(57)【要約】本発明は、胚、好ましくは初期胚（例えば、胚盤葉）を含有する鳥類の卵に注入する改良された方法を提供する。本発明の方法は、卵に物質を送達するため、卵からサンプルを取り出すため、および／またはそれからの情報を収集するために、卵の中へ検出装置を挿入するために使用できる。好ましい実施形態では、本発明は卵の中の胚へ物質を送達するために使用される。他の好ましい実施形態では、本発明は卵の中でキメラまたはトランスジェニック鳥類胚を産生するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類の卵に注入する方法であって、
胚盤葉を含有する鳥類の卵を所定位置に方向付けるステップと、
小開口部を卵殻の中へ導入するステップと、
卵殻における該小開口部を通して装置を伸長させるステップと、
該装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該装置を挿入する前は本質的に無傷でなければならず、
該装置を卵から引き抜くステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記装置が送達装置であり、前記方法が、前記穿刺するステップの後に、該送達装置を通して物質を放出するステップと、該物質を卵の中へ配置するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記装置がサンプリング装置であり、前記方法が、前記穿刺するステップの後に、卵からサンプルを取り出すステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４】
前記装置が検出装置であり、前記方法が、前記穿刺するステップの後に、該検出装置を用いて卵の内部から情報を検出するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記装置が卵殻における小開口部を通して所定の位置へ伸長される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記装置が卵殻における小開口部を通して胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接する位置へ伸長される、請求項１の方法。
【請求項７】
前記装置が卵殻における小開口部を通して、
（ａ）胚下腔と、
（ｂ）暗域と卵黄膜との間と、
（ｃ）明域と卵黄膜との間と、
（ｄ）暗域と明域との間と、
（ｅ）明域内と、
（ｆ）暗域内と、
（ｇ）上記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組み合わせと
からなる群から選択される位置へ伸長される、請求項６の方法。
【請求項８】
前記胚盤葉を傷つけるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項９】
前記卵が概して水平位置に方向付けられ、前記卵殻における小開口部が卵の上に面する側に導入される、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記卵が処理前に貯蔵されている、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記卵殻内へ小開口部を導入するステップの前に、該卵殻へシーラントを適用するステップをさらに備え、前記小開口部はシーラントが塗布される部位で卵殻内に導入される、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記胚盤葉がステージＸＩＩＩ（ＥＧ＆Ｋ）またはそれより早期の胚盤葉である、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記胚盤葉がステージＶＩＩＩからステージＸＩＩＩ（ＥＧ＆Ｋ）の胚盤葉である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記胚盤葉がステージＸ（ＥＧ＆Ｋ）の胚盤葉である、請求項１２の方法。
【請求項１５】
前記卵がニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタンインコ、オカメインコ、ダチョウおよびエミューの卵からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記卵がニワトリの卵である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記卵がシチメンチョウの卵である、請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記胚盤葉が異種核酸を含む、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記胚盤葉を所望の位置へ導くステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記導くステップが、
（ａ）卵を撹拌するステップと、
（ｂ）卵を加熱するステップと、
（ｃ）卵を一定位置に保持するステップと、
（ｄ）卵の化学処理と、
（ｅ）上記の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの組み合わせと
からなる群から選択される方法を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記胚盤葉またはその中の区画の位置を決定するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２２】
前記決定するステップが前記胚盤葉を視認するステップを含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記決定するステップが検出装置を用いて前記胚盤葉またはその中の区画の位置を決定するステップを含む、請求項２１の方法。
【請求項２４】
前記卵殻における小開口部をシールするステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２５】
前記外殻膜における小開口部を導入するステップをさらに備え、前記伸長させるステップが卵殻および外殻膜における小開口部を通して送達装置を伸長させるステップを含む、請求項１の方法。
【請求項２６】
孵化するまで前記卵を培養するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２７】
前記装置が多重注入送達装置である、請求項２の方法。
【請求項２８】
前記卵の中に配置される物質がポリペプチドを含む、請求項２の方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、抗体、ホルモン、成長因子、酵素およびサイトカインからなる群から選択される、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記卵の中に配置される物質がヌクレオチド配列を含む、請求項２の方法。
【請求項３１】
前記ヌクレオチド配列が、ウイルスベクター、リポソームおよびエレクトロポレーションからなる群から選択される方法を使用して胚盤葉内へ導入される、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記ヌクレオチド配列が、ポリペプチドもしくはアンチセンス核酸をコードする、請求項３０の方法。
【請求項３３】
前記卵の中に配置される物質が抗生物質を含む、請求項２の方法。
【請求項３４】
前記卵の中に配置される物質がドナー細胞を含む、請求項２の方法。
【請求項３５】
前記ドナー細胞が鳥類の卵である、請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記ドナー細胞が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタンインコ、オカメインコ、ダチョウおよびエミュー細胞からなる群から選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記ドナー細胞が前記胚盤葉の種以外の鳥類種由来である、請求項３５の方法。
【請求項３８】
前記ドナー細胞がトランスジェニック細胞である、請求項３４の方法。
【請求項３９】
前記ドナー細胞が、胚盤葉細胞、幹細胞、培養幹細胞、胚幹細胞、始原生殖細胞、胚生殖細胞、および上記のいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４の方法。
【請求項４０】
前記胚盤葉がニワトリ胚盤葉であり、前記ドナー細胞がニワトリ細胞である、請求項３４の方法。
【請求項４１】
前記胚盤葉および前記ドナー細胞がニワトリの相違する系統または品種からである、請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記卵から取り出されたサンプルが胚下腔液を含む、請求項３の方法。
【請求項４３】
前記卵から取り出されたサンプルが胚盤葉細胞を含む、請求項３の方法。
【請求項４４】
前記検出装置が電気センサーである、請求項４の方法。
【請求項４５】
前記検出装置が光センサーである、請求項４の方法。
【請求項４６】
前記検出装置が化学センサーである、請求項４の方法。
【請求項４７】
前記検出装置が温度センサーである、請求項４の方法。
【請求項４８】
前記検出装置が音響センサーである、請求項４の方法。
【請求項４９】
前記検出装置が圧力センサーである、請求項４の方法。
【請求項５０】
鳥類の卵に注入する方法であって、
鳥類の卵の鈍端を所定位置に方向付けるステップであって、該鳥類の卵が（ｉ）胚盤葉および（ｉｉ）気室を含有し、
気室の上方の卵の鈍端で卵殻の中に小開口部を導入するステップと、
卵殻における該小開口部の下の外殻膜内に小開口部を導入するステップと、
卵殻および外殻膜における該小開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、
該送達装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該送達装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
該送達装置を通して物質を放出するステップと、該物質を胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接する位置に配置するステップと、
該送達装置を卵から引き抜くステップと
を含む方法。
【請求項５１】
前記方向付けるステップが卵の鈍端を概して上向き位置に配置するステップを含む、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記卵殻の卵の鈍端に位置する小開口部が所定位置へ導入される、請求項５０の方法。
【請求項５３】
前記所定位置が実質的に気室の中心にある、請求項５２の方法。
【請求項５４】
前記卵殻および外殻膜における小開口部を導入するステップが、実質的に同時に実施される、請求項５０の方法。
【請求項５５】
前記放出するステップの前に胚盤葉の位置を決定するステップをさらに含む、請求項５０の方法。
【請求項５６】
前記送達装置が卵殻における小開口部を通して、
（ａ）胚下腔と、
（ｂ）暗域と卵黄膜との間と、
（ｃ）明域と卵黄膜との間と、
（ｄ）暗域と明域との間と、
（ｅ）明域内と、
（ｆ）暗域内と、
（ｇ）上記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組み合わせと
からなる群から選択される位置へ伸長される、請求項５０の方法。
【請求項５７】
鳥類の複数の卵を注入する方法であって、
鳥類の複数の卵を所定位置へ方向付けるステップであって、このとき各卵が胚盤葉を含有し、
小開口部を各卵殻の中へ導入するステップと、
各卵殻における開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、
該送達装置を用いて各卵の内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該送達装置を挿入する前には本質的に無傷であり、
該送達装置を通して物質を放出するステップと、該物質を胚盤葉内または各卵の胚盤葉に極めて近接する位置に配置するステップと、
該送達装置を各卵から引き抜くステップと
を含む方法。
【請求項５８】
孵化するまで複数の卵を培養するステップをさらに含む、請求項５７の方法。
【請求項５９】
結果として生じる孵化率が少なくとも約５０％である、請求項５８の方法。
【請求項６０】
結果として生じる孵化率が少なくとも約６５％である、請求項５８の方法。
【請求項６１】
キメラ鳥を産生する方法であって、
胚盤葉を含有する鳥類の卵を所定位置に方向付けるステップと、
小開口部を卵殻の中へ導入するステップと、
該卵殻における小開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、
該送達装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該送達装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
キメラ胚を生じさせるために十分な条件下で、該送達装置を通して鳥類ドナー細胞を放出して該ドナー細胞を胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接させて配置するステップと、
