(57)【要約】  本発明は、川椒抽出物を含む脳細胞保護及び記憶力増進用組成物に関するものであり、本発明の組成物は各種ストレス、飲酒、喫煙等の環境的要因により脳損傷を受けている現代人の脳細胞保護効果を誘発し、退行性疾患の予防及び治療並びに記憶力増進の効果を誘発する薬剤及び健康補助食品に利用することができる。
2005512999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、有機溶媒、または該水と有機溶媒を混合した混合溶媒で抽出した川椒抽出物を含む脳細胞保護及び記憶力増進用医薬組成物。
【請求項２】
組成物総重量に対して川椒抽出物を0.5〜50重量％含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
川椒抽出物が、川椒を炭素数1〜4の低級アルコール、アセトン、クロロホルム、塩化メチル、エーテル、酢酸エチル及びこれらの混合物からなる群から選ばれる有機溶媒で抽出して得られる請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
川椒抽出物が、請求項３に従って得られた川椒抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解した後、酸でpH2〜4に調節して同量のクロロホルムでさらに抽出し分画することにより得られる請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
川椒抽出物が、請求項３に従って得られた川椒抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解し、酸でpH2〜4に調節して同量のクロロホルムで抽出した後、クロロホルムに溶解されない分画を水酸化アンモニウムでpH9〜12に調節して同量のクロロホルム：メタノール混合溶媒で抽出、分画することにより得られる請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
川椒抽出物が、請求項３に従って得られた川椒抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解し、酸でpH2〜4に調節して同量のクロロホルムで抽出した後、クロロホルムに溶解されない分画を水酸化アンモニウムでpH9〜12に調節して同量のクロロホルム：メタノール混合溶媒で抽出し、このうちクロロホルム：メタノール混合溶媒に溶解されない分画をメタノールでさらに抽出、分画することにより得られる請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
川椒抽出物が、請求項３に従って得られた川椒抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解し、酸でpH2〜4に調節して同量のクロロホルムで抽出した後、クロロホルムに溶解されない分画を水酸化アンモニウムでpH9〜12に調節して同量のクロロホルム：メタノール混合溶媒で抽出し、このうちクロロホルム：メタノール混合溶媒に溶解しなかった分画をメタノールでさらに抽出、分画してメタノールに溶解されない分画から得られる請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
担体、賦形剤、希釈剤又はこれらの混合物をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
経口製剤、外用剤、座剤又は注射剤に剤形化される請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
脳細胞保護及び記憶力増進効果を表す川椒抽出物、及び食品学的に許容される食品補助添加剤を含む健康補助食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、川椒抽出物を含む脳細胞保護及び記憶力増進用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳細胞の損傷に関与する重要な因子の一つはアミノ酸としてのグルタメート(glutamate)である。グルタメートは主に4種類の受容体、即ちNMDA(N-メチル-D-アスパテート)受容体、AMPA(L-α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオネート)受容体、カイニン酸受容体、及び1S,3R-ACPD受容体に結合して作用する[Craig CR, Stitzel RE, Modern Pharmacology with Clinical Applications, p293-302, 1997]。脳虚血のような刺激下では神経細胞への酸素供給が減り、その結果、嫌気性の解糖が増加して組織内のエネルギー源であるATPが減ってイオンポンプの作用が減少し、細胞外カリウムイオン量が増加して神経細胞膜の脱分極が誘導される。この状態で、興奮性神経伝達物質が分泌されNMDA、AMPA、カイニン酸受容体の活性化により脳損傷が起きる。
