(57)【要約】本発明は、異種遺伝子を発現させるために好適な発現カセットに関する。さらに、本発明は、そのような発現カセットを含む組換えプラスミドに関する。また、本発明は、そのようなカセットまたはプラスミドを含む宿主細胞に関する。別の実施態様は、発現カセットおよび異種発現システムにおいて使用されるプロモーターに関する。最後に、１つの実施態様は、異種遺伝子を発現させるための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムにおいて見出されるようなｙｙａＦ遺伝子の停止コドンとｒｐｓＦ遺伝子の開始コドンとの間の領域から得ることができるプロモーターを含むことを特徴とする、発現カセット。
【請求項２】
下記の特徴：
ａ）−１０部位におけるヌクレオチド配列ＴＡＴＡＡＴ、好ましくはＧＴＡＴＡＡＴまたはＴＡＴＡＡＴＡ
ｂ）−３５部位におけるヌクレオチド配列ＴＴＧＴＡＡ、好ましくはＧＴＴＧＴＡＡまたはＴＴＧＴＡＡＡ
ｃ）１７±２ヌクレオチド、好ましくは１７±１ヌクレオチド、より好ましくは１７ヌクレオチドのスペーサー
を有するプロモーターを含むことを特徴とする、発現カセット。
【請求項３】
プロモーターは配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の発現カセット。
【請求項４】
プロモーターは配列番号２に示されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の発現カセット。
【請求項５】
プロモーターは配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の発現カセット。
【請求項６】
プロモーターの前には、少なくとも１個、好ましくは２個、より好ましくは３個さえものＡＴリッチ領域を有するヌクレオチドのストレッチが−３５領域の上流に存在することを特徴とする、請求項１から５に記載の発現カセット。
【請求項７】
ＡＴリッチ領域を−３５領域の上流に有する前記ヌクレオチドのストレッチが、配列番号４、好ましくは配列番号５、より好ましくは配列番号６に示されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の発現カセット。
【請求項８】
コンセンサス配列ＡＡＡＡＮＮＮＮＮＴＴＴＴＸｎＡＡＡＡＮＮＮＮＮＴＴＴＴ（式中、１０＜ｎ＜１５０）を有するプロモーターを含むことを特徴とする、発現カセット。
【請求項９】
プロモーターは、配列番号７、好ましくは配列番号８、より好ましくは配列番号９に示されるようなヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載の発現カセット。
【請求項１０】
請求項１から９に記載の発現カセットを含むことを特徴とする、組換えプラスミド。
【請求項１１】
請求項１から９に記載の発現カセットまたは、請求項１０に記載の組換えプラスミドを含む細菌宿主細胞。
【請求項１２】
発現カセットにおける、請求項１から９に記載のプロモーターの使用。
【請求項１３】
異種発現システムにおける、請求項１から９に記載のプロモーターの使用。
【請求項１４】
請求項１から９に記載の発現カセットの構築を含むことを特徴とする、遺伝子を異種発現させる方法。
【請求項１５】
請求項１から９に記載の発現カセットを用いた細菌の形質転換を含むことを特徴とする、遺伝子を異種発現させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現カセット、そのような発現カセットを含む組換えプラスミド、そのようなカセットまたは組換えプラスミドを含む宿主細胞、発現カセットにおいて使用され、異種発現システムおいて使用されるプロモーター、および異種遺伝子の発現方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌の異種発現システムが、様々な異なる異種遺伝子を発現させるために汎用されている。異種遺伝子は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来しない遺伝子であると考えられ、あるいは、枯草菌に由来する場合、その天然のプロモーターの制御下にはなく、または、単独ではその天然のプロモーターの制御下にはない。異種遺伝子は、（例えば、天然の遺伝子の過剰発現が必要とされる場合における）発現システムのための宿主としても使用される細菌細胞、または別の種に由来する細菌細胞のいずれかに見出される細菌起源の遺伝子であり得る。異種遺伝子は全く同様に真核生物起源の遺伝子であってもよい。細菌の異種発現システムは、真核生物の異種発現システムを上回るいくつかの知られている欠点を有する場合があり、しかし、原核生物起源および真核生物起源の両方の多くの異種遺伝子を発現させる場合には、非常に多方面かつ安価なシステムを提供する。細菌発現システムの宿主細胞に関しては、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との間には違いがある。グラム陰性細菌は内膜および外膜の両方を有する。外膜は、細胞膜を越える分泌タンパク質の輸送に負に干渉する。グラム陽性細菌は外膜を有しないので、この問題にはそれほど悩まされない。異種発現システムのための宿主細胞として好適なグラム陽性細菌の無作為に選ばれたいくつかの例として、例えば、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ペジオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコックス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サルシナ（Ｓａｒｃｉｎａ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属に属する細菌が挙げられる。
【０００３】
すべての異種発現システムに関連した１つの問題は、異種発現産物の（過剰）産生が、多くの場合、異種発現産物を発現させる宿主細胞の生存性または増殖特性に負に干渉するということである。従って、細菌発現システムを選ぶときには、発現される異種タンパク質が宿主細胞に対して有害または毒性でさえあるかどうかを最初に決定しなければならない。これが当てはまる場合、異種発現システムでは、好ましくは、異種発現のオンまたはオフを切り換えるという選択肢が考えられる。しかし、発現される異種タンパク質が、宿主細胞に対してほんのわずかに毒性であるか、または全く毒性さえないことが知られている場合でさえ、増殖が定常期に達した後での異種遺伝子の連続発現は、最終的には宿主細胞を殺すことになる。そのような場合、所望される異種タンパク質を継続して合成するが、細菌の増殖速度と直接結びつけられるレベルにだけ合成する発現システムが好ましい。すなわち、増殖速度が低下または停止する場合、異種発現レベルも同様に、好ましくは、低下または停止することが望ましい。
【発明の開示】
【０００４】
上記で示された問題に対する解決策を提供する非常に多才な発現システムを提供することが本発明の目的の１つである。
【０００５】
