(57)【要約】識別可能な位置における単一の個々の生細胞を評価するためまたは識別可能な位置における細胞群を各々評価するために有用な相互作用型透明個別細胞バイオチッププロセッサー（ＩＴＩＣＢＰ）。【選択図】図４３ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
識別可能な位置における１個だけの個々の生細胞を評価するため、またはそれぞれが識別可能な位置における細胞からなる群を評価するための相互作用型透明個別細胞バイオチッププロセッサー（ＩＴＩＣＢＰ）装置であって、（ａ）それぞれが底部を有し、かつ１個だけの細胞または任意の規定された数の細胞または他の規定された粒子を保持するためにサイズが一致する光学的に透明なウエルを含有する透明な細胞チップ（ＴＣＣ）、（ｂ）細胞を導き、かつ細胞をウエル内に進入させるか、またはウエルに細胞を直接的に置くか、または細胞をウエルから除き、もしくは取り出すための手段；（ｃ）前記ＴＣＣに対するホルダー；（ｄ）固体、液体および細胞懸濁物をＴＣＣに移すための手段；（ｅ）個々の生存および／または非生存の細胞または細胞もしくは細胞フラグメントの群を移すための手段；（ｆ）他の細胞および／または特定の生物学的活性物質との接触の存在または不存在の結果として生じ得る細胞の形態学、細胞の活性、細胞の生理学、細胞の代謝、細胞の親和性および活力および変化を測定および評価するための手段；（ｇ）着色画像および走査電子顕微鏡画像を評価し、モニターし、かつ分析するための手段；（ｈ）装置の機能を制御し、個々の全体的な細胞および装置の状態および活動のそれぞれを記録し、データを分析し、かつ情報および結果を提供するためのコンピューター内蔵システム、を含む相互作用型透明個別細胞バイオチッププロセッサー（ＩＴＩＣＢＰ）装置。
【請求項２】
透明な細胞チップ（ＴＣＣ）は内部のウェブ担体を伴うまたは伴わないガラスから作製される請求項１に記載の装置。
【請求項３】
ＴＣＣは透明ポリマーから作製される請求項１に記載の装置。
【請求項４】
ＴＣＣはポリカーボネート、ナイロン、積層または非積層テフロン(登録商標)、酢酸セルロース、ガラス繊維、セルロースエステルおよびそれらに類似する材料および／またはそれらから誘導された材料からなる群から選択される材料から作製される請求項１または３に記載の装置。
【請求項５】
ＴＣＣは内部のウェブ担体を伴うまたは伴わない材料から作製される請求項１，３または４に記載の装置。
【請求項６】
ＴＣＣの少なくとも一部は多孔性または有孔性物質から作製される請求項１，３〜５のいずれかに記載の装置。
【請求項７】
ウエルは、多孔性物質から作られるとき、ウエルの底部または壁に位置された少なくとも一つの孔または穴を含む請求項１，３〜６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
ＴＣＣはウエルのアレイを含み、それらのそれぞれが規定された形状、構成、既知の場所および位置を有してもよい請求項１に記載の装置。
【請求項９】
ウエルの上面の形状は上面図でみると六角形である請求項８に記載のＴＣＣ。
【請求項１０】
ウエルの上面の形状は上面図でみると円形である請求項８に記載のＴＣＣ。
【請求項１１】
ウエルの上面の形状は上面図でみると正方形または長方形である請求項８に記載のＴＣＣ。
【請求項１２】
ウエルの上面の形状は上面図でみると三角形である請求項８に記載のＴＣＣ。
【請求項１３】
ウエルの上面の形状は上面図でみると不規則形状である請求項８に記載のＴＣＣ。
【請求項１４】
ウエルの寸法は、ウエルが個々の単一細胞、または任意の規定された数の細胞もしくは他の粒子を操作および評価のために保持および維持することができるものである請求項１または８に記載のＴＣＣ。
【請求項１５】
ウエルの寸法は、ウエルが一対の細胞を操作および細胞−細胞の相互作用の評価のために保持および維持することができるものである請求項１４に記載のＴＣＣ。
【請求項１６】
ウエルの壁は断面図において対称または非対称である請求項１および８〜１３のいずれかに記載のＴＣＣ。
【請求項１７】
ウエルの壁は断面図において可変勾配をとることができ、その可変勾配は垂直であるかまたは可変勾配を有する請求項１６に記載のＴＣＣ。
【請求項１８】
ウエルの縁は鋭い先端を頂点に形成する多角形の各側に沿ってナイフ縁のアーチ状にされた線から作製される請求項１および８〜１３のいずれかに記載のＴＣＣ。
【請求項１９】
鋸歯状の縁の先端は、液体がウエルの出入を自由にすることができ、しかも細胞のウエル中への移動を阻止することができるように設計されている請求項１８に記載のＴＣＣ。
【請求項２０】
ウエルの壁は透明であり、ウエルの底部は透明である請求項１および８〜１３のいずれかに記載のＴＣＣ。
【請求項２１】
ウエルの壁は不透明であり、ウエルの底部は透明であるかまたは黒色化されている請求項１および８〜１３のいずれかに記載のＴＣＣ。
【請求項２２】
ウエルの壁は黒色化され、ウエルの底部は透明であるかまたは黒色化されている請求項１および８〜１３のいずれかに記載のＴＣＣ。
【請求項２３】
平面が反射防止被覆（ＡＲＣ）で被覆される請求項１および８〜１３のいずれかに記載のＴＣＣ。
【請求項２４】
規定された高さを有する規定された数のスペーサが、カバープレートを支持しかつ従って正確な容量を包囲するＴＣＣから突出する請求項１または８に記載のＴＣＣ。
【請求項２５】
スペーサの数及びそれらのＴＣＣの面上の分布が予め定められている請求項２４に記載のＴＣＣ。
【請求項２６】
スペーサの高さおよび厚さが予め定められている請求項２４に記載のＴＣＣ。
【請求項２７】
ウエルは少なくとも一つの電極を含み、それは好ましくは透明であり、個々の細胞をウエル内において引き寄せ、反発させ、かつ位置決めさせる電場を含む（細胞位置決め電極と称する）請求項１または８に記載のＴＣＣ。
【請求項２８】
細胞位置決め電極はウエルの底部にまたはウエルの側壁に沿って位置される請求項２７に記載のＴＣＣ。
【請求項２９】
ウエルの側壁に沿って位置される三つの位置決め電極がある請求項２７に記載のＴＣＣ。
【請求項３０】
ＴＣＣは少なくとも一つの電極を構成するカバーガラスを含み、それは好ましくは透明であり、個々の細胞をウエル内において引き寄せ、反発させ、かつ位置決めさせる電場の誘導において正確に位置決めする電極とともにまたはそれとは別個に作用する（プレート位置決め電極と称する）請求項２７に記載のＴＣＣ。
【請求項３１】
ＴＣＣは少なくとも一つの電極を構成するカバーガラスを含み、それは好ましくは透明であり、個々の細胞をウエル内においてそれらの二つの回転軸で回転させる電場の誘導において正確に位置決めする電極とともにまたはそれとは別個に作用する（回転電極と称する）請求項２７に記載のＴＣＣ。
【請求項３２】
ＴＣＣは電極のアレイを構成するカバーガラスを含み、それは好ましくは透明であり、個々の細胞、または細胞群をＴＣＣの全空間内において移動、位置決めまたは回転するように使用されうる静的または動的電場線の誘導において正確に位置決めする電極とともにまたはそれとは別個に作用する（操作電極と称する）請求項２７に記載のＴＣＣ。
【請求項３３】
ウエルは少なくとも一つのバイオセンサー電極を含み、それは好ましくは透明であり、細胞から放出された物質または細胞に影響を与える生物学的に活性な物質の検出および定量の役割を果たす（反応電極と称する）請求項１または８に記載のＴＣＣ。
【請求項３４】
バイオセンサー電極はウエルの底部またはウエルの側壁に沿って多く位置される請求項３３に記載のＴＣＣ。
【請求項３５】
ウエルの側壁に沿って位置される三つの反応電極がある請求項３３に記載のＴＣＣ。
【請求項３６】
反応電極は反応応答を処理および定量されうる信号に変換する変換システムとして作用しうる請求項３３〜３５のいずれかに記載のＴＣＣ。
【請求項３７】
細胞応答は、処理および定量されうる信号に変換される物質、イオン、ラジカル、電子、熱、質量、光の変化を検出およびモニターすることによって測定および分析される請求項１または３６に記載のＴＣＣ。
【請求項３８】
反応電極の少なくとも一つは、認識可能な特定物質と特異的に反応するかまたは結合する生物学的または化学的に感受性のある材料で被覆され、続いて処理および定量されうる信号の生成を行う請求項３３〜３６のいずれかに記載のＴＣＣ。
【請求項３９】
反応電極は酵素、抗体、免疫原、抗原、リガンド、核酸、蛋白質、ペプチドおよび受容体からなる群から選択される化学的または生物学的に活性な物質で被覆される請求項３８に記載のＴＣＣ。
【請求項４０】
ウエルはＴＣＣの表面のような“丸い丘”を包囲する谷の間に最も近い交差点である請求項１または８に記載のＴＣＣ。
【請求項４１】
ＴＣＣは少なくとも一つの透明な基本単位（コインと称する）からなり、その上にウエルの少なくとも一つのアレイが位置される請求項１に記載の装置。
【請求項４２】
ウエルの場を含む任意の所望の形状を有する請求項４１に記載のコイン。
【請求項４３】
ウエルの場はウエルの任意の所望の形状、サイズ、数及びそれらの分布をとりうる請求項４２に記載のコイン。
【請求項４４】
ＴＣＣは液体の自由な通過を可能にするように設計された断面寸法（直径）を有するトンネルによって分離された多数の場（コイン）を含む請求項１，４２，４３のいずれかに記載の装置。
【請求項４５】
ＴＣＣは細胞の通過を阻止しながら液体の自由な通過を可能にするように設計された断面寸法（直径）を有するウエル間の微小トンネルを含む請求項１，４２，４３のいずれかに記載の装置。
【請求項４６】
ＴＣＣは共通の透明ベースを有する任意の規定された数のコインからなる請求項４１に記載の装置。
【請求項４７】
ＴＣＣはホルダーとは別個の部品またはホルダーの一体部分である請求項１に記載の装置。
【請求項４８】
ＴＣＣの表面を部分的にまたは完全に被覆するプレートを担持する手段を有する請求項１に記載のホルダー。
【請求項４９】
プレートは薄膜ガラスであり、好ましくはそれは光学顕微鏡検査に使用されるカバーガラスタイプからなる請求項４８に記載のホルダー。
【請求項５０】
プレートは透明ポリマー材料から作製される請求項４８に記載のホルダー。
【請求項５１】
プレートはウエル内に位置された位置決め電極とともに各ウエルとプレートの間に延びる間隙においてコンピューターによって制御される電場を誘導する少なくとも一つの電極を含む請求項４８に記載のホルダー。
【請求項５２】
コンピューターによって制御された誘導された電場は個々の細胞をウエル内に正確に位置させるためまたは細胞をウエルから引き上げるために使用される請求項５１に記載のホルダー。
【請求項５３】
細胞は前記誘導された電場と接線方向の洗浄の組合せを使用することによってそれらのウエルに配置またはそれらのウエルから除去されうる請求項１，５１，５２のいずれかに記載の装置。
【請求項５４】
細胞は沈降によってそれらのウエルに配置されうる請求項１に記載の装置。
【請求項５５】
細胞は光学ピンセットと接線方向の洗浄の組合せを使用することによってそれらのウエルに配置またはそれらのウエルから除去されうる請求項１に記載の装置。
【請求項５６】
必要により、ＴＣＣを保持しながら分離されたユニットとして操作される装置から除去され、装置へ再取付されることができる脱着自在のホルダーユニットを有する請求項１に記載の装置。
【請求項５７】
液体をＴＣＣへ移動するおよび／またはＴＣＣから移動するための手段を含む請求項１または５６に記載のホルダー。
【請求項５８】
移動される液体は細胞懸濁液、溶液および液体試薬である請求項５７に記載のホルダー。
【請求項５９】
細胞懸濁液は汎用目的の管または高度に精巧な管のいずれかでＴＣＣ中へ移動されるおよび／またはＴＣＣから移動される請求項５８に記載のホルダー。
【請求項６０】
個々の細胞を観察（視覚化）し、それらの形態を評価および分析するための手段を有する請求項１に記載の装置。
【請求項６１】
光学顕微鏡が個々の細胞及びそれらの形態を観察（視覚化）するために使用される請求項６０に記載の装置。
【請求項６２】
生物学的、化学的または任意の他の物質、または別の細胞との接触によって刺激、抑制を受けながら個々の細胞を同時に観察（視覚化）するための手段を有する請求項１に記載の装置。
【請求項６３】
同じ細胞を使用して二つ以上の測定を同時に行うことによって、単一の個々の細胞、または選択された個々の細胞群を評価するための手段を有する請求項１に記載の装置。
【請求項６４】
同じ単一細胞の透明画像および蛍光画像の両方が細胞の照明後に得られる請求項６３に記載の装置。
【請求項６５】
同じ単一細胞の透明画像および蛍光画像は細胞を照明し、好ましくは同じ個々の細胞の透明画像を得るための反射および屈折された光を同時に収集しながら、ＴＣＣの表面に平行な面から光ファイバーまたはレーザビームを使用し、前記個々の細胞から放出された蛍光を検出および記録した後、得られる請求項６４に記載の装置。
【請求項６６】
細胞の照明はコンピューター制御のアドレス指定可能なデジタルミラーディスプレイ（ＤＭＤ）アレイによって支配され、ＤＭＤのそれぞれ一つは独立して、細胞の照明の時間および量を制御するような方向および期間でウエル内に置かれた任意の個々の細胞または選択された個々の細胞群の方に進めるか又はそれから離れるようにしうる請求項６４または６５に記載の装置。
【請求項６７】
細胞の照明は、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）をＴＣＣの上部表面および下部表面のいずれかの上に使用すること、およびＬＣＤ画素のいずれかを選択的に切り換えることにより照明光が任意の所望の個々の細胞および／または所望の個々の細胞の群に到達できる能力を有することを含む請求項６４に記載の装置。
【請求項６８】
光ファイバーの束はＴＣＣ面の上部面または下部面のいずれかに取り付けられ、各ファイバーまたはファイバー群は照明光を細胞に別個にまたは結合して移すか、または細胞によって生成される光シグナルを拾い上げる請求項６４に記載の装置。
【請求項６９】
二次元マイクロレンズのアレイは、各マイクロレンズの焦点が識別可能でアドレス指定可能なウエルに位置された個々の細胞の方に向けられるような方法でＴＣＣの上部表面および下部表面上に位置される請求項６４に記載の装置。
【請求項７０】
マイクロレンズのアレイは任意の所望の波長のフィルターで被覆されるかまたは関連づけられる請求項６４に記載の装置。
【請求項７１】
透明、着色、ＳＥＭおよび蛍光画像および反応電極によって収集される電気化学データは同じ単一細胞の同時測定から得られる請求項６３に記載の装置。
【請求項７２】
生物学的に活発な懸濁物と接触した細胞は好ましくはＴＣＣの表面に平行な面から光ファイバーまたはレーザビームを使用して照明された後、個々の細胞から放出された蛍光を検出および記録し、同時に反応電極によって得られたデータを収集および記録し、同じ個々の細胞の透明画像を得るために反射および屈折光を使用する請求項７１に記載の装置。
【請求項７３】
同じ細胞を同じまたは異なる測定を行うために繰り返しまたは連続して使用することによって単一の個々の細胞または選択された個々の細胞の群を評価するための手段を有する請求項１に記載の装置。
【請求項７４】
特定の反応における同じ個々の細胞の関与は繰り返し測定され、動的項を含むいずれかの項で表現される請求項７３に記載の装置。
【請求項７５】
各ウエルの内部表面、またはウエルの群は規定された量の生物学的に活性な物質および／または任意の他の所望の物質で被覆または埋め込まれている請求項１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同定された同じ１個だけの細胞または異なる１個だけの細胞の活性を測定することにおいて適用可能な、細胞チップ装置上のラボと呼ばれる新世代のサイトメーターを提案する新しい相互作用型透明個別細胞バイオチッププロセッサー（ＩＴＩＣＢＰ）装置に関する。より詳細には、本発明の新しいＩＴＩＣＢＰ装置は、形態計測、蛍光、比色測定、反射率、電気化学的処理、ならびに化学および光学に基づく他の処理などの広範囲の方法を使用した、視覚的に観測可能な個々の細胞または細胞群の莫大な範囲の生理学的活性のオンライン測定を可能にする。新しい個別細胞プロセッサーのこれらの新しい能力により、初めて、集団における同じ個々の細胞を測定すること、および／または同定可能な細胞の群を測定することにおける形態計測パラメーター、蛍光測定パラメーター、比色測定パラメーターおよび生化学的（代謝的）パラメーターの使用が拡大される。
【０００２】
本発明のＩＴＩＣＢＰ装置は細胞生物学の領域において新しい範囲を開拓する。ＡＩＤＳ、ガン生物学、免疫学および出生前診断における分析細胞学の急速に拡大しつつある分野において、ＩＴＩＣＢＰ装置は、１個だけの生細胞における制御された生物学的プロセスを定量的に測定し、操作し、かつ調節することの必要性に対する１つの答えを提供すると考えられる。
【背景技術】
【０００３】
コンビナトリアル（生）化学は、多くの生物学的活性構造体および医薬品構造体の合成を可能にする不可欠な実用的手段として発展しており、それらの構造体はその後で動物およびヒトに対するその作用について調べなければならない。単一の個々の細胞に基づくアッセイの使用は現代および先進の生物医学研究における重要なツールである。さらに、細胞の機能は、多くの相互につながるシグナル伝達経路およびフィードバック経路から構成される。多くの場合、単離された標的または細胞懸濁物に基づく化合物の研究はこの複雑性を解明することができない。従って、化合物の作用を包括的に理解するためには、１個だけの完全な生細胞を調べることが必要である。そのような試験は、より安全な生成物を発見し、開発する際の助けに加えて、生物学的作用および毒性作用を検出する際の有用なツールを提供する。このことは、試験のために使用される動物の数の削減をもたらす、現在の毒物学試験に対する代替的な方法を示唆している。
【０００４】
化合物のスクリーニングのために無傷な個々の生細胞を使用することの利点には、下記が含まれる：
・試験された化合物の機能の効力が、１個だけの無傷な細胞に対するか、または１個だけの無傷な細胞の内部におけるその生物学的作用を観測および測定することによって最も良く推定され得る；
・細胞の細胞間分子相互作用が細胞の内部の「作用環境」の状況において評価され得る；
・毒性および非特異的作用が個々の細胞のレベルで同定され得る；
・選択的な細胞タイプに対する薬物作用が識別され得る；
・薬物の浸透が、１個だけの完全な細胞を適用する研究において評価され得る；
オーファン標的は、細胞に基づく機能的アッセイを必要とする；
・全細胞アッセイでは、タンパク質の精製工程＆発現工程が不要になる。
【０００５】
細胞に基づく多くのアッセイ手法が年々開発されており、今日では、最も多くの場合、一次スクリーニングからの「的中」を制限するためのリード物質の最適化および予測毒物学のために使用されている。例には、ウイルス力価アッセイ、ルシフェラーゼのような第２メッセンジャーアッセイ、および改良された蛍光シグナルアッセイが含まれる。それでもなお、これらのアッセイは、測定され得る最少サンプルサイズに制限があり、これらはどれも、個々の細胞に基づくアッセイ手法を可能にしていない。
【０００６】
生細胞の静的性質および動的性質が、現在、２つの主要な方法を使用して測定されている：（ａ）キュベット（巨視的ウエルアレイ）における全体的な測定、これは、全体としての集団のシグナル特性をもたらし、従って、好ましくは、非常に均一な集団を研究するために使用されている；（ｂ）フローサイトメトリーでは、測定が、その測定後に失われる移動しつつある単一細胞に対して行われている。従って、同じ個々の細胞に対する一連の連続した静的測定および動的測定を行うことは不可能である。フローサイトメトリーの装置および技術を開発および使用している多くの関係者は、細胞生物学および発生生物学、免疫学、腫瘍学ならびに薬理学の様々な領域における非常に重要な問題のいくつかが、非常に精巧なフローサイトメーターを使用した場合でさえ解決することができないという認識に至っている。その理由は、これらの機器では、様々な１回だけの事象が数マイクロ秒の間に１回だけ測定されるという事実が存在するということである。
【０００７】
抗原、発ガン因子、薬物、増殖因子およびホルモンにより誘導される細胞反応を理解するためには、数分間、数時間、そして数日間にわたってさえ様々なプロセスをモニターすることが必要である。これには、同じ細胞または細胞群に対する非侵入性の反復的な測定手段が要求される。従って、その測定された性質を、培養におけるその後の挙動および／またはさらなる物理的分析もしくは生化学的分析と相関させるために、細胞の生存性を維持し、そしてそれぞれの個々の細胞の位置を規定し、かつ保持することができることが必要である。
【０００８】
既存のサイトメトリー法の欠点を克服するために、それぞれの個々の生細胞を正確な位置に配置しなければならないという必要性によって促された３０年間の集中的な研究は成果をほとんどもたらしてない（ＦｒｅｅｄおよびＥｎｇｌｅ、１９６２；ＭａｎｓｂｅｒｇおよびＯｈｒｉｎｇｅｒ、１９６９；Ｔｏｍｅｉ他、１９８８；Ｓｈａｃｋ他、１９７９；Ｈａｒｔ他、１９９０；ＢｕｒｇｅｒおよびＧｅｒｓｈｍａｎ、１９８８；Ｇｒｅｅｎ、１９７９；ＫａｍｅｎｔｓｋｙおよびＫａｍｅｎｔｓｋｙ、１９９１；Ｒｅａｄ他、１９７９；Ｔａｎａｋａ他、１９７９；Ｂｏｄｄｉｎｇｔｏｎ他、１９６７；Ｄａｗｓｏｎ他、１９６７；Ｓｈａｐｉｒｏ、１９８３；ｄｅ  Ｇｒｏｏｔｈ他、１９８５）。
【０００９】
反復可能な個々の細胞の測定に対する必要性を取り組むことに成功した唯一のシステムがＣｅｌｌｓｃａｎ装置（ＤｅｕｔｓｃｈおよびＷｅｉｎｒｅｂ、１９９４）である。Ｃｅｌｌｓｃａｎ静的サイトメーターの心臓部は、マイクロエレクトロニクス製造において、そして透過電子顕微鏡グリッドを作製するために商業的に用いられているタイプの標準的な電気メッキ技術を使用して導電性材料（銅、ニッケルなど）から作製される細胞キャリアである。当該技術分野では知られているように、そのプロセスは、その最後の段階において、耐光性物質（誘電体）から作製されたスポットのアレイを上に有する、通常、銅から作製された導電性平面での電気分解による金属の析出を伴う。導電性平面の無スポット域に形成された析出金属は耐光性スポットを対称的に覆う。新しい析出金属層（約１０μｍの厚さ）を除き、そして復帰した耐光性スポットを溶解することにより、金属層を突き抜ける穴が形成される。穴の断面は、（直径が約７μｍの）円形の上部開口部と（直径が約３．５μｍの）円形の下部開口部とを有する円錐様である。
【００１０】
Ｓｅｌｌｓｃａｎの細胞キャリアでは、繰り返し行われる細胞観察および／または繰り返し行われる刺激、それに続くその後の分析のために戻すことができる既知の所在地において正確な大きさを有する穴の中にそれぞれの分離された細胞を置くことによって生物学的細胞を互いに分離することができる。
【００１１】
個々の細胞の活性を測定することにおけるＣｅｌｌｓｃａｎ装置およびその適用に関連する米国特許がいくつか存在する。より詳細には、それらの特許は、規定された位置に置かれた生細胞を細胞毎に個々に分析するための方法およびシステムを取り扱っている。
【００１２】
米国特許第４７２９９４９号は、繰り返し行われる細胞活性の測定および／または繰り返し行われる刺激、それに続くその後の分析のために戻すことができる既知の所在地において正確な大きさを有する穴（これは開口域と呼ばれる）の中にそれぞれの分離された細胞を置くことによって生物学的細胞を互いに分離することができることを提供する。より詳細には、この特許は、規定された位置に置かれた生細胞を細胞毎に個々に分析するための方法およびシステムを取り扱っている。それぞれの細胞に対する試験および作用が、試験時間を短くするために、かつ比較的非熟練者によって作業が行われることを可能にするために自動化して行われる。
【００１３】