【０００３】
興奮性神経伝達物質による興奮性毒性は細胞ストレスを誘発し、アルツハイマー病、パーキソン病、脳卒中及び筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患のような病理学的状態を誘発する際に重要な役割を果たすことが一般に知られている[Haloween, B., Reactive oxygen species and the central nervous system. J. Neurochem. 59, p1609-1623, 1992; Coyle, J. T.及びPuttfarcken, P., Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science 262, p689-695, 1993; Olanow, C. W., A radical hypothesis for neurodegeneration. Trends Neurosci. 16, p439-444, 1993]。中枢神経系の神経変性疾患は、記憶と認知機能の低下を伴う場合がある。特に、痴呆は現代のような高齢化社会の深刻な問題であり、遺伝、老化、脳損傷、喫煙及び飲酒のような環境的要因並びにその他複合的な要因によるものである。主に海馬が損傷を受けるが、これは一般的に脳のアセチルコリン含量の減少と密接な関連がある。現在は、脳のアセチルコリンの量を増加させるためにアセチルコリンエステラーゼ阻害剤がアルツハイマー性痴呆の治療に広く使われている。この他にも、この脳損傷を抑制するための多くの研究が進められており[Gagliardi RJ, Neuroprotection, excitotoxicity and NMDA antagonists, Arq. Neuro-Psiquiatr. p58, 2000]、例えば、NMDA拮抗剤、AMPA拮抗剤、GABAアゴニスト、細胞内カルシウム減少剤、酸化窒素阻害剤、遊離ラジカル除去剤、ナトリウムチャンネル阻害剤、グルタミン酸遊離阻害剤、成長因子、アシドーシス、低体温法、カリウムチャンネル活性化剤等の開発が試みられている。
【０００４】
NMDA拮抗剤としてドゾサイルピン(dozocyilpin)(MK 801)、セルフォテル(selfotel)、セレステイト(cerestat)、デクストロメトルファン(dextrometorfan)等が開発されたが、この薬物は低容量で投与すると知覚認知の変化、不快感、眼振症等を誘発し、さらに、高容量で投与すると興奮、パラノイア、幻覚のような精神的副作用を示す。また、AMPA拮抗剤としてNBQXが開発されたが、深刻な腎臓毒性を示すため、医薬品としての実用可能性は低い。
従って、毒性のない脳保護剤の開発が急がれている。
【０００５】
最近の研究によると、AMPA受容体の活性化による神経細胞損傷はアルツハイマー病と関連した前脳基底コリン性ニューロン(BFCNs)に選択的に影響するため、AMPA受容体はアルツハイマー病の発生に非常に重要な役割を果たすことが明らかになった。これは即ち、AMPA拮抗剤を利用したアルツハイマー病治療剤の開発が可能であることを示唆している[Weiss, J. H. et al., Basal forebrain cholinergic neurons are selectively vulnerable to AMPA/kainate receptor-mediated neurotoxicity. Neuroscience 60, p659-664]。グリア細胞は神経細胞の生存に決定的な役割を有する。グリア細胞は、発達過程の中枢神経系では神経細胞の正確な移動と増殖を調節し、発達後は神経細胞の恒常性とシナプス柔軟性の維持に関与する。また、グリア細胞は神経細胞の生存と死滅に必須の神経細胞のメッセージを開始できる受容体と神経伝達物質を含有している。その結果、グリア細胞を外部の損傷から保護することがすなわち神経細胞の柔軟性、恒常性及び生存と関係する。
【０００６】
