(57)【要約】【課題】  蛍光発生化合物でコートされたウェルを備えるマルチモダリティ蛍光参照プレートとその製造方法について開示する。【解決手段】  本発明のマルチモダリティ蛍光参照プレートは１以上のウェルを備え、各ウェルがベースを有し、１以上のウェルのベースは蛍光発生化合物のコーティングを含む。本参照プレートは、定常状態蛍光、時間分解蛍光、蛍光寿命及び／又は蛍光偏光の測定用蛍光プレートリーダー及びイメージングシステムの較正に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のウェルを備えるマルチモダリティ蛍光参照プレートであって、各ウェルがベースを有し、１以上のウェルのベースが蛍光発生化合物のコーティングを含む、参照プレート。
【請求項２】
前記ウェルが１以上の壁部を含む、請求項１記載の参照プレート。
【請求項３】
前記コーティングがインクジェット印刷によってベースに塗工される、請求項１又は請求項２記載の参照プレート。
【請求項４】
前記コーティングがスクリーン印刷によってベースに塗工される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項５】
前記ベースが印刷用紙又は印刷用カードを含んでなる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項６】
前記印刷用紙又は印刷用カードが金属膜を備える、請求項５記載の参照プレート。
【請求項７】
前記金属膜が、アルミニウム、銀、スズ及び金からなる群から選択される、請求項６記載の参照プレート。
【請求項８】
前記印刷用紙又は印刷用カードがさらにポリマーコーティングを備える、請求項５乃至請求項７のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項９】
前記ベースが有機ポリマーを含んでなる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項１０】
前記有機ポリマーが、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及びナイロンからなる群から選択される、請求項９記載の参照プレート。
【請求項１１】
前記ベースが金属を含んでなる、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項１２】
前記金属がアルミニウム又はステンレス鋼からなる、請求項１１記載の参照プレート。
【請求項１３】
前記蛍光発生化合物が安定な非放射性原子からなる、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項１４】
前記蛍光発生化合物が不安定な放射性同位体を含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項１５】
ベースの第二の表面に固定された支持体をさらに含む、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項１６】
前記支持体の第二の表面に固定された底層部をさらに含む、請求項１５記載の参照プレート。
【請求項１７】
前記蛍光発生化合物が、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５Ｂ、Ｃｙ７、ＣｙｐＨｅｒ、クマリン、ＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ染料、ＤＲＡＱ５、アクリドン、キナクリドン、ランタニドキレート、ルテニウム錯体、タートラジン、緑色蛍光タンパク質（ＧＥＰ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン及びフィコエリトリンからなる群から選択される、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項１８】
前記ランタニドキレートが、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロジウム及びサマリウムからなる群から選択される、請求項１７記載の参照プレート。
【請求項１９】
前記プレート内のウェル数が、１、６、１２、２４、４８、９６、３８４及び１５３６個からなる群から選択される、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載の参照プレート。
【請求項２０】
請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載の参照プレートの、定常状態蛍光、時間分解蛍光、蛍光寿命及び／又は蛍光偏光の測定用機器の較正における使用。
【請求項２１】
前記較正が、蛍光シグナルの波長、蛍光強度、蛍光シグナルの寿命もしくは持続時間、又はマイクロウェルプレートの整列度に関するものである、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
データ規格化、データ補正及び／又は画像補正のための請求項２０又は請求項２１記載の参照のプレートの使用。
