(57)【要約】本発明は、成体の多分化能のヒト幹細胞であって、これらは：  i）有意なテロメラーゼ活性、  ii）HLAクラスI陰性の表現型、  iii）正常な核型、  iv）静止状態になる能力、  v）少なくとも130回の集団倍加の間保存される自己複製のための能力、を有することを特徴とするヒト幹細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成体の多分化能のヒト幹細胞であって：
i）有意なテロメラーゼ活性、
ii）HLAクラスI陰性の表現型、
iii）正常な核型、
iv）静止状態になる能力、
v）少なくとも130回の集団倍加の間保存される自己複製の能力、
を有することを特徴とするヒト幹細胞。
【請求項２】
少なくとも200回の集団倍加の間保存される自己複製能を有することを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】
ヒト脂肪組織から単離することができることを特徴とする、請求項１または請求項2に記載の幹細胞。
【請求項４】
内胚葉、外胚葉、または中胚葉起源の細胞に分化することができることを特徴とする、前述の請求項のいずれか1項に記載の幹細胞。
【請求項５】
脂肪細胞、骨芽細胞、筋細胞、軟骨細胞、または内皮細胞に分化することができることを特徴とする、請求項4に記載の幹細胞。
【請求項６】
参照株化細胞のテロメラーゼ活性の少なくとも20%に対応するテロメラーゼ活性を有することを特徴とする、前述の請求項のいずれか1項に記載の幹細胞。
【請求項７】
転写因子Oct-4および／またはRex-1を発現することを特徴とする、前述の請求項のいずれか1項に記載の幹細胞。
【請求項８】
少なくとも１つの導入遺伝子を発現することができることを特徴とする、前述の請求項のいずれか1項に記載の幹細胞。
【請求項９】
請求項1または51〜54のいずれか1項に記載の複数の細胞を含む細胞集団であって、脂肪細胞、線維芽細胞、前脂肪細胞、内皮細胞、周皮細胞、肥満細胞、および平滑筋細胞がないことを特徴とする細胞集団。
【請求項１０】
クローンであることを特徴とする、請求項９に記載の細胞集団。
【請求項１１】
約60回の集団倍加後に静止状態になることを特徴とする、請求項9または請求項10のいずれか1項に記載の細胞集団。
【請求項１２】
塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、PDGF、EGF、NGF、SCFなどの成長因子の存在下において増殖することができることを特徴とする、請求項11に記載の細胞集団。
【請求項１３】
以下の工程を含む多分化能のヒト幹細胞を得るための方法：
−ヒト組織試料、特にヒト脂肪組織に由来する細胞を培養することと、
−「CA」集団および「CS」集団と名付けた2つの細胞亜集団であって、前記「CA」集団は12時間未満の接着速度を有し、前記「CS」集団は12時間以上の接着速度を有する2つの細胞亜集団を選択することと、
−静止細胞集団が得られるまで前記「CA」集団を濃縮することと、
−前記「CA」集団の幹細胞の増殖を誘導すること。
【請求項１４】
以下の工程を含む請求項13に記載の方法：
a）脂肪組織試料の酵素消化；
b）脂肪細胞を除く（a）において得られた標品に存在する細胞タイプの全てを含む脂肪細胞のない細胞分画を回収することと；
c）工程（b）で得られた前記細胞分画のインビトロ培養を少なくとも12時間行うことと；
d）2つの細胞亜集団「CA」および「CS」を選択することと；
e）静止状態に入ることができる細胞集団が得られるまで集団「CA」を濃縮することと、
f）選択的に、集団「CA」の幹細胞の増殖を誘導すること。
【請求項１５】
脂肪組織試料が10歳以下の健常な子供に由来することを特徴とする、請求項13または請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
脂肪組織試料が、たとえば臍領域に、または恥骨領域に、または鼠径領域に、または会陰領域に、または腹部領域に、または皮下領域に由来する延髄外の組織の試料であることを特徴とする、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（f）において誘導される増殖が、成長因子を加えることによって誘導される集中的な（intensive）増殖であることを特徴とする、請求項13または請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
工程（a）の酵素消化が、前記脂肪組織試料をコラゲナーゼ標品と最大10分間接触した状態にすることによって行われることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
前記脂肪細胞のない細胞分画が、脂肪細胞排除工程を行うことによって、たとえば遠心分離によって得られることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項２０】
工程（c）で培養される前記細胞分画が、培養する前にいずれの濾過工程も受けていないことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項２１】
培養工程（c）が、その他の成長因子のを添加することなくウシ胎仔血清を補った培地中で行われることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項２２】
培養工程（e）の間に、前記細胞が80%のコンフルエンスに達したときに細胞導入が行われ、導入は、約1000〜3500細胞／cm2の接種密度で行われることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項２３】
前記「CA」集団が、約60回の集団倍加後に静止状態になることを特徴とする、請求項13または請求項14に記載の方法。
【請求項２４】
工程（f）の間に使用される成長因子が、bFGF、PDGF、EGF、NGF、およびSCFから選択されることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
【請求項２５】
請求項13〜24のいずれか1項に記載の方法を行うことによって得られる幹細胞。
【請求項２６】
治療に使用するための、請求項1〜12または25のいずれか1項に記載の幹細胞。
【請求項２７】
前記治療が、個々に細胞を移植し、続いてインビボで細胞分化および組織再生することを含むことを特徴とする、請求項26に記載の幹細胞。
【請求項２８】
移植が同種間であることを特徴とする、請求項26に記載の幹細胞。
【請求項２９】
インビボでの組織再生のための治療的な製品を製造するための、請求項1〜8または25のいずれか1項に記載の細胞または請求項9〜12のいずれか1項に記載の細胞集団の使用。
【請求項３０】
前記組織が骨組織であることを特徴とする、請求項29に記載の使用。
【請求項３１】
前記組織が脂肪組織であることを特徴とする、請求項29に記載の使用。
【請求項３２】
前記組織が筋肉または内皮組織であることを特徴とする、請求項29に記載の使用。
【請求項３３】
請求項1〜13または25のいずれか1項に記載の幹細胞が、分化培地の存在下においてコンフルエンスから培養されることを特徴とする、前記中胚葉系統の分化細胞を作製するための方法。
【請求項３４】
前記幹細胞が、約10000〜25000細胞／cm2の密度で播種されることを特徴とする、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記培地が、脂肪細胞へ分化させることができることを特徴とする、請求項33または請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記培地が、骨芽細胞へ分化させることができる培地であることを特徴とする、請求項33または請求項34に記載の方法。
【請求項３７】
前記培地が、筋細胞または血管形成へ分化させることができることを特徴とする、請求項33または請求項34に記載の方法。
【請求項３８】
前記中胚葉系統の細胞への細胞の分化を調整することができる薬剤を同定するためのスクリーニング方法であって：
a）請求項1〜13または25のいずれか1項に記載の幹細胞を、これらが前記中胚葉系統の細胞へ分化できる条件下で、前記候補薬剤の存在下において培養することと；
b）前記候補薬剤の存在下における細胞の分化を、前記候補薬剤の非存在下における分化と比較することと、
によって特徴付けられる方法。
【請求項３９】
前記培養条件が脂肪細胞に分化できることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
培前記養条件が骨芽細胞に分化をできることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
前記培養条件が筋細胞に分化をできることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
【請求項４２】
前記分化を調整することができる薬剤が抗分化物質であることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
【請求項４３】
脂肪分解活性を有するであろう薬剤を同定するためのスクリーニング方法であって：
a）これらが脂肪細胞に分化をできる条件下で、請求項1〜13または25のいずれか1項に記載の幹細胞を培養することと、
b）こうして得られた前記脂肪細胞を候補薬剤と接触する状態にすることと、
c）前記候補薬剤の脂肪分解活性を評価することと、
によって特徴付けられる方法。
【請求項４４】
抗脂肪分解活性を有するであろう薬剤を同定するためのスクリーニング方法であって：
a）これらが脂肪細胞に分化をできる条件下で、請求項1〜13または25のいずれか1項に記載の幹細胞を培養することと、
b）こうして得られた脂肪細胞を、脂肪分解性の薬剤の存在下において候補薬剤と接触する状態にすることと、
c）前記候補薬剤の抗脂肪分解活性を評価することと、
によって特徴付けられる方法。
【請求項４５】
インスリン増感作用活性を有するであろう薬剤を同定するためのスクリーニング方法であって：
a）これらが脂肪細胞に分化をできる条件下で、請求項1〜13または25のいずれか1項に記載の幹細胞を培養することと、
b）得られた前記脂肪細胞を候補薬剤と接触する状態にすることと、
c）前記候補薬剤のインスリン増感作用活性を評価することと、
によって特徴付けられる方法。
【請求項４６】
化粧品における請求項1〜13または25のいずれか1項に記載の幹細胞の使用。
【請求項４７】
請求項1〜13または25のいずれか1項に記載の複数の幹細胞を、賦形剤、媒体、溶媒、着色材、香料、抗生物質、または美容製品において許容されるその他の添加物と共に含む化粧品組成物。
【請求項４８】
請求項1〜13または25のいずれか1項に記載の複数の幹細胞を、生理的に許容される賦形剤と共に含む薬学的組成物。
【請求項４９】
「CS」細胞と名付けられた成体の多分化能のヒト細胞であって、
i）これは、HLAクラスI陰性の表現型を有すること、
ii）これは、正常な核型を有すること、
iii）これは、約40〜60回の集団倍加の間保存される自己複製能力を有すること、
iv）これは、静止状態になることができないこと、
v）その増殖速度は、LIFによる影響を受けないこと、
を特徴とする細胞。
【請求項５０】
請求項49に記載の複数の細胞を含む「CS」集団と名付けられた多分化能のヒト細胞集団。
【請求項５１】
以下の表現型を有することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の幹細胞：
HLAクラスI陰性；
HLAクラスII陰性；
CD3陰性；
CD13陽性。
【請求項５２】
10%のウシ胎仔血清の存在下においてCD13陽性の表現型を有することを特徴とする、請求項1〜8または51いずれか1項に記載の幹細胞。
【請求項５３】
成体の多分化能のヒト幹細胞であって、静止状態に達した後に、インビトロで安定に以下の表現型を示すことと：
HLAクラスI陰性、
HLAクラスII陰性、
CD3陰性、
CD13陽性、
LIF-R陰性、
Oct-4陽性、
Rex-1陽性、
ABCG2陽性、
および正常な核型および有意なテロメラーゼ活性を有することと、
を特徴とする細胞。
【請求項５４】
インビボにおける免疫特権的な挙動および未分化な状態に移行する能力を有することを特徴とする、請求項53に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト脂肪組織から単離することができる多分化能のヒト幹細胞に、および治療および美容学における前記細胞の使用に関する。また、本発明は、前記幹細胞を成体ヒト脂肪組織から単離するための方法に、およびこれらを内胚葉、または外胚葉、または中胚葉起源の細胞に分化させるための方法に関する。最後に、本発明は、細胞分化に対して、または分化した細胞の機能に対して効果を及ぼすことができる薬剤を同定するためのスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体に多分化能の「幹」細胞が存在することは、多くの組織、例えば骨髄、血液、肝臓、筋肉、神経系において、および脂肪組織において証明されていた。理論的には無限の自己複製ができる成体「幹」細胞は、大きな細胞可塑性、すなわちこれらが予定されると考えられていたもの以外の組織に分化する能力を有する。胚幹細胞（ES）と同様である前記細胞により、特にこれらの使用では、ES細胞で遭遇される適合性および倫理の問題をもたらさないので、かなりの治療的な展望が開ける。
【０００３】
残念なことに、これらの医療適用（移植）は、現在、2つの主な理由のために極めて制限されている：
-第1に、前記細胞を単離することは、非常に困難である。実際、幹細胞は、生物体中で非常にまれであり、現在これらについてほとんど何も知られておらず、特に分子レベルでは、直接精製することは不可能である。生体染色を排除する能力に基づいて多分化能の細胞（「副次的な集団（side population）」の「SP」として既知の集団）を濃縮する方法がある（Goodell MAら、（1996）, J Exp Med, vol 83, 1797-1806； Zhou Sら、（2001） Nature Medecine, vol 7, 1028-1034）。その他の方法では、細胞マーカーの有無に基づいたポジティブまたはネガティブ選択を含む。一例として、国際特許出願国際公開公報第01/11011号には、CD45+グリコホリンA+細胞の骨髄細胞の枯渇に続いて、成長因子の存在下においてCD45-/GlyA-細胞を培養することが記載されている。同様の方法が、Reyesら（Blood, November 2001, vol. 98, n° 9, 2615-2625）によって記載されている。
【０００４】
-第2に、未分化な状態の前記細胞のインビトロにおける従来の増幅は、重大な問題をもたらす。
【０００５】
多くの研究者は、多数の組織において多分化能のヒト細胞が存在することをうまく証明したが、これらの細胞をインビトロにおいて50〜80回の集団倍加を越えて未分化な状態に維持することはだれもできなかった。自己複製能力は、二重に重要な指標であり：第1に、成体組織には非常に限られた数の幹細胞しか天然に存在しないので、これらがインビトロで増加することができ、一方でこれらの本来の特徴を維持できる場合にのみ、治療的に使用するために十分な幹細胞の量を得ることができる。第2に、自己複製能力は、真の幹細胞（それは、不死である）のまさしくその定義に密接に関連があり、したがって細胞可塑性の延長と間接的に相関し得る。したがって、100回以上の集団倍加が保存される自己複製能力を有する多分化能の細胞を単離できることが、非常にに望ましい。
【０００６】
