(57)【要約】本発明はリポソーム中に活性な生物学的物質を効率的に封入するための方法を開示する。この方法はリポソーム形成性脂質の懸濁液を乾燥させ、そして次に得られた乾燥組成物を、このように形成するリポソーム中に高収率で封入される生物学的に活性な材料を含む水溶液で水和することを含んでなる。また本発明は本発明の方法により生成されるリポソーム製剤およびそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的物質をリポソーム小胞に充填する方法であって：
ｉ）少なくとも１つのリポソーム形成性脂質を溶媒中で可溶化し、そしてそれを乾燥させて乾燥リポソーム形成性脂質を形成し；
ｉｉ）生物学的物質の水溶液を提供し；
ｉｉｉ）該生物学的物質をリポソーム形成性脂質から形成されたリポソームに充填する様式で、生物学的物質の溶液で乾燥リポソーム形成性脂質を水和する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
リポソーム小胞に生物学的物質を充填する方法であって：
ｉ）少なくとも１つのリポソーム形成性脂質を溶媒中で可溶化し、そしてそれを凍結乾燥させて乾燥リポソーム形成性脂質を形成し；
ｉｉ）生物学的物質の水溶液を提供し；
ｉｉｉ）該生物学的物質を該脂質から形成されたリポソームに充填する様式で、生物学的物質の溶液で凍結乾燥リポソーム形成性脂質を水和する、
ことを含んでなる方法。
【請求項３】
上記リポソーム形成性脂質がリン脂質、リポポリマー、カチオン性脂質、スフィンゴ脂質それらの組み合わせ物、およびそれらと膜活性ステロールとの組み合わせ物を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記リン脂質が、飽和もしくは不飽和リン脂質、水素添加、部分的水素添加もしくは非水素添加リン脂質、完全もしくは半合成リン脂質から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記水素添加、部分的水素添加または非水素添加リン脂質が天然源に由来し、該天然源が卵黄、乳、コメまたはダイズから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記完全合成または半合成リン脂質がジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリンまたはそれらの混合物から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
リポソーム形成性脂質がＤＭＰＣおよびＤＭＰＧの混合物を含んでなる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記ＤＭＰＣおよびＤＭＰＧの混合物が１：２０から２０：１の間のモル比である請求項７に記載の方法。  
【請求項９】
上記リポポリマーがＰＥＧ化脂質である請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
上記スフィンゴ脂質が卵に由来するＳＰＭ、乳に由来するＳＰＭ、Ｎ−パルミトイル−ＳＰＭ、Ｎ−ステアロイル−ＳＰＭ、Ｎ−オレイル−ＳＰＭ（Ｃ１８：１）、Ｎ−ネルバシルＣ（Ｃ２４：１）ＳＰＭ、Ｎ−リグノセリルＳＰＭ（Ｃ２４：０）またはそれらの混合物から選択されるスフィンゴミエリン（ＳＰＭ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
上記カチオン性脂質が１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）から選択されるモノカチオン性脂質、またはスペルミンに基づくＮ−［２［［２，５−ビス［（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキソペンチル］アミノ］エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス［（１−オキソ−９−オクタデセニル）オキシ］−１−プロパンアミニウム１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＳＰＡ）であるポリカチオン性脂質、またはコレステロールで修飾されたカチオン性脂質である、請求項３記載の方法。
【請求項１２】
上記生物学的物質が、生物学的細胞構造、細胞産物および天然または合成のバイオポリマーおよび／もしくはオリゴマーを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
上記生物学的細胞構造が、細胞膜、リボソームまたはミトコンドリアを含んでなり；そして上記バイオポリマーもしくはオリゴマーが酵素、プロ酵素、コファクター、受容体、ビリオンまたはビリオン表面抗原、細菌または他の病原体、それらの膜、断片および表面抗原；抗原、抗体、補体因子、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記生物学的物質が免疫アジュバントである、請求項１、２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
上記免疫アジュバントが免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド配列（ＩＳＳ−ＯＤＮ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記生物学的物質が抗原または抗原の混合物である、請求項１、２または１３に記載の方法。
【請求項１７】
上記生物学的物質がペプチドまたはペプチド混合物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
上記生物学的物質がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
上記生物学的物質がサイトカインである請求項１、２または１３に記載の方法。
【請求項２０】
上記生物学的物質が免疫アジュバントおよび少なくとも１つの抗原の組み合わせ物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
上記溶媒が極性の水混和性溶媒である請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
上記溶媒が３級−ブタノールである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
溶媒が無極性溶媒である請求項１および２に記載の方法。
【請求項２４】
上記無極性溶媒がシクロヘキサンである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記生物学的物質の溶液が、滅菌水中、または０．９％ＮａＣｌ、緩衝生理食塩水、５％デキストロース、緩衝化デキストロース、１０％シュクロースおよび緩衝化シュクロースからなる群から選択される生理学的に許容される水溶液中のそれらの溶液である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
乾燥リポソーム形成性脂質またはリポソーム形成性脂質の乾燥混合物の第１製剤、および生物学的物質の第２製薬学的組成物を含んでなる２つの製薬学的組成物の組み合わせ物であって、組み合わせ物が該生物学的物質を充填したリポソームを含んでなる製薬学的組成物の調製に使用される、上記組み合わせ物。
【請求項２７】
包装状態である、請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項２８】
上記製薬学的製剤を調製するために上記第１および第２製薬学的組成物の使用に関する使用説明書、該使用説明書は第１組成物の乾燥リポソーム形成性脂質を第２組成物の生物学的物質の水溶液で水和して生物学的物質を充填したリポソームを得ることを含んでなり；およびこのようにして得られた製薬学的製剤の必要な個体への投与を処方する使用説明書を含んでなる、請求項２６または２７に記載の組み合わせ物。
【請求項２９】
上記生物学的物質の溶液を形成するために、生理学的に許容され得る水性媒質および／または滅菌水を含んでなる、請求項２６ないし２８のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項３０】
上記リポソーム形成性脂質がリン脂質、リポポリマー、カチオン性脂質、スフィンゴ脂質それらの組み合わせ物およびそれらと膜活性ステロールとの組み合わせ物を含んでなる、請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項３１】
上記水素添加、部分的水素添加または非水素添加リン脂質が天然源に由来し、該天然源が卵黄、乳、コメまたはダイズから選択される、請求項３０に記載の組み合わせ物。
【請求項３２】
上記完全合成または半合成リン脂質がジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリンまたはそれらの混合物から選択される、請求項３０に記載の組み合わせ物。
【請求項３３】
リポソーム形成性脂質がＤＭＰＣおよびＤＭＰＧの混合物を含んでなる請求項３２に記載の組み合わせ物。
【請求項３４】
上記ＤＭＰＣおよびＤＭＰＧの混合物が１：２０から２０：１の間のモル比である請求項３３に記載の組み合わせ物。  
【請求項３５】
上記リポポリマーがＰＥＧ化脂質である請求項３０に記載の組み合わせ物。
【請求項３６】
上記スフィンゴ脂質が卵に由来するＳＰＭ、乳に由来するＳＰＭ、Ｎ−パルミトイル−ＳＰＭ、Ｎ−ステアロイル−ＳＰＭ、Ｎ−オレイル−ＳＰＭ（Ｃ１８：１）、Ｎ−ネルバシルＣ（Ｃ２４：１）ＳＰＭ、Ｎ−リグノセリルＳＰＭ（Ｃ２４：０）またはそれらの混合物から選択されるスフィンゴミエリン（ＳＰＭ）である、請求項３０に記載の組み合わせ物。  
【請求項３７】
上記カチオン性脂質が１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）から選択されるモノカチオン性脂質、またはスペルミンに基づくＮ−［２［［２，５−ビス［（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキソペンチル］アミノ］エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス［（１−オキソ−９−オクタデセニル）オキシ］−１−プロパンアミニウム１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＳＰＡ）であるポリカチオン性脂質、またはコレステロールで修飾されたカチオン性脂質である、請求項３０記載の組み合わせ物。
【請求項３８】
上記生物学的物質が、生物学的細胞構造、細胞産物、天然または合成のバイオポリマーおよび／もしくはオリゴマーを含んでなる、請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項３９】
上記生物学的細胞構造が、細胞膜、リボソームまたはミトコンドリアを含んでなり；上記バイオポリマーもしくはオリゴマーが酵素、プロ酵素、コファクター、ビリオンまたはビリオン表面抗原、抗原、抗体、補体因子、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ、または阻害ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）である、請求項３８に記載の組み合わせ物。
