(57)【要約】本発明は、血漿タンパク質の混合物によって形成された、細胞培養物用フィブリン細胞支持体に関する。この血漿タンパク質は、フィブリノーゲンおよびトロンビンを含む。このフィブリン細胞支持体は、好ましくは、細胞（例えば、ケラチノサイト）の培養物を調製するために使用され、再構成された組織の形態でその培養物を回収し、そしてその培養物を輸送する。その再構成された組織は、特に、皮膚移植片として使用するために適切である。
2005537845.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚移植片用のフィブリン細胞支持体であって、トロンビンとフィブリノーゲンとを含み、該トロンビンの濃度は、約０．５Ｕ／ｍｌと約２．５Ｕ／ｍｌとの間である、支持体。
【請求項２】
請求項１に記載のフィブリン細胞支持体であって、前記フィブリノーゲンの濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌと約２５０ｍｇ／ｍｌとの間である、支持体。
【請求項３】
請求項１に記載のフィブリン細胞支持体であって、前記トロンビンの濃度は、約１．０Ｕ／ｍｌと約１．５Ｕ／ｍｌとの間である、支持体。
【請求項４】
請求項１に記載のフィブリン細胞支持体であって、前記トロンビンの濃度は、約１．２５Ｕ／ｍｌであり、前記フィブリノーゲンの濃度は、約７５ｍｇ／ｍｌと約１５０ｍｇ／ｍｌとの間である、支持体。
【請求項５】
請求項１に記載のフィブリン細胞支持体であって、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、支持体。
【請求項６】
請求項２に記載のフィブリン細胞支持体であって、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、支持体。
【請求項７】
請求項３に記載のフィブリン細胞支持体であって、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、支持体。
【請求項８】
請求項４に記載のフィブリン細胞支持体であって、プロテアーゼインヒビターをさらに含む、支持体。
【請求項９】
請求項１に記載のフィブリン細胞支持体であって、前記プロテアーゼインヒビターは、アプロチニンである、支持体。
【請求項１０】
請求項９に記載のフィブリン細胞支持体であって、前記アプロチニンの濃度は、約１，０００ＫＩＵ／ｍｌと約１０，０００ＫＩＵ／ｍｌとの間である、支持体。
【請求項１１】
請求項９に記載のフィブリン細胞支持体であって、前記アプロチニンの濃度は、約３０００ＫＩＵ／ｍｌである、支持体。
【請求項１２】
請求項１に記載のフィブリン細胞支持体であって、ポリペプチド増殖因子、サイトカイン、酵素、ホルモン、抗生物質、プロテアーゼインヒビター、および抗真菌剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上の分子をさらに含む、支持体。
【請求項１３】
請求項２に記載のフィブリン細胞支持体であって、ポリペプチド増殖因子、サイトカイン、酵素、ホルモン、抗生物質、プロテアーゼインヒビター、および抗真菌剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上の分子をさらに含む、支持体。
【請求項１４】
請求項３に記載のフィブリン細胞支持体であって、ポリペプチド増殖因子、サイトカイン、酵素、ホルモン、抗生物質、プロテアーゼインヒビター、および抗真菌剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上の分子をさらに含む、支持体。
【請求項１５】
請求項１に記載のフィブリン細胞支持体であって、１種以上の細胞をさらに含む、支持体。
【請求項１６】
請求項２に記載のフィブリン細胞支持体であって、１種以上の細胞をさらに含む、支持体。
【請求項１７】
請求項３に記載のフィブリン細胞支持体であって、１種以上の細胞をさらに含む、支持体。
【請求項１８】
請求項４に記載のフィブリン細胞支持体であって、１種以上の細胞をさらに含む、支持体。
【請求項１９】
請求項１５に記載のフィブリン細胞支持体であって、前記細胞は、ケラチノサイトである、支持体。
【請求項２０】
請求項１に記載のフィブリン細胞支持体であって、前記トロンビンは、石灰トロンビンである、支持体。
【請求項２１】
フィブリン細胞支持体を調製する方法であって、
ａ）フィブリノーゲンを含む第１溶液と、石灰トロンビンを含む第２溶液とを、等容量混合する工程であって、該石灰トロンビンの濃度は、約１．０Ｕ／ｍｌと約１．５Ｕ／ｍｌとの間である、工程；および
ｂ）表面上に該混合物を供給して、フィブリン細胞支持体が該表面上に形成されるようにする工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記フィブリン細胞支持体を１種以上の細胞と接触させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記細胞は、上皮細胞である、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記上皮細胞は、ケラチノサイトである、方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法であって、前記上皮細胞は、角膜上皮細胞である、方法。
【請求項２６】
請求項２１に記載の方法であって、前記表面上に前記混合物を供給する前に、該混合物を１種以上の細胞と接触させ、それによって該細胞を前記フィブリン細胞支持体中に組み込む工程をさらに包含する、方法。
【請求項２７】
請求項２１に記載の方法であって、前記表面は、組織培養皿またはフラスコである、方法。
【請求項２８】
フィブリン細胞支持体を使用する方法であって、
ａ）１種以上の細胞をフィブリン細胞支持体と接触させて、皮膚置換組織を形成する工程であって、該支持体は、石灰トロンビンとフィブリノーゲンとを含み、該石灰トロンビンの濃度は、約１．０Ｕ／ｍｌと約１．５Ｕ／ｍｌとの間である、工程；および
ｂ）該皮膚置換組織を回収する工程；
ｃ）必要に応じて、該皮膚置換組織を輸送する工程；および
ｄ）該皮膚置換組織を移植片として適用する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記細胞は、前記フィブリン細胞支持体の表面上にある、方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記細胞は、ケラチノサイトである、方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、前記細胞は、前記フィブリン細胞支持体内に組み込まれる、方法。
