別の好ましいグループは、PTPN12、PTPN2、PRKD2、および/またはGSK3βの活性の阻害により腫瘍の増殖が制御される、哺乳動物の細胞を式(Ia)の化合物で治療する方法のグループである。これらの好ましい方法のこれらの別の好ましいグループは、PTPN12、PTPN2、PRKD2、および/またはGSK3βの活性の阻害によりリンパ球活性化が制御される、哺乳動物の細胞を式(Ia)の化合物で治療する方法のグループである。
【０１０８】
別の好ましい方法のグループは、PTPN2および/またはPTPN1の活性の阻害によりインスリン受容体によって媒介される疾患が制御される、哺乳動物の細胞を式(I)または(Ia)の化合物で治療する方法のグループである。
【０１０９】
発明の開示に記載する本発明の薬学的組成物のうち、好ましい薬学的組成物は、式(Ia)の化合物が式(Ia)
(式中、
pが1であり、
R1が水素、アルキルまたはアラルキルであり、
R2が水素またはアルキルであり、
R3が-O-または-S-であり、
R4がハロ、ハロアルキルまたはハロアルコキシである)
の化合物である薬学的組成物である。
【０１１０】
式(I)および式(IA)の化合物の製造
本発明の方法および薬学的組成物における式(I)および式(Ia)の化合物は、当業者に既知の方法により、またはEad, H. A.ら、Arch. Pharmacal Res. (1990年)、13巻、1号、5〜8ページに開示されているものと同様の方法によって、または以下に記載されている方法と同様の方法によって製造することができる。
【０１１１】
以下の説明において、図示されている式の置換基および/または変種の組み合わせは、このような寄与により安定な化合物を生じる場合にのみ許容されることが理解される。
【０１１２】
以下に記載する過程において、中間体化合物の官能基は好適な保護基によって保護する必要がある場合もあることも当業者によって考慮される。このような官能基には、ヒドロキシ、アミノ、メルカプトおよびカルボン酸が挙げられる。ヒドロキシの好適な保護基には、トリアルキルシリルまたはジアリルアルキルシリル(例えば、t-ブチルジメチルシリル、t-ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル)、テトラヒドロピラニル、ベンジル等が挙げられる。アミノ、アミジノおよびグアニジノの好適な保護基には、t-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル等が挙げられる。メルカプトの好適な保護基には、-C(O)-R(式中、Rはアルキル、アリールまたはアラルキルである)、p-メトキシベンジル、トリチル等が挙げられる。カルボン酸の好適な保護基には、アルキル、アリールまたはアラルキルエステルが挙げられる。
【０１１３】
保護基は、当業者に既知であり、本明細書に記載されている標準的な技法により付加または脱離させることができる。
【０１１４】
保護基の使用は、Green, T. W.およびP. G. M. Wutz、有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)(1991年)、第2版、Wiley-Interscienceに詳細に記載されている。保護基は、Wang樹脂または塩化2-クロロトリチル樹脂などのポリマー樹脂であってもよい。
【０１１５】
発明の開示に上記した式(I)の化合物のこのような保護された誘導体は薬理作用を持たなくてもよいが、それらが癌または炎症を有する哺乳動物に投与され、その後生体内で代謝されて、薬理学的に活性な本発明の化合物を形成することができることも当業者に考慮されている。従って、このような誘導体は「プロドラッグ」と記載される場合もある。式(I)の化合物の全てのプロドラッグは本発明の範囲内に含まれる。
【０１１６】
例示目的だけのために、以下の反応スキームは式(Ia)(式中、R1、R2、R3およびR4は好ましい態様に上記されているとおりである)の化合物の製造を図示する。しかし、式(I)の他の化合物は、当業者に既知の方法によって同様の様式で製造することができることが理解される。
【０１１７】
反応スキーム1
2005535593.tif 000008
【０１１８】
この一般的なスキームにおいて、出発成分はアルドリッチ(Aldrich)などの製造元から入手してもまたは当業者に既知の出典、例えば、SmithおよびMarch、「Marchの最新有機化学：反応、機序および構造(March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure)」、第5版(Wiley Interscience、New York)により合成してもよい。基R1、R2、R3およびR4は、本明細書に前述する成分から選択される。
【０１１９】
一般に、式(C)ジチオカルバメート化合物は、約0℃において水酸化アンモニウムの存在下において、約3.5 mol/Lの濃度の二硫化炭素(すなわち、式(A)の化合物)に約2.8 mol/Lの濃度の式(B)のアミン化合物を反応させることによって製造することができる。混合物を周囲温度に加温し、最長18時間撹拌し、濃縮して乾燥させる。得られる物質は式(C)の化合物である。
【０１２０】
式(D)の化合物は、アルドリッチなどの製造元から入手しても、または当業者に既知のスキームにより製造してもよい。例えば、ヒドロキシカルボニルメチレンハライド化合物にほぼ等モル量の五硫化二リンを反応させて、前述の反応スキームに使用することができる式(D)のヒドロキシチオカルボニルメチレンハライド化合物を得ることができる。
【０１２１】
式(E)のローダミン由来の化合物は、当業者に既知のスキームにより環化条件下において製造することができる。例えば、Ead, H. A.ら、Arch. Pharmacal. Res. (1990年)、13巻、1号、5〜8ページを参照されたい。例えば、式(E)の化合物は、希炭酸ナトリウムでアルカリ性にした水溶液(約0℃)中で前述の量の式(C)の化合物に約3 mol/Lの濃度の式(D)の化合物またはその塩基性塩を合わせることによって製造される。反応混合物を周囲温度に加温し、約6.4容量の加温した5 M  塩酸(約70℃)を混合し、約90℃において約1時間加熱する。冷却後、得られる沈殿物をろ過して単離し、水で洗浄し、乾燥させて式(E)の化合物を得る。
【０１２２】
式(F)(式中、R3はOまたはSである)の置換ヘテロアリール化合物は、アルドリッチなどの製造元から入手しても、または当業者に既知のスキームにより製造してもよい。一局面において、式(F)のニトロ置換化合物は、2-フランカルボキシアルデヒドまたは2-チオフェンカルボキシアルデヒドを硝酸および硫酸で処理するなどによって、標準的な親電子的な芳香族置換条件下において製造することができる。別の局面において、式(F)のハロゲン置換化合物は、金属鉄の存在下において2-フランカルボキシアルデヒドまたは2-チオフェンカルボキシアルデヒドを天然型二原子ハロゲン化合物(すなわち、F2、Cl2、Br2またはI2)で処理するなどによって標準的な親電子的な芳香族置換条件下において製造することができる。よりさらに別の局面において、式(F)のアルキル置換化合物は、ハロゲン化アルミニウム化合物の存在下において2-フランカルボキシアルデヒドまたは2-チオフェンカルボキシアルデヒドをハロゲン化アルキルによりフリーデル-クラフトアルキル化することによって、またはハロゲンアルミニウムもしくはハロゲン化第二スズ化合物の存在下において2-フランカルボキシアルデヒドまたは2-チオフェンカルボキシアルデヒドをハロゲン化アシルによりフリーデル-クラフトアシル化し、次に標準的な条件下において還元するなどによって、標準的なアルキル化条件下において製造することができる。このような処理は、通常、使用する試薬、特に芳香族化合物の特異的な化学的特性により、種々の異なる環位置に置換基を有する化合物を含む混合物を生じ、主要な合成生成物として特定の環位置に置換基を有する化合物の合成を促進することができる。純粋な主要および/または少量の合成生成物の回収は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの分取的な分離および単離技法を使用することによって実施することができる。
【０１２３】
