(57)【要約】本発明は、Ｃ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質のスカフォールドを含む宿主原核細胞において可溶性形態の多量体を形成することができる組換え融合タンパク質を得る方法であって、（ｉ）原核細胞において機能的なプロモーターに機能しうるように連結された、この組換えタンパク質をコードする核酸を保有する宿主原核細胞を提供するステップ；（ｉｉ）この組換えタンパク質が発現される条件下で、この宿主細胞を培養するステップ；および（ｉｉｉ）この組換えタンパク質を回収するステップであって、このタンパク質が、スカフォールドのリフォールディングステップを行うことなく多量体形態で回収されるステップを含む前記方法を、提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質のスカフォールドを含む、宿主原核細胞において可溶性形態の多量体を形成することができる組換え融合タンパク質を得る方法であって、以下のステップ：
（ｉ）原核細胞において機能的なプロモーターに機能しうるように連結された、前記組換えタンパク質をコードする核酸を保有する宿主原核細胞を提供するステップ；
（ｉｉ）前記組換えタンパク質が発現される条件下で、前記宿主細胞を培養するステップ；および
（ｉｉｉ）前記組換えタンパク質を回収するステップであって、そのタンパク質が、スカフォールドのリフォールディングステップを行うことなく多量体形態で回収されるステップ、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記組換えタンパク質が、細胞培養物１Ｌ当たり少なくとも２ｍｇの濃度で少なくとも存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主原核細胞が大腸菌（E.coli）である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
大腸菌が、株Ｃ４１（ＤＥ３）［Ｂ９６０７０４４４］、株Ｃ４３（ＤＥ３）［Ｂ９６０７０４４５］もしくは株ＣＯ２１４（ＤＥ３）［ＮＣＩＭＢ４０８８４］、または過剰発現された組換えタンパク質の毒性に対して耐性である他の株から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えタンパク質が、異種ポリペプチドに融合された前記Ｃ４ｂｐコアタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
異種ポリペプチドがＴＮＦレセプタータンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
異種ポリペプチドが、ＢＡＦＦ−ＲのＢＡＦＦ結合部分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
異種ポリペプチドが、トロンボポエチンアゴニストペプチド ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡまたはソマトスタチンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｃ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質とＢＡＦＦ−Ｒとの融合タンパク質をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項１０】
Ｃ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質と、トロンボポエチンアゴニストペプチド ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡまたはソマトスタチンとの融合タンパク質をコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項１１】
原核細胞において機能的なプロモーターに機能しうるように連結された、Ｃ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質と異種ポリペプチドとの融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、原核生物発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換された、細菌宿主細胞。
【請求項１３】
ＢＡＦＦ−Ｒに融合されたＣ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質を含む、タンパク質。
【請求項１４】
トロンボポエチンアゴニストペプチド ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡに融合されたＣ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質を含む、タンパク質。
【請求項１５】
前記組換えタンパク質を薬学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物へと製剤化することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
患者における、ＢＡＦＦの血清レベルの上昇を伴う病的状態を治療する方法であって、治療有効量の請求項１４に記載のタンパク質または請求項９に記載の核酸を患者に投与するステップを含む前記方法。
【請求項１７】
前記状態が全身性エリテマトーデスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
真核細胞において機能的なプロモーターに機能しうるように連結された、請求項１３または１４に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む、真核生物発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターで形質転換された、宿主真核細胞。
【請求項２０】
ヒトまたは動物の身体の治療方法における、請求項１８に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２１】
ヒトまたは動物の身体の治療における使用のための、Ｃ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質のスカフォールドを含む組換え融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、真核生物発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序論
本発明は、原核細胞において、Ｃ４ｂｐドメインを含む融合タンパク質およびポリペプチドを高収量で産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組換えＤＮＡ技術の出現により、治療的使用のための生物学的に活性なタンパク質の大規模生産が可能になった。現在、エリスロポエチン、小ペプチドおよび抗体フラグメントのような大きなタンパク質を含む、臨床段階にあるかまたは開発中の多数の組換えＤＮＡ産生された生成物が存在する。
【０００３】
タンパク質を用いる難点は、半減期の問題であることが当該分野で知られている。多くのタンパク質およびペプチドが短いin vivo半減期を有し、そのために、それらの有用性が低くなっている。タンパク質分子およびペプチド分子を多量体化することが、これらの分子の半減期を増大させ、すなわち、これらの分子がより長い時間的規模にわたってそれらの活性を発揮できるようにする方法であることが見出されている。多数の機能的な生体分子が、オリゴマー構造の形態をとる場合に、in vivoでより強力に機能することが見出されている。これは、親和性(affinity)ではなく結合活性(avidity)による結合、および／または分子（例えば、二量体化によって活性化されるインスリンレセプターと同様の同一のレセプターサブユニット、または細胞表面上のシグナル伝達複合体を形成する同一ではない分子（例えば、リンパ球でのような））を架橋する能力のような因子に起因する。増大した半減期および結合活性のこれらの特性により、より低い用量のタンパク質分子およびペプチド分子を使用できるようになり、それによって、費用および用量依存的な副作用が低減する。
【０００４】
いろいろな方法が、組換えタンパク質の多量体を作製するために提唱されてきた。例えば、ポリエチレングリコールのようなポリマーへのタンパク質の化学的結合が試みられてきた(Katreら, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1487)。しかし、この技術は厄介であり、大量の精製物質を必要とする。抗体分子において、ヒンジ部および分子の他の領域におけるジスルフィド形成の可能性の改変が、抗体が互いに会合する程度を調整するために試みられてきた。しかし、結果は首尾一貫せず、予測できないものであった。同様に、多量体抗体を生成するためのプロテインＡ融合物の使用は、抗体フラグメントをうまく連結し得るが、他の分野では適用が限定されている。
【０００５】
補体４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）を使用した新たな多量体化システムが、ＷＯ  ９１／１１４６１に記載されている。ヒトＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）は、７つの同一のα鎖および単一のβ鎖からなるクモ様構造を有する、高分子量（５７０ｋＤａ）の血漿糖タンパク質である。Ｃ４ｂｐα鎖は、多量体への分子の構築を担うＣ末端コア領域を有する。標準的なモデルによれば、あるＣ４ｂｐ単量体の＋４９８位のシステインが、別の単量体の＋５１０位のシステインと共に、ジスルフィド結合を形成する。７つのα鎖のみを含むマイナーな形態もまた、ヒト血漿中で見出されている。この血漿糖タンパク質の本来の機能は、補体活性化の古典的経路を阻害することである。
【０００６】
ＷＯ  ９１／１１４６１では、Ｃ４ｂｐタンパク質が多量体化する能力を利用して、Ｃ４ｂｐの全てまたは一部と目的の生物学的タンパク質とを含む融合タンパク質を作製することができることが提唱されている。この融合タンパク質は、目的のタンパク質のためのプラットホームを提供する多量体を形成し、ここで、そのタンパク質は、増強された血清半減期およびその標的に対する増大した親和性または結合活性を有するものである。ＷＯ  ９１／１１４６１において、Ｃ４ｂｐの融合タンパク質は、治療用生成物のための、新規な送達システムおよび運搬システムの焦点として標的とされた。
【０００７】
Ｃ４ｂｐのα鎖の大部分は、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）反復配列として知られる約６０アミノ酸長の８つの直列に整列したドメインからなる。ＷＯ  ９１／１１４６１において記載される融合タンパク質においてはこれらのドメインを１つまたはそれ以上含むことが好ましいが、これは、多量体化を阻止することなく全てのＣＣＰが（Ｃ末端の５７アミノ酸のみを残して）欠失され得ることが実証されたからである(Libyh M. T.ら, (1997) Blood 90,3978)。Ｃ４ｂｐのこのＣ末端領域は、Ｃ４ｂｐコアと称される。
【０００８】
Libyhら（１９９７）は、Ｃ４ｂｐのα鎖のＣ末端部分に基づくタンパク質多量体化システムを記載している。Ｃ４ｂｐのＣ末端部分は生物学的機能を欠くが、Ｃ４ｂｐを産生するＣＨＯ細胞の細胞質において、Ｃ４ｂｐのポリマー化を担う。Libyhらは、Ｃ４ｂｐフラグメントを使用して、会合した抗体フラグメントの自発的な多量体化を誘導し、ｓｃＦｖフラグメントのホモ多量体を生成することができた。使用したＣ４ｂｐのＣ末端部分は、ｓｃＦｖ配列に対してＣ末端側に、必要に応じてＭＹＣタグによって間を隔てて配置された。
【０００９】