国際特許出願国際公開公報第01/11011号（Furcht、VerfaillieおよびReyes）は、骨髄から単離されたヒトの多分化能細胞を記載する。前記細胞は、通常の核型、HLAクラスI陰性の表現型を有し、40回の集団倍加までインビトロにおける培養で維持することができる。しかし、いくつかのまれな細胞は、70回の集団倍加に達することができる。著者は、これらの細胞が中胚葉系統の細胞に、たとえば骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞、および筋細胞に、更に外胚葉系統および内胚葉系統の細胞に分化することができることを示す。しかし、前記細胞は、限られた数の分裂ができるだけであり、したがって、著者は、大量の細胞を生じさせるためには、テロメラーゼをコードする異種遺伝子が導入されるべきであることを提案する。異種遺伝子は、移植に使用する前に切除されなければならない。しかし、この可逆的な不死化技術は、非常に議論の余地が残ったままとなっている。事実、外因性のテロメラーゼ活性が非生理的および細胞によって制御されない発現レベルで導入されると、細胞が悪性化する危険度がある（Wong Jingら、Nature, 405, June 2000, 755-756）。また、同様の研究が、Reyesら（Blood, November 2001, vol. 98, n° 9, 2615-2625）によっても記載されている。
【０００７】
Jiangら（Nature, Advance Online Publication 20 June 2002, doi：10.1098/nature00870）は、100回以上の集団倍加をインビトロ培養で維持することができる多分化能のマウスおよびラット細胞の産生を記載している。著者も、80回以上の集団倍加をインビトロで維持することができるヒト多能集団に言及している。しかし、これらのヒト細胞に関して補足的な情報は、伝えられていない。
【０００８】
Qu-Petersenら（J. Cell Biol. 157, 5, 2002, 851-864）は、筋組織からの多分化能のマウス細胞の産生を報告する。「MDSC」細胞と名付けられた前記細胞（「筋肉由来幹細胞」）は、正常な核型を有し、かつ自己複製能力を有し、一方でこれらの多分化能を約30回の集団倍加の間維持する。これらは、種々の系統から細胞に分化することができる。しかし、多分化能の特徴は、40回以上の集団倍加で消失し、この段階で、細胞は老化して死滅する。この研究は、前記多分化能の細胞が免疫特権的な挙動を示すことを強く示唆する。実際は、MDSC細胞に由来するものとは免疫学的に異なるジストロフィーマウスの筋肉への前記細胞の注射は、シクロスポリン・タイプの免疫抑制物質の非存在下でさえ実質的な筋肉再生を生じる。驚くべきことに、著者は、移植により、移植されたマウスのCD4+およびCD8+リンパ球による組織の浸入を生じないことを観察した。この耐性は、MDSC細胞のMHCクラスI陰性の表現型によって少なくとも部分的に説明される。したがって、本研究は、MDSC細胞が（免疫学的に適合しない）レシーバのTリンパ球によって認識されないことを示し、前記細胞が同種移植に使用することができることを示唆する。本研究では、ヒト細胞に拡張しなかった。
【０００９】
今までに単離された種々の多分化能細胞によって示される限られた自己複製能力を説明するために、2つの仮説を提唱することができる：
-第１に、種々の研究では、真の「幹」細胞で行われておらず、むしろ中間前駆体で行われていたものと思われ得る。この仮説は、幹細胞が可塑性に関して前駆体と容易に混同され得るという事実によっていっそう裏付けられる。さらに、前駆体による培養物の混入は、「幹」細胞と比較してこれらが豊富であることによって促進されるが、これらの寿命は制限される；
-第2に、培養条件が不適当であったので、「幹」細胞を未分化な状態でインビトロに維持することができなかったものと想定することも可能である。
【００１０】
また、現在まで、多分化能の細胞を得るために行われる方法の多くが、細胞供与源として骨髄を使用する点に留意するべきである。しかし、骨髄から細胞を除去することは、患者に対する危険を含み、かつ幹細胞の乏しい供与源であるために、困難な手術である。したがって、これは、大規模な幹細胞の産生にはあまり適していない技術である。
【００１１】
従って、いくつかの研究者のチームは、多分化能の細胞をその他のさらに豊富な組織から単離することができ、患者に対して大きな危険のない方法を開発することを試みた。この見地から、脂肪組織は、経験的に有望な供与源を構成する。しかし、現在までに、多分化能細胞の存在がヒト脂肪組織において証明されているものの、結果はかなり期待外れであった。得られた細胞集団は、たいてい不均一であり、2または3回の集団倍加以上インビトロ培養で維持することができない。さらに、現在までに、研究者は、HLAクラスI陰性の表現型を有する多分化能細胞がヒト脂肪組織から産生されることを報告していない。この特徴は、自己移植術での使用には必要とされず、細胞が、より広範な治療的な使用を、特に同種移植を企図する場合に不可欠になる。たとえば、国際特許出願国際公開第01/62901号（Artecel Sciences Imc）および欧州特許第1077254号（Zen Bio Inc）には、多分化能の特徴を有する間質性細胞集団の、脂肪組織からの産生が記載されている。前記集団は、不均一であり、とりわけ周皮細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞を含む（Ericksonら、Biochem. and Biophys. Res. Com. 290, 763-769, （2002）を参照されたい）。これらの自己複製能力は、極めて制限されており、表面マーカーの発現の解析によって、これらがHLAクラスI陽性であることを確認する。したがって、前記細胞集団の特徴は、治療におけるこれらの使用に適合しない。
【００１２】
また、アメリカ特許の米国特許第2002/0076400号（Katzら）および国際公開第00/53795号（University of Pittsburghおよびthe Regents of the University of Califonia）は、ヒト脂肪組織からの多分化能細胞集団の産生を記載する。前記細胞集団は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および筋細胞に分化させることができる。著者によれば、これらは、これらの多分化能の性質を失うことのなく、少なくとも15回の細胞移入の間インビトロ培養で維持することができる。対応する集団倍加に関しての情報は得られていない。細胞を連続した移動に供する前に、前記集団において不均一なテロメラーゼ活性が発見された。この活性は、連続した移動の後には測定されなかった。表面マーカー分析は、行わなかった。したがって、HLAクラスI抗原の発現は決定しなかった。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、上記で記載されている技術の不利な点を克服する。
【００１４】
本発明者らは、多分化能の「幹」細胞を幼児の脂肪組織から再現的に単離することができ、インビトロで200回以上の集団倍加の間、多量に未分化な状態でこれらを増加させることができる方法を開発した。したがって、これらの治療的な使用が可能になる。その主要な側面において、本発明は、脂肪組織から幹細胞を産生するための方法、更には得られた幹細胞の使用に関する。
【００１５】
本発明の前後関係において、以下の用語の意味は：
自己複製：細胞の最初の特徴を変えることのなく分裂する能力。  
幹細胞：高い自己複製能力を有し、テロメラーゼ活性を有し、かつ静止状態になることができる多分化能の細胞。  
成体幹細胞：たとえば、新生児、子供、または成体に由来する胚幹細胞以外の幹細胞。  
多能または多分化能：少なくとも2つの細胞型に分化することができること。  
静止状態：細胞が非増殖性かつ非老化状態のままである能力。  
を意味する。
【００１６】
より詳しくは、本発明は、成体組織から、特に成体脂肪組織からヒト多能幹細胞を産生するための方法に関する。第1工程において、本方法は、組織試料、好ましくは成体脂肪組織に由来する細胞を培養することを含む。使用することができる組織のその他のタイプは、筋肉、骨髄、肝臓、神経軽を含む。12時間の培養後、培地中の懸濁液において、細胞をこれらの接着速度に応じて2つの亜集団、12時間未満に付着する第1の細胞集団「CA」およびよりゆっくり付着し、かつ12時間の培養後に生じる第2の細胞集団「CS」に分離する。次いで、静止状態になることができる細胞集団が得られるまで、「CA」集団を富ませる。次いで、この段階から、「CA」集団の幹細胞の集中的な増殖を誘導することができる。
【００１７】
本発明の好ましい変形例において、多分化能のヒト幹細胞を産生するための方法は、次の工程を含む：
a）脂肪組織試料の酵素消化；
b）脂肪細胞を除く（a）において得られた標品に存在する細胞タイプの全てを含む脂肪細胞のない細胞分画を回収することと；
c）工程（b）で得られた細胞分画のインビトロ培養を少なくとも12時間行うことと；
d）2つの細胞亜集団「CA」および「CS」を選択することと；
e）静止状態に入ることができる細胞集団が得られるまで集団「CA」を富ませることと、
f）選択的に、集団「CA」の幹細胞の増殖を誘導すること。
【００１８】
図19は、本発明の方法の好ましい変形例の図を示す。
【００１９】
工程（a）：脂肪組織試料の酵素消化：
酵素消化工程は、好ましくは、脂肪組織試料を短期間、すなわち最大で10分、より好ましくは、5〜10分、または5〜8分間コラゲナーゼなどの酵素の標品と接触する状態にすることによって行われる。これにより、組織を完全に解離することができるが、特定の細胞型に対するダメージを回避し、したがって全ての細胞型においてより優れた生存度を生じる。
【００２０】
脂肪組織の性質に関しては、好ましくは健康な個人、好ましくは健康な幼児、好ましくは10歳以下、たとえば2〜3月〜8歳の新生児または子供に由来する。子供は、男性でもまたは女性でもよい。
【００２１】
提供者の年齢は、重要な点であると思われる。実際に、造血「幹」細胞から得られる一定量のデータでは、「幹」細胞は、個々の年齢と共に数が減少するだけでなく、老化現象も受けて機能喪失を生じることも強力に示差している（Geiger HおよびVan Zant （2002）, Nature, vol3, n°4, 329-333）。
【００２２】
このデータが推定されるならば、幼児の脂肪組織は、成人個体の脂肪組織よりも豊富かつ機能的な「幹」細胞の供与源を構成するものと思われる。
【００２３】
脂肪組織試料は、いずれの解剖学的な部位に由来することもできるが、好ましくは、延髄外の起源、特に臍領域から、または恥骨領域から、または鼠径領域から、または会陰領域から、または腹部から、または皮下領域からの組織の試料である。恥骨、プレ恥骨、鼠径領域、臍領域は、特に好ましい。
【００２４】
工程（b）：脂肪細胞のない細胞分画の回収：
次いで、脂肪細胞を除去するために、酵素消化を受けた脂肪組織を処理する。次いで、脂肪細胞を除いて脂肪組織に存在する全ての細胞タイプ（たとえばプレ脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞、周皮細胞、肥満細胞...）を含む脂肪細胞のない細胞分画を回収する。
【００２５】
脂肪細胞は、何らかの適切な手段によって除去することができる。関心対象の細胞の全ては、遠心分離ペレットに見出されるが、脂肪細胞は上清に浮くので、遠心処理は特に有効である。
【００２６】
この工程は、手順において、ろ過を伴わずに行なわれ、脂肪細胞以外の全ての細胞タイプを培養中に保存することができる点に留意することが重要である。脂肪組織から細胞を調製するための従来の技術において、濾過工程は、通常、無駄を除去するために連続してまたはその反対で、著者に応じて遠心する前か後に行う。しかし、この工程は、特定の細胞タイプを損失するリスクがある。
【００２７】
工程（c）：インビトロ培養：
次いで、工程（b）の間に得られた細胞分画を少なくとも12時間、たとえば12〜72時間、好ましくは12〜80時間培養する。
【００２８】
手順におけるこの工程のためには、細胞を1000〜5000細胞／cm2、例えば1000〜3500の細胞／cm2の範囲の密度で接種する。多分化能の細胞は、実際にはその他の細胞型と比較してわずかしか存在せず、したがって、高密度接種により、それぞれのディッシュがこの細胞タイプを確実に含むようにする。
【００２９】
本方法のこの工程に使用される培地は、通常、その他の成長因子を添加していないウシ胎仔血清を補ったDMEM基準培養培地である。一例として、特に適切な培地は：脱補体した（decomplemented）DMEM+10%ウシ胎仔血清+抗生物質（100U/mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン）である。
【００３０】
この工程における細胞収率は、試料に応じて：組織mgにつき1000〜5000細胞で変化する。
【００３１】
工程（d）：2つの細胞亜集団の選択：
多分化能の幹細胞の濃縮工程は、培養工程（c）の開始時に、これらの接着速度の関数：
-l2時間よりも前に付着する付着する細胞集団CA
-よりゆっくりと（48〜72時間）付着する細胞集団CS、
として2つの細胞亜集団に分離することによって開始する
12時間の培養の後、集団CSは、培地中の懸濁液に存在するが、集団CAは、ディッシュに付着する。
【００３２】
「幹」細胞は、亜集団CAのみに見いだされるが、第2の亜集団は、多分化能の前駆体を含み、約60回の集団倍加後に死滅する。従って、集団CSは、幹細胞の産生に使用することができないが、それにもかかわらず、その他の適用に使用することができる。CS集団は、以下の特徴を有する：
i）それは多能であり、
ii）それはHLAクラスI陰性の表現型を有し、
iii）それは通常の核型を有し、
iv）その自己複製能力は、約40〜60回の集団倍加の間維持されており、
v）その増殖速度は、白血病抑制因子（LIF）による影響を受けない。
【００３３】
したがって、この細胞集団は、これ自体が、従来技術の多分化能の細胞について通常知られるものに匹敵するほど治療的および美容的な使用に向いている。
【００３４】
急速に付着する集団（集団CA）を選択する工程により、培養の開始から最初の選択を行うことによって種々の前駆細胞の大半に関して、「幹」細胞がより希釈されなくすることができるので、これは、重要である。
【００３５】
工程（e）：幹細胞の濃縮：
次いで、CAおよびCS集団を同一の条件で培養する。集団CAについては、この培養により、実質的に幹細胞の濃縮を生じる。この濃縮工程は、前駆体が幹細胞（これは、理論的には不死である）と比較して制限された寿命を有するという事実に基づく。最初の集団倍加の間に、前駆体を幹細胞よりも急速に増殖させ、次いで50〜80回の集団倍加までにこれらは死に始める。現段階で、集団は、幹細胞が非常に濃縮されている。
【００３６】
この工程の間に、細胞が80%コンフルエンスに達したときに、それぞれの細胞の移動を行い、高密度接種を、すなわち1000〜5000細胞／cm2の範囲に、好ましくは1000〜3500細胞／cm2の範囲に、および特に2000〜2500細胞／cm2の範囲の密度で行う。
【００３７】
それぞれの細胞導入において、細胞を約50〜80回の集団倍加の間（CA集団が、「幹」細胞に非常に濃縮され、前駆体の死滅に対応してCS集団が死滅する段階）に最高2または3まで希釈する。この工程は、その標準状態において静止状態である真の「幹」細胞が、前駆体よりもゆっくりと分裂するという仮説に基づくことが不可欠である。トリプシン処理工程の間に細胞をより希釈すると、特定の培養ディッシュにおいてこれらの多分化能の細胞を失う危険が生じ得る。
【００３８】
約50〜80回の集団倍加（たとえば、60回の集団倍加）の後、CS集団は、老化集団の特徴（増殖能の減少および多分化能の減少）を有し、死滅する。対照的に、同じ段階におけるCA集団は、第1の集団倍加（最初の平均倍加時間の約36時間と比較して、約72時間の倍加時間の集団）と比較してさらにゆっくり増殖し、静止状態になることができる。
【００３９】