驚くべきことに、今回、枯草菌のゲノムにおいて見出された一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする２つの遺伝子が、プロモーター配列を、所望される特性の一方または両方を伴う異種発現システムのために非常に好適にする特性を正に有するプロモーター配列を有することが見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
１つのＳＳＢ様遺伝子（これはさらにｓｓｂとして示される）がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノムの３５８．６°にマッピングされ、リボソームタンパク質のＳ６およびＳ１８をそれぞれコードするｒｐｓＦ遺伝子およびｒｐｓＲ遺伝子に隣接されている（図１Ａ）。ρ依存性転写ターミネーターと類似する構造がｒｐｓＲ遺伝子の下流に存在する。ターミネーター様構造が、ｒｐｓＦ遺伝子、ｓｓｂ遺伝子およびｒｐｓＲ遺伝子の間に見出されなかったので、これらの遺伝子は１つのオペロンに属すると考えられる。もう一方のｓｓｂ様遺伝子（ｙｗｐＨ）が３１９．４°にマッピングされ、機能が知られていない別の遺伝子（ｙｗｐＧ）、および、炭素異化代謝抑制に関与する調節因子をコードするｇｌｃＲ遺伝子に隣接されている（図１Ｂ）。述べられた遺伝子の存在位置および配列の完全な詳細が、Ｆ．Ｋｕｎｓｔ他、Ｎａｔｕｒｅ、３９０：２４９〜２５６（１９９７）に示されている。
【０００７】
プロモーター非存在のｌａｃＺ遺伝子と、潜在的なプロモーターを含有するフラグメントとの転写融合体が構築され、異所的部位においてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの染色体に組み込まれた。異所的部位は、その遺伝子が野生型細菌において見出されない部位である。ｓｓｂ遺伝子およびｙｗｐＨ遺伝子の上流領域（これらは、Ｓ１、Ｓ２、Ｒ１およびＹ１として示される）が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８の染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲフラグメントをプロモータースクリーニング用のベクターにクローン化して、形質転換によってＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８に導入し、カナマイシン耐性の形質転換体について選択した。形質転換体をアミラーゼ欠損表現型についてスクリーニングして、構築物が、選択された異所的部位（すなわち、ａｍｙＥ遺伝子座）に組み込まれていることを確認した（ａｍｙＥ遺伝子は非必須遺伝子であり、従って、別の遺伝子を挿入するために安全に使用することができるので、ａｍｙＥ遺伝子座は好適な組み込み部位の一例にすぎない）。
【０００８】
富化培地（ＴＹ）寒天平板および最少培地（ＭＭ）寒天平板における得られたＢＩＶ７株（Ｓ１）、ＢＩＶ１７株（Ｓ２）、ＢＩＶ８株（ＲＩ）およびＢＩＶ１２株（Ｙ１）の青色または白色の表現型により、プロモーター活性が、ＢＩＶ１７株、ＢＩＶ８株、ＢＩＶ１２株およびＢＩＶ１３株における構築物についてだけ明らかにされ、ＢＩＶ７では明らかにされなかった。ＢＩＶ１２では、プロモーター活性がＭＭにおいてだけ検出された。このことは、遺伝子ｙｗｐＨの発現が培地依存的であることを示している（図１）。ｙｗｐＨはその遺伝子のすぐ上流のプロモーターから転写されることが見出されたのに対して、プロモーター活性は、ｓｓｂの開始コドンからすぐ上流の２９５ｂｐを含むＳ１フラグメントからは検出することができなかった。しかしながら、プロモーター活性が、完全なｒｐｓＦ遺伝子と、その開始コドンから上流の２７４ｂｐとを同様に含有するＳ２フラグメントから検出された。このことは、ｓｓｂが、ｒｐｓＦ遺伝子、ｓｓｂ遺伝子およびｒｐｓＲ遺伝子から構成されるオペロンの第２の遺伝子であることを示している。明瞭なプロモーター活性が、ｒｐｓＦの開始コドンから上流の２７４ｂｐのみを含むより小さいＲＩフラグメントからも見出された。これらの結果は、ｓｓｂが、リボソームタンパク質をコードする遺伝子とともに同時に転写され、かつ同時に調節され、それにより、タンパク質合成およびＤＮＡ代謝の調節を共役させていることを示している。
【０００９】
ｓｓｂおよびｙｗｐＨの発現をより詳しく調べるために、Ｓ１−ｌａｃＺ融合体、Ｒ１−ｌａｃＺ融合体およびＹ１−ｌａｃＺ融合体をそれぞれ含有する菌株（ＢＩＶ７、ＢＩＶ８およびＢＩＶ１２）をＴＹおよびＭＭで増殖させ、β−ガラクトシダーゼ活性を、Ｍｉｌｌｅｒ他（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、１９８２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）によって記載されるようにして調べた。発現が、用いられた条件のもとではＳ１フラグメントからは検出することができなかったのに対して、ｓｓｂオペロンは、富化培地および最少培地の両方においてｒｐｓＦプロモーターから強く発現されるようであった。最高値（これは１ＯＤあたり２００から３００Ｍｉｌｌｅｒユニットの間であった）が指数増殖時に達した（図２Ａ、図２Ｂ）。細胞が成長を停止したとき、発現が低下した。定常期には発現が依然として存在するが、はるかに低下したレベルである。
【００１０】
まとめると、これらの結果は、ｓｓｂオペロンの発現挙動、および従ってｒｐｓＦプロモーターの発現挙動の、増殖に関係づけられる特徴を直接示している。従って、このプロモーターは明らかに、非毒性のタンパク質またはわずかに毒性のタンパク質をコードする異種遺伝子を発現させるための優れたプロモーターである。発現レベルが細菌の増殖速度に直接結びつけられる。異種遺伝子によりコードされるタンパク質は対数増殖時にだけ発現する。細菌の増殖速度が、例えば、栄養分の量が減少した結果として遅くなる場合、異種遺伝子によりコードされるタンパク質の合成もまた低下し、これにより、従って、異種遺伝子の過剰産生による増殖の遅れまたは宿主細胞（すなわち、細菌）の死さえもが回避される。
【００１１】
そのような発現システムの長所の１つは、その宿主細胞が生存し続けるということである。細胞が任意の時点で定常期に一時的に達し得るという事実にもかかわらず、さらなる発現を、より多くの培地を細胞に加えることだけによって非常に容易に得ることができる。
【００１２】
対照的に、ｙｗｐＨ遺伝子の発現は、ＴＹで増殖させたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＢＩＶ１２の細胞では検出することができず、非常に低い発現のみがＭＭにおける指数増殖中の細胞で観測されただけであった。しかしながら、ｙｗｐＨの発現は、ＭＭで増殖している細胞が定常期に入り、その後２時間以内にその最高レベルに達したとき、著しく増大した（図２Ｃ）。
【００１３】