Oudinら(2000, Journal of Immunology, 164,1505)はさらに、ヘテロ多量体のマルチＣＲ１／ｓｃＦｖ抗Ｒｈ（Ｄ）分子を形成するために、Ｃ４ｂｐコア多量体化システムを使用している。これらのキメラタンパク質は、ＣＨＯ細胞の、２つの異なるベクター（一方のベクターはＣＲ１をコードし、他方のベクターはＳｃＦｖ抗Ｒｈ−Ｄをコードする）による同時トランスフェクションによってＣＨＯ細胞系統において発現され、これらのキメラタンパク質が分泌されるトランスフェクトされた細胞の細胞質において自発的に多量体化することが見出された。
【００１０】
Christiansenら(2000, Journal of Virology, 74,4672)はさらに、２９３  ＥＢＮＡ細胞において、Ｃ４ｂｐコアに連結されたＣＤ４６外部ドメインを含むホモ多量体融合タンパク質の産生を実証している。
【００１１】
自己構築性多量体の可溶性ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質もまた、Shinyaら(1999, Biomed & Pharmacother, 53,471)において実証されており、その場合、この融合タンパク質は、２９３細胞中で発現された。
【００１２】
Shinyaらはさらに、Ｃ４ｂｐコアドメインを含む融合タンパク質の薬物動態特性が、マウスにおけるこれらの組換え融合タンパク質のin vivo血漿半減期の増大のために改変されることを示唆している。使用するコアドメインはヒト起源なので、そのヒトへの投与に由来する有害な免疫学的結果は最小限になるであろう。
【００１３】
今日まで、Ｃ４ｂｐコアタンパク質に基づく融合タンパク質は、真核細胞において発現されている。真核細胞からの融合タンパク質の収率は、培養上清１ミリリットル当たり２マイクログラムに達することはほとんどなく（Oudinら、同上）、これは、遺伝子増幅を何回か反復した後にのみ達成され得る。このレベルは、治療的使用のために多数の融合タンパク質を大量に経済的に産生するためには低すぎる。
【００１４】
より高い収率を達成する１つの可能な方法は、原核生物発現系を使用することである。ＷＯ９１／００５６７には、このような産生の実験的証明は開示されていないものの、宿主原核細胞が、Ｃ４ｂｐベースのタンパク質の産生において使用され得ることが示唆されている。しかし、多数の考慮事項が、原核生物系の使用が不利であることを示唆している。特に、多くの真核生物タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）のような細胞において発現される場合、それらの活性な折り畳み構造の一部または全てを喪失する。原核細胞において発現される場合には、他の真核生物タンパク質は変性するか、または完全に不活性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
Ｃ４ｂｐは、哺乳動物においては分泌タンパク質であり、これらを原核生物において正しくフォールディングされた形態で産生することが特に困難であることは、当該分野で公知である。ジスルフィド架橋を有するタンパク質は、オリゴマー化を必要とするので、特に問題がある。ジスルフィド結合は、細菌細胞質の還元環境では正常に産生されず、ジスルフィド結合が形成し得る場合、それらジスルフィド結合はそのタンパク質の誤ってフォールディングされた形態または凝集形態を安定化する可能性がある。
【００１６】
通常、原核生物において発現される組換えタンパク質は、宿主原核細胞内の封入体の内部に凝集する。それは、通常は凝集形態または不活性形態で発現されたタンパク質を含む、細胞のそれ以外の部分とは分離した別個の粒子または小球体である。必要なリフォールディング技術が非効率的かつ費用のかかる技術であるため、発現されたタンパク質が封入体中に存在することにより、タンパク質を活性な可溶性形態で回収することが困難になっている。封入体から精製されたタンパク質は、活性な機能的タンパク質を得るために、比較的低い収率で、苦労して操作、変性およびリフォールディングする必要がある。
【００１７】
原核細胞においてＣ４ｂｐコア融合タンパク質を発現することに関して、他の考慮事項もまた、検討されるべきである。第一に、各コア単量体は、２つのシステイン残基を保持しており、当該分野で受け入れられているＣ４ｂｐ多量体のモデルによると、これらのシステインは、多量体の構築の際に分子間ジスルフィド結合を形成するために必要である。原核性細胞質ゾル（例えば、細菌細胞質ゾル）の還元環境は、これらのジスルフィド結合を還元することによって、Ｃ４ｂｐコア多量体の形成を阻害すると予測される。
【００１８】
第二に、多量体は、真核生物分泌装置を通過する間に構築されるが、この真核生物分泌装置は、原核生物においては利用できない方法（例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび独自のシャペロンの存在）でタンパク質のフォールディングを補助することが知られている。第三に、真核細胞において比較的少ない収量（１ミリリットル当たり数マイクログラム）が得られる条件下でさえも、この分泌経路は、ホモ型タンパク質を産生することができない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の要旨
本発明者らは、驚くべきことに、Ｃ４ｂｐコアの融合タンパク質が、原核細胞において効率的に合成されるだけではなく、Ｃ４ｂｐコア自体が正しくフォールディングでき、そして原核性細胞質ゾルの還元環境においてホモ型多量体へと構築できることを見出した。原核細胞において産生されるＣ４ｂｐコアの多量体は、驚くべきことに、ジスルフィド結合を含むことが見出された。
【００２０】
さらに、本発明者らはまた、原核性発現系において産生された、Ｃ４ｂｐコアに融合させたタンパク質が、その機能的活性を保持することを見出した。したがって、本発明は、Ｃ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質のスカフォールドを含む、宿主原核細胞の細胞質ゾルにおいて可溶性形態の多量体を形成することができる組換え融合タンパク質を得る方法であって、以下のステップ：
（ｉ）その原核細胞において機能的なプロモーターに機能しうるように連結された、その組換えタンパク質をコードする核酸を保有する宿主原核細胞を提供するステップ；
（ｉｉ）その組換えタンパク質が発現される条件下で、この宿主細胞を培養するステップ；および
（ｉｉｉ）その組換えタンパク質を回収するステップであって、このタンパク質が、スカフォールド（scaffold）のリフォールディング（refolding）ステップを行うことなく多量体形態で回収されるステップ、
を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明者らは、本発明の細胞培養物におけるタンパク質の収率が比較的高く、例えば、培養物１Ｌ当たり２ｍｇより高く（例えば、培養物１Ｌ当たり５ｍｇより高く）、好ましくは培養物１Ｌ当たり１０ｍｇより高く（例えば、培養物１Ｌ当たり２０ｍｇより高く）、さらにより好ましくは培養物１ｌ当たり１００ｍｇより高くなり得ることを見出した。
【００２２】
本発明のＣ４ｂｐコア融合タンパク質は、そのＮ末端またはＣ末端で目的とする生物学的に活性な配列に融合させたＣ４ｂｐコアタンパク質配列を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
Ｃ４ｂｐα鎖のコアタンパク質
これは、本明細書中で、「Ｃ４ｂｐコアタンパク質」または「コアタンパク質」、あるいは「Ｃ４ｂｐスカフォールド」と称される。これらの用語は、互換的に使用される。このタンパク質は、哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質、または多量体を形成できるそのフラグメント、あるいは多量体を形成できるその合成変異型であり得る。
【００２４】
多数の哺乳動物Ｃ４ｂｐタンパク質の配列が当該分野で入手可能である。これらには、ヒトＣ４ｂｐコアタンパク質（配列番号１）が含まれる。ヒトＣ４ｂｐコアタンパク質の多数のホモログが、当該分野で入手可能である。ホモログには、オルソログとパラログの２つの型がある。オルソログは、異なる生物における相同遺伝子として定義される。すなわち、それら遺伝子は、それらの生物をつくりだした種分化事象と同時期の、共通の先祖を共有する。パラログは、遺伝子、染色体またはゲノムの重複に由来する、同じ生物内の相同遺伝子として定義される。すなわち、これらの遺伝子の共通の先祖は、最後の種分化事象の後に生じた。
【００２５】
例えば、ＧｅｎＢａｎｋの検索により、哺乳動物Ｃ４ｂｐコアホモログタンパク質が、ウサギ、ラット、マウスおよびウシ起源を含む種において示される（それぞれ、配列番号２〜５）。パラログは、ブタ（ＡｐｏＲ）、モルモット（ＡＭ６７）およびマウス（ＺＰ３）において同定され、それぞれ、配列番号６〜８として示す。
【００２６】
配列番号１〜８のアラインメントを図１として示す。そのＣ末端においてより高い程度の差異を有するものの、８つ全ての配列が高い程度の類似性を有することが理解され得る。さらなるＣ４ｂｐコアタンパク質が、一般に入手可能な検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して、ＤＮＡ配列またはタンパク質配列のデータベースを検索することによって同定され得る。
【００２７】
所望の哺乳動物起源由来のＣ４ｂｐタンパク質がデータベース中で入手可能でない場合、当該分野で充分確立された慣用のクローニング方法論を使用してそれを得ることができるであろう。本質的に、このような技術は、目的の他の生物種由来のＣ４ｂｐコアタンパク質の配列を回収および決定するために、利用可能なＣ４ｂｐコアタンパク質の１つをコードする核酸をプローブとして使用することを含む。広範な種々の技術がこのために利用可能であり、例えば、ｍＲＮＡの適切な供給源（例えば、胚、または活発に分裂している分化細胞もしくは腫瘍細胞に由来するもの）を使用した遺伝子のＰＣＲ増幅およびクローニング、あるいは、哺乳動物からｃＤＮＡライブラリー（例えば、上記の供給源のうちの１つからのｃＤＮＡライブラリー）を得て、このライブラリーを、中〜高ストリンジェンシー（例えば、約５０℃〜約６０℃での、０．０３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）の液条件下で、既知のＣ４ｂｐ核酸を用いてプローブし、そしてその哺乳動物のＣ４ｂｐタンパク質の全てまたは一部をコードするｃＤＮＡを回収することを含む方法によるものがある。部分的なｃＤＮＡが得られる場合には、全長コード配列は、プライマー伸長法によって決定され得る。
【００２８】
多量体を形成することができるＣ４ｂｐコアタンパク質のフラグメントは、少なくとも４７アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含み得る。このフラグメントが多量体を形成する能力は、本発明に従う宿主原核細胞においてこのフラグメントを発現させ、完全な５７アミノ酸のＣ４ｂｐコアの多量体化を生じる条件下でこのＣ４ｂｐフラグメントを回収し、このフラグメントもまた多量体を形成するか否かを決定することによって、試験され得る。望ましくは、Ｃ４ｂｐコアのフラグメントは、配列番号１の残基６〜５２、またはそのホモログの対応する残基を少なくとも含む。
【００２９】
配列番号１のヒトＣ４ｂｐコアタンパク質は、全長Ｃ４ｂｐタンパク質配列のアミノ酸＋４９３〜＋５４９に対応する。多量体を形成することが当該分野で公知のこのフラグメントは、Ｃ４ｂｐコアタンパク質のアミノ酸＋４９８〜＋５４９に対応する。
【００３０】
Ｃ４ｂｐコアの変異型および多量体を形成できるフラグメント（この変異型も同様に、多量体を形成する能力（これは、フラグメントについて上記したようにして決定され得る）を保持する）もまた使用され得る。この変異型は、好ましくは、野生型哺乳動物Ｃ４ｂｐコアまたは多量体を形成するそのフラグメントに対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％または最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。
