(57)【要約】本発明は、グルタチオンペルオキシダーゼミメティックに共有結合された親油性カチオン部分を含む、ミトコンドリアをターゲティングする抗酸化化合物を提供する。これらの化合物は、酸化ストレスの軽減が有効である患者の治療に使用できる。
2005535696.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタチオンペルオキシダーゼミメティックである抗酸化部分に共有結合している親油性カチオン部分を含む化合物。
【請求項２】
グルタチオンペルオキシダーゼミメティック部分が少なくとも１個のセレン原子を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
グルタチオンペルオキシダーゼミメティック部分が、ベンズイソセレナゾロン、ジアリールジセレニドおよびジアリールセレニドからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
グルタチオンペルオキシダーゼミメティック部分が、
【化１】
2005535696.tif 000011
である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
親油性カチオン部分が、アンモニウムカチオン；ホスホニウムカチオン；アルソニウムカチオン；ローダミン123；JC-1；N,N’-ビス(2-エチル-1,3-ドキシレン)クリプトシアニン；ピロニンY；o-トルイジンブルー；カルコゲンピリリウム；およびベンゾ(a)フェノキサジニウムからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
親油性カチオン部分がトリベンジルまたはトリフェニルで置換されているアンモニウムまたはホスホニウムカチオンである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
親油性カチオン部分がトリフェニルホスホニウムである請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
式：
【化２】
2005535696.tif 000012
［式中、Lは連結基であり、Zはアニオンである］
を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
連結基が、場合によりグルタチオンペルオキシダーゼミメティック部分の末端にO、SまたはNHを含む、１〜30個の炭素原子を有するアルキレン基であり、かつ、場合により、ヒドロキシ、チオ、アミノ、カルボキシ、アミドおよび糖もしくは糖誘導体から誘導される基から選択される基で置換されている、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Zが薬学的に許容されるアニオンである、請求項８または９に記載の化合物。
【請求項１１】
式：
【化３】
2005535696.tif 000013
である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
式：
【化４】
2005535696.tif 000014
［式中、XはO、Sからなる群から選択され、nは１〜30である］
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
ヒトまたは動物の身体の治療方法において使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物を、１種以上の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１５】
酸化ストレスの軽減により改善される症状の治療において使用するための医薬を製造するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
酸化ストレスの軽減により改善される症状が、パーキンソン病、フリートライヒ運動失調、ウィルソン病、mtDNA病、糖尿病、運動ニューロン病、炎症、ならびに卒中、心臓発作、臓器移植および手術における虚血再灌流組織障害から選択される、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリアをターゲティングする抗酸化剤である化合物、それらの使用および合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、エネルギー代謝に関与する細胞内オルガネラである。したがって、ミトコンドリアの異常は、特に高いエネルギーを必要とする神経組織および筋肉組織にとって有害である。
【０００３】
ミトコンドリア機能障害は、多くのヒトの変性疾患の主因であり、核コード遺伝子の突然変異によるミトコンドリアDNAによりコードされる遺伝子の一次的な欠陥によるものであるか、あるいは、他の欠損の二次的な結果によるものである可能性がある。ミトコンドリアの酸化的損傷は、これらの疾患の病態生理学における主要な要因である。何故ならば、ミトコンドリアの呼吸鎖が、多くのヒト細胞内の活性酸素種（ROS）の主な供給源であるからである。これらの疾患としては、パーキンソン病、フリートライヒ運動失調、ウィルソン病、mtDNA病、糖尿病、運動ニューロン病、ならびに加齢（老化）に伴う非特異的な活力喪失が含まれる。また、ミトコンドリアの酸化的損傷は、卒中や心臓発作および臓器移植や手術の際の炎症および虚血再灌流障害の病態生理学の原因にもなる。
【０００４】
酸化ストレスにより引き起こされる損傷を防止するために、多くの抗酸化療法が開発されてきた。さらに、ミトコンドリアの機能を保護または改変するように設計された、治療または予防に有用な一連の化合物が設計されてきた。本発明者らは、先に、ある特定のクラスの抗酸化剤が、アルキレン鎖により親油性カチオンに共有結合することによって、ミトコンドリアをターゲティングできることを開示している（WO 99/26954）。特に、ビタミンＥおよびユビキノールの、トリフェニルホスホニウムイオンに結合することによるミトコンドリアのターゲティングについて記載した。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、１つのクラスの抗酸化部分の、親油性カチオン部分に結合することによる、ミトコンドリアへのターゲティングに関する。
【０００６】
従来ミトコンドリアをターゲティングしてきた抗酸化部分は、活性酸素種を除去すると、ある程度破壊される。その場合、活性な抗酸化部分は、ミトコンドリアまたは細胞において起こるプロセスによって、ある程度は再生される可能性があるが、その再生プロセスにより副生成物が生成し、最終的には酸化機能の完全な喪失または深刻な低下をまねく。この機能低下を克服するためには、治療の効力を低下させないように、抗酸化化合物を経時的に補充するか、あるいは十分な量で存在させなければならない。
【０００７】
本発明の第１の態様は、グルタチオンペルオキシダーゼミメティックである抗酸化部分に共有結合している親油性カチオン部分を含む化合物を提供することである。
【０００８】
好ましくは、グルタチオンペルオキシダーゼミメティックは、有機セレン化合物、すなわち、少なくとも１個のセレン原子を含む有機化合物である。好ましい有機セレン系グルタチオンペルオキシダーゼミメティックのクラスとしては、ベンズイソセレナゾロン、ジアリールジセレニドおよびジアリールセレニドが含まれる。そのような化合物は、Sies, H., Adv. Pharmacol., 38, 229-246 (1996)；Galet, V.ら, J. Med. Chem., 37, 2903-2911 (1994)；Parnham, M.J.ら, Agents and Actions, 27, 306-308；Andersson, C-M.ら, Free Radical Biol. & Med., 16, 17-28 (1994)；R. Paolettiら編, Raven Press, New York (1994)のOxidative Processes and AntioxidantsのChaudiere, Jら, “Design of New Selenium-Containing Mimics of Glutathione Peroxidase” 165-184（それらは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０００９】