【請求項４０】
上記生物学的物質が免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド配列（ＩＳＳ−ＯＤＮ）を含んでなる、請求項３８に記載の組み合わせ物。
【請求項４１】
上記生物学的物質がペプチドまたはタンパク質を含んでなる請求項３８に記載の組み合わせ物。
【請求項４２】
上記生物学的物質が免疫アジュバントである請求項３８に記載の組み合わせ物。
【請求項４３】
上記生物学的物質が抗原または抗原の混合物である請求項３８に記載の組み合わせ物。
【請求項４４】
上記生物学的物質がアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項３９に記載の組み合わせ物。
【請求項４５】
上記生物学的物質がサイトカインである請求項３９に記載の組み合わせ物。
【請求項４６】
上記生物学的物質が免疫アジュバントおよび少なくとも１つの抗原の組み合わせである、請求項３９に記載の組み合わせ物。
【請求項４７】
上記生理学的に許容される水性媒質が滅菌水、または０．９％ＮａＣｌ、緩衝化生理食塩水、５％デキストロース、緩衝化デキストロース、１０％シュクロース、緩衝化シュクロースおよびその混合物からなる群から選択される溶液である、請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項４８】
有効成分として生物学的物質を充填した治療に有効な量のリポソームおよび製薬学的に許容される添加剤を含んでなり、充填したリポソームが請求項１ないし２５のいずれか１項に記載の方法により調製された製剤。
【請求項４９】
治療に有効な量の請求項４８に記載の製剤を必要な個体に投与することを含んでなる、疾患の防止または処置法。
【請求項５０】
少なくとも１つの抗原と組み合わせた上記製剤の投与を含んでなり、該抗原が遊離状態であるか、またはリポソームに内包されている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
上記抗原が生物学的物質と同じリポソームに内包されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
上記抗原が生物学的物質とは別のリポソームに内包されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
上記有効量が１ｋｇの体重あたりのリン脂質により測定して最高２，０００ｍｇの充填リポソーム小胞の投薬用量である、請求項４９ないし５２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般にリポソーム製剤、そして特に生物学的物質を充填したリポソームの調製法および様々な使用法およびその生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
以下は本発明の技術分野の状況の説明に直接関係すると考えられる従来技術の一覧表である。
（１）非特許文献１；
（２）非特許文献２；
（３）特許文献１；
（４）特許文献２；
（５）非特許文献３；
（６）非特許文献４；
（７）非特許文献５；
（８）非特許文献６；
（９）非特許文献７；
（１０）非特許文献８；
（１１）非特許文献９；
（１２）非特許文献１０；
発明の背景
効果的な物質を投与するための媒介物として天然または合成のリン脂質により形成された脂質小胞を使用するための幾つかの試みがなされた。提案された臨床的使用には、ワクチンのアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）、遺伝子伝達および診断用撮影を含んだが、主な努力は悪性および真菌感染のような感染性疾患の処置における非標的性および標的性薬剤担体としてのリポソームの開発であった。
【０００３】
効果的ではあるが毒性の抗真菌性のアンホテリシンＢは、欧州で経口使用が認可された最初のリポソームに配合された薬剤である。
【０００４】
アドリアマイシン（ドキソルビシン）のような抗腫瘍剤もリポソームに包含された。ＤＯＸＩＬ（リポソーム中のドキソルビシン）は米国で非経口的な臨床使用が認められた最初のリポソーム製剤である。他のリポソーム製剤はワクチン、アジュバントおよび生物学的応答モディファイヤーのようなサイトカインおよびその他の担体として開発された。
【０００５】
リポソームは遺伝子伝達の分野で媒介物としても利用されている［非特許文献１１］。別の応用では、リポソームは治療用タンパク質の送達に使用された。Ｎ．Ｓａｋｕｒａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．［非特許文献１２；非特許文献１３］は、第ＶＩＩＩ因子を含むリポソームがフォン  ウイルブランド（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ）病に罹患している患者に経口投与するために調製されたことを報告する。
【０００６】
第ＶＩＩＩ因子の内包は、タンパク質である第ＶＩＩＩ因子濃縮物をアプロチニンを含む溶液に溶解し、そしてレシチンをコートしたフラスコに移すことにより行なわれた。フラスコを陰圧下で３０分間回転させることにより乾燥させた後、第ＶＩＩＩ因子濃縮物を封じ込めたリポソームが形成された。このリポソーム分散物を遠心してリポソーム中に封入された４０％の第ＶＩＩＩ因子を生成した。
【０００７】
リポソームに薬剤を封入する別の方法は、用語「脱水−再水和（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ−ｒｅ−ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）」と称される手順に基づく。これはＣ．Ｋｉｒｂｙ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ［非特許文献３］に記載されている。この調製では、封入はさらなる脂質を使用することにより上昇し、そしてコレステロールの使用が薬剤の封入に正の影響を有すると記載された。
【０００８】
小胞に生物学的物質を充填するためのさらに別の方法は、特許文献２の３．２．２および特許文献１に記載されている。そこに記載されている方法（１つまたは複数）に従い、生物学的構造、バイオポリマーおよび／またはオリゴマーを充填したリポソームは、有機溶媒中の両親媒性材料（リポソーム形成性脂質：ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｌｉｐｉｄｓ）の画分と生物学的構造（１つまたは複数）、バイオポリマーおよび／またはオリゴマーの画分を水性媒質から同時に乾燥（ｃｏ−ｄｒｙｉｎｇ）することにより得られる。
【０００９】
本発明は生物学的物質、特に治療的に活性な材料を脂質膜小胞（リポソーム）に効率的に内包する（＞６０％）新規方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明に従い興味深い生物学的物質の群は、オリゴヌクレオチド、そして特に免疫刺激オリゴデオキシ−ヌクレオチドおよびそれらの類似体（ＩＳＳ−ＯＤＮまたはＣｐＧモチーフ）である。典型的にはＩＳＳ−ＯＤＮは、２つの５’プリン、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよび２つの３’ピリミジン（Ｐｕ−Ｐｕ−ＣｐＧ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒ）の一般構造を有する活性な６−ｍｅｒ配列を通常含む短い合成オリゴデオキシヌクレオチド（６〜３０塩基）である。
【００１１】
細菌ＤＮＡおよびその合成ＩＳＳ−ＯＤＮは、先天的免疫および特異的な適応免疫応答の両方に有力な刺激物であることが知られており、それらには単球／マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞の直接的な活性化を含む。さらに細菌ＤＮＡおよびその合成ＩＳＳ−ＯＤＮは前−炎症サイトカイン（例えばＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮｓ、ＴＮＦα等）の生産を誘導し、そしてＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩおよび同時刺激分子の発現をアップレギュレートする［非特許文献１４］。
【００１２】
動物実験では、ＩＳＳ−ＯＤＮｓは強力なＴｈ１および粘膜アジュバント性を広い範囲の抗原［非特許文献５］またはアレルゲン［非特許文献６］に対して現す。さらにＩＳＳ−ＯＤＮを用いた前処置は関連抗原の同時投与無しでも、細胞内病原体の後の感染に対して防御を有することを示し（約２週間）［非特許文献７］、先天的免疫の活性化を示した。
【００１３】
ＩＳＳ−ＯＤＮｓの免疫刺激活性には、Ｔｏｌｌ−様受容体ファミリーに属する細胞受容体、ＴＬＲ９へのそれらの結合後に、エンドサイトーシスによる細胞の取り込みが必要である。エンドソームの酸性化およびＯＤＮの消化、続いて特異的タンパク質キナーゼとの相互作用は、反応性酸素中間体の急速な生成をもたらし、ＭＡＰＫおよびＮＦ−κＢ経路の活性そして続いてサイトカイン生産を導く［非特許文献１５］。
【００１４】
望ましい免疫調節効果を達成するために、マウスでは５０〜１００μｇ／用量／マウスの可溶性ＩＳＳ−ＯＤＮの用量、そして多くの場合、２回以上の投与が必要である。この比較的高用量および反復投与は、理論的には誘導される「サイトカイン−ストーム（ｓｔｏｒｍ）」から生じる副作用を引き起こす可能性がある［非特許文献８］。
【００１５】
リポソームは、インビボで長期にわたりゆっくりと放出され、そしてマクロファージおよび樹状細胞により迅速かつ効率的に取り込まれる種々の薬剤および生物物質を効果的に封入することができ、このことはリポソームがＩＳＳ−ＯＤＮに基づくワクチンのような生物学的物質の効率的送達系として役立ち得ることを示唆している［非特許文献９；および非特許文献１０］。
【００１６】
本発明に従い興味深い生物学的物質の他の群は抗原（すなわちワクチン）および免疫刺激サイトカイン（例えばインターロイキン−２［ＩＬ−２］、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子［ＧＭ−ＣＳＦ］、インターフェロンγ［ＩＦＮ−γ］）である。幾つかの実験ではワクチンおよびサイトカインのリポソーム送達が動物モデルにおいてそれらの生物活性を顕著に強化したことが示された［非特許文献９；非特許文献１０；および非特許文献１６］。
【００１７】
しかしこれらの実験において、リポソームへの内包は、時間がかかり、そしてしばしば低い内包効率および低い安定性をもたらす種々の技術により行われたことに注目すべきである。
【特許文献１】米国特許第６，１５６，３３７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０６６，３３１号明細書
【非特許文献１】Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ  Ｄ．，ａｎｄ  Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ  Ｙ．、生化学的分析の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）で、（Ｇｌｉｃｋ  Ｄ．，編集）、ウィリー（Ｗｉｌｅｙ）  ＮＹ  第３３７−４６２頁、１９８８
