(57)【要約】本発明は、２つ以上の軟骨層を含有する組織工学された付着性軟骨構築物を含む培養された層状化軟骨組織に関し、この場合、各軟骨層は、天然軟骨の表面隣接域、天然軟骨の中間移行域、天然軟骨の深層域、または天然軟骨の石灰化軟骨域に存在する軟骨細胞に対応する軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）２つ以上の軟骨層を含有する組織工学された付着性軟骨構築物を含み、それぞれの軟骨層が、
（ｉ）天然軟骨の表面隣接域、
（ｉｉ）天然軟骨の中間移行域、
（ｉｉｉ）天然軟骨の深層域、または
（ｉｖ）天然軟骨の石灰化軟骨域
に存在する軟骨細胞に対応する軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含む、培養された層状化軟骨組織。
【請求項２】
軟骨形成細胞が、軟骨細胞性表現型に対応する天然軟骨域から得られる軟骨細胞である、請求項１に記載の軟骨組織。
【請求項３】
付着性軟骨構築物が、中間移行域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第２の層に隣接する、表面隣接域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第１の層を含有する、請求項１に記載の軟骨組織。
【請求項４】
付着性軟骨構築物が、表面隣接域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第１の層と、中間移行域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第２の層と、深層域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第３の層とを含有し、さらにこの場合、第１の層が第２の層に隣接し、かつ第２の層が第３の層に隣接する、請求項３に記載の軟骨組織。
【請求項５】
付着性軟骨構築物が、深層域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第２の層に隣接する、中間移行域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第１の層を含有する、請求項１に記載の軟骨組織。
【請求項６】
付着性軟骨構築物が固体支持体によって支持されない、請求項１に記載の軟骨組織。
【請求項７】
各層が、軟骨細胞性表現型が関連する軟骨域に存在する軟骨基質に対応する軟骨形成細胞結合基質をさらに含む、請求項１に記載の軟骨組織。
【請求項８】
細胞結合基質が未成熟な軟骨または成熟した軟骨に対応する、請求項７に記載の軟骨組織。
【請求項９】
層の１つが、表層域タンパク質を分泌する表面隣接域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含む、請求項１に記載の軟骨組織。
【請求項１０】
（Ａ）（ｉ）天然軟骨の表面隣接域、
（ｉｉ）天然軟骨の中間移行域、
（ｉｉｉ）天然軟骨の深層域、または
（ｉｖ）天然軟骨の石灰化軟骨域
に対応する軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞の第１の群を、
（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）に対応する軟骨形成性表現型を有する軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群とともに培養して、２つ以上の軟骨層を含有する組織工学された付着性軟骨構築物を製造することを含み、
第１の軟骨層が、培養された軟骨形成細胞の第１の群を含み、培養された軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群のそれぞれが連続した軟骨層を含む、層状化軟骨組織を製造する方法。
【請求項１１】
（Ｂ）軟骨形成細胞の第１の群を培養して、軟骨形成細胞の第１の群を含有する第１の細胞結合基質を産生させること；および
（Ｃ）軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群を培養して、軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群を含有する１つ以上のさらなる細胞結合基質を産生させること
をさらに含み、
軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群のそれぞれが、軟骨形成細胞のその群に対して特異的な細胞結合基質を産生する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１の細胞結合基質が、第１の軟骨細胞性表現型が関連する軟骨域に存在する軟骨基質に対応し、、１つ以上のさらなる細胞結合基質が、軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群の特定の群の軟骨細胞性表現型が関連する軟骨域に存在する軟骨基質に対応する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（Ｂ）および（Ｃ）がアルギン酸塩培地において行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
軟骨形成細胞の第１の群および軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群が半透過性培地上で培養される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
軟骨形成細胞の第１の群および軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群が増殖因子の存在下で培養される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
軟骨形成細胞の第１の群および軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群が、それらの表現型が関連する天然軟骨域から隔てられている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
第１の細胞群が表面隣接域の軟骨細胞に対する表現型を有し、第１のさらなる細胞群が中間移行域の軟骨細胞に対する表現型を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
第１の細胞群が中間移行域の軟骨細胞に対する表現型を有し、第１のさらなる細胞群が深層域の軟骨細胞に対する表現型を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
第１の細胞群が表面隣接域の軟骨細胞に対する表現型を有し、第１のさらなる細胞群が中間移行域の軟骨細胞に対する表現型を有し、そして第２のさらなる細胞群が深層域の軟骨細胞に対する表現型を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
組織工学された付着性軟骨構築物を関節内に手術により移植することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
（Ｄ）１つ以上の試験剤を、（ａ）軟骨形成細胞の第１の群、（ｂ）軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群、（ｃ）細胞結合基質を有する軟骨形成細胞の第１の群、（ｄ）細胞結合基質を有する軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群、および（ｅ）組織工学された付着性軟骨構築物からなる群から選択される１つ以上の細胞または組織と接触させること、および
（Ｅ）１つ以上の試験剤が接触細胞または接触組織に対して有する影響を測定すること
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
（Ｆ）望ましい性質を有する１つ以上の試験剤を特定すること、および
（Ｇ）前記１つ以上の試験剤を治療薬として製造すること
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
試験剤が軟骨組織の知られている調節因子の存在下で細胞または組織と接触させられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１０に記載される方法を行うための説明書を含む、層状化軟骨組織を製造するためのキット。
【請求項２５】
１つ以上の色素、培養培地、培養培地補充物、または使い捨て型実験室器具をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
請求項１０に記載される方法によって製造される組織工学された付着性軟骨構築物。
【請求項２７】
少なくとも第１の軟骨層における軟骨細胞の実質的にすべてが同じ軟骨細胞性表現型を有する、軟骨細胞を含有する少なくとも第１の軟骨層を含有する工学的処理された軟骨組織を含む培養された軟骨組織。
【請求項２８】
軟骨細胞を含有する第２の軟骨層をさらに含み、第２の軟骨層における軟骨細胞の実質的にすべてが同じ軟骨細胞性表現型を有する、請求項２７に記載の培養された軟骨組織。
【請求項２９】
第１の軟骨層における軟骨細胞が、第２の軟骨層における軟骨細胞とは異なる軟骨細胞性表現型を有する、請求項２８に記載の培養された軟骨組織。
【請求項３０】
第１の軟骨層における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型、および第２の軟骨層における軟骨細胞の表現型は、それぞれが独立して、天然の関節軟骨の表面隣接域における軟骨細胞に特徴的な表現型、天然の関節軟骨の中間移行域における軟骨細胞に特徴的な表現型、天然の関節軟骨の深層域における軟骨細胞に特徴的な表現型、または天然の関節軟骨の石灰化軟骨域における軟骨細胞に特徴的な表現型から選択される、請求項２８に記載の培養された軟骨組織。
【請求項３１】
軟骨細胞を取り囲む細胞結合基質をさらに含む、請求項２７に記載の培養された軟骨組織。
【請求項３２】
第１の軟骨層における約７５％より大きい軟骨細胞が同じ軟骨細胞性表現型を有する、請求項２７に記載の培養された軟骨組織。
【請求項３３】
第１の軟骨層における約９０％より大きい軟骨細胞が同じ軟骨細胞性表現型を有する、請求項２７に記載の培養された軟骨組織。
【請求項３４】
第１の軟骨層における約７５％より大きい軟骨細胞が同じ軟骨細胞性表現型を有し、かつ第２の軟骨層における約７５％より大きい軟骨細胞が同じ軟骨細胞性表現型を有する、請求項３０に記載の培養された軟骨組織。
【請求項３５】
第１の軟骨層における約９０％より大きい軟骨細胞が同じ軟骨細胞性表現型を有し、かつ第２の軟骨層における約９０％より大きい軟骨細胞が同じ軟骨細胞性表現型を有する、請求項３０に記載の培養された軟骨組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学された軟骨組織に関する。より詳細には、本発明は、天然の軟骨組織をそれに類似して複製する処理された層状化軟骨組織、ならびにそれを使用するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、いくつかの異なる層または域、すなわち、表層域、中間域、深部域および石灰化軟骨域（これらはそれぞれが、細胞外基質により取り囲まれた軟骨細胞を含有する）に組織化されている複雑な無血管組織である。細胞外基質の組成は域により異なるが、主に、コラーゲン（ＩＩ型、ＩＸ型、ＸＩ型）、プロテオグリカンおよび水を含有する。軟骨細胞は、成体軟骨の５パーセント未満の体積を占めるが、細胞外基質を産生し、かつ維持すること、従って、適正な関節機能を担っている。軟骨基質には血液が供給されないので、軟骨は、損傷を受けた場合、治癒能力が限られており、変性的な病理学的変化を受けることが多い。軟骨の傷害を効果的に処置することは、軟骨傷害の機構および自然な進展ならびに傷害軟骨の治癒および再生の完全な理解が不足しているので、さらに複雑化している。
