(57)【要約】サイトカインに由来し、そのアミノ酸の少なくとも１個が上記サイトカインに対応するレセプターの原子から５Å（０．５ｎｍ）未満の距離ｄ（上記間隔ｄが構造データに基づいて評価される）を隔てた少なくとも１個の原子を含む５〜４０個のアミノ酸に相当するサイズのペプチド、誘導体、それらを含む免疫原性化合物、サイトカインの過剰または存在に関連する疾病を治療または予防するための治療または予防薬の調製、あるいは自己免疫疾病の治療を目的とするペプチドまたはペプチド誘導体あるいは免疫原性化合物の利用、並びに少なくとも１つの上記ペプチドまたはペプチド誘導体、あるいは免疫原性化合物を活性成分として含む医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインに由来し、５〜４０個のアミノ酸を包含するサイズのペプチドであって、上記ペプチドのアミノ酸の少なくとも１個が、上記サイトカインに対応するレセプターの原子から、構造データに基づく評価で、５Å（０．５ｎｍ）未満の距離ｄを隔てた少なくとも１個の原子を有することを特徴とする、但し：
−当該ペプチドは、ｈ  ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α及びＭＩＰ１βの第２及び第３システイン間に含まれる、及び
−当該ペプチドは、ＩＦＮαの第１２３と第１４０アミノ酸の間に含まれる、
前記ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドの２個の連続するアミノ酸が、前記サイトカインに対応するレセプターの原子から５Å（０．５ｎｍ）未満の距離ｄを隔てた少なくとも１個の原子を有することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
以下のサイトカイン：ＴＧＦβ、ＩＬ１β、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ＩＦＮα及びγ、ＩＬ４、５、６，１０、１２、１３、１５、１８、２３、ＩＰ１０、ＭＩＰ１α及び１β、並びにＲａｎｔｅｓの断片から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
以下のサイトカイン：ＴＧＦβ、ＩＬ１β、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ４、５、６、１０、１２、１３、１５、１８、２３の断片から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ｄが４Å（０．４ｎｍ）未満であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
前記サイトカイン・ペプチドの３または４個の連続するアミノ酸が、前記と同じ間隔基準に合致することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
３０個未満のアミノ酸を包含することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
以下のペプチド：
【表１】
2005530723.tif 000025
【表２】
2005530723.tif 000026
または上記ペプチドの断片から選択されるか、またはそれに由来する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドの１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加、環化、（Ｄ体アミノ酸の使用による）立体化学修飾、または（アシル化のような）官能基化によって得られる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド誘導体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドまたはペプチド誘導体を含むが、前記サイトカインの他のエピトープを含まないと理解され、且つ、天然のサイトカインを認識する抗体を被検体内に産生させうることを特徴とする免疫原性化合物。
【請求項１１】
ヒトまたは動物の治療法に使用することを目的とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の、またはＩＦＮαの第１２３と第１４０アミノ酸の間に含まれるペプチドまたはペプチド誘導体、あるいは免疫原性化合物。
【請求項１２】
サイトカインの過剰または存在に関連する疾病の治療または予防のための治療薬または予防薬の製造を目的とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の、またはＩＦＮαの第１２３と第１４０アミノ酸の間に含まれるペプチドまたはペプチド誘導体、あるいは免疫原性化合物の使用。
【請求項１３】
自己免疫疾病の治療のための治療薬または予防薬の製造を目的とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の、またはＩＦＮαの第１２３と第１４０アミノ酸の間に含まれるペプチドまたはペプチド誘導体、あるいは免疫原性化合物の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の、またはＩＦＮαの第１２３と第１４０アミノ酸の間に含まれる少なくとも１種類のペプチドまたはペプチド誘導体、あるいは免疫原性化合物を活性成分として含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ペプチド及び治療を目的とするその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
