(57)【要約】本発明は、一般に、真核生物シグナル配列を用いて原核細胞宿主でタンパク質またはポリペプチドを発現させるための方法および組成物に関する。一態様では、本発明は、Ｆａｂフラグメントを発現するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）真核生物のシグナル配列にそれぞれが作動可能に結合した抗体重鎖および抗体軽鎖をコードするジシストロニックな転写ユニットに作動可能に結合したラムノースプロモーターを含むベクターを有する細菌細胞の培養物を提供する工程；（ｉｉ）培養物にラムノースを添加してラムノースプロモーターを誘導することで、抗体重鎖および抗体軽鎖ならびにそれらに結合したシグナル配列を発現させ、ペリプラズムに分泌させ、シグナルペチド配列が抗体重鎖および抗体軽鎖からプロセスされ、抗体重鎖と抗体軽鎖とが結合して標的分子に特異的に結合するＦａｂフラグメントを形成する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆａｂフラグメントを発現させる方法であって、以下：
ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）またはＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）に示されたシグナルペプチド配列をコードする真核生物のシグナル配列にそれぞれが作動可能に結合した抗体重鎖および抗体軽鎖をコードするジシストロニックな転写ユニットに対して作動可能に結合したラムノースプロモーターを含むベクターを有する細菌細胞の培養物を提供する工程と、
該培養物にラムノースを添加して該ラムノースプロモーターを誘導することで、該抗体重鎖および該抗体軽鎖ならびにそれらに結合したシグナル配列を発現させ、ペリプラズムに分泌させ、該シグナルペチド配列が該抗体重鎖および該抗体軽鎖からプロセッシングされ、該抗体重鎖と該抗体軽鎖とが組み立てられて標的分子に特異的に結合するＦａｂフラグメントを形成する工程と、
該細菌細胞の培養物から該Ｆａｂフラグメントを回収する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記重鎖に作動可能に結合した前記シグナル配列がＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）をコードし、前記軽鎖に作動可能に結合した前記シグナル配列がＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記重鎖に作動可能に結合した前記シグナル配列がＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）をコードし、前記軽鎖に作動可能に結合した前記シグナル配列がＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記重鎖に作動可能に結合した前記シグナル配列と、前記軽鎖に作動可能に結合した前記シグナル配列とが共にＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記重鎖に作動可能に結合した前記シグナル配列と前記軽鎖に作動可能に結合した前記シグナル配列とが共にＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｈａＢ＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｈａＢ−である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養物中の培地から前記Ｆａｂフラグメントを回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記回収工程に先立って、前記細胞を溶解して前記Ｆａｂフラグメントを放出させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ファージからＦａｂフラグメントを提示する方法であって、該方法は、抗体重鎖および抗体軽鎖をコードするファージ提示ベクターを細菌細胞内で発現させる工程を包含し、該軽鎖が第１のシグナルペプチド配列に作動可能に結合しており、そして該重鎖がファージ外表面タンパク質および第２のシグナルペプチド配列に作動可能に結合しており、それによって該抗体の鎖が発現されて該細胞のペリプラズムに分泌され、そしてプロセッシングされることで、該シグナルペプチド配列から該抗体の鎖が分離され、標的分子に対する特異的結合親和性を持ち、ファージ粒子の外表面から掲示されるＦａｂフラグメントとして該抗体の鎖が組み立てられ、
該第１のシグナルペプチド配列および第２のシグナルペプチド配列の各々が配列ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）またはＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）を有する真核生物のシグナル配列である、方法。
【請求項１１】
前記第１のシグナルペプチド配列がＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）であり、前記第２のシグナルペプチド配列がＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のシグナルペプチド配列がＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）であり、前記第２のシグナルペプチド配列がＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のシグナルペプチド配列および前記第２のシグナルペプチド配列が、共にＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のシグナルペプチド配列および前記第２のシグナルペプチド配列が、共にＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
融合タンパク質であって、
ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）とＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）とからなる群から選択される真核生物シグナルペプチド配列と作動可能に結合した抗体鎖を含む、融合タンパク質。
【請求項１６】
前記真核生物シグナルペプチド配列がＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）である、請求項１５に記載の融合タンパク質方法。
【請求項１７】
前記真核生物シグナルペプチド配列がＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）である、請求項１５に記載の融合タンパク質方法。
【請求項１８】
細菌細胞内でポリペプチドを発現するための発現ベクターであって、
細菌プロモーターと、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを有し、
該ポリヌクレオチドが、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）とＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）とからなる群から選択されるシグナルペプチド配列をコードする真核生物シグナル配列に作動可能に結合している、発現ベクター。
【請求項１９】
前記シグナルペプチド配列がＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）であり、前記プロモーターが、誘導可能なラムノースプロモーターである、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
細菌細胞内でポリペプチドを発現させる方法であって、
ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）およびＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）からなる群から選択されるシグナルペプチドをコードする真核生物シグナル配列に作動可能に結合しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとラムノースプロモーターとを含むベクターを有する細菌細胞の培養物を提供する工程と、
ラムノースを該培養物に添加して該ラムノースプロモーターを誘導することで、該ポリヌクレオチドと該シグナル配列とを発現させてペリプラズムを分泌させ、そして発現されたシグナルペプチド配列が、該ポリヌクレオチドから発現された該ポリペプチドからプロセッシングされる工程と、
該細菌細胞の培養物から該ポリペプチドを回収する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記シグナルペプチド配列がＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記シグナルペプチド配列がＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞内でポリペプチドを発現させる方法であって、
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを有する該宿主細胞の培養物を提供する工程であって、ここで、該ポリヌクレオチドが、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）から選択されるシグナルペプチドをコードする真核生物シグナル配列に作動可能に結合する工程と、
該ポリヌクレオチドおよび該シグナル配列を発現させる工程であって、該ポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドと発現された該シグナルペプチド配列とが分泌され、該発現されたシグナルペプチド配列が、該ポリヌクレオチドから発現された該ポリペプチドからプロセッシングされる工程と、
該宿主細胞の培養物から該ポリペプチドを回収する工程と、
を含む、方法。
【請求項２４】
複製可能な遺伝子パッケージからポリペプチドを提示する方法であって、該方法は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチド提示ベクターを原核宿主細胞または真核宿主細胞内で発現させる工程を含み、ここで、該ポリヌクレオチドは、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）から選択されるシグナルペプチドをコードする真核生物シグナル配列に作動可能に結合し、
これによって、該ポリヌクレオチド配列およびシグナル配列が発現および分泌され、発現された該シグナルペプチド配列が、発現された該ポリペプチドからプロセッシングされ、その結果、該ポリペプチドが該複製可能な遺伝子パッケージの外表面から提示される、方法。
【請求項２５】
ポリペプチド提示ライブラリーを作製する方法であって、
外来性ポリペプチドをコードするポリペプチドを複製可能な遺伝子パッケージのゲノムに導入し、該複製可能な遺伝子パッケージの外表面から通常発現される内在性タンパク質と融合タンパク質を形成させる工程であって、ここで、該ポリヌクレオチドが、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）から選択されるシグナルペプチドをコードする真核生物シグナル配列に作動可能に結合する工程と、
該融合タンパク質を該外表面に輸送してアセンブリングさせることで、該複製可能な遺伝子パッケージの外表面から該外来性ポリペプチドを提示させる融合タンパク質を発現させる工程と、
を含む、方法。
【請求項２６】
ポリペプチドを発現させるための宿主細胞であって、
該宿主細胞が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドに作動可能に結合した真核生物シグナル配列とを含むベクターを含み、該真核生物シグナル配列は、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）とから選択される真核生物シグナルペプチドを該真核生物シグナル配列がコードする、宿主細胞。
【請求項２７】
ポリペプチドを宿主細胞内で発現させるためのベクターであって、該ベクターが、以下：
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
該ポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターと、
該ポリヌクレオチドに作動可能に結合した真核生物シグナル配列と、を含み、
該真核生物シグナル配列がＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）から選択される真核生物シグナルペプチドをコードする、ベクター。
【請求項２８】
前記宿主細胞が原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、またはほ乳動物組織宿主細胞である、請求項２３、２６、または２７に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項２９】
前記プロモーターが誘導可能なプロモーターである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３０】
前記宿主細胞が細菌細胞であり、前記プロモーターが細菌プロモーターである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３１】
前記プロモーターが、ラクトースプロモーター、ラムノースプロモーター、アラビノースプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、トリプトファンプロモーター、ベータラクトマーゼプロモーター、ファージラムダ由来プロモーター、ファージＴ７由来プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ガラクトースプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、または免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスもしくはサイトメガロウイルスに由来するプロモーターから選択される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが真核生物ポリペプチドである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが原核細胞ポリペプチドである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが抗体であり、該抗体がマウス抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが完全抗体またはその結合フラグメントである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが抗体結合フラグメントであり、該フラグメントが単鎖フラグメント、Ｆｖフラグメント、またはＦａｂフラグメントである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが受容体（核内受容体、膜貫通型受容体、Ｇタンパク質受容体、またはチロシンキナーゼ受容体）、サイトカイン（ケモカイン）、ホルモン（増殖因子または分化因子）、神経ペプチドもしくは血管媒介物質、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヌクレオチドシクラーゼ、マトリックス分子（接着、カドヘリン、細胞外基質分子、インテグリン、もしくはセレクチン）、Ｇタンパク質、イオンチャンネル（カルシウム、塩化物、カリウム、もしくはナトリウム）、プロテアーゼ、トランスポーター／ポンプ（アミノ酸、タンパク質、糖、金属、もしくはビタミン；カルシウム、リン酸塩、カリウム、もしくはナトリウム）、または調節タンパク質である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項３９】
前記シグナルペプチドをコードするシグナル配列が配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６から選択される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項４０】
前記シグナル配列が、前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドに対して５’側である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項４１】
前記シグナル配列と前記ポリペプチドとがゼロアミノ酸によって分離されている、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項４２】
前記ベクターがポリシストロニックベクターである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項４３】
前記宿主細胞が細菌宿主細胞である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項４４】
前記宿主細胞が細菌宿主細胞であり、該細菌宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ    ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、もしくはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項４５】
前記宿主細胞が昆虫細胞であり、そして前記ベクターがバキュロウイルスベクターである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項４６】
前記ベクターは、前記宿主細胞によって認識される複製起点、終止コドン、および／または少なくとも１つの選択マーカーを、さらに含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法、宿主細胞、またはベクター。
【請求項４７】
前記複製可能な遺伝子パッケージが細胞、胞子、またはウイルスである、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項４８】
前記複製可能な遺伝子パッケージがバクテリオファージであり、該バクテリオファージとして線状ファージ、特にファージＭ１３、Ｆｄ、Ｆ１、またはファージミドが挙げられる、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）スクリーニングする工程、（ｂ）前記ポリペプチド掲示ライブラリーを富化する工程、および／または（ｃ）同定された前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにサブクローニングする工程を、さらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項５０】
請求項２３に記載の方法に従って調製された、ポリペプチド。
【請求項５１】
請求項２４または２５に記載の方法に従って調製された、ポリペプチド提示ライブラリー。
【請求項５２】
細菌細胞内でのポリペプチドの発現のための真核生物シグナル配列を選択する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養する工程であって、該ポリヌクレオチドが、ラムノースプロモーターに作動可能に結合するとともにシグナルペプチドをコードする真核生物シグナル配列に作動可能に結合する工程と、
（ｂ）該ポリヌクレオチドおよび該シグナル配列を発現させる工程と、
（ｃ）該ポリペプチドの発現と該細菌細胞による該ポリペプチドからの該シグナル配列のプロセッシングとを試験する工程と、
（ｄ）（ｉ）ポリペプチド発現が検出可能であり、かつ（ｉｉ）該シグナル配列が該ポリペプチドからプロセッシングされる場合、該真核生物シグナル配列を選択する工程と、
を包含する、方法。
【請求項５３】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項５２または５３に記載の方法に従って選択された、真核生物シグナル配列。
【請求項５５】
細菌細胞内でのポリペプチドの発現のための真核生物シグナル配列を選択する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからポリペプチドを発現する工程であって、該ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドをコードする第１の真核生物シグナル配列に作動可能に結合する工程と、
（ｂ）該ポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチドから、該ポリペプチドを発現させる工程であって、該ポリヌクレオチドが、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）である、第２の真核生物シグナル配列に作動可能に結合する工程と、
（ｃ）（ｉ）該工程（ａ）のポリペプチド発現が該工程（ｂ）のポリペプチド発現と実質的に同等またはそれよりも大きい場合、ならびに／あるいは（ｉｉ）該工程（ａ）の第１の真核生物シグナル配列が、該工程（ｂ）の第２の真核生物シグナル配列と実質的に同等またはそれよりも大きい場合、該第１の真核生物シグナル配列である該真核生物シグナル配列を選択する工程と、
を包含する、方法。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリペプチドがさらに作動可能にラムノースプロモーターに結合される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
請求項５５、５６、または５７に記載の方法に従って選択された、真核生物シグナル配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００２年２月１３日出願の米国特許出願番号１０／０７６，８０２の一部継続出願であり、該出願の開示内容すべては、参考として本明細書で援用される。
【０００２】
（発明の分野）
この出願は、ポリペプチドを効率的に発現および分泌させる特定の真核生物シグナル配列を、特に原核宿主細胞で用いる方法に関する。また、本発明は真核生物シグナル配列を用いてポリペプチド提示ライブラリーを産生およびスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
細胞膜を介して細胞から分泌されるタンパク質は、通常、タンパク質の細胞膜横断の手助けに必要とされる付加的なペプチド配列をアミノ末端に有する「プレタンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）」と呼ばれる前駆体の形態で細胞内に産生される。この付加的なペプチド酸配列は、「シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と呼ばれている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核生物では、シグナルペプチドは、タンパク質分泌をペリプラズムおよび外膜へ指向させる。真核生物細胞では、シグナル配列を含むプレタンパク質が粗面小胞体（ＲＥＲ）膜を貫くようにして挿入されており、それによってプレタンパク質が分泌経路に導かれる。このプロセスの過程で、シグナル配列はシグナル認識粒子（ＳＲＰ）と呼ばれる粒子と相互作用し、続いて該粒子がＳＲＰ受容体またはドッキングタンパク質（ｄｏｃｋｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれるＲＥＲ膜タンパク質によって認識される。ＲＥＲへのプレタンパク質の挿入後または挿入と同時に、シグナルペプチダーゼと呼ばれる酵素によって、プレタンパク質からシグナル配列が切り出され、それによって成熟タンパク質がＲＥＲに放出される。いったんタンパク質が分離してＥＲの内腔に入ると、該タンパク質はゴルジ体に移動し、さらに分泌小胞に移る。分泌小胞が原形質膜と融合すると、小胞の含有物が細胞外環境に放出される。原形質膜および細胞壁の両方を持つ生物（例えば、酵母）では、概して小胞の内容物が上記膜と上記細胞壁との間のペリプラズム空間に放出される。
【０００４】
分泌タンパク質のシグナル配列はいくつかの共通する一般的特徴（例えば、一般的にカルボキシル末端および疎水性の中央領域において短い鎖のアミノ酸）があるにもかかわらず、分泌されたタンパク質の巨大な配列（ｖａｓｔ  ａｒｒａｙ）について均一なコンセンサス配列は存在していない（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｅ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：５１４５−５１６４を参照のこと）。同一種の分泌タンパク質間および異なる種の分泌タンパク質間の両方において、実際、異なる分泌タンパク質のシグナル配列の一次構造が著しく変化している。このことは、各々の分泌タンパク質が細胞膜を横切る移動に十分適している特定のシグナル配列をともなって進化していることを示唆する。それらのシグナルペプチドの配列の違いに加えて、原核生物および真核生物もまた、分泌プロセス（例えばシグナル認識粒子の機能およびシャペロンの用途）に違いがある。
【０００５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で異種ポリペプチドを効率的に発現させる上で、異なるＥ．ｃｏｌｉシグナル配列が適合可能であることが示されている。しかし、異なる種のシグナル配列間、特に原核生物のシグナル配列と真核生物のシグナル配列との間での機能的置換は、予測不可能で問題があり、さらに効率性に劣る。第一に、宿主は、該宿主のネイティブシグナル配列によって首尾よく異質タンパク質を発現および分泌することが可能かもしれないが、そのシグナルペプチドを正しく切断することができないかもしれない（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内のＢａｃｉｌｌｕｓ  αアミラーゼ、例えば、Ｓｕｏｍｉｎｅｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：６４９−５４，１９９５を参照のこと）。また、わずかの真核生物タンパク質がネイティブシグナル配列を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムに分泌させる一方で、ほとんどの真核生物シグナル配列が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核生物宿主細胞で効率的に機能することができないことが示唆されている（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ．２０：２５２−６４，２０００を参照のこと）。いくつかの真核生物タンパク質（例えば、ヒトアポリポタンパク質Ｅ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムに分泌されるように、原核生物シグナルと置換したそのネイティブシグナル配列を持つことが必要である（例えば、Ｍｏｎｔｅｉｌｈｅｔら、Ｇｅｎｅ  １２５：２２３−８，１９９３を参照のこと）。
【０００６】
分泌された形状で組み換えタンパク質（例えば、免疫グロブリン）を効率よく産生する能力が強く望まれている。なぜなら、その後に、宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が増殖している培地から分泌タンパク質を回収することができるからである。例えば、上記のように、組み換えタンパク質のネイティブシグナル配列が宿主細胞で十分に作用しないことから、このプロセスはしばしば所望の程度まで機能しない。組み換えタンパク質（例えば、組み換え免疫グロブリン）の分泌に有用であり得る特定のシグナル配列が同定されているが、原核生物宿主細胞内で組み換え免疫グロブリン等のタンパク質の効率的な分泌を促進することができる付加的なシグナル配列に対する必要性がいまだ存在する。本発明は、このような要求や他の要求を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