まとめると、ｙｗｐＨプロモーターはＭＭにおいて定常期のときに発現するだけである。このプロモーターは明らかに、宿主細胞に対して毒性であるタンパク質を産生させるための優れたプロモーターであると考えられる。これは、細胞の対数増殖のとき、増殖が毒性の異種タンパク質の発現によって全く妨害されないからである。そのようなタンパク質をコードする遺伝子は、ｙｗｐＨプロモーターの下流に安全にクローン化することができる。これは、細胞を、異種遺伝子の発現を何ら伴うことなくＭＭ培地または富化培地において高密度に増殖させることができるからである。定常期に達し、細胞がＭＭにおいて増殖させられるとただちに、異種の毒性タンパク質が合成される。さらにより効率的には、細胞は、富化培地において、より高密度に、すなわち、定常期に増殖させることができ、その後、ＭＭにおいてさらに培養することができる。これは、毒性タンパク質の合成の引き金となる。必要な場合、少量の細胞サンプルを、対数増殖期のときに採取し、さらなる培養における使用のために凍結保存することができる。
【００１４】
異種発現システムの基本的な要素は、プロモーターと、発現される異種遺伝子との組合せである。この組合せは、原理的には、ｒｐｓＦプロモーターまたはｙｗｐＨプロモーターの影響下で発現させられるような異種発現産物（すなわち、異種遺伝子によりコードされるタンパク質）を得るために十分である。
【００１５】
この基本的な要素はさらに発現カセットと呼ばれる。
【００１６】
しかしながら、通常、この発現カセットは続いてプラスミドにクローン化され、かつ／または宿主のゲノムに挿入されることは明らかであるに違いない。
【００１７】
発現カセットを有する組換えプラスミドは、宿主細菌を形質転換するために使用することができる。高コピープラスミドが選ばれた場合、これは一般には、数コピーの発現カセットが宿主内で同時に発現されるという事実のために、増強された発現をもたらす。これにより、作製された発現産物の量のさらなる微調整が可能になる。そのような高コピープラスミドはこの分野では知られている。発現カセットを宿主内のプラスミド上で維持する代わりに、発現カセットを、例えば、相同組換えのプロセスによって宿主細胞のゲノムに１コピー以上組み込むことができる。これら２つのシステムの組合せもまた実施可能である。
【００１８】
従って、本発明の第１の実施態様は、ｙｙａＦ遺伝子の停止コドンと、ｒｐｓＦ遺伝子の開始コドンとの間の領域に位置する、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムから得ることができるプロモーターを含む発現カセットに関する。
【００１９】
１個だけのプロモーターがこの領域において見出されており、従って、本発明によるプロモーターが、ｙｙａＦ遺伝子の停止コドンと、ｒｐｓＦ遺伝子の開始コドンとの間の領域に位置するという事実は、このプロモーターの明確な同定である。
【００２０】
上記で述べたように、言及した遺伝子の存在位置および配列の完全な詳細が、Ｆ．Ｋｕｎｓｔ他、Ｎａｔｕｒｅ、３９０：２４９〜２５６（１９９７）に示されている。
【００２１】
その完全なゲノム配列が知られている微生物のゲノムが、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｈｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用してＳＳＢホモログおよびその遺伝子構成についてスクリーニングされた。現在のところ、細菌ゲノムの６９個の完全な配列が利用可能であり、これには、５９の異なる種が含まれる。これらのうち、２３の種が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓについて観測されたように、ｒｐｓＦ遺伝子およびｒｐｓＲ遺伝子に隣接されるｓｓｂ遺伝子を示している。これらの種は主に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓそのもののような発酵菌門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の分類学的群、ならびに、スピロヘータ目（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ）、テルモトガ門（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｌｅｓ）およびアクイフェックス門（Ａｑｕｉｆｉｃａｌｅｓ）に属する。
【００２２】
この探索により、ｒｐｓＦ−ｓｓｂ−ｒｐｓＲの遺伝子構成がこれらの分類学的群において共通して見出されることが明らかにされた。
【００２３】
枯草菌におけるこの領域の配列が図３に示される。所望されるプロモーター領域（これは下記においてより詳しく記載される）を、今や、枯草菌のゲノムにおいて容易に見つけことができ、また、続いて、この分野で広く知られている標準的なＰＣＲ技術の助けを借りて合成し、クローン化することができる。そのようなＰＣＲ技術およびクローニング技術は、例えば、標準的な研究室マニュアルに記載されており、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４４７−５、１９９５年）、およびＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、１９８９年、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）などに記載されている。
【００２４】
本発明による発現カセットのプロモーターは、上記で述べられたように枯草菌から得ることができ、しかし、上記でまた言及されたように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓそのもののような発酵菌門の分類学的群、ならびに、スピロヘータ目、テルモトガ門およびアクイフェックス門に存在することが示された。従って、本発明による発現カセットのプロモーターは、図３に示される配列をプローブとして使用して、これらの分類群に属する細菌のいずれかのゲノムをスクリーニングすることによって、容易にその位置を突き止めることができ、かつ、これらの分類群からクローン化することができる。そのようなスクリーニングもまた、今では何年も前からこの分野では知られ、また、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｄｒｅｋｓｌｅｒ；ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４４７−５、１９９５年）、およびＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、１９８９年、ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）にも記載される標準的な技術である。
【００２５】
従って、上記の分類学的群のいずれかから得られる、本発明において記載されるようなプロモーターは、本発明の範囲に含まれると見なされる。
【００２６】
プロモーターがこれらの分類学的群に存在し、従ってこれらの分類学的群において認識されるので、上記の分類学的群はどれもまた、本発明による発現カセットのための宿主細胞としての使用に好適であることは明らかである。
【００２７】