能動的抗サイトカイン免疫化は特に特許出願ＷＯ  ９２/２２５７７に基づいてＺａｇｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．が１９９０年に開発した能動的免疫療法ストラテジーである。
【０００３】
このアイデアを幾つかのチームが取り上げ、国際的な科学雑誌において、例えば、グルタルアルデヒド処理により多量体化させた全ＩＦＮαタンパク質（Ｇｒｉｎｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＩＤＳ  １９９９；２０：３５８−７０）、天然型ＴＮＦαと卵アルブミンとの結合から成るキメラＴＮＦαタンパク質（Ｄａｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９；１７：６６６−６９）、ＫＬＨと結合した全ＩＬ９（Ｒｉｃｈｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０００；９７：７６７−７２）または破傷風毒素のＴエピトープと結合したキメラ全ＩＬ５（Ｈｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００１；１６７：３７９２−９９）に対する能動的免疫化を報告している。
【０００４】
これらのアプローチは自己由来抗サイトカイン免疫化の実現可能性を裏付けたが、これらの僅かの成功は何人かの著者が報告している失敗例を覆い隠す結果となっている：即ち、サイトカインの種類によっては充分に防御性の且つ臨床的に有効な抗体が得られず、また、ある態様では有効な態様に形成された同じサイトカインが他の態様では有効ではない（Ｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０００；９７：７６７−７２）。
【０００５】
この現象を解明する過程で出願人は、いずれの著者も（場合によっては僅かだけ修飾された）サイトカイン全体を使用し、結果として、このことが特に以下のレベルの難点を生むとの所見を得た：
−（Ｂ及びＴ反応に関連する）抗原決定基の免疫原性の低下
−生体内に促通抗体を発生させる可能性
従って、サイトカインに対して充分に防御性であり、サイトカインの活性を制限する抗体の獲得を可能にする抗原を利用できることが望まれる。
【０００６】
ＷＯ−Ａ−９８/５１７０５はＣＣＲ５コレセプターと結合するケモカインの第２及び第３システイン間に存在するｈ  ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α及びＭＩＰ１βペプチドを開示している。
【０００７】
ＷＯ−Ａ−９８/３４６３１はサイトカインの結合またはレセプターの活性化を阻止するのに利用されるサイトカイン・レセプターのγ鎖に由来するペプチドを開示している。
ＷＯ−Ａ−９４/０１４５７は医薬化合物の担体物質として使用されるＩＦＮαペプチドを開示している。
ＥＰ−Ａ−０２１８５３１は抗体の調製に使用されるＩＬ１ペプチドを開示している。
【発明の開示】
【０００８】
上記したような現状に鑑み、本発明の目的は、サイトカインに由来し、サイズが５〜４０個のアミノ酸に相当し、アミノ酸の少なくとも１個、好ましくは連続する少なくとも２個が前記サイトカインに対応するレセプターの原子から、（例えば結晶学またはＮＭＲによる）構造データに基づく評価で、５Å未満の距離ｄを隔てた少なくとも１個の原子を有することと、前記サイトカインと相互作用する抗体を発生させることを特徴とする、以下のペプチド：
−ｈ  ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α及びＭＩＰ１βの第２及び第３システイン間のペプチド及び
−ＩＦＮαの第１２３と第１４０アミノ酸の間のペプチド
を除くペプチドを提供することにある。
【０００９】
本明細書中に使用する語“サイトカイン”は真正サイトカインだけでなく、ケモカインとも呼称される化合促進性のサイトカインをも意味する。本明細書中に使用する語“相互作用する”は免疫試験（ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）によって立証されるように天然型タンパク質を認識するという理由から、または生理活性試験または生化学拮抗試験によって立証されるようにサイトカインとそのレセプターとの結合を阻止するという理由から、これらの抗体が生体内において有益な臨床効果を有することを意味する。
【００１０】
サイトカインとしては、例えば、ＴＧＦβ、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ｖＥＧＦ、ＴＮＦα、ＩＦＮα及びγ、ＩＬ４、５、６、１０、１２、１３、１５、１８、２３、ＩＰ１０、ＭＩＰ１α及び１β、ＭＣＰ１、及びＲａｎｔｅｓを挙げることができる。上記サイトカインのうち、好ましいのはＴＧＦβ、ＩＬ１β、ｖＥＧＦ、ＴＮＦα、ＩＦＮα及びγ、ＩＬ４、５、６、１０、１２、１３、２３、またはこれらのサイトカインのうちの幾つかの組合わせであり、特に好ましいのはＩＬ１β、ｖＥＧＦ、ＴＮＦα、ＩＬ２３及びＩＦＮαまたはこれらのサイトカインのうちの幾つかの組合わせである。
【００１１】
本発明のサイトカイン・ペプチドはサイトカインを起源とするか、またはサイトカインから誘導する。“起源とする”とは、そのアミノ酸配列がサイトカインのそれと全く同じであることを意味する。“誘導する”とは、そのアミノ酸配列がサイトカインのそれと殆ど同じであるが、後述するような２、３の相違点を含むことを意味する。
【００１２】
