(57)【要約】試験作用物質の作用を評価するために有用な動物のコレクションが開示される。動物のコレクションは、選定遺伝子座でまたはゲノムを通して遺伝子多様性を最大化するよう意図された組合せ交配近交系動物の子孫である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ繁殖子孫を含む齧歯類のコレクションであって、該子孫が該近交系系統の各々の異なる交配からの６匹またはそれ以上のＦ１個体を含むコレクション。
【請求項２】
前記齧歯類が少なくとも６つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ繁殖子孫を含む請求項１記載のコレクション。
【請求項３】
前記齧歯類のコレクションが少なくとも８つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ繁殖子孫を含む請求項１記載のコレクション。
【請求項４】
前記齧歯類が少なくとも１０つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ繁殖子孫を含む請求項１記載のコレクション。
【請求項５】
前記齧歯類がラットおよびマウスからなる群から選択される請求項１記載のコレクション。
【請求項６】
前記近交系のうちの１つがフィッシャー３４４である請求項１記載のコレクション。
【請求項７】
前記コレクションが、４つの遺伝的に異なる近交系ラット系統の組合せ繁殖子孫を含み、該系統がフィッシャー３４４、ブラウン・ノルウェイ、ルイスおよびウイスター・キョートである請求項１記載のコレクション。
【請求項８】
各々の異なる交配からの少なくとも７匹またはそれ以上のＦ１個体を含む請求項１記載のコレクション。
【請求項９】
各々の異なる交配からの少なくとも７匹のＦ１個体を含む請求項７記載のコレクション。
【請求項１０】
前記子孫が前記近交系の各々の異なる交配からの１２匹またはそれ以上のＦ１個体を含む請求項１記載のコレクション。
【請求項１１】
前記コレクションが少なくとも６つの遺伝的に異なる近交系の組合せ繁殖子孫を含み、該子孫が前記近交系の各々の異なる交配からの８匹またはそれ以上のＦ１個体を含む請求項１記載のコレクション。
【請求項１２】
前記近交系が少なくとも予備選定遺伝子座に関する対立遺伝子を集合的に包含する請求項１記載のコレクション。
【請求項１３】
前記遺伝子座がシトクロムＰ−４５０酵素をコードする請求項１２記載のコレクション。
【請求項１４】
前記近交系が１つまたは複数の予備選定遺伝子座での対立遺伝子の数を最大にするために選択される請求項１記載のコレクション。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の予備選定遺伝子座が毒物学的に関連する酵素の１つのクラスの成員をコードする請求項１４記載のコレクション。
【請求項１６】
前記酵素がシトクロムＰ−４５０酵素である請求項１５記載のコレクション。
【請求項１７】
前記近交系の少なくとも１つが特定の疾患形質を示す請求項１記載のコレクション。
【請求項１８】
齧歯類のコレクションの成員から単離されたＲＮＡの逆転写により作製されるｃＤＮＡ分子のコレクションであって、少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ繁殖子孫を含み、該子孫が前記近交系の各々の異なる交配からの６匹またはそれ以上のＦ１個体を含むコレクション。
【請求項１９】
前記ｃＤＮＡ分子が齧歯類のコレクションの各成員から作製される請求項１８記載のコレクション。
【請求項２０】
前記近交系齧歯類系統がＦ４３４４、ブラウン・ノルウェイ、ルイスおよびウイスター・キョートである請求項１９記載のコレクション。
【請求項２１】
齧歯類のコレクションの成員から単離されたＲＮＡの逆転写により作製される標識化ｃＤＮＡ分子のコレクションを含むｃＤＮＡマイクロアレイであって、前記コレクションが少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ繁殖子孫を含み、該子孫が前記近交系の各々の異なる交配からの６匹またはそれ以上のＦ１個体を含むｃＤＮＡマイクロアレイであって、前記ｃＤＮＡ分子が、非無作為方式で単一固体支持体に結合された遺伝子特異的ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズされるｃＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２２】
前記ｃＤＮＡ分子がコレクションの各成員から作製される請求項２１記載のｃＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項２３】
齧歯類のコレクションの作製方法であって、
ａ）少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統を組合せ交配すること、および
ｂ）前記近交系の各々の異なる交配からの６匹またはそれ以上のＦ１個体をプールする
ことを含む方法。
【請求項２４】
前記近交系齧歯類系統が集合的にゲノムを通して最大遺伝子不均質性を示す請求項２３記載の齧歯類のコレクションの作製方法。
【請求項２５】
前記近交系齧歯類系統が集合的に１つまたは複数の染色体を通して最大遺伝子不均質性を示す請求項２３記載の齧歯類のコレクションの作製方法。
【請求項２６】
前記近交系齧歯類系統が集合的に１つまたは複数の遺伝子座を通して最大遺伝子不均質性を示す請求項２３記載の齧歯類のコレクションの作製方法。
【請求項２７】
前記遺伝子座が毒物学的関連酵素の１つのクラスをコードする請求項２６記載の齧歯類のコレクションの作製方法。
【請求項２８】
前記クラスがシトクロムＰ−４５０クラスである請求項２７記載の齧歯類のコレクションの作製方法。
【請求項２９】
前記近交系の少なくとも１つが特定の疾患形質を示す請求項２３記載の齧歯類のコレクションの作製方法。
【請求項３０】
試験作用物質の評価方法であって、親系統の各々の考え得る組合せ交配からの子孫の組の各成員に前記試験作用物質を投与し、そして前記齧歯類に及ぼす前記試験作用物質の作用を測定することを含み、前記組が異なる対毎の交配からの少なくとも６匹のＦ１子孫を含み、かつ前記親系統が少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統を含む方法。
【請求項３１】
前記測定が前記齧歯類から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、そして前記ｃＤＮＡを核酸マイクロアレイとハイブリダイズすることを含む請求項３０記載の試験作用物質の評価方法。
【請求項３２】
系統がフィッシャー３４４、ブラウン・ノルウェイ、ルイスおよびウイスター・キョートである請求項３０記載の試験作用物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６０／３６１，８９０号（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に対する優先権を主張する。
【連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述】
【０００２】
本発明は、以下の機関に授与された米国連邦政府の援助で成された：ＡＩ０４２３８０、ＨＬ０５４５０８、ＨＬ０５４９９８、ＨＬ０５９８２５、ＨＬ０６４５４１、ＨＬ０６６５７９、ＨＬ０６９３２１および１Ｒ４３ＥＳ１１４３２−０１。米国連邦国家は、本発明において一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
医薬品は、個体間の作用強度および効能において広範な差異を示すことが多く、そして薬剤、化学物質および食品は、ヒトに及ぼす予期せぬ毒性作用を有すことが多い。このような作用を予測するための確かな方法は、薬学的および薬剤発見産業を、ならびに食物および製品の安全性の評価を課されたものを免れてきた。
【０００４】
例えば候補治療薬の初期段階評価は通常、被験者の遺伝子型またはモデル系の遺伝子型が治療効果または副作用に及ぼす作用を有するのかを考察することなく、非ヒト被験体を試験することを包含する。後期臨床試験は通常、初期段階試験より１０〜２０倍多い被験体を試験することを包含する。一旦有望視された候補治療薬は、被験者のうちの１人が十分に応答しないかまたは副作用を示す遺伝子型を有するという可能性が増大したため、後期臨床試験では作用し得ない。遺伝子不均質性は、治療薬ならびに珍しい遺伝子型にさえ悪影響を及ぼす作用物質を摂取した可能性のある何人かの患者の間で、危害の許容不可能な危険性を示し、その結果、開発中止かあるいはすでに認可された薬剤の市場から撤退する可能性がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、試験作用物質（test agent）を評価するために有用な方法および物質に関する。特に本発明は、齧歯類のコレクション(collection)ならびに異なる遺伝子型に及ぼす試験作用物質の作用を評価するためのそれらの使用に関する。
【０００６】
本発明は、一部は、近交系齧歯類の組合せ交配(combinatorial mating)に基づいて、遺伝子多様性（例えば特に代謝酵素および経路）を示す子孫のコレクションを生じる。本発明は、異なる遺伝子型における試験作用物質、例えば候補治療分子ならびに推定アレルゲン、毒素、化学物質または食品の作用を評価するために有用な組合せ交配動物のコレクションを特徴付ける。異なる遺伝子型における試験作用物質の作用を評価するために開示された方法は、新規の治療分子の開発においてかなりの時間および資金を削減することができ、製品、食品および環境的安全性確定の精度を改良することができる。本発明は、固体支持体に結合された所定の齧歯類中で発現される全ての遺伝子に由来する核酸、好ましくはｃＤＮＡを有するマイクロアレイの使用も特徴付ける。ＲＮＡは、コレクションからの２匹の個体から単離されるか、あるいは２つの異なる色彩蛍光色素で標識される組合せ交配の２つの異なる系統からプールされ、そしてマイクロアレイ上の核酸と一緒にハイブリダイズされて、系統間で示差的に発現される遺伝子を見つけ出す。このアプローチは、組合せ繁殖子孫を用いて、毒素または化合物に対する特異的応答に関与する個々の遺伝子を同定することを可能にする。
