(57)【要約】本発明の形態の一つは、脱髄された軸索を希突起膠細胞前駆細胞で、軸索の再有髄化を可能にする条件下で処理することにより、脱髄された軸索を再有髄化する方法に関する。本発明の別の局面は、希突起膠細胞前駆細胞の対象への、ミエリン喪失または希突起膠細胞喪失により媒介される症状の治療に効果的な条件下で投与することにより、ミエリン喪失または希突起膠細胞喪失により媒介される症状を有する対象を治療する方法に関する。更なる本発明の局面は、哺乳類の脳または脊髄のその他細胞型を含有する混合集団から、希突起膠細胞前駆細胞を同定および分離するインビボ法に関する。この更なる本発明の局面は、処理された混合集団を作成するための、混合集団からの神経細胞および神経前駆細胞の除去に関する。その後希突起膠細胞前駆細胞が、処理された混合集団から分離され、希突起膠細胞前駆細胞高含有集団を生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱髄された軸索を、軸索の再有髄化を可能にする条件下で、希突起膠細胞前駆細胞で処理する段階を含む、脱髄された軸索を再有髄化する方法。
【請求項２】
処理段階が、経子宮的な胎児脳室内注射、脳室内もしくは実質内注射、成人および若年対象への実質内注射、または、血管内投与により実行される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ミエリン喪失または希突起膠細胞喪失により媒介される症状を治療するのに有効な条件下で、対象に希突起膠細胞前駆細胞を投与する段階を含む、ミエリン喪失または希突起膠細胞喪失により媒介される症状を有する対象を治療する方法。
【請求項４】
希突起膠細胞喪失により媒介される症状を伴う対象を治療するために使用される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ミエリン喪失により媒介される症状を伴う対象を治療するために使用される、請求項3記載の方法。
【請求項６】
症状が、虚血性脱髄症状である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
虚血性脱髄症状が、皮質性脳卒中、ラクナ梗塞、低酸素症後白質脳症、糖尿病性白質脳症および高血圧性白質脳症からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
症状が、炎症性脱髄症状である、請求項5記載の方法。
【請求項９】
炎症性脱髄症状が、多発性硬化症、シルダー病、横断性脊髄炎、視神経炎、ワクチン後脳脊髄炎、および感染後脳脊髄炎からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
症状が、小児白質萎縮である、請求項5記載の方法。
【請求項１１】
小児白質萎縮症状が、リソソーム蓄積症、キャナヴァン症、ペリツェウス-メルツバッハー病、およびクラッベ型球様体白質萎縮からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
小児白質萎縮症状が、ティ-サックス病である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
症状が、ムコ多糖沈着症である、請求項5記載の方法。
【請求項１４】
症状が、スライ病である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
症状が、周産期胚マトリックス出血、脳室周囲白質軟化症、または脳性麻痺である、請求項5記載の方法。
【請求項１６】
症状が、放射線誘導症状である、請求項5記載の方法。
【請求項１７】
放射線誘導症状は、放射線誘導白質脳症または放射線誘導脊髄炎である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
症状が、皮質下白質脳症を引き起こす病因であり、該病因が、HIV/AIDS、頭部外傷、または多発性硬化状態である、請求項5記載の方法。
【請求項１９】
治療が、対象への放射線照射後、および脱髄が起こる前に実行される、請求項3記載の方法。
【請求項２０】
対象がヒトである、請求項3記載の方法。
【請求項２１】
対象がヒト新生児である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
対象がヒト成人である、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
脳内で実行される、請求項3記載の方法。
【請求項２４】
脊髄内で実行される、請求項3記載の方法。
【請求項２５】
哺乳類の脳または脊髄のその他細胞型を含有する混合集団から、希突起膠細胞前駆細胞を同定および分離するインビトロ法であって、以下の段階を含む方法：
神経細胞および神経前駆細胞を混合集団から除去し、処理済みの混合集団を作成する段階；ならびに
希突起膠細胞前駆細胞を、処理済みの混合集団から分離し、希突起膠細胞前駆細胞高含有集団を形成する段階。
【請求項２６】
希突起膠細胞前駆細胞の分離段階が以下の段階を含む、請求項25記載の方法：
希突起膠細胞前駆細胞においてのみ機能するが他の細胞型においては機能しないプロモーターを選択する段階；
蛍光タンパク質をコードする核酸分子を、該プロモーターの制御下で、処理済みの混合集団の全細胞型へ導入する段階；
他の細胞型を除いて、希突起膠細胞前駆細胞のみが、処理済みの混合集団内で該蛍光タンパク質を発現できるようにする段階；
希突起膠細胞前駆細胞に限定されている、蛍光性である細胞型の処理済みの混合集団内の細胞を同定する段階；および
処理済みの混合集団から蛍光細胞を分離し、希突起膠細胞前駆細胞高含有集団を形成する段階。
【請求項２７】
導入段階が、哺乳類の脳または脊髄のその他細胞型を含む、処理済みの混合集団の全細胞型のウイルス媒介性形質転換を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
ウイルス媒介性形質転換が、アデノウイルス媒介性形質転換、レトロウイルス媒介性形質導入、レンチウイルス媒介性形質導入、またはアデノ随伴ウイルス媒介性形質導入を含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
導入段階がエレクトロポレーションを含む、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
導入段階が、哺乳類の脳または脊髄のその他細胞型を含む、処理済みの混合集団の全細胞型のリポソーム媒介性形質転換を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
蛍光細胞の分離段階が、蛍光標示式細胞選別を含む、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
プロモーターが、環状ヌクレオチドホスホリラーゼIプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、JCウイルス最小コアプロモーター、プロテオリピドタンパク質プロモーター、qk1プロモーター、および環状ヌクレオチドホスホリラーゼIIプロモーターからなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
希突起膠細胞前駆細胞の分離段階が、希突起膠細胞前駆細胞を免疫分離する段階を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３４】
免疫分離段階が、処理済みの混合集団から、A2B5抗原を有する細胞を除去する段階により実行される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
免疫分離段階が、希突起膠細胞前駆細胞上の抗原を認識する蛍光標識抗体で実行される、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
希突起膠細胞前駆細胞の分離段階が、蛍光標示式細胞選別を行う段階を更に含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
除去段階が以下の段階を含む、請求項25記載の方法：
神経細胞および神経前駆細胞においてのみ機能するプロモーターを選択する段階；
プロモーターの制御下でマーカータンパク質をコードする核酸分子を、混合集団に導入する段階；
神経細胞および神経前駆細胞にマーカータンパク質を発現させる段階；および
マーカータンパク質を発現している細胞を細胞の混合集団から分離する段階であって、ここで、分離された細胞が神経細胞および神経前駆細胞である段階。
【請求項３８】
導入段階が、細胞の混合集団のウイルス媒介性形質導入を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
ウイルス媒介性形質導入が、アデノウイルス媒介性形質導入、レトロウイルス媒介性形質導入、レンチウイルス媒介性形質導入、またはアデノ随伴ウイルス媒介性形質導入を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
導入段階が、エレクトロポレーションを含む、請求項37記載の方法。
【請求項４１】
導入段階が、遺伝子銃による形質転換を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４２】
導入段階が、リポソーム媒介性形質転換を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４３】
マーカータンパク質が蛍光タンパク質であり、かつ分離段階が蛍光標識式細胞選別を含む、請求項37記載の方法。
【請求項４４】
プロモーターが、Tα1チューブリンプロモーター、MAP-1Bプロモーター、NCAMプロモーター、HES-5 HLHプロモーター、α-インターネキシンプロモーター、またはGAP-43プロモーターである、請求項37記載の方法。
【請求項４５】
細胞型がヒトである、請求項25記載の方法。
【請求項４６】
ヒトが成人である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
ヒトが新生児である、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
請求項25記載の方法により作成された、希突起膠細胞前駆細胞高含有集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2002年2月15日に出願された、米国特許仮出願第60/358,006号の恩典を請求するものである。
【０００２】