該送達装置を卵から引き抜くステップと、
キメラ鳥を産生させるためのキメラ胚を孵化させるために培養するステップと
を含む方法。
【請求項６２】
前記送達装置が卵殻における小開口部を通して、
（ａ）胚下腔と、
（ｂ）暗域と卵黄膜との間と、
（ｃ）明域と卵黄膜との間と、
（ｄ）暗域と明域との間と、
（ｅ）明域内と、
（ｆ）暗域内と、
（ｇ）上記の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組み合わせと
からなる群から選択される位置へ伸長される、請求項６１の方法。
【請求項６３】
トランスジェニック鳥を産生する方法であって、
胚盤葉を含有する鳥類の卵を所定位置に方向付けるステップと、
小開口部を卵殻の中へ導入するステップと、
該卵殻における小開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、
該送達装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該送達装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
トランスジェニック胚を生じさせるために十分な条件下で、該送達装置を通してヌクレオチド配列を含む物質を放出するステップと、該物質を胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接させて配置するステップと、
該送達装置を卵から引き抜くステップと、
トランスジェニック鳥を産生させる目的で孵化させるためにトランスジェニック胚を培養するステップと
を含む方法。
【請求項６４】
鳥類の卵に注入する方法であって、
鳥類の卵の鈍端を所定位置に方向付けるステップであって、該鳥類の卵が（ｉ）胚盤葉および（ｉｉ）気室を含有し、
該気室の上方の卵の鈍端で卵殻の中に小開口部を導入するステップと、
該卵殻における小開口部の下の外殻膜内に小開口部を導入するステップと、
該卵殻および外殻膜における小開口部を通してサンプリング装置を伸長させるステップと、
該サンプリング装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該サンプリング装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
該サンプリング装置を用いて胚盤葉からサンプルを取り出すステップと、
該サンプリング装置を卵から引き抜くステップと
を含む方法。
【請求項６５】
鳥類の卵に注入する方法であって、
鳥類の卵の鈍端を所定位置に方向付けるステップであって、該鳥類の卵が（ｉ）胚盤葉および（ｉｉ）気室を含有し、
該気室の上方の卵の鈍端に、卵殻の中に小開口部を導入するステップと、
該卵殻における小開口部の下の外殻膜内に小開口部を導入するステップと、
該卵殻および外殻膜における小開口部を通して検出装置を伸長させるステップと、
該検出装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、該内殻膜はそれを通して該検出装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、
該検出装置を用いて該卵の内側から情報を検出するステップと、
該卵から前記検出装置を引き抜くステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願情報］
本出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００１年８月１３日出願の米国特許仮出願第６０／３１２，０１５号の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、胚を含有する卵を操作する方法、および特に、鳥類の胚を含有する卵の中へ物質を導入する方法、またはそのような卵から物質を取り出す方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
鳥類の初期胚を含有する卵を注入するために望ましい多数の用途がある。例えば、胚盤葉のような初期胚へ一つの物質を送達するのが望ましいことがある。具体的には、養鶏業では発育中の胚内へ異種核酸分子を導入する（すなわち、トランスジェニック鳥を創出する）ため、または異種細胞を導入する（すなわち、キメラ鳥を創出する）ために、卵内の初期胚を操作することが望ましいことがある。
【０００４】
同様に、初期胚を含有する卵を注入する改良された方法は、胚体内および胚体外物質のサンプルを含む卵からのサンプルを取り出すために使用できる可能性がある。さらに、他の用途では、胚を含有する卵の内側に、それから情報を収集するために検知装置を挿入することが望ましいことがある。
【０００５】
初期胚を含有する鳥の卵を操作する現行の方法は、受け入れ難いほど低い孵化率を生じさせる可能性があるので、望ましくないことがある。これまでに、孵化率の低下は、卵殻内に作成された開口部、卵の中への気泡の導入、胚体外膜もしくは胚自体の損傷、またはこれらの因子の組み合わせの結果であると示唆されてきた。
【０００６】
したがって、当分野においては、初期胚を含有する鳥類の卵を操作する改良された方法に対する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、胚、特に初期段階の胚を含有する鳥類の卵を操作する方法を提供するが、本方法は胚の外傷の減少ならびに生育力および孵化率の向上を生じさせる可能性がある。したがって、本発明は、胚、特に初期胚（例えば、胚盤葉）を含有する鳥類の卵の中へ様々な装置（例えば、送達装置、サンプリング装置、および／または検出装置等）を挿入する、または移植する改良された方法を提供するが、これは操作された胚間でより低レベルの罹患率および死亡率を生じさせる可能性がある。本発明の方法は、ワクチン、ビタミン、成長促進ホルモンおよび成長因子、酵素、サイトカイン、核酸および／または細胞を鳥の卵へ送達する方法において特に有用である。例えば、本方法はキメラ鳥（すなわち、異種細胞を含有する）またはトランスジェニック鳥（すなわち、異種核酸配列を含有する）を作製するために使用できる。本発明の方法はさらにまた、例えば、雌雄鑑別法に使用するため、胚の生育力を決定するため、および／またはその胚の遺伝的プロフィールについての情報を入手するために、卵の中の鳥からサンプルもしくは情報を収集するためにも有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の方法は、単一の卵または複数の卵について実施できる。さらに、本発明の方法は手動であっても自動であっても、または半自動であってもよい。
【０００９】
したがって、第１態様として、本発明は、胚盤葉を含有する鳥類の卵を所定位置に方向付けるステップと、小開口部を卵殻の中へ導入するステップと、卵殻における開口部を通して装置を伸長させるステップと、前記装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、このとき内殻膜はそれに通して前記装置を挿入する前は本質的に無傷でなければならないステップと、前記装置を卵から引き抜くステップとを含む鳥類の卵に注入する方法を提供する。
【００１０】
前記装置は、例えば送達装置、サンプリング装置、または検出装置であってよい。好ましくは、卵殻における開口部は気室の上方で卵の鈍端に作成される。
【００１１】
また別の態様として、本発明は、鳥類の卵の鈍端を所定位置に方向付けるステップであって、鳥類の卵が（ｉ）胚盤葉と（ｉｉ）気室とを含有し、気室の上方の卵の鈍端で卵殻の中に小開口部を導入するステップと、卵殻における小開口部の下の外殻膜内に小開口部を導入するステップと、卵殻および外殻膜における開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、前記送達装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、このとき内殻膜はそれに通して前記送達装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならないステップと、前記送達装置を通して物質を放出するステップと、前記物質を胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接する位置に配置するステップと、前記送達装置を卵から引き抜くステップとを含む鳥類の卵に注入する方法を提供する。特定の実施形態では、卵は概して上向きの位置に方向付けられる。
【００１２】
さらにまた別の態様として、本発明は、胚盤葉を含有する鳥類の卵を所定位置に方向付けるステップと、小開口部を卵殻の中へ導入するステップと、前記サンプリング装置を卵殻における開口部を通して伸長させるステップと、前記サンプリング装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、このとき内殻膜はそれに通して前記サンプリング装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならないステップと、前記サンプリング装置を用いて卵からサンプルを取り出すステップと、前記サンプリング装置を卵から引き抜くステップとを含む鳥類の卵に注入する方法を提供する。
【００１３】
さらにまた別の態様として、本発明は、胚盤葉を含有する鳥類の卵を所定位置に方向付けるステップと、小開口部を卵殻の中へ導入するステップと、卵殻における開口部を通して検出装置を伸長させるステップと、前記検出装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、このとき内殻膜はそれを通して前記検出装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならないステップと、前記検出装置を用いて卵の内側から情報を検出するステップと、卵から前記検出装置を引き抜くステップとを含む鳥類の卵に注入する方法を提供する。
【００１４】
下記でより詳細に記載するように、本発明は有益にも、初期胚（例えば、胚盤葉）を含有する鳥類の卵の内容物を操作すること、またはそれからの情報を入手することが望ましいあらゆる用途に使用できる可能性がある。特に、本発明はトランスジェニック胚もしくはキメラ胚を作製するために、またはあらゆる染色体もしくはＤＮＡに基づく決定（例えば、雌雄鑑別または胚の遺伝的プロファイルを評価するため）を実施するために使用できる。あるいはまた、本発明は初期胚を含有する鳥類の卵からいずれかの胚体内液もしくは胚体外液または組織のサンプルを取り出すために実行できる。加えて、あるいはまた、本発明は卵もしくは胚から情報を入手するために実施することができ、本方法は送達法またはサンプリング法と結合して使用できる。
【００１５】
本発明のこれらおよびその他の態様について、下記の本発明の説明においてより詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
下記では、本発明の好ましい実施形態を示した添付の図面を参照しながら本発明について記載する。しかし、本発明は様々な形態で具体化することができ、ここに記載した実施形態に限定されると見なされてはならない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧かつ完全であり、そして本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供されている。
【００１７】
ここで、本発明の一部の代替実施形態では、図１〜６のフローチャートのブロック内に記載した機能が記載された以外の順番で発生する可能性があることを述べておかなければならない。例えば、連続的に示された２つもしくは３つ以上のブロックは、実際には実質的に同時に実行することができる、または２つもしくは３つ以上のブロックは、逆の（もしくはさもなければ相違する）順番で実行できることもある。さらに、本発明の一定の実施形態では、図１〜６に例示した機能は平行して、または連続的に実施することができる。さらに、他の実施形態では、いくつかのブロックはまとめて省略することができる。
【００１８】
他に規定していない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本発明の説明において使用する用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としており、本発明を限定することは意図されていない。
【００１９】
本発明の説明および添付の請求の範囲において使用するように、その内容が明らかに他のことを意味しているのではない限り、単数形「ある（ａ）、（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には複数形も同様に含まれる。
【００２０】
本明細書で言及したすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、それらを引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００２１】
ここで使用する用語「鳥類」および「鳥類対象」には、あらゆる鳥類種の雄性および雌性を含むことが意図されているが、しかし主として卵、肉のために、またはペットとして商業的に飼育される家禽類を含むことが意図されている。したがって、用語「鳥類」および「鳥類対象」は特にニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタンインコ、オカメインコ、ダチョウ、エミュー等を含むことが意図されている。ニワトリおよびシチメンチョウは好ましい鳥類対象であり、最も好ましいのはニワトリである。あるいはまた、鳥類または鳥類対象は絶滅危惧種の鳥である。