式(Ia)の化合物は、当業者に既知のスキームにより標準的な縮合反応条件下において製造することができる。例えば、式(I)の化合物は、酢酸ナトリウム(約1〜6 mol/L)および氷酢酸を含有する水溶液中で、約0.5〜2.0 mol/Lの濃度の式(E)のローダミン由来化合物にほぼ等モル量の式(F)(式中、R2、R3およびR4は本明細書に規定する要素から選択される)の置換ヘテロアリール化合物を合わせることによって製造される。反応液を加熱して、撹拌しながら最長16時間還流する。冷却して、選択的に最高約7容量の水を添加してから、得られる沈殿物をろ過して単離し、水で洗浄し、乾燥させて、式(Ia)の化合物および/または式(I)の立体異性体および/または化合物の塩を得る。
【０１２４】
以下の実施例は、本発明を製造する方法および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されており、本発明と考えられるものの範囲を限定する意図のものではない。使用する数値(例えば、量、温度、濃度等)に関して正確さを確実にする努力が払われているが、実験誤差および偏差は斟酌されるべきである。特示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１２５】
実施例1
酵素の作製および使用
A.  PTPN2
PTPN2は、IMPACT(商標)(New England BioLabs)細菌発現系のヒト胎盤cDNAライブラリーからクローニングした。この技術は、Chongら、Gene(1997年)、192巻、271〜281ページによって最初に記載された。IMPACT(商標)タンパク質精製システムはNew England BioLabsから市販品を購入した。得られた産物は、標的分子のハイスループットスクリーニング(HTS)のためのプロテインホスファターゼアッセイ法の開発および本明細書に記載する他のアッセイ法(実施例2を参照されたい)に使用した。
【０１２６】
組換えヒトPTPN2融合タンパク質に実施した生化学的分析は、合成チロシンリン酸化ペプチドからのリン酸塩の放出として測定したとき、プロテインホスファターゼの活性が1500〜2500 pmol/min/μg程度であることを示した。この活性は、アッセイした他の組換えタンパク質チロシンホスファターゼと比較したとき、高い範囲であると考えられた。PTPN2調製物は、以降において、PTPN2活性を阻害する能力を有する化合物の最初に発見するためのインビトロアッセイ法に広範に使用した。
【０１２７】
B.  PTPN12
PTPN12は、IMPACT(商標)(New England BioLabs)細菌発現系においてクローニングした。IMPACT(商標)タンパク質精製システムはNew England BioLabsから市販品を購入した。
【０１２８】
1.  切断型ヒトPTPN12のpTWIN-II発現ベクターへのクローニング
融合タンパク質としてのヒト切断型PTPN12の発現は、cDNAが、IMPACT(商標)発現ベクターpTWIN-IIのインテイン遺伝子の上流のインフレームに位置するポリクローナル部位にライゲーションされている必要があった。切断型は、取扱いがかなり容易であり、比較試験において完全長のタンパク質に類似する結果を生じるため使用した。簡単にするために、これらの実施例において、PTP-PEST-NはPTPN12と同義的に使用する。
【０１２９】
PTPN12コード配列は、遺伝子特異的プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって作製した。
【０１３０】
2.  ヒトPTPN12の発現および精製
活性なPTPN12酵素は、細菌株ER2566においてIMPACT(商標)ベクター系から発現される。組換えPTPN12タンパク質は、キチン-アガロースビーズで親和性クロマトグラフィーを実施し、次にPTPN12が親和性タグから放出される化学的処理を使用して細菌細胞から精製する。タンパク質の完全な定量および定性分析は、SDS-PAGE分離した調製物のクーマシーブルー染色を使用し、PTPN12特異的ウェスタンブロット法によってモニターする。PTPN12は、細菌細胞培養液1 Lあたり0.1〜0.5 mgの範囲のレベルで産生する。
【０１３１】
3.  PTPN12のインビトロにおけるホスファターゼアッセイ法
組換えヒトPTPN12融合タンパク質に生化学的分析を実施する。典型的には、PTPN12調製物は、合成チロシンリン酸化ペプチドからのリン酸塩の放出として測定したとき、プロテインホスファターゼの活性が1500〜2500 pmol/min/μg程度であることが見出されている。この活性は、他の組換えタンパク質チロシンホスファターゼと比較したとき、高い範囲であると考えられる。PTPN12調製物は、以降において、PTPN12活性を阻害する能力を有する化合物の最初に発見するためのインビトロアッセイ法に広範に使用した。
【０１３２】
実施例2
ホスファターゼのインビトロにおける活性プロフィール
望ましいホスファターゼの活性を阻害する能力について、式(I)および式(Ia)の化合物を以下のアッセイ法において試験した。
【０１３３】
A.  試薬の調製：
1.  マラカイトグリーン-モリブデン酸アンモニウム試薬
最初に2つの溶液を調製した。溶液1は、4 N HCl中に4.2%モリブデン酸アンモニウム四水和物(Sigma、Cat# A-7302)を含有した。溶液2は、0.045 % マラカイトグリーン(Sigma、Cat. # M-9636)を含有した。2つの溶液を以下のように混合した：250 mLの溶液1と750 mLの溶液2を常に撹拌しながら20分間混合した。得られた混合物を0.22μMのフィルターでろ過した(Nalgene(商標)真空ボトルトップフィルターCat # 28199-317を使用することができる)。溶液は4℃において褐色瓶に保存した。
【０１３４】
B.  1 mM ppC SRC 60基質の作製
ペプチド配列：TSTEPQY(PO4)QPGENLは従来の方法で作製した。このうち、154 mgを100 mLのdH2Oに溶解し、ペプチドが完全に溶解するまで溶液をボルテックスした。次いで、ppC SRC 60を-20℃において1 mLの分量で保存した。これは、基質ワーキングストック溶液を調製するために使用する「基質」である。
【０１３５】
C.  アッセイ手法
酵素(ホスファターゼ)活性は、Harderら、Biochem. J. (1994年)、298巻、395〜401ページによって最初に記載された方法を使用して、チロシンリン酸化位置特異的ペプチドからのリン酸塩の放出を測定する反応において測定した。これは、Van VeldhovenおよびMannaerts、Anal Biochem. (1987年)、161巻、45〜48ページによって最初に記載されたマラカイトグリーン方法によって遊離のリン酸塩を測定するための非放射性方法である。10Xアッセイ緩衝液(250 mM Tris: 100 mM、β-メルカプトエタノール、50 mM EDTA、pH 7.2)を蒸留したH2O(dH2O)で5X濃度(conc.)に希釈した。次いで、71.4μMの基質ワーキングストック溶液をdH2O中で調製した。
【０１３６】
微小遠心管に、必要量の酵素ストックをピペットで取り、必要量の5Xアッセイ緩衝液で希釈し、混合した。
【０１３７】
10 mLのマラカイトグリーン-モリブデン酸アンモニウム試薬と100μLの1% Tween 20(1 mL Tween 20(BDH、#06435)を99 mLのdH2Oに溶解する)を試薬容器内で十分に混合することによって着色試薬を調製し、室温において保存した。アッセイプレート1枚あたり約10 mLの着色試薬、すなわち、ウェルあたり100μLが必要である。
【０１３８】
試料化合物の調製
Falcon(商標)96ウェルプレートにおいて、試料化合物ワーキングストック溶液の濃度がアッセイにおいて化合物の望ましい最終濃度の10倍になるように、試料化合物を1 % DMSO(1 mL DMSO(Sigma、Cat. # D-8779)を99 mLのdH2Oに溶解して、室温において保存する)で希釈した。
【０１３９】
ワーキングストック溶液は、アッセイにおける試料化合物の必要濃度のように調製した。
【０１４０】
陰性対照は、ウェルあたり5μlの1 % DMSOおよび35μlの基質ワーキングストック溶液および10μlの希釈酵素からなり、プレートの最初のカラムのウェルに置いた。プレートの最後のカラムのウェルは、ウェルあたり5μLの1 % DMSOおよび35μLの基質ワーキングストック溶液および10  μLの5Xアッセイ緩衝液からなる酵素ブランクのために用意した。試験試料はカラム2〜11に置き、ウェルあたり試料の1 % DMSO溶液5μL、35μlの基質ワーキングストック溶液および10μlの希釈酵素からなり、望ましい濃度であった。Biohit Multichannel(商標)ピペッターのリピータ機能を使用して、Falcon(商標)プレートカラムから100μMの試料5μLを対応するCostar(商標)アッセイプレートカラムに添加した。
