(57)【要約】本発明は、生細胞の細胞周期位置を決定するための、新規、非破壊的および動力学的方法を提供する。当該発明はまた、ＤＮＡ構成物、および当該構成物を含み細胞周期特異的に検出可能なレポーター分子の活性化および不活性化を示す細胞系統を提供する。そのため、本発明は、既存技術よりもより正確に細胞周期相状態を決定し得、更に、各細胞における細胞周期進行の連続的モニタリングの方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前決定した位置にて発現する。
【請求項２】
当該発現コントロールエレメントが、細胞周期特異的に転写をコントロールする、請求項１の構成物。
【請求項３】
当該発現コントロールエレメントが、細胞周期特異的に翻訳をコントロールする、請求項１または２の何れかの構成物。
【請求項４】
当該発現コントロールエレメントは、細胞周期特異的プロモーターおよび細胞周期特異的ＩＲＥＳから選択される、請求項１−３の構成物。
【請求項５】
当該プロモーターが、サイクリンＢ１プロモーター、Cdc25Bプロモーター、サイクリンＡ２プロモーター、Cdc2プロモーター、Cdc25Cプロモーター、サイクリンＥプロモーター、Cdc6プロモーター、DHFRプロモーターおよびヒストンプロモーターからなる群から選択される、請求項４の構成物。
【請求項６】
当該ＩＲＥＳは、G2-IRES、HCV IRES、ODC IRES、c-myc IRESおよびp58 PITSLRE IRES からなる群から選択される、請求項４または５の何れかの構成物。
【請求項７】
当該破壊コントロールエレメントが、サイクリンＢ１ Ｄ-ボックス、サイクリンＡ Ｎ末端、KENボックス、サイクリンＥおよびp27Kip1からなる群から選択される、請求項１から６の何れかの構成物。
【請求項８】
当該生細胞検出可能レポーター分子は、細胞周期相特異的空間的局在性コントロールエレメントに作動可能なように連結されそのコントロール下にある、請求項１から７の何れかの構成物。
【請求項９】
当該細胞周期相特異的空間的局在性コントロールエレメントは、サイクリンＢ１細胞質保持配列(ＣＲＳ)(そのＮＥＳを含む)である、請求項８の構成物。
【請求項１０】
当該生細胞レポーター分子は、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される、請求項１から９の何れかの構成物。
【請求項１１】
当該蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、および野生型ＧＦＰのアミノ酸配列がアミノ酸欠失、付加または置換により変化した機能的ＧＦＰ類似体から選択される、請求項１０の構成物。
【請求項１２】
当該酵素レポーターが、β−ラクタマーゼおよびニトロレダクターゼからなる群から選択される、請求項１０の構成物。
【請求項１３】
サイクリンＢ１プロモーター、サイクリンＢ１破壊ボックス(Ｄ-ボックス)、サイクリンＢ１細胞質保持配列(ＣＲＳ)および緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を含む請求項１から１２の何れかの構成物。
【請求項１４】
a)i)細菌性の複製オリジン、および
ii)細菌性薬剤耐性遺伝子
を含むベクターバックボーン、
b)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、
c)破壊コントロールエレメント、ならびに
d)レポーター分子をコードする核酸配列
を含む、発現ベクターを含有する核酸レポーター構成物。
【請求項１５】
更に、細胞周期相特異的空間的局在性コントロールエレメントおよび／または真核細胞性薬剤耐性遺伝子を含む、請求項１４の構成物。
【請求項１６】
請求項１から１５の何れかの構成物でトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１７】
当該細胞が真核細胞である、請求項１６の宿主細胞。
【請求項１８】
当該細胞は、哺乳類細胞、真菌細胞、線虫細胞、魚細胞、両生類細胞、植物細胞および昆虫細胞からなる群から選択され得る、請求項１６または１７の宿主細胞。
【請求項１９】
細胞の細胞周期位置を決定する方法であって、
a)請求項１から１５の何れかの核酸レポーター構成物を細胞中で発現させること、
b)レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を決定すること、
を含む当該方法。
【請求項２０】
細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を決定する方法であって、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロールの下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を、細胞中において当該試験システムの非存在下および／または存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
ここで、当該試験システムの非存在下および／または存在下で測定する放射シグナル間の相違は、当該細胞の当該細胞周期位置における当該試験システムの効果を示す、
を含む当該方法。
【請求項２１】
細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を測定する方法であって、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を、当該細胞中において当該試験システムの存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
c)当該試験システムの存在下での放射シグナルを、当該試験システムの非存在下での放射シグナルの既知の値と比較すること、
ここで、試験システムの存在下で測定した放射シグナルと当該試験システムの非存在下で既知の値との相違は、細胞の細胞周期位置での試験システムの効果を示す、
を含む当該方法。
【請求項２２】
細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を測定する方法であって、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を含む細胞を提供すること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現し、
b)試験システムの存在下および非存在下で、および核酸レポーター構成物の発現を許容する条件下で、第一および第二の群の細胞をそれぞれ培養すること、および
c)第一および第二の細胞群におけるレポーター分子により放射されるシグナルを測定すること、
ここで、第一および第二の細胞群中で測定された放射シグナル間の相違は、細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を示す、
を含む当該方法。
【請求項２３】
試験システムに応答して変化することが知られる第一の検出可能レポーターの発現、トランスロケーションまたは細胞内分布における細胞周期の効果を測定する方法であって、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む第二の核酸レポーター構成物を、当該細胞中において当該試験システムの存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該第二のレポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
c)当該第一の検出可能レポーターにより放射されるシグナルをモニターすること、
ここで、ステップb)により測定した細胞周期位置と当該第一の検出可能レポーターにより放射されるシグナルとの関連は、当該第一の検出可能レポーターの発現、トランスロケーションまたは細胞内分布が細胞周期依存性であるかどうかを示す、
を含む当該方法。
【請求項２４】
当該核酸レポーター構成物は請求項１３の構成物を含む、請求項１９から２３の何れかの方法。
【請求項２５】
当該試験システムが、当該細胞がさらされる薬物、核酸、ホルモン、タンパク質、またはペプチドから選択される物質である、請求項２０から２４の何れかの方法。
【請求項２６】
当該試験システムが、対象となる細胞で発現させるペプチドまたはタンパク質から選択される物質である、請求項２０から２４の何れかの方法。
【請求項２７】
宿主生物中で異種移植片の確立に使用するための請求項１６から１８の何れかの細胞を含む細胞系統。
【請求項２８】
宿主生物中で同種移植片の確立に使用するための請求項１６から１８の何れかの細胞を含む細胞系統。
【請求項２９】
請求項１６から１８の何れかの細胞を含むトランスジェニック生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、生細胞の細胞周期位置(cell cycle position)を決定するための新規、非破壊的および動力学的方法に関する。
【０００２】
背景技術
真核細胞の細胞分裂は、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２およびＭと呼ばれる連続的な相を含む、高度にコントロールされた細胞周期を通して進行する。細胞周期または細胞周期コントロールの崩壊は、増殖の正常コントロールに非応答性である非常に侵襲性の細胞中に増殖制限した細胞を形質転換する複数の遺伝学的変化から生ずる癌のような、細胞異常または疾患を生じ得る。正常細胞の癌細胞への移行は、ＤＮＡ複製およびＤＮＡ修復機構における校正機能の喪失により生じ得る。分裂細胞はすべて、細胞周期チェックポイントとして知られる、異常型細胞を停止または破壊を誘発することにより遺伝学的完全性を維持する、多くのコントロール機構下に置かれている。細胞周期の進行およびコントロールの調査は、従って抗癌剤の設計に重要である(Flatt, P. M and Pietenpol, J.A. Drug Metab. Rev. (2000), 32(3-4), 283-305; Buolamwini, J.K. Current Pharmaceutical Design, (2000), 6, 379-392)。
【０００３】
細胞周期の状態の正確な決定は、細胞周期に影響するか、または細胞周期位置に依存する細胞のプロセスの調査の鍵となる要件である。その測定は、薬剤スクリーニングの適用に特に重要であり、ここで：
i)細胞周期の進行を直接または間接的に修飾する物質は、例えば、抗癌処置の可能性についての研究に望ましい；
ii)薬剤候補の、細胞周期の進行に望ましくない影響はチェックされるべきである；および／または
iii)物質(agent)は、細胞周期の特定の相において細胞に対し活性または不活性であると推測される。
【０００４】
従来、細胞群の細胞周期の状態は、細胞核のＤＮＡ含有物を染色する蛍光色素を用いるフローサイトメトリーにより測定された(Barlogie, B. et al, Cancer Res., (1983), 43 (9), 3982-97)。フローサイトメトリーは、細胞のＤＮＡ含有物の定量的な情報を生じ、ここでは、細胞周期のＧ１、ＳおよびＧ２＋Ｍ相における相対的な細胞数を決定し得る。しかし、この分析は、破壊的な非動力学的方法であり、時間とともに細胞周期の状態を決定するためには一群の連続的サンプリングを必要とする。更に、標準的なフローサイトメトリー技術は、サンプル中のすべての細胞群を調査し、個々の細胞については制限的なデータしか得られないものであり、従って分析中の試料内に存在し得る種々の細胞型の細胞周期の状態の研究は不可能である。
【０００５】
EP798386は、異種性細胞サンプル中に存在する部分-細胞集団(cell sub-population)の細胞周期の分析の方法を記載する。この方法は、特定の細胞型を同定するため蛍光的に標識したモノクローナル抗体および核酸に特異的に結合する蛍光色素を伴うサンプルの連続的インキュベーションを用いる。これにより、サンプル中に存在する細胞の部分集団の細胞周期分布が決定され得る。しかし、この方法がフローサイトメトリーを使用するため、非動力学的データのみを得、細胞周期の進行に対する効果の調査しようとする物質にさらした後に時間にともなう細胞群の細胞周期の状態の変化を決定するためには、細胞の別々のサンプルにおいて行われる連続的な測定を必要とする。