米国特許第５２７２０８１号には、少なくとも１つの共通する光学的性質または電磁気学的性質または生物学的性質（米国特許第４７２９９４９号を参照のこと）を有する細胞を作製するための方法が明らかにされている。選択された生細胞は、キャリア上のすべての他の細胞から、または望ましくない生細胞をキャリアから除くことによって、または望ましくない生細胞をキャリア上で殺すことによって分離される。所望する選択された細胞は、キャリア上で、またはキャリアから除かれた後のいずれかで成長し続ける。
【００１４】
米国特許第５３１０６７４号および同第５５０６１４１号はともに、個々の生細胞（１つの開口域または穴あたり１個だけの細胞）を識別可能な位置に含有することができる、開口域を有する細胞キャリアに関する。これらの細胞キャリアにより、米国特許第４７２９９４９号の方法を実施することができる。すなわち、これらの細胞キャリアは、個々の細胞を既知の位置において捕捉し、それにより、少なくとも１つの細胞亜集団が、亜集団に共通する規定されたパラメーターを使用してより一般的な細胞集団から選択されることを可能にするために、そしてまた、生細胞の大きな群（例えば、１００００個以上の生細胞の群）の細胞毎の同時研究を可能にするために利用される。
【００１５】
一般に、これらの特許には、個々の細胞をキャリアの穴において識別可能な所在地に設置し、そして下記の操作：
ａ）生細胞の性質を観測または測定すること；
ｂ）（個体または亜集団としてではなく細胞キャリアを移動させることによって）生細胞を移動させること；
ｃ）生細胞を殺すこと
の１つ以上を細胞毎に行うための方法および装置が開示されている。
一般的に言えば、上記に示された一連の特許によれば、非常に多数の細胞、例えば、（細胞の一群または規定された集団を表す）血液中のリンパ球が、すべての他の細胞から、すなわち、細胞の異なる集団群から最初に分離される。分離プロセスの後、分離されたリンパ球は、選択された試験に同時に供され、その後、それぞれの細胞が、試験または刺激の結果として、特定の性質を示すか否かを明らかにするために別々に調べられる。前記性質を示すすべての細胞の所在地が記録される。従って、分離された細胞のすべてが調べられた後、特定の性質を示したすべての細胞の所在地が明らかにされる。これらの細胞は、リンパ球のより大きな集団全体におけるリンパ球の特定の亜集団を表す。
【００１６】
亜集団におけるそれぞれの細胞は、細胞の特有の知られている位置または所在地に対して研究用手段を向かわせることによって個々に調べられる（亜集団の一部でない他の細胞は無視される）。その結果、亜集団が同定されていると、その細胞のみが調べられ、それにより、研究時間が、注目される亜集団の細胞にだけ限定される。
【００１７】
最初の工程において、リンパ球が、血液に含有される細胞の残りから分離される。分離は、（上部がその底部よりも大きい開口部を有する開口域または穴が形成されている基部を含む）穴の開いた細胞キャリアによって行われる。開口域の形状は、キャリアの上部側と底部側との圧力差、または電磁力などの手段を加えることによって細胞をキャリアに対して効果的に保持することを可能にする。キャリアは、十分に規定されたサイズの穴を有するように選ばれ、その結果、様々な細胞群を含有するサンプル（例えば、血液）がキャリアに置かれたとき、穴のすべてではないが、穴のほとんどが、１つの穴について１個の細胞で、目的とする群の細胞によって効果的に占有されるようになる。このようにして、所望する細胞集団（例えば、７μｍのリンパ球）を、実質的な損傷を受けることなく容易に開口域に入れることができ、しかし、開口域に入ると、細胞はその中に保持され、キャリアの底部から抜け出ることができない。開口域のサイズは、所望する細胞が開口域に入ったとき、特に細胞全体が開口域において捕らえられ、保持され、従って、細胞が洗浄工程時に洗い流されないように、所望する細胞のサイズに関連させなければならない。
【００１８】
それにもかかわらず、上記の細胞キャリアには下記のようないくつかの大きな重要な欠点がある：
（ａ）生細胞が、その特徴的な円錐形断面のために細胞キャリア（ＣＣ）の穴に強固に捕捉され、その中で動くことができない。これは、何らかのさらなる処理のために細胞を取り出すことを含む、捕捉された細胞の何らかの機械的な操作を妨げる。
（ｂ）球状であるが、柔軟な生細胞が穴トラップの内部傾斜（湾曲）壁と接触する最大接線円周の下に始まる空間は、この空間への溶液の流出またはこの空間からの溶液の流入がいずれもできないので、何らかの生化学的操作を妨げている。従って、細胞球体の上半分の表面付近のみが色素および／または生化学物質の送達のために利用される状態のままである。例えば、細胞懸濁物において生じるプロセスと比較して、細胞染色速度、ならびに浸透している物質からの細胞内生成物の産生速度が強く影響を受ける（低下する）。同様に、同じ理由から、生成物の放出速度および漏出速度の測定が不正確になる。
（ｃ）ＣＣは不透明であり、そして各トラップの下部開口部（第２の断面）の直径は、捕捉された細胞の直径よりも小さくなければならないので、その場合、捕捉された細胞の像を決して視覚的に観測することができない。これは、多くの研究分野および適用分野では非常に大きな欠陥である。測定されたデータ（すなわち、蛍光強度（ＦＩ）、蛍光の偏光または異方性（ＦＰ）、蛍光寿命（ＦＬＴ）、蛍光偏光減衰（ＦＰＤ）、および電極に基づく反応）と、視覚的に観測されたデータ（すなわち、形態、形状、細胞内区画化など）とを相関させる方法がないからである。
（ｄ）ＣＣ上の穴トラップは一度も視覚的に観測することができない。結果として、偶然により、２つ以上の細胞が同じ穴トラップに捕捉されたとき、そのトラップから得られる測定データは区別することができず、かつ捕捉された細胞のいずれとも特異的に関連させることができない。
（ｅ）強い反射のために、黒色化ＣＣが使用されたときでさえ、ＣＣにおける１個だけの捕捉された細胞の散乱光の測定は実現されていない。
（ｆ）電気めっき技術の望ましくない欠点の１つが、米国特許第５５０６１４１号の図１９〜図２２において認めることができるように、平坦な空間（または非常に穏やかに湾曲した空間）が穴の間に生じるということである。通常、それらの全面積は、穴の上部開口部の全面積よりも４倍大きい。従って、負荷された細胞の大きな割合が、穴の内部ではなく、穴と穴との間に沈む。すなわち、負荷効率を低下させることは、サンプルサイズが限られているときには縮小するかもしれないが、細胞の無駄を生じさせる。
（ｇ）金属ＣＣにより誘導される捕捉細胞への毒性が、生理学的環境では金属イオンが放出されるために避けられない。これにより、捕捉された細胞の長期間にわたる測定、インキュベーションおよび／または成長が妨げられるか、または妨害される。純シリコンまたはシリコン誘導体でＣＣ表面を被覆しても、金属イオンがＣＣ底部（第２の面）からＣＣ穴の下部開口部を通って捕捉細胞に拡散するので、この毒性作用はなくならない。
（ｈ）穴トラップ壁ならびに中間域の滑らかさのレベルは、製造プロセスの固有的な限界のために極めて制限される（米国特許第５５０６１４１号における図２０〜２２、図３６および図３２を参照のこと）。インビボでの細胞の成長および増殖の経験則により、細胞担持表面が滑らかであるほど、その上部で細胞を培養できる可能性が大きくなると言われている。
（ｉ）ＣＣ金属表面の近く（近傍）における電磁気学的操作は、鏡作用のために極めて制限され、かつ不十分である。
（ｊ）金属トラップにおける微小電極の製造が不可能である。
（ｋ）米国特許第５５０６１４１号では、操作された生細胞における電場のいくつかの使用が議論されていた（第１４欄５２行〜第１６欄２１行）。これらの種類の使用の処理効率は、緩衝化する生理学的懸濁用媒体の遊離イオンにより生じる電気的遮蔽効果によって強く損なわれる。さらに、さらなる望ましくない作用が電気分解であり、これは、米国特許第５５０６１４１号（第１４欄６４行〜６５行）に、「駆動力としての電場の使用は電気分解の問題を生じさせ得る」と述べられているように、懸濁用媒体の特性を変化させ、細胞死を生じさせることがある。実際、このことが、その考えがこのＣＣに関して決して達成されていない理由であった。
【００１９】
上記に列挙された欠点を考慮に入れた場合、本発明の主要な目的の１つは、一段階手法、多段階手法、一連の同じ手法、または連続した異なる手法を使用して、１個だけの識別可能な個々の生存細胞における広範囲の機能を手作業または自動化のいずれかで観測し、測定し、研究し、試験し、評価し、モニターし、そして制御するための装置を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、個々の細胞の可視化を可能にし、その結果、形態学的に試験することができる透明な細胞チップ（ＴＣＣ）を有するサイトメーターを提供することである。本発明のさらなる目的は、なかでも、（生）化学的センサーとして機能する１つ以上の透明な微小電極を含有する製造されたウエルを伴うＴＣＣを有するサイトメーターを提供することである。さらに本発明のさらなる目的は、ウエル間にすき間がないか、またはウエル間のすき間が最小限である六角形ウエルを含むＴＣＣを有するサイトメーターを提供することである。
【００２１】
さらに本発明のかなり重要な目的は、個々の細胞溶解物に対してだけでなく、細胞に対する広範囲の様々な生物学的活性物質の作用を個々に調べながら明らかにするために、一般的には、何らかの測定可能な分光光学的特徴および電気化学的特徴および電磁気学的特徴（これらは静的および時間依存的である）を利用するスクリーニングプラットホームを提供することである。
【発明の開示】
【００２２】
本発明は、識別可能な位置における１個だけの個々の生細胞を評価するため、またはそれぞれが識別可能な位置における細胞からなる群を評価するための相互作用型透明個別細胞バイオチッププロセッサー（ＩＴＩＣＢＰ）装置であって、（ａ）それぞれが底部を有し、かつ１個だけの細胞または任意の規定された数の細胞または他の規定された粒子を保持するためにサイズが一致する光学的に透明なウエルを含有する透明な細胞チップ（ＴＣＣ）、（ｂ）細胞を導き、かつ細胞をウエル内に進入させるか、またはウエルに細胞を直接的に置くか、または細胞をウエルから除き、もしくは取り出すための手段；（ｃ）そのようなＴＣＣに対するホルダー；（ｄ）固体、液体および細胞懸濁物をＴＣＣに移すための手段；（ｅ）個々の生存および／または非生存の細胞または細胞もしくは細胞フラグメントの群を移すための手段；（ｆ）他の細胞および／または特定の生物学的活性物質との接触の存在または不存在の結果として生じ得る細胞の形態学、細胞の活性、細胞の生理学、細胞の代謝、細胞の親和性および活力および変化を測定および評価するための手段；（ｇ）着色画像および走査電子顕微鏡画像を評価し、モニターし、かつ分析するための手段；（ｈ）装置の機能を制御し、個々の全体的な細胞および装置の状態および活動のそれぞれを記録し、データを分析し、かつ情報および結果を提供するためのコンピューター内蔵システム、を含む相互作用型透明個別細胞バイオチッププロセッサー（ＩＴＩＣＢＰ）装置を提供する。
【００２３】
本発明により、新しい透明個別細胞プロセッサー（ＩＴＩＣＢＰ）装置が提供される。このインビトロでのハイスループット装置は、六角形アレイに非常に詰め込まれた識別可能な制御されたミクロンサイズの透明なウエルにおいて個々の生細胞を保存／保持することができる。細胞は、個々および／または群のいずれかで調べることができる。本発明のＩＴＩＣＢＰ装置は、なかでも、下記の機能および性質によって特徴づけられる：
１．ウエルにより保持および維持されながら個々の細胞を可視化し、その結果、形態学的に調べることができる非常に優れた透明性。
２．個々のウエルが、１つ以上の透明な微小電極を伴って製造され、一体化された適合し得る電子回路によって制御およびモニターされる。
微小電極は、細胞の電気的特徴の変化を検出する際に微弱な局限化収束交流電圧（ＣＡＶ）を加えて細胞の取扱いおよび保持（閉じ込め、移動、刺激、融合）を行うことにおいて有用である。また、好適な基質被覆微小電極（電気化学的バイオセンサー）は、様々な生成物の産生および分泌によって現れるような細胞の代謝活性を測定することにおいて有用である。
３．装置により、光学的ピンセットを利用する細胞の選別および分離が、上を通る洗浄、および／または制御されたレーザービーム出力による選択的な細胞殺傷と一緒に局所的な電位を加えることによって行われる。
４．ＩＴＩＣＢＰ装置は、同時に、かつ乱れない様式で、大きな細胞集団を細胞毎に収容することができる。例えば、ＩＴＩＣＢＰ装置は、それぞれが分離用溝を間に有する１５０ｘ１５０ミクロンサイズのウエルからなる９個の場を容易に含むことができ、従って、９個の場（それぞれの場が、同じまたは異なる起源および／またはタイプの２２５００個の個々の細胞で占められる）を少なくとも９個の異なる生物学的および／または生化学的および／または蛍光性の活性な作用剤に同時にさらすことができる。
５．細胞を、様々な生物学的活性物質（光活性化分子を含む）を含有し得るか、または様々な生物学的活性物質（光活性化分子を含む）で被覆され得る細胞キャリア（ＣＣＰ）のウエル内で増殖させることができる。
６．研究されているか、または調べられている個々の細胞における生化学的変化を、特異的な蛍光性レポーターを使用する蛍光測定によって、かつ／あるいは、特異的な基質による被覆を有する製造された透明な微小電極を利用して、細胞内代謝産物および／または細胞外代謝産物のいずれかに関連するデータを提供する電気化学的測定によって、その両方で、同時または連続的のいずれかで測定（またはモニター）することができる。
７．ＩＴＩＣＢＰ装置は、清浄化および滅菌化のいずれかが可能であり、従って再使用および／または廃棄可能であり得る。ＩＴＩＣＢＰ装置は、生物学および臨床および毒物学の研究室環境における広範囲の細胞機能研究のために設計されている。
８．ＩＴＩＣＢＰ装置およびアクセサリーは下記の２つのサブシステムから構成される：
ａ）光学ツール、電子的ツールおよび他の測定用ツール、ならびに制御、データ取得およびデータ分析のための手段を含有するＴＣＣプラットホームおよび装置の測定設備を含むサブシステム（これは、以降、「プラットホーム・測定システムと呼ばれる」）；
ｂ）それぞれの個々のウエルにおいて行われるコンピューター制御活動を含むサブシステム（これは、以降、ＩＴＩＣＢＰシステムと呼ばれる）。
【００２４】
ＩＴＩＣＢＰは、コンピューターにより制御されるステージに取り付けられ、研究されている細胞を質問地点（励起レーザービームの中心部または測定／観測／操作の場）に置くために配置される。それぞれの細胞の所在地は、ＩＴＩＣＢＰにおけるその位置によって決定される一方で、細胞が受ける一連の測定および操作を通して維持される。細胞をＩＴＩＣＢＰ上に保持することにより、様々な刺激を加えたり、または除いたりしながら、適した条件のもとで細胞を維持することができる。
図面の簡単な記述
図１は六角形のウエルから組み立てられたＴＣＣの部分上面図を例示する。
図２はＴＣＣのウエルの内部における個々の細胞（ウエルあたり１個の細胞）を示しており、この場合、細胞のウエル間の集積は不可能である。
図３は図２に示されるウエルの断面を示す。
図４は非常に詰め込まれた六角形の整列させられたウエルの上面図を示す走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を示す。
図５は図４のＳＥＭからの１つのウエルに注目する。
図６はウエル壁の鋭さを強調するＳＥＭの等角図を示す。
図７は１つのウエルの内部を占有する１個だけの細胞に注目する。
図８は平坦な底部を有するウエルの内部における細胞を示すＳＥＭ像を示す。
図９はＴＣＣのウエルの内部におけるＴジャーカット細胞の透過光画像（ｘ４０）を示す。占有率は９０％を越えている。
図１０及び１１はＴＣＣのウエルの内部における個々の生細胞（ウエルあたり１個だけの細胞）を視覚的に測定することができることを強調する透過光画像（ｘ１００）を示す。
図１２は集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。透過画像（ｘ４０）が示される。
図１３は集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。蛍光画像（ｘ４０）が示される。
図１４は集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。透過画像（ｘ１００）が示される。
図１５は集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。蛍光画像（ｘ１００）が示される。
図１６は１つのウエルにおける細胞間の相互作用を追跡することに関連する別の特有の特徴に注目する。写真の上部右隅に位置する、ウエルの内部における２つの相互作用している細胞が（透過光画像（ｘ１００）を使用して）示される。
図１７は１つのウエルにおける細胞間の相互作用を追跡することに関連する別の特有の特徴に注目する。蛍光画像（ｘ１００）を使用して、同じ１対の細胞が示される。
図１８は１つのウエルにおける細胞間の相互作用を追跡することに関連する別の特有の特徴に注目する。１５分の相互作用の後における同じ１対の細胞が示される。
図１９はウエルの内部における個々の細胞の着色された観察結果を提供する。ギムザ処理された細胞の着色画像が示される。
図２０はウエルの内部における個々の細胞の着色された観察結果を提供する。図１９の同じ細胞の細胞核および細胞膜が強調される。
図２１はウエルの内部における個々の細胞の着色された観察結果を提供する。図１９に記載されるように処理された細胞の高分解能拡大写真が示される。
図２２は細胞内オルガネラを調べるための画像分析（ＩＡ）ツールの使用を明らかにする。
図２３は非対称断面を有するウエルを示す。
図２４は非対称断面を有するウエルを示す。図２４では、垂直壁の一体化された一部として閉鎖用歯状物が含まれる。
図２５は階段様壁および対称断面を有するウエルを示す。
図２６は波形の反復する丸い丘のアレイを例示する。この場合、細胞は、丸い丘と丘との間に形成される谷に局在化する。
図２７は溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図２６の谷のＳＥＭ写真を示す。局在化前のリンパ球を示す。
図２８は溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図２６の谷のＳＥＭ写真を示す。局在化後のリンパ球を示す。
図２９は溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図２６の谷のＳＥＭ写真を示す。３つの無作為なリンパ球がそれらの位置に近く存在することを示す。
図３０は溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図２６の谷のＳＥＭ写真を示す。細胞−細胞の相互作用を調べるときには常に、ウエルあたり２つ以上の細胞を有することが、そのようなことが所望される場合には可能であることに関連する。
図３１は「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。丘の円形の円周と、少数の交点において保持または局在化されるリンパ球とを強調する波形丘アレイの上面図（ｘ４０）を示す。
図３２は「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。同じ現象がｘ１００で示され、この場合、細胞−細胞の相互作用に関する位置が観測されている。
図３３は「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。同じ現象が示され、この場合、細胞−細胞の相互作用に関する位置が観測されている。
図３４は「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。末梢血リンパ球と比較してサイズがより大きいＴジャーカット細胞が示される。
図３５は波形丘アレイ形態の蛍光画像を示す。
図３６は波形丘アレイ形態の着色画像を示す。細胞膜および核が着色画像において識別される。
図３７は装置の電気化学的測定能に関連する。図は、ウエルの内側表面に取り付けられるか、または置かれる円形の電極（２０）を含有するウエルを明らかにする。
図３８は１つのウエルの内部に多数の電極（２０ａおよび２０ｂ）を有することができることを示す。
図３９は細胞位置決め電極の様々な配置およびＣＡＶ回路の操作を例示する（図３９〜図３９ｆ）。
図４０は広範囲のウエル詰め込み形態を明らかにする。正方形型ウエルのアレイを例示する。
図４１は広範囲のウエル詰め込み形態を明らかにする。三角形型ウエルのアレイに関連する。
図４２は所定の数のウエルからなるマトリックスをその中心に有する透明なコインを例示する。この図は、透明な正方形コインが、１００ｘ１００のウエルからなるマトリックスに対する基部であることに関連する。
図４３は所定の数のウエルからなるマトリックスをその中心に有する透明なコインを例示する。この図は、透明な円形コインが同じウエルマトリックスに対する基部であることに関連する。
図４４は円形コインの表面図を示す。
図４５は円形コインの表面図を示す。互いに向き合うそのベルト壁に２つの開口部を有するコインホルダーを示す。
図４６はコインおよびそのホルダーの断面を示す。
図４７はコインおよびそのホルダーの断面を示す。細胞を負荷し、溶液を洗浄し、排出するための経路が例示される。
図４８はコインおよびそのホルダーの断面を示す。液体容器に注目し、これらは、ホルダーの内部に、そしてホルダーを横切って溶液を移動させるための好適な圧力を生じさせる。図４８ａ〜図４８ｉは穴あきＴＣＣを例示する。図４８ｂおよび図４８ｃは穴あきウエル壁を示す。図４８ｄおよび図４８ｅは、各ウエルの底部に穴が開いていることを明らかにする。図４８ｆおよび図４８ｇは、細胞の超音波処理前および超音波処理後における底部の穴あきウエルに注目する。図４８ｈおよび図４８ｉはＴＣＣにおける多孔性領域および非多孔性領域を記載する。
図４９はコインおよびそのホルダーに数タイプの溶液または異なる溶液を供給するためのマルチリザーバーシステムの上面図を例図する。
図５０はコインのアレイからなるＴＣＣ（ＭＣＡ）を示す。９個のウエル場の上面図を明らかにする。
図５１はコインのアレイからなるＴＣＣ（ＭＣＡ）を示す。同じ９個のウエル場の等角図を表す。
図５２はコインのアレイからなるＴＣＣ（ＭＣＡ）を示す。そのような場の拡大図を明らかにする。
図５３はコインのアレイからなるＴＣＣ（ＭＣＡ）を示す。そのような場の拡大図を明らかにする。
図５４は細胞をそのウエルから回収用の場に移すことに関連する。
図５５は細胞をそのウエルから特別設計のマクロウエルに移すことに関連する。
図５６はＴＣＣの表面において懸濁物および／または溶液を移動させるためのウエル間の通路を例示する。
図５７は液体が谷内を移動し、（ウエルとして役立つ）谷の交点における池として蓄積する、波形の丸い丘からなるＴＣＣを例示する。
図５８は液体が谷内を移動し、（ウエルとして役立つ）谷の交点における池として蓄積する、波形の丸い丘からなるＴＣＣを例示する。液体がその間で移動しない池が示される。
図５９はＴＣＣの下側から細胞を見るための概略的な光学系配置を示す。
図６０は照射面に直交して蛍光を検出するための概略的な光学系配置を示す。
図６１はＴＣＣの４つの側面に接続された光ファイバーリード線の４つの束を示す。
図６２はアドレス指定可能なデジタルミラーディスプレイを使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
図６３は液晶ディスプレイ技術を使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
図６４は光ファイバーを使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
