(57)【要約】この発明は、腫瘍細胞抗原発現をアップレギュレートする方法を提供し、この方法は、非処理腫瘍細胞に比べてＴＬＰの発現を増加させるために十分な量のサイマルファシンを細胞に投与するステップを含む。また、免疫診断法または免疫療法の感度を高める方法を提供し、この方法は標的腫瘍細胞を、非処理腫瘍細胞に比べてＴＬＰの発現を増加させるために十分な量のサイマルファシンを細胞に投与することによって前処理し、その後免疫診断法または免疫療法を適用するステップを含む。これらの方法は、インビボおよびインビトロ診断法の両方ならびにインビボ免疫療法に適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞抗原発現をアップレギュレートする方法であって、非処理腫瘍細胞に比べてＴＬＰの発現を増加させるために十分な量のサイマルファシンを腫瘍細胞に投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
投与はインビボで患者に対して行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サイマルファシンは２μｇ／ｋｇ体重から６ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サイマルファシンは２０μｇ／ｋｇ体重から２００μｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
免疫診断法または免疫療法の感度を高める方法であって、標的腫瘍細胞を、非処理腫瘍細胞に比べてＴＬＰの発現を増加させるために十分な量のサイマルファシンを細胞に投与することによって前処理し、その後免疫診断法または免疫療法を適用するステップを含む、方法。
【請求項６】
投与はインビボで患者に対して行なわれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
サイマルファシンは２μｇ／ｋｇ体重から６ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サイマルファシンは２０μｇ／ｋｇ体重から２００μｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
投与はインビトロで細胞に対して行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
投与はインビトロで細胞に対して行なわれる、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
この出願は、２００２年６月２８日に提出された仮出願第６０／３９１，９６９号の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
この発明は、癌診断学および治療学の分野に関し、また癌の診断および処置におけるサイマルファシン（thymalfasin）（チモシンα−１）の用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
抗癌ワクチン、免疫イメージングおよび薬物送達技術の開発はすべて、腫瘍細胞膜において利用可能でありかつＭＨＣ−１分子によって適切に提示される特定の分子標的（たとえば腫瘍抗原）の同定に依存している。抗原同定は、腫瘍免疫療法および特に癌ワクチン開発においてなおも中心的問題である。さまざまな腫瘍特異的な抗原が同定されてきたが、これらの抗原の発現のレベルおよび／またはそれらのＭＨＣ−１分子による不定の提示では、癌細胞の存在を検出して破壊できるために十分な特異性および感度の免疫療法および免疫ベースの診断法を開発するのは困難であった。腫瘍抗原の検出の感度を高めることによって、疾患の初期段階における診断、およびより少ない腫瘍細胞を有する初期段階における処置、ならびに転移状態のより集中的な処置が可能になる。
【０００４】
我々は以前に、腫瘍特異的抗原であるＴＬＰがヒトおよび実験的な腫瘍の両方で発現されており、保存された配列を有することを示した。このことからＴＬＰは免疫診断および免疫療法のための標的抗原として用い得る有力な候補となったが、ＴＬＰの発現のレベルは、腫瘍分子標的のほとんどと同様に、これらの目的に対して理想的なレベルに満たない。
【０００５】
チモシンα−１またはサイマルファシンは、通常循環において見出される２８−アミノ酸ペプチドである。サイマルファシンは胸腺細胞の生育および分化、ならびにＩＬ−２、Ｔ細胞ＩＬ−２受容体、ＩＦＮαおよびＩＦＮγの生成を促進する。バクセバニス、１９９０；ベプラー、１９９４；セラーテ、１９８７；スツァイン（Stzein）、１９８９。チモシンアルファ１はまた、ＭＨＣクラスＩ発現をアップレギュレートすることが示されている。ジュリアーニ、２０００。慢性Ｂ型およびＣ型肝炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、予防接種に対する反応抑制、および癌を含む多数の疾患におけるサイマルファシンの治療の可能性が評価されてきた。アンドレオン、１９９６；ガラシ、１９９８、２０００；グラベンスタイン、１９８６；マッチニック、１９９９；シャーマン、１９９８。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
