(57)【要約】本発明は、哺乳類のＰＡＫ５関連タンパク質をコードする核酸、およびコードされるタンパク質を提供する。本発明は、ベクター、細胞、及び組成物も提供する。最後に、本発明は、前記核酸及びタンパク質を用いて様々な細胞プロセスを誘導する方法及び阻害する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のＰＡＫ５ドメインをコードする配列を含む単離された核酸（但し、該核酸は完全長のヒトＰＡＫ５をコードしない）。
【請求項２】
前記ＰＡＫ５ドメインが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン、哺乳類のＰＡＫ５制御ドメイン、及び哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインからなる群から選択される、請求項１の核酸。
【請求項３】
前記核酸が、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメイン又は哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードしない配列を含む、請求項１の核酸。
【請求項４】
前記核酸が、哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン又は哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードしない配列を含む、請求項１の核酸。
【請求項５】
前記核酸が、哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン又は哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードしない配列を含む、請求項１の核酸。
【請求項６】
哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインと哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードしない配列を含む核酸。
【請求項７】
哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインと哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードしない配列を含む核酸。
【請求項８】
哺乳類の制御ドメインと哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインをコードしない配列を含む核酸。
【請求項９】
前記哺乳類のＰＡＫ５がヒトのＰＡＫ５である、請求項１、６、７、又は８の核酸。
【請求項１０】
前記哺乳類のＰＡＫ５がマウスのＰＡＫ５である、請求項１、６、７、又は８の核酸。
【請求項１１】
マウスのＰＡＫ５をコードする配列を含む、請求項１の単離された核酸。
【請求項１２】
哺乳類のＰＡＫ５をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする単離された核酸。
【請求項１３】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１２の核酸。
【請求項１４】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１２の核酸。
【請求項１５】
外来制御要素に作用可能に連結された哺乳類のＰＡＫ５コード配列を含む核酸。
【請求項１６】
内在制御要素に作用可能に連結された哺乳類のＰＡＫ５コード配列を含む核酸。
【請求項１７】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１５又は１６の核酸。
【請求項１８】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１５又は１６の核酸。
【請求項１９】
（ａ）請求項１、６、７、８、１５、若しくは１６の核酸、又は（ｂ）請求項１２の核酸をコードする核酸を備えたベクター。
【請求項２０】
前記ベクターが、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、及び真核細胞ウイルスからなる群から選択される、請求項１９のベクター。
【請求項２１】
前記真核細胞ウイルスがアデノウイルス又はレトロウイルスである、請求項２０のベクター。
【請求項２２】
請求項１５又は１６の核酸を有する細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される、請求項２２の細胞。
【請求項２４】
前記動物細胞が、神経細胞、上皮細胞、筋肉細胞、血液細胞、免疫細胞、幹細胞、骨細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される、請求項２３の細胞。
【請求項２５】
請求項１の核酸によってコードされるタンパク質。
【請求項２６】
請求項３の核酸によってコードされるタンパク質。
【請求項２７】
請求項４の核酸によってコードされるタンパク質。
【請求項２８】
請求項５の核酸によってコードされるタンパク質。
【請求項２９】
請求項６の核酸によってコードされるタンパク質。
【請求項３０】
請求項７の核酸によってコードされるタンパク質。
【請求項３１】
請求項８の核酸によってコードされるタンパク質。
【請求項３２】
請求項１の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３３】
請求項３の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３４】
請求項４の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３５】
請求項５の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３６】
請求項６の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３７】
請求項７の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３８】
請求項８の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項３９】
請求項１２の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４０】
請求項１５の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４１】
請求項１６の核酸と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４２】
請求項２５のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４３】
請求項２６のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４４】
請求項２７のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４５】
請求項２８のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４６】
請求項２９のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４７】
請求項３０のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４８】
請求項３１のタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項４９】
哺乳類細胞による突起（protrusion）形成を誘導する方法であって、前記細胞による突起形成を誘導するのに有効な量の請求項４、７、１５若しくは１６の核酸又は請求項２７若しくは３０のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項５０】
前記突起が、スパイク（spike）、伸出部（outgrowth）、糸状仮足（filopodia）、又は膜状仮足（lamelipodia）である、請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記伸出部が神経突起の伸出部（neurite outgrowth）である、請求項５０の方法。
【請求項５２】
哺乳類細胞中で細胞骨格の再編成を引き起こす方法であって、前記細胞中での細胞骨格の再編成を引き起こすのに有効な量の請求項４、７、１５若しくは１６の核酸又は請求項２７若しくは３０のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項５３】
哺乳類細胞上へのラッフル（ruffle）の形成を誘導する方法であって、前記細胞上へのラッフルの形成を誘導するのに有効な量の請求項４、７、１５若しくは１６の核酸又は請求項２７若しくは３０のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項５４】
哺乳類細胞の遊走（migration）を誘導する方法であって、前記細胞の遊走を誘導するのに有効な量の請求項４、７、１５若しくは１６の核酸又は請求項２７若しくは３０のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項５５】
哺乳類細胞の増殖を誘導する方法であって、前記細胞の増殖を誘導するのに有効な量の請求項４、７、１５若しくは１６の核酸又は請求項２７若しくは３０のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項５６】
哺乳類細胞による突起（protrusion）形成を阻害する方法であって、前記細胞による突起形成を阻害するのに有効な量の請求項３、５、６、８若しくは１２の核酸又は請求項２６、２８、２９若しくは３１のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項５７】
前記突起が、スパイク（spike）、伸出部（outgrowth）、糸状仮足（filopodia）、又は膜状仮足（lamelipodia）である、請求項５６の方法。
【請求項５８】
前記伸出部が神経突起の伸出部（neurite outgrowth）である、請求項５７の方法。
【請求項５９】
哺乳類細胞中での細胞骨格の再編成を阻害する方法であって、前記細胞中での細胞骨格の再編成を阻害するのに有効な量の請求項３、５、６、８若しくは１２の核酸又は請求項２６、２８、２９若しくは３１のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項６０】
哺乳類細胞上へのラッフル（ruffle）の形成を阻害する方法であって、前記細胞上へのラッフルの形成を阻害するのに有効な量の請求項３、５、６、８若しくは１２の核酸又は請求項２６、２８、２９若しくは３１のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項６１】
哺乳類細胞の遊走（migration）を阻害する方法であって、前記細胞の遊走を阻害するのに有効な量の請求項３、５、６、８若しくは１２の核酸又は請求項２６、２８、２９若しくは３１のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項６２】
哺乳類細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項３、５、６、８若しくは１２の核酸又は請求項２６、２８、２９若しくは３１のタンパク質に前記細胞を接触させることを備えた方法。