一態様では、本発明は、Ｆａｂフラグメントを発現するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）真核生物のシグナル配列にそれぞれが作動可能に結合した抗体重鎖および抗体軽鎖をコードするジシストロニック（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）な転写ユニットに作動可能に結合したラムノースプロモーターを含むベクターを有する細菌細胞の培養物を提供する工程；（ｉｉ）培養物にラムノースを添加してラムノースプロモーターを誘導することで、抗体重鎖および抗体軽鎖ならびにそれらに結合したシグナル配列を発現させ、ペリプラズムに分泌させ、シグナルペチド配列が抗体重鎖および抗体軽鎖からプロセスされ、抗体重鎖と抗体軽鎖とが結合して標的分子に特異的に結合するＦａｂフラグメントを形成する工程；ならびに（ｉｉｉ）前記細菌細胞の培養物から前記Ｆａｂフラグメントを回収する工程、を含む。それらの方法では、真核生物シグナル配列の各々がＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）またはＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）の配列を有するシグナルペプチドをコードする。
【０００８】
上記方法のいくつかでは、重鎖に作動可能に結合したシグナル配列は、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）をコードし、軽鎖に作動可能に結合したシグナル配列がＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）をコードする。いくつかの方法では、重鎖に作動可能に結合したシグナル配列は、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）をコードし、軽鎖に作動可能に結合したシグナル配列は、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）をコードする。さらにいくつかの他の方法では、重鎖に作動可能に結合したシグナル配列と、軽鎖に作動可能に結合したシグナル配列とが共にＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）をコードするか、もしくは共にＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）をコードする。
【０００９】
上記方法のいくつかでは、Ｆａｂフラグメントを発現するための宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｈａＢ＋細胞である。いくつかの他の方法では、上記宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｈａＢ−細胞である。いくつかの方法では、培養物中の培養液からＦａｂフラグメントを回収する。いくつかの方法は、回収工程に先立って、細胞を溶解してＦａｂフラグメントを放出させる工程をさらに含む。
【００１０】
一態様では、本発明は、ファージからＦａｂフラグメントを提示する改善された方法を提供する。この方法は、重鎖および軽鎖をコードするファージ提示ベクターを細菌細胞内で発現させることを含む。軽鎖は第１のシグナルペプチド配列に作動可能に結合しており、そして重鎖はファージ外表面タンパク質および第２のシグナルペプチド配列に作動可能に結合している。この方法では、抗体鎖が発現されて細胞のペリプラズムに分泌され、さらにプロセッシングされることで、シグナルペプチド配列から抗体鎖が分離される。次いで、Ｆａｂフラグメントがファージ粒子の外表面から掲示される場合、上記抗体鎖とが結合する。上記方法の改良点は、第１のシグナルペプチド配列および第２のシグナルペプチド配列の各々が、配列ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）またはＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）を有する真核生物のシグナルペプチドをコードすることにある。第１および第２のシグナルペプチド配列を異なるものとすることができる。例えば、一方を配列番号１の配列を有するものとし、他方を配列番号２の配列を有するものとする。あるいは、両方のシグナルペプチド配列を同じものとすることができる。例えば、両方とも配列番号１の配列を有するもの、または配列番号２の配列を有するものとする。
【００１１】
別の態様では、本発明は真核生物シグナルペプチド配列と作動可能に結合している抗体鎖を含む融合タンパク質を提供する。真核生物シグナルペプチドは、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）またはＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）であり得る。
【００１２】
別の態様では、本発明は細菌細胞内でポリペプチドを発現させるための発現ベクターを提供する。ベクターは、細菌プロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドに作動可能に結合した真核生物シグナル配列を有する。この真核生物シグナルペプチドは、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）またはＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）であり得る。いくつかのベクターでは、細菌プロモーターは、誘導可能なラムノースプロモーターである。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、細菌細胞内でポリペプチドを発現させるための方法を提供する。この方法は、（ｉ）ラムノースプロモーター、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドに作動可能に結合した真核生物シグナル配列を含むベクターを含む細菌細胞の培養物を提供する工程；および（ｉｉ）ラムノースを培養物に添加してラムノースプロモーターを誘導することで、ポリヌクレオチドとシグナル配列とを発現させてペリプラズムを分泌させ、そして発現されたシグナルペプチド配列が、ポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドからプロセッシングされる工程；および（ｉｉｉ）細菌細胞の培養物からポリペプチドを回収する工程を含む。この方法では、真核生物シグナル配列は、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）またはＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）の配列を持つシグナルペプチドをコードする。
【００１４】
一態様では、本発明は、宿主細胞内でポリペプチドを発現させる方法を提供する。この方法は、（ｉ）宿主細胞の培養物を提供する工程であって、該宿主細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、そしてこのポリヌクレオチドが、真核生物シグナル配列に作動可能に結合する工程；（ｉｉ）ポリヌクレオチド配列およびシグナル配列を発現させることで、ポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドおよび発現されたシグナルペプチド配列が分泌し、発現されたシグナルペプチド配列が、ポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドからプロセッシングされる工程；ならびに（ｉｉｉ）宿主細胞の培養物からポリペプチドを回収する工程、を含む。この方法では、真核生物シグナル配列は、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）の配列を有するシグナルペプチドをコードする。
【００１５】
別の態様では、本発明は複製可能な遺伝子パッケージからポリペプチドを提示させる方法を提供する。この方法は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチド提示ベクターを原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞で発現させる工程を含むもので、上記ポリヌクレオチドは、真核生物シグナル配列に作動可能に結合し、それによってポリヌクレオチド配列およびシグナル配列が発現および分泌され、さらに発現されたシグナルペプチド配列が、発現されたポリペプチドからプロセッシングされて、複製可能な遺伝子パッケージの外表面から掲示されるようにする。この方法では、真核生物シグナル配列は、  ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）の配列を持つシグナルペプチドをコードする。
【００１６】
別の態様では、本発明はポリペプチド提示ライブラリーを調製する方法を提供する。この方法は、外来性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを複製可能な遺伝子パッケージのゲノム内に導入して、複製可能な遺伝子パッケージの外表面から通常発現される内在性タンパク質との融合タンパク質を形成し、それによって上記ポリヌクレオチドが真核生物シグナル配列に操作可能に結合して上記融合タンパク質を発現し、該融合タンパク質が上記外表面に送られてアセンブリングされることで、複製可能な遺伝子パッケージの外表面から上記外来性ポリペプチドを提示する。このような方法では、真核生物シグナル配列は、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）の配列を持つシグナルペプチドをコードする。
【００１７】
別の態様では、本発明はポリペプチドを発現させるための細胞を提供する。宿主細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに作動可能に結合した真核生物シグナル配列とを含むベクターを含む。このような宿主細胞では、真核生物シグナル配列は、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）の配列を持つシグナルペプチド配列をコードする。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は宿主細胞内でポリペプチドを発現させるためのベクターを提供する。このベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチドに作動可能に結合したプロモーターと、このポリヌクレオチドに作動可能に結合した真核生物シグナル配列とを含む。真核生物シグナル配列は、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）の配列を持つ真核生物シグナルペプチドをコードする。
【００１９】
本発明にもとづく方法、宿主細胞、またはベクターで有用なポリペプチドは、原核生物細胞または真核細胞のポリペプチドであり得、該ポリペプチドとして抗体が挙げられる。抗体は、完全抗体またはその結合フラグメントであり得、例えばＦａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、または単鎖フラグメントが挙げられる。
【００２０】
宿主細胞は、原核生物、酵母、昆虫、またはほ乳動物の組織宿主細胞であり得る。本発明にもとづく方法、宿主細胞、またはベクターで有用なプロモーターは、誘導可能なプロモーターであり得る。好ましい宿主細胞は、原核生物細胞、特にプロモーターが細菌プロモーターである細菌細胞である。
【００２１】
一態様では、本発明は、細菌細胞内のポリペプチド（抗体ポリペプチド等）発現のための真核生物シグナル配列を選択する方法を提供する。この方法では、（ａ）ラムノースプロモーターに作動可能に結合し、かつシグナルペプチドをコードする真核生物シグナル配列に対して作動可能に結合する、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細菌細胞を培養する工程；（ｂ）ポリヌクオチドおよびシグナル配列を発現させる工程；（ｃ）ポリペプチドの発現と細菌細胞によるポリペプチドからのシグナル配列のプロセッシングとについて試験する工程；ならびに（ｄ）（ｉ）ポリペプチド発現が検出可能である場合、および（ｉｉ）シグナル配列がポリペプチドからプロセッシングされる場合に、真核生物シグナル配列を選択する工程、を含む。真核生物シグナル配列は、それらの方法にもとづいて選択され、ポリペプチドの効率的な発現および産生に有用である。
【００２２】
別の態様では、本発明は、細菌細胞内のポリペプチド（抗体ポリペプチド等）発現のための真核生物シグナル配列を選択するさらなる方法を提供する。さらなる方法は、（ａ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからポリペプチドを発現する工程であって、このポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする第１の真核生物シグナル配列に作動可能に結合する工程；（ｂ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから、ポリペプチドを発現させる工程であって、このポリヌクレオチドは、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）、ＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）、またはＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ（配列番号３）である第２の真核生物シグナル配列に作動可能に結合する工程；（ｃ）（ｉ）工程（ａ）のポリペプチド発現が工程（ｂ）のポリペプチド発現と実質的に同等またはそれよりも大きい場合、および／または（ｉｉ）工程（ａ）の第１の真核生物シグナル配列が、工程（ｂ）の第２の真核生物シグナル配列と実質的に同等またはそれよりも大きいポリペプチドからプロセッシングされる場合、第１の真核生物シグナル配列である真核生物シグナル配列を選択する工程、を含む。上記ポリヌクレオチドは、任意に、作動可能にラムノースプロモーターに結合する。真核生物シグナル配列は、そのようなさらなる方法にもとづいて選択され、ポリペプチドの効率的な発現および産生に有用である。
【００２３】
本発明の本質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分、図面、および特許請求の範囲を参照することによって達成することが可能である。
【００２４】
本明細書で引用されたすべての刊行物、ＧｅｎＢａｎｋ寄託配列、ＡＴＣＣ寄託物、特許、および特許出願は、それらの全体かつすべての目的のために明らかに援用される。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．概観）
１つの種に由来するシグナル配列が他の種で機能的および／効率的であるかどうかは、一般に予測不可能である。このことは、特に原核生物と真核生物との間のシグナル配列の機能的置換に関して当てはまる（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、前出）。そのような予測不可能なこともまた、本発明者によって示されている。試験した合計１９種類の真核生物シグナルペプチドのうち、たったの３種類のみが適切にプロセッシングされ原核生物発現系に作動可能に結合したポリペプチド配列の効率的な発現および分泌を導いた（実施例２〜３）。
【００２６】
発見にもとづいて、本発明は、選択された真核生物シグナル配列を利用し、タンパク質またはポリペプチドの発現に対して、特に原核生物宿主細胞内で、普遍的な適応性を持つ方法およびベクターを提供する。いくつかの方法は、特に抗体またはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）の発現および単離に向けられている。また、上記方法は他の非抗体ポリペプチドの発現、特に原核生物発現系での発現にも好適である。
【００２７】
実施例６、７、および１３に示すように、本発明者によって選択された特定の真核生物シグナルペプチド配列（例えば、配列番号１または２）を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主系から多くのタンパク質およびポリペプチドを効率的に発現、検出、および／または精製した。これらは、抗体および非抗体のポリペプチドの両方を含む。
【００２８】
本発明は、ポリペプチド掲示ライブラリーを生産およびスクリーニングする改善された方法を提供する。この改善は、原核生物系での効率的発現および分泌を可能とする選択された真核生物シグナル配列を掲示ベクターに与える。ポリペプチド掲示ライブラリーをスクリーニングおよび富化した後、同定された目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターにサブクローニングすることが、著しく促進された。作動可能に結合した真核生物シグナル配列は、原核生物系での目的のポリペプチドの発現および効率的な分泌を可能とする。改善された方法の有効性を実施例８〜１０に示す。
【００２９】
以下のセクションで、本発明の組成物の作製および使用についての説明、また本発明の方法の実施についての説明をおこなう。
【００３０】
（ＩＩ．定義）
特に明記しない限り、本明細書で使われる技術用語および科学用語のすべてが本発明の技術分野で当業者により通常理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載したものと類似または同等の方法および材料のいずれも、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が記載される。以下の定義は、本発明を実施する上で読者の手助けとなるものである。
【００３１】
基本的な抗体構築物ユニットは、テトラマーを含むことが公知である。各々のテトラマーは、同一の２対のポリペプチド鎖から構成され、各々の対が１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各々の鎖のアミノ末端部分は約１００ないし１１０以上のアミノ酸の可変領域を有し、該可変領域は主に抗原認識の役割を担う。各々の鎖のカルボキシル末端部分は、主にエフェクター機能の役割を担う定常領域を規定する。
【００３２】
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはエプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および可変領域が約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はまた、約１０アミノ酸以上の「Ｄ」領域を含む。
【００３３】
各々の軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。これらの鎖はすべて、３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる）によって連結される相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示す。各対の２本の鎖由来のＣＤＲをフレームワーク領域によって並べることで、特定のエピトープへの結合を可能とする。Ｋａｂａｔら（上掲）の標準的配列定義にもとづいて、ＣＤＲおよびＦＲ残基を描写する。それに代わる構造定義は、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６，  ９０１−９１７  （１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ    ３４２，  ８７８−８８３  （１９８９）、および  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８６，  ６５１−６６３  （１９８９）に提案されている。抗体という用語は、全抗体およびそれらのフラグメントを意味するものとして用いられる。結合フラグメントとして、単鎖フラグメント、Ｆｖフラグメント、およびＦａｂフラグメントが挙げられる。Ｆａｂフラグメントという用語は、当該技術分野で、インタクトな抗体をパパイン処理で切断することで生じる結合フラグメントの意味でしばしば用いられる。Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２という用語は、当該技術分野ではしばしば、ペプシンによる切断によって生ずるインタクトな抗体の結合フラグメントをいう。ここで、Ｆａｂは、抗原特異的結合にとって十分な、少なくとも実質的に完全な軽鎖および重鎖の可変ドメインと、軽鎖と重鎖との結合を保つのに十分な軽鎖および重鎖の定常領域の一部とを有するインタクトな抗体の二重鎖結合フラグメントを一般にいうように使用される。ＩｇＧ１サブクラスのＦａｂフラグメントは、インタクトな免疫グロブリンの２本の重鎖間の２つのジスフィルドを形成する２つのシステイン残基のいずれも含まない。通常、Ｆａｂフラグメントは、可変ドメインと定常領域の少なくともＣＨ１ドメインとを含む重鎖に、全長または実質的に全長の軽鎖を組み合わせることで、形成される。さらに、軽鎖上のＣ末端システインをセリンまたは他のアミノ酸と置換することによって、重鎖と軽鎖とのあいだの鎖間ジスルフィド結合を取り除くことができる。
【００３４】
キメラ抗体は、一般に遺伝子工学的によって、例えば、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、可変領域をコードするセグメントと定常領域をコードするセグメント）から軽鎖および重鎖の遺伝子が構築された抗体である。一例として、マウスのモノクローナル抗体由来の遺伝子可変（Ｖ）セグメントを、ヒトの定常（Ｃ）セグメント、例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ４と連結することができる。したがって、典型的なキメラ抗体は、マウス抗体由来のＶドメインまたは抗原結合ドメインとヒト抗体由来のＣドメインまたはエフェクタードメインとからなるハイブリッドタンパク質である。キメラ抗体は、抗体の可変領域を与えるマウス抗体または他の非ヒト抗体として同一または類似の結合特異性および親和性を有する。
【００３５】
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来（もし存在するならば）の可変領域および定常領域を有する抗体を包含する。本発明のヒト抗体として、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発により誘導された突然変異、またはインビボでの体細胞突然変異）を挙げることができる。しかし、用語「ヒト抗体」は、他のほ乳類動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系由来のＣＤＲ配列をヒトのフレームワーク配列に移植した抗体（すなわち、ヒト化抗体）は包含しない。
【００３６】
エピトープという用語は、抗体に対して特異的に結合し得る抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖鎖のような分子の化学的に活性な表面群からなり、そして通常、特定の３次元構造的特徴ならびに特定の電荷特徴を有する。立体配座エピトープまたは非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は喪失するが、後者に対する結合は喪失しないという点で区別される。
【００３７】
「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド構築物であり、宿主細胞で特定のポリヌクレオチドの転写を可能とする一連の特定ポリヌクレオチドエレメントにより組み換え的または合成的に生成される。通常、発現ベクターはプロモーターに作動可能に結合した転写されるべきポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
単離種または種母集団は、支配的に存在する種（すなわち、モル基準で、組成物中、他の種よりも多く存在する）である目的種（例えば、本発明の結合ポリペプチド）を意味する。好ましくは、存在する高分子種全体のうち単離種は少なくとも約５０、８０、または９０％（モル基準で）を占める。最も好ましくは、目的種を精製して本質的に均質なものにする（従来の検出法では組成物中のコンタミ種の検出は不可能であった）。標的は、該標的に対する特異的結合親和性を持つパートナーを分離するのに必要な任意の分子である。
【００３９】
用語「作動可能に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、２つ以上のポリペプチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的相互関係に言及したものである。通常、その用語は、転写された配列に対する転写調節配列の機能的関係に言及したものである。例えば、本発明のプロモーター／エンハンサー配列は、シス（ｃｉｓ）作用性転写制御因子の任意の組み合わせを含むもので、適当な宿主細胞または他の発現系でコード配列の転写を刺激または修飾する場合、該コード配列に作動可能に結合する。一般に、転写配列に対して作動可能に結合しているプロモーター転写調節配列は、該転写配列に対して物理的に連続している（すなわち、それらはｃｉｓ作用性である）。しかし、いくつかの転写調節配列（例えば、エンハンサー）は、該配列によって転写が増強されるコード配列に対して物理的に連続または近接している必要はない。ポリリンカーは、遺伝子が作動可能にプロモーターに結合するように、コード配列の挿入に都合のよい位置を提供する。ポリリンカーは、一連の３つ以上の近接した制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むポリヌクレオチド配列である。
【００４０】
シグナル配列とは、細胞によって非細胞質の位置に通常エクスポート（例えば、分泌）されるか、もしくは膜成分となる通常はエクスポートされる特定のタンパク質のＮＨ２末端に存在する短いアミノ酸配列（すなわち、シグナルペプチド）をコードするポリヌクレオチド配列のことをいう。シグナルペプチドは、細胞質から非細胞質の位置へのタンパク質輸送を指示する。
【００４１】
抗体または他の結合因子と抗原とのあいだの特異的結合は、結合親和性が少なくとも１０６Ｍ−１であることを意味する。好ましい結合因子は、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは１０８Ｍ−１ないし１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１の親和性で結合する。
【００４２】
目的の標的として抗体が含まれ、この抗体の例としては、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、多発性硬化症、およびリウマチ様関節炎）に存在する抗イデオタイプ抗体および自己抗体が挙げられる。目的の他の標的は、成長因子受容体（例えば、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＦＧ、ＮＧＦＲ、およびＶＥＧＦ）およびそれらのリガンドである。他の標的は、Ｇタンパク質受容体であり、サブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、αおよびβアドレナリン作用性受容体、セレトニン受容体、およびＰＡＦ受容体が挙げられる。例えば、Ｇｉｌｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６，６２５−６４９（１９８７）を参照せよ。他の標的としては、イオンチャンネル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウムチャンネル）、ムスカリン性受容体、アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、およびドーパミン受容体が挙げられる（Ｈａｒｐｏｌｄ、米国特許第５，４０１，６２９号および第５，４３６，１２８号を参照のこと）。他の標的は、インテグリン、セレクチン、および免疫グロブリンスーパーファミリー構成要素等の接着タンパク質である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４６，  ４２５−４３３  （１９９０）．  Ｏｓｂｏｒｎ，  Ｃｅｌｌ  ６２，  ３  （１９９０）；  Ｈｙｎｅｓ，  Ｃｅｌｌ  ６９，  １１  （１９９２））。他の標的は、サイトカイン、例えばインターロイキンＩＬ１〜ＩＬ−１３、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ならびに顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である（Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （Ａｇｇｒａｗａｌ  ら、編著、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ  １９９１）を参照せよ）。他の標的は、ホルモン、酵素、ならびに細胞内および細胞間メッセンジャー（例えば、アデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、およびホスホリパーゼＣ）である。薬物も目的の標的である。標的分子は、ヒト、哺乳動物、または細菌であり得る。他の標的分子は、ヒト、哺乳動物、または細菌のものとすることができる。他の標的は、抗原であり、該抗原の例として、微生物病原体（ウイルス性および細菌性の両方）ならびに腫瘍由来のタンパク質、糖タンパク質、および炭水化物が挙げられる。さらに別の標的は、米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている。