【請求項２３】
前記機器がプレートリーダー又はイメージングシステムである、請求項２０乃至請求項２２のいずれか１項記載の参照プレートの使用。
【請求項２４】
前記イメージングシステムがＬｅｅｄｓｅｅｋｅｒ（商標）、ＩＮＣｅｌｌ（商標）又はＶｉｅｗｌｕｘ（商標）である、請求項２３記載の参照プレートの使用。
【請求項２５】
マルチモダリティ蛍光参照プレートの製造方法であって、
ｉ）ベースシートの第一の表面に蛍光発生化合物をインクジェット印刷又はスクリーン印刷する段階、及び
ii）上記ベースシートを１以上のウェルを備えるプレートの第一の表面に固定してそれらの間を封止する段階
を含んでなる方法。
【請求項２６】
上記封止が水密シールである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ベースシートが印刷用紙又は印刷用カードを含んでなる、請求項２５又は請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記印刷用紙又は印刷用カードが金属膜を備える、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記金属膜が、アルミニウム、銀、スズ及び金からなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記印刷用紙又は印刷用カードがさらにポリマーコーティングを備える、請求項２５乃至請求項２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
前記ベースが有機ポリマーを含んでなる、請求項２５又は請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
前記有機ポリマーが、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及びナイロンからなる群から選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ベースが金属を含んでなる、請求項２５又は請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
前記金属がアルミニウム又はステンレス鋼からなる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ベースシートの第二の表面に支持体の第一の表面を固定してベースシートを補強する段階をさらに含む、請求項２５乃至請求項３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
前記支持体の第二の表面に底層部を固定する段階をさらに含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記蛍光発生化合物が、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５Ｂ、Ｃｙ７、ＣｙｐＨｅｒ、クマリン、ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ染料、ＤＲＡＱ５、アクリドン、キナクリドン、ランタニドキレート、ルテニウム錯体、タートラジン、緑色蛍光タンパク質（ＧＥＰ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン及びフィコエリトリンからなる群から選択される、請求項２５乃至請求項３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
前記蛍光発生化合物が安定な非放射性原子からなる、請求項２５乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
前記蛍光発生化合物が不安定な放射性同位体を含む、請求項２５乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
前記プレート内のウェル数が、１、６、１２、２４、４８、９６、３８４及び１５３６個からなる群から選択される、請求項２５乃至請求項３９のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、イメージング装置、プレートリーダーのような蛍光分光器の較正及び検査に有用なマルチモダリティ蛍光参照プレートに関する。本発明は、かかるプレートの製造方法、並びに該プレートを定常状態蛍光、時間分解蛍光、蛍光偏光及び蛍光寿命に使用する方法に関する。  
【背景技術】
【０００２】
多くの染料分子は、可視光又は紫外光の照射によって吸収エネルギの一部を長波長の蛍光として放射する。こうした染料分子は、蛍光発生化合物として知られ、生物学的アッセイに広く用いられており、それらの発生する蛍光信号から研究対象の系に関する情報を得ることができる。蛍光測定法は、被検材料が極く微量でも高感度の測定ができるので、極めて有用である。
【０００３】