プロモーター配列は、いくつかのモチーフ（例えば、その特異的ないわゆる−３５部位、−１０部位、およびこれらの部位の間のスペーサーなど）、ならびに、−１０部位の下流の（非常に大雑把には）５０ヌクレオチド〜６５ヌクレオチドの、これらの部位から一定の距離で、リボソーム結合部位モチーフが見出されるという事実によって認識され得る。しかしながら、−１０部位とＲＢＳとの距離は重要ではない。
【００２８】
この実施態様の好ましい形態において、本発明による異種発現システムのｒｐｓＦプロモーターは下記の特徴を有する：
ａ）−１０部位におけるヌクレオチド配列ＴＡＴＡＡＴ、好ましくはＧＴＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＡＡＴＡまたはＧＴＡＴＡＡＴＡ、より好ましくはＧＧＴＡＴＡＡＴ、ＴＡＴＡＡＴＡＴまたはＧＧＴＡＴＡＡＴＡＴ、
ｂ）−３５部位におけるヌクレオチド配列ＴＴＧＴＡＡ、好ましくはＧＴＴＧＴＡＡ、ＴＴＧＴＡＡＡまたはＧＴＴＧＴＡＡＡ、より好ましくはＡＧＴＴＧＴＡＡ、ＴＴＧＴＡＡＡＧまたはＡＧＴＴＧＴＡＡＡＧ、
ｃ）１７±２ヌクレオチド、好ましくは１７±１ヌクレオチド、より好ましくは１７ヌクレオチドのスペーサー。
【００２９】
スペーサーは、−３５配列（ＴＴＧＴＡＡ）を−１０配列（ＴＡＴＡＡＴ）から隔てる核酸配列であると理解される。このスペーサーは、長さが１５ヌクレオチド〜１９ヌクレオチドの間で変化する。
【００３０】
この実施態様のより好ましい形態において、プロモーターは、配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
原理的には、使用されるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）は重要でない。特に、リボソーム結合部位はそれ自体がプロモーターの実際の一部ではないからである。にもかかわらず、ｒｐｓＦプロモーターとｒｐｓＦ遺伝子の開始コドンとの間に見出されるようなＲＢＳは好ましいＲＢＳであると考えられる。
【００３２】
従って、さらにより好ましい形態において、プロモーターは、配列番号２に示されるようなヌクレオチド配列を含む。この配列は、ｒｐｓＦ遺伝子の前にリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むために−１０領域の下流の配列をさらに含むという点で、配列番号１の配列とは異なる。
【００３３】
ｒｐｓＦプロモーターの最も天然の形態を得るためには、ＲＢＳ領域と、ｒｐｓＦ遺伝子の開始コドンとの間の領域（好ましくは開始コドンを含む）も使用することが好ましい。
【００３４】
従って、最も好ましい形態において、本発明によるプロモーターは、配列番号３に示されるようなヌクレオチド配列を含む。この配列は、ｒｐｓＦ遺伝子のＡＴＧコドンを含むようＲＢＳの下流の配列をさらに含むという点で、配列番号２の配列とは異なる。
【００３５】
図３から理解され得るように、−３５領域の上流に存在するＤＮＡ配列は、ＤＮＡらせんをより柔軟にするＡＴリッチ領域をいくつか含む。この繰り返しモチーフは典型的なＤＮＡ屈曲モチーフである。
【００３６】
そのようなＤＮＡ屈曲モチーフは、転写に関与する離れた上流配列が空間的にプロモーター領域の近くに位置することを可能にする。図５に示されるように、いくつかの構築物が作製されている。この場合、本発明によるｒｐｓＦプロモーターがプロモーター非存在のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に融合され、そして、ｒｐｓＦプロモーターの前には、天然の状況ではプロモーター配列の上流に存在するように、異なる長さのヌクレオチド部分が存在する。図６は、−３５領域の上流の天然のヌクレオチド配列のより長いストレッチを依然として所定の位置に有するそのような構築物が、−３５配列の上流部がより短いそのような構築物と比較して、より高い発現レベルをもたらすことを明瞭に示している。
【００３７】
このことは、これらＡＴリッチ領域の存在が本発明によるｒｐｓＦプロモーターの効率を増強していることを明瞭に示している。
【００３８】
従って、この実施態様のより好ましい形態において、本発明において記載されるプロモーターの前には、例えば、ＡＴＴＴ、ＡＴＴＴＡまたはＴＴＡＴＴなどの少なくとも１つのＡＴリッチ領域、好ましくは２つのＡＴリッチ領域、より好ましくは３つさえものＡＴリッチ領域を有するヌクレオチドのストレッチが−３５領域の上流に存在する。
【００３９】
好ましくは、ＡＴリッチ領域を−３５領域の上流に有するヌクレオチド部分は、配列番号４（より好ましくは配列番号５、さらにより好ましくは配列番号６）に示されるようなヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
ｙｗｐＨプロモーターの配列が図４に示される。実際、このプロモーターの重要な領域はｃｏｍＫボックスとして示される。ｃｏｍＫボックスはコンピーテンス−シグナル−伝達ネットワークにおいて重要な役割を果たしている。ｃｏｍＫボックスは、コンセンサスなモチーフＡＡＡＡＮＮＮＮＮＴＴＴＴを共有することを共通する特徴として有する。下記のことをここで強調しておかなければならない：コンセンサスなモチーフは、これらのモチーフのいくつかが比較されたときに最も優先的に見出されるモチーフ（統計学的に最も一般的なモチーフ）である。このことは、小さい変化が許容されないことを意味していない。Ａ／Ｔ、Ａ／ＧまたはＡ／Ｃの塩基転位がモチーフのＡＡＡＡストレッチに見出されることがあり、また、Ｔ／Ａ、Ｔ／ＧまたはＴ／Ｃの塩基転位がＴＴＴＴストレッチに見出されることがある。ｙｗｐＨ遺伝子の最も上流に位置するｃｏｍＫボックスにおいてＴＴＴＴ配列の代わりに見出されるＴＡＴＴテトラヌクレオチドはそのような塩基転位の良い一例である。従って、「ｃｏｍＫボックス」は、コンセンサス配列と比較したとき、ボックスの「Ａ」側および／または「Ｔ」側において２つ以上のヌクレオチドが異ならない配列を有することが理解される。結果として、ｃｏｍＫボックスは、本発明において使用されるとき、すなわち、コンセンサスなｃｏｍＫボックスの定義に含まれる場合、例えば、配列ＡＡＡＡＮＮＮＮＮＴＴＴＴ、ＡＴＡＡＮＮＮＮＮＴＴＴＴ、ＡＡＴＡＮＮＮＮＮＴＡＴＴまたはＡＡＡＡＮＮＮＮＮＴＡＴＴを有し得る。これらの例は、当然のことながら、非限定的である。
【００４１】
ｃｏｍＫボックスの別の特徴は、ｃｏｍＫボックスが常に２回見出されるということである。２つのｃｏｍＫボックスが存在することが、その機能性のための必要条件である。
【００４２】
図４における２つのｃｏｍＫボックスが太字で表されている。
【００４３】
２つのｃｏｍＫボックスを隔てるスペーサー領域の長さは重要ではない。しかしながら、１０塩基対〜１５０塩基対の間の値が実に一般的に見出される。
【００４４】
２つのｃｏｍＫボックスが、重要でない距離で、発現させられる遺伝子の上流に配置される。しかしながら、大雑把ではあるが、これらのｃｏｍＫボックスと、発現させられる遺伝子との間の距離は５００ヌクレオチドを越えるべきではない。典型的には、その距離は２０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドの間である。
【００４５】