【０００６】
フローサイトメトリー技術の更なる不利な点は、ＤＮＡ含有量に基づいて細胞の細胞周期位置を間接的、および推測的に割り当てること(assignment)に関連する。細胞核のＤＮＡ含有量は、細胞周期を通して合理的に予測可能な型で変わるため、すなわち、Ｇ２またはＭの細胞はＧ１の細胞の２倍のＤＮＡ含有量を有し、Ｓ相でＤＮＡ合成を行う細胞は中間的な量のＤＮＡを有するため、細胞周期の種々の相間の細胞の相対的分布をモニターすることができる。しかし、当該技術は、任意の個々の細胞の細胞周期位置の決定において正確とはなり得ない。それは、Ｇ２またはＭ相への細胞の割り当てが曖昧であるためであり、更に細胞周期で隣接する相間の境界に近い細胞間の正確な識別がそもそも困難であるなどの群内の個々の細胞の固有のＤＮＡ含有量が相違することからから生ずるさらなる不正確性のためである。更に、種々の組織または器官由来の種々の細胞型間のＤＮＡ含有量およびＤＮＡ染色性の相違は、当該技術が各細胞型について最適化されることを必要し、そして細胞型間または実験間のデータの直接の比較を複雑にし得る(Herman, Cancer (1992),69 (6), 1553-1556)。そのため、フローサイトメトリーは、群内での細胞の全体的な細胞周期分布の調査に適当であるが、時間にわたる各細胞の正確な細胞周期の状態のモニターに使用することはできない。
【０００７】
細胞周期の進行は、細胞周期間で高い動力学的挙動を示す多くの細胞周期レギュレーターの明確に定められた時間的および空間的発現、位置および破壊によりしっかりとコントロールされる(Pines, J., Nature Cell Biology, (1999), 1, E73-E79)。例えば、特定の細胞周期段階では、幾つかのタンパク質は、核から細胞質にトランスロケートするか、またはその逆となり、その幾つかは迅速に崩壊する。既知の細胞周期コントロールコンポーネントおよび相互作用の詳細については、Kohn, Molecular Biology of the Cell (1999), 10,2703-2734参照。
【０００８】
最も詳しく解明されている、ヒト細胞中の細胞周期レギュレーターの１つは、サイクリンＢ１であり、その時間的および空間的な発現および破壊は、Ｇ２からＭへの細胞変化およびＭから抜け出すのをコントロールする。サイクリンＢ１の発現は、細胞周期相特異的プロモーターにより行われ、Ｓ相の最後で発現を開始しＧ２間でピークとなる。一旦発現すると、このタンパク質は、Ｇ２相で核および細胞質間で頻繁に往復するが、それは、排出の割合が搬入よりも大きいため本来は細胞質にある。有糸分裂の開始において、サイクリンＢ１は、リン酸化依存の形式で、搬入の割合が実質的に増加し排出が減少すると、核中に迅速にトランスロケートする(図１)。そのため、細胞中のサイクリンＢ１の局在性を用い、Ｇ２相から有糸分裂への変化をマークし得る。一旦、細胞が中期に到達すると、またはより正確にはスピンドルアセンブリチェックポイントが満たされると、サイクリンＢ１は非常に迅速に分解される。サイクリンＢ１崩壊は、次のＧ１相を通して続くが、細胞がＤＮＡ複製を始めると止まる。これらのイベントは、蛍光的に標識したサイクリンＢ１を生細胞中にマイクロインジェクションすることによりリアルタイムで視覚化された(Clute and Pines, Nature Cell Biology, (1999), 1, 82-87)。
【０００９】
時間的発現および破壊を調節するコントロールエレメントは多くの研究で解明された。サイクリンＢ１の生合成は、細胞周期の後期ＳおよびＧ２相に発現を制限するプロモーター配列により転写レベルでコントロールされることが判った(Piaggio et al, Exp. Cell. Research, (1995), 216,396-402 ; Cogswell et al, Mol. Cell. Biology, (1995), 15,2782-2790)。Ｍ相での適当なときでのサイクリンＢ１の破壊は、ユビキチン化によるタンパク質分解のためにタンパク質を標的とする破壊ボックス(D-box)と称する、９アミノ酸配列によりコントロールされることが判った。構造性ポリユビキチンプロモーター(Huang and Raff, EMBO Journal, (1999), 18 (8), 2184-2195)により作動するショウジョウバエ サイクリンＢ１-ＧＦＰ融合タンパク質の発現は、蛍光性タグ化サイクリンＢは中期の最後で崩壊する内在性サイクリンＢの挙動を模倣することを示した。ヒトサイクリンＢ１-ＧＦＰに用いる研究(Hagting et al, Current Biology, (1999), 9,680-689)は、細胞周期の進行を伴うサイクリンＢ１の細胞質のおよび核の局在性の時間的変化は、核排出シグナル(ＮＥＳ)、そのリン酸化により核搬入を生ずる、に依存することを示した。
【００１０】
他の細胞周期チェックポイントは、時間的および空間的なコントロール機構により同様に調節され、多くのコンポーネントおよび相互関係が解明された(Pines, J., Nature Cell Biology, (1999), 1, E73-E79)。
【００１１】
細胞周期のコントロール機構の特定のコンポーネントを使用し、細胞増殖状態を分析または探索する手順を提供する、多くの方法が記載されている。
【００１２】
WO00/29602は、蛍光活性化細胞のソーティングにより非分裂細胞のバックグラウンドから分裂細胞を単離し得る分裂トランスジェニック幹細胞の選択マーカーとしてＧＦＰの発現を生ずるためのサイクリンＡプロモーターの使用を記載する。この方法は、細胞周期中の特定ステージを進行した細胞の同定および選択をし得る一方、任意の所定の細胞が、過去に同じ時期に細胞周期のＧ２相を通過するかまたは通過しないかという過去の情報(historical information)以外の、該細胞の細胞周期の状態についての情報は得られない。
【００１３】
US6048693は、細胞周期調節タンパク質に影響する化合物のスクリーニング法を記載し、ここでレポーター遺伝子の発現は、サイクリンまたは他の細胞周期コントロールタンパク質により作用するコントロールエレメントと連結している。この方法では、レポーター遺伝子産物の時間的発現は、細胞周期に特有の形式で生じ、１つ以上の細胞周期コントロールコンポーネントにおいて作用する化合物は発現レベルを増加または減少し得る。このアッセイシステムは、レポーター遺伝子産物の破壊を生じるエレメントも、レポーター遺伝子から生ずる任意のシグナルの破壊を生じるエレメントも含まないため、当該方法は、当該アッセイにおける任意の細胞の細胞周期位置の情報を得ることができず、細胞周期機構の一般的な変化レポートするのみである。
【００１４】
US5849508およびUS6103887は、サイクリンＡに結合する抗体の使用による細胞の増殖状態を決定する方法を記載する。これらの方法は、対照群に対する試験群中の増殖細胞の割合を測定する手段を提供する。
【００１５】
US6159691は、細胞周期の進行の推定レギュレーターについてアッセイする方法に関する。この方法では、細胞周期相に特異的な転写因子ＤＰ−３およびＥ２Ｆ−１から得られる核局在性シグナル(ＮＬＳ)を用い、検出可能マーカーに融合したＮＬＳの核局在性を増大または減少するためにアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物の活性をアッセイする。
【００１６】
多くの研究者が、当該細胞を固定化または溶解する必要がある従来のレポーター分子を用い細胞周期を研究している。例えば、植物分裂組織における細胞分裂を研究するためにβ-ガラクトシダーゼを使用するHauser and Bauer (Plant and Soil, 2000,226,p1-10)およびサイクリンレベルでの変化を研究するためにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)融合タンパク質を使用したBrandeis and Hunt (EMBO J., 1996, vol 15, pp5280-5289)。これらの方法は、特定細胞の細胞周期位置(ＧＵＳを用いる)または細胞の群の平均細胞周期の状態(ＣＡＴを用いる)を研究する手段を提供するが、それらは何れも破壊的である。何れの方法も、経時的な特定細胞の繰り返し分析ができず、そのため、それらは、細胞周期を通じた細胞の進行の追跡には適当ではない。
【００１７】
細胞周期のコントロール機構のコンポーネントを使用する、先の方法は、各細胞または細胞群の細胞周期の状態を決定する手段を提供しない。結果として、単一の生細胞の細胞周期位置を非破壊的に決定し得、当該同一細胞を経時的に繰り返し調査(interrogate)し得、そして細胞周期における望ましいまたは望ましくない効果を有する可能性のある物質の効果の研究を可能とする方法が必要とされる。更に、細胞周期のコントロールコンポーネントにより直接コントロールされるプローブから細胞周期位置を決定することは、むしろＤＮＡ含有量または上記のような細胞周期位置の他の間接的なマーカーを通じて間接的にコントロールされるプローブから決定されることよりも望ましい。本発明は、動力学的な読み取りを提供する非破壊的なプロセスにおける各生細胞について細胞周期の状態を決定する新規手段を提供する確定した組み合わせの細胞周期の調節機構の鍵となるコンポーネントを利用する方法を記載する。
【００１８】
本発明は、細胞周期コンポーネントの時間的および空間的発現および破壊をスイッチするレポーターシグナルの直接の連結により、細胞相特異的に検出可能なレポーター分子の活性化および破壊を示すＤＮＡ構成物、およびその構成物を含む細胞系統を提供する。これは、細胞周期相の状態の決定の精度を非常に改善し、各細胞の細胞周期の進行を継続的にモニターし得る。更に、鍵となるコントロールエレメントは、細胞周期のコントロール機構の機能性エレメントから単離および取り出すことができ、内在性細胞周期コントロールコンポーネントと合わせて、しかしそれとは独立して動力学的に調節および操作される細胞周期相レポーターを設計し得る。こうして、細胞周期の天然での進行に影響または阻害することなく細胞周期位置をモニターするための方法を提供し得ることが判った。
【００１９】
本発明の要約
従って、本発明の第一の態様では、
i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を提供し、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前決定した位置にて発現する。遺伝子からのタンパク質の生合成を含む、すべてのプロセスであるとして発現は定義される。用語"生細胞"は、レポーター分子と関連する場合には、生細胞中で検出可能なシグナルを生じ、そのため生細胞イメージングシステムでの使用に適当であるレポーター分子を決定すると理解されるであろう。
【００２０】
本発明の第二の態様では、細胞の細胞周期での位置を決定する方法であって、
a)i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を細胞中において発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、および
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を決定すること、
を含む当該方法を提供する。
【００２１】
第一および第二の態様の好ましい実施態様では、核酸レポーター構成物はまた、細胞周期相特異的空間局在性コントロールエレメントに連結されおよびそのコントロールの下にある。
【００２２】
好適には、核酸レポーター構成物はＤＮＡ構成物である。
【００２３】
