(57)【要約】本発明は、炎症性応答、炎症、または炎症もしくは炎症性応答により調節され、影響を受け、または引き起こされる疾患および／もしくは状態の防止、処置、誘導または他の所望の調節のためのヒスタミンＨ４レセプター調節物質の使用に関する。また本発明は特定部位への移動のような多形核白血球応答、または多形核白血球により調節され、影響をうけ、または引き起こされる疾患および／もしくは状態の防止、処置、誘導または他の所望の調節のためのヒスタミンＨ４レセプター調節物質の使用に関する。また本発明は脱−顆粒のようなマスト細胞応答、またはマスト細胞により調節され、影響をうけ、または引き起こされる疾患および／もしくは状態の防止、処置、誘導または他の所望の調節のためのヒスタミンＨ４レセプター調節物質の使用に関する。
2005539207.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質活性を調節する化合物の同定法であって：
ａ）哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質活性の推定上の調節物質化合物を、哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質および既知のヒスタミンレセプターＨ４リガンドと合わせ；そして
ｂ）該調節物質がタンパク質機能またはリガンドに結合するその能力に及ぼす効果を測定し、該効果は阻害、活性化、アンタゴニスト、アゴニストまたはリバースアゴニスト活性であり、
ここで該調節物質化合物は炎症または炎症性応答の調節物質である、上記方法。
【請求項２】
工程（ｂ）で測定される効果が工程（ａ）の調節物質とヒスタミンＨ４レセプターの既知のリガンドとの間のレセプターへの結合に対する競合である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）で測定される効果がヒスタミンＨ４レセプター細胞内第二メッセンジャーの調節である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞内第二メッセンジャーがｃＡＭＰ、カルシウムおよびレポーター遺伝子産物からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプター機能のインヒビターおよびインビボまたはインビトロで炎症または炎症性応答のインヒビターである、請求項１に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項６】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプターのアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストであり、そしてインビトロまたはインビボで炎症または炎症性応答を調節する、請求項１に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項７】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質の発現を調節し、そしてインビトロまたはインビボで炎症または炎症性応答を調節する、請求項１に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項８】
化合物が炎症または炎症性応答の調節物質である、請求項１に記載の方法で活性な化合物および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の製薬学的組成物を投与することを含んでなる、炎症およびヒスタミンＨ４レセプターにより媒介される炎症または疾患または状態を調節するような処置が必要な患者の処置法。  
【請求項１０】
インビトロまたはインビボで炎症または炎症性応答を調節する、哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質と免疫的に反応性の単一特異性抗体。
【請求項１１】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質のヒスタミン結合または活性化を遮断し、インビトロまたはインビボで炎症または炎症性応答を調節する、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質活性を調節する化合物を同定する方法であって：
ａ）哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質活性の推定上の調節物質化合物を、哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質および既知のヒスタミンレセプターＨ４リガンドと合わせ；そして
ｂ）該調節物質がタンパク質機能またはリガンドに結合するその能力に及ぼす効果を測定し、該効果は阻害、活性化、アンタゴニスト、アゴニストまたはリバースアゴニスト活性であり、
ここで該調節物質化合物は多形核白血球活性化の調節物質である上記方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）で測定される効果が工程（ａ）の調節物質とヒスタミンＨ４レセプターの既知のリガンドとの間のレセプターへの結合に対する競合である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）で測定される効果がヒスタミンＨ４レセプター細胞内第二メッセンジャーの調節である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
細胞内第二メッセンジャーがｃＡＭＰ、カルシウムおよびレポーター遺伝子産物からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプター機能のインヒビターおよびインビボまたはインビトロで多形核白血球活性化のインヒビターである、請求項１２に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項１７】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプターのアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストであり、そして上記化合物がインビトロまたはインビボで多形核白血球活性化を調節する、請求項１２に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項１８】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質の発現を調節し、そしてインビトロまたはインビボで多形核白血球活性化を調節する、請求項１２に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項１９】
化合物が多形核白血球活性化の調節物質である、請求項１２に記載の方法で活性な化合物および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の製薬学的組成物を投与することを含んでなる、多形核白血球活性化およびヒスタミンＨ４レセプターにより媒介される炎症または疾患または状態を調節するような処置が必要な患者の処置法。  
【請求項２１】
インビトロまたはインビボで多形核白血球活性化を調節する、哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質と免疫的に反応性の単一特異性抗体。
【請求項２２】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質のヒスタミン結合または活性化を遮断し、インビトロまたはインビボで多形核白血球活性化を調節する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質活性を調節する化合物の同定法であって：
ａ）哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質活性の推定上の調節物質化合物を、哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質および既知のヒスタミンレセプターＨ４リガンドと合わせ；そして
ｂ）該調節物質がタンパク質機能またはリガンドに結合するその能力に及ぼす効果を測定し、該効果は阻害、活性化、アンタゴニスト、アゴニストまたはリバースアゴニスト活性であり、
ここで該調節物質化合物はマスト細胞活性化の調節物質である上記方法。
【請求項２４】
工程（ｂ）で測定される効果が工程（ａ）の調節物質とヒスタミンＨ４レセプターの既知のリガンドとの間のレセプターへの結合に対する競合である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）で測定される効果がヒスタミンＨ４レセプター細胞内第二メッセンジャーの調節である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
細胞内第二メッセンジャーがｃＡＭＰ、カルシウムおよびレポーター遺伝子産物からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプター機能のインヒビターおよびインビボまたはインビトロでマスト細胞活性化のインヒビターである、請求項２３に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項２８】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプターのアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストであり、そしてインビトロまたはインビボでマスト細胞の活性化を調節する、請求項２３に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項２９】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質の発現を調節し、そしてインビトロまたはインビボでマスト細胞の活性化を調節する、請求項２３に記載の方法を使用して同定される化合物。
【請求項３０】