【００２２】
本発明は、鳥類胚を含有する卵を操作する改良された方法を提供する。「操作するステップ」もしくは「操作」は、卵の卵殻、外殻膜、および内殻膜内に開口部が作成され、物質もしくは装置がその中に植え込まれる、または挿入されることを意味している。
【００２３】
ここで使用する用語「初期胚」とは、産卵日（胚盤葉期）から始原生殖細胞（ＰＧＣ）が移動している発育期頃までの鳥類胚を意味する。特別にニワトリ胚に関しては、「初期胚」は概してほぼ胚ステージ２０（Ｈ＆Ｈ）胚以前の胚である。ニワトリ胚の発育期は当分野においてよく理解されており、例えば「ニワトリの発育のアトラス（Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｃｋ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」，Ｒ．Ｂｅｌｌａｉｒｓ  ＆  Ｍ．Ｏｓｍｏｎｄ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８を参照されたい。特定の実施形態では、ニワトリ初期胚はステージ約４〜ステージ約１８の胚、またはステージ約１２〜ステージ約１７（Ｈ＆Ｈ）の胚、あるいはまたステージ約１３〜ステージ約１５（Ｈ＆Ｈ）の胚である（例えば、ＰＧＣを送達するため）。他の特定の実施形態では、初期胚は下記に記載するように胚盤葉期の胚である。
【００２４】
ここで使用する用語「胚盤葉（blastoderm）」は、当分野において理解される意味を有している。一般に、本発明の実施においては、胚盤葉には産卵時から原腸胚形成終了時までの胚が含まれる。胚盤葉は、また別の名称「胚盤（germinal discもしくはembryonic disc）」と呼ばれることもある。胚盤葉は、初期胚中での分割中に形成して原腸胚形成終了時まで存続する平坦な細胞盤であると説明することができる。産卵時までに、中央に位置する明域および周辺に位置する暗域である胚盤葉の２つの主要領域は目で見ることができる（「ニワトリの発育のアトラス［Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｃｋ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ］」，Ｒ．Ｂｅｌｌａｉｒｓ  ＆  Ｍ．Ｏｓｍｏｎｄ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８を参照されたい）。特にニワトリの胚に関して、胚盤葉は典型的には産卵時（すなわち、ステージＩＸもしくはステージＸ（ＥＧ＆Ｋ））からステージ約ＸＩＩＩ（ＥＧ＆Ｋ）までの胚であると特徴付けられる。本発明の特定の実施形態では、ニワトリ胚はステージ約ＶＩＩＩ〜ステージ約ＸＩＩＩ（ＥＧ＆Ｋ）胚、あるいはまたステージ約ＩＸ〜ステージ約ＸＩＩ（ＥＧ＆Ｋ）胚である。他の実施形態では、ニワトリ胚はステージ約Ｘ〜ステージ約ＸＩ（ＥＧ＆Ｋ）胚である。さらにまた別の実施形態では、ニワトリ胚はステージ約Ｘ（ＥＧ＆Ｋ）胚である。
【００２５】
現在使用されている初期胚を含有する卵を操作する方法は、それらが容認できないほど高レベルの罹患率および死亡率を生じさせるという点で、商業的目的のためには満足できない可能性がある。特定の実施形態では、鳥類胚はトランスジェニック（すなわち、異種ヌクレオチド配列を含有する）であってよい。
【００２６】
胚もしくは胚盤葉に「極めて近接」させた装置の注入または挿入とは、装置が初期胚もしくは胚盤葉の真上、真下もしくは隣接して、または例えば初期胚もしくは胚盤葉から１０、８、５、３、２もしくは１ｍｍ以内の周囲構造内へ注入または挿入されることを意味する。「胚盤葉へ極めて近接して」という用語には、暗域と卵黄膜との間、明域と卵黄膜との間、および／または暗域と明域との間のような胚の胚下腔内への装置の注入または挿入が含まれる。
【００２７】
ここで使用する用語「注射」および「注射するステップ」には、卵もしくは胚の中へ物質を送達もしくは放出する方法、卵もしくは胚から物質（すなわち、サンプル）を取り出す方法、および／または卵もしくは胚の中へ検出装置を挿入する方法を含む、卵もしくは胚の中へ装置（典型的には細長い装置）を挿入する方法が含まれる。
【００２８】
用語「キメラ鳥」もしくは「キメラ胚」とは、「ドナー」と呼ばれる他の鳥もしくは胚からの細胞（すなわち、体細胞および／または生殖体）を含有する各々「レシピエント鳥」もしくは胚を意味する。結果として生じるキメラ鳥もしくは胚は、典型的にはレシピエントおよびドナーの両方から引き出された細胞を含有するであろう。特定の実施形態では、キメラ鳥における少なくとも約５％、１０％、２５％、３５％、５０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％以上の体細胞をドナーから引き出すことができる。同様に、他の実施形態では、体細胞の実質的に全てがドナーから引き出される。さらにまた別の特定の実施形態では、キメラ鳥もしくは胚における生殖細胞の少なくとも一部分（例えば、少なくとも約５％、１０％、２５％、３５％、５０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％以上）の体細胞がドナーから引き出される。他の特定の実施形態では、生殖体の実質的に全てがドナーから引き出される。
【００２９】
用語「トランスジェニック鳥」および「トランスジェニック胚」は、ここでは当分野において一般に理解されている意味にしたがって使用される。トランスジェニック鳥もしくはトランスジェニック胚は、一つもしくは２つ以上の細胞中に異種核酸配列を含有する。異種核酸は、相違する種（例えば、鳥類、哺乳動物、昆虫、細菌、原生動物、酵母、真菌、ウイルス）から、または同一種からであってよい。例えば、野生型コード配列の追加のコピーまたは同一種からのコード配列の突然変異形が導入されてもよい。異種核酸は、下記でより詳細に記載するように、ポリペプチド、アンチセンスＲＮＡもしくは他の非翻訳ＲＮＡをコードする可能性がある。異種核酸は、例えばゲノム内への安定組み込みまたは宿主細胞によって安定性に維持されているエピソーム構築物の導入によって、トランスジェニック鳥もしくは胚中の一つもしくは２つ以上の細胞内へ一般に安定性で形質転換されている。
【００３０】
ここで使用する用語「所定位置」は、卵内の決まった位置もしくは深さを指示する。例えば、装置は卵内の決まった深さおよび／または一定の位置に卵内へ挿入できる（例えば、卵は所定方向に配置することができ、装置は卵の中に一定の点で一定の深さへ挿入される）。また別の実施形態では、注入は、例えば卵内での胚（例えば、胚盤葉）の位置もしくはその中の区画、卵黄膜等に関する卵から入手された情報に基づいて実施できる（例えば、所望の区画の位置はセンサーもしくはプローブを使用して決定することができ、装置はその情報に基づいて挿入される）。
【００３１】
卵殻または内殻膜もしくは外殻膜を説明するために使用される用語「本質的に無傷（essentially intact）」は、それを通過する重大な穿孔もしくは裂傷がないことを指示する。内殻膜を説明するために使用される用語「本質的に無傷」は、内殻膜に重大な穿孔もしくは裂傷がないことを指示している。典型的には、内殻膜の目に見える部分だけが卵殻に形成された窓もしくは開口部の下方にあり、そして内殻膜の状態は開口部の下のこの露出した部分に関して決定される。
【００３２】
米国特許第５，８９７，９９８号（Ｓｐｅｋｓｎｉｊｄｅｒ）は、長軸に対して水平位置に配置された卵殻の中に開口部を作成することによって鳥類の卵の内容物を操作するための方法を記載しているが、このとき開口部は卵の上側の卵殻に作成される。その後、１滴の液体が、「開口部が完全に被覆されるように」、卵殻における開口部の上方に置かれる（米国特許第５，８９７，９９８号、要約）。下にある膜は切り取られ、そして液は殻および膜における開口部を通して卵の中へ顕微注入することができ、そして開口部がシールされる。
【００３３】
本発明者らは、液滴を通して卵の中へ装置を挿入することが不要であることを見いだした。さらに、液体が配置される場合にも、米国特許第５，８９７，９９８号によって教示されているように、卵殻における露出した膜および開口部の表面全体を被覆する必要はない。さらに、本発明者らは、卵の中へ前記装置を挿入する前に少なくとも卵の内殻膜を本質的に無傷で残すことによって操作された胚の生存率が向上する可能性があることを見いだした。
【００３４】
具体的には、鳥類の卵の中に物質を導入する好ましい代表的方法では、卵は所定位置に方向付けられ、内殻膜が注射前には本質的に無傷で維持されるように、卵殻の中に小開口部が作成される。送達装置は卵殻における開口部を通して伸長させられ、そして内殻膜は送達装置（例えば、マイクロピペットもしくはマイクロインジェクション・ニードル）を用いて穿刺され、物質が前記送達装置を通して放出され、そして卵の中の所望の位置へ配置される。物質は、概しておよそ１〜２０μＬ（典型的には、５μＬもしくは１０μＬ）の量である所定の用量で放出される。送達される量は、それが胚を過度に傷つけず、送達のために有効である限りにおいて、決定的に重要ではない。
【００３５】
卵殻における「小開口部」は、発育中の胚を過度に傷つけないために十分に小さく、シールできる、さもなければそれが所望であれば閉鎖できる開口部を意味する。特定の実施形態では、卵殻における「小開口部」は、例えば径が約１０ｍｍ〜約３０ｍｍ、または径が約１５ｍｍ〜約２５ｍｍのように径が約３５ｍｍ以下であってよい。さらにまた別の実施形態では、「小開口部」は、径が約１０ｍｍ未満、約５ｍｍ未満、もしくは約３ｍｍ、２ｍｍもしくは１ｍｍ未満でさえある。
【００３６】
典型的には、送達装置は、送達装置が卵内に放置される移植可能な装置でない限り、卵から引き抜かれるであろう。一般には、卵殻における開口部は、セルフシール材料（すなわち、シーラント）がその中に開口部を導入する前に卵殻へ適用されていない限り、シールされる。操作された卵は、その後培養器中に配置することができる、または孵化もしくはいずれか所望のエンドポイントまで貯蔵される。
【００３７】
卵殻における開口部は、例えば赤道軸の近くの卵の側方または卵のどちらかの端のようないずれかの適切な位置に作成することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、卵殻における開口部は気室の上方で卵の鈍端に導入される。この実施形態によると、小開口部は外殻膜内にも導入される。気室によって外殻膜から分離されている内殻膜は、注入前には本質的に無傷で残されている。内殻膜は送達装置によって穿刺され、物質はそれを通して卵内の所望の位置内へ放出される。
【００３８】
外殻膜における「小開口部（small opening）」は、本質的に卵殻における小さい開口部について上記で記載した通りである。
【００３９】
当業者であれば、初期胚（例えば、胚盤葉）は、卵が水平に、垂直に、またはある角度で置かれようと、典型的には卵の一番上の部分の領域もしくはその近くに自然に位置することを理解するであろう。そこで、卵殻における開口部は一般に、胚を卵の中の様々な位置へ導く（steer）ための措置が講じられない限り、初期胚（例えば、胚盤葉）が位置すると予想される近くの卵の一番上の部分に作成される。
【００４０】
特定の実施形態では、卵殻における開口部は卵の上側に（すなわち、卵の長軸に沿って）作成される。この実施形態によると、卵は典型的には概して水平位置に、すなわち長軸を水平から約４５度未満の角度で傾斜させて方向付けられるであろう。特定の実施形態では、卵は卵の長軸に対して水平から約３０、２０、１５、１０もしくは５度未満傾斜させられる。他の実施形態では、卵は実質的に水平位置に、すなわち本質的に卵をその長軸に沿って傾斜させずに置かれる（例えば、水平から約５％もしくは１０％未満の傾斜で）。
【００４１】
卵の側方内に注入するときは、装置は概して内殻膜および外殻膜の両方を同時に通して挿入されるであろう。他の特定の実施形態では、開口部が卵殻に作成されるときに膜は取り除かれてよい。さらにまた別の実施形態では、装置を内殻膜に通して挿入する前に外殻膜内に開口部が作成されるが、このとき内殻膜はそれに通して装置を挿入する前には本質的に無傷である。
【００４２】
特に好ましい実施形態では、卵は、卵の鈍端を概して上向き位置に方向付けて、卵の長軸に対して垂直位置に方向付けられる。「概して上向き位置」とは、卵が垂直に配置され、そして長軸が垂直から約４５度未満の角度で傾斜させられることを意味する。特定の実施形態では、卵は卵の長軸に対して水平から約３０、２０、１５、１０もしくは５度未満傾斜させられる。他の実施形態では、卵は実質的に直立位置に、すなわち本質的に卵をその長軸に沿って傾斜させずに置かれる（例えば、垂直から約５％もしくは１０％未満傾斜させて）。この実施形態によると、卵は概して、初期胚（例えば、胚盤葉）が卵の鈍端で気室の下方に位置するように傾斜させられる。
【００４３】
卵殻膜における開口部は、所定位置（例えば、卵の鈍端の中心、または卵の鈍端で気室の中心）に作成できる、または少なくとも一部には、卵の中の初期胚（例えば、胚盤葉）の位置によって決定される位置に作成できる。
【００４４】
本発明は、有益にも卵の中の初期胚（上記に記載した通り）へ物質を送達するため、または初期胚から物質を取り出すために使用できる。特定の実施形態では、初期胚は胚盤葉である（同様に上記に記載した通り）。さらにまた、初期胚は気室を卵の中で検出可能である段階にあることが好ましい。