本出願の主題は、米国立衛生研究所(NIH)の研究支援金番号NINDSR01NS39559号により、米国政府の支援のもとでなされた。米国政府は一定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の分野
本発明は、希突起膠細胞前駆細胞を使用する、先天性髄鞘発育不全の前脳の有髄化、並びにミエリン喪失または希突起膠細胞喪失により媒介される症状を有する対象を治療する方法に関する。更に、哺乳類の脳または脊髄のその他細胞型を含む混合集団から希突起膠細胞前駆細胞を同定および分離する方法を明らかにする。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
遺伝性白質萎縮から血管性白質脳症まで、多発性硬化症までの広い範囲の疾患は、ミエリンの損傷または喪失により生じる。特に小児の白質萎縮においては、高密なミエリンが適切に発育できないか、または毒物貯蔵異常の状況で損傷される。最近の研究は、これらの先天性髄鞘疾患を治療するための、移植された希突起膠細胞またはそれらの前駆体の使用に焦点が当てられている。齧歯類およびヒトの両方に由来した細胞移植片が、先天性髄鞘発育不全の様々な実験モデルにおいて評価されている。移植された脳細胞有髄化の可能性は、シバラー(Shiverer)マウスにおいて最初に注目された(Lachapelleら、「Transplantation of CNS Fragments Into the Brain of Shiverer Mutant Mice: Extensive Myelination by Implanted Oligodendrocytes」、Dev. Neurosci、6:325-334(1983))。シバラーとは、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)を欠損している突然変異体であって、これは、その最後の5個のエキソンの省略を生じるような、MBP遺伝子における未熟停止コドンに起因している(Roachら、「Chromosomal Mapping of Mouse Myelin Basic Protein Gene and Structure and Transcription of the Partially Deleted Gene in Shiverer Musant Mice」、Cell、42:149-155 (1985))。シバラーは、常染色体劣性突然変異であり、およびshi/shiホモ接合体は中枢の高密なミエリンを発生することに失敗している。これらは、典型的には20〜22週齢という若さで、運動失調、非協調(dyscoordination)、痙縮および痙攣により、死亡する。ヒト胎児脳組織がシバラーに移植された場合に、希突起膠細胞分化および局所的有髄化の両方の証拠が認められた(Lachapelleら、「Transplantation of Fragments of CNS Into the Brains of Shiverer Mutant Mice: Extensive Myelination by Implanted Oligodendrocytes」、Dev. Neurosci、6:326-334(1983)；Gumpelら、「Transplantation of Human Embryonic Oligodendrocytes Into Shiverer Brain」、Ann NY Acad Sci、495:71-85(1987)；および、Seilheanら、「Myelination by Transplanted Human and Moune Central Nervous System Tissue After Long-Term Cryopreservation」、Acta Neuropathol、91:82-88(1996))。しかしこれらの未分画の移植片は、断片的な再有髄化しか生じず、他の潜在的に望ましくない表現型の再生成をもたらすであろう。濃縮されたグリア前駆細胞は、それらの有髄化能について評価され、シバラー軸索を有髄化することができることがわかった(Warringtonら、「Differential Myelinogenic Capacity of Specific Development Stages of the Oligodendrocyte Lineage Upon Transplantation Into Hypomyelinating Hosts」、J. Nesrosci Res、34:1-13(1993))が、おそらく移植された細胞による主として星状膠細胞分化のために、その効率は低い。Snyderとその同僚は(Yandavaら、「Global Cell Replacement is Feasible via Neural Stem Cell Transplantation: Evidence from the Dysmyelinated Shiverer Mouse Brain」、Proc Natl. Acad. Sci.、96:7029-7034(1999))、不死化された多能前駆体は、シバラーにおける有髄化にも寄与することに引き続き注目した。Duncanおよびその同僚は同様に、新生仔齧歯類の脳室下ゾーンから生じた希突起球(oligosphere)由来の細胞は、周産期脳室内投与時に、他の髄鞘発育不全化された突然変異体であるミエリン欠損ラットに生着することができることに注目した(Learishら、「Intraventricular Transplantation of Oligedendrocyte Progenitors into a Fetal Myelin Mutant Results in Widespread Formation of Myelin」、Ann Neurol、46:716-722(1999))。これらの研究にもかかわらず、ヒト希突起膠細胞前駆細胞単離体の髄鞘発育不全の脳を有髄化する能力は、これまでは試験されていな��。
【０００５】
本発明は、当技術分野のこの欠点を克服することに関する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明の一つの局面は、軸索の再有髄化を可能にする条件下での、脱髄された軸索の希突起膠細胞前駆細胞による処理による、脱髄された軸索を再有髄化する方法に関する。
【０００７】
本発明の別の局面は、ミエリン喪失または希突起膠細胞喪失により媒介される症状を治療するのに有効な条件下での対象への希突起膠細胞前駆細胞の投与により、ミエリン喪失または希突起膠細胞喪失により媒介される症状を有する対象を治療する方法に関する。
【０００８】
本発明の更なる局面は、哺乳類の脳または脊髄のその他細胞型を含有する混合集団から希突起膠細胞前駆細胞を同定および分離するインビトロ法に関する。この方法は、混合集団から神経細胞および神経前駆細胞を除去し、処理された混合集団を作成することに関する。その後希突起膠細胞前駆細胞は、処理された混合集団から分離され、希突起膠細胞前駆細胞高含有集団を形成する。
【０００９】
本出願人は、グリア前駆細胞および希突起膠細胞前駆細胞をヒト脳から単離する手段を開発したが、これは、細胞移植試験のための天然のヒト希突起膠細胞前駆細胞(OPC)高含有単離体の使用を可能にしている。
【００１０】
本研究において、ヒト脳から直接単離されたグリア前駆細胞高含有集団が、先天性髄鞘発育不全の細胞に基づく療法の物質として使用されるかどうかが調べられた。詳細に述べると、その希突起新生(oligoneogenesis)期間中の胎児脳に由来したものに加え、成人脳に由来したヒトOPCは、十分に移動および有髄化し、周産期宿主の広範な有髄化を媒介することが仮定された。これは、希突起膠細胞前駆細胞が、実際に胎児および成人の両方のヒト前脳から表面抗原に基づくFACSによりバルク抽出されおよび単離されることを示した。これらの細胞は、周産期の異種移植により、シバラー脳の広範および高度に効果的な有髄化が可能であった。これらは、推定の白質全体に広範に浸潤し、残存する(resident)マウス軸索を鞘被覆し、並びに抗原性であり、および超微細構造的に高密なミエリンを形成した。移植後、これらの細胞は、時間と共にそれらの有糸分裂による増殖を遅延させ、望ましくない表現型も実質性の凝塊も生じなかった。胎児および成人の両方に由来したOPCは、マウス軸索を再有髄化する受容能力があるが、重要な差異は認められず；胎児OPCは高度に移動したにもかかわらず、これらはゆっくりおよび不充分に有髄化された。対照的に、成人由来のOPCは、より少ない距離を移動したが、それらの胎児の対応物よりもより迅速およびより高い割合で有髄化した。従って、これらのヒトグリア前駆細胞の単離体は、先天性髄鞘発育不全または少なく有髄化した脳の再有髄化のための、効果的細胞性物質を提供することができる。胎児および成人の両方のOPCは構造的再有髄化に作用することにかなうことが証明されているので、実践的に、段階を規定した細胞型の選択は、ドナー材料の利用可能性、および疾患標的の特異的生物学の両方により決定づけられた。
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書で使用される「単離された」という用語は、核酸分子と共に使用される場合は、1)実質的に精製された形で生体から分離されている核酸分子(すなわち、実質的にその生体を起源とする他の物質を含まない)、または2)同じヌクレオチド配列を有するが、必ずしも生体から分離されていない核酸分子(すなわち、合成されたまたは組換えにより産生された核酸分子)を意味する。
【００１２】
本発明の一つの局面は、軸索の再有髄化を可能にする条件下で、希突起膠細胞前駆細胞で、脱髄された軸索を処理することにより、脱髄された軸索を再有髄化する方法に関する。
【００１３】
脱髄された軸索の再有髄化は、以下により実行することができる：
(1)経子宮的な胎児脳室内注射；(2)脳室内もしくは実質内(すなわち、脳、脳幹、または脊髄)注射；(3)成人および若年の対象への実質内注射；または、(4)血管内投与。このような投与は、望ましい再有髄化の程度に応じて、1×105〜5×107個の範囲の細胞用量に関連している。
【００１４】
本発明の別の局面は、ミエリン喪失または希突起膠細胞喪失により媒介される症状を治療するのに有効な条件下で、対象へ希突起膠細胞前駆細胞を投与することによる、ミエリン喪失または希突起膠細胞喪失により媒介される症状を有する対象を治療する方法に関連している。
【００１５】
ミエリン喪失により媒介される症状は、虚血性脱髄症状、炎症性脱髄症状、小児白質萎縮、ムコ多糖症、周産期胚マトリックス出血、脳性麻痺、脳室周囲白質軟化症(periventricular leukoinalacia)、放射線誘導症状、および様々な病因による皮質下白質脳症を含む。
【００１６】
虚血性脱髄症状は、皮質性脳卒中、ラクナ梗塞、低酸素症後白質脳症、糖尿病性白質脳症、および高血圧性白質脳症を含む。