化合物がマスト細胞活性化の調節物質である、請求項２３に記載の方法で活性な化合物および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の製薬学的組成物を投与することを含んでなる、マスト細胞の活性化およびヒスタミンＨ４レセプターにより媒介される炎症または疾患または状態を調節するような処置が必要な患者の処置法。  
【請求項３２】
インビトロまたはインビボでマスト細胞の活性化を調節する、哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質と免疫的に反応性の単一特異性抗体。
【請求項３３】
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプタータンパク質のヒスタミン結合または活性化を遮断し、インビトロまたはインビボでマスト細胞の活性化を調節する、請求項３２に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は炎症性応答、炎症、または炎症もしくは炎症性応答により調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）され、影響を受け、または引き起こされる疾患および／もしくは状態の防止、処置、誘導または他の所望の調節のためのヒスタミンＨ４レセプター調節物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒスタミンはグアニンヌクレオチド結合タンパク質を介して細胞内経路に連結する細胞表面レセプターを通してシグナルを発する多機能性化学伝達物質である。このクラスのヒスタミン結合細胞表面レセプターは、Ｇ−タンパク質共役レセプターまたはＧＰＣＲｓと呼ばれるレセプターの広いファミリーの一部である。ヒスタミンレセプターには現在、薬理学的に定義され、そしてＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＨ４分類に分けられる４つのサブタイプがある（Ｈｉｌｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９７）。Ｈ１ヒスタミンレセプターはクローン化され（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）、そしてアレルギー応答において平滑筋に及ぼすヒスタミンの効果を遮断するためにジフェンヒドラミンのような薬剤の標的である。Ｈ２ヒスタミンレセプターはクローン化され（Ｇａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）、そして胃の酸分泌に及ぼすヒスタミンの効果を遮断するためにラニチジンのような薬剤の標的である。１９８３年に存在することが推定された（Ａｒｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）Ｈ３ヒスタミンレセプターはクローン化され（Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、そして現在は中枢神経系薬剤を開発するための標的である。未知のクラスのヒスタミンレセプターにより媒介され得るヒトにおけるヒスタミンの多数のさらなる機能が存在する。例えばヒスタミンは白血球の走化性因子であり、皮膚、鼻、目および肺のようなアレルギー性攻撃の領域にそれらの蓄積を引き起こす（ｄｅ  Ｖｏｓ，１９９９）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要約
本発明は、炎症および／もしくは炎症性応答、および炎症および／もしくは炎症性応答により媒介される疾患および状態の処置および／または防止のためのヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストの使用に関する。ヒスタミンＨ４レセプターの調節物質は、ヒスタミンＨ４レセプター調節物質がＨ４レセプター活性のアゴニスト、インバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）アゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかに依存して、炎症性応答の誘導ならびに阻害を含む哺乳動物における炎症性応答を調節するために使用することができる。白血球またはマスト細胞により媒介される炎症および炎症性応答は、ヒスタミンＨ４レセプターのアンタゴニストまたはインヒビターを用いた処置により阻害される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００４】
発明の詳細な説明
哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプターをコードするＤＮＡ分子はクローン化され、そして特性決定され、そしてＧ−タンパク質に共役するクラスのレセプターの新たなメンバーを表す［Ｃｈａｎｇｌｕ  Ｌｉｕ，Ｓａｎｄｙ  ｊ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔｅｒ  Ｋｕｅｉ，ａｎｄ  Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｗ．Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，（２００１），２９９（１）：１２１−１３０］。組換え発現系を使用して、これらヒスタミンＨ４レセプターをコードする機能的ＤＮＡ分子がマウス、ラット、モルモットおよびヒトから単離された。これらタンパク質の生物学的および構造的特性が、アミノ酸およびヌクレオチド配列のように開示された。組換えタンパク質は限定するわけではないが、ヒトヒスタミンＨ４レセプターの調節物質の同定を含む様々な目的に有用である。特にモルモット、ラットおよびマウス種が新規な化学物質の臨床前評価に通常使用されるので、マウス、ラットおよびモルモットのヒスタミンＨ４レセプターには、限定するわけではないが異なる哺乳動物種間で観察される薬理学的差異の分析を含め、様々な用途がある。そのような調節物質にはアゴニスト、アンタゴニストおよびインバースアゴニストを含むことができる。本明細書に開示するアッセイにより同定される調節物質は、例えば治療薬、予防薬および診断薬として有用である。該治療薬用の適応症には限定するわけではないが、喘息、アレルギー、炎症、心血管および脳血管障害、非−インスリン依存性糖尿病、高血糖症、便秘症、不整脈、神経内分泌系の障害、ストレスおよび痙性、ならびに酸分泌、潰瘍、気道狭窄および前立腺機能不全を含む。組換えＤＮＡ分子およびその部分は、限定するわけではないがＤＮＡ分子の相同体の単離、ＤＮＡ分子のゲノム均等物の同定および単離、およびＤＮＡ分子の突然変異体の同定、検出または単離を含む様々な使用を有する。本明細書で使用するヒトヒスタミンＨ４レセプターは、Ｈ４サブクラスのヒスタミンに対するレセプターとして特異的に機能することができるタンパク質を指す。
【０００５】
炎症は外傷もしくは他の身体的刺激、化学的刺激、生物病原体の感染もしくは存在、または外部の物体による侵襲のような出来事により誘導される哺乳動物の正常な保護的または防御的応答である。炎症性応答は疼痛、体温の上昇、赤み、腫大および場合により機能の阻害または損失を特徴とする。これら兆候のすべてまたは幾つかのみがある期間に存在し得るが、それらの１つが常に存在する必要はない。これらの症状は細胞の作用ならびに細胞により生産される化学物質または物質から生じる一連の相互に関連する反応によるものであり、そしてそのような反応には血管の拡張、流体および血漿タンパク質の滲出および白血球の損傷もしくは刺激領域への移動を含むことができる。感染または他の刺激を防ぐために必要な炎症性応答と、炎症性疾患を導く可能性がある過剰応答との間に微妙なバランスが存在する。アレルギー、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アテローム硬化症、および慢性関節リウマチおよび狼瘡を含む自己免疫疾患のような多くの病状は、過剰なまたは長期炎症を特徴とする。ほとんどのこれら状態が白血球の炎症領域への漸増により進められ、したがってこれを遮断する作用物質は主な治療効果を有することができる。
【０００６】
当該技術分野で周知な炎症が媒介する疾患または状態には、限定するわけではないが活動性炎、急性炎、癒着性炎、アレルギー性炎、変質性炎、萎縮性炎、カタル性炎、慢性炎、慢性活動性炎、退行性炎、滲出性炎、線維素性化膿性炎、線維素炎、線維様炎、肉芽性炎、増殖性（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ）炎、免疫性炎、間質性炎、壊死性炎、増殖性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）炎、増殖性（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）炎、偽膜性炎、化膿性炎、硬化性炎、漿液線維素炎、漿液炎、亜急性炎および化膿性（ｓｕｐｐｅｒａｔｉｖｅ）炎を含む。
【０００７】
マスト細胞は炎症性反応の重要な部分であり、そしてマスト細胞の脱−顆粒（エキソサイトーシス）はヒスタミンにより調節される蕁麻疹および発赤反応を最初に特徴とし得る炎症性反応を導く。広範な種類の刺激物がマスト細胞の活性化を導き、そして続いてそれらが特定場所へ移動すること（漸増）および／または脱−顆粒を受けることを引き起こすことができる。これらの刺激物は免疫性（抗体またはアレルゲンのような）または非免疫性（化学品のような）であり得る。マスト細胞の活性化はアレルギー性の炎症性応答を開始し、これが次に炎症性応答にさらに貢献する他のエフェクター細胞の漸増を引き起こす。ヒスタミンＨ１レセプターはこの種の炎症性応答に重要であり、一方、ヒスタミンＨ２レセプターは胃酸分泌を調節し、そしてヒスタミンＨ３レセプターは中枢神経系における神経伝達物質の放出に影響を与える。最近、ヒスタミンレセプターＨ４がクローン化され、そして限定するわけではないが白血球およびマスト細胞を含む種々の細胞で発現されることが証明された。
【０００８】