蛍光光度計は、３つの主要部品を有する。すなわち、１）励起用の光源、２）波長選択用の１以上のフィルター及び／又は分散型モノクロメーター、及び３）蛍光を電気信号に変換する検出器である。従来、大半の検出器はダイオード又は光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、いずれも一回に１つのサンプルしか測定できない。近年、一度に多数のサンプルの同時画像形成と定量が可能となることから、電荷結合素子（ＣＣＤ）を備えた検出器が用いられている。
【０００４】
蛍光測定法は感度が高く、サンプル所要量が少ないことから、製薬業界での新薬創製のためのスクリーニング法に好適であり、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に多大な有用性が認められている。マルチウェルプレート又はマイクロウェルプレートは、そのコンパクトなフォーマット（通例１０８×７２ｍｍの設置面積でウェル数９６又は３８４個）のためサンプル量及びスペースの制約を最小限に抑えつつ処理能力（スループット）を最大限にすることができるので、ＨＴＳに多用される。かかるプレートは周知であり、数多くの供給元（例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ社）から市販されている。
【０００５】
ＨＴＳに用いられる最も一般的な形態の蛍光光度計はＰＭＴ式スキャナーであり、おそらく「同一の」手法で一回に１つのウェルを測定する（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（英国バッキンガムシャー）製のＦａｒｃｙｔｅ（商標））。このタイプの蛍光光度計はプレートリーダーとして知られる。そのプロセスでは、概して、各ウェルが検出器の下方に配置され各ウェルから蛍光を測定できるように、プレートを複数の読取位置の間で移動させる。そのため、既知の蛍光物質の標準溶液を用いて、システムが正確に作動し、すべてのウェルからの信号が同じように測定されていることを頻繁に確認する必要がある。
【０００６】
近年、Ｌｅｅｄｓｅｅｋｅｒ（商標、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）やＶｉｅｗｌｕｘ（商標、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（米国マサチューセッツ州））のようなＣＣＤ式イメージングシステムがＨＴＳに用いられるようになってきた。全プレートで同時に画像処理できるので、アッセイ時間が大幅に短縮され、スループットが向上するからである。ＩＮＣｅｌｌ（商標）１０００及び３０００セルアナライザー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）は、細胞下レベルでのハイスループット細胞スクリーニング用の一体型自動化画像収集・分析装置である。これらについても、装置を較正して、装置が再現性をもって正確に動作していることを確認するための頻繁なチェックが必要である。
【０００７】
そこで、蛍光標準の定期的測定によって蛍光定量装置を較正する必要が依然存在する。かかる標準は、試験間又は研究所間での実質的にバラツキのない適切に特性化された信号源に基づく。
【０００８】
当技術分野では、この目的を達成するための数多くの方法が存在する。例えば、Ｍｏｄｅｌ及びＢｕｒｋｈａｒｄｔ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ２００１，  ４４，  ３０９−３１６）は、フルオレセイン保存液と顕微鏡スライドを用いて、参照標準の蛍光画像に対して蛍光画像を規格化する方法について報告している。しかし、この方法はマイクロウェルプレートの使用及びＨＴＳには容易に応用できない。
【０００９】
米国特許第６３４８９６５号には、マイクロプレートの蛍光・吸収リーダーを較正するためのソリッドステートデバイスが記載されている。この米国特許に記載された発明は、マイクロプレートのウェルに適合するように形作られた一連の光学ガラスプローブを蛍光材料でコーティングしたものからなる。従って、所定濃度の蛍光発生化合物でコーティングした適当なプローブを、ユーザーがマイクロプレートの特定のウェルに手動で配置する必要がある。こうした作業は時間がかかり、誤差を生じ易い。さらに、プローブを継続して取り扱ううちに、蛍光コーティングが摩耗して、蛍光信号の減衰を生じかねない。
【００１０】
米国特許出願公開第２００２／００４８８１７号には、蛍光装置を較正するための、粘度可変ポリマーと染料からなる標準が記載されている。この標準は広範な各種の染料を溶解して、マイクロウェルプレートに分配し、ゲルに変換すると、装置の較正に用いることができる。この方法でも、手動又は機械的に溶液を準備し、マイクロウェルプレートに分配する作業が必要とされる。
【００１１】
米国特許出願公開第２００３／００１２７０２号には、蛍光光度計の妥当性を検査するための蛍光検証マイクロプレートが開示されている。励起波長及び発光波長が既知のフルオロフォアをマイクロプレートのウェルに装着又は配置する。フルオロフォアは、フィルム表面の、剛性スライド上にコーティングもしくは塗工された或いはポリマーマトリックス中に埋め込まれた有機物質又は無機物質であり、プレートのウェル又は溝に挿入される。かかるプレートの調製は、フルオロフォアがウェル又は溝に均等に嵌合していることの確認に時間がかかる。
