(57)【要約】本発明は、液体試料に含まれる、巨大分子、あるいは、分子または粒子の凝集体を、選択的に濃化する方法に関する。本発明の方法は以下の工程、すなわち、前記液体試料と界面層とを含む媒体からの、泡沫またはエマルジョンのタイプの安定化された分散体の生成工程(前記界面層は、濃化しようとする前記巨大分子または前記凝集体を選択的に固定することができる);および、前記界面層を再形成するような、前の工程で生成した前記分散体の吸収工程、を含む。DNA、タンパク質、プリオン、コロイド粒子を濃化するのに本発明を用いることができる。
2005530131.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中に含まれる、巨大分子、あるいは、分子または粒子の凝集体の選択的濃化方法であって、逐次的に行われる以下の工程:
前記液体試料と、界面層とを含む媒体からの、泡沫またはエマルジョンのタイプの安定化された分散体の生成工程であって、前記界面層が濃化しようとする前記巨大分子または前記凝集体を選択的に固定することができる工程;および
前記界面層が再形成されるような、前の工程で生成した前記分散体の吸収工程;
を含む前記方法。
【請求項２】
前記分散体生成工程が、前記液体試料および前記界面層を含む前記媒体の機械的攪拌により実施される請求項1に記載の濃化方法。
【請求項３】
前記分散体生成工程が、前記液体試料に、気体または液体キャピラリジェットを直接注入することにより実施される請求項1に記載の濃化方法。
【請求項４】
前記界面層が前記巨大分子または前記凝集体を選択的に固定することができる少なくとも1種の分子を含む請求項1から3のいずれか一項に記載の濃化方法。
【請求項５】
濃化しようとする前記巨大分子、あるいは、分子または粒子の前記凝集体を選択的に固定することができる前記分子が、化学的親和力、電気的もしくは磁気的分極、および/または、イオン化により前記巨大分子または前記凝集体を固定することができる基を含む分子であり、好ましくは、前記分子が界面活性剤分子である請求項4に記載の濃化方法。
【請求項６】
前記巨大分子が、核酸と、抗原および抗体のようなタンパク質とからなる群から選択される請求項1から5のいずれか一項に記載の濃化方法。
【請求項７】
前記分子の凝集体がプリオンである請求項1から3のいずれか一項に記載の濃化方法。
【請求項８】
前記粒子の凝集体が、コロイド粒子からなる群から選択される請求項1から5のいずれか一項に記載の濃化方法。
【請求項９】
濃化しようとする前記巨大分子がDNAである請求項1から6のいずれか一項に記載の濃化方法。
【請求項１０】
濃化しようとする前記巨大分子がDNAである場合に、前記DNAを固定できる前記分子が、濃化しようとする前記DNAの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするように、プローブで機能化されている請求項4に記載の濃化方法。
【請求項１１】
前記DNAを固定できる前記分子が、濃化しようとする前記DNAに相補的なDNAプローブで機能化されている脂質である請求項10に記載の濃化方法。
【請求項１２】
前記脂質がアビジン基もしくはアビジン誘導体を含むビオチン化脂質であり、前記DNAに前もって組み入れられたビオチン化末端により、前記相補DNAが前記のアビジン基もしくはアビジン誘導体上にグラフトされている請求項11に記載の濃化方法。
【請求項１３】
前記脂質が、前記相補DNAがその上に吸着されている少なくとも1つのスペルミン基を含むカチオン性脂質である請求項11に記載の濃化方法。
【請求項１４】
最初に液体試料に含まれる、巨大分子、あるいは、分子または粒子の凝集体の精製方法であって、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法を用いて、層内に前記巨大分子または前記凝集体を濃化する工程、および、前記の濃化工程の後に、前記巨大分子または前記凝集体が枯渇した前記液体試料を除去する工程、を含む方法。
【請求項１５】