【０１４１】
次いで、1% DMSO 5μLをカラム1および12に添加し、5Xアッセイ緩衝液10μLをカラム12に添加した。
【０１４２】
マルチチャネルピペッターを使用して、71.4 μMのppC-SRC 60基質の35μLを全てのアッセイウェルに添加し、次いで約10μLの希釈酵素を、カラム間に5秒の間隔をおいて、カラムごとにウェルに添加した。時間計測は最初の添加から開始した。
【０１４３】
アッセイプレートは室温(21℃)において15分間インキュベーションした。カラム間に5秒の間隔をおいて、カラムごとに100μLの着色試薬を添加することによって反応を「停止」した。室温において少なくとも15分間、2時間を越えないように発色させた。Bio-tek Instruments EL312e(商標)マイクロプレートBio-Kinetics(商標)リーダーで590nmにおいてプレートを「読み」、装置の取扱説明書のようにデータを収集した。
【０１４４】
データ解析は以下のように実施した。ブランクおよび陰性対照を読み、ブランクを陰性対照の値および試料の値の平均から引き、阻害率%を以下の式によって表した。
阻害率% = 100 - [補正した試料の読み値/補正した陰性対照の読み値*100]
【０１４５】
本発明の化合物は以下の阻害プロフィールを示した。
【表１】
2005535593.tif 000009
【０１４６】
実施例3
PRKD2の作製およびアッセイ法
A.  酵素の作製：
PRKD2 cDNA(Kinetek clone # K237)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってヒト脳cDNAライブラリーから増幅し、pPCR-Script Amp SK(+)クローニングベクター(Stratagene)に直接クローニングした。DNA配列決定後、2637 bpと確認したヒトPRKD2 cDNAをバキュロウィルス発現ベクターpAcG4T3にサブクローニングした。このベクターは、追加の制限部位をマルチクローニングサイト領域に付加することによってpAcG2T(BD Pharmingen)から作製した。その後、pAcG4T3を昆虫細胞における組換えタンパク質発現およびHTSのためのプロテインキナーゼアッセイ法の開発に使用した。
【０１４７】
融合タンパク質としてのヒトPRKD2の発現は、cDNAが、バキュロウィルス発現ベクターpAcG4T3のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子の下流のインフレームに位置するポリクローナル部位にライゲーションされていることを必要とした。元の配列の5'および3'コード領域の後にパターン形成した遺伝子特異的順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によってPRKD2コード配列を増幅した。PRKD2 cDNAは、PfuDNAポリメラーゼ、Srfl制限酵素およびT4 DNAリガーゼを含むPCR-Script Amp(商標)クローニングキット(stratagene)を使用してベクターpPCR-Script Amp SK(+)にクローニングした。増幅したクローンの配列分析は、元の野生型配列と矛盾がないことを明らかにした。
【０１４８】
pPCR-Script Amp SK(+)-PRKD2クローンをBamHIおよびXhoI制限酵素で消化し、その後断片をpAcG4T3の同じ部位にクローニングした。pAcG4T3ベクターへのPRKD2挿入の確認は制限分析によって判定した。
【０１４９】
バキュロウィルス発現ベクター系を使用して活性なヒトGST-融合PRKD2酵素を発現させた。感染性バキュロウィルスは、製造業者が提供するプロトコールを使用して、接着性ヨトウガSf9昆虫細胞(Invitrogen)に組換えpAcG4T3-PRKD2および鎖状AcNPV(イラクサキンウワバ(Autographa californica)核多角体病ウィルス)DNA(BD Pharmingen)を同時トランスフェクトすることによって作出した。相同部位の組換えにより、トランスフェクションベクターpAcG2T3-PRKD2からゲノムAcNPV DNAに異種GST-PRKD2遺伝子が導入され、最終的にパッケージングされたバキュロウィルス粒子が作出され、増幅された。
【０１５０】
組換えGST-PRKD2タンパク質は、懸濁発現条件においてHigh Five(商標)細胞(Invitrogen)において産生され、GST-グルタチオンアフィニティーシステムで精製した。72時間の発現後、細胞を遠心分離し、ペレットを溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl、pH 7.5、2.5 mM EDTA 、150 mM NaCl、1% NP-40、0.1%β-メルカプトエタノール、0.5 mM バナジン酸ナトリウム、50 mMβ-グリセロホスフェート、0.1 mM PMSF、1 mM ベンザミジンおよび0.5%(V/V)プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII(CalBiochem))中で溶解した。遠心分離によって溶解液から細胞残骸を除去し、除去後の上清を、製造業者の取扱説明書(Pharmacia)によりバッチ-吸着回転によってグルタチオンアガロースビーズ(Sigma)と共にインキュベーションした。融合タンパク質のグルタチオン-アガロースビーズへのバッチ吸着後、基質を1×10 cmのFlex-カラム(商標)(Kontes Glass)クロマトグラフィーシステムに移した。カラムを高塩濃度緩衝液(50 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM EDTA、500 mM NaCl、0.1% NP-40、0.1%β-メルカプトエタノール、0.5 mM バナジン酸ナトリウム、50 mMβ-グリセロホスフェート、0.1 mM PMSFおよび1 mM ベンザミジン)で洗浄した。最後に、還元型グルタチオン緩衝液(50 mM Tris-HCl、pH7.5、50 mM NaCl、10 mM グルタチオン、0.1%β-メルカプトエタノールおよび1 mM PMSF)を使用して、GST-PRKD2タンパク質をカラムから溶出した。タンパク質の完全な定量および定性分析は、クーマシーブルー染色およびGST特異的ウェスタンブロット法によってモニターした(Kinetek)。
【０１５１】
B.  PRKD2のインビトロにおけるキナーゼアッセイ法：
下記に「キナーゼのインビトロにおける活性プロフィール」と題したセクションに概略されている実験プロトコールを使用して、組換えヒトGST-PKD2融合タンパク質に生化学的分析を実施した。一般に、GST-PRKD2調製物は、周囲温度における15分間の反応中に、50 uMの[γ-32P]-ATPおよび116.5 uMの基質CREBtide(商標)ペプチド(アミノ酸配列：KRREILSRRPSYR)の存在下において150 pmol/min/μg程度の良好なタンパク質ホスホトランスフェラーゼ活性を示すことが見出されている。
【０１５２】
実施例4
GSK3βの作製およびアッセイ法
A.  酵素の作製：
元のpBluescript-SK-h-GSK3β型はOntario Cancer InstituteのDr. James Woodgettsの研究所からの供与であった(Biochem. J. (1994年)、303巻、701〜704ページ)。融合タンパク質としてのヒトGSK3βの発現は、cDNAが、細菌発現ベクターpGEX-4T3(Pharmacia)のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子の下流のインフレームに位置するマルチクローニングサイトにライゲーションされていることを必要とした。元のpBluescript-SK-GSK3βクローンの5'および3'コード領域に相補的な遺伝子特異的な順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によってGSK3βコード配列を増幅した。pGEX-4T3発現ベクターへのcDNA増幅産物のサブクローニングおよび発現を容易にするために、追加の塩基を各DNAプライマーの5'末端に挿入した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは以下のように構築した。