【請求項６３】
哺乳類のＰＡＫ５をコードするＤＮＡ分子の転写を阻害する方法であって、かかる阻害がなければＤＮＡの転写が可能な条件下で、請求項１２の核酸を前記ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせて、前記ＤＮＡ分子の転写を阻害することを備えた方法。
【請求項６４】
哺乳類のＰＡＫ５をコードするｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する方法であって、かかる阻害がなければｍＲＮＡの翻訳が可能な条件下で、請求項１２の核酸を前記ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズさせて、前記ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害することを備えた方法。
【請求項６５】
被処置対象において神経細胞の伸出部（neuronal outgrowth）を増加させる方法であって、前記被処置対象において神経細胞の伸出部を増加させるのに有効な量の請求項３４、３７、４０、４１、４４又は４７の組成物を前記被処置対象に投与することを備えた方法。
【請求項６６】
前記被処置対象がマウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモット、及び霊長類からなる群から選択される、請求項６５の方法。
【請求項６７】
前記被処置対象がヒトである、請求項６５の方法。
【請求項６８】
被処置対象において神経細胞の伸出部（neuronal outgrowth）を阻害する方法であって、前記被処置対象において神経細胞の伸出部を阻害するのに有効な量の請求項３３、３５、３６、３８、３９、４３、４５、４６又は４８の組成物を前記被処置対象に投与することを備えた方法。
【請求項６９】
前記被処置対象がマウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモット、及び霊長類からなる群から選択される、請求項６８の方法。
【請求項７０】
前記被処置対象がヒトである、請求項６８の方法。
【請求項７１】
哺乳類細胞の突起形成能の減少がＰＡＫ５の上流又はＰＡＫ５のレベルでのシグナル伝達の遮断によるものであるか否かを決定する方法であって、
（ａ）ＰＡＫ５を前記細胞中に導入することと、
（ｂ）前記細胞の突起の数が増加しているかどうかを測定することと、
を備え、増加していれば、前記細胞の突起形成能の減少が、ＰＡＫ５の上流又はＰＡＫ５のレベルでのシグナル伝達の遮断によるものであることを意味する方法。
【請求項７２】
前記細胞が、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞、モルモット細胞、又は霊長類細胞である、請求項７１の方法。
【請求項７３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項７１の方法。
【請求項７４】
前記細胞が、神経細胞、上皮細胞、筋肉細胞、血液細胞、免疫細胞、幹細胞、骨細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される、請求項７１の方法。
【請求項７５】
その体細胞が、ＰＡＫ５をコードするＤＮＡを欠損している、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７６】
前記哺乳動物がマウスである、請求項７５の哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願および文献の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００１年１２月２８日に出願された米国仮出願第６０／３４３，９７２号の一部継続出願であり、その優先権を主張するものであって、前記仮出願の内容は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本明細書に開示されている発明は、国立衛生研究所のグラントＲＯＩ  ＣＡ  ７６３４２号による合衆国政府の補助を受けてなされたものである。従って、合衆国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
本出願を通じて、様々な文献が引用されている。本発明が属する技術分野の水準をより完全に記述するために、これらの文献の開示内容全体は、本出願に参照により援用される。
【発明の背景】
【０００４】
Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ、Ｒｈｏ等のＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅは、当初、哺乳類の繊維芽細胞中に存在するアクチン細胞骨格の構成を制御する上で中心的な役割を果たすタンパク質として同定された（１８、３５、３７、３８）。活性化されたＣｄｃ４２を繊維芽細胞中にマイクロインジェクトすると、糸状仮足が誘導されるのに対して、活性化されたＲａｃは膜状仮足の形成を誘導し、活性化されたＲｈｏは張線維の形成を引き起こす。Ｃｄｃ４２ＨとＲａｃは何れも、張線維の分解においても役割を果たすことが示されており（１０、１８、２６）、このことは、これら２つのＧＴＰａｓｅとＲｈｏとが拮抗していることの反映である可能性がある（１９、３９）。
【０００５】
これらは、最初、繊維芽細胞中に見出されたが、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅは他の細胞種の形態を制御することも示されている。例えば、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅは、線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ニワトリ、哺乳類の初代神経細胞および細胞株における神経突起の伸出の制御に重要な役割を果たしていることが示されている（５、８、１４、１９、２２、２５、４７、５３）。おそらく、これは、糸状仮足と膜状仮足が神経突起の伸長において中心的役割を果たしていることが少なくとも原因の一つであろう（２４）。従前の研究によって、ＮＧＦ、ＢＤＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４等の神経栄養因子、ネトリン−１等の化学遊走物質は、神経突起の伸出を誘導し又は軸索の誘導を制御できることが示されている（３、４５）。
【０００６】
哺乳類の神経細胞株では、Ｃｄｃ４２とＲａｃはＲｈｏに対して拮抗的に作用するようである。Ｎ１Ｅ−１１５神経芽細胞中にＣｄｃ４２とＲａｃの活性変異体を構成的に導入することによって、神経突起の形成（４０、５１）と発育途上の成長円錐中での糸状仮足および膜状仮足の生成（１９）とを引き起こすのに対して、Ｃｄｃ４２とＲａｃのドミナントネガティブ変異体を導入すると、Ｎ１Ｅ−１１５細胞とＰＣ１２細胞中での神経突起の伸出が阻害される（８、１９、４０、５１）。これに対して、活性化されたＲｈｏＡＶ１４はＰＣ１２細胞とＮ１Ｅ−１１５細胞中で神経突起の退縮を引き起こすが、ＲｈｏＡを阻害すると、Ｎ１Ｅ−１１５細胞中での神経突起の生成が刺激される（１１、１９、４９−５１）。これらの結果は、ＲｈｏＡの不活化により、Ｃｄｃ４２とＲａｃの活性化が実際に引き起こされて神経突起の生成がもたらされる（１９）ことを示唆している。かかる事実と符合して、Ｎ１Ｅ−１１５細胞は、血清の不存在下で成長させると神経突起を形成するが、血清の存在下で成長させると神経突起を形成しない。これは、おそらく、血清中の成分（特にＬＰＡ）がＲｈｏを活性化し、次いで、Ｃｄｃ４２とＲａｃに応答した神経突起の生成を遮断するためであろう（１９）。
【０００７】
Ｃｄｃ４２とＲａｃが、成長円錐の形成と神経突起の伸出を調節する形態的変化を制御する上で重要な役割を果たしているのは明らかであるが、神経細胞中でＧＴＰａｓｅが作用を発揮する機序は、なお完全には理解されていない。Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅに対する分子標的を同定し、性質を決定することは、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅが神経細胞及び非神経細胞の両者での細胞形態の調節をどのように行っているかを決定する上で重要な段階である。
【０００８】
セリン／スレオニンキナーゼの哺乳類ｐ２１活性キナーゼ（「ＰＡＫ」）ファミリーのメンバーは、ＲａｃとＣｄｃ４２に結合するが、Ｒｈｏには結合しないキナーゼのファミリーを構成している（概説として、（７、１７、４３）を参照）。ＰＡＫファミリーのメンバーは、アミノ酸配列に基づいて、２つのカテゴリーに分類することができる。第一のカテゴリーには、ヒトＰＡＫ１とＰＡＫ２及びマウスＰＡＫ３が含まれる。これらの各タンパク質キナーゼは、カルボキシル末端のキナーゼドメインとアミノ末端の制御ドメインとを有している。制御ドメイン内には、活性化されたＣｄｃ４２とＲａｃに結合するＧＴＰａｓｅ結合ドメイン（「ＧＢＤ」）が存在する。制御ドメインには、アダプタータンパク質Ｎｃｋと交換因子ＰＩＸ等のＳＨ３ドメイン含有タンパク質に結合する２乃至３つのプロリンに富む領域と（７）、Ｇタンパク質のβγサブユニットに結合することができるモチーフ（７）も含有されている。本ファミリーのメンバーは、全て配列が極めて似通っており、全体の配列同一性は７３％、キナーゼ及びＧＢＤドメイン内の配列同一性は約９２％である（４３）。このＰＡＫのサブファミリーのメンバーは、細胞の形態と細胞骨格の構成を制御する上で重要な役割を果たしていると考えられているが、これらは、Ｃｄｃ４２とＲａｃによって誘発される細胞骨格効果を特異的に媒介しているのではないと思われる（１３、２１、４４、４６）。
【０００９】
ＰＡＫ４は、その配列に基づいて、ＰＡＫの第二カテゴリーに属することが明らかとなった最初のＰＡＫファミリーのメンバーである（１）。ＰＡＫ４は、アミノ末端のＧＢＤとカルボキシル末端のキナーゼドメインとを含有するが、ＰＩＸ又はＮｃｋには結合せず、Ｇタンパク質βγ−結合モチーフを有しない（１）。さらに、ＰＡＫ４のＧＢＤとキナーゼドメインは、他のＰＡＫのドメインと約５０％の同一性を有するにすぎず、ＧＢＤの外側にあるＰＡＫ４の制御ドメインは、他のＰＡＫとは完全に異なっている（１）。他のＰＡＫとは異なり、ＰＡＫ４は、Ｃｄｃ４２と糸状仮足の形成を結び付けることが示されている（１）。糸状仮足の形成に加え、ＰＡＫ４は、他の機能も有している可能性がある。例えば、構成的に活性なＰＡＫ４変異体は、張繊維の分解と局所接着も引き起こすが、これらは、ＲｈｏＡの活性を阻害することによって行われている可能性が最も高い（３６）。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、哺乳類のＰＡＫ５ドメインをコードする配列を含む単離された核酸（但し、該核酸は完全長のヒトＰＡＫ５をコードしない）を提供する。
本発明は、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインと哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインとをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードしない配列を含む核酸も提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインと哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードしない配列を含む核酸を提供する。