CA集団は、これが以下の特徴を示すときに、静止状態に達したと考えらることができる：  
・約70%のコンフルエンスでの自発的な増殖の停止；  
・コンフルエンスは、bFGFまたはその他の成長因子の存在下において現段階で達成されていてもよい。72時間から約36時間への集団倍加時間の減少が観察されてもよい；  
・倍加時間に対するbFGFまたはその他の成長因子の効果は、可逆的である。
【００４０】
さらに、CA集団においてpH6で決定される内因性のX−gal活性の測定は、陰性（0.05%未満）であり、この集団が老化状態ではなく静止状態にあることが確認された。
【００４１】
この濃縮工程に使用される培地は、典型的には成長因子の添加を伴わない培地であり、たとえば脱補体した（decomplemented）培地DMEM+10%ウシ胎仔血清+抗生物質（100U/mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン）である。
【００４２】
工程（f）：未分化な状態における幹細胞増殖の誘導：
静止状態に達した後、CA集団の細胞増殖を、トリプシン処理および新たなディッシュ内での細胞希釈によって誘導する。望ましくは、細胞は、80%のコンフルエンスでトリプシン処理に供し、同一の新たな培養ディッシュ内でのに2〜10倍、好ましくは5〜10倍希釈する。
【００４３】
現段階で成長因子、例えば塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、PDGF、EGF、NGF、またはSCFを添加することにより、CA集団の「幹」細胞の集中的な増殖ができる。ヒトbFGFの添加は現段階が特に好ましい。
【００４４】
組み込まれたbFGFなどの成長因子の、たとえば約3〜20ng／ml、特に5〜10ng／mlの培地の濃度での添加により、集団倍加時間を半分にするだけでなく（たとえば、bFGFのない集団倍加時間は、約72時間であるが、bFGFを有すると約36時間である）、集団がコンフルエンスに達することもできる。成長因子がなくても、本発明の幹細胞の静止集団の増殖は、トリプシン処理および希釈によって引き起こすことができるが、増殖は、約70%のコンフルエンスで自発的に止まる。コンフルエンスは、インビトロにおいて多くの細胞タイプの分化を開始するために不可欠であるので、この種の分化細胞のインビトロでの産生のためには、bFGFなどの増殖因子の使用を想定しなければならない。
【００４５】
本方法のこの工程は、従来技術の方法とは明らかに区別される。本発明の方法において、bFGFなどの成長因子は、静止状態になることができる集団を得た後に使用されるだけである。対照的に、bFGFは、通常、新たに単離された細胞の培養の開始から使用される（（Tsutsumi Sら、Biochemical and Biophsysical Research Communications 288,413-419 （2001））。このbFGFの非常に早期の使用は、真の「幹」細胞の増殖だけでなく、全ての前駆体の増殖も刺激するので、誤った（peverse）効果を有する。これにより、さらに前駆体／幹細胞の比率の増大を生じ、希釈によってこの珍しい細胞タイプが減少してしまう。本発明によれば、革新的な点は、前駆体の集団が消えたときのbFGFの使用であり、集団は、非常に「幹」細胞が濃縮され、静止状態になる。
【００４６】
幹細胞の増殖を誘導することにより、これらの多分化能の細胞を大量に産生することができる。産生された細胞は、常法を使用して培地から回収することができる。
【００４７】
要約すると、本発明の方法は、幹細胞の産生を最適化することができる多くの革新的な要素：
-組織の完全解離ができ、一方で特定の細胞タイプに対するダメージを防止する、コラゲナーゼなどの酵素的標品での迅速な消化（工程a）；
-特定の細胞タイプの減少を回避するために、工程b）においてろ過工程がない；
-培養工程d）およびe）の間の高密度な細胞接種。実際は、多分化能の細胞は、その他の細胞タイプと比較して少ししか供給されない；
-2つの亜集団「CA」および「CS」の、これらの接着速度の関数としての隔離；
-細胞が静止状態になったあと、bFGFなどの成長因子の遅い使用（工程f）、
を含む。
【００４８】
本発明の方法を行うことにより、本発明者は、幼児の脂肪組織から複数のヒト多能株を確立した。本発明の技術は、いくつかの脂肪組織試料、例えば表1（下記の実施例を参照）に示したものについて確証された。
【００４９】
本発明の細胞は、幹細胞の多くの特徴：たとえば、静止状態になる能力；bFGFまたはその他の成長因子によって静止状態が誘導された場合に静止状態が停止し、強力な増殖の再開を生じる（体へのダメージの際にインビボにおいて生物体内に分泌される前記成長因子の可逆性の効果）；多くの集団倍加にわたる多潜在性の維持；有意なテロメラーゼ活性；
通常の核型を有する。
【００５０】
より詳細には、本発明の細胞は、多分化能の成体ヒト幹細胞であって、これらは：
i）少なくとも80回の集団倍加にわたって、および好ましくは少なくとも100回の集団倍加にわたって維持される自己複製の能力；
ii）有意なテロメラーゼ活性
iii）HLAクラスI陰性の表現型；
iv）通常の核型；
v）静止状態になる能力、
を有することを特徴とする細胞である。
【００５１】
本発明の細胞の自己複製能力は、少なくとも80回の集団倍加、好ましくは少なくとも100回の、または130回の集団倍加、および特に少なくとも200回以上の集団倍加にわたって維持される。これは、本発明の細胞がこれらの本来の特徴を失うことのなく、少なくとも80回もしくは130回の、または200回の集団倍加を受けることができることを意味する。言い換えると、多潜在性、テロメラーゼ活性、HLAクラスI陰性の表現型、通常の核型、および静止状態になる能力は、これらの集団倍加の全ての全体にわたって維持される。
【００５２】
本発明の細胞のテロメラーゼ活性は、特に重要であり、これは従来の技術によって測定することができる。WattおよびHogan （Science, vol 287, February 2000）による「幹」細胞の定義によれば、テロメラーゼ活性は、通常、得られた細胞が無限に自己再生できるはずであることを意味する。テロメラーゼ活性は、胚細胞に、および成体においては、腫瘍細胞および「幹」細胞において存在するだけである。したがって、この活性は、細胞が幹細胞であることを確証させる。
【００５３】
本発明の細胞の内因性のテロメラーゼ活性のレベルは、好ましくは参照株化細胞のテロメラーゼ活性の少なくとも20%、たとえば20%〜50%、特に22%〜50%に対応する。参照株は、典型的には形質転換されたヒト系HEK293T（T抗原で不死化されたヒト胚性腎臓293 などの内因性テロメラーゼ活性を有する形質転換された株である。この活性は、どの段階でも測定することができる。これは、好ましくは30回または40回の集団倍加の後に、たとえば約60回の集団倍加の後の静止段階で測定される。
【００５４】
本発明の細胞の免疫学的な特徴に関して、これらは、従来の体細胞とは区別される。これらの細胞は、これらの表面上にHLAクラスIシステムの分子を発現しておらず（フローサイトメトリーによって確認される）、これらは、表面上にHLAクラスIIを発現しない。HLAクラスIシステムの分子は、自己および非自己ペプチドをCD8+細胞障害性Tリンパ球に提示し、それゆえに移植拒絶反応においてこれらが重要な役割を提示する。表面HLAクラスI分子の非存在は、移植における本発明の幹細胞の「普遍的な」性質を示差する。前記細胞は、その遺伝形質とは独立して、宿主による拒絶のリスクを伴わずに、同種移植に使用することができる。
【００５５】
HLAクラスIおよび／またはクラスII陰性の組織の表現型は、任意の従来技術によって分析することができる。これは、好ましくは30回または40回の集団倍加の後に、たとえば約60回の集団倍加の後の静止段階で、またはより後い段階で、すなわち、静止状態の後、たとえば100回または120回の集団倍加で測定する。第1の集団倍加の間、HLAクラスI分子の表面発現は低いが、有意であり、次いで初期の前駆体が姿を消す段階に対応して後期の段階で（たとえば、50回〜80回の集団倍加の間の静止状態の後に）消える。
【００５６】
本発明の状況において、発現「HLA陰性」は、本発明の幹細胞が、単一のラベリングによる（蛍光色素を使用する）フローサイトメトリーによって検出することができないHLAクラスI分子の表面発現レベルを有することを意味する。望ましくは、本発明の「HLA陰性」細胞も、単一のラベリングによるフローサイトメトリーによって検出することができないレベルのHLAクラスII分子の表面発現を有することを意味する。
【００５７】
さらに、免疫特権的な挙動の現象のために、分化した状態の本発明の細胞は、その遺伝形質から独立して、おそらく宿主において拒絶反応を誘導しない。
【００５８】
本発明の細胞は、通常の核型を有し、これらが形質転換されないことを確証させる。
【００５９】
正常な状態において、本発明の細胞は、静止状態であり（Blau HMら、Cell, 105,
829-841, June 29, （2001））、bFGFの存在下において再び増殖し始める。静止状態は、幹細胞に特異的な特徴である。一定数の集団倍加を越えると、「非幹」細胞は、老化する。静止状態は、理論的には無期限に維持することができる。本発明の細胞について、本発明者らは、最高1年間この状態を維持した。次いで、トリプシン処理および希釈によって、選択的に成長因子を添加することを伴って、増殖を誘導することができる。静止状態では、本発明の細胞は、コンフルエンスに達する前に、たとえば50%〜90%のコンフルエンスの間に、特に60%〜70%のコンフルエンスの間に自発的に増殖を停止する。
【００６０】
本発明の細胞の1つの重要な特徴は、これらの多分化能である。これらは、少なくとも2つの細胞タイプに分化することができる。より詳細には、これらは、内胚葉起源（たとえば、肝臓）もしくは外胚葉起源（神経細胞：アストロサイト、オリゴデンドロサイト、およびニューロン）の、または中胚葉性の起源の細胞に分化することができる。挙げることができる中胚葉系統の細胞の例は、脂肪細胞、骨芽細胞、筋細胞、内皮細胞、および軟骨細胞である。
【００６１】
本発明の細胞は、後期の段階でさえ、細胞を機能的な脂肪細胞（脂肪分解、GPDH活性、脂肪細胞マーカーによって証明される）に、機能的な骨芽細胞（骨芽細胞マーカーの存在および細胞外基質の石灰化によって証明される）に、機能的な筋細胞に、および内皮細胞に分化することができることが証明された。この分化は、インビトロで、またはインビボで生じ得る。
【００６２】
本発明のCA細胞は、単一細胞レベルで、筋細胞、脂肪細胞、骨芽細胞に、および内皮細胞に分化する能力を有すること、すなわち、本発明のそれぞれのCA細胞は、これらの4つの細胞タイプに分化できることが証明された。脂肪細胞、骨芽細胞および筋細胞細胞とは対照的に、「肢芽中胚葉」内臓中胚葉に由来する内皮細胞に属する。したがって、本発明の細胞は、間充織系統の細胞への分化に限定されず、さらに一般的にいえば、中胚葉系統の細胞に分化することができる。
【００６３】
本発明者らは、本発明の幹細胞上のマーカーの存在を調査した。彼らは、これらが転写因子Oct-4およびRex-1、並びに表面抗原ABCG2を発現すること確立した（ABC transporter responsible for the SP phenotype, Zhou Sら、Nature Medicine, 7, n° 9, Sept 2001, 1028-1034）。Oct-4およびRex-1転写因子は、マウスおよびヒトの胚幹細胞において特異的に発現する。Oct-4は、マウス胚幹細胞の多分可能を維持するために不可欠である。また、Oct-4は、ヒト胚幹細胞によって発現されることが示された。
【００６４】
また、本発明の幹細胞は、約10ng／mlの濃度で、白血病抑制因子（LIF）に反応しないことが観察された。LIPは、細胞の形態または増殖に何の変化も生じない。ヒト幹細胞、特に胚幹細胞を用いてその他の研究者によって得られた結果に従うと、本発明の細胞は、おそらくLIP（LIF-R）の受容体を発現おらず、したがってLIF-R陰性であると結論することができる。
【００６５】
望ましくは、本発明の細胞は、静止状態に達した後に、インビトロで安定に以下の表現型を示す：
HLAクラスI陰性、
HLAクラスII陰性、
CD3陰性、
CD13陽性、
Oct-4陽性、
Rex-1陽性、
ABCG2陽性。
【００６６】
これらの表現型の特徴は、通常の核型および有意なテロメラーゼ活性と関係する。望ましくは、細胞は、LIF-R陰性でもある。この表現型は、インビトロで、すなわちFGF-2の非存在下または存在下において、および10%を上回るであろうウシ胎仔血清の濃度で、安定に維持される。また、表現型は、高接種密度で、および140回の集団倍加を越えて維持される。
【００６７】
本発明の細胞集団倍加時間は、存在する幹細胞の比率の関数として変化する。一例として、静止状態に達する前では、倍加時間は、約36〜40時間であり、CA集団の前駆体の存在を反映する。幹細胞比率が増大すると、倍加時間も増大し、静止状態で約70〜80時間に達する。幹細胞は、前駆体よりも非常にゆっくりと分裂する。静止状態となった後、bFGFなどの成長因子を添加することにより、有意に倍加時間を、たとえば約36時間まで減少ささせることができ、集中的かつ迅速に幹細胞を産生することができる。
【００６８】
本発明の細胞は、たとえば内因性遺伝子の切除または修飾によって、または適切なプロモーター、たとえば普遍的または組織特異的なプロモーターの制御下での、リポーター遺伝子もしくはその発現産物が治療的な性質を有する遺伝子などの導入遺伝子の発現のために、遺伝子改変を行い、次いで新規の特徴の発現を導入または引き起こすように選択することができる。
【００６９】
導入遺伝子またはDNAまたはRNAの発現は、構成的であることができ、または可逆的もしくは不可逆的に誘導性であることができる。関心対象の異種DNAまたはRNAは、任意の発現ベクター、たとえばウィルスベクター（レトロウイルスベクターを含む）、不活性ベクター、プラスミドベクター、またはエピソームベクターによって行うことができる。ベクターは、トランスフェクションによって、たとえばリン酸カルシウムなどの化学剤を使用して、リポフェクションによって、または電気穿孔法、微量注入...などの物理的因子を使用することによって細胞に導入することができる。前記ベクターは、エピソームの形態またはゲノム内にランダムにもしくはターゲットされた方法で組み込んだもののいずれかで、細胞に維持することができる。
【００７０】
前記遺伝子改変された細胞を遺伝子治療に使用して、個々に異種遺伝子の発現産物を供給することができる。多分化能の性質およびHLAクラスI陰性の性質のために、本発明の幹細胞は、特にこの種の適用に適している。
【００７１】
本発明の細胞が、リポーター遺伝子によって導入され、またはトランスフェクトされたときに、これらは、多くの研究を行うために使用することができる。一例として、多分化能の脂肪組織の幹細胞の可塑性は、β-ガラクトシダーゼ（Xgalで染色後に青い）をコードするlacZ遺伝子をトランスフェクトした幹細胞を使用して調査することができる。これらのラベルされた細胞は、インビトロおよびインビボでの実験に使用することができる。
【００７２】
たとえば、インビトロでの、前記細胞の可塑性は、共培養実験によって研究することができる。特に、前記（中胚葉起源の）細胞が内胚葉起源（たとえば、肝臓）の細胞に、および外胚葉起源の細胞（神経細胞：アストロサイト、オリゴデンドロサイト、およびニューロン）に分化するの能力を研究することができる。
【００７３】
また、インビボにおいて、ラベルされた細胞を不十分な免疫系を有し、したがってこれらの細胞を拒絶することができない胸腺欠損（ヌード）マウスに移植することができる。移植された細胞は、腫瘍を生じない。前記細胞が再生する力は、移植されるマウスにおいて適切な病変が最初に生じた場合に見えるだけである。
【００７４】