本発明のサイトカイン・ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは連続する２個のアミノ酸が前記サイトカインに対応するレセプターの原子から５Å（０．５ｎｍ）未満の距離を隔てた１個の原子を有する。前記サイトカインに対応するレセプターの原子から、好ましくは４．５Å（０．４５ｎｍ）未満、特に好ましくは４Å（０．４ｎｍ）未満、より好ましくは３．５Å（０．３５ｎｍ）未満の距離を隔てる。
一般に、問題のアミノ酸原子は前記アミノ酸の側鎖に位置する。
【００１３】
本発明の好ましい実施条件下では、サイトカイン・ペプチドの２個、特に３個、好ましくは４個の連続するアミノ酸がこれと同じ間隔基準に合致する。
この間隔は、例えば、結晶学的測定またはこれと同様の測定結果を出すＮＭＲによる構造データに基づいて評価される。
上記サイトカイン・ペプチドは８個、特に１０個、さらに具体的には１２個、より具体的には１５個を上回るアミノ酸から成ることが好ましい。
【００１４】
本発明の他の好ましい実施条件下では、上記サイトカイン・ペプチドが３５個未満、好ましくは３０個未満、さらに好ましくは２０個未満のアミノ酸から成る。一般に、最も短い配列は前記サイトカインに対応するレセプターの原子から５Å（０．５ｎｍ）未満の距離を隔てた少なくとも１個の原子を含む少なくとも２個の連続するアミノ酸から成る１群を含むペプチドに相当し、最も長い配列はこのような連続するアミノ酸を２群、または３群以上を含む本発明のペプチドに相当する。これらの群は、ＩＬ１βの場合に見られるように、数個、例えば１０個のアミノ酸によって隔てられている。
【００１５】
上記サイトカイン・ペプチドから特に重要なペプチドを挙げると以下の通りである：
【００１６】
【表１】
2005530723.tif 000002
【００１７】
【表２】
2005530723.tif 000003
【００１８】
【表３】
2005530723.tif 000004
【００１９】
上記配列は炎症反応または特異的免疫反応における役割によってヒトの疾病発生に関与するサイトカインから選択した。
以下のペプチドは特に注目に値する：
【００２０】
【化１】
2005530723.tif 000005
【００２１】
免疫学の当業者には公知のように、免疫原性を有するペプチドの免疫学的性質を変えることなく天然性ペプチド鎖の修飾を行うことができる。従って、天然性配列と極めて相同性の、例えば、対応する天然性ペプチドと５０％、具体的には７０％、好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％を超える相同性を有し、しかも天然性ペプチドのこのエピトープ部位の免疫学的特性を保つサイトカイン・ペプチド誘導体を挙げることができる。相同ゾーンは５〜４０残基の範囲、例えば、８〜４０残基、または８〜３５残基、好ましくは１０〜３５残基または１２〜３５残基、特に好ましくは１２〜３０残基、さらに好ましくは１５〜３０残基、より具体的には１５〜２５残基である。
【００２２】
サイトカイン・ペプチド誘導体は化学基（メチル、アセチルなど）を付加するか、または（Ｄ体アミノ酸を使用する）立体化学的修飾によって免疫原性を著しく低下させないという条件で、サイトカイン・ペプチド誘導体は修飾残基を含むことができる。サイトカイン・ペプチド誘導体はサイトカイン・ペプチドと同様に、サイトカインと相互作用する抗体を誘発するものでなければならない。
【００２３】
本発明のサイトカイン・ペプチド誘導体はそれを構成するアミノ酸中に、上記した（免疫学的特性に関する）規定の範囲内であれば、例えば、１つまたは２つ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加、または（例えばアシル化のような）官能化のような１つまたは２つ以上の修飾を含むことができる。例えば、ロイシン残基をイソロイシン残基に置き換えても免疫学的性質を変化させることはない。一般に、修飾は天然性ペプチドを構成するアミノ酸の４０％、具体的には３０％、好ましくは２０％、さらに好ましくは１０％以上に及んではならない。修飾ペプチドによって誘発される抗体は天然性サイトカインに対して活性でなければならない。
【００２４】
これらの修飾は、簡単な試験によって修飾を確認できる当業者の範囲内である。このような修飾誘導体の免疫原性は、マウスを免疫化した後、全サイトカインまたは免疫化サイトカイン・ペプチドを被検抗原とするＥＬＩＳＡまたはサイトカイン‐レセプター結合阻害試験によって評価することができる。修飾は８個、好ましくは６個、特には４個、さらに好ましくは３個以上のアミノ酸に及ばないこと、または２個または１個のアミノ酸だけに及ぶことが好ましい。
【００２５】
本発明の他の目的は、は少なくとも１個の上記サイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン・ペプチド誘導体を含むことを特徴とする化合物を提供することにある。このような化合物は同じペプチド/誘導体反復、または異なるペプチド/誘導体組合わせを、直鎖、または分枝構造または担体タンパク質と混合した結合の形で含むことができる。このような化合物は環状の形態を呈することもできる。従って、本発明のサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン・ペプチド誘導体を比較的長いアミノ酸配列に挿入することによって、（タンパク質またはＤＮＡを免疫化するため）優れた立体配座を構成するか、または外因性Ｔエピトープと組合わせることができる。
【００２６】
本発明のサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン・ペプチド誘導体の利点として、例えばＫＬＨのような担体タンパク質と共有会合させることができる。