【０００３】
軟骨の損傷は、合衆国だけで毎年、数百万人に影響を及ぼしているので、この知識不足は大きな人的コストおよび経済的コストの両方を有する。数十万人が、主にスポーツ傷害のために、主要な関節における関節軟骨に対する傷害に苦しんでいる。５千万人のアメリカ人が、変形性関節症、すなわち、関節内の軟骨を襲う痛みのある衰弱性疾患に罹患していることもまた推定されている。
【０００４】
いくつかの試みが、軟骨を回復させるために行われてきている。軟骨を回復させるか、または軟骨の修復を促進させるための努力は、いくつかの理由のためにほどんど成功していない。
【０００５】
関節軟骨を手術により回復する現在の方法は、３つのカテゴリー、すなわち、（１）線維軟骨修復の刺激、（２）骨軟骨の移植、および（３）自己軟骨細胞移植に分けられる。いくつかの手術的技術が、軟骨損傷の領域における線維軟骨の形成を促進させるために開発されている。これらには、軟骨下穿孔、剥離および微小骨折が含まれる。これらの手法の考えは、軟骨下骨への侵入により、骨髄由来の軟骨始原細胞を欠陥部内に遊走させ、軟骨始原細胞に修復を行わせるということである。しかしながら、この手法によって生じる軟骨は線維軟骨であり、これは、機械的性質が比較的不良であり、関節軟骨の複雑な物理的性質および化学的性質を再現していない。
【０００６】
骨軟骨の移植では、関節軟骨が、軟骨下骨の層と一緒に採取され、関節の欠陥部に移植される。宿主への移植片の固定が、移植片の骨が宿主の骨に癒合することにより達成される。この技術の大きな欠点は、ドナー部位の病的状態（自家移植片の場合）および疾患伝播の危険性（同種移植片の場合）である。さらに、組織拒絶が同種移植片に関しては生じることがあり、これにより、手術結果が損なわれる。骨軟骨の同種移植片はまた、一般には、軟骨下骨の中に深く広がるより大きな損傷領域のために使用される。
【０００７】
自己軟骨細胞移植は、単離された軟骨細胞を使用する軟骨修復法の１つである。臨床的には、これは２段階の処置であり、この場合、軟骨の生検物が最初に得られ、次いで、一定期間のエクスビボ処理の後、培養された軟骨細胞が欠陥部に導入される。エクスビボ処理のとき、細胞外基質（ＥＣＭ）が除かれ、軟骨細胞が、細胞分裂を促進する条件のもとで培養される。好適な数の細胞が得られると、細胞が関節の欠陥部に移植される。封じ込めが、周囲の宿主軟骨に接合される骨膜片によってもたらされる。細胞は欠陥部の壁に接着して、ＥＣＭをその場に産生する。この技術による関節軟骨の回復に関する困難は、３つのカテゴリー、すなわち、細胞接着、表現型の変換、およびＥＣＭ産生に分けられる。（ＥＣＭを有しない）個々の細胞を移植することの成功は、欠陥床に接着する細胞に極めて依存している。軟骨ＥＣＭは抗接着性を有することが示されており、この抗接着性は、小さなプロテオグリカンおよび大きなプロテオグリカンによってもたらされると考えられている。インビボ研究により、ウサギでの移植の後では、移植された軟骨細胞の８％のみが欠陥床に留まることが示されている。細胞集団をインビトロで拡大する処理のとき、軟骨細胞は、通常、表現型変換または脱分化を受ける。細胞を注入した後、移植片構築物は負荷を支えることができず、そして数週間から数ヶ月間にわたって荷重負荷から保護されなければならなず、従って、この処置形態からの全体的な回復期間は９ヶ月から１２ヶ月である。
【０００８】
他の試みが、天然の軟骨の代わりに使用するために使用され得るか、または天然の軟骨を修復するために使用され得る人工軟骨を製造するために行われている。現在の軟骨修復方法はそれぞれが、相当の制限を有している。結果として、軟骨組織をインビトロで産生させるためのいくつかの実験室的方法が提案されている。これらは、一般に、培養された細胞（軟骨細胞または多能性幹細胞のいずれか）を生物学的足場または合成的足場の中に接種することを伴う。このタイプの方法の大きな欠点は、（１）軟骨細胞表現型を獲得または維持することが困難であること、（２）移植された軟骨細胞および生来的な軟骨細胞ならびに他の関節組織に対する足場材料の生物学的作用が不明であること、および（３）工学的処理された組織構築物の欠陥床への接着が限られていることである。同様に、これらの方法では、軟骨組織から一般には単離される軟骨細胞の均一な集団が利用されるが、天然軟骨の層状構造または機能が正確には模倣されていない。
【０００９】
従って、天然の関節軟骨を正確に模倣する軟骨組織が引き続き求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、２つ以上の軟骨層を含有する組織工学された付着性軟骨構築物を含む培養された層状化軟骨組織を提供する。各軟骨層は、
（ｉ）天然軟骨の表面隣接域（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ−ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｚｏｎｅ）、
（ｉｉ）天然軟骨の中間移行域（ｍｉｄｄｌｅ−ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｚｏｎｅ）、
（ｉｉｉ）天然軟骨の深層域（ｄｅｅｐ−ｒａｄｉａｌ  ｚｏｎｅ）、または
（ｉｖ）天然軟骨の石灰化軟骨域
に存在する軟骨細胞に対応する軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、軟骨形成細胞は、軟骨細胞性表現型に対応する天然軟骨域から得られる軟骨細胞である。
【００１２】
軟骨構築物のいくつかにおいて、付着性軟骨構築物は、中間移行域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第２の層に隣接する、表面隣接域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第１の層を含む。他の軟骨構築物では、付着性軟骨構築物は、表面隣接域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する少なくとも第１の層と、中間移行域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第２の層と、深層域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第３の層とを含有し、さらにこの場合、第１の層が第２の層に隣接し、かつ第２の層が第３の層に隣接する。さらに他の軟骨構築物では、付着性軟骨構築物は、深層域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第２の層に隣接する、中間移行域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を含有する第１の層を含む。本明細書中に記載される処理された付着性軟骨は固体支持体によって支持される必要はない。上記の工学的処理された軟骨において、各層は、軟骨細胞性表現型が関連する軟骨域に存在する軟骨基質に対応する軟骨形成細胞結合基質をさらに含むことができる。軟骨の細胞結合基質は未成熟な軟骨または成熟した軟骨に対応し得る。いくつかの実施形態において、層の１つは、表層域タンパク質を分泌する表面隣接域における軟骨細胞の軟骨細胞性表現型を有する軟骨形成細胞を有することができる。
【００１３】
本発明はまた、軟骨細胞を含有する少なくとも第１の軟骨層を含有する工学的処理された軟骨組織を提供し、この場合、少なくとも第１の軟骨層における軟骨細胞の実質的にすべてが同じ軟骨細胞性表現型を有する。この工学的処理された軟骨組織はまた、軟骨細胞を含有する１つ以上の連続する軟骨層を含むことができ、この場合、それぞれの個々の連続する軟骨層における軟骨細胞の実質的にすべてが同じ軟骨細胞性表現型を有する。第１の軟骨層における軟骨細胞は、連続する軟骨層における軟骨細胞とは異なる軟骨細胞性表現型を有することができる。
【００１４】
本発明はまた、層状化軟骨組織を製造する方法を提供し、この方法では、第１の軟骨形成性表現型を有する軟骨形成細胞の第１の群を、さらなる軟骨形成性表現型を有する軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群とともに培養して、２つ以上の軟骨層を有する組織工学された付着性軟骨構築物を製造することが伴う。軟骨形成性表現型は、（ｉ）天然軟骨の表面隣接域、（ｉｉ）天然軟骨の中間移行域、（ｉｉｉ）天然軟骨の深層域、または（ｉｖ）天然軟骨の石灰化軟骨域に対応し得る。本発明の方法は、軟骨形成細胞の第１の群を培養して、軟骨形成細胞の第１の群を含有する第１の細胞結合基質を産生させること；および軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群を培養して、軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群を含有する１つ以上のさらなる細胞結合基質を産生させることの１つ以上をさらに含むことができ、この場合、軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群のそれぞれが、軟骨形成細胞のその群に対して特異的な細胞結合基質を産生する。これらの工程は、アルギン酸塩培地などの任意の好適な培地で行うことができる。軟骨形成細胞はまた、半透過性培地上で、または１つ以上の増殖因子の存在下で、またはその両方で培養することができる。いくつかの実施形態において、軟骨形成細胞の第１の群および軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群は、それらの表現型が関連する天然軟骨域から隔てられる。これらの域は、表面隣接域の軟骨細胞、中間移行域の軟骨細胞、深層域の軟骨細胞、または石灰化軟骨域の軟骨細胞を含むことができる。軟骨構築物が製造された後、軟骨構築物は、軟骨の欠陥の修復が行われるところなどの関節内に移植することができる。
【００１５】
本発明の方法ではまた、１つ以上の試験剤を、（ａ）軟骨形成細胞の第１の群、（ｂ）軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群、（ｃ）細胞結合基質を有する軟骨形成細胞の第１の群、（ｄ）細胞結合基質を有する軟骨形成細胞の１つ以上のさらなる群、および（ｅ）組織工学された付着性軟骨構築物からなる群から選択される１つ以上の細胞または組織と接触させることが伴い得る。一般に、これらの方法には、１つ以上の試験剤が接触細胞または接触組織に対して有する影響を測定することが伴う。その後、望ましい性質を有する試験剤を特定することができ、、その試験剤を治療薬として製造することことができる。
【００１６】
本発明はまた、本発明の軟骨組織を製造するためのキット、および本発明を実施するためのキットを提供する。これらのキットは一般に、説明書および１つ以上の試薬を含む。
【００１７】