【００１７】
炎症性脱髄症状は、多発性硬化症、シルダー病、横断性脊髄炎、視神経炎、ワクチン接種後の脳炎、および感染症後の脳炎を含む。
【００１８】
小児白質萎縮症状は、リソソーム貯蔵疾患(例えば、ティ-サックス病)、キャナヴァン(Cavavan)疾患、ペリツェウス-メルツバッハー病、およびクラッベ型球様体白質萎縮を含む。
【００１９】
スライ病は、ムコ多糖症の一例である。
【００２０】
放射線誘導症状は、放射線誘導した白質脳症および放射線誘導した脊髄炎を含む。
【００２１】
皮質下白質脳症を引き起こす病因は、HIV/AIDS、頭部外傷、および多発性梗塞状態を含む。
【００２２】
希突起膠細胞前駆細胞は、希突起膠細胞前駆細胞により脱髄された軸索を治療することに関して実質的に前述と同じ方法で、本発明のこの局面に従い投与することができる。
【００２３】
本発明の一つの態様において、希突起膠細胞前駆細胞は、放射線照射後および脱髄が生じる前に、対象へ投与される。放射線照射の目的は、中枢神経系における原発性および転移性腫瘍を治療するためである。
【００２４】
本発明に従い希突起膠細胞前駆細胞により治療された対象は、ヒトが好ましく、および最も好ましくはヒト成人またはヒト新生児(post-natal)である。
【００２５】
本発明の更なる局面は、哺乳類の脳または脊髄のその他細胞型を含有する混合集団から、希突起膠細胞前駆細胞を同定および分離するインビトロ法に関する。この方法は、この混合集団から神経細胞および神経前駆細胞を除去し、処理された混合集団を作成することに関する。その後希突起膠細胞前駆細胞は、処理された混合集団から分離され、希突起膠細胞前駆細胞高含有集団が形成される。
【００２６】
哺乳類の脳または脊髄のその他細胞型を含有する混合集団から神経細胞および神経前駆細胞を除去する段階は、プロモーターベースの細胞選別により実行することができる。この手法は、脳および脊髄から細胞の混合集団を提供し、この集団は、神経細胞および神経前駆細胞に加え、希突起膠細胞前駆細胞を含む段階、並びに神経細胞および神経前駆細胞において機能するが、希突起膠細胞前駆細胞においては機能しないプロモーターを選択する段階を含む。このプロモーターの制御下でマーカータンパク質をコードする核酸分子が、細胞型の混合集団へ導入され、および神経細胞または神経前駆細胞の集団は、このマーカータンパク質を発現することができる。これらのマーカータンパク質を発現している細胞は、細胞の混合集団から分離され、分離された細胞は、神経細胞および神経前駆細胞である。神経細胞および神経前駆細胞において機能するプロモーター並びにマーカータンパク質をコードする核酸を使用する、細胞型の混合集団からの神経細胞および神経前駆細胞を選択するプロセスは、Goldmanらの米国特許第6,245,564号に開示されており、その全体が本明細書に参照として組入れられている。
【００２７】
神経細胞および神経前駆細胞は、選択された細胞に特異的なプロモーターが利用可能である限りは、本発明の方法に従い、哺乳類の脳または脊髄のその他細胞型を含有する混合集団から分離することができる。本明細書においてプロモーターを説明するために使用される「特異的」とは、そのプロモーターが選択された細胞型においてのみ機能することを意味する。選択された細胞型は、細胞の異なる型または前駆細胞の発生周期の異なる段階を意味することができる。例えば、選択された細胞は、特定の成人細胞表現型を委任することができ、および選択されたプロモーターは、その前駆細胞においてのみ機能し；すなわち、このプロモーターは、成人細胞においては機能しない。関連（committed）前駆細胞および非関連（uncommitted）前駆細胞は、両方とも前駆細胞と考えることができるが、これらの細胞は、前駆細胞発生の異なる段階にあり、並びに選択されたプロモーターが前駆細胞の特定の段階に特異的である場合は、本発明に従い分離することができる。当業者は、関心対象の細胞に特異的なプロモーターの利用可能性を基に選択するために、関心対象の細胞を容易に決定することができる。
【００２８】
神経細胞または神経前駆細胞に特異的である適当なプロモーターは、MAP-1Bプロモーター(LiuおよびFischer、Gene、171:307-308(1996)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)、NCAMプロモーター(Holstら、J Biol Chem、269:22245-22252(1994)、これは全体が本明細書に参照として組入れられている)、HES-5 HLHタンパク質プロモーター(Takebayashiら、J Biol Chem、270:1342-1349(1995)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)、α1-チューブリンプロモーター(Gloster, A.ら、J Neurosci、14:7319-7330(1994)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)、α-インターネキシンプロモーター(Chingら、J Biol Chem、266:19459-19468(1991)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)、およびGAP-43プロモーター(Starrら、Brain Res、638:211-220(1994)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)を含む。
【００２９】
神経細胞および神経前駆細胞に特異的なプロモーターが決定されたならば、タンパク質マーカー、好ましくは緑色蛍光タンパク質をコードする核酸分子を、このプロモーターの制御下で、複数の選別される細胞に導入される。
【００３０】
単離された緑色蛍光タンパク質をコードする核酸分子は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA、メッセンジャーRNAまたはmRNAを含む)、ゲノムまたは組換え体、生物学的に単離されたまたは合成されたものであることができる。DNA分子は、GFPをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)のDNAコピーである、cDNA分子であることができる。ひとつの態様において、GFPは、オワンクラゲ(Aequorea victoria)由来であることができる(Prasherらの米国特許第5,491,084号、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。pGFP10.1と称されるプラスミドは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」に従い、その要件を満たすよう、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301 Parklawn Drive、ロックビル、MD、20852)に、ATCCアクセッション番号75547として、1993年9月1日に寄託されている。このプラスミドは、プラスミドが記載された1996年2月13日付けの米国特許第5,491,084号の発行により、ATCCから市販されている。このプラスミドは、その全体が本明細書に参照として組入れられているChalfieらの米国特許第5,491,084号に開示されたように、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするcDNAを含んでいる。このGFPの変異された形(赤色シフトした突然変異体)はpRSGFP-C1と称され、これはClontech Laboratories社(パロアルト、CA)から市販されている。
【００３１】
pTα1-RSGFPと称されるプラスミドは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」に従い、その要件を満たすよう、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301 Parklawn Drive、ロックビル、MD、20852)に、ATCCアクセッション番号98298として、1997年1月21日に寄託されている。このプラスミドは、Clontech Laboratories社(パロアルト、CA)の赤色シフトしたGFP(RS-GFP)、およびF. Miller博士(Montreal Neurological Institute, McGill大学、モントリオール、カナダ)により提供されたTα1プロモーター配列を使用する。本発明に従い、標準の制限酵素およびライゲーション手法を用い、Tα1プロモーターは、別の特異的プロモーターと交換することができ、およびRS-GFP遺伝子は、GFPの別の形と交換することができる。
【００３２】
天然のタンパク質よりもより強力に発光する変異型のGFPに加え、より高等脊椎動物において安定して翻訳され易い型のGFPが現在市販されており、並びに同じ目的に使用することができる。pTα1-GFPhと称されるプラスミドは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」に従い、その要件を満たすよう、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301 Parklawn Drive、ロックビル、MD、20852)に、ATCCアクセッション番号98299として、1997年1月21日に寄託されている。このプラスミドは、ZolotukhinおよびMuzyczka(Levy, J.ら、Nature Biotechnol、14:610-614(1996)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)のヒト化GFP(GFPh)、およびF. Miller博士(モントリオール)により提供されたTα1プロモーター配列を使用する。本発明に従い、標準の制限酵素およびライゲーション手法を用い、Tα1プロモーターは、別の特異的プロモーターと交換することができ、およびGFPh遺伝子は、GFPの別の形と交換することができる。GFPの蛍光型をコードするいずれかの核酸分子を、本発明に従い使用することができる。
【００３３】
その後、標準技術を用い、GFPをコードする核酸分子を、選択された細胞特異的プロモーターの制御下に配置する。一般に、これは、制限酵素の使用およびライゲーションが関連している。
【００３４】
得られた構築物は、選択されたプロモーター(それ自身が核酸分子)の制御下でGFPをコードする核酸分子(望ましいならば他の適当な調節エレメントを伴う)を含むが、これはその後、複数の選別される細胞に導入される。構築物の核酸分子を複数の細胞へ導入する技術は、これらの核酸分子を含む発現ベクターの使用に関連している。その後これらの発現ベクター(例えば、プラスミドおよびウイルス)を使用し、この核酸分子を複数の細胞へ導入することができる。