最初に液体試料に含まれる、巨大分子、あるいは、分子または粒子の凝集体の検出方法であって、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法を用いて、層内に前記巨大分子または前記凝集体を濃化する工程、および、適当な検出法により前記の層内の前記巨大分子または前記凝集体を検出する工程、を含む方法。
【請求項１６】
最初に液体試料に含まれる、巨大分子、あるいは、分子または粒子の凝集体の増幅方法であって、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法を用いて、層内に前記巨大分子または前記凝集体を濃化する工程、ならびに、前記層内に前記巨大分子または前記凝集体を濃化する前記工程の後、増幅試薬を含む液体で前記液体試料を置換する工程と、それに続く前記試薬により増幅する工程、を含む前記方法。
【請求項１７】
前記巨大分子がDNAである請求項16に記載の増幅方法。
【請求項１８】
前記分子凝集体がプリオンである請求項16に記載の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨大分子あるいは、分子または粒子の前記凝集体を可能な限り検出する、あるいは特異的に抽出するための、前記巨大分子または凝集体の濃化(concentration)方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、巨大分子または分子凝集体の濃化方法は、大部分、医療診断の分野、特にDNA鎖、あるいは、抗原もしくはプリオンのようなタンパク質複合体を検出する分野のためのものである。
【０００３】
DNA鎖の検出では、最も一般的に、現行の方法は、通常略してPCR(「ポリメラーゼ連鎖反応」)と呼ばれる方法に従って、液体媒体中で増幅することによりDNA鎖を濃化することに基づく。
【０００４】
この方法は、一連の熱サイクルに供する試料にポリメラーゼを注入することにより、液体試料中に含まれるDNA鎖を多数回(最大で105〜106回)複製することに基づく。
【０００５】
非常に多数回（どんな場合でも10回よりは多い）の熱サイクルを行った後では、DNAの濃度は検出できるのに十分なだけ高い。
【０００６】
しかし、この方法は、上で説明したように、十分な量のDNAを得るために非常に何度も繰り返される熱サイクルのために、かなりの時間を必要とする。さらに、この方法には、液体試料中に存在し、検出しようとするDNAセグメントとは本質的に異なるDNAセグメントをポリメラーゼが増幅し得るという事実のために、かなりのバックグラウンドノイズがつきものである。
【０００７】
これらの不都合を克服するために、PCRに代わる方法が開発されてきた。これらの方法の中で特に、増幅を必要としない方法を挙げることができる。増幅しないで検出するこの方法の原理は、標的DNAセグメントを、それらが少ないままで、捕捉することに基づいている。それは、標的DNAセグメントを機能化された常磁性ナノビーズと、検出前にこれらのビーズの表面で前記セグメントを濃化するように、ハイブリダイズさせることに基づく。しかし、この方法は、非特異的吸着の問題に直面する;ラテックスでコートされた常磁性ビーズの中には、反応器の固体壁面に付着するものがあり、この方法はそこでは疎水性または電気力の影響の下で実施される。この場合、達成される感度は、もはや期待されるものではない。
【０００８】
抗体または抗原のようなタンパク質の検出に関しては、2つのタイプの試験、「均一相」試験および「不均一相」試験が区別される。均一相試験は溶液中で行われる。使用された抗体の量は、この抗体が相補的な抗原に結合することにより、遊離の抗体と抗原に結合した抗体とを物理的に分離させずとも、溶液中で直接測定される。遊離の抗体と結合した抗体との間のこの区別は、様々な方法で、特に、例えば、2種の抗体の間の蛍光転移に基づいて行われる(例えば、抗原が2つの標識抗体の間にサンドイッチ状に挟まれる)。これらの試験には迅速で比較的安価であるという利点がある。