【０００７】
一態様において、本発明は、少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ繁殖子孫を含む齧歯類のコレクションを特徴付ける。別の実施態様では、コレクションは、少なくとも６つのまたは少なくとも８つまたは少なくとも１０の遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ子孫を含む。子孫は、近交系の各々の異なる交配からの６匹またはそれ以上のＦ１個体、あるいは８匹またはそれ以上のＦ１個体を含む。いくつかの実施態様では、子孫は、近交系の各々の異なる交配からの１２匹またはそれ以上のＦ１個体を含む。いくつかの実施態様では、近交系齧歯類系統は、例えば近交系Ｆ３４４のようなラットである。いくつかの実施態様では、近交系は集合的に、予備選定遺伝子座（例えばシトクロムＰ−４５０酵素をコードする遺伝子座）に対する少なくとも２つの対立遺伝子を含む。いくつかの実施態様では、近交系は、１つまたは複数の予備選定遺伝子座（例えば、シトクロムＰ−４５０酵素のような毒物学的に関連する酵素の一クラスの成員をコードする遺伝子座）での対立遺伝子の数を最大にするために選択される。
【０００８】
別の態様において、本発明は、齧歯類の上記のコレクションの成員から単離された核酸、好ましくはＲＮＡを特徴付ける。好ましい実施態様では、上記のコレクションからの齧歯類の対からの、または各々の組合せからの系統を代表するプール試料からのＲＮＡは、ｃＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズされる。齧歯類のコレクションは、少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ繁殖子孫を含み、子孫は近交系の各々の異なる交配からの６匹またはそれ以上のＦ１個体を含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、齧歯類のコレクションの作製方法を特徴付ける。
【００１０】
本方法は、少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統を組合せ交配し、そして近交系の各々異なる交配からの６匹またはそれ以上のＦ１個体をプールすることを含む。いくつかの実施態様では、近交系齧歯類系統は集合的に、ゲノムを通して最大遺伝子不均質性を示す。いくつかの実施態様では、近交系齧歯類系統は集合的に、１つまたは複数の染色体を通して最大遺伝子不均質性を示す。いくつかの実施態様では、近交系齧歯類系統は集合的に、１つまたは複数の遺伝子座（例えば、毒物学的関連酵素の一クラス、例えばシトクロムＰ−４５０クラスをコードする遺伝子座）を通して最大遺伝子不均質性を示す。別の実施態様では、近交系齧歯類モデルは、薬剤または毒性作用物質に対する応答における、あるいは疾患、癌、心臓疾患、糖尿病または卒中の症候を特に発症することに対する感受性および耐性において最大多様性を示すよう選択される。
【００１１】
別の実施態様では、モデルは、選定組の遺伝子での多様性を最小限にし、そして残りの全体的バックグラウンドゲノム多様性を最大にするよう選択される。
【００１２】
別の態様において、本発明は、試験作用物質の評価方法を特徴付ける。本発明は、親系統の各々の考え得る(possible)組合せ交配からの子孫の組の各成員に試験作用物質を投与し、そして齧歯類に及ぼす試験作用物質の作用を測定することを含む。子孫の組は異なる対毎の交配からの少なくとも６匹のＦ１子孫を含み、そして親系統は少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系齧歯類系統を含む。いくつかの実施態様では、試験作用物質の効果の測定は、齧歯類から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、そしてｃＤＮＡを核酸マイクロアレイとハイブリダイズすることを含む。
【００１３】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【００１４】
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術および科学用語は全て、本発明が属する当技術分野の当業者により一般に理解される意味を有する。本明細書中に記述された出版物、特許出願、特許およびその他の参考文献は全て、その記載内容が参照により本明細書中で援用される。食い違う場合は、本明細書、例えば定義が規制する。開示された材料、方法および実施例は、単に例示であって、本発明を限定するものではない。本明細書中に記載されたものと類似のまたは等価の方法および材料が、本発明を実施するために用いることができることが当業者により理解されよう。
【詳細な説明】
【００１５】
本発明は、遺伝子多様性（例えば代謝酵素または経路における）を示す子孫のコレクションを得るための近交系動物または生物体（例えば齧歯類、例えばマウス、ラット、ハムスターおよびモルモット）の組合せ交配に関する。組合せ繁殖子孫のこのようなコレクションは、異なる遺伝子型に基づいた試験作用物質に対する生物学的応答における差を評価するために用いることができる。試験作用物質としては、候補治療分子、推定アレルゲンまたは毒素、食品およびその他の消費者製品（例えば化粧品、衛生用品およびテキスタイル）ならびに環境化学物質が挙げられる。
【００１６】
組合せ繁殖齧歯類
一態様において、本発明は、齧歯類コレクション（即ち、一単位を構成し、一単位とみなされる複数の齧歯類）を提供する。このようなコレクションは、少なくとも４つの遺伝的に異なる近交系の各々の考え得る組合せ交配からの６つまたはそれ以上のＦ１子孫を含む。別の実施態様では、コレクションは、少なくとも６つ、または少なくとも８つまたは少なくとも１０の遺伝的に異なる近交系齧歯類系統の組合せ子孫を含む。
【００１７】
このようなコレクションは、各々の異なる対毎の組合せにおいて親系統を交配することにより作製される。例えば親系統Ａ、Ｂ、ＣおよびＤが用いられる場合、異なる対毎の交配は：Ａ×Ｂ、Ａ×Ｃ、Ａ×Ｄ、Ｂ×Ｃ、Ｂ×ＤおよびＣ×Ｄである。各交配からのＦ１子孫はプールされて、組合せ繁殖子孫のコレクションを作製する。各々の異なる対毎の交配からの子孫は１つまたは複数の同腹子から得られ、そして同一のまたは異なる個々の親が産む同腹子から得られる。２つの近交系の所定の交配からのＦ１ラットは遺伝的に同一であるため、子孫は、例えば同一ラット閉じ込め設備中に２つの特定の近交系の各交配からの６匹またはそれ以上のＦ１子孫を入れることによりプールされることができる。
【００１８】
親系統の遺伝子多様性、ならびにそれによりそれらの組合せ交配により出産される子孫は、候補親系統において遺伝子マーカーを分析することにより、最適化されることができる。遺伝子マーカー分析を用いて、当業者は１）ゲノム全体のある程度の遺伝子同一性または異質性；２）１つまたは複数の特定染色体上のある程度の遺伝子同一性または異質性；あるいは３）１つまたは複数の予備選定遺伝子座での一定数の対立遺伝子を有すると集合的に考えられる親系統を、同定することができる。
【００１９】
一実施態様では、ゲノム全体で最大多様性を示す子孫のコレクションを生成するために最大の全体的遺伝子多様性を示すと集合的に考えられる親系統を同定し、そして組合せ交配することができる。このようなコレクションは、遺伝子標的が既知でないかまたは推測されない試験作用物質を評価するために特に有用であり得る。
【００２０】
別の実施態様では、１つまたは複数の特定の染色体（例えばＸまたは常染色体）上で最大多様性を示す子孫のコレクションを生成するために１つまたは複数の特定の染色体上で最大の遺伝子多様性を示すと集合的に考えられる親系統を同定し、そして組合せ交配することができる。
【００２１】
さらに別の実施態様では、１つまたは複数の特定の遺伝子座（例えば試験作用物質の代謝に関与すると考えられる座）で最大多様性を示す子孫のコレクションを生成するために１つまたは複数の特定の遺伝子座で最大数の異なる対立遺伝子を示すと集合的に考えられる親系統を同定し、そして組合せ交配することができる。
【００２２】
多様化のために標的化される遺伝子座としては、例えば薬剤および毒素の代謝に重要な一クラスの酵素の一成員をコードする遺伝子座が挙げられる。
【００２３】
このような酵素の活性の差は、薬剤および化学物質の生物学的利用能および代謝に影響を及ぼし、それによりこれらの作用物質の血中レベル、効能および毒性に作用する。薬剤代謝に重要な酵素のクラスとしては、例えばシトクロムＰ−４５０クラス、シトクロムＰ−４５０レダクターゼクラス、フラビン含有モノオキシゲナーゼクラス、ペルオキシダーゼクラス、エポキシドヒドロラーゼクラス、アリールエステラーゼクラス、カルボキシルエステラーゼクラス、アセチルエステラーゼクラス、コリンエステラーゼクラス、アミダーゼクラス、アルコールデヒドロゲナーゼクラス、アルデヒドレダクターゼクラス、ケトンレダクターゼクラス、アルデヒドデヒドロゲナーゼクラス、アルデヒドオキシダーゼクラス、グルクロノシルトランスフェラーゼクラス、アリールスルホトランスフェラーゼクラス、ヒドロキシステロイドスルホトランスフェラーゼクラス、エストロンスルホトランスフェラーゼクラス、胆汁酸塩スルホトランスフェラーゼクラス、メチルトランスフェラーゼクラス、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼクラス、ＡＴＰ依存性酸：ＣｏＡリガーゼクラス、Ｎ−アシルトランスフェラーゼクラス、グルタチオンＳ−アルキルトランスフェラーゼクラス、グルタチオンＳ−アリールトランスフェラーゼクラス、グルタチオンＳ−アラルキルトランスフェラーゼクラス、グルタチオンＳ−アルケントランスフェラーゼクラス、グルタチオンＳ−エポキシデトランスフェラーゼクラス、グルタチオンＳ−アリールエポシキデトランスフェラーゼクラスおよびロダネーゼクラス、ならびにここに今日まで未だ同定されていないが、しかしラットゲノムがシーケンシングされつつあることが目下既知である薬剤および化学物質の代謝に関連したその他の酵素が挙げられる。