【００３５】
核酸分子を宿主細胞へ導入する様々な方法が、当技術分野において公知である。これらは以下を含む：1)微量注入法（DNAが、直接細胞の核に細いガラス針により注入される）；2)デキストランインキュベーション法（DNAは、正帯電した化学基(DEAE、ジエチルアミノエチル様)が結合した不活性高分子炭水化物(デキストラン)と共にインキュベーションされる(DNAは、その負帯電したリン酸基を介してDEAE-デキストランに貼り付き、次に大きいDNA含有粒子が、細胞(これはエンドサイトーシスとして知られている過程によりそれらを取込むと考えられる)表面に貼り付き、並びに一部のDNAは、細胞の細胞質内での破壊を回避し、および核に逃避し、そこでこれは細胞内の他の遺伝子のようにRNAに転写され得る)）；3)リン酸カルシウム共沈法（細胞は、リン酸カルシウムとの沈殿物の形で効率的にDNAを取込む）；4)エレクトロポレーション法（細胞は、DNAを含有する溶液中に配置され、およびそれらの膜の孔の一過性の開放を引き起こす短時間の電気パルスが加えられ、その結果DNAは、孔を通って直接細胞質へと進入し、DEAE-デキストラン法およびリン酸カルシウム法ではそれらがそこを通過するエンドサイトーシス性の小胞を迂回する(これらの小胞を通る通路は時々DNAを破壊または損傷することがある)）；5)リポソーム媒介型形質転換法（DNAは、細胞膜に融合する人工的脂質小胞リポソームに組込まれ、それらの内容物を直接細胞質に送達する）；6)遺伝子銃形質転換法（DNAは、金粒子の表面に吸着され、および遺伝子銃装置を用い、高圧下で細胞へと発射される）；7)裸のDNA挿入；ならびに、8)ウイルス媒介型形質転換法（核酸分子は、ウイルスベクターを用い細胞へ導入される）。ウイルス増殖は、ウイルスゲノムを細胞に取込む能力により左右されるので、ウイルスは、そうするための効率的方法を工夫している。これらのウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含む。
【００３６】
示されたように、細胞形質転換法のいくつかは、媒介プラスミドベクターの使用を必要としている。CohenおよびBoyerの米国特許第4,237,224号は、制限酵素切断およびDNAリガーゼによるライゲーションを使用する、組換えプラスミドの形の発現システムの作成を開示しており、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている。これらの組換えプラスミドは次に、形質転換により導入されおよび組織培養において増殖される原核生物および真核細胞を含む単細胞培養において複製される。このDNA配列は、その全体が本明細書に参照として組入れられている、Sambrookらの著書「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY(1989)に説明されたような、当技術分野において公知の標準のクローニング法を用い、プラスミドベクターへクローニングされる。
【００３７】
前述の方法のひとつに従い、GFPをコードする核酸分子はこうして複数の細胞へ導入される。しかしGFPの発現を制御するプロモーターは、関心対象の細胞においてのみ機能する。従って、GFPは、関心対象の細胞においてのみ発現される。GFPは蛍光タンパク質であるので、その結果関心対象の細胞を、GFPの蛍光により、複数の細胞の中で同定することができる。
【００３８】
蛍光細胞を検出するいずれか適当な手段を使用することができる。これらの細胞は、表在性蛍光(epifluorescence optics)を用いて同定することができ、かつ、物理的に採取しおよびLaser Tweezers(Cell Robotics社、アルバカーキ、NM)により集めることができる。これらは、蛍光標示式細胞選別によりバルクで分離することができるが、この方法は、蛍光細胞を非蛍光細胞から効果的に分離するものである。
【００３９】
本発明のこの局面に従って希突起膠細胞前駆細胞を処理済みの混合集団から分離する一つの態様は、プロモーターの制御下で蛍光タンパク質をコードする核酸分子を、哺乳類の脳または脊髄の細胞型を希突起膠細胞前駆細胞に加え含む全体の混合集団へ導入することで開始すること、核酸分子が、処理済みの混合集団に導入されること以外は、前述のプロモーターベースの細胞分離により実行される。処理された混合集団から希突起膠細胞前駆細胞を選別することにおいて、希突起膠細胞前駆細胞に特異的なプロモーターが使用される。本発明のこの局面の実行に適したプロモーターは、環状ヌクレオチドホスホリラーゼIプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、JCウイルス最小核プロモーター、プロテオリピドタンパク質プロモーター、qk1プロモーター(すなわち、クエーキング遺伝子産物のためのプロモーター)、および環状ヌクレオチドホスホリラーゼIIプロモーターであることができる。
【００４０】
処理済みの混合集団からの希突起膠細胞前駆細胞の回収にプロモーターに基づく細胞選別を使用する代わりに、免疫分離法が利用される。
【００４１】
これは、特定型の前駆細胞上に天然に存在するタンパク質性表面マーカーを基にした細胞の分離に関連している。例えば、表面マーカーA2B5は、最初に発現された初期希突起膠細胞マーカーである。本明細書に参照として組入れられている、Nunesら「Identification and Isolation of Multipotential Neural Progenitor Cells from the Adult Human White Matter」、Soc. Neurosci. Abstr. (2001)を参照されたい。そのマーカーに特異的な抗体を使用することにより、希突起膠細胞前駆細胞を、細胞型の混合集団から分離することができる。このような抗体は、それらが結合した細胞の分離を促進するために、蛍光タグで標識することができる。あるいはこれらの抗体は、常磁性ビーズに付着させ、その結果付着した抗体を介してビーズに結合する細胞を、生体磁気分離法を用い、回収することができる。
【００４２】
A2B5と称される、Gqガングリオシドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」に従い、その要件を満たすよう、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301 Parklawn Drive、ロックビル、MD、20852)に、ATCCアクセッション番号CRL-01520として寄託されている。
【００４３】
希突起膠細胞前駆細胞高含有集団は、少なくとも90％純粋であり、好ましくは少なくとも95％純粋であり、最も好ましくは少なくとも99％純粋である。本発明のこの局面を実行するために使用される細胞型の混合集団は、ヒト細胞であることが好ましい。これらの細胞は、ヒトの成人または新生児の細胞が望ましい。
【００４４】
脳および脊髄の細胞型の混合集団から神経細胞および神経前駆細胞を除去し、処理済みの混合集団を残し、次に希突起膠細胞前駆細胞を処理済みの集団から分離することにより、希突起膠細胞前駆細胞を得るために前述の手法を利用する代わりに、全体が本明細書に参照として組入れられている、Goldmanらの米国特許第6,245,564号、およびGoldmanらの米国特許出願第09/282,23910号に開示されたプロモーターベースの細胞選別法を用い、この希突起膠細胞前駆細胞を脳および脊髄の細胞型の混合種団から直接回収することができる。この方法は、希突起膠細胞前駆細胞においてのみ機能するプロモーターを使用する、本質的に先に説明されたものである。
【００４５】
実施例
実施例1−細胞
妊娠期間のヒト胎児(21週齢〜23週齢)の細胞組織を、流産時に得た。前脳の脳室／脳室下ゾーンを、残りの脳実質を含まないように迅速に切除し、これらの試料を氷冷した。その後細かく裁断した試料を、先に説明されたように(Keyoungら、「Specific Identification, Selection and Extraction of Neural Stem Cells from the Fetal Human Brain」、Nature Biotechnology、19:843-850(2001)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)パパイン／DNAseを用いて、常に抽出の3時間以内に解離させた。その後この解離物を、20ng/ml FGFを含有する、DMEM/F12/N1最小培養培地において一晩維持した。
【００４６】
実施例2−選別
解離の翌日、これらの細胞を、MAb A2B5上清(クローン105；ATCC、マナサス、VA)と共に1:1で30分間インキュベーションし、その後洗浄し、マイクロビーズでタグ付けしたラットの抗マウスIgM(Miltenyi Biotech社)により標識した。全てのインキュベーションを、振盪機(rocker)上で4℃で行った。場合によっては、2チャンネル蛍光標示式細胞選別を行い、A2B5およびPSA-NCAM規定した亜集団の割合および表現型の等質性を、先に説明された方法(Keyoungら、「Specific Identification, Selection and Extraction of Neural Stem Cells from the Fetal Human Brain」、Nature Biotechnology、19:843-850(2001)、およびRoyら、「In Vitro Neurogenesis by Progenitor Cells Isolated from the Adult Human Hippocampus」、Nat Med、6:271-277(2000)、これらはその全体が本明細書に参照として組入れられている)に従い、FACSVantage SE/Turboを用い規定した。より典型的で、および移植目的のための全ての調製的選別のためには、次にA2B5+細胞(MACS；Miltenyi社)の磁気分離を、製造業者のプロトコールに従い行った。その後結合した細胞を溶離し、抗NCAM(Pharmingen社)と1:25で30分間インキュベーションし、抗マウスPEにより1:200で標識した。その後PSA-NCAM+集団を、FACSにより除去し、A2B5+/PSA-NCAM-細胞高含有集団を取り出した。これらをインビトロで、1〜7日間、20ng/ml bFGFを含有する基本培地において、移植時まで維持した。図1参照。
【００４７】
実施例3−移植およびタグ付け