図６５は一体化されたマイクロレンズアレイを使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
図６６は一体化されたマイクロレンズアレイを使用するＴＣＣウエルの照射を示す（図６６および図６６ａ）。
図６７は一体化マイクロレンズアレイおよびＣＣＤアレイを伴うＴＣＣを示す。
図６８は細胞の操作、走査、測定および分析を行う本発明のシステムの実施形態を示す。
図６９は細胞の操作、走査、測定および分析を行う本発明のシステムの実施形態を示す（図６９および図６９ａ）。
図７０は蛍光原性基質の細胞内回転を記述するための単純化されたモデルを示す。
図７１は染色プロトコルのシミュレーション結果をいくつか示す（図７１Ａ〜図７１Ｄ）。
図７２は実際の染色プロトコル実験の結果をいくつか示す（図７２Ａ〜図７２Ｄ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
Ａ章
ＩＴＩＣＢＰ装置：装置構造ならびに細胞の保持および取扱いおよび処理の原理
下記の章は、生物学的流体に含有される特定タイプの細胞からなる特定の集団を他の細胞集団から選択し、かつ分析するために本発明のＩＴＩＣＢＰ装置において用いられる主要な特徴に関する。また、特別な亜集団のさらなる選択を最初に選択された特定の集団から行うことができる。より詳細には、一例として、Ｔジャーカット細胞を選択し、かつ分析することが記載される。従って、本発明のＩＴＩＣＢＰ装置のウエルアレイにより、生存細胞の集団および亜集団が、それらのウエルの大きさおよび他の測定可能なパラメーターに従って、驚くべき程度の純度で他にないほど選択されることを理解しなければならない。
【００２６】
細胞毎の分析は、全体的な測定またはフロー測定と比較した場合、研究している現象の生物学的意味を理解することに対してはるかに多くの情報をもたらすことは明かである。
【００２７】
本発明は、ハイスループット様式および正確なプロセスで、さらなる分析のために個々の細胞を迅速に選択することを簡潔かつ非常に効率的に可能にする。同等に重要ではあるが、本発明は、システムおよび方法の両方に関して、それぞれの分離された細胞を、細胞の繰り返される観察および／または分析のために戻すことができる既知の所在地に置くことによって、生物学的細胞を相互に分離することを可能にする。
【００２８】
簡単に記載すると、本発明によれば、非常に多数の細胞、例えば、血液中のリンパ球、Ｔジャーカット細胞株、リンパ節細胞、腫瘍細胞、および他の代表する細胞群または細胞集団などを、選択された試験に同時に供することができ、その後、これらの試験および／または刺激に応答している細胞、すなわち、同じ特定の性質を有する細胞がさらなる分析のために分離される。前記の性質を示すあらゆる細胞の所在地が明らかにされ、かつ記録される。これらの選択された細胞は、例えば、リンパ球のより大きな群全体に含まれる特定のリンパ球亜群を表し得る。亜群における細胞が同定されると、細胞は、（そうすることが所望される場合には、リンパ球の残りと一緒に）、１つ以上のさらなる試験に供することができる。亜群内のそれぞれの細胞は、細胞の特徴的な知られている位置または所在地に対して研究用手段を向かわせることによって、個々に、探査し、分析し、かつ調べることができる。従って、亜群内の細胞が、特定の注目される性質を有するとしてさらに同定されると、その細胞は続いて調べられ、一方、その細胞の残りは、同じ亜群に属してはいるが、無視される。その結果、目的とする細胞が同定されると、その細胞のみがさらに研究されることになり、それにより、本当に注目される細胞からなる亜群に対して調査時間が限定される。さらに、調査は細胞毎に行われるので、より良好で、かつより正確なデータを、増大した診断精度のために得ることができる。
【００２９】
Ａ１．ＩＴＩＣＢＰ装置の説明
（ａ）透明な細胞チップ（ＴＣＣ）
下記では、ＩＴＩＣＢＰ装置の詳細な説明が、好ましい形式、形態、細胞の取扱い、観察、操作、制御、測定、データ集積、および装置の一体化された多機能的能力を含めて、議論され、かつ示される。図では、同じ構成要素が、異なる図に、または同じ図の異なる投影図に存在するとしても、同じ数字が、同じ構成要素を記載するために使用される。
【００３０】
調べられる細胞同士の分離は、「コイン」と名付けられたユニットに組織化されたウエルのアレイからなるＩＴＩＣＢＰ装置の透明な細胞チップ（ＴＣＣ）によって行われる。六角形のウエルから組み立てられる部分上面図が図１に示される。ＴＣＣは、ウエルの六角形形態のために高密度に詰め込まれたウエルを含有し、その場合、ウエルは、設計された有効直径を有し、所望する距離のピッチを有する。隣接ウエル間のすき間（１）および各ウエル内のすき間（２）はともに、図２に示されるように、１個だけの細胞（３）に関して適合するように設計される（時には、例えば、細胞−細胞の相互作用が調べられているときにはウエルあたり複数の細胞に関して適合するようにされる）。その間のすき間が十分に狭い六角形の高密度の詰め込み形態は、何らかの誘導された外部の力の非存在下、そして細胞をウエル間に留まらせることなく、細胞が沈降することによりウエルの占有を強制した。図２の断面が図３に示される。ウエルの深さ（ｈ）が、その中に保持される細胞のサイズによって規定される。ＴＣＣの深さ（Ｈ）は可変である。
【００３１】
本発明の顕著な特徴は、測定細胞の視覚的観測を可能にするために光学的に透明であり、かつ平坦になっている、ウエル（２）の底部（４）に関する。
【００３２】
図４は、高密度に詰め込まれ、整列させられた六角形ウエルの上面図を示す走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。倍率スケールが図の底部左側に示される。この例では、有効ウエル直径が２０μｍであり、ピッチ間隔が２０μｍであり、深さが１０μｍである。ウエル間のすき間（２）は明るい領域（１）である。１つのウエルをより拡大したＳＥＭ画像が図５に示される。ウエル壁が鋭いことが明かであり、１μｍ未満であるようである。少数のウエルの等角図が図６に示され、図７には、１個だけの細胞で占有された１個のウエルの等角図が示される。ここで、再度ではあるが、高密度の詰め込みが明瞭に明らかにされている。ウエルの断面（ＳＥＭ）が図８に示される。ウエル底部（４）の平坦さ、および光学的に非常に優れていることは、明かである。
【００３３】
最も簡便な細胞負荷法の１つは、ＴＣＣ表面を覆って細胞懸濁物を施すことである。負荷後直ちに（１０秒未満）、細胞は表面の上部に沈降し、前記の詰め込み形態のためにウエルの底部に沈降させられる。
【００３４】
図９は、上記の前記負荷法を行った５秒後に撮影されたＴジャーカット細胞の透過光画像（ｘ４０）である。占有率は９０％を越えており、占有率は、懸濁媒体における細胞濃度を制御することによって容易に前もって決定することができる。図１０および図１１は、それぞれがミクロペトリ皿様のウエルで取り扱われた個々の生細胞を視覚的に観測することができることを強調するさらなる透過光画像（ｘ１００）である。細胞内の区画化およびオルガネラ構造が明かである。
【００３５】
図１２〜図１５は、その識別を失うことなく繰り返し操作される一方で、集団内の全く限定できない同じ個々の細胞の透過画像および蛍光画像を示し得るＩＴＩＣＢＰ装置の他にない特徴を示す。図１２および図１３はＴジャーカット細胞の４０倍の倍率であり、これに対して、図１４および図１５は１００倍の倍率である。
【００３６】
ＩＴＩＣＢＰ装置は、細胞−細胞の相互作用を観測し、研究し、かつ追跡することを他にない様式で可能にする。図１６〜図１８は、キラー（エフェクター細胞）と標的細胞との間における相互作用の速度論を示す。図１６は、図の上部右隅に位置する、相互作用している細胞対の透過光画像を示す。最初の細胞付着が観測される。図１７は、同じ相互作用している細胞対の蛍光画像を明らかにし、一方、図１８は、約１５分後に撮影された同じ視野の写真を示す。実際、測定手順は下記のように行われた。最初に、ＦＤＡ染色された標的細胞が負荷された。次いで、いずれかの形態計測的パラメーターならびに生命活動に伴う蛍光パラメーター（蛍光強度、偏光、エネルギー転移など）のコントロール測定値が記録された。その後、ＦＤＡ染色されたエフェクター細胞（キラー）が標的細胞の上部に負荷され、形態計測データおよび蛍光データの両方が繰り返し記録され、これにより、エフェクター−標的細胞の相互作用の速度論が得られた。しかしながら、上記に記載された手順は一例であり、任意のタイプの細胞−細胞相互作用が検討および研究され得ることを指摘しなければならない。そのような研究のために、細胞対を保持するために特別に設計されたウエルを含有する特異的なＴＣＣを利用することができる。
【００３７】
細胞の相互作用を追跡することができることの重要性は、広域にわたり、かつ明かであり、説明を必要としない。薬物開発、特に、免疫性の調節において、そして同様に薬物抵抗性において役割を果たすそのようなタイプの薬物開発は、エフェクター−標的の相互作用と深く関連しており、製薬業界の場合と同様に基礎研究においても大きな意味を有している。明らかなことではあるが、形態計測的および蛍光の両方の指標および／またはパラメーターによって明らかにされるような集団における個々の細胞対の速度論に関する、同時に検討されている問題は、現在存在する精巧なフローサイトメーターによって、かつ／または改良された静的サイトメーターによって、そのいずれでも解決することができない。これに反して、ＩＴＩＣＢＰ装置およびＩＴＩＣＢＰ方法論は、彩色的観測を以前に議論された形態計測データおよび蛍光データに加えることを可能にする。
【００３８】
図１９〜図２１は、ウエル内に位置する個々の細胞の着色画像を示す。それぞれの個々の局在化した細胞の膜および核を区別することができる。実際、すべての所定の生命活動実験を終えた後、ウエル内の細胞は固定処理液にさらされ、その後、着色染色される。これらの特定の図には、ギムザ処理された細胞が示される。
【００３９】
本発明の分析能力が、ハイスループット作業での細胞内オルガネラの試験を可能にする画像分析（ＩＡ）ツールを適合させることによって著しく強化され得ることは明かである。図２２は、ウエル内に保持された個々の細胞に対して行われたＩＡの一例である。カラースペクトルにより、光学濃度のレベルが示される。同様に、すべての計画された組の生命活動測定を終えた後、ＴＣＣ上の細胞は、ＳＥＭ観察のために固定および調製することができる（図６および図７）。
【００４０】
（ｂ）ウエルの内部形態
図２３〜図２６には、ウエル内部の構造および形態が非常に万能的であることを強調するために、様々なウエルの断面の例がいくつか明らかにされる。
【００４１】
図２３は、透明な細胞チップ（ＴＣＣ）に非対称な断面を有するウエルを示す。ウエルの左側の壁（５）は、光学的に透明なウエル底部（４）に対して垂直であり、一方、反対側の壁は緩い傾斜を有する。この構造は、洗浄流（６）の方向が右から左であるとき、より良好に細胞をそのウエルの内部に維持および保持するために設計されている。図２４は、ウエルの垂直壁の一体化された一部としての閉鎖用歯状物（７）を例示しており、これにより、細胞をウエル内に維持および保持することを容易にするために、下側が切り取られた領域がその下にもたらされる。
【００４２】
図２５は壁様の階段を示す。
【００４３】
図２６は、波形の反復する丸い丘構造のアレイを例示しており、この場合、細胞が、ウエルの底部を表す「深い」谷（４）の交点に局在化している。この谷は、下記に示されるように、溶液および細胞の両方を輸送するための溝として使用することができる。図２７〜図３０は丸い丘設計物のＳＥＭ写真である。これらの図は、最も低い地形学的地点（約１０μｍの深さおよび約５０μｍのピッチ間隔）を有する谷の交点ウエル（２）における局在化前のリンパ球（図２７）および局在化後のリンパ球（図２８）をそれぞれ示している。丘間の谷（８）は、溶液および細胞を輸送するための経路として役立つ。図２９には、それらのウエル（谷の交点）またはウエル近傍のいずれかに既に局在化している３つの無作為なリンパ球が明らかにされる。図３０では、細胞−細胞の相互作用を調べるためにウエルあたり２つ以上の個々の細胞を有することが、そのようなことが所望される場合には可能であることが強調される。図３１〜図３４は、これらの「波形の丸い丘アレイ形態」を有するＴＣＣのウエルにより維持および保持された細胞の透過光画像を提供する。
【００４４】
図３１（ｘ４０）は丘の円形の円周部（上面図）を示し、リンパ球（３）が少数の交点に局在化および保持されている。この現象は図３２（ｘ１００）および図３３（ｘ４０）においてさらに明らかにされており、これらの図では、細胞−細胞相互作用の現象が観測されている。図３４では、いくつかのＴジャーカット細胞が明らかにされている。これらの細胞は、末梢血リンパ球よりも大きい（それぞれ、約１５μｍおよび約７μｍ）。上記の前記波形の丸い丘アレイに局在化した細胞の蛍光および着色画像が図３５および図３６に示される。
【００４５】
ＩＴＩＣＢＰ装置およびＩＴＩＣＢＰ方法論は、なかでも、電気化学的測定の様々な可能性を提供する。それぞれのウエルが、一体化された適合し得る電子回路によって個々の制御およびモニターされる１つ以上の透明な微小電極を伴って微細加工される。
【００４６】
これらの微小電極は、例えば、（微弱な局限化収束交流電圧（ＣＡＶ）による）細胞捕捉、細胞の移動、電気的刺激、細胞融合を容易にすること、分泌された生化学物質の検出、電気生化学的反応のモニターリングなどのいくつかの適用のために使用される。
【００４７】
さらに、対応する電気化学的センサーまたはバイオセンサーと共役する微小電極は、細胞の代謝活性を検出するために使用される。これらの微小電極は、細胞の事前に選ばれた反応物を検出するために特異的な感知用化合物で被覆された後、ウエル内においてそれぞれの個々の細胞の近くに配置される。簡単に記載すると、様々な形式のバイオセンシングＩＴＩＣＢＰ装置を組み立てることができる。図３７には、各ウエルの内側表面または選択されたウエルの任意の群の内側表面に取り付けられ、または置かれた円形の微小電極（２０）とともに構築されたウエルを含有するＩＴＩＣＢＰ装置のＴＣＣが示される。電極は、任意の適切な材料から、例えば、不活性な金属（銅、金、ニッケル、銀など）、または半導体材料（ドープ処理されたゲルマニウムまたはシリコーンなど）、または他の電気伝導性材料から作製される。電極は、分析の必要性および条件により決定され得るように、その表面のウエル露出側を絶縁性材料（プラスチックポリマー、ガラス、ワックス、純シリコーンなど）による被覆処理または析出処理によって電気的に絶縁されてもよく、または電気的に絶縁されなくてもよい。電極（透明または不透明であっても）はそれぞれが、他のリード線および光学的分光測定を妨げないような方法でＴＣＣの本体に埋め込まれた電気伝導性リード線（２１）（透明または不透明）を備える。各リード線は、図３７に示されるようにＴＣＣ本体から電気回路インターフェースに延びる。電極はそれぞれが別々にアドレス指定可能であり、電気シグナルを、二方向に、細胞から電気回路インターフェースへの方向または電気回路インターフェースから細胞への方向のいずれかで通過または収集することができることを指摘しなければならない。細胞に与えられる制御された電気シグナルは、相互作用を、細胞と電極との間で、または細胞と、細胞がさらされているその周りの試薬溶液との間でもたらす。
【００４８】
微小電極に与えられた制御されたＣＡＶ電気シグナルは、細胞を交互に引き寄せ、かつ反発させ、従って、細胞をウエル内の正確な位置に配置する電場を誘導するために使用することができる。あるいは、この同じ電極を反応性バイオセンサー電極として使用することができる。その場合、同じ電極を介して集められたシグナルは、任意の測定目的のために、例えば、細胞外の酸性化（ｐＨｅｘ）の測定、細胞分泌生成物（ＮＯ、Ｏなど）を誘導する選択的な細胞内酸化還元プロセスなどのために使用することができる。図３８は、多数の電極（２０ａおよび２０ｂ）とともに構築されたウエルを含有するＩＴＩＣＢＰ装置のＴＣＣを示す。周辺電極および中央電極はともに、同じ細胞に取り付けることができる。さらに、電極の数は可変であり、その計画された役割に依存する。
【００４９】
下記は、電気化学測定に関する簡単な概略である：
ＩＴＩＣＢＰ装置における各ウエルまたは任意の選択された数のウエルが、図３９に示されるように、中心電極（２０ｂ）をその底部に伴って構築される。中心電極（これは細胞位置決め電極と呼ばれる）を図３８において容易に認めることができる（２０ｂ）。中心電極のプレートに与えられる制御されたＣＡＶシグナルにより、細胞をそれぞれのウエル内において引き寄せ、かつ反発させ、細胞をウエル内の所望する位置において正確に配置する電場（２１）が誘導される。
【００５０】
簡単に記載すると、ＣＡＶによって不均一な交流電場を加えることにより、細胞が、電極の幾何学的配置およびそれ自身の形状によって規定される一定体積の空間に閉じ込められ得る。２つの電極によって生じる電場は、様々な細胞タイプを引き寄せることが証明されている。本発明者らは、２ＭＨｚのＣＡＶを使用して細胞捕捉実験を行い、これにより、細胞が、電極間に１５０μｍ〜５０μｍの分離距離を有する１対の約１μｍの直径の電極に、２００μｍまでの距離から引き寄せられることが示されている。ＩＴＩＣＢＰ装置の場合、参照（第２の）電極は、透明な金属被覆されたカバーガラスであり、これは、図３９で明らかにされるように、十分な電場が所与の電圧（電位差）によって作製されることを可能にするために細胞面から好適な距離で配置される。
【００５１】
より詳細には、ＩＴＩＣＢＰ装置は、制御された微弱な局限化収束交流電圧（ＣＡＶ）によって交互に細胞を引き寄せ、かつ／または反発させるために設計される。
【００５２】
一例が図３９に明らかにされ、上記に記載される。ＴＣＣにおける各ウエルまたは任意の選択された数のウエルが、細胞位置決め電極先端（２０ｂ）をその底部に伴って構築される。透明または不透明なプレート（３４）（これは、ＴＣＣウエル場の全体を覆うための好適なサイズで通常的な顕微鏡カバーガラスから作製することができる）が、ＴＣＣ面の上方で、かつＴＣＣ面に平行して、先端から所定の距離で取り付けられる。プレートおよび細胞位置決め電極に与えられる制御されたＣＡＶシグナルにより、細胞（３）をそれぞれのウエル（２）に引き寄せ、かつ細胞をプレートと電極先端との間のすき間に沿って正確な位置に配置する電場（２１）が誘導される。
【００５３】
別の配置が図３９に示されるが、この配置では、重力が、ウエルから細胞を配置するために使用され、一方、ＣＡＶにより、細胞がそのウエルに選択的に保持される。細胞位置決め電極の１つを選択的に操作し、その一方で、他の電極をオフに保つことにより、細胞（３．１）のそのウエル（２．１）への引き寄せ、そして同時に、重力による細胞（３．２および３．３）のそれらの対応するウエル（２．２および２．３）からの放出がもたらされる。落下する細胞は、接線方向の洗浄が同時に行われるので、質問領域に蓄積しない。
【００５４】
実際、この例では、選択のための細胞の観察および明確化が、それらのウエルに留まらせるか、またはそれらのウエルから排出することのいずれかのために、ＣＡＶの操作に先立って行われる。選択段階は、図３９ａの場合ように、ウエルが逆さに配置されたときに実行することができ、一方、それらの底部により、細胞が支えられる。
【００５５】
あるいは、細胞位置決め電極は、図３９ｂに示されるように、カバーガラスから電気的に隔てて配置することができ、その一方で、ウエルの内部壁は同じ１つの電極である。細胞位置決め電極先端は、ウエルのそれぞれの底部中心に対応して向き合って配置される。このとき、ＣＡＶをそのような配置で選択的に操作したとき、電場・電流の流れ方向は、プレート電極に向かって上方向に収束し、重力に対抗する、事前に選択された細胞に対する選択的な引き出し（反発）力を生じさせる。上記で議論された配置は、同時測定および細胞選択の必要性に対処している。再度ではあるが、質問領域から細胞を洗い流すことが、接線方向の洗浄によって行われる。
【００５６】
細胞を同時かつ多重的に取り扱うための万能的なＩＴＩＣＢＰ形式が、１つの代表的なウエルの断面が示される図３９ｃ〜図３９ｄに明らかにされる。ウエルは、それぞれが異なる電気回路によって制御され、かつ非導電性区域によって間が隔てられるＥ１（リング様電極）およびＥ２（チップ電極）の少なくとも２つの電極を含有する。ウエルの向かいには、ウエルがカバーガラスに取り付けられている場合には、非導電性区域が間に存在する平坦なリング電極（Ｅ３）およびチップ電極（Ｅ４）の少なくとも２つの電極を含有する類似する電極配置が存在する。再度ではあるが、異なる電気回路により、Ｅ３およびＥ４が制御される。この例（図３９ｃ）では、２つのチップ電極（Ｅ２およびＥ４）が互いに向き合って配置される。面電極（Ｅ１およびＥ３）が同様に述べられる。
【００５７】
これらの電極を操作する選択肢の１つは下記の通りである：細胞をウエルに引き寄せるために、Ｅ３およびＥ４の電極が電気的に接続され、チップ電極Ｅ２に向き合う１つの大きな電極として作用する（Ｅ１は非接続／非作動である）。このとき、ＣＡＶをこの配置に導入することにより、電場・電流の流れ方向がＥ２に向かって収束させられ、その結果として、細胞がウエルに引き寄せられる。逆に、細胞をウエルから反発させるために、Ｅ１およびＥ２の電極が電気的に接続され、チップ電極Ｅ４に向き合う１つの大きな電極として作用する（Ｅ３は非接続／非作動である）。このとき、ＣＡＶをそのような配置に導入することにより、電場・電流の流れ方向がＥ４に向かって収束させられ、その結果として、細胞がウエルからの反発がもたらされる（図３９ｄ）。
【００５８】
そのような電極配置の直接的な結果の１つが、細胞をそのミリ−ナノリットル（マイクロ−マイクロリットル）容量（μμＬ）で上下方向に振とう／振動させることができることである。これにより、例えば、保持された細胞とその環境の懸濁媒体との間でのより良好な接触が確実になる。
【００５９】
この配置は、以前に記載されたように、質問領域から細胞を洗い流すことを可能にする接線方向の洗浄という選択肢を含む。
【００６０】
上記の説明は非限定的な例として示されることを強調しなければならない。ウエル内の細胞は、異なる電極形状、配置および相対的な位置を使用して、そして同様に、コンピューターのプログラムされた組合せおよび時間順序によって電極を作動させることによって異なるように操作することができる。例えば、図３９ｅは、図３９ｃの電極Ｅ１が、異なる回路によって制御される２つの自動制御電極（Ｅ１．１およびＥ１．２）に分割されている配置を示す。従って、ウエルは、２つの向き合う電極をその内側斜面に含有し、斜面には、中間部の下部に、チップ電極がウエル底部の中心に存在する。このとき、ＣＡＶをＥ２およびＥ１．１に繰り返し導入すること（左側、実線）は、細胞を時計回りに回転させるように作用し、一方、ＣＡＶをＥ２およびＥ１．２に繰り返し導入すること（右側、点線）は、細胞をそのウエルにおいて反時計回りに回転させるように作用する。
【００６１】
あるいは、４つの内側の円周電極がウエルの内側壁斜面に配置される。図３９ｆに示されるように、電極の２つ（Ｅ１．２およびＥ１．４）はチップ様であり、互いに向き合っている。１対のＥ１．１およびＥ１．３は、これらもまた向き合っているが、第１の対よりも著しく大きい。すべての電極は、隔てられた電気回路によって制御される。このとき、ウエルを上方から見たとき、ＣＡＶがＥ１．１−Ｅ１．４およびＥ１．２−Ｅ１．３の組合せに導入されたときには、細胞をそのウエルにおいて時計回り（実線）に回転させるように作用し、一方、ＣＡＶがＥ１．１−Ｅ１．２およびＥ１．３−Ｅ１．４の組合せに導入されたときには、細胞をそのウエルにおいて反時計回り（実線）に回転させるように作用することが理解され得る。
【００６２】
