(57)【要約】チモモナス組込み体は、ペントースをエタノールに発酵する能力を有する。ペントース発酵酵素をコードするオペロンは、相同組換えおよび転位という２つの組込み事象により、チモモナスゲノムに組込まる。各オペロンは、１つ以上のペントース還元酵素をコードする配列を含む。ある実施態様での該組込み体は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする酵素配列を含む。チモモナス組込み体は、非常に安定であり、８０〜１６０世代間でペントース発酵酵素を産生する能力を保持している。該組込み体について、培地１Ｌ当り８〜１６ｇのアセテートが存在しても充分なエタノール産生が証明されたことから、該組込み体は、アセテート阻害に対して耐性でもある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペントース糖からエタノールを産生するための、遺伝的に改変したチモモナス組込み体の使用方法であって、
１以上のペントース糖発酵酵素をコードする配列を含むチモモナス組込み体を調製し、該ペントース発酵酵素が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼからなる工程、
該組込み体チモモナスを、適切な発酵条件下で、ペントースを含む工業原料に加える工程、
ペントース糖を発酵してエタノールを含む組成物を提供する工程を含み、
該ペントース発酵酵素をコードする該配列が、第１の組込み事象および第２の組込み事象によって、該組込みチモモナス内に組み込まれる方法。
【請求項２】
前記第１組込み事象が転位であり、前記第２組込み事象が相同組換えである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１組込み事象が、１以上のペントース発酵酵素をコードする配列を含む第１オペロンの転位組込みからなる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１オペロンが、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする配列を含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第１オペロンが、さらにＰｅｎｏｔａｌｔｋｔまたはＰｇａｐｔａｌｔｋｔを含むように定義される請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記第２組込み事象が、１以上のペントース−発酵酵素をコードする配列を含む、第２オペロンとの相同組換えからなる請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記第２オペロンが、さらにＰｇａｐｘｙｌＡＢを含むとして定義される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第２オペロンが、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする配列を含む請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記チモモナス組込み体が、ＡＴＣＣ３１８２１−５Ｃ  Ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｙｌＡＢである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記チモモナス組込み体が、ＡＴＣＣ３１８２１−５Ｃ  Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｙｌＡＢである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記第１組込み事象が相同組換え事象、前記第２組込み事象が転位事象からなる請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ペントース含有工業原料をエタノールに発酵することができるチモモナス組込み体を調製するための方法であって、
ナイーブなチモモナス株に対して第１組込み事象を実施し、ペントース−発酵酵素をコードする配列を含む第１オペロンを組み込み、部分的チモモナス組込み体を提供する工程、
該部分的チモモナス組込み体に対して第２組込み事象を実施し、第１オペロンの酵素以外の、１以上のペントース−発酵酵素をコードする配列を含む第２オペロンを組み込み、ペントース含有工業原料をエタノールに発酵することができるチモモナス組込み体を提供する工程を含む方法。
【請求項１３】
前記チモモナス組込み体が、少なくとも４つのペントース糖発酵酵素をコードする配列を含み、該ペントース発酵酵素が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼからなる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記第１オペロンが、さらにＰｇａｐｘｙｌＡＢを含むとして定義される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記第２オペロンが、さらにＰｅｎｏｔａｌｔｋｔまたはＰｇａｐｔａｌｔｋｔを含むとして定義される請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２記載の工程によって調製される、ペントース発酵可能なチモモナス組込み体。
【請求項１７】
前記チモモナス組込み体が、ＡＴＣＣ３１８２１−５Ｃ  Ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｙｌＡＢである請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記チモモナス組込み体が、ＡＴＣＣ３１８２１−５Ｃ  Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｙｌＡＢである請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
リットル培地あたり８グラムのアセテート／酢酸の存在下で、増殖可能なチモモナス組込み体。
【請求項２０】
請求項１６記載のチモモナス組込み体を含む、ペントース発酵のための生体触媒。
【請求項２１】
染色体上またはネイティブなプラスミド上に組込まれた、１以上のペントース−発酵酵素をコードする配列からなる、ペントースをエタノールに発酵可能なチモモナス組込み体であって、該組込み体が、少なくとも８０世代安定である、チモモナス組込み体。
【請求項２２】
さらに、アセテートの存在下で、ペントース糖をエタノールに発酵可能であると定義される請求項２１記載のチモモナス組込み体。
【請求項２３】
さらに、リットル培地あたり、８グラムのアセテート／酢酸の存在下で、ペントース糖を発酵可能であると定義される請求項２２記載のチモモナス組込み体。
【請求項２４】
マンノース−発酵酵素をコードする配列をさらに含む請求項２１記載のチモモナス組込み体。
【請求項２５】
Ｚ．モビリス  ８ｂと定義されるチモモナス組込み体。
【請求項２６】
Ｚ．モビリス  ２０３２と定義されるチモモナス組込み体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース基質の、燃料および化学物質への生物学的変換、とくにキシロース、アラビノースおよびマンノースを発酵する、またはこれらすべてをエタノールに発酵する、組換え体チモモナス  モビリス（Zymomonas mobilis）株に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２０００年５月１日に出願した米国特許出願番号第０９／５６５，２３３号の一部継続出願である。本出願は、２００１年４月６日に出願したＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＵＳ０１／１１３３４号に関連するものであり、米国番号第０９／５６５，２３３号の優先権を主張している。
［発明起源］
米国政府は、米国エネルギー省と、ミッドウエスト  リサーチ  インスティチュート（Midwest Researh Institute）の１部門であるザ  ナショナル  リニューワブル  エナジー  ラボラトリー（the National Renewable Energy Laboratory）との間の、規約ＤＥ−ＡＣ３６−９９Ｇ０１０３３７２に基づき、本発明に対して権利を有する。
［背景技術］
発酵技術は、再生可能バイオマスセルロース基質を、エタノールなどの燃料および化学物質に変換するのに有用である。典型的な基質は、３５〜４５％のセルロース、３０〜４０％のへミセルロース、および１５％のリグニンからなる。加水分解画分はグルコースポリマーを含み、ヘミセルロース画分は主にキシロースを含む。アラビノースは、スイッチガラスガラスおよびとうもろこし繊維などの、バイオマス物質中で見出される重要な発酵可能基質でもある。このように、ペントース糖の発酵における、高い比速度の産物形成および変換効率を達成することは、再生可能基質からの燃料および化学物質の商業的生産において極めて重要である。
【０００３】
Ｚ．モビリス（Z.mobilis）は、嫌気性培地および主としてリグノセルロース加水分解物に関連する阻害化合物を含む培地において、低ｐＨで、迅速かつ効果的に、グルコース基質をエタノールに変換する能力について、広く報告されている。しかしながら、Ｚ．モビリスの使用において明白な不利益は、ペントース糖を発酵しないことである。この不利益を克服するために、先行技術では、キシロースおよびアラビノースの代謝を触媒する外来遺伝子を用いて、グルコースと、キシロースまたはアラビノース、またはその両方との混合物を発酵する組換えＺ．モビリス株に焦点が当てられていた。このような株およびクローニングベクターは、抗生物質耐性マーカーを含む多コピープラスミドの使用に基づいている。
【０００４】
米国特許第５，５１４，５８３号は、外来遺伝子を有する、形質転換されたＺ．モビリスキシロース発酵株（ＣＰ４／ｐＺＢ４およびｐＺＢ５）、およびキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードし、さらに少なくとも１つの該遺伝子の発現を調節するチモモナスによって認識される、少なくとも１つのプロモーター（ＰｇａｐおよびＰｅｎｏ）を含むプラスミドベクター（ｐＺＢ４およびｐＺＢ５）に関する。該微生物は、単独の炭素供給源としてのキシロースで増殖可能であり、約８８％の最大理論的生産率でキシロースをエタノールに発酵可能である。米国特許第５，７１２，１３３号および第５，７２６，０５３号は、とりわけ、アラビノースからエタノールへの発酵能を与える、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼおよびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外来遺伝子を含む、Ｚ．モビリスアラビノース発酵形質転換体（３９６７６／ｐＺＢ  ２０６）に関する。プラスミドベクター（ｐＺＢ  ２０６）、およびグルコースおよびアラビノース含有基質を発酵する形質転換体の使用方法も記載されている。米国特許第５，８４３，７６０号は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−5−リン酸−４−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードし、該遺伝子の少なくとも１つの発現を調節するチモモナスによって認識される少なくとも１つのプロモーターをさらに含む外来遺伝子を含む、Ｚ．モビリスキシロースおよびアラビノース発酵形質転換体（２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１）を開示し、そこで、該微生物は、単独または組み合わせで、炭素供給源として、アラビノースおよび／またはキシロースで増殖可能であり、該アラビノースおよびキシロースをエタノールに発酵可能である。また、プラスミドベクター（ｐＺＢ３０１、ｐＺＢ４０１、ｐＺＢ４０２およびｐＺＢ４０３）とともに形質転換体を使用する方法も記載されている。ハイブリッドプラスミドは、制御条件下で単独培養中に培養した場合、Ｚ．モビリス内で容易に維持され得るが、プラスミド維持のための選択圧力がない状態、すなわち抗生物質の存在下で宿主有機体を増殖する場合、これらはしばしば不安定である。たとえば、前記株中の外来遺伝子は、約４０世代の間、安定な発現が可能である。Ｚ．モビリスが、セルロース同時糖化発酵方法などの、混合培地で他の有機体と競合しなければならない場合、不安定性は悪化する。さらに、抗生物質耐性マーカーは、一般的に、エタノールの大規模生産などの工業適用に対しては望ましくない。したがって、クローン化遺伝子が低い通常のコピー数で保持され、過剰発現しない場合や、ゲノムＤＮＡと同様に安定であるべき場合には、クローン化遺伝子はＺ．モビリスゲノム内に挿入されることが好ましい。
【０００５】
大腸菌において、外来遺伝子のゲノム挿入を引き起こすための古典的な方法に、溶原性状態での、安定に存在可能である特殊化１ファージクローニングベクターの使用が含まれる。または、遺伝子は、大腸菌染色体配列で囲んて相同組換えを介して、または該遺伝子がトランスポゾンの許容部位（permissive sites）でクローン化可能な場合に転位によって、挿入できる。転位は、Ｚ．モビリスで立証されてきたが（Pappas, K. M., et al.（1997）Journal of Applied Microbiology, 82: 329-388）、それは、遺伝的解析用の、ランダムな栄養要求性または抗生物質耐性表現型のミニＭｍまたはＴｎ５多重転位に限られていた。Ｔｎ５誘導体の場合、該挿入は、報告されたところによると、５〜１５世代のみで安定である（Pappas, K. M., et seq. P. 383、図１）。さらに、Ｚ．モビリス中の相同組換えを介した部位特異的挿入は立証されておらず、バクテリオファージは、チモモナスから単離されていない。
【０００６】
トランスポゾンＴｎ５およびＴｎ１０は周知であり、変異導入および種々のグラム陰性細菌内へのクローン化ＤＮＡの挿入のために広く使用されている。Herrero, M., et al.,（1990）（J. Bacteriol. 172: 6557-6567）には、グラム陰性真生細菌の染色体への外来遺伝子のクローニングおよび安定挿入が、２組のプラスミド、（ｉ）Ｔｎ１０およびＴｎ５の転位特性、（ii）特定の化合物に対する耐性、ならびに（iii）Ｒ６ＫベースのプラスミドｐＧＰ７０４の自殺伝達特性（suicide delivery properties）を組み合わせることによってなされることが記載されている。得られた構造は、Ｔｎ１０またはＴｎ５いずれかの逆方向反復配列に、固有のＮｏｔＩまたはＳｆｉＩ部位内部を含む。これらの部位は、２つのさらに特殊化したクローニングプラスミド（ｐＵＣ１８ＮｏｔおよびｐＵＣ１８Ｓｆｉ）の助けにより、ＤＮＡ断片のクローニングに使用される。新しく誘導された構造物は、Ｒ６Ｋ特殊化タンパク質（Ｒ６Ｋおよびそれより誘導されるプラスミドに必要不可欠な複製タンパク質）を産生するドナー宿主株でのみ維持される。ハイブリッドトランスポゾンを含むドナープラスミドは、幅広い宿主範囲の接合伝達機能を提供する染色体に組込まれたＲＰ４とともに、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｓｍ１０（ｌｐｉｒ）などの特殊化ｌｐｒｉ溶原性大腸菌株に形質導入される。ドナープラスミドの、選択した宿主細菌内への伝達は、標的株との接合を介して達成される。伝達された自殺プラスミド（suicide plasmide）から標的内でのレプリコンへの、ハイブリッドトランスポゾンの転位は、該トランスポゾンの外部部位で、プラスミドにコードされたコグネイトトランスポーゼースによって仲介される。トランスポーゼース機能は、標的細胞内で維持されないので、そのような細胞は、さらなる転位ラウンドに対して免疫がある。したがって、同一株内での多重挿入は、明確な選択マーカーの有効性によってのみ限定される。
【０００７】
Herrero, M. et al.,（1990）,（Journal of Bacteriol. 172（11）: 6568-6572）は、Ｔｎ５ＴｃなどのＴｎ５誘導ミニトランスポゾンのコレクションの構築に関する。種々のグラム陰性細菌のゲノムに外来ＤＮＡ断片を挿入するために、Ｔｎ５ＴｃなどのＴｎ誘導ミニトランスポゾンを使用することは可能である。ミニトランスポゾンは、選択マーカーとしてカナマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性、およびＴｎ５の１９塩基対の末端反復配列に挟まれた固有のＮｏｔＩクローニング部位からなる。トランスポゾンは、シス位ではあるが可動性因子に対して外側にＩＳ５０Ｒトランスポーゼースｔｎｐ遺伝子を備えるＰ６Ｋベース自殺伝達プラスミドであって、レシピエントへの接合トランスファーが、ドナーにおけるＲＰ４可動機能によって仲介されるＰ６Ｋベース自殺伝達プラスミド上に局在する。したがって、これらの因子によって産生される挿入物は、一般的に、トランスポーゼース−仲介第二転位、欠失および逆位がないために、より安定である。また、Berg et al.,（1989）の、細菌の転位因子および遺伝工学（Transposable elements and the genetic engineering of bacteria.）p. p. 879-926, D. E. Berg, Mobile DNA, American Society of Microbiology, Washington, DCも参照。安定な挿入は、このように、たとえばＴｎ１０からも誘導される因子により達成できる。Way, J. C. et al.,（1984）（Gene 32: 369-379）。