【００１２】
蛍光定量装置の較正用の製品は幾つか市販されている。最も単純な形態なものとして、Ｖａｒｉａｎ社（Ｍｅｓａ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（米国カリフォルニア州）から、蛍光定量装置と共に使用されるポリマーブロック中の蛍光基準物質からなる蛍光参照セット（ｒｅｆ．  ６６  １００  １０３  ００）が市販されている。Ｓｔａｒｎａ社（Ｏｐｔｉｇｌａｓｓ社（英国エセックス））は、炭化水素ブロック中の安定な蛍光物質からなる同様の「参照セット」（ｒｅｆ．６ＢＦ）を販売している。こうした材料は、ＰＭＴ蛍光光度計やＣＣＤ式イメージングシステムの較正に直ちに役立つわけではない。
【００１３】
ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（英国バッキンガムシャー）からは、蛍光測定に使用できる「較正マイクロプレート」（ｒｅｆ．  ＣＬＳ９６Ｍ）が販売されている。このマイクロプレートはＬＥＤ／ソリッドステート技術に基づいて１２個のウェルで５００〜５２０ｎｍ域で再現性の良い光信号を発生する。信号を発生できるウェルが１２個しかないので、この較正マイクロプレートは、ＣＣＤ式イメージングシステム用の参照標準としては余り実用性がない。
【００１４】
Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（米国ノースカロライナ州）から市販のＱＣ  Ｐａｋ（商標）マイクロウェルプレートは、ＰＭＴ式及びＣＣＤ式イメージングシステムのいずれにも適している。ＱＣ  Ｐａｋ（商標）製品は、陽極酸化アルミニウムの９６マイクロウェルプレート内のスチレンマトリックス中に埋め込まれた有機フルオロフォア（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン）からなる。プレートはすぐに使用できる状態にあり、濃度の種々異なる各種のフルオロフォアを含むので、波長と強度の較正がいずれも可能である。しかし、製造プロセスのため、製品にはコストの点及び有機溶媒に溶解する染料しか利用できないという点で幾つかの制約が生じる。
【００１５】
Ｍａｔｅｃｈ（商標）（Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（英国バッキンガムシャー））はマルチウェルプレートの形態の蛍光参照標準（「ＦＲＳ」）を提供している。これらのプレートのウェルの多くは濃度の異なる一連の無機標準を含んでおり、無機標準は放射性で、特定の光源での照射時に特定の波長及び強度で蛍光信号を発生する。無機標準は放射能性であるので、これらのプレートの取扱い及び使用にはある種の安全規制を課す必要がある。さらに、参照標準の数は市販の「無機標準」に制限される。
【特許文献１】米国特許第６３４８９６５号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００４８８１７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／００１２７０２号
【非特許文献１】Ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ２００１，  ４４，  ３０９−３１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
そこで、蛍光装置の較正に単純なダイオード／ＰＭＴモダリティ又はマルチＣＣＤ画像処理モダリティのいずれかで使用できるコストパフォーマンスの高い参照プレートに対するニーズが存在する。本発明は、従来技術の装置の上述の問題点の多くに取り組んだもので、プレートの位置合わせ、蛍光波長、強度及び寿命の較正に使用できるマルチモダリティ蛍光プレートを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第一の態様では、１以上のウェルを備えるマルチモダリティ蛍光参照プレートであって、各ウェルがベースを有し、１以上のウェルのベースが蛍光発生化合物のコーティングを含む参照プレートを提供される。「ウェル」という用語は、そのベースによって画成される離散した領域であって所定容量の被検試料の保持に使用することができるものをいう。例えば、ウェルはそのベースの表面に液体試料を保持できる二次元のものであってもよい。好ましくは、ウェルは三次元のもので１以上の壁部を含む。
【００１８】
好ましくは、コーティングはインクジェット印刷でベースに塗工される。他の標識法に対するインクジェット印刷の利点は、該プロセスは低コストでありながら精度が極めて高いので、コスト及び精度である。例えば、蛍光発生化合物を含有する一連の離散粒子をベース表面に正確に印刷することができ、表面に連続コーティングを形成する。
【００１９】
好適には、コーティングはスクリーン印刷でベースに塗工される。
【００２０】