大部分の体細胞とは対照的に、本発明の幹細胞は、表面HLAクラスI分子を発現しない。その免疫機能が重要な前記タンパク質の不存在下では、何らの拒絶反応も伴わずに前記幹細胞を普遍的に移植することができることを示唆する。
【００７５】
実際に、本発明者らは、本発明の細胞は、移植の6月後にも拒絶反応を伴わずに免疫適格性のマウスに移植することができることを証明した。
【００７６】
したがって、本発明のCA細胞は、インビボで、これらが免疫特権的な挙動を有すること、すなわちこれらを免疫適格性の哺乳類（マウスなどの）に移植したときに、移植後10日以上後、好ましくは80日後に、およびより好ましくは6月後でさえ、これらが拒絶反応を生じないことを特徴とする。移植は、同種間または異種間であることができる。拒絶反応がないことは、リンパ球浸潤がないことを証明することができる技術を使用して、たとえば抗CD3抗体を使用して、またはヘマトキシリン染色を使用して決定することができる。
【００７７】
驚くべきことに、インビボでも、本発明の細胞が未分化な状態で遊走する能力を有することが示された。免疫適格性のマウスの前脛骨に本発明のCA細胞を移植した50日後に、注射部位に隣接した傷害組織において前記細胞の存在が観察された。この挙動は、本発明の細胞が動員されることによって、注射部位以外の解剖学的な部位で正常な表現型を回復することに寄与し得ることを示唆する。
【００７８】
また、本発明は、濃縮された多分化能の細胞であって、これらは、本発明の幹細胞を含むこと、およびこれらは、脂肪細胞、線維芽細胞、前脂肪細胞、内皮細胞、周皮細胞、肥満細胞、および平滑筋細胞がないことを特徴とする細胞の集団に関する。
【００７９】
本発明の集団は、好ましくは完全に均質であり、すなわちこれらは、幹細胞のみを含む。より詳細には、集団は、クローン集団である。
【００８０】
また、本発明は、本発明の幹細胞から分化した細胞の産生に関する。
【００８１】
たとえば、本発明は、本発明の幹細胞が適切な分化培地の存在下においてコンフルエンスから培養されることを特徴とする中胚葉系統の分化細胞の産生に関する。
【００８２】
以下の培地を脂肪細胞の分化ができる培地として挙げることができる：
-DMEM培地／Ham's Fl2（vol／vol、1：1）抗生物質、例えば100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、
5μg/mlのヒトインスリン（Sigma）、
10μg/mlのヒト・トランスフェリン（Sigma）、
PPARγ活性化因子、たとえば1μMのBRL49653または2μmのシグリタゾン（Biomol）、
100〜250μMのイソブチル-メチルキサンチン（IBMX）、
0.2nmのデキサメサゾン、
1μMのトリヨードチロニン（T3 Sigma）を補ったもの。
【００８３】
48〜72時間後に、この培地をIBMXまたはデキサメサゾンを含まない同じ培地によって置換する。
【００８４】
以下の培地は、骨芽細胞を分化できる培地として挙げることができる：
-抗生物質、たとえば100U／mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、
10%の脱補体した（decomplemented）ウシ胎仔血清、
0.1μMのデキサメサゾン（SIGMA）、
10mMのβーグリセロリン酸（SIGMA）
50μg/mlのアスコルビン酸（SIGMA）を補ったDMEM。
【００８５】
培地は、15〜20日間の期間にわたって2〜3日ごとに置きかえる。
【００８６】
以下の培地は、筋細胞を分化できる培地として挙げることができる：
商品名Promo Cell販売される培地、または
DMEM培地
2%の脱補体した（decomplemented）ウシ胎仔血清
抗生物質（例えば100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン）。
【００８７】
培地は、4〜6週間にわたって2〜3日ごとに置きかえる。
【００８８】
以下の培地は、内皮細胞に分化できる培地として挙げることができる：
抗生物質、10ng／mlのヒトVEGF121（SIGMA）を補ったDMEM培地。
【００８９】
脂肪細胞、骨芽細胞、および筋細胞の分化のためには、幹細胞を、通常、約10000〜25000細胞／cm2の密度で接種する。
【００９０】
分化工程の前に、細胞は、通常、25000細胞／cm2の密度の増殖培地（10%のFCSおよび2.5ng/mlのFGF-2を補ったDMEM）溶液で接種する。2日後に、培地をFGF-2の存在下で48時間交換する。次いで、分化培地において10日間、細胞を維持する。
【００９１】
本発明の幹細胞は、特に治療に、または美容学に使用するために適している。
【００９２】
本発明の幹細胞の治療的な使用は、なかでも、移植における、および遺伝子治療における使用を含む。
【００９３】
たとえば、移植に使用するためには、本発明の細胞をインビトロで細胞を未分化な状態に増殖させ、続いて個体に導入する。細胞は、循環に注射するか、または解剖部位に移植する。次いで、細胞は、ダメージを受けた解剖部位の機能としてインビボで分化させる。一例として、筋肉病変を有する個体への本発明の幹細胞の筋肉内移植により、筋肉の分化および再生を生じる。同様に、脂肪組織の再生は、細胞の脂肪細胞へのインビボでの分化によって認識することができる。
【００９４】
したがって、本発明の細胞の移植は、インビボで組織、たとえば骨組織、脂肪組織、または筋組織を再生させるために使用することができる。
【００９５】
必要に応じて、移植は、組織再生を改善することができるマトリックスの移植を、たとえば細胞の増殖のための物理的な担体を供給することを、または成長因子などの物質を供給することを伴うことができる。マトリックスは、生物分解可能でもよい。
【００９６】
本発明によれば、移植は、自己由来または同種間でもよい。本発明の細胞は、特にこれらがHLAクラスI陰性の性質ために、同種移植に適している。したがって、細胞は、拒絶のリスクを伴わずに、遺伝形質から独立して、任意の個体において使用することができる。
【００９７】
さらなる変形例において、本発明の幹細胞は、たとえば脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞などとして、分化された状態で使用することができる。この変形例において、幹細胞をインビトロでの分化に供し、続いて個体に分化した細胞を導入する。
【００９８】
本発明の医療適用については、幹細胞は、遺伝子改変されていてもよく、またはされていなくてもよい。細胞が遺伝子改変されているときは、これらを遺伝子治療に使用して、患者に発現産物、例えば異種タンパク質を供給することができる。次いで、修飾された細胞を未分化な状態でインビトロで培養し、次いでレシピエントに導入することができる。あるいは、細胞を分化された状態でインビトロで倍加させ、次いでレシピエントに導入することができる。
【００９９】
また、本発明は、本発明の幹細胞を使用する外科的および治療的な方法の実施に関する。また、生理的に許容される賦形剤と結合して本発明の幹細胞を含む薬学的組成物に関する。
【０１００】
また、本発明の幹細胞は、インビトロでタンパク質を産生するために使用することができ、これは組換え、特に治療的なタンパク質であっても、またはなくてもよい。事実、本発明の細胞は、少なくとも100回、例えば少なくとも200回の集団倍加の間インビトロで培養し、したがってほぼ無尽蔵な発現産物の供与源を構成する。問題のタンパク質は、幹細胞に対して内因性の遺伝子の発現産物であることができ、またはあるいは、異種遺伝子の発現産物であることもできる
また、本発明の細胞は、活性な薬剤、たとえば遺伝子産物、セリック（seric）抽出物、条件培地、動物または植物起源の産物、薬物ライブラリーなどの同定のためのスクリーニング系に使用することができる。
【０１０１】
たとえば、本発明は、中胚葉系の細胞への細胞の分化を調整することができる薬剤を同定するためのスクリーニング法であって：
a）候補薬剤の存在下における中胚葉系統（たとえば脂肪細胞、骨芽細胞または筋細胞）の細胞に、これらを分化させることができる条件下で、本発明に従って幹細胞を培養することと、
b）候補薬剤の存在下における細胞の分化を候補薬剤の非存在下における分化と比較することと、
によって特徴づけられるスクリーニング法を含む。
【０１０２】
試験薬剤は、または分化を増強することができる薬剤、分化を防げ、もしくは減速させ、もしくは減少させることができる（抗分化物質）薬剤、または分化ルートを修飾することができる物質であってもよい。
【０１０３】
また、本発明は、脂肪分解活性を有する可能性のある薬剤を同定することができるスクリーニング法であって：
a）本発明の幹細胞を、これらが脂肪細胞に分化することができる条件下で培養することと、
b）こうして得られた脂肪細胞を候補薬剤と接触させて、候補薬剤の脂肪分解活性を決定することと、
によって特徴づけられる方法を含む
また、本発明は、抗脂肪分解活性を有する可能性のある薬剤を同定することができるスクリーニング法であって：
a）本発明の幹細胞を、これらが脂肪細胞に分化することができる条件下で培養することと；
b）こうして得られた脂肪細胞を、脂肪分解性の薬剤の存在下において候補薬剤と接触させることと；
c）候補薬剤の抗脂肪分解活性を決定することと、
によって特徴づけられるスクリーニング法を含む。
【０１０４】
また、本発明は、インスリン感受性を増加させる活性を有する可能性のある薬剤を同定することができるスクリーニング法であって：
a）本発明の幹細胞を、これらが脂肪細胞に分化することができる条件下で培養することと、
b）こうして得られた脂肪細胞を候補薬剤と接触させることと；
c）無処置の脂肪細胞と比較して候補薬剤のインスリン感受性を増加させる活性を決定することと、
によって特徴づけられるスクリーニング法を含む。
【０１０５】
また、本発明は、美容学における幹細胞の使用に属する。
【０１０６】
本発明の幹細胞が脂肪細胞に分化することができる限り、これらは、たとえば、皮膚のしわが寄っている外見を減少させるために、瘢痕もしくは種々の皮膚傷を減少させるために、または組織修復を行うために、美容手術または修復手術に使用することができる。従って、本発明は、本発明の細胞を使用する前記手術法の実施に関する。
【０１０７】
また、細胞は、賦形剤、媒体、溶媒、着色材、芳香剤、抗生物質、または化粧品に通常使用されるその他の製品および添加物を含む。クリーム、ポマード、軟膏、ゲル類、種々の液体などの中に細胞を封入することにより、これらを直接皮膚またはその他の組織または目に見えるもの（phanera）に適用することができる。したがって、本発明は、また、未分化な状態の本発明の幹細胞を含むか、または幹細胞に由来する分化細胞を含む化粧品組成物に属する。
【実施例】
【０１０８】
脂肪組織からの多分化能幹細胞を得るための、およびインビトロでの増殖させるための方法
1.1.得られた脂肪組織試料に関する記述
6種の脂肪組織試料を1月〜7年歳の幼児から得た；性および解剖学的な位置は、異なっていた。
【０１０９】
表Iは、それぞれの試料の起源、以下に記載されている技術を使用して得られた細胞のその重量および数を示す。
【表１】
2005534314.tif 000002
表I：多分化能の幹細胞を作製するために使用したヒト脂肪組織試料  
以下の実施例には、試料Primo1〜6から多分化能の幹細胞を得ることを記載する。前記幹細胞は、次の工程を行うことによって得られた：
・試料から多分化能の細胞を単離すること  
・インビトロで多分化能の細胞の細胞培養を濃縮すること  
・静止状態の幹細胞を得ること  
・幹細胞の集中的な増殖を誘導すること  
得られた幹細胞は、
・テロメラーゼ活性の測定  
・種々の段階において核型を作製すること  
・細胞可塑性（異なる細胞型への分化）を研究すること  
・幹細胞をクローニングすること  
によって特徴づけた。
【０１１０】
以下、方法論および結果の詳細について説明する。
【０１１１】
1.2多分化能の細胞を幼児の脂肪組織から単離するための方法
手術後に、試料は、DMEM培地（ダルベッコ修正イーグル培地）+10%のウシ胎仔血清中に外界温度で貯蔵する。組織を37℃においてPBS（リン酸緩衝食塩水）でリンスして、次いで流して、計量する。次いで、酵素消化工程を最適化するために、試料を非常に細かく切る。
【０１１２】
消化培地は、抗生物質（100U/mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン）、2mg／mlのコラゲナーゼ（Boerhinger reference 103586）、および20mg/mlのウシ血清アルブミン画分5（Sigma A reference 2153）を含むDMEM培地（ダルベッコ修正イーグル培地）から成る。消化体積は、組織重量の関数であり；通常、100〜200mgの組織に対して1mlの消化培地である。消化は、穏やかな撹拌下において37℃で行う。ヒト前脂肪細胞の調製のための従来の技術とは対照的に、消化時間は、非常に迅速（5〜10分）であり、コラゲナーゼによる組織の完全な解離に対応している。次いで、ウシ胎仔血清（200μL/mlの消化培地）を加えることによって、コラゲナーゼ活性を阻害する。
【０１１３】
次いで、細胞標品を5分間1000rpmで遠心する（脂肪組織に含まれるその他の細胞型（前脂肪細胞、幹細胞、内皮細胞、周皮細胞、肥満細胞...）から脂肪細胞を分離することができる工程）。手順のうちのこの工程は、濾過をせずに行われ、これにより脂肪組織に含まれる細胞型の全てが保存される（脂肪細胞を除いて）ことを意味する点に注意することが重要である。遠心処理後に得られた細胞ペレットを培地：培地DMEM+脱補体した（decomplemented）ウシ胎仔血清+抗生物質（100U/mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン）に再懸濁する。得られた細胞の数を計数する。細胞収率は、試料に応じて変化する：組織1mgにつき1000〜5000細胞。細胞は、高密度に、プラスチック・ディッシュ（結晶質ポリスチレン、Greiner）にcm2につき1000〜3000細胞で播種する。
【０１１４】
培養に入れたときに、2つの細胞亜集団を、これらの接着速度に従って単離する。第1の亜集団（「CA」と命名）は、非常に急速（12時間未満）に付着する細胞によって構成される。第2の亜集団（CS）は、さらにゆっくりと（48〜72時間）付着する細胞によって構成される。
【０１１５】
実際には、培養を始めた12時間後に、一定の細胞がプラスチックに付着した。これらの細胞は、CA集団を構成する。CS集団を構成する細胞は、同じ瞬間に培地中の懸濁液中のものである。その培地を除去して、新たな培養皿に沈着させる。72時間後、CS細胞は付着した。
【０１１６】
1.3幹細胞中の多分化能の培養の濃縮：
1.3.1静止幹細胞の集団を得る：
2つの亜集団（CAおよびCS）を同じ方法で培養において維持する。前記細胞は、初期段階（約50〜60回の集団倍加に対応する）では可塑性、増殖、および形態学に関して同様の特徴を有する。
【０１１７】
細胞は、培地DMEM+脱補体した（decomplemented）ウシ胎仔血清+抗生物質（100U/mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン）において維持する。
【０１１８】
細胞が80%のコンフルエンスに達したときに、これらをトリプシン（Trypsine-EDTA、Invitrogen）で処理し、同じ直径の3つの新たなディッシュにおいて培養を始める。播種密度は、1000〜3500細胞／cm2に対応する。細胞は、故意に希釈せずに多分化能細胞を保存して、理論的には、全てのディッシュにおいて前駆体よりもゆっくりと分裂した。
【０１１９】
これらが増殖を停止するまで、細胞をこれらの条件下で維持した。Primo2については、CAおよびCS細胞は、60回の集団倍加に対応する細胞移入20回（T20）の後に増殖を停止した。
【０１２０】
Xgal染色（pH6で検出される内因性のβ-ガラクトシダーゼ活性を示し、細胞老化を証明する）により、CS集団は、老化したが、CA集団は、単に静止状態であったことが分かった（図1を参照されたい）。