多数の医学書が出版され、周知であり、そして関連する技術分野の当業者は容易に利用することができる。炎症の分野においてさらに多数の科学および医学研究刊行物が出版された。炎症を主題とした広く利用することができる出版された教科書の例は、Ｊ．Ｉ．Ｇａｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓｙｎｄｅｒｍａｎ、炎症：基本原理および臨床的相関（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ）、第３版、（リッピンコット  ウィリアムス  アンド  ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、フィラデルフィア、１９９９）；Ｖ．Ｓｔｖｒｔｉｎｏｖａ，Ｊ．Ｊａｋｕｂｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｈｕｌｉｎ、「炎症および発熱（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｖｅｒ）」、疾患の病態生理学的原理（Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）（医学生用の教科書、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９５）；Ｃｅｃｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、医学テキスト（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第１８版（Ｗ．Ｂ．サンダース社（Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９８８）；およびステッドマン医学大辞典を含む。
【０００９】
本発明はヒスタミンＨ４レセプターが炎症性応答、そして特に白血球の炎症部位への漸増に関与し、そしてこのレセプターに対するアンタゴニストが炎症物質であることを証明する。本発明はヒスタミンＨ４レセプターにより直接的または間接的に媒介される炎症性応答を調節する方法を提供する。本発明はヒスタミンＨ４レセプターの調節物質で哺乳動物を処置することを通して、ヒスタミンＨ４レセプターにより媒介される炎症性応答を阻害し、防止し、軽減し、誘導し、またはそうではなく影響を及ぼす方法も提供する。本発明の方法に有用なヒスタミンＨ４レセプターの調節物質には、限定するわけではないがヒスタミンＨ４レセプターに結合する抗体および抗体フラグメント、限定するわけではないがタンパク質、核酸または他の有機分子を含むヒスタミンＨ４レセプターのインヒビター、アクチベーター、アンタゴニスト、アゴニストおよびリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）アゴニストを含む。これらの調節物質は必要なヒトに投与するために有用であり、そして限定するわけではないが非ヒト哺乳動物を含む非ヒト動物に投与するための獣医学的目的にも有用である。
【００１０】
ヒスタミンはほぼすべての生理学的および病態生理学的状況において、かなりの能力で機能する生物起源のアミン伝達物質である。ヒスタミンは中枢神経系では神経伝達物質および神経調節物質として作用し、炎症性およびアレルギー性応答を媒介し、気道の機能を調節し、胃中の酸分泌を制御し、心血管機能ならびに動脈および静脈応答を調節し、そして疑いなく未だ決定されていないプロセスに関与している。これらの効果を媒介するヒスタミンレセプターは完全に特性決定されていない。どのヒスタミンレセプターがこれらのプロセスに関与しているかを理解する１つの方法は、研究道具および治療用の物体としてレセプターの化学的調節物質（アゴニスト、アンタゴニストおよびインバースアゴニストのような）を開発することである。哺乳動物のヒスタミンＨ４レセプターを発現する組換え宿主細胞を使用して、そのようなアゴニストおよびアンタゴニストを同定するスクリーニング法のための材料を提供することができる。そのようなものとして本発明の哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターは、研究道具として有用であると示すことができ、または炎症性応答および炎症のようなヒスタミンレセプターが直接もしくは間接的に関与する障害を処置するための治療薬として使用することができる新規アゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法を直接教示する。ヒスタミンＨ４レセプターの化合物相互作用または調節を検出するアッセイは、限定するわけではないが、直接リガンド結合アッセイ、競合（または置換）リガンド結合アッセイ、または例えばｃＡＭＰの生産によりリガンドに対するレセプターの応答を測定する機能的アッセイを含む。これらのアッセイは当業者には既知であるが、これまでそれらは本明細書に教示する組換え分子を得る前には可能ではなかった。
【００１１】
哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターに対する単一特異性抗体は、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターに対して反応性の抗体を含有する哺乳動物の抗血清から精製されるか、あるいはＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７の教示を使用して、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターと反応性のモノクローナル抗体として調製される。本明細書で使用する単一特異性抗体は、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターに対して均一な結合特性を持つ単一の抗体種または多くの抗体種と定義する。本明細書で使用する均一な結合とは、上記のように哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターと会合するもののような特異的抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力を称する。哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物（ウサギが好ましい）を、免疫アジュバントを含むか含まない適当な濃度の哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターを用いて免疫感作することにより生じる。
【００１２】
前免疫血清を初回免疫感作前に集める。各動物は許容され得る免疫アジュバントと会合した約０．１から約１０００ｍｇの間の哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターを受ける。そのような許容されうるアジュバントには限定するわけではないが、フロインド完全、フロインド不完全、明礬−沈殿物、コリネバクテリウム  パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）およびｔＲＮＡを含む油中水型のエマルジョンを含む。初回免疫感作は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）のいずれか、または両方の多くの部位で、好ましくはフロインド完全アジュバント中の哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターからなる。各動物は定期的間隔、好ましくは毎週、抗体力価を決定するために採血される。動物は初回免疫感作後に追加免疫注射を受けても受けなくてもよい。追加免疫注射を受けるこれらの動物は、一般にフロインド不完全アジュバント中に等量の抗原を同じ経路により与えられる。追加免疫注射は約３週間の間隔で、最大の力価が得られるまで与えられる。各追加免疫感作から約７日後、または単回の免疫感作から約１週間後に、動物から採血し、血清を集め、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。
【００１３】
哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系交配マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃを哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターおよびそのフラグメントで免疫感作することにより調製する。マウスは、上記のような許容され得る等容量のアジュバントに包含された約０．５ｍｌのバッファーまたは塩水中の約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇの哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターで、ＩＰまたはＳＣ経路により免疫感作する。フロインド完全アジュバントが好ましい。マウスは０日に初回免疫感作を受け、そして約３〜３０週間休ませる。免疫感作したマウスは、リン酸緩衝化生理食塩水のようなバッファー溶液中、約０．１〜約１０ｍｇの哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターの１回以上の追加免疫感作を静脈内（ＩＶ）経路で受ける。抗体陽性マウスに由来するリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球は、当該技術分野で知られている標準的手順により免疫感作マウスから脾臓を摘出することにより得る。ハイブリドーマ細胞は、脾臓のリンパ球を適切な融合パートナー、好ましくはミエローマ細胞と、安定なハイブリドーマが形成できる条件下で混合することにより生産される。融合パートナーには限定するわけではないが、マウスミエローマＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を含むがＳｐ２／０が一般には好ましい。抗体生産細胞およびミエローマ細胞は、約３０％〜約５０％濃度の約１０００モル分子量のポリエチレングリコール中で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞はヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での成長により当該技術分野で既知の手順で選択される。上清流体は約１４、１８および２１日に成長陽性ウェルから集め、そして抗体の生産を抗原として哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターを使用する固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイによりスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈殿アッセイで試験してｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ「ソフト寒天法（Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、組織培養法および応用（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ）（編集）、アカデミック出版、１９７３）のソフト寒天法のような技法によりクローン化される。