【００２４】
その他の実施態様では、多様化のために標的化される遺伝子座は、疾患関連酵素、例えば異常であるかまたは異常発現された場合に、疾患状態を引き起こすかまたは個体を疾患状態にかかり易くする酵素をコードする。疾患関連酵素は、治療薬のための潜在的標的を表すことができる。例示的な疾患関連酵素としては、アンギオテンシン変換酵素（高血圧に関連）、ヒト白血球抗原（例えば自己免疫疾患、例えばインスリン依存性（Ｉ型）または非依存性（ＩＩ型）糖尿病および多発性硬化症；癌例えばホジキン病；ならびに感染性疾患、例えば結核およびＡＩＤＳに関連）、Ｐ５３（種々の癌腫に関連）、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２（乳癌に関連）、ならびにＡＰＰ（アルツハイマー病に関連）が挙げられる。
【００２５】
親系統は、例えば種々の試験作用物質の毒性または効能における系統差を予測する尿および血漿試料中の小分子またはタンパク質生物マーカーを同定するために核磁気共鳴、質量分光分析およびその他のプロテオーム的アプローチを用いることにより、あるいは多形性遺伝子マーカー（「マーカー」）を分析することにより選択されることができる。有用な遺伝子マーカーとしては、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）、ＲＡＰＤ（無作為増幅多型ＤＮＡ）、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型）およびマイクロサテライト反復または全ての遺伝子マーカーの基礎である配列変異体を確定するための任意のその他の手段が挙げられる。ＳＳＬＰ（単一配列長多型）マーカーは、候補親系統を分析するための特に有用な遺伝子マーカーである。特定の遺伝子座での多様性を最適化するために、当該遺伝子座と（物理的または遺伝的に）より密接に関連するマーカーは、その遺伝子座とあまり密接に関連しないマーカーが好ましい。
【００２６】
ＳＳＬＰマーカーは易変異性であると報告されているが、一方、フランキングＤＮＡははなはだしく低易変異性である。したがってＳＳＬＰ対立遺伝子サイズは、異なるゲノムの特定の領域が同一であるかまたは異なるかを推論するために有用であり得る。個々のＳＳＬＰマーカーは限定量の情報を提供するが、しかし異なるゲノム間の同一性を示す一連のＳＳＬＰマーカーは、保存マーカーを含めたゲノムの領域も配列中で同一であることを示唆する。
【００２７】
ラットゲノム中の５，２００の既知のＳＳＬＰマーカーのうちの４，３００より多い対立遺伝子サイズが、４８の一般的に試験された近交系ラット系統で分析されている。少なくとも２つの塩基対により長さが異なるＳＳＬＰ対立遺伝子は、４６％の割合で生じる。ＳＳＬＰ遺伝子座は、２〜１３、平均で６の対立遺伝子を示す。同一先祖由来の密接に関連した系統は、複数の長いハプロタイプ（即ち、同一対立遺伝子サイズを有する＞１０のＳＳＬＰマーカー）を有する。２つの系統間の多型の数が多ければ多いほど、ハプロタイプの数は少ない（同一対立遺伝子サイズを有する≧３のＳＳＬＰマーカー）。したがって連鎖不平衡を用いて、近交系ならびに系統間の遺伝子多様性の程度を試験することができる。
【００２８】
ゲノムの特定領域内に見出されるＳＳＬＰ多型性に基づいてパターンを識別するために、コンピューターソフトウェアを用いることができる。例えばＡＣＰハプロタイパー（ACP Haplotyper）コンピュータープログラムを用いて、近交系（例えばラット対立遺伝子特性化プロジェクトにおいてキャラクタライズされた４８の系統）全体のＳＳＬＰ対立遺伝子サイズを、互いに、ならびに各遺伝子座で最も共通する対立遺伝子サイズを有する仮説的な「祖先系統」と比較することができる。ＡＣＰハプロタイパーは、種々の遺伝的および物理的マップに従って対立遺伝子を順序付けて、系統間の保存の領域を研究者が可視化するのを可能にし、そして系統間比較、進化的干渉およびその他の実際的利益、例えばマップ配置評価を可能にする。ＡＣＰハプロタイパーはウエブベースであり、Ｐｅｒｌ（Practical Extraction and Report Language）ＣＧＩ（Common Gateway Interface）をオラクル（Ｏｒａｃｌｅ）８ｉ（Oracle Corp.）データベースとともに用いて、対立遺伝子およびマーカーデータの保存を取り扱う。ＡＣＰハプロタイパーコンピュータープログラムは、ラットゲノムデータベース（Rat Genome Database）メディカル・カレッジ・オブ・ウイスコンシン，ミルウォーキー，ウイスコンシン，アメリカ合衆国（Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA）を介してデパートメント・オブ・フィジオロジー・アンド・ザ・ヒューマン・アンド・モレキュラー・ジェネティックス・センター（Department of Physiology and the Human and Molecular Genetics Center）から入手可能である。
【００２９】
いくつかの実施態様において、特定の疾患形質を示す親系統を組合せ交配することができる。疾患の病理生理学、例えば高血糖、高血圧および高脂血症は、例えば血漿コレステロールレベルを下げるようまたは血圧を低減するよう意図された候補薬剤の治療効能および毒性に影響を及ぼす場合がある。同様に試験作用物質は、正常動物に対してよりも糖尿病あるいは先在心臓または血管性疾患を有する動物に対してより有毒である場合がある。したがって近交系疾患状態、例えば高血圧症、高脂血症、糖尿病および腎臓病を有する親系統が選択されることができる。ラットの適切な系統としては、例えばダール（Dahl）Ｓラット（高血圧症、高脂血症およびインスリン耐性）、Fawn Hooded高血圧ラット（高血圧症、肺高血圧症および腎臓病）、高血圧自然発症ラット（高血圧症）、卒中易発性高血圧ラット（卒中）、ザッカー（Zucker）肥満ラット（肥満症、高血圧症、高脂血症およびインスリン耐性）ならびにＧＫラット（２つの型の糖尿病、ならびに腎臓病）が挙げられる。親系統は、選定疾患状態を保持しながら、所望レベルの遺伝子多様性を達成するよう選択される。その他の実施態様では、複数の疾患形質を集合的に示す親系統を組合せ交配することができる。
【００３０】
細胞株、組織バンクおよびｃＤＮＡライブラリー
本発明は、細胞株、組織バンクおよびその他の物質（例えばプロテオノミクス（proteonomics）のため、小分子同定（メタボノミクス）のための核磁気共鳴分析ために種々の器官および細胞型から抽出されたＲＮＡおよびタンパク質、ならびに上記の齧歯類のコレクション由来のｍＲＮＡ発現アレイも提供する。細胞株は、不死化細胞株を含むことができる。組織バンクは、任意の型の組織（例えば腎臓、肝臓、肺、リンパ、胃、膵臓、脳、前立腺、精巣、乳房および卵巣）を含むことができる。細胞株および組織バンクの作製方法は、ＲＮＡまたはタンパク質を抽出するための、ならびにｃＤＮＡおよびタンパク質ライブラリーを作製するための方法と同様に、既知である。
【００３１】
例えば米国特許第６，２５１，６０１号、第５，８００，９９２号および第５，４４５，９３４号に記載されたような核酸マイクロアレイを用いた発現プロファイリングは、組合せ繁殖パネルにおける個体またはＦ１系統間の特定条件下で示差的に発現される遺伝子を同定するために用いることができる。したがってマイクロアレイを用いて、組合せ繁殖動物中で示差的に発現される遺伝子を同定し、それにより特定の試験作用物質に対する応答における効力、効能および／または毒性の差を示すそれらの遺伝子型を同定することができる。マイクロアレイは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド標的のコレクションで構成されることができる。いくつかの実施態様では、固体支持体に結合されたポリペプチド、ポリペプチド断片または抗体を含むタンパク質アレイが用いられることができる。タンパク質アレイは、例えばタンパク質またはリン酸化シグナル伝達タンパク質の発現における系統差を調べるために用いられることができる。系統間の発現タンパク質のプロフィールの差は、特に異なるクラスのタンパク質のレベルを定量するために示差的ラベリング誘導体化技法と組合せた場合、質量分光分析技法、例えばＬＣ／ＭＳを用いても評価されることができる。
【００３２】
マイクロアレイ中の試験される各試料は、個々の動物からの組織の試料であり得る。あるいはマイクロアレイ中の試験される各試料は、複数の動物からプールされ、例えば試験作用物質に曝露されていた６匹の組合せ繁殖ラットの等量の肝臓組織から抽出されたＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質であり得る。
【００３３】
試験作用物質の評価
試験作用物質の薬理学的および毒物学的作用は、上記の齧歯類のコレクションを用いて評価されることができる。試験作用物質としては、例えば製品、食品または環境試料中の候補治療用分子および推定アレルゲンまたは毒素が挙げられる。試験作用物質の評価は、組合せ繁殖動物のコレクションを試験作用物質と接触させることを含む。試験作用物質が組合せ繁殖動物に投与される方法は、評価される試験作用物質の性質によって決まる。試験作用物質は、例えば局所処理、注射、吸入送達、経口送達、鼻送達および食餌補充により、試験動物に投与されることができる。投与レジメンも評価される試験作用物質の性質によって決まり、試験作用物質の１回投与または反復投与を含むことができる。試験作用物質の生理学的、生化学的および遺伝学的作用は、評価される試験作用物質に適した技法により確定されることができる。
【００３４】