さらに、本発明は、哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインと哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインをコードしない配列を含む核酸を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、哺乳類のＰＡＫ５をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする単離された核酸を提供する。
さらに、本発明は、外来制御要素に作用可能に連結された哺乳類のＰＡＫ５コード配列を含む核酸を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、内在制御要素に作用可能に連結された哺乳類のＰＡＫ５コード配列を含む核酸を提供する。
さらに、本発明は、（ａ）前記タンパク質をコードする核酸のうちの１つ、又は（ｂ）これらにハイブリダイズする核酸をコードする核酸を備えたベクターを提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、制御要素が連結された前記核酸のうちの１つを備えた細胞を提供する。
さらに、本発明は、前記各核酸によってコードされるタンパク質を提供する。
さらに、本発明は、各々が前記核酸のうちの１つ又は前記タンパク質のうちの１つとともに薬学的に許容される担体を含んだ組成物を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、適宜前記核酸又はタンパク質を用いて細胞を制御する方法を提供する。これらの方法には、哺乳類細胞による突起形成を誘導する方法および阻害する方法、哺乳類細胞中で細胞骨格を再編成させる方法、哺乳類細胞上へのラッフルの形成を誘導する方法および阻害する方法、哺乳類細胞の遊走を誘導する方法および阻害する方法、並びに哺乳類細胞の増殖を誘導する方法および阻害する方法が含まれる。
【００１６】
さらに、本発明は、前記核酸のうちの１つを用いて、哺乳類のＰＡＫ５をコードするＤＮＡ分子の転写を阻害する方法を提供する。
さらに、本発明は、前記核酸分子のうちの１つを用いて、哺乳類のＰＡＫ５をコードするｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する方法を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、被処置対象における神経細胞の伸出部を増加させる方法であって、前記被処置対象における神経細胞の伸出部を増加させるのに有効な量の前記組成物のうちの適切なものを１つ、前記被処置対象に投与することを備えた方法を提供する。
さらに、本発明は、被処置対象における神経細胞の伸出部を阻害する方法であって、前記被処置対象における神経細胞の伸出部を阻害するのに有効な量の前記組成物のうちの適切なものを１つ、前記被処置対象に投与することを備えた方法を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、哺乳類細胞の突起形成能の減少がＰＡＫ５の上流又はＰＡＫ５のレベルでのシグナル伝達の遮断によるものであるか否かを決定する方法であって、（ａ）ＰＡＫ５を前記細胞中に導入することと、（ｂ）哺乳類細胞の突起の数が増加しているかどうかを測定することとを備え、増加していれば、前記細胞の突起形成能の減少が、ＰＡＫ５の上流又はＰＡＫ５のレベルでのシグナル伝達の遮断によるものであることを意味する、方法を提供する。
【００１９】
最後に、本発明は、体細胞が、ＰＡＫ５をコードするＤＮＡを欠如しているヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
定義
本出願で使用する以下の各用語は、本明細書中に明示的に別段の記載がなされている場合を除き、以下に記された意味を有するものとする。
【００２１】
「投与する」とは、当業者に知られた任意の様々な方法や送達システムを用いて実行又は実施される送達を意味する。投与は、例えば、静脈内、心膜、経口、経インプラント、経粘膜、経皮、筋肉内、皮下、腹腔内、鞘内、リンパ内、病巣内、又は硬膜外から実施することができる。投与は、例えば、一回、複数回、及び／又は一若しくは複数の長期間にわたって実施することができる。
【００２２】
「細胞骨格の再編成」とは、細胞の細胞質フィラメント又はミクロフィラメントの変化を意味するものとする。細胞骨格の再編成には、単量体のＧアクチンに対する繊維状Ｆアクチンの比率の増加、凝縮したアクチン層の形成、及び細胞内アクチンの多量体化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
「免疫細胞」とは、免疫反応に特異的に関与する細胞を意味するものとし、Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンパ球、抗原提示細胞、及びマクロファージが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
「翻訳を阻害する」とは、翻訳の量若しくは速度を減少させること、又は翻訳を完全に停止させることを意味するものとする。
「発現を阻害する」とは、発現の量若しくは速度を減少させること、又は発現を完全に停止させることを意味するものとする。
【００２５】
「哺乳類の細胞」とは、あらゆる哺乳類の細胞を意味するものとする。哺乳類の細胞には、正常な細胞、異常な細胞、及び形質転換された細胞が含まれるが、これらに限定されず、例えば、神経細胞、上皮細胞、筋肉細胞、血液細胞、免疫細胞、幹細胞、骨細胞、内皮細胞、及び芽細胞が挙げられる。
【００２６】
細胞の「遊走（migration）」とは、ある地点から別の地点へと細胞が移動し又は伸長することを意味するものとする。
「神経突起の伸出部（neurite outgrowth）」とは、例えば軸索や樹状突起等の神経細胞から伸出した部分を意味するものとする。
【００２７】
「伸出部（outgrowth）」とは、細胞に関して用いた場合、細胞の本体から伸長した突起を意味するものとする。伸出部には、長い紡錘突起（spindle process）、短い紡錘突起、長い厚突起（thick process）、短い厚突起、長い薄突起（thin process）、短い薄突起が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
「ＰＡＫ５キナーゼ基質」は、ＰＡＫ５によってリン酸化され得る基質を意味するものとする。ＰＡＫ５キナーゼ基質には、ＰＡＫ５及びヒストンＨ４が含まれるが、これらに限定されるものではない。
「ＰＡＫ５キナーゼ活性」とは、ＰＡＫ５キナーゼ基質のＰＡＫ５によるリン酸化を意味するものとする。
【００２９】
「薬学的に許容される担体」は、当業者に周知であり、０．０１−０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液又は０．８％の生理的食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、このような薬学的に許容される担体は、水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンであり得る。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルがある。水性担体には、水、生理的食塩水や緩衝化された溶媒を含む、アルコール溶液／水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、又は不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、リンゲルのデキストロースを基礎とするもの等の液体及び栄養素補給物、電解質補給物等が含まれる。防腐剤やその他の添加物、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等が存在してもよい。
【００３０】
「突起（protrusion）形成」とは、細胞に関して用いた場合、細胞表面から生じたあらゆる外側への成長を意味するものとする。突起形成には、糸状仮足（filipodia）、膜状仮足（lamelopodia）、伸出部（outgrowth）、及びスパイク（spike）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
「ラッフル（ruffle）形成」とは、細胞に関して用いた場合、細胞の先端に突出（projection）が形成されることを意味する。ラッフル形成は、特に、ゆっくり進んでいる細胞中に観察され、これは波打っているように見える。
【００３２】
「スパイク」とは、細胞に関して用いた場合、細胞の先端から生じた突出（projection）を意味するものとする。スパイクには、例えば、神経の成長円錐や、約１００ｎｍ×５−１０μｍのスパイクで、緩やかに束ねられたマイクロフィラメントによって支えられた「マイクロスパイク」が含まれる。
【００３３】
「被処置対象」は、任意の哺乳動物を意味し、マウス、ラット、イヌ、モルモット、ウサギ、及び霊長類が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、前記被処置対象はヒトである。
【発明の実施形態】
【００３４】
本発明は、１０の核酸を提供する。第一の核酸は、哺乳類のＰＡＫ５ドメインをコードする配列を含む単離された核酸（但し、該核酸は完全長のヒトＰＡＫ５をコードしない）である。前記第一の核酸の１つの実施形態では、前記ＰＡＫ５ドメインは、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン、哺乳類のＰＡＫ５制御ドメイン、及び哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインからなる群から選択される。
【００３５】
第二の核酸は、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメイン又は哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードしない配列を含む。
第三の核酸は、哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン又は哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードしない配列を含む。
【００３６】
第四の核酸は、哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン又は哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードしない配列を含む。
第五の核酸は、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインと哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードしない配列を含む。
【００３７】
第六の核酸は、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインと哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードしない配列を含む。
第七の核酸は、哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインと哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインをコードしない配列を含む。
【００３８】
前記第一、第五、第六、及び第七の核酸のある実施形態では、前記哺乳類のＰＡＫ５はヒトＰＡＫ５である。前記第一、第五、第六、及び第七の核酸の別の実施形態では、前記哺乳類のＰＡＫ５はマウスＰＡＫ５である。前記第一の核酸のある実施形態では、前記核酸はマウスＰＡＫ５をコードする配列を含む。
