(57)【要約】本発明は、作用物質および抗体またはその断片を利用する組成物に関する。これらの組成物中で、作用物質、例えば抗癌薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾患薬、抗接着薬、抗血栓症薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗細菌薬、抗ウイルス薬および抗炎症薬のような作用物質は、抗体またはその断片と複合体形成されまたは化合されあるいは接合され得る。さらに、作用物質および／または抗体またはその断片は、作用物質が単独で投与された場合に臨床的に有効であることが一般的に見出される作用物質の量より低い量である準臨床量で組成物中に存在し得る。好ましくは本発明のこれらの組成物においては、作用物質はアントラサイクリンまたはその誘導体、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）またはその誘導体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用物質及び抗体、又はその断片を含む組成物。
【請求項２】
前記作用物質が、抗体又はその断片と複合体形成される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記作用物質が、抗体又はその断片と化合される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記作用物質が、抗体又はその断片と接合される、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記作用物質が準臨床量で存在する、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記作用物質の準臨床量は、抗疾患薬による罹患細胞の感受性を有効に変えるためには不十分である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記作用物質の準臨床量が、細胞ローリング、炎症、自己免疫疾患、血栓症、再狭窄、転移、あるいは腫瘍細胞又は白血病細胞の増殖及び／又は複製を有効に抑制するためには不十分である、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
前記作用物質の準臨床量が、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数の増大を有効に抑制するために、又は白血病を有する患者における白血病細胞の数の増大を抑制するためには不十分である、請求項５記載の組成物。
【請求項９】
前記作用物質の準臨床量が、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数を低減するために、又は白血病を有する患者における白血病細胞の数を低減するためには不十分である、請求項５記載の組成物。
【請求項１０】
前記作用物質の準臨床量が、腫瘍細胞又は白血病細胞の死亡率を増大させ、抗癌薬による損傷に対する腫瘍細胞の感受性を増大させ、又は抗白血病薬による損傷に対する白血病細胞の感受性を増大させるためには不十分である、請求項５記載の組成物。
【請求項１１】
前記作用物質の準臨床量が、細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板、及び／又は細胞−血小板複合体形成、凝集又は接着を有効に抑制するためには不十分である、請求項５記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体又はその断片が準臨床量で存在する、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体又はその断片が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３のｓｃＦｖ抗体断片の結合能力を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体又はその断片がペプチド又はポリペプチドの結合能力を有し、かつ、当該ペプチド又はポリペプチドが、配列番号４を有する第一超可変部を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチド又はポリペプチドが配列番号５を有する第二超可変部、及び／又は配列番号６、配列番号７又は配列番号８を有する第三超可変部をさらに含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗体又はその断片がｓｃＦｖ又はＦａｂ断片である、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
作用物質及び抗体、又はその断片を含む組成物であって、当該抗体又はその断片は、約3〜約126アミノ酸残基長のペプチド又はポリペプチドエピトープに結合し、当該ペプチド又はポリペプチドのエピトープは、少なくとも2つの酸性アミノ酸及び少なくとも1つの硫酸化チロシン残基を有する前記組成物。
【請求項１８】
作用物質及び抗体、又はその断片を含む組成物であって、当該抗体又はその断片は、ＰＳＧＬ−１、フィブリノーゲンガンマプライム（γ’）、ＧＰ１ｂα、ヘパリン、ルミカン、補体化合物４（ＣＣ４）、インターアルファ阻害剤、及びプロトロンビンから成る群から選択される少なくとも2つの異なる分子と結合する前記組成物。
【請求項１９】
作用物質及び抗体、又はその断片を含む組成物であって、当該抗体又はその断片は、ＰＳＧＬ−１、フィブリノーゲンガンマプライム（γ’）、ＧＰ１ｂα、ヘパリン、ルミカン、補体化合物４（ＣＣ４）、インターアルファ阻害剤及びプロトロンビンから成る群から選択される少なくとも2つの異なる分子と結合し、そしてＢ細胞白血病細胞、Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞および転移細胞からなる群から選択される少なくとも1つの細胞型と結合する前記組成物。
【請求項２０】
作用物質及び抗体、又はその断片を含む組成物であって、当該抗体又はその断片は、2つ又はそれ以上のエピトープと交差反応し、各エピトープが１つ又は複数の硫酸化チロシン残基並びに2つ又はそれ以上の酸性アミノ酸の少なくとも1つのクラスターを含む前記組成物。
【請求項２１】
前記作用物質が、抗癌薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾患薬、抗接着薬、抗血栓症薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗細菌薬、抗ウイルス薬、及び抗炎症薬からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
前記作用物質が、アシクロビル、ガンシクロビル、及びジドブジンからなる群から選択される抗ウイルス薬である、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
前記作用物質が、シロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウム、及びアスピリンからなる群から選択される抗血栓症／抗再狭窄薬である、請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
前記作用物質が、ザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸１７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブ、及びニメスリドからなる群から選択される抗炎症薬である、請求項２１記載の組成物。
【請求項２５】
前記作用物質が、レフルノミド、デニロイキンジフチトックス、スブレウム、WinRho SDF、デフィブロチド、及びシクロホスファミドからなる群から選択される抗自己免疫薬である、請求項２１記載の組成物。
【請求項２６】
前記作用物質が、リマプロスト、クロルクロメン、及びヒアルロン酸からなる群から選択される抗接着／抗凝集薬である、請求項２１記載の組成物。
【請求項２７】
前記作用物質が、毒素、放射性同位体、及び治療薬からなる群から選択される、請求項２１記載の組成物。
【請求項２８】
前記毒素が、ゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、リシン、及びその修飾体及び誘導体からなる群から選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
前記放射性同位体が、ガンマ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体、ベータ放射体、及びアルファ放射体からなる群から選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項３０】
前記放射性同位体が、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルル、122mテルル、125mテルル、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123ヨウ素、126ヨウ素、131ヨウ素、133ヨウ素、81mクリプトン、33キセノン、90イットリウム、213ビスマス、77臭素、18フッ素、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウム、及び68ガリウムからなる群から選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項３１】
前記治療薬は、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニソン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド、及びブレオマイシン並びにそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項３２】
前記治療薬は、アントラサイクリン又はその誘導体である、請求項２７記載の組成物。
【請求項３３】
前記治療薬は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、並びにそれらの誘導体及び組合せからなる群から選択される、請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
前記治療薬は、ドキソルビシン又はその誘導体である、請求項３２記載の組成物。
【請求項３５】
抗体又はその断片が、２以上の作用物質と結合されるか又は複合体形成されるか又は化合されるビヒクル又は担体と、結合されるか又は複合体形成されるか又は化合される、請求項１記載の組成物。
【請求項３６】
前記ビヒクル又は担体が、デキストラン、親油性ポリマー、親水性ポリマー、ＨＰＭＡ、及びリポソームからなる群から選択される、請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
前記ビヒクル又は担体が、ドキソルビシン装飾リポソームである、請求項３６記載の組成物。
【請求項３８】
前記ビヒクル又は担体が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はデキストランである、請求項３６記載の組成物。
【請求項３９】
細胞ローリングの抑制を必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む細胞ローリングの抑制方法。
【請求項４０】
炎症の抑制を必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む炎症の抑制方法。
【請求項４１】
自己免疫疾患の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項４２】
血栓症の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項４３】
再狭窄の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項４４】
転移の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項４５】
腫瘍細胞の増殖及び／又は複製の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項４６】
腫瘍細胞の死亡率の増大方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項４７】
白血病細胞の増殖及び／又は複製の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項４８】
白血病細胞の死亡率の増大方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の製剤組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項４９】
抗疾患薬による損傷に対する罹患細胞の感受性の増大方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５０】
抗癌薬による損傷に対する腫瘍細胞の感受性の増大方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５１】
抗癌薬による損傷に対する白血病細胞の感受性の増大方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５２】
腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数の増大の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５３】
腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数の低減方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５４】
白血病を有する患者における白血病細胞の数の増大の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５５】
白血病を有する患者における白血病細胞の数の低減方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５６】
細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板、及び／又は細胞−血小板複合体形成の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５７】