試験作用物質を評価するための本発明に従って齧歯類コレクションを使用することにより、非近交系または近交系を用いる伝統的プロトコールを上回る利点が提供される。伝統的には、候補治療用物質および推定アレルゲンまたは毒素を評価するために、非近交系、例えばスプレーグ・ドーリイ（ＳＤ）またはウィスター（Ｗｉｓｔ）ラットを用いることを好む研究者もいた。これは、非近交系を構成する個体が、ヒト集団の一特徴である遺伝的不均質性をある程度示すためである。しかしながら非近交系は、基礎コロニーを確立する先祖の数が少なく、そして次世代に伝達するために利用可能な対立遺伝子の数が限定されるために起こる対立遺伝子固定により限定遺伝子多様性を有する閉鎖コロニーから得られる場合が多い（Festing, M.F., Environ. Health Perspect. 103: 44-52, 1995参照）。したがって非近交系は通常、所望されるほど遺伝的に多様でなく、そしてヒトの遺伝子多様性の範囲を表すための適切なモデルでない。
【００３５】
非近交系齧歯類により提供される限定された遺伝子不均質性は、試験作用物質を評価する場合の結果の変動性の損失、同一コロニーからのラットの異なる群を用いて実験室間および実験室内で実験を追試できないこと、ならびに困難な証明および品質制御も生じる。例えば異なる供給元により繁殖された非近交系は異なる遺伝子型を有し、そしてしばしば種々の試験作用物質に対して異なる応答を示す。この現象は、試験作用物質の生化学的および分子的評価における許容不可能な変動性をもたらすことができる。さらにＳＤラットの遺伝子マーカー分析は、マーカー当たり２つの対立遺伝子のみという平均を示す。この対立遺伝子頻度が３０，０００ほどのラット遺伝子の各々に関して言える場合、そして試験作用物質の毒性応答が２つの遺伝子型の適切な組合せを要する場合、一般的な５０の動物プロトコールにおける試験作用物質の評価はこの考え得る作用を明示し得ない。遺伝子多様性限定は、非近交系を用いた試験作用物質の安全性を正確に評価するためには非常に大きいサイズの試料が必要とされることを示す。試験作用物質を評価するための非近交系の使用は、動物の同一コレクションが観察された作用を追試するために集合され得る見込みがないことによりさらに複雑になる。最後に、非近交系に関する差別的遺伝子マーカーの欠如は、非近交系ストックのための確実性および品質制御を難しくする。
【００３６】
近交系は通常、少なくとも２０連続同胞（brother-sister）交配後に作製される。近交系を構成する動物は、同質遺伝子であると考えられる（即ち、各個体は遺伝的に同一であると考えられる）。近親交配はしばしば、特定のヒト疾患表現型を模倣する特定の系統を作製するために用いられてきた。系統内の異なる個体における作用は同様であると予測され、環境は主要変数であるために、近交系動物はしばしば、試験作用物質を評価するために用いられてきた。米国合衆国全国毒物学プログラム（ＮＴＰ）は、フィッシャー３４４近交系ラットおよび１３６０１７１ハイブリッドマウスを用いて、試験作用物質の安全性を評価する。
【００３７】
近交系の使用は試験作用物質を評価する場合の再現可能性を改良することができるが、しかし選定系統は副作用を明示するための適切な遺伝子型を有さないことを犠牲にする。試験作用物質の作用を明示する特定系統の能力についての従来の知識が存在しない限り、単一系統の選択は試験作用物質の作用を検出する能力を限定し、紛らわしい結果をもたらし得る。近交系使用の付加的欠点は、このような動物が一般的に非健常であり、そして薬剤応答および毒性に影響を及ぼす形質を示し得るという点である。近交系は通常、より少ない同腹子を生じ、全ての遺伝子座で遺伝的に同型接合性であるということの結果として複数の表現型異常を示す。
【００３８】
本発明にしたがって作製される齧歯類のコレクションは遺伝的に不均質であり、１つまたは複数の近交系というよりむしろこのようなコレクションの使用は、試験作用物質の全ての考え得る作用を検出する能力を増大する（好ましい一実施態様では、齧歯類はラットである。別の好ましい実施態様では、齧歯類はマウスである）。さらに、近交系親の組合せ交配由来のＦ１動物は一般に、近交系動物より健常である。その連鎖不平衡マッピングにおける試験作用物質を評価するための動物のこのようなコレクションを使用する別の利点を用いて、系統間の試験作用物質の有効性または毒性の差に関連した遺伝子座を同定することができる。ｃＤＮＡおよびタンパク質マイクロアレイも、パネル中の系統間の試験作用物質に対する示差的応答に関与している示差的発現遺伝子を同定するために用いられることができる。さらに、組合せ交配に由来するＦ１動物は適切な近交系親系統の個体の交配により再現可能的に再構築されることができるため、試験作用物質を評価するための非近交系の使用に関連した再現可能性の欠如は回避されることができる。
【００３９】
本発明の好ましい１つのバージョンでは、齧歯類のコレクションは、下記の実施例に記載されたラット系統を組合せ繁殖することにより作製される。特にこれらの系統は、ウィスター・キョート、ルイス、フィッシャー３４４およびブラウン・ノルウェイ・ラットである。齧歯類のこの特定コレクションおよびこれらの齧歯類に由来するｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のコレクションは、本発明において有用であり且つ適している、と本発明者らは予見する。「系統」とは、好ましい系統の全ての亜系統を含むことを意味する。例えば「ブラウン・ノルウェイ」とは、亜系統ＢＮｍｃｗｉ、ＢＮｓｓ、ＢＮｈｓｄを含むことを意味する。
【００４０】
これらの系統は、複数の商業的売主から全て入手可能である。本発明の好ましい１つのバージョンでは、ウィスター−キョート、ルイス、フィッシャー３４４およびブラウン・ノルウェイ親系統は、チャールズ・リバー・ラボラトリー（Charles River Laboratories）（Wilmington, MA）から購入した。
【００４１】
以下の実施例において本発明をさらに説明するが、これらは特許請求項に記載された本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００４２】
実施例１−特定遺伝子多様性を有する近交系ラットの選択および組合せ交配
本実施例は、シトクロムＰ−４５０酵素をコードする遺伝子に連結されたＳＳＬＰマーカー間で遺伝子多様性を示すＦ１子孫のコレクションを作製するための４つの遺伝的に異なる近交系親系統の選択および組合せ交配を記載する。ソフトウェアプログラムＡＣＰハプロタイパーを用いて、候補親系統の比較遺伝子マーカー分析を促した。
【００４３】
マイクロサテライトマーカーを用いて遺伝子型分類した４８の近交系の１５系統サブセットに関して、遺伝子マーカー分析を実施した（スティーン, R.G., et al., Genome Res. 9: AP1-8, 1999挿入記事参照）。１５系統サブセットを選択して、ＡＣＰハプロタイパーコンピューター処理時間および出力の複雑さを低減した。１４系統を、表１に列挙する。
【００４４】
【表１】
2005520503.tif 000002
【００４５】
以下の判定基準に基づいて、１５系統サブセット中の系統を選択した：１）商業的入手可能性および繁殖用の適切なアイソレータ中での保持；２）カンジアン等, Genome Res. 7: 262-267, 1997のラット系統樹に関する少なくとも１０〜１５段階による分離；３）毒物学的研究のための製薬産業による高頻度使用；４）毒物学的研究における歴史的使用；ならびに５）特定のクラスの試験作用物質に対する感受性または耐性。近交系ラットにおける適切な商業的供給元としては、チャールズ・リバー・ラボラトリー（Charles River Laboratories）（Wilmington, MA）、ハーラン（Harlan）（Indianapolis, IN）、タコニック（Taconic）（Germantown, NY）および学術的研究機関、例えばジャクソンラボラトリー（Jackson Laboratory）（Bar Harbor, ME）が挙げられる。製薬産業にしばしば用いられるラット系統としては、Ｆ３４４、ＬＥＷ、ＷＫＹ、ＤＡ、ＢＮ、ＷＡＧ、ＰＶＧ、ＢＵＦおよびＷＦが挙げられる。ＬＥＷは、ＳＤよりペルオキシソーム性増殖により感受性であり、そしてＦ３４４は、ＳＤよりゲンタマイシンの腎毒性作用により感受性である。
【００４６】
組合せ交配のために選択した４つの系統は、Ｆ３４４、ＢＮ、ＬＥＷおよびＷＫＹであった。以下のシトクロムＰ−４５０酵素：Ｃｙｐ１Ａ１、Ｃｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ２ファミリー、Ｃｙｐ３Ａ３、Ｃｙｐ４Ａ１およびＣｙｐ４Ａ１１に遺伝子的に近接した多型性マーカーでの多様性を最大にするために、これらの親系統を選択した。Ｃｙｐ遺伝子座に遺伝子的に近接したＳＳＬＰマーカーを、ラットゲノムデータベース（Rat Genome Database）（Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI）、ローカスリンク（Locus Link）（National enter for Biotechnology Information, Bethesda,MD）中で、ならびに科学文献中で同定した。ＡＣＰハプロタイパーを用いて、Ｃｙｐ１Ａ１、Ｃｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ２ファミリー、Ｃｙｐ３Ａ３、Ｃｙｐ４Ａ１およびＣｙｐ４Ａ２に関するコード配列遺伝子座に連結されたマーカーの視覚的比較をなした。ＡＣＰハプロタイパーを用いて近交系を比較する場合には、異型接合性ＳＳＬＰマーカー遺伝子座を無視する。しかしながら異型接合性ＳＳＬＰマーカー遺伝子座の数は、４つの選定系統中では少ない（ＢＮに関しては７４０８５；ＬＥＷに関しては５／４１８５；Ｆ３４４に関しては３／４２２４；およびＷＫＹに関しては６／４０９６）。
【００４７】
表２は、Ｃｙｐ遺伝子座の各群に関して同定されたＳＳＬＰマーカーの数を示す。系統の対を反復的に比較することにより、各Ｃｙｐ連結ＳＳＬＰマーカーでの異なる対立遺伝子の数を最大化した。表２も、各Ｃｙｐ遺伝子座に関する４つの選定親系統中の異なる対立遺伝子の数を示す。さらに、コンジアン等のラット系統樹における１１〜１９段階は、他の３つの選定系統からの選定親系統の各々を分離する。
【００４８】