サイマルファシンは、インビトロまたはインビボにおいて結腸直腸癌細胞のＴＬＰの発現をアップレギュレートできることが見出された。このようにＴＬＰ発現を高めることは、たとえば放射免疫ガイド下の手術または免疫シンチグラフィ技術などの改善された癌細胞標的化に基づくさまざまな改善された診断および治療法を可能にする。よってサイマルファシンなどの非毒性処置によって腫瘍抗原の発現を高め得ることは、治療および診断の両方の目的に対して非常に有用であり、癌のより早期の検出および処置、ならびに進行した癌、特に転移癌のより集中的かつ徹底的な処置を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
詳細な説明
サイマルファシンによる処理によってＴＬＰ抗原の発現をアップレギュレートできる。この発現の増加は、特定のＣＤ８数の誘導からのより効果的なＣＴＬ応答をもたらし得る。加えてこの発現の増加によって、放射免疫ガイド下の手術または免疫シンチグラフィ技術に対して細胞がよりよく標的化および検出されるようになる。さらに、ヒト抗原を自然に発現する実験的な腫瘍の可用性は、前臨床モデルの開発に非常に有用である。この方法による腫瘍抗原発現の増加は、診断および免疫治療法の両方に感度の増加を付加し、癌のより早期の検出および処置、ならびに転移癌を含む進行した癌のより集中的かつ徹底的な処置を可能にする。
【０００８】
サイマルファシンペプチドのＴＬＰ発現増加量は、慣用の用量滴定実験によって定め得る。ＴＬＰのアップレギュレートは、インビボにおいて、２μｇ／ｋｇ体重から６ｍｇ／ｋｇ体重のサイマルファシン、好ましくは２０μｇ／ｋｇから２００μｇ／ｋｇの投与によって得ることができる。サイマルファシンは、ヒトに対しては１６ｍｇ／用量／日の用量で投与されるときにも安全であり、ラットにおいては６ｍｇ／ｋｇ／日の量でも安全であることが見出されている。
【０００９】
サイマルファシンは、当該技術分野において周知のさまざまな手段のいずれかによって、たとえば、静脈、腹膜内、筋肉内、または腫瘍の周囲領域に直接的に、注射または点滴することによって投与されてもよい。好ましい実施例において、サイマルファシンペプチドは、注射用の水、生理的濃度の食塩水、または類似物などの医薬的に受容可能な液体担体中に存在する。皮下注射されたサイマルファシンの血漿半減期は約２時間しかない。ロストら、１９９８。しかし、サイマルファシンペプチドへの重合体の接合によって、ペプチドの血漿半減期がかなり増加する。ラーシら（未発表の観察）。接合サイマルファシンの状況で適用されるとき、前述の投与量は組成物中に存在するサイマルファシンペプチドのみを反映し、それに接合される重合体の重量は含まない。
【００１０】
サイマルファシンペプチドの単離、特徴付けおよび使用は、たとえば米国特許第４，０７９，１２７号、米国特許第４，３５３，８２１号、米国特許第４，１４８，７８８号および米国特許第４，１１６，９５１号などに記載されている。この発明は、天然に存在するサイマルファシン、ならびに、天然に存在するサイマルファシンのアミノ酸配列、それに実質的に類似するアミノ酸配列、またはその短縮された配列形を有する合成サイマルファシンおよび組換えサイマルファシン、およびサイマルファシンと実質的に類似の対生物活性を有する、置換、削除、延長、交換、またはその他の態様で変更された配列を有するその生理活性類似体、たとえば、サイマルファシンと実質的に同じ活性で実質的に同じ態様で機能するために十分なサイマルファシンとのアミノ酸相同性を有するサイマルファシンペプチドなどを含むサイマルファシンペプチドに適用可能である。
【実施例】
【００１１】
例１（インビトロ）
ＷｉＤｒ（ヒト）、ＩＡ−ＸｓＳＢＲ（ラット）およびＤＨＤ−Ｋ１２（ラット）結腸直腸癌細胞系を、５−１００μｇ／ｍｌのサイマルファシンで６時間から４８時間処理した。ＴＬＰ（ＣＳＨ−２７５）の９アミノ酸ペプチドエピトープに対して生成されたＴＬＰ抗血清を用いて、ＴＬＰ抗原発現をフローサイトメトリ（ＦＣ）によって、また抗原局在性を共焦点レーザ走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）によって定めた。
【００１２】
ＴＬＰは３つの結腸直腸細胞系のすべてにおいて自然に発現され、細胞質と細胞膜の両方において、細胞質では細胞の３０−５５％の範囲（易透化後ＣＬＳＭおよびＦＣによる
）で、細胞膜においては細胞の１０−２０％の範囲（ＦＣによる）で発現される。図１。サイマルファシンは、試験されたすべての細胞系においてこの抗原の発現を増加できる。図２。増加のレベルおよび膜対細胞質の局在性は、投与量および処理のタイミングによって変わり、細胞の９０％の発現レベルに達し得る。
【００１３】
例２（インビボ）
ＢＤ−ＩＸラットに同系のＤＨＤ−Ｋ１２細胞を腹膜内（i.p.）注射し、腹膜内または皮下的（s.c.）にサイマルファシンで処理した。腹水または腫瘍塊の両方から得られた腫瘍細胞に対して、上述のようにＴＬＰ発現および局在性を定めた。
【００１４】
サイマルファシンで処理した動物からの腫瘍細胞は、インビトロで見られたのと同様のＴＬＰの発現増加を示す。図３。
【００１５】
参考文献