ホモ接合体シバラーを、コロニー中で繁殖した。誕生日のうちに、仔マウスに、細胞送達のために寒冷麻酔をかけた。その後ドナー細胞を、脳梁、内包または側脳室のいずれかに、頭蓋を通して挿入した引き延ばした(pulled)ガラスピペットを用い、移植した。次に仔マウスを、核母親マウスに返し、その後4週、8週、12週または16週目に屠殺した。一部の実験については、レシピエントマウスに、2日連続してq12時間、BrdU(100μg/g、1.5mg/100μl溶液として)を、屠殺前の2日間に注射した。
【００４８】
実施例4−免疫組織化学
移植した細胞を、Chemicon社の抗ヒト核抗体(MAB 1281)を用い、並びにローダミンレッドX複合ヤギ抗マウスFab(Jackson社；カタログ番号115-295-146)または非複合ウサギ抗マウスFab(Jackson社315-007-003)のいずれか、それに続けてローダミンレッドX-ヤギ抗ウサギ(Jackson社111-295-144)を用いて同定した。図2参照のこと。CNPは、Sternberger MAb 94またはAbcam 7349(ラット)のいずれかによるMBPであるSternberger Monoclonal 91を用いて認識し；ヒトGFAPは、抗ヒトGFAP(Sternberger MAb 21)を用いて検出した。図3および図4A〜図4C参照。BrdUは、説明されたように表現型マーカーで同時に免疫標識した(Louissaintら、「Coordinated Interaction of Angiogenesis and Neurogenesis in the Adult Songbird Brain」、Neuron、34:945-960(2002)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。
【００４９】
実施例5−電子顕微鏡
動物は、6％ショ糖リン酸緩衝液(ショ糖-PB)中の4％パラホルムアルデヒドおよび0.25％グルタルアルデヒドで還流し、同じ溶液で後固定し、その後、厚い(400μm)および薄い(100μm)切片へと交互に、Vibratomeを用いてスライスした。薄い切片は、MBPについて免疫染色したのに対し、厚い切片は、2％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒドを含むショ糖-PB中で後固定した。その後明らかなMBP発現を示している薄い切片に隣接する厚い切片を、1％オスミニウム-1.5％フェリシアニド、1.5％酢酸ウラニル水溶液中で処理し、プロピレンオキシドにより脱水し、その後Eponに包埋し、クエン酸鉛で染色した。図4D〜図4G参照。
【００５０】
実施例6−希突起膠細胞前駆体はヒト胎児脳室壁から選別することができる
妊娠21週〜23週の妊娠中期後半のヒト脳室ゾーンから解離した細胞を、最初に磁気的に選別し、A2B5+細胞を単離した。これらは、希突起膠細胞および神経細胞の両前駆細胞を含有していた。PSA-NCAMは、事実上ヒト脳室ゾーン発生のこの段階で全ての未熟な神経細胞により発現されるので、FACSを使用し、PSA-NCAM+細胞を、より大きいA2B5+細胞集団から選択した。このNCAM-規定神経前駆細胞および若い神経細胞のA2B5+プールからの除去は、A2B5+/PSA-NCAM-細胞の亜集団を生じ、これを本発明者らの希突起膠細胞前駆体プールとした。偽陽性の発生率を＜0.1％に制限することを意図した高ストリンジェンシー制御閾値を伴う、2色蛍光標示式細胞選別(FACS)により、A2B5+/PSA-NCAM-画分は、これらのプールされた21週〜23週の脳室vvゾーン試料(n＝5)の細胞の15.4±4.8％を構成することを決定した(図1)。PSA-NCAM枯渇したA2B5+プールは、基本培養条件下で、大部分は希突起膠細胞−および独占的にグリア−を生じたので、これらのVZ前駆体のグリア限定(glial restriction)および希突起膠細胞バイアスが、インビトロにおいて証明された(図1)。これらの同じ条件下で、A2B5+細胞のPSA-NCAM+画分は、専ら神経細胞に分化した。従って二重抗原免疫選別すなわち2色FACS、ならびに、A2B5+細胞の一連の免疫磁気濃縮およびその後のPSA-NCAM+細胞のFACS枯渇という二つの別々の方法は、各々21週〜23週のヒト胎児脳室ゾーンからの希突起膠細胞前駆細胞の選択的濃縮および高収率の抽出をもたらした。後者の技術−免疫時期的分離とそれに続く1色FACS枯渇−は、直接2色FACSよりもより高い正味の収率を実現したので、この一連の方法を使用し、生着したヒトOPC集団を抽出および単離した。
【００５１】
実施例7−異種移植後広範に移動した移植希突起膠細胞前駆細胞
ホモ接合体shi/shiマウスに、前駆細胞単離体を、P0〜1において、脳室内および脳梁内に注射した。これらの動物を亜群に分け、その後4週間隔で、4週、8週、12週または16週齢時に屠殺した。これらの動物は、免疫抑制されず、また周産期寛容化により、移植片の忍容を確実にし、その結果動物に、誕生日または翌日(P0〜1)のいずれかに移植したが、それ以降は移植しなかった。これらの注射は、本試験のために注射した新生仔マウス44匹中の34匹(胎児hOPCを注射した33匹中25匹、成人由来のOPCを注射した11匹中9匹)において、顕著で定量可能な細胞生着を生じた(3種の吻側尾側(rostrocaudal)レベルで、1冠状面切片につき≧100個の細胞と定義され、＞100μm離れて採取された)。細胞の凝集は、4週目の脳室において注目されることが多かったが、12週目までに、移植された細胞の全てではなくともほとんどが、脳梁壁および采壁を貫通し、脳梁、采および包の白質に侵入していた(図2)。
【００５２】
これらのOPCは典型的には迅速に移動し、吻側は小鉗子の前方白質から、尾側の橋底部へと、皮質下の実質全体に分散していた。4週目に、ヒト核抗原(hNA)の発現により同定された移植した細胞は、主に脳梁、外包、および海馬の采内において、白質全体に広範に分散したことが認められた(図2)。特に注射部位に対し吻側または尾側の多くの核は、移動体(migrant)の形態を伴い、これらの路の方向に伸長しているように見える。加えて、個別の小さい領域は、中隔、線条および嗅球を含む灰白質領域に侵入し、新皮質は少ない。8週までに、ヒト細胞は、前脳全体に広く広がり、それより少ない数が間脳に広がっている。これらの8週目の動物中2匹において、細胞は脳幹白質路に侵入し、橋底部の範囲まで脳脚(preduncle)を通って移動していることが注目された。12週間生存できた動物において、細胞は、前脳全体で認められたが、依然主に白質路内であった。ヒト核は前脳全体に、および吻側の脳幹の周りに散在しての両方で認められたが、異種移植片の密度は、細胞導入した采部位および脳梁部位において常に最大であった。
【００５３】
実施例8−生着された胎児前駆体は成熟して、ミエリン塩基性タンパク質を発現した
次の疑問点は、生着した胎児由来の前駆体がインビボにおいて有髄化する希突起膠細胞として成熟するかどうかであった。この目的のために、移植したおよび移植していない両対照マウスを、希突起膠細胞のミエリン塩基性タンパク質(MBP)について、移植後4週、8週、および12週目に免疫染色した。シバラーマウスはMBP遺伝子の最初のエキソンのみを発現する(Roachら、「Chromosomal Mapping of Mouse Myelin Basic Protein Gene and Structure and Transcription of the Partially Deleted Gene in Shiverer Mutant Mice」、Cell、42:149-155(1985)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)ので、C末端配向抗MBP抗体は、シバラーホモ接合体の切断型MBPを認識しなかった。結果的に、移植された動物において検出されたMBPの免疫反応性は、必ずドナー由来の希突起膠細胞に由来する。4週目に、検出可能なMBPは、広範な細胞分布にもかかわらず、11匹の動物中10匹において認められず；発生期のMBP免疫反応性の希薄な領域が、1匹のマウスにおいて注目された。8週目に、MBP発現のまだらな巣が、7匹のマウス中4匹において、典型的にはそれらの脳梁および海馬交連内に、認められた。12週目までに、7匹のマウス中5匹において、広範なMBP発現が、前脳白質路全体に認められた。MBP発現は特に後部は采および前部は脳梁において豊富であった。実際脳梁は、典型的にはその中外側の範囲全体、および矢状方向内のその全長に沿って、MBPを発現していた(図3A〜図3C)。
【００５４】
生着された細胞による有髄化の広範な分布は、レシピエント脳において髄鞘再構成の著しい容積を生じた。例えば、図3に示された12週齢の脳において、脳梁の有髄化の領域は、脳梁長について吻尾側に約4mm広がるが、中外側の幅は、尾側に1mmから吻側に4mmの三角形に広がった。平均の脳梁の深さが200μmであるならば、MBP規定したミエリン産生の有効容積は、1.4mm3であった。このMBPは、ヒトドナー細胞に関連していることが重要である(図3D)。MBP-IRが移植されたヒトドナーOPCに独占的に関連していることを証明するために、共焦点撮像を使用し、MBP免疫反応性およびヒト核抗原の局在を試験した。直交面の再構成(orthogonal reconstruction)を伴う光学切片を使用し、抗ヒト核免疫染色により規定されたように(図3E〜図3H)、MBP+細胞はヒト起源であり、その各々はヒト細胞体(soma)に関連していることを確認した。
【００５５】
実施例9−前駆体由来の希突起膠細胞は軸索を再有髄化する
次の課題は、ドナー由来のミエリンが宿主のシバラー軸索を実際に鞘被覆したかどうかであった。この目的のために、共焦点撮像および電子顕微鏡の両方を用い、各々、軸索の鞘被覆およびミエリンの圧密を評価した。共焦点解析は、最初に、各々100,000個の選別されたヒト胎児OPCをP1に移植し、その後12週目に屠殺した3個のシバラー脳試料について行った(図4A〜図4C)。脳梁のMBP発現領域は、最初に固定した切片の免疫標識により同定した。その後これらの濃いMBP発現の巣を、ドナー由来の細胞および宿主シバラー軸索のタグ付けのために、各々、ヒト核抗原および神経線維タンパク質の両方で免疫標識した後に、共焦点撮像により評価した。この手段により、ヒト前駆体は、有髄化している希突起膠細胞を多数生成したことが分かった。これらの細胞の髄鞘は、それらの直ぐ近傍の宿主軸索に直接付着し、および全般的には完全に取り囲んでいることがわかった。スコア化したレシピエントの間で、NF+宿主脳梁軸索の11.9±1.6％(平均±SD)が、MBP免疫反応性に取り囲まれていることが分かった(n＝3マウス、1匹の動物につき3視野でスコア化)(図4A〜図4C)。試料採取は、最大脳梁MBP発現の領域に偏っており、その結果これらの数は、全ての前脳路における有髄化の発生率を必ずしも反映してはいなかった。むしろ、これらのデータは単純に、残存しているマウス軸索の有意な部分が、ドナー前駆細胞の周産期生着後、ヒトミエリンにより鞘被覆され得ることを確認している。