本発明の様々な目的および利点が下記の詳細な説明からより容易に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の１つの実施形態により、天然軟骨（特に関節軟骨）の物理的に区域化された構造を模倣する２つ以上の層を含有する工学的処理された軟骨組織が提供される。この実施形態において、工学的処理された軟骨は、工学的処理された軟骨の各層が、天然軟骨域に存在する軟骨細胞の対する表現型（すなわち、特徴）、すなわち、表面隣接域の表現型、中間移行域の表現型、深層域の表現型、または石灰化軟骨域の表現型を有する軟骨形成細胞を含む付着性組織片である。好ましくは、各層における軟骨形成細胞の表現型は異なる。他の好ましい実施形態において、組織の外側層の１つは、表層域タンパク質である発達的内皮位置−１（Ｄｅｌ１）タンパク質、および／または関節の潤滑をもたらすことを助ける他のタンパク質を分泌する。
【００１９】
本発明の別の実施形態により、軟骨細胞を含有する少なくとも１つの軟骨層を含有する軟骨組織が提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの軟骨層における軟骨細胞の実質的にすべてが同じ軟骨形成性表現型を有する。本明細書中で使用される表現「軟骨細胞の実質的にすべてが同じ軟骨形成性表現型を有する」または同様の表現は、軟骨層における軟骨細胞が、全層の軟骨に一般には由来する軟骨組織のホモジネート化サンプルを培養することによって得ることができるレベルを超えてただ１つの特定の表現型について富化されていることを意味する。当業者は、任意の層が、天然に存在する軟骨の２つ以上の域から単離された軟骨細胞、または天然に存在する軟骨の２つ以上の域の表現型を有する軟骨細胞を含み得ることを理解する。異なる表現型を有する軟骨細胞の混合物が使用される場合、軟骨層は全体として、好ましくは、天然に存在する軟骨の層の１つに特徴的である優勢な表現型を有する。例えば、表層域軟骨細胞および中間域軟骨細胞の混合物が同じ層に存在する場合、この層は、層に存在する表層域軟骨細胞または中間域軟骨細胞の比率に依存して、中間域よりも表層域の軟骨に類似し得るか、またはその逆であり得る。いくつかの実施形態において、任意の所与層における軟骨細胞の５０パーセント以上が、同じ域の表現型に対する特徴を有する。さらなる実施形態において、任意の所与層における約６０パーセント、６５パーセント、７０パーセント、７５パーセント、８０パーセント、８５パーセント、９０パーセント、９５パーセントまたは９９パーセントより大きい軟骨細胞が、１つの特定の軟骨域に対する軟骨細胞の表現型を有する。従って、任意の所与層における軟骨細胞の約４０パーセント、３５パーセント、３０パーセント、２５パーセント、２０パーセント、１５パーセント、１０パーセント、５パーセントまたは１パーセントは、その軟骨層によって主に表される軟骨域の表現型とは異なる１つ以上の表現型を有し得る。異なる軟骨層はまた、他の層と比較して、同じ表現型を有する軟骨細胞の異なる割合を有し得る。
【００２０】
工学的処理された軟骨組織は、所望するほどの多くの層から、例えば、２層、３層または４層などを含有し得る。好ましくは、軟骨組織は軟骨の天然の区域化構造を複製する。他の好ましい実施形態において、本発明は、表面隣接域を模倣し、かつ大きい引張り強度ならびにＳＺＰ分泌および／またはＤｅｌ１分泌の表現型特徴を有する少なくとも１つの外側層を含む。例えば、２つの工学的処理された軟骨層が存在するとき、１つの層が、中間移行域表現型の軟骨細胞を含有する第２の層に隣接する表面隣接域表現型の軟骨細胞を含有し、１つの層が中間移行域表現型の軟骨細胞を有し、そして隣接する層が深層域表現型の軟骨細胞を有するか、または１つの層が深層域表現型の軟骨細胞を含み、そして隣接する層が石灰化軟骨域表現型の軟骨細胞を含む。３層の工学的処理された軟骨が存在するとき、１つの層は、深層域表現型の軟骨細胞を含有する第３の層に自身が隣接する中間移行域表現型の軟骨細胞を含有する第２の層に隣接する表面隣接域表現型の軟骨細胞を含有することができる。同様に、１つの層は、石灰化軟骨域表現型の軟骨細胞を含む第３の層に隣接する深層域表現型の軟骨細胞を含む第２の層に隣接する中間移行域表現型の軟骨細胞を含むことができる。４層が、工学的処理された組織に存在するとき、第１の層は表面隣接域表現型の軟骨細胞を含有することができ、第２の層は、第１の層と第３の層との間にはさまれた中間移行域表現型の軟骨細胞を含有し、第３の層には、第２の層と、石灰化軟骨域表現型の軟骨細胞を含む隣接する第４の層との間にはさまれた深層域表現型の軟骨細胞が含まれる。
【００２１】
上記の例は、天然軟骨における各域の順序を模倣する工学的処理された組織を例示しているが、本発明の工学的処理された組織はそのように限定されず、異なる軟骨細胞性表現型を含有する軟骨層のすべての可能な組み合わせが考えられる。例えば、表面隣接域表現型の軟骨細胞を含有する層を、深層域表現型の軟骨細胞または石灰化軟骨域表現型の軟骨細胞を含有する層に隣接させることができる。同様に、本発明の工学的処理された組織は、最大数の軟骨層を有することに限定されない。
【００２２】
別の実施形態において、工学的処理された組織層はそれぞれが、その層における軟骨形成細胞の表現型に対して特異的である軟骨形成細胞に関連する基質をさらに含むことができ、その結果、連続する層のそれぞれもまた、その層における軟骨形成細胞に対して特異的なそれ自身の異なる細胞結合基質を有するようになる。
【００２３】
関節軟骨は、骨格が成熟した後、流体で満たされた細胞外基質において比較的少ない数および体積（約２％から５％）の細胞を含有する水和した結合組織である。細胞外基質の分子的構成成分は組織の機能的な生化学的性質を主に担っているようである。硫酸化プロテオグリカンであるアグリカンは、イオン化して、膨潤し、かつ圧縮および硬化に耐える性質を組織に与える高密度の硫酸基成分およびカルボキシル成分を組織にもたらす。様々なアグリカンモノマーは、ポリアニオン性のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合するコアタンパク質、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸からなる。これらのモノマーは、リンクタンパク質とヒアルロナン（ＨＡ）骨格との間での非共有結合的相互作用によって安定化される。これに対して、架橋されたコラーゲン網はプロテオグリカンの膨大化傾向を妨げ、組織の一体性および引張り強度をもたらす。三官能性架橋のヒドロキシリシルピリジノリン（ＨＰ）が、コラーゲンの選択されたリシン残基の翻訳後ヒドロキシル化を含む一連の反応によって形成される。
【００２４】
関節軟骨の組成、構造および機能は、関節表面から軟骨下骨までの深さによりともに変化し、これは、典型的には、表層域、中間域、深部域および石灰化域の一連の域を有するとして記載される。正常な成体の関節軟骨では、水分含有量および細胞性は関節表面からの深さとともに低下し、一方、硫酸化ＧＡＧ含有量は、一般に、深さとともに増大する。ＧＡＧの深さによる変化は、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸およびケラタン硫酸の相対的な割合の変化と関連する。コラーゲン含有量はほぼ一定しているが、表層域の細胞およびコラーゲン原線維はともに関節表面に平行して（すなわち、接線方向に）配向しており、一方、深部域のコラーゲン原線維および細胞は表面に対して垂直（すなわち、半径方向）に配向している。制限（ｃｏｎｆｉｎｅｄ）圧縮弾性率は、関節表面では低く、深さとともに増大し、これに対して、引張り弾性率はおよび強度は関節表面からの深さとともに低下する。深さによって変化する関節軟骨の構造はその生物機械的機能にとって重要である。軟骨の比較的柔らかい表層領域の圧縮により、関節表面間の適合性が改善され、応力の集中が低下し、関節の潤滑が維持される。表層域におけるコラーゲン網の大きい引張り特性および付着特性は、組織の一体性を維持し、かつ摩耗に耐えることを助ける。
【００２５】
一般的には、ホモジネート化された関節軟骨組織は、最少量のＩ型コラーゲンとともに、アグリカン、コラーゲン（ＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型）およびヒアルロナンから主に構成されるが、これらの成分の割合は、調べられた軟骨域に依存して変化する。また、関節軟骨の厚さは関節毎に変化し、一般には２ｍｍから４ｍｍの範囲にある。本発明の工学的処理された軟骨はこれらの物理的変化および組成的変化を忠実にたどることができる。
【００２６】
好ましくは、本発明の工学的処理された軟骨はまた、下記のように天然の関節軟骨の物理的構造の１つ以上の特徴に類似する。天然の関節軟骨では、表面隣接域は、最大の細胞域であるが、軟骨の厚さの約１０パーセントから２０パーセントである。表現型的には、この域における軟骨細胞は、その長軸が関節表面に平行している長円形である。表面隣接域における軟骨細胞はまた、関節を潤滑することを助けるＳＺＰ、およびＤｅｌ１を分泌する。この域における細胞結合基質は、関節表面に平行して組織化された微細な密に詰まったコラーゲン原線維から主に構成され、それ以外の域と比較して、プロテオグリカンの濃度が最も低く、コラーゲンの濃度が最も大きい。より深い軟骨域は表層域の軟骨よりも約２５倍の堅さを有し得るように、表層域はまた、最も柔らかい域である傾向を有する。さらに詳しくは、表面隣接域は２つの亜域を含有する。それら２つの亜域は多糖をほとんど有さず、そして何らかの細胞が存在したとしても、細胞をほとんど伴うことなく、小さい原線維のシートから主に構成される透明な薄膜である原線維状シート／板層（ｌａｍｉｎａ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）のより表面に近い層、および平坦化した軟骨細胞を伴う第２の細胞層である。表面隣接域は、変形性関節症の影響を示す最初のところである。中間移行域は、典型的には、軟骨の厚さの約４０パーセントから６０パーセントを占める。中間移行域におけるコラーゲン原繊維は、一般には、より大きな直径を有し、ランダムな配置を有する。表現型的には、中間移行域の軟骨細胞は形状が球状である。この域はまた、域の中で最も大きいプロテオグリカン濃度を有する。この域におけるコラーゲン濃度は表面隣接域よりも少ない。軟骨の厚さの約３０パーセントを占める深層域では、プロテオグリカン濃度およびコラーゲン濃度はともに、中間域と比較して濃度が減少している。深部域における軟骨細胞は、軟骨下板に対して垂直である半径方向に配向したコラーゲン繊維束とともに整列させられる柱状体を形成しやすい。これらの大きい繊維束は、境目、すなわち、非石灰化（すなわち、ガラス状）軟骨と石灰化軟骨との境界を越えて入り込み、軟骨を骨にしっかり固定する。石灰化軟骨域には、低密度の比較的小さい細胞が含有される。当業者は、各軟骨域の前記の例示が限定的でないこと、しかし、軟骨の構造をよりよく理解するための概念的な手段として単に存在するだけであることを理解する。軟骨の生化学的性質、組織学的性質、代謝的性質、生物機械的性質および構造的性質はさらに、Ａｙｄｅｌｏｔｔｅら、Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、１８：２２３〜３４（１９８８）；Ａｙｄｅｌｏｔｔｅら、Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、１８：２０５〜２２（１９８８）；Ａｙｄｅｌｏｔｔｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｔｈｅｒ．、３：３〜８（１９９６）；Ｆｌａｎｎｅｒｙら、Ｆｌａｎｎｅｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２５４：５３５〜４１（１９９９）；Ｈａｕｓｅｌｍａｎｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．、３９：４７８〜８８（１９９６）；Ｐｆｉｓｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２８６：２６８〜７３（２００１）；���ｅｉｄら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、１８：３６４〜７３（２０００）；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３１１：１４４〜５２（１９９４）；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、１７：１１０〜２０（１９９９）において議論されている。