【請求項３２】
請求項２８に記載の方法であって、前記細胞は、ケラチノサイトである、方法。
【請求項３３】
請求項２８に記載の方法であって、前記細胞は、新鮮な細胞層の分散後に得られる、方法。
【請求項３４】
請求項２８に記載の方法であって、前記細胞は、液体窒素中に保存された細胞バンクから得られる、方法。
【請求項３５】
皮膚置換組織を使用する方法であって、
ａ）１種以上のケラチノサイトを、フィブリノーゲンと石灰トロンビンとを含む溶液と接触させて、皮膚置換組織を形成する工程であって、該石灰トロンビンの濃度は、約１．０Ｕ／ｍｌと約１．５Ｕ／ｍｌとの間である、工程；および
ｂ）必要に応じて、該皮膚置換組織を必要とする患者に、該組織を輸送する工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、前記溶液は、培養皿中にあるケラチノサイトを含む細胞層に添加される、方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、前記ケラチノサイトは、液体窒素中に保存された細胞バンクから得られる、方法。
【請求項３８】
フィブリン細胞支持体を保存する方法であって、
ａ）フィブリン細胞支持体を、円筒状の内側キャリアと接触させる工程；
ｂ）該フィブリン細胞支持体と該内側キャリアとを、中空外側キャリア中に挿入する工程であって、該外側キャリアは、該内側キャリアの外径よりも大きい内径を有する、工程；
ｃ）該フィブリン細胞支持体と該外側キャリアの内壁との間に形成された空間に、細胞培地を充填し、そして滅菌環境を維持するように該外側キャリアを密封し、それにより該フィブリン細胞支持体を保存する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
フィブリン細胞支持体を保存する方法であって、
ａ）フィブリン細胞支持体をキャリアと接触させる工程であって、該キャリアは、第１シートと第２シートとを含み、該第１シートと該第２シートとは、互いに作動可能に連結されて、該支持体が該第１シートと接触するようになっている、工程；
ｂ）該フィブリン細胞支持体と該第２シートとの間に形成された空間に、細胞培地を充填し、そして滅菌環境を維持するように該第１シートと該第２シートとを接触させ、それにより該フィブリン細胞支持体を保存する工程、
を包含する、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記フィブリン細胞支持体は、１種以上の細胞を含む、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、前記細胞は、前記第１シートと接触する、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、前記細胞は、前記第１シートとも前記第２シートとも接触しない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞培養物用のフィブリン細胞支持体（血漿タンパク質（フィブリノーゲンおよびトロンビンを含む）の凝固した混合物を含む）；細胞培養物調製におけるその使用；単離された細胞、細胞コロニー、または再構成された上皮の形態でのその輸送および移植；ならびに治療目的のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
生検から得た少数の細胞由来のヒト皮膚と類似する生存皮膚の再構成、または正常皮膚の生理的機能を実施する簡略化した皮膚の再構成は、疾患（血管腫、ケロイド、過形成性瘢痕、水疱性類天疱瘡、ウイルス感染もしくは細菌感染、または挫瘡）によって、外傷（例えば、大きな火傷）によって、急性創傷（例えば、形成外科、または腫瘍塊の除去）によて、あるいは慢性創傷（例えば、潰瘍）によって、損傷された皮膚を置換する目的で、広範に研究されている。
【０００３】
皮膚は、３種の並列した組織（表皮、真皮、および皮下）から構成される、複雑な器官である。表皮の８５％は、ケラチノサイトによって構成され、ケラチノサイトは、外側環境から身体を隔離する不透過層を形成する。表皮は、主にコラーゲンから構成される結合組織によって隔てられた細胞（線維芽細胞を含む）を含む。皮下は、脂肪を貯蔵すること専用の細胞を含む。従って、このような複雑な器官の人工的再構成は、多数の問題を引き起こす。真皮および表皮の両方が、インビトロで部分的に再構成された（Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：１９７９〜１２７４を参照のこと）。
【０００４】
皮膚生検から開始して、線維芽細胞が、培養中で、最初に単層の状態で、その後、複数回の継代の後にこれらの細胞をコラーゲン（ラットの尾の腱から抽出した）含有培養培地中に分散することによって、首尾良く樹立された。後者は、ゲルを形成し、３次元培養物を可能にした。このような培養において、線維芽細胞は、コラーゲンマトリックスと相互作用し、正常な真皮において生じるように、コラーゲンマトリックスと組織化して収縮する。この組織（インビトロで再構成された）は、「皮膚等価物」として公知である。２〜３週間の増殖の後、この等価な皮膚の機械的品質によって、患者または損傷したヒトへ移植するためにこの皮膚等価物を使用することが可能である。この皮膚等価物は、その宿主によって拒絶されないようである。しかし、この等価な皮膚は、単に一時的な包帯でしかない。なぜなら、この等価な皮膚は、皮膚の皮膚障壁機能を回復し得ないからである。
【０００５】
さらに、ケラチノサイトを長期間増殖させることを可能にする方法および培養培地が、以前に開発された（Ｇｒｅｅｎら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：５６６５〜８を参照のこと）。この方法は、予め樹立された線維芽細胞（特に３Ｔ３細胞）単層上に、トリプシンを分散されたケラチノサイトを接種する工程を包含し、この単層は、致死的照射されており、そして栄養層およびマトリックスとして作用する。表皮層は、非常に迅速に発達して、厚さが３細胞分〜５細胞分である組織を形成する。表皮層は、患者上に移植され得、インサイチュで分化し続ける。この技術は、重篤な火傷に罹患している患者を処置するために使用されている（Ｇａｌｌｉｃｏら（１９８４）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３１１：４４８を参照のこと）。
【０００６】
Ｇｒｅｅｎらの技術を使用して、２ｃｍ２の生検から、３週間で１ｍ２の表皮を得ることが可能である。
【０００７】
