(57)【要約】  新規遺伝子（１０１Ｐ３Ａ１１またはＰＨＯＲ−１）およびそのコードタンパク質、ならびにその改変体が記載され、ここで１０１Ｐ３Ａ１１は、正常な成体組織における組織特異的発現を示し、そして表Ｉに列挙される癌において異常発現される。結果として、１０１Ｐ３Ａ１１は、癌に対する診断的、予後的、予防的および／または治療的標的を提供する。１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子もしくはそのフラグメント、またはそのコードタンパク質、またはその改変体、またはそのフラグメントが体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘発するために使用され得；１０１Ｐ３Ａ１１と反応性の抗体またはＴ細胞は、能動免疫または受動免疫において使用され得る。
2005512509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、以下：
ａ）図２（配列番号２８、３０および３２）のタンパク質の状態を調節する基質、またはｂ）図２のタンパク質によって調節され、これによって図２のタンパク質を発現する細胞の状態が調節される分子
を含む、組成物。
【請求項２】
生理学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒト単位投薬形態で請求項１に記載の組成物を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記基質が、図２のタンパク質に関するタンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、組成物。
【請求項５】
モノクローナルである、請求項４に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
請求項４に記載の抗体を産生する、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
請求項５に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項９】
図２（配列番号２８、３０、および３２）のタンパク質を発現する細胞に細胞傷害性試薬または診断剤を送達する方法であって、該方法は：
請求項４に記載の抗体またはそのフラグメントに結合体化した細胞傷害性試薬または診断剤を提供する工程；および
該細胞を抗体−薬剤結合体またはフラグメント−薬剤結合体に曝露する工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、前記基質が、そのいずれかが図２のタンパク質に免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、前記基質が、図２のタンパク質に関するタンパク質を含む、組成物。
【請求項１２】
図２（配列番号２８、３０、および３２）に示される全体のアミノ酸配列に少なくとも９０％相同性である、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、前記基質が以下：
ａ）図２のタンパク質の８個、９個、１０個または１１個の連続したアミノ酸のペプチド
ｂ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに記載のペプチド（配列番号２８、３０、および３２）
ｃ）表ＸＸＩＩ〜ＸＬＶＩＩに記載のペプチド（配列番号２８、３０、および３２）；または
ｄ）表ＸＬＶＩＩＩ〜ＬＩに記載のペプチド（配列番号２８、３０、および３２）
を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、前記基質が、図２のタンパク質（配列番号２８、３０、および３２）のアミノ酸由来のＣＴＬポリペプチドまたはそのアナログを含む、組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物であって、エピトープが図２の全体のアミノ酸配列（配列番号２８、３０、および３２）ではないｐｒｏｖｉｓｏによってさらに制限される、組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の組成物であって、前記基質が、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに記載されるＣＴＬポリペプチド（配列番号２８、３０、および３２）を含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、前記ポリペプチドが、図２のタンパク質の全体のアミノ酸配列（配列番号２８、３０、および３２）でないｐｒｏｖｉｓｏによってさらに制限される、組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物であって、前記基質が、図２のアミノ酸配列（配列番号２８、３０、および３２）由来の抗体ポリペプチドエピトープを含む、組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、前記エピトープが、図２の全体のアミノ酸配列（配列番号２８、３０、および３２）でないｐｒｏｖｉｓｏによってさらに制限される、組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の組成物であって、前記抗体エピトープが、前記ペプチドの末端までの任意の全ての数の増大において図２の少なくとも５つのアミノ酸（配列番号２８、３０、および３２）のペプチド領域を含み、ここで該エピトープが以下から選択されるアミノ酸位：
ａ）図５のヒドロパシープロフィールにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位；
ｂ）図６のヒドロパシープロフィールにおいて０．５よりも少ない値を有するアミノ酸位；
ｃ）図７の受容可能残基％において０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位；
ｄ）図８の平均可変性プロフィールにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位；
ｅ）図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位；
ｆ）ａ）〜ｅ）の少なくとも２つの組み合わせ；
ｇ）ａ）〜ｅ）の少なくとも３つの組み合わせ；
ｈ）ａ）〜ｅ）の少なくとも４つの組み合わせ；
ｉ）ａ）〜ｅ）の５つの組み合わせ；
を含む、組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、前記エピトープが図２の全体のアミノ酸配列（配列番号２８、３０および３２）でないｐｒｏｖｉｓｏによってさらに制限される、組成物。
【請求項２２】
請求項１１に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
図２に記載の核酸分子を含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドであって、前記コードされたタンパク質が、図２の全体のアミノ酸配列（配列番号２８、３０および３２）でないｐｒｏｖｉｓｏによってさらに制限される、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ＴがＵで置換されている、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項１に記載の組成物であって、前記基質が、図２の核酸配列のコード配列（配列番号２７、２９および３１）を含むポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２７】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドであって、請求項１１に記載のさらなるタンパク質をコードするさらなる核酸配列をさらに含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２９】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３０】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載の組成物であって、前記基質が、ａ）１０１Ｐ３Ａ１１コード配列を有するポリヌクレオチドを切断するリボザイム、またはｂ）該リボザイムをコードする核酸分子；および生理学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項３２】
請求項１に記載の組成物であって、前記基質がヒトＴ細胞を含み、該Ｔ細胞が、特定のＨＬＡ分子の状況において１０１Ｐ３Ａ１１ペプチド部分配列を特異的に認識する、組成物。
【請求項３３】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法が、
該細胞に請求項１に記載の組成物を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法が：
該細胞に、そのいずれかが１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３５】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
該細胞に１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３６】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
該細胞に、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチド、または１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質のコード配列に相補的であるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
該細胞に、図２のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを切断するリボザイムを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
図２のタンパク質および特定のＨＬＡ分子を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
ヒトＴ細胞を該癌細胞に投与する工程であって、該Ｔ細胞が図２のタンパク質のペプチド配列を特異的に認識する一方で、前記基質が特定のＨＬＡ分子の状況にある工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法であって、該方法が：
一本鎖モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを送達するベクターを投与する工程であって、これにより、該コードされた一本鎖抗体が図２のタンパク質を発現する癌細胞内で細胞内発現される工程
を包含する、方法。
【請求項４０】
図２のタンパク質に対して指向される哺乳動物免疫応答を生成する方法であって、該方法は：
該哺乳動物の免疫系の細胞を、以下の部分
ａ）１０１３ＰＡ１１関連タンパク質および／または
ｂ）該タンパク質をコードするヌクレオチド
に曝露する工程であって、これにより免疫応答が該タンパク質に対して生成される、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の免疫応答を生成する方法であって、該方法は：
少なくとも１つのＴ細胞または少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む１０１３Ａ１１関連タンパク質を提供する工程；および
該エプトープを哺乳動物免疫系Ｔ細胞またはＢ細胞とそれぞれ接触させ、これによってＴ細胞またはＢ細胞が活性化される工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、前記免疫系細胞がＢ細胞であり、これによって誘導されたＢ細胞が１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質に特異的に結合する抗体を生成する、方法。
【請求項４３】
請求項４１に記載の方法であって、前記免疫系細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）であるＴ細胞であり、これによって活性化されたＣＴＬ細胞が、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を発現する自己細胞を殺傷する、方法。
【請求項４４】
請求項４１に記載の方法であって、前記免疫系細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）であるＴ細胞であり、これによって活性化ＨＴＬが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞傷害活性、またはＢ細胞の抗体産生活性を促進するサイトカインを分泌する、方法。
【請求項４５】
サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質または１０１Ｐ３Ａ１１関連ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法であって、該方法は：
該サンプルを、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質または１０１Ｐ３Ａ１１関連ポリヌクレオチドとそれぞれ特異的に結合する請求項１に記載の基質と接触させる工程；および
それぞれ該基質と該１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質との複合体、または該基質と該１０１Ｐ３Ａ１１関連ポリヌクレオチドとの複合体が存在するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の存在を検出するための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
該サンプルを、そのいずれかが該１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントと接触させる工程；および
該抗体またはそのフラグメントと１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質との複合体が存在するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の方法であって、癌を有しているか、または癌を有していると疑われる患者からサンプルを採取する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４８】
サンプル中の図２のタンパク質およびｍＲＮＡの存在を検出するための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
少なくとも１つのプライマーを用いて逆転写によって該サンプルからｃＤＮＡを生成する工程；
１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用して生成されたｃＤＮＡを増幅させる工程であって、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用された該１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドが１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡを増幅させるために役立つ、工程；ならびに
該増幅された１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡの存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
癌を有しているか、または癌を有していると疑われる患者由来の生物学的サンプルにおける１つ以上の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物をモニタリングするための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
個体由来の組織サンプル中の細胞によって発現される１つ以上の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態を決定する工程；
そのように決定された状態を、対応する正常なサンプルにおける１つ以上の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態と比較する工程；および
該正常なサンプルに対する該サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の１つ以上の異常な遺伝子産物の存在を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の１つ以上の上昇した遺伝子産物が存在するか否かを決定する工程をさらに包含し、これによって前記正常な組織サンプルと比較した前記試験サンプル中の１つ以上の上昇した遺伝子産物の存在が、癌の存在または状態を示す、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、前記癌が表Ｉに記載の組織中で生じる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府支援の研究の下でなされた本発明に対する陳述）
適用なし。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書中に記載された発明は、特定の癌において発現される１０１Ｐ３Ａ１１またはＰＨＯＲ−１といわれる遺伝子およびそのコードタンパク質、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌の取り扱いにおいて有用な診断方法および治療方法、および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ガンは、冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）に次いで、ヒトの第２の死亡原因である。全世界的に、数百万の人々が、毎年癌により死亡している。米国単独では、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによって報告されるように、癌は毎年５０万人をはるかに超える人々の死亡原因であり、毎年１２０万あまりの新たな症例が診断されている。心臓疾患での死亡は顕著に減少している一方で、癌に起因する死亡は、一般に増加の傾向にある。来世紀の初期には、癌は死亡の主要な原因になると予測されている。
【０００４】
全世界で、いくつかの癌が主要な死亡原因（ｋｉｌｌｅｒ）として顕著である。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、主要な癌による死亡原因を代表する。これらおよび事実上全ての他の癌腫は、共通する致死的特徴を共有している。ごくわずかな例外はあるが、癌腫が原因の転移性疾患は、致命的である。さらに、初期の段階ではその原発性癌を生き延びた癌患者についてすら、その生活が劇的に変化したという共通の経験が示されている。多くの癌患者は、再発または処置の失敗についての可能性を知ることによって駆り立てられる、強い不安を経験している。多くの癌患者は、処置後に肉体的衰弱を経験している。さらに、多くの癌患者は、再発を経験している。
【０００５】
全世界で、前立腺癌は、男性において４番目に最も一般的な癌である。北部アメリカおよび北欧では、はるかに、最も一般的な男性の癌であり、そして男性における癌による死亡の２番目に主要な原因である。米国単独では、肺癌のみに次いで、３０，０００人をはるかに超える男性がこの疾患で毎年死亡している。これらの数字の規模にもかかわらず、転移性の前立腺癌に対する有効な処置は未だ存在しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモン除去（ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｂｌａｔｉｏｎ）療法、外科的去勢および化学療法は、主要な処置様式であり続けている。不運にも、これらの処置は、多くに対して有効でなく、かつしばしば、所望されない結果を付随する。
【０００６】
診断現場において、初期段階の局在化した腫瘍を正確に検出し得る前立腺腫瘍マーカーが存在しないことは、依然としてこの疾患の診断および管理における大きな限界を残している。血清の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイは非常に有用なツールであるが、その特異性および一般的利用性は、いくつかの重大な点が欠如していると広く考えられている。
【０００７】
前立腺癌についてのさらなる特異的マーカーを同定することにおける進歩は、マウスにおける疾患の異なるステージを再現し得る前立腺癌異種移植片の生成により改善されてきた。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ）異種移植片は、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける経過を生き延び、かつアンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行を模倣する能力を示した前立腺癌異種移植片である（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２）。より近年同定された前立腺癌マーカーとしては、ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７２５２）、前立腺特異膜（ＰＳＭ）抗原（Ｐｉｎｔｏら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６  Ｓｅｐ；２（９）：１４４５−５１）、ＳＴＥＡＰ（Ｈｕｒｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９  Ｄｅｃ  ７；９６（２５）：１４５２３−８）および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１７３５）。
【０００８】
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡおよびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーは、前立腺癌を診断し、そしてこれを処置する取り組みを促進したが、診断および治療をさらに改善するために、前立腺癌および関連する癌に対するさらなるマーカーおよび治療標的を同定する必要がある。
【０００９】
腎臓細胞癌（ＲＣＣ）は、成体の悪性疾患の約３％に及ぶ。一旦、腺腫が２〜３ｃｍに到達すると、悪性疾患の潜在性が存在する。成体において、２つの主な悪性腎臓腫瘍は、腎臓の骨盤および尿管の腺癌および転移性細胞癌である。腎臓細胞腺癌の発病率は、米国で２９，０００症例を超え、そして１９９８年にこの疾患で１１，６００人を超える患者が死亡したと見積もられる。転移性細胞癌は、余り頻繁ではなく米国において１年あたり約５００症例ほどの発生率である。
【００１０】
手術は、長い年月にわたり腎臓細胞腺癌のための主な治療であった。近年まで、転移性疾患は、任意の全身性治療に対して難治性であった。全身性治療（特に、免疫治療）における近年の発達に伴ない、悪性腎臓細胞癌は、耐久性応答の可能性を有する適切な患者に攻撃的にアプローチ到達しうる。それにもかかわらず、これらの患者に対する効果的な治療の必要性が存在し続けている。
【００１１】
米国における癌の全ての新しい症例のうち、膀胱癌は、男性において約５％（最も一般的な新生物の５番目）および女性において３％（最も一般的な新生物の８番目）を表す。発生率は穏やかに増加し、高齢の人口の増加と一致する。１９９８年において、男性における３９，５００症例と女性における１５，０００症例を含む５４，５００症例が見積もられた。米国における年齢調整された（ａｇｅ−ａｄｊｕｓｔｅｄ）発病率は、男性について１００，０００人当たり３２人、および女性において１００，０００人当たり８人である。３：１の歴史的な男性／女性比は、女性における喫煙パターンに関連して減少し得る。１９９８年に膀胱癌で１１，０００人が死亡したと見積もられた（男性７，８００人および女性３，９００人）。膀胱癌発生率および死亡率は、年齢と共に大きく増加し、そして人口がより高齢化することにつれて問題も増大する。
【００１２】
多くの膀胱癌は、膀胱中で再発する。膀胱癌は、膀胱の経尿道的切除術（ＴＵＲ）と膀胱内化学療法または免疫療法との組み合わせを用いて取り扱われる。膀胱癌の多病巣性の性質および再発性の性質は、ＴＵＲの制限を指摘する。ほとんどの筋肉侵襲性癌は、ＴＵＲ単独では治療されない。根治的膀胱切除術および尿の寸法は、癌を切除するための最も効果的な手段であるが、尿の機能および制的機能に否定できない影響を及ぼす。膀胱癌患者に有益な処置様相の有意な必要性が存在し続けている。
【００１３】
米国で２０００年に生じた結腸直腸癌の見積もられた１３０，２００症例は、９３，８００症例の結腸癌および３６，４００症例の直腸癌を含む。結腸直腸癌は、男性および女性における三番目に一般的な癌である。発生率は、１９９２年〜１９９６年の間に有意に減少していた（１年あたり−２．１％）。調査は、これらの減少が侵襲性の癌へのポリープの進行を予防する、スクリーニングの増加およびポリープ除去に起因していることを示唆する。２０００年には５６，３００人の死亡者（４７，７００人は結腸癌、８，６００人は直腸癌）が見積もられ、全ての米国の癌死亡者の約１１％を占めた。
【００１４】
現在、手術が、結腸直腸癌、および広がっていない癌のための最も一般的な形態であり、これは大抵治癒的である。化学療法または化学療法と放射線照射は、その癌が、腸壁に深い穴を開けているか、またはリンパ節に広がっている患者に対して手術前もしくは後に提供される。永久的な人工肛門形成（身体の排泄物の除去するための腹部開口部の形成）は、結腸癌について場合によって必要とされ、そして直腸癌については頻繁に要求される。結腸直腸癌についての効果的な診断様相および処置様相の必要性が存在し続けている。
【００１５】
２０００年の肺癌および気管支癌は１６４，１００症例新しく見積もられ、全ての米国癌診断の１４％を占める。肺癌および気管支癌の発生率は、１９８４年の１００，０００人中８６．５人の高値から１９９６年の７０．０人へと、男性において有意に減少している。１９９０年代、女性の間での発生率は低くなり始めた。１９９６年の女性における発生率は、１００，０００人中４２．３人である。
【００１６】
肺癌および気管支癌は、２０００年に推定１５６，９００人の死亡者を生じ、全ての癌死亡者の２８％を占めた。１９９２年〜１９９６年の間、肺癌での死亡率は、男性の間で有意に減少（１年当たり−１．７％）した一方で、女性についての死亡率は優位に増加している（１年当たり０．９％）。１９８７年以来、より多くの女性が乳癌よりも肺癌で毎年死亡しており、４０年に渡って女性における癌死の腫瘍な原因となっている。肺癌発生率および死亡率の減少は、前の３０年にわらる喫煙率の減少に起因しているようであるが；女性の間での喫煙パターンの減少は、男性のそれに遅れている。成体におけるタバコの使用の減少が低くなっている一方で、若者におけるタバコの使用が再度増加していることが、重大である。
【００１７】
肺癌および気管支癌のための処置選択肢は、癌の型および段階によって決定され、選択肢としては、手術、放射線治療および化学療法が挙げられる。多くの局在化された癌について、手術は、通常選択される処置である。この疾患は、通常発見されてから時間によって広がるので、放射線治療および化学治療が、手術と組み合わせてしばしば必要とされる。化学治療単独または放射線治療との組み合わせは、小細胞肺癌について選択される処置であり；このレジメンにおいて、患者の大きな％が寛解を経験し、これはいくつかの場合において長く持続する。しかし、肺癌および気管支癌に対する効果的な処置アプローチおよび診断アプローチに必要が存在し続けている。
【００１８】
推定１８２，８００の乳癌の新しい侵襲性症例が、２０００年の間に米国の女性の間で生じると予測された。さらに、約１，４００の乳癌の新しい症例が、２０００年に男性において診断されると予測された。１９８０年代における一年当たり約４％の増加後、女性における乳癌発生率は、１９９０年代に１００，０００件当たり約１１０．６件に頭打ちとなった。
【００１９】
米国単独で、乳癌に起因して２０００年に推定４１，２００人死亡した（４０，８００人が女性、４００人が男性）。乳癌は、女性における癌の２番目に主要なものである。最も最近のデータによると、死亡率は、１９９２年〜１９９６年の間に有意に減少しており、白人および黒人の両方の若い女性の間で最も大きく減少していた。これらの減少は、おそらく早期発見および処置の改善の結果であった。
【００２０】
医学的環境および患者の優先度を考慮にいれると、乳癌の処置としては、ランペクトミー（腫瘍の局所的な除去）および脇下リンパ節の除去；乳房切除（乳房の外科的除去）および脇下リンパ節の除去；放射線治療；化学療法；またはホルモン療法が挙げられ得る。しばしば、２つ以上の方法が組み合わせて使用される。多数の研究が疾患の初期段階について示されており、ランペクトミーと放射線治療との併用の後の長期間の生存率は、改変された放射線乳房切除後の生存率に同様である。再構築における有意な進歩は、乳房切除後の乳房再建についていくつかの選択肢を提供する。近年、このような再構築は、乳房切除と同時に行われる。
【００２１】
十分な量の周囲の正常胸部組織を伴うインサイチュの腺管癌（ＤＣＩＳ）の局所切除によって、ＤＣＩＳの局所的な再発を防ぎ得る。胸部への放射線照射および／またはタモキシフェンによって、残っている胸部組織において生じるＤＣＩＳの発生率が低減され得る。このことは、ＤＣＩＳが未処理のままである場合に、浸潤性癌へと発達し得るので重要である。それにもかかわらず、これらの処置について、深刻な副作用または後遺症が存在する。従って、効果的な乳癌処置の必要性が存在する。
【００２２】
２０００年の米国において卵巣癌の推定２３，１００の新症例が存在した。乳癌は女性における全ての癌のうち４％に匹敵し、婦人科における癌において第２位に位置付けられている。１９９２年〜１９９６年の間において、卵巣癌の発症率は、顕著に低下した。卵巣癌の結果として、２０００年においては推定１４，０００人の死亡者がでた。卵巣癌は、女性の生殖系の他のいかなる癌よりも最も多い死亡例を生じる。
【００２３】
外科的手術、放射線療法、および化学療法は、卵巣癌にとっての治療における選択肢である。外科的手術としては、通常、卵巣の片方かまたは両方の切除、ファロービウス管の切除（卵管卵巣摘出術）、および子宮の切除（子宮摘出術）が挙げられる。いくつかの非常に初期の腫瘍において、浸潤した卵巣は、子供を持つことを望む若い女性において特に、除去される。進行した疾患において、内部の異常疾患を除去して化学療法の効力を増大させることが試みられる。卵巣癌についての効果的な処置の選択肢についての重要な必要性が存在し続ける。
【００２４】
２０００年の米国において膵臓癌の推定２８，３００の新症例が存在する。過去２０年間にわたって、膵臓癌の割合は、男性においては減少している。女性における割合は、おおよそ一定のままであるが、減少し始めてはいる。膵臓癌は、米国において推定２８，２００の死者を２０００年に出した。過去２０年間にわたって、男性における致死率は僅かであるが確かに減少した（１年間で約−０．９％）が、その一方で、その割合が女性においては僅かに上昇した。
【００２５】
外科手術、放射線療法、および化学療法は、膵臓癌にとっての治療の選択肢である。これらの治療における選択肢は、延命し得、そして／または多くの患者をその症状から解放し得るが、殆どの人とっての治療法を生み出すには有望ではない。膵臓癌にとってのさらなる治療的および診断的選択肢に対しての重大な必要性が存在する。
【００２６】
（Ｇタンパク質共役型レセプター）
Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）は、共通の構造モチーフを有する。多くのこれらのレセプターは、７つのαへリックスを形成する２２〜２４の間の疎水性アミノ酸の７つのアミノ酸配列を有しており、これらのαヘリックスの各々は膜にまたがる。これらの膜貫通へリックスは、膜の細胞外側にある第４膜貫通ヘリックスと第５膜貫通ヘリックスとの間の長いループを有するアミノ酸のストランドによって接続されている。別の長いループ（主に疎水性アミノ酸から構成されている）は、この膜の細胞内側にある第５膜貫通ヘリックスと第６膜貫通ヘリックスを接続する。このレセプターのカルボキシ末端は細胞内に存在し、アミノ末端は細胞外空間に存在する。第５ヘリックスと第６ヘリックスを接続しているループは、カルボキシ末端と同様に、Ｇタンパク質と相互作用していると考えられている。特定のＧＰＣＲにおいて、第１の細胞内ループがまた、Ｇタンパク質の相互作用にとって重要であるという証拠が存在する。現在、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、およびＧｏが同定されているＧタンパク質である。
【００２７】
生理学的条件下において、ＧＰＣＲは、細胞膜内で、以下の２つの異なる状態すなわち２つの異なるコンホメーションの間にて平衡状態で存在している：「不活性状態」および「活性状態」。不活性状態にあるレセプターは、生物学的応答を生じるための細胞内伝達経路にリンクすることができない。このレセプターのコンホメーションを活性状態に変化させると、伝達経路への連結を可能にし、そして、生物学的応答を可能にする。
【００２８】
レセプターは、内因性リガンドまたは外因性アゴニストリガンドによって活性状態で安定化される。最近の発見（レセプターのアミノ酸配列に対する改変を含むがこれらに排他的に限定されない）によって、活性状態コンホメーションを安定化するリガンドではない代替的な機構が提供される。これらのアプローチによって、レセプターに対してリガンドが結合する効果を刺激することによって活性状態にあるレセプターが効果的に安定化される。このようなリガンド非依存的アプローチによる安定化は、「構成性レセプター活性化」と呼ばれる。内因性リガンドが未知であるかまたは同定されていないレセプターは「オーファンレセプター」として言及される。
【００２９】
従来の化合物スクリーニングに関して、一般的に、このようなレセプターに関連する生物学的応答を調節する化合物を同定するためのスクリーニング目的のためのオーファンレセプターの使用は、可能となってない。これは、化合物のスクリーニングに関する従来の「ドグマ」が、このレセプターについてのリガンドが既知であり、それによってこのレセプターと競合的に結合する化合物が選択される（すなわち、このレセプターとの天然のリガンドとの結合を干渉するかまたはブロックすることによる）ことを要求するためである。定義によれば、このアプローチは、オーファンレセプターに関して適用可能性はない。従って、この治療剤の発見に対するドグマ的アプローチを支持することによって、当該技術は、本質的に、オーファンレセプターについての天然のリガンドが発見されなければそれまでずっと、これらのレセプターの使用は取りやめることを教示している。オーファンレセプターに対する内因性リガンドの追及は、数年間を必要とし得、かつ数約万ドルを費やし得る。
【００３０】
さらに、ヒトゲノムにおいて推定２，０００のＧＰＣＲが存在し、その大多数がオーファンレセプターであるならば、従来のドグマは、これらのレセプターに対する治療剤の発見に対しての創造的アプローチを非難する。多くのオーファンＧタンパク質共役レセプターは、それらの内因性状態において構成的に活性である。マウスの嗅覚レセプターＭＯＲ１８−１（＞ｇｉ｜１８４７９２８４，図６５）。１０１Ｐ３Ａ１１に対する内因性リンガンドは、未知である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３１】
（発明の要旨）
本発明は、１０１Ｐ３Ａ１１として示される遺伝子に関し、この遺伝子は、表Ｉに列挙される癌において過剰発現されていることが現在見出されている。正常組織における１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子発現のノーザンブロット発現分析は、成人組織における制限された発現パターンを示している。１０１Ｐ３Ａ１１のヌクレオチド配列（図２）およびアミノ酸配列（図２および図３）が提供されている。正常な成人組織における１０１Ｐ３Ａ１１の組織関連プロファイルは、表Ｉにおいて列挙される組織において観察された過剰発現とあわせて、１０１Ｐ３Ａ１１が少なくともいくつかの癌において異常なほど過剰発現されており、したがって、表Ｉで列挙された組織のような組織の癌について有用な診断標的、予防標的、予後診断標的および／または治療標的として役割を果たすことを示している。
【００３２】
本発明は、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の全てまたは一部分に対応するかまたは相補的であるポリヌクレオチド、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列を、好ましくは単離された形態で提供し、これらとしては、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２５を超える連続したアミノ酸の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質およびフラグメントをコードするポリヌクレオチド；少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、３１７または３１８；あるいは３１７または３１８を超える連続したアミノ酸の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質、ならびにペプチド／タンパク質自体；ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、１０１Ｐ３Ａ１１の遺伝子またはｍＲＮＡ配列あるいはそれらの一部に対して相補的であるかまたは少なくとも９０％の相同性にを有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１の遺伝子またはｍＲＮＡ配列あるいはそれらの１０１Ｐ３Ａ１１コードポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを提供する。１０１Ｐ３Ａ１１をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するための手段もまた提供される。１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換または形質導入された細胞、および１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系がまた、提供される。本発明はさらに、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質およびそれらのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供し、これらの抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウス抗体および他の哺乳類抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、および検出可能なマーカーまたは治療剤で標識された抗体を含む。特定の実施形態において、図２の核酸配列の全体がコードされ、そして／または図２のアミノ酸配列が調製され、これらのいずれかは、それぞれのヒト単位投薬形態であり得る。特定の実施形態において、図２の核酸全体がコードされるか、そして／または、図２のアミノ酸配列が調製され、これらのうちのいずれかはそれぞれのヒト単位投薬形態であり得る。
【００３３】
本発明は、種々の生物学的サンプルの中で１０１Ｐ３Ａ１１のポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在および状態を検出するための方法、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞を同定する方法をさらに提供する。本発明の代表的な実施形態は、癌のような増殖非制御のいくつかの形態を有するかまたはそれらを有すると疑われる組織サンプルまたは血液学的サンプルにおいて１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物をモニターするための方法を提供する。
【００３４】
本発明は、種々の免疫原性組成物または治療組成物、および１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌（例えば、表Ｉに列挙された組織の癌）を処置するためのストラテジー（１０１Ｐ３Ａ１１の転写、翻訳、プロセシングまたは機能を阻害することを目的とした治療を含む）ならびに癌ワクチンをさらに提供する。１つの局面において、本発明はヒト被験体において１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌を処置するための組成物、ならびにそれらを含む方法を提供し、ここで、この組成物は、ヒトの用途について適切なキャリアならびに１０１Ｐ３Ａ１１の産生または機能を阻害する１つより多い薬剤のヒトの単位用量を含む。好ましくは、このキャリアは、特有のヒトキャリアである。本発明の別の局面において、これらの薬剤は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質と免疫反応性部分である。このような部分の非限定的な例としては、抗体（例えば、単鎖、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体）、（天然に存在しているかまたは合成された）それらの機能的等価物ならびにそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。これらの抗体は、診断的部分または治療的部分に結合体化され得る。別の局面において、この薬剤は、本明細書中で定義されるような低分子である。
【００３５】
別の局面において、この薬剤は、１０１Ｐ３Ａ１１に対するＣＴＬ応答を誘導するためのヒトにおけるＨＬＡクラスＩ分子に結合する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む１以上のペプチドおよび／またはヒトにおいてＨＬＡクラスＩＩ分子に結合してＨＴＬ応答を誘発するヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープを含む１以上のペプチドを含む。本発明のペプチドは、同一のものまたは１以上の別個のポリペプチド分子であり得る。本発明のさらなる局面において、この薬剤は、上記のようにＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答を刺激するペプチドのうちの１つの１以上を発現する核酸分子のうちの１つ以上を含む。本発明のさらに別の局面において、１以上の核酸分子は、上記のように１０１Ｐ３Ａ１１と免疫学的に応答する部分を発現し得る。１つ以上の核酸分子はまた、１０１Ｐ３Ａ１１の産生を阻害する分子であり得るか、またはこれをコードし得る。このような分子の非限定的な例としては、１０１Ｐ３Ａ１１の産生にとって必須のヌクレオチド配列に相補的な分子（例えば、アンチセンス配列または１０１Ｐ３Ａ１１産生にとって必須の二重鎖を有する三重鎖に由来する核酸を有する分子）または１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡを溶解するのに効果的なリボザイムが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３６】
備考：親タンパク質（例えば、改変体１，改変体２など）に関して表Ｖ−ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ−ＩＬ（集合的にＨＬＡペプチド表（ＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｔａｂｌｅ）とする）に示される任意のペプチドの開始位置を決定するために、以下の３つの因子を参照する：特定の改変体、ＨＬＡペプチド表におけるペプチドの長さ、および表ＬＩＩにおける表ＬＩＩにおけるペプチド検索（Ｓｅａｒｃｈ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）。一般に、固有のペプチド検索を使用して、特定の改変体に対する特定のＨＬＡペプチドを得る。そのそれぞれの親分子に対する各ペプチド検索の位置は、表ＬＩＩに列挙される。したがって、ペプチド検索が位置「Ｘ」で開始した場合、これらの親分子におけるＨＬＡペプチドの実際の位置を得るために表Ｖ−ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ−ＩＬにおける各位置に対して値「Ｘ−１」を加えなければならない。例えば、特定のペプチド検索がその親分子の１５０位で開始するとき、親分子におけるアミノ酸の位置を計算するために各ＨＬＡペプチドアミノ酸の位置に１５０−１、すなわち１４９を加算しなければならない。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
（節の概要）
Ｉ．）定義
ＩＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド
ＩＩ．Ａ．）１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドの使用
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝的異常のモニタリング
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの実施形態
ＩＩ．Ａ．３．）プライマーおよびプライマー対
ＩＩ．Ａ．４．）１０１Ｐ３Ａ１１コード核酸分子の単離
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子および宿主ベクター系
ＩＩＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ保有タンパク質の実施形態
ＩＩＩ．Ｂ．）１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の発現
ＩＩＩ．Ｃ．）１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の改変
ＩＩＩ．Ｄ．）１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の使用
ＩＶ．）１０１Ｐ３Ａ１１抗体
Ｖ．）１０１Ｐ３Ａ１１細胞免疫応答
ＶＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１トランスジェニック動物
ＶＩＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１の検出方法
ＶＩＩＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１関連遺伝子およびそれらの産物の状態をモニタリングするための方法
ＩＸ．）１０１Ｐ３Ａ１１と相互作用する分子の同定
Ｘ．）治療法および組成物
Ｘ．Ａ．）抗癌ワクチン
Ｘ．Ｂ．）抗体ベースの治療のための標的としての１０１Ｐ３Ａ１１
Ｘ．Ｃ．）細胞免疫応答のための標的としての１０１Ｐ３Ａ１１
Ｘ．Ｃ．１．ミニ遺伝子ワクチン
Ｘ．Ｃ．２．ヘルパーペプチドとＣＴＬペプチドとの組み合わせ
Ｘ．Ｃ．３．Ｔ細胞プライミング剤とＣＴＬペプチドとの組み合わせ
Ｘ．Ｃ．４．ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスしたＤＣを含むワクチン組成物
Ｘ．Ｄ．）養子免疫療法
Ｘ．Ｅ．）治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
ＸＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１の診断的実施形態および予後的実施形態
ＸＩＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質機能の阻害
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体を用いた１０１Ｐ３Ａ１１の阻害
ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質を用いた１０１Ｐ３Ａ１１の阻害
ＸＩＩ．Ｃ．）１０１Ｐ３Ａ１１の転写または翻訳の阻害
ＸＩＩ．Ｄ．）治療的ストラテジーのための一般的考慮
ＸＩＩＩ．）キット／物品の製品
ＸＩＶ．）ＧＰＣＲおよびその調節因子の評価
ＸＶ．）候補化合物のスクリーニング
ＸＶＩ．）ＧＰＣＲ融合タンパク質
（Ｉ．）定義）
他に特に定義されていない限りは、本明細書中で使用される当該分野の全ての用語、記号、および他の科学的用語または専門用語は、本発明が関係している当業者によって一般的に理解されている意味を有するように意図される。いくつかの場合においては、一般的に理解されている意味を有する用語は、明確さおよび／または容易な参照のために本明細書中で定義され、そして本明細書中でのこのような定義の包含は、当該分野で一般的に理解されている意味を超える実質的な差異を示すようには決して解釈されないはずである。本明細書中に記載されるかまたは参照される技術および手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｎｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている、広範囲に利用されている分子クローニング方法論）は、一般的に十分に理解されており、そして当業者によって、従来の方法論を用いて一般的に使用される。適切である場合には、商業的に入手可能なキットおよび試薬の使用を含む手順が、一般的には、製造業者によって定義されるプロトコルおよび／またはそうでなければ他に記載されているパラメーターに従って行われる。
【００３８】
用語「進行した前立腺ガン」、「局所的に進行した前立腺ガン」、「進行した疾患」、および「局所的に進行した疾患」は、前立腺の莢膜を通じて拡大した前立腺ガンを意味し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）システムのもとでのステージＣの疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−ＪｅｗｅｔｔシステムのもとでのステージＣ１〜Ｃ２の疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移（ｔｕｍｏｒ、ｎｏｄｅ、ｎｅｔａｓｔａｓｉｓ））システムのもとでのステージＴ３〜Ｔ４およびＮ＋の疾患を含むように意味される。一般的には、外科手術は、局所的に進行した疾患を有する患者については推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在化した（器官に限定された）前立腺ガンを有している患者と比較して、実質的にあまり好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の側縁を超えるしこり、あるいは前立腺の基部の上部の非対称性またはしこりの明白な証拠によって、臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺ガンは、現在は、腫瘍が前立腺の莢膜に侵入または浸潤するか、外科的な縁に伸びるか、あるいは精子の小包に侵入する場合には、根治的な前立腺切除後に病理学的に診断される。
【００３９】
「ネイティブなグリコシル化パターンを改変すること」は、本明細書中の目的を意図し、ネイティブ配列の１０１Ｐ３Ａ１１において見出される１つ以上の炭水化物部分を除去すること（内在するグリコシル化部位を除去することによってか、または化学的手段および／もしくは酵素的手段によってグリコシル化を除去することによってのいずれかで）、および／あるいはネガティブ配列の１０１Ｐ３Ａ１１に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。さらに、句は、ネガティブタンパク質のグリコシル化の質的な変化を含み、種々の炭水化物部分の存在の性質および比率の変化に関する。
【００４０】
用語「アナログ」は、構造的に類似するか、別の分子と類似する特性または一致する特性を共有する分子をいう（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質）。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアナログは、１０１Ｐ３Ａ１１に特異的に結合する抗体またはＴ細胞によって特異的に結合され得る。
【００４１】
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用される。従って、「抗体」は、天然に存在し得るか、または慣習なハイブリドーマ技術によって産生されるモノクローナル抗体のような人工であり得る。抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびに抗原結合ドメインおよび／またはこれらの抗体の１つ以上の相補的決定領域を含むフラグメントを含む。
【００４２】
「抗体フラグメント」は、標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部分（すなわち、抗原結合領域）として定義される。１つの実施形態において、これは、単一の抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体およびそのクローン（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体が挙げられる）ならびにポリエピトープの（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）特異性を有する抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体組成物を特に網羅する。
【００４３】
用語「コドン最適化配列」は、少なくとも約２０％の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって特定の宿主種を最適化するヌクレオチド配列をいう。偽ポリアデニル化配列の除去、エキソン／イントロンスプライシングシグナルの除去、トランスポソン様リピートの除去および／またはコドン最適化に加えてＧＣ含量の最適化によって、所定の宿主種における発現について最適化されたヌクレオチド配列は、「発現増強配列」として本明細書中で参照される。
【００４４】
用語「細胞傷害性試薬」は、細胞の発現活性、細胞の機能を阻害するかまたは防止し、そして／あるいは細胞の破壊を引き起こす物質をいう。用語は、放射活性アイソトープ化学療法剤および毒素（例えば、低分子毒素または細菌起源、真菌起源、植物起源または動物起源の酵素的活性毒素）（フラグメントおよび／またはその改変体を含む）を含むことが意図される。細胞障害性試薬の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、イットリウム、ビスマス、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロマイド、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、およびグルココルチコイド、ならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位元素（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）。抗体はまた、活性形態にプロドラッグを変換し得る抗癌プロドラッグ活性化酵素に結合し得る。
【００４５】
用語「ホモログ」は、別の分子と相同性を示す（例えば、対応する位置で同様かまたは類似である化学残基の配列を有する）分子をいう。
【００４６】
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトのクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第８編．，Ｌａｎｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）。
【００４７】
ポリヌクレオチドの状況で使用される、用語「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」などは、従来のハイブリダイゼーション条件（好ましくは、例えば、５０％のホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション）をいうことが意味される。ここでは、ハイブリダイゼーションの温度は３７℃を超え、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄のための温度は５５℃以上である。
【００４８】
句「単離された」または「生物学的に純粋」は、ネイティブな状態で見出されるような物質を通常伴う構成要素を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくはインサイチュ環境においてペプチドに通常付随する物質を含まない。例えば、ポリヌクレオチドは、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子以外の遺伝子に対応するかまたは相補的であるか、または１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物またはそのフラグメント以外のポリペプチドをコードする混入物のポリヌクレオチドから実質的に分離される場合、「単離される」と言われる。当業者は、単離された１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドを得るために核酸単離手順を容易に利用し得る。タンパク質は、例えば、物理的方法、機械的方法または化学的方法が、タンパク質に通常付随する細胞の成分から１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を除するするために利用される場合、「単離された」と言われる。当業者は、単離された１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を得るために標準的な精製方法を容易に利用し得る。あるいは、単離されたタンパク質は、化学的手段によって調製され得る。
【００４９】
用語「哺乳動物」は、哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む）に分類される任意の生物をいう。本発明の１つの実施形態において、哺乳動物はマウスである。本発明の別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００５０】
用語「転移性の前立腺ガン」および「転移性の疾患」は、局所的なリンパ節または離れた部位に拡大した前立腺ガンを意味し、そしてＡＵＡシステムのもとでのステージＤの疾患、およびＴＮＭシステムのもとでのステージＴ×Ｎ×Ｍ＋を含むように意味される。局所的に進行した前立腺ガンの症例における場合には、外科手術は、一般的には、転移性の疾患を有している患者については意図されず、そしてホルモン（アンドロゲンの切除）治療が、好ましい処置様式である。転移性の前立腺ガンを有している患者は、最終的には、処置の開始の１２〜１８ヶ月以内のアンドロゲン治療不応性状態を発症する。これらのアンドロゲン治療不応性の患者のほぼ半分が、その状態の発症後６ヶ月以内に死亡する。前立腺ガンの転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺ガンの骨転移は、しばしば、骨溶解よりもむしろ骨芽細胞性（すなわち、正味の骨の形成を生じる）である。骨転移は、脊椎においてもっとも頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、肋骨郭（ｒｉｂｃａｇｅ）、頭蓋骨、および上腕骨が続く。他の一般的な転移の部位として、リンパ節、肺、肝臓、および脳が挙げられる。転移性の前立腺ガンは、代表的には、開放性骨盤リンパ腺切除または腹腔鏡による骨盤リンパ腺切除、全身の放射性核種スキャン、骨格のレントゲン撮影、および／あるいは骨の病変の生検によって、診断される。
【００５１】
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の集団から得られる抗体（すなわち、少量存在する、天然に存在する可能性を除いて同一である集団を含む抗体）をいう。
【００５２】
１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の生物学的モチーフとしての「モチーフ」は、タンパク質の一次配列の一部を形成するアミノ酸の任意のパターン（特定の機能（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用など）、または改変（例えば、リン酸化、グリコシル化、もしくはアミノ化）、または局在（例えば、分泌配列、核局在化配列など）に関連する）、あるいは免疫原性（体液性または細胞性のいずれか）と関連する配列をいう。モチーフは、一般的に、特定の機能または特性に関連する特定の位置に隣接し得るか、または整列し得るかのいずれかである。ＨＬＡモチーフの文脈において、「モチーフ」とは、特定のＨＬＡ分子によって認識される、規定された長さのペプチドにおける残基（通常、クラスＩ  ＨＬＡモチーフに対する約８〜約１３のアミノ酸、およびクラスＩＩ  ＨＬＡモチーフに対する約６〜約２５のアミノ酸からのペプチド）のパターンをいう。ＨＬＡ結合についてのペプチドモチーフは、代表的に、各ヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各タンパク質について異なり、そして一次アンカー残基および二次アンカー残基のパターンにおいて異なる。
【００５３】
「薬学的な賦形剤」とは、アジュバント、キャリア、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張剤、湿潤剤、保存剤などのような物質を含む。
【００５４】
「薬学的に受容可能な」とは、非毒性、不活性および／またはヒトまたは他の哺乳動物に生理学的に適合する組成物をいう。
【００５５】
用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０個の塩基または塩基対の長さのヌクレオチドの多型性の形態（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、あるいはいずれかのヌクレオチドの型の改変された形態）を意味し、そして一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことを意味する。当該分野において、この用語は、必要であれば、しばしば「オリゴヌクレオチド」と相互に使用される。ポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されたヌクレオチド配列を含み得、ここでチミジン（Ｔ）（例えば、図２に示されるような）はまたウラシル（Ｕ）であり得る。この説明は、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的構造間の違い、特に４つの主な塩基のうち１つがＲＮＡでは、チミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）であるという知見に関連する。
【００５６】
用語「ポリペプチド」は、少なくとも約４、５、６、７または８アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸についての標準的な３文字表記または１文字表記が使用される。当該分野において、この用語は、しばしば「ペプチド」または「タンパク質」と相互に使用される。
【００５７】
ＨＬＡの「一次アンカー残基」は、免疫ペプチドおよびＨＬＡ分子との間に接触点を提供することが理解される、ペプチド配列に沿う特定の位置でのアミノ酸である。１〜３つ、通常２つの、規定された長さのペプチド内の一次アンカー残基は、一般的に、免疫原性ペプチドに対する「モチーフ」を規定する。これらの残基は、ＨＬＡ分子のペプチド結合グルーブと、結合グローブの特異的ポケットに埋め込まれるそれらの側鎖と密接に接触することが理解される。１つの実施形態において、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子についての一次アンカー残基は、本発明に従って、（アミノ末端位置から）２位、そしてカルボキシ末端位置の残基ペプチドエピトープ８位、９位、１０位、１１位または１２位に局在される。別の実施形態において、例えば、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドの一次アンカー残基は、ペプチドの末端ではなく、互いに関連して間隔をおいて配置される。ここで、ペプチドは、一般に少なくとも９アミノ酸長である。各モチーフおよびスーパーモチーフ（ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆ）についての一次アンカー位置は、表ＩＶに示される。例えば、アナログペプチドは、表ＩＶに示される、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。このようなアナログは、特定のＨＬＡモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性および／または集団範囲（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を調整するために使用される。
【００５８】
「組換え」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【００５９】
低分子の非限定的な例としては、１０１Ｐ３Ａ１１リガンドに結合または相互作用する化合物（ホルモン、神経ペプチド、ケモカイン、臭気剤、リン脂質、および結合し、そして好ましくは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質機能を阻害するそれらの機能等価物が挙げられる）が挙げられる。このような非限定的な低分子は、好ましくは約１０ｋＤａ未満の分子量、より好ましくは約９ｋＤａ、約８ｋＤａ、約７ｋＤａ、約６ｋＤａ、約５ｋＤａまたは約４ｋＤａ以下の分子量を有する。特定の実施形態において、低分子は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質と物理的に会合するか、または１０１Ｐ３Ａ１１に結合する；天然に存在する代謝経路において見出されない；そして／または：非水溶液よりも水溶液により可溶性である。
【００６０】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、それらの融解温度以下の環境下に相補鎖が存在する場合に、変性された核酸が再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度はあまりそうではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。
【００６１】
「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書中で定義される場合は、以下によって同定され得るがこれらに限定されない：（１）洗浄のために低いイオン強度および高温（例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）を使用する；（２）変性剤（例えば、ホルムアミド）をハイブリダイゼーションの間に使用する（例えば、０．１％のウシの血清アルブミンを有する５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを有するｐＨ６．５の５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液、４２℃）；または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精子のＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、そして５０％のホルムアミド中で５５℃で洗浄し、続いて５５℃でＥＤＴＡを含有している０．１×ＳＳＣから構成される高ストリンジェンシーの洗浄が続く。「中程度のストリンジェントな条件」は、限定されないが、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９によって記載され、そして上記に記載されているハイブリダイゼーション条件よりもストリンジェントの低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントの条件の例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍＬの変性された剪断されたサケの精子のＤＮＡを含有している溶液中で３７℃での一晩のインキュベーション、続く１×ＳＳＣ中での約３７℃〜５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブの長さなどの因子に順応させることが必要とされる場合には、温度、イオン強度などを調節するための方法を認識する。
【００６２】
ＨＬＡの「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子によって特異的に共有されるペプチド結合である。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「処置すること」または「処置的な」および文法的に関連する用語は、疾患の任意の結果（例えば、延長した生存、より少ない罹患率、および／または副作用（代替的な治療形式の副産物；疾患の完全な撲滅が必要とされない））の任意の改善をいう。
【００６４】
「トランスジェニック動物」（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、この導入遺伝子は、動物に導入されたか、または出生前（例えば、胚の段階）に動物の先祖に導入された。「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれるＤＮＡである。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、ＨＬＡまたは細胞性免疫応答「ワクチン」は、本発明の１つ以上のペプチドを含むか、またはコードする組成物をいう。このようなワクチン（例えば１つ以上の別個のペプチド；ポリエピトープペプチドによって含まれる、本発明の１つ以上のペプチド；あるいはこのような別個のペプチドまたはポリエピトープ（例えば、ポリエピトープペプチドをコードする小遺伝子）をコードする核酸）の多数の実施形態が存在する。「１つ以上のペプチド」は、１〜１５０またはそれ以上（例えば、本発明の少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、もしくは１５０以上）の任意の全整数単位が挙げられ得る。ペプチドまたはポリペプチドは、必要に応じて、（例えば、脂質化、標的化配列または他の配列の付加によって）改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進させるために、ＨＬＡクラスＩＩ分子と混合または連結され得る。ＨＬＡワクチンはまた、ペプチドパルス抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み得る。
【００６６】
用語「改変体」とは、記載される型または基準（例えば、特に記載されるタンパク質（例えば、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質）の対応部分に、１つ以上の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質）からの改変を示す分子をいう。アナログは、改変タンパク質の例である。スプライシングアイソフォームおよびシングルヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、さらなる改変体の例である。
【００６７】
本発明の「１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質」としては、本明細書中で特異的に同定されたタンパク質、ならびに対立遺伝子改変体、（本明細書中に概説される方法または当該分野で用意に利用可能な方法に従って実験を実施することなく、単離／生成され得、そして特徴付けられ得る）保存的置換改変体、アナログおよびホモログが挙げられる。異なる１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質またはそのフラグメントの一部分に結合する融合タンパク質、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた、含まれる。このような１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質は、本発明のタンパク質である１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質、または１０１Ｐ３Ａ１１として集合的に称される。用語「１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質」とは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、もしくは３１７または３１８以上のアミノ酸の、ポリペプチドフラグメントまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列をいう。
【００６８】
「薬学的組成物」の文脈において「活性な成分」は、薬学的な利点を提供しないことが一般的に認識されている「不活性な成分」とは対照的に、主要な薬学的な利点を提供する薬学的組成物の成分を意味する。
【００６９】
「アゴニスト」は、レセプターに結合するか、または膜へのＧＴＰ結合を促進する場合に、細胞内応答を活性化する分子を意味する。開示される本発明の文脈において、１０１Ｐ３Ａ１１アゴニストを含む薬学的候補物は、代謝に影響するために利用され得る。「部分的なアゴニスト」とは、アゴニストに結合するよりもより低い程度／範囲でレセプターに結合するか、またはアゴニストに結合するよりもより低い程度／範囲での膜へのＧＴＰ結合を促進する場合、細胞内応答を活性化する部分を意味する。
【００７０】
「アンタゴニスト」は、アゴニストとして同一な部位でレセプターに競合的に結合するが、レセプターの活性化形態によって開始される細胞内応答を活性化せず、それによってアゴニストまたは部分的なアゴニストによる細胞内応答を阻害し得る部分をいう。アゴニストは、アゴニストまたは部分的アゴニストの非存在において、基本の細胞内応答を減少しない。
【００７１】
開示される本発明の文脈において、「候補化合物」は、スクリーニング技術に適切な低分子を意味する。
【００７２】
「組成物」は、標準的な用途に従う意味を有する。例えば、組成物は、少なくとも２つの化合物、成分または置換を含む物質を意味し得る；例えば、少なくとも１つの活性成分および少なくとも１つの他の成分を含む薬学的組成物に限定されない。
【００７３】
「化合物の有効性」は、レセプター結合親和性とは対照的に、レセプター機能を阻害または刺激する化合物の能力の測定値を意味する。
【００７４】
「構成的なレセプター活性化」は、レセプターと、その内在性リガンドまたはその化学的等価物との結合以外の手段による活性状態でのレセプターの安定化をいう。
【００７５】
「接触する」または「接触すること」は、インビトロ系であろうとインビボ系であろうと、少なくとも２つの部分と一緒に架橋することを意味する。
【００７６】
「内因性」とは、哺乳動物が天然に産生する物質を意味する。例えば、限定ではなく、用語「レセプター」に関して、内因性とは、哺乳動物（例えば、限定ではなくヒト）、酵母、細菌またはウイルスによって天然に産生されるレセプターを意味する。対照的に、用語「非内因性」は、この文脈において、哺乳動物（例えば、限定ではなくヒト）、酵母、細菌またはウイルスによって天然に産生されないレセプターを意味する。例えば、限定ではなく、その内因性形態において構成的に活性ではないが、操作された場合に構成的に活性になるレセプターは、最も好ましくは、本明細書中で「非内因性の構成的に活性化されたレセプター」といわれる。両方の用語は、「インビボ」の系および「インビトロ」の系の両方を記述するために利用され得る。例えば、限定ではなく、スクリーニングアプローチにおいて、内因性レセプターまたは非内因性レセプターは、インビトロのスクリーニング系に関するものであり得る。さらなる例として、限定ではなく、哺乳動物のゲノムが、非内因性の構成的に活性化されたレセプターを含むように操作された場合、インビボ系の手段による候補化合物のスクリーニングが、実施可能である。
【００７７】
「Ｇタンパク質共役レセプター融合タンパク質」および「ＧＰＣＲ融合タンパク質」は、本明細書中に開示される本発明の文脈において、各々、少なくとも１つのＧタンパク質、最も好ましくはこのようなＧタンパク質のα（ａ）サブユニット（これは、ＧＴＰに結合するサブユニットである）に融合した内因性の構成的に活性化されたオーファンＧＰＣＲを含む、非内因性タンパク質を意味し、このＧタンパク質は、好ましくは、内因性オーファンＧＰＣＲと天然に共役するＧタンパク質と同じ型である。例えば、限定ではなく、内因性状態において、Ｇタンパク質「Ｇｓａ」は、１０１Ｐ３Ａ１１と共役する優勢なＧタンパク質であり、その結果、１０１Ｐ３Ａ１１に基づくＧＰＣＲ融合タンパク質は、Ｇｓｃｃに融合した１０１Ｐ３Ａ１１を含む、非内因性タンパク質である。このＧタンパク質は、内因性の構成的に活性なオーファンＧＰＣＲのｃ末端に直接融合され得るか、またはこれら２つの間にはスペーサーが存在し得る。
【００７８】
用語「応答」と関連して、「阻害する」または「阻害」は、ある化合物の存在下で、その化合物の非存在下とは反対に、応答が低減または防止されることを意味する。
【００７９】
「インバースアゴニスト」は、レセプターの内因性形態に結合し、そしてレセプターの活性な内因性形態によって開始されるベースラインの細胞内応答を、内因性のリガンド、アゴニストまたは部分的アゴニストの非存在下において観察される活性の通常の基準レベル未満に阻害するか、あるいは膜へのＧＴＰ結合を低減する部分を意味する。好ましくは、ベースラインの細胞内応答は、インバースアゴニストの非存在下のベースライン応答と比較して、インバースアゴニストの存在下で、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくは少なくとも７５％低減される。生物学的に、「１０１Ｐ３Ａ１１インバースアゴニスト」は、その部分が１０１Ｐ３Ａ１１と相互作用したことの単なる決定以外の因子によって、インビボで評価され得る部分を意味する。
【００８０】
「リガンド」は、内因性の天然に存在するレセプターに特異的な、内因性の天然に存在する分子を意味する。
【００８１】
「薬学的組成物」は、少なくとも１つの活性成分、および活性成分ではない少なくとも１つの成分（例えば、限定ではなく、充填剤、色素または徐放のための機構）を含む組成物を意味し、それによって、この組成物は、哺乳動物またはその細胞内（例えば、インビトロ（例えば、限定ではなく、この哺乳動物はヒトである））の特定された有効な結果についての調査を受けやすい。当業者は、活性成分が、当業者の要求に基づく所望の有効な結果を有するか否かを決定するために適切な技術を、理解および認識する。
【００８２】
「低分子」は、本明細書中に開示される発明の文脈において、非タンパク質ベースの部分であり；例えば、限定ではなく、ＮＦ４４９は、本発明の文脈における低分子である。好ましい実施形態において、レセプターについての内因性リガンドは、「低分子」ではない。
【００８３】
（ＩＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド）
本発明の１つの局面は、１０１Ｐ３Ａ１１の遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列の全てまたは一部に対応するかまたは相補的な、好ましくは単離形態のポリヌクレオチドを提供し、これには、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、１０１Ｐ３Ａ１１の遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはその一部、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１の遺伝子、ｍＲＮＡ、もしくは１０１Ｐ３Ａ１１コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド（集合的に「１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド」）が挙げられる。この節において参照される場合、全ての例において、Ｔは、図２において、Ｕでもあり得る。
【００８４】
１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドの実施形態としては、以下が挙げられる：図２に示される配列を有する１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド、図２に示されるような１０１Ｐ３Ａ１１ヌクレオチド配列（ここで、ＴはＵである）；図２に示されるような配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個連続するヌクレオチド；または図２に示される配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個連続するヌクレオチド（ここで、ＴはＵである）。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１ヌクレオチドの実施形態は、限定ではなく、以下を含む：
（Ｉ）図２に示されるような配列を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＩ）図２Ａに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号１３０〜ヌクレオチド残基番号１０８６（必要に応じて最後に終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＩＩ）図２Ａに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号１３３〜ヌクレオチド残基番号１０８６（必要に応じて最後に終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＶ）図２Ｂに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号１３０〜ヌクレオチド残基番号３４８（必要に応じて最後に終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（Ｖ）図２Ｂに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号１３３〜ヌクレオチド残基番号３４８（必要に応じて終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩ）図２Ｃに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号１３０〜ヌクレオチド残基番号１０８６（必要に応じて最後に終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩＩ）図２Ｃに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号１３３〜ヌクレオチド残基番号１０８６（必要に応じて最後に終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩＩＩ）図２Ａ〜Ｃに示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同な１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＩＸ）図２Ａ〜Ｃに示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一な１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（Ｘ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬに示される少なくとも１つのペプチドをコードするポリヌクレオチド（但し、必要に応じて、このポリヌクレオチドは、図２の核酸配列由来の連続配列ではない）；
（ＸＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬに示されるペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドをコードするポリヌクレオチド（但し、必要に応じて、このポリヌクレオチドは、図２の核酸配列由来の連続配列ではない）；
（ＸＩＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬに示されるペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドをコードするポリヌクレオチド（但し、必要に応じて、このポリヌクレオチドは、図２の核酸配列由来の連続配列ではない）；
（ＸＩＩＩ）図３Ａまたは図３Ｃのペプチドの、図５の親水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＩＶ）図３Ａまたは図３Ｃのペプチドの、図６の疎水性プロフィールにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶ）図３Ａまたは図３Ｃのペプチドの、図７のアクセス可能な残基％プロフィールにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶＩ）図３Ａまたは図３Ｃのペプチドの、図８の平均自由度プロフィールにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶＩＩ）図３Ａまたは図３Ｃのペプチドの、図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶＩＩＩ）図３Ｂのペプチドの、図５の親水性プロフィールにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＩＸ）図３Ｂのペプチドの、図６の疎水性プロフィールにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸ）図３Ｂのペプチドの、図７のアクセス可能な残基％プロフィールにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＩ）図３Ｂのペプチドの、図８の平均自由度プロフィールにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＩ）図３Ｂのペプチドの、図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、少なくとも５アミノ酸から、３１７または３１８までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＩＩ）２００２年５月１５日に、受託番号ＰＴＡ−４３５１として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、Ｘ１８（１）４の名称で受託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体またはその結合領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＶ）２００２年５月１５日に、受託番号ＰＴＡ−４３５２として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、Ｘ１８（１）１０の名称で受託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体またはその結合領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＶ）２００２年５月１５日に、受託番号ＰＴＡ−４３５３として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、Ｘ１８（１）２３の名称で受託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体またはその結合領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩ）２００２年５月１５日に、受託番号ＰＴＡ−４３５４として、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、Ｘ１８（４）７の名称で受託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体またはその結合領域をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩＩ）（Ｉ）〜（ＸＸＶＩ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド；および
（ＸＸＶＩＩＩ）（Ｉ）〜（ＸＸＶＩ）のいずれかによってコードされるペプチド；
（ＸＸＩＸ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬ中に、集合的に少なくとも２回現れるペプチド、またはこのようなＨＬＡペプチドをコードするオリゴヌクレオチド；
（ＸＸＸ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ中に少なくとも１回現れるペプチドおよびＸＸＩＩ〜ＩＬ中に少なくとも１回現れるペプチド、またはこのようなＨＬＡペプチドをコードするオリゴヌクレオチド；
（ＸＸＸＩ）以下の特徴のうち、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを有する、ペプチド領域を含むペプチド、またはこのペプチドをコードするオリゴヌクレオチド：
ｉ）図５の親水性プロットにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値または１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、図３のタンパク質の全長までの任意の自然数の増分のペプチド領域；
ｉｉ）図６の疎水性プロフィールにおいて、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１以下の値または０．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、図３のタンパク質の全長までの任意の自然数の増分のペプチド領域；
ｉｉｉ）図７のアクセス可能な残基％プロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値または１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、図３のタンパク質の全長までの任意の自然数の増分のペプチド領域；
ｉｖ）図８の平均自由度プロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値または１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、図３のタンパク質の全長までの任意の自然数の増分のペプチド領域；
ｖ）図９のβ−ターンプロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値または１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、図３のタンパク質の全長までの任意の自然数の増分のペプチド領域；
（ＸＸＸＩＩ）薬学的賦形剤と一緒になったか、そして／またはヒトの単位投薬形態中での、（Ｉ）〜（ＸＸＶＩＩ）のうちのいずれかのポリヌクレオチドまたは（ＸＸＶＩＩＩ）〜（ＸＸＸＩ）のうちのペプチド。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、ある範囲は、その全単位位置の全てを具体的に開示することが理解される。
【００８６】
本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態としては、１０１Ｐ３Ａ１１のｍＲＮＡ配列の特定の部分をコードする１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド（およびこのような配列に相補的なポリヌクレオチド）が挙げられる（例えば、以下：
（ａ）１０１Ｐ３Ａ１１の、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３７５、３００または３１７もしくは３１８個連続するアミノ酸、
のタンパク質および／またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）。
【００８７】
例えば、本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態としては、以下が挙げられる：図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の約アミノ酸１〜約アミノ酸１０をコードする、ポリヌクレオチドおよびコードされたペプチド自体、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の約アミノ酸１０〜約アミノ酸２０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の約アミノ酸２０〜約アミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の約アミノ酸３０〜約アミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の約アミノ酸４０〜約アミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の約アミノ酸５０〜約アミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、あるいは図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の約アミノ酸６０〜約アミノ酸７０またはアミノ酸３１７もしくは３１８をコードするポリヌクレオチド。従って、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸１〜カルボキシル末端アミノ酸の（約１０アミノ酸の）アミノ酸配列の部分をコードするポリヌクレオチドは、本発明の実施形態である。ここで、各特定のアミノ酸位置は、±５アミノ酸残基の位置を開示することが理解される。
【００８８】
１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の比較的長い部分をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。例えば、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質またはその「改変体」の、約アミノ酸１（または２０または３０または４０など）〜約アミノ酸２０（または３０または４０または５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術によって生成され得る。これらのポリヌクレオチドフラグメントは、図２に示されるような１０１Ｐ３Ａ１１配列の任意の部分を含み得る。
【００８９】
本明細書中に開示される発明のさらなる例示的実施形態としては、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列または「改変体」配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフをコードする１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドフラグメントが挙げられ、これには、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬに示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質または「改変体」の、１以上のモチーフ保有部分配列が挙げられる。別の実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、既知の分子に対する相同性を示す１０１Ｐ３Ａ１１のタンパク質または改変体の、１以上の領域をコードする。本発明の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、１０１Ｐ３Ａ１１のタンパク質または改変体のＮ−グリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存性およびｃＧＭＰ依存性のプロテインキナーゼリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位またはＮ−ミリストイル化部位、ならびにアミド化部位のうち１以上をコードし得る。
【００９０】
その親タンパク質（例えば、改変体１、改変体２など）に対する、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＩＬ（集合的に、ＨＬＡペプチド表）に示される任意のペプチドのそれぞれの出発位置を決定するために、以下の３つの因子について言及がなされることに留意のこと：特定の改変体、ＨＬＡペプチド表中のペプチドの長さ、表ＬＶＩＩに列挙される検索ペプチド。一般に、独自の検索ペプチドが、特定の改変体についてのＨＬＡペプチドを得るために使用される。そのそれぞれの親分子に対する各検索ペプチドの位置は、表ＬＬＩＩに列挙される。従って、検索ペプチドが位置「Ｘ」で開始する場合、それらの親分子中のＨＬＡペプチドの実際の位置を得るために、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＩＬ中の各位置に、「Ｘ−１」の値を加算しなければならない。例えば、特定の検索ペプチドがその親分子の位置１５０にて開始する場合、親分子中のアミノ酸の位置を計算するために、１５０−１（すなわち、１４９）を、各ＨＬＡペプチドのアミノ酸位置に加算しなければならない。
【００９１】
（ＩＩ．Ａ．）１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドの用途）
（ＩＩ．Ａ．１．）遺伝子異常のモニタリング）
上記項目のポリヌクレオチドは、多数の異なる特定の用途を有する。ヒト１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子は、「１０１Ｐ３Ａ１１の染色体マッピング」との表題の実施例において示される染色体位置にマッピングされる。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子は、この染色体にマッピングされるので、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドは、この染色体位置の細胞発生異常（例えば、種々の癌に関連するとして同定された異常）を特徴付けるために使用される。特定の遺伝子において、再編成を含む種々の染色体異常が、多数の異なる癌における頻繁な細胞発生的異常として同定されている（例えば、Ｋｒａｊｉｎｏｖｉｃら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３８２（３−４）：８１−８３（１９９８）；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ  ８６（１０）：３９０５−３９１４（１９９５）およびＦｉｎｇｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８５（２３）：９１５８−９１６２（１９８８）を参照のこと）。従って、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性の表現型に寄与し得る、１０１Ｐ３Ａ１１をコードする染色体領域における細胞発生的異常を説明するために使用され得る、以前に可能であったツールよりもより正確な、新たなツールを提供する。この文脈において、これらのポリヌクレオチドは、より微妙な染色体異常およびあまり一般的でない染色体異常を同定するために、染色体スクリーニングの感受性を拡大することについての、当該分野における必要性を満たす（例えば、Ｅｖａｎｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ  １７１（４）：１０５５−１０５７（１９９４）を参照のこと）。
【００９２】
さらに、１０１Ｐ３Ａ１１は、膀胱癌および他の癌において高度に発現されることが示されているので、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドは、正常組織  対  癌性組織における１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態を評価する方法において使用される。代表的に、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の特定の領域（例えば、１以上のモチーフを含む領域）における乱れ（例えば、抗原の喪失などを生じる欠失、挿入、点変異または変更）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイとしては、ＲＴ−ＰＣＲアッセイおよび一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方が挙げられ、これらは両方とも、タンパク質内の特定の領域を試験するために、タンパク質内のこれらの領域をコードするポリヌクレオチドを利用する。
【００９３】
（ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンス実施形態）
本明細書中に記載される発明の実施形態に関連する、他の具体的に企図された核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならびに天然供給源由来であるか合成であるかにかかわらない、代替的骨格に基づく核酸分子または代替的塩基を含む核酸分子であり、そしてこれには、１０１Ｐ３Ａ１１のＲＮＡ発現またはタンパク質発現を阻害し得る分子が含まれる。例えば、アンチセンス分子は、塩基対依存的な様式でＤＮＡまたはＲＮＡに特異的に結合する、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または非核酸分子（ホスホロチオエート誘導体）を含む、ＲＮＡまたは他の分子であり得る。当業者は、本明細書中に開示される１０１Ｐ３Ａ１１のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列を使用して、これらのクラスの核酸分子を容易に獲得し得る。
【００９４】
アンチセンス技術は、細胞内に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を伴う。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１）に相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  １：１−５（１９８８）を参照のこと。本発明の１０１Ｐ３Ａ１１アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、誘導体（例えば、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ  Ｃｏｈｅｎ（前出）を参照のこと）が挙げられ、これは、増強された癌細胞増殖阻害活性を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、リン酸基の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置換されている、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログである。本発明のＳ−オリゴは、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（これは、硫黄転移試薬である）での対応するＯ−オリゴの処置によって調製され得る。例えば、Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）。本発明のさらなる１０１Ｐ３Ａ１１アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる（例えば、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９９６、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ６：１６９−１７５を参照のこと）。
【００９５】