例えば製薬業界で、ハイスループットスクリーニングプログラムで大量に使用されているのは、これらの試験である。しかし、それらの感度は、核酸に基づく試験に関しては、ほぼ1nMに限られている。この理由で、診断産業では不均一相試験が主に使用され、その場合、抗体が固相支持体に固定され、次に、実質的に全ての標識試薬を除去するために、支持体を洗浄することができる。さらに、酵素を標識分子として用いて、シグナルの増幅が実施される。固相支持体上でのこれらの試験は、均一相での試験よりも遅く費用が掛かるが、それらにより、0.1pMの領域、すなわち、均一相の試験より10,000倍良好な感度を実現することが可能となる。しかし、固相支持体の使用により、これらの試験の実施は難しくなっている。
【０００９】
プリオンのようなタンパク質複合体に関しては、それらは、血液のような生理学的液体中で検出可能であるためには濃化段階を経なければならない。これらの分子では、ヌクレオチドを含んでいないので、前記のPCR法を使用することはできない。その結果、プリオンの分野に関連する研究により、最近、「protein misfolding cyclic amplification」またはPMCAと呼ばれる方法が確立されるに至った。
【００１０】
プリオンは、特に海綿状脳症の原因であり、生物の多くの細胞表面に一般に存在する天然タンパク質のPrPc糖タンパク質と、間違って折り畳まれるそのコンホメーションだけが正常な糖タンパク質PrPcと異なる感染性タンパク質PrPscとからなる複合体または凝集体である。PrPscタンパク質は、第1に、PrPcタンパク質と結合することができ、第2に、正常なタンパク質の感染性のタンパク質への変換を誘発させることができる。プリオンの検出は、それらが脳だけには顕著な量で存在するが、血液中には微量しか存在しないという事実により困難となっている。
【００１１】
こうして、PMCA法により、試料媒体、すなわち血液中でプリオンを濃化することが可能となり、それにより、それらを検出することができる。
【００１２】
これを行うために、プリオンをフラグメント化するための音波処理法が用いられる。この超音波によるフラグメント化により誘導される全てのプリオンは、試料のPrPcタンパク質の助けで、in vitroで再生する。この基本サイクル(フラグメント化-再生)は、プリオンの量が検出可能になるまで、必要なだけ何度でも繰り返される。
【００１３】
増幅工程により容易になった検出工程は、蛍光分光法により実施される。検出されるタンパク質は蛍光プローブで標識され、それが存在することは、前記プローブが特性波長の光で照射された時にわかる。しかし、この技術では、ほとんどの場合、検出すべきプリオン以外の分子とプローブが結合し得るという事実のために、無視できないバックグラウンドノイズが発生する。
【００１４】
蛍光相関法と呼ばれるより進んだ方法では、2種の蛍光プローブを用いる。これらのプローブは、2つの異なる波長で発光し、また、いずれも、プリオンと共にかなりの濃度で存在するPrPcタンパク質に対称的かつ特異的に結合する。次に、検出しようとするプリオンを含む非常に少量の液体に2つの異なる波長のビームを照射し、プリオンの存在による2つの強い蛍光発光が非定常的な様式で検出され、そのプリオンは、蛍光プローブが結びつく正常または感染性PrPタンパク質からなる凝集体を構成している。しかし、特に、特異的な吸着部位を見出すことができなかった蛍光プローブの存在と、蛍光プローブが結合している、単離された正常PrPcタンパク質の存在により、バックグラウンドノイズは残る。
【００１５】
このように、上で開示された濃化の方法は全て、以下の欠点の1つまたは複数を示す。
-これらの方法のいくつかは、特に実施し得る検出中に、かなりのバックグラウンドノイズとなり得る化学種を生成するという事実により、それらによっては、濃化しようとする巨大分子または凝集体の特異的な濃化ができていない。
