(57)【要約】本発明は、インビボでIL-1β活性を中和するヒト化抗体Hu007の類縁体に関する。これらの抗体は、関節リウマチおよび変形性関節症のような種々の疾患を治療するために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟ヒトIL-1βに特異的に結合するヒト化Hu007の類縁体であって、
Glu Ile Leu Pro Xaa54 Xaa55 Xaa56 Asn Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly (配列番号：1)
ここで、
54位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrまたはTrp；
55位のXaaは、Asn、Gln、Arg、Asp、Ser、GlyまたはAla；
56位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrまたはTrp；
ただし、Xaa55がAsnの場合、Xaa56はGlyではない；
で示される重鎖相補性決定部位2(CDR2)，配列番号：1の54、55または56位における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む類縁体。
【請求項２】
アミノ酸置換が、重鎖CDR2部位の55位における脱アミドを減少または排除する請求項１に記載の類縁体。
【請求項３】
Xaa54がGly、Xaa55がAsnおよびXaa56がValである請求項１に記載の類縁体。
【請求項４】
Xaa54がGly、Xaa55がAsnおよびXaa56がAlaである請求項１に記載の類縁体。
【請求項５】
Xaa54がGly、Xaa55がAspおよびXaa56がGlyである請求項１に記載の類縁体。
【請求項６】
Xaa54がGly、Xaa55がGlnおよびXaa56がGlyである請求項１に記載の類縁体。
【請求項７】
Xaa54がGly、Xaa55がSerおよびXaa56がGlyである請求項１に記載の類縁体。
【請求項８】
Xaa54がGly、Xaa55がAlaおよびXaa56がGlyである請求項１に記載の類縁体。
【請求項９】
Xaa54がGly、Xaa55がGlyおよびXaa56がGlyである請求項１に記載の類縁体。
【請求項１０】
Xaa54がGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrおよびTrpから選ばれ、Xaa55がAlaおよびXaa56がGlyである請求項１に記載の類縁体。
【請求項１１】
Xaa54がGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrおよびTrpから選ばれ、Xaa55がGlyおよびXaa56がGlyである請求項１に記載の類縁体。
【請求項１２】
類縁体が、配列番号：7の配列を有する軽鎖可変部を含む請求項１に記載の類縁体。
【請求項１３】
類縁体が、配列番号：10の配列を有する重鎖可変部を含む請求項１に記載の類縁体。
【請求項１４】
配列番号：2、配列番号：3および配列番号：4に対応する配列を含む３つの軽鎖相補性決定部位(CDR)を含むヒト化軽鎖、ならびに配列番号：1、配列番号：5および配列番号：6に対応する配列を有する３つの重鎖CDRを含むヒト化重鎖を含む、成熟ヒトIL-1βに特異的に結合するヒト化抗体Hu007の類縁体。
【請求項１５】
類縁体が、配列番号：7の配列を有する軽鎖可変部を含む請求項１４に記載の類縁体。
【請求項１６】
類縁体が、配列番号：10の配列を有する重鎖可変部を含む請求項１４に記載の類縁体。
【請求項１７】
配列番号：8の配列を有する全長軽鎖および配列番号：11の配列を有する全長重鎖を含む請求項１４に記載の類縁体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１つに記載の類縁体の酵素開裂により得られる類縁体フラグメント。
【請求項１９】
FabまたはF(ab’)2フラグメントである請求項１８に記載の類縁体フラグメント。
【請求項２０】
１本鎖抗体である請求項１〜１９のいずれか１つに記載の類縁体。
【請求項２１】
抗体がIgGイソタイプを有する請求項１〜１９のいずれか１つに記載の類縁体。
【請求項２２】
イソタイプがIgG１およびIgG４から選ばれる請求項２１に記載の類縁体。
【請求項２３】
イソタイプがIgG1である請求項２２に記載の類縁体。
【請求項２４】
イソタイプがIgG４であり、ヒンジ部が229位のセリン残基がプロリン残基への変更を含む請求項２２に記載の類縁体。
【請求項２５】
類縁体が、成熟ヒトIL-1βに対するMu007の結合親和性の５倍以内である成熟ヒトIL-1βに対する結合親和性を有する請求項１〜２４のいずれか１つに記載の類縁体。
【請求項２６】
重鎖または軽鎖可変フレームワーク領域が抗体Mu007の対応するフレームワーク領域と少なくとも65％の同一性を有する請求項１〜２４のいずれか１つに記載の類縁体。
【請求項２７】
配列同一性が少なくとも70％である請求項２６に記載の類縁体。
【請求項２８】
配列同一性が少なくとも80％である請求項２７に記載の類縁体。
【請求項２９】
抗体が、成熟ヒトIL-1βに対するMu007のIC50の10倍以内である成熟ヒトIL-1βに対するIC50を有する請求項１〜２８のいずれか１つに記載の類縁体。
【請求項３０】
抗体がMu007の５倍以内であるIC50を有する請求項２９に記載の類縁体。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１つに記載の類縁体をコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸。
【請求項３２】
配列番号：8および配列番号：11から選ばれる配列を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含む請求項３１に記載の核酸。
【請求項３３】
請求項３１および３２のいずれか１つに記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３４】
宿主細胞が請求項１〜２８のいずれか１つに記載のタンパク質を発現する請求項３３に記載の発現ベクターで安定にトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項３５】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、SP2/0骨髄腫細胞、NS0骨髄腫細胞、ゴールデンハムスター卵巣細胞および胚腎臓細胞から選ばれる請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１〜２８のいずれか１つに記載の類縁体を含む医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１〜２８のいずれか１つに記載の類縁体の有効量を被験者に投与することを含む関節リウマチまたは変形性骨関節症の治療方法。
【請求項３９】
請求項１〜２８のいずれか１つに記載の類縁体の有効量を、軟骨の破壊の阻止を必要とする被験者に投与することを含む軟骨の破壊を阻止する方法。
【請求項４０】
関節リウマチまたは変形性骨関節症を有する被験者の治療用医薬の製造のための請求項１〜２８のいずれか１つに記載の類縁体の使用。
【請求項４１】
軟骨の破壊を阻止する必要がある被験者において軟骨の破壊を阻止するための医薬の製造のための請求項１〜２８のいずれか１つに記載の類縁体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
インターロイキン-１β(IL-1β)は前炎症性サイトカインである。IL-1β過剰産生は、疾患関節リウマチおよび変形性関節症などの種々の病因に関与している。IL-1βは、接着分子のアップレギュレーション、プロスタグランジンおよびメタロプロテイナーゼの産生刺激、コラーゲンおよびプロテオグリカン合成の阻害、および破骨細胞骨吸収の刺激による関節の炎症滑膜への細胞遊走を上昇させることが明らかにされている。これらの特性により、IL-1は関節炎における骨および軟骨の破壊の主なメディエーターの１つである。それゆえ、IL-1βの活性を低下させる薬剤は、関節炎のような疾患に対する治療の可能性を示す。
【０００２】
３種のIL-1遺伝子ファミリー、IL-1α、IL-1βおよびIL-1レセプターアンタゴニスト(IL-1ra)がある。IL-1αおよびIL-1βはIL-1レセプターのアゴニストであり、他方、IL-1raは特異的レセプターアンタゴニストであり、それゆえ、IL-1の内因性の競合インヒビターである。臨床試験において、組換えIL-1raの投与は、重篤な関節リウマチを有する患者においてプラセボと比較して顕著な臨床上の改善を提供した。さらに、IL-1raの投与は進行性関節損傷の速度を低下させた。しかしながら、薬物動態特性が良くなく、大用量を投与しなければならないことが、組換えIL-1raを理想の治療用薬剤よりも劣ったものにしている。