本発明の１０１Ｐ３Ａ１１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、１０１Ｐ３Ａ１１ゲノム配列または対応するｍＲＮＡの最初の１００個の５’側コドンまたは最後の１００個の３’側コドンに相補的であり、かつこれらと安定にハイブリダイズする、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。絶対的な相補性は必要ないが、高度な相補性が好ましい。この領域に特異的なオリゴヌクレオチドの使用によって、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡへの選択的なハイブリダイゼーションは可能になるが、プロテインキナーゼの他の調節サブユニットを指定するｍＲＮＡへの選択的なハイブリダイゼーションは可能にならない。１つの実施形態において、本発明の１０１Ｐ３Ａ１１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０マーのフラグメントである。必要に応じて、１０１Ｐ３Ａ１１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０１Ｐ３Ａ１１の最初の１０個の５’側コドンまたは最後の１０個の３’側コドン中の領域に相補的な３０マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、このアンチセンス分子は、１０１Ｐ３Ａ１１発現の阻害においてリボザイムを使用するように改変される（例えば、Ｌ．Ａ．Ｃｏｕｔｕｒｅ  ＆  Ｄ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １２：５１０−５１５（１９９６）を参照のこと）。
【００９６】
（ＩＩ．Ａ．３．）プライマーおよびプライマー対）
本発明のヌクレオチドのさらに特定の実施形態としては、プライマーおよびプライマー対（これらは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅を可能にする）、ならびにプローブ（これは、本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的にかまたは特異的にハイブリダイズする）が挙げられる。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーは、サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドの存在を検出するため、および１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用される。
【００９７】
このようなプローブの例としては、図２に示されるヒト１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡ配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが挙げられる。１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマー対の例は、実施例に記載される。当業者によって理解されるように、非常に多数の異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そして１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡを増幅および／または検出するために有効に使用され得る。
【００９８】
本発明の１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドは、種々の目的のために有用であり、その用途としては、限定ではなく以下が挙げられる：１０１Ｐ３Ａ１１の遺伝子、ｍＲＮＡもしくはそのフラグメントの増幅および／または検出のためのプローブおよびプライマーとして；前立腺癌および他の癌の診断および／または予後についての試薬として；１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列として；１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の発現および／または１０１Ｐ３Ａ１１転写物の翻訳を調節または阻害するためのツールとして；そして治療剤として。
【００９９】
本発明は、天然に存在する供給源（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）由来の１０１Ｐ３Ａ１１核酸配列または１０１Ｐ３Ａ１１関連核酸配列を同定および単離するための、本明細書中に記載されるような任意のプローブの使用、ならびに単離された核酸配列自体（これは、使用されるプローブ中に見出される配列の全てまたはほとんどを含む）を包含する。
【０１００】
（ＩＩ．Ａ．４．）１０１Ｐ３Ａ１１コード核酸分子の単離）
本明細書中に記載される１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡ配列は、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物ホモログ、選択的スプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体および１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の変異形態をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質のアナログをコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子をコードする全長ｍＲＮＡを単離するために使用され得る種々の分子クローニング方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９５を参照のこと）。例えば、λファージクローニング方法論は、市販のクローニングシステム（例えば、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、簡便に使用され得る。１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子のｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識された１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いて探索することによって、同定され得る。例えば、１つの実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡ（例えば、図２）またはその一部が、合成され得、そして１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子に対する重複および１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを検索するためのプローブとして使用され得る。１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子自体は、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などを、１０１Ｐ３Ａ１１  ＤＮＡのプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングすることによって、単離され得る。
【０１０１】
（ＩＩ．Ａ．５．組換え核酸分子および宿主−ベクター系）
本発明はまた、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド、そのフラグメント、アナログ、またはホモログを含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに当該分野で周知の種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない）、およびこのような組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。このような分子を生成する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出を参照のこと）。
【０１０２】
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中に１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド、そのフラグメント、アナログ、またはホモログを含む組換えＤＮＡ分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞のようなバキュロウイルス感染性細胞））が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＤＵ１４５およびＴｓｕＰｒ１）、他のトランスフェクト可能または形質導入可能な前立腺癌細胞株、一次細胞（ＰｒＥＣ）、および組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、１０１Ｐ３Ａ１１のコード配列を含むポリヌクレオチド、またはそのフラグメント、アナログ、もしくはホモログは、当該分野で慣用的に使用され、そして広範に知られている任意の数の宿主−ベクター系を用いて、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質またはそのフラグメントを生成するために使用され得る。
【０１０３】
１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質またはそのフラグメントの発現に適切な広範な範囲の宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、前出を参照のこと）。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１  ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ  １１：１７８５）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの発現ベクターを用いて、１０１Ｐ３Ａ１１は、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＴｓｕＰｒ１を含む）において発現され得る。本発明の宿主−ベクター系は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質またはそのフラグメントを生成するのに有用である。このような宿主−ベクター系は、１０１Ｐ３Ａ１１および１０１Ｐ３Ａ１１変異体もしくはアナログの機能的特性を研究するために使用され得る。
【０１０４】
組換えヒト１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質またはそのアナログもしくはホモログもしくはフラグメントは、１０１Ｐ３Ａ１１関連ヌクレオチドをコードする構築物でトランスフェクトされた哺乳動物細胞により生成され得る。例えば、２９３Ｔ細胞は、１０１Ｐ３Ａ１１またはそのフラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする発現プラスミドでトランスフェクトされ得、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質が、２９３Ｔ細胞中で発現され、そして組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質が、標準的な精製方法（例えば、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を用いるアフィニティー精製）を用いて単離される。別の実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１コード配列は、レトロウイルスベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローニングされ、そして１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞株を確立するために、種々の哺乳動物細胞株（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＴｓｕＰｒ１、２９３、およびｒａｔ−１）を感染するために使用される。当該分野で周知の種々の他の発現系もまた、使用され得る。１０１Ｐ３Ａ１１コード配列にインフレームで連結されたリーダーペプチドをコードする発現構築物は、分泌形態の組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の生成のために使用され得る。
【０１０５】
本明細書中で議論されるように、遺伝子暗号の重複性は、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子配列におけるバリエーションを許容する。詳細には、特定の宿主種は、しばしば、特定のコドン優先性を有することが、当該分野で公知であり、従って、当業者は、開示された配列を、所望の宿主で優先されるよう適合し得る。例えば、優先されるアナログコドン配列は、代表的に、より高頻度のコドンと置きかえられた稀なコドン（すなわち、所望の宿主の公知の配列において約２０％未満の使用頻度を有するコドン）を有する。特定種についてのコドン優先性は、例えば、インターネット上（例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍｌ）で利用可能なコドン使用表を用いることによって算出される。
【０１０６】
さらなる配列の改変は、細胞性宿主におけるタンパク質発現を増強することが知られている。これらとしては、偽ポリアデニル化シグナルをコードする配列の除去、エキソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および／または遺伝子発現に対して有害な他のこのような十分特徴付けられた配列が挙げられる。配列のＧＣ含量は、所定の細胞性宿主について平均的なレベル（その宿主細胞において発現される公知の遺伝子を参照することによって算出される）に調整される。可能な場合、配列は、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するよう改変される。他の有用な改変としては、Ｋｏｚａｋ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９：５０７３−５０８０（１９８９）に記載されるような、オープンリーディングフレームの開始点での翻訳開始コンセンサス配列の追加が挙げられる。当業者は、真核生物リボソームが５’近位のＡＵＧコドンで排他的に翻訳を開始することが、稀な条件下でのみ排除されるという一般規則を理解する（例えば、Ｋｏｚａｋ  ＰＮＡＳ  ９２（７）：２６６２−２６６６、（１９９５）およびＫｏｚａｋ  ＮＡＲ  １５（２０）：８１２５−８１４８（１９８７）を参照のこと）。
【０１０７】
（ＩＩＩ．１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質）
本発明の別の局面は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を提供する。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の特定の実施形態は、図２または図３に示されるようなヒト１０１Ｐ３Ａ１１のアミノ酸配列の全てまたは一部を有するポリペプチドを包含する。あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の実施形態は、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１のアミノ酸配列中に変更を有する改変体、ホモログ、またはアナログポリペプチドを包含する。
【０１０８】
１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドの実施形態としては、図２に示される配列を有する１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド、図２に示されるような１０１Ｐ３Ａ１１のヌクレオチド配列（ここで、ＴがＵである）；図２に示されるような配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０連続ヌクレオチド；または図２に示されるような配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０連続ヌクレオチド（ここで、ＴがＵである）が挙げられる。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１ヌクレオチドの実施形態は、以下を包含する（しかし、これらに限定されない）：
（Ｉ）図２に示される配列を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質；
（ＩＩ）図２Ａ〜Ｃに示される全アミノ酸配列に少なくとも９０％相同な１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質；
（ＩＩＩ）図２Ａ〜Ｃに示される全アミノ酸配列に少なくとも９０％同一な１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質；
（ＩＶ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩまたは表ＸＸＩＩ〜ＩＬに示される少なくとも１つのペプチドを含むタンパク質（ただし、必要に応じて、図２の全タンパク質ではない）；
（Ｖ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示される少なくとも１つのペプチド（集合的に、このペプチドはまた、表ＸＸＩＩ〜ＩＬにも示される）を含むタンパク質（ただし、必要に応じて、図２の全タンパク質ではない）；
（ＶＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＩＬに示されるペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドを含むタンパク質（ただし、必要に応じて、図２の全タンパク質ではない）；
（ＶＩＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＩＬに示されるペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドを含むタンパク質（ただし、必要に応じて、このタンパク質は、図２のアミノ酸配列由来の連続配列ではない）；
（ＶＩＩＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示されるペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド；および表ＸＸＩＩ〜ＩＬに示される少なくとも１つのペプチドを含むタンパク質（ただし、このタンパク質は、図２のアミノ酸配列由来の連続配列ではない）；
（ＩＸ）図５のＨｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙプロフィールにおける、０．５より高い値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える、図３Ａまたは３Ｃのタンパク質の少なくとも５アミノ酸（３１７または３１８まで）を含むポリペプチド；
（Ｘ）図６のＨｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙプロフィールにおける、０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える、図３Ａまたは３Ｃのタンパク質の少なくとも５アミノ酸（３１７または３１８まで）を含むポリペプチド；
（ＸＩ）図７のＰｅｒｃｅｎｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓプロフィールにおいて、０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える、図３Ａまたは３Ｃのタンパク質の少なくとも５アミノ酸（３１７または３１８まで）を含むポリペプチド；
（ＸＩＩ）図８のＡｖｅｒａｇｅ  Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙプロフィールにおいて、０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える、図３Ａまたは３Ｃのタンパク質の少なくとも５アミノ酸（３１７または３１８まで）を含むポリペプチド；
（ＸＩＩＩ）図９のＢｅｔａ−ｔｕｒｎプロフィールにおいて、０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える、図３Ａまたは３Ｃのタンパク質の少なくとも５アミノ酸（３１７または３１８まで）を含むポリペプチド；
（ＸＩＶ）図５のＨｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙプロフィールにおいて、０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える、図３Ｂのタンパク質の少なくとも５アミノ酸（７２まで）を含むポリペプチド；
（ＸＶ）図６のＨｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙプロフィールにおいて、０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む、７２までの任意の自然数増分の、図３のタンパク質の少なくとも５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＶＩ）図７のＰｅｒｃｅｎｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓプロフィールにおいて、０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える、図３のタンパク質の少なくとも５アミノ酸（７２まで）を含むポリペプチド；
（ＸＶＩＩ）図８のＡｖｅｒａｇｅ  Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙプロフィールにおいて、０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える、図３のタンパク質の少なくとも５アミノ酸（７２まで）を含むポリペプチド；
（ＸＶＩＩＩ）図９のＢｅｔａ−ｔｕｒｎプロフィールにおいて、０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える、図３のタンパク質の少なくとも５アミノ酸（７２まで）を含むポリペプチド；
（ＸＩＸ）２００２年５月１５日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、受託番号ＡＴＣＣ−ＰＴＡ−４３５１として寄託されたハイブリドーマＸ１８（１）４によって分泌されるモノクローナル抗体またはその結合領域；
（ＸＸ）２００２年５月１５日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、受託番号ＡＴＣＣ−ＰＴＡ−４３５２として寄託されたハイブリドーマＸ１８（１）１０によって分泌されるモノクローナル抗体またはその結合領域；
（ＸＸＩ）２００２年５月１５日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、受託番号ＡＴＣＣ−ＰＴＡ−４３５３として寄託されたハイブリドーマＸ１８（１）２３によって分泌されるモノクローナル抗体またはその結合領域；
（ＸＸＩＩ）２００２年５月１５日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に、受託番号ＡＴＣＣ−ＰＴＡ−４３５４として寄託されたハイブリドーマＸ１８（４）７によって分泌されるモノクローナル抗体またはその結合領域；
（ＸＸＩＩＩ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬにおいて少なくとも２度現れるペプチド；
（ＸＸＩＶ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩにおいて少なくとも１度現れ、そして表ＸＸＩＩ〜ＩＬにおいて少なくとも１度現れるペプチド；
（ＸＸＶ）以下の特徴の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つを含むペプチド、またはこのようなペプチドをコードするオリゴヌクレオチド：
ｉ）図５のＨｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙプロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える図３におけるそのタンパク質（全長まで）、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
ｉｉ）図６のＨｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙプロフィールにおいて、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１以下の値を有するかまたは０．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える図３におけるそのタンパク質（全長まで）、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
ｉｉｉ）図７のＰｅｒｃｅｎｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓプロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える図３におけるそのタンパク質（全長まで）、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
ｉｖ）図８のＡｖｅｒａｇｅ  Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙプロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える図３におけるそのタンパク質（全長まで）、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；あるいは
ｖ）図９のＢｅｔａ−ｔｕｒｎプロフィールにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３におけるそのタンパク質の全長までの任意の自然数増分の、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
（ＸＸＶＩ）薬学的賦形剤と共に、および／またはヒト単位投薬形態での、（Ｉ）〜（ＸＸＶ）のペプチド。
【０１０９】
本明細書中で使用される場合、範囲は、その全ての全単位の位置を詳細に開示することが理解される。
【０１１０】
本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態としては、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ配列の特定の部分（およびこのような配列に相補的な配列）をコードする１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド（例えば、タンパク質および／またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）が挙げられる。例えば、以下：
（ａ）１０１Ｐ３Ａ１１の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または３１７もしくは３１８連続アミノ酸。
【０１１１】
一般的に、ヒト１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の天然に存在する対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的同一性および相同性（例えば、９０％以上の相同性）を共有する。代表的に、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載される１０１Ｐ３Ａ１１配列中に保存的アミノ酸置換を含むか、または１０１Ｐ３Ａ１１のホモログにおいて対応する位置からのアミノ酸の置換を含む。１０１Ｐ３Ａ１１対立遺伝子の１つのクラスは、特定の１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列の少なくとも小部分と高い程度の相同性を共有するが、その配列由来の根本的な逸脱（例えば、非保存的置換、短縮、挿入、またはフレームシフト）をさらに含むタンパク質である。タンパク質配列の比較において、用語、類似性、同一性、および相同性は、各々、遺伝子の分野で理解されるのと別個の意味を有する。さらに、オルソロジーおよびパラロジーは、ある生物における所定のタンパク質ファミリーのメンバーの、他の生物における同じファミリーのメンバーに対する関係を記載する重要な概念であり得る。
【０１１２】
アミノ酸略号は、表ＩＩに提供される。保存的アミノ酸置換は、しばしば、そのタンパク質のコンホメーションまたは機能のいずれも変更することなくタンパク質中で起こり得る。本発明のタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５保存的置換を含み得る。このような変更としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれかの、これらの疎水性アミノ酸の他のいずれかでの置換；グルタミン酸（Ｅ）でのアスパラギン酸（Ｄ）の置換およびその逆；アスパラギン（Ｎ）でのグルタミン（Ｑ）の置換およびその逆；ならびにスレオニン（Ｔ）でのセリン（Ｓ）の置換およびその逆が挙げられる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境およびそのタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であるとみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば、交換可能であり、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）も同様であり得る。比較的疎水性のメチオニン（Ｍ）は、しばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換され得、そして時々、バリンと交換され得る。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、しばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置で交換可能である。さらに他の変更は、特定の環境で「保存的」であるとみなされ得る（例えば、本明細書中の表ＩＩＩ；１３〜１５頁「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第２版、Ｌｕｂｅｒｔ  Ｓｔｒｙｅｒ編（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｂｅｒｓｉｔｙ）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、ＰＮＡＳ  １９９２  Ｖｏｌ８９  １０９１５−１０９１９；Ｌｅｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９５  Ｍａｙ  １９；２７０（２０）：１１８８２−６を参照のこと）。
【０１１３】
本明細書中に開示される発明の実施形態として、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の広範な種々の当該分野で受け入れられる改変体またはアナログ（例えば、アミノ酸挿入、欠失、および置換を有するポリペプチド）が挙げられる。１０１Ｐ３Ａ１１改変体は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャンニング、およびＰＣＲ変異誘発）を用いて作製され得る。部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１０：６４８７（１９８７））、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５（１９８５））、制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ、３１７：４１５（１９８６））、または他の公知の技術が、１０１Ｐ３Ａ１１改変体ＤＮＡを生成するために、クローニングしたＤＮＡにおいて実施され得る。
【０１１４】
スキャンニングアミノ酸分析はまた、特異的な生物学的活性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用）に関連する連続配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定するのに使用され得る。比較的小さく、中性のアミノ酸が、好ましいスキャンニングアミノ酸に含まれる。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、代表的に、この群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸である。なぜならば、アラニンは、β炭素の後ろの側鎖を排除し、そして改変体の主鎖のコンホメーションを変更する可能性がより低いからである。アラニンはまた、代表的に、それが、最も一般的なアミノ酸であるので好ましい。さらに、アラニンは、しばしば、埋もれた位置および露出した位置の両方において見出される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９７６））。アラニン置換が、十分な量の改変体を生じない場合、等比体積のアミノ酸が使用され得る。
【０１１５】
本明細書中で規定される場合、１０１Ｐ３Ａ１１改変体、アナログ、またはホモログは、図３のアミノ酸配列を有する１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質と「交差反応性」である少なくとも１つのエピトープを有するという特徴的な特性を有する。この文で使用される場合、「交差反応性」は、１０１Ｐ３Ａ１１改変体に特異的に結合する抗体またはＴ細胞がまた、図３に示されるアミノ酸配列を有する１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質に特異的に結合することを意味する。ポリペプチドは、最初の１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質に特異的に結合する抗体またはＴ細胞により認識され得るいかなるエピトープも含まない場合、図３に示すタンパク質の改変体でなくなる。当業者は、タンパク質を認識する抗体が、異なる大きさのエピトープに結合し、そして約４または５アミノ酸オーダーの一群（連続していようとしていまいと）が、最小エピトープにおける代表的な数のアミノ酸とみなされることを理解する。例えば、Ｎａｉｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  １６５（１２）：６９４９−６９５５；Ｈｅｂｂｅｓら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）２６（９）：８６５−７３；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５）１３５（４）：２５９８−６０８を参照のこと。
【０１１６】
他のクラスの１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質改変体は、図３のアミノ酸配列またはそのフラグメントと、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％以上の類似性を共有する。別の特定のクラスの１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質改変体またはアナログは、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で現在公知の１０１Ｐ３Ａ１１の生物学的モチーフの１つ以上を含む。従って、最初のフラグメントと比較して変更された機能的（例えば、免疫原性）特性を有する１０１Ｐ３Ａ１１フラグメント（核酸またはアミノ酸）のアナログは、本発明に包含される。現在当該分野の一部であるかまたは当該分野の一部となるモチーフが図２または図３の核酸配列またはアミノ酸配列に適用されることが理解される。
【０１１７】
本明細書中で議論されるように、本発明の実施形態は、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の全長未満のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、本発明の代表的な実施形態は、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の任意の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の連続するアミノ酸を有するペプチド／タンパク質を含む。
【０１１８】
さらに、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は、１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列全体を通して、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約１〜アミノ酸約１０からなるポリペプチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約１０〜アミノ酸約２０からなるポリペプチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約２０〜アミノ酸約３０からなるポリペプチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約３０〜アミノ酸約４０からなるポリペプチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約４０〜アミノ酸約５０からなるポリペプチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約５０〜アミノ酸約６０からなるポリペプチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約６０〜アミノ酸約７０からなるポリペプチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約７０〜アミノ酸約８０からなるポリペプチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約８０〜アミノ酸約９０からなるポリペプチド、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約９０〜アミノ酸約１００からなるポリペプチドなどを含む。さらに、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸約１（または２０または３０または４０など）〜アミノ酸約２０（または１３０または１４０または１５０など）からなるポリペプチドが、本発明の実施形態である。この段落における開始位置および停止位置は、特定の位置およびプラス５残基マイナス５残基の位置をいう。
【０１１９】
１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質は、標準的なペプチド合成技術を用いてかまたは当該分野で周知の化学切断方法を用いて生成される。あるいは、組み換え方法が、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質をコードする核酸分子を生成するのに使用され得る。１つの実施形態において、核酸分子は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質（またはその改変体、ホモログ、またはアナログ）の規定されたフラグメントを生成する手段を提供する。
【０１２０】
（ＩＩＩ．Ａ．モチーフ保有タンパク質の実施形態）
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示の実施形態は、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチド配列中に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドを包含する。種々のモチーフが当該分野で周知であり、そしてタンパク質は、多くの公に利用可能なインターネットサイト（例えば、ＵＲＬアドレス：ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／；ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ；ｐｓｏｒｔ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／；ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｓｃａｎ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｋｓ／ｓｃｎｐｓｉｔ．ｈｔｍｌ；ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ｗｗｗ．ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ；およびＢＩＭＡＳ、ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により、このようなモチーフの存在について評価され得る。
【０１２１】
全ての１０１Ｐ３Ａ１１改変体タンパク質のモチーフ保有部分配列は、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬＩにおいて示されそして同定される。
【０１２２】
表ＸＩＸは、ｐｆａｍサーチ（ＵＲＬアドレスｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／を参照のこと）に基づくいくつかの頻繁に生じるモチーフを示す。表ＸＩＸのカラムは、（１）モチーフ名の略称、（２）このモチーフファミリーの異なるメンバーの間で見出された同一性（％）、（３）モチーフ名または詳細、および（４）最も一般的な機能を列挙し；位置情報は、そのモチーフが位置に関連性がある場合に含まれる。
【０１２３】
先に議論された１つ以上の１０１Ｐ３Ａ１１モチーフを含むポリペプチドは、先に議論された１０１Ｐ３Ａ１１モチーフが増殖調節不全に関連するという観察の観点で、および１０１Ｐ３Ａ１１が特定の癌で過剰発現されるという理由から、悪性の表現型の特異的な特徴を解明するのに有用である（例えば、表Ｉを参照のこと）。カゼインキナーゼＩＩ、ｃＡＭＰおよびｃａｍｐ依存性プロテインキナーゼ、ならびにプロテインキナーゼＣは、例えば、悪性の表現型の発現に関連することが公知である酵素である（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．、７８（２）：１６５−１７４（１９９８）；Ｇａｉｄｄｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６（１０）：４３３１−４３３８（１９９５）；Ｈａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４（６）：１１１９−１１２６（１９９６）；Ｐｅｔｅｒｚｉｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（４６）：６３２２−６３２９（１９９９）、およびＯ’Ｂｒｉａｎ、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５（２）：３０５−３０９（１９９８）を参照のこと）。さらに、グリコシル化およびミリストイル化の両方は、癌および癌の進行にも関連するタンパク質修飾である（例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４７３（１）：２１−３４（１９９９）；Ｒａｊｕら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３５（１）：１４５−１５４（１９９７）を参照のこと）。アミド化は、癌および癌の進行にも関連する別のタンパク質修飾である（例えば、Ｔｒｅｓｔｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．（１３）：１６９−１７５（１９９２）を参照のこと）。
【０１２４】
別の実施形態において、本発明のタンパク質は、当該分野で認知された方法に従って同定された１つ以上の免疫反応性エピトープ（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬに示されるペプチド）を含む。ＣＴＬエピトープは、特定のＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得る１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質中のペプチドを同定するための特別なアルゴリズムを用いて決定され得る（例えば、表ＩＶ：ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ；およびＢＩＭＡＳ、ＵＲＬ  ｂｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。さらに、ＨＬＡ分子に対して十分な結合親和性を有し、そして免疫原性エピトープであることに関連するペプチドを同定するためのプロセスが当該分野で周知であり、そして過度の実験を行うことなく実施される。さらに、免疫原性エピトープであるペプチドを同定するためのプロセスが、当該分野で周知であり、そしてインビトロまたはインビボのいずれかで、過度の実験を行わずに実施される。
【０１２５】
免疫原性を調節するために、このようなエピトープのアナログを作製するための原理もまた、当該分野で公知である。例えば、当業者は、ＣＴＬまたはＨＴＬモチーフ（例えば、表ＩＶのＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフを参照のこと）を有するエピトープを用いて開始する。このエピトープは、特定の位置のうちの１つのアミノ酸を選択し、そしてそれをその位置のために特定された別のアミノ酸で置き換えることにより、アナログを作製される。例えば、当業者は、任意の他の残基（例えば、表ＩＶに規定されるような優先性の残基）に有利となるように、有害な残基を選択するか；優先性の低い残基を、表ＩＶに規定されるような優先性の残基で置換するか；または最初から存在する優先性の残基を、表ＩＶに規定されるような別の優先性の残基で置換し得る。置換は、ペプチド中の主要なアンカー位置または他の位置で生じ得る；例えば、表ＩＶを参照のこと。
【０１２６】
種々の参考文献は、目的のタンパク質およびそのアナログにおけるエピトープの同定および生成に関する技術を反映している。例えば、Ｃｈｅｓｎｕｔらに対するＷＯ９７／３３６０２；Ｓｅｔｔｅ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９９  ５０（３−４）：２０１−２１２；Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６６（２）：１３８９−１３９７；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ５８（１）：１２−２０；Ｋｏｎｄｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９７  ４５（４）：２４９−２５８；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  １５７（８）：３４８０−９０；およびＦａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４）；Ｋａｓｔら、１９９４  １５２（８）：３９０４−１２；Ｂｏｒｒａｓ−Ｃｕｅｓｔａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  ６１（３）：２６６−２７８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４（３）；１６４（３）：１６２５−１６３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、ＰＭＩＤ：７８９５１６４、ＵＩ：９５２０２５８２；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１  １４７（８）：２６６３−２６６９；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９４  １（９）：７５１−７６１、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８  １８（２）：７９−９２を参照のこと。
【０１２７】
本発明の関連の実施形態は、表ＸＸに示される異なるモチーフ、ならびに／または表Ｖ〜ＸＶＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＶＩＩの１つ以上の推定ＣＴＬエピトープ、ならびに／または表ＸＬＶＩＩＩ〜ＬＩの１つ以上の推定ＨＴＬエピトープ、ならびに／または当該分野で公知の１つ以上のＴ細胞結合モチーフの組み合わせを含むポリペプチドを包含する。好ましい実施形態は、このポリペプチドのモチーフまたは介在配列のいずれにも、挿入、欠失、または置換を含まない。さらに、これらのモチーフのいずれかの側に、多くのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基のいずれかを含む実施形態が、望ましくあり得る（例えば、モチーフが位置するポリペプチド構造のより大きな部分を含むために）。代表的に、モチーフのいずれかの側のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基の数は、約１〜約１００アミノ酸残基の間、好ましくは、５〜約５０アミノ酸残基の間である。
【０１２８】
１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質は、多くの形態、好ましくは、単離された形態で具体化される。調製された１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質分子は、抗体、Ｔ細胞または他のリガンドへの１０１Ｐ３Ａ１１の結合を障害する、他のタンパク質または分子を、実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の実施形態は、精製された１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質、および機能的な可溶性１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を含む。１つの実施形態において、機能的な可溶性１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質またはそのフラグメントは、抗体、Ｔ細胞または他のリガンドによって結合される能力を維持する。
【０１２９】
本発明はまた、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含む１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、以下のような出発１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の特性を示す：１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質に関連するエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力；ＨＴＬまたはＣＴＬの活性化を誘発する能力；ならびに／あるいは、この出発タンパク質にもまた特異的に結合するＨＴＬまたはＣＴＬによって認識される能力。
【０１３０】
特定の興味深い構造を含む１０１Ｐ３Ａ１１関連ポリペプチドは、当該分野で周知の種々の分析技術を使用してかまたは免疫原性に基づいて、予測および／または同定され得、これらの技術としては、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法が挙げられる。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体もしくはＴ細胞の作製、または１０１Ｐ３Ａ１１に結合する細胞因子の同定において、特に有用である。例えば、親水性プロフィールが作製され得、そして免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．およびＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｐ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８の方法を使用して、同定され得る。ヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）プロフィールが作製され得、そして免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２の方法を使用して、同定され得る。アクセス可能なパーセント（％）残基プロフィールが作製され得、そして、免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｊａｎｉｎ  Ｊ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２の方法を使用して、同定され得る。平均可変性プロフィールが作製され得、そしてＢｈａｓｋａｒａｎ  Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を使用して、免疫原性ペプチドフラグメントが同定される。β−ターンプロフィールが作製され得、そして免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ  Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １：２８９−２９４の方法を使用して、同定され得る。
【０１３１】
ＣＴＬエピトープは、特定化されたＨＬＡ対立遺伝子に必要に応じて結合し得る１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質内のポリペプチドを同定するために、特定のアルゴリズムを使用して（例えば、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ＵＲＬ  ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／のＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイト；表ＩＶ（Ａ）〜（Ｅ）の表；ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＲＬ（ｗｗｗ．ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ）；ならびに、ＢＩＭＡＳ，ＵＲＬ  ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を使用することによって）決定され得る。この例示において、ヒトＭＨＣクラスＩ分子の状況において示される１０１Ｐ３Ａ１１由来のペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ７およびＢ３５）が、予測される（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ、表ＸＸＩＩ〜ＩＬを参照のこと）。詳細には、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の完全なアミノ酸配列および他の改変体の等価な部分（すなわち、ＨＬＡクラスＩ予測については、点変異のいずれかの側上の９個の隣接した残基、およびＨＬＡクラスＩＩ予測については、点変異のいずれかの側上の１４個の隣接した残基）を、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイトにおいて見出されるＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｔｉｆ  Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムに入力し、そして、ＵＲＬ  ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／のＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイトを、使用した。
【０１３２】
ＨＬＡペプチドモチーフ検索アルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子、詳細には、ＨＬＡ−Ａ２のグルーブにおける特定のペプチド配列の結合に基づいて、Ｄｒ．Ｋｅｎ  Ｐａｒｋｅｒによって発見された（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４）を参照のこと）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２および他の多数のＨＬＡクラスＩ分子への予測される結合についての完全なタンパク質配列から、８マー、９マー、および１０マーのペプチドを配置およびランク付けすることを可能にする。多数のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、８マー、９マー、１０マーまたは１１マーである。例えば、クラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２について、エピトープは、好ましくは、２位においてロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を含み、そしてＣ末端においてバリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）を含む（例えば、Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）を参照のこと）。１０１Ｐ３Ａ１１予測結合ペプチドの選択結果は、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＩＬに示される。表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＩＬにおいて、選択された候補物である、各ファミリーメンバーに対する９マー１０マーおよび１５マーが、それらの位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアとともに示される。この結合スコアは、３７℃（ｐＨ６．５）においてペプチドを含む複合体の解離の、推定半減時間に対応する。最も高い結合スコアを有するペプチドは、最良の期間にわたって、細胞表面上でＨＬＡクラスＩに最も密接して結合され、Ｔ細胞認識のための最良の免疫原性標的を示すと予測される。
【０１３３】
ＨＬＡ対立遺伝子へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ発現を安定性化させることによって評価され得る（例えば、Ｘｕｅら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３０：７３−８（１９９７）およびＰｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３６：１２９−３８（１９９８）を参照のこと）。特定のペプチドの免疫原性は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の存在下におけるＣＤ＋８細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することによって、インビトロで評価され得る。
【０１３４】
ＢＩＭＡＳ部位、ＥｐｉｍｅｒＴＭ部位およびＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭ部位によって予測されるか、あるいは当該分野で利用可能であるかまたは表ＩＶに示されるような分野の一部である、ＨＬＡクラスＩモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩモチーフによって特定化される（あるいは、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ｓｉｔｅ  ＵＲＬ  ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／、またはＢＩＭＡＳ，ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を使用して決定される）、全てのエピトープは、本発明に従って、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質に「適用」される。この文脈において使用される場合、「適用される」とは、例えば、可視によってかまたは当業者によって理解されるような、コンピューターベースのパターン認定方法によって、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質が評価されることを意味する。ＨＬＡクラスＩモチーフを保有する、８、９、１０もしくは１１のアミノ酸残基の１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の全ての部分配列、またはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有する９アミノ酸残基以上の部分配列は、本発明の範囲内である。
【０１３５】
（ＩＩＩ．Ｂ．）１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の発現）
以下の実施例において記載される実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１は、市販の発現ベクター（例えば、Ｃ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＴａｇ５，ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ  ＴＮ）を用いて１０１Ｐ３Ａ１１をコードする、ＣＭＶ駆動発現ベクター）でトランスフェクトした細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）中で簡便に発現され得る。Ｔａｇ５ベクターは、ＩｇＧＫ分泌シグナルを提供し、このシグナルを使用して、トランスフェクト細胞中の分泌される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の生成を容易にし得る。培養培地中の分泌されたＨＩＳタグ化１０１Ｐ３Ａ１１は、例えば、標準技術を使用するニッケルカラムを使用して、精製され得る。
【０１３６】
（ＩＩＩ．Ｃ．）１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の改変）
１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の改変（例えば、共有結合的改変）は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合的改変の１つの型は、１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、有機誘導体化因子（これは、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の選択される側鎖残基またはＮ末端もしくはＣ末端の残基と反応し得る）と反応させることを包含する。本発明の範囲内に含まれる１０１Ｐ３Ａ１１の共有結合的改変の別の型は、本発明のタンパク質のネイティブなグリコシル化パターンを変化させることを包含する。１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドの共有結合的改変の別の型は、１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドを、種々の非タンパク様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つに、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第号４，７９１，１９２；または同第４，１７９，３３７号に記載される様式で連結させることを包含する。
【０１３７】
本発明の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質はまた、キメラ分子を形成するように改変され得、このキメラ分子は、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された１０１Ｐ３Ａ１１を含む。このようなキメラ分子は、化学的にかまたは組換え的に、合成され得る。キメラ分子は、別の腫瘍関連抗原またはそのフラグメントに融合された本発明のタンパク質を有し得る。あるいは、本発明に従うタンパク質は、１０１Ｐ３Ａ１１配列のフラグメントの融合体（アミノ酸または核酸）を含み得、その結果、その長さを通して、図２または図３に示されるアミノ酸配列または核酸配列に直接的に相同な分子が作製される。このようなキメラ分子は、１０１Ｐ３Ａ１１の複数の同じ部分配列を含み得る。キメラ分子は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の、ポリヒスチジンエピトープタグとの融合体を含み得、これは、固定化されたニッケルが選択的に結合するエピトープに、サイトカインまたは増殖因子を提供する。エピトープタグは、一般に、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に位置される。代替の実施形態において、キメラ分子は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含む。二価の形態のキメラ分子（「「免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）とも呼ばれる」）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に代わる、可溶性（膜貫通ドメインを欠失または不活性化した）形態の１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドでの置換を含む。好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧＩ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日発行）もまた参照のこと。
【０１３８】
（ＩＩＩ．Ｄ．）１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の用途）
本発明のタンパク質は、多くの異なる特定の用途を有する。１０１Ｐ３Ａ１１が前立腺癌および他の癌において高度に発現される場合、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質は、癌組織に対して、正常な１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され、それによって悪性表現型が明らかになる。代表的には、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の特定の領域由来のポリペプチドが、それらの領域（例えば、１つ以上のモチーフを含む領域）における摂動（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイは、癌性組織に対して正常な領域の特徴を評価するか、またはエピトープに対する免疫応答を惹起させるために、抗体、または１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチド配列に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＴ細胞標的化１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を用いる。あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質において１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含む１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１の領域と相互作用する因子についてスクリーニングする。
【０１３９】
１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質フラグメント／部分配列は、ドメイン特異的抗体（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の細胞外エピトープまたは細胞内エピトープを認識する抗体）を作製しそして特徴付ける際に、１０１Ｐ３Ａ１１またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子を同定するために、そして種々の治療状況および診断状況（診断アッセイ、癌ワクチンおよびこのようなワクチンを調製する方法が挙げられるがこれらの限定されない）において、特に有用である。
【０１４０】
１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそれらのアナログ、ホモログもしくはフラグメントによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有し、これらの用途としては、抗体の作製、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物に結合する、リガンドおよび他の薬剤および細胞構築物を同定するための方法が挙げられるがこれらに限定されない。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質またはそのフラグメントに対して惹起される抗体は、診断アッセイおよび予後アッセイ、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌（例えば、表１に列挙されるような癌）の管理における画像化方法に有用である。このような抗体は、細胞内で発現され得、そしてこのような癌を有する患者を処置する方法において使用され得る。１０１Ｐ３Ａ１１関連核酸または１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質はまた、ＨＴＬ応答またはＣＴＬ応答を生じさせる際に使用される。
【０１４１】
１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を検出するために有用な種々の免疫学的アッセイが、使用され、これらのアッセイとしては、種々の型の放射免疫アッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞化学方法などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として（例えば、放射性核種（ｒａｄｉｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法において）、標識および使用され得る。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質はまた、本明細書中でさらに記載されるように、癌ワクチンを作製する際に、特に有用である。
【０１４２】
（ＩＶ．）１０１Ｐ３Ａ１１抗体）
本明細書中の別の局面は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質に結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質に特異的に結合し、そしてペプチドまたは１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質ではないタンパク質には結合しない（または弱く結合する）。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１に結合する抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質（例えば、それらのホモログまたはアナログ）に結合し得る。
【０１４３】
本発明の１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、癌（例えば、表Ｉを参照のこと）の診断アッセイおよび予後アッセイ、および画像化方法論において、特に有用である。同様に、このような抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１がまた、他の癌において発現されるかまたは過剰に発現される程度まで、これらの他の癌を処置、診断および／または予後診断する際に有用である。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば、一本鎖抗体）は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現が関与する癌（例えば、進行性または転移性の前立腺癌）の処置において、治療学的に有用である。
【０１４４】
本発明はまた、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質および変異１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の検出および定量化のために有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、適切な場合、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を認識および結合し得る、１種以上の１０１Ｐ３Ａ１１抗体を含み得る。これらのアッセイは、当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ様式の範囲内で実施され得、これらのアッセイとしては、種種の型の放射免疫アッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４５】
本発明の免疫学的非抗体アッセイはまた、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）ならびに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合アッセイも含む。
【０１４６】
さらに、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する前立腺癌および他の癌を検出し得る免疫学的画像化方法もまた、本発明によって提供され、これらとしては、標識化１０１Ｐ３Ａ１１抗体を使用する、放射性核種画像化方法が挙げられるがこれらに限定されない。このようなアッセイは、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌（例えば、前立腺癌）の検出、モニタリング、および予後診断において、臨床学的に有用である。
【０１４７】
１０１Ｐ３Ａ１１抗体はまた、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を精製するための方法、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１ホモログおよび１０１Ｐ３Ａ１１関連分子を単離するための方法において使用され得る。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を精製する方法は、以下の工程を包含する：固体マトリクスに結合している１０１Ｐ３Ａ１１抗体を、溶解物または１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を含有する他の溶液とともに、１０１Ｐ３Ａ１１抗体が１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質に結合することが可能な条件下でインキュベートする工程；この固体マトリクスを洗浄して、不純物を取り除く工程；ならびに、結合している抗体から、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を溶出する工程。本発明に従う、１０１Ｐ３Ａ１１抗体の他の用途としては、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体を作製することが挙げられる。
【０１４８】
抗体を調製するための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質、ペプチド、またはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって、単離形態または免疫結合体化形態で、調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，編，Ｈａｒｌｏｗ，ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。さらに、１０１Ｐ３Ａ１１  ＧＳＴ融合タンパク質のような１０１Ｐ３Ａ１１融合タンパク質もまた、使用され得る。特定の実施形態において、図２または図３のアミノ酸配列の全てまたは大部分を含むＧＳＴ融合タンパク質が生成され、次いで、これを免疫原として使用して、適切な抗体を作製する。別の実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質が合成され、そして免疫原として使用される。
【０１４９】
さらに、当該分野で公知の裸のＤＮＡ免疫技術が使用され（精製された１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質または１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞を用いてかまたは用いずに）、そのコードされた免疫原に対する免疫応答が生じる（総説としては、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８を参照のこと）。
【０１５０】
図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ酸配列を分析して抗体を作製するための、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列の疎水性分析および親水性分析を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１構造における親水性領域を同定する。免疫原構造を示す１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、当該分野で公知の種々の他の方法（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析）を使用して、容易に同定され得る。親水性プロフィールは、Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．およびＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８の方法を使用して、作製され得る。ヒドロパシープロフィールは、Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２の方法を使用して、作製され得る。アクセス可能なパーセント（％）残基プロフィールは、Ｊａｎｉｎ  Ｊ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２の方法を使用して、作製され得る。平均可動性プロフィールは、Ｂｈａｓｋａｒａｎ  Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を使用して、作製され得る。βターンプロフィールは、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ  Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １：２８９−２９４の方法を使用して、作製され得る。従って、これらのプログラムまたは方法のいずれかによって同定される各領域は、本発明の範囲内である。１０１Ｐ３Ａ１１抗体を作製するための方法は、本明細書中で提供される実施例によって、さらに例示される。免疫原として使用するためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法は、当該分野で周知である。キャリア（例えば、ＢＳＫ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）とタンパク質との免疫原性結合体を調製するための方法もまた、当該分野で周知である。いくつかの状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的結合体化が使用され；別の例においては、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給される結合試薬が有効である。１０１Ｐ３Ａ１１免疫原の投与は、当該分野で理解されるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントを使用して注射することによって、しばしば行われる。免疫スケジュールの間、抗体の力価を収集して、抗体形成の妥当性を決定し得る。
【０１５１】
１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手段によって生成され得る。例えば、所望なモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または一般に公知のように、抗体産生Ｂ細胞を不死化する改変を使用して、調製される。所望な抗体を分泌する不死化細胞株は、免疫アッセイによってスクリーニングされる（このアッセイにおいて、抗原は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質である）。適切な不死化細胞培養物が同定された場合、この細胞が拡大され得、そしてインビトロ培養物または腹水のいずれかから、抗体が生成され得る。
【０１５２】
本発明の抗体またはフラグメントはまた、組換え手段によっても生成され得る。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の所望な領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種起源のキメラ抗体または相補性決定領域（ＣＤＲ）移植化（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の状況下で産生され得る。ヒト化１０１Ｐ３Ａ１１抗体またはヒト１０１Ｐ３Ａ１１抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ましい。１つ以上の非ヒト抗体ＣＤＲを、対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５、およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６もまた参照のこと。
【０１５３】
完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ方法およびトランスジェニック方法が挙げられる（概要については、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：５３５−５３９を参照のこと）。完全なヒト１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体は、大きいヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して生成され得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｎ．Ｃｌａｒｋ，Ｍ．編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５−６４頁（１９９３）のＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（同書）６５−８２頁）。完全なヒト１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体はまた、１９９７年１２月３日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ７（４）：６０７−６１４；米国特許第６，１６２，９６３号（２０００年１２月１９日発行）；米国特許第６，１５０，５８４号（２０００年１１月１２日発行）；および米国特許第６，１１４，５９８号（２０００年９月５日発行）もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高い親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【０１５４】
１０１Ｐ３Ａ１１抗体の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質との反応性は、多数の周知方法によって確立され得、これらの方法としては、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、および適切な場合、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞またはそれらの抽出物を使用する、ＦＡＣＳ分析が挙げられるがこれらに限定されない。１０１Ｐ３Ａ１１抗体またはそれらのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得るか、または第二の分子に結合体化され得る。適切な検出可能なマーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、２つ以上の１０１Ｐ３Ａ１１エピトープに特異的な二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が、当該分野で一般に公知の方法を使用して、作製される。ホモダイマー抗体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって、作製され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
【０１５５】
従って、本発明は、１０１Ｐ３Ａ１１、またはその生物学的に活性なフラグメントのいずれかに対して誘発するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体に関する。本発明のポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体は、特に１０１Ｐ３Ａ１１中和抗体（１０１Ｐ３Ａ１１機能をブロックし、そして／またはそのリガンドとの結合をブロックする、抗体）もまた、１０１Ｐ３Ａ１１発現および／または１０１Ｐ３Ａ１１活性を調節するための治療法として有用である。さらに、本発明のポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体は、（ｉ）種々の免疫アッセイ（例えば、（組織、血清、血液、尿または精液のような材料のサンプル／検体）のウェスタンブロッティング；免疫組織化学および免疫沈降）における、１０１Ｐ３Ａ１１発現の定性的検出および／または定量的検出のための診断方法；ならびに（ｉｉ）上記のように、表Ｉに列挙された組織の癌のような、１０１Ｐ３Ａ１１の過剰発現に関連する疾患を処置するために、１０１Ｐ３Ａ１１中和抗体を使用した１０１Ｐ３Ａ１１機能の阻害において、有用である。１０１Ｐ３Ａ１１の効果を拮抗する抗体（例えば、アポトーシス（すなわち細胞死）から特定の細胞を保護する１０１Ｐ３Ａ１１の能力、またはそのリガンドに結合する１０１Ｐ３Ａ１１の能力を阻害する抗体）は、当該分野で公知の方法によって、直接投与され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７７）を参照のこと）。モノクローナル抗体は、異常な１０１Ｐ３Ａ１１発現に関連する腫瘍を処置するために、特に好ましい。例えば、癌細胞内の１０１Ｐ３Ａ１１発現の増加に関連する癌の進行を遅滞し、次いで、長時間を経て、腫瘍の収縮を引き起こし得る、１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体が、特に有用である。
【０１５６】
有用な例は、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭの初期の成功である、組換えＤＮＡ誘導ヒト化モノクローナル抗体抗体である。このモノクローナル抗体は、ヒト表皮増殖因子２（ＨＥＲ２）の細胞外ドメインに選択的に結合する。この抗体は、ＣＨＯ細胞において産生され、そして最終産物は、凍結乾燥粉末として利用可能である。ＨＥＲ２は、原発性乳癌の２５〜３０％において過剰発現されることが示されている。次いで、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭの投与は、ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されている。予測される１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法（例えば、ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭ技術（Ａｂｇｅｎｉｘ）、または抗体ファイジディスプレイ）によって「ヒト化」され、抗体のヒト投与に対する、いずれの望ましくない免疫学的効果をも低減し得る。あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１に基づく抗体は、キメラであり得、最も可能性のあるのは、マウス／ヒトキメラまたはラット／ヒトキメラであり得る。さらに、このような任意の治療用の１０１Ｐ３Ａ１１に基づく抗体は、単独でか、または１０１Ｐ３Ａ１１発現の増加に関連する腫瘍増殖を低減に関与するように作用し得る他の癌療法を含むレジーム（例えば、公知の化学療法剤）の範囲内で、投与され得る。種々の癌を処置するためのモノクローナル抗体の使用の別の例は、ＲｉｔｕｘａｎＴＭ、すなわち、低等級のＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、免疫系の癌を有する患者を処置する際に有用であることが示されている、組換えＤＮＡベースのマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体である。Ｒｉｔｕｘａｎは、疾患に関与する白血球（Ｂ細胞）を標的化および破壊し、ほとんどの癌処置よりも重篤な副作用の少ない、些細な腫瘍の縮小を生じる。現在開発中のさらなるモノクローナル抗体としては、（ｉ）低等級のリンパ腫を有する患者を処置するための、抗ＣＤ−２０モノクローナル抗体、（ｉｉ）ホルモン不応性前立腺癌を有する患者における、抗ＥＧＦｒ抗体とドキソルビシンとの組み合わせ、ならびに頭頸部癌および肺癌を有する患者における、抗ＥＧＦｒ抗体とシスプラチンとの組み合わせが挙げられる。１０１Ｐ３Ａ１１抗イディオタイプ抗体はまた、１０１Ｐ３Ａ１１を過剰発現する腫瘍に対する宿主免疫応答を刺激するように、投与され得る。従って、１０１Ｐ３Ａ１１抗体、特に１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１発現の増加によって特徴付けられる癌の直接的な介入のための、他の癌療法とともにかまたは他の癌療法と組み合わせた、潜在的に有用なツールであることが証明されている。
【０１５７】
当業者は、１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体の阻害性活性を模倣する、当該分野で公知の等価な分子が、１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体を用いる本発明の開示方法の局面であることを、理解する。このような分子の例としては、１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体に少なくとも匹敵する増殖またはそれらの抗体の様式と類似の増殖を阻害する、抗１０１Ｐ３Ａ１１ペプチド模倣物が挙げられる。
【０１５８】
（ポリクローナル抗体）
本発明の抗体はまた、ポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤、および所望な場合、アジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動物において誘発され得る。代表的には、免疫剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、哺乳動物に注射される。この免疫剤は、１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含有し得る。この免疫剤を、免疫されるべき哺乳動物において免疫原であることが公知のタンパク質に結合体化させることが、有用であり得る。免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるがこれらに限定されない。使用され得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルＬｉｐｉｄＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート）が挙げられる。免疫プロトコルは、過度な実験を行うことなく、当業者によって選択され得る。次いで、哺乳動物を出血させ、そしてその血清を、抗体力価についてアッセイする。所望ならば、哺乳動物は、その抗体力価が増加するかまたは停止するまで、ブーストされ得る。
【０１５９】
（モノクローナル抗体）
あるいは、本発明の抗体はまた、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって記載されているような、ハイブリドーマ方法によって調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、代表的には、免疫剤で免疫されて、この免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。
【０１６０】
免疫剤は、代表的には、１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む。
【０１６１】
一般には、ヒト起源の細胞が望ましい場合、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、非ヒト哺乳動物供給源が望ましい場合、膵臓細胞またはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、５９−１０３頁）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、詳細には、げっ歯類起源、ウシ起源およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が、用いられる。ハイブリドーマ細胞は、適切な培養培地中で培養され得、この培養培地は、好ましくは、未融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する１種以上の物質を含有する。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、代表的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含有し、この物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。あるいは、当業者によって明らかなように、スクリーニングのために、ＳＬＡＭ技術が用いられ得る。
【０１６２】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞によって、抗体の適切な高レベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である。より好ましい不死化細胞株は、マウス骨髄腫株であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒから入手することができる。このようなマウス骨髄腫細胞株の例は、Ｐ３Ｘ６３ＡｇＵ．１である。ヒト骨髄腫細胞株およマウス−ヒトヘテロ骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生についても記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）、５１−６３頁）。
【０１６３】
ハイブリドーマ細胞が培養され得る培養培地は、次いで、１０１Ｐ３Ａ１１に対するモノクローナル抗体の存在について、アッセイされ得る。好ましくは、このハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によってか、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって、決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定され得る。
【０１６４】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、それらのクローンが、限界希釈手順によってサブクローン化され得、そして標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））によって増殖され得る。この手順のために適切な培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水のように、インビボで増殖される。
【０１６５】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来型の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡセファロースクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地または腹水から、単離または精製され得る。
【０１６６】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるもの）によって、作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦、単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れられ得、このベクターは次いで、宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはトランスフェクトされなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインに対するコード配列を、相同なマウス配列と置換することによって（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照のこと）、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全体もしくは一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、改変され得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換されるか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換されて、キメラ二価抗体を作製し得る。必要に応じて、本明細書中に開示される抗体から選択される抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の、少なくとも１つの可変ドメインまたは超可変ドメインを含む、キメラ抗体が構築され得る。
【０１６７】
必要に応じて、本発明の１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体は、本明細書中に開示される抗体のいずれかと同じエピトープに結合する。これは、本明細書中に記載されるような種々のアッセイを実施することによって、決定され得る。例えば、モノクローナル抗体が本明細書中に言及される抗体と同じ特異性を有するか否かを決定するためには、ブロッキングアッセイまたは阻害アッセイまたは機能的アッセイにおいて、この抗体の活性を比較し得る。
【０１６８】
本発明の抗体は、「架橋」抗体を含む。用語「架橋」とは、本明細書中において使用される場合、少なくとも２つのＩｇＧ分子を一緒に結合して、１つ（すなわち単一）の分子を形成することをいう。１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、種々のリンカー分子を使用して架橋され得、そして必要に応じて、抗体は、抗ＩｇＧ分子、補体、化学修飾または分子工学を使用して架橋される。補体は、一旦抗体が細胞表面膜に結合すると、この抗体分子に対して比較的高い親和性を有することが、当業者によって理解される。従って、補体は、細胞表面膜に結合した２つ以上の抗体を連結するための架橋分子として、使用され得る。種々のマウスＩｇアイソタイプのうちでも、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂは、補体を固定することが公知である。
【０１６９】
本発明の抗体は、必要に応じて、二量体抗体および抗体の多価形態を含み得る。当業者は、このような二量体または多価形態を、当該分野において公知の技術によって、そして本明細書中の抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を使用して、構築し得る。
【０１７０】
本発明の抗体はまた、一価抗体を含み得る。一価抗体を調製するための方法は、当該分野において周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリンの軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を包含する。この重鎖は、一般に、Ｆｃ領域における任意の点において短縮されて、重鎖の架橋を防ぐ。あるいは、関連するシステイン残基が、架橋を防ぐために、別のアミノ酸残基で置換されるか、または欠失される。
【０１７１】
一価抗体を調製するために、インビトロ方法もまた適切である。抗体のフラグメント（特に、Ｆａｂフラグメント）を産生するための抗体の消化は、当該分野において公知の慣用的な技術を使用して、達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８、および米国特許第４，３４２，５６６号に記載されている。抗体のパパイン消化は、代表的に、２つの同一の抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメントと称され、各々が、単一の抗原結合部位を有する）および残余のＦｃフラグメントを産生する。ペプシン処理により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これは、２つの抗原結合部位を有し、そして依然として、抗原を架橋し得る。
【０１７２】
抗体消化において産生されるＦａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端（抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む）でのいくつかの残基の付加により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中において、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を保有する、Ｆａｂ’を表す名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元来、Ｆａｂ’フラグメントの対（これらの間に、ヒンジシステインを有する）として産生された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた、公知である。
【０１７３】
単鎖Ｆｖフラグメントもまた産生され得る（例えば、Ｉｌｉａｄｅｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０９：４３７−４４１（１９９７）に記載される）。このような単鎖フラグメントの、種々のリンカーを用いる結合は、Ｋｏｒｔｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：４２３−４３３（１９９７）に記載されている。
【０１７４】