-それらによっては、検出が実施可能であるのに十分な、巨大分子または凝集体の濃化ができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の主題はまさに、巨大分子、あるいは、分子または粒子凝集体の濃化方法、特に、バックグラウンドノイズをできるだけ制限することによって検出が実施可能であるように、あるいは、前記巨大分子または前記凝集体を含む試料の精製が実施可能であるように、前記巨大分子または前記凝集体を選択的に濃化できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これを行うために、本発明の主題は、液体試料中に含まれる巨大分子あるいは分子または粒子凝集体の選択的濃化方法であり、逐次的に行われる以下の工程を含む:
-前記液体試料と、濃化しようとする前記巨大分子または前記凝集体を選択的に固定することができる界面層(interface layer)とを含む媒体(medium)からの、泡沫(foam)またはエマルジョンのタイプの安定化された分散体(dispersion)の生成工程;および
-前記界面層が再形成されるような、前の工程で生成した前記分散体の吸収(resorption)工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明では、「界面層」という用語は、濃化しようとする巨大分子または凝集体を含む液体試料(第1液体相と呼ばれる)表面に存在する単分子層(monolayer)(あるいは、実質的に2次元の領域)を意味するとする。この層は、その性質と特異性により、前記巨大分子または凝集体が液体試料から界面層へと選択的に移行できるようにし、液体試料に比べてその容量が僅かであることにより、前記巨大分子または前記凝集体を濃化することができる。
【００１９】
濃化される巨大分子と凝集体の性質に応じて、界面層は、液体試料表面に載っている第2の液体相に相当することがあり(例えば、DNA型の巨大分子を濃化するという問題である場合)、この相は、それに向けて巨大分子または凝集体を引き付けることをそれが可能にするような特性をもつ。界面層はまた、周辺雰囲気と液体試料との間の界面に相当することもある(例えば、プリオンのように、濃化される巨大分子または凝集体の性質が疎水性である場合、かつ、それを含む液体試料が水性媒体である場合)。
【００２０】
界面層が第2の液体相に相当する場合、本発明の方法は、前記の第2の液体相または界面層を、液体試料の表面で沈積させることからなる前工程(分散体生成工程の前に置かれる)を含み得る。
【００２１】
一般に、分散体生成工程は、液体試料と界面層とを含む媒体を機械的に攪拌することにより、あるいは、界面層が上に載った液体試料へ直接、気体または液体のキャピラリジェットを注入することにより実施される。
【００２２】
泡沫は、気泡沫(典型的には空気)の間の薄い介在膜の形態の介在液体媒体と共存する複数の気泡沫の組合せを含む分散体を表すことを指摘しておく。
【００２３】
このように、このタイプの分散体には、液体-気体の多数の界面ができる。例えば、前記媒体を激しく機械的に攪拌することにより、あるいは、この媒体へ気体のキャピラリジェット(典型的には空気のジェット)を注入することにより、本発明の泡沫を得ることができる。
【００２４】
本発明では、エマルジョンは、界面層が液体試料内で小球に分割されていて、前記液体試料が介在媒体をなす分散体を表すことを指摘しておく。こうして、液体-液体の界面が多数形成され、結果として、液体試料と界面層との間の接触表面はかなり増加する。
【００２５】
泡沫と全く同様に、エマルジョンを、液体試料と界面層とを含む媒体の機械的攪拌により、あるいはまた、界面層が上に載った液体試料への液体または気体のキャピラリジェットの直接注入により得ることができる。
【００２６】
こうして、本発明によれば、本発明の手順が、巨大分子あるいは分子または粒子凝集体を濃化するための、泡沫またはエマルジョンのタイプの分散体を含むという事実は、液体試料と界面層との間に多数の介在領域を伴うことに寄与し、このことが、これら2つの媒体の間の表面の量をかなり増大させ、結果として、分散した界面層による巨大分子または分子凝集体の固定を容易にしている。固定が介在領域で起こるという事実により、この固定は実質的に2次元の領域で起こり、このことによって、界面層による濃化される巨大分子の捕捉の効率と時間とが大幅に向上する。