【００４３】
完全長ポリペプチドコード配列を有する掲示ライブラリー構成要素は、ベクター増殖前に提示ベクターにもともと挿入されているコード配列と等しい長さのコード配列を有する。
【００４４】
（ＩＩＩ．ポリペプチドを発現させるための真核生物シグナル配列）
本発明は、宿主細胞、特に原核宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））で目的のタンパク質またはポリペプチドを真核生物シグナル配列を用いて発現させるための方法およびベクターを提供する。好ましくは、真核生物シグナル配列は、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）またはＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）の配列を有するシグナルペプチドをコードする。配列番号１はヒトセルロプラスミンシグナル配列（受託番号ＣＥＲＵ＿ＨＵＭＡＮ）に対応し、配列番号２はヒト好中球ディフェンシン１，２，３前駆体シグナル配列（受託番号ＤＥＦＮ＿ＨＵＭＡＮ）に対応する。本発明に用いられ得る別の好ましい真核生物シグナルペプチド配列は、ＭＧＡＬＡＶＦＡＶＡＣＬＡＡＶＡＳＶＡＨＡ  （配列番号３）である。それはクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）アリールスルファターゼ前駆体のシグナルペプチドである（受託番号ＡＲＳ＿ＣＨＬＲＥ）。目的のタンパク質が免疫グロブリンまたはＦａｂフラグメントである場合、Ｉｇ重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドは各々が真核生物シグナル配列に対して作動可能に結合している。そのようなベクターによって宿主細胞およびアセンブリから機能性免疫グロブリン分子またはＦａｂフラグメントへの発現および分泌が可能となる。
【００４５】
（Ａ．目的のポリペプチド）
目的の様々なポリペプチドを本発明の発現ベクターによって発現させることができる。いつくかの方法では、目的のポリペプチドが抗体またはそのフラグメントである。発現されるポリペプチドは、マウス抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、目的のポリペプチドはＦａｂフラグメントである。発現される抗体は、重鎖配列および軽鎖配列がすでに知られている特定の抗体であり得る。別の用途では、抗体は目的の特定の標的についての親和性に対するポリペプチド掲示ライブラリースクリーニングを介して同定される（例えば、実施例４〜７を参照せよ）。セクションＩＶで、より詳細に開示されるように、セクションＩＶでは、スクリーニングと濃縮化の後、抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列が提示ベクターから発現ベクターに移される。原核細胞系で機能的抗体の発現に真核生物シグナル配列を用いることの有効性は、実施例６〜７に例示されている。
【００４６】
抗体以外に、種々の非抗体ポリペプチドも本明細書に開示したベクターおよび方法を用いて発現することができる。例示的な実施形態を実施例１２および１３に示す。真核細胞のタンパク質もしくは原核細胞のタンパク質または真核細胞のポリペプチドもしくは原核細胞のポリペプチドを本発明の方法にもとづいて発現することができる。好ましくは、発現させる目的の非抗体ポリペプチドは、ネイティブなシグナルペプチドを有する非抗体ポリペプチドである。本発明の方法を用いて、例えば、シグナル配列を持つことが知られている多くの真核細胞タンパク質（例えば、米国特許第５，９３２，４４５号を参照のこと）を、原核宿主細胞で発現させることができる。これらのタンパク質としては、受容体（核内受容体、膜貫通型受容体、Ｇタンパク質結合受容体、およびチロシンキナーゼ受容体）、サイトカイン（ケモカイン）、ホルモン（増殖因子および分化因子）、神経ペプチドおよび血管媒介物質、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヌクレオチドシクラーゼ、マトリックス分子（接着、カドヘリン、細胞外基質分子、インテグリン、およびセレクチン）、Ｇタンパク質、イオンチャンネル（カルシウム、塩化物、カリウム、およびナトリウム）、プロテアーゼ、トランスポーター／ポンプ（アミノ酸、タンパク質、糖、金属、およびビタミン；カルシウム、リン酸塩、カリウム、およびナトリウム）、ならびに調節タンパク質が挙げられる。
【００４７】
（Ｂ．真核生物シグナル配列を含む発現ベクター）
本発明は、少なくとも１つの転写ユニットを含む発現ベクターを提供する。この転写ユニットは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に結合した真核生物シグナル配列を含む。ベクターのいくつかも転写ユニットに作動可能に結合した細菌プロモーターを含む。いくつかのベクターにおいて、細菌プロモーターはラムノース誘導プロモーターである。さらに、発現ベクターは、宿主細胞内のポリペプチドを適当に転写およびそれに続く翻訳にとって必要な、または好ましい他の要素（例えば宿主細胞によって認識される複製起点）、終止コドン、および任意の他のポリヌクレオチド配列も含み得る。ベクターもまた、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。
【００４８】
いくつかのベクター内に、目的のポリペプチドの複数のコピーをコードするポリヌクレオチドが存在する。目的のポリペプチドのコピー数は、２から約１００までの範囲に及び得る。好ましいコピーの数は、約２〜約１０である。好ましい実施形態では、シグナル配列ペプチドは、目的のポリペプチドの多数のコピーに対するアミノ末端であり、これら多数のコピーは連続的かつ一体となったかたちで配置される。いくつかのベクターでは、いくつかの目的の異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが存在し得る。目的の異なるポリペプチドの数は、２から約１０までの範囲である。好ましくは、シグナル配列ペプチド（例えば、配列番号１〜３）によって処理され、目的の各々のポリペプチドは、目的のポリペプチドが可変な状態で配置されるように、これらのポリペプチドが連続的かつ一体的なかたちで配置される。上記ポリシストロニックベクターでは、目的の多数のポリペプチド（等しい配列または異なる配列のいずれか）の各々が内在リボソーム挿入部位（ＩＲＥＳ）の制御下にあり得る（Ｍｏｌｌａ  Ａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：  ２５５−２５７  （１９９２）；  Ｊａｎｇ  Ｓ．  Ｋ．ら、  Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．  ２６３：  １６５１−１６６０  （１９８９））。例えば、本発明のいくつかの発現ベクターでは、目的の異なるポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖または免疫グロブリンのＦａｂフラグメントであり得る。したがって、いくつかのベクターは、ジシストロニック転写ユニットに作動可能に結合した細菌プロモーターを含み、該ジシストロニック転写ユニットは、真核生物シグナル配列に各々が作動可能に結合している抗体重鎖および抗体軽鎖をコードする。
【００４９】
多くの真核生物シグナル配列を本発明の発現ベクターで用いることができる。表３および４は、本発明の発現およびファージ提示ベクターで使用することができる例示的なシグナル配列を示す。ジストロニック転写ユニットが免疫グロブリンを発現するために用いられる場合、表４に例示したように、ベクター内で重鎖および軽鎖に結合したシグナル配列を、同一または異なるものとすることができる。好ましい実施形態では、用いた真核生物シグナル配列によってコードしたシグナルペプチドは、ＭＫＩＬＩＬＧＩＦＬＦＬＣＳＴＰＡＷＡ（配列番号１）またはＭＲＴＬＡＩＬＡＡＩＬＬＶＡＬＱＡＱＡ（配列番号２）である。いくつかの好ましい実施形態では、軽鎖は配列番号１に示すペプチド配列をコードするシグナル配列（例えば、配列番号４３）に作動可能に結合しており、そして重鎖は配列番号２に示すペプチド配列をコードするシグナル配列（例えば、配列番号４５）に作動可能に結合している。いくつかの他の好ましい実施形態では、軽鎖および重鎖の両方がシグナル配列（例えば、配列番号４３および４４）に作動可能に結合しており、該シグナル配列は配列番号１に示す同一のペプチド配列をコードする。
【００５０】
本発明の発現ベクターで用いられる真核生物シグナル配列を商業的に得ることができ、あるいは化学的に合成することもできる。例えば、表３および４に示すシグナル配列は、自動合成装置（例えば、Ｖａｎ  Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：６１５９−６１６８  （１９８４）に記載）を用いて固相ホスホラミダイトトリエステル法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ    Ｌｅｔｔｓ．  ２２：１８５９−１８６２  （１９８１）に記載）にもとづいて合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｒｅａｎｉｅｒ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  ２５５：１３７−１４９  （１９８３）に記載されているように、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動によって、または陰イオン交換ＨＰＬＣによって実施することができる。
【００５１】
ラムノース誘導プロモーターの特性が文献で特徴付けられている（例えば、Ｅｇａｎ  およびＳｃｈｌｅｉｆ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３４：８７−９８，  １９９３を参照のこと）。ラムノース誘導プロモーターを含むベクターは、分子生物学で日常的に実施される技術を用いて容易に構築することができる（一般的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （第３版），  第１〜３巻，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  （２００１）  （「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ    Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｓｕｂｅｌ編  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））を参照のこと）。
【００５２】
本発明では、シグナル配列と目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとが発現ベクター内に配置される順番を変えることができる。好ましい実施形態では、シグナル配列は、５’から目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。前記シグナルペプチド配列と目的のポリペプチドとが、０ないし約１，０００アミノ酸によって分離することができる。好ましい実施形態では、シグナルペプチド配列と目的のポリペプチドとが互いに直接隣接し合っている（すなわち、０個のアミノ酸によって隔てられている）。
【００５３】
（Ｃ．原核宿主細胞での発現および分泌）
本発明の発現ベクターにとって好ましい宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））である。発現ベクターからの目的のポリペプチドの発現は、当該技術分野で日常的に実施されている方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲、およびＡｕｓｕｂｅｌ、上掲）を用いて、原核宿主細胞内で実行することができる。原核宿主細胞系において、作動可能に結合した真核生物シグナル配列によって、目的のポリヌクレオチドを発現させる方法もまた、セクションＶで詳細に説明する。ラムノース誘導プロモーターを用いた場合、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｈａＢ＋株または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｈａＢ−株のいずれかであり得る。これらの宿主細胞でのラムノースによる発現の誘導は、以下の実施例に記載したようにして実施することができる。ラムノース誘導プロモーターからのポリペプチドの発現もまた、当該技術分野では記載されている（例えば、ＥｇａｎおよびＳｃｈｌｅｉｆ，  上掲；Ｈａｌｄｉｍａｎｎら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：４１２１−３０，  １９９８；ならびにＷｉｌｍｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．  ７３：９５−１０３，２００１）。
【００５４】
宿主細胞での発現およびペリプラズムへの分泌に続いて、目的のタンパク質またはポリペプチドを宿主細胞の培養物から回収し得る。目的のポリペプチドが免疫グロブリン鎖である場合、重鎖および軽鎖はそれぞれ宿主細胞で発現され、細胞のペリプラズムに分泌される。発現ベクターの真核生物シグナル配列によってコードされたシグナルペプチドがさらに免疫グロブリン鎖からプロセッシングされる。次に、成熟重鎖および軽鎖が組み合わさってインタクトな免疫グロブリンまたはＦａｂフラグメントを形成する。単一鎖抗体フラグメントを、１つの真核生物シグナル配列のみを用いて発現させることができる。
【００５５】
いくつかの方法では、タンパク質またはポリペプチドが、宿主細胞の粗ライセートとして最初に得られる。つぎに、当該技術分野で知られている標準的なタンパク質精製法を用いて、粗ライセートを精製する。そのようなタンパク質精製方法としては、微分沈降法、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電集束法、ゲル電気泳動、親和性、および免疫親和性クロマトグラフィーが挙げられ得る。これらの周知で、かつ日常的に実施されている方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲；Ａｕｓｅｂｅｌ，上掲、およびＷｕら（編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されている。例えば、免疫親和性クロマトグラフィーにより精製され、発現された免疫グロブリンが特異的に結合し得る標的分子に結合した樹脂を含むカラムに流すことで、組み換えにもとづいて産生された免疫グロブリンまたはＦａｂフラグメントの精製をおこなう。
【００５６】
（ＩＶ．  提示ライブラリーの真核生物シグナル配列）
本発明は、ポリペプチド提示ライブラリーの産生およびスクリーニングの改善された方法を提供する。該方法で用いられる提示ベクターは、宿主系（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核宿主細胞）での効率的な分泌を可能とする真核生物シグナル配列（例えば、表３および４に示す配列）を含む。続いて、掲示ライブラリーをスクリーニングすることによって同定される目的のポリペプチドは、発現ベクターにクローニングされ得る（例えば、原核生物発現ベクター）また、同定されたポリペプチドを産生する宿主系に、発現ベクターを導入し得る。抗体掲示ライブラリーのスクリーニングの際、重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドをファージ提示ベクターから発現ベクターにサブクローニングする。発現ベクターを宿主に導入して発現させ、シグナルペプチドを含む軽鎖および重鎖を産生させる。次に、重鎖および軽鎖によって成熟抗体が形成されて宿主から放出される。
【００５７】
抗体ライブラリーの構築およびスクリーニング法は、米国特許第６，０５７，０９８号（本明細書で参考として援用される）に記載されている。後述の実施例８〜１０に、真核生物シグナル配列を含む掲示ベクターによるファージライブラリーの産生およびスクリーニングのための方法を例示する。提示およびスクリーニングされる抗体は、マウス抗体またはヒト抗体であり得る。これらの抗体をキメラ抗体とすることもできる。特定の目的で用いられるポリペプチドは、Ｆａｂフラグメントである。以下のセクションでは、本発明の多価ポリペプチド提示ライブラリーの産生およびスクリーニングについて詳細に説明する。
【００５８】
（Ａ．複製可能な遺伝子パッケージ）
複製可能な遺伝子パッケージとは、細胞、胞子、またはウイルスを意味する。複製可能な遺伝子パッケージは、真核細胞または原核細胞のものであり得る。掲示ライブラリーの作製は、掲示される外来性ポリペプチドをコードする核酸を複製可能な遺伝子パッケージのゲノムに導入して、内在性タンパク質との融合タンパク質を作ることによっておこなわれる。この融合タンパク質は、複製可能な遺伝子パッケージの外面から通常発現される。融合タンパク質の発現、外表面およびアセンブリへの移動は、遺伝子パッケージの外表面由来の外来性ポリペプチドの掲示に帰する。
【００５９】
掲示ライブラリーに最も頻繁に使用される遺伝子パッケージは、バクテリオファージ、特に線状ファージであり、とりわけファージＭ１３、Ｆｄ、およびＦ１である。ほとんどの研究が、融合タンパク質を形成するそれらのファージのｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩのいずれかに、掲示されるポリペプチドをコードするライブラリーを挿入することであった。例えば、Ｄｏｗｅｒ，  ＷＯ  ９１／１９８１８；  Ｄｅｖｌｉｎ，  ＷＯ  ９１／１８９８９；  ＭａｃＣａｆｆｅｒｔｙ，    ＷＯ  ９２／０１０４７  （遺伝子ＩＩＩ）；  Ｈｕｓｅ，  ＷＯ  ９２／０６２０４；  Ｋａｎｇ，  およびＷＯ  ９２／１８６１９  （遺伝子ＶＩＩＩ）を参照のこと。そのような融合タンパク質は、ファージ外殻タンパク質以外の分泌タンパク質から通常由来するシグナル配列、提示されるポリペプチド、および遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質もしくはそのフラグメントのいずれかを含む。外来性のコード配列は、他のインサート部位でも可能であるが、しばしば遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのＮ末端またはその近傍に挿入される。遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかの第２のコピーを産生させるために、いくつかの線状ファージベクターが設計されている。そのようなベクターでは、２つのコピーのうち、１つのコピーのみに外来性配列が挿入される。他のコピーの発現は、ファージ粒子に取り込まれた融合タンパク質の割合を効果的に下げ、ファージ増殖に有害なポリペプチドに対する選択の減少に有利となり得る。別の例として、外来性ポリペプチド配列は、ファージ外殻タンパク質およびファージパッケージング配列をコードするが複製することができないファージミドベクターにクローニングする。ファージミドを細胞にトランスフェクションさせて、ヘルパーファージの感染によってパッケージングする。ファージミド系を用いることは、外殻タンパク質と提示されたポリペプチドとから形成された融合タンパク質をヘルパーファージから発現した外殻タンパク質の野生型コピーによる希釈の効果もある。例えば、Ｇａｒｒａｒｄ，  ＷＯ  ９２／０９６９０を参照のこと。
【００６０】
真核生物ウイルスを使用して、類似方法でポリペプチドを提示することができる。例えば、マローニーマウス白血病ウイルスのｇｐ７０に融合されるヒトヘレグリンの提示がＨａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９２，  ９７４７−９７５１  （１９９５）によって報告されている。胞子もまた、複製可能な遺伝子パッケージとして用いることができる。この場合、ポリペプチドは胞子の外表面から掲示される。例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子が好適であることが報告されている。これらの胞子の外殻タンパク質の配列は、Ｄｏｎｏｖａｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６，  １−１０  （１９８７）によって提供されている。複製可能な遺伝子パッケージとして、細胞を用いることもできる。提示されるポリペプチドは、細胞表面で発現される細胞タンパク質をコードする遺伝子に挿入される。細菌細胞の例としては、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、クレブシエラ肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、バクテロイデスノドスス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｄｏｓｕｓ）、および牛モラクセラ菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｉｓ）、特に好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．  ｃｏｌｉ）が挙げられる。外表面タンパク質の詳細は、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，５７１，６９８号および  Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５，  ２９−３４  （１９９７）  で議論されており、これらの文献を本明細書中で引用する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｍＢタンパク質が適切である。
【００６１】
（Ｂ．  抗体のライブラリー掲示）
抗体ライブラリーの多価ファージ提示を、米国特許第６，０５７，０９８号の記載にしたがって作ることができる。すなわち、出発材料は、ファージのライブラリーであり、ライブラリー構成要素は、ファージ外殻タンパク質、抗体軽鎖可変ドメインまたは抗体重鎖可変ドメイン、およびタグから構成される融合タンパク質を外表面から提示することが可能なファージを有する。少なくともいくつかの構成要素では、抗体重鎖または抗体軽鎖がパートナー抗体重鎖可変ドメインまたはパートナー軽鎖可変ドメイン鎖と複合体を形成し、スクーリングすべきＦａｂフラグメントが該錯体によって形成される。融合タンパク質および／またはパートナー抗体重鎖もしくは軽鎖は、ファージゲノムのセグメントによってコードされる。さらに、掲示ベクターは、抗体重鎖または軽鎖（例えば、表３および４に示すように）に作動可能に結合した少なくとも１つの真核生物シグナル配列を含む。Ｆａｂフラグメントの掲示が意図される場合、掲示ベクターは、重鎖配列に作動可能に結合した第１の真核生物シグナル配列および軽鎖配列に作動可能に結合した第２の真核生物シグナル配列を含む。第１および第２のシグナル配列は、同一または異なった配列であり得る。いくつかの方法では、シグナル配列は配列番号１、２、または３に示すシグナルペプチド配列をコードする。例えば、軽鎖に結合したシグナル配列は、配列番号１に示すシグナルペプチド配列をコードする配列番号４３であり得、重鎖に結合するシグナル配列は配列番号２に示す（実施例８に例示したような）シグナルペプチドをコードする配列番号４５であり得る。あるいは、両方の鎖を、配列番号１に示す同一のシグナルペプチド配列をコードするシグナル配列（例えば配列番号４３および４４）に作動可能に結合させることができる。
【００６２】
ファージあたりの提示されたパートナー抗体鎖と融合タンパク質のコピーの数は、ライブラリー構成要素間で変動する。ライブラリーまたはその一部分は、融合タンパク質のコピーを少なくとも２つ掲示するライブラリー構成要素が受容体と少なくとも２つのタグコピーとの間の多価結合により固定化受容体に優先的に結合する条件下で、タグに対して特異的親和性を持つ受容体と接触する。次に、受容体に結合したライブラリー構成要素を、結合していないライブラリー構成要素から分離し、融合タンパク質の少なくとも２つのコピーを提示する構成要素のライブラリーに比べて相対的に豊かなサブライブラリーを作る。
【００６３】
（１．一本鎖抗体ライブラリーまたは二本鎖抗体ライブラリー）
抗体ライブラリーは、一本鎖または二本鎖である。一本鎖抗体ライブラリーは、１個の抗体のみの重鎖または軽鎖、あるいはその可変ドメインを有し得る。しかし、より典型的には、一本鎖抗体ライブラリーの構成要素は、連続する単一のタンパク質内で、ペプチドスペイサーによって分離された重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインの融合から形成される。（例えば、Ｌａｄｎｅｒら、ＷＯ  ８８／０６６３０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ  ９２／０１０４７  を参照のこと）二本鎖抗体は、重鎖および軽鎖、またはその結合フラグメントの、非共有結合または共有結合によって形成される。二本鎖抗体はまた、２個の抗体結合部位を有する安定した二量体を形成する２個の一本鎖抗体から形成され得る。（Ｓｃｈｉｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５５，  ２８−４３  （１９９６）；  Ａｒｎｄｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，  １２９１８−１２９２６  （１９９８）を参照のこと）抗体ライブラリーの多様性は、免疫化Ｂ細胞または非免疫化Ｂ細胞の非クローン個体群のような、天然由来の抗体コード配列を獲得することによって起こり得る。それとは別に、またはそれに加えて、多様性は、他のタンパク質について論じられるような、人工的変異誘発によってもたらされることもある。
【００６４】
スペイサーによって必要に応じてフランクされて提示されるべきポリペプチドをコードする核酸は、標準的なＤＮＡ組み換え技術によって、上述のように、複製可能な遺伝子パッケージのゲノムの中に挿入される（概ね、本明細書に参考として援用された、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  ２０００，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００６５】
当該核酸は、最終的には、複製可能パッケージの外表面タンパク質の全部または一部に融合したポリペプチド（スペイサーまたはフレイムワーク残基とともに、またはなしで）として発現する。ライブラリーは、約１０３、１０４、１０６、１０７、１０８以上の構成要素の大きさであることが多い。
【００６６】