細胞周期相特異的発現コントロールエレメントは、典型的には、１つ以上の核酸配列の転写および／または翻訳をコントロールし、発現の細胞周期特異的コントロールを許容するＤＮＡ配列である。細胞周期の１以上の相で特異的に活性である任意の発現コントロールエレメントは、好適には、周期位置レポーター構成物の構成に使用され得る。
【００２４】
好適には、当該細胞周期相特異的発現コントロールエレメントは、細胞周期特異的プロモーターおよび細胞周期特異的な転写または翻訳のコントロールに影響する他のエレメントから選択され得る。発現コントロールエレメントがプロモーターである場合、当該プロモーターの選択は、研究用に選択された細胞周期の相に依存するであろう。
【００２５】
適当なプロモーターには、サイクリンＢ１プロモーター(Cogswell et al, Mol. Cell Biol., (1995), 15 (5), 2782-90, Hwang et al, J. Biol. Chem., (1995), 270 (47), 28419-24, Piaggio et al, Exp. Cell Res., (1995), 216 (2), 396-402); Cdc25B プロモーター (Korner et al, J. Biol. Chem., (2001), 276 (13), 9662-9); サイクリンＡ２プロモーター(Henglein et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1994), 91 (12), 5490-4, Zwicker et al, Embo J., (1995), 14 (18), 4514-22); Cdc2プロモーター(Tommasi and Pfeifer, Mol. Cell Biol., (1995), 15 (12), 6901-13, Zwicker et al, Embo J (1995), 14 (18), 4514-22), Cdc25Cプロモーター(Korner and Muller, J. Biol. Chem., (2000), 275 (25), 18676-81, Korner et al, Nucl. Acids Res., (1997), 25 (24), 4933-9); サイクリンＥプロモーター(Botz et al, Mol. Cell Biol., (1996), 16 (7), 3401-9, Korner and Muller, J. Biol. Chem., (2000), 275 (25), 18676-81); Cdc6プロモーター(Hateboer et al, Mol. Cell Biol., (1998), 18(11), 6679-97, Yan et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1998), 95(7), 3603-8); DHFRプロモーター(Shimada et al, J. Biol. Chem., (1986), 261(3), 1445-52, Shimada and Nienhuis, J. Biol. Chem., (1985), 260(4), 2468-74)およびヒストンプロモーター(van Wijnen et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1994), 91, 12882-12886)が含まれる。
【００２６】
好適には、細胞周期相特異的発現コントロールエレメントは、細胞周期特異的ＩＲＥＳエレメントおよび細胞周期特異的な翻訳のコントロールに影響する他のエレメントから選択し得る。ＩＲＥＳエレメントは、リボゾームの結合および５'-キャップ領域ではないｍＲＮＡの領域で生ずる翻訳の開始を許容する内部リボゾーム移入部位(internal ribosomal entry site)である。細胞周期特異的ＩＲＥＳエレメントは、翻訳のcap-独立開始を細胞周期の特定段階に制限する(Sachs, A. B., Cell, (2000), 101,243-5)。発現コントロールエレメントは、ＩＲＥＳであるように選択される場合、好適には、その選択は、研究対象の細胞周期相に依存するであろう。この場合、構造的に発現する(例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０)または誘導性(例えば、pTet-on pTet-off system, Clontech)プロモーターを用い、ビシストロン性ｍＲＮＡの転写をコントロールし得る(Sachs, A. B., Cell, (2000), 101, 243-5)。他に、細胞周期相非依存性ＩＲＥＳエレメント(pIRESベクターで見られるEMCV IRES、BD Clontech)は、細胞周期特異的プロモーターエレメントと共に使用され得る。他に、レポーターの発現のより正確なコントロールは、細胞周期相特異的ＩＲＥＳエレメントと共に細胞周期相特異的プロモーターを用いることにより得られ得る。
【００２７】
本発明での使用に適当なＩＲＥＳエレメントには、G2-IRES (Cornelis et al, Mol. Cell, (2000),5 (4), 597-605); HCV IRES (Honda et al, Gastroenterology, (2000),118, 152-162); ODC IRES (Pyronet et al, Mol. Cell, (2000), 5,607-616); c-myc IRES (Pyronnet et al, Mol. Cell, (2000),5 (4), 607-16)およびp58 PITSLRE IRES (Cornelis et al, Mol.Cell, (2000), 5 (4), 597-605)が含まれる。
【００２８】
表１は、本発明により使用し得る幾つかの好ましい発現コントロールエレメントを列挙し、各エレメントが活性化される細胞周期相を示す。
【００２９】
表１：細胞周期相特異的発現コントロールエレメント
【表１】
2005504550.tif 000002
【００３０】
破壊コントロールエレメントは、タンパク質モチーフをコードするＤＮＡ配列であり、それは、その配列を含むタンパク質の破壊をコントロールする。好適には、破壊コントロールエレメントは、細胞周期に仲介されるものである、例えば：サイクリンＢ１ Ｄ-ボックス(Glotzer et al, Nature, (1991),349, 132-138, Yamano et al, EMBO J., (1998), 17 (19), 5670-8, Clute and Pines, Nature Cell Biology,(1999), 1, 82-87); サイクリンＡ Ｎ末端(den Elzen and Pines, J. Cell Biol.,(2001),153 (1), 121-36, Geley et al, J. Cell Biol., (2001), 153, 137-48); KEN ボックス(Pfleger and Kirschner, Genes Dev, (2000), 14 (6), 655-65), サイクリンＥ(Yeh et al, Biochem Biophys Res Commun., (2001) 281, 884-90), サッカロマイセス・セレヴィシエ(S. cerevisiae)由来のCln2サイクリン(Berset et al, Mol. Cell Biol., (2002), pp4463-4476)およびp27Kip1(Montagnoli et al, Genes Dev., (1999), 13(9), 1181-1189, Nakayama et al, EMBO J., (2000), 19(9), 2069-81, Tomoda et al, Nature, (1999), 398(6723), 160-5)。
【００３１】
表２は、本発明により使用され得る破壊コントロールエレメントを列挙し、各エレメントが活性化される細胞周期相を示す。
【００３２】
他に、破壊コントロールエレメントは、Rogers et al, Science, (1986), 234, 364-8により記載されているＰＥＳＴ配列のような、細胞周期非仲介性のものである。細胞周期非仲介性破壊コントロールエレメントの例は、カゼイン、オルニチンデカルボキシラーゼおよびタンパク質半減期を減少するタンパク質を誘導する配列を含む。本発明の方法における細胞周期非仲介性破壊コントロール配列の使用は、細胞周期特異的プロモーターによる発現の誘導後の細胞周期レポーターの持続時間を決定するための手段を提供する。
【００３３】
表２：破壊コントロールエレメント
【表２】
2005504550.tif 000003
【００３４】
好適には、核酸配列によりコードされる生細胞レポーター分子は、蛍光性タンパク質および酵素からなる群から選択され得る。好ましい蛍光性タンパク質には、オワンクラゲ(Aequorea victoria)由来の緑色蛍光タンパク質および野生型ＧＦＰのアミノ酸配列がアミノ酸欠失、付加または置換により変化されている機能的ＧＦＰ類似体のようなＧＦＰの類似体を含む。本発明の使用に適当なＧＦＰ類似体には、EGFP(Cormack, B. P. et al, Gene, (1996), 173, 33-38); EYFPおよびECFP(US6066476, Tsien, R. et al); F64L-GFP(US6172188, Thastrup,O. et al); BFP, (US 6077707, Tsien, R. et al)が含まれる。他の蛍光タンパク質には、DsRed, HcRedおよび他の新規蛍光性タンパク質(BD Clontech and Labas, Y.A. et al, Proc Natl Acad Sci USA (2002), 99,4256-61)およびRenilla GFP(Stratagene)が含まれる。適当な酵素レポーターは、その酵素の基質中で検出可能な(例えば、蛍光性または発光性)シグナルを生じ得るものである。特に適当な酵素／基質には、ニトロレダクターゼ／Ｃｙ−Ｑ(WO 01/57237に開示のように) およびβ-ラクタマーゼ／CCF4が含まれる。
【００３５】
本発明の好ましい実態態様では、核酸レポーター構成物は、所望により、細胞周期特異的にタンパク質の細胞内(subcellular)局在性をコントロールし得るタンパク質モチーフをコードするＤＮＡ配列を含む細胞周期相特異的空間的局在性コントロールエレメントを含み得る。その局在性コントロールエレメントは、本発明により、：ここで
i)レポーターの特異的細胞内局在性が望ましい、および／または
ii)細胞周期位置のより正確な決定が必要とされる場合に有利に使用され得る。
有効な操作および／または破壊の何れかを確実とするためにレポーターの細胞内局在性を決定することが必要であり得る。細胞周期位置のより正確な決定は、局在性コントロールエレメントを用い可能となり得るが、それは、これが、レポーターシグナルの強度および局在性の両方の測定を許容するためである。
【００３６】
適当な空間的局在性コントロールエレメントには、細胞周期コントロールタンパク質、例えば、サイクリンＢ１ ＣＲＳの局在性を調節するものが含まれる。
【００３７】
作動可能なように連結との用語は、エレメントが、目的に合わせて機能するように、例えば、転写はプロモーターで開始し、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を通じて進行するように配置されることを示す。図２(２Ａ／２Ｂ／２Ｃ)は、本発明によるＤＮＡ構成物の一般的構造を解説する。
【００３８】
本発明の好ましい態様では、当該構成物は、サイクリンＢ１プロモーター、サイクリンＢ１破壊ボックス(Ｄ-ボックス)、サイクリンＢ１細胞質保持配列(ＣＲＳ)および緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を含む。
【００３９】
本発明による特定の例では、核酸レポーター構成物は、以下のエレメントを含む発現ベクターを含有する：
a)i)細菌性複製オリジン、および
ii)細菌性薬剤耐性遺伝子