【０００８】
ミニ−Ｔｎ５Ｔｃの構造、すなわちHerrero，et seq., p. 6569は、挿入変異の挿入のための使用に関して、またはＮｏｔＩ部位で挟まれたＤＮＡ断片のクローニング用のトランスポゾンベクター（まずｐＵＣ１８誘導体ｐＵＣ１８ＮｏｔおよびｐＵＣ１８Ｎｏｔ内へのＤＮＡ断片のクローニングによって単離されたもの）として記載されている。ミニ−Ｔｎ５Ｔｃ因子は、インビトロで、標準の組換えＤＮＡ断片技術を用いて構築される。Maniatis, T., et al.,（1989）Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，N．Y．テトラサイクリン（Ｔｃ）耐性の決定因子は、インターポゾンとしてこれらを含むプラスミドからＥｃｏＲＩ断片として得られる。Fellay, R., et al.（1987）。土壌および水中の細菌のインターポゾン変異導入：グラム陰性細菌のインビトロ挿入変異導入のために設計されたＤＮＡ断片のファミリー（Interposon mutagenesis of soil and water bacteria: a family of DNA fragments designed for in vitro insertion mutagenesis of Gram-negative bacteria.）Gene 52: 147-154。断片は、その後、ｐＵＣ１８Ｓｆｉの単一ＥｃｏＲＩ部位にクローンニングされ、ＳｆｉＩ断片として切り取られ、可動性単位が、伝達プラスミドのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ（部分的）部分としてすべての場合で存在するように、ｐＵＴにおいてＴｎ５  １９塩基対末端の間に挿入される。その得られた因子がミニ−Ｔｎ５Ｔｃである。
【０００９】
Ｔｎ１０ベーストランスポゾンベクター伝達系は、概して、Herrero M. et seq. 172: 6557-6567に記載されている。ファージ１、すなわち誘導体１ＲＰ１６７は、ミニ−Ｔｎ１０Ｋｍ因子を含む５．１ＫｂのＥｃｏＲＩ挿入物を運び、ＩＳ１０Ｒのトランスポーゼース遺伝子は、可動性因子の逆方向反復配列の外側で、ＰＴａｃプロモーターの下流に位置する。その転位の宿主非依存的調節によるトランスポゾン伝達プラスミドを得るために、ＥｃｏＲＩ挿入断片を、ｐＢＯＲ８（プラスミドｐＭＪＲ１５６０からのｌａｃｌｑ遺伝子を含むｐＧＰ７０４の誘導体）とライゲーションする。このプラスミドは、ｐｉｒ遺伝子のＲ６Ｋ特異的ｐタンパク質産物を欠く宿主株中では複製不可能である。ｐＧＰ７０４は、ＲＰ４プラスミドの接合トランスファーオリジン（ｏｒｉＴ配列）を含むので、トランスに可動性（Ｍｏｂ）機能を備える場合、グラム陰性細菌にトランスファーできる。ミニ−Ｔｎ１０の本来のカナマイシン耐性遺伝子の本来の特異的ｐタンパク質産物を含む逆方向反復配列の内部にあるＭｌｕＩ断片は、ＮｏｔＩ部位およびＭｌｕＩアダプターの添加によって適切に改変されたＳｆｉＩ−Ｐｔｔカセット（ｐＬＯＤＰｔｔを産生する）を含む断片で置換される。この構造物は、ミニ−Ｔｎ１０逆方向反復配列の間に固有のＳｆｉＩ、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩクローニングサイトを有する。ｐＬＯＦＰｔｔのＰｔｔ耐性マーカー（Ｐｔｔ’）は、カナマイシン耐性で置換され、プラスミドｐＬＯＦＫｍが作製される。
【００１０】
チモモナス  モビリスの遺伝的操作分野には、エタノール生産におけるペントース糖発酵に必要な遺伝的要素を含む遺伝的に安定な株を作製という困難が続いている。チモモナスをペントース糖利用可能にさせるために必要な遺伝的要素は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードすることである。
【００１１】
以上を考慮すると、キシロースおよびアラビノース、またはその両方などのペントース糖をエタノールに発酵可能な、安定な組換えＺ．モビリス株の構築が必要である。したがって、ペントース糖異化に必要な酵素をコードする安定なゲノム挿入物の作製が必要である。チモモナスなどの商業用に適切な株の存在が必要であり、これは、そのような株は、抗生物質耐性でなく、非選択培地で、少なくとも４０世代またはそれ以上のあいだ安定であることも意味する。商業的に価値のある株は、最大理論的産物生産率の近くで、高い比速度の産物形成を示すのが好ましいに違いない。微生物のエタノール生産の技術分野における、このような欠陥およびその他の欠陥を、本発明は取り組む。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の目的は、ペントース糖の利用および発酵に必要な酵素をコードする外来構造遺伝子を含む、安定なチモモナス組込み体（integrant）の製造方法を提供することである。いくつかの実施様態で、これらの酵素は、ｘｙｌＡＢ、ｔａｌ／ｔｋｔおよびａｒａＢＡＤからなる群より選択される。Ｚ．モビリスゲノムへの構造遺伝子の導入のための少なくとも１つの調節遺伝子も、この構成の他の実施様態に含まれるべきである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、非選択培地（すなわち、抗生物質または抗生物質耐性マーカーのない状態）で、ペントース糖利用に必要な酵素をコードする構造遺伝子を安定に発現できる改良Ｚ．モビリス株を提供することである。
【００１４】
さらに、本発明のその他の目的は、構造遺伝子を安定に発現でき、かつ高い比速度の産物形成および変換効率を提供する、染色体またはネイティブプラスミドで改良された改変Ｚ．モビリス株を提供することである。本発明の安定チモモナス組込み体は、８０〜１６０世代後、安定性を示した。また他の実施様態において、本発明は、セルロース加水分解物反応混合物中での使用に対して、改良生体触媒を提供する。このような生体触媒は、本発明の一部として記載された組換えチモモナスである。
【００１５】
本発明はまた、外来遺伝子を細菌ゲノムへ安定に挿入するのに有用なトランスポゾンを提供する。ある実施様態において、トランスポゾンには、ｘｙｌＡｘｙｌＢ、ａｒａＢＡＤおよびｔａｌ／ｔｋｔからなる群より選択される酵素をコードする構造遺伝子を有する少なくとも１つのオペロン；バクテリアにおける構造遺伝子発現のための少なくとも１つのプロモーター；逆方向挿入配列の対；挿入配列の内部に含まれるオペロン；ならびに挿入配列の外側に位置するトランスポーゼース遺伝子が含まれる。他の局面において、本発明は、バクテリアのチモモナスゲノムを、ペントース発酵酵素コード遺伝子で形質転換することができるプラスミドシャトルベクターを提供する。いくつかの実施様態において、プラスミドシャトルベクターは、ｘｙｌＡｘｙｌＢ、ａｒａＢＡＤおよびｔａｌ／ｔｋｔからなる群より選択される酵素をコードする構造遺伝子を有する少なくとも１つのオペロン、バクテリアにおける構造遺伝子発現のための少なくとも１つのプロモーター、ならびに形質転換されるバクテリアゲノムの遺伝子と相同性を有する少なくとも２つのＤＮＡ断片を含む。また他の実施様態において、本発明は、ペントース糖発酵酵素コード遺伝子を含む、少なくとも２つのオペロンを組込む方法を提供する。例をあげると、これらの２つのオペロンは、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔまたはＰｇａｐｔａｌｔｋｔである。チモモナス  モビリスＡＴＣＣ３１８２１株の複合型制限系（complex restriction system）が、本発明のまた他の実施様態において、安定なペントース発酵株の作製のために使用され得る。他の実施様態において、トランスポゾンおよびシャトルベクターは、ペントース糖含有基質をエタノールに発酵する、改良安定チモモナス  モビリス株の構築に使用される。セルロース誘導ペントース糖を、燃料および化学物質に変換する方法も、非選択培地で発現が安定な遺伝的に改変したチモモナスを使用して提供される。
【００１６】
本発明は、特定の局面において、ペントース糖からエタノールを生産する、遺伝的に改変したチモモナスの使用方法を提供する。
【００１７】
特定の実施様態において、この方法には、少なくとも４つのペントース糖発酵酵素（キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ）をコードする、安定に組み込まれた遺伝子を含む、組込み体チモモナス株を調製し、該組込みが、第１および第２ペントース糖発酵酵素をコードする遺伝子を組み込むための、第１オペロンでの第１の相同組換え工程、および第３および第４ペントース糖発酵酵素をコードする遺伝子を組み込むための、第２オペロンでの第２転位工程からなる少なくとも２つの組込み事象を含む工程、
組込み体チモモナス株を、ペントース糖含有工業原料に加える工程、およびペントース糖を発酵して、エタノール含有組成物を提供する工程が含まれる。
【００１８】
ある実施様態において、ペントース糖には、キシロース、アラビノースまたはこれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施様態において、そのペントース糖は、さらにバイオマスから誘導されるとして記載されうる。本工程の特定の局面は、さらに、チモモナス  モビリス株ＡＴＣＣ３１８２１を使用することとして定義される。本発明の組込みチモモナス  モビリス株は、Ｚ．モビリスＡＴＣＣ３１８２１  Ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｙｌＡＢ組込み体と定義され得る。例として、特定の組込み体は、ｉｎｔ２／３２１、ｉｎｔ２／１８２１、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃８，３２１（５）、４８１，２０３２，２１２２、８ｂおよび３２１−ａと設計される。
【００１９】
ある実施様態において、本発明は、比較的高濃度のアセテートまたは酢酸の存在下で、ペントース糖（キシロース、アラビノース）をエタノールに発酵可能な、チモモナス組込み体およびその誘導体を提供する。例として、本発明は、２、４、８、１０、１２および〜１６ｇ／Ｌの濃度のアセテートまたは酢酸の存在下で、エタノールを効率よく生産する組込み体を提供する。
【００２０】
他の局面において、本発明は、ペントース工業原料をエタノールに発酵可能な組込み体チモモナスを提供する。組込み体の具体例は、ｉｎｔ２／３２１、ｉｎｔ２／１８２１、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃８，３２１（５）、４８１，２０３２，２１２２、８ｂおよび３２１−ａである。
【００２１】
他の実施様態において、マンノース利用遺伝子（ｍａｎＡ）をプラスミドに提供し、該プラスミドを使用してチモモナス  モビリスＡＴＣＣ３１８２１および３９６７６を形質転換し、マンノース−発酵チモモナス株を作製する。同一の形質転換方法は、本発明に記載された組込み体に適用し、バイオマス中のキシロースおよびマンノース、またはキシロース、アラビノースおよびマンノースを発酵可能なチモモナス株を作製する。
【００２２】
また他の実施様態において、マンノース利用遺伝子（ｍａｎＡ）、およびマンノース利用に必要な他の任意の遺伝子を、Ｚ．モビリスＡＴＣＣ３１８２１、３９６７６、これらの誘導体および本明細書に記載する組込み体のゲノム内に組込み、バイオマス中のキシロースおよびマンノース、またはキシロース、アラビノースおよびマンノースを発酵可能なチモモナス株を作製する。
【００２３】
本発明のさらなる利点は、以下の記載にある程度記載され、ある程度その記載により明らかであり、本発明の実施により確認できる。本発明の利点は、添付の請求項で特に指摘した方法によって明らかであり、得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
特に別段の断りのない限り、本明細書において使用されているすべての技術的または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験の際は、本明細書に記載されるものと同類または同等のあらゆる方法および材料を使用し得るが、好ましい方法および材料をここに記載する。すべての米国特許は、引用することによって、本明細書において完全に説明されているかのように組み込まれる。
【００２５】
ペントース利用のための遺伝的に安定なＺ．モビリスＡＴＣＣ３１８２１の構築に関して、相同組換えおよび転位を含む２つの組込み方法が開発された。２つのオペロン、すなわちＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔ（またはＰｇａｐｔａｌｔｋｔ）は、それぞれが単一カセットとして組込まれるように構築された。それぞれのオペロンは、組込み体選択用の抗生物質耐性遺伝子を含むことが好ましい。
【００２６】
相同組換えに関して、株３１８２１のｌｄｈのＰgapｘｙｌＡＢオペロンの組込みは、ｐｇｍおよびａｄｈＩ遺伝子を挟む１ｋｂのｌｄｈ領域を有する相同標的として、４ｋｂのＤＮＡ断片を使用した。この相同ＤＮＡ断片をｌｄｈＬ４と示す。断片ＩｄｈＬ４を、３１８２１のＤＮＡを鋳型として使用し、Ｐｆｕポリメラーゼを使用して、２つのＤＮＡ断片（５’ＩｄｈＬＲおよび３’ｉｄｈＬ４）として増幅し、ベクターｐＺＢ１８６１でのクローニングを介して再構築した。ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ部位をＰＣＲ過程で導入し、その後ＰgapｘｙｌＡＢおよびＴｃrをクローニングした（以下の実施例を参照）。プライマーは、Ｚ．モビリスＣＰ４のＤＮＡ配列に基づいて設計した（Yamano et al（1993）J. Bact. 175: 3926-3933）。
【００２７】
転位に関して、株３１８２１は、宿主細胞へ導入されるメチル化ＤＮＡを分解する制限系を有することが見出された。ドナー宿主としてＥ．ｃｏｌｉ  Ｓｍ１０（λｐｉｒ）を介するＭｉｎｉＴｂ５Ｔｃを用いる転位は成功しなかった。そこで、ＰenoｔａｌｔｋｔまたはＰｇａｐｔａｌｔｋｔオペロンの組込みを、EZ::TNTM Insertion Kit（Epicentre, Wisconsin）を用いて実施し、有効なトランスポーゼース（Ｔｎ５ベース）、および遺伝的に改良された挿入配列（モザイク末端）を運搬するベクター（ｐＭＯＤ）が提供された。キットを用いて、宿主細胞をトランスポーゼース（トランスポーゼース結合ＰenoｔａｌｔｋｔまたはＰｇａｐｔａｌｔｋｔ）で形質転換し、ＤＮＡを、Ｐenoｔａｌｔｋｔを組込んだ、メチル化欠損宿主またはネイティブＺ．モビリスプラスミドから調製した。
【００２８】
以下の記載および実施例は、Ｚ．モビリスのゲノムへの２つのオペロンの組込みに特定されているけれども、本発明の方法は、４つのペントース利用遺伝子のそれぞれを独立して、各遺伝子自身のプロモーターの制御下に組込まれるように改変することができる。さらに、いずれのプロモーターも、該プロモーターが、Ｚ．モビリスにおいてキシロース利用遺伝子の発現を誘導する限り、標的遺伝子の発現のために本発明の内容で使用することができる。
【００２９】
ここで、本発明の現在の好ましい実施態様に関する言及を詳細におこない、その例は添付の図面に示されている。以下に記載した実施例に関して、「プラスミド保持株（plamid-bearing strains）」は、関連技術の記載にて同定された米国特許に記載された株およびベクターを意味するか、関連する。「Ｚ．モビリス  ゲノムまたはゲノムの」とは、全体として、所定のＺ．モビリスで発現する、または潜在的に発現可能なすべての遺伝子を意味する。
【実施例】
【００３０】
株、プラスミドおよび培地
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｃ１１８λ（ｐｉｒ）、ＣＣ１１８（ｐｉｒ）（ｍｉｎｉ−ｔｎ５Ｔｃ）、ＳＭ／０λ（ｐｉｒ）、およびプラスミドｐＵＣ１９、ｐＬＯＦ／Ｋｍ、ｐＵＣ１８ｓｆｉ、ｐＵＴ／Ｔｃ含有ミニトランスポゾンＴｎ５、Ｔｎ１０およびｐＵＣ１８を、Dr. K. Timmis, GBF-Gasellschaft Fur Biotechnologische Forschung mbH, Mascheroder weg 1D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germanyより得た。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（Life Technologies）を、プラスミドの構築用の宿主として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＭ１０λｐｉｒを、接合実験におけるドナー宿主として使用した。Ｚ．モビリス  ＡＴＣＣ３９６７６株およびその誘導体２０６Ｃ（米国特許第５，８４３，７６０号）を、本発明にしたがってレシピエントとして使用した。Ｔｎ１０ベースプラスミドを構築し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＣ１１８中で維持した。Ｚ．モビリスＡＴＣＣ３１８２１宿主またはその誘導体５Ｃ（組込みプラスミドを、３１８２１／ｐＺＢ５からプラスミドを取り除くことによって得たもの）における形質転換の前に、ＪＭ１１０やＤＭ１などのメチル化欠損大腸菌宿主を形質転換するために使用した。大腸菌株を、ＬＢ培地内で、攪拌（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で培養した。別段の言及がない限り、Ｚ．モビリス株は、２０ｇ／Ｌのグルコース、Ｄ−キシロースまたはＬ−アラビノースを補充されたＲＭ（１０ｇ／Ｌ  イーストエクストラクト、２ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4）で、嫌気的に維持した。プラスミドを含むすべての株を、適切な抗生物質、テトラサイクリン（Ｔｃ）（Ｚ．モビリスおよび大腸菌についての液体培地中１０μｇ／ｍｌ、Ｚ．モビリスについての寒天培地中２０μｇ／ｍｌ、ならびに大腸菌についての寒天培地中１５μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（Ａｐ）（大腸菌について１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（Ｃｍ）（Ｚ．モビリスについて１２０μｇ／ｍｌおよび大腸菌について１００μｇ／ｍｌ）の存在下で、増殖させた。Ｚ．モビリス形質転換体またはトランス接合体の作製および選択に関して、テトラサイクリンまたはナリジクス酸（２０μｇ／ｍｌ）を補充された接合プレート（（ＭＭＧまたはＭＭＸ；１０ｇ／Ｌ  イーストエクストラクト、５ｇ／Ｌ  トリプトン、２．５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4および５０ｇ／Ｌ  糖））を使用した。すべての寒天プレートを、１５ｇ／Ｌ  アガーで作製した。