川椒(Pericarpium Zanthoxyli)は、サンショウ科のカショウ(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)、 イヌザンショウ(Zanthoxylum schinifolium Sieb. Et Zucc.)及び山椒(Zanthoxylum piperitum A. P. DC)の乾燥果実の果皮を称するもので、韓国、中国等に分布し、その成分としては(+)-γ-カジネン(Cadinene)、(+)-β-ピネン、(-)-アロマデンドレン(Aromadendrene)、(-)-イソプレゴール(Isopulegol)、(-)-N-アセチルアノナイン(Acetylanonaine) (R-型)、(2E, 4E, 8Z, 11E)-2-ヒドロキシ-N-イソブチル-2,4,8,11-テトラデカテトラエナミド、(2E, 4E, 8Z, 11Z)-2-ヒドロキシ-N-イソブチル-2,4,8,11-テトラデカテトラエナミド、(2E, 4E, 8E, 10E, 12E)-2-ヒドロキシ-N-イソブチル-2,4,8,10,12-テトラデカテトラエナミド、2-トランス-6-トランス-8-トランス-10-トランス-2-ヒドロキシ-N-イソブチルドデカ-2,6,8,10--テトラデカテトラエナミド、1,8-シネオール、2-フェニルプロパン-2-オール、アルノチアナミド(arnottianamide)、シトロネラール、デ-N-メチルコレリトリン(methylcholerythrine)、ハロピン(Halopine)、ヒドロキシ-α-サンショオール、ヒドロキシ-β-サンショオール、ヒドロキシ-γ-サンショオール、リナロール、ネロール、ピペリトン、スキミアニン(Skimmianine)、テルピネン-4-オール、ザントキシリン(Zanthoxylin)、ザントブンゲアニン(Zanthobungeanine)、α-ピネン、(+, -)α-サンショオール、α-テルピネオール、α-チュジェン、β-サンショオール、β-シトステロール、γ-サンショオール、トランス-オシメン等の成分を含んでいる。脾胃の虚汗、腹冷痛、下痢、腰部及び膝の冷え、消化不良、急・慢性胃炎、赤痢、歯痛等に用いられ、駆虫及び抗菌作用があることで知られている(ジョン ボソプ、シン ミンギョ著、図解郷薬大辞典、ヨンリン社 p795-796、1998年及び新東医薬宝鑑伝統東洋薬物データベース(TradMed)ソウル大学天然物科学研究所、1999年)。
【０００７】
しかし、これまで川椒抽出物に脳細胞保護及び記憶力増進効果があるという報告はなかった。
本発明者らは、各種ストレス、飲酒、喫煙等の環境的要因により脳損傷を受けている現代人の脳細胞保護効果と記憶力増進効果を誘発する物質に対する研究を重ねた結果、川椒抽出物が脳細胞保護及び記憶力増進の効果を示すことを発見し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、脳細胞保護効果及び記憶力増進効果を表わす医薬組成物及び健康補助食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一般的な目的は水、有機溶媒または該水と有機溶媒を混合した混合溶媒で抽出した川椒抽出物を含む脳細胞保護及び記憶力増進用医薬組成物を提供することである。
この川椒抽出物を含む脳細胞保護及び記憶力増進用医薬組成物は、組成物総重量に対して川椒抽出物を0.5〜50重量％含むことが好ましい。
川椒抽出物が川椒を炭素数1〜4の低級アルコール、アセトン、クロロホルム、塩化メチル、エーテル、酢酸エチル及びこれらの混合物からなる群から選ばれる有機溶媒で抽出して得られることが特に好ましい。
【００１０】
好ましくは、川椒抽出物は、請求項３に従って得られた川椒抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解した後、酸でpH2〜4に調節して同量のクロロホルムでさらに抽出し分画することにより得られる。
好ましくは、川椒抽出物は、請求項３に従って得られた川椒抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解し、酸でpH2〜4に調節して同量のクロロホルムで抽出した後、クロロホルムに溶解されない分画を水酸化アンモニウムでpH9〜12に調節して同量のクロロホルム：メタノール混合溶媒で抽出、分画することにより得られる。
好ましくは、川椒抽出物は、請求項３に従って得られた川椒抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解し、酸でpH2〜4に調節して同量のクロロホルムで抽出した後、クロロホルムに溶解されない分画を水酸化アンモニウムでpH9〜12に調節して同量のクロロホルム：メタノール混合溶媒で抽出し、このうちクロロホルム：メタノール混合溶媒に溶解されない分画をメタノールでさらに抽出、分画することにより得られる。
【００１１】
好ましくは、川椒抽出物が、請求項３に従って得られた川椒抽出物をメタノール：水の混合溶媒に溶解し、酸でpH2〜4に調節して同量のクロロホルムで抽出した後、クロロホルムに溶解されない分画を水酸化アンモニウムでpH9〜12に調節して同量のクロロホルム：メタノール混合溶媒で抽出し、このうちクロロホルム：メタノール混合溶媒に溶解されない分画をメタノールでさらに抽出、分画してメタノールに溶解されない分画から得られる。