したがって、この態様の化合物は、次の構造を有する：
【化１】
2005535696.tif 000003
【００１０】
［式中、Lは連結基であり、Zはアニオン、好ましくは薬学的に許容されるアニオンである］。
【００１１】
本発明の第２の態様では、ヒトまたは動物の身体の治療方法において使用するための、第１の態様の化合物が提供される。
【００１２】
本発明の第３の態様では、第１の態様の化合物を、１種以上の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物が提供される。
【００１３】
本発明の第４の態様では、酸化ストレスの軽減が有効な患者の治療方法であって、その患者に、治療上有効量の第１の態様の化合物を投与するステップを含む上記方法が提供される。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、細胞において酸化ストレスを軽減する方法であって、その細胞に、第１の態様の化合物を投与するステップを含む上記方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様では、酸化ストレスの軽減により改善される症状の治療において使用するための医薬の製造のための、第１の態様の化合物の使用が提供される。
【００１６】
酸化ストレスの軽減により改善される症状としては、パーキンソン病、フリートライヒ運動失調、ウィルソン病、mtDNA病、糖尿病、運動ニューロン病、炎症ならびに卒中、心臓発作、臓器移植および手術における虚血再灌流組織障害が含まれる。
【００１７】
ここで、以下の図面を参照しながら、さらなる定義および実施例により、本発明の好ましい特徴を説明する。
【００１８】
親油性カチオン部分
ミトコンドリアは、その内膜を横切って180mVまでの実質的な膜電位を有する（内側が負）。この電位により、膜透過性の親油性カチオンは、ミトコンドリアマトリックス内に数百倍も蓄積する（Rottenberg、Methods in Enzymology, 55, 547-560 (1979); Chen, Ann. Rev. Cell Biol., 4, 155-181 (1988)）。そのようなイオンは、正の電荷を選別するか、または正の電荷を広い表面積にわたって非局在化させるのに十分に親油性である場合、さらには、有効な流出経路が存在せず、カチオンが代謝されないか直ちに細胞にとって有害になる場合に蓄積する。
【００１９】
本発明の親油性カチオン部分は、アンモニウム、ホスホニウムまたはアルソニウムカチオン、特には、トリベンジルまたはトリフェニルで置換されたカチオン部分とすることができ、そこにおいて、そのフェニル基は、場合により、３位、４位または５位の１箇所以上において例えばヒドロキシ（OH）、アルコキシ（O-C1-7アルキル）、ニトロ（NO2）、アミド（CONH2）、カルボキシ（COOH）またはC1-7アルキルで置換されていてもよい。例としては、トリベンジルアンモニウム、トリベンジルホスホニウム、トリベンジルアルソニウムおよびトリフェニルホスホニウムカチオンが挙げられるが、それらに限定されない。これらの中で、トリフェニルホスホニウムが好ましい。
【００２０】
また、親油性カチオン部分は、蛍光発光性であっても光吸収性であってもよい。例としては、ローダミン123、JC-1、N,N’-ビス(2-エチル-1,3-ドキシレン)クリプトシアニン、ピロニンY、o-トルイジンブルー、カルコゲンピリリウムおよびベンゾ(a)フェノキサジニウム（Chen, L., Ann. Rev. Cell Biol., 4, 155-181 (1988)を参照されたい；これは参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２１】
トリフェニルホスホニウムが、本発明で、最も好ましい親油性カチオン部分である。
【００２２】
グルタチオンペルオキシダーゼミメティック部分
グルタチオンペルオキシダーゼは、過酸化水素を水に、有機ヒドロペルオキシドをアルコールへと還元し、一方、グルタチオンをグルタチオンジスルフィドへと酸化する。グルタチオンペルオキシダーゼは、その活性部位の必須部分としてセレンを含んでいることが知られている。したがって、グルタチオンペルオキシダーゼミメティックは、有機セレン化合物、すなわち、少なくとも１個のセレン原子を含む有機化合物であることが好ましい。
【００２３】
上記に示す引用文献には、有機セレン系グルタチオンペルオキシダーゼミメティックの幾つかのクラスが開示されており、ベンズイソセレナゾロン、ジアリールジセレニドおよびジアリールセレニドが挙げられている。
【００２４】
ベンズイソセレナゾロンは、一般式：
【化２】
2005535696.tif 000004
【００２５】
［式中、Rは、様々なアルキル基およびアリール基とすることができる］
を有する。ベンゼン環は、置換基を有することができ、また、例えばピリジンなどの他の縮合芳香族環で置き換えることも可能である。最も広く研究され、好ましいとされるこのクラスのメンバーは、エベルセン（Ebelsen）(2-フェニル-ベンゾ[d]イソセレナゾール-3-オン)：
【化３】
2005535696.tif 000005
【００２６】
である。
【００２７】
ジアリールジセレニドは、一般式：
【化３】
2005535696.tif 000006
【００２８】
のものであり、この式中、「アリール」という用語は、本明細書中で用いられているように、芳香族化合物の芳香族環原子から水素原子を除去することにより得られる一価の部分に関していい、この部分は、（特に特記しない限り）３〜20個の環原子を有する。好ましくは、各環は、５〜７個の環原子を有する。
【００２９】
環原子は、「カルボアリール基」のように、全て炭素原子とすることができ、例えば、ベンゼンに由来するもの（すなわちフェニル）（C6）およびナフタレンに由来するもの（C10）であるか、あるいは、環原子は、「ヘテロアリール基」のように、１個以上のヘテロ原子を含むことができ、例えばピリジン（C6）、フラン（C5）、チオフェン（C5）およびピリミジン（C6）に由来するものが挙げられる。
【００３０】
好ましくは、アリール基は、場合により置換されているフェニル基である。
【００３１】
このクラスの化合物の例としては、ビス(2-アミノ)フェニルジセレニドおよびビス(2-アミノ,5-アセチル)フェニルジセレニドが含まれる。
【００３２】
ジアリールセレニドは、一般式：
【化５】
2005535696.tif 000007
【００３３】
のものであり、その式中、「アリール」という用語は上記で定義したとおりである。好ましくは、アリール基は、場合により置換されているフェニル基である。
【００３４】
このクラスの化合物の例としては、ジ(4-アミノフェニル)セレニドおよびジ(4-フェニルフェニル)セレニドが含まれる。
【００３５】
ベンズイソセレナゾロンは、有機セレン系グルタチオンペルオキシダーゼミメティックの好ましいクラスであり、エベルセン（Ebelsen）が最も好ましい。
【００３６】
共有結合連結基