【００３１】
場合によっては、４つすべての遺伝子（ｘｙｌＡ、ｘｙｌＢ、ｔａｌおよびｔｋｔ）を含む組込み体は、キシロース培地で増殖した。組込み体を、ＲＭＧＴｃＣｍからＲＭＸ（１：５０）に移し、３０℃で培養した。ＲＭＸの適応のために、およそ対数増殖ステージに達したときに、キシロース増幅培地を新鮮なＲＸＭに交換した。Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ６０１（Milton Roy）におけるＯＤ６００測定によって、定期的に増殖をモニターした。
【００３２】
プラスミドｐＺＢ７０１を、シャトルベクターｐＺＢ１８８において、ＰｐｄｃｍａｎＡを含むＤＮＡ断片をクローニングすることによって構築した。Ｐｐｄｃ、およびＭａｎＡの構造遺伝子をそれぞれＰＣＲを用いて増幅し、第３ＰＣＲ（オーバーラップエクステンションＰＣＲ）によって混合して、プロモーターＲＢＳおよびＰＤＣ遺伝子の開始コドンを含む５’転写および翻訳調節領域を、ｍａｎＡ構造遺伝子に正確に融合した。
【００３３】
組換え体ＤＮＡ技術
プラスミドＤＮＡの単離、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーションおよび形質転換、アガロース電気泳動法およびその他の組換えＤＮＡ技術を、本技術分野で指定され周知の刊行プロトコールである、Sambrook et al.,（1989）, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory press, Cold Spring Harbor, NYまたは各試薬の取扱説明書にしたがって実施した。Ｚ．モビリスのゲノムＤＮＡを、２５０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−５０ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁された、３ｍｌの一晩培養細胞を用いて抽出した。細胞をリソソームで３７℃で３０分間処理し、ついで１００ｍｌの５％  ＳＤＳ溶液およびＲＮＡａｓｅ（最終濃度＝２０ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらに３０分間インキュベートした。フェノール−クロロホルム抽出を２回行い、タンパク質を除去した。ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿によって回収した。または、Ｚ．モビリスの全ゲノムＤＮＡを、Ｐｕｒｅｇｅｎキット（Gentra System, MN）を用いて抽出した。プラスミドＤＮＡの抽出は、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Qiagen, CA）を用いて行なった。
【００３４】
接合、転位および形質転換
プラスミドを、フィルター接合技術（Conway et al., 1987）での接合によって、ドナー株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＭ１０λｐｉｒまたはＳ１７−１から、Ｚ．モビリス株へ移した。
【００３５】
場合によっては、市販のキット、ＥＺ：：ＴＮTM  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、転位用のトランスポーゼースを作製した。プラスミドｐＭＯＤＰenoｔａｌｔｋｔＣｍを、大して重要でない改変を加えた取り扱いプロトコールにしたがってトランスポーゼースで処理した。インビトロ転位のために、組込みプラスミドを、Ｚ．モビリス３１８２１のネイティブプラスミド（標的ＤＮＡ）の存在下で、３７℃で２時間、トランスポーゼースで処理した。ついで、該反応液を、０．１％  ＳＤＳの存在下で７０℃で１０分間加熱し、Ｚ．モビリス３１８２１での形質転換の前に、５％  グリセロールおよび５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）に透析した。インビボ転位のために、組込みプラスミドを、室温にて１時間トランスポーゼースで処理したのち、エレクトロポレーション（Bio−Rad Gene Pulser、０．１ｃｍギャップキュベット、１．６ｋＶ、２００オーム、２５μＦＤ）を行った。エレクトロコンピテントＺ．モビリスまたは大腸菌細胞を、ＯＤ６００＝０．４〜０．６で細胞を収集することで調製した。細胞を、氷冷滅菌水、続いて１０％  グリセロールで１回洗浄し、およそ１０００倍濃縮した。コンピテント細胞を分取し、−８０℃で保存した。
【００３６】
プラスミドＤＮＡはまた、Zhang et al.,（1995）Science 267: 240-243に記載されているエレクトロポレーションによって、Ｚ．モビリス３９６７６または大腸菌細胞いずれかの形質転換に使用した。
【００３７】
サザンブロット解析
ＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｏｓｉ  Ｂｌｏｔプレッシャーブロッターを用いて、ナイロン膜上に移した。ＤＮＡプローブの、Ｔｃ、ｘｙｌＢ、ＴｎｐおよびＴａｌを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ジゴキシゲニン−ＵＴＰで標識した。以下のプライマーをＤＮＡ標識に使用した。
Ｔｃ：    ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣ−３’（配列番号：１）
５’−ＧＡＡＴＣＣＧＴＴＡＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号：２）
ｘｙｌＢ  ５’−ＴＡＴＧＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＴＧＡＧ−３’（配列番号：３）
５’−ＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＧＡＴＣＣＡＴＡＧＣＣ−３’
（配列番号：４）
Ｔｎｐ    ５’−ＴＣＣＴＡＡＣＡＴＧＧＴＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号：５）
５’−ＣＣＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＡＧＧＧＣ−３’（配列番号：６）
Ｔａｌ：  ５’−ＣＧＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＧＧＴＴＴＣＧＡＴＡ
ＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＡＴＴＧＡＣＣ−３’（配列番号：７）
５‘−ＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＡ
ＴＣＧＣＣＧＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣ−３’（配列番号：８）
【００３８】
プレハイブリダイゼーションよびハイブリダイゼーションを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍハイブリダイゼーションキットに記載された、確立プロトコールにしたがって実施した。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた増幅
遺伝子組込み用の種々の組込みプラスミドの構築のために、以下の断片を、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）およびその適切なプライマーペアーを用いて、ＰＣＲで増幅した。
【００４０】
１．  ５’ＩｄｈＬ４（１．９ｋｂ）
鋳型：Ｚ．モビリス３１８２１ＤＮＡ
プライマー：
ｐ１６（Ｆ）５‘ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＣＴＣＧＣＧＴＡＡＴＡＡ
ＡＡＣＴＡＴＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＧ３’（配列番号：９）  
ｐ１７（Ｒ）５‘ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣ
ＴＣＡＴＡＡＴＡＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＣＡＣＴＣＣＣＧ３’（配列番号：１０）
【００４１】
２．  ３’ＩｄｈＬ４（２．４ｋｂ)
鋳型:Ｚ．モビリス３１８２１ＤＮＡ
プライマー：
ｐ１８（Ｆ）５‘ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＴＧＧＴＧＣＣＡ
ＡＴＧＴＴＡＴＣＧＣＣ３’（配列番号：１１）
ｐ１９（Ｒ）５‘ＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＣＴＴＡＴ
ＡＧＣＡＡＣＧＡＧＴＧＣ３’（配列番号：１２）
【００４２】
３．  Ｔｃｒ（１．５ｋｂ）
鋳型：ｐＢＲ３２２
プライマー：
Ｔｃ（Ｆ）５‘ＡＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＧＣＣ３’（配列番号：１３）
Ｔｃ（Ｒ）５‘ＡＡＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣ３’（配列番号：１４）
【００４３】
４．  Ｃｍr  （１  ｋｂ）
鋳型：ｐＺＢ１８６
プライマー：
Ｃｍ（Ｆ、Ｅａｇ）５‘ＣＣＧＡＡＴＡＡＡＴＡＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＴＧＡＣ
ＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣ３’（配列番号：１５）
Ｃｍ（Ｒ、Ｅａｇ）５‘ＴＡＡＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＡＡＣ
ＣＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＧ３’（配列番号：１６）
【００４４】
相同組換え用のｐＺＢ５１２ＸＴｃおよびｐＺＢ５１０ｘＴｃの構築
ついでＰgapｘｙｌＡＢ（ｐＺＢ４由来）およびＴｃr（ＰＣＲ産物）を、５’ＩｄｈＬ４（１．９ｋｂ）断片および３’ＩｄｈＬ４（２．４ｋｂ）断片の間のＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ部位に挿入することによって、組込みプラスミドｐＺＢ５１０ｘＴｃ（図１９（Ａ）参照）を構築した。ＰgapｘｙｌＡＢの方向を逆にする以外はｐＺＢ５１０ＸＴｃと同様にして、プラスミドｐＺＢ５１２ＸＴｃ（図１９（Ｂ）参照）を構築した。
【００４５】
転位のためのｐＭＯＤＰenoｔａｌｔｋｔ／Ｃｍの構築
ＰＣＲ作製Ｃｍr断片を、ベクターｐＭＯＤ（Epicentre, WI）のＳｍａＩ部位でクローンニングして、ｐＭＯＤＣｍを得た。ついで、ｐＵＣｔａｌｔｋ（Zhang et al（1995）Science 267: 240-243）由来のＢｇｌＩＩ断片を、ＢａｍＨＩ部位でｐＭＯＤＣｍでクローンニングして、ｐＭＯＤＰenoｔａｌｔｋｔＣｍを形成した（図２０参照）。ｐＭＯＤでクローニングした断片は、２つの１９ｂｐモザイク末端（ＩＳ）に挟まれており、転位の際トランスポーゼースに認識される。
【００４６】
相同組換えにより、ｘｙｌＡＢ組込み体を得るためのプラスミド調製
ＲＭＧＴｃＣｍ（３０℃）で増殖した、Ｚ．モビリス５Ｃ／ｐＺＢ５１２ＸＴｃの一晩培養液を、１０回以内の植継ぎの間、３７℃にて５ｍｌ  ＲＭＧチューブで毎日培養した（１：１００）。各植継ぎにおいて、培養液をプレートに塗布し、ＲＭＧおよびＲＭＧＣｍプレート上のコロニー数を比較することによって、プラスミドの消失をモニターした。プラスミド保持細胞の集団が全体の１０％以下の場合、培養液をＲＭＧＴｃ中に接種し（１：１００）、潜在的なＰｇａｐｘｙｌＡＢＴｃ組込み体の増殖を高めた。ＲＭＧＴｃ富化培養液を、ＲＭＧＴｃプレートに塗布し、ＲＭＧＴｃおよびＲＭＧＣｍプレートにレプリカした。ＴｃrＣｍs表現型のコロニーをさらに解析して、組込みを確認した。
【００４７】
酵素アッセイ
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）、キシルロキナーゼ（ＸＫ）、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）およびトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）を、場合によっては、Ｚ．モビリス組込み体および対照株の細胞なしの抽出物を用いて、改変されたZhang et al.,（1995）Science 267: 240-243にしたがって、アッセイした。Ｚ．モビリスの細胞なしの抽出物を、超音波処理緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で１回洗浄したのち、超音波処理した後期対数期の培養液を回収することによって調製した。細胞残渣を、遠心（１４，０００ｒｐｍ、４５分、４℃）によって除去した。
【００４８】
実施例１
以下の実施例は、キシロース同化酵素をコードする遺伝子を含むＭｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃの構築物、およびＺ．モビリス２０６ＣおよびＡＴＣＣ３９６７６への該構築物の接合トランスファーを示すものである。Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢオペロンを、プラスミドｐＧＰ７０４に含まれるＭｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃ固有のＮｏｔＩ部位に挿入することによって、キシロース同化酵素をコードするＭｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃ含有遺伝子を構築した。図１参照。Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢオペロンを、プラスミドｐＺＢ４またはｐＺＢ５（米国特許第５，７１２，１３３号および第５，７２６，０５３号）より得た。Ｍｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃ  ｘｙｌＡｘｙｌＢ（Ｘ４）およびＭｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃ  ｘｙｌＡｘｙｌＢ（Ｘ５）と命名された該プラスミドを、エレクトロポレーションによって、ドナー株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＭ１０λｐｉｒ内に形質転換し、Ｚ．モビリスＡＴＣＣ３９６７６または２０６Ｃ株いずれかと接合した。Ｚ．モビリス２０６Ｃは、言及によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４３，７６０号に開示されている。９つのチモモナスＴｃrトランス接合体を、Ｔｃおよびナリジクス酸含有培地での選択によって、Ｍｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃ  ｘｙｌＡｘｙｌＢ（Ｘ４）およびＭｉｎｉ−Ｔｎ５Ｔｃ  ｘｙｌＡｘｙｌＢ（Ｘ５）を含むＳＭ１０λｐｉｒドナーの両方から得た。図２（ｂ）参照。
【００４９】
ついで、９つのＺ．モビリスＴｃrトランス接合体由来のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを、サザンブロット解析に供した。トランス接合体由来のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡをＳｐｈＩで消化し、ハイブリッドトランスポゾンおよびキシロースオペロンで切断し、ついでブロットを、Ｔｃプローブ、ＸｙｌＢプローブまたはトランスポーゼースＴｎｐプローブいずれかとハイブリッド形成した。オートラジオグラフィーから、（１）キシロースオペロンＰｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢが、Ｔｃr遺伝子とともに、チモモナスゲノムに挿入されたこと；（２）各トランス接合体において、単一挿入のみが起こったこと；（３）各挿入が、ゲノムの認識される位置で起こったこと；（４）Ｔｃr遺伝子およびＸｙｌＢは、プラスミド画分に存在しなかったこと；および（５）ｔｎｐトランスポーゼース遺伝子が、トランス接合体には存在しなかったことが測定された。