【００４５】
物質は、胚（例えば、胚盤葉）自体（例えば、明域または暗域）内へ放出することができる。あるいはまた、物質は例えば、胚（例えば、胚盤葉）から約１０、８、５、３、２もしくは１ｍｍ以内のように、初期胚に極めて近接させて（例えば、真上、真下または隣接して）放出することができる。この実施形態によると、前記物質は暗域と卵黄膜との間、明域と卵黄膜との間、および／または暗域と明域との間のような胚の胚下腔内へ放出することができる。本発明のさらにまた別の実施形態では、物質はラテブラ（latebra）内、および／またはパンダー核（nucleus of pander）内へ放出される。
【００４６】
ＰＧＣを送達する方法は当分野において知られており、概してＰＧＣを胚内の血管（例えば、背側大動脈）または胚体外膜におけるいずれかの十分に大きい血管内へ注射するステップによって実施される（例えば、マサチューセッツ大学の国際公開公報第９９／０６５３３号を参照）。同様に、血液サンプルを胚内の血管またはＰＧＣステージ胚の胚体外膜内の血管から取り出すことができる。
【００４７】
一つの特定の実施形態では、本発明は初期胚（例えば、胚盤葉）および気室を含む鳥類の卵へ物質を送達する方法を提供するが、この方法は、卵の鈍端が所定位置（例えば、上記に定義したように概して上向き位置）にあるように卵を方向付けるステップと、気室の上方にある卵の鈍端で卵殻および外殻膜に小開口部を導入するステップであって、このとき内殻膜は本質的に無傷状態で維持されているステップと、卵殻における開口部および外殻膜を通して送達装置を伸長させるステップと、前記送達装置を用いて内殻膜を穿刺するステップと、前記送達装置を通して胚盤葉内または胚盤葉に極めて近接させて前記物質を放出するステップとを備えている。
【００４８】
外殻膜に開口部を形成して内殻膜を穿刺するステップは、２つの膜を通して前記装置を挿入することによって実質的に同時に実施できる。特定の実施形態では、開口部は最初に外殻膜に作成され、そしてその後前記装置はその中に開口部を作成するために内殻膜を通して挿入されるであろう。同様に、卵殻における開口部は、外殻膜における開口部の形成前に（例えば、最初に卵殻内に一つの開口部が穿孔され、その後外殻膜に開口部が置かれる）、または外殻膜における開口部の形成と実質的に同時に（すなわち、単一のステップとして）形成することができる。
【００４９】
上記のように、内殻膜を通しての注入は、内殻膜上に配置されている液滴を通して行われないのが好ましい。液体を通して注入が行われるそれらの実施形態では、液体が水溶液（例えば、卵白液）であり、そしてほんの小量（例えば、２〜１０μＬ）が内殻膜上に配置されるのが好ましい。
【００５０】
当業者であれば、本発明の方法が例えば商業的養鶏事業におけるように、複数の鳥類の卵に実施できることを理解するであろう。本発明の方法が複数の鳥類の卵について実施される場合は、一群において総じて向上した孵化率および低下した罹患率を観察できる可能性があるが、それでもまだ卵の中での操作を受けた個々の鳥においては罹患率および死亡率が生じることがある。
【００５１】
好ましくは、操作された卵における孵化率は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上である。さらにまた、操作された卵における孵化率は、操作を受けなかった（例えば、殻の中に開口部が作成されていない）対照卵において観察されたものに類似する、または対照卵と比較した孵化率の減少が約２５％、１５％、１０％、５％、３％、２％または１％未満さえであるのが好ましい。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明は初期胚（例えば、胚盤葉）を含有する卵へ物質を送達するため、または初期胚自体へ物質を送達するために使用できる。本発明の実施形態によると、細胞、ワクチン、ポリペプチド、成長促進剤、競合排除培地のようなプロバイオティック培地、抗生物質、遺伝子導入ベクターを含む異種ヌクレオチド配列、ビタミン、および／または色素のようなマーカー等を含むがそれらに限定されないいずれかの物質を注入できる。物質は、単独で、または組み合わせて注入することができる（例えば、他の物質の送達と一緒に抗生物質を含めることができる）。別の実施例として、送達が所望の位置へ行われたかどうかを決定する手段を提供するために、色素またはその他のマーカーを送達すべき他の物質と一緒に含めることができる。
【００５３】
ここで使用する「ポリペプチド」には、タンパク質およびペプチドの両方が含まれる。卵または胚自体へ送達されるポリペプチドには、抗体、抗原（例えば、免疫のため）、成長因子、ホルモン、およびその他の成長もしくは性能を増強するポリペプチド、酵素、サイトカイン等が含まれる。
【００５４】
「成長もしくは性能を増強する」とは、成長、動物の最終サイズ、飼料対利得比、産卵数、食肉生産等の速度が向上することを意味する。
【００５５】
ワクチン有機体には、死滅、生存もしくは減衰ウイルス、細菌、原生動物および真菌が含まれ、さらに様々なライフステージにあるこれらの種々の有機体が含まれる。
【００５６】
本方法はさらにまた有益にも、目的のヌクレオチド配列を発育中の胚内へ導入する（好ましくは、ヌクレオチド配列は胚細胞内へ安定に形質転換される）ために、すなわち（上記で定義した通りの）トランスジェニック鳥を創出するために使用できる。当業者であれば、結果として生じるトランスジェニック鳥の全細胞が導入遺伝子を含有していることが必ずしも必要ではないことを理解するであろう。ヌクレオチド配列はＤＮＡもしくはＲＮＡであってよく、そしてそれはいずれかの目的のポリペプチドをコードできる、または非翻訳ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）をコードできる。ヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする実施形態では、ポリペプチドはレポーターポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質もしくはアルカリホスファターゼのような酵素）、治療用ポリペプチド、免疫原性ポリペプチド（すなわち、ワクチン接種のため）、成長もしくは性能を増強するポリペプチド等であってよい。
【００５７】
ヌクレオチド配列は、当分野において知られているいずれかのベクターおよび方法を使用して胚内へ導入することができる。例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス）もしくはＤＮＡベクターは、目的の異種ヌクレオチド配列を運ぶために使用できる。特定の実施形態では、前記ヌクレオチド配列を胚の中へ導入するためにウイルスベクターは使用されない。ウイルス形質導入および裸のＤＮＡベクターを細胞内へ導入する（例えば、リポソームまたはエレクトロポレーションを使用して）方法は当分野において知られている。卵内エレクトロポレーションのために適切な装置には、ＢＴＸ  ＥＣＭ  ２００１エレクトロポレーション装置（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ．ｃｏｍ）が含まれる。
【００５８】
他の好ましい実施形態では、本発明は異種もしくは「ドナー」細胞をレシピエント胚内へ導入するために（すなわち、上記で定義したように、キメラ胚、および任意選択的にキメラ鳥を創出するために）使用される。ドナー細胞はトランスジェニック細胞であってよい、または胚内へ導入するために他の目的の特徴を有していてよい。ドナー細胞は、典型的には上記で記載したように鳥類細胞であろう。
【００５９】
特定の実施形態では、レシピエント胚およびドナー細胞は同一の鳥類種からである。あるいはまた、ドナー細胞はレシピエント胚からの相違する鳥類種からであってもよい（例えば、ニワトリ胚内へシチメンチョウ細胞を取り入れる）。さらにまた別に、胚およびドナー細胞は同一の鳥類種からではあるが、しかし相違する系統もしくは品種からであってよい（例えば、ニワトリの２種の品種または系統）。レシピエントもしくはドナー細胞は鳥の絶滅危惧種からであってよい。
【００６０】
さらにその上、ドナー細胞はまた高性能の、または優良血統の鳥からであってよい。典型的には、高性能の、または優良血統の鳥は、所望の遺伝形質を備えた系統を創出するための種畜として使用される。本発明は有益にも、連続する世代を通して前記系統を拡大させるが所望の遺伝形質の一部の希釈または消失を生じさせることがある従来型のステップによるより、むしろ単一のステップで多数の「子孫」を作製するために、単一の高性能の、または優良血統鳥からの細胞（およびこのため、遺伝物質）の直接移入を許容する。高性能の、または優良血統鳥は、筋産生上昇、脂肪組成減少、産卵数上昇、疾患抵抗性向上、変化したサイズ（例えば、より小型の鳥）、羽毛減少の低下または変化した羽毛組成、および／または変化した雄性鳥の比率を含むがそれらに限定されない、いずれかの所望の遺伝形質（例えば、商業的に重要な遺伝形質）について改良されている、または優れている可能性がある。
【００６１】
典型的には、ドナー細胞は胚盤葉細胞、幹細胞、培養幹細胞、胚幹細胞、始原生殖細胞、および胚生殖細胞からなる群から選択されるであろう。
【００６２】
一部の実施形態では、ドナー細胞を導入する前にレシピエント胚内の細胞を傷つけることが所望であることがある。胚細胞を傷つける方法は、当業者には知られている。胚を傷つける適切な方法には、コアリング（レシピエント胚から細胞を取り出す方法）、機械的傷害（例えば、裂傷）、γ線照射、マイクロ波、軟Ｘ線、化学処理（例えば、アンモニアガス）、加熱、レーザー処理、および／または極低温冷却等が含まれるがそれらに限定されない。特定の実施形態では、照射、加熱、化学処理および軟Ｘ線は卵全体へ適用できる。紫外線照射、マイクロ波、加熱、レーザー処理、極低温処理、機械的傷害およびコアリングは、胚を傷つけるために卵殻における窓を通して他の実施形態で使用できる。
【００６３】
胚が傷つけられる程度は、例えば色素、特に壊死細胞（例えば、ヨウ化プロピジウム）もしくはアポトーシス細胞（例えば、ヘキスト３３３３４２染色）を選択的に染色する蛍光色素を使用することによって、当分野において知られているいずれかの方法で決定できる。あるいはまた、当分野において知られている壊死もしくはアポトーシス状態の指標であるｍＲＮＡ転写体もしくはポリペプチドを検出することができる。
【００６４】
したがって、一つの好ましい実施形態では、本発明は、卵殻の中へ小開口部を導入するステップと、卵殻における開口部を通して送達装置を伸長させるステップと、前記送達装置を用いて内殻膜を穿刺するステップであって、このとき内殻膜はそれに通して前記送達装置を挿入する前には本質的に無傷でなければならず、キメラ胚を生じさせるために十分な条件下で、前記送達装置を通して鳥類ドナー細胞を放出して前記ドナー細胞を胚盤葉内に、または胚盤葉に極めて近接させて（上記の通りに）配置するステップと、前記送達装置を卵から引き抜くステップと、キメラ鳥を生じさせるためのキメラ胚を孵化させるために培養するステップとを含む、キメラ鳥を産生するための方法を提供する。
【００６５】
胚盤葉および／またはキメラ産生への細胞の送達が成功したかどうかは、当分野において知られているいずれかの方法によって評価できる。例えば、ドナー細胞は色素（例えば、カルボキシフルオレセイン−ジアセテート−スクシニル−エステルのような蛍光色素）、金粒子、またはレシピエント胚へ細胞を送達した後に検出できる可能性がある当分野において知られているいずれかその他のマーカーと接触させることができる。あるいはまた、ドナー細胞は、胚盤葉、胚もしくは結果として生じる鳥におけるドナー細胞もしくはその子孫の存在を同定するために、抗体もしくは標準核酸検出法を使用して検出できる特定エピトープもしくは核酸配列を運ぶことができる。加えて、あるいはまた、ドナー細胞は孵化後に胚もしくは鳥において容易に検出できる特定表現型遺伝形質（例えば、羽毛の色）を授与する遺伝子を運ぶことができる。
【００６６】
本発明に関する上記の説明は、主として卵または初期胚（例えば、胚盤葉）へ物質を送達する方法に関する。卵を注入する方法は、さらにまた卵（例えば、上記で記載したように、胚）から物質（例えば、サンプル）を取り出すためにサンプリング装置を卵の中へ挿入するために、および／または卵（例えば、胚から）からの情報を検出するためにも実施できる。
【００６７】
一つの実施形態では、サンプリング装置はそれからサンプルを取り出すために卵の中に挿入することができる。サンプルは、卵の胚体外部分（例えば、卵黄または卵白）から採取できる。例えば、サンプルはその中の微生物汚染（例えば、サルモネラ菌）の存在もしくは不在を決定するために卵白から採取できる。他の実施形態では、サンプルは例えば明域、暗域、および／または胚下腔からのように初期胚（例えば、胚盤葉）から採取される。本発明の実施形態では、サンプルは胚盤葉細胞を含有する。典型的には、サンプルはそれから情報を入手するために取り出されるであろう。サンプルは、例えば雌雄鑑別法または胚の生育力を決定する方法と結合して取り出すことができる。具体的には、細胞を含有するサンプルは、当業者には知られているように、性染色体または染色体上の性特異的配列を検出するために胚から取り出すことができ、そして細胞を分析する（典型的には卵から取り出した後に）ことができる。サンプルはさらにまた、例えば胚内の特定遺伝子もしくは目的の対立遺伝子の存在を決定するために、いずれか他のＤＮＡに基づくアッセイのために使用できる。