【非特許文献２】Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ  Ｙ．，ａｎｄ  Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ  Ｄ．Ｊ．Ａ．、製薬技法の辞典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、（Ｓｗａｂｒｉｃｋ  Ｊ  ａｎｄ  Ｂｏｙｌａｎ  Ｊ．Ｃ．編集）第９巻、マルセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）ＮＹ  第１−３９頁（１９９４）
【非特許文献３】Ｃ．Ｋｉｒｂｙ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ［バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９８４年１１月、第９７９−９８４頁
【非特許文献４】Ｖａｎ  Ｕｄｅｎ  Ｊ．，ａｎｄ  Ｒａｚ，Ｅ．（ｅｄ．）  ｉｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２２：１−９（２０００）
【非特許文献５】ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，  Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：２６５７−２６６０（２００１）
【非特許文献６】Ｈｏｍｅｒ，Ａ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１７９，１０２−１１８（２００１）
【非特許文献７】Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２２：１７３−１８３（２０００）
【非特許文献８】Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２２：１６７−１７１（２０００）
【非特許文献９】Ａｌｖｉｎｇ，Ｃ．Ｒ．（１９９７）、新世代ワクチン（Ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）で、第２版（Ｌｅｖｉｎｅ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｗｏｏｄｒｏｗ，  Ｇ．Ｃ．，Ｋａｐｅｒ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｏｂｏｎ，Ｇ．Ｓ．，編集）、マルセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク、第２０７−２１３頁
【非特許文献１０】Ｋｅｄａｒ，Ｅ．ａｎｄ  Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙ．（１９９８）  ガンの生物学的療法：免疫療法から遺伝子療法へ（Ｔｈｅ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒｓ；ｆｒｏｍ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）で、（Ｃｈｏｕａｉｂ  Ｓ，編集），ＩＮＳＥＲＭ，パリ、第３３３−６３２頁
【非特許文献１１】Ｋａｓｔｅｌ  Ｐ．Ｌ，ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ  Ｒ．Ｊ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．５：１９７−２２０（２０００）
【非特許文献１２】Ｎ．Ｓａｋｕｒａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８：６８１−６８５，（１９８５）
【非特許文献１３】Ｎ．Ｓａｋｕｒａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２９（５）：６５５−６６１（１９８８）
【非特許文献１４】Ｖａｎ  Ｕｄｅｎ  Ｊ．，ａｎｄ  Ｒａｚ，Ｅ．ｉｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２２：１−９（２０００）
【非特許文献１５】Ｃｈｕ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １０３：９０９−９１８（２０００）
【非特許文献１６】Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．，ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ｂ．，Ｏｂｒｅｎｏｖｉｃ，Ｍ．，Ｓａｆｆｉｅ，Ｒ．，Ｚａｄｉ，Ｂ．ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｅ，Ｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９：１５６−１６２（１９９９）
【発明の開示】
【００１８】
発明の要約
本発明は、前以て凍結乾燥した脂質を、リポソームに充填する生物学的物質を含む溶液を用いて段階的に水和することにより、これまでに知られている充填法に比べて大変効果的な材料の充填（＞６０％）がもたらされるという驚くべき知見に基づく。
【００１９】
すなわちその第１の観点に従い本発明は、リポソームに生物学的物質を充填する方法を提供し、この方法は
ｉ）少なくとも１つのリポソーム形成性脂質を溶媒中で可溶化（溶解）し、そしてそれを乾燥させて乾燥リポソーム形成性脂質またはそのような脂質の混合物を形成し；
ｉｉ）生物学的物質または生物学的物質の混合物の水溶液を提供し；
ｉｉｉ）乾燥リポソーム形成性脂質（１つまたは複数）を生物学的物質の溶液で水和して該生物学的物質を充填したリポソームを生成する、
ことを含んでなる。
【００２０】
本明細書で使用する用語「リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）」には、自然に、または自然にではなく小胞を生じることができる両親媒性物質、例えば少なくとも１つのアシル基が複合リン酸エステルに置換されたグリセリドであるリン脂質のすべての球状物または小胞を含む。
【００２１】
用語「充填する（ｌｏａｄｉｎｇ）」とは、充填される生物学的物質のすべての種類の相互作用、例えば内包、接着、吸収、封入（小胞の内側または外側壁のいずれか、あるいはリポソーム内の水相に）、あるいは生物学的物質を含むリポソームの押出しを含むか、または含まないリポソーム膜での包埋のような相互作用を意味する。
【００２２】
また本明細書で使用する用語「リポソーム形成性脂質（ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ）」は、特徴的に異なる特性、例えば親水性および疎水性の両方を持つ基またはそのような分子の混合を含み、そして水性媒質にそれらを分散するとリポソーム小胞を形成する生理学的に許容できる両親媒質性の物質を表す。これからさらに詳しく述べるように、この用語は１つの両親媒質性物質を指すか、またはそのような物質の混合物を指す。両親媒質性物質にはとりわけ、リン脂質、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドのような糖脂質、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）脂質、およびコレステロールのようなステロールおよびその他を含む。
【００２３】
用語「乾燥」または「乾燥する」とは、乾燥脂質ケーキの形成を生じるリポソーム形成性脂質を乾燥する任意の様式を称する。１つの好適な態様に従えば、乾燥することは凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ）とも言う）により行われる。あるいは乾燥は噴霧乾燥により行ってもよい。
【００２４】
本明細書で使用する用語「生物学的物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、細胞または細胞成分（例えば酵素、受容体）に生物学的効果を有する任意の化合物またはポリマー（例えばバイオポリマー：ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）あるいは他の生物学的構造を称する。生物学的物質は天然または合成でよく、そしてとりわけ活性もしくは不活性ビリオン、細菌または他の病原体、および生物学的細胞構造（例えばリボソーム、膜画分またはミトコンドリアのような細胞の小器官、細胞産物（例えばサイトカイン）、および天然もしくは合成バイオポリマーおよび／または天然もしくは合成バイオオリゴマー（すなわちペプチド、炭水化物およびＤＮＡ、ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む核酸）を含む。
【００２５】
本明細書で用語「溶解する（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）」または「分散する（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）」と互換的に使用する用語「可溶化する（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ）」は、、該可溶化が行われる嵩のある水性媒質の単一使用により達成することができる。しかしこの用語は好ましくは２以上の等量の該媒質の段階的な添加を称する。
【００２６】
本発明の方法は以下の記載において時に用語「後内包（ｐｏｓｔ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）」と称し、これに従い乾燥脂質を生物材料を含む水溶液で水和する。これは同時内包（ｃｏ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）技術とは反対である。「同時内包」はリポソーム形成性脂質および生物材料を同時乾燥（ｃｏ−ｄｒｙｉｎｇ）（同時凍結乾燥：ｃｏ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）することを含み、その後にそれらを水性媒質で同時水和（ｃｏ−ｈｙｄｒａｔｅｄ）する内包法である。同時カプセル技術は、中でも米国特許第６，１５６，３３７号および同第６，０６６，３３１号明細書に記載されている。
【００２７】
本明細書に開示する後内包法の１つの独自な特徴は、生物材料を凍結乾燥する必要がないという点である。想定されるように、多数の生物学的物質（例えばワクチン抗原として役立つタンパク質または酵素）が存在し、これらは生物学的物質の不活性化を導く凍結乾燥に感受性である。そのような感受性ワクチンの１例は、インフルエンザワクチンである。さらに本発明の方法に従い、生物学的物質はその活性に破壊的であるかもしれない有機溶媒または界面活性剤に暴露される必要がない。例えばインフルエンザウイルスの赤血球凝集素分子の有機溶媒の存在下での溶解は、この三量体タンパク質をその単量体へと解離し、そして最終的にはその生物学的活性（免疫原性）の損失を生じる。