【００５０】
チモモナスＴｃr  Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢトランス接合体の酵素解析を、チモモナス  Ｔｃ  Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢトランス接合体におけるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）の発現を確認するために行なった。この解析により、全てのトランス接合体に関するキシロースイソメラーゼの酵素レベルは、それらのプラスミド対照物の約半分のレベルであることがわかった。同様に、プラスミド保持株の約半分のキシルロキナーゼ活性が、組込み体で観察された。チモモナスゲノムにおいて遺伝子の単一コピーから発現したＸＩおよびＸＫの活性はいずれも、プラスミド保持株で観察された１細胞当り１０コピー分の活性と比較して予想したものよりも、かなり高いものであった。
【００５１】
実施例２（Ｃ２５）
本実施例は、４つのペントース発酵遺伝子を発現するチモモナス組込み体を作製するための組込み事象方法の有用性を示すものである。抗生物質選択のない状態で、改良された遺伝的に安定なチモモナス組込み体を、この方法によって作製する。キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードするキシロース同化遺伝子（ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ）、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードするペントースリン酸経路遺伝子（ｔａｌＢおよびｔｋｔＡ）を、ペントース発酵株の作製を実施するために、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５を用いて、Ｚ．モビリスゲノムに導入する必要がある。ＰｇａｐｘｙｌＡ／ｘｙｌＢおよびＰｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡを含む２つのオペロンを、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５において構築し、得られたプラスミドを、Ｚ．モビリスに接合した。ｍｉｎｉ−Ｔｎ５カセットの外側に位置するトランスポーゼースの助けを借りて、Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢおよびＰｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡの単一コピーを、サザンハイブリダイゼーションによって示すように、Ｚ．モビリスゲノムに挿入した。キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素解析によって、全ての遺伝子が同等に発現され、組込まれた株が、プラスミド保持株の酵素活性の約３０〜７０％を産生することが示された。このような酵素レベルは、有機体が増殖するのに、とくにペントース、キシロースをエタノールに発酵するのに充分なものであった。
【００５２】
クローニング方法を促進するために、オペロンＰｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡを含むＢｇｌＩＩ断片を、図３に示すように、新しく構築した補助プラスミドであるｐＵＳＣｆｉＭＣＳのＢａｍＨＩ部位に挿入した。補助プラスミドであるｐＵＳＣｆｉＭＣＳは、ｐＵＳＣＳｆｉに、ｐＵＣ１９由来のマルチクローニング部位を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を挿入することによって構築された。ついで、ＰＵＣｔａｌｔｋｔを、図３に示すように、ｐＵＣｐｆｉＭＣＳおよびｐＵＣｔａｌｔｋｔＳｆｉから構築した。
【００５３】
ここで図２に言及するように、ついでＰｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡを、ｐＵＣｔａｌｔｋｔＳｆｉから、ＳｆｉＩ断片として削り取ったものを使用し、ｍｉｎｉ−ｔｎ５−Ｔｃ−ｘｙｌＡｘｙｌＢにクローニングした。図に示すように、Ｔｃr遺伝子は、Ｔｎ５−Ｔｃ−ｘｙｌＡｘｙｌＢカセットのＳｆｉＩ部位に挟まれる。Ｍｉｎｉ−Ｔｎ５−Ｔｃ−ｘｙｌＡｘｙｌＢは、部分的におよび完全にＳｆｉＩで消化し、図２（ｃ）に示すように、Ｐｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡＳｆｉ断片とライゲーションした。部分的消化によって、Ｔｃr遺伝子を含むプラスミドが作製され、ｍｉｎｉ−ｔｎ５−Ｔｃ  ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢとして命名し（図２（ｃ））、一方で完全消化によって、Ｔｃr遺伝子を含まない本発明のプラスミドが作製され、ｍｉｎｉＴｎ５−ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢと命名された。図２（ｄ）参照。
【００５４】
両方のプラスミドを、ドナー株大腸菌Ｓ１７−１に形質転換し、Ｚ．モビリス２０６Ｃと接合させた。得られたトランス接合体を、ｍｉｎｉＴｎ５−ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ−Ｔｃに関して、グルコース、Ｔｃおよびナリジクス酸を含む接合培地で選択した。ｍｉｎｉ−ｔｎ５−ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢに関しては、トランス接合体を、キシロースおよびナリジクス酸を含む、接合培地で直接選択した。ｍｉｎｉ−ｔｎ５−ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ−Ｔｃについて、多数のＴｃrトランス接合体（グルコース−増殖）を得た。ｍｉｎｉ−ｔｎ５−ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢについて、いくつかのキシロース増殖トランス接合体も得られた。
【００５５】
予備バッチ培地を、その発酵力学に関して、２％キシロースを含む８０ｍｌのＲＭを含むボトルで、ｐＨ制御なしの３０℃で、統計試験を行なった。ＲＭ＋２％キシロースプレートから得たコロニーを、培養が定常増殖期（５００ｎｍでの光学密度600＝０．１）に達するまで、３０℃にて一晩、ＲＭ２％キシロース培地で培養した。これらを、接種物として使用した。キシロースおよびエタノールを、Ｐ１０４７．Ａ屈折率検出器と、６５℃で０．０１Ｎ硫酸移動相０．６ｍｌ／分流速で操作するＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ−８７Ｈ有機酸解析カラムとを備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １０９０Ｌ  ＨＰＬＣを用いて解析した。エタノール生産率を、発酵した糖の重量または培地で利用可能な糖の総量のいずれかを用いて計算した。最大理論的生産率は、０．５１ｇエタノール／ｇキシロースに基づく。
【００５６】
Ｚ．モビリストランス接合体由来のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡ試料のサザンハイブリダイゼーションを、ｍｉｎｉ−ｔｎ５  ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢカセットの転位が起こるかどうか測定するために、実施した。ｍｉｎｉ−ｔｎ５  ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢの４つのトランス接合体から調製した、ゲノムおよびプラスミドＤＮＡを、ＳｐｈＩで消化した。ＳｐｈＩは、カセット内で２回切断し、Ｔａｌプローブと相同性を有する１つの断片を産出する。ついで該ブロットを、ＴａｌプローブまたはＴｎｐプローブのいずれかでハイブリダイゼーションを行なった。図４のオートラジオグラフは、Ｔａｌプローブとハイブリッド形成した際、Ｚ．モビリスＤＮＡに近接する４ｋｂ以上の１つの固有のバンド（Ｐｅｎｏ−ｔａｌＢ／ｔｋｔＡの大きさ）が、全てのゲノムＤＮＡ調製物から検出されたことを示す。試料の３つ（番号２２、２３および２４、おそらく姉妹（siblings））もまた、プラスミド画分で１つのバンドを示したことから、ネイティブプラスミドにおいて、組込みが起こったことが示唆される。組込みは、試料番号２１でＺ．モビリスゲノムで起こり、たった１つコピーが挿入された。これらのトランス接合体由来のゲノムおよびプラスミドＤＮＡの、Ｔｎｐプローブによるハイブリダイゼーション（図５）によって、同一のＤＮＡとＴｎｐプローブ間の相同性の欠如が明らかになった。これらの結果により、Ｔｃr遺伝子とともに、キシロース同化遺伝子およびペントースリン酸経路遺伝子が、Ｚ．モビリスゲノムに転位されたこと、各トランス接合体で単一挿入のみが起こったこと、および挿入がゲノムの認識可能な位置であったことが示唆された。
【００５７】
キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性を、Ｚ．モビリストランス接合体について、以前（Zhang et al., 1995）に記載されたように測定した。前述のとおり、ゲノム上のＰｇａｐ−ｘｙｌＡｘｙｌＢの単一コピーの発現は、プラスミド保持株についてのＸＩおよびＸＫ酵素収率の発現の約半分であることが観察された。しかしながら、図６に示すように、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）が、チモモナス  ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ−Ｔｃおよびｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢトランス接合体中に発現されるかどうか確認するために、酵素解析を実施した際、全てのトランス接合体（番号４、５、１７、１８、２１、２３および２４）で、ＴＡＬの酵素レベルが、そのプラスミド対応物の約５０〜７０％であることが示された。プラスミド保持株の約３０〜７０％のＴＫＴ活性が、組込み体で観察された。プラスミド組込み体が、わずかに上昇したＴＡＬおよびＴＫＴ活性を有する一方で、チモモナスゲノム中の該遺伝子の単一コピーからの発現は、プラスミド保持株で観察された１細胞あたり１０コピー分と比較して予想したものよりも、かなり高かった。
【００５８】
ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢチモモナス組込み体の４つすべて（番号２１、２２、５および１１）は、キシロースで増殖可能であった。ついで、これらの組込み体の予備発酵研究を、３０℃で２％キシロース基質を用いて実施した。これらの組込み体についての発酵特性を、図７に示す。図にて、Ｚ．モビリス組込み体番号２１の増殖率および糖利用率は、プラスミド保持株３９６７６／ｐＺＢ４よりも遅かった。しかしながら、ほとんどのＺ．モビリス組込み体（番号２２、５および１１）は、プラスミド保持株に匹敵するものであった。すべての組込み体が、最大理論的産物生産率の９２％で、キシロースからエタノールを産生した。
【００５９】
これらゲノム組込み株および３つのプラスミド保持株の安定性を、非選択培地で測定した。すべての株を、ＲＭＧ培地で培養し、毎日およそ１０世代ごとに、連続的に植継ぎた。各４０世代で、キシロースをエタノールに発酵するその能力を測定するために、１％グルコースおよび５％キシロースを含むＲＭ培地のフラスコへの接種に、その細胞を使用した。エタノール生産率およびキシロース利用率を、安定性事象として使用した。２つのゲノム組込み株が、９０以上の世代のあいだ安定性を示す一方（Ｃ２５およびＤ９２）、プラスミド保持株（２０６／ｐＺＢ４、２０６／ｐＺＢ４ＬおよびＢｃｌｐＺＢ４Ｌ）は、約４０世代の間で安定であった。図８参照。
【００６０】
ｐＨ制御条件下、異なる濃度の総グルコースおよびキシロース（１％グルコースおよび５％キシロース；３％グルコースおよび３％キシロース；ならびに４．５％グルコースおよび４．５％キシロース）を含むＲＭ培地中で、株Ｃ２５およびＤ９５の発酵性能を解析した。図９に示すように、株Ｃ２５は、４．５％グルコースおよび４．５％キシロースを含むＲＭで、ｐＨ５およびｐＨ５．５の両方で、Ｄ９２よりも優れたキシロース利用率およびエタノール生産率を示した。以下の実施例において、３つのアラビノース同化遺伝子（ａｒａＢＡＤ）を、Ｃ２５ゲノムに組込んだ。
【００６１】
実施例３（ＡＸ）
以下の実施例は、Ｉｄｈを介した相同組換えおよびミニトランスポゾンＴｎ１０を用いる転位を通じた、Ｃ２５のゲノムへの、アラビノース同化酵素の導入を示すものである。以下に記載するプラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａを使用して、エレクトロポレーションによって、Ｚ．モビリスまたは大腸菌を形質転換した。形質転換体を、グルコースおよびテトラサイクリンで補充された接合プレートで選択した。Ｔｃrコロニーはさらに、キシロースまたはアラビノースで補充されたＲＭ（ＲＭＸおよびＲＭＡ）での増殖によって、Ａｒａ+Ｘｙｌ+であることが確認された。また以下に記載するプラスミドＴｎ１０Ｇを、フィルター接合技術（Conway et al. 1987）での接合によって、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＭ１０λｐｉｒドナーからＺ．モビリスＣ２５に移した。得られたトランス接合体を、アラビノース含有接合プレートで選択した。
【００６２】
Ａ．ｐＺＢ１８６２−ＩｄｈＬ−ａｒａの構築、および相同組換えを用いたＣ２５への組込み
以前の、相同領域の１ｋｂのｌｄｈ断片を用いるチモモナスゲノムにａｒａＢＡＤを組込む試みは、成功しなかった。組換え頻度を高めるために、より高い相同領域を使用した。ｌｄｈおよびそのフランキング領域を含む２．５ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｐｆｕ  ＰＣＲを用いて増幅した。プライマーは、Yamano I.,（1993）Journal of Bacteriology, Vol. 175. 3926-3933に公開された、Ｚ．モビリスＣＰ４のＤＮＡ配列に基づいて設計した。ＰＣＲからは２．５ｋｂ断片が予測されたが、そうではなく３．４ｋｂ断片が得られた。この３．４ｋｂ断片をＢａｍＨＩで消化した後、２つの断片（２．５および０．９ｋｂ）が得られた。両断片について、ｌｄｈでのみアニールするよう設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲで試験した。２．５ｋｂ断片は、正しい大きさのＰＣＲ産物を産出したが、０．９ｋｂ断片は産出しなかったことから、前者がｌｄｈ配列を含むことを示唆している。したがって、２．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片（ｌｄｈＬと命名）をクローニングし、Ｃ２５への遺伝子組込み用の相同領域として使用した。
【００６３】
ｌｄｈＬ断片を、Ｐｆｕ（Stratagene, La Jolla, CA）ＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen, Valencia, CA）を用いるＰＣＲで増幅した。ｌｄｈＬのＰＣＲ産物は２．５ｋｂであった。以下のプライマー配列を使用した。
【００６４】
ｌｄｈＬ：  ５’−ＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡ
ＴＣＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＧＧ−３'（配列番号：１７）
５’−ＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＴＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＴＴＧＣ
ＧＡＡＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１８）
【００６５】
クローニングの目的のために、ｌｄｈ遺伝子の中間に位置するＮｏｔＩ部位で、オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号：１９）の挿入によって、ｌｄｈＬにＮｏｔＩ部位を導入した。新規ＮｏｔＩ部位は、ｌｄｈＬのいずれかの末端から、およそ１．４および１．１ｋｂであった。ＮｏｔＩ部位を含むｌｄｈＬのＢａｍＨＩ断片（２．５ｋｂ）を、ＢｃｌＩ部位で、ｐＺＢ１８６２にライゲーションした。最後に、ｐＺＢ２０６（米国特許第５，７１２，１３３号および第５，７２６，０５３号）から単離された、４．４ｋｂのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤを、ｌｄｈＬのＮｏｔＩ部位にクローニングし、組込みプラスミド（ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａ）を形成した。図１０参照。
【００６６】
３つのアラビノース−同化遺伝子を含む、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤオペロンを、相同組換えを介して、Ｃ２５ゲノムのｌｄｈ部位に組込んだ。Ｃ２５ゲノムにａｒａＢＡＤを組込むために、ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａを大腸菌ＤＨ５αで構築した。プラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａを、エレクトロポレーションによって、Ｃ２５に移した。Ｔｃ耐性形質転換体を選択し、アラビノースでの増殖を試験した。形質転換体の増殖中に、Ｐｇａｐ−ａｒａ−ＢＡＤは、ＩｄｈＬの、相同組換えを介してｌｄｈＬ‘−ａｒａＢＡＤ−ｌｄｈＬ’カセット（プラスミド由来）での置換によって、Ｃ２５のゲノムに組込まれ得る。