【００３１】
一態様において、このＣ４ｂｐコアは、配列番号１〜３および５〜８の６位および１８位に現れる２つのシステイン残基を含むコアである。望ましくは、変異型は、これら２つの残基間の相対的な間隔を保持する。
【００３２】
上記で特定した同一性の程度は、配列番号１〜８またはそれらの多量体形成フラグメントのうちの任意の１つに対するものである。
【００３３】
最も好ましくは、特定した同一性の程度は、配列番号１またはその多量体形成フラグメントに対するものである。
【００３４】
配列同一性の程度は、当該分野で広く使用され、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（以前にはＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）から入手可能な「Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ」のアルゴリズムの一部であるアルゴリズムＧＡＰによって決定され得る。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して、一致の数を最大化し、かつギャップの数を最小化する方法で、２つの完全配列のアライメントを作成する。ＧＡＰは、類似した長さをもつ密接に関連した短い配列のアラインメントに有用であり、したがって、配列が上記の同一性レベルを満たすか否かを決定するために適切である。ＧＡＰは、デフォルトパラメータで使用され得る。
【００３５】
哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質の合成変異型には、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入、またはＣ末端もしくはＮ末端への付加を有するものが含まれる。置換は、特に想定される。置換には、保存的置換が含まれる。保存的置換の例には、以下の表に示されるものが含まれ、表中、第二の列の同じブロックにあり、かつ好ましくは第三の列の同じ行にあるアミノ酸が、互いに置換され得る：
【表１】
2005535353.tif 000002
【００３６】
したがって、作製され、多量体を形成するその能力について試験され得るＣ４ｂｐコアタンパク質のフラグメントおよび変異型の例には、以下の表１に示される配列番号９〜１６が含まれる：
【表２】
2005535353.tif 000003
【００３７】
Ｎ末端切断またはＣ末端切断以外の配列の欠失が起こる場合、これらは、好ましくは、１つ以下、２つ以下または３つ以下の欠失（この欠失は、連続していても非連続でもよい）に限定されるであろう。
【００３８】
コアタンパク質配列に対して挿入、またはＮ末端もしくはＣ末端の伸長が起こる場合、それらの数もまた、望ましくは、コアタンパク質のサイズが野生型配列の長さを２０アミノ酸より多く、好ましくは１５アミノ酸より多く、より好ましくは１０アミノ酸より多く超えることがないように限定される。したがって、配列番号１の場合、挿入または伸長によって改変されるとすれば、このコアタンパク質は、望ましくは、７７アミノ酸長以下である。
【００３９】
Ｎ末端またはＣ末端の伸長は、タンパク質ドメイン（特に抗体Ｖドメイン）を互いに結合させるために当該分野で使用される柔軟なリンカー（例えば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは１〜４である））を含み得る。
【００４０】
本発明の融合タンパク質が化学合成によって作製される場合、Ｎ末端またはＣ末端の伸長は、ペプチドおよびポリペプチドの合成の分野において使用され得る、タンパク質中に天然には存在しないアミノ酸類似体を含んでもよい。
【００４１】
組換えタンパク質
本発明の組換えタンパク質は、単独の、または生物学的な対象となる少なくとも１つの配列にインフレームで連結された、上記のようなＣ４ｂｐコア（すなわち、「スカフォールド」）を含む。このような配列は、前記タンパク質、および／または治療（特にヒトの治療）において有用なタンパク質の同定または精製に有用なタグを含み得る。
【００４２】
この組換えタンパク質は、式：ＢｉＮ−Ｃｏ−Ｂｉｃ［式中、Ｃｏは上記のようなコアタンパク質であり、ＢｉＮは、コアタンパク質または生物学的な対象となる少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）の配列のいずれかのアミノ末端であり、そしてＢｉＣは、コアタンパク質または生物学的な対象となる少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）の配列のいずれかのＣ末端である］の一般構造を有するとして記載することができる。
【００４３】
好ましくは、ＢｉＮおよびＢｉＣのうち一方は、生物学的な対象となる配列ではない（すなわち、一方または他方は、融合物、または必要に応じてタンパク質の回収を助けるためのタグ（例えば、ポリヒスチジンタグ）の末端である）。より好ましくは、生物学的な対象となる配列は、ＢｉＮによって示される。
【００４４】
あるいは、対象となるタンパク質または非タンパク質性産物は、コアの側鎖に対して（例えば、コア配列の内部またはコア配列の末端に付加された、リジン残基の側鎖のアミノ基またはシステイン残基を介して）、あるいは既存のシステイン残基に対して、合成的手段によって結合され得る。
【００４５】
対象となる生物学的配列は、Ｃ４ｂｐコアタンパク質に通常連結されるＣ４結合タンパク質の全体でも一部でもないこと、すなわち、対象となる生物学的配列は、ヘテロ性配列であることが好ましい。
【００４６】
本発明者らは、上記定義に入るタンパク質が、スカフォールドのリフォールディングを必要とせずに、多量体形態で、細菌発現系において発現されてそこから回収され得ることを見出した。本発明者らは、約３０ｋＤａまでの単量体質量を有するタンパク質を発現させた。したがって、本発明は、このサイズ範囲内のタンパク質を発現させるために使用することができ、より一般的には、約１００ｋＤａまで、より好ましくは約５０ｋＤａまでのタンパク質を発現させるために使用し得る。
【００４７】
特定のクラスの融合タンパク質は、Ｃ４ｂｐコアが２〜２５アミノ酸残基のペプチドに融合された融合タンパク質である。多くの生物学的に活性なペプチドが公知であり、あるいはファージディスプレイによって選択することができる。しかし、これらの生物学的に活性なペプチドはしばしばin vivoで不安定であり、これは特に、これらの生物学的に活性なペプチドが腎糸球体を通って濾過され得るからである。これらをコア・スカフォールドに融合させると、この濾過が不可能になる。さらに、これは、オリゴマー化したペプチドに結合活性を付与する（その結果、これらの生物学的に活性なペプチドは、それらの標的へより密に結合し、かつより低い用量で効果を発揮し、レセプターを架橋し得る）。対象となる特定の生物学的に活性なペプチドには、天然に存在するペプチドまたはポリペプチドホルモン（例えば、ソマトスタチン、カルシトニンおよびα−ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）およびそれらの変異型）、ならびに本明細書の別の箇所で言及される他のものが含まれる。
【００４８】
したがって、Ｃ４ｂｐコアタンパク質のある範囲の融合タンパク質が、本発明の方法を使用して合成され得る。産生された多量体融合タンパク質は、増大した生物活性を示すと予測される。なぜなら、多量体は、Ｃ４ｂｐコアタンパク質に結合された部分をより高い密度で有し、したがって、より長い半減期および減少した代謝回転速度を示すと予測されるからである。
【００４９】
対象となる生物学的配列は、本発明において使用されるＣ４ｂｐコアタンパク質に対してヘテロ性である、ポリペプチドまたは化学化合物（例えば、薬物またはプロドラッグ）または炭水化物であり得る。言い換えると、対象となる生物学的配列は、同じ分子の一部では全くない。この対象となる生物学的配列は、同じ生物由来であり得る。結合部分が化学化合物である場合、この結合は、代謝および排泄（例えば、肝臓チトクロムによる）からこの化合物を保護するように機能し得るだけでなく、この化合物を組織に送達するように機能しうる。ポリペプチドの例には、医療用にまたはバイオテクノロジー用途のために使用されるポリペプチド（例えば、インスリン、サイトカイン（インターロイキンおよびインターフェロンを含む）、抗体およびそれらのフラグメント、増殖因子、レセプター、レセプターリガンド、アゴニストまたはアンタゴニスト、酵素、酵素アンタゴニスト、抗原、毒素ならびにプロテアーゼ）が含まれる。
【００５０】
本発明に従って調製される融合タンパク質、および本明細書中に記載される本発明の新規融合タンパク質は、１またはそれ以上の薬学的に許容される担体または希釈剤と共にこのタンパク質を含む医薬組成物の形態に調製することができる。この組成物は、この融合タンパク質の意図された使用および投与経路に従って調製される。
【００５１】
薬学的に許容される担体または希釈剤には、経口投与、直腸投与、鼻内投与、局所投与（バッカル投与および舌下投与を含む）、経膣投与または非経口投与（皮下投与、筋内投与、静脈内投与、皮内投与、髄腔内投与および硬膜外投与を含む）に適切な製剤に使用されるものが含まれる。これらの製剤は、便利に単位剤形で提供してもよいし、または薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製してもよい。
【００５２】
固形組成物について、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれ、これらが使用され得る。上記で定義したような活性化合物は、例えば、ポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどを担体として使用して、坐剤として製剤してもよい。液状の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、担体（例えば、水、生理食塩水水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど）中に、本発明の融合タンパク質、任意の医薬アジュバントを溶解し、分散させたりして、溶液または懸濁物を形成することによって、調製され得る。所望の場合、投与されるべき組成物はまた、ｐＨ緩衝化剤などのような助剤物質を含み得る。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者にとって公知であるかまたは明らかである；例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania,第19版, 1995を参照のこと。
【００５３】
投与すべき組成物または製剤は、いずれにせよ、治療される被験体の症状を緩和するのに有効な量で、ある量の活性化合物を含む。非毒性担体を加えて０．２５〜９５％の範囲に調整した活性成分を含む剤形または組成物が調製され得る。
【００５４】
非経口投与は一般に、皮下、筋内または静脈内のいずれかの注射によって特徴付けられる。注射剤は、従来剤形で、すなわち液体溶液または懸濁物、注射前の液状の液剤または懸濁剤にするのに適した固体形態、あるいはエマルジョンのいずれかとして、調製され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。非経口投与のためのより最近考案された方法は、徐放システムまたは持続放出システムを埋め込み、それにより投薬レベルが一定に維持されることを用いるものである。例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照のこと。
【００５５】
以下のクラスのポリペプチドが好ましいが、本発明はこれらに限定されない。
【００５６】
サイトカイン
インターロイキンには、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１およびＩＬ−１２を含む任意の公知のインターロイキンが含まれる。インターロイキンは、免疫系の調節因子である。いくつかのインターロイキンは、炎症応答または疾患に対する免疫応答に関与する。