【００２８】
上に示したように、そして以下の実施例でさらに表すように、本発明の方法は生物学的物質の実質的に高い充填率を有する小胞を得ることを可能とする（少なくとも好ましくは６０％より高い）。この特徴はリポソームに充填された生物学的物質を用いた処置または予防効率を改善し、ならびに所望の治療効果を達成するために必要な組成物投与の用量および頻度／回数を減らすことを可能とするので有利である。
【００２９】
本発明の別の特徴は脂質（１つまたは複数）物質（１つまたは複数）および生物学的物質が別個に維持されるので、組み合わせ製剤が可能となり、すなわち医師が処方してもよく、そして薬剤師がリポソーム形成物質と生物学的作用物質の組み合わせ物を配合してもよく、そして必要に応じて本発明のこのように簡単かつ柔軟性のある段階的方法に従い、薬剤師は選択した組み合わせ物を容易に調製し、そして所望の製剤を調製することができる。
【００３０】
本発明のさらに別の特徴は、凍結乾燥した脂質が４℃または室温で長期の寿命を有し、それらの封入能力（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を１年以上保存し（以下の実施例４にも例示されように）、そしてリポソームを形成するために脂質を生物学的物質を含む溶液で水和することは大変単純であり、そしてわずか数分しかかからない点である。したがってリポソーム製剤は処置前に直ちに調製することができ、製剤の高い製薬学的安定性およびリポソームから封入された材料の漏出が無いことを確実とする。
【００３１】
第２の観点に従い、乾燥リポソーム形成性脂質を含んでなる第１組成物および生物学的物質を含んでなる第２組成物を含む２つの組成物の組み合わせ物が提供され、この組み合わせ物はリポソームの生物学的物質を含んでなる製薬学的組成物の調製に使用することを意図する。
【００３２】
本発明の組み合わせ物は包装状態で提供され得る。したがって本発明は製薬学的組成物を調製するための包装物も提供し、これは：
（ａ）乾燥リポソーム形成性脂質（１つまたは複数）の少なくとも１つの組成物；
（ｂ）生物学的物質の少なくとも１つの組成物；
（ｃ）該製薬学的組成物を調製するために、（ａ）および（ｂ）を選択および使用するための使用説明書、該使用説明書は該乾燥リポソーム形成性脂質を該生物学的物質の水溶液で水和して、該生物学材料を充填したリポソームを含んでなる製薬的組成物を得ることを含んでなり；そして
（ｄ）該製薬的組成物の健康な個体への、または該組成物が必要な患者への投与を処方する使用説明書、
を含んでなる。
【００３３】
本発明の別の観点では、有効成分としてリポソームに充填された治療に有効な量の生物学的物質を含んでなる製薬学的組成物を提供し；充填されたリポソームは本発明の方法により調製される。
【００３４】
本明細書の目的のための製薬学的に「有効な量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」には予防に有効な量も含め、当該技術分野で知られているような考察により決定される。生物学的物質の量は、所望する治療効果を達成するために効果的でなければならない。
【００３５】
本発明のさらなる観点に従い、本発明に従い生物学的物質を充填した有効量のリポソームを必要とする個体に投与することにより、疾患の防止または処置法を提供する。
【００３６】
本明細書で使用する用語「防止または処置（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置」は、リポソームに充填した生物学的物質の治療的量を投与することを称し、これは疾患に付随する望ましくない症状を軽減し、そのような症状が起こる前に発症を防止し、疾患の進行をゆるかやにし（ｓｌｏｗ  ｄｏｗｎ）、症状の悪化をゆるやかにし、寛解期間の発生を強化し、疾患の進行性の慢性的段階で生じる不可逆的な傷害をゆるやかにし、該進行的段階の発生を遅らせ、疾患の重篤度を下げるか、または治癒し、生存率またはより迅速な回復を改善し、疾患が起こることを防止し、または上記の２以上の組み合わせに効果的である。さらに本明細書の内容で使用する用語「処置」は、疾患の発症を防止することを称する。処置（予防的処置も）処方および投与される具体的な製剤は、処置する疾患の種類に依存し、そして薬剤の当業者（例えば医師）が既知である種々の考察により決定することができる。
発明の詳細な説明
リポソームは様々なパラメーターに従い分類することができる。例えばラメラのサイズおよび数（構造的パラメーター）を使用する時、４つの主な種類のリポソームに識別される：マルチラメラ小胞（Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ：ＭＬＶ）、小さいユニラメラ小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ）、大きいユニラメラ小胞（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ：ＬＵＶ）およびオリゴラメラ小胞。
【００３７】
ＭＬＶはそれらのゲルから液体結晶相への相転移温度（Ｔｍ）より上で乾燥リン脂質の水和により自然に形成する。それらのサイズおよび形状は異種であり、そしてそれらの正確な構造はそれらの調製法により決定される［Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ  Ｙ．ａｎｄ  Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｄ．Ｊ．Ａ．，（１９９４）、同上］。一般にＭＬＶは二層により別れた水性および脂質成分を有する。
【００３８】
ＳＵＶは超音波照射、高圧均一化により、または押出しによりＭＬＶから形成され、そして１つの二層を有する（ｓｉｎｇｌｅ  ｂｉｌａｙｅｒｅｄ）（＜１００ｎｍ）。それらは高い曲率および高い表面−対−容量比を有する最小の種類であり、それゆえに脂質の重量に対して最小の捕捉容量（ｃａｐｔｕｒｅ  ｖｏｌｕｍｅ）の水性空間を有する。
【００３９】
この分類に従う第３種類のリポソームには、大きな水性区分および１つの（ユニラメラ）脂質層を有する大きなユニラメラ小胞（ＬＵＶ、＞１００ｎｍ）を含み、一方第４種類のリポソームにはオリゴラメラ小胞（ＯＬＶ）を含み、これは数枚のラメラ（脂質二重層）を含む小胞である。ＬＵＶは主に押出しにより形成される。
【００４０】
リポソームは、自然にまたは自然にではなく小胞を形成することができる両親媒性化合物から形成される。そのような両親媒性化合物は典型的には、少なくとも１つのアシルまたは１つのアルキル基が極性および／または荷電した部分により置き換えられているトリアシルグリセロールまたはトリアルキルグリセロール、例えば複合リン酸エステルにより形成されるリン脂質を含む。任意の通常知られているリポソーム形成性脂質が本発明の方法による使用に適する。脂質の供給源またはその合成法は重要ではない：修飾を含むかまたは含まない任意の自然に存在する脂質、または合成ホスファチドを使用することができる。
【００４１】
脂性物質は、水性媒質中にそれらを分散するとリポソームを形成する任意の物質でよい。好適なリポソーム形成両親媒性物質は天然、半合成または完全に合成の分子；場合によりコレステロールのようなステロールと組合わせた負または正に荷電した脂質、リン脂質またはスフィンゴ脂質；および／またはＰＥＧ化脂質のようなリポポリマーである。
【００４２】
リポソーム形成性脂質は、飽和または不飽和両親媒性物質を含む。そのような両親媒性物質の非限定的な例はリン脂質であり、それらを限定するわけではないが完全に水素添加された、部分的に水素添加された、または非水素添加ダイズに由来するリン脂質、卵黄リン脂質、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、他のホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリンおよび上記の混合物を含む。別のリポソーム形成性脂質群は、カチオン性脂質であり、それらには１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）および１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）のようなモノカチオン性脂質、およびスペルミンに基づく脂質であるＮ−［２［［２，５−ビス［（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキソペンチル］アミノ］エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス［（１−オキソ−９−オクタデセニル）オキシ］−１−プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）のようなポリカチオン性脂質（これは単独またはコレステロールと、もしくは中性リン脂質と組み合わせて使用してもよい）を含む。
【００４３】
具体的なホスファチドの例は、Ｌ−α−（ジステアロイル）ホスファチジルコリン（レシチン）、Ｌ−α−（ジパルミトイル）レシチン、Ｌ−α−ホスファチジン酸、Ｌ−α−（ジラウロイル）ホスファチジン酸、Ｌ−α（ジミリストイル）ホスファチジン酸、Ｌ−α（ジオレオイル）ホスファチジン酸、ＤＬ−α（ジパルミトイル）ホスファチジン酸、Ｌ−α（ジステアロイル）ホスファチジン酸および様々な種類のＬ−α−ホスファチジルコリン、および脳、肝臓、卵黄、乳、心臓、ダイズ等から、または合成的に調製された他のリン脂質、およびそれらの塩である。他の適当な修飾には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）および他のリン脂質中の脂肪アシル残基架橋剤の制御された過酸化、およびそれら自身により、またはＰＣのアルキル類似体のようなＰＣｓと混合した時にミセルを形成する両イオン性のアンフィフェート（ａｍｐｈｉｐｈａｔｅｓ）を含む。
【００４４】
１つの態様に従い、リン酸のコリンエステルに連結したステアリン、パルミチンおよびオレイン酸のジグリセリド混合物であるレシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）としても知られている）を使用する。レシチンは卵、ダイズおよび動物組織（脳、心臓等）のようなすべての動物および植物に見いだされ、そして合成的に生産することもできる。
【００４５】
本発明に従い好適なリン脂質の組み合わせには、約１：２０から２０：１の間のＤＭＰＣ：ＤＭＰＧのモル比のＤＭＰＣおよびＤＭＰＧの混合物を含む。そのような混合物はコレステロールおよび／またはＰＥＧ化脂質と組み合わせてもよい。ＰＥＧ化脂質は市販されている。好適なＰＥＧ化脂質にはそれらを限定するわけではないが、負に荷電したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００［Ｈａｒａｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１５１：２０１−２１５（１９９３）］またはジヘキサデシル  ホスファチジルＰＥＧ２０００（ＤＨＰ−ＰＥＧ２０００）［Ｔｉｒｏｓｈ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７４：１３７１−１３７９（１９９８）；米国特許第６，１６５，５０１号明細書］、中性ＰＥＧジアシルグリセロールおよびＰＥＧセラミド（アバンティ（Ａｖａｎｔｉ）カタログ）を含む。別の好適な脂質の組み合わせは、１：２〜２０：１のモル比のＤＯＴＡＰおよびコレステロールからなる。