【００６７】
組込み体を濃縮し単離するために、形質転換体からプラスミドを取り除いた。プラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは、Ｚ．モビリスで複製し得る。しかしながら、Ｚ．モビリスは、準最適増殖条件（たとえば３７℃）では、外来プラスミドを消失する傾向にある。この特性を利用して、ｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａの取り除きを、複数回の植継ぎの間、Ｔｃのない状態で、３７℃で、Ｃ２５形質転換体を培養することによって達成した。各植継ぎからの培養液を、プラスミドの消失について、絶えずモニターした。第３の植継ぎまでに、１００％の細胞がＴｃ5になったことから、プラスミドを消失したことが示された。第３、第４、第５および第６の植え継ぎからの培養液を、３０℃で、アラビノース含有ＲＭ（ＲＭＡ）に接種し、潜在的なＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組込み体の増殖を高めた。濃縮された細胞を、ＲＭＧプレートに移し、ＲＭＡ、ＲＭＸおよびＲＭＧＴｃプレートレプリカ接種した。Ｘｙｌ+Ａｒａ+Ｔｃ5の表現型のいくつかの組込み体（ＡＸ）を、以下に記載するように、さらなる解析に供した。これらの組込み体は、単独炭素供給源としてキシロースおよびアラビノースを使用する可能であった。
【００６８】
Ｂ．Ｔｎ１０Ｇの構築およびＣ２５への接合
Ｐｅｎｏ−ｔａｌ／ｔｋｔおよびＰｇａｐ−ｘｙｌＡＢオペロンとともにＣ２５を構築するために、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５を使用した。トランスポーゼース遺伝子はＣ２５に存在しないが、ｍｉｎｉ  Ｔｎ１０を、その後Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組込みに使用して、同一のトランスポゾン間の不和合性の可能性を回避した。プラスミドＴｎ１０Ｇ（図１１）を、Ｔｎ１０ベース伝達プラスミドであるｐＬＯＦＫｍに基づいて構築した。Ｋｍr遺伝子を、ｐＺＢ２０６から単理されたＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤのＮｏｔＩ断片で置換した。Ｔｎ１０Ｇを構築し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ１１８中で維持した。ついでプラスミドを、Ｚ．モビリスとの接合のために、接合ドナー、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＭ１０λｐｉｒ内に移した。Ｔｎ１０Ｇは、Ｚ．モビリスにおいては自殺プラスミドであるので、ａｒａＢＡＤ組込みによるトランス接合体のみが、アラビノースで補充された接合プレートで増殖可能であった。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＭ１０λｐｉｒドナーは、ナリジクス酸の存在によって、プレートで阻害された。トランス接合体が、第７日に、接合／ａｒａプレートに出現した。コロニーをＲＭＡおよびＲＭＸでレプリカ接種し、その表現型を確認した。接種した８６パーセントのコロニーがＸｙｌ+Ａｒａ+であった。接種プレートからの２０コロニーを、異なるプレートに交差して移した（キシロースプレートからアラビノースプレート、またはその逆）。これらのコロニーの６０％がＸｙｌ+Ａｒａ+であった。２０個のコロニーを、予備サザンハイブリダイゼーションで解析した。ｔｎｐプローブを用いたところ、約５０％の株が、ゲノム中にトランスポーゼース遺伝子を含んでいた。ついで８つの組込み体を、サザンハイブリダイゼーションによる、詳細な解析にかけた。ｐＺＢ１８６２−ＩｄｈＬ−ａｒａ組込み体ＤＮＡについて、Ｃ２５のＩｄｈへのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組込みを、ＤＩＧ−標識化ａｒａおよびＩｄｈプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションで確認した。図１２（ａ）および（ｂ）参照。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化ｌｄｈ、ａｒａ、およびｔｎｐプローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen, Valencia, CA）を用いるＰＣＲによって増幅した。ＤＩＧ−ＵＴＰは、Boehringer Mannheim, Indianapolis, INより購入した。Ｔｎ１０のトランスポーゼース遺伝子であるＩＳ１０Rを調べるために、ｔｎｐプローブを使用した。ｌｄｈ、ａｒａ、およびｔｎｐのＰＣＲ産物は、それぞれ１、１．４、および０．８ｋｂであった。以下のプライマー配列を使用した。
【００６９】
ＤＩＧ−ｌｄｈ：  ５’−ＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＴＡＴＧＣＧＣＧＣＧＴＣＧＣ
ＡＡＴＡＴＴＣＡＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：２０）
５’−ＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴＴＧＴＣＴＡＴＴＡＡＡ
ＣＡＡＧＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣ−３’（配列番号：２１）
ＤＩＧ−ａｒａ：  ５’−ＣＴＡＡＣＡＴＧＴＴＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＣＴ
ＴＡＧＣＧ−３’（配列番号：２２）
５’−ＧＴＴＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＧＣ−３’
（配列番号：２３）
ＤＩＧ−ｔｎｐ：  ５’−ＣＧＣＡＣＴＡＣＡＣＧＧＴＣＧＴＴＣＴＧＴＴＡＣ−３’
（配列番号：２４）
５’−ＧＧＴＴＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＧＴＡＡＧＴＣＴＴＣ−３’
（配列番号：２５）
【００７０】
ブロットにおいて、ｐＺＢ１８６２−１ｄｈＬ−ａｒａにはたった１つＰｓｔＩが存在し、それはＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ内に位置する。したがって、ａｒａプローブを用いる場合、ＰｓｔＩ消化プラスミドからは１つのハイブリッド形成バンド（１２．９ｋｂ）が予想された。ゲノムに組込まれたＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤを用いる場合、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ内のＰｓｔＩ部位によって２つのバンドが形成されるので、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤの外側に位置するゲノムにＰｓｔＩ部位が隣接することが予想された。図１３（ａ）からの結果は、明らかに、全ＤＮＡ調製物からの２つのバンドが、ａｒａプローブとハイブリッド形成することを示し、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤの組込みが証明された。チモモナス組込み体のプラスミドＤＮＡ由来のハイブリッド形成バンドの欠失は、組込みが、ネイティブプラスミド上ではなく、ゲノム上で起こったことを示唆する。Ｉｄｈが、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組込みによって破壊されたことを示すために、同一のＤＮＡを移し、ｌｄｈプローブとハイブリッド形成させた。予想したように、組込み体についてのハイブリッド形成パターンは、図１２（ｂ）に示されるように、Ｃ２５をのぞいて、両方のブロット上で同じであった。インタクトなｌｄｈを有するＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤ組込み体について使用した、宿主株Ｃ２５からの全ＤＮＡは、たった1つのバンドを示した。この結果から、ａｒａＢＡＤがＣ２５のｌｄｈに組込まれたことが確認された。
【００７１】
図１３（ａ）および（ｂ）は、Ｔｎ１０転位によって作製された８つのＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤトランスポゾン組込み体についての、それぞれＤＩＧ−標識Ｔｎｐおよびａｒａプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション結果を示すものである。ＤＮＡはＰｓｔＩ制限酵素で消化した。ＰｓｔＩは、Ｔｎ１０Ｇを２つの断片に切断し、これらは、ａｒａプローブとハイブリッド形成する。ブロットによると、Ｇ８、Ｇ１１、Ｇ１５およびＧＨ１７のみが、ａｒａ−陽性およびｔｎｐ−陰性であった。異なるバンドパターンにより、Ｐｇａｐ−ａｒａＢＡＤが、ゲノムの異なる座に組込まれたことが示された。トランスポーゼース遺伝子は、組込み体のゲノムに維持されていることは予想されなかったが、８つのうち４つの株（Ｇ５、Ｇ６、Ｇ１４およびＧ１９）が、トランスポーゼース遺伝子を含んでいた。さらに、Ｇ１４およびＧ１９は、プラスミド上にトランスポーゼース遺伝子を含んでいた。ａｒａプローブを用いる場合は、組込み体からは２つのバンドが予想された。しかしながら、単一のバンドのみが観察された。この曖昧さを解決するために、組込み体について、ａｒａプライマーを用いるＰＣＲを実施し、８つすべての組込み体が、ゲノムにＰｇａｐ−ａｒａＢＡＤを含むことを確認した。
【００７２】
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）、キシルロキナーゼ（ＸＫ）、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ＡＩ）、Ｌ−リブロキナーゼ（Ｌ−ＲＫ）、Ｌ−リブロース−５−Ｐ−４−エピメラーゼ（Ｌ−Ｒｅｐｉ）、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）およびトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）を、わずかに改変をしたZhang, et al., 1995; およびDeanda et al., 1996にしたがって、Ｚ．モビリスおよび対照株の、細胞なしの抽出物を用いて、アッセイした。細胞なしの抽出物を、後期対数期（３０℃、ＯＤ600およそ１．２）の培養液を回収し、超音波処理緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で１回洗浄し、ついで超音波処理することによって調製した。細胞残渣を、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、４５分、４℃）によって除去した．Ｌ−ＡＩアッセイにおいて、経時試料の量を、半分（５０μｌ）、７０％  Ｈ2ＳＯ4（１．５ｍｌ）および０．１２％  カルバゾール（５０μｌ）までスケールダウンした。すべてのチューブを、吸収度で読み取るまで、７０％  Ｈ2ＳＯ4の添加前後の両方で、２５℃の水浴中で維持した。試料を、反応の間、０、５、１０および２０分の時点で分取した。相同組換えおよび転位組込みに由来する組込み体はいずれも、Ｄ−キシロースおよびＬ−アラビノースで増殖可能であった。組込まれた遺伝子の発現レベルを、酵素活性を測定することによって測定した。以下に記載する安定性研究で測定されたように、単離体Ｃ２５／ＡＸ１、Ｃ２５／ＡＸ１０１およびＣ２５／Ｇ８はもっとも安定な組込み体であったので、これらを酵素アッセイ用に選択した。酵素アッセイの結果を、図１４および１５にて要約した。すべてのアッセイ（キシルロキナーゼ有りおよび無し）に関して、組込み体は、対照（Ｃ２５および／または２０６Ｃ）に比べて陽性反応を示した。ほとんどのアッセイ（Ｌ−リブロキナーゼおよびキシロースイソメラーゼを除く）で、組込み体は、プラスミド保持株（２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１）よりも低い活性を示した。これは、おそらく、遺伝子のコピー数に関連する。
【００７３】
安定性試験のために、培養液を、ＲＭＧを含む試験チューブに接種させ、３０℃にて一晩インキュベートし、ＲＭＧチューブに毎日交換した。接種物を、１０世代ごとに移すように制御した。４０世代ごとで、細胞を糖の混合液を含むフラスコに接種して、３０℃のｐＨ制御なしで糖の発酵能を試験した。バッチ発酵試験を、ｐＨを制御して３０℃で、実際用量として５００ｍｌを用いて、Ｂｉｏ−ＳｔａｔＱRケモスタットで実施した。ｐＨを自動的に２Ｎ  ＫＯＨで制御した。初期糖濃度およびｐＨは、培養液条件に応じて、各バッチ毎で変化した。使用したすべての糖は、試薬等級であった。試料を、発酵を通して定期的に分取し、先行する（Zhang 1995）に記載されているように、糖、エタノールおよび副生成物をＨＰＬＣで解析した。細胞増殖をモニターは、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）で測定した。エタノール生産率は、全利用可能な糖の量に基づくものである。
【００７４】
相同組換えおよび転位の両方を介して開発された複数のゲノム組込みキシロースおよびアラビノース発酵Ｚ．モビリス株を、非選択培地（ＲＭＧ）でのその安定性を試験した。これらの株を、ＲＭＧ培地で培養し、約１０世代後に、毎日連続的に移した。各４０世代後に、該細胞を使用して、キシロースおよびアラビノースをエタノールに発酵する能力を試験するために、１％グルコース、２％キシロースおよび２％アラビノースを含むフラスコに接種した。エタノール生産率、およびキシロースおよびアラビノース利用率を、安定性特性として使用した。２つの単理体は、１６０世代のあいだ、安定を維持した。図１６および１７を参照。３つの組込み株およびプラスミド保持株をさらに、ｐＨ５．５および３０℃で、４％グルコース、４％キシロースおよび２％アラビノースの混合物を含む培地で、発酵性能を試験した。図１８に示すように、全ての３つの株が、７２時間以内にグルコース、キシロースおよびアラビノースを利用する中で、プラスミド保持株は、６ｇ／Ｌの残留アラビノースを有した。しかしながら、組込み株は、プラスミド保持株（１ｇ／Ｌ）よりも多くのキシリトール（４ｇ／Ｌ）を産生した。２つの相同組換えＡＸ１およびＡＸ０１株は、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が、遺伝子組込みを介して不活性だったので、ラクテートを産生しなかった。組込み株の生産率（理論上の約８３％）は、プラスミド保持株と非常に類似していた。さらに、組込み株は、より高い細胞密度にまで増殖したことから、７つの遺伝子の単一コピーのみを持つことに関連して、代謝負担がより少なくなったことを示す。
【００７５】
実施例４
以下の実施例は、相同組換えを介する、Ｚ．モビリス３１８２１−５ＣのｌｄｈへのＰｇａｐｘｙｌＡＢの組込みを示すものである。Ｚ．モビリス３１８２１は、以前から、高糖供給流（high sugar feed stream）、高温および酢酸に対して高い耐性を有することが明らかにされている。そのため、Ｚ．モビリス３１８２１は、キシロース利用に関する４つの遺伝子（ｔａｌ、ｔｋｔ、ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ）を組込む標的として優れている。しかしながら、株３１８２１は、通常の大腸菌宿主由来のＤＮＡを用いて形質転換することが非常に困難であることがわかった。この株が、宿主のメチル化からＤＮＡを制限する固有の遺伝的背景を有するようであることが見出された。ドナー宿主としてＥ．ｃｏｌｉ  Ｓｍ１０（λｐｉｒ）を用いる、トランス接合を介したｍｉｎｉ  Ｔｎ５Ｔｃを用いる既存の方法は、３１８２１−５Ｃでは作用しなかったので、異なる組込み技術を試みた。ｍｉｎｉ−Ｔｎ５およびｍｉｎｉ−Ｔｎ１０系は、３１８２１株での接合にトランスポゾンプラスミドが必要であり得る、メチル化欠損大腸菌ドナー宿主の欠如のため、適切ではない。ｍｉｎｉＴｎ５（挿入配列間にＴｃr遺伝子を含む）を３１８２１−５Ｃへ接合するために、２回試験を行ったが、トランス接合体は得られなかった。Ｔｃr（１．５ｋｂ）のように小さな断片が、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５転位によって、３１８２１−５Ｃのゲノムに接合および組込むことが出来ないことを考慮すると、ＰｇａｐｘｙｌＡＢＴｃまたはＰｅｎｏｔａｌｔｋｔＣｍなどの、任意のより大きな断片の組込みは実現不可能である可能性がある。宿主への接合に代わる形質転換に基づいた転位方法が開発され（ＥＺ：：ＴＮ挿入キット、以下参照）、相同組換えのための拡大された相同領域が、株３１８２１の低い組換え率のために開発された。
【００７６】