【００２７】
本発明のサイトカイン・ペプチドは一般的には少数のサイトカイン・エピトープの相当する。特に、挿入されたり、組合わせられたり、会合させられる場合、上記化合物は前記サイトカインの他のエピトープを含まない。
【００２８】
これらのサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体は、天然性サイトカインの他のエピトープとは相同を含まない如何なるタンパク質配列中にも存在し得る。例えば、レセプターとの結合部位を形成することができ、その端部にシステインを加えるだけでペプチドに環状構造を付与することができる。他の例は破傷風毒素のＴエピトープの配列に囲まれたペプチドである。さらに他の例として、レセプター結合部位の配列に相当し、但し、アゴニスト効果を回避するため数個のアミノ酸がそのＤ体異性体に置き換えられているペプチドを挙げることができる。必要に応じ、免疫原が免疫反応を妨げないように、レセプターに対してアゴニスト活性を有しないペプチド誘導体を使用すれば有益である。
【００２９】
免疫反応を促進するには、これらのサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体を担体タンパク質と結合させればよい。結合の方法と担体タンパク質の種類とはターゲットとなるペプチドに応じて異なる。例えば、カルボジミド、グルタルアルデヒドまたはビス‐ジアゾタイズドベンジジン結合のような当業者に公知の化学的方法によってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質と破傷風毒素（ＴＴ）をペプチドと結合させればよい。このような結合は配列に対して、例えば、リジン、ヒスチジン、チロシンまたはシステインのようなアミノ酸を付加または組み込むことで容易に実現できる。（プラスモジウム・ファルシパルム、ＫＬＨなどに由来する）外因性Ｔエピトームと化学的または遺伝学的に結合されたペプチドもまた本発明の範囲に含まれる。
多枝型の、またはトランスフェリンやフェリチンのような分子との網状結合によって免疫反応を有効に刺激することも可能である。
【００３０】
本発明のペプチドは化学合成または遺伝子工学またはその他の適当な方法で生成させることができる。必要に応じてジスルフィド架橋を形成するため鎖の端部にシステインのような１個または２個以上のアミノ酸を接合して環状ペプチドを合成することによって、これらのペプチド断片にタンパク質の３次元構造をもたせる２次構造の一部を回復することができる。
【００３１】
本発明のサイトカイン・ペプチド、サイトカイン誘導体及びその化合物は極めて有用な医薬特性を有し、特に顕著な抗サイトカイン性を備えている。即ち、免疫原として作用し、被験者の体内に天然性サイトカインを認識する抗体を発生させることができる。これらのペプチドは対応するサイトカインに由来する他のエピトープを含まない。
これらの特性は実験例に基づいて後述するように、上記ペプチドが医薬用として好適であることを裏付けるものである。
【００３２】
レセプター結合部位近傍に位置し、他のサイトカイン・エピトープを含まないペプチドに限定されるから、サイトカイン活性を促進または増強するような抗体の発生を制限できるという点で有益である。しかも、ターゲットとなる抗原決定基の数が制限されるから、抗サイトカイン免疫化の質を高めることができる。
【００３３】
従って、本発明の他の目的は、上記したサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体または化合物、即ち、上記したサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体、あるいは免疫原性化合物によって構成されるか、またはｈ  ＲＡＮＴＥＳの第２及び第３システインの間に含まれるか、またはＩＦＮαの第１２３と第１４０アミノ酸の間に含まれ、ヒトまたは動物の身体の治療法に利用され且つサイトカインの過剰または存在と関連する疾病の治療または予防を目的とする治療または予防薬の調製に利用されることを特徴とする医薬を提供することにある。
【００３４】
本発明の医薬は、例えば、（特に、多発性硬化症、リウマチ多発性動脈炎、乾癬、自己免疫糖尿病、狼そうなどのような）自己免疫疾病、アレルギーまたは喘息、癌またはＡＩＤＳなど、サイトカインの過剰生成を伴う免疫系のデレギュレーションと関連する疾病の治療及び予防に使用される。即ち、リウマチ多発性動脈炎には攻撃性のＩＬ１βまたはＴＮＦαが有効であり、多発性硬化症または自己免疫糖尿病には攻撃性のＩＦＮγ、ＩＬ１８、ＩＬ２３またはＩＬ１２が有効であり、アレルギーまたは喘息には攻撃性のＩＬ４、ＩＬ５及びＩＬ１３が有効であり、ある種の癌には攻撃性のＩＬ１０またはｖＥＧＦが有効であることは明らかである。より一般的には、免疫反応そのものを支配し、ＩＬ１２、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＦＮγ、ＴＮＦαを標準的な態様で関与させるＴｈ１/Ｔｈ２デレギュレーションは能動免疫化による平衡の再調整から恩恵を受けることができる。以上は例に過ぎず、本発明は他のサイトカイン・エピトープを含まないように修飾された上記ペプチド配列を伴う能動免疫化（ＤＮＡまたはペプチド免疫化）に基づいてヒトの疾病を治療することをも目的とする。これらの配列は本願明細書に記述するように修飾することができ、ＤＮＡ免疫化は遺伝コードから翻訳するだけで行われる。
【００３５】
体液性免疫反応はＥＬＩＳＡ試験または天然性サイトカインとそのレセプターとの結合の阻止を示す試験によって評価することができる。細胞反応は使用されるペプチドに対する細胞増殖試験で評価することができる。