細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板、及び／又は細胞−血小板凝集の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５８】
細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板、及び／又は細胞−血小板接着の抑制方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項５９】
疾患の作用を改善し、疾患を予防し、疾患を治療し、又は疾患の進行を抑制する方法であって、それを必要とする患者に請求項１記載の組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項６０】
治療的処置を必要とする患者に、以下の：
（ｉ）抗体又はその断片、及び
（ｉｉ）作用物質
を投与することを含む治療的処置方法であって、当該抗体又はその断片、及び／又は作用物質の内の一つ又は両者が準臨床量で投与される前記方法。
【請求項６１】
前記抗体又はその断片、及び前記作用物質が、別々に投与される、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記抗体又はその断片が、前記作用物質の前に投与される、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体又はその断片が、前記作用物質の後に投与される、請求項６１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
産業上の利用分野
本発明は、抗癌活性、抗転移活性、抗白血病活性、抗ウイルス活性、抗感染活性、および／またはその他の疾患、例えば炎症性疾患、異常または病原性接着に関与する疾患、血栓症および／または再狭窄、異常または病原性凝集、ならびに自己免疫疾患、心臓血管性疾患、例えば心筋梗塞、網膜症性疾患、硫酸化チロシン依存性タンパク質−タンパク質相互作用ならびに一般的に罹患細胞により引き起こされる疾患に対する活性を有し得る作用物質および抗体を利用する治療用および診断用組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗体、ファージ表示および組織ターゲッティング
治療薬の組織選択的ターゲッティングは、製薬産業において台頭しつつある研究分野である。毒性を低減しそして全体的効能を増強しながら治療の特異性および効力を増大するために、ターゲッティングに基づいた新しい癌治療が意図されてきた。腫瘍に対して毒素、放射性核種および化学療法用接合物をターゲッティングするための試みにおいて、腫瘍関連抗原に対するマウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が用いられてきた。さらに、分化抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ２５は、造血系悪性疾患を治療する場合の癌特異的標的として利用されてきた。広範囲に研究されたが、しかしこのアプローチはいくつかの制約を有する。制約の１つは、選択的結合を表示する適切なモノクローナル抗体を単離することの難しさである。第二の制約は、抗体単離を首尾よく行うために前もって必要なこととして、高抗体免疫原性を要することである。第三の制約は、最終製品が、非ヒト物質に対する免疫応答（例えばヒト抗マウス抗体−ＨＡＭＡ応答）を生じる非ヒト配列を含むことである。ＨＡＭＡ応答はしばしば、より短い血清中半減期を生じ、そして反復治療を妨げ、したがって抗体の治療価値を減少させる。この後者の制約は、マウス起源のキメラまたはヒト化モノクローナル抗体を工学処理するに際して、そしてヒト抗体を発見するに際して、興味を刺激してきた。このアプローチのもうひとつの制約は、それが既知および精製抗原のみに対して向けられる単一抗体種のみの単離を可能にするということである。さらにこの方法は、それが正常細胞上に、ならびに悪性細胞上にも存在する細胞表面マーカーに対する抗体の単離を可能にする限り、選択的でない。
【０００３】
癌を治療するためのＭＡｂの治療効能に影響を及ぼす多数の因子が存在する。これらの因子としては、腫瘍細胞上の抗原発現の特異性、発現のレベル、抗原不均質性および腫瘍塊の接近可能性が挙げられる。白血病およびリンパ腫は一般に、固形腫瘍例えば癌腫よりも、抗体を用いた治療により応答性であった。ＭＡｂは血流中で白血病およびリンパ腫細胞と迅速に結合し、そしてリンパ組織中の悪性細胞に容易に浸入し、したがってリンパ腫をＭＡｂベースの療法のための優れた候補にする。理想的な系は、悪性子孫細胞を産生している幹細胞の細胞表面のマーカーを認識するＭＡｂを同定することを必要とする。
【０００４】
ファージライブラリーは、単離予定標的タンパク質、例えば抗体、ホルモンおよび受容体と結合する無作為一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を選択するために用いられる。さらに抗体の使用は概してライブラリーを表示し、そしてファージｓｃＦｖライブラリーは特に、特異的な、未だ認識されていないし確定されていない細胞表面部分をターゲッティングするための独特の分子を発見するための代替手段を助長する。
【０００５】
白血病、リンパ腫および骨髄腫は、骨髄およびリンパ組織で生じる癌であり、そして、細胞の非制御化増殖に関与する。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、特異的臨床および免疫学的特徴により定義される異質性疾患である。他の形態のＡＬＬと同様に、Ｂ細胞ＡＬＬ（Ｂ−ＡＬＬ）のほとんどの場合の限定原因は未知であるが、しかし多くの場合、疾患は単一細胞の獲得遺伝子変化に起因し、それを異常になるようにさせ、そして継続的に増大させる。Ｂ−ＡＬＬに悩む患者に関する予後は、小児および成人の両者において、他の白血病患者に関するよりも有意に悪い。
【０００６】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、正常条件下で骨髄性細胞系の最終的分化細胞（赤血球、顆粒球、単球および血小板）を生じる先祖細胞に関する新生物の不均質群である。他の形態の新生物の場合と同様に、ＡＭＬは、１つまたは複数の型の初期骨髄性分化を示す相対的未分化芽細胞による正常分化骨髄性細胞の置換を生じる獲得遺伝子変化に関連する。ＡＭＬは一般に、骨髄において、そして少程度に二次造血器官において徐々に現れる。ＡＭＬは主に成人に影響を及ぼして、15〜40歳の年齢で発生率がピークになるが、しかし小児および高齢者の両方にも影響を及ぼすことが既知である。ほぼ全てのＡＭＬ患者が、異常レベルの循環未分化芽細胞の証拠が認められない臨床的寛解を達成するためには、診断直後の治療を要する。
【０００７】
今日まで、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性を誘導する種々のモノクローナル抗体が開発されてきた。Ｐ１８５−増殖因子受容体（ＨＥＲ２）−の細胞外ドメインに向けられるモノクローナル抗体ＭｕＭＡｂ４Ｄ５のヒト化バージョンがＦＤＡに認可され、ヒト乳癌を治療するために用いられている（米国特許第5,821,337号および第5,720,954号）。結合後、抗体は、ＨＥＲ２増殖因子受容体によっている腫瘍細胞増殖を抑制し得る。さらに、リンパ腫に関連するものを含めた末梢Ｂ細胞の急速枯渇を引き起こすＣＤ２０に対するキメラ抗体が、近年ＦＤＡにより認可された（米国特許第5,843,439号）。この抗体と標的細胞との結合は、補体依存性溶解を生じる。この生成物は近年認可されており、そして低等級Ｂ細胞非ホジキン病性リンパ腫を治療するために病院で近年用いられている。
【０００８】
いくつかのその他のヒト化およびキメラ抗体は、開発中であるかまたは臨床試験中である。さらに、正常骨髄細胞上にならびにほとんどの型の骨髄性白血病細胞上に発現されるＣＤ３３抗原と特異的に反応するヒト化Ｉｇは、抗癌薬カリケアマイシンＣＭＡ−６７６と接合された（Sievers et al., Blood Supplement, 308, 504a (1997)）。薬剤MYLOTARG（商標）として既知であるこの接合物は、近年、ＦＤＦ認可を受けた（Caron et al., Cancer Supplement, 73, 1049-1056 (1994)）。その細胞溶解活性にかんがみて、近年臨床試験中である付加的抗ＣＤ３３抗体（ＨｕｍＭ１９５）は、いくつかの細胞傷害剤、例えばゲロニン毒素（McGraw et al., Cancer Immunol. Immunother. 39, 367-374 (1994)）ならびに放射性同位体131Ｉ（Caron et al., Blood 83, 1760-1768 (1994)）、90Ｙ（Jurcic et al., Blood Supplement, 92, 613a (1998)）および213Ｂｉ（Human et al., Blood Supllement,38: 231P (1997)）と接合された。
【０００９】
白血球抗原ＣＤ４５（ｃＨｕＬｙｍ３）に対するキメラ抗体は、ヒト白血病およびリンパ腫の治療に関して臨床試験中である（Sun et al., Cancer Immunol. Immunother., 48, 595-602 (2000)）。In vitro検定において、特異的細胞溶解がＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）検定で観察された（Henkart, Immunity, 1, 343-346 (1994); Squier and Cohen, Current Opin. Immunol., 6, 447-452 (1994)）。
【００１０】
マウスモノクローナルヒト化およびキメラ抗体の構築に対比して、ファージ表示技法の使用は、全ヒト配列を含むｓｃＦｖの単離を可能にする。ファージ表示技法から得られるｓｃＦｖクローンを基礎にしたヒトＴＧＦｂ２受容体に対する全ヒト抗体が、近年開発された。ＴＧＦｂ２の結合と競合し得る全ヒトＩｇＧ４に変換されるこのｓｃＦｖ（Thompson et al., J. Immunol Methods, 227, 17-29 (1999)）は、強力な抗増殖活性を有する。当業者に知られたこの技法は、以下の出版物中により明確に記載されている：Smith, Science, 228, 1315 (1985); Scott et al., Science, 249, 386-390 (1990); Cwirla et al., PNAS, 87, 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249, 404-406 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 13 (14), 3245-3260 (1994); Bass et al., Proteins, 8, 309-314 (1990); McCafferty et al., Nature, 348, 552-554 (1990); Nissim et al., EMBO J., 13, 692-698 (1994);米国特許第5,427,908号、第5,432,018号、第5,223,409号および第5,403,484号lib.。
【００１１】
単離ｓｃＦｖ抗体分子に関するリガンド
血小板、フィブリノーゲン、ＧＰＩｂ、セレクチンおよびＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）は各々、いくつかの病原状態または疾患状態、例えば異常または病原性炎症、異常または病原性免疫反応、自己免疫反応、転移、異常または病原性接着、血栓および／または再狭窄、ならびに異常または病原性凝集において重要な役割を演じる。したがって血小板とならびにこれらの分子と交差反応する抗体は、これらのおよびその他の病原性状態を包含する疾患および障害の診断および治療に有用である。
【００１２】
血小板
血小板は血液系の十分に特性化された構成成分であり、そして止血、血栓および／または再狭窄においていくつかの重要な役割を演じる。血管に対する損傷は、一連の逐次事象により特性化される止血として既知である過程を始動させる。損傷血管に対する初期反応は、血管のない表面の患部への血小板の付着である。次の過程は、前に付着された血小板上に血小板の多数の層が凝集して、止血栓を形成することである。血小板のこの塊が、血管壁を密封する。止血栓は、フィブリンポリマーの沈着により強化される。血餅は、損傷が修復された場合にのみ分解される。
【００１３】
転移における血小板の重要性
腫瘍転移は、おそらくは癌患者の生存を限定する最も重要な因子である。蓄積データは、宿主血小板と相互作用する腫瘍細胞の能力が転移の必要不可欠な決定因子の１つを表す、ということを示す（Leslie Oleksowicz, Z.M., “Characterization Of Tumor-Induced Platelet Aggregation: The Role Of Immunorelated GPIb And GPIIb/IIIa Expression By MCF-7 Breast Cancer Cells,” Thrombosis Research 79: 261-274 (1995)）。
【００１４】
血小板を凝集する腫瘍細胞の能力は腫瘍細胞転移能力と相関するということが実証されており、そして腫瘍誘導性血小板凝集の抑制は齧歯類モデルにおける転移の抑制と相関することが示されている。血小板との腫瘍細胞相互作用は膜接着分子およびアゴニスト分泌を包含する、ということが実証されている。免疫関連血小板糖タンパク質の発現が、腫瘍細胞株に関して同定されている。血小板免疫関連糖タンパク質ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩｂ／ＩＸおよびインテグリンαvサブユニットは乳房腫瘍細胞株の表面に発現される、ということが実証された（Oleksowicz, Z.M., “Characterization Of Tumor-Induced Platelet Aggregation: The Role Of Immunorelated GPIb And GPIIb/IIIa Expression By MCF-7 Breast Cancer Cells,” Thrombosis Research 79: 261-274 (1995); Kamiyama, M., et al., “Inhibition of platelet GPIb/IIIa binding to fibrinogen by serum factors: studies of circulating immune complexes and platelet antibodies in patients with hemophilia, immune thrombocytopenic purpura, human immunodeficiency virus-related immune thrombocytopenic purpura, and systemic lupus erythematosus,” J Lab Clin Med 117 (3): 209-17 (1991)）。