【００３９】
第八の核酸は、哺乳類のＰＡＫ５をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする単離された核酸である。第八の核酸のある実施形態では、前記核酸はＤＮＡである。第八の核酸の別の実施形態では、前記核酸はＲＮＡである。
【００４０】
第九の核酸は、外来制御要素に作用可能に連結された哺乳類のＰＡＫ５コード配列を含む。第十の核酸は、内在制御要素に作用可能に連結された哺乳類のＰＡＫ５コード配列を含む。第九及び第十の核酸のある実施形態では、前記核酸はＤＮＡである。第九及び第十の核酸の別の実施形態では、前記核酸はＲＮＡである。
【００４１】
さらに、本発明は、（ａ）前記第一、第五、第六、第七、第九、若しくは第十の核酸、又は（ｂ）前記第八の核酸をコードする核酸を備えたベクターを提供する。ある実施形態では、前記ベクターは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、及び真核細胞ウイルスからなる群から選択される。さらなる実施形態では、上記真核細胞ウイルスは、アデノウイルス又はレトロウイルスである。
【００４２】
本発明は、前記第九又は第十の核酸を有する細胞も提供する。該細胞のある実施形態では、前記細胞は、細菌細胞、真菌細胞、及び動物細胞からなる群から選択される。さらなる実施形態では、上記動物細胞は、神経細胞、上皮細胞、筋肉細胞、血液細胞、免疫細胞、幹細胞、骨細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される。
【００４３】
さらに、本発明は、前記第一乃至第七の核酸によってコードされる各タンパク質を提供する。
さらに、本発明は、各々が薬学的に許容される担体と前記核酸又はタンパク質のうちの１つとを含んだ組成物を提供する。
【００４４】
本発明は、前記核酸とタンパク質を用いて細胞に作用を及ぼす方法を提供する。便宜上、以下の核酸及びタンパク質を「誘導因子」と総称する。（ａ）哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン又は哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードしない配列を含む第一の核酸、（ｂ）前記第六、第九、及び第十の核酸、（ｃ）（ａ）の核酸によってコードされるタンパク質、（ｄ）第六の核酸によってコードされるタンパク質。さらに、便宜上、以下の核酸及びタンパク質を「阻害因子」と総称する。（ａ）（ｉ）哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメイン若しくは哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードしない配列、又は（ｉｉ）哺乳類のＰＡＫ５制御ドメインをコードするが、哺乳類のＰＡＫ５  ＧＴＰａｓｅ結合ドメイン若しくは哺乳類のＰＡＫ５キナーゼドメインをコードしない配列を含む第一の核酸、（ｂ）前記第五、第七、及び第八の核酸、（ｃ）（ａ）の核酸によってコードされるタンパク質、及び（ｄ）第五、第七、及び第八の核酸によってコードされるタンパク質。本明細書において、このような因子を含んだ組成物は、適宜、「誘導」又は「阻害組成物」と称する。
【００４５】
第一の方法は、哺乳類細胞による突起形成を誘導する方法であって、細胞による突起形成を引き起こすのに有効な量の誘導因子に細胞を接触させることを備えた方法を提供する。本方法のある実施形態では、前記突起はスパイク、伸出部、糸状仮足、又は膜状仮足である。好ましい実施形態では、前記伸出部は、神経突起の伸出部である。
【００４６】
第二の方法は、哺乳類細胞中で細胞骨格を再編成させる方法であって、前記細胞中での細胞骨格の再編成を引き起こすのに有効な量の誘導因子に前記細胞を接触させることを備えた方法である。
第三の方法は、哺乳類細胞上へのラッフルの形成を誘導する方法であって、前記細胞上へのラッフルの形成を誘導するのに有効な量の誘導因子に前記細胞を接触させることを備えた方法である。
【００４７】
第四の方法は、哺乳類細胞の遊走を誘導する方法であって、前記細胞の遊走を誘導するのに有効な量の誘導因子に前記細胞を接触させることを備えた方法である。
第五の方法は、哺乳類細胞の増殖を誘導する方法であって、前記細胞の増殖を誘導するのに有効な量の誘導因子に前記細胞を接触させることを備えた方法である。
【００４８】
第六の方法は、哺乳類細胞による突起形成を阻害する方法であって、前記細胞による突起形成を阻害するのに有効な量の阻害因子に前記細胞を接触させることを備えた方法である。本方法のある実施形態では、前記突起はスパイク、伸出部、糸状仮足、又は膜状仮足である。好ましい実施形態では、前記伸出部は、神経突起の伸出部である。
【００４９】
第七の方法は、哺乳類細胞中での細胞骨格の再編成を阻害する方法であって、前記細胞中での細胞骨格の再編成を阻害するのに有効な量の阻害因子に前記細胞を接触させることを備えた方法である。
第八の方法は、哺乳類細胞上へのラッフルの形成を阻害する方法であって、前記細胞上へのラッフルの形成を阻害するのに有効な量の阻害因子に前記細胞を接触させることを備えた方法である。
【００５０】
第九の方法は、哺乳類細胞の遊走を阻害する方法であって、前記細胞の遊走を阻害するのに有効な量の阻害因子に前記細胞を接触させることを備えた方法である。
第十の方法は、哺乳類細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞の増殖を阻害するのに有効な量の阻害因子に前記細胞を接触させることを備えた方法である。
【００５１】
さらに、本発明は、哺乳類のＰＡＫ５をコードするＤＮＡ分子の転写を阻害する方法であって、かかる阻害がなければＤＮＡの転写が可能な条件下で、前記第八の（「ハイブリダイジング」）核酸を前記ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせて、前記ＤＮＡ分子の転写を阻害することを備えた方法を提供する。
【００５２】
さらに、本発明は、哺乳類のＰＡＫ５をコードするｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する方法であって、かかる阻害がなければｍＲＮＡの翻訳が可能な条件下で、前記第八の（「ハイブリダイジング」）核酸を前記ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズさせて、前記ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害することを備えた方法を提供する。
【００５３】
さらに、本発明は、被処置対象において前記組成物を使用する方法を提供する。第一の方法は、被処置対象における神経細胞の伸出部を増加させる方法であって、前記被処置対象における神経細胞の伸出部を増加させるのに有効な量の誘導組成物を前記被処置対象に投与することを備えた方法を提供する。本方法のある実施形態では、前記被処置対象はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモット、及び霊長類からなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記被処置対象はヒトである。
【００５４】
第二の方法は、被処置対象における神経細胞の伸出部を阻害する方法であって、前記被処置対象の神経細胞の伸出部を増加させるのに有効な量の阻害組成物を前記被処置対象に投与することを備えた方法を提供する。本方法のある実施形態では、前記被処置対象はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモット、及び霊長類からなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記被処置対象はヒトである。
【００５５】
さらに、本発明は、哺乳類細胞の突起形成能の減少がＰＡＫ５の上流又はＰＡＫ５のレベルでのシグナル伝達の遮断によるものであるか否かを決定する方法であって、（ａ）ＰＡＫ５を前記細胞中に導入することと、（ｂ）哺乳類細胞の突起の数が増加しているかどうかを測定することとを備え、増加していれば、前記細胞の突起形成能の減少が、ＰＡＫ５の上流又はＰＡＫ５のレベルでのシグナル伝達の遮断によるものであることを意味する、方法を提供する。本方法のある実施形態では、前記細胞は、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞、モルモット細胞、又は霊長類細胞である。好ましい実施形態では、前記細胞は、ヒト細胞である。同じく好ましい実施形態では、前記細胞は、神経細胞、上皮細胞、筋肉細胞、血液細胞、免疫細胞、幹細胞、骨細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される。
【００５６】
最後に、本発明は、ＰＡＫ５をコードするＤＮＡが欠如した体細胞を有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。好ましい実施形態では、前記哺乳動物はマウスである。
本発明は、以下に記載されている実験の詳細を通じて、さらに深く理解されるであろう。しかしながら、当業者であれば、論述されている具体的な方法と結果は、特許請求の範囲にさらに完全に記載されている本発明を例示的に説明したものにすぎないことが容易に理解できるであろう。
【実験の詳細】
【００５７】
本発明は、ｐ２１活性化キナーゼ、ＰＡＫ５、および幾つかの細胞機能（細胞伸出、細胞遊走、細胞増殖、細胞突起形成および細胞骨格の再編成を含むが、これらに限定されない）を誘導し又は阻害することができる関連タンパク質をコードする新規核酸を提供する。ＰＡＫ５は、キナーゼドメインおよびＧＢＤモチーフがＰＡＫ４とおよそ８５％の配列相同性を有するが、残りの調節ドメインに関しては、ＰＡＫ４とは全く異なる。ＰＡＫ４と同様、予想アミノ酸配列に基づき、ＰＡＫ５はＰＡＫ群の第２のカテゴリーに分類される。しかし、ＰＡＫ４がほとんどの組織で発現されているのとは異なり、ＰＡＫ５は限られた組織でしか発現されず、特に脳において高い発現を示す。ＰＡＫ５がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）ＭＢＴと類似している（２８）ことから、これは非常に興味深い。ＭＢＴは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの脳の構造の１つであるきのこ体中での細胞の発生、増殖または生存において役割を有すると考えられている。注目すべきことに、ＰＡＫ５の発現により、Ｎ１Ｅ−１１５細胞中で糸状仮足形成と神経突起の伸出がともに引き起こされた。構成的に活性なＰＡＫ５は、野生型ＰＡＫ５よりもさらに劇的な効果を有しているのに対して、ドミナントネガティブＰＡＫ５突然変異体は神経突起の伸出を抑制した。ＰＡＫ５とは対照的に、活性型ＰＡＫ１は、これらの細胞における神経突起の伸出に対して何ら影響を示さなかった。本明細書中の結果から、神経突起の伸出促進に必要な細胞骨格変化をＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅが調節する際のシグナル経路において、ＰＡＫ５が重要なメディエーターであることが示唆される。
【００５８】
材料および方法
［ＰＡＫ５のクローニング］