【０００３】
IL-1βに対する高親和性の中和抗体は、優れた治療薬剤を作製する。高親和性結合で結合した、通常の排泄半減期の長い抗体は、組換えIL-1raよりもかなり低い濃度でかなり少ない頻度で投薬しうる治療薬剤を生じる。多数のIL-1β抗体が記載されているが、高親和性、高い特異性および強力な中和活性を有するモノクローナル抗体を同定することは非常に困難であった。
重鎖のCDR2領域における脱アミド部位が、ヒトIL-1βに対する高親和性ヒト化抗体の生物特性に影響を及ぼすことがわかっている。この高親和性抗体の類縁体は、脱アミドを減少または排除し、その結果として安定性の改良が得られる。
【０００４】
本発明は、特に成熟ヒトIL-1βに結合するHu007の類縁体を包含する。本発明は、重鎖相補性決定部位2(CDR2)，配列番号：1の54、55または56位における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む脱アミドが減少または排除される類縁体を含む。
Glu Ile Leu Pro Xaa54 Xaa55 Xaa56 Asn Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly (配列番号：1)
ここで、
54位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrまたはTrp；
55位のXaaは、Asn、Gln、Arg、Asp、Ser、GlyまたはAla；
56位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrまたはTrp；
ただし、Xaa55がAsnの場合、Xaa56はGlyではない。
好ましい類縁体として、以下のものが挙げられる：
Xaa54がGly、Xaa55がAsnおよびXaa56がVal；
Xaa54がGly、Xaa55がAsnおよびXaa56がAla；
Xaa54がGly、Xaa55がAspおよびXaa56がGly；
Xaa54がGly、Xaa55がGlnおよびXaa56がGly；
Xaa54がGly、Xaa55がAlaおよびXaa56がGly；
Xaa54がGly、Xaa55がGlyおよびXaa56がGly；
Xaa54がGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrおよびTrpから選ばれ、Xaa55がAlaおよびXaa56がGly；および
Xaa54がGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrおよびTrpから選ばれ、Xaa55がGlyおよびXaa56がGly。
最も好ましいのは、Xaa54がGly、Xaa55がSerおよびXaa56がGlyである類縁体である。
【０００５】
もう一つの好ましい類縁体は、配列番号：7である式（Ｉ）に対応する全長軽鎖および配列番号：10である式（ＩＩ）に対応する全長軽鎖を含むヒト化抗体Hu007を含む（ここで、式（ＩＩ）は、CDR2領域、配列番号：1を含む）。本発明の類縁体は、マウスモノクローナル抗体Mu007の対応するフレームワーク領域と少なくとも65％の同一性を有するフレームワーク領域を有する類縁体を含む。本発明の類縁体は、マウスモノクローナル抗体Mu007またはヒト型抗体Hu007の10倍以内の結合親和性を有し、マウスモノクローナル抗体Mu007またはヒト化抗体Hu007の10倍以内のIC50値の強力な中和活性を有することが好ましい。
【０００６】
本発明は、本明細書および特許請求の範囲に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸に関する。本発明はまた、本明細書および特許請求の範囲に記載の抗体を発現する、これらのポリヌクレオチドでトランスフェクトした宿主細胞に関する。
本発明は、有効量の本明細書および特許請求の範囲に記載の抗体を被験者に投与することを含む関節リウマチおよび変形性関節症の治療方法、ならびに関節炎になり易い、または関節炎を有する被験者で生じる軟骨の破壊の阻止方法に関する。
【０００７】
本発明は、マウスモノクローナル抗体Mu007およびヒト化抗体Hu007が結合するエピトープと同じヒトIL-1β上のエピトープに結合するHu007の類縁体、好ましくはヒト化類縁体に関する。好ましくは、これらの類縁体は、重鎖CDR2，配列番号：1およびMu007抗体の相補性決定部位(CDR)を含む。これらの類縁体のフレームワークおよび他の部分は、ヒト生殖細胞系を起源としてもよい。Mu007抗体のヒト化バージョンは、Mu007マウス抗体で観察される高い親和性、高い特異性および強力な中和活性を保持する。
【０００８】
本明細書中で用いる用語「治療(処置)」は、処置される病態がすでに存在することが知られている場合の治療的処置、および予防、すなわち、病態の将来の発生の可能性の予防または改善を含む。「被験者」は、治療の必要性を有する哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。治療の必要性を有する被験者としては、関節炎になり易い哺乳動物、任意の軟骨破壊を示す哺乳動物、および関節リウマチまたは変形性関節症に関連した兆候および症状を有する哺乳動物が挙げられる。
【０００９】
「抗体」は、マウスモノクローナル抗体Mu007またはヒト化抗体Hu007が結合するエピトープと同一のエピトープに結合する、全長重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子、そのフラグメント(Fab、Fab’またはF(ab’)2またはFvフラグメント）；１本鎖抗体フラグメント(たとえば、１本鎖Fv）、重鎖の一量体または二量体、連結構造により互いに結合した、２、３、４以上の抗体またはそのフラグメントを含む多価モノ特異的抗原結合タンパク質、または上記の任意のものの類縁体を意味する。本明細書中のいくつかの文脈において、フラグメントは具体的に強調して言及されているが、当然のことながら、それ以外の場合にはフラグメントが特記されているかどうかにかかわらず、用語「抗体」は、そのようなフラグメントならびに１本鎖形態を含む。タンパク質がヒトIL-1β上のMu007またはHu007が結合するエピトープと同じエピトープに結合する能力を保持し、重鎖CDR2，配列番号：1を含む限り、用語「抗体」の定義内に含まれる。好ましくは、しかし必ずしも必須ではないが、本発明に有用な抗体は組換え技術により産生される。
【００１０】
「Hu007」は、ヒトIL-1β上のマウスモノクローナル抗体Mu007が結合するエピトープと同じエピトープに結合する高親和性ヒト化抗体を意味する(米国仮出願No.60/312,278を参照)。
用語「類縁体」は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する結果として、CDR領域におけるアミノ酸の脱アミドの減少または排除が得られ、その結果として、増強された安定性をもつ抗体が得られるHu007抗体を意味する。たとえば、類縁体は、重鎖CDR2領域の54、55または56位に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する結果として、重鎖CDR2領域の55位の脱アミドの減少または排除が得られる本発明の抗体を意味する(Hu007類縁体)。
【００１１】
成熟ヒトIL-1βに「特異的に結合する」類縁体（抗IL-1β類縁体）としては、当該分野において公知の成熟型ヒトIL-1βに結合する上記および図３に示される、成熟ヒトIL-1αに結合しない類縁体が挙げられる。成熟ヒトIL-1βに特異的に結合する類縁体は、他の種起源の成熟IL-1βにいくらかの交差反応性を示し得る。
【００１２】
抗体に関連して、用語「組換え」は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離される抗体を含む。代表的な例として、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（たとえば、マウス）から単離される抗体（たとえば、Taylor、L.D.ら、Nucl. Acids Res. 20:6287-6295,(1992)を参照）；またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングなどのいずれかの手段によって調製、発現、作製または単離される抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される可変および定常部を有する。
【００１３】
基本的な抗体構造単位は、四量体であることが知られている。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は１本の「軽」鎖(約25kDa)および１本の「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主な抗原認識を担う約100〜110以上のアミノ酸の可変域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は主にエフェクター機能を担う定常域を規定する。