【表２】
2005520503.tif 000003
【００４９】
Ｆ３４４、ＢＮ、ＬＥＷおよびＷＫＹをチャールズ・リバー・ラボラトリーから入手し、各々の考え得る対毎の組合せ（即ち、Ｆ３４４×ＢＮ、Ｆ３４４×ＬＥＷ、Ｆ３４４×ＷＫＹ、ＢＮ×ＬＥＷ、ＢＮ×ＷＫＹおよびＬＥＷ×ＷＫＹ）で交配した。
【００５０】
４つの親系統の各組合せ交配からの８つの子孫をプールして、４８匹のＦ１子孫ラットのコレクションを作製した。コレクションをラット閉じ込め設備中に収容し、各ラットを別個のケージ中に収容した。収集Ｆ１ラットに明確な同定のためのマイクロチップを植え込み、５つの異なる染色体の各々の上の１つまたは複数の多型マーカーに関して遺伝子型分類する（下記の実施例３は、この特定の組合せをより詳細に説明する）。
【００５１】
実施例２−一般的遺伝子多様性を有する近交系ラットの同定
本実施例は、齧歯類系統の対間の特定染色体上の遺伝子類似性の程度の比較を説明する。実施例１に記載された１５の近交系ラット系統に関して、５，２１４のＳＳＬＰ遺伝子座に関する対立遺伝子サイズを確定した。対毎の比較を系統間で実行し、各対中に同一対立遺伝子を有する遺伝子座の百分率を各染色体に関して算定した。第１、５、８および１２染色体の結果を、図１のそれぞれ表３〜６に示す。残りの染色体に関して、同様の比較を実行した。１００％から類似性％を差し引くことにより、データから遺伝子多様性％を算定する。
【００５２】
実施例３−繁殖のための親系統の選択
本発明者らの目標は、好ましい組合せパネル（以後、パネルと呼ぶ）を構築するために用いられる４つの異なる近交系親系統間の遺伝子多様性を最大化することであった。実験室ラットの４８の最も一般的に用いられる系統の全ゲノムを〜４，３００の遺伝子マーカーで特性化しておいたため、ソフトウエアプログラムＡＣＰハプロタイパー（ウィスコンシン医科大学のバイオインフォーマティクス・リサーチ・センター（Bioinformatics Research Center at the Medical College of Wisconsin）で作製）を用いて互いに関連する各々の近交系に関する全体的程度の遺伝子多様性で本発明者らは開始した。問題を簡単にするために、以下の判定基準に基づいて４８の近交系の１５系統サブセットに関して、遺伝子マーカー分析を実施した：１）系統の商業的入手可能性；２）少なくとも１０〜１５段階による系統樹上の系統の概算分離；３）毒物学的研究のためのファルマ（Pharma）社による最新および過去の使用；ならびに４）以下のシトクロムＰ−４５０酵素での多様性：Ｃｙｐ１Ａ１、Ｃｙｐ１Ａ２、Ｃｙｐ２ファミリー、Ｃｙｐ３Ａ３、Ｃｙｐ４Ａ１およびＣｙｐ４Ａ２。ファルマ社で最も高頻度に用いられるラット系統としては、Ｆ３４４、ＬＥＷ、ＷＫＹ、ＤＡ、ＢＮ、ＷＡＧ、ＰＶＧ、ＢＵＦおよびＷＦが挙げられる（M. Festing、私信）。
【００５３】
組合せ交配のために選択された４つの系統は、Ｆ３４４（フィッシャー３４４）、ＢＮ（ブラウンノルウェイ）、ＬＥＷ（ルイス）およびＷＫＹ（ウィスターキョート）であった。ＢＮは、それがラットゲノムシーケンシングコンソーシアム（Rat Genome Sequencing Consortium）によりシーケンシングされた系統であり、最も遺伝子的に異なったラットの１つであるため選択した（カンジアン, F., Genome Res. 7(3): 262-267, 1997）。Ｆ３４４系統は、それがＮＴＰおよびいくつかの製薬会社によるプロトコールに用いられる支配的なラットモデルであり、したがって既存の毒物学的データベースと系統比較することができるように参照点を提供するため、選択された。残り２つの親系統は、遺伝子マーカーに基づいて特定領域（シトクロムＰ−４５０）ならびに全ゲノムを通しての遺伝子多様性を最大にするようという意向で、そしてラット系統樹上の１１〜１９段階が選定親系統の各々を他の３つの選定系統から分離するという意向で選択した。
【００５４】
各親ラット（ＢＮ、ＬＥＷ、Ｆ３４４およびＷＫＹ）に関するゲノム中の〜４３００の遺伝子マーカーの各々での対立遺伝子差の数を計数し、そして（４８の既知のラット系統からの）ラットゲノム中の対立遺伝子差の総数を知ることにより、遺伝子座当たりの対立遺伝子平均数として６を用いて、パネルは平均で４２％の既知のラット多様性を含む、ということを本発明者らは見出した。ラットゲノム中に５０％の遺伝子多様性を捕らえるという本発明者らの初期の目標に達しなかったが、しかし試験前に、最も顕著には、１）シトクロムＰ−４５０での最大多様性；２）Ｆ３４４（ＮＴＰが使用）およびＢＮ（このラット系統はシーケンシング中である）系統の含入；ならびに３）商業的入手可能性を確立した緊縮選択判定基準を考察することができると同時に、実行することができた。
【００５５】
表７は、〜３３％のゲノムを集合的に表す４つの異なる染色体での系統対系統比較を示す。これらのデータは、染色体レベルでの遺伝子マーカーにおいて各親系統間に高レベルの変異（平均で６６〜７２％）が認められることを示す。任意の２つの系統間の平均多型率が約５０％であるとすると（スティーン, R.G., et al., Genome Res. 9(6): AP1-8, 1999、挿入記事）、７１％の平均多型率を有することはおそらくは、任意の４つの系統を用いて達成されることができる最大に近い。
【００５６】
【表３】
2005520503.tif 000004
【００５７】
ベースライン表現型特性化。  本発明者らは、研究の一部として、パネル中に生成される６つのＦ１系統、４つの親系統およびＣＤ−ＩＧＳ非近交系の各々に関するベースラインデータ組を収集した。本発明者らは、例えば約４〜１０週齢からの６つのパネル系統全ての成長曲線を測定した（図２）。これらの曲線は、系統間での重量におけるかなりの多様性を実証するが、しかし興味深いことに、勾配は系統間で全く同様である。図２は、系統間の比較を用いてファルマ（Pharma）社がパネルデータをそれらの既存データに「固定する」のに役立つことができる方法も実証する。
【００５８】
ベースライン臨床化学。  パネルを生成するために用いられるパネル、非近交系ＣＤ−ＩＧＳおよび近交系親系統における６つのＦ１系統のベースライン臨床化学プロフィールを、表８に要約する。それらは、各系統中の測定した８〜１０匹の動物（８〜１０週齢）を平均することにより得られた。表８は、各系統に関する２０の臨床測定値を示し、そして本発明者らは、それらの群内の全動物の平均として、親ラットおよびパネルラットに関する試験値も報告する。パネルが非近交系ＣＤ−ＩＧＳと表現型で同様であった場合には、ベースライン臨床化学は異ならない、と本発明者らは予測した。
【００５９】
一元ＡＮＯＶＡを用いて、ＣＤ−ＩＧＳおよびパネルおよび親ラットに関して得られた値を、比較した（表８）。予測通り、ビヒクル処置ラットの異なる群の全体的応答は、劇的に類似した（なお、２０の臨床検定のうち１５が異ならなかった）。しかしながらＣＤ−ＩＧＳは、ＡＬＰ、ＣＡ、ＮＡ、ＣＬおよびＴＲＩＧの測定値においてパネルおよび親の両方と異なった。その他の１５の臨床化学値に関しては、パネルはＣＤ−ＩＧＳラットにおいて測定された値と同一であり、発表データもある。ＣＤ−ＩＧＳとパネルのＦ１系統との間のベースライン臨床化学の差は、応答における変異に関する遺伝的基礎を示唆する。
【００６０】
【表４】
2005520503.tif 000005
【００６１】
実施例４−対照系統の選択および評価。  ＣＲＬからのＣＤ−ＩＧＳ（Caesarean-Derived International Genetic Standard）がファルマ社で用いられる優勢非近交系であると思われるため、二次参照点として、全ての実験にこの系統を含めた。この系統は、１９２５年にロバートＷ．ドーリーによりハイブリッド頭巾斑（hooded）雄および雌ウィスターラットから始まった。この系統は、１９５０年にＣＲＬによりスプレーグ・ドーリイ社（Sprague-Dawley）から得られ、そして１９５５年にオリジナルのチャールズ・リバー・スプレーグ・ドーリイ（ＳＤ）コロニーからカエサリアン・リデライブ(caesarean re-derived)した。
【００６２】
近交系対照のためにＣＲＬから近交系（Ｆ３４４、ＬＥＷ、ＷＫＹ、ＢＮ）も購入し、使用した。これらは、パネル用にＦ１ハイブリッドラットを繁殖させるために用いられる同一ラット系統であった。ＣＤ−ＩＧＳは、研究者達の予測より低い遺伝子多様性を有し、表現型分散増大は分析的挑戦を示す。尿中のタンパク質の出現により示されるように、スプレーグ・ドーリイラットがゲンタマイシンの腎毒性作用に耐性であり、一方ＬＥＷ株は感受性であると文献に報告されているため、試験作用物質としてゲンタマイシンを選択した。
【００６３】
本発明者らは、研究において（図３）、ＣＤ−ＩＧＳラットの亜群（ｎ＝７）はゲンタマイシンに対して高感受性であるが、一方、同一動物の大多数（ｎ＝１１）は耐性である、ということを見出した。平均して、しかしほとんどのＣＤ−ＩＧＳは、ＬＥＷおよびその他のラット系統と比較した場合、ゲンタマイシンの腎毒性作用に耐性であった（下記の図４）。例えばＣＤ−ＩＧＳは、ゲンタマイシン曝露後に、腎障害の指標である血漿ＢＵＮレベルの５０％増を示しただけであった。これに対比して、ＬＥＷ×Ｆ３４４、ＢＮ、Ｆ３４４、ＬＥＷおよびＬＥＷ×Ｂｎ系統は、ゲンタマイシンで処置した場合、ＢＵＮの２〜３倍増を示した。
【００６４】
この結果における変動性を研究者が最良に解釈する方法は？ゲンタマイシンがいくつかのラットにおいて毒性作用を有するという結論が認められるか？あるいは外れ値が存在するか、そしてその場合、本発明者ら自身を納得させるために別の方法で確認試験を実行するか？さらに重要なことは、いくつかの個体による毒性応答のために、この段階で中止される薬剤開発が存在するか？ＣＤ−ＩＧＳラットの使用に際しては高度の変動性が常に存在するが、しかし非近交系における遺伝子差のために変動の程度は薬剤試験毎に異なる、ということを意味するために、本発明者らはデータを解釈する。残念ながら、ここに記載されたシナリオは、ヒト薬剤試験においても同様に、頻度が高すぎて使い古されると思われる。薬剤発見見通しから、これは、ゲンタマイシンが標準毒性検定（即ち、ＣＤ−ＩＧＳまたはＷＫＹラットを用いて副作用を調べるスクリーン）をパスするが、しかし後に該化合物は、この薬剤の作用に対して個体を感受性にする遺伝子型を保有するヒト患者のいくつかのサブセットにおいて腎毒性であることが見出されることを意味する。