本明細書中に記載される抗体に加えて、キメラ抗体またはハイブリッド抗体が、合成タンパク質化学（架橋剤を含むものが挙げられる）において公知の方法を使用して調製されることが、企図される。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって、構築され得る。この目的での適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０１７５】
本発明の１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含む。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の抗原結合部分配列）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、移入されたＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして代表的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（代表的には、ヒト免疫グロブリンの一部）を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１７６】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般に、ヒト化抗体には、非ヒトである供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入」残基と称され、これらは代表的に、「移入」可変ドメインから採取される。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって、実施され得る。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、ここで、実質的に、インタクト未満のヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。事実上、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくらかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似の部位由来の残基で置換されている、ヒト抗体である。このような移入残基または移入可変ドメイン（またはＣＤＲ）の供給源としては、１０１Ｐ３Ａ１１を特異的に結合する抗体が挙げられる。
【０１７７】
ヒト化抗体を作製する際に使用するための、ヒト可変ドメイン（軽鎖と重鎖との両方）の選択は、抗原性を減少させるために非常に重要である。「ベストフィット」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として認容される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６−２３０８（１９９３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体について使用され得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５−４２８９（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３−２６３２（１９９３））。
【０１７８】
抗体が、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが、さらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列および種々の概念のヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元の免疫グロブリンモデルは、通常利用可能であり、そして当業者に馴染み深い。選択された候補免疫グロブリン配列の推定の三次元コンホメーションの構造を示し、そして表示するコンピュータープログラムが、利用可能である。これらの表示の調査は、候補免疫グロブリン配列の機能における、残基の可能な役割の分析（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響を与える残基の分析）を可能にする。この様式で、ＦＲ残基は、コンセンサスな重要な配列から選択および結合され得、その結果、所望の抗体特徴（例えば、標的抗原に対する増加した親和性）が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与える際に、直接的かつ最も大きく関与する（１９９４年３月３日に公開されたＷＯ９４／０４６７９を参照のこと）。
【０１７９】
ヒトモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に記載されたハイブリドーマ方法の適用によって、ヒトＢリンパ球を融合パートナーとして使用することによって、作製され得る。目的の抗体を産生するヒトＢリンパ球は、例えば、ヒト個体から、インフォームドコンセントを得た後に、単離され得る。例えば、この個体は、特定の障害（例えば、全身性エリテマトーデス（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７０：２０５（１９８２））、免疫媒介血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）（Ｎｕｇｅｎｔら、Ｂｌｏｏｄ，７０（１）：１６−２２（１９８７））、または癌）と共に起こるような自己抗原に対する抗体を産生し得る。あるいは、またはさらに、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。例えば、単離されたヒト末梢血リンパ球を、インビトロで、リソモトロフィック剤（ｌｙｓｏｍｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｌ−ロイシン−Ｏ−メチルエステル、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステル、またはＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシン−Ｏ−メチルエステル）（米国特許第５，５６７，６１０号、Ｂｏｒｒｅｂｅａｃｋら）に曝露し得；そして／またはＴ細胞除去ヒト末梢血リンパ球は、８−メルカプトグアノシンおよびサイトカインのようなアジュバントで、インビトロで処理され得る（米国特許第５，２２９，２７５号、Ｇｏｒｏｆｆら）。
【０１８０】
次いで、被験体から回収されたかまたはインビトロで免疫されたＢリンパ球は、一般に、ヒトモノクローナル抗体を作製するために不死化される。Ｂリンパ球を不死化するための技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）ヒト骨髄腫、マウス骨髄腫、またはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞との、ヒトＢリンパ球の融合；（ｂ）ウイルス形質転換（例えば、エプスタイン−バーウイルスを用いる；例えば、Ｎｕｇｅｎｔら、前出を参照のこと）；（ｃ）リンパ芽球様（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞株との融合；あるいは（ｄ）リンパ腫細胞との融合。
【０１８１】
リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。このように調製されるハイブリドーマ細胞は、適切な培養培地（これは好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む）中に播種され、そして増殖される。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、このハイブリドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。適切なヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が、記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原に指向するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））によって、決定される。
【０１８２】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後に、クローンは、限界希釈手順によってサブクローニングされ得、そして標準的な方法によって増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に適切な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。このサブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）、または血清から、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、適切に分離される。
【０１８３】
ヒト抗体はまた、ヒト抗体を産生し得る非ヒト宿主（例えば、マウス）を使用して生成され得る。上記のように、免疫の際に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の全レパートリーを産生し得る、トランスジェニックマウスが、現在利用可能である。例えば、キメラマウスおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合の欠失は、内因性抗体の産生の完全な阻害を生じることが記載されている。このような生殖細胞系変異体マウスにおける、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原投与の際にヒト抗体の産生を生じた。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；米国特許第５，５９１，６６９号；米国特許第５，５８９，３６９号；および米国特許第５，５４５，８０７号を参照のこと。ヒト抗体はまた、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスを使用して調製され得る（Ｄｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８−２６２（１９９２））。
【０１８４】
別の実施形態において、ヒト抗体は、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーから選択され得る。抗体またはそのフラグメントのライブラリーの調製は、当該分野において周知であり、そして任意の公知の方法が使用されて、宿主細胞に導入され得る形質転換ベクターのファミリーが構築され得る。ファージにおける抗体の軽鎖および重鎖のライブラリー（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５（１９８９））、あるいはファージまたはプラスミドにおける融合タンパク質のライブラリーは、公知の手順に従って調製され得る。例えば、Ｖａｕｇｈａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４（１９９６）；Ｂａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）；Ｂａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１３：３２４５−３２６０（１９９４）；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８：９７−１０５（１９９５）；ＷＯ  ９８／０５３４４；ＷＯ  ９８／１５８３３；ＷＯ  ９７／４７３１４；ＷＯ  ９７／４４４９１；ＷＯ  ９７／３５１９６；ＷＯ  ９５／３４６４８；米国特許第５，７１２，０８９号；米国特許第５，７０２，８９２号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５，４３２，０１８号；米国特許第５，２７０，１７０号；ＷＯ  ９２／０６１７６；ＷＯ  ９９／０６５８７；米国特許第５，５１４，５４８号；ＷＯ  ９７／０８３２０；ならびに米国特許第５，７０２，８９２号を参照のこと。目的の抗原は、当該分野において公知の手順を使用して、ファージライブラリーに対してパニングされ、標的抗原に結合するファージ−抗体が選択される。
【０１８５】
１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、本明細書中に記載される場合、必要に応じて、１つ以上の所望の生物学的活性または特性を有する。このような抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および親和性が十分な（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ）抗体が挙げられ得るが、これらに限定されない。上記のように、これらの抗体は、種々の技術を使用して構築または操作されて、これらの所望の活性または特性を達成し得る。１つの実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、少なくとも１０−５Ｍ、好ましくは、少なくとも１０−６Ｍ〜１０−７Ｍの範囲、より好ましくは、少なくとも１０−８Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲、そしてなおより好ましくは、少なくとも１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲の、１０１Ｐ３Ａ１１結合親和性を有する。抗体に対する結合親和性は、当該分野において公知の技術（スキャッチャード分析（ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０））が挙げられる）に従って抗体を試験することによって、過度の実験なしに決定され得る。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１（その構築物またはフラグメントを含む）に対する結合親和性についてアッセイされ得る。
【０１８６】
別の実施形態において、抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害または増強し得る抗体の結合を防止する立体コンホメーションを作製するような様式で相互作用する。本発明の抗体のエピトープ結合特性は、当該分野において公知の技術を使用して、決定され得る。
【０１８７】
（他の改変）
１０１Ｐ３Ａ１１抗体の他の改変は、本明細書中で企図される。本発明の抗体は、この抗体を細胞傷害性因子（毒素分子のような）またはプロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと）を活性抗癌薬物に転換するプロドラッグ活性化酵素に結合させることによって、改変され得る。例えば、ＷＯ  ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。この技術はまた、「抗体依存性酵素媒介プロドラッグ治療」（ＡＤＥＰＴ）と称される。
【０１８８】
ＡＤＥＰＴのために有用な免疫結合体の酵素成分としては、プロドラッグをそのより活性な細胞傷害性形態に転換し得るような様式で、プロドラッグに作用し得る、任意の酵素が挙げられる。本発明の方法において有用な酵素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に転換するために有用な、アルカリホスファターゼ；硫酸含有プロドラッグを遊離薬物に転換するために有用な、アリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌性薬物の５−フルオロウラシルに転換するために有用な、シトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に転換するために有用な、プロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）；カスパーゼ−３のようなカスパーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを転換するために有用な、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に転換するために有用な、炭水化物切断酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に転換するために有用な、β−ラクタマーゼ；ならびにアミン窒素においてフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を、それぞれ遊離薬物に転換するために有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼ。あるいは、酵素活性を有する抗体（当該分野において、「アブザイム」としてもまた公知）は、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に転換するために使用され得る（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと）。抗体−アブザイム結合体は、アブザイムを腫瘍細胞集団に送達するために、本明細書中に記載されるように調製され得る。
【０１８９】
酵素は、当該分野において周知の技術（例えば、ヘテロ二官能性架橋試薬の使用）によって、抗体に共有結合され得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に結合した、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質が、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術を使用して、構築され得る（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８（１９８４）を参照のこと）。
【０１９０】
本発明のポリペプチドに対するさらなる改変が企図される。例えば、抗体は、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマー）の１つに結合され得る。抗体はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、あるいはマクロエマルジョンの中にトラップされ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｏｌｓｏ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に、抗体フラグメント）に組み込み得る。本明細書中において使用される場合、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のインビボでの血清半減期の増加の原因となるＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープをいう。
【０１９１】
（処方物）
１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体は、好ましくは、キャリア中で投与される。この分子は、単一のキャリア中で投与され得るか、あるいは、別個のキャリア中に含まれ得る。適切なキャリアおよびそれらの処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、１９８０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｏｌｓｏら編に記載されている。代表的に、適切な量の薬学的に受容可能な塩がキャリア中で使用されて、この処方物を等張性にする。キャリアの例としては、生理食塩水、リンガー溶液およびブドウ糖溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８であり、そしてより好ましくは、約７．４〜約７．８である。例えば、投与経路および投与される薬剤の濃度に依存して、特定のキャリアが好ましいことが、当業者に明らかである。キャリアは、凍結乾燥処方物または水溶液の形態であり得る。
【０１９２】
受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、好ましくは、使用される投薬量および濃度において、細胞および／またはレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝剤；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンが挙げられる）；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが挙げられる）；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１９３】
処方物はまた、処置される特定の適応症のために必要な場合、１より多くの活性化合物（好ましくは、相補的活性を有する化合物であり、そして好ましくは、互いに有害に影響を与えない）を含有し得る。あるいは、またはさらに、組成物は、細胞傷害性因子、サイトカインまたは増殖阻害因子を含有し得る。このような分子は、意図される目的のために有効量で組み合わされて存在する。
【０１９４】
１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにトラップされ得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０１９５】
インビボでの投与のために使用される処方物は、滅菌されるべきである。このことは、滅菌濾過膜を通して濾過することによって、容易に達成される。
【０１９６】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と（エチル−Ｌ−グルタメート）とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートからなる、注射可能なマイクロスフィア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたって、タンパク質を放出する。
【０１９７】
（投与形態）
１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体は、公知の方法に従って（例えば、ボーラスによる静脈内投与またはある期間にわたる連続的な注入によって、筋肉内、腹腔内、鞘内、皮下、関節内、滑液胞内、鞘内、経口、局所、または吸入経路によって、投与され得る。必要に応じて、投与は、種々の市販のデバイスを使用して、ミニポンプ注入を介して実施され得る。
【０１９８】
１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体の投与のための効果的な投薬量およびスケジュールは、実験的に決定され得、そしてこのような決定を行うことは、当該分野の技術の範囲内である。単独で使用される、１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体の効果的な投薬量または量は、１日あたり約１μｇ／体重ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。投薬量の種間のスケーリングは、当該分野において公知の様式（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．，８：１３５１（１９９１）に開示されるような）で実施され得る。投与されなければならない、１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体の投薬量は、例えば、１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体を受ける哺乳動物、投与経路、およびその哺乳動物に投与される他の薬物または治療剤に依存して変動することを、当業者は理解する。
【０１９９】
細胞の型および／または疾患の重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１以上の別個の投与によっても、連続的な注入によっても、最初の投与のための候補投薬量である。代表的な毎日の投薬量は、上述の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日間以上にわたる繰り返しの投与のためには、状態に依存して、処置は、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、維持される。しかし、他の投薬レジメンが有用であり得る。
【０２００】
なおさらなる治療剤が、この方法において使用され得ることが企図される。１つ以上の他の治療剤としては、他の化学療法（もしくは化学療法剤）および／または放射線治療、免疫アジュバント、増殖阻害因子、サイトカイン、ならびに他の非Ｈｅｒ−２抗体に基づく治療が挙げられ得るが、これらに限定されない。例としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６）、白血病阻害因子、インターフェロン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、および抗ＶＥＧＦ抗体が挙げられる。哺乳動物細胞の増殖を阻害することが既知である他の薬剤もまた使用され得、そしてこのような薬剤としては、ＴＮＦ−α、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、およびＡｐｏ−１リガンドが挙げられる。
【０２０１】
本発明によって企図されるさらなる化学療法剤としては、当該分野において公知であり、そして市販されている、化学物質または薬物（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、ロイコボリン、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソール、トキソテレ（Ｔｏｘｏｔｅｒｅ）、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトザントロン、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｅｉｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カライノマイシン（Ｃａｒｒａｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン（ａｍｉｍｏｐｔｅｒｉｎ）、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（Ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファランおよび他の関連するナイトロジェンマスタード）が挙げられる。腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように働く因子（例えば、タモキシフェンおよびオナプリストン）もまた、含まれる。
【０２０２】
このような化学療法のための調製物および投薬スケジュールは、製造業者の指示に従って、または熟練した開業医によって経験的に決定されるように、使用され得る。このような化学療法のための調製物および投薬スケジュールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９２）に記載されている。化学療法剤は、１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体の投与に先行し得るか、または後続し得るか、あるいはこの抗体と同時に与えられ得る。
【０２０３】
化学療法剤は、好ましくは、キャリア（例えば、上記のもの）中で投与される。化学療法剤の投薬の様式は、１０１Ｐ３Ａ１１機能を調節（例えば、阻害または増強）し得る抗体について使用されるものと同じであり得るか、または異なる様式によって投与され得る。
【０２０４】
放射線治療は、当該分野において通常使用され、そして当業者に公知のプロトコルに従って、施され得る。このような治療は、セシウム放射線、イリジウム放射線、ヨウ素放射線、またはコバルト放射線を含み得る。放射線治療は、全身の照射であり得るか、あるいは身体内または身体上の特定の部位または組織に局所的に指向され得る。代表的に、放射線治療は、約１〜約２週間の期間にわたって、パルスで施される。しかし、放射線治療は、より長期間にわたって施され得る。必要に応じて、放射線治療は、単一の線量または複数の連続した線量として、施され得る。
【０２０５】
１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体（および１つ以上の他の治療剤）は、同時にかまたは連続的に投与され得る。１０１Ｐ３Ａ１１機能を阻害し得る抗体の投与に続いて、インビトロで処理された細胞が分析され得る。インビボでの処置がなされた場合には、処置された哺乳動物は、当業者に周知の種々の様式でモニタリングされ得る。例えば、腫瘍塊が、生検または標準的なＸ線画像化技術によって、物理的に観察され得る。
【０２０６】
（Ｖ．）１０１Ｐ３Ａ１１細胞免疫応答）
Ｔ細胞が抗原を認識する機構は、解明されている。本発明の有効なペプチドエピトープワクチン組成物は、世界中の集団の非常に広範な区分において治療的免疫応答または予防的免疫応答を誘導する。細胞免疫応答を誘導する本発明の組成物の価値および効力の理解のために、免疫学関連技術の簡単な総説を示す。
【０２０７】
ＨＬＡ分子とペプチド抗原との複合体は、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞によって認識されるリガンドとして作用する（Ｂｕｕｓ，Ｓら、Ｃｅｌｌ  ４７：１０７１，１９８６；Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：３５９，１９８５；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．およびＢｏｄｍｅｒ，Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１，１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３，１９９３）。単一のアミノ酸が置換された抗原アナログおよび内因性結合した天然でプロセシングされたペプチドの配列決定を通して、ＨＬＡ抗原分子への特異的結合に必要なモチーフに対応する重要な残基が、同定されており、表ＩＶに記載される（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３，１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１７８，１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂを介してＵＲＬ  ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／にアクセスのこと）；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８，１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３，１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＧｒｅｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９，１９９２；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５２，１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ  ７４：９２９−９３７，１９９３；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２，１９９５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：９７−９３，１９９６；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９９  ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２、総説を参照のこと）。
【０２０８】
さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体のＸ線結晶学的分析は、対立遺伝子特異的様式においてペプチドリガンドにより保有される残基を収容するＨＬＡ分子のペプチド結合間隙／溝部内のポケットを明らかにし；次いで、これらの残基は、この残基が存在するペプチドのＨＬＡ結合能を決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４：２０３，１９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：３０５，１９９８；Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：２４５，１９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５，１９９７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：３３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０５３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３６４，１９９２；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３６７，１９９２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９２７，１９９２；Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅｌｌ  ７０：１０３５，１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：９１９，１９９２；Ｓａｐｅｒ，ＭＡ．Ａ，Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：２７７，１９９１を参照のこと）。
【０２０９】
従って、クラスＩおよびクラスＩの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフ、またはクラスＩおよびクラスＩＩのスーパーモチーフの定義は、特定のＨＬＡ抗原への結合と関連するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
【０２１０】
従って、ＨＬＡモチーフの同定プロセスによって、エピトープベースのワクチンの候補が、同定されている；このような候補は、エピトープとその対応するＨＬＡ分子との会合の結合親和性および／または期間を決定するために、ＨＬＡ−ペプチド結合アッセイによりさらに評価され得る。これらのワクチン候補の中から、集団適用範囲および／または免疫原性の観点で好ましい特徴を有するエピトープを選択するために、さらなる確証実験が行われ得る。
【０２１１】
種々のストラテジーが、細胞免疫原性を評価するために使用され得、これには以下が挙げられる：
１）正常な個体由来の一次Ｔ細胞培養物の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら，Ｍｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３，１９９５；Ｃｅｌｉｓ，Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１０５，１９９４；Ｔｓａｉ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６，１９９７；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９９８を参照のこと）。この手順は、抗原提示細胞の存在下で、インビトロで数週間の期間にわたって、正常な被験体由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を試験ペプチドで刺激することを包含する。このペプチドに特異的なＴ細胞は、この時間の間に活性化され、そして例えば、ペプチドで感作された標的細胞を含むリンホカイン放出アッセイまたは５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、検出される。
【０２１２】
２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７，１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１，１９９６；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３，１９９７を参照のこと）。例えば、このような方法において、不完全フロイントアジュバント中のペプチドが、ＨＬＡトランスジェニックマウスに皮下投与される。免疫の数週間後、脾細胞が取り出され、そして試験ペプチドの存在下で、約１週間インビトロで培養される。ペプチド特異的Ｔ細胞は、例えば、ペプチドで感作された標的細胞および内因的に生成された抗原を発現する標的細胞を含む、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、検出される。
【０２１３】
３）効果的にワクチン接種された免疫個体および／または慢性的に病気の患者のいずれか由来のリコールＴ細胞応答の証明（例えば、Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４７，１９９５；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：９７，１９９７；Ｂｅｒｔｏｎｉ，ＲＡ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１，１９９７を参照のこと）。従って、リコール応答は、疾患に起因して抗原に曝露され、従って「自然に」免疫応答を生成した被験体由来のＰＢＬ、または抗原に対してワクチン接種された患者由来のＰＢＬを培養することによって、検出される。被験体由来のＰＢＬは、試験ペプチド＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で１〜２週間、インビトロで培養され、「未刺激」Ｔ細胞と比較して「メモリー」Ｔ細胞の活性化を可能にする。この培養期間の最後に、Ｔ細胞活性が、ペプチドで感作した標的を含む５１Ｃｒ放出、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン放出を含むアッセイを使用して、検出される。
【０２１４】
（ＶＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１トランスジェニック動物）
１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために使用され得、この動物は、次いで、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。確立された技術によって、１０１Ｐ３Ａ１１をコードするｃＤＮＡが、１０１Ｐ３Ａ１１をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。次いで、このクローン化されたゲノム配列は、１０１Ｐ３Ａ１１をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を作製するための方法は、当該分野で通常になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号（１９８８年４月１２日発行）および同第４，８７０，００９号（１９８９年９月２６日発行）において記載されている。代表的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを用いる１０１Ｐ３Ａ１１導入遺伝子組込みのために標的化される。
【０２１５】
１０１Ｐ３Ａ１１をコードする１コピーの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物は、１０１Ｐ３Ａ１１をコードするＤＮＡの発現を増加する効果を試験するために使用され得る。このような動物は、例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として使用され得る。本発明のこの局面によると、動物は、試薬で処置され、そしてこの導入遺伝子を有する未処置の動物と比較して減少した病理学的状態の発生率は、この病理学的状態に対する潜在的な治療的介入を示す。
【０２１６】
あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１の非ヒトホモログは、１０１Ｐ３Ａ１１「ノックアウト」動物を構築するために使用され得、この１０１Ｐ３Ａ１１「ノックアウト」動物は、１０１Ｐ３Ａ１１をコードする内在性遺伝子と、この動物の胚性細胞に導入された１０１Ｐ３Ａ１１をコードする変化したゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、１０１Ｐ３Ａ１１をコードする欠損遺伝子または変化した遺伝子を有する。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って、１０１Ｐ３Ａ１１をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。１０１Ｐ３Ａ１１をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子（例えば、組込みをモニタリングするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。代表的には、数キロベースの変化していない隣接ＤＮＡ（５’末端と３’末端との両方）が、ベクター中に含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そしてこの導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。ついで、この選択された細胞は、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注入されて、凝集キメラが形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと）。キメラ胚は、次いで、適切な偽妊娠雌性代理母動物に移植され得、そしてこの胚は、出産されて、「ノックアウト」動物が作製される。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫が、標準的な技術によって同定され得、そして全ての細胞が相同組み替えされたＤＮＡを含む動物を育種させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御する能力について、または１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態の発症について、特徴付けされ得る。
【０２１７】
（ＶＩＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１の検出のための方法）
本発明の別の局面は、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドおよび１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を検出するための方法、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞を同定するための方法に関する。１０１Ｐ３Ａ１１の発現プロフィールは、１０１Ｐ３Ａ１１を、転移した疾患についての診断マーカーにする。従って、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態は、進行した病期の疾患に対する感受性、進行速度および／または腫瘍の攻撃性を含む種々の因子を推定するために有用な情報を提供する。本明細書中で詳細に議論されるように、患者サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態が、当該分野で周知の種々のプロトコルによって分析され得、このプロトコルとしては、免疫組織化学分析、種々のノーザンブロット技術（インサイチュハイブリダイゼーションを含む）、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉微小解剖サンプルについて）、ウェスタンブロット分析および組織アレイ分析が挙げられる。
【０２１８】
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺および他の組織、尿、精液、細胞調製物など）中の１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能な１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドとしては、例えば、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子またはそのフラグメント、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ、選択的スプライス改変体１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ、および１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が挙げられる。１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドを増幅し、そして／または１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドの存在を検出するための多数の方法が、当該分野で周知であり、本発明のこの局面の実施において用いられ得る。
【０２１９】
一実施形態において、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して、逆転写によりこのサンプルからｃＤＮＡを生成する工程；センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドを使用して、このようにして生成されたｃＤＮＡを増幅して、その中の１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡを増幅する工程；およびこの増幅された１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡの存在を検出する工程、を包含する。必要に応じて、この増幅された１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡの配列が、決定され得る。
【０２２０】
別の実施形態において、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子を検出する方法は、第１に、このサンプルからゲノムＤＮＡを単離する工程；センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドを使用して、この単離されたＤＮＡを増幅する工程；およびこの増幅された１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。多数の適切なセンスプローブとアンチセンスプローブとの組合せが、１０１Ｐ３Ａ１１ヌクレオチド配列から設計され得（例えば、図２を参照のこと）、そしてこの目的のために使用され得る。
【０２２１】
本発明はまた、組織または他の生物学的サンプル（例えば、血清、精液、骨、前立腺、尿、細胞調製物など）中の１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の存在を検出するためのアッセイを提供する。１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を検出するための方法もまた、周知であり、これには、例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウェスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが挙げられる。例えば、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の存在を検出する方法は、第１に、このサンプルと、１０１Ｐ３Ａ１１抗体、その１０１Ｐ３Ａ１１反応性フラグメント、または１０１Ｐ３Ａ１１抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質とを接触させる工程；次いで、このサンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の結合を検出する工程、を包含する。
【０２２２】
１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞を同定するための方法もまた、本発明の範囲内である。一実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、この細胞中の１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡの存在を検出する工程を包含する。細胞中の特定のｍＲＮＡを検出するための方法は、周知であり、そして例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識された１０１Ｐ３Ａ１１リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連の技術）、および種々の核酸増幅アッセイ（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１に対して特異的な相補的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および他の増幅型検出方法（例えば、分枝状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど））が挙げられる。あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、この細胞中に存在するか、またはこの細胞により分泌される１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の存在を検出する工程を包含する。タンパク質の検出のための種々の方法が、当該分野で周知であり、そして１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の検出のためおよび１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を発現する細胞の検出のために用いられる。
【０２２３】
１０１Ｐ３Ａ１１発現分析はまた、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子発現を調節する因子を同定および評価するための手段として有用である。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１発現は、前立腺癌において有意にアップレギュレートされ、そして表Ｉに列挙される組織の癌において発現される。癌細胞における１０１Ｐ３Ａ１１発現または１０１Ｐ３Ａ１１過剰発現を阻害する分子または生物学的因子の同定は、治療的価値を有する。例えば、このような因子は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗体結合により１０１Ｐ３Ａ１１発現を定量するスクリーニングを使用することによって、同定され得る。
【０２２４】
（ＶＩＩＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１関連遺伝子およびその産物の状態をモニタリングするための方法）
腫瘍形成は、細胞増殖が次第に調節不全になり、細胞が正常な生理学的状態から前癌状態まで進行し、次いで癌状態まで進行する、多段階プロセスであることが知られている（例えば、Ａｌｅｒｓら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．７７（５）：４３７−３４８（１９９７）およびＩｓａａｃｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．２３：１９−２３（１９９５）を参照のこと）。この状況において、生物学的サンプルを調節不全性の細胞増殖の証拠（例えば、癌における異常な１０１Ｐ３Ａ１１発現）について試験することにより、癌のような病理学的状態が、治療選択肢がより制限される段階まで進行する前、そして／または予後が悪化する前に、このような異常な生理学を早期に検出することが可能になる。このような試験において、目的の生物学的サンプル中の状態が、例えば、対応する正常なサンプル（例えば、病理により影響を受けていない、この個体または代替の別の個体由来のサンプル）中の１０１Ｐ３Ａ１１の状態と比較され得る。生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の状態における（正常なサンプルと比較した場合の）変化は、調節不全性の細胞増殖の証拠を提供する。病理により影響を受けていない生物学的サンプルを正常なサンプルとして使用することに加えて、所定の規範値（例えば、ｍＲＮＡ発現の所定の正常なレベル）（例えば、Ｇｒｅｖｅｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９６  Ｄｅｃ  ９；３７６（２）：３０６−１４および米国特許第５，８３７，５０１号を参照のこと）が、サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の状態を比較するために使用され得る。
【０２２５】
この文脈において、用語「状態」は、当該分野で認められた意味に従って使用され、遺伝子およびその産物の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎまたはｓｔａｔｅ）をいう。代表的には、当業者は、多数のパラメーターを使用して、遺伝子およびその産物の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎまたはｓｔａｔｅ）を評価する。これには、発現された遺伝子産物の位置（１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞の位置を含む）、ならびに発現された遺伝子産物（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）のレベルおよび生物学的活性が挙げられるが、これらに限定されない。１０１Ｐ３Ａ１１の状態における変化は、１０１Ｐ３Ａ１１および／または１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞の位置における変化、ならびに／あるいは１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡおよび／または１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の発現の増加を含む。
【０２２６】
サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の状態は、当該分野で周知の多数の手段によって分析され得、この手段としては、免疫組織化学分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザー捕捉微小解剖サンプルに対するＲＴ−ＰＣＲ分析、ウェスタンブロット分析および組織アレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ  ２（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），１５（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）ａｎｄ  １８（ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）に見出される。従って、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の状態は、当業者により使用される種々の方法によって評価され、これらの方法としては、ゲノムサザン分析（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子中の変動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を試験するため）、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡのノーザン分析および／またはＰＣＲ分析（例えば、ポリヌクレオチド配列または１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡの発現レベルにおける変化を試験するため）、ならびにウェスタン分析および／または免疫組織化学分析（例えば、ポリペプチド配列における変更、サンプル内のポリペプチドの局在化における変化、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の発現レベルにおける変化、および／または１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質とポリペプチド結合パートナーとの会合を試験するため）が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドとしては、例えば、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子またはそのフラグメント、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ、選択的スプライス改変体、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ、および１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子または組換えＲＮＡ分子が挙げられる。
【０２２７】
１０１Ｐ３Ａ１１の発現プロフィールは、１０１Ｐ３Ａ１１を局所疾患および／または転移性疾患についての診断マーカーとし、そして生物学的サンプルの増殖または腫瘍形成の可能性についての情報を提供する。特に、１０１Ｐ３Ａ１１の状態は、特定の疾患段階、進行および／または腫瘍の攻撃性に対する感受性を推定するために有用な情報を提供する。本発明は、１０１Ｐ３Ａ１１の状態を決定し、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌（例えば、表Ｉに列挙される組織の癌）を診断するための方法およびアッセイを提供する。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡは、正常な前立腺組織と比較して前立腺癌および他の癌において非常に発現されるので、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ転写物または１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のレベルを評価するアッセイが、１０１Ｐ３Ａ１１の調節不全と関連する疾患を診断するために使用され得、そして適切な治療選択肢を規定する際に有用な予後情報を提供し得る。
【０２２８】
１０１Ｐ３Ａ１１の発現状態は、形成異常細胞、前癌状態の細胞および癌細胞の存在、病期および位置を含む、種々の段階の疾患に対する感受性を予測する情報、および／または腫瘍の攻撃性を評価するための情報を提供する。さらに、発現プロフィールは、１０１Ｐ３Ａ１１を、転移性疾患のための画像化試薬として有用にする。結果的に、本発明の局面は、生物学的サンプル（例えば、調節不全性の細胞増殖により特徴付けられる病理（例えば、癌）に罹患している個体由来のサンプル、またはこのような病理に罹患している疑いのある個体由来のサンプル）中の１０１Ｐ３Ａ１１の状態を試験するための種々の分子予後方法および分子診断方法に関する。
【０２２９】
上記のように、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の状態は、当該分野で周知の多数の手順によって試験され得る。例えば、身体の特定の位置から採取された生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の状態は、このサンプルを、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を発現する細胞）の存在または非存在について評価することによって、試験され得る。この試験は、例えば、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞が、通常ではこのような細胞を含まない生物学的サンプル（例えば、リンパ節）中に見出された場合、調節不全性の細胞増殖の証拠を提供し得る。なぜなら、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の状態におけるこのような変化は、しばしば、調節不全性の細胞増殖に不随するからである。詳細には、調節不全性の細胞増殖の１つの指標は、起源の器官（例えば、前立腺）から身体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の転移である。この状況において、調節不全性の細胞増殖の証拠は、重要である。なぜなら、例えば、前立腺癌を有する集団のうちのかなりの比率において、潜伏性リンパ節転移が検出され得、そしてこのような転移は、疾患の進行の既知の予測因子と関連するからである（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４２（４）：３１５−３１７（２０００）；Ｓｕら、Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１８（１）：１７−２８（２０００）およびＦｒｅｅｍａｎら、Ｊ  Ｕｒｏｌ  １９９５  Ａｕｇ  １５４（２  Ｐｔ  １）：４７４−８を参照のこと）。
【０２３０】
１つの局面において、本発明は、調節不全性の細胞増殖に関連する疾患（例えば、過形成または癌）を有すると疑われる個体由来の細胞により発現される１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態を決定し、次いでこのように決定した状態を、対応する正常なサンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態と比較することによって、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。正常なサンプルと比較して、試験サンプル中の異常な１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の存在は、個体の細胞内の調節不全性の細胞増殖の存在の指標を提供する。
【０２３１】
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在を決定する際に有用なアッセイを提供し、このアッセイは、対応する正常な細胞または正常な組織における発現レベルと比較して、試験細胞サンプルまたは試験組織サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の有意な増加を検出する工程を包含する。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡの存在は、表Ｉに列挙される組織を包含するがそれに限定されない組織において評価され得る。これらの組織のいずれかにおける有意な１０１Ｐ３Ａ１１発現の存在は、癌の発症、存在および／または重篤度を示すために有用である。なぜなら、対応する正常な組織は、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡを発現しないか、これを低レベルでしか発現しないからである。
【０２３２】
関連の実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１の状態は、核酸レベルでよりもむしろタンパク質レベルで決定される。例えば、このような方法は、試験組織サンプル中の細胞により発現される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のレベルを決定し、このように決定されたレベルを、対応する正常なサンプルにおいて発現される１０１Ｐ３Ａ１１のレベルと比較する工程を包含する。一実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して、評価される。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質発現を検出し得る１０１Ｐ３Ａ１１抗体または１０１Ｐ３Ａ１１結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ様式で使用される。
【０２３３】
さらなる実施形態において、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１ヌクレオチド配列および１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列の状態が、これらの分子の構造における変動を同定するために、評価され得る。これらの変動としては、挿入、欠失、置換などが挙げられ得る。このような評価は、有用である。なぜなら、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における変動は、増殖調節不全性の表現型と関連する多数のタンパク質において観察されるからである（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、１９９９，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８を参照のこと）。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１の配列における変異は、腫瘍の存在または発癌補助作用を示し得る。従って、このようなアッセイは、１０１Ｐ３Ａ１１における変異が潜在的な機能喪失または腫瘍増殖の増加を示す場合、診断的価値および予測的価値を有する。
【０２３４】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における変動を観察するための種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で考察されるノーザンプロトコル、サザンプロトコル、ウェスタンプロトコル、ＰＣＲプロトコルおよびＤＮＡ配列決定プロトコルにより観察される。さらに、ヌクレオチド配列および核酸配列における変動を観察するための他の方法（例えば、一本鎖高次構造多型分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号（１９９９年９月７日発行）および同第５，９５２，１７０号（１９９５年１月１７日発行）を参照のこと）。
【０２３５】
さらに、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子のメチル化状態が試験され得る。遺伝子の５’調節領域中のＣｐＧアイランドの異常な脱メチル化および／または過剰メチル化が、しばしば、不死化細胞および形質転換細胞において生じ、種々の遺伝子の変化した発現を生じ得る。例えば、πクラスのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（正常な前立腺において発現されるタンパク質であり、前立腺癌の９０％より多くにおいては発現されない）のプロモーター過剰メチル化は、この遺伝子の転写を永久的に止めるようであり、最も頻繁に検出される前立腺癌におけるゲノム変化である（Ｄｅ  Ｍａｒｚｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５−１９９２（１９９９））。さらに、この変化は、高度な前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）の症例のうちの少なくとも７０％において存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１９９８，７：５３１−５３６）。別の例において、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子の発現（これは、正常な前立腺においては発現されないが、前立腺癌の２０〜５０％において発現される）は、リンパ芽球細胞においてデオキシ−アザシチジンにより誘導され、このことは、腫瘍発現が脱メチル化に起因することを示唆している（Ｌｅｔｈｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６（６）：９０３−９０８（１９９８））。遺伝子のメチル化状態を試験するための種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、当業者は、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、メチル化されたＣｐＧ部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素を使用して、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を評価し得る。さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧアイランド中に存在する全てのＣｐＧ部位のメチル化状態を容易にプロファイルし得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム（これはメチル化されていない全てのシトシンをウラシルに変換する）によりまずＤＮＡを改変し、続いてメチル化されていないＤＮＡに対してメチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを使用して増幅することを包含する。メチル化干渉を含むプロトコルはまた、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  １２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５において見出され得る。
【０２３６】
遺伝子増幅は、１０１Ｐ３Ａ１１の状態を評価するためのさらなる方法である。遺伝子増幅は、本明細書中で提供される配列に基づいて、例えば、適切に標識されたプローブを使用して、ｍＲＮＡの転写を定量するための従来のサザンブロッティングまたはノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５）、ドットブロッティング、またはインサイチュハイブリダイゼーションによってサンプル中で直接測定される。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識する抗体が、使用される。次いで、この抗体は、標識され、そしてアッセイが実施され、このアッセイにおいて、この二重鎖は、表面に結合され、その結果、この表面上で二重鎖が形成されると、この二重鎖に結合した抗体の存在が、検出され得る。
【０２３７】
生検組織または末梢血が、例えば、ノーザン分析、ドットブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、癌細胞の存在について簡便にアッセイされて、１０１Ｐ３Ａ１１発現が検出され得る。ＲＴ−ＰＣＲ増幅可能な１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野で周知である。末梢血中の腫瘍細胞のためのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理において使用するために、現在評価されている。前立腺癌の分野において、このアッセイには、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイが挙げられる（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７，Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３−３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５−２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７−１６８８）。
【０２３８】
本発明のさらなる局面は、発症中の癌に対して個体が有する感受性の評価である。一実施形態において、癌に対する感受性を予想するための方法は、組織サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質（その存在は、癌に対する感受性を示す）を検出する工程を包含し、ここで、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ発現の程度は、感受性の程度と相関する。特定の実施形態において、前立腺または他の組織中の１０１Ｐ３Ａ１１の存在が、試験され、ここで、このサンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の存在は、前立腺癌感受性（または前立腺腫瘍の発症もしくは存在）の指標を提供する。同様に、当業者は、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１ヌクレオチド配列および１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得る。サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の１つ以上の変動の存在は、癌感受性（または腫瘍の発症もしくは存在）の指標である。
【０２３９】
本発明はまた、腫瘍の攻撃性を評価するための方法を包含する。一実施形態において、腫瘍の攻撃性を評価するための方法は、腫瘍細胞によって発現される１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のレベルを決定する工程、このように決定したレベルを、同じ個体もしくは正常な組織参照サンプルから採取した対応する正常な組織において発現される１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のレベルと比較する工程を包含し、ここで正常なサンプルに対する腫瘍サンプルにおける１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の発現の程度は、攻撃性の程度を示す。特定の実施形態において、腫瘍の攻撃性は、１０１Ｐ３Ａ１１が腫瘍細胞において発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍を示す。別の実施形態は、１０１Ｐ３Ａ１１ヌクレオチドおよびアミノ酸の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するための、生物学的サンプル中のこの１０１Ｐ３Ａ１１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の完全性の評価である。１つ以上の変動の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
【０２４０】
本発明の別の実施形態は、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法に関する。一実施形態において、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞により発現される１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のレベルを決定する工程、このようにして決定されたレベルを、異なる時間に同じ個体から採取した同等な組織サンプルにおいて発現される１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のレベルと比較する工程、を包含し、ここで、経時的な腫瘍サンプルにおける１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の発現の程度は、癌の進行についての情報を提供する。特定の実施形態において、癌の進行は、腫瘍細胞における１０１Ｐ３Ａ１１の発現を経時的に決定することにより評価され、ここで経時的に増加した発現は、癌の進行を示す。また、当業者は、生物学的サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１ヌクレオチド配列および１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得、ここで、１つ以上の変動の存在は、癌の進行を示す。
【０２４１】
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の種々の予後プロトコルおよび診断プロトコルのいずれか１つと組み合わされ得る。例えば、本発明の別の実施形態は、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の発現および１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の発現（または１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の変動および１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物における変動）、組織サンプルの状態を診断および予想するための手段としての悪性腫瘍に関連する因子との間の同時発生に関する。悪性腫瘍に関連する種々の因子（例えば、悪性腫瘍に関連する遺伝子（例えば、前立腺癌についてのＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＭの発現など）、ならびに肉眼で見える細胞学的知見）が、使用され得る（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら、１９８４，Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４−８８；Ｅｐｓｔｅｉｎ，１９９５，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（２）：２２３−９；Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９８，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１１（６）：５４３−５１；Ｂａｉｓｄｅｎら、１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）；８１９−２４を参照のこと）。１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の発現および１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の発現（または、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子および１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物における変動）と、悪性腫瘍に関連する別の因子との間の同時発生を観察するための方法は、有用である。なぜなら、例えば、疾患と同時に生じる特定の因子のセットの存在は、組織サンプルの状態を診断および予測するために重要な情報を提供するからである。
【０２４２】
一実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の発現と１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の発現（または、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子および１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物における変動）と、悪性腫瘍に関連する別の因子との間の同時発生を観察するための方法は、組織サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡおよび１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の過剰発現を検出すること、組織サンプル中のＰＳＡ  ｍＲＮＡまたはＰＳＡタンパク質の過剰発現（またはＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）を検出すること、および１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡもしくは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の過剰発現と、ＰＳＡ  ｍＲＮＡもしくはＰＳＡタンパク質の過剰発現（またはＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）との同時発生を観察することを伴う。特定の実施形態において、前立腺組織における１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡおよびＰＳＡ  ｍＲＮＡの発現が、試験され、ここで、このサンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ過剰発現とＰＳＡ  ｍＲＮＡ過剰発現との同時発生は、前立腺癌の存在、前立腺癌感受性または前立腺腫瘍の発症もしくは状態を示す。
【０２４３】
１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を検出および定量するための方法が、本明細書中に記載されており、そして標準核酸およびタンパク質の検出技術および定量技術は、当該分野で周知である。１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡの検出および定量するための標準方法としては、標識１０１Ｐ３Ａ１１リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連する技術、１０１Ｐ３Ａ１１に対して特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、並びに他の増幅型検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡ発現を検出および定量する。１０１Ｐ３Ａ１１を増幅し得る任意の数のプライマーを、この目的のために使用し得、このプライマーとしては、本明細書中で具体的に記載される種々のプライマーセットが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、野生型１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、生検組織の免疫組織化学アッセイにおいて使用し得る。
【０２４４】
（ＩＸ．１０１Ｐ３Ａ１１と相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質および核酸配列は、当業者が、１０１Ｐ３Ａ１１と相互作用するタンパク質、低分子および他の薬剤、ならびに種々の分野で受け入れられたプロトコルのうちのいずれか１つを介して、１０１Ｐ３Ａ１１によって活性化される経路を同定することを可能にする。例えば、いわゆる相互作用トラップ系（「２ハイブリッドアッセイ」とも呼ばれる）のうちの１つを利用し得る。このような系において、分子は、レポーター遺伝子の発現を指向する転写因子と相互作用し、そして再構成し、一方でこのレポーター遺伝子の発現をアッセイする。他の系は、真核生物転写活性化因子の再構築を介して、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する（例えば、１９９９年９月２１日に発行された米国特許第５，９５５，２８０号、１９９９年７月２０日に発行された同第５，９２５，５２３号、１９９８年１２月８日に発行された同第５，８４６，７２２号、および１９９９年１２月２１日に発行された同第６，００４，７４６号を参照のこと）。アルゴリズムもまた、タンパク質機能のゲノムベースの予測のために当該分野で利用可能である（例えば、Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：１９９９年１１月４日，８３−８６を参照のこと）。
【０２４５】
あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために、ペプチドライブラリをスクリーニングし得る。このような方法において、１０１Ｐ３Ａ１１に結合するペプチドは、アミノ酸のランダムな収集物または制御された収集物をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコードされたペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、このバクテリオファージ粒子は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質に対してスクリーニングされる。
【０２４６】
従って、種々の広範の用途（例えば、治療剤、予後剤または診断剤）を有するペプチドは、予想されるリガンド分子またはレセプター分子の構造に関する以前の情報なしで同定される。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る、代表的なペプチドライブラリおよびスクリーニング方法は、例えば、１９９８年３月３日に発行された米国特許第５，７２３，２８６号、および１９９８年３月３１日に発行された同第５，７３３，７３１号で開示される。
【０２４７】
あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞株は、１０１Ｐ３Ａ１１によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用される。このような相互作用は、免疫沈降技術（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｂ．Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９，２６１：６４６−５１を参照のこと）を使用して試験され得る。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質は、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を使用する１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓ−ｔａｇに対する抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１およびＨｉｓ−ｔａｇ（上記のベクター）の融合物を発現するように操作された細胞株中で使用され得る。この免疫沈降複合体は、ウェスタンブロット、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識、タンパク質のマイクロシークエンシング、銀染色および２次ゲルゲル電気泳動のような手順に沿ってタンパク質に関して試験され得る。
【０２４８】
１０１Ｐ３Ａ１１と相互作用する低分子およびリガンドは、このようなスクリーニングアッセイの関連する実施形態を介して同定され得る。例えば、低分子（リン酸化および脱リン酸化を媒介し得る１０１Ｐ３Ａ１１の能力に干渉する分子を含む）により、タンパク質機能との干渉が、細胞サイクル、第２メッセンジャーシグナル伝達、または腫瘍形成の調節の指標としてのＤＮＡまたはＲＮＡとの相互作用として機能することが同定され得る。同様に、１０１Ｐ３Ａ１１関連イオンチャネル、タンパク質ポンプ、または細胞連絡機能を調節する小分子を、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌を有するタンパク質を処理するために、同定および使用される（例えば、Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９９２）。さらに、１０１Ｐ３Ａ１１機能を調節するリガンドは、１０１Ｐ３Ａ１１に結合し、そしてレポーター構築物を活性化するためのそれらの能力に基づいて同定され得る。代表的な方法は、例えば、１９９９年７月２７日に発行された米国特許第５，９２８，８６８号において議論されており、そして少なくとも１つのリガンドが小分子である、ハイブリッドリガンドを形成するための方法を含む。例示の実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１の融合タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質を発現するために操作された細胞を使用して、ハイブリッドリガンド／小分子の融合タンパク質およびｃＤＮＡライブラリー転写活性化タンパク質を同時発現する。この細胞は、レポーター遺伝子（この発現は、第１融合タンパク質および第２融合タンパク質の互いに隣接して調整される）をさらに含み、この事象は、ハイブリッドリガンドが、両方のハイブリッドタンパク質の標的部位に結合する場合のみ生じる。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞を選択し、そして未知の小細胞または未知のリガンドを同定する。この方法は、１０１Ｐ３Ａ１１を活性化または阻害する、調節因子を同定する手段を提供する。
【０２４９】
本発明の実施形態は、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列と相互作用する分子をスクリーニングする方法を含み、この方法は、一群の分子と１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列とを接触させる工程、上記一群の分子と上記１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列とを、相互作用を容易にする条件下で相互作用させる工程、１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次いで、１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列を相互作用しない分子を相互作用する分子から分離する工程を包含する。特定の実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程、特徴付けする工程および同定する工程をさらに包含する。この同定された分子は、１０１Ｐ３Ａ１１によって実施される機能を調節するために使用され得る。好ましい実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列は、ペプチドライブラリと接触される。
【０２５０】
（Ｘ．治療方法および組成物）
限定されたセットの組織において正常に発現されるが、前立腺癌および他の癌においても発現されるタンパク質のような１０１Ｐ３Ａ１１の同定により、多数の治療アプローチをこのような癌の処置に広げる。本明細書において企図されるように、１０１Ｐ３Ａ１１は、腫瘍促進遺伝子を活性化すること、または腫瘍形成をブロックする遺伝子を抑制することに関連する転写因子として機能する。
【０２５１】
従って、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の活性を阻害する治療アプローチは、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌を患った患者に有用である。このような治療アプローチは、一般に、２つのクラスに入る。一つのクラスは、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質とその結合パートナーまたは他のタンパク質との結合または会合を阻害するための種々の方法を含む。別のクラスは、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の翻訳または１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための種々の方法を含む。
【０２５２】
（Ｘ．Ａ．抗癌ワクチン）
本発明は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質または１０１Ｐ３Ａ１１関連核酸を含む、癌ワクチンを提供する。１０１Ｐ３Ａ１１の発現に関して、癌ワクチンは、非標的組織において最小の効果または効果なしで、１０１Ｐ３Ａ１１発現癌を予防および／または処置する。抗癌治療として、体液性免疫応答および／または細胞媒介免疫応答を生じるワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、周知であり、ヒトＰＳＭＡおよびげっ歯ＰＡＰ免疫原を使用して前立腺癌において利用されている（Ｈｏｄｇｅら，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：２３１−２３７；Ｆｏｎｇら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３−３１１７）。
【０２５３】
このような方法は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質、または１０１Ｐ３Ａ１１コード核酸分子および１０１Ｐ３Ａ１１免疫原（これは、代表的に、多数の抗体またはＴ細胞エピトープを含む）を発現および提示し得る組換えベクターを利用することによって容易に実施され得る。当業者は、免疫反応性エピトープの送達のための広範な種々のワクチン系が当該分野で周知であることを理解する（例えば、Ｈｅｒｙｌｎら，Ａｎｎ  Ｍｅｄ  １９９９年２月，３１（１）：６６−７８；Ｍａｒｕｙａｍａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０００年１１月，４９（３）：１２３−３２）。簡潔には、哺乳動物において、免疫応答（例えば、体液性免疫応答および／または細胞媒介免疫応答）を生じるこのような方法は、以下の工程を包含する：免疫反応性エピトープ（例えば、エピトープは、図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質、またはそのアナログもしくはホモログ中に存在する）に哺乳動物の免疫系を曝露し、その結果、この哺乳動物に、エピトープに対して特異的な免疫応答を生じさせる（例えば、このエピトープを特異的に認識する抗体を生じさせる）工程。好ましい方法において、１０１Ｐ３Ａ１１免疫原は、生物学的モチーフを含む（例えば、表Ｖ−ＸＶＩＩＩ〜ＩＬ、または図５、図６、図７、図８、および図９に示される１０１Ｐ３Ａ１１由来のあるサイズ範囲のペプチドを参照のこと）。
【０２５４】
全１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質、免疫原性領域またはそれらのエピトープを、種々の手段によって合わせ、および送達し得る。このようなワクチン組成物としては、例えば、以下が挙げられる：リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）マイクロカプセル中にカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７−２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：２９９−３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：６７５−６８１，１９９５を参照のこと）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれたペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：８７３−８７５，１９９０；Ｈｕら，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５−２４３，１９９８を参照のこと）、多抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９−５４１３，１９８８；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１７−３２，１９９６を参照のこと）、多価ペプチドとして処方されたペプチド、弾道送達系において使用するためのペプチド（代表的に、結晶化したペプチド）、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編，第３７９頁，１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：５３５，１９８６；Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：５３７，１９８６；Ｋｉｎｅｙ，Ｍ．−Ｐ．ら，ＡＩＤＳ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：７９０，１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７５：５３５，１９９０）、ウイルス起源または合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５，１９９６；Ｅｌｄｒｉｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３；Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．およびＣｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：２９３，１９９３）、リポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５，１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：１３１，１９９６）または裸のｃＤＮＡもしくは粒子吸収ｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．およびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：９５７，１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編，第４２３頁，１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３，１９９４およびＥｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３）。毒素標的送達技術（レセプター媒介標的化（例えば、Ａｖａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のレセプター媒介標的化）としても公知）もまた、使用され得る。
【０２５５】
１０１Ｐ３Ａ１１に関連する癌を有する患者において、本発明のワクチン組成物はまた、癌のために使用される他の処置（例えば、手術、化学療法、薬物治療、放射線治療など（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどのような免疫アジュバントと組み合わせた使用を含む））と合わせて使用され得る。
【０２５６】
（細胞ワクチン）
ＣＴＬエピトープは、対応するＨＬＡ対立遺伝子に結合する１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズムを使用して決定され得る：（例えば表ＩＶ；ＥｐｉｍｅｒＴＭおよびＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭ，Ｂｒｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ）；およびＢＩＭＡＳ（ＵＲＬ  ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／；ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ  ＵＲＬ  ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｉｍ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／））。好ましい実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１免疫原は、当該分野で周知の技術を使用して同定された１種以上のアミノ酸配列を含み、これらは、表Ｖ−ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬに示される配列、またはＨＬＡクラスＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ａ）、表ＩＶ（Ｄ）、または表ＩＶ（Ｅ）によって特定された８個、９個、１０個もしくは１１個のアミノ酸のペプチド、および／またはＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ｂ）、または表ＩＶ（Ｃ）を含む、少なくとも９個のアミノ酸のペプチドである。当該分野で理解されているように、ＨＬＡクラスＩ結合溝は、本質的に、閉鎖的に終結され、その結果、特定のサイズ領域のみのペプチドが、溝に適合し、かつ、結合され得、一般に、ＨＬＡクラスＩエピトープが、８、９、１０、または１１個のアミノ酸長である。対照的に、ＨＬＡクラスＩＩ結合溝は、本質的に、開放的に終結され、従って、約９個以上のアミノ酸のペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって結合され得る。ＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩとの間の結合溝の差異に起因して、ＨＬＡクラスＩモチーフは、長さ特異的である。すなわち、クラスＩの２つの位置は、この位置のアミノからカルボキシル方向の第２アミノ酸である。クラスＩＩモチーフのアミノ酸位置は、互いに対してのみ相関し、全体のペプチドに対して相関していない。すなわち、さらなるアミノ酸は、モチーフ保有配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に付着され得る。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、しばしば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長、または２５アミノ酸長よりも長い。
【０２５７】
（抗体ベースのワクチン）
哺乳動物において免疫応答を発生するための広範な種々の方法は、（例えば、ハイブリドーマの発生における第１工程として）当該分野で公知である。哺乳動物における免疫応答を発生させる方法は、タンパク質（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質）上の免疫原性エピトープに哺乳動物の免疫系を曝露し、その結果、免疫応答を発生させる工程を包含する。代表的な実施形態は、十分な量の少なくとも１つの１０１Ｐ３Ａ１１細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープまたはそれらのアナログを宿主と接触させ；そして少なくとも１回の周期的な間隔の後、１０１Ｐ３Ａ１１Ｂ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープまたはそれらのアナログを宿主と再び接触させることによって、宿主において、１０１Ｐ３Ａ１１に対する免疫応答を発生させるための方法からなる。特定の実施形態は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質または人工多エピトープペプチドを発生する方法からなり、この方法は、１０１Ｐ３Ａ１１免疫原（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質またはそのペプチドフラグメント、１０１Ｐ３Ａ１１融合タンパク質またはアナログなど）を、ヒトまたは別の哺乳動物に対してワクチン調製物として投与する工程を包含する。代表的に、このようなワクチン調製物は、さらに、適切なアジュバント（例えば、米国特許第６，１４６，６３５号）またはＰＡＤＲＥＴＭペプチドのような汎用ヘルパーエピトープ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４（３）；１６４（３）：１６２５−１６３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９４  １（９）：７５１−７６１およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８  １８（２）：７９−９２を参照のこと）。代替方法は、１０１Ｐ３Ａ１１免疫原をコードするＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列の発現を制御する調製配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を、個々の身体の筋肉または皮膚にインビボで投与することによって、１０１Ｐ３Ａ１１免疫原に対して個々の免疫応答を発生させる工程を包含し、ここで、このＤＮＡ分子は、細胞によって取り込まれ、ＤＮＡ分子は、この細胞において発現され、そして免疫応答を、免疫原に対して発生する（例えば、米国特許第５，９６２，４２８号を参照のこと）。必要に応じて、遺伝子ワクチン促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）（例えば、アニオン性脂質；サポニン；レクチン；エストロゲン化合物；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスルホキシド；および尿素）がまた、投与される。さらに、１０１Ｐ３Ａ１１を模倣する抗イディオタイプ抗体が、標的抗原に対する応答を発生させるために投与され得る。