【００３６】
本発明の免疫原性活性成分は以下のように利用することができる。
本発明のサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体、あるいは免疫原性化合物は、例えば、皮下または筋肉注射で治療に充分な量を、このような治療を必要とする被験者に投与される。投与量は例えば１〜１０００μｇ、具体的には１０〜５００μｇであり、１ヶ月に１回、３ヶ月にわたって皮下注射し、発生した血清抗体のカウントに応じて周期的に、例えば、２〜６ヶ月ごとに投与する。１種類だけの免疫原性分子では、中和すべき過剰生成サイトカインの活性部位すべてに対応できない場合、有害作用部位を残らず中和する抗体を生成させるため、同じ製剤に２種類以上の異なる免疫原性分子を加えて投与することができる。
【００３７】
本発明の他の目的は、少なくとも１つの上記サイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体、あるいは免疫原性化合物を活性成分として含有する医薬組成物、特に、ワクチンを提供することにある。
【００３８】
医薬として、本発明のサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体、あるいは免疫原性化合物を、ワクチンの分野では標準的な経路、即ち、皮下、筋中、静中、または経口投与用の医薬組成物に組み込むことができる。投与は１回、または一定期間を置いてさらに１回または２回以上行うことができる。
【００３９】
本発明の他の目的は、既に述べたように、新規の、またはＩＦＮαの第１２３と第１４０アミノ酸の間に存在する１種類または２種類以上のサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体、あるいは免疫原性化合物を活性成分として含有することを特徴とする治療または予防用医薬組成物を提供することにある。
【００４０】
免疫原性剤は単独でコンディショニングしてもよいし、賦活剤としての賦形剤または製薬上許容できる賦形剤混合物と配合してもよい。本発明の他の目的は、免疫原として上記サイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体、あるいは免疫原性化合物を含有するワクチンを提供することにある。
【００４１】
本発明の他の目的は、それ自体は公知の方法によって、活性成分を許容できる、特に製薬上許容できる賦形剤と配合することを特徴とする上記組成物の製法を提供することにある。患者に対する本発明のサイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体、あるいは免疫原性化合物の投与は能動免疫療法に相当する。但し、受動免疫療法を行うこと、即ち、患者が必要とする抗体を患者に直接与える療法も有用である。
【００４２】
ワクチン剤はカルボポールを賦形剤とするゲル、点鼻剤または鼻腔スプレーのような鼻腔内投与形式の他、胃耐久性（ｇａｓｔｒｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ）カプセル、糖衣錠または胃耐久性顆粒のような経口投与形式に調剤することができる。
【００４３】
全身的にまたは粘膜を介して投与されるＤＮＡワクチンの場合、プラスミドの製剤方式として、生理的ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水＝ＰＢＳ）のような生理的食塩水にプラスミドを懸濁させればよい。プラスミドを生物分解性ポリマー（ＰＬＧ、ＰＬＡ、ＰＣＬ）の微小球体に封入し、胃抵抗性カプセルの形で投与すればよい（経口）。ＤＮＡをバクテリア、サルモネラ‐タイプまたはウィルス‐タイプ、アデノウィルスまたはポックスウィルス‐タイプの生きたベクター中に発現させることもできる。
【００４４】
最後に、本発明の他の目的は、好ましくは鉱物性、油性または合成の免疫性賦活剤と連携させて、上記サイトカイン・ペプチドまたはサイトカイン誘導体、あるいは免疫原性化合物を免疫原として使用することを特徴とする、患者の能動免疫化方法を提供することにある。
【００４５】
免疫化は標準的な態様で、具体的には、好ましくは例えばＩＳＡ５１またはＡｌｕｍのような賦活剤の存在において、配合体としてのペプチドまたは免疫原性化合物によって行うことができる。免疫化は、裸のＤＮＡまたは、例えば、ｐＣＲ３．１のような好適なプロモーターを含有する発現ベクターを使用し、ＤＮＡに基づいて行うことができる（外因性Ｔエピトープと組み合わされた結合部位と相同の配列）。投与されるＤＮＡｓは適当な基（ＣｐＧなど）を使用することでヌクレアーゼから保護することができる。最初のＤＮＡ免疫化が行われた後、ペプチド化合物を使用して標準的なブースター投与を行うことができる。
【００４６】
以上に述べたペプチドの好ましい適用条件は上記本発明の他の目的にも適用される。
図１及び図１の拡大図である図２はＩＬ１０に由来し、対応のレセプターと接触しているペプチドの結晶構造を示す。図示のように、ＩＬ１０サイトカイン（左側）はそのレセプター（右側）と接触している。
【００４７】
図２から明らかなように、黒く塗りつぶしたアミノ酸は４Å（０．４ｎｍ）未満の距離（ｄ＝２つの黒点間の破線）を隔てている。即ち、図の下から上へ、下記のようなペアを構成している：１９２ＩＬ１０Ｒセリンと２８ＩＬ１０アスパラギン酸（３．１８Å（０．３１８ｎｍ））、１００ＩＬ１０Ｒアスパラギン酸及び１０１ＩＬ１０Ｒグルタミン酸と３４ＩＬ１０リシン（３．８３Å（０．３８３ｎｍ）及び３．８４Å（０．３８４ｎｍ））、９４ＩＬ１０Ｒアスパラギンと３９ＩＬ１０メチオニン（３．７０Å（０．３７０ｎｍ））。それぞれのアミノ酸に関して、中心点を該アミノ酸のα炭素の重心とし、側鎖の端部、即ち第３の点として、この側鎖における先行する２つの点から最も遠い点を選んだ。測定される距離ｄはサイトカイン及びそのレセプターのアミノ酸中心間距離である。この距離は他の公知の方法を利用して求めることも可能である。