ｃｏｍＫボックスに関するさらなる情報を、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｅｌｍｓ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／ｄｂｔｂｓ／ｔｆａｃ／ＣｏｍＫ．ｈｔｍｌにおいて見出すことができる。
【００４６】
従って、本発明の別の実施態様は、１０ヌクレオチド〜１５０ヌクレオチドの間の相互距離で２回存在するコンセンサス配列ＡＡＡＡＮＮＮＮＮＴＴＴＴを有する２つのｃｏｍＫボックスを有するプロモーターを含む発現カセットに関する。従って、この種のプロモーターの配列は簡単には下記のように表すことができる：ＡＡＡＡＮＮＮＮＮＴＴＴＴＸｎＡＡＡＡＮＮＮＮＮＴＴＴＴ（式中、Ｘｎは１０〜１５０の間のヌクレオチド数を表し、ＮおよびＸは、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであり得る）。
【００４７】
この実施態様の好ましい形態において、本発明による発現カセットはｙｗｐＨ遺伝子のプロモーターを含む。
【００４８】
このプロモーターは、配列番号７に示されるようなヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
この実施態様のより好ましい形態において、プロモーターの後には、ｙｗｐＨのＲＢＳを含んで、それまでの天然の下流のヌクレオチド配列が続く。このプロモーターは、配列番号８に示されるような配列を有する。
【００５０】
この実施態様のさらにより好ましい形態において、プロモーターの後には、ｙｗｐＨのＲＢＳを含んでそれまでの、そしてさらにはｙｗｐＨ遺伝子の開始コドンにまで及ぶ天然の下流のヌクレオチド配列が続く。このプロモーターは、配列番号９に示されるような配列を有する。
【００５１】
本発明の別の実施態様は、本発明による発現カセットを含む組換えプラスミドに関する。上記で述べられたように、そのようなプラスミドは、宿主細胞を形質転換する手段として役立つ。そのようなプラスミドは高コピープラスミドまたは低コピープラスミドであり得る。
【００５２】
細菌細胞（より具体的には、バチルス様細胞）を形質転換するための様々な技術が当分野で広く知られている。
【００５３】
所望される場合、例えば、非必須の遺伝子をコードする細菌遺伝子の５’末端部および３’末端部を本発明による発現カセットの上流端および下流端に加えることができる。これにより、組換えプラスミドによって場合により担持される発現カセットが一旦宿主細胞の中に入れられると、宿主細胞のゲノムとの相同組換えが可能なる。こうして、発現カセットが宿主のゲノムに安定的に組み込まれる。選択可能な非必須遺伝子中への相同組換えは、組み込み体に関する選択を非常に容易にする。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける選択可能な非必須遺伝子として、ａｍｙＥ遺伝子は非常に好適な遺伝子であると考えられる。
【００５４】
本発明のさらに別の実施態様は、本発明による発現カセットまたは組換えプラスミドを含む細菌宿主細胞に関する。上記で述べられたように、この実施態様は、組換えプラスミド上に存在する発現カセットを含む細菌宿主細胞、および細菌ゲノムに組み込まれた発現カセットを含む細菌宿主細胞の両方に関する。
【００５５】
再度、本発明のさらに別の実施態様は、発現カセットにおいて使用される上記で記載されたようなプロモーターに関する。
【００５６】
また、本発明のさらに別の実施態様は、異種発現システムにおいて使用される上記で記載されたようなプロモーターに関する。
【００５７】
再度、本発明のさらに別の実施態様は、遺伝子を異種発現させるための方法に関する。この場合、そのような方法は、本発明による発現カセットを構築することを含む。そのような発現カセットの構築例が下記の実施例に示される。
【００５８】
さらに他の実施態様は、発現カセットにおける本発明で記載されるようなプロモーターの使用、および異種発現システムにおけるそのようなプロモーターの使用に関する。
【００５９】
最後に、本発明の１つの実施態様は、細菌を本発明による発現カセットで形質転換することを含む、遺伝子を異種発現させるための方法に関する。
【実施例１】
【００６０】
ｓｓｂ遺伝子およびｙｗｐＨ遺伝子の転写分析
すべてのＰＣＲ反応について、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８のＤＮＡがテンプレートとして使用された。この株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓｔｒａｉｎｓ＆Ｄａｔａ、オハイオ州立大学生化学学部、４８４  Ｗｅｓｔ  Ｔｗｅｌｆｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ  ４３２１０、米国）から得ることができる。
【００６１】
これら２つの遺伝子の発現およびそれらの個々のプロモーターの位置決定。
【００６２】
潜在的なプロモーターを含有するフラグメントと、プロモーター非存在のｌａｃＺ遺伝子との転写融合体を構築して、異所的部位（α−アミラーゼＥ遺伝子、ａｍｙＥ）においてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの染色体に組み込んだ。
【００６３】
ｓｓｂ遺伝子およびｙｗｐＨ遺伝子の上流領域、すなわち、フラグメントＳ１（ｓｓｂの開始コドンの２９５ｐｂ上流から開始コドンの１１ｂｐ下流まで）、フラグメントＳ２（ｓｓｂの開始コドンの６０２ｐｂ上流から開始コドンの１１ｂｐ下流まで）、フラグメントＲ１（ｒｐｓＦの開始コドンの２７４ｐｂ上流から開始コドンの５０ｂｐ下流まで）、フラグメントＹ１（ｙｗｐＨの開始コドンの２８２ｐｂ上流から開始コドンの１０ｂｐ下流まで）を、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）およびテンプレートとしてのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８の染色体ＤＮＡを使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲフラグメントをＳｍａＩ消化されたプロモータースクリーニング用ベクターｐＢＴＫ２にクローン化した（ｐＢＴＫ２は、枯草菌のａｍｙＥ遺伝子の３’末端部および５’末端部を有するプラスミドであり、それぞれがプロモーター非存在ｌａｃＺ遺伝子の一方の側と隣接する）。詳細については、Ｍｅｉｊｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｊ．、１９９５、枯草菌におけるプラスミドの複製および保持、博士論文（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ大学（オランダ）から入手可能）を参照のこと。正しい配向で挿入物を有する得られたプラスミドを線状化して、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８を形質転換するために使用し、カナマイシン耐性の形質転換体について選択した。形質転換体を、構築物がａｍｙＥ遺伝子座に組み込まれていることを確認するためにアミラーゼ欠損表現型についてスクリーニングした。クローニングおよび形質転換は一般的な技術に従って行われた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；供給者のマニュアル；Ｂｒｏｎ，Ｓ．およびＧ．Ｖｅｎｅｍａ、１９７２、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．、１５：１〜１０）。