新しいＰＡＫファミリーのメンバーを同定するために、Ｂｌａｓｔ  ｓｅａｒｃｈを用いてＥＳＴデータベースをスクリーニングした。ＥＳＴクローンｔｓ９７ｂ０５．ｘ１は、哺乳類ＰＡＫ４のキナーゼドメインのアミノ酸４８３から停止コドンまでと類似性を示した。対応するクローンの５’末端を得るために、テンプレートとしてヒト精巣全ＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。５’プライマーは、ＰＡＫ４のＧＢＤドメイン中の配列ＡＰＳＮＦＥＨ（配列番号５）に相当する縮重オリゴヌクレオチドであり、３’プライマー、ａｇｔａｇｇｇａｇｔｇｃｃａａｃｃａａｔ（配列番号６）は、ＰＡＫ４とは異なるｔｓ９７ｂ０５．ｘ１中の領域に相当するオリゴヌクレオチドであった。得られたＰＣＲ産物をクローニングし、配列を決定した。データベースをさらにスクリーニングすることにより、ＰＣＲ産物およびｔｓ９７ｂ０５．ｘ１はともに、ＫＩＡＡ１２６４に対するヒトｍＲＮＡと相同であることが明らかになった。切断されていない完全長のｃＤＮＡを得るために、ＫＩＡＡ１２６４の５’および３’末端に相当するオリゴヌクレオチドを用いてさらに別のＰＣＲ反応を行った。完全長ＰＣＲ産物をＰＡＫ５と名付けた。後に、ＰＡＫ５は、ＧｅｎＢａｎｋクローンＡＢＯ４０８１２とほぼ同一であることが明らかとなった。
【００５９】
［プラスミド］
ＰＡＫ５、ＰＡＫ５ＲＤおよびＰＡＫ５ＲＤΔＧＢＤをコードするｃＤＮＡを、Ｍｙｃエピトープタグを含有するｐＣＡＮ−Ｍｙｃ１発現ベクターのＣｌａＩとＥｃｏＲＩサイトとの間にサブクローニングした。アミノ酸１−４５１に相当するＰＡＫ５ＲＤは、キナーゼドメインを含まないＰＡＫ５のアミノ末端部分であり、ＰＡＫ５  ｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲにより得た。アミノ酸３１−４５１に相当するＰＡＫ５ＲＤΔＧＢＤは、キナーゼドメインおよびＧＢＤドメインの両方を欠き、ＰＡＫ５  ｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲにより得た。指定部位突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ｋｉｔ）により、ｐＣＡＮ−Ｍｙｃ１中に恒常的に活性なＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）を得たが、これは推定自己リン酸化部位であるアミノ酸６０２のセリンがグルタミン酸に、キナーゼドメイン中のアミノ酸５７３のセリンがアスパラギンに置換されている。ＰＡＫ５（Ｋ４７８Ｍ）も、指定部位突然変異誘発により得られたが、これはアミノ酸４７８のリジンがメチオニンに置換されている。また、ＰＡＫ５、ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）およびＰＡＫ５（Ｋ４７８Ｍ）をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）発現ベクター中のＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩＩサイトとの間にサブクローニングし、ＰＡＫ５−ＥＧＦＰベクターを得た。Ｍｙｃ−タグ付加ＰＡＫ４については、（１）で説明されている。ＨＡ−タグ付加ＪＮＫ、ＧＳＴ−ｃ−ＪｕｎおよびＭＥＫＫ１Δについては、（３１）で説明されている。ドミナントネガティブＪＮＫは、２箇所のリン酸化部位（Ｔｈｒ−１８３およびＴｙｒ−１８５）がそれぞれＡｌａおよびＰｈｅに置換されている点突然変異を有しており、（９）で説明されている。Ｃｄｃ４２Ｖ１２、Ｒａｃ  Ｖ１２およびＲｈｏＶ１４については、（３０）で説明されている。
【００６０】
［ノーザンブロット］
ヒト多組織ＲＮＡブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてノーザン分析を行った。製造元により推奨されている方法に従い、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った。ＰＡＫ４由来の配列またはＧｅｎＢａｎｋデータベース中の他のいかなる配列とも異なる、ＰＡＫ５キナーゼドメイン内部から得た４００ｂｐの断片をプローブとして用いた。ランダムプライミングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてプローブを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。
【００６１】
［オーバーレイアッセイ］
オーバーレイアッセイについては、（２７）で説明されている。以下、簡潔に説明を行う。２９３細胞に対して１０μｇの空のベクター、Ｍｙｃ−ＰＡＫ４またはＭｙｃ−ＰＡＫ５をトランスフェクトした。次に、ＰＡＫ４およびＰＡＫ５を抗−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて免疫精製し、免疫精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、ＰＶＤＦ膜に転写した。次に、その膜を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄およびブロッキングした。組換えＧＴＰａｓｅ（２μｇ）に予め［γ−３２Ｐ］ＧＴＰを添加しておき、前記ＰＶＤＦ膜とともに５分間インキュベートした。この膜を５分間洗浄し、フィルムに２時間曝露した。
【００６２】
［ＧＳＴ−Ｃ２１融合タンパク質の産生とＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅ活性アッセイ］
ＧＳＴ−Ｃ２１は、Ｒｈｏ結合ドメインから成るＲｈｏエフェクタータンパク質であるＲｈｏｔｅｋｉｎのＮ−末端９０アミノ酸を含有する。ＧＳＴ−Ｃ２１コンストラクトで形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）  ＢＬ２１を、６００ｎｍの光学密度が０．３０になるまで３０℃で培養した。Ｓａｎｄｅｒら（１９９９）が記述した方法にのっとって、融合タンパク質の発現と精製、およびＧＴＰａｓｅ活性のアッセイを行った。以下、簡潔に述べる。空のベクター、ＰＡＫ５または活性型ＰＡＫ５ベクターのいずれかとともにＭｙｃ−ＲｈｏＡ発現ベクターをトランスフェクションした２９３細胞から、細胞可溶化液を調製した。次に、グルタチオンを結合させたアガロースビーズと結合され、細菌で発現されたＧＳＴ−Ｃ２１融合タンパク質とともに、細胞可溶化液をインキュベートした。前記ビーズおよび結合したタンパク質を過剰量の溶解緩衝液で３回洗浄し、次にＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を用いて溶出した。Ｍｙｃタグに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、結合したＲｈｏＡタンパク質を分析した。可溶化液の一部を抗−Ｍｙｃ抗体を用いた直接のウエスタンブロッティング分析を行うために採取しておいた。
【００６３】
［組換えタンパク質の調製］
（４２）に記載されているように、組換えＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ、ＧＳＴ−Ｒａｃ１Ｖ１２およびＧＳＴ−Ｃｄｃ４２Ｖ１２を調製した。
【００６４】
［細胞培養およびトランスフェクション］
全ての細胞は、３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。１０％のウシ胎児血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含有するダルベッコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ‘ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））中で、２９３およびＮ１Ｅ−１１５細胞を培養した。２９３細胞におけるトランスフェクションでは、リン酸カルシウム沈殿法を用いて、１０ｃｍのプレート（集密度６０％）中の細胞に総量１０μｇのＤＮＡをトランスフェクトした。Ｎ１Ｅ−１１５細胞の場合、１０μｇ／ｍｌのマウス・ラミニン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を１時間３７℃で予め被覆しておいたカバーガラスを入れた３５ｍｍウェル（１ｘ１０４細胞／ウェルになるように播種）中で、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて４μｇのトータルＤＮＡを細胞にトランスフェクトした。
【００６５】
［ウエスタンブロット］
（１）に記載されているようにしてウエスタンブロットを行った。
【００６６】
［プロテインキナーゼアッセイ］
ＰＡＫ群によるヒストンＨ４（ＨＨ４）のリン酸化をアッセイするために、２９３細胞に対して１０μｇの空のベクター、Ｍｙｃ−ＰＡＫ４、またはＭｙｃ−ＰＡＫ５（野生型、または恒常的に活性な型）発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に細胞をＭ２緩衝液（３２）中に回収した。次に、Ｍｙｃエピトープタグに対して産生させた抗体（９Ｅ１０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびプロテインＡセファロースを用いて、およそ１００μｇの細胞抽出液から、ウエスタンブロット分析でアッセイした等量のＭｙｃ−タグ付加タンパク質を免疫精製した。４℃にて２時間インキュベーションを行った後、免疫沈降物をＭ２緩衝液で２回洗浄し、その後２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液で２回洗浄し、次に、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  β−グリセロールリン酸、１０ｍＭ  ＰＮＰＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２０μＭ  ＡＴＰ、および５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含有する緩衝液中で、２０分間、３０℃にて、５μｇのＨＨ４とともにインキュベーションを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液により反応を停止させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを行った。
【００６７】
ヘマグルチニン（ＨＡ）−タグ付加ＪＮＫのキナーゼ活性を分析するために、２９３細胞に対して、漸増用量のＭｙｃ−ＰＡＫ５（１、３および５μｇ）または、Ｒａｃ２Ｌ６１を含有する発現ベクター（２．５μｇ）またはＭＥＫＫ１Δ（２．５μｇ）の非存在下または存在下で、１０μｇの空のベクターまたは５μｇのＨＡ−タグ付加ＪＮＫ発現ベクターのいずれかをトランスフェクトした。各トランスフェクションにおけるＤＮＡの全量は、空のベクターを用いて１０μｇに保った。トランスフェクションから４８時間後に細胞を回収し、細胞可溶化液中のＨＡ−ＪＮＫの量をウエスタンブロットにより標準化した。次に、抗−ＨＡ抗体（１２ＣＡ５、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびプロテインＡセファロースを用いて、Ｍ２緩衝液中、４℃で２時間、およそ１００μｇの細胞可溶化液から等量のＨＡ−ＪＮＫを免疫精製した。次に、プロテインＡセファロースビーズをＭ２緩衝液で２回洗浄し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）と１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液で２回洗浄した後、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  β−グリセロールリン酸、１０ｍＭ  ＰＮＰＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２０μＭ  ＡＴＰ、および５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含有する緩衝液中で、２μｇの精製組換えＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎとともに、２０分間、３０℃でインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液により反応を停止させ、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを行った。ホスホイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）分析によりｃＪｕｎのリン酸化を定量した。