【００１５】
抗体誘導性血小板減少症は、ＣＴ２６結腸腺癌、ルイス肺癌およびＢ１６黒色腫により産生される転移の数および容積を顕著に低減する、ということを、Gasic (J.T.B. Gasic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 46-52 (1968))および共同研究者等は示した（Karpatkin, S., et al., “Role of adhesive protein in platelet tumor interaction in vitro and metastasis formation in vivo, ” J. Clin. Invest. 81 (4): 1012-9 (1988); Clezardin, P., et al., “Role of platelet membrane glycoproteins Ib/IX and IIb/IIIa, and platelet alpha-granule protein in platelet aggregation induced by human osteosarcoma cells,” Cancer Res. 53 (19): 4695-700 (1993)）。さらに単一ポリペプチド鎖（60 kd）は、ＧＰＩｂと密接に関連し、そして不完全または異常Ｏ−グリコシル化ＧＰＩｂαサブユニットに対応するＨＥＬ細胞の表面膜上に発現される、ということが判明した（Kieffer, N., et al., “Expression of platelet glycoprotein Ib alpha in HEL cells,” J. Biol. Chem. 261 (34): 15854-62 (1986)）。
【００１６】
ＧＰＩｂ複合体
止血の方法における各過程は、血小板表面の受容体の存在を要する。止血において重要である一受容体は、糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ複合体（ＣＤ４２としても既知である）である。この受容体は、内皮下層中のフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）を結合することにより、損傷の部位での血管壁への血小板の接着（初期付着）を媒介する。それは、止血において重要な2つのその他の血小板機能における重大な役割も有する：（ａ）動脈狭窄の領域における高剪断率により誘導される血小板の凝集、ならびに（ｂ）低濃度のトロンビンにより誘導される血小板活性化。
【００１７】
ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、血小板形質膜の外表面の主要構成成分の1つである。ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、３つの膜貫通ポリペプチド、即ちＧＰＩｂのジスルフィド結合130 kDaα鎖および25 kDaβ鎖ならびに非共有結合ＧＰＩＸ（22 kDa）を含む。4つのユニットは全て、ＣＤ４２複合体の効率的細胞表面発現および機能のために、血小板膜上に等モル量で存在する。ＧＰＩｂのα鎖は、以下の3つの別個の構造ドメインからなる：（１）富ロイシン反復配列およびＣｙｓ結合フランキング配列を含有する球状Ｎ末端ペプチドドメイン；（２）高度グリコシル化ムチン様マクロ糖ペプチドドメイン；ならびに（３）ＧＰＩｂβとのジスルフィド架橋ならびに膜貫通および細胞質配列を含有する膜関連Ｃ末端領域。
【００１８】
証拠のいくつかの系列は、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体のｖＷＦおよびトロンビン結合ドメインは、ＧＰＩｂαのアミノ末端に約300アミノ酸を包含する球状領域に存在する、ということを示す。ヒト血小板ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体は、血小板機能および反応性の両方を媒介する重要な膜受容体である。ＧＰＩｂによる内皮下層結合ｖＷＦの認識は、血小板を損傷血管に接着させる。さらにＧＰＩｂαへのｖＷＦの結合は、血小板活性化を誘導し、これは、ＧＰＩｂ−ＩＸの細胞質ドメインと細胞骨格またはホスホリパーゼＡ２との相互作用を包含し得る。さらにＧＰＩｂαは、今のところ十分には明確にされていないメカニズムにより、血小板活性化を促進するα−トロンビンに関する高親和性結合部位を含有する。
【００１９】
ＧＰＩｂαのＮ末端球状ドメインは、負に荷電したアミノのクラスターを含有する。証拠のいくつかの系列は、ＧＰＩｂ−ＩＸ複合体を発現するトランスフェクト化ＣＨＯ細胞において、ならびに血小板ＧＰＩｂαにおいて、このドメインに含入される3つのチロシン残基（Ｔｙｒ−２７６、Ｔｙｒ−２７８およびＴｙｒ−２７９）は硫酸化を受ける、ということを示す。
【００２０】
タンパク質硫酸化
タンパク質硫酸化は、糖側鎖とのまたはポリペプチド主鎖との硫酸塩の酵素的共有結合を包含する広範囲に及ぶ翻訳後修飾である。この修飾は、トランスゴルジ区画中で生じ、したがってこの区画を横断するタンパク質のみに影響を及ぼす。このようなタンパク質としては、分泌タンパク質、顆粒に関して標的化されるタンパク質、ならびに形質膜タンパク質の細胞外領域が挙げられる。チロシンは、硫酸化を受けることが目下既知であるアミノ酸残基である（J.W. Kehoe et al., Chemistry and Biol 7: R57-R61 (2000)）。その他のアミノ酸、例えばトレオニンもおそらくは、特に罹患細胞において硫酸化を受け得る。
【００２１】
多数のタンパク質はチロシン硫酸化されるということが判明しているが、しかし単一ポリペプチド中の3つまたはそれ以上の硫酸化チロシンの存在は、ＧＰＩｂに関して見出されたように、一般的でない。血小板および巨核球により発現されるＧＰＩｂα（ＣＤ４２）は、ｖＷＦとの結合を介した内皮下層との血小板結合および内皮下層上でのローリングを媒介し、さらにまたそのＮ末端ドメインに多数の負電荷を含有する。このような高度の酸性および親水性環境は、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼが酸性アミノ酸に隣接するチロシンを特異的に認識し、硫酸化するため、硫酸化のための必要条件であると考えられる（J.R. Bundgaard et al., JBC 272: 21700-21705 (1997)）。ＧＰＩｂαの酸性領域の完全硫酸化は、顕著な密度の負電荷、即ち19のアミノ酸範囲内に13の負電荷を有する領域を生じて、それを他のタンパク質との静電相互作用のための候補部位にする。
【００２２】
セレクチンおよびＰＳＧＬ−１
Ｐ−、Ｅ−およびＬ−セレクチンは、他の機能の中でも、血管内皮上の白血球のローリングを媒介する接着分子の一ファミリーである。Ｐセレクチンは、血小板中の顆粒中に貯蔵され、そしてトロンビン、ヒスタミン、ホルボールエステルまたはその他の刺激分子による活性化後に表面に運搬される。Ｐセレクチンは、活性化内皮細胞上にも発現される。Ｅセレクチンは内皮細胞上に発現され、そしてＬセレクチンは好中球、単球、Ｔ細胞およびＢ細胞上に発現される。
【００２３】
ＰＳＧＬ−１（ＣＤ１６２とも呼ばれる）は、Ｐセレクチン、ＥセレクチンおよびＬセレクチンに関するムチン糖タンパク質リガンドである。ＰＳＧＬ−１は、ＰＡＣＥ（対合塩基性アミノ酸変換酵素）切断部位を有するジスルフィド結合ホモ二量体である。ＰＳＧＬ−１は、3つの潜在的チロシン硫酸化部位と、その後のプロリン、セリンおよびトレオニン中で高度である約15の十量体反復も有する。ＰＳＧＬ−１の細胞外部分は、3つのＮ連結グリコシル化部位を含有し、そして多数のシアリル化、フコシル化Ｏ連結オリゴ糖分枝を有する（K.L. Moore et al., JBC 118: 445-456 (1992)）。Ｎ−グリカン部位のほとんどおよび多数のＯ−グリカン部位が占有される。ヒトＨＬ−６０細胞からのＰＳＧＬ−１のＯ−グリカンの構造が確定されている。これらのＯ−グリカンのサブセットは、セレクチンとの結合に必要とされるコア−２、シリル化およびフコシル化構造である。ＰＳＧＬ−１のアミノ末端領域のチロシン硫酸化も、ＰセレクチンおよびＬセレクチンとの結合のために必要とされる。さらに、おそらくは翻訳後に切断されるＮ末端プロペプチドが存在する。
【００２４】
ＰＳＧＬ−１は、ＨＬ６０細胞中に361残基を有し、267残基細胞外領域、25残基膜貫通領域および69残基細胞内領域を伴う。ＰＳＧＬ−１をコードする配列は単一エキソン内に存在し、それゆえ代替的スプライシングは起こり得ないはずである。しかしながらＨＬ６０細胞中の、ならびにほとんどの細胞株中のＰＳＧＬ−１は、細胞外領域に存在する10残基コンセンサス配列の15連続反復を有するが、しかし同様に、多形核白血球、単球およびいくつかのその他の細胞株、例えばほとんどのネイティブ白血球中にこの配列の14および16反復が存在する。ＰＳＧＬ−１は、細胞表面にジスルフィド結合ホモ二量体を形成する（V. Afshar-Kharghan et al., Blood 97: 3306-3312 (2001)）。
【００２５】
ＰＳＧＬ−１は、250 kDaおよび160 kDaの両方の見掛けの分子量を有する二量体として好中球上に発現されるが、一方、ＨＬ６０上では、二量体形態は〜220 kDaである。還元条件下で分析される場合、各サブユニットは半分だけ還元される。分子量の差は、異なる数の十量体反復の存在により引き起こされる分子の多型性による（Leukocyte Typing VI, Edited by T. Kishimoto et al. (1997)）。
【００２６】
ＰＳＧＬ−１は、ほとんどの血中白血球、例えば好中球、単球、白血球、Ｂ細胞のサブセットおよび全てのＴ細胞上で発現され、Ｐセレクチンに及ぼす好中球のローリングを媒介する（Leukocyte Typing VI. Edited by T. Kishimoto et al. (1997)）。ＰＳＧＬ−１は、Ｌセレクチンとの結合により好中球−好中球相互作用も媒介し、それにより炎症に介在する（Snapp, et al., Blood 91 (1): 154-64 (1998)）。
【００２７】
ＰＳＧＬ−１は活性化内皮細胞上、活性化血小板上、ならびにその他の白血球および炎症部位上での白血球のローリングを媒介する。
【００２８】
ヒトＰＧＳＬ−１に対する市販のモノクローナル抗体ＫＰＬ１が生成され、ＰＧＳＬ−１およびＰセレクチン間の、ならびにＰＧＳＬ−１およびＬセレクチン間の相互作用を抑制することが示された。ＫＰＬ１エピトープは、ＰＧＳＬ−１のチロシン硫酸化コンセンサスモチーフ（ＹＥＹＬＤＹＤ）に対してマッピングされた。ＫＰＬ１はこの特定のエピトープのみを認識し、他の細胞、例えばＢ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、転移細胞、多発性骨髄腫細胞等の上に存在する硫酸化エピトープと交差反応しない。
【００２９】
白血球ローリングは炎症において重要であり、そしてＰセレクチン（活性化内皮により及び血小板上で発現され、これらは損傷部位において固定化されうる）およびＰＳＧＬ−１間の相互作用は、血管壁上の白血球の繋ぎ止め（tethering）およびローリングのために役立つ（Ramachandran et al., PNAS 98 (18): 10166-71 (2001); Afshar-Kharghan, et al., Blood 97 (10): 3306-7 (2001)）。
【００３０】
細胞ローリングは転移においても重要であり、そして内皮細胞上のＰおよびＥセレクチンは転移細胞と結合し、それにより血流から周囲組織への血管外遊出を促すと考えられる。
【００３１】
血小板も転移の過程に関与する。転移癌細胞が血流中に入ると、腫瘍細胞を被覆する血小板および白血球からなる多細胞性複合体が形成される。微小塞栓と呼ばれ得るこれらの複合体は、腫瘍細胞が免疫系を免れるのを手助けする。血小板による腫瘍細胞のコーティングは、血小板によるＰセレクチンの発現を要する。
【００３２】
Ｐ−およびＬセレクチンの阻害薬であるヘパリンを用いた治療は、腫瘍細胞−血小板相互作用を抑制する。シアリル化、フコシル化ムチンリガンドを除去するＯ−シアログルコプロテアーゼを用いた腫瘍細胞の前処理も、腫瘍細胞−血小板複合体形成を抑制する。これらの治療のいずれかが循環腫瘍細胞とのより大きい単球関連を生じる、ということをin vivo実験は示し、このことは、血小板結合低減が、循環腫瘍細胞への免疫細胞による接近を増大する、ということを示唆する（Varki and Varki, Braz. J. Biol. Res. 34 (6): 711-7 (2001)）。
【００３３】
ＰＳＧＬ−１およびＧＰＩｂは構造類似性を共有し、ムチン様高グリコシル化リガンド結合領域を有する（Afshar-Kharghan, et al., Blood 97 (10): 3306-7 (2001)）。
【００３４】
ＰＳＧＬ−１は、全ての白血球：好中球、単球、リンパ球、活性化末梢Ｔ細胞、顆粒球、好酸球、血小板上に、ならびにいくつかのＣＤ３４陽性幹細胞およびＢ細胞のある種のサブセット上に見出されている。Ｐセレクチンは、活性化血小板および内皮細胞上に選択的に発現される。ＰセレクチンおよびＰＳＧＬ−１間の相互作用は、血管壁上の白血球のローリングを促進し、そして血管部位での白血球の異常蓄積は病理的炎症を生じる。ＰＳＧＬ−１に関する個々の硫酸チロシンの立体特異的寄与は、ＰセレクチンのＰＳＧＬ−１との結合のために重要である。電荷も結合のために重要である。：ＮａＣl低減（150から50へ）は、結合を増強する（Kd〜75 nM）。ＰＳＧＬ−１上のチロシン硫酸化は、Ｐセレクチン上のＰＳＧＬ−１接着を増強するが、しかし結局はＰＳＧＬ−１接着を要しない。ＰＳＧＬ−１チロシン硫酸化は、全ての剪断率でのより遅いローリング接着を支持し、そしてはるかに高い剪断率でのローリング接着を支持する（Rodgers SD, et al., Biophys J. 81: 2001-9 (2001)）。
【００３５】
フィブリノーゲン