【００２７】
機能化された界面層の構造が界面空気の生成の影響の下で潜在的に不安定である場合、レイリー不安定(Rayleigh instability)を利用して、最も重い液体が最も軽い液体の上の位置にある初期条件下で、実質的に静的な条件の下でエマルジョンを生成させることができる。
【００２８】
分散体の吸収の後、こうして再び、そこには、濃化された巨大分子または分子凝集体を含む再形成された界面層と、前記巨大分子または前記分子凝集体を完全にまたは部分的に失った液体試料に相当する液体相とが存在する。
【００２９】
したがって、本発明の利点は、濃化の効率を上げる分散体の生成を含めることにより、迅速に、増幅を行わずに、巨大分子または凝集体を選択的に濃化できることである。
【００３０】
前記のように、濃化される巨大分子あるいは分子または粒子凝集体の捕捉の後、分散体は吸収工程に従う。様々なやり方でこの工程を実施することができる。例えば、この分散体吸収工程を、泡沫の場合には介在膜の、エマルジョンの場合には介在媒体の流去(drainage)により実施することができる。吸収の速度は、適切であれば、界面層を作り上げている分子、巨大分子または凝集体の、分子鎖の長さによる、賢明な選択により、例えば、分散体の機械的剪断によって制御することができる。
【００３１】
界面層、濃化される巨大分子または凝集体の性質により、また特に界面層が第2の液体相に相当する場合、界面層は、問題となっている巨大分子あるいは分子または粒子凝集体を選択的に固定することができる少なくとも1種の分子を含み得る。
【００３２】
この実施形態によれば、濃化される巨大分子あるいは分子または粒子凝集体を固定化できる分子は、泡沫あるいはエマルジョンの生成の前に、最初から界面層に含まれる;それは、その巨大分子または前記凝集体を、化学的親和力、電気的もしくは磁気的分極、および/またはイオン化により固定化することができる基を含む分子であり得るし、前記分子は好ましくは1種の界面活性剤分子であることが可能である。
【００３３】
前記分子が、他の界面活性剤分子と混合されていない場合、前記分子はまた、界面活性の性質により、本発明の方法の1工程の間に生成する分散体を安定化させる分子でもあり得る。
【００３４】
この場合には、その分子は、二重の機能、すなわち、濃化される巨大分子または凝集体を固定すること、さらにまた、分散体を安定化させることにより、引き付ける分子と、濃化される巨大分子または凝集体との間の介在領域における接触時間を増すのに寄与すること、を果す。
【００３５】
本発明による方法は、どのようなタイプの巨大分子または凝集体の濃化にも適用され得る。
【００３６】
例として、本発明の方法により濃化され得る巨大分子として、核酸、あるいは、抗体または抗原のようなタンパク質を挙げることができる。
【００３７】
例として、本発明の方法により濃化され得る分子凝集体として、プリオンを挙げることができる。
【００３８】
例として、濃化され得る粒子凝集体として、金粒子のようなコロイド粒子を挙げることができる。
【００３９】
このように、本発明による方法は、DNAである特定の核酸を濃化するのに使用することができる。
【００４０】
DNAの場合には、界面層は、DNAを固定化することができる分子を含む第2の液体相に相当し、その分子は、例えば、濃化されるDNAが特異的にハイブリダイスできるように、プローブ(例えば、濃化されるDNAに相補的なDNA)で機能化された分子、例えば、濃化しようとするDNAに相補的なDNAで機能化された脂質である。
【００４１】
前記の分子が脂質であるという事実は、この種の分子は、生成した分散体を安定化するのに寄与するので、本発明の状況では特に有利である。さらに、濃化しようとするDNAに相補的なDNAによるこの分子の機能化により、前記DNAの選択的濃化と抽出が可能になる。
【００４２】