二本鎖抗体ディスプレイライブラリーは、例えば、Ｄｏｗｅｒ，米国特許第５，４２７，９０８号；  Ｈｕｓｅ  ＷＯ  ９２／０６２０４；Ｈｕｓｅ，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  （Ｆｒｅｅｍａｎ  １９９２），  Ｃｈ．  ５；  Ｋａｎｇ，  ＷＯ  ９２／１８６１９；Ｗｉｎｔｅｒ，  ＷＯ  ９２／２０７９１；  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，  ＷＯ  ９２／０１０４７；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＷＯ  ９３／０６２１３；Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２，  ４３３−４５５  （１９９４）；  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０，  ４１−６８  （１９９２）；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０，  １０９−１２４  （１９９２）、に記載されているように、作成することができる。好適な一実施形態において、一個の抗体鎖は、一本鎖ライブラリーの場合と同様に、ファージ外殻タンパク質に融合する。パートナー抗体鎖は、第一の抗体鎖と複合体をなすが、上記パートナーは直接ファージ外殻タンパク質には結合しない。重鎖または軽鎖のいずれかが、外殻タンパク質に融合する鎖であり得る。外殻タンパク質に融合しないのがどちらの鎖であっても、それがパートナー鎖である。このアレンジメントは、典型的には、シグナル配列、抗体鎖、およびファージ外殻タンパク質を有する融合タンパク質を形成するために、ファージ提示ベクターのｇＩＩＩまたは  ｇＶＩＩＩ  のいずれかに、一個の抗体鎖遺伝子をコードする核酸セグメントを組み込むことで達成される。パートナー抗体鎖をコードする核酸セグメントを、第一の抗体鎖をコードする核酸セグメントと同じベクターの中に挿入することができる。必要に応じて、重鎖および軽鎖は、同じプロモーターに結合し、かつ、多シストロン性メッセージ（例えば、Ｆａｂフラグメントおよび作動可能に結合されたシグナルペプチドをコードするジストロニックｍＲＮＡ）として転写された、同じ提示ベクターに挿入することができる。
【００６７】
あるいは、パートナー抗体鎖をコードする核酸は、分離ベクター（ファージベクターであってもなくてもよい）に挿入することができる。この場合、これら２個のベクターは、同じ細胞内で発現される（ＷＯ９２／２０７９１参照）。パートナー鎖をコードする配列は、このパートナー鎖がシグナル配列に連結されるように挿入されるが、ファージ外殻タンパク質には融合されない。両方の抗体鎖は発現して、細胞のペリプラズムに搬出され、そこで、集合し、ファージ粒子へと組み込まれる。
【００６８】
抗体コード配列は、ヒトまたは非ヒト動物のリンパ細胞から得られ得る。これらの細胞は免疫化されていることが多く、その場合、免疫化は、インビボでは細胞を回収する前に、またはインビトロでは細胞を回収した後、あるいはこれら両方で行われ得る。免疫化した動物の脾臓細胞は、好ましい供給材料である。ヒトの免疫化は、特定の抗体によってのみ可能である。免疫化動物由来の脾臓内にある、異なったＨ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子の数は、約１０６であり、それは、１０１２の可能な組み合わせで構築することができる。
【００６９】
再編成された免疫グロブリン遺伝子は、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡからクローニングすることができる。後者の場合、ｍＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡを逆転写酵素およびポリ−ｄＴオリゴヌクレオチドプライマーを使って調製する。抗体コード配列をクローニングするためのプライマーについては、次の文献で、述べられている：Ｌａｒｉｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，９３４（１９８９）、ＤａｎｉｅｌｓｓｏｎおよびＢｏｒｒｅｂａｃｅｉｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ（Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，１９９２），８９頁、およびＨｕｓｅ（同上）第５章。
【００７０】
抗体フラグメントのレパートリーは、増幅したＶＨ配列およびＶＬ配列を、いくつかの方法で一緒に組み合わせることにより構築されてきた。軽鎖および重鎖を、異なったベクターに挿入し、そのベクターを、インビトロで（Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｇｅｎｅ  １２８，１１９−１２６（１９９３））、またはインビボで（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１，２２６５−６６（１９９３））、組み合わせることができる。あるいは、その軽鎖および重鎖を、同じベクター内に順次クローニングするか（Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８８，７９８７−８２（１９９１））、またはＰＣＲによって一緒に組み立てて、その後、ベクターに挿入し得る（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−２８（１９９１））。重鎖のレパートリーはまた、一本の軽鎖と組み合わせられ得、その逆もある。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，３８１−８８（１９９２）。
【００７１】
重鎖および軽鎖をコードする配列の集団をクローニングするための、例示的なベクターおよび手順のいくつかを、Ｈｕｓｅが記述している（ＷＯ９２／０６２０４）。Ｈｃポリペプチドをコードする配列の多様な集団を、Ｍ１３ＩＸ３０内にクローニングし、Ｌｃポリペプチドをクローニングする配列を、Ｍ１３ＩＸ１１内にクローニングする。この集団を、Ｍ１３ＩＸ３０内のＸｈｏＩ−ＳｅｅＩまたはＳｔｕＩ制限酵素部位の間に、および、Ｍ１３ＩＸ１１内のＳａｃＩ−ＸｂａＩまたはＥｃｏＲＶ部位の間に挿入する（それぞれ、Ｈｕｓｅの図１ＡおよびＢ）。両方のベクターとも、ＨｃおよびＬｃコード配列と、それらの関連ベクター配列を一緒に結合させるために、二対のＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位（Ｈｕｓｅの図１ＡおよびＢ）を含む。この二対は、発現すべき配列を含むベクタータンパク質だけが、正確に、一個のベクター内に合わせられるように、クローニング部位に対して対称的に配向している。
【００７２】
（２．キメラまたはヒト抗体ライブラリー）
本発明の多価提示ライブラリーを作成およびスクリーニングするための改良された方法は、キメラまたはヒト抗体ライブラリーを包含する。キメラ抗体は、例えば、抗体が第一の種由来の可変領域および第二の種由来の定常領域を有するものを含む、少なくとも１のキメラ抗体鎖を有する。Ｆａｂフラグメントのようないくつかのキメラ抗体は、キメラ重鎖およびキメラ軽鎖を含む。いくつかのキメラ軽鎖は、第一の種由来の軽鎖可変領域、および第二の種由来の定常領域を含む。同様に、いくつかのキメラ重鎖は、第一の種由来の重鎖可変領域、および第二の種由来の重鎖定常領域を含む。インタクトな抗体は、２コピーのキメラ軽鎖および２コピーのキメラ重鎖を含み得る。キメラＦａｂフラグメントは、キメラ軽鎖およびキメラ重鎖を含み得る。第一の種由来の可変領域、および第二の種由来の定常領域を有するキメラ抗体について、その可変領域は、典型的には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ハゲワシ（ｖｕｌｃｈｅｒ）、サル、またはチンパンジーのような、非ヒト種から得られる。その定常領域は、典型的には、ヒトでの利用を意図したキメラについてヒト由来であるか、または獣医学的適用が意図される動物種由来である。Ｆａｂフラグメントにおいて、重鎖定常領域は通常ＣＨ１領域を含み、軽鎖定常領域はＣ−κまたはＣ−λのようなインタクトな軽鎖定常領域である。インタクトなＩｇＧ抗体において、重鎖定常領域は、典型的にＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含み、軽鎖は、インタクトなＣ−κ軽鎖またはＣ−λ軽鎖である。
【００７３】
本発明のポリクローナルキメラ抗体のライブラリーは、例えば、米国特許第６，４２０，１１３号として発行された１９９９年１０月２日に出願の米国特許出願番号０９／４１０，９０３（本明細書に参照のため引用されている）に記述されている方法にしたがって作成することができる。いくつかの方法では、ファージベクターまたは他の複製可能な遺伝子パッケージは、重鎖可変領域に作動可能に連結された第一の真核生物シグナル配列、および軽鎖可変領域に作動可能に連結された第二の真核生物シグナル配列を含む。さらに、重鎖定常領域（ＣＨ１領域）および軽鎖定常領域をそれぞれ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域とインフレームで挿入する。提示ベクターに適した真核生物シグナル配列の例を、表３および表４に示す。
【００７４】
いくつかの方法では、複製可能な遺伝子パッケージまたはファージ提示ライブラリーは、非ヒト可変領域およびヒト定常領域を含むキメラＦａｂフラグメントを発現および提示することができる。例えば、上記提示ベクターは、ヒトのＣＨ１領域を、挿入重鎖可変領域とインフレームでコードすることができ、インタクトなヒト軽鎖領域（κまたはλのような）を、挿入軽鎖可変領域とインフレームでコードすることができる。いくつかの方法では、上記発現ベクターを、Ｆａｂフラグメント内にあるキメラ重鎖のセグメントとインフレームで、ヒト重鎖定常領域（典型的には、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域）のさらなるセグメントをコードするように設計する。その結果生じる、改変ベクターの集団は、インタクトな抗体の集団を発現する。
【００７５】
本発明はまた、真核生物シグナル配列を含む、ヒト抗体のファージライブラリーの提示およびスクリーニングのための方法も提供する。上記ヒト抗体は、予想外の特徴を有するヒト抗体の集団を産生するために、元来、非ヒトトランスジェニック動物内で発現される。これらの特徴としては、異常に高い結合親和性（例えば、いくつかの例では、ｐＭ解離定数）、事実上無限数のそのような抗体、および上記集団におけるそのような抗体に対する高い富化率が挙げられる。そのような特徴を有するヒト抗体のライブラリーは、例えば、１９９９年１２月１日出願の米国特許出願番号０９／４５３，２３４（本明細書に参考として援用される）、およびＷＯ０１／２５４９２に記述されているように作成できる。略述すると、その方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）の免疫化を必要とする。その動物は、上記抗原に結合するヒト抗体の多様な範囲を発現する。そのような抗体の抗体鎖成分をコードする核酸は、その後、上記動物から提示ベクター内にクローニングされる。典型的には、重鎖および軽鎖配列をコードする分離された核酸集団がクローニングされ、その別個の集団は、その後、上記ベクターのどのコピーでも、重鎖および軽鎖の無作為的組み合わせを受けるように、ベクター内に挿入されて組み換えられる。
【００７６】
（Ｃ．多価提示メンバーについての富化）
ポリペプチドの複数のコピーを提示するライブラリーのメンバーは、提示ライブラリーにおいては比較的稀少である。そのライブラリーがスクリーニング標的と接触する前に、１つより多いポリペプチドを提示するライブラリーメンバーを富化するには、対になったタグとレセプターとを使用することができる。タグは、レセプターと結合するものなら何でもよいが、典型的には、短いペプチド配列である。レセプターは、そのタグに対して、特異的ではあるが、可逆的な結合を示し、支持体に固定化することができるものなら何でもよい。本発明に適した様々なタグ−レセプターの組み合わせが、米国特許第６，０５７，０９８号に開示されている。例えば、エピトープと抗体との対は、抗ダイノルフィン（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ）ｍＡｂ  ３２．３９に対して高い親和性を有することが知られているヘキサペプチドリガンド（Ｂａｒｒｅｔｔら、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ６，１１３−１２０（１９８５）およびＣｕｌｌら、ＰＮＡＳ  ８９，１８６５−１８６９（１９９２）を参照せよ）と、ＭＡｂ  ３Ｅ７を結合することが知られている種々の短いペプチド（Ｓｃｈａｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，１１３８−４３（１９９３））を含む。タグと抗体とのもう別の組み合わせは、ＢｌａｎａｒおよびＲｕｔｔｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，１０１４−１０１８（１９９２）が記述している。さらに別のタグ−レセプター対の例は、ＦＬＡＧＴＭシステム（Ｋｏｄａｋ）である。
【００７７】
レセプターはビオチンによって標識されることが多く、そのレセプターがアビジン被覆支持体に固定化されることを可能にする。ビオチン標識は、ビオチン化酵素ＢｉｒＡを使用して行う（例えば、Ｓｃｈａｔｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，１１３８−４３（１９９３）を参照せよ）。
【００７８】
タグをコードする核酸配列は、そのタグが、提示されるべきポリペプチドおよび複製可能な遺伝子パッケージの外表面タンパク質を含む融合タンパク質の一部として発現されるように、提示ベクター内に挿入される。これら成分の相対的な順序は、タグおよび提示されるべきポリペプチドの両方が上記パッケージの外表面上に露出される限り、重要ではない。例えば、タグは、外表面タンパク質と提示ポリペプチドの間に、または融合タンパク質の露出端もしくはその近くに、配置され得る。タグは、抗体の定常ドメインのような、全てのライブラリーメンバーに共通な提示ポリペプチドの一部であり得る。
【００７９】
Ｆａｂフラグメントを提示する複製可能な遺伝子パッケージにおいて、タグは、どちらの鎖がファージ外殻タンパク質に結合するかに関係なく、重鎖または軽鎖のＦａｂのどちらかに融合され得る。必要があれば、２個の異なったタグが使われ得、１個は、重鎖および軽鎖の各々に融合される。一つのタグは、通常、ファージ外殻タンパク質とそれに結合した抗体鎖との間に配置され、もう一つのタグは、パートナー鎖のＮ末端またはＣ末端のどちらかに配置される。
【００８０】
（Ｄ．多価メンバーの選択）
多価ライブラリーメンバーの選択は、ライブラリーメンバーのタグ成分に対するレセプターにライブラリーを接触させることにより実行する。通常、固相に固定化したレセプターにライブラリーを接触させ、ライブラリーメンバーをそれらのタグを介してレセプターに結合することにより、平衡に達することが可能となる。その後、複合体となったレセプターおよびライブラリーメンバーを、レセプターが親和性を有する固相の添加（例えば、アビジンで標識した固相を用いて、ビオチンで標識したレセプターを固定化することができる）によって、溶液から取り出す。あるいは、溶液中でライブラリーをレセプターに接触させることができ、この結果、レセプターが固定化される。大部分の提示されたタグがレセプターに平衡で結合するように、レセプターの濃度は、通常、液相結合の間、タグ／レセプターのＫｄ以上にすべきである。レセプター−ライブラリーメンバーを固相に接触させる際、溶液中でライブラリーメンバーから固相が分離された後、少なくとも２つの提示されたタグを介してレセプターに結合するライブラリーメンバーのみが、固相に結合したままである。単一のタグを介してレセプターに結合されるライブラリーメンバーは、固相の分離および洗浄の間、固相より剪断されると推定される。未結合のライブラリーメンバーを除去した後、イオン強度もしくはｐＨを変化させるか、またはレセプターへの結合についてタグと競合する物質を添加することによって、結合したライブラリーメンバーをレセプターおよび固相から解離できる。例えば、アガロースに固定化されるとともにＮｉ２＋を含む金属キレートリガンドのヘキサヒスチジン配列への結合は、イミダゾールを溶液に添加して金属キレートリガンドの結合について競合させることにより、簡単に逆転できる。抗体−ペプチド結合は、多くの場合、ｐＨを１０．５以上に上げることによって解離できる。
【００８１】
この方法により選択されるライブラリーメンバー当たりのポリペプチドの平均数は、多数の因子に影響される。液相結合の間、レセプターの濃度を低下させることは、選択されたライブラリーメンバー中のポリペプチドの平均数の増加効果を有する。また、洗浄条件のストリンジェンシーを増すこともまた、選択されたライブラリーメンバー当たりのポリペプチドの平均数を増加させる。ライブラリーメンバーと固相との間の物理的関係を操作して、ライブラリーメンバー当たりのポリペプチドの平均数を増加することも可能である。例えば、離散した粒子を固相として用いる場合、粒子のサイズを小さくすると、結合の立体的な制約が増し、より高密度の、ライブラリーメンバー当たりの提示されるポリペプチドが必要となるはずである。
【００８２】
各抗体鎖に連結される２つのタグを有するＦａｂライブラリーについて、第１ラウンドの産物を第２ラウンドへの出発材料にして、選択を同様に２周実行することができる。第１のタグに対するレセプターを用いて選択の第１ラウンドを実行し、第２のタグに対するレセプターを用いて第２ラウンドを実行する。両タグについての選択によって、重抗体鎖および軽抗体鎖の両方の２つのコピー（すなわち、２つのＦａｂフラグメント）を提示するライブラリーメンバーが富化される。
【００８３】
（Ｅ．目的の標的への親和性についての選択）
Ｆａｂまたは他のポリペプチドの多価提示について富化されたライブラリーメンバーを、目的の標的への結合についてスクリーニングした。目的の標的は、結合パートナーを同定することが望まれるためいずれの目的の分子でもよい。この工程では、スクリーニングされるのは、提示されたポリペプチドであって、標的に結合するタグではないので、標的はタグに対する特異的結合親和性を欠くべきである。この工程でのスクリーニング手順は、親和性試薬がタグに対するレセプターではなく目的の標的である以外は、先の工程に非常に類似している。富化されたライブラリーメンバーを、その固定化を可能にする方法で通常標識した（例えば、ビオチンを用いて）標的に接触させる。結合により、平衡へと進むことが可能となり、その後、パンニングとして公知のプロセスで固相と接触させることにより、標的を溶液から取り出す（ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ  ７３、３０５−３１８（１９８８））。選択プロセス全体を通して、固相と結合したままのライブラリーメンバーには、それらと固定化した標的分子との間の多価結合よって同様のことを行う。未結合のライブラリーメンバーを洗浄して、固相から取り除く。
【００８４】
通常、スクリーニングの次のラウンドを実行する前に、ライブラリーメンバーを増幅にかける。多くの場合、結合したライブラリーメンバーは、支持体から解離することなく増幅できる。例えば、ビーズに固定化した遺伝子ＶＩＩＩファージライブラリーメンバーは、ビーズをＥ．ｃｏｌｉの培養物に浸漬させることによって増幅できる。同様に、細菌提示ライブラリーは、結合したライブラリーメンバーに増殖培地を添加することによって増幅できる。あるいは、結合したライブラリーメンバーは、次の選択、増幅または増殖を実行する前に、（例えば、イオン強度またはｐＨを変化させることによって）固相から解離できる。
【００８５】
親和性選択の後、結合したライブラリーメンバーは、２つの特徴、すなわちポリペプチドの多価提示および目的の標的に対する特異的親和性を有するポリペプチドの提示のためこの時点で富化される。しかし、次の増幅の後、２次ライブラリーを生産するため、標的に対する特異的親和性を有するポリペプチドを提示するために、２次ライブラリーは富化されたままであるが、増幅の結果として、ポリペプチドの多価提示のためにはこれ以上富化されない。このようにして、その後多価富化の２度目のサイクルを実行し、それに続いて、スクリーニング標的に対する親和性富化の２度目のサイクルを行う。さらに、スクリーニング標的に対する親和性富化のサイクルは、必要に応じて、多価提示のために増幅および富化と交互にすることを、濃度が所望の度合いに至るまで実行できる。
【００８６】
変形では、標的に類似していても同一ではない化合物と拮抗させて、標的に対する親和性スクリーニングを実行する。このようなスクリーニングでは、化合物上には存在しない標的エピトープに結合するライブラリーメンバーが優先的に選択される。さらに別の変形では、抗原に対する標的との既知の交差反応性を有する化合物と拮抗させて、結合したライブラリーメンバーを固相から解離できる。標的に対する既知の化合物と同一または同様の結合特異性を有するライブラリーメンバーは、優先的に溶離される。エピトープを介して標的に対する親和性を有するライブラリーメンバーは、固相と結合状態の化合物によって認識されるものとは区別される。
【００８７】
標的に対する異なる一価親和性のポリペプチド間で選択する点での区別は、液相結合中の、ライブラリーメンバーの結合価および標的の濃度に影響される。ｉで表示した標的分子の最小量がライブラリーメンバーに結合して、それを固相に固定化すると仮定して、ｎ個のポリペプチドを提示するライブラリーメンバーについて、固定化の確率が計算できる。質量作用の法則から、結合／未結合ポリペプチド分数Ｆは、Ｋ［ｔａｒｇ］／（１＋Ｋ［ｔａｒｇ］）であり、式中、［ｔａｒｇ］は、溶液中の総標的濃度である。このようにして、ライブラリーメンバー当たり、標識した標的リガンドによってｉ以上の提示されたポリペプチドが結合される確率は、２項確率分布：
【００８８】
【数１】
2005517407.tif 000002
【００８９】
によって求められる。
【００９０】
確率は、Ｋおよび［ｔａｒｇｅｔ］の関数であるので、標的に対してそれぞれが一価親和性Ｋを有する多価提示メンバーは、標的の濃度を変化させることによって選択され得る。ライブラリーメンバーが０．１／［Ａｇ］、１／［Ａｇ］、および１０／［Ａｇ］の一価親和性を示し、メンバー当たりｎ個のポリペプチドを提示し、ｉ＝１、２、または３であるときの固相固定化の確率は、次の通りである。
【００９１】
【数２−１】
2005517407.tif 000003
【００９２】
【数２−２】
2005517407.tif 000004
【００９３】
上記の表は、異なる一価結合親和性の固定化ポリペプチド間の区別が、ライブラリーメンバー（ｎ）の結合価によって、および液相結合に対する標的の濃度によって影響されることを示す。ｎ（ファージ当たりの提示されるポリペプチド数）がｉ（固相結合に必要な最小結合価）に等しいとき、区別は最大になる。また、液相結合の間、標的の濃度を低下することによっても、区別は増大する。通常、標的濃度は、単離しようとするポリペプチドのＫｄ付近である。１０−８〜１０−１０Ｍの標的濃度が代表的である。
【００９４】
上記方法で生産した富化されたライブラリーを、標的に対する特異的親和性を有するポリペプチドをコードする高比率のメンバーにより特徴づける。例えば、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９５％または９９％のメンバーが標的に対する特異的親和性を有するポリペプチドをコードする。標的に対する親和性を有するメンバーの正確な％値は、増幅によって、遺伝的欠失の出現が増すので、ライブラリーが選択に続いて増殖されたかどうかに依存する。しかし、完全長ポリペプチドコード配列を有するメンバーの中で、標的に対する特異的親和性を有するポリペプチドをコードする比率は非常に高い（例えば、少なくとも５０％、７５％、９５％または９９％）。標的に対する特異的親和性を有するポリペプチドをコードする全てのライブラリーメンバーが必ずしもポリペプチドを提示するわけではない。例えば、全長コード配列のメンバーの９５％が標的に対する特異的親和性を有するポリペプチドをコードするライブラリーでは、通常半数より少ない数が実際にポリペプチドを提示する。通常、このようなライブラリーは、少なくとも４、１０、２０、５０、１００、１０００、１０，０００、または１００，０００個の異なるコード配列を有する。通常、このようなコード配列の任意の１つの出現は、ライブラリー中の全コード配列の５０％、２５％、または１０％以下である。
【００９５】
（Ｖ．宿主系でのサブクローニングおよび発現）
（Ａ．サブクローニング）
提示ライブラリーメンバーのスクリーニングでは、代表的に、標的に対する特異的親和性を有するライブラリーメンバーの小集団が生じる。いくつかの方法では、ライブラリーメンバーのクローン性単離物が得られ、これらの単離物を様々な他の分析に直接用いる。他の方法では、ライブラリーメンバーのクローン性単離物を得て、抗体鎖をコードするポリヌクレオチド配列をそれぞれの単離物から増幅する。代表的に、発現ベクターに移す前に、同一のポリヌクレオチド分子の成分として重鎖および軽鎖を増幅するので、提示ベクター中に存在する重鎖および軽鎖の組み合わせは、発現ベクター中でも保存される。さらに、各シグナル配列もまた、発現ベクターに移され、その中で、抗体鎖に対するその作動可能な結合が保存される。発現ベクターは、上記に開示したような原核生物ベクターであり得る。発現ベクターは、また、真核生物ベクターであり得る。さらに、いくつかの方法では、１つの発現ベクター（例えば、セクションＩＩＩで論じる原核生物発現ベクター）中の目的のポリヌクレオチド（例えば、Ｆａｂコード配列）を、別の発現ベクター（他の原核生物ベクターまたは真核生物ベクター）に移す。
【００９６】
ヒト可変領域およびヒト定常領域の両方を含む提示抗体鎖について、代表的に、可変領域および定常領域の両方をコードする核酸をサブクローニングする。他の方法では、抗体鎖をコードする核酸を増幅し、個々のメンバーのクローン単離をせずに、ライブラリーメンバーのプールから全てまとめて発現ベクターの複数のコピーへサブクローニングする。提示ベクターから発現ベクターへポリヌクレオチドの混合集団を移すためのサブクローニングプロセスは、下記に詳細に記述するように、個々の提示ベクターのクローン性単離物から得た核酸を移すための方法と本質的に同じである。
【００９７】
サブクローニングすべき抗体鎖をコードするポリヌクレオチドは、隣接配列の制限消化により切り出すことができるか、またはコード配列に隣接する部位に対するプライマーを用いるＰＣＲ法によって増幅することができる。一般的なＰＣＲ技術に関しては、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．、１９９２）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編集、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照せよ。ＰＣＲプライマーは、発現ベクターに導入する際、増幅フラグメントのポジティブな選択を可能にするマーカー配列を含むことができる。ＰＣＲプライマーは、必須ではないが、発現ベクターへのクローニングを可能にするための制限部位を含むこともできる。Ｆａｂライブラリーについて、重鎖および軽鎖を互いに隣接させるか、または近接させて提示ベクターに挿入する場合、これら２つ鎖を増幅させるか、または一緒に切り出すことができる。いくつかのＦａｂライブラリーについては、抗体鎖の可変領域のみを切除するか、または増幅する。Ｆａｂライブラリーの重鎖または軽鎖を別々に切り出すか、または増幅する場合、続いて、それらを同一または異なる発現ベクターに挿入することができる。
【００９８】
真核生物発現ベクターを用いる際、重鎖および軽鎖の配列を２つの別々のベクターに移すことができる。一方で、重鎖および軽鎖の配列は、同一の発現ベクターにサブクローニングすることができる。後者の場合、軽鎖および重鎖を２つの別々の真核生物プロモーターの制御下に置くことができる。あるいは、重鎖および軽鎖の配列を同一のベクターの１つのプロモーターの制御下に置くことができる。しかし、リボソームが下流配列（例えば、軽鎖配列）に結合することを確実にするためには、下流配列に作動可能に会合するようにＩＲＥＳ配列を挿入することもできる。
【００９９】
提示抗体鎖をコードするフラグメントを切り出すか、または増幅した場合、これらのフラグメントは、通常、アガロースゲルまたはショ糖勾配でサイズ的に精製される。代表的に、これらのフラグメントは、コード配列の様々な欠失形態に対応するより低い分子でスメアを有する単一の鮮明な完全長バンドとなる。完全長コード配列に対応するバンドを、ゲルまたは勾配から取り出し、これらの配列を次の工程で使用する。
【０１００】