【００６８】
また別の実施形態では、検出装置はそれから（すなわち、卵および／または胚から）情報を検出するために卵の中に挿入することができる。前記検出装置は、卵の胚体外位置（例えば、卵黄または気室）内へ挿入することができる。あるいはまた、検出装置は胚に極めて近接して（上記に定義した通り）配置できる。他の実施形態では、検出装置は胚の明域もしくは暗域内へ、または胚下腔内へ配置できる。
【００６９】
検出装置は、胚のサイズ、胚の位置、胚の発育期、胚の性別、および／または胚の生育力を含むがそれらに限定されない情報を収集するために使用できる。好ましくは、検出装置は胚および胚下腔の位置に関する情報を入手する。情報は、検出装置に接続されている機器（例えば、コンピュータまたはその他のデータプロセッサ）によって捕捉できる。
【００７０】
特定の実施形態については、それからサンプルが取り出される、または検出装置を用いて情報が検出される卵が同定される。サンプルに関する情報または検出装置によって入手される情報は、卵の同定と結び付けて保存することができる。代表的な検出装置について、下記でより詳細に考察する。
【００７１】
図１〜６は、本発明の特定の実施形態を具体的に示したフローチャートである。
【００７２】
図１に示したように、本発明による初期胚（例えば、胚盤葉）を含有する鳥類の卵に注入する一つの特定方法は、注入前に卵を準備するステップ１０００と、胚を卵の内側にポジショニングするステップ２０００と、開口部を卵の中に導入するステップ３０００と、胚の位置を確認するステップ４０００と、装置を卵の中の所望の位置内へ挿入するステップ５０００とを含む。
【００７３】
図２に示したように、卵は注入前に任意選択的に準備される。卵の表面、少なくとも注入部位の周囲は、微生物汚染を減少させるために消毒される（例えば、アルコールもしくはその他の消毒液を用いて）１２００。卵は、さらに所定位置に方向付けることができる（例えば、卵の鈍端を概して上向き位置にして）１３００。特定の実施形態では、卵は注入前には貯蔵される１１００。典型的には、卵は、卵の中の所望の位置へ胚をポジショニングする、もしくは「導く」際に役立つのに十分であるが、しかし胚の容認できない罹患率もしくは死亡率の発生を生じさせるには不十分である期間にわたり貯蔵される。具体的には、卵は約６、１２、２４時間以上貯蔵することができる。貯蔵期間には、生育力が過度に損なわれない限り、または胚が本方法のための適切な時点を超えて発育しない限り、特定の限界はない。卵は、注入前に約３０日間もしくは約６０日間もの長い期間にわたって貯蔵することができる。本発明の実施形態では、卵は注入前に約３０日間以内、約１４日間以内、約１０日間以内、または約７日間以内にわたり貯蔵される。他の特定の実施形態では、卵は注入前に約１、２、３、４、５、７、８、１０、１４もしくは２１日間にわたり、あるいはまた、注入前に約１〜２１日間、約１〜１４日間、約１〜７日間、約１〜４日間、約４〜８日間、または約６〜１２日間にわたり貯蔵される。
【００７４】
一般に、卵は、卵の中の胚の発育を促進しない、または所望の発育期（例えば、胚盤葉期）を超えた発育を回避する条件（例えば、温度）で貯蔵される。当業者であれば、一部の細胞分割が貯蔵期間中に発生する可能性があることを理解するであろう。しかし、一般に、胚の発育は貯蔵期間中には一時的に中断され、または重大に遅延される。
【００７５】
卵は、貯蔵期間中に（長軸に対して）水平もしくは垂直位置に、またはそれからある角度で方向付けることができる。特定の実施形態では、卵は注入に使用される方向と同一方向で貯蔵される。さらに、卵は左右両方向の移動および卵の長軸の周囲での回転が制限または防止される一定位置（例えば、装置内で）に保持することができる。
【００７６】
特定の実施形態では、胚はさらにまた上記の通りに、胚内への注入前に傷つけることができる。
【００７７】
先行段落で指摘したように、特に卵を注入する自動的な方法もしくは半自動的な方法のためには、注入前に胚を導く、またはポジショニングすることがしばしば所望され、かつ有益である。ここで図３を参照すると、上記の通りに、卵黄の中央上面上への胚盤葉のポジショニングを促進するために、卵は注入前に貯蔵することができる２１００。あるいはまた、または同時に、卵は胚を導くために撹拌する（例えば、振とうする）２２００、回転させる２３００、遠心する２４００、および／または旋回させる２５００ことができる。あるいはまた、またはそれに加えて、卵の内容物は加熱するステップ２６００（例えば、華氏約５５度もしくは華氏６０度から華氏約７５度、華氏８０度もしくは華氏９５度未満の温度へ）または冷却するステップ２７００によって変化した温度条件へ曝すことができる。上記の通りに卵を加熱するときには、当業者には胚が所望の段階を超えて発育しないように卵が十分に穏やかな加熱処理（時間×温度）に曝されることが理解されるであろう。さらにまた別の、または追加の処理として、卵は胚を所望の位置へ導くことを促進するために化学的に処理する２８００（例えば、卵白をアンモニアガスで化学的に処理する）ことができる。加えて、あるいはまた、卵を取り囲んでいる空気の相対湿度を制御する２９００（例えば、約７５％より上または下へ）ことができる。
【００７８】
特定の実施形態では、卵は卵白の菲薄化（すなわち、硬さの消失または壊れた卵における低いハウ単位（Haugh Unit））を生じさせる（例えば、化学的または機械的）処理に曝される。卵黄の中央上面への胚盤葉のポジショニングは菲薄化した卵白によって容易になる可能性があると考えられる。あるいはまた、本発明の方法では高齢群からの卵および／または大きな卵を使用することができる。高齢産卵鶏によって産生した卵および大きな卵はどちらも相当に薄い卵白を有する可能性がある。
【００７９】
アンモニアガスは、卵白の菲薄化を生じさせることが文献において報告されている。卵は、所望の位置での胚盤葉のポジショニングを生じさせるいずれかの適切な濃度のアンモニアガスへ曝すことができる。適切な濃度のアンモニアガスは、十分な時間（例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２、３、４、５もしくは６時間）にわたって約１００、１５０、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００未満、または３５００、４０００、５０００、６０００、７０００、もしくは８０００ｍｇ／ｋｇ以上であってよい。特定の実施形態では、卵は相当に短時間（例えば、約０．５〜約１時間）にわたって相当に高濃度（例えば、約２０００〜４０００ｍｇ／ｋｇ）のアンモニアガスに曝される。他の特定の実施形態では、卵は約０．５〜約２時間にわたって約２５０〜１０００または約５００〜１５００ｍｇ／ｋｇの低用量のアンモニアガスに曝される。
【００８０】
特定の実施形態では、胚盤葉を卵黄の中央上面へポジショニングするもしくは導くのに役立つようにアプローチの組み合わせが講じられる。例えば、一つの特定の実施形態では、卵は貯蔵期間中に同時に卵の向きを変えながら、約６５℃〜約７５℃で約２日〜約７日間にわたり貯蔵される。さらに、この処理のために選択された卵は大きい卵、および／または高齢産卵鶏からの卵であってよい。
【００８１】
ここで図４を参照すると、小開口部が卵殻内３３００および外殻膜内３４００に導入される。これらのステップは別個に実施できるが、それらはさらにまた実質的に同時に、特に自動的方法または半自動的方法で実施することもできる。さらに任意のステップとして、卵の鈍端での気室の位置は、典型的には卵殻に開口部を導入する前に決定することができる３１００。さらに任意のステップとして、卵殻における開口部が本質的にセルフシールとなるように、その中に小開口部を作成する前、または作成した後に卵殻にシーラントを適用することができる３２００。あるいはまた、またはこれに加えて、シーラントは前記装置を用いて内殻膜を穿刺する前または穿刺した後に内殻膜に適用することができる。
【００８２】
本発明のある実施形態では、前記装置は所定の深さおよび位置で卵の中へ挿入されるであろう。他の実施形態では、前記装置は例えば卵の中の胚もしくは胚下腔のような卵における特定の区画もしくは構造の位置に基づいて卵の中に挿入されるであろう。胚もしくは胚下腔の位置は、注入（またはサンプリング）と同時に、またはその前に決定できる。胚の位置を決定する好ましい方法は、図５に示した。手動または半自動方法のために、胚は卵殻における窓を通して単純に（拡大機器を用いて、または用いずに）視認できる４２００。卵は、胚が見えるようにするためにさらに回転させることができる４１００。胚とバックグラウンドとの対照は、卵殻における開口部を通して特定波長（例えば、青色）の光線を卵の内部へ向けることによって、または造影剤（例えば、着色色素もしくは蛍光色素）を添加することによって増強することができる。初期胚の視認は、さらにまた当分野において知られている技術を使用して、卵黄の色（例えば、紫色の陰影または相違する黄色の陰影）に影響を及ぼす飼料または化合物を雌鶏に使用することによって促進することができる。
【００８３】
他の実施形態、特に自動または半自動注入方法では、卵の中の胚または他の区画の位置に関する情報は、検出装置を用いて検出することができる４３００。検出装置については下記で詳細に考察するが、侵襲性または非侵襲性の装置であってよい。しかしながら、典型的には、装置は、卵中の胚の位置を決定するために重要な情報を収集するために卵殻における開口部および外殻膜内に挿入される。検出するステップは、送達するステップおよび／またはサンプリングステップと実質的に同時に実施することができる。あるいはまた、それらは連続的に実施することもできる。卵内への注入および検出を同時に行うための好ましい装置は、米国特許第６，２４４，２１４号（Ｈｅｂｒａｎｋ）に記載されている。
【００８４】
上に記載し、そして図６に示したように、内殻膜はそれに通して装置を挿入する前に本質的に無傷の状態（上記に記載したように）で維持される。小開口部は、典型的には胚の上方または胚に極めて近接させて、内殻膜に作成される５１００。典型的には、小開口部はそれを通して装置を挿入することで内殻膜を穿刺することによって作成される。装置は、送達装置５２００、サンプリング装置５３００、または検出装置５４００であってよい。一部の実施形態では、装置は検出、送達および／またはサンプリング機能を含むことができる。
【００８５】
一部の実施形態では、開口部を殻および外殻膜内へ導入するステップ、および任意選択的に内殻膜を穿刺するステップは同時に、すなわち単一のステップで実施される。しかしながら、典型的には、別個のステップとして、開口部は卵殻内に導入されるが、それは本発明により使用される装置は機能性に依存して、卵殻を通して穿孔するには径が細すぎる可能性があるからである（例えば、マイクロインジェクション・ニードル）。同様に、本発明は、外殻膜および内殻膜を通して同時に注入するステップによって実施できるが（特にそれらの膜が融合している卵の側方内へ注入するときに）、卵の鈍端内へ注入するときには、これらのステップは一般に別個に実施されるであろう。
【００８６】
ここに記載した注入方法は完全に手動であっても、完全に自動であっても、または半自動であってもよい。例えば、図１に示したように、卵を準備するステップおよび胚をポジショニングするステップは手動方法により適応させられてよい。卵殻および外殻膜に開口部を導入するステップ、胚の位置を決定するステップおよび前記装置を挿入するステップは、手動であってよいが、好ましくは自動である。
【００８７】
好ましい実施形態では、例えば米国特許第６，０３２，６１２号（Ｗｉｌｌｉａｍｓら）に記載されたようにマルチサイト注入もしくはサンプリング装置が使用される。その他の好ましい送達装置またはサンプリング装置には、米国特許第５，１３６，９７９号（Ｐａｕｌら）、米国特許第４，６８１，０６３号および米国特許第４，９０３，６３５号（Ｈｅｂｒａｎｋ）、および米国特許第４，０４０，３８８号、米国特許第４，４６９，０４７号および米国特許第４，５９３，６４６号（Ｍｉｌｌｅｒ）に記載された装置が含まれる。
【００８８】
さらにまた別の実施形態では、さらに米国特許第６，２４４，２１４号（Ｈｅｂｒａｎｋ）に記載された検出装置を含む注入装置は、胚（例えば、胚盤葉）もしくはその他の区画の位置に関する情報を卵の中への注射の前にまたは注射と同時に収集する（卵もしくは胚の中の物質をサンプリングするおよび／または卵もしくは胚の中へ物質を送達する）ために使用される。
【００８９】
検出するステップの実施時期は、方法の特定の目的または検出される特徴、および注入される物質または取り出されるサンプルの性質に依存するであろう。一般に、検出するステップは、送達するステップまたはサンプリングステップの前、後、またはサンプリングステップと同時に実施することができる。
【００９０】
電気センサー、光センサー、化学センサー、温度センサー、音響センサー、圧力センサーまたは任意のその他の物理的もしくは化学的パラメーターを検出するための装置は、本発明のこの態様を実施する際の検出手段もしくは検出装置として機能することができる。検出装置もしくはセンサーは注入装置の外側壁へ接続できる、または電気検出装置の場合、そして装置が絶縁材料もしくはポリマー材料以外の導電性金属材料から形成されている場合は、注入装置自体の側壁がそれに接続された適切な回路と一緒に検出装置として機能することができる。検出装置は、非導電性注入装置に載せられた、または導電性注入装置の絶縁部分上に載せられた一つもしくは２つ（以上）の電極であってよい。卵の解剖学的構造内の深さもしくは位置を検知するために、およびその他の様々な目的のために、それらが卵に注入されるべきかどうかについての有用な指示、または特定の深さもしくは位置が達成されたという有用な指示を提供する限り、極めて多数の相違する物理的もしくは化学的パラメーターを検知もしくは検出できることは理解されるであろう。