ＥＺ：：ＴＮ挿入キットを用いた、３１８２１−５Ｃのゲノム内の４つすべての遺伝子（２つのオペロン−ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔに配置する）を組込む複数回の試みは成功しなかった。これは、２つの潜在的な問題による。第１に、挿入物の大きさが、ゲノム内で起こる組込みには大きすぎる可能性がある。第２に、キシロース培地での直接的な選択により、組込み体が増殖するときに遺伝子が発現されない可能性がある。この潜在的問題を解消するために、３１８２１での遺伝子組込みのための異なるアプローチ手段が必要である。４つすべての遺伝子の組込みの代わりに、２つの遺伝子（１つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢまたはＰｅｎｏｔａｌｔｋｔ）を同時に組込むものである。２つのオペロンを、同一の宿主に連続的に組込む。各オペロンは、組込み体の初期選択のために、抗生物質マーカー（ＴｃrまたはＣｍr）に連結する。こうすれば、組込み体を、抗生物質耐性によって選択できる。２つの組込み方法を、３１８２１−５Ｃへのキシロース利用遺伝子挿入のために使用した（相同組換えおよび転位）。Ｔｃr遺伝子を、ｌｄｈを含む２ｋｂ相同領域（すなわちＩｄｈＬ）を用いて、３１８２１−５Ｃのｌｄｈに組み込んだ。２ｋｂのｌｄｈ座においてＰｅｎｏｔａｌｔｋｔＴｃ断片を組込むための複数回の試みのうち２回は、取り除きや濃縮処理に時間がかかったため、組込み体を得るのに非常に長い時間がかかった（少なくとも１４日間)。しかしながら、組込み体は、プラスミド含有ＰｇａｐｘｙｌＡＢで組込み体を形質転換した際、キシロースで増殖不可能であった。ｌｄｈ特異的プライマー、および鋳型として組込み体ゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲ断片を作製し、ＤＮＡシークエンシングで解析した。結果は、Ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔオペロンに、変異は導入されなかったことを示唆した。２つの潜在的な問題について検証した。第１に、ｔａｌｔｋｔ遺伝子の方向は、ゲノム内のｌｄｈのすぐ上流の遺伝子であるｐｇｍと逆方向であった。ｐｇｍ遺伝子中には強力なプロモーターがあり、ｔａｌｔｋｔの発現を妨害するのかもしれない。第２に、Ｐｅｎｏはチモモナスでは比較的弱いプロモーターである。組込み体のＰｅｎｏｔａｌｔｋｔの単一コピーは、遺伝子発現に対して十分ではない可能性がある。ついで、Ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔの組込みを転位によって試み（ｌｄｈ部位には、上流の強力なプロモーターの問題があるので）、ＰｇａｐｘｙｌＡＢを相同組換えによって試みた。より重要なことに、組込みのための相同領域は、組換え効率を高めるためには、２ｋｂのｌｄｈＬ領域を超えて拡大する必要があった。新しく相同領域を拡大し、ｌｄｈの隣接領域（ｐｇｍおよびａｄｈＩ遺伝子）を含むようにした。全相同サイズは、およそ４ｋｂであった（ｌｄｈＬ４と呼ぶ）。
【００７７】
ｐＺＢ５１０ＸＴｃおよびｐＺＢ５１２ＸＴｃ（図１９Ａおよび１９Ｂ）、および２つの非常に類似するプラスミド（ｐＺＢ５１１ＸＴｃおよびｐＺＢ５１３ＸＴｃ）（複製プラスミドであるｐＺＢ１８６１に基づくカセット内の遺伝子に異なる構成を有する）を構築することによって、３１８２１ゲノムへＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンを組込む戦略を開発した。相同断片ｌｄｈＬ４を、２つのＰＣＲ反応によって作製し、結果、５’および３’断片を得た。ＰＣＲで作製した断片５’ｌｄｈＬ４（１．９ｋｂ）および３’ｌｄｈＬ４（２．４ｋｂ）を、順次、シャトルベクターであるｐＺＢ１８６１のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ部位、およびＢａｍＨＩ部位内に挿入した。ＰＣＲにおいて、ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ制限部位を、５’ｌｄｈＬ４と３’ｌｄｈＬ４の間に導入した。ついで、組込みプラスミドｐＺＢ５１０ｘＴｃを、ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ部位で、ＰgapｘｙｌＡＢ（ｐＺＢ４由来）およびＴｃr（ＰＣＲ産物）を挿入することによって構築した。プラスミドｐＺＢ５１２ＸＴｃを、ＰgapｘｙｌＡＢの方向をｐＺＢ５１０ＸＴｃとは逆方向にすること以外は同様にして、構築した。
【００７８】
プラスミドを、エレクトロポレーションによって、株３１８２１−５Ｃに導入した。プラスミドｐＺＢ５１０ＸＴｃ、ｐＺＢ５１２ＸＴｃ、ｐＺＢ５１１ＸＴｃおよびｐＺＢ５１３ＸＴｃを使用して、３１８２１−５Ｃを形質転換した。複数回の試み後、ｐＺＢ５１０ＸＴｃおよびｐＺＢ５１２ＸＴｃによる形質転換体を得た。ｐＺＢ５１１ＸＴｃおよびｐＺＢ５１３ＸＴｃによる形質転換体は得られなかった。
【００７９】
Ｔｃrマーカーは、組込みカセットに含まれ、組込み体の選択に使用した。しかしながら、Ｃｍrマーカーは、ベクターのバックグラウンドのカセットの外側に位置した。ＴｃrＣｍr形質転換体を、２〜４間毎日植継ぎして、Ｔｃの存在下で、選択し培養した。形質転換体の増殖のあいだ、相同組換えを介して、ＰｇａｐｘｙｌＡＢＴｃを宿主のｌｄｈに組込んだ。組込み体を濃縮して単離するために、プラスミドの取り除きを実施した。プラスミドの取り除きは、約７〜１４日間、毎日数回植継ぎして、抗生物質のない状態で、３７℃で形質転換体を培養することによって達成できる。プラスミドの欠失の定常的なモニタリングを、各植継ぎからの培養液で行なった。第３の植継ぎまでに、＞９９％の細胞がＣｍsとなった。これは、プラスミドの欠失を示すものである。第３回、第４回、第５回および第６回の植継ぎからの培養液を、３０℃にてＲＭＧＴｃに播種し、潜在的ＰｇａｐｘｙｌＡＢ組込み体の増殖を高めた。高められた培養液を、ＲＭＧＴｃプレートに塗布し、ＲＭＧＣｍおよびＲＭＧＴｃプレートにレプリカ接種した。組込み体（ＴｃrＣｍs）を、抗生物質耐性の表現型によって、野生型（ＴｃsＣｍs）およびプラスミド保持細胞（ＴｃrＣｍr）と区別した。複数の潜在的ＰｇａｐｘｙｌＡＢ組込み体を単離し、さらなる解析に供した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５ａにおける、組込み体から抽出したプラスミドＤＮＡでのバック形質転換を実施して、プラスミド保持株を排除した。コロニーについてＰＣＲ解析を実施して、Ｔｃ、ｘｙｌＡＢおよびＣｍrプライマー対をそれぞれ使用して、組込み体の表現型を試験した。４つの単理体（ｘ４ｉ、ｘ６ｉ、ｘ９Ｕおよびｘ１０ｉ）は、バック形質転換で形質転換体が得られなかったので、組込み体であることが示された。また、ＰＣＲの結果により、Ｃｍrバンドではなく、ｘｙｌＡＢおよびＴｃrバンドが示された。ＰｇａｐｘｙｌＡＢ組込み体（ｘ４ｉ、ｘ６ｉ、ｘ９Ｕおよびｘ１０ｉ）を、チモモナス複製プラスミドｐＺＢ１９２（ＰｇａｐｘｙｌＡＢではなくＰｅｎｏｔａｌｔｋｔを運搬する）で形質転換した。形質転換体は、ＲＭＸで増殖可できたことから、組込まれたＰｇａｐｘｙｌＡＢの単一コピーは、ｔａｌおよびｔｋｔ遺伝子がプラスミドに供給されたとき（多コピー）、キシロース利用に関するキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの充分な活性を提供することが示された。この結果は、ＰｇａｐｘｙｌＡＢ組込み体に、Ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔをさらに組込み、完全に組込まれたキシロース発酵３１８２１株を構築することができることを裏付けるものでもある（実施例６参照）。
【００８０】
実施例５
以下の実施例は、転位を介する、Ｚ．モビリス３１８２１−５ＣのゲノムへのＰｅｎｏｔａｌｔｋｔの組込みを示すものである。ｍｉｎｉ−Ｔｎ５またはｍｉｎｉ−Ｔｎ１０転位は、接合用のメチル化欠損ドナー宿主の欠如のために、３１８２１２において適用されなかった。そこで、新規の転位方法（ＥＺ：：ＴＮ挿入キット）を採用した。本方法の性質は、細胞内にエレクトロポレーションしたときに、モザイク末端近接ＰｅｎｏｔａｌｔｋｔＣｍに結合し、末端の結合が維持している場合その断片を切断するトランスポゼースが必要である。細胞内部で、トランスポゼースは、宿主のゲノムへのＤＮＡ断片の転位を誘導する。組込みプラスミドｐＭＯＤＰｅｎｏｔａｌｔｋｔＣｍ（図２０を参照）は、メチル化欠損大腸菌宿主から調製した、チモモナスにおける非複製プラスミドである。エレクトロポレーションした細胞を、ＭＭＧＣｍプレート上に塗布した。Ｃｍr形質転換体は組込み体であるべきである。３つのＣｍr組込み体は、この転位方法を用いて得られ、本明細書においてｉｎｔ１、ｉｎｔ２およびｉｎｔ３と呼ぶ。組込み体を、ｔａｌまたはＣｍ用のプライマーを用いるＰＣＲスクリーニングによって確認した。また、該確認は、ＰｅｎｏｔａｌｔｋｔＣｍrが、ｐＭＯＤプラスミドで運搬されないことを確認するために、組込み体由来のプラスミドを大腸菌内にバック形質転換することによって行なった。組込み体を、ＰｇａｐｘｙｌＡＢ（ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔではない）を有するプラスミドｐＺＢ１８８−ｚｙｌで形質転換した。エレクトロポレーションした細胞を、ＭＭＸプレートに直接塗布した。この相補実験では、形質転換体は得られなかった。Ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔの単一コピーは、キシロースプレートでの初期増殖では、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの十分な活性を提供し得ない。Ｐｐｄｃ（ピルビン酸ジカルボキシラーゼ遺伝子）およびＰｇａｐ（グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）などのより強力なチモモナスプロモーターは、ｔａｌｔｋｔ発現に対する低コピー数効果を相補し得る。
【００８１】
実施例６
以下の実施例は、Ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｙｌＡＢ組込み体の構築を示すものである。４つのキシロース利用遺伝子を組込む試みは、転位または相同組換えいずれを使用しても成功しなかった。３１８２１−５ＣゲノムへのＰｅｎｏｔａｌｔｋｔの単一コピーは、キシロース同化遺伝子をプラスミドに供給する場合、キシロースでの株の増殖を支持するものではなかった。本発明者らは、株３１８２１ネイティブプラスミドへのｐＭＯＤＰｅｎｏｔａｌｔｋｔＣｍのインビトロ転位によって、組込みＰｅｎｏｔａｌｔｋｔのコピー数の増加を試みた。ついで、転位ネイティブプラスミドを、ＰｇａｐｘｙｌＡＢ組込み体（ｘ９ｉ）内にエレクトロポレーションした。ＴｃrＣｍrで最終的に選択した組込み体を、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉとした。組込み体から単離したプラスミドを、Ｚ．モビリス３１８２１−５Ｃおよび大腸菌ＤＨ５ａへバック形質転換に使用した。バック形質転換体は、Ｚ．モビリスからは得られたが、大腸菌からは得られったことから、ｘ９ｉのネイティブプラスミドに該遺伝子が組込みられたことが示された。他のアプローチにおいて、組込みプラスミドである、ＰｇａｐｘｙｌＡＢＴｃrを含むｐＺＢ５１０ＸＴｃおよびｐＺＢ５１２ＸＴｃを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＭ１から調製し、ｉｎｔ２に形質転換した。ＴｃrＣｍr形質転換体は、多くのエレクトロポレーションの試みによって得られた。ついで形質転換体を用いて、前述のように、取り除きおよび濃縮工程を行った。両方のアプローチによって得た組込み体を、キシロースを含む培地（ＲＭＸ）での増殖について試験した。複数の組込み体においてＲＭＸでの増殖が観察されたが、最小限なものだった。ＲＭＸでの連続的な適応の後（以下の実施例を参照）、各組込みによる２つの組込み体（ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４および＃８；ｉｎｔ２／３２１およびｉｎｔ２／１８２１）は、ＲＭＸにて比較的良好に機能し、さらに解析した。得られた潜在的Ｐｅｎｏｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｙｌＡＢ組込み体を、標的ＤＮＡの存在を確かめるために、サザンハイブリダイゼーション解析に供した。ハイブリダイゼーションをｘｙｌＢプローブ（図２１Ａ）を用いて実施し、これらの組込み体から調製した全ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡはＳｐｈＩで消化した。プラスミドｐＺＢ５１２ＸＴｃ（対照）が、２つの５．４および２．５ｋｂのバンドを有し、そのうち２．５ｋｂのバンドは、組込み体、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４、＃８およびｉｎｔ２／３２１の全ＤＮＡに共通することが予想された。一方、プラスミドｐＺＢ５１０ＸＴｃは、２つのバンド４．２および３．７ｋｂのバンドを有し、そのうち３．７ｋｂは、組込み体ｉｎｔ２／１８２１の全ＤＮＡに共通であることが予想された。すべての組込み体はｘ９ｉ（ＰｇａｐｘｙｌＡＢが、ゲノム中のＬＤＨ座に組込まれている）に基づくものである。すべての組込み体は、第２のバンド（予想されるプラスミドから作製されるバンドとは異なるもの）だけでなく、各組込みプラスミドに共通する１つのバンドを有する。すべての組込み体は、プラスミドＤＮＡプレップではなく、全ＤＮＡプレップにバンドを含むことから、ＰｇａｐｘｙｌＡＢが、ＡＴＣＣ３１８２１のネイティ��プラスミドにではなく、染色体に組込みられたことが示された。ｔｋｔプローブによるハイブリダイゼーションにおいて、これらの組込み体から調製した、全ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを、ＢｓｓＨＩＩで消化した（図２１Ｂ）。プラスミドｐＭＯＤＰenoｔａｌｔｋｔＣｍ（対照）は、４．２、１．５、０．９および０．１ｋｂの４つのバンドを有し、そのうち１．５および０．９ｋｂのバンドは、全ての組込み体の全ＤＮＡに共通であることが予想された。０．１ｋｂのバンドは小さすぎたため、ゲル上に残留できなかった。図２１Ｂに示されるように、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４、＃８は、全ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡプレップの両方で１．５と０．９ｋｂバンドを含んでいたため、Ｐenoｔａｌｔｋｔが、ネイティブプラスミドに組込まれたことが確認された。ブロット上＃４および＃８にはない第３のバンドは、小さすぎるためゲル上に存在しないかもしれない。マップ（図２０を参照）によると、このバンドは、０．４ｋｂと小さい可能性がある。２つの共通のバンドに加えて、ｉｎｔ２／３２１およびｉｎｔ２／１８２１は、プラスミドとは異なる６．４ｋｂのバンドを有したことから、Ｐenoｔａｌｔｋｔは、これらの２つの組込み体の染色体に組込まれたことを示された。
【００８２】
実施例７
以下の実施例は、組込み体チモモナスの酵素活性を示すものである。培養液を、ＲＭＸからＲＭＧへの第５回植継ぎ（ｘ９（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４および＃８）、および第４植継ぎ（ｉｎｔ２／３２１およびｉｎｔ２／１８２１）から接種し、新鮮なＲＭＧへの接種前に１６時間増殖させた。細胞を、アッセイのために、ＲＭＧで増殖したものをＯＤ６００＝１．０で回収した。結果を、図２２に示す。
【００８３】
ＴＡＬおよびＴＫＴアッセイには、３１８２１−５Ｃに基づく株ｉｎｔ２、染色体に組込まれたＰenoｔａｌｔｋｔ株、および３１８２１−５Ｃ／ｐＺＢ１１２、シャトルプラスミドにＰenoｔａｌｔｋｔを含むプラスミド保持株（ｐＺＢ１８６１誘導体）ならびに宿取株３１８２１−５Ｃを、対照として含む。キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼでの酵素アッセイを、すべての組込み体および対照株で実施した。株３１８２１−５Ｃ／ｐＺＢ１１２は、予想通り、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼに対して高い活性を示した。組込み体では、異なる酵素レベルが観察された。さらに、同様の組込み方法を用いて得られた組込み体においても、異なる酵素レベルが観察された。すべてのアッセイで、株ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４がもっとも高く、ｉｎｔ２／３２１が、２番目に高い活性を示した。これらの株は、ＲＭＸでもよりよく増殖した（図２３を参照）。ネイティブプラスミド組込み株（ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４および＃８）は、必ずしもより高いＴＡＬ、ＴＫＴ活性を示すわけではないことに注意すべきである。
【００８４】
実施例８
以下の実施例は、Ｚ．モビリス３８１２１−５Ｃ  Ｐenoｔａｌｔｋｔ／ＰgapｘｙｌＡＢ組込み体が、ＲＭＸでの連続適応の後に、Ｄ−キシロースをエタノールに発酵可能であることを示すものである。組込み体を、蒸発を防ぐためにパラフィンで密封したＲＭＸチューブ（２％のキシロースを含む）に播種した。増殖を、ＯＤ６００測定によって定期的にモニターした。対数期からの培養液を、新鮮なＲＭＸに移した。図２３に示すように、第１回植継ぎおよび第４回植継ぎ間で、増殖曲線の比較を行った。
【００８５】