を含むベクターバックボーン、
b)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、
c)破壊コントロールエレメント、ならびに
d)レポーター分子をコードする核酸配列。
【００４０】
所望により、核酸レポーター構成物は、更に、細胞周期相特異的空間的局在性コントロールエレメントおよび／または真核細胞性薬剤耐性遺伝子、好ましくは哺乳類薬剤耐性遺伝子を含む。
【００４１】
発現ベクターはまた、他の核酸配列を含み、例えば、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナー／スプライスアクセプターシグナル、介在配列、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列などである。所望により、当該薬剤耐性遺伝子およびレポーター遺伝子は、２つの遺伝子が別々のプロモーターから作動するというよりも、細胞周期特異的であるか(Sachs, et al, Cell, (2000), 101, 243-245)または細胞周期独立性である(Jang et al, J. Virology, (1988),62, 2636-2643 および Pelletier and Sonenberg, Nature, (1988), 334, 320-325)、内部リボゾーム移入部位(ＩＲＥＳ)により作動可能なように連結され得る。細胞周期非特異的ＩＲＥＳエレメントを用いるとき、Clontechから商業的に入手可能なpIRES-neo およびpIRES-puroベクターを用い得る。
【００４２】
第一の態様の特定の実施態様では、核酸レポーター構成物は、サイクリンＢ１のアミノ末端の１７１アミノ酸をコードするＤＮＡ配列に作動可能なように連結したサイクリンＢ１プロモーターをコードするＤＮＡ配列および緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)をコードするＤＮＡ配列よりアセンブルされる(図３)。サイクリンＢ１の局在性および破壊をコントロールするモチーフは、当該分子のアミノ末端の〜１５０アミノ酸にすべて位置した。結果として、人工細胞周期マーカーは、パートナーキナーゼに結合し活性化する必要があるサイクリンボックスと称せられる特定配列(Nugent et al, J. Cell. Sci., (1991), 99,669-674)を欠くため、細胞周期の進行を阻害しない、サイクリンＢ１のアミノ末端由来の配列のみを用い構成され得る。サイクリンＢ１のアミノ末端配列より必要とされる鍵となる調節モチーフは、i)破壊ボックス(Ｄ-ボックス)と称せされる９アミノ酸モチーフ。これは、サイクリンＢ１をユビキチン化機構の標的とする際に必要であり、そして少なくとも１つのＣ末端リシン残基と共に、これはまた、その細胞周期特異的崩壊に必要である；ii)おおよそ１０アミノ酸の核排出シグナル(ＮＥＳ)。このモチーフは、エクスポーチン１(exportin 1)により、直接または間接的の何れかで認識され、間期を通して細胞質中のサイクリンＢ１のバルクを維持するのに十分である；iii)ＮＥＳ中に位置しＮＥＳに隣接し、そして有糸分裂において迅速な核搬入および減少した核排出を供与する、おおよそ４つの有糸分裂特異的リン酸化部位である。真核細胞中で発現するとき、当該構成物は、内在性サイクリンＢ１の発現および崩壊に匹敵するＧＦＰレポーターの細胞周期特異的発現および破壊を示す。従って、ＧＦＰ蛍光強度の測定は、細胞周期のＧ２／Ｍ相で細胞の同定を可能とする(図４)。更に、当該構成物の蛍光産物は、内在性サイクリンＢ１の空間的局在性を模倣するため、蛍光の細胞内分布の分析は、細胞周期位置の割り当てにおいて更に正確となり得る。前期で、サイクリンＢ１は、迅速に核中へトランケートし、その結果、細胞中のＧＦＰ蛍光の正確な局在性を用い、間期から有糸分裂に変化する細胞を識別し得る。一旦、細胞が中期に到達し、そしてスピンドルアセンブリチェックポイントが満たされると、サイクリンＢ１は非常に迅速に崩壊し、その結果、ＧＦＰ蛍光の消失を用い、ｍｉｄ−Ｍ相で細胞を同定し得る。
【００４３】
非同期化細胞の群に構成物を発現させることは、当該構成物からの蛍光性産物の周期的な発現および破壊が各細胞で生じ、当該群中のすべての細胞からの蛍光の連続的明滅パターンを生ずる。時間を伴う各細胞の蛍光性強度の分析は、結果として、図４に示すような各細胞の細胞周期状態における動力学的情報を生ずる。
【００４４】
第一の態様による核酸レポーター構成物の更なる実施態様は、細胞周期の望ましいセクションをレポートする細胞周期相レポーターを設計するための、適当な他の細胞周期コントロールエレメント、例えば、表１および２に示されるもの、を選択することにより構成され得る。
【００４５】
発現ベクターおよびプラスミドの構成および使用は、当業者に既知である。実際には、任意の哺乳類細胞発現ベクターを、ここで開示の細胞周期マーカーと共に使用し得る。細菌性および哺乳類薬剤耐性遺伝子および細菌性複製オリジンを含む適当なベクターバックボーンの例は、以下に限らないが、pCI-neo (Promega), pcDNA(Invitrogen)およびpTriEx1 (Novagen)を含む。適当な細菌性薬剤耐性遺伝子は、以下に限らないが、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールを含む抗生物質に対し耐性を供与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。真核細胞性薬剤選択マーカーは、ネオマイシン、ヒグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸(mycophenolic acid)、ヒスチジノール、ゲンタマイシンおよびメトトレキサートのような薬剤を含む。
【００４６】
ＤＮＡ構成物は、当業者に既知であり、Sambrook, J. et al (1989), Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている方法による、制限消化、ライゲーション、形質転換およびプラスミド精製の標準的組み換え分子生物学的技術により調製され得る。他に、当該構成物は、確立された方法、例えばBeaucage and Caruthers, (Tetrahedron Letters, (1981),22, 1859-1869)により記載されるホスホロアミダイト法またはMatthes et al(EMBO J., (1984), 3, 801-805)により記載さえる方法により合成的に調製され得る。ホスホロアミダイト法により、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成し、精製し、アニールし、ライゲーションし、そして適当なベクター中にクローニングする。ＤＮＡ構成物はまた、例えば、US4683202に記載されるような、またはSaiki et al (Science,(1988), 239, 487-491)による特異的プライマーを用いポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により調製され得る。ＰＣＲ法のレビューは、PCR protocols, (1990), Academic Press, San Diego, California, U. S. A.に見られ得る。
【００４７】
ＤＮＡ構成物の調製の間、レポーターをコードする遺伝子配列は、細胞周期相特異的破壊コントロールエレメントおよび所望により空間的局在性コントロールエレメントとフレームを合わせて結合しなければならない。次いで、得られたＤＮＡ構成物を、１以上の適当な細胞周期相特異的発現コントロールエレメントのコントロールの下に置くべきである。
【００４８】
第三の態様では、本発明の核酸レポーター構成物でトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。その構成物を含む構成または発現ベクターを導入する宿主細胞は、当該構成物を発現できる任意の細胞であり得、そして真核細胞、例えば、哺乳類細胞、真菌細胞、線虫細胞、魚細胞、両生類細胞、植物細胞および昆虫細胞からなる群から選択され得る。
【００４９】
調製したＤＮＡレポーター構成物は、当業者に既知の技術を用い宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。１つのアプローチは、化学的または物理的方法の何れかを用い細胞を一時的に浸透することである。これらの技術には、エレクトロポレーション(Tur-Kaspa et al, Mol. Cell Biol. (1986),6, 716-718; Potter et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1984), 81,7161-7165)、リン酸カルシウムに基づく方法(例えば、Graham and Van der Eb, Virology, (1973),52, 456-467 および Rippe et al, Mol. Cell Biol., (1990), 10,689-695)または直接のマイクロインジェクションが含まれ得る。
【００５０】
他に、カチオン脂質に基づく方法(例えば、Superfect(Qiagen)またはFugene6(Roche)の使用)を用い、ＤＮＡを細胞中に導入し得る(Stewart et al, Human Gene Therapy,(1992), 3, 267;Torchilin et al, FASEB J, (1992),6, 2716; Zhu et al, Science, (1993), 261, 209-211 ; Ledley et al,J. Pediatrics, (1987), 110,1 ; Nicolau et al, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, (1983), 80,1068 ; Nicolau and Sene, Biochem. Biophys. Acta,(1982), 721,185-190)。Jiao et al, Biotechnology, (1993), 11,497-502は、ＤＮＡを宿主細胞中に移すのにも使用し得る脳組織における転移および発現遺伝子の電子銃(bombardment)仲介遺伝子転移プロトコールの使用を記載する。
【００５１】
ＤＮＡ構成物を細胞中にトランスフェクトするための更に他の方法は、細胞に入るウイルスの天然の能力を使用する。その方法は、例えば、ヘルペス単純ウイルス(U.S. Pat5288641)、サイトメガロウイルス(Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol.,(1992), 158,1)、ワクシニアウイルス(Baichwal and Sugden, 1986, in Gene Transfer, ed. R. Kucherlapati, New York, Plenum Press,p117-148)、およびアデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス(Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., (1992), 158,97-129)に基づくベクターおよびトランスフェンクションプロトコールを含む。
【００５２】
適当な組み換え宿主細胞の例は、HeLa細胞、Vero細胞、Chinese Hamster ovary (CHO), U20S, COS, BHK, HepG2, NIH 3T3, MDCK, RIN, HEK293およびインビトロで増殖する他の哺乳類細胞系統を含む。その細胞系統は、American Tissue Culture Collection (ATCC), Bethesda, Maryland, U.S.A.から入手できる。哺乳類から細胞を取り除きその後限定された時間当該細胞を培養した後に確立した最初の細胞系統由来の細胞もまた、本発明に含めることを意図する。