【００１４】
モノクローナル抗体は、プリスタンで感作したＢａｌｂ／ｃマウスを感作から約４日後に、マウスあたり約０．５ｍｌで、約２×１０６〜約６×１０６のハイブリドーマ細胞を注射することによりインビボで生産される。細胞の転移から約８〜１２日後に腹水を集め、そしてモノクローナル抗体を当該技術分野で既知の方法により精製する。
【００１５】
抗−哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターｍＡｂのインビトロ生産は、十分量の特異的ｍＡｂを得るために、約２％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを成長させることにより行う。ｍＡｂは当該技術分野で既知の方法により精製する。腹水またはハイブリドーマカルチャー流体の抗体力価は、限定するわけではないが沈殿、受動凝集反応、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法を含む種々の血清学または免疫学アッセイにより決定する。同様のアッセイを使用して体液または組織および細胞抽出物中の哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターの存在を検出する。
【００１６】
当業者には上記の単一特異性抗体の生産法が、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターポリペプチドフラグメント、または完全長のナセント哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターポリペプチド、または個々の哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターエピトープに特異的な抗体を生産するために利用することができることは直ちに明白である。具体的には当業者には哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター部分または完全に機能的なヒスタミンＨ４レセプターの唯一の種に特異的な単一特異性抗体を生成できることは直ちに明白である。また当業者は、ヒスタミンＨ４レセプターに特異的な抗体が、限定するわけではないがレセプターを活性化または不活性化し、そのリガンドへの結合を遮断し、その結合したリガンドからの放出を遮断し、またはヒスタミンＨ４レセプターに関連する正常な様式で機能することを防止することを含め、レセプターの機能的活性における変化を引き起こすことができることは明白である。
【００１７】
ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターをコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列は、アンチセンス治療のために合成することができる。これらのアンチセンス分子はＤＮＡ、ホルホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘導体、または他のヒト  ヒスタミンＨ４レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド模造物であることができる。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームのカプセル化により、またはアンチセンス配列を持つベクターからの発現により細胞に導入することができる。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターアンチセンス治療は、ヒト  ヒスタミンＨ４レセプター活性を低減することが有利である疾患の処置に特に有用となり得る。
【００１８】
ヒト  ヒスタミンＨ４レセプター遺伝子治療は、ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターを標的生物の細胞に導入するために使用することができる。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプター遺伝子は、受容宿主細胞の感染によりヒト  ヒスタミンＨ４レセプターＤＮＡの転移を媒介するウイルスベクターに連結することができる。適当なウイルスベクターにはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等を含む。あるいはヒト  ヒスタミンＨ４レセプターＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ結合物またはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合物を使用するレセプター媒介型の標的化ＤＮＡ転移、リポフェクチン膜融合または直接的なマイクロインジェクションを含む非ウイルス技術により遺伝子治療のために細胞に転移させることができる。これらの手順およびその変法は、エクスビボならびにインビボヒト  ヒスタミンＨ４レセプター遺伝子治療に適当である。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプター遺伝子治療は、ヒトヒスタミンＨ４レセプター活性を上げること有利な疾患の処置に特に有用となり得る。
【００１９】
本発明は哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現ならびにインビトロおよびインビボで哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプタータンパク質の機能を調節する化合物をスクリーニングする方法も対象とする。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質または非タンパク質様有機分子であることができる。化合物は哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいは哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプタータンパク質の機能を上昇または弱めることにより調節することができる。哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいは哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプタータンパク質の機能を調節する化合物は、種々のアッセイにより検出することができる。アッセイはレセプターをコードする核酸の発現の変化、またはレセプタータンパク質の機能もしくは活性の変化があるかどうかを決定するための単純な「イエス／ノー」アッセイでよい。アッセイは試験サンプルの発現または機能を標準サンプル中のレセプター発現またはレセプタータンパク質機能のレベルと比較することにより定量的にすることができる。この工程で同定される調節物質は、治療薬、研究用の道具および診断薬として有用である。
【００２０】
哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターのＤＮＡもしくはＲＮＡ、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターに対する抗体、または哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプタータンパク質を含むキットを調製することができる。そのようなキットは哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターのＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出するために、またはサンプル中の哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプタータンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検出するために使用する。そのような特性決定は限定するわけではないが、法医学分析、診断的応用および疫学的研究を含む様々な目的に有用である。
【００２１】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体は、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターのＤＮＡ、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターのＲＮＡ、または哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプタータンパク質のレベルをスクリーニングし、そして測定するために使用することができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体はそれら自体が、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターの検出および類型化（ｔｙｐｉｎｇ）に適するキットの形成に役立つ。そのようなキットは閉鎖されたコンファインメント（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）に少なくとも１つの容器を保持するために適する区画化された担体を含んでなる。担体はさらに組換え哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプタータンパク質または哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターを検出するために適する抗−哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター抗体のような試薬を含んでなる。担体はまた標識された抗原または酵素基質等のような検出手段を含むことができる。