【００５７】
インターフェロンには、ＩＦＮ−αならびにＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γの任意の形態が含まれる。これらはまた、免疫応答のモジュレーションに使用される。
【００５８】
サイトカインのさらなるクラスは、腫瘍壊死因子ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βである。
【００５９】
他のサイトカインには、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳを含む、ＭＩＰファミリーのメンバーが含まれる。ＲＡＮＴＥＳは、ＣＣＲ５  ＨＩＶコレセプターに結合し、ＲＡＮＴＥＳを用いた治療は、ＨＩＶ感染の進行を緩和するのに有効であり得る。
【００６０】
抗体
抗原に対する抗体または抗体フラグメントの親和性は、これらの抗体が本発明の方法に従ってＣ４ｂｐコア融合タンパク質として産生される場合、オリゴマー化によって増大され得る。抗体フラグメントは、Ｆｖフラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはそれらの任意の誘導体（例えば、一本鎖Ｆｖフラグメント）のようなフラグメントであり得る。これらの抗体または抗体フラグメントは、非組換え、組換えまたはヒト化のものであり得る。この抗体は、任意の免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭなど）の抗体であり得る。
【００６１】
別の態様において、これらの抗体フラグメントは、ラクダ化ＶＨドメインであり得る。抗体とその同族（cognate）抗原との間の主な分子間相互作用は、ＶＨ  ＣＤＲ３を介して媒介されることが公知である。しかし、ラクダまたはラマ由来のもののような、ＶＨのみの抗体（天然にＶＨのみの一本鎖抗体）は、その同族抗原に対して低い親和性のみを有する。
【００６２】
本発明の方法は、ＶＨドメインまたは高親和性抗体であるＶＨ  ＣＤＲ３ドメインを有するＣ４ｂｐコアタンパク質のオリゴマーを、改善された収率で得ることを可能にする。２つ以上のドメインが、本発明の方法に従って作製されたＣ４ｂｐコアオリゴマーに含められ、８つまでのドメインが含められて、オクタマー抗体分子を形成することができる。
【００６３】
抗体標的には、多くの結腸および乳房の腫瘍においてそれぞれ見出されるＣＥＡおよびｅｒｂＢなどの腫瘍関連抗原が含まれ得る。
【００６４】
一実施形態において、目的の生物学的タンパク質は、プロドラッグを、腫瘍細胞に対して毒性の薬物へと変換することができる酵素に融合された抗体を含み得る。これは、抗体指向性酵素プロドラッグ療法（antibody-directed enzyme-prodrug therapy（ＡＤＥＰＴ））の方法において使用され得る。あるいは、腫瘍指向性抗体を保有する単量体およびこのような酵素（例えば、カルボキシペプチダーゼ、ニトロレダクターゼなど）を保有する単量体を、１つの細胞中で同時発現させるか、または別個の細胞中で発現させて一緒に混合し、腫瘍細胞に対して指向されたヘテロ多量体を形成させることができる。
【００６５】
抗体はまた、免疫原としての使用のための抗原に関して、以下に言及するものを含む病原性生物の抗原に対して標的化され得る。
【００６６】
増殖因子
増殖因子としては、成長ホルモン（特に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ））のようなホルモン、ならびに単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチンおよび血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）が挙げられる。これらの増殖因子の活性フラグメントもまた使用され得る。哺乳動物、特にヒトの増殖因子が特に好ましい。
【００６７】
レセプター
レセプターは、ヒト身体中で異常なレベルまたは望ましくないレベルで発現されるタンパク質に結合する点で、治療上有用であり得る。
【００６８】
例えば、ＴＮＦ−αの過剰発現は、関節リウマチに関連しており、抗ＴＮＦ治療は、この病的状態の治療において成功してきた。したがって、目的の生物学的タンパク質は、ＴＮＦ−αレセプターであり得る。
【００６９】
目的のレセプターはまた、ＢＡＦＦレセプター(Thompsonら、Science, 2001,293, 2108)として公知の、ＴＮＦレセプターファミリーの別のメンバーである。ヒトＢＡＦＦレセプター（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ３７３８４６）は、ＴＮＦ関連リガンドＢＡＦＦに結合する１８４アミノ酸のタンパク質である。マウスにおけるこのリガンドの過剰発現は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）様の症状を引き起こす可能性があり、したがって、このＢＡＦＦレセプターは、この疾患の可能性のある治療剤として関心が持たれる。
【００７０】
一態様において、本発明は、Ｃ４ｂｐコアとＢＡＦＦレセプター（ＢＡＦＦリガンドに結合し得るその細胞外ドメインのフラグメントを含む）との融合タンパク質を提供する。そのようなフラグメントは、ＢＡＦＦのアミノ酸２〜５１に対応し得る。
【００７１】
細胞表面レセプターもまた興味が持たれる。例えば、ＣＤ４レセプターは、ＨＩＶ表面タンパク質ｇｐｌ２０／１６０に対する標的であり、ＣＤ４またはその可溶性フラグメントをＨＩＶ感染に対する治療剤として使用し、それによりＣＤ４が、血液循環中のＨＩＶがＣＤ４＋  Ｔ細胞に侵入する能力を遮断することは当該分野で広く提唱されている。
【００７２】
他の細胞表面レセプターもまた、ウイルス感染に関連しており（例えば、麻疹ウイルスではＣＤ４６（Christiansenら、同上））、そのような細胞表面レセプタータンパク質もまた、本発明において使用され得る。
【００７３】
レセプターリガンド、アゴニストまたはアンタゴニスト
多数の細胞表面レセプターが、二量体化によって活性化される。周知の例は、インスリンおよびエリスロポエチンについてのものである。リガンドの機能は、２つのレセプターに同時に結合し、そしてそれらのレセプターを二量体化して活性化することである。列挙される例において、レセプターの自己リン酸化が生じる。これにより、その細胞内部分にチロシンキナーゼドメインを有するレセプターが活性化される。このキナーゼは、レセプターが単量体である場合には不活性であるが、二量体化に際して活性化される。これが、シグナル伝達と総称される細胞内事象のカスケードを誘発する。
【００７４】
いくつかのリガンド（例えば、サブスタンスＰ）は短いポリペプチドであるが、その他（インスリン（５１アミノ酸）ならびにキナーゼ基質およびホスファターゼ基質を含む）は、その表面から突出する結合ループを保有する複雑な分子である。レセプターに対する天然のリガンドを模倣し得るより小さい分子が、研究目的（例えば、リガンドレセプター結合の特異性を理解するため）に有用である。
【００７５】
短いペプチドまたはループが、本発明に従う融合タンパク質へと組み込まれて、非常に低い濃度でレセプターおよび／またはキナーゼを活性化または阻害するために有用である、多価レセプターリガンドまたはキナーゼ基質／ホスファターゼ基質を形成し得る。
【００７６】
レセプターまたはキナーゼ／ホスファターゼの、それらのリガンドまたは基質に対する特異性をマッピングするために、スカフォールド中に挿入されたヘテロ性ポリペプチドに変異を導入してもよい。新規キナーゼ／ホスファターゼの特異性を迅速に評価するために、同じループの変異型が産生され得るか、または標準的な異なるループのセットが考案され得る。
【００７７】
変異型は、公知の技術（例えば、ＰＣＲ）に従って、配列のランダム化によって作製され得る。これらの変異型は、本発明に従ってタンパク質スカフォールドに組み込む前に、スクリーニングプロトコル（例えば、ファージディスプレイ）による選択に供してもよい。
【００７８】
アゴニストには、レセプターに結合して、そのレセプターに対する天然のリガンドの不在下でさえレセプターの作用を誘発するようなペプチド（ペプチド模倣体を含む）が含まれる。アゴニストの例は、トロンボポエチンアゴニストペプチドである。この線状の１４merのペプチドは、単量体の場合と比べ、二量体の場合に４０００倍活性が高いことが見出されている(Dower W. J.ら、Stem Cells (1998) 16, 補遺2,21 Peptide agonists of the thrombopoietin receptor)。この配列ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡの、Ｃ４ｂｐのコアドメインへの融合は、他のペプチドについて以下に記載されるのと同様に、血小板の産生および／または成熟を促進するのに有用な非常に強力なトロンボポエチンアゴニストを生成するはずである。
【００７９】
さらなる態様において、本発明は、Ｃ４ｂｐコアタンパク質とトロンボポエチンアゴニストペプチドとを含む組換えタンパク質、ならびにヒト被験体において血小板の産生および／または成熟を促進するための治療方法におけるこのようなタンパク質の使用を提供する。この方法は、治療を必要とする被験体に、有効量のこのタンパク質を投与することを含む。
【００８０】
アゴニストのさらなる例は、ソマトスタチンペプチドである。この環状ペプチドは、多数のＧタンパク質共役型レセプターに結合し、ソマトトロピンの放出を阻害することが公知である。類似体は、悪性カルチノイド腫瘍に関連する副作用の治療および胃腸感染によって引き起こされる下痢の治療を含む様々な医学適応に対して、Sandostatin（Novartis）として市販されている。
【００８１】
British Journal of Pharmacology (1998)「Somatostatin displayed on filamentous phage as a receptor-specific agonist」、第125巻,5-16頁に記載されるような、線維状バクテリオファージへのソマトスタチン配列の融合は、ソマトスタチンレセプターに結合してこれを活性化できるハイブリッドファージを生成する。Ｃ４ｂｐスカフォールドへのソマトスタチンの融合（ファージをスカフォールドで置き換えた）は、ハイブリッドファージよりも医薬としてより所望される特性を有する、ソマトスタチンレセプターに対する強力なアゴニストを、同様に生成する。同様に、そのように生成されたオリゴマーアゴニストは、PatelらによってProc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 第99巻,3294-3299頁に記載されるように、ソマトスタチンレセプターをオリゴマー化し、それによりシグナル伝達を増強し得る。
【００８２】
このように、本発明は、上記に示されるような組換え融合タンパク質（この融合タンパク質が、ソマトスタチンを含む）を調製するための手段を提供する。本発明はさらに、ソマトスタチンに連結されたＣ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質の融合タンパク質を提供する。本発明はさらに、悪性カルチノイド腫瘍に関連する副作用の治療および胃腸の感染によって引き起こされる下痢の治療を含む治療方法における、このタンパク質またはこのタンパク質をコードする核酸ベクター（本明細書中でさらに定義され、記載されるもの）の使用を提供する。
【００８３】
アンタゴニストには、レセプターに結合して、天然のリガンドが結合するのを阻止するペプチドが含まれる。
【００８４】
酵素
多数の生物学的反応は、複数のタンパク質活性の連続した作用および／または相乗作用を伴う。このようなタンパク質活性を、本発明に従って単一の分子へと組み込むことができる。したがって、好ましくは、本発明に従ってオリゴマーを構成するために使用される単量体には、別個の生物学的活性をコードする複数のアミノ酸配列を組み込む。これらの活性は有利には相補的であり、その結果、これらの活性は生物学的反応において連続的に必要とされるか、または相乗的に作用する。したがって、本発明は、１つまたは複数の酵素を含む複数機能の高分子構造体を提供する。