個々の細胞を任意の所望する方向に回転させることができるこの可能性は、それらの対応するウエルにおいて個々の細胞の形態学的観測、蛍光観測および彩色観測のために、そして同様に、細胞の切り取りおよび細胞内実施などのさらなる細胞操作のために非常に多くの重要性を有し得る。
【００６３】
（ｃ）ウエルの詰め込み
自然界は、六角形の詰め込みが最も効率的な詰め込み方法であることを我々に教えている。ＩＴＩＣＢＰ装置のＴＣＣは、個々の細胞ウエルの間にすき間を残さない六角形ウエルのアレイから組み立てられ、従って、ほぼ１００パーセントの負荷効率を理論的および実際に明らかにしており、これは、細胞のサンプルサイズ（調べられる細胞の利用可能な量）が制限されるときには重要な特徴である。この状況は、例えば、ガン評価における病理学的検査のためのリンパ節触診の場合、または、肺ガンの評価のために唾液に見出される少量の細胞の場合には一般的である。
【００６４】
測定手法および細胞取扱い操作に関して、それらは、関係しない細胞（非選択細胞）の妨害を回避する六角形ウエルのアレイを使用したとき、はるかにより容易かつ円滑に行われる。しかしながら、本発明は、最も効率的かつ好ましい高密度詰め込みの六角形幾何形態に限定されず、他の詰め込まれた形態および配置も同様に含む。２つの普通の例として、正方形ウエルからなるアレイおよび三角形ウエルからなるアレイがある（図４０および図４１）。
【００６５】
（ｄ）「コイン」：ＩＴＩＣＢＰ装置のＴＣＣの基本ユニットを構成するもの
ウエルのアレイが配置されるＴＣＣの基本ユニットである「コイン」は任意の所望する形状を有し得る。明らかなことではあるが、そのようなコインは、別のコインに対するその安定な取り付け、または生物学的サンプルの取扱いおよび維持（負荷、洗浄など）、ならびにそのようなコインをＩＴＩＣＢＰ装置の一体化された一部として運搬することを可能するホルダーに対するその安定な取り付けのいずれかを可能にするように設計されていた。
【００６６】
コイン形態の多くの選択肢のなかで、正方形（図４２）および円形（図４３）の幾何学的形状が議論される。図４２および図４３は、１００ｘ１００のウエルからなるマトリックスをその中心に含有する透明なコインを例示しており、この透明なコインでは、ウエルのない区域が、コインを別のコインに取り付けるために、または、測定、供給、洗浄などの任意の所望する操作を行うためのホルダーに取り付けるために使用されるようになっている。正方形の一辺の長さＬ１（図４２）および前記コインの直径Ｄ（図４３）は、任意の所望される必要性に従って決定され得る。同じことが、ウエルアレイのマトリックスサイズ、形状および大きさについて当てはまる。
【００６７】
他のタイプのコインが、（調べられている細胞がさらされなければならない）所望する試薬の正確な量を必要とする研究および適用を検討するために設計されている。そのような典型的なコインの概略的な配置が図４３ａに示される。このコインは、任意のタイプの被覆手段（なかでも、顕微鏡カバーガラス、プラスチックポリマーおよび他の好適なポリマー、ならびに任意の種類の柔軟な層（ホルムバルフィルム、テフロンフィルムなど）である）を支えることを助けた一体化されている組み込まれたスペーサー（６０）を含有する。スペーサーは、ウエルの場に均一または不均一に分布および局在化させることができ、そして種々の直径または断面を有し得る（６０ａ）。
【００６８】
（ｅ）コイン：保持および取扱い
本節では、ＩＴＩＣＢＰ装置のＴＣＣの必須部分としてのコインの保持および取扱いが議論される。図４４は、バス（３１）によって囲まれる円形コイン（３０）の上面図を示しており、これらはともに、コインホルダー（３３）の一部であるベルト壁（３２）によって取り囲まれる。ベルト壁は、ＴＣＣ表面の全体を覆うための好適なサイズの通常の顕微鏡カバーガラスであり得る透明または部分的に不透明なプレート（３４）を支え、そして、溶液を維持するためにその下側に空間を残す高さを有する。図４５には、細胞の負荷、洗浄および排出（３５）を可能にするための、互いに向き合う２つの開口部（３４）をそのベルト壁（３２）に有する前記コインホルダーの別の形式が明らかにされる。前記コインホルダーシステムの概略的な断面が図４６に示される。別のホルダー形式が図４７に示されており、この場合、３つの直交するパイプ（３５）が、任意の所望する溶液および細胞懸濁物の輸送を可能にするために、コインホルダー本体部に貫通している。溶液（または懸濁物）の流速は、そのようなパイプ（水路）に接続されたポンプおよび弁によって制御することができる。流速を制御する多くの可能な方法の１つが図４８に示される。パイプの２つが２つの溶液リザーバー（３６）に接続され、この場合、それらの液高（Ｓｈ１およびＳｈ２）の差（？Ｓｈ）により、容易に決定され得る勾配が形成される。リザーバー（３６）における圧力は、例えば、ピストン（３７）によって容易に制御することができる。
【００６９】
調べられている細胞サンプルは、図４９に概略的に示されるような制御されたマルチリザーバーシステム（３９）を介して様々なタイプの溶液および／または試薬および／または懸濁物にさらすことができる。
【００７０】
図４８ａにおいて、ウエルのコインは、例えば、ポリカーボネート、ナイロン、積層テフロン(登録商標)および／または非積層テフロン(登録商標)、酢酸セルロース、ガラス繊維、セルロースエステルおよび類似する材料または誘導された材料から作製された多孔性物質から作製される（この場合、すべてが、内部のウエブ担体とともに、または内部のウエブ担体を伴うことなく作製される）。これは、ウエルの面に対して垂直な溶液の通過を可能にする。そのような配置は細胞の操作可能性を向上させ、かつ細胞をそのウエルに快適に維持することを可能にする。多孔性コインの使用は、コインの下部に位置する下部排出路の存在と一緒にすることができる。再度ではあるが、溶液の流れは、？Ｓｈおよび弁の両方によって制御することができる。試験サンプルは、図４８ａに概略的に示されるような制御されたマルチリザーバーシステムを介して、様々なタイプの溶液、試薬および懸濁物に導入することができる。
【００７１】
実際、ＴＣＣのような透過性材料の使用は、「保持・取扱い」の局面よりもはるかに遠くにまで及ぶ。例えば、穏やかな吸引とともに好適な細孔サイズの使用は、ウエルのそれぞれの底部において、その分子量によって十分に規定される細胞分泌分子（すなわち、ろ液）の収集を可能にし得る。ろ液は、その後、特異的／非特異的な蛍光性／有色性／放射活性の指示物によって標識され、それに従って検出することができる。
【００７２】
この能力は、セルロースが使用されたとき、初めて、そしてもっぱら、個々の細胞の生化学（ＩＣＢ）または個々の細胞の透析（ＩＣＤ）を細胞集団において可能にするので、細胞−生化学において新しい一章を開く。
【００７３】
この概念を利用することにより、細胞から分泌されない物質の生化学を下記のように個々の細胞に基づいて調べることができる。すべての生命活動測定が完了したとき、ウエルの反対側からの穏やかな吸引が行われながら、細胞が、超音波処理、界面活性剤または他の手段によって破裂させられる。それぞれの個々の細胞またはサンプルの放出された細胞ろ液または細胞内ろ液が、対応するウエルの底部のそれぞれに集められ、その後、必要とされる調査に供される。１つのウエルからその隣りに物質が拡散する可能性は無視できるので、後者（「破裂」法）は非多孔性のウエルについても当てはまることは強調しておかなければならない。
【００７４】
（ｆ）マルチコインからなるＴＣＣ
コインのアレイ（マルチコインアレイ、ＭＣＡ、３９）からなるＴＣＣの一例が図５０に示される。このＴＣＣは、それぞれが１５０ｘ１５０のウエルマトリックスから構成され、幅が約０．３ｍｍの分離用溝（４０）によって取り囲まれている９個のコイン（３０）、すなわち、９個の異なるウエル場を含有する。そのような溝の重要な役割の１つは、１つの場からその隣りに物質が浸透することを防止することである。従って、溝には、隣接する場と場との間における任意の物理的バリア、例えば、好適なサイズの壁などが含まれる。
【００７５】
認識され得るように（例えば、ｍｍ単位でのスケール）、１つの場の大きさは約３ｘ３ｍｍであり、これは、それぞれの六角形ウエルの直径が約２０μｍであるという事実により確認されている。
【００７６】
前記ＭＣＡの等角図および２つの拡大図が図５１〜図５３にそれぞれ示されており、この場合、図５３では、ウエルが高密度に詰め込まれていることが明かである。ウエル−場−コインのそれぞれは、例えば、１組の数字、文字、それらの組合せ、または任意の他の形状もしくは色（すべてが光学的に可視化されるか、または磁気的にコード化される）によって、印をその表面の任意のところに区別されるように付けることができる。
【００７７】
前記ＭＣＡ配置は一例にすぎず、従って、任意の種類の外側フレーム、内部パターン、ならびに、ウエル場（コイン）およびそれらの分離用溝の両方の大きさが本発明の範囲内であることは指摘しなければならない。
【００７８】
ＭＣＡは多くの適用を有し得る：例えば、異なる試薬で被覆されるか、あるいは異なる物質で処理される異なるコインおよび別個のコインに、同じバッチ由来の細胞が置かれる細胞チップ（ＬＣＣ）構成要素における理想的な実験室として。これは、高処理能の小型化されたＬＣＣを診断および予後のために使用することにおける直接的な適用を有することがあり、この場合、同じ起源の微小サンプルサイズを、少量の診断試薬を使用して同時に試験することができる。
【００７９】
（ｇ）細胞の取扱いおよび操作：細胞の選択、回収および移送
ＩＴＩＣＢＰ装置のＴＣＣにおけるそのウエルからの細胞の引き上げおよび移送を、下記に記載されるように、ウエルとカバーガラスとの間のすき間にコンピューター制御による移動する電場を誘導すること、またはコンピューター制御による光学的ピンセットの使用のいずれかによって行うことができる。選択された細胞を引き上げるために使用される方法にもかかわらず、選択された細胞は、試験条件により決定されるように、ウエル場（Ａ、Ｂ、Ｃ）の間に位置するミクロ水路（４２）、または回収用の場（図５４）、または選択された細胞の回収用マクロウエル（４１、図５５）などの任意のアドレス指定可能な場のいずれかに移される。減圧状態が、図５５に示されるように、細胞を吸引し、細胞を所定のマクロウエルに向かわせるために、特に、水路コレクター（４２）に存在する。
【００８０】
（ｈ）懸濁物および溶液の取扱いおよび操作
ＴＣＣの表面における懸濁物および／または溶液の微量操作が、図５６に示されるように、小さい開通路または閉通路を生じさせるような方法でウエル間に、制御されたすき間（４３）を有するウエル場を構築することによって確立され得る。そのような場合、開通している溝の幅（直径）は壁幅の程度であり、従って、隣接ウエル間における細胞の安定した局在化を妨げる。図２７〜図３０に記載される詰め込まれたウエルの丸い丘の間での谷における溶液の流れの一例が図５７に示される。写真の左から右への溶液の流れが認められる。以前に述べられたように、谷に存在する、この配置または構造におけるウエルは、谷により隔てられた波形の丸い丘の間における交点である。これらの谷における最も低いところが各交点の中心に配置される。これらの交点（ウエル）は、集積した溶液の小さい池（４４）をもたらし、それにより、最も浅い谷が、隣接する池と池との間の接続用経路（４５）として役立つ。温度、流体吸引速度などの様々なパラメーターを制御することによって、池と池との間を流れる流体の連続性の中断（４６）が誘導され、従って、これにより、図５８に示されるように、離れた接続されていない池（４７）がもたらされる。
【００８１】
（ｉ）細胞の処理および操作：細胞の垂直洗浄
図４８ｂに示されるようなウエル側面の（１０００オングストローム程度での）垂直な小さい穿孔がイオン衝撃技術によって作製される。これらの穿孔は細胞の垂直洗浄を可能にする。穿孔のサイズは、ＩＴＩＣＢＰに関連して使用される光波長と比較して非常に小さいので、光学的干渉が全く生じない。流れ方向を伴った穴開きウエル壁の断面が図４８ｃに示される。
【００８２】
穿孔がウエルの中心または底部領域全体に行われている穴あきＩＴＩＣＢＰの別の形式が図４８ｄおよび図４８ｅに示される。この形式は、それ以外の点では、上記に記載されたＩＴＩＣＢＰと同一である。ＩＴＩＣＢＰの最初の穴あき型形式でのように、穿孔のサイズは十分に光波長の回折限界の範囲内にあり、従って、光学的干渉を全く生じさせない。
【００８３】
垂直洗浄の利点が、多孔性コインを記載する節において議論されている。種々の穿孔パターンを、生物学的な試験条件に依存して作製することができる。本発明は、１つのウエル底部および／または壁について少なくとも１つの単一の細孔（穿孔）を、底部および／または壁を円形または偏心のいずれかで通り抜けて局在化して含有するウエルの底部および／またはその壁が少なくとも作製される任意のタイプの多孔性材料を包含し、かつそのような材料に関連することは強く強調しておかなければならない。
【００８４】
多孔性のＩＴＩＣＢＰ用ＴＣＣの使用に対する一例を図４８ｆおよび図４８ｇに見ることができる。最初に、細胞は、多孔性の底部（７）を有するそのウエルに配置させられる。観察後、細胞は、その噴出を生じさせる超音波処理にさらされ、その一方で、同時に、ＩＴＩＣＢＰを通した穏やかな吸引が行われ、これにより、そのウエルの底部におけるそれぞれの個々の細胞溶解物の強制的な沈降が保証される。
【００８５】
図４８ｈは、非多孔性領域（２）によってその間で分離されている多孔性材料（１）のアレイを示す。この場合、各アイランドの直径は、試験されているサンプル／個々の細胞を保持するために適する。そのようなアレイは、上記に記載されたウエルアレイのために同様に使用することができる。そのような配置において、アイランドは非多孔性であり得るが、それらを（間で）隔てている領域は多孔性であることは述べておかなければならない（図４８ｉ）。両方の場合において、アイランドの面は光学的に透明であり、従って、アイランドあたりの保持されたサンプルの非常に優れた形態学的検査を可能にする。
【００８６】
（ｊ）細胞分析：照射方法およびＩＴＩＣＢＰ装置に配置された細胞からの光収集方法
一般に、ＩＴＩＣＢＰ装置における保持された細胞は、通常型または倒立型の顕微鏡を利用して、日常的に使用されているエピフルオレセンス方法によって画像化および試験され得る。さらに、細胞チップが透明であることは、透過光として励起（落射照明）光を利用することによって、細胞をＴＣＣの下側から見ることを可能する。概略的な光学系配置が図５９に示される。
【００８７】
ＩＴＩＣＢＰ装置の細胞チップは透明であるので、保持された細胞の照射をＴＣＣ面において行うことができ、その一方で、消去光が同じ面において伝わる。図５９において、細胞ＴＣＣの側面に配置され、かつ細胞ＴＣＣの面に平行している光ファイバーリード線により、細胞が照射される。サンプルから放射される蛍光が、サンプルの上方に位置する光学システムによって細胞面に直交して集められ、そして画像分析（ＩＡ）または他の検出用配置のために要求されるデータを提供するための検出装置によって捕らえられる。透明な細胞チップの下に位置する長い作動距離（ＬＷＤ）の対物レンズが、細胞からの反射および屈折した光を集めることによって細胞の観察および画像化のために使用される。提案された光学配置は落射照明の配置よりも優れている（図６０）。エピフルオレセンス顕微鏡システムとは異なり、上面画像または逆転型のいずれかであっても、光の照射および放射が軸に平行している場合、照射および放射が互いに直交しており、これにより、散乱光の妨害が最小限に抑えられるので、このシステムはエピフルオレセンスシステムの様々な欠陥の発生を有しない。この配置により、細胞からの蛍光放射の収集およびその形態学の観察が同時に可能になる。
【００８８】
この照射形態を使用することによって、ウエルの底部に沿って伝わるエバネッセント波もまた生じる。ウエルの底部に微少量で置かれた物質の検出が、放射された蛍光光を測定することによって可能である。この特徴は、単層の蛍光性分子を検出するために適用することができる。例えば、この手法は、細胞からの分子の流出または分泌を検出するために使用することができる。例えば、ウエルの内側表面に被覆されている特異的な抗原はこれらの分子と結合することができ、そして、これが結合したときに蛍光性になり得る。
【００８９】
図６１に示される別の照射配置では、光ファイバーリード線の４つの束が、その頂点の各辺に、ＴＣＣに平行して接続される。
【００９０】
図６２は、それぞれのウエルに向けられたアドレス指定可能なデジタルミラーディスプレイ（ＤＭＤ）を使用するＴＣＣの照射を示す。この方法を使用することにより、識別可能なウエルに配置された任意の個々の細胞または選択された細胞群の照射が同時に可能になる。
【００９１】
液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）技術を応用する別の照射方法が図６３に示されるが、この場合、ＬＣＤにより、ＴＣＣコインまたはホルダーの上部表面または下部表面が覆われる。ＬＣＤ画素を選択的に切り換えることにより、照射光が個々の細胞または任意の選択された細胞群に到達させられる。
【００９２】
細胞照射の上記に記載された方法は、ＩＴＩＣＢＰ装置のＴＣＣを照射するために存在する様々な可能性の広範囲の万能性に対する例であることを述べておかなければならない。
【００９３】
（ｋ）ＦＯＰ束あたりウエル毎の細胞−ＬＣＤの選択的な照射・放射の光学的配置
ＴＣＣにおける個々の細胞の照射およびそのそれらの放射の測定を行うために光ファイバー（ＦＯＰ）を利用する方法が図６４に示される。ＩＴＩＣＢＰは、非常に多数のサブミクロンのファイバー（ブローアウト）からなるＦＯＰ束（１１）に対して、直接的に、または光学的な媒介物質もしくは作用因によって、そのいずれかで光学的に結合させられる。ＦＯＰ束のサイズは、ＴＣＣの全領域またはちょうど一部分のいずれかを覆うことができるようにされる。束は、二次元ＬＣＤアレイ（１２）プレートによって分離された２つの部分（１１）および（１３）から構成される。ＬＣＤエレメントはそれぞれが、束の一方の側（１１）ともう一方の側（１３）との間での光の通過を、完全または部分的に、通過させるか、または遮断するかのいずれかのために電気的に制御される。この照射配置は、二方向的であるように設計される。すなわち、細胞の照射光およびその放射光がＦＯＰ束およびＬＣＤを通過する。細胞からの放射／散乱光がＦＯＰ束の一方の側を通り、ＬＣＤアレイを通って、ＦＯＰ束のもう一方の側に達し、最後には、ＴＣＣの全体または選択された部分が画像化される画像化装置（１４）（例えば、ＣＣＤまたは他の検知用装置）に達する。
【００９４】
画像の分解能およびサイズは生物学的試験の性質によって決定され、それに基づいて、束におけるファイバーの数およびそれらの厚さに関する設計基準、画像化装置の分解能、ならびにＬＣＤアレイプレートの構築が定められる。ＴＣＣにおける任意の個々の細胞または選択された数の細胞の照射が、ＬＣＤアレイによって制御可能に切り換えられるＦＯＰ束に取り付けられた光源によって行われる。使い捨て型のＴＣＣが、多くの場合、検討されている特定の研究に従って取り換えられる。ＴＣＣをＦＯＰ束の表面に取り付け、そしてＴＣＣをＦＯＰ束の表面から取り除く、使用者に優しい迅速な取り換え機構（１５）が提供される。この機構により、ＴＣＣのＦＯＰ束表面（光学的ベンチ）への滑動または持ち上げのいずれかが可能になる。これらの操作は、ＬＣＤ−ＦＯＰ−ＣＣＤシステムの照射特性または放射特性を擾乱または妨害しないように設計される。ＴＣＣ上の各ウエルの位置は、その画像ならびにデータポイントの画像の両方によって決定され、その両方が画像面（ＣＣＤ）に得られる。これらの座標はともに、画像化装置のコンピューターによって計算され、従って、これにより、完全に制御されたＬＣＤアレイの切り換えが、選択的な照射光をＴＣＣ上の細胞に与えるために可能になる。
【００９５】
照射は、（垂直に、もしくは広角的に、すなわち、臨界角度よりも小さい入射角で）ＴＣＣの上方から、または下方から行うことができる。
【００９６】
両方の場合において、ウエルあたりのそれぞれの個々の細胞の画像が、それぞれのウエルに関連する束をそのように規定する関連するファイバー束（１３）を介する検出システム（ＣＣＤ）によって画像化される。最終的な結果は、束−ＬＣＤの選択的な照射・放射の光学的配置あたりウエル毎の細胞である。
【００９７】
光ファイバーとＩＴＩＣＢＰ装置との組合せは、各ファイバーの端部に永続的なウエルを有するという考えよりも優れており、かつはるかに実用的である。その理由は下記の通りである：生物学的サンプルは、細胞または細胞内オルガネラまたは溶液のいずれかであっても、すべての担持用表面に沈降物を残し、これは、担持用表面に溝がより大きく刻まれるので、除去することがより困難にする。光学的洗浄液、弱酸は、そして、超音波処理の組合せを用いたとしても、担持用表面の光学的特性を損なうことなく、繰り返し使用することができない。従って、ＦＯＰとの組合せでの使い捨て型ＴＣＣは、そのような問題に対する好都合かつ実用的な解決策を示唆する。
【００９８】
（ｌ）ＩＴＩＣＢＰ装置方法論とミクロ光学との組合せ
ＩＴＩＣＢＰ装置のＴＣＣにおける細胞およびそのウエルの典型的な大きさは、ミクロ光学系構成要素において使用される一体化されたマイクロレンズアレイと同じ程度である。ＩＴＩＣＢＰ装置は、ミクロ光学技術における最新の進歩を利用し、ミクロ光学システムを取り込んでいる。
【００９９】
凸型の透明なマイクロレンズの二次元アレイが、図６５に示されるように、各レンズの焦点がそのウエルの中の細胞に正確に向かうような方法でＴＣＣの真上に配置される。照射光が、照射光を細胞の方に向かわせるマイクロレンズを越え、細胞を照射し、そして、放射光が同じマイクロレンズに戻り、マイクロレンズから、放射光が、上記に記載されたような様式で集められる。ウエルは、上記で議論されたように、機械的だけでなく、光学的に使用され得る凹レンズとして実際には見なすことができる。マイクロレンズおよびＴＣＣの上部表面および下部表面はそれぞれ、試験条件が要求するように、任意の所望する波長の対応するフィルターを備えることができる。
【０１００】
この装置のより複雑な光学的配置は様々なミクロ光学アセンブリーを含む。マイクロレンズアレイとウエルとの間の空間は、試験のために要求される流体および試薬および細胞懸濁物が容易に流れ、かつＴＣＣにおける対応するウエルに達し得るようにされる。凹型マイクロレンズおよび凸型マイクロレンズのこれらの組合せは、顕微鏡を必要としない細胞試験をもたらすことを可能にするＩＴＩＣＢＰキットで終了し得ることは強調しなければならない（好適な二次元検出器アレイが十分である）。
【０１０１】
図６５に記載される別の配置において、ＴＣＣおよびマイクロレンズが密封アセンブリーで組み立てられる。場合によりアセンブリーに接続された容器により、流体および細胞懸濁物がアセンブリー内に供給される（図６５ａ）。バキュテイナーは、細胞および試薬をアセンブリー内に吸引する好適な制御された吸引力を提供する。それ以外の点で、このアセンブリーは、上記に記載されたものと同一である。一例として、生物学的材料またはマーカーのいずれかの挿入が、シリコーン栓を介してアセンブリーの内部体積に達するニードルを介して行うことができる。わずかに異なる配置では、密封アセンブリーは、キット形態での場合を含めて、ＣＣＤアレイを備える（図６７）。この配置により、独立した自己充足的な測定システムが可能になる。
【０１０２】
（ｍ）細胞の操作および測定のための統合システム
注目される図６８、図６９および図６９ａには、個々の細胞またはグループ化された細胞の操作、走査、測定および分析のための全体的なシステムが示される。このシステムは下記からなる：
（１）中央制御コンピューター；
（２）光源、例えば、多スペクトル線の連続レーザーおよびパルスレーザー、分光的に連続した放電ランプまたは特定スペクトル線の放電ランプ（これらに限定されない）など；