【００２２】
哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターをコードするＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列は、アンチセンス治療のために合成することができる。これらのアンチセンス分子はＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘導体、または他の哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド模築物を含む。哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化により、またはアンチセンス配列を持つベクターからの発現により細胞に導入することができる。哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターアンチセンス治療は、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター活性を低減することが有利である疾患の処置に特に有用となり得る。
【００２３】
哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター遺伝子治療は、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターを標的器官の細胞に導入するために使用することができる。哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター遺伝子は、受容宿主細胞の感染により哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターＤＮＡの転移を媒介するウイルスベクターに連結することができる。適当なウイルスベクターにはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等を含む。あるいは哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ結合物もしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合物を使用するレセプター媒介型の標的化ＤＮＡ転移、リポフェクチン膜融合または直接的なマイクロインジェクションを含む非ウイルス技術により遺伝子治療のために細胞に転移させることができる。これらの手順およびその変法は、エクスビボならびにインビボ哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター遺伝子治療に適当である。哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター遺伝子治療は、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター活性を上げることが有利な疾患の処置に特に有用となり得る。
【００２４】
哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターのＤＮＡ、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターのＲＮＡ、または哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプタータンパク質、または哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター活性の調節物質を含んでなる製薬学的に有用な組成物は、製薬学的に許容され得る担体の混合によるような既知の方法に従い配合することができる。そのような担体および配合法の例は、レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に見いだすことができる。効果的な投与に適する製薬学的に許容され得る組成物を形成するために、そのような組成物は有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは調節物質を含む。
【００２５】
本発明の治療用または診断用組成物は、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターに関連する活性の調節が示される障害を処置または診断するために十分な量で個体に投与される。有効量は個人の条件、体重、性別および年齢のような種々の因子に従い変動してよい。他の因子には投与様式を含む。製薬学的組成物は皮下、局所、経口および筋肉内のような種々の経路により個体に提供され得る。
【００２６】
用語「化学的誘導体」は、通常は基本的分子の一部ではないさらなる化学的部分を含む分子を示す。そのような部分は基本分子の溶解性、半減期、吸収等を改善することができる。あるいはこの部分は基本分子の望ましくない副作用を弱め、または基本分子の毒性を下げることができる。そのような部分の例はレミングトンの製薬科学のような様々なテキストに記載されている。
【００２７】
本明細書に開示する方法に従い同定される化合物は、いかなる潜在的毒性も最少にすると同時に哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターまたはその活性の最適な阻害を得るために、日常的な試験により定められた適切な投薬用量で単独で使用することができる。さらに、他の作用物質の同時投与または順次投与も望ましい。
【００２８】
本発明は本発明の新規処置法に使用するために、適当な局所用、経口用、全身用および非経口用製剤を提供する目的も有する。哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターの調節に使用するための有効成分として本発明に従い同定される化合物または調節物質を含む組成物は、投与に通例の賦形剤中、広い種類の治療用剤形で投与することができる。例えば化合物または調節物質は錠剤、カプセル（各々が時限放出および徐放性製剤を含む）、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ、溶液、懸濁液、シロップおよび乳液のような経口剤形で、または注入により投与することができる。同様にそれらは静脈内に（ボーラスおよび注入の両方を含む）、腹腔内に、皮下に、局所に（貯蔵（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を含むか、または含まない）、または筋肉内の状態でも投与することができ、すべての使用形態が製薬分野の当業者には周知である。効果的であるが、非毒性量の所望する化合物を、哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター調節剤として使用することができる。
【００２９】
生成物の１日の投薬用量は、０．０１〜１，０００ｍｇ／患者／日の広い範囲で変動することができる。経口投与には、処置する患者に対する投薬用量を症状に合わせて調整するために、組成物は好ましくは０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラムの有効成分を含む刻み目が付いた、または刻み目が付いていない錠剤の状態で提供される。有効量の薬剤は通常、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投薬用量レベルで供給される。範囲はより詳細には約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプター調節物質の投薬用量は、所望の効果を達成するために合わせた時に調整される。他方、これら種々の薬剤の投薬用量は独立して至適化され、そして相乗的な結果を達成するために合わせることができ、ここで病状はいずれかの薬剤を単独で使用する場合よりも軽減する。
【００３０】
有利には本発明の化合物または調節物質は１日に単回の用量で投与することができ、または１日の全投薬用量を１日に２、３または４回に分けて投与してもよい。さらに本発明の化合物または調節物質は、適当な鼻内賦形剤の局所的使用を介して、または当業者には周知な経皮的皮膚パッチの形態を使用して経皮経路を介して鼻内形態で投与することができる。経皮的送達系の形態で投与されるには、投薬はもちろん、投薬計画を通して断続的というよりは連続的になる。
【００３１】
１以上の活性剤との併用処置には、活性剤が別々の投薬製剤である場合、活性剤を同時に投与することができ、またはそれらは各々が別個に別れた時期に投与することができる。
【００３２】
本発明の化合物または調節物質を利用する投薬計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；処置する状態の重篤度；投与経路；患者の腎臓および肝機能；および使用するその特定の化合物を含む様々な因子に従い選択される。標準的な技術を持つ医師または獣医師は、状態の進行を防止し、対抗し、または静止するために必要な薬剤の有効量を容易に決定し、そして処方することができる。毒性無しに効力を生じる範囲内の薬剤濃度を達成する最適な精度には、標的部位に対する薬剤利用性の動力学に基づく管理が必要である。これには薬剤の分布、平衡化および排除の考察が関与する。
【００３３】
本発明の方法では、本明細書に詳細に記載する化合物または調節物質が有効成分を形成することができ、そして意図する投与形態、すなわち経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップ等に関して適当に選択され、そして通例の製薬学的プラクティスと合致した適当な製薬学的希釈剤、賦形剤または担体（集合的に本明細書では「担体」材料と呼ぶ）との混合物で典型的には投与される。
【００３４】