【００９１】
センサーは、注入装置の先端に、またはその側壁に沿った所定位置に、および／または注入装置の先端から間隔をあけてポジショニングすることができる。
【００９２】
バイオセンサーは、本発明を実施するために使用できる。数多くのバイオセンサーが知られている。例えば、米国特許第５，８０４，４５３号、米国特許第５，７７０，３６９号、米国特許第５，４９６，７０１号、米国特許第４，６８２，８９５号、米国特許第５，６４６，０３９号、米国特許第５，５８７，１２８号および米国特許第４，７８６，３９６号を参照。
【００９３】
電気検出装置が使用されたときは、第１電極と作動関連している第２電極を用意することが望ましいことがある。２つの電極が使用される場合は、それらはどちらも注入装置に接続されてよい、または一つは注入装置へ接続され、そしてもう一つは別個に卵殻における同一の開口部を通して挿入されてよい。一つの好ましい実施形態では、第２電極は卵の外部と接触させる。電気シグナルは２つの電極を通過することができ、そして２つの電極間の伝導の存在または不在が検出される。第２電極を卵の外部と単純に接触させるときは、シグナルは、第２電極が卵の内容物へ容量結合するように好ましくは交流シグナルである。好ましくは、各卵（もしくは複数の卵を収容するフラット）が電気検出装置を使用した検出の前に導電性材料の上部に配置される（例えば、導電性ポリウレタンフォームに関する米国特許第５，５９１，４８２号を参照）。
【００９４】
例えば、胚下腔のような液体が充填された区画の位置を検知するために電気検出装置が使用される場合、前記電気検出装置は液体区画内へのプローブの進入を検知するので、したがって深さ検出装置として機能する（本明細書では用語「深さ検出装置」は「位置検出装置」を包含する）。本発明の一つの実施形態では、検出装置および／または関連注入装置の移動は、前記検出装置および／または装置が前記区画に進入すると停止させられる。この方法では、注入装置は胚下腔液（subgerminal cavity fluid）に貫通した直後、しかし胚下腔を最後まで貫通する前に停止させることができる。
【００９５】
光センサーは、光ファイバーを備えていてよく、さらに注入装置の外壁部分に接続されていてもよい。光源は、卵の中へ前記装置と同時に挿入される第２光ファイバーを通して提供されてよい、または外部の照明源が卵に向けられてもよい。光線の伝導または透過特性は、胚または胚下腔の位置を決定するために使用できる。光線はさらにまた、生理学的測定、疾患の測定、または性別測定のためにカラーマーカーを検出することができる。
【００９６】
化学センサーは、バイオセンサーの当業者に知られている様々な方法のいずれかで用意されてよい。例えば、化学センサーは、ベクトン・ディッキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，コッキーズビル、メリーランド、米国）から入手できる、または米国特許第４，７０３，０１７号および米国特許第４，７４３，５６０号に記載されているＢＢＬ（登録商標）リポソーム技術を通して用意できる。このようなアッセイの結果は、成分が注入装置上に載せられると、上記の通りに光ファイバーを用いて読み取ることによって決定できる。その他の化学アッセイは、電気化学的検出によって実施できる。このようなセンサーは、例えば卵の中の胚の位置もしくは性別を決定するために、そして卵の中の潜在的微生物感染を検出するために使用できる。
【００９７】
化学センサーは、注入装置上に取り付けたｐＨセンサーであってよく、ｐＨ測定値は潜在的な微生物汚染を検出するため、卵の生死を識別するため等に使用できる。下記で詳細に考察するように、様々なアニオンもしくはカチオン種を検出するためのイオン特異的電極もまた使用できる。イオンおよびｐＨプローブは、卵の様々な領域および区画内に存在する生体液の化学的性質における差によって卵の中の区画間の運動を検知する。
【００９８】
温度センサーは、その温度に基づいて生きている卵を死滅した卵から、または胚および／または胚下腔の位置を識別するために、または卵の雌雄鑑別のために使用することができる。
【００９９】
音響センサーは、深さを決定するため、生育可能な卵を生育不能な卵から識別するため、胚もしくは胚下腔の位置を決定する等のための受動センサーもしくは能動センサーとして（すなわち、卵の外側部分に接触させたトランスデューサ−のような音響シグナル源と結合して）使用できる。
【０１００】
位置センサーもしくは深さセンサーは、様々な技術のいずれかによって実行できる。気室膜との電気的接触は、胚下腔内、胚内、または他のいずれか所望の位置等内へのより正確な注入を保証するために、卵の事前に選択した区画、例えば気室膜の下方の所定の深さに対して前記装置の貫通を制御するために使用できる。あるいはまた、卵内の区画から区画（例えば、気室から胚、胚から胚下腔、等）への前記装置の移行中における圧力変化を評価するために、深さは圧力センサーを用いて検知することができる。センサーの位置を検知する一つの適切な方法は、センサーを取り囲んでいる卵の媒質によってセンサーに加えられた圧を測定する。例えば、センサー内に位置する出射孔を取り囲んでいる媒質内へ気体もしくは液体を放出するために必要とされる圧力は、注入装置または中空の気体もしくは液体充填チューブのどちらかを使用して測定することができる。必要とされる排出圧は、出射孔が気体充填区画（例えば、気室）から液体充填区画へ移動するにつれて上昇する。そして出射孔が液体充填区画から胚内へ移動するにつれて再び上昇する。圧力変化は、卵の外側に配置された圧力測定装置によって測定できる。
【０１０１】
光センサーは、前記装置が気室のような気体充填区画、胚下腔もしくは卵黄のような液体充填区画、または胚のような細胞区画のいずれにあっても、外部光源または前記装置に取り付けられた光源と結び付けて使用できる。
【０１０２】
センサーは、例えば卵の大腸菌、サルモネラ菌、もしくはリステリア菌汚染のような、卵の細菌汚染またはその他の微生物汚染を検出するための診断センサーであってよい。診断センサーは、いずれか適切な手段、典型的には化学センサーまたはバイオセンサーによって実行できる。汚染した卵の検出は、引き続いて汚染されていない卵から汚染した卵を分類するためのシグナルを誘発するために使用できる。
【０１０３】
前記装置には複数のセンサーを関連付けることができる。例えば、卵の微生物汚染を検出することが望ましい場合に、卵の中の構造の位置を決定するために、または卵の雌雄鑑別を行うことが望ましい場合に、所望の条件をより正確に指示するために、２種の相違する、または別個のタイプのデータを提供することが有益なことがある。
【０１０４】
検出ステップは、引き続いて分析が実施される処理システム内へ卵からのサンプルを引き出すことによって実施できる。例えば、液体サンプルは、少量の液体サンプルを処理するために利用できる分析システム（例えば、その中でサンプルは液体処理ラインにおける空隙により分離される）と同一の方法で、それから所望の情報を入手するために引き出して分析できる。このような場合には、それが所望の方法で使用されるまでの短期間または長期間にわたってその情報をサンプリングして保存する時間と関連付けて、卵および各卵の相対位置を計数するために、例えばハードウエア、ソフトウエア、またはハードウエアとソフトウエアの組み合わせを提供することによって、そこから各生体サンプルが引き出される卵を（例えば特定の卵を排除するため、鳥の雌雄を判定するため、および性別で分類するため、または注入される卵の量もしくはその他の一部のパラメーターについての大きな情報データベースを提供するために）識別するための方法を提供することが好ましい。
【０１０５】
本発明が、注入される卵についての大量の情報を記録かつ保存するための方法を提供できることは理解されるであろう。例えば、品質管理プログラムのため、卵の事前処理を変更するため、または選択的飼育プログラムを変更するために使用できる集団データを入手することができる。このような場合には、注入された卵の同一性は、そのバッチの卵内の特定の個体としての同一性よりむしろ特定バッチの卵と関連している可能性がある。
【０１０６】
したがって、本発明は、初期胚（例えば、胚盤葉）を含有する鳥類の卵を操作する、および胚自体を操作するための改良された方法を提供する。本発明は、例えば卵から情報を収集するため、卵からサンプルを取り出すため、および／または卵へ物質を送達するために使用できる。
【０１０７】
これまで本発明を記載してきたが、以下では一定の実施例を参照しながら本発明について具体的に説明する。これらの実施例は、具体的に説明する目的でのみ含まれており、本発明を限定することは意図されていない。
【実施例１】
【０１０８】
以下は、卵の鈍端を通して卵の中のレシピエントニワトリの胚盤葉内へ液体または細胞を注入するために使用される代表的方法である。
１．１００％のエタノールを用いて拭うことによりＥ０日齢の卵の表面全体を殺菌する。
２．気室の位置を確認するために卵を明かりに透かして見る。鉛筆で気室の位置を殻上にマークする。
３．殻に穴を開けることによって、窓（小開口部）を卵の鈍端（気室の中心）に作成する。外殻膜を無傷で維持するために細心の注意を払う。
【０１０９】
下記のステップは、全部を好ましくは層流フード内またはクリーンルーム内で実施する。
４．殻における窓を通して外殻膜が露出している場所である卵の鈍端、および周囲領域は、再び７０％のエタノールを使用して表面を殺菌する。
５．膜にギザギザの縁が残らないように注意しながら、鉗子およびメス（＃１１ブレード、ペルソナメディカル（Ｐｅｒｓｏｎｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ）製）を用いて外殻膜を注意深く取り除く。
６．胚盤葉は、ドーナツ形構造として気室膜（すなわち、内殻膜）の下方で視認される。
７．ガラス製のマイクロピペット（もしくはニードル）を使用して気室膜を穿刺し、胚盤葉の胚下腔液内へ注入する。約３〜５μＬの液体（１００ｇ／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンを含有する）を注入する。マイクロピペットは、サッター（Sutter）製Ｐ−３０プラー、温度−８００、引張力−９５０を使用して引っ張った。
８．注入後、窓に適合するように切断した耐水テープ（ジョンソン・エンド・ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）製、幅１インチ）を貼付し、所定の位置に押し付ける。
９．その後、テープの辺縁をシールすることに重点を置いて、テープの全面を覆うようにシリコン（ＧＥ製Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ＩＩ、透明）シールを広げる。
１０．卵を培養器へ移す前に、シリコンを約３０〜４５分間にわたり乾燥させる。
【実施例２】
【０１１０】
卵の中のレシピエントニワトリの胚盤葉（ほぼステージＸ）の胚下腔内へ液体または細胞のいずれかを注入する実施例１に記載したような手動注入の使用を評価するために、一連の実験を実施した。ドナー細胞もまたステージＸのニワトリ胚盤葉からであった。一部の場合には、レシピエント胚を注入前に傷つけた。前期の実験では、小滴（数μＬ）の卵白液を胚盤葉の上方の内殻膜上に配置し、そして卵白液を通して前記膜を穿刺することによって注入を実施した。後期の実験では、このステップを省いた。卵は貯蔵しなかったか、または処理前４〜８日間にわたり貯蔵した。
【０１１１】
対照卵および操作した卵における孵化率を決定した。キメラ産生の成功率についてもまた評価した。結果は下記の表１に示した。
【０１１２】
【表１Ａ】
2005518188.tif 000002
【表１Ｂ】
2005518188.tif 000003
【実施例３】
【０１１３】
紫外線（ＵＶ）照射またはレーザーアブレーションのような胚の物理的傷害の一定方法は、卵殻および殻膜における窓を通して適用できる。本発明者らは、卵の側方に窓を作成し、それをシールし、そして胚が通常は２日間で発育する極めて高いパーセンテージ（＞９０％）を可能にする標準条件（９９°Ｆ、振動）下で卵を培養する方法を開発した（図７）。この方法は、２日間の胚発育での傷害およびキメラ産生の作用を評価するために使用できる。さらに、この方法は卵の側方内へ注入するためにも使用できる。
【０１１４】
端的には、卵は下記の通りに処理した。
１．卵は、胚盤葉を卵の側方の中心に向けて導くために、それらの長軸上で、０〜７日間にわたり６０°Ｆ、湿度７５％で貯蔵した。
２．上に向いている位置をサインペンでマークした。
３．貯蔵後、卵の側方にペンマークの位置で７ｍｍ径の穴を穿孔した。
４．卵殻を取り除いた。通例、内殻膜および外殻膜は無傷で残ったが、それらもまた取り除いた。
５．胚盤葉は、卵殻に作成した開口部の近く、またはすぐ下方で同定された。この特別の実験のため、ＵＶ光線のような様々な傷害処理の適用を許容するように、胚盤葉が前記開口部のすぐ下方にある卵だけを使用した。
６．穴は、５〜１０分間は開いたままにした。
７．この穴は、ＧＥ製シリコンＩＩおよびＪ＆Ｊ製耐水テープを用いてシールした。
８．シリコンは約３０分間かけて乾燥させた。
９．卵は鈍端を上に、穴を側方に向けて培養器内に配置し、２日間にわたり、３時間毎に回転させながら９９°Ｆで培養した。
１０．写真撮影のために卵から胚を収集した。
【０１１５】