2つの形態の正常ヒトフィブリノーゲンが存在する：即ちフィブリノーゲンγ大変異体およびフィブリノーゲンガンマプライム小変異体であって、各々正常個体中に見出される。より豊富な形態である（身体中に見出されるフィブリノーゲンの〜90％を構成する）正常フィブリノーゲンは、2つの同一の55 kDaアルファ（α）鎖、2つの同一の95 kDaベータ（β）鎖および2つの同一の49.5 kDaガンマ（γ）鎖から成る。低豊富形態である（身体中に見出されるフィブリノーゲンの〜10％を構成する）正常変異体フィブリノーゲンは、2つの同一の55 kDaアルファ（α）鎖、2つの同一の95 kDaベータ（β）鎖、1つの49.5 kDaガンマ（γ）鎖および1つの50.5 kDaガンマ（γ）鎖から成る。ガンマおよびガンマプライム鎖はともに、同一遺伝子によりコードされ、代替的スプライシングは３‘末端で起こる。正常ガンマ鎖は、アミノ酸１〜４１１から成る。正常変異体ガンマプライム鎖は、427アミノ酸から成る：アミノ酸１〜４０７は正常ガンマ鎖中のものと同一であり、そしてアミノ酸４０８〜４２７はVRPEHPAETEYDSLYPEDDLである。この領域は、普通はトロンビン分子で占められる。
【００３６】
フィブリノーゲンは、イオン化カルシウムの存在下でのトロンビンの作用によりフィブリンに変換されて、血液の凝固を生じる。フィブリンは、血栓および急性炎症滲出物の一構成成分でもある。
【００３７】
血小板、ならびに細胞−細胞相互作用、細胞−マトリックス相互作用、血小板−血小板相互作用、血小板−細胞相互作用、血小板−マトリックス相互作用、細胞ローリングおよび接着ならびに止血において重要な役割を演じる分子（例えばフィブリノーゲン、ＧＰＩｂ、セレクチンおよびＰＳＧＬ−１）も、病原状態または疾患状態、例えば異常または病原性炎症、異常または病原性免疫反応、自己免疫反応、転移、異常または病原性接着、血栓および／または再狭窄、ならびに異常または病原性凝集において重要な役割を演じる。したがって血小板とならびにこれらの分子と交差反応する抗体は、これらのおよびその他の病原性状態を包含する疾患および障害の診断および治療に有用である。
【００３８】
抗体またはその断片、ならびに作用物質、例えば抗癌薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾患薬、抗接着薬、抗血栓症薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗細菌薬、抗ウイルス薬または抗炎症薬の組成物を提供することは、本発明の一目的である。
【００３９】
種々の症状、例えば細胞ローリング、炎症、自己免疫疾患、転移、腫瘍細胞の増殖および／または複製、腫瘍細胞の死亡率、白血病細胞の増殖および／または複製、白血病細胞の死亡率、抗疾患薬による損傷に対する罹患細胞の感受性、抗癌薬による損傷に対する腫瘍細胞の感受性、抗白血病薬による損傷に対する白血病細胞の感受性、腫瘍または癌を有する患者における腫瘍細胞の数、ならびに白血病を有する患者における白血病細胞の数を処置するために作用物質および抗体またはその断片を利用する方法を提供することは、本発明の別の目的である。
【００４０】
作用物質および抗体またはその断片を用いた治療的処置の方法であって、作用物質および／または抗体またはその断片が、作用物質が単独で投与された場合に臨床的に有効であることが一般に判明した作用物質の量未満である量で組成物中に存在する方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【００４１】
本発明のこれらのおよびその他の目的が本明細書中で提供される。
【発明の開示】
【００４２】
発明の要約
本発明は、作用物質および抗体またはその断片を有する組成物を提供する。本発明の組成物は、作用物質が抗体またはその断片と複合体形成され得る、作用物質が抗体またはその断片と化合され得る、あるいは作用物質が抗体またはその断片と接合され得るようなものである。本発明の組成物の抗体またはその断片は、１つまたは複数の抗体または断片の複合体または集合体として存在し得る。
【００４３】
本発明の組成物中では、作用物質および／または抗体またはその断片は準臨床量で存在し得る。この準臨床量は、作用物質に対する感受性、特に罹患細胞の感受性を有効に変えるのには不十分であり得る。作用物質は、抗癌薬、抗転移薬、抗白血病薬、抗疾患薬、抗接着薬、抗血栓症薬、抗再狭窄薬、抗自己免疫薬、抗凝集薬、抗細菌薬、抗ウイルス薬または抗炎症薬であり得る。好ましくは作用物質は、アントラサイクリンまたはその誘導体であり、これは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシホルホリニルドキソルビシンあるいはそれらの誘導体または組合せであり得る。最も好ましくは、作用物質はドキソルビシンまたはその誘導体である。
【００４４】
さらに作用物質の準臨床量は、細胞ローリング、炎症、自己免疫疾患、血栓症、再狭窄、転移、あるいは腫瘍細胞または白血病細胞の生存、増殖および／または複製を有効に抑制するためには不十分であり得る。さらに作用物質の準臨床量は、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数の増大を有効に抑制するために、あるいは白血病を有する患者における白血病細胞の数の増大を抑制するためには不十分であり得る。さらにまた、作用物質の準臨床量は、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数を低減するために、あるいは白血病を有する患者における白血病細胞の数を有効に低減するためには不十分であり得る。さらに作用物質の準臨床量は、腫瘍細胞または白血病細胞の死亡率を高め、抗癌薬による損傷に対する腫瘍細胞の感受性を有効に増大させ、あるいは抗白血病薬による損傷に対する白血病細胞の感受性を有効に増大させるためには不十分であり得る。最後に、作用物質の準臨床量は、細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板および／または細胞−血小板複合体形成、凝集または接着を有効に抑制するためには不十分であり得る。
【００４５】
本発明の組成物の抗体またはその断片は、配列番号１、配列番号２または配列番号３のｓｃＦｖ抗体断片の結合能力を有し得る。さらに抗体またはその断片は、ペプチドまたはポリペプチドの結合能力を有し得るが、この場合、ペプチドまたはポリペプチドは配列番号４を有する第一超可変部を有する。このようなペプチドまたはポリペプチドは、配列番号５を有する第二超可変部および／または配列番号６、配列番号７または配列番号８を有する第三超可変部もさらに含み得る。抗体またはその断片は、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片であり得る。
【００４６】
本発明の組成物は、作用物質および抗体またはその断片も有し得るが、この場合、抗体またはその断片は、約3〜約126アミノ酸残基長のペプチドまたはポリペプチドエピトープと結合し、ペプチドまたはポリペプチドエピトープは少なくとも2つの酸性アミノ酸および少なくとも1つの硫酸化チロシン残基を有する。さらに本発明の組成物は、作用物質および抗体またはその断片を有し得るが、この場合、抗体またはその断片は、ＰＳＧＬ−１、フィブリノーゲンガンマプライム（γ’）、ＧＰ１ｂα、ヘパリン、ルミカン、補体化合物４（ＣＣ４）、インターアルファ阻害剤およびプロトロンビンから成る群から選択される少なくとも2つの異なる分子と結合する。さらにまた、本発明の組成物は、作用物質および抗体またはその断片を有し得るが、この場合、抗体またはその断片は、ＰＳＧＬ−１、フィブリノーゲンガンマプライム（γ’）、ＧＰ１ｂα、ヘパリン、ルミカン、補体化合物４（ＣＣ４）、インターアルファ阻害剤およびプロトロンビンから成る群から選択される少なくとも2つの異なる分子と結合し、そしてＢ細胞白血病細胞、Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞および転移細胞からなる群から選択される少なくとも1つの細胞型と結合する。さらに本発明の組成物は、作用物質および抗体またはその断片を有し得るが、この場合、抗体またはその断片は2つまたはそれ以上のエピトープと交差反応し、各エピトープは１つまたは複数の硫酸化チロシン残基ならびに2つまたはそれ以上の酸性アミノ酸の少なくとも1つのクラスターを含む。
【００４７】
本発明の組成物中では、抗体またはその断片は、1つより多い作用物質と結合されるかまたは複合体形成されるかまたは化合されるビヒクルまたは担体と結合されるかまたは複合体形成されるかまたは化合され得る。このようなビヒクルまたは担体は、デキストラン、親油性ポリマー、親水性ポリマー、ＨＰＭＡおよびリポソームからなる群から選択され得る。好ましくはビヒクルまたは担体は、ドキソルビシン装飾リポソームである。あるいは好ましくはビヒクルまたは担体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはデキストランである。
【００４８】
本発明は、それを必要とする患者に本発明の組成物を投与する種々の方法も提供する。例えば本発明は、本発明の組成物のいずれかをそれを必要とする患者に投与することにより、疾患の作用を改善し、疾患を予防し、疾患を治療し、または疾患の進行を抑制する方法も提供する。本発明は、細胞ローリング、炎症、自己免疫疾患、血栓症、再狭窄、転移、腫瘍細胞の生存、増殖および／または複製、白血病細胞の増殖および／または複製、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数の増大、白血病を有する患者における白血病細胞の数の増大を抑制する方法を提供する。さらにまた本発明は、腫瘍細胞の死亡率、白血病細胞の死亡率、抗疾患薬による損傷に対する罹患細胞の感受性、抗癌薬による損傷に対する腫瘍細胞の感受性、または抗癌薬による損傷に対する白血病細胞の感受性を増大する方法を提供する。さらに本発明は、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数、白血病を有する患者における白血病細胞の数を低減する方法を提供する。最後に本発明は、細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板および／または細胞−血小板複合体形成、凝集または接着を抑制する方法を提供する。
【００４９】
本発明は、治療的処置方法であって、それを必要とする患者に（ｉ）抗体またはその断片、および（ｉｉ）作用物質を投与することによる方法も提供するが、この場合、抗体またはその断片および／または作用物質の一方または両方が準臨床量で投与される。この方法では、作用物質よび抗体またはその断片は、接合され、複合体形成され、あるいは組合せて投与され得る。さらに作用物質は、抗体またはその断片の前にまたは後に別々に、あるいは任意のその他の順序または配置で、ならびにその逆に投与され得る。
【００５０】
定義
抗体（Ａｂ）または免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、抗原と結合するタンパク質分子である。それらは、ジスルフィド結合により一緒に連結された4つのポリペプチド鎖（2つの重鎖および2つの軽鎖）のユニットから成る。鎖は各々、定常部および可変部を有する。それらは、それらの重鎖構成成分を基礎にして、5つのクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥに分けられ得る。ＩｇＧクラスは、いくつかのサブクラス、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3およびＩｇＧ4を包含するが、これらに限定されない。免疫グロブリンは、Ｂリンパ球によりin vivoで産生され、特定の外来抗原決定基を認識し、そしてその抗原の除去を促す。
【００５１】
抗体は、抗体複合体を含めた多数の形態で産生され、用いられ得る。本明細書中で用いる場合、「抗体複合体」または「抗体複合体（複数）」という用語は、１つまたは複数の抗体と別の抗体との、あるいは単数または複数の抗体断片との複合体を、あるいは2つまたはそれ以上の抗体断片の複合体を意味するために用いられる。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ’）、ＦｃおよびＦｄ断片が挙げられる。
【００５２】
明細書においておよび特許請求の範囲において、本明細書中で用いる場合、Ｆｖは、ヒト抗体の重鎖の可変部およびヒト抗体の軽鎖の可変部から作製される分子として定義され、これらは同一であるかまたは異なり、そしてこの場合、重鎖の可変部は軽鎖の可変部と接続され、連結され、融合され、または共有結合されるか、あるいは会合される。Ｆｖは,一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）であり得る。ｓｃＦｖは、柔軟性アミノ酸ポリペプチドスペーサーまたはリンカーにより連結される抗体の重鎖および軽鎖の各々の可変部から成る。リンカーは、分枝または非分枝され得る。好ましくはリンカーは、0〜15アミノ酸残基であり、最も好ましくはリンカーは（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3である。
【００５３】
Ｆｖ分子それ自体は第一鎖および第二鎖から成り、各鎖は第一、第二および第三超可変部を含む。軽鎖および重鎖の可変部内の超可変ループは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。重鎖および軽鎖の各々には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が存在する。これらの領域は抗原結合部位を形成すると考えられ、そして特異的に修飾されて、結合活性増強を生じ得る。これらの領域のほとんどの可変部は、事実上重鎖のＣＤＲ３領域である。ＣＤＲ３領域は、Ｉｇ分子のほとんどの曝露領域であると理解され、そして本明細書中に示され、提供されるように、主として観察された選択的および／または特異的結合特性に関与する部位である。
【００５４】
Ｆｖ分子の断片は、本来のＦｖの選択的および／または特異的結合特性を依然として保持する本来のＦｖより小さい任意の分子と定義される。このような断片の例としては、（１）ミニボディ（Ｆｖの重鎖のみの断片を含む）、（２）マイクロボディ（抗体重鎖可変部の小分画単位を含む）（ＰＣＴ出願PCT/IL99/00581）、（３）軽鎖の断片を含む同様のボディ、ならびに（４）軽鎖可変部の機能性単位を含む同様のボディが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書中で用いる場合、「Ｆａｂ断片」という用語は、免疫グロブリンの一価抗原結合断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖と重鎖の一部とから成る。
【００５６】
Ｆ（ａｂ’）2断片は、ペプシン消化により得られる免疫グロブリンの二価抗原結合断片である。
【００５７】
Ｆｃ断片は、免疫グロブリンの非抗原結合部分である。それは重鎖のカルボキシ末端部分およびＦｃ受容体のための結合部位を含有する。
【００５８】
Ｆｄ断片は、免疫グロブリンの重鎖の可変部および第一定常部である。
【００５９】
ポリクローナル抗体は免疫応答の産物であり、多数の異なるＢリンパ球により生成される。モノクローナル抗体は、単一細胞から得られる。