（３）電子的な高速度の二方向の多重化されたシグナルの発生・取得回路；
（４）時間、用量および経路を制御するための適切な電子回路を含む溶液容器；
（５）直立型および倒立型の複合顕微鏡、これには、適切な光学増幅装置、分光的フィルター処理装置、および、ＩＴＩＣＢＰに捕捉されたサンプルを照射し、その結果としてそのサンプルを観察するためのビーム形状化装置のすべてが含まれる；
（６）コンピューターにより制御されるサブミクロンでの走査機構、これは、（Ａ）Ｘ、Ｙ、Ｚ、および３つの回転軸（θ、φ、δ）でランダムに操作することができるステージ、（Ｂ）検流計偏向型ミラーによりＦ−θレンズおよび光を操作することによる光学的に制御される視野、から構成される。走査運動の範囲および速度は中央コンピューターによって制御され、生物学的試験条件によって決定される；
（７）上記に記載されるようなＩＴＩＣＢＰ：
（８）測定変換器、例えば、（Ａ）高感度ＰＭＴ、（Ｂ）ＣＣＤカメラ、（Ｃ）ＭＣＰ（マイクロチャンネルプレート）で強化されたＣＣＤラインアレイなど；
（９）測定値およびシグナルを処理するサブシステム装置：（Ａ）蛍光寿命および蛍光偏光減衰の測定、（Ｂ）分光計および音響チューナブルフィルターなどによる観測された光シグナルの分光分析；
（１０）捕捉された細胞を機械的に操作するか、または捕捉された細胞をＩＴＩＣＢＰウエルに、もしくはＩＴＩＣＢＰウエルから移すための手段、例えば、（Ａ）光学的ピンセット、（Ｂ）マイクロマニピュレーターなど。
【０１０３】
生物学的試験は、一般には、細胞をＩＴＩＣＢＰ（７）ウエルに負荷すること、所定の時間で正確に与えられる様々な試薬で細胞を操作すること、細胞に電気シグナルを与えること、または固定処理などの他の操作を行うことから構成される。上記に列挙されるような計測によるその反応の観察および測定が続けられるか、またはこれらの操作および細胞操作と同時に行われる。
【０１０４】
中央コンピューター（１）は、正しい時間で試薬を配分すること、上記に列挙されるようなサブシステムを制御すること、ＩＴＩＣＢＰ（７）ウエルにおける細胞およびその周囲からデータを取得すること、データ管理および連絡を行うこと、データ分析、ならびにすべての使用者インターフェース機能などの事象の試験系列のすべてを制御する。コンピューターは、コンピューターが測定データおよび分析データを記憶し、かつ検索する大容量記憶媒体においてデータベースを作製する。
【０１０５】
様々な光源（２）が、システムに対して行われる試験の性質に依存して使用される。寿命測定の場合、パルスレーザーまたは正弦波変調レーザーのビームが使用され、それ以外の場合には、出力が制御された単スペクトル線または多スペクトル線または連続スペクトル線の光源が使用される。細胞サンプルを、光源（２）で、かつ／または光源（２）との組合せで照射したとき、蛍光が放射され、光が細胞表面またはそのオルガネラで屈折する。これらの光シグナルはマイクロレンズ（５）およびその光学システムを通過し、光学システムにおいて、光シグナルは、試験条件により所望されるようにフィルター処理されるか、または弱められ、最後に、測定変換器（８）の１つ以上によって捕らえられる。生物学的試験の性質に依存して、電気シグナルはコンピューターによって、寿命（９−Ａ）、分光計（９−Ｂ）、または電子的な二方向シグナルプロセッサー（３）などの適切なサブシステム装置（９）に送られる。これらの装置によって処理されたシグナルは、さらなる処理および分析のためにコンピューターにフィードバックされる。個々の細胞または任意の数の細胞の物理的な操作もまた、マイクロマニピュレーター（１０−Ｂ）または多数の光学的ピンセット（１０−Ａ）によって、データ分析の結果または他の所望されるパラメーターを受けるコンピューターにより制御される。選択された細胞は、細胞が配置されているウエルからＩＴＩＣＢＰの表面にまで持ち上げられ、別の位置に横方向に移動もしくは移送される。
【０１０６】
Ａ２．微弱な局限化収束交流電圧（ＣＡＶ）を利用する誘導泳動力による細胞の閉じ込め
ＩＴＩＣＢＰ装置の細胞キャリアにおける個々のウエルは、１つだけの細胞を保持および維持するために設計されたその特有の形態に加えて、その一時的な閉じ込めのために細胞に対して作用する誘電泳動力を利用する。
【０１０７】
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【０１０８】
電極サイズ、形状および位置は、ＩＴＩＣＢＰアレイを構成するウエルのそれぞれの中心に電気的流れを集中させるために特別に設計される。従って、誘電泳動力およびその位相関係は、ＩＴＩＣＢＰ微小構造アレイのそれぞれにおける１個だけの細胞の保持および循環のために有用になる。
【０１０９】
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【０１１０】
均一なＡＣ電場および不均一なＡＣ電場における細胞および非常に多数の微粒子の挙動が１９７０年代にＰｏｈｌ（Ｐｏｈｌ、１９７８）によって調べられ、その先駆的研究論文において議論された。特に、不均一なＡＣ場における個々の細胞の動き（これは誘電泳動（ＤＰ）と呼ばれる）が、その後の数十年間、詳しく研究された。しかしながら、高導電性媒体における電場影響下での細胞の挙動についてはほとんど知られていない。（幅が１５μｍ未満である）極小電極における電気化学的プロセスを理解することにおける近年の進歩は、強いＡＣ場が元の培養培地において生じる可能性を再点検させた。この問題に対する鍵は、境界効果および非線形性によって支配される、小さい電極の表面における電気化学である。さらに、電極が小さくなり、かつ互いに接近するほど、場の勾配が強くなり、必要なシグナル増幅が低くなる。従って、電極の小型化、多電極システムの開発、端子ワイヤの絶縁、ならびに薄い誘電層による電極の被覆（数百ナノメートルの厚さ）、そして良好な熱伝導性を有する電極（シリコン）の平坦な配置が必要である。これらの前提条件のすべてが、半導体技術により製造されるハイブリッドミクロシステムによって満たされ得る（Ｗａｎｇ他、１９９３；Ｓｃｈｒｅｌｌｅ他、１９９３）。
【０１１１】
Ａ３．使い捨て型の密閉／開放細胞チップチャンバー
ＩＴＩＣＢＰの主要な局面の１つは、それが、細胞培養を取り扱わなければならないという要件を作業条件が満たさない一般的な分析化学の研究室において潜在的に使用される使い捨て型の密閉／開放ＴＣＣチャンバー装置であるということである。概して、これらの状況では、研究室動物が使用されている。研究を開始することによって、使い捨て型の生物ＴＣＣおよび／または使い捨て型の完全フロースルー細胞ＴＣＣを開発することは、生物医学的な薬物研究において動物の代用物として細胞培養物を使用することを促進することに寄与し、そして成功した場合には、生物医学的な薬物研究において動物の代用物として細胞培養物を使用することを促進することを目的とする世界中のプログラムに強い影響を与える。
【０１１２】
ＩＴＩＣＢＰ方法論はまた、アメリカ／欧州（西洋）の様々な組織（例えば、代替法の妥当性確認に関する欧州センター）の目的と一致しており、このことは、生命科学にとって重要であり、かつ研究室動物の使用を削減し、または除き、または置き換える様々な代替法の科学的および規制的な受け入れを強く促進している。
【０１１３】
ゲノム計画における進展に基づく薬物標的の迅速な同定、および非常に様々な化学構造体を供給するコンビナトリアル化学の証明された能力は、非常に多数の生物医学的な関連化合物が、それらの毒性作用を検出し、かつ安全な生成物を発見するためにスクリーニングされなければならないという状況をもたらしている。
【０１１４】
２つの述べられた領域における進歩は、明らかに、分析的試験法および生物分析的試験法がハイスループットスクリーニング様式で行われ得ることを要求している。これは、試験において動物をモデル細胞により置き換えることによって部分的に実現されている。しかしながら、細胞の培養／取扱いおよび測定は、手間がかかり、資格者および特別な研究室条件に関して過大な要求をし、そして多くの場合、医薬品候補物に対する細胞の応答としての動的事象を何ら表していない。薬学的試験を容易にするために、さらに科学的にではあるが、ＩＴＩＣＢＰは、「オンチップ」臨床検査に対する可能性を実現することに向けられている。ＩＴＩＣＢＰは、
ａ）微小電極アレイおよび蛍光性レポーター分子にそれぞれ基づく電気化学および光学的分光法の測定技術を、
ｂ）非接着性／接着性の動物細胞またはヒト細胞の細胞チップアレイ（培養細胞プレートおよび／または単層）について個々のマイクロウエルと、
結合させることによって「オンチップ」臨床検査の方向での一ステップを提案する。
【０１１５】
一般に、細胞は電極アレイ上で増殖させられているが、そのような細胞は主に、「ネイクド（ｎａｋｅｄ）」アレイ電極が、単純な「電気的活性」（Ｉｓｒａｅｌ他、１９８４）、すなわち、電気生理学的活性を測定するために意図された神経化学的研究のためであった。他方で、ＩＴＩＣＢＰは、その局在化するウエルにおいて、それぞれの個々の細胞の下に、かつ／またはそれぞれの個々の細胞の近傍に配置される特異的なセンサーとして使用され得る機能化されたアレイ電極である。そのようなことは以前には行われていなかった。
【０１１６】
ＩＴＩＣＢＰの埋め込み可能なセンサー／微小電極は、生体適合性の問題が、細胞とともに作動するときにはあまり重大でないという事実のために安定であることが予想される（ＷｉｌｓｏｎおよびＹｉｂａｉ、１９９９）。
【０１１７】
アレイ電極の機能化、すなわち、アレイ電極を、例えば、ＮＯ、過酸化物、グルタミン酸に対して高感度かつ選択的にすることは、バイオセンサー技術において蓄積された膨大な技術に依拠する。
【０１１８】
しかしながら、研究は、機能化された微小電極を、埋め込み可能なセンサー／電極としてではなく、挿入可能で、正確に配置されるプローブとして用いて行われている。
【０１１９】
個々にアドレス指定可能な電極のアレイを生物認識分子の付着／カプセル化のために改変するための最も関連する方法が、電気重合ポリマー層内への閉じ込めによって行われる。他の代わりの方法もまた使用され、例えば、チトクロームＣのＮＯ−マーカーを直接的にＩＴＩＣＢＰ表面の上部に固定化すること、または脂質／界面活性剤内への閉じ込めなどが使用される（Ｂａｙａｃｈｏｕ他、１９９８）。最後のものが、特異性を高めた、フリーラジカルの複合型光学的・電気化学的（すなわち、電気反射率）検出のための基礎として使用される。電気反射率は、分析化学の分野に入ってきている、分析目的のためにはこれまで使用されていなかった新しい分光電気化学的技術である。
【０１２０】
Ａ４．特定細胞の単離および取扱い
１個だけの細胞に基づいて測定される生物学的プロセスの光学的分析および生化学的分析に基づく光学的分光システムによって選択された細胞の取扱い。さらなる操作のための、事前に選択された亜集団または個々の細胞または細胞分泌生成物の単離または転化は、すべてが光学的ピンセットまたは機敏な制御されたマイクロピペット操作によって行われる。
【０１２１】
Ａ５．ＩＴＩＣＢＰに対する相互作用分子の結合
様々な生物学的活性分子（光活性化分子を含む）によるＩＴＩＣＢＰ表面の被覆。
【０１２２】
誘電性材料における固定化技術が２０年以上にわたって広く知られている。吸着、共有結合的結合、またはビオチン−アビチン架橋を含むいくつかの方法論が、生物学的活性物質を無機表面に結合させるために存在する。
【０１２３】
従って、酵素、抗原、抗体、受容体、テトラマーペプチド複合体、ならびに他の高分子量化合物および低分子量化合物の固定化をＩＴＩＣＢＰ上で行うことができる。
【０１２４】
部位特異的な固定化もまた、表面をストレプトアビジンまたは脱グリコシル化アビジンで被覆することによって達成することができる。そのような機能化された表面は、ビオチンの光活性なリガンド（これはホトビオチンと呼ばれる）と特異的に結合させるために使用することができ、これにより、生物学的活性分子が固定化され得る光アドレス指定可能な表面がもたらされる。さらに、少なくとも３つの主要な被覆技術が提供される。第１の方法では、ウエルの場（コイン）が１つのタイプの試薬で均一に被覆され、これにより、同じ１つだけの刺激に応答する個々の細胞が得られる。第２の方法では、所定の配置の場の各コイン（コインの場）が、異なる試薬で被覆され、その結果、ウエル場の１つ（コイン）によって維持されているそれぞれの細胞群が、対応する好適な試薬で処理される（これは、以降、「被覆されたデザイン化マルチコインアレイ」と呼ばれる）。第３の方法では、細胞示差被覆ＩＴＩＣＢＰあたり１つのデザイン化単一ウエルが要求される。この場合、任意の所望する単一ウエル被覆分布を利用することができ、これにより、事前に規定された刺激に対する個々の細胞の暴露がもたらされる（これは、以降、「被覆されたデザイン化ＩＴＩＣＢＰ」と呼ばれる）。記載された方法は無傷の細胞だけに限定されないこと、そして細胞の溶解物もまた含まれることを指摘しておかなければならない。
【０１２５】
例：特定リンパ球の活性化
多くの疾患が免疫系における不具合から生じている。不適切な免疫応答が、ガン、移植臓器の拒絶、喘息およびアレルギーを含む多くの疾患において役割を果たしている。２つのタイプの白血球細胞（Ｂ細胞およびＴ細胞）が免疫応答において中心的である。Ｂリンパ球は、異物のタンパク質および抗原を破壊することによって身体を保護する抗体（免疫グロブリン）を産生することに関わっており、一方、Ｔリンパ球は、異物の細胞（ガン細胞を含む）を認識し、破壊のための印をそれに付ける。
【０１２６】
ＩＴＩＣＢＰ表面に固定化された薬物または特異的な抗原の使用は、これらの細胞の細胞機能を活性化または抑制するために使用することができる。
【０１２７】
ＩＴＩＣＢＰに固定化されている特異的な薬物によるＢ細胞活性化の調節は、慢性関節リウマチおよび糖尿病などの自己免疫疾患に対する薬物発見において使用することができる。
【０１２８】
ＩＴＩＣＢＰ表面に固定化された、Ｔ細胞受容体に対して特異的な抗原は、特異的なリガンド結合性Ｔ細胞の活性化のために利用することができる。これは、腫瘍抗原特異的なＴリンパ球がガンの実験的免疫治療のために使用される腫瘍免疫学の分野では非常に必要とされている。
【０１２９】
Ａ６．ＩＴＩＣＢＰ結合物質の光活性化
光活性化可能な物質の閃光光分解は「ケージ化」状態からのその放出をもたらす。非ケージ化はＩＴＩＣＢＰの照射とともに容易に達成され、これにより、目的とする生物学的活性生成物または他の試薬の空間的および時間的の両方での放出を制御する手段が提供される。「ケージ化」分子は、分子の結合または活性を最大限に妨害するように設計される。「ケージ化」分子は、閃光光分解によってマイクロ秒〜ミリ秒で脱離し、活性な生成物のパルスをもたらす。
【０１３０】
光分解的放出の作用を、蛍光性プローブまたはＩＴＩＣＢＰ埋設電極のいずれかを用いてモニターすることができる。ケージ化分子（薬物、抗体、抗原）の光活性化は、細胞の活性を迅速に開始または阻止し、従って、個々の細胞に基づいて行われることになる、上記で述べられた機能的特性の速度論的研究のためのツールを提供する。
【０１３１】
Ｂ章：
ＩＴＩＣＢＰ装置：適用可能な測定技術および測定手順
下記の特徴および適用は、ＩＴＩＣＢＰ装置の広範囲の測定能力を非限定的な様式で明らかにするために示される：
・蛍光測定および電気化学的測定による、ＩＴＩＣＢＰウエルおよび／または細胞のそれぞれに蓄積した細胞外および細胞内のＮＯ、Ｏ２・ラジカルおよびグルタミン酸の測定；
・識別可能な個々の細胞を使用する生物医学的物質の毒性の評価；
・生細胞の構造的パラメーターおよび形態学的パラメーターのモニターリング；
・ＣＡＶを利用した誘電泳動力による細胞の閉じ込め；
・一体化されたバイオセンサー技術を使用する（生物）電気化学的測定；
・免疫センサーによる免疫反応性の決定；
・個々の細胞の細胞内酵素反応の推定；
・下記のそれぞれの適用：
１．個々の細胞の生化学
２．個々の細胞の透析
３．同じ個々の細胞に対する生命活動検査およびＳＥＭ検査の実施
４．細胞質対核での細胞内蛍光測定値の地形学的分布などの特定の測定の必要性に従って個々の細胞の姿勢を制御することは、ＮＦｋＢなどの調節分子の転移の分析を可能にし、ＦＩＳＨ分析のためには不可欠である。
【０１３２】
Ｂ１．蛍光試験
本発明のＩＴＩＣＢＰ装置およびその周辺測定システムでは、蛍光試験の様々な特有の性質が利用されており、これらには下記が含まれる：
・蛍光強度（ＦＩ）
・蛍光スペクトル（ＦＳ）
・蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）
・蛍光偏光または蛍光異方性（ＦＰまたはＦＡ）
・時間分解蛍光（ＴＲＦ）
・蛍光寿命測定（ＦＬＴ）
・蛍光偏光減衰（ＥＰＤ）
・蛍光相関分光学（ＦＣＳ）
【０１３３】
蛍光測定は正確であり、比較的高感度であり、柔軟性があり、かつ安全である。他の生化学的標識技術および細胞に基づく標識技術と比較したとき、蛍光は、同位体標識、比色測定および化学発光のような方法を著しく上回る利点を有している。
【０１３４】
１個だけの蛍光分性子から放射されているシグナルを確実に検出することは、現代の計測については比較的簡単である。生物学的適用において、この感度レベルは、非常に少数でしか存在し得ない分子を容易に検出することを可能にし、そしてＩＴＩＣＢＰ装置の場合、それらの細胞内位置を決定することができる。この高い感度レベルはまた、一過性の生物学的事象を非常に迅速に検出することができ、従って、個々の生細胞の内部で非常に迅速に生じている事象の測定および理解を可能にすることを意味する。重要なことではあるが、蛍光技術の固有的な感度はまた、非常に低い濃度の蛍光標識の使用を可能にする。他の標識技術と比較して、このことは、データの信頼性を大きく増大させる。なぜなら、レポーター分子は正常な細胞機能を妨害しないからである。
【０１３５】
蛍光性マーカーの特異性は非常に大きい。蛍光性マーカーは、事実上任意の生体分子または構造体または細胞タイプを標識するために容易に利用することができる。免疫蛍光プローブは、特異的なタンパク質だけでなく、特異的な確認、切断産物、またはリン酸化のような部位修飾体に対しても結合させることができる。個々のペプチドおよびタンパク質は、それらをＡＦＰキメラとして細胞内で発現させることによって自己蛍光性に操作することができる。標識時における高親和性抗体の結合および／または構造的連結の使用は、非特異的なバックグラウンドの劇的な低下をもたらし、容易に検出されるきれいなシグナルをもたらす。そのような高レベルの特異性は、同定された１個だけの生存細胞における細胞内構成体の間および細胞内構成体同士で生じる複雑な相互作用を研究および理解するために、それぞれが特有の色で発光するいくつかの異なる蛍光標識の同時使用のために新しいＩＴＩＣＢＰ装置を適用することができる。あるいは、多数の蛍光標識を、同じ個々の細胞または細胞群に対する一連の連続する定量的研究において使用することができ、多数の細胞応答の測定を同時または連続的のいずれかで可能にする。他の標識方法と比較して、蛍光試薬の検出は、優れたダイナミックレンジ、リニアリティおよび正確性を提供する。
【０１３６】
それにもかかわらず、蛍光性マーカーおよび蛍光方法論には、蛍光性マーカーおよび蛍光方法論を無力にする、少数ではあるが、重大な欠陥がある：
・測定の特性および正確性が染色方法によって決定される。種々の製造者によって作製された蛍光プローブの非均一性の程度が大きいことおよびそれらの限られた貯蔵安定性は、日常的な研究適用および臨床適用において、そして結果の解釈に関連する一般的な合意に達することにおいて大きな測定問題を長年にわたってもたらしている。これらの問題はさらに複雑になっており、これは、染色するための調製的技術、例えば、色素を細胞内に入れるために必要とされ得る固定処理および透過化処理などは、未だ均一的でなく、かつ／または確立されていないからである（Ｓｈａｐｉｒｏ、１９９５）。
・均一かつ安定した染色が、共有結合的に結合したプローブにおいてさえ保障され得ない。周囲条件（温度、ｐＨ、イオン強度など）のわずかな変化が測定結果に大きな影響を及ぼしている。
・免疫蛍光などにおける低い染色レベルでの不安定性の問題に対して、自己蛍光から生じるノイズが加わる。この自己蛍光は、主にピリジンヌクレオチドおよびフラビンヌクレオチドが存在するためであり（Ａｕｂｉｎ、１９７９；Ｂｅｎｓｏｎ他、１９７９）、免疫蛍光測定の感度を制限する。
・蛍光シグナル測定値の標準化。この問題は非常に厄介であるので、雑誌「Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」の特集号がこの課題に対して完全に向けられた（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９８年１０月）。
・退色、蛍光性マーカーの細胞からの漏出／放出、そして正常な細胞機能の妨害は、蛍光測定に関連して広く知られている欠点である。
【０１３７】
ＩＴＩＣＢＰ装置は、細胞を収容しながら、細胞の大きな角度の散乱パターンの測定を可能にする個々の透明なウエルの様々な特徴を利用することによって上記欠点に対処している。その結果、特別な染色調製処理を必要とせず、かつ妨害しない相補的な静的および動的な可視光散乱技術を行うことができる（Ｓｃｈｉｆｆｅｒ他、１９９９）。さらに、散乱光の測定では、妨害しない光エネルギー（振動数）が使用されるという事実は、蛍光技術において可能であるよりもはるかに長い、非常に長い期間にわたるモニターリング（数時間〜数日）を可能にしている。このことは、ＴＣＣの特有の特徴との組合せで、同じ個々の細胞および関連する子孫に対して行われる長期間にわたる実験生物学の研究開発（Ｒ＆Ｄ）に対する広範囲の選択肢をもたらしている。
【０１３８】
Ｂ２  示差的光散乱（ＤＬＳ）
生細胞の構造パラメーターを見つけることは、細胞の研究および診断学の分野における中心的なツールになりつつある。雄性および雌性の両方の不妊などのプロセス（Ｐａｓｔｅｕｒ他、１９８８；Ｓｃｈｉｆｆｅｒ他、１９９６）では、異常な細胞構造が潜在的な機能不全と相関している。細胞増殖およびプログラム化された死（アポトーシス）では、細胞サイズがアポトーシスの段階と相関しており、このことは臨床研究において役立ち得る（Ｓｏｉｎｉ他、１９９７）。現在、構造的パラメーターは、主に、フロースルー法およびビデオ画像分析法を使用して測定されている：
・フローサイトメーター（ＦＣ）システムでは、細胞構造が、細胞を含有する生理学的液体のジェット流をレーザービームの中に入れることによってサンプリングされる。細胞によって散乱された光を前方方向および側方方向で集めることができる。前方方向の強度は、細胞体積と相関すると考えられ（Ｓｌｏｏｔ他、１９８８）、これに対して、側方の散乱は細胞の内部粒状性を表す。しかしながら、実際の使用では、これらのパラメーターは、光学的変動性（Ｓｅｇｅｌ他、１９８１）、誤って解釈される細胞水分含有量の変化（Ｓｌｏｏｔ他、１９８８）、および細胞の吸収特性、従って前方散乱強度を変化させる蛍光性マーカーの存在（Ｓｈａｐｉｒｏ他、１９８５）などの理由のために多くの場合には分かりにくいことが判明している。
【０１３９】
画像分析（ＩＡ）では、細胞のデジタル分析が、光学顕微鏡を使用して行われる。これは、ＣＣＤ検出器表面に細胞の安定した焦点像を作るために、対象物面の正確な位置決めを要求する。実際、これは、顕微鏡において一般的に使用されているカメラによって達成することができない。ミクロンスケールでの非常にわずかなずれは、比較的大きい偏差を細胞サイズ測定においてもたらし得る（Ｍｏｒｕｚｚｉ他、１９８８）。さらに、各フレームが数十個の細胞を含有する多数のフレームがビデオ画像分析では使用される。このようにして、形態学的情報が、細胞の塊に関して得られ、一方、個々の細胞の挙動についてはほとんどない。従って、細胞調製物における異質性を規定することは不可能である。