【００１２】
好ましくは、川椒抽出物は、担体、賦形剤、希釈剤又はこれらの混合物をさらに含む。
さらに、川椒抽出物は、経口製剤、外用剤、座剤又は注射剤に剤形化されるのが特に好ましい。
本発明の別の目的は、脳細胞保護及び記憶力増進効果を表す川椒抽出物及び食品学的に許容される食品補助添加剤を含む健康補助食品を提供することである。
【発明の効果】
【００１３】
川椒抽出物を含む組成物は、川椒抽出物の脳細胞保護機能により、退行性脳疾患の予防及び治療効果だけではなく、記憶力向上誘発効果を示す。各種環境的ストレスによる脳損傷を受けている現代人の脳細胞保護機能を有するため、痴呆患者等の記憶力が低下した人に対して使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
上記の目的に従い、本発明は川椒抽出物を含む脳細胞保護及び記憶力増進用組成物を提供するものである。
本発明の脳細胞保護及び記憶力増進用組成物は、組成物の総重量に対し川椒抽出物を0.5〜50重量％含有する。
【００１５】
本発明の川椒抽出物は、以下のような製造工程で製造することができる。
第一段階：川椒をメタノール、エタノール等の炭素数1〜4の低級アルコール又はアセトン、クロロホルム、塩化メチル、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒、好ましくはメタノール又はメタノールと水の1：0.2〜1.5の範囲の混合溶媒で5〜80℃の温度、好ましくは30〜55℃で、15分〜48時間、好ましくは30分〜12時間の反応時間で抽出してテルペノイド及びフェノール性物質を大量に含む低級アルコール可溶分画を得る。
【００１６】
第二段階：上記で得られた低級アルコール可溶分画を低級アルコール及び水の混合溶媒、好ましくはメタノールと水との1：0.5〜1：1.5の範囲の混合溶媒に溶解後、酸でpH2〜4に調節し、同量のクロロホルムでさらに抽出することにより川椒のクロロホルム可溶分画を得る。
【００１７】
第三段階：上記のクロロホルム溶媒に溶解しない分画を水酸化アンモニウムでpH9〜12に調節し、同量のクロロホルム：メタノール混合溶媒で抽出及び分画してクロロホルム：メタノール溶媒可溶分画を得る段階であり、このときクロロホルム：メタノール混合溶媒の混合比は1：0.1〜1の範囲にすることが好ましい。上記クロロホルムに溶解しない分画のうち、次の抽出時、クロロホルム：メタノール混合溶媒に溶解した分画は主にアルカロイドを含有し、クロロホルム：メタノール混合溶媒に溶解しない分画のうちメタノールに溶解する分画は4級アルカロイド及びN-オキシドを含む。
【００１８】
第四段階：上記クロロホルム：メタノール混合溶媒に溶解しない分画をメタノールで追加抽出して、メタノール可溶分画及びメタノールに溶解しない水分画を得る。
本発明は、以上の各段階で得られる低級アルコール可溶分画、クロロホルム可溶分画、クロロホルム：メタノール可溶分画、メタノール可溶分画及び水可溶分画を含む脳細胞保護及び記憶力増進用組成物を提供する。
また、本発明の川椒抽出物は、追加の分画工程を行うこともできる(Harborne J.B. Phytochemical methods : A guide to modern techniques of plant analysis. 3rd Ed. pp 6-7, 1998)。
【００１９】
本発明の川椒抽出物を含む組成物は、一般的な方法に従って、適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
本発明の川椒抽出物を含む組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、カルシウム、リン酸、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、マイクロクリスタリンセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物が挙げられる。
【００２０】
本発明による川椒抽出物を含有する組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、乳剤、シロップ、エアゾール等の経口製剤、外用剤、座剤及び注射剤に剤形化することができる。
川椒抽出物の投与量は、患者の年齢、性別、体重により異なり得るが、0.1〜500 mg/kgの量を一日一回〜数回投与できる。川椒抽出物及び分画物の投与量は、投与経路、疾病の程度、性別、体重、年齢等によって増減できる。従って、上記投与量は、如何なる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００２１】