【００８５】
酵素の例には、大腸菌のＤｓｂＡのような細菌酵素が含まれる。
【００８６】
抗原
本発明に従って作製される多量体についての特定の使用は、免疫原（この用語は、本明細書中で「抗原」と互換的に使用される）の作製における使用である。本発明の方法に従ってもたらされるこのＣ４ｂｐコア融合タンパク質スカフォールド技術の主要な適用は、構築したまたは多量体化したペプチドまたはポリペプチドの抗原としての使用である。オリゴマー化は、このような抗原に対する抗体の検出およびこのような抗原に対する抗体の誘導の両方を改善する。これらの抗原のうちのあるものは、予防における価値があり得る。すなわち、これらはワクチン接種のために有用であり得る。この方法により、ヌクレオチド配列から、多価形態の組換え抗原の生産への、迅速な進行が可能である。予測されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、予測されたタンパク質配列をコードするオリゴヌクレオチド配列を設計するために使用され得る。Ｃ４ｂｐコアタンパク質をコードするベクターへのこれらのオリゴヌクレオチドのクローニングは、例えば、ｃＤＮＡを単離して大腸菌のような異種系においてそれらを発現させる必要なしに、非常に迅速な抗原生産を可能にする。
【００８７】
細菌免疫原、寄生虫免疫原およびウイルス免疫原は、ワクチンとして有用な、多量体またはヘテロ多量体のＣ４ｂｐ融合タンパク質を生成するためのポリペプチド部分として有用である。
【００８８】
これらの免疫原の細菌供給源には、細菌性肺炎、ニューモシスチス肺炎、髄膜炎、コレラ、破傷風、結核およびハンセン病の原因となるものものが含まれる。
【００８９】
寄生虫供給源には、マラリア原虫（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）が含まれる。
【００９０】
ウイルス供給源には、ポックスウイルス（例えば、ウシポックスウイルスおよびｏｒｆウイルス）；ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス１型および２型、Ｂウイルス、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスならびにエプスタイン−バーウイルス）；アデノウイルス（例えば、マストアデノウイルス）；パポバウイルス（例えば、ＨＰＶ１６のようなパピローマウイルスならびにＢＫウイルスおよびＪＣウイルスのようなポリオーマウイルス）；パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）；レオウイルス（例えば、レオウイルス１型、２型および３型）；オルビウイルス（例えば、コロラドダニ熱）；ロタウイルス（例えば、ヒトロタウイルス）；アルファウイルス（例えば、東部脳炎ウイルスおよびベネズエラ脳炎ウイルス）；ルビウイルス（例えば、風疹）；フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）；コロナウイルス（例えば、ヒトコロナウイルス）；パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザ１型、２型、３型および４型、ならびに流行性耳下腺炎）；モービリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）；ニューモウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス）；ベシクロウイルス（例えば、水泡性口内炎ウイルス）；リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）；オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡ型およびＢ型）；ブンヤウイルス（例えば、ラクロセウイルス）；フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）；ナイロウイルス（例えば、コンゴ出血熱ウイルス）；ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎）；アレナウイルス（例えば、ｌｃｍウイルス、ラッサ（Lasso）ウイルスおよびフニンウイルス）；レトロウイルス（例えば、ＨＴＬＶ  Ｉ、ＨＴＬＶ  ＩＩ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）；エンテロウイルス（例えば、ポリオウイルス１型、２型および３型、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスならびにノーウォークウイルス）；ライノウイルス（例えば、ヒトライノウイルス）；ならびにフィロウイルス科（例えば、マールブルグ（病）ウイルスおよびエボラウイルス）が含まれる。
【００９１】
これらの細菌供給源、ウイルス供給源および寄生虫供給源由来の抗原は、ワクチンとして有用な多量体タンパク質の産生において使用され得る。これらの多量体は、異なる抗原を保有する単量体の混合物を含み得る。
【００９２】
研究目的または治療目的のためのヒトタンパク質への免疫原が作製され得る。生物の免疫系に曝露された場合に免疫応答を惹起し得る免疫原性ペプチドは、本発明の方法に従ってＣ４ｂｐコアタンパク質融合タンパク質を作製するために好ましいポリペプチドである。本発明からのオリゴマー化Ｃ４ｂｐコア融合タンパク質の改善された収率は、ワクチン接種のみならず研究においても多数の用途を有する。例えば、ヒトゲノムプロジェクトによるヒト遺伝子配列データの作成により、新規ポリペプチドに対して反応性の抗血清の作製が差し迫った必要性として現れてきた。同じ必要性は、細菌のような原核生物、および真菌を含む他の真核生物、遺伝子産物にも当てはまる。Ｃ４ｂｐコア多量体に融合した目的の免疫原は、免疫グロブリン分子に対する結合活性が増大するために、有効性が増大すると考えられる。
【００９３】
本発明は、免疫応答の惹起において多数の利点を有する。例えば、オリゴマーの使用は、免疫系に対して多数の抗原を同時に提示することを可能にし得る。これは、単一の生物または多数の異なる生物に存在し得る２以上のエピトープに対して免疫応答を惹起し得る多価ワクチンの製造を可能にする。したがって、本発明に従って形成されたワクチンは、２種以上の疾患に対する同時ワクチン接種のために、または所定の病原体の複数のエピトープを同時に標的とするために使用され得る。これらのエピトープは、単一の単量体単位に存在してもよく、または組み合わされてヘテロ多量体を提供する異なる単量体単位に存在してもよい。
【００９４】
さらに、本発明は、免疫原と共に、Ｃ４ｂｐコアオリゴマー上にアジュバントを組み込むことによって、利用され得る。適切なアジュバントは、例えば、細菌毒素およびサイトカイン（例えば、インターロイキン）である。この免疫原の効力はそれによって増強され、抗血清のより有効な生起およびより有効な免疫化を可能にする。非常に好ましいアジュバントは、補体のＣ３ｄ成分である。
【００９５】
Ｃ４ｂｐコア融合タンパク質を有することは、免疫化に関して有用である。なぜなら、このコアタンパク質は、免疫のレシピエントの血清または血漿中に通常は存在しないだけでなく、それ自体免疫応答を惹起しないからである。Ｃ４ｂｐタンパク質は、多数の哺乳動物種において公知であり、哺乳動物種についての適切なホモログは、標準的な遺伝子クローニング技術を使用して、当業者に見出され得る。
【００９６】
この系が大腸菌において可溶性タンパク質の産生を可能にするという事実により、この系を使用することによって、それらのＣ末端および／またはＮ末端に対する拘束の欠如に起因してそれら自体の上に発現される場合にフォールディングされないタンパク質のドメインまたはフラグメントを、フォールディングされた可溶性のタンパク質として生成することが可能になる。特異的な切断部位を操作することにより、目的の遊離ドメインの産生が可能になる。同様に、目的のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端を拘束することは、リフォールディング過程の際に有益であり得る。さらに、オリゴマー化構造は、変性および解離に対して非常に耐性であるので、挿入されたタンパク質の変性の際も安定である。したがって、リフォールディングの際、等量の目的のタンパク質に対する遊離タンパク質の実際の濃度は、オリゴマー化数と等しい倍数分、減少する。タンパク質技術における多数の方法は、非常に低分子量のタンパク質および具体的にはペプチドを扱うのには最適化されていないので、オリゴマー化は、精製目的のためにも有益であり得る。
【００９７】
アッセイ方法
本発明の方法に従って産生されたＣ４ｂｐコア融合タンパク質は、in vivoまたはin vitroでの抗体の検出または中和に適用され得る。例えば、in vitroの多価または一価の抗原保有Ｃ４ｂｐコア融合タンパク質は、ファージディスプレイ実験に由来する抗体分子を選択するために使用され得る。さらに、本発明の方法に従って産生された抗原保有Ｃ４ｂｐコア融合タンパク質は、in vivoで、自己免疫疾患における自己抗体を中和するため、あるいは病理学的状態を示し得る抗体を検出するため（例えば、ＨＩＶ試験において）、または他の診断適用のために、使用され得る。
【００９８】
ファージディスプレイ
ファージディスプレイ技術は、生物学的研究において非常に有用であることが証明されている。この技術により、大きな分子ライブラリーからリガンドを選択することが可能となる。本発明のタンパク質もまた、この技術の力を利用するが、通常の適用を超えるいくつかの強力な利点を有している。Ｃ４ｂｐ分子は、ちょうど一本鎖Ｆｖ分子がそうであるように、ｆｄバクテリオファージ上に単量体としてディスプレイされ得る。融合物のライブラリーは、標準的な方法によって構築され、得られたライブラリーは目的のリガンドについてスクリーニングされる。これは、親和性に基く選択であることに留意することが重要である。特性解析した後、親和性について選択されたリガンドは、オリゴマー化され、したがって、結合活性を利用し得る。リガンドに対する標的がオリゴマーである場合、非常に密な結合が生じる。さらに、単量体として選択されたリガンドは、それらの結合パートナーを架橋またはオリゴマー化できる。この効果の用途は、レセプター活性化の誘発にある。
【００９９】
タンパク質チップ
現在、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ産物またはクローニングしたＤＮＡのいずれであれ、ＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子発現の高度に並行した分析における迅速な展開を可能にする主要なツールである。明らかに、多くの状況において、遺伝子発現を直接モニタリングすること、すなわち、ｍＲＮＡレベルではなくタンパク質発現レベルをアッセイすることによってモニタリングすることが、はるかに好ましい。しかし、後者は、標識されたｃＤＮＡのハイブリダイゼーションに依存する遺伝子活性の間接的測定であり、特定のｍＲＮＡの存在量とタンパク質へと翻訳される頻度との間の相関がしばしば乏しいので、非常に誤りを導きやすい。さらに、ｍＲＮＡ分析は、コードされたタンパク質が翻訳された場合に活性があるか否かをおそらく決定できない。これは、翻訳後修飾に依存し得る。
【０１００】
したがって、コア・スカフォールドと目的のタンパク質に対するある範囲のリガンドとの融合タンパク質を含むタンパク質アレイが作製され、サンプル中のこれらのタンパク質の発現レベルを決定するために使用され得る。
【０１０１】
例えば、スカフォールドリガンド融合物を発現する細菌細胞のアレイを提供し、その結果、これらの融合物をin situで発現させ、回収し、その後サンプルを添加することができる。あるいは、これらの融合物を別々に作製し、次いで適切な固体支持体上に整列させ、サンプル中のタンパク質の検出を提供し得る。検出は、標識された所定量の目的のタンパク質を提供してサンプル中に存在するタンパク質に対して競合させ、標識されたタンパク質がどの程度リガンドに結合するかを測定することによってなされ得る。あるいは、リガンドを標識し、目的のタンパク質に結合した標識リガンドの量を検出してもよい。