【００６８】
［免疫蛍光］
一過性トランスフェクション後、Ｎ１Ｅ−１１５細胞を３％  パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理し、５％ヤギ血清により２０分間室温でブロッキングを行った。Ｍｙｃ−ＰＡＫ５、Ｍｙｃ−ＰＡＫ５（Ｋ４７８Ｍ）、Ｍｙｃ−ＰＡＫ５ＲＤ、Ｍｙｃ−ＰＡＫ５ＲＤΔＧＢＤ、またはＭｙｃ−Ｃｄｃ４２Ｎ１７の存在を調べるために、マウス抗−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いて細胞を染色した後、ローダミンが抱合された抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＰＩＥＲＣＥ）とともにインキュベーションを行った。
【００６９】
［神経突起伸出スコアリングアッセイ］
３５ｍｍウェル中のマウス・ラミニンで前もって被覆したカバーガラス上でＮ１Ｅ−１１５細胞を培養し、４μｇの表記の発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションから２０時間後、蛍光顕微鏡によりＮ１Ｅ−１１５を調べ、トランスフェクショトされたプラスミドを含有する緑色蛍光細胞の存在を検出した。最低１細胞体の長さの神経突起様の構造を有するトランスフェクション細胞数を数え、トランスフェクションを行った全細胞に対するパーセンテージとして評価した。エピ蛍光装置および１０ｘの対物レンズを用いたカラーＣＣＤカメラが装着されているＮｉｋｏｎ  ＤＩＡＰＨＯＴ３００倒立顕微鏡か、又はＮｉｋｏｎ  ＯＰＴＩＰＨＯＴ−２蛍光顕微鏡および６０ｘの対物レンズを用いたデジタルカメラにより、細胞像を撮影した。
【００７０】
［ＰＡＫ５およびＰＡＫ４ノックアウトマウスの作製］
エクソン３（キナーゼドメインの不可欠な部分を含有する）をネオマイシン抵抗性遺伝子と置換して、ＰＡＫ５標的ベクターを作製した。このベクターを、ＥＳ細胞中にエレクトロポレーションし、Ｇ４１８抵抗性クローンを単離した。サザンブロット分析により、３個のクローンが所望の相同組換え現象を含有することが明らかとなった。これらのクローンを胚盤胞中に注入しキメラを作製した。次に、このキメラを交雑させて、ＰＡＫ５ヘテロ接合体を作製した。ＰＡＫ５ヘテロ接合体マウスを交雑させ、ＰＡＫ５ヌルマウスを得た。
【００７１】
エクソン３に代えてエクソン１が欠失した別の標的ベクターも作製した。エクソン１には、開始コドンおよびＧＴＰａｓｅ結合ドメインが含有される。上記と同様の操作を使用し、このベクターを用いてキメラを作製した。上記のように、これらのキメラを戻し交雑させれば、ＰＡＫ５ヘテロ接合体およびＰＡＫ５ノックアウトマウスが得られるであろう。
【００７２】
結果
［キナーゼ類のＰＡＫファミリーの新規メンバーであるＰＡＫ５の同定］
材料と方法の部で記述したように、ヒトＰＡＫ５  ｃＤＮＡをクローニングした。完全長ＰＡＫ５の配列および予想アミノ酸配列を図１に示す。本図では、アミノ酸１０−３０から構成されるキナーゼドメイン、アミノ酸４５２−７０２から構成されるＧＢＤドメインに下線が付されている。これらのドメインのアミノ酸配列と、ｈＰＡＫ４、ＭＢＴ、ｈＰＡＫ６およびｈＰＡＫ１のアミノ酸配列とを比較したところ、ＰＡＫ５がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＭＢＴタンパク質と驚くべき相同性を有するということが示された。ＭＢＴは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの脳の構造の１つであるキノコ体の中に発現されている。例えば、ＰＡＫ５キナーゼドメインは、ＭＢＴの同じドメイン（ＭＢＴのアミノ酸３７１−６２０）と８０％の配列相同性を有している。ＰＡＫ５がＰＡＫ４の同一ドメイン（ＰＡＫ４のアミノ酸３２４−５７３）と８４％の配列相同性を有することと比較して、このＭＢＴとの相同性は若干低いものにすぎず、ＰＡＫ６およびＰＡＫ１のキナーゼドメイン（ＰＡＫ１のアミノ酸２７３−５２３、およびＰＡＫ６のアミノ酸４２０−６５９より）との相同性がそれぞれ７６％および５７％であることと比較して著しく高い。ＰＡＫ５は、ＭＢＴのＧＢＤドメインとも、同様に高い配列相同性を有する。ＧＢＤドメインは、ＰＡＫ４（ＰＡＫ４のアミノ酸１０−３０）、ＭＢＴ（ＭＢＴのアミノ酸１０−３０）、ＰＡＫ６（ＰＡＫ６のアミノ酸１０−３０）およびＰＡＫ１（ＰＡＫ１のアミノ酸７４−９４）の対応するドメインと、それぞれ８６％、７６％、７０％および５７％の相同性を有する。ＧＢＤおよびキナーゼドメインの外側では、ＰＡＫ５とＰＡＫ４との間、又はＰＡＫ５と他の公知のあらゆるタンパク質との間には、ほとんど相同性がない。さらに、明確なＳＨ３ドメイン認識部位またはＰＡＫ１のものと同様のＧβγ結合ドメインは、ＰＡＫ５には明瞭に認められない。ＰＡＫ５のノーザン分析は、ＰＡＫ５が脳および膵臓中に発現されていることを示している。分析を行った他のいくつかのヒトの臓器中では、ＰＡＫ５は極めて少量しか検出されないか、あるいは全く検出されなかった（データは示さず）。
【００７３】
［ＰＡＫ５はＧＴＰ結合型ＲａｃおよびＣｄｃ４２Ｈと相互作用する］
配列解析により、ＰＡＫ５が、ＰＡＫ４のＧＢＤ／ＣＲＩＢモチーフと類似したＧＢＤ／ＣＲＩＢモチーフの候補を有することが示されている。ＰＡＫ４は、このドメインを通して、Ｃｄｃ４２と強く結合し、Ｒａｃへの結合はこれより弱い。ＧＴＰａｓｅ群とＰＡＫ５が相互作用するかどうかを調べるために、固定化したＰＡＫ４およびＰＡＫ５を含有するフィルターに、ＧＴＰを結合させたＲａｃ１Ｖ１２またはＣｄｃ４２Ｖ１２がプローブされたオーバーレイアッセイを使用した。本発明者らは、ＰＡＫ５がＣｄｃ４２およびＲａｃの両者と相互作用するということを見出した（図２）が、このことは、ＰＡＫ５がこれらのＧＴＰａｓｅ群の標的となることを示唆している。しかし、ＰＡＫ４と同様に、ＰＡＫ５は、ＲａｃよりもＣｄｃ４２と強固に相互作用するようであった。ＰＡＫ５は、ＧＴＰ−結合ＲｈｏＡには結合せず、ＧＢＤを欠くＰＡＫ５変異体（ＰＡＫ５ΔＧＢＤ）はＣｄｃ４２またはＲａｃに結合し得なかった。
【００７４】
［ＰＡＫ５は自己リン酸化および外来基質のリン酸化を行う］
以前、野生型ＰＡＫ４が自己リン酸化、およびヒストンＨ４（ＨＨ４）をリン酸化し得る（１）こと、恒常的に活性な型のＰＡＫ４であるＰＡＫ４（Ｓ４４５Ｎ）が野生型ＰＡＫ４よりも強いキナーゼ活性を有する（３６）ということが明らかとなった。ＰＡＫ４（Ｓ４４５Ｎ）は、推定自己リン酸化部位（アミノ酸４７４）にセリンからグルタミン酸への変異を有し、アミノ酸４４５のセリンがアスパラギンに変異されているが、これによって、触媒ループが安定化されると考えられている（３６、４８）。この突然変異体ではキナーゼ活性のレベルが上昇しているが、その基質特異性は変化しないと考えられ、非特異的な形態的変化を誘導しない（３６）。
【００７５】
ＰＡＫ５が同じように機能するかどうかを調べるために、Ｍｙｃ−タグ付加ＰＡＫ５発現ベクターまたはＰＡＫ４（Ｓ４４５Ｎ）と類似の突然変異を含有するＭｙｃ−タグ付加ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）を、２９３細胞にトランスフェクトした。Ｍｙｃ−タグ付加野生型ＰＡＫ４発現ベクターを比較のために用いた。等量のＰＡＫ５、ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）、およびＰＡＫ４（ウエスタンブロットにより定量した）を、細胞可溶化液から免疫精製し、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを含有するキナーゼ緩衝液中でヒストンＨ４（ＨＨ４）とともにインキュベーションを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー後、自己リン酸化およびＨＨ４リン酸化について分析した（図３Ａおよび３Ｂ）。この結果は、ＰＡＫ５およびＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）の両者が自己リン酸化およびＨＨ４のリン酸化を行い得ることを示しているが、ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）のキナーゼ活性は、野生型ＰＡＫ５よりも強かった（図３Ａ）。野生型ＰＡＫ５は、等量のＰＡＫ４よりも極めて強い活性を有していた。実際に、ＰＡＫ４の活性を検出するには、ＰＡＫ５の活性と比較して、オートラジオグラムを過剰曝露しなければならなかった（図３Ｂ）。
【００７６】
［ＰＡＫ５はＪＮＫ経路を活性化する］
アクチン細胞骨格の調節に加え、Ｃｄｃ４２Ｈ類およびＲａｃの機能の一つには、ＪＮＫ  ＭＡＰキナーゼ経路の活性化が挙げられる（２、４、６、３０、５２）。ＰＡＫ５はＲａｃおよびＣｄｃ４２と相互作用するので、ＰＡＫ５によるＪＮＫの活性化能を調べた。ＰＡＫ５  ｃＤＮＡを含有する漸増用量の発現ベクターとともにＨＡ−タグ付加ＪＮＫ発現ベクターを２９３細胞にトランスフェクトした。ポジティブコントロールとして活性型ＲａｃおよびＭＥＫＫ１発現ベクターを使用した。一過性発現後、細胞可溶化液からＪＮＫを免疫精製した後、基質としてＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎを用いたインビトロキナーゼ分析を行った。この結果から、野生型ＰＡＫ５の過剰発現によりＪＮＫ経路が活性化され、それがＲａｃによる活性化とほぼ同等の強さであったということが示された（図４）。これに対して、ＰＡＫ４によるＪＮＫの活性化は、Ｒａｃによる活性化より有意に弱かった（１）。ＰＡＫ５は、ＥＲＫ経路を活性化せず、ｐ３８経路に対する活性化も効率が低いものにすぎなかった（データは示さず）。
【００７７】
［ＰＡＫ５の発現により、Ｎ１Ｅ−１１５細胞中に糸状仮足および神経突起形成が誘導される］
ＰＡＫ５の発現によって、神経細胞中に形態的変化が促進されうるかどうかを調べるために、血清の存在下で培養したＮ１Ｅ−１１５神経芽細胞腫細胞に対して、改良型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）のみを含有する空のベクターまたはＥＧＦＰに融合させたＰＡＫ５またはＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）を含有する発現ベクターのいずれかを一過性トランスフェクトした。比較のために、活性型ＰＡＫ１（Ｔ４２３Ｅ）を含有するベクターを細胞にトランスフェクトした。ＥＧＦＰのみをトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクションしない細胞と同様の様相を呈した。ほとんどの細胞が丸い形態で、およそ７％が神経突起様伸長を示した。これに対して、ＰＡＫ５−発現細胞は、少なくとも３倍の数の細胞で神経突起様突起が見られた。最も注目すべきことに、ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）の発現により、およそ７０%のトランスフェクション細胞で長い神経突起様突起の形成が誘導された。ＰＡＫ５発現細胞およびＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）発現細胞の両方で、神経突起が見られなかった細胞の場合でも、糸状仮足の劇的な増加が見られた。ＰＡＫ５とは対照的に、ＰＡＫ１（Ｔ４２３Ｅ）の発現によって、これらの細胞中に糸状仮足または神経突起の形成は増加されなかった。６０倍で可視化された各条件の代表的な細胞を図５Ａに示す。図５Ｂには、空のベクターを発現する細胞、ＰＡＫ１（Ｔ４２３Ｅ）を発現する細胞、またはＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）を発現する細胞を１０倍の倍率で可視化した像が示されている。各条件下での神経突起を有する細胞のパーセンテージを図６Ａにまとめる。