【０２５８】
（核酸ワクチン）
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を含む。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、患者に投与され得る。遺伝子免疫方法は、
１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌細胞に対する、予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を発生させるために利用され得る。１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡを含む構成物および適切な調節配列は、個体の筋肉または皮膚に直接注射され、その結果、筋肉または皮膚の細胞は、この構成物を取り込み、そしてコードされた１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質／免疫原を発現する。あるいは、ワクチンは、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を含む。１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質免疫原の発現は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を保有する細胞に対する、予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の発生を生じる。当該分野で使用される、種々の予防的または治療的な遺伝子免疫技術は、使用され得る（総説のために、インターネットアドレスｗｗｗ．ｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。核酸ベース送達は、例えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０）および米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；ＷＯ  ９８／０４７２０に記載されている。ＤＮＡベースの技術の例としては、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介送達（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）を含む。
【０２５９】
治療的または予防的な免疫の目的のために、本発明のタンパク質は、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを介して発現され得る。本発明の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達系としては、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（例えば、Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３；Ｔｓａｎｇら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８７：９８２−９９０（１９９５）を参照のこと）。非ウイルス送達系もまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質をコードする裸のＤＮＡを（例えば筋内または皮内で）導入することにより利用され得る。
【０２６０】
ワクチンウイルスは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして使用される。宿主への導入の際に、組換えワクチンウイルスは、タンパク質免疫原性ペプチドを発現し、そしてこれによって、宿主免疫応答を惹起する。免疫プロトコルにおいて有用なワクチンベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−４６０（１９９１）に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫のための有用な、広範な種々の他のベクター（例えば、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書の記載から当業者に明らかである。
【０２６１】
従って、遺伝子送達系は、１０１Ｐ３Ａ１１関連核酸分子を送達するために使用される。一つの実施形態において、全長ヒト１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡを使用する。別の実施形態において、特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／または抗体エピトープをコードする１０１Ｐ３Ａ１１核酸分子を使用する。
【０２６２】
（エキソビボワクチン）
種々のエキソビボストラテジーを利用して、免疫応答を発生させ得る。一つのアプローチは、患者の免疫系に対して１０１Ｐ３Ａ１１抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）の使用に関する。従って、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７−同時刺激、ならびにＩＬ−１２を発現する樹状細胞は、高度に特異的な抗原提示細胞である。前立腺癌において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドを用いて適用される自己樹状細胞が、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために、フェーズＩ臨床試験において使用される（Ｔｊｏａら，１９９６，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら，１９９６，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２９：３７１−３８０）。従って、樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の内容物中で、１０１Ｐ３Ａ１１ペプチドをＴ細胞に提示するために使用され得る。一つの実施形態において、自己樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し得る１０１Ｐ３Ａ１１ペプチドでパルスされる。別の実施形態において、樹状細胞は、完全１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質でパルスされる。なお別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクターを使用する樹状細胞中で、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の過剰発現を操作することに関する（Ａｒｔｈｕｒら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、または腫瘍誘導ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２）。１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞はまた、免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように操作され得る、そして免疫剤として使用され得る。
【０２６３】
（Ｘ．Ｂ．抗体ベースの治療のための標的としての１０１Ｐ３Ａ１１）
１０１Ｐ３Ａ１１は、抗体ベースの治療ストラテジーのための魅力的な標的である。多数の抗体ストラテジーは、細胞外分子と細胞内分子との両方を標的するために、当該分野で公知であり（例えば、相補体およびＡＤＣＣ媒介の殺傷および身体内での使用を参照のこと）。１０１Ｐ３Ａ１１は、対応する正常な細胞に対応する種々の系統の癌細胞によって発現されるので、免疫活性組成物を非標的器官および組織に結合することによって生じる、毒性効果、非特異的効果および／または非標的効果なしで、優れた感受性を示す、１０１Ｐ３Ａ１１免疫活性組成物の全身投与を調製する。１０１Ｐ３Ａ１１のドメインと特異的に反応する抗体は、トキシンまたは治療剤と組み合わせてか、または細胞増殖または機能を阻害し得る裸の抗体としてのいずれかで、全身的に癌を発生する１０１Ｐ３Ａ１１を処置するために有用である。
【０２６４】
１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、抗体が１０１Ｐ３Ａ１１に結合し、そして機能（例えば、結合パートナーとの相互作用）を調節し、そして結果として腫瘍細胞の破壊を媒介し、そして／または腫瘍細胞の増殖を阻害するように、患者に導入され得る。このような抗体が治療効果を発揮する機構としては、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害、１０１Ｐ３Ａ１１の生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞分化を調節すること、腫瘍脈管形成因子プロフィールを変化させること、および／またはアポトーシスを包含し得る。
【０２６５】
当業者は、抗体が、免疫原性分子（例えば、図２または図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１配列の免疫原性領域）を特異的に標的および結合するために使用され得ることを理解する。さらに、当業者は、抗体を細胞傷害性試薬に結合体化することは慣用的であることを理解する（例えば、Ｓｌｅｖｅｒｓら，Ｂｌｏｏｄ  ９３：１１  ３６７８−３６８４（１９９９年６月１日）を参照のこと）。細胞傷害性試薬および／または治療試薬は、例えば、この細胞（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１）によって発現される分子に対して特異的な抗体にそれらの試薬を結合体化させることによって、細胞に直接送達され、この細胞傷害性試薬は、それらの細胞上において公知の生物学的効果（例えば、細胞傷害性）を発揮する。
【０２６６】
抗体細胞傷害性試薬を使用するための広範な種々の組成物および方法が細胞を殺傷するために結合体化することは、当該分野で公知である。癌の状況において、代表的な方法は、腫瘍を有する哺乳動物に、生物学的に有効な量の結合体を投与する工程を包含し、この結合体は、発現されたか、結合に接近可能か、または細胞表面上に局在化された、マーカー（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１）に結合する標的試薬（例えば、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体）に連結される、選択された細胞傷害性試薬および／または治療的試薬を含む。代表的な実施形態は、細胞傷害性試薬および／または治療試薬を細胞発現１０１Ｐ３Ａ１１に送達する方法であり、この方法は、１０１Ｐ３Ａ１１エピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞傷害性試薬を結合体化させる工程、および抗体試薬結合体に細胞を曝露する工程を包含する。別の例示的な実施形態は、転移癌を患ったと疑われる個体を処置する方法であり、この方法は、細胞傷害性試薬および／または治療試薬に結合体化された、治療有効量の抗体を含む薬学的組成物を個体に非経口的に投与する工程を包含する。
【０２６７】
抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を使用する癌免疫治療は、他の型の癌の処置に首尾良く使用される種々のアプローチに従ってなされ、この癌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３〜１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３１７９〜３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ  ９０：２４３７〜２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２７７１〜２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９０３〜１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１〜５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６１６０〜６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４３９８〜４４０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７〜１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素および放射線同位体への裸の抗体の結合（例えば、抗ＣＤ２０抗体へのＹ９１または１３１Ｉの結合（例えば、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．、またはＢｅｘｘａｒＴＭ、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含むが、一方他のアプローチは、抗体と他の治療薬剤との（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）との）同時投与を含む。これらの抗体は、治療剤に対して結合体化され得る。前立腺癌の処置のために、例えば、１０１Ｐ３Ａ１１抗体が、照射、化学療法またはホルモン切除と組み合わせて、投与され得る。また、抗体は、カリヘアミシン（例えば、ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭ，Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ，抗腫瘍抗菌性カリヘアミシンに結合体化された組換えヒト化ＩｇＧ４κ抗体）またはマンタシノイド（例えば、タキサンベース腫瘍活性化プロドラック、ＴＡＰ、プラットホーム、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、また米国特許第５，４１６，０６４号を参照のこと）。
【０２６８】
１０１Ｐ３Ａ１１抗体治療は、癌の全てのステージに対して有用であるが、進行癌または転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いた処置は、以前に１つ以上の化学療法を受けている患者に示される。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者のために、化学療法レジメンまたは照射レジメンと組み合わせられる。さらに、抗体療法は、減少した投薬量の同時化学療法の使用を、特に、非常に十分にはその化学療法薬剤の毒性を許容しない患者にとって、可能にし得る。Ｆａｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｓ．５３：４６３７−４６４２，１９９３）、Ｐｒｅｗｅｔｔら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｏｎｃｏ．９：２１７−２２４，１９９６）、およびＨａｎｃｏｃｋら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４５７５−４５８０，１９９１）は、化学治療剤と組み合わせた、種々の抗体の使用を記載する
１０１Ｐ３Ａ１１抗体治療は、癌の全てのステージに対して有用であるが、抗体治療は、進行癌または転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体治療を用いた処置は、以前に１つ以上の化学療法を受けている患者に示される。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者のために、化学療法レジメンまたは照射レジメンと組み合わせられる。さらに、抗体療法は、減少した投薬量の同時化学療法の使用を、特に、非常に十分にはその化学療法薬剤の毒性を許容しない患者にとって、可能にし得る。
【０２６９】
癌患者は、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的１０１Ｐ３Ａ１１画像化、または１０１Ｐ３Ａ１１発現の存在および程度を確かに示し得る他の技術を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１発現の存在およびレベルについて評価し得る。腫瘍生検または外科的生検の免疫組織化学分析が、この目的に好ましくあり得る。腫瘍バイオプシーまたは外科用試料の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
【０２７０】
前立腺癌および他の癌を処置する抗１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体としては、その腫瘍に対する強力な免疫応答を示し得る抗体、および直接細胞傷害性であり得る抗体が挙げられる。これに関して、抗１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のいずれかの機構によって、腫瘍細胞溶解を惹起し得、これらの機構の両方が、補体タンパク質上のエフェクター細胞Ｆｃレセプター部位との相互作用のために、その免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする。さらに、腫瘍増殖に対する直接の生物学的効果を発揮する抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂが、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌を処置するのに有用である。直接的に細胞傷害性ｍＡｂが作用する機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍脈管形成因子プロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が、挙げられる。特定の抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機構は、当該分野で一般的に知られているように、ＡＤＣＣ、ＡＳＭＣＣ、補体媒介性細胞溶解などの細胞死を評価する、任意の数のインビトロアッセイを使用して、評価され得る。
【０２７１】
何人かの患者において、マウスまたは他の非ヒトのモノクローナル抗体の使用、あるいはヒト／マウスキメラｍＡｂの使用が、非ヒト抗体に対する中程度から強力な免疫応答を誘導し得る。これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効力をもたらす。最も深刻な場合において、このような免疫応答は、潜在的に腎不全を引き起こし得る、免疫複合体の広範な形成をもたらし得る。従って、本発明の治療法の実施にて使用される好ましいモノクローナル抗体は、高い親和性で標的１０１Ｐ３Ａ１１抗原に特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは全く抗原性を示さない、完全にヒトであるかまたはヒト化されているかのいずれかである抗体である。
【０２７２】
本発明の治療法は、単一の抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂの投与、ならびに異なるモｍＡｂの組み合わせまたはカクテルの投与を意図する。このようなｍＡｂカクテルは、それらが、異なるエピトープを標的とするｍＡｂ含むか、異なるエフェクター機構を使用するか、または免疫エフェクター機能性に依存するｍＡｂと直接細胞傷害性ｍＡｂを組み合わせるのと同じ程度だけ、特定の利点を有し得る。組み合わせたこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗１０１Ｐ３Ａ１１ｍＡｂの投与は、種々の化学療法薬剤、アンドロゲン遮断薬、免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、手術または放射線を含むがこれらに限定されない、他の治療薬剤と同時に投与され得る。抗１０１Ｐ３Ａ１１ｍＡｂは、その「裸」の形態または非結合形態で投与され得るし、またはそれらに結合した治療薬剤を有し得る。
【０２７３】
抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体処方物は、腫瘍細胞に抗体を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。投与の経路としては、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的に、代表的に、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５ｍｇ／体重の範囲の用量で、受容可能な投薬経路を介する、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体調製物の組換えし投与を含む。一般に、１週間に１０〜１０００ｍｇ  ｍＡｂの範囲の用量が、効果的であり得かつ十分に許容され得る。
【０２７４】
転移性乳癌の処置においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ  ｍＡｂを用いる臨床実験に基づいて、抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂ調製物の約４ｍｇ／ｋｇ患者体重（ＩＶ）の初回負荷用量に引き続いて、約２ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の毎週の用量が、受容可能な投薬レジメンを示す。好ましくは、この初回負荷用量が、９０分以上の注入として投与される。その初回用量が十分に許容された場合、周期的維持用量が、３０分以上の注入として投与される。当業者が理解するように、種々の因子が、特定の場合における理想的な用量レジメンに影響し得る。このような因子としては、例えば、使用されるＡｂまたはｍＡｂの結合親和性および半減期、患者における１０１Ｐ３Ａ１１発現の程度、循環する放出された（ｓｈｅｄ）１０１Ｐ３Ａ１１抗原の程度、所望される安定状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬剤または他の因子の影響ならびに特定の患者の健康状態が、挙げられる。
【０２７５】
必要に応じて、患者は、最も有効な投与レジメンなどの決定を補助するために、所定のサンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１のレベル（例えば、循環する１０１Ｐ３Ａ１１抗原および／または１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞のレベル）について評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じて目的のものをモニタリングするために使用され、そして他のパラメーター（例えば、膀胱癌治療における尿細胞学および／またはＩｍｍｕｎｏＣｙｔレベル、あるいは、類推されるところによれば、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組合せて治療的成功を評価するために有用である。
【０２７６】
抗イディオタイプ抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体はまた、抗癌療法において、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であり；この方法論は、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を生成するように容易に適合され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３３〜４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：３３４〜３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３：６５〜７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【０２７７】
（Ｘ．Ｃ．  細胞免疫応答についての標的としての１０１Ｐ３Ａ１１）
本明細書に記載される、免疫原的に有効量の１つ以上のＨＬＡ結合ペプチドを含むワクチンおよびこのワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。さらに、本発明に従うワクチンは、１つ以上の特許請求されるペプチドの組成物を含む。ペプチドは、ワクチンにおいて個々に存在し得る。あるいは、ペプチドは、同じペプチドの複数コピーを含むホモポリマーとして、または種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、増加した免疫学的反応の利点を有し、そして異なるペプチドエピトープがポリマーを構成するために使用される場合、免疫応答を標的化する病原性生物または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するというさらなる能力を有する。この組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか、または例えば、組換えもしくは化学合成によって調製され得る。
【０２７８】
本発明のワクチンとともに使用され得るキャリアは、当業者に周知であり、そして例えば、サイログロブリン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。ワクチンは、生理学的に許容可能（すなわち、受容可能）な希釈剤（例えば、水、または生理食塩水、好ましくは、リン酸緩化衝生理食塩水）を含み得る。ワクチンはまた、代表的に、アジュバントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中で開示されるように、ＣＴＬ応答は、本発明のペプチドを脂質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））に結合体化することによって、初回刺激され得る。さらに、アジュバント（例えば、合成シトシン−ホスホロチオール化グアニン含有（ＣｐＧ）オリゴヌクレオチド）は、ＣＴＬ応答を１０〜１００倍増加することが見出された（例えば、ＤａｖｉｌａおよびＣｅｌｉｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５３９〜５４７（２０００）を参照のこと）。
【０２７９】
注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸内、髄腔内、または他の適切な経路による、本発明に従うペプチド組成物での免疫に際して、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な、大量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することによってワクチンに応答する。結果として、宿主は、１０１Ｐ３Ａ１１抗原を発現するかまたは過剰発現する細胞の後期発生に少なくとも部分的に免疫されるか、あるいは抗原が腫瘍関連であった場合、少なくともいくつかの治療的利益を導く。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、クラスＩペプチド成分を、標的抗原に対する中和抗体および／またはヘルパーＴ細胞応答を誘導するかまたは促進する成分と組み合わせることが望ましくあり得る。このような組成物の好ましい実施形態は、本発明に従うクラスＩエピトープおよびクラスＩＩエピトープを含む。このような組成物の代替の実施形態は、交差反応性ＨＴＬエピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）分子（例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載される））とともに、本発明に従うクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む。
【０２８１】
本発明のワクチンはまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））を、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして含み得る。樹状細胞を動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）し、そして収集し、これによって、樹状細胞の負荷をインビトロで生じさせた後に、ワクチン組成物が、インビトロで作製され得る。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明に従うミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、またはペプチドでパルスされる。次いで、樹状細胞は、インビボで免疫応答を惹起するために患者に投与され得る。ワクチン組成物（ＤＮＡベースまたはペプチドベースのいずれか）はまた、樹状細胞動員とともにインビボで投与され得、これによって、樹状細胞の負荷がインビボで生じる。
【０２８２】
好ましくは、以下の原理が、ワクチンにおける使用のためにポリエピトープ組成物中での封入のために、あるいはワクチンに含まれるべき、そして／または核酸（例えば、ミニ遺伝子）によってコードされるべき別々のエピトープを選択するためにエピトープのアレイを選択する場合に利用される。以下の原理のそれぞれが選択を行うためにバランスをとられることが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれるマルチエピトープは、エピトープが由来するネイティブ抗原において連続した配列であり得る（しかし、必要ではない）。
【０２８３】
１．）投与のとき、腫瘍クリアランスと相関して観測された免疫応答を模倣するエピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩについて、これは、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する３〜４エピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩについて、類似の原理が使用される；再び、３〜４エピトープは、少なくとも１つのＴＡＡから選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１４４７〜１４５０を参照のこと）。１つのＴＡＡからのエピトープは、１つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープと組み合わせて使用され得、頻繁に発現されるＴＡＡの種々の発現パターンを有する腫瘍を標的化するワクチンを産生する。
【０２８４】
２．）免疫原性と関連することが確証された必須の結合親和性を有するエピトープが選択される：ＨＬＡクラスＩについて、５００ｎＭ以下（しばしば、２００ｎＭ以下）のＩＣ５０；およびクラスＩＩについて、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０。
【０２８５】
３．）十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが、広い集団適用範囲を与えるように選択される。例えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有することが好ましい。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団適用範囲の幅または冗長性を評価し得る。
【０２８６】
４．）癌関連抗原由来のエピトープが選択される場合、アナログを選択することがしばしば有用である。なぜなら、患者は、ネイティブのエピトープに対して耐性を発生し得るからである。
【０２８７】
５．）「ネスティッドエピトープ（ｎｅｓｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」と呼ばれるエピトープが、特に関連する。ネスティッドエピトープは、少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列で重なる場合、生じる。ネスティッドペプチド配列は、Ｂ細胞エピトープ、ＨＬＡクラスＩエピトープおよび／またはＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み得る。ネスティッドエピトープを提供する場合、一般的な目的は、配列当たり最も多くの数のエピトープを提供することである。従って、１つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端よりも長いペプチドを提供することを避けることである。マルチエピトープ配列（例えば、ネスティッドエピトープを含む配列）を提供する場合、病理学的なまたは他の有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、配列をスクリーニングすることが一般的に重要である。
【０２８８】
６．）ポリエピトープタンパク質を作製する場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的は、目的のエピトープを含む最小のペプチドを作製することである。この原理は、ネスティッドエピトープを含むペプチドを選択する場合に使用される原理と同じでない場合、類似する。しかし、人工ポリエピトープペプチドを用いる場合、サイズ最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間に任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスがとられる。例えば、スペーサーアミノ酸残基は、接合エピトープ（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）（免疫系によって認識され、標的抗原に存在せず、かつエピトープの人工並置によってのみ作製されるエピトープ）を避けるためにか、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強するために導入され得る。接合エピトープは、一般的に、避けられるべきである。なぜなら、レシピエントは、その非ネイティブなエピトープに対する免疫応答を生成し得るからである。「優性エピトープ」である接合エピトープが特に関心が高い。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少されるかまたは抑制されるような強い（ｚｅａｌｏｕｓ）応答を導き得る。
【０２８９】
７．）同じ標的タンパク質の複数の改変体の配列が存在する場合、潜在的なペプチドエピトープはまた、それらの保存性に基づいて選択され得る。例えば、保存性についての基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体またはクラスＩＩ結合ペプチドの９マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定された割合で保存されることを規定し得る。
【０２９０】
（Ｘ．Ｃ．１．  ミニ遺伝子ワクチン）
マルチエピトープの同時送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である。ミニ遺伝子中への封入のためのエピトープは、好ましくは、先の節に記載されるガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の１つまたはマルチエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
【０２９１】
マルチエピトープミニ遺伝子の使用は、以下およびＩｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３９１５〜３９２５、１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：４２６，１９９８に記載される。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１由来のスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはモチーフ保有エピトープをコードするマルチエピトープＤＮＡプラスミド、１０１Ｐ３Ａ１１由来のＰＡＤＲＥ（登録商標）ユニバーサルヘルパーＴ細胞エピトープまたは複数のＨＴＬエピトープ、（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬを参照のこと）、および小胞体トランスロケーションシグナル配列が操作され得る。ワクチンはまた、他のＴＡＡ由来のエピトープを含み得る。
【０２９２】
マルチエピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験されるエピトープに対してＣＴＬ誘導応答の大きさを評価するためにトランスジェニックマウスで確認され得る。さらに、インビボのＤＮＡコードエピトープの免疫原性は、ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトされた標的細胞に対する特定のＣＴＬ株のインビトロ応答と相関し得る。従って、これらの実験は、ミニ遺伝子が、１）ＣＴＬ応答を生成すること、および２）誘導されたＣＴＬが、コードされたエピトープを発現する細胞を認識することの両方に役立つことを示し得る。
【０２９３】
例えば、ヒト細胞における発現のために選択されたエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列は、逆翻訳され得る。ヒトコドン使用頻度表は、各アミノ酸に対するコドン選択の指針のために使用され得る。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、直接隣接し得、その結果、翻訳された場合に、連続したポリペプチド配列が作製される。発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、ミニ遺伝子設計に組み込まれ得る。ミニ遺伝子配列に逆翻訳され得、そして含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、抗体エピトープ、ユビキチン化シグナル配列、および／または小胞体標的化シグナル。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープに隣接する、合成（例えば、ポリ−アラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって改善され得る；エピトープを含むこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
【０２９４】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってＤＮＡに変換され得る。重複オリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）は、周知技術を使用して、適切な条件下で、合成され得、リン酸化され得、精製され得、そしてアニールされ得る。オリゴヌクレオチドの末端は、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して結合され得る。次いで、この合成ミニ遺伝子（エピトープポリペプチドをコードする）は、所望の発現ベクターにクローン化され得る。
【０２９５】
当業者に周知の標準的な調節配列は、好ましくは、標的細胞における発現を確実にするためにベクターに含まれる。いくつかのベクターエレメントが、望ましい：ミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；十分な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；およびＥ．ｃｏｌｉ選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。多くのプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）がこの目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
【０２９６】
さらなるベクター改変は、ミニ遺伝子発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合において、イントロンは、効率的な遺伝子発現に必要とされ、そして１つ以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写領域に組み込まれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列および哺乳動物細胞における複製のための配列を含ませることもまた、ミニ遺伝子発現を増加するために考慮され得る。
【０２９７】
一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローン化される。このプラスミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換され、そしてＤＮＡは、標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクターに含まれる全ての他のエレメントは、制限マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンクおよび作業細胞バンクとして保存され得る。
【０２９８】
さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性を増強することが望ましい場合に、ミニ遺伝子コード配列の外側で、ベクターに含まれ得る。
【０２９９】
いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第２タンパク質（免疫原性を増強または減少するために含まれる）の両方の産生を可能にするビシストロニック（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターが使用され得る。同時発現される場合に免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、同時刺激分子、または、ＨＴＬ応答について、ｐａｎ−ＤＲ結合タンパク質（ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに結合され得、そして発現されるＣＴＬエピトープから別々に発現され得る；これは、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの方向付けを可能にする。必要とされる場合、これは、ＨＴＬエピトープにＨＬＡクラスＩＩ経路へのより効率的な進入を促進し得、それによって、ＨＴＬ誘導を改善する。ＨＴＬ誘導またはＣＴＬ誘導と対照的に、免疫抑制分子分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現によって免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有益であり得る。
【０３００】
プラスミドＤＮＡの治療的な量は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでの発酵、続く精製によって生成され得る。作業細胞バンクからのアリコートを使用して、増殖培地に播種し、そして周知技術に従ってシェーカーフラスコまたはバイオリアクターで飽和まで増殖される。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給される固相アニオン交換樹脂のような標準的な生物分離技術を使用して精製され得る。必要な場合、スーパーコイルＤＮＡは、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、開環状形態および線形形態から単離され得る。
【０３０１】
精製プラスミドＤＮＡは、種々の処方物を使用して注射のために調製され得る。これらのうち最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥されたＤＮＡの再構成である。このアプローチ（「裸（ｎａｋｅｄ）のＤＮＡ」として公知である）は、臨床試験における筋肉内（ＩＭ）投与のために現在使用される。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大化するために、精製プラスミドＤＮＡを処方するための代替方法が、望ましくあり得る。種々の方法が記載され、そして新規な技術が利用可能となり得る。カチオン性脂質、糖脂質、およびフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームもまた、処方物中で使用され得る（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ  ＆  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ６（７）：６８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；およびＦｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３（１９８７）を参照のこと）。さらに、保護性の相互作用性非凝縮化合物（ＰＩＮＣ）として集合的に呼ばれるペプチドおよび化合物もまた、安定性、筋肉内分散性、あるいは特定の器官または細胞型への輸送のような変数に影響するように、精製プラスミドＤＮＡに複合化され得る。
【０３０２】
標的細胞感作は、ミニ遺伝子コードＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラスＩ提示についての機能性アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドＤＮＡは、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切な哺乳動物細胞株に導入される。使用されるトランスフェクション方法は、最終処方物に依存する。エレクトロポレーションは、「裸」のＤＮＡのために使用され得るが、カチオン性脂質は、直接的なインビトロトランスフェクションを可能とする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは、蛍光細胞分離分析装置（ＦＡＣＳ）を使用して、トランスフェクトされた細胞の濃縮を可能にするために同時トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、クロム−５１（５１Ｃｒ）標識され、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ株に対する標的細胞として使用され；細胞溶解（５１Ｃｒ放出によって検出される）は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの産生およびＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するためのアッセイを使用して、類似の様式で評価され得る。
【０３０３】
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能試験についての第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、ＤＮＡ産物を用いて免疫する。用量および投与経路は、処方物依存である（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてＩＭ、脂質複合化ＤＮＡについて腹腔内（ｉ．ｐ．））。免疫の２１日後、脾細胞を収集し、そして試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間、再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準的技術を使用して、ペプチド負荷５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コードエピトープに対応するペプチドエピトープを負荷されたＨＬＡによって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ導入についてのＤＮＡワクチン機能を実証する。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、類似の方法で、トランスジェニックマウスにおいて確認される。
【０３０４】
あるいは、核酸は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるように、弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して投与され得る。この技術を使用して、ＤＮＡのみから構成される粒子が投与される。さらなる代替の実施形態において、ＤＮＡは、粒子（例えば、金粒子）に接着され得る。
【０３０５】
ミニ遺伝子はまた、当該分野で周知の他の細菌送達系またはウイルス送達系を使用して送達され得る（例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築物が、ワクシニアのようなウイルスベクターに組み込まれ得る）。
【０３０６】
（Ｘ．Ｃ．２．  ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合せ）
本発明のＣＴＬペプチドを含むワクチン組成物は、所望の性状（例えば、改善された血清半減期、広げられた集団適用範囲、または増強された免疫原性）を提供するために改変（例えば、アナログ化）され得る。
【０３０７】
例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、ペプチドを、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを含む配列に連結することによって増強され得る。ＣＴＬペプチドは直接Ｔヘルパーペプチドに連結され得るが、しばしば、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体は、スペーサー分子によって連結される。スペーサーは、代表的に、比較的小さな中性の分子（例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）（これは、生理学的条件下において、実質的に荷電されていない）から構成される。スペーサーは、代表的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、あるいは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペーサーが同じ残基から構成される必要はなく、従って、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが理解される。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１つまたは２つの残基、より通常には、３〜６個の残基、ときどき、１０以上の残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて、直接的またはスペーサーを介してのいずれかで、Ｔヘルパーペプチドに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。
【０３０８】
特定の実施形態において、Ｔヘルパーペプチドは、遺伝的に多様な集団の大部分に存在するＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多く、ほとんど、または全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを選択することによって達成され得る。多くのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するこのようなアミノ酸の例は、破傷風トキソイドの８３０〜８４３位ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号３９）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）（ＣＳ）タンパク質の３７８〜３９８位ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号４０）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  １８ｋＤタンパク質の１１６〜１３１位ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ（配列番号４１）のような抗原由来の配列を含む。他の例としては、ＤＲ  １−４−７スーパーモチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを有するペプチドを含む。
【０３０９】
あるいは、天然に見出されないアミノ酸配列を使用して、緩いＨＬＡ拘束様式（ｌｏｏｓｅｌｙ  ＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７を参照のこと）。Ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物は、大部分のＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に最も優先的に結合するように設計される。例えば、式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号４２）（ここで、「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンのいずれかであり、そしてａは、Ｄ−アラニンまたはＬ−アラニンのいずれかである）を有するｐａｎ−ＤＲ結合エピトープペプチドは、大部分のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、そしてそれらのＨＬＡ型に関わりなく、大部分の個体由来のＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見出された。ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープの代替物は、全て「Ｌ」天然アミノ酸を含み、そしてエピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
【０３１０】
ＨＴＬペプチドエピトープはまた、それらの生物学的特性を変更するために改変され得る。例えば、これらは、プロテアーゼに対するそれらの耐性を増加し、従って、それらの血清半減期を拡大するためにＤ−アミノ酸を含むように改変され得るか、あるいはこれらは、それらの生物学的活性を増加させるために、脂質、タンパク質、炭水化物などのような他の分子に結合され得る。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、１つ以上のパルミチン酸に結合体化され得る。
【０３１１】
（Ｘ．Ｃ．３．  ＣＴＬペプチドとＴ細胞初回刺激剤との組合せ）
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、Ｂリンパ球またはＴリンパ球を初回刺激する少なくとも１つの成分を含むことが望ましくあり得る。脂質は、ＣＴＬをインビボで初回刺激し得る薬剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどのような１つ以上の連結残基を介して免疫原性ペプチドに連結され得る。次いで、脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子で直接的に投与され得るか、リポソームに組み込まれ得るか、またはアジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）中で乳化され得るかのいずれかで投与され得る。好ましい実施形態において、特に有効な免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−アミノ基およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸（これは、免疫原性ペプチドのアミノ末端に連結（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して結合される）を含む。
【０３１２】
ＣＴＬ応答の脂質初回刺激の別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））は、適切なペプチドに共有結合される場合、ウイルス特異的ＣＴＬを初回刺激するために使用され得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１，１９８９を参照のこと）。本発明のペプチドは、例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合され得、そしてこのリポペプチドは、標的抗原に免疫応答を特異的に初回刺激するために個体に投与され得る。さらに、中和抗体の導入がまたＰ３ＣＳＳ結合エピトープを用いて初回刺激され得るので、２つのこのような組成物は、体液性応答および細胞媒介応答の両方をより効率的に惹起するように組み合わせられ得る。
【０３１３】
（Ｘ．Ｃ．４．  ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを含むワクチン組成物）
本発明に従うワクチン組成物の実施形態は、患者血液由来のＰＢＭＣ、またはそれら由来の単離されたＤＣに対する、エピトープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を含む。ＤＣの収集を容易にする薬物（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）が使用され得る。ＤＣをペプチドでパルスした後、そして患者に再注入する前に、未結合ペプチドを除去するためにＤＣを洗浄する。この実施形態において、ワクチンは、それらの表面に、ＨＬＡ分子を複合体化した、パルスされたペプチドエピトープを提示するペプチドパルス化ＤＣを含む。
【０３１４】
ＤＣは、ペプチドのカクテルを用いてエキソビボでパルスされ得、これらのうちのいくつかは、１０１Ｐ３Ａ１１に対するＣＴＬ応答を刺激する。必要に応じて、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチド（例えば、天然または人工の緩い拘束性ＨＬＡクラスＩＩペプチド）は、ＣＴＬ応答を促進するために含められ得る。従って、本発明に従うワクチンは、１０１Ｐ３Ａ１１を発現するかまたは過剰発現する癌を処置するために使用される。
【０３１５】
（Ｘ．Ｄ．  養子免疫療法）
抗原性１０１Ｐ３Ａ１１関連ペプチドは、エキソビボでＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答もまた惹起するために使用される。得られるＣＴＬ細胞またはＨＴＬ細胞は、他の従来の形式の治療に応答しないか、または本発明に従う治療ワクチンペプチドまたは核酸に応答しない患者の腫瘍を処置するために使用され得る。特定の抗原に対するエキソビボＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答は、組織培養物中において、患者のまたは遺伝的に適合性のＣＴＬ前駆細胞またはＨＴＬ前駆細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）の供給源および適切な免疫原性ペプチドとともにインキュベートすることによって誘導される。適切なインキュベーション時間（代表的には、約７〜２８日）（ここで、前駆細胞が、活性化され、そして効果細胞に増殖する）後に、細胞は、患者に注入して戻され、ここで、これらは、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）か、または破壊を促進する（ＨＴＬ）。トランスフェクトされた樹状細胞はまた、抗原提示細胞として使用され得る。
【０３１６】
（Ｘ．Ｅ．  治療目的または予防目的のためのワクチンの投与）
本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、代表的に、１０１Ｐ３Ａ１１を発現するかまたは過剰発現する癌を処置および／または予防するために使用される。治療適用において、ペプチド組成物および／または核酸組成物は、抗原に対して有効なＢ細胞応答、ＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘発し、そして症状および／または合併症を治癒するかあるいは少なくとも部分的に停止または遅延させるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効用量」として規定される。この使用のための有効量は、例えば、投与される特定の組成物いてぼうａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）物１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１１０１Ｐ３Ａ１１、投与方法、処置される疾患の病期および重篤度、患者の体重および全身状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
【０３１７】
薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡは、一般的に、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する腫瘍をすでに有する個体に投与される。ペプチドまたはそれらをコードするＤＮＡは、個々に、または１つ以上のペプチド配列の融合物として投与され得る。患者は、適切なように、別々にまたは他の処置（例えば、外科手術）とともに、免疫原性ペプチドを用いて処置され得る。
【０３１８】
治療的使用のために、投与は、一般的に、１０１Ｐ３Ａ１１関連癌の第１の診断において開始すべきである。これは、少なくとも症状が実質的に停止するまで、そしてその後の一定期間の間、用量をブーストすることによって続けられる。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（すなわち、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、またはＴＡＡ特異的ＣＴＬまたはパルスされた樹状細胞のような実施形態を含むが、これらに限定されない）は、疾患の病期または患者の健康状態に従って、変化し得る。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する腫瘍を有する患者において、１０１Ｐ３Ａ１１特異的ＣＴＬを含むワクチンは、代替の実施形態よりも進行した疾患を有する患者において腫瘍細胞を殺す際に、より有効であり得る。
【０３１９】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を効率的に刺激するのに十分な投与の様式によって送達されるペプチドエピトープの量を提供することが一般的に重要である；ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物はまた、本発明のこの実施形態に従って、与えられ得る。
【０３２０】
最初の治療的免疫化のための投薬量は、一般的に、下限値が約１μｇ、５μｇ、５０μｇ、５００μｇ、または１，０００μｇであり、かつ上限値が約１０，０００μｇ；２０，０００μｇ；３０，０００μｇ；または５０，０００μｇである単位用量範囲で存在する。ヒトのための投薬量値は、代表的に、７０ｋｇの患者当たり、約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。数週間〜数ヶ月にわたるブーストレジメンに従って、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のブースト投薬量のペプチドが、患者の血液から得られたＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって決定されるような患者の応答および状態に依存して投与され得る。投与は、少なくとも臨床的症状または実験室の試験によって、新生物形成が、排除されるかまたは減少することを示すまで、そしてその後、一定期間続けられるべきである。投薬量、投与の経路、および用量スケジュールは、当該分野に公知の方法論に従って調整される。
【０３２１】
特定の実施形態において、本発明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態（すなわち、生命を脅かすかまたは潜在的に生命を脅かす状態）で使用される。このような場合、本発明の好ましい組成物では、外来性物質が最小量でありそしてペプチドが比較的非毒性の性質であることの結果として、これらの記載された投薬量と比較してかなり過剰のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そして処置する医師によって望ましく感じられら得る。
【０３２２】
本発明のワクチン組成物はまた、純粋に予防薬剤として使用され得る。一般的に、初回の予防免疫のための投薬量は一般に、低い値が約１、５、５０、５００または１０００μｇでありかつ高い値が約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである単位投薬量範囲で存在する。ヒトのための投薬量の値は、代表的に、７０ｋｇの患者あたりで約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。これに続いて、初回のワクチン投与から約４週間後〜６ヵ月後の規定された間隔で、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のペプチドのブースト投薬量が投与される。ワクチンの免疫原性は、患者の血液サンプルから得られるＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって評価され得る。
【０３２３】
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口投与、局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与、経鼻投与、クモ膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投与、または局部的（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、クリームまたは局所的軟膏として）のために意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的（例えば、静脈内、皮下的、皮内、または筋内）に投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解または懸濁された免疫原性ペプチドの溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。
【０３２４】
種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が使用され得る。これらの組成物は、従来からの周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または濾過滅菌され得る。得られた水溶液は、使用のためにその状態のままでパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得る（この凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌溶液と合わせられる）。
【０３２５】
この組成物は、必要に応じて、生理的条件に近づけるために、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、張度調整剤、湿潤剤、防腐薬など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど））を含み得る。
【０３２６】
薬学的処方物における本発明のペプチドの濃度は、広範に（すなわち、重量で、約０．１％未満から、通常は、約２％であるかもしくは少なくとも約２％から、２０％〜５０％ほど多くまで、またはそれより多くまで）変動し得、そして選択された特定の投与様式に従って、主に流体容量、粘度などにより選択される。
【０３２７】
組成物のヒト単位投薬形態は、代表的に、ヒト単位用量の受容可能なキャリア（１つの実施形態では、水性キャリア）を含む薬学的組成物中に含まれ、そしてヒトへのこのような組成物の投与のために使用されることが当業者に公知（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，編者Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８５を参照のこと）の容量／量で投与される。例えば、初回免疫のためのペプチド用量は、７０ｋｇの患者について、約１〜約５０，０００μｇ、一般的には、１００〜５，０００μｇであり得る。例えば、核酸については、初回免疫は、裸の核酸の形態で発現ベクターを使用して実施され得、複数の部位に０．５〜５ｍｇの量でＩＭ（またはＳＣもしくはＩＤ）投与され得る。核酸（０．１〜１０００μｇ）もまた、遺伝子銃を使用して投与され得る。３〜４週間のインキュベーション期間後に、次いで、ブースター用量が投与される。ブースターは、５×１０７〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。
【０３２８】
抗体について、処置は一般に、静脈内注射（ＩＶ）のような受容可能な投与経路を介して、代表的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体調製物を反復投与することを包含する。一般的には、１週間あたり１０〜５００ｍｇ  ｍＡｂの範囲の用量が有効であり、かつ十分に許容される。さらに、抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂ調製物を、ＩＶで約４ｍｇ／ｋｇ患者体重の初回負荷用量で与え、次いで毎週、ＩＶで約２ｍｇ／ｋｇの用量を与えることは、受容可能な投薬レジメンを表す。当業者に理解されるように、種々の要因が、特定の場合における理想的な用量に影響を及ぼし得る。このような要因としては、例えば、組成物の半減期、Ａｂの結合親和性、物質の免疫原性、患者における１０１Ｐ３Ａ１１の発現程度、循環しているシェッド（ｓｈｅｄ）１０１Ｐ３Ａ１１抗原の程度、所望される定常状態の濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法剤または他の薬剤の影響、ならびに特定の患者の健康状態が挙げられる。非制限的に好ましいヒト単位用量は、例えば、５００μｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、１００ｍｇ〜２００ｍｇ、２００ｍｇ〜３００ｍｇ、４００ｍｇ〜５００ｍｇ、５００ｍｇ〜６００ｍｇ、６００ｍｇ〜７００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ、８００ｍｇ〜９００ｍｇ、９００ｍｇ〜１ｇ、または１ｍｇ〜７００ｍｇである。特定の実施形態では、この用量は、以下の範囲内にある：２〜５ｍｇ／ｋｇ体重であって、例えば、毎週１〜３ｍｇ／ｋｇの用量が続くか；０．５ｍｇ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇ／ｋｇ体重であって、例えば、２、３、または４週間にわたり毎週の用量が続くか；０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であって、例えば、２、３、または４週間にわたり毎週の用量が続くか；毎週、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００ｍｇ  ｍ２体表面積であるか；毎週、１〜６００ｍｇ  ｍ２体表面積であるか；毎週、２２５〜４００ｍｇ  ｍ２体表面積であり；これらの用量には、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、１１、１２またはそれらより多くの週にわたって、毎週の用量が続けられ得る。
【０３２９】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドのヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲または有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、ポリヌクレオチドの配列、ポリヌクレオチドの分子量、および投与経路を含む多数の要因に依存する。投薬量は一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような、当該分野で公知の種々のパラメーターに従って、医師または他の医療専門家により選択される。一般的には、約２０塩基のポリヌクレオチドについて、投薬量範囲は、例えば、約０．１、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｍｇ／ｋｇのような独立して選択される下限から、その下限よりも大きな約６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１０，０００ｍｇ／ｋｇの独立して選択される上限までの中から選択され得る。例えば、用量は、以下のほぼいずれかであり得る：０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５００〜５０００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ。一般的に、非経口的な投与経路は、疾患組織に対するより直接的なポリヌクレオチドの適用（増加する長さのポリヌクレオチドで行う場合）と比較して、より多い用量のポリヌクレオチドを必要とし得る。
【０３３０】
１つの実施形態では、Ｔ細胞のヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲または有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、多数の要因に依存する。投薬量は一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような、当該分野で公知の種々のパラメーターに従って、医師または他の医療専門家により選択される。用量は、約１０４細胞〜約１０６細胞、約１０６細胞〜約１０８細胞、約１０８細胞〜約１０１１細胞、または約１０８細胞〜約５×１０１０細胞であり得る。用量はまた、約１０６細胞／ｍ２〜約１０１０細胞／ｍ２、または約１０６細胞／ｍ２〜約１０８細胞／ｍ２であり得る。
【０３３１】
本発明のタンパク質（１つまたは複数）および／またはそのタンパク質（１つまたは複数）をコードする核酸はまた、リポソームを介して投与され得、それらはまた以下のために役立ち得る：１）リンパ系組織のような特定組織へのタンパク質（１つまたは複数）の標的化；２）疾患細胞に対する選択的な標的化；または、３）ペプチド組成物の半減期の増加。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫体（ｆｏａｍ）、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、層状層などが挙げられる。これらの調製物において、送達されるペプチドは、単独でかあるいはリンパ系細胞に蔓延しているレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と組み合わせてかまたは他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と組み合わせて、リポソームの部分として組み込まれる。従って、本発明の所望のペプチドを充填しているかまたは施されているかのいずれかのリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向され得、次いで、このリンパ系細胞に、リポソームはペプチド組成物を送達する。本発明に従って使用するためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般的に、中性リン脂質および負に荷電したリン脂質、ならびにステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は一般的に、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性、および血流中でのリポソームの安定性の考慮により導かれる。リポソームを調製するためには、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されているように、種々の方法が利用可能である。
【０３３２】
免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに取り込まれるべきリガンドとしては、例えば、所望される免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントが挙げられ得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、静脈内、局部的、局所的などによって、とりわけ投与様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の病期に従って変動する用量において投与され得る。
【０３３３】
固形組成物については、従来の非毒性の固形キャリアが使用され得、これには、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性の組成物は、任意の通常使用される賦形剤（例えば、先に列挙されたキャリアなど）と、一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチド）そしてより好ましくは、２５％〜７５％の濃度の活性成分とを組み込むことによって形成される。
【０３３４】
エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドは好ましくは、界面活性剤および噴霧剤と共に細かく分割された形態で供給される。ペプチドの代表的なパーセンテージは、約０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、約１％〜１０％である。当然ながら、界面活性剤は非毒性でなければならず、そして好ましくは、噴霧剤に可溶性でなければならない。このような薬剤の代表例は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有する、約６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸（例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、およびオレイン酸）のエステルおよび部分エステルである。混合エステル（例えば、混合グリセリドまたは天然のグリセリド）が使用され得る。界面活性剤は、その組成物の約０．１重量％〜２０重量％、好ましくは、約０．２５〜５％を構成し得る。組成物の残りは通常、噴霧剤である。キャリアもまた、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンの場合のように、所望の場合に含まれ得る。
【０３３５】
（ＸＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１の診断および予後の実施形態）
本明細書中で開示されるように、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド、１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチド、１０１Ｐ３Ａ１１反応性の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、１０１Ｐ３Ａ１１反応性のヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）および抗ポリペプチド抗体は、癌のような調節不全性の細胞増殖と関連した状態、特に、表Ｉに列挙された癌（例えば、その組織発現の特異的パターン、ならびに、例えば、「正常組織、および患者検体における１０１Ｐ３Ａ１１の発現分析」と表題を付けられた実施例に記載されているような特定の癌におけるその過剰発現の両方を参照のこと）を試験する周知の診断的アッセイ、予後的アッセイ、および治療的アッセイにおいて使用される。
【０３３６】
１０１Ｐ３Ａ１１は、前立腺関連抗原であるＰＳＡに類似し得る。ＰＳＡは、前立腺癌の存在を同定およびモニターするために数年間にわたり医療従事者により使用されてきた原型マーカーである（例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（２）：５０３−５１２０（２０００）；Ｐｏｌａｓｃｉｋら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ａｕｇ；１６２（２）：２９３−３０６（１９９９）およびＦｏｒｔｉｅｒら，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９１（１９）：１６３５−１６４０（１９９９）を参照のこと）。種々の他の診断マーカーもまた、同様の状況下で使用され、これらにはｐ５３およびＫ−ｒａｓが挙げられる（例えば、Ｔｕｌｃｈｉｎｓｋｙら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １９９９  Ｊｕｌ  ４（１）：９９−１０２およびＭｉｎｉｍｏｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖ  ２０００；２４（１）：１−１２を参照のこと）。従って、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドおよび１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドプローブおよび抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体）ならびにそれらの特性に関する本開示により、当業者は、使用された方法と類似した方法において（例えば、癌に関連した状態を試験することに関する種々の診断アッセイにおいて）これらの分子を利用することが可能となる。
【０３３７】
１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド、１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチド、１０１Ｐ３Ａ１１と反応性のＴ細胞および抗体を利用する診断方法の代表的な実施形態は、例えば、ＰＳＡポリヌクレオチド、ＰＳＡポリペプチドならびにＰＳＡと反応性のＴ細胞および抗体を使用する十分に確立された診断アッセイ由来の方法と類似する。例えば、ＰＳＡの過剰発現または前立腺癌の転移をモニターする方法において、ＰＳＡ  ｍＲＮＡの存在および／またはレベルを観察するために、まさしくＰＳＡポリヌクレオチドを、プローブ（例えば、ノーザン分析において（例えば、Ｓｈａｒｉｅｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３（３）：５６７〜７４（１９９４）を参照のこと））およびプライマー（例えば、ＰＣＲ分析において（例えば、Ｏｋｅｇａｗａら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（４）：１１８９〜１１９０（２０００）を参照のこと））として使用するように、本明細書中に記載される１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドは、１０１Ｐ３Ａ１１の過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺癌および他の癌の転移を検出するために、同じ様式で利用され得る。あるいは、まさしくＰＳＡポリペプチドを使用してＰＳＡに特異的な抗体を生成し、次いで、この抗体を、ＰＳＡタンパク質の過剰発現（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５５（４）：５６０〜３（２０００）を参照のこと）または前立腺細胞の転移（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３〜７（１９９６）を参照のこと）をモニターする方法においてＰＳＡタンパク質の存在および／またはレベルを観察するために使用し得るように、本明細書中に記載される１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドは、１０１Ｐ３Ａ１１の過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺細胞および他の癌細胞の転移の検出する際に使用するための抗体を生成するために使用され得る。
【０３３８】
詳細には、転移は、元々の器官（例えば、肺または前立腺など）から身体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の移動に関連するので、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドおよび／または１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドを発現する細胞の存在について生物学的サンプルを試験するアッセイが、転移の証拠を提供するために使用され得る。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞を通常含まない組織（リンパ節）由来の生物学的サンプルが、ＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９（それぞれ、リンパ節および骨の転移から単離された異種移植片）に見られる１０１Ｐ３Ａ１１発現のような、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞を含むことが見出される場合、この発見は転移を示す。
【０３３９】
あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドおよび／または１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドは、例えば、通常１０１Ｐ３Ａ１１を発現しないかまたは異なるレベルで１０１Ｐ３Ａ１１を発現する生物学的サンプル中の細胞が、１０１Ｐ３Ａ１１を発現するかまたは１０１Ｐ３Ａ１１の増加した発現を有することが見出された場合（例えば、表Ｉに列挙された癌および添付の図面に示される患者サンプルなどにおける１０１Ｐ３Ａ１１の発現を参照のこと）に、癌の証拠を提供するために使用され得る。このようなアッセイにおいて、当業者は、（１０１Ｐ３Ａ１１に加えて）第二の組織制限マーカー（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＣＡなど）の存在について生物学的サンプルを試験することによって、転移に関する補足的な証拠を生み出すことをさらに所望し得る（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）。
【０３４０】
まさしくＰＳＡポリヌクレオチドフラグメントおよびＰＳＡポリヌクレオチド改変体が、ＰＳＡをモニターする方法における使用のために当業者によって利用されるように、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドフラグメントおよび１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレチド改変体は、類似の様式で使用される。特に、ＰＳＡをモニターする方法において使用される代表的なＰＳＡポリヌクレオチドは、ＰＳＡ  ｃＤＮＡ配列のフラグメントから構成されるプローブまたはプライマーである。これを例にとると、ＰＳＡポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において機能するように、ＰＳＡ配列全体よりも短い配列を含まなくてはならない。このようなＰＣＲ反応の状況において、当業者は一般に、目的のポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するためにかまたは増幅反応を最適化するためにプライマーとして使用され得る、種々の異なるポリヌクレオチドフラグメントを作製する（例えば、Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ，Ｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５（３）：４７２−４７６，４７８−４８０（１９９８）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：１２１−１５４（１９９８）を参照のこと）。このようなフラグメントの使用のさらなる例示が、「正常組織、および患者検体における１０１Ｐ３Ａ１１の発現分析」と表題を付けられた実施例に提供され、ここで、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドフラグメントは、癌細胞における１０１Ｐ３Ａ１１  ＲＮＡの発現を示すためのプローブとして使用される。さらに、改変体ポリヌクレオチド配列は、代表的に、ＰＣＲ分析およびノーザン分析において、対応するｍＲＮＡについてのプライマーおよびプローブとして使用される（例えば、Ｓａｗａｉら，Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．１９９６  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１１（６）：４０７−１３およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｕｎｉｔ  ２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｕｌら編，１９９５を参照のこと）。ポリヌクレオチドフラグメントおよび改変体は、それらが、高ストリンジェンシー条件下で、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、図２に示される１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドまたはその改変体）に結合し得る状況下において有用である。
【０３４１】
さらに、抗体によって認識され得るエピトープを含むＰＳＡポリペプチドまたはそのエピトープに特異的に結合するＴ細胞が、ＰＳＡをモニターする方法において使用される。１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドフラグメント、および１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチドアナログまたは改変体もまた、類似の様式で使用され得る。ポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド改変体を使用して抗体（例えば、抗ＰＳＡ抗体またはＴ細胞）を生成するこの実施は、代表的に、当業者によって使用されている融合タンパク質のような広範な種々の系と共に当該分野の技術の範囲内にある（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｕｎｉｔ  １６，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５を参照のこと）。この状況において、各エピトープ（１つまたは複数）は、抗体またはＴ細胞と反応性である構造体を提供するように機能する。代表的に、当業者は、目的のポリペプチドの異なる部分に特異的な免疫応答を生成するために使用され得る種々の異なるポリペプチドフラグメントを生成する（例えば、米国特許第５，８４０，５０１号および米国特許第５，９３９，５３３号を参照のこと）。例えば、本明細書中に考察される１０１Ｐ３Ａ１１の生物学的モチーフまたは当該分野で利用可能なモチーフに基づいて当業者により容易に同定される部分配列を有するモチーフの１つを含むポリペプチドを利用することが好適であり得る。ポリペプチドのフラグメント、改変体またはアナログは代表的に、これらが標的ポリペプチド配列（例えば、図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチド）に特異的な抗体またはＴ細胞を生成し得るエピトープを含む限りにおいて、この状況で有用である。
【０３４２】
本明細書中に示されるように、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドおよび１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドプローブおよび抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体またはＴ細胞）は、表Ｉに列挙された癌のような癌を診断するにおいてそれらを有用なものとする特異的特性を示す。前立腺癌のような、本明細書中に記載の疾患状態の存在または発症を評価するために、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の存在を測定する診断アッセイは、ＰＳＡを用いてまた首尾よく行われているように、予防的な測定またはさらなるモニタリングのための患者を同定するために使用される。さらに、これらの物質は、例えば、前立腺起源の転移の明確な診断がＰＳＡのみについての試験に基づいてなされ得ず（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）、そしてその結果、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドおよび１０１Ｐ３Ａ１１ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用される１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドプローブおよび抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体）のような物質が、前立腺起源の転移を確認するために使用されることが必要となる状況において、ＰＳＡに対して類似した特徴または補足的な特徴を有する分子についての当該分野での必要性を満たす。
【０３４３】
最後に、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示される１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドは、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子がマッピングされる染色体領域（以下の「１０１Ｐ３Ａ１１の染色体マッピング」と表題付けられた実施例を参照のこと）におけるオンコジーン関連染色体異常の同定におけるそれらの使用のような、多くの他の用途を有する。さらに、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示される１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質および１０１Ｐ３Ａ１１関連ポリヌクレオチドは、未知起源の組織の法医学的分析におけるそれらの使用のような他の用途を有する（例えば、Ｔａｋａｈａｍａ  Ｋ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ  Ｉｎｔ  １９９６  Ｊｕｎ  ２８；８０（１−２）：６３−９を参照のこと）。
【０３４４】
さらに、本発明の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質または１０１Ｐ３Ａ１１関連ポリヌクレオチドを使用して、１０１Ｐ３Ａ１１の過剰発現により特徴付けられる病理学的状態を処置し得る。例えば、図２もしくは図３のアミノ酸配列もしくは核酸配列、またはいずれかのフラグメントを使用して、１０１Ｐ３Ａ１１抗原に対する免疫応答を生成し得る。１０１Ｐ３Ａ１１と反応性の抗体または他の分子を使用して、この分子の機能を調節し得、それにより治療的効果を提供し得る。
【０３４５】
（ＸＩＩ．）１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質機能の阻害）
本発明は、１０１Ｐ３Ａ１１のその結合パートナーへの結合を阻害するためまたは他のタンパク質（１つまたは複数）とのその結合を阻害するための種々の方法および組成物、ならびに、１０１Ｐ３Ａ１１の機能を阻害するための方法を含む。
【０３４６】
（ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体を用いる１０１Ｐ３Ａ１１の阻害）
１つのアプローチにおいて、１０１Ｐ３Ａ１１に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞へと遺伝子移入技術を介して導入される。それにより、そのコードされた単鎖抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は細胞内で発現され、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質に結合し、そしてそれによりその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は周知である。このような細胞内抗体（「内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」としても公知）は、その細胞内の特定の区画に特異的に標的化され、その処置の阻害活性が焦点をあわせられる箇所に対する制御を与える。この技術は、当該分野で首尾良く適用されている（概説として、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻を参照のこと）。内部抗体は、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３１３７〜３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１〜２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：３３２〜３３７を参照のこと）。
【０３４７】
単鎖抗体は、可変性のリンカーポリペプチドにより連結された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に連結された単鎖可変領域フラグメントとして発現される。周知の細胞内輸送シグナルが、内部抗体を所望の細胞内区画に対して正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えポリヌクレオチドベクター中に操作される。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的化された内部抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、そして必要に応じて、Ｃ末端ＥＲ保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬ（配列番号４３）アミノ酸モチーフ）を組み込むように、操作される。核において活性を発揮することが意図される内部抗体は、核局在化シグナルを含むように操作される。脂質部分が、形質膜の細胞質ゾル側に内部抗体をつなぐために、その内部抗体に連結される。内部抗体はまた、細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾル内部抗体を使用して、細胞質ゾル内に因子を隔離し、それによりそれらの因子がその天然での細胞での目的地に輸送されることを防ぐ。
【０３４８】
１つの実施形態では、内部抗体を使用して、核に１０１Ｐ３Ａ１１を捕捉し、それにより核内でその活性を妨げる。核標的化シグナルが、所望の標的化を達成するために、このような１０１Ｐ３Ａ１１内部抗体に操作される。このような１０１Ｐ３Ａ１１内部抗体は、特定の１０１Ｐ３Ａ１１ドメインに特異的に結合するように設計される。別の実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾル内部抗体を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１が核に近づくことを妨げ、それにより、１０１Ｐ３Ａ１１が、核内においていかなる生物学的活性を発揮することをも妨げる（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１が他の因子と転写複合体を形成するのを妨げる）。
【０３４９】
このような内部抗体の発現を特定の細胞に特異的に指向するために、その内部抗体の転写は、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節制御下に配置される。内部抗体の発現を前立腺に特異的に標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが、利用され得る（例えば、１９９９年７月６日付けで発行された、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
【０３５０】
（ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質を用いる１０１Ｐ３Ａ１１の阻害）
別のアプローチにおいて、組換え分子は、１０１Ｐ３Ａ１１に結合し、それにより１０１Ｐ３Ａ１１の機能を妨げる。例えば、このような組換え分子は、１０１Ｐ３Ａ１１が、その結合パートナー（１つまたは複数）に接近／結合すること、または他のタンパク質（１つまたは複数）と結合することを防止または阻害する。このような組換え分子は、例えば、１０１Ｐ３Ａ１１特異的抗体分子の反応性部分（１つまたは複数）を含み得る。特定の実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１結合パートナーの１０１Ｐ３Ａ１１結合ドメインは、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分に連結された２つの１０１Ｐ３Ａ１１リガンド結合ドメインを含む二量体融合タンパク質へと操作される。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインならびにヒンジ領域を含み得るが、ＣＨ１ドメインは含まない。このような二量体融合タンパク質は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現と関連する癌に罹患している患者に可溶性形態で投与され、それによりこの二量体融合タンパク質は１０１Ｐ３Ａ１１に特異的に結合し、そして１０１Ｐ３Ａ１１の結合パートナーとの相互作用をブロックする。このような二量体融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して、多量体タンパク質へと組み合わされる。
【０３５１】
（ＸＩＩ．Ｃ．）１０１Ｐ３Ａ１１の転写または翻訳の阻害）
本発明はまた、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を含む。同様に、本発明はまた、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
【０３５２】
１つのアプローチにおいて、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の転写を阻害する方法は、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子を１０１Ｐ３Ａ１１アンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡをアンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、１０１Ｐ３Ａ１１特異的リボザイムが、１０１Ｐ３Ａ１１メッセージを切断し、それにより翻訳を阻害するために使用される。このようなアンチセンスに基づく方法およびリボザイムに基づく方法はまた、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の調節領域（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１プロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメント）に関し得る。同様に、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子転写因子を阻害し得るタンパク質が、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用される。上述の方法において有用な種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記で記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンス分子およびリボザイム分子の使用は、当該分野で周知である。