アンドレオン（Andreone）P.、カーサロ（Cursaro）C.、グラメンツィ（Gramenzi）A.ら、「Ｂ型肝炎ｅ抗原抗体（およびＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ）陽性慢性Ｂ型肝炎患者における、チモシンアルファ１対インターフェロンアルファ処置のランダム化比較試験（A randomized controlled trial of thymosin alpha 1 versus interferon alpha treatment in patients with hepatitis B e antigen antibody - and hepatitis B virus DNA - positive chronic hepatitis B）」、Hepatology 24(4): 774-777 (1996)。
【００１６】
バクセバニス（Baxevanis）、C.N.ら、「プロチモシンアルファによるヒトＴリンパ球機能の向上：正常ヒト末梢血Ｔリンパ球におけるインターロイキン２の生成およびインターロイキン２受容体の発現の増加（Enhancement of human T lymphocyte function by prothymosin alpha: increased production of interleukin-2 and expression of interleukin-2 receptors in normal human peripheral blood T lymphocytes）」、Immunopharmacol. Immunotoxicol. 12(4): 595-617 (1990)。
【００１７】
ベプラー（Bepler）、G.、「悪性腫瘍の従来の療法に対する添加物としてのチモシンアルファ１：概説（Thymosin alpha-1 as adjunct for conventional therapy of malignant tumors: a review）」、Cancer Invest. 12:491-6 (1994)。
【００１８】
ガラシ、E.ら、「ＣＤ４カウントが２００から５００細胞／mm3であるＨＩＶ感染個体におけるジドブジン、チモシンアルファ１およびインターフェロンアルファの３種併用の活性の評価に対するランダム化比較研究（A randomized controlled study for the evaluation of the activity of a triple combination of zidovudine, thymosin alpha 1, and interferon alpha in HIV-infected individuals with CD4 counts between 200 and
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【００１９】
ガラシ、E.、F.ピカ（Pica）、G.ラーシ、およびC.ファバッリ（Favalli）、「癌治療におけるチモシンアルファ１：基礎研究から臨床応用まで（Thymosin alpha 1 in the treatment of cancer: from basic research to clinical application）」、Int. J. Immunopharm. 22: 1067-1076 (2000)。
【００２０】
ジュリアーニ（Giuliani）、C.、G.ナポリターノ（Napolitano）、A.マスティノ（Mastino）、S.ダビンセンツォ（Da Vincenzo）、C.ダゴスティーニ（D'Agostini）、S.グレッリ（Grelli）、I.ブッチ（Bucci）、D.S.シンガー（Singer）、L.D.コーン（Kohn）、F.モナコ、E.ガラシ、およびC.ファバッリ、「チモシンα１はＦＲＴＬ−５細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現を転写レベルで制御する（Thymosin-α1 regulates MHC class I expression in FRTL-5 cells at transcriptional level）」、Eur. J. Immunol. 30:778-86 (
2000)。
【００２１】
グラベンスタイン（Gravenstein）S.、エルシュラー（Ershler）W.B.、ドルマスキン（Drumaskin）S.、シュワブ（Schwab）R.、ウェクスラー（Weksler）M.E、「抗インフルエンザ抗体応答：チモシンアルファ１による高年「免疫不応答者」の増加（Anti-influenza
antibody response: augmentation in elderly“non-responders”by thymosin alpha 1）」、Gerontologist26: 150A (1986)。
【００２２】
マッチニック（Mutchnick）、M.G.ら、「慢性Ｂ型肝炎のチモシンアルファ１処置：第ＩＩＩ相多中心、ランダム化、二重盲検およびプラセボ比較試験の結果（Thymosin alpha
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【００２３】
ロスト（Rost）、K.L.、W.ウィーリッチ（Wierich）、F.マサユキ（Masayuki）、C.W.タットヒル（Tuthill）およびW.M.ヘルマン（Herrmann）、「健康なボランティアにおける３種類の配合の皮下注射後のチモシンα−１の薬物動態（Pharmacokinetics of thymosin α-1 after subcutaneous injection of three different formulations in healthy volunteers）」、Eur. J. Clin. Pharmacol. 37:51-57 (1998)。
