(57)【要約】  複数のポリペプチドを迅速に生成および分析する方法が開示される。より具体的には、個々の免疫原性効果を測定するために、ポリペプチドのライブラリーおよびアレイをアッセイする。ポリペプチドの免疫原性効果に基づいて、特定のサブユニットワクチンを開発することができる。
2005515754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法であって、以下の：
（ａ）転写的に活性でない増幅コード配列を提供する為に、前記標的生物由来の所望のポリヌクレオチド配列を増幅することが可能な第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施する工程、
（ｂ）前記増幅コード配列に転写活性を付与する少なくとも１つのヌクレオチド配列を付加することが可能な第２のＰＣＲヌクレオチドプライマー対を提供する工程、
（ｃ）転写的に活性なコード配列の増幅をもたらす為に、前記第２のプライマー対および前記増幅コード配列を用いて第２のＰＣＲ反応を実施する工程、
（ｄ）前記転写的に活性なコード配列のポリペプチドを発現させる工程、
（ｅ）前記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なる第１のプライマー対を用いて、工程（ａ）〜工程（ｄ）を少なくとも１０回繰り返す工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）〜工程（ｄ）は少なくとも２０回繰り返される、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）〜工程（ｄ）は少なくとも１００回繰り返される、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）〜工程（ｄ）は約２６６回繰り返される、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項５】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項６】
リンカー分子を操作可能にコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を、前記増幅コード配列または前記転写的に活性なコード配列に付加することをさらに含む方法であって、前記リンカー分子は前記ポリヌクレオチドを固体支持体に固定化する、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項７】
前記転写的に活性なコード配列およびリンカー分子を操作可能にコードするポリヌクレオチド配列を発現させることにより、リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドを生じさせる、請求項６に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項８】
前記リンカー分子はエピトープである、請求項７に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項９】
前記リンカー分子は、６×、７×、８×、９×および１０×ｈｉｓ−タグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ、Ｆｌａｇタグ、ならびにＨＡタグからなる群から選択される、請求項７に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項１０】
前記転写活性を付与する少なくとも１つの配列はプロモーター配列である、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項１１】
前記転写活性を付与する少なくとも１つの配列はターミネーター配列である、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項１２】
自動化システムを用いて前記第１のプライマー対を設計することをさらに含む、請求項
１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項１３】
前記第１のＰＣＲ反応は自動化システムを用いて実施される、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項１４】
前記第２のＰＣＲ反応は自動化システムを用いて実施される、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項１５】
前記転写的に活性なコード配列は自動化システムを用いて発現される、請求項１に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項１６】
体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の：
請求項７に記載の方法により調製されるリンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供する工程、
少なくとも１０個の前記標的生物ポリペプチドを固体支持体に固定化する工程、および
体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つの抗体を用いて前記ポリペプチドをアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項１７】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項１６に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項１８】
細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の：
請求項１に記載の方法により標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供する工程、
少なくとも１０個の前記標的生物ポリペプチドを複数の抗原提示細胞に供給する工程、および
細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つのＴ細胞を用いて前記抗原提示細胞をアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項１９】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項１８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項２０】
前記抗原提示細胞はＢ細胞である、請求項１８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項２１】
前記抗原提示細胞はマクロファージである、請求項１８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項２２】
前記抗原提示細胞は樹状細胞である、請求項１８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項２３】
標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の：
請求項１６に記載の方法により同定される、免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供する工程、
前記抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも１つの他
の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与する工程、および
前記被験体における前記抗原または該抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項２４】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項２３に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項２５】
標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の：
請求項１８に記載の方法により同定される免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供する工程、
前記抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも１つの他の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与する工程、および
前記被験体における前記抗原または該抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項２６】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項２５に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項２７】
標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の：
請求項１６に記載の方法により免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供する工程、
前記核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも１つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入する工程、および
前記被験体における前記核酸または該核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項２８】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項２７に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項２９】
標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の：
請求項１８に記載の方法により免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供する工程、
前記核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも１つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入する工程、および
前記被験体における前記核酸または核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項３０】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項２９に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項３１】
請求項１により調製される少なくとも２０個の標的生物ポリペプチドのアレイ。
【請求項３２】
細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法であって、以下の：
請求項３１に記載の標的生物ポリペプチドの前記アレイを提供する工程、
少なくとも１０個の前記標的生物ポリペプチドを複数の抗原提示細胞に供給する工程、
および
細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つのＴ細胞を用いて前記抗原提示細胞をアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
【請求項３３】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項３２に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
【請求項３４】
前記抗原提示細胞はＢ細胞である、請求項３２に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
【請求項３５】
前記抗原提示細胞はマクロファージである、請求項３２に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
【請求項３６】
前記抗原提示細胞は樹状細胞である、請求項３２に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
【請求項３７】
標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の：
請求項３２に記載の方法により同定される、免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供する工程、
前記抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも１つの他の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与する工程、および
前記被験体における前記抗原または前記抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項３８】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項３７に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項３９】
標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の：
請求項３２に記載の方法により免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供する工程、
前記核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも１つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入する工程、および
前記被験体における前記核酸または前記核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項４０】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項３９に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項４１】
請求項７により調製されるリンカー分子に結合された少なくとも２０個の標的生物ポリペプチドのアレイ。
【請求項４２】
体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法であって、以下の：
請求項４１に記載の方法により調製されるリンカー分子に結合された標的生物ウイルスポリペプチドのアレイを提供する工程、
少なくとも１０個の前記標的生物ポリペプチドを固体支持体に固定化する工程、および
体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つの抗体を用いて前記ポリペプチドをアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
【請求項４３】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項４２に記載の標的生物ポリペプチドのアレイをスクリーニングする方法。
【請求項４４】
標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の：
請求項４２に記載の方法により同定される、免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供する工程、
前記抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも１つの他の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与する工程、および
前記被験体における前記抗原または前記抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項４５】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項４４に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項４６】
標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法であって、以下の：
請求項４２に記載の方法により免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供する工程、
前記核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも１つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入する工程、および
前記被験体における前記核酸または前記核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングする工程、
を含む標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項４７】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項４６に記載の標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法。
【請求項４８】
請求項１に記載の方法を実施することが可能な自動化システム。
【請求項４９】
複数の別個の位置を含むアレイであって、標的生物由来の異なるポリペプチドが各位置に配置され、前記標的生物由来の発現ポリペプチド全体の少なくとも約５０％が前記アレイ上に配置されるアレイ。
【請求項５０】
前記標的生物由来の発現ポリペプチド全体の少なくとも約７５％が前記アレイ上に配置される、請求項４９に記載のアレイ。
【請求項５１】
前記標的生物由来の発現ポリペプチド全体の約１００％が前記アレイ上に配置される、請求項４９に記載のアレイ。
【請求項５２】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項４９に記載のアレイ。
【請求項５３】
前記配置されるポリペプチドは、６×、７×、８×、９×または１０×ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ、ならびにＦｌａｇタグからなる群から選択されるリンカー分子に結合される、請求項４９に記載のアレイ。
【請求項５４】
前記配置されるポリペプチドは前記別個の位置に結合される、請求項５３に記載のアレイ。
【請求項５５】
前記アレイは複数のサブアレイを含む、請求項４９に記載のアレイ。
【請求項５６】
前記サブアレイはマイクロタイタープレートである、請求項５５に記載のアレイ。
【請求項５７】
前記マイクロタイタープレートは９６ウェルプレートである、請求項５６に記載のアレイ。
【請求項５８】
標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法であって、以下の：
（ａ）前記標的生物由来の所望の核酸コード配列を、該コード配列を第１のアダプター配列および第２のアダプター配列と隣接させることによりベクターにＰＣＲクローニングする工程であって、前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列はＰＣＲにより付加されることを特徴とし、
（ｂ）宿主細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えにより、前記コード配列が、前記ベクターに組み込まれるような条件下で、前記宿主細胞内の前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列に相同的な配列を有する前記ベクターと前記コード配列とを接触させる工程と、
（ｃ）前記コード配列によりコードされる前記ポリペプチドを発現させる工程と、
（ｄ）前記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なるコード配列を用いて、工程（ａ）〜工程（ｃ）を少なくとも１０回繰り返す工程と、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項５９】
工程（ａ）〜工程（ｄ）は約２６６回繰り返される、請求項５８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項６０】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項５８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項６１】
前記標的生物は炭疽菌(B. anthracis)である、請求項５８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項６２】
前記標的生物は野兎病菌(Francisella tularensis)である、請求項５８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項６３】
前記標的生物は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)である、請求項５８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項６４】
前記標的生物は結核菌(Mycobacterium tuberculosis)である、請求項５８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項６５】
リンカー分子を操作可能にコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を、前記標的生物由来の前記核酸コード配列に付加することをさらに含む方法であって、前記リンカー分子は前記発現されるポリヌクレオチドを固体支持体に固定化する、請求項５８に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項６６】
前記所望の核酸コード配列およびリンカー分子を操作可能にコードするポリヌクレオチド配列を発現させることにより、リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドを生じさせる、請求項６５に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項６７】
体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の：