【００５３】
細胞周期位置レポーターの安定発現を示す細胞系統はまた、標準的方法(Krasagakis, K. J et al, Cell Physiol., (2001), 187 (3), 386-91; Paris, S. et al, Clin. Exp. Metastasis, (1999), 17(10), 817-22)を用いて宿主動物への、操作された細胞の異種移植片の確立に使用され得る。細胞周期位置レポーターを発現するように工作された腫瘍細胞系統の異種移植片は、モデルシステムの確立を可能とし、このモデルシステムによって腫瘍細胞分裂、転移(stasis and metastasis)を研究し、新規抗癌薬物をスクリーニングする。
【００５４】
宿主動物において同種移植片として細胞周期位置レポーターを発現するように作成された細胞系統またはトランスジェニック組織の使用により、組織移植の許容または拒絶に影響する機構の研究をすることができる(Pye D and Watt, D. J., J. Anat., (2001), 198 (Pt 2), 163-73; Brod, S. A. et al, Transplantation (2000), 69 (10), 2162-6)。
【００５５】
第二の態様により細胞の細胞周期位置を決定する方法を行うため、ＤＮＡレポーター構成物でトランスフェクトした細胞を、細胞周期の特定の段階でレポーター分子の発現を可能とするのに十分な条件および時間、培養し得る。典型的に、レポーター分子の発現はトランスフェクション後１６から７２時間の間で生ずるが、培養条件に依存して変化し得る。レポーター分子が緑色蛍光タンパク質配列に基づいているならば、当該レポーターは、蛍光性のあるコンホメーションにフォールドするには一定の時間がかかり得る。この時間は、使用する緑色蛍光タンパク質誘導体の一次配列に依存する。蛍光レポータータンパク質はまた、時間と共に色が変化し得(例えば、Terskikh, Science, (2000), 290, 1585-8)、その場合、トランスフェクション後、特定時間のインターバルでイメージングが必要とされる。
【００５６】
当該細胞の細胞周期位置は、レポーター分子の発現をモニターすることにより、および適当な検出装置を用いレポーターによって放出されるシグナルを検出することにより決定され得る。次いで、レポーター分子が蛍光シグナルを生ずるならば、通常の蛍光顕微鏡または共焦点に基づく蛍光顕微鏡の何れかを用い得る。次いで、レポーター分子がルミネセンス光を生ずるならば、ルミノメーターのような適当な装置を用い得る。これらの技術を用い、当該レポーター分子を発現する細胞の特性が決定され得る。ＤＮＡ構成物が、トランスロケーションコントロールエレメントを含み、当該細胞が顕微鏡を用い調査されるならば、レポーターの位置がまた決定され得る。本発明の方法では、当該ＤＮＡ構成物で形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞の蛍光は、好適には、光学的手段により測定され、それは、例えば、スペクトロフォトメーター、フルオリメーター、蛍光顕微鏡、冷却電荷結合素子(ＣＣＤ)イメージャー(スキャンニングイメージャーまたはエリアイメージャー)、蛍光活性化セルソーター、共焦点顕微鏡またはスキャンニング共焦点装置であり、ここで、培養細胞のスペクトル特性は、光励起および放出のスキャンで決定され得る。
【００５７】
核酸レポーター構成物が薬剤耐性遺伝子を含む本発明の態様では、薬剤耐性遺伝子のトランスフェクションおよび発現後(通常、１−２日)、修飾レポーター遺伝子を発現する細胞は、選択マーカー遺伝子の存在によりトランスフェクト細胞が耐性となる抗生物質の存在下で当該細胞を増殖させることにより選択し得る。抗生物質を添加する目的は、レポーター遺伝子を発現する細胞、そして、ある場合には、関連するプロモーター、ＩＲＥＳエレメント、エンハンサーおよび終止配列を伴うレポーター遺伝子を当該細胞系統のゲノム中に組み込んだ細胞について選択することである。選択後、当該構成物を発現するクローン化細胞系統は、標準的技術を用い単離し得る。次いで、クローン化細胞系統は、標準的な条件下で増殖し得、そしてレポーター分子を発現し、細胞周期の特定の位置で検出可能なシグナルを生ずる。
【００５８】
本発明の核酸レポーター構成物でトランスフェクトされた細胞は、研究対象の試験システム(test system)および細胞の細胞周期における効果を決定すべきである試験システムの非存在下および／または存在下で増殖され得る。レポーター分子を発現する細胞の割合および所望により当該細胞内でのシグナルの局在性を決定することにより、当該細胞の細胞周期における試験システムの効果、例えば、当該試験システムが細胞周期の特定段階で当該細胞を停止させるかどうか、または当該効果は細胞分裂をスピードアップするのかスローダウンするのかを決定することが可能である。
【００５９】
そのため、第四の態様では、細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を決定する方法を提供し、当該方法は、
a)i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を、細胞中において当該試験システムの非存在下および存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
ここで、当該試験システムの非存在下および存在下で測定する放射シグナル間の相違は、当該細胞の細胞周期位置における当該試験システムの効果を示す、
を含む。
【００６０】
第五の態様では、細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を測定する方法を提供し、当該方法は、
a)i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を、細胞中において当該試験システムの存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
c)当該試験システムの存在下での放射シグナルを、当該試験システムの非存在下での放射シグナルの既知の値と比較すること、
ここで、試験システムの存在下で測定した放射シグナルと当該試験システムの非存在下での既知の値との相違は、細胞の細胞周期位置での試験システムの効果を示す、
を含む。
【００６１】
第六の態様では、細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を測定する方法を提供し、当該方法は、
a)i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を含む細胞を提供すること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)試験システムの存在下および非存在下で、および核酸レポーター構成物の発現を許容する条件下で、第一および第二の群の細胞をそれぞれ培養すること、および
c)第一および第二の細胞群におけるレポーター分子により放射されるシグナルを測定すること、
ここで、第一および第二の細胞群中で測定された放射シグナル間の相違は、細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を示す、
を含む。
【００６２】
試験システムという用語は、細胞がさらされる薬物、ホルモン、タンパク質、ペプチド、核酸などのような物質(agent)を意味することが意図される。他に、試験システムは、対象となる細胞で発現させる核酸、ペプチドまたはタンパク質のような物質であり得る。例えば、本発明による核酸レポーター構成物でトランスフェクトした細胞を用い、対象となるタンパク質をコードする構成物を含むｃＤＮＡの発現は、細胞の細胞周期位置に効果を有するかどうかを測定し得る。哺乳類発現ベクター中へ挿入した一連のｃＤＮＡは、細胞周期位置レポーターを安定に発現する細胞中に一時的にトランスフェクトし得る。これらのトランスフェクト細胞中の核酸レポーター構成物の発現性および局在性をモニターすることにより、細胞周期におけるｃＤＮＡによりコードされるタンパク質の効果を測定し得る。
【００６３】
本発明の細胞周期位置核酸レポーター構成物はまた、細胞性プロセスにおける細胞周期位置の効果を測定するか、または細胞性プロセスにおける試験物質の作用における細胞周期位置の効果を測定する方法に使用し得る。外部からの刺激に対し応答するものを含む、多くの細胞性プロセスが、細胞周期の種々の段階で種々に作用または応答するために細胞周期により影響されることが知られる。例えば、エンドセリンレセプターは、細胞周期の種々の相の間に種々のレベルで発現されること(Okazawa et al. J. Biol. Chem., (1998), 273, 12584-12592)が示され、その結果、エンドセリン誘導性アポトーシスに対する細胞の感度は、細胞周期位置で変わる。同様に、バソプレシンに対する細胞性Ｃａ２＋起動応答は、細胞周期位置により相違し(Abel et al. J. Biol. Chem., (2000), 275, 32543-32551)、それは、種々の細胞周期相で種々のＧ-タンパク質を用いるシグナルトランスダクション経路の変化によるものである。細胞周期位置レセプター構成物の使用により、細胞は生物学的アッセイにおいて細胞変化し得(適当なアッセイレポーターを用い測定する)、それは、アッセイシグナル中の任意の変化が細胞周期位置レポーターシグナルと相関するかどうか決定し、それゆえアッセイシグナルの任意の細胞周期依存性を決定するため、細胞周期位置レポーターからのシグナルと相関する。例えば、アッセイは、細胞表面レセプターに結合する赤色蛍光標識リガンドの量が、ＧＦＰ細胞周期位置レポーターを用い決定された細胞周期状態と相関すると考えられ得る。細胞性プロセスにより、生細胞は、生体合成、取り込み、輸送、レセプター結合、代謝、融合、生化学的応答、増殖および死滅が行われ(undergo)そしてそれらを含む、通常のプロセスを意味する。
【００６４】
２以上の細胞周期位置核酸レポーター構成物は、同一細胞内の２以上の細胞周期相の変化のレポートを含む適用における組み合わせに使用し得る。二重または複数のレポーティングを行うため、２種以上の構成物が同一細胞中で作成され発現され、ここで、各レポーター構成物は、種々の識別可能なレポーターに連結したコントロールエレメントの種々の組み合わせを含む。例えば、ＧＦＰに作動可能なように連結したサイクリンＢ１プロモーターおよびサイクリンＢ１ Ｄ-ボックスを含む構成物の細胞での発現を青色蛍光タンパク質(ＢＦＰ)に作動可能なように連結したサイクリンＡ２プロモーターおよびサイクリンＢ１ Ｄ-ボックスを含む第二の構成物の同一細胞中での発現と組み合わせた場合、Ｓ相(青色蛍光)の細胞をＧ２／Ｍ相の細胞(青色および緑色蛍光)から識別し得る。
【００６５】
本発明による細胞周期位置核酸レポーター構成物およびアッセイ法は、種々の更なる適用に使用し得、例えば：
i)本発明の細胞周期位置レポーター構成物でトランスフェクトされた細胞を用い、複合化アッセイにおける第二のマーカーの発現、トランスロケーションまたは細胞内分布における細胞周期の効果を測定し得る。例えば、原形質膜に対する蛍光レポーターの細胞内トランスロケーションを研究し、試験化合物が細胞の割合でトランスロケーションを生ずることが判るならば、次いで、本発明の構成物でトランスフェクションした細胞を用い、トランスロケーションは細胞周期依存性であるかどうか決定することが可能である。
【００６６】
そのため、本発明の第七の態様では、試験システムに応答して変化することが知られる第一の検出可能レポーターの発現、トランスロケーションまたは細胞内分布における細胞周期の効果を測定する方法を提供し、当該方法は、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む第二の核酸レポーター構成物を細胞中において試験システムの存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該第二のレポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