【０１４０】
相対的な回折指数の関数として識別能を評価するために、水およびスクロース溶液に懸濁された、直径が６μｍ、７μｍおよび９μｍであるポリスチレンビーズの前方散乱シグナルがＦＡＣＳで測定された。図１０１Ｍに示される結果は、屈折率が増大したとき、２つの大きな問題を示している：（ａ）識別能が著しく低下する（３つのビーズ群が、スクロースに懸濁されたときには分離することができなかった）；そして（ｂ）対象物の体積の誤った解釈（低下）。
【０１４１】
集団において個々の細胞における構造的変化を定量化するために示差的散乱法を適用することにおけるＩＴＩＣＢＰ装置の使用は、本明細書に示されるように、これらの問題に対処しており、それにより、示差的散乱を、生細胞の静的局面および動的局面の両方における形態学的測定のための非常に実用的な方法にしている。ミクロンの対象物を形態学的に定量することの利点を例示するために、対象物自体の屈折率に近い屈折率を有する溶液に試験対象物を懸濁した後のサイズ測定における分解能に関する比較が行われた。ＤＬＳ測定は、これらの２つの他の方法に関して顕著な安定性および正確性を示している。
【０１４２】
ＩＴＩＣＢＰ装置を使った個々の生細胞の構造的パラメーターおよび形態学的パラメーターのモニターリングは、細胞の大きい角度の回折パターンのそれぞれを分析することに基づいている。
【０１４３】
平行化された光ビームが細胞に向けられたとき、細胞の構造的特徴を事実上含有する散乱パターンがもたらされる。これらの構造的特徴は、直接的な分析手法を適用したときに抜き出すことができる。この方法の第１の利点は、平行化されたビームが対象物に対する特定の面を要求しないという事実であり、従って、焦点問題が生じないはずである。第２は、それぞれの細胞の挙動が記録され得るように、それぞれの細胞が個々に照射されるということである。また、検出用ＣＣＤカメラの表面アレイを対象物面の下の任意のところに位置させることができる。対象物がビーム域内に存在しないとき、光は決して散乱されないので、コントラストは常に十分である。
【０１４４】
基本的には、散乱をもたらす対象物は、散乱体の光学的プロフィルの二次元フーリエ変換として記述することができる。
【数１】
2005506083.tif 000005
式中、α（ｘ，ｙ）＝Ｄ（ｘ，ｙ）［ＲｅΔｕ（ｘ，ｙ）＋ｉＩｍΔｕ（ｘ，ｙ）］であり、Δｕ（ｘ，ｙ）は対象物の複素屈折率であり、Ｄ（ｘ，ｙ）は任意の所定の点でのその幅である。φおよびθは散乱角である。対象物の大きさは照射波長よりもかなり大きく（すなわち、生細胞は可視光によって照射され）、そして懸濁媒体の屈折率との差が、生理学的溶液に懸濁された生細胞の場合などのように小さいときには、式１は下記のように書くことができる。
【数２】
2005506083.tif 000006
この積分は、散乱パターンが、照射ビームの波面における位相ずれの結果として妥当に記述されることを示唆している。これらの位相ずれにより、そうでない場合の一方向の波面は、対象物の散乱回折パターンとして遠方のスクリーンに表される光線の角度分布に分けられる。
【０１４５】
・対象物を２つの波長で同時に照射し、従って、二重照射を使用して細胞パラメーターを測定することによって既存の分解能を向上させることが可能である。
【０１４６】
Ｂ３．ＩＴＩＣＢＰ装置へのバイオセンサーおよび電気化学型反応技術の一体化
バイオセンサーは、複雑なサンプル処理を必要とすることなく直接的に生物学的または化学的な化学種を検出するために生物学的感受性物質を使用する分析装置である。バイオセンサーは、通常、生化学的応答を定量可能かつ処理可能な電気シグナルに変換する好適な変換システムに生物学的感受性物質を結合することによって作製される。
【０１４７】
生物学的感受性物質は、酵素、抗体（Ａｂ）または抗原（Ａｇ）、核酸、受容体またはリガンド、ペプチドなどであり得る。これらの物質は、試験混合物の認識に関与し、最終的な装置の選択性および感度を提供する。非常に簡単な言い方では、分子の認識は、それぞれの受容体領域および認識される生物学的成分（または分析物）の「鍵穴および鍵」原理によって達成される。生物学的分子が特異的に相互作用するとき、相互作用に伴う１つ以上の物理化学的パラメーターの変化が生じる。この変化は、イオン、電子、熱、集塊または光を生じさせ得る。変換器により電気シグナルに変換されるこれらの量は増幅され、処理されて、好適な形態で表示される。
【０１４８】
（ａ）生物電気化学的センサー：生物学的認識の選択性を、現在の電気分析技術の高感度および相対的な簡便性と組み合わせること。生物電気化学的センサーは、生化学的応答を定量可能な電気シグナルに変換する電極に取り付けられた生物学的感受性物質（酵素、抗体または抗原、核酸、受容体またはリガンド、ペプチドなど）からなる。
【０１４９】
（ｂ）免疫センサーによる免疫反応性の決定：ＩＴＩＣＢＰ装置の免疫センサーは、非限定的な様式で下記において説明される酵素チャンネリング機構に基づいている。固定化された抗体で被覆された電極がサンプルとインキュベーションされ、標的抗原が表面において選択的に捕捉される。同定および定量が、酵素標識された抗原を競合アッセイにおいて使用して、または酵素で標識された二次抗体をサンドイッチアッセイにおいて用いて行われる。感度は、電極により、溶液全体における生成物の濃度ではなく、表面の酵素層によって生じる生成物の高い局所濃度が検知されるので高い。
【０１５０】
（ｃ）電気化学型反応：電気化学型反応は、生物活性な表面の特徴づけにおいて十分に明らかにされている。様々な電流測定酵素電極および電位差測定酵素電極が知られ、かつ商品化されており、そして診断装置におけるそれらの使用が、最近では、特に活発な研究領域になっている（Ｗｅｅｔａｌｌ、１９７６；Ｗｅｅｔａｌｌ、１９９３）。様々な電気化学的技術を、電極表面での薄膜における構造機能の関係性を調べる際にはさらに利用することができる。例えば、インピーダンス測定およびクロノアンペロメトリーにより、電極上の薄膜の誘電定数および輸送特性に関する情報が明らかにされる。
【０１５１】
（ｄ）ガン細胞において一酸化窒素をモニターするための修飾電極
フタロシアニン修飾電極は、ナノモル濃度の一酸化窒素を測定することができるので、活性化剤または阻害剤にさらされた後のガン細胞によって放出されるＮＯのモニターリングにおいて適用されていた（Ｒａｖｅｈ他、１９９７）。
【０１５２】
近年、その場での遺伝子発現を検出するためのバイオセンサーもまた開発されている。レポーター遺伝子ＬａｃＺを有する遺伝子操作された細胞が、重金属に対する細胞応答のオンラインモニターリングのために使用されていた。ＣｄイオンまたはＨｇイオンの存在下で、これらの細胞は酵素β−ガラクトシダーゼの産生を開始し、細胞内部での酵素活性が電気化学的に追跡された（Ｂｉｒａｎ他、１９９８）。
【０１５３】
Ｂ４．単一の個々の細胞において行われる細胞内酵素反応の推定
酵素活性は、通常、２つのパラメーターによって特徴付けられる：ＶＭＡＸ−その飽和濃度における基質（Ｓ）からの生成物（Ｐ）の最大酵素産生割合（速度）、およびＫＭ−ミカエリス−メンテン定数（これは、基質に対する酵素親和性に逆比例する）。
【０１５４】
ＶＭＡＸ、ＫＭ、基質濃度［Ｓ］、およびＳがＰに変換される初速度Ｖの関係は、下記のミカエリス−メンテン式によって与えられる。
【数３】
2005506083.tif 000007
残念なことではあるが、式１は、下記のプロセス：
［Ｓ］＋［Ｅ］←→［ＥＳ］および［ＥＳ］→［Ｐ］＋［Ｅ］
（式中、［Ｅ］および［ＥＳ］はそれぞれ酵素濃度および酵素−基質複合体濃度である）
が生じる均一な媒体においてだけ正確である。
【０１５５】
式１を利用してＫＭおよびＶＭＡＸを決定するために、様々な値の［Ｓ］について同じ個々の細胞の連続した暴露および反復可能な測定が要求される。
【０１５６】
残念なことではあるが、この要件は、一般的なサイトメーター、すなわち、フローサイトメーター（ＦＣ）ならびにレーザー走査サイトメトリー（ＬＳＣ）によって達成することができない。ＦＣでは、大きな細胞集団の蛍光強度（ＦＩ）の迅速な測定が可能である。しかしながら、流れの中にある各細胞は１回だけ測定されるだけであるので、ＦＣの速度論的曲線は、同じ１個だけの細胞の逐次的測定ではなく、様々な１個だけの細胞の逐次的な経時的測定をもたらす。例えば、下記を参照のこと：
１．Ｄｏｌｂｃａｒｅ  Ｆ、フローサイトメトリーのための酵素の蛍光染色、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、３３：８１〜８８、１９９０；
２．Ｋｌｉｎｇｅｌ  Ｓ、Ｒｏｔｈｅ  Ｇ、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ  Ｗ、Ｖａｌｅｔ  Ｇ、ローダミン１１０基質を用いた生細胞でのセリンプロテイナーゼ活性のフローサイトメトリー測定、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４１：４４９〜４６０、１９９４；
３．Ｍａｌｉｎ−Ｂｅｒｄｅｌ  Ｊ、Ｖａｌｅｔ  Ｇ、蛍光原性基質を用いた造血細胞におけるエステラーゼおよびホスファターゼの活性および速度論のフローサイトメトリー測定、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１：２２２〜２２８、１９８０；
４．Ｎｏｏｔｅｒ  Ｋ、Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒ  Ｈ、Ｊｏｎｋｅｒ  ＲＲ、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｎｇｈ  ＧＪ、オンラインフローサイトメトリー。速度論的測定のための万能的な方法、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４１：５０９〜５２６、１９９４；
５．Ｔｕｒｃｋ  ＪＪ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＪＰ、フローサイトメトリーによるロイシンアミノペプチダーゼ活性、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４１：４６１〜４６８、１９９４；
６．Ｗａｔｓｏｎ  ＪＶ、Ｄｉｖｅ  Ｃ、酵素速度論、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、４１：４６９〜５０８、１９９４。
【０１５７】
従って、ＦＣを使用して、種々の細胞タイプにおいて、または細胞内領域において種々の酵素活性を調べることは、細胞集団について、または無細胞系における様々な特定の酵素について平均的なＫＭ値を与えるだけである。
【０１５８】
ＬＳＣでは、選択された場における低い細胞密度、ならびに測定を中断させる退色を受けない細胞タイプおよび色素の特異的な条件のもとで個々の細胞の蛍光速度論が測定される［Ｗａｔｓｏｎ  ＪＶおよびＤｉｖｅ  Ｃ、酵素速度論、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９８４）、４１：４６９〜５０８］。ＬＳＣ技術では、細胞はその最初の位置を保っていないことがあるので、反復可能な染色処理の後における同じ細胞の正確な再走査を保障することができない。さらに、ＬＳＣでは、細胞位置の保持が保障され得ず、従って、細胞の同定が、反復され得る洗浄、および種々の基質濃度に対する暴露のときに失われることがある。
【０１５９】
反復可能な染色条件のもとで個々の細胞の速度論的測定に対する様々な可能性を提供するために、特別に設計されたサイトメーターが使用されていた。このサイトメーター（以降、Ｃｅｌｌｓｃａｎ  Ｍａｒｋ  ＳまたはＣＳ−Ｓとして示される）は、その形式の１つが米国特許第４，７２９，９４９号、同第５，２７２，０８１号、同第５，３１０，６７４号および同第５，５０６，１４１号に記載されているが、細胞操作時における個々の細胞の時間分解速度論を測定するために適用可能であることが見出されていた。
【０１６０】
ＣＳ−Ｓの特有な適用を使用して、同じ細胞が、増大する基質濃度に順次さらされる新しい方法が開発された。生成物の形成速度が、どの基質濃度でもそれぞれの細胞について測定され、これにより、一連の速度が同じ個々の細胞について得られる。このデータを使用して、ＶＭＡＸおよび見かけＫＭＡＰＰ（ａｐｐ＝見かけ）の値をそれぞれの細胞について計算することができ、これにより、測定された集団のＫＭＡＰＰおよびＶＭＡＸの分布が得られる。
【０１６１】
しかしながら、本発明のプロセスは、ＣＳ−Ｓサイトメーターに限定されず、そして、顕微鏡、光検出手段、細胞が個々に配置させられるキャリアを含む任意のサイトメーターは本発明の範囲内であることを強調しておかなければならない。
【０１６２】
速度論的分析
速度論的パラメーターは、線形モデル構築および非線形モデル構築の適用によって得られる。線形モデルのｙ（ｔ）＝Ａｔ＋Ｂでは、データを直線式に近似するパラメーター（ＡおよびＢ）が求められる：この場合、ｙ（ｔ）は測定量であり、ｔは時間であり、ＡおよびＢは、計算されたパラメーターである。ＣＳ−Ｓアルゴリズムでは、χ２が、適合度に対する基準として使用される。
【０１６３】
（ａ）単一工程の細胞染色
蛍光原性基質の細胞内回転を記述するための単純化されたモデルが図７０に示される。最初に、細胞外基質［Ｓ］Ｏが細胞内に浸透して、［Ｓ］ｉ（細胞内基質濃度）になる。その後、［Ｓ］ｉは酵素によって加水分解または切断されて、細胞内（例えば、蛍光性）生成物［Ｐ］ｉをもたらし、これは細胞から培地に放出され、［Ｐ］ｏになり得る。
【０１６４】
以前に示されたように［Ｂｅｄｎｅｒ  Ｅ、Ｍｅｌａｍｅｄ  ＭＲ、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  Ｚ、レーザー走査サイトメトリーによって個々の細胞において測定された酵素の速度論的反応および蛍光色素の取り込み速度、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３３：１〜９、１９９８］、［Ｐ］ｉの速度論は、良好な近似により、下記の速度式によって記述することができる：
【数４】
2005506083.tif 000008
（式中、αおよびβは、細胞内フルオレセインの生成および漏出に対する速度定数である）。αが２つのプロセスを表すことを強調することは重要である：Ｓの浸透およびその細胞内分布、ならびに［Ｓ］ｉの酵素加水分解。
【０１６５】
式２を一工程染色の初期条件［Ｐ（ｔ＝０）］Ｉ＝０のもとで解いたとき、
【数５】
2005506083.tif 000009
であることが容易に示される。
【０１６６】
（ｂ）連続した染色
本発明の別の局面は、同じ個々の細胞を種々の基質濃度に順次さらすことに関する。これは、染色開始時点において、所定の溶液に関して、細胞が、既に、下記のレベル：
【数６】
2005506083.tif 000010
（式中、τは、所定の基質濃度による染色、例えば、［Ｓ］のＭ倍（Ｍ［Ｓ］）による染色を終了し、異なる基質濃度による染色、例えば、Ｎ［Ｓ］による染色の開始する時点を表す）
に染色されつつあるという事実によって上記の場合とは異なる。
【０１６７】
ここで、式２を、式４によって示される初期条件のもとで解くことが可能である。変数分離、そして、［Ｐ（τ）］ｉおよび［Ｐ（ｔ）］ｉの濃度範囲の間での［Ｐ］ｉに関する積分、ならびに、０（染色液が置き換えられたとき）およびｔの時点の間での時間に関する積分によって、下記の式が得られる：
【数７】
2005506083.tif 000011
対数表現を指数関数表現に変換し、式４の［Ｆ（τ）］Ｉを式５に導入することにより、下記の式が得られる：
【数８】
2005506083.tif 000012
単一工程の染色が行われたとき（非染色細胞の開始、Ｍ＝０）、式６の最後の項のみが残り、これは式３と一致する。
【０１６８】
表現ｅｘｐ（−βｔ）≒１−βｔが、それらの染色履歴にかかわりなく、所定の条件における個々の細胞の観測間隔の継続期間にわたって適用される限り、式６における指数関数項のそれぞれは、正確性を失うことなく、べき乗級数のその最初の２つの項によって置き換えることができる。従って、式６は線形近似することができ、下記の式が得られる：
【数９】
2005506083.tif 000013
式７は下記のように理解しなければならない。０＜ｔ＜τの場合、染色は［Ｐ（ｔ）］ｉ＝α［Ｓ］Ｍｔに従って進行する。時間ｔ＝τで染色液ＭをＮによって置き換えた後では、Ｍ［Ｓ］による染色は［Ｐ（τ）］Ｉ＝α［Ｓ］Ｍτで一定のままであり、一方、Ｎによる染色は、α［Ｓ］Ｎの割合で、すなわち、使用中の濃度にだけ依存して増大する。
【０１６９】
いくつかの実際の染色プロトコルの、式７に基づくシミュレーションが、図７１にグラフ的に示され、簡単には下記に記載される：
ａ）［Ｎ］＝［Ｍ］を維持する染色液［Ｎ］で細胞を洗浄することにより、染色曲線［Ｐ（ｔ）］Ｉ＝α［Ｓ］Ｎ［τ＋ｔ］が得られる。観測時間τ＋ｔにおいて、［Ｐ］ｉは、α［Ｓ］Ｎの生成速度を有していた。これは、τ＋ｔの前におけるα［Ｓ］Ｍの生成速度と同じ速度である（図７１ａ）。
ｂ）細胞をＰＢＳ単独で洗浄することにより、［Ｍ］残渣が洗い流され、染色液が濃度［Ｍ］＝０で残る。この作用は、任意のさらなる産生［Ｐ］Ｉを停止させた（適用時間τにおいてα［Ｓ］Ｎ＝０であるからである）。従って、［Ｐ］ｉ線は、観測継続期間ｔにわたって時間軸に平行したままであった（図７１ｂ）。
ｃ）同様に、細胞が染色液［Ｎ］≠［Ｍ］で洗浄され、これにより、［Ｍ］が洗い流され、染色液が濃度［Ｎ］で残った。［Ｐ］ｉの生成速度は、予想されるように、観測継続期間ｔにわたってαＮ［Ｓ］に変化した（図７１ｃ）。
ｄ）最後の実験は、ｂ）およびｃ）を連続して組み合わせたものであった。最初に、細胞が時間ｔ１においてＰＢＳで洗浄され、これにより、ＦＩの産生が停止した。次の段階は、ＰＢＳを濃度［Ｎ］の溶液によって置き換えて、染色液［Ｎ］≠［Ｍ］で洗浄することであった。その場合の生成速度は、観測継続期間ｔにわたってα［Ｓ］Ｎに変化した（図７１ｄ）。
【０１７０】
図７２には、上記に述べられたシミュレーション実験に正確に従って行われた実際の実験結果が示される。
【０１７１】
最後に、Δｔ（逐次染色実験処理時間の全体的な継続時間）の決定は、個々の細胞のＦＩ測定を行う際、現在のＣＳ−Ｓの標準偏差（これは２％未満である）に従うように限定されていた。
【０１７２】
指数関数項を線形近似したときにこの値を超えないために、下記の比率：
ｅｘｐ（−βΔｔ）／（１−βΔｔ）≒２％
を保つΔｔ値が求められる。従って、β≒１０−４秒−１（これは、数百回の独立した実験の結果（データは示されず）である）を導入することにより、Δｔ≒１０３秒が得られる。
【０１７３】
下記の例は、本手法を単に例示するために提供されており、このプロセスおよび適用の範囲をいかなる点においても限定することを意図していない。
【０１７４】
例：基質としてフルオレセインジアセタート（ＦＤＡ）を使用して１個だけのリンパ球における細胞内の非特異的なエステラーゼ活性を測定すること。
【０１７５】
（ａ）材料および方法
フィトヘマグルチニンＰＨＡ（ＨＡ１５、Ｍｕｒｅｘ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を５ｍｌの二回蒸留水で再構成し、さらに１０倍に希釈した。刺激のために、この溶液の１０μｌを９０μｌの細胞懸濁物（７ｘ１０６細胞／ｍｌ）に加えた。
【０１７６】
培養培地は、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０単位／ｍｌのストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）からなった。
【０１７７】
ダルベッコリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）における３．６μＭのＦＤＡ（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ  Ａｇ．Ｓｅｅｌｚｅ−Ｈａｎｏｖｅｒ）の染色液を下記のように調製した：５０ｍｇのＦＤＡを５ｍｌのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に溶解した。この溶液の７．５μｌを５０ｍｌのＰＢＳに加えた。０．６μＭ、１．２μＭおよび２．４μＭについては、溶液をＰＢＳでさらに希釈した。
【０１７８】
（ｂ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製：
３０ヘパリン添加血液（３０ｍｌ）は健康かつ正常な志願者に由来した。ＰＢＭＣの分離手順はどこかに詳細に記載されている［Ｓｕｎｒａｙ  Ｍ、Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｍ、Ｋａｕｆｍａｎ  Ｍ、Ｔｉｒｏｓｈ  Ｒ、Ｗｅｉｎｒｅｂ  ＡおよびＲａｃｈｍａｎｉ  Ｈ、細胞の活性化は細胞染色速度論に影響を及ぼす、Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  Ａ（１９９７）、５３：１６４５〜１６５３］。鉄吸収細胞を除いた後直ちに、残った細胞を２層（１００％および８０％）での細胞密度勾配（フィコールパーク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１．０７７ｇ／ｍｌ）に重層し、遠心分離した。２つのフィコール層の間の境界に集積した細胞を集めて、５ｍｌの富化培養培地において３７℃で一晩保った。翌日、ＰＢＭＣを洗浄し、ＰＢＳに７・１０６細胞／ｍｌの最終濃度で再懸濁した。７０％を超える細胞がＴリンパ球として明らかにされ、そしてエオシンを使用して決定された生存性は常に９０％よりも大きかった。
【０１７９】
（ｃ）ＰＨＡによるＰＢＭＣの活性化：
新しく調製されたＰＢＭＣ（７・１０６細胞／ｍｌ）を、３７℃、５％ＣＯ２で、５μｇｒ／ｍｌのＰＨＡと３０分間インキュベーションした。ＰＢＭＣのコントロールは、同一条件下、ＰＨＡを加えることなくインキュベーションされた。
【０１８０】
細胞に、Ｈｅ−Ｃｄレーザーからの１μＷ〜１０μＷの４４２ｎｍ光を照射した。ここで使用された染色条件のもとでは、それぞれの色素負荷細胞からの統計学的光子誤差が約１％であるための１０，０００個の光子カウント数を得るための走査時間は、０．００１秒〜約０．５秒の範囲であった。
【０１８１】
取得データは、細胞位置、それぞれの細胞についての測定継続時間、絶対時間、２つの異なる波長での強度、コンピューター処理された蛍光偏光値、および試験設定情報を含めて、スクリーンに、オンラインで、グラフ的および数値的に表示され、メモリーに記録される。ソフトウエアにより、走査前または走査時に、細胞集団全体、またはオペレーターにより選択された亜集団、または個々の細胞のいずれかについて、すべてのパラメーターの範囲および他の統計学的特長を決定することができる。
【０１８２】
（ｄ）細胞負荷：
ウエルにおける細胞の負荷を、Ｄｅｕｔｓｃｈ  ＭおよびＷｅｉｎｒｅｂ  Ａ、生細胞の高精度な反復的逐次光学測定を行うための装置、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９９４）、１６：２１４〜２２６に記載されるように行った。８０μｌ量の非染色細胞懸濁物（７ｘ１０６細胞／ｍｌ）をＣＣに負荷した。その後、最初の走査を、個々の細胞のバックグラウンドの散乱および自己蛍光を検出するために行った。この望まれないシグナルは、測定位置毎に記録され、正しい蛍光シグナルを得るために（暴露後の）総放射シグナルから引かれる。
【０１８３】
（ｅ）細胞の染色および速度論的測定：
蛍光強度ＦＩ（ｔ）を測定するために、ＣＣ上の捕捉された細胞を、ＰＢＳ染色液においてＦＤＡの濃度を増大させながらＦＤＡに順次さらした。