【００６５】
実施例５−パネルは腎毒素の副作用を検出する時に有効である。  ゲンタマイシンは、パネルを用いて検査された最初の薬剤である。ゲンタマイシンは、細菌が他の抗生物質に耐性であると思われる場合、ヒトにおける重症グラム陰性細菌感染（例えば敗血症または肺炎）の治療のために、依然として一般に用いられる。しかしながらゲンタマイシンは、近位尿細管に作用する腎毒素であることも既知であり、そしていくつかの個体においては、聴覚障害および不可逆的前庭毒性を生じることができる。本発明者らはゲンタマイシンを２つの用量で試験した。第一用量（１２０ｍｇ／ｋｇ）は、ラットにおける腎毒性応答を引き出す発表済み投与レジメン（通常、８０ｍｇ／ｋｇ）と同様であったが、これは、ＬＥＷラットの場合を除いて、強健組（robust set）の表現型を生じなかった（示されていない）。系統全体の薬剤悪作用に対する遺伝的感受性の範囲を最大にするよう試みた。したがって、２２５〜２７５ｇの範囲の体重を有する動物（特定系統により約７〜１０週齢）における腹腔内注射として、６連続日間、高容量のゲンタマイシン（２４０ｍｇ／ｋｇ）を送達した。
【００６６】
【表５】
2005520503.tif 000006
【００６７】
表９は、ラットの系統を用いたゲンタマイシンおよびビヒクル処置間の臨床化学データにおける差に関するＰ値を要約する。この方法でのデータの表示は、臨床化学値が、この試験においてスクリーニングされる６つのＦ１パネル系統、４つの親系統および非近交系において、ゲンタマイシンによる影響を受けたか否かの迅速な同定を可能にする。個体を比較した場合、試験した系統は全て（ＷＫＹ以外）、ゲンタマイシン（２４０ｍｇ／Ｋｇ／日）で処置した場合、血漿ＢＵＮまたはクレアチニン濃度（腎障害の指標）における統計学的に有意の増大を示した。
【００６８】
表９は、ゲンタマイシン（２４０ｍｇ／Ｋｇ／日）が複数のその他の臨床化学値における有意の変化も引き起こした、ということも示す。これらのいくつかは、この時点で関連があるとは思われないが、しかし混合遺伝的バックグラウンドの影響を考察する将来的試験において探求する価値があると思われる。例えば、高用量のゲンタマイシン処置を施したラットにおいて、肝機能の３つの指標であるＡＳＴ（ＢＮ×Ｆ３４４）、ＴＰ（ＷＫＹ×ＬＥＷ）およびコレステロール（ＬＥＷ）濃度における有意の変化を本発明者らは見出した。
【００６９】
図４は、第Ｉ相試験において試験した全系統に関する血漿ＢＵＮ濃度の増加百分率を示す。上記のように、平均して、ＣＤ−ＩＧＳは、他の試験系統と比較して、ゲンタマイシンの腎毒性作用に耐性であると思われる。Ｆ１ハイブリッドに関する組合せパターンの解読は、ＬＥＷおよびＦ３４４が最も感受性系統であり、一方、ＷＫＹは最も耐性系統である、ということを示唆する。これがそのようであるのは、他の遺伝子型バックグラウンドとの組合せにおいて、ＷＫＹがゲンタマイシンの腎毒性作用に対するＢＮおよびＬＥＷ遺伝的バックグラウンドの感受性を低下させる（ＷＫＹ×ＢＮ、ＷＫＹ×ＬＥＷ）かまたは実質的に排除する（ＷＫＹ×Ｆ３４４）ことができるためであると思われる。
【００７０】
同様のパターンは、系統間の血漿クレアチニン濃度の変化を分析する場合に見出される。パネルラットをスクリーニングし、パターンを解読した後に、追跡調査実験において親系統の感受性または耐性を本発明者らが確証したということは重要である（図４にも示されている）。これは、組合せ戦略からのデータがオリジナル親系統における薬剤作用の差を精確に予測し、それによりＦ１パネルラットおよび親系統の両方を用いるほとんどの薬剤試験を反復する必要性を不要にすることができる、ということを意味する。さらにこれは、ほとんどの場合に、薬剤作用がＦ１ハイブリッドを用いて検出される、ということを実証する。
【００７１】
図５は、ゲンタマイシンによる処置の最初の６日間の１１系統全てに関するタンパク質排出を比較する。これらのデータは、これらの同一動物の結晶中に見出されるＢＵＮおよびクレアチニンレベルと一致し、各系統における腎障害の低度に関する腎臓の組織学的検査と良好に相関する（図６）。例えば、ＬＥＷ×Ｆ３４４Ｆ１ラットからの腎臓は最も損傷されており（全近位尿細管がほぼ完全に壊死）、それらはＢＵＮおよびクレアチニンの血漿濃度の最大増加を示した。ゲンタマイシン処置親系統からの腎臓は全て、ＷＫＹを除いて、５０％を超える尿細管障害を有した。ゲンタマイシンはＷＫＹラットの腎臓には事実上何の作用も及ぼさず（ビヒクルおよびゲンタマイシン処置動物ともに、２５％の損傷尿細管を伴う腎臓を有した）、ゲンタマイシンは、この系統においてＢＵＮおよびクレアチニンの血漿濃度、ならびにタンパク質排出に最小作用を及ぼした。Ｆ１ハイブリッドの腎臓の組織学的検査は、近位尿細管に対する５０％以上の障害を示したが、但しＷＫＹ×ＢＮのＦ１系統の場合は、腎障害をほとんど示さず、血漿ＢＵＮ、クレアチニン濃度またはタンパク質排出における変化は最小度であった。
【００７２】
ゲンタマイシンに関する結果の要約は、以下の観点と一致する：１）パネルは、ゲンタマイシン処置により引き起こされる一連の薬剤作用の検出に際して、ファルマ社に一般に用いられる非近交系（ＣＤ−ＩＧＳ）または一般に用いられる近交系（Ｆ３４４）単独より優れており；そして２）組合せ方式での薬剤の試験は、薬剤応答（薬理ゲノミクス作用）に及ぼす遺伝子作用のアンマスキングを可能にする。これらの形質における差の定量は、ゲノム全体を通して遺伝子マーカーの差を有するそれらに重複する系統間では、薬剤、化学物質および食品の作用に対する感受性または耐性、ならびにマイクロアレイを用いたｍＲＮＡ発現レベルでの系統差に関与する遺伝子の同定を促す。３）ゲンタマイシンを用いた試験は、Ｆ１ラット系統のパネルが薬剤応答における遺伝子差を検出することができる、ということを実証する。
【００７３】
本発明者らは、一般的に用いられる抗癌治療であり、そしてヒトにおける有意の腎毒性作用も有する第三の化合物シスプラチンを用いた付加的試験も実施した（ファング, Q., et al., Toxicol. Sci. 63(2): 196-207, 2001; ミウラ, K., et al., Toxicology 44(2): 147-158, 1987; デミュール, M., et al., Am. J. Physiol. 277 (6 Pt 2): F832-F840, 1999）。５ｍｇ／Ｋｇの用量で、シスプラチン処置動物は全て、ＢＵＮおよびクレアチニンの血漿濃度の上昇により反映されるように、有意の腎障害（ビヒクル処置動物と比較して）を伴って応答した（表１０）。タンパク質尿の程度の顕著な差、グルコース排出の増大および腎近位尿細管に対する組織学的障害が、シスプラチンの腎毒性作用に対する感受性における遺伝的差異を反映した系統間に認められる、ということを本発明者らは見出した。
【００７４】
【表６】
2005520503.tif 000007
【００７５】
任意のその他の系統においては観察されなかったシスプラチンにより処置したＬＥＷ×ＢＮ  Ｆ１ラットにおける血漿グルコースレベルの有意の変化も本発明者らは検出した（表１０）。これは、シスプラチンが患者によっては高血糖を生じることが報告されているため、興味深い（ゴルドシュタイン, R.S., et al., Toxicology 24 (3-4): 273-80, 1982; ゴルドシュタイン, R.S., et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 69 (3): 432-441, 1983; ゴガス, H., et al., Gynecol. Oncol. 61 (1): 22-26, 1996）。ここでは、パネルＦ１ハイブリッド（対照ＣＤ−ＩＧＳでなく）の１つだけがヒト臨床応答とのこの類似性を検出した。このデータはさらに、Ｆ１パネルが、非近交系または近交系単独で使用する場合比較して、薬剤応答における遺伝子差を検出するに際して優れている、ということを示唆する。
【００７６】
実施例６−パネルは肝毒素の機能および毒性における差を検出することができる。  クロフィブレートは、パネル、親系統および非近交系を用いて、臨床化学および組織病理学応答を本発明者らが比較した第三の薬剤である。クロフィブレートは、欧州で一般に用いられてきた抗脂血症薬であるが、しかしながらそれは肝毒素であり、ある患者においては肝癌を生じるとも報告されている。本発明者らは、６連続日にラットに胃管栄養法（ヒドロキシプロピルメチルセルロース中に２５０ｍｇ／Ｋｇ）により経口的にクロフィブレートを送達した。興味深いことに、図７は、クロフィブレートのこの用量で、ほとんどの（しかし全てではない）系統のトリグリセリドレベルが有意に低下したことを示す。しかしながら、血漿トリグリセリドレベルの低下の大きさは、ＷＫＹ由来系統（ＷＫＹ×ＬＥＷ、ＷＫＹ×ＢＮおよびＷＫＹ×Ｆ３４４）間で３倍変化した。ＢＮラットは、クロフィブレートに対するいかなる抗脂血性応答も示さず、ＢＮ様遺伝子型を有する「患者」は、このクラスの化合物に対して治療的に応答できないと予測される場合がある。これは、研究者が薬剤応答の遺伝的差異を曝露するためにパネルを用いることができ、そしてＦ１ラットの遺伝的バックグラウンドの差異を利用して、種々のクラスの化合物の治療的および毒性作用に対する個々の応答を確定するのに関与する遺伝子を同定することができる、ということを強く示唆する。
【００７７】
親およびパネルに関する臨床化学プロフィールは、この用量（２５０ｍｇ／ｋｇのクロフィブレート）で期待されたような確固たる肝障害の予測を生じなかった。例えばＡＳＴレベル（肝臓毒性の予測子）は、いずれの系統においても有意に作用しなかった（データは示されていない）。しかしながら一系統（ＷＫＹ×ＢＮ  Ｆ１）は、ＡＬＴレベルの有意の増大を示し（図８）、これは、パネルにおける遺伝子型の少なくとも１つの組合せがこの化合物の既知の毒性を検出することができたことを実証する。さらに、肝障害の別の指標であるアルカリ性ホスファターゼレベル（ＡＬＰ）は、６つのＦ１ハイブリッド系統のうち５つに関して有意であったが、しかしＣＤ−ＩＧＳにおいては変化しなかった（データは示されていない）。