最初に、1つの塩基をコード配列(ATG開始コドンを含まず、発現は、製造業者によって発現ベクターに最初に構築されたグルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子の上流の最初のATGコドンから開始する)のすぐ上流に挿入した。第二に、Eco RI制限部位をGSK3βコード配列の開始部の5'に挿入した。第三に、Eco RI制限酵素のPCR増幅DNA産物への結合を促進するために、3つの追加の塩基をEco RI制限部位の5'に配置した。3'オリゴヌクレオチドプライマーは以下のように構築した。Xho I制限部位をTGA停止コドンのすぐ下流に挿入した。その後、3つの塩基をXho I制限部位の5'に付加した。補正後の組換えクローンの配列分析は、1263 bpの元の野生型配列との矛盾を示さなかった。細菌発現系を使用して、活性なGSK3β酵素を発現した。融合タンパク質の発現は、イソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)などのラクトース類似物を添加すると誘導可能となるtacプロモーターの緊縮制御下にある。宿主細菌細胞UT5600をpGEX-4T3-GSK3βで形質転換し、100μg/mlアンピシリンを添加した2xYT培地で増殖させた。室温において150 μM IPTGを導入し終夜経過後、UT5600[pGEX-4T3-GSK3β]細胞を回収し、緩衝液(50 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、500 mM NaCl、1% Triton X-100、1 mg/mlリゾチーム(lysosyme)、1 mM ベンザミジン、0.1 mM PMSFおよび1ug/ml大豆トリプシンインヒビター)中でゆるやかに超音波処理して溶解する。製造業者の取扱説明書によりGST-グルタチオンアフィニティーシステム(Sigma)を使用して上清から組換えGST-GSK3βタンパク質を精製した。融合タンパク質のグルタチオン-アガロースビーズへのバッチ吸着後、基質を径2インチのフレックスカラム(Kontes Glass)に移した。次いで、カラムを高塩濃度緩衝液(50 mM Tris-HCl、PH 8.0、1 mM EDTAおよび500 mM NaCl)および低塩濃度緩衝液(50 mM Tris-HCl、PH 8.0、1 mM EDTAおよび50 mM NaCl)で洗浄した。最後に、グルタチオン緩衝液(50 mM Tris-HCl、PH 7.5、1 mM EDTA、50 mM NaClおよび10 mM グルタチオン)を使用して、GST-GSK3β融合タンパク質を基質から溶出した。
【０１５３】
B.  GSK3βのインビトロにおけるキナーゼアッセイ法
「キナーゼのインビトロにおける活性プロフィール」と題したセクションに概略されている実験プロトコールを使用して、組換えヒトGSK3β融合タンパク質に生化学的分析を実施した。一般に、GST-GSK3β調製物は、周囲温度における15分間の反応中に、50 uMの[γ-32P]-ATPおよび69.3 uMのGSK基質ペプチド(アミノ酸配列：TRRAAVPPSPSLSRHSSPHQSEDEEE)の存在下において150 pmol/min/μg程度のタンパク質ホスホトランスフェラーゼ活性を示すことが見出されている。
【０１５４】
実施例5
キナーゼのインビトロにおける活性プロフィール
PRKD2およびGSK3βなどの望ましいキナーゼの活性を阻害する能力について、式(I)の化合物を以下のアッセイ法において試験した。特定の阻害剤のインビトロにおける望ましい効力は、その化合物が治療薬として、すなわち、ナノモルまたはマイクロモル範囲において有用である。
【０１５５】
A.  アッセイ法の説明
試験化合物を凍結乾燥し、-20℃で保存した。化合物を秤量し、それらをジメチルスルホキシド(DMSO)に標準的な濃度、通常20 mMに溶解することによってストック溶液を作製し、-20℃で保存した。化合物を1% DMSOで出発中間濃度250 μMに希釈し、次いで連続2倍希釈段階を使用して96ウェルプレートの列方向に連続的に希釈した。希釈した100% DMSOを陰性対照として使用した。
【０１５６】
同一のプレートレイアウトのCostar(商標)セロクラスタープレートに各化合物希釈液の5μLをロボットを使用してピペット分注した。全てのアッセイ混合物は以下の容量からなった。
5μLの希釈した化合物
10μLの標的酵素調製物
1μLの基質
5μLのアッセイATP
【０１５７】
次いで、アッセイ混合物を周囲温度において15分間インキュベーションした。
【０１５８】
各アッセイ混合物から、10μLのアッセイ混合物を、Millipore Multiscreen-PH(商標)不透明プレートにスポットし、1%リン酸中で10分間の洗浄を2回実施した。プレートを40℃において30分間乾燥し、次いで基質リン酸複合体をシンチレーション計測によって定量した。これらのMilliporeプレートは、ウェルにP81ホスホセルロース膜が固定されている96ウェル様式のものである。基質のリン酸化型および非リン酸化型は膜に結合するが、ATP(取り込まれていないリン酸塩)はその後の洗浄段階で除去される。
【０１５９】
B.  IC50の算出
試験化合物による標的の阻害は、アッセイの終了時にろ紙に固定されている特異的な基質への放射性リン酸塩の取り込みをシンチレーション計測することによって測定される。有意義な阻害の測定を提供するために、特異的で、既知の阻害剤の非存在下および存在下においてアッセイを実施し、取り込まれる放射能の量を比較してベースライン測定値を提供する。
【０１６０】
「ベースライン活性」は、標的阻害剤の非存在下において取り込まれる放射能の量である。標的阻害剤の存在下において取り込まれる放射能の量を「試料の活性」と呼び、阻害率%は以下の式
阻害率% = 100 - (試料の活性/ベースラインの活性*100)
によって表され、通常化合物の濃度に関連して表される。標的阻害剤の濃度範囲を使用することによって、阻害剤のIC50が推定される(すなわち、酵素活性が50%低下する濃度)。特定の標的に対する種々の阻害剤のIC50を比較することができ、この場合IC50が低いと阻害剤がより強力であることを示す。インビトロにおいてPRKD2に対する5-[5-(4-ブロモフェニル)-フラン-2-イルメチレン]-チアゾリジン-2,4-ジチオンのIC50は4.7であった。インビトロにおいてGSK3βに対する5-[5-(4-ブロモフェニル)-フラン-2-イルメチレン]-チアゾリジン-2,4-ジチオンに対するIC50は5.2であった。
【０１６１】
実施例6
ボイデンチャンバーにおける細胞遊走
ある範囲の細胞系統、特に前立腺癌細胞系統PC3およびPTPN12マウス胚線維芽細胞(MEF)をこのアッセイ法に使用した。遊走におけるPTPN12の作用は、PTPN12陰性MEFsを観察することに基づいて確立されている。細胞接着および遊走は、タンパク質のリン酸化によって調節される数多くの細胞外および細胞内分子、例えば、アクチンの集成および分解に関係する動的な生物作用である。リン酸化状態(ホスファターゼの阻害)または脱リン酸化(キナーゼの阻害)状態においてシステムを固定すると、集成/分解過程、最終的には遊走に顕著な影響を与える。遊走はPTPN12ノックアウトMEFにおいて低下する。拡大解釈すると、PTPN2阻害剤はボイデンチャンバーにおいて細胞の遊走を低下する。従って、PTPN12活性の読取として、ボイデンチャンバーにおいて細胞の遊走を分析するために以下のアッセイ法を設計する。ボイデンアッセイ法は、細胞種が細胞外基質において遊走することができるかどうかを判定するために使用する実験である。示さない限り、全ての手法は層流フード内で滅菌条件化において実施し、37℃における全てのインキュベーションはCO2インキュベーターにおいて実施する。
【０１６２】
A.  試薬
1.  染色溶液
カルセインAM(Molecular Probes、Cat# C-1430)染色液は、ハンクス緩衝生理食塩液(GIBCO/BRL、Cat#14170-112)で0.5μg/mlの濃度に調製する。
【０１６３】
2.  フィブロネクチン溶液
フィブロネクチンのストック溶液は、5 mgのフィブロネクチン:(Sigma、Cat: F-2006)を5 mLの滅菌リン酸緩衝液(PBS)に溶解し、P1000ピペットで転倒混和することによって調製する。ワーキング溶液は、100 ulのこのストック溶液に10 mLの滅菌PBSを混合することによって調製する。
【０１６４】
B.  アッセイ法(腫瘍細胞系統)