本発明の川椒抽出物を含む組成物は、上記のような剤形で脳細胞保護及び記憶力増進のための薬剤、食品及び飲料等に利用することができる。川椒抽出物を添加できる食品としては、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類等がある。
本発明の川椒抽出物自体は毒性及び副作用がほとんどないため、長期間服用する場合も安全な薬剤である。
【００２２】
本発明の上記川椒抽出物は、脳細胞保護及び記憶力増進の目的で食品又は飲料に添加することができる。このとき食品又は飲料中の上記川椒抽出物の量については、健康補助食品には一般的に、食品総重量の0.1〜15重量％、好ましくは1〜10重量％で加えることができ、健康補助飲料には100 mlにつき基準に1〜30 g、好ましくは3〜10 gの比率で加えることができる。
【００２３】
本発明の健康飲料組成物は、特定の比率で必須成分として上記川椒抽出物を含む以外は液体成分には特に制限はなく、一般の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物等を追加成分として含むことができる。
上述の天然炭水化物の例としてはブドウ糖、果糖等の単糖；マルトース、スクロース等の二糖；及びデキストリン、シクロデキストリン等の通常の糖等の多糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールが挙げられる。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤(レバウジオシドA及びグリチルリチン等のステビア抽出物、タウマチン)、及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム等）を好ましく用いることができる。上記の天然香味剤の比率は、本発明の組成物100 ml当り一般的に約1〜20 g、好ましくは約5〜12 gである。
【００２４】
上記の他に本発明の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物(電解質)、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び充填剤(チーズ、チョコレート等)、ペクチン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤等を含むことができる。そのほか本発明の組成物は、天然果実ジュース及び果実ジュース及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。これらの成分は独立に又は組み合せて用いることができる。このような添加剤の比率はあまり重要ではないが、通常、本発明の組成物100重量部当り0〜約20重量部の範囲で選択される。
【実施例】
【００２５】
本発明を、以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明がこれらの実施例により制限されるものではない。
例１：川椒抽出物の製造
川椒250 gを切断し、ソックスレー装置を用いて70％メタノール(750 ml)で3回抽出した。抽出物をろ過し、ロータリーエバポレーター (EYELA N-N系列)を利用して減圧濃縮し、凍結乾燥してメタノール粗抽出物16 gを得た(分画１)。
【００２６】
凍結脱水メタノール抽出物10gを異なる有機溶媒で分画するために、200 mlのメタノール：水(4：1)に溶解し、2M硫酸でpH3に調節し、同量のクロロホルムで3回連続抽出し、これを減圧濃縮及び凍結乾燥しクロロホルム可溶分画3.83 gを得(分画２)、水層は水酸化アンモニウムでpH10に調節した後、同量のクロロホルム：メタノール(3：1)で2回抽出した。クロロホルム：メタノール(3：1)に溶解する層を減圧濃縮及び凍結乾燥し、クロロホルム−メタノール可溶分画0.26 gを得た(分画3)。水層は同量のメタノールで3回抽出、減圧濃縮及び凍結乾燥を行い、4.5 gのメタノール可溶分画(分画4)と0.65 gの水可溶分画(分画5)をそれぞれ得、これらを一つの活性化実験に試料として用いた。
【００２７】
実験１：グリースギャップ分析試験
1)実験方法