【００２７】
このように、関節軟骨の構造および組成の１つ以上の特徴を物理的および生物学的に模倣し、関節表面からのその深さに従って変化する関節軟骨組織が提供される。本発明の工学的処理された軟骨は、別個ではあるが、連続した層を提供し、これらは、天然に存在する関節軟骨に見出される各域に類似しており、天然軟骨の特徴をより容易に複製することができる。例えば、工学的処理された軟骨は、組織の外側表面から、組織の中央領域における最大量にまで増大し、組織の深部層に向かって減少するプロテオグリカン濃度を有することができる。同様に、最も外側の層は、軟骨組織における主要な潤滑剤であるＤｅｌ１および／または表層域タンパク質（ＳＺＰ）を分泌する滑液細胞および／または表面隣接軟骨細胞などの細胞を含有することができ、従って、生来的な軟骨の機能を模倣することができる。
【００２８】
本発明はまた、工学的処理された層状化軟骨組織を製造するための方法を提供する。本発明の工学的処理された軟骨組織を製造するための１つの方法が図１に示される。この方法によれば、軟骨１０（これは、一般には、骨１２に結合している）が得られ、表面隣接部分１４、中間移行部分１６、深層部分１８または石灰化軟骨部分２０の２つ以上に物理的に分割される。軟骨形成細胞（２２、２４または２６）がそれらのそれぞれの軟骨域から得られる。例示目的のみのために、細胞２２が表面隣接部分１４から得られ、細胞２４が中間移行部分１６から得られ、細胞２６が深層部分１８から得られる。軟骨形成細胞の数は、拡大培養された軟骨形成細胞（２８、３０および３２）を得るために、場合により増大させることができる。拡大培養された軟骨形成細胞（２８、３０および３２）は、その後、場合により、培養されている軟骨形成細胞（３４、３６および３８）に対して特異的な細胞結合基質を有する軟骨形成細胞を得るために、培地において、または培地上で増殖させられる。理解され得るように、これらの工程は、異なる軟骨域に由来する細胞を混合することなく、細胞（２２、２４および２６）に対して行われる。それらの細胞結合基質を有する細胞が得られた後、細胞およびそれらの細胞結合基質（３４、３６および３８）は、一体にされた層状化軟骨組織４０を形成させるために一緒に培養される。あるいは、軟骨形成細胞（２２、２４、２６、２８、３０または３２）の１つ以上を、層状化軟骨組織４０を得るために、細胞外基質の非存在下で培養することができる。特に、層状化軟骨の表層域４２を構成する細胞を細胞外基質の産生を伴うことなく単層物として培養し、上記されるようにそれ以外の細胞層で積層化することができる。
【００２９】
個々の軟骨層を培養するための好ましい方法は、Ｍａｓｕｄａらに対して発行された米国特許第６，１９７，０６１号（発明の名称：「移植可能な軟骨組織のインビトロ製造、それにより製造される付着性軟骨、および軟骨損傷の外科的修復方法」）に記載される方法と同様に行うことができる。一般的には、軟骨形成細胞が、所望する軟骨域から単離され、軟骨形成細胞結合基質を有する軟骨形成細胞を得るために培養される。軟骨細胞およびそれらの細胞結合基質が、その後、工学的処理された軟骨組織を得るために、半透過性メンブラン上で、好ましくは、１つ以上の増殖因子の存在下で培養される。他の好適な方法および技術を、細胞表現型を特定の域に対して最適化するために、本発明の方法において使用することができる。
【００３０】
軟骨細胞／軟骨形成細胞の単離
本発明の方法において有用な軟骨形成細胞は、所望する表現型を有する軟骨形成細胞を含有する本質的には任意の組織から単離することができる。本明細書中で使用される用語「軟骨形成細胞」は、適切な刺激にさらされたとき、軟骨組織の特徴的な成分を産生し、分泌することができる細胞に分化し得る任意の細胞を意味することが理解される。軟骨形成細胞は、既に存在する軟骨組織から、例えば、硝子軟骨、弾性軟骨または線維軟骨から直接的に単離することができる。具体的には、軟骨形成細胞を、（荷重負荷関節または荷重非負荷関節のいずれかに由来する）関節軟骨、肋軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、気管軟骨、咽頭蓋軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨および輪状軟骨から単離することができる。好ましくは、軟骨形成細胞は、表面隣接部分、中間移行部分、深層部分および石灰化軟骨部分に分けられた関節軟骨から得られる。これらの部分は、全層の関節軟骨を最初に得て、次いで、切断デバイスを使用することなどにより組織を適切な部分に物理的に分けることによって行うことができる。
【００３１】
あるいは、軟骨形成細胞は骨髄から単離することができる。例えば、米国特許第５，１９７，９８５号および同第４，６４２，１２０号、ならびにＷａｋｉｔａｎｉら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．、７６：５７９〜５９１（１９９４）を参照のこと。軟骨形成細胞はまた、幹細胞、滑膜、関節半月板、腱、靱帯、または任意の他の好適な供給源に由来し得る。
【００３２】
好適な軟骨細胞は、ヒト、オランウータン、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ブタなど（これらに限定されない）を含む任意の好適な哺乳動物供給源生物から単離することができる。軟骨細胞は、正常な軟骨を有する供給源、または遺伝的欠陥を有するなどの、何らかの様式で不完全であることが知られている軟骨を有する供給源のいずれかから単離することができる。
【００３３】
本発明のインビトロ細胞培養デバイスを製造するために使用される軟骨細胞は、任意の好適な方法によって単離することができる。軟骨細胞を単離するための様々な出発材料および方法が知られている（一般的には、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１３７頁〜１６８頁、１９８７年）；Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ、「軟骨細胞の大規模調製」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、５８：５６０〜５６４（１９７９）を参照のこと）。
【００３４】
出発材料が、軟骨細胞が本質的には存在する唯一の細胞タイプである組織（例えば、関節軟骨）である場合、細胞を、従来のコラゲナーゼ消化および組織培養の方法によって直接的に得ることができる。あるいは、細胞を、出発材料に存在する他の細胞タイプから単離することができる。軟骨細胞を単離するための１つの知られている方法では、プラスチック製の組織培養容器に対して示差的に接着させることが含まれる。別の方法では、軟骨細胞の細胞表面マーカーに結合する抗体を組織培養プレートにコーティングすることができ、その後、その抗体を、不均一な細胞集団に由来する軟骨細胞と選択的に結合させるために使用することができる。さらに別の方法では、軟骨細胞に特異的な抗体を使用する蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が、軟骨細胞を単離するために使用される。さらに別の方法では、軟骨細胞が、ＦｉｃｏｌｌまたはＰｅｒｃｏｌｌなどの密度勾配による遠心分離によって、その浮遊密度に基づいて単離される。
【００３５】
分化した軟骨細胞ではなく、軟骨細胞幹細胞を利用することが、いくつかの状況では望ましい場合がある。分化させるための幹細胞、または分化転換のために好適な分化した細胞を単離することができる組織の例には、胎盤、臍帯、骨髄、皮膚、筋肉、骨膜、軟骨膜または脂肪組織が含まれる。細胞は、従来の方法を使用して、外植片培養および／または周囲基質の酵素消化によってこれらの組織から単離することができる。
【００３６】
軟骨細胞の細胞結合基質を産生させるための培地における培養
単離された軟骨細胞／軟骨形成細胞は、アガロースなどの可逆的ゲルまたはアルギン酸ナトリウムの溶液を含む適切な培地に、好ましくは少なくとも約１０４細胞／ｍｌの密度で懸濁される。細胞結合基質を産生させるために軟骨細胞を培養する好ましい方法が、Ｈａｕｓｅｌｍａｎｎら、「アルギン酸塩で培養された成人軟骨細胞は生来的なヒト関節軟骨に類似する基質を形成する」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７１（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４０）：Ｃ７４２〜Ｃ７５２（１９９６）に開示される。細胞は、軟骨形成性表現型に対して特異的であり、かつインビボで見出される細胞結合基質と類似する細胞結合基質の軟骨細胞膜上での産生を行わせるその表現型形態を維持するために効果的な条件のもとで培養される。好ましくは、軟骨細胞は、細胞結合基質の形成を行わせるために少なくとも約５日間にわたってアルギン酸塩において培養される。軟骨細胞が培養される培地は、細胞結合基質の産生を高めるために、ウシ胎児血清などの刺激因子を含有することができる。
【００３７】
１つの実施形態において、軟骨細胞は、増殖培地において、例えば、２０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、約２５μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩、および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）などの抗生物質を含有する、ダルベッコ改変イーグル培地およびハムＦ１２培地の等量混合物などにおいて培養される。代わりの方法では、軟骨細胞は、培地の連続したポンプ送液を可能にする密閉チャンバーで培養される。好ましくは、培地は、内因性のインスリン様増殖因子−１を少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で含有するウシ胎児血清を含有する。この使用法では、ウシ胎児血清もまた、増殖因子と見なすことができる。細胞結合基質の形成を最大限に刺激するために培地に外部から添加することができる好適な増殖因子には、骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）、骨形態形成タンパク質−２および他の骨形態形成タンパク質、トランスフォーミング増殖因子β、ならびにインスリン様増殖因子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の代わりの局面において、軟骨細胞に対する培養培地は、外部から添加された特異的な増殖因子をさらに含むことができる。特異的な増殖因子の添加は、基質形成の効果的な刺激因子として作用し得る。増殖因子の例には、骨形成タンパク質−１、骨形態形成タンパク質−２、他の骨形態形成タンパク質、トランスフォーミング増殖因子β、およびインスリン様増殖因子、ならびにウシ胎児血清にもう存在しない増殖因子が含まれる。本発明のこの局面では、増殖因子は、好ましくは、細胞結合基質の形成をほぼ最大に刺激するための量で培地に添加される。