次の工程では、完全長コード配列をコードする核酸を発現ベクターに連結させ、それによって、異なるインサートを保持する発現ベクターの改変形態の集団を作製する。これは、適合する末端を有するように切断されたインサートの混合物を持つ切断された発現ベクターを従来通りライゲーションすることによって達成され得る。あるいは、インサートＤＮＡに対する制限酵素の使用を避けることができる。天然にコードされる制限酵素部位は、インサート配列内に存在し、このために制限酵素で処理する際、配列の破壊を引き起こす可能性があるので、このクローニング法が有益である。制限酵素を用いないクローニングについて、インサートおよび線状化したベクター配列の混合集団を、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ等の３’→５’エキソヌクレアーゼで短時間処理する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、ＣＳＨＰ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９）を参照せよ。消化により生成されたインサートの突出５’末端は、ベクターの消化により生成された１本鎖オーバーハングに相補的である。オーバーハングをアニーリングして、再アニーリングしたベクターをレシピエント宿主細胞にトランスフェクションする。３’→５’エキソヌクレアーゼではなく５’→３’エキソヌクレアーゼを用いても同じ結果が達成され得る。
【０１０１】
好ましくは、発現ベクターへのインサートのライゲーションは、再アニーリングしたベクターおよび未切断のベクターに対する選択が可能となる条件下で実行する。非許容条件下での再アニーリングしたベクターに対する選択を可能にする条件的致死遺伝子を含む多くのベクターが公知である。例えば、ＣｏｎｌｅｙおよびＳａｕｎｄｅｒｓ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９４：２１１−２１８（１９８４）を参照せよ。これらのベクターによって、インサートを収容したベクターに対するポジティブな選択を効果的に可能にする。選択は、ポジティブ選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）の一部を欠失するように発現ベクターを切断することによっても達成できる。欠けた部分は、その後、完全長インサートで補充する。この部分は、提示ベクター中のポリペプチドコード配列の３’末端で導入できるか、または、インサートの増幅に用いるプライマー中に含むことができる。
【０１０２】
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させる目的の宿主細胞に依存する。通常、ベクターは、他の調節配列の発現を確実にする挿入されるコード配列に作動可能に結合されて、プロモーターおよび他の調節配列を含む。誘導可能なプロモーターを使用すると、誘導条件下以外での挿入配列の発現を防ぐため都合がよい。誘導可能なプロモーターとしては、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターが挙げられる。その発現産物が宿主細胞によっていっそう寛容されるコード配列に対して集団を偏らせることなしに、形質転換された生体の培養物は、非誘導条件下で増殖できる。多くの場合、ベクターに内包される前に、挿入ポリペプチドはシグナル配列に結合するけれども、ベクターには、挿入配列によってコードされるポリペプチドを有する融合タンパク質を形成するように配置される分泌シグナル配列を設けてもよい。抗体軽鎖および重鎖可変ドメインをコードする配列を収容するために用いるベクターは、挿入鎖を有する融合タンパク質として発現することができる定常領域またはその部分をコードすることもあり、それによって、インタクトな抗体またはそのフラグメントの産生に至る。通常、このような定常領域は、ヒトのものである。保存的変異は、好ましくはないが、許容され得る。例えば、提示パッケージがＣＨ１定常領域に結合する重鎖可変領域と、インタクトな軽鎖定常領域に結合する軽鎖可変領域とを提示し、全抗体鎖が提示ベクターから発現ベクターに移される場合、発現ベクターは、挿入重鎖核酸のＣＨ１領域を有するヒト重鎖定常領域ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域インフレームをコードするように設計することができ、それによって、インタクトな抗体が発現される。当然、正確に、ヒト重鎖定常領域のセグメントが提示パッケージによっておよび発現ベクターによって補充されるように多数の小さな変形が可能である。例えば、ＣＨ１領域およびヒンジ領域のいくつかまたは全てを含むように提示パッケージを設計することもできる。この場合、インタクトな抗体を発現させるために、ヒンジ領域の残部（もし存在するならば）と、ＣＨ２およびＣＨ３領域とを補充するように発現ベクターを設計する。
【０１０３】
（Ｂ．宿主系および発現）
セクションＩＩＩおよびＩＶで論ずるような対象となるポリヌクレオチドを発現させるために様々な宿主系を用いることができる。セクションＩＩＩで論ずるように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングするために特に有用な１つの原核宿主細胞である。使用に好適な他の細菌宿主としては、バチラススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の棹菌（ｂａｃｉｌｌｉ）と、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、および多種の  シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種等の他の腸内細菌（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）  とが挙げられる。これらの原核細胞宿主では、発現ベクターを作製することもでき、宿主細胞に適合した発現制御配列を通常含む（例えば、複製起点）。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダもしくはファージＴ７から得たプロモーター系等の様々な周知のプロモーターの任意の数を存在させる。プロモーターは、転写および翻訳を開始終了するために、通常、発現を制御し、任意でオペレーター配列を有し、リボソーム結合部位配列等を有する。
【０１０４】
他の細菌、例えば酵母もまた発現のために用いることができる。サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の解糖酵素を含むプロモーターまたはガラクトースプロモーター、および複製起点、終止配列等の発現制御配列を所望の通りに有する好適なベクターとともに使用する好適な宿主である。昆虫細胞も、バキュロウイルスベクターと組み合わせて用いることができる。
【０１０５】
ほ乳類組織細胞培養物を利用して、本発明の対象となるポリペプチドを発現および産生させることもできる（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎ．Ｙ．、Ｎ．Ｙ．、１９８７）を参照せよ）。インタクトな免疫グロブリンを分泌することができる多数の好適な宿主細胞系が開発されており、ＣＨＯ細胞系、様々なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞系、形質転換したＢ細胞、およびハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞に対する発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサー等の発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８（１９８６））と、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列等の必要なプロセッシング情報部位とを含むことができる。好適な発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターである。
【０１０６】
目的のポリヌクレオチド配列を含むベクターの導入方法は、細胞宿主の種類によって変わる。例えば、原核細胞には通常塩化カルシウムトランスフェクション法が利用される一方で、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理または電気穿孔法が用いることも可能である（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲）。
【０１０７】
いったん発現させると、抗体の集合を、培養物培養液および宿主細胞から精製する。一般に、シグナル配列とともに抗体鎖を発現させ、これによって、培養物培養液に放出する。しかし、抗体鎖が宿主細胞から天然に分泌されない場合、抗体鎖は穏やかな界面活性剤による処理によって放出することができる。抗体鎖は、その後、硫酸アンモニウム沈降法、固定標的に対するアフィニティークロマトグラフィー法、カラムクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法等の従来法により精製できる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、１９８２）を参照せよ）。
【０１０８】
上記方法によって、選択された標的に対する特異的親和性を有する抗体鎖をコードする核酸配列の新規ライブラリーが生じる。核酸のライブラリーは、通常、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、または１０５の異なる構成要素を有する。一般に、単一の構成要素がライブラリーの全配列の２５または５０％以上を占めることはない。通常、ライブラリー構成要素の少なくとも２５、５０、７５、９０、９５、９９または９９．９％は、標的分子に対して特異的親和性を有する抗体鎖をコードする。核酸ライブラリーは、任意のベクターの成分として自由な形態で存在することができ、また宿主細胞にベクター成分としてトランスフェクションすることができる。いくつかのライブラリーでは、抗体重鎖をコードする核酸の少なくとも９０、９５、または９９％がＩｇＧアイソタイプの重鎖をコードする。いくつかのライブラリーでは、標的に対して特異的親和性を有する構成要素の重鎖をコードする核酸は、鎖に対して少なくとも５、１０、１４、１５、２０、または２５の体細胞ヌクレオチド変異の中央値を有する。いくつかのライブラリーでは、標的に対して特異的親和性を有する構成要素の軽鎖をコードする核酸は、鎖に対して少なくとも２、３、５、１０、１５、２０、または２５の体細胞ヌクレオチド変異の中央値を有する。
【０１０９】
核酸ライブラリーが発現して、標的に対して特異的親和性を有する抗体のポリクローナルライブラリーを生成できる。このようなライブラリーの組成物は、ヌクレオチドライブラリーの組成物から決定される。その結果、このようなライブラリーは、通常、異なるアミノ酸組成物を有する少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、１０４、または１０５の構成要素を有する。一般に、単一の構成要素がライブラリーの全ポリペプチドの２５または５０％以上を占めることはない。標的に対する特異的親和性を有する抗体鎖ライブラリー中の抗体鎖の％値は、通常、抗体鎖をコードする対応する核酸の％値よりも低い。この差は、適当な１次アミノ酸配列を有して適当な折り畳みを支持するにもかかわらず、全てのポリペプチドが結合に適当な構造に折り畳まれるわけではないという事実に起因する。いくつかのライブラリーでは、抗体鎖の少なくとも２５、５０、７５、９０、９５、９９、または９９．９％が標的分子に対する特異的親和性を有する。また、多鎖抗体のライブラリーでは、各抗体（例えば、Ｆａｂまたはインタクトな抗体）がライブラリー構成要素であると考えられる。いくつかのライブラリーでは、少なくとも９０、９５、または９９％の重鎖がＩｇＧアイソタイプである。いくつかのライブラリーでは、標的に対する特異的親和性を有する重鎖は、鎖に対して、少なくとも１、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、または２０の体細胞アミノ酸変異の中央値を有する。いくつかのライブラリーでは、標的に対する特異的親和性を有する軽鎖は、鎖に対して、少なくとも１、２、３、５、１０、１２、１５、または２０の体細胞アミノ酸変異の中央値を有する。異なる抗体鎖は、標的に対する優れた結合特異性および親和性の点で、互いに異なる。このようなライブラリーのいくつかは、同一抗原上の異なるエピトープに結合する構成要素を含む。このようなライブラリーのいくつかは、互いに拮抗することなく、同一抗原に結合する少なくとも２つの構成要素を含む。
【０１１０】
上記方法から生じるヒト抗体のポリクローナルライブラリーは、本ライブラリーの高親和性結合剤の高い％値によって、さらに本ライブラリーが天然の集団に存在する抗体の同様の多様性を通常示さない点で、ヒト抗体の天然の集団とは区別される。本ライブラリーの多様性の減少は、全てのヒト免疫グロブリン遺伝子を含まない原料物質を提供する非ヒトトランスジェニック動物が原因である。例えば、いくつかのポリクローナル抗体ライブラリーは、ラムダ軽鎖を有する抗体とは無関係である。本発明のいくつかのポリクローナル抗体ライブラリーは、１０、２０、３０、または４０より少ない数のＶＨ遺伝子にコードされる抗体重鎖を有する。本発明のいくつかのポリクローナル抗体ライブラリーは、１０、２０、３０、または４０より少ない数のＶＬ遺伝子にコードされる抗体軽鎖を有する。
【０１１１】
先述した発明は、明確に理解されるために詳述されているが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更が実施されてもよいことは明らかである。本出願で引用される全ての刊行物および特許文献は、それぞれがそのように個別に明記されていない限り、同程度で、全ての目的のために、その全文が参考として本明細書に援用される。以下の実施例は、例証の目的で提供するものであり、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
（発現ベクターの構築）
本明細書に記載したように、ポリヌクレオチドに作動可能に連結するｌａｃおよびラムノースプロモーター等のプロモーターにしたがって発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターを構築した。
【０１１３】
（ＡＬ１．３発現ベクターの調製）
米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１７記載のものと同様の発現ベクターを、κ鎖上に異なるシグナル配列を有するＦａｂをクローニングするために開発した。このベクターは修飾ｐＢＲ３２２プラスミドであり、このベクターをＡＬ１．３と命名した。これは、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、アンピシリン耐性遺伝子、ＮｓｉＩ制限酵素切断部位、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位、および部分的なテトラサイクリン耐性遺伝子を含む。
【０１１４】
ｌａｃプロモーターの３’および５’末端にある配列に対応させて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーＢおよびＣ（表２）をそれぞれ作製した。プライマーＢおよびＣは、Ｐｌａｃに特異的な配列を有するとともに、それらの５’末端に、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位の３’末端およびＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位の５’末端に相補的な約２０ヌクレオチドのｐＢＲベクター配列を含む。さらに、プライマーＢは、抗体カセットの導入を調製する際に最終コンストラクトを線状化するために、ｌａｃプロモーターの３’末端に、ＮｓｉＩ制限酵素切断部位を配置する。ＰＣＲ反応を５回実行し、それぞれ、プライマーＢ  １００ｐｍｏｌ、プライマーＣ  １００ｐｍｏｌ、エクスパンドポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）２単位、２ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）１０μｌ、１０倍Ｅｘｐａｎｄ反応緩衝液１０μｌ、ＢＳ５１ウラシル鋳型（実施例８）５０ｎｇ、さらに水を併せて１００μｌにしたものを含む。反応は、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）サーマルサイクラー（Ｍｏｄｅｌ  ９６００、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｅｍｏｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）で行い、以下の温度プロファイルを用いた。すなわち、変性（１分、９４℃）を１サイクル；変性（１５秒、９４℃）、アニーリング（３０秒、５５℃）、および伸長（６０秒、７２℃）を１０サイクル；変性（１５秒、９４℃）、アニーリング（３０秒、５５℃）、および伸長（８０秒、追加サイクルごとに２０秒、７２℃）を２０サイクル；伸長（６分、７２℃）；浸漬（４℃、時間上限なし）である。ＰｌａｃＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により検証した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分画して、完全長産物をゲルから切り出し、ＱｉａＱｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）で製造元の推奨にしたがって精製した。インサートの濃度をＡ２６０によって測定した後、精製し、水に再懸濁した。
【０１１５】
米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１７記載のものと同様の発現ベクターを改変して、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮＤ．）で、製造元の推奨に従いベクターを消化することによって、Ｐｌａｃインサートを得た。これらの酵素で発現ベクターを消化することによって、ｐＢＲ３２２ベクターを消化して得られるものと同一のｐＢＲ３２２主鎖を生産する。消化したベクターをアガロースゲル電気泳動にかけ、ｐＢＲ３２２主鎖に対応する産物をゲルから切り出し、ＱｉａＱｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて製造元の推奨にしたがって精製した。インサートの濃度をＡ２６０によって測定した。
【０１１６】
１０倍緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮＤ．）１．０μｌをＤＮＡ１．０μｇに添加し、水と併せて全量９μｌにすることによって、Ｔ４エキソヌクレアーゼ消化用に、Ｐｌａｃインサートと、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで線状化したｐＢＲ３２２ベクターとを調製した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮＤ．）１μｌ（１Ｕ／μｌ）を用いて、３０℃、４分間、試料を消化した。１０分間、７０℃でインキュベートして、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを熱不活性化した。試料を冷却し、短時間撹拌した。異なる管に、消化したＰｌａｃインサート１２ｎｇ、消化したベクター１００ｎｇ、および１０倍アニーリング緩衝液（Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）２００ｍＭ、ＭｇＣｌ２２０ｍＭ、およびＮａＣｌ５００ｍＭ）１．０μｌを添加し、水と併せて１０μｌ量にした。２分間、７０℃まで、試料を加熱し、その後２０分間以上、３０℃まで冷却して、インサートおよびベクターの相補的５’一本鎖オーバーハングを、エキソヌクレアーゼ消化によって互いにアニーリングさせた。１０倍合成緩衝液（各ｄＮＴＰを５ｍＭ、ＡＴＰを１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２を５０ｍＭ、ＤＴＴを２０ｍＭ）１．３μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮＤ．）１．３μｌ、希釈Ｔ７ＤＮＡ（１Ｕ／μｌ）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）１．３μｌを添加し、３０分間、３７℃でインキュベートすることによって、インサートおよびベクターを互いにライゲートさせた。
【０１１７】
ライゲーション反応物は、ＤＮＡ１部に対して蒸留水３部の割合で希釈し、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例８に記載のように、１μｌを電気穿孔法でエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）４０μｌに導入した。形質転換した試料を、２倍ＹＴで１ｍｌに即座に希釈し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、Ｐａ．）を添加したＬＢ寒天プレートに、様々な希釈度で播種し、３７℃で一晩培養した。
【０１１８】
ＡＬ１．１、ＡＬ１．２、ＡＬ１．３、およびＡＬ１．４と命名した４つのコロニーを選別し、２倍ＹＴ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）５０ｍｌで、３７℃、一晩培養した。翌日、−８０℃で長期保存するためにグリセロール凍結保存菌を作製し、キアゲンハイ‐スピードプラスミドミディキット（Ｑｉａｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて一晩培養した菌の残りからプラスミドを精製した。ベクターをＮｓｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）で切断して、アガロースゲル電気泳動によって解析した。４つのベクター全てが両方の制限酵素切断部位を含んでいることが判明した。
【０１１９】
抑制抗体ＣＤ．ＴＸＡ．２２．２を用いて、抗体の発現に関して、ＡＬ１．１、ＡＬ１．２、ＡＬ１．３、およびＡＬ１．４ベクターを試験した。このモノクローナル抗体は、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１５に記載される選択プロセスから得た。製造元の推奨にしたがってキアゲンハイ‐スピードプラスミドミディキット（Ｑｉａｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）を用いて、一晩培養した菌からＣＤ．ＴＸＡ．２２．２プラスミドを調製した。プライマーＡおよびＯとともに、鋳型としてＣＤ．ＴＸＡ．２２．２プラスミド５ｎｇを用いて、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１８に記載するように、ＰＣＲによって抗体カセット領域を増幅した（表２）。プライマーは、ＣＤ．ＴＸＡ．２２．２に特異的な配列を有するとともに、その５’末端に、Ｐｌａｃの３’末端と、ＨｉｎｄＩＩＩ部位のすぐ下流にある配列とに対応する約２０ヌクレオチドのベクター配列を含む。さらに、プライマーＯは、６つのヒスチジンコドンと、ＴＡＡ終止コドンと、ＣＤＴＸＡ．２２．２コード配列およびベクター配列間にある１９ヌクレオチドのテトラサイクリンプロモーターとを有する（実施例１７、米国特許第６，０５７，０９８号）。前述のように、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動にかけ、完全長産物をゲルから切り出し、精製した。Ｔ４エキソヌクレアーゼ消化用にＣＤＴＸＡ．２２．２インサートと、ＮｓｉＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したベクターとを、各１．０μｇずつ異なる管にアリコートし、１０倍制限エンドヌクレアーゼ緩衝液Ａを１．０μｌを添加して、水と併せて９．０μｌ量にすることによって調製した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを１μ１（ｌＵ／μｌ）用いて、３０℃で、４分間試料を消化した。１０分間、７０℃でインキュベートすることによって、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを熱不活性化した。試料を冷却し、短時間撹拌して、消化したインサート（１００ｎｇ）およびベクター（１００ｎｇ）を、１０倍アニーリング緩衝液１μｌと混和して、水を加えて１０μｌ量にした。上述のように、試料をアニーリングおよびライゲートして、電気穿孔法でエレクトロコンピテント細胞に導入した。形質転換した細胞を、２倍ＹＴ培養液で１．０ｍｌに希釈して、１μｌ、１０μｌ、および１００μｌを、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ社，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，Ｐａ．）を添加したＬＢ寒天プレート上に播種し、３７℃で一晩培養した。各ＡＬ１ベクターサブタイプから３つの異なる候補を取り、振とうフラスコで一晩培養した。翌日、−８０℃で長期保存するためにグリセロール凍結保存菌を作製し、このクローンをＷＣ２と名づけた。これらＷＣ２クローンを培養して、ＣＤ．ＴＸＡ．２２．２抗体を、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）を１ｍＭに添加して発現を誘導したもの以外は、実施例３に記載するように、ニッケルキレートクロマトグラフィーによって精製した。これらの発現結果に基づいて、ＡＬ１．３ベクターを今後のクローニング実験用に選択した。
【０１２０】
（ＡＬ２．２発現ベクターの構築）
シグナル配列ありで、またはシグナル配列無しで、タンパク質をクローニングするため、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１７に記載のものと類似した別の発現ベクターを開発した。ベクターは、ＡＬ２．２と命名された修飾ｐＢＲ３２２プラスミドであり、ラムノースプロモーター（ＰｒｈａＳＢ）を含んだｒｈａＲおよびｒｈａＳ遺伝子と、アンピシリン耐性遺伝子と、ＮｓｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位と、部分的なテトラサイクリン耐性遺伝子とを有する。
【０１２１】
ＰｒｈａＳＢを含んだｒｈａＲおよびｒｈａＳ調節遺伝子からなるターゲットを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、プライマーＤおよびＥ（表２）を用いて、高適合性ＰＣＲシステム、エクスパンド（Ｒｏｃｈｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用したＰＣＲにより増幅した。プライマー  ＤおよびＥは、ｒｈａＲおよびＰｒｈａＳＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥ０００４６５）に特有な配列を有すことに加えて、それらの５’末端に各々、約２０ヌクレオチドのｐＢＲ３２２ベクター配列のＥｃｏＲＩ制限部位５’側に相補的な配列、およびＨｉｎｄＩＩＩ  制限部位３’側に相補的な配列を含む。この相補的配列により、ｒｈａインサート（ｒｈａＲ  ｒｈａＳ  ＰｒｈａＳＢ）をｐＢＲ３２２種鎖にクローニングすることが容易になる。
【０１２２】
ラムノースＰＣＲの鋳型は、一晩培養したＸＬ１の１００μｌを遠心し、そのペレットを１ｍｌの蒸留水に再懸濁することによって調製した。細胞懸濁液を蒸留水で３回洗った。最終ペレットを１００μｌの蒸留水に再懸濁し、９５℃で５分間インキュベートした。１００μｌＰＣＲ反応を４回実行した。各ＰＣＲ反応は、プライマーＤ  １００μｌ、プライマーＥ  １００ｐｍｏｌ、エクスパンドポリメラーゼ２単位、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １０μｇ、１０倍エクスパンド反応緩衝液１０μｌ、および鋳型として１、２、または４μｌの熱変成させたＥ．ｃｏｌｉストックを含み、水を加えて１００μｌにした。ＰＣＲ反応は、パーキンエルマーのサーマルサイクラー（Ｍｏｌｄｅｌ９６００）内で、以下の温度プロファイルを用いて行った。すなわち、９４℃での変性（１分）１サイクル；変性（１５秒、９４℃）、アニーリング（３０秒、５５℃）、および伸長（１２０秒、７２℃）を１０サイクル；変性（１５秒、９４℃）、アニーリング（３０秒、５５℃）、および伸長（１４０秒、プラス各追加のサイクルあたり２０秒、７２℃）を２０サイクル；伸長（６分、７２℃）；ソーク（４℃、時間上限なし）。ｒｈａＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって確認した。それらの反応液を合わせ、製造元の推奨にしたがってキアクイックカラムを用いて精製した。インサートの濃度は、Ａ２６０によって決定した。