【００６０】
カセットは、ポリペプチドに適用される場合、ならびに本発明で定義される場合、フレームワークとして役立ち、そして単一ユニットとみなされる、そしてこのようなものとして操作される連続アミノ酸の所定の配列を指す。アミノ酸は、一端または両端で置換され、挿入され、除去されまたは結合され得る。同様に、アミノ酸のストレッチは、一端または両端で置換され、挿入され、除去されまたは結合され得る。
【００６１】
「エピトープ」という用語は、抗原決定基、あるいは抗体、抗体断片、抗体複合体またはその結合断片を含む複合体あるいはＴ細胞受容体と相互作用する抗原部位を意味するために本明細書中で用いられる。エピトープという用語は、本明細書中では、リガンド、ドメインおよび結合領域という用語と互換的に用いられる。
【００６２】
選択性は、本明細書中では、細胞型または細胞状態の混合物から一細胞型または細胞状態を選択し、そして結合するターゲッティング分子の能力と定義され、その細胞型または細胞状態は全て、ターゲッティング分子に特異的であり得る。
【００６３】
「親和性」という用語は、本明細書中で用いる場合、受容体（例えば抗体上の一結合部位）およびリガンド（例えば抗原決定基）間の結合強度（会合定数）の測定値である。抗体上の単一抗原結合部位と単一エピトープとの間の非共有的相互作用の総和の強度が、そのエピトープに対する抗体の親和性である。低親和性抗体は抗原を弱く結合し、そして容易に解離する傾向があるが、一方、高親和性抗体は抗原をよりしっかり結合し、より長く結合したままである。「結合力」という用語は、それが抗原−抗体相互作用の力価を反映するため、親和性とは異なる。
【００６４】
抗体−抗原相互作用の特異性：抗原−抗体反応は特異的であるが、しかしいくつかの場合、一抗原により引き出される抗体は、別の非関連抗原と交差反応し得る。このような交差反応は、2つの異なる抗原が相同のまたは類似の構造、エピトープまたはそのアンカー領域を共有する場合に、あるいは一エピトープに特異的な抗体が類似の構造配置または化学特性を保有する非関連エピトープと結合する場合に起こる。
【００６５】
血小板は、骨髄洞中に収容され、その後末梢血流中を循環する巨核球の円板様細胞質断片である。血小板は、凝結における主要な役割を含めたいくつかの生理学的機能を有する。血小板は、中心部分に顆粒を、そして周辺部に透明な原形質を含有するが、明確な核は含有しない。
【００６６】
膠着とは、本明細書中で用いる場合、懸濁細菌、細胞、円板または同サイズのその他の粒子が接着され、集塊の形を取る過程を意味する。その過程は沈殿と類似するが、しかし粒子はより大きく、そして溶液中に存在するというよりむしろ懸濁液中に存在する。
【００６７】
凝集という用語は、血栓または止血栓の形成をもたらす逐次的メカニズムの一部としての、in vitroで誘導される血小板、ならびにトロンビンおよびコラーゲンの集塊化を意味する。
【００６８】
保存的アミノ酸置換は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質あるいはそれらの断片の1つまたは2つのアミノ酸を変更することによるアミノ酸組成物における変化と定義される。置換は、置換がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質特徴(例えば電荷、ＩＥＦ、親和性、結合力、立体配座、溶解度)または活性を実質的に大規模に変更しないよう、一般的に類似の特性(例えば酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正または負荷電性、極性、非極性)を有するアミノ酸についてである。このような保存的アミノ酸置換のために実施され得る典型的置換は、以下のようなアミノ酸の群の間であり得る：
グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびイソロイシン（Ｉ）；
アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）；
ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）；
アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）。
【００６９】
保存的アミノ酸置換は、分子の選択的および／または特異的結合特徴に主に関与する超可変部、ならびに分子のその他の部分、例えば可変性重鎖カセットをフランキングする場合にも同様になされ得る。さらにまたは代替的に、分子を再構築して、全サイズ抗体、二重特異性抗体（二量体）、三重特異性抗体（三量体）および／または四重特異性抗体（四量体）を形成し、あるいはミニボディまたはマイクロボディを形成することにより、修飾が達成され得る。
【００７０】
ファージミドは、プラスミドＤＮＡを保有するファージ粒子と定義される。ファージミドは、ｆｄのｍ１３のような糸状ファージからの複製の起点を含有するよう設計されたプラスミドベクターである。それがプラスミドＤＮＡを保有するため、ファージミド粒子はファージゲノムの完全補体を含有するための十分なスペースを有さない。ファージゲノムから欠けている構成成分は、ファージ粒子を包装するために不可欠な情報である。したがってファージを増殖させるためには、欠けている包装情報を補足するヘルパーファージ株と一緒に、所望のファージ粒子を培養することが必要である。
【００７１】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、そして転写を開始するＤＮＡ上の領域である。
【００７２】
ファージ表示ライブラリー(ファージペプチド／抗体ライブラリー、ファージライブラリーまたはペプチド／抗体ライブラリーとも呼ばれる)はファージの大集団(一般に108〜109)を含み、各ファージ粒子は異なるペプチドまたはポリペプチド配列を表示する。これらのペプチドまたはポリペプチド断片は、種々の長さを有するよう構築し得る。表示ペプチドまたはポリペプチドは、ヒト抗体重鎖または軽鎖に由来し得るが、これらに限定される必要はない。
【００７３】
製剤組成物は、本発明のペプチドまたはポリペプチドならびにそれらの製薬上許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む処方物を指す。
【００７４】
治療薬（製剤）は、哺乳類、例えばヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ネズミ、イヌ、ネコまたは任意のその他の温血動物（これらに限定されない）の予防的処置または診断に有用である作用物質を指す。製剤は、放射性同位体、毒素、オリゴヌクレオチド、組換えタンパク質、抗体断片および抗癌薬からなる群から選択される。このような製剤の例としては、抗ウイルス薬、例えばアシクロビル、ガンシクロビルおよびジドブジン；抗血栓症／再狭窄薬、例えばシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウムおよびアスピリン；抗炎症薬、例えばザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸１７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブおよびニメスリド；抗自己免疫薬、例えばレフルノミド、デニロイキンジフチトックス、スブレウム、WinRhoＳＤＦ、デフィブロチドおよびシクロホスファミド；ならびに抗接着／抗凝集薬、例えばリマプロスト、クロルクロメンおよびヒアルロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
抗白血病薬は、抗白血病活性を有する作用物質である。例えば抗白血病薬としては、白血病または未熟前白血病細胞の増殖を抑制するかまたは停止させる作用物質、白血病または前白血病細胞を殺害する作用物質、他の抗白血病薬に対する白血病または前白血病細胞の感受性を増大する作用物質、ならびに白血病細胞の転移を抑制する作用物質が挙げられる。本発明においては、抗白血病薬は、腫瘍の血管新生を防止し、抑制し、遅らせまたは停止させる抗血管形成活性を有する作用物質でもあり得る。
【００７６】
遺伝子の発現パターンは、種々の条件下で、特定時間に、種々の組織中等で産生された遺伝子産物の量を分析することにより試験され得る。遺伝子は、遺伝子産物の量が正常対照、例えば非罹患対照において見出されたものより高い場合、「過剰発現された」とみなされる。
【００７７】
所定細胞は、所定抗体に関する結合部位（エピトープ）を有するタンパク質をその表面に発現し得るが、しかしその結合部位は、第一段階（段階Ｉ）と呼ばれ得る状態での細胞中に潜在形態(例えば立体的に妨害または遮断された、あるいは抗体による結合に必要な特徴を欠く)で存在し得る。段階Ｉは、例えば正常健常非罹患状態であり得る。エピトープが潜在形態で存在する場合、それは所定抗体により認識されない。即ちこのエピトープとのまたは段階Ｉの所定細胞との抗体の結合は認められない。しかしながら例えば修飾それ自体を受けることにより、あるいは直ぐ近くのまたは関連の分子が修飾されるため、あるいはある領域が立体配座変化を受けるため遮断されないことにより、エピトープは曝露され得る。
【００７８】
修飾の例としては、フォールディングにおける変化、翻訳後修飾における変化、リン脂質化における変化、硫酸化における変化、グリコシル化における変化等が挙げられる。このような修飾は、第二段階（段階ＩＩ）と呼ばれ得る異なる状態に細胞が入ると起こり得る。第二段階（単数または複数）の例としては、活性化、増殖、形質転換または悪性状態が挙げられる。修飾されると、エピトープは次に曝露され、抗体が結合し得る。
【００７９】
ペプチド模倣物は、もう一つの存在物、例えば抗体の同一機能的作用または活性を有する小分子、ペプチド、ポリペプチド、脂質、多糖またはそれらの接合物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
本発明の詳細な説明
本発明は、作用物質および抗体またはその断片を包含する組成物および方法に関する。本発明の組成物は、１つまたは複数の抗体またはその断片が１つまたは複数の種々の作用物質、例えば薬剤、毒素および放射性同位体と、任意に製薬上有効な担体とともに凝集され（aggregated）、会合され（associated）、複合体形成され（complexed）または化合される（combined）かあるいは接合され、融合されまたは連結されて、抗疾患および／または抗癌活性を有する薬剤−ペプチド複合体、組成物または接合物を生成するようなものであり得る。このような複合体、組合せ物、接合物は、診断目的のためにも用いられ得る。さらに作用物質および／または抗体は、準臨床量で組成物中に存在し得る。準臨床量とは、作用物質および／または抗体が単独で投与される場合に、臨床的に最適に有効であることが一般的に見出された作用物質および／または抗体の量未満である量を意味する。準臨床量は、限定臨床応答を引き出すことが一般的に見出された作用物質および／または抗体の必要とされる量未満である量も意味し得る。準臨床量は、本発明の組成物および方法に従って投与される場合に、作用物質および／または抗体が臨床的に非有効であることを意味するよう意図されない、と理解されるべきである。
【００８１】
好ましい実施形態では、作用物質の準臨床量は、作用物質に対する感受性、特に罹患細胞の感受性を有効に変えるためには十分であり得ない。例えば作用物質の準臨床量は、細胞ローリング、炎症、自己免疫疾患、血栓症、再狭窄、転移、あるいは腫瘍細胞または白血病細胞の増殖および／または複製を有効に抑制するためには不十分であり得る。さらに作用物質の準臨床量は、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数の増大を有効に抑制するために、あるいは白血病を有する患者における白血病細胞の数の増大を抑制するためには不十分であり得る。作用物質の準臨床量は、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数を有効に低減するために、あるいは白血病を有する患者における白血病細胞の数を有効に低減するためには不十分であり得る。さらに作用物質の準臨床量は、腫瘍細胞または白血病細胞の死亡率を有効に増大し、抗癌薬による損傷に対する腫瘍細胞の感受性を有効に増大し、あるいは抗白血病薬による損傷に対する白血病細胞の感受性を有効に増大するためには不十分であり得る。最後に、作用物質の準臨床量は、細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板および／または細胞−血小板複合体形成、凝集または接着を有効に抑制するためには不十分であり得る。
【００８２】
好ましくは本発明の組成物は、配列番号１、配列番号２または配列番号３のｓｃＦｖ抗体断片の結合能力を有する抗体またはその断片を有する。配列番号１のｓｃＦｖ断片はＹ１と呼ばれており、配列番号２のｓｃＦｖ断片はＹ１７と呼ばれており、そして配列番号３のｓｃＦｖ断片はＬ３２と呼ばれている。これらの抗体は、重鎖ＣＤＲ３領域にのみ多様性を有するヒト抗体ファージライブラリーをスクリーニングすることにより同定された。ヒトｓｃＦｖ  Ｙ１およびＹ１７抗体の場合、血小板と結合する抗体を同定するために、固定ヒト血小板がスクリーニングされた。Ｌ３２は、白血病細胞表面決定基を認識する特異的抗体を選択するために白血病細胞に対してスクリーニングされたが、この場合、特異的受容体は前には既知でなかったかまたは特性化されなかった。この同一方法を用いて、別の抗体Ｌ３１が同定された。
【００８３】
本発明の組成物において有用な抗体は、同一ファージライブラリーを用いて、米国特許出願10/032,423；10/032,037；10/029,988；10/029,926；09/751,181および60/258,948ならびに国際出願PCT/US01/49442およびPCT/US01/49440において過去に同定された。これらの出願中に開示された抗体の特定の例としては、Ｙ１およびＹ１７抗体が挙げられる。これらの出願中に開示された抗体は、Ｎ末端チロシンで硫酸化されそして細胞移動例えば腫瘍転移に関与すると考えられる造血細胞のタンパク質上に見出されるエピトープと、特異的に結合することが発見された。
【００８４】
Ｙ１抗体に関するエピトープは、Ｙ１とグリコカリシンとの結合に不可欠である硫酸化基に起因する負荷電アミノ酸のクラスターが存在するＣＤ４２複合体のサブユニットの１つであるグリコカリシン上のアミノ酸２７２〜２８５間に位置する。さらにＹ１は、負荷電アミノ酸のクラスターを伴う硫酸化チロシン残基を含有するＥ、ＬおよびＰセレクチンに関する受容体であるＰＳＧＬ−１のＮ末端と結合する。Ｙ１抗体は、いくつかの分子、例えば血小板上のグリコカリシン分子、フィブリノーゲン−ガンマプライム、ヒト血漿の補体化合物４およびＫＧ−１細胞上のＰＳＧＬ−１分子と結合するが、しかしＡＭＬまたは多発性骨髄腫(ＭＭ)患者由来の原発性白血病細胞に対するその親和性は、上記のエピトープと比較して数倍高い。