【００６４】
０．００４％のＸ−Ｇａｌをそれぞれ含有する富化培地（ＴＹ）または最少培地（ＭＭ）の寒天平板における得られたＢＩＶ７株（Ｓ１）、ＢＩＶ１７株（Ｓ２）、ＢＩＶ８株（Ｒｌ）およびＢＩＶ１２株（Ｙ１）の青色表現型または白色表現型（Ｍｅｉｍａ，Ｒ．、Ｃ．Ｅｓｃｈｅｖｉｎｓ、Ｓ．Ｆｉｌｌｉｎｇｅｒ、Ａ．Ｂｏｌｈｕｉｓ、Ｌ．Ｗ．Ｈａｍｏｅｎ、Ｒ．Ｄｏｒｅｎｂｏｓ、Ｗ．Ｊ．Ｑｕａｘ、Ｊ．Ｍ．ｖａｎ  Ｄｉｊｌ、Ｒ．Ｐｒｏｖｖｅｄｉ，１．Ｃｈｅｎ、Ｄ．ＤｕｂｎａｕおよびＳ．Ｂｒｏｎ、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：６９９４〜７００１）により、プロモーター活性が、ＢＩＶ１７株、ＢＩＶ８株、ＢＩＶ１２株およびＢＩＶ１３株における構築物についてのみ明らかにされ、ＢＩＶ７では明らかにされなかった。ＢＩＶ１２では、プロモーター活性がＭＭにおいてだけ検出された。このことは、遺伝子ｙｗｐＨの発現が培地依存的であることを示している（図１）。ｙｗｐＨは遺伝子のすぐ上流のプロモーターから転写されることが見出されたのに対して、プロモーター活性は、ｓｓｂの開始コドンからすぐ上流の２９５ｂｐを含むＳ１フラグメントから検出することができなかった。しかしながら、プロモーター活性が、完全なｒｐｓＦ遺伝子と、その開始コドンから上流の２７４ｂｐとを同様に含有するＳ２フラグメントから検出された。このことは、ｓｓｂが、ｒｐｓＦ遺伝子、ｓｓｂ遺伝子およびｒｐｓＲ遺伝子から構成されるオペロンの第２の遺伝子であることを示している。明瞭なプロモーター活性が、ｒｐｓＦの開始コドンから上流の２７４ｂｐのみを含むより小さいＲＩフラグメントからも見出された。これらの結果は、ｓｓｂが、リボソームタンパク質をコードする遺伝子とともに同時に転写され、かつ同時に調節され、それにより、タンパク質合成およびＤＮＡ代謝の調節を共役させていることを示唆している。
【００６５】
ｓｓｂおよびｙｗｐＨの発現をより詳しく調べるために、Ｓ１−ｌａｃＺ融合体、Ｒ１−ｌａｃＺ融合体およびＹ１−ｌａｃＺ融合体をそれぞれ含有する株（ＢＩＶ７、ＢＩＶ８およびＢＩＶ１２）をＴＹおよびＭＭで増殖させ、β−ガラクトシダーゼ活性を、Ｍｉｌｌｅｒ他（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．、１９８２、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）によって記載されるようにして調べた。発現が、用いられた条件のもとではＳ１フラグメントから検出することができなかったのに対して、ｓｓｂオペロンは、富化培地および最少培地の両方においてｒｐｓＦプロモーターから強く発現されるようであった。最高値（これは１ＯＤあたり２００〜３００Ｍｉｌｌｅｒユニットの間であった）が指数増殖時に達した（図２Ａ、図２Ｂ）。細胞が増殖を停止したとき、発現が低下した。定常期には発現が依然として存在するが、はるかに低下したレベルである。
【００６６】
まとめると、これらの結果は、ｓｓｂオペロンの発現挙動、および従ってｒｐｓＦプロモーターの発現挙動の、増殖に関係づけられる特徴を直接示している。
【００６７】
対照的に、ｙｗｐＨ遺伝子の発現は、ＴＹで増殖させたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＢＩＶ１２の細胞では検出することができず、非常に低い発現のみがＭＭにおける指数増殖中の細胞で観測されただけであった。しかしながら、ｙｗｐＨの発現は、ＭＭで増殖している細胞が定常期に入り、その後２時間以内にその最高レベルに達したとき、有意に増大した（図２Ｃ）。
【００６８】
まとめると、ｙｗｐＨプロモーターはＭＭにおいて定常期のときに発現するだけである。
【００６９】
下記には、Ｓ１、Ｓ２、Ｒ１およびＹ１の構築物に対するプライマーならびに構築物の配列が示される。下線部の領域は制限部位を表す。
【００７０】
Ｓ１：下記のプライマーを用いて作製された：
ｓｓｂ−１  ｓｓｂプロモーター領域を増幅するためのフォワードプライマー
【００７１】
【化１】
2005534327.tif 000002
【００７２】
ｓｓｂ−２  ｓｓｂプロモーター領域を増幅するためのリバースプライマー
【００７３】
【化２】
2005534327.tif 000003
【００７４】
配列：
【００７５】
【化３】
2005534327.tif 000004
Ｓ２：下記のプライマーを用いて作製された：
ｒｐｓ−１  ｒｐｓＦプロモーター領域を増幅するためのフォワードプライマー
【００７６】
【化４】
2005534327.tif 000005
【００７７】
ｓｓｂ−２  ｓｓｂプロモーター領域を増幅するためのリバースプライマー
【００７８】
【化５】
2005534327.tif 000006
【００７９】
配列：
【００８０】
【化６】
2005534327.tif 000007
【００８１】
Ｒ１：下記のプライマーを用いて作製された：
ｒｐｓ−１  ｒｐｓＦプロモーター領域を増幅するためのフォワードプライマー
【００８２】
【化７】
2005534327.tif 000008
【００８３】
ｒｐｓ−２  ｒｐｓＦプロモーター領域を増幅するためのリバースプライマー
【００８４】
【化８】
2005534327.tif 000009
【００８５】
配列：
【００８６】
【化９】
2005534327.tif 000010
【００８７】
Ｙ１：下記のプライマーを用いて作製された：
ｙｗｐＨ−１  ｙｗｐＨプロモーター領域を増幅するためのフォワードプライマー
【００８８】
【化１０】
2005534327.tif 000011
【００８９】
ｙｗｐＨ−２  ｙｗｐＨプロモーター領域を増幅するためのリバースプライマー
【００９０】
【化１１】
2005534327.tif 000012
【００９１】
配列：
【００９２】
【化１２】
2005534327.tif 000013
【実施例２】
【００９３】
枯草菌組み込みにおけるクローニングの戦略／発現カセットを有する多コピープラスミド。
【００９４】
この構築物では、本発明において記載されるようなｒｐｓＦプロモーターが使用されるが、しかし、ＲＢＳは、枯草菌のゲノムにおいても見出されるようなｓｐｏＶＧのＲＢＳである。この発現カセットにおいてクローン化され、発現させられる遺伝子はクロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のβ−毒素（Ｈｕｎｔｅｒ他、Ｉｎｆｅｃｔ．＆Ｉｍｍｕｎ．、６１：３９８〜９６５（１９９３））である。
【００９５】
１  ＰＣＲ反応：
１．１  ａｍｙＥ