【００５６】
次に電子顕微鏡を用い、宿主軸索は実際に、ドナー由来の希突起膠細胞により鞘被覆されたこと、および後者は超微細構造的に圧密なミエリンを形成したことを証明した。MBPは、ミエリンの連続層を互いに圧密するために必要であるので、その発現は、健康な中枢のミエリンの大きい濃い線の形成に必要とされる。MBP欠損シバラーにおいて、ミエリンは、単に緩やかに軸索の周りを包み、数個より多い包みを示すことができず、かつ大きな濃い線を有さない。周産期ヒト前駆細胞移植のshi/shiホモ接合体レシピエントにおいて、移植されたヒトOPCは実際に単に有髄化されるのみではなく、大きい濃い線を伴う圧密なミエリンを生じたことがわかった(図4D〜図4G)。移植後12週および16週目に超微細構造を評価した場合、ドナー由来のミエリンが、宿主シバラーの軸索を取り囲みおよび鞘被覆したことを確認した(図4D〜図4G)。
【００５７】
この超微細構造解析は、共焦点解析により得られたデータをバリデーションする手段として、ドナー由来のOPCにより有髄化された軸索集団の定量を可能にする。出生後1日目に移植されおよび16週後に組織学のために屠殺された2匹のマウスに由来した、MBP+視野の試料(n＝50)において、全般的平均の残存する脳梁軸索の7.4％は、大きい濃い線の存在により規定された、ドナー由来の髄鞘を有することがわかった(1832個のスコア化した軸索のうち136個)。共焦点解析において、これらのデータは、それらのMBP免疫反応性を基に選択された脳梁領域において実現された有髄化の正味の効率を反映し、これによりうまくいった生着領域の最前線を規定するので；これらの結果は、レシピエント白質の偏らない試料を反映することは意図されていない。その警告にもかかわらず、これらの知見は、選別されたヒト胎児OPCは、周産期異種移植において有髄化する希突起膠細胞として効率的に分化することができることを示している。
【００５８】
実施例10−有糸分裂活性のあるドナーOPCの割合は異種移植後に徐々に減少する
次の課題は、移植されたOPCが、生着後継続して分裂するかどうか、およびそうであるならばどのくらいの期間続くかであった。この目的のために、マウスに、胎児hOPCを誕生時(n＝6)に移植し、その後4週、8週、および12週齢で最終的に屠殺する前に2日間、BrdUを1日2回注射した。BrdUの免疫染色は、出生後1日目に移植されおよびそれらの抗ヒト核抗原(hNA)の発現により規定された、生着したヒトOPCの平均42±6.1％が、4週齢で依然活発に分裂していることを明らかにした(図5)。対照的に、移植後8週および12週間まで、生着されたOPCの有糸分裂しているBrdU+/hNA+細胞の画分は、各々、11.2±1.6および8.2±2.4％に低下した。これらの結果は、移植された前駆細胞が、生着後少なくとも最初の1ヶ月間は、当初有糸分裂活性があるが、その後それらの有糸分裂活性は減速され、その結果全てのOPCおよびそれらの後代の10％未満が、明らかにそれらの移植後3ヶ月までに周期をなす(cycling)ことを示唆している(図5A〜図5C)。回帰分析は、ドナー由来の細胞の有糸分裂指数と生着後の時間の長さの間の強力な逆相関関係を明らかにした(r＝0.90；p＜0.05)。移植された前駆体プールの保存された有糸分裂受容能にもかかわらず、本試験の胎児OPC移植したマウスのいずれにおいても、腫瘍形成、退形成、または悪性転移の組織学的証拠は、移植後3ヶ月間は認められないことが重要である(n＝34；16週時点で分析した9匹を含む)。
【００５９】
実施例11−多くの移植した細胞は星状膠細胞として分化する
一部の移植した胎児OPCが、GFAPにより規定されるように、星状膠細胞として分化し、移植後4週と早い時期からそのように挙動することは注目される。これらのGFAP+星状膠細胞は、MBP+希突起膠細胞と混ざり合うことが分かったが、これらは、典型的には白質に限定されるそれらの希突起膠細胞の対応物よりも広い領域を超えて典型的には伸長した。移植された胎児hOPCは、シバラー脳において神経細胞として分化することが稀であることが重要である。異所性βIII-チューブリンまたはMAP2規定した神経細胞は、移植後4週、8週、または12週目のいずれかにおいて、移植されたシバラー白質において認められなかった(合計でn＝33)。同様に、中隔または線条に移動したこれらの細胞は、神経細胞としては分化せず；場合によっては、脳梁から腹側新生皮質に侵入することが分かっている移動体でもなかった。hNA/βIIIチューブリン+神経細胞が4週目に嗅球において認められたわずかに2匹のマウスが、注目されたヒトドナー由来の神経であり、恐らく嗅覚上衣下および嗅球の特定の神経学的環境を反映している。より典型的には、灰白質に侵入したこれらのドナーOPCは、典型的には星状膠細胞として発生した。結果として、ドナー由来の星状膠細胞および希突起膠細胞は、典型的には、各々、灰白質および白質に相当する鋭く境界を定めた地図的ドメインにおいて認められた。ドナー由来の星状膠細胞は、典型的には宿主灰白質においてより豊富であるが、これらはそれにもかかわらず、灰白質および白質の両方に分散し；対照的に、ドナー由来の希突起膠細胞は、宿主灰白質からは排除された(図3I)。このドナー由来のグリア表現型の隔離は、生着された細胞に関する鋭く規定されたドメイン境界につながった。
【００６０】
実施例12−成人由来のOPCは胎児OPCよりもより迅速に有髄化する
本出願人らは、次に胎児OPCは、それらの移動能、有髄化能力、またはそれらの時間経過に関して、成人ヒト脳由来のそれらの対応物と異なるかどうかを調べた。この目的のために、シバラーマウスの2匹の同腹仔に、P0で、A2B5選別した成人OPCを移植した(マウスn＝12匹、そのうち9匹はドナー生着の成功を示した)。これらの成人由来のhOPCは、正常なヒト皮質下白質の手術切除片から抽出し、そこからA2B5+OPCを、A2B5に対する免疫磁気選別(IMS)により抽出し、その後一晩最小培地において培養し、それらを周産期異種移植した。移植したマウスは、4週間、8週間または12週間のいずれか生存させ、その後組織学のために屠殺した。それらの脳を切片とし、MBP、GFAPおよび抗ヒト核抗原で染色し、それらの胎児OPC移植対応物も同様にした。
【００６１】
胎児および成人由来のヒト希突起膠細胞前駆細胞は、異種移植時の有髄化のそれらの各時間経過および効率において、実質的に異なることがわかった。成人OPCは、それらの胎児対応物よりも、シバラー脳をより迅速に有髄化し、広範で濃いMBP発現を異種移植後4週までに達成した。対照的に、胎児OPCによる実質的MBP発現は、一般に移植後12週まで認められなかった(図6A〜図6D)。
【００６２】
実施例13−成人OPCは胎児OPCよりも高効率で有髄化希突起膠細胞を生じる
胎児OPCはより迅速に成熟するにもかかわらず、成人OPCは、胎児由来のOPCよりも、はるかに高い相対割合で希突起膠細胞を生じ、およびはるかに少ない星状膠細胞の同時生成を伴うことが分かった。レシピエント脳梁の正中線で評価した場合、12週目に胎児hNA規定したOPCの10.2±4.4％がMBP発現したのに対し、4週目では事実上全く発現しなかった。対照的に成人OPCの39.5±16.3％が、合致したレシピエントへの異種移植後4週目にMBPを発現した(p＜0.001、スチューデントt-検定、両側(2-tailed))(図6E参照)。更に同じように移植した成人OPCと比べ、実質的により高い数の胎児ドナー細胞が、宿主脳において認められた(図6F参照)。従って、胎児OPCは、シバラーレシピエントへ成人OPCと同様またはより良く生着したが、生着するそれらの成人細胞は、それらの胎児の対応物よりも、少なくとも4倍多く希突起膠細胞として成熟しおよびミエリンを発生した。
【００６３】
更に成人OPCは宿主白質に制限され大きく残存したが、その中でこれらはほぼ全てMBP+希突起膠細胞を発生したのに対し、胎児OPCは、灰白質および白質の両方に移動し、状況依存した様式で星状膠細胞および希突起膠細胞の両方を生じた(図3I)。おそらくそれらの希突起膠細胞への分化のより大きい速度および効率の結果として、移植された成人OPCおよびそれらの誘導体は、白質の境界を超えて移動することは稀であるのに対し、胎児OPCは広範に移動し、それらの星状膠細胞および未分化の誘導体は、前脳の灰白質および白質の両方全体に広がる。
【００６４】
従って、高度に希突起新生性の妊娠中期後半の前脳から選別したヒトOPC高含有単離体はうまく生着し、および周産期白質萎縮の遺伝的モデルであるシバラーマウス脳を有髄化することが示されている。特にヒトOPCは、抗原性表現型A2B5+/PSA-NCAM-に対するFACSを用い、妊娠中期後半のヒト脳室ゾーンから高い収率で選択的に抽出されることが分かった。新生児マウス前脳に移植した場合、これらの細胞は、前脳全体に広範に確実に移動し、発生している白質において希突起膠細胞および星状膠細胞の両方として、並びに推定の灰白質において星状膠細胞として成熟した。その後4週間〜12週間にわたり、移植したヒトOPCが胎児または成人起源かに応じた時間経過で、ドナー由来の希突起膠細胞は成熟しミエリンを生成し、これはシバラー皮質下の残存する軸索の広範な有髄化につながった。この有髄化は、共焦点および超微細構造分析の両者により証明され、これらは地図的に広範であり、および終脳の白質領域全てに広がった。
【００６５】
実施例14−天然のヒト前脳OPCの高収率の精製