請求項６６に記載の方法により調製されるリンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供する工程、
少なくとも１０個の前記標的生物ポリペプチドを固体支持体に固定化する工程、および
体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つの抗体を用いて前記ポリペプチドをアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項６８】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項６７に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項６９】
前記標的生物は炭疽菌(B. anthracis)である、請求項６７に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７０】
前記標的生物は野兎病菌(Francisella tularensis)である、請求項６７に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７１】
前記標的生物は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)である、請求項６７に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７２】
前記標的生物は結核菌(Mycobacterium tuberulosis)である、請求項６７に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７３】
細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の：
請求項５８に記載の方法により標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供する工程、
少なくとも１０個の前記標的生物ポリペプチドを複数の抗原提示細胞に供給する工程、および
細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定する為に、前記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つのＴ細胞を用いて前記抗原提示細胞をアッセイする工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７４】
前記標的生物はワクシニアウイルスである、請求項７３に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７５】
前記標的生物は炭疽菌(B. anthracis)である、請求項７３に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７６】
前記標的生物は野兎病菌(Francisella tularensis)である、請求項７３に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７７】
前記標的生物は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)である、請求項７３に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７８】
前記標的生物はマイコバクテリウム属である、請求項７３に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法。
【請求項７９】
標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法であって、以下の：
（ａ）所望のポリヌクレオチドコード配列を増幅することが可能な第１のプライマー対を用いてＰＣＲを実施することにより、前記標的生物由来の前記所望のポリヌクレオチドコード配列を増幅する工程、
（ｂ）前記増幅ポリヌクレオチドコード配列を発現させる工程、
（ｃ）前記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なる第１のプライマー対を用いて、工程（ａ）〜工程（ｂ）を少なくとも１０回繰り返す工程、
を含む標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【請求項８０】
前記ＰＣＲ反応は、以下の：
（ａ）転写的に活性でない増幅コード配列を提供する為に、前記標的生物由来の所望のポリヌクレオチド配列を増幅することが可能な第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施する工程、
（ｂ）前記増幅コード配列に転写活性を付与する少なくとも１つのヌクレオチド配列を付加することが可能な第２のＰＣＲヌクレオチドプライマー対を提供する工程、
（ｃ）転写的に活性なコード配列の増幅をもたらす為に、前記第２のプライマー対および前記増幅コード配列を用いて第２のＰＣＲ反応を実施する工程、
を含む、請求項７９に記載の標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［省益の主張］
米国政府は、Naval Medical Research CenterによりＣＲＡＤＡ  ＮＣＲＡＤＡ−ＮＭＲ−０１−１０３７の条件により提供されるように政府により、または政府の利益になるように世界中で本発明を実施するか、あるいは実施された本発明を有する非独占的取消不能払込済みライセンスを有する。
【０００２】
本発明は、複数のポリペプチドを迅速に生成および分析する方法に関する。より具体的には、個々の免疫原性効果を測定するために、ポリペプチドをアッセイすることができる。ポリペプチドの免疫原性効果をモニタリングすることにより、当業者は特定のサブユニットワクチンを開発することが可能である。
【背景技術】
【０００３】
伝統的なワクチン技術は、それが種々の宿主において様々な度合いの反応原性(reactogenicity)を生じることが多いという問題に悩まされている。全体的な健康に対する懸念およびバイオテロリズムの高まる脅威を考慮すると、多数のかつ遺伝的に多様な宿主に適切な免疫応答を誘発することが可能なサブユニットワクチンを開発する必要がある。このアプローチは、多数の特定の抗原性ポリペプチドの同定を必要とする。ワクチンまたは任意の組換え型サブユニットワクチンを開発する際の最も困難な作業の１つが、特に病原体のゲノムが大きい場合に、特定の病原体に対して最も有効な免疫応答を促すことができる抗原を同定することである。
【０００４】
例として、天然痘は、その高い致死率および伝染性のために、今では最も深刻なバイオテロリストの脅威の１つである。何世紀にもわたって、天然に存在する天然痘は、その３０％以上の致死率およびその任意の気候および季節で蔓延する能力で、すべての感染疾患うちで最も壊滅的なものの１つとして全世界的に恐れられてきた。ワクチンとしてワクシニアウイルスを使用することにより、天然に存在する天然痘の世界的な根絶が可能となった。天然痘の最後の天然に存在した事例は、１９７７年にソマリアで見られた。１９８０年５月に、この世界から天然に存在する天然痘がなくなったことを世界保健総会は認証した。米国での日常的なワクチン接種は１９７１年に終了し、いくらかの軍人および研究室労働者を除いて、１９８３年以来ワクチン接種したものはいない。しかしながら、テロリズムの兵器として使用される天然痘の現在の脅威により、大量のワクチン接種が再度最前線に現れる可能性がある。
【０００５】
不運にも、天然痘ワクチンとしてのワクシニアウイルスの使用は、天然痘根絶キャンペーン全体にわたって、１９８０年代の一般市民におけるワクチン接種の中止まで、２５年前の技術を用いて製造されてきた。この技術は、生ワクチン付与体(vaccinifer)からウイルス含有物質を収集することを含む。この製造方法の安全性の記録が証明されているにもかかわらず、様々な度合いの反応原性がワクチン受容体で報告されている。現代では、大衆のワクチン接種が重要な目的であり得るが、おそらく免疫抑制疾患がより一層流行する場合、生ウイルスの感染特性のないワクチンがより一層重要である。病原体の免疫活性化ポリペプチドの完全な領域の理解が、より有効なワクチンを開発する重要な第一歩となる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施の形態は、標的生物のポリペプチドのライブラリーを作製する方法である。本方法は以下の：（ａ）該標的生物由来の所望のポリヌクレオチド配列を増幅することが可能な第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施する工程であって、それにより転写的に活性でない増幅コード配列を提供する、実施する工程と、（ｂ）該増幅コード配列に転写活性を付与する少なくとも１つのヌクレオチド配列を付加することが可能な第２のＰＣＲヌクレオチドプライマー対を提供する工程と、（ｃ）該第２のプライマー対および該増幅コード配列を用いて第２のＰＣＲ反応を実施する工程であって、それにより転写的に活性なコード配列の増幅をもたらす、実施する工程と、（ｄ）該転写的に活性なコード配列のポリペプチドを発現させる工程と、（ｅ）上記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なる第１のプライマー対を用いて、工程（ａ）〜工程（ｄ）を少なくとも１０回繰り返す工程とを含む。他の実施形態では、工程（ａ）〜工程（ｄ）は、上記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なる第１のプライマー対を用いて、少なくとも約１０回、約２０回、約３０回、約４０回、約５０回、約６０回、約７０回、約８０回、約９０回、約１００回、約１１０回、約１２０回、約１３０回、約１４０回、１５０回、約１６０回、約１７０回、約１８０回、約１９０回、約２００回、約２１０回、約２２０回、約２３０回、約２４０回、約２５０回、約２６０回、約２６６回、約３００回、約３５０回、約４００回、約４５０回、約５００回、約５５０回、約６００回、約６５０回、約７００回、約７５０回、約８００回、約８５０回、約９００回、約９５０回、約１，０００回、約１，０５０回、約１，１００回、約１，１５０回、約１，２００回、約１，２５０回、約１，３００回、約１，３５０回、約１，４００回、約１，４５０回、約１，５００回、約１，６００回、約１，７００回、約１，８００回、約１，９００回、約２，０００回、約２，５００回、約３，０００回、約３，５００回、約４，０００回、約４，５００回、約５，０００回、約６，０００回、約７，０００回、約８，０００回、約９，０００回、約１０，０００回、約１５，０００回、約２０，０００回、約２５，０００回、約３０，０００回またはそれ以上繰り返され得る。
【０００７】
標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法は、リンカー分子を操作可能にコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を、上記増幅コード配列または上記転写的に活性なコード配列に付加することをさらに含むことができ、ここで上記リンカー分子は上記ポリヌクレオチドを固体支持体に固定化する。他の実施形態では、上記転写的に活性なコード配列および上記リンカー分子を操作可能にコードするポリヌクレオチド配列を発現させることで、リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドを生じる。一実施形態では、上記リンカー分子は、エピトープ、例えばＨＡエピトープであり得る。他のリンカー分子としては、例えば６×、７×、８×、９×または１０×ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ、Ｆｌａｇタグ等であり得る。
【０００８】
他の実施形態では、上記転写活性を付与する少なくとも１つの配列は、プロモーター配列、ターミネーター配列等である。
【０００９】
他の実施形態は、本明細書中で議論する方法を実施することが可能である自動化システムに関する。例えば、自動化システムは、上記第１のプライマー対を設計すること、上記第１のＰＣＲ反応を実施すること、上記第２のＰＣＲ反応を実施すること、上記転写的に活性なコード配列を発現すること等に使用することができる。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態は、体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法に関する。上記方法は、リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供すること、少なくとも約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個
、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２６６個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１，０００個、約１，０５０個、約１，１００個、約１，１５０個、約１，２００個、約１，２５０個、約１，３００個、約１，３５０個、約１，４００個、約１，４５０個、約１，５００個、約１，６００個、約１，７００個、約１，８００個、約１，９００個、約２，０００個、約２，５００個、約３，０００個、約３，５００個、約４，０００個、約４，５００個、約５，０００個、約６，０００個、約７，０００個、約８，０００個、約９，０００個、約１０，０００個、約１５，０００個、約２０，０００個、約２５，０００個、約３０，０００個またはそれ以上のポリペプチドを固体支持体に固定化すること、および上記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つの抗体を用いて上記ポリペプチドをアッセイすることであって、それにより体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定することを含むことができる。
【００１１】
さらなる実施形態は、細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法に関する。上記方法は、例えば、標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供すること、少なくとも約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２６６個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１，０００個、約１，０５０個、約１，１００個、約１，１５０個、約１，２００個、約１，２５０個、約１，３００個、約１，３５０個、約１，４００個、約１，４５０個、約１，５００個、約１，６００個、約１，７００個、約１，８００個、約１，９００個、約２，０００個、約２，５００個、約３，０００個、約３，５００個、約４，０００個、約４，５００個、約５，０００個、約６，０００個、約７，０００個、約８，０００個、約９，０００個、約１０，０００個、約１５，０００個、約２０，０００個、約２５，０００個、約３０，０００個またはそれ以上の標的生物ポリペプチドを複数の抗原提示細胞に供給すること、および上記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つのＴ細胞を用いて上記抗原提示細胞をアッセイすることであって、それにより細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定することを含むことができる。ある特定の実施形態では、上記抗原提示細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞等であり得る。
【００１２】
他の実施形態は、標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法に関する。本方法は、体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供すること、該抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも１つの他の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与すること、および該被験体における該抗原または該抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングすることを含む。
【００１３】
別の実施形態において、細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を提供することにより標的生物に対するサブユニットワクチン開発される。本方法は、該抗原を、単独であるいは免疫応答を誘発することが可能である少なくとも１つの他の標的生物抗原と組み合わせて被験体に投与すること、および該被験体における該抗原または該抗原の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングすることを含む。
【００１４】
さらなる実施形態は、標的生物に対するサブユニットワクチンを開発する方法に関する
。本方法は、体液性免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供すること、該核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも１つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入すること、および該被験体における該核酸または核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングすることを含む。
【００１５】
標的生物に対するサブユニットワクチンを開発するさらなる方法は、細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能であると同定された標的生物抗原を操作可能にコードする核酸配列を提供すること、該核酸配列を、単独であるいは標的生物抗原を発現することが可能である少なくとも１つの他の核酸と組み合わせて被験体に導入すること、および該被験体における該核酸または核酸の組合せに対する免疫応答の発生をモニタリングすることを含み得る。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、少なくとも約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２６６個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１，０００個、約１，０５０個、約１，１００個、約１，１５０個、約１，２００個、約１，２５０個、約１，３００個、約１，３５０個、約１，４００個、約１，４５０個、約１，５００個、約１，６００個、約１，７００個、約１，８００個、約１，９００個、約２，０００個、約２，５００個、約３，０００個、約３，５００個、約４，０００個、約４，５００個、約５，０００個、約６，０００個、約７，０００個、約８，０００個、約９，０００個、約１０，０００個、約１５，０００個、約２０，０００個、約２５，０００個、約３０，０００個またはそれ以上の標的生物ポリペプチドのアレイに関する。上記アレイは、細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドをスクリーニングするのに使用することができる。上記方法は、標的生物ポリペプチドのアレイを提供すること、少なくとも約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２６６個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１，０００個、約１，０５０個、約１，１００個、約１，１５０個、約１，２００個、約１，２５０個、約１，３００個、約１，３５０個、約１，４００個、約１，４５０個、約１，５００個、約１，６００個、約１，７００個、約１，８００個、約１，９００個、約２，０００個、約２，５００個、約３，０００個、約３，５００個、約４，０００個、約４，５００個、約５，０００個、約６，０００個、約７，０００個、約８，０００個、約９，０００個、約１０，０００個、約１５，０００個、約２０，０００個、約２５，０００個、約３０，０００個またはそれ以上の標的生物ポリペプチドを複数の抗原提示細胞に供給すること、および上記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つのＴ細胞を用いて上記抗原提示細胞をアッセイすることであって、それにより細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定することを含むことができる。上記抗原提示細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞等であり得る。
【００１７】
さらなる実施形態はまた、リンカー分子に結合された少なくとも約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、１５０個、約１６０個、約１７０
個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２６６個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１，０００個、約１，０５０個、約１，１００個、約１，１５０個、約１，２００個、約１，２５０個、約１，３００個、約１，３５０個、約１，４００個、約１，４５０個、約１，５００個、約１，６００個、約１，７００個、約１，８００個、約１，９００個、約２，０００個、約２，５００個、約３，０００個、約３，５００個、約４，０００個、約４，５００個、約５，０００個、約６，０００個、約７，０００個、約８，０００個、約９，０００個、約１０，０００個、約１５，０００個、約２０，０００個、約２５，０００個、約３０，０００個またはそれ以上の標的生物ポリペプチドのアレイに関する。上記アレイは、体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために、標的生物ポリペプチドをスクリーニングするのに使用することができる。上記方法は、リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドのアレイを提供すること、少なくとも１０個の標的生物ポリペプチドを固体支持体に固定化すること、および上記標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つの抗体を用いて上記ポリペプチドをアッセイすることであって、それにより体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定することを含むことができる。