【００７８】
Ｃｄｃ４２およびＲａｃ経路は、Ｎ１Ｅ−１１５細胞中でＲｈｏ経路と拮抗的に機能すると思われるが、この場合、Ｃｄｃ４２とＲａｃは神経突起伸出に必要でありＲｈｏは神経突起後退を引き起こす（１９、４０、５１）。ＰＡＫ５がＲｈｏと拮抗的に機能するのかどうかを明らかにするために、活性型ＲｈｏＡＶ１４ベクターとともにＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）を細胞にトランスフェクトした。ＲｈｏＡＶ１４の発現により、神経突起を有するＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）トランスフェクション細胞のパーセンテージが著しく減少した（図６Ａ参照）。これに対して、ＰＡＫ５およびＲｈｏ阻害剤Ｃ３トランスフェラーゼをトランスフェクトした細胞ではおよそ９０％で神経突起が見られた。ドミナントネガティブＪＮＫは、神経突起伸出に対する抑制効果を持たなかった（図６Ａ参照）が、ＭＥＫＫによるｃ−Ｊｕｎプロモーターの活性化は効果的に阻害した（データは示さず）。この結果は、Ｒｈｏ経路に対して拮抗的に機能し且つＪＮＫの活性化とは独立した経路によって、ＰＡＫ５が神経突起伸出を引き起こすことを示している。ＰＡＫ５が実際にＲｈｏＡ活性を阻害できるかどうかを調べるために、空のベクター、野生型ＰＡＫ５またはＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）のいずれかとともに野生型ＲｈｏＡを２９３細胞にトランスフェクトし、Ｒｈｏｔｅｋｉｎ結合アッセイによりＲｈｏＡ活性を評価した。図７で示すように、活性型ＰＡＫ５により、活性型Ｒｈｏ量が著しく低下したが、全ＲｈｏＡレベルに対する影響は全く見られなかった。
【００７９】
［Ｎ１Ｅ−１１５細胞における神経突起伸出にＰＡＫ５は必要である］
ＰＡＫ５が神経突起伸出に必要であるかどうかを調べるために、Ｎ１Ｅ−１１５細胞に対して、空のベクターまたは３つの異なるドミナントネガティブＰＡＫ５突然変異体のうち１つを含有するベクターのいずれかをトランスフェクトした。ＰＡＫ５（Ｋ４７８Ｍ）は、キナーゼドメイン中に単一の点突然変異を有しており、これによりキナーゼは不活性化される。ＰＡＫ５ＲＤはキナーゼドメインを欠失しており、ＰＡＫ４ＲＤΔＧＢＤはキナーゼドメインおよびＧＢＤドメインを欠失している。一過性トランスフェクション後、細胞を無血清培地に移して神経突起伸出を誘導し、７２時間後に細胞を観察した。空のベクターをトランスフェクトした細胞のうちおよそ７０％が神経突起を有していたが、各ドミナントネガティブ突然変異の発現により、神経突起を有する細胞のパーセンテージは減少した。ドミナントネガティブＰＡＫ５突然変異体による阻害レベルは、ドミナントネガティブＣｄｃ４２Ｎ１７の発現により得られた阻害レベルと同等であった。野生型ＰＡＫ５の発現は、神経突起伸出の阻害を全く引き起こさなかった。これらの結果を図６Ｂにまとめる。これらの結果を合わせると、ＰＡＫ５がＮ１Ｅ−１１５細胞における神経突起伸出誘導に必要かつ十分であるということが示される。
【００８０】
［ＰＡＫ５ヘテロ接合体マウスおよびノックアウトマウス］
方法の部で説明したようにして、ＰＡＫ５欠失についてヘテロ接合のマウスを作製し、ヘテロ接合体マウスを繁殖させて、ＰＡＫ５ヌルマウスを作製した。尾部ＤＮＡのＰＣＲ分析およびサザンブロット分析で評価した結果、２個体のＰＡＫ５ヘテロ接合体マウス間の交配により、野生型（＋／＋）、ＰＡＫ５ヘテロ接合体（＋／−）、およびＰＡＫ５ノックアウト（−／−）子孫が生まれた。脳由来の可溶化液をウエスタンブロット解析を実施すれば、（−／−）マウスではＰＡＫ５タンパク質が欠如していることが確認されるであろう。ＰＡＫ５（−／−）マウスは、生存能力を有しかつ繁殖能力を有する。
【００８１】
考察
本考察では、哺乳類ＰＡＫファミリーの新規メンバーであり、ＧＴＰ−結合Ｃｄｃ４２と特異的に相互作用し、これより弱くＲａｃと特異的に相互作用するＰＡＫ５の特性について記載する。ＰＡＫ５は、ＧＢＤおよびキナーゼドメインがＰＡＫ４と配列相同性を有するが、これらのドメインの外側では、これら２つのタンパク質キナーゼの配列類似性は非常に低い。ＰＡＫ４とは異なり、ＰＡＫ５は、限られた数の組織にしか発現されておらず、特に脳において高い発現性を示す。この点において、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ脳のキノコ体において細胞成長を調節していると考えられるキナーゼであるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＭＢＴと、ＰＡＫ５は配列類似性を有する（２８）ということは非常に興味深い。従って、ＰＡＫ５は、神経細胞において成長と形態を調節するＣｄｃ４２／Ｒａｃの標的の有力候補となる。
【００８２】
細胞骨格の組織化は、神経発生の重要な部分である。例えば、糸状仮足および膜状仮足は、誘引刺激に向かい、反誘引刺激から離れる神経細胞の成長円錐の誘導に重要な役割を果たしており、これらの糸状仮足および膜状仮足が安定すると神経突起伸長が起こる。これらの構造体が安定すると、次いで、新しい糸状仮足および膜状仮足の伸長が起こって神経軸策の誘導と成長のサイクルが継続可能となる（２４，３３）。糸状仮足および膜状仮足の形成は神経突起伸出および成長円錐の誘導にとって非常に重要であるため、これらの過程におけるＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅ群が果たしうる役割に非常に関心が向けられてきた。特に興味深いのはＣｄｃ４２およびＲａｃであるが、これらは線維芽細胞において糸状仮足および膜状仮足の形成を調節するタンパク質として最初に記載されたものである。続いて、Ｃｄｃ４２およびＲａｃの両者が、成長円錐の誘導および神経軸策伸長を含む神経発生の全局面で重要な役割を果たすことが明らかになった（２４）。
【００８３】
神経細胞中でＲｈｏ  ＧＴＰａｓｅ群により誘導される形態的変化を仲介するエフェクタータンパク質は、未だ明らかになっていない。ＰＡＫセリン／スレオニンキナーゼ群は、Ｃｄｃ４２およびＲａｃの直接的な標的であるため、有力な候補といえる。しかし、ＰＡＫ１、２、３は、これらのＧＴＰａｓｅ群により誘導される全ての細胞骨格変化には直接関係しないであろうし、ＰＡＫ１、２、３に結合し得ないＣｄｃ４２およびＲａｃのエフェクター突然変異体も、なお糸状仮足および膜状仮足を誘導しうる（１３、２１）。これに対して、新規ＰＡＫグループの中で初めて見出されたＰＡＫ４は、Ｃｄｃ４２に反応して直接糸状仮足形成を調節する。それ以前に同定されたＰＡＫ類と異なり、ＰＡＫ４は修飾されたＧＴＰａｓｅ結合ドメイン（ＧＴＰａｓｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ、ＧＢＤ）を有しており、ＰＡＫ１、２、３と結合しないＣｄｃ４２エフェクター突然変異体にさえ、このドメインを経由して結合することができる（１）。ＰＡＫ５は、特にＧＢＤおよびキナーゼドメインの配列がＰＡＫ４と非常に類似しているが、主に脳内で発現される。従って、本発明では、ＰＡＫ５は、神経突起伸出に関連するＧＴＰａｓｅ群の標的と想定されている。
【００８４】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＰＡＫおよびＭＢＴを含むＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＰＡＫファミリーのメンバーが神経発生に関連すると考えられているのに対し（１２、３４）、神経発生における哺乳類ＰＡＫの役割は良く分かっていない。活性型ＰＡＫ５の発現により、Ｎ１Ｅ−１１５細胞中で神経突起様伸長物の形成が激増することが明らかになった。神経突起が見られない一部のＰＡＫ５発現細胞でさえも、糸状仮足の形成が増加した。この糸状仮足の形成は神経突起形成における重要なステップである。従って、本結果から、実際にＰＡＫ５が神経細胞においてＣｄｃ４２と、おそらくＲａｃの主要な標的であり、糸状仮足および神経突起形成を調節していることが示唆される。先行研究により、ＰＡＫ１もＰＣ１２細胞において神経突起伸出を引き起こしうることが示されている。しかし、これには、膜標的配列を付加して膜に誘導させる必要があり、しかも、そのキナーゼ活性またはそのＣｄｃ４２／Ｒａｃ結合ドメイン（ＧＢＤ）を必要としない機序により引き起こされる。従って、ＰＡＫ１は、他のタンパク質を膜に動員する一種の足場タンパク質として機能するものと思われ（８）、動員されたタンパク質は神経突起の伸出を膜で促進することができる。本実験において、活性型ＰＡＫ１がＮ１Ｅ−１１５細胞中で神経突起伸出を促進しないことが明らかとなった。これに対して、ＰＡＫ５は、これらの細胞において糸状仮足形成および神経突起伸出の両方を明瞭に引き起こした。この場合、ＰＡＫ５を膜に誘導する必要がなく、神経突起伸出の程度がＰＡＫ５のキナーゼ活性レベルと直接関係していた。従って、本結果から、特異的に神経突起伸出と関連する標的タンパク質をリン酸化することにより、ＰＡＫ５がこれらの細胞の形態を調節しているということが示唆される。
【００８５】
ＰＡＫ５の基質とＮ１Ｅ−１１５細胞中でＰＡＫ５が神経突起伸出を引き起こす機序はまだ完全には解明されていない。１つの可能性としては、Ｃｄｃ４２およびＲａｃと同様、Ｒｈｏに対して拮抗的な機序によりＰＡＫ５が神経突起伸出を促進しうることが考えられる（１９、４０、５１）。恒常的に活性なＲｈｏ突然変異体であるＲｈｏＶ１４の過剰発現により、活性型ＰＡＫ５による神経突起形成が阻害されることが明らかとなったが、これは上記の事実と符合する。従って、ＰＡＫ５がＲｈｏの活性を阻害することにより機能を発揮しているのかを調べることは興味深いものとなろう。Ｃｄｃ４２およびＲａｃのように（２、４、６、３０、５２）、ＰＡＫ５がＪＮＫ経路を活性化することも明らかになった。しかし、ＪＮＫがＰＣ１２細胞の分化に関わっている一方で（１５、１６、２３）、Ｎ１Ｅ−１１５細胞の分化に対しては重要ではないということが示されており（４０）、キナーゼ不活性型ＪＮＫは、ＰＡＫ５により引き起こされた神経突起伸出に対して全く阻害効果示さないことが明らかとなった。従って、これらの結果からは、ＪＮＫはＰＡＫ５によって活性化される平行する経路の一部であり、形態的変化を導く経路の一部ではないということが示唆される。