しかし、移植片を生成するための再構成組織の回収は、さらに多くの技術的問題を引き起こす。例えば、細胞を解離することなく、酵素処理を使用して培養皿から多層化上皮を剥離することが、必要である。この手順の間に、細胞層の収縮が、従って、移植片の表面積のうちの特定の割合が喪失することが、観察される。さらに、一旦その再構成組織が剥離されると、その再構成組織は、それを輸送して患者に移植することを可能にする支持体に固定されなければならない。代表的には、接着剤処理したガーゼの包帯が、一般的には使用される。これらの操作は、繊細でかつ時間がかかる。これにより、移植可能な上皮の品質が危うくなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、移植片を受容した患者によって吸収され得、かつ培養上皮の取扱いおよびその品質の保存を簡単にする、自由に使用可能な新規なフィブリン細胞支持体を有することが、非常に有益である。さらに、その利用性を確保するために、そのような支持体またはその構成物質は、それ自体を、産業上の目的に従う調製およびパッケージングに役立てるべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
一局面において、本発明は、細胞培養物用のフィブリン細胞支持体（トロンビンとフィブリノーゲンとを含む）に関し、そのトロンビンの濃度は、約０．５Ｕ／ｍｌと約２．５Ｕ／ｍｌとの間である。一般に、上記フィブリノーゲンの濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌと約２５０ｍｇ／ｍｌとの間である。本発明のいくつかの実施形態において、上記フィブリン細胞支持体は、プロテアーゼインヒビター（すなわち、アンチプロテアーゼ）（例えば、アプロチニンもしくは合成プロテアーゼインヒビター（例えば、トラネキサム酸））、または他の分子（ポリペプチド増殖因子、サイトカイン、酵素、ホルモン、抗生物質、抗真菌剤、またはこれらの分子のうちの２種以上の組み合わせを含む）を含む。本発明の他の実施形態において、上記フィブリン細胞支持体は、１種以上の細胞（例えば、ケラチノサイトまたは他の上皮細胞）をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記トロンビンは、石灰トロンビンである。
【００１０】
別の局面において、本発明は、フィブリン細胞支持体を調製する方法を提供する。この方法は、フィブリノーゲンを含む第１溶液と、トロンビンを含む第２溶液とを、等容量混合する工程；および表面上にその混合物を供給して、フィブリン細胞支持体がその表面上に形成されるようにする工程、を包含する。本発明の特定の実施形態において、この方法は、上記フィブリン細胞支持体を１種以上の細胞（例えば、ケラチノサイトまたは他の上皮細胞）と接触させる工程をさらに包含する。
【００１１】
なお別の局面において、本発明は、フィブリン細胞支持体を使用する方法を提供する。この方法は、１種以上の細胞をフィブリン細胞支持体と接触させて、皮膚置換組織を形成する工程（この支持体は、トロンビンとフィブリノーゲンとを含む）；および上記皮膚置換組織を回収し、輸送し、そして移植片として適用する工程、を包含する。上記細胞は、上記フィブリン細胞支持体の表面上に位置し得るか、または上記フィブリン細胞支持体中に組み込まれ得る。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、皮膚置換組織を使用する方法を提供する。これは、１種以上の細胞を、フィブリノーゲンとトロンビンとを含む溶液と接触させて、皮膚置換組織を形成する工程；およびこの皮膚置換組織を必要とする患者に、この組織を輸送する工程による。
【００１３】
別の局面において、本発明は、移植前の輸送の間における、上記フィブリン細胞支持体に対する機械的損傷の可能性を減少するための方法を提供する。
【００１４】
他のように規定されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは同等の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）が支配する。さらに、上記の材料、方法および実施例は、単なる例示に過ぎず、限定することは意図されない。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、細胞を培養するために有用な新規なフィブリン細胞支持体を提供する。これらの支持体は、トロンビン存在下でフィブリノーゲンを含む血漿タンパク質の凝固によって、形成される。この凝固は、主に、重合したフィブリンネットワークの形成の結果であり、これは、血餅の形成を開始する。トロンビンは、酵素切断によってフィブリノーゲンをフィブリンへと変換し、そしてまた、プロトランスグルタミナーゼ（第ＸＩＩＩ因子）を活性トランスグルタミナーゼ（第ＸＩＩＩａ）へと変換する。カルシウムは、トロンビンのタンパク質分解活性を加速する。細胞培養物の調製のために適切な支持体を形成するために、凝固は、フィルムの形成をもたらす条件下で、より具体的には、細胞培養フラスコまたは皿において、実行される。
【００１７】
本発明の一局面は、細胞を培養するために有用なフィブリン細胞支持体に関する。この支持体は、血漿タンパク質（例えば、フィブリノーゲン）溶液を、石灰トロンビン溶液を合わせて、フィブリンマトリックスが形成するようにすることによって、生成される。そのフィブリンマトリックス上に、細胞が支持されて培養され得る。用語「石灰トロンビン」とは、本明細書中で使用される場合、カルシウム存在下でのトロンビンを包含する。例えば、石灰トロンビンは、トロンビンと、任意の濃度のカルシウムとを含む、溶液を包含する。フィブリノーゲンもまた、カルシウムの非存在下でトロンビンと接触され得る。
【００１８】
血漿タンパク質（例えば、フィブリノーゲン）は、ヒト血漿から得られ得る（例えば、血液ドナーから得られ得る）か、または組換え体であり得る。固体形態（例えば、凍結乾燥されている（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ）かまたは凍結乾燥されている（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））の場合、フィブリノーゲンは、例えば、等張性溶液中で再構成されなければならない。本発明のいくつかの実施形態において、上記等張性溶液は、塩化カルシウムを含む等張性塩化ナトリウムである。塩化ナトリウムの濃度は、約０．５％〜約５．０％の範囲、好ましくは約１．０％〜約３．０％の範囲であり得る。塩化カルシウムの濃度は、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの範囲、好ましくは約１ｍＭ〜約２ｍＭの範囲であり得る。この等張性溶液は、１種以上のプロテアーゼインヒビター（例えば、多価プロテアーゼインヒビター（例えば、アプロチニン））を、約１，０００〜１０，０００ＫＩＵ／ｍｌ（カリクレインインヒビター単位／ｍｌ）の濃度範囲で、好ましくは約３０００ＫＩＵ／ｍｌで、さらに含み得る。あるいは、溶液中のそのようなプロテアーゼインヒビターは、上記タンパク質を再構成するためにフィブリノーゲンに直接添加され得る。フィブリノーゲンの濃度は、通常は、約１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５０〜１５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは６０ｍｇ／ｍｌである。このフィブリノーゲン溶液は、さらに、他の血漿タンパク質または血漿ポリペプチド（フィブロネクチン、第ＶＩＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。