【００１８】
さらなる実施形態は、複数の別個の位置を含むアレイに関し、ここで標的生物由来の異なるポリペプチドが各位置に配置され、上記標的生物由来の発現ポリペプチドすべての少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が上記アレイ上に配置される。アレイは、任意の標的生物由来の異なる発現ポリペプチドを含むことができる。本発明のある特定の実施形態では、ワクシニアウイルスが標的生物である。他の実施形態では、例えば、炭疽菌(B. anthracis)、ボツリヌス菌(Clostridium botulism)、ペスト菌(Yersinia pestis)、大痘瘡(Variola major)、野兎病菌(Francisella tularensis)、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、連鎖球菌属(Streptococcus)、ライム病菌(Borrelia burgdorferi)、トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ウイルス性出血熱の原因となる病原体、エボラ(Ebola)、マールブルグ(Marburg)、ポックスウイルス(pox viruses)、アレナウイルス(Arenaviruses)、ＬＣＭ、フニンウイルス(Junin virus)、マチュポウイルス(Machupo virus)、グアナリトウイルス(Guanarito virus)、ブンヤウイルス(Bunyaviruses)、ハンタウイルス(Hantaviruses)、フラビウイルス(Flaviviruses)、デング熱ウイルス(Dengue virus)、フィロウイルス(Filoviruses)、Ｑ熱リケッチア(Coxiella burnetti)、ブルセラ(Brucella)種、鼻疽菌(Burkholderia mallei)、トウゴマ(Ricinus communis)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)および他のリケッチア属(Rickettsias)、食物および水媒介性病原体、下痢原性大腸菌(Diarrheagenic E. coli)、病原性ビブリオ属(Pathogenic Vibrios)、赤痢菌属(Shigella)種、サルモネラ属(Salmonella)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、カリチウイルス(Caliciviruses)、Ａ型肝炎原生動物(Hepatitis A Protozoa)、クリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum)、シクロスポラ・カヤタネンシス(Cyclospora cayatanesis)、ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、トキソプラスマ属(Toxoplasma)、微胞子虫類(Microsporidia)、ウイルス性脳炎(Viral encephalitides)、西ナイルウイルス(West Nile Virus)、ラクロセウイルス(LaCrosse virus)、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス(Japanese Encephalitis Virus)、キャサヌール森林ウイルス(Kyasanur Forest Virus)、ニパウイルス(Nipah virus)、ダニ媒介出血熱ウイルス(Tickborne hemorrhagic fever viruses)、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス(Crimean-Congo Hemorrhagic fever virus)、ダニ媒介脳炎ウイルス(
Tickborne encephalitis viruses)、多剤耐性ＴＢ、狂犬病ウイルス(Rabies virus)、リフトバレー熱ウイルス(Rift Valley Fever virus)、ラッサ熱ウイルス(Lassa Fever virus)、インフルエンザウイルス(Influenza virus)、ならびに黄熱病ウイルス(Yellow fever
virus)等を含む病原体であり得る。アレイ中のポリペプチドは、無数の様式（例えば、溶液中に懸濁されているか、またはアレイに結合されている）で配置させることができる。さらに、配置されるポリペプチドは、例えば６×、７×、８×、９×または１０×ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ、またはＦｌａｇタグからなる群から選択されるリンカー分子に結合され得る。リンカー分子を伴い配置されたポリペプチドは、アレイに結合され得る。
【００１９】
さらなる実施形態は、標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法であって、以下の：（ａ）該標的生物由来の所望の核酸コード配列を、該コード配列を第１のアダプター配列および第２のアダプター配列と隣接させることによりベクターにＰＣＲクローニングする工程であって、該第１のアダプター配列および第２のアダプター配列はＰＣＲにより付加されることを特徴とし、（ｂ）宿主細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えにより、該コード配列が、前記ベクターに組み込まれるような条件下で、宿主細胞内の該第１のアダプター配列および第２のアダプター配列に相同的な配列を有する前記ベクターと該コード配列とを接触させる工程と、（ｃ）該コード配列によりコードされるポリペプチドを発現させる工程と、（ｄ）上記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なるコード配列を用いて、工程（ａ）〜工程（ｃ）を少なくとも１０回繰り返す工程とを含む標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製する方法に関する。
【００２０】
他の実施形態では、工程（ａ）〜工程（ｃ）は、上記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なるコード配列を用いて、少なくとも約１０回、約２０回、約３０回、約４０回、約５０回、約６０回、約７０回、約８０回、約９０回、約１００回、約１１０回、約１２０回、約１３０回、約１４０回、１５０回、約１６０回、約１７０回、約１８０回、約１９０回、約２００回、約２１０回、約２２０回、約２３０回、約２４０回、約２５０回、約２６０回、約２６６回、約３００回、約３５０回、約４００回、約４５０回、約５００回、約５５０回、約６００回、約６５０回、約７００回、約７５０回、約８００回、約８５０回、約９００回、約９５０回、約１，０００回、約１，０５０回、約１，１００回、約１，１５０回、約１，２００回、約１，２５０回、約１，３００回、約１，３５０回、約１，４００回、約１，４５０回、約１，５００回、約１，６００回、約１，７００回、約１，８００回、約１，９００回、約２，０００回、約２，５００回、約３，０００回、約３，５００回、約４，０００回、約４，５００回、約５，０００回、約６，０００回、約７，０００回、約８，０００回、約９，０００回、約１０，０００回、約１５，０００回、約２０，０００回、約２５，０００回、約３０，０００回またはそれ以上繰り返され得る。
【００２１】
標的生物は、例えば、炭疽菌、ボツリヌス菌、ペスト菌、大痘瘡、野兎病菌、熱帯熱マラリア原虫、連鎖球菌属、ライム病菌、トラコーマクラミジア、ヘリコバクター・ピロリ、結核菌、ウイルス性出血熱の原因となる病原体、エボラ、マールブルグ、ポックスウイルス、アレナウイルス、ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ブンヤウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、デング熱ウイルス、フィロウイルス、Ｑ熱リケッチア、ブルセラ種、鼻疽菌、トウゴマ、ウェルシュ菌、ブドウ球菌属、発疹チフスリケッチアおよび他のリケッチア属、食物および水媒介性病原体、下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ属、赤痢菌属種、サルモネラ属、リステリア菌、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリティカ、カリチウイルス、Ａ型肝炎原生動物、クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カヤタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラスマ属、微胞子虫類、ウイルス性脳炎、西ナイルウイルス、ラクロセウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス
、ニパウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、多剤耐性ＴＢ、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、インフルエンザウイルス、ならびに黄熱病ウイルス等を含む病原体であり得る。
【００２２】
さらなる方法は、リンカー分子を操作可能にコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を、上記標的生物由来の上記核酸コード配列に付加することに関し、ここで上記リンカー分子は、上記発現されるポリペプチドを固体支持体に固定化する。さらに、上記所望の核酸コード配列および上記リンカー分子を操作可能にコードするポリヌクレオチド配列を発現させる方法は、リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドを生じる。
【００２３】
さらなる方法は、体液性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすることに関し、以下の：リンカー分子に結合された標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供すること、少なくとも１０個の該標的生物ポリペプチドを固体支持体に固定化すること、および該標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つの抗体を用いて該ポリペプチドをアッセイすることであって、それにより体液性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定することを含み得る。
【００２４】
さらなる実施形態は、細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である標的生物抗原を同定するために標的生物ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法であって、以下の：標的生物ポリペプチドのライブラリーを提供すること、少なくとも１０個の該標的生物ポリペプチドを複数の抗原提示細胞に供給すること、および該標的生物由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物からの少なくとも１つのＴ細胞を用いて該抗原提示細胞をアッセイすることであって、それにより細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能な標的生物抗原を同定することを含む方法に関する。
【００２５】
さらなる方法は、標的生物ポリペプチドのライブラリーを作製することであって、以下の：（ａ）所望のポリヌクレオチドコード配列を増幅することが可能な第１のプライマー対を用いてＰＣＲを実施することにより、該標的生物由来の該所望のポリヌクレオチドコード配列を増幅する工程と、（ｂ）該増幅ポリヌクレオチドコード配列を発現させる工程と、上記標的生物の異なるポリペプチドを発現するための異なる第１のプライマー対を用いて、工程（ａ）〜工程（ｂ）を少なくとも１０回繰り返す工程とに関する。
【００２６】
上記ＰＣＲ反応は、以下の：（ａ）転写的に活性でない増幅コード配列を提供する為に、上記標的生物由来の所望のポリヌクレオチド配列を増幅することが可能な第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施すること、（ｂ）該増幅コード配列に転写活性を付与する少なくとも１つのヌクレオチド配列を付加することが可能な第２のＰＣＲヌクレオチドプライマー対を提供すること、（ｃ）転写的に活性なコード配列の増幅をもたらす為に、該第２のプライマー対および該増幅コード配列を用いて第２のＰＣＲ反応を実施すること、を含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は概して、標的生物のポリペプチドライブラリーを作製する方法、これらのポリペプチドの免疫原性効果をモニタリングする方法、抗原性ポリペプチドの同定に基づいて標的生物に対するサブユニットワクチン、薬学的組成物、および免疫原性組成物を開発する方法、ならびにこれらに関連したシステムに関する。さらに、本発明は、特定の標的生物に由来するポリペプチドのアレイに関する。さらに、本発明は、標的生物によりコードされるポリペプチドを発現し、上記ポリペプチドの免疫原性効果を測定することが可能な自動化システムに関する。
【００２８】
ポリペプチドライブラリー
標的生物
「標的生物」という用語は広く解釈されるべきであり、ヒトおよび他の霊長類または家畜のような哺乳類、細菌、真菌、原生動物、ウイルス等を含む任意の原核もしくは真核生物または細胞を包含する。ある特定の実施形態では、標的生物は、比較的大きなゲノムを有する病原体であり得る。標的生物の例としては、ワクシニアウイルス、炭疽菌、ボツリヌス菌、ペスト菌、大痘瘡、野兎病菌、熱帯熱マラリア原虫、連鎖球菌属、ライム病菌、トラコーマクラミジア、ヘリコバクター・ピロリ、結核菌、ウイルス性出血熱の原因となる病原体、エボラ、マールブルグ、ポックスウイルス、アレナウイルス、ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ブンヤウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、デング熱ウイルス、フィロウイルス、Ｑ熱リケッチア、ブルセラ種、鼻疽菌、トウゴマ、ウェルシュ菌、ブドウ球菌属、発疹チフスリケッチアおよび他のリケッチア属、食物および水媒介性病原体、下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ属、赤痢菌属種、サルモネラ属、リステリア菌、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリティカ、カリチウイルス、Ａ型肝炎原生動物、クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カヤタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラスマ属、微胞子虫類、ウイルス性脳炎、西ナイルウイルス、ラクロセウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ニパウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、多剤耐性ＴＢ、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、インフルエンザウイルス、ならびに黄熱病ウイルス等が挙げられる。
【００２９】
本発明はまた、自己免疫疾患により生み出される細胞を分析するのに使用することができる。自己免疫疾患により生み出される細胞によりコードされるポリペプチドを理解することにより、より効果的な治療を開発することができる。本発明で分析することができる自己免疫疾患の非排他的リストとしては、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、またはグレーヴズ病が挙げられる。したがって、幾つかの実施形態では、「標的生物」は、特定の自己免疫疾患により生み出される細胞型を包含することができる。さらに、「標的生物」は、例えば癌細胞、腫瘍細胞、および病変細胞を含む異常細胞型を包含することができる。
【００３０】
「ポリペプチド」という用語もまた広く解釈されるべきであり、コードされた産物における特定数のアミノ酸に限定されない。幾つかの実施形態では、「ポリペプチド」は、少なくとも約３個、４個、５個、６個、７個、８個またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。本発明による「ポリペプチド」は、例えば、天然に存在するポリペプチド、組換えポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、天然に存在するタンパク質、組換えタンパク質、断片、およびポリペプチド配列の変異体または類縁体等を包含する。
【００３１】
「アレイ」という用語は広く解釈されるべきであり、複数の異なるポリペプチドが保持、提示、配置、位置または支持される任意の配置を包含する。アレイとしては、マイクロタイタープレート（例えば、４８ウェル、９６ウェル、１４４ウェル、１９２ウェル、２４０ウェル、２８８ウェル、３３６ウェル、３８４ウェル、４３２ウェル、４８０ウェル、５７６ウェル、６７２ウェル、７６８ウェル、８６４ウェル、９６０ウェル、１０５６ウェル、１１５２ウェル、１２４８ウェル、１３４４ウェル、１４４０ウェル、または１５３６ウェルプレート）、チューブ、スライド、チップ、フラスコ、または任意の他の適切な実験室装置を挙げることができる。さらに、アレイはまた、複数のサブアレイを包含することができる。複数のサブアレイは、標的生物のポリペプチドを配置するのに２つ以上の配置が使用されるアレイを包含する。例えば、多重９６ウェルプレートは、複数のサブアレイおよび単一アレイを構成することができる。
【００３２】
同様に「ライブラリー」という用語は広く解釈されるべきであり、配列されようとそうでなかろうと、ポリペプチドの任意の非天然収集物を包含する。したがって、ライブラリーはアレイを包含するが、２つの用語は必ずしも同義ではない。
【００３３】
本発明の実施形態は、特定の標的生物からポリペプチドライブラリーを作製する方法を包含する。本発明は、任意の特定サイズのゲノムを有する任意の所定の標的生物から複数のポリペプチドを生成するのに使用することができる。本発明の他の実施形態では、標的生物は、そのゲノム中に５０個以上のヌクレオチドコード配列を有することができる。さらなる実施形態では、標的生物は、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１，０００個、約１，０５０個、約１，１００個、約１，１５０個、約１，２００個、約１，２５０個、約１，３００個、約１，３５０個、約１，４００個、約１，４５０個、約１，５００個、約１，６００個、約１，７００個、約１，８００個、約１，９００個、約２，０００個、約２，５００個、約３，０００個、約３，５００個、約４，０００個、約４，５００個、約５，０００個、約６，０００個、約７，０００個、約８，０００個、約９，０００個、約１０，０００個、約１５，０００個、約２０，０００個、約２５，０００個、約３０，０００個またはそれ以上のヌクレオチドコード配列を有するゲノムを有することができる。
【００３４】
ＴＡＰ技術
本発明のある特定の方法は、転写的に活性なポリメラーゼ連鎖反応（「ＴＡＰ」）の使用によりポリペプチドライブラリーを迅速に作製するのに有用である。ＴＡＰ技術を用いると、例えば１日未満で所定の特定の遺伝子を転写的に活性にさせ、発現の準備を完了させることができる。ＴＡＰ断片は、転写的に活性なコード配列を包含し、２つの用語は交換可能に使用することができる。ＴＡＰ断片は発現ベクターへのサブクローニングおよび細菌由来のプラスミドＤＮＡの精製を必要とせずに、任意の核酸トランスフェクション技法により動物細胞または組織に容易にトランスフェクトすることができるポリヌクレオチド断片を包含する。転写的に活性なＤＮＡ断片は、ネスト化したオリゴヌクレオチドプライマーおよび２つのＤＮＡ断片を用いて、任意の所定の遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により合成することができ、２つのＤＮＡ断片のうち１つは、活性な転写プロモーター配列を含み、もう１つは基本的な転写ターミネーター要素を含む。
【００３５】
ＴＡＰ断片およびそれらを作製する方法は、「転写的に活性なＤＮＡ断片を生成する方法(Method for generating transcriptionally active DNA fragments)」という表題の米国特許第６，２８０，９７７号に詳述されている。一実施形態では、ＴＡＰ断片を創出する方法は、ｉ）オリゴヌクレオチド設計工程、ｉｉ）ＴＡＰ一次断片増幅工程、およびｉｉｉ）ＴＡＰ発現断片増幅工程を組み込むことができる。図１は、ＴＡＰ断片を生成する方法の１つを示す。
【００３６】
ＴＡＰ断片の創出は、カスタムオリゴヌクレオチド配列の設計を包含する。所定の遺伝子の５’および３’末端に相補的なプライマーを合成することができる。「所定の遺伝子」という用語は、任意の「所望のポリヌクレオチド配列」または「コード配列」を包含し、所定の遺伝子の増幅を可能にするための任意の適切数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、５’−カスタムオリゴヌクレオチドは、約４１個、４２個、４３個、４４個、４５個および４６個のヌクレオチドを包含することができ、これらのうち、約２６個のヌクレオチドが５’−ＴＡＰ末端普遍配列を含み、約１５〜２０個のヌクレオチドが該遺伝子特異的配列を構成する。したがって、遺伝子特異的配列は、例えば、約１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のヌクレオチドであり得る。５’オリゴヌク
レオチドはまた、ｍＲＮＡのより効率的な翻訳のために、開始コドン周辺にコザックコンセンサス配列（Ａ／ＧＣＣＡＵＧＧ）を組み込んでもよい。一実施形態では、開始コドンＡＴＧが、カスタム５’−オリゴヌクレオチドに含まれ得る。別の実施形態では、所定のペプチドをコードする配列はその５’末端に開始メチオニンコドンを欠如する場合、開始コドンＡＴＧがカスタム５’−オリゴヌクレオチドに包含され得る。
【００３７】
３’−カスタムオリゴヌクレオチドは、所定の遺伝子の増幅を可能にするための任意の適切数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、３’−カスタムオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、および４５個のヌクレオチドを含有することができ、これらのうち、約２０個のヌクレオチドが好ましくは３’−ＴＡＰ末端普遍配列を含み、約２０個のヌクレオチドが好ましくはポリヌクレオチドまたは所定の遺伝子に特異的である。さらに別の実施形態では、相補的終止コドン配列（例えば、ＴＣＡ、ＴＴＡ、またはＣＴＡ）を遺伝子配列の末端に付加して、発現される遺伝子の適正な翻訳終結を達成することができる。