【０１８４】
バックグラウンド測定の後、細胞を覆うＰＢＳの全量を除き、下記の手順を行った：
時間ゼロで、４０μｌの最低基質濃度溶液を捕捉細胞の上に加え、事前に選ばれた細胞場を６回順次走査した。これにより、正確な時間での６個のＦＩデータポイントが所定の色素濃度でそれぞれの個々の細胞について得られた。ＦＩは、通常、励起エネルギーと、光電子増倍管、ＣＣＤ検出器などにより検出され得る放射蛍光エネルギーとの区別を可能にするエピフルオレセンス光学配置を利用して測定される。
【０１８５】
上記手順は、実験で使用されるそれぞれの異なる基質溶液について繰り返される。
【０１８６】
これにより、１つの基質濃度につき６個のＦＩデータポイントがそれぞれの個々の細胞について得られ、これから、Ｖが得られ、個々の細胞のＫＭＡＰＰ値およびＶＭＡＸ値が計算された。不感時間（すなわち、染色液の添加から測定開始までの経過時間）は、コンピューターによってモニターされているが、約７秒〜１５秒である。
【０１８７】
Ｂ５．蛍光測定および形態計測測定と画像分析との間における相関
この節は、フローサイトメトリー分析および蛍光画像分析の能力を補うＩＴＩＣＢＰ装置技術の下記の特有の分析能力に集中する：
ａ）個々の細胞が、測定期間中、ＩＴＩＣＢＰの識別されたウエルに配置され、その結果、個々の細胞を経時的に繰り返し試験することができる。これは、酵素速度論および他の時間分解プロセスの研究のためには有用な特徴である；
ｂ）同じ細胞の逐次分析を、異なる免疫染色または細胞化学的染色または遺伝子プローブを使用して行うことができ、これにより、細胞免疫表現型、細胞機能、特定のタンパク質の発現、ＤＮＡ倍数性および細胞周期位置、および／または細胞遺伝学的プロフィルに関する情報がそれぞれの測定された細胞についてまとめられる；
ｃ）測定された細胞はどれも、蛍光顕微鏡観察もしくは明視野顕微鏡観察による肉眼検査と、または任意の他のパラメーターと相関させるために再配置することができる；
ｄ）細胞質対核での細胞内蛍光測定値の地形学的分布は、ＮＦＫＢ、ｐ５３などの調節分子の転移の分析を可能にし、そしてＦＩＳＨ分析のためには不可欠である；
ｅ）最大画素蛍光強度によって測定されるような核ＤＮＡの濃色性により、有糸分裂細胞またはアポトーシス細胞などの、クロマチン凝縮の程度が異なる細胞タイプを同定することが可能になる；
ｆ）ＤＮＡ含有量に対して正規化される比率測定法アッセイによる組織切片内の横切断細胞における組織断面構造および構成要素の分析により、臨床病理学においてＩＴＩＣＢＰ技術の適用が拡大される；
ｇ）サンプル調製時および染色時における細胞喪失が最小限であるので、少量の細胞を含むサンプルを分析することができる；
ｈ）分析された細胞は、例えば、記録的保存またはさらなる分析のために無限に保管することができる。
【０１８８】
Ｂ６．光学的および生化学的なマルチパラメーター測定
いくつかのパラメーターの相関された測定は、機能的パラメーターに相関し得る形態学的変化および生化学的変化のモニターリングを可能にする。この方法は、アポトーシス、細胞周期、細胞成長および細胞分化などの複雑な生物学的プロセスを伴うマルチパラメーター変化の非妨害性の定量的測定が必要であることに対する答えを提供する。
【０１８９】
Ｂ７．光生物刺激
低出力レーザー照射の生物刺激作用が、様々な分子レベルおよび細胞レベルで、そして同様に、全体的な器官レベルおよび組織レベルで明らかにされている。ある種の状況のもとでは、レーザー照射による相乗的作用が、免疫系において明らかにされるように見出されている。様々な作用が照射部位から離れて生じるという証拠が存在する。このことは、循環性の活性な分子が存在することを示唆している。十分な強度の場合、刺激作用は消失し、阻害が生じる。
【０１９０】
Ｂ８．光活性化
光活性化可能なプローブまたは「ケージ化」プローブの閃光光分解は、生物学的活性分子の放出を制御するための手段を提供する。ケージ化成分は、分子の結合または活性を妨害するように設計されているので、マイクロ秒〜ミリ秒を要する光活性化による非ケージ化は、活性な生成物のパルスを生じさせる。非ケージ化は、レーザービームによる照射により達成され得る。ケージ化されたイオンまたは薬物または神経伝達物質の光活性化は、細胞活性または神経伝達物質作用を迅速に開始または阻止し、従って、受容体結合、チャンネル開放および細胞活性化の速度論的研究のためのツールを提供する。
【０１９１】
さらに、本質的には非蛍光性であるケージ化分子の光活性化は、細胞骨格エレメントの動的挙動のモニターリングを可能し、そして細胞質基質の流体力学的性質および膜における側方拡散の研究を可能にする。
【０１９２】
Ｂ９．制御された生物学的プロセスの操作および調節：
生物学的活性分子（抗体、抗原、薬物）をＩＴＩＣＢＰ装置におけるＴＣＣウエルの表面に取り込むことによって、そして生理学的条件（緩衝液、イオン、浸透圧モル濃度、活性な分子）を操作することによって誘導され得るそれらの結合特性または代謝挙動による特定の細胞の検出および選択。
【０１９３】
この測定手法は、一連の適用において、特に、
ａ）抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の選択
ｂ）細胞の融合をモニターすること
ｃ）細胞分類
において非常に有用である。
【０１９４】
Ｂ１０．細胞現象の動的モニターリング（時間）
ＩＴＩＣＢＰ装置は、特定の個々の細胞の、正常および異常な分化、成長、加齢および挙動のときにおける機能的特長と相関させられた構造的変動を検出および定量することにおいて適用可能である。これは、細胞サイズ、細胞形状、細胞形態、細胞内運動、細胞質の流動性または微小粘度などの構造的パラメーターを測定することによって、そして蛍光強度および蛍光偏光によって行われ、相補的段階として、着色データおよびＩＡデータと相関させられる。
【０１９５】
Ｂ１１．蛍光性ＴＣＲ抗原リガンドを用いた特異的なリガンド結合性Ｔ細胞の直接的な視覚化および活性化−免疫診断
ガン患者に由来するＴ細胞により認識される腫瘍抗原の近年の分子同定により、腫瘍免疫学における新しい時代が始まっている（Ｃｏｏｌｉｅ、１９９７）。これまで、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答を刺激することが知られている明らかにされた腫瘍抗原のほとんどすべてが、ＭＨＣクラスＩ分子と非共有結合的に会合した短い抗原性ペプチドからなる。これらの複合体は、腫瘍細胞の表面に呈示されるが、ＣＤ８＋のＣＴＬの表面における特異的なクローン分布したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対するリガンドである。
【０１９６】
これらの抗原性ペプチドの同定は新しい可能性を開いている。第１は、内因的に産生されている抗原性ペプチドを模倣するための合成ペプチドの潜在的可能性に基づいている。第２のより注目される方法は、合成ペプチドのガンワクチンとしての潜在的な使用に基づいている。これに関連して、合成ペプチドは、単独で、またはアジュバントとの組み合わせで、ガン患者の繰り返される免疫化により強力な腫瘍特異的ＣＴＬ応答を誘発し得る。
【０１９７】
ガンの実験的免疫治療に対するこの新しい方法は、腫瘍抗原に特異的なＣＴＬの大規模なモニターリングが必要であることをもたらしている。実際、古典的なワクチン接種との類推により、応答性Ｔ細胞のレベルについてワクチン接種の影響を正確に評価するための標準的なアッセイを開発することが今や不可欠である。刺激されたことがない循環しているリンパ球集団における単一ＭＨＣ−ペプチド複合体に対して特異的なＴ細胞の頻度が変化し得ることは、現在、受け入れられている。
【０１９８】
Ｃ章：
ＩＴＩＣＢＰ装置により提供される生物学的研究および生化学的研究および毒物学的研究の範囲
一般に、内容が多い同時スクリーニングを行うための、生物学的な乱れをもたらさないＩＴＩＣＢＰの導入は、関連する情報を細胞から得るために、別のスクリーニング形式の層を置き換えるか、または少なくともそのような層を加える。ＩＴＩＣＢＰは、下記のような複雑な細胞活性：
・形態学の変化
・分化
・移動
・アポトーシス
・接着
・シグナル伝達分子の転移
・タンパク質輸送
を捕捉するために設計されている。
【０１９９】
Ｃ１．（表面に結合した）生物学的活性物質との個々の細胞の相互作用反応を研究するためのモデルとしてのＩＴＩＣＢＰ装置の使用
個々の細胞が周囲の生物学的活性物質の存在と相互作用的に応答する広範囲の生物学的研究におけるその適用に基づくＩＴＩＣＢＰ装置の顕著な特徴。２つの主要な相互作用研究は非常に注目される：
（ａ）表面に結合した生物学的活性物質との相互作用反応
誘電性表面における物質の様々な固定化技術が広く知られており、特に、吸着、共有結合的な結合、ビオチン−アビジン架橋などが広く知られている。その結果、試験されている個々の細胞の機能の活性化因子／阻害剤／調節因子／センサーとして作用する表面結合の生物学的活性物質（酵素、薬物、抗原、抗体、受容体など）の様々な研究を、ＩＴＩＣＢＰを使用して行うことができる。例えば、ＩＴＩＣＢＰの開口域表面に固定化された薬物または特異的な抗原を、Ｔリンパ球の細胞機能を活性化または制限するために使用することができる。同様に、開口域表面に固定化されたＴ細胞受容体特異的抗原を、特異的なリガンド結合性Ｔ細胞を活性化するために利用することができる。このことは、抗原性の腫瘍特異的Ｔ細胞がガンの実験的免疫治療のために使用される腫瘍免疫学の分野において非常に重要である。
（ｂ）光活性化可能な物質との相互作用反応
光活性化可能（「ケージ化」）分子の閃光光分解は、（溶液中での）遊離した生物学的活性物質または表面結合した生物学的活性物質の放出を制御するための手段を提供する。光活性化（「非ケージ化」）は、ＩＴＩＣＢＰ開口域のレーザー（またはＵＶ）照射により行うことができる。光分解的放出の細胞相互作用的作用を、蛍光プローブを使用すること、またはＩＴＩＣＢＰ開口域内に埋め込まれた電極を使用することのいずれかによってモニターすることができる。その結果、ケージ化分子（薬物、抗体、抗原など）の光活性化は、試験されている個々の細胞の活性を迅速に開始／阻害し、従って、光活性化可能な物質と試験されている個々の細胞との間における相互作用的関係の速度論的研究に対するツールを提供する。
【０２００】
Ｃ２．高反応性物質（フリーラジカル）の細胞内濃度および細胞外濃度を同時に測定することに基づく個々の細胞の生理学的状態を研究するためのモデルとしてのＩＴＩＣＢＰ装置の使用
ＮＯ、過酸化物（Ｏ２・・）およびグルタミン酸の細胞内および細胞外のレベルを測定することによる高反応性物質（これは「フリーラジカル」と呼ばれることが多い）の細胞外および細胞内の同時モニターリング。
【０２０１】
ＮＯおよびＯ２・・の細胞内レベルを同時かつ非妨害的にリアルタイムで測定することは、ＮＯ産生とＯ２・・産生とのバランスが、反応性、増殖およびアポトーシスを含む主要な細胞機能の制御に関係しているので、きわめて重要である。これらのラジカルおよびそれらの代謝産物の不適切な産生は、動物モデルにおいてこれまでにほとんどが研究されている様々な病変の発生をもたらしている。これらの病変には、心臓血管の機能不全、アテローム性動脈硬化、虚血および自律神経系疾患が含まれる。細胞においてフリーラジカルに対する有益な作用および有害な作用が同時に存在すること、そしてそれらの代謝経路の複雑さを考えた場合、生物医学的関連性を有する化学物質に対する応答として細胞集団におけるそれらの濃度を同時かつ直接的に測定できることは非常に重要である。従って、ＮＯおよびＯ２・・の同時モニターリングを可能にする強力かつ選択的な分析装置が明らかに求められている。本発明のＩＴＩＣＢＰ装置は、培養細胞についてこれらの濃度を測定することができる。このことは、本発明のＩＴＩＣＢＰ装置により、完全な動物に対する研究の代替法が提供され、そして単離された器官を用いて行われる研究が大いに補足されるので、大きな進歩をなしている。グルタミン酸は、ニューロン細胞の代謝において、そして上皮細胞の恒常性、ならびに、細胞における正常なバリア機能および輸送機能の維持において、きわめて重要な分析物であるということを考慮すると、様々な研究の範囲に含まれる。下記は、ＩＴＩＣＢＰ装置を使用して、個々の細胞（または細胞群）によって産生されたＮＯ、Ｏ２・・およびグルタミン酸を測定するための方法である：
・細胞外のＮＯ、Ｏ２・・およびグルタミン酸は、修飾された微小電極をアレイで利用して電気化学的に測定される（Ｂａｒｋｅｒ他、１９９８）。
それぞれのウエルが、これらの３つの重要な細胞反応物に対して特異性を向かわせる「感知化学反応性」でそれぞれが被覆された少なくとも３つの微小電極を伴って製造される。
・酸化的活性の細胞内アッセイが、蛍光強度（ＦＩ）、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光寿命（ＦＬＴ）および蛍光偏光減衰（ＦＰＤ）を使用して、蛍光プローブを用いてＮＯおよびＯ２・・のレベルを測定することによって行われる。
【０２０２】
ＮＯの場合、色素の４，５−ジアミノフルオレセインジアセタート（ＤＡＦ−２ＤＡ）が使用される。これは、細胞質ゾルのエステラーゼによりＤＡＦ−２に加水分解される細胞透過性プローブである。生理学的ｐＨ（６．５〜７．４）において、ＤＡＦ−２は相対的に非蛍光性であるが、ＮＯおよび酸素の存在下では、蛍光性の生成物であるＤＡＦ−２トリアゾール（ＤＡＦ−２Ｔ）が形成される。ＤＡＦ−２からＤＡＦ−２Ｔへの変換は、ＦＩ、ＦＰおよびＦＬＴの変化を生じさせる分光学的特徴の変化が伴う。ＤＡＦ−２は、ＮＯの安定な酸化形態（ＮＯ２およびＮＯ３など）と、または過酸化物もしくは過酸化水素と、そのいずれとも反応しないので、ＮＯに対して特異的である。４−アミノフルオレセインジアセタート（４Ａ−ＦＤＡ）を陰性のコントロール化合物として使用することができる。
【０２０３】
過酸化物の細胞内検出の場合、フルオレセイン、ローダミンおよびエチジウムの「ジヒドロ」誘導体（ロイコ色素）を使用することができる。これらの無色の還元形態の非蛍光性ロイコ色素は容易に酸化されて、元の色素に戻り、従って、生細胞における酸化的活性を検出するための蛍光原性プローブとして役立ち得る。しかしながら、それらは、過酸化物を直接的には検出せず、むしろ、ペルオキシダーゼ、チトクロームＣまたはＦｅ２＋の存在下、過酸化水素と反応する。
【０２０４】
一酸化窒素は過酸化物と反応して、ペルオキシニトリトをもたらし、これはジヒドロローダミン１２３とさらに反応にして、蛍光性色素をもたらす（Ｋｏｏｙ他、１９９４）。ジヒドロローダミン６Ｇの細胞内酸化は、生細胞のミトコンドリアに局在化するローダミン６Ｇをもたらす。このカチオン性酸化生成物は、より低い波長のスペクトル（赤方放射）を有しており、フルオレセイン誘導体を用いた同時分析のために特に使用することができる。
【０２０５】
ジヒドロエチジウムは、おそらくはミトコンドリアの酸化的リン酸化の脱共役によって、静止白血球において著しい酸化を受けることが示されていた。細胞質ゾルのジヒドロエチジウムは青色の蛍光を示す。しかし、このプローブがエチジウムに酸化されると、エチジウムは、細胞のＤＮＡにインターカレーションし、その核を明るい蛍光性赤色に染色する。
【０２０６】
細胞内のＮＯおよび過酸化物はまた、蛍光性のナノセンサーを利用して評価することができる。そのような場合、いくつかのセンサー送達システムが使用され、これには、リポソーム送達、遺伝子銃衝撃、および単一生細胞内へのピコ注入が含まれる。
【０２０７】
まとめると、ＩＴＩＣＢＰ装置は、フリーラジカルの細胞内レベルおよび細胞外レベルの光学的および電気化学的な同時リアルタイム測定の組み合わせを適用して細胞の毒性状態を評価することにおいて非常に有用である。すなわち、本発明の装置は、試験されている個々の１個だけの細胞の内部および外部におけるフリーラジカルの濃度を測定することに依拠する新世代の毒性試験法に対する基礎をもたらしている。
【０２０８】
Ｃ３．生細胞を乱すことなく潜在的な（生物）医学的物質の毒性に対するスクリーニング
ＩＴＩＣＢＰプラットホームの重要な局面の１つは、個々にアドレス指定されるアレイ電極を利用すること（すなわち、個々の微小電極の非常に近いところにおけるフリーラジカルの局所的濃度を測定すること）によって、生物医学的物質の毒性が、インビボでの生細胞の乱れを伴うことなく研究され得るということである。さらに、これは、毒性化合物が（例えば、ロボット工学によって、そして同様に、毒性被覆ＩＴＩＣＢＰを利用することによって）局所的に送達される場合、局所的な毒生試験を細胞モデルに対して行うことを可能にする増大した空間分解能のもとで行われる。
【０２０９】
この方法は、薬学的物質における毒性を検出するためのハイスループットスクリーニングを示唆している。この方法は、フリーラジカルならびに他の述べられたパラメーターのモニターリングを可能にし、そして、使用者に便利な装置をもたらす分析速度を増大させることができ、これにより、健康管理のためのより良好な診断的および治療的な集積を築くことを助けることができる。
【０２１０】
ＩＴＩＣＢＰ装置を使用したフリーラジカルの細胞外および細胞内の同時モニターリングは、生物医学的な関連化合物の毒性を識別するための理由をより良く評価することを可能にする。一例として、ＮＯ合成阻害剤の１つ（Ｎｗ−モノメチル−Ｌ−アルギニン）は、細胞の傷害を生じさせる酵素によって、ＮＯの阻害をもたらすが、過酸化物をも生じさせる。類似する作用は、フリーラジカルの動力学（すなわち、リアルタイムモニターリング）を検討することによって検出され得るだけである。
【０２１１】
まとめると、本発明のＩＴＩＣＢＰ装置は、培養された細胞株および初代細胞などの個々の細胞または細胞群に対するインビトロでの非常に改良された測定を行うために、精巧な現代の様々な技術を組み合わせている。より詳細には、本発明の装置は、特に、薬物発見において、そして生物学的活性物質ならびに新しい薬学的作用剤に対するハイスループット（ロボット的）スクリーニングにおいて、産業にとってさらに有益な一体化された新規な一般的技術を提供する。
【０２１２】
Ｃ４．蛍光性ＴＣＲ抗原リガンドを用いた特異的なリガンド結合性Ｔ細胞の直接的な可視化および活性化−免疫診断
ガン患者に由来するＴ細胞により認識される腫瘍抗原の近年の分子同定により、腫瘍免疫学における新しい時代が始まっている（Ｃｏｏｌｉｅ、１９９７）。これまで、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答を刺激することが知られている明らかにされた腫瘍抗原のほとんどすべてが、ＭＨＣクラスＩ分子と非共有結合的に会合した短い抗原性ペプチドからなる。これらの複合体は、腫瘍細胞の表面に呈示されるが、ＣＤ８＋のＣＴＬの表面における特異的なクローン分布したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対するリガンドである。
【０２１３】
これらの抗原性ペプチドの同定は新しい可能性を開いている。第１は、内因的に産生されている抗原性ペプチドを模倣するための合成ペプチドの潜在的可能性に基づいている。第２のより注目される方法は、合成ペプチドのガンワクチンとしての潜在的な使用に基づいている。これに関連して、合成ペプチドは、単独で、またはアジュバントとの組み合わせで、ガン患者の繰り返される免疫化により強力な腫瘍特異的ＣＴＬ応答を誘発し得る。
【０２１４】
ガンの実験的免疫治療に対するこの新しい方法は、腫瘍抗原に特異的なＣＴＬの大規模なモニターリングが必要であることをもたらしている。ＩＴＩＣＢＰ装置は、そのような大規模な研究を行うための理想的なツールである。実際、古典的なワクチン接種との類推により、Ｔ細胞の応答レベルについてワクチン接種の影響を正確に評価するための標準的なアッセイを開発することが今や不可欠である。刺激されたことがない循環しているリンパ球集団における単一ＭＨＣ−ペプチド複合体に対して特異的なＴ細胞の頻度が非常に低いことがあることは、現在、受け入れられている。従って、低い頻度を測定するための手段は非常に高感度である必要がある。
【０２１５】
特異的なＴ細胞をリンパ球の混合物において評価する最も直接的な方法が、最近、報告された（Ｃａｌｌａｎ他、１９９８；Ａｌｔｍａｎ他、１９９７；Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ他、１９９６）。この技術は、ＴＣＲリガンドの可溶性蛍光性形態の使用に基づいている。可溶性のクラスＩのＭＨＣ−抗原ペプチドオリゴマー（ほとんどが四量体）が、特異的なＣＴＬをフローサイトメトリーによって検出するために使用され得ることを示す最近の実験は、この方法が実際的であり得ることを示唆している（Ｒｏｍｅｒｏ他、１９９８）。その手法は、抗原特異的なリンパ球によって使用されるＴＣＲ遺伝子セグメントとは無関係である。ＴＣＲに対する単量体リガンドの低い固有的な親和性を迂回するために、Ｔ細胞に対するアビディティーが増大している多量体ペプチド−ＭＨＣ試薬が設計された。これは、コンセンサスなビオチン化ペプチドをＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−２）のＣ末端にコードする遺伝子セグメントを導入することによって行われていた。
【０２１６】
インビトロで組み立てられ、ビオチン化されたＭＨＣに特異的な複合体は、蛍光標識されたアビジン分子を加えることにより四量体アレイを形成するようにされた。そのような試薬は、特異的なＴ細胞と結合し、バックグラウンド染色の１０倍を超えるシグナルを生じさせる。この有望な技術的進歩は、最近、ネズミリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞媒介による免疫性を測定することに適用され、成功し、そして、腫瘍関連抗原を含むいくつかの他の抗原認識系において試験中である。
【０２１７】
本発明によれば、蛍光性ＴＣＲ抗原リガンドが、特異的なリガンド結合性Ｔ細胞の直接的な可視化および活性化のためにＩＴＩＣＢＰ装置のＴＣＣのウエル表面に固定化される。このことは、なかでも、ガンの実験的免疫治療の分野において、そして同様に、ガンワクチンとしての合成ペプチドの潜在的な使用において、腫瘍抗原特異的なＣＴＬの大規模なモニターリングを可能にしている。
【０２１８】
また、抗原性ペプチドの光反応性誘導体が使用される。光反応基の付加がペプチドのＭＨＣ結合性およびＴＣＲ結合性をそのままにしているならば、これは、ＵＶ光をサンプルに放つことによって多量体ＭＨＣ分子アレイに共有結合的に連結される。このようにして、抗原性ペプチドの解離が除かれる。
【０２１９】
下記では、本発明の主要な目標の１つにおいてＩＴＩＣＢＰ装置のウエルの表面に被覆された四量体の独占的な利用を強調するための一例が示される：Ｃｅｒｃｅｋ他の先駆的研究を考慮した免疫診断によるガンの検出および予後。
【０２２０】
ＣｅｒｃｅｋおよびＣｅｒｃｅｋ（ＣｅｒｃｅｋおよびＣｅｒｃｅｋ、１９７７；ＣｅｒｃｅｋおよびＣｅｒｃｅｋ、１９８１；Ｃｅｒｃｅｋ他、１９７８）は、悪性障害の診断において細胞質基質（ＳＣＭ）の構造化度の変化の現象を適用することに関して、生細胞におけるフルオレセインの励起スペクトルおよび放射偏光スペクトルを議論した。
【０２２１】
簡単に記載すると、Ｃｅｒｃｅｋ他は、密度勾配技術によってリンパ球の特定の亜群を他のリンパ球ならびに他の細胞タイプから最初に分離しようとした後、いわゆるＳＣＭ試験を行った。この技術は、前に指摘されたように（Ｒａｈｍａｎｉ他、１９９６；Ｒｏｎ他）、大きな欠点をいくつか有している：
・第１に、当該技術の熟知者により理解されるように、そしてＣｅｒｃｅｋ他による論文から明らかに認められるように、この技術は非常に時間がかかる。