【００４６】
脂質は純度が変動してよく、そして完全または部分的に水素添加され得る。水素添加（部分的または完全）は、望ましくない過酸化レベルを下げ、そして充填（ｐａｃｋｉｎｇ）および漏出を生じるゲルから液体／結晶相主転移温度（Ｔｍ）を修飾し、そして制御する。
【００４７】
リポソームは他の脂質成分または脂質成分の組み合わせを含むことができる。そのような脂質には限定するわけではないが、ステロール（すなわちコレステロール）、リポポリマー（すなわちＰＥＧ化脂質）、グリコスフィンゴ脂質（すなわちガングリオシド）およびホスファチジルエタノールアミンを含む。
【００４８】
リポソームは、生物学的流体の安定性を凝集またはクロマトグラフィー分離無しで維持する種々の生物学的流体を含む任意の具体的な容器の要件に「しつらえる（ｔａｉｌｏｒｅｄ）」ことができ、それにより注入する流体がよく分散し、そして懸濁したままとなる。その場での流動性は、組成、温度、塩濃度、二価イオンおよびタンパク質の存在により変化する。リポソームは他の溶媒または表面活性剤を含んで、または含まずに使用することができる。
【００４９】
異なる種類のリポソームを生成する様々な方法が知られ、そして利用することができる。そのような方法にはとりわけ：
１．リン脂質の薄く乾燥したフィルムを水性媒質で水和し、続いて機械的振盪、超音波照射し、かつ／またはこのように形成したリポソームを適当な孔サイズのフィルターに通して押出す；
２．リン脂質を適当な有機溶媒に溶解し、水性媒質と混合し、続いて溶媒を除去する；
３．ガスの臨界点より上でガスを使用する（すなわちフレオンおよびＣＯ２のような他のガス、またはＣＯ２と他のガス状炭素水素との混合物）、あるいは
４．脂質−界面活性剤混合ミセルを調製し、続いてリポソームが形成される界面活性剤の臨界濃度未満のレベルにその濃度を下げる［Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ  Ｄ  ａｎｄ  Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ  Ｙ，（１９８８）同上］。
５．同時（ＣＯ）充填法と呼ばれる水性媒質を用いて活性剤を充填した乾燥リポソームを水和する（米国特許第６，０６６，３３１号および同第６，１５６，３３７号明細書）。
【００５０】
薬剤送達の道具としてリポソームを使用する時の１つの障害は、リポソームに充填される生物学的物質に及ぼす充填法の潜在的な破壊的／不活性化効果、および生物学的に効果的な材料の充填効率である。リポソーム内の水性相に受動的に充填される水溶性の高価な薬剤については、これまでの最高の充填は＜６０％である。非効率的充填は大量の薬剤を内包せず、そして薬剤が毒性および／または高価である時、この内包されない薬剤は主な欠点となる。したがって遊離薬剤を取り出すさらなる工程が必要となり、これがリポソーム製剤の調製法に望ましくない取り扱いおよび経費を加える。
【００５１】
本発明は生物学的物質を効率的に充填した（すなわち少なくとも６０％の充填）リポソームを調製する新規かつ簡便な方法を提供する。本発明の方法は：
ｉ）少なくとも１つのリポソーム形成性脂質を溶媒中で可溶化し、そしてそれを乾燥させて乾燥脂質または脂質の乾燥混合物を生成し；
ｉｉ）生物学的物質または生物学的物質の混合物の溶液を提供し；そして
ｉｉｉ）該生物学的物質の溶液で乾燥脂質（１つまたは複数）を水和して、生物学的物質を充填したリポソームを生成する、
ことを含んでなる。
【００５２】
以下の具体的な実施例で示すように、本発明の方法はリポソームに生物学的に活性な材料の典型的には６０％より高い（充填に使用する生物学的物質の初期の量から）高度に効果的な封入を提供する。
【００５３】
本発明に従い、リポソーム形成性脂質は好ましくは凍結乾燥（ｆｒｅｅｄ  ｄｒｉｅｄ）され（すなわちそれらの凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）により）、水和で生物学的物質のリポソーム中への効果的な充填を行うことを可能にする独自の配列を有する脂質の粉末を生じる。
【００５４】
本発明に従い溶媒は、両親媒性物質（脂質）を可溶化することができる任意の溶媒であり、そして３級ブタノールのような極性溶媒またはシクロヘキサンのような無極性溶媒を含む。
【００５５】
本発明の方法に従いリポソームに封入される活性材料は、生物学的物質または生物学的物質の混合物であり、とりわけ生物学的な細胞構造または細胞産物、天然または合成のバイオポリマーおよび／またはオリゴマー（例えばアミノ酸または核酸配列）を含む。
【００５６】
生物学的細胞構造は好ましくは、細胞膜、リボソームまたはミトコンドリアであり、一方細胞産物、バイオポリマーおよびオリゴマーは好ましくは酵素、プロ酵素、ホルモンおよびコファクターであり；また生きている、または不活性化されたウイルスまたはウイルス表面抗原、抗原、抗体、補体因子、生きている、または不活性化された細菌、細菌断片、細菌表面抗原、他の病原体およびそれらの産物、サイトカイン、増殖因子、天然または合成ヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または阻害ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）である。
【００５７】
１つの態様に従い、生物学的物質はオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、好ましくは免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド配列（ＩＳＳ−ＯＤＮ）である。本明細書で説明するように、そのような配列は免疫応答を強化することが知られており（免疫アジュバントとして作用する）、それゆえに治療的価値がある。
【００５８】
本発明に従い１つの好適なＯＤＮは、エンドトキシンを含まないホスホロチオエートＩＳＳ−ＯＤＮである。さらに別の態様に従い、ＯＤＮはＢｃｌ２タンパク質の発現を抑制することが知られているアンチセンス抗−Ｂｃｌ２であり、これにより細胞のアポトーシスを強化する［Ｍｅｉｄａｎ  Ｖ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４６４：２５１−２６１（２０００）］。
【００５９】
本発明の方法に従い、ラクトース、シュクロースまたはトレハロースのような製薬学的に許容され得る作用物質である凍結保存剤を含むか、または含まずに最高５％の塩化ナトリウムに相当するイオン強度を有する媒質中に、バイオポリマーおよびオリゴマーを維持することがすすめられる。すなわち本発明の水溶液は生物学的物質を可溶化、溶解または分散するために、本発明の方法により使用される生理学的に許容され得る水性媒質であり、典型的には０．９重量％ＮａＣｌ（生理食塩水）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝化生理食塩水、５％デキストロース、緩衝化デキストロース、１０％シュクロースおよび緩衝化シュクロースおよびその任意の組み合わせからなる群から選択される。あるいは生物学的物質は発熱物質を含まない滅菌水（時々、「注入用水（ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」と呼ぶ）に可溶化し、そして乾燥脂質を水和した後、生成した分散物を投与に適する生理学的条件に適合させる。
【００６０】
第２の観点に従い、２つの組成物の組み合わせ物が提供され、それには乾燥リポソーム形成性脂質を含んでなる第１組成物、および生物学的物質を含んでなる第２組成物を含み、この組み合わせ物は生物学的物質を充填したリポソームを含んでなる製薬学的組成物の調製に使用することを意図している。
【００６１】
本発明の組み合わせ物は包装状態で提供することができる。したがって本発明は、乾燥リポソーム形成性脂質を含んでなる少なくとも１つの第１組成物；および生物学的物質（乾燥または水溶液中のいずれか）を含んでなる少なくとも１つの第２組成物の組み合わせ物；および該製薬学的組成物を調製するための第１および第２組成物の使用に関する使用説明書、該使用説明書は乾燥脂質（１つまたは複数）を生物学的物質を含んでなる該水溶液で水和して生物学的物質を充填したリポソームを得ることを含んでなり；およびさらに必要な個体へ製薬学的組成物の投与を処方する使用説明書を含んでなる製薬学的組成物の調製に関する包装物も提供する。
【００６２】
本発明の包装物の中で、乾燥脂質および生物学的物質はそれぞれ別の容器に含まれる。このようにキットは１種類より多くの乾燥脂質の組成物を別個の容器に、そして１より多くの生物学的物質を含むことができ、異なる組成物（すなわち第１および第２組成物）の選択および使用に関する使用説明書は、目的の具体的なリポソーム／生物学的物質の配合に依存する。これらの使用説明書は医師、薬剤師またはさらに必要な個体に向けることができる。
【００６３】
包装物はさらに水性媒質、例えば生理学的に許容され得る水性媒質を含んでもよく、これを用いて使用前に生物学的物質を溶解または希釈することができる。あるいは水性媒質は典型的には市販されている媒質であるので、別個に得ることもできる。使用に適する媒質の選択は当業者に既知の考察に依存し、したがって本明細書でさらに検討する必要はない。
【００６４】
１つの態様に従い、包装物は乾燥リポソーム形成性脂質（１つまたは複数）を含んでなる該第１組成物の２以上の組成物、および生物学的物質の２以上の該第２組成物を含んでなり、これにより医療実務者（ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｃｔｉｔｉｏｎｅｒ）により処方される使用説明書に従い異なる製剤の組み合わせを構成することが可能となる。包装物は医師により、薬剤師により、または時にはリポソーム製剤が必要な個体により使用され得る。
【００６５】
本発明のさらなる観点に従い、生物学的物質および場合により製薬学的に許容され得る添加剤を充填した治療に有効な量のリポソームを有効成分として含んでなる製薬学的組成物を提供し、充填されたリポソームは本発明の方法により調製される。
【００６６】
実際には本発明の製薬学的組成物は本発明の方法により得ることができるリポソーム製剤であるが、具体的な疾患の処置または防止が必要な個体に投与するために適合させる。
【００６７】
本発明の有効成分（すなわち生物学的物質を充填したリポソーム）は、生物学的物質の性質、処置する個体の臨床的状態、投与の部位、経路および方法、投与計画、個体の年齢、性別、体重および医療実務者に既知の他の因子を考慮して良好な医学的プラクティスに従い投与され、そして投薬される。
【００６８】
本発明の製薬学的組成物は種々の方法で投与することができる。例えば風味、色、潤滑等をリポソーム製剤に加える目的で、当該技術分野で知られている生理学的に許容され得る希釈剤、賦形剤、添加剤およびアジュバントと組み合わせて配合することができる。
【００６９】
本発明に従い使用する製薬学的に許容され得る希釈剤（１つまたは複数）、賦形剤（１つまたは複数）、添加剤（１つまたは複数）は、好ましくは本発明のリポソーム製剤と反応しない一般に不活性な非毒性物質と称する。