共有結合連結基は、親油性カチオン部分を酵素ミメティックに、各末端での共有結合で結合させ、かつ、ミトコンドリア内膜を通過してミトコンドリアマトリックスに侵入する際に、それら２つの基を結合したままにすることができる基であれば如何なるものであってもよい。
【００３７】
典型的には、この基は、アルキレン基である。本明細書中で用いられる「アルキレン」という用語は、１〜30個の炭素原子を有する炭化水素化合物の同一の炭素原子または２個の異なる炭素原子のそれぞれ一方から２個の水素原子を除去することにより得られる二座配位部分に関していい、その炭化水素化合物は、脂肪族化合物であっても脂環式化合物であってもよく、また飽和、部分不飽和または完全不飽和であってもよい。したがって、「アルキレン」という用語は、以下に述べるサブクラスであるアルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレンなどを包含する。
【００３８】
これに関して、接頭語（例えば、C1-4、C1-7、C1-30、C2-7、C3-7など）は、炭素原子の数または炭素原子の数の範囲を示す。例えば、本明細書中で用いられる「C1-4アルキレン」という用語は、１〜４個の炭素原子を有するアルキレン基に関していう。アルキレン基のグループの例としては、C1-4アルキレン（「低級アルキレン」）、C1-7アルキレンおよびC1-30アルキレンが挙げられる。
【００３９】
直鎖状の飽和C1-7アルキレン基の例としては、-(CH2)n-［式中、nは１〜７の整数である］、例えば-CH2-（メチレン)、-CH2CH2-（エチレン）、-CH2CH2CH2-（プロピレン）および-CH2CH2CH2CH2-（ブチレン）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４０】
分枝状の飽和C1-7 アルキレン基の例としては、-CH(CH3)-、-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-および-CH2CH(CH2CH3)CH2-が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４１】
直鎖状の部分不飽和C1-7アルキレン基の例としては、-CH=CH-（ビニレン）、-CH=CH-CH2-、-CH=CH-CH2-CH2-、-CH=CH-CH2-CH2-CH2-、-CH=CH-CH=CH-、-CH=CH-CH=CH-CH2-、-CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-、-CH=CH-CH2-CH=CH-および-CH=CH-CH2-CH2-CH=CH-が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４２】
分枝状の部分不飽和C1-7アルキレン基の例としては、-C(CH3)=CH-、-C(CH3)=CH-CH2-および-CH=CH-CH(CH3)-が挙げられるが、それらに限定さない。
【００４３】
脂環式の飽和C1-7アルキレン基の例としては、シクロペンチレン（例えばシクロペンタ-1,3-イレン）およびシクロヘキシレン（例えばシクロヘキサ-1,4-イレン)が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４４】
脂環式の部分不飽和C1-7アルキレン基の例としては、シクロペンテニレン（例えば4-シクロペンテン-1,3-イレン）、シクロヘキセニレン（例えば2-シクロヘキセン-1,4-イレン；3-シクロヘキセン-1,2-イレン；2,5-シクロヘキサジエン-1,4-イレン）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４５】
アルキレン基は、分子の溶解性を増大させるか、ミトコンドリア膜を介しての分子の取り込を増大させるか、あるいはin vivoでの分子の分解速度を低下させる置換基で置換されていてもよい。特に、連結基は、ヒドロキシ基（式-OHを有する）；チオ基（式-SHを有する）；アミノ基（式-NH2を有する）；カルボキシ基（式-C(=O)OHを有する）；アミド基（式-C(=O)NH2を有する）、または糖もしくは糖誘導体から誘導される基で置換されていてもよい。
【００４６】
ヒドロキシ基、チオ基、アミノ基、カルボキシ基およびアミド基は、好ましくは、連結基内の分枝の末端に位置して、全体的な作用が、それぞれ連結基の主鎖の末端に結合しているアルコール、チオール、アミン、カルボン酸またはアミドの作用となるようにする。
【００４７】
糖（サッカライド）は、ヒドロキシル化されたアルデヒドおよびケトンと考えることができる炭水化物である。２個以上の単糖が例えばアセタール結合によって連結している場合、その化合物は、慣用的には、二糖（例えばショ糖、マルトース）、三糖などと呼ばれ、これらは全て、本発明において使用することができる。多糖は本発明において使用することが意図されていない。
【００４８】
単糖は、慣用的には、例えばトリ-（tri-）(C3)、テトラ-（tatr-）（C4）、ペンタ-（pent-）（C5）およびヘキサ-（hex-）（C6）などのように、炭素原子の総数によって命名される。単糖は、例えば、アルドース、ケトース、アルドケトースおよびジアルドースの形態をとりうる。アルドースは、慣用的には、例えばトリオース（C3）、テトロース（C4）、ペントース（C5）、ヘキソース（C6）およびヘプツロース（C7）などのように、-オース（-ose）として命名される。ケトースは、慣用的には、例えばテトルロース（C4）、ペンツロース（C5）、ヘクスロース（C6）およびヘプツロース（C7）のように、-ウロース（-ulose）として命名される。アルドケトースは、慣用的には、-ウスロース（-osulose）として命名される。ジアルドースは、慣用的には、-オジアルドース（-odialdose）として命名される。
【００４９】
単糖は、１つ以上のキラル中心を有することができ、したがって、異なる立体異性形態（例えば、R-、S-、D-、L-、α-、β-、(+)、(-)、およびα-D-、β-D-、α-L-、β-L-などのそれらの組合せ）を有することができる。重ね合わせることができる鏡像である異性体は、慣用的には、エナンチオマーと呼ばれる。２つ以上のキラル中心での立体配置が互いに異なる異性体は、慣用的には、ジアステリオマーと呼ばれる。１つのキラル中心での立体配置だけが互いに異なる異性体は、慣用的には、エピマー（例えばD-リボースおよびD-キシロース）と呼ばれる。
【００５０】
各キラル中心における立体配置は、慣用的にはRまたはSで表される。D-またはL-という接頭語は、慣用的には、それぞれ、D-およびL-グリセルアルデヒドに関連する立体配置を有する単糖を示すのに用いられる。(+)-および(-)-という接頭語は、慣用的には、右旋性（偏光面を右に、つまり時計方向に回転する）、または左旋性（偏光面を左に、つまり反時計方向に回転する）の単糖を示すのに用いられる。
【００５１】
エリトロ-（erythro-）およびトレオ-（threo-）という接頭語は、特定のテトロース（C4）ジアステリオマーを表わす。アラビノ-（arabino-）、リキソ-（lyxo-）、リボ-（ribo-）およびキシロ-（xylo-）という接頭語は、特定のペントース（C5）ジアステリオマーを表わす。アロ-（allo-）、アルトロ-（altro-）、グルコ-（gluco-）、マンノ-（manno-）、グロ-（gulo-）、イド-（ido-）、ガラクト-（galacto-）およびタロ-（talo-）という接頭語は、特定のヘキソース（C6）ジアステリオマーを表わす。
【００５２】