【０１０２】
核酸
Ｃ４ｂｐコアを含むタンパク質は、組換えタンパク質をコードする核酸構築物を使用して、宿主原核細胞におけるタンパク質の発現によって産生される。
【０１０３】
この構築物は一般に、複製可能なベクターの形態であり、このベクターにおいて、タンパク質をコードする配列は、所望の宿主細胞におけるタンパク質の発現に適切なプロモーターに機能しうるように連結されている。このプロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。適切なプロモーターには、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λプロモーターＰＬまたはＰＲ、および当業者に周知の他のプロモーターが含まれる。
【０１０４】
これらのベクターは、複製起点を有し、必要に応じてプロモーターのレギュレーターを有して提供され得る。これらのベクターは、１つまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子または好ましくはカナマイシン耐性遺伝子）を含み得る。当該分野でそれ自体公知の広範な種々の細菌発現ベクターが存在し、本発明では、当業者の個々の好みに従って任意のベクターを利用し得る。
【０１０５】
広範な種々の宿主原核細胞が、本発明の方法において使用され得る。これらの宿主には、Escherichia、Pseudomonas、Bacillus、Lactobacillus、Thermophilus、Salmonella、EnterobacteriacaeまたはStreptomycesの株が含まれ得る。例えば、Escherichia属由来の大腸菌が本発明の方法において使用される場合、使用するのに好ましいこの細菌の株には、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびそれらの誘導体（Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）もしくはＣＯ２１４（ＤＥ３）を含む）、またはＷＯ９８／０２５５９において記載されかつ利用可能となったような、組換えタンパク質発現の毒性に対して耐性である他の株が含まれる。
【０１０６】
なおより好ましくは、プロファージＤＥ３を欠くこれらの株の誘導体が、プロモーターがＴ７プロモーターでない場合には使用され得る。
【０１０７】
ＤＮＡワクチンおよび治療剤
別の態様において、本発明は、ヒトまたは動物の身体の治療において使用するための、Ｃ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質のスカフォールドを含む組換え融合タンパク質をコードする核酸配列を含む真核生物発現ベクターを提供する。
【０１０８】
このような治療は、遺伝性疾患または他の疾患に罹患した細胞または組織中への特定の核酸配列の導入によって、あるいは免疫応答を惹起する目的のための抗原をコードする核酸配列の導入によって、その治療効果を達成する。疾患に罹患した細胞または組織とは異なる細胞または組織へと遺伝子配列を導入して、その遺伝子産物が、疾患細胞または疾患組織に対する直接的または間接的な影響を与えることを目的とすることもまた、可能である。核酸の送達は、（「裸」または製剤化形態の）プラスミドベクターまたは組換え発現ベクターを使用して達成され得る。
【０１０９】
遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が含まれる。レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。被験体がヒトである場合、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）のようなベクターが利用され得る。
【０１１０】
このベクターは、ＲＮＡ合成の開始を指令するのに充分な転写調節配列、特にプロモーター領域を含む。適切な真核生物プロモーターには、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター(Hamerら、1982 J. Molec. Appl. Genet. 1,273)；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター(McKnight, 1982 Cell 31,355)；ＳＶ４０初期プロモーター(Benoistら、1981 Nature 290,304)；ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Gormanら、1982 Proc. Natl Acad. Sci. USA 79,6777)；およびサイトメガロウイルスプロモーター(Foeckingら、1980 Gene 45,101)が含まれる。
【０１１１】
遺伝子治療を必要とする細胞型に特異的なプロモーターが、多数の例において望ましい。特定の細胞型が、（直接的作用または間接的作用のいずれかのために）別の部位へと運命付けられた治療タンパク質を産生するためのプラットホームとして使用される状況では、選択されたプロモーターが、その「工場」部位において充分に働くべきである。筋肉はこれについての良い例である。なぜなら、有糸分裂後、このタンパク質を発現する筋線維に対する免疫応答が存在しない限り、筋肉は数年間続いて治療タンパク質を産生し得るからである。したがって、強力な筋肉プロモーターの使用も、本明細書中で特に適用可能である。筋肉疾患自体を治療することを除いて、筋肉の使用は、通常、分泌されたタンパク質が循環して他の場所で機能するように存在する場合（例えば、ホルモン、増殖因子、凝固因子）にのみ、適切である。
【０１１２】
プラスミドベクターとしてかまたはウイルスベクターの一部としてのいずれかでの、被験体への本発明のこの態様のベクターの投与は、多数の異なる経路によって影響され得る。プラスミドＤＮＡは、「裸」であり得るか、カチオン性および中性の脂質（リポソーム）を用いて製剤化され得るか、または直接的送達もしくは間接的送達のいずれかのためにマイクロカプセル化され得る。ＤＮＡ配列はまた、直接的送達または間接的送達のいずれかのために使用され得るウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）ベクター内に含まれ得る。送達経路には、筋内、皮内(Sato, Y.ら、1996 Science 273, 352)、静脈内、動脈内、髄腔内、肝内、吸入、膣内点滴注入(Bagarazziら、1997 J Med. Primatol. 26,27)、直腸内、腫瘍内または腹腔内が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
したがって、本発明は、ＤＮＡベクターでのいくつかの細胞のトランスフェクションを可能にし、その結果、治療ポリペプチドが発現され、（感染または疾患に起因する症状を緩和する）治療効果を有するようにするのに有用な医薬組成物として、本明細書中で記載されるようなベクターを包含する。本発明に従う医薬組成物は、溶媒、担体、送達システム、賦形剤、および添加剤または助剤を使用して、本発明に従う構築物を、被験体への投与に適切な形態にすることによって調製される。よく使用される溶媒には、滅菌水および滅菌生理食塩水（緩衝化されていてもいなくてもよい）が含まれる。ある担体としては、遺伝子銃で（すなわち、ガス圧下で）送達される金粒子が含まれる。他の頻繁に使用される担体または送達システムには、液体溶液として与えられるか、送達カプセル内に封入されるか、食物中に組み込まれる、カチオン性リポソーム、蝸牛状物（cochleate）およびマイクロカプセルが含まれる。
【０１１４】
遺伝子治療ベクターの投与のための別の製剤には、リポソームが含まれる。リポソームカプセル化は、ポリヌクレオチドおよび発現ベクターの投与のための別の製剤を提供する。リポソームは、水性コンパートメントを取り囲む１つまたは複数の脂質二重層からなる、微細な小胞である。一般には、Bakker-Woudenbergら、1993 Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.12, 補遺1, S61およびKim, 1993 Drugs 46,618を参照のこと。リポソームは、組成が細胞膜と類似であり、そのため、リポソームは安全に投与することができ、かつ生体分解性である。調製方法に依存して、リポソームは単層または多層であり得、リポソームは、０．０２μＭから１０μＭを超えるまでの範囲の直径でサイズが変動し得る。例えば、Machyら、 1987 LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY AND PHARMACOLOGY(John Libbey)およびOstroら、  1989 American J. Hosp. Phann. 46,1576を参照のこと。
【０１１５】
発現ベクターは、標準的な技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。種々の異なるリポソーム組成物および合成方法が、当業者に公知である。例えば、米国特許第４８４４９０４号、米国特許第５０００９５９号、米国特許第４８６３７４０号、米国特許第５５８９４６６号、米国特許第５５８０８５９号および米国特許第４９７５２８２号（これら全てが、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１１６】
一般に、投与されたリポソームカプセル化ベクターの投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身的な医学的状態および過去の病歴のような因子に依存して変動する。特定の製剤についての用量範囲は、適切な動物モデルを使用することによって決定され得る。
【０１１７】
一実施形態において、このベクターは、コアと、さらに、１つまたは複数の抗原および必要に応じてかつ好ましくは免疫賦活性を有するタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする。Ｃ３ｄは、強力な免疫賦活性を有することが公知であり、インターロイキン、特にＩＬ−２またはＩＬ−１２と同様に、この目的のために使用され得る。
【０１１８】
細胞培養
本発明に従う融合タンパク質をコードするプラスミドは、従来の形質転換技術を使用して宿主細胞へと導入され得、これらの細胞は、融合タンパク質の産生を促進する条件下で培養され得る。誘導性プロモーターが使用される場合、タンパク質の回収を最大化するために、これらの細胞は、誘導因子の不在下で最初に培養され得、次いで、この誘導因子が一旦添加されると、より高い密度で細胞が増殖し得る。
【０１１９】
細胞培養条件は、当該分野で広く知られており、それ自体公知の手順に従って使用され得る。
【０１２０】
培養物からのタンパク質の回収
一旦細胞を増殖してタンパク質の産生が可能になると、このタンパク質は細胞から回収され得る。本発明者らは、驚きべきことに、このタンパク質が可溶性のままであることを見出したため、これらの細胞は通常、遠心してから超音波処理によって溶解させるが、この処理で、タンパク質画分は可溶性のまま維持され、さらに高速（例えば、１５，０００ｒｐｍで１時間）の遠心分離の後に上清中にこの画分が残るようになる。
【０１２１】
上清タンパク質画分中の融合タンパク質は、標準的なタンパク質クロマトグラフィー技術の任意の適切な組み合わせによって、さらに精製してもよい。本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィーを使用し、その後ゲル濾過クロマトグラフィーを使用した。他のクロマトグラフィー技術（例えば、アフィニティクロマトグラフィー）もまた使用できる。
【０１２２】