【００２４】
セラーテ（Serrate）S.、シュロフ（Schulof）R.、レオンダリディス（Leondaridis）L.、ゴールドスタイン（Goldstein）A.L.、スツァイン（Sztein）M.B.、「胸腺ホルモンによるヒトナチュラルキラー細胞の細胞毒活性、リンフォカイン生成、およびインターロイキン２受容体発現の調節（Modulation of human natural killer cell cytotoxic activity、lymphokine production、and interleukin 2 receptor expression by thymic hormones）」、J. Immunol.139:2338-2343 (1987)。
【００２５】
シャーマン（Sherman）、K.E.およびシャーマン、S.N.「慢性Ｃ型肝炎感染のインターフェロンプラスチモシンアルファ１処置：メタ分析（Interferon plus thymosin alpha 1
treatment of chronic hepatitis C infection: a meta-analysis）」、「ウイルス肝炎の治療法」（Therapies for Viral Hepatitis）より、シナジ（Schinazi）、RF、ソマドーシ（Sommadossi）、J-P、およびトーマス、HC編、インターナショナルメディカルプレス（International Medical Press）、379-383 (1998)。
【００２６】
スツァイン、M.およびセラーテ、S.、「正常なヒトリンパ球におけるインターロイキン２生成およびインターロイキン２受容体発現に対するチモシンアルファ１の免疫調節特性の特徴付け（Characterization of the immunoregulatory properties of thymosin alpha 1 on interleukin-2 production and interleukin-2 receptor expression in normal human lymphocytes）」、Int. J. Immunopharmacol. 11:789-800 (1989)。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】結腸直腸癌細胞系ＤＨＤ−Ｋ１２の細胞膜においてＴＬＰが発現される。
【図２】結腸直腸癌細胞系ＷｉＤｒの細胞表面におけるＴＬＰ発現はサイマルファシンによる処理により増加する。
【図３】腹水からの腫瘍細胞のＴＬＰ発現はサイマルファシンによる動物の処理により増加する。
【図１】
2005537246.tif 000002
【図２】
2005537246.tif 000003
【図３】
2005537246.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月1日(2005.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞抗原発現をアップレギュレートするために用いられる組成物であって、前記組成物は、非処理腫瘍細胞に比べて腫瘍抗原の発現を増加させるために十分な量のサイマルファシンを含む、組成物。
【請求項２】
サイマルファシンはインビボで投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
サイマルファシンは２μｇ／ｋｇ体重から６ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
サイマルファシンは２０μｇ／ｋｇ体重から２００μｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
免疫診断法または免疫療法の感度を高めるために用いられる組成物であって、前記組成物は、非処理腫瘍細胞に比べて腫瘍抗原の発現を増加させるために十分な量のサイマルファシンを含む、組成物。
【請求項６】
投与はインビボで患者に対して行なわれる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
サイマルファシンは２μｇ／ｋｇ体重から６ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
サイマルファシンは２０μｇ／ｋｇ体重から２００μｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
投与はインビトロで細胞に対して行なわれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
投与はインビトロで細胞に対して行なわれる、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記腫瘍抗原はＴＬＰである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記腫瘍抗原はＴＬＰである、請求項５に記載の組成物。
【国際調査報告】
2005537246.tif 000005