単糖は、環状形態（ヘミアセタールまたはヘミケタールの形態）では、慣用的に、環原子の数によって命名される。例えば、フラノースは５員環を有し；ピラノースは６員環を有し；セプタノースは７員環を有する。α-およびβ-という接頭語は、慣用的には、環化の際に形成される新たなキラル中心から生じる２つのアノマーを表わすのに用いられる。
【００５３】
糖の例としては、以下のものが挙げられるが（しかし、それらに限定されない）、それらはα-D、β-D、α-Lまたはβ-Lの形態でありうる：
エリトロースおよびトレオース；
アラビノース、リキソース、リボースおよびキシロース；
アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトースおよびタロース；
アラビノフラノース、リキソフラノース、リボフラノースおよびキシロフラノース；
アロフラノース、アルトロフラノース、グルコフラノース、マンノフラノース、グロフラノース、イドフラノース、ガラクトフラノース、タトフラノース；
アロピラノース、アルトロピラノース、グルコピラノース、マンノピラノース、グロピラノース、イドピラノース、ガラクトピラノースおよびタロピラノース。
【００５４】
多くの糖は、それらの慣用名で知られており、例えば、D-トレオース（D-トレオ-テトロース）、D-リボース（(D-リボ-ペントース)、D-ガラクトース（D-ガラクト-ヘキソース）、D-フルクトース（D-アラビノ-2-ヘクスロース）、L-ソルボース（L-キシロ-2-ヘクスロース）、D-リブロース（D-エリトロ-2-ペンツロース）、D-セドヘプツロース（D-アルトロ-2-ヘプツロース）が挙げられる。
【００５５】
多くの糖誘導体が周知であり、例えば、デオキシ-サッカライド（例えばL-フコースとしても知られる6-デオキシ-L-ガラクトース；L-ラムノースとしても知られる6-デオキシ-L-マンノース；デオキシリボースもしくは2-デオキシ-D-リボースとしても知られる2-デオキシ-D-エリトロ-ペントース）；グリコシド（例えば、メチルα-D-グルコピラノシド）；グルコサミンとしても知られるアミノ-デオキシ-サッカライド（例えばD-グルコサミン、D-ガラクトサミン）；アルジトール（例えば、D-ソルビトールとしても知られるD-グルチトール；D-マンニトール；meso-ガラクチトール）；グリコン酸としても知られるアルドン酸（例えばD-グルコン酸）；グリコウロン酸としても知られるウロン酸（例えばD-ガラクトウロン酸）；ならびにグリカル酸としても知られるアルダル酸（例えばL(+)-酒石酸）が挙げられる。
【００５６】
アルキレン基は、酵素ミメティック部分に隣接するその末端に、O、SまたはNHから選択されるヘテロ原子を有することができる。
【００５７】
好ましい連結基は、場合により酵素ミメッティック末端にOまたはSが付いているC1-30アルキレン基、さらに好ましくはC1-20、C1-10もしくはC1-4アルキレン基であり、例えば-S-(CH2)3-および-O-(CH2)4-が挙げられる。
【００５８】
連結基は、好ましくは、ベンゼン環またはピリジン環などの芳香族環で酵素ミメティック部分に結合している。
【００５９】
アニオン
好適な無機アニオンの例としては、次の無機酸から誘導されるものが挙げられるが、それらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸および亜リン酸。
【００６０】
好適な有機アニオンの例としては、次の有機酸から誘導されるものが挙げられるが、それらに限定されない：テトラフェニルボロン酸、2-アセチオキシ安息香酸（2-acetyoxybenzoic）、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンフルスルホン酸（camphorsulfonic）、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルケプトン酸（glucheptonic）、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸および吉草酸。
【００６１】
上記のアニオンは、一般に、薬学的に許容される。薬学的に許容される塩の例は、Bergeら, "Pharmaceutically Acceptable Salts," J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977)（参照により本明細書に組み込まれる）に述べられている。
【００６２】
本発明では、無機アニオンが好ましく、特にハロアニオンが挙げられ、その中でもBr-が最も好ましい。
【００６３】
好ましい化合物
本発明の好ましい化合物は、式：
【化６】
2005535696.tif 000008
【００６４】
［式中、ZおよびLは上記で定義したとおりである］
を有するものであり、さらに好ましくは、式：
【化７】
2005535696.tif 000009
【００６５】
［式中、Zは上記で定義したとおりであり、XはO、SまたはNH、好ましくはOまたはSであり、nは１〜20、さらに好ましくは３〜６である］
を有するものである。
【００６６】
治療
本明細書中で症状の治療という文脈で用いられる「治療」という用語は、一般に、ヒトまたは動物（例えば獣医学的適用）の、例えば症状の進行の抑制などのある目的とする効果が達成される治療および療法に関していい、進行速度の低減、進行速度の停止、症状の改善、および症状の治癒が含まれる。また、予防的手段としての治療（すなわち予防）も含まれる。
【００６７】
本明細書中で用いられる「治療上有効量」という用語は、合理的な利益−リスク比に応じた、ある目的とする治療効果を得るのに有効な、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物もしくは剤形の量に関していう。
【００６８】
「治療」という用語には、２種以上の治療または療法を（例えば逐次的または同時に）組み合わせる併用（組合せ）治療および療法が含まれる。
【００６９】
上記化合物または上記化合物を含む医薬組成物は、被験体に、全身的／末梢的または局所的（すなわち、目的とする作用部位に）であれ、任意の慣用の投与経路で投与できる。
【００７０】
活性化合物は単独でも使用（例えば投与）することが可能であるが、それを製剤とすることが好ましい場合も多い。
【００７１】
好適な担体、希釈剤、賦形剤などは、標準的な製剤学の文書に見ることができる。例えば、Handbook for Pharmaceutical Additives, 第２版 (M. AshおよびI. Ash編), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA)、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990；およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 第２版, 1994（それらは参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００７２】
本明細書中で用いられる「薬学的に許容される」という用語は、適切な医薬判定の範囲内にあり、問題となる被験体（例えばヒト）の組織と接触させて使用するのに適し、合理的な利益／リスク比に対応して過度の毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題や合併症を引き起こさない化合物、成分、材料、組成物、剤形などをいう。また、それぞれの担体、希釈剤、賦形剤などは、製剤の他の成分と適合性である、という意味でも「許容される」ものでなければならない。
【００７３】