【００１４】
軽鎖はκおよびλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEとして抗体イソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変域および定常域は約12以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結され、また、重鎖は約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含んでいる。
【００１５】
IgG抗体は血清中で最も豊富な免疫グロブリンである。また、IgGは血清中の任意の免疫グロブリンの中で最も長い半減期を有する。他の免疫グロブリンとは異なり、IgGはFcRnに結合した後に効率よく再循環する。４種のIgGサブクラス、G1、G2、G3およびG4が存在し、これらは各々異なるエフェクター機能を有する。G1、G2およびG3はC1qに結合し、補体を固定することができるが、他方、G4はできない。G3はG1よりも効率よくC1qと結合することができるが、G1の方が補体依存性細胞溶解の媒介に有効である。G2は非常に非効率的に補体を固定する。IgG中のC1q結合部位は、３次元空間においても隣接する、fγ2β鎖(318-322アミノ酸)、b6屈曲(331残基)および下部ヒンジ(235および237残基)に位置する。
【００１６】
ヒトIgG4は、分泌されたヒトIgG4の一部におけるヒトヒンジ部の重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性により２つの分子型において存在する。この不均一性は、HL「半抗体」が検出される変性、非還元条件下においてのみ示される（Angalら、Molecular Immunology 30(1):105(1993)を参照）。IgG4ヒンジ部配列：: ES-KYGPP---------CPSCP（ここで、Sは229位である）（番号付けは、Kabat 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」National Institutes of Health、Bethesda、Md.、1987および1991による、297AsnにおけるN-結合グリコシル化部位に基づく）。IgG4ヒンジ部における241位でのSからPへの突然変異は、半抗体を排除し、均一な抗体が生成される(Angalら、1993)。
【００１７】
IgGサブクラスは全て、Fcレセプター(CD16、CD32、CD64)と結合することができ、G1およびG3は、G2およびG4よりも効率的である。IgGのFcレセプター結合領域は、CH2ドメインのヒンジおよびカルボキシ末端領域の両方に位置する残基により形成される。
【００１８】
IgAは、一量体およびＪ鎖により共に保持されている二量体形態の両方で存在し得る。IgAは血清中で２番目に豊富なIgであるが、半減期はわずか６日間である。IgAは３つのエフェクター機能を有する。マクロファージおよび好酸球上のIgA特異的レセプターに結合し、それぞれ食作用および脱顆粒を引き起こす。また、未知の別の経路を介して補体を固定するかもしれない。
IgMは五量体または六量体のいずれかで発現され、これらは両方ともＪ鎖でともに保持されている。IgMは血清中での半減期が５日間である。そのCH3ドメインに位置する結合部位を介してC1qに弱く結合する。IgDは血清中での半減期が３日間である。どのようなエフェクター機能がこのIgにあるのかは不明である。IgEは一量体Igであり、血清中での半減期が2.5日間である。IgEは２つのFcレセプターに結合し、これは脱顆粒を引き起こし、前炎症因子の放出を生じる。
【００１９】
所望のインビボ効果および所望の半減期に応じて、本発明の抗体は上記の任意のイソタイプを含み得るか、または補体および／Fcレセプター結合機能が変化している変異領域を含み得る。
【００２０】
各軽鎖／重鎖対の可変域は抗体結合部位を形成する。従って、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。鎖は全て、３つの超可変部(相補性決定基またはCDRとも呼ぶ)により連結した比較的保存されているフレームワーク領域(FR)の同じ全体構造を示す。各対の２つの鎖に由来するCDRをフレームワーク領域により整列させると特異的エピトープに結びつけることができる。Ｎ−末端からＣ−末端で、軽鎖および重鎖は両方とも、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインに対するアミノ酸の配置は、公知の慣例に従って行う［Kabat 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」 National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987および1991; Chothiaら、J. Mol. Biol. 196:901-917(1987); Chothiaら、Nature 342:878-883(1989)]。
【００２１】
「ヒト化抗体」は、ヒト抗体生殖細胞系または転移配列に由来するアミノ酸配列から部分的に、または完全に構成されており、非ヒト相補性決定部位(CDR)を有する抗体の配列を変更することにより作製される抗体を意味する。フレームワーク領域の可変域を、対応するヒトフレームワーク領域で置換し、非ヒトCDRは実質的にもとのままで残す。フレームワーク領域は完全にヒトであってもよく、標的抗原に対する抗体の結合に影響を与える領域内の置換を含んでいてもよい。これらの領域は、対応する非ヒトアミノ酸で置換されていてもよい。本明細書中に記載のように、ヒト化抗体の文脈中での抗体とは、全長抗体に限定されず、フラグメントおよび１本鎖形態を含み得る。別の態様では、フレームワークをヒト生殖細胞系配列に固定することができ、非ヒトCDRドメインを挿入することができ、そして非ヒトCDRと全ヒトフレームワークとの間の立体相互作用による親和性のいくらかの損失を軽減するための突然変異誘発を介して親和性が成熟する。
【００２２】
ヒト化抗体は、ヒト治療での使用に関して、非ヒトおよびキメラ抗体を超える種々の利点を有する可能性がある。たとえば、ヒト免疫系はヒト化抗体のフレームワークまたは定常部を異種として認識せず、それゆえ、このような注射抗体に対する抗体反応は完全に異種の非ヒト抗体または部分的に異種のキメラ抗体よりも少ない。さらに、注射したヒト化抗体は、通常、循環中において注射した非ヒト抗体よりも長い半減期を有する。さらに、エフェクター機能が望ましい場合、エフェクター部分はヒトであるので、ヒト免疫系の他の部分とよりよく相互作用することができる。
【００２３】
用語「脱アミドされた、または脱アミド」は、タンパク質／pHにおけるAsnまたはGln残基の分解を意味する(Robinsonら、(2001)Proc. Natl Acad. Sci. USA 12409-12413)。たとえば、アスパラギン脱アミドのための分子内経路は、中間体スクシンイミド形成を経るものであり、その結果としてアスパルチルおよびイソアスパルチル残基の混合物が得られる(Harrisら、(2001)J. of Chromatography 752:233-245)。脱アミドにより、安定性の減少および／またはタンパク質の活性の減少または喪失が導かれる。脱アミドは製剤化された治療薬の製造中にエクスビボで生じることが可能であり、医薬の製造および貯蔵に悪い影響を与える。さらに、脱アミドはインビボで生じ、抗体の効力および作用期間に影響を及ぼしうる。
【００２４】
好ましくは、本発明の類縁体は、特に成熟ヒトIL-1βに結合するHu007の類縁体を包含する。本発明は、重鎖相補性決定部位2(CDR2)，配列番号：1の54、55または56位における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、部位特異的変化によってAsn55位において脱アミドが減少または排除される類縁体を含む。
Glu Ile Leu Pro Xaa54 Xaa55 Xaa56 Asn Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly 
(配列番号：1)
ここで、
54位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrまたはTrp；
55位のXaaは、Asn、Gln、Arg、Asp、Ser、GlyまたはAla；
56位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrまたはTrp。
好ましい類縁体として、以下のものが挙げられる：
Xaa54がGly、Xaa55がAsnおよびXaa56がVal；
Xaa54がGly、Xaa55がAsnおよびXaa56がAla；
Xaa54がGly、Xaa55がAspおよびXaa56がGly；