一実施形態において、本発明者らは、溶解物の遠心分離後または任意の他の精製ステップ後のいずれかで上清サンプルを加熱することが、タンパク質の回収を助けることを見出した。このサンプルは、約１０〜約３０分の期間にわたって、約７０〜８０℃まで加熱すればよい。
【０１２３】
タンパク質の意図された使用に依存して、このタンパク質は、さらなる精製ステップ（例えば、透析）または濃縮ステップ（例えば、凍結乾燥）に供してもよい。
【０１２４】
以下の実施例によって本発明を説明する。
【実施例１】
【０１２５】
ｄｂ−Ｃ４ｂｐの産生
ベクター構築物
ヒトＣ４ｂｐα鎖のＮ末端〜５７アミノ酸の「コア」ドメインに融合された下流ボックスペプチド配列 ＭＡＳＭＮＨＫＧＳ (Sprengert M. L. , Fuchs E.およびPorter A. G 1996「The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli」、EMBO J. 第15巻,665-674)をコードする発現ベクターを構築した。
【０１２６】
簡潔に述べると、このＣ４ｂｐコアドメインは、ヒトゲノム中の単一エキソン内に完全にコードされるため、これをヒトゲノムＤＮＡから直接増幅することが可能である。使用したオリゴヌクレオチドプライマーは以下である：
AVD102:5'CCCGCGGATCCGAGACCCCCGAAGGCTGTGA3'；および
AVD103:5'CCCCGGAATTCTTATTATAGTTCTTTATCCAAAGTGG3'。
【０１２７】
これらは、増幅されたＤＮＡフラグメントをクローニングするために使用する、付加された制限部位を含んでいた。酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてＰＣＲ産物を消化する際に得られる１８３塩基対のフラグメントを、プラスミドベクター中の翻訳エンハンサーまたは「下流ボックス」およびＴ７プロモーターの下流にクローニングした。このプラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給されるプラスミドｐＲｓｅｔＡから誘導したが、ｆ１複製起点は、プラスミドｐＳＣ１０１由来のｐａｒ遺伝子座によって置換されている。すなわちこのプラスミドは、機能的エレメントとして以下を含む：選択マーカー（アンピシリン耐性）、複製起点（ｐＵＣファミリー由来）、およびＴ７プロモーターおよびＴ７転写ターミネーター、ならびにｐａｒ遺伝子座。得られた構築物を、プラスミドｐＡＶＤ  ７７と命名した。図８に、Ｃ４ｂｐのコード配列（小文字）に融合された翻訳エンハンサーおよびＴ７プロモーターの配列を示す。
【０１２８】
ｄｂ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質の予測されたサイズは、７４９１．５Ｄａである。
【０１２９】
形質転換および発現
このベクターを、大腸菌株Ｃ４１（ＤＥ３）（ＢＬ２１（ＤＥ３）の誘導体； Bruno MirouxおよびJohn E. Walker 1996「Over-production of Proteins in Escherichia coli: Mutant Hosts that Allow Synthesis of some Membrane Proteins and Globular Proteins at High Levels」、Journal of Molecular Biology 第260巻,289-298)中に形質転換した。
【０１３０】
１リットルのＬＢ−アンピシリン培地にこれらの細胞を接種し、これを３時間にわたって攪拌しながら３７℃でインキュベートし（ＯＤ６００ｎｍが０．６に達するまで）、次いで最終濃度０．７ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて３時間にわたって誘導した。この細胞を、４６００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって回収した。
【０１３１】
ペレット（Ｐ）を、３０ｍｌのトリス５０ｍＭ（ｐＨ７）で再懸濁し、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ装置を使用して２回超音波処理することによってこれらの細胞を破壊した（各処理と処理の間に、１５０００ｒｐｍで１時間にわたり遠心分離し、各遠心からの上清（それぞれ、ＳＮ１およびＳＮ２と命名した）を保存し、ペレットＰ１を同じ緩衝液で再懸濁した）。
【０１３２】
両方の上清をプールし（６０ｍｌ）、３０ｍｌの２つの溶液へと分けた。これらのｄｂ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質の３０ｍｌアリコートの各々を、２つの類似の方法のうち１つを使用して精製した。それらの方法は、一方の方法における加熱ステップが、他方の方法においてはＭｏｎｏＱイオン交換ステップで置換されること以外は同一であった。
【０１３３】
加熱ステップを行わない精製
天然型のｄｂ−Ｃ４ｂｐを、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ７０、高さ１３ｃｍかつ直径２．６ｃｍのカラムを使用）によって、トリス-ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ  ｐＨ７）および塩勾配（０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ）を使用して、５００ｍｌの培養物から精製した。融合タンパク質は３００〜４００ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。各７．５ｍｌの画分を収集した。図２を参照のこと。
【０１３４】
画分Ｂ８〜Ｂ１１をプールし、トリス-ＨＣｌ  ２０ｍＭ  ｐＨ７に対して透析した。次いで、トリス緩衝液（５０ｍＭ  ｐＨ７）および塩勾配（０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ）を使用して、この溶液をイオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １６／１０）に載せた。２．５ｍｌの画分を収集した。融合タンパク質は、５００〜５５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させた（図３）。
【０１３５】
画分Ａ１０〜Ｂ１をプールし、次いで、最終溶液を１０ｍｌの体積まで濃縮した後、ゲル濾過カラム（Ｓ７５  ２６／６０）上でのクロマトグラフィーにかけた。５ｍｌの画分を収集した。融合タンパク質を、１３９ｍｌの体積の緩衝液（トリス-ＨＣｌ  １００ｍＭ  ｐＨ７、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いてこのカラムから溶出させた。図４を参照のこと。分子量標準品を用いたカラムの較正から、このタンパク質の分子量がアルブミン（６７ｋＤａ）（これもまた、トリス５０ｍＭ＋ＮａＣｌ  １５０ｍＭ中に、体積１３９ｍｌで溶出する）と類似することが示唆され、一方、この単量体の予想分子量は７．４９１ｋＤａである。このことは、大腸菌の細胞質ゾルから、この融合タンパク質をリフォールディングするための任意のステップを行わずに精製した場合、この融合タンパク質はオリゴマー構造をとることを示している。
【０１３６】
画分Ａ１０〜Ｂ１をプールし（３１２μｇ／ｍｌ）、アリコートをリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）に対して透析した。
【０１３７】
精製後の培養物１リットル当たりのタンパク質収量は、１２．４ミリグラムであった。
【０１３８】
ＣＤスペクトルを調べ、正しくフォールディングされたタンパク質複合体と一致する、有意な二次構造の存在を示した。
【実施例２】
【０１３９】
加熱ステップを伴うｄｂ−Ｃ４ｂｐの精製
ｄｂ−Ｃ４ｂｐの他方の３０ｍｌのアリコートを含む溶液を７６℃で１５分間加熱し、次いで２０，５００ｒｐｍで１時間遠心分離した。ｄｂ−Ｃ４ｂｐを含む上清を、トリス緩衝液（５０ｍＭ  ｐＨ７）および塩勾配（０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ）を使用して、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ７０ｍｌ）によって精製した。７．５ｍｌの画分を収集した。融合タンパク質を、３００〜４００ｍＭのＮａＣｌで溶出させた（図５）。
【０１４０】
画分Ｂ８〜Ｂ１１をプールし、次いで、最終溶液を１０ｍｌの体積まで濃縮した後で、ゲル濾過カラム（Ｓ−７５  ２６／６０）上でのクロマトグラフィーにかけた。５ｍｌの画分を収集した。融合タンパク質は、体積１４０ｍｌの緩衝液を用いてこのカラムから溶出させた（図６）。分子量標準品を用いたカラムの較正から、加熱することなく精製したタンパク質の分子量と同一の分子量が示唆されるが（上記を参照のこと）、一方、この単量体の予想分子量は７．４９１ｋＤａである。したがって、大腸菌の細胞質ゾルから、この融合タンパク質をリフォールディングするための任意のステップを行わずに精製した場合、この融合タンパク質もまたオリゴマー構造をとる。さらに、この融合タンパク質は、５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ  ｐＨ７を含む（すなわち、塩が存在しない）緩衝液中で７６℃で１５分間加熱されるにもかかわらず、オリゴマーのままである。
【０１４１】
画分Ａ１１〜Ｂ１をプールし（５９５．５μｇ／ｍｌ）、アリコートをリン酸ナトリウム（ＮａＰ）緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）に対して透析した。
【０１４２】
円二色性を用いた分析は、加熱ステップに供されたサンプルを用いて得られたスペクトルが、非加熱のサンプルを用いて得られたスペクトルと同等であることを示した。このことは、タンパク質の二次構造要素が、加熱ステップにもかかわらず保持されていることを実証した。
【０１４３】
加熱ステップを用いた場合の収率は、１リットル当たり３．５ミリグラムであった。
【０１４４】
加熱ステップの付加は、タンパク質の精製を大幅に簡素化し得る。本明細書中の実施例では、加熱ステップにより１回のイオン交換（ＭｏｎｏＱ）ステップを置換したが、それにもかかわらず、少なくとも同等な純度のタンパク質を生じた。
【実施例３】
【０１４５】
変性剤を用いたタンパク質の処理
このタンパク質が実際にオリゴマーであることをさらに確認するために、変性条件下でゲル濾過を繰り返す前に、６Ｍの塩化グアニジンおよび２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）中で、室温にて、精製したタンパク質を変性させる試みを行った。
【０１４６】
簡潔に述べると、実施例１の細胞培養物５００ｍｌを、上記のように増殖させ、誘導した。融合タンパク質を、トリス-ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ  ｐＨ７．４）および塩勾配（０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ）を使用して、イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。融合タンパク質を、４５０〜６５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し、次いで１０ｍｌの体積まで濃縮した。この濃縮ステップの後、ｄｂ−Ｃ４ｂｐタンパク質の濃度は、１ｍｌ当たり７４０マイクログラムであった。
【０１４７】
次いで、このタンパク質を、１ｍｌ当たり７４０マイクログラムの濃度で、４℃にて一晩、６Ｍの塩化グアニジンおよび２０ｍＭ  ＤＴＴで処理した後、ゲル濾過カラム（Ｓ−７５）上でのクロマトグラフィーにかけた。融合タンパク質は、体積１１．４ｍｌの緩衝液でこのカラムから溶出させた。分子量標準品を用いたカラムの較正により、このタンパク質の分子量が約６０ｋＤａであることが示唆され、一方、この単量体の予想分子量は７．５ｋＤａである。したがって、この融合タンパク質は、この融合タンパク質をリフォールディングするための任意のステップを行わなくても、そして変性条件で処理される場合でさえ、大腸菌の細胞質ゾルから精製した場合にオリゴマー構造をとる。