【００４８】
以下の例は本発明の内容を明らかにするための例である。
【実施例】
【００４９】
実施例１：
ヒトＩＬ１βの配列からペプチドＫＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱ（配列番号３７）を合成し、グルタルアルデヒドを利用する結合によってＫＬＨとの結合を可能にするため、天然性配列にＫ残基を付加した。
ＩＳＡ５１賦活剤の存在において５匹のマウスを免疫化した。初日に行う最初の注射のため、１００μｌのエマルションを調製するのに充分な量のＩＳＡ５１に４０μｇの免疫原を含むエマルションを調製した。２１日目と４０日目に行うブースターのため、２０μｇの免疫原を含む１００μｌのエマルションを調製した。対照マウスと並行して５匹のマウスを、同じ賦活剤に混入したＫＬＨで免疫化した。
【００５０】
６０日目に血清を採取し、抗体の存在を明らかにするため、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施した。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００５１】
【表４】
2005530723.tif 000006
【００５２】
天然性サイトカインを中和する抗体の存在を下記のように評価した：２０単位の天然性ＩＬ１βサイトカインを、１/１００〜１/２０００に希釈された（免疫化または対照）マウスから採取した血清と一緒に、３７℃で２時間にわたり前保温した。５０,０００個/マイクロウェルの割合で用意したＥＬ４細胞にこの混合物全体を加えた。２４時間後、上澄みでＩＬ２の生成をサンドウィッチＥＬＩＳＡ試験（Ｒ＆Ｄ診断用薬）によって評価した。ＩＬ２生成の抑制％はＩＬ１βの中和％を示す。当然のことながら、対照マウスではなく、免疫化されたマウスについて反応を観察した。
【００５３】
【表５】
2005530723.tif 000007
【００５４】
実施例２：
ヒトｖＥＧＦ：ＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳ（配列番号３８）に由来する合成ペプチドで５匹のマウスを免疫化した。グルタルアルデヒドとの反応によってこのペプチドを担体タンパク質ＫＬＨと結合させた。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００５５】
【表６】
2005530723.tif 000008
【００５６】
実施例３：
ヒトＴＮＦαに由来する合成ペプチド：ＫＹＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬ（配列番号３９）で５匹のマウスを免疫化した。このペプチドをジアゾベンジジンとの反応によって担体タンパク質ＫＬＨと結合させた。グルタルアルデヒドを利用する結合によってＫＬＨとの結合を可能にするため、天然性配列にＫ及びＹ残基を付加した。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００５７】
【表７】
2005530723.tif 000009
【００５８】
天然性サイトカインを中和する抗体の存在を下記のように評価した：５０単位の天然性ＴＮＦαサイトカインを、１/２００に希釈された（免疫化または対照）マウスから採取した血清と一緒に、３７℃で２時間にわたり前保温した。２５,０００個/マイクロウェルの割合で用意したＬ９２９細胞にこの混合物全体を加えた。２４時間後、ナフトールブルーブラック（Ｓｉｇｍａ）で着色することによって細胞の溶解を評価した。溶解の抑制％はＴＮＦαの中和％を示す。当然のことながら、対照マウスではなく、免疫化されたマウスについて反応を観察した。
【００５９】
【表８】
2005530723.tif 000010
【００６０】
実施例４：
ヒトＩＦＮγ：ＫＫＹＦＮＡＧＨＳＤＶＡＤＮＧＴＬＦＬＧＩＬＫＮ（配列番号４０）に由来する合成ペプチドで５匹のマウスを免疫化した。このペプチドを化学的にＭＡＰＳの形て合成した。グルタルアルデヒドとの反応によってこのＭＡＰＳペプチドを担体タンパク質破傷風毒素と結合させた。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００６１】
【表９】
2005530723.tif 000011
【００６２】
天然性サイトカインを中和する抗体の存在を下記のように評価した：１００単位の天然性サイトカインを、１/２５０に希釈された（免疫化または対照）マウスから採取した血清と一緒に、３７℃で２時間にわたり前保温した。３００，０００個のＲＡＷ  ２６４．７細胞を２ｍｌウェルに収容し、これに混合物全体を加えた。細胞におけるクラスＩＩ  ＣＭＨの発現を２４時間後、＞＞＞＞＞フルオレセインと結合させたクラスＩＩ  抗ＣＭＨ抗体でマーキングすることにより、フラックス血球計算法によって細胞におけるクラスＩＩ  ＣＭＨの発現を評価した。クラスＩＩ  ＣＭＨの発現抑制％はＩＦＮγの中和％を示す。当然のことながら、対照マウスではなく、免疫化されたマウスについて抑制を観察した。この実験の有意性閾値は３０％である。
【００６３】
【表１０】
2005530723.tif 000012
【００６４】
実施例５：