例として、DNAを濃化するのに有効な機能化脂質として、前もって相補的なDNAに組み込まれたビオチン末端により、前記の相補的なDNAがその上にグラフトされるアビジン基またはアビジン誘導体を含むビオチン化脂質、あるいは他に、相補的なDNAがその上に吸着される少なくとも1つのスペルミン基を含むカチオン性脂質を挙げることができる。このようなカチオン性脂質は、Transfectam(商標)の商品名で販売されている、DOGSすなわちジオクタデシルアミドグリシルスペルミン型の脂質であり得る。これらの脂質は、2つの飽和C18炭素鎖と、DNAに大きな親和性を示すスペルミン基からなる極性のヘッド部をもっている。こうして、相補的なDNAがスペルミン部位に吸着される。得られた脂質は、標的DNAと呼ばれる、濃化しようとするDNAが特異的にハイブリダイスする真に機能化されたプローブを形成する。
【００４３】
本発明による方法は、従来技術を実施する場合のように固相支持体を用いずに、液体試料中に含まれる抗体または抗原を選択的に濃化するのに使用することができる。この実施形態では、界面層は、液体試料の表面に載る第2の液体相に相当し、また、濃化される抗原または抗体に相補的な抗体または抗原を含む、リン脂質からなる担体またはリポソームを含む。
【００４４】
また、本発明による方法は、プリオンのような、分子凝集体の濃化にも用いることができる。プリオンの場合には、界面層は、(液体試料/周辺雰囲気の)界面に相当し、この界面層は、プリオンの疎水性により、プリオンを選択的に濃化することができる(この液体試料は血液のような水性媒体である)。
【００４５】
また、本発明による方法は、コロイド粒子の濃化にも用いることができる。これらの粒子は、例えば、水(本発明の用語では第1の液体相に相当する)に可溶化された金のサブミクロン粒子であり得る。この場合には、界面層は、これらの金のコロイド粒子を固定化することができる分子を含む第2の液体相に相当し、前記分子は、例えば、チオール、-SH基をもつ分子である。
【００４６】
前記の濃化方法は、その名前が示すように、界面層に、所定の巨大分子または巨大分子の凝集体を選択的に濃化するのに役立つ。結果として、所定の巨大分子あるいは所定の分子または粒子の凝集体を、精製、検出または増幅するために、その方法を用いることができる。
【００４７】
こうして、本発明の主題はまた、前記の濃化方法を用いて、前記界面層内に前記巨大分子または前記凝集体を濃化すること、次に、濃化工程の後に、前記巨大分子または前記凝集体が使い果たされた液体試料を除去することを含む、最初に液体試料中に含まれている巨大分子あるいは分子または粒子の凝集体の精製方法でもある。
【００４８】
例えば、DNAの精製の場合に、この方法の用途がある。この場合、本発明による方法は、特異的な相補的DNAで機能化された分子を用いて、例えば、様々なDNA、あるいはDNAの様々な部分の混合物を含む液体試料から標的DNAを特異的に抽出することからなり、次いで、前記試料は除去される。
【００４９】
タンパク質の精製にもこの方法の用途があり得る。機能化された脂質の層によりタンパク質を選択的に捕捉する工程、次の前記タンパク質を再結晶する工程により、それらの構造を研究するためにこれらのタンパク質を単離することが可能となり、あるいは他に、問題のタンパク質の溶液を精製することが可能になる。
【００５０】
本発明の主題はまた、前記の濃化方法を用いて、界面層内に前記巨大分子または前記凝集体を濃化すること、次に、前記界面層内の前記巨大分子または前記凝集体を、適当な検出方法により検出することを含む、最初に液体試料中に含まれている巨大分子あるいは分子または粒子の凝集体の検出方法でもある。
【００５１】
こうして、巨大分子がDNAである場合、選択的濃化の後、レーザ誘起蛍光により、あるいは、機能化された層内の表面電位の変化を検出することにより、あるいは他に、界面レオロジー法により、DNAの検出を実施することができる。蛍光検出または電気的検出の能力レベルは、特に、機械的または流体力学的な方法によって、ハイブリダイスした標的DNAを含む界面層を、レーザの励起容量、そうでなければ、電気的プローブの近傍と一致する、界面の1点(例えば、中心)に圧縮することにより改善され得る。