例えば錠剤またはカプセル形態での経口投与には、活性薬剤成分はエタノール、グリセロール、水等のような経口の非毒性の製薬学的に許容され得る不活性担体と合わせることができる。さらに所望により、または必要ならば、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤を混合物に包含することもできる。適当な結合剤には限定するわけではないが澱粉、ゼラチン、グルコースもしくはベータ−ラクトースのような天然糖、トウモロコシ甘味料、アラビア、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等を含む。これらの剤形に使用する潤滑剤には限定するわけではないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を含む。崩壊剤には限定するわけではないが澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等を含む。
【００３５】
液体形には活性薬剤成分は、合成および天然ガム、例えばトラガカント、アラビア、メチル−セルロース等のような適当に風味を付けた沈殿防止または分散剤と合わせることができる。使用することができる他の分散剤にはグリセリン等を含む。非経口投与には滅菌懸濁液および溶液が望ましい。一般には適当な保存剤を含む等張性の調製物は、静脈内投与が望まれる時に使用する。
【００３６】
活性薬剤成分を含有する局所用の調製物は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネート等のような当該技術分野で周知の種々の担体材料と混合して、例えばアルコール性溶液、局所用洗浄剤、クレンジングクリーム、スキンゲル、スキンローションおよびクリームもしくはゲル製剤のシャンプーを形成することができる。
【００３７】
本発明の化合物または調節物質は、小さい一枚膜小胞、大きい一枚膜小胞および多重層小胞のようなリポソーム送達系の状態でも投与することができる。リポソームはコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンのような種々のリン脂質から形成することができる。
【００３８】
本発明の化合物は化合物分子を結合させる個々の担体としてモノクローナル抗体の使用により送達することもできる。本発明の化合物または調節物質は、標的可能な薬剤担体として可溶性ポリマーとも結合することができる。そのようなポリマーにはポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドルキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルタミドフェノールまたはパルミトイル残基で置換されたポリエチル−エンオキシドポリリシンを含むことができる。さらに本発明の化合物または調節物質は、薬剤の放出制御を達成するために有用な種類の生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロ−ピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋−結合もしくは両親媒性ブロックコポリマーに結合させることもできる。
【００３９】
経口投与には、化合物または調節物質はカプセル、錠剤またはボーラス形態で投与することができ、あるいはそれらは動物飼料に混合することができる。カプセル、錠剤およびボーラスは、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたはリン酸二カルシウムのような適切な担体賦形剤と組み合わせた有効成分を含んでなる。これらの単位剤形は均一な混合物が得られるように、有効成分を希釈剤、充填剤、崩壊剤および／または結合剤を含む適当な微粉化された不活性成分と完全に混合することにより調製する。不活性成分は化合物または調節物質と反応せず、そして処置する動物に非毒性なものである。適当な不活性成分には澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性ガムおよび油等を含む。これらの製剤は処置する動物種のサイズおよびタイプ、ならびに感染のタイプおよび重篤度のような多数の因子に依存して、広く変動しうる活性および不活性成分の量を含むことができる。有効成分は化合物を飼料と単に混合することにより、または化合物を飼料の表面に適用することにより飼料に対する添加物としても投与することができる。あるいは有効成分を不活性担体と混合し、そして生成した組成物を飼料と混合するか、または動物に直接供給してもよい。適当な不活性担体にはトウモロコシの粗挽き粉、柑橘類の粗挽き粉、発酵残渣、ダイズ粗粒、乾燥穀粒等を含む。最終組成物が０．００１〜５重量％の有効成分を含むように、有効成分はこれらの不活性担体と粉砕、撹拌、製粉またはタンブリングにより完全に混合される。
【００４０】
あるいは化合物または調節物質は、不活性な液体担体中に溶解した有効成分からなる製剤の注入により非経口的に投与することもできる。注入は筋肉内、第１胃内、気管内または皮下のいずれかでよい。注入可能な製剤は、適切な不活性液体担体と混合した有効成分からなる。許容され得る不活性液体担体にはピーナッツ油、綿実油、ゴマ油等のような植物油、ならびにソルケタール（ｓｏｌｋｅｔａｌ）、グリセロールホルマール等のような有機溶媒を含む。別の選択として、水性の非経口製剤も使用することができる。植物油は好適な液体担体である。製剤は最終製剤が０．００５〜１０重量％の有効成分を含むように、有効成分を液体担体に溶解または懸濁することにより調製する。
【００４１】
化合物または調節物質の局所的適用は、水溶液または懸濁液として本化合物または調節物質を含む水薬またはシャンプーの使用を介して可能である。これらの製剤は一般にベントナイトのような沈殿防止剤を含み、そして通常は消泡剤も含む。０．００５〜１０重量％の有効成分を含有する製剤が許容され得る。好適な製剤は０．０１〜５重量％の本化合物または調節物質を含有するものである。
【００４２】
以下の実施例は本発明を具体的に説明する目的で提供するが、本発明を限定することはない。
【実施例１】
【００４３】
ザイモサンが誘導するマウスの腹膜炎のヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストによる阻害
この実施例はヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストが、サッカロミセス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞壁上の不溶性多糖であるザイモサンにより誘導される腹膜炎を遮断できることを最初に見いだしたことを示す。これはマウスにおける腹膜炎を誘導するために通常使用され、そしてマスト細胞依存的様式で作用するようである。
材料および方法
動物
オスの異系交配スイス（Ｓｗｉｓｓ）アルビノマウスは、Ｂａｎｔｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｍａｎ（Ｔ．Ｏ．種；ハル、バンバーサイド）から購入し、そして水道水を自由に与ながら標準的なチャウペレット食（ｃｈｏｗ  ｐｅｌｌｅｔ  ｄｉｅｔ）、および１２時間の明／暗サイクルで管理した。すべての動物は実験前に少なくとも３日間収容して、体重が実験日に〜３０グラムに達するようにした。この特別な実験に関して、体重は３０．５±０．３（ｎ＝３２）であった。動物は以下に記載するすべてのＳ．ｃ．およびｉ．ｐ．処置について、ハロタンで簡単に麻酔をかけた（３０〜６０秒）。
薬剤処置および実験計画
薬剤は暗中、室温で保存した。実験日に、薬剤は以下に示すように滅菌ＰＢＳに溶解し、そして大きくボルテックス処理した。
・Ｈ４  ＡＮＴＡＧ＃１は１０ｍｇ／５ｍｌで調製し、そして５ｍｌ／ｋｇで注入した。
・イメティット（Ｉｍｅｔｉｔ）を５ｍｇ／５ｍｌで調製し、そして５ｍｌ／ｋｇで注入した。
・チオペルアミドを５ｍｇ／５ｍｌで調製し、そして５ｍｌ／ｋｇで注入した。
時間
時間−１５分：化合物またはＰＢＳを報告した用量でｓ．ｃ．投与した。
時間０：０時に、マウスは１ｍｇのザイモサンＡ（シグマ：Ｓｉｇｍａ）をｉ．ｐ．で受けた。
時間＋２時間：化合物またはＰＢＳを報告した用量でｓ．ｃ．投与した。
時間＋４時間：腹膜腔は、３ｍＭのＥＤＴＡを含有する３ｍｌのＰＢＳで４時間後に洗浄し、そして洗浄液のアリコートを取り（１００μｌ）、そして１：１０にＴｕｒｋの溶液（３％酢酸中の０．０１％のクリスタルバイオレット）で希釈することにより移動した白血球の数を決定した。次いでサンプルをボルテックス混合し、そして１０μｌの染色された細胞液をＮｅｕｂａｕｅｒヘモサイトメーターに入れた。細胞分画（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｓ）を光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｂ０６１）を使用して行った。それらの染色性の特徴およびそれらの核および細胞質の外観の観点から、多形核白血球（ＰＭＮ；＞９５％好中球）を容易に同定できた。  
実験群を以下に記載する：
・ＰＢＳ＋ザイモサン  ｎ＝８
・Ｈ４  ＡＮＴＡＧ＃１＋ザイモサン  ｎ＝８
・イメティット＋ザイモサン  ｎ＝８
・チオペルアミド＋ザイモサン  ｎ＝８
統計
データは１匹のマウスについて示し、そして群あたり８匹のマウスの平均±Ｓ．ｄ．またはＳＥＭとしても示す。阻害のパーセントも示す。統計的差異はアノバに続いてボンフェローニの多重比較（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）により決定した。
結果
【００４４】
【表１】
2005539207.tif 000003
【００４５】
データ分析から、ザイモサンは４時間の時点で強くなった白血球の管外遊出を生じたことが分かる。１０ｍｇ／ｋｇ  Ｈ４  ＡＮＴＡＧ＃１での処置はＰＭＮ流入を有意に減少した（ＰＢＳを、表１および図１のＨ４  ＡＮＴＡＧ＃１群に対して比較する）。阻害の程度は＞６０％であった。イメティット（５ｍｇ／ｋｇ）は不活性であり、一方、有意な阻害効果が５ｍｇ／ｋｇのチオペルアミドにより達成された。
結論
結論すると、この実験は１０ｍｇ／ｋｇの用量で与えたヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストであるＨ４  ＡＮＴＡＧ＃１が、マウス腹膜腔のザイモサン局所投与に応答する細胞漸増の実験モデルでＰＭＮ蓄積を減少させるのに効果的であることを示す。さらに二重Ｈ３／Ｈ４レセプターアンタゴニストであるチオペルアミドも効果的である。二重Ｈ３／Ｈ４レセプターアゴニスト、イメティットは効果がない。これはヒスタミンＨ４レセプターのアンタゴニストがザイモサンにより誘導される炎症を遮断できることを示す。