ヒトＩＬ１０に由来するペプチド：ＤＥＣＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＣ（配列番号４１）で５匹のマウスを免疫化した。このペプチドを化学的に合成し、それぞれの端部にシステインを付加して環状ペプチドを得た。カルボジイミドとの反応によってこのペプチドを担体タンパク質ＫＬＨと結合させた。カルボジイミドとの反応でＫＬＨと結合できるように天然配列にＤＥ残基をも付加した。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００６５】
【表１１】
2005530723.tif 000013
【００６６】
実施例６：
ヒトＩＬ４に由来するペプチド：ＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬＷＧＬＡＧ（配列番号４２）で５匹のマウスを免疫化した。グルタルアルデヒドとの反応によってこのペプチドを担体タンパク質ＫＬＨと結合させた。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００６７】
【表１２】
2005530723.tif 000014
【００６８】
実施例７：
ヒトＩＬ１２ｐ４０に由来するペプチド：ＫＫＥＤＧＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲＣＥ（配列番号４３）で５匹のマウスを免疫化した。ビス‐ジアゾ化ベンジジン（ジアゾ）との反応によって、このペプチドを担体タンパク質破傷風毒素と結合させた。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００６９】
【表１３】
2005530723.tif 000015
【００７０】
実施例８：
ヒトＩＬ  １８に由来するペプチド：ＫＹＦＧＫＬＥＳＫＬＳＶＩＲＮＬＮＤＱＶＬＦＩＤ（配列番号４４）で５匹のマウスを免疫化した。グルタルアルデヒドとの反応によってこのペプチドを担体タンパク質ＫＬＨと結合させた。グルタルアルデヒドを利用する結合によってＫＬＨとの結合を可能にするため、天然性配列にＫ残基を付加した。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００７１】
【表１４】
2005530723.tif 000016
【００７２】
実施例９：
ヒトＩＰ１０に相当する合成ペプチド：ＫＫＫＧＥＫＲＣＬＮＰＥＳＫＡ（配列番号４５）で５匹のマウスを免疫化した。グルタルアルデヒドとの反応によってこのペプチドを担体タンパク質破傷風毒素と結合させた。天然性配列中に存在する３個のＫ残基が、グルタルアルデヒドを利用する結合によるＫＬＨとの結合を可能にする。。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００７３】
【表１５】
2005530723.tif 000017
【００７４】
実施例１０：
ヒトＩＬ５に相当するペプチド：ＫＬＱＥＦＬＧＶＭＮＴＥＷＩ（配列番号４６）で５匹のマウスを免疫化した。グルタルアルデヒドとの反応によってこのペプチドを担体タンパク質ＫＬＨと結合させた。グルタルアルデヒドを利用する結合によってＫＬＨとの結合を可能にするため、天然性配列にＫ残基を付加した。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００７５】
【表１６】
2005530723.tif 000018
【００７６】
実施例１１：
ヒトＴＧＦβ２に相当するペプチド：ＤＴＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥ（配列番号４７）で５匹のマウスを免疫化した。カルボジイミドとの反応によってこのペプチドを担体タンパク質ＫＬＨと結合させた。天然性配列にＤ残基を付加することにより、結合部位を形成した。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００７７】
【表１７】
2005530723.tif 000019
【００７８】
実施例１２：
ヒトＩＬ６に相当するペプチド：ＫＱＩＲＹＩＬＤＧＩＳＡ（配列番号２５）で５匹のマウスを免疫化した。ビス‐ジアゾ化ベンジジン（ジアゾ）との反応によって、このペプチドを担体タンパク質ＴＴと結合させた。実施例１と同じ条件下で免疫化した後、６０日目に血清を採取し、天然性サイトカインと一緒にＥＬＩＳＡ試験を実施して抗体の存在を明らかにした。
それぞれのマウスについて得られた平均吸光度を下表に示す：
【００７９】
【表１８】
2005530723.tif 000020
【００８０】
実施例１３：
ＩＬ１βのペプチド１−ＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬ−１０（ＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＣＴＣ）（配列番号４８）、２９−ＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱ−３９（ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡ）（配列番号５０）に対応するＤＮＡｓを合成し、ＧＹＧスペーサー（ＧＧＣＴＡＣＧＧＣ）（配列番号５４）によって、破傷風毒素：ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号５５）（ＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＴＡＡＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧ）（配列番号５１）及びＫＬＨ：ＶＤＴＶＶＲＫＮＶＤＳＬ（ＧＴＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＣＴＣＣＣＴＴ）（配列番号５２）のＴエピトープから分離した。