【０１２３】
ｒｈａインサート、および、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで線状化されたｐＢＲベクター（上記ＡＬ１．３発現ベクターの調製を参照）は、ＤＮＡ１．０μｇに１０ｘ緩衝液Ａ１．０μｌを加え、水で最終容積を９μｌにすることでＴ４エキソヌクレアーゼ消化に準備した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ（１Ｕ／μｌ）を用い、それらの試料を、３０℃で、４分間消化した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、７０℃１０分間インキュベートし、熱不活性化した。試料を冷やし、短時間遠心した。別の試験管に、消化されたｒｈａインサート１００ｎｇ、消化されたベクター１００ｎｇ、および１０倍アニーリング緩衝液１．０μｌを加え、水で容積を１０μｌにした。試料をアニーリングし、かつ結合させ、上述のようにエレクトロコンピテントセルに電気穿孔した。形質転換した細胞を、２倍ＹＴ培養液で１．０ｍｌに希釈し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレートに、様々な希釈率で播種し、３７℃で一晩培養した。
【０１２４】
１０クローンを取り、３０μｌの２倍ＹＴに懸濁した。これらのクローンに正しいインサートがあるか、懸濁した細菌１μｌを鋳型とし、プライマーＤおよびＥ（表２）を用いたＰＣＲ増幅によって、テストした。ＰＣＲ反応のアガロースゲル電気泳動により、１０のクローンのうちの９つにｒｈａインサートがあることが明らかになった。陽性のクローンのうちの４つを取り、１００  μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌのＬＢ培養液中で、３７℃で、一晩培養した。翌日、−８０℃で長期保存するためにグリセロール凍結保存菌を作製し、製造元の推奨にしたがって、キアゲンハイ‐スピードプラスミドミディキット（Ｑｉａｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて一晩培養した菌の残りからプラスミドを精製した。プラスミド１μｇを、制限酵素ＮｓｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。消化産物のアガロースゲル電気泳動により、コンストラクトのうちの３つが、両方の制限酵素切断部位を含んでいることが判明した。これらの新規ベクター、すなわちＡＬ２．１、ＡＬ２．２  、およびＡＬ２．３は、ＰｒｈａＳＢプロモーターと、ｒｈａＲおよびｒｈａＳ遺伝子と、アンピシリン耐性遺伝子と、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部と、ＮｓｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とを有した。これらのベクターに挿入されたｒｈａ  インサート配列の確認は、マックコーネルリサーチ（ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）において、セクアサーム（Ｓｅｑｕａｔｈｅｒｍ）シークエンシングキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、マディソン、ウィスコンシン）を用いたジデオキ鎖ターミネーション法と、オリゴヌクレオチドプライマーＪ、Ｋ、およびＮ（表２）を用いたＬＩ−ＣＯＲ  ４０００Ｌ自動シークエンサー（ＬＩ−ＣＯＲ、リンカーン、ネブラスカ）とによって、おこなった。これらの配列結果に基づき、発現ベクターとして使用するのにＡＬ２．２を選択した。
【０１２５】
対照抗体ＣＤＴＸＡ．２２．２をＡＬ２．２のクローニングを、上述のＡＬ１．３ベクターに用いた方法と、ＰＣＲ増幅部分でプライマーＦ（表２）をプライマーＡの代わりとして用いる点を除いて、同様の方法でおこなった。ＣＤＴＸＡ．２２．２のクローンであるＷＣ２３を培養し、ラムノースで誘導した後、実施例３に記載のニッケルキレートクロマトグラフィーにより、ＣＤＴＸＡ．２２．２抗体をうまく精製することができた。
【０１２６】
ＡＬ２．２ベクター１０μｇを、ＮｓｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限し、アガロースゲル電気泳動で分画化した後、完全長産物をゲルから切り出し、製造元の推奨にしたがって、キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）カラムを用いて精製した。ベクターの濃度を、Ａ２６０によって測定した。上述の通り、Ｔ４消化によってインサートを受けるためにベクターの調製をおこなった。
【０１２７】
（ｐＢＲＳａｃ１／ＨｉｎｄＩＩＩ（ｐＢＲｓａｃＨ３）発現ベクター）
ｐＢＲＳａｃＨ３ベクターを、ＡＬ２．２から誘導した。該ベクターは、ＮｓｉＩ部位がヒトセルロプラシミンシグナル配列と置き換えられる点を除き、あらゆる点でＡＬ２．２と同じである。セルロプラシミンシグナル配列の３’末端最後の２塩基を修飾してＳａｃＩ制限部位を生成した。ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の存在により、インサート導入の準備としてベクターを線状化することが可能となる。このコンストラクトは、その５’末端にヒトセルロプラシミンシグナル配列を使う抗体および抗原をクローニングするために作られた。シグナル配列をベクターに置くことにより、サブクローニング用のＰＣＲプライマーをかなり小さくできる。したがって、ＰＣＲ  反応がより効率的になる。必要とされる反応数がより少なくなるので、必要とされる時間および資源の両方が削減される。
【０１２８】
ＰＣＲプライマーであるプライマーＡＡおよびＵ（表２）の各々を、ｒ−メタンフェタミン（ｒＭＥＴ１０）κ鎖の５’および３’末端のコード配列に一致するように作製した。このモノクローナル抗体は、実施例４に記載の選択プロセスで得られた。製造元の推奨にしたがって、キアゲンハイ−スピードプラスミドミディキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）を使用し、ｒＭＥＴ１０プラスミドを一晩培養してから調製した。κ鎖コード配列に加えて、５’プライマーはその５’末端に、ＡＬ２．２ベクターのＮｓｉＩ部位上流領域に一致する約２０ヌクレオチドのベクター配列を含み、ヒトセルロプラシミンシグナル配列をコードする配列がその後に続く。セルロプラシミンシグナル配列の最後のコドンを、最後から２番目のコドンと合わせてＳａｃＩ制限部位を形成するように修飾した。３’プライマーはその５’末端に、３’からＨｉｎｄＩＩＩ部位の約２０ヌクレオチドのベクター配列を含み、κ鎖コード配列の３’末端と一致する配列がその後に続く。上述の通り、ｒＭＥＴ１０プラスミド５ｎｇを鋳型として用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって確かめた。それらの反応を合わせ、製造元の推奨にしたがって、セルロプラシミンのＳａｃＩインサートをキアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）カラムによって精製した。インサートの濃度は、Ａ２６０によって測定した。
【０１２９】
上述の通り、ＡＬ２．２ベクターをＮｓｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、セルロプラシミンのＳａｃＩインサート導入の準備をし、さらに、セルロプラシミン−ＳａｃＩインサートと共に、上述の通り、Ｔ４消化およびアニーリングを行い、ＤＨ１０Ｂに電気穿孔し、播種した。３コロニーを取り、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２倍ＹＴ培養液５０ｍｌ中で、３７℃で、一晩培養した。翌日、−８０℃における長期保存用にグリセロール凍結保存ストックを作り、製造元の推奨にしたがって、キアゲンハイ  −  スピードプラスミドミディキット（Ｑｉａｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）を用い、一晩培養した菌の残りからプラスミドを精製した。それらのプラスミドを、製造元の推奨にしたがって、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ  制限酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で消化した。消化産物のアガロースゲル電気泳動によって、アガロースゲル電気泳動によって、３つのコンストラクト全てが両方の制限酵素切断部位を含んでいることが判明した。これらの新規ベクター、すなわちｐＢＲｓａｃＨ３。１、ｐＢＲｓａｃＨ３．２、ｐＢＲｓａｃＨ３．３は、ＰｒｈａＳＢ  プロモーターと、ｒｈａＲおよびｒｈａＳ遺伝子と、ヒトセルロプラシミンシグナル配列と、アンピシリン耐性（βラクタマーゼ）遺伝子と、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部と、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とを有する。３つのベクターの配列は、プライマーＮ（表２）を用い、実施例１の記載のように、マックコーネルリサーチ（Ｍａｃｃｏｎｎｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で確かめられた。
【０１３０】
（実施例２）
（真核生物シグナル配列の選択）
真核生物シグナル配列を選択し、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共に発現ベクターに組み込んだ。ポリペプチドには、本明細書に記載されているような、抗体重鎖ポリペプチドおよび抗体軽鎖ポリペプチドが含まれる。
【０１３１】
計２０の異なる真核生物シグナル配列（表１）を、コントロール抗体であるＣＤＴＸＡ．２２．２（米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１５）上のペクチン酸塩リアーゼ（ｐｅｌＢ）シグナル配列との置換に使用した。生じたクローンは、κ鎖の分泌を指示する真核生物シグナル配列と、重鎖の分泌を指示する原核細胞シグナル配列（アルカリホスファターゼ（ａｌｋＰ））とを有した。κ鎖と連結された真核生物シグナル配列の効率的な発現および分泌の分析、ならびに完全なプロセシングについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって毒値ステイ分析され得るように、ａｌｋＰシグナル配列を重鎖に使用した。
【０１３２】
表１における２０の真核生物シグナル配列と一致する５’プライマー全ては、ベクターＡＬ１．３（実施例１）内のｌａｃプロモーター３’末端に対応する約２０ヌクレオチドを５’末端に有し、その後に成熟ＣＤＴＸＡ．２２．２κ鎖の５’末端に対応する最初の２０ヌクレオチドと同じフレームにある各々の真核生物シグナル配列をコードする配列を従えている。これらのシグナル配列をコードするために選択されたコドンは、腸内細菌における高発現遺伝子で観察された優先的コドンの使用頻度（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．によるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）に一部基づいており、より少ない程度に、あらゆる副次的な構造（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ２０、２５２−２６４（２０００））の可能性を最小限にするように設計された。それは両者が発現レベルに影響を与える可能性があるからである。したがって、これらの配列に使われるコドンは、それら自然界の生物において使用されるコドンと幾分異なっていた。２０の異なる真核生物シグナル配列に対応する２０の抗体ＤＮＡカセットの増幅は、それぞれ、上述の５’プライマー群および前述の３’プライマーＯ（表２）を用い、５ｎｇのＣＤＴＸＡ．２２．２プラスミド（実施例１）を鋳型とし、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１８に記載の通り、Ｅｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラ−ゼを使用しておこなった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、実施例１に記載の通り、完全長インサートを切り出し、精製した。
【０１３３】
κ鎖および重鎖上で、それぞれｐｅｌＢおよびａｌｋＰ分泌シグナルを使用する真核生物シグナル配列抗体カセットを、コントロールクローンＷＣ２（実施例１）とともに、ＰｒｈａＳＢプロモーター下でより厳密に調節されているベクターＡＬ２．２へ導入してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析用抗体の発現に使用するクローンを生成するために修飾した。この修正を実現するため、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１８記載の通り、Ｅｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラ−ゼと、プライマーＨおよびＯ（表２）とを用い、各々、熱変成させたＷＣ２細胞ストック１μｌと、精製した真核生物シグナル配列抗体カセット５ｎｇとを鋳型として、ＷＣ２培養から抗体カセットを増幅し、また、真核生物シグナル配列抗体カセットを再増幅した。プライマーＨは、ＰｒｈａＳＢの３’末端に対応するＡＬ２．２ベクター配列を５’末端に有し、その後にｌａｃプロモーターの３’末端に特異的な配列が続く。
【０１３４】
実施例１の記載ように、抗体カセットおよびＡＬ２．２ベクターを用いて、アニーリングおよび電気穿孔を行い、その後播種した。これらのクローンは、元のＷＣ系の名前を保持し、ＡＬ２．２ベクターを示すために「Ａ」を後につけた。ＷＣ２Ａ−２２Ａクローンを増殖、誘導し、実施例３の記載のように、抗体を精製した。
【０１３５】
（表１：真核生物シグナル配列）
プラスミドクローン＊／シグナル配列説明／受託番号  
ＷＣ３／カルボキシペプチダーゼＹ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）／Ｍ１５４８２．１
ＷＣ４／ＫＲＥ５タンパク質（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）／Ｍ３３５６．１
ＷＣ５／アポリポタンパク質Ｃ−１前駆体（ラット（ｈａｔ））／ＡＰＣ１＿ＲＡＴ
ＷＣ６／アリールスルファターゼ前駆体（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）／ＡＲＳ＿ＣＨＬＲＥ
ＷＣ７／クララ細胞１０ｋｄ分泌タンパク質前駆体（ヒト）／１０ＫＳ＿ＨＵＭＡＮ
ＷＣ８／クロモグラニンＡ前駆体（ヒト）／ＣＭＧＡ＿ＨＵＭＡＮ
ＷＣ９／好中球ディフェンシン１，２，３前駆体（ヒト）／ＤＥＦＮ＿ＨＵＭＡＮ
ＷＣ１０／β−ヘキソサミニダーゼａ鎖前駆体（ヒト）／ＨＥＸＡ＿ＨＵＭＡＮ
ＷＣ１１／スパーク（ＳＰＡＲＣ）前駆体（ヒト）／ＳＰＲＣ＿ＨＵＭＡＮ
ＷＣ１２／腫瘍壊死因子前駆体２（ヒト）／ＴＮＲ２＿ＨＵＭＡＮ
ＷＣ１３／λ’ＣＬ（マウス）／Ｒｅｆ．Ａ
ＷＣ１４／κ６Ａ４’ＣＬ（マウス）／Ｒｅｆ．Ｂ
ＷＣ１５＊＊／嚢子壁タンパク質１（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）／Ｕ０９３３０
ＷＣ１６／κ鎖３−１３’ＣＬ（マウス）／Ｒｅｆ．Ｃ
ＷＣ１７／糖タンパク抗原ＢＭ８６前駆体（ウシダニ）／ＢＭ８６＿ＢＯＯＭＩ
ＷＣ１８／炭酸脱水酵素２前駆体（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎ．）／ＣＡＨ２＿ＣＨＬＲＥ
ＷＣ１９／セルロプラスミン前駆体（ヒト）／ＣＥＲＵ＿ＨＵＭＡＮ
ＷＣ２０／糖脂質アンカー型表面タンパク質前駆体（酵母）／ＧＡＳ１＿ＹＥＡＳＴ
ＷＣ２１／インターロイキン６受容体前駆体（ラット）／ＩＬ６Ｒ＿ＲＡＴ
ＷＣ２２／抑制酸性ホスファターゼ前駆体（酵母）／ＰＰＡ５＿ＹＥＡＳＴ
＊    クローンは、ｒｈａＳＢプロモーターの制御下で、ＡＬ２．２ベクターに存在する場合、名前の末尾に「Ａ」を付加する。
＊＊  ＰＣＲ増幅の結果、完全長インサートを成しえず、ＷＣ１５をこの研究から除外した。
参考文献：
Ａ）Ｂｅｒｎａｒｄら、（１９７８）ＣＥＬＬ  １５、１１３３〜１１４４頁。
Ｂ）Ｍａｒｇｅｔら、（１９８８）ＧＥＮＥ  ７４、３３５〜３４５頁。
Ｃ）Ｂｅｄｚｙｋら、（１９９０）ＪＢＣ  ２６５、１３３〜１３８頁。
【０１３６】
（表２：ＰＣＲおよび配列決定用プライマー配列（配列識別番号４〜４２））
【０１３７】
【表２−１】
2005517407.tif 000005
【０１３８】
【表２−２】
2005517407.tif 000006
【０１３９】
（実施例３）
（真核生物のシグナル配列の評価と選択）
本明細書に記載する通り、宿主細胞中での抗体重鎖または軽鎖ポリペプチドの発現を含めた、宿主細胞中のポリペプチド発現のための多種類のシグナル配列を評価し、選択した。誘導ラムノースプロモーター経由のバクテリア宿主細胞中を含め、培養宿主細胞中でポリペプチドを発現させた。試験には、ペプチド発現の評価（例、収率、量）とペプチドからのシグナル配列のプロセシング（例、切断）を含めた。例えば、検出可能なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるものを含む検出可能な発現、および例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で証拠付けられるようなものを含むポリペプチドからのシグナル配列のプロセシングの証拠は、発現のための真核生物のシグナル配列を選択することを可能にした。好ましい真核生物のシグナル配列は、効率的な発現（例えば、検出可能な、ごく弱いものでなく好ましくは強い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるポリペプチドバンド）および効果的なおよび／または完全なプロセシング（例えば、シグナル配列および／または発現されたポリペプチド鎖それぞれについてのプロセシングを示すポリペプチド鎖バンドの早い泳動、シグナル標識の完全なプロセシングを示す２つ以下の単一バンドの存在）をもたらすものである。発現および／またはプロセシングを検出するための多種類の方法が、本明細書に記述したＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を含め、当業者に周知であり、また利用されている。
【０１４０】
（ＣＤ．ＴＸＡ．２２．２抗体発現量による真核生物のシグナル配列の評価）
実施例２に記述した通り、異なるプラスミドすなわちＷＣ２Ａ〜ＷＣ２２Ａを含むクローンを２０セット構築し、誘導性ラムノースプロモーターにより抗Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＡ抗体（ＣＤＴＸＡ．２２．２）を発現させるのに用いた。全てのケースで、重鎖は原核生物のアルカリホスファターゼシグナル配列を用い人工的に作った。コントロールセットであるＷＣ２Ａでは、κ鎖は原核生物のｐｅｌＢシグナル配列を用いて作り、一方残りの１９においては、それを１９の異なる原核生物シグナル配列を用いて作った。全てのケースで、抗体重鎖に対してまた、そのＣ末端にアフィニティ精製を可能にするためにヘキサヒスチジンタグを設けた。これらのプラスミドに対して、培養中の選択を可能にするためテトラサイクリンおよびアンピシリン耐性遺伝子を持たせた。これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ  ｒｈａ＋株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に電気穿孔した。それぞれのセットからの３つのクローンについて、ＣＤＴＸＡ．２２．２抗体の発現に関し評価した。
【０１４１】
振蕩フラスコに−７０℃の細胞バンクからの細胞を植え付け、イノーバ（Ｉｎｎｏｖａ）４３３０冷蔵培養シェーカー（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）を用い一晩３７℃で培養した。細胞を、Ｌ−ロイシン０．３ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．３ｇ／Ｌ、カゼイン酵素加水酸化物１２ｇ／Ｌ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）、グリセロール１２．５ｇ／Ｌを補充した半合成培地（Ｐａｃｋ，Ｐ．ら、１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１〜１２７７）中で培養した。培地には選択を維持するために１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを補充した。この接種材料を５００ｍＬ振蕩フラスコに植え付け、それをまた３７℃で培養した。対数増殖期には、望ましい濃度でＬ−ラムノース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、タンパク質発現を誘導し、続いて温度を２３℃に制御した。バッチ処理終了後は、培養物をｐＨ７に調整し、１０ｍＭまでのイミダゾールを補充した。その後、培養物をＭ−１１０Ｙ  マイクロフリューダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）にて１７，０００ｐｓｉでホモジナイズした。
【０１４２】
キレートセファローズＦＦ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を０．１Ｍ  ＮｉＣｌ２で満たし、２０ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、０．０１％ＮａＮ３、ｐＨ８．０緩衝液で平衡化した。５００ｍＬの培養ホモジネートをそれぞれ５ｍＬの樹脂と共に、培養器シェーカーにて室温で培養した。このホモジネート／樹脂混合物を次いで漏斗の付いた使い捨てクロマトグラフィーカラムに注入した。樹脂はそのままカラムの中に定着させ、ホモジネートを真空ポンプで吸引した。再平衡化後、カラムを２０ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール、０．０１％ＮａＮ３、ｐＨ８．０緩衝液で溶出した。次に、使い捨てクロマトグラフィーカラムそれぞれに２ｍＬのプロテインＧセファローズＦＦ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を詰めた。カラムを２０ｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％ＮａＮ３、ｐＨ８．０緩衝液で平衡化した。最初の精製ステップからの溶出物をプロテインＧのカラムに装填した。再平衡化後、カラムを０．１Ｍグリシン、０．０１％ＮａＮ３、ｐＨ３．０緩衝液で溶出した。次いで、プロテインＧ溶出物にただちに１５０ｍＭまでのＮａＣｌを補充し、１ＭトリスｐＨ１０．２緩衝液でｐＨ８．０に中和した。精製された抗体は４℃で貯蔵した。
【０１４３】
精製した抗体について、１２％  トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で収率とバンドパターンを評価した。候補クローン、すなわち真核生物のシグナル配列に対応するもの、からは除外するものとして、次の基準を採用した。
【０１４４】
（ａ）  ゲル上のバンドの不在、抗体発現が検出できないことを示す；
（ｂ）  ゲル上の極めて薄いバンド、受け入れられないほどに弱い抗体発現を示す；
（ｃ）  κ鎖バンドの遅い泳動、シグナル配列のプロセシングのないことを示す；
（ｄ）  ２つ以上のκ鎖バンドの存在、シグナル配列の不完全なプロセシングを示す。
【０１４５】
これらにより、次の３つの真核生物のシグナル配列だけが選択基準に合致することになった。
【０１４６】
ヒトセルロプラスミン前駆体
ヒト好中球ディフェンシン１，２，３前駆体
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉアリールスルファターゼ前駆体
これら３つの真核生物シグナル配列の完全なプロセシングを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅタンパク質／ペプチドシーケンサー（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を使い、κ鎖上のＮ末端アミノ酸の配列を解読することで確かめた。これら３つのシグナル配列のポリヌクレオチド配列は表３に示す通りである。
【０１４７】
（表３  選択基準に合致する真核生物のシグナル配列クローンの配列）
ＷＣ６：  アリールスルファターゼ前駆体（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）シグナル配列  ５’−（ＡＴＧＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＴＣＧＣＴＧＴＡＧＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＧＣＣＧＴＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＡ）（配列番号４６）
ＷＣ９：好中球ディフェンシン１，２，３（ヒト）シグナル配列：５’−（ＡＴＧＣＧＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＧＣＧ）（配列番号４５）
ＷＣ１９：セルロプラスミン前駆体（ヒト）シグナル配列：５’−（ＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＴＣＧＧＴＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＴＡＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡ）（配列番号４３）
（実施例４）
（モノクローナル抗体の調製）
本明細書に記載したｒＭＥＴ１およびｒＭＥＴ．１０抗体を含め、モノクローナル抗体を選択し、調製した。
【０１４８】
（ｒＭＥＴ１およびｒＭＥＴ１０モノクローナル抗体の調製）
（Ｐ−（３−メルカプトプロピル）アミノ−ｄ−メタンフェタミンの合成）
Ｐ−（３−メルカプトプロピル）アミノ−ｄ−メタンフェタミン（還元メタンフェタミン誘導体）は米国特許第５，４７０，９９７号の実施例１１に記載された通りに合成することができる。
【０１４９】
（還元メタンフェタミン誘導体の結合体の調製）
還元メタンフェタミン誘導体とキーホールリンペットヘモシアン、ウシ血清アルブミン、およびアルカリホスファターゼとの結合体を次のように調製した。
【０１５０】
キーホールリンペットヘモシアン（ＫＬＨ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、スルフォスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と、ＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣを加えた上で１Ｎ水酸化カリウムによりｐＨを７から７．５に保ちつつ、室温で１時間以上撹拌して反応させた。反応しなかったＳＵＬＦＯ−ＳＭＣＣから、０．１Ｍリン酸カリウム、０．０２Ｍカリウムホウ酸塩、および０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０でのゲル濾過クロマトグラフィーを用い、タンパク質を分離した。還元メタンフェタミン誘導体をＫＬＨ−マレイミドに、推定されるマレイミド存在量を越える十分なモル濃度で加え、溶液を４℃で４時間かき混ぜ、次いで、免疫付与に先立って、３容量の１リットル発熱物質を含まないリン酸緩衝生理的食塩水ｐＨ７．４で透析した。