【００３９】
好ましくは、増殖培地における軟骨細胞または軟骨形成細胞の増幅は、増幅が単層培養で行われるときに生じるような、軟骨細胞表現型の喪失を誘導しない。一般に、軟骨細胞表現型は、（ｉ）適切な形状を有し、、所望する軟骨域に対応する著量の（ｉｉ）アグリカンおよび（ｉｉｉ）ＩＩ型コラーゲンを基質内に合成し、分泌し、かつ／または蓄積する能力を有する細胞で、（ｉｖ）適量のＩ型コラーゲンを基質内に蓄積することを伴わない細胞を示す。アルギン酸塩において培養された軟骨細胞は、（軟骨細胞の典型的な）その表現型形状を保持し、多量の基質を維持する。基質は、組織学的には硝子軟骨に類似し、アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンが多い。
【００４０】
表現型が安定している軟骨細胞はまた、主要な高分子を軟骨様基質内に効果的に取り込む能力を保持しなければならない。正常な軟骨細胞は、翻訳されないＩ型コラーゲンに対するｍＲＮＡを少量発現し得る。さらに、アルギン酸塩において数ヶ月間培養された関節軟骨細胞は少量のＩ型コラーゲン分子を合成し得るが、後者は形成中の基質に決して取り込まれない。その結果、少量の新しく合成されたＩ型コラーゲン分子が培地に出現することは、必ずしも脱分化の開始を意味しない。さらに、ヒアルロナンは、多くの他の細胞タイプによって多量に合成されるので、軟骨細胞性表現型のマーカーでない。しかし、ヒアルロナンは軟骨基質の重要な成分である。表層の軟骨細胞は、表現型的には表層域タンパク質（ＳＺＰ）を分泌し、高度に特殊化され、中間域または深部域の軟骨細胞とは著しく異なる。
【００４１】
表現型が安定している細胞は、好ましくは、アグリカンを（質量基準で）コラーゲンよりも少なくとも約１０倍多く合成する。さらに、基質におけるアグリカン対ヒアルロナンの比率は、好ましくは、約１０を越えたままである。当業者は、表現型安定性が、培養された軟骨細胞のタイプ（例えば、表層域、中間域または深部域）に依存して異なり、従って、コラーゲン、アグリカン、ヒアルロナンの量が、軟骨細胞のタイプに依存して変化することを認識する。
【００４２】
細胞結合基質を有する軟骨細胞
アルギン酸塩における軟骨細胞の培養は、下記の２つの区画に編成されるＥＣＭの産生をもたらす：（ｉ）生来的な組織の細胞周囲基質および軟骨小腔周囲基質に代謝的に類似する細胞結合基質区画、および（ｉｉ）生来的な組織の軟骨小腔間基質に代謝的に類似するさらなる隔たった基質区画。
【００４３】
層状化軟骨を製造するために細胞結合基質を有する軟骨細胞を使用することは要求されないが、各軟骨細胞の周りにおける高度に構造化された細胞結合基質の形成が、いくつかの利用のために所望される。第１に、細胞結合基質は、アンコリンＣＩＩ（これはコラーゲンに結合する）およびＣＤ４４（これはプロテオグリカン凝集体内のヒアルロナンに結合する）などの受容体を介して細胞に固定される。この基質が再び確立されると、細胞は、脱分化する可能性がはるかに少なくなる。第２に、軟骨細胞は、プロテオグリカンアグリカンを代謝し、従って、この基質を比較的迅速に再構成する。また、細胞結合基質は、（ｉ）膜に結合した弾性ＰＧ、および（ｉｉ）円形の架橋コラーゲン原繊維が多い。結果として、軟骨細胞は、それ自身の保護外皮、すなわち、変形から細胞を保護する外皮を有する。軟骨細胞はまた、一般に、さらなる隔たった基質を再構成することにおいてあまり効果的でない。
【００４４】
好ましくは、アルギン酸塩での培養時に産生されたＥＣＭの細胞結合基質区画は、ＥＣＭを産生する軟骨形成性表現型のために適するように、アグリカン（主要な軟骨プロテオグリカン）、コラーゲン（ＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型）、およびヒアルロナンを含む。アグリカン分子は、ヒアルロナン分子を介して軟骨細胞の細胞膜における受容体（ＣＤ４４を含む）に結合した凝集体において主に形成される。
【００４５】
細胞結合基質における各成分の相対的な割合は、培養時間の長さに依存して変化する。好ましくは、ホモジネート化された細胞結合基質は、この場合にはすべての軟骨層がまとめてアッセイされるが、少なくとも約５ｍｇ／ｃｃ３のアグリカンを有し、アグリカン対ヒアルロナンの比率（ｍｇ／ｍｇ）が１０：１から２００：１の間であり、アグリカン対コラーゲンの比率（ｍｇ／ｍｇ）が１：１から約１０：１である。さらに、（各細胞の周りの）細胞結合基質および（細胞間の）さらなる隔たった基質の分子的組成を、培養条件の特異的な改変によって変化させることができる。これらの改変には、培養システムの物理的な配置、および様々な増殖因子の添加が伴う。基質産生および編成を操作することは、軟骨傷害を手術により処置するために関節軟骨をインビトロで処理することにとって重要である。
【００４６】
好ましくは、コラーゲンの含有量およびコラーゲンのピリジノリン架橋の含有量は培養時間とともに増大する。架橋は、特に、２週間の培養の後に濃度の劇的な増大を示す。培養期間の長さを比較的短く保つことによって、細胞結合基質におけるコラーゲン原繊維は過度に架橋されない。良好な機能的性質を有するが、架橋が比較的不十分である組織は、操作がより容易である。より成熟した軟骨がシミュレートされようとしているときには、より大きな量の架橋を有する組織が所望され得る。
【００４７】
その細胞結合基質を有する軟骨細胞の回収
好ましくは、その細胞結合基質を有する軟骨細胞の回収は、十分な培養期間の後、アルギン酸塩ゲルを可溶化することによって達成される。アルギン酸塩ゲルは、知られている技術を使用して最初に可溶化される。得られる細胞懸濁物が、その後、遠心分離され、これにより、その細胞結合基質を有する軟骨細胞が、上清中のさらなる隔たった基質の成分からペレットで分離される。
【００４８】
好ましくは、上記の工程は軟骨形成性表現型のそれぞれについて平行して行われ、その後、各層が、付着性軟骨組織を形成させるために一緒に培養される。
【００４９】
その細胞結合基質を有する軟骨細胞の半透過性メンブラン上での培養
本発明のこの局面において、その細胞結合基質を有する軟骨細胞は、上記されるように単離された場合、半透過性メンブラン上での層で培養される。あるいは、細胞結合基質を有しない細胞層の１つ以上を、付着性軟骨組織を製造するために培養に加えることができる。好ましくは、細胞培養挿入物はプラスチック製支持体フレームの中に置かれ、培養培地が細胞培養挿入物の周りを流れる。この局面において、細胞培養挿入物は半透過性メンブランを含む。半透過性メンブランにより、培地を、軟骨細胞およびその細胞結合基質を完全に浸すために効果的な量で細胞培養挿入物の中に流すことができる。１つの実施形態において、半透過性メンブランは化学的または酵素的または生物学的に分解可能である。別の実施形態において、付着性の層状化軟骨組織は、さらなる使用のために半透過性体から取り除かれる。
【００５０】
好ましくは、半透過性メンブランは、細胞の近傍からの老廃物の拡散を可能にしながら、軟骨細胞が栄養分に対して連続的に接触することを可能にする。この局面において、メンブランは、細孔を通る軟骨細胞の遊走、そしてメンブランに対するその後の固着を妨げるために効果的な細孔サイズを有しなければならず、好ましくは約５ミクロンを越えてはならない。さらに、利用されるメンブランは、らせん状になることなくその培養フレームから取り除かれ得るような十分な強度で、かつメンブラン上の組織を操作し、その所望するサイズに切断することができるような十分な強度をメンブランにもたらすために効果的な細孔密度を有しなければならない。好ましくは、メンブランは少なくとも約８ｘ１０５細孔／ｃｍ２の細孔密度を有しなければならない。メンブランは、培養における使用のための好適な任意の材料から作製することができる。好適なメンブランシステムの例には、（ｉ）Ｆａｌｃｏｎ細胞培養挿入物ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）メンブラン［０．４ミクロンから３ミクロンの細孔サイズ、１２ｍｍから２５ｍｍの直径］；（ｉｉ）Ｃｏｓｔａｅｒトランスウエルプレート［ポリカーボネートメンブラン、０．１ミクロンから５．０ミクロンの細孔サイズ、１２ｍｍから２４．５ｍｍの直径］；（ｉｉｉ）Ｎｕｎｃ組織培養挿入物（ポリカーボネートメンブラン挿入物、０．４ミクロンから３．０ミクロンの細孔サイズ、１０ｍｍから２５ｍｍの直径）；Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ培養プレート挿入物（ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）メンブラン、ポリカーボネート、０．４ミクロンから３．０ミクロンの細孔サイズ、２７ｍｍの直径）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明の別の局面において、その再確立された細胞結合基質を有する細胞は、層状化された付着性軟骨基質の形成を可能にするために効果的な時間にわたって半透過性メンブラン上の培地においてさらに培養される。培養時間は、一般には、標準的な培養条件のもとで少なくとも約３日である。移植に先立つ、基質成熟化の部分的な阻害は、成熟した軟骨と同じほどの堅さでないが、取扱い時にその形状および構造を保持するための十分な引張り強度を有する基質をもたらすことにおいて重要であり得る。１つの実施形態において、そのような組織は、手術による修復時に欠陥軟骨の欠陥の中に圧入されるために十分な適応性を有しなければならない。
【００５２】
付着性軟骨組織を製造する際には、軟骨細胞は、細胞結合基質を伴って、または細胞結合基質を伴うことなく、種々の物理的または生化学的な条件のもとに置くことができる。いくつかの実施形態において、軟骨性組織は、自由に膨大する条件のもとで培養することができる。他の実施形態において、軟骨は、流体流のもとで、圧縮（静的または動的）条件のもとで、剪断条件のもとで、またはそれらの組合せのもとで培養することができる。あるいは、軟骨組織は、成長が軸（厚さ）方向にだけ生じるように半径方向が制限された形態で培養することができる。軟骨基質の機械的性質もまた、軟骨組織がメンブラン上で培養される時間の量を増大または減少することによって制御することができる。培養時間を長くすると、増大した架橋密度がもたらされる。層のそれぞれにおける軟骨細胞の密度は、複製されている軟骨域の細胞性を反映させるために所望するように変化させることができる。
【００５３】
軟骨基質
好ましくは、全体として、半透過性メンブラン上で形成される軟骨構築物は、アグリカンの濃度が少なくとも約５ｍｇ／ｃｃ３であり、軟骨基質は、新しく合成された分子のすべてがプロテオグリカン凝集物に取り込まれることを可能にするために効果的な量のヒアルロナンを含有する。メンブラン上で形成された組織の基質は、凝集したアグリカン分子を５ｍｇ／ｃｃ３以上の濃度で含有し、アグリカン対ヒアルロナンの比率が約１０：１から約２００：１であり、アグリカン対コラーゲンの比率が約１：１から約１０：１である。本発明の方法において使用される工学的処理された軟骨は、その物理化学的性質が、短い期間で、典型的には約１４日後に、天然に存在する関節軟骨によく類似する。工学的処理された軟骨を半透過性メンブランから取り除くこともまた好ましい。