・第２に、Ｃｅｒｃｅｅｋ他が認めるように、最終的に分離された細胞は、目的とする亜群だけに属しておらず、非常に多数（５０％程度）の他のリンパ球を含む。従って、分離された細胞の刺激に対するそれらの応答の分析は非常に限られることがある。
・第３に、分離された細胞に対してＣｅｒｃｅｋ他によって行われた刺激および応答測定はすべてが、細胞毎ではなく、バッチ物（懸濁物）における細胞のすべてに対して行われている。しかしながら、細胞毎の分析は、研究中の現象の生物学的意味を理解することについてはるかにより多くの情報をもたらすことは明らかである。
・第４に、そして最も重要なことではあるが、ＳＣＭ試験での刺激は、分離された細胞を、腫瘍組織から抽出された可溶性の腫瘍由来タンパク質（ＴＤＰ）とインキュベーションすることによって行われている。細胞活性化のこの方法は、リンパ球の刺激は、好ましくは固相として与えられるＭＨＣとの会合で所定のペプチドを与えることによって最も良く達成されるという事実のために、あまり十分ではない。
【０２２２】
最初の３つの欠点は、上記（米国特許第５，３１０，６７４号、同第４，７２９，９４９号および同第５，５０６号）で議論されたＣｅｌｌｓｃａｎ装置およびそのＴＣＣによって実にうまく解決されているが、４番目の欠点は解決されていない。
【０２２３】
しかしながら、本発明および方法論が、最初の３つの欠点を取り扱うことにおいてＣｅｌｌｓｃａｎ装置およびその細胞キャリアよりも優れているという事実に加えて、本発明は、もっぱら、明快かつ最も効率的に第４の欠点に対処している。
【０２２４】
実際、四量体の複合体は、結合した複合体との相互作用によるリンパ様細胞の活性化を高めるために、タンパク質および複合体の安定な結合を可能にするＩＴＩＣＢＰ装置のセルの、（ガラスまたはプラスチック（ポリスチレン）から作製された）透明なウエルの表面に結合させられる（複合体の結合は蛍光性マーカーおよび放射性同位体によって評価することができる）。例えば、（メラノーマ特異的ＨＬＡ−Ａ２四量体による）実験的な研究室動物および／またはガン（メラノーマ）患者のいずれかから摘出／入手された細胞。
【０２２５】
本発明によれば、活性化のシグナル伝達が、操作され、かつ視覚的に観察されながら、同じ個々の細胞および／または細胞群に関連する、電気反射率、電気化学的、電気蛍光および光学的パラメーターなどの、上記で議論された広範囲のオンラインの反復可能なモニターリング手段によってモニターされる。
【０２２６】
Ｃ５．免疫診断に基づくさらなる適用
ＩＴＩＣＢＰ装置は、ドナーリンパ球の特異的な活性化によるウイルス感染および細菌感染ならびに自己免疫疾患の検出；個体の混合リンパ球応答（ＭＬＲ）；潜在的な化学療法剤、薬物および増殖因子のスクリーニング；ウイルスワクチンおよび細菌ワクチンの試験；アレルギー試験；精子の分析；ウイルスおよび他の細胞内病原体の検出；移植における移植片拒絶の診断を含む広範囲の免疫診断アッセイにおいて適用可能である。
【０２２７】
Ｃ６．個々の細胞におけるインビボ／インシトゥー遺伝子発現をモニターするためのＩＴＩＣＢＰ装置の適用
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（これはクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）から最初に単離された）は、インビボおよびインシトゥーでの遺伝子発現をモニターするための有用なレポーターであることが証明されている（ＬｉｔｔｌｅおよびＭｏｕｎｔ、１９８２；ＷｏｏｄｇａｔｅおよびＳｅｄｇｗｉｃｋ、１９９２）。
【０２２８】
目的とするタンパク質は、簡便には、ＧＦＰ融合タンパク質がトランンスフェクション細胞において発現時に生じるように目的とするｃＤＮＡをベクターにクローン化することによって蛍光性ＧＦＰにより直接標識される。あるいは、ＧＦＰを、目的とするタンパク質を発現する同じベクターからの第２の転写ユニットまたは翻訳ユニットとして同時に発現させることができる。ＧＦＰまたはＧＦＰ標識タンパク質を発現する細胞は、その後、ＦＡＣＳまたは他のサイトメトリー分析によって検出および分取される。さらに、個々の細胞の分析もまた、ＧＦＰをレポーター遺伝子として使用して、種々の哺乳動物プロモーターのインビボ活性をモニターするために使用することができる。
【０２２９】
ＧＦＰレポーター遺伝子アッセイを利用することにより、蛍光シグナルを検出するために細胞の溶解または細胞構造の破壊を行う必要がないので、連続検出システムを行うことができる。
【０２３０】
タンパク質を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識することにより、生細胞における特異的なタンパク質のリアルタイムでの輸送または発現または活性化を直接的に可視化することが可能になる。そのような分析は、様々な細胞機能を制御することに関与する機構への非常に重要な洞察を提供している。
【０２３１】
ＧＦＰは、検出のために二次的な試薬（色素または抗体など）とインキュベーションする必要がないので、フローサイトメトリーで使用される便利なマーカーである。赤方偏移した励起スペクトルを有する新しいＧＦＰ変化体が利用できることは、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）分析をより効率的にする。さらに、この新しい赤方偏移ＧＦＰ変化体により、二重標識抗体が作製される。しかしながら、ＧＦＰ標識タンパク質は、細胞を蛍光標識試薬とインキュベーションする必要がないために、そして抗体コンジュゲートが非特異的に結合することによるバックグラウンドがないために、ＦＡＣＳ適用においてコンジュゲート化抗体よりも優れている。さらに、ＧＦＰの蛍光は安定であり、かつ種に依存せず、そして基質または補因子を何ら要求しない。
【０２３２】
Ｃ７．培養における細胞増殖のモニターリングおよび制御
ＩＴＩＣＢＰ装置は、モニターリング、研究、および刺激に対して応答することを可能にするだけでなく、遺伝子作用および細胞産物（サイトカイン、ケモカイン、ＮＯおよび他の細胞産物など）の検査をさらに可能にする。これは、回折測定と一緒に作動する装置のバイオセンサー能力を開発することによって容易になる。
【０２３３】
本システムの極めて重要な特徴の１つは、生物反応性表面に結合した細胞を長期間にわたって培養し、これにより、遺伝子発現、そして媒介因子、生物学的応答修飾因子などの産生を可能にするという選択肢である。
【０２３４】
Ｃ８．ＩＴＩＣＢＰ装置および方法論の予想される利点
全体的な構成要素および対応する方法論は、すべてが本発明に付属するが、細胞生物学適用および電気光学の絶えず拡大し続けている総合的な分野に影響を及ぼすことが予想される。見込まれる開発には、新しい設計、製造技術、細胞操作技術および細胞診断ツールが含まれる。これらの新しい開発は、ミクロ光学、電気光学および細胞生物学技術の一体化を成功させるためには必須である。そのような一体化は、一般には細胞の進化および操作、特に、細胞の悪性形質転換の研究、薬物Ｒ＆Ｄ、ならびに診断および治療などの、非常に労力を要する適用に対して非常に有益である。
【０２３５】
提案されたＩＤＣおよびその実用的な暗示のいくつかの具体的な可能性が、簡単ではあるが、下記に記載される：
Ｃ９．経済的なハイスループットスクリーニングの産物
ＴＣＣ装置プレートは、１００ｘ１００または１５０ｘ１５０のマイクロウエルからそれぞれが組み立てられる少数の試験用の場を保有する顕微鏡スライドガラスの標準的な外形寸法を有し得る。それにもかかわらず、マイクロウエルは、約５ｘ１０−１２リットル（５μμＬ、プレートにおいて今日利用可能な９６マイクロウエルについての５０μＬと比較のこと）の総体積と、光学的に平坦な、直径が約１２μｍの底部とを有するように特別に設計される。減少した作業体積は、様々な蛍光アッセイおよび比色測定アッセイにおいて使用される試薬の著しい削減と、顕著なコスト削減との両方を可能にする。狭い直径の底部はまた、約１０個のマイクロウエルの底部の全量が、ＩＴＩＣＢＰプレートを移動させることなく、ｘ１００の倍率で同時に、または観測場を限定することにより別々に可視化され得るので、微量の単一細胞培養物の迅速な分析を可能にする。
【０２３６】
ＩＴＩＣＢＰならびにその一致するカバーガラスはともに、透明または不透明なポリスチレン（蛍光アッセイの場合には黒色および白色）から、そして、下記の少なくとも４つの表面処理：
・一般的な使用については、非処理で、標準的な詰め込み；
・ＥＬＩＳＡアッセイにおいて有用であるＩＴＩＣＢＰ表面に対するタンパク質の結合を改善するための表面処理；
・それぞれのＩＴＩＣＢＰが個々に包まれ、放射線滅菌される、細胞培養のための表面処理；
・溶液がマイクロウエル全面に均一に広がるように濡れ性を増大させるための表面処理
からの選択で製造することができる。
【０２３７】
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【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】六角形のウエルから組み立てられたＴＣＣの部分上面図を例示する。
【図２】ＴＣＣのウエルの内部における個々の細胞（ウエルあたり１個の細胞）を示しており、この場合、細胞のウエル間の集積は不可能である。
【図３】図２に示されるウエルの断面を示す。
【図４】非常に詰め込まれた六角形の整列させられたウエルの上面図を示す走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を示す。
【図５】図４のＳＥＭからの１つのウエルに注目する。
【図６】ウエル壁の鋭さを強調するＳＥＭの等角図を示す。
【図７】１つのウエルの内部を占有する１個だけの細胞に注目する。
【図８】平坦な底部を有するウエルの内部における細胞を示すＳＥＭ像を示す。
【図９】ＴＣＣのウエルの内部におけるＴジャーカット細胞の透過光画像（ｘ４０）を示す。占有率は９０％を越えている。
【図１０】ＴＣＣのウエルの内部における個々の生細胞（ウエルあたり１個だけの細胞）を視覚的に測定することができることを強調する透過光画像（ｘ１００）を示す。
【図１１】ＴＣＣのウエルの内部における個々の生細胞（ウエルあたり１個だけの細胞）を視覚的に測定することができることを強調する透過光画像（ｘ１００）を示す。
【図１２】集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。透過画像（ｘ４０）が示される。
【図１３】集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。蛍光画像（ｘ４０）が示される。
【図１４】集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。透過画像（ｘ１００）が示される。
【図１５】集団内の同じ個々の細胞の透過光画像および蛍光画像を提供する装置の特有の特徴を明らかにする。蛍光画像（ｘ１００）が示される。
【図１６】１つのウエルにおける細胞間の相互作用を追跡することに関連する別の特有の特徴に注目する。写真の上部右隅に位置する、ウエルの内部における２つの相互作用している細胞が（透過光画像（ｘ１００）を使用して）示される。
【図１７】１つのウエルにおける細胞間の相互作用を追跡することに関連する別の特有の特徴に注目する。蛍光画像（ｘ１００）を使用して、同じ１対の細胞が示される。
【図１８】１つのウエルにおける細胞間の相互作用を追跡することに関連する別の特有の特徴に注目する。１５分の相互作用の後における同じ１対の細胞が示される。
【図１９】ウエルの内部における個々の細胞の着色された観察結果を提供する。ギムザ処理された細胞の着色画像が示される。
【図２０】ウエルの内部における個々の細胞の着色された観察結果を提供する。図１９の同じ細胞の細胞核および細胞膜が強調される。
【図２１】ウエルの内部における個々の細胞の着色された観察結果を提供する。図１９に記載されるように処理された細胞の高分解能拡大写真が示される。
【図２２】細胞内オルガネラを調べるための画像分析（ＩＡ）ツールの使用を明らかにする。
【図２３】非対称断面を有するウエルを示す。
【図２４】非対称断面を有するウエルを示す。図２４では、垂直壁の一体化された一部として閉鎖用歯状物が含まれる。
【図２５】階段様壁および対称断面を有するウエルを示す。
【図２６】波形の反復する丸い丘のアレイを例示する。この場合、細胞は、丸い丘と丘との間に形成される谷に局在化する。
【図２７】溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図２６の谷のＳＥＭ写真を示す。局在化前のリンパ球を示す。
【図２８】溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図２６の谷のＳＥＭ写真を示す。局在化後のリンパ球を示す。
【図２９】溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図２６の谷のＳＥＭ写真を示す。３つの無作為なリンパ球がそれらの位置に近く存在することを示す。
【図３０】溶液および細胞の両方を輸送するための溝として適用可能である図２６の谷のＳＥＭ写真を示す。細胞−細胞の相互作用を調べるときには常に、ウエルあたり２つ以上の細胞を有することが、そのようなことが所望される場合には可能であることに関連する。
【図３１】「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。丘の円形の円周と、少数の交点において保持または局在化されるリンパ球とを強調する波形丘アレイの上面図（ｘ４０）を示す。
【図３２】「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。同じ現象がｘ１００で示され、この場合、細胞−細胞の相互作用に関する位置が観測されている。
【図３３】「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。同じ現象が示され、この場合、細胞−細胞の相互作用に関する位置が観測されている。
【図３４】「波形丘アレイ形態」の透過光画像を示す。末梢血リンパ球と比較してサイズがより大きいＴジャーカット細胞が示される。
【図３５】波形丘アレイ形態の蛍光画像を示す。
【図３６】波形丘アレイ形態の着色画像を示す。細胞膜および核が着色画像において識別される。
【図３７】装置の電気化学的測定能に関連する。図は、ウエルの内側表面に取り付けられるか、または置かれる円形の電極（２０）を含有するウエルを明らかにする。
【図３８】１つのウエルの内部に多数の電極（２０ａおよび２０ｂ）を有することができることを示す。
【図３９】細胞位置決め電極の様々な配置およびＣＡＶ回路の操作を例示する。
【図３９ａ】細胞位置決め電極の様々な配置およびＣＡＶ回路の操作を例示する。
【図３９ｂ】細胞位置決め電極の様々な配置およびＣＡＶ回路の操作を例示する。
【図３９ｃ】細胞位置決め電極の様々な配置およびＣＡＶ回路の操作を例示する。
【図３９ｄ】細胞位置決め電極の様々な配置およびＣＡＶ回路の操作を例示する。
【図３９ｅ】細胞位置決め電極の様々な配置およびＣＡＶ回路の操作を例示する。
【図３９ｆ】細胞位置決め電極の様々な配置およびＣＡＶ回路の操作を例示する。
【図４０】広範囲のウエル詰め込み形態を明らかにする。正方形型ウエルのアレイを例示する。
【図４１】広範囲のウエル詰め込み形態を明らかにする。三角形型ウエルのアレイに関連する。
【図４２】所定の数のウエルからなるマトリックスをその中心に有する透明なコインを例示する。この図は、透明な正方形コインが、１００ｘ１００のウエルからなるマトリックスに対する基部であることに関連する。
【図４３】所定の数のウエルからなるマトリックスをその中心に有する透明なコインを例示する。
【図４３ａ】所定の数のウエルからなるマトリックスをその中心に有する透明なコインを例示する。
【図４４】円形コインの表面図を示す。
【図４５】円形コインの表面図を示す。互いに向き合うそのベルト壁に２つの開口部を有するコインホルダーを示す。
【図４６】コインおよびそのホルダーの断面を示す。
【図４７】コインおよびそのホルダーの断面を示す。細胞を負荷し、溶液を洗浄し、排出するための経路が例示される。
【図４８】コインおよびそのホルダーの断面を示す。
【図４８ａ】コインおよびそのホルダーの断面を示す。図４８ａは穴あきＴＣＣを例示する。
【図４８ｂ】コインおよびそのホルダーの断面を示す。穴あきＴＣＣを例示する。図４８ｂは穴あきウエル壁を示す。
【図４８ｃ】コインおよびそのホルダーの断面を示す。穴あきＴＣＣを例示する。図４８ｃは穴あきウエル壁を示す。
【図４８ｄ】コインおよびそのホルダーの断面を示す。穴あきＴＣＣを例示する。図４８ｄは、各ウエルの底部に穴が開いていることを明らかにする。
【図４８ｅ】コインおよびそのホルダーの断面を示す。穴あきＴＣＣを例示する。図４８ｅは、各ウエルの底部に穴が開いていることを明らかにする。
【図４８ｆ】コインおよびそのホルダーの断面を示す。穴あきＴＣＣを例示する。図４８ｆは、細胞の超音波処理前および超音波処理後における底部の穴あきウエルに注目する。
【図４８ｇ】コインおよびそのホルダーの断面を示す。穴あきＴＣＣを例示する。図４８ｇは、細胞の超音波処理前および超音波処理後における底部の穴あきウエルに注目する。
【図４８ｈ】コインおよびそのホルダーの断面を示す。穴あきＴＣＣを例示する。図４８ｈはＴＣＣにおける多孔性領域および非多孔性領域を記載する。
【図４８ｉ】コインおよびそのホルダーの断面を示す。穴あきＴＣＣを例示する。図４８ｉはＴＣＣにおける多孔性領域および非多孔性領域を記載する。
【図４９】コインおよびそのホルダーに数タイプの溶液または異なる溶液を供給するためのマルチリザーバーシステムの上面図を例図する。
【図５０】コインのアレイからなるＴＣＣ（ＭＣＡ）を示す。９個のウエル場の上面図を明らかにする。
【図５１】コインのアレイからなるＴＣＣ（ＭＣＡ）を示す。同じ９個のウエル場の等角図を表す。
【図５２】コインのアレイからなるＴＣＣ（ＭＣＡ）を示す。そのような場の拡大図を明らかにする。
【図５３】コインのアレイからなるＴＣＣ（ＭＣＡ）を示す。そのような場の拡大図を明らかにする。
【図５４】細胞をそのウエルから回収用の場に移すことに関連する。
【図５５】細胞をそのウエルから特別設計のマクロウエルに移すことに関連する。
【図５６】ＴＣＣの表面において懸濁物および／または溶液を移動させるためのウエル間の通路を例示する。
【図５７】液体が谷内を移動し、（ウエルとして役立つ）谷の交点における池として蓄積する、波形の丸い丘からなるＴＣＣを例示する。
【図５８】液体が谷内を移動し、（ウエルとして役立つ）谷の交点における池として蓄積する、波形の丸い丘からなるＴＣＣを例示する。液体がその間で移動しない池が示される。
【図５９】ＴＣＣの下側から細胞を見るための概略的な光学系配置を示す。
【図６０】照射面に直交して蛍光を検出するための概略的な光学系配置を示す。
【図６１】ＴＣＣの４つの側面に接続された光ファイバーリード線の４つの束を示す。
【図６２】アドレス指定可能なデジタルミラーディスプレイを使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
【図６３】液晶ディスプレイ技術を使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
【図６４】光ファイバーを使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
【図６５】一体化されたマイクロレンズアレイを使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
【図６６】一体化されたマイクロレンズアレイを使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
【図６６ａ】一体化されたマイクロレンズアレイを使用するＴＣＣウエルの照射を示す。
【図６７】一体化マイクロレンズアレイおよびＣＣＤアレイを伴うＴＣＣを示す。
【図６８】細胞の操作、走査、測定および分析を行う本発明のシステムの実施形態を示す。
【図６９】細胞の操作、走査、測定および分析を行う本発明のシステムの実施形態を示す。
【図６９ａ】細胞の操作、走査、測定および分析を行う本発明のシステムの実施形態を示す。
【図７０】蛍光原性基質の細胞内回転を記述するための単純化されたモデルを示す。
【図７１】染色プロトコルのシミュレーション結果をいくつか示す（図７１ａ〜図７１ｄ）。
【図７２Ａ】実際の染色プロトコル実験の結果を示す。
【図７２Ｂ】実際の染色プロトコル実験の結果を示す。
【図７２Ｃ】実際の染色プロトコル実験の結果を示す。
【図７２Ｄ】実際の染色プロトコル実験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図３９ａ】
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【図３９ｂ】
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【図３９ｃ】
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【図３９ｄ】
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【図３９ｅ】
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【図３９ｆ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４３ａ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４８ａ】
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【図４８ｂ】
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【図４８ｃ】
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【図４８ｄ】
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【図４８ｅ】
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【図４８ｆ】
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【図４８ｇ】
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【図４８ｈ】
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【図４８ｉ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６６ａ】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図６９ａ】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２Ａ】
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【図７２Ｂ】
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【図７２Ｃ】
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【図７２Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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