【００７８】
これに対比して、クロフィブレートで処置した場合、全系統が肝臓の肥大を示した。低脂血症薬、例えばクロフィブレートは一般に、ペルオキシソーム増殖およびペルオキシソームβ−酸化経路の活性増大を誘導する。クロフィブレートまたはビヒクル処置ラットのいずれかの肝臓からの左葉外側の切片の組織学的分析により、本発明者らのラットにおけるこれらの変化を探した。本発明者らは、任意の系統内のクロフィブレート処置肝臓対ビヒクル対照間に細胞差（例えば肝細胞肥大、肝細胞空胞化、核大小不同および門脈リンパ球浸潤物）を検出することができた。しかしながら組織病理学における定量的差異は、パネル内の系統間では検出されなかった。
【００７９】
肝臓の組織学的査定は種々の系統間を区別することができないため、本発明者らは系統間の肝臓中のクロフィブレートに対するペルオキシソーム増殖応答の程度の遺伝的差異を確定するための脂肪酸オキシダーゼ活性の測定に方向転換した。ラット肝臓ペルオキシソーム脂肪−アシルＣｏＡオキシダーゼ活性（ＦＡＯ）に関する蛍光強度測定検定を用いることにより、検定を実行した。この検定の第一段階は、パルミトイル−ＣｏＡ依存性ＮＡＤ＋還元系を使用して、ＦＡＯを酸化し、Ｈ２Ｏ２を還元する。次にＨ２Ｏ２を、天然蛍光化合物であるスコポレチンの酸化のためのペルオキシダーゼ触媒反応において結合させる。試料の蛍光の低下はＦＡＯ活性の増大を示し、これはその後、肝臓中の脂肪酸オキシダーゼの増大を反映する。本発明者らは、クロフィブレートまたはビヒクルで処置したラットの肝臓から調製したミクロソーム中に見出されるＦＡＯ活性を比較した。クロフィブレートに感受性であることが前に示された一親系統（ＬＥＷ）、耐性非近交系（ＣＤ−ＩＧＳ）およびパネル中の３つのＦ１系統を試験した。
【００８０】
６つのクロフィブレート試料および４つのビヒクル試料を、ＦＡＯ活性に関して二重反復実験で個々に試験した。Ｈ２Ｏ２標準曲線を使用することにより、蛍光の変化をＦＡＯ活性単位に変換させることができる（ワルシンビ・キシツ, M. and E.H. ハリソン, J. Lipid Res. 24(8): 1077-1084, 1983）。全系統のＡＮＯＶＡ分析により有意差（ｐ＝．００３）を見出し、そしてＴ検定（両側分布および仮定不等分散）分析は系統間に有意差が認められることを確証した（示されていない）。図９はさらに、クロフィブレート処置によるＦＡＯ活性の増大を例示し、パネル系統およびＬＥＷ親のうちの３つが全て、耐性ＣＤ−ＩＧＳと有意に異なることを示す（有意を星印で示す）。これは、パネル（およびＬＥＷラット）が肝臓中のクロフィブレートのペルオキシソーム増殖作用を検出するためには、一般に用いられる非近交系ラットより良好なモデルであり、そしてＣＤ−ＩＧＳラットは他の系統と比較してクロフィブレートの肝毒性作用に耐性である、ということを示唆する。パネル内では、ＬＥＷ×Ｆ３４４ハイブリッド（十字記号で示す）は、クロフィブレート処置に対して最も感受性であり、そして２つの他の関連ハイブリッド系統（ＬＥＷ×ＢＮ、ＷＫＹ×ＬＥＷ）とのＦＡＯ活性における有意差も示す。ゲンタマイシンを用いた試験と同様に、このデータは、非近交系ＣＤ−ＩＧＳラットまたは近交系単独を用いる場合より、Ｆ１パネルを用いたクロフィブレートに対する応答における遺伝的差を本発明者らはより良好に検出することができる、ということを明示する。
【００８１】
実施例７−核酸マイクロアレイの調製
本実施例は、系統間の薬剤応答における遺伝的差異に関与する示差的発現遺伝子を同定するためにパネルとともに用いられるｃＤＮＡマイクロアレイの調製を説明する。
【００８２】
８４４８個のラットＵｎｉＧｅｎｅｓは全て、Research Genetics, Huntsville, AL,USAから入手する。ＵｎｉＧｅｎｅ組は、１９２８個の既知の遺伝子および６５２０個の未知の発現配列タグを含有する。プライマー組、例えばＴ７／Ｔ３プロモーター：５’−ＴＴＡＣＧＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’／５’−ＡＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’を用いたＰＣＲにより、ＵｎｉＧｅｎｅ組中の各核酸を増幅する。ペルチエ熱循環器（Pelletier Thermal Cycler）ＰＴＣ−２２５（MJ Research, Watertown, AM）：１ｕｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、０．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Centri-Sep Column, Princeton Separation, Adelphia, NJにより精製）、２５０ｎＭの各プライマー、２００ｕＭの各ｄＮＴＰおよび各ｃＤＮＡクローン保持大腸菌の０．４ｕｌの液体培養を用いて１０ｕｌの反応容積を有する３８４ウエルプレート中で、ＰＣＲ反応を実行する。ＰＣＲサイクルは以下の通りである：１回目、９５℃で１１分、５５℃で１分および７２℃で１．５分；２回目〜３６回目、９５℃で１分、５５℃で１分および７２℃で１．５分；最終回、７２℃で７分。反応後、７ｕｌの水および１７ｕｌのＤＭＳＯを反応混合物に付加する。ＰＣＲ反応物を、２％アガロースゲル上で電気泳動処理し、ＥＡＧＬＥ  ＥＹＥ  ＩＩ（Strategene）で可視化する。
【００８３】
４ピン配置ロボット（Genomic Solution, Ann Arbor, MI）を用いて、１８×３６ｍｍの面積中に１８０ｕｍの間隙を有するポリ−Ｌ−リシン被覆スライド上で、マイクロアレイを生成した。各遺伝子／ＥＳＴを、ＰＣＲ産物の精製なしに直接、３８４ウエルプレートから貼り付けた。各遺伝子／ＥＳＴを、スライド上に、１回はスライドの上部に９６×９６アレイに、１回はスライドの株に９６×９６アレイに、二重反復実験で貼り付けた。プリントアレイを、湿潤小室（Sigma, St. Louis, MO）中でインキュベートして、１×ＳＳＣで２時間再水和して、８５℃の温熱プレート上で２時間加熱する。ストラタリンカー（Stratalinker）（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて６５ｍＪでアレイをＵＶ架橋し、１０％ホルマリン中で１分間安定化し、蒸留水で２回すすぐ。アレイを３２５ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノンおよび２５ｍｌの１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中の５．５ｇの無水コハク酸中に２０分間浸漬し、次に９５℃で２分間、蒸留水中に沈めて、直ぐに９５％ＥｔＯＨ中に移す。遠心分離によりアレイを乾燥し、室温で暗所に保存する。
【００８４】
実施例８−遺伝子発現プロフィール
本実施例は、示差的に発現され、系統間の薬剤応答の差異に関与する遺伝子を同定するために用いられることができる組合せ繁殖Ｆ１ラットにおける組織特異的薬剤誘導性遺伝子発現プロフィールを生成するためのＤＮＡマイクロアレイの使用を説明する。
【００８５】
パネルラットの腎臓および肝臓からＲＮＡを抽出し、プロセシングした。同様の薬剤応答を示す８匹のＳＤ動物からのＲＮＡ試料をプールした。各系統の３匹のＦ１動物からのＲＮＡ試料をプールした。オリゴテックス（Oligotex）ｍＲＮＡキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、総ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。Ｃｙ３−またはＣｙ５−ｄＵＴＰ（Amersham, Piscataway, NJ）を、９０ｕｌの反応容積中：９ｕｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１０ｍＭのＤＴＴ，２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｕｇのオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー、１８００ＵのスーパースクリプトＩＩ（Invitrogen, Carlsbad, CA）、５００ｕＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、４０ｕＭのｄＴＴＰ、４０ｕＭのＣｙ３−またはＣｙ５−ｄＵＴＰ中で、３９℃で２分間、４ｕｇのｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡ中に混入した。１６ＵのＲＮＡアーゼＨ（Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA）を付加し、反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。Ｃｙ３−およびＣｙ５−標識化試料を混合し、その後、Centri-Sep Column、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）で精製し、３０ｕｇのマウスＣｏｔｌＤＮＡ（Gibco Invitrogen）の付加後、マイクロコン（Microcon）ＹＭ−３０（Millipore, Bedford, MA）で濃縮した。
【００８６】
濃縮プローブに、２０ｕｇのポリ−ｄＡ（Sigma）および４０ｕｇの酵母総ＲＮＡ（Gibco Invitrogen）を付加し、３．５×ＳＳＣおよび０．３５％のＳＤＳを含む２１ｕｌのハイブリダイゼーション溶液を核酸マイクロアレイに適用する。実施例３に従ってマイクロアレイを調製し、２２×４０ｍｍのカバーガラス下で６５℃で１７時間、ハイブリダイゼーションを実行する。スライドを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で２分間、０．２×ＳＳＣ中で２分間、次に０．５×ＳＳＣ中で２分間、室温ですすぎ、最後にスキャンアレイ（ScanArray）３０００（General Scanning, Watertown, MA）で走査して、２色蛍光ハイブリダイゼーションシグナルを検出する。