【００５２】
最後に、本発明の主題はまた、前記の濃化方法を用いて、界面層内に前記巨大分子または前記凝集体を濃化すること、前記界面層内に前記巨大分子または前記凝集体を濃化する工程の後、増幅試薬を含む液体で前記液体試料を置換すること、次に、前記試薬により増幅する工程を含む、最初に液体試料中に含まれている巨大分子あるいは分子または粒子の凝集体の増幅方法である。
【００５３】
こうして、前記の増幅方法がDNAに適用された場合、標的DNAセグメントを界面層に濃化した後、これらのセグメントが激減した液体試料は、抜き取られ、ポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドのような増幅試薬を含む精製液体で置換される。次に、PCR増幅段階を、寄生DNAセグメントの存在なしに実施することができ、結果的に、PCRに対するバックグラウンドノイズはかなり減っている。
【００５４】
例えば、増幅方法がプリオンのような分子凝集体に適用される場合、前記の濃化方法に従って所定の界面層にプリオンを濃化した後、前記プリオンが激減した液体試料を、抜き取り、さらに、まだ変態していない正常なPrPcタンパク質のような増幅試薬を含む純粋な液体で置換することができる。次に、寄生分子により損なわれることなく、PMCAの通常の工程(音波処理など)を実施することができる。
【００５５】
この増幅法の後に、PMCAと連携して実施されることもされないこともある、超高感度検出、例えば、蛍光相関を行うことができる。この方法により、機械的または流体力学的方法を用いて、レーザ測定容量、そうでなければ、電気的プローブの近傍と一致する、界面層の1点に局所的にプリオンを濃化することにより、検出能力レベルを上げることができる。
【００５６】
本発明の他の特徴と利点は、添付図を参照して、以下の特定の実施形態の説明を読めば、より完全に明らかとなるであろう。
【００５７】
図1は、非限定的な例示として、標的DNAの濃化のための、本発明による方法の実施を、4つの工程、(a)、(b)、(c)および(d)において示している。
【００５８】
図1の工程(a)は、マイクロピペットまたはシリンジを用いて、図でストランド状に表された標的DNA14を含む液体試料12が入ったマイクロビーカ10を示している。前記試料12の上は周辺雰囲気11である。
【００５９】
図1で(b)と記された工程の間に、脂質リガンド18と希釈脂質17(脂質リガンド/希釈脂質は1:4の比率)の混合物を含む単分子層16が、液体試料12の表面に乗せられる。この単分子層16が、本発明の用語によれば、界面層に相当する。これらの脂質リガンド18は、標的DNAがこの脂質とハイブリダイスできるようなものである。そのために、これらの脂質は予備工程で機能化されていなければならない。こうして、脂質リガンドは、最初にビオチン化された、ビオチン-(LC)-DPPE型の脂質であり、その上に、第1に、アビジンが吸着され、それから、第2に、標的DNAに相補的なDNAが、その相補的なDNAの一方の末端に付けられたビオチン基により、アビジン上にグラフトされ得る。この組合せ(ビオチン化脂質-アビジン-ビオジン化相補DNA)は、標的DNAストランドが特異的にハイブリダイスするプローブで機能化された脂質を形成する。
【００６０】
この脂質はまた、濃化される標的DNAに相補的なDNAがその上に吸着される少なくとも1つのスペルミン末端を含むカチオン性脂質であり得る。
【００６１】
標的DNAと結びつくことができる分子には、標的DNAを選択的に固定できる如何なる種類の分子も含まれることが明らかである。
【００６２】
本発明によれば、また、図1の工程(c)に示されるように、泡沫のタイプの分散体20が、液体試料に空気を注入することにより作り出され、前記の泡沫は介在液体膜により繋がりが保たれた一群の気泡沫からなる。泡沫の一時的な安定性は、単分子層16の形に相を作り上げる脂質により与えられる。