Xaa54がGly、Xaa55がGlnおよびXaa56がGly；
Xaa54がGly、Xaa55がAlaおよびXaa56がGly；
Xaa54がGly、Xaa55がGlyおよびXaa56がGly；
Xaa54がGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrおよびTrpから選ばれ、Xaa55がAlaおよびXaa56がGly；および
Xaa54がGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrおよびTrpから選ばれ、Xaa55がGlyおよびXaa56がGly。
最も好ましいのは、Xaa54がGly、Xaa55がSerおよびXaa56がGlyである類縁体である。
【００２５】
本発明の好ましい類縁体は、結合特異性、結合親和性、およびMu007で観察される効力と類似の効力を有する。本発明の類縁体を規定する特性は、主に抗体の可変部にある。したがって、定常部の任意の状況において、Mu007抗体の完全な軽鎖および重鎖の可変部を用いることができ、結合親和性および特異性、ならびに成熟ヒトIL-1βを中和する能力は通常、影響を受けない。本明細書中で用いる「Mu007」は、任意のマウス定常部、好ましくはκ軽鎖およびγ−１重鎖の状況において、図１および図２に示される可変鎖配列を意味する。
【００２６】
本発明の好ましい類縁体は、重鎖CDR2，配列番号：1および１種以上のCDRと以下のアミノ酸配列を含むヒト化抗体である：
軽鎖CDR1:  配列番号：2
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr Leu Ser
軽鎖CDR2:  配列番号：3
Arg Val Lys Arg Leu Val Asp
軽鎖CDR3:  配列番号：4
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Tyr Thr
重鎖CDR1:  配列番号：5
Arg Tyr Trp Ile Glu
重鎖CDR3:  配列番号：6
Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Thr Tyr
【００２７】
基本的に、任意のヒト抗体由来のフレームワーク配列は、CDR継ぎ合せのための鋳型として機能し得る。しかしながら、このようなフレームワークへの直鎖置換は、抗原への結合親和性をいくらか損失することが多い。ヒト抗体が本来のマウス抗体に対して相同であればあるほど、マウスCDRとヒトフレームワークとの組み合わせが、CDR中へのひずみ(これが親和性を低下させ得る)を導入する可能性がおそらく低くなる。従って、CDRは除いて、マウス可変フレームワークを置き換えるために選択したヒト可変フレームワークは、マウス抗体可変部フレームワークと少なくとも65％の配列同一性を有することが好ましい。CDRは除いて、ヒトおよびマウス可変部が、少なくとも70％の配列同一性を有することがより好ましい。CDRは除いて、ヒトおよびマウス可変部が、少なくとも75％の配列同一性を有することがさらにより好ましい。CDRは除いて、ヒトおよびマウス可変部が、少なくとも80％の配列同一性を有することが最も好ましい。たとえば、図１に示す、本発明の抗体の可変軽鎖に対する好ましいヒトフレームワーク領域は、対応するマウス配列(CDR以外)と約80％の配列同一性を有する。図２に示す本発明の抗体の可変重鎖に対して好ましいヒトフレームワーク領域は、対応するマウス配列(CDR以外)と約70％の配列同一性を有する。
【００２８】
重鎖および軽鎖可変部フレームワーク残基は、同一または異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は天然に存在するヒト抗体の配列であってもよく、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。本発明のヒト化抗体の重鎖可変部に対する好ましいヒトフレームワーク配列には、VHセグメントDP-5(Tomlinsonら、(1992)J. Mol. Biol. 227:776-798)およびJセグメントJH4(Ravetchら、(1981)Cell 27:583-591)が挙げられる。VkセグメントL1(Coxら(1994)Eur. J. Immunol. 24:827-836)およびJセグメントJk2(Hieterら(1982)J. Biol. Chem. 10:1516-1522)は、ヒト化軽鎖可変部に対するフレームワークを提供するために好ましい配列である。
【００２９】
ヒト可変部フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸を対応するマウスアミノ酸で置換してCDR構造および／またはIL-1β抗原に対する結合への影響を最小にした。
【００３０】
通常、アミノ酸が以下のカテゴリーに入る場合、用いるヒト免疫グロブリン(アクセプター免疫グロブリン)のフレームワークアミノ酸はCDR提供(CDR-providing)非ヒト免疫グロブリン(ドナー免疫グロブリン)由来のフレームワークアミノ酸で置き換えられる。
(a)アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸は、その位置のヒト免疫グロブリンにとっては異常であるが、ドナー免疫グロブリン内の対応するアミノ酸はその位置ではヒト免疫グロブリンにとっては典型的なものである。
(b)アミノ酸の位置はCDRの１つにすぐ隣接している。
(c)３次元免疫グロブリンモデルにおいて、フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子は、CDRアミノ酸の任意の原子の約５〜６オングストローム(中心〜中心)内にある［Queenら、Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033(1989)およびCoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869(1991)]。アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク域内のアミノ酸、およびドナー免疫グロブリン内の対応するアミノ酸はそれぞれ、その位置ではヒト免疫グロブリンにとっては異常であり、このようなアミノ酸はその位置ではヒト免疫グロブリンにとっては典型的であるアミノ酸により置き換えられる。
【００３１】
本発明のヒト化抗体に好ましいフレームワーク領域の分析は、CDRと有意に接触しているかもしれないいくつかのアミノ酸を示唆した。マウスモノクローナル抗体Mu007由来のこれらのアミノ酸は、本来のヒトフレームワークアミノ酸を置換する。
【００３２】
図１および２は、マウス配列、好ましいヒト化配列および好ましいヒト生殖系配列由来の可変軽鎖および重鎖部のアラインメントを提供する。ヒト化配列中に１本の下線を付したアミノ酸は、対応するマウス残基で置換した。これは、たとえば、重鎖の29、30、48、67、68、70、72および97位の残基で行った。軽鎖に関しては、置換は66位および71位の残基で行った。
【００３３】
別の種由来の抗体をヒト化する主な理由(impetus)は、治療としてヒト患者に注射した場合に抗体が免疫反応を引き起こす可能性を減少させることである。ヒト化抗体で用いられるヒト配列が多ければ多いほど、免疫原性の危険性が低くなる。抗体の生物学的特性に重大な影響を与えることなく、好ましい重鎖および軽鎖領域として本明細書中に記載される配列に変更を行うことができる。これは、特に、CDRのIL-1βに結合する能力に影響を与えない抗体定常部および可変部の一部に当てはまる。
【００３４】
さらに、本明細書中に記載するように、他のヒトフレームワーク可変部およびその変異体を本発明において使用することができる。しかしながら、選択したフレームワークにかかわらず、免疫原性の危険性の減少が目的である場合、選択したヒトフレームワークに対する変更の数は最小にされるべきである。
【００３５】
本発明の抗体の好ましい軽鎖可変部は、配列番号：7である式（Ｉ）を含む。Kabatの定義に基づくCDRには下線を付す。
【数１】
2005518802.tif 000002
3位のXaaは、GlnまたはLys；
7位のXaaは、SerまたはThr；
11位のXaaは、LeuまたはMet；
12位のXaaは、Ser、TyrまたはThr；
15位のXaaは、ValまたはLeu；
17位のXaaは、AspまたはGlu；
46位のXaaは、SerまたはThr；
66位のXaaは、AlaまたはGly；および
69位のXaaは、ThrまたはGln；
式（Ｉ）[配列番号：7]
【００３６】
本発明の抗体にさらに好ましい軽鎖可変部は、配列番号：8を含む。Kabatの定義に基づくCDRには下線を付す。
【数２】
2005518802.tif 000003
【数３】
2005518802.tif 000004
【００３７】
配列番号：8または7の直前の好ましいシグナル配列は以下のとおりである。
【数４】