c)当該第一の検出可能レポーターにより放射されるシグナルをモニターすること、
ここで、ステップb)により測定した細胞周期位置と当該第一の検出可能レポーターにより放射されるシグナルとの関連は、第一の検出可能レポーターの発現、トランスロケーションまたは細胞内分布が細胞周期依存性であるかどうかを示す、
を含む。用語"試験システム"は、本発明の第四、第五および第六の態様との関連で前記したように理解すべきである。
【００６７】
ii)本発明の細胞周期位置レポーターは、個々の細胞または細胞群の細胞周期状態における更なる情報を得るため、細胞周期関連の内在性細胞性マーカーまたは現象の分析と組み合わせて使用され得る。例えば、ゴルジ複合体は、哺乳類細胞中で、核に隣接するリボンのような構造を含む特徴的な形態を有することが知られ、そして、リボン構造体は、有糸分裂細胞全体に分散する小胞および細管のクラスターに変換されるため、細胞が有糸分裂するとき特徴的な変化がゴルジ構造体で生ずることが知られる(Lowe et al., Trends Cell Biol., (1998), 8(1) 40-44)。ゴルジ体(例えば、特定の蛍光染色の使用により細胞周期の既知の進行が変化する)のような細胞コンポーネントの形態の分析を、細胞周期の進行のより詳細な分析を可能とする細胞周期位置レポーターと組み合わせて用い得る。
【００６８】
iii)本発明の細胞周期位置レポーターはまた、インビボ適用で細胞周期状態および進行をモニターするために使用し得る。各細胞または複数の細胞のトランスフェクションによる、例えば、アフリカツメガエル(Xenopus oocyte)のような生体試料、および線虫(C. elegans)およびショウジョウバエ(Drosophila)のような生体中への細胞周期レポーターをコードするＤＮＡ構成物の導入はマイクロインジェクション(Krone P. H., and Heikkila J. J., Development, (1989), 106 (2), 271-81)、バリスティックインジェクション(Horard B. et al., Insect Mol. Biol., (1994), 3 (4), 61-5)および当業者に既知の他の方法により行い得る。その試料中への細胞周期レポーター構成物の導入は、トランスフェクトした細胞の子孫での細胞周期の進行およびコントロールの調査を可能とする。レポーターからの情報は、モデル生体での増殖および発生の研究に有意な価値となるようである。
【００６９】
iv)本発明のレポーターは、トランスジェニック生物の作成に使用され得、すなわち、細胞周期位置レポーターをコードするＤＮＡは、生体または動物のすべての細胞中で安定して発現する。そのトランスジェニック生物は、ＤＮＡを初期胚に、一般的には新たに受精した卵の前核の１つにマイクロインジェクトすることにより作成され得る(Bishop J.O., Reprod. Nutr. Dev.,(1996), 36 (6),607-18)。トランスジェニック技術は、線虫のような単純な生体(Daniells, C. et al, Mutat. Res. , (1998), 399(1), 55-64)からマウスおよびラットのようなより複雑な生体(Sills, R. C. , et al., Toxicol. Lett., (2001), 20 (1-3), 187-98)までの宿主種の範囲中に細胞周期位置レポーターを作成するのに使用し得る。トランスジェニック生物の全細胞中での細胞周期位置レポーターの安定なトランスジェニック発現の確立により、細胞周期状態は、生体から得られる培養細胞系統を含む生体内で何れかの細胞型の決定がされ得るか、または当該生体から単離され得る。従って、本発明の第八の態様では、上記のような細胞を含むトランスジェニック生物を提供する。
【００７０】
v)細胞周期位置レポーターの安定発現を示す細胞系統はまた、標準的方法(Krasagakis, K. J et al, Cell Physio., (2001), 187 (3), 386-91; Paris, S. et al, Clin. Exp. Metastasis, (1999), 17 (10), 817-22)を用い宿主動物中に、作成した細胞の異種移植片の確立に使用され得る。そのため、本発明の第九の態様では、宿主生物中で異種移植片の確立に使用するための上記のような細胞を含む細胞系統を提供する。細胞周期位置マーカーを発現するように作成した腫瘍細胞系統の異種移植片は、腫瘍細胞分裂、停止および転移を研究し新規抗癌薬剤のスクリーニングするためのモデルシステムの確立を可能とする。
【００７１】
vi)宿主動物中の同種移植片のような細胞周期位置レポーターを発現するように作成した細胞系統またはトランスジェニック組織の使用は、組織移植の許容または拒絶に影響する機構の研究をすることができる(Pye, D. and Watt, D. J., J. Anat., (2001), 198(Pt 2), 163-73; Brod, S. A. et al, Transplantation (2000), 69 (10), 2162-6)。そのため、本発明の第十の態様では、宿主生物で同種移植片の確立に使用するための上記のような細胞を含む細胞系統を提供する。
【００７２】
本発明の第十一の態様では、上記のような細胞を含むトランスジェニック生物を提供する。
【００７３】
本発明の簡単な説明
本発明は、以下の実施例および図面を参照することにより解説される。
【００７４】
図１は、細胞周期の進行におけるサイクリンＢ１調節を説明する模式図である。細胞周期は矢印の方向に進み、Ｓ相の終わりで発現が始まり、Ｇ２の間にピークとなる細胞周期相特異的プロモーターによりサイクリンＢ１発現は作動する(Ａ)。有糸分裂の開始において(Ｂ)、サイクリンＢ１は細胞質から核へトランスロケートし、中期より先(Ｃ)タンパク質は特異的に崩壊する。
【００７５】
図２は、本発明の細胞周期位置核酸レポーター構成物を説明する模式図であり、２Ａは、細胞周期相特異的プロモーターを用いるが、ＩＲＥＳエレメントは用いず、２Ｂは、ＩＲＥＳエレメントを用い哺乳類選択を促進し、そして２Ｃは、構造性および誘導性哺乳類プロモーターおよび発現コントロールエレメントとして細胞周期相特異的ＩＲＥＳを含む。それぞれにおいて、Ａは細胞周期相特異的発現コントロール(プロモーター)を示し、Ｂは細胞周期相特異的破壊コントロールエレメントを示し、Ｃは細胞周期相特異的局在性コントロールエレメントを示し、Ｄはレセプター遺伝子を示し、Ｅは細胞周期非特異的ＩＲＥＳエレメントを示し、Ｆは哺乳類選択マーカーを示し、Ｇは哺乳類構造性プロモーターを示し、そしてＨは細胞周期特異的ＩＲＥＳエレメントを示す。
【００７６】
図３は、細胞周期のＧ２／Ｍ相を測定するためのＤＮＡ構造物を示し、当該構造物は、サイクリンＢ１プロモーター(Ａ)、サイクリンＢ１破壊ボックス(Ｄ-ボックス)(Ｂ)、サイクリンＢ１ ＣＲＳ(Ｃ)およびＧＦＰレポーター(Ｄ)を含む。
【００７７】
図４は、非同調化細胞群中でＧ２／Ｍ細胞周期相マーカーを発現する核酸構成物の発現を示す。各細胞は、当該構成物由来の蛍光産物の周期的な発現および破壊を示し、これにより、群中のすべての細胞で連続的に「明滅する」パターンの蛍光が生じている。時間１、２、３および４での各細胞の蛍光強度の分析により、各細胞の細胞位置の状態における動力学的情報が得られる。
【００７８】
図５は、本発明の細胞周期相マーカーからのＧＦＰ蛍光における細胞周期ブロッキング剤の効果を示す棒グラフである。Ａはデメコルチシン(demecolchicine)により有糸分裂中で阻害された細胞を示し、Ｂは対照細胞を示し、そしてＣはミモシン(mimosine)によりＧ１／Ｓ相で阻害される細胞を示す。
【００７９】
図６は、実施例３の、実施例１で記載された構成物をマイクロインジェクションされ、有糸分裂している細胞の一連の低速度撮影写真である。
【００８０】
図７は、有糸分裂している実施例１に記載の構成物を発現するＵ２−０Ｓ細胞を示す、実施例４による連続低速度撮影写真である。パネルＡでは、左の細胞は細胞周期のＧ２−相にあり、パネルＢでは、細胞は前期に入っており、パネルＣでは、細胞は中期にあり、パネルＤでは、細胞は終期にあり、そしてパネルＥでは、２つの娘細胞は非蛍光性であり、Ｇ１相にある。
【００８１】
図８は、実施例１に記載の構成物を安定して発現するＵ２−０Ｓ細胞およびその子孫の相対的蛍光性を実施例４により示すグラフである。当該細胞は、４時間後有糸分裂し(Ａ)、２つの娘細胞に分裂する(１、２)。次いで、娘１は３４時間で有糸分裂し２つの孫娘(１．１および１．２)に分裂し(Ｂ)、娘２は４２時間で有糸分裂し孫娘(２．１および２．２)に分裂する。太い矢印は、Ｇ２-相であって有糸分裂前の娘細胞の蛍光性の増加を示す。
【００８２】
図９は、構成物を含むｅＧＦＰを安定して発現するＵ２−０Ｓ細胞系統の実施例５によるＦＡＣＳ分析である。上のグラフは、ＦＬ３Ａ(赤色蛍光)で染色するヨウ化プロピジウムのヒストグラムを示し、Ｘ軸は蛍光強度、Ｙ軸はその蛍光強度の細胞数をプロットした。このグラフは、Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍの細胞の割合は予測通りであることを示す。下のグラフは、Ｘ軸がＦＬ３Ａ(赤色)でありＹ軸がＦＬ１Ｈ(緑色蛍光)である同一細胞のドットプロットである。斜め方向のパターン(囲った部分)は、Ｇ２／Ｍ中の細胞がＳ相細胞よりも緑色蛍光性があり、次いでＳ相はＧ１相細胞よりも蛍光性があることを示す。
【００８３】
図１０は、実施例５に記載の安定細胞系統の相対的緑色蛍光強度における細胞周期インヒビターの効果を示す実施例６によるＦＡＣＳ分析である。図９に示すように、ヒストグラム(左側)はＦＬ３Ａに対して細胞数(Ｙ軸)を示し、ドットプロット(右側)は同一細胞について示しておりＦＬ３Ａ(Ｘ軸)に対してＦＬ１Ｈ(Ｙ軸)をプロットした。上の２つのグラフは、細胞周期インヒビターで処理していない対照細胞を示す。判るように、これらの細胞は、典型的な細胞周期プロファイル(Ａ)を示し、よりＧＦＰを有する細胞は細胞周期のＧ２／Ｍパターンにあることを示す模式パターンを有する。真ん中の２つのグラフは、コルチシンによりＧ２／Ｍでブロックされた細胞を示す(Ｃ)。これらの細胞の殆どは、比較的高い緑色蛍光を有する(Ｄ)。下の２つのグラフは、ミモシンによりＧ１／Ｓで部分的にブロックされた細胞を示す(Ｅ)。これらの細胞の殆どは、比較的低い緑色蛍光を有する(Ｆ)。
【００８４】
本発明の詳細な説明
実施例
１．ＤＮＡ構成物の調製
i)サイクリンＢ１破壊ボックスおよびＮＥＳをコードする、Ｎ末端の三分の一のサイクリンＢ１ ｍＲＮＡ(アミノ酸１−１７１)を、標準的ＰＣＲ技術および以下のプライマー：
【化１】
2005504550.tif 000004
を用いHindIIIおよびBamHI端で増幅した。
【００８５】
ii)ｗｔＧＦＰの遺伝子は、融合タンパク質の構成を促進する制限部位を導入するように設計したプライマーで増幅した。ＰＣＲ産物は、製造者指示書によりｐＴＡＲＧＥＴ(Promega)中にクローニングし、変異(F64L/S175G/E222G)はQuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene)を用い導入した。構成物は、自動ＤＮＡシーケンシングにより確認した。次いで、変異ＧＦＰをコードするＤＮＡを、BamHIおよびSalI制限酵素部位を用いサイクリンＢ１ Ｎ末端領域の下流にクローニングした。
【００８６】
iii)サイクリンＢ１プロモーター(-150->+182)の細胞周期依存性領域は、SacIおよびHindIII部位で増幅し、サイクリンＢ１ Ｎ末端領域およびＧＦＰ融合タンパク質の上流にクローニングした。
【００８７】
iv)ＤＮＡをコードするプロモーターおよび組み換えタンパク質を切除し、BglII／NheI切断ｐＣｌ-Ｎｅｏ誘導ベクター中のＣＭＶプロモーターに代えてクローニングした。
【００８８】