ラットの大脳皮質のウェッジを調製して二区画のブレインバスに取り付け、試験を行った[Harrison NL, Simmonds, MA, Quantitative studies on some antagonists of N-methyl D-aspartate in slices of rat cerebral cortex. Br. J. Pharmacol. 84, p381-391, 1985年]。脳を素早く取出し、脳組織スライサーを利用して前方2〜3mmを除去し、残りの部位を垂直に切り500〜600μm厚さの冠状切片を製造して素早く酸化されたクレブス培地に入れた後、中央線を中心に二等分して、大脳皮質と脳梁を含む大脳皮質側が1.5 mmで、脳梁側は1 mmのウェッジを製造した。室温で酸化されたクレブス培地に2時間放置した後、ウェッジを二区画のブレインバスに高圧シリコングリースを塗ったスリット間に取り付けた。両側の区画全て1分当り2 mlの速度でクレブス培地を灌流させた。川椒抽出物(分画1,2,3,4及び5)を大脳皮質側の区画に10μg/mlの濃度で10分前に予め投与し始め、興奮性アミノ酸のAMPA(α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸)40μMを2分間投与し、二区画間のd.c.電位をAg/AgCl電極で測定した。このシグナルは、増幅してメクラブ（McLab）ソフトウェアで分析した。
【００２８】
2)実験結果
AMPAによる神経細胞の脱分極誘発は、神経細胞の損傷による刺激の尺度と考えられる。図1Aに示されるように、実験の結果、AMPA 40μMを二区画のブレインバスに投与した場合、0.45 mVの脱分極が誘導されることが明らかになったが、一方で、川椒抽出物(分画1)(1μg/ml)を前処理してAMPAを投与した場合、脱分極の程度が0.21 mVに著しく減った (図1B)。特に、川椒抽出物の他の分画(分画2,3,4及び5)で前処理した結果、AMPAによる脱分極はそれぞれ75％、54％、27％、67％抑制されることが明らかになった(図２)。
従って、川椒抽出物中の様々な成分により神経保護が誘発されることがわかる。
【００２９】
実験2：細胞生存率試験(MTT assay)
1)実験方法
MTT試験は、ミトコンドリアの酸化還元を比色計で測定する方法で、ミトコンドリア酸化還元電位や細胞生存率を調べる際に主に利用される(Mosmann et al. J. Immunol. Methods. 65, p55-63, 1983)。
本実験では、細胞の生存率を調べるため、培養液で24時間培養された細胞の各群に異なる濃度の川椒抽出物をそれぞれ添加した。MTT試薬(Sigma, USA)；3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、製品番号M 2128をPBS(リン酸緩衝液)に溶解してろ過した後、最終0.5 mg/mlの濃度で各ウェルに添加した。細胞はさらに37度で3時間培養した。このとき、活動するミトコンドリアを有する生存細胞は、テトラゾリウム環を分解し濃藍色のホルマザンを生成するので、これを溶かすために100μl DMSOと10μlソレンソングリシン緩衝液(Sorenson glycine buffer, 0.1M glycine, 0.1M NaCl, pH10.5)を添加し、570 nmで吸光度を測定した。
【００３０】
2)実験結果
図３に示すように、実験の結果、AMPA(40μM)をC6グリア細胞に投与した場合、約32％の細胞が死滅するが、川椒抽出物(分画１)(10μg/ml)を前処理すると細胞の生存率は90％以上に回復することが明らかになった。
【００３１】
実験３：NaNO2 記憶試験
NaNO2 による脳の酸素代謝欠乏と記憶及び学習と関連があるコリン性神経伝導は、互いに密接な関係があることが知られている[Schindler等、Nootropic drugs : Animal models for studying effects on cognition, Drug Develop Res 4: p567-576, 1984]。NaNO2による脳の酸化的代謝障害とコリン性神経抑制による記憶障害は互いに密接に関係している。従って、薬物処理後NaNO2 による死滅誘発時間が遅れる場合は、その薬物の記憶力増加効果を示す尺度の一つであると考えることができる。
【００３２】
1)実験方法
雄性マウス(20 g)に川椒抽出物(分画１)を10 mg/kg, 経口投与し、60分後にNaNO2（250mg/kg, s.c.）を注射して呼吸が停止するまでの時間を測定し、呼吸が持続する時間を対照群と比較して記憶向上効果を評価した。
【００３３】
2)実験結果
図4に示すように、実験の結果、NaNO2による脳代謝障害による死滅誘導時間に比べて、川椒抽出物(分画１)(10 mg/kg, p.o.)を前処理した場合に死滅誘導時間が45％増加したことから、川椒による記憶力増加効果が示された。
【００３４】
実験４：受動回避記憶試験
1)実験方法