腫瘍細胞系統については、ストック細胞(すなわち、PC3細胞)をT175フラスコにおいて集密度50〜70%まで増殖させる。細胞をトリプシン処理し、懸濁液を無血清培地で2×105/mlの濃度に調製する。HTS FluoroBlok(商標)24ウェルインサートシステムプレート(Cat# 351158)の各ウェルのチャンバーの上部に450μlの細胞懸濁液(または対照用の培地)を添加する。試験するための化合物は、DMSOストックから無血清培地で10×ストックとして調製し、最終的な最大DMSO濃度は0.25%である。次いで、50μlの化合物(またはDMSO対照)を各トップチャンバーに添加し、10%ウシ胎仔血清を含有する750μlの培地を化学的遊走物質としてボトムチャンバーに添加する。プレートを、5%CO2、37℃において20〜24時間インキュベーションする。インキュベーション後、インサートプレートを、5 ug/mlカルセインAMのHBSS溶液0.5 mlを含有する第2の24ウェルコンパニオンプレートに移し、5%CO2、37℃において1時間インキュベーションする。遊走した細胞の蛍光を、励起/放射波長485/538 nmにおけるボトムリーディングを行うFluoroskan Ascent FL(商標)(または等価物)で読む。FluoroBlok(商標)膜の孔を通過して遊走した細胞だけが読み取られる。MEFsについては、プレートは、膜の両側に10 mg/mLフィブロネクチン溶液を4℃において18時間コーティングする。インキュベーション後、コーティング溶液を吸引によって除去し、過剰分をPBSで2回洗浄する。次いで、細胞の播種および検出は腫瘍細胞系統について記載されているように実施する。
【０１６５】
C.  データ解析
データは、24ウェルあたり中央の25領域の合計の蛍光単位(FU)としてまたは以下の式によって遊走阻害の割合として表される：侵入阻害率% = 100 - 化合物処理した細胞侵入のFU/DMSO処理した細胞侵入のFU × 100。バックグラウンドを全ての値から引き、バックグラウンドは培地のみの対照によって表される。
【表２】
2005535593.tif 000010
【０１６６】
実施例7
ウェスタンブロットにおけるp130CASリン酸化の状態
PTPN12ヘテロ接合体およびPTPN12ノックアウトマウス線維芽細胞のホスホチロシンプロファイリングにより、130 kDaにおいて遊走するタンパク質はノックアウト細胞において構成的に過剰リン酸化されていることが示された(Cote, J. F.ら、Biochemistry (1998年)、37巻、38号、13128〜13137ページ)。このタンパク質は、接着斑複合体に見られるタンパク質であるp130casであると同定された。PTPN12ノックアウト細胞におけるp130casのリン酸化により細胞の運動性および接着斑の代謝回転が欠損すると思われた(Angers-Loustauら、1999年)。
【０１６７】
この追跡アッセイ法は、p130casのリン酸化状態をPTPN12またはPTP-1Bなどの他のPTP活性の読取として測定する。簡単に説明すると、全ての細胞タンパク質の一般的なチロシンリン酸化状態は、細胞懸濁液をインキュベーションし、次いで細胞をフィブロネクチンコーティングプレートで培養し、それによってインテグリン経路を介してチロシンリン酸化を刺激することによって低下する。細胞溶解後、4G10抗ホスホチロシン抗体を使用するp130cas免疫沈降およびウェスタンブロット法を使用して、p130casのチロシンリン酸化状態を測定する。低レベルのp130casのチロシンリン酸化は高いPTPN12活性を示す。アッセイ法は、PTPN12ノックアウトおよびヘテロ接合体マウス線維芽細胞を使用して実施する。
【０１６８】
A.  材料
1.  McGill大学癌センターのMichel Tremblayらにより提供されたPTPN12+/-マウス線維芽細胞(AC4+/-)およびPTPN12-/-マウス線維芽細胞(AC6-/-)。
2.  RIPA緩衝液。50 mM Tris-HCl pH 7.2、150 mM NaCl、0.1% SDS(BioShop、Cat#: SDS 001)、0.05%デオキシコール酸ナトリウム10%溶液(Sigma、Cat#: D-6750)、1%NP-40(BDH Laboratory Supplies、Cat: 56009 2L)、1 mM バナジン酸ナトリウム(Fisher Scientific、Cat: S454-50) 200 mM 溶液および「完全なプロテアーゼ阻害剤混合物」(Roche Cat. 1836153)を混合することによって作製する。
3.  SDS試料緩衝液。62.5 mM Tris-HCl pH6.8、20% グリセロール(BioShop、Cat#: Gly 001)、2% SDS、5%β-メルカプトエタノール(Acros Organics、Cat#: 12547-2500)および0.025%ブロモフェノールブルー(EM Science、OmniPur(商標))を混合することによって調製する。
【０１６９】
B.  フィブロネクチン刺激
6ウェルプレート(Fisher Scientific、Cat: 08-772-1B、Falcon No. 3530)に、10 mg/mLフィブロネクチン溶液(Sigma、Cat: F-2006、Lot: 109H7602)を4℃において18時間コーティングする(密度1 g/cm2)。950μl容量のフィブロネクチンを各ウェルに添加する。周囲温度において2 mLのPBSを各ウェルに添加し、吸引によってPBSを除去することによってプレートを2回洗浄する。PBS 1% BSA溶液(2 mL)を各ウェルに添加し、非特異的部位をブロックし、プレートをCO2インキュベーターで37℃において1時間インキュベーションする。吸引によってブロック溶液を吸引し、細胞をウェルに添加する前にウェルを洗浄する。
【０１７０】
C.  細胞の添加
調製済みのプレートに細胞(AC4+/-およびAC6-/-)を添加する前に、CO2インキュベーターで37℃において10分間、1.5 mLのトリプシン/EDTA(0.05%トリプシン、0.53 mM EDTA)(GibcoBRL、Cat: 25300-054)溶液と共にインキュベーションすることによってそれらを洗浄し、10cm培養皿から除去する。剥離した細胞を周囲温度において5 mLのPBSに懸濁させ、15 mLのコニカル管に入れ、臨床遠心分離器で600gで5分間遠心分離する。吸引によってPBSを除去し、次いで血球計を使用して細胞を計数し、DMEM 0.5% BSAで細胞濃度を1×106細胞/mLに調節する。
【０１７１】
25〜50 μMの濃度範囲を提供するのに十分な量の試験化合物を混合した細胞懸濁液を、10分毎に混合しながら、CO2インキュベーターで37℃において30分間インキュベーションする。フィブロネクチン処理する前の基底状態のリン酸化レベルを求めるために少量を対照として取っておく。フィブロネクチン処理については、CO2インキュベーターで37℃において45分間インキュベーションする前に集密度60%(3×106細胞/ウェル)を得るために、3 mLの細胞懸濁液をフィブロネクチン基質に添加する。各試料は2連で実施する。
【０１７２】
フィブロネクチン刺激または懸濁培養の終了時に、1 mMバナジン酸ナトリウムを添加した氷冷PBSで細胞を洗浄する。プロテアーゼ阻害剤および1 mMバナジン酸ナトリウムを添加した0.5 mLの氷冷RIPA緩衝液を添加することによって細胞を平板培地上で直接溶解する。平板培地を頻繁に撹拌しながら、4℃において10分間インキュベーションし、次いでP1000(商標)マイクロピペットで反復吸引することによって分離してから、1.5 mL微小遠心管に移す。微小遠心器で4℃において10分間13,000 rpm(10000g)において細胞残骸をペレット化し、上清を別の1.5 mL微小遠心管に注いだ。
【０１７３】
製造業者の取扱説明書により、Bio-Radタンパク質濃度キットDC(商標)(Bio-Rad)を使用して、細胞溶解物中のタンパク質濃度をアッセイする。p130casの免疫沈降は、1 mMバナジン酸塩および阻害剤を添加したRIPA緩衝液で最終容量1 mLに調整した250 mgタンパク質量で実施した。
【０１７４】
免疫沈降は、1 mg(4 mL)の抗p130casマウスモノクローナル(Transduction Laboratories、Cat: P27820)を各試料に添加し、混合物を回転装置で4℃において2時間インキュベーションする。免疫沈降の対照として、同じ量の細胞溶解液を1 mg(3 mL)のウサギ免疫前血清と共にこの段階においてインキュベーションする。次いで、20 mLの再懸濁したプロテインG-Agarose(商標)ビーズ(GibcoBRL、Cat: 15920-010)を添加し、混合物を回転装置において撹拌しながら4℃において1時間インキュベーションする。4℃において5分間2000gで遠心分離することによって免疫沈降物を回収する。1 mLの氷冷RIPA緩衝液でペレットを3回洗浄する(上清は吸引によって除去する)。最後の洗浄後、ビーズを60 mLのSDS試料緩衝液に再懸濁する。