【００３８】
ＴＡＰ断片を生成する別の工程は、ＴＡＰ一次断片を増幅することである。「ＴＡＰ一次断片」という用語は「増幅コード配列」を包含し、一実施形態において、増幅されたが、転写的に活性でないポリヌクレオチド配列に関する。この工程は、付加された５’および３’−ＴＡＰ普遍末端配列を有する所定の遺伝子を含有するポリヌクレオチド断片を生成するＰＣＲを実施することを包含する。これらの５’および３’−ＴＡＰ普遍末端配列は、転写活性を付与する１つまたは複数のヌクレオチド配列を付加するのに有用である。一実施形態では、これらの配列は、ＴＡＰ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭプロモーターおよびターミネーター断片を包含することができる。当業者は、必要性が生じた場合には、上述の特定のＰＣＲ反応を最適化するために上記方法を調節することができる。
【００３９】
さらなる工程は、ＴＡＰ一次断片上に転写活性を付与する少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を付加することを包含する。ＴＡＰ発現断片と称される第２のＰＣＲ反応の最終産物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、無細胞）発現研究で直接使用することができる転写的に活性なＤＮＡである。ある特定の実施形態では、ＴＡＰ発現断片を培養細胞にトランスフェクトするか、または動物に注入することができる。「ＴＡＰ発現断片」という用語は、「転写的に活性なコード配列」という用語を包含する。
【００４０】
ＴＡＰ断片の生成は、転写的に活性な多数のポリヌクレオチドコード配列を作製する迅速かつ効率的な方法である。したがって、実施形態では、標的生物由来の複数の異なる遺伝子を、ＴＡＰ技術を用いて転写的に活性にさせることができる。一実施形態では、約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２６６個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１，０００個、約１，０５０個、約１，１００個、約１，１５０個、約１，２００個、約１，２５０個、約１，３００個、約１，３５０個、約１，４００個、約１，４５０個、約１，５００個、約１，６００個、約１，７００個、約１，８００個、約１，９００個、約２，０００個、約２，５００個、約３，０００個、約３，５００個、約４，０００個、約４，５００個、約５，０００個、約６，０００個、約７，０００個、約８，０００個、約９，０００個、約１０，０００個、約１５，０００個、約２０，０００個、約２５，０００個、約３０，０００個またはそれ以上の遺伝子が、ＴＡＰ技術を用いて転写的に活性になり得る。当業者は、適切数の回数で開示した方法を繰り返すことにより、多数の異なる遺伝子を転写的に活性にさせることができることを理解できる。
【００４１】
転写活性を付与するポリヌクレオチド配列の例は、プロモーター配列、ターミネーター配列、転写因子用の結合部位、ＴＡＴＡボックス配列、およびエンハンサーである。一実施形態では、１つのプロモーターおよび１つのターミネーター配列がＴＡＰ断片上に付加される。これらのプロモーターおよびターミネーター配列は、数多くの方法で得ることができる。例えば、市販のプラスミドおよびｃＤＮＡ分子の制限酵素消化を用いて、あるいは当業者に既知の方法を用いて自動化ＤＮＡ合成機を使用して、上記配列を合成することができる。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「プロモーター」という用語は、転写開始部位から上流に伸長し、かつＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡ配列である。プロモーターは、概して２００個を超える塩基対にわたって散在される、転写因子を結合する幾つかの短い（１０塩基対未満）配列要素を含有し得る。一般的なかつ上流の因子により認識される唯一の要素を含有するプロモーターは通常、任意の細胞型で転写される。かかるプロモーターは、構成的に発現される細胞遺伝子（ときには、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれる）の発現を担い得る。また、重金属イオンおよびグルココルチコイドによりアップレギュレートされるヒトメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーターのような特定の細胞型に限定される組織特異的プロモーターも存在する。プロモーターは、核酸断片に関する所望の使用を考慮することに基づいて選択することができる。当業者は、核酸断片の使用に応じて適切なプロモーターを容易に選択することができる。例えば、核酸配列がヒト細胞において潜在的有用性を有する遺伝子をコードする場合、哺乳類細胞で転写を促進することが可能なプロモーターが選択され得る。プロモーターの他の例としては、植物または植物病原体（例えば、カリフラワーモザイクウイルス等）由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＭＭＶ、ＨＩＶ等のような哺乳類または哺乳類病原体由来であり得る。他の例では、プロモーターは、酵母（Ｇａｌ  ４プロモーター）等のような真菌由来であり得る一方で、他の例では、プロモーターは、細菌または細菌ファージ、例えばλ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６等由来であり得る。プロモーターはまた、レトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、筋クレアチンキナーゼプロモーター、アクチンプロモーター、伸長因子プロモーター、合成プロモーター、組織特異的プロモーター等であり得る。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「ターミネーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させる、転写の終わりを表わすＤＮＡ配列を包含する。さらに、「ターミネーター」という用語は、転写されたＲＮＡを翻訳前にプロセシングさせる（例えば、ポリアデニル化）シグナル配列を包含する。これは成熟３’末端の下流の別個の部位に見られ、切断およびポリアデニル化により生成される。任意のタイプのターミネーターがこれらの方法に使用され得る。例えば、ターミネーター配列は、原核生物または真核生物（例えば、植物供給源）に由来し得る。一実施形態では、人工的な哺乳類転写ターミネーター要素を使用することができる。ターミネーター配列の非排他的リストとしては、ＳＶ４０転写ターミネーター、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネーター、合成ターミネーター、ウサギβ−グロビンターミネーター等が挙げられる。ターミネーターはまた、ＴＡＰ断片の３’末端にあるアデニンヌクレオチドの連続伸長物であり得る。
【００４４】
Ｔａｐリンカー分子
上述するように、ＴＡＰ技術を用いて、プロモーター配列、ターミネーター配列、転写因子用の結合部位、ＴＡＴＡボックス配列、およびエンハンサー等の追加要素を有した形で、遺伝子を増幅することができる。さらに、遺伝子がコードするポリペプチドのより迅速なスクリーニング、特性化、精製および研究を可能にすることができる追加の要素有した形をで、遺伝子を増幅することができる。これらの追加要素としては、例えば、レポーター遺伝子、親和性タグ、抗体タグ、ＰＮＡ結合部位、ヒスチジンタグ、分泌シグナル、
レポーター遺伝子等が挙げられる。ＴＡＰ一次断片またはＴＡＰ発現断片に付加することができる他のかかる追加要素の１つは、リンカー分子をコードするポリヌクレオチドである。「リンカー分子」という用語は、ポリペプチドを固体支持体に固定化することが可能である任意の分子を包含する。
【００４５】
一実施形態では、リンカー分子はエピトープタグであり得る。近代分子実験室では、ウェスタンブロット、免疫沈降、および蛍光タグ付け抗体を用いた免疫細胞化学のような様々な抗体ベースの実験方法で、発現されたポリペプチドを検出する作業に頻繁に直面する。これらの様々な研究を遂行するために、各ポリペプチドに特異的な抗体の入手可能性が最も貴重である。しかしながら、特定の実験室で研究中の組換えポリペプチドすべてに特異的な抗体の開発は、高価で時間がかかり、一般に非現実的な計画であろう。このことは、世界的シーケンシングの努力の結果として発見されている未知の機能を有する新規遺伝子数の急速な増大を考慮するときには、特に手ごわい問題である。
【００４６】
ＴＡＰ断片のエピトープタグ付けは、ＴＡＰ断片の発現産物の細胞内分布を迅速かつ利便性よく測定すること、ポリペプチドの精製を容易にすること、関連ポリペプチドを同定すること、および免疫沈降により新規ポリペプチドを特性化することに有用である。エピトープタグ付けの使用により、組換えポリペプチドは、標的生物の天然遺伝子によりコードされるポリペプチドに付加された短オリゴペプチドエピトープを保有する融合ポリペプチドとして発現される。次に、付加エピトープに対する抗体を、所望の融合ポリペプチドのウェスタンブロット、免疫細胞化学、ＤＮＡバンドスーパーシフト実験、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）およびアフィニティ精製におけるポリペプチドの検出用のツールとして使用することができる。
【００４７】
したがって、本発明の一実施形態は、基本的なＴＡＰ系を修飾して、所定の遺伝子および赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグをコードするポリヌクレオチド配列の融合を創出することである。ＨＡエピトープタグは、十分に特性化されており、非常に免疫反応性が高い。このエピトープタグ付けＴＡＰ断片を細胞にトランスフェクトした後、生じたＨＡタグ付けポリペプチドを、市販の抗ＨＡ抗体で同定することができる。したがって、ＨＡエピトープコード配列を有する所定の遺伝子を増幅することにより、発現産物は、遺伝子産物およびＨＡエピトープ部位を包含することができる。したがって、この発現産物は、ＨＡエピトープに特異的な抗体を用いて、素早く捕捉および／または精製することができる。
【００４８】
同様に、ヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチド配列を、ＴＡＰ断片に組み込むことができ、発現遺伝子産物を利便性よく精製することが可能である。組換えポリペプチドの発現、精製、検出、およびアッセイは、ＨＡおよびヒスチジンタグのような小さな親和性タグを使用することによりかなり簡素かつ強力となり得る。例えば、十分に確立されたＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓタンパク質発現および精製系は、QIAGEN(Seattle, Washington)から入手可能な６個の連続ヒスチジン残基（６×Ｈｉｓタグ）でタグ付けしたポリペプチドに対して特許化されたニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）金属−アフィニティクロマトグラフィマトリックスの顕著な選択性および親和性に基づいている。
【００４９】
ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ系は、６個の連続ヒスチジン残基の親和性タグ、すなわち６×Ｈｉｓタグを有するポリペプチドに対するＮｉ−ＮＴＡ（ニッケル−ニトリロ三酢酸）の顕著な選択性に基づいている。この技術は、任意の発現系から、ほとんどの任意の６×Ｈｉｓタグ付けポリペプチドの精製、検出、およびアッセイを可能とする。６×Ｈｉｓタグを有するポリペプチドは、ニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂により精製することができる。
【００５０】
ＴＡＰ断片は、検出および精製を簡素化するように設計されたタグを含むことができる。組換えポリペプチド精製に関する最も強力な技術の１つは、６個の連続ヒスチジン残基の親和性タグの付加である。６×Ｈｉｓタグを有するポリペプチドは、ニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂により精製することができる。６×Ｈｉｓタグは、ほとんどの他の親和性タグよりもかなり小さく、生理学的ｐＨで荷電されない。６×Ｈｉｓタグは、ポリペプチド免疫原性を変化させるか、または免疫原性に寄与することはほとんどなく、ポリペプチド構造または機能を妨害することはほとんどなく、分泌を妨害せず、プロテアーゼ切断による除去を必要とせず、変性用緩衝液系と適合性である。したがって、このタグは、従来のプラスミドベースのクローニングアプローチを用いてクローニングすることが極めて困難であるプロテインキナーゼのような真核生物遺伝子の発現、アッセイおよび精製用の強力なツールである。
【００５１】
オリゴヌクレオチドは、例えばｐＣＭＶｍおよびｐＴＰ−ＳＶ４０由来のＴＡＰプロモーターおよびターミネーター断片と一緒に６×Ｈｉｓエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を含むように設計することができる。コード配列の５’末端に６×Ｈｉｓエピトープを付加するために、ヒスチジン残基をコードする配列をプロモーターと一緒に包含することができる。コード配列の３’末端に６×Ｈｉｓエピトープを付加するために、ヒスチジン残基をコードする配列をターミネーターと一緒に包含することができる。
【００５２】
ＨＡおよび６×Ｈｉｓエピトープの実施形態は、限定するものと解釈されるべきではなく、説明の目的で提供される。例えば、７×、８×、９×、または１０×ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ、Ｆｌａｇタグ等のような任意のタイプのリンカー分子を発現産物に結合させることができることが当業者には理解されよう。
【００５３】
分泌シグナルを伴うＴＡＰ断片
多くの遺伝子療法およびＤＮＡワクチン適用に関して、遺伝子産物がトランスフェクト細胞から分泌されることが有益である。この理由により、ＴＡＰ系および方法の１つのバージョンは、遺伝子産物が分泌シグナルを含有するように設計され得る。一般に使用されるシグナルペプチドは、以下に示す：ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＡＧＡ
ＧＧＧ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ
ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＧＴＴ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＡＧＣ（配列番号１）のようなコード配列を有するヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）由来の最初の２３個のアミノ酸である。この配列は、ＴＡＰプロモーター断片に組み込まれることができ、上述のタグ付けポリペプチドの構築と同様の様式で新規ＴＡＰ断片を創出することができる。
【００５４】
プラスミドベクターへのＴＡＰ断片の組み込み
遺伝子の機能または免疫原性がＴＡＰ  ｅｘｐｒｅｓｓを用いることでいったん同定されれば、遺伝子をプラスミドベクターにクローニングすることに関心がもたれ得る。ＴＡＰ  ｅｘｐｒｅｓｓは、Gene Therapy Systems, San Diego, Californiaから入手可能である。ＴＡＰクローニングは、これを達成する迅速かつ利便性のよい方法である。
【００５５】
指定機能を有する遺伝子がＴＡＰ  ｅｘｐｒｅｓｓによりいったん同定されれば、さらなる遺伝子の特性化および操作を容易とするためには、遺伝子をプラスミドベクターにクローニングすることが望ましくなり得る。標準的なクローニング技法は、プラスミドおよび挿入されるべき遺伝子断片を消化するための制限酵素の使用を包含し得る。適合性末端のアニーリングおよびライゲーションにより、ベクターへの遺伝子の挿入を導くことができる。制限末端指向性クローニングの代替的な方法は、二重鎖ＤＮＡ上の３’末端上にＴオーバーハングを有する線状化プラスミドを調製して、ＰＣＲにより特定のポリメラーゼを用いて増幅されたＤＮＡ断片を収容することである。この方法は、「Ｔ／Ａクローニング」と呼ばれることがある。
【００５６】
ある特定の実施形態では、ＴＡＰクローニング系、方法およびキットは、第１または第２のＰＣＲ工程後にＴＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ断片上に存在する普遍５’および３’配列を利用することにより、クローニングプロセスをさらに簡素化することができる。これらの領域は、本発明者等の線状化ＴＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓクローニングベクターの末端配列と重複する。ＴＡＰ断片および線状化プラスミドを一緒に混合し、ＴＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ
Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｏｍｐ細胞に直接エレクトロポレートすると、内因性細菌リコンビナーゼ活性が２つのＤＮＡ断片を組換えて、挿入ＴＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ断片を有するプラスミドを生じる。このプロセスは、従来のクローニングを２つの簡素なＰＣＲ工程で置き換えることができる。幾つかの実施形態では、上記プロセスは、ＤＮＡ断片の切断、ペースティングおよび連結を必要としない。さらに、このプロセスは、制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、トポイソメラーゼ、または他のＤＮＡ修飾酵素に頼ることなく、ＴＡＰ  ＰＣＲ断片の迅速かつ利便性のよいクローニングに非常に適し得る。すべての「ＴＡＰ」系、ベクターおよび細胞は、Gene Therapy Systems, San Diego, Californiaから容易に入手可能である。
【００５７】
ＧｅｎｅＧｒｉｐ  ＰＮＡ適合性ＴＡＰ系もまた、ＰＮＡ依存性遺伝子化学によりＤＮＡ上にポリペプチドを連結させるのに使用することができ、これは上述の方法論を限定しない。ＧｅｎｅＧｒｉｐは、Gene Therapy Systems, San Diego, Californiaから入手可能である。このアプローチは、配列特異的かつ非常に高度な親和性様式で、二本鎖ＤＮＡとハイブリダイズさせるためにペプチド核酸（ＰＮＡ）の特性を利用する。ＰＮＡ結合部位は、例えば、トランスフェクトプラスミドを標的とし、かつ導入遺伝子の発現を改善するために、ＤＮＡ上に一連のポリペプチドを結合させるのに使用することができる。これにより、科学者等は、核の取り込みを増加するか、エンドソーム逃避を促進するか、あるいは細胞表面または細胞内受容体への遺伝子供給を標的とするように意図される要素を付加することにより、遺伝子供給の効率および有効性を改善するための合理的アプローチを追随することが可能となる。
【００５８】
ＧｅｎｅＧｒｉｐ部位をＴＡＰに組み込むことにより、ペプチド核酸（ＰＮＡ）をＴＡＰ遺伝子とハイブリダイズさせることが可能となる。続いて、遺伝子のバイオアベイラビリティおよびＤＮＡワクチン効力を改善するために、リガンドをＰＮＡに結合させることができる。
【００５９】
ＴＡＰ方法を実施するための自動化システム
本発明の実施形態では、標的生物由来のＴＡＰ断片の生成に関与したあらゆる工程を実施するためのシステムを使用することができる。さらに、各個々の工程は、システムにより制御され得る。例えば、システムは、カスタマイズされたＰＣＲプライマーを設計し、上記プライマーを獲得し、ＴＡＰ技術を利用してＰＣＲ反応を実施し、プロモーターおよびターミネーターを結合し、リンカー分子をコードする配列を一次断片または発現断片に結合することができる。上記システムは、自動化され得るか、または自動化され得ない。
【００６０】
ＴＡＰ断片の発現
転写的に活性な状態で増幅されたＤＮＡ断片は、ゲノムで各遺伝子に関して相当するポリペプチドを獲得するために、各種発現系で直接使用することができる。本発明は、任意の核酸トランスフェクション技法により、動物細胞または組織に容易にトランスフェクトされ得る転写的に活性なＤＮＡ断片を生成する簡素で効率的な方法を提供する。上記方法は、発現ベクターへのサブクローニングおよび細菌からのプラスミドＤＮＡの精製の必要性を回避することができる。当業者が理解できることであるが、ＴＡＰ断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、無細胞）発現系を用いて迅速に発現させることができる。例えば、増幅断片は、発現用の真核細胞または原核細胞に直接トランスフェク
トすることができる。発現に使用され得る真核細胞の例としては、哺乳類、昆虫（例えば、バキュロウイルス発現系）、酵母（例えば、ピキア・パストリス）等が挙げられる。原核細胞発現系の例としては、大腸菌が挙げられる。
【００６１】
あるいは、発現は、無細胞系、例えばＴ７プロモーター系で達成され得る。無細胞翻訳系としては、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽および大腸菌からの抽出物を挙げることができる。これらの系は、外因性ＲＮＡの翻訳に必要とされる巨大分子構成成分（７０Ｓまたは８０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、開始因子、伸長因子および終結因子等）を含有する粗製抽出物として調製され得る。効率的な翻訳を促進するために、各抽出物を、アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生系（真核生物系に関してはリン酸クレアチンおよびクレアチンホスホキナーゼ、および大腸菌溶解産物に関してはホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼ）、および他の補因子（Ｍｇ２＋、Ｋ＋等）で補充することができる。
【００６２】
ＴＡＰ技術の使用により、当業者は、複数の遺伝子を迅速に発現させることが可能である。特定の所定の遺伝子が転写的に活性になった後、他の異なる遺伝子もまた、本発明の方法により転写的に活性にさせることができる。したがって、本発明の一実施形態では、ポリペプチドライブラリーを作製するために、標的生物由来の複数の遺伝子を増幅および発現する。本発明の一実施形態では、複数のＴＡＰ断片を発現することによりポリペプチドのライブラリーを作製することができる。本発明の他の実施形態では、少なくとも約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２６６個またはそれ以上の異なる遺伝子が、ＴＡＰ技術により転写的に活性となった後に発現される。
【００６３】