本出願人らは、初期希突起膠細胞CNP2プロモーターにより起動されたGFP発現を基にしたFACSを用い、成人ヒト白質から希突起膠細胞前駆細胞を単離することを先に認めた(Royら、「Identification, Isolation, and Promoter-Defined Separation of Mitotic Oligodendrocyte Progenitor Cells from the Adult Human Subcorttcal White Matter」、Neurosci、19:9986-9995(1996)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。これらの細胞は、A2B5抗体により認識される表面ガングリオシドを発現し、これは同じく成人白質からの集団の選択的抽出に使用することができる(Windremら、「Progenitor Cells Derived from the Adult Human Subcortical White Matter Disperse and Differentiate as Oligodendrocytes Within Demyelinated Regions of the Rat Brain」、J. Neurosci. Res.、69:966-975(2002)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。しかし、A2B5は、希突起膠細胞に加え若い神経細胞を認識する(Eisenbarthら、「Monoclonal Antibody to a Plasma Membrane Antigen of Neurons」、Proc. Natl. Acad. Sci.、76:4913-17(1979)、およびRaffら、「Two Types of Astrocytes in Cultures of the Developing Rat White Matter: Differences in Morphology, Surface Gangliosides, and Growth Characteristics」、J. Neurosci.、3:1219-1300(1983)、これらは全体が本明細書に参照として組入れられている)。従って、A2B5に基づく分離は、神経細胞をほぼ含まない成人白質からOPCを抽出するために効果的に使用することができるが、A2B5+神経が豊富である胎児脳からそうするには適していない。この課題に対処するために、本出願人らは、A2B5、および若い神経細胞において普遍的に発現されるポリシアル化されたN-CAM(PSA-NCAM)の両方に対して二重選別した。A2B5選別した試料からPSA-NCAM+細胞を除外することにより、ほぼ独占的にグリア細胞および主として希突起膠細胞を生じる細胞集団を単離した。このA2B5+/PSA-NCAM-表現型は、胎児ヒト脳中の有糸分裂性の希突起膠細胞前駆体の豊富なプールを信頼できるように同定し、これはP/CNP2:hGFPおよびA2B5単独により認識される成人前駆体プールに類似しているように見えた。この高含有されたOPCの、高度に希突起新生性の21週〜23週のヒト脳室ゾーンにおける非常に豊富なOPCと組合わされた高収率の技術の組合せは、治療的移植に適した純度および品質で単離された、ヒト希突起膠細胞前駆細胞の最初の有意な定量のために提供された。
【００６６】
実施例15−移動時の差次的分散
これらの実験において、ヒトOPC高含有プールを、新生仔シバラーマウスの脳に移植し、それらの移動活性、希突起膠細胞成熟、および有髄化効率を評価した。選別したOPCは、高度の移動を提供し、移植の4週間〜8週間以内に前脳のほとんどの構造に達したことがわかった(図2)。更に希突起膠細胞および星状膠細胞のふたつの誘導表現型のそれらの分散パターンは、シバラー宿主においてかなり異なっていた。希突起膠細胞は、注射部位に近接して豊富であるのに対し、星状膠細胞はより広範に分散し、前脳灰白質に広く侵入していた。これは、選択過程を反映し、大グリア細胞はそれらの希突起膠細胞対応物よりもより迅速またはより攻撃的に移動した。同様に、A2B5+/PSA-NCAM-を定義したプールは、不均質であり、その結果系統が制限された希突起膠細胞前駆体は、注射部位の近傍に残存すると同時に、余り分化せず、より運動性の前駆体は、初期増殖の間移動し続け、移動の休止時に主に星状膠細胞として分化した。あるいは、大グリア細胞の灰白質実質部位への優先的移動は、白質区画を超えた希突起膠細胞の浸潤に対する地図的制限を反映することがある。恐らく、これらの考察の各々は、注目した異なる分散パターンに寄与しているであろう。
【００６７】
実施例16−非関連前駆体の持続性
試料採取した全ての時点で、星状膠細胞抗原または希突起膠細胞抗原のいずれかを発現できない非常に多数のネスチン+/hNA+細胞が注目され、これは代わりに持続性の前駆体として宿主実質を維持するように見えた。これらの非関連ネスチン+/GFAP-/MBP-ドナー細胞の出現率は、胎児のほうが、成人由来の移植片よりも明らかに高かった。しかしながら、ほとんどの成人由来のOPCは希突起膠細胞として成熟し、星状膠細胞は少ないので、大きい画分は、ネスチン+/GFAP-/MBP-として残存した(図4A)。このような非関連細胞は、生着されたレシピエントにおいて恩典および大害(blessing and curse)の両方に寄与し、これらは恐らく、インビボにおいて更に刺激され得る前駆体の給源を含み、薬学的にまたは脱髄損傷に反応し、有髄化した希突起膠細胞を生じるであろう。他方でこれらは、神経細胞の運命に再度方向付けられた異所性神経細胞の可能性のある給源も示し；考えられる限りでは、これらは、後の新生物の悪性転換のための有糸分裂受容能力の細胞の貯蔵にも寄与するであろう(少なくとも、出願人はヒト脳由来の前駆細胞のレシピエントの腫瘍形成には注目していない)。従って、その表現型の運命および後の増殖の可能性が依然不明である、非関連前駆体の生着したレシピエントの持続性(persistence)は、選別された希突起膠細胞前駆細胞を臨床療法において使用する前に考慮されるべきである警戒すべき注意点を提供する。
【００６８】
実施例17−臨床利用
前述の結果は、成人の脱髄に似た先天性髄鞘発育不全(Windremら、「Progenitor Cells Derived from the Adult Human Subcortical White Matter Disperse and Differentiate on Oligodendrocytes Within Demyelinated Regions of the Rat Brain」、J. Neurosci Res.、69:966-975(2002)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)が、直接単離されたヒトCNS前駆細胞の同種移植片を使用する、細胞ベースの治療の適当な標的であり得ることを示唆している。本試験において、レシピエントマウスの疾患表現型または生存のいずれかにおけるドナー生着および有髄化の作用は、評価しなかった。しかしシバラーCNSは、そのCNS全体が髄鞘発育不全であるので、恐らく脳に加え、広範な脳幹および脊髄の有髄化は、著しい治療的恩典に必要であろう。このような広範な移植片に関連した有髄化は、本試験において使用されるものよりもより高い細胞用量を必要とし、中枢神経系(neuraxis)にの広がる反復注射部位で送達される。これに関して、より高い細胞用量の大槽および前脳脳室への同時注射は、前脳のみへの注射により達成されるものよりも、実質的により広範なドナー細胞の生着および有髄化を生じ得る(Mitomeら、「Towards the Reconstruction of Central Nervous System White Matter Using Precursor Cells」、Brain、124:2147-2161(2001)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。
【００６９】
このような髄鞘発育不全の宿主の細胞に基づく有髄化の戦略は、新生児レシピエントに向けられる場合に特別な恩典を有し、新生児レシピエントへ導入された同種抗原に対する免疫寛容をもたらすであろう(Ridgeら、「Neonatal Tolerance Revisited: Turning on Newborn T Cells With Dendritic Cells」、Science、271:1723-1726(1996)；Roser, B.、「Cellular Mechanisms in Neonatal and Adult Tolerance」、Immunol. Rev.、107:179-202(1989)；および、Witzkeら、「Induction of Tolerance to Alloantigen」、Rev. Immunogenet.、1:374-386(1999)、これらはその全体が本明細書に参照として組入れられている)。動物は、免疫抑制療法を受け取らず、および生着されたヒト細胞に対する免疫拒絶反応の証拠はなかった。これは、移植された細胞の免疫拒絶反応は、シクロスポリンを使用する高用量の持続型免疫抑制を指示するのに問題となるのに十分である(Windremら、「Progenitor Cells Derived from the Adult Human Subcortical White Matter Disperse and Differentiate as Oligodendrocytes Within Demyelinated Regions of the Rat Brain」、J. Neurosci. Res.、69:966-975(2002)、これはその全体が本明細書に参照として組入れられている)ような、ヒトOPCの成体ラット脳への移植と著しく対照的である。このように、とりわけクラベ病、キャナヴァン病およびティー-サックス病を含む遺伝性白質萎縮に加え、周産期胚マトリックス出血および脳性麻痺のような先天性疾患は、全て細胞ベースの治療的再有髄化の実行可能な標的であることが証明される。
【００７０】
実施例18−胎児および成人前駆体の明確な特徴
胎児および成人の希突起膠細胞前駆細胞は、根本的にそれらの有髄化の時間経過および効率が異なるという発見は、驚くべきことであった(図6)。成人由来のOPCは、同様に単離された胎児対応物よりも、より迅速に、より高い効率およびより大きい相対割合で成熟しおよび有髄化することができる。胎児OPCは一般に移植後8週目までは有髄化が認められず、12週以前は実質的有髄化を示さないが、成人OPCは、ほぼ間違いなく4週目までに、迅速に成熟し有髄化する。有髄化はそれらの胎児対象物よりもはるかに迅速であるにもかかわらず、成人OPCは、より高い効率で−すなわち、より高い相対割合で、有髄化希突起膠細胞として成熟し、星状膠細胞の同時生成は、胎児由来の前駆体と比べはるかに少なかった。成人由来のOPCは、それらのより効率的で、即座におよび豊富な有髄化の結果として、他のアナログおよび同様に誘導した胎児由来のOPCよりも、より迅速で有用な治療用ベクターを構成するように見える。この知見は、これらの細胞の治療的適用に関して、特に胎児および成人OPCによる方法のために選択される疾患標的に関して、重大な意味を有する。胎児細胞は、さもなければ内在性の有髄化が緩徐化されおよび遅延された、先天性髄鞘発育不全が運命付けられた発生しつつある脳の髄鞘発育不全を予防するために、適当な治療的ベクターである。対照的に、現存のミエリンが喪失されおよび成熟した軸索が変性される、後天性髄鞘発育不全の疾患には、成人由来の前駆体により提供される迅速な成熟および有髄化が必要とされる。
【００７１】