好適には、ベースは印刷用紙又は印刷用カードを含んでなる。好ましくは、印刷用紙又は印刷用カードは金属膜を備える。典型的には、金属膜は、アルミニウム、スズ、銀及び金からなる群から選択される。最も好ましくは、金属膜はアルミニウムを含む。
【００２１】
好ましくは、印刷用紙又は印刷用カードはさらにポリマーコーティングを備える。さらに好ましくは、ポリマーコーティングは有機ポリマーからなる。
【００２２】
適当な印刷用紙としては、例えば、Ｓｅｎｓｉｔｉｓｅｒｓ  Ｇｒｏｕｐ社（Ｓｅｎｓｉｔｉｓｅｒｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（英国コーンウォール））から商品参照番号Ｆ１０２ＣＭＥＴとして市販されている「Ｓｉｌｖｅｒ  Ｇｌｏｓｓｙ  Ｆｉｌｍ」がある。
【００２３】
好適には、ベースは有機ポリマーを含んでなる。好ましくは、有機ポリマーは、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）及びナイロンからなる群から選択される。
【００２４】
好適には、ベースは金属を含んでなる。好ましくは、金属はアルミニウム又はステンレス鋼からなる。
【００２５】
好適には、参照プレートは、ベースの第二の表面に固定された支持体をさらに含む。支持体は、例えばゴムシートからなる。支持体の第二の表面に底層部を固定してもよい。底層部は、金属、プラスチック又は紙材料の固体シートからなるものでよく、接着剤によって支持体に固定し得る。
【００２６】
好適には、蛍光発生化合物は安定な非放射性原子からなる。非放射性原子を使用すると、プレート使用時の作業員の安全、取扱い及び輸送面での制約が回避される。
【００２７】
好適には、蛍光発生化合物は不安定な放射性同位体を含む。典型例は１４Ｃや３Ｈのようなβ粒子を放出する同位体である。同位体は、ＰＰＯやＰＯＰＯＰのような当技術分野で周知のシンチレーション液中又は蛍光体の存在下で利用される。適当な蛍光体は、米国特許第６５２４７８６号及び国際公開第９９／０９４１５号に記載されているようなユーロピウムの有機キレート又はユーロピウムをドープした無機ホスト物質である。当技術分野で周知の市販標品（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡｍｐｌｉｆｙ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｉｃ試薬）に用いられているような水溶性シンチラントも使用できる。
【００２８】
好ましくは、蛍光発生化合物はフルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５Ｂ、Ｃｙ７、ＣｙｐＨｅｒ、クマリン、ＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ染料、ＤＲＡＱ５、アクリドン、キナクリドン、ランタニドキレート、ルテニウム錯体、タートラジン、緑色蛍光タンパク質（ＧＥＰ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン及びフィコエリトリンからなる群から選択される。アクリドン及びキナクリドン系蛍光発生化合物は、それぞれ国際特許出願第ＧＢ０２／０２５０９号（国際公開第０２／０９９４２４号）及び同第ＧＢ０２／０２５３７号（国際公開第０２／０９９４３２号）に記載されている。典型的なランタニドキレートには、ユーロピウム、テルビウム、サマリウム及びジスプロジウムがある。
【００２９】
蛍光発生化合物をまず水性又は有機溶媒に溶解又は懸濁して、ベースシートに印刷するため通常のインクジェットプリンターカートリッジに移す。
【００３０】
好適には、プレートにおけるウェルの数は、１、６、１２、２４、４８、９６、３８４及び１５３６個からなる群から選択される。好ましくは、マイクロウェルプレートは、９６、３８４又は１５３６個のウェルからなる。
【００３１】
なお、本発明の参照プレートは上述の通り「トップ」リーダーシステムで上から読み取ることもできるし、反転して又は「ボトム」読取装置（例えばＩｍａｇｅｔｒａｋ／Ｚｅｉｓｓリーダー）によって下から読み取ることもできる。
【００３２】
本発明の第二の態様では、上述の参照プレートを定常状態蛍光、時間分解蛍光、蛍光寿命及び／又は蛍光偏光の測定用機器の較正に使用する方法が提供される。ここで、較正という用語は、蛍光信号の波長、蛍光信号の強度、蛍光信号の寿命又は持続時間及び／又はマイクロウェルプレートの位置合わせに関する。機器の較正に、機器の妥当性検査、品質管理、機器性能の測定及びトラブルシューティングを始めとする一連の仕事が必要とされることは明らかであろう。位置合わせは、最大蛍光強度が観察される位置までリーダーに対してプレートを移動させることによってチェックできる。本発明の参照プレートがデータ規格化、データ補正及び／又は画像補正にも使用できることは明らかであろう。
【００３３】