雄性マウス(20 g)に川椒抽出物(分画1、分画2、分画3、分画4、又は分画5)を一日に10 mg/kg, 経口で3日間投与し、ジェミニ回避システム(Gemini Avoidance System, San Diego Instruments, USA)を利用して受動回避記憶試験を行った。実験はクマルらの方法を基に若干の修正を加えて次の通り行った[Kumar, V., Singh, P.N., Muruganadan, A. V., Bhattacharya. Effect of Indian Hypericum perforatum Linn on animal models of cognitive dysfunction. J Ethnopharmacology 72, p119-128, 2000]。
【００３５】
初日のトレーニング実験では、マウスを明るいボックスに入れて300秒間順化させた後、自動的にドアが開くようにして暗いボックスに移動するようにした。次に暗いボックスに移動したら0.3 mAの電気刺激を1秒間与えた。24時間後の２日目の記憶実験ではマウスを明るいボックスで300秒間順化させた後、ドアを開けて暗いボックスに移動するようにし、このとき暗いボックスに移動するまでにかかる時間を測定した。記憶実験の日には電気刺激を与えなかった。マウスが500秒間で暗いボックスに移動しない場合は最大点の500秒を与えた。
【００３６】
2)実験結果
図5Aに示すように、初日のトレーニング実験では、各実験群に有意な差はなかった。図5Bに示すように、記憶実験の二日目では、スコポラミン処置で誘発された痴呆のマウスでは記憶能力が対照群に比べて92.7％落ちた。しかし、川椒分画1,2,3,4又は5を3日間投与されたマウスでは、スコポラミンによる記憶障害がそれぞれ99％、33％、61％、133％及び112％回復し、優れた記憶回復力効果を示した。
【００３７】
実験５：川椒抽出物の経口毒性試験
1)実験方法
約20 gのICRマウス25匹を温度23℃、相対湿度50％、照度150〜300ルクスの動物室で1週間飼育した後、各5匹ずつ5群に分けて実験した。
実施例で得られた川椒抽出物(分画1、分画2、分画3、分画4、又は分画5)を0.1％のツイン80に溶解した後、5群のマウスにそれぞれ薬効誘発容量(10 mg/kg, p.o.)の100倍(1,000 mg/kg,p.o.)〜1000倍(10,000 mg/kg, p.o.)を一回経口投与した。投与後、一般症状の変化及び死亡動物の有無を7日間観察した。そして投与7日目、マウスを致死させ解剖して肉眼で内部臓器を検査した。
【００３８】
2)実験結果
川椒抽出物の分画投与による異常所見は観察されず、川椒抽出物分画1、分画2、分画3、分画4及び分画5の致死量はそれぞれ5,000 mg/kg以上、10,000 mg/kg以上、10,000 mg/kg以上、5,000 mg/kg以上及び5,000 mg/kg以上であった。
以下、上記医薬組成物の製剤例を説明するが、本発明はこれを限定するのではなく単に具体的に説明するものである。
【００３９】
製剤例１. 錠剤
通常の錠剤製造方法に従って、下記の組成の錠剤を製剤化した。
川椒メタノール抽出物                                            500.0 mg
乳糖                                                            500.0 mg
タルク                                                          5.0 mg
ステアリン酸マグネシウム                                        1.0 mg
【００４０】
製剤例２. カプセル剤
下記の方法に従い、下記の組成のカプセル剤を製造した。
川椒抽出物を篩って賦形剤と混合した後、ゼラチンカプセル中に充填してカプセルを製造した。
川椒メタノール抽出物                                            500.0 mg
澱粉1500                                                        10.0 mg
ステアリン酸マグネシウム                                        100.0 mg
【００４１】
製剤例３. シロップ剤
下記の方法に従い、下記の組成のシロップ剤を製造した。
まず、精製水に白糖を溶解させた。パラオキシベンゾエート、パラオキシプロピルベンゾエート及び川椒抽出物を加えて60℃で溶解させた後冷却し、精製水を加えて150 mlにした。
川椒メタノール抽出物                                            5.0 g
白糖                                                            95.1 g
パラオキシベンゾエート                                          80.0 mg