【０１２１】
この濃縮工程に対して、異なる培地を試験した。本発明の幹細胞は、「白血病抑制性因子」（LIF）（lOng/ml）に反応しないことが観察された。LIFは、細胞の形態または増殖に何ら変化を生じない。これにより、細胞がLIF受容体（LIF-R）を発現しない傾向があることが確証される。
【０１２２】
1.3.2集中的な幹細胞増殖の誘導
静止状態のCA細胞集団を確立した後に、ヒトbFGF（塩基性線維芽細胞成長因子）を5ng／mlの培地の濃度で上記した培地に添加する。図2に示したように、CA集団の細胞のみが効率的にbFGFに反応する。対照的に、bFGFは、後期段階（すなわち、50回の集団倍加後）で、実際にCS集団に対して全く効果を有さなかった。
【０１２３】
これらの観察により、CA集団の静止状態およびCS集団の老化状態をもう一度確認する。
【０１２４】
bFGFで処理したCA細胞を80%コンフルエンスでトリプシン処理に供し、このときに新たな同一の培養ディッシュ中で5〜10倍に希釈した。
【０１２５】
bFGFに関して、2つの補足的点を作製することができる：
-bFGFは、細胞の形態の変化を引き起こす。静止状態のときに、これらは平らになり、拡張する。bFGFの存在下において、およびしたがって、増殖期において、これらは、線維芽細胞形態をとり（図3、図12）、
-さらに、bFGFの効果は可逆性である（図3）。
【０１２６】
1.4.  2つの亜集団CAおよびCSに由来する凍結細胞
2つの亜集団CAおよびCSからの細胞を定期的に凍結してそれぞれの細胞集団の系統を構築し、引き続く細胞の移動の間にこれを発生させる。寒冷保存では、前記細胞の性質は変化しない。
【０１２７】
実際に、細胞をトリプシン処理し、遠心し、10%のDMSOを補ったウシ胎仔血清によって構成される凍結培地に再懸濁した。次いで、これらの細胞を-20℃で1時間、次いで-80℃一晩おき、最終的に-180℃の液体窒素に貯蔵した。
【０１２８】
2.幹細胞のテロメラーゼ活性の測定
2.1テロメラーゼ活性を決定するための方法：
テロメラーゼ活性は、Te1oTAGGGテロメラーゼPCR ElisaPLUSキット（Roche）を使用して定量する。
【０１２９】
テロメラーゼ活性は、2工程で定量される：
i）第1工程は、増幅／伸長工程（または、TRAPアッセイ法）であって、テロメラーゼがビオチン化されたプライマーの3'末端にテロメアモチーフ（TTAGGG）を付加する工程である。
【０１３０】
ii）第2工程は、Elisaによる検出および定量である。
【０１３１】
工程1で得られたPCR産物をジゴキシゲニンでラベルしたテロメア末端に特異的なプライマーとハイブリダイズさせる。さらに、Elisaマイクロプレートをストレプトアビジンで処理し、ビオチンを介して産物を固定化した。固定された単位複製配列は、抗DIG-HRPおよびペルオキシダーゼ基質TMBと結合した抗ジゴキシゲニン抗体で検出した。
【０１３２】
測光反応の強度は、Elisaマイクロプレートリーダー（690nmの参照波長での450nmにおける吸光度）を使用して推定した。
【０１３３】
次いで、試料の相対的なテロメラーゼ活性を陽性対照（HEK293系からの細胞、Human Embryonic Kidney 293）のテロメラーゼ活性に関して算出する。
【０１３４】
2.2テロメラーゼ活性の決定の結果：
Rocheによって販売される「Telo TAGGGテロメラーゼPCR Elisa Plus」キットを用いて、Primo2の2つの亜集団CAおよびCSに存在するテロメラーゼ活性を定量した。
【０１３５】
本発明の幹細胞において、有意なテロメラーゼ活性が検出された。Primo2CA（T25：細胞移動25回、約100回の集団倍加に対応する）については、テロメラーゼ活性は、形質転換されたヒト系HEK293T（T抗原によって不死化されたヒト胎児腎臓293）のテロメラーゼ活性と比較して約20%であった。HEK293T株は、このキットにおいて参照として使用されている。
【０１３６】
対照的に、有意なテロメラーゼ活性は、CS細胞では検出されず、例えばPrimo2CS（T20）からの細胞は、HEK293Tのものと比較して約5%の活性を有した。
【０１３７】
3.幹細胞の核型
核型により、中期に存在する染色体を観察すること、および分類することができる。
【０１３８】
3.1核型を決定するための方法：
中期は、従来の細胞発生の技術を使用して得られる。紡錘体（fusorial）装置のブロッキングによって中期の細胞を蓄積（コルヒチンの存在下において3時間のインキュベーション）した後、低張液（75mMのKClを37℃で40分間）の作用によって細胞質において染色体の分散を行い、続いてメタノール／酢酸（3/1）で固定する。次いで、RHG-バンド形成技術を使用して染色体を同定する。
【０１３９】
3.2核型の決定の結果：
細胞核型を決定した。これらの核型は、bFGFの存在下または非存在下において2つの亜集団CAおよびCSで、および異なる継代（Primo2CAについてT21、T23、およびT34）で行った。
【０１４０】
全ての場合において、核型は完全に正常であった。したがって、細胞は、いずれの染色体再編成も受けなかった。図4は、Primo2CA細胞の核型を示す。
【０１４１】
4.幹細胞の細胞可塑性  
幹細胞可塑性を以下の技術を使用して評価する：
4.1細胞可塑性を評価するための方法：
4.1.1.異なる細胞型への分化のための条件：
細胞をトリプシン処理し、次いで20000細胞／cm2で接種する。細胞は、24〜48時間後にコンフルエンスに達する。コンフルエンスは、分化に重要な工程であるので、細胞を、分化（脂肪細胞、骨芽細胞、筋細胞）へ進む前にさらに24時間コンフルエンスで維持する。
【０１４２】
i）脂肪細胞への分化のための条件
コンフルエントな細胞は、100U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、5μg/mlのヒトインスリン（Sigma）、10μg/mlのヒトトランスフェリン（Sigma）、1μMのPPAR活性化因子（たとえばBRL49653）、100〜250μMのイソブチル-メチルキサンチン（IBMX）、および1μMのデキサメサゾンを補ったDMEM/Ham'sF12（体積／体積、1：1）培地中でインキュベートする。48〜72時間後に、この培地を上記した培地であるが、IBMXおよびデキサメサゾンを含まない培地に置換する。この分化培地を最適な脂肪細胞分化に対応する15〜20日間2〜3日ごとに置換する。
【０１４３】
ii）骨芽細胞細胞への分化のための条件
24時間にコンフルエントであった細胞をDMEM、100μ/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、10%の脱補体したウシ胎仔血清、0.1μMのデキサメサゾン（SIGMA）、10mMのβ-グリセロリン酸（SIGMA）、および50μMのアスコルビン酸（SIGMA）から成る骨芽細胞分化培地でインキュベートする。
【０１４４】
培地は、15〜20日間にわたって2〜3日ごとに置換する。
【０１４５】
iii）筋細胞細胞への分化のための条件
24時間コンフルエントであった細胞をDMEM培地か、または2%の脱補体されたウシ胎仔血清および抗生物質（100μ/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン）の存在下においてPromoCell培地中でインキュベートする。培地は、3〜6週にわたって2-3日ごと、特に21日にわたって3日ごとに置換する。
【０１４６】
iv）内皮細胞への分化のための条件
細胞を10ng／mlのヒトVEGF121（SIGMA）を含むDMEM培地中に20000／cm2で接種する。分化培地は、21日間2〜3日ごと置換する。
【０１４７】
4.1.2染色
i）オイルレッドO染色（脂肪細胞：細胞内脂質の染色）
PBS／0.25%のグルタルアルデヒド溶液において固定後、細胞をオイルレッドO溶液2%（重量／体積）溶液中において外界温度で5分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、70%のグリセリン中に保存する。
【０１４８】
ii）アリザリンレッド染色（骨芽細胞：細胞外基質の石灰化）
PBS／0.25%のグルタルアルデヒド溶液において固定後、細胞をアリザリンレッドO1%（重量／体積）溶液中において外界温度で5分間インキュベートする。次いで、細胞を水で洗浄し、乾燥状態で貯蔵する。
【０１４９】
4.1.3.転写解析：
i）d'RNAの抽出
Tri Reagent （Euromedex, Ref TR-1 18）を使用して細胞のRNAを抽出する。
【０１５０】
ii）ノーザンブロット
20μgのRNA/ウェルをが堆積したである抽出された使用する（Euromedex、ref跡-118）であるアガロースゲル（1.2%）／MOPS（1×）/ホルムアルデヒド（1.1M）に対して沈着させるを。MOPS（1×）遊走緩衝液中で電気泳動した後、RNAをナイロンHybondN+（Amersham Pharmacia）の膜へ転写する。
【０１５１】
次いで、膜をRediprime TMII Random Prime Labellingシステム（Amersham Pharmacia）を使用して32P[dCTP]でラベルした特異的なプローブの存在下でハイブリダイズさせる。
【０１５２】
iii）RT-PCR
逆転写PCR反応は、QiagenからのOneStepRt-PCRキットを使用して行った。
【０１５３】
4.1.4.細胞内標識の発現の分析：
この技術は、インビトロで筋細胞に分化できるPrimo2CA細胞の数を定量するために使用した。分析されたマーカーは、速い収縮のミオシンou FTミオシン（筋形成の後期マーカー）であった。
【０１５４】
細胞を分離した後に、これらをPBS／1%のホルムアルデヒドの存在下において外界温度で15分間固定し、次いで外界温度で7〜8分間ジギトニン（10μg/mlのPBS）溶液で透過化処理する。次いで、表面マーカーを検出するために記載されているプロトコル（下記の実施例7および11を参照されたい）を使用して、抗体ラベリングを行う。使用した抗体は、フィコエリトリンと直接接合され、かつヒトFTミオシンを認識するマウス抗体である。
【０１５５】
4.1.5.免疫組織化学
細胞を外界温度で10分間4%のパラホルムアルデヒドで固定する。所望のタンパク質が核にあるときは（たとえば、ミオゲニンなど）、細胞をPBS／0.l%トリトンX100の存在下において10分間透過化処理する。次いで、3%のH2O2と細胞を5分間インキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼの活性をブロックする。
【０１５６】
次いで、細胞を一次抗体と共に外界温度で30分〜1時間インキュベートし、次いで二次抗体（ペルオキシダーゼと結合した抗マウスIgG（Vector Laboratories）またはペルオキシダーゼと結合した抗ヤギIgGが（Santa Cruz Biotechnology）と共にインキュベートする。
【０１５７】
我々の実験に使用した一次抗体、フォンビルブラント因子（vWF）（ヤギIgG、ヒト、ラット、およびマウスvWFをいずれも認識する）（Santa Cruz Biotechnology）およびミオゲニン（マウス抗ヒトIgG）（Santa Cruz Biotechnology）は、1：100の比率で使用した。
【０１５８】
4.2細胞可塑性分析
4.2.1初期継代における2つの細胞亜集団CAおよびCSの可塑性の結果
初期（たとえばT1、T5、T7、それぞれ3、15、および21回の集団倍加に対応する）において、CAおよびCS集団は、可塑性、形態学、および増殖に関して同じ特徴を有する。
【０１５９】
i）脂肪細胞への分化
Primo1CA（40回の集団倍加）、Primo3CA（25回の集団倍加）およびPrimo6CA（25回の集団倍加）について、オイルレッドO染色を含む実験の結果を図5（Primo2CAおよびPrimo2CSについて）および図14に示してある。さらに、それぞれ50回、40回、40回の集団倍加後のPrimo1CA、Primo3CA、およびPrimo6CAからの脂肪細胞を図13に示してある。図13および14の比較では、集団倍加が多いほどで、より分化が均質になることを示す。
【０１６０】
「ノーザンブロットブロット」解析（図6）は、分化の間の脂肪生成のマーカー（aP2およびPPARy2）の転写発現を証明する：CAT14（42回の集団倍加）およびCST16（48回の集団倍加）。
【０１６１】
ii）骨芽細胞への分化
図7は、CSおよびCA細胞の骨芽細胞への分化を示す。アリザリン染色。
【０１６２】
4.2.2.後期継代における細胞可塑性の変化
Primo2CSの細胞は、20回の移動（約60回の集団倍加に対応する）後に老化する。これらは、同時にこれらの増殖能およびこれらの分化能を失う。
【０１６３】
対照的に、CA集団の細胞は、同じ段階で静止状態になる。これらは、bFGFの存在下において増殖し、これらの可塑性を保持する。前記可塑性は、40回の移動（約200回の集団倍加に対応する）でも不変のままである。図8は、Primo2CAT30（約130回の集団倍加）の脂肪細胞分化および骨芽細胞分化を示す。
【０１６４】
後期継代において、CA集団は、脂肪細胞分化に対して、または骨芽細胞分化に対して異なる特異的マーカーの転写発現を保持する。（図9）Primo2CAT32（140回の集団倍加）。
【０１６５】
4.2.3-Primo2CA細胞がインビトロで筋細胞および内皮細胞に分化する能力  
適切な培養条件下で、Primo2CA細胞は、筋細胞および内皮細胞に約3週後にインビトロで分化することができる。
【０１６６】
i）筋細胞分化
筋細胞分化培地の存在下において4日後に、Primo2CA細胞は、ミオゲニン（免疫組織化学的なラベリング、図21参照）などの筋細胞分化の初期マーカーを発現する。7日後には、ミオゲニン発現はもはや検出できない。
【０１６７】
21日後には、この培地で培養したPrimo2細胞の95%は、筋細胞分化の後期マーカー、すなわち、速い収縮のミオシンを発現する（細胞内ラベリングおよびFACS分析、図22参照）。
【０１６８】
ii）内皮細胞への分化
「肢芽中胚葉」に属する脂肪細胞、骨芽細胞、および筋細胞細胞とは対照的に、内皮細胞は、内臓中胚葉に由来する。DMEMおよびhVEGF121（longlml）から成る培地中で21日間維持した後に、Primo2CA細胞は、フォンビルブラント因子、内皮細胞に特異的なマーカーを発現する（免疫組織化学、図23を参照）。
【０１６９】
5.酵素のアッセイ法による脂肪細胞機能の特性付け
5.1脂肪細胞機能を特徴づけるための方法
5.1.1グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ活性（GPDH）の測定
第1に、GPDH活性が測定される細胞を溶解する。アッセイ法の原理は、以下のスキームに要約することができる：
【化１】
2005534314.tif 000003
NADHの最初の消失速度は、340nm（NADH、DHAP、および細胞可溶化物の存在下において）で決定し、これにより、分解した基質およびそれ故に特異的な酵素活性（タンパク質をアッセイした後）の量を算出することができる。読み込みは、分光光度計で行い、反応速度測定を行うことができる（37℃で自動温度調節したKONTRON Uvicon 860）。
【０１７０】
5.1.2.脂肪分解試験
この試験は、アドレナリン受容体アゴニストの存在下において脂肪細胞によって遊離される放射標識されたグリセリンを測定することからなる。使用される方法は、Bradley DCおよびKaslow HR （Anal Biochem, 1989, 180,11-16）によって記載されている。遊離したグリセリンは、グリセロキナーゼおよびATPおよびγ位に32PでラベルしたATPの存在下においてリン酸化される。次いで、残りのATPを90℃の酸性培地中で加水分解し、モリブデン酸アンモニウムおよびトリエチルアミンによって沈殿させる。32Pでラベルしたグリセロリン酸の形態で組み込まれた放射能をβカウンターで計数することによって推定し、検量線を使用して、pmolで値を表す。