【００８６】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのタンパク質であるＭＢＴは、特にキナーゼドメインおよびＧＢＤモチーフ内部の配列がＰＡＫ５と非常に類似している。興味深いことに、ｍｂｔ遺伝子の崩壊によりＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ脳のキノコ体の細胞数が減少する。従って、ＭＢＴは、神経細胞の増殖または生存の調節に関連しているといえる（２８）。発生中の神経系における細胞死が、ニューロンとその標的との不適切な連絡または連絡の欠如に起因する（４１）ことに着目することは興味深い。ＭＢＴの配列はＰＡＫ５と類似しているので、細胞が軸策を適切に成長させることができないために適切な連絡が起こらずに、ｍｂｔ突然変異体ハエで細胞死が起こりうる可能性があるのは、極めて興味深い。その他の可能性として考えられるのは、ＭＢＴおよびＰＡＫ５が特異的に細胞生存経路を誘発しうるということである。この点に関し、哺乳類細胞においてＪＮＫ経路が細胞成長の制御に関与しており（２９）、脳の様々な部分で生存およびアポトーシスの両方に寄与していると考えられる（２０）ので、ＰＡＫ５がＪＮＫを活性化したということは興味深いことである。
【参考文献】
【００８７】
2005518198.tif 000002
2005518198.tif 000003
2005518198.tif 000004
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2005518198.tif 000007
2005518198.tif 000008
2005518198.tif 000009
2005518198.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】ヒトＰＡＫ５の核酸配列とアミノ酸配列が示されている。アミノ酸配列の中で下線が付されている領域は、ＧＢＤドメイン（アミノ酸１０−３０）とキナーゼドメイン（アミノ酸４５２−７０２）に対応する。
【図１Ｂ】ＰＡＫ５のアミノ酸配列を複数の配列ＰＡＫ４とＰＡＫ６のアミノ酸配列と併置した図。同一部分は、強調表示されている。
【図１Ｃ】ＰＡＫ５のキナーゼドメインの一部を含有するｃＤＮＡを用いて、ヒトの複数組織ｍＲＮＡのノーザンブロットをプローブした。約５．５ｋｂのバンドが示されている。
【図１Ｄ−１】マウスＰＡＫ５の核酸配列とアミノ酸配列が示されている。
【図１Ｄ−２】マウスＰＡＫ５の核酸配列とアミノ酸配列が示されている。
【図１Ｄ−３】マウスＰＡＫ５の核酸配列とアミノ酸配列が示されている。
【図１Ｄ−４】マウスＰＡＫ５の核酸配列とアミノ酸配列が示されている。
【図２】ＰＡＫ４とＰＡＫ５は、活性化されたＲａｃおよびＣｄｃ４２と相互作用する。Ｍｙｃでタギングした以下のタンパク質：野生型ＰＡＫ４（Ｍｙｃ−ＰＡＫ４）、野生型ＰＡＫ５（Ｍｙｃ−ＰＡＫ５）、又はＰＡＫ５ΔＧＢＤをコードする等量の発現ベクターにより、２９３細胞をトランスフェクトした。一活性発現の後、マウス抗Ｍｙｃ抗体とプロテインＡセファロースを用いて、Ｍｙｃをタギングした前記タンパク質を細胞全体の可溶化液から免疫沈降させた。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。次いで、表記のごとく、精製ＲｈｏＶ１４、Ｒａｃ１Ｖ１２、又はＣｄｃ４２Ｖ１２を用いて、前記膜をプローブした。材料と方法に記載されているように、ＧＴＰａｓｅには［γ−３２Ｐ］ＧＴＰを予めロードした。前記可溶化液の一部を抗Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット分析（ＷＢ）に使用して、可溶化液中の各トランスフェクトされたタンパク質の量を測定した。
【図３】図３Ａ：ＰＡＫ５は自己リン酸化と、ヒストンＨ４（ＨＨ４）のリン酸化を行う。Ｍｙｃでタギングした以下のタンパク質：ＰＡＫ４、ＰＡＫ５、又はＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）のうちの１つを含有する等量のＧＦＰベクター又は発現ベクターのうち何れかにより、２９３細胞をトランスフェクトした。一活性発現の後、マウス抗Ｍｙｃ抗体でプローブしたウェスタンブロットによって、Ｍｙｃをタギングした前記タンパク質の量を標準化した。マウス抗Ｍｙｃ抗体とプロテインＡセファロースを用いて、概ね等量のＭｙｃ−ＰＡＫ４、Ｍｙｃ−ＰＡＫ５、及びＭｙｃ−ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）を細胞全体の可溶化液から免疫沈降させた。次いで、ヒストンＨ４及び［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとともに、インビトロキナーゼ緩衝液中で免疫複合体をインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）及びオートラジオグラフィー後に、基質のリン酸化と自己リン酸化を分析した。ＰＡＫ４、ＰＡＫ５、ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）の自己リン酸化とヒストンＨ４のリン酸化がともに示されている。パネルＡでは、ゲルを１５分間露光し、パネルＢでは、ゲルを２時間露光した。Ｍｙｃ−ＰＡＫ５とＭｙｃ−ＰＡＫ４の発現を示すウェスタンブロットが、一番下のパネルに示されている（１０％ゲル）。    図３Ｂ：ＰＡＫ５は自己リン酸化と、ヒストンＨ４（ＨＨ４）のリン酸化を行う。Ｍｙｃでタギングした以下のタンパク質：ＰＡＫ４、ＰＡＫ５、又はＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）のうちの１つを含有する等量のＧＦＰベクター又は発現ベクターのうち何れかにより、２９３細胞をトランスフェクトした。一活性発現の後、マウス抗Ｍｙｃ抗体でプローブしたウェスタンブロットによって、Ｍｙｃをタギングした前記タンパク質の量を標準化した。マウス抗Ｍｙｃ抗体とプロテインＡセファロースを用いて、概ね等量のＭｙｃ−ＰＡＫ４、Ｍｙｃ−ＰＡＫ５、及びＭｙｃ−ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）を細胞全体の可溶化液から免疫沈降させた。次いで、ヒストンＨ４及び［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとともに、インビトロキナーゼ緩衝液中で免疫複合体をインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）及びオートラジオグラフィー後に、基質のリン酸化と自己リン酸化を分析した。ＰＡＫ４、ＰＡＫ５、ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）の自己リン酸化とヒストンＨ４のリン酸化がともに示されている。パネルＡでは、ゲルを１５分間露光し、パネルＢでは、ゲルを２時間露光した。Ｍｙｃ−ＰＡＫ５とＭｙｃ−ＰＡＫ４の発現を示すウェスタンブロットが、一番下のパネルに示されている（１０％ゲル）。
【図４】ＰＡＫ５は、ＪＮＫ経路を活性化する。単独で又はＭｙｃをタギングしたＰＡＫ５（１、３、および５μｇ）を含有する発現ベクター若しくはＲａｃ２Ｌ６１（２．５μｇ）を含有する発現ベクター若しくはＭＥＫＫ１Δ（２．５μｇ）の量を増加させながら、空のベクター又はＨＡでタギングされたＪＮＫ（ＨＡ−ＪＮＫ）を含有する５μｇの発現ベクターにより、２９３細胞をトランスフェクトした。一活性発現の後、細胞を溶解し、マウス抗ＨＡ抗体でプローブしたウェスタンブロットによって、ＨＡ−ＪＮＫの量を標準化した。次いで、マウス抗ＨＡ抗体とプロテインＡセファロースを用いて、等量のＨＡ−ＪＮＫを細胞全体の可溶化液から免疫沈降させた。次いで、インビトロキナーゼ緩衝液中、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で、免疫沈降物を組換えＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎとともにインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーの後に、基質のリン酸化を分析した。ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎのリン酸化が示されている。数字は、ホスホイメージャー分析によって定量した、ＰＡＫ５、Ｒａｃ２Ｌ６１、及びＭＥＫＫ１ΔによるＪＮＫの活性化倍数を表している。
【図５】図５Ａ：ＰＡＫ５は、神経突起の伸出と糸状仮足を誘導する。ＥＧＦＰ（対照）、ＰＡＫ５、ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）、ＰＡＫ４、ＰＡＫ４（Ｓ４４５Ｎ）、又はＰＡＫ１（Ｔ４２３Ｅ）を含有する発現ベクターをＮ１Ｅ−１１５細胞中にトランスフェクトした。ＰＡＫ４とＰＡＫ５を含有するベクターを、１：３の比（ＥＧＦＰ：ＰＡＫ５）でＥＧＦＰベクターとともに同時トランスフェクトするか、ＥＧＦＰ融合体として発現させたが、ともに同様の結果を得た。ＰＡＫ１（Ｔ４２３Ｅ）はＥＧＦＰと同時トランスフェクトした。トランスフェクションから２０時間後に、蛍光顕微鏡により細胞を可視化した。次いで、１００倍の対物レンズを用いて、細胞の写真を撮影した。複数の細胞が示されている場合には、トランスフェクトされた細胞（蛍光顕微鏡によって観察された細胞）を矢印で示してある。空のベクターＥＧＦＰ、ＰＡＫ１（Ｔ４２３Ｅ）、又はＰＡＫ４でトランスフェクトされた細胞は、それぞれ、パネルａ、ｂ、ｃに示されている。糸状仮足が認められるが、神経突起は認められないＰＡＫ５、ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）、ＰＡＫ４（Ｓ４４５Ｎ）発現細胞の代表的な顕微鏡写真が、それぞれパネルｄ、ｅ、ｆに示されている。分化伸長した神経突起が認められる細胞の代表的な顕微鏡写真は、それぞれ、パネルｇ、ｈ、ｉに示されている。
【図６】神経突起の形成に対するＰＡＫ５の効果の定量。パネルＡでは、表記のごとく３倍過剰のドンミナントネガティブＪＮＫ、ＲｈｏＶ１４、又はＣ３トランスフェラーゼのうちいずれかとともに、表記のタンパク質をコードするＥＧＦＰ発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの後に、血清の存在下で細胞を増殖させた。神経突起を有する細胞を計数し、神経突起を有するトランスフェクト細胞のパーセントが示されている。ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）ベクターをＥＧＦＰベクターとともに同時トランスフェクトした場合、ＥＧＦＰ−ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）と同様の結果が得られた（データは示さず）。パネルＢでは、表記の発現ベクターによるトランスフェクションの後、無血清培地中で細胞を７２時間培養し、パネルＡと同様に、神経突起を有する細胞を計数した。各実験で、約１００個のトランスフェクト細胞が計数された。結果は、各条件につき少なくとも２つの独立した実験の平均である。
【図７】活性化されたＰＡＫ５は、Ｒｈｏ活性を阻害する。等量の空のベクター、野生型ＥＧＦＰ−ＰＡＫ５、又はＥＧＦＰ−ＰＡＫ５（Ｓ５７３Ｎ）発現ベクター（Ｍｙｃタグなし）のうち何れかとともに、野生型Ｍｙｃ−ＲｈｏＡ発現ベクターにより２９３細胞をトランスフェクトした。一過性発現の後、ＧＴＰ結合型ＲｈｏＡに特異的に結合するＧＳＴ−ローテキングルタチオンアガロース複合体とともに、細胞可溶化液をインキュベートした。次いで、複合体を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタン免疫ブロッティングにより、ＧＴＰ  ＲｈｏＡ含量を分析した。総ＲｈｏＡ含量が、一番下のパネルに示されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図１Ｄ−３】
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【図１Ｄ−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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