従って、ヒト希突起膠細胞前駆細胞は、各々治療的再有髄化を目的とした生着を可能にする純度および収量で、胎児および成人の両方のヒト脳から単離される。胎児および成人由来の表現型は、胎児OPCはより広範に移動するのに対し、成人OPCはより迅速にミエリンを生成するが、付随的星状膠細胞の生成は少ない点が異なる。従って、ふたつの段階規定表現型は、極めて異なる疾患標的および治療戦略に適していることが証明される。さもなければ、胎児および成人由来の両方の精製したヒトOPCを使用し、先天性髄鞘発育不全の哺乳類脳において広範かつ効果的な有髄化を達成することができる。
【００７２】
本発明は例証を目的として詳細に説明されているが、このような詳細は単にその目的のためであり、当業者により、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の精神および範囲を逸脱しない限りは変更を行うことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図1A〜図1Dは、胎児ヒト希突起膠細胞前駆細胞の蛍光標示式細胞選別を示している。これは、A2B5およびPSA-NCAMの両方について同時免疫染色した後の、23週目のヒト胎児脳室ゾーン解離の二色FACSの結果を示している。左側のFACSプロット(図1A)は、合致したが染色されない23週の解離を図示している。右側の図1Bは、A2B5(FL1、y軸)およびPSA-NCAM(FL2、x軸)について二重免疫標識後に選別された、同じVZ解離を示している。図1C〜図1Dは、A2B5選別した細胞が、モノクローナル抗体O4により認識された希突起膠細胞スルファチド抗原を発現したことを示している。R1R3内のA2B5+/PSA-NCAM-画分は、解離の16.5％を含み、これはグリア前駆細胞に相当していた。これらは星状膠細胞および希突起膠細胞の両方を作成することができるが、この妊娠期間に由来した場合には、優先的に希突起膠細胞であり、従って希突起膠細胞前駆細胞(OPC)と称された。対照的に、R1R5画分は、抗原性表現型A2B5-/PSA-NCAM+により規定され、これはインビトロにおいて多くは神経細胞を生じ、その結果神経前駆プールと称された。
【図２】図2A〜図2Eは、胎児ヒトOPCが迅速に移動し、前脳を浸潤することを示している。この合成写真は、シバラーレシピエントへの周産期移植の4週後の、移植されたヒト細胞の分布を示している。ヒト細胞は、抗ヒト核抗原(ANA)免疫染色により局在化され；その結果低い検出力の蛍光像が、代表的前後方向のレベルで収集され、概略化された。生着された細胞は、前脳全体に広範に分散されたが、ほとんどは皮質下の白質路内に留まっている。図2Aは、試料採取されたレベルを確定している、矢状方向の概略を示す。図2B〜図2Eは、前頭面におけるAP 1.25、1.0、-1.0、および-2.0に対応する断面を示している。スケールバー＝3mm。
【図３】図3A〜図3Iは、生着されたヒトOPCが、前脳の広範な領域を有髄化することを示している。図3A〜図3Bは、乳幼仔としてのホモ接合体シバラーマウスへ移植された、選別されたヒト胎児OPCによる広範なミエリン塩基性タンパク質(MBP)の発現は、脳梁の大きい領域(図3Aおよび図3B、2匹の異なるマウス)が、12週目までに有髄化されることを指摘することを示している。図3Cは、ヒトOPCも、内包の背腹方向の範囲へ移動し、その全体で線維を有髄化し、単回の周産期注射後に前脳の広範な再有髄化を顕在化することを示している。図3Dは、周産期の異種移植の3ヶ月後の生着されたシバラー脳梁における、ミエリン塩基性タンパク質発現が、ヒト核抗原(hNA)により同定された、ヒトドナー細胞に関連していることを明らかにしている。生着されたヒト細胞およびそれらに関連したミエリンの両方が、脳梁の軸索路に平行に位置することが常に認められた。図3E〜図3Hは、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)により取り囲まれたヒト細胞(hNA)による、移植されたシバラー脳梁の共焦点光学断片を示している。ヒト細胞(矢印)は、MBP+線維の網内に認められる(図3E、図3F〜図3Hの光学断面を重ねた像、1μmおきに採取)。図3Iは、OPCが、状況に応じた方式で希突起膠細胞または星状膠細胞として動員され、その結果移植されたOPCが典型的には、推定の白質内で有髄化している希突起膠細胞として成熟したが、白質および灰白質および白質の両方内ではGFAP定義された星状膠細胞としてであったことを明らかにしている。この写真は、ヒト胎児OPC(hNA)の周産期生着の3ヶ月後の、シバラー脳の脳梁線条境界を示している。ドナー由来のMBP発現は、脳梁において明らかであるが、ドナー由来のGFAP+星状膠細胞は、線条体の側部に顕著である。スケールバー＝200μm。スケール：図3A〜図3C、1mm；図3D、100μm；図3E〜図3H、20μm；図3I、200μm。
【図４】図4A〜図4Gは、生着されたヒト前駆細胞による、軸索の鞘被覆およびミエリン圧密を示している。図4Aは、MBP、ヒトANA、および神経線維タンパク質の三重免疫染色を示している共焦点顕微鏡写真である。この画像において、全てのMBP免疫染色は、貯蔵されたヒトOPCに由来するのに対し、NF+軸索は、マウス宿主のものである。矢印は、ヒト希突起膠細胞MBPにより鞘被覆されたマウス軸索のセグメントを同定している。図4Bは、胎児OPC移植後12週目に屠殺したシバラーレシピエントの脳梁を通じて撮影した、光学断面の深さ2μmの合成写真である。シバラー軸索は、指標線がMBP免疫反応性により各側上に隣接されたNF+軸索と交差した時に、鞘被覆としてスコア化した。アスタリスクは、図4Cにおいて拡大された視野を示している。比較的高い倍率の図4Cにおいて、MBP免疫反応性は、両側に鞘被覆された軸索を取り囲むように見ることができる。図4Dは、成体のshi/shiホモ接合体の脳梁を通る矢状方向断面の電顕写真である。シバラー軸索は典型的には、圧密できないミエリンの単独の緩い包み(wrapping)を有し、その結果主要な濃い線は形成されない。図4E〜図4Gは、誕生直後にヒト希突起膠細胞前駆細胞を移植された、16週齢のシバラーホモ接合体の代表的顕微鏡写真である。これらの画像は、濃密に圧密された髄鞘を伴う、残存するシバラー軸索を示している。アスタリスクは、挿入図において拡大された視野を示している。拡大図の主要な濃い線は、ミエリン層板間に認められ、これは生着されたヒトOPCによる、有髄化のEM構造を提供している。スケールバー＝図4A、20μm；図4B、40μm；図4C〜図4F、1μm。
【図５】図5A〜図5Cは、生着された前駆体の有糸分裂活性が、経時的に低下することを示している。図5A〜図5Bは、異種移植後4週目(図5A)および12週目(図5B)の、移植された胎児ヒトOPCによる、BrdU組込みを示している。シバラーレシピエントには、生後1日目に選別されたヒトOPCが脳室内注射により与えられ、その後屠殺前2日間は、BrdU(100μg/g、i.p.)が1日2回注射された。有糸分裂しているヒトOPCは、BrdU/hNA+細胞(矢印)として認められた。スケールバー＝50μm。図5Cは、周産期移植後の時間の関数としての、有糸分裂活性のあるドナー細胞の発生率の回帰である。屠殺前48時間に組込まれたBrdUのヒトドナー細胞の画分は、4週目の42±6.1％から、12週目の8.2±2.4％に下落した。回帰分析は、BrdU組込み速度は、指数回帰に従い経時的に減少することを明らかにした：y＝83.4e-0.22x、相関係数r＝-0.87(p＝0.012)。
【図６】図6A〜図6Fは、胎児および成人のOPCが、有髄化の速度および効率において実質的に異なることを示している。図6Aは、成人由来のヒトOPC(hNA)が、異種移植後4週間までに、濃密なMBP発現を実現したことを示している。対照的に、図6Bは、胎児OPCは、4週間までに検出可能なMBP-IRを発現しなかったことを示し、このような発現は12週目まで認められなかった。スケール＝100μm。図4C〜図4Dは、シバラーホモ接合体の脳梁-采接合部(fimbrial junction)の低および高倍率の冠状面画像であり、成人由来のhOPCの周産期生着後12週目までに濃い有髄化を示している。個別に評価された場合、このレシピエント白質のドナー細胞のほぼ半分が、MBPを発現することが認められた。図6Eは、12週目に両方を評価した場合に、実質的に高い割合の移植された成人OPCが、胎児OPCよりも、MBP発現を明らかにしたことを示している。図6Fは、胎児ドナー細胞は決して、同様に移植された成人OPCの結果よりも、より効率およびより高い数で生着されなかったことを示している。*は、各々スチューデントt-検定(両側)で、p＜0.O5；**、p＜0.005であることをを示している。スケール：図6A〜図6B、100μm、図6C、1mm；図6D、30μm。
【図１Ａ】
2005517717.tif 000002
【図１Ｂ】
2005517717.tif 000003
【図１Ｃ】
2005517717.tif 000004
【図１Ｄ】
2005517717.tif 000005
【図２】
2005517717.tif 000006
【図３Ａ】
2005517717.tif 000007
【図３Ｂ】
2005517717.tif 000008
【図３Ｃ】
2005517717.tif 000009
【図３Ｄ】
2005517717.tif 000010
【図３Ｅ】
2005517717.tif 000011
【図３Ｆ】
2005517717.tif 000012
【図３Ｇ】
2005517717.tif 000013
【図３Ｈ】
2005517717.tif 000014
【図３Ｉ】
2005517717.tif 000015
【図４Ａ】
2005517717.tif 000016
【図４Ｂ】
2005517717.tif 000017
【図４Ｃ】
2005517717.tif 000018
【図４Ｄ】
2005517717.tif 000019
【図４Ｅ】
2005517717.tif 000020
【図４Ｆ】
2005517717.tif 000021
【図４Ｇ】
2005517717.tif 000022
【図５】
2005517717.tif 000023
【図６Ａ】
2005517717.tif 000024
【図６Ｂ】
2005517717.tif 000025
【図６Ｃ】
2005517717.tif 000026
【図６Ｄ】
2005517717.tif 000027
【図６Ｅ】
2005517717.tif 000028
【図６Ｆ】
2005517717.tif 000029
【国際調査報告】
2005517717.tif 000030
2005517717.tif 000031
2005517717.tif 000032
2005517717.tif 000033
2005517717.tif 000034