【００１９】
同様に、上記トロンビンはまた、天然供給源由来であっても、組換え体または合成品であってもよい。固体形態である場合、トロンビンは、カルシウム含有等張性溶液（例えば、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１．１％  ＮａＣｌ）中で再構成され得る。上記トロンビン溶液の濃度は、通常は、約０．１〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５．０Ｕ／ｍｌ、なおより好ましくは１〜３Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは２．５Ｕ／ｍｌである。トロンビンの単位は、ＮＩＨ基準によって規定されたような活性基準（ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔａｎｄａｒｄ）を指す。１ＮＩＨ単位は、１．１５国際単位に相当する（例えば、Ｇａｆｆｎｅｙら（１９９５）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７４：９００〜３を参照のこと）。トロンビンはまた、カルシウムの非存在下でフィブリノーゲンと合わされ得る。しかし、当業者は、カルシウムの存在によって、トロンビンのタンパク質分解活性が促進されることを認識する。
【００２０】
上記フィブリノーゲン溶液と上記トロンビン溶液とは、（通常は等容量で）合わせられ
、そして凝固が生じる前に容器（例えば、組織培養皿）に供給される。一旦凝固が生じると、フィブリン細胞支持体またはフィブリン細胞マトリックスが、形成される。あるいは、この２つの溶液は、混合連結基によって接続された２つのシリンジを使用して、容器中に同時に注入され得る。一般に、上記石灰トロンビンと上記フィブリノーゲン溶液との組み合わせによって形成されるフィブリンマトリックスは、透明である。上記使用されたフィブリノーゲンとトロンビンとを含む溶液の体積は、望ましいフィブリン細胞支持体の厚さに依存する。代表的には、各溶液約２．５ｍｌが、各約１００ｃｍ２の表面のために使用される。
【００２１】
当業者は、他のポリペプチドまたは分子（例えば、増殖因子もしくはサイトカイン（例えば、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＮＧＦ、およびＴＧＦ−β）；治癒因子；酵素（例えば、マトリックス分解酵素およびマトリックス酵素インヒビター（例えば、ＴＩＭＰ））；抗生物質；および／または抗真菌剤）が、上記石灰トロンビンと上記フィブリノーゲン成分とを混合する前、混合すると同時、または混合した後に、上記フィブリノーゲン溶液および／または上記トロンビン溶液に添加され得ることを、認識する。さらに、血漿トランスグルタミナーゼ因子ＸＩＩＩａが、上記フィブリノーゲン溶液、上記トロンビン溶液、上記混合物、または上記フィブリン細胞支持体に、生じたフィブリン細胞支持体を共有結合架橋するために添加され得る。
【００２２】
本発明のフィブリン細胞支持体は、細胞培養物（特に、ケラチノサイト培養物（例えば、ヒトケラチノサイト培養物））を調製する場合に、有利である。これらの細胞培養物は、患者から得た皮膚生検由来の初代培養物（１／１５〜１／２０希釈物での１回と６回以上との間の回数の継代を行った）か、または液体窒素中にバンク（ｂａｎｋ）の形態で保存されている細胞のいずれかであり得る。細胞は、フィーダー細胞層（例えば、致死的照射したヒト線維芽細胞層）の存在下で培養され得る（Ｌｉｍａｔら、１９８６、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８６  Ｏｃｔ；８７４（４）４８５〜８を参照のこと）。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞（例えば、ケラチノサイト）が、コンフルエンスになるまで増殖され、トリプシン処理され、適切な培養培地中に懸濁され、そして上記フィブリン細胞支持体上に再プレートされる。細胞はまた、サブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な密度で上記フィブリン細胞支持体上にプレートされ得、そして上記フィブリン細胞支持体上で培養してコンフルエンスに達するようにされ得る。細胞はまた、凝固する前にトロンビンとフィブリノーゲンとの混合物に添加され得、その細胞が上記フィブリン細胞支持体内に包埋されるようになる。
【００２４】
本発明は、細胞培養条件下で維持され得、好ましくは、インビトロで数を増やした後に再構成された上皮中に組み込まれ得る、任意の哺乳動物細胞型または非哺乳動物細胞型を包含する。いくつかの実施形態において、上記細胞は、同じ動物から単離されて再導入され（自己由来細胞（すなわち、意図されるレシピエントから得られた細胞））、それによって、免疫拒絶および疾患伝達の危険を回避する。他の実施形態において、上記細胞は、成体組織よりも本質的に免疫原性が小さい、同種異系の胚組織または新生児組織から単離される。なお他の実施形態において、いわゆる免疫学的に中性の同種異系細胞が、使用される。免疫学的に中性の同種異系細胞は、レシピエントの免疫系による自己／非自己の認識を担う細胞表面抗原の合成および／または発現を排除するようにそれ自体が遺伝子改変された、胎児起源または成体起源の同種異系細胞である。そのような抗原は、主に、主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）のクラスＩおよびＩＩに当てはまるが、これらに限定はされない。
【００２５】