【０１７１】
5.2脂肪細胞機能性の特性付けの結果
5.2.1グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ活性（GPDH）
Primo2CA細胞（ヒトbFGFの存在下においてT24）：  
分化の11日後（2実験）  
対照：77nmol/min/mgのタンパク質  
PPARγ（BRL49653）のアゴニストの存在下において：290nmol/min/mgのタンパク質  
分化の16日後（3実験）  
対照：20nmol/min/mgのタンパク質  
PPARγ（BRL49653）のアゴニストの存在下において：390nmol/min/mgのタンパク質  
Primo2CS細胞（ヒトbFGFの存在下においてT22）：
分化の13日後（3実験）  
対照：22nmol/min/mgのタンパク質  
PPARγ（BRL49653）のアゴニストの存在下において：30nmol/min/mgのタンパク質  
5.2.2  Primo2CA細胞の脂肪分解能力  
異なるβアドレナリン受容体に対して特異的なアゴニストで、Primo2CAT32細胞に対して脂肪分解を行った、すなわち：
イソプロテレノール：β1、β2アドレナリン作動性  
ドブタミン：β1アドレナリン作動性  
テルブタリン：β2アドレナリン作動性  
CL316243 β3 アドレナリン作動性：
以下の脂肪分解率が得られた（グリセリン検量線を使用する）：
対照：5.76nmol/min/mgのタンパク質  
ドブタミン：60.lnmol/min/mgのタンパク質  
テルブタリン：93.78nmol/min/mg：60.1nmol/min/mgのタンパク質
CL316243：17.1nmol/min/mgのタンパク質  
結果は、図10に示してある。
【０１７２】
脂肪分解実験は、β1およびβ2アドレナリン受容体の存在およびβ3アドレナリン受容体の非存在を示し；これらの結果は、インビボの観察に一致する（Galitzkyら；（1997） British J. Pharmacol 122： 1244-1250）。
【０１７３】
6.細胞外基質に結合するカルシウムを検出することによる骨芽細胞機能性の特性付け：  
6.1骨芽細胞の機能性を特徴づけるための方法  
骨芽細胞によって分泌されるカルシウムを検出するために、上記した骨芽細胞分化培地で細胞を培養した。
【０１７４】
適切に分化した後、細胞基質（mat）を0.1NのNaOH溶液で45分間溶解する。次いで、1NのHCl（0.2vol/l体積のNaOH）を添加することによって中和工程を行う。細胞外基質が残っているディッシュを乾燥し、次いで「SIGMAカルシウム検出キット」から溶液とインキュベートする。骨芽細胞によって分泌されるカルシウムの量は、分光光度計（D0575）を使用して前記溶液を測定することによって定量する。
【０１７５】
6.2.結果：骨芽細胞の機能性
骨芽細胞の機能性は、細胞外基質に結合するカルシウムを検出するための技術によって証明した（図11）。
【０１７６】
また、我々は、骨芽細胞分化におけるウシ胎仔血清のバッチの重要性を強調するべきである。これは、特徴づけられておらず、かつ血清バッチに応じて割合が変化して存在する特定のサイトカイン、ホルモン類、または成長因子の骨芽細胞分化における重要な役割を反映する。
【０１７７】
7.細胞ラベリングおよびフローサイトメトリー分析  
本発明の幹細胞のHLAクラスI陰性の性質は、従来の単一ラベル系を使用するフローサイトメトリーによって証明した：
7.1単一ラベリング  
細胞を単離し、次いでPBS中で洗浄する。遠心処理後、細胞を再懸濁し、4℃で30分間10μg/mlの濃度で一次抗体とインキュベートした。使用した抗体は、クラスIHLA分子に対して向けられたモノクローナル・マウス抗体（W6/32、Novocastra）またはネガティブ対照として使用したマウスIgG抗体（Santa Cruz）のいずれかである。それぞれの条件に使用した細胞数は、5×105〜106である。この分析のために以下の細胞を使用した：
HeLa：ヒト腫瘍細胞（HLAクラスI陽性：陽性対照）。  
SVF：成体脂肪組織、集団倍加なし（HLAクラスI陽性）  
Primo2CA：120回の集団倍加  
Primo2CS：45回の集団倍加。
【０１７８】
次いで、細胞を洗浄し、4℃で20分間、FITCに結合したマウス抗IgG抗体（0.2μg/106細胞）（Caltag）である抗体（二次）と共にインキュベートした。
【０１７９】
次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（Scan FACS Becton Dickinson）によってこれらの蛍光を解析する。
【０１８０】
結果を図15に示してあり、本発明の幹細胞（たとえば、Primo2CA）は、単一ラベルのフローサイトメトリーによって検出することができないレベルのHLAクラスI分子発現を有することを示す。したがって、本発明の幹細胞は、「HLAクラスI陰性」である。
【０１８１】
また、このフローサイトメトリー実験は、PrimolCAおよびPrimo3CAからの幹細胞で、およびPrimo2CSからの細胞でも行った（図15）。全ての場合において、HLAクラスIの表面発現は、陰性であった。
【０１８２】
8.CA細胞からの多分化能クローンの取得  
Primo2CA細胞を、限界希釈条件、すなわち24穴プレートのウェルにつき細胞の1/3にまき、次いで、5ng/mlのbFGFを含む10%のFCSの存在下において維持した。
【０１８３】
10日後にクローンを分離し、増幅した。これらのクローンは、分化を生じるまでこれらの未分化な表現型を維持した。次いで、これらが脂肪細胞および骨芽細胞へ分化する能力を証明した。
【０１８４】
図16は、2つのクローン、CAlおよびCA3を示しており、これらを培地中におき、脂肪細胞および骨芽細胞に分化させた。脂肪細胞は、レッドオイル染色によって明らかにし、骨芽細胞は、アリザリンレッド染色によって明らかにした。また、フローサイトメトリーによって解析したクローンは、HLAクラスIおよびII陰性であることが明らかにされた。
【０１８５】
9.幹細胞における導入遺伝子の発現  
本発明の幹細胞、特にクローンCA1由来の細胞（実施例7に記載したとおりに得られる）には、抗生物質抵抗性、ピューロマイシン、およびLTRプロモーターの制御下にリポーター遺伝子LacZの遺伝子を発現するレトロウイルスによって、21回の集団倍加段階で導入した。感染性のビリオンは、ベクターを発現しており、水疱性口内炎のためにウイルスのGタンパク質を含むプラスミドpFB-Neo-lacZおよびベクターPVPack-VSVGで同時トランスフェクトされたPVPackGPベクター（gagおよびpol配列を含む）によって安定にトランスフェクトされた293細胞から産生した。図17は、その後にピューロマイシンの存在下において選択された導入細胞は、β-ガラクトシダーゼ活性によってインサイチュウで示されるように、全てがLacZ遺伝子を発現する。
【０１８６】
10.CA幹細胞におけるOct-4、ABCG2およびRex-1の発現
Oct-4は、マウス胚幹細胞に特異的に発現され、これらの多能性を維持するために不可欠な転写因子である。また、Oct-4は、ヒト胚幹細胞によって発現されることを示した。
【０１８７】
Oct-4の転写発現を本発明の幹細胞で証明した。RNAをCA細胞（均質な集団およびクローンの集団）から抽出し、Oct-4発現は、RT-PCRによって増幅し、次いでイブリダイゼーションによって検出した。PCR条件は、94℃（1分）；57℃（1分）；72℃（1分）を45サイクルであった。-RT：ネガティブ対照。
【０１８８】
同様に、ABCG2の転写発現を本発明の幹細胞で証明した。RNAをCA細胞（均質な集団およびクローンの集団）から抽出し、ABCG2発現は、RT-PCRによって増幅し、次いでイブリダイゼーションによって検出した。ABCG2のためのPCR条件は、94℃（1分）；60℃（1分）；72℃（1分）を31サイクルであった。
【０１８９】
図18は、移動16回（48回の集団倍加）のPrimo2CA細胞で、および移動5回（15回の集団倍加）のPrimo2CA1クローンの細胞について得られた結果を示す。これらは、Oct-4およびABCG2を発現する。
【０１９０】
また、Primo2CA細胞は、転写因子Rex-1を発現する（図18、右側）。転写因子Rex-1は、マウスおよびヒト胚幹細胞の特異的なマーカーである。Rex-1のためのPCR条件は、以下の通りである：94℃1分、60℃1分、72℃1分、31回のサイクル数、72度5分を1サイクル。
【０１９１】
11.表面マーカーに関する本発明のCA細胞の特徴付け  
本発明のCA細胞、特にPrimo2CA細胞の特徴付けは、フローサイトメトリーを使用して、表面マーカーに関してさらに調査した。
【０１９２】
11.1.フローサイトメトリーによって表面マーカーの発現を解析するためのための方法論：
ラベリングのプロトコルは、上記した通りである（実施例7を参照されたい）。使用した抗体は、以下の通りであった：
フルオレッセイン（FITC）結合HLAクラスI；
フィコエリトリン（PE）結合HLA-DR（HLAクラスII組織）；
PE結合CD-3（Tリンパ球の標識）；
FITC結合CD13（骨髄の間質性細胞、内皮細胞、顆粒球／単球の初期前駆体、およびこれらの子孫のマーカー）
11.2表面マーカーに関する本発明のCA細胞の特性付けの結果：
Primo2CA細胞は、CD3、HLAクラスI、およびHLA-DRの発現について表面陰性である。対照的に、これらは、CD13陽性である（なかでも、骨髄間質細胞にマーカーを発現した（図20を参照されたい）。
【０１９３】
表面HLAクラスIおよびII分子の非存在は、Primo2CAの非免疫原性を強く示差する。
【０１９４】
Primo2CA細胞は、Reyesら（Blood, Nov 2001）によって記載されたヒト骨髄細胞とは異なる点に注意することは興味深い。
【０１９５】
「中胚葉性の前駆体細胞」に対してMPCと名付けられたこれらの細胞は、EGFおよびPDGFの存在を必須として、低濃度のウシ胎仔血清（2%）を含む培地中において低密度で培養したときに、HLAクラスIおよびクラスII組織陰性であり、かつCD13陽性である。対照的に、10%のウシ胎仔血清（本発明の細胞、特にPrimo2CA細胞を増幅するために使用される濃度）の存在下において培養すると、hMPCsは、逆の表現型（すなわち、HLAクラスIおよびHLA-DR陽性およびCD13陰性）を示す。hMIPCsを10%のウシ胎仔血清またはbFGF（図2）の存在下において培養すると、非常に急速にこれらは増殖能を失って死滅する。
【０１９６】
12.内本発明のCA幹細胞の皮細胞への、および筋細胞へのインビボ分化：
実施例4では、本発明の細胞がインビトロで3週後に内皮細胞に、および筋細胞に分化することができることを証明した。
【０１９７】
以下に示した実施例は、mdxマウス（ヒトのデュシェーヌ病の動物モデル）の筋肉に注射した本発明のヒトCA細胞（特にPrimo2CA、Primo1CA、およびPrimo3CAの細胞）が、10日後のみに正常な繊維を再生することができることを証明した。驚くべきことに、前記細胞は、非免疫抑制性のマウスに移植されるときには拒絶されない。前記細胞により、これらがインビボで再生する能力およびこれらには免疫原性がないことによって、同種間状況において多くの治療的な展望を提供する。
【０１９８】
12.1移植プロトコルおよび免疫蛍光およびFISH（蛍光インサイチュウハイブリダイゼーション）によるインビボでの再生の分析 
12.1.1.移植プロトコル
本発明のCA細胞（より具体的には、Primo2CA、Primo1CA、およびPrimo3CAの細胞）のインビボでの再生能を分析するために、mdxマウス動物モデル（C57BL／lOScSn DMDmdMDX/J）を使用した。
【０１９９】
これらのmdxマウス（X染色体にリンクした筋ジストロフィー）は、これらがジストロフィン（X染色体上に位置する）の遺伝子の点突然変異を有し、ジストロフィンの非翻訳を引き起こすため、ヒトのデュシェンヌ筋障害を調査するために良好なモデルを構成する。ヒトでは、ジストロフィン（ほとんど役割が分かっていないタンパク質）が存在しないと、現在ほとんど理解されないイベントのカスケードを引き起こし、筋線維の進行性の消失および死に至る。
【０２００】
以下の細胞をインビボでの筋肉再生実験に使用した：
・80回から160回の間の集団倍加（より正確に言うと、80回の、120回の、160回の集団倍加）で得られたPrimo2CA細胞；
・50回および120回の集団倍加で得たPrimo1CA細胞；
・45回、80回、110回の集団倍加のPrimo3CA細胞。
【０２０１】
実験の全てにおいて、両方の性の3〜4月齢のmdxマウスを使用した。
【０２０２】
左前脛骨筋肉に、50μlの量のHBSS（ハンクの緩衝化塩類溶液）で吸い取った150000個のPrimo2CA、Primo1CA、またはPrimo3CA細胞を移植した。同じ量のHBSSをネガティブ対照として役立つように右の筋肉に注射した。
【０２０３】
本発明の細胞の筋肉再生脳を分析するために、第一段階において、我々は、免疫性拒否のリスクを回避するために、免疫抑制薬（シクロスポリン）で移植マウスを処理した。シクロスポリンは、移植したものの10mg/kg動物重量／日の濃度で、1日に一度腹腔内に投与した。
【０２０４】
同時にシクロスポリンで処理した移植mdxマウスを10日後に屠殺した。
【０２０５】
平行して、Primo2CA、Primo1CA、またはPrimo3CA細胞の免疫原性がないことを試験するために、本発明者らは、同じ移植プロトコルを使用したが、mdxマウスに対しては通常の免疫系を使用し、すなわちシクロスポリンで処理しなかった。
【０２０６】
移植された筋肉および対照筋肉（50μlのHBSSだけを注射したもの）を回収し、イソペンタン、次いで液体窒素中で凍結した。
【０２０７】
12.1.2免疫蛍光によるジストロフィンの検出
12μMの連続切片は、凍結して、50、75、および100%のエタノール中で10分連続して通過させることによって脱水した筋肉から調製した。
【０２０８】
ジストロフィンのラベリングを実行するために、凍結切片を外界温度で15分間メタノール／氷酢酸（70/30、v／v）中で固定した。PBS（リン酸緩衝食塩水）で洗浄して、ブロッキング溶液（3%PBS+BSA（ウシ血清アルブミン）中で30分間インキュベートした後、切片をヒト・ジストロフィンに対して特異的な抗体（マウス抗ヒトIgG2a、Novocastra NCL-DYS3）、またはヒト、ラット、およびマウスのいずれのジストロフィンも認識する抗体（マウスIgG1 NCL-DYS2、Novacastra）と共に1時間インキュベートした。バックグラウンド・ノイズを減少させるために、抗体（Molecular Probes）に応じて、「Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG2a またはIgG1ラベリング・キット」を使用して、抗体をまずフルオレッセイン（Alexa Fluor 488）と結合させた。
【０２０９】
次いで、切片をPBSおよび水で洗浄し、蛍光顕微鏡（Olympus BH2）を使用して解析した。
【０２１０】
12.1.3.FISH（蛍光インサイチュウハイブリダイゼーション）によるヒト移植核の検出
スライドを、濃度増大（70、80、および100%）しながらエタノールの浴槽中で2分間連続して通過することによって脱水し、次いで70%のホルムアミド／2×SSC溶液（クエン酸塩加塩類溶液）中で73℃において2分30秒間変性させた。次いで、ハイブリダイゼーションへ進む前に、スライドを再水和された（100、80、および70%の濃度を減少したエタノール浴槽）。
【０２１１】