2005518802.tif 000005
【００３８】
本発明の抗体に好ましい重鎖可変部は配列番号：10である式（ＩＩ）を含む。Kabatの定義に基づくCDRには下線を付す。
【数５】
2005518802.tif 000006
1位のXaaは、GlnまたはGlu；
24位のXaaは、Val、AlaまたはSer；
30位のXaaは、SerまたはThr；
37位のXaaは、ValまたはIle；
43位のXaaは、Lys、GlnまたはHis；
48位のXaaは、IleまたはMet；
54位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrまたはTrp；
55位のXaaは、Asn、Gln、Arg、Asp、Ser、GlyまたはAla；
56位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、TyrまたはTrp；  
67位のXaaは、LysまたはArg；
68位のXaaは、AlaまたはVal；
70位のXaaは、Ile、MetまたはVal；
74位のXaaは、ThrまたはSer；
76位のXaaは、ThrまたはSer；
77位のXaaは、Asp、GluまたはSer；および
87位のXaaは、ArgまたはSer
式（ＩＩ）[配列番号：10]
【００３９】
本発明の抗体にさらに好ましい重鎖可変部は配列番号：11を含む。Kabatの定義に基づくCDRには下線を付す。
【数６】
2005518802.tif 000007
【数７】
2005518802.tif 000008
【数８】
2005518802.tif 000009
【００４０】
配列番号：11または10の直前の好ましいシグナル配列は以下のとおりである。
【数９】
2005518802.tif 000010
【００４１】
本明細書中で言及する類縁体は、配列番号：7に対応する軽鎖配列および配列番号：10に対応する重鎖配列を有するマウスモノクローナル抗体Mu007のヒト化バージョンである抗体「Hu007」の類縁体である。
本発明の類縁体は、重鎖CDR2部位の54、55および56位における部位特異的突然変異誘発の結果である。類縁体は55位の脱アミドを減少または排除する。脱アミドのプロセスは、タンパク質の安定性／活性に影響を与え、AsnまたはGln残基において起こるよく知られている現象である。Asnにおける脱アミドは、より頻繁に起こり、脱アミド速度はタンパク質の一次、二次および三次構造に大きく依存する。モデルペプチドを用いる実験により、Asnに続いて小さい側鎖を持つ残基、すなわちGly（特徴的な-NG-モチーフ）がある場合、脱アミド速度は、Valなどのより大きな残基がAsnに続く場合よりも100倍速くなりうることが示される。抗体Hu007の重鎖は、３個の-NG-配列モチーフを含む(55-56、318-319および387-388位)。予期せぬことに、55位におけるAsnが、脱アミドの唯一の主要な部位である（実施例１２）。完全に脱アミドされた抗体に似ているHu007類縁体N55Dは、インビトロ細胞ベースアッセイで測定すると約15〜20分の1の低い効力をもち（実施例１０）、BIAcore分析により測定するとそのIL-1βへの結合親和性が約15分の1に失われる（実施例１３）。
【００４２】
本発明は、重鎖CDR2，配列番号：1および抗体Mu007のCDRの１種以上を含む類縁体に関する。本発明のCDRはMu007抗体の超可変部であり、特異的IL-1βエピトープに対する抗体の結合に関する定常部の大部分を提供する。したがって、本明細書中に記載のCDRは、CDRに連結した場合に活性構造配置にCDRを維持し、CDRを用いるタンパク質の成熟IL-1βに対する結合親和性をMu007の結合親和性と比較して上昇させる、Mu007の結合親和性と同じである、またはMu007抗体の結合親和性と比較して10分の1以下には減少しない、全長抗体および機能的フラグメントまたは他のタンパク質を製造するために使用することができる。好ましくは、結合親和性はMu007抗体の結合親和性と比較して5分の1未満には減少しない。最も好ましくは、結合親和性はMu007抗体の結合親和性の３倍以内である。
【００４３】
Mu007抗体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴(BIAcoreTM)を用いて決定した。これらの実験においては、抗体をBIAcoreTMチップ上に低密度で固定化し、リガンドを流す(flow past)。チップの表面での塊の蓄積を測定した。この分析方法により、結合についてのオンおよびオフの速度を両方リアルタイムで測定することができる。Mu007抗体は、約6.2ピコモルの親和性を有する(実施例９を参照)。本発明の好ましいヒト化抗体、Hu007は、約10.2ピコモルの親和性を有する(実施例９を参照)。Mu007およびHu007抗体は、IL-1βに特異的に結合し、他のIL-1ファミリーメンバーまたは同じ化学種に属する構造的に関連するタンパク質には結合しない。
【００４４】
本発明の類縁体の結合親和性も、表面プラズモン共鳴(BIAcoreTM)を用いて決定した（実施例１３）。また、本発明の類縁体がIL-1βに特に結合するのが好ましい。たとえば、本発明の最も好ましい類縁体は、重鎖CDR2，N55S（55位のAsnがSerで置換される）が、Hu007抗体のIL-1βに対する結合親和性の３倍以内の結合親和性をもつ（表３、実施例１３）。
本発明の類縁体は、重鎖CDR2部位における55位のアミノ酸の脱アミドを減少または排除する。好ましい類縁体は、野生型（WT）Hu007抗体と比較して、増強された安定性をもつ（実施例１４）。たとえば、類縁体G56Vは、WTと比較して脱アミドを減少し、類縁体N55D、N55SおよびN55Qは、WTと比較して、この部位における脱アミドを本質的に排除する（表４、実施例１４）。
【００４５】
また、本発明の類縁体が、IL-1βの生物活性を中和するのが好ましい。２種の異なるアッセイを用いて、Mu007、Hu007および本発明の類縁体のIL-1β活性を中和する能力を試験した。増殖に低レベルのIL-1βを必要とするマウス細胞株を第１のアッセイで用いた。ヒトIL-1βは倍地中に一定濃度で存在し、各抗体の希釈系列を加えた。増殖の阻害により、抗体のIL-1レセプターのIL-1β活性化をブロックする能力の効力の測定値を得た。異なる濃度の抗体の増殖測定により、IC50の平均値を生じた(Mu007に関して220ピコモル、およびHu007に関して480ピコモル)(実施例10を参照)。本発明の類縁体が、Mu007よりも良い、同じ、または10倍以内のIC50効力を有することが好ましい。好ましくは、IC50効力はMu007の５倍以内である。最も好ましくは、IC50効力はMu007の３倍以内である。本明細書中における「IC50」は、抗体のヒトIL-1β活性を阻害する効力の測定値である。IC50は、単濃度実験において50％ IL-1β阻害を生じる抗体濃度である。IC50は、ヒトIL-1β活性の阻害を検出する任意のアッセイにより測定することができる。しかしながら、得られるIC50値は、用いるアッセイに応じて変化しうる。同じアッセイを用いる実験間でさえ、いくらかのばらつきがあるかもしれない。たとえば、上記のIL-1β依存性細胞の状態は、得られるIC50の値に影響を有する。したがって、本発明の目的に関して重要な値は、単独実験でMu007、Hu007または本発明の類縁体を用いて得られた値に対して比較した値である（表３、実施例１０）。
【００４６】
Hu007または本発明の類縁体はいずれも、マウスIL-1βと交差反応性を示さず、このことによりマウスモデルを用いてインビボでの中和活性を試験することが困難となっている。しかしながら、IL-1βの前炎症活性の影響のひとつはIL-6(IL-1βの非局所的な効果をいくらか媒介する別の前炎症性サイトカイン)の誘導である。ヒトIL-1βはマウスIL-1βレセプターに結合し、刺激してマウスIL-6の上昇を導くことができる。したがって、中和活性を有する抗体は、一定用量のヒトIL-1βを与えたマウスにおいてIL-6の誘導をブロックする。Mu007およびHu007は両方とも、炎症刺激のマウスモデルにおいて、ヒトIL-1βの強力な中和を示した。ヒト化抗体は、Mu007抗体の約１／３の有効性であった(実施例１１を参照)。
【００４７】
また、本発明は、Mu007 CDRをヒトフレームワーク領域またはヒトフレームワーク変異体(たとえば、Hu007)に移植し、結合親和性または他の生物学的特性(たとえば、IC50値として表され得る、特定の濃度での抗体がIL-1β活性を中和する能力)を上昇させるように修飾または変異させている抗体に関する。
【００４８】
本発明の抗体は、Mu007およびHu007抗体の場合と同じヒトIL-1β上のエピトープに結合することが好ましい。さらに、本発明は、これらの抗体がヒトIL-Iβをインビボで中和する能力を有するならば、Mu007およびHu007抗体が結合するエピトープと重ねてか、またはそれらを含むエピトープに結合する抗体に関する。
【００４９】