【実施例２】
【００４６】
尿酸ナトリウム結晶が誘導するマウスの腹膜炎のヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストによる阻害
この実施例はヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストが、尿酸ナトリウム結晶により誘導される腹膜炎を遮断できることを最初に見いだしたことを示す。そのような結晶は急性痛風に伴う炎症の主要因である。
材料および方法
動物
オスの異系交配スイスアルビノマウスは、Ｂａｎｔｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｍａｎ（Ｔ．Ｏ．種；ハル、バンバーサイド）から購入し、そして水道水を自由に与ながら標準的なチャウペレット食、および１２時間の明／暗サイクルで管理した。すべての動物は実験前に少なくとも３日間収容して、体重が実験日に〜３０ｇに達するようにした。この特別な実験には、体重は３０±１（ｎ＝３２）であった。
薬剤処置および実験計画
Ｈ４  ＡＮＴＡＧ＃１は暗中、室温で保存した。実験日に、Ｈ４  ＡＮＴＡＧ＃１をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に３ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。時間−１５分：Ｈ４  ＡＮＴＡＧ＃１を１０ｍｇ／ｋｇの用量でｓ．ｃ．投与し、一方、対照群には賦形剤のみを与えた（１０ｍｌ／ｋｇ）。マウスは時間０に３ｍｇの尿酸一ナトリウムの結晶（ＭＳＵ）を腹腔内に受けた。時間＋２時間および時間＋４時間で、Ｈ４  ＡＮＴＡＧ＃１（１０ｍｇ／ｋｇ）または賦形剤（１０ｍｌ／ｋｇ）をｓ．ｃ．で与えた。
時間＋６時間：腹膜腔は、３ｍＭのＥＤＴＡを含有する３ｍｌのＰＢＳで６時間後に洗浄し、そして洗浄液のアリコートを取り（１００μｌ）、そして１：１０にＴｕｒｋの溶液（３％酢酸中の０．０１％のクリスタルバイオレット）で希釈することにより移動した白血球の数を決定した。次いでサンプルをボルテックス混合し、そして１０μｌの染色された細胞液をＮｅｕｂａｕｅｒヘモサイトメーターに入れた。細胞分画を光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｂ０６１）を使用して行った。それらの染色性の特徴およびそれらの核および細胞質の外観の観点から、細胞多形核白血球細胞（ＰＭＮ；＞９５％好中球）を容易に同定できた。  
実験群を以下に記載する：
・賦形剤＋ＭＳＵ結晶  ｎ＝８
・Ｈ４  ＡＮＴＡＧ＃１＋ＭＳＵ結晶  ｎ＝８
統計
データは１匹のマウスについて示し、そして群あたりのマウス（ｎ）の平均±Ｓ．ｄ．としても示す。統計的差異はスチューデントｔ検定により決定した。Ｐ値＜０．０５を有意とした。
結果
【００４７】
【表２】
2005539207.tif 000004
【００４８】
マウスはＰＢＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＨ４  ＡＮＴＡＧ＃１（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで−１５分、＋２時間および＋４時間に、そして３ｍｇのＭＳＵ結晶で時間０に処置した。腹膜腔へのＰＭＮ流入は洗浄液の回収後６時間の時点で測定し、そして実験の章に記載した特異的染色を行った。
結論
予想通り、ＭＳＵ結晶は６時間の時点で強くなるＰＭＮ管外遊出を生じた。特異的なヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストであるＨ４  ＡＮＴＡＧ＃１での処置によりＰＭＮ移動か有意に減少し（表２；図２）；阻害の程度は２４％であった。結論すると、この実験はヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストが、マウス腹膜腔のＭＳＵ結晶の局所投与に応答する細胞漸増の実験モデルでＰＭＮ蓄積を減少させるのに効果的であることを示す。
【実施例３】
【００４９】
クロトン油が誘導するマウスの局所的炎症のヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストによる阻害
この実施例はヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストが、クロトン油の局所適用により誘導される炎症を遮断できることを最初に見いだしたことを示す。
材料および方法
動物
体重が２２±１グラムのオスまたはメスのＩＣＲ起源マウスを使用した。５匹の動物に割り当てられた空間は、４５ｘ２３ｘ１５ｃｍであった。マウスはＡＰＥＣ  Ｒケージに収容した。すべての動物を制御された温度（２２℃〜２４℃）および湿度（６０％〜８０％）の環境で、１２時間の明／暗サイクルで管理した。マウス用の標準的なラボチャウ（ｌａｂ  ｃｈｏｗ）（ＬａｂＤｉｅｔ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ、ＰＭＩ  ニュートリッション  インターナショナル（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、米国）を自由に与え、そして水道水を与えた。
化学品
アセトン（ワコー（Ｗａｋｏ）、日本）、クロトン油（シグマ、米国）、インドメタシン（シグマ、米国）およびパイロジェンを含まない塩水（アスター（Ａｓｔａｒ）、台湾）。
クロトン油が誘導する局所炎症のプロトコール
体重が２２±１グラムの５匹のＩＣＲ起源のオス群を使用した。Ｈ４  ＡＮＴＡＧ＃１（１０ｍｇ／ｋｇ）および賦形剤（０．９％  ＮａＣｌ）ならびに陽性対照としてインドメタシン（３０ｍｇ／ｋｇ）を皮下に投与して、クロトン油（２０μｌのアセトン中８％）を局所的に適用する３０分前および２、４時間後に動物を試験した。炎症の指標としてクロトン油適用の６時間後の耳の腫れをＤｙｅｒモデルマイクロメーターゲイジにより測定した。
結果
【００５０】
【表３】
2005539207.tif 000005
【００５１】
結論
クロトン油が誘導する局所炎症の耳の腫れのアッセイでは、ヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストであるＲＩＷ４２３６４０が１０ｍｇ／ｋｇｘ３（ｓ．ｃ．）の用量で、賦形剤に対して有意に腫れを減少させた。この効果はインドメタシン（３０ｍｇ／ｋｇｘ３）に類似した。これらの結果はヒスタミンＨ４レセプターアンタゴニストが抗−炎症薬として作用できることを示す。
【実施例４】
【００５２】
ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡの哺乳動物発現ベクターへのクローニング
ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡ（集合的にｐＨ４Ｒと呼ぶ）を、哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏへクローニングした。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡクローンは、ヒト視床ｃＤＮＡライブラリーから単離した。完全長のｃＤＮＡは、クローニング用のＥｃｏＲ１およびＮｏｔ１部位を持つ特異的プライマーを使用したＰＣＲ用の鋳型として使用した。ＰＣＲ産物はカラム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  ＤＮＡ精製キット）で精製し、そしてＮｏｔ１およびＥｃｏＲ１（ＮＥＢ）で消化して付着末端を作成した。生成物は低融点アガロースゲル電気泳動により精製した。ｐＣＩｎｅｏベクターをＥｃｏＲ１およびＮｏｔ１酵素で消化し、そして続いて低融点アガロースゲルで精製した。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡ挿入物を連結するために直線状ベクターを使用した。組換え体を単離し、ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターと命名し、そしてＣａＰＯ４−ＤＮＡ沈殿により哺乳動物細胞（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ−細胞）にトランスフェクトするために使用した。安定な細胞クローンをＧ４１８の存在下での成長により選択した。１つのＧ４１８耐性クローンを単離し、そして完全なヒト  ヒスタミンＨ４レセプター遺伝子が含まれていることが示された。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡを含むクローンは、（Ｋｏｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）の方法に従いヒスタミンに応答するアデニル酸シクラーゼの阻害を測定することにより、またはＦｌａｓｈｐｌａｔｅｓ（ＮＥＮ）を使用したラジオイムノアッセイによりｃＡＭＰ蓄積を直接測定することによりｐＨ４Ｒ発現について分析した。また発現は［３Ｈ］−ヒスタミン結合アッセイ（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）を使用して分析した。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミドを使用して、哺乳動物ＣＯＳ７もしくはＣＨＯ細胞もしくはＨＥＫ２９３もしくはＬ−細胞もしくはＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を形質転換した。
【００５３】
安定に、または一時的にヒト  ヒスタミンＨ４レセプターを発現する細胞を使用して、ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターの発現および［３Ｈ］−ヒスタミン結合活性について試験する。これらの細胞を使用して、ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターを調節し、阻害し、または活性化し、そして放射性ヒスタミン結合について競合するするそれらの能力について他の化合物を同定し、そして調査する。
【００５４】