【０３５３】
１０１Ｐ３Ａ１１の転写活性化を妨害することにより１０１Ｐ３Ａ１１の転写を阻害する他の因子もまた、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌を処置するために有用である。同様に、１０１Ｐ３Ａ１１のプロセシングに干渉する因子は、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌を処置するために有用である。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内である。
【０３５４】
（ＸＩＩ．Ｄ．）治療的ストラテジーについての一般的な考慮事項）
遺伝子移入および遺伝子治療の技術が、１０１Ｐ３Ａ１１を合成している腫瘍細胞に、治療用ポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、内部抗体をコードするポリヌクレオチド、および他の１０１Ｐ３Ａ１１阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野で公知である。１０１Ｐ３Ａ１１アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、１０１Ｐ３Ａ１１の転写に干渉し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
【０３５５】
上記の治療的アプローチは、広範な種々の外科的レジメン、化学療法的レジメンまたは放射線療法レジメンのいずれかと組み合わされ得る。本発明の治療的アプローチは、すべての患者に対して、そして特に、化学療法剤の毒性に十分に耐性ではない患者に対して利点となる、化学療法（または他の療法）の投薬量の減少および／またはより低頻度の投与の使用を可能にし得る。
【０３５６】
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、内部抗体）、またはこのような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、種々のインビトロアッセイ系およびインビボアッセイ系を使用して評価され得る。治療的活性を評価するためのインビトロアッセイとしては、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、その治療用組成物が結合パートナーへの１０１Ｐ３Ａ１１の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【０３５７】
インビボでは、１０１Ｐ３Ａ１１治療用組成物の効力は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種間前立腺癌モデル（ここで、ヒト前立腺癌の外植片または継代された異種移植片組織が、免疫無防備状態の動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）が使用され得る（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：４０２〜４０８）。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８および米国特許第６，１０７，５４０号は、原発性腫瘍の発生、微小転移、および疾患の後期段階に特徴的な骨芽細胞性転移の形成を再現し得るヒト前立腺癌の種々の異種移植片モデルを記載する。効力は、腫瘍形成、腫瘍後退または転移などの阻害を測定するアッセイを使用して予測され得る。
【０３５８】
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイが、治療用組成物の評価において有用である。１つの実施形態において、治療用組成物で処置された腫瘍保有マウス由来の異種移植片は、アポトーシス性病巣の存在について試験され得、そして未処置のコントロール異種移殖片保有マウスと比較され得る。アポトーシス性病巣が処置マウスの腫瘍に見出される度合いが、この組成物の治療的効力の指標を提供する。
【０３５９】
前述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適切なキャリアを含む薬学的組成物に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療用組成物と組み合わされる場合に、その治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ患者の免疫系と一般に無反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、任意の多数の標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水など）が挙げられるがこれに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版），Ａ．Ｏｓａｌ．編、１９８０を参照のこと）。
【０３６０】
治療用処方物は、可溶化され得、そして腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。潜在的に有効な投与経路としては、静脈内、非経口、腹腔内、筋内、腫瘍内、皮内、器官内、同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）などが挙げられるがこれらに限定されない。静脈内注射に好ましい処方物は、保存静菌水、滅菌非保存水の溶液中および／または注射用０．９％滅菌塩化ナトリウムを含むポリビニルクロリド製またはポリエチレン製のバッグ（ＵＳＰ）に希釈された治療用組成物を含む。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌粉末として、好ましくは減圧下で保存され得、次いで注射する前に、静菌水（例えば、ベンジルアルコール防腐剤を含む）または滅菌水中で再構築され得る。
【０３６１】
前述の方法を使用する癌の処置についての投薬量および投与プロトコルは、方法および標的の癌とともに変動し、そして一般に、当該分野で理解される多数の他の要因に依存する。
【０３６２】
（ＸＩＩＩ．キット／物品）
本明細書中で記載される診断適用および治療適用における使用について、キットはまた、本発明の範囲内である。このようなキットは、キャリア、パッケージ、またはバイアル、チューブなどのような１つ以上の容器を収容するために区画化されている容器を含み得、各容器は、本方法において使用される別々のエレメントのうちの１つを含む。例えば、容器は、検出可能に標識されているかまたは標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれ図２関連タンパク質または図２の遺伝子もしくはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。本方法が標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットはまた、この標的核酸配列増幅のためのヌクレオチドを含む容器、および／またはレポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識または放射性同位体標識）に結合されたレポーター手段（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質）を含む容器を有し得る。キットは、図２もしくは図３のアミノ酸配列またはこれらのアナログ、あるいはこのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子の全てまたは一部を含み得る。
【０３６３】
本発明のキットは、典型的には上記の容器、ならびに商業的および使用者の立場から所望される物質を含む１つ以上の他の容器を含み、この物質としては、以下が挙げられる：緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ；キャリア、パッケージ、容器、バイアル、ならびに／または含有量および／もしくは使用のための指示書を列挙するチューブラベル、ならびに使用のための指示書を有するパッケージ挿入物。
【０３６４】
ラベルは、組成物が特定の治療適用または非治療適用（例えば、診断適用または実験室適用）に使用されることを示すために容器上にあり得、そしてインビボ用途またはインビトロ用途（例えば、本明細書中に記載される用途）のいずれであるかについての指示もまた示し得る。指示および／または他の情報はまた、挿入物、またはキットとともに含まれるかもしくはキット上にあるラベルの上に含まれ得る。
【０３６５】
用語「キット」および「物品」は、同義語として使用され得る。
【０３６６】
本発明の別の実施形態において、アミノ酸配列、低分子、核酸配列、および／または抗体のような組成物（例えば、表Ｉに示されるような組織の新生物形成の診断、予後、予防および／または処置に有用な物質）を含む物品が、提供される。物品は、典型的には、少なくとも１つの容器および少なくとも１つのラベルを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。これらの容器は、種々の材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）より形成され得る。容器は、アミノ酸配列、低分子、核酸配列、および抗体を保持し得、１つの実施形態において、容器は、この目的に使用される試薬と一緒に、細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルを試験する際に使用するためのポリヌクレオチドを保持する。
【０３６７】
容器は、状態を処置、診断、予後または予防するに効果的な組成物を代替的に保持し得、そして滅菌アクセス口を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通し得るストッパーを有する静脈内溶液のバッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性剤は、１０１Ｐ３Ａ１１を特異的に結合し得かつ１０１Ｐ３Ａ１１の機能を調節し得る抗体であり得る。
【０３６８】
ラベルは、容器上であっても容器に取り付けられていてもよい。文字、数、またはこのラベルを形成する他の特徴がこの容器自体にかたどられるかまたはエッチングされる場合、ラベルは容器上であり得；容器（例えば、パッケージ挿入物）をまた保持する容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）またはキャリア内に存在する場合、ラベルは容器に取り付けられ得る。ラベルは、状態（例えば、表Ｉに記載される組織の新生物形成）を診断、処置、予防または予後するために使用される。物品はさらに、薬学的に受容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液および／またはデキストロース溶液）を含む第２の容器を含む。物品はさらに、商業的および使用者の立場から所望される他の物質を含み得、この物質としては、以下が挙げられる：他の緩衝液、希釈液、フィルター、スターラー、針、シリンジ、ならびに／または指示を有するパッケージ挿入物および／もしくは使用のための指示書。
【０３６９】
（ＸＩＶ．ＧＰＣＲおよびその調節因子の評価）
レセプターの伝統的な研究は、常に、アンタゴニストおよびレセプターを影響し得る他の分子を見出すための発見が進められる前に、内因性リガンドが同定されるべきであるという推定的な仮説（歴史的に基いた）から進められてきた。アンタゴニストが最初に知られ得た場合でさえ、検索は、内因性リガンドを探索するように直ちに広がった。この思考様式は、構成的に活性であるレセプターの発見後でさえもレセプター研究に固持した。レセプターのアゴニスト、部分的アゴニスト、および逆アゴニストの発見に最も有用なのは、レセプターの活性状態であるということは、認識されなかった。過度に活性なレセプターによって生じた疾患について、治療に所望される薬物は、レセプターの活性状態を低減させるように働く化合物であり、内因性リガンドのアンタゴニストである薬物である必要はない。これは、レセプター活性状態の活性を低減させる化合物（例えば、治療的、予防的、診断的、予後的または研究室での反応物質）が、内因性リガンドと同一の部位で結合する必要がないからである。本開示に従って、関連化合物の検索はいずれも、リガンド非依存的活性状態に対する化合物のスクリーニングによって始められるべきである。次いで、この検索は、活性状態レセプターに対する逆アゴニストについてである。
【０３７０】
オーファンレセプター（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１および１０１Ｐ３Ａ１１融合タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない）に対するスクリーニング候補化合物は、任意の過去の知識またはレセプターの内因性リガンドの使用を必要とすることなく、オーファン細胞表面レセプターで働く候補化合物の直接同定を可能にする。このようなレセプターが発現されるおよび／または過剰発現される体内での領域を決定することによって、これらのレセプターの発現および／または過剰発現に関連する関連疾患／障害状態を決定することが可能であり；このようなアプローチが本明細書中に開示される。
【０３７１】
（疾患／障害の同定および／または選択）
１０１Ｐ３Ａ１１に対する逆アゴニストおよびアゴニストは、本明細書中で開示される方法論によって同定され得る。このような逆アゴニストおよびアゴニストは、このレセプターに関連する疾患を処置するための薬物発見プログラムにおけるリード化合物として理想的な候補である。確かに、（たとえリガンドが知られていても）このようなレセプターのアゴニストは、もしこのレセプターがリガンド−レセプター結合の非存在下でさえ活性化されるならば、効果的でないかもしれない。これらのレセプターに対する逆アゴニストおよびアゴニストを直接同定し、これにより薬学的組成物の開発を可能にする能力のために、これらのレセプターに関連する疾患および障害の検索が可能である。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１は、表Ｉに記載される組織の癌において発現される。
【０３７２】
（ＸＶ．候補化合物のスクリーニング）
（一般的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術）
Ｇタンパク質レセプターが構成的に活性になる場合、このレセプターは、Ｇタンパク質（例えば、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ）に結合し、Ｇタンパク質へのＧＴＰの結合を刺激する。次いで、Ｇタンパク質は、ＧＴＰａｓｅとして働き、そしてＧＴＰからＧＤＰへ徐々に加水分解し、これにより、正常な条件下で、このレセプターは、不活性になる。しかし、構成的に活性化されたレセプターは、ＧＤＰをＧＴＰに交換し続ける。ＧＴＰの非加水分解性アナログである［３５Ｓ］ＧＴＰ７Ｓを使用して、構成的に活性化されたレセプターを発現する膜への増強された結合をモニタリングし得る。［３５Ｓ］ＧＴＰ７Ｓを使用してリガンドの存在下および非存在下でＧタンパク質の膜への結合をモニタリングし得ることが、報告されている。当業者に周知でありかつ利用可能である例の中で特にこのモニタリングの例は、１９９５年にＴｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉ（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９５  Ａｐｒ；４７（４）：８４８−５４）によって報告された。一般に、このアッセイ系のこの好ましい用途は、候補化合物の最初のスクリーニングである。なぜなら、この系は、レセプターの細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質にかかわらず全てのＧタンパク質共役型レセプターに包括的に適用可能であるからである。
【０３７３】
（特定のＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術）
一旦、「包括的」Ｇタンパク質共役型レセプターアッセイ（すなわち、アゴニスト、部分アゴニストまたは逆アゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を使用して候補化合物が同定されると、その化合物がそのレセプター部位で相互作用することを確認するためのさらなるスクリーニングが、好ましい。例えば、「包括的」アッセイによって同定された化合物は、そのレセプターに結合しないかもしれないが、単にその細胞内ドメインからＧタンパク質を「解離させる（ｕｎｃｏｕｐｌｅ）」だけであり得る。
【０３７４】
従って、アゴニストおよび／またはアンタゴニストの競合結合アッセイにおいて「包括的」アッセイを使用して同定されたこれらの候補化合物をスクリーニングすることによって、選択プロセスにおけるさらなる改善が提供される。
【０３７５】
１０１Ｐ３Ａ１１の場合、このレセプターはＧタンパク質Ｇｓと共役することが、決定された。
【０３７６】
Ｇｓは、酵素アデニリルシクラーゼを刺激する（一方、Ｇｉは、この酵素を阻害する）。
【０３７７】
アデニリルシクラーゼは、ＡＴＰからｃＡＮＴへの変換を触媒する；よって、候補化合物がそのレセプターに対する逆アゴニストであるか否かを決定するために、ｃＡＮＴを検出するアッセイ（例えば、これに限定されないが、細胞ベースのｃＡＮＴアッセイ）が利用され得る（すなわち、このレセプターに接触するこのような化合物は、接触していないレセプターと比較してｃＡＭＰレベルが減少している）。結果として、「シクラーゼベースのアッセイ」を使用して、アゴニストおよび／またはアンタゴニストの競合結合アッセイからこれらの化合物をさらにスクリーニングし得る。
【０３７８】
（ＸＶＩ．ＧＰＣＲ融合タンパク質）
逆アゴニスト、アゴニストおよび部分アゴニストの直接同定のための候補化合物をスクリーニングの際に使用するために、内因性で、構成的に活性化されたオーファンＧＰＣＲ（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１）を使用することは、定義通り、内因性レセプターがそこに結合される内因性リガンドの非存在下でさえ活性であるという独特のチャレンジを提供する。
【０３７９】
従って、例えば、候補化合物の存在下での内因性レセプターとその化合物の非存在下での内因性レセプターとの間を差別化するために、このような化合物が逆アゴニスト、アゴニスト、部分アゴニストであり得るか、またはこのようなレセプターに対する効果を有し得ないかに関する理解を可能にするためのこのような差別化の目的で、このような差別化を増強し得るアプローチが利用されることが好ましい。好ましいアプローチは、ＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【０３８０】
一般に、本明細書中に記載されるアッセイ技術（および当該分野において公知の他の技術）を使用して、一旦、内因性オーファンＧＰＣＲが構成的に活性化されていることが決定されると、内因性ＧＰＣＲと共役する優性なＧタンパク質を決定し得る。Ｇタンパク質のＧＰＣＲへの結合は、評価され得るシグナル伝達経路を提供する。哺乳動物発現系を使用することによってスクリーニングが行われることが最も好ましいので、このような系は、そこに内因性Ｇタンパク質を有することが予期される。よって、定義通り、このような系において、内因性で、構成的に活性なオーファンＧＰＣＲは、絶えずシグナルを発する。この点で、このシグナルが増強されることが好ましく、その結果、例えば、レセプターに対する逆アゴニストの存在下で、レセプターがその逆アゴニストと接触される場合のレセプター間を（特に、スクリーニングの面で）より容易に差別化し得ることがより起こりそうである。
【０３８１】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、内因性ＧＰＣＲと共役するＧタンパク質の効率の増強が意図される。ＧＰＣＲ融合タンパク質は、内因性で、構成的に活性化されたＧＰＣＲを用いるスクリーニングに重要であるようである。なぜなら、このようなアプローチは、このようなスクリーニング技術においてもっとも好ましく利用されるシグナルを増加させるからである。これは、有意な「シグナル対ノイズ」比を促進させる際に重要である。有意な比は、本明細書中に開示されるような候補化合物のスクリーニングに好ましい。
【０３８２】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現に有用な構築物の構築は、当業者の範囲内である。市販の発現ベクターおよび系は、研究者の特定の要求に合致し得る種々のアプローチを提供する。このようなＧＰＣＲ融合タンパク質構築物に重要な基準は、内因性ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列の両方がインフレーム（好ましくは、内因性ＧＰＣＲの配列は、Ｇタンパク質配列の上流である）であり、そしてＧＰＣＲの「終止」コドンが欠失または置換されるべきであり、その結果、ＧＰＣＲの発現の際にＧタンパク質もまた発現され得ることである。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質に直接結合され得るか、またはＧＰＣＲとＧタンパク質との間のスペーサー残基（好ましくは、約１２個以下であるが、この数は当業者によって容易に確かめられ得る）が存在し得る。両方のアプローチが評価され、そして、ＧＰＣＲの活性測定の点で、結果は実質的に同一である；しかし、いくつかの使用されない制限部位が、発現の際に効果的にスペーサーとなるので、スペーサーの使用に対する（便利さに基づく）好みが存在する。より好ましくは、内因性ＧＰＣＲに共役するＧタンパク質は、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の作製の前に同定される。同定されているＧタンパク質がわずかに存在するので、構築物は、そこに内因性ＧＰＣＲ配列を挿入するために利用可能であるＧタンパク質配列（すなわち、普遍的なＧタンパク質構成物）を含むことが好ましい；これは、異なる配列を有する種々の異なる内因性ＧＰＣＲを大規模スクリーニングする点での効率を提供する。
【０３８３】
さらなる開発のために活性成分として選択される薬学的組成物候補化合物は、当業者に周知の技術を使用して薬学的組成物中に処方され得る。適切な薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に利用可能であり；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，（Ｏｓｌｏら編）を参照のこと。
【実施例】
【０３８４】
本発明の種々の局面は、以下のいくつかの実施例によってさらに記載および例示され、これらの実施例は、いずれも本発明の範囲を限定することが意図されない。
【０３８５】
（実施例１：正常組織および患者標本における１０１Ｐ３Ａ１１の発現分析）
ＲＴ−ＰＣＲによる１０１Ｐ３Ａ１１分析を、図１０Ａに示す。第１鎖ｃＤＮＡを、バイタル（ｖｉｔａｌ）プール１（ＶＰ１：肝臓、肺および腎臓）、バイタルプール２（ＶＰ２：膵臓、結腸および胃）、前立腺異種移植片プール、前立腺癌プール、腎癌プール、結腸癌プール、乳癌プール、および癌転移プールから調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを使用するＰＣＲによって、正規化を行った。１０１Ｐ３Ａ１１に対するプライマーを使用する半定量的ＰＣＲを、３０サイクルの増幅で行った。１０１Ｐ３Ａ１１の発現を、前立腺異種移植片プール、前立腺癌プール、腎癌プール、結腸癌プール、乳癌プール、および癌転移プールにおいて観察したが、ＶＰ１およびＶＰ２においては観察しなかった。患者由来の増幅したｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を使用するドットブロットは、３／３前立腺癌患者、６／１４腎癌患者、２／８子宮癌、１／１子宮頸癌、３／８胃癌、および７／７直腸癌患者のＰＨＯＲ−１のアップレギュレートを示す（図１０Ｂ）。ヒト患者癌標本のパネルにおいて１０１Ｐ３Ａ１１の発現をアッセイした（図１１）。癌患者由来の３つの前立腺腫瘍のプール、腎癌腫瘍プール、結腸癌腫瘍プール、乳癌腫瘍プール、および癌転移プール、ならびに正常前立腺（ＮＰ）、正常膀胱（ＮＢ）、正常腎臓（ＮＫ）および正常結腸（ＮＣ）から、ＲＮＡを抽出した。１０μｇ総ＲＮＡ／レーンのノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列フラグメントでプローブした。キロベース（ｋｂ）のサイズ標準を、横に示す。この結果は、前立腺癌腫瘍、腎癌腫瘍、結腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、癌転移プール、膀胱癌プール、および正常前立腺において１０１Ｐ３Ａ１１が発現するが、他の正常組織には発現しないことを、示す。
【０３８６】
個々の前立腺患者腫瘍標本に対するノーザンブロット分析を、図１２Ａに示す。前立腺癌患者由来の前立腺腫瘍（Ｔ）およびこれらの正常隣接組織（Ｎａｔ）から、ＲＮＡを抽出した。１０μｇ総ＲＮＡ／レーンのノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした。結果は、全ての３つの患者標本において１０１Ｐ３Ａ１１の発現を示し、そして３つの前立腺腫瘍組織のうちの１つにおいて発現が特にアップレギュレートされることを示した。
【０３８７】
アンチセンス１０１Ｐ３Ａ１１リボプローブを使用するＲＮＡインサイチュ分析は、正常前立腺患者（４／４）、ＰＩＮ患者（１／１）および前立腺癌患者（６／６）において、有意な腺上皮細胞発現および基底細胞発現を示した。１０１Ｐ３Ａ１１センスリボプローブは、ほとんど染色しなかったかまたは全く染色しなかった。ＰＩＮおよび前立腺癌におけるＲＮＡインサイチュ染色を、図１２Ｂおよび図１２Ｃに示す。これらの癌細胞における染色強度は、一般に正常腺で観察されるものよりも高かった（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。ＲＮＡインサイチュ結果はまた、前立腺組織において観察した発現が、腺上皮細胞、基底細胞および癌細胞において観察した発現であることを示す。
【０３８８】
１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の内因性発現を、抗１０１Ｐ３Ａ１１（ＰＥＰＴＩＤＥ１：アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体の免疫組織化学分析において実証する（図４０Ａ〜４０Ｆ）。前立腺癌における染色は、正常前立腺において観察した染色よりも強い。この染色は、正常前立腺の腔上皮内の先端に（ａｐｉｃａｌｌｙ）局在化する（図４０Ｅおよび４０Ｆ）。前立腺癌において観察した染色はまた、低程度から中程度の癌において先端に局在化し（図４０Ｂおよび４０Ｃ）、そしてより進行した前立腺癌の細胞全体を通して局在化する（図４０Ａ）。染色を、分析した１９／２０の正常前立腺患者および１９人の前立腺癌患者の全てにおいて観察した。前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰはまた、ほとんど全ての細胞において同様の染色を示す（図４０Ｄおよび４０Ｆ）。
【０３８９】
さらに、本プロトコルを使用して、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、結腸癌、肺癌および乳癌における１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の内因性発現を同定した。抗１０１Ｐ３Ａ１１（ＰＥＰＴＩＤＥ１：アミノ酸１〜１４）ウサギポリクローナル抗体を用いて、免疫組織化学分析を行った（前立腺癌、図４１Ａ；膀胱癌、図４１Ｂ；腎癌、図４１Ｃ；結腸癌、図４１Ｄ；肺癌、図４１Ｅ；および乳癌、図４１Ｆ）。特異的染色を、分析した６つの癌の腫瘍細胞において観察する。
【０３９０】
１０１Ｐ３Ａ１１の発現をまた、２人の結腸癌患者の腫瘍において検出したが、正常結腸組織では検出せず（図１３）、そして腎癌患者から単離した６つの腎臓腫瘍のうち５つにおいて検出した（図１４）。正常な隣接組織（疾患組織から分離した）においては検出したが腎臓の正常組織（健常なドナーから単離した）においては検出しなかった発現は、これらの組織は完全には正常ではなくそして１０１Ｐ３Ａ１１を初期段階の腫瘍で発現することを示す。１０１Ｐ３Ａ１１発現のアンドロジェン調節についてアッセイするために、ＬＡＰＣ−９細胞を、チャコールストリップ培地（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）中で増殖させ、そして合成アンドロジェンミボレロン（ｍｉｂｏｌｅｒｏｎｅ）で１４時間か２４時間かのいずれかにわたって刺激した（図１５Ａ、図１５Ｂ、および図１５Ｃ）。１０μｇ総ＲＮＡ／レーンでのノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした（図１５Ａ）。ＲＮＡゲルのエチジウムブロミド染色の写真もまた示す（図１５Ｃ）。結果は、１０１Ｐ３Ａ１１発現がアンドロジェンによって調節されないことを示した。実験サンプルを、アンドロジェン調節性前立腺癌遺伝子ＰＳＡの発現について試験することによって確認した（図１５Ｂ）。この実験は、予想通り、チャコールストリップ血清の存在下でＰＳＡレベルが下がり、そしてミボレロンの存在下で１４時間および２４時間で発現が誘導されることを示した。
【０３９１】
インビボでの１０１Ｐ３Ａ１１のアンドロジェン調節の分析を、図１６に示す。雄性マウスに、ＬＡＰＣ−９ＡＤ腫瘍細胞を注射した。腫瘍が触知可能なサイズに達したときに、マウスを去勢し、そして去勢後の異なる時点で腫瘍を回収した。異種移植片細胞からＲＮＡを単離した。１０μｇ総ＲＮＡ／レーンのノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした。キロベース（ｋｂ）のサイズ標準を、横に示す。ＲＮＡゲルのエチジウムブロミド染色の写真もまた図１６に示す。この結果は、１０１Ｐ３Ａ１１発現がアンドロジェン奪取によってもたらされず、よってアンドロジェンで調節されないことを、示した。
【０３９２】
（実施例２：１０１Ｐ３Ａ１１のスプライシング改変体／転写改変体）
転写改変体は、選択的転写または選択的スプライシングによって生じる同一遺伝子からの成熟ｍＲＮＡの改変体である。選択的転写は、同一遺伝子からの転写物であるが、異なる点で転写を開始する。スプライシング改変体は、同一転写物から差示的にスプライシングされたｍＲＮＡ改変体である。真核生物において、複数のエキソンを有する遺伝子（ｍｕｌｔｉ−ｅｘｏｎ  ｇｅｎｅ）が、ゲノムＤＮＡから転写される場合、最初のＲＮＡがスプライシングされて、エキソンのみを有しかつアミノ酸配列への翻訳に使用される機能的ｍＲＮＡを産生する。よって、所定の遺伝子は、０から多くの選択的転写物を有し得、そして各転写物は、０から多くのスプライシング改変体を有し得る。各転写改変体は、独特のエキソン構成（ｍａｋｅｕｐ）を有し、そしてもともとの転写物由来の異なるコード部分および／または非コード部分（５’末端または３’末端）を有し得る。転写改変体は、同一または同様の機能を有する同様または異なるタンパク質をコードしても、異なる機能を有するタンパク質をコードしてもよく、そして同一の時点で同一組織に発現しても、同一の時点で異なる組織に発現しても、異なる時点で同一の組織に発現しても、異なる時点で異なる組織に発現してもよい。転写改変体によりコードされるタンパク質は、同様または異なる細胞内局在または細胞外局在（例えば、分泌型対細胞内）を有し得る。
【０３９３】
転写改変体は、当該分野において受容された種々の方法によって同定される。例えば、選択的な転写物およびスプライシング改変体は、全長クローニング実験によって、または全長転写物およびＥＳＴ配列の使用によって、同定される。第１に、全てのヒトＥＳＴを、互いに直接的または間接的に同一性を示すクラスターにグループ化した。第２に、同一クラスター中のＥＳＴをさらに、サブクラスターにグループ化し、そしてコンセンサス配列に集合させた。もともとの遺伝子配列を、コンセンサス配列または他の全長配列と比較する。各コンセンサス配列は、その遺伝子についての潜在的なスプライシング改変体である（例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｄｏｕｂｌｅｔｗｉｓｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｃ１１＿ａｇｅｎｔｓＯｖｅｒｖｉｅｗ．ｊｈｔｍｌを参照のこと）。全長クローンではない改変体が同定された場合でさえ、その改変体のその部分は、当該分野において公知の技術を使用する抗原生成および全長スプライシング改変体のさらなるクローニングに非常に有用である。
【０３９４】
さらに、ゲノム配列に基づいて転写改変体を同定するコンピュータープログラムが当該分野において利用可能である。ゲノムベースの転写改変体同定プログラムとしては、ＦｇｅｎｅｓＨ（Ａ．ＳａｌａｍｏｖおよびＶ．Ｓｏｌｏｖｙｅｖ，”Ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ  ｇｅｎｅ  ｆｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０００  Ａｐｒｉｌ；１０（４）：５１６−２２）；Ｇｒａｉｌ（ＵＲＬ  ｃｏｍｐｂｉｏ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／Ｇｒａｉｌ−ｂｉｎ／ＥｍｐｔｙＧｒａｉｌＦｏｒｍ）およびＧｅｎＳｃａｎ（ＵＲＬ  ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）が挙げられる。スプライシング改変体同定プロトコルの一般的議論については、例えば、以下を参照のこと：Ｓｏｕｔｈａｎ，Ｃ．，Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００１  Ｊｕｎ  ８；４９８（２−３）：２１４−８；ｄｅ  Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２２  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ＯＲＦ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００  Ｎｏｖ  ７；９７（２３）：１２６９０−３。
【０３９５】
転写改変体のパラメーターをさらに確認するために、種々の技術（例えば、全長クローニング、タンパク質確認（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）、ＰＣＲベースの確認、および５’ＲＡＣＥ確認など）が当該分野において利用可能である（例えば、タンパク質確認：Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｓ．Ｏ．ら，Ａｌｂｕｍｉｎ  ｂａｎｋｓ  ｐｅｎｉｎｓｕｌａ：ａ  ｎｅｗ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９９  Ａｕｇ  １７；１４３３（１−２）：３２１−６；Ｆｅｒｒａｎｔｉ  Ｐら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｃａｐｒｉｎｅ  ａｌｐｈａ（ｓｌ）−ｃａｓｅｉｎ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７  Ｏｃｔ  １；２４９（１）：１〜７を、ＰＣＲベースの確認については：Ｗｅｌｌｍａｎｎ  Ｓら，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｂｙ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００１  Ａｐｒ；４７（４）：６５４−６０；Ｊｉａ，Ｈ．Ｐ．ら，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｅｎｅ．２００１  Ｊａｎ  ２４；２６３（１−２）：２１１〜８を、ＰＣＲベースの確認および５’ＲＡＣＥ確認については：Ｂｒｉｇｌｅ，Ｋ．Ｅ．ら，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆｏｌａｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｔ  ｓｐｌｉｃｅ  ｆｏｒｍｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９７  Ａｕｇ  ７；１３５３（２）：１９１−８を参照のこと）。
【０３９６】
ゲノム領域が癌において調節されることは、当該分野において公知である。遺伝子マップに対するゲノム領域が特定の癌において調節される場合、その遺伝子の選択的な転写物またはスプライシング改変体もまた調節される。１０１Ｐ３Ａ１１は癌に関連する特定の発現プロファイルを有するということが、本明細書中に開示される。１０１Ｐ３Ａ１１の選択的な転写物およびスプライシング改変体はまた、同一または異なる組織における癌に関連され得よって腫瘍関連マーカー／抗原として働く。
【０３９７】
１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．１と示されるもともとの転写物のエキソン組成は、以下である：
【０３９８】
【化１】
2005512509.tif 000003
。
【０３９９】
全長遺伝子およびＥＳＴ配列を使用して、１つの転写改変体を同定し、１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．２と名付けた。１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．１と比較して、転写改変体１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．２は、図４６に示すように、改変体１の第２のエキソンからのフラグメントをスプライシングで失っている（ｓｐｌｉｃｅｄ  ｏｕｔ）。他のエキソン全ては、１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．１の対応するエキソンと同一である。理論上、空間的順番でのエキソンの異なる組合わせ（例えば、エキソン２および３）の各々は、潜在的スプライシング改変体である。図４６は、２つの転写改変体のエキソンの整列スキームを示す。
【０４００】
図２は、転写改変体（１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．２）のヌクレオチド配列を示す。図６９は、１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．１の核酸配列を有する転写改変体の整列を示す。図７０は、同定したリーディングフレーム方向についての転写改変体のアミノ酸翻訳を配列する。図７１は、スプライシング改変体によってコードされるアミノ酸配列と１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．１のアミノ酸配列との整列を示す。
【０４０１】
（実施例３：１０１Ｐ３Ａ１１の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、特定の位置でのヌクレオチド配列中の単一塩基対改変である。ゲノムの任意の所定の点で、可能性のある４つの塩基対（Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｇ／ＣおよびＴ／Ａ）が存在する。遺伝子型は、個々のゲノム中の１つ以上の位置の特定の塩基対配列をいう。ハプロタイプは、しばしば、１つの遺伝子の観点でかまたはいくつかの堅く連結した遺伝子の点で、同一のＤＮＡ分子（または、高等生物における同一の染色体）上の１つより多い位置の塩基対配列をいう。ｃＤＮＡ上に生じるＳＮＰは、ｃＳＮＰと呼ばれる。これらのｃＳＮＰは、その遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸を変化し得、よってそのタンパク質の機能を変化し得る。いくつかのＳＮＰは、遺伝的疾患を生じる；他のＳＮＰは、表現型における定量的改変および環境因子（個体での食餌および薬物を含む）に対する反応に寄与する。よって、ＳＮＰおよび／または対立遺伝子の組合わせ（ハプロタイプと呼ばれる）は、多くの適用（遺伝的疾患の診断、薬物反応および投薬量の決定、疾患に応答性の遺伝子の同定、および個体間での遺伝的関係の分析を含む）を有する（Ｐ．Ｎｏｗｏｔｎｙ，Ｊ．Ｍ．ＫｗｏｎおよびＡ．Ｍ．Ｇｏａｔｅ，”ＳＮＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｄｉｓｓｅｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｉｔｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００１  Ｏｃｔ；１１（５）：６３７−６４１；Ｍ．ＰｉｒｍｏｈａｍｅｄおよびＢ．Ｋ．Ｐａｒｋ，”Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００１  Ｊｕｎ；２２（６）：２９８−３０５；Ｊ．Ｈ．Ｒｉｌｅｙ，Ｃ．Ｊ．Ａｌｌａｎ，Ｅ．ＬａｉおよびＡ．Ｒｏｓｅｓ，”Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｒｎｉｃｓ．２０００  Ｆｅｂ；１（１）：３９−４７；Ｒ．Ｊｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＡ．Ｗｉｎｄｅｍｕｔｈ，”Ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００  ｆｅｂ；１（１）：  １５−２６）。
【０４０２】
ＳＮＰは、当該分野において受容された種々の方法（Ｐ．Ｂｅａｎ，”Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｖｏｙａｇｅ  ｏｆ  ＳＮＰ  ｔａｒｇｅｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，”Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．２００１  Ｏｃｔ−Ｎｏｖ；２０（９）：１８−２０；Ｋ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓ，”Ｉｎ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９８  Ｊｕｌ；８（７）：６９１−６９７：Ｍ．Ｍ．Ｓｈｅ，”Ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００１  Ｆｅｂ；４７（２）：１６４−１７２）によって同定される。例えば、ＳＮＰは、ゲルベースの方法（例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）および変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ））によって多型を示すＤＮＡフラグメントを配列決定することによって同定される。これらはまた、異なる個体からプールされたＤＮＡサンプルの直接配列決定によってか、または異なるＤＮＡサンプルからの配列を比較することによって、見出され得る。公的データベースおよび私的データベースにおける配列データ迅速な蓄積を用いて、コンピュータープログラム（Ｚ．Ｇｕ，Ｌ．ＨｉｌｌｉｅｒおよびＰ．Ｙ．Ｋｗｏｋ，”Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃｙｂｅｒｓｐａｃｅ，”Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９９８；１２（４）：２２１−２２５）を使用して配列を比較することによってＳＮＰが見出され得る。ＳＮＰが確認され得、そして個々の遺伝型またはハプロタイプは、直接配列決定およびハイスループットマイクロアレイを含む種々の方法によって決定され得る（Ｐ．Ｙ．Ｋｗｏｋ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１；２：２３５−２５８；Ｍ．Ｋｏｋｏｒｉｓ，Ｋ．Ｄｉｘ，Ｋ．Ｍｏｙｎｉｈａｎ，Ｊ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｂ．Ｅｒｗｉｎ，Ｐ．Ｇｒａｓｓ，Ｂ．ＨｉｎｅｓおよびＡ．Ｄｕｅｓｔｅｒｈｏｅｆｔ，”Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｍａｓｓｃｏｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ，”Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２０００  Ｄｅｃ；５（４）：３２９−３４０）。
【０４０３】
上記の方法を使用して、５つのＳＮＰを、もともとの転写物１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．１において、４４１位（Ｔ／Ｇ）、１４３０位（Ｇ／Ａ）、１５３２位（Ｇ／Ａ）、２７７４位（Ｃ／Ｇ）、および２８３３位（Ｇ／Ａ）にて同定した。選択的な対立遺伝子を有する転写物またはタンパク質を、それぞれ改変体１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．３、１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．４、１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．５、１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．６および１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．７と名付けた。図４４は、ＳＮＰ改変体の整列スキームを示す。図４５は、タンパク質改変体、対応するヌクレオチド改変体の整列スキームを示す。改変体１と同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド改変体は、図１１には示されない。ＳＮＰのこれらの対立遺伝子は、本明細書中に別々に示されるが、異なる組み合わせ（ハプロタイプ）、およびＳＮＰの配列背景を含む転写改変体のいずれか１つ（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．２）において生じ得る。
【０４０４】
（実施例４：原核生物系および酵母系における組換え１０１Ｐ３Ａ１１の産生）
原核生物細胞において組換え１０１Ｐ３Ａ１１を発現させるために、全長または部分長の１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡ配列を、当該分野において公知の種々の発現ベクターのいずれか１つ中にクローニングし得る。１０１Ｐ３Ａ１１の以下の領域の１つ以上を、これらの構築物中に発現させる：１０１Ｐ３Ａ１１、その改変体もしくはアナログからのアミノ酸１〜３１７；あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１、その改変体もしくはアナログからの連続する任意の８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれより多くのアミノ酸。
【０４０５】
（Ａ．インビトロでの転写構築物および翻訳構築物）
ｐＣＲＩＩ：ＲＮＡインサイチュ研究のための１０１Ｐ３Ａ１１のセンスおよびアンチセンスのＲＮＡプローブを作製するために、ｐＣＲＩＩ構築物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を作製する（これは、１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡの全体またはフラグメントのいずれかをコードする）。ｐＣＲＩＩベクターは、挿入物に隣接するＳｐ６プロモーターおよびＴ７プロモーターを有し、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用するための１０１Ｐ３Ａ１１  ＲＮＡの転写を誘導する。これらのプローブは、ＲＮＡレベルでの１０１Ｐ３Ａ１１の細胞発現および組織発現を分析するために用いられる。１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子のｃＤＮＡアミノ酸コード領域を表す、転写された１０１Ｐ３Ａ１１  ＲＮＡを、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を合成するためのＴｎＴＴＭ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｒｏｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のようなインビトロでの翻訳系において用いる。
【０４０６】
（Ｂ．細菌構築物）
ｐＧＥＸ構築物：  細菌細胞において組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質（これは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質に融合される）を産生するために、１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１またはｐＧＥＸファミリーの任意の他のＧＳＴ−融合ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中にクローニングすることによって、ＧＳＴ遺伝子に融合させる。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＧＳＴおよびカルボキシル末端の６つのヒスチジンエピトープ（６Ｘ  Ｈｉｓ）を有する組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＧＳＴおよび６Ｘ  Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いて誘導された細菌からの組換え融合タンパク質の精製を可能にし、そして抗ＧＳＴ抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いる融合タンパク質の認識を可能にする。６Ｘ  Ｈｉｓタグは、例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端のクローニングプライマーへの６つのヒスチジンコドンの添加により作製される。タンパク質切断部位（例えば、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１中のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭ認識部位）を用いて、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質からＧＳＴタグの切断を可能にし得る。アンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのｐＧＥＸプラスミドの選択および維持を可能にする。１つの実施形態では、アミノ酸８６−３１７は、ｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクターへとクローニングされ、タンパク質が発現および精製される。
【０４０７】
ｐＭＡＬ構築物：細菌において、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合される組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を産生するために、１０１Ｐ３Ａ１１ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部は、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）へとクローニングすることによりＭＢＰ遺伝子に融合される。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＭＢＰおよびカルボキシル末端の６Ｘ  Ｈｉｓを有する組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＭＢＰおよび６Ｘ  Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いて誘導された細菌からの組換え融合タンパク質の精製を可能にし、そして抗ＭＢＰ抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いる融合タンパク質の認識を可能にする。６Ｘ  Ｈｉｓエピトープタグは、３’クローニングプライマーへの６つのヒスチジンコドンの添加により作製される。Ｘａ因子認識部位は、１０１Ｐ３Ａ１１からのｐＭＡＬタグの切断を可能にする。ｐＭＡＬ−ｃ２ＸベクターおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクターは、それぞれ、細胞質または周辺質において組換えタンパク質を発現するように最適化される。周辺質発現は、ジスルフィド結合を有するタンパク質の折畳みを増大させる。１つの実施形態では、アミノ酸８６−３１０は、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ発現ベクターへクローニングされ、タンパク質が発現および精製される。
【０４０８】
ｐＥＴ構築物：細菌において、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を発現させるために、１０１Ｐ３Ａ１１ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部は、ｐＥＴファミリーのベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へとクローニングされる。これらのベクターは、可溶性を増大させるタンパク質（例えば、ＮｕｓＡおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ））、および組換えタンパク質の精製および検出を補助するエピトープタグ（例えば、６Ｘ  ＨｉｓおよびＳ−タグＴＭ）への融合を用いておよび用いずに、細菌における組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の緊密に制御された発現を可能にする。例えば、構築物を、ｐＥＴＮｕｓＡ融合系４３．１を利用して作製して、その結果、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の領域が、ＮｕｓＡへのアミノ末端融合物として発現される。
【０４０９】
（Ｃ．酵母構築物）
ｐＥＳＣ構築物：組換えタンパク質の産生および機能的研究のために、酵母種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて１０１Ｐ３Ａ１１を発現させるために、１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＥＳＣファミリーのベクター（これらの各々は、４つの選択マーカー、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の内１つを含む）へとクローニングする。これらのベクターは、同じ酵母細胞中にＦｌａｇＴＭまたはＭｙｃエピトープタグのいずれかを含む、２つまでの異なる遺伝子またはクローン化された配列の同じプラスミドからの、制御された発現を可能にする。この系は、１０１Ｐ３Ａ１１のタンパク質−タンパク質相互作用を確認するために使用される。さらに、酵母における発現は、真核生物細胞において発現される場合に見出される翻訳後修飾に、類似の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化およびリン酸化）を生じる。
【０４１０】
ｐＥＳＰ構築物：酵母種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅにおいて１０１Ｐ３Ａ１１を発現させるために、１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＥＳＰファミリーのベクターにクローニングする。これらのベクターは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかで、組換えタンパク質の精製を補助するＧＳＴへ融合される、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列の制御された高レベル発現を可能にする。ＦｌａｇＴＭエピトープタグは、抗ＦｌａｇＴＭ抗体を用いる組換えタンパク質の検出を可能にする。
【０４１１】
（実施例５：より高度な真核生物系における組換え１０１Ｐ３Ａ１１の産生）
（Ａ．哺乳動物構築物）
真核生物細胞において組換え１０１Ｐ３Ａ１１を発現させるために、１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡ配列の全長または部分長を、当該分野で公知の種々の発現ベクターのいずれか１つへとクローニングし得る。１０１Ｐ３Ａ１１の以下の領域の１つ以上が、これらの構築物において発現される：ｖ．１およびｖ．３のアミノ酸１〜３１８、ｖ．２のアミノ酸１〜７２；または１０１Ｐ３Ａ１１由来の任意の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上の連続するアミノ酸、これらの改変体もしくはアナログ。
【０４１２】
これらの構築物は、２９３Ｔ細胞のような広範な種々の哺乳動物細胞のいずれか１つへとトランスフェクトされ得る。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞溶解産物は、本明細書中に記載されるように、抗１０１Ｐ３Ａ１１ポリクローナル血清を用いてプローブされ得る。
【０４１３】
ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ構築物：哺乳動物細胞において１０１Ｐ３Ａ１１を発現させるために、１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとクローン化した。タンパク質発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＰ１６翻訳エンハンサーから誘導する。この組換えタンパク質は、アミノ末端に融合されたＸｐｒｅｓｓＴＭおよび６つのヒスチジン（６Ｘ  Ｈｉｓ）エピトープを有する。このｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘベクターはまた、大Ｔ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０４１４】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物：哺乳動物細胞において１０１Ｐ３Ａ１１を発現させるために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有する１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導される。この組換えタンパク質は、カルボキシル末端に融合されたｍｙｃエピトープおよび６Ｘ  Ｈｉｓエピトープを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、大Ｔ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子を用い得る。なぜならば、ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にするからである。
【０４１５】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＦＰ構築物：哺乳動物細胞において１０１Ｐ３Ａ１１を発現し、そして蛍光を用いる組換えタンパク質の検出を可能にするために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有する１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＦＰへとクローン化した。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導された。組換えタンパク質は、非侵襲的にインビボでの検出および細胞生物学研究を容易にする、カルボキシル末端に融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＦＰベクターはまた、大Ｔ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。図６６は、１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ融合タンパク質の発現および検出を示す。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ組換え発現ベクター（Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＦＰベクター（Ｂ）またはコントロールｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｃ）のいずれかを用いてトランスフェクトした。細胞を２４時間後に収集し、そして緑色蛍光の検出のために顕微鏡により分析した。結果は、１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ融合タンパク質が、主に細胞膜に局在され、一方フリーなＧＦＰの発現は、細胞の全体に渡ったことを示す。コントロールベクターは、蛍光を示さなかった。本発明者らは、１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ融合タンパク質がｐＣＤＮＡ３．１／１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ構築物から発現され、そしてこの融合タンパク質は細胞膜に局在されると結論付ける。
【０４１６】
アミノ末端ＧＦＰ融合物を有するさらなる構築物は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の全体の長さにわたるｐｃＤＮＡ３．１／ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯにおいて作製される。
【０４１７】
コドン最適化１０１Ｐ３Ａ１１：１０１Ｐ３Ａ１１のタンパク質翻訳を増大させるために、１０１Ｐ３Ａ１１の核酸配列を、コドン最適化した（ｓ１０１Ｐ３Ａ１１）。コドン最適化したｓ１０１Ｐ３Ａ１１の配列を、図６７に列挙する。このｓ１０１Ｐ３Ａ１１を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＦＰ構築物へとクローニングし、そしてｐＳＲａレトロウイルスベクターへとクローン化して、ｓ１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ融合タンパク質を作製した。この組換えタンパク質は、非侵襲的な、インビボでの検出および細胞生物学研究を容易にする、カルボキシル末端へ融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する。図６８は、コドン最適化されたｓ１０１Ｐ３Ａ１．ＧＦＰ融合タンパク質の発現および検出を示す。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターコントロール（明るい線）、または３つの異なるｐｃＤＮＡ３．１／ｓ１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰベクタークローン（１Ｇ２、２Ｇ３、または３Ｈ５）（暗い線）のいずれかを用いてトランスフェクトした。細胞を２４時間後に収集し、そして緑色蛍光について直接分析するか（Ａ）、またはポリクローナル抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体（Ｂ）を用いて目に見えるように染色して、そしてフローサイトメトリーにより分析するかのいずれかを行った。結果は、トランスフェクトした細胞の細胞表面でのコドン最適化ｓ１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ融合タンパク質の強力な発現を示す。
【０４１８】
ＰＡＰｔａｇ：１０１Ｐ３Ａ１１の、１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦ、またはその部分を、ｐＡＰｔａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｒｏｐ．Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）へとクローン化する。この構築物は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のカルボキシル末端のアルカリホスファターゼ融合物（これは、一方で、アミノ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合している）を作製する。アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列を有するアルカリホスファターゼが１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ末端に融合されている構築物もまた作製される。得られた組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培地への分泌に最適化され、そして１０１Ｐ３Ａ１１と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために用いられ得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導され、そして組換えタンパク質はまた、検出および精製を容易にするカルボキシル末端で融合されたｍｙｃおよび６Ｘ  Ｈｉｓエピトープを含む。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０４１９】
ｐｔａｇ５：１０１Ｐ３Ａ１１の１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦ、またはその部分を、ｐＴａｇ−５へとクローン化する。このベクターは、ｐＡＰｔａｇに類似するが、アルカリホスファターゼ融合物を含まない。この構築物は、アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列、ならびに検出およびアフィニティー精製を容易にするカルボキシル末端のｍｙｃおよび６Ｘ  Ｈｉｓエピトープタグを有する、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を産生した。得られた組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化し、そして免疫原、または１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するためのリガンドとして用いた。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導される。ベクターに存在するゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０４２０】
ＰｓｅｃＦｃ：１０１Ｐ３Ａ１１の１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦ、またはその部分をまた、ｐｓｅｃＦｃへとクローン化する。このｐｓｅｃＦｃベクターをヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ）Ｆｃ（ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域）をｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へとクローニングすることにより、アセンブリした。この構築物は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のカルボキシル末端のＩｇＧ１  Ｆｃ融合物（一方で、これは、Ｎ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合する）を作製する。マウスＩｇＧ１  Ｆｃ領域を利用する１０１Ｐ３Ａ１１融合物もまた用いる。得られた組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化し、そして免疫原としてか、または１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために用い得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導される。ベクター中に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０４２１】
１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦのアミノ酸領域１５９−２０２を、ｐｓｅｃＦｃへとクローニングした。得られた組換え１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃ構築物を、２９３Ｔ細胞およびＣｏｓ−７細胞へとトランスフェクトし、そして組換え１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃタンパク質の発現を、ウェスタンブロッティング（図１７）によりアッセイした。結果は、１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃ融合タンパク質が、２９３Ｔ細胞およびＣｏｓ−７細胞の両方の溶解物において発現されたことを示す。１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃ融合タンパク質はまた、両方の細胞型の培養上清において分泌および検出された。
【０４２２】
ｐＳＲα構築物：１０１Ｐ３Ａ１１を発現する哺乳動物細胞株を、構成的に、作製するために、１０１Ｐ３Ａ１１のＯＲＦを、ｐＳＲα構築物へとクローン化した。アンホトロピックなレトロウイルスおよびエコトロピックなレトロウイルスを、それぞれ、２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株へのｐＳＲα構築物のトランスフェクション、またはｐＳＲαおよびヘルパープラスミド（欠失したパッケージング配列を含む）の２９３細胞への同時トランスフェクションにより作製した。このレトロウイルスを、種々の哺乳動物細胞株を感染させるために用いて、クローン化された遺伝子である１０１Ｐ３Ａ１１の宿主細胞株への統合を生じた。タンパク質発現は、長い末端反復配列（ＬＴＲ）に由来する。ベクター中に存在するネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択および維持を可能にする。図１８は、１０１Ｐ３Ａ１１が細胞株３００．１９においてｐＳＲαレトロウイルスベクターを用いて発現されたことを示す。その後、このレトロウイルスベクターは、例えば、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＴｓｕＰｒｌ細胞、２９３細胞、またはｒａｔ−１細胞を用いる、種々の細胞株の感染および産生のために用いられ得る。
【０４２３】
さらなるｐＳＲα構築物を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いる検出を可能にするために、１０１Ｐ３Ａ１１配列のカルボキシル末端に、ＦＬＡＧＴＭタグのようなエピトープタグを融合して作製する。例えば、ＦＬＡＧＴＭ配列５’ｇａｔ  ｔａｃ  ａａｇ  ｇａｔ  ｇａｃ  ｇａｃ  ｇａｔ  ａａｇ３’（配列番号４４）を、ＯＲＦの３’末端のクローニングプライマーに添加する。さらなるｐＳＲα構築物を、全長１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端のＧＦＰおよびｍｙｃ／６Ｘ  Ｈｉｓ融合タンパク質の両方を産生させるために作製した。
【０４２４】
さらなるウイルスベクター：さらなる構築物を、ウイルス媒介送達および１０１Ｐ３Ａ１１の発現のために作製する。１０１Ｐ３Ａ１１の高レベル発現につながる高ウイルス力価は、アデノウイルスベクターおよびヘルペスアンプリコンベクターのようなウイルス送達系において達成される。１０１Ｐ３Ａ１１コード配列またはそのフラグメントは、ＰＣＲにより増幅され、そしてＡｄＥａｓｙシャトルベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へとサブクローニングされる。組換えおよびウイルスパッケージングを、アデノウイルスベクターを作製するための製造業者の指示書に従って実施する。あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１コード配列およびそのフラグメントは、ＨＳＶ−Ｉベクター（Ｉｍｇｅｎｅｘ）へとクローニングされて、ヘルペスウイルスベクターを作製する。その後、このウイルスベクターを、ＳＣａＢＥＲ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、２９３またはｒａｔ−１細胞のようなウイルス細胞株の感染のために用いる。
【０４２５】
調節された発現系：哺乳動物細胞における１０１Ｐ３Ａ１１の発現を制御するために、１０１Ｐ３Ａ１１のコード配列またはその部分を、Ｔ−Ｒｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｔｉｇｈｙｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｃｄｙｓｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような調節された哺乳動物発現系へとクローニングする。これらの系は、組換え１０１Ｐ３Ａ１１の時間依存効果および濃度依存効果の研究を可能にする。その後、これらのベクターは、ＳＣａＢＥＲ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、２９３細胞、またはｒａｔ−１細胞のような種々の細胞株における１０１Ｐ３Ａ１１の発現を制御するために用いられる。
【０４２６】
（Ｂ．バキュロウイルス発現系）
バキュロウイルス発現系において組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を産生するために、１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦ、またはその部分を、バキュロウイルス移入ベクターであるｐＢｌｕｅＢａｃ  ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（これは、Ｎ末端にＨｉｓタグを提供する）へとクローニングされる。具体的には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−１０１Ｐ３Ａ１１は、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞へと同時トランスフェクトされて、組換えバキュロウイルスを作製する（詳細については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示マニュアルを参照のこと）。次いで、バキュロウイルスを、細胞上清から収集し、そしてプラークアッセイにより精製する。
【０４２７】
次いで、組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、精製したバキュロウイルスを用いるＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の感染により、作製される。組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、抗１０１Ｐ３Ａ１１または抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出し得る。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、精製し、そして種々の細胞ベースのアッセイにおいて、または１０１Ｐ３Ａ１１に特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための免疫原として用い得る。
【０４２８】
（実施例５：より高度な真核生物系における組換え１０１Ｐ３Ａ１１の産生）
（Ａ．哺乳動物構築物）
真核生物細胞において組換え１０１Ｐ３Ａ１１を発現させるために、１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡ配列の全長または部分長を、当該分野で公知の種々の発現ベクターのいずれか１つへとクローニングし得る。１０１Ｐ３Ａ１１の以下の領域の１つ以上が、これらの構築物において発現される：アミノ酸１〜３１７または３１８；または１０１Ｐ３Ａ１１由来の任意の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上の連続するアミノ酸、これらの改変体もしくはアナログ。
【０４２９】
これらの構築物は、２９３Ｔ細胞のような広範な種々の哺乳動物細胞のいずれか１つへとトランスフェクトされ得る。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞は、本明細書中に記載されるように、抗１０１Ｐ３Ａ１１ポリクローナル血清を用いてプローブされ得る。
【０４３０】
ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ構築物：哺乳動物細胞において１０１Ｐ３Ａ１１を発現させるために、１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）へとクローン化した。タンパク質発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＰ１６翻訳エンハンサーから誘導する。この組換えタンパク質は、アミノ末端に融合されたＸｐｒｅｓｓＴＭおよび６つのヒスチジン（６Ｘ  Ｈｉｓ）エピトープを有する。このｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘベクターはまた、大Ｔ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０４３１】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物：哺乳動物細胞において１０１Ｐ３Ａ１１を発現させるために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有する１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導される。この組換えタンパク質は、カルボキシル末端に融合されたｍｙｃエピトープおよび６Ｘ  Ｈｉｓエピトープを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓベクターはまた、大Ｔ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子を用い得る。なぜならば、ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にするからである。
【０４３２】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ構築物：哺乳動物細胞において１０１Ｐ３Ａ１１を発現し、そして蛍光を用いる組換えタンパク質の検出を可能にするために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有する１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦを、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ，ＣＡ）へとクローン化した。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導された。組換えタンパク質は、非侵襲的にインビボでの検出および細胞生物学研究を容易にする、カルボキシル末端に融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する。ｐｃＤＮＡ３．１ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯベクターはまた、大Ｔ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。アミノ酸末端ＧＦＰ融合物を有するさらなる構築物を、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の全体の長さにわたるｐｃＤＮＡ３．１／ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯにおいて作製した。
【０４３３】
ＰＡＰｔａｇ：１０１Ｐ３Ａ１１の、１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦ、またはその部分を、ｐＡＰｔａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｒｏｐ．Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）へとクローン化する。この構築物は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のカルボキシル末端のアルカリホスファターゼ融合物（これは、一方で、アミノ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合している）を作製する。アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列を有するアルカリホスファターゼが１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ末端に融合されている構築物もまた作製される。得られた組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培地への分泌に最適化され、そして１０１Ｐ３Ａ１１と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために用いられ得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導され、そして組換えタンパク質はまた、検出および精製を容易にするカルボキシル末端で融合されたｍｙｃおよび６Ｘ  Ｈｉｓエピトープを含む。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０４３４】
ｐｔａｇ５：１０１Ｐ３Ａ１１の１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦ、またはその部分を、ｐＴａｇ−５へとクローン化する。このベクターは、ｐＡＰｔａｇに類似するが、アルカリホスファターゼ融合物を含まない。この構築物は、アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列、ならびに検出およびアフィニティー精製を容易にするカルボキシル末端のｍｙｃおよび６Ｘ  Ｈｉｓエピトープタグを有する、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を産生した。得られた組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化し、そして免疫原、または１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するためのリガンドとして用いた。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導される。ベクターに存在するゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０４３５】
ＰｓｅｃＦｃ：１０１Ｐ３Ａ１１の１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦ、またはその部分をまた、ｐｓｅｃＦｃへとクローン化する。このｐｓｅｃＦｃベクターをヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ）Ｆｃ（ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域）をｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へとクローニングすることにより、アセンブリした。この構築物は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のカルボキシル末端のＩｇＧ１  Ｆｃ融合物（一方で、これは、Ｎ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合する）を作製する。マウスＩｇＧ１  Ｆｃ領域を利用する１０１Ｐ３Ａ１１融合物もまた用いる。得られた組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化し、そして免疫原としてか、または１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために用い得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導される。ベクター中に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０４３６】
１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦのアミノ酸領域１５９−２０２を、ｐｓｅｃＦｃへとクローニングした。得られた組換え１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃ構築物を、２９３Ｔ細胞およびＣｏｓ−７細胞へとトランスフェクトし、そして組換え１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃタンパク質の発現を、ウェスタンブロッティング（図１７）によりアッセイした。結果は、１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃ融合タンパク質が、２９３Ｔ細胞およびＣｏｓ−７細胞の両方の溶解物において発現されたことを示す。１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃ融合タンパク質はまた、両方の細胞方の培養上清において分泌および検出された。
【０４３７】
ｐＳＲα構築物：１０１Ｐ３Ａ１１を発現する哺乳動物細胞株を、構成的に、作製するために、１０１Ｐ３Ａ１１のＯＲＦを、ｐＳＲα構築物へとクローン化した。アンホトロピックなレトロウイルスおよびエコトロピックなレトロウイルスを、それぞれ、ｐＳＲα構築物の２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株へのトランスフェクション、またはｐＳＲαおよびヘルパープラスミド（欠失したパッケージング配列を含む）の２９３細胞への同時トランスフェクションにより作製した。このレトロウイルスを、種々の哺乳動物細胞株を感染させるために用いて、クローン化された遺伝子である１０１Ｐ３Ａ１１の宿主細胞株への統合を生じた。タンパク質発現は、長い末端反復配列（ＬＴＲ）に由来する。ベクター中に存在するネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択および維持を可能にする。図１８は、１０１Ｐ３Ａ１１が細胞株３００．１９においてｐＳＲαレトロウイルスベクターを用いて発現されたことを示す。その後、このレトロウイルスベクターは、例えば、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＴｓｕＰｒｌ細胞、２９３細胞、またはｒａｔ−１細胞を用いる、種々の細胞株の感染および産生のために用いられ得る。
【０４３８】
さらなるｐＳＲα構築物を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いる検出を可能にするために、１０１Ｐ３Ａ１１配列のカルボキシル末端に、ＦＬＡＧＴＭタグのようなエピトープタグを融合して作製する。例えば、ＦＬＡＧＴＭ配列５’ｇａｔ  ｔａｃ  ａａｇ  ｇａｔ  ｇａｃ  ｇａｃ  ｇａｔ  ａａｇ３’（配列番号４５）を、ＯＲＦの３’末端のクローニングプライマーに添加する。さらなるｐＳＲα構築物を、全長１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端のＧＦＰおよびｍｙｃ／６Ｘ  Ｈｉｓ融合タンパク質の両方を産生させるために作製した。
【０４３９】
さらなるウイルスベクター：さらなる構築物を、ウイルス媒介送達および１０１Ｐ３Ａ１１の発現のために作製する。１０１Ｐ３Ａ１１の高レベル発現につながる高ウイルス力価は、アデノウイルスベクターおよびヘルペスアンプリコンベクターのようなウイルス送達系において達成される。１０１Ｐ３Ａ１１コード配列またはそのフラグメントは、ＰＣＲにより増幅され、そしてＡｄＥａｓｙシャトルベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へとサブクローニングされる。組換えおよびウイルスパッケージングを、アデノウイルスベクターを作製するための製造業者の指示書に従って実施する。あるいは、１０１Ｐ３Ａ１１コード配列およびそのフラグメントは、ＨＳＶ−Ｉベクター（Ｉｍｇｅｎｅｘ）へとクローニングされて、ヘルペスウイルスベクターを作製する。その後、このウイルスベクターを、ＳＣａＢＥＲ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、２９３細胞またはｒａｔ−１細胞のようなウイルス細胞株の感染のために用いる。
【０４４０】
調節された発現系：哺乳動物細胞における１０１Ｐ３Ａ１１の発現を制御するために、１０１Ｐ３Ａ１１のコード配列またはその部分を、Ｔ−Ｒｅｘ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｔｉｇｈｙｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｃｄｙｓｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような調節された哺乳動物発現系へとクローニングする。これらの系は、組換え１０１Ｐ３Ａ１１の時間依存効果および濃度依存効果の研究を可能にする。その後、これらのベクターは、ＳＣａＢＥＲ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、２９３細胞、またはｒａｔ−１細胞のような種々の細胞株における１０１Ｐ３Ａ１１の発現を制御するために用いられる。
【０４４１】
（Ｂ．バキュロウイルス発現系）
バキュロウイルス発現系において組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を産生するために、１０１Ｐ３Ａ１１  ＯＲＦ、またはその部分を、バキュロウイルス移入ベクターであるｐＢｌｕｅＢａｃ  ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（これは、Ｎ末端にＨｉｓタグを提供する）へとクローニングされる。具体的には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−１０１Ｐ３Ａ１１は、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞へと同時トランスフェクトされて、組換えバキュロウイルスを作製する（詳細については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示マニュアルを参照のこと）。次いで、バキュロウイルスを、細胞上清から収集し、そしてプラークアッセイにより精製する。
【０４４２】
次いで、組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、精製したバキュロウイルスを用いるＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の感染により、作製される。組換え１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、抗１０１Ｐ３Ａ１１または抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出し得る。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、精製し、そして種々の細胞ベースのアッセイにおいて、または１０１Ｐ３Ａ１１に特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための免疫原として用い得る。
【０４４３】
（実施例６抗原性プロフィールおよび二次構造）
図５、図６、図７、図８および図９は、１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列の５つのアミノ酸プロフィール（各々は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ（ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置付けられるＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトにアクセスすることにより利用可能である）を図示する。
【０４４４】
これらのプロフィール：図５、親水性、（Ｈｏｐｐ  Ｔ．Ｐ．，Ｗｏｏｄｓ  Ｋ．Ｒ．，１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８）；図６、疎水性、（Ｋｙｔｅ  Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ．Ｆ．，１９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）；図７、アクセス可能な残基の百分率、（Ｊａｎｉｎ  Ｊ．，１９７９  Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２）；図８、平均可変性、（Ｂｈａｓｋａｒａｎ  Ｒ．，およびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．１９８８．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５）；図９、βターン（Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ  Ｂ．１９８７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １：２８９−２９４）；および、必要に応じて、例えば、ＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトにあるような、当該分野で利用可能な他のもの、を用いて、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の抗原領域を同定した。１０１Ｐ３Ａ１１の上記のアミノ酸プロフィールの各々を、分析のために以下のＰｒｏｔＳｃａｌｅパラメーターを用いて作製した：１）９のウィンドウサイズ；２）ウィンドウセンターと比較したウィンドウエッジの１００％ウェイト；および３）０と１との間にあるように正規化されたアミノ酸プロフィール値。
【０４４５】
疎水性プロフィール（図５）、ヒドロパシープロフィール（図６）および接近可能な残基パーセンテージプロフィール（図７）を使用して、疎水性アミノ酸（すなわち、ヒドロパシープロフィールおよび接近可能な残基パーセンテージプロフィールにて値が０．５より大きく、ヒドロパシープロフィールにて値が０．５より小さい）のストレッチを決定した。そのような領域は、水性環境に曝される可能性があり、タンパク質表面上に存在する可能性があり、したがって、（例えば、抗体による）免疫認識に利用可能である。
【０４４６】
平均可変性プロフィール（図８）およびβターンプロフィール（図９）は、二次構造（例えば、βシートおよびαヘリックス）に拘束されていないアミノ酸（すなわち、βターンプロフィールおよび平均可変性プロフィールにて値が０．５より大きい）のストレッチを決定する。そのような領域はまた、タンパク質の露出した部分である可能性が高く、従って、（例えば、抗体による）免疫認識に利用可能である。
【０４４７】
例えば、図５、図６、図７、図８、および／または図９に示されるプロフィールにより示される、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の抗原性配列を使用して、免疫原（ペプチド、またはペプチドをコードする核酸のいずれか）を調製して、抗１０１３Ａ１１抗体を生成する。その免疫原は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、または５０個より長く連続する、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質由来の任意のアミノ酸、またはそれをコードする対応核酸であり得る。特に、本発明のペプチド免疫原は、図５の疎水性プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む３１７または３１８までの全増分にて図２の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図６のヒドロパシープロフィールにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む３１７または３１８までの全増分にて図２の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図７の接近可能な残基パーセンテージプロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む３１７または３１８までの全増分にて図２の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図８の平均可変性プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む３１７または３１８までの全増分にて図２の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；および図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む３１７または３１８までの全増分にて図２の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；を含み得る。本発明のペプチド免疫原はまた、上記のいずれかをコードする核酸を含み得る。
【０４４８】
本発明の免疫原、ペプチド、または核酸はすべて、ヒト単位投与形態で実施され得るか、またはヒトの生理に適合する薬学的賦形剤を含む組成物により含有され得る。
【０４４９】
１０１Ｐ３Ａ１１の二次構造（すなわち、推定されるαヘリックス、伸長鎖、およびランダムコイルの存在および位置）は、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）（ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ．／ｔｏｏｌｓ／からアクセスされる）を使用して、一次アミノ酸配列から推定される。この分析は、１０１Ｐ３Ａ１１が、４７．９５％のαヘリックス、２１．４５％の伸長鎖、および３０．６０％のランダムコイルから構成されることを示す（図１９Ａ）。
【０４５０】
１０１Ｐ３Ａ１１中の膜貫通ドメインの潜在的存在についての分析を、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／からアクセスされる種々の膜貫通推定アルゴリズムを使用して実行した。これらのプログラムは、１０１Ｐ３Ａ１１中の７回膜貫通ドメインの存在を推定し、このことは、Ｇタンパク質共役レセプターの構造と一致する。図１９Ａに図示されるのは、ＴＭｐｒｅｄ推定プログラムを使用した分析の結果（図１９Ｂ）およびＴＭＨＭＭ推定プログラム使用した分析の結果（図１９Ｃ）であり、７回膜貫通ドメインの位置を示す。各プログラムの結果（すなわち、膜貫通ドメインをコードするアミノ酸）を、表ＸＸＩにまとめる。
【０４５１】
（実施例７：１０１Ｐ３Ａ１１ポリクローナル抗体の生成）
ポリクローナル抗体を、例えば、免疫因子および（所望される場合は）アジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動物において惹起し得る。代表的には、その免疫因子および／またはアジュバントを、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、その哺乳動物中に注射する。全長１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質で免疫することに加えて、アミノ酸配列分析に基づいて、抗原性でありかつ免疫される宿主の免疫系による認識に利用可能な免疫原の設計において、コンピューターアルゴリズムが使用される（「抗原性プロフィールおよび二次構造」と題する実施例を参照のこと）。そのような領域は、一般的には、疎水性であり、可変性であり、β−ターン立体構造の状態であり、そして／またはそのタンパク質の表面上に露出されている（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１のそのような領域を示すアミノ酸プロフィールについて、図５、図６、図７、図８、または図９を参照のこと）。
【０４５２】
例えば、１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列の疎水性、可変性、β−ターン領域（例えば、アミノ酸１〜２３±利用可能な末端の１〜１０アミノ酸、アミノ酸１５９〜２０２±利用可能な末端の１〜１０アミノ酸）を含む、１０１Ｐ３Ａ１１細菌組換え融合タンパク質または１０１Ｐ３Ａ１１細菌組換え融合ペプチドを、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギにおいてポリクローナル抗体を生成するための抗原として使用する。免疫される哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質に、その免疫因子を結合体化することが有用である。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１のアミノ酸１〜２３をコードするペプチドを、ＫＬＨに結合体化し、ウサギを免疫するために使用する。あるいは、その免疫因子は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質、そのアナログまたは融合タンパク質のすべてもしくは一部を含み得る。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１アミノ酸配列を、当該分野で周知の種々の融合タンパク質パートナーのいずれか１つに、組換えＤＮＡ技術を使用して融合し得る（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ化融合タンパク質およびＨＩＳタグ化融合タンパク質）。そのような融合タンパク質を、適切な親和性マトリックスを使用して誘導した細菌から精製する。
【０４５３】
１つの実施形態において、アミノ酸８６〜３１７±利用可能な末端の１〜１０アミノ酸をコードするＧＳＴ−融合タンパク質を、生成し、精製し、そして免疫原として使用する。使用し得る他の組換え細菌融合タンパク質としては、マルトース結合タンパク質、ＬａｃＺ、チオレドキシン、ＮｕｓＡ、または免疫グロブリン定常領域が挙げられる（「原核生物系における１０１Ｐ３Ａ１１の生成」と題する節、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｕｎｉｔ  １６，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｂｒａｄｙ，Ｗ．，Ｕｒｎｅｓ，Ｍ．，Ｇｒｏｓｍａｉｒｅ，Ｌ．，Ｄａｍｌｅ，Ｎ．，およびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，５６１〜５６６を参照のこと）。
【０４５４】