製剤は、製剤学の技術分野で周知の任意の方法によって調製できる。そのような方法は、活性化合物を、１種以上の補助成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性化合物を担体(例えば、液状担体、微粉砕固形担体など)と均一かつ十分に会合させ、次いで必要に応じてその生成物を成形することにより調製される。
【００７４】
当業者であれば、上記化合物および上記化合物を含む組成物の適切な投与量は、患者間で異なることができることが理解されよう。最適な投与量の決定は、一般に、治療上の利益レベルとリスクまたは有害な副作用とのバランスを取ることを含む。選択した投薬レベルは、限定するものではないが特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排出速度、治療期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／もしくは材料、症状の重篤度、ならびに患者の種、性別、年齢、体重、状態、総合的な健康状態およびこれまでの病歴を含む様々な要因に応じて決まる。化合物の量および投与経路は、最終的には、医師、獣医師または臨床医の判断に委ねられるが、一般に、投薬量は、実質的な有害もしくは有毒な副作用を引き起こさずに目的とする作用をあげる、作用部位での局所濃度を達成するように選択される。
【００７５】
投与は、治療全体にわたって、単回用量で、連続的または断続的に（例えば適当な間隔をあけて分割用量で）実施することができる。最も有効な投与手段および投与量の決定方法は、当業者には周知であり、治療に用いる製剤、治療目的、処置しようとする標的細胞および治療する患者によって異なってくる。単回または複数回投与は、処置する医師、獣医師または臨床医が選択した用量レベルおよびパターンで実施することができる。
【００７６】
一般に、活性化合物の適切な投与量は、約１μg〜約250mg／被験体の体重（kg）／日である。
【００７７】
さらに別の使用
第１および第２の態様の化合物はまた、切り離した臓器の移植前の灌流や、胚などの凍結細胞の保存にも有用である。
【００７８】
合成経路
ここで、本発明の化合物の化学的合成方法について説明する。これらの方法は、本発明の範囲に含まれるさらなる化合物を合成しやすくするために、公知の方法で修正し、かつ／または適合させることができる。示す試薬の量は参考のためである。本発明の化合物の製造に有用な概略的な実験方法および手順の説明は、Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry (第５版, Furniss, B. S., Hannaford, A.J., Smith, P.W.G., Tatchell, A.R., Longmann, UK編)に記載されている。
【００７９】
本発明の化合物の合成は、３つの重要なステップを含む。
【００８０】
(i)抗酸化部分の形成；
(ii)親油性カチオン部分への連結基の結合；
(iii)連結基と抗酸化部分との結合。
【００８１】
これらの３つのステップは、どのような順序で行ってもよく、用いる方法や３つの基のそれぞれの性質に応じて決まる。抗酸化部分を形成する間に、前駆体を連結基に連結することが可能である。必要であれば、保護基を用いて、合成の間に望ましくない反応が起こらないようにすることができる（Protective Groups in Organic Synthesis, T. GreenおよびP. Wuts; 第３版; John Wiley and Sons, 1999を参照）。
【００８２】
抗酸化部分の形成：これは、抗酸化部分の性質によって異なり、通常は、開示したその部分の形成経路に基づくものとすることができる。場合によっては、その部分に隣接する連結基のアルキレン鎖の末端にヘテロ原子（O、SまたはNH）を有する酵素ミメティック部分を合成して、連結基と酵素ミメティック部分との結合を補助することが好都合なこともある。
【００８３】
連結基と親油性カチオン部分との連結：一般に、このステップは、場合により適切な溶媒中で、ハロゲン化前駆体、好ましくはヨウ素化または臭素化前駆体（RBrまたはRI）を、２〜３当量の親油性カチオン前駆体と共に、窒素下で、数日間加熱することにより行うのが好ましい。Rは、連結基、酵素ミメティック部分に既に結合させてある連結基、または酵素ミメティック部分の前駆体に結合させた連結基とすることができる。次に、化合物を、その臭化物またはヨウ化物の塩として単離する。こうするために、（必要に応じて）溶媒を除去し、次に、固体が残存するまで、生成物をジエチルエーテルなどの化合物とともに繰り返し粉砕する。次に、これを溶媒（例えばジクロロメタン）に溶解し、ジエチルエーテルで析出させて、過剰な未反応のカチオンを除去する。これは繰り返すことができる。精製は、例えば塩化メチレン／ジエチルエーテルからの再結晶、またはジクロロメタン／エタノール混合物で溶出させるシリカゲルでのクロマトグラフィーを含むことができる。
【００８４】
連結基と抗酸化部分との連結：これは、抗酸化部分の性質によって異なる。この連結を達成するための１つの方法は、抗酸化部分の一部として連結基を合成することである。あるいはまた、抗酸化部分が代わりにヘテロ原子を含んで合成されている場合には（上記を参照）、連結基は、抗酸化部分を強塩基で処理し、それを適切な脱離基（例えばハロ）を有する連結基と反応させることにより連結させることができる。
【実施例】
【００８５】
共通実験の詳細
分取カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（Merck）タイプ60（200〜400メッシュ、40〜63μm）を用いて行った。分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）は、アルミナロールで被覆されているシリカゲル（Merck）60F 254を用いて行い、可視化は、UV光で行った。核磁気共鳴スペクトルは、Varian 300 MHz装置を用いて得た。テトラメチルシランを、CDCl3中での1Hおよび13C NMR実験の内部標準として用い、85％リン酸を、全ての溶媒中での31P NMR実験の内部標準として用いた。残留溶媒ピークを、CDCl3以外の1Hおよび13C NMR実験の内部標準として用いた。化学シフト（δ）のデータは、内部標準に対するppmの単位で報告する。13C NMRのピークの割当は、化学シフト、相対強度およびHSQCデータに基づいて行った。赤外吸収スペクトルは、Perkin Elmer Spectrum BX FTIR装置を用いて得た。サンプルは、無水KBrを用いて調製したKBrディスクとして調べ、吸光度の単位は波数（cm-1）で報告する。低分解能エレクトロスプレー（LRES）および低分解能大気圧化学イオン化（LRAPCI）の質量スペクトルは、Shimadzu LCMS-QP800X液体クロマトグラフマススペクトロメーターを用いて得、データはm/z値として報告する。融点は、Kofler Heizbank融点ベンチを用いて得、無修正で報告する。
【００８６】
2-[4-(4-トリフェニルホスホニオブトキシ)フェニル]-1,2-ベンズイソセレナゾール)-3(2H)-オンヨージド（化合物６）の合成
【化８】
2005535696.tif 000010
【００８７】
N-(4-ヒドロキシフェニル)-ベンズアミド（化合物１）