ａｍｙＥ遺伝子を増幅し、５’のＸｂａｌＩ部位および３’のＳａｃＩ部位を導入するためのプライマーは下記の通りであった：
ａｍｙＥ−１：フォワードプライマー：
【００９６】
【化１３】
2005534327.tif 000014
【００９７】
ａｍｙＥ−２：リバースプライマー：
【００９８】
【化１４】
2005534327.tif 000015
【００９９】
テンプレート：染色体ＤＮＡ１６８
生成物サイズ：８２３ｂｐ。
【０１００】
１．２  カナマイシン耐性遺伝子
カナマイシン耐性遺伝子（ｐＵＢ１１０での場合と同じ）を増幅し、５’のＰｓｔＩ部位およびＮｒｕＩ部位ならびに３’のＫｐｎＩ部位を導入するためのプライマー。
【０１０１】
Ｋｎ−１：フォワードプライマー：
【０１０２】
【化１５】
2005534327.tif 000016
【０１０３】
Ｋｎ−２：リバースプライマー：
【０１０４】
【化１６】
2005534327.tif 000017
【０１０５】
テンプレート：ｐＵＢ１１０（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ．、Ｃｏｎｔｅｎｔｅ，Ｓ．、Ｄｕｂｎａｕ，Ｄ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１３４：３１８〜３２９（１９７８）；ＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｔ．、Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｔ．、Ｔａｎａｋａ，Ｔ．、Ｓｕｅｏｋａ，Ｎ．、Ｐｌａｓｍｉｄ、１５：９３〜１０３（１９８６））。
【０１０６】
生成物サイズ：７９４ｂｐ。
【０１０７】
１．３  ｓｐｏＶＧのＲＢＳ
人工的に作製された：
【０１０８】
【化１７】
2005534327.tif 000018
【０１０９】
プライマー：
【０１１０】
【化１８】
2005534327.tif 000019
【０１１１】
ｓｐｏＶＧのＲＢＳは枯草菌のゲノムにおいて見出され得る。
【０１１２】
このカナマイシン遺伝子におけるＢｇｌＩＩ部位のために、ｓｐｏＶＧのＲＢＳは、ＢｇｌＩＩを用いてクローン化することができず、従って、ＢｇｌＩＩの代わりに、ＰｓｔＩ部位を導入しなければならない：
ｓｐｏＶＧ５：フォワードプライマー：
【０１１３】
【化１９】
2005534327.tif 000020
【０１１４】
ｓｐｏＶＧ４：リバースプライマー：
【０１１５】
【化２０】
2005534327.tif 000021
【０１１６】
テンプレート：ｓｐｏＶＧのＲＢＳ。
【０１１７】
生成物サイズ：７５ｂｐ。
【０１１８】
１．４  ｇｎｔターミネーター
３つの停止コドンおよびｇｎｔターミネーターを増幅し、５’のＢａｍＨＩ部位およびＨｐａＩ部位ならびに３’のＸｂａＩ部位およびＳｔｕＩ部位を導入するためのプライマー。
【０１１９】
Ｇｎｔｔｅｒｍ−１：フォワードプライマー：
【０１２０】
【化２１】
2005534327.tif 000022
【０１２１】
Ｇｎｔｔｅｒｍ−２：リバースプライマー：
【０１２２】
【化２２】
2005534327.tif 000023
【０１２３】
テンプレート：染色体ＤＮＡ１６８。
【０１２４】
生成物サイズ：１０７ｂｐ。
【０１２５】
１．５  クロストリジウム・ペルフリンゲンスのβ−毒素（Ｂｔｏｘ）
Ｂｔｏｘを増幅し、５’のＰｓｔＩ部位、ＮｄｅＩ部位、ならびに３’のＢａｍＨＩ部位を導入するためのプライマー。
【０１２６】
Ｂ−ｔｏｘｏｉｄ３：
【０１２７】
【化２３】
2005534327.tif 000024
【０１２８】
Ｂｔｏｘｏｉｄ２：
【０１２９】
【化２４】
2005534327.tif 000025
【０１３０】
生成物サイズ：約１０００ｂｐ。
【０１３１】
１．６  ｒｐｓＦのＲＢＳを含まないｒｐｓＦプロモーター
【０１３２】
【化２５】
2005534327.tif 000026
【０１３３】
テンプレート：染色体ＤＮＡ１６８。
【０１３４】
生成物サイズ：２９５ｂｐ。
【０１３５】
２  クローニング
２．１  ｐＢｌｕｅＫＳ−におけるカナマイシンのクローニング
カナマイシンのＰＣＲ産物をＰｓｔｌおよびＫｐｎｌで消化し、同様に消化されたｐＢｌｕｅＳＫ−に連結した。これにより、ｐＩＶ２６が得られた。
【０１３６】
２．２  ｐＩＶ２６におけるａｍｙＥのクローニング
その後、ａｍｙＥ  ＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＳａｃｌで消化して、同様に消化されたｐＶＩ２６に連結した。これにより、ｐＩＶ２７が得られた。
【０１３７】
２．３  ｐＩＶ２７におけるＢｔｏｘのクローニング
Ｂｔｏｘ  ＰＣＲ産物をＰｓｔｌおよびＢａｍＨｌで消化して、同様に消化されたｐＶＩ２７に連結した。これにより、ｐＩＶ２８が得られた。
【０１３８】
２．４  ｐＩＶ２８におけるｇｎｔターミネーターのクローニング
ｇｎｔターミネーターＰＣＲフラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨｌで消化して、同様に消化されたｐＶＩ２８に連結した。これにより、ｐＩＶ２９が得られた。
【０１３９】
２．５  ｐＩＶ２９におけるｓｐｏＶＧ  ＲＢＳのクローニング
ｓｐｏＶＧのＰＣＲ産物をＰｓｔｌおよびＮｄｅｌで消化し、同様に消化されたｐＩＶ２９に連結した。これにより、ｐＩＶ３３が得られた。
【０１４０】
２．６  ｐＴＲＫＨ２におけるｓｐｏＶＧ−ＲＢＳ＋Ｂｔｏｘターミネーター−カセットのクローニング
プラスミドｐＩＶ３３をＸｂａＩおよびＰｓｔｌで消化して、同様に消化されたｐＴＲＫＨ２に連結した。これにより、ｐＩＶ６９が得られた。ｐＴＲＫＨ２は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ＤＪおよびＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，ＴＲ著のＧｅｎｅ  １３７：２２７−２３１（１９９３）に記載されている。
【０１４１】
２．７  ｐＩＶ６９におけるｒｐｓＦプロモーター（ｓｐｏＶＧ  ＲＢＳとともに）のクローニング
プラスミドｐＩＶ６９をＳｔｕＩで消化して、平滑末端化ｒｐｓＦ  ＰＣＲフラグメントに連結した。これにより、ｐＩＶ８２が得られた。
このプラスミドを、枯草菌の形質転換に使用した。
【０１４２】
続いて、枯草菌を２．７の構築物で形質転換し、富化培地で増殖させた。図７からわかるように、多量のクロストリジウム・ペルフリンゲンスβ毒素が発現され、上清中に分泌された。細胞中の不溶性物質の形成の増加は、恐らく高すぎるレベルの発現のせいである。発現レベルは、低コピーベクターを使用することにより、または単一組み込み部位もしくは数個の組み込み部位での、ゲノムへの発現カセットの組み込みによって容易に低下され得る。
【０１４３】
これまでのところ、幾種かの他の毒素、例えば、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ毒素（例えば、ＥＰ４０９８９５参照）、大腸菌熱不安定性毒素、および黄色ブドウ球菌α毒素が、等しく成功裏に発現されている。
【０１４４】