本発明は、ヒトIL-1βの165アミノ酸成熟形態の特定の領域の発見に関し、そのような領域への抗体の結合は、タンパク質の活性を完全に中和する。さらに、成熟IL-1βの特定の領域に対する抗体は、それらが他のIL-1ファミリーメンバーまたは関連タンパク質とは交差反応しないという点で特異的である。本発明はこのエピトープに結合し、IL-1β活性を中和する類縁体のいずれにも関するが、類縁体が重鎖CRD2、配列番号：1およびMu007に存在するCDRのうちの少なくとも１つを用いることが好ましい。IL-1β活性を中和する抗体は、成熟IL-1βタンパク質がレセプターに結合すること、および／またはシグナル伝達経路を開始させることを阻害する。
【００５０】
本発明はまた、発現させた場合にMu007およびHu007が結合するエピトープと同一のエピトープに特異的に結合し、強力なインビボ中和活性を有する抗体をコードする組換えDNAに関する。
好ましくは、DNAは、発現させた場合に、配列番号：1ならびに１種以上の重鎖および軽鎖Mu007 CDRを含む抗体をコードする［配列番号：2、3、4、5および6］。発現させると、Mu007およびHu007抗体の重鎖および軽鎖のCDRを含むポリペプチド鎖をコードする代表的なDNA配列は、配列番号8および11と表される。遺伝コードの縮重により、他のDNA配列は容易に例示配列のかわりに置き換えられることができる。
【００５１】
本発明の類縁体をコードするDNAは、通常、抗体コード配列(天然で関与する、または異種性のプロモーター領域を含む)に動作可能に連結されている発現制御ポリヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし得るベクター中の真核細胞プロモーター系であるが、原核生物宿主に対する制御配列もまた使用することができる。一旦、適切な宿主細胞株にベクターを組み込むと、宿主細胞をヌクレオチド配列の発現、望ましい場合には軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体またはもとのままの抗体、結合フラグメント、または他の免疫グロブリン形態の回収および精製に適切な条件下で増殖させる。
【００５２】
最終的に所望の類縁体を発現し得る本発明の核酸配列は、種々の異なるポリヌクレオチド(ゲノムまたはcDNA、RNA、合成オリゴヌクレオチドなど)および構成成分(たとえば、Ｖ、Ｊ、ＤおよびＣ領域)から任意の種々の公知の技術を用いて形成することができる。適切なゲノム配列および合成配列の連結が一般的な産生方法であるが、cDNA配列もまた、利用することができる。
【００５３】
ヒト定常部DNA配列は、種々のヒト細胞から公知の方法を用いて単離することができるが、好ましくは不死化Ｂ細胞由来である。ポリヌクレオチド配列に適した供給源細胞、および免疫グロブリン発現および分泌用の宿主細胞は、当業界において公知の多数の供給源から入手することができる。
【００５４】
本明細書中に具体的に記載する類縁体に加えて、本明細書中に記載の他の「実質的に相同な」修飾類縁体は、当業者に公知の種々の組換えDNA技術を用いて容易に設計および製造することができる。たとえば、フレームワーク領域は、種々のアミノ酸置換、末端および中間の付加および欠失などにより、一次構造レベルでネイティブな配列から変更することができる。さらに、種々の異なるヒトフレームワーク領域が、単独で、または本発明のヒト化免疫グロブリンに対する基礎として組み合わせて使用されうる。通常、遺伝子の修飾は、種々の公知の技術(部位特異的突然変異誘発など)により容易に達成されうる。
【００５５】
あるいは、一次抗体構造の一部のみを含むポリペプチドフラグメントを製造することができ、このフラグメントは1種以上の免疫グロブリン活性(たとえば、補体結合活性)を有する。これらのポリペプチドフラグメントは、当該分野において公知の方法により、または部位特異的突然変異誘発法を用いて停止コドンをベクター中の所望の位置に挿入することにより、インタクトな抗体のたんぱく質分解性切断により製造することができる（たとえば、CH1の後にFabフラグメントを製造するため、またはヒンジ部の後にF(ab’)２フラグメントを製造するためなど）。１本鎖抗体は、VLおよびVHをDNAリンカーと連結することにより製造することができる。
【００５６】
先に記載したように、ポリヌクレオチドは、配列を発現制御配列に動作可能に連結した(すなわち、確実に機能し得るように配置した)後に、宿主細胞中で発現される。これらの発現ベクターは、通常、エピソームまたは宿主染色体DNAの必須部分のいずれかとして、宿主細胞中で複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のDNA配列でトランスフェクトした細胞の検出を可能にするために選択マーカー(テトラサイクリン、ネオマイシンおよびジヒドロ葉酸レダクターゼ等)を含む。
【００５７】
大腸菌は本発明のポリヌクレオチドのクローニングに特に有用な原核生物宿主である。使用に適した他の微生物宿主としては、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）のようなバシラス属（bacilli）およびサルモネラ（Salmonella）、セラティア（Serratia）のような腸内細菌および種々のシュードモナス（Pseudomonas）種が挙げられる。これらの原核生物宿主において、通常は宿主細胞と適合した発現制御配列(たとえば、複製起点)を含む、発現ベクターもまた、作製することができる。さらに、多数の公知のプロモーターのうちの任意のものが存在してもよい（たとえば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、β-ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダ由来のプロモーター系）。通常、プロモーターは発現を制御するが、場合により、転写および翻訳の開始および完了のために、オペレーター配列を伴い、リボソーム結合部位配列などを有する。
【００５８】
他の微生物(酵母等)もまた、発現のために使用することができる。サッカロミセス(Saccharomyces)は好ましい宿主であり、3-ホスホグリセラートキナーゼまたは他の糖分解酵素を含む発現制御配列(プロモーター等)、および複製起点、所望であれば終止配列などを含む適切なベクターを有している。
【００５９】
微生物に加えて、植物細胞もまた、発現のために使用することができる。植物形質転換に最適の方法は、植物のタイプに依存して変化する（WO00/53794、米国特許番号5,202,422および6,096,547ならびにGiddingsら、Nature Biotechnology 18:1151(2000)を参照）。
【００６０】
哺乳動物組織細胞培養物もまた、本発明のポリペプチドを発現させ、生産するために使用することができる。インタクトな免疫グロブリンを分泌し得る多数の適切な宿主細胞株が当該分野において開発されているので、真核生物細胞は実際に好ましく、これには、CHO細胞株、種々のCOS細胞株、ゴールデンハムスター卵巣細胞株、HeLa細胞、骨髄腫細胞株、形質転換したＢ細胞、ヒト胚腎臓細胞株またはハイブリドーマが挙げられる。好ましい細胞株はCHOおよび骨髄腫細胞株(SP2/0およびNS0等）である。
【００６１】
これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列(たとえば、複製起点)、プロモーター、エンハンサー、および必須のプロセシング情報部位(たとえば、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終止部位)を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウィルス等に由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位としては、SV40およびウシ成長ホルモン由来の配列があげられる。
【００６２】
目的のポリヌクレオチド配列(たとえば、重鎖および軽鎖をコードする配列および発現制御配列)を含むベクターを、公知の方法(細胞宿主のタイプに応じて変わる)により宿主細胞にトランスフェクトすることができる。たとえば、真核生物細胞に関しては、塩化カルシウムトランスフェクションが通常用いられるが、他の細胞宿主に関しては、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが用いられ得る。
【００６３】