無水THF（250mL）中のベンゾイルクロリド（12.9g、91.7mmol）の溶液を、無水THF（700mL）中の4-アミノフェノール（10.0g、91.7mmol）およびEt3N （9.4g、92.9mmol）の溶液に滴下し、混合物を乾燥チューブ下で２日間撹拌した。溶媒を減圧除去し、固形の残渣をH2O（３回×250mL）およびジエチルエーテル（３回×250mL）で抽出した。残存する固形物質をエタノール水溶液から再結晶化し、結晶を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、吸引乾燥して、１を白色固体として得た（14.97g、77％）。1H NMR (299.9 MHz, d6-DMSO) δ 10.06 (ブロード s, 1H, -OH), 9.28 (s, 1H, -NH-), 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 2H, Ar-H), 7.57 (m, 5, Ar-H), 6.78 (d, J = 7.8 Hz, Ar-H)；13C NMR (125.7 MHz, d6-DMSO) δ 165.92（カルボニル）, 154.56（芳香族）, 136.09（芳香族）, 132.30（芳香族）, 131.61（芳香族）, 129.33（プロトン化芳香族）, 128.48（プロトン化芳香族）, 123.21（プロトン化芳香族）, 115.90（プロトン化芳香族）；C13H11NO2の分析理論値：C:73.22, H: 5.20, N: 6.57, 実測値：C: 73.33, H: 5.27, N: 6.69；m.p. 224℃。
【００８８】
N-[4-(tert-ブチルジメチルシロキシ)フェニル]ベンズアミド（化合物２）
無水THF（160mL）中の１（14.5g、68.01mmol）およびイミダゾール（11.6g、67.91mmol）の溶液を、乾燥チューブ下で０℃まで冷却した。その冷却した溶液に、無水THF（60mL）中のTBDMSClの溶液を乾燥チューブ下で滴下した。得られた懸濁液をアルゴン雰囲気下で終夜撹拌した。次に、この懸濁液をH2O（500mL）で希釈し、CH2Cl2（２回×500mL）で抽出した。有機抽出物を合わせ、Na2SO4で乾燥し、濾過した。濾液から溶媒を減圧除去して、白色固体を得た。この固体を、熱濾過の後でヘキサンから再結晶した。結晶を濾過により回収し、ヘキサンで洗浄し、吸引乾燥して、十分な純度の２を白色結晶として得た（19.86g、89％）;1H NMR (299.9 MHz, CDCl3) δ 7.86 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.85 (d, J = 8.1Hz, 1H, Ar-H), 7.57 - 7.44 (m, 5H, Ar-H), 6.84 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar-H), 0.99 (s, 9H, t-ブチルメチル), 0.20 (s, 6H, メチル)；13CNMR (125.7 MHz, CDCl3) δ 165.97（カルボニル）, 152.9（芳香族）, 135.45（芳香族）,132.04（プロトン化芳香族）, 131.88（芳香族）, 129.11（プロトン化芳香族）, 127.31（プロトン化芳香族）, 122.22（プロトン化芳香族）, 120.80（プロトン化芳香族）, 26.04 (メチル), 18.56 (tertiary), -4.10 (メチル); LRAPCI MS (+ギ酸) C19H24NO2SiSeの理論値：328, 実測値：328。
【００８９】
2-[4-(tert-ブチルジメチルシロキシ)フェニル]-1,2-ベンズイソセレナゾール-3(2H)-オン（化合物３）
アルゴン下で-15℃に冷却した無水THF（150mL）中の２（9.20g、28.09mmol）の溶液に、n-BuLi（ヘキサン中1.6M、35mL、56.0mmol）をカニューレから45分間かけてゆっくり添加した。得られた有機溶液を-15℃で45分間撹拌し、次にセレンパウダー（2.22g、28.12mmol）を添加した。得られた懸濁液を-15℃で45分間撹拌して、深紅色の溶液を得た。この溶液を-78℃に冷却し、CuBr2（12.55g、56.18mmol）を３回に分けて15分間かけて添加した。得られた懸濁液を-78℃で１時間撹拌し、次に冷却浴から外し、22時間撹拌した。得られた褐色の懸濁液を１％酢酸水溶液（600mL）に注ぎ、CH2Cl2（３回×500mL）で抽出した。有機画分を合わせ、濾過した。濾液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、濾液から溶媒を減圧除去して、灰褐色の固体を得た。この固体をクロマトグラフィーにかけ（CH2Cl2中に充填したシリカゲル、CH2Cl2で溶出）、生成物を含む画分を合わせ、溶媒を減圧除去して、淡黄褐色の固体を得た。この固体をEtOHから再結晶し、結晶を濾過し、ヘキサンで洗浄し、吸引乾燥して、３を淡黄色結晶として得た（5.09g、45 ％）。1H NMR (299.9 MHz, CDCl3) δ 8.11 (d, J = 7.8 Hz, 1H Ar-H), 7.64-7.60 (m, 2H, Ar-H), 7.50-7.42 (m, 3H, Ar-H), 6.88 (d, J = 9Hz, 2H, Ar-H), 1.00 (s, 9H, t-ブチルメチル), 0.22 (s, 6H, メチル); 13C NMR (125.7 MHz) δ 166.12（カルボニル）, 154.91（芳香族）, 138.09（芳香族）, 132.72（プロトン化芳香族）, 132.54（芳香族） 129.72（プロトン化芳香族）, 127.78（芳香族）, 127.45（プロトン化芳香族）, 126.82（プロトン化芳香族）, 124.05（プロトン化芳香族）, 120.96（プロトン化芳香族）, 25.71 (t-ブチルメチル), 18.27 (tertiary), -4.34 (メチル)；C19H23NO2SiSeの分析理論値：C: 56.43, H: 5.73, N: 3.46, 実測値：C: 56.72, H: 5.84, N: 3.56；m.p. 188℃。
【００９０】
2-(4-ヒドロキシフェニル)-1,2-ベンズイソセレナゾール-3(2H)-オン（化合物４）
THF（25mL）中の３（2.0g、4.95mmol）の０℃溶液に、TBAF溶液（THF中1M、14mL、14mmol）を窒素雰囲気下で15分間かけて滴下した。混合物を０℃で１時間撹拌し、その後、TLC分析（シリカゲル、19：１ CH2Cl2/ジエチルエーテル）を行ったところ、出発物質が存在しないことが示された。溶媒を減圧除去して、褐色油状物を得た。この油状物をCH2Cl2（50mL）に溶解し、有機相を５％ HCl（150mL）およびH2O（４回×50mL）で洗浄した。２回目の水での洗浄により、分液漏斗の内側に黄色固体が形成された。両方の相を濾過することにより固体を回収し、残存する固体を漏斗から最後の２回の洗浄により得た。濾過した固体を最後の２つの水性抽出物で洗浄し、吸引乾燥し、１：１ EtOH/THF（35mL）から再結晶化した。結晶を濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄し、吸引乾燥して、４を黄色結晶として得た（1.01g、97％）。1H NMR (299.9 MHz, d6-DMSO) δ 9.65 (s, 1H, -OH), 8.10 (d, J = 7.8 Hz, 1H, Ar-H), 7.91 (d, J = 8.4 Hz, Ar-H), 7.70 (dd, 1H, Ar-H), 7.49 (dd, 1H, Ar-H), 7.39 (d, J = 9Hz, 2H, Ar-H), 6.86 (d, J = 9 Hz, 2H, Ar-H); 13C NMR (125.7 MHz, d6-DMSO) δ 165.82（カルボニル）, 156.71（芳香族）, 139.94（芳香族）, 132.87（芳香族）, 131.54（芳香族）, 129.26（芳香族）, 128.75（芳香族）, 127.70 (プロトン化芳香族), 127.07（芳香族）, 126.71（芳香族）, 116.51（プロトン化芳香族）; C13H9NO2Seの分析理論値：C: 53.81, H: 3.13, N: 4.83, 実測値：C:54.04, H: 3.03, N: 4.88；m.p. >260℃。