本発明の他の実施形態は、リンカー分子をコードするポリヌクレオチドの産物を発現することに関する。リンカー分子をコードするポリヌクレオチドは、ＴＡＰ一次断片またはＴＡＰ発現断片に付加させることができる。したがって、リンカー分子は、所定の遺伝子とともに発現させることができる。上述のように、一実施形態では、リンカー分子はエピトープタグであり得る。エピトープタグは、発現産物の精製を容易にすること、関連ポリペプチドを同定すること、免疫沈降により新規ポリペプチドを特性化すること、細胞下局在化を確定すること等に有用である。特定のリンカー分子の一例は、ＨＡエピトープタグである。したがって、ＨＡエピトープを含有する発現産物は、ＨＡエピトープに特異的な抗体を用いて迅速に捕捉および／または精製され得る。他のリンカー分子としては、例えば６×、７×、８×、９×、または１０×ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ、Ｆｌａｇタグ等が挙げられる。
【００６４】
本発明の方法によるポリペプチドライブラリーの作製により、当業者は、続く探索および研究でポリペプチドライブラリーを容易に使用することが可能である。例えば、発現ポリペプチドを、さらなる分析用のアレイへと構築することが可能である。例えば、微生物疾患、新生物性疾患等に対する新規ワクチンおよび薬物標的を同定するために、発現ポリペプチドアレイをスクリーニングすることができる。発現ポリペプチドを用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングすること、試薬を開発すること、機能的プロテオミクス研究を実施すること等のために使用することができる。これらはすべて、従来の方法をはるかに超える速度で迅速に達成することができる。
【００６５】
本発明の方法により作製されるアレイは、約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１
９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２６６個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、約１，０００個、約１，０５０個、約１，１００個、約１，１５０個、約１，２００個、約１，２５０個、約１，３００個、約１，３５０個、約１，４００個、約１，４５０個、約１，５００個、約１，６００個、約１，７００個、約１，８００個、約１，９００個、約２，０００個、約２，５００個、約３，０００個、約３，５００個、約４，０００個、約４，５００個、約５，０００個、約６，０００個、約７，０００個、約８，０００個、約９，０００個、約１０，０００個、約１５，０００個、約２０，０００個、約２５，０００個、約３０，０００個またはそれ以上の異なるポリペプチドを包含してもよい。さらに、本発明は、ポリペプチドの少なくとも１つが少なくとも１つのリンカー分子に結合されたアレイを包含する。
【００６６】
ＴＡＰによるヒトプロテオーム
一実施形態では、完全ヒトプロテオームまたは複数のヒトポリペプチドは、例えば抗体ライブラリーをスクリーニングために迅速に獲得および利用され得る。完全ヒトプロテオームは、非常に短期間で生成することができる。この企画は、４工程に分けることができる。例えば、ヒトゲノムの配列は、公的遺伝子データベースから当業者により容易に獲得され得る。配列情報に基づいて、ヒトゲノム中の各遺伝子または複数のヒト遺伝子をコードする、およそ２７，０００個の転写的に活性なＰＣＲ（ＴＡＰ）一次断片が生成され得る。これらのおよそ２７，０００個の断片が必ずしも選択的スプライシングにより産生された追加的な産物の原因となるとは限らないことに留意すべきである。これらの産物用のヌクレオチドコード配列もまた、増幅および発現され得る。
【００６７】
およそ２７，０００個の断片の生成は、およそ５４，０００個の遺伝子特異的プライマーを必要とし得て、それらは、当業者に既知の手段および会社（例えば、Genset）により獲得および迅速に生成することができる。いったんプライマーが獲得されれば、一次ＴＡＰ断片は、ＰＣＲマシンを用いて迅速に増幅させることができる。ある特定の実施形態では、多数回の反応、例えば７６８回の反応／マシンが可能なマシンを使用することで、時間を大いに減少させることができる。
【００６８】
続いて、一次ＴＡＰ断片は続くＰＣＲを経て、およそ２７，０００個の転写的に活性なＰＣＲ（ＡＴＰ）断片を生成することができる。一実施形態では、ＴＡＰ断片はＴ７プロモーターを含有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳反応に使用することができる。ＴＡＰ断片は、ＴＡＰ一次断片とまさに同程度に迅速に生成および分析され得る。ＴＡＰ断片を生成するのに使用されるプライマーは遺伝子すべてについて同じであり、それらは大量に獲得および購入することができる。生成される各ＴＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ断片の量は、９６ウェルプレート中での少なくとも１０回、１５回、２０回、１００回またはそれ以上の転写／翻訳反応に十分であり得る。代替的実施形態では、ＴＡＰ断片は、上述するように、例えば「核酸断片の迅速かつ無酵素クローニング(Fast and Enzymeless Cloning Nucleic Acid Fragments)」という表題の米国特許第０９／８３６，４３６号に記載されるような「ＴＡＰクローニング」を用いて、発現ベクターに利便性よく移入させることができる。クローニングされた断片は、さらなるおよび今後の研究のために確保および使用され得る。
【００６９】
およそ２７，０００個のＴＡＰ断片を用いて、非常に短期間で全ヒトプロテオームを合成することができる。例えばＰ７プロモーター系を有するＴＡＰ断片を使用して、各ＴＡＰ断片は、９６ウェルプレート中で適切な転写／翻訳試薬とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することができる。かかる系を用いた幾つかの実施形態では、例えば、１０〜５０マイクログラムの各タンパク質が生成され得る。生成されるポリペプチド調製物は概して、例
えば抗体スクリーニングアッセイで使用するためのさらなる精製を必要としない。プロテオームはマイクロチップ上に表示され、組換え抗体ライブラリーをスクリーニングするのに使用され得る。プロテオームは、例えば細胞スクリーニングアッセイで使用され得る。続いて、抗体は、例えば試薬を開発するのに使用され得る。あるいは、抗体を用いて、どのポリペプチドがそこで発現されるかを確認するために各種細胞および組織（例えば、ヒト腫瘍組織のような）におけるポリペプチド発現を確認することができる。このアプローチは、任意の組織でポリペプチドを局在化させるのに使用することができる。ポリペプチドは、例えば免疫疾患のようなヒト疾患に関与したポリペプチドに関してスクリーニングすることができる。
【００７０】
上述のように、ＴＡＰ断片は、自動化システムにより生成され得る。さらに、ＴＡＰ断片によりコードされるポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、無細胞）発現系を用いて発現され得る。発現産物は、自動化システムを用いて精製され得る。
【００７１】
アダプター技術
ＴＡＰ技術を用いて所定の遺伝子を増幅する以外に、本発明はまた、「アダプター技術」を用いて遺伝子を増幅することを包含する。幾つかの実施形態では、アダプター技術は、１工程のＰＣＲ反応を利用することができる。本明細書中に記載する場合、「アダプター技術」という用語は、所望の核酸配列、例えば所定の遺伝子を、第１および第２のアダプター配列と隣接させることにより、所望の核酸断片をベクターにクローニングする方法に関する。得られた断片は、宿主細胞における核酸断片がｉｎ  ｖｉｖｏでの相同組換えによりベクターに組み込まれるような条件下で第１および第２のアダプター配列に相同的な配列を有するベクターと接触させることができる。したがって、アダプター技術は、ベクターへの核酸断片の迅速かつ無酵素クローニングを可能とし、首尾よい形質転換用の強制クローニング選択に使用することもできる。アダプター技術は、「核酸断片の迅速かつ無酵素クローニング(Fast and Enzymeless Cloning of Nucleic Acid Fragments)」という表題の米国特許出願第０９／８３６，４３６号、「核酸断片の迅速かつ無酵素クローニング(Rapid and Enzymeless Cloning of Nucleic Acid Fragments)」という表題の米国特許出願第１０／１２５７８９号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴＵＳ  ０２／１２３３４号にさらに詳述されている。
【００７２】
核酸断片は、任意のベクターに組み込まれ得る。幾つかの実施形態では、断片が組み込まれるベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）等であり得る。プラスミドは、ＣｏＥ１、ＰＲ１００、Ｒ２、ｐＡＣＹＣ等であり得る。ベクターはまた、機能的選択マーカーを含むことができる。機能的選択マーカーは、例えば、カナマイシン、アンピシリン、ブラストサイジン、カルボニシリン(carbonicillin)、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等に関する耐性遺伝子であり得る。ベクターはさらに、重要な要素を欠如し、かつ重要な要素が首尾よい相同組換え時に上記核酸断片により供給される機能障害性選択マーカーを含むことができる。機能障害性選択マーカーは、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、カルボニシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等であり得る。さらに、機能障害性選択マーカーは、例えば、ｌａｃＺ遺伝子のようなレポーター遺伝子等であり得る。
【００７３】
ベクターは、宿主細胞成長にとって有害なネガティブ選択要素を含むことができる。ネガティブ選択要素は、首尾よい相同組換え時に上記核酸断片により無能にされ得る。ネガティブ選択要素は誘導性であり得る。ネガティブ選択要素は、例えば、マウスＧＡＴＡ−１遺伝子であり得る。ベクターは、機能障害性選択マーカーおよびネガティブ選択要素を含むことができる。
【００７４】
アダプター技術で使用される宿主細胞は細菌であり得る。細菌は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えが可能であり得る。細菌の例としては、ＪＣ８６７９、ＴＢ１、ＤＨα、ＤＨ％、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＬＥ３９２等が挙げられる。プラスミドは、機能的選択マーカーに対して選択する選択条件下で宿主細胞において維持され得る。
【００７５】
第１および第２のアダプターは、所望の核酸配列がベクターに組み込まれるようにベクターの相同配列に結合するのに十分な任意の長さであり得る。第１および第２のアダプター配列は、例えば、少なくとも１１ｂｐ、１２ｂｐ、１３ｂｐ、１４ｂｐ、１５ｂｐ、１６ｂｐ、１７ｂｐ、１８ｂｐ、１９ｂｐ、２０ｂｐ、２１ｂｐ、２２ｂｐ、２３ｂｐ、２４ｂｐ、２５ｂｐ、２６ｂｐ、２７ｂｐ、２８ｂｐ、２９ｂｐ、３０ｂｐ、３１ｂｐ、３２ｂｐ、３３ｂｐ、３４ｂｐ、３５ｂｐ、３６ｂｐ、３７ｂｐ、３８ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ等であり得る。さらに、第１および第２のアダプター配列は、６０ｂｐ以上であり得る。
【００７６】
第１および第２のアダプター配列はさらに、機能的要素を含むことができる。機能的要素としては、プロモーター、ターミネーター、選択マーカー遺伝子をコードする核酸断片、リンカー分子をコードする核酸、既知のタンパク質をコードする核酸断片、融合タグ、選択マーカー遺伝子の一部をコードする核酸断片、成長促進タンパク質をコードする核酸断片、転写因子をコードする核酸断片、自己蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）をコードする核酸断片等を挙げることができる。
【００７７】
核酸断片の５’末端および３’末端の両方上の共通の配列が線状化空ベクターにおける末端配列と相補的であり、断片および線状化ベクターが例えばエレクトロポレーションにより宿主細胞に一緒に導入される場合、それらは組換わり、定方向的に挿入される断片を有する新規発現ベクターを生じる。代替的実施形態では、宿主細胞は、核酸断片のみが宿主細胞に導入されるように線状化空ベクターを含むことができる。本発明の代替的実施形態では、ベクターは環状化され得て、本明細書中で使用する場合、ベクターは線状化され得るか、または環状化され得ることに留意すべきである。宿主細胞は、相同組換えにより発現ベクターに変換される。原則的に、このアプローチは、概して従来のクローニング方法に対する代替法として適用され得る。
【００７８】
第１および第２のアダプター配列を有する核酸断片は、当業者に既知の方法により生成することができる。例えば、既知の５’および３’配列を有する所定の遺伝子は、重複する５’および３’プライミングオリゴヌクレオチドと一緒にＰＣＲを受ける。プライミングオリゴヌクレオチドは、商業的供給業者による製造を含む当該技術分野で既知の方法により得ることができる。アダプター配列を有する一次断片を生成することができる。所定の遺伝子と隣接するアダプター配列は、ベクター上の配列、または続くＰＣＲで使用されるべき他の５’もしくは３’断片由来の配列に相同的であり得る。
【００７９】
本発明の幾つかの実施形態では、標的生物由来の特定の所定の遺伝子は、３’末端および５’末端の両方上のアダプター配列とともに増幅させることができる。他の実施形態では、アダプターは、標的生物のゲノム内の複数の遺伝子、例えばあらゆる遺伝子に結合させることができる。ある特定の実施形態では、アダプターは、所望の遺伝子を転写的に活性にすることができる。いったん所望のベクターに組み込まれれば、所望の遺伝子は迅速に複製させて、発現させることができ、その結果複数の標的生物の遺伝子、例えばあらゆる遺伝子が発現される。
【００８０】
複数の発現産物をライブラリーまたはアレイ中に保管することができ、以下に記載するようにそれらの免疫原性特性に関してアッセイすることができる。アッセイ方法論に関す
るほとんどの実施形態がＴＡＰ技術に関して議論されるが、以下のアッセイはすべて、同様にアダプター技術発現産物で使用することができる。いったん適切なアッセイがアダプター技術発現産物で実施されれば、ワクチンを開発する方法が利用され得る。以下に記載するワクチンを開発することに関する実施形態のほとんどがＴＡＰ技術に関係するが、ワクチン実施形態のすべてはまた、アダプター技術から生じるポリペプチドライブラリーおよびアレイとともに使用することができる。
【００８１】
ポリペプチドの免疫原性効果の同定
ＴＡＰまたはアダプター技術、および続く発現により調製されるポリペプチドのライブラリーおよびアレイは、ポリペプチドまたは核酸サブユニットワクチンの開発に有用であり得る。ＤＮＡワクチンは、製造するのに安価な有効ワクチンであり、広く分布させることができる。ＤＮＡワクチン（または任意の組換えサブユニットワクチン）を開発する際の最も困難な作業の１つは、特に生物のゲノムが大きい場合に、病原体に対して最も有効な免疫応答を刺激することができる抗原の同定である。
【００８２】
これを達成する包括的な方法は、ライブラリーまたはアレイの様式で特定の病原体から複数のポリペプチドを得ることである。これらのポリペプチドは、体液性および／または細胞媒介性免疫応答を誘起するそれらの能力を測定するために試験され得る。免疫原性応答を誘起するポリペプチドは、サブユニットワクチンとしての有効性に関して、個々にまたは他の抗原とともに試験され得る。さらに、同定された抗原性ポリペプチドをコードする核酸もまた、特定の病原体用のサブユニットワクチンを開発するために、単独であるいは抗原をコードする他の核酸とともに使用することができる。
【００８３】
以下に記載する実施形態の多くがワクシニアポリペプチドの免疫原性効果を同定することに関するが、本発明の方法は任意の標的生物を取り扱うことができる。特定の実施形態では、標的生物は、例えば、ワクシニアウイルス、炭疽菌、ボツリヌス菌、ペスト菌、大痘瘡、野兎病菌、マラリア(Malaria)、トラコーマクラミジア、連鎖球菌属、ライム病菌、ヘリコバクター・ピロリ、結核菌、ウイルス性出血熱の原因となる病原体、エボラ、マールブルグ、ポックスウイルス、アレナウイルス、ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ブンヤウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、デング熱ウイルス、フィロウイルス、Ｑ熱リケッチア、ブルセラ種、鼻疽菌、トウゴマ、ウェルシュ菌、ブドウ球菌属、発疹チフスリケッチアおよび他のリケッチア属、食物および水媒介性病原体、下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ属、赤痢菌属種、サルモネラ属、リステリア菌、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリティカ、カリチウイルス、Ａ型肝炎原生動物、クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カヤタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラスマ属、微胞子虫類、ウイルス性脳炎、西ナイルウイルス、ラクロセウイルス、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ニパウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、多剤耐性ＴＢ、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、インフルエンザウイルス、ならびに黄熱病ウイルス等のような病原体であり得る。この病原体リストは、単なる例示の目的で提供しており、当業者は、本発明の方法により使用することができる無数の標的生物を認識することができる。
【００８４】
ワクシニアウイルス実施形態
本発明の一実施形態は、体液性および細胞媒介性免疫応答を引き起こすワクシニアウイルスにおける抗原すべてを系統的にスクリーニングおよび同定することが可能であるＴＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓを用いた迅速なハイスループットワクチン抗原スキャニングアプローチを取り入れる。上記ワクシニア抗原の同定により、高特異的サブユニットワクチンの開発が可能となる。図２は、ＴＡＰ技術を用いて多数の遺伝子を増幅し、上記遺伝子産物を
発現させ、得られたポリペプチドを精製および定量化する方法を示す。図２はさらに、細胞媒介性または体液性免疫応答を誘起するポリペプチドの能力を同定するためにアッセイされ得るポリペプチドを調製する方法を示す。
【００８５】
天然痘ワクチンを開発するある特定の方法では、複数のワクシニア遺伝子を転写的に活性とすることができる。一実施形態では、ワクシニアウイルスゲノム由来の２６６個のオープンリーティングフレームそれぞれをコードするおよそ２６６個の発現ベクターを、ＴＡＰ技術を用いて転写的に活性にすることができる。得られたＴＡＰ断片は、当該技術分野で既知の任意の方法に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで精製および発現され得る。ポリペプチドを包含する発現産物は、体液性および／または細胞媒介性免疫原性応答を誘起するそれらの能力を測定するためにアッセイされ得る。免疫応答を誘起することが可能であると同定されたポリペプチドは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドサブユニットワクチンを開発するのに使用され得る。完全な方法は以下にさらに詳述する。
【００８６】
一実施形態によれば、遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、ワクシニアウイルスから複数の転写的に活性な遺伝子を生成するように設計される。ある特定の実施形態では、プライマーは、ワクシニアウイルスゲノム中のあらゆる遺伝子に関して設計される。他の実施形態では、プライマーの設計により、当業者は、ＴＡＰ技術を用いて任意の所定の遺伝子を転写的に活性にすることが可能である。
【００８７】
上述のように、これらのＰＣＲプライマーは、自動化システムを用いて設計することができる。例えば、ＴＡＰプロセスで使用するためのカスタムプライマーを設計するために、ロボットワークステーションを、Ｌｉｎｕｘオペレーティングシステムを実行するデュアルペンティアムＩＩＩ  ＣＰＵ（１．４ＧＨｚ）コンピュータとインターフェースで接続することができる。さらに、カスタマイズドＭｙＳＱＬデータベースは、ジーンバンクおよび他の供給源からの入力配列データすべてを管理することができる。このデータベースは、操作、試料およびロボットにより作製される解析データすべてを探知することができる。別の実施形態では、ＰＣＲプライマー、ＰＣＲ産物およびポリペプチドは、データベースにより探知され得る。例えば、ＰＣＲプライマー、ＰＣＲ産物およびポリペプチドは、バーコード付き９６ウェルプレートを使用することにより探知され得る。以下の実施形態はある特定の実施形態において９６ウェルプレートを使用することについて議論しているが、任意のサイズのウェルプレートを使用することができることを当業者は理解することができる。例えば、ウェルプレートは、約４８個、約９６個、約１４４個、約１９２個、約２４０個、約２８８個、約３３６個、約３８４個、約４３２個、約４８０個、約５７６個、約６７２個、約７６８個、約８６４個、約９６０個、約１，０５６個、約１，１５２個、約１，２４８個、約１，３４４個、約１，４４０個、約１，５３６個またはそれ以上のウェルから構成され得る。ウェルプレートのほかに、ＰＣＲ産物およびポリペプチドは、任意の適切な容器、例えば試験管を用いて探知され得る。
【００８８】
ＰＣＲ反応に必要とされるカスタムオリゴヌクレオチドは、ＴＡＰ技術を実施するために生成または獲得され得る。一実施形態では、ワクシニアウイルスゲノム配列データおよびプライマー設計ソフトウェア（プライマー３）を、ワクシニアウイルスゲノムにおける遺伝子すべてに関して遺伝子特異的プライマーを生成するためにデータベースで使用することができる。プライマーは、遺伝子サイズおよびＧＣ含有量に従って、約４８個、約９６個、約１４４個、約１９２個、約２４０個、約２８８個、約３３６個、約３８４個、約４３２個、約４８０個、約５７６個、約６７２個、約７６８個、約８６４個、約９６０個、約１，０５６個、約１，１５２個、約１，２４８個、約１，３４４個、約１，４４０個、約１，５３６個の５’プライマーおよび３’プライマーを有するアレイへと構築させることができ、その結果、最適ＰＣＲ反応条件はすべて、各プレートにとって同じであり得