ヒト核を検出するために使用したプローブは、ジゴキシゲニン（CP5095-DG.5、Appligene Oncor）と結合した全てのヒト動原体（α-サテライト）に特異的なプローブであった。
【０２１２】
プローブは、まず最初にハイブリダイゼーション緩衝液Hybrisol IV（Appligene Oncor）に希釈し（10μlの緩衝液に対して1μLのプローブ）、72℃で5分間変性させ、次いでスライドに沈着させた。ハイブリダイゼーション工程は、湿室で12時間、37℃で行った。
【０２１３】
次いで、スライドを洗浄した：50%のホルムアミド／2×SSC中で43℃において15分間を1洗浄、続いて2×SSC中で37℃において8分間洗浄する。
【０２１４】
最終工程は、ローダミン結合抗ジゴキシゲニン抗体（Appligene Oncor）をスライドに適用することからなる検出工程（暗い所で5分）であった。
【０２１５】
切片を解析する前に、DAPI溶液（青色染色）を使用して、核を完全に染色した。
【０２１６】
次いで、100ワットのランプおよびフィルターシステム（Perceptive Scientific International）を有する蛍光顕微鏡（Axiophot Zeiss）下でスライドを観察した。
【０２１７】
12.1.4.二重免疫蛍光ラベリング／FISH
ジストロフィンを再発現する筋線維と共にヒト核を共局在のために、本発明者らは、二重ラベリング（ジストロフィン／ヒト核）を行った。この目的のために、FISHでヒト核をラベルする前にジストロフィン検出工程を行った。
【０２１８】
12.2結果：インビボでの本発明のCA細胞の筋肉再生能力および非免疫原性：
12.2.1インビボにおける筋肉再生能力  
インビボにおける成体幹細胞の多能性に関する多くの研究では、特に前記細胞の融合力を証明した後が問題であった（Teradaら、Nature 2002 ； Wurmserら、Nature, 2002およびYingら、Nature, 2002）。さらに、特定の研究では、前記細胞が、これらを移植した組織に特異的なマーカーを発現する能力は、極めて珍しいイベントであることを示唆する（Wagersら、Science,2002； Morsheadら、Nature, 2002）。
【０２１９】
前述の問題を回避するために、mdxマウス（デュシェーヌ病の動物モデル）を使用した。これらのマウスは、ジストロフィンに欠損（遺伝子に点突然変異）がある。（実際は、招集のジストロフィンを再発現する復帰した繊維が存在するが、これらの繊維の割合は、1%未満である（Hoffmanら、J Neurol Sci, 1990； Gillis, J Muscle Research and Cell Motility, 1999））。
【０２２０】
第1に、あらゆる拒絶の問題を回避するために、mdxマウスを免疫抑制薬（シクロスポリン）で処理した。前脛骨筋への少数のPrimo2CA細胞（100000〜150000細胞）の注射により、10日のみにおいて繊維の約50%にジストロフィンの回復を生じた。これらの陽性の繊維は、クラスター（注射点に対応する）に集まった。
【０２２１】
上記の結果と一致して、FISHを使用すると、ジストロフィンが陽性の筋繊維を有するヒト核（図24および25を参照されたい）の位置を特定することができる。
【０２２２】
同様の結果は、bFGF（FGF-2）によって処理された、または処理されていない、60回および160回の集団倍加間のPrimo2CA細胞についても得られた。同様の結果は、Primo2CA集団に由来するCA1クローンでも得られた。
【０２２３】
12.2.2インビボCA細胞の非免疫原性：
大部分の体細胞とは対照的に、本発明のCA細胞は、HLAクラスIマーカー（実施例7を参照されたい）および表面HLAクラスIIマーカー（実施例11）がない。この極めて珍しい表現型は、本発明のCA細胞の非免疫原性を強く示差する。
【０２２４】
インビボでのこれらの細胞の非免疫原性を確認するために、12.2.1の節に記載したものと同様の実験法を、非免疫抑制性のmdxマウスは使用したことを除いて使用した。
【０２２５】
移植の10日間後に、移植して、かつ免疫抑制していないマウスの筋肉では、シクロスポリンで処理したマウスのものと同等のレベルのジストロフィンを再発現する。免疫抑制薬の非存在下において、Primo2CA細胞について、並びにPrimo1CA細胞およびPrimo3CA細胞について、筋肉再生能を観察した（Primo2CA細胞について図24およびPrimo1CA細胞およびPrimo3CA細胞について図31を参照されたい）。
【０２２６】
50日の移植の後、免疫抑制薬の非存在下において、ジストロフィンが陽性の筋線維数は、注射した前脛骨筋において増大し続けたが、繊維が、腓腹筋などのその他の筋肉においても見いだされた（図25を参照されたい）。これらの結果は、Primo2CA細胞が注入点で筋肉を再生させることでだけでなく、移動して周囲の筋肉も修復することができることを強く示唆する。繊維内のヒト起源の周辺核の割合の増大および中心的核の割合の減少が、移植の10〜50日後に観察されたことから（それぞれ73%、85%、および27%、15%）、注入された細胞が筋細胞の終末分化に関与していることが示される。
【０２２７】
FISHを使用すると、ヒト核は、なおも存在し、ジストロフィン陽性の繊維と共に局在ていした。さらに、陽性繊維の外面における一定数のヒト核の局在化は、ヒト衛星細胞および／またはヒト起源の内皮細胞が存在することを示差する。
【０２２８】
比較によると、大量のヒト筋芽細胞（4,000,000）を非免疫抑制性マウスへ移植すると、1月後に完全な拒絶を生じ、したがって筋肉再生はなかった（Huardら、Muscle and Nerve, 1994）。
【０２２９】
移植の80日後、ジストロフィン陽性の筋線維数は、注入された筋肉において増大し続け、繊維は、腓腹筋においても見いだされた（図26を参照されたい）。
【０２３０】
初期の50%に対して、6月移植の後に繊維の80%以上がヒト・ジストロフィンを発現した（図27）。さらに、繊維内で、我々は、ジストロフィン発現が同じ繊維内で不規則であった移植初期と比較して、より規則的なジストロフィンの発現を決定した。さらに、移植された筋肉は、繊維の形態に実質的な改善を示した（より規則的で、およびこの年齢のmdxマウスにおいて重要なプロセスである壊死が存在しない）。
【０２３１】
これらの観察は、移植された細胞が、免疫適格性のマウスにおいて何ら拒絶反応を生じないことを示す。移植された細胞の非免疫原性の性質を、ヘマトキシリン染色を使用して証明した。拒絶反応がないこと（CD3+Tリンパ球による浸潤がないこと）は、Primo2CA細胞の移植の10日（図29）、50日、80日（結果示さず）後に、または6月後（図30を参照されたい）に観察されなかった。同様に、リンパ球浸潤がないことも、Primo1CAおよびPrimo3CA細胞の移植の10日後に観察することができ、拒絶反応がないことを確証させる。同じ結果がPrimo1CA細胞でも得られた。したがって、Primo1CA細胞およびPrimo3CA細胞の免疫特権的な挙動は、Primo2CAで観察されたものと同じであった。これらの結果は、抗CD3抗体を使用しても確認され、リンパ球浸潤が存在しないことを証明している。
【０２３２】
対照的に、ヒト脂肪組織から単離された未精製のヒト間質性血管細胞の移植では、細胞障害能および体液性の免疫反応を誘導した（図29（c）および（c'））。
【０２３３】
結論として、移植の6月後、細胞は、ヒト・ジストロフィンを高い割合で発現し、かつ壊死を有さない移植された筋肉の実質的な改善を生じ、これは同じ年齢の無処置のmdxマウスでは観察されない；（これは、免疫抑制薬の非存在下であった）。
【０２３４】
移植された筋肉のミオ繊維に発現されるヒト起源のジストロフィンは、ヒト・ジストロフィンに特異的な抗体（ヒト・ジストロフィンのN末端の末端に向けた：マウス抗ヒトIgG2a：NovocastraからのNCL-DYS3）およびヒト・ジストロフィンおよびマウスのジストロフィンを認識することができる抗体（ヒトおよびマウスのジストロフィンのC末端の末端に向けた：マウス抗ヒトIgG1：NovocastraからのNCL-DYS2）を使用して比較免疫検出によって証明された。
【０２３５】
この比較免疫検出の結果を図28に示してある。移植の10日後に、ジストロフィンを発現するミオ繊維の存在および前脛骨の細胞下の位置が見える。図28（a）と（b）の類似性から、発現されたジストロフィンがヒト起源であることを示す。ヒト・ジストロフィンは、筋細胞膜の下に位置する。対照的に、マウス・コラーゲンIIIは、ミオ繊維間の細胞外空間に存在する（図28（c）〜（e））。
【０２３６】
異種間の状況、すなわちまだ免疫学的に非常に異なる（mdxマウス）生物体で、本発明のCA細胞の寛容に関与する機構を解明しなければならない。
【０２３７】
しかし、筋線維の外周に位置する一定数の細胞が、この耐性に重要な役割を果たすと推定されるであろう。これらの細胞は、免疫抑制因子、たとえばIL1Oなどの抗炎症性のTh2タイプのサイトカインを合成することによって、および／または表面タンパク質を発現することによって局部的な免疫抑制の役割を担い、宿主の同種反応性リンパ球による認識の欠如を引き起こすのかもしれない（Jorgensenら、Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy, Gene Therapy 10, 928-931（2003））。
【０２３８】
また、これらの細胞は、宿主の免疫系を再教育することによって、普遍的な寛容を誘導しうる。宿主の胸腺および脾臓にヒトCA細胞が存在することは、この仮説を補強する（Fandrich Fら、“Preimplantation-stage stem cells induce long-term allogeneic graft acceptance without supplementary host conditioning”, Nat. Med 8, 171-178 （2002））。
【０２３９】
これらの結果は、拒絶されることのない筋肉を再生させることができる本発明のヒトCA細胞の免疫特権を証明する。したがって、これらの細胞は、同種移植における細胞療法に対して多くの展望を提供する。特に、自家移植が不可能である筋障害などの遺伝病のためには、Primo2CAと同様の細胞の使用により、良好な治療の変形例を構成するであろう。
【０２４０】
図に対する手がかり
本発明の種々の態様を図に示してある：
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】pH6で検出されるCAおよびCS細胞の内因性のβ-ガラクトシダーゼ活性。    内因性のβ-ガラクトシダーゼ活性を示す（細胞老化を示す）Xgal染色を60回の集団倍加（細胞移入20回（「T20」）に対応する）段階で行い、CS集団が老化しているが（0.415±0.025%お老化の程度）、CA集団は単に静止状態である（0.045±0.01%の老化の程度）ことが分かる。
【図２】後期の段階における、すなわち50回の集団倍加後のCAおよびCS集団に対する5ng／mlの濃度でのbFGF（基性線維芽細胞成長因子）の効果。    図2は、CA±bFGFおよびCS±bFGFの増殖を示す（横軸：12000細胞／35mm直径のディッシュにおけるプレーティング後の日数；縦軸：細胞（×1000）数／ディッシュ）。CA集団の細胞のみが効率的にbFGFに反応する。50回の集団倍加の後、bFGFは、CS集団に対して有意な効果を有さない。これらの観察は、CA集団の静止状態およびCS集団の老化の状態を確証させる。
【図３】bFGFの非存在下およびbFGFの存在下における後期段階（50回の集団倍加の後）のCA細胞の形態。    「W／OFGF」=bFGFなし    「+bFGF」=bFGF（5ng／ml）    「FCS」=ウシ胎仔血清    bFGFは、細胞形態に変化を引き起こす。静止状態のときに、細胞は、平らで拡張する。bFGFの存在下では、およびしたがって、増殖期においては、これらは線維芽細胞の形態をとる。bFGFの効果は、可逆性である。
【図４】Primo2CA細胞の核型。    Primo2細胞を、bFGFの存在下または非存在下において、および種々の継代において、2つの亜集団CAおよびCSについて核型を決定した。Primo2CA細胞については、核型は、以下の段階で生じた：T21=80回の集団倍加；T23=90回の集団倍加；T34=130回の集団倍加。全ての場合において、核型は正常であった。図4は、Primo2CA細胞の核型の例を示す。
【図５】Primo2CAおよびPrimo2CSのイ細胞のンビトロでの初期の脂肪細胞への分化：  CST1：継代1（3回の集団倍加に対応する）における集団CS；  CST7：継代7（21回の集団倍加に対応する）における集団CS；  CAT：継代5（15回の集団倍加に対応する）における集団CA。オイルレッドO染色。
【図６】Primo2細胞分化の間の脂肪生成マーカーの転写性の発現。ノーザンブロット分析。
【０２４２】
JO、J7、J12=それぞれ分化誘導後の0、7、および12日、
CAT14：継代14（42回の集団倍加に対応する）におけるPrimo2CA集団；
CST16：継代16（48回の集団倍加に対応する）におけるPrimo2CS集団。
【図７】初期の継代におけるCAおよびCS細胞のインビトロでの骨芽細胞への分化：  CST1：継代1（3回の集団倍加に対応する）におけるCS集団；  CST7：継代7（21回の集団倍加に対応する）におけるCS集団；  CAT5：継代5（15回の集団倍加に対応する）におけるCA集団。
【０２４３】
アリザリンレッド染色。
【図８】後期の継代におけるCA細胞の分化能力。
【０２４４】
A：Primo2CA細胞の脂肪細胞分化。脂肪細胞分化の誘導は、細胞がT30段階（約130回の集団倍加）であるときに行った。オイルレッドO染色。
【０２４５】
B：Primo2CA細胞の骨芽細胞分化。骨芽細胞分化の誘導は、細胞がT30段階（約130回の集団倍加）であるときに行った。アリザリンレッド染色。
【図９】脂肪細胞および骨芽細胞の機能性：脂肪細胞分化のための、または骨芽細胞分化のための特異的なマーカーの転写性の発現。
【０２４６】
マーカーhPPARγ-2、haP2、およびhOCの転写性の発現は、RT-PCRを使用して決定した。使用した細胞は、i）Primo2CAからの脂肪細胞（図の左側）、段階T32（約140回の集団倍加）において脂肪細胞誘導を行い、ii）Primo2CAからの骨芽細胞（図の右側）、段階T32（約140回の集団倍加）において骨芽細胞誘導を行った。
【０２４７】
hPPARγ-2：ヒト・ペルオキシゾーム増殖因子活性型受容体γ：脂肪細胞のマーカー。
【０２４８】
haP2：ヒト脂肪酸結合タンパク質：
hOC：脂肪細胞標識。
【図１０】ヒト・オステオカルシン（骨芽細胞標識）：脂肪細胞の機能性：Primo2CA細胞の脂肪分解能力。    脂肪分解は、種々のβーアドレナリン作動性受容体に特異的なアゴニストで、Primo2CAT32細胞（約140回の集団倍加）から得られる脂肪細胞に対して行った。図10は、得られた脂肪分解の割合を示し、β3アドレナリン受容体の非存在を確証させる。
【図１１】骨芽細胞の機能性：細胞外基質に関係したカルシウムの検出。    細胞基質（mat）の溶解の後の培養皿に存在する細胞外基質を「SIGMAカルシウム検出キット」からの溶液と共にインキュベートし、次いで乾燥させた。骨芽細胞によって分泌されるカルシウムの量は、分光光度計（OD 575）を使用して溶液を読み込むことによって定量した。骨芽細胞機能性を確認した。骨芽細胞によって分泌されるカルシウムの量は、血清バッチ（211707、210407、210811、210812、3903、従来）の関数として変化した。これらのバッチは、異なる比率で存在する特徴づけられていないサイトカイン、ホルモン類、または成長因子を含んでもよい。    脂肪細胞は、有意な量のカルシウムを分泌しなかった。