【００９１】
2-[4-(4-ヨードブトキシ)フェニル]-1,2-ベンズイソセレナゾール-3(2H)-オン（化合物５）
０℃でアルゴン下にある無水DMF（1mL）中のNaH（ペンタンで洗浄して減圧乾燥した60％乳濁液、60mg、1.50mmol）の懸濁液に、無水DMF（7mL）中の４（300mg、1.03mmol）の溶液を、アルゴン下でカニューレにより添加した。得られた溶液を室温で２時間撹拌し、次に、無水DMF（2mL）中の1,4-ジヨードブタン（3.20g、10.3mmol）の溶液にアルゴン下でカニューレで添加した。得られた溶液を暗所で、アルゴン下で室温にて２日間撹拌した。水（１mL）を慎重に添加し、溶媒を減圧除去して、油状の残渣を得た。この残渣をCH2Cl2（20mL）に溶解し、有機相をH2O（20mL）、10％ Na2S2O3（20mL）およびH2O（20mL）で洗浄した。有機抽出物をNa2SO4で乾燥し、濾過した。濾液から溶媒を減圧除去して、黄色の油状残渣を得た。この残渣をクロマトグラフィーにかけ（CH2Cl2中に充填したシリカゲル、19：１ CH2Cl2/ジエチルエーテルで溶出）、生成物を含む画分を合わせた。溶媒を減圧除去して、十分な純度の５を白色固体として得た（254mg、52％）。1H NMR （299.9 MHz, CDCl3) δ 8.11 (d, J = 7.8 Hz, 2H, Ar-H), 7.68-7.62 (m, 2H, Ar-H), 7.52-7.43 (m, 3H, Ar-H), 6.94 (d, J = 9Hz, 2H, Ar-H), 4.02 (t, J = 5.9Hz, 2H, -O-CH2-), 3.27 (t, J = 6.6 Hz, 2H, -CH2-I), 1.98 (m, 4H, -CH2-CH2-); 13CNMR (125.7 MHz, CDCl3) δ 166.20（カルボニル）, 158.0（芳香族）, 138.12（芳香族）, 132.73（芳香族）, 132.03（芳香族）, 129.73（芳香族）, 127.73（プロトン化芳香族）, 127.60（芳香族）, 126.85（芳香族）, 126.85（芳香族）, 124.08（芳香族）, 115.41（プロトン化芳香族）, 67.32 (-O-CH2-), 30.43 (メチレン), 6.64 (-CH2-I); LRAPCI MS (+ギ酸) C17H17NOSeIの理論値：473, 実測値：473。
【００９２】
2-[4-(4-トリフェニルホスホニオブトキシ)フェニル]-1,2-ベンズイソセレナゾール)-3(2H)-オンヨウ化物（化合物６）
５（50mg、0.106mmol）およびトリフェニルホスフィン（278mg、1.06mmol）が入っている乾燥Kimax試験管をアルゴンでパージし、密封し、暗所に置いた。混合物を溶融物として90℃で２時間撹拌した。混合物を冷却し、固形の残渣をCH2Cl2（１mL）に溶解した。生成物をジエチルエーテルで粉砕し、遠心分離（3500rpmで10分間）により回収した。固形残渣をジエチルエーテルでCH2Cl2から２回以上粉砕し、遠心分離により回収した。析出物から残存溶媒を減圧除去して、粗製の６を黄色固体として得た（68mg、87％）。1H NMR (299.9 MHz, CD2Cl2) δ 8.44 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.90 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar-H), 7.86-7.34 (m, 19H, Ar-H, -P+Ph3), 6.79 (d, J = 9Hz, 2H, Ar-H), 3.97 (t, J = 5.7 Hz, 2H, -O-CH2-), 3.41 (m, 2H, -CH2-P+Ph3), 2.04 (m, 2H, -O-CH2-CH2-), 1.87 (m, 2H, -CH2-CH2-P+Ph3); 31P NMR (121.4 MHz, CD2Cl2) δ 24.29; LRES+ Calcd for [C35H31NO2PSe]+: 608, 実測値：608。
【００９３】
化合物６のミトコンドリアでの蓄積
グルタチオンペルオキシダーゼミメティックのミトコンドリアへのターゲティングが有効であること、およびこれらの化合物がミトコンドリア内膜の脂質二重層を通過できることを判定するために、単離したミトコンドリアについて化合物６を試験した。
【００９４】
肝臓ミトコンドリアは、雌性ウイスター（Wistar）ラットから、250mMのショ糖、10mMのTris-HCL（pH 7.4）および１mMのEGTAを含有する培地（Chappell, J.B.およびHansford, R.G., In: Subcellular components: preparation and fractionation （Birnie GD編), pp. 77-91. Butterworths, London, 1972、参照により本明細書に組み込まれる）中で、ホモジナイズし、続いて遠心分離することにより調製した。
【００９５】
化合物６についてのイオン選択電極は、標準的な手順（Kamo, N.ら, Journal of Membrane Biology, 49, 105-121 (1979)およびDavey, G.P.ら,  Biochemical Journal, 288, 439-443 (1992)、それらは参照により本明細書に組み込まれる）により調製し、100μMの化合物６に１〜３日間浸漬することにより活性化した。
【００９６】
ラット肝臓ミトコンドリア（タンパク質0.5mg/ml）を、30℃の恒温チャンバー内で、ロテノン（２μg/ml）を加えた２mLのKCl培地（120mMのKCl、10mMのHEPES、pH 7.2、１mMのEGTA）に懸濁した。化合物６を、DMSO中の1.5μlのアリコートとして、１μMずつ増やしながら滴定し、化合物６を０〜５μMにわたって電極の応答を測定した。この応答は、化合物６の濃度に対して対数をとった。
【００９７】
ミトコンドリアを賦活化するために、呼吸基質であるコハク酸（10mM）を添加した。これらの条件は、約180mVのミトコンドリア膜電位を生じることが知られている（Burnsら, Arch Biochem Biophys, 332,60-68 (1995)；BurnsおよびMurphy, Arch Biochem Biophys, 339, 33-39 (1997)、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。図１から判るように、ミトコンドリアの外側の化合物６の濃度は、急速に低下する。
【００９８】
図１から判るように、ミトコンドリアが膜電位を確立できないようにする脱カップリング剤であるFCCP（カルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）（Burnsら, 1995)（332nM）を添加して、膜電位を逃がしたところ、化合物６のミトコンドリアへの蓄積は逆戻りした。
【００９９】
このことから、化合物６が、ミトコンドリア膜電位により駆動されるミトコンドリアへ迅速かつ選択的に蓄積されることが示される。この蓄積は、化合物６がミトコンドリア内部に蓄積した後で脱カップリング剤FCCPを添加してミトコンドリア膜電位を逃がすことにより急速に（10秒未満で）逆戻りするので、化合物６のミトコンドリア特異的蓄積は、単にミトコンドリア膜電位によるものであり、特定の結合または共有結合性相互作用によるものではない。