【０１５１】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ，Ｃａｌｚｙｍｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，ＣＡ）を、最低１００容積のカラム緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭカリウムホウ酸塩、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ７）を反対液とする透析に、２〜８℃で最低４時間かけた。ＡＰを使用する前に、緩衝液を最低２回取り替えた。ＡＰを透析から外し、室温に戻した時、その濃度を、溶液１ｍｇ／ｍＬにつき０．７７の吸光度を用い、２８０ｎｍでの吸光度で測定した。ＡＰをカラム緩衝液で５ｍｇ／ｍＬに薄めた。ＡＰとスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の反応を、ＳＭＣＣとＡＰの比率を２０：１にして行った。ＳＭＣＣを２０ｍｇ／ｍＬのアセトニトリルに溶かし、ボルテックスしかつ素早くかき混ぜながらＡＰに加えた。溶液を室温で９０分間放置した後、反応しなかったＳＭＣＣと低分子量の反応産物を、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｇ５０  Ｆｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使って、カラム緩衝液で平衡にしたカラムの中でＡＰから分離した。還元メタンフェタミン誘導体をＡＰ−ＳＭＣＣに、推定されるマレイミドの存在量を越える十分なモル濃度で加え、溶液を室温で最低１時間培養し、次いで３容量の２０ｍＭカリウムホウ酸塩、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ８．０を反対液とし透析した。メタンフェタミン−ＡＰを米国特許第６，０５７，０９８号の実施例９に示されるようにビオチニル化した。
【０１５２】
ＢＳＡを、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例９に示されるように、ビオチニル化した。ビオチニル化ＢＳＡをＳＭＣＣと、ＳＭＣＣのアセトニトリル溶液をＢＳＡ対ＳＭＣＣのモル比率１：１０でＢＳＡに加え、さらにその溶液のｐＨを１Ｎ水酸化カリウムで７から７．５の間に保ちつつ１時間室温でかき混ぜることで、反応させた。反応しなかった物質から、０．１Ｍリン酸カリウム、０．０２Ｍカリウムホウ酸塩、および０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０でのゲル濾過クロマトグラフィーにより、タンパク質を分離した。還元メタンフェタミンをＢＳＡ−ＳＭＣＣに、推定されるマレイミドの存在量を越える十分なモル濃度で加え、溶液を室温で最低１時間攪拌した。反応しなかった物質は、大規模な透析により、０．１Ｍリン酸カリウム、０．０２Ｍカリウムホウ酸塩、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の中に取り除いた。
【０１５３】
（ＢＳＡ−ＳＭＣＣの調製）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，２０ｍｇ／ｍｌ）とＳＭＣＣとの反応を、ＳＭＣＣのアセトニトリル溶液をＢＳＡ対ＳＭＣＣのモル比率１：５０でＢＳＡに加え、さらにその溶液のｐＨを１Ｎ水酸化カリウムで７から７．５の間に保ちつつ１時間室温でかき混ぜることで、おこなった。反応しなかった物質から、０．１Ｍリン酸カリウム、０．０２Ｍカリウムホウ酸塩、および０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０でのゲル濾過クロマトグラフィーにより、タンパク質を分離した。β−メルカプトエタノール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｕｂｕｒｇｈ，ＰＡ）をＢＳＡ−ＳＭＣＣに、推定されるマレイミドの存在量を越える十分なモル濃度で加え、溶液を室温で最低１時間攪拌した。遊離メルカプトエタノールは、大規模な透析により、０．１Ｍリン酸カリウム、０．０２Ｍカリウムホウ酸塩、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の中に取り除いた。
【０１５４】
（ファージ提示ライブラリーからのｒＭｅｔ１の選択）
米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１〜４および７に記載の通り、ＢＳ４５ウラシル鋳型を用い、還元メタンフェタミンＫＬＨにより免疫されたマウスの脾臓から精製されたＲＮＡを用い、ファージ提示ライブラリーを作製した。還元メタンフェタミンＡＰビオチン結合体に結合した抗体ファージを、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１５に記載の通り、選択した。還元メタンフェタミンＡＰビオチンよりはるかに大量のＢＳＡ−ＳＭＣＣを抗体ファージに加え、何ラウンドかのパンニング法により、ＳＭＣＣリンカーに特異的な抗体を取り除いた。パンニング法の５回目のラウンドの後、抗体ファージを、還元メタンフェタミンＡＰビオチン、およびそれらの薬剤と交差反応するメタンフェタミン抗体を取り除くための何種類かの過剰な薬剤と共に、インキュベートした。加えられた交差反応薬剤は、＋エフェドリン、−エフェドリン、ｄ−擬エフェドリン、ラニチジン、プロカインアミド、フェンメトラジン、およびトリメトベンズアミドであった。これらの交差反応物質の存在下で、２ラウンドの選択を行った。アビジン乳濁液と結合したファージのアリコートを、これらの交差反応物質の存在下で、１００ｍｍＬＢ平板に播種し、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１５に記載の通り、プラークをニトロセルロースフィルターでオーバーレイした。このフィルターは、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１５に記載の通り、ＡＰ−還元メタンフェタミン結合体を用いて開発した。ポジティブなプラークは、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１８に記載の通り、ｐＢＲｎｃｏＨ３発現プラスミド中にサブクローニングした。これらのクローンのうち１つをｒＭＥＴ１と名付けた。
【０１５５】
抗体ｒＭＥＴ１０は、ｒＭｅｔ１と同じ抗体配列である。しかし、κ鎖の３’末端の１０ヌクレオチドが欠失していた。ｒＭｅｔ１の凍結ストック細胞を鋳型として用い（実施例１参照）、Ｅｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラーゼを使ってＰＣＲ反応を２回行った（米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１８）。第１の反応は、オリゴヌクレオチドＫＫおよびＱ（表２）を用いて行った。第２の反応は、オリゴヌクレオチドＰおよびＯ（表２）を用いて行った。米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１８に記載の通り、両方のＰＣＲ産生物を精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで消化し、ｐＢＲｎｃｏＨ３にサブクローニングした。ｒＭｅｔ１およびｒＭｅｔ１０クローンについて、ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、Ｓｅｑｕａｔｈｅｒｍシーケンシングキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とＬＩ−ＣＯＲ  ４０００Ｌ自動シーケンサー（ＬＩ−ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ．ＮＥ）とを用いたジデオキシ鎖終止法により配列を決定した。κ鎖の５’末端、および重鎖の３’末端にそれぞれ結び付くオリゴヌクレオチドプライマーＪＪおよびＮ（表２）を用いた。
【０１５６】
（実施例５）
（発現ベクターへのクローニング）
本明細書中に記載されているｒＭＥＴ１０モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローニングした。
【０１５７】
（ヒトセルロプラスミンシグナル配列（配列番号１）をκ鎖および重鎖の両方に用いたＡＬ２．２ベクターへのｒ−メタンフェタミン１０（ｒＭＥＴ１０）抗体のクローニング）
モノクローナル抗体ｒＭＥＴ１０は、実施例４に記載の選択プロセスとクローニングプロセスによって得た。元の構成では、κ鎖および重鎖の分泌を指示するために、ｐｅｌＢシグナル配列およびアルカリホスファターゼシグナル配列をそれぞれ用いた。これらのシグナル配列をヒトセルロプラスミンシグナル配列に変換するため、κ鎖および重鎖を別々に増幅し、その後、サブクローニングプロセスの際にκ鎖−重鎖カセットに再構成した。κ鎖は、プライマーＳとプライマーＧ（表２）とを用いて増幅した。プライマーＳは、ｒＭＥＴ１０に特異的な配列を有することに加えて、ＰｒｈａＳＢの３’末端に対応する約２０ヌクレオチドのＡＬ２．２ベクター配列をその５’末端に含み、それに続き、κ鎖と同じフレームにあるヒトセルロプラスミンシグナル配列をコードする配列を含む。プライマーＧは、ファージ提示ベクター内のκ鎖の終止コドンの下流にあり、かつ重鎖のリボソーム結合部位の上流にある領域に結合する。重鎖は、プライマーＴとプライマーＲ（表２）とを用いて増幅した。プライマーＴは、ｒＭＥＴ１０に特異的な配列を有することに加えて、プライマーＧに相補的な約２０ヌクレオチドをその５’末端に含み、それに続き、重鎖と同じフレームにあるヒトセルロプラスミンシグナル配列をコードする配列を含む。
【０１５８】
組み換えの確率を最小にするため、重鎖のセルロプラスミンシグナル配列と、κ鎖のセルロプラスミンシグナル配列（表４）について用いたヌクレオチド配列がＥ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度を考慮に入れながらも、実際に用いられたコドンができる限り異なるものとなるようにした。５ｎｇのｒＭＥＴ１０プラスミドを鋳型として用い、κ鎖および重鎖を別々のＰＣＲ反応で増幅し、精製の後、米国特許第６，０５４，０９８号、実施例１８の記載と同様に、Ｔ４消化を行い、クローニングの準備とした。ｒｍｅｔ１０プラスミドは、製造元の推奨にしたがって、ｒＭＥＴ１０クローン（実施例４）を一晩培養したものからＱｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いて調製した。Ｔ４消化の後、試料を冷却し、短時間遠心した。κ鎖および重鎖の消化済みインサート各５０ｎｇを、新しい微量遠心チューブ中の消化済みＡＬ２．２ベクター１００ｎｇに加えた。１．０μｌの１０×アニーリング緩衝液を添加した後、水で容量を１０μｌにし、インサートとベクターとをアニーリングさせるため、混合液を２分間、７０℃に加熱し、さらに２０分以上の時間をかけて室温まで冷却した。アニーリングしたＤＮＡを蒸留水で１対３に希釈し、その１μｌを４０μｌのエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂに電気穿孔し（米国特許第６，０５７，０９８号の実施例８）、実施例１２の記載同様、播種した。コロニーをとり、５０ｍｌの２倍ＹＴ（テトラサイクリン、２０μｇ／ｍｌ）中で３７℃にて、一晩培養した。翌日、−８０℃における長期保存のため、クローンｒＭＥＴ．１０．ＬＳ．１についてグリセロール凍結保存ストックを調製し、プラスミドは、一晩培養した残りから、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用い、製造元の推奨にしたがって精製した。配列は、実施例１の記載同様、Ｍａｃｃｏｎｎｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈで、プライマーＫおよびプライマーＮ（表２）を用いて確認した。クローンｒＭＥＴ１０．ＬＳ．１を発現し、実施例６の記載同様、ニッケルキレートクロマトグラフィーで首尾良く精製した。
【０１５９】
【表４】
2005517407.tif 000007
【０１６０】
（実施例６）
（発現の用量試験）
本明細書中に記載されているｒＭＥＴ１０抗体を含む、ポリペプチド発現の用量試験を行った。
【０１６１】
（２種のＥ．ｃｏｌｉ株における、ｒＭＥＴ１０抗体発現のＬ−ラムノース用量試験）
ｒＭＥＴ１０抗体の発現用プラスミドは、実施例５の記載と同様に構築した。このコンストラクト中のκ鎖および重鎖は、ともに、ヒトセルロプラスミンシグナル配列をもつように加工した。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ  ｒｈａ＋株に電気穿孔することで、クローンｒＭＥＴ１０．ＬＳ．１を生成し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン選択下で培養した。このプラスミドをまた、別のＥ．ｃｏｌｉ  ＥＣＬ３３９  ｒｈａ−株（ＡＴＣＣ）に電気穿孔することで、クローンｒＭＥＴ１０．ＥＣＬ．２０を生成した。宿主株がゲノムにテトラサイクリン耐性遺伝子をもつため、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン選択下でこのクローンを培養した。
【０１６２】
これら２つのクローンのフラスコ振盪培養５００ｍｌを複数個複製し、異なった濃度のＬ−ラムノースによって誘導した。ＥＣＬ３３９  ｒｈａ−細胞を誘導するのに、比較的小量のＬ−ラムノースが必要であったが、それはこの糖がこの細胞株によって代謝されていないためである。抗体は、実施例３に記載された手順にしたがって、精製された。抗体の濃度は、ＵＶ−１２０１分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）で２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、減衰係数１．６（ｍＬ）／（ｍｇｃｍ）を用いることによって決定した。抗体活性は、機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。ビオチン化された標的抗原（実施例４）を、９６穴Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（登録商標）プレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にコーティングした。試料抗体を捕捉し、ヤギ抗（マウスκ鎖）−アルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）で標識した。最後に、ＥＬＩＳＡ増幅試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、比色分析シグナルを発色させた。４９０ｎｍにおける最終読み取り値をＶｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で測定し、ＳＯＦＴｍａｘ（登録商標）ＰＲＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、データを分析した。比較のため、精製された抗体収率を表５に示す。最適ラムノース濃度で生産された抗体に関し、ＥＬＩＳＡ標準曲線を図１に示す。
【０１６３】
（実施例７）
（発現の追加用量試験）
本明細書中に記載されているｒＭＥＴ１抗体を含む，ポリペプチド発現の追加用量試験を行った。
【０１６４】
（２種のＥ．ｃｏｌｉ株における，ｒＭＥＴ１抗体発現のＬ−ラムノース用量試験）
プラスミドｐＢＲｓａｃＨ３（実施例１）を、ｒＭＥＴ１抗体（実施例９）のクローニングに用いた。この実験で、κ鎖および重鎖を加工して、それぞれヒトセルロプラスミンシグナル配列およびヒト好中球ディフェンシンシグナル配列を、持つようにした（実施例９）。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ  ｒｈａ＋株に電気穿孔することで、クローンｒＭＥＴ１．ＬＳ．１を生成し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン選択下で培養した。このプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＣＬ３３９  ｒｈａ−株に電気穿孔することで、クローンｒＭＥＴ１．ＥＣＬ．１を生成し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン選択下で培養した。
【０１６５】
これら２つのクローンのフラスコ振盪培養５００ｍｌを複数個複製し、異なった濃度のＬ−ラムノースによって誘導した後、実施例６の記載同様、精製し、分析した。比較のため、精製された抗体収率を表６に示す。最適Ｌ−ラムノース濃度で生産された抗体に関し、ＥＬＩＳＡ標準曲線を図２にプロットした。
【０１６６】
【表５】
2005517407.tif 000008
【０１６７】
【表６】
2005517407.tif 000009
【０１６８】
（実施例８）
（真核生物シグナル配列をもった提示ベクターの構築）
本明細書に記載されている抗体ファージ提示ベクターを含む、真核生物シグナル配列をもった提示ベクターを構築した。
【０１６９】
抗体クローニング用の抗体ファージ提示ベクターを、Ｍ１３ベクターＢＳ５１から得た。ＢＳ４５にあるｐｅｌＢシグナル配列の最後のコドンが、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発によって、ＢＳ５１から取り除かれていることを除いて、ＢＳ５１は、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例５に記載されているＢＳ４５と同一である（Ｋｕｎｋｅｌ，ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８２：４８８（１９８５）；  Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７（１９８７））。
【０１７０】
カッパ鎖および重鎖の原核細胞シグナル配列を、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発によって、ＢＳ５１から削除した。オリゴヌクレオチドＢＢ（表２）は、カッパ鎖上のｐｅｌＢシグナル配列を削除するのに用い、オリゴヌクレオチドＣＣ（表２）は、重鎖上のアルカリホスファターゼシグナル配列を削除するのに用いた。
【０１７１】
オリゴヌクレオチドＭおよびオリゴヌクレオチドＫＫ（表２）、ならびにオリゴヌクレオチドＭおよびオリゴヌクレオチドＬＬ（表２）を用いたＰＣＲによって、両鎖の定常領域を含むＤＮＡ配列を増幅し、その後、ＤＮＡアガロースゲルでＰＣＲ産物の大きさを判定することによって、両シグナル配列の削除を決定した。このＰＣＲでは、ｃＤＮＡではなく、ファージ１μｌが鋳型であったが、そのことを除いては、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例３に記載の２本鎖ＤＮＡのＰＣＲと同様に行われた。望み通りの削除が行われたファージは、オリゴヌクレオチドのどちらの組み合わせでも、ＰＣＲ産物を生じなかった。アガロースゲル電気泳動法によってＰＣＲ産物が検出されなかった２つのクローンに関し、カッパ鎖の３’側と重鎖の３’側とにそれぞれ結合するオリゴヌクレオチドプライマーＬおよびオリゴヌクレオチドプライマーＭ（表２）を用いて、実施例１の記載と同様に、それらの配列をマックコーネルリサーチ（Ｍａｃｃｏｎｎｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で確認した。両クローンとも正しい配列をもっていた。米国特許第６，０５７，０９８号、実施例６の記載と同様に、両方の欠失をもつ１個のファージストックからウラシル鋳型を調製した。この鋳型、すなわちＢＳ５５は、カッパ鎖およびＩｇＧ１用の真核生物シグナル配列を挿入するのに用いた。
【０１７２】
真核生物シグナル配列を、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発によってＢＳ５５に挿入した。オリゴヌクレオチドＤＤ（表２）は、配列番号４３のシグナル配列をカッパ鎖に挿入するのに用い、オリゴヌクレオチドＥＥ（表２）は、配列番号４５のシグナル配列を重鎖に挿入するのに用いた。オリゴヌクレオチド１（表８）およびオリゴヌクレオチドＨ（表２）を用いたＰＣＲによって、両鎖の定常領域を含むＤＮＡ配列を増幅し、その後、ＤＮＡアガロースゲルでＰＣＲ産物の大きさを判定することによって、両シグナル配列が挿入されているかを決定した。このＰＣＲでは、ｃＤＮＡではなく，ファージ３μｌが鋳型であったが、そのことを除いては、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例３に記載の２本鎖ＤＮＡのＰＣＲと同様に行われた。望み通りの挿入が行われたファージは、ＢＳ５５対照群より大きいＰＣＲ産物を有した。アガロースゲル電気泳動法によって２重挿入を見られるものを有する３つのクローンに関し、カッパ鎖の３’側と重鎖の３’側とにそれぞれ結合するオリゴヌクレオチドプライマーＬおよびオリゴヌクレオチドプライマーＭ（表２）を用いて、実施例１の記載と同様に，それらの配列をマックコーネルリサーチ（ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で確認した。３種類のクローンすべてが、正しい配列をもっていた。この真核生物シグナル配列をもつウラシル鋳型は、ＢＳ６０と呼ばれ、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例６の記載と同様に調製した。
【０１７３】
（実施例９）
（ポリペプチドの提示と選択）
抗体ファージ提示ベクターを含む、真核生物シグナル配列をもった提示ベクターをポリペプチドの提示と選択に利用した。
【０１７４】
（真核生物シグナル配列をもったファージ提示ベクターにおける、ｒＭｅｔ１の提示と選択）
米国特許第６，０５７，０９８号、実施例３および実施例４の記載とほぼ同様に、カッパ鎖および重鎖可変領域の一本鎖ＤＮＡ配列をｒＭｅｔ１用に調製した。オリゴヌクレオチド４１と９７１（表７）はカッパ鎖可変領域を増幅するのに用いられ、オリゴヌクレオチド２０４と１１７０（表８）は、重鎖可変領域を増幅するのに用いられた。一本鎖ＤＮＡ反応（それぞれ４Ｘ１００μｌ）は、オリゴヌクレオチド１のみを重鎖用に用い、オリゴヌクレオチド２のみをカッパ鎖用に用いて行った（表７および表８）。一本鎖ＤＮＡを精製し、ウラシル鋳型ＢＳ６０に結合させた。これは、２５０μｇスケールのみのウラシル鋳型が用いられたことを除き、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例７の記載と同様に行われた。アニーリングは、試料を７０℃で２分間インキュベートし、３７℃より低い温度にゆっくり冷却することによって行われた。エクステンションおよびライゲーションの後、９０μｌの突然変異誘発停止緩衝液を混合液に加え、１μｌの希釈ＤＮＡを、米国特許第６，０５７，０９８号実施例８の記載と同様に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１２Ｓの電気穿孔用コンピテントセル４０μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に電気穿孔した。電気穿孔した細胞のアリコートを、１００ｍｍプレートの上にプレーティングした。プレート上のプラークにニトロセルロースフィルターをかぶせ、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例１３の記載と同様に、ＡＰ−メタンフェタミンでフィルターを展開した。機能的陽性プラークを選択し、５０μｌの２倍ＹＴにとった。
【０１７５】
【表７−１】
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【０１７６】
【表７−２】
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【０１７７】
【表８−１】
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【０１７８】
【表８−２】
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【０１７９】
ｒＭＥＴ１突然変異誘発のプラークリフトで得た機能的陽性プラークを、Ｍ１３表面での抗体提示用に選択した。プレートからプラークをとり、５０μｌの２ＹＴにいれた。チューブをボルテックスにかけ、その後、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例１２の記載と同様に、ファージ４０μｌを１５０ｍｍのＬＢアガープレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で４時間、さらにその後、２０℃で一晩インキュベートした。抗体ファージは、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例１５の記載と同様にして、プレートから溶出した。２００μｌのファージを２ｍＬのパンニング緩衝液（４０  ｍＭ  ＴＲＩＳ，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０  ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ，  ０．２５％  カゼイン，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０  （Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ），  ｐＨ  ７．５）に希釈し、ファージを２×１ｍＬ画分に分注することによって、ファージをパンニング用に調製した。画分の１つに、１０μＬの１０−６Ｍの還元メタンフェタミンＢＳＡ−ビオチン（実施例４）を加え、２番目の画分には何にも加えなかった。抗体と抗原との間の均衡を獲得するため、試料を室温で１時間インキュベートした。米国特許第６，０５７，０９８号、実施例１４の記載とほぼ同様に、アビジン磁気ラテックス（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｆｉｓｈｅｒｓ，  ＩＮ）を用いて、ファージ試料のパンニングを行ったが、以下のような違いがあった。液体操作ステップすべてを、テカンジェネシス１５０ロボット（Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  １５０  ｒｏｂｏｔ（Ｔｅｃａｎ，  Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，  ＮＣ））において、製造元の推奨にしたがって行った。１０分間、アビジンラテックスをファージとインキュベートした後、チューブを磁石の上に置き、パンニング緩衝液でファージを希釈することなく、ラテックスを分離した。アビジンラテックスを、３回、各１ｍＬのパンニング緩衝液で洗った。最後の洗浄の後、アビジンラテックスを５００μＬの２ＹＴに再懸濁した。フォアグランド試料およびバックグランド試料から、ラテックスのアリコートをとり、１００ｍｍのＬＢアガープレート上にプレーティングした（米国特許第６，０５７，０９８号の実施例１２）。プラークの計数を行ったところ、フォアグランドのバックグラウンドに対する比が６１７：１であった。このことは、Ｍ１３ファージ上での抗体の提示が非常によいことを示す。
【０１８０】
米国特許第６，０５７，０９８号、実施例１８の記載とほぼ同様に、選択された機能的陽性プラークの１つをｐＢＲｓａｃＨ３（実施例１）にサブクローニングした。このモノクローナル抗体をサブクローニングする際、重鎖可変領域およびカッパ鎖を増幅するのに、オリゴヌクレオチドＷ（表２）およびオリゴヌクレオチド１（表８）を用い、重鎖定常領域を増幅するのに、オリゴヌクレオチドＲとオリゴヌクレオチドＭＭ（表２）を用いた。各ＰＣＲ反応に、３μＬのファージを鋳型として用いた。米国特許第６，０５７，０９８号、実施例１８の記載と同様に、２つのＰＣＲ産物およびｐＢＲｓａｃＨ３ベクター（ともに、ＳａｃＩ，およびＨｉｎｄＩＩＩで切断されている）のすべてを、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで消化、アニールし、さらに電気穿孔に用いた。カッパ鎖５’側および重鎖３’側にそれぞれ結合するオリゴヌクレオチドプライマーＫおよびオリゴヌクレオチドプライマーＮ（表２）を用い、実施例１の記載と同様に、３つのｒＭｅｔ１クローンをＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈで配列決定した。
【０１８１】
（実施例１０）
（ポリクローナルファージ富化）
本明細書に記載されているパンニング法を含めたポリペプチド発現およびポリペプチド提示に用いる、真核生物シグナル配列をもったポリクローナルファージの富化を行った。
【０１８２】
真核生物シグナル配列をもった、マトリックスメタロプロテナーゼ９前駆体（ｐｒｏＭＭＰ９）に対するポリクローナルファージのポリクローナルファージ富化