好適には、機器はプレートリーダー及びイメージングシステムからなる群から選択される。適当なプレートリーダー装置には、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）及びＦａｒｃｙｔｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）がある。好ましくは、機器はイメージングシステムである。最も好ましくは、機器はＬｅｅｄｓｅｅｋｅｒ（商標）又はＶｉｅｗｌｕｘ（商標）イメージングシステムである。
【００３４】
本発明の第三の態様では、マルチモダリティ蛍光参照プレートの製造方法であって、
ｉ）ベースシートの第一の表面に蛍光発生化合物をインクジェット印刷又はスクリーン印刷する段階、及び
ii）上記ベースシートを１以上のウェルを備えるプレートの第一の表面に固定してそれらの間を封止する段階
を含んでなる方法が提供される。
【００３５】
好ましくは、プレートのウェルに液体を分配する場合には、封止は水密シールである。
【００３６】
本方法は、適宜、ベースシートの第二の表面に支持体を固定してベースシートを補強する段階をさらに含む。好ましくは、支持体は、二つの平坦面を有し、一方の平坦面はベースシートに接し、他方はマイクロウェルプレート用の設置面とする。適宜、支持体の第二の表面に底層部シートを固定して、参照プレート用の設置面としてもよい。
【００３７】
好ましくは、ベースシートは印刷用紙又は印刷用カードを含んでなる。好ましくは、印刷用紙又は印刷用カードは、銀、アルミニウム、スズ又は金からなる群から選択される金属膜を備える。最も好ましくは、金属膜はアルミニウムを含む。
【００３８】
好ましくは、印刷用紙又は印刷用カードはさらにポリマーコーティングを備える。さらに好ましくは、ポリマーコーティングは有機ポリマーからなる。
【００３９】
好適には、ベースシートは有機ポリマーを含んでなる。好ましくは、有機ポリマーは、ポリエチレン、ポリスチレン及びポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）からなる群から選択される。
【００４０】
好適には、ベースは金属を含んでなる。好ましくは、金属はアルミニウム又はステンレス鋼からなる。
【００４１】
好適には、蛍光発生化合物をまず水性又は有機溶媒に溶解又は懸濁して、ベースシートに印刷するため通常のインクジェットプリンターカートリッジに移す。
【００４２】
好適には、蛍光発生化合物はフルオレセイン、ローダミン、ウンベリフェロン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５Ｂ、Ｃｙ７、ＣｙｐＨｅｒ、クマリン、ＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ染料、ＤＲＡＱ５、アクリドン、キナクリドン、ランタニドキレート、ルテニウム錯体、タートラジン、緑色蛍光タンパク質（ＧＥＰ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン及びフィコエリトリンからなる群から選択される。典型的なランタニドキレートには、ユーロピウム、テルビウム、サマリウム及びジスプロジウムがある。
【００４３】
好適には、蛍光発生化合物は安定な非放射性原子からなる。
【００４４】
好適には、蛍光発生化合物は不安定な放射性同位体を含む。典型例は１４Ｃや３Ｈのようなβ粒子を放出する同位体である。同位体は、ＰＰＯやＰＯＰＯＰのような当技術分野で周知のシンチレーション液中又は蛍光体の存在下で利用される。適当な蛍光体としては、米国特許第６５２４７８６号及び国際公開第９９／０９４１５号に記載されているようなユーロピウムの有機キレート又はユーロピウムをドープした無機ホスト物質がある。当技術分野で周知の市販標品（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡｍｐｌｉｆｙ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｉｃ試薬）に用いられているような水溶性シンチラントも使用できる。
【００４５】
好適には、プレートにおけるウェルの数は、１、６、１２、２４、４８、９６、３８４及び１５３６個からなる群から選択される。好ましくは、マイクロウェルプレートは、９６、３８４又は１５３６個のウェルからなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
図１ａ及びｂは、ベースシート（１０）の第一の表面に１種以上の蛍光発生化合物をインクジェット印刷する様子を示す概略図である。図１ａに示す具体例において、ベースシート（１０）は、紙（１５）の第一の表面をアルミニウム膜（１３）で被覆してなる印刷用紙からなる。後段での印刷を容易にするためアルミニウム膜（１３）は適宜ポリマーコーティング（図示せず）で被覆してもよい。適当な印刷用紙としては、例えば、Ｓｅｎｓｉｔｉｓｅｒｓ  Ｇｒｏｕｐ社から市販されている「Ｓｉｌｖｅｒｙ  Ｇｌｏｓｓｙ  Ｆｉｌｍ」（ｒｅｆ．  Ｆ０１２ＣＭＥＴ）が挙げられる。蛍光発生化合物を適当な水性溶媒に溶解し、得られた溶液を標準的インクジェットカートリッジ（例えば、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ（ＨＰと略す。）製５１６４１０Ａ又はキャノン製ＢＣｌ−２１）に注入する。図１ａで、蛍光発生化合物（２２）を含む溶液は、インクジェットプリンターノズル（２０）からアルミニウム膜（１３）の表面に印刷される。別の実施形態では、ベースシート（１０）は、直接印刷できるようにプラスチックポリマーからなるものであってもよい。