【０１４８】
ＣＤ分析によって明らかなように、２時間または１６時間にわたって６Ｍグアニジン-ＨＣｌを用い７５〜８０℃に加熱する変性ステップを繰り返すことにより、変性タンパク質が生じた。
【実施例４】
【０１４９】
ヒスチジンタグ配列に融合したヒトＣ４ｂｐコアの、大腸菌中でのクローニングおよび組換え発現
翻訳エンハンサーが大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるコアドメインの高レベル発現のために必須ではないことを実証し、かつこのタンパク質の精製を容易にするために、下流ボックスをコードするＤＮＡ配列を、ｐＡＶＤ  ７７中のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを以下の配列：
CATATGCGGG GTTCTCATCA TCATCATCAT CATGGTCTGG TTCCGCGTGG ATCC
で置き換えることによって、６×ヒスチジンタグをコードする配列で置換した。
【０１５０】
得られたプラスミドｐＡＶＤ  ９３は、以下のアミノ酸配列：
MRGSHHHHHH GLVPRGSETP EGCEQVLTGK RLMQCLPNPE DVKMALEVYK LSLEIEQLEL QRDSARQSTL DKEL
を有する８．４６ｋＤａの組換えタンパク質を過剰産生する。
【０１５１】
プラスミドｐＡＶＤ  ９３を、細菌株Ｃ４１（ＤＥ３）中に形質転換し、この融合タンパク質の発現を、上記のようにしてＩＰＴＧを使用して誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示されるような８．５ｋＤａのタンパク質は、誘導の３時間後に、誘導した培養物中には存在したが、誘導しなかった培養物には存在しなかった。
【実施例５】
【０１５２】
ＤｓｂＡタンパク質に融合したヒトＣ４ｂｐコアの、大腸菌におけるクローニングおよび組換え発現
下流ボックスエンハンサーによってコードされる短いペプチド配列またはヒスチジンタグへのＣ４ｂｐコアドメインの融合は、このコアドメインがより長いタンパク質に融合することが可能であることを必ずしも示唆しない。このことを確認するために、Ｃ４ｂｐコアを、ＤｓｂＡタンパク質（大腸菌の周辺腔において通常見出される酵素）のＣ末端に融合させた。ＤｓｂＡは１７７アミノ酸を含み、それ自体が、コアドメイン自体（５７アミノ酸）よりも実質的に大きい。
【０１５３】
ＤｓｂＡ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質をコードするプラスミドｐＡＶＤ  ７８の構築
下流ボックスエンハンサーをコードする、ｐＡＶＤ  ７７中のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントを、ＤｓｂＡをコードするＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントによって置き換えた。ＤｓｂＡをコードするフラグメントを得るために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは、以下のものであった：
AVD52:5'GGGGCCCCCATATGGCGCAGTATGAAGATGGTAAACAG3'；および
AVD115:5'GGGGAATTCTTAGGATCCAGAACCTTTTTTCTCGGACAGATATTTCAC3'。これらのプライマーを使用して、大腸菌のゲノムＤＮＡから、（終止コドンを欠く）ＤｓｂＡコード配列を増幅した。このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの両方の制限酵素で消化し、ｐＡＶＤ  ７７中にクローニングして、ｐＡＶＤ  ７８を作製した。
【０１５４】
このプラスミドｐＡＶＤ  ７７を、細菌株Ｃ４１（ＤＥ３）中に形質転換し、この融合タンパク質の発現を、上記のようにしてＩＰＴＧを使用して誘導した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示されるような２８ｋＤａのタンパク質は、誘導の３時間後に、誘導した培養物中には存在したが、誘導していない培養物では存在しなかった。驚くべきことに、このタンパク質は、細胞抽出物の可溶性画分中に存在した。
【０１５５】
ＤｓｂＡ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質の精製
この融合タンパク質を、各々の場合にトリス-ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ  ｐＨ７．４）および塩勾配（０Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ）を使用した２回のイオン交換クロマトグラフィーのステップ（１回目はＤＥＡＥ、２回目はＭｏｎｏＱ）によって精製した。融合タンパク質は、１回目の（ＤＥＡＥ）イオン交換クロマトグラフィー後に約１００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出し、次いでより分解能の高い（ＭｏｎｏＱ）イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。この融合タンパク質を、ＭｏｎｏＱから３５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出し、濃縮した後、Ｓ２００ゲル濾過カラム（１０／３０）上でのクロマトグラフィーにかけた。融合タンパク質は、このカラムから１２．５４ｍｌの体積の緩衝液中に溶出した。
【０１５６】
分子量標準品を用いたカラムの較正により、このタンパク質の分子量は約２００ｋＤａであることが示唆される。この単量体の予想分子量は２８．０８ｋＤａである。したがって、この融合タンパク質もまた、この融合タンパク質をリフォールディングするための任意のステップを行わずに大腸菌の細胞質ゾルから精製した場合、オリゴマー構造をとる。
【０１５７】
ゲル濾過での融合タンパク質の挙動が異常なのではなく、この融合タンパク質が実際にオリゴマーであることを確認するために、精製したタンパク質を、６Ｍの塩化グアニジンおよび２０ｍＭ  ＤＴＴ中で（室温で２時間３０分間にわたって）変性させ、変性条件下（これは、６Ｍの塩化グアニジンおよび２０ｍＭ  ＤＴＴの存在下である）でゲル濾過を繰り返した。
【０１５８】
このような状況下で、１２．５ｍｌの体積で溶出したタンパク質は、約２２０ｋＤａの分子量と一致する。したがって、この融合タンパク質は、これらの条件下で変性せず、すなわちこのタンパク質はなおオリゴマーである。
【０１５９】
このタンパク質の完全な変性は、上記の実施例３（この場合、完全な変性を得るために７５〜８０℃への加熱が必要とされた）とは対照的に、４℃で１６時間にわたるグアニジンＨＣｌでの処理後に得られた。
【０１６０】
ＤｓｂＡ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質の活性
ＤｓｂＡ−Ｃ４ｂｐの活性を試験するために、インスリンアッセイを実施した。ＤＴＴの存在下で、活性なＤｓｂＡはインスリンのジスルフィド結合の還元を触媒するが、これは、その２つの鎖の分離を可能にし、したがって、遊離のインスリンＢ鎖の沈殿を引き起こす。したがって、比濁法が、インスリンのジスルフィド結合の還元を検出するために使用される(Holmgren A (1979) Thioredoxin catalyses the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J.Biol. Chem. 254,9627)。
【０１６１】
最終反応混合物は、０．１４ｍＭの新たに調製したインスリン、０．１Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．６７ｍＭ  ＤＴＴ、ならびに１００μｇのＤｓｂＡまたは１００μｇのＤｓｂＡ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質を１．２ｍｌの最終体積中に含む。
【０１６２】
この反応を、８μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴの添加によって開始させ、５分毎に６０分まで、６５０ｎｍで濁度の増大を測定することによってモニタリングした。各サンプルを３〜４回穏やかに混合した後、６５０ｎｍで吸光度を測定した。反応の装置ブランクは、０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．０および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ。
【０１６３】
結果を図７に示すが、これにより、ＤｓｂＡ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質中に存在するＤｓｂＡがなお活性であり、この活性が可溶性ＤｓｂＡの活性に直接相当しうることが実証される。
【実施例６】
【０１６４】
非還元条件下でのＣ４ｂｐ融合タンパク質の分析
変性条件下ではあるが非還元条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によるｄｂ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質の分析を実施して、オリゴマーの単量体間のジスルフィド結合の存在の有無を判定した。
【０１６５】
ｄｂ−Ｃ４ｂｐ（３１２μｇ／ｍｌ）のアリコート（１２μｌ）を、β−メルカプトエタノールを含むかまたは含まない、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（トリス-ＨＣ１  １．５Ｍ（ｐＨ６．８）、ＳＤＳ２％、グリセロール１５％、０．０２％ブロモフェノールブルー）と混合した。これらのサンプルを、９０℃で５分間煮沸し、同様にβ−メルカプトエタノールを含まない１８％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析した。
【０１６６】
この結果は、β−メルカプトエタノールの不在下で、ｄｂ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質が、オリゴマーとして移動した（ゲルの上部、図９の右側）というものであり、このことは、ジスルフィド結合が単量体間に存在することを示す。対照的に、β−メルカプトエタノールの添加は、上述の図および図９の左側（精製の際に還元されたｄｂ−Ｃ４ｂｐサンプルを示す）に示されるように、その単量体の分子量でのｄｂ−Ｃ４ｂｐタンパク質の移動をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】様々な生物種由来のＣ４ｂｐ配列のアラインメントを示す図である。
【図２】イオン交換カラムからの、融合タンパク質ｄｂ−Ｃ４ｂｐ（ｄｂは、実施例１に記載されるペプチドである）の精製を示す図である。
【図３】第２のイオン交換カラムでのｄｂ−Ｃ４ｂｐのさらなる精製を示す図である。
【図４】ゲルクロマトグラフィーカラムでのｄｂ−Ｃ４ｂｐの精製を示す図である。
【図５】加熱ステップに続くイオン交換カラムでのｄｂ−Ｃ４ｂｐの精製を示す図である。
【図６】ゲルクロマトグラフィーカラムでのｄｂ−Ｃ４ｂｐのさらなる精製を示す図である。
【図７】インスリンアッセイにおけるＤｓｂＡ−Ｃ４ｂｐの活性を示す図である。
【図８】ｐＡＶＤ７７中のプロモーターおよびＣ４ｂｐコード領域の配列を示す図である。
【図９】非還元条件下でのＣ４ｂｐ融合タンパク質の分析を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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