このことは、本発明の発現カセットが、非常に多面的な発現ベクターであることを示している。
【実施例３】
【０１４５】
二重組み込み構築物のクローニング法
【０１４６】
１．ＰＣＲ
１．１  ａｍｙＥｂａｃｋ：
ａｍｙＥの５’領域を増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位を導入するためのＰＣＲ。
【０１４７】
ａｍｙＥｂａｃｋ−１：
【０１４８】
【化２６】
2005534327.tif 000027
【０１４９】
ａｍｙＥｂａｃｋ−２：
【０１５０】
【化２７】
2005534327.tif 000028
【０１５１】
生成物サイズ：１２５６ｂｐ。
【０１５２】
１．２  ａｍｙＥｆｒｏｎｔ：
ａｍｙＥの３’領域を増幅し、ＳａｃＩ部位およびＸｂａＩ部位を導入するためのＰＣＲ。
【０１５３】
ａｍｙＥｆｒｏｎｔ−１：
【０１５４】
【化２８】
2005534327.tif 000029
【０１５５】
ａｍｙＥｆｒｏｎｔ−２：
【０１５６】
【化２９】
2005534327.tif 000030
【０１５７】
生成物サイズ：６３４ｂｐ。
【０１５８】
１．３  クロラムフェニコール：
クロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅し、ＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入するためのＰＣＲ。
【０１５９】
ｃｍＲ−１：
【０１６０】
【化３０】
2005534327.tif 000031
【０１６１】
ｃｍＲ−２：
【０１６２】
【化３１】
2005534327.tif 000032
【０１６３】
生成物サイズ：１３１０ｂｐ。
【０１６４】
１．４  ターミネーター：
すべてのフレームでの停止コドンと、ｇｎｔターミネーター配列とを増幅し、ＢａｍＨＩ部位、ＳｎａＢＩ部位、ＨｐａＩ部位およびＸｂａＩ部位を導入するためのＰＣＲ。
【０１６５】
Ｇｎｔｔｅｒｍ−３：フォワードプライマー：
【０１６６】
【化３２】
2005534327.tif 000033
【０１６７】
Ｇｎｔｔｅｒｍ−２：リバースプライマー：
【０１６８】
【化３３】
2005534327.tif 000034
【０１６９】
テンプレート：染色体ＤＮＡ１６８。
【０１７０】
生成物サイズ：１０７ｂｐ。
【０１７１】
１．５  ｒｐｓＦプロモーター：
ｒｐｓＦプロモーターを増幅し、ＰｓｔＩ部位およびＮｄｅＩ部位を導入するためのＰＣＲ。
【０１７２】
【化３４】
2005534327.tif 000035
【０１７３】
テンプレート：１６８の染色体ＤＮＡ。
【０１７４】
生成物サイズ：２９５ｂｐ。
【０１７５】
１．６  Ｂｔｏｘ：
Ｂｔｏｘを増幅し、ＢａｍＨＩ部位およびＮｄｅＩ部位を導入するためのＰＣＲ。
【０１７６】
Ｂ−ｔｏｘｏｉｄ３：
【０１７７】
【化３５】
2005534327.tif 000036
【０１７８】
Ｂｔｏｘｏｉｄ２：
【０１７９】
【化３６】
2005534327.tif 000037
【０１８０】
生成物サイズ：１０３７ｂｐ。
【０１８１】
２  クローニング
２．１  ｐＢｌｕｅＫＳ−におけるａｍｙＥｂａｃｋ
ａｍｙＥｂａｃｋのＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に消化されたｐＢｌｕｅＫＳ−に連結して、構築物１を作製した。
【０１８２】
２．２  構築物１におけるａｍｙＥｆｒｏｎｔ
【０１８３】
ａｍｙＥｆｒｏｎｔのＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化し、同様に消化された１に連結して、構築物２を作製した。
【０１８４】
２．３  構築物２におけるクロラムフェニコール
【０１８５】
ｃｍのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に消化された２に連結して、構築物３を作製した。
【０１８６】
２．４  構築物３おけるｇｎｔターミネーター
【０１８７】
ターミネーターのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、同様に消化された３に連結して、構築物４を作製した。
【０１８８】
２．５  構築物４おけるｒｐｓＦプロモーター
【０１８９】
ｒｐｓＦのＰＣＲ産物をＰｓｔＩで消化し、ＰｓｔＩ−ＳｍａＩで消化された４に連結して、構築物５を作製した。
【０１９０】
２．６  構築物５おけるＢｔｏｘ
【０１９１】
ＢｔｏｘのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化し、同様に消化された５に連結して、構築物６を作製した。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】構築されたｌａｃＺ融合体の概略図とともに、Ｂ．ｓｕｂｔｌｉｓ  １６８におけるｓｓｂオペロン（Ａ）およびｙｗｐＨ遺伝子（Ｂ）の遺伝子構成を示す。太い黒線は、プロモーター非存在ｌａｃＺ遺伝子に融合されたＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを表す。富化培地（ＴＹ）または最少培地（ＭＭ）で増殖させた後での様々な構築物におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の存在または非存在が、右側に、「＋」および「−」によってそれぞれ示される。
【図２】Ｂ．ｓｕｂｔｌｉｓにおけるｓｓｂオペロンおよびｙｗｐＨ遺伝子の発現を示す。ＴＹ培地（三角形）または最少培地（丸）における細菌の増殖（白抜き記号）、および１ＯＤあたりのβ−ガラクトシダーゼ活性として反映される、ＢＩＶ８株（Ａ、Ｂ）におけるｒｐｓＦプロモーターの制御下、または、ＢＩＶ１２株（Ｃ）におけるｙｗｐＨプロモーターの制御下における転写ｌａｃＺ融合体の発現（黒塗り記号）を示す。
【図３】ｒｐｓＦ遺伝子の上流領域を示す。ｒｐｓＦ遺伝子のＲＢＳおよび開始コドンだけでなく、さらに上流の−１０領域および−３５領域ならびにＡＴリッチなストレッチの存在位置が示される。
【図４】ｙｗｐＨ遺伝子の上流領域を示す。２つのｃｏｍＫボックス（太字）、ＲＢＳ（斜体字）、およびｙｗｐＨ遺伝子の（ＡＴＧ開始コドンを含む）最初の３０ヌクレオチド（下線部）が示される。
【図５】β−ガラクトシダーゼ遺伝子に融合されたｒｐｓＦプロモーターを含む様々な長さの構築物の概略図である。−１０領域および−３５領域の存在位置、ＲＢＳおよびｒｐｓＦ開始コドン、ならびに、様々な上流フラグメントの長さが示される。
【図６】図５の様々な構築物のβ−ガラクトシダーゼ活性の概略図である。
【図７】高コピーベクターでのｒｐｓＦプロモーターの制御下におけるＢｔｏｘの発現を示す。Ｓｕｐ＝上清、Ｓｏｌ＝可溶性画分、Ｉｎｓｏｌ＝不溶性画分。ＢｔｏｘＣｐ＝野生型クロストリジウム・パーフリンゲンスのβ−毒素。Ｔ＝増殖時間（時間）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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