【００８５】
さらにＬ３２およびＬ３１抗体は、米国特許出願60/   ,   （表題「L32 Antibodies and Uses Thereof」）（2002年7月1日提出）に開示されている。Ｌ３２抗体ならびにＹ１／Ｙ１７出願に開示された抗体はともに白血病細胞と結合するが、しかしＬ３２はＹ１の約５倍の親和性で白血病細胞と結合する。Ｌ３２およびＹ１／Ｙ１７抗体は共通の生殖細胞系から全て単離され、そしてＬ３２はＹ１／Ｙ１７と同一の硫酸化エピトープと結合するように見えるが、一方、Ｌ３２は血小板と結合せず、そしてさらに血小板凝集に影響を及ぼさない。
【００８６】
本発明の好ましい抗体と結合するとして以前に同定された硫酸化エピトープは、炎症、免疫反応、感染、自己免疫反応、転移、接着、血栓症および／または再狭窄、細胞ローリングならびに凝集といったような多様な過程において重要な役割を演じるリガンドおよび受容体上に見出される、好ましくは2つまたはそれ以上のアミノ酸のクラスター内の硫酸化部分、例えば硫酸化チロシン残基または硫酸化炭水化物または脂質部分の存在により特性化される。このようなエピトープは、罹患細胞、例えばＢ細胞白血病細胞、Ｂ−ＣＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、多発性骨髄腫細胞および転移細胞上にも見出される。これらのエピトープは、これらの過程の治療的介在のための、そして診断手法のための有用な標的である。
【００８７】
好ましくは本発明の組成物の抗体は、炎症に関与する異なる分子またはエピトープ、例えばＰＳＧＬ−１、フィブリノーゲンガンマプライム（γ’）、ＧＰ１ｂ、ヘパリン、ルミカン、補体化合物４（ＣＣ４）、インターアルファ阻害剤およびプロトロンビンと結合する。さらに好ましくは抗体は、炎症または腫瘍形成に関与する少なくとも１つの細胞型上に、例えばＢ−ＣＬＬ細胞、Ｔ−ＡＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、Ｂ−白血病細胞、多発性骨髄腫細胞および転移細胞上に存在するエピトープと結合する。さらに好ましくは本発明の組成物の抗体は、脂質、炭水化物、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質および／またはリポ多糖分子上のエピトープと結合する。このようなエピトープは、好ましくは少なくとも１つの硫酸化部分を有する。あるいは、しかし好ましくは、抗体は2つまたはそれ以上のエピトープと交差反応し、各エピトープは１つまたは複数の硫酸化チロシン残基、ならびに2つまたはそれ以上の酸性アミノ酸の少なくとも１つのクラスターを有し、この例はＰＳＧＬ−１である。
【００８８】
抗原結合部位の形成に関与するのは、本発明の抗体の超可変部である。抗原結合部位は、抗体が結合するエピトープの構造と相補的である。したがってこれらの結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる。抗体の各軽鎖および重鎖上には3つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が存在し、各々はＶHおよびＶLドメインのβ鎖をつなぐループ上に位置する。これらの領域のうち最も可変性であるのは、重鎖のＣＤＲ３領域である。ＣＤＲ３領域は、Ｉｇ分子の最も曝露された領域であると理解され、そして本明細書中に提示されたように、観察された選択的および／または特異的結合特質を確定するに際して中心的役割を有する。
【００８９】
本発明の組成物の好ましい一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４の第一超可変部（ＣＤＲ３）を有する。さらに、あるいは代替的に、抗体またはその断片は、配列番号５の第二超可変部（ＣＤＲ２）を有する。さらにまた、あるいは代替的に、抗体またはその断片は、配列番号６、配列番号７または配列番号８の第三超可変部（ＣＤＲ１）を有する。
【００９０】
本発明によれば、ＣＤＲはさらにまた、カセット中に挿入されて抗体を産生し得る。カセットは、ポリペプチドに適用される場合、ならびに本発明で定義される場合、フレームワークとして役立ち、そして単一ユニットとみなされる、そしてこのようなものとして操作される連続アミノ酸の所定の配列を指す。アミノ酸は、一端または両端で置換され、挿入され、除去されまたは結合され得る。同様に、アミノ酸のストレッチは、一端または両端で置換され、挿入され、除去されまたは結合され得る。カセットのアミノ酸配列は見かけ上固定され得るが、一方、置換、挿入または結合配列は、高可変性であり得る。カセットはいくつかのドメインからなり、その各々は最終構築物にとってきわめて重大な機能を包含する。本発明の特定の実施形態のカセットは、Ｎ末端から、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、フレームワーク領域３（ＦＲ３）およびフレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む。本発明の一実施形態では、カセット内の別個の領域を置換することが可能である。例えばカセットのＣＤＲ２およびＣＤＲ１超可変部は、非保存的または好ましくは保存的アミノ酸置換により置換されるかまたは修飾され得る。
【００９１】
本明細書中に記載されならびに詳述された≦25のアミノ酸残基のアミノ酸配列（例えばＣＤＲ領域、ＣＤＲフランキング領域）の全てに関して、これらのアミノ酸配列が、それらの範囲内に、1つまたは2つのアミノ酸置換（単数または複数）を含み、そして好ましくは置換は保存的アミノ酸置換であるということは、本発明のさらなる一実施形態である、と理解され、みなされるべきである。本明細書中に記載されならびに詳述された＞25のアミノ酸残基のアミノ酸配列の全てに関して、これらのアミノ酸配列が、それらの範囲内に、本来の配列と≧90％の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むということは、本発明の一実施形態と理解され、みなされるべきである（Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)）。類似のまたは相同のアミノ酸は、類似の特性、例えば酸性、塩基性、芳香族性、サイズ、正または負荷電性、極性、非極性を表示する非同一アミノ酸と定義される。
【００９２】
アミノ酸類似性または相同性、あるいは配列類似性のパーセントは、2つの異なるペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより確定される。抗体配列は、ＤＮＡシーケンシングにより確定された。2つの配列は、通常はその目的のために意図された種々のコンピュータープログラムのうちの１つの使用により整列され、そして各位置のアミノ酸残基が比較される。次にアミノ酸同一性または相同性が確定される。次にアルゴリズムが適用されて、アミノ酸類似性パーセンテージを確定する。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質分子間の微妙な関係の検出に対する感受性の大きな増大のため、アミノ酸配列を比較するのが一般的に好ましい。タンパク質比較は保存的アミノ酸置換の存在を考慮に入れることが可能で、それにより、非同一アミノ酸が類似の物理的および／または化学的特性を有する場合、ミスマッチは正のスコアを依然として生じ得る（Altschul et al. (1997)、上記）。
【００９３】
本発明の一実施形態では、軽鎖および重鎖の各々の3つの超可変部は、2つの鎖間で、そして鎖内および／または鎖間の3つの超可変部の中で交換され得る。
【００９４】
本発明は、抗体またはその断片、その構築物または断片の構築物を有するペプチドまたはポリペプチドを提供する。本発明によれば、抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体が挙げられる。ＩｇＧクラスは、いくつかのサブクラス、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3およびＩｇＧ4を包含する。
【００９５】
抗体は、多数の形態で、例えば断片、複合体および多量体の形態で提供され得る。本発明によれば、抗体断片としては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ2およびＦｄ分子が挙げられる。より小さい抗体断片、例えばＦｖの断片およびＦａｂの断片も、それらが本来の抗体のまたはより大きい断片の結合特徴を保持する限り、「断片」という用語に含まれる。このような断片の例は、（１）ミニボディ（Ｆｖの重鎖のみの断片を含む）、（２）マイクロボディ（抗体重鎖可変部の小分画単位を含む）（国際出願PCT/IL99/00581）、（３）軽鎖の断片を有する同様のボディ、ならびに（４）軽鎖可変部の機能性単位を有する同様のボディである。構築物としては、例えば多量体、例えば二重特異性抗体、三重特異性抗体および四重特異性抗体が挙げられる。「抗体またはその断片あるいは抗体またはその断片を有する複合体」ならびに「抗体または断片」という語句は、当該技術分野における情況および／または知識に基づいて別に具体的に記述または別記されないかぎり、これらの分子、ならびにその誘導体および相同体、模倣物および変異体の全てを包含するよう意図される。
【００９６】
ｓｃＦｖは、それらのサイズがより小さいため、完全サイズより迅速に組織に浸入しそして血液から取り除かれる、ということが確定されている（Adams et al., Br. J. Cancer 77: 1405-12 (1988); Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11 (5): 548-557 (1999); Wu et al., Tumor Targeting 4: 47 (1999)）。したがってｓｃＦｖはしばしば、身体からの放射性標識のより迅速な除去を可能にするために、放射性標識、例えば腫瘍画像診断を包含する診断に用いられ得る。多数の癌ターゲッティングｓｃＦｖ多量体が、近年、in vivo安定性および効能に関する前臨床評価を受けた（Adams et al. (1988); Wu (1999)、上記）。
【００９７】
典型的には、ｓｃＦｖ単量体は、ＶLのＮ末端残基に対してポリペプチドリンカーにより繋がれたＶHドメインのＣ末端を用いて設計される。任意に、逆方向が用いられる：即ち、ＶLドメインのＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介してＶHのＮ末端残基に繋がれる（Power et al., J. Immun. Meth. 242: 193-204 (2000)）。ポリペプチドリンカーは、典型的には約15アミノ酸長である。リンカーが約3〜7アミノ酸に低減されると、ｓｃＦｖは機能性Ｆｖドメインにフォールディングし得ず、代わりに第二ｓｃＦｖと会合して、二重特異性抗体を生成する。さらにリンカーの長さが3より少ないアミノ酸に低減すると、リンカーの長さ、組成およびＦｖドメイン配向によって、三量体または四量体へのｓｃＦｖ会合を余儀なくされる（Powers (2000)、上掲）。
【００９８】
近年、多価抗体断片、例えばｓｃＦｖ二量体、三量体および四量体はしばしば、親抗体と標的との結合を上回るより高い親和性を提供する、ということが発見された。このより高い親和性は、潜在的利点、例えば腫瘍ターゲッティング用途のための薬物動態改善を提供する。さらに、白血球の繋ぎ止めおよびローリングに関与するＰセレクチンおよびそのリガンドＰＳＧＬ−１を試験するに際して、二量体形態のＰＳＧＬ−１を発現する細胞は、このより高い結合親和性のため、より安定なローリング接着を確立する、と科学者は推論した。これらの接着はより剪断耐性であり、ローリング速度における低変動を示した（Ramachandran et al., PNAS, 98 (18): 10166-71 (2001)）。
【００９９】
これらの多価形態のより大きい結合親和性は、診断および治療レジメンに有益であり得る。例えばｓｃＦｖは、標的受容体を結合するための遮断剤として用いられ、したがって「天然」リガンドの結合を遮断し得る。このような場合、標的との天然リガンドの望ましくない結合を可能にし得る解離のための機会を低減するためにｓｃＦｖおよび受容体間のより高い親和性会合を有するのが望ましい。さらにこの高い親和性は、標的受容体が接着およびローリングに関与する場合、あるいは標的受容体が高剪断流の領域に存在する細胞上に、例えば血小板上に存在する場合、有用であり得る。
【０１００】
所望の結合能力を有する抗体、断片または構築物が一旦選択されおよび／または開発されれば、それは、本来の抗体の特質を保持する構築物および断片を産生するために本明細書中に提示された指針を用いる当業者の十分に能力内である。例えば完全抗体分子、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ2断片、二量体、三量体および最初に選択されまたは開発された抗体、断片または構築物の所望の特質を保持するその他の構築物が作製され得る。
【０１０１】
アミノ酸を置換するが、しかし抗体または断片の特質を依然として保持するのが望ましい場合、保存的アミノ酸置換を為すことは十分に当業者の範囲内である。製剤または診断薬と複合体形成し、化合しまたは接合するといったような修飾も、それらの結合特質を変えることなく抗体または断片に対してなされ得る。その他の修飾、例えばより安定な抗体または断片を産生するためになされるものも、それらの特異性を変えることなく抗体または断片に対してなされ得る。例えばペプトイド修飾、半ペプトイド修飾、環状ペプチド修飾、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、主鎖修飾および残基修飾が実施され得る。本発明の明細書の指針に従って、修飾抗体または断片を試験して、それらの結合特質が変更されたか否かを査定することも、熟練研究者の能力内である。
【０１０２】
同様に、本明細書中に提供された指針を用いて、抗体、断片または構築物の結合特質を変えて、より望ましい特質を有する分子を得ることは、熟練研究者の能力内である。例えば望ましい特性を有する抗体が一旦同定されれば、無作為または指向性突然変異誘発を用いて抗体の変異体を生成し得るし、そしてそれらの変異体は望ましい特質に関してスクリーニングされ得る。
【０１０３】
当該技術分野で既知の慣用的方法を用いて、本発明の組成物において有用な結合能力を有する付加的抗体またはその断片を確定することも可能である。例えば付加的抗体は、本明細書中に記載されたバイオパニング法を用いて単離され得るが、この場合、固定ヒト血小板または白血球と結合する分子または細胞を用いて、特定ファージ表示ライブラリー、特に白血病、リンパ腫または骨髄腫患者から調製されたライブラリーをスクリーニングする。