【００７０】
さらに本発明の組成物は、生物学的に活性な作用物質の組み合わせを含んでなることができる。さらなる生物学的作用物質は遊離状態であるか、またはリポソームに内包されてもよい（他の生物学的物質／生物学的または薬理学的に活性な材料を含んでなるリポソームと一緒に、または別に）。
【００７１】
生物学的物質が例えばＩＳＳ−ＯＤＮ（免疫アジュバント）である時、１以上の抗原と組み合わせて投与することが好ましい。抗原は同じリポソーム中にＩＳＳ−ＯＤＮと同時に内包されるか、別のリポソームに内包されるか、または遊離状態（例えば可溶性または乳液の一部）でもよい。ＩＳＳ−ＯＤＮと抗原（１つまたは複数）が分かれている時、それらは同時に、予め定めた時間間隔内で相伴い（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ）投与することができる。抗原はとりわけ殺された、または修飾された（例えば遺伝的に）生物またはウイルスに由来するものであることができる。
【００７２】
製薬学的組成物は経口的に、鼻内に、または静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、鞘内を含む非経口的に、および局所的送達および注入技法により投与することができる。さらに本発明の製薬学的組成物は吸入による投与用のエーロゾル製剤に作成することができる。そのようなエーロゾル製剤はジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような加圧された許容され得る推薬に入れることができる。それらはまた、ネブライザーまたは噴霧器のような非加圧調製物用の製薬として配合してもよい。投与様式は当業者に既知の様々な考察に依存する（例えばリポソームに充填するワクチンの種類に依存する）。
【００７３】
最後に本発明は疾患の防止法または処置法に関し、この方法には必要な個体に有効量の本発明のリポソームに充填した生物学的物質を投与することを含む。
【００７４】
好適な態様に従い、該処置の投薬用量は処置する個体の体重１ｋｇあたりの脂質により測定して最高２，０００ｍｇの充填した小胞を含む。しかし正確な投薬用量は劇的に変動することができ、その変動は例えばリポソームに封入される生物学的物質の種類および効力、内包の効率（本発明の方法を用いれば高いが）、投与経路等に依存することに注目するべきである。個々のパラメーターは当業者により容易に至適化され得、そして日常的な実験であると見なすことができる。
【００７５】
本発明を今、さらに以下の非限定的実施例で具体的に説明する。前述の説明は本発明の幾つかの具体的態様を詳細に説明しただけであるが、当業者は本発明がそれらに限定されず、そして特許請求の範囲により定められる本発明の範囲および精神から逸脱することなく他の変更形態および詳細も可能であることを理解し、それらは本明細書の開示内に含まれると読むべきである。
具体的実施例
【実施例１】
【００７６】
ペプチドを充填したリポソーム
以下はアミノ酸配列：
【００７７】
【表１】
2005525992.tif 000002
【００７８】
を有するペプチドの内包の例である。形成する種々の型のリポソームに使用する脂質は、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧおよびコレステロールであった。本発明の調製法をこれまでに知られている他の方法と比較する目的で、３種のリポソーム調製物を形成した。使用した３種の内包法は本明細書では、後内包法（本発明の方法）；同時内包法および脱水−再水和法と命名する。（後者の方法により形成したリポソームは、脱水−再水和小胞（ＤＲＶ）と呼ぶ）。
リポソーム調製−
１．後内包法：脂質の凍結乾燥混合物（脂質：ペプチド  重量／重量比率は以下の組成物の説明に示するように変動する）を、蒸留水、０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）および／または５％デキストロースのような水性媒質に前以て溶解したペプチドで水和した。特に脂質を３級ブタノールに溶解し、そして一晩、凍結乾燥することによリ凍結乾燥した。次いで形成された脂質ケーキはペプチド溶液で室温にて段階的に再水和し、そして約１分間、ボルテックスで激しく撹拌した。
２．同時内包法：可溶化した脂質およびペプチドを一晩、同時に凍結乾燥させ、そして次いで０．９％生理食塩水および／または５％デキストロースで水和した。
３．ＤＲＶ：蒸留水中に押出した（１００ｎｍ）リポソームと前以て混合したペプチドを凍結乾燥して粉末を形成し、続いて粉末を０．９％生理食塩水および／または５％デキストロースで水和した［Ｋｉｒｂｙ  Ｃ，ａｎｄ  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：９７９−８４（１９８４）］。
【００７９】
すべての調製において、脂質：ペプチド比（重量／重量）は１００：１に至適化した。
【００８０】
４種の脂質組成物を本実施例で使用した：
（ｉ）ＤＭＰＣ単独；
（ｉｉ）９：１のモル比のＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ；
（ｉｉｉ）６：４のモル比のＤＭＰＣ：コレステロール；および
（ｉｖ）９：１：６．５のモル比のＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール。
【００８１】
内包法および凍結乾燥した材料を水和する水性媒質に依存して、２４種のペプチド充填リポソーム組成物を調製した。対照として空のリポソーム（すなわちペプチドを含まない）を、後内包法に従い調製した。表１は得られた異なるペプチド充填リポソーム組成物および内包効率をまとめる。各リポソーム組成物はバッチ番号で命名した：バッチ１〜１２は０．９％生理食塩水を含む水溶液で水和し、そしてバッチ１３〜２４は５％デキストロースを含む水溶液で水和した。
【００８２】
異なるリポソーム組成物を調製するために、同時凍結乾燥脂質およびペプチド、ペプチドまたは脂質のみを含む容器を調製した。各バイアルの粉末は０．６ｍｇのペプチドを含んだ。ペプチドは損失無しに濾過滅菌した（０．２μ、ゲルマンサイエンス（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｎｏ．４１８７）。すべての組成物を滅菌条件で調製した。
内包効率の測定
内包していない（遊離）ペプチドは、ＴＬ１００ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）遠心機を使用して１０５，０００ｇで３０分間、４℃で遠心することによりＭＬＶに付随（またはＤＲＶに付随）ペプチドから分離した。上清を非内包ペプチドの測定に使用した。内包の安定性を試験するために、リポソーム沈殿を同じ溶液（最初の時と）で洗浄した。遠心を繰り返し、そして洗浄液中のペプチドのレベルを測定した。ペプチドの内包レベルは、フルオレサミン−標識ペプチドを使用して蛍光アッセイにより測定した［Ｂｏｌｉｋｅｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５５：２１３−２２０（１９７３）］。
結果および考察
異なるｐＨ（５、７および８）で、オクタノールと水の２相系の間のペプチドの分配係数を最初に決定した。したがって０．１ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を、酢酸ナトリウムバッファー（５ｍｌ、ｐＨ５．０）または５ｍＭ硼酸（１ｍｌ、ｐＨ７．０または８．０）に調製した。溶液をオクタノールと１時間混合し、その後に分配係数を決定するために１００μｌおよび２００μｌのアリコートを水性相（下相）から取り出した。ほぼ１００％のペプチドが水性相に分配され、ペプチドの低い疎水性が示された。これはペプチド中、負−対正−に荷電したアミノ酸残基の比率が３対１であるという事実と合わせると、内包されたペプチドは恐らくリポソーム内の水性相に存在し、そしてリポソーム膜には会合していないことを示唆している。形成されたリポソームの内包効率および他の特徴を、以下の表１にまとめる。
【００８３】
【表２】
2005525992.tif 000003
【００８４】
表１は最高の内包（７７％〜８５％の内包、サンプル番号４および１６）が、後内包調製法を使用して９：１：６．５のＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール（モル比）の脂質組成で得られたことを示す。コレステロールおよびＤＭＰＧはカプセルを至適化するために必要だった。
【００８５】
さらにデキストロースの存在下で、ペプチドを含有するリポソーム分散物は０．９％ＮａＣｌで調製したものよりも粘稠であった。興味深いことには、９：１のＤＭＰＣ／ＤＭＰＧリポソーム（５．０％デキストロース中）について、リポソーム分散物はヒドロゲルを形成した。
【実施例２】
【００８６】
インフルエンザワクチンのアジュバントとして免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ−ＯＤＮｓ）を充填したリポソーム
材料および試薬 
インフルエンザサブユニットワクチン（ＨＮ）−インフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）に由来する、ウイルス表面タンパク質である赤血球凝集素（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）をそれぞれ８０〜９０％および５〜１０（重量／重量）％で主に含むサブユニット調製物は、スイス、ベルンのベルナバイオテック（Ｂｅｒｎａ  Ｂｉoｔｅｃｈ）のＲ．ＧｌｅｕｃｋおよびＲ．Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎ博士から提供された。
【００８７】
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）−Ｌｉｐｏｉｄ  ＰＣ  １４：０／１４：０  ５６２１５７（リポイド社（Ｌｉｐｏｉｄ  ＧｍｂＨ）、ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）
ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）−Ｌｉｐｏｉｄ  ＰＧ  １４：０／１４：０  ６０２０３５−１（リポイド社、ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）  ＩＳＳ−ＯＤＮ−両方とも蒸留水に溶解したエンドトキシンを含まない（１＜ｎｇ／ｍｇ  ＤＮＡ）ホスホロチオエートＩＳＳ−ＯＤＮ  Ｎｏ．５４０７６
【００８８】
【表３】
2005525992.tif 000004
【００８９】
は、イスラエル、レハボットのザ  ワイズマンインスティチュート（Ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から得た。
調製法
可溶性ＨＮの調製
サブユニットワクチンの調製物は、注入用の滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳｐＨ７．４）に希釈した（用量あたり０．５μｇ）。
ＩＳＳ−ＯＤＮ（Ｌｉｐ  ＩＳＳ−ＯＤＮ）の調製