【０１００】
グルタチオンペルオキシダーゼアッセイ
グルタチオンペルオキシダーゼミメティックの活性は、グルタチオンレダクターゼの存在下でNADPHの誘起酸化を測定することにより間接的に求めた。インキュベーションは、143mMのリン酸カリウム緩衝液、6.3mMのEDTA、pH 7.5、250μMのNADPH、１mMのGSH、50μMのエブレレンもしくは化合物６、および１Uのグルタチオンレダクターゼが入っている石英キュベット内で37℃にて行った。１mMの過酸化水素または１mMのtert-ブチルヒドロペルオキシドで反応を開始し、Shimadzu UV-2501PC型スペクトロメーターにより基準として空気を用いて340nmにて記録した。エベルセンと化合物６、グルタチオンと酸化剤の濃度を増大させながら、反応をさらに試験した。
【０１０１】
この間接的なグルタチオンペルオキシダーゼアッセイから、グルタチオンペルオキシダーゼミメティックを含有しない対照のインキュベート物において、過酸化水素によるGSHの基礎酸化が55±２nmolのNADPH/分になることが示される。この基礎速度は、エベルセンにより３倍速くなり、140±４nmolのNADPH/分であった。化合物６は、この基礎酸化と比較して、約２倍の増大を示し、その速度は115±４nmolのNADPH/分であった（図2a）。t-ブチルヒドロペルオキシドによるGSHの基礎酸化は29±１nmolのNADPH/分であり、これは化合物６により２倍増大し、エベルセンにより３倍増大した（データは示さず）。このNADPHの酸化は、ヒドロペルオキシド（図2b）、GSH（図2c）および化合物６もしくはエブセレン（図2d）の濃度を増大させることにより速くなる。GSHおよびペルオキシドの不在下では、反応は見られなかった。このことから、化合物６が有効なミメティックであることが確認される。
【０１０２】
化合物６の抗酸化効果
化合物６の抗酸化効果を調べるために、ミトコンドリアまたはミトコンドリア膜をcis-パリナリン酸と共にインキュベートした。この脂肪酸蛍光団は、脂質二重層に取り込まれると、蛍光を発する。蛍光団の共役二重結合が酸化されると、蛍光は弱まり、これが脂質過酸化の指標となる。
【０１０３】
cis-パリナリン酸酸化を測定するために、ラットの肝臓ミトコンドリア（タンパク質0.5mg/mL）を、３mLフルオロメーターキュベット内で、１μMのエブセレンもしくは化合物６（「ミトエベルセン（mitoエベルセン）」）の存在下または不在下で、100mMのKClおよび10mMのTris-HCl、pH 7.6、10mMのコハク酸、８μg/mLのロテノン、10mMの2,2’-アゾビス(アミジノプロパン)二塩酸塩（AAPH）に37℃で懸濁した。対照のインキュベートは、１μMのTPMPの存在下で行った。酸化反応は、0.5μMのcis-パリナリン酸の添加により開始させ、蛍光を測定した（λ励起＝324nm、λ発光＝413nm）。ミトコンドリア懸濁液にcis-パリナリン酸を取り込んだ対照のインキュベート物は、経時的に、自己消光のために、ゆっくりした蛍光の減衰を示した。cis-パリナリン酸酸化は、ウシの心臓ミトコンドリア膜（タンパク質0.1mg/mL）を用い、50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH 8.0）中で、上記に記載したのと同じ条件を用いて測定した。
【０１０４】
ミトコンドリアもしくはミトコンドリア膜の存在下では、cis-パリナリン酸は蛍光発光し、ゆっくりした自動酸化速度を示す（図３）。この基礎酸化速度は、ラジカル開始剤である脂質過酸化AAPHの存在下では急速に加速される（図3a）。ミトコンドリアでは、１μMの化合物６（「ミトエブセレン（mitoエブセレン）」）は、AAPHによるcis-パリナリン酸の酸化を抑制し、その抗酸化活性を示し、この濃度のエブセレンでは、cis-パリナリン酸を酸化から防止できなかった（図3a）。TPMPを含む対照のインキュベート物は、cis-パリナリン酸の酸化を減速させなかった（図3a）。ミトコンドリア膜を用いた同様の実験から、５μMの化合物６（「ミトエブセレン」）およびエブセレンが、cis-パリナリン酸の酸化を効果的に防止することが示された（図3b）。親油性カチオンであるTPMPは、cis-パリナリン酸の酸化に対して何の影響も及ぼさず、化合物６（‘ミトエブセレン’）およびエブセレンの抗酸化作用が確認された（図3b）。
【０１０５】
化合物６の抗酸化作用を定量するために、ミトコンドリアを、100mMのKClおよび10mMのTris-HCl（pH 7.6）、10mMのコハク酸、８μg/mLのロテノン、50μMのFeCl2中で、ラット肝臓ミトコンドリア（タンパク質２mg /mL）と共に、１μMの化合物６もしくはエブセレンの存在下または不在下で、37℃にて15分間インキュベートした。対照のインキュベート物、１μMのTPMPおよびFeCl2だけの存在下で行った。次に、0.8mLのアリコートを、0.1％のブチル化ヒドロキシトルエン、200μLの１％チオバルビツル酸および200μLの35％ HClO4と混合し、100℃で15分間加熱し、３mLの水で希釈し、３mLのn-ブタノール中に抽出した。TBARS（チオバルビツル酸関連種）は、プレートリーダーで蛍光測定し（λ励起＝515 nm、λ発光＝553 nm）、上記のように処理した1,1,3,3-テトラエトキシプロパンの標準溶液と比較することによりMDAのナノモルで表わし、MDAの蓄積を脂質過酸化の指標として測定した。
【０１０６】
ミトコンドリアを１μMの化合物６（「ミトエブセレン」）と共にインキュベートすると、MDAの蓄積が抑制された（図3c）。１μMのTPMPを含む対照のインキュベート物は、MDAの蓄積を抑制せず、化合物６の抗酸化作用がそのエブセレンセレノール部分によるものであることが確認された（図3c）。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】化合物６のミトコンドリアマトリックスへの取込みを示すための実験における、化合物６（「ミトエベルセン」）の濃度の経時的変化を示す図である。
【図２ａ】矢印で示す時点で添加したグルタチオンレダクターゼおよびさらなる化合物の存在下でのNADPHの酸化により引き起こされる340nMでの吸光度に及ぼす影響を示す図である：過酸化水素（「基礎」）；過酸化水素と化合物６（「ミトエベルセン」）；ならびに過酸化水素とエベルセン（「エベルセン」）。
【図２ｂ】NADPH酸化の速度がH2O2の濃度の増大に伴ってどのように変化するかを示す図である。
【図２ｃ】NADPH酸化の速度がGSHの濃度の増大に伴ってどのように変化するかを示す図である。
【図２ｄ】NADPH酸化の速度が化合物６（「ミトエベルセン」）またはエベルセンの濃度の増大に伴ってどのように変化するかを示す図である。
【図３ａ】AAPH（「AAPH」）の存在下での、ミトコンドリアにおけるcis-パリナリン酸（矢印の時点で添加）の過酸化により起こる蛍光発光に及ぼす影響、ならびに、これがさらなる化合物：TPMP（「TPMP」）、化合物６（「ミトエベルセン」）およびエベルセン（「エベルセン」）の存在下でどのように変化するかを示す図である。
【図３ｂ】ミトコンドリア膜におけるものとした以外は同じ影響を示す図である。
【図３ｃ】化合物６（「ミトエベルセン」）、エベルセンおよびTPMPの存在下での、酸化ストレス下でミトコンドリアにより生じるMDAの量を示す図である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【国際調査報告】
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