２．一時的にトランスフェクトした細胞を用いる、細胞周期相マーカーからのＧＦＰ蛍光における細胞周期ブロッキング剤の効果
Ｕ２０Ｓ細胞(ATCC HTB-96)を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェル中で培養した。細胞は、実施例１で調製した細胞周期レポーター構成物でトランスフェクトし、当該構成物は、トランスフェクト剤としてFugene6(Roche)を用いpCORON4004ベクター(Amersham Biosciences)中に、サイクリンＢ１ Ｄ-ボックス、サイクリンＢ１ ＣＲＳ、およびＧＦＰをコードする配列に作動可能なように連結したサイクリンＢ１プロモーターを含んだ。
【００８９】
２４時間の培養後、細胞を、特異的細胞周期ブロッカーミモシン(Ｇ１／Ｓ相境界でブロックする)またはデメコルシン(demecolcine)(Ｍ相でブロックする)にさらした。対照細胞は培養培地のみにさらした。
【００９０】
細胞を更に２４時間インキュベーションし、次いで自動イメージ分析を伴う共焦点スキャンニングイメージャー(IN Cell Analysis System, Amersham Biosciences)を用い核ＧＦＰ発現について分析した。
【００９１】
図５に示すように、デメコルシンにさらした細胞は、対照細胞と比較すると蛍光が増大し、その一方、ミモシンにさらした細胞は、対照細胞と比較すると蛍光は減少した。これらの結果は、本発明の細胞周期相レポーターで提唱される使用と一致する。サイクリンＢ１プロモーターの活性化時期の前に、Ｇ１／Ｓ相でブロックされた(ミモシン処理した)細胞は蛍光が減少し、その一方、サイクリンＢ１ Ｄ-ボックスの作用時期の前に、Ｍ相でブロックされた(デメコルシン処理した)細胞は蛍光が増大した。
【００９２】
これらの結果は、本発明の細胞周期相レポーターが、一時的なシステムにおいて細胞周期の進行をモジュレートする物質の検出に適当であり、更にそのレポーターにより、細胞がブロックされる細胞周期相の同定が可能となる。
【００９３】
３．当該構成物のマイクロインジェクションおよび低速度撮影写真
HeLa細胞は、実施例１により調製された構成物と共にマイクロインジェクトされ、図６に示すように、低速度撮影顕微鏡により調査した。微分干渉コントラスト(Differential interference contrast)(ＤＩＣ)イメージを左側に示しており、それは右側の蛍光イメージに相当する。フレームＡは、核中で明るい蛍光を示す中期の細胞(矢印)を示す。フレームＢおよびＣは、後期(Ｂ)および後期の後期(late anaphase)(Ｃ)のより遅い時期の同一細胞を示す。ＢおよびＣのＤＩＣイメージは、２つの娘細胞への細胞分裂(２つの矢印で示す)を示し、相当する蛍光イメージは、細胞周期が進行するにつれて蛍光構成物の破壊を伴い蛍光が喪失する。
【００９４】
４．安定した細胞系統産生および低速度撮影写真
Ｕ２０Ｓ細胞(ATCC HTB-96)を実施例１に記載の構成物でトランスフェクトし、当該構成物を安定して発現する細胞を選択するため1mg/ml ジェネチシン(geneticin)を含む培養培地中で数ヶ月増殖させた。多くのクローンを標準的方法によりピックし(例えば、Freshney, Chapter 11 in Culture of Animal Cells, (1994) Wiley-Liss Incに記載されている)、蛍光細胞を含むクローンを単離した。この細胞系統は、25mM HEPESを含む培養培地中で３７℃で保持し、細胞の蛍光および放射イメージを488nmの標準的キセノンランプを用い24時間、経時的に15分毎に得た。図７は、一部のイメージからの５フレームを示し、細胞系統は予測されるような挙動することが示される。Ｇ２の細胞は、細胞質中で緑色蛍光を示し、初期有糸分裂中の細胞は核中で有意に蛍光性を有し、有糸分裂後、レポーター遺伝子は崩壊し、当該細胞は蛍光性を喪失する。
【００９５】
図８は、４８時間かけてモニターし、２つに細胞分裂し４つの孫娘細胞を生ずる、同一クローンからの細胞の結末を示す。各位置では、各細胞子孫の平均強度を測定し、時間に対してプロットする。判るように４時間以内で元の細胞は有糸分裂し、一方の娘は、実験中、３２時間で分裂し、他方は４２時間で分裂する。細胞がＳ-相を出てＧ２相へ入り、有糸分裂までは平均強度は一定の増加を示し、有糸分裂時に細胞は球状化し、平均強度は急激に増加する。
【００９６】
５．より明るい安定細胞系統の調製およびその後のＦＡＣＳ分析
実施例１に記載のベクター中の緑色蛍光タンパク質レポーター配列は、標準的方法により促進されたＧＦＰ(ＥＧＦＰ；Cormack, B. P. et al, Gene, (1996), 173,33-38 ; BD Clontech)で置換された。ＥＧＦＰ遺伝子は、変異Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔを含むＧＦＰのより明るい型である。加えて、ＥＧＦＰは、哺乳類細胞中での発現を最適化するように変化させたコドンを含む。この新しい構成物は、Ｕ２−０Ｓ細胞にトランスフェクトされ、多くのコロニーがジェネチシンで選択され、その後、蛍光活性化セルソーターを用い単一細胞をソーティングすることにより単離された。これらのクローンは、実施例４で生ずる蛍光よりもより明るい蛍光を示し、予測されるように蛍光強度および局在性は、細胞の細胞周期相により変化することが明らかとなった。
【００９７】
当該細胞は、標準的方法によりＦＡＣＳ分析のために調製された。端的には、細胞は、製造者手順によりCytoFix/CytoPerm (Becton Dickinson)を用い固定化および浸透させた。次いで、当該細胞は、50μg/ml RNAse および 0.4% TritonX-100で処理され、100μg/mlヨウ化プロピジウムで対比染色した。ヨウ化プロピジウム染色の程度は、細胞中のＤＮＡ量に、およびそのため細胞の細胞周期相の測定に比例する。図９に示され得るように、予測されるように、赤色ヨウ化プロピジウム染色の程度および緑色ＧＦＰ蛍光の量は、細胞中で比例するように思われる。
【００９８】
６．ＧＦＰ発現レベルにおける細胞周期阻害薬剤の効果
実施例５で調製した細胞は、２４時間、２５ｃｍ２フラスコ中で増殖させ、100ng/ml デメコルシン(Sigma) または 1 mM ミモシン(Sigma)の何れかで処理した。次いで、当該細胞を固定化し、浸透させ、そして実施例５に記載のようなヨウ化プロピジウムで染色した。ＦＡＣＳ分析は、予測されるように、コルチシン類似体で処理した細胞はＧ２／Ｍで停止し、ミモシンで処理した細胞はＧ１／Ｓ境界で停止することを示した。また予測されるように、Ｇ２／Ｍで停止した細胞は、Ｇ１／Ｓで停止した細胞よりも明るかった(図１０)。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】細胞周期の進行の間のサイクリンＢ１調節を説明する模式図である。
【図２】本発明の細胞周期位置核酸レポーター構成物を説明する模式図である。
【図３】細胞周期のＧ２／Ｍ相を測定するためのＤＮＡ構造物を示す。
【図４】非同調化細胞の群中のＧ２／Ｍ細胞周期相マーカーを発現する核酸構成物の発現を示す。
【図５】本発明による細胞周期相マーカーからのＧＦＰ蛍光における細胞周期ブロッキング剤の効果を示す棒グラフである。
【図６】実施例１で記載された構成物をマイクロインジェクションした細胞を示し、実施例３により有糸分裂している、一連の低速度撮影写真である。
【図７】実施例４による有糸分裂している実施例１に記載の構成物を発現するＵ２−０Ｓ細胞を示す、一連の低速度撮影写真である。
【図８】実施例４による実施例１に記載の構成物を安定して発現するＵ２−０Ｓ細胞およびその子孫の相対的蛍光性を示すグラフである。
【図９】実施例５による構成物を含むｅＧＦＰを安定して発現するＵ２−０Ｓ細胞系統のＦＡＣＳ分析である。
【図１０】実施例６による実施例５に記載の安定細胞系統の相対的緑色蛍光強度における細胞周期インヒビターの効果を示すＦＡＣＳ分析である。
【図５】
2005504550.tif 000005
【図８】
2005504550.tif 000006
【国際公開パンフレット】
2005504550.tif 000007
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504550.tif 000059
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月26日(2003.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物、
ここで、当該レポーター構成物は、哺乳類細胞中において細胞周期の事前決定した位置にて発現する。
【請求項２】
当該発現コントロールエレメントが、細胞周期特異的に転写をコントロールする、請求項１の構成物。
【請求項３】
当該発現コントロールエレメントが、細胞周期特異的に翻訳をコントロールする、請求項１または２の何れかの構成物。
【請求項４】
当該発現コントロールエレメントは、細胞周期特異的プロモーターおよび細胞周期特異的ＩＲＥＳから選択される、請求項１−３の構成物。
【請求項５】
当該プロモーターが、サイクリンＢ１プロモーター、Cdc25Bプロモーター、サイクリンＡ２プロモーター、Cdc2プロモーター、Cdc25Cプロモーター、サイクリンＥプロモーター、Cdc6プロモーター、DHFRプロモーターおよびヒストンプロモーターからなる群から選択される、請求項４の構成物。
【請求項６】
当該ＩＲＥＳは、G2-IRES、HCV IRES、ODC IRES、c-myc IRESおよびp58 PITSLRE IRES からなる群から選択される、請求項４または５の何れかの構成物。
【請求項７】
当該破壊コントロールエレメントが、サイクリンＢ１ Ｄ-ボックス、サイクリンＡ Ｎ末端、KENボックス、サイクリンＥおよびp27Kip1からなる群から選択される、請求項１から６の何れかの構成物。
【請求項８】
当該生細胞検出可能レポーター分子は、細胞周期相特異的空間的局在性コントロールエレメントに作動可能なように連結されそのコントロール下にある、請求項１から７の何れかの構成物。
【請求項９】
当該細胞周期相特異的空間的局在性コントロールエレメントは、サイクリンＢ１細胞質保持配列(ＣＲＳ)(そのＮＥＳを含む)である、請求項８の構成物。
【請求項１０】
当該生細胞レポーター分子は、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される、請求項１から９の何れかの構成物。
【請求項１１】
当該蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、および野生型ＧＦＰのアミノ酸配列がアミノ酸欠失、付加または置換により変化した機能的ＧＦＰ類似体から選択される、請求項１０の構成物。
【請求項１２】
当該酵素レポーターが、β−ラクタマーゼおよびニトロレダクターゼからなる群から選択される、請求項１０の構成物。
【請求項１３】
サイクリンＢ１プロモーター、サイクリンＢ１破壊ボックス(Ｄ-ボックス)、サイクリンＢ１細胞質保持配列(ＣＲＳ)および緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)を含む請求項１から１２の何れかの構成物。
【請求項１４】
a)i)細菌性の複製オリジン、および
ii)細菌性薬剤耐性遺伝子
を含むベクターバックボーン、
b)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、
c)破壊コントロールエレメント、ならびに
d)レポーター分子をコードする核酸配列
を含む、発現ベクターを含有する核酸レポーター構成物。
【請求項１５】
更に、細胞周期相特異的空間的局在性コントロールエレメントおよび／または真核細胞性薬剤耐性遺伝子を含む、請求項１４の構成物。
【請求項１６】
請求項１から１５の何れかの構成物でトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１７】