ＩＳＳ−ＯＤＮｓは、ＤＭＰＣおよびＤＭＰＧ（ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ，９；１のモル比）からなる大きな（平均直径１４００±２００ｎｍ）マルチラメラ小胞（ＭＬＶ）に、５０：１〜５００：１（重量／重量）の脂質：ＯＤＮ比で、以下の無菌的条件下で内包した：リン脂質は３級ブタノールに溶解し、そして一晩凍結乾燥することにより凍結乾燥した。次いで脂質粉末（脂質ケーキ）を室温でＯＤＮ溶液を用いて再水和した。効率的な内包を確実にするために、ＯＤＮ溶液を最少量で加えた（例えば１０ｍｇ〜３０ｍｇ脂質に、２５〜５０μｌのＯＤＮ溶液を加えた）。次いでこれをペーストが得られるまでボルテックスで１分間、激しく撹拌した。次いでペーストは滅菌ＰＢＳまたは生理食塩水でボルテックス処理することによりさらに段階的に希釈して、必要な濃度を得た。この方法は本発明の後内包法に対応する。
【００９０】
内包効率を測定するために、リポソーム調製物を４℃で１時間、４５，０００ｒｐｍにて遠心した。リポソーム沈殿物および上清（非内包ＯＤＮおよび微量の小リポソームを含む）を２相液体抽出法に供し［Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９５９）  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−９１７］、そして遊離および内包ＯＤＮおよびリポソームのリン脂質の量を有機リン測定により評価した［Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ，Ｙ．ａｎｄ  Ａｍｓｅｌｅｍ，Ｓ．（１９９３）、リポソーム技術（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２版、Ｉ巻（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ、編集）、ＣＲＣ出版、ボカラトン、フロリダ州、第５０１〜５２５頁（１９９３）］。新しく調製したＬｉｐ  ＩＳＳ−ＯＤＮの脂質の完全性は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＧ）により分析し、そして高く、脂質の原材料の完全性と同一であることが判明した（９８％より高い）。
【００９１】
脂質：ＩＳＳ−ＯＤＮを以下の比率（重量／重量）−５０：１、１００：１、３００：１および５００：１で使用して、平均内包効率（３回の実験の）は、それぞれ６０、７５、９０および９５％であった。４℃で３カ月間保存した後にリポソームからＯＤＮの有意な漏出は無いことが判明した（＜１０％）。非特異的な免疫刺激を引き起こし得る過剰な脂質をマウスに過剰負荷することを回避するために［Ｋｅｄａｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３：１３１−１４５（２０００）］、１００：１（重量／重量）の脂質：ＯＤＮ比（平均内包効率７５％）で調製した製剤をワクチン接種に選択した。
【００９２】
代表的な実験では、ＢＡＬＢ／ｃマウス（４／群）に１回、０．５μｇの遊離抗原（ＨＮ）を単独で、および遊離またはリポソームＩＳＳ−ＯＤＮ（Ｎｏ．５４０７６またはＮｏ．５１９９７）とそれぞれ１０μｇで組み合わせたワクチンを筋肉内に接種した。体液性応答：赤血球凝集反応−阻止（ＨＩ）抗体および抗原−特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを、ワクチン接種から４週間後に試験した。ＨＩ試験は個々の血清について行い、一方ＩｇアイソタイプはＥＬＩＳＡによりプールした血清サンプルについて試験した。
結果および考察
以下の表２から分かるように、遊離抗原（群２）は大変低いＨＩおよびＩｇＧ２ａ力価を誘導し、そして両非内包ＯＤＮｓはこれらの力価を著しく上昇させた（３、５群）。リポソームＩＳＳＮ−ＯＤＮｓ（群４、６）は対応する遊離（非リポソーム）ＯＤＮｓよりも２〜７倍強力であった。さらに遊離ＨＮ単独により誘導される応答はＴｈ２型（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比＝０．０４）であったが、ＯＤＮ、遊離およびリポソームはＴｈ１に基づく応答（ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比＞１）を誘導した。これらのデータはＩＳＳ−ＯＤＮのリポソーム送達がＩＳＳ−ＯＤＮに固有の免疫アジュバント活性を強化し、そしてそれらのＴｈ１アジュバント性を保持することを示す。
【００９３】
【表４】
2005525992.tif 000005
【実施例３】
【００９４】
アンチセンスＢｃｌ−２のリポソーム内包（Ｌｉｐ  Ｂｃｌ−２）
後（ＰＯＳＴ）内包法をＢｃｌ−２に対するアンチセンスの内包に応用し、その工程はＩＳＳ−ＯＤＮの後内包との関連で記載した工程と同じであった。内包法は１００：１および３００：１（重量／重量）の脂質：Ｂｃｌ−２比で行い、それぞれ７８％および７４％の内包効率を得た。内包効率はＩＳＳ−ＯＤＮとの関連で本明細書に前に記載したように測定した。
【実施例４】
【００９５】
種々のリポソーム製剤中のインフルエンザＨＮ抗原のリポソーム内包（Ｌｉｐ  ＨＮ）
材料および試薬
脂質
ＭＬＶリポソームの調製に使用した脂質には、実施例２のようなＤＭＰＣ、ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ（９／１のモル比）を含んだ。さらなる製剤は、ＤＭＰＣ／コレステロール（Ｃｈｏｌ）（６／４のモル比）および：ＤＭＴＡＰ（ジミリストイル−トリメチルアンモニウムプロパン）／Ｃｈｏｌ（１／１のモル比）、ＤＳＴＡＰ：（ジステアロイル−トリメチルアンモニウム  プロパン）／Ｃｈｏｌ（１／１のモル比）、ＤＯＴＡＰ（ジオレオイル−トリメチルアンモニウムプロパン）／Ｃｈｏｌ（１／１のモル比）、ＤＣＣＨＯＬ（ジメチルアミノエタン−カルバモール−コレステロール）／ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン）（１／１のモル比）およびＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）／Ｃｈｏｌ（１／１のモル比）からなるカチオン性リポソームを含んだ。
インフルエンザ抗原
Ａ／北京／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シドニー／５／９７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／パナマ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／ヤマナシ／１６６／９８に由来するサブユニット（ＨＮ）抗原調製物は、スイス、ベルンのベルナバイオテック（Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＲ．ＺｕｒｂｒｉｇｇｅｎおよびＲ．Ｇｌｅｕｃｋ博士から提供された。それらは内包前に０．９％ＮａＣｌで希釈した。
調製法
ＨＮを充填した大きなマルチラメラ小胞（ＭＬＶ）（平均直径、１．５μｍ）は、ＨＮサブユニットを乾燥脂質ケーキに加えることにより、Ｌｉｐ  ＩＳＳ−ＯＤＮの調製に関連して上に記載した後−内包法を使用して調製した。
【００９６】
簡単に説明すると、３級ブタノールに懸濁した１０〜１００ｍｇの種々のリン脂質の混合物（詳細については表３、５を参照にされたい）の容器を凍結し、そして次に一晩、凍結乾燥させて乾燥脂質ケーキを形成した。必要ならば、乾燥脂質はサブユニット（ＨＮ）ワクチン調製物（１、２または３株を使用して、材料および方法を参照にされたい）を用いて、可溶性ＨＮサブユニットを３００：１（重量／重量）の脂質：ＮＨ比で５０μｌの増分で加えることにより水和し、そして激しくボルテックス混合した。次いでリポソームを滅菌生理食塩水またはＰＢＳに懸濁した。
【００９７】
内包効率は以下のように評価した：リポソームをＤ２Ｏで希釈し（１／１  容量／容量）、そして３０℃で４５分間、１４，０００ｒｐｍでエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１７Ｒ遠心機で遠心した。これらの条件下で、リポソームは稠密なＤ２Ｏ上に浮遊するが、ほとんどの非内包抗原は沈殿する。リポソームおよび微量の遊離抗原を含む上清を集め、そして４℃で６０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心した。これらの条件下でリポソームは沈殿し、そしてほとんどの遊離抗原は上清に残る。抗原沈殿物および後者の上清（両方とも非カプセル加抗原を含む）の、およびリポソーム画分（封入された抗原を含む）中のタンパク質濃度は、ローリーのタンパク質濃度測定アッセイ［Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｇ．Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：９５−１１９（１９８３）］を使用して測定した。回収は＞９５％であり、そして精度は〜９０％である。
結果および結論
最初の実験では（表３）、後（ＰＯＳＴ）技法（本発明）を使用してサブユニット（ＨＮ）調製物を中性（ＤＭＰＣ、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）または負に荷電した（ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ）リポソームの３種の製剤に内包した。見れば分かるように、６０〜１００％の抗原がウイルス株および製剤に依存して内包された。この高レベルのＨＮ内包は、ＣＯ技法により、またはＤＲＶを使用することにより得られるレベルに等しいか、またはより良かった。しかし後技法により内包されたＨＮの免疫原性は完全保持されたが、ＣＯ技法またはＤＲＶを使用すると著しく減少（最高９０％、特にインフルエンザＢ株）した（データは示さず）。ＨＮを充填したリポソームの脂質の完全性（ＴＬＣにより測定）は９８％より高かった。
【００９８】
【表５】
2005525992.tif 000006
【００９９】
遊離およびリポソーム（ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ、９／１モル比）の二価インフルエンザサブユニットワクチンの免疫原性を、単回の腹腔投与後（各ウイルス株の０．５μｇＨＮ）にＢＡＬＢ／ｃマウスで試験した。応答（血清ＨＩ力価）をワクチン接種から３０日後に試験した。表４を見れば分かるように、２つのＡ株に関してリポソームの抗原（Ｌｉｐ  ＨＮ）は遊離抗原よりもかなり免疫原性であった。
【０１００】
【表６】
2005525992.tif 000007
【０１０１】
種々のカチオン性リポソームの製剤に封入されたインフルエンザサブユニットワクチン（ＨＮ）の鼻内投与によるインフルエンザに対するワクチン接種