【０１７５】
D.  SDS-PAGEおよびウェスタンブロット法
30μlの免疫沈降物を125Vにおいて1.5時間10%ポリアクリルアミドゲルで分離する(p130casは130 kDaのタンパク質である)。
【０１７６】
簡単に説明すると、ニトロセルロース膜を、周囲温度において、撹拌しながら、TBS-Tween(TBST): 20 mM Tris-HCl、pH 7.2〜7.4(BioShop、Cat#: TRS 001))、150 mM NaCl:(BioShop、Cat#: SOD 001)および0.1%(v/v)Tween-20: (BioShop、Cat: TWN508) 1 % BSAでブロックする。抗ホスホチロシンモノクローナル抗体クローン4G10(Upstate Biotechnologies)をTBST 1 % BSAで1000倍希釈して使用し、周囲温度において撹拌しながら1時間インキュベーションする。抗マウスIgG-HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)結合体(Jackson Laboratories)をTBST 1 % BSAで20000倍希釈して使用し、周囲温度において1時間インキュベーションする。
【０１７７】
E.  データ分析
データは、p130casリン酸化状態の関数として分析する。
【０１７８】
試験した本発明の化合物は、フィブロネクチン処理後のPTPN12+/-細胞と比較すると、PTPN12-/-細胞において高いレベルのリン酸化を証明している。本発明の化合物により+/-細胞においてPTPN12を阻害すると、未処理の細胞と比較して、処理した細胞ではp130casのリン酸化状態が高かった。
【０１７９】
本発明の化合物がPTPN12活性を阻害する能力を試験するために、適当な出発試薬および酵素調製物を用いて上記のアッセイ法を使用する。
【０１８０】
実施例8
細胞増殖
この手法(Jelinkova, R. B.ら、「レクチン-および抗Thy-1.2抗体標的HPMAコポリマー結合ドキソルビシンが原発性および転移性ヒト結腸直腸癌およびマウスThy-1.2遺伝子をトランスフェクトしたヒト結腸直腸癌に与える抗増殖作用(Antiproliferative effect of a lectin- and aniti-Thy-1.2 antibody-targeted HPMA copolymer-bound doxorubicin on primary and metastatic human colorectal carcinoma and on human colorectal carcinoma transfected with the mouse Thy-1.2 gene)」、Bioconjug. Chem. (2000年、9〜10月)、11巻、5号、664〜73ページ)を使用して、化合物が増殖に関する種々の細胞系統に与える影響を評価する。種々の腫瘍細胞の足場非依存性増殖速度は、ある期間にわたって細胞に取り込まれた遊離のチミジン同位体の量を測定することによって定量化する。任意の化合物が種々の腫瘍細胞の増殖を阻害する作用は、癌において疾患の進行を妨害する能力の指標として使用できると思われる。
【０１８１】
培養中の腫瘍細胞は、通常の手法、すなわち、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、計数する手法により回収した細胞である。90μlの容量を使用して96ウェルプレートに5,000細胞/ウェル播種する。細胞を5%CO2下において、37℃で24時間インキュベーションする。インキュベーション後、細胞は集密度80〜90%であるはずである。
【０１８２】
3H-チミジン(Amersham)を細胞培養培地で100μCi/mLの濃度に希釈する。試験化合物をチミジンブロスで望ましい最終濃度の10倍に希釈する。
【０１８３】
次いで、希釈した化合物の10μLを、すでに96ウェルプレートに添加しておいた90μLに添加する。カラム2〜11において処理あたり6つの同型培養ウェルを実施する。プレートは振動させることによって混合した。
【０１８４】
スタウロスポリンなどの既知の細胞傷害性化合物を、カラム1において陽性対照として比較的高い濃度で使用する。希釈したDMSOをカラム12において陰性対照として使用する。プレートは37℃において正確に24時間インキュベーションする。
【０１８５】
インキュベーション後、顕微鏡下で明白な細胞死、異常な細胞形状、化合物の結晶形成等についてプレートを観察する。次いで、冷却した50%TCAの25μL容量を各ウェルにすでに添加されている100μL容量に徐々に添加し、4℃において1〜2時間インキュベーションする。次いで、プレートを水道水で5回洗浄し、周囲温度において完全に乾燥させる(通常は終夜)。最後に100μLのシンチレーション液を各ウェルに添加し、ユーザーマニュアル取扱説明書によりWallac 1450 Microbeta(商標)カウンターでプレートを計測する。
【０１８６】
阻害量は以下の式によって求められる。
阻害率% = 100 - [(AVG処理 - AVG陽性対照)/100(AVG陰性対照 - AVG陽性対照)]
【表３】
2005535593.tif 000011
【０１８７】
実施例9
細胞傷害性アッセイ法
この手法を使用して、化合物が細胞の生存度に関して種々の細胞系統に与える影響を評価する。細胞の生存度は、カルセインAM((3',6'-ジ(O-アセチル)-2',7'-ビス[N,N-ビス-(カルボキシメチル)アミノメチル]-フルオレセイン、テトラアセトキシメチルエステル)を使用し、蛍光産物(カルセイン)への変換を蛍光光度計(fluorimeter)を用いて測定することによって定量化する。
【０１８８】
このアッセイ法の原理は、生細胞において見られる偏在的な細胞内エステラーゼ活性の存在に基づいている。エステラーゼの酵素反応によって、非蛍光細胞透過性カルセインAMは強い蛍光のカルセインに変換される。ポリアニオン系染料カルセインは生細胞内に保持され、生細胞において緑色の蛍光を生ずる。それは、別法(例えば、3H-チミジン取り込み)と比較して、迅速で、安全で、関連の良好な細胞傷害の指標である。カルセインAMは、水分に接触すると加水分解を受けやすくなる。従って、カルセインAMを含有する水性のワーキング溶液は使用直前に調製し、ほぼ1日以内に使用する。
【０１８９】
このアッセイ法を実施するのに利用可能なキットは、モレキュラー・プローブス(Molecular Probes)による「LIVR/DEAD(登録商標)生存度/細胞傷害キット(L-3224)」である。
【０１９０】
細胞は組織培養フラスコから回収し、トリプシン処理し、遠心分離し、再懸濁し、計数する。集密度80〜90%となるように細胞を播種する(通常の細胞では、10,000細胞/ウェル(HUVEC細胞では8000細胞/ウェル))。ウェルあたり90μL容量を使用するので、110,000細胞/mL(HUVEV細胞では88,000細胞/ウェル)の細胞濃度を調製する。
【０１９１】
8チャネルマルチディスペンスピペッターを使用して、細胞をプレート(Nunclon(商標)96ウェルフラット-ボトムプレート)の中央の列に播種し、端のトップおよびボトム列は同じ容量の培地だけにした。プレートを5%CO2、37℃において終夜、ほぼ24時間インキュベーションした。
【０１９２】
試験化合物については、細胞培養培地(例えば、RPMI + 10%FBS)、望ましい最終濃度の10×化合物溶液を20 mMストック化合物から調製した。
【０１９３】
この10×化合物溶液の10μlを、96ウェルプレートにすでに添加されている90μLの細胞に添加し、以前の試験の既知の細胞傷害性化合物を陽性対照として使用する。陰性対照は、化合物と同じ倍数に希釈した100% DMSOである。
【０１９４】
プレートは37℃において約24時間インキュベーションし、周囲温度においてプレートを2400 rpmで10分間遠心分離してから培地を吸引する。1×DPBSの100μl(塩化カルシウムを含有しない、塩化マグネシウムを含有しない(GibcoBRL、cat#14190-144))を各ウェルに添加する。
【０１９５】