【０１０４】
当該技術分野で既知の慣用的方法を用いて、配列番号１、配列番号２または配列番号３のｓｃＦｖ抗体断片の結合能力を有する抗体またはその断片を確定することも可能である。炎症に関与する異なる分子またはエピトープと結合する付加的抗体、例えばＰＳＧＬ−１、フィブリノーゲンガンマプライム（γ’）、ＧＰ１ｂ、ヘパリン、ルミカン、補体化合物４（ＣＣ４）、インターアルファ阻害剤およびプロトロンビンも、当該技術分野で既知である慣用的方法を用いて確定され得る。慣用的方法を用いて、炎症または腫瘍形成に関与する少なくとも１つの細胞型上に、例えばＢ−ＣＬＬ細胞、Ｔ−ＡＬＬ細胞、ＡＭＬ細胞、Ｂ−白血病細胞、多発性骨髄腫細胞および転移細胞上に存在するエピトープと結合する付加的抗体も確定し得る。さらに、脂質、炭水化物、ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質および／またはリポ多糖分子上のエピトープ（エピトープは、好ましくは少なくとも１つの硫酸化部分を有する）と結合する抗体は、慣用的方法を用いて確定され得る。あるいは、慣用的方法は、2つまたはそれ以上のエピトープと交差反応する抗体を確定するためにも用いられ、各エピトープは１つまたは複数の硫酸化チロシン残基、ならびに2つまたはそれ以上の酸性アミノ酸の少なくとも１つのクラスターを有し、この例はＰＳＧＬ−１である。例えば結合データは、バイオセンサー分析を用いて、例えば市販のバイオセンサーBIACORE（Piscataway, N.J.）を用いて確定され得る（Myszka, J. Mol. Recognition, 12: 279-84 (1999); Malmborg & Borrebaeck, J. Immunol. Meth., 183: 7-13 (1999)）。
【０１０５】
本発明は、ｓｃＦｖ抗体を提供する。本明細書中で用いる場合、ｓｃＦｖは、ヒト抗体の重鎖の可変部およびヒト抗体の軽鎖の可変部から作製される分子として定義され、これらは同一であるかまたは異なり、そしてこの場合、重鎖の可変部は軽鎖の可変部と接続され、連結され、融合され、または共有結合されるか、あるいは会合される。
【０１０６】
ｓｃＦｖ構築物は、抗体の１つまたは複数の超可変部を組入れるｓｃＦｖ分子の多量体（例えば二量体、三量体、四量体等）であり得る。ｓｃＦｖ由来構築物および断片は全て、他の細胞に有利に標的細胞と選択的におよび／または特異的に結合するように、結合特質増強を保持する。結合選択性および／または特異性は、主に超可変部により確定される。本発明の抗体は、多価Ｆｖ形態にフォールディングするよう構築され、これが結合親和性および特異性を改善し、そして血中半減期を増大し得る。
【０１０７】
ｓｃＦｖの多価形態は、他のものにより設計され、産生されている。一アプローチは、2つのｓｃＦｖをリンカーと連結することであった。別のアプローチは、連結のために2つのｓｃＦｖ間にジスルフィド結合を用いることを包含する。二量体または三量体Ｆｖの産生のための最も簡単なアプローチは、Holliger et al., PNAS 90: 6444-48 (1993)およびKortt et al., Protein Eng. 10: 423-33 (1997)により報告された。このような一方法は、ＦＯＳおよびＪＵＮタンパク質の配列を付加して、ｓｃＦｖのＣ末端にそれらの間にロイシンジッパーを生成することにより、ｓｃＦｖの二量体を作製するよう意図された（Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5): 1547-53 (1992); De Kruif et al., J Biol Chem. 271 (13): 7630-34 (1996)）。別の方法は、ｓｃＦｖのＣ末端にストレプタビジンコード配列を付加することにより四量体を作製するよう意図された。ストレプタビジンは4つのサブユニットからなり、したがってｓｃＦｖ−ストレプタビジンがフォールディングされると、4つのサブユニットはそれら自体を抱き込んで、四量体を形成する（Kipriyanov et al., Hum Antibodies Hybridomas 6(3): 93-101 (1995)）。さらに別の方法では、二量体、三量体および四量体を作製するために、遊離システインが当該タンパク質に導入される。当該タンパク質を遊離システインに交差結合するために、可変数（2〜4）のマレイミド基を有するペプチドベースのクロスリンカーが用いられた（Cochran et al., Immunity 12 (3): 241-50 (2000)）。
【０１０８】
この系では、ファージライブラリ（本明細書中に上記）は、抗体のＦｖ領域の一価形態にフォールディングし得るｓｃＦｖを表示するよう意図され得る。さらに、そして本明細書中に上記されたように、構築物は細菌発現に適している。遺伝子工学処理ｓｃＦｖは、連続コード化15アミノ酸柔軟ペプチドスペーサーによりつながれた重鎖および軽鎖可変部を含む。好ましいスペーサーは(Ｇｌｙ4Ｓｅｒ)3である。このスペーサーの長さは、そのアミノ酸成分と一緒に、非嵩高スペーサーを提供し、これが、ＶHおよびＶL領域をその標的との有効な結合を提供する機能性Ｆｖドメインにフォールディングさせる。
【０１０９】
スペーサーの長さの変更は、二量体、三量体および四量体（当該技術分野ではしばしば、それぞれ二重特異性抗体、三重特異性抗体および四重特異性抗体と呼ばれる）を形成するためのさらに別の好ましい方法である。二量体は、ｓｃＦｖの2つの可変鎖を結合するスペーサーが一般的に5〜12アミノ酸残基に短縮される条件下で形成される。この短縮スペーサーは、同一分子からの2つの可変鎖が機能性Ｆｖドメインにフォールディングしないようにする。その代わり、ドメインは別の分子の相補的ドメインと対合させられて、2つの結合ドメインを作成する。好ましい方法では、5つのみのアミノ酸のスペーサー（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）が二重特異性抗体構築のために用いられた。この二量体は、2つの同一のｓｃＦｖから、あるいはｓｃＦｖの2つの異なる集団から形成され、そして親ｓｃＦｖ（単数または複数）の選択的および／または特異的増強化結合活性を保持し、および／または結合強度または親和性増大を示し得る。
【０１１０】
同様にして、三重特異性抗体は、ｓｃＦｖの2つの可変鎖を結合するスペーサーが一般的に5未満のアミノ酸残基に短縮される条件下で形成され、同一分子からの2つの可変鎖が機能性Ｆｖドメインにフォールディングしないようにする。その代わり、3つの別個のｓｃＦｖ分子が会合して、三量体を形成する。好ましい方法では、この柔軟性スペーサーを完全に除去することにより、三重特異性抗体が得られた。三重特異性抗体は、3つの同一ｓｃＦｖから、あるいはｓｃＦｖの2または3つの異なる集団から形成され、そして親ｓｃＦｖ（単数または複数）の選択的および／または特異的増強化結合活性を保持し、および／または結合強度または親和性増大を示し得る。
【０１１１】
四重特異性抗体は同様に、ｓｃＦｖの2つの可変鎖を結合するスペーサーが一般的に5未満のアミノ酸残基に短縮される条件下で形成され、同一分子からの2つの可変鎖が機能性Ｆｖドメインにフォールディングしないようにする。その代わり、4つの別個のｓｃＦｖ分子が会合して、四量体を形成する。四重特異性抗体は、4つの同一ｓｃＦｖから、あるいはｓｃＦｖの異なる集団からの1〜4つの個々のユニットから形成され、そして親ｓｃＦｖ（単数または複数）の選択的および／または特異的増強化結合活性を保持し、および／または結合強度または親和性増大を示すはずである。三重特異性抗体または四重特異性抗体が、スペーサーが一般的に5未満のアミノ酸残基長である条件下で生成するか否かは、混合物中の特定のｓｃＦｖ（単数または複数）のアミノ酸配列および反応条件によっている。
【０１１２】
抗体、その断片またはその構築物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質ならびにそれらの断片および構築物は、原核生物または真核生物発現系において産生され得る。原核生物および真核生物系における抗体および断片の産生方法は、当該技術分野で周知である。
【０１１３】
真核生物細胞系は、本発明で定義されるように、そして考察されるように、遺伝子工学処理法によりペプチドまたはポリペプチドを産生するための発現系を指し、この場合、宿主細胞は真核生物細胞である。真核生物発現系は哺乳類系であり、そして哺乳類発現系で産生されるペプチドまたはポリペプチドは、精製後、好ましくは実質的に哺乳類夾雑物を含有しない。有用な真核生物発現系のその他の例としては、酵母発現系が挙げられる。
【０１１４】
本発明のペプチドまたはポリペプチドの産生のための好ましい原核生物系は、発現ベクターのための宿主として大腸菌を用いる。大腸菌系で産生されるペプチドまたはポリペプチドは、精製後、大腸菌E. coli夾雑タンパク質を実質的に含有しない。原核生物発現系の使用は、本発明において提供される配列のいくつかまたは全てのＮ末端へのメチオニン残基の付加を生じ得る。Ｎ末端メチオニン残基の除去は、ペプチドまたはポリペプチドの完全発現を可能にするためのペプチドまたはポリペプチド産生後、当該技術分野で既知であるように実施され得るが、一例は、適切な条件下でグラム陰性細菌アミノペプチダーゼの使用によるものである(米国特許第5,763,215号)。
【０１１５】
本発明による抗体および断片は、その調製および同定に際して、ならびに診断に際して手助けするためにそれに挿入されるかまたは取り付けられ得るタグも有し得る。タグは、後に分子から除去される。有用なタグの例としては以下のものが挙げられる：ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（商標）、Ｔ７、Ｖ５およびＶＳＶ−Ｇ（Jarvik and Telmer, Ann. Rev. Gen., 32, 601-18 (1998)）。タグは好ましくはｃ−ｍｙｃまたはＫＡＫである。
【０１１６】
任意の適切な作用物質は、本発明の組成物中に用いられ得る。このような作用物質は一般に、抗癌、抗転移、抗白血病、抗疾患、抗接着、抗血栓症、抗再狭窄、抗自己免疫、抗凝集、抗細菌、抗ウイルスおよび抗炎症活性を有する。したがって本発明の組成物の作用物質は、抗癌薬、抗新生物薬、抗ウイルス薬、抗転移薬、抗炎症薬、抗血栓症薬、抗再狭窄薬、抗凝集薬、抗自己免疫薬、抗接着薬、抗心臓血管性疾患薬、またはその他の抗疾患薬または製剤であり得る。治療薬（製剤）とは、哺乳類、例えばヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ネズミ、イヌ、ネコまたは任意のその他の温血動物（これらに限定されない）の予防的処置または診断に有用である作用物質を指す。
【０１１７】
このような治療薬（製剤）の例としては、抗ウイルス薬、例えばアシクロビル、ガンシクロビルおよびジドブジン；抗血栓症／再狭窄薬、例えばシロスタゾール、ダルテパリンナトリウム、レビパリンナトリウムおよびアスピリン；抗炎症薬、例えばザルトプロフェン、プラノプロフェン、ドロキシカム、アセチルサリチル酸１７、ジクロフェナク、イブプロフェン、デキシブプロフェン、スリンダク、ナプロキセン、アムトルメチン、セレコキシブ、インドメタシン、ロフェコキシブおよびニメスリド；抗自己免疫薬、例えばレフルノミド、デニロイキンジフチトックス、スブレウム、WinRhoＳＤＦ、デフィブロチドおよびシクロホスファミド；ならびに抗接着／抗凝集薬、例えばリマプロスト、クロルクロメンおよびヒアルロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
その他の製剤の例としては、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニソン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイドおよびブレオマイシンならびにそれらの誘導体および組合せが挙げられる。好ましくは製剤は、アントラサイクリンまたはその誘導体であり、さらに好ましくは製剤はドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、イダルビシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシンまたはメトキシホルホリニルドキソルビシンならびにそれらの誘導体および組合せであり、最も好ましくは製剤はドキソルビシン（アドリアマイシン）である。
【０１１９】
抗癌薬は、抗癌活性を有する作用物質である。例えば抗癌薬としては、癌性または未熟前癌性細胞の増殖を抑制するかまたは停止させる作用物質、癌性または前癌性細胞を殺害する作用物質、その他の抗癌薬に対する癌性または前癌性細胞の感受性を増大する作用物質、癌性細胞の転移を抑制する作用物質が挙げられる。本発明においては、抗癌薬は、腫瘍の血管新生を防止し、抑制し、遅延しまたは停止する抗血管形成活性を有する作用物質でもあり得る。癌細胞の増殖の抑制としては、例えば（ｉ）癌性または転移性増殖の防止、（ｉｉ）癌性または転移性増殖の鈍化、（ｉｉｉ）細胞を無傷のままで生存させながらの、癌細胞の増殖過程または転移過程の全体的防止、（ｉｖ）癌細胞と微小環境との接触妨害、あるいは（ｖ）癌細胞の殺害が挙げられる。
【０１２０】
抗白血病薬は、抗白血病活性を有する作用物質である。例えば抗白血病薬としては、白血病または未熟前白血病細胞の増殖を抑制するかまたは停止させる作用物質、白血病または前白血病細胞を殺害する作用物質、他の抗白血病薬に対する白血病または前白血病細胞の感受性を増大する作用物質、ならびに白血病細胞の転移を抑制する作用物質が挙げられる。本発明においては、抗白血病薬は、腫瘍の血管新生を防止し、抑制し、遅らせまたは停止させる抗血管形成活性を有する作用物質でもあり得る。白血病細胞の増殖の抑制としては、例えば例えば（ｉ）白血病性または転移性増殖の防止、（ｉｉ）白血病性または転移性増殖の鈍化、（ｉｉｉ）細胞を無傷のままで生存させながらの、白血病細胞の増殖過程または転移過程の全体的防止、（ｉｖ）癌細胞と微小環境との接触妨害、あるいは（ｖ）白血病細胞の殺害が挙げられる。
【０１２１】
本発明の抗体および断片が有用に結合され得る抗疾患薬、抗癌薬および抗白血病薬の例としては、毒素、放射性同位体および製剤が挙げられる。毒素の例としては、ゲロニン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシンまたはその修飾体および誘導体が挙げられる。放射性同位体の例としては、位置測定および／または治療のために用いられ得るガンマ放射体、ポジトロン放射体およびＸ線放射体、ならびに治療のために用いられ得るベータ放射体およびアルファ放射体が挙げられる。診断のために有用であると上記された放射性同位体は、治療のためにも有用である。抗癌または抗白血病製剤の例としては、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニソン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイドおよびブレオマイシンならびにそれらの誘導体および組合せまたはそれらの修飾物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