ＢＳ６０ウラシル鋳型（実施例８）を用い、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例７とほぼ同様にして、第１ラウンド抗体ファージを調製したが、ここでは以下のような相違を伴っていた。表７および表８に示すオリゴヌクレオチドを用い、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例３の記載と同様にして、二本鎖ＰＣＲ産物を調製した。相補的ｃＤＮＡの独立した調製（米国特許第６，０５７，０９８号、実施例２）は行わなかった。代わりに、プラチナＴａｑ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ）によるスーパースクリプトワンステップＲＴ−ＰＣＲ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いて、ＲＮＡ鋳型から始まるＤＮＡ増幅を、製造元の推奨にしたがって行った。一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡから分離するＨＰＬＣの勾配（米国特許第６，０５７，０９８号の実施例４）を短くした。以下の熱プロフィールを用い、ウラシル鋳型とｓｓ−ＤＮＡインサートのアニーリングを行った。すなわち、７０℃を２分間３０秒、７０℃から４２℃までの傾斜（ｒａｍｐ）を１０分以上、４２℃で１０秒間維持（ｈｏｌｄ）、４℃で保存（ｓｔｏｒｅ）である。突然変異誘発ＤＮＡは、キアクイック（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用い、製造元の説明にしたがって精製した。３０μＬの溶出緩衝液で突然変異誘発ＤＮＡをカラムから溶出し、１μＬをＤＨ１２Ｓの電気穿孔用コンピテントセル４０μＬに電気穿孔した。電気穿孔された細胞を、一晩培養したＸＬ１細胞（０．６ｍＬ）と２ＹＴ（０．４ｍＬ）との混合液１ｍＬに再懸濁した。１ｍＬの試料すべてを、１５０ｍｍのＬＢアガープレート上にプレーティングした。プレートを３７℃で４時間、さらにその後、２０℃で一晩インキュベートした。第１ラウンドの抗体ファージ試料は、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例１５の記載と同様にして、プレートから溶出した。
【０１８３】
２つの異なった脾臓からの突然変異誘発ＤＮＡを用い、４回の電気穿孔（各脾臓、２回の電気穿孔）を行った結果、４種の異なったファージ試料を得た。各試料に関し、第１ラウンドファージ９５０μＬ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）５０μＬ、３００ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ  ３０μＬ、５％  カゼイン５０μＬ（Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｎ  ｇｒａｄｅ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）と、１０−７Ｍ  ｐｒｏＭＭＰ９−ビオチン（実施例４）１１μＬとを混合し、室温で３時間インキュベートすることによって、ｐｒｏＭＭＰ９−ビオチンとのパンニングをセットアップした。
【０１８４】
ｒＭＥＴ１抗体ファージを用いた実施例９の記載と同様にして、アビジン磁気ラテックスを用いて、抗体ファージ試料のパンニングを行った。最後の洗浄の後、各ラテックスを５００μＬの２倍ＹＴに再懸濁し、その後、第２ラウンドの抗体ファージを調製するために、各試料全体のラテックスを１５０ｍｍのＬＢプレート上にプレーティングした。１５０ｍｍプレートを３７℃で４時間、さらにその後、２０℃で一晩インキュベートした。
【０１８５】
生じた第２ラウンド抗体ファージ試料を、カッパチェーン上のデカペプチドタグと、７Ｆ１１磁気ラテックスとを用い、米国特許第６，０５７，０９８号、実施例１６の記載とほぼ同様にして、多価提示（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｄｉｓｐｌａｙ）用に富化した。液体操作ステップのすべてを、テカンジェネシス１５０ロボットにおいて、製造元の推奨にしたがって行った。各試料に関し、７Ｆ１１／デカペプチドで富化したファージ１ｍＬと、１．４９×１０−６ＭのｐｒｏＭＭＰ９−ビオチン５μＬとを混合し、室温で１．５時間インキュベートすることによって、ｐｒｏＭＭＰ９ービオチンとのパンニングをセットアップした。ラウンド１抗体ファージについての上記の記載と同様に、アビジン磁気ラテックスを用いてファージ試料のパンニングを行い、さらにＬＢアガープレート上にプレーティングした。
【０１８６】
生じた第３ラウンドの抗体ファージ試料を、第２ラウンドの抗体ファージ試料に関する上記の記載と同様に、カッパチェーン上のデカペプチドタグと、７Ｆ１１磁気ラテックスとを用いて、多価提示用に富化し、その後アビジン磁気ラテックスでパンニングを行った。
【０１８７】
第４ラウンドの各ファージストック１５０μＬを混合することによって、第４ラウンドの抗体ファージ試料をプールした。パンニング緩衝液９００μＬと、プールされた第４ラウンドの抗体ファージ１００μＬとを用い、上記の記載と同様に、プールされた抗体ファージを第４ラウンドの機能的パンニング用に二連でセットアップした。試料の１つ（フォアグランド）に、１０−７ＭのｐｒｏＭＭＰ９−ビオチン１０μＬを加え、もう一方の試料（バックグラウンド）には、ｐｒｏＭＭＰ９ビオチンを加えずに、磁気ラテックスに対するファージの非特異的結合をモニターするブランク（ｂｌａｎｋ）として用いた。２〜８℃での一晩のインキュベーションの後、上記の記載と同様に、アビジン磁気ラテックスでファージ試料のパンニングを行った。翌日、第５ラウンドの抗体ファージを溶出し、フォアグランドプレート上のプラーク数、およびバックグラウンドプレート上のプラーク数の計数を行った。フォアグランド：バックグラウンドの比は、２．１：１であった。
【０１８８】
第４ラウンドのファージに関する上記の記載と同様に、第５ラウンドの抗体ファージを二連でセットアップしたが、このとき、１．４９ｘ１０−６ＭのｐｒｏＭＭＰ９−ビオチン６．７μＬをフォアグランド試料に加えたことが異なる。１時間室温においた後、アビジン磁気ラテックスでファージ試料のパンニングを行い、上記の記載と同様に処理した。第６ラウンドの抗体ファージ試料における、フォアグランド：バックグラウンドの比は、２１．８：１であった。これらの結果は、多様な抗体のライブラリーがファージ上に提示されており、さらにアフィニティーの高い抗体が選択されたことを示す。
【０１８９】
（実施例１１）
（ポリペプチドのクローニング、発現、精製、および修飾）
本明細書に記載したように、抗体産生の免疫原として有用なポリペプチド等のポリペプチドのクローニング、発現、精製、および修飾をおこなった。
【０１９０】
（ヒトマトリックスメタロプロテナーゼ−９前駆体（ｐｒｏＭＭＰ９）のクローニング、発現、精製、およびビオチン化）
抗体産生に用いた免疫原は、バイオサイト社（Ｂｉｏｓｉｔｅ    Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）によって調製した。ＰＣＲプライマーは、ヒトｐｒｏＭＭＰ９の５’末端の配列およびヒトｐｒｏＭＭ９の３’末端のコード配列とに一致させた（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ０５０７０）。上記プライマーは、６つのヒスチジンコドン、プライマーＦＦ、およびＧＧを含み、それぞれがコード配列の一端と停止コドンとのあいだあり、かつ金属キレートアフィニティクロマトグラフィによる組み換えタンパク質の精製を補助する（表２）。５’プライマーも同様に、ＥｃｏＲＩ部位およびすぐ上流の配列に対応する５’末端に２１塩基対のｐＥＡＫ１２ベクター配列（Ｅｄｇｅ    ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む。３’プライマーは、約２０ヌクレオチドのベクター配列を有し、その５’末端に６塩基のＮｏｔＩ部位およびすぐ下流の配列が含まれる。これらのプライマーの５’末端にあるベクター配列は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって、ｐＥＡＫ１２ベクターのものに対して特異的かつ相補的である単一鎖のオーバーハングを形成する。ｐｒｏＭＭＰ９遺伝子インサートのＰＣＲ増幅を、５’プライマー（ＦＦ）１００ｐｍｏｌ、３’プライマー（ＧＧ）１００ｐｍｏｌ、エクスパンドポリメラーゼ２．５単位、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  １０μｌ、１０ｘエクスパンド反応緩衝液１０μｌ、鋳型としてクロンテッククイック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｑｕｉｃｋ）−クローンヒト脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）  １μｌ、および水１００μｌを含む２ｘ１００μｌ反応スケールでおこなった。反応は、実施例１８（米国特許第６，０５７，０９８号）の記載にしたがって、パーキンエルマーサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）でおこなった。ＰＣＲ産物を沈殿させ、アガロースゲル電気泳動で画分化して、全長の産物をゲルから切り出し、精製し、さらに水に再懸濁した（実施例１７、米国特許第６，０５７，０９８号）。インサートの挿入に備え、ｐＥＡＫ１２ベクターをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ（（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）による消化によって調製した。Ｔ４エクソヌクレアーゼ消化のために、ＤＮＡ１．０μｇに１０×緩衝液Ａ１．０μｌを添加し、さらに水によって最終容量を９μｌにすることで、インサートおよびＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＥＡＫ１２ベクターを調製した。試料を１μｌ（１Ｕ／μｌ）のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで３０℃、４分間にわたり消化した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを７０℃、１０分間インキュベートすることで、加熱による不活性化をおこなった。試料を冷やし、軽く遠心し、さらに新しい微小遠心管で消化インサート４５ｎｇを消化ｐＥＡＫ１２ベクター１００ｎｇに添加した。１．０μｌの１０倍アニーリング緩衝液を加えた後、水で容量を１０μｌにした。混合物を７０℃、２分間加熱し、２０分間以上冷やして室温にし、インサートおよびベクターのアニーリングを可能にした。アニールＤＮＡを希釈水によって１対４に希釈し、３０μｌのエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ株（Ｉ���ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を電気穿孔（実施例８、米国特許第６，０５７，０９８号）にかけた。形質転換細胞を２倍ＹＴブロスで１．０ｍｌに希釈し、アンピシリン（７５μｇ／ｍｌ）添加ＬＢ寒天プレート上に１０μｌ、１００μｌ、３００μｌプレーティングし、さらに３７℃で一晩増殖させた。コロニーを取り、２倍ＹＴ（３７℃で７５μｇ／ｍｌアンピシリン）で一晩増殖させた。翌日、長期間−８０℃保存のためにグリセロールストックを作製した。これらのクローン（ｐｒｏＭＭＰ９ピーク１２）の配列を、実施例１に記載したように、ｐＥＡＫ１２ベクター内のインサートの５’および３’側に結合したオリゴヌクレオチドプライマーＨＨおよびＩＩ（表２）をそれぞれ用いて、マックコーネルリサーチ（ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で確認した。ヒトｐｒｏＭＭＰ９のトランスフェクションおよびそれに続く発現および精製に好適なプラスミドを、エンドフリープラスミドメガキット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ）を用い、かつ製造元の推奨（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って、クローンｐｒｏＭＭＰ９ピーク１２．２から調製した。
【０１９１】
ＨＥＫ２９３（「ピーク（ｐｅａｋ）」）細胞を５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｌｅｎｅｘａ，  ＫＳ）、２０単位／ｍｌヘパリン、０．１％プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８（（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を含有するＩＳ２９３培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）の凍結バイアルストック（５×１０６細胞／ｍｌ）１ｍｌからＴ−７５フラスコに展開させた。温度３７℃、湿度８５％、およびＣＯ２濃度５％で２〜３日間インキュベートした後、培地中のＦＢＳを２％に減少させるとともにＴ−１７５フラスコに細胞を展開させた。次に、細胞を２〜３週間にわたって１：２に展開させることで、結合した細胞からなる一貫性のある単層が形成される。上記方法によって増殖したピーク細胞を１０００ｒｐｍ、６分間遠心し、上清を捨てた。細胞数を数えて密度を定め、標準的な色素試験による最小９０％生存度を調べた後、細胞を２％ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン含有のＩＳ２９３（４００ｍｌ）に５ｘ１０５細胞／ｍｌで懸濁し、さらに１Ｌ浸透フラスコに添加した。次に、円錐管に、４００ｍｌ浸透フラスコ１本あたり５ｍｌのＩＳ２９３と３２０μｇのｐｒｏＭＭＰ９ＤＮＡを添加した。これを混合し、２分間、室温でインキュベートした。浸透フラスコ１本あたり４００μｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＲＯ１５３９トランスフェクション（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を上記円錐管に添加して混合し、さらに室温で２０分間、インキュベートした。混合物を浸透フラスコに添加し、温度３７℃、湿度８５％、およびＣＯ２濃度５％で４日間、１００ｒｐｍでインキュベートした。上記浸透フラスコから細胞ブロスを３，５００ｒｐｍ、２０分間で沈降させ、上清をｐｒｏＭＭＰ９の精製のために保存した。ＮｉＣｌ２を充填したキレーティングファストフロー樹脂（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）２０ｍｌを含有するカラムをＢＢＳ（２０ｍＭ  ホウ酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０１％  ＮａＮ３）で平衡化させた。次に、浸透フラスコの上清をカラムに載せ、ＢＢＳおよび１０ｍＭイミダゾールで洗浄し、さらにＢＢＳおよび２００ｍＭイミダゾールで溶出させた。溶出液は、ＣａＣｌ２を１０ｍＭまで加えた後の次の精製ステップの装填物として使用した。５ｍＬゼラチンセファロース４Ｂ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）含有カラムをＢＢＳおよび１０ｍＭ  ＣａＣｌ２緩衝液で平衡化させた。抗体を載せた後、カラムを平衡緩衝液で洗浄し、さらにｐｒｏＭＭＰ９をＢＢＳ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、および２％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）緩衝液で溶出させた。ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル（ＢＲＩＪ−３５）（０．００５％）、およびＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を溶出液に添加し、次に��出液を最終緩衝液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、  ４００  ｍＭ  ＮａＣｌ、  １０  ｍＭ  ＣａＣｌ２、  ０．０１％  ＮａＮ３、  ｐＨ    ７．５、  ０．００５％  ＢＲＩＪ−３５、および１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ）に透析した。最後に、４℃で保存するために、タンパク質を約０．２５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ザイモグラムゲルを用いてｐｒｏＭＭＰ９の産生および精製について調べた。また、ウェスタンブロットを用いてタンパク質の活性について調べた。ＰＥＡＫ細胞系を用いて作られた精製抗原と既知の標準との比較をおこなうために、ｐｒｏＭＭＰ９（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いた。ｐｒｏＭＭＰ９は、米国特許第６，０５７，０９８号の実施例９に記載されているように、ビオチニル化した。
【０１９２】
（実施例１２）
（真核生物シグナル配列を用いたポリペプチド抗原のクローニング）
ポリペプチド抗原をクローン化し、真核生物シグナル配列（本明細書に記載したようにヒトセルロプラスミンシグナル配列を含む）を用いて、発現させた。
【０１９３】
（ヒトセルロプラスミンシグナル配列を用いた成熟マカクインターロイキン８抗原のクローニング）
成熟マカクインターロイキン８抗原の５’末端のコード配列およびマカクインターロイキン８抗原の３’末端のコード配列、ならびにプライマーＹおよびＺにそれぞれ対応したＰＣＲプライマーを作製した（表２）。特に、５’プライマーは、ｐＢＲｓａｃＨ３ベクターの３’末端に対応する２２塩基対のベクター配列をその５’末端に有し、また７つのヒスチジンコドン、および該コード配列の上流にあるエンテロキナーゼ切断部位を有する。上記３’プライマーは、５’末端にあるＨｉｎｄＩＩＩ部位に対して３’側の２４個のヌクレオチドのベクター配列に加えて、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって取り除かれるｔｅｔプロモーターの１９ヌクレオチドを含む（実施例１７、米国特許第６，０５７，０９８）。
【０１９４】
インターロイキン−８遺伝子インサートのＰＣＲ増幅を３×１００μｌ反応スケールで実施した。各スケールは、５’プライマーＹ（１００ｐｍｏｌ）、３’プライマーＺ（１００ｐｍｏｌ）、エクスパンドポリメラーゼ（２単位）、２ｍＭ  ｄＮＴＰ（１０μｌ）、１０×エクスパンド反応緩衝液（１０μｌ）、鋳型としてヒトＩＬ−８プラスミド調製物（５０ｎｇ）、および１００μｌにするための水を含んだ。キアゲンハイスピードプラスミドミディキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）を用い、かつ製造元の推奨にしたがって、ヒトＩＬ−８クローンの一晩培養からヒトＩＬ−８プラスミドを調製した。このＩＬ−８クローンは、ＰＣＴ出願９８／０６７０４に記載されたプロセスから得た。反応は、パーキンエルマーサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ９６００））により、以下の温度プロフィルを用いておこなった。すなわち、変性（１分、９４℃）を１サイクル；変性（１５秒、９４℃）、アニーリング（３０秒）、５５伸長（６０秒、７２℃）を１０サイクル；変性（１５秒、９４℃）、アニーリング（３０秒、５５℃）、伸張（８０秒プラス各追加サイクルあたり２０秒、７２℃）の２０サイクル；伸張（６分、７２℃）；浸漬（４℃、上限なし）。ＰＣＲ産物を沈殿させ、アガロースゲル電気泳動で分画化して、完全長の産物をゲルから切り出し、キアゲンハイ−スピードプラスミドミディキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）で精製した。インサートの濃度は、Ａ２６０で測定した。Ｔ４エクソヌクレアーゼ消化のために、ＤＮＡ１．０μｇに１０×緩衝液Ａ（１．０μｌ）を添加し、さらに水によって最終容量を９μｌにすることで、インサートおよびＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＢＲｓａｃＨ３ベクター（実施例１）を調製した。試料を１μｌ（１Ｕ／μｌ）のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで３０℃、４分間にわたり消化した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを７０℃、１０分間インキュベートすることで、加熱による不活性化をおこなった。試料を冷やし、軽く遠心し、さらに新しい微小遠心管で消化インサート８０ｎｇを消化ｐＢＲｓａｃＨ３ベクター（１００ｎｇ）に添加した。１．０μｌの１０倍アニーリング緩衝液を加えた後、水で容量を１０μｌにした。混合物を７０℃、２分間加熱し、２０分間以上冷やして室温にし、インサートおよびベクターのアニーリングを可能にした。アニーリング後、１０×合成緩衝液（１．０μｌ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ／μｌ）（１．０μｌ）、および希釈Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）（１．０μｌ）を添加し、３７℃、３０分インキュベートすることで、インサートとベクターとを連結した。アニールＤＮＡを希釈水によって１対３に希釈し、１μｌを４０μｌのエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ株に電気穿孔した（実施例８、米国特許第６，０５７，０９８号）。形質転換細胞を２×ＹＴブロスで１．０ｍｌに希釈し、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）補充ＬＢ寒天プレート上に１０μｌ、５０μｌ、２００μｌプレートし、さらに３７℃で一晩増殖させた。���ロニーを取り、３７℃で２×ＹＴ（２０μｇ／ｍｌテトラサイクリン）（５０ｍｌ）を一晩増殖させた。翌日、長期間−８０℃保存のためにグリセロール凍結保存ストックを作製し、キアプレプ（ＱｉａＰｒｅｐ）カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、一晩培養したものの残りからプラスミドを精製した。３つのコロニーの配列を、ｐＢＲｓａｃＨ３ベクター内のインサートの３’側に結合したオリゴヌクレオチドプライマーＮ（表２）を用いて、実施例１に記載したように、マックコーネルリサーチ（ＭａｃＣｏｎｎｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で確認した。３つのクローン（ｍａｃ−ｉｌ８−５’ｈｉｓ．１、ｍａｃ−ｉｌ８−５’ｈｉｓ．２、およびｍａｃ−ｉｌ８−５’ｈｉｓ．３）のすべてが正しい配列を持っていた。実施例１３に記載したように、マカクインターロイキン−８抗原を発現させ、ニッケル−キレートクロマトグラフィーによって精製した。
【０１９５】
（実施例１３）
（ポリペプチドの発現と精製）
本明細書に記載されているポリペプチド抗原を含むポリペプチドを発現させ、精製した。
【０１９６】
（マカクＩＬ−８抗原の発現と精製）
このクローンは、実施例１２の記載と同様に、マカクＩＬ−８抗原を発現するプラスミドで電気穿孔された宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ  ｒｈａ＋株からなった。この構築物は、Ｎ末端の加工により、セプタヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位、およびヒトセルロプラスミンシグナル配列をこの順序でもった。細胞は、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン選択下で培養した。
【０１９７】
５００ｍＬの振盪フラスコ培養物を１０個複製し、それぞれを４ｇ／ＬのＬ−ラムノースで誘導し、実施例３の記載と同様に、キレート性セファロースＦＦクロマトグラフィーに通して精製した。溶出液をプールし、緩衝液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０１％  ＮａＮ３、ｐＨ８の緩衝液に交換した。その後、タンパク質溶液に６μｇ／ｍＬまでのエンテロキナーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を加え、４℃で一晩インキュベートすることにより、マカクＩＬ−８抗原上のセプタヒスチジンタグを切断した。
【０１９８】
次に、消化後タンパク質溶液の緩衝液を、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  ＮａＮ３、ｐＨ７．４の緩衝液に交換し、５ｍＬのＱセファロースＦＦ樹脂を充填し、かつ同じ緩衝液で平衡化されているディスポーサブルクロマトグラフィーカラムに通した。マカクＩＬ−８抗原はフロースルーに含まれたが、当初の精製工程からのいくつかの夾雑物がカラムに結合した。
【０１９９】
Ｑセファロースのフロースルーに、１０ｍＭまでのイミダゾールを加え、０．１Ｍ  ＮｉＣｌ２をチャージしたキレート性セファロースＦＦ樹脂５ｍＬを充填したディスポーサブルクロマトグラフィーカラムに通した。このカラムは、２０ｍＭボレート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、０．０１％  ＮａＮ３、ｐＨ８．０の緩衝液で平衡化された。この工程では、マカクＩＬ−８抗原にはもはやＮ末端のセプタヒスチジンタグが含まれておらず、そのためマカクＩＬ−８抗原はフロースルーにあり、唯一残っていた夾雑物がカラムに結合した。
【０２００】
その後、キレート性セファロースＦＦのフロースルーを、ＹＭ−１０セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で処理し、それに続き、濃縮液の緩衝液を、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７の緩衝液に交換した。これを、同じ緩衝液で平衡化されたハイＱ（Ｈｉｇｈ  Ｑ）樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）（２．５ｍＬ）を充填したディスポーサブルクロマトグラフィーカラムに通した。この工程で、マカクＩＬ−８抗原はフロースルーに含まれたが、エンドトキシンがカラムに結合した。精製されたマカクＩＬ−８抗原を、最後の０．２μｍシリンジ濾過にかけ、４℃で保存した。最終的な収率として、１．９ｍｇのマカクＩＬ−８抗原を得た。
【０２０１】
吸光度０．７（ｍＬ）／（ｍｇｃｍ）を用い、２８０ｎｍの吸光度によって、精製されたマカクＩＬ−８抗原の濃度を測定した。精製された抗原を、４〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、９５％より高い純度を有するという結果を得た。マカクＩＬ−８抗原およびヒトＩＬ−８抗原（ＰＣＴ出願９８／０６７０４）を、イムン−ブロット（Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ）ＴＭＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上へ、ウェスタントランスファーした。マカクＩＬ−８とヒトＩＬ−８との間には、高い％の同一性があるため、ヒトＩＬ−８は良いコントロールとなる。組換え型の抗ヒトＩＬ−８  オムニクローナル（Ｏｍｎｉｃｌｏｎａｌ）ＴＭ抗体であるＭＥＤ００２．１とＭＥＤ００２Ａ．２（ＰＣＴ出願９８／０６７０４）を標識に用い、ヤギ抗（ヒトカッパ）−アルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を二次標識および検出に用いた。両抗原のバンドは、ウェスタンブロットにおいて、同程度の強度であった。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】図１は、重鎖および軽鎖の両方で同一の真核生物シグナル配列を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのｒＭＥＴ１０抗体の発現を示す。
【図２】図２は、重鎖および軽鎖で異なる真核生物シグナル配列を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのｒＭＥＴ１抗体の発現を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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