【００５４】
一般に、工学的処理された軟骨組織は、メンブランに合致するディスク様構造を有する。しかし、軟骨構築物がディスク様構造を有するということは要求されない。本発明のこの局面において、軟骨構築物の形状は、整形外科医が組織（ディスクまたはシートのいずれか）を取扱い、欠陥部内への圧入のために必要とされるサイズに組織を切断することを可能にするために効果的でなければならない。軟骨構築物のサイズは、一般には、欠陥部のサイズよりもわずかに大きい。本発明の工学的処理された層状化軟骨組織は、その後、所望されるように、軟骨の欠陥部内に手術により移植することができる。
【００５５】
本発明の別の実施形態により、工学的処理された軟骨組織に対する種々の試験剤の作用を試験する方法が提供される。本発明の方法では、工学的処理された軟骨組織は１つ以上の化合物（試験剤）にさらされて、（存在する場合には）どのような作用を、これらの化合物が、軟骨組織の増殖、恒常性的平衡および／または分解に対して有するかが明らかにされる。本発明の培養システムおよび方法はまた、基質恒常性がバランスしている同化プロセスおよび異化プロセスを研究するために有用である。１つの方法において、工学的処理された軟骨組織は、関節軟骨の物理的性質ならびに化学的成分および生物学的成分を効果的に模倣するように培養される。その後、工学的処理された軟骨組織は、工学的処理された軟骨の物理的および化学的な構成に対する試験剤の、単独または他の薬剤との組み合わせでの作用を明らかにするために培養システムで使用される。本明細書中で使用される用語「試験剤」は、試験剤が投与される軟骨発達の段階において軟骨組織に対する既知の調節作用を何ら有しない化学的化合物として定義される。従って、当業者は、用語「試験剤」が、試験される化合物、および化合物が投与される軟骨の発達段階を少なくとも含む多数の要因に依存することを理解する。そのため、同じ化合物が、細胞結合基質を産生させるために軟骨形成細胞を培養することなどの、軟骨発達の１つの段階については試験剤であり得るが、軟骨発達の別の段階については試験剤でないことがある。これは、この化合物が軟骨発達のその段階に対する既知の作用を有しているからである。
【００５６】
培養システムにおいて、工学的処理された軟骨は試験剤と接触させられる。試験剤は、軟骨組織に対して直接的に作用する既知の調節因子の存在下または非存在下で培養システムに加えることができ、この場合、そのような調節因子には、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびセリンプロテアーゼ、またはこれらの直接的に作用する化合物を誘導もしくは阻害する調節因子、例えば、メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＲＡＰ）、およびサイトカイン類、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）またはインターロイキン−１（ＩＬ−１）などが含まれる。同様に、試験剤は、工学的処理された軟骨に対して薬剤の組み合わせが有する作用を明らかにするために１つ以上のさらなる試験剤の存在下で培養システムに加えることができる。好ましい実施形態において、試験剤は、ＩＬ−１および増殖因子などの、軟骨組織の既知の調節因子ではない。従って、試験剤は、（ｉ）軟骨組織に対して直接的に作用する化合物、（ｉｉ）軟骨組織に対して直接的に作用する化合物に対して作用する化合物、または（ｉｉｉ）軟骨組織に対して直接的に作用する化合物の調節因子に対して作用する化合物であり得る。
【００５７】
同様に、試験剤は、上記で議論されている、工学的処理された軟骨の生活環の様々な段階の１つ以上の段階で培養システムに加えることができる。例えば、試験剤は、（ｉ）細胞結合基質を産生させるために増殖培地において軟骨形成細胞を培養すること；（ｉｉ）軟骨細胞および細胞結合基質を回収すること；（ｉｉｉ）層状化された付着性の工学的処理された軟骨組織を製造するために軟骨細胞および細胞結合基質を培養すること；または（ｉｖ）層状化された付着性の工学的処理された軟骨組織を得ることに先立って、またはその途中で、またはその後で、単離された細胞と接触させることができる。このようにして、試験剤は、下記のいずれかまたはすべてにおける活性について調べることができる：（ｉ）軟骨形成細胞の生存性を維持すること；（ｉｉ）軟骨形成細胞の表現型を維持すること；（ｉｉｉ）細胞結合基質の成長の調節；（ｉｖ）軟骨基質の産生および成長の調節；（ｖ）軟骨恒常性の調節；または（ｖｉ）軟骨分解の調節。
【００５８】
好ましくは、コントロール実験が比較のために行われ、その結果、試験剤の作用をより容易に評価することができるようになる。典型的には、コントロール実験では、試験剤、試験剤の組み合わせからの１つ以上、軟骨組織に対して直接的に作用する化合物の１つ以上、または軟骨に対して直接的に作用する化合物の調節因子の１つ以上が除かれる。
【００５９】
この実施形態は、化合物の試験が比較的短い時間で完了し得るので、ハイスループットスクリーニング方法に役立つ。同様に、多量の処理された軟骨組織を迅速に得ることができ、そして少量のサンプルをマルチウエルプレートにおけるサンプルリングのためにそれらから取り出すことができ、従って、すばやいスクリーニング方法の容易な自動化がもたらされ得る。いくつかの組織サンプルを、工学的処理された組織の同じ組織片から得ることができるので、本発明の方法に従って得られるデータのアッセイ内およびアッセイ間の変動は非常に低い。重要なことに、工学的処理された軟骨は培養することができ、そしてマルチウエルプレートの同じウエルで試験することができ、従って、組織の操作または補正をほとんど必要としないので、本発明の方法は経済的に達成することができる。本発明の方法の別の重要な利点が、試験が、典型的には放射性同位体での標識化の使用により達成される本質的でない放射能の付加を伴うことなく完了し得るという事実からもたらされる。
【００６０】
非放射能技術が、試験剤による処理または軟骨組織の調節因子による処理の後、工学的処理された軟骨成分を定量するために使用されるとき、工学的処理された軟骨基質を酵素で消化することが好ましい。軟骨基質の酵素消化は、パパイン、キモパパイン、プロナーゼおよびプロテイナーゼＫなどの１つ以上のプロテアーゼを使用して達成することができる。酵素消化後、軟骨のプロテオグリカン含有量およびＤＮＡ含有量を、この分野におけるいくつかの広く知られている技術を使用して、例えば、ＤＭＭＢ法およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素法をそれぞれ使用して測定することができる。
【００６１】
本発明の培養システムはまた、物理的損傷および疾患状態（慢性関節リウマチなど）を含む、軟骨組織における種々の病理学的状態を模倣するために使用することができる。この実施形態により、軟骨は培養され、その後、例えば、工学的処理された軟骨組織を物理的に切断または引き裂くことなどにより人為的に傷つけられるか、あるいは疾患状態の進行を生じさせることが知られている因子で、例えば、炎症性因子および軟骨基質分解化合物などで処理されるかのいずれかである。病理学的状態を模倣する処理された軟骨は、その後、試験剤が病理学的状態に対して有する作用を明らかにするために、上記されるような１つ以上の試験剤で処理することができる。この実施形態では、他の実施形態の場合のように、遺伝的欠陥などのある種の欠陥を有することが知られている軟骨形成細胞、または所与の欠陥を生じさせるために遺伝子改変されている軟骨形成細胞を単離することが望ましい場合がある。
【００６２】
試験剤が、軟骨の産生をアップレギュレーションする、または軟骨分解を阻害する、または軟骨分解を増強するなどの所望する性質を有するとして特定された後、試験剤は、治療薬を製造するために、特定され、その後、単離または化学合成のいずれかが行われ得る。従って、本発明の方法は、軟骨組織のインビトロおよびインビボでの治療的処置のために有用な薬物製造物を作製するために使用することができる。
【００６３】
本発明はまた、本明細書中に記載される方法を実施するためのキットを提供する。１つの実施形態において、キットは、本明細書中に記載される方法のいずれかを実施するための説明書を含有する。説明書は、紙に印刷されたものまたはコンピューター読み取り可能な媒体などの有形媒体による任意の理解可能な形態で提供され得る。本発明のキットはまた、本発明の方法の実施を容易にするために、１つ以上の試薬、緩衝液、培養培地、培養培地補充物、処理された軟骨を分解することができる酵素、軟骨組織の特定成分を染色もしくは標識するための発色色素もしくは蛍光色素、軟骨組織の特定成分を標識するための放射性同位体、および／または使い捨て型の実験室器具、例えば、マルチウエルプレートなどを含むことができる。好ましいキット成分の例を上記の記載および下記の実施例に見出すことができる。
【００６４】
本発明の方法または組成物は、上記で議論された工程または条件のいずれかまたはすべてを、様々な組み合わせで、所望するように伴うことができる。従って、開示された方法のいくつかでは、いくつかの工程が削除され得るか、またはさらなる工程が、方法の実行可能性に影響を及ぼすことなく行われ得ることが当業者には容易に明かである。
【００６５】
本発明は下記の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【００６６】
実験プロトコル：表層域（０μｍから２００μｍ）および中間域（４００μｍから１６００μｍ）から得られる関節軟骨薄片を子ウシ膝（１週齢から３週齢、６頭）の大腿膝蓋溝から採取した。表層域および中間域の軟骨細胞亜集団を、０．２％プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で１時間、そして０．０２５％コラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で１２時間、連続して消化することによって単離した。Ｍｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、３３０２１〜７（１９９４）。軟骨細胞を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌにおける１．２％アルギン酸塩（Ｋｅｌｔｏｎｅ  ＬＶ、Ｋｅｌｃｏ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）に４ｘ１０６細胞／ｍｌで懸濁して、２２ゲージのニードルから１０２ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液の中に押し出し、アルギン酸塩を小さいビーズとして重合させた。Ｈａｕｓｅｌｍａｎｎら、Ｍａｔｒｉｘ、１２、１１６〜２９（１９９２）。アルギン酸塩ビーズを、その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加剤（１０％のウシ胎児血清、２５μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのファンギゾン、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、０．