別の態様において、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックである動物（たとえば、マウス）において発現することができる（Taylor、L.D.ら、 Nucl. Acids Res.、20:6287-6295(1992)などを参照）。免疫感作を行って、内因性の免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の全レパートリーを産生する能力をもつトランスジェニック動物を用いることができる。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイ突然変異マウスにおけるそのようなアレイの伝達の結果として、抗原チャレンジを行うとヒト抗体が産生される（Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:2551-2555、(1993)； Jakobovitsら、Nature、362:255-258、(1993)； Bruggemannら、Nature Biotechnology 14:826(1996)； Gross、J.A.ら、Nature、404:995-999(2000)；および米国特許番号5,874,299、5,814,318および5,789,650などを参照）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー内で産生されることができる(HoogenboomおよびWinter、J. Mol. Biol.、227:381(1992)； Marksら、J. Mol. Biol.、222:581(1991))。ColeらおよびBoernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の製造に利用できる(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therap、Alan R. Liss、p. 77(1985)およびBoernerら、J. Immunol.、147(l):86-95(1991))。さらに、ヒトモノクローナル抗体は、乳房上皮細胞において選択的に外来性抗体遺伝子を発現するトランスジェニック動物の作製を介して、哺乳動物のミルクにおいて製造することができる(米国特許番号5,849,992)。
【００６４】
一旦発現させたら、標準的な方法(硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換、アフィニティー(たとえば、プロテインＡ)、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動など)にしたがって、類縁体を精製することができる。医薬用途には、少なくとも約90〜95％の純度を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、98〜99％以上の純度が最も好ましい。部分的または所望される均質性まで精製した後、本明細書中に記載するようにポリペプチドを治療的または予防的に使用することができる。
【００６５】
本発明はまた、IL-1β媒介性炎症性障害を経験しているヒトの治療方法に関し、この方法は、有効用量の抗IL-1β類縁体を、治療を必要とする患者に投与することを含む。本発明の類縁体はIL-1βに結合し、IL-1βがIL-1βレセプターに結合してシグナル伝達(signal)を開始することを阻害する。種々のIL-1β媒介性障害としては、関節リウマチ(RA)、変形性関節症(OA)、アレルギー、敗血症性または内毒素性ショック、敗血症、脳卒中(stroke)、喘息、移植片対宿主病、クローン病および他の炎症性腸疾患が挙げられる。好ましくは、本発明に関する抗IL-1β類縁体はRAおよび／またはOAを治療するために使用される。
【００６６】
RAを有する患者は関節の慢性の腫脹および関節の炎症、および進行中の軟骨および骨の破壊をわずらっている。IL-1βおよびTNF-αはRAの病因において最も重要なサイトカインである。しかし、IL-1βおよびTNF-αは両方とも炎症を媒介するが、IL-1βは骨および軟骨破壊の主なメディエーターである。滑膜組織中の活性型の単球および線維芽細胞はIL-1βを産生し、これは次に、さらなる前炎症性サイトカイン、プロスタグランジンおよびマトリックスメタロプロテアーゼの産生を刺激する。滑膜内膜は肥大し、骨および軟骨内に進入し、侵食する。
【００６７】
予防維持性抗リウマチ薬(DMARDS)、たとえば、ヒドロキシクロロキン、経口用または注射金剤、メトトレキサート、アザチオプリン、ペニシラミンおよびスルファサラジンは、RAの処置に用いられてきたが、これらは効き目が穏やかである。それらのRAの経過を改変する活性は、IL-1βのような炎症性メディエーターの抑制および変更に起因すると考えられている。たとえば、メトトレキサートは、一週間あたり7.5〜10 mgの用量で、RA患者のIL-1βの血漿濃度の減少を引き起こす。類似の結果が、コルチコステロイドで観察されている。したがって、本発明の抗IL-1β類縁体は、単独または血漿中のIL-1βたんぱく質レベルを低下させるように作用し得るDMARDSと組み合わせて用いられ得る。
【００６８】
本発明の抗IL-1β類縁体の有効量は、容認し難い副作用または毒性を伴わずに臨床上の有効性を提供する量である。RA患者に対する臨床上の有効性は、アメリカリウマチ学会、改善の定義(the American College of Rheumatology Definition of Improvement)(ACR20)を用いて評価することができる。患者が、関節の滑らかさの評点、関節の腫脹の評点、および５つの他の構成要素(患者の疼痛の評価、患者の全体的な評価、医師の全体的な評価、健康評価質問表(Health Assessment Questionnaire)、および血清C反応性タンパク質(serum C-reactive protein)を含む）のうち３つにおいて20％の改善を示した場合に患者を応答者とみなす。構造的損傷の予防は、放射線写真のシャープ評点システム(Sharp Scoring system)のファンデルハイジ(van der Heijde)の改変法の評価することができる(腐食カウント、関節腔の狭さ)。
【００６９】
また、本発明の抗IL-1β類縁体は変形性関節症(OA)を罹患した患者を処置するために使用することができる。OAはヒト関節の最も一般的な疾患であり、関節軟骨の損失および骨棘形成により特徴づけられる。臨床上の特徴としては、関節痛、硬直、肥大、不安定(instability)、動きの制限、および機能的な障害が挙げられる。OAは、特発性(原発性)および二次型に分類することができる。膝および股関節部のOAの分類に関する判断基準は、臨床上のパラメーター、放射線写真のパラメーターおよび研究室内でのパラメーターに基づいてアメリカリウマチ学会により開発された。
【００７０】
本発明の抗IL-1β類縁体は、RAまたはOAの患者を治療するための医薬の製造に用いることもできる。さらに、本発明の抗IL-1β類縁体は、必要とする患者における軟骨破壊を阻止するための医薬の製造に用いることができる。
本発明の抗IL-1β類縁体の有効量は、疼痛および機能ならびに構造的損傷の予防における改善により測定した場合に、OA患者において臨床上の有効性を示す量である。疼痛および機能における改善とは、疼痛および肉体機能のサブスケールのWOMAC OAインデックスを用いて評価することができる。このインデックスにより、疼痛の領域、硬直、および肉体機能の、臨床上重要な患者に関連する症状を調べる。構造的損傷の予防は、膝または股関節の放射線写真における関節腔の幅を測定することにより評価することができる。
【００７１】
本発明の類縁体は、標準的な投与方法、好ましくは静脈内、腹膜内、皮下、経肺、経皮、筋肉内、経鼻、経頬粘膜、舌下または坐薬での投与により末梢から(すなわち、中枢神経系への投与によるものではない)、投与される。
【００７２】
投与用医薬組成物は、選択した投与の態様に適切であるように設計されており、適切な場合には、緩衝剤、界面活性剤(surfactant)、保存剤、溶解補助剤、等張化剤、安定剤などの製薬上許容される賦形剤を用いる。Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, 最新版(本明細書中に参照して組み込む)は、通常、当業者に公知の製薬技術の要約を提供する。
【００７３】
製剤中の抗IL-1β類縁体の濃度は、約0.1重量％の低い程度から、15または20重量％の高い程度であってよく、主に、流体の体積、粘性、安定性等に基づき、選択した特定の投与態様にしたがって選択する。IL-1β抗体の好ましい濃度は、通常、１〜約100 mg/mLの範囲にある。好ましくは、10〜約50 mg/mLである。
【００７４】
製剤は緩衝剤を含んでもよい。好ましくは、緩衝剤はクエン酸緩衝剤またはリン酸緩衝剤、またはそれらの組み合わせである。通常、製剤のpHは約４〜約８の間である。好ましくは、pHは約５〜約7.5の間である。製剤のpHは、類縁体の安定性(化学的および物理的)および投与時の患者への快適さのバランスをとって選択される。また、製剤はNaClのような塩を含有しうる。さらに、製剤は凝集を予防し、安定性の維持を助けるために界面活性剤(detergent)を含んでいてもよい。たとえば、Tween-80およびTween-20は、Hu007抗体と適合性であることが示されている。
【００７５】
製剤を作製後に滅菌ろ過しても良いし、または微生物学的に許容可能にしても良い。保存剤(m-クレゾールまたはフェノール、あるいはそれらの混合物)を添加して微生物の増殖および汚染を予防してもよい。