哺乳類細胞の細胞周期位置を決定する方法であって、
a)請求項１から１５の何れかの核酸レポーター構成物を細胞中で発現させること、
b)レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を決定すること、
を含む当該方法。
【請求項１８】
哺乳類細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を決定する方法であって、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロールの下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を、細胞中において当該試験システムの非存在下および／または存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
ここで、当該試験システムの非存在下および／または存在下で測定する放射シグナル間の相違は、当該細胞の当該細胞周期位置における当該試験システムの効果を示す、
を含む当該方法。
【請求項１９】
哺乳類細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を測定する方法であって、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を、当該細胞中において当該試験システムの存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
c)当該試験システムの存在下での放射シグナルを、当該試験システムの非存在下での放射シグナルの既知の値と比較すること、
ここで、試験システムの存在下で測定した放射シグナルと当該試験システムの非存在下で既知の値との相違は、細胞の細胞周期位置での試験システムの効果を示す、
を含む当該方法。
【請求項２０】
哺乳類細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を測定する方法であって、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を含む細胞を提供すること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現し、
b)試験システムの存在下および非存在下で、および核酸レポーター構成物の発現を許容する条件下で、第一および第二の群の細胞をそれぞれ培養すること、および
c)第一および第二の細胞群におけるレポーター分子により放射されるシグナルを測定すること、
ここで、第一および第二の細胞群中で測定された放射シグナル間の相違は、細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を示す、
を含む当該方法。
【請求項２１】
試験システムに応答して変化することが知られる第一の検出可能レポーターの発現、トランスロケーションまたは細胞内分布における哺乳類細胞周期の効果を測定する方法であって、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む第二の核酸レポーター構成物を、当該細胞中において当該試験システムの存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該第二のレポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
c)当該第一の検出可能レポーターにより放射されるシグナルをモニターすること、
ここで、ステップb)により測定した細胞周期位置と当該第一の検出可能レポーターにより放射されるシグナルとの関連は、当該第一の検出可能レポーターの発現、トランスロケーションまたは細胞内分布が細胞周期依存性であるかどうかを示す、
を含む当該方法。
【請求項２２】
当該核酸レポーター構成物は請求項１３の構成物を含む、請求項１７から２１の何れかの方法。
【請求項２３】
当該試験システムが、当該細胞がさらされる薬物、核酸、ホルモン、タンパク質、またはペプチドから選択される物質である、請求項１８から２２の何れかの方法。
【請求項２４】
当該試験システムが、対象となる細胞で発現させるペプチドまたはタンパク質から選択される物質である、請求項１８から２２の何れかの方法。
【請求項２５】
宿主生物中で異種移植片の確立に使用するための請求項１６の細胞を含む細胞系統。
【請求項２６】
宿主生物中で同種移植片の確立に使用するための請求項１６の細胞を含む細胞系統。
【請求項２７】
請求項１６の細胞を含むトランスジェニック生物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
細胞周期のコントロール機構のコンポーネントを使用する、先の方法は、各細胞または細胞群の細胞周期の状態を決定する手段を提供しない。結果として、単一の生細胞の細胞周期位置を非破壊的に決定し得、当該同一細胞を経時的に繰り返し調査(interrogate)し得、そして細胞周期における望ましいまたは望ましくない効果を有する可能性のある物質の効果の研究を可能とする方法が必要とされる。更に、細胞周期のコントロールコンポーネントにより直接コントロールされるプローブから細胞周期位置を決定することは、むしろＤＮＡ含有量または上記のような細胞周期位置の他の間接的なマーカーを通じて間接的にコントロールされるプローブから決定されることよりも望ましい。本発明は、動力学的な読み取りを提供する非破壊的なプロセスにおけるそれぞれ生きている哺乳類細胞について細胞周期の状態を決定する新規手段を提供する確定した組み合わせの細胞周期の調節機構の鍵となるコンポーネントを利用する方法を記載する。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明の要約
従って、本発明の第一の態様では、
i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を提供し、
ここで、当該レポーター構成物は、哺乳類細胞中において細胞周期の事前決定した位置にて発現する。遺伝子からのタンパク質の生合成を含む、すべてのプロセスであるとして発現は定義される。用語"生細胞"は、レポーター分子と関連する場合には、生細胞中で検出可能なシグナルを生じ、そのため生細胞イメージングシステムでの使用に適当であるレポーター分子を決定すると理解されるであろう。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の第二の態様では、哺乳類細胞の細胞周期での位置を決定する方法であって、
a)i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を細胞中において発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、および
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を決定すること、
を含む当該方法を提供する。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
第三の態様では、本発明の核酸レポーター構成物でトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。その構成物を含む構成または発現ベクターを導入する宿主細胞は、当該構成物を発現できる任意の哺乳類細胞であり得、そして真核細胞、例えば、哺乳類細胞、真菌細胞、線虫細胞、魚細胞、両生類細胞、植物細胞および昆虫細胞からなる群から選択され得る。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
そのため、第四の態様では、哺乳類細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を決定する方法を提供し、当該方法は、
a)i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を、細胞中において当該試験システムの非存在下および存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
ここで、当該試験システムの非存在下および存在下で測定する放射シグナル間の相違は、当該細胞の細胞周期位置における当該試験システムの効果を示す、
を含む。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
第五の態様では、哺乳類細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を測定する方法を提供し、当該方法は、
a)i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を、細胞中において当該試験システムの存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該レポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
c)当該試験システムの存在下での放射シグナルを、当該試験システムの非存在下での放射シグナルの既知の値と比較すること、
ここで、試験システムの存在下で測定した放射シグナルと当該試験システムの非存在下での既知の値との相違は、細胞の細胞周期位置での試験システムの効果を示す、
を含む。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
第六の態様では、哺乳類細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を測定する方法を提供し、当該方法は、
a)i)少なくとも１つの細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む核酸レポーター構成物を含む細胞を提供すること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)試験システムの存在下および非存在下で、および核酸レポーター構成物の発現を許容する条件下で、第一および第二の群の細胞をそれぞれ培養すること、および
c)第一および第二の細胞群におけるレポーター分子により放射されるシグナルを測定すること、
ここで、第一および第二の細胞群中で測定された放射シグナル間の相違は、細胞の細胞周期位置における試験システムの効果を示す、
を含む。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
そのため、本発明の第七の態様では、試験システムに応答して変化することが知られる第一の検出可能レポーターの発現、トランスロケーションまたは細胞内分布における哺乳類細胞周期の効果を測定する方法を提供し、当該方法は、
a)i)細胞周期相特異的発現コントロールエレメント、および
ii)破壊コントロールエレメント
に作動可能なように連結しそのコントロール下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードする核酸配列を含む第二の核酸レポーター構成物を細胞中において試験システムの存在下で発現させること、
ここで、当該レポーター構成物は、細胞中において細胞周期の事前に決定した位置にて発現する、
b)当該第二のレポーター分子により放射されるシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を測定すること、
c)当該第一の検出可能レポーターにより放射されるシグナルをモニターすること、
ここで、ステップb)により測定した細胞周期位置と当該第一の検出可能レポーターにより放射されるシグナルとの関連は、第一の検出可能レポーターの発現、トランスロケーションまたは細胞内分布が細胞周期依存性であるかどうかを示す、
を含む。用語"試験システム"は、本発明の第四、第五および第六の態様との関連で前記したように理解すべきである。




【国際調査報告】
2005504550.tif 000060