単離された細胞は、ヒトまたは他の哺乳動物（例えば、齧歯類、霊長類、ウシ、またはブタ）から得られ得る。特定の実施形態において、これらの細胞は、皮膚または他の器官（例えば、眼、心臓、脳、もしくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、筋肉、腸、または胃）に由来し得る。他の実施形態において、これらの細胞は、培養中に望ましい細胞型へと分化され得る幹細胞であり得る。
【００２６】
本発明の特定の実施形態において、上記の単離された細胞は、ケラチノサイト（例えば、上皮ケラチノサイト）；口腔および胃腸の粘膜上皮；尿路上皮；角膜上皮細胞；角膜上皮幹細胞；ならびに他の器官系、骨格関節滑膜、骨膜、骨、軟骨膜、および軟骨に由来する上皮；線維芽細胞；筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、もしくは心筋細胞）；内皮細胞；心膜細胞；硬膜細胞；髄膜細胞；ケラチノサイト前駆細胞；ケラチノサイト幹細胞（例えば、ＮＩＫＳＴＭ）；内皮細胞；周皮細胞；神経膠細胞；神経細胞；羊膜細胞および胎盤膜細胞；幹細胞；および漿膜細胞（例えば、体腔の内側にある漿膜細胞）である。本発明の細胞はまた、組換え細胞または遺伝子改変細胞を包含し得る。
【００２７】
当業者は、本発明に従うフィブリン細胞支持体の使用が、複数の様式で適合され得ることを認識する。例えば、ある使用方法によって、上記フィブリン細胞自体は、その２つの構成成分（トロンビン、石灰トロンビン、およびフィブリノーゲン）を培養皿中で混合することによって、フィルムの形態で調製される。その後、細胞懸濁物が、このフィルム上に、適切な培養培地中で播種される。この細胞培養物がコンフルエントまたはセミコンフルエントになった場合、その細胞培養物は、移植片として直接回収され得る置換組織を形成し、その移植片は、鉗子を使用して剥離され得、そしてその培養皿から患者へと輸送され得る。その移植片は、そのままで（一時的支持体（例えば、ガーゼ）も全く必要とせずに）創傷に適用され得る。この方法は、作業時間のかなりの節約、および増殖した組織の１００％回収をもたらす。
【００２８】
本発明のフィブリン細胞支持体を使用する別の方法に従って、上記支持体の２つの構成成分は、細胞懸濁物と、その細胞が、後で形成されるフィルム中に組み込まれる様式で、混合される。この方法によると、上記２つの構成成分は、培養皿中の上記細胞懸濁物と混合され得、その後、上記のように移植片として使用され得る。この方法はまた、患者における創傷部位に対して直接実施され得る。この患者は、上記フィブリン細胞支持体と上記細胞との混合物を、２ｂａｒｒ〜２．５ｂａｒｒの圧力でベクターガス（窒素）を用いて創傷上に噴霧することによってか、またはペーストを創傷に適用することによって、移植片を受容するように用意されている。
【００２９】
本発明に従うフィブリン細胞支持体を使用するさらなる方法によると、上記支持体の２つの構成成分が、創傷に付着するための粘性細胞ペーストを形成するように混合される。好ましくは、生じるペーストは、生分解性かつ生体適合性である。このペーストは、必要な場合は、例えば、１週間に１回、創傷に適用され得る。この実施形態に従う細胞ペーストの適用は、顆粒組織の誘導および創傷閉鎖の刺激を促進する。
【００３０】
本発明に従う支持体を使用するなお別の方法に従って、上記２つの構成成分が、細胞皿中で予め確立された細胞層上に混合される。これは、その細胞が、後で形成されるフィルムでコートされる様式で、行われる。この方法において、上記細胞は、剥離され得、そして移植片として創傷に適用されるために輸送され得る。
【００３１】
本発明の特定の実施形態において、上記支持体は、１種以上の殺菌剤（好ましくは、メチレンブルー）ならびに／または１種以上の薬物（抗生物質、フィブリン溶解剤、および生物学的応答改変剤（例えば、サイトカインおよび創傷修復プロモーター）から選択される）を、さらに含む。好ましくは、これらの化合物は、フィブリン＋トロンビンの全乾燥重量に関して１重量％までの量で含まれる。適切なフィブリン溶解剤の例としては、ｔ−ＰＡ、μ−ＰＡ、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、プラスミノーゲンなどが挙げられる。これらは、フィブリン溶解を促進し、従って、インビボでフィブリンフィルムの分解速度を制御するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「生物学的応答改変剤」とは、生物学的応答（例えば、創傷修復）を、上記フィブリン細胞支持体の望ましい治療効果を増強する様式で改変することに関与する物質をさす。適切な生物学的応答改変剤の例としては、サイトカイン、増殖因子、創傷修復プロモーターなどが挙げられる。
【００３２】
さらに、上記フィブリン細胞支持体が生成される施設から、そのフィブリン細胞支持体が使用される施設へと、そのフィブリン細胞支持体を送達することが、必要であり得る。従って、本発明のフィブリン細胞支持体の輸送用システムが、必要である。第１のシステムは、上記フィブリン細胞支持体を円筒状内側キャリアと接触させることを包含する。例えば、上記フィブリン細胞支持体は、上記内側キャリアの周囲に丸められ得る。この内側キャリアは、中実であっても、中空であってもよい（例えば、プラスチックチューブ）。その後、このフィブリン細胞支持体および内側キャリアは、上記内側キャリアの外径よりも大きな内径を有する中空外側キャリア中に配置される。その後、このフィブリン細胞支持体と外側キャリアの内壁との間の空間に、細胞培地または他の適切な物質が充填され、その外側キャリアは、滅菌環境を維持するように密封される。
【００３３】
第２輸送システムは、上記フィブリン細胞支持体を、本質的に平坦であるかまたは平面状であるキャリア（例えば、天然物質もしくは合成物質（例えば、ポリエステル膜））と接触させることを包含する。このキャリアは、互いに作動可能に連結された２枚のシートを有する。このキャリアはまた、上記フィブリン細胞支持体および適切な細胞培養培地が挿入される、被膜であり得る。このフィブリン細胞支持体は、上記キャリアと接触して上記細胞を含む、キャリアに付着される。あるいは、このフィブリン細胞支持体は、上記キャリアと接触していない細胞を含むキャリアに付着される。適切なキャリアは、以下の材料（ポリエステル、ＰＴＦＥもしくはポリウレタン）のうちの１種以上から；１種以上の生分解性ポリマー（例えば、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、もしくはコラーゲン）から；あるいはシリコーンもしくはワセリンガーゼ包帯、または創傷包帯のために適切な他の任意の材料から、作製された合成膜からなり得る。
【００３４】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載される。この実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定はしない。