最終ヌクレオチド配列は以下の通りである：
【００８１】
【化２】
2005530723.tif 000021
【００８２】
（配列番号５３）。
ｐＲＳＥＴ−Ａでクローン化されたこのＤＮＡ配列は遺伝子工学によってポリ‐ヒスチジン融合タンパク質の形で形成し、精製したポリペプチド化合物に相当するコードである。このポリペプチドを実施例１と同様に免疫原として使用した。
天然性ＩＬ１βに対するマウスの抗体反応をＥＬＩＳＡによって測定し、以下の結果を得た：
【００８３】
【表１９】
2005530723.tif 000022
【００８４】
実施例１４：
ＩＬ１βのペプチド１−ＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬ−１０（ＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＣＴＣ）（配列番号４８）、２９−ＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱ−３９（ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＡ）（配列番号５０）に対応するｃＤＮＡｓを合成し、ＧＹＧスペーサーによって、破傷風毒素：ＡＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号５５）（ＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＴＡＡＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＧ）（配列番号５１）及びＫＬＨ：ＶＤＴＶＶＲＫＮＶＤＳＬ（ＧＴＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＣＴＣＣＣＴＴ）（配列番号５２）のＴエピトープから分離した。
最終ヌクレオチド配列は以下の通りである：
【００８５】
【化３】
2005530723.tif 000023
【００８６】
（配列番号５３）。
ｐＣＲ３．１でクローン化されたこのＤＮＡはＣＭＶプロモーターの制御下にＩＬ１ｂポリペプチドをコード化する。
【００８７】
１００μｌの食塩水に溶解させたベクター１００μｇを注射することによって最初の筋肉注射を実施した。２１日目と４０日目に実施例１３のペプチドで２回のブースター投与を実施した（“プライム‐ブースト”免疫化）。６０日目に５匹の免疫化マウスと５匹の対照マウスを被検体として、天然性サイトカインに対する抗体反応をＥＬＩＳＡ試験によって評価した。
結果は以下の通りであった：
【００８８】
【表２０】
2005530723.tif 000024
【００８９】
実施例１５：
５０％のＩＳＡ  ５１（Ｐａｒｉｓ，Ｓｅｐｐｉｃ社製）と実施例１のペプチド水溶液５０％（５０μｇ/投与量）から成るｗ/ｏ型エマルションからワクチンを形成した。
実施例１６：
ＩＬ１０全身タイプＤＮＡワクチン接種のためのプラスミド‐免疫原‐系ワクチン。
筋中投与のため、ＩＬ１βのペプチドＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬ及びＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱに相当するコードを有するプラスミド（２０μｇ/投与量）を０．２ｍｌのＰＢＳ中に懸濁させた。
【００９０】
実施例１７：
５０％のＩＳＡ（Ｐａｒｉｓ、ＳＥＰＰＩＣ社製）と、ＫＬＨと結合させたヒトＴＮＦαから誘導された５０％の合成ペプチドＫＹＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬ水溶液から成るｗ/ｏ型エマルションからワクチン（１００μｇ/投与量）を調製した。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＩＬ１０に由来し、対応のレセプターと接触しているペプチドの結晶構造を示す。ＩＬ１０サイトカイン（左側）はそのレセプター（右側）と接触している。
【図２】図１の拡大図である。
【図１】
2005530723.tif 000027
【図２】
2005530723.tif 000028
【配列表】
2005530723000001.app
【国際調査報告】
2005530723.tif 000029
2005530723.tif 000030
2005530723.tif 000031
2005530723.tif 000032
2005530723.tif 000033
2005530723.tif 000034
2005530723.tif 000035
2005530723.tif 000036
2005530723.tif 000037
2005530723.tif 000038
2005530723.tif 000039
2005530723.tif 000040
2005530723.tif 000041
2005530723.tif 000042
2005530723.tif 000043
2005530723.tif 000044
2005530723.tif 000045
2005530723.tif 000046
2005530723.tif 000047
2005530723.tif 000048
2005530723.tif 000049
2005530723.tif 000050