増殖速度および最終ＯＤ６００の値は、適応期間を通して良くなった。最終ＯＤは、０．０８（第１回植継ぎ）から０．６（第４回植継ぎ）まで増加した。増殖率および最大ＯＤ６００の値は、第５回植継ぎの後安定化した。培養液の変化が、適応過程中に起こったと思われる。ＲＭＸは、変異体の自然淘汰を、より効果的に利用させるものである。解析した４つの組込み体のうち、２つ（ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４およびｉｎｔ２／３２１）が、最も高い増殖率およびＯＤを示した。第４回／第５回植継ぎの培養液からの試料を、ＨＰＬＣ解析のために、１４０時間時点で得た。表１に示すように、キシロースが、初期濃度２０ｇ／Ｌから４〜１４ｇ／Ｌまで消費され、有意水準のエタノールが形成されたことから、Ｚ．モビリス３１８２１−５Ｃ  Ｐenoｔａｌｔｋｔ／ＰgapｘｙｌＡＢ組込み体は、Ｄ−キシロースをエタノールに発酵可能であることが示された。
【００８６】
【表１】
2005534343.tif 000002
【００８７】
実施例９
この実施例は、Ｚ．モビリスへの転位用のｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの構築を示すものである。２つのＬｏｘＰ部位を導入すること以外は、同様にしてｐＭＯＤＰｅｎｏｔａｌｔｋｔＣｍを構築した。２．２ｋｂのｔｋｔ断片を、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ消化によってｐＵＣｔａｌｔｋｔより単離し、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＭＯＤベクターにクローニングし、ｐＭＯＤｔｋｔを得た。ＰＣＲ断片Ｐｇａｐｔａｌを、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）のチモモナスプロモーター領域とｔａｌの構造遺伝子を融合することによって作製した。この断片を、ＸｂａＩで消化し、プラスミドｐＭＯＤｔｋｔにクローンニングした。最後に、Ｃｍrを挟む２つのＬｏｘＰ配列を含むＰＣＲ断片（Palmeros et al., 2000, Gene 247: 255-264）（ＣｍｌｏｘＰ）を、プラスミドのＳｆｉＩ部位に挿入し、組込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを形成した（図２４）。Ｃｍrを挟むＬｏｘＰ配列は、ファージＣｒｅ組換え酵素の結合標的として使用でき、必要に応じて、Ｃｍrを組込み体ゲノムから除去できる。同様に、このアプローチは、Ｔｃ耐性遺伝子をルーピングアウトするのにも使用できる。抗生物質耐性遺伝子を除去できることは有利である。本発明者らは、この目的のために、ＬｏｘＰ／ｃｒｅ系を導入した。この構築のためのＰＣＲ用のオリゴ配列は、以下の通りである。
【００８８】
１．  Ｐｇａｐ（０．３ｋｂ）
鋳型：ｐＺＢ４
プライマー：
ＰｇａｐＸｂＳｆｉ（Ｆ）  ５’ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＧＣＣＧＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣ３’（配列番号：２６） 
３’Ｐｇａｐ５’ｔａｌ（Ｒ）  ５’ＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＴＧＴＴＴＡＴＴＣＴＣＣＴＡＡＣ３’（配列番号：２７）
【００８９】
２．  ｔａｌ（１ｋｂ）
鋳型： ｐＺＢ４
プライマー：
３’Ｐｇａｐ５’ｔａｌ（Ｆ）  ５’ＧＴＴＡＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＣＡＡＡＴＴＧ３’（配列番号：２８）
ｔａｌＸｂ（Ｒ）  ５’ＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＣＣ３’（配列番号：２９）
【００９０】
３．  Ｐｇａｐｔａｌ（１．３ｋｂ）
鋳型：Ｐｇａｐおよびｔａｌ
プライマー：
ＰｇａｐＸｂＳｆｉ（Ｆ）  ５’ＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＧＣＣＧＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣ３’  （配列番号：３０）
ｔａｌＸｂ（Ｒ）  ５’ＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＣＣ３’  （配列番号：３１）
【００９１】
４．  ＣｍｌｏｘＰ（１．１ｋｂ）
鋳型：ｐＺＢ  １８６
Ｃｍｌｏｘ（Ｆ、ｓｆｉ）
５’ＣＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＧＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣ３’（配列番号：３２）
Ｃｍｌｏｘ（Ｒ、ｓｆｉ）
５’ＣＡＧＧＧＣＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＴＣＧ３’（配列番号：３３）
【００９２】
実施例１０
以下の実施例は、Ｚ．モビリス３１８２１−５Ｃに基づくＰｇａｐｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｌｙＡＢ組込み体の構築を示すものである。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＭ１またはＪＭ１１０から調製したプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍをＥＺ：：ＴＮ  トランスポーゼースで処理してトランスポゾンを作製した。そのトランスポゾン混合物を、ＰｇａｐｘｌｙＡＢ組込み体であるｘ９１にエレクトロポレーションした。ＲＭＧＴｃＣｍでの選択により、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｌｙＡＢ組込み体を得た（Ｔｃ耐性遺伝子は既にｘ９ｉゲノムに組込まれた）。組込み体からのプラスミドＤＮＡを用いた大腸菌でのバック形質転換などの初期解析を行い、プラスミド保持菌株に対する真の組込み体を同定した。複数回の組込み体プラスミドＤＮＡは、大腸菌をバック形質転換し、それらの偽組込み体は除去した。潜在的なＴｃrＣｍr組込み体を、キシロースを単一炭素源として含むＲＭに播種し、３０℃でインキュベートした。ＯＤ６００での測定により増殖をモニターした。すべての菌株が、最初はＯＤ０．３で、ＲＭＸでゆっくり増殖することができた。増殖率および最終的なＯＤは、ＲＭＸでの第６回植継ぎ後に改善された。よりよく増殖した２つの菌株（＃２０、＃２１）の増殖曲線を図２５に示す。
【００９３】
実施例１１
以下の実施例は、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｌｙＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔ／ＰｇａｐｘｌｙＡＢチモモナス組込み体の単離方法を示すものである。混合集団中でよりよく増殖する菌株を単離するために、細胞をＲＭＸプレートにストリークし、培養した。第４回植継ぎ後、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４株およびｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃８株をストリークし、第３回植継ぎ後にｉｎｔ２／ｘｙ１３２１およびｉｎｔ２／ｘｙ１８２１をストリークし、第６回植継ぎ後に＃２０および＃２１をストリークした。この単離工程１回りを第１単離とした。ＲＭＸプレートには大きさの異なるコロニーが見られた。大きいコロニーを取り、さらにＲＭＸプレートにストリークした（第２単離）。際立って大きい複数のコロニーを取り、増殖解析用にＲＭＸ液体培地に播種した。ＲＭＸでの促進された増殖をみせた４つの菌株を選び、サザンハイブリダイゼーション、発酵、および酵素アッセイなどのさらなる分析に用いた。その４つの菌株を３２１（５）（ｉｎｔ２／ｘｙ１３２１由来）、４８１（ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４由来）、２０３２（＃２０由来）、および２１２２（＃２１由来）と称した。実施例６に記載の同様の方法で、サザンハイブリダイゼーションを行なった。図２６Ａ（プローブとしてｘｙｌＢを使用）および２６Ｂ（プローブとしてｔｋｔを使用）に示すように、組込みが、プラスミドプレップにおいてハイブリッド形成バンドが見られないことにより確認された。なお、Ｚ．モビリス３１８２１のネイティブプラスミドへのＰｅｎｏｔａｌｔｋｔの組込みにより故意に構築した、図２６ｂの４８１株（ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４由来）は例外である。４８１株と対照ｐＭＯＤＰｅｎｏｔａｌｔｋＣｍとのバンドパターンの違いは、そのバンドが組込みプラスミドのものでないことを示した。そのかわり、それはネイティブプラスミドへのＰｅｎｔａｌｔｋｔＣｍの組込みによるもであった。図２６Ａにおいて、予想通り、２．５ｋｂの通常のバンドが、ｐＺＢ５１２ｘＴｃおよび４つの組込み体全てで観察された。しかし、第２のバンドは、ｐＺＢ５１２ｘＴｃと組込み体のあいだで異なり、染色体（おそらく１ｄｈ遺伝子）へのｘｙｌＡＢの組込みを示した。２０３２の高分子量バンドは、１ｄｈＬ４領域近くのゲノムのＳｐｈ１部位における自発的変化によるものである可能性がある。図２６Ｂにおいて、１．５、０．９および０．１ｋｂの共通のバンドが、ｐＭＯＤＰｅｎｏｔａｌｋｔＣｍまたはｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｋｔとすべての組込み体のあいだで予想された。異なるバンドにより、３１８２１−５ＣのゲノムへのＰｅｎｏｔａｌｋｔＣｍまたはｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｋｔの組込みが確認された。
【００９４】
４つの組込み体、３２１（５）、４８１、２０３２および２１２２、ならびに対照株３１８２１／ｐＺＢ５（プラスミド保持株）、Ｃ２５（３９６７６に基づくキシロース発酵組込み体）ならびに３１８２１−５Ｃ（宿主）について予備発酵を行なった。発酵条件は、ボトル中８０ｍｌのＲＭＸ（２％キシロース）またはＲＭＧＸ（１％グルコースおよび２％キシロース）；ｐＨ非制御；３０℃にて静止；であった。発酵培養液の上清をＨＰＬＣ分析することにより発酵をモニターした。すべての組込み体がＲＭＧＸで増殖することができ、キシロースおよびグルコースの両方を最高収率でエタノールに発酵できた（図２７Ａ、ＢおよびＣ）。すべての組込み体は、ＲＭＸで増殖することができ、キシロースを最高収率でエタノールに発酵できた（図２８ＡおよびＢ）。エタノール産生特性は、どちらの培地でも、組込み体およびプラスミド保持対照株（３１８２１／ｐＺＢ５）ならびにＣ２５組込み体（３９６７６に基づくキシロース組込み体）の間で類似していた（図２７Ｃおよび２８Ｂ）。予想通り、宿主株だけがＲＭＧＸ培地でグルコースをエタノールに発酵した（図２７Ｂ）。
【００９５】
酵素アッセイについてもまた、４つの組込み体、および対照株、３１８２１／ｐＺＢ５（プラスミド保持株）、Ｃ２５（３９６７６に基づくキシロース発酵組込み体）ならびに３１８２１−５Ｃ（宿主）について行なった。データを以下の表２に示す。すべての組込み体が３１８２１／ｐＺＢ５やＣ５よりも低い活性を示した。
【００９６】
表２：組込み体の酵素活性
非活性（μｍｏｌ／ｍｉｎ−ｍｇタンパク質）
ＸＩ        ＸＫ       ＴＡＬ      ＴＫＴ
３２１（５）          ０．０６    ０．１７    ２．１０    ０．９１
４８１                ０．０４    ０．２３    ２．２７    ０．７４
２０３２              ０．１５    ０．２３    １．７６    １．０５
２１２２              ０．０４    ０．１９    １．５６    ０．５１
ｉｎｔ２              ０．０２    ０．０２    １．１９    ０．３１
ｘ９ｉ                ０．０４    ０．０６      ＮＤ      ０．０３
３１８２１／ｐＺＢ５  ０．０６    ０．５５    ２．５２    １．７８
Ｃ２５                ０．２０    ０．８１    ３．７８    １．９９
３１８２１−５Ｃ      ０．０８    ０．０７    ０．０１    ０．０１
ＮＤ：  未測定
【００９７】
実施例１２
以下の実施例は、キシロース培地での増殖を改善することを試みる、チモモナスの突然変異誘発工程を示すものである。ｉｎｔ２／ｘｙｌ３２１およびｘ９ｔ（Ｐｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃８組込み体の単一コロニーをＲＭＧに播種し、３０℃で一晩インキュベートした。増殖した培養物を、５％グルコースで補充された接合培地（Mating  Medium）への播種に用い（ＯＤ＝０．１５〜０．２）、ＯＤ＝０．５〜０．６になるまで３０℃にてインキュベートした。細胞を回収し、突然変異誘発化学物質である１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧまたはＮＴＧ）を濃度２５μｇ／ｍｌで用いて処理した。ＮＴＧで処理した細胞を集めてＲＭＧで２回洗浄し、ＲＭＧＸ（０．５％グルコースおよび１．５％キシロース）中に懸濁させ、増殖させた。増殖した培養物を、同じ培地で２回培養したのち、ＲＭＸプレートにストリークした。より大きいコロニーをＲＭＸプレートで再度ストリークした。もっとも大きいコロニーを採取して、ＲＭＸ液体培地に接種した。増殖した培養物を再びＲＭＸプレートでストリークした。最後に、もっとも大きいコロニーを採取してＲＭＸで増殖させた。もっともよく増殖した２つの菌株を８ｂおよび２／３２１−２と称した。その菌株の１つである８ｂについて、さらに評価した。通常、突然変異体では、以下の実施例に記載するように、アセテートだけでなくグルコースとキシロースの混合物中において、キシロース利用が改良された。
【００９８】
実施例１３
以下の実施例は、Ｚ．モビリスＡＴＣＣ３１８２１−５Ｃ宿主を基にして構築した複数の組込み体の発酵評価を示すものである。Ｃ２５株およびプラスミド保持株３１８２１／ｐＺＢ５を発酵評価の対照として用いた。
【００９９】
発酵評価は、ｐＨおよび温度制御下で、５００ｍｌの使用容量でＢｉｏＳｔａｔ−Ｑ発酵槽中で行なった。ｐＨはＫＯＨ（２Ｎ）を滴定に用いて５．５に制御し、温度は３０℃に制御した。発酵培地ＲＭにはグルコースおよびキシロースを含有させた（（ＲＭＧＸ１％：６％）およびＲＭＧＸ（３．５％：３．５％））。増殖培地のすべての成分は、ろ過滅菌した原料溶液、ＲＭ（１０Ｘ）、グルコース（５０％）、およびキシロース（５０％）として別々に調製した。発酵槽をオートクレーブ処理し、増殖培地を滅菌条件下で発酵槽に設置した。接種物を、ＲＭＧＸ培地（２％：２％）２００ｍｌを入れた２５０ｍｌフラスコに調製した。一晩増殖後、培養物を遠心分離して、発酵培地と同様の培地１０ｍｌに濃縮した。６００ｎｍでのＯＤが０．１の状態で発酵を始めるのに必要な接種物の量を計算して、発酵槽に接種した。必要に応じて何度か発酵槽から試料を採取した。試料は、糖、エタノール、および副生成物についてＨＰＬＣで分析した。
【０１００】
全ての菌株がグルコースおよびキシロースをエタノールに発酵させたが、中でも８ｂ株および２０３２株がｐＨ制御下の発酵において最もよく機能した（図２９および３０）。組込み株８ｂおよび２０３２は、宿主３９６７６を基とするプラスミド保持株３１８２１／ｐＺＢ５および組込み体Ｃ２５と同様の機能を示した。
【０１０１】
実施例１４
以下の実施例は、チモモナス組込み体の安定性を示すものである。１０ｍｌの培地を入れた１５ｍｌファルコン（Falcon）滅菌チューブを用いて、非選択培地（ＲＭＧ）において培養物を連続して植継ぎすることにより試験を行なった（図３１を参照）。それらの株をＲＭＧ培地で培養し、約１０世代増殖後に毎日連続的に植継ぎを行なった。それぞれ第４０世代に、細胞を２％のグルコースおよび２％のキシロースを入れたフラスコに接種し、グルコースおよびキシロースをエタノールに発酵させる能力を試験した。エタノール生産率およびキシロース利用率を、安定性の指標として用いた。３０℃および３７℃の両方で、選択なしで、すべての組込み体が少なくとも１４０〜１６０世代まで安定であることが示された（図３２および３３）。プラスミド保持株３１８２１／ｐＺＢ５は、３０℃および３７℃においては４０世代以内のうちにキシロース利用能を消失した（図３３に示す３７℃のデータ）。
【０１０２】
実施例１５
以下の実施例は、ＡＸ１０１の増殖およびキシロース発酵における酢酸濃度の影響、ならびにｐＨの影響を示すものである。酢酸は通常、前処理したバイオマス工業原料の加水分解物中に存在しており、微生物による発酵を阻害する。ｐＨ５、ｐＨ５．５およびｐＨ６．０で、２ｇ／Ｌのアセテート補充して、および補充しないで（ｐＨ５．５）発酵を行い、ＡＸ１０１株の性能を評価した。使用した培地は、所望の濃度のアセテートを補充したＲＭＧＸＡ（４％：４％：２％）である。この結果（図３４）より、２ｇ／Ｌのアセテートが菌株の増殖、キシロース利用、およびエタノール産生を阻害することが示された。阻害性は、より高いｐＨ（６．０）に比べ、より低いｐＨ（５．０）の方が数段強かった。
【０１０３】
実施例１６
以下の実施例は、ＡＸ１０１による発酵の差し引き（fill and draw）方法を示すものである。ＡＸ１０１株のアセテートに対する段階的な適応が、高濃度の酢酸を含む培地で該菌株の性能が改良されるかどうか確認する試験を計画した。まず、ｐＨ５．５、Ｔ３０℃において、ＲＭＧＸＡ（４％：４％：２％）での一連のバッチ発酵を、アセテートを含まない場合と２ｇ／Ｌの酢酸を含む場合とで比較した。アセテートが２ｇ／Ｌというアセテートの低い濃度で糖の利用に影響したため、それぞれ０．５ｇ／Ｌおよび１ｇ／Ｌというより低い濃度のアセテートを含ませる以外は、２ｇ／Ｌのアセテートで補充したＲＭＧＸＡ（４％：４％：２％）を含む２つの発酵槽と同様の糖濃度にて、別の発酵槽から接種するという別の調査を計画した。その結果、２ｇ／Ｌのアセテートの存在下では、ＡＸ１０１株の糖利用の改善は見られなかった。