さらに抗疾患、抗癌または抗白血病薬は、増殖因子受容体リガンドによる増殖因子受容体の刺激を抑制し、それにより増殖因子受容体を発現する細胞の増殖を抑制する増殖因子受容体アンタゴニストでもあり得る。増殖因子受容体のいくつかの例は、上皮増殖因子（ＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦＲ）、神経増殖因子（ＮＧＦＲ）および繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に関する受容体である。
【０１２３】
本発明の抗体およびその断片はまた、任意に製薬上有効な担体と会合され、複合体形成されまたは化合されるか、あるいは接合され、融合されまたは連結され得る。本発明に有用な担体の例としては、デキストラン、親油性ポリマー、例えばＨＰＭＡ、および親水性ポリマーが挙げられる。あるいは装飾リポソーム、例えばｓｃＦｖ  Ｙ１分子で装飾されたリポソーム、例えば多量のドキソルビシンを含有する市販のリポソームであるドキシルが用いられ得る。このようなリポソームは、１つまたは複数の所望の製剤を含有するよう調製され、そして高薬剤対抗体比を提供するために本発明の抗体と混合され得る。好ましくはビヒクルまたは担体は、ドキソルビシン装飾リポソームである。あるいは、しかしさらにまた好ましくは、ビヒクルまたは担体は親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはデキストランである。
【０１２４】
あるいは抗体またはその断片および製剤間の連結は、直接連結であり得る。2またはそれ以上の隣接分子間の直接連結は、分子中の元素または元素群間の化学結合により生成され得る。化学結合は、例えばイオン結合、共有結合、疎水性結合、親水性結合、静電結合または水素結合であり得る。結合は、例えばアミン、カルボキシ、アミド、ヒドロキシル、ペプチドおよび／またはジスルフィド結合であり得る。直接連結は、好ましくはプロテアーゼ耐性結合であり得る。
【０１２５】
ペプチドおよび製剤間のまたはペプチドおよび担体間のまたは担体および製剤間の連結は、リンカー化合物を介してであり得る。本明細書中で用いる場合、明細書中および特許請求の範囲では、リンカー化合物は2つまたはそれ以上の部分をつなぐ化合物と定義される。リンカーは、直鎖または分枝鎖であり得る。分枝鎖リンカー化合物は、二重分枝、三重分枝または四重あるいはそれ以上の分枝化合物から成る。本発明で有用なリンカー化合物としては、二カルボン酸、マレイミド  ヒドラジド、ＰＤＰＨ、カルボン酸ヒドラジドおよび小ペプチドを有する群から選択されるものが挙げられる。
【０１２６】
本発明に有用なリンカー化合物のさらに特定の例としては、（ａ）二カルボン酸、例えばコハク酸、グルタル酸およびアジピン酸；（ｂ）マレイミド  ヒドラジド、例えばＮ−［マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジドおよびＮ−［マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド；（ｃ）ＰＤＰＨリンカー、例えばイオウヒドリル反応性タンパク質に接合された（３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド）；ならびに（ｄ）2〜5個の炭素原子から選択されるカルボン酸ヒドラジドが挙げられる。
【０１２７】
小ペプチドリンカーを用いた直接カップリングによる連結も有用である。例えば抗癌薬ドキソルビシンの遊離糖とｓｃＦｖとの間の直接カップリングはたとえば、小ペプチドを用いて成し遂げられ得る。小ペプチドの例としては、ＡＵ１、ＡＵ５、ＢＴａｇ、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＡ、Ｈｉｓ６、ＨＳＶ、ＨＴＴＰＨＨ、ＩＲＳ、ＫＴ３、プロテインＣ、Ｓ−ＴＡＧ（商標）、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−ＧおよびＫＡＫが挙げられる。
【０１２８】
本発明の抗体およびその断片は、画像診断薬（指示マーカーとも呼ばれる）、例えば放射性同位体と結合され、接合され、複合体形成され、または別の方法で会合され得るし、これらの接合物は診断および画像診断のために用いられ得る。このような放射性同位体−抗体（または断片）接合物を有するキットが提供される。
【０１２９】
診断に有用な放射性同位体の例としては、111インジウム、113インジウム、99mレニウム、105レニウム、101レニウム、99mテクネチウム、121mテルル、122mテルル、125mテルル、165ツリウム、167ツリウム、168ツリウム、123ヨウ素、126ヨウ素、131ヨウ素、133ヨウ素、81mクリプトン、33キセノン、90イットリウム、213ビスマス、77臭素、18フッ素、95ルテニウム、97ルテニウム、103ルテニウム、105ルテニウム、107水銀、203水銀、67ガリウムおよび68ガリウムが挙げられる。好ましい放射性同位体はＸ線に対して不透性であるかまたは任意の適切な常磁性イオンである。
【０１３０】
指示マーカー分子は、蛍光マーカー分子でもあり得る。蛍光マーカー分子の例としては、フルオレセイン、フィコエリトリンまたはローダミン、あるいはそれらの修飾物または接合物が挙げられる。
【０１３１】
指示マーカーに接合される抗体または断片は、疾患状態を診断し、またはモニタリングするために用いられ得る。このようなモニタリングは、in vivo、in vitroまたはex vivoで実行され得る。モニタリングまたは診断がin vivoまたはex vivoで実行される場合、画像診断薬は好ましくは生理学的に許容可能であり、その場合、それは患者を許容不可能レベルにまで害さない。許容可能レベルの害は、疾患の重症度およびその他の選択肢の利用可能性のような判定基準を用いて、臨床医により確定され得る。
【０１３２】
本発明は、指示マーカー分子または画像診断薬に連結された本発明のペプチドを有する画像診断薬を有する、治療前、治療中または治療後の治療効能のin vitro分析のための診断キットを提供する。本発明はさらに、癌の、さらに特に腫瘍の診断的位置測定および画像診断のための画像診断薬の使用方法であって、以下の：（ａ）細胞を組成物と接触させ；（ｂ）細胞に結合された放射能を測定し；したがって（ｃ）腫瘍を可視化する過程を有する方法を提供する。
【０１３３】
適切な画像診断薬の例としては、蛍光染料、例えばＦＩＴＣ、ＰＥ等、ならびに蛍光タンパク質、例えばグリーン蛍光タンパク質が挙げられる。その他の例としては、放射性分子、ならびに認識可能な変化、例えば色変化を生じるための物質と反応する酵素が挙げられる。
【０１３４】
一例では、キットの画像診断薬は蛍光染料、例えばＦＩＴＣであり、そしてキットは癌の、特に血液関連癌、例えば白血病、リンパ腫または骨髄腫の治療効能の分析を提供する。ＦＡＣＳ分析は、疾患の各段階での、例えば診断時、治療中、寛解中および再発中の画像診断薬により染色された細胞のパーセンテージおよび染色の強度を確定するために用いられる。
【０１３５】
本発明は、それを必要とする患者に本発明の組成物のいずれかを投与することにより、疾患の作用を改善し、疾患を予防し、疾患を治療し、または疾患の進行を抑制する方法も提供する。例えば本発明は、細胞ローリング、炎症、自己免疫疾患、血栓症、再狭窄、転移、腫瘍細胞の増殖および／または複製、白血病細胞の増殖および／または複製、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞数の増大、あるいは白血病を有する患者における白血病細胞数の増大を抑制する方法を提供する。さらにまた本発明は、腫瘍細胞の死亡率、白血病細胞の死亡率、抗疾患薬による損傷に対する罹患細胞の感受性、抗癌薬による損傷に対する腫瘍細胞の感受性、または抗癌薬による損傷に対する白血病細胞の感受性を増大する方法を提供する。さらに本発明は、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞の数、白血病を有する患者における白血病細胞の数の低減方法を提供する。最後に本発明は、細胞−細胞、細胞−マトリックス、血小板−マトリックス、血小板−血小板および／または細胞−血小板複合体形成、凝集または接着の抑制方法を提供する。
【０１３６】
本発明の方法は、好ましくは無症状である量で投与される作用物質および抗体の一方または両方を用いて実行される。したがって本発明は、治療的処置の方法であって、それを必要とする患者に、以下の：（ｉ）抗体またはその断片、および（ｉｉ）作用物質を投与することを包含する方法であって、抗体またはその断片および／または作用物質の一方または両方が無症状敵有効量で投与される方法を提供する。この使用のための有効量は、疾患の重症度ならびに患者自身の免疫系の全身状態によっている。投与スケジュールも、疾患状態および患者の状態に伴って変わり、そして典型的には１回ボーラス投薬または連続注入から、多数回投与／日（例えば4〜6時間毎）の範囲であるか、あるいは治療医によりそして患者の症状により指示されるような範囲である。しかしながら本発明は任意の特定投与に限定されない、ということに留意すべきである。
【０１３７】
さらに、本発明の方法は、１回投与または多数回投与における作用物質および抗体の投与であって、作用物質が抗体またはその断片の投与の前に、同時にまたは後に投与されるようなものである投与を包含する、と当業者は理解する。作用物質は、抗体またはその断片の前に、同時にまたは後に、あるいは任意のその他の順序または配列で、そしてその逆でも投与され得る。このようなものとして、作用物質および抗体は別個の組成物中に存在し得る。
【０１３８】
本発明の抗体、構築物、接合物、組合せ物および断片は、任意の適切な方法によりそれを必要とする患者に投与され得る。例示的方法としては、静脈内、筋肉内、皮下、局所、気管内、くも膜下腔内、腹腔内、リンパ内、鼻腔内、舌下、口腔、直腸、膣、呼吸器、頬、皮内、経皮または胸膜内投与が挙げられる。
【０１３９】
静脈内投与のために、処方物は好ましくは、患者に投与される量が約0.1 mg〜約1000 mgの所望の組成物の有効量である。さらに好ましくは投与量は、約1 mg〜約500 mgの所望の組成物という範囲である。本発明の組成物は、広範な投薬量範囲に亘って有効であり、そして治療される疾患の特性、患者の身体中のペプチドまたはポリペプチドベースの製剤組成物の半減期、製剤のおよび製剤組成物の物理的および化学的特徴、製剤組成物の投与方式、治療されるかまたは診断される患者の特性、ならびに治療医により重要であるとみなされたその他のパラメーターといったような因子によっている。
【０１４０】
経口投与のための製剤組成物は、任意の適切な形態であり得る。例としては、錠剤、液体、乳濁液、懸濁液、シロップ、ピル、カプレットおよびカプセルが挙げられる。製剤組成物の製造方法は、当該技術分野で周知である（例えばRemington, The Science and Practise of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (pub)参照）。
【０１４１】
製剤組成物は、時限性、持放性、パルス化または連続放出を促すようにも処方され得る。製剤組成物は、時限性、持放性、パルス化または連続放出装置のような装置中でも投与され得る。
【０１４２】
局所投与のための製剤組成物は、クリーム、軟膏、ローション、パッチ、溶液、懸濁液、凍結乾燥物およびゲルのような任意の適切な形態であり得る。
【０１４３】
本発明の抗体、構築物、接合物、組合せ物および断片を含む組成物は、慣用的な製薬上強要可能な希釈剤、賦形剤、担体等を含み得る。錠剤、ピル、カプレットおよびカプセルは、慣用的賦形剤、例えばラクトース、デンプンおよびステアリン酸マグネシウムを含み得る。座薬は、賦形剤、例えば蝋およびグリセロールを含み得る。注射溶液は、滅菌無発熱物質培地、例えば生理食塩水を含み、そして緩衝剤、安定剤または防腐剤を含み得る。慣用的腸溶性コーティングも用いられ得る。
【０１４４】
以下の実施例は本発明の理解を助けるために記述されるものであって、いかなる点においても本発明を限定するよう意図されないし、そのように解釈されるべきでない。特定の試薬および反応条件が記載されているが、しかし本発明の範囲に包含される修正がなされ得る。したがって、本発明をさらに説明するために、以下の実施例が提供される。本明細書中に記述されまたは説明された参考文献は全て、それらの記述内容が援用される。
【実施例】
【０１４５】
実施例
実施例１
本実施例は、ＭＯＬＴ−４腫瘍保有マウスにおける化学療法処置およびＹ１間の相互作用を検査する。
【０１４６】
最初に、ＳＣＩＤマウス（Jackson）を100 mg/kgのＣＴＸ（サイトキサン−注射用シクロホスファミド、Mead Johnson）で前処理した。ＣＴＸ注射の5日後に、ＭＯＬＴ−４（Ｔ白血病）細胞を、2 ×10細胞を用いて尾静脈を介して静脈内（i.v.）接種した。マウスを5つの処置群に無作為に分けて（13匹／群）、それらを処置し、下記の表に示したように細胞接種後5日目に開始した。腫瘍保有マウスを、準最適用量のドキソルビシン（Ｄｏｘ）を、同時的にまたはＤｏｘ治療経過後に投与するＹ１と組合せて用いて、2週間処置した。療法に対する応答を，生存の場合にモニタリングした。上記のように、実験群は以下の通りであった：
【０１４７】
【表１】
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【０１４８】
図１における結果は、準最適用量のＤｏｘ単独による処置が、対照群（平均生存時間−ＭＴＳは39.08±0.8日）と比較して、腫瘍保有マウスの生存率（ＭＳＴ33.5±1.68日）に及ぼす陰性作用を有した、ということを示す。しかしながらＤｏｘで、その後Ｙ１で、逐次的に処置されたマウスの生存率は、非常に有意に延長された。Ｙ１単独は腫瘍保有マウスの生存率に劇的作用を及ぼしたが、しかし準臨床的最適Ｄｏｘ＋Ｙ１の組合せは、最良作用を有した。生存率の有意の増大は、化学療法およびＹ１抗体間の相乗作用の結果であると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、ドキソルビシンおよびＹ１単独を順次または組合せて投与後の時間（日数）の一関数としてのＭＯＬＴ−４腫瘍保有マウスの生存率（％）を表すグラフである。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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