パラオキシプロピルベンゾエート                                  16.0 mg
精製水                                                          150 mlまで
【００４２】
製剤例４. 液剤
通常の液剤製剤方法に従って下記の組成の液剤を薬学的に調製し、琥珀色の瓶に充填した。
川椒メタノール抽出物                                            500.0 mg
異性化糖                                                        20.0 g
酸化防止剤                                                      5.0 mg
メチルパラオキシベンゾエート                                    2.0 mg
精製水                                                          100.0 mlまで
【００４３】
製剤例５. 散剤
通常の散剤製造方法に従って下記の組成の散剤を調製し、袋に入れて密封した。
川椒メタノール抽出物                                            50.0 mg
乳糖                                                            100.0 mg
タルク                                                          5.0 mg
【００４４】
製剤例６. 注射剤
通常の注射剤製造方法に従って薬学的に調製し、下記の組成で2.0mlの容量のアンプルに充填し、滅菌した。
川椒メタノール抽出物                                            50.0 mg
酸化防止剤                                                      1.0 mg
ツイン80                                                        1.0 mg
注射用蒸留水                                                    2.0 mlまで
【００４５】
また、下記の方法で健康食品を製造した。
[健康食品の製造方法]
玄米、麦、ハトムギを周知方法でアルファ化、脱水及び分散させた後、粉砕機で粒度60メッシュの粉末を製造した。さらに、黒豆、黒ゴマ、シソ（perilla）も周知方法で蒸して脱水し、分散させた後、粉砕機で粒度60メッシュの粉末を製造した。
【００４６】
上記で製造した穀物類、種実類及び乾燥川椒抽出物を次の比率で配合し顆粒を製造した。
[穀物類：玄米 30重量％、ハトムギ 15重量％、麦 20重量％、
種実類：シソ 7重量％、黒豆 8重量％、黒ゴマ 7重量％、
川椒抽出物乾燥粉末：3重量％、霊芝（bracket fungus） 0.5重量％、地黄 (geogen)0.5重量％]
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ラットの大脳皮質におけるAMPAによる神経細胞脱分極を川椒抽出物(分画１が抑制することを示す図である。データは平均±標準偏差(n=5)で表されている。**:対照群に関して P<0.05。
【図２】ラットの大脳皮質におけるAMPAによる神経細胞脱分極を川椒抽出物(分画2,3,4,及び5)が抑制することを示す図である。データは平均±標準偏差(n=5)で表されている。対照群に関して*: P<0.05、**: P<0.01。
【図３】C6グリア細胞においてAMPAにより誘導された細胞損傷に対して川椒抽出物(分画１)が阻害効果を有することを示す図である。データは平均±標準偏差(n=5)で表されている。対照群に関して***: P<0.001
【図４】NaNO2試験において川椒抽出物(分画1)が記憶力を増進させたことを示す図である。データは平均±標準偏差(n=8)で表されている。対照群に関して*: P<0.05
【図５】受動回避記憶試験において川椒抽出物(分画1,2,3,4及び5)が記憶力増進を刺激したことを示す図である。データは平均±標準偏差(n=6)で表されている。対照群に関して*: P<0.05、**: P<0.01
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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