【０１０４】
実施例１７
以下の実施例は、ＡＸ１０１の継続発酵を示すものである。ＭｕｌｔｉＧｅｎ発酵槽（New Bruswick Scientific, NJ, USA）を３００ｍｌの使用容量および３００ｒｐｍの攪拌回転数で用いて、継続発酵を行なった。ｐＨはＫＯＨ（２Ｎ）で制御して、４．５、５および５．５で行なった。温度は試験中３０℃を維持した。バッチ発酵を初期ＯＤが６００ｎｍで０．１にて開始した。発酵工程を通して定期的に試料を採取し、糖、エタノールおよび副生成物をＨＰＬＣにより分析した。すべてのグルコースが利用され、ほぼ１０ｇ／Ｌのキシロースが発酵槽に残った状態になったら、所望の糖組成物を含む培地を０．０２（１／ｈｒ）の低い希釈率（Ｄ）で加えることにより継続発酵を開始した。安定した周期で４〜５回後にグルコースがすべて利用され、キシロースが８０％利用されたのが確認されたところで希釈率を増加させた（図３５）。この工程を、残留キシロース濃度の上昇およびエタノール濃度の減少によって示される、ウォッシュアウト段階に達するまで継続した。エタノール生産率（Ｙｐ）を、培地に加えた初期の全糖重量当りの産生したエタノールの最終濃度に基づいて計算した。
【０１０５】
ＡＸ１０１株は、ウォッシュアウト段階が観察された後に６ｇ／Ｌのアセテートのみで補充したコーンスティ−プ液体培地で、８０ｇ／Ｌグルコース、４０ｇ／Ｌキシロースおよび１５ｇ／Ｌのアラビノースの糖混合物を発酵することができた。
【０１０６】
実施例１８
以下の実施例は、組込み体が高濃度のアセテート存在下で、グルコースおよびキシロースをエタノールに発酵できることを示すものである。アセテートは、通常、前処理したバイオマス工業原料からの加水分解物中でみられる阻害化合物である。
【０１０７】
異なる濃度のアセテートを補充したＲＭＧＸ（２％：２％）を含む３５ｍｌの培地を入れた５０ｍｌ振とうフラスコで評価を行なった。アセテートを、酢酸としてＲＭＧＸ培地に加え、ＫＯＨペレットを用いてｐＨを５．８に調整した。接種物を、１００ｍｌのＲＭＧＸ培地（２％：２％）を入れた１２５ｍｌフラスコ中で調製し、所望の温度３０℃または３７℃で、初期ｐＨを５．８とした。
【０１０８】
一晩増殖後、６００ｎｍでのＯＤを測定し、それぞれのフラスコを６００ｎｍでのＯＤが０．１のところで接種し、所望の温度で攪拌器においてインキュベートした。異なる経過時間に試料を採取し、糖、エタノール、および副生成物についてＨＰＬＣ分析を行なった。図３６に示すように、８ｂ組込み体および２０３２組込み体は、ｐＨ非制御下で、培地中のアセテート濃度が２ｇ／Ｌ〜６ｇ／Ｌの場合に、増殖でき、かつキシロースをエタノールへ発酵することができる。これらの濃度でのアセテートによるキシロース利用阻害が、最小であった。
【０１０９】
図３７に示すように、すべての組込み体が、１６ｇ／Ｌのアセテートの存在下においても、さらにはｐＨ制御をしていない培地においても、グルコースおよびキシロースをエタノールに発酵させることができ。増殖培地の最終的なｐＨは、３．５〜４／５であると測定された。ＡＸ１０１およびＣ２５などの３９６７６に基づく、前述の構築された株は、２ｇ／Ｌという低い酢酸濃度によりきわめて強力に阻害されることが分かった。
【０１１０】
実施例１９
以下の実施例は、Ｚ．モビリス株３９６７６および３１８２１が、チモモナスピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）プロモーター（Ｐｐｄｃ）の制御下で、大腸菌リン酸マンノースイソメラーゼ遺伝子（ＭａｎＡ）を含有するプラスミドｐＺＢ７０１（図３８）を用いて形質転換できることを示すものである。
【０１１１】
図３９に示すように、どちらの株の形質転換体も単一の炭素源としてＤ−マンノースを利用することができる。ＭａｎＡの発現を確認するために、生成されたすべての中間体および最終産物（ｐＺＢ８０１を含む）を、ｍａｎＡ（−）宿主のＥ．ｃｏｌｉ  ＧＭＳ４０７の形質転換に用いた。形質転換体を、炭素源としてマンノースを含有するＭｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地に塗布した。マンノースを利用したコロニーは暗いピンク色を示した。プラスミドｐＺＢ７０１を暗いピンク色のコロニーから抽出して、その後のＺ．モビリス２０６Ｃまたは３１８２１の形質転換に用いた。Ｚ．モビリス形質転換体を、テトラサイクリン（Ｔｃr）を含有する接合培地（ＭＭＧ）で選択したのち、マンノース含有培地（ＲＭＭ）で試験した。図３９に示すように、すべての形質転換体は、最初はＲＭＭで増殖することができ、ＲＭＭで数回連続して植継ぎしたところ増殖率の改善がみられた。
【０１１２】
Ｚ．モビリス３１８２１の形質転換のために、ｐＺＢ７０１をＥ．ｃｏｌｉ  Ｊｍ１１０から調製した。これらＴｃr形質転換体は、ＲＭＭで増殖することができた。ＲＭＭで増殖した培養物の上清を分析した結果、３９６７６および３１８２１どちらの形質転換体によっても、エタノールが産生されることが示された。
【０１１３】
マンノース利用遺伝子を含有するプラスミドｐＺＢ７０１はさらに、３９６７６および３１８２１宿主株に基づくＣ２５、ＡＸ１０１、ＡＸ１、３２１（５）、４８１、８ｂ、２０３２、２１２２などの、本発明者が構築したゲノム組込みキシロース発酵株およびアラビノース発酵株を形質転換することができる。ｐＺＢ７０１（ＭａｎＡ遺伝子含有）を有するＺ．モビリス３９６７６および３１８２１における形質転換、および形質転換体によるマンノースからエタノールの発酵の成功が、証明された。前記チモモナス組込み体もまた、プラスミドｐＺＢ７０１を用いて形質転換し、キシロース、アラビノース、マンノース、およびグルコースをエタノールに発酵できるＺ．モビリス株を得ることができる。形質転換されたチモモナス株は、バイオマス工業原料中のキシロース、アラビノース、マンノースおよびグルコースを利用し、それらすべての糖をエタノールに発酵できることが期待される。
【０１１４】
例示の実施態様に関して本発明を説明したが、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく改変がなされ得ることが、認識および理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の原理の記載、説明とともに、本発明の少なくとも１つの実施様態を説明するものである。
【図１】本発明のキシロース同化オペロンを含む、ｐＧＰ７０４におけるＭｉｎｉ−Ｔｎ５  Ｔｃのプラスミドマップである。
【図２】本発明のミニ−Ｔｎ５の一連の構築物を説明するプラスミドマップである。
【図３】ｐＵＣｔａｌｔｋｔＳｆｉのプラスミドマップを生じる一連の構築物の説明図である。
【図４】Ｔａｌプローブを用いるｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ  Ｚ．モビリストランス接合体のサザン解析の結果である。Ｃは対照プラスミドのＴｎ５  ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢである。λＨは、ＤＮＡサイズマーカーである。
【図５】Ｔｎｐプローブを用いるｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢ  Ｚ．モビリストランス接合体のサザン解析の結果である。Ｃは対照プラスミドのｍｉｎｉ−Ｔｎ５  ｔａｌ／ｔｋｔ−ｘｙｌＡｘｙｌＢである。λ／Ｈは、ＤＮＡサイズマーカーである。
【図６】本発明の安定なキシロース発酵Ｚ．モビリスの数種の単離体に関する酵素活性のグラフである。
【図７】図６の４つの単理体（番号２１、２２、５および１１）に関する発酵特性、およびプラスミド保持株３９６７３／ｐＺＢ４およびＢＣ１／ｐＺＢ４Ｌに関するその性能のグラフを示す。
【図８】本発明の安定なキシロース発酵Ｚ．モビリス株Ｃ２５およびＤ９２の安定性を示すグラフ表示である。このグラフは、エタノール生産率およびキシロース利用パラメータを指標として使用した、プラスミド保持およびゲノム組込みキシロース発酵株の安定性を示す。本発明の株Ｃ２５およびＤ９２は、９０世代以上のあいだ、安定を維持した。発酵培地は、１％グルコースおよび５％キシロースを含むＲＭからなり、温度は３０℃で一定であった。
【図９】本発明にしたがい、ｐＨ５．０およびｐＨ５．５、３０℃で、４．５％グルコース、および％キシロースを含むＲＭ培地で、ゲノム組込みキシロース発酵株Ｃ２５、Ｄ９２のバッチ発酵に関する、バイオマス濃度（ａ）、エタノール濃度（ｂ）、キシロース利用（ｃ）、および％キシロース利用と比較した生産率を示す。
【図１０】組込みプラスミドｐＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａのマップである。ａｒａＢＡＤをｌｄｈＬのＮｏｔＩ部位に挿入し、ｌｄｈを破壊する。構築物は、Ｚ．モビリスの複製プラスミドｐＺＢ１８６２をベースとする。
【図１１】Ｔｎ１０Ｇのプラスミドマップである。ＩＳ１０Rは、トランスポーゼース遺伝子である。ＩＲは、トランスポゾンの逆方向反復配列である。ａｒａＢＡＤを、ＮｏｔＩ部位の２つの逆方向反復配列のあいだに挿入した。
【図１２】ＤＩＧ−ａｒａおよびＤＩＧ−ｌｄｈプローブを用いた、相同組換えより得られたゲノム組込みキシロース／アラビニース発酵Ｚ．モビリス株のサザン解析を示す。ＡＸ１、１３、２３、１０１、１０４および１０７は、ａｒａＢＡＤ組込み体である。Ｃ２５は宿主対照であり、ＰＺＢ１８６２−ｌｄｈＬ−ａｒａは、ＤＨ５αから単離されたプラスミド対照である。λ／Ｈは、分子量マーカー（２３、９．４、６．６、４．３、２．３および２．０ｋｂ）である。
【図１３】ＤＩＧ−ｔｎｐおよびＤＩＧ−ａｒａプローブを用いた、トランスポゾン組込みより得られたゲノム組込みキシロース／アラビニース発酵Ｚ．モビリス株のサザン解析を示す。Ｇ５、６、１１、１５、１７、１４および１９は、ａｒａＢＡＤ組込み体である。Ｃ２５は宿主対象である。Ｔｎ１０Ｇはプラスミド対照である。λ／Ｈは、分子量マーカー（２３、９．４、６．６、４．３、２．３および２．０ｋｂ）である。図１３（ａ）は、ｔｎｐプローブ、ＰｓｔＩ消化物であり、図１３（ｂ）は、ａｒａプローブ、ＰｓｔＩ消化物である。
【図１４】ゲノム組込み株の、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼの酵素活性の棒グラフを示す。２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１はプラスミド対照である。２０６Ｃは宿主対象である。Ｃ２５は、キシロース発酵組込み体である。Ｇ８は、Ｔｎ１０転位より得られたキシロース／アラビノース発酵組込み体である。ＡＸ１およびＡＸ１０１は、相同組換えより得られたキシロース／アラビノース発酵組込み体である。
【図１５】ゲノム組込み株の、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼおよびＬ−リブロース−５リン酸−４−エピメラーゼの酵素活性の結果を、棒グラフに示す。２０６Ｃ／ｐＺＢ３０１はプラスミド対照である。２０６Ｃは宿主対照である。Ｃ２５はキシロース発酵組込み体である。Ｇ８は、Ｔｎ１０転位より得られたキシロース／アラビノース発酵組込み体である。ＡＸ１およびＡＸ１０１は、相同組換えより得られたキシロース／アラビノース発酵組込み体である。
【図１６】Ｔ＝３０℃でｐＨ制御なしでのＲＭＧＸＡ（１：２：２％）における、ゲノム組込みキシロースおよびアラビノース発酵チモモナス株のエタノール生産率の結果を、棒グラフに示す。これらの株は、非選択培地での種々の世代にて、培養液より接種したものである。
【図１７】３０℃でｐＨ制御での、１％グルコース、２％キシロースおよび２％アラビノースを含むＲＭにおける、ゲノム組込みキシロースおよびアラビノーズ発酵チモモナス株の、キシロースおよびアラビノース利用の結果を、棒グラフに示す。これらの株は、非選択培地上での種々の世代にて、培養液より接種したものである。
【図１８】ｐＨ５．５、３０℃での、４％グルコース、４％キシロースおよび２％アラビノースを含むＲＭ中における、ゲノム組込みキシロースおよびアラビノース発酵チモモナス株の、発酵能を表す線グラフである。
【図１９】Ｚ．モビリス株３１８２１への相同組換え用の、ｐＺＢ５１０ＸＴｃ（１９Ａ）およびｐＺＢ５１２ＸＴｃ（１９Ｂ）のプラスミドマップである。
【図２０】Ｚ．モビリス３１８２１への組込み転位用の、ｐＭＯＤＰenoｔａｌｔｋｔＣｍのプラスミドマップである。
【図２１】図２１ＡおよびＢは、Ｚ．モビリス３１８２１の組込み体のサザンハイブリッドブロットを表す。プローブｘｙｌＢ（２１Ａ）およびｔｋｔ（２１Ｂ）を本実験で使用した。プラスミド対照には、ｐＭＯＤＰenoｔａｌｔｋｔＣｍＰＺＢ５１０ＸＴｃおよびｐＺＢ５１２ＸＴｃを含まれ、またｉｎｔ２／３２１のＰgapｘｙｌＡＢは、ｐＺＢ５１２ＸＴｃ由来であることに注意。ｉｎｔ２／１８２１のＰgapｘｙｌＡＢはｐＺＢ５１０ＸＴｃ由来であった。λ／Ｈは分子量マーカーとして使用した。
【図２２】ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃８、ｉｎｔ２／３２１、ｉｎｔ２／１８２１および対照株の酵素活性を示す棒グラフを表す。
【図２３】ＲＭＸ培地でのｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃４、ｘ９ｔ（ｅｎｏｔｔ）Ｐｉ＃８、ｉｎｔ２／３２１およびｉｎｔ２／１８２１の増殖適応のグラフ的表示である。
【図２４】Ｚ．モビリス３１８２１への組込み転位用の、ｐＭＯＤＰgapｔａｌｔｋｔＣｍのプラスミドマップである。
【図２５】ＲＭＸ培地での、＃２０および＃２１の増殖適応のグラフ的表示である。
【図２６】図２６ＡおよびＢは、Ｚ．モビリス３１８２１の組込み体に関する、サザンハイブリダイゼーションブロットを表す。プローブｘｙｌＢ（２６Ａ）およびｔｋｔ（２６Ｂ）を本実験で使用した。プラスミド対照には、ｐＭＯＤＰenoｔａｌｔｋｔＣｍ、ｐＭＯＤＰgapｔａｌｔｋｔＣｍおよびｐＺＢ５１２ＸＴｃが含まれ、また３２１（５）１のＰgapｘｙｌＡＢは、ｐＺＢ５１２ＸＴｃ由来であることに注意。λ／Ｈは、分子量マーカーとして使用した。
【図２７】図２７Ａ〜Ｃは、チモモナス組込み体に関する、ＲＭＧＸでの、キシロース（２７Ａ）およびグルコース（２７Ｂ）利用およびエタノール産生（２７Ｃ）を示す。
【図２８】図２８ＡおよびＢは、チモモナス組込み体に関する、ＲＭＸでの、キシロース（２８Ａ）利用およびエタノール産生（２８Ｂ）を示す。
【図２９】図２９Ａ〜Ｃは、ｐＨ制御発酵における、チモモナス組込み体に関する、ＲＭＧＸ（１％：６％）での、グルコース（２９Ａ）およびキシロース（２９Ｂ）利用およびエタノール産生（２９Ｃ）を示す。
【図３０】図３０Ａ〜Ｃは、ｐＨ制御発酵における、チモモナス組込み体に関する、ＲＭＧＸ（３．５％：３．５％）での、グルコース（３０Ａ）およびキシロース（３０Ｂ）利用およびエタノール産生（３０Ｃ）を示す。
【図３１】安定性試験の説明である。
【図３２】図３２ＡおよびＢは、本発明にしたがった、安定なキシロース発酵Ｚ．モビリス株２０３２、８Ｂ、４８１および２／３２１−２の安定性を示すグラフ表示である。グラフは、キシロース利用（３２Ａ）およびエタノール生産率（３２Ｂ）を用いた、ゲノム組込みキシロース発酵株の安定性を示す。本発明の株２０３２、８Ｂ、４８１および２／３２１−２は、８０世代以上安定性を維持した。発酵培地は、２％グルコースおよび２％キシロースを含むＲＭからなり、温度は３０℃で一定であった。
【図３３】図３３ＡおよびＢは、本発明にしたがった、安定なキシロース発酵Ｚ．モビリス株８Ｂ、２０３２、４８１およびプラスミド保持株（３１８２１／ｐＺＢ５）の安定性を示すグラフ表示である。グラフは、キシロース利用（３３Ａ）およびエタノール生産率（３３Ｂ）を用いた、ゲノム組込みキシロース発酵株の安定性を示す。本発明の株２０３２、８Ｂ、４８１は、８０世代以上安定性を維持した。発酵培地は、２％グルコースおよび２％キシロースを含むＲＭからなり、温度は３７℃で一定であった。
【図３４】図３４Ａ〜Ｆは、ｐＨ５．０、５．５および６．０における、アセテート存在下での、グルコース利用（３４Ａ）、キシロース利用（３４Ｂ）、アラビノース利用（３４Ｃ）、増殖（３４Ｄ）、エタノール産生（３４Ｅ）およびエタノール生産率（３４Ｆ）特性を示すグラフ表示である。
【図３５】図３５ＡおよびＢは、アセテート濃度の増加を伴う、グルコースおよびキシロースからの連続的かつ定常的なエタノール産生（３５Ａ）および副生産物形成（３５Ｂ）を示すグラフ表示である。
【図３６】図３６ＡおよびＢは、０、２、４および６ｇ／Ｌの濃度のアセテート存在下での、キシロース利用（３６Ａ）およびエタノール生産率（３６Ｂ）を示すグラフ表示である。
【図３７】図３７ＡおよびＢは、０、８、１２および１６ｇ／Ｌの濃度のアセテート存在下での、キシロース利用（３７Ａ）およびエタノール生産率（３７Ｂ）を示すグラフ表示である。
【図３８】マンノース利用遺伝子を含むｐＺＢ７０１のプラスミドマップである。
【図３９】図３９ＡおよびＢは、ＲＭＭ培地での、＃２、４、６、１３および１９の増殖適応を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
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【図３４Ｆ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際調査報告】
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