代表的な対照胚および処理胚の写真は図７に示した。
【実施例４】
【０１１６】
レシピエント胚内への胚盤葉細胞の取り込み方法を開発した。この方法は、あらゆる鳥類種または系統から新しく単離した胚盤葉細胞を追跡するために適用することができ、そして胚幹細胞のような他の細胞の取り込みを監視するために容易に適用できるはずである。この方法を要約すると、新しく単離した胚盤葉細胞は注入前にカルボキシフルオレセイン−ジアセテート−スクシニル−エステル（ＣＦＤＡ  ＳＥ）に曝露させた。ＣＦＤＡ  ＳＥはアミン反応化合物であり、これは細胞内タンパク質と反応すると高度に蛍光性になる。胚盤葉細胞内に取り込まれると、それらの細胞は蛍光顕微鏡によってレシピエント胚内で観察できる。
【０１１７】
下記に例示する実験では、新しく単離した胚盤葉細胞をＣＦＤＡ  ＳＥにより標識し、卵の鈍端で内殻膜を通しての注入（実施例１に記載した通り）によって、ステージＸの胚盤葉内に顕微注入した。２日間の培養後に顕微鏡によって観察すると、様々な組織中で蛍光標識ドナー細胞が見いだされた。図８は、キメラ胚を創出するために２日間培養されたレシピエント胚の体節内へ取り込まれた蛍光標識ドナー細胞を示した図である。蛍光色素標識は、初期胚におけるドナー細胞取り込みに続いて遺伝子組み換え細胞を使用する方法にとって魅力的な代替法または補完法となる可能性がある。
【実施例５】
【０１１８】
ニワトリキメラ産生を最適化するために、レシピエント胚は、それらがドナー細胞に対してより受容的となるように、「傷つけられ」ても、またはプレコンディショニングされてもよい。最も広範に容認された傷害方法には、レシピエント卵を６００ラドのγ線照射に曝露させるステップが含まれる。レシピエント胚へ様々な処理が及ぼす作用を評価するために、本発明者らはレシピエント胚盤葉中でのインサイチュー細胞死の量を測定する技術を開発した。
【０１１９】
インサイチューでの壊死細胞を同定するために、本発明者らは、主として死滅細胞へ透過性である蛍光ＤＮＡ染色液のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による色素標識を評価した。繊細な胚盤葉の取り扱いおよび洗浄を最小量に抑えると、ＰＩは壊死細胞を効果的に標識することが見いだされた。これらの細胞は蛍光顕微鏡によって同定かつ写真撮影することができ、そして相対量の細胞死はデジタル画像解析によって決定することができた（図９を参照）。胚盤葉中の壊死細胞の正確な位置もまた、デジタル画像解析によって決定することができる（図９を参照）。本発明者らの知る限り、これは生きている鳥類胚の細胞死がインサイチューで測定された最初である。
【０１２０】
この実験では、ＰＩ標識法を未処理胚、物理的に損傷した胚、および熱処理胚へ適用した。未処理胚盤葉（図９、第１欄）は、低レベルのバックグラウンドの細胞死を示している。この実験で加えられた物理的損傷（第２および第３欄）は、胚盤葉単離方法によって惹起された意図的ではない損傷であった。細胞死は、胚盤葉における裂傷を取り囲む領域へ精密に局在化できることに注目されたい。加熱処理（５５℃の水浴中で１５分間）は、この処理が孵化を完全に排除することを示す以前のデータに基づいていた。この実験において証明されたように（図９、第４欄）、この孵化の減少はおそらく胚盤葉における極めて高レベルの細胞死に起因すると思われる。蛍光ピクセル数（図９、一番下の列）を使用すると、処理間の細胞死の量を定量的に測定かつ比較することができる。
【０１２１】
アポトーシス細胞の検出もまた（壊死細胞とは対照的に）、生きている細胞とアポトーシス細胞を示差的に染色する蛍光色素ヘキスト３３３３４２を使用して決定することができる。アポトーシス細胞および／または壊死細胞の測定を使用すると、レシピエント胚の傷害の程度を決定することができる。
【実施例６】
【０１２２】
商業的孵化場の貯蔵条件下で貯蔵した卵内の胚盤葉の位置および径を決定するために下記の試験を実施した。単一群からのホワイトレグホン（ボバンス）の卵を週１回測定した。この群を産卵周期の終了時まで試験した。卵は産卵２４時間以内に入手した。卵を入手した後、それらは商業的孵化場で貯蔵される方法と同様に、６０°Ｆおよび相対湿度７５％のフラットで、６日間もしくは７日間にわたり貯蔵した。各週、フラットで５０個の卵を測定した。胚盤葉の平均偏心距離は、フラット内で６日間もしくは７日間にわたり貯蔵された卵については５．２４ｍｍであったが、胚の３．０５％については極端な偏心距離が所見された。
【０１２３】
さらに、ハイライン（Ｈｙ−Ｌｉｎｅ）Ｗ−３６ホワイトレグホン群について試験した。これらの卵は産卵４８時間後までに入手した。卵は６０°Ｆおよび相対湿度７５％で６日間もしくは７日間にわたり貯蔵した。胚盤葉の平均偏心距離はフラット内で６日間もしくは７日間にわたり貯蔵された卵については５．８６ｍｍであり、極端な偏心距離は胚の３．９６％について所見された。
【０１２４】
明域の径を含む胚盤葉の径もまた、胚盤葉の位置を測定する時点に測定した。商業的孵化場の貯蔵条件下での結果は、下記の表２に示した。卵は７日間貯蔵し、胚は典型的にはステージＸ胚であると所見された。
【０１２５】
【表２】
2005518188.tif 000004
【実施例７】
【０１２６】
貯蔵条件を調節することにより胚盤葉が受動的に導かれうるかどうかを決定するために実験を実施した。卵は、商業的条件（対照）下のようなフラット内、または左右両方向への移動および卵の垂直軸の周囲での回転の両方が実質的に防止される固定直立位置（鈍端を上に向けて）で卵を保持する「フィクスチャー（fixture）」と呼ばれる装置内のどちらかで貯蔵した。
【０１２７】
ボバンス群（雌鳥は産卵６９週齢であった。それらは換毛を伴わずにほぼ７０週間まで産卵した）を用いた進行中の試験では、計２，７６６個の卵を６０°Ｆおよび相対湿度７５％でフラット内またはフィクスチャー内で７日間貯蔵し（毎週、３０個の卵をフラット内、そして３０個の卵をフィクスチャー内で３１週間にわたって貯蔵した）、胚盤葉のコントラストを増強するために青色光ファイバー光源を備えたアキュゲージ（Ａｃｕ−Ｇａｇｅ）光学座標測定装置（ＣＭＭ）上で測定した。収集したデータに基づいて、胚盤葉の平均偏心距離は、フラット内で７日間貯蔵した卵については５．２４ｍｍであった。偏心距離は、卵の長軸が垂直であるように卵を保持するフィクスチャー装置内で７日間貯蔵した卵については平均４．５８ｍｍへ向上する。フラットに貯蔵された卵では、胚の３．０５％で極端な偏心が所見されたが、他方フィクスチャーに貯蔵された卵では極端な偏心を示したのは２．５３％だけであった。ペンシルバニア州エリザベスタウンからのハイラインＷ−３６卵ももまた測定した。計１，６４９個の卵を測定したが、この場合、卵は６０°Ｆおよび相対湿度７５％で６日間もしくは７日間にわたり貯蔵した。胚盤葉の平均偏心距離はフラット内で６日間もしくは７日間にわたり貯蔵された卵については５．８６ｍｍであったが、胚の３．９６％については極端な偏心距離が所見された。卵の長軸が垂直であるようにフィクスチャー内で６日間もしくは７日間にわたり貯蔵された卵についての偏心距離は平均５．３１ｍｍとわずかに良好であったが、胚の４．８１％については極端な偏心距離が所見された。
【０１２８】
フィクスチャー装置内で卵を保持することが胚盤葉の位置に影響を及ぼすかどうかを決定するために、データ（ボバンス、２３〜６９週、ハイライン、２６〜４２週）についての統計解析を実施した。無精卵または損傷した卵からのデータは除外した。胚盤葉が測定される中心から極端に離れている場合は、１３．７１６の数値を適用した。位置を従属変量と見なし、貯蔵装置（フィクスチャーまたは卵フラット）を固定値と見なす共分散分析を利用し、品種毎に別個に分析を実施した。群年齢にわたってプールした胚盤葉の位置にフラットと比較して、フィクスチャー内での貯蔵が及ぼす影響は下記の表３に提示した。
【０１２９】
【表３】
2005518188.tif 000005
【０１３０】
フィクスチャー内の貯蔵の影響は、ボバンス（ｐ≦０．００１）およびハイライン（ｐ≦０．００４）の両方について有意であった。フィクスチャー内で貯蔵した卵は中心から有意に近い胚盤葉を生じさせた。
【０１３１】
フィクスチャー内に貯蔵した卵のデータセットは、胚盤葉の位置の偏心が群年齢および／または卵重量と相関しているかどうかを決定するために分析された。卵重量を共変量とし、位置を従属変量と見なし、群年齢を固定値と見なす共分散分析を実施した。解析は品種毎に分離した。ボバンス卵は、フィクスチャー内に貯蔵した卵について高度に有意な（ｐ≦０．００１）群年齢の作用を示したが、ハイライン卵は胚盤葉位置と群年齢との有意な相関を証明しなかった（ｐ≧０．０５）。
【０１３２】
予想通りに、卵重量は群年齢とともに増加した。卵重量と卵中心からの胚盤葉の距離との間では逆関係が観察された。ボバンスデータセットは、卵重量が有意な（ｐ≦０．０５）共変量であることを証明した。だがハイライン卵については、卵重量は有意な共変量ではなかった（データは示していない）。卵重量はハイライン分析では有意な共変量ではない可能性があるが、これは、群年齢は４２週齢を超えておらず、したがって卵重量がまだ要因ではない可能性があるためである。ボバンスデータセットの回帰分析は卵重量と胚盤葉の位置との間の有意な関係を証明したが、胚盤葉の位置における１％未満の変動は卵重量によって説明できる可能性があることを示した（Ｒ2＝０．００７）。
【０１３３】
上記の実験のための対照群は、フラットに貯蔵された卵から構成された。これらは、卵が輸送される段ボール紙製フラットである。卵は、フラット内に保持されている間に垂直軸の周囲では比較的に自由に移動することができる。孵化場は、その中で卵が垂直軸の周囲で制限されたレベルの移動しかできないプラスチック製フラットを使用する。プラスチック製フラット内と段ボール紙製フラット内またはフィクスチャー内で卵を貯蔵する影響を決定するために、ボバンス卵はプラスチック製フラット内または段ボール紙製フラット内のどちらか、ならびにフィクスチャー内において６０°Ｆ、相対湿度７５％で６日間貯蔵した。下記の表４に示したように、胚盤葉の位置偏心はプラスチック製フラット内で貯蔵した卵では減少したが、しかしフィクスチャー内で貯蔵した卵でははるかに向上した。
【０１３４】
【表４】
2005518188.tif 000006
【実施例８】
【０１３５】
様々な貯蔵期間が胚盤葉の位置に及ぼす作用を決定するために試験を実施した。以前の試験は、７日間（６０°Ｆおよび相対湿度７５％で）貯蔵した卵は０日卵に比較して胚盤葉の位置における有意な改善（第０日の９．７１ｍｍの偏心から第７日の５．６１ｍｍの偏心、０．０００１レベルで有意）を示すが、１０日間にわたる卵の貯蔵はもはや胚盤葉の位置を有意に改善させないことを証明した。
【０１３６】
胚盤葉の位置に影響を及ぼすと考えられた変量の一つは卵白の厚さである。卵白が厚くなるほど卵黄の自由な回転を制限する。卵白の厚さは、ハウ単位によって測定した。別個の実験では、卵白の厚さを様々な期間にわたって貯蔵された卵内で測定した。５５週齢の群からのボバンス卵を計量し、０、３、６、１０、１３または１７日間にわたってフラット内で貯蔵した後にハウ単位を決定した。卵白の高さ、またはハウ単位は、貯蔵期間が増加するにつれて有意に減少することが証明された。
【０１３７】
貯蔵期間が胚盤葉の位置偏心ならびに卵白の厚さに及ぼす影響を決定するために一つの実験を実施した。３７週齢の群からのハイライン卵を計量し、２、６、９、１２または１５日間にわたって６０°Ｆおよび７５％相対湿度のフィクスチャー内で（鈍端を上に向けて）貯蔵した。この群を６日間貯蔵し、対照群と指定した。胚盤葉の位置を従属変量と考え、そして貯蔵期間（日数）を固定値と考える共分散分析を実施した。別個に、ハウ単位を従属変量と考え、貯蔵期間は固定変量と考えた。その後ＳＮＫ検定によって、各貯蔵期間についての平均胚盤葉の位置または平均ハウ単位を比較した。下記の表５に示したように、胚盤葉の位置偏心は貯蔵期間が増加するにつれて有意に減少し、１２日間および１５日間についての平均位置は２日間より有意に少なく、６日間および９日間については中間であった（６日間についての平均位置は実際に９日間より少なく、そして１２日間については１５日間より少なかった）。さらに、ハウ単位もまた貯蔵期間に伴って有意に減少したが、これは胚盤葉の位置よりむしろいっそう明白な影響を証明した。
【０１３８】
【表５】
2005518188.tif 000007
【０１３９】
総合すると、卵白を菲薄化すると卵黄のより自由な回転が許容され、それによって垂直の、鈍端を上に向けた位置に保持された卵の「上死点」により近い胚盤葉のポジショニングが可能になると思われる。
【実施例９】
【０１４０】
貯蔵期間中の卵の方向を調節することが胚盤葉の位置に及ぼす作用を決定するために研究を実施した。卵を横向きにして７日間貯蔵した予備実験は、胚盤葉の位置を改善しなかった。しかしながら、これらの実験は卵を平坦な表面上に置き、それらが自由に横向きになることを可能にすることによって実施されていた。
【０１４１】
本試験では、卵は実施例７に記載したようにフィクスチャー内に保持された様々な位置で貯蔵したが、これは胚盤葉の位置に及ぼす影響を決定するために左右への横移動および回転運動を限定した。フィクスチャーは、卵を一定の水平または垂直位置に保持した。その中に卵が貯蔵された様々な方向、ならびにその中で胚盤葉の位置を測定するために卵が保持された方向は以下の通りであった。
１．横向き（ボバンスおよびハイラインＷ−３６）に貯蔵し、そして横向きで測定した。
２．上下を逆さまに（すなわち、鈍端を下に）して３日間（ハイラインＷ−３６）にわたり、その後は鈍端を上に向け３〜４日間にわたり貯蔵し、そして鈍端を上にして測定した。