【００８７】
グリーム（Gleams）２．０ソフトウェア（NuTec Services, Stafford, TX）を用いて、データを収集した。アレイ画像上に格子を配置して、各スポットを明示した。格子を手動で検査して、必要な場合には調整する。平均強度から局所バックグラウンドを差し引くことにより、シグナル強度を確定する。全遺伝子の強度を平均するために各染料を標準化することにより、染料間の標準化を成し遂げた。ｌｏｇ（Ｃｙ３＋Ｃｙ５）対ｌｏｇ（Ｃｙ３／Ｃｙ５）のプロットに基づいて、閾値を選択する。各アレイ中の全遺伝子に関してＣｙ３強度＋Ｃｙ５強度の平均の２０％を下回るシグナル強度を有する遺伝子は、Ｃｙ３／Ｃｙ５の比の大きな分散を示し、分析から除かれる。この閾値を用いて、処置Ｆ１子孫間ならびに処置Ｆ１子孫および処置ＳＤラット間で遺伝子シグナルを比較する。例えば以下の通りである：
マイクロアレイ数 試料
１〜３                                      Ａ×Ｂ  Ｆ１処置対ＳＤ処置
４〜６                                      Ａ×Ｄ  Ｆ１処置対ＳＤ処置
７〜９                                      Ａ×Ｂ  Ｆ１処置対Ｂ×ＣＦ１処置
１０〜１２                                  Ａ×Ｄ  Ｆ１処置対Ｃ×ＤＦ１処置
１３〜１５                                  ＳＤ処置対ＳＤ対照
【００８８】
３つのマイクロアレイの各組に関して、１チップを他の蛍光プローブで逆標識して、ラベリング人工物による遺伝子発現における差異を除外する。例えばスライド１は、Ｃｙ３で標識されたＡ／Ｂ処置ｃＤＮＡおよびＣｙ５で標識されたＳＤ処置を有する。同一交差標識化ＲＮＡを用いて、スライド１をストリップし、プローブする。スライド２は、Ｃｙ３で標識されたＳＤ処置ｃＤＮＡおよびＣｙ５で標識されたＡ／Ｂ処置ｃＤＮＡを有する。この設計は、ラベリング効率およびハイブリダイゼーション効率を制御する。
【００８９】
マイクロアレイ中に示された特定遺伝子の発現に及ぼす示差的作用（例えば２倍またはそれ以上の変化）に関して、一方または両方の薬剤処置を評価する。他のＦ１系統およびＳＤラットと比較した場合の、ある処置Ｆ１系統から採取された腎臓および肝臓検体中の遺伝子発現プロフィールにおいて観察された差異は、処置群内では、Ｆ１ラットの組合せ繁殖コレクション内の異なる遺伝子型は薬剤作用を区別することができる、ということを示す。
【００９０】
薬剤およびビヒクル処置組合せ繁殖ハイブリッドＦ１ラットの種々の組織から抽出されたＲＮＡの遺伝子発現プロフィールを比較することにより、系統内の薬剤作用ならびに系統間の薬剤の治療的または毒性作用の差異に関与する遺伝子を確定することができる。
【その他の実施態様】
【００９１】
本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、上記の説明は例示することを意図されたものであり、添付の特許請求項の範囲に規定された本発明の範囲を限定するものではない。その他の態様、利点および修正は、特許請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、齧歯類系統の対間の特定染色体上の遺伝子類似性の百分率を示す表のセットである。
【図２】図２は、第Ｉ相試験における全ラットに関する成長曲線のセットである。６つのパネルラット系統全ての平均体重を、非近交系（ＣＤ−ＩＧＳ）および近交系親（Ｆ３４４、ＢＮ、ＳＫＹ、ＬＥＷ）と比較してプロットする。右側の記号は、雄親の名称（一番目）そして次に雌の名称（二番目の親）に従ってハイブリッド子孫に関する成長プロットを名前付けする。
【図３】図３は、ゲンタマイシン（２４０ｍｇ／Ｋｇ）またはビヒクルで毎日処置した個々のスプレーグ・ドーリイ（Sprague Dawley）ラットの尿中のタンパク質排出を比較する。各線は、７日間の処置プロトコール中の個々のラットに関する尿中タンパク質レベルのプロットである。中白記号は、ゲンタマイシンで処置したラットからのタンパク質尿結果を示し、一方、中黒記号はビヒクル処置動物からの結果を示す。
【図４】図４は、パネル、ＣＤ−ＩＧＳ（非近交系対照）および近交系（親）ラット系統における血漿血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルに及ぼすゲンタマイシンの作用を実証する。ビヒクル処置対照（ビヒクル処置）と比較した場合のゲンタマイシン処置ラットに関する血漿ＢＵＮ濃度における増加（％）を示す。増加（％）は、試験した各系統に関して、［（平均薬剤−平均ビヒクル対照）／平均ビヒクル対照×１００］と定義される。各群中の試験動物数を、薬剤処置動物数（＃）／ビヒクル処置動物数（＃）として系統名の下の括弧内に示す。
【図５】図５は、第Ｉ相試験における全系統に関するゲンタマイシン（２４０ｍｇ／Ｋｇ）の作用を示す。処置の最初の６日間を通してのゲンタマイシンによる１日平均尿中タンパク質排出を示す。平均タンパク質値をｘ軸上にプロットし、薬剤処置動物により排出されるタンパク質からビヒクル処置動物により排出されるタンパク質の平均量（ｍｇ／日）を差し引くことにより算定する。系統に対する記号表を右側に示し、下に行くほどゲンタマイシンに対する反応が重症であることを順に列挙する。ｘ軸は処置日数を示し、ｙ軸は尿中に見出されるタンパク質のレベルを示す。
【図６】図６は、ゲンタマイシンおよびビヒクル処置ラットからの腎臓組織学の比較を示す。パネルＡは、ゲンタマイシン２４０ｍｇ／Ｋｇ／日（上パネル）またはビヒクル（下パネル）で処置されたパネルラットから単離された腎臓の代表的組織切片を示す。矢印は、以下のように採点された近位尿細管障害の領域を指す：０＝損傷なし、１＝２５％損傷尿細管、２＝５０％損傷尿細管および管腔中にタンパク質円柱、３＝＞５０％の尿細管の重症損傷、４＝全尿細管のほぼ完全な壊死。非近交系スプレーグ・ドーリイラットＣＤ−ＩＧＳ（パネルＢ）ならびに４つの近交系親系統ブラウン・ノルウェイ、フィッシャー３４４、ルイスおよびウイスター・キョート・ラット（パネルＣ）からの代表的組織学的試料も示す。
【図７】図７は、パネルのＦ１系統、非近交系スプレーグ・ドーリイラット（ＣＤ−ＩＣＳ）ならびに親系統ブラウン・ノルウェイ、フィッシャー３４４、ルイスおよびウイスター・キョート・ラットにおける低トリグリセリドレベルに対するクロフィブレートの機能的作用を示す。１１系統（パネル６、親４、非近交系１）を、２５０ｍｇ／ＫｇのクロフィブレートまたはビヒクルとしてのＨＰＭＣの６回の経口注入で処置した。血漿中のトリグリセリドレベルを７日目の安楽死後に測定した。特定薬剤処置群におけるトリグリセリド値の差（％）をプロットする。各群における試験動物数を、薬剤処置動物数（＃）／ビヒクル処置動物数（＃）として系統名の下の括弧内に示す。各試験系統に関して［（平均薬剤−平均ビヒクル対照）／平均ビヒクル対照×１００］。
【図８】図８は、パネルのＦ１系統、非近交系ならびに親系統ブラウン・ノルウェイ、フィッシャー３４４、ルイスおよびウイスター・キョート・ラットにおけるクロフィブレートの機能的作用を示す。１１系統（パネル６、親４、非近交系１）を、２５０ｍｇ／Ｋｇのクロフィブレートまたはビヒクルを有するＨＰＭＣの６回の経口注入で処置した。肝障害の指標である血漿中のアラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを、７日目の安楽死後に非近交系および近交系（上パネル）ならびにパネルＦ１ハイブリッド（下パネル）で測定した。特定薬剤処置群内の薬剤（左）およびビヒクル（右）に関する平均ＡＬＴ値をプロットする（系統により示す）。各群における試験動物数を、薬剤処置動物数（＃）／ビヒクル処置動物数（＃）として系統名の下の括弧内に示す。「＊」は、薬剤対ビヒクルＡＬＴの統計学的に有意の測定値を意味する。
【図９】図９は、非近交系スプレーグ・ドーリイラット、近交系親株（ルイス）およびパネルのＦ１系統の肝臓における脂肪酸オキシダーゼ（ＦＡＯ）活性を誘導するためのクロフィブレートの作用の比較である。各系統の肝臓からのペルオキシソーム分画を、ＦＡＯ活性に関して測定した。系統内変動性を説明するために、各々の個々の薬剤誘導性ＦＡＯからビヒクルＦＡＯ（平均）を差し引くことにより得られる平均値をグラフ化する。ｙ軸は、ＦＡＯ活性（Ｈ２Ｏ２ｎｍｏｌ／分のパーオキシマル(peroximal)タンパク質ｍｇ）を表す。ｘ軸は、この検定に用いられたラット系統を示し、そして星印（＊）は、ＦＡＯ値がＣＤ−ＩＧＳとは有意に異なる全ての系統にこの印をつける。十字印は、他のパネル系統とは有意に異なるパネル系統を示す。
【図１０】図１０は、本試験で測定された薬剤応答における系統差を検出するための親系統対Ｆ１パネルの使用の力を比較する。パネル系統（Ｆ１）系統は、親近交系からの累積データより実質的に大きい力（測定された形質のほとんどに関して有意に小さいｐ値）を示す。ｘ軸は、以下の測定形質：それぞれＧＬＵ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、ＴＢＩＬＩ、ＣＨＯＬ、ＴＰ、ＡＬＢ、ＧＬＯＢ、ＢＵＮ、ＣＲＥＡＴ、ＰＨＯＳ、ＣＡ、ＮＡ、Ｋ、ＣＬ、ＢＩＣＡＲＢ、ＡＮＩＯＮ、ＧＡＰ、ＧＧＴ、ＴＲＩＧのナンバリングである。親およびＦ１に関する２つの曲線の一般的形状は、異なるパネル間に共通の遺伝子要素が存在すると予測されるものと同様である。しかしながら、Ｆ１ハイブリッドラットを用いた本試験計画の力の増大は劇的である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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