細菌由来融合タンパク質に加えて、哺乳動物により発現されるタンパク質抗原もまた、使用する。これらの抗原を、哺乳動物発現ベクター（例えば、Ｔａｇ５融合ベクターおよびＦｃ融合ベクター）から発現させる（「真核生物系における組換え１０１Ｐ３Ａ１１の生成」と題する節を参照のこと）。これらの抗原は、ネイティブタンパク質で見出される翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を保持する。１つの実施形態において、アミノ酸１５９〜２０２を、Ｔａｇ５哺乳動物分泌ベクター中にクローニングする。その組換えタンパク質を、その組換えベクターを安定に発現する２９３Ｔ細胞の組織培養上清から、金属キレートクロマトグラフィーによって精製する。その後、精製Ｔａｇ５  １０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を、免疫原として使用する。
【０４５５】
この免疫プロトコルの間、宿主動物の免疫応答を増強するアジュバント中に抗原を混合または乳濁することが、有用である。アジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）およびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５６】
代表的プロトコルにおいて、ウサギに、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に混合したＫＬＨに結合体化した、２００μｇまで（代表的には、１００〜２００μｇ）の融合タンパク質または融合ペプチドを、まず皮下免疫する。その後、ウサギに、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の２００μｇまで（代表的には、１００〜２００μｇ）の免疫原を、２週間ごとに皮下注射する。各免疫の約７〜１０日後に、試験採血を採取し、そしてＥＬＩＳＡにより抗血清の力価をモニターするために使用する。
【０４５７】
免疫血清（例えば、アミノ酸１５９〜２０２をコードするＴａｇ５  １０１Ｐ３Ａ１１による免疫で誘導されたウサギ血清）の反応性および特異性を試験するために、全長１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１ｍｙｃ−ｈｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングする（「真核生物系における組換え１０１Ｐ３Ａ１１の生成」と題する実施例を参照のこと）。２９３Ｔ細胞中にその構築物をトランスフェクションした後、細胞溶解物を、抗１０１Ｐ３Ａ１１血清および抗Ｈｉｓ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でプローブし、ウェスタンブロット技術を使用して変性１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質に対する特異的反応性を決定する。２９３Ｔ細胞および他の組換え１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞の免疫沈降分析およびフローサイトメトリー分析により、その抗血清によるネイティブタンパク質の認識を測定する。さらに、１０１Ｐ３Ａ１１を内因性発現する細胞を使用して、ウェスタンブロット、免疫沈降、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリー技術を実行して、特異性を試験する。
【０４５８】
Ｔａｇ５  １０１Ｐ３Ａ１１免疫ウサギ由来の抗血清を、Ａｆｆｉｇｅｌマトリックス（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ）に共有結合したＴａｇ５抗原から構成されるカラムを通すことによって、親和性精製する。その後、その血清を、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーにより精製して、ＩｇＧ画分を単離する。融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合タンパク質およびＭＢＰ融合タンパク質）で免疫したウサギ由来の血清を、融合パートナーを単独でかまたは不適切な融合タンパク質の状況で含む親和性カラムを通すことにより、融合パートナー配列に対して反応性である抗体を除去することによって精製する。他のＨｉｓタグ化抗原およびペプチド免疫ウサギ由来の血清、ならびに融合パートナー除去血清を、もとのタンパク質免疫原または遊離ペプチドから構成されるカラムマトリックスを通すことによって親和性精製する。
【０４５９】
（実施例８：１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成）
１つの実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１に対する治療ｍＡｂは、１０１Ｐ３Ａ１１の生物学的機能を破壊または調節するタンパク質エピトープと反応するｍＡｂ、例えば、その生物学的活性を媒介するかまたは関与するリガンドもしくはタンパク質との相互作用を破壊するタンパク質エピトープと反応するｍＡｂを包含する。治療ｍＡｂはまた、細胞表面上に露出された１０１Ｐ３Ａ１１のエピトープに特異的に結合し、従ってｍＡｂ−毒素結合体において有用である、ｍＡｂを包含する。モノクローナル抗体はまた、細胞内領域中にあると推定されるアミノ酸配列を含む１０１Ｐ３Ａ１１の他の抗原性エピトープに対して惹起され得る。これらのモノクローナル抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１のシグナル伝達機構（例えば、ヘテロトリマーＧタンパク質との相互作用）を破壊する場合に、イントラホディとして有用である。そのような抗体はまた、免疫組織学のような技術のための診断剤として有用である。そのようなｍＡｂの生成のための免疫原としては、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質全体をコードするかもしくは含むように設計された免疫原、または細胞外環境もしくは親水性細胞質環境に露出されていると推定される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質領域をコードするかもしくは含むように設計された免疫原、および／またはアミノ酸配列のコンピューター分析から抗原性であると推定される１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質領域をコードするかもしくは含むように設計された免疫原が挙げられる（図５、図６、図７、図８、または図９、ならびに「抗原性プロフィールおよび二次構造」と題する実施例を参照のこと）。免疫原としては、ペプチド、組換え細菌タンパク質、ならびに哺乳動物に発現されるＴａｇ５タンパク質、ならびにヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質およびマウスＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。さらに、高レベルの１０１Ｐ３Ａ１１（例えば、２９３Ｔ−１０１Ｐ３Ａ１１マウスＰｒｅ−Ｂ細胞または３００．１９−１０１Ｐ３Ａ１１マウスＰｒｅ−Ｂ細胞）を使用して、マウスを免疫する。
【０４６０】
１０１Ｐ３Ａ１１に対するｍＡｂを生成するために、マウスに、代表的には、完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原または１０７個の１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞を、まず腹腔内（ＩＰ）免疫する。あるいは、マウスに皮下免疫する。その後、マウスに、代表的には、不完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原または１０７個の細胞を、２〜４週間ごとに腹腔内（ＩＰ）免疫する。あるいは、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバントを、免疫に使用する。上記のタンパク質ベースの免疫ストラテジーおよび細胞ベースの免疫ストラテジーに加えて、１０１Ｐ３Ａ１１配列をコードする哺乳動物発現ベクターを使用してプラスミドＤＮＡの直接注射によりマウスを免疫する、ＤＮＡベースの免疫プロトコルを使用する。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１の推定第１細胞外ループであるアミノ酸８２〜１０４、または１０１Ｐ３Ａ１１の第２の細胞外ループであるアミノ酸１５９〜２０２、または第３の細胞外ループであるアミノ酸２５８〜２７５（各場合、±１０アミノ酸）を、Ｔａｇ５哺乳動物分泌ベクター中にクローニングし、そしてその組換えベクターを免疫原として使用する。別の例において、同じアミノ酸を、Ｆｃ−融合分泌ベクター中にクローニングし、そのベクターにおいて、１０１Ｐ３Ａ１１配列がアミノ末端でＩｇＫリーダー配列に融合しておりカルボキシ末端でヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域コード配列に融合している。その後、この組換えベクターを免疫原として使用する。細胞内領域由来のアミノ酸配列もまた、同様のストラテジーを使用して抗原として使用し得る。これらの領域は、アミノ酸５０〜６３、アミノ酸１２１〜１４６、アミノ酸２６１〜２７５、およびアミノ酸２９５〜３１８（各場合、Ｃ末端残基以外は、±１０アミノ酸）を包含する。プラスミド免疫プロトコルを、同じベクターから発現された精製タンパク質と、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞と組み合わせて、使用する。
【０４６１】
その免疫プロトコルの間に、試験採血を、注射の７〜１０日後に行って、その免疫応答の力価および特異性をモニターする。一旦適切な反応性および特異性を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリー分析により決定して得ると、その後、融合物およびハイブリドーマの生成を、当該分野で周知の確立された手順（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８を参照のこと）を用いて実行する。
【０４６２】
１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体を生成するための１つの実施形態において、アミノ酸１５９〜２０２をコードするＴａｇ５−１０１Ｐ３Ａ１１抗原を、発現させ、そして安定にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から精製する。ＢａｌｂＣマウスに、最初、完全フロイントアジュバント中に混合した２５μｇのＴａｇ５−１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質で腹腔内免疫する。その後、マウスに、合計３回の免疫のために、不完全フロイントアジュバント中に混合した２５μｇの抗原で２週間ごとに免疫する。Ｔａｇ５抗原を使用するＥＬＩＳＡによって、免疫したマウス由来の血清の力価を決定する。全長１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質に対する血清の反応性および特異性を、１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡをコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用して、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、およびフローサイトメトリーによってモニターする（例えば、「真核生物系における組換え１０１Ｐ３Ａ１１の生成」と題する実施例を参照のこと）。他の組換え１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞または１０１Ｐ３Ａ１１を内因性発現する細胞もまた、使用する。最強の反応性を示すマウスを、休息させ、そしてＰＢＳ中にあるＴａｇ５抗原で最終注射し、そして４日後に屠殺した。屠殺したマウスの脾臓を採取し、そして標準的手順（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）を使用してＳＰＯ／２ミエローマ細胞に融合させた。ＨＡＴ選択した増殖ウェル由来の上清を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリーによってスクリーニングして、１０１Ｐ３Ａ１１特異的抗体生成クローンを同定する。
【０４６３】
１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体の結合親和性を、標準的技術を使用して決定する。親和性測定によって、エピトープ結合に対する抗体の強度を定量し、親和性測定を使用して、どの１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体が、例えば、当業者により認識されるような診断用途または治療用途のために好ましいかを規定するのを補助する。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）は、結合親和性を決定するために好ましい方法である。このＢＩＡｃｏｒｅシステムは、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ，Ｗｅｌｆｏｒｄ  Ｋ．１９９１，Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｅｌｅｃｔ．２３：１；ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２９５：２６８）を使用して、リアルタイムで生体分子相互作用をモニターする。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数を簡便に生じる。
【０４６４】
（実施例９：ＨＬＡクラスＩ結合アッセイおよびＨＬＡクラスＩＩ結合アッセイ）
精製ＨＬＡ分子を使用するＨＬＡクラスＩ結合アッセイおよびＨＬＡクラスＩＩ結合アッセイを、開示されたプロトコル（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８．３１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４））に従って、実施する。簡単に述べると、精製ＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を、種々の非標識ペプチドインヒビターおよび１〜１０ｎＭの記載されるような１２５Ｉ放射標識プローブペプチドとともにインキュベートする。インキュベーション後、ＭＨＣ−ペプチド複合体を、ゲル濾過により遊離ペプチドから分離し、そして結合ペプチドの画分を、測定する。代表的には、予備実験において、各ＭＨＣ調製物を、固定量の放射標識ペプチドの存在下で力価決定して、全放射能のうちの１０〜２０％に結合するのに必要なＨＬＡ分子の濃度を決定する。その後のすべての阻害アッセイおよび直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度を使用して実施する。
【０４６５】
これらの条件下では［標識］＜［ＨＬＡ］かつＩＣ５０≧［ＨＬＡ］であるので、測定したＩＣ５０値は、真のＫＤ値の妥当な近似である。ペプチドインヒビターを、代表的には、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験し、そして完全に独立した２つ〜４つの実験において試験する。種々の実験において得られたデータの比較を可能にするために、相対的結合数を、各ペプチドについて計算する。この計算は、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０を、試験した各ペプチドについてのＩＣ５０（代表的には、放射標識プローブペプチドの非標識バージョン）で除算することによる。データベースのため、および実験間比較のために、相対的結合値を集計する。これらの値を、その後、ＩＣ５０ｎＭへと変換して戻し得る。この変換は、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０ｎＭを、目的のペプチドの相対的結合によって除算することによる。このデータ集計方法は、正確であり、そして異なる日に試験したペプチドまたは異なるロットの精製ＭＨＣを用いて試験したペプチドを比較するために、一貫性がある。
【０４６６】
上記に概略したような結合アッセイを使用して、ＨＬＡスーパーモチーフ保有ペプチドおよび／またはＨＬＡモチーフ保有ペプチド（表ＩＶを参照のこと）を分析するために使用し得る。
【０４６７】
（実施例１０：ＨＬＡスーパーモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープおよびＨＬＡモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープの同定）
本発明のＨＬＡワクチン組成物は、マルチエピトープを含み得る。そのマルチエピトープは、広範な集団適用範囲を達成するために、複数のＨＬＡスーパーモチーフまたはＨＬＡモチーフを含み得る。本実施例は、そのようなワクチン組成物中に含めるための、スーパーモチーフ保有エピトープおよびモチーフ保有エピトープの同定および確認を示す。集団適用範囲の計算を、下記のストラテジーを使用して実施する。
【０４６８】
（スーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはモチーフ保有エピトープの同定のためのコンピューターサーチおよびアルゴリズム）
「抗原性プロフィール」と題する実施例および表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＩＬにおいてモチーフ保有ペプチド配列を同定するために実施するサーチは、図２および図３に示される１０１Ｐ３Ａ１１の遺伝子産物からのタンパク質配列データを使用する；表を作成するために使用する特定のペプチドを、表ＬＩＩに列挙する。
【０４６９】
ＨＬＡクラスＩスーパーモチーフもしくはＨＬＡクラスＩモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフもしくはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有するエピトープについてのコンピューターサーチを、以下のように実施する。翻訳されるすべての１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列を、文字列サーチソフトウェアプログラムを使用して分析して、適切なＨＬＡ結合モチーフを含む可能性のあるペプチド配列を同定する；そのようなプログラムを、公知のモチーフ／スーパーモチーフの開示を考慮して、当該分野における情報に従って容易に作成する。さらに、そのような計算は、頭でなし得る。
【０４７０】
同定したＡ２スーパーモチーフ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列、およびＤＲスーパーモチーフ配列を、多項アルゴリズムを使用してスコア付けして、それらのモチーフが、特定のＨＬＡ−クラスＩ分子またはＨＬＡ−クラスＩＩ分子に結合する能力を推測する。これらの多項アルゴリズムは、種々の位置にある異なるアミノ酸の影響を考慮する。これらの多項アルゴリズムは、ペプチド−ＨＬＡ分子相互作用の全親和性（またはΔＧ）は、
「ΔＧ」＝ａ１ｉ×ａ２ｉ×ａ３ｉ．．．×ａｎｉ
の型の線形多項関数として近似し得、ここで、ａｊｉは、ｎアミノ酸のペプチド配列に沿って所定の位置（ｉ）にある所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を示す係数である。この方法の重大な仮定は、各位置での効果は、互いに本質的に独立している（すなわち、個々の側鎖の独立した結合である）ということである。残基ｊが、そのペプチド中に位置ｉに存在する場合、そのペプチドの残りの配列とは関係なく、そのペプチドの結合の自由エネルギーに一定量ｊｉを付与すると仮定する。
【０４７１】
特定のアルゴリズム係数の誘導方法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８〜１２６，１９９７に記載されている（また、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９〜９３，１９９６；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３〜３３７３，１９９８もまた参照のこと）。簡単に述べると、すべてのｉ位置について、アンカーおよび非アンカーを問わず、ｊを保有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の幾何平均を、その群の残りに対して計算し、そしてｊｉの推定値として使用する。クラスＩＩペプチドについて、多重アライメントが可能である場合、反復手順に従って、最高スコアリングアライメントのみを利用する。試験セット中の所定のペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に対応するＡＲＢ値を乗算する。その積が、選択した閾値を超える場合、そのペプチドは結合すると推定される。適切な閾値を、望ましい推定の厳密度の関数として選択する。
【０４７２】
（ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択）
１０１Ｐ３Ａ１１由来のタンパク質配列を、モチーフ同定ソフトウェアを利用してスキャンして、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ主要アンカー特異性を含む、９マー配列、１０マー配列、および１１マー配列を同定する。代表的には、その後、これらの配列を、上記のプロトコルを使用してスコア付けし、そして正のスコアを持つ配列に対応するペプチドを合成し、インビトロでの精製ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合する能力について試験する（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１は、プロトタイプＡ２スーパータイプ分子とみなされる）。
【０４７３】
その後、これらのペプチドを、さらなるＡ２スーパータイプ分子（Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６、およびＡ＊６８０２）に結合する能力について試験する。試験した５つのＡ２スーパータイプ対立遺伝子のうちの少なくとも３つに結合するペプチドを、代表的には、Ａ２スーパータイプ交差反応性結合体と見なす。好ましいペプチドは、３つ以上のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ分子に５００ｎＭ以下の親和性で結合する。
【０４７４】
（ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
上記でスキャンする１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列を、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ主要アンカーを含むペプチドの存在についても試験する。その後、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有配列に対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ａ＊０３０１分子およびＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子（最も有力な２つのＡ３スーパータイプ対立遺伝子によりコードされる分子）への結合について試験する。その後、≦５００ｎＭ、しばしば≦２００ｎＭの結合親和性を有するその２つの対立遺伝子のうちの少なくとも１つに結合するペプチドを、他の一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子（例えば、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１）に対する結合交差反応性について試験して、試験する５つのＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ分子のうちの少なくとも３つに結合し得る分子を同定する。
【０４７５】
（ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
上記でスキャンする１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質配列を、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフを含む、８マーペプチド、９マーペプチド、１０マーペプチド、または１１マーペプチドの存在についても試験する。対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子（すなわち、プロトタイプＢ７スーパータイプ対立遺伝子）によりコードされる分子）への結合について試験する。ＩＣ５０≦５００ｎＭでＢ＊０７０２に結合するペプチドを、標準的方法を使用して同定する。その後、これらのペプチドを、他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（例えば、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５３０１およびＢ＊５４０１）への結合について試験する。それによって、試験する５つのＢ７スーパータイプ対立遺伝子のうちの３つ以上に結合し得る分子を、同定する。
【０４７６】
（Ａ１モチーフ保有エピトープおよびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択）
集団適用範囲をさらに増大するために、ＨＬＡ−Ａ１エピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４エピトープもまた、ワクチン組成物中に組み込み得る。１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の分析もまた、ＨＬＡ−Ａ１モチーフ含有配列およびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ含有配列を同定するために実施し得る。
【０４７７】
他のモチーフおよび／またはスーパーモチーフを保有する、高親和性結合エピトープおよび／または交差反応性結合エピトープを、同様の方法論を使用して同定する。
【０４７８】
（実施例１１：免疫原性の確認）
本明細書中に記載されるように同定される交差反応性候補ＣＴＬ  Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを、インビトロでの免疫原性を確認するために選択する。以下の方法論を使用して確認を実施する。
【０４７９】
（細胞スクリーニングのための標的細胞株）
ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子をＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃヌル変異体ヒトＢリンパ芽球細胞株である７２１．２２１に移入することによって生成した．２２１Ａ２．１細胞株を、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束ＣＴＬの活性を測定するためのペプチド負荷標的として使用する。この細胞株を、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および１０％（ｖ／ｖ）熱非働化ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させる。目的の抗原を発現する細胞、または目的の抗原をコードする遺伝子を含むトランスフェクタントを、ペプチド特異的ＣＴＬが内因性抗原を認識する能力を確認するための標的細胞として使用し得る。
【０４８０】
（一次ＣＴＬ誘導培養）
（樹状細胞（ＤＣ）の産生）  ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼを含むＲＰＭＩ中で解凍し、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋５％  ＡＢヒト血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン）で２回洗浄し、この完全培地中に再懸濁する。その単球を、６ウェルプレート中に１０×１０６ＰＢＭＣ／ウェルでプレートすることによって精製する。３７℃にて２時間後、そのプレートを穏やかに振盪し、その上清を吸引することによって、非接着細胞を除去する。ウェルを、３ｍｌのＲＰＭＩで合計３回洗浄して、非接着細胞および緩く接着する細胞のほとんどを除去する。その後、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む３ｍｌの完全培地を、各ウェルに添加する。６日目に、７５ｎｇ／ｍｌにてＴＮＦαを、ＤＣに添加し、７日目に、その細胞を、ＣＴＬ誘導培養に使用する。
【０４８１】
（ＤＣおよびペプチドを用いてのＣＴＬの誘導）  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｌ免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０）およびｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬を用いるポジティブ選択によって単離する。代表的には、約２００×１０６個〜２５０×１０６個のＰＢＭＣを、２４×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞（４８ウェルプレート培養のために十分である）を得るために処理する。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮアーゼを含むＲＰＭＩ中で解凍し、そして１％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで１回洗浄し、そしてＰＢＳ／１％ＡＢ血清中に、濃度２０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。磁気ビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ血清を用いて３回洗浄し、細胞（１４０μｌビーズ／２０×１０６細胞）に添加し、そして継続して混合しながら４℃で１時間インキュベートする。そのビーズおよび細胞を、ＰＢＳ／ＡＢ血清を用いて４回洗浄して、非接着細胞を除去し、そして１００μｌ／ｍｌｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬および３０μｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼを含むＰＢＳ／ＡＢ血清中に、１００×１０６細胞／ｍｌ（もとの細胞数に基く）で懸濁する。その混合物を、継続して混合しながら室温にて１時間インキュベートする。そのビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ／ＤＮアーゼで再び洗浄し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を収集する。ＤＣを収集し、そして１３００ｒｐｍにて５〜７分間遠心分離し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄し、計数し、そして３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で、２０℃で４時間、細胞濃度１×１０６〜２×１０６／ｍｌで、４０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルスする。その後、そのＤＣに照射（４，２００ｒａｄ）し、培地で１回洗浄し、そして再び計数する。
【０４８２】
（誘導培養の設定）  ０．２５ｍｌのサイトカイン産生ＤＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で、４８ウェルプレートの各ウェル中で０．２５ｍｌのＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）とともに共培養する。翌日、組換えヒトＩＬ−１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、４８時間後に、ヒトＩＬ−２を、１０ＩＵ／ｍｌで添加する。
【０４８３】
（ペプチドでパルスした接着細胞を用いる、誘導培養物の再刺激）  一次誘導の７日後および１４日後に、その細胞を、ペプチドでパルスした接着細胞を用いて再刺激する。そのＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩおよびＤＮアーゼで２回洗浄する。その細胞を、５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、そして約４２００ｒａｄで照射する。ＰＢＭＣを、１ウェルあたり０．５ｍｌ完全培地中２×１０６にてプレートし、３７℃で２時間インキュベートする。そのプレートを穏やかにタッピングすることによってＲＰＭＩで２回洗浄して非接着細胞を除去し、０．２５ｍｌのＲＰＭＩ／５％ＡＢ／ウェル中３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの存在下で１０μｇ／ｍｌのペプチドで接着細胞を３７℃で２時間パルスする。各ウェルからペプチド溶液を吸引し、そのウェルを、ＲＰＭＩで１回洗浄する。その培地のほとんどを、誘導培養物（ＣＤ８＋細胞）から吸引し、そして新鮮な培地で０．５ｍｌにする。その後、その細胞を、ペプチドでパルスした接着細胞を含むウェルへと移す。２４時間後に、組換えヒトＩＬ−１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、そして翌日および２〜３日後に再度、組換えヒトＩＬ２を５０ＩＵ／ｍｌで添加する（Ｔｓａｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８（１〜２）：６５〜７５，１９９８）。７日後に、その培養物を、５１Ｃｒ放出アッセイにおいてＣＴＬ活性についてアッセイする。いくつかの実験において、その培養物を、２回目の再刺激の際にインサイチュＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡにおけるペプチド特異的認識についてアッセイし、７日後に、内因的認識のアッセイを行う。増殖後、並列比較のために両方のアッセイにおいて活性を測定する。
【０４８４】
（５１Ｃｒ放出によるＣＴＬ溶解活性の測定）
２回目の再刺激の７日後、単一のＥ：Ｔにて個々のウェルをアッセイすることによって、標準的（５時間）５１Ｃｒ放出アッセイにおいて細胞傷害性を測定する。細胞を１０μｇ／ｍｌペプチドとともに３７℃で一晩インキュベートすることによって、ペプチドでパルスした標的を調製する。
【０４８５】
接着標的細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養フラスコから除去する。標的細胞を、２００μＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて３７℃で１時間標識する。標識した標的細胞を、１ｍｌあたり１０６で再懸濁し、Ｋ５６２細胞（非特異的溶解を減少するために使用されるＮＫ感受性赤芽球株）を用いて濃度３．３×１０６／ｍｌで１：１０希釈する。標的細胞（１００μｌ）およびエフェクター（１００μｌ）を、９６ウェル丸底プレート中にプレートし、そして３７℃で５時間インキュベートする。その時、１００μｌの上清を各ウェルから収集し、そして式：
［試験サンプルのｃｐｍ−自然発生５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）／（最大５１Ｃｒ放出サンプル−自然発生５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）］×１００
に従って、溶解パーセントを決定する。
【０４８６】
最大放出および自然発生放出を、それぞれ、標識標的を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および培地単独とともにインキュベートすることによって、決定する。特異性溶解（サンプル−バックグラウンド）が個々のウェルの場合１０％以上であり、増殖した培養物をアッセイする場合には最高の２つのＥ：Ｔ比にて１５％以上である培養物として、ポジティブ培養物を規定する。
【０４８７】
（ペプチド特異的かつ内因性認識の指標としてのヒトＩＦＮγ生成のインサイチュ測定）
Ｉｍｍｕｌｏｎ２プレートを、マウス抗ヒトＩＦＮγモノクローナル抗体（４μｇ／ｍｌ  ０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２）を使用して、４℃にて一晩コーティングする。このプレートをＣａ２＋、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ／１０％  ＦＣＳを使用して２時間ブロッキングし、その後、ＣＴＬ（１００μｌ／ウェル）および標的（１００μｌ／ウェル）を各ウェルに添加する（標準物質およびブランクのためのウェルは、培地のみを入れ、空にしておく）。標的細胞（ペプチドパルスまたは内因性標的いずれか）を１×１０６細胞／ｍｌの濃度にて使用する。プレートを、５％  ＣＯ２により３７℃にて４８時間インキュベートする。
【０４８８】
組換えヒトＩＦＮ−γを、４００ｐｇまたは１２００ｐｇ／１００μｌ／ウェルにて開始した標準ウェルに添加し、プレートを３７℃にて２時間インキュベートする。プレートを洗浄し、１００μｌのビオチン化マウス抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に２μｇ／ｍｌ）を添加し、室温にて２時間インキュベートする。再び洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：４０００）を添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートする。次いで、このプレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、１００μｌ／ウェルの発色溶液（ＴＭＢ  １：１）を添加し、プレートを５〜１５分間、発色させる。５０μｌ／ウェル  １Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を使用して反応を停止し、ＯＤ４５０にて読み取る。バックグラウンドを超える、少なくとも５０ｐｇのＩＦＮ−γ／ウェルにて測定されかつ発現のバックグラウンドレベルの２倍である場合、培養をポジティブとみなす。
【０４８９】
（ＣＴＬ発現）
ペプチドパルスした標的および／または腫瘍標的に対する特異的溶解活性を示す培養物を、抗ＣＤ３とともに２週間にわたり増殖させる。簡潔には、５×１０４  ＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する：ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５μＭ  ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する）中、１×１０６照射（４，２００ラド）ＰＢＭＣ（自己または同種異系）／ｍｌ、２×１０５照射（８，０００ラド）ＥＢＶ形質転換細胞／ｍｌ、および３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（抗ＣＤ３）。組換えヒトＩＬ２を２００ＩＵ／ｍｌの最終濃度にて２４時間後に添加し、その後３日間毎に、５０ＩＵ／ｍｌにて新たな培地を加える。細胞濃度が１×１０６／ｍｌを超えたら細胞を分け、培養物を、５１Ｃｒ放出アッセイにて３０：１、１０：１、３：１および１：１のＥ：Ｔ比で１３〜１５日の間にアッセイするか、または増殖前と同じ標的を使用してインサイチュＩＦＮγアッセイにて１×１０６／ｍｌでアッセイする。
【０４９０】
培養物を、以下の通り、抗ＣＤ３＋の非存在下で増殖させる。ペプチドおよび内因性標的に対する特異的溶解活性を示す培養物を選択し、５×１０４  ＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する：ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須ＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ  ２−ＭＥ、Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを含有する）１ｍｌあたり中、１×１０６自己ＰＢＭＣ／ｍｌ（１０μｇ／ｍｌ  ペプチドを用いて３７℃にて２時間ペプチドパルスし、かつ照射（４，２００ラド）した）；２×１０５照射（８，０００ラド）ＥＢＶ形質転換細胞／ｍｌ。
【０４９１】
（Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの免疫原性）
Ａ２スーパーモチーフ交差反応性結合ペプチドを、正常個体におけるペプチド特異的ＣＴＬを誘導する能力について細胞アッセイにて試験する。この分析において、ペプチドは、代表的には、少なくとも個体におけるペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、好ましくは、内因的に発現されたペプチドもまた認識する場合、エピトープであると考えられる。
【０４９２】
１０１Ｐ３Ａ１１を発現する腫瘍を保有する患者から単離されたＰＢＭＣを使用して、免疫原性もまた確認し得る。簡潔には、ＰＢＭＣを患者から単離し、ペプチドパルスした単球を用いて再刺激し、ペプチドパルスした標的細胞および抗原を内因的に発現するトランスフェクト細胞を認識する能力についてアッセイする。
【０４９３】
（Ａ＊０３／Ａ１１免疫原性の評価）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有交差反応性結合ペプチドもまた、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドの免疫原性を評価するために使用される方法と同様の方法を使用して、免疫原性について評価する。
【０４９４】
（Ｂ７免疫原性の評価）
本明細書中で示されるように同定されたＢ７スーパータイプ交差反応性結合ペプチドの免疫原性スクリーニングを、Ａ２スーパーファミリーおよびＡ３スーパーファミリーを保有するペプチドの確認と同様の様式で確認する。
【０４９５】
他のスーパーモチーフ／モチーフ（例えば、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２４など）を保有するペプチドもまた、同様の方法を使用して確認する。
【０４９６】
（実施例１２：アナログを作製することによるネイティブエピトープの結合能力を改善するための伸長したスーパーモチーフの実行）
ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフ（一次残基および／または二次残基を含む）は、本明細書中に実証されるように、高度に交差反応性のネイティブペプチドの同定および調製において有用である。さらに、ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフの規定はまた、ネイティブペプチド配列内の残基を同定することにより高度に交差反応性のエピトープをを操作することを可能にする。このネイティブペプチド配列は、ペプチドに特定の特性（例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子の群内のより大きな交差反応性および／またはそれらのＨＬＡ分子のいくつかまたは全てに対するより大きな結合親和性）を付与するためにアナログ化され得る（ａｎａｌｏｇｅｄ）。調節された結合親和性を示すアナログ化ペプチドの例は、本実施例に示される。
【０４９７】
（一次アンカー残基でのアナログ化）
ペプチド操作ストラテジーを、エピトープの交差反応性をさらに増大させるために実行する。例えば、Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの主要アンカーを、例えば、好ましくは、２位にＬ、Ｉ、ＶまたはＭ、およびＣ末端にＩまたはＶを導入するために改変する。
【０４９８】
アナログペプチドの交差反応性を分析するために、各操作アナログを、最初に、基本型Ａ２スーパータイプ対立遺伝子Ａ＊０２０１に対する結合について、次いで、Ａ＊０２０１結合能力が維持されていれば、Ａ２スーパータイプ交差反応性について試験する。
【０４９９】
あるいは、ペプチドを、１つまたは全てのスーパータイプメンバーを結合すると確認し、次いで、スーパータイプメンバーのいずれか１つ（または１以上）に対する結合親和性を調節するためにアナログ化して、集団範囲（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｏｖｅｒａｇｅ）を付加する。
【０５００】
細胞スクリーニング分析における免疫原性についてのアナログ選択は、代表的には、親野生型（ＷＴ）ペプチドが、３以上のＡ２スーパータイプ対立遺伝子に少なくとも弱く結合する（すなわち、５０００ｎＭ以下のＩＣ５０にて結合する）能力によりさらに制限される。この要件についての原理は、ＷＴペプチドが生物学的に関連するに十分な量にて内因的に存在しなければならないということである。アナログ化ペプチドは、親エピトープに特異的なＴ細胞による増大した免疫原性および交差反応性を有することが示された（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９，１９９６；およびＰｏｇｕｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８１６６，１９９５を参照のこと）。
【０５０１】
これらのペプチドアナログの細胞スクリーニングにおいて、アナログ特異的ＣＴＬもまた、野生型ペプチド、および可能である場合は、このエピトープを内因的に発現する標的細胞を認識することが可能であることを確認することが重要である。
【０５０２】
（ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７のスーパーモチーフを保有するペプチドのアナログ化）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープのアナログは、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドのアナログ化において使用されるストラテジーと同様のストラテジーを使用して生成される。例えば、Ａ３スーパータイプ分子の３／５に結合するペプチドは、２位に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、ＭまたはＡ）を保有するように一次アンカー残基にて操作される。
【０５０３】
次いで、このアナログペプチドは、Ａ＊０３およびＡ＊１１（基本型Ａ３スーパータイプ対立遺伝子）を結合する能力について試験される。次いで、≦５００ｎＭの結合能を示すペプチドは、Ａ３スーパータイプ交差反応性を有すると確認される。
【０５０４】
Ａ２モチーフおよびＡ３モチーフを保有するペプチドに類似して、３以上のＢ７スーパータイプ対立遺伝子を結合するペプチドを改善して、可能な場合、増大した交差反応結合性またはより大きな結合親和性もしくは結合半減期を達成し得る。Ｂ７スーパーモチーフを保有するペプチドは、Ｓｉｄｎｅｙら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６）に示されるように、例えば、Ｃ末端一次アンカー位置にて好ましい残基（Ｖ、Ｉ、ＬまたはＦ）を有するように操作される。
【０５０５】
他のモチーフおよび／またはスーパーモチーフを保有するエピトープの一次アンカー残基でのアナログ化は、同様の様式で実施される。
【０５０６】
次いで、アナログペプチドは、代表的には、細胞スクリーニングアッセイにおいて免疫原性について確認される。繰り返すと、アナログ特異的ＣＴＬもまた、野生型ペプチド、および可能な場合、このエピトープを内因的に発現する標的を認識することが可能であることを実証することが一般に重要である。
【０５０７】
（二次アンカー残基でのアナログ化）
さらに、ＨＬＡスーパーモチーフは、高度に交差反応性のペプチドおよび／または増大した親和性を有するＨＬＡ分子を結合するペプチドを、このような特性と関連する二次アンカー位置にて特定の残基を同定することにより、操作することにおいて価値がある。例えば、１位にＦ残基を有するＢ７スーパーモチーフを保有するペプチドの結合能力を分析する。次いで、このペプチドを、例えば、１位のＦをＬで置換するようにアナログ化する。このアナログ化ペプチドを、増大した結合親和性、結合半減期および／または増大した交差反応性について評価する。このような手順は、増強した特性を有するアナログ化ペプチドを同定する。
【０５０８】
十分に改善された結合能力または交差反応性を有する操作されたアナログを、例えば、ＩＦＡ免疫またはリポペプチド免疫に従って、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスにおいて免疫原性についてもまた試験し得る。アナログ化ペプチドを、１０１Ｐ３Ａ１１発現腫瘍を有する患者由来のＰＢＭＣを使用してリコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を刺激する能力についてさらに試験する。
【０５０９】
（他のアナログ化ストラテジー）
ペプチドアナログ化の別の形態は、アンカー位置とは無関係に、システインを、α−アミノ酪酸で置換することを包含する。その化学的性質に起因して、システインは、ジスルフィド架橋を形成し、かつ結合能力を減少させるに十分、ペプチドを構造的に変化させる特性を有する。システインの代わりにα−アミノ酪酸での置換は、この問題を軽減するだけでなく、いくつかの場合において、結合能力および交差結合能力を改善することもまた示される（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｒ．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈｅｎ編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９による総説を参照のこと）。
【０５１０】
従って、単一アミノ酸置換の使用により、ＨＬＡスーパータイプ分子についてのペプチドリガンドの結合特性および／または交差反応性が調節され得る。
【０５１１】
（実施例１３：ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフを有する１０１Ｐ３Ａ１１由来配列の同定および確認）
ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはモチーフを有するペプチドエピトープは、ＨＬＡクラスＩペプチドについて記載された方法と類似の方法を使用して、以下に概説されるように同定および確認される。
【０５１２】
（ＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープの選択）
１０１Ｐ３Ａ１１由来のＨＬＡクラスＩＩ  ＨＴＬエピトープを同定するために、１０１Ｐ３Ａ１１抗原を、ＨＬＡ−ＤＲモチーフまたはスーパーモチーフを保有する配列の存在について分析する。具体的には、ＤＲスーパーモチーフを含む（９マーのコアおよび３残基のＮ末端および３残基のＣ末端隣接領域を含む（計１５アミノ酸））１５マーの配列を選択する。
【０５１３】
ＤＲ分子に結合するペプチドを推定するためのプロトコルを開発した（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９８）。個々のＤＲ分子に対して特異的なこれらのプロトコルは、９マーコア領域のスコア付けおよび順位付けを可能にする。各プロトコルは、９マーコア内のＤＲスーパーモチーフ一次アンカー（すなわち、１位および６位）の存在についてペプチド配列をスコア付けするのみならず、二次アンカーの存在についての配列もさらに評価する。対立遺伝子特異的選択表（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，同書を参照のこと）を使用して、これらのプロトコルが、特定のＤＲ分子を結合する確率が高いペプチド配列を効率的に選択することを見いだした。さらに、これらのプロトコルを連携して（ｉｎ  ｔａｎｄｅｍ）実施することは、具体的に、ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７に対する実施が、ＤＲ交差反応性ペプチドを効率的に選択し得ることを見いだした。
【０５１４】
上記で同定された１０１Ｐ３Ａ１１由来ペプチドは、種々の一般的なＨＬＡ−ＤＲ分子についてのそれら結合能力について試験される。全てのペプチドは、一次パネル：ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７においてＤＲ分子に対する結合について最初に試験される。次いで、これら３つのＤＲ分子のうちの少なくとも２つを結合するペプチドを、二次アッセイにおいてＤＲ２ｗ２β１、ＤＲ２ｗ２β２、ＤＲ６ｗ１９、およびＤＲ９分子に対する結合について試験する。最後に、この４つの二次パネルＤＲ分子のうちの少なくとも２つを結合するペプチド、従って、７つの異なるＤＲ分子のうちの少なくとも４つを累積的に結合するペプチドは、ＤＲ４ｗ１５、ＤＲ５ｗ１１、およびＤＲ８ｗ２分子に対する結合について三次アッセイにおいてスクリーニングされる。一次スクリーニングアッセイ、二次スクリーニングアッセイおよび三次スクリーニングアッセイを含む、この１０個のＤＲ分子のうちの少なくとも７つを結合するペプチドは、交差反応性ＤＲ結合因子（ｂｉｎｄｅｒ）と考えられる。一般的なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を結合することが見いだされた１０１Ｐ３Ａ１１由来のペプチドは、特に興味深い。
【０５１５】
（ＤＲ３モチーフペプチドの選択）
ＨＬＡ−ＤＲ３が白色人種集団、黒色人種集団およびラテンアメリカ系集団において優性である対立遺伝子であるので、ＤＲ３結合能力は、ＨＴＬエピトープの選択において適切な基準である。従って、候補であることが示されたペプチドはまた、それらのＤＲ３結合能力についてアッセイされ得る。しかし、ＤＲ３モチーフの結合特異性を考慮すると、ＤＲ３に対してのみ結合するペプチドはまた、ワクチン処方物中に含めるための候補物と考えられ得る。
【０５１６】
ＤＲ３を結合するペプチドを効率的に同定するために、標的１０１Ｐ３Ａ１１抗原を、Ｇｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８，１９９４）により報告された２つのＤＲ３特異的結合モチーフのうちの１つを有する配列について分析する。次いで、対応するペプチドを合成し、１μＭまたはより良好な（すなわち、１μＭ未満）の親和性でＤＲ３を結合する能力を有すると確認する。この結合基準を満たし、ＨＬＡクラスＩＩ高親和性結合因子とみなされるペプチドが見いだされる。
【０５１７】
このようにして同定されるＤＲ３結合エピトープは、ＤＲスーパーモチーフ保有ペプチドエピトープとともにワクチン組成物中に含められる。
【０５１８】
ＨＬＡクラスＩモチーフ保有ペプチドの場合と同様に、クラスＩＩモチーフ保有ペプチドは、親和性または交差反応性を改善するようにアナログ化される。例えば、９マーコア配列の４位のアスパラギン酸は、ＤＲ３結合についての最適残基であり、その残基についての置換は、しばしば、ＤＲ３結合を改善する。
【０５１９】
（実施例１４：１０１Ｐ３Ａ１１由来ＨＴＬエピトープの免疫原性）
この実施例は、本明細書中で記載された方法を使用して同定されたものの中から、免疫原性のＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよびＤＲ３モチーフ保有エピトープを決定する。
【０５２０】
ＨＴＬエピトープの免疫原性を、ＨＴＬ応答を刺激する能力を評価することにより、および／または適切なトランスジェニックマウスモデルを使用することにより、ＣＴＬエピトープの免疫原性の決定に類似の様式にて確認する。免疫原性を、以下についてスクリーニングすることにより決定する：１．）通常ＰＢＭＣを使用するインビトロ初代誘導または２．）１０１Ｐ３Ａ１１発現腫瘍を有する患者からのリコール応答。
【０５２１】
（実施例１５：集団の範囲の幅を決定するための種々の人種バックグラウンドにおけるＨＬＡスーパータイプの表現型頻度の算出）
この実施例は、複数のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを含むマルチエピトープから構成されるワクチン組成物の集団範囲の幅の評価を示す。
【０５２２】
集団範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を決定する。各ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を、二項分布式ｇｆ＝１−［ＳＱＲＴ（１−ａｆ）］を用いて、抗原または対立遺伝子頻度から計算する（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６を参照のこと）。表現型頻度全体を得るために、累積的遺伝子頻度を計算し、累積的抗原頻度を、逆方程式（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｆｏｒｍｕｌａ）［ａｆ＝１−（１−Ｃｇｆ）２］を使用することにより導出する。
【０５２３】
頻度データがＤＮＡ型決定のレベルにて利用可能でない場合、血清学的に規定された抗原頻度に対する対応が推定される。潜在的スーパータイプ集団範囲全体を得るために、連鎖不平衡は推定されず、スーパータイプの各々に属すると確認された対立遺伝子のみが含められる（最小推定（ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｔｉｍａｔｅ））。遺伝子座間の組み合わせにより達成される潜在的な範囲全体の推定を、考えられたＢ対立遺伝子により包含されると予測され得る非Ａ包含集団の割合をＡ範囲に加えることにより行う（例えば、合計＝Ａ＋Ｂ＊（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認されたメンバーは、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ＊３３０１、およびＡ＊６８０１である。Ａ３様スーパータイプは、Ａ３４、Ａ６６、およびＡ＊７４０１もまた含み得るが、これらの対立遺伝子は、頻度計算全体には含められなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミリーの確認されたメンバーは、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２、およびＡ＊６９０１である。最後に、Ｂ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ＊３５０１−０３、Ｂ５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１−２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１、およびＢ＊７８０１である（潜在的には、Ｂ＊１４０１、Ｂ＊３５０４−０６、Ｂ＊４２０１、およびＢ＊５６０２も）。
【０５２４】
Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプを組み合わせることにより達成される集団範囲は、５つの主要な人種群において約８６％である。範囲は、Ａ１モチーフおよびＡ２４モチーフを保有するペプチドを含めることにより拡げられ得る。平均して、Ａ１は、５つの異なる主要人種群（白人、北アメリカの黒人、中国人、日本人、およびラテンアメリカ系人）にまたがる集団の１２％に存在し、Ａ２４は、２９％に存在する。まとめると、これらの対立遺伝子は、これらの同じ人種集団において３９％の平均頻度で示される。Ａ１およびＡ２４が、Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプ対立遺伝子の範囲と組み合わせられると、主要人種にまたがる合計範囲は、９５％を超える。類似のアプローチが、クラスＩＩモチーフ保有エピトープの組み合わせにより達成される集団範囲を推定するために使用され得る。
【０５２５】
ヒトにおける免疫原性研究（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｄｏｏｌａｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：９７，１９９７；およびＴｈｒｅｌｋｅｌｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７）は、高度に交差反応性の結合ペプチドが、エピトープとしてほぼ常に認識されることを示した。高度に交差反応性の結合ペプチドを使用することは、多様な集団において免疫原性であるワクチンに含めるための候補エピトープを同定することにおける重要な選択基準である。
【０５２６】
十分な数のエピトープを用いることにより（本明細書中および当該分野で開示される）、平均集団範囲は、５つの主要人種集団の各々において９５％を超えることが推定される。ゲームの理論であるモンテカルロシミュレーション分析（これは、当該分野で公知である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｍ．Ｊ．およびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．「Ａ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｇａｍｅ  ｔｈｅｏｒｙ」ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４を参照のこと））は、白人、北アメリカ黒人、日本人、中国人、およびラテンアメリカ人の人種群から構成される集団中の個体のどの程度の割合が本明細書中に記載されるワクチンエピトープを認識するかを推定するために使用され得る。好ましい割合は、９０％である。より好ましい割合は、９５％である。
【０５２７】
（実施例１６：プライミング後に内因的にプロセシングされた抗原のＣＴＬ認識）
この実施例は、本明細書中で記載されるように同定され、選択されたネイティブペプチドまたはアナログ化ペプチドのエピトープにより誘導されたＣＴＬが、内因的に合成された抗原（すなわち、ネイティブ抗原）を認識することを確認する。
【０５２８】
ペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープ）で免疫したトランスジェニックマウスから単離したエフェクター細胞を、ペプチドコーティングした刺激因子細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を用いてインビトロで再刺激する。６日後、エフェクター細胞を、細胞傷害性についてアッセイし、ペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株を、さらに再刺激する。さらに６日後、これらの細胞株を、ペプチドの存在下または非存在下で５１Ｃｒ標識Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋｂ標的細胞に対する細胞傷害性活性について試験し、内因的に合成された抗原を有する５１Ｃｒ標識標的細胞（すなわち、１０１Ｐ３Ａ１１発現ベクターで安定にトランスフェクトされた細胞）に対しても試験する。
【０５２９】
結果は、ペプチドエピトープでプライムされた動物から得られたＣＴＬ株が、内因的に合成された１０１Ｐ３Ａ１１抗原を認識することを実証する。このような分析のために使用されるトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されるエピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスに加えて、ヒトＡ１１（これはまた、Ａ３エピトープを評価するために使用され得る）およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジェニックマウスモデルが特徴付けられ、他（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルがまた開発され、これは、ＨＴＬエピトープを評価するために使用され得る。
【０５３０】
（実施例１７：トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エピトープの活性）
この実施例は、１０１Ｐ３Ａ１１由来のＣＴＬおよびＨＴＬペプチドワクチン組成物の使用により、トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの誘導を示す。本明細書中で使用されるワクチン組成物は、１０１Ｐ３Ａ１１発現腫瘍を有する患者に投与されるペプチドを含む。このペプチド組成物は、複数のＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得る。このエピトープは、本明細書中に記載される方法を用いて同定される。この実施例はまた、増強された免疫原性が、ＣＴＬワクチン組成物中に１以上のＨＴＬエピトープを含めることにより達成され得ることを示す；このようなペプチド組成物は、ＣＴＬエピトープに結合体化されたＨＴＬエピトープを含み得る。このＣＴＬエピトープは、５００ｎＭ以下の親和性にて、複数のＨＬＡファミリーメンバーに結合するエピトープまたはそのエピトープのアナログであり得る。このペプチドは、所望であれば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。
【０５３１】
免疫手順：トランスジェニックマウスの免疫を、記載のように（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１，１９９７）行う。例えば、Ａ２／Ｋｂマウス（これは、ヒトＨＬＡ  Ａ２．１対立遺伝子についてトランスジェニックであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフまたはＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを保有するエピトープの免疫原性を確認するために使用される）を、フロイント不完全アジュバント中、あるいはこのペプチド組成物が脂質化ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体である場合は、ＤＭＳＯ／生理食塩水中、またはこのペプチド組成物がポリペプチドである場合はＰＢＳもしくはフロイント不完全アジュバント中、０．１ｍｌのペプチドを用いて皮下で（尾の基部）プライムする。プライムして７日後、これらの動物から得た脾細胞を、ペプチドを使用してコーティングした同系の照射ＬＰＳ活性化リンパ芽球で再刺激する。
【０５３２】
細胞株：ペプチド特異的細胞傷害性アッセイについての標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂキメラ遺伝子（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７，１９９１）を使用してトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞である。
【０５３３】
インビトロＣＴＬ活性化：プライムして１週間後、１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコ中にて脾臓細胞（３０×１０６細胞／フラスコ）を、３７℃にて同系の照射（３０００ラド）ペプチドコーティングリンパ芽球（１０×１０６細胞／フラスコ）とともに同時培養する。６日後、エフェクター細胞を採取し、細胞傷害性活性についてアッセイする。
【０５３４】
細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０６）を、２００μｌの５１Ｃｒの存在下で、３７℃にてインキュベートする。６０分後、細胞を３回洗浄し、Ｒ１０培地中に再懸濁する。ペプチドを、必要であれば１μｇ／ｍｌの濃度にて添加する。アッセイのために、１０４の５１Ｃｒ標識標的細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中の異なる濃度のエフェクター細胞（最終容積は２００μｌ）に添加する。３７℃にて６時間インキュベートした後、上清の０．１ｍｌアリコートを各ウェルから取り出し、放射活性を、Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ自動ガンマカウンタにて測定する。特異的溶解の％を、以下の式により決定する：％特異的放出＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。同じ条件下での別個のＣＴＬアッセイ実施の間の比較を容易にするために、％５１Ｃｒ放出データを、溶解単位／１０６細胞として表す。１溶解単位は、６時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおける１０，０００の標的細胞の３０％溶解を達成するために要したエフェクター細胞の数として任意単位にて規定される。特異的溶解単位／１０６を得るために、ペプチドの非存在下で得た溶解単位／１０６を、ペプチドの存在下で得た溶解単位／１０６から差し引く。例えば、ペプチドの非存在下で、５０：１のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００の標的に対して５×１０５のエフェクター細胞）にて、ペプチドの存在下で、５：１（すなわち、１０，０００の標的に対して５×１０４のエフェクター細胞）にて、３０％の５１Ｃｒ放出が得られる場合、特異的溶解単位は、以下の通りである：［（１／５０，０００）−（１／５００，０００）］×１０６＝１８ＬＵ。
【０５３５】
結果を分析して、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体ワクチン調製物を注射した動物のＣＴＬ応答の大きさを評価し、実施例標題「免疫原性の確認」において上記で解説したように、例えば、ＣＴＬエピトープを使用して達成されたＣＴＬ応答の大きさと比較する。これに類似の分析を行って、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエピトープを含むペプチド結合体の免疫原性を確認し得る。これらの手順に従って、ＣＴＬ応答が誘導され、同時にＨＴＬ応答がこのような組成物の投与の際に誘導されることを見いだす。
【０５３６】
（実施例１８：１０１Ｐ３Ａ１１特異的ワクチン中に含めるためのＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープの選択）
この実施例は、本発明のワクチン組成物のためのペプチドエピトープを選択するための手順を示す。この組成物中のペプチドは、ペプチドをコードする単一の配列または１以上の配列（すなわち、ミニ遺伝子）のいずれかの核酸配列の形態にあり得るか、あるいは単一エピトープおよび／またはポリエピトープのペプチドであり得る。
【０５３７】
以下の原理を、ワクチン組成物中に含めるためのマルチエピトープを選択する場合に利用する。以下の原理の各々を、選択を行うために釣り合いをとる。
【０５３８】
投与の際に、１０１Ｐ３Ａ１１クリアランスと相関する免疫応答を模倣するエピトープを選択する。使用されるエピトープの数は、自発的に１０１Ｐ３Ａ１１を消去する患者の観察に依存する。例えば、自発的に１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞を消去する患者が、１０１Ｐ３Ａ１１抗原由来の少なくとも３つのエピトープに対する免疫応答を生じることが観察された場合、ＨＬＡクラスＩについて少なくとも３つのエピトープが含められるべきである。同様の原理が、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを決定するために使用される。
【０５３９】
しばしば、ＨＬＡクラスＩ分子については５００ｎＭ以下というＩＣ５０、クラスＩＩについては１０００ｎＭ以下というＩＣ５０という結合親和性を有するエピトープ；またはＢＩＭＡＳウェブサイト（ＵＲＬ  ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からの高結合スコアを有するＨＬＡクラスＩペプチドが選択される。
【０５４０】
多様な集団全体を通じたワクチンの広い範囲を達成するために、十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが選択されて、広い集団範囲が与えられる。１つの実施形態において、エピトープは、少なくとも８０％の集団範囲を提供するように選択される。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計学的評価法）は、集団範囲の幅、すなわち重複を評価するために使用され得る。
【０５４１】
ポリエピトープ組成物、またはこれをコードするミニ遺伝子を作製する場合、目的のエピトープを含む、あり得る、最も小さなペプチドを生成することが代表的には所望される。使用される原理は、同じでないとしても、ネスト化されたエピトープを含むペプチドを選択する場合に使用されるものと同様である。例えば、ワクチン組成物についてのタンパク質配列は、この配列が、配列内に含まれるエピトープの最大数を有する（すなわち、高濃度のエピトープを有する）ので、選択される。エピトープは、ネスト化されてもよいし、重複（すなわち、互いにフレームシフトしている）していてもよい。例えば、重複するエピトープを使用する場合、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸ペプチド中に存在し得る。各エピトープは曝され得、このようなペプチドの投与の際にＨＬＡ分子により結合される。マルチエピトープのペプチドは、合成により、組換えにより、または天然の供給源からの切断により生成され得る。あるいは、このネイティブ配列からアナログが生成され得、それにより１以上のエピトープは、このポリエピトープのペプチドの交差反応性および／または結合親和性特性を変化させる置換を含む。このようなワクチン組成物は、治療目的または予防目的のために投与される。この実施形態は、免疫系の未だ発見されていない局面として、プロセシングがネイティブのネスト化された配列に適用され、それにより治療的または予防的免疫応答誘導ワクチン組成物の生成を容易にするという可能性を提供する。さらに、このような実施形態は、現在未知のＨＬＡ構造（ｍａｋｅｕｐ）についてのモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（アナログを作製しない）は、免疫応答を、１０１Ｐ３Ａ１１に実際存在する複数のペプチド配列に方向付け、従って、何らかの連結エピトープを評価する必要性が避けられる。最後に、この実施形態は、核酸ワクチン組成物を生成する際のスケールの経済性を提供する。  この実施形態に関連して、コンピュータープログラムが当該分野の原理に従って導出され得、このプログラムは、標的配列において配列長さについてのエピトープの最大数を同定する。
【０５４２】
選択されたペプチドから構成されるワクチン組成物は、投与される場合、安全で、有効であり、かつ大きさが１０１Ｐ３Ａ１１を有するまたはこれを過剰発現する細胞を制御または消去する免疫応答に類似の免疫応答を惹起する。
【０５４３】
（実施例１９：「ミニ遺伝子」マルチエピトープ（Ｍｕｌｔｉ−Ｅｐｉｔｏｐｅ）ＤＮＡプラスミドの構築）
本実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築を議論する。ミニ遺伝子プラスミドは、当然、本明細書中に記載される種々の構成のＢ細胞、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬのエピトープまたはエピトープアナログを含み得る。
【０５４４】
ミニ遺伝子発現プラスミドは、代表的に、複合的ＣＴＬペプチドエピトープおよびＨＴＬペプチドエピトープを含む。本実施例において、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープならびにＨＬＡ−Ａ１モチーフ保有ペプチドエピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ保有ペプチドエピトープを、ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはＤＲ３エピトープと組み合わせて使用する。１０１Ｐ３Ａ１１由来のＨＬＡクラスＩスーパーモチーフまたはＨＬＡクラスＩモチーフ保有ペプチドエピトープを、複合的スーパーモチーフ／モチーフが表現されて広範な集団を提供するように、選択する。同様に、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを、広範な範囲の集団を提供するように、１０１Ｐ３Ａ１１から選択する。すなわち、ＨＬＡ  ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ保有エピトープおよびＨＬＡ  ＤＲ−３モチーフ保有エピトープの両方を、ミニ遺伝子構築に含有させるために選択する。選択されたＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを、次いで、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子に組み込む。
【０５４５】
このような構築は、さらに、ＨＴＬエピトープを小胞体に指向する配列をさらに含み得る。例えば、Ｉｉタンパク質（Ｉｉ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、当該分野において記載されるように１つ以上のＨＴＬエピトープに融合され得、ここでＩｉタンパク質のＣＬＩＰ配列は、除去され、そしてＨＬＡクラスＩＩエピトープ配列と置換され、その結果、ＨＬＡクラスＩＩエピトープが、小胞体に指向され、このエピトープは、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。
【０５４６】
本実施例は、ミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築のために使用される方法を例示する。ミニ遺伝子の構成のために使用され得る他の発現ベクターは、当業者に利用可能であり、かつ知られている。
【０５４７】
本実施例のミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列およびコンセンサスマウスκＩｇ軽鎖シグナル配列と、それに続く本明細書中に開示される原理に従い選択されるＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含む。この配列は、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｙｃ−ＨｉｓベクターによりコードされるＭｙｃおよびＨｉｓの抗体エピトープタグに融合されたオープンリーディングフレームをコードする。
【０５４８】
例えば、１５のヌクレオチドオーバーラップを有する約７０ヌクレオチド長の平均であり得るオーバーラップオリゴヌクレオチドを合成し、そしてＨＰＬＣ精製する。これらのオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープおよび適切なリンカーヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列、およびシグナル配列をコードする。最終的なマルチエピトープミニ遺伝子を、ＰＣＲを用いる３セットの反応においてオーバーラップオリゴヌクレオチドを伸長することによってアセンブリする。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ  ９６００  ＰＣＲ機を用い、そして合計３０サイクルを、以下の条件を用いて実施する：９５℃で１５秒、（各々のプライマー対の最も低い計算値Ｔｍより５℃低い）アニーリング温度で３０秒、そして７２℃で１分間。
【０５４９】
例えば、ミニ遺伝子を以下のように調製する。第一のＰＣＲ反応において、５μｇの各々２つのオリゴヌクレオチドを、アニーリングし、そして伸長する。８つのオリゴヌクレオド（すなわち、４対のプライマー）を使用する実施例において、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド４、オリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６、およびオリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド８とを、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（１×＝１０ｍＭ  ＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓクロリド（ｐＨ  ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）、０．２５ｍＭの各々のｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応物中で組み合わせる。全長二量体産物を、ゲル精製し、そして１と２および３と４との産物、５と６および７と８との産物を含む２つの反応物を混合し、アニーリングし、そして１０サイクルにわたり伸長する。次いで、２つの反応物の半分を混合し、そして隣接するプライマーを添加して、全長の産物を増幅する前に５サイクルのアニーリングおよび伸長を実施した。この全長産物を、ゲル精製し、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そして個々のクローンを配列決定によりスクリーニングする。
【０５５０】
（実施例２０：プラスミド構築およびそのプラスミドが誘導する免疫原性の程度）
プラスミド構築物（例えば、前出の実施例に従い構築されたプラスミド）が誘導し得る免疫原性の程度を、ＡＰＣによるエピトープ提示を決定し、続いてエピトープ発現核酸構築物を用いてＡＰＣを形質導入またはトランスフェクトすることによりインビトロで確認した。このような研究により「抗原性」を決定し、そしてヒトＡＰＣの使用を可能とする。このアッセイによりこの細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量することによって、Ｔ細胞により認識される状態においてＡＰＣにより提示されるエピトープの能力を決定する。定量を、ＡＰＣから溶出するペプチドの量を直接測定することにより実施し得る（例えば、Ｓｉｊｉｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：６８３〜６９２、１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：６８２〜６８４、１９８９を参照のこと）か；またはペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数を、罹患したかまたはトランスフェクトされた標的細胞により誘導された溶解物またはリンホカインの放出の量を測定し、次いで等しいレベルの溶解物またはリンホカインの放出を得るために必要なペプチドの濃度を決定することにより、評価し得る（例えば、Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５６７〜５７６、１９９５を参照のこと）。
【０５５１】
あるいは、免疫原性を、マウスへのインビボでの注射および引き続くＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性（これらの活性を、細胞障害性および細胞増殖性のアッセイ（それぞれ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１〜７６１、１９９４において詳述される）により分析する）のインビトロでの評価を介して確認する。
【０５５２】
例えば、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドを有するＤＮＡミニ遺伝子構築物がＣＴＬをインビボで誘導する能力を確認するために、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、１００μｇの裸のｃＤＮＡを用いて筋肉内で免疫する。ｃＤＮＡ免疫により誘導されたＣＴＬのレベルを比較する方法の場合、コントロール群の動物もまた、ミニ遺伝子によりコードされるような単一のポリペプチドとして合成されたマルチエピトープを含むペプチド組成物そのものを用いて免疫する。
【０５５３】
免疫した動物由来の脾臓細胞を、各々の組成物（ミニ遺伝子においてコードされるペプチドエピトープまたはポリエピトープペプチド）をそれぞれ用いて２回刺激し、次いで５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド特異的な細胞傷害性活性をアッセイする。これらの結果は、Ａ２制限エピトープに対するＣＴＬ応答の強度を示し、従ってミニ遺伝子ワクチンおよびポリペプチドワクチンのインビボでの免疫原性を示す。
【０５５４】
従って、ミニ遺伝子が、ポリエピトープペプチドワクチンが誘発するような、ＨＬＡ−Ｈ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対して指向される免疫応答を誘発することが見いだされる。同様の分析もまた、ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７のモチーフエピトープまたはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために他のＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて実施し、それにより、このミニ遺伝子が、提供されるエピトープに対して指向される適切な免疫応答を誘発することも見出す。
【０５５５】
クラスＩＩエピトープをコードするミニ遺伝子がＨＴＬをインビボで誘導する能力を確認するために、ＤＲトランスジェニックマウスか、または適切なマウスＭＨＣ分子と交叉反応するそれらのエピトープについて、例えば、Ｉ−Ａｂ−制限マウスを、１００μｇのプラスミドＤＮＡを用いて筋肉内免疫する。ＤＮＡ免疫により誘導されたＨＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール動物の群も、フロイントの完全アジュバンド中に乳化したペプチド組成物そのもので免疫する。ＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわちＨＴＬ）を、免疫した動物の脾臓細胞から精製し、そして各々の組成物（ミニ遺伝子中にコードされるペプチド）のそれぞれを用いて刺激する。ＨＴＬ応答を、３Ｈ−チミジン取り込み増殖アッセイを用いて測定する（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１〜７６１、１９９４を参照のこと）。この結果は、ＨＴＬ応答の強度を示し、従って、このミニ遺伝子のインビボでの免疫原性を実証する。
【０５５６】
前出の実施例ににおいて記載されるように構築されたＤＮＡミニ遺伝子をまた、プライムブーストプロトコル（ｐｒｉｍｅ  ｂｏｏｓｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いてブースト剤と組み合わせたワクチンとして確認し得る。このブースト剤は、組み換えタンパク質（例えば、Ｂａｒｎｅｔｔら、Ａｉｄｓ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １４、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３：Ｓ２９９〜Ｓ３０９、１９９８）または例えば、完全な目的のタンパク質をコードするミニ遺伝子またはＤＮＡを発現する組み換えワクチン（例えば、Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：４３９〜４４５、１９９８；Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：７６４８〜５３、１９９８；ＨａｎｋｅおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６６：１７７〜１８１、１９９９；ならびにＲｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：５２６〜３４、１９９９を参照のこと）からなり得る。
【０５５７】
例えば、プライムブーストプロトコルにて用いられるＤＮＡミニ遺伝子の有効性を、最初に、トランスジェニックマウスにおいて評価する。本実施例において、Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、免疫原性ペプチド（少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを保有するペプチドを含む）をコードする１００μｇのＤＮＡミニ遺伝子でＩＭ免疫する。インキュベーション期間の後（３〜９週間の範囲をとる）、このマウスを、ＤＮＡミニ遺伝子によりコードされる同じ配列を発現する１０７ｐｆｕ／マウス一匹の組み換えワクシニアウイルスを用いてＩＰでブーストする。コントロールマウスを、ミニ遺伝子配列を有さない１００ｍｇのＤＮＡもしくは組み換えワクシニアをもちいるか、またはこのミニ遺伝子をコードするＤＮＡを用いるが、ワクシニアブーストを伴わずに免疫する。２週間のさらなるインキュベーション期間の後、このマウスの脾臓細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的な活性について直ぐにアッセイする。さらに、脾臓細胞を、ミニ遺伝子中にコードされるＡ２制限ペプチドエピトープおよび組み換えワクシニアを用いてインビトロで刺激し、次いでαＩＦＮ  ＥＬＩＳＡ、βＩＦＮ  ＥＬＩＳＡ、およびγＩＦＮ  ＥＬＩＳＡにおいてペプチド特異的な活性についてアッセイする。
【０５５８】
プライムブーストプロトコルにおいて使用されるミニ遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドに対してＤＮＡ単独より高い免疫応答を誘発することが見出される。そのような分析をまた、ＨＬＡ−Ａ３またはＨＬＡ−Ｂ７のモチーフエピトープまたはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために、ＨＬＡ−ＡＩＩトランスジェニックマウスモデルまたはＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて実施し得る。ヒトにおけるプライムブーストプロトコルの使用を、「プライムブーストプロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導」と題した以下の実施例において記載する。
【０５５９】
（実施例２１：予防使用のためのペプチド組成物）
本発明のワクチン組成物を、この抗原を保有する腫瘍についての危険性を有するヒトにおける１０１Ｐ３Ａ１１発現を予防するために使用し得る。例えば、上記実施例において選択されるエピトープのような複合的ＣＴＬおよびＨＴＬのエピトープを含むポリエピトープペプチドエピトープ組成物（またはポリエピトープペプチドエピトープをコードする核酸）（これらはまた、集団の８０％より多くを標的化するように選択される）を、１０１Ｐ３Ａ１１関連腫瘍についての危険性がある個体に投与する。
【０５６０】
例えば、ペプチドベースの組成物を、マルチエピトープを包含する単一のポリペプチドとして提供する。代表的には、アジュバント（例えば、フロイントの不完全アジュバンド）を含む生理学的溶液中にワクチンを投与する。最初の免疫のためのペプチド容量は、７０ｋｇの患者について約１μｇ〜約５０，０００μｇであり、一般的には１００μｇ〜５，０００μｇである。ワクチンの最初の投与に引き続いて、４週間でブースター投与をし、さらに引き続いてＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的ＣＴＬ集団の存在を決定する技術により患者における免疫応答の強度の評価をする。さらなるブースター容量を、必要とされるように投与する。この組成物が、安全でありかつ１０１Ｐ３Ａ１１関連疾患に対する予防薬として効果的の両方であることが見出される。
【０５６１】
あるいは、代表的にトランスフェクト薬剤を含む組成物を、当該分野において公知の方法論および本明細書中で開示される方法論に従い、核酸ベースのワクチンの投与によって使用する。
【０５６２】
（実施例２２：ネイティブの１０１Ｐ３Ａ１１配列由来のポリエピトープワクチン組成物）
ネイティブの１０１Ｐ３Ａ１１ポリタンパク質配列を、好ましくはマルチエピトープを含むポリタンパク質の「比較的短い」領域を同定するために、各々のクラスＩおよび／またはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフについて規定されるコンピューターアルゴリズムを用いて分析する。好ましくは、この「比較的短い」領域は、全長のネイティブの抗原の長さより短い。複数の別個またはオーバーラップする「組み込まれた（ｎｅｓｔｅｄ）」エピトープを含むこの比較的短い領域を、ミニ遺伝子構築物を作製するために使用し得る。この構築物を、ネイティブのタンパク質配列に対応するペプチドを発現するように操作する。この「相対的に短い」ペプチドは、一般的に２５０アミノ酸長未満であり、しばしば１００アミノ酸長未満であり、好ましくは７５アミノ酸長未満であり、より好ましくは５０アミノ酸長未満である。このワクチン組成物のタンパク質配列は、この配列中に含有される最大数のエピトープを有する（すなわち、それは、高濃度のエピトープを有する）ので、このワクチン組成物のタンパク質配列を選択する。本明細書中に示されるように、エピトープモチーフは、組み込まれていても、オーバーラップしてもよい（すなわち、互いに対してフレームが移動する）。例えば、オーバーラップエピトープにおいて、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸のペプチド中に存在し得る。そのようなワクチン組成物を、治療目的または予防目的のために投与する。
【０５６３】
このワクチン組成物としては、例えば、１０１Ｐ３Ａ１１抗原由来の複合ＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープが挙げられる。このポリエピトープネイティブ配列を、ペプチドとしてかまたはこのペプチドをコードする核酸配列としてかのいずれかを投与する。あるいは、アナログを、そのネイティブ配列から作製し得、それにより１つ以上のエピトープが、そのポリエピトープペプチドの交叉反応性および／結合親和性特性を変化する置換を含む。
【０５６４】
本実施例の実施形態は、免疫系プロセシングのなお開発されていない局面が、ネイティブの組み込まれた配列に適合し、それにより治療的または予防的免疫応答を誘導するワクチン組成物の産生を用意にする可能性を提供する。さらに、そのような実施形態は、現在未知のＨＬＡ構造についてのモチーフ含有エピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（類似の実施形態を除く）は、ネイティブの１０１Ｐ３Ａ１１中に実際に存在する複数のペプチド配列に対する免疫応答に関し、従って、任意の接合するエピトープを評価する必要性を除外する。最後に、この実施形態は、ペプチドワクチン組成物または核酸ワクチン組成物を産生する場合の規模の節約を提供する。
【０５６５】
この実施形態に関して、標的配列において、配列長あたり最も多数のエピトープを同定するために使用され得るコンピュータープログラムが、当該分野において利用可能である。
【０５６６】
（実施例２３：複数の抗原由来のポリエピトープワクチン組成物）
本発明の１０１Ｐ３Ａ１１ペプチドエピトープを、他の標的腫瘍関連抗原由来のエピトープと組み合わせて使用して、１０１Ｐ３Ａ１１およびそのような他の抗原を発現する癌の予防および処置に有用なワクチン組成物を作製する。例えば、ワクチン組成物を、１０１Ｐ３Ａ１１発現に関連する標的の癌でしばしば発現される１０１Ｐ３Ａ１１および腫瘍関連抗原由来のマルチエピトープを組み込む単一のポリペプチドとして提供し得るか、または１つ以上の別個のエピトープのカクテルを含む組成物として投与し得る。あるいは、このワクチンを、ミニ遺伝子構築物またはインビトロでペプチドエピトープを充填した樹状細胞として投与し得る。
【０５６７】
（実施例２４：免疫応答を評価するためのペプチドの使用）
本発明のペプチドを、１０１Ｐ３Ａ１１に関連する特定の抗体、ＣＴＬまたはＨＴＬの存在についての免疫応答を分析するために使用し得る。そのような分析を、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：２１０３〜２１０６、１９９８に記載される様式で実施し得る。本実施例において、本発明に従うペプチドを、診断または予防目的のための試薬として（免疫原としてではなく）使用する。
【０５６８】
本実施例において、高度に感受性なヒト白血病抗原四量複合体（「四量体））を、例えば、疾患の異なる病期またはＡ＊０２０１モチーフを含む１０１Ｐ３Ａ１１ペプチドを含む免疫後でのＨＬＡ  Ａ＊０２０１陽性の個体由来の１０１Ｐ３Ａ１１ＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ頻度の断面解析のために使用する。四量複合体を、上記のように（Ｍｕｓｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１２６７、１９９７）合成する。簡単には、精製したＨＬＡ重鎖（本実施例におけるＡ＊０２０１）およびβ２−ミクログロブリンを、原核生物発現系の手段によって合成する。この重鎖を、膜貫通の細胞質ゾルテイルの欠失およびＢｉｒＡ酵素ビオチン化部位を含む配列のＣＯＯＨ末端付加により修飾する。重鎖、β２−ミクログロブリン、およびペプチドを、希釈により再折り畳みをする。この４５ｋＤの再折り畳み産物を、高速タンパク質液体クロマトフラフィーを用いて単離し、次いでビオチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、アデノシン５’三リン酸およびマグネシウムの存在下でＢｉｒＡによりビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリスリン結合体を、１：４のモル比で添加し、四量体産物を１ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。得られた産物を、四量体フェコエリスリンという。
【０５６９】
患者の血液サンプルの分析のために、約１００万のＰＢＭＣを、３００ｇで５分間遠心分離し、５０μｌの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する。三色分析を、抗ＣＤ８トリカラー（Ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、および抗ＣＤ３８と共に四量体フィコエリスリンを用いて実施する。ＰＢＭＣを、氷上で四量体および抗体と共に３０〜６０分間インキュベートし、次いでホルムアルデヒド固定の前に２回洗浄する。９９．９８％より高いコントロールサンプルを含むようなＧａｔｅを適用する。四量体についてのコントロールは、Ａ＊０２０１陰性の個体およびＡ＊０２０１陽性の罹患していないドナーの両方を含む。次いで、四量体を有する染色された細胞の百分率を、フローサイトメトリーを用いて決定する。この結果は、エピトープ制限ＣＴＬを含むＰＢＭＣサンプル中の細胞の数を示し、これにより１０１Ｐ３Ａ１１エピトープに対する免疫応答の程度、従って、１０１Ｐ３Ａ１１への曝露、または予防的または治療的応答を誘発するワクチンへの曝露の状態を容易に示す。
【０５７０】
（実施例２５：リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を評価するためのペプチドエピトープの使用）
本発明のペプチドエピトープを、患者におけるＴ細胞応答（例えば、急性またはリコール応答）を評価するための試薬として使用する。そのような分析を、１０１Ｐ３Ａ１１関連疾患から回復した患者または１０１Ｐ３Ａ１１ワクチンでワクチン接種した患者において実施し得る。
【０５７１】
例えば、ワクチン接種したヒトのクラスＩ制限ＣＴＬ応答を分析し得る。このワクチンは、任意の１０１Ｐ３Ａ１１ワクチンでよい。ＰＢＭＣを、ワクチン接種した個体およびＨＬＡ型の個体から回収する。次いで、複合的ＨＬＡスーパータイプファミリーメンバーに交叉反応性を提供するためのスーパーモチーフを最適に保有する本発明の適切なペプチドエピトープを、ＨＬＡ型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する。
【０５７２】
ワクチン接種した個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）上で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３回洗浄し、熱で不働化した１００％のヒトＡＢ血清を含むＬ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびＨｅｐｅｓ（１０ｍＭ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（完全ＲＰＭＩ）中に再懸濁し、マイクロ培養形式を用いてプレートする。本発明のエピトープを含む合成ペプチドを、各々のウェルに１０μｇ／ｍｌで添加し、そしてＨＢＶコア１２８〜１４０エピトープを、刺激の第一週目の間、Ｔ細胞ヘルプの供給源として各々のウェルに１μｇ／ｍｌ添加する。
【０５７３】
マイクロ培養形式において、４×１０５ＰＢＭＣを、１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩの９６ウェルの丸底プレート中の８つの複製培養中のペプチドで刺激する。３日目および１０日目に、１００μｌの完全ＲＰＭＩおよび２０Ｕ／ｍｌの最終濃度のｒＩＬ−２を、各々のウェルに添加する。７日目に、この培養物を、９６ウェルの平底プレートに移し、そしてペプチド、ｒＩＬ−２および１０５の放射性（３，０００ｒａｄ）の自己フィーダー細胞を用いて再刺激する。この培養物を、１４日目に細胞傷害性について試験する。陽性ＣＴＬ応答は、以前に記載されるような（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：１１０４、１１０８、１９９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５５〜１６６５、１９９６；およびＲｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１４３２〜１４４０、１９９６）罹患していないコントロール被検体との比較に基づいて、８つの複製培養物のうち２つ以上が１０％より多い特異的５１Ｃｒ放出を示すことを必要とする。
【０５７４】
標的細胞株は、自己由来であり、そして同種異系のＥＢＶ形質転換したＢ−ＬＣＬであり、これらは、両方Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＳＨＩ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入されたか、または記載されるように（Ｇｕｉｌｈｏｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２６７０〜２６７８、１９９２）患者のプールから確立されるかのいずれかである。
【０５７５】
細胞傷害性アッセイを、以下の様式で実施する。標的細胞は、自己由来のＨＬＡに適合するＢリンパ芽球細胞株または自己由来のＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株のいずれかからなり、これらを、１０μＭでの本発明の合成ペプチドエピトープと共に一晩インキュベートし、そして１００μＣｉの５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて１時間にわたり標識し、その後これらを、ＨＢＳＳを用いて４回洗浄する。
【０５７６】
細胞傷害活性を、３，０００標的／ウェルを含むＵ底の９６ウェルプレートを用いる標準的な４時間の、別々のウェルの５１Ｃｒ放出アッセイにおいて決定する。刺激されたＰＢＭＣを、２０〜５０：１のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）の比率で１４日目に試験する。細胞傷害性％を、式：１００×［（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）］から決定する。最大放出を、界面活性剤（２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）による標的の溶解により決定する。自発的放出は、全ての実験について最大放出の２５％未満である。
【０５７７】
このような分析の結果は、ＨＬＡ制限ＣＴＬ集団が、上記の１０１Ｐ３Ａ１１または１０１Ｐ３Ａ１１ワクチンへの曝露により刺激される程度を示す。
【０５７８】
同様に、クラスＩＩ制限ＨＴＬ応答もまた分析し得る。精製されたＰＢＭＣを、１．５×１０５細胞／ウェルでの９６ウェルの平底プレート中で、１０μｇ／ｍｌの本発明の合成ペプチド、全長１０１Ｐ３Ａ１１抗原、またはＰＨＡを用いて刺激する。細胞を、各々の条件について４〜６ウェルの重複で慣用的にプレートする。７日間の培養の後、培地を除去し、そして１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新しい培地と置換する。２日後、１μＣｉの３Ｈチミジンを、各々のウェルに添加し、そしてさらに１８日間にわたりインキュベーションを続ける。次いで、細胞ＤＮＡを、グラスファイバーマット上に回収し、そして３Ｈチミジン取り込みについて分析する。抗原特異的Ｔ細胞増殖を、抗原の存在下での３Ｈチミジン取り込みを抗原の非存在下での３Ｈチミジン取り込みで割った比として計算する。
【０５７９】