３．上下を逆さまに（すなわち、鈍端を下に）して６〜７日間にわたり貯蔵し、鈍端で測定した（ボバンス）。
４．上下を逆さまに（すなわち、鈍端を下に）して６〜７日間にわたり貯蔵し、鈍端で測定した（ハイラインＷ−３６）。
【０１４２】
結果は下記の表６に要約した。
【表６】
2005518188.tif 000008
【０１４３】
卵の横向きにした貯蔵は、どちらのタイプの卵についても有意に向上した結果を生じさせなかった。胚盤葉距離は低下したが、極端な偏心を示した胚盤葉の数もまた増加した。３日間にわたる卵の上向きの貯蔵は有意に近づいたが、しかし、実際には卵の中心からの胚盤葉の距離を増加させた（ｐ≦０．０５７）。右側を上または上下を逆さまにしてのどちらかで測定した上下を逆さまにした卵の貯蔵は、ボバンスおよびハイラインＷ−３６の両方について、有意差を生じさせはしたが、胚盤葉の卵の中心からの距離を大きく増加させた。
【実施例１０】
【０１４４】
貯蔵温度および相対湿度が胚盤葉の位置に及ぼす作用についてもまた研究した。温度は卵白の質（すなわち、厚さ）に影響を及ぼす重要な因子であると考えられているが、これは順に卵黄の移動または可動性、したがって胚盤葉の位置に影響を及ぼす可能性がある。予備実験は、より高温で卵を貯蔵すると胚盤葉を卵黄の表面の中心に向かって「導く」のに役立つ可能性があることを指示した。
【０１４５】
４７週齢の群からのハイライン卵を計量し、６０°Ｆ（商業的孵化場の条件）または７０°Ｆ（１５．５または２１．１℃）のどちらかで７日間にわたって貯蔵した。７０°で貯蔵した卵の胚盤葉の位置偏心は６０°Ｆで貯蔵した卵の胚盤葉の位置偏心より少なかった（ｐ＝０．０６３で有意性に近づいた）。
【０１４６】
フォローアップ試験では、卵の貯蔵中の温度および相対湿度条件の様々な置換が胚盤葉の位置に及ぼす影響について試験した。実施例７に記載した通りに６〜７日間にわたりフィクスチャー内で貯蔵した卵は、様々な温度および相対湿度の組み合わせに供したが、６０°Ｆおよび相対湿度７５％を対照処理と見なした。以下の様々な処理条件を評価した。
１．標準温度（６０°Ｆ）で、相対湿度を７５％から５０％に下げた（ハイラインＷ−３６卵）。
２．最初の５日間は、標準温度（６０°Ｆ）および相対湿度（７５％）、その後の最終２日間の貯蔵期間中は温度を、８０°Ｆに上昇させた（７５％ＲＨ）。
３．標準温度（６０°Ｆ）だが相対湿度は９０％に設定した（ハイラインＷ−３６）。
４．温度を７０°Ｆに、そして相対湿度は５０％に設定した（ハイラインＷ−３６）。
５．温度を７０°Ｆに、そして標準相対湿度へ設定した（ハイラインＷ−３６）。
６．温度を７０°Ｆに、そして相対湿度は９０％に設定した（ボバンスおよびハイラインＷ−３６）。
７．温度を８０°Ｆに、そして標準相対湿度へ設定した（ハイラインＷ−３６）。
【０１４７】
データ分析は下記の表７に要約した。
【表７】
2005518188.tif 000009
【０１４８】
これらをまとめると、７０°Ｆの温度はすべての場合に胚盤葉のポジショニングを改善すると思われ、９０％相対湿度でのハイラインＷ−３６卵を除いて全部の場合に、ｐ≦０．０５まで有意であった。相対湿度の変化単独は、胚盤葉の位置にほとんど影響を及ぼさないと思われた（すべての場合に有意性とは無関係に対照群は中心からの胚盤葉の距離を増加させたことに注目されたい）。結果は対照条件と比較して全処理群について低下したハウ単位と類似であった（標準温度および９０％相対湿度試験についてはハウ単位データが収集されなかったことに留意されたい）。ハウ単位データは、胚盤葉の位置データより高度の有意性を示したが、標準温度および５０％相対湿度群だけは有意な影響を示さなかった。
【実施例１１】
【０１４９】
外部環境を調節することは、胚盤葉の位置に影響を及ぼす一つの方法である。卵をアンモニアガスへ曝露させると卵白が菲薄化することが証明されている。Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｒａｋｅ（２０００）は、高濃度のＮＨ3（２７４７および６０５２ｍｇ／ｋｇ）に１時間曝露させた卵は、対照と比較したときに、同時の卵白ｐＨの増加を伴う卵白高さの有意な減少を示すことを証明している（０ｍｇ／ｋｇ  ＮＨ3）。卵白の高さにおける減少は卵白のより多くの流動性と正に相関していたので、胚盤葉を卵の中心のより近くへ導くためのＮＨ3処理を評価した。
【０１５０】
第１回の実験では、３８週齢のハイラインニワトリからの卵（卵の型Ｗ３６、群Ｉ．Ｄ．：ＰＬ２５０６）を入手し、６０°Ｆおよび７５％ＲＨで１日間維持した。１８個の卵（３バッチで計５４個の卵）はガラス製乾燥器（径２５０ｍｍ、カップ付き）（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製）内の磁器製プレート上に横向きに配置した。１ＬのＮＨ4ＯＨ液（１４．８Ｍ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）製）または二重蒸留水（double distilled water：対照）を乾燥器内に注入した。１４．８ＭのＮＨ4ＯＨは、６０５２ｍｇ／ｋｇのＮＨ3を放出すると推定される（Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｒａｋｅ，２０００）。これらの卵を各濃度のＮＨ3へ１時間曝露させた。その後、卵を取り出し、そして胚盤葉の位置、卵白の高さおよびｐＨを測定した。これらの結果は下記の表８に提示した。
【０１５１】
【表８】
2005518188.tif 000010
【０１５２】
これらの結果は、ＮＨ3処理がそれらの各対照と比較したときに卵白ｐＨの有意な上昇を引き起こすことを指示している。ＮＨ3処理群における卵白の高さはより低くなった（すなわち、より低いハウ単位値を有した）が、これは卵白の菲薄化を指示している。
【０１５３】
また別の実験では、卵をアンモニアへの曝露後に貯蔵した。卵（６８週齢のボバンス）を２種の濃度（２７４７および１４２ｍｇ／ｋｇのＮＨ3）のＮＨ3へ供させた。対照は０ｍｇ／ｋｇのＮＨ3へ曝露させなかった。ＮＨ3処理には計５０個の卵を使用し、対照のためには４８個の卵を使用した。１ＬのＮＨ4ＯＨ液（１４．８Ｍ）（シグマ製）の連続希釈を実施して、２７４７または１４２ｍｇ／ｋｇのＮＨ3を入手した。対照のために、二重蒸留水（１Ｌ）を乾燥器内へ注入した。これらの卵を各濃度のＮＨ3へ１時間曝露させた。その後、卵を取り出し、回転運動も左右方向の移動もできないフィクスチャー内に配置し、６０°Ｆおよび７５％ＲＨで６日間貯蔵した。６日間の貯蔵後、胚盤葉の位置、卵白の高さおよびｐＨを決定するために測定を実施した。結果は下記の表９に示した。
【０１５４】
【表９】
2005518188.tif 000011
【０１５５】
２７４７ｍｇ／ｋｇのＮＨ3を用いて処理した卵における胚盤葉の位置偏心は、対照と比較して、卵の鈍端の上死点へはるかに近い。興味深いことに、これらの卵のｐＨは対照と類似である。ＮＨ3処理卵および対照卵間でハウ単位における差はなかった。低濃度のＮＨ3（１４２ｍｇ／ｋｇ）は、対照と比較していずれの測定パラメータにおいても変化を示さなかった。
【０１５６】
２７４７ｍｇ／ｋｇのＮＨ3処理群での胚を用いて観察された変化の一つは、それらが「調理済み」の外観を有しており、生きているように見えないことであった。そこで、高濃度のアンモニアを用いた処理は、胚を傷つける方法として有用な可能性がある。
【実施例１２】
【０１５７】
胚盤葉を卵の中心へ能動的に「導く」ことができるかどうかを決定するために様々なアプローチを評価した。
【０１５８】
遠心分離
重力は、卵の中で胚盤葉を最上の位置に方向付ける際に重要な役割を果たすと考えられる。遠心分離は、人工重力を作り出す、または重力の実質的に働く力（body force）を増大させるための一つの方法である。遠心分離に起因するより大きな力が胚盤葉の位置を改善するかどうかを決定するために試験を実施した。
【０１５９】
２７週齢の群からのハイライン卵を計量し、実施例７に記載した通りにフィクスチャー内に配置し、そして計７日間にわたり貯蔵した。貯蔵第５日に、卵をソーバル（Ｓｏｒｖａｌ）製ＲＣ  ５Ｃ遠心分離用バケット内に入れ、回転を通して卵の長軸を人工重力と整列させてフィクスチャー内に保持している間に５００ｒｐｍで３分間回転させた。これらの卵をさらに２日間貯蔵し、その後、卵の中心からの胚盤葉の位置を測定した。遠心分離を原因とする胚盤葉の位置における有意な変化は認められなかった。
【０１６０】
その後の試験で、卵（ハイライン）を計量し、フィクスチャー内で５日間貯蔵し、３００ｒｐｍで３０分間回転させ（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）製Ａｌｌｅｇｒａ  ６ＫＲ遠心分離器）、さらに１日間貯蔵して胚盤葉の位置を測定した。位置を従属変量と見なし、遠心分離を固定値と見なす共分散分析を利用した。下記の表１０に示したように、胚盤葉の位置における有意差は生じず、そして実際に遠心分離した卵はわずかに中心から遠い胚盤葉の位置を示した。
【０１６１】
【表１０】
2005518188.tif 000012
【０１６２】
回転
貯蔵中に卵を回転させることが卵の上心に向かう胚盤葉の方向性に及ぼす作用を評価した。卵は６０°Ｆおよび７５％ＲＨのホバベータ（Ｈｏｖａｂａｔｏｒ）回転装置に６〜７日間配置した。この回転装置は、卵を垂直からプラスおよびマイナス４５度移動させ、０度〜＋４５度から０度〜−４５度および０に戻る１完全サイクルは４時間を要した。未処理の卵は、比較のため（回転装置内の卵と適合させるため）にフラット（段ボール紙製）内に貯蔵した。結果は下記の表１１に示した。
【０１６３】
【表１１】
2005518188.tif 000013
【０１６４】
変量解析は、処理群間の結果がボバンス卵とハイライン卵のどちらについても有意ではないことを指示したが、中心からの平均距離は回転させた卵の方が短かった。
【０１６５】
旋回
貯蔵中に卵を旋回させることが卵の上心に向かう胚盤葉の方向性に及ぼす作用を評価した。卵は実施例７に記載した通りフィクスチャー内に貯蔵し、旋回させなかったが同様にフィクスチャー内に貯蔵した卵と比較した。この試験では、卵を５日間貯蔵し、３００ｒｐｍで３０分間旋回させ、さらに１日間貯蔵して胚盤葉の位置を測定した。旋回群は中心からわずかに大きい胚盤葉の位置を有したが、極端な偏心が所見された胚盤葉のパーセンテージはわずかに改善された。結果は下記の表１２に示した。
【０１６６】
【表１２】
2005518188.tif 000014
【０１６７】
変量解析は、結果が処理群間で統計的有意に相違していないが、中心からの平均距離は回転させた卵の方がわずかに小さいことを指示した。
【０１６８】
振とう
貯蔵中に卵を振とうさせることが卵の上死点に向けて胚盤葉を方向付けることを評価した。卵は実施例６に記載した通りフィクスチャー内に貯蔵し、振とうしなかったが同様にフィクスチャー内に貯蔵した卵と比較した。
【０１６９】
胚盤葉の径も測定したが、胚盤葉の位置は上記の通りに相違する処理各々について測定した。結果は、いずれの処理についても胚盤葉のサイズに変化が生じないことを証明した。
【０１７０】
上記の発明を明瞭に理解できるように実例を示しながら詳細に説明してきたが、添付の請求の範囲およびその均等物の範囲内で一定の変更および修飾を実践できることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】本発明に記載の卵を操作する方法を具体的に示したフローチャートである。
【図２】本発明の実施形態に記載の注入する前に卵を準備する方法を具体的に示したフローチャートである。
【図３】本発明の実施形態に記載の注入する前に胚を所望の位置へ導くまたはポジショニングする方法を具体的に示したフローチャートである。
【図４】本発明の実施形態に記載の卵の中に開口部を導入する方法を具体的に示したフローチャートである。
【図５】本発明の実施形態に記載の注入する前に胚の位置を決定する方法を具体的に示したフローチャートである。
【図６】本発明の実施形態に記載の卵の中に装置を挿入する方法を具体的に示したフローチャートである。装置は、例えば送達装置、サンプリング装置、もしくは検出装置、または上記の組み合わせであってよい。
【図７】窓の開いた卵からの２日齢胚の写真である。パネル：（ａ）窓の開いていない卵からの、代表的な対照胚。（ｂ〜ｈ）窓の開いた卵からの、実験胚。実験胚は、対照と比較してステージおよび形態に関して実質的に同一である。
【図８】２日間培養されたレシピエント胚の体節における蛍光標識された細胞（緑色）の検出を示した図である。
【図９】ステージＸの鳥類胚における細胞死のインサイチュー同定を示している一連の顕微鏡写真である。ここに示した全部の写真は、ステージＸの鳥胚の明域の中心領域からのものである。上列（パネルａ〜ｄ）に示した胚は明視野照明下で撮影したものであり、中列（パネルｅ〜ｈ）はローダミン・フィルターセットを使用したエピ蛍光照明下で撮影した同一領域を示している。下列（パネルｉ〜ｌ）は、胚盤葉における細胞死の正確な局在を示すために、上の２列をデジタル合成した写真を示している。蛍光ピクセル数（下列）は、細胞死の量の定量的比較を許容するデジタル化蛍光画像からの赤色ピクセル数を示している。
【図１】
2005518188.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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