４ｍＭのＬ−プロリン、２ｍＭのＬ−グルタミン）とともに含有するＴ−１７５フラスコに移し、培地（百万個の細胞あたり１ｍｌ）を毎日交換しながら７日間培養した。細胞およびその結合基質（ＣＭ）を、５５ｍＭクエン酸ナトリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用してアルギン酸塩から遊離させた。選択された細胞を、１０μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）オレンジＣＭＴＭＲ（中間）またはグリーンＣＭＦＤＡ（表層）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を含有する培地で２時間インキュベーションすることによって標識した。その後、ＣＭを、細孔サイズが０．４μｍであるポリエステルメンブラン（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を有する直径が６．５ｍｍまたは１２ｍｍの細胞挿入物の上に播種して、５百万細胞／ｃｍ２メンブラン面積の最終密度を達成した。Ｓ構築物およびＭ構築物を、ＣＭを一度に播種することによって形成させ、一方、Ｓ／Ｍ構築物を、中間ＣＭ（２５０万／ｃｍ２）を播種し、続いて、最初の層を合着させるために１８時間経た後、表層ＣＭを播種することによって形成させた。すべての群を一晩インキュベーションし、その後、組織培養ウエルを培地で満たした。構築物を、培地（添加剤含有ＤＭＥＭ）を毎日交換しながら１週間または２週間にわたって培養した。培養が終了したとき、構築物をメンブランから取り除き、電流検知マイクロメーターを用いて厚さについて測定し、湿重量を測定した。標識された細胞を有する部分の蛍光顕微鏡写真および位相差顕微鏡写真を１週間目に得た。同一視野を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して重ね合わせて、細胞の層形成を可視化した。
【００６７】
生化学的分析：いくつかの構築物（ｎ＝６個から１９個の構築物／タイプ／時点）を生化学的分析のために使用した。直径３ｍｍのパンチ物をプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で可溶化し、ＤＮＡについて（Ｋｉｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７４、１６８〜７６（１９８８））、ヒドロキシプロリン１ｇあたり７．２５ｇのコラーゲンであるという仮定（Ｐａｌ，Ｓ．ら、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．、１、１５１〜７６（１９８１））を用いてヒドロキシプロリンとしてコラーゲンについて（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、９３、４４０〜７（１９６１））、そしてジメチルメチレンブルー分光光度法アッセイ（Ｆａｒｎｄａｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、８８３、１７３〜７（１９８６））を使用して硫酸化ＧＡＧについて分析した。
【００６８】
機械的試験：その後、他の構築物（ｎ＝６個から１０個の構築物／タイプ／時点）を、半径方向が制限されたチャンバーにリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）とともに移し、制限圧縮試験に供して、平衡制限圧縮弾性率ＨＡ０を測定した。Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ、３４、１〜１２（２００１）。
【００６９】
免疫組織化学：第三の組の構築物を、ゴルジ装置からのＳＺＰの分泌を妨げるために培地において０．１μＭのモネンシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１６時間処理し（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、１７、１１０〜２０（１９９９））、Ｏ．Ｃ．Ｔ．で冷凍して、構築物の表面に対して直角に４０μｍ厚の切片に切断した。切片を、抗ウシＳＺＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）３−Ａ−４、マウスｍＡｂ抗コラーゲンＩＩ抗体カクテル（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）、またはコントロールとしてのマウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を用いて、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用してＳＺＰおよびコラーゲンＩＩについてプローブした。切片を、室温で２分間から５分間、メチルグリーン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で対比染色して、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に固定した。連続する切片を、０．４Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）における０．１％アルシアンブルーで染色して、ＧＡＧを染色した。Ａｙｄｅｌｏｔｔｅら、Ｃｏｎｎｅｃｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、１８、２２３〜３４（１９８８）；Ｓｃｏｔｔら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ、５、２２１〜３３（１９６５）。ＳＺＰおよびコラーゲンＩＩに関する陽性の反応性、そしてＧＡＧ染色が、明視野照明を使用する顕微鏡写真撮影によって記録された。ＳＺＰの陽性細胞および陰性細胞には、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して印が付けられ、、それらの細胞は、ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６２での校正画像を使用して、自由表面から開始して２００μｍの区分で計数された。構築物は厚さが変化するので、深さ４００μｍと、メンブラン表面から２００μｍとの間の計数をまとめた。
【００７０】
ＳＺＰのＥＬＩＳＡ：構築物培養の１２日目から１４日目に由来するプールされた培地の個々のサンプル（タイプあたり９個から１３個の構築物）を、０．１ＭグアニジンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）において４℃で一晩、９６ウエルプレートのウエルに結合させた。表層域軟骨の外植片培養から得られる使用済み培地（これは精製ＳＺＰに関して２２．５μｇ／ｍｌの濃度に標準化された）もまた、２倍希釈物でアッセイされ、Ｓ字形のコントール曲線が作製された。プレートを、０．１％ツイーン−２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で徹底的に洗浄し、非特異的な結合を５％脱脂乳／ＰＢＳで１時間ブロッキング処理した。プレートを洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳにおけるｍＡｂ３−Ａ−４の１：１０００希釈物で１時間インキュベーションして、洗浄し、そして上記のように同じ二次抗体の１：１０００希釈物でさらに１時間インキュベーションした。ＡＢＴＳ基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を１５分間加え、そして反応を１％ＳＤＳ／水の添加によって停止させた。光学濃度（ＯＤ）の測定をＥＭＡＸマイクロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）で４０５ｎｍにおいて行った。３つの希釈物を使用して、等価正味ＯＤを最小二乗シグモイド近似に基づいて計算し、その後、コントロール曲線を使用してＳＺＰ濃度に変換した。
【００７１】
ウエスタンブロット：構築物培養（タイプあたり５個の構築物）の１２日目から１４日目に由来するプールされた培地、および精製されたＳＺＰを、３７℃で２時間、サンプル緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓおよび０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ８．０）においてコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で消化した。サンプルを等量の２Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液と混合し、３分間煮沸し、その後直ちに５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供した。分離されたタンパク質を、１２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび６ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する転写緩衝液（ｐＨ７．４）において２５０ｍＡで、４℃で一晩、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）に転写した。その後、メンブランを取り出し、ＰＢＳ−Ｔにおける５％脱脂乾燥乳（Ｎｅｓｔｌｅ  Ｆｏｏｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｇｌｅｎｄａｌｅ、ＣＡ）で３０分間ブロッキング処理した。洗浄後、メンブランを、ＰＢＳ−Ｔで１：２００希釈されたｍＡｂ３−Ａ−４で１時間インキュベーションし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）二次抗体（１：１０００）で２時間インキュベーションした。タンパク質を、ハイパーフィルム−ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて可視化した。ＳＺＰバンドのおおよその分子量を、レインボウ分子量標準物を使用して決定した。
【００７２】
統計学的分析：データは平均±ＳＥＭとして表される。構築物タイプおよび培養持続期間の影響が、適する場合にはチューキー事後検定を用いて、Ｓｙｓｔａｔ  ５．２．１（Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を使用してＡＮＯＶＡによって評価された。
【００７３】
実験結果
付着性軟骨構築物を、アルギン酸塩回収型軟骨細胞法を使用して、子ウシ軟骨の表層域および中間域から別々に単離された軟骨細胞から製造した。Ｍａｓｕｄａ，Ｋ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ、７０（１９９９）。３タイプの構築物が形成された：均一な表層型（Ｓ）、均一な中間型（Ｍ）、および表層型が中間型の上に層化された層状化型（Ｓ／Ｍ）（図１）。異なる細胞層が作製され、これらはＳ／Ｍ構築物において維持された。このことは、蛍光標識された表層域細胞および中間域細胞の局在化によって明らかにされた（データは示されず）。構築物の厚さは構築物のタイプにより変化し（ｐ＜０．００１）、培養持続期間とともに増大し（ｐ＜０．００１）、Ｍ構築物はＳ／Ｍ構築物よりも著しく厚く、Ｓ／Ｍ構築物は、培養の１週間後および２週間後のＳ構築物よりも厚かった（図２Ａ）。構築物の湿重量は、厚さのデータと一致した様式で変化した（図２Ｂ）。細胞増殖もまた、ＤＮＡ含有量が１週間から２週間で増大した（ｐ＜０．００１）ので明かであったが、すべての構築物で類似していた（ｐ＝０．１２）（図２Ｃ）。