（実施例２６：ヒトにおける特異的ＣＴＬ応答の誘導）
本発明のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物についてのヒト臨床試験を、ＩＮＤフェーズＩ、容量上昇研究として設定し、そして無作為化した二重盲検偽薬制御試験として実施する。そのような試験を、例えば、以下のように設計した：
全体で約２７人の個体を登録し、そして３つのグループに分ける。
【０５８０】
グループＩ：３人の被検体に偽薬を注射し、そして６人の被検体に５μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩ：３人の被検体に偽薬を注射し、そして６人の被検体に５０μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩＩ：３人の被検体に偽薬を注射し、そして６人の被検体に５００μｇのペプチド組成物を注射する。
【０５８１】
最初の注射の４週間後に、全ての被検体に同じ投与量でブースター接種した。
【０５８２】
この研究において測定される終点は、このペプチド組成物の安全性および安定性、ならびにその免疫原性に関連する。このペプチドに対する細胞性免疫応答は、このペプチド組成物の固有の活性の指標であり、従って生物学的有効性の尺度として見られ得る。
【０５８３】
以下は、安全性および有効性の終点に関する臨床データおよび研究室データを要約する。
【０５８４】
安全性：有害な事象の影響を、偽薬処置群および薬物処置群においてモニターし、そしてその程度および可逆性をもって評価する。
【０５８５】
ワクチン有効性の評価：ワクチン有効性の評価のために、注射前後に、被検体から採血する。末梢血液単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により新しいヘパリン化血液から単離し、凍結媒体中にアリコート化し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０５８６】
ワクチンが、安全でありかつ有効の両方であることが見出される。
【０５８７】
（実施例２７：１０１Ｐ３Ａ１１を発現する患者における病期ＩＩ試験）
病期ＩＩ試験を、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌を有する患者へのＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物の投与の有効性を研究するために実施する。この試験の主要な目的は、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌患者においてＣＴＬを誘導するために有効な容量とレジメンを決定すること、これらの患者においてＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答を誘導することの安全性を確立すること、ならびに、どの程度のＣＴＬの活性化が、明らかになるような、これらの患者の臨床像を改善するかをみること（例えば、病巣の減少および／または萎縮により）である。このような研究を、例えば、以下のように設計する。
【０５８８】
この研究を、複数の中枢において実施する。この試験の設計は、オープンラベル（ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ）、未制御、容量上昇プロトコルであり、ここで、このペプチド組成物を、単回容量として投与し、続いて、６週間後に同じ容量の単回のブースター注射を行う。この投与量は、注射一回あたり５０μｇ、５００μｇ、および５，０００μｇである。薬物関連の有害な効果（重篤度および可逆性）を記録する。
【０５８９】
３つの患者のグループ分けをする。第一のグループに５０μｇのこのペプチド組成物を注射し、第二および第三のグループにそれぞれ、５００μｇおよび５，０００μｇのペプチド組成物を注射する。各々のグループの患者は、２１歳〜６５歳の範囲であり、そして種々の民族的バックグラウンドを示す。彼らの全ては、１０１Ｐ３Ａ１１発現する腫瘍を有する。
【０５９０】
臨床的発現または抗原特異的Ｔ細胞応答を、このペプチド組成物を投与することの効果を評価するためにモニタリングする。このワクチン組成物が、１０１Ｐ３Ａ１１関連疾患の処置において安全かつ有効の両方であることが見出される。
【０５９１】
（実施例２８：プライムブーストプロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導）
「プラスミド構築物およびそれが誘導する免疫原性の程度」と題された上記実施例において記載されるようなトランスジェニックマウスにおけるＤＮＡワクチンの有効性を確認するために使用される原理の根底にある原理に類似するプライムブーストプロトコルをまた、ヒトにワクチンを投与するために使用し得る。そのようなワクチンレジメンは、例えば、裸のＤＮＡの最初の投与と、引き続くそのワクチンをコードする組み換えウイルスを用いるブースト、またはアジュバント中の組み換えタンパク質／ポリペプチドもしくはペプチド混合物の投与を含み得る。
【０５９２】
例えば、最初の免疫を、発現ベクター（例えば、「「ミニ遺伝子」マルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築」と題した実施例において構築されるような発現ベクター）を、複数の部位で０．５ｍｇ〜５ｍｇの量でＩＭ（またはＳＣまたはＩＤ）投与される裸の核酸の形態で用いて実施し得る。この核酸（０．１μｇ〜１０００μｇ）をまた、遺伝子ガンを用いて投与し得る。３〜４週間のインキュベーション期間の後、次いで、ブースター容量を投与する。このブースターは、５×１０７ｐｆｕ〜５×１０９ｐｆｕの容量で投与される組み換え鶏痘ウイルスであり得る。代替的な組み換えウイルス（例えば、ＭＶＡウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）をまた、ブースターのために使用し得るか、またはポリエピトープタンパク質もしくはこれらのペプチドの混合物を投与し得る。ワクチン有効性の評価のために、免疫前ならびに最初のワクチンおよびブースター容量の投与後間隔を空けて患者の血液サンプルを得る。抹消血液単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により新しいヘパリン化血液から単離し、凍結培体中にアリコート化し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０５９３】
これらの結果の分析は、１０１Ｐ３Ａ１１に対する治療的免疫または保護免疫を達成するのに十分な強度の応答が産生されることを示す。
【０５９４】
（実施例２９：樹状細胞（ＤＣ）を用いるワクチン組成物の投与）
本発明のペプチドエピトープを含むワクチンを、ＡＰＣまたは「プロフェッショナル」ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を用いて投与し得る。本実施例において、ペプチドパルスされたＤＣを、患者に投与して、インビボでのＣＴＬ応答を刺激する。この方法において、樹状細胞を、単離し、伸長させ、そして本発明のペプチドＣＴＬエピトープおよびペプチドＨＴＬエピトープを含むワクチンでパルスする。これらの樹状細胞を患者に注入して戻し、インビボでＣＴＬ応答およびＨＬＴ応答を誘発させる。次いで、誘導されたＣＴＬおよびＨＴＬは、このワクチンおけるエピトープが由来する１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質を保有する標的細胞をそれぞれ破壊するか、または破壊を促進する。
【０５９５】
例えば、エピトープを含むペプチドのカクテルを、ＰＢＭＣにエキソビボで投与するか、またはそれからＤＣを単離する。ＤＣの回収を容易にするための医薬（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）を用い得る。ペプチドを用いてＤＣをパルスした後、および患者への再注入の前に、このＤＣを洗浄して、結合していないペプチドを除去する。
【０５９６】
臨床的に理解され、そして臨床的結果に基づいて当業者により容易に決定されるように、患者に再注入されるＤＣの数は変化し得る（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：３２８、１９９８；Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２：５２、１９９６およびＰｒｏｓｔａｔｅ  ３２：２７２、１９９７を参照のこと）。患者１人あたり２〜５０×１０６ＤＣを代表的に投与するが、より多い数のＤＣ（例えば、１０７または１０８もまた、提供し得る。そのような細胞集団は、代表的に、５０％〜９０％の間のＤＣを含む。
【０５９７】
いくつかの実施形態において、ペプチド充填されたＰＢＭＣを、ＤＣを精製することなく患者に注射する。例えば、薬剤（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ）での処理の後に産生されたＰＢＭＣを、ＤＣを精製することなく患者に注射する。投与するＰＢＭＣの総数は、しばしば、１０８〜１０１０の範囲をとる。一般的に、患者に注射する細胞容量は、例えば、特異的な抗ＤＣ抗体を用いる免疫蛍光分析により決定されるような、各々の患者の血液中のＤＣのパーセンテージに基づく。従って、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭが所定の患者の末梢血液中の２％のＤＣを起動させ（ｍｏｂｉｌｉｚｅ）、そしてその患者が５×１０６ＤＣを受容している場合、この患者に、合計２．５×１０８ペプチドを充填したＰＢＭＣを注射する。薬剤（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ）により起動したＤＣ％は、代表的に、２〜１０％の間であると評価されるが、当業者に理解されるように変化し得る。
【０５９８】
（エキソビボでのＣＴＬ／ＨＴＬ応答の活性化）
あるいは、エキソビボの１０１Ｐ３Ａ１１抗原に対するＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、ＤＣのようなＡＰＣの供給源および免疫原性ペプチドと共に、患者の、または遺伝的に適合性のＣＴＬまたはＨＴＬ前駆体細胞を、組織培養中でインキュベーションすることによって誘導され得る。適切なインキュベーション時間（典型的には約７〜２８日間）後、その前駆該細胞は活性化され、そしてエフェクター細胞中に拡大された。このエフェクター細胞は患者中に注入され、特異的標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）かまたは破壊を促進する（ＨＴＬ）。
【０５９９】
（実施例３０：モチーフ保有ペプチドの同定および確認の代替方法）
モチーフ保有ペプチドを同定および確認する別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を保有する細胞からそのペプチドを溶出することである。例えば、ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株を使用して、ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株が発現するＨＬＡ分子を決定するように広範に特徴付けられた組織型決定をする。特定の場合において、これらの細胞は、ＨＬＡ分子の単一型のみを発現する。これらの細胞は、目的の抗原（例えば、１０１Ｐ３Ａ１１）を発現する核酸でトランスフェクトされ得る。次いで、トランスフェクトの結果として産生されるペプチドの内在性抗原プロセシングによって産生されるペプチドを細胞内のＨＬＡ分子に結合させ、そして輸送されて細胞表面に提示させる。次いで、温和な酸条件にさらすことによって、ペプチドをＨＬＡ分子から溶出し、そしてこれらのアミノ酸配列を決定した（例えば、質量分析器（例えば、Ｋｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３，１９９４）を使用して）。特定のＨＬＡ分子に結合するペプチドの大部分はモチーフを保有しているために、これは、細胞上で発現される特定のＨＬＡ分子と関連するモチーフ保有ペプチドを得るための代替の様式である。
【０６００】
あるいは、内在性ＨＬＡ分子を発現しない細胞株は、単一のＨＬＡ対立遺伝子をコードする発現構築物でトランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、記載されるように使用され得る（すなわち、これらの細胞は、細胞表面上に提示される１０１Ｐ３Ａ１１に対応するペプチドを単離するために、１０１Ｐ３Ａ１１をコードする核酸でトランスフェクトされ得る）。このような分析から得られたペプチドは、細胞中で発現される単一のＨＬＡ対立遺伝子への結合に対応するモチーフを保有する。
【０６０１】
当業者に理解されるように、１つより多いＨＬＡ対立遺伝子を保有する細胞における同様の分析、そしてそれに続く発現された各々のＨＬＡ対立遺伝子に対して特異的なペプチドの決定が実施され得る。さらに、当業者はまた、タンパク質抗原でのローディングのようなトランスフェクション以外の手段もまた、細胞に対する抗原供給源の提供のために使用され得ることを認識する。
【０６０２】
（実施例３１：相補ポリヌクレオチド）
１０１Ｐ３Ａ１１コード配列またはその任意の部分に相補的な配列を使用して天然に存在する１０１Ｐ３Ａ１１の発現の検出、減少、または阻害を行なった。約１５〜３０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの使用が記載されるが、実質的には、より小さい配列フラグメントまたはより大きい配列フラグメントを用いて同一の手段を使用する。適切なオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および１０１Ｐ３Ａ１１のコード配列を使用して設計される。転写を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを、最も独特な５’側配列から設計し、そしてその相補オリゴヌクレオチドを使用して、コード配列へのプロモーターの結合を阻止する。翻訳を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを設計して、１０１Ｐ３Ａ１１をコードする転写物へのリボソーム結合を阻止する。
【０６０３】
（実施例３２：１０１Ｐ３Ａ１１特異的抗体を使用する、天然に存在する１０１Ｐ３Ａ１１または組換え１０１Ｐ３Ａ１１の精製）  
天然に存在する１０１Ｐ３Ａ１１または組換え１０１Ｐ３Ａ１１は、１０１Ｐ３Ａ１１に特異的な抗体を使用して、免疫親和性クロマトグラフィーによって実質的に精製される。免疫親和性カラムを、活性化されたクロマトグラフィー樹脂（例えば、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））に抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を共有結合させることによって構築する。この結合後、樹脂をブロックし、そして製造者の指示にしたがって洗浄した。
【０６０４】
１０１Ｐ３Ａ１１を含む培地を、免疫親和性カラムを通過させ、そしてそのカラムを１０１Ｐ３Ａ１１を優先的に吸着する条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度緩衝液）で洗浄した。このカラムを、抗体／１０１Ｐ３Ａ１１の結合を妨害する条件下（例えば、ｐＨ２〜ｐＨ３の緩衝液、または高濃度のカオトロープ（例えば、尿素またはチオシアネートイオン））で溶出し、そしてＧＣＲ．Ｐを回収する。
【０６０５】
（実施例３３：１０１Ｐ３Ａ１１と相互作用する分子の同定）  
１０１Ｐ３Ａ１１または生物学的に活性なそのフラグメントを、１２１  １Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（例えば、Ｂｏｌｔｏｎら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５２９．を参照のこと）で標識する。マルチウエルプレートのウェル中に事前に並べられた候補分子を、標識した１０１Ｐ３Ａ１１でインキュベートし、洗浄し、そして標識した１０１Ｐ３Ａ１１複合体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度の１０１Ｐ３Ａ１１を使用して得られたデータを使用して、１０１Ｐ３Ａ１１の数、親和性、および１０１Ｐ３Ａ１１と候補分子との会合の値を算出する。
【０６０６】
（実施例３４：１０１Ｐ３Ａ１１腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ）
腫瘍細胞増殖に対する１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の効果を、前立腺、腎臓、結腸、および膀胱を含む種々の癌細胞中での遺伝子の過剰発現によってインビボで確認し得る。例えば、ＳＣＩＤマウスに、１×１０６個の前立腺癌細胞、腎臓癌細胞、結腸癌細胞または膀胱癌細胞（例えば、ＰＣ３細胞、ＬＮＣａＰ細胞、ＳＣａＢＥＲ細胞、ＵＭ−ＵＣ−３細胞、ＳＫ−ＣＯ細胞、Ｃａｃｏ細胞、ＲＴ４細胞、Ｔ２４細胞、Ｃａｋｉ細胞、Ａ−４９８細胞およびＳＷ８３９細胞）（ｔｋＮｅｏエンプティ−ベクター（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）または１０１Ｐ３Ａ１１を含む）を、側腹部に皮下注射し得る。
【０６０７】
以下の少なくとも２つのストラテジーを使用し得る：
（１）ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（ＵＫ２，２１１，５０４（１９８９年７月５日公開））、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムまたは異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）（これらのプロモーターが宿主細胞系と適合性である限り）から得られる構築プロモーターのようなプロモーターの制御下での構成的１０１Ｐ３Ａ１１の発現。
【０６０８】
（２）誘導性ベクター系（例えば、エクジソン、ｔｅｔなど）の制御下での調節された発現を使用し得る（これらのプロモーターが宿主細胞系と適合性である限り）。次いで、腫瘍体積を、明らかな腫瘍の出現においてモニターし、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞がより早い速度で増殖し、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞によって産生される腫瘍が変化された病原力（例えば、増強された転移、血管新生、化学療法薬物に対する減少された応答）の特徴を示すことを確証する時間続ける。図２１は、コントロールである３Ｔ３−ｎｅｏと３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞との皮下の増殖を比較している。ｎｅｏまたは１０１Ｐ３Ａ１１を安定に発現する１００万個の細胞を、マトリゲルと共に、ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍容積をカリパー測定によって評価した。この実験は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中の１０１Ｐ３Ａ１１の発現が、６匹中６匹のマウスにおいて腫瘍形成を誘導することを示す。Ｒａｓのような強力な発癌遺伝子の影響と１０１Ｐ３Ａ１１の影響を比較する実験において、本発明者らは、１０１Ｐ３Ａ１１が、より迅速かつ積極的な様式で３Ｔ３細胞の腫瘍増殖を誘導することを示した（１２Ｖ−Ｒａｓ（図Ｍ８））。この結果は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現が、インビボでの腫瘍形成を誘導するのに十分であることを示した。図４２は、１０１Ｐ３Ａ１１が、腫瘍の同所性増殖を誘導することを示す。さらに、１０１Ｐ３Ａ１１が、前立腺において局所的に増殖する効果、またはその細胞が転移（特に、肺またはリンパ節に）するための能力を有しているかを決定するために、ＳＣＩＤマウスに、前立腺中に同一の３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を移植した。この実験（図Ｍ１０）は、コントロールである３Ｔ３−ｎｅｏ細胞は、ＳＣＩＤマウスの前立腺において腫瘍形成を誘導しなかったが、有意な腫瘍増殖が１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞中で見られたことを示す。類似の様式において、細胞は、膀胱、結腸または腎臓中に同所的に移植され得る（Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ  １０：１０７３−１０７８；Ｆｕ，Ｘ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９１．４９：ｐ．９３８−９３９；Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９７．１７：ｐ．３２３９−３２４２；Ｐｅｒａｌｔａ，Ｅ．Ａ．ら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１９９９．１６２：ｐ．１８０６−１８１１）。１０１Ｐ３Ａ１１の腫瘍増強効果はまた、１０１Ｐ３Ａ１１がＰＣ３のような前立腺癌細胞中で発現され、そしてＳＣＩＤマウスの前立腺へ導入された場合に観察された（図Ｍ１１）。コントロール細胞と比較して、腫瘍重量の２．５倍の増加が、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する腫瘍において観察される。
【０６０９】
１０１Ｐ３Ａ１１の発現はまた、ＳＣＩＤマウスの脛骨中での腫瘍増殖および進行を増強する。臨床的な研究は、前立腺癌が、骨へ転位し得ることを繰り返し示している。骨における骨屈性および腫瘍増殖への１０１Ｐ３Ａ１１の寄与を調査するために、コントロール細胞および１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞をＳＣＩＤマウスの脛骨中で腫瘍増殖を誘導する能力について比較した。図Ｍ１４およびＭ１５の実験は、３Ｔ３またはＰＣ３細胞を発現する１０１Ｐ３Ａ１１の、ＳＣＩＤマウスの骨への注射が、コントロール細胞と比較して、腫瘍増殖および腫瘍形成の増加を生じることを示す。
【０６１０】
さらに、これらのアッセイは、例えば、１０１Ｐ３Ａ１１抗体または１０１Ｐ３Ａ１１内体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、および１０１Ｐ３Ａ１１アンチセンス分子もしくはリボザイム、または１０１Ｐ３Ａ１１指向性低分子のような候補治療組成物の抗１０１Ｐ３Ａ１１阻害効果を確認するために有用である。図２２において、本発明者らは、３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞による腫瘍形成における低分子、百日咳毒素（ＰＴＸ）の影響を示す。この実験において、ＳＣＩＤマウスを３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１単独でまたはＰＴＸと組み合わせて注射した。それぞれのマウスに３〜４日の間隔で、５用量のＰＴＸを与えた。腫瘍体積をカリパー測定によって評価した。図２２は、ＰＴＸが、用量依存性様式で腫瘍増殖を阻害することを示す。より短い間隔でのＰＴＸの送達（例えば、１週間に５回）は、より大きい割合の腫瘍増殖阻害を生じる（２５日後に腫瘍増殖の７０％の阻害が観察された）（図Ｍ９）。同様に、Ｇプロテインインヒビタースラミンでの処理は、３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１腫瘍の増殖を阻害する（図Ｍ１３）。１０１Ｐ３Ａ１１が腫瘍増殖において重要な役割を果たすことを示しているのに加え、図２１、２２およびＭ９は、１０１Ｐ３Ａ１１と関連するシグナル伝達経路を同定し、そして１０１Ｐ３Ａ１１が、アデニル化シクラーゼ依存性経路を活性化することによって腫瘍増殖におけるその効果を生じることを示す。
【０６１１】
（実施例３５：インビボにおける腫瘍の１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体媒介性阻害）
癌組織における１０１Ｐ３Ａ１１の有意な発現、および正常組織におけるその制限された発現は、１０１Ｐ３Ａ１１を、抗体治療の優れた標的にする。モノクローナル抗体標的が１０１Ｐ３Ａ１１のような細胞表面タンパク質である場合において、抗体は、腫瘍増殖の阻害において効果的であることが示されている（例えば、Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ  １０：１０７３−１０７８またはｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５１６２４６９８を参照のこと）。標的が前立腺癌中のＰＳＡおよびＰＡＰのような細胞表面上にない場合において、抗体はまた、これらのタンパク質を発現する細胞の増殖を認識し、阻害することも示されている（Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．Ｃ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９９．１８：４３７−４４９）。制限された発現プロフィールを有する任意の細胞タンパク質のように、１０１Ｐ３Ａ１１は、Ｔ細胞ベースの免疫療法のための標的である。
【０６１２】
したがって、ヒト結腸、腎臓、膀胱および前立腺癌のマウスモデルにおける抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂの治療効果は、１０１Ｐ３Ａ１１を発現するように操作された、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する腎臓、結腸、膀胱、または前立腺癌異種移植片または癌細胞株（表題「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  １０１Ｐ３Ａ１１  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ」の実施例において記載されるような細胞株）においてモデル化される。
【０６１３】
腫瘍増殖および転移形成における抗体効果は、例えば、マウスの同所性前立腺癌、結腸癌、膀胱癌または腎臓癌異種移植片モデルにおいて確認される。この抗体は、当業者に理解されるような治療様式と組み合わせられ得ないか、または組み合わせられ得る。抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂが、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する腎臓、結腸、膀胱および前立腺腫瘍の形成を阻害することが確認される。抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂはまた、確立された同所性腫瘍の増殖を遅らせ、そして腫瘍保有マウスの生存を延長させる。これらの結果は、癌の局在的段階および進行した段階の処置における抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂの有効性を示す（例えば、Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ  １０：１０７３−１０７８またはｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５１６２４６９８を参照のこと）。
【０６１４】
抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂの投与は、確立された同所性腫瘍増殖を遅らせ、そして離れた部位への転位を阻害し、腫瘍保有マウスの生存の有意な延長を生じる。これらの研究は、１０１Ｐ３Ａ１１が、免疫治療のための魅力的な標的であることを示し、そして局所性および転移性の腎臓癌、結腸癌、膀胱癌および前立腺癌の処置のための抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂの治療可能性を示す。同様の研究は、１０１Ｐ３Ａ１１が、手術、放射線治療、ホルモン療法または化学療法のようなタンパク質の治療様式と組み合わせて使用される場合に、安全でありかつ有効であることを示す。
【０６１５】
この実施例は、ＳＣＩＤマウス中で増殖されるヒト膀胱腫瘍の増殖を阻害するために、非結合体化１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体の有効であることを示し；したがって、これらの有効なモノクローナル抗体の組み合わせがまた、有効である。
【０６１６】
（複数の非結合体化１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂを使用する腫瘍阻害）
（材料および方法）  
（１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体）：
モノクローナル抗体は、表題「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  １０１Ｐ３Ａ１１  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｍＡｂｓ）」の実施例に記載されるように、１０１Ｐ３Ａ１１に対して惹起される。この抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１に結合し得るそれらの能力について、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫沈降によって特徴付けられる。ＥＬＩＳＡおよびウェスタン分析によって測定されるような抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂについてのエピトープマッピングデータは、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質上のエピトープを認識する。前立腺癌組織および細胞の、これらの抗体を用いる免疫組織化学分析が実施される。
【０６１７】
モノクローナル抗体が、プロテインＧセファロースクロマトグラフィー、ＰＢＳに対する透析、フィルター滅菌、および−２０℃での貯蔵によって復水またはハイブリドーマ組織培養上清から精製される。タンパク質測定をＢｒａｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって実施する。治療モノクローナル抗体または個々のモノクローナル抗体の混合物を含むカクテルを調製し、ＵＭ−ＵＣ３、Ｊ８２、ＣａＫｉｌ、７６９Ｐ、ＣａＯｖｌまたはＰＡ１腫瘍異種移植片の皮下的または同所的な注射を受けるマウスの処置のために使用する。
【０６１８】
（細胞株）
膀胱癌、腎臓癌および卵巣癌細胞株、ＵＭ−ＵＣ３、Ｊ８２、ＣａＫｉｌ、７６９Ｐ、ＣａＯｖｌおよびＰＡ１ならびに線維芽細胞株ＮＩＨ  ３Ｔ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、Ｌ−グルタミン酸および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で維持する。
【０６１９】
ＵＭ−ＵＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１、Ｊ８２−１０１Ｐ３Ａ１１、ＣａＫｉｌ−１０１Ｐ３Ａ１１、７６９Ｐ−１０１Ｐ３Ａ１１、ＣａＯｖＩ−１０１Ｐ３Ａ１１、ＰＡ１−１０１Ｐ３Ａ１１および３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞集団を、Ｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９９．９６（２５）：１４５２３に記載されるようにレトロウイルス遺伝子の移送によって作製する。
【０６２０】
（異種移植片マウスモデル）
皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍を、雄ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１の希釈で混合された１×１０６個の癌細胞を注射することによって作製する。腫瘍形成における抗体効果を試験するために、ｉ．ｐ．抗体注射を、腫瘍細胞注射と同じ日に開始する。コントロールとして、マウスに、精製マウスＩｇＧ（ＩＣＮ）もしくはＰＢＳ；またはヒト細胞中に発現されない無関係の抗原を認識する精製モノクローナル抗体のいずれかを注射する。予備研究において、腫瘍増殖におけるマウスＩｇＧまたはＰＢＳの間に差異は見られない。腫瘍サイズは、カリパー測定によって決定され、そして腫瘍体積は、長さ×幅×高さから算出される。１．５ｃｍよりも大きい直径のｓ．ｃ．腫瘍を有するマウスを屠殺する。
【０６２１】
同所性の注射をケタミン／キシラジンを使用することによって、麻酔下で実施する。膀胱の同所性研究のために、膀胱を曝露するために腹部を切開し、そしてＭａｔｒｉｇｅｌと混合された腫瘍細胞（５×１０５個）を１０μｌ容量の膀胱壁に注射する。腫瘍増殖をモニターするために、マウスを触診し、そしてＢＴＡレベルを測定するために血液を１週間おきに回収する。腎臓および卵巣の同所性モデルのために、腎臓または卵巣を曝露するために腹筋を切開する。Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合された腫瘍細胞を、腎臓莢膜または卵巣の下に１０μｌの容量で注射する（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８，１８：３２７；Ａｈｎら，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．２００１，２２：１４６）。腫瘍増殖をモニターするために、血液を、１週間おきのＧ２５０およびＳＭ０４７レベルの測定において回収する。マウスを、ｉ．ｐ．注射される抗１０１Ｐ３Ａ１１またはコントロールｍＡｂでの適切な処置のためにグループに分ける。
【０６２２】
（抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂは、１０１Ｐ３Ａ１１発現異種移植片癌腫瘍の増殖を阻害する）
腫瘍形成に対する抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂの効果を、ＵＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１、Ｊ８２−１０１Ｐ３Ａ１１、ＣａＫｉｌ−１０１Ｐ３Ａ１１、７６９Ｐ−１０１Ｐ３Ａ１１、ＣａＯｖｌ−１０１Ｐ３Ａ１１およびＰＡ１−１０１Ｐ３Ａ１１同所性モデルを使用して、膀胱癌、腎臓癌および卵巣癌の異種移植片の増殖および進行について試験する。ｓ．ｃ．腫瘍モデルと比較して、同所性モデルは、マウスの膀胱、腎臓および卵巣における腫瘍細胞の直接的な注射を必要とし、局所的腫瘍増殖、遠位部位への転移の発達、マウスの健康の悪化、およびそれに続く死を生じる（Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ（前出）；Ｆｕ，Ｘ．ら，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９２．５２（６）：ｐ．９８７−９０；Ｋｕｂｏｔａ，Ｔ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４．５６（１）：ｐ．４−８）。この特徴は、同所性モデルをより代表的なヒトの疾患進行のモデルとし、そして臨床的に関連する終点におけるｍＡｂの治療効果をもたらすことを可能にする。
【０６２３】
従って、腫瘍細胞をマウスの膀胱、腎臓または卵巣に注射し、そして２日後、このマウスを２つのグループに分けて以下のいずれかで処理する：ａ）２００〜５００μｇの抗１０１Ｐ３Ａ１１  Ａｂ、またはｂ）ＰＢＳ（２〜５週間の間、１週間に３度）。
【０６２４】
同所性癌モデルの主要な利点は、転移の発達を研究するための能力である。確立された同所性腫瘍を保有するマウス中の転位の形成は、抗ＣＫ２０（膀胱癌について）、抗Ｇ２５０（腎臓癌について）およびＳＭ０４７抗体（卵巣癌モデルについて）のような腫瘍特異的細胞表面タンパク質に対する抗体を使用して肺切片におけるＩＨＣ分析によって研究される（Ｌｉｎ  Ｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖ．２００１；２５：２０２；ＭｃＣｌｕｇｇａｇｅ  Ｗら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２００１，３８：５４２）。
【０６２５】
確立された同所性腫瘍を保有するマウスは、４週間にわたって抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂまたはＰＢＳのいずれかの１０００μｇ注射を投与される。両方のグループのマウスは、高い全身腫瘍組織量を確立し得、マウスの肺における転移形成を確実に高頻度にさせる。次いで、マウスを殺傷し、それらの膀胱、肝臓、骨および肺をＩＨＣ分析によって腫瘍細胞の存在について分析する。
【０６２６】
これらの研究は、異種移植片マウスモデル中の前立腺癌および腎臓癌の発生および進行における、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の広範な抗腫瘍効果を示す。抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、腫瘍の腫瘍形成を阻害し、既に確立された腫瘍の増殖を遅らせ、処置されたマウスの生存を延長させる。さらに、抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂは、大きい全身腫瘍組織量の存在下でさえも局所的な膀胱腫瘍、腎臓腫瘍および卵巣腫瘍の、遠位部位への拡散に対して劇的な阻害効果を示す。従って、抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂは、主要な臨床的に関連する終点（腫瘍増殖）生存性の延長および健康に対して効果的である。
【０６２７】
（実施例３６：ヒトにおける抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の治療用途および診断用途）
抗１０１Ｐ３Ａ１１モノクローナル抗体は、ヒトにおける診断、予防、予後および／または治療目的のために安全かつ有効に使用される。抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂを有する癌組織および癌異種移植片のウェスタンブロットおよび免疫組織化学分析は、癌の強く広範な染色を示すが、正常組織においては有意に低いかまたは検出不可能なレベルを示す。癌および転移疾患における１０１Ｐ３Ａ１１の検出は、診断および／または予後のインジケーターとしてのｍＡｂの有用性のなさを示す。従って、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、疑わしい患者から癌を検出するために腎臓の生検の免疫組織化学のような診断適用において使用される。
【０６２８】
フローサイトメトリーによって測定されるように、抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＡｂは、癌細胞に特異的に結合する。従って、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現を示す局在化された癌および転位癌の検出のために、放射性免疫シンチグラフィーおよび放射免疫療法（例えば、Ｐｏｔａｍｉａｎｏｓ  Ｓ．ら，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０（２Ａ）：９２５−９４８（２０００）を参照のこと）のような全身の画像診断用途において使用される。１０１Ｐ３Ａ１１の細胞外ドメインの、細胞外環境への分断または放出（例えば、アルカリホスホジエステラーゼＢ１０について見られるような）（Ｍｅｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｒ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：５６３−５６８（１９９８））は、疑わしい患者由来の血清および／または尿サンプル中の抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体によって１０１Ｐ３Ａ１１の診断検出を可能にする。
【０６２９】
１０１Ｐ３Ａ１１に特異的に結合する抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌の処置のための治療適用に使用される。抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、非結合体化様式および結合体化形態として使用され、その中で抗体は、プロドラッグ、酵素または放射性同位体のような当業者に周知の種々の治療剤または画像様式のうちの１つに結合される。前臨床研究において、非結合体化抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体および結合体化抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、ＳＣＩＤマウス癌異種移植片モデル（例えば、腎臓癌モデルであるＡＧＳ−Ｋ３およびＡＧＳ−Ｋ６）中の腫瘍予防および増殖阻害について試験される（例えば、「１０１Ｐ３Ａ１１  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌａｄｄｅｒ，Ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」というタイトルの実施例を参照すること）。結合体化抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体および非結合体化抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、単独でかまたは以下の実施例に記載されるようなタンパク質の処置と組み合わせてヒトの臨床試験における治療様式として使用される。
【０６３０】
（実施例３７：インビボでのヒト抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の使用を介した、ヒト癌腫の処置および診断のためのヒト臨床試験）
１０１Ｐ３Ａ１１上のエピトープを認識する本発明に従う抗体を使用し、そして表１に列挙されるような特定の腫瘍の処置において使用する。多数の因子（１０１Ｐ３Ａ１１発現レベルを含む）に基づいて、表１に列挙されるような腫瘍は、現在好ましい指標である。これらの指標の各々と関連して、３つの臨床的アプローチを、首尾よく実行する。
【０６３１】
Ｉ．）補助的治療：補助的治療において、患者を、化学療法剤もしくは抗新生物剤および／または放射線療法と組み合わせて、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体で処置する。表Ｉに列挙されるような原発性癌標的を、標準的な第一の系および第二の系の標準的な治療に、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を付加することによって、標準的なプロトコルの下で処置する。プロトコルの設計は、腫瘍塊の減少によって評価されるような有効性および通常用量の標準的な化学療法を低減する能力を扱う。これらの投薬量の低減は、化学療法剤の用量関連毒性を低減することによって、さらなる治療および／または延長された治療を可能にする。抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、化学療法剤または抗新生物剤のアドリアマイシン（進行した前立腺癌腫）、シスプラチン（進行した頭部および頸部の癌腫、ならびに肺癌腫）、タキソール（乳癌）およびドキソルビシン（臨床前）と組み合わせて、いくつかの補助的臨床試験において利用される。
【０６３２】
ＩＩ．）単独療法：腫瘍の単独療法における抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の使用に関連して、これらの抗体は、化学療法剤も抗新生物剤も伴わずに、患者に投与される。１実施形態において、単独療法は、広範な転移性疾患を有する、末期の癌患者において臨床的に実施される。患者は、いくらかの疾患安定化を示す。試験は、癌性腫瘍を有する再発患者における有効性を実証する。
【０６３３】
ＩＩＩ．）造影剤：放射性核種（例えば、ヨウ素またはイットリウム（Ｉ１３１、Ｙ９０））を抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体に結合させることによって、放射性標識した抗体を、診断剤および／または造影剤として利用する。このような役割において、標識された抗体は、固形腫瘍ならびに１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞の転移性病変の療法に局在する。造影剤としての抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の使用に関連して、これらの抗体は、手術前スクリーニングならびにどの腫瘍が残存および／または復帰するかを決定するための術後追跡の両方として、固形腫瘍の外科的処置の補助として使用される。１実施形態において、（１１１Ｉｎ）−１０１Ｐ３Ａ１１抗体を、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する癌腫を有する患者における、第Ｉ期ヒト臨床試験において造影剤として使用する（類推として、Ｄｉｖｇｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８３：９７−１０４（１９９１）を参照のこと）。患者を、標準的な前方γ線カメラおよび後方γ線カメラで追跡する。これらの結果は、原発性病変および転移性病変が同定されることを示す。
【０６３４】
（投与用量および投与経路）
当業者によって理解されるように、投薬考慮は、診療所における類似の製品と比較して決定され得る。従って、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、５〜４００ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与され得、例えば、安全性試験に関しては、より低い容量で使用される。その標的に対する既知の抗体の親和性と比較した抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の親和性は、類似の用量レジメンを決定するために当業者によって使用される１つのパラメーターである。さらに、完全にヒト抗体である抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、キメラ抗体と比較して、よりゆっくりしたクリアランスを有する；従って、このような完全にヒト抗体である抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を用いる、患者における投薬は、おそらく５０〜３００ｍｇ／ｍ２の範囲より低いが、なお有効なままであり得る。ｍｇ／ｋｇでの従来の容量測定と反対に、ｍｇ／ｍ２での投薬は、表面積に基づく測定であり、そして幼児から成人までの全てのサイズの患者を含むように設計された便利な投薬測定である。
【０６３５】
３つの別個の送達アプローチが、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の送達に有用である。従来の静脈内送達は、多くの腫瘍についての１つの標準的な送達技術である。しかし、腹腔内の腫瘍（例えば、卵巣、胆管、他の管などの腫瘍）に関して、腹腔内投与は、腫瘍において高い用量の抗体を得るために、そして抗体クリアランスを最小にするために好都合であることを証明し得る。同様の様式で、特定の固形腫瘍は、局所的灌流に適する脈管を有する。局所的灌流は、腫瘍部位における高い用量の抗体を可能にし、そして抗体の短期クリアランスを最小にする。
【０６３６】
（臨床的開発計画（ＣＤＰ））
概論：ＣＤＰは、補助的治療、単独療法に関して、および造影剤としての、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の処置を追跡および開発する。試験は、最初に安全性を実証し、その後反復用量で効力を確認する。試験は、標準的な化学療法を、標準的治療＋抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体と比較する、オープンラベルである。理解されるように、患者の登録に関して利用され得る１つの基準は、生検によって決定されるような、患者の腫瘍における１０１Ｐ３Ａ１１の発現レベルである。
【０６３７】
任意のタンパク質または抗体注入ベースの治療を用いるときのように、安全性の考慮は、主に以下に関連する：（ｉ）サイトカイン放出症候群（すなわち、低血圧、発熱、震せん、寒気）；（ｉｉ）物質に対する免疫応答の発生（すなわち、患者による、抗体療法に対するヒト抗体の発生、またはＨＡＨＡ応答）；および（ｉｉｉ）１０１Ｐ３Ａ１１を発現する正常細胞に対する毒性。標準的な試験および追跡を、これらの安全性の考慮の各々をモニタリングするために利用する。抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、ヒト投与の際に安全であることが見出される。
【０６３８】
（実施例３８：ヒト抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体および化学療法剤を用いる、ヒト臨床試験補助治療）
第Ｉ期のヒト臨床試験を、固形腫瘍（例えば、表Ｉに列挙される組織の癌）の処置に関して、ヒト抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の６つの静脈内用量の安全性を評価するために開始する。この研究において、抗新生物剤または化学療法剤（例えば、シスプラチン、トポテカン、ドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソールなど）に対する補助的治療として利用される場合、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の単回用量の安全性を、評価する。試験設計は、抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の６つの単回用量の送達を含み、抗体の投薬量は、以下のスケジュールに従う処置過程にわたって、ほぼ約２５ｍｇ／ｍ２から約２７５ｍｇ／ｍ２まで増大する：
０日目    ７日目      １４日目    ２１日目  ２８日目    ３５日目
ｍＡｂ用量  ２５      ７５        １２５      １７５    ２２５      ２７５
ｍｇ／ｍ２  ｍｇ／ｍ２    ｍｇ／ｍ２  ｍｇ／ｍ２  ｍｇ／ｍ２  ｍｇ／ｍ２
化学療法    ＋        ＋          ＋          ＋        ＋          ＋
（標準用量）
抗体および化学治療剤のそれぞれの投与後、患者を１週間密接にフォローする。特に、上記の安全性の懸念：（ｉ）サイトカイン放出症候群（すなわち、低血圧、発熱、振せん（ｓｈａｋｉｎｇ）、悪寒）；（ｉｉ）その物質に対する免疫原性応答の発生（すなわち、ヒト抗体治療剤に対する、患者によるヒト抗体の発生、またはＨＡＨＡ応答）；ならびに（ｉｉｉ）１０１Ｐ３Ａ１１を発現する正常細胞に対する毒性について、患者を評価する。標準的な試験および追跡試験を利用して、これらの安全性の懸案のそれぞれをモニターする。患者はまた、臨床結果について、そして特に、ＭＲＩまたは他の画像化によって証明されるような腫瘍重量の低減について、評価される。
【０６３９】
この抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、安全かつ有効であることが実証され、そして臨床試験フェーズＩＩはこの有効性を確認し、そして最適な投薬を洗練する。
【０６４０】
（実施例３９：ヒト臨床試験：ヒト抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を用いる単独治療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ））
抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体は、上で考察した付属試験に関して安全であり、フェーズＩＩヒト臨床試験は、単独治療法についての有効性および最適な投薬を確認する。このような試験が達成され、そして患者が抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の用量を受けると同時の化学療法を受けないことを除外する上記の付属試験に対して、同じ安全性および結果の分析を必要とする。
【０６４１】
（実施例４０：ヒト臨床試験：抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体を用いる診断的画像化）
繰り返すと、上で考察した付属の治療法が上で考察した安全性の判定基準内で安全であるので、ヒト臨床試験は診断的造影剤としての抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の使用に関して行われる。このプロトコルは、当該分野で記載される様式と実質的に類似の様式で設計される（例えば、Ｄｉｖｇｉら、Ｊ，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８３：９７−１０４（１９９１））。この抗体は、治療モダリティーとして使用される場合、安全かつ有効の両方であることが見出される。
【０６４２】
（実施例４１：リガンド結合に関与する１０１Ｐ３Ａ１１配列の同定）
図４に示すように、ＴＭＨＭＭアルゴリズムを使用して推定された１０１Ｐ３Ａ１１およびマウス嗅覚レセプターＳ２５（ＯＲＳ２５）の膜貫通領域を、グレーで強調する。リガンドであるヘキサノールの結合に関与することおよび／またはリガンド結合ポケットの形成に関与することが推測されたＯＲＳ２５のアミノ酸を、図４で斜体かつ太字にして、そして以下に列挙する（Ｆｌｏｒｉａｎｏ，Ｗ．Ｂ．ら，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１０７１２−１０７１６）
【０６４３】
【化２】
2005512509.tif 000004
。
【０６４４】
リガンド結合に関与する１０１Ｐ３Ａ１１の配列は、マウス嗅覚レセプターＳ２５に対する相同性に基づいて同定された。各ＧＰＣＲの推定される膜貫通ドメインを記す、マウス嗅覚レセプターＳ２５との１０１Ｐ３Ａ１１のアミノ酸配列アラインメントを示す。リガンドであるヘキサノールの認識および結合に関与するか、または結合ポケットの近位に存在するＳ２５のアミノ酸（Ｆｌｏｒｉａｎｏ，Ｗ．Ｂ．ら，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１０７１２−１０７１６）もまた示す。これらのアミノ酸は、ＯＲＳ２５の膜貫通ドメイン近傍かまたは膜貫通ドメイン内に存在する。従って、１０１Ｐ３Ａ１１の構造的に相同な領域は、その同族のリガンドの結合に関与する。これらの領域は、以下をコードする：第１細胞外ループのアミノ酸および膜貫通ドメイン３のアミノ末端のアミノ酸（アミノ酸８２−１１２）、膜貫通ドメイン４のカルボキシル末端のアミノ酸および第２細胞外ループ中のアミノ酸（アミノ酸１６０−１８５）、第２細胞外ループの末端のアミノ酸および膜貫通ドメイン５のアミノ酸（アミノ酸１８６−２１２）、ならびに膜貫通ドメイン６のカルボキシル末端のアミノ酸、第３の細胞外ループのアミノ酸および膜貫通ドメイン７のアミノ末端のアミノ酸（アミノ酸２５０−２８０）。従って、１０１Ｐ３Ａ１１の以下の領域の少なくとも３つと相互作用する１０１Ｐ３Ａ１１のリガンドが同定される：アミノ酸８２−１１２、アミノ酸１６０−１８５、アミノ酸１８６−２１２、およびアミノ酸２５０−２８０。
【０６４５】
（実施例４２：既知配列との１０１Ｐ３Ａ１１の相同性の比較）
図３の１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質は、計算上の分子量３５．２ｋＤａおよび８．７のｐＩを有する３１８アミノ酸を有する。１０１Ｐ３Ａ１１は細胞表面タンパク質であることが推測される。図Ｍ１７（パネルＢ）に示されるように、１０１Ｐ３Ａ１１を発現するよう操作された細胞における、ＦＡＣＳ分析および免疫蛍光によって、細胞内局在を示した。透過性にした細胞の免疫蛍光染色により、１０１Ｐ３Ａ１１が内部移行して次いで細胞質に局在することが明かにした（図Ｍ１７）。
【０６４６】
１０１Ｐ３Ａ１１は、ラット嗅覚レセプターＲＡ１ｃ（ｇｉ３４２０７５９、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に対して最もよい相同性を示し、このタンパク質と５９％の同一性および７６％の相同性を共有する。１０１Ｐ３Ａ１１はまた、ヒト前立腺特異的ＧＰＣＲ（ｇｉ１３５４０５３９）およびヒト嗅覚レセプター５１Ｉ１２（ｇｉ１４４２３８３６）に対して相同性を示し、各々に対してそれぞれ、５９％の同一性／７７％の相同性、および５３％の同一性および６９％の相同性を共有する（図２３〜２５）。最も最近の研究により、１０１Ｐ３Ａ１１のマウスホモログが同定されている（すなわち、ＭＯＲ  １８−１）（ｇｉ１８４７９２８４、図６５）。ＭＯＲ  １８−１は、マウス嗅覚レセプターであり、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質と９３％の同一性および９６％の相同性を共有する。
【０６４７】
以下に列挙される研究において主に使用される１０１Ｐ３Ａ１１改変体１に加えて、１０１Ｐ３Ａ１１は２つのさらなる改変体を有する。改変体３は改変体１のＳＮＰであり、そして１０４位に、その位置でイソロイシンがメチオニンに交換する変異を示す。改変体３は、改変体１と同様の様式で細胞表面に局在されることが予測され、そして改変体１と同じモチーフおよび同じ膜貫通ドメインを示す（表ＸＸＩ）。１０１Ｐ３Ａ１１の改変体２は、７２アミノ酸長であり、２つの膜貫通を含み、そしていくらかの細胞質局在を伴い、主に細胞表面に局在する。
【０６４８】
配列分析およびモチーフ分析により、１０１Ｐ３Ａ１１が嗅覚レセプターのファミリーに属する事が示される。バイオインフォマティクス分析により、１０１Ｐ３Ａ１１が７回膜貫通タンパク質であり、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）に対して強力なドメイン相同性および構造的相同性を有することが明らかにされた（表ＸＸＩのＴＭ  Ｐｒｅｄ、Ｓｏｓｕｉ、Ｐｆａｍ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｒｉｎｔを参照のこと）。Ｇタンパク質共役レセプターファミリーのメンバーであるタンパク質は、細胞外アミノ末端、３つの細胞外ループ、３つの細胞内ループおよび細胞内カルボキシ末端を示す。Ｇタンパク質共役レセプターは、ペプチドホルモン、神経伝達物質、ケモカインおよびリン脂質によって刺激される、７回膜貫通レセプターである（Ｃｉｖｅｌｌｉ  Ｏら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１，２４：２３０；Ｖｒｅｃｌ  Ｍら，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９８、１２：１８１８）。リガンド結合は、伝統的に、ＧＰＣＲの第１細胞外ループと第２細胞外ループとの間で発生する。リガンド結合の際、ＧＰＣＲは三量体Ｇタンパク質と会合することによって、細胞表面の膜を横切ってシグナルを伝達する。これらのシグナルは、三量体のグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を介して、エフェクター酵素またはイオンチャンネルへと伝達される（Ｓｉｍｏｎら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：８０２）。ＧＰＣＲによって媒介されるシグナル伝達および生物学的出力（ｏｕｔｐｕｔ）は、ペプチド模倣物、低分子インヒビター、およびＧＰＣＲキナーゼまたはＧＲＫを含む種々の機構を介して調節され得る（Ｐｉｔｃｈｅｒ  ＪＡら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９、３；２７４：３４５３１；Ｆａｗｚｉ  ＡＢら  ２００１，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９：３０）。
【０６４９】
最近、ＧＰＣＲはまた、チロシンキナーゼの有糸分裂シグナル経路に連なることが示された（Ｌｕｔｔｒｅｌｌら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６５５；Ｌｕｔｔｒｅｌｌら、１９９９  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７）。ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲキナーゼ（ＧＲＫ）によって媒介されるリン酸化によって調節され、このＧＣＰＲキナーゼ自体はＧＣＰＲによって間接的に活性化される（Ｐｉｔｃｈｅｒら，１９９８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：６５３）。嗅覚ＧＰＣＲは、アデニル酸シクラーゼを介してｃＡＭＰ経路を活性化し、その結果プロテインキナーゼＡへと下流にシグナル伝達することにより、そしてイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生成することによりホスホリパーゼＣ経路を活性化することによって、それらのシグナルを伝達する（Ｂｒｅｅｒ，１９９３，Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ  １７９：９７；Ｂｒｕｃｈ，１９９６，Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１３：４５１）。ＩＰ３は結果として、細胞内カルシウムの上昇を生じ、一方でＤＡＧはプロテインキナーゼＣを活性化する。
【０６５０】
最近の研究により、ＧＰＣＲと細胞の形質転換とが関連付けられた。特に、ＫＳＨＶ  Ｇタンパク質共役レセプターは、インビトロでＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を形質転換することが見出され、そしてＫＳＨＶ−ＧＰＣＲトランスジェニックマウスにおいて、多病巣性のＫＳ様病変を誘導する（Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｍ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＰＭ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１，１６７：５０５）。ＫＳＨＶ−ＧＰＣＲは、ＡＫＴ生存経路を含む、規定されたシグナル伝達経路を活性化することによって、内皮細胞および線維芽細胞に対するその作用を生成し得た（Ｍｏｎｔａｎｅｒ  Ｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１，６１：２６４１）。さらに、ＫＳＨＶ−ＧＰＣＲは、ＡＰ−１およびＮＦκＢのような有糸分裂経路の活性化を誘導し、その結果、炎症促進性遺伝子の発現を生じる（Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｍ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＰＭ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１，１６７：５０５）。腫瘍形成に関連する他のＧＰＣＲとしては、Ｇ２Ａ、およびＰＡＲ−１が挙げられ、これらはＮＩＨ  ３Ｔ３細胞の形質転換を誘導することが見出されている（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００１，２０：１５４７）。
【０６５１】
この情報は、１０１Ｐ３Ａ１１が哺乳動物細胞の形質転換において役割を果たし、種々のシグナル伝達経路の活性化を含む有糸分裂応答を誘導し、そして細胞表面のシグナルを核へと伝達することにより遺伝子の転写を調節すことを、示す。また、表題「１０１Ｐ３Ａ１１腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ」の実施例を参照のこと。
【０６５２】
従って、１０１３ＰＡ１１が細胞の形質転換、腫瘍の形成の調節因子として、または炎症腫瘍形成もしくは増殖に関連する遺伝子の活性化に関与する転写調節因子として機能する場合、１０１Ｐ３Ａ１１は、本明細書中および当該分野において考察されるように、ＧＰＣＲに類似の様式でか、または他のＧＰＣＲを追従する様式で、治療目的、診断目的、予後目的および／または予防目的のために使用される。
【０６５３】
（実施例４３：潜在的なシグナル伝達経路の同定および確認）
多くの哺乳動物のタンパク質は、シグナル伝達分子と相互作用し、そしてシグナル伝達経路を調節する役割を担うことが報告されている（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００１；７６：２１７−２２３）。特に、ＧＰＣＲは、ＭＡＫカスケードおよびＧタンパク質を活性化することが報告されており、そして上皮細胞においてＥＧＦＲ経路と関連している（Ｎａｏｒ，Ｚ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２０００，１１：９１；Ｖａｃｃａ  Ｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００，６０：５３１０；Ｄｅｌｌａ  Ｒｏｃｃａ  Ｇ．Ｊ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４：１３９７８）。免疫沈降技術およびウェスタンブロッティング技術を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１と結合し、そしてシグナル伝達事象を媒介するタンパク質を同定した。リン脂質経路（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴなど）、接着経路および移動経路（ＦＡＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ−Ｉなどを含む）、ならびにＥＲＫ、ｐ３８などのような有糸分裂／生存カスケードを含む、癌の生物学において役割を果たすことが知られるいくつかの経路が、１０１Ｐ３Ａ１１によって調節され得る（Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０００，１１：２７９；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４：８０１；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００，１９：３００３；Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７，１３８：９１３）。
【０６５４】
ウェスタンブロッティングおよび他の技術を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１がこれらの経路を調節する能力を確認する。１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞または１０１Ｐ３Ａ１１を欠損した細胞を、未処理のままか、またはサイトカイン、アンドロゲンおよび抗インテグリン抗体で刺激した、いずれかの状態に置く。ＥＲＫ、ｐ３８、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＰＬＣおよび他のシグナル伝達分子のリン酸化および調節を検出するために、抗リン酸特異的抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、細胞溶解物を分析した。このような技術を使用して、本発明者らは、１０１Ｐ３Ａ１１がＮＩＨ  ３Ｔ３細胞のチロシンリン酸化パターンを変化させ（図２６）、１０１Ｐ３Ａ１１がプロテインキナーゼおよびホスファターゼを調節していることを示唆することを示した。この実験（データが図２６に示される）において、コントロール３Ｔ３−ｎｅｏ細胞および３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、０．５％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳのどちらかで処理し、そして全細胞溶解物を、抗ホスホチロシンのウェスタンブロッティングによって分析した。１０１Ｐ３Ａ１１の発現は、ＮＩＨ  ３Ｔ３中のいくつかのタンパク質のリン酸化の低減を生じ、一方で、７９〜８１ｋＤａおよび２８〜３２ｋＤａのタンパク質のリン酸化を誘導した。
【０６５５】
抗ホスホＥＲＫ抗体を使用して、本発明者らは１０１Ｐ３Ａ１１の発現が、前立腺癌細胞株ＰＣ３において、ＥＲＫのリン酸化を誘導すること（図２７Ａおよび２７Ｂ）、および１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞内のＥＲＫリン酸化がＧＰＣＲリガンドによって調節されることを実証した。この実験において、コントロールＰＣ３−ｎｅｏ細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、未処理（０．１％ＦＢＳ）のままにしたか、または１０％ＦＢＳ、リポホスファチジン酸（ＬＡＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ロイコトリエン（ＬＫＢ４）または血小板活性化因子（ＰＡＦ）を用いて刺激した。細胞を溶解し、そして抗ホスホＥＲＫ  ｍＡｂ（図２７Ａ）または抗ＥＲＫ  ｍＡｂ（図２７Ｂ）を使用するウェスタンブロッティングによって分析した。これらの結果は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現が、ＦＢＳ、ＬＰＡ、ＧＲＰおよびＰＡＦによる有意なＥＲＫリン酸化を媒介し、一方ＬＫＢ４はＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞においてより中程度のレベルのＥＲＫリン酸化を生じることを示した。対照的に、ＧＰＣＲリガンドのいずれもＰＣ３−ｎｅｏ細胞において有意なＥＲＫリン酸化を誘導せず、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞におけるＧＰＣＲリガンド媒介性応答の特異性を実証した。ＥＲＫのオーバーレイは等量の充填を示し、このデータの特異性を支持する。癌細胞において１０１Ｐ３Ａ１１がＥＲＫリン酸化を媒介するシグナル伝達経路を解明するために、２つの経路のインヒビター：ＭＥＫインヒビターＰＤ９８０５９またはｐ３８インヒビターＳＢ２０３５８０のうちのどちらが１０１Ｐ３Ａ１１媒介性ＥＲＫリン酸化を調節するかを確認した（図２８）。このデータを得るために、ＰＣ３−ｎｅｏ細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、培地単独で処理するか、またはＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０もしくはゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）の存在下で、ＦＢＳもしくはＧＲＰを用いて刺激した。細胞を溶解し、そして抗ホスホＥＲＫ  ｍＡｂまたは抗ＥＲＫ  ｍＡｂを使用するウェスタンブロッティングによって分析した。１０％ＦＢＳを用いるかまたはＧＲＰを用いた処理は、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞においてＥＲＫのリン酸化を誘導したが、コントロールＰＣ３−ｎｅｏ細胞においては誘導しなかった。ＭＥＫ−１インヒビターＰＤ９８０５９は１０１Ｐ３Ａ１１媒介性ＥＲＫリン酸化を阻害したが、ｐ３８インヒビターＳＢ２０３５８０もゲニステインも阻害しなかった。ＥＲＫのオーバーレイは等量の充填を示し、これらの結果の特異性を支持する。さらに２つのセット実験の組み合わせで得られた結果により、これらの結果を確認した。ＰＤ９８０５９による１０１Ｐ３Ａ１１媒介性ＥＲＫリン酸化の阻害は、１０１Ｐ３Ａ１１が、有糸分裂促進、増殖および腫瘍形成と関連する経路である古典的ＭＥＫ−ＥＲＫカスケードを活性化することを実証する。
【０６５６】
図２６〜２８の結果は、１０１Ｐ３Ａ１１がＥＲＫを含むキナーゼ、およびホスファターゼの活性を調節することを示す。１０１Ｐ３Ａ１１のホスファターゼ活性との関連を確認するために、１０１Ｐ３Ａ１１媒介性ＥＲＫリン酸化に対する、プロテインホスファターゼインヒビターのオルトバナジン酸ナトリウムの影響を決定した（図２９）。ＰＣ３−ｎｅｏ細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、培地単独中か、またはオルトバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）の存在下で増殖させ、そして０．１％または１０％のＦＢＳを用いて刺激した。細胞を溶解し、そして抗ホスホＥＲＫ  ｍＡｂまたは抗ＥＲＫ  ｍＡｂを使用するウェスタンブロッティングによって分析した。Ｎａ３ＶＯ４を用いた処理は、ＰＣ３−ｎｅｏ細胞におけるＥＲＫリン酸化の２倍の増加と比較して、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞においてＥＲＫリン酸化の４．５倍の増加を生じた。図２９の結果は、１０１Ｐ３Ａ１１媒介性シグナル伝達へのプロテインホスファターゼの寄与を確認する。
【０６５７】
いくつかのＧＰＣＲは、細胞膜に結合したレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ））をトランス活性化する（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ）ことが示されている（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｋ．Ｌ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：２３１５５；Ｎａｔｈ，Ｄ．ら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ２００１，１１４：１２１３）。１０１Ｐ３Ａ１１シグナル伝達がＥＧＦＲの活性化を生じるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＥＧＦＲ媒介性ＥＲＫリン酸化および１０１Ｐ３Ａ１１媒介性ＥＲＫリン酸化に対するＥＧＦＲインヒビターＡＧ１５１７の影響を比較した（図３０）。図３０において、ＰＣ３−ｎｅｏ細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、培地単独（０．１％  ＦＢＳ）中か、またはＡＧ１５１７の存在下で増殖させた。この細胞を、０．１％もしくは１０％のＦＢＳ、ＧＲＰ、またはＥＧＦを用いて刺激し、細胞を溶解し、そして抗ホスホＥＲＫ  ｍＡｂまたは抗ＥＲＫ  ｍＡｂを使用するウェスタンブロッティングによって分析した。１０％のＦＢＳ、ＧＲＰおよびＥＧＦを用いた処理は、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞においてＥＲＫリン酸化を誘導した。ＥＧＦによるＥＲＫのリン酸化は、ＡＧ１５１７によって完全に阻害された。１０％のＦＢＳを用いて処理された細胞中の１０１Ｐ３Ａ１１媒介性ＥＲＫリン酸化を、ＡＧ１５１７によって部分的に阻害した。図３０のデータは、１０１Ｐ３Ａ１１シグナル伝達経路とＥＧＦＲシグナル伝達経路との間にいくらかのクロストークが生じることを示唆する。
【０６５８】
ＥＲＫカスケードの活性化に加えて、１０１Ｐ３Ａ１１は、並行するＭＡＫ経路（すなわち、ｐ３８）を活性化した。図３１Ａおよび３１Ｂにおいて、ＰＣ３−ｎｅｏ細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、１％または１０％のＦＢＳ中で増殖させた。細胞を溶解し、そして抗ホスホｐ３８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（図３１Ａ）または抗ｐ３８モノクローナル抗体（図３１Ｂ）を使用するウェスタンブロッティングによって分析した。本発明者らの結果は、１０％のＦＢＳを用いて処理された細胞において、１０１Ｐ３Ａ１１媒介性ｐ３８リン酸化の出現を示す。ｐ３８のオーバーレイで等量の充填を示した。
【０６５９】
図２６〜３０および図３１Ａ〜３１Ｂに示される結果は、１０１Ｐ３Ａ１１が癌細胞において、ＥＲＫカスケードおよびｐ３８カスケードを含むいくつかのシグナル伝達経路を活性化することを確認する。ＭＡＰＫに加えて、１０１Ｐ３Ａ１１シグナル伝達は、プロテインホスファターゼ活性およびＥＧＦＲトランス活性化と関連した。これらのシグナル伝達経路は、細胞増殖、生存および転写活性化と関連しており、これらの全ては腫瘍のイニシエーションおよび進行に重要な役割を果たす。１０１Ｐ３Ａ１１はシグナル伝達経路において、単独であれ協調的であれ、調節の役割を果たすので、これは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的の標的として使用される。
【０６６０】
１０１Ｐ３Ａ１１が細胞内で、直接的または間接的に既知のシグナル伝達経路を活性化することを確認するために、個々の遺伝子を発現する細胞において、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ベースの転写レポーターアッセイを実行する。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する、既知の転写因子についてのコンセンサス結合配列を含む。レポーターおよびこれらの関連転写因子の例、シグナル伝達経路、ならびに活性化刺激を、以下に列挙する。
【０６６１】
１．ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＮＦκＢ／Ｒｅｌ；Ｉκ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス。
【０６６２】
遺伝子媒介性の影響を、ｍＲＮＡ発現を示す細胞においてアッセイし得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質媒介性トランスフェクション（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって導入し得る。細胞抽出物をルシフェリン基質と共にインキュベートすることによって、相対的な転写活性の指標であるルシフェラーゼ活性を測定し、そしてこの反応の発光をルミノメーターでモニタリングする。
【０６６３】
１０１Ｐ３Ａ１１によって活性化されるシグナル伝達経路をマップし、そして治療標的の同定および確認のために使用する。１０１Ｐ３Ａ１１は細胞シグナル伝達に関与するので、これは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的の標的として使用される。
【０６６４】
（実施例４４：ＧＰＣＲとしての１０１Ｐ３Ａ１１の機能）
１０１Ｐ３Ａ１１の配列および相同性の分析は、１０１Ｐ３Ａ１１がＧＰＣＲの嗅覚レセプターファミリーの一員であることを示唆した。嗅覚レセプターは、アデニル酸シクラーゼを活性化することによって生物学的応答を調節することが公知である。１０１Ｐ３Ａ１１がＧＰＣＲとして機能し、そしてアデニル酸シクラーゼの活性化を媒介することを確認するために、ＰＣ３細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞におけるｃＡＭＰの蓄積を比較した（図３２）。コントロールＰＣ３細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在下または非存在下で低濃度のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で、１４時間増殖させた。細胞を、０．１％または１０％のＦＢＳ中を用いて刺激し、ＰＢＳで洗浄し、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａより提供される溶解緩衝液を使用して溶解した。ｃＡＭＰの細胞内濃度を、製造業者の推奨に従って、市販の酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測定した。各アッセイを二連で実施した。ｃＡＭＰ濃度の計算は、ＯＤ４５０の標準曲線に基づいた。１０１Ｐ３Ａ１１の発現は、刺激の非存在下のｃＡＭＰ蓄積の４倍の増加を誘導した。１０％ＦＢＳを用いる処理は、さらに、コントロールＰＣ３−ｎｅｏ細胞よりほぼ７倍多くまで、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞におけるｃＡＭＰの蓄積を増強した。１０１Ｐ３Ａ１１媒介性ｃＡＭＰ蓄積は、ＰＴＸによって阻害された。これらの結果を、２つの別個の組の実験により確認した。図３２に示される結果は、１０１Ｐ３Ａ１１が前立腺癌細胞においてＧＰＣＲとして機能し、そしてＰＴＸにより阻害されるｃＡＭＰ蓄積のような、古典的ＧＰＣＲ特性を示すことを実証する。
【０６６５】
アデニル酸シクラーゼの活性は、細胞内ｃＡＭＰレベルを調節し、そしてプロテインキナーゼＡシグナル伝達、カルシウムシグナル伝達およびＥＲＫ  ＭＡＰＫシグナル伝達の活性化のような下流のシグナル伝達事象を誘導する（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｋ．Ｌ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ：２００１，２０：１５３２）ので、本発明者らは、アデニル酸シクラーゼシグナル伝達インヒビターであるＰＴＸが、ｃＡＭＰ蓄積を阻害することと一緒に１０１Ｐ３Ａ１１媒介性ＥＲＫリン酸化を妨害することを決定した（図３３および図３４）。ＰＣ３−ｎｅｏ細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、培地単独中か、または百日咳毒素（ＰＴＸ）の存在下の０．１％  ＦＢＳ中で一晩増殖させた。細胞を、０．１％もしくは１０％のＦＢＳ（図３３）、または１０％  ＦＢＳ、ＥＧＦ、あるいはＧＲＰを用いて刺激した（図３４）。細胞を溶解し、そして抗ホスホＥＲＫ  ｍＡｂを使用するウェスタンブロッティングによって分析した。１０１Ｐ３Ａ１１の発現は、ＰＣ３細胞において１０％のＦＢＳによるＥＲＫリン酸化を媒介し、このリン酸化はＰＴＸによって阻害された（図３３および図３４）。対照的に、ＧＲＰ媒介性ＥＲＫリン酸化およびＥＧＦ媒介性ＥＲＫリン酸化は、比較的、ＰＴＸによっては影響されず（図３４）、１０１Ｐ３Ａ１１媒介性応答の特異性を実証した。さらなる実験において、これらの結果を反復した。ＥＲＫリン酸化および１０１Ｐ３Ａ１１媒介性シグナル伝達を阻害することに加えて、ＰＴＸは、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞の増殖に著明な作用を有したが、コントロールＰＣ３−ｎｅｏ細胞の増殖にはそうではなかった（図Ｍ６）。図Ｍ６は、ＰＴＸが１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞の増殖を用量依存様式で阻害することを示し、そして１０１Ｐ３Ａ１１のＧＰＣＲ機能が腫瘍の増殖において重要であることを確認する。
【０６６６】
ＧＰＣＲは、三量体Ｇタンパク質を活性化することによりこれらのシグナルを伝達する。一旦ＧＰＣＲが活性化されると、共役のＧａサブユニットがＧＴＰを結合し、レセプターから解離し、そして下流のシグナル事象に役割を果たす（Ｓｃｈｉｌｄ，Ｄ．，およびＲｅｓｔｒｅｐｏ，Ｄ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９９８，７８：４２９−６６）。Ｇａサブユニットの阻害が１０１Ｐ３Ａ１１媒介性細胞増殖に対する影響を有することを決定するために、３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞の増殖に対する２つのＧａサブユニットインヒビターの影響を調査した。コントロール３Ｔ３細胞および３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、スラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）またはその誘導体ＮＦ４４９（Ｓｉｇｍａ）の存在下または非存在下で増殖させた。７２時間後に増殖について細胞を分析した（図３５）。この実験を三連で実施した。これらのデータは、スラミンおよびＮＦ４４９が３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞の増殖をそれぞれ６０％および８０％阻害したことを示した。この応答は、スマリンおよびＮＦ４４９がコントロール３Ｔ３細胞の増殖に対しては全く影響を有さなかったので、１０１Ｐ３Ａ１１特異的であった。同様に、ＰＣ３細胞におけるスマリンおよびＮＦ４４９によるＧタンパク質活性化阻害は、５％  ＦＢＳ中で増殖したＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞の増殖を阻害する（図Ｍ４）。ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１の増殖に対するスマリンおよびＮＦ４４９の阻害効果と並行して、本発明者らは前立腺癌細胞における１０１Ｐ３Ａ１１媒介性シグナル伝達に対するそれらの阻害効果を実証する（図Ｍ２）。図２７および２８に示されるように、ＦＢＳを用いる処置は、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞においてＥＲＫのリン酸化を誘導する。このＥＲＫリン酸化および活性化は、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞および３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞において、スマリンおよびＮＦ４４９によって阻害された。スマリンを用いて処理したＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞において、ＥＲＫリン酸化は、用量依存様式で阻害された。従って、１０１Ｐ３Ａ１１がＧＰＣＲ活性に関与するので、これは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的の標的として使用される。
【０６６７】
ＧＰＣＲは、ホルモン、神経ペプチド、ケモカイン、臭気物質およびリン脂質を含む、種々のリガンドによって活性化され得る。嗅覚レセプターの場合、個々の嗅覚レセプターは複数の臭気物質を認識し得、そして多様な列（ａｒｒａｙ）の分子によって活性化され得る。１つのレセプターにより（上記のように）認識される、これらのリガンドおよび分子は、本明細書中で記載されるような低分子である。
【０６６８】
１０１Ｐ３Ａ１１（低分子）リガンドを同定するために、上皮細胞が１０１Ｐ３Ａ１１アクチベーターを分泌し得る可能性を調査した（図３６Ａおよび３６Ｂ）。前立腺癌上皮細胞（ＰＣ３、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１、ＬＡＰＣ４２ｈＴ）、正常な前立腺細胞（ＰｒＥＣ）、線維芽細胞（３Ｔ３、３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１）、およびヒト腎臓上皮細胞（２９３Ｔ）をＦＢＳの存在下または非存在下で増殖させた。細胞上清を収集し、ＰＣ３細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を刺激するために使用した。休止のＰＣ３細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞、ならびに上清で処理したＰＣ３細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞由来の細胞溶解物を溶解し、そして抗ホスホＥＲＫ  ｍＡｂ（図３６Ａ）および抗ＥＲＫ  ｍＡｂ（図３６Ｂ）を使用するウェスタンブロッティングによって分析した。図３６Ａおよび３６Ｂに示されるように、正常前立腺細胞ＰｒＥＣ由来の上清、ならびに前立腺癌細胞ＰＣ３、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１およびＬＡＰＣ４２ｈＴ由来の上清は、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞においてＥＲＫのリン酸化を誘導したが、コントロールＰＣ３細胞においては誘導しなかった。対照的に、３Ｔ３細胞または２９３Ｔ細胞由来の上清を使用すると、特異的なＥＲＫリン酸化は全く見られなかった。本発明者らの結果は、血清非存在下で増殖した前立腺細胞が、１０１Ｐ３Ａ１１媒介性シグナル伝達事象の活性化に寄与する１つ以上の分子を産生することを示す。従って、１０１Ｐ３Ａ１１は、刺激に応答してそしてシグナル伝達およびＧＰＣＲ活性において機能するので、これは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的の標的として使用される。
【０６６９】
（実施例４５：１０１Ｐ３Ａ１１のＧＰＣＲ機能のインヒビター）
表題「既知配列との１０１Ｐ３Ａ１１の相同性比較」の実施例において述べたように、ＧＰＣＲは細胞外ループに結合するリガンドによって活性化され、その結果、三量体Ｇタンパク質の活性化およびいくつかのシグナル伝達カスケードの開始を生じる。この情報を使用して、ＧＰＣＲ活性化および下流のシグナル伝達事象を阻害するための、いくつかの治療的分子かつ低分子のストラテジーが利用される。
【０６７０】
１つのストラテジーは、レセプターとリガンドとの結合を阻害する。いくつかの型のＧＰＣＲを使用した最近の研究により、このストラテジーの有効性が実証されている（Ｆａｗｚｉ  ＡＢ，ら  ２００１，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９：３０）。ＳＣＨ−２０２６７６と名付けられた化合物を使用して、この著者らは、アロステリックにリガンド−ＧＰＣＲ相互作用を妨げることによって、ＧＰＣＲへのアゴニストおよびアンタゴニストの結合を阻害した。このインヒビターおよびさらにより特異的なアロステリック（低分子）インヒビターを使用して、１０１Ｐ３Ａ１１を介したシグナル伝達を阻害し、これによって、治療的利益、予後的利益、診断的利益および／または予防的利益を提供する。
【０６７１】
第２のアプローチは、Ｇαサブユニットの活性化を阻害することである。ＧＰＣＲの活性化は、結果として三量体Ｇタンパク質のＧαサブユニット上でのＧＴＰからＧＤＰへの交換を生じる。Ｇα活性化の阻害は、下流のシグナル伝達カスケードの活性化、従ってＧＰＣＲの生物学的効果を妨げる。Ｇαサブユニット上のＧＤＰ交換を阻害するために使用される１つの分子は、スラニム（Ｓｕｒａｎｉｍ）である（Ｆｒｅｉｓｓｍｕｔｈ  Ｍら，１９９６，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４９：６０２）。スラニムは普遍的なＧαインヒビターとして機能するので、これは大部分のＧαサブユニットの活性化を妨げる。例としてかつ非限定的に、表題「１０１Ｐ３Ａ１１腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ」、「潜在的なシグナル伝達経路の同定および確認」、「ＧＰＣＲとしての１０１Ｐ３Ａ１１の機能」、および「転写調節」の本実施例において記載される技術を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１と結合するＧαサブユニットを選択的に阻害する低分子を同定し、これによって、治療的利益、予後的利益、診断的利益および／または予防的利益を提供する。
【０６７２】
第３のアプローチは、ＧαサブユニットのＧＰＣＲとの結合を阻害することである。三量体Ｇタンパク質がＧＰＣＲ／リガンド相互作用の後に活性化されるためには、これらが対応するＧＰＣＲと結合することが必要である。変異分析により、ＧＰＣＲの第１細胞外ループおよび第３細胞外ループへのＧαの総合作用がマップされている（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｒら  １９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ）。いくつかの研究は、インヒビターとして、ループ１およびループ３の細胞内配列に対応する合成（低分子）ペプチドを使用している（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．，ら  １９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）。レセプター模倣物として役立つこのような短いペプチドを使用して、これらを使用して、１０１Ｐ３Ａ１１に対するＧａサブユニットの結合について競合させ、これによって治療的利益、予後的利益、診断的利益および／または予防的利益を提供する。
【０６７３】
従って、１０１Ｐ３Ａ１１機能および下流のシグナル伝達事象を阻害するよう設計された化合物および低分子は、治療目的、診断目的、予後目的および／または予防目的に使用される。
【０６７４】
（実施例４６：腫瘍進行との関与）
この１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子は、癌細胞の増殖に寄与し得る。腫瘍増殖における１０１Ｐ３Ａ１１の役割は、種々の初代細胞株またはトランスフェクトした細胞株（前立腺細胞株、結腸細胞株、膀胱細胞株および腎臓細胞株、ならびに１０１Ｐ３Ａ１１を定常発現するよう操作されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞が挙げられる）において確認される。１０１Ｐ３Ａ１１を欠いた親細胞および１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞を、十分に記載された増殖アッセイ（Ｆｒａｓｅｒ  ＳＰ，ら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２０００；４４：６１，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＥ，Ｏｃｈｉｅｎｇ  Ｊ，Ｅｖａｎｓ  ＳＬ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．１９９６，７：２８８）を使用して細胞増殖について評価する。このような技術を使用して、本発明者らは、１０１Ｐ３Ａ１１がＮＩＴ３Ｔ３細胞に対して増殖優位性を付与することを実証した（図３７を参照のこと）。３Ｔ３−ｎｅｏ細胞および３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を０．５％または１０％のＦＢＳ中で増殖させ、４８時間後に分析した。このアッセイを三連で実施した。１０１Ｐ３Ａ１１の発現は、０．５％  ＦＢＳ中で増殖したコントロール３Ｔ３細胞に対して、６倍に増加した増殖を生じた。さらに、１０１Ｐ３Ａ１１は、図Ｍ７および図Ｍ１６に示されるように、ＰＣ３細胞に対して増殖優位性を付与する。０．５％および１０％のＦＢＳ中で増殖したＰＣ３細胞を、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１と比較した。図Ｍ７は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現が両方の条件下でＰＣ３細胞の増殖を増強することを示す。１０１Ｐ３Ａ１１の影響をまた、細胞周期進行において観察した。コントロール細胞および１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞を低血清中で一晩増殖させ、そして４８時間および７２時間、１０％  ＦＢＳを用いて処理した。ＦＡＣＳ分析によって、ＢｒｄＵおよびヨウ化プロピジウムの取り込みについて細胞を分析した。図Ｍ１６は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現が、３Ｔ３細胞およびＰＣ３細胞の両方において、細胞周期開始（ｅｎｔｒｙ）を増強することを示す。
【０６７５】
形質転換プロセスにおける１０１Ｐ３Ａ１１の役割を確認するために、コロニー形成アッセイにおいてその影響を調査した。ストリンジェントな条件下およびより許容的な条件下でのソフトアガーアッセイ（Ｓｏｎｇ  Ｚ．ら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００；６０：６７３０）を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１を欠いた親ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、１０１Ｐ３Ａ１１を発現するＮＩＨ  ３Ｔ３細胞と比較した。これらの結果を図４３に示す。ここで、１０１Ｐ３Ａ１１は、ｎｅｏ耐性コントロールに対して、１００倍以上多いコロニー形成を誘導した。本発明者らは以前に、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞における１０１Ｐ３Ａ１１の発現が、ソフトアガー中でのこれら細胞の増殖を誘導する（通常２４に対して１２９）こと示した。このことは１０１Ｐ３Ａ１１が形質転換のプロセスに役割を果たすことを示唆する。
【０６７６】
癌細胞の侵襲および転移における１０１Ｐ３Ａ１１の役割を確認するために、十分に確立されたアッセイを使用する。非限定的な例は、細胞が侵襲性であるかどうかを検出するために使用される基底膜またはそのアナログを提供するアッセイ（例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍアッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；５９：６０１０））の使用である。コントロール細胞（１０１Ｐ３Ａ１１を欠損する前立腺細胞株、結腸細胞株、膀胱細胞株および腎細胞株を含む）を、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞と比較する。細胞に、蛍光染料（カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）をロードし、そして細胞を基底膜アナログ（例えば、トランスウェル挿入（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔ））でコートされた支持構造の上部ウェルにプレートし、そしてアッセイに使用する。侵襲を、細胞集団全体の蛍光に対する、下方チャンバー中の細胞の蛍光によって決定する。
【０６７７】
１０１Ｐ３Ａ１１はまた、細胞周期およびアポトーシスにおいて役割を果たし得る。親細胞および１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞を、十分に確立されたＢｒｄＵアッセイ（Ａｂｄｅｌ−Ｍａｌｅｋ  ＺＡ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８８，１３６：２４７）を使用して細胞周期調節における差異について比較する。簡単に言えば、細胞を、最適な条件下（十分な血清）および限定された条件下（低血清）の両方で増殖させ、ＢｒｄＵで標識し、そして抗ＢｒｄＵ  Ａｂおよびヨウ化プロピジウムで染色する。細胞を、細胞周期のＧ１相、Ｓ相およびＧ２Ｍ相への進入について分析する。あるいは、アポトーシスに対するストレスの効果を、コントロール親細胞および１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞（正常および腫瘍性の前立腺細胞、結腸細胞および肺細胞を含む）において評価する。操作された細胞および親細胞を、様々な化学療法剤（例えば、エトポシド、フルタミドなど）およびタンパク質合成インヒビター（例えば、シクロヘキシミド）で処理する。細胞を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色し、そして細胞死をＦＡＣＳ分析によって測定する。１０１Ｐ３Ａ１１による細胞死の改変は、腫瘍進行および腫瘍負荷の調節において重大な役割を果し得る。
【０６７８】
１０１Ｐ３Ａ１１が細胞増殖、形質転換、侵襲またはアポトーシスにおいて役割を果す場合、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として使用される。
【０６７９】
（実施例４７：新脈管形成との関係）
新脈管形成または新しい毛細血管形成は、腫瘍増殖に必要である（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．；Ｃｅｌｌ．１９９６，８６：３５３；Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９８  １３９：４４１）。いくつかのアッセイが、インビトロおよびインビボでの新脈管形成を測定するために開発された（例えば、内皮細胞管形成および内皮細胞増殖についての組織培養アッセイ）。これらのアッセイおよびインビトロでの新血管新生を使用して、新脈管形成における１０１Ｐ３Ａ１１の役割（増強または阻害）を確認する。
【０６８０】
例えば、１０１Ｐ３Ａ１１を発現するように操作された内皮細胞を、管形成アッセイおよび増殖アッセイを使用して評価する。１０１Ｐ３Ａ１１の効果はまた、インビボで動物モデルにおいて確認する。例えば、１０１Ｐ３Ａ１１を発現するかまたは欠損するいずれかの細胞を、免疫無防備状態マウスの皮下に移植する。内皮細胞遊走および新脈管形成を、５〜１５日後、免疫組織化学的技術を使用して評価する。１０１Ｐ３Ａ１１は、新脈管形成に影響し、そして診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として使用される。
【０６８１】
（実施例４８：転写の調節）
１０１Ｐ３Ａ１１の細胞表面位置決定およびＧＰＣＲとその類似は、１０１Ｐ３Ａ１１が、真核生物の遺伝子の転写調節の調節因子として有効に使用されることを示す。遺伝子発現の調節を、例えば、１０１Ｐ３Ａ１１を発現するかまたは欠損する細胞における遺伝子発現を研究することによって確認する。この目的のために、２つの型の実験を行う。
【０６８２】
第１のセットの実験において、親細胞および１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞由来のＲＮＡを、抽出し、そして市販される遺伝子アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にハイブリダイズさせる（Ｓｍｉｄ−Ｋｏｏｐｍａｎ  Ｅら  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０００．８３：２４６）。休止細胞とＦＢＳまたはアンドロゲンで処理した細胞とを比較する。示差的に発現した遺伝子を、当該分野で公知の手順に従って同定する。次いで、示差的に発現した遺伝子を、生物学的経路にマッピングする（Ｃｈｅｎ  Ｋら  Ｔｈｙｒｏｉｄ．２００１．１１：４１．）。
【０６８３】
第２のセットの実験において、特定の転写経路活性化を、市販されるルシフェラーゼレポーター構築物（ＮＦｋＢ−ｌｕｃ、ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＥＬＫｌ−ｌｕｃ、ＡＲＥ−ｌｕｃ、ｐ５３−ｌｕｃおよびＣＲＥ−ｌｕｃを含む）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して評価する。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル変換経路の下流に位置する公知の転写因子に対するコンセンサスな結合部位を含み、そして経路活性化を確かめるため、経路活性化のポジティブな調節因子およびネガティブな調節因子ついてスクリーニングするための良好なツールを表す。
【０６８４】
従って、１０１Ｐ３Ａ１１は、遺伝子調節で役割を果し、そして診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として使用される。
【０６８５】
（実施例４９：細胞接着への関与）
細胞接着は、組織のコロニー形成および転移に重大な役割を果す。１０１Ｐ３Ａ１１は、細胞構築に関与し得、そしてその結果、細胞接着および細胞運動性に関与し得る。１０１Ｐ３Ａ１１が細胞接着を調節することを確認するために、１０１Ｐ３Ａ１１を欠損するコントロール細胞を、上記の技術を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞と比較する（例えば、Ｈａｉｅｒら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９９，８０：１８６７；ＬｅｈｒおよびＰｉｅｎｔａ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９８，９０：１１８を参照のこと）。手短に言えば、１つの実施形態において、蛍光指示薬（例えば、カルセイン）で標識された細胞を、培地単独でか、またはマトリックスタンパク質でコートされた組織培養ウェル上でインキュベートする。接着性細胞を、蛍光定量分析によって検出し、接着のパーセントを計算する。別の実施形態において、１０１Ｐ３Ａ１１を欠損するかまたは発現する細胞を、上記のような類似の実験技術を使用して、細胞−細胞接着を媒介するそれらの能力について分析する。それらの実験システムの両方を使用して、細胞外マトリックスへの細胞接着および細胞−細胞相互作用を調節するタンパク質、抗体および／または低分子を同定する。細胞接着は、腫瘍増殖、腫瘍進行およびコロニー形成において重要な役割を果し、そして１０１Ｐ３Ａ１１は、それらのプロセスに関与する。従って、これは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として役立つ。
【０６８６】
（実施例５０：タンパク質−タンパク質会合）