【実施例】
【００３５】
（実施例１：細胞培養物用のフィブリン細胞支持体の調製）
細胞培養物用のフィブリン細胞支持体を、フィブリノーゲン含有溶液と、石灰トロンビン含有溶液とを混合することによって、調製する。
【００３６】
凍結乾燥フィブリノーゲン（３７５〜５７５ｍｇ）を、５ｍｌのアプロチニン（３，０００ＫＩＵ／ｍｌ；カリクレインインヒビター単位／ｍｌ）を用いて再構成し、その後、２ｍＭの塩化カルシウムを含有する５ｍｌの２．２％  ＮａＣｌと合わせる。凍結乾燥トロンビン（２２５〜２７５ｍｇ；約２５０００国際単位）を、１ｍＭ塩化カルシウムを含有する１．１％  ＮａＣｌ中に希釈して、最終濃度０．２２５ｍｇ〜０．２７５ｍｇまたは２．５ＩＵにする。溶解したフィブリノーゲンと溶解したトロンビンとを、１：１の比で混合し、細胞培養皿またはフラスコ中に供給（１００ｃｍ２の培養皿表面当たり２．５ｍｌの上記フィブリノーゲン−トロンビン混合物）して、フィブリン細胞支持体を形成する。その後、上記フィブリン細胞支持体を、細胞培養培地で覆う。
【００３７】
（実施例２：上記フィブリン細胞支持体上でのケラチノサイト培養物の調製）
皮膚生検に由来するヒトケラチノサイトを、致死的に照射したヒト線維芽細胞もしくはマイトマイシンＣ処理したヒト線維芽細胞、または致死的に照射したマウスフィーダー細胞もしくはマイトマイシンＣ処理したマウスフィーダー細胞の存在下で、培養する。（Ｌｉｍａｔら（１９８６）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８７（４）：４８５〜８；Ｇｒｅｅｎら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：５６６５を参照のこと）。
【００３８】
コンフルエントケラチノサイト層を、トリプシン処理し、培養培地中の懸濁物中に配置し、そして実施例１に記載されるように調製したフィブリン細胞支持体で覆った組織培養皿上に、サブコンフルエントな密度で（例えば、１／１０希釈して）播種する。その後、このケラチノサイトをコンフルエンスに到達させ、その時点で、生じたケラチノサイト移植片を、治療方法において使用し得る。本発明のフィブリン細胞支持体は、取扱いに十分有効であり、剥離の時点で収縮しない。これによって、培養物の細胞層の表面積１００％を回収することが可能になる。
【００３９】
別の実施形態において、上記フィブリン細胞支持体のケラチノサイトは、サブコンフルエント濃度である。例えば、このケラチノサイトは、２つ以上のコロニーの状態であり得、各コロニーは、約４個と約１，０００個との間の細胞を含む。
【００４０】
このケラチノサイト移植片は、上記フィブリン細胞支持体が患者と接触するか、あるいは、このケラチノサイト細胞層が患者と接触するような方法で、必要な患者に適用され得る。
【００４１】
（実施例３：上記フィブリン細胞支持体を使用する、すでに樹立された細胞層の回収）
ケラチノサイトは、従来のＧｒｅｅｎの方法に従って、致死的に照射された線維芽細胞層で覆われたペトリ皿中に接種される（Ｇｒｅｅｎら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：５６６５を参照のこと）。ケラチノサイトがコンフルエントであり、いくつかの細胞層から形成される場合、その培養培地を除去し、ＥＤＴＡ溶液を、１時間３０分間添加する。この後に、ＰＢＳで２回洗浄する。その後、実施例１に記載されるように調製したフィブリン細胞支持体を、コンフルエントなケラチノサイトに直接注ぐ。
【００４２】
このフィブリン細胞支持体が凝固すると、そのフィブリン細胞支持体を、機械的に剥離し得、そして実施例２に示されるように、移植片として使用し得る。
【００４３】
（実施例４：上記フィブリン細胞支持体中へのケラチノサイトの組み込み）
ケラチノサイトを、いくつかの方法のうちのいずれかかによって、上記フィブリン細胞支持体内に包埋し得る。第１の方法において、溶解したフィブリノーゲンのシリンジと、懸濁物中のケラチノサイトを含む溶解したトロンビンのシリンジを、調製する。これらのケラチノサイトを、新鮮なトリプシン処理培養物からか、または液体窒素中に保存した細胞バンクから、採取し得る。この２つのシリンジを、混合接続器によって接続し、得られる上記細胞を含むフィブリン細胞支持体を、組織培養皿上（または移植片を受容するように用意した創傷上）に噴霧する。この方法において、上記細胞を、その凝固の間にこのフィブリン細胞支持体内に保持する。この噴霧は、ベクターガス（例えば、２ｂａｒｒ〜２．５ｂａｒｒの圧力の窒素）を使用して、または当業者に公知の他の方法を使用して、実行され得る。この噴霧は、上記細胞を損傷させることも、ポリペプチドを変性させることもなく、上記細胞層は、培養中で改変することが観察され得る。従って、これらの細胞は、上記混合物を、創傷上に非常に薄い層の状態で直接噴霧した場合に、通常は増殖する。
【００４４】
第２の方法において、上記の溶解したフィブリノーゲンおよび溶解したトロンビンを、１：１比の混合し、ケラチノサイト含有溶液と合わせ、そして細胞培養皿またはフラスコ中に供給（１００ｃｍ２の培養皿表面当たり、２．５ｍｌのフィブリノーゲン−トロンビン混合物）して、ケラチノサイト含有フィブリン細胞支持体を形成する。
【００４５】
（実施例５：人工真皮とフィブリン上皮との組み合わせ）
本発明のフィブリン細胞支持体は、無細胞人工皮膚（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ＮＪによって開発されたＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標））の適用によって現在処理されている急性創傷の早期の一時的覆いのために有用である。一般的に、無細胞人工皮膚を、それを必要とする患者の創傷床状に適用する場合、その患者自身の細胞がそのマトリックス中に浸潤して新たな真皮を生成するために、３〜５週間の時間が必要である。その後、上皮自己移植片が、持続的な創傷閉鎖を達成するために必要である。従来の培養された上皮自己移植片は、上記の覆いを提供するためには部分的に不成功であった。これは、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）マトリックス上への上皮固定が欠如しているのが原因である。本発明のフィブリン細胞支持体の使用は、上皮固定および皮膚移植片の成功を非常に改善する。
【００４６】