【００７４】
軟骨基質分子であるコラーゲンおよびＧＡＧは、様々なタイプの構築物によって、異なる速度で蓄積した。コラーゲン含有量は１週間から２週間で３倍になり（ｐ＜０．００１）、Ｍ構築物では、Ｓ構築物よりも著しく大きく（ｐ＜０．００１）、そしてＳ／Ｍ構築物では中間的なレベルであった（Ｓに対してｐ＜０．００１、Ｍに対してｐ＜０．０５）（図２Ｅ）。ＧＡＧ含有量は、傾向が類似していた（図２Ｄ）が、コラーゲンよりも量が多く、１週間から２週間で５１％増大した（ｐ＜０．００１）。平衡制限圧縮弾性率は、有意ではない（ｐ＝０．０６）が、時間とともに増大し、Ｍ構築物では、Ｓ構築物（ｐ＜０．０１）およびＳ／Ｍ構築物（ｐ＜０．０５）よりも大きかった（図２Ｆ）。
【００７５】
ＩＩ型コラーゲン（これは硝子軟骨のマーカーとして使用される）は、免疫組織化学によってすべてのタイプの構築物の厚さ全体で強く検出された（図３ｃ、ｆ、ｉ）。ＧＡＧ（具体的にはコンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸）が、アルシアンブルー色素を使用して構築物断面で可視化された。ＩＩ型コラーゲンと同様に、ＧＡＧがすべての断面の厚さ全体に存在した（図３ｄ、ｇ、ｊ）。染色は、Ｓ／Ｍ構築物の下方部が濃くなっていた（図３ｊ）。
【００７６】
ＳＺＰ（基質内に保持されない分泌された分子）が、モネンシンで処理された構築物において免疫組織化学によって細胞内に検出された。ＳＺＰは、Ｓ構築物およびＳ／Ｍ構築物では軟骨細胞の大きな部分の内部に免疫局在化したが、Ｍ構築物では非常に少ない軟骨細胞に免疫局在化した（図３ｂ、ｅ、ｈ）。Ｓ構築物の両表面に近い細胞が内部の細胞よりも強く染色され、一方、自由表面の細胞はＳ／Ｍ構築物における他の細胞よりも強く染色された。Ｓ／Ｍ構築物におけるＳＺＰ発現のこのパターンは、生来的な子ウシ軟骨におけるＳＺＰ陽性細胞の急峻で単調な勾配に類似した。２週間の培養の後、ＳＺＰ陽性細胞の割合は、上部の２００μｍでは５２±１５％であり、これに対して、その次の２００μｍでは３６±８％であり、そして組織の残り部分では１３±１４％にすぎなかった（図４Ｂ）。しかしながら、Ｓ構築物は、両方の表面で類似するレベル（上部の２００μｍで４８±１６％、そして底部の２００μｍで４８±１４％）を示し、内部ではより低いレベル（２００μｍから４００μｍで２０±９％、残りの組織で２９±２１％）を示した（図４Ｂ）。Ｍ構築物はすべての部分で低いレベルのＳＺＰ陽性細胞を有し、上部の２００μｍにおける２±２％から、底部の２００μｍにおける１５±０％に及ぶ範囲であった（図４Ｂ）。
【００７７】
ウエスタンブロットによって分析されたとき、培養の１２日目から１４日目に由来するプールされた培地におけるＳＺＰは、約３４５ｋＤの見かけ分子量で、精製ＳＺＰと同じ電気泳動移動度を有した。各プール物におけるＳＺＰの量をＥＬＩＳＡによって定量した。Ｓ構築物は２１．５±４．０μｇ／［ｃｍ２＊日］を分泌し、これは、Ｓ／Ｍ構築物およびＭ構築物の両方よりも１日あたり３倍から４倍多いＳＺＰであった（ｐ＜０．００１）（図４Ａ）。
【００７８】
結果の考察
上記の結果は、軟骨細胞亜集団が、組織工学された軟骨の構造、組成、代謝および機械的機能を決定することにおいて重要な役割を果たし得ることを示している。表層域の軟骨細胞から形成された構築物は、中間域の軟骨細胞から形成された構築物よりも比較的低い基質含有量および圧縮性質を有した。また、表層域の細胞および中間域の細胞が層化様式で組み合わされたとき、組織は、表層域の少数の細胞層のみからの最大のＳＺＰ分泌を伴って、中間的な基質性質、および生来的な軟骨に類似するＳＺＰ局在化を発達させた。
【００７９】
層状化構築物を用いたこれらのインビトロ研究では、胎児様軟骨が、大きい細胞性、ＳＺＰ層状化および低い圧縮弾性率を伴って繰り返されていた。未成熟な軟骨を模倣するこの組織は、生物学的インプラントとして使用するために選ぶことができる。若い軟骨は、傷害を受けたとき、治癒することが示されており（Ｎａｍｂａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．、８０−Ａ、４〜１０（１９９８））、これに対して、成体の軟骨は治癒せず、生物学的移植片との一体化が不良である（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｗ．Ｐｈｉｌｏｓ、Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ、４２、５１４〜２１（１７４３）；ＤｉＭｉｃｃｏら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ（印刷中）、（２００１））。機械的性質が未完成である工学的処理された軟骨もまた、より完全に発達した基質性質を有する処理された軟骨よりも大きい一体化能を示している。また、若い軟骨のより大きな成長能は、異常を有する欠陥部のより完全な充填を可能にし得る。
【００８０】
軟骨細胞亜集団は、インビトロで、そして欠陥部位に移植された後、分化し得る一方で、工学的処理された組織におけるそれらのそれぞれの域に対する適切な域表現型を有する細胞を提供することにより、組織成熟化の時間を、組織における細胞の遊走および／または分化に対する要求を低下させることによって短くすることができる。この研究では、Ｓ構築物におけるＳＺＰ発現細胞の数が培養持続期間とともに減少したが、それにもかかわらず、ＳＺＰの全体的な産生は増大した。このことは、ＳＺＰ産生の表現型スイッチングおよび複雑な調節を示している。これらの構築物の表面に近い細胞は、培養期間を通して陽性のままであり、一方、内部でのＳＺＰ陽性細胞の割合は減少した。このことは、軟骨の無血管性のために、インビボで明らかにされるように、組織における栄養レベルまたは栄養勾配に対する表現型依存性を示唆し得る。あるいは、ＳＺＰの発現が、細胞−細胞相互作用またはより考えられることには細胞−基質相互作用によって阻害され得る。本明細書中に記載される層化スキームにより、細胞がその適正な域に局在化され、表現型発現パターンが維持されている。
【００８１】
生来的な軟骨を模倣する層状化を有する工学的処理された構築物は、将来において軟骨欠陥を修復するために特に有用であり得る。機能的な表層域を移植時に提供することによって、インプラントの表面における摩損を、保護的かつ潤滑性の分子が産生されることに因って低下させることができる。Ｆｌａｎｎｅｒｙ，Ｃ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２５４、５３５〜４１（１９９９）。また、ＳＺＰの潤滑作用は、一体化における阻害的な役割を果たすことがあり、従って、宿主−移植片の境界での関節表面下では望ましくないと考えられる。むしろ、中間域の軟骨細胞および深部域の軟骨細胞を作り出す基質により、負荷を支えるために必要な堅さと、軟骨の一体化における重要な介在因子として関係しているコラーゲンなどの基質分子との両方が提供され得る。ＤｉＭｉｃｃｏら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．、１９、１１０５〜１２（２００１）。
【００８２】
実験結果に基づいて、ＳＺＰ発現細胞をＳＺＰ陰性細胞の層の上に含有する層を有する組織を製造するための方法が確立された。
【００８３】
当業者によって理解されるように、すべての目的のために、特に、記載された説明を提供することに関して、本明細書中に開示されるすべての範囲はまた、すべての可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせを包含する。示された範囲はいずれも、同じ範囲を少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分、十等分などに分けることを十分に記載し、それが可能であるとして容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書中で議論された各範囲は、下位側３分の１、中間の３分の１および上位側３分の１などに容易に分けることができる。当業者によりまた理解されるように、「までの」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「未満」および「を超える」などの表現はすべて、示された数を含み、上記で議論されたように部分範囲にその後に分けることができる範囲を示す。同じように、本明細書中に開示されるすべての比率もまた、このより広い比率に含まれるすべての部分比率を含む。
【００８４】
当業者はまた、数字が一般的な様式で、例えば、マーカッシュ群などで、まとめてグループ化されている場合、本発明は、全体として示された群全体だけでなく、群の各要素を個々に、そして主群のすべての可能な部分群をも包含することを容易に認識する。従って、すべての目的のために、本発明は、主群だけでなく、群要素の１つ以上が存在しない主群をも包含する。本発明では、請求項に記載される発明における群要素のいずれかの１つ以上の明示的な除外もまた考えられる。
【００８５】
本明細書中に開示された参考文献はすべて、それらに対する参照によって特に本明細書中に組み込まれる。
【００８６】
好ましい実施形態が例示および記載されているが、様々な変化および改変が、下記の請求項において規定されるようなそのより広い局面における発明から逸脱することなく、この分野での通常的な技術に従ってそのような実施形態において行われ得ることを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明による処理された軟骨組織の製造を示す概略図である。
【図２】実施例に示されるような培養で１週間後および２週間後における、表層域および／または中間域の軟骨細胞から形成される軟骨構築物の３つのタイプの構造的性質、組成的性質および機能的性質を示す。湿重量（ＷＷ）、ＤＮＡ、ＧＡＧおよびコラーゲンはすべて、構築物の断面積に対して正規化された。データは平均±ＳＥＭとして表される（ｐ＜０．００１（左向き黒三角）、ｐ＜０．０１（黒丸）、ｐ＜０．０５（黒ひし形））。
【図３】２週間目のＳ軟骨構築物、Ｓ／Ｍ軟骨構築物およびＭ軟骨構築物における分泌された基質分子の局在化を示す。切片はマウスＩｇＧコントロール（ａ）で処理され、またはＳＺＰ（ｂ、ｅ、ｈ）については免疫染色され、またはコラーゲンＩＩ（ｃ、ｆ、ｉ）についてはメチルグリーンで対比染色された。各構築物の上部（１）、中間部（２）に由来する選択された領域の高倍率像が明確化のために示される。ＧＡＧ（ｄ、ｇ、ｊ）がアルシアンブルーで組織化学的に検出された。横棒＝１００μｍ。
【図４】構築物培養の１２日目から１４日目に由来するプールされた使用済み培養培地において間接的ＥＬＩＳＡにより測定された表層域タンパク質（ｐ＜０．００１（左向き黒三角））（Ａ）、および免疫組織化学により測定された、２週間の培養の後での各構築物における深さ依存的なＳＺＰ発現（Ｂ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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