【００４７】
図１ｂは、斜線で示すように、ベースプレート（１０）のアルミニウム膜（１３）の表面に印刷した蛍光発生化合物１２のコーティング（斜線で示す。）を示す。インクジェット印刷では、ベースプレート（１０）の特定の領域が印刷されるように正確に制御できる。そうすると、最終的に蛍光光度計で読み取られるプレートの領域だけを蛍光発生化合物で処理することができる。例えば、各ウェルのベース部だけが蛍光材料を含む溶液でコーティングされるように印刷を制御することができ、材料及び時間コストを削減できる。
【００４８】
蛍光発生化合物のインクジェット印刷は公知であり、例えば米国特許第６４０２９８６号には、製品の識別及び検証を補助するため、標準的なＨＰ製カートリッジを用いて、ユーロピウム誘導体の水溶液をインクジェット印刷する方法が開示されている。米国特許出願公開第２００２／００４７８８４号には、インクジェット印刷で物品に塗工できる蛍光発生化合物の混合物を含む特定のインク成分の使用が開示されいる。ただし、上述の従来例のいずれにおいても、染料は、製品の標識又は識別のため、定量的ではなく定性的に用いられている。
【００４９】
図２ａ〜ｃは、プレート（１３０）にベースシート（１１０）を固定するプロセスを示す。図２ａでは、プレート（１３０）は側壁（１３３）を有するブロックからなり、複数のウェル（１３５）がプレートを貫通している。この実施例では、ブロックに３８４個のウェルが存在するが、他の実施例では２４、４８、９６、１５３６個のようにすることも同様に可能である。典型的にはブロックは黒色ポリスチレンからなるが、その他のプラスチック及び金属（アルミニウム等）を始めとする他の材料を用いることもできる。
【００５０】
図２ｂは、蛍光発生化合物１１２をコーティングした図１ｂのベースシート（１１０）を、プレート（１３０）に固定すべき配置で示す。接合又は固定プロセス（矢印Ａ）は、ベースシート（１１０）とプレート（１３０）が確実に封止されるように、接着又は溶接法などの当技術分野で周知の方法で達成できる。プレートで液体試料を取り扱う場合には、封止部は水密性としてもよい。蛍光発生化合物をベースシートの特定の領域だけに塗工する場合、シートの蛍光材料がコーティングされた領域の上だけにウェルが配置されていなければならないので、プレートとベースシートの位置合わせ精度が重要であることは明らかである。
【００５１】
固定プロセス（図２ｃ）でプレート（１３０）にベースシート（１１０）を接合したら、マイクロウェルプレート（１４０）はいつでも使用できる状態にある。図に示す通り、確実な封止を為し遂げるため、ベースシート（１１０）はプレート（１３０）よりも幅と長さが大きい。ただし、ベースシート（１１０）がウェルの面積よりも広ければ妥当な封止を得ることができ、必ずしもプレートの面積よりも大きくする必要はない。このよう場合、ベースシートがマイクロウェルプレート（１４０）の「設置面積」内に収まって、側壁（１３３）内にはめ込まれるようにされる。液体アッセイ溶液又は試料をプレート（１４０）のウェル（１３５）に分配されるような状況下では、水密接合部を得ることが必須となる。アッセイ溶液の典型的容積は１μｌ〜１ｍｌである。
【００５２】
図２ａ〜ｃには示していないが、補強のため追加の支持体をベースシートの第二の表面に隣接して配置してもよい。
【００５３】
図３ａ〜ｃは、ベースシート（２１０）の面積がウェル（２３５）の全面積よりもほんのわずか広い場合に、ベースシート（２１０）をプレート（２３０）に固定するプロセスを示す。図３ａは、プレート（２３０）の下からの概略斜視図であり、プレート（２３０）はプレートを貫通した複数のウェル（２３５）を有している。
【００５４】
図３ｂに示すように、ベースシート（２１０）は、紙シート（２１５）の上面にアルミニウム膜（２１３）を有する。この斜視図には示していないが、アルミニウム膜（２１３）の露出面には蛍光発生化合物がコーティングされている（図１で説明した通り。）。このコート面を矢印Ａで示すようにプレート（２３０）の底面に固定又は接合して、それらの接触面を封止する。固定プロセスは、溶接や接着のような周知の従来技術を用いて達成できる。
【００５５】
図３ｃに得られたマイクロウェルプレート（２４０）を示すが、ベースシート（２１０）は、シートの蛍光コート面がウェル（図示せず）の底部となるようにプレート（２３０）に固定されている。図から明らかなように、ベースプレートの表面積はプレート内のウェルの表面積よりもほんのわずか広いだけなので、ベースシートはマイクロウェルプレート（２４０）の「設置面積」内に収まる。
【００５６】
図３ａ〜ｃには示していないが、ベースシート（２１０）を補強するため、追加の支持パネル（例えばポリエチレン製又はゴム製のもの）を適宜ベースシートの未処理の露出面に接合してもよい。
【００５７】