【００７６】
静脈内注入用の通常の組成物は、液体(たとえば、滅菌リンガー液)250mLもの容量および１〜100mg/mL以上の抗体濃度を有してもよい。本発明の治療用薬剤は保存用に凍結または凍結乾燥させて、使用前に適切な滅菌キャリア中で再構築してもよい。凍結乾燥および再構築は、種々の程度の抗体活性の損失を生じるかもしれない(たとえば、通常の免疫グロブリンであるIgM抗体は、IgG抗体よりも抗体活性損失の程度が高い傾向にある)。補うために用量を調整する必要があるかもしれない。
【００７７】
前記の方法が、適切な適用により、ヒト化抗体のようなタンパク質の投与に最も都合が良く、最も適切であるが、適切な製剤が設計されている場合には他の投与方法(たとえば、経皮投与および経口投与)が使用されうる。さらに、生分解性フィルムおよびマトリックス、または浸透性ミニポンプ、またはデキストランビーズ、アルギナートまたはコラーゲンに基づくデリバリーシステム、を用いる制御放出製剤を用いることが望ましいかもしれない。要約すると、製剤は本発明の類縁体の投与のために利用可能であり、種々の選択肢から選択することができる。
【００７８】
代表的な用量レベルは、標準的な臨床上の技術を用いて最適化することができ、投与の態様および患者の状態に依存する。通常、用量は10μg/kg/月〜10 mg/kg/月の範囲である。
本発明を以下の実施例により例示するが、これはいかなる様式においても限定は意図しない。
【実施例】
【００７９】
実施例１
Mu007可変部
Mu007軽鎖および重鎖可変部のcDNAをハイブリドーマ細胞株からクローニングした。数個の軽鎖および重鎖のクローンを、２回の独立したPCR反応から配列決定した。機能的な軽鎖可変域配列は機能的なマウスκ鎖可変部の典型的なものであり、Kabatの定義(Johnson, G.およびWu, T. T.(2000)Nucleic Acids Res. 28: 214-218)に基づきサブグループＶに属することを見出した。重鎖に関しては、代表的なマウス重鎖可変部に相同な独特の配列を同定した。Mu007可変重鎖を、Kabatの定義(JohnsonおよびWu, 2000)に基づきサブグループII(A)に分類した。軽鎖および重鎖可変部をコードするcDNA配列は、それぞれ、配列番号１および３とあらわす。
【００８０】
実施例２
Hu007可変部
Mu007 CDRに対するアクセプターとして用いるヒト可変部フレームワークを構築し、約65〜80塩基の長さにわたる８個の重複合成オリゴヌクレオチド(Heら、(1998)J. Immunol. 160: 1029-1035)を用いて増幅した。オリゴヌクレオチドを対でアニーリングさせ、DNAポリメラーゼＩのクレノーフラグメントを用いて伸長し、４本の二重鎖フラグメントを得た。得られたフラグメントを変性させ、対でアニーリングさせ、クレノーを用いて伸長させて２本のフラグメントを得た。これらのフラグメントを変性し、対でアニーリングさせ、もう一度伸長し、全長遺伝子を得た。PCR増幅したフラグメントをゲル精製し、pCR4Bluntベクターにクローニングした。配列を確認した後、可変軽鎖および可変重鎖の遺伝子をMluIおよびXbaIで消化し、ゲル精製し、それぞれ軽鎖および重鎖の発現用のベクターにサブクローニングしてpVk-Hu007およびpVg1-Hu007を作製した。
【００８１】
実施例３
Hu007およびHu007類縁体のクローニングおよび発現
Hu007：
マウス骨髄腫細胞株Sp2/0-Ag14(以下、Sp2/0)をATCCから入手し、37℃のインキュベーター中で10％FBS(カタログ番号SH30071.03, Hyclone, Logan, UT)を含むDME培地に維持した。
【００８２】
マウス骨髄腫細胞株Sp2/0への安定なトランスフェクションを、取扱説明書に従ってGene Pulser装置(BioRad, Hercules, CA)を360 Vおよび25 μFで用いるエレクトロポレーションにより達成した。トランスフェクションの前に、pVk-Hu007およびpVg1-Hu007プラスミドDNAを、FspIを用いて線状化した。約107のSp2/0細胞をpVk-Hu007(30μｇ)およびpVg1-Hu007(60μｇ)でトランスフェクトした。トラスフェクトした細胞を、10％FRSを含有するDME培地に懸濁し、数枚の96ウェルプレートにプレーティングした。48時間後、細胞を選択培地(10％FBS、HT培地補充物、キサンチン0.3 mg/mlおよびミコフェノール酸１μg/mlを含有するDME培地)を用いてgpt発現に関して選択した。選択の開始の約10日後、培養物上清を、ELISAにより抗体産生についてアッセイした(実施例７を参照のこと)。高収率のクローンを、10％FBSを含有するDME培地に広げ、抗体発現についてさらに分析した。次いで、選択したクローンを無血清培地(Hybridoma SFM,カタログ番号12045-076, Life Technologies, Rockville, MD)中での増殖に適合させた。これは、血清レベルが0.1％未満になるまで、細胞を徐々にHybridoma SFMに分割することにより(通常は、分割毎に25〜50％)達成する。その後、トランスフェクト物をHybridoma SFM中で維持した。細胞密度を２×105/ml〜106/mlの間で維持した。
【００８３】
CHO-DG44細胞をpVk-Hu007(50μg)およびpVg1-Hu007(50μg)でトランスフェクト(ゲノムトランスフェクション)するか、またはHu007軽鎖に対応するcDNAを含む発現ベクター(50μｇ)およびHu007重鎖に対応するcDNAを含むベクター(50μｇ)でトランスフェクトした。約107の細胞を、ゲノムトランスフェクションのためには350ボルト/50μFおよび380/50μF、およびcDNAトランスフェクションのためには350ボルト/71μFおよび380ボルト/71μFでエレクトロポレーションを行った。細胞を室温でインキュベートし、次いで増殖培地(Growth Medium)(20 ml)(ExCell 302 培地+ L-グルタミン(4mM)+ 1×ヒポキサンチン/チミジン試薬+ 硫酸デキストラン(100 μg/mL))中で希釈し、37℃/5％ CO2インキュベーター中で72時間回復させた。ゲノムトランスフェクション用にはメトトレキサート(50nM)、およびcDNAトランスフェクション用にはメトトレキサート(20nM)およびG418(200μg/mL)を含有する培地を用いて細胞を選択した。
【００８４】
部位特異的突然変異誘発法を用いるHu007類縁体クローニング：
以下の手順を用い、Hu007のCDR2部位において突然変異誘発を行う：Hu007のCDR2部位は、
【数１０】
2005518802.tif 000011
として定義される。N55をD、QおよびSに突然変異させ、G56をAおよびVに突然変異させる。PCR増幅のためのテンプレートとして、CMVプロモーターから上流のSsp I部位およびHu007のCDR2部位から下流のSsp I部位を含むpCID-Hu007HC-cDNAプラスミドを用い、Hu007のCDR2部位を突然変異させる。各突然変異のためのオリゴヌクレオチドプライマーは下記のとおりである：
N55D：
フォワードプライマー（SspI部位を太字で示す）
【数１１】
2005518802.tif 000012
および
リバースプライマー（SspI部位を太字で示し、N55D突然変異を下線で示す）
【数１２】
2005518802.tif 000013
N55Q：
フォワードプライマー（N55Dからのフォワードプライマーを用いる）および
リバースプライマー（SspI部位を太字で示し、N55Q突然変異を下線で示す）
【数１３】
2005518802.tif 000014
N55S：
フォワードプライマー（N55Dからのフォワードプライマーを用いる）および
リバースプライマー（SspI部位を太字で示し、N55S突然変異を下線で示すー、診断上の切断部位としてBam HI部位（これも太字）を導入する）
【数１４】
2005518802.tif 000015
G56V：
フォワードプライマー（N55Dからのフォワードプライマーを用いる）および
リバースプライマー（SspI部位を太字で示し、G56V突然変異を下線で示す）
【数１５】
2005518802.tif 000016
G56A：
フォワードプライマー（N55Dからのフォワードプライマーを用いる）および
リバースプライマー（SspI部位を太字で示し、G56A突然変異を下線で示す）
【数１６】
2005518802.tif 000017
【００８５】
得られる1316 bp PCRフラグメントをTOPOベクター(pCR 2.1)に付加し、続いて、Ssp Iで開裂し、ゲル精製し、予めSsp Iで分解して突然変異を創成したベクターpCID-Hu007HC-cDNAプラスミドにライゲートする（図４）。WT Hu007軽鎖遺伝子とのコトランスフェクションにおいて各類縁ベクターを用い、pcIDにクローニングする。前記CH0細胞に対