ケラチノサイトを、Ｌｉｍａｔおよびその同僚によって改変されたＲｈｅｉｎｗａｌｄおよびＧｒｅｅｎの方法（Ｇａｌｌｉｃｏら、１９８４、Ｌｉｍａｔら、１９８６）に従って培養した。ヒトケラチノサイトを、アプロチニンの存在下で上記フィブリンマトリックスの上部にて培養した。その培養物がコンフルエンスに達した時に、フィブリンを伴う上皮シートを、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上に適用した。コントロール培養物（ＣＥＡコントロール）を、コンフルエンスに達した時にディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ）で処理しその皿の底から上皮シートを剥離した。（Ｇｒｅｅｎら、１９７９を参照のこと）。その後、この上皮シートを、シリコーン膜を使用してプレートから持ち上げて、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上に適用した。
【００４７】
（インビトロ移植および培養）：ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）の片（０．８×０．８ｃｍ）に、ヒト真皮線維芽細胞を播種し、２週間培養した。その後、それらを細胞培養挿入物上に配置して、それらが側底表面から供給されるようにした。その後、コントロール上皮（ＣＥＡ）およびフィブリン上皮を、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上に配置し、シリコーン膜で覆った。
【００４８】
（インビボ移植）：マウスに対する手術を、動物取扱いの標準的指針に従って進行した。これは、獣医学の権威によって認可された。約６〜８週齢（体重２４〜３２ｇ）の無胸腺マウス（ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓヌード）を、麻酔した。約２．２ｃｍ２の全厚皮膚創傷を、各動物の背中中心にて作製し、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）で覆った。その後、ワセリンガーゼおよび接着包帯を、この移植片上に適用した。包帯は、毎週交換した。ＣＥＡコントロールおよびフィブリン上皮を、３週間後に移植した。１週間後、上記シリコーン膜を除去したが、包帯はそのままにした。さらに１週間後、残った全ての包帯を除去し、上記移植片から覆いを外したままにした。生検を、移植後１５日および２１日に採取した。
【００４９】
（組織学）：生検を、緩衝化ホルマリン（５％）中に固定し、パラフィンロウ中に包埋した。５μｍ切片を、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。ヒト被膜（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、マウス組織由来のヒトケラチノサイトを同定した。これらの研究は、（１）コントロール上皮についてのわずか５０％と比較して、フィブリンシートの存在下で増殖した上皮のうちの１００％がＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）に付着し、そして２週間の培養後には、重層した上皮を発生可能であったこと；（２）移植片領域の収縮は、上皮をフィブリンシートの存在下で増殖した場合に、移植２週間後には、ＣＥＡコントロール上皮と比較して有意に低かった（ｐ＜０．０５）こと；および（３）フィブリン上皮を移植させたマウスのうちの７５％が、移植２１日後に、分化したヒト上皮の存在を示したが、そのような上皮は、（特定のヒト細胞マーカーが存在しないことによって示されるように）コントロール群の動物すべてにおいて存在しなかったことを、示す。フィブリンマトリックスの使用はまた、細胞接着、表皮発生、およびＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上への移植片生着を非常に改善した。
【００５０】
（結果）
（フィブリン細胞支持体を使用する上皮のインビトロ付着）
図１は、２日間の培養後のＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）の上部に適用した上皮の品質についての評価を示す：（Ａ）線維芽細胞を含まないＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上のＣＥＡコントロール、（Ｂ）線維芽細胞を含むＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上のＣＥＡコントロール、（Ｃ）線維芽細胞を含まないＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上のフィブリン上皮、（Ｄ）線維芽細胞を含むＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上のフィブリン上皮。コントロールＣＥＡ（Ａ、Ｂ）と比較した場合に、十分に組織化された上皮を、フィブリン上皮を用いて得る（Ｃ、Ｄ）。
【００５１】
ＣＥＡコントロールの組織学的断面は、（１）ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）に細胞が存在した場合に、細胞が存在しないＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）マトリックスと比較して、付着領域は、はるかに多数であったこと、および（２）細胞が存在しないＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）および細胞が存在するＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）の両方において、上皮の縁は、付着されておらず、しばしば折畳まれていたことを、示した。培養２日目まで、ＣＥＡコントロールの多くの領域は、アポトーシス核を含む死にかけの細胞、そしてまたさらに分割することが不可能な分化中の細胞を示した。これは、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上のＣＥＡコントロールについての細胞生着収量が乏しかったこと（図１）を示す。
【００５２】