カルセインAM溶液は、50μgのカルセインAM結晶(m.w.=994.87g/mol、Molecular Probes)および無水DMSO(Sigma Aldrich)を添加して1 mMのストックを作成し、アッセイ直前にストックを1×DPBSで望ましい最終濃度の2倍に希釈することによって調製する。この2倍液の100μLをウェルの100μLのDPBSに添加し、プレートを周囲温度において30分間インキュベーションする。蛍光データを読み取り、記録する(Fluoroskan Ascent(登録商標)FL蛍光光度計(fluorimeter)(励起〜485 nm、放射〜527 nm))。
【０１９６】
同型培養(通常6)の値を平均し、以下のように阻害率%を算出する。
阻害率% = 100 - [(AVG処理 - AVG陽性対照)/(AVG陰性対照 - AVG陽性対照)*100]
【表４】
2005535593.tif 000012
【０１９７】
実施例10
インビボにおける腫瘍効力検討
試験化合物が単独およびドキソルビシンと併用してH460皮下異種移植片に与える効力を試験するためである。
【０１９８】
雌胸腺欠損ヌードマウスをこの実験に使用する。1群60匹のマウスに、500万個のH460細胞を100μLのMatrigel(商標)(VWR Canada)賦形剤に加えたものを接種する。1週間に3回デジタル式カリパーで腫瘍を測定し、腫瘍の容積を算出する。腫瘍が平均サイズ100 mm3に達したとき、腫瘍の植え込みから約2週間経過していた。その時点において、等しく、実質的に同じ腫瘍質量である集団に動物を分配する、すなわち、群あたり約10匹のマウスを含む6つの群に分割されるように、増殖していない任意の「アウトライアー(outlier)」を除外する。
【０１９９】
試験化合物による処理は約20日間継続し、試験化合物の既知の溶解度に応じて経口(胃管投与)、静脈内、皮下または腹腔内による。25mg/kgの用量がこのような試験に典型的であるが、選択する用量は化合物の効力および投与経路を反映している。最高200 mg/kgを選択することができる。
【０２００】
陽性対照は、ドキソルビシンまたはシスプラチンまたはシクロホスファミドを交互に使用してもよい。
【０２０１】
表形式による検討の内訳
2005535593.tif 000013
【０２０２】
検討の終了時に、試験化合物の最後の投与の3時間後にマウスを麻酔し、血漿および組織を採取し、凍結する。腫瘍を望ましい数の分量に分割し、後に分析に使用するために速やかに凍結する。
【０２０３】
実施例11
MATRIGEL(商標)における細胞侵入
Matrigel(商標)コーティングFluoroblok(商標)インサートを通過する腫瘍細胞侵入に対する化合物の影響を評価するためにこの手法を使用する。侵入によって、腫瘍細胞は原発腫瘍以外の部位に拡散することができる。BDバイオサイエンス(BD Bioscience)のBioCoat FluoroBlok(商標)Invasion System(商標)は、BD BioCoat Matrigel(商標) Invasion Chambersの利点とBD Falcon(商標) HTS FluoroBlok(商標)24-Multiwell Insert Systemの蛍光をブロックする膜能力とを合わせている。以下のアッセイ法はこのシステムを使用して、Matrigel(商標)細胞外基質を介する抗腫瘍細胞侵入に対する化合物の影響を評価している。
【０２０４】
使用する細胞系統はHT 1080 (ATCC、Cat# CCL-121)、DU-145(ATCC、Cat# HTB-81)、PC3(ATCC、Cat# CRL-1435)またはB16F1(ATCC、Cat# CRL-6323)である。
【０２０５】
侵入試験システムは、-20℃で保存されているパッケージから取り出し、周囲温度に加温させる。PBSをインサートの内側に添加し、37℃において2時間再水和させる。次いで、培地を除去し、450μLの腫瘍細胞の細胞懸濁液(集密度50〜70%まで増殖させ、トリプシン処理し、無血清培地において1×106/mlの濃度で再懸濁させる)をトップチャンバーに添加する。望ましい最終濃度の10倍の濃度で50μL容量の試験化合物をトップチャンバーに添加する。DMSOは対照として作用する。
【０２０６】
次いで、10%FBSおよびNIH 3T3条件培地を含有する50%の新鮮な増殖培地を含有する750μLの培地をボトムウェルの各々に添加する。次いで、侵入システムを5%CO2雰囲気下で、37℃において24〜48時間インキュベーションする。
【０２０７】
インキュベーション後、インサートプレートを、5μg/mlのカルセインAM(Molecular Probes)のハンクス緩衝塩溶液(HBSS)の溶液0.5 mLを含有する第2の24ウェルプレートに移し、プレートと5%CO2、37℃において1時間インキュベーションする。
【０２０８】
細胞侵入を示す蛍光データを、485/538 nmの励起/放射波長におけるボトムリーディングを行うFluoroskan Ascent FL(商標)(LabSystems)で読む。
【０２０９】
データは、24ウェルあたり中央の25領域の合計の蛍光単位(FU)としてまたは以下の式によって侵入阻害の割合として表される：侵入阻害率% = 100 - 化合物処理した細胞侵入のFU/DMSO処理した細胞侵入のFU × 100。
【０２１０】
化合物はこのアッセイ法において侵入を阻害するので、癌の転移および組織再構築を防止するために使用することができる。
【０２１１】
実施例12
腹腔マクロファージ刺激および分析
A.  炎症アッセイパネルの確立
マクロファージは感染に対する自然免疫の重要な要素であり、感染菌に接触して活性化される免役応答における第一の細胞種に含まれる。IFN-γおよびLPSはマクロファージの強力な活性化因子であり、種々の生物学的影響に対してそれらを誘発する。感染に応答してNKおよびT細胞によって最初に分泌されるIFN-γは、マクロファージを休止状態から活性化状態(炎症性マクロファージ)に変換し、細胞内病原菌の死滅並びに抗原処理およびリンパ球への提示の増加によって発現される抗菌作用を生じるようにそれらを誘発する。IFN-γの作用はLPSセカンドメッセンジャーと相乗して、NK-κBの活性化によりマクロファージの刺激を増強し、誘導性iNOS(一酸化窒素シンターゼ)を含む、細胞性免疫応答に関与する数多くの遺伝子の転写上方制御を生ずる。活性化されたマクロファージは、休止状態のマクロファージと質的に異なる。これらの差は、典型的には、増殖指数の増加、MHC-II発現の上方制御および種々の生物活性分子の産生によって観察される。後者の生物学的影響は、NO(一酸化窒素)放出および炎症性サイトカイン(IL-6、TNF-γ、IL-1)の産生の増加によって媒介される。Balb/cマウスおよびRAW 264.7細胞(Balb/cバックグラウンド)由来の一次マクロファージを使用して、読み取りが迅速で、信頼できるインビトロ炎症モデルを確立する。
【０２１２】
B.  材料および方法
1.  試薬
iNOS阻害剤NG-モノメチル-L-アルギニン(L-NMMA)およびマウスrIFN-γはカルビオケム(Calbiochem)(San Diego、CA)から購入する。無タンパク質フェノール/水-抽出LPS(大腸菌(E. coli)血清型0111:B4 0127: B8由来)、Zymosan A(商標)、デキサメサドンおよびヒドロコルチゾン、スルファニルアミドおよびN-(1-ナフチル)-エチレンジアミンはシグマ(Sigma)(St. Louis、MO)から購入する。ヒト組換え血管内皮増殖因子(VEGF)はR&Dシステムズ(R&D Systems)(Minneapolis、MN)から購入する。活性な(リン酸化)細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)に対するウサギポリクローナル抗体およびHRP結合ロバ抗ウサギIgGはプロメガ(Promega)(Madison、WI)から入手する。IL-6を検出するためのELISAデュアル-セットキットはファーミンジェン(PharMingen)(San Diego、CA)から購入する。抗マウスiNOS/NOS II型およびシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)抗体はトランスダクション・ラボラトリーズ(Transduction Laboratories)(Lexington、KY)から入手する。
【０２１３】
6〜12週齢の雌BALB/c同系マウスはハーラン社(Harlan Inc.)(Indianapolis、IN)から購入し、1日あたり12時間蛍光光線下で飼育する。マウスはケージで飼育し、カナダ動物管理協会(Canadian Council on Animal Care)の標準に遵守して維持する。