プロモーターに関して正の方向にヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡを含むカセットを、プロモーターの３’側の適当な制限部位に連結し、そして制限部位マッピングおよび／またはシークエンシングにより確認する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターは繊維芽宿主細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）およびＣＶ−１ｔａｔ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：１５７５］、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６３６２）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１０）に、限定するわけでないが電気穿孔、または化学的手法（カチオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を含む標準法により導入する。トランスフェクトされた細胞および細胞培養上清を回収し、そしてヒト  ヒスタミンＨ４レセプター発現について本明細書に記載したように分析する。
【００５５】
哺乳動物の一時的発現に関して使用するすべてのベクターは、ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターを発現する安定な細胞系を樹立するために使用することができる。発現ベクターにクローン化された非改変ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡ構築物は、宿主細胞がヒト  ヒスタミンＨ４レセプタータンパク質を作成するようにプログラムすると期待される。トランスフェクション宿主細胞には限定するわけではないがＣＶ−１−Ｐ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：１５７５］、ｔｋ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（１９７７）１１：２２３］、ＮＳ／０およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ［Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５９：６０１］を含む。
【００５６】
ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡを含むベクターと、限定するわけではないがＧ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ：ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む薬剤選択プラスミドとのコトランスフェクションにより、安定にトランスフェクトされたクローンの選択が可能となる。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターのレベルは本明細書に記載のアッセイにより定量される。
【００５７】
ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡ構築物は、できる限り最高のヒト  ヒスタミンＨ４レセプターを合成する哺乳動物細胞クローンを生産するために、増幅可能な薬剤耐性マーカーを含むベクターに連結する。これらの構築物を細胞へ導入した後、プラスミドを含むクローンを適当な薬剤で選択し、そして高コピー数のプラスミドを持つ過剰発現しているクローンの単離は薬剤の用量を上げる選択により行う。
【００５８】
組換えヒト  ヒスタミンＨ４レセプターの発現は、完全長のヒト  ヒスタミンＨ４レセプターｃＤＮＡを哺乳動物宿主細胞にトランスフェクションすることにより達成する。
ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターの特性決定 
ヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞はｐＨ４Ｒでトランスフェクトし、そして１０日間、ネオマイシンの存在下で選択した。個々のコロニーを取り上げ、そして６ウェル皿で成長させた。次いで細胞を９６ウェルプレートにまき、そしてコンフルエントになるまで成長させた。細胞を２０分間、イソブチルメチルキサンチン（１ｍＭ）とインキューベーションした。次いで細胞をヒスタミン（１００ｐＭ−１００μＭ）で５分間刺激した。次いで細胞をフオールスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）（３ｕＭ）で刺激し、そして３７℃で２０分間インキューベーションした。次いで細胞を０．１Ｎ塩酸で処理した。次いで細胞を凍結し、そして解凍した。次いで上清のアリコートをそれらのサイクリックＡＭＰ含量について標準的なｃＡＭＰラジオイムノアッセイキット（フラッシュプレート（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅｓ）、ＮＥＮ）を使用して分析した。フォルスコリン処置はｃＡＭＰの細胞内濃度を上げる。フォルスコリンに応答したｃＡＭＰの減少によりヒスタミンに対して応答した任意の細胞は、活性な機能的ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターを発現していると考えられた。本明細書に記載するヒト  ヒスタミンＨ４レセプターをコードするＤＮＡ分子から発現された組換えヒト  ヒスタミンＨ４レセプターは、ヒスタミンにより特異的に活性化されることが示された。
【実施例５】
【００５９】
組換えヒト  ヒスタミンＨ４レセプターに関する結合アッセイ
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞またはＣＯＳ７細胞は、ｐＨ４Ｒで一時的にトランスフェクトし、そして１５０ｃｍ２の組織培養皿で成長させた。細胞を塩溶液で洗浄し、細胞スクレーパーで掻き取り、そして遠心（１０００ｒｐｍ、５分）により集めた。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターを発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣまたはＣＯＳ７細胞は、高い親和性で３Ｈ−ヒスタミンに結合する（図４）。細胞膜は細胞ペレットを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中でポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎ）組織ホモジナイザーを用いて１０秒間、高速で均一化することにより調製する。ホモジネートを１０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心する。次いで上清を集め、そして２０，０００ｘｇで２５分間、４℃で遠心する。最終ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁する。細胞膜を３Ｈ−ヒスタミン（．５ｎＭ〜７０ｎＭ）と過剰量のヒスタミン（１０００ｎＭ）の存在または不存在下でインキューベーションする。インキューベーションは室温で２５分間行う。膜はワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｃフィルター上の迅速な濾過で回収し、そして氷冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌで４回洗浄する。次いでフィルターを乾燥させ、シンチラントと混合し、そして放射性についてカウントする。ヒト  ヒスタミンＨ４レセプターを発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣまたはＣＯＳ７細胞を使用して、他の化合物の結合の親和性およびそれらが３Ｈ−リガンド結合を置換する能力について、様々な濃度の試験するインヒビターまたは化合物の濃度の存在下で上記の反応でインキューベーションすることにより測定する。
【実施例６】
【００６０】
哺乳動物ヒスタミンＨ４レセプターに対するリガンド結合
ラット、マウス、モルモットおよびヒトヒスタミンＨ４レセプターに関する３Ｈ−ヒスタミンの親和性を、本明細書に記載する標準技法を使用して決定した。飽和結合は、適当なヒスタミンＨ４レセプターで安定にトランスフェクトしたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に由来する膜上で行った。Ｋｄ値はスキャッチャードプロットの曲線回帰の−１／傾斜から誘導された（結合／遊離  対  結合）。結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
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【００６２】
数種の既知のヒスタミンレセプターリガンドの相対的親和性を、３０ｎＭの３Ｈ−ヒスタミンの競合結合により決定した。各リガンドに関するＫｉ値は、Ｃｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｕｓｃｏｆｆの方法に従い算出した（Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［３Ｈ−ヒスタミン］／Ｋｄ）。３Ｈ−ヒスタミンに関するＫｄ値は、表２に説明するものであった。結果を表５に与える。
【００６３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ザイモサムを局所適用した後の腹腔洗浄液中の多形核細胞の量。丸は各マウスの数を表し、そして棒は平均である。
【図２】尿酸一ナトリウム結晶を局所適用した後の腹腔洗浄液中の多形核細胞の量。丸は各マウスの数を表し、そして棒は平均である。
【図３】クロトン油に暴露された耳と暴露されていない耳との間の耳の厚さの差異。丸は各マウスの数を表し、そして棒は平均である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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