対照的に、フィブリン上皮の主要付着領域は、移植片の縁にあった（図１Ｃ、Ｄを参照のこと）。そのケラチノサイトは、フィブリン層からＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）へと移動し、フィブリン上皮とＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）との間に結合を形成した。同じ付着特徴が、細胞が存在する線維芽細胞および細胞が存在しないＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）マトリックスの両方について、観察された。これは、移植されたフィブリン上皮を覆うシリコーンシートが培養７日目に除去された場合でさえ、フィブリン上皮が適所に残るために十分な付着強度を生じた。フィブリン層と、線維芽細胞が存在するマトリックス中の線維芽細胞との間で、閉鎖連接（ｃｌｏｓｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が観察された。これは、正常な重層皮膚構造の形成を示唆する。上皮層を、コントロール上皮について観察されたように、丸い核を備えて細胞内空間も細胞内小胞も備えない増殖中の正常細胞から作製した。従って、フィブリン層は、ケラチノサイトが生存して上皮が重層するために適切な環境を提供する。従って、「インビトロ移植」後の細胞生存は、コントロールと比較して、フィブリン上皮の存在下で増加した（図１）。
【００５３】
（フィブリン細胞支持体を備えるインビボ上皮移植片）
約２．２ｃｍ２の全厚皮膚創傷を、各ヌードマウスの背中中心にて作製し、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）で覆った。ＣＥＡコントロールおよびフィブリン上皮を、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）の移植の３週間後に移植した。生検を、移植後１５日および２１日に採取した。ヒト被膜（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）抗体を使用して、組織学的断面上での免疫組織学的染色によって、マウス組織由来のヒトケラチノサイトを分化させた。
【００５４】
図２は、フィブリン細胞支持体を使用するヌードマウスにおける上皮移植片の増大した成功を示す。図２Ａは、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）単独を示す；図２Ｂは、ＣＥＡコントロールを含むＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）を示す；図２Ｃは、フィブリン上皮を含むＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）を示し、図２Ｄ〜Ｆは、対応する各移植片の断面を示す（４０×倍率）。ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）＋フィブリン上皮と比較しての実質的な移植片収縮が、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）単独またはＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）＋ＣＥＡコントロールの存在下で生じた。移植の成功（すなわち、「生着」）は、ヒトケラチノサイトマーカーである被膜（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）の存在によって示されるように、フィブリン上皮がＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上に適用された場合のみ、生じた。図２Ｄにおける白抜きの矢印は、マウス上皮を示す。
【００５５】
ヒト上皮を、フィブリン上皮を移植した動物においてのみ、創傷部位にて同定した（ＣＥＡコントロールについては、６匹のマウスのうちの０匹において同定したのに対して、６匹の動物のうちの５匹において同定した（移植後１４日目および２１日目）。経時的な上皮移植片の保持もまた、試験した。図３は、フィブリン細胞支持体の存在下または非存在下での、ヌードマウス上の上皮移植片の大きさを、移植後４０日目まで示す。上記したように、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）を、０日目にすべてのマウス上に適用し、１９日間妨害しなかった。その後、フィブリンを用いずに培養した上皮のシート（ＣＥＡコントロール）、またはフィブリンを用いて培養したシートを、ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上に適用した。その移植片の大きさを、カリパーを用いて測定した。動物を、４０日目に屠殺した。フィブリン上皮をＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）上に適用した場合には、収縮は少なかった。ＣＥＡコントロールを用いるかまたは上皮移植をしなかった動物と比較して、初期創傷サイズの小さい収縮率が、観察された（図３）。従って、フィブリン上皮は、コントロール移植方法と比較して、移植片生着を改善した。これは、インビトロ研究において上記で示された細胞生存の増加によって、支持される。
【００５６】
（実施例６：上皮細胞を含むフィブリン細胞支持体を包む方法）
上皮細胞を含むフィブリン細胞支持体の出荷および輸送を容易にするために、上皮のコンフルエントなシートを含むフィブリン細胞支持体を、内側プラスチックチューブ上に巻き、そのフィブリン細胞支持体およびプラスチックチューブを、外側プラスチックチューブ中に挿入した。この外側チューブに、培地を充填し、密封し、そして室温にて４８時間維持した。この時点の後、保存した上皮を、代謝活性および生存性についてアッセイした（ＭＴＴ検定）。これらの結果は、代謝活性が、この様式で保存されなかったコントロールフィブリン上皮と同様であることを示す。
【００５７】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて記載されているが、上記の説明は、本発明を例示することが意図されており、本発明の範囲を限定することは意図されない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定される。他の局面、利点、および改変は、特許請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、人工膜の表面上に位置するフィブリン支持体における上皮の増加したインビトロでの付着を示す、一連の写真である。
【図２】図２は、フィブリン細胞支持体と培養上皮とを含む移植片の増加したインビボでの受容を示す、一連の写真である。
【図３】図３は、フィブリン細胞支持体を用いて培養した場合の上皮細胞移植片の減少した創傷収縮を示す、グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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