図４ａ〜ｅの分解図は、ベースシート（３１０）と金属底層（３６０）シートの間にゴム支持体（３５０）を挿入し、ベースシートをプレート（３３０）内の位置に固定した本発明の別の実施形態を例示する。そこで、蛍光発生化合物（３１０）でコーティングしておいた図４ｂのベースシート（３１０）をまず図４ａのプレート（３３０）内に矢印Ａで示すように下から挿入して配置する。次いで、矢印Ｂ及びＣで示すように、支持体（３５０，図４ｃ）及び底層シート（３６０，図４ｄ）を挿入することによって、ベースシート（３１０）を所定位置に固定する。底層シート（３６０）は、プレート（３３０）内の位置に「スナップフィット」する寸法のものでもよいし、接着剤のような適当な接着剤でプレート（３３０）又は支持体（３５０）に固定してもよい。得られたマイクロウェル参照プレート（３４０）を図４ｅに示す。
【００５８】
図５ａ〜ｄの分解図は、ＩＮＣｅｌｌ（商標）１０００又は３０００装置その他この機器に使用することができる本発明の別の実施形態を示す。
【００５９】
印刷していないシート箔（４１３）を矢印Ａで示すようにトッププレート（４３０）の底に取り付ける。透明ベース（４１０）、例えば蛍光発生物質を印刷しておいた上方透明材料（その全面（符号４１２で示す。）に印刷したもの或いはトッププレート（４３０）内のウェル（４３５）の数及び領域に合致する所要の数の円／四角部の形態で印刷したもの）を矢印Ｂで示すように箔（４２３）に接合する。蛍光発生物質の印刷は箔の下側の透明材料の上面で行われる。得られるマイクロウェルプレート（４４０）は矢印Ｃで示すように下側から読み取られる。
【００６０】
図６ａ〜ｃの分解図は、下方読取式参照プレートに使用できる本発明の別の実施形態を示す。箔（５１３）をトッププレート（５３０）の下面に取り付け（矢印Ａ）、箔の底面（図示せず）を蛍光発生物質（５１２）でその全面又はトッププレート（５３０）内のウェル（５３５）の数に対応した数のスポットをコートする。得られるマイクロウェルプレート（５４０）は矢印Ｂで示すように下側から読み取ることができる。
【実施例】
【００６１】
本発明に従って製造した参照プレートで得られた典型的な蛍光の結果を表１に示す。蛍光色素Ｃｙ３を濃度が１０μＭとなるように水溶性印刷インク基剤（Ｃｏａｔｅｓ  Ｂｒｏｔｈｅｒｓ社（英国バース））に溶解した。この溶液をキャノン製ＢＣｌ−２１インクジェットカートリッジに注入し、これを標準的なキャノン製Ｓ１００プリンターに装着した。インクジェット印刷によってＣｙ３の均一なコーティングを「Ｓｉｌｖｅｒｙ  Ｇｌｏｓｓｙ  Ｆｉｌｍ」からなるベースシートに塗工し、３８４ウェルの参照プレートを上述の図３ａ〜ｃで説明したように構成した。３８４個のウェルすべてについて、Ｌｅａｄｓｅｅｋｅｒ（商標）イメージングシステムで、波長５５８ｎｍの励起光を用いて蛍光強度の測定値を得た。平均蛍光強度を表１に示す。表から明らかな通り、得られた変動係数は極めて低く、本発明の印刷プロセスの正確性及び精度並びに得られた蛍光信号の一様性が明らかである。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
表２に、上述のＬｅａｄｓｅｅｋｅｒ（商標）イメージングシステムを用いて本発明の参照プレートで得られた典型的な結果をさらに例示する。本例では、Ｃｙ３Ｂ、ユーロピウムキレート及びＣｙ２の３種類の異なる染料でコートしたプレートでデータを得た。ここでも、変動係数が低いことから、本発明の印刷プロセスの正確性及び精度並びに信号の一様性が明らかである。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
プレートリーダーを用いて得られた代表的データを表３に示す。ここでは、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）及びＦａｒｃｙｔｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）装置とＣｙ３Ｂ染料を用いた。結果は、機器ソフトウェアで標準プロトコルを作り出すことによって得た。ゲイン、焦点高さなどは機器及び付属ソフトウェアで作り出した。
【００６６】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１ａ及びｂは、ベースシートの表面に蛍光発生化合物をインクジェット印刷する様子を示す概略図である。
【図２】図２ａ〜ｃは、複数のマイクロウェルを有するプレートにベースシートを固定する様子を示す。
【図３】図３ａ〜ｃは、ベースシートの表面積が小さい点を除けば、図２ａ〜ｃと同様のプロセスを示す。
【図４】図４ａ〜ｅは、本発明の一実施形態の部品の分解図である。
【図５】図５ａ〜ｄは、下方から読取りを行う本発明の別の実施形態の部品の分解図である。
【図６】図６ａ〜ｃは、本発明の別の「下方読取」式実施形態を示す。
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【国際調査報告】
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