る。さらに、遺伝子特異的プライマー配列を、オリゴヌクレオチド合成供給者（例えば、MWG Biotech, Inc, High Point, NC.）に送ることができ、そこでプライマーが合成され得る。合成プライマーは、１００ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でバーコード付きプレートに構築および分取され、凍結され、実施者へと輸送され得る。一実施形態では、２６６個のワクシニアウイルス遺伝子それぞれを増幅することが可能である５２４個の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーが設計され、生成され、注文され、構築される。
【００８９】
遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを獲得または生成した後、遺伝子は増幅され得る。一実施形態では、プライマーは、遺伝子サイズに従って、アレイの９６個の５’プライマー、および９６個の３’プライマーへと構築され、ロボットワークステーション上へ配置され得る。ロボットは、適切な５’および３’プライマーをＴａｑポリメラーゼおよびワクシニアウイルスゲノムＤＮＡと混合することにより、約４８回、約９６回、約１４４回、約１９２回、約２４０回、約２８８回、約３３６回、約３８４回、約４３２回、約４８０回、約５７６回、約６７２回、約７６８回、約８６４回、約９６０回、約１，０５６回、約１，１５２回、約１，２４８回、約１，３４４回、約１，４４０回、約１，５３６回のＰＣＲ反応のプレートを生成するようにプログラムされ得る。Ｔａｑのほかに、任煮の熱的に安定なポリメラーゼをＰＣＲ反応に使用することができる。例えば、Ｖｅｎｔ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、およびＴｇｏポリメラーゼが使用され得る。ロボットワークステーションは、混合試薬を含有するＰＣＲ反応プレートを、増幅用ＰＣＲマシンに移行させることができる。一実施形態では、ロボットワークステーションは、ＰＣＲ反応プレートをＰＣＲマシンへ移行させるためのロボットアームを使用することができる。
【００９０】
第１のＰＣＲ手順は、任意のサイクル数で実行することができる。一実施形態では、ＰＣＲマシンは、例えば、約２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回またはそれ以上のサイクルで実行される。第１のＰＣＲ反応は、必要であれば、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｏｎｔａｇｅ９６ウェルクリーンアップキットにロボットにより移行させることができる。しかしながら、任意の方法、キットまたはシステムがこれらの反応を清浄化することができる。一実施形態によれば、ロボットプラットフォームの真空ステーションが精製工程を実施し得る。幾つかの実施形態では、得られた産物の分取量が、ｄｓＤＮＡ産物のみと反応するＰｉｃｏ−Ｇｒｅｅｎ蛍光プローブ(Molecular Probes, Eugene, OR)を含有する分析プレートへロボットにより移行させることができる。ウェルの数に応じて、プレートは、約４８個、約９６個、約１４４個、約１９２個、約２４０個、約２８８個、約３３６個、約３８４個、約４３２個、約４８０個、約５７６個、約６７２個、約７６８個、約８６４個、約９６０個、約１，０５６個、約１，１５２個、約１，２４８個、約１，３４４個、約１，４４０個、約１，５３６個またはそれ以上のウェル蛍光プレート読取り機へ移行させることができる。蛍光シグナルを標準曲線と比較して、この第１のＰＣＲ工程で生成される二重鎖ＰＣＲ産物の量を確定することができる。当業者は、必要性が生じた場合には、それらの特定のＰＣＲ反応を最適化するために上記方法を調節することができる。
【００９１】
第１のＰＣＲ手順に加えて、一次転写物に転写活性を付与する少なくとも１つの配列を付加するために、第２のＰＣＲ反応を実施することができる。一実施形態では、ロボットは、先の工程からの各ＰＣＲ反応の分取量を、プロモーターおよびターミネーター配列を含有するＰＣＲ反応に移行させるようにプラグラムされ得る。特定の実施形態では、プロモーターはＴ７−ヒスチジンプロモーター断片であり得て、ターミネーターはＴ７−ヒスチジンターミネーター断片であり得る。任意のプロモーターまたはターミネーター配列が一次転写物に付加され得ることを当業者は理解することができる。さらに、発現ポリペプチドを検出または精製することを可能とする分子をコードする任意のポリヌクレオチド配列もまた予期されうる。
【００９２】
第１のＰＣＲ反応と同様に、第２のＰＣＲ反応は、任意のサイクル数で実行することができる。一実施形態では、第２のＰＣＲ反応は、約２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回またはそれ以上のサイクルで実行される。さらに、任意のタイプの熱安定性ポリメラーゼを第２のＰＣＲ反応に使用することができる。特定の実施形態では、ポリメラーゼはＴａｑであり得る。幾つかの実施形態では、Ｖｅｎｔ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、およびＴｇｏポリメラーゼが使用され得る。第２のＰＣＲ反応から生じたＰＣＲ断片は、任意のキット、方法またはシステムにより清浄化され得る。生じたＴＡＰ断片を清浄化するのに使用することができる特定のキットは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｏｎｔａｇｅ９６ウェルクリーンアップキットである。さらに、上述するように、回収されたＰＣＲ産物レベルは、任意の検出剤、例えばＰｉｃｏ−Ｇｒｅｅｎを用いて測定され得る。
【００９３】
生じたＴＡＰ断片は、任意の遺伝子発現方法を用いて発現させることができる。一実施形態では、ＴＡＰ断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、無細胞）系を用いて発現させることができる。例えば、断片は、発現用の任意の真核細胞または原核細胞に直接トランスフェクトすることができる。発現に使用され得る真核細胞の例としては、哺乳類、昆虫、酵母等が挙げられる。原核細胞発現系の例としては、大腸菌が挙げられる。ＴＡＰ断片はまた、無細胞系により発現させることができる。本発明の一実施形態によれば、生じたＴＡＰ断片は、例えばＲｏｃｈｅ  ＲＴＳ（迅速翻訳システム）１００のようなハイスループット無細胞発現マシンで発現させることができる。さらなる実施形態では、ＴＡＰ断片は、Ｒｏｃｈｅ  ＲＴＳ  １００システムで、３０℃で５時間インキュベートされ得る。特定の無細胞翻訳マシンの説明書に従うことの有用性を当業者は容易に理解することができる。Ｔ７−ヒスチジンプロモーターまたはターミネーター断片が一次転写物に付加される場合、ＴＡＰ断片の翻訳は、ヒスチジンタグ付けポリペプチドを生じることができ、これは以下で議論するように精製することができる。本明細書中に記載するように、任意のタグが使用され得る。
【００９４】
発現されるワクシニアポリペプチドは、発現ポリペプチドを精製する任意の精製方法を用いて精製され得る。一実施形態では、ヒスチジンタグ付けポリペプチドは、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ９６  ＢｉｏｒｏｂｏｔキットのようなＱｉａｇｅｎニッケルカラムを用いて精製され得る。特定のポリペプチド精製系の説明書に従うことの有用性を当業者は容易に理解することができる。ポリペプチドを精製するのに使用することができる他の方法としては、限外濾過、抽出、およびクロマトグラフィが挙げられる。
【００９５】
精製されたワクシニアポリペプチドの同定、量および純度は、ＳＤＳゲル電気泳動により確証され得る。一実施形態では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型質量分析法）を用いて、精製されたポリペプチドの身元を確認することができる。この実施形態によれば、各ポリペプチドの分取量（１〜２μｇ）を約４８個、約９６個、約１４４個、約１９２個、約２４０個、約２８８個、約３３６個、約３８４個、約４３２個、約４８０個、約５７６個、約６７２個、約７６８個、約８６４個、約９６０個、約１，０５６個、約１，１５２個、約１，２４８個、約１，３４４個、約１，４４０個、約１，５３６個またはそれ以上のウェルプレートに分取し、修飾トリプシンで消化させることができる。生じた物質をマトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ））と混合して、適切なスポット数、例えば、４８個、約９６個、約１４４個、約１９２個、約２４０個、約２８８個、約３３６個、約３８４個、約４３２個、約４８０個、約５７６個、約６７２個、約７６８個、約８６４個、約９６０個、約１，０５６個、約１，１５２個、約１，２４８個、約１，３４４個、約１，４４０個、約１，５３６個またはそれ以上のスポットで、任意の標的プレート上へスポットさせること
ができる。一実施形態では、３８４スポットの「アンカーチップ」標的プレート(Bruker Daltonics, Billerica, MA)が使用され得る。プレートは、Ｂｒｕｃｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計の試料段へと移行させることができる。分析計は、自動的にプレートをスキャンし、インターネットを介してＭａｓｃｏｔポリペプチドデータベースを検索するように設定することができる。したがって、非常に迅速な確証システムは、ポリペプチドの量に応じて、例えば１日未満で純度、同定および量を確証することができる。精製ポリペプチドは、ライブラリーに配置され得るか、または続く試験および分析用のアレイへと構築され得る。
【００９６】
体液性免疫応答
例えば上記方法に従って（例えば、ＴＡＰまたはアダプター技術を用いて）調製されるワクシニアウイルスポリペプチドライブラリーおよびアレイの使用は、ワクシニアでワクチン接種した動物における体液性免疫性の抗原性標的を同定するのに使用され得る。体液性免疫応答は、抗体の生成および特定の抗原に結合する抗体の能力に関する。概して、体液性免疫系は白血球細胞を使用し、これは抗原を認識する能力を有し、抗原に結合することが可能である抗体を生成する。
【００９７】
一実施形態では、ワクシニアポリペプチドは、上述の方法に従って生成される。より特定の実施形態では、リンカー分子をコードするさらなるポリヌクレオチド配列がＴＡＰ一次断片またはＴＡＰ発現断片に付加され、その結果発現産物は、リンカー分子に結合された遺伝子産物を包含することができる。上述のように、「リンカー分子」という用語は、ポリペプチドを固体支持体に固定化することが可能である分子を包含する。
【００９８】
特定の実施形態では、ワクシニアの所定の遺伝子は、ＨＡエピトープコード配列と組み合わせられ、その結果、発現産物は、ワクシニア遺伝子産物およびＨＡエピトープ部位を包含することができる。別の実施形態では、ワクシニアの所定の遺伝子は、ヒスチジンコード配列と組み合わせられ、その結果、発現産物は、ワクシニア遺伝子産物および６×、７×、８×、９×、または１０×ヒスチジンタグを包含することができる。他の実施形態では、ワクシニア遺伝子は、ＧＳＴタグ、蛍光タンパク質タグ、またはＦｌａｇタグをコードする配列と組み合わせられる。これらの方法を使用して、そのゲノムによりコードされるあらゆるワクシニアウイルスポリペプチドを発現およびタグ付けすることが可能である。別の実施形態では、タグ付けしたワクシニアウイルスポリペプチドは、９６ウェルプレートのような固体支持体に結合され得る。結合されたポリペプチドは、ワクシニアウイルス由来の１つまたは複数の抗原で免疫化された動物由来のＢリンパ球を含有する血清または他の液体と接触させられ得る。一実施形態では、典型的なＥＬＩＳＡアッセイを実施して、抗原特異的抗体の存在を検出することができる。
【００９９】
ＥＬＩＳＡアッセイの例として、タグ付けしたワクシニアポリペプチドは、９６ウェルプレートのような固体支持体に結合され得る。結合されたワクシニアポリペプチドは、ワクシニアウイルス由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物由来の血清とともにインキュベートされ得る。反応混合物を洗浄して、任意の未結合の血清抗体を除去することができる。血清抗体の結合ワクシニアポリペプチドへ結合する能力は、無数の方法を用いて検出することができる。例えば、酵素結合二次抗体を添加して、抗原特異的抗体の存在を検出することができる。血清の供給源に応じて、任意の酵素結合二次抗体が本発明で使用され得る。例えば、一次抗体を提供するのにワクチン接種されたマウス血清を使用する場合、酵素結合抗マウス抗体を二次抗体として使用することができる。同様に、一次抗体を提供するのにヒト血清を使用する場合、酵素結合抗ヒト血清を二次酵素として使用することができる。
【０１００】
任意の適切なアッセイを使用して、結合されるポリペプチド特異的抗体の量を測定する
ことができる。また、当業者は、結合されているポリペプチド特異的抗体の量を測定するための酵素アッセイを開発することができる。一実施形態では、アッセイからの読み出しは、９６ウェルそれぞれにおける異なるレベルの抗体の存在を示すことができる。例えば、いかなる血清抗体をも生成することができないワクシニアウイルスポリペプチドがある一方で、中間レベルの抗体を生成することができるポリペプチドもあれば、高抗体レベルを生成することができるものもある。一実施形態では、高抗体力価を生成するポリペプチドは、どのポリペプチドがウイルスの表面上に存在するかを測定するためにさらに研究され得る。特定の実施形態では、高抗体力価を生成し、ウイルスの表面に位置するポリペプチドは、サブユニット天然痘ワクチンの開発で使用するための良好な候補物であり得る。
【０１０１】
図３は、ポリペプチドのアレイにより生成される体液性免疫応答を測定する一実施形態を示す。当業者は、図３に示すものからある特定の細部で逸脱させてもよい。例えば、ＨＡタグは、エピトープがプレートへの結合に起因して隠されないことを保証するために、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかに配置させてもよい。ＨＡタグ付けポリペプチドの代わりに、ヒスチジンタグを使用することができ、ポリペプチドをニッケルでコーティングしたプレートに結合させることができる。例えば、６×、７×、８×、９×、または１０×ヒスチジンタグが使用され得る。あるいは、ヒスチジンタグ付けポリペプチドは、トランスフェクト細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系から精製され得る。精製されたポリペプチドは、例えばＩｍｍｕｌｏｎプレートのようなポリペプチド吸収プレートに非特異的に結合させることができる。
【０１０２】
細胞媒介性免疫応答
上記方法に従って（例えば、ＴＡＰまたはアダプター技術を用いて）調製されるワクシニアウイルスポリペプチドライブラリーおよびアレイの使用はまた、ワクシニアでワクチン接種した動物における細胞媒介性免疫性の抗原性標的を同定するのに使用され得る。抗体が抗原への結合を直接結合する体液性免疫応答と対比して、細胞媒介性免疫応答は、抗原を表示する他の細胞の表面上へのＴ細胞結合に関する。ある特定のＴ細胞が提示抗原と接触すると、Ｔ細胞はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）または腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のようなサイトカインを産生および放出する。サイトカインは、別の細胞の挙動または特性を変更させることができる細胞性シグナルである。例えば、サイトカインは、ウイルス複製を阻害し得るか、感染細胞におけるＭＨＣクラスＩおよびペプチド輸送体分子の発現の増加を誘導し得るか、またはマクロファージを活性化し得る。したがって、抗原への結合に関連したＴ細胞より放出されるサイトカインは、Ｔ細胞／抗原相互作用を同定および検出するのに使用することができる。
【０１０３】
細胞によっては、その膜上にＭＨＣ分子を有して、Ｔ細胞に抗原を提示するものもある。効率的なＴ細胞機能は、ＭＨＣ抗原複合体の適正な認識に依存する。２つのタイプのＭＨＣ分子：クラスＩおよびクラスＩＩが存在する。２つの異なる種類のＭＨＣ分子は、細胞表面上での提示のための細胞内部の異なる供給源からのペプチドを、異なる種類のＴ細胞に結合する。任意のＴ細胞を本発明で使用することができ、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞の両方を包含する。ＣＤ８＋細胞（細胞障害性Ｔ細胞）は、クラスＩ  ＭＨＣ分子の一部であるエピトープを結合する。炎症性ＣＤ４  Ｔ細胞およびヘルパーＣＤ４
Ｔ細胞を包含するＣＤ４＋Ｔ細胞は、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子の一部であるエピトープを結合する。特殊抗原提示細胞のみが、クラスＩＩ分子を発現する。
【０１０４】
３つの主要なタイプの抗原提示細胞：Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞が存在する。これらの細胞型はそれぞれ、異なる供給源からの抗原をプロセシングして、Ｔ細胞に提示するように特殊化されており、これらのうちの２つであるマクロファージおよびＢ細胞はまた、防御エフェクターＴ細胞の続く作用の標的でもある。これらの３つの細胞型は、それらがナイーブＴ細胞を活性化することを可能にする特殊同時刺激分子を発現するこ
とができるが、マクロファージおよびＢ細胞は、感染により適切に活性化される場合のみ、それらの分子を発現する。
【０１０５】
本発明の実施形態は、サブユニットワクチンまたは他の薬学的組成物で使用するための潜在的候補物を同定するために、細胞媒介性免疫応答を誘起することが可能なワクシニアポリペプチドを検出することに関する。細胞媒介性免疫応答を検出する一方法によれば、ポリペプチドは抗原提示細胞へ供給され、そこでポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞により認識される様式で提示され得る。本発明の別の実施形態では、転写的に活性な遺伝子を抗原提示細胞へ供給することができ、そこで抗原特異的Ｔ細胞により認識され得る様式で発現および提示される。抗原特異的Ｔ細胞は、多数の供給源から獲得され得る。例えば、ワクシニアウイルス由来の１つまたは複数の抗原で免疫化した動物は、抗原特異的Ｔ細胞の良好な供給源である。例えば、ワクシニアで免疫化したヒトボランティアは、抗原特異的Ｔ細胞の供給源であり得る。
【０１０６】
ワクシニアポリペプチドの細胞媒介性応答を誘発する能力を試験するために、ＴＡＰ技術を用いて、複数のワクシニア遺伝子を増幅して、転写的に活性にすることができる。一実施形態では、約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、約２１０個、約２２０個、約２３０個、約２４０個、約２５０個、約２６０個、約２６６個のワクシニアウイルス遺伝子を、ＴＡＰ技術を用いて転写的に活性とさせる。
【０１０７】
転写的に活性な遺伝子は、抗原提示細胞へトランスフェクトされ、細胞内で発現され得る。別の実施形態では、遺伝子を抗原提示細胞にトランスフェクトする代わりに、遺伝子はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（無細胞）発現系で発現させることができ、発現されたポリペプチドが抗原提示細胞に供給され得る。ポリペプチドは、任意の方法に従って抗原提示細胞に供給され得る。一実施形態では、ポリペプチドは、「細胞内タンパク質供給試薬(Intracellular Protein Delivery Reagent)」という表題の米国特許出願第０９／７３８０４６号、および「細胞内タンパク質供給組成物および使用方法(Intracellular Protein Delivery Compositions and Methods of Use)」という表題の米国特許出願第１０／１４１５３５号に記載される技術を用いて供給され得る。そこに記載される試薬は、任意のタイプのポリペプチドを任意の細胞型に供給することが可能である。さらに、図５の結果は、抗原性ポリペプチドが上述の出願からの試薬を用いて樹状細胞に供給された後に、樹状細胞が、免疫化された宿主から供給されるＴ細胞に抗原を提示することができることを示す。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドを培養細胞へ供給するのに使用される試薬は、カチオン脂質配合物であり得る。一実施形態では、これらの試薬は、蛍光標識した抗体、高および低分子量デキストラン、フェコエリトリン−ＢＳＡ、カスパーゼ３、カスパーゼ８、グランザイムＢ、およびβ−ガラクトシダーゼを、各種接着細胞および懸濁細胞の細胞質に供給することができる。カスパーゼは細胞をアポトーシスさせることが示され得るため、ともに細胞へ供給されるカスパーゼは機能的である。一実施形態では、ワクシニアポリペプチドは、これらの試薬を用いて樹状細胞へ供給される。
【０１０９】
抗原提示細胞が特定のポリペプチドをプロセシングした後に、抗原提示細胞に結合するＴ細胞の能力を検出することは、特定のポリペプチドは細胞媒介性免疫応答を誘起するかどうかを確定するのに有用である。特定のポリペプチドは、いったん抗原提示細胞に供給されるか、または抗原提示細胞で発現されれば、アッセイを実施して、ＭＨＣ抗原複合体とのＴ細胞相互作用を同定することができる。一実施形態では、ワクシニアで免疫化した動物から得られるＴ細胞が、抗原提示細胞により提示される特定の抗原に結合することが
できるかどうかが測定され得る。例えば、ＥｌｉＳｐｏｔアッセイを実施して、抗原特異的Ｔ細胞を同定することができる。同様の免疫アッセイを実施して、ワクシニアで免疫化した個体由来のＴ細胞を刺激するワクシニア抗原（抗原提示細胞により提示される）を同定することができる。
【０１１０】
Ｔ細胞／抗原相互作用を検出する方法の１つは、Ｔ細胞がＭＨＣ抗原複合体と相互作用する場合に、Ｔ細胞により放出される特定のサイトカインの量を測定することである。細胞媒介性免疫応答を示すために、他の細胞性シグナルを使用することができることを当業者は理解することができる。一実施形態では、Ｔ細胞により放出されるＩＦＮ−γレベルは、特定のペプチドが細胞媒介性免疫応答を誘起することが可能であるかどうかを示すことができる。特定の実施形態では、ＩＦＮ−γに特異的な抗体は、固体支持体上へコーティングされ得る。未結合の抗体を洗い流し、Ｔ細胞＋抗原提示細胞または抗原形質導入抗原提示細胞を含有する上清から得られるＩＦＮ−γがウェルに添加され得る。ＩＦＮ−γに特異的なビオチン化二次抗体が添加され得る。過剰の二次抗体を除去することができ、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを混合物に添加することができる。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼは、４つのメンバーからなる免疫アッセイ「サンドイッチ」を完全なものにするために、ビオチン化抗体への結合が可能である。過剰または未結合のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼは、混合物から容易に除去される。結合ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの量を検出するために、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼと反応して発色する基質溶液が添加され得る。着色産物の強度は、Ｔ細胞／抗原提示細胞上清中に存在するＩＦＮ−γの濃度に正比例する。これらのタイプの免疫アッセイを実施するためのキットは、多くの商業的供給業者から容易に入手可能であるか、またはかかるキットを構成する必要な試薬は別個に購入され得るか、または内部で生産され得る。一実施形態では、Ｔ細胞を誘起して、高レベルのＩＦＮ−γを産生する、プロセシングおよび提示されたワクシニアポリペプチドは、サブユニットワクチンを開発する際に使用される強力な候補物であるとみなすことができる。