いくつかのＧＰＣＲは、他のタンパク質と相互作用し、それによって、シグナル変換、遺伝子転写、形質転換および細胞接着を調節することが示されている（Ｓｅｘｔｏｎ  ＰＭら、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．２００１，１３：７３；Ｔｕｒｎｅｒ  ＣＥ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２０００，２３：４１３９）。免疫沈降技術および酵母ツーハイブリッドシステムを使用して、１０１Ｐ３Ａ１１と会合するタンパク質を同定する。１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞および１０１Ｐ３Ａ１１を欠損する細胞からの免疫沈降物を、特定のタンパク質−タンパク質会合について比較する。
【０６８７】
研究を、エフェクター分子（例えば、レセプター、アダプタータンパク質ならびにパキシリン（ｐａｘｉｌｌｉｎ）、キナーゼ、リン酸塩およびＧａタンパク質）と１０１Ｐ３Ａ１１との会合の程度を確認するために行う。１０１Ｐ３Ａ１１ポジティブ細胞および１０１Ｐ３Ａ１１ネガティブ細胞を比較する研究、および刺激されない細胞／休止細胞と上皮細胞アクチベーター（例えば、サイトカイン、成長因子、アンドロゲンおよび抗インテグリンＡｂ）で処理された細胞を比較する研究は、独特の相互作用を明らかにする。
【０６８８】
さらに、タンパク質−タンパク質相互作用を、酵母ツーハイブリッド方法論を使用して確認する（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１９９９，３：６４）。転写因子の活性化ドメインに融合したタンパク質のライブラリーを保有するベクターを、１０１Ｐ３Ａ１１−ＤＮＡ−結合ドメイン融合タンパク質およびレポーター構築物を発現する酵母へと導入する。タンパク質−タンパク質相互作用を、比色レポーター活性によって検出する。エフェクター分子と転写因子との特異的会合は、当業者を１０１Ｐ３Ａ１１の作用様式に導き、従って、癌に対する治療的、予後的および／または予防的標的を同定する。このアッセイおよび類似のアッセイをまた使用して１０１Ｐ３Ａ１１と相互作用する低分子を同定し、そしてこのような低分子についてスクリーニングする。
【０６８９】
従って、１０１Ｐ３Ａ１１は、タンパク質および低分子と会合することが見出される。従って、１０１Ｐ３Ａ１１ならびにこれらのタンパク質および低分子を、診断的、予後的、予防的および／または治療的目的のために使用する。
【０６９０】
（実施例５１：抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体の生物学的効果）
抗原としてアミノ酸１〜１４（ＭＶＤＰＮＧＮＥＳＳＡＴＹＦ；配列番号４６）をコードするアミノ末端ペプチドを使用する、抗１０１Ｐ３Ａ１１ポリクローナルＡｂ（ｐＡｂ）の産生を、本発明者らの優先権出願に報告した。１０１Ｐ３Ａ１１媒介ＥＲＫリン酸化（図３８）およびｃＡＭＰ蓄積（図３９）に対するこの抗体の効果を、決定した。２９３Ｔ細胞を、コントロールｃＤＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１ｃＤＮＡでトランスフェクトした。細胞を、一晩休止させ、そして抗１０１Ｐ３Ａ１１またはコントロールＡｂで、０．５％または１０％ＦＢＳの存在下で処理した。細胞を、溶解し、そして抗ホスホＥＲＫ  ｍＡｂおよび抗ＥＲＫ  ｍＡｂを用いて、ウェスタンブロッティングによって分析した。図３８は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現が、０．５％または１０％ＦＢＳで処理された細胞においてＥＲＫリン酸化を誘導することを示す。抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｐＡｂは、０．５％ＦＢＳで処理された２９３Ｔ−１０１Ｐ３Ａ１１細胞におけるＥＲＫのリン酸化を減少させた。ＥＲＫのオーバーレイは、等しくローディングしたことを証明し、このことはこのデータの特異性を支持する。
【０６９１】
抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｐＡｂがｃＡＭＰ蓄積に対する検出可能な効果を有することを確認するために、ＰＣ３細胞およびＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、０．１％ＦＢＳ中で増殖させ、そして抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｐＡｂで処理した。細胞を、図３２に記載されるようにｃＡＭＰ含有量について分析した。１０１Ｐ３Ａ１１の発現は、ＰＣ３細胞中のｃＡＭＰ蓄積において５倍の増加を誘導し、これはＰＴＸによって部分的に阻害された。抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｐＡｂでのＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞の処置は、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１中のｃＡＭＰ蓄積において４倍増加を生じたが、コントロールのＰＣ３細胞では生じなかった。図３８および図３９に示される結果は、抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｐＡｂが、１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞中で測定可能な生物学的効果を生成することを示す。従って、１０１Ｐ３Ａ１１は、診断的、予後的、予防的および／または治療的目的のための標的として使用される。
【０６９２】
（実施例５２：１０１Ｐ３Ａ１１プロモーター）
真核生物細胞プロモーターは、遺伝子の５’領域に位置する短いＤＮＡ配列である。これは、組立ての際、遺伝子の転写を促進する、ＲＮＡポリメラーゼおよび関連転写コファクターに対する結合部位を提供する。ヒトにおいては、ほとんどの遺伝子が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。プロモーターＤＮＡ配列は、通常、ＲＮＡポリメラーゼならびにその関連コファクターおよびアクチベーター（ＴＡＴＡボックス、ｃａｐシグナル、ＣＣＡＡＴボックスおよびＧＣボックスを含む）に対する結合モチーフを含む。真核生物細胞エンハンサーは、ＤＮＡ配列である。ここで、転写因子およびそれらの関連コアクチベーターまたはサプレッサーが、プロモーター結合ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして相互作用して、そのプロモーターの次に位置する遺伝子の発現を調節する。プロモーターが遺伝子の転写開始部位（通常２５〜３０塩基対）に近接して位置するが、エンハンサーは、その方向の遺伝子の転写開始部位に対していずれかの方向に５０，０００塩基対までに見出され得る。多くの異なる遺伝子調節タンパク質、すなわち転写因子ならびにそれらの関連コアクチベーターおよび特定のエンハンサー配列に結合しそして遺伝子発現を調節するコサプレッサーが存在する。特定のＤＮＡ調節配列と相互作用する際、およびお互いに相互作用する際、これらのタンパク質は、各々の遺伝子を、異なる組織および細胞タイプにおいてアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることを可能にする（第９章「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ．第３版  Ａｌｂｅｒｔｓら編、（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ）Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９４）。
【０６９３】
組織特異的遺伝子発現は、転写因子ならびにそれらの関連コアクチベーターおよびサプレッサー、その遺伝子の特定のＤＮＡ調節領域に存在する、これらの因子のための特異的結合部位の存在、およびそれらの相対的活性を調整するシグナル伝達経路の活性化または不活性化の特定の組み合わせに存在する。例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ、またはヒトカリクレイン３）の前立腺特異的発現は、その遺伝子の規定された５’上流エンハンサーおよびプロモーター配列中のアンドロゲンレセプター結合エレメントならびにインタクトなアンドロゲンレセプターシグナル伝達経路の存在に依存する（Ｐａｎｇ  Ｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｆｅｂ  １；５７（３）：４９５−９）。これはまた、プロモーター領域中の他のシス作用ＤＮＡ調節エレメントの存在（Ｚｈａｎｇ  Ｊ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，Ａｕｇ．１；２５（１５）：３１４３−５０）および他の転写因子（例えば、前立腺特異的ｅｔｓ様転写因子）の発現（Ｏｅｔｔｇｅｎ  Ｐ，ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００，Ｊａｎ．１４；２７５（２）：１２１６−２５）に依存する。
【０６９４】
ヒトの遺伝子発現に関する、データおよび知識の蓄積を用いて、プロモーターおよびエンハンサーを、異なるアルゴリズムおよびコンピュータープログラムを使用して同定する（第８章「Ｇｅｎｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｍｏｕｎｔ編Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。従って、本発明者らは、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  コンピュータープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｎｎｐｐＡｂｓｔ．ｈｔｍｌ；Ｒｅｅｓｅ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｅｅｃｋｍａｎ，Ｆ．Ｈ．（１９９５）Ｎｏｖｅｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｓｉｔｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ａｃｃｅｐｔｅｄ  ｔａｌｋ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｈｙａｔｔ  Ｒｅｇｅｎｃｙ，Ｈｉｌｔｏｎ  Ｈｅａｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １６−２０，１９９５）を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１コード配列の５．０４ｋＢの５’上流ゲノム領域中のプロモーターを同定し（表ＬＶ）、表ＬＩＶで下線を付した配列によって示した。ＳＩＧＮＡＬ  ＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｓｉｇｎａｌ／；Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ，Ｄ．Ｓ．（１９９１）ＳＩＧＮＡＬ  ＳＣＡＮ：Ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｈａｔ  ｓｃａｎｓ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＣＡＢＩＯＳ  ７，２０３−２０６．）（これは、調節エレメント結合部位の包括的なデータベースを検索する）と呼ばれるプログラムを使用して、本発明者らは、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の５’側の５．０４ｋＢ配列中の様々な公知の転写因子に対する多数の転写結合部位を見出しタ。このことは、組織特異的１０１Ｐ３Ａ１１転写を媒介し得る特定のエンハンサー領域の存在を示唆する。このような転写因子としては、限定されないが、以下が挙げられる：ＮＦＡＴ、ＮＦ−１、ＮＦ−Ｅ、ＣＰ２、ＡＰｌ、ＡＰ−２、Ｓｐｌ、ＯＣＴ−Ｉ、ＯＣＴ−２、ＮＦＫＢ、ＣＲＥＢ、ＣＴＦ、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、Ｐｉｔ−Ｉ、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＲＦおよび種々のステロイドレセプター（例えば、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）およびアンドロゲンレセプター（ＡＲ）（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｐ  ＪおよびＴｉｊａｎ  Ｒ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：３７１））。ＰＳＡ遺伝子の５ｋＢ上流配列と１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の５ｋＢ上流配列とを比較して、前立腺細胞の特異的発現に重要である５つの相同領域が見出された。表ＬＶＩは、これらの配列の整列を示し、そしてまた、ＳＩＧＮＡＬ  ＳＣＡＮを使用して同定された両方の配列に共通する、推定された転写因子結合部位を示す。
【０６９５】
実験的に、当該分野で周知の種々の方法（例えば、転写レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）に融合させた推定の調節領域の欠失分析および変異分析）を使用して、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の５’ゲノム上流領域中の領域を定義する。次いで、これらの転写レポーターベクターを、レポーター遺伝子の転写およびの発現の組織および細胞タイプ特異性を分析するために、細胞株、組織またはトランスジェニック動物へ導入する。特定の１０１Ｐ３Ａ１１転写調節配列と相互作用する転写因子およびタンパク質を同定するために、当該分野で公知の種々の技術（例えば、ＤＮアーゼフットプリント法、ゲル移動度シフトアッセイおよびＤＮＡ／タンパク質アフィニティークロマトグラフィー）の１つ以上を利用する。プロモーターの使用に関する種々の技術は、例えば、米国特許第５，９１９，６５２号（これは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーターを単独で、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとの組み合せで含む核酸組成物および関連する使用の実施形態に関する）；および米国特許第６，１１０，７０２号（これは、ＰＳＡポジティブ調節配列（ＰＳＡＲ）および関連する使用に関する）に記載される。
【０６９６】
一旦、１０１Ｐ３Ａ１１組織特異的発現を媒介する調節配列を同定すると、これらの配列は、癌に対しての種々の遺伝子治療的ストラテジー（例えば、毒性遺伝子または細胞自殺遺伝子の組織特異的発現の駆動）に利用される。このような細胞自殺ストラテジーは、現在、チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系を使用するＰＳＡプロモーターエンハンサーを使用して、用いられる（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｓ，Ｔａｄａｋｕｍａ  Ｔ，Ａｓａｎｏ  Ｔ，Ｈａｙａｋａｗａ  Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１  Ｆｅｂ  １５；６１（４）：１２７６−９０）。アンドロゲンに調節される遺伝子であるＰＳＡとは異なり、１０１Ｐ３Ａ１１は、アンドロゲンに調節された発現を示さない。従って、例えば、前立腺特異的であるが、アンドロゲン非感受性の遺伝子発現を媒介する１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子の調節配列の同定および使用は、初期段階のアンドロゲン感受性前立腺癌および後期段階のアンドロゲン非感受性またはホルモン無反応性前立腺癌の両方の処置に有用である。
【０６９７】
（実施例５３：ＰＨＯＲ−１モノクローナル抗体の産生）
バイオプシー標本片中のＰＨＯＲ−１の存在を同定するためまたはＰＨＯＲ−１の効果を中和するための試薬の使用は、診断、予後、予防および／または治療において有益な効果を有する。抗ＰＨＯＲ−１試薬の１つの特に有用なクラスは、抗体であり、特にＰＨＯＲ−１に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。ＰＨＯＲ−１タンパク質のエピトープと反応し、その結果、その存在を示すか、その生物学的機能を破壊もしくは調節する（例えば、その生物学的活性を媒介するかまたはその活性に関与するリガンドまたはタンパク質との相互作用を破壊するもの）か、またはＰＨＯＲ−１を発現する細胞に毒性を運び得る、抗ＰＨＯＲ−１  Ａｂ（例えばｍＡｂ）が、産生される。
【０６９８】
本明細書中で使用される場合、用語「抗ＰＨＯＲ−１抗体」は、ＰＨＯＲ−１遺伝子産物の任意のエピトープに対する抗体を網羅すると理解されるべきである。診断的ｍＡｂ（例えば、画像化または免疫細胞化学のために使用されるｍＡｂ）は、ＰＨＯＲ−１タンパク質のエピトープに特異的に結合し、従って、その存在を証明するｍＡｂを含む。治療的ｍＡｂは、診断に有用であるｍＡｂを含むが、細胞表面に曝露されたＰＨＯＲ−１のエピトープに特異的に結合し、従って、ＰＨＯＲ−１を発現する細胞の機能を破壊し、そして／またはＰＨＯＲ−１を発現する細胞とＰＨＯＲ−１に対するリガンドとの相互作用を破壊することによって、ＰＨＯＲ−１を発現する細胞の増殖および生存を調整するために有用であるｍＡｂもまた含む。
【０６９９】
本発明の１つの局面を形成する好ましい抗体としては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｘ１８（１）４、Ｘ１８（１）１０、Ｘ１８（１）２３、Ｘ１８（４）７と呼ばれる抗体、または番号Ｘ２０およびＸ４７を接頭語とする抗体、ならびにそれらの誘導体。これらの産生は、本明細書中に記載される。これらの抗体を産生するハイブリドーマは、それぞれ、２００２年５月１４日にＡＴＣＣに寄託された。
【０７００】
ＰＨＯＲ−１発現の存在によって特徴付けられる病理学的状態としては、限定されないが、表Ｉに列挙されるような組織の新生物が挙げられる。本発明の１つの局面は、ＰＨＯＲ−１の存在を検出する方法を提供する。本発明のさらなる局面は、ＰＨＯＲ−１の存在によって特徴付けられた状態を処置する方法を提供し、この方法は、有効量の抗ＰＨＯＲ−１抗体を投与する工程を包含する。抗ＰＨＯＲ−１抗体の投与は、ＰＨＯＲ−１の存在によって特徴付けられた状態の処置において特に有利である。
【０７０１】
本発明に従う使用のためのＰＨＯＲ−１に対する抗体は、任意の種由来であり得、そして任意の免疫グロブリンクラスに属し得る。従って、例えば、本発明に従う使用のための抗ＰＨＯＲ−１抗体は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭまたは免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＥであり得る。
【０７０２】
抗ＰＨＯＲ−１抗体は、動物（例えば、哺乳動物起源または鳥類起源）由来であり得、そして例えば、マウス起源、ラット起源またはヒト起源であり得る。抗体は、全体の免疫グロブリンまたはそのフラグメント（例えば、全抗体のタンパク質分解切断によって誘導されたフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦａｂフラグメント））、あるいは組換えＤＮＡ技術によって得られたフラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント）であり得る。
【０７０３】
本発明に従う使用のための特に有用な抗体は、ヒト化抗ＰＨＯＲ−１抗体または完全なヒト抗ＰＨＯＲ−１抗体およびそのフラグメントを含む。これらの抗体は、任意の適切な手順（限定されないが、哺乳動物細胞および細菌細胞発酵システムを含む）によって作製される。
【０７０４】
抗ＰＨＯＲ−１ｍＡｂは、ＰＨＯＲ−１抗原を利用する免疫学的技術によって調製される。従って、例えば、任意の適切な宿主は、免疫原として利用可能なＰＨＯＲ−１を作製する適切な試薬を注射（試薬で免疫）され得る。宿主由来の免疫細胞（例えば、脾細胞またはリンパ球）は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，５１１（１９７６）の方法を使用して、免疫化宿主から回収されそして不死化されるか、またはそれらの免疫グロブリン遺伝子が、単離され、そして適切な細胞タイプでの発現に適切なＤＮＡベクターに移入され得る。いずれかの技術によって生成された、得られた細胞を、選抜し、より通常にはモノクローナル抗体として知られる、単一の特異なタイプの抗体を生成する単一遺伝子系統を得る。抗体フラグメントは、全抗体の酵素的分解（例えば、ペプシン（Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３１：２８９５（１９８３））またはパパイン（ＬａｍｏｙｉおよびＮｉｓｏｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．５６：２３５（１９８３）を用いる）のような技術を用いるか、または組換えＤＮＡ技術によって、生成され得る。
【０７０５】
ＰＨＯＲ−１に対するＭａｂの生成のための適切な宿主は、マウス、ラット、ハムスターおよびウサギを含む。例えば、マウスは、抗原性材料（免疫原）の供給源として利用可能であるＰＨＯＲ−１を作製する多数の異なる試薬で免疫化される。免疫化の経路およびタイミングは、免疫原の供給源および／または実施形態に依存する。ＰＨＯＲ−１に対する免疫原の供給源としては、限定されないが、以下が挙げられる：ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、ＤＮＡ，ＲＮＡ、細胞または細胞膜。これらは、ＰＨＯＲ−１に対する特異的免疫反応を産生するために、免疫原として別々でか、また組み合わせで使用され得る。これらの様々な免疫原の使用および適用は、添付の実施例に十分に記載される。
【０７０６】
（実施例５４：免疫原としてＰＨＯＲ−１の最初の２３Ｎ’末端アミノ酸をコードするペプチドを使用する、ＰＨＯＲ  １に対する抗体の産生）
１つの実施形態において、ＰＨＯＲ−１の最初の２３アミノ酸（ＭＶＤＰＮＧＮＥＳＳＡＴＹＦＩＬＩＧＬＰＧＬＥ）（配列番号４７）をコードするペプチドを生成した。これらは、ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓの特注ペプチドサービスを使用して、ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓによって合成された。このペプチドを、セリン−グリシン−セリン−グリシン−システイン（ＳＧＳＧＣ）Ｃ末端リンカー配列を付加して合成し、ついで、Ｃ末端システイン残基を介してＫＬＨに結合した。この芳香性では、Ｎ末端ＰＨＯＲ−１配列は、抗原認識に関して拘束を受けないままである。
【０７０７】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１０μｇのペプチドで２週間毎に４週間にわたって腹腔内（ｉ．ｐ．）に免疫した。最初の免疫化を、ｉ．ｐ．で完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で与え、続く２回の免疫化を、ｉ．ｐ．で不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で与えた。
【０７０８】
免疫化後の応答の特異性を決定するために、マウスから、最後の免疫化の１０日後に、採血した。反応性を、標的としてＫＬＨ非結合体化（遊離）ペプチドを使用して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。５匹の全てのマウスは、抗原に対して非常に高い力価を有した。
【０７０９】
最も高い力価を有する２匹のマウスに、ＰＢＳ中１０μｇのペプチドの最終追加免疫を与え、３日後に融合のためにマウスを屠殺した。免疫化マウス由来の脾臓細胞を、標準のプロトコル（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：５１１（１９７６））に従って、ＰＥＧ１５００を使用して、マウスＳｐ２／０骨髄腫細胞と融合した。融合細胞を、１０個の９６ウェルマイクロタイタープレートにプレーティングし、そしてハイブリドーマを、ＨＡＴ培地補充を使用して選択した。融合ウェルからの上清を、ＰＨＯＲ−１ペプチドに対してＥＬＩＳＡによって１０〜１７日後にスクリーニングした。２１のポジティブなハイブリドーマを同定した；これらのハイブリドーマを表Ｌに示す。
【０７１０】
【化３】
2005512509.tif 000005
（実施例５５：ＤＮＡ免疫化を使用してのＰＨＯＲ  １に対するｍＡｂの産生）
ＰＨＯＲ−１に対する治療的ｍＡｂは、ＰＨＯＲ−１の生物学的機能を破壊するかまたは調整するＰＨＯＲ−１エピトープと反応するｍＡｂ（例えば、その生物学的活性を媒介するかまたはその活性に関与するリガンドまたはタンパク質とのその相互作用を破壊するｍＡｂｓ）を含む。マウスの嗅覚レセプターＳ２５の構造モデリングおよび実験結合データは、細胞外ループ１および膜貫通ドメイン３の接合部、膜貫通ドメイン４と５の間の細胞外ループ２の領域、ならびに膜貫通ドメイン６と７の間の細胞外ループ３の領域のアミノ酸残基が、リガンドのヘキサノールの結合に関与することを示す（Ｆｌｏｒｉａｎｏ，Ｗ．Ｂ．ら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７：１０７１２−１０７１６）。
【０７１１】
従って、１つの実施形態において、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ）Ｆｃ（ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域）にＣ末端で融合したＰＨＯＲ−１の膜貫通ドメイン４と５の間の細胞外ループ２（１５９〜２０２）のアミノ酸をコードするベクターを、構築した。この構築物を、ＤＮＡベースの免疫化ストラテジーに使用した。
【０７１２】
５つのＢａｌｂ／ｃマウスを、マウスの尾の基部に皮内（ＩＤ）に免疫した。３回の免疫を、ＰＢＳ中１００μｇのＤＮＡを２週間にわたって各々のマウスに与えた。免疫応答の増大のために、各々のマウスに、最後のＤＮＡ免疫化の１０日後に、組織培養培地中２μｇのＰＨＯＲ−１−Ｆｃタンパク質のｉ．ｐ．追加免疫を与えた。血液を、最後の免疫化の１０日後に回収し、そしてＰＨＯＲ−１の中央のループに対する血清における反応性を、標的としてＰＨＯＲ−１−Ｆｃ融合タンパク質を使用してＥＬＩＳＡによって試験した（試験１）。並行して、血清をまた、無関係のヒトＦｃ融合タンパク質について試験した（試験２）。融合タンパク質のＰＨＯＲ−１の部分に対する特異的反応性が示された。
【０７１３】
全マウスを屠殺し、そして融合選択およびハイブリドーマ選択を、実施例５４に記載されるように実行した。ハイブリドーマの上清を、標的としてＰＨＯＲ１−Ｆｃタンパク質を使用してＥＬＩＳＡによって１０〜１７日後にスクリーニングした。引き続いて、ＰＨＯＲ−１−Ｆｃポジティブを、ＰＨＯＲ  １特異的クローンを同定するために、無関係なＦｃタンパク質について交差スクリーニングした。他のＦｃ融合タンパク質に対しては反応性でないがＰＨＯＲ１−Ｆｃに特異的である全１６個のポジティブを同定し、これらのハイブリドーマを表ＬＩに示す。
【０７１４】
【化４】
2005512509.tif 000006
（実施例５６：ＰＨＯＲ−１のアミノ酸８６〜３１０に特異的なモノクローナル抗体の産生）
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）にアミノ末端で融合したＰＨＯＲ−１のアミノ酸８６〜３１０をコードする、融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質（ＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１）は、膜貫通ドメイン３から膜貫通ドメイン７に生じる配列を包含し、その結果、ＰＨＯＲ−１の全ての細胞外ループの全てを表し、そして表されない唯一の細胞外ドメインはＮ’末端である。この融合タンパク質を、標準的なグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーを使用して、誘導した細菌から精製し、そして実施例５４のプトロコルに従って、５匹のマウスを免疫するために使用した。血清のＰＨＯＲ−１特異的力価を、第４の免疫化（採血２）の後に、マルトース結合タンパク質に融合したＰＨＯＲ−１のアミノ酸８６〜３１０から構成される融合タンパク質（ＰＨＯＲ  １−ＭＢＰ）を使用して、決定した（下記の表ＬＩＩおよび図４９を参照のこと）。各マウス由来の血清は、ウェスタン分析によって評価されるように、エピトープタグ化ＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞中のＰＨＯＲ−１タンパク質を特異的に認識した（図４８）。２９３Ｔ−ＰＨＯＲ  １細胞上でスクリーニングし、ＦＡＣＳによって２９３Ｔ−ｎｅｏ細胞と比較した場合、いくつかの血清がポジティブであッタ。（このことは、細胞関連ＰＨＯＲ１に特異的な抗体の産生を示す（図５０を参照のこと）。
【０７１５】
【化５】
2005512509.tif 000007
高い力価を有する２つのマウスに、ＰＢＳ中のＭＢＰ−ＰＨＯＲ−１融合タンパク質の最終追加免疫を与え、そしてこれらのマウスを融合のために３日後に屠殺した。融合およびハイブリドーマ増殖選択を、実施例５４のように実行した。ハイブリドーマを、ＧＳＴ−ＰＨＯＲ１に対してＥＬＩＳＡよってスクリーニングし、そしてＭＢＰ−ＰＨＯＲ−１に対して交差スクリーニングし、ＰＨＯＲ−１配列反応性クローンを同定した。ＭＢＰ−ＰＨＯＲ−１に特異的な反応性を示す４８ハイブリドーマを、同定した。これらのハイブリドーマを表ＬＩＩＩに示す。
【０７１６】
【化６】
2005512509.tif 000008
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ＭＢＰ−ＰＨＯＲ−１に反応性の４つのハイブリドーマは、細胞中に発現したＰＨＯＲ−１タンパク質に強い特異的反応性を示した。これを、エピトープタグ化ＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のウェスタン分析によって証明した。ポジティブクローンを命名した（すなわち、１８（１）４；１８（１）１０；１８（１）２３；および１８（４）７）。それぞれ、１８（１）４；１８（１）１０；１８（１）２３；および１８（４）７を発現するハイリドーマを、２００２年５月１４日にＡＴＣＣに寄託した。
【０７１７】
（実施例５７：１０１Ｐ３Ａ１１の活性化）
上記の実施例４４に記載のｃＡＭＰ蓄積アッセイを使用してか、またはＧＴＰアナログ（すなわち、［３５Ｓ］ＧＴＰｙＳ）の結合を測定することによって、１０１Ｐ３Ａ１１の構成的でリガンドに媒介される活性化を測定することが可能である。［３５Ｓ］ＧＴＰｙＳ結合は、一般的に、全ＧＰＣＲに適用可能であり；そしてＧＣＰＲが位置する膜表面の近傍で生じる。好ましくは、ＧＰＣＲ：融合タンパク質は、これらのアッセイについて使用される。このアッセイは、関連するレセプターを発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰｙＳ結合を刺激する、Ｇタンパク質共役レセプターの能力を利用する。従って、このアッセイを使用して、１０１Ｐ３Ａ１１の活性化に対する効果について、化合物および抗体を直接スクリーニングし得る。
【０７１８】
シンチレーション近接アッセイを利用して、１０１Ｐ３Ａ１１−Ｇｓ−融合タンパク質（２９３細胞または３Ｔ３細胞に発現される）を発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰ７Ｓの結合をモニターし得る。手短に言えば、膜タンパク質を、［３５Ｓ］ＧＴＰｙＳおよびＧＤＰと６０分間インキュベートする。このアッセイプレートを、シンチレーション計数器でカウントする。
【０７１９】
本出願の全体にわたって、様々なウェブサイトのデータコンテンツ、刊行物、特許出願および特許を参照する。ウェブサイトは、Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌｏｃａｔｏｒ（またはＵＲＬ）によって、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ（ＷＷＷ．）上のアドレスを付与される。
【０７２０】
本発明は、本明細書中に開示される実施形態によって範囲を限定されるべきでなく、この実施形態は、本発明の個々の局面の一つの例示として意図され、そして任意の機能的な等価物も、本発明の範囲内である。本明細書中に記載される改変に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、先の説明および教示から当業者に明らかになり、そして本発明の範囲内にあることが同様に意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実行され得る。
【０７２１】
【表１】
2005512509.tif 000010
【０７２２】
【表２】
2005512509.tif 000011
【０７２３】
【表３】
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【０７２４】
【表４】
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【０７２５】
【表５】
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【０７２６】
【表６】
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【０７２７】
【表７】
2005512509.tif 000016
【０７２８】
【表８】
2005512509.tif 000017
【０７２９】
【表９】
2005512509.tif 000018
【０７３０】
【表１０】
2005512509.tif 000019
【０７３１】
【表１１】
2005512509.tif 000020
【０７３２】
【表１２】
2005512509.tif 000021
【０７３３】
【表１３】
2005512509.tif 000022
【０７３４】
【表１４】
2005512509.tif 000023
【０７３５】
【表１５】
2005512509.tif 000024
【０７３６】
【表１６】
2005512509.tif 000025
【０７３７】
【表１７】
2005512509.tif 000026
【０７３８】
【表１８】
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【０７３９】
【表１９】
2005512509.tif 000028
【０７４０】
【表２０】
2005512509.tif 000029
【０７４１】
【表２１】
2005512509.tif 000030
【０７４２】
【表２２】
2005512509.tif 000031
【０７４３】
【表２３】
2005512509.tif 000032
【０７４４】
【表２４】
2005512509.tif 000033
【０７４５】
【表２５】
2005512509.tif 000034
【０７４６】
【表２６】
2005512509.tif 000035
【０７４７】
【表２７】
2005512509.tif 000036
【０７４８】
【表２８】
2005512509.tif 000037
【０７４９】
【表２９】
2005512509.tif 000038
【０７５０】
【表３０】
2005512509.tif 000039
【０７５１】
【表３１】
2005512509.tif 000040
【０７５２】
【表３２】
2005512509.tif 000041
【０７５３】
【表３３】
2005512509.tif 000042
【０７５４】
【表３４】
2005512509.tif 000043
【０７５５】
【表３５】
2005512509.tif 000044
【０７５６】
【表３６】
2005512509.tif 000045
【０７５７】
【表３７】
2005512509.tif 000046
【０７５８】
【表３８】
2005512509.tif 000047
【０７５９】
【表３９】
2005512509.tif 000048
【０７６０】
【表４０】
2005512509.tif 000049
【０７６１】
【表４１】
2005512509.tif 000050
【０７６２】
【表４２】
2005512509.tif 000051
【０７６３】
【表４３】
2005512509.tif 000052
【０７６４】
【表４４】
2005512509.tif 000053
【０７６５】
【表４５】
2005512509.tif 000054
【０７６６】
【表４６】
2005512509.tif 000055
【０７６７】
【表４７】
2005512509.tif 000056
【０７６８】
【表４８】
2005512509.tif 000057
【０７６９】
【表４９】
2005512509.tif 000058
【０７７０】
【表５０】
2005512509.tif 000059
【０７７１】
【表５１】
2005512509.tif 000060
【０７７２】
【表５２】
2005512509.tif 000061
【０７７３】
【表５３】
2005512509.tif 000062
【０７７４】
【表５４】
2005512509.tif 000063
【０７７５】
【表５５】
2005512509.tif 000064
【０７７６】
【表５６】
2005512509.tif 000065
【０７７７】
【表５７】
2005512509.tif 000066
【０７７８】
【表５８】
2005512509.tif 000067
【０７７９】
【表５８Ａ】
2005512509.tif 000068
【０７８０】
【表５９】
2005512509.tif 000069
【０７８１】
【表６０】
2005512509.tif 000070
【０７８２】
【表６１】
2005512509.tif 000071
【０７８３】
【表６２】
2005512509.tif 000072
【０７８４】
【表６３】
2005512509.tif 000073
【０７８５】
【表６４】
2005512509.tif 000074
【０７８６】
【表６５】
2005512509.tif 000075
【０７８７】
【表６６】
2005512509.tif 000076
【０７８８】
【表６７】
2005512509.tif 000077
【０７８９】
【表６８】
2005512509.tif 000078
【０７９０】
【表６９】
2005512509.tif 000079
【０７９１】
【表７０】
2005512509.tif 000080
【０７９２】
【表７１】
2005512509.tif 000081
【０７９３】
【表７２】
2005512509.tif 000082
【０７９４】
【表７３】
2005512509.tif 000083
【０７９５】
【表７４】
2005512509.tif 000084
【０７９６】
【表７５】
2005512509.tif 000085
【０７９７】
【表７６】
2005512509.tif 000086
表ＸＬ−１０１Ｐ３Ａ１１  Ｖ１−ＨＬＡ  Ｂ０８  １０マーは、結果なし。
表ＸＬ−１０１Ｐ３Ａ１１  Ｖ２−ＨＬＡ  Ｂ０８  １０マーは、結果なし。
表ＸＬ−１０１Ｐ３Ａ１１  Ｖ３−ＨＬＡ  Ｂ０８  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＩ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ１−ＨＬＡ  Ｂ１５１０  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＩ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ２−ＨＬＡ  Ｂ１５１０  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＩ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ３  ＨＬＡ  Ｂ１５１０  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＩＩ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ１−ＨＬＡ  Ｂ２７０５  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＩＩ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ２−ＨＬＡ  Ｂ２７０５  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＩＩ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ３  ＨＬＡ  Ｂ２７０５  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＩＩＩ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ１−ＨＬＡ  Ｂ２７０９  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＩＩＩ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ２−ＨＬＡ  Ｂ２７０９  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＩＩＩ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ３  ＨＬＡ  Ｂ２７０９  １０マーは、結果なし。
【０７９８】
【表７７】
2005512509.tif 000087
【０７９９】
【表７８】
2005512509.tif 000088
表ＸＬＶ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ１−ＨＬＡ  Ｂ５１０１  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＶ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ２−ＨＬＡ  Ｂ５１０１  １０マーは、結果なし。
表ＸＬＶ−１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ３  ＨＬＡ  Ｂ５１０１  １０マーは、結果なし。
【０８００】
【表７９】
2005512509.tif 000089
【０８０１】
【表８０】
2005512509.tif 000090
【０８０２】
【表８１】
2005512509.tif 000091
【０８０３】
【表８２】
2005512509.tif 000092
【０８０４】
【表８３】
2005512509.tif 000093
【０８０５】
【表８４】
2005512509.tif 000094
【０８０６】
【表８５】
2005512509.tif 000095
【０８０７】
【表８６】
2005512509.tif 000096
【０８０８】
【表８７】
2005512509.tif 000097
【０８０９】
【表８８】
2005512509.tif 000098
【０８１０】
【表８９】
2005512509.tif 000099
【０８１１】
【表９０】
2005512509.tif 000100
【０８１２】
【表９１】
2005512509.tif 000101
【０８１３】
【表９２】
2005512509.tif 000102
【０８１４】
【表９３】
2005512509.tif 000103
【０８１５】
【表９４】
2005512509.tif 000104
【０８１６】
【表９５】
2005512509.tif 000105
【０８１７】
【表９６】
2005512509.tif 000106
【０８１８】
【表９７】
2005512509.tif 000107
【０８１９】
【表９８】
2005512509.tif 000108
【０８２０】
【表９９】
2005512509.tif 000109
【図面の簡単な説明】
【０８２１】
【図１】１０１Ｐ３Ａ１１  ＳＳＨ配列。
【図２Ａ−１】１０１Ｐ３Ａ１１改変体の１〜３のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。開始メチオニンに下線を付す。改変体１および３のオープンリーディングフレームは、核酸１３３から１０８６にわたり、停止コドンを含む。より短いペプチドがより好ましいＫｏｚａｋ配列を有し得るので、各改変体における開始Ｍのコドンは省略され得る）。
【図２Ａ−２】１０１Ｐ３Ａ１１改変体の１〜３のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。開始メチオニンに下線を付す。改変体１および３のオープンリーディングフレームは、核酸１３３から１０８６にわたり、停止コドンを含む。より短いペプチドがより好ましいＫｏｚａｋ配列を有し得るので、各改変体における開始Ｍのコドンは省略され得る）。
【図２Ｂ−１】１０１Ｐ３Ａ１１改変体の１〜３のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。開始メチオニンに下線を付す。改変体１および３のオープンリーディングフレームは、核酸１３３から１０８６にわたり、停止コドンを含む。より短いペプチドがより好ましいＫｏｚａｋ配列を有し得るので、各改変体における開始Ｍのコドンは省略され得る）。
【図２Ｂ−２】１０１Ｐ３Ａ１１改変体の１〜３のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。開始メチオニンに下線を付す。改変体１および３のオープンリーディングフレームは、核酸１３３から１０８６にわたり、停止コドンを含む。より短いペプチドがより好ましいＫｏｚａｋ配列を有し得るので、各改変体における開始Ｍのコドンは省略され得る）。
【図２Ｃ−１】１０１Ｐ３Ａ１１改変体の１〜３のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。開始メチオニンに下線を付す。改変体１および３のオープンリーディングフレームは、核酸１３３から１０８６にわたり、停止コドンを含む。より短いペプチドがより好ましいＫｏｚａｋ配列を有し得るので、各改変体における開始Ｍのコドンは省略され得る）。
【図２Ｃ−２】１０１Ｐ３Ａ１１改変体の１〜３のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。開始メチオニンに下線を付す。改変体１および３のオープンリーディングフレームは、核酸１３３から１０８６にわたり、停止コドンを含む。より短いペプチドがより好ましいＫｏｚａｋ配列を有し得るので、各改変体における開始Ｍのコドンは省略され得る）。
【図３Ａ】１０１Ｐ３Ａ１１改変体１のアミノ酸配列。
【図３Ｂ】１０１Ｐ３Ａ１１改変体２のアミノ酸配列。
【図３Ｃ】１０１Ｐ３Ａ１１改変体３のアミノ酸配列。
【図４】１０１Ｐ３Ａ１１（Ｓｂｊｃｔ）とマウス嗅覚レセプターＳ２５（Ｑｕｅｒｙ．）とのアラインメント。ＴＭＨＭＭアルゴリズムを用いて推定した１０１Ｐ３Ａ１１およびマウス嗅覚レセプターＳ２５（ＯＲＳ２５）の膜貫通領域を灰色に強調した。リガンドヘキサノールの結合に関与する、および／またはリガンド結合ポケットの形成に関与すると推定したＯＲＳ２５のアミノ酸（Ｆｌｏｒｉａｎｏ，Ｗ．Ｂ．ら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９７：１０７１２−１０７１６）を、図中、イタリック体および太字で示し、そしてこれは、以下の通りである：Ｌｅｕ  １３１、Ｖａｌ  １３４、Ｖａｌ  １３５、Ｇｌｙ  １３８、Ｔｈｒ  ｌ３９、Ｓｅｒ  １９３、Ｓｅｒ  １９７、Ｐｈｅ  ２２５、Ａｌａ  ２３０、Ｉｌｅ  ２３１、Ｇｌｙ  ２３４、Ｔｈｒ  ２８４、Ｐｈｅ  ２８７、Ｇｌｎ  ３００、Ｌｙｓ  ３０２。
【図５】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを介してＰｒｏｔｓｃａｌｅ  ｗｅｂｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）  上でアクセスされるＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの方法  （Ｈｏｐｐ  Ｔ．Ｐ．，Ｗｏｏｄｓ  Ｋ．Ｒ．，１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８）を用いてコンピューターアルゴリズム配列解析により決定された１０１Ｐ３Ａ１１の親水性アミノ酸プロフィール。
【図６】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを介してＰｒｏｔＳｃａｌｅ  ｗｅｂｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）上でアクセスされるＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｋｙｔｅ  Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ．Ｆ．，１９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）を用いてコンピューターアルゴリズム配列解析により決定された１０１Ｐ３Ａ１１の親水性アミノ酸プロフィール。
【図７】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを介してＰｒｏｔＳｃａｌｅ  ｗｅｂｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）上でアクセスされるＪａｎｉｎの方法（Ｊａｎｉｎ  Ｊ．，１９７９  Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２）を用いてコンピューターアルゴリズム配列解析により決定された１０１Ｐ３Ａ１１％アクセス可能な残基アミノ酸プロフィール。
【図８】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを介してＰｒｏｔＳｃａｌｅ  ｗｅｂｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）でアクセスされるＢｈａｓｋａｒａｎおよびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙの方法  （Ｂｈａｓｋａｒａｎ  Ｒ．，ａｎｄ  Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  Ｐ．Ｋ．，１９８８．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５）を用いてコンピューターアルゴリズム配列解析により決定された１０１Ｐ３Ａ１１の平均可変性アミノ酸プロフィール。
【図９】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを介してＰｒｏｔＳｃａｌｅ  ｗｅｂｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）上でアクセスされるＤｅｌｅａｇｅおよびＲｏｕｘの方法（Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ  Ｂ．１９８７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １：２８９−２９４）を用いてコンピューターアルゴリズム配列解析により決定された１０１Ｐ３Ａ１１のβ−ターンアミノ酸プロフィール。
【図１０Ａ】ＲＴ−ＰＣＲによる１０１Ｐ３Ａ１１の発現。第一鎖ｃＤＮＡをバイタルプール１（ＶＰ１：肝臓、肺、および腎臓）、バイタルプール２（ＶＰ２、膵臓、結腸、および胃）、前立腺異種移植片プール、前立腺癌プール、腎臓癌プール、結腸癌プール、乳癌プール、および癌転移プールから調製した。正規化を、アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いるＰＣＲによって実施した。１０１Ｐ３Ａ１１に対するプライマーを用いる半定量ＰＣＲを、３０サイクルの増幅で実施した。１０１Ｐ３Ａ１１の発現は、前立腺異種移植片プール、前立腺癌プール、腎臓癌プール、結腸癌プール、乳癌プール、および癌転移プールにおいて観察されたが、ＶＰ１およびＶＰ２においては観察されなかった。
【図１０Ｂ】患者由来の増幅ｃＤＮＡを用いる腫瘍ＲＮＡ（Ｔ）および正常ＲＮＡ（Ｎ）マッチ試料のドットプロット分析により実証されたヒト癌における１０１Ｐ３Ａ１１の発現。ＰＨＯＲ−１発現のアップレギュレーションが、３人の前立腺癌患者のうち３人で、１４人の腎臓癌患者のうち６人で、８人の子宮癌患者のうち２人で、８人の胃癌患者のうち３人で、そして７人の直腸癌患者のうち７人で見出された。
【図１１】ヒト患者前立腺癌標本における１０１Ｐ３Ａ１１の発現。ＲＮＡを、３つの前立腺癌腫瘍のプール、腎臓癌腫瘍、結腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、および癌患者に由来する癌転移プール、ならびに正常前立腺（ＮＰ）、正常膀胱（ＮＢ）、正常腎臓（ＮＫ）および正常結腸（ＮＣ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを伴うノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１フラグメントでプローブした。キロ塩基（ｋｂ）でのサイズ標準を側方に示す。結果は、前立腺癌腫瘍、腎臓癌腫瘍、結腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、癌転移プール、膀胱癌プールにおいて、および正常前立腺において、１０１Ｐ３Ａ１１の発現を示したが、他の正常組織では示さなかった。ＲＮＡゲルの臭化エチジウム染色の写真もまた示す。
【図１２Ａ】前立腺癌患者標本における１０１Ｐ３Ａ１１の発現。ＲＮＡを、前立腺癌患者由来の前立腺腫瘍（Ｔ）およびそれらの正常隣接組織（Ｎａｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを伴うノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした。結果は、１０の腫瘍標本のうち８つで１０１Ｐ３Ａ１１のアップレギュレートされた発現を示す。
【図１２Ｂ】アンチセンス１０１Ｐ３Ａ１１リボプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）における１０１Ｐ３Ａ１１発現を示す顕微鏡写真。
【図１２Ｃ】アンチセンス１０１Ｐ３Ａ１１リボプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる前立腺癌組織における１０１Ｐ３Ａ１１発現を示す顕微鏡写真。
【図１２Ｄ】アンチセンス１０１Ｐ３Ａ１１リボプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる前立腺癌における１０１Ｐ３Ａ１１発現を示す顕微鏡写真。正常前立腺（図１２Ｅ）に対する発現のアップレギュレーションに留意されたい。
【図１２Ｅ】アンチセンス１０１Ｐ３Ａ１１リボプローブを用いるインサイチュハイブリダイゼーションによる正常前立腺における１０１Ｐ３Ａ１１発現を示す顕微鏡写真。
【図１３】結腸癌患者標本における１０１Ｐ３Ａ１１の発現。ＲＮＡを、結腸癌患者由来の結腸腫瘍（Ｔ）およびそれらの正常隣接組織（Ｎａｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを伴うノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした。キロ塩基（ｋｂ）でのサイズ標準を側方に示す。結果は、結腸腫瘍において１０１Ｐ３Ａ１１の発現を示したが、正常組織において発現を示さなかった。発現はまた、結腸癌細胞株Ｔ８４においても見られた。ＲＮＡゲルの臭化エチジウム染色の写真もまた示す。
【図１４】腎臓癌患者標本における１０１Ｐ３Ａ１１の発現。ＲＮＡを、腎臓癌患者由来の腎臓腫瘍（Ｔ）およびそれらの正常隣接組織（Ｎａｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを伴うノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした。キロ塩基（ｋｂ）でのサイズ標準を側方に示す。結果は、６つの腎臓腫瘍標本のうち５つにおいて１０１Ｐ３Ａ１１の発現を示した。発現が正常隣接組織（疾患組織から単離された）で検出されるが、正常組織（健常ドナーから単離された）で検出されないことが、これらの組織が完全には正常ではなく、１０１Ｐ３Ａ１１が早期腫瘍において発現されることを示す。ＲＮＡゲルの臭化エチジウム染色の写真もまた示す。
【図１５】図１５Ａ−Ｃ。組織培養細胞における１０１Ｐ３Ａ１１のアンドロゲン調節。ＬＡＰＣ−９細胞を、炭ストリップ培地で増殖させ、合成アンドロゲンミボレロンで１４時間または２４時間のいずれかの間、刺激した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを伴うノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした（図１５Ａ）。ＲＮＡゲルの臭化エチジウム染色の写真もまた示す（図１５Ｃ）。結果は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現がアンドロゲンによって調節されなかったことを示した。実験サンプルを、アンドロゲン調節前立腺癌遺伝子ＰＳＡの発現について試験することにより確認した（図１５Ｂ）。この実験は、予期されるように、ＰＳＡレベルが、炭ストリップ血清の存在下で低下し、発現が、ミボルレンの存在下で１４時間および２４時間で誘導されることを示した。
【図１６】インビボにおける１０１Ｐ３Ａ１１のアンドロゲン調節。雄マウスにＬＡＰＣ−９ＡＤ腫瘍細胞を注射した。腫瘍が触知可能な大きさ（直径０．３〜０．５ｃｍ）に達したとき、マウスを去勢し、去勢後の種々の時点で腫瘍を採集した。ＲＮＡを異種移植片組織から単離した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを伴うノーザンブロットを１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした。キロ塩基（ｋｂ）でのサイズ標準を側方に示す。ＲＮＡゲルの臭化エチジウム染色の写真もまた示す。結果は、１０１Ｐ３Ａ１１の発現がアンドロゲン調節されないことを示した。
【図１７】１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃ融合タンパク質の発現および検出。１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃベクターを構築した。組換え発現ベクターＤＮＡを、２９３Ｔ細胞またはＣｏｓ−７細胞のいずれかにトランスフェクトした。細胞ならびに培養上清（培地）を２４時間後に採集した。細胞を溶解し、培地サンプルと共にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流した。ゲルをニトロセルロースに転写させ、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧで染色し、ＥＣＬ化学発光検出キットを用いて展開した。結果は、２９３Ｔ細胞およびＣｏｓ−７細胞の両方の溶解物中で、１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃ融合タンパク質の発現を示した。１０１Ｐ３Ａ１１（１５９−２０２）−ｐｓｅｃＦｃ融合タンパク質はまた、両細胞型の培養上清中に分泌され、そして検出された。
【図１８】レトロウイルス媒介遺伝子送達後の３００．１９細胞における１０１Ｐ３Ａ１１の発現。３００．１９細胞を、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子をコードするｐＳＲαレトロウイルスベクターで形質導入した。ネオマイオシンでの選択後、細胞を広げ、ＲＮＡを抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを伴うノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした。キロ塩基（ｋｂ）でのサイズ標準を側方に示す。結果は、レトロウイルスＬＴＲから駆動された１０１Ｐ３Ａ１１転写物の発現を示した。ＬＡＰＣ−４ＡＤおよびＬＡＰＣ−９ＡＤは、内因性１０１Ｐ３Ａ１１転写物の発現を示した。図は、オートラジオグラムの短時間露出の結果を示す。
【図１９Ａ】１０１Ｐ３Ａ１１についての二次構造および膜貫通推定。図１９Ａ：１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の二次構造（配列番号２８）を、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされたＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？  ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）を用いて推定した。この方法は、一次タンパク質配列から、αへリックス、伸長鎖、およびランダムコイルの存在および位置を推定する。所定の二次構造におけるタンパク質のパーセントもまた示す。
【図１９Ｂ】１０１Ｐ３Ａ１１についての二次構造および膜貫通推定。図１９Ｂは、ＨｏｆｍａｎｎおよびＳｔｏｆｆｅｌのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（これは、ＴＭＢＡＳＥ（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ．ＴＭＢＡＳＥ−Ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３７４：１６６，１９９３）を利用する）に基づいて、１０１Ｐ３Ａ１１の膜貫通領域の存在および方向の確率の模式図である。ＴＭｐｒｅｄアルゴリズムおよびＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされる。図１９Ｂおよび図１９Ｃに示される膜貫通推定プログラムの結果は、１０１Ｐ３Ａ１１が、Ｇタンパク質カップリングレセプターと一致する、７つの膜貫通ドメインを含有することを図示する。
【図１９Ｃ】１０１Ｐ３Ａ１１についての二次構造および膜貫通推定。図１９Ｃは、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，およびＫｒｏｇｈのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Ｅｒｉｋ  Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓ  Ｋｒｏｇｈ：Ａ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｉｎ  Ｐｒｏｃ．ｏｆ  Ｓｉｘｔｈ  Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ  １７５−１８２  Ｊ．Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｔ．Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎ，Ｆ．Ｍａｊｏｒ，Ｒ．Ｌａｔｈｒｏｐ，Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ，およびＣ．Ｓｅｎｓｅｎ（編）Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ：ＡＡＡＩ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８）に基づく、１０１Ｐ３Ａ１１の膜貫通領域の存在、ならびに細胞外方向および細胞内方向の確率の模式図である。ＴＭｐｒｅｄアルゴリズムおよびＴＭＨＭＭアルゴリズムは、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされる。図１９Ｂおよび図１９Ｃに示される膜貫通推定プログラムの結果は、１０１Ｐ３Ａ１１が、Ｇタンパク質カップリングレセプターと一致する、７つの膜貫通ドメインを含有することを図示する。
【図２０】ＮＩＨ−３Ｔ３腫瘍における１０１Ｐ３Ａ１１の発現。マウスにコントロール３Ｔ３−ｎｅｏ細胞または１０１Ｐ３Ａ１１を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を皮下注射した。腫瘍を増殖させ、次いで、マウスを屠殺し、そして腫瘍を採集した。ＲＮＡをＬＡＰＣ−４ＡＤ異種移植片およびＬＡＰＣ−４ＡＩ異種移植片から単離し、培養で増殖させた３Ｔ３−ｎｅｏ細胞および３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞をコントロールとして使用した。３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞（腫瘍番号１−３）に由来する６つの異なる腫瘍から単離したＲＮＡをノーザンブロッティングにより比較した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを伴うノーザンブロットを、１０１Ｐ３Ａ１１配列でプローブした。ＲＮＡゲルの臭化エチジウム染色の写真もまた示す。結果は、３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１腫瘍全体において、ならびに腫瘍を枯渇させるために使用した３Ｔ３／１０１Ｐ３Ａ１１細胞において、１０１Ｐ３Ａ１１の発現を示したが、ネガティブコントロール細胞３Ｔ３／ｎｅｏ細胞においては示さなかった。
【図２１】１０１Ｐ３Ａ１１は、３Ｔ３細胞の腫瘍形成を誘導する。６匹の雄ＳＣＩＤマウス（右腹）の皮下に１０６の３Ｔ３−ｎｅｏ、３Ｔ３−Ｒａｓまたは３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞（１０６の示した細胞をＭａｔｒｉｇｅｌと混合）を注射することにより、６匹の３Ｔ３−ｖｌ２Ｒａｓ注射マウスのうち６匹が腫瘍を形成し、６匹の３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１注射マウスのうち６匹が腫瘍を形成し、そして６匹の３Ｔ３−ｎｅｏ−注射マウスの１匹も腫瘍を形成しなかったことが判明した。各データ点は、各グループにおける平均腫瘍体積（ｎ＝６）を表す。
【図２２】ＰＴＸは、３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１腫瘍のインビボ増殖を減少させる。百日咳毒素は、用量依存様式でＳＣＩＤマウスにおいて３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１腫瘍の皮下増殖を阻害することが見いだされた。
【図２３】１０１Ｐ３Ａ１１−ＰＨＯＲ−１（Ｐｈｏｒ）のラットＧＰＣＲ  ＲＡ１Ｃ（ｇｉ｜３４２０７５９）との整列。同一性＝１７９／２９９（５９％），ポジティブ＝２３１／２９９（７６％），ギャップ＝１／２９９（０％）。
【図２４】１０１Ｐ３Ａ１１−ＰＨＯＲ−１（Ｐｈｏｒ）のヒト前立腺特異的ＧＰＣＲ（ｇｉ｜１３５４０５３９）とのアラインメント。同一性＝１７９／２９９（５９％），ポジティブ＝２３３／２９９（７７％），ギャップ＝１／２９９（０％）。
【図２５】１０１Ｐ３Ａ１１−ＰＨＯＲ−１（Ｐｈｏｒ）のヒト嗅覚レセプター５ｌＩ１２，ＨＯＲ５，（ｇｉ｜１４４２３８３６）とのアラインメント。．同一性＝１６３／３０４（５３％），ポジティブ＝２１４／３０４（６９％），ギャップ＝１／３０４（０％）。
【図２６】ＮＩＨ−３Ｔ３細胞における１０１Ｐ３Ａ１１調整チロシンリン酸化。１０１Ｐ３Ａ１１は、２００、１２０−１４０、８５−９０および５５ｋＤａのタンパク質の脱リン酸を媒介した。１０１Ｐ３Ａ１１は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において８０および２９ｋＤａのタンパク質のリン酸化を誘導した。
【図２７】ＰＣＲリガンドによる１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞におけるＥＲＫリン酸化。ＦＢＳ、リポホスファチジン酸、ガストリン放出ペプチド、ロイコトリエン、および血小板活性化因子は、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞においてＥＲＫのリン酸化を誘導した。
【図２８】ＰＤ９８０５９による１０１Ｐ３Ａ１１媒介ＥＲＫ活性化の阻害。ＥＲＫリン酸化は、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞において、ＭＥＫ特異的インヒビター（ＰＤ９８０５９）によって阻害されたが、ｐ３８特異的インヒビター（ＳＢ２０３５８０）によって阻害されなかった。
【図２９】オルトバナジン酸ナトリウム処理したＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞におけるＥＲＫリン酸化の増大。オルトバナジン酸ナトリウムは、ＰＣ３−ｎｅｏ細胞に対して、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞においてＥＲＫリン酸化の増加を誘導した。
【図３０】ＡＧ  １５１７による１０１Ｐ３Ａ１１媒介ＥＲＫリン酸化の阻害。ＥＧＦＲインヒビターであるＡＧ１５１７は、コントロールＰＣ３細胞および１０１Ｐ３Ａ１１発現ＰＣ３細胞においてＥＧＦ媒介ＥＲＫリン酸化を阻害する。ＡＧ１５１７は、ＰＣ３細胞における１０１Ｐ３Ａ１１媒介ＥＲＫリン酸化を部分的に阻害する。
【図３１】図３１Ａ−Ｂ。ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞におけるｐ３８の活性化。１０１Ｐ３Ａ１１の発現は、ｐ３８（図３１Ｂ）に比較して、ホスホ−ｐ３８（図３１Ａ）に対する抗体でブロッティングすることにより示されるように、１０％ＦＢＳで処理した細胞においてｐ３８リン酸化を媒介する。
【図３２】１０１Ｐ３Ａ１１は、ＰＣ３細胞においてｃＡＭＰの蓄積を誘導した。１０１Ｐ３Ａ１１の発現が、０．１％ＦＢＳおよび１０％ＦＢＳで処理した細胞においてｃＡＭＰの蓄積を増大した。１０１Ｐ３Ａ１１細胞におけるＦＢＳ誘導ｃＡＭＰ蓄積が百日咳毒素によって阻害された
【図３３】百日咳毒素は、１０１Ｐ３Ａ１１媒介ＥＲＫリン酸化を阻害する。百日咳毒素は、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞においてＦＢＳ媒介ＥＲＫリン酸化を阻害した。
【図３４】百日咳毒素は、ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞においてＥＲＫリン酸化を阻害した。百日咳毒素は、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞において、ＦＢＳ媒介ＥＲＫリン酸化を阻害した。ＥＲＫリン酸化に対する百日咳毒素の阻害活性は、ＥＧＦまたはＧＲＰで処理したＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞におけるよりもＦＢＳで処理したＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞においてより劇的であった。
【図３５】スラニム（Ｓｕｒａｎｉｍ）、Ｇタンパク質インヒビターによる１０１Ｐ３Ａ１１媒介シグナル伝達の阻害。コントロールＮＩＨ  ３Ｔ３細胞および３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を、Ｇタンパク質インヒビターであるスラニム（Ｓｕｒｉｎａｍ）およびＮＦ４４９の存在または不在下で増殖させた。増殖は、７２時間後にＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅによって分析した。スラニムおよびＮＦ４４９は、１０１Ｐ３Ａ１１発現細胞の増殖を阻害したが、コントロール細胞では阻害しなかった。
【図３６】図３６Ａ−Ｂ。馴化培地による１０１Ｐ３Ａ１１媒介ＥＲＫリン酸化。図３６Ａ：抗ホスホＥＲＫ抗体でのブロッティング；図３６Ｂ：抗ＥＲＫ抗体でのブロッティング。ＰＣ３，ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１，ＰｒＥＣおよびＬＡＰＣ４２細胞からの上清は、ＰＣ３  １０１Ｐ３Ａ１におけるＥＲＫリン酸化を誘導するが、ＰＣ３細胞においては誘導しない。３Ｔ３細胞および２９３Ｔ細胞からの上清は、ＥＲＫリン酸化に対して特異的な効果はほとんどなかった。
【図３７】１０１Ｐ３Ａ１１は３Ｔ３細胞の増殖を増強する。コントロールＮＩＨ  ３Ｔ３細胞および３Ｔ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞を０．５％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳの存在または不在下で増殖させた。増殖を、４８時間後にＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅによって分析した。１０１Ｐ３Ａ１１の発現は、０．５％ＦＢＳにおいて増殖した３Ｔ３細胞の増殖の６倍の増大を誘導した。
【図３８】１０１Ｐ３Ａ１１特異的抗体による１０１Ｐ３Ａ１１媒介ＥＲＫリン酸化の阻害。１０１Ｐ３Ａ１１の発現は、２９３Ｔ細胞においてＥＲＫリン酸化を誘導した。抗１０１Ｐ３Ａ１１  ｐＡｂは、２９３Ｔ−１０１Ｐ３Ａ１１細胞においてＥＲＫリン酸化を阻害した。
【図３９】ＰＣ３−１０１Ｐ３Ａ１１細胞における抗１０１Ｐ３Ａ１１  Ａｂ媒介ｃＡＭＰ蓄積。コントロールＰＣ３細胞および１０１Ｐ３Ａ１１を発現する細胞を、抗１０１３Ａ１１  ｐＡｂで２分間処理し、そして細胞内ｃＡＭＰ含有量について評価した。アッセイを２連で実施した。
【図４０】図４０Ａ−４０Ｆ。ホルマリン固定およびパラフィン包埋前立腺癌組織における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体  （図４０Ａ）；ホルマリン固定およびパラフィン包埋前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰにおける抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４０Ｂ）；ホルマリン固定およびパラフィン包埋前立腺癌組織における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４０Ｃ）；ホルマリン固定およびパラフィン包埋正常前立腺における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４０Ｄ）；ホルマリン固定およびパラフィン包埋前立腺癌組織における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４０Ｅ）；ならびにホルマリン固定およびパラフィン包埋正常前立腺における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４０Ｆ）を用いる免疫組織化学分析を示す顕微鏡写真。
【図４１】図４１Ａ−４１Ｆ。ホルマリン固定およびパラフィン包埋前立腺癌組織における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４１Ａ）；ホルマリン固定およびパラフィン包埋膀胱癌組織における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４１Ｂ）；ホルマリン固定およびパラフィン包埋腎臓癌組織における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４１Ｃ）；ホルマリン固定およびパラフィン包埋結腸癌組織における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４１Ｄ）；ホルマリン固定およびパラフィン包埋肺癌組織における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４１Ｅ）；ならびにホルマリン固定およびパラフィン包埋乳癌組織における抗１０１Ｐ３Ａ１１（ペプチド１；アミノ酸１−１４）ウサギポリクローナル抗体（図４１Ｆ）を用いる免疫組織化学分析を示す顕微鏡写真。
【図４２】図４２は、１０１Ｐ３Ａ１１が腫瘍の正常位増殖を誘導することを示す。５×１０５細胞を、１グループあたり７匹のマウスのＳＣＩＤマウスに正常的に注射した；腫瘍重量は、細胞注射の２４〜２５日後に評価した。
【図４３】図４３は、１０１Ｐ３Ａ１１が軟寒天アッセイにおいてコロニー形成を誘導することを示す。
【図４４】図４４は、１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子改変体の概略図を示す。
【図４５】図４５は、１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質改変体の概略図を示す。
【図４６】図４６は、エキソンマップを示す。
【図４８】図４８は、ＧＳＴ−ＰＨＯＲ−１免疫化マウス由来の血清によって２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされたＰＨＯＲ−１タンパク質の認識を示す。
【図４９】図４９は、４つのハイブリドーマが、細胞内で発現したＰＨＯＲ−１タンパク質に対する強い特異的反応を示すＭＢＰ−ＰＨＯＲ−１と反応することを示すデータを示す。これを、エピトープタグ化ＰＨＯＲ−１  ｃＤＮＡでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のウェスタン分析によって実証した。
【図５０】図５０は、アミノ酸１〜２３に生じるマウスポリクローナル抗体が、２９３Ｔ細胞内において発現されるＰＨＯＲ−１を検出することを示す。
【図５１】図５１は、ＧＰＣＲインヒビターによるＥＲＫリン酸化の阻害を示す。
【図５２】図５２は、ＧＰＣＲインヒビターによるＰＣ３増殖の阻害を示す。
【図５３】図５３は、ＰＴＸによるＰＣ３−ＡＧＳ−３増殖の阻害を示す。
【図５４】図５４は、ＡＧＳ−３が３Ｔ３細胞およびＰＣ３細胞の増殖を増強することを示す。
【図５５】図５５は、ＡＧＳ−３が３Ｔ３細胞のインビトロでの腫瘍形成を誘導することを示す。
【図５６】図５６は、ＰＴＸによる３Ｔ３−ＡＧＳ−３腫瘍形成の阻害を示す。
【図５７】図５７は、ＡＧＳ−３が３Ｔ３腫瘍の正常位増殖を誘導することを示す。
【図５８】図５８は、ＡＦＧＳ−３がＰＣ３細胞の正常位増殖を増強することを示す。
【図５９】図５９は、スラミンによる３Ｔ３−ＡＧＳ−３腫瘍形成の部分的阻害を示す。
【図６０】図６０は、ＡＧＳ−３が３Ｔ３細胞の脛骨内の腫瘍増殖を誘導することを示す。
【図６１】図６１は、ＡＧＳ−３がＰＣ３細胞の脛骨内の腫瘍増殖を誘導することを示す。
【図６２】図６２は、ＡＧＳ−３特異的抗体によるＡＧＳ−３媒介性ＥＲＫリン酸化の阻害を示す。
【図６３】図６３は、ＡＧＳ−３が３Ｔ３細胞およびＰＣ３細胞の細胞周期侵入を増進することを示す。
【図６４】図６４は、ＭＤＣＫ細胞の抗ＡＧＳ３染色を示す。
【図６５−１】図６５は、核酸アライメントを示す。
【図６５−２】図６５は、核酸アライメントを示す。
【図６６】図６６は、１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ融合タンパク質の発現および検出を示す。ｐｃＤＮＡ３．１／１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰベクターを構築した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１／１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ組換え発現ベクター（Ａ）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＦＰベクター（Ｂ）またはコントロールｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｃ）のいずれかでトランスフェクトした。細胞を２４時間後に回収し、そして緑色蛍光の検出について顕微鏡によって分析した。結果は、１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ融合タンパク質の発現は、細胞膜に大部分が局在するが、遊離のＧＦＰの発現が細胞中に存在することを示す。コントロールベクターは、いずれの蛍光も示さなかった。発明者らは、１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ融合タンパク質がｐｃＤＮＡ３．１／１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ構築物から発現し、そして、融合タンパク質が細胞膜に局在するという結論を出す。
【図６７Ａ】図６７Ａは、コドン最適化ｓ１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．１（Ａ）のオープンリーディングフレームのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図６７Ｂ】図６７Ｂは、コドン最適化ｓ１０１Ｐ３Ａ１１  ｖ．３（Ｂ）のオープンリーディングフレームのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図６８】図６８は、コドン最適化ｓ１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰ融合タンパク質の発現および検出を示す。１０１Ｐ３Ａ１１を最適化したコドンについてのｐｃＤＮＡ３．１／ｓ１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰベクターを構築した。２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターコントロール（明るい線）、または３つの異なるｐｃＤＮＡ３．１／ｓ１０１Ｐ３Ａ１１．ＧＦＰベクタークローン（１Ｇ２、２Ｇ３または３Ｈ５）（暗い線）のうち１つのいずれかでトランスフェクトした。細胞を２４時間後に回収し、緑色蛍光について直接分析する（Ａ）か、または、ポリクローナル抗１０１Ｐ３Ａ１１抗体をｐ使用して生存可能に染色し、（Ｂ）そしてフローサイトメトリーによって分析した。結果は、細胞表面でＰＨＯＲ−１．ＧＦＰ融合タンパク質を最適化したコドンの強い発現を示す。
【図６９−１】なし
【図６９−２】なし
【図６９−３】なし
【図６９−４】なし
【図６９−５】なし
【図７０】なし
【図７１】なし
【図１】
2005512509.tif 000110
【図２Ａ−１】
2005512509.tif 000111
【図２Ａ−２】
2005512509.tif 000112
【図２Ｂ−１】
2005512509.tif 000113
【図２Ｂ−２】
2005512509.tif 000114
【図２Ｃ−１】
2005512509.tif 000115
【図２Ｃ−２】
2005512509.tif 000116
【図３Ａ】
2005512509.tif 000117
【図３Ｂ】
2005512509.tif 000118
【図３Ｃ】
2005512509.tif 000119
【図４】
2005512509.tif 000120
【図５】
2005512509.tif 000121
【図６】
2005512509.tif 000122
【図７】
2005512509.tif 000123
【図８】
2005512509.tif 000124
【図９】
2005512509.tif 000125
【図１０Ａ】
2005512509.tif 000126
【図１０Ｂ】
2005512509.tif 000127
【図１１】
2005512509.tif 000128
【図１２Ａ】
2005512509.tif 000129
【図１２Ｂ】
2005512509.tif 000130
【図１２Ｃ】
2005512509.tif 000131
【図１２Ｄ】
2005512509.tif 000132
【図１２Ｅ】
2005512509.tif 000133
【図１３】
2005512509.tif 000134
【図１４】
2005512509.tif 000135
【図１５】
2005512509.tif 000136
【図１６】
2005512509.tif 000137
【図１７】
2005512509.tif 000138
【図１８】
2005512509.tif 000139
【図１９Ａ】
2005512509.tif 000140
【図１９Ｂ】
2005512509.tif 000141
【図１９Ｃ】
2005512509.tif 000142
【図２０】
2005512509.tif 000143
【図２１】
2005512509.tif 000144
【図２２】
2005512509.tif 000145
【図２３】
2005512509.tif 000146
【図２４】
2005512509.tif 000147
【図２５】
2005512509.tif 000148
【図２６】
2005512509.tif 000149
【図２７】
2005512509.tif 000150
【図２８】
2005512509.tif 000151
【図２９】
2005512509.tif 000152
【図３０】
2005512509.tif 000153
【図３１】
2005512509.tif 000154
【図３２】
2005512509.tif 000155
【図３３】
2005512509.tif 000156
【図３４】
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【図３５】
2005512509.tif 000158
【図３６】
2005512509.tif 000159
【図３７】
2005512509.tif 000160
【図３８】
2005512509.tif 000161
【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
2005512509.tif 000165
【図４３】
2005512509.tif 000166
【図４４】
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【図４５】
2005512509.tif 000168
【図４６】
2005512509.tif 000169
【図４８】
2005512509.tif 000170
【図４９】
2005512509.tif 000171
【図５０】
2005512509.tif 000172
【図５１】
2005512509.tif 000173
【図５２】
2005512509.tif 000174
【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
2005512509.tif 000177
【図５６】
2005512509.tif 000178
【図５７】
2005512509.tif 000179
【図５８】
2005512509.tif 000180
【図５９】
2005512509.tif 000181
【図６０】
2005512509.tif 000182
【図６１】
2005512509.tif 000183
【図６２】
2005512509.tif 000184
【図６３】
2005512509.tif 000185
【図６４】
2005512509.tif 000186
【図６５−１】
2005512509.tif 000187
【図６５−２】
2005512509.tif 000188
【図６６】
2005512509.tif 000189
【図６７Ａ】
2005512509.tif 000190
【図６７Ｂ】
2005512509.tif 000191
【図６８】
2005512509.tif 000192
【図６９−１】
2005512509.tif 000193
【図６９−２】
2005512509.tif 000194
【図６９−３】
2005512509.tif 000195
【図６９−４】
2005512509.tif 000196
【図６９−５】
2005512509.tif 000197
【図７０】
2005512509.tif 000198
【図７１】
2005512509.tif 000199
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月15日(2004.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、以下：
ａ）図２（配列番号２８、３０および３２）のタンパク質の状態を調節する物質、またはｂ）図２のタンパク質によって調節され、これによって図２のタンパク質を発現する細胞の状態が調節される分子
を含む、組成物。
【請求項２】
生理学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒト単位投薬形態で請求項１に記載の組成物を含む、薬学的組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質が、図２のタンパク質に関するタンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、組成物。
【請求項５】
モノクローナルである、請求項４に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
請求項４に記載の抗体を産生する、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
請求項５に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項９】
図２（配列番号２８、３０、および３２）のタンパク質を発現する細胞に細胞傷害性試薬または診断剤を送達するための組成物であって、以下：
請求項４に記載の抗体またはそのフラグメントに結合体化した細胞傷害性試薬または診断剤、
を包含する、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質が、抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含み、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが、図２のタンパク質に免疫特異的に結合する、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質が、図２のタンパク質に関するタンパク質を含む、組成物。
【請求項１２】
図２（配列番号２８、３０、および３２）に示される全体のアミノ酸配列に少なくとも９０％相同性である、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質が以下：
ａ）図２のタンパク質の８個、９個、１０個または１１個の連続したアミノ酸のペプチド
ｂ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ（配列番号２８、３０、および３２）に記載のペプチド
ｃ）表ＸＸＩＩ〜ＸＬＶＩＩ（配列番号２８、３０、および３２）に記載のペプチド；または
ｄ）表ＸＬＶＩＩＩ〜ＬＩ（配列番号２８、３０、および３２）に記載のペプチド
を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質が、図２（配列番号２８、３０、および３２）のタンパク質のアミノ酸配列由来のＣＴＬポリペプチドまたはそのアナログを含む、組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物であって、ただし、エピトープは、図２（配列番号２８、３０、および３２）のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載の組成物であって、前記物質が、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ（配列番号２８、３０、および３２）に記載されるＣＴＬポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、ただし、前記ポリペプチドは、図２（配列番号２８、３０、および３２）のタンパク質のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質が、図２（配列番号２８、３０、および３２）のアミノ酸配列由来の抗体ポリペプチドエピトープを含む、組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、ただし、前記エピトープは、図２（配列番号２８、３０、および３２）のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の組成物であって、前記抗体エピトープが、前記ペプチドの末端までの任意の整数で増える、図２（配列番号２８、３０、および３２）の少なくとも５つのアミノ酸のペプチド領域を含み、ここで該エピトープが以下：
ａ）図５のヒドロパシープロフィールにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位；
ｂ）図６のヒドロパシープロフィールにおいて０．５よりも少ない値を有するアミノ酸位；
ｃ）図７の受容可能残基％において０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位；
ｄ）図８の平均可変性プロフィールにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位；
ｅ）図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位；
ｆ）ａ）〜ｅ）の少なくとも２つの組み合わせ；
ｇ）ａ）〜ｅ）の少なくとも３つの組み合わせ；
ｈ）ａ）〜ｅ）の少なくとも４つの組み合わせ；
ｉ）ａ）〜ｅ）の５つの組み合わせ；
から選択されるアミノ酸位を含む、組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、ただし、前記エピトープは、図２（配列番号２８、３０および３２）のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
【請求項２２】
請求項１１に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
図２に記載の核酸分子を含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドであって、ただし、前記コードされたタンパク質は、図２（配列番号２８、３０および３２）のアミノ酸配列全体ではない、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ＴがＵで置換されている、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質が、図２（配列番号２７、２９および３１）の核酸配列のコード配列を含むポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２７】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドであって、請求項１１に記載のさらなるタンパク質をコードするさらなるヌクレオチド配列をさらに含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２２に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２９】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３０】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質が、ａ）１０１Ｐ３Ａ１１コード配列を有するポリヌクレオチドを切断するリボザイム、またはｂ）該リボザイムをコードする核酸分子；および生理学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項３２】
請求項１に記載の組成物であって、前記物質がヒトＴ細胞を含み、該Ｔ細胞が、特定のＨＬＡ分子の状況において１０１Ｐ３Ａ１１ペプチド部分配列を特異的に認識する、組成物。
【請求項３３】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害するための請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害するための請求項３３に記載の組成物であって、以下：
抗体またはそのフラグメントであって、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質に特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント
を含む、組成物。
【請求項３５】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害するための請求項３３に記載の組成物であって、以下：
１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質
を含む、組成物。
【請求項３６】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害するための請求項３３に記載の組成物であって、以下：
１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチド、または１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質のコード配列に相補的であるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド
を含む、組成物。
【請求項３７】
図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害するための請求項３３に記載の組成物であって、以下：
図２のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを切断するリボザイム
を含む、組成物。
【請求項３８】
図２のタンパク質および特定のＨＬＡ分子を発現する癌細胞の増殖を阻害するための請求項３３に記載の組成物であって、以下：
ヒトＴ細胞であって、該Ｔ細胞が図２のタンパク質のペプチド配列部分を特異的に認識する一方で、前記物質が特定のＨＬＡ分子の状況にある、ヒトＴ細胞
を含む、組成物。
【請求項３９】
請求項３３に記載の組成物であって、以下：
一本鎖モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを送達するベクターであって、これにより、該コードされた一本鎖抗体が図２のタンパク質を発現する癌細胞内で細胞内発現される、ベクター
を含む、組成物。
【請求項４０】
図２のタンパク質に対して指向される哺乳動物免疫応答を生成するための組成物であって、以下：
ａ）１０１３ＰＡ１１関連タンパク質および／または
ｂ）該タンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含み、これにより免疫応答が該タンパク質に対して生成される、組成物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の免疫応答を生成するための組成物であって、以下：
少なくとも１つのＴ細胞または少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む１０１３Ａ１１関連タンパク質を含み；そして
ここで、該エプトープは、哺乳動物免疫系Ｔ細胞またはＢ細胞とそれぞれ接触され、これによってＴ細胞またはＢ細胞が活性化される、
組成物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の組成物であって、前記免疫系細胞がＢ細胞であり、これによって誘導されたＢ細胞が１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質に特異的に結合する抗体を生成する、組成物。
【請求項４３】
請求項４１に記載の組成物であって、前記免疫系細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）であるＴ細胞であり、これによって活性化されたＣＴＬ細胞が、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質を発現する自己細胞を殺傷する、組成物。
【請求項４４】
請求項４１に記載の組成物であって、前記免疫系細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）であるＴ細胞であり、これによって活性化ＨＴＬが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞傷害活性、またはＢ細胞の抗体産生活性を促進するサイトカインを分泌する、組成物。
【請求項４５】
サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質または１０１Ｐ３Ａ１１関連ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法であって、該方法は：
該サンプルを、１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質または１０１Ｐ３Ａ１１関連ポリヌクレオチドとそれぞれ特異的に結合する請求項１に記載の物質と接触させる工程；および
それぞれ該物質と該１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質との複合体、または該物質と該１０１Ｐ３Ａ１１関連ポリヌクレオチドとの複合体が存在するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質の存在を検出するための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
該サンプルを、抗体またはそのフラグメントと接触させる工程であって、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが該１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質に特異的に結合する、工程；および
該抗体またはそのフラグメントと１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質との複合体が存在するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
請求項４５に記載の方法であって、癌を有しているか、または癌を有していると疑われる患者からサンプルを採取する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４８】
サンプル中の図２のタンパク質およびｍＲＮＡの存在を検出するための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
少なくとも１つのプライマーを用いて逆転写によって該サンプルからｃＤＮＡを生成する工程；
そのように生成されたｃＤＮＡを、１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用して増幅させる工程であって、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用された該１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチドが１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡを増幅させるために役立つ、工程；ならびに
該増幅された１０１Ｐ３Ａ１１  ｃＤＮＡの存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
癌を有しているか、または癌を有していると疑われる患者由来の生物学的サンプルにおける１つ以上の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物をモニタリングするための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
個体由来の組織サンプル中の細胞によって発現される１つ以上の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態を決定する工程；
そのように決定された状態を、対応する正常なサンプルにおける１つ以上の１０１Ｐ３Ａ１１遺伝子産物の状態と比較する工程；および
該正常なサンプルに対する該サンプル中の１０１Ｐ３Ａ１１の１つ以上の異常な遺伝子産物の存在を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、１０１Ｐ３Ａ１１  ｍＲＮＡまたは１０１Ｐ３Ａ１１タンパク質の１つ以上の上昇した遺伝子産物が存在するか否かを決定する工程をさらに包含し、これによって前記正常な組織サンプルと比較した前記試験サンプル中の１つ以上の上昇した遺伝子産物の存在が、癌の存在または状態を示す、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、前記癌が表Ｉに記載の組織中で生じる、方法。