【０２１４】
2.  一次マウスマクロファージの単離
BALB/cマウスに0.5 mLの滅菌Zymosan A(商標)(1 mg/0.5 mL 0.9%生理食塩液)を腹腔内注射した24時間後に、氷冷した滅菌生理食塩液による腹腔内洗浄によって腹腔滲出液マクロファージを単離する。細胞を洗浄し、1 mM D-グルコース、1 mM ピルビン酸ナトリウム、100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンおよび5% FBSを添加したRPMI 1640に再懸濁する。
【０２１５】
3.  一次マクロファージの処理
iNOSおよびCOX-2発現を測定するために、一次マクロファージ(1.5×105細胞/ウェル)を96ウェルプレート(亜硝酸塩アッセイ法)または6ウェルプレート(2×106細胞/ウェル)中で増殖させる。5%CO2、37℃において3時間インキュベーション後(マクロファージを結合させる)、種々の濃度の試験化合物の非存在下または存在下において細胞をLPS(5μg/mL)およびIFN-γ(100 U/mL)で刺激する(全ての処理は6回反復する)。細胞をさらに24時間インキュベーションし、NOおよびサイトカインを測定するために、各ウェルから細胞を含まない培養上清を回収する。残りの細胞をクリスタルバイオレッドまたはMTSで染色して、細胞の生存度に対する試験化合物の影響を測定する。
【０２１６】
4.  NO産生
刺激後、NOと分子状酸素の安定な反応生成物であるNO2について培養上清をアッセイすることによってNOの産生を測定する。簡単に説明すると、100μLの培養上清を当容量のグリース試薬と室温において10分間反応させる。550 nmにおける吸光度を測定する。全ての測定は6回実施する。NO2の濃度は、NaNO2を使用して作製した標準曲線と比較することによって算出する。
【０２１７】
5.  ウェスタンブロット分析
阻害剤の存在下において示した刺激と共にインキュベーション後、細胞(2連の試料、2×106細胞/6ウェルプレート)をPBSで洗浄し、60μLの溶解緩衝液で氷上で溶解する。各試料のタンパク質含有量はブラッドフォードタンパク質アッセイキット(Bio-Rad、Richmond、CA)を使用して測定する。Beckman DU530分光光度計(Palo Alto、CA)を用いて750 nmの吸光度を測定する。タンパク質を45×SDS試料緩衝液と混合する。8%ビス-アクリルアミドを含む分離ゲルを使用するSDS-PAGEによるタンパク質の分離後、100Vにおいて1.5時間MiniProtean(商標)III Cell(Bio-Rad)を使用してタンパク質をゲルからPVDF膜に移す。製造業者の仕様(Transduction Laboratories)により、等量のタンパク質(5μg)をSDS-PAGEゲルにロードし、抗アクチン、抗iNOS、抗COX-2マウスモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析によって調査する。5%ブロッキング緩衝液(5% NFM/TTBS)中の一次抗体をブロットと共に4℃において2時間または終夜インキュベーションし、次にペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベーションする。化学発光基質を使用して陽性バンドを明らかにする。バンドをX線フィルムに露出する。フィルムを使用して、種々の対照と比較したときの、iNOSおよびCOX-2の発現に対する阻害剤の影響並びにタンパク質ローディングを制御し、タンパク質産生に対する任意の非特異的な影響を検出するための「ハウスキーピング」タンパク質(アクチン)濃度を分析する。バイオラド(Biorad)社製のMulti-Analyst(商標)/PCシステムを使用して、フィルム上の発現タンパク質のバンドを定量する。このバージョンのMulti-AnalystをBio-Rad Gel Doc 1000(商標)画像形成システムと共に使用する。白色光を選択光源として選択したので、シグナル強度はOD(光学密度)単位で測定される。各バンドのODは、ゲルの全体的なバックグラウンド領域が差し引かれている。
【０２１８】
C.  インビトロにおける血管形成
0.5% FCSを添加したM199中で24時間培養したHUVEC細胞を、0.5% FCSを添加したM199中で、300μLのMatrigel(10.7 mg/mL、Becton Dickinson)を事前コーティングした12ウェルプレートで、VEGE(1 ng/mL)の存在下および陽性対照(Z)-3-[2,4-ジメチル-5-(2-オキソ-1,2-ジヒドロインドール-3-イリデンメチル)-1H-ピロール-3-イル]プロピオン酸または種々の阻害剤の非存在下または存在下において6×105細胞/ウェルで平板培養する。37℃、5%CO2加湿雰囲気下において5時間インキュベーション後、倒立光学顕微鏡を使用して細胞の三次元組織化を調査する。細胞をクリスタルバイオレット(20%エタノール中0.05%)で固定して、デジタル写真を撮影する。
【０２１９】
D. マウスIL-6の酵素イムノアッセイ法
抗マウスIL-6 AbペアおよびマウスrIL-6標準(PharMingen)を使用して開発したファーミンジェンのOptEIA ELISAセットでIL-6レベルを測定する。Maxisorp F16マルチウェルストリップ(Nunc、Roskilde、Denmark)に、抗マウスIL-6捕獲Ab(推奨濃度)の0.1 M NaHCO3、pH9.5溶液、100μL/ウェルを4℃において終夜コーティングする。プレートを0.05% Tween 20のPBS溶液(PBST)で3回洗浄し、10% FCSのPBS溶液(ブロッキングおよび希釈緩衝液)の200μL/ウェルで周囲温度において1時間ブロックする。プレートをPBSTで3回洗浄し、2連の試料(100μL/ウェル)または標準(100μL/ウェル)を希釈緩衝液に加えたものを周囲温度において2時間インキュベーションする。プレートをPBSTで5回洗浄し、ビオチン化抗マウスIL-6およびアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体(製造業者が推奨する濃度)と共に周囲温度において1時間インキュベーションする。プレートをPBSTで7回洗浄し、3,3',5,5'テトラメチルベンジジン基質溶液(TMB基質試薬セット、BD PharMingen)の100μLを各ウェルに添加する。周囲温度で15〜30分間インキュベーション後、2N H2SO4(Sigma)50μLを添加することによって呈色を停止する。EL 312eマイクロプレートリーダー等で450 nmの吸光度を読む。IL-6の検出下限は15.6 pg/mLである。
【０２２０】
実施例13
NIDDMモデル
本発明の式(I)または式(Ia)の化合物によるインビボにおける経口治療により、糖尿病のいくつかのげっ歯類モデルにおいて有意なグルコースの低下が生じる。db/dbマウスでは、本発明の化合物の経口投与は高血糖の有意な矯正を誘発した。ストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウスモデルでは、化合物はインスリンのグルコース低下作用を賦活する。
【０２２１】
正常ラットでは、糖投与後にインスリン放出が有意に低下する経口糖耐性を改善する。構造的に関連のある不活性な類似物は、db/dbマウスにおいてインスリン受容体活性化またはグルコース低下に効果がない。
【０２２２】
本願において言及されているおよび/または出願データシートに掲載されている米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および特許以外の文献は全て、全体の内容が参照として本明細書に組み入れられている。
【０２２３】
本発明の具体的な態様は例示のために本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改良を加えることができることは上記から、考慮される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いて限定されない。
【配列表】
2005535593000001.app
【国際調査報告】
2005535593.tif 000038
2005535593.tif 000039
2005535593.tif 000040
2005535593.tif 000041
2005535593.tif 000042
2005535593.tif 000043