【図１２】集団倍加の数の関数としてのPrimo2CA細胞の形態    A：40回の集団倍加  B：100回の集団倍加：静止状態  C：150回の集団倍加：静止状態  D：150回の集団倍加+bFGF：増殖期。
【０２４９】
bFGFは、細胞の形態の変化を引き起こす。静止状態のときに、これらは平らになり拡張する。bFGFの存在下において、およびしたがって、増殖期において、これらは、線維芽細胞の形態をとる（図3も参照されたい）。
【図１３】Primo1CA、Primo3CA、およびPrimo6CAの脂肪細胞分化能力：分化の8日後の脂肪細胞。    A：Primo1：50回の集団倍加で誘導される分化    B：Primo3：40回の集団倍加で誘導される分化    C：Primo6：40回の集団倍加で誘導される分化
【図１４】Primo1CA、Primo3CA、およびPrimo6CAの脂肪細胞分化能力：オイルレッドO染色    A：Primo1：40回の集団倍加で誘導される分化    B：Primo3：25回の集団倍加で誘導される分化    C：Primo6：25回の集団倍加で誘導される分化
【図１５】細胞のマーキングおよびフローサイトメトリー分析。
【０２５０】
Primo2CA幹細胞のHLAクラスI陰性の性質の証明。  
単一ラベル：FITC  
1.HELA：ヒト腫瘍細胞。HLAクラスI陽性。  
2.SVF：成体脂肪組織（集団倍加がない）。HLAクラスI陽性。  
3.Primo2CA：120回の集団倍加。  
4.Primo2CS：45回の集団倍加  
黒線：マウスIgG：ネガティブ対照抗体  
灰色の線：抗HLAクラスI W6/32抗体。
【図１６】CA細胞由来の多分化能クローンの取得。    クローンCA1およびCA3を脂肪細胞および骨芽細胞への分化が可能な培地に置いた。
【０２５１】
脂肪細胞はレッドオイルでの染色によって明らかにし、骨芽細胞はアリザリンレッドによって明らかにした。
【図１７】CA幹細胞における導入遺伝子の発現。    CA幹細胞には、抗生物質、ピューロマイシンに対して抵抗性の遺伝子およびリポーター遺伝子LacZを発現するレトロウイルスによって伝達した。次いで、これらをピューロマイシンの存在下で選択した。選択した細胞は、全てLacZ遺伝子を発現し、β-ガラクトシダーゼ活性によってインサイチュウで明らかにされた。
【図１８】CA幹細胞におけるOct-4、Rex-1、およびABCG2の発現：  左側の写真：CA細胞およびクローンCA1におけるOct-4およびABCG2 RNAの発現。    RNAをCAおよびCA1細胞から抽出し、Oct-4およびABCG2の発現は：-RT-PCRによって増幅し、-次いで、ハイブリダイゼーションによって検出する。    右側写真：80回および160回の集団倍加後のPrimo2CA細胞によるRex-1転写因子の発現。転写因子Rex-1は、胚幹細胞の未分化な状態の維持に関与している。数「1」、「2」および「3」は、それぞれ「-RT（ネガティブ対照）」、「CA細胞」、および「CA1細胞」を意味する。    PCR条件は：  -Oct-4のために：94℃、1分；57℃、1分；72℃、1分を45サイクル。
【０２５２】
プライマー：5'-GACAACAATGAAAATCTTCAGGAGA-3'および5'-TTCTGGCGCCGGTTACAGAACCA-3'、
220塩基対断片のための内部プライマー5'-CACTCGGTTCTCGATACTGG-3'  
-ABCG2のために：94℃、1分；60℃、1分；72℃、1分を31サイクル、
プライマー：5'-GGCCTCAGGAAGACTTATGT-3'および5'-AAGGAGGTGGTGTAGCTGAT-3'  
-Rex-1のために：94℃、1分、60℃、1分、72℃、1分を31回のサイクル数；72℃、5分、1サイクル  
プライマー：5'-CTCTCCAGTATGAACCAGG-3'および5'-GAAAGGATCAGAACAACAGC-3'  
400塩基対断片のための内部プライマー5'-GGCATTGACCTATCAGATCC-3'。
【図１９】ヒト脂肪組織から成体幹細胞を産生するための方法の好ましい変形例の概略図。
【図２０】表面マーカーに関するPrimo2CA細胞の特徴。  80回、120回、160回の集団倍加段階で、Primo2CA細胞を、予めFITCまたはフィコエリトリンと結合された抗HLA I、抗HLA-DRantm-CD3、抗CD13抗体でラベルした。対照=IgG；以下の抗体を使用した：フルオレッセイン（FITC）と結合されたHLAクラスI；フィコエリトリン（PE）と結合されたHLA-DR（HLAクラスII組織）；PEと結合されたCD3（Tリンパ球の標識）；FITCと結合されたCD13（骨髄、内皮細胞、顆粒球／単球の初期の前駆体、およびこれらの子孫の間質性細胞のマーカー）。    薄い線：IgG対照    濃い線：関心対象の抗体。
【図２１】4日後におけるインビトロでの筋細胞分化。  ミオゲニン（筋細胞分化の初期の因子）の免疫組織化学による検出。図21は、150回の集団倍加におけるPrimo2CA細胞の、筋細胞分化培地の存在下において4日後の顕微鏡写真を図示する。細胞を外界温度で10分間4%のパラホルムアルデヒドで固定して、PBS/0.1%のトリトンX1O0の存在下において10分間透過化処理し；次いで、3%のH2O2と共に5分間細胞をインキュベートすることによって内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックする。次いで、細胞を一次抗体：抗ミオゲニン抗体（マウス抗ヒトIgG）（1：100）と共に外界温度で30分〜1時間、次いで二次抗体（ペルオキシダーゼと結合された抗マウスのIgG）と共にインキュベートする。
【図２２】21日後におけるインビトロでの筋細胞分化。    筋細胞分化培地、速い単収縮ミオシンまたはFTミオシンの存在下において21日後に、筋細胞分化の後期マーカー（細胞内マーカー）を検出した。FACSによる検出：Primo2CA細胞（150回の集団倍加）を剥離させた後に、これらをPBS／1%のホルムアルデヒドの存在下において外界温度で15分間固定し、次いで外界温度で7〜8分間ジギトニン溶液（10μg/mlのPBS）で可溶化処理する。次いで、表面マーカーの発現のために記載されているプロトコルを用いて抗体ラベリングを行う（図20）。使用した抗体は、フィコエリトリンに直接結合され、かつヒトFTミオシンを認識するマウス抗体である。    薄い線：IgG対照    濃い線：FT-ミオシン。
【図２３】内皮細胞のインビトロでの分化。    免疫組織化学によるフォンウィルブランド因子（vWF）（内皮細胞の特異的なマーカー）の検出。図23は、血管形成培地の存在下において21日後の、150回の集団倍加でのPrimo2CA細胞によるvWFの発現を図示する。細胞を外界温度で10分間4%のパラホルムアルデヒドで固定して、PBS/0.1%のトリトンX1O0の存在下において10分間透過化処理し；次いで、3%のH2O2と共に5分間細胞をインキュベートすることによって内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックする。次いで、細胞を一次抗体：抗vWF（ヒト、ラットおよびマウスのいずれのvWFも認識するヤギIgG）と共に外界温度で30分、次いで二次抗体（ペルオキシダーゼと結合された抗マウスのIgG）（1：100）と共にインキュベートする。DMEMおよびhVEGF121（lOng/ml）からなる培地中で21日間維持したあと、Primo2CA細胞は、vWFを発現する。
【図２４】免疫抑制薬を伴わずにmdxマウスにおいて移植の10日、50日、80日、および6月後における、Primo2CA細胞のインビボで筋肉を再生させる力：図24、25、26、および27は、前脛骨筋内へのPrimo2CA細胞の移植の10日（図24）、50日（図25）、80日（図26）および6月（図27）後においてジストロフィンを再発現する筋線維とヒト核の共局在を図示する。この共局在は、免疫蛍光によってジストロフィンを、およびFISHによってヒト核を二重ラベリングすることによって行った。移植された細胞は、160回の集団倍加（総計150000回）のPrinio2CA細胞である。    ジストロフィン免疫蛍光検出工程は、FISHによってヒト核にラベルする前に行った：  -免疫蛍光によるジストロフィンの検出：筋肉切片を、予めフルオレッセインと結合させたヒト・ジストロフィンを認識する抗体と共に1時間インキュベートする。使用した抗体は、以下の通りである：  ヒトおよびマウス・ジストロフィンのいずれかに特異的な抗体（マウス抗ヒトIgG1：ヒトおよびマウス・ジストロフィンのC末端の末端に対して向けられたNovocastraからのNCL-DYS2）または、  ヒト・ジストロフィンに特異的な抗体（マウス抗ヒトIgG2a：ヒト・ジストロフィンのN末端の末端に対して向けられたNovocastraからのNCL-DYS3）。    FISHによるヒト核の検出：  ヒト核を検出するために使用したプローブは、ジゴキシゲニン（CP5095-DG.5、Appligene Oncor）と結合されたヒト動原体（α-サテライト）に特異的なプローブである。検出工程は、スライドにローダミンと結合させた抗ジゴキシゲニン抗体を適用することを含む。切片を分析する前に、DAPI溶液（青色染色）を使用して、核を完全に染色する。次いで、100ワットの電球およびフィルターシステム（Perspective Scientific International）を有する蛍光顕微鏡（Axiophot Zeiss）下でスライドを観察する。
【０２５３】
緑：ジストロフィン；  
赤：ヒト動原体  
青：核（ヒトおよびマウス）  
TA：前脛骨筋  
G：腓腹筋  
図24（10日）：抗ジストロフィン抗体：NCL-DYS2  
左側写真：無処置の前脛骨筋（対照）；  
中心の写真：シクロスポリン（移植の10日後）で処理したmdxマウスの前脛骨筋；  
右側写真：免疫適格性のマウス（シクロスポリンなし）（移植の10日後）の前脛骨筋。
【図２５】図25（50日）：抗ジストロフィン抗体：NCL-DYS2    左側写真：無処置の前脛骨筋（対照）；    中心の写真：シクロスポリン（移植の50日後）で処理したmdxマウスの前脛骨筋；    右側写真：免疫適格性のマウス（シクロスポリンなし）（移植の50日後）の前脛骨筋。
【図２６】図26（80日）：抗ジストロフィン抗体：NCL-DYS2    左側写真：シクロスポリン（移植の80日後）で処理したmdxマウスの前脛骨筋；    右側写真：免疫適格性のマウス（シクロスポリンなし）（移植の80日後）の前脛骨筋。
【図２７】図27（6月）：抗ジストロフィン抗体：NCL-DYS2  左側写真：無処置の前脛骨筋（対照）；    中心の写真：シクロスポリン（移植の6月後）で処理したmdxマウスの前脛骨筋；    右側写真：無処置の前脛骨筋（対照）；
【図２８】移植された筋肉のミオ繊維に発現されたジストロフィンのヒト起源の比較免疫検出による証明：ジストロフィンを発現するミオ繊維の存在および移植の10日後の前脛骨における細胞下の局在の解析は、以下の抗体を使用して行った：  （a）：ヒトおよびマウス・ジストロフィンのC末端の末端に対して向けられた抗体（マウス抗ヒトIgG1：NovocastraからのNCL-DYS2）、  （b）および（c）：ヒト・ジストロフィンのN末端の末端に対して向けられ抗体（マウス抗ヒトIgG2a：NovocastraからのNCL-DYS3）、  （d）および（e）：マウス・コラーゲンIIIに特異的な抗体。    スケールバーは、図28（a）および28（b）では15μmに、および図28（c）〜（e）では1μmに対応する。星*は、同じミオ繊維からの断面を示す。図28（a）と（b）の間の類似性は、発現されたジストロフィンがヒト起源であることを示す。ヒト・ジストロフィンは、筋細胞膜の下に位置する。対照的に、マウス・コラーゲンIIIは、ミオ繊維間の細胞外間隙に存在する（図28（c）〜（e））。
【図２９】本発明の幹細胞の移植の10日後の細胞性および体液性の免疫反応の非存在：免疫適格性のmdxマウス内へのPrimo2CA細胞の移植に続く何らかのリンパ球浸潤の存在は、ヘマトキシリン（図29（a）、（b）、および（c））またはマウス抗CD3抗体（図29（a'）、（b'）、および（c'））を使用して研究した。    図29（a）および（a'）：無処置のmdx免疫適格性のマウス（対照）の前脛骨；  図29（b）および（b'）：150,000の数のPrimo2CA細胞の移植の10日後のマウスで前脛骨；  図29（c）および（c'）：脂肪組織から単離した未精製のヒト間質性血管細胞の移植の10日後のマウス前脛骨；  スケールバーは、図29（a）〜（c）では50μmに対応し、図29（a'）〜（c'）では、20μmに対応する。
【０２５４】
Primo2CA細胞の移植の10日後に、リンパ球浸潤（CD3+）は、観察されない（図29（a）および（a'）と比較して、図29（b）および（b'）を参照されたい）。対照的に、ヒト脂肪組織から単離された未精製の間質性血管細胞の移植は、細胞障害能および体液性の反応を誘導した（図29（c）および（c'））。
【図３０】Primo2CA細胞の移植の6月後の細胞の体液性の免疫反応の非存在：mdx免疫適格性のマウスへのPrimo2CA細胞の移植の6月後における免疫反応の存在の可能性を図29について記載したものと同じ技術を適用することによって研究した。    左側写真：Primo2CA細胞の移植6月後における、mdx免疫適格性のマウスの前脛骨、ヘマトキシリンでラベリング；  右側写真：未処置の（対照）の、mdx免疫適格性のマウスの前脛骨、ヘマトキシリンでラベリング。    CD3+Tリンパ球による浸潤がないことをPrimo2CA細胞を移植した筋肉において決定し、移植6月後に拒絶反応がないことを示した。
【図３１】mdxマウスへ免疫抑制薬を伴わずに移植した10日後のPrimoiCA細胞およびPrimo3CA細胞のインビボでの筋肉再生力：インビボでの筋肉再生能力を、ジストロフィンを再発現する筋線維を有するヒト核の共局在化（co-localisation）によって評価した。共局在化技術は、Primo2CA細胞のために記載したもの（図24〜27に対するレジェンドを参照されたい）と同一であるが、移植された細胞は、Primo1CAまたはPrimo3CA細胞である。  -写真PR1MO1：mdx免疫適格性マウス（シクロスポリンでない）の前脛骨、50回および120回の集団倍加におけるPrimo1CA細胞の移植の10日後、150000の数。ジストロフィンを検出するために使用した抗体は、ヒト・ジストロフィンに特異的な抗体（マウス抗ヒトIgG2a：NovocastraからのNCL-DYS3、ヒト・ジストロフィンのN末端の末端に対して向けられたもの）。    PRIMO3写真：mdx免疫適格性のマウス（シクロスポリンでない）の前脛骨、45回、80回、110回の集団倍加におけるPrimo3CA細胞の移植の10日後、150000の数。ジストロフィンを検出するために使用した抗体は、また、NovocastraからのNCL-DYS3である。移植の10日後、Primo1CA細胞について、およびPrimo3CA細胞について、両方とも筋肉再生の可能性が見えた。
【図３２】Primo3CA細胞の移植の10日後の細胞性および体液性の免疫反応の非存在：免疫反応の存在する可能性は、免疫適格性のmdxマウスにおいてPrimo3CA細胞の移植の10日後に、Primo2CA細胞のために記載されているものと同じ技術（図29および30に対するレジェンドを参照されたい）を適用することによって研究した。    Primo3写真：mdx免疫適格性のマウスで前脛骨、Primo3CA細胞（総計で110回の集団倍加、150000）の移植の10日後、ヘマトキシリンでラベリング。    リンパ球浸潤がないことがPrimo3CA細胞で観察され、Primo2CA細胞のものと同じ挙動を示差する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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