さらなる実験では、メス（ｎ＝５／群）のＢａｌｂ／ｃマウスに、インフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）に由来する３μｇのサブユニットワクチン（ＨＮ）を使用して、０および７日にワクチン接種した（１０μＬ／鼻孔／用量）。抗原は表５に示すよう可溶性状態またはにコレステロールを含むか（１／１のモル比）、または含まない種々のカチオン性リン脂質からなる大きい（平均直径〜１．５μｍ）マルチラメラリポソーム（Ｌｉｐ）に封入されたいずれかで投与された。脂質／ＨＮ（タンパク質）重量／重量比は３００／１であり、そして内包効率は〜８０％であった。コレラトキシン（ＣＴ）（動物実験における標準的な粘膜アジュバント）を陽性対照として使用した。マウスはワクチン接種から２８日後に採血し、そして血清を赤血球凝集反応−阻止（ＨＩ）抗体について（個々のマウスについて試験した）、および抗原−特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体に関してＥＬＩＳＡにより（各群のプール血清について試験した）、１／１０血清希釈から始めて試験した。
【０１０２】
表５を見れば分かるように、遊離抗原（群２）はいかなる応答も誘導することが完全にできなかった。対照的に、内包抗原はＨＩ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ  Ａｂｓの誘導に高度に効率的であり、特にＤＯＴＡＰ：ＣＨＯＬ（群５）、続いてＤＭＴＡＰ：ＣＨＯＬ（群３）を含んでなるリポソームに内包された時に高度に効率的であった。前者の製剤により得られた抗体応答は、最も強力ではあるが毒性である（ヒトに使用できない）粘膜アジュバントであることが知られているＣＴ（群８）で得られる応答よりもかなり高かった。
【０１０３】
さらなるアジュバントを必要とせずに鼻内（粘膜）ワクチン接種後にそのような強力な全身性免疫応答の誘導は特に興味深く、そして特定のカチオン性リポソーム製剤が抗原の効率的な送達系および強力な粘膜アジュバントの両方として役立つことを示す。ＤＯＴＡＰ／ＣＨＯＬおよびＤＭＴＡＰ／ＣＨＯＬ製剤は筋肉内のワクチン接種でも高度に効果的であった（データは示さず）。
【０１０４】
中性リポソーム（ＤＭＰＣ、ＤＭＰＣ／ＣＨＯＬ）または負に荷電したリポソーム（ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ）に内包されたＨＮ抗原は（表３、４を参照にされたい）、非経口的に投与（ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．）した時に遊離抗原よりも免疫原性であるが、そのようなリポソーム抗原製剤は鼻内投与した時に効果が低く（データは示さず）、これは鼻内（粘膜）ワクチン接種のために「後」法により調製されたカチオン性リポソームの卓越性を強調していることに注目するべきである。
【０１０５】
【表７】
2005525992.tif 000008
【０１０６】
ａＣＨＯＬ＝コレステロール；ＤＭＴＡＰ：＝ジミリストイル−トリメチルアンモニウム−プロパン；ＤＳＴＡＰ＝ジステアロイル−トリメチルアンモニウム−プロパン；ＤＯＴＡＰ＝ジオレイル−トリメチルアンモニウム−プロパン；１：１のモル比のＤＣＣＨＯＬ：ＤＯＰＥ＝ジメチルアミノエタン−カルバモール−コレステロール：ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン；ＤＤＡＢ＝ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド。
ｂ赤血球凝集反応阻止による試験。括弧内の値はセロコンバージョン％を表す（ＨＩ力価＞４０のマウスの％）。０は＜１０を表す。
インフルエンザＨＮ抗原のリポソーム内包効率および脂質の化学的完全性に及ぼす凍結乾燥脂質の長期保存効果
ＨＮを充填した大きなマルチラメラ小胞は、３級ブタノールに溶解したＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ（９／１モル比）を使用して後内包技法により調製し、次いで一晩、凍結乾燥させ、そして４℃で２０カ月保存した後、ＨＮ溶液で水和した（３種のインフルエンザ株に由来する）。脂質の加水分解は５％未満であり、そしてＨＮ内包の％（株に応じて６０〜８０％）およびリポソームの平均サイズ（１〜１．５μｍ）は新たに凍結乾燥した脂質と同一であった。このリポソームワクチンはマウスにおいて、新たに凍結乾燥した脂質から調製したワクチンと同様な効力があった。これらの知見は大きなバッチの凍結乾燥脂質を調製し、そして使用するまで保存できることを示している。
【実施例５】
【０１０７】
組換えヒトインターロイキン２のリポソーム内包（Ｌｉｐ  ＩＬ−２）
ＩＬ−２は有力な免疫刺激サイトカインであり、そして転移性黒色腫、転移性腎癌肉腫およびＡＩＤＳの患者の処置に使用されている。ＩＬ−２（ケイローン（Ｃｈｉｒｏｎ）、米国、１８ｘ１０６ＩＵ／ｍｇ）は、例えば１２５：１〜３００：１（重量／重量）の脂質：ＩＬ−２比でのＬｉｐ  ＩＳＳ−ＯＤＮの調製に関連して本明細書に開示されている後内包技法を使用して、ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ（９：１のモル比）ＭＬＶリポソーム（平均直径、１．２〜１．５ｕｍ）に内包した。バイオアッセイ［Ｋｅｄａｒ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｒ  ２３：１３１−１４５（２０００）］により測定した内包効率は８０〜９０％であった。リポソームＩＬ−２はＰＢＳに懸濁し、そして４Ｃで６カ月保存した。３カ月目のＩＬ−２の漏出は１０％未満であり、そして６カ月目で２０〜３０％であった。
【０１０８】
リポソームＩＬ−２は、インフルエンザワクチンとの同時投与でマウスに可溶性ＩＬ−２よりも一層有力なワクチンアジュバントであることが示された。表６に示す代表的な実験では、遊離またはリポソーム三価インフルエンザサブユニット（ＨＮ）ワクチンが１回、２月齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに単独で、または遊離もしくはリポソーム（別個の小胞中）の組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）と共に腹腔内投与された。ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ（９／１のモル比）からなるリポソーム（ＭＬＶ）は、３００／１の脂質／ＮＨおよび脂質／ＩＬ−２重量／重量比で上記の後技法により調製した。抗原用量は０．２５μｇＨＮの各ウイルス株、そしてＩＬ−２用量は３．３μｇ（６０，０００ＩＵ）であった。
【０１０９】
体液性応答は、赤血球凝集反応阻止（ＨＩ）アッセイを使用してワクチン接種から１５および３０日後に試験した。  
【０１１０】
表６を見ればわかるように、アジュバントとしてリポソームＩＬ−２の同時投与は（群４）、ＨＩ力価およびセロコンバージョン％により測定して、両方の時点ですべての３種の株に対して遊離ＩＬ−２（群）よりも有意に大きな応答を誘導した。同様な結果が老齢（１８月齢）のマウスでも得られた（データは示さず）。
【０１１１】
【表８】
2005525992.tif 000009
【０１１２】
凍結乾燥した脂質のヒトＩＬ−２内包に及ぼす保存効果
ＩＬ−２を充填したＭＬＶは、３級ブタノールに溶解したＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ（９／１のモル比）を使用して上記のように後技法により調製し、一晩凍結乾燥し、そして４℃で２０カ月保存した後にＩＬ−２溶液で水和した。内包効率（〜８０％）、平均リポソームサイズ（〜１．５μｍ）および安定性（４℃で３カ月後のＩＬ−２の漏出が＜１０％）は、新たに凍結乾燥した脂質で調製したリポソームＩＬ−２と同様であった。
【実施例６】
【０１１３】
ヒト有志を対象とした混合リポソームインフルエンザワクチンの効力 
リポソームインフルエンザ抗原（ＨＮ）およびリポソームＩＬ−２からなる混合ワクチン（表６を参照にされたい）を用いたワクチン接種後に強化された免疫応答を示したマウスを対象とした成功裏の前−臨床実験、およびウサギを対象とした良好な安全性プロフィールに基づき、混合ワクチン（ＩＮＦＬＵＳＯＭＥ−ＶＡＣと命名）を２０００／２００１に２回の臨床試験で実験した。１回の実験は健康な若い成人（平均年齢２８歳、ｎ＝５３）で行い、そして２回目は老人ホームの居住者（平均年齢８１歳、ｎ＝８１）について行った。有志は標準的（市販の）な三価ワクチン（１５μｇの各ウイルス株、サブユニットまたは分かれた（ｓｐｌｉｔ）ビリオン調製物）、あるいは同じワクチンから調製したＩＮＦＬＵＳＯＭＥ−ＶＡＣのいずれかを無作為に単回、筋肉内投与された。混合リポソームワクチンは、別個のリポソームにインフルエンザ抗原およびｒｈＩＬ−２（６００，０００  ＩＵ／用量）を充填したＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ（９／１のモル比）のリポソームを含んでなった。リポソームはＨＮおよびＩＬ−２について約５００／１の脂質／タンパク質重量／重量比を使用して後内包技法（本発明）により調製した。
結果および結論
応答は赤血球凝集反応−阻止（ＨＩ）アッセイを使用してワクチン接種前および２８日後に試験した。表７を見れば分かるように、ＩＮＦＬＵＳＯＭＥ−ＶＡＣはセロコンバージョン％により測定されるように（ＨＩ力価に＞４倍の上昇があるワクチンの％、２８日目に力価＞４０に達する）、若い有志においては３種のウイルス株に対して、そして老年の有志においては２種のＡ株に対して、有意により効率的であった（Ｐ＜０．０５、フィッシャーの直接法）。いずれの実験でも逆反応（若い有志における局所的な疼痛は除く）の増加は観察されなかった。すなわちＩＮＦＬＵＳＯＭＥ−ＶＡＣは若い有志および老人においても標準的なインフルエンザワクチンより安全でしかも免疫原性である。
【０１１４】
【表９】
2005525992.tif 000010
【配列表】
2005525992.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月21日(2005.4.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム小胞に生物学的物質を充填する方法であって：
ｉ）少なくとも１つのリポソーム形成性脂質を溶媒中で可溶化し、そしてそれを凍結乾燥させて乾燥リポソーム形成性脂質を形成し；
ｉｉ）生物学的物質の水溶液を提供し；
ｉｉｉ）該生物学的物質を該脂質から形成されたリポソームに充填する様式で、生物学的物質の溶液で凍結乾燥リポソーム形成性脂質を水和する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
生物学的物質を充填したリポソームを含んでなる製剤組成物の調製に使用するための、凍結乾燥リポソーム形成性脂質または凍結乾燥リポソーム形成性脂質の混合物の第１製剤、および生物学的物質の第２製剤組成物を含んでなる２つの製剤組成物の組み合わせ物。
【請求項３】
有効成分として生物学的物質を充填した治療に有効な量のリポソームおよび製薬学的に許容される添加剤を含んでなり、該充填したリポソームが請求項１に記載の方法により調製された、製剤処方物。
【請求項４】
疾患の防止または処置のための製剤処方物の調整のための、請求項１に記載の方法により調整された生物学的材料を充填したリポソームの使用。
【国際調査報告】
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