【００６３】
泡沫のタイプの分散体を作り上げる介在液体膜の詳細な様子が図2に示されている。この図では、この膜は、8面体形状22であり、容量は非常に小さく、その中に、液体試料12と単分子層16すなわち界面層が共存する。この結果として、標的DNA14は、単分子層または界面層の機能化された脂質18と実質的に直接接触し、こうして、これらの脂質18により非常に迅速に吸着される。泡沫が含まれると、泡沫を作り上げている介在膜の容量が非常に小さいために、脂質によるDNA捕捉の効率および速度が増す。
【００６４】
最後に、図1の(d)に示される最終工程の間に、泡沫は吸収され、ハイブリダイズした脂質19上に標的DNAが非常に薄いその水平面(level)で吸着した脂質単分子層24(この単分子層は図で参照番号24を与えられた界面層に対応する)と、標的DNAが激減した液体試料12に相当する相26とを含む非分散2相媒体に再び変わる。図1を通して、脂質17、18および19は全体として、僅かな厚さの、単分子層16または界面層24(図1dの場合)の水平面にだけ存在するはずであることが明らかである。しかし、見易くするために、前記脂質はかなり大きく誇張されている。
【００６５】
図3、4および5は、前記の特定の実施形態に従って実施される本発明の濃化方法の様々な、想定し得る応用を示している。
【００６６】
こうして、図3は、図1で説明された方法による、前記標的DNAの濃化の後、前記DNAが蛍光法により検出される場合を示している。この場合には、標的DNAに相補的なDNAで機能化され、ハイブリダイズした脂質19は、さらに、蛍光ラベルを含む。こうして、蛍光測定により、界面層24に標的DNAが存在することを突き止めることが可能である。
【００６７】
図4は、図1に従って説明された濃化方法によって前もって濃化されたDNAの精製という特定の場合を示している。泡沫の吸収が完了すると、DNAが相24に大部分吸着され、DNAが激減した相26が、マイクロピペット23により抜き取られ、精製されたDNAからなる界面層24が得られる。
【００６８】
図5は、所定のDNAの元の相より前記DNAがより高濃度である相を得るという唯一の目的で、濃化方法が用いられる場合を示している。この場合は、様々な用途で使用されるように、標的DNAが豊富な層24が、マイクロピペット23により抜き取られる。
【００６９】
これらの図に示されていない他の用途を想定できることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１ａ】本発明による濃化方法の特定の実施形態による、標的DNAを濃化するための工程を示す図である。
【図１ｂ】本発明による濃化方法の特定の実施形態による、標的DNAを濃化するための工程を示す図である。
【図１ｃ】本発明による濃化方法の特定の実施形態による、標的DNAを濃化するための工程を示す図である。
【図１ｄ】本発明による濃化方法の特定の実施形態による、標的DNAを濃化するための工程を示す図である。
【図２】泡沫の生成で作り出される介在膜の詳細な様子を示す図である。
【図３】図1に示される濃化方法の後で実施される、検出の方法を示す図である。
【図４】図1に示される濃化方法の後で実施される、精製の方法を示す図である。
【図５】図1に示される濃化方法の後で実施される、濃化の方法を示す図である。
【符号の説明】
【００７１】
10  マイクロビーカ
11  周辺雰囲気
12  液体試料
14  標的DNA
16  脂質を含む単分子層(界面層)
17  希釈脂質
18  脂質リガンド
19  (蛍光ラベルを含む)ハイブリダイスした脂質
20  泡沫のタイプの分散体
21、22  8面体形状の膜
23  マイクロピペット
24  標的DNAを吸着した脂質を含む単分子層(界面層)
26  標的DNAが激減した液体試料12の相
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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