【０１１１】
他の方法を使用して、Ｔ細胞／抗原相互作用を検出することができることが当業者には理解されよう。これらの方法としては、ビーズベースのアッセイ、流動ベースのアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイ、サイトカインＥＬＩＳＡ、リンパ球増殖アッセイ、細胞障害性Ｔ細胞アッセイ、またはＴ細胞とレスポンダー細胞（例えば、マクロファージ）との相互作用を検出することができる任意の他のアッセイが挙げられる。
【０１１２】
熱帯熱マラリア原虫の実施形態
ワクシニアの実施形態と同様に、以下の熱帯熱マラリア原虫の実施形態に開示される方法および装置は、任意の所定の標的生物または細胞に適用可能である。したがって、この実施形態は、本発明の限定として提供されるのではなく、特定の標的生物の実用的な例として提供されるものである。
【０１１３】
マラリアは、人間の最も重大な寄生虫疾患である。化学的予防剤および化学療法剤に対するその耐性が増大しており、有効なマラリアワクチンの開発は、国際的公衆衛生の優先事項として認識されている。マラリアワクチンの開発に向けての進展は、寄生虫の複雑なライフサイクルにより幾分妨害されてきた。寄生虫は無数の細胞内および細胞外環境で発達し、寄生虫は、５，０００個以上の遺伝子を含有する大きな２６メガベースのゲノムを有する。これらの遺伝子の多くはライフサイクルの種々の段階で発現され、寄生虫は株間を広範囲に変化する。
【０１１４】
マラリアの原因である寄生虫である熱帯熱マラリア原虫のゲノムは５，０００個を上回るポリペプチドをコードすると予測され、それらのそれぞれが、ＤＮＡまたはポリペプチドワクチンに有用な潜在的抗原である。あらゆる熱帯熱マラリア原虫ポリペプチドを発現
およびスクリーニングする時間および費用は、本発明の方法を使用して大いに低減される。今やＤＮＡまたはポリペプチドワクチンに関して最も有効な抗原を同定し、ならびにこれらの抗原の段階特異的発現ならびに細胞下局在化および機能的活性を確立するための基盤を提供することが可能である。
【０１１５】
２つのタイプの免疫化が、動物およびヒトにおけるマラリア感染に対する防御を達成するのに効果的であることが見出されている。寄生虫全体または放射線弱毒性スポロゾイトによる免疫化が、前赤血球段階で免疫性を誘発する。マラリアに対する自然に獲得された免疫性は、赤血球段階に対して発生する。これらの観察により、マラリアワクチンの開発は実現可能であるが、サブユニットワクチンの現在の生成は、最適な防御も遺伝的に多様なバックグラウンドに対する防御も提供しないという確信が提供される。
【０１１６】
本発明のシステム、方法、キットおよびアレイは、マラリアに暴露された人々からのマラリアゲノム中の個々の抗原それぞれに対する体液性および細胞性免疫応答を定量化するために系統的にアッセイするのに使用され得る。この情報を用いて、マラリアＤＮＡワクチンの次の生成のための新規標的抗原を同定することができる。
【０１１７】
したがって、システム、方法、キット、およびポリペプチドアレイは、生物全体のワクチン接種により誘発される防御を再現することが生物全体自体と同程度複雑なワクチンを必要とし得るという仮定に基づく効果的なマラリアワクチンの開発のための代替的アプローチとして使用され得る。本発明による新規ワクチンは、十分数の抗原性エピトープを取り入れ、多様な宿主遺伝的特徴の状況で適切な免疫応答を誘発する。これは、生物全体誘発性の防御的免疫性の寛容性および多重性を再現するために、前例のない数の寄生虫由来のポリペプチド抗原の同定、およびこれらの抗原に基づいたワクチン供給系の開発を伴う。したがって、本発明は、２つの異なる経路の効果的な免疫化において発現される抗原性標的を同定するために、マラリアゲノムプロジェクトから得られるゲノム配列データを利用することができる。
【０１１８】
本明細書中に記載する方法、システム、およびキットは、２つの連続したＰＣＲ反応において任意の所定の遺伝子から転写的に活性なＰＣＲ（ＴＡＰ）断片を生成するのに使用され得る。ＴＡＰ断片は、培養細胞にトランスフェクトされ得るか、または動物に注入されて、同じポリペプチドをコードするスーパーコイルプラスミドに匹敵する発現レベルをもたらす。さらに、免疫原性抗原をコードするＴＡＰ断片が動物に注入される場合、スーパーコイルプラスミドにより誘発される力価に匹敵する抗体力価が生成される。
【０１１９】
照射スポロゾイトで免疫化したヒトボランティアは、宿主肝細胞内のマラリア寄生虫により発現される何百または何千もの抗原に対して体液性および細胞性免疫応答のレパートリーを発生する。主に肝臓段階抗原に対して誘導され生じた免疫応答は、感染性熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる続く攻撃から免疫化個体を防御するのに十分である。他方で、マラリアへの自然暴露により個体で誘発される防御は、主に寄生虫のライフサイクルの赤血球段階中に発現される寄生虫ポリペプチドに対して誘導される抗体により媒介される。個体の第３の関連群は、慢性的に寄生虫血症であるが、臨床的に無症候性である、マラリアに自然に暴露された個体の亜群である。不明瞭な理由で、これらの患者は通常無症候性であるが、彼らは臨床的症状を定期的に発症する場合がある。ある特定の抗原に対する免疫応答の変動は、この回復と臨床疾患のサイクルを説明できるかもしれない。
【０１２０】
中心的な仮定は、マラリアに対する免疫性を誘発する生物全体の２つのヒトモデル（照射スポロゾイトモデルおよび自然に獲得された免疫性モデル）に基づいて、５，０００個以上のマラリア抗原のうち、肝臓段階生物により発現されるポリペプチドに対して誘導される防御的Ｔ細胞応答の標的の１つのサブセット、および赤血球段階中に発現されるポリ
ペプチドに対して誘導される防御的抗体の標的である別のサブセットが存在することである。本発明の目標は、人における防御的細胞性および体液性免疫応答を生成することを担うマラリアポリペプチドすべてを同定およびカタログ作製し、また照射スポロゾイト免疫化により誘発される応答をマラリアへの自然暴露により誘発される応答と比較するための迅速なハイスループットアプローチを開発することである。
【０１２１】
この迅速なワクチン抗原スキャニングシステムは、穏やかな疾患、重症の疾患、大脳マラリア、母子感染（妊娠）、および無症候性寄生虫血症を伴う患者を含むマラリアに暴露された個体の種々の集団における免疫応答を特性化するのに使用することができる。臨床的疾患および後天性免疫性はまた、個体の年齢により影響を受けるため、幼児、児童、および成人における免疫応答はモニタリングされ得る。臨床的症状を示す患者および臨床的に無症候性の患者における免疫応答を比較して、臨床的疾患を調べることが可能である特定の抗原に対する免疫応答を同定する。これらの抗原は、予防用ワクチン開発にとって特に適した候補物であり、臨床的に症状を示すエピソードの頻度を減少するために、無症候性寄生虫血症集団を治療するための治療用ワクチンの状況でも有用であり得る。
【０１２２】
本発明の迅速なワクチン抗原スキャニングアプローチを図６および図７に示す。上述するように、これらのアプローチは、任意のタイプの生物または細胞に適用させることができる。例として、マラリアゲノムをスキャニングするためのアプローチが示される。例示的手順を以下に詳述する。体液性抗原スキャン（図６）に関して、マラリア抗原それぞれをコードするＨＡ−エピトープＴＡＰ断片は個々に増幅される。各断片１マイクログラムが、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ試薬(Gene Therapy Systems, San Diego, CA)のようなトランスフェクション試薬２マイクログラムと混合され、混合物は、ＣＨＯ−Ｋ１またはＵＭ４４９細胞を含有する９６ウェルプレートに移行される。トランスフェクションは、４８時間続けて、細胞を溶解し、上清および溶解産物を、抗ＨＡ抗体でコーティングした別の９６ウェルプレートセットに移行させる。ＨＡ−ＥｐｉＴＡＰ断片それぞれがＨＡエピトープを含有するため、溶解産物中のＨＡエピトープタグ付けポリペプチドの幾つかがＨＡ抗体でコーティングしたプレートに結合する。
【０１２３】
別の実施形態では、細胞は、発現産物を捕捉するために溶解されない。より具体的には、発現産物が細胞から分泌され、かつ／または細胞表面上で発現される場合、細胞の溶解産物に対して細胞自体が、適切なアッセイを用いて発現産物を捕捉するのに使用され得る。溶解が行われないこの実施形態では、捕捉アッセイは、トランスフェクションが行われた同じプレート（単数または複数）で行われ得る。
【０１２４】
細胞系を使用するほかに、当業者は、無細胞転写および翻訳系、例えばＴ７プロモーター系を使用してＴＡＰ発現産物を得ることができる。無細胞翻訳系としては、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽および大腸菌からの抽出物を挙げることができる。これらの系は、外因性ＲＮＡの翻訳に必要とされる巨大分子構成成分（７０Ｓまたは８０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、開始因子、伸長因子および終結因子等）を含有する粗製抽出物として調製され得る。効率的な翻訳を促進するために、各抽出物を、アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生系（真核生物系に関してはリン酸クレアチンおよびクレアチンホスホキナーゼ、および大腸菌溶解産物に関してはホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼ）、および他の補因子（Ｍｇ２＋、Ｋ＋等）で補充することができる。
【０１２５】
ある特定のマラリアエピトープが、ＨＡ抗体へのポリペプチドの結合により阻止されないことを確実にするために、２つの型のＨＡエピトープタグアプローチが使用され得る。一方の型は、マラリアポリペプチドのＣ末端に融合されたＨＡエピトープを有し、他方は、Ｎ末端に融合されたＨＡエピトープを有する。この方法では、プラスモディウム属(Pla
smodium)プロテオームは、９６ウェルマイクロタイタープレートの表面上に表示され得る。ＨｉｓＴＡＰ方法、システム、およびキットは、ＨＡ−ＥｐｉＴＡＰアプローチの代わりに使用され得る。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳アプローチにおけるＴ７は、細胞ベースのシステム、あるいはそれらと連動したものよりむしろ、遺伝子を発現するためのシステムおよび方法の一例である。
【０１２６】
照射スポロゾイトまたはマラリアへの自然暴露のいずれかにより免疫化した個体由来の血清をプレートに塗布することができ、抗原結合抗体は、アルカリホスファターゼ結合抗ヒト抗体で検出され得る。アルカリホスファターゼシグナルの強度レベルが、血清中に存在する所定の抗原に対する抗体量に比例するように、アッセイを設定することができることが当業者には理解されよう。
【０１２７】
細胞性ワクチン抗原スキャン（図７）に関して、マラリア抗原それぞれをコードするＴＡＰ断片（ＨＡタグなし）は個々に増幅される。再び、マラリアおよび熱帯熱マラリア原虫ゲノムを用いて、シナリオの１つに対する適用を説明する。しかしながら、システム、方法およびキットを任意の生物または細胞に適用させることが可能であることが当業者には理解されよう。
【０１２８】
変形体ゲノムをスキャニングする例となるプロトコルについて記載する。各断片１マイクログラムは、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬２マイクログラムと混合され得て、混合物は、ハプロタイプ特異的抗原提示細胞を含有する９６ウェルプレートに移行される。トランスフェクションを４８時間続ける。これらのＴＡＰトランスフェクト細胞は、細胞性免疫アッセイに関する標的細胞として作用することができ、抗ＩＦＮ−γ（Ｔｈ１型応答）または抗ＩＬ−４（Ｔｈ２型応答）ｍＡｂでプレコーティングした標準的なＥＬＩｓｐｏｔプレートに移行され得る。スポロゾイト免疫化個体または自然に暴露された個体由来のＴ細胞（エフェクター細胞）は、トランスフェクト抗原提示細胞を含有する各ウェルに移行され、２４時間培養され、続いて従来のＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより処理される。スポット形成細胞（ＳＦＣ）を、コンピュータによるＥＬＩｓｐｏｔ計数マシンを用いて数え上げる。サイトカイン産生細胞数は、個々のウェルに関して抗原提示細胞においてトランスフェクトされたＴＡＰ断片に対して誘導されるＴ細胞を個体が有することを示す。さらに、培養物からの上清は、必要であれば、従来のサイトカインＥＬＩＳＡアッセイによるアッセイのために−７０℃で保管され得る。
【０１２９】
体液性ワクチン抗原スキャン用のＥｐｉＴＡＰ断片を生成するのに使用される遺伝子特異的プライマーはすべて、細胞性ワクチン抗原スキャンに必要とされるＴＡＰ断片の生成に適用可能であり得て、したがって、いかなる新規プライマーを生成する必要はない。完全ゲノムが、伝統的な技法では不可能な期間でスキャニングされ得る。さらに、ほとんどの人種および民族集団で高頻度で表される種々のＨＬＡ対立遺伝子（例えば、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ１、Ａ３、Ｂ７）を発現する多数の個体をスクリーニングすることができる。
【０１３０】
候補ワクチン抗原に関してスクリーニングするためのゲノムデータを利用する方法の開発は、適切な想起免疫応答が同定標的に対して誘発され得ることを実証する能力により制限され得る。本発明は、Ｔ細胞および抗体応答をモニタリングするためのシステムを包含し、妥当な免疫想起を確実にするために、マラリア暴露された個体からの細胞性および体液性免疫応答の測量を可能にする。標的抗原の段階特異的発現の特定は重要であり得る。照射スポロゾイトによる免疫化により誘発される前赤血球段階マラリアに対する防御的免疫性がＩＦＮ−γにより媒介されることから、ＩＦＮ−γは細胞免疫原性の主要マーカーとして使用され得る。プロフェッショナル抗原提示細胞、具体的にはＨＬＡ−トランスフェクトＢ細胞系もまた利用され得る。防御的Ｔ細胞特異性の全レパートリーがこれらの個体で表されるため、スクリーニングアッセイは、放射線弱毒性熱帯熱マラリア原虫スポロ
ゾイトで免疫化した免疫ボランティアまたはマラリアに自然に暴露された半免疫個体からの試料の使用に依存し得る。混合培養中のＩＦＮ−γレベルは、ワクシニアウイルスに関して実施例３に開示するアッセイと同様のＥｌｉｓｐｏｔアッセイを用いることで測定され得る。
【０１３１】
本発明の実施形態は、照射熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトで実験的に免疫化した免疫個体またはマラリアに自然に暴露された半免疫個体由来のＰＢＭＣおよび血清による認識のために熱帯熱マラリア原虫ゲノム由来の遺伝子に対する体液性および細胞性免疫応答をスキャニングするための方法およびシステムを包含する。このスキャンの結果の１つは、ハプロサイトにおいて照射スポロゾイトにより発現される抗原（防御的Ｔ細胞免疫応答の標的）および血液段階寄生虫により発現される抗原（防御的抗体応答の標的）の同定である。
【０１３２】
サブユニットワクチン、薬学的組成物または免疫原性組成物の開発
体液性または細胞媒介性免疫応答のいずれかを誘発すると同定された特定のポリペプチドは、サブユニットワクチン、薬学的組成物または免疫原性組成物で使用されるその能力を確定するためにさらに調査され得る。「サブユニットワクチン」、「薬学的組成物」および「免疫原性組成物」という用語は、ポリペプチド、核酸、またはその両方の組合せから構成されるワクチンを包含する。ポリペプチド候補物のさらなる調査には、高率の患者におけるポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸の試験が含まれる。特定の実施形態では、表面抗原は、それらがウイルス感染性を抑制し得る見込みのために綿密に研究され得る。一実施形態では、ワクシニアゲノムによりコードされるあらゆるポリペプチドは、その免疫原性効果を測定するためにアッセイされる。細胞媒介性であろうと体液性であろうと、免疫応答を誘発するポリペプチドは、サブユニットワクチン、薬学的組成物、または免疫原性組成物として、単独での、あるいは他のポリペプチドおよび遺伝子と併用した潜在的使用を測定するためにより綿密に研究され得る。免疫応答を選択および研究するための適切な方法論は、当該技術分野で十分に確立されている。
【０１３３】
他の標的生物
上記実施形態は、ワクシニアポリペプチドの免疫原性応答を検出し、その結果に基づいてサブユニットワクチンを開発するための詳細な説明を提供するが、任意の特定の標的生物に関して同様の方法が利用され得ることを当業者は理解することができる。
【実施例１】
【０１３４】
ヒスチジンタグ付けＴＡＰ  ｅｘｐｒｅｓｓ断片の生成手順
タグ付けＴ７−ＴＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ断片を生産するのに使用された詳細な手順は、以下の通りである：９６個の異なる遺伝子をプラスミド鋳型の混合物から増幅した。第１のＰＣＲ反応は、カスタマイズされた５’および３’プライマーを用いて実行した。５’プライマーは、４３〜４８塩基を含有していた。特に、Ｔ７−Ｈｉｓ  ＴＡＰ末端は２８塩基を含有していた一方で、遺伝子特異的構成成分は１５〜２０塩基を含有していた。３’プライマーは４５〜５０塩基を含有していた。具体的には、Ｔ７−ターミネーターＴＡＰ末端は３０塩基を含有していた一方で、遺伝子特異的構成成分は１５〜２０塩基を含有していた。第１のＰＣＲ反応に関する反応温度および時間は、９４℃で２分間、続いて９４℃で２０秒間、５８℃で３５秒間、および７０℃で２分間（２ｋｂ以上を含有する遺伝子に関しては、各ｋｂについて１分を追加）を２８サイクルであった。
【０１３５】
第１のＰＣＲ反応を実施した後、先の工程からの各ＰＣＲ反応の分取物を、Ｔ７−ヒスチジンプロモーター断片およびＴ７ターミネーター断片を含有するＰＣＲ反応に移行させた。Ｔ７プロモーターは２５塩基を含有していた一方で、Ｔ７−プロモーターＨｉｓタグ断片は１０４塩基のＥｃｏＲＶ／ＢｇｌＩＩ断片を含有していた。Ｔ７−ターミネーター
断片は７４塩基オリゴヌクレオチドであった。第２のＰＣＲ反応に関する反応時間および温度は、９４℃で２分間、続いて９４℃で２０秒間、６０℃で３５秒間、および７０℃で２分間（２ｋｂ以上を含有する遺伝子に関しては、各ｋｂについて１分を追加）を３０サイクルであった。
【実施例２】
【０１３６】
ワクシニアでワクチン接種したマウスおよびヒトにおける体液性免疫性の抗原性標的を同定するためのワクシニアウイルスプロテオームの使用
防御的体液性免疫応答を引き起こすワクシニアウイルスにおける抗原すべてを系統的にスクリーニングおよび同定するのに使用される方法は以下の通りである。ＴＡＰ技術の使用により、ワクシニアゲノムのあらゆる遺伝子が増幅される。ＰＣＲ反応は、ＨＡエピトープをコードするヌクレオチド配列がこれらの増幅された転写的に活性な遺伝子に結合されるように実施される。生じたＨＡタグ付けＴＡＰ断片を、ＨＡエピトープタグを含有する２６６個のワクシニアウイルスポリペプチドすべてを産生するように発現させる。２６６個のＨＡタグ付けポリペプチドを、９６ウェルプレート中の異なるＨＡ抗体でコーティングしたウェルに入れる。ワクシニアで免疫化したヒト由来の血清を２６６個の異なるウェルそれぞれに添加する。反応をインキュベートして、洗浄して、未結合の血清ポリペプチドを除去する。プレートに結合したポリペプチドに特異的な抗体は、依然としてプレートに結合したままである。酵素結合抗ヒト抗体（ヒト血清由来のポリペプチド特異的抗体の検出用）を各ウェルに添加する。ウェルをインキュベートして、洗浄して、未結合の抗体を除去する。基質を添加して、プレートに結合しているポリペプチド特異的抗体を定量化する。
【実施例３】
【０１３７】
ワクシニアでワクチン接種したマウスおよびヒトにおける細胞媒介性免疫性の抗原性標的を同定するためのワクシニアウイルスプロテオームの使用
防御的細胞媒介性免疫応答を引き起こすワクシニアウイルスにおける抗原すべてを系統的にスクリーニングおよび同定するのに使用される方法は以下の通りである。ＴＡＰ技術の使用により、ワクシニアゲノムのあらゆる遺伝子が増幅される。ＰＣＲ反応は、あらゆる遺伝子が転写的に活性となるように実施される。生じたＴＡＰ断片を、２６６個のワクシニアウイルスポリペプチドすべてを産生するように発現させる。ポリペプチドそれぞれを、ポリペプチド供給試薬を用いて９６ウェルプレート中に配置される樹状細胞へと供給する。ワクシニアで免疫化したヒト由来の血清を２６６個の異なるウェルそれぞれに添加する。
【０１３８】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、以下の材料および方法を用いて実行される：
【０１３９】
材料：
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ９６ウェルマルチスクリーンフィルトレーションプレート（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ  ＃ＭＡＩＰ  Ｓ４５−１０）(Millipore, Bedford, MA)
抗ＩＦＮ−ｇ精製ＭＡｂ（クローン１−Ｄ１Ｋ）（ＭＡＢＴＥＣＨ  ＃３４２０−３）(Mabtech, Naka, Sweden)
抗ＩＦＮ−ｇビオチン化ＭＡｂ（クローン７−Ｂ６−１）（ＭＡＢＴＥＣＨ  ＃３４２０−６）(Mabtech, Naka, Sweden)
ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＭＡＢＴＥＣＨ  ＃３３１０−８）(Mabtech, Naka, Sweden)
アルカリホスファターゼ基質キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＃１７０−６４３２）(Bio-Rad, Hercules, CA)
カーボーネート緩衝液ｐＨ９．６（０．２μＭ滅菌濾過）
ＰＲＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＃２２４００−０８９）(Gibco, Grand Island
, N.Y.)
ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｆ４１３５−５００ｍＬ）(Sigma, St. Louis, MO)
１×ＰＢＳ（１０×ＰＢＳ  ＤＩＧＥＮＥ  ＃３４００−１０１０から調製）(DIGENE,
Gaithersburg, MD)
Ｔｗｅｅｎ(R)２０（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  ＃Ｘ２５１−０７(J.T.Baker, Phillipsburg, NJ)
【０１４０】
方法：
９６ウェルプレートは、１０〜１５μｇ／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）でコーティング抗体（抗ＩＦＮ−ｇクローン１−Ｄ１Ｋ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。無菌技法を用いて、プレートを軽くはじいてコーティング抗体を除去して、ＲＰＭＩ−１６４０で６回洗浄する。プレートを、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ（またはヒトＡＢ血清）１００μＬ／ウェルで室温にて１〜２時間ブロックする。プレートを軽くはじいてブロッキング緩衝液を除去して、抗原特異的ペプチドまたは対照ペプチド１００μＬ／ウェルを、最終濃度１０μｇ／ウェルで添加する。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を４×１０５／ウェルおよび１×１０５／ウェルで添加する。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で３６時間インキュベートする。プレートを軽くはじいて細胞を除去して、２００〜２５０μＬ／ウェルでＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ(R)２０を用いて６回洗浄する。プレートをペーパータオル上でブロット乾燥する。
【０１４１】
１×ＰＢＳで１：１，０００で希釈したビオチン化抗体（抗ＩＦＮ−ｇクローン７−Ｂ６−１）を１００μｌ／ウェルで添加する。得られた溶液を室温で３時間インキュベートする。プレートを軽くはじいてビオチン化抗体を除去して、２００〜２５０μＬ／ウェルでＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ(R)２０を用いて６回洗浄する。プレートをペーパータオル上でブロット乾燥する。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを、１×ＰＢＳで１：１，０００に希釈して１００μＬ／ウェルで添加する。プレートを室温で１時間インキュベートする。プレートを軽くはじいてストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを除去して、２００〜２５０μＬ／ウェルで０．０５％Ｔｗｅｅｎ(R)２０で６回洗浄する。プレートを、２００〜２５０μＬ／ウェルで１×ＰＢＳを用いてさらに３回洗浄する。プレートをペーパータオル上でブロット乾燥する。
【０１４２】
基質を、１００μＬ／ウェルで室温にて１０〜１５分間添加する。基質は、製造業者のプロトコルに従って調製される。２５×基質緩衝液を、ｄＨ２０中に１×濃度へと希釈する。試薬Ａ＆Ｂそれぞれを、１×基質緩衝液中に１：１００で希釈する。多量の水道水でプレートをすすぐこと（プレートに多量の水を注ぎ、数回軽くたたくこと）により、比色基質を停止させる。プレートを暗所で室温にて一晩乾燥させる。実体顕微鏡(Zeiss KS ELIspot)を用いて、ＩＦＮ−γ産生細胞に相当するスポットを視覚的に測定する。結果は、１０６個の脾臓細胞当たりのＩＦＮ−γ分泌細胞数として表され得る。ワクシニアペプチドエピトープを試験するための応答がペプチドなしに対する応答と比較した場合に有意差がある（ｐ＜０．０５）場合、および刺激指数（ＳＩ＝試験ペプチドによる応答／対照ペプチドによる応答）が２．０を超える場合には、応答は陽性であるとみなされる。
【実施例４】
【０１４３】
細胞性ワクチン抗原選別
ヒトボランティアを、マラリアの原因である感染性作用物質である熱帯熱マラリア原虫由来の照射スポロゾイトで免疫化した。ボランティア由来の樹状細胞を単離および培養する。熱帯熱マラリア原虫由来の組換えＣＳＰポリペプチドを、「細胞内タンパク質供給試薬(Intracellular Protein Delivery reagents)」という表題の米国特許出願第０９／７３８０４６号に記載されるポリペプチド供給試薬を用いてまたは用いずに、樹状細胞へ供給した。免疫化ボランティアから単離したＴ細胞を培養物に添加した。ＥｌｉＳｐｏｔア
ッセイにより、ＣＳＰが上記供給試薬と一緒に培養物に添加された場合に培養物に添加された２５０，０００個のＴ細胞から１２０個のＣＳＰ抗原特異的Ｔ細胞が同定された。ＣＰＳが上記供給試薬なしで添加された場合、シグナルはかろうじてバックグラウンドを超えた。
【実施例５】
【０１４４】
マウスのＤＮＡ免疫化
１つの実験当たり４０匹の動物を平均とし、４週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスから構成される１群当たり５匹の動物で実験を設定する。これらのマウスを、選択したワクシニアウイルス抗原をコードするプラスミドＤＮＡまたは転写的に活性なＰＣＲ断片５０μｇで、各前脛骨筋に、３週間隔で３回筋内に免疫化する。
【０１４５】
抗体研究のために、各免疫化の１０日後に血清を収集する。血液試料（約５０μｌ）を、滅菌パスチュラピペットを用いて眼窩出血によりマウスから収集する。マウスは、およそ５０μｌの容量で約一週間に一度出血させる。
【０１４６】
３回目の免疫化の１４日後に脾臓細胞を収集し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩｓｐｏｔアッセイのようなＴ細胞観察に供する。実験の最後にＣＯ２（ＳＯＰ  ９８．１９）により安楽死させた動物で組織収集を行う。実験は、５匹の動物／群であり得て、４０匹の動物／実験×４回の実験を平均として、総数１６０匹のマウスである。
【実施例６】
【０１４７】
ＰＣＲ鋳型として使用されるべきワクシニアウイルスゲノムＤＮＡの調製
ワクシニアビリオンＤＮＡをＰＣＲ鋳型として使用する。粗製ストックワクシニアを用いて、ＨｅＬＡ細胞攪拌培養物１０リットルを感染させる。感染の２〜３日後に、遠心分離により細胞を収集し、氷上で１０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）中で少しずつ破壊する。核をペレット化して、洗浄して、再ペレット化して、その後上清を組み合わせて、トリプシン処理して、３６％スクロースクッション上に置いた。遠心分離後、ペレット化したウイルスを分散させて、トリプシン処理して、５〜４０％スクロース勾配上へ載せる。バンドを収集し、希釈して、ウイルスを洗浄する。精製ビリオンのデオキシコレート抽出物を遠心分離して、細片を除去して、ペレットを再抽出し、組み合わせた上清をＤＥＡＥセルロースカラムにかけて、０．１Ｍ  ＫＣｌ、トリスＨＣｌ（ｐＨ８．４）で平衡化する。２５０ｍＭ  ＫＣｌでカラムを洗浄した後、ワクシニアＤＮＡを０．７Ｍ  ＫＣｌで溶出させ、エタノール沈殿し、ＴＥ緩衝液に再溶解させる。
【実施例７】
【０１４８】
ヒト樹状細胞の調製
樹状細胞を、Allcells：カタログ番号ＰＢ００２（ＮＰＢ−単核細胞）から注文した。細胞は５０ｍＬ緩衝液中に存在していた。細胞をすぐに計数し、総数は３１２．５×１０６個であった。細胞をペレット化して、ＤＮアーゼを含有する２５ｍＬ  ＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁させた。この溶液（３０μｇ／ｍＬ）を室温で５分間インキュベートした。完全培地で細胞を二度洗浄した。細胞を１０×１０６個の細胞／３ｍＬで再懸濁させた。皿それぞれに完全培地１０ｍＬを含有する１２個の１０ｍｍ皿を使用した。細胞を３７℃で３時間インキュベートした。プレートを穏やかに振とうし、上清を吸引することにより、非接着細胞を除去した。その後、接着細胞を含有する皿を、２％ヒト血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０  １０ｍＬで３回洗浄した。５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび５００ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４を含有する培養培地１０ｍＬを、プレートそれぞれに添加した。この培養培地は４日目まで添加した。４日後、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の入っていない培養培地を添加した。トランスフェクションは５日目に行われた。完全培地は、ＲＰＭＩ−１６４０（４５５ｍＬ）、５％ヒトＡＢ血清（２５ｍＬ）、非必須アミノ酸（５ｍ
Ｌ）、ピルビン酸ナトリウム（５ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（５ｍＬ）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（５ｍＬ）から構成されていた。
【実施例８】
【０１４９】
マウス骨髄からの樹状細胞の生成
１匹のマウスの骨（マクロファージを除去していない大腿骨２つおよび脛骨２つ）から細胞を採取した。骨髄から赤血球を獲得して、溶解した。細胞を計数し（５１×１０６個の細胞、総数）、トランスフェクション前に、成長培地中で８日間培養した（２．５×１０６個の細胞／プレート、１０ｍＬ／プレート）。４日目に、成長培地をもう１０ｍＬ添加した。６日目に、古い培地１０ｍＬを各プレートから採取して、細胞をペレット化した。１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび２．５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−４を有する培地１０ｍＬ中に細胞を再懸濁させた。細胞を培養に戻した。８日目にトランスフェクトするまで細胞を培養した。トランスフェクションの日に、２．５×１０６個の細胞を各皿から収集した。ｍｂｍＤＣ用の成長培地は、ＤＭＥＭ／Ｉｓｃｏｖｅ、１０％  ＦＣＳ、５０μＭ  β−メルカプトエタノール、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ヘペス、１×非必須アミノ酸、２０ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＧＭ−ＣＳＦ、および５ｎｇ／ｍＬ  ｒｍＩＬ−４を含有していた。
【実施例９】
【０１５０】
ＨＡエピトープタグの付加
オリゴは、それぞれｐＣＭＶｍおよびｐＴＰ−ＳＶ４０からのＴＡＰプロモーターおよびターミネーター断片を用いて、ＨＡエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を付加して設計される。コード配列の５’末端へのＨＡエピトープの付加に関して、以下の配列を使用する：
プロモーター５’：ＣＣＧＣＣＡＴＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧ（配列番号２）
プロモーター３’：ＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＧＴＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＣＡＴＴＧＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＧＧＴＧＣ（配列番号３）
コード配列の３’末端へのＨＡエピトープの付加に関して、以下の配列を使用する：
ターミネーター５’：ＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧＣＴＴＡＧＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣＡＴＧ（配列番号４）
ターミネーター３’：ＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧ（配列番号５）
【０１５１】
上記方法は以下を包含する：
ＰＣＲを用いて、鋳型としてｐＣＭＶｍを利用して新規ＨＡプロモータを、および鋳型としてｐＴＰ−ＳＶ４０を利用して新規ＨＡターミネーターを増幅する。得られたＰＣＲ産物を、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット(Qiagen, Seattle, WA)を用いてゲル精製する。ＰＣＲ産物および両方のプラスミド（ｐＣＭＶｍおよびｐＴＰ−ＳＶ４０）をＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩ制限酵素で消化する。消化産物すべてを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲル精製する。ＨＡプロモーターおよびＨＡターミネーターを、消化ｐＣＭＶｍおよびｐＴＰ−ＳＶ４０プラスミドに個々に連結する。これらのプラスミドをＤＨ５に形質転換して、カナマイシンを含有するＬＢプレート上で一晩成長させ、コロニーを選択して、カナマイシンを含有するＬＢ培地中で成長させる。ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキットを用いて、プラスミドを単離する。ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩを用いてプラスミドを消化する。消化物をゲル上に流して、正しいサイズの挿入物を有するプラスミドを含有するコロニーを同定する。プラスミドをシーケンシングして、挿入物が正しいことを確認する。プレップ培養を成長させ、プラスミドを単離して、プラスミドをＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで消化して、プロモーターおよびターミネーター断片をゲル精製する。Ｅｐｉ−ＴＡＰ−５’ＨＡおよびＥｐｉ−ＴＡＰ−３
’ＨＡキットを使用する。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】ＴＡＰ発現断片を生成するのに使用される方法の１つを示す図である。
【図２】ＴＡＰ技術を用いて多数の遺伝子を増幅し、上記遺伝子産物を発現させ、得られたポリペプチドを精製および定量化する方法を示す図である。
【図３】各ポリペプチドの、体液性免疫応答を誘発する能力を測定するために、標的生物由来の複数のポリペプチドをアッセイし得る方法を示す図である。
【図４】各ポリペプチドの、細胞媒介性免疫応答を誘発する能力を測定するために、標的生物由来の複数のポリペプチドをアッセイし得る方法を示す図である。
【図５】蛍光タンパク質（ヤギＩｇＧ抗体）は、タンパク質供給試薬なし（Ａ＆Ｃ）に対して、タンパク質供給試薬（Ｂ＆Ｄ）を有するＮＩＨ−３Ｔ３細胞（Ａ＆Ｂ）およびヒト樹状細胞（Ｃ＆Ｄ）により効果的に供給することができることを示す図である。
【図６】体液性ワクチン抗原スキャンを示す図である。熱帯熱マラリア原虫由来の４２４個の異なる抗原をコードするＨＡ−ＥｐｉＴＡＰ断片を増幅し、ＵＭ４４９細胞を含有する５個の９６ウェルプレートの別個のウェルに個々にトランスフェクトすることができる。細胞を溶解して、上清および溶解産物を、プレートの表面に結合されたＨＡ抗体を含有する別の９６ウェルプレートセットに移行する。ＨＡ抗体は、細胞溶解産物中に存在するＨＡエピトープタグ付け抗体を捕捉することができる。感染個体由来の血清を各ウェルに添加して、ウェルの底部の抗原は、血清中に存在する抗マラリア抗体を捕捉することができる。結合抗マラリア抗原抗体は、抗ヒト検出用抗体を用いて定量化される。自然に免疫化された個体は一般に、血液段階生物に対する抗原を示し得るのに対して、スポロゾイト免疫化した個体は一般に、肝臓段階生物に対する抗体を有する。
【図７】細胞性ワクチン抗原スキャンを示す図である。熱帯熱マラリア原虫由来の４２４個の異なる抗原をコードするＴＡＰ断片を増幅し、９６ウェルプレート中のハプロタイプ適合性抗原提示細胞に個々にトランスフェクトする。免疫化個体の血液から単離したＴ細胞をトランスフェクト細胞と混合し、インターフェロン−γ産生をＥｌｉｓｐｏｔアッセイによりモニタリングする。スポロゾイト個体における防御的応答に寄与する多数の潜在的抗原がこのアプローチにより発見される。
【図８】プロモーターおよびターミネーターを隣接する５’および３’プライマー（Ｐ１およびＰ２）を用いて、ＣＭＶベースのプラスミド鋳型から生成されるＰＣＲ増幅産物を示す図である。これにより、完全長プロモーターおよびターミネーター配列が隣接するレポーター遺伝子をコードするＰＣＲ断片が産生される。
【図９】触媒量の遺伝子特異的プライマー（Ｐ３およびＰ４）と混合した触媒量のプロモーターおよびターミネーター断片（Ｆ１およびＦ２）を示す図である。プライマーＰ３およびＰ４はまた、プロモーターおよびターミネーターに相補的な約２０個のヌクレオチド配列を有する。プロモーターおよびターミネーターの５’末端および３’末端に相補的な過剰量のプライマーＰ１およびＰ２は、プロモーターおよびターミネーター配列を隣接して有する遺伝子断片に導く産物を増幅するのに使用される。
【図１０】ＴＡＰターミネーターおよびＴＡＰプロモーター断片用の供給源として使用することができるプラスミドを示す図である。
【図１１】ＴＡＰクローニングスキームを示す図である。ＴＡＰ断片を、相補的末端を含有する線状化プラスミドと混合することができ、混合物を、高リコンビナーゼ活性を含有する宿主細菌細胞にエレクトロポレートすることができる。生じた安定なコロニーのほとんどが、定方向的に挿入された所定の遺伝子を有するプラスミドを含有する。
【図１２】共通の５’および３’ＴＡＰ末端を有する各遺伝子に特異的なカスタムオリゴを用いて増幅したマラリア寄生虫由来の３つの抗原をコードするＤＮＡ鋳型を示す図である。第２のＰＣＲ反応を実施して、各一次ＴＡＰ産物にＴＡＰプロモーターおよびＴＡＰターミネーターを付加して、さらなる１０５０ｂｐのサイズを付加して、最終的な活性ＴＡＰ発現断片を生産した。相当する一次および最終ＰＣＲ産物を互いに隣接して流して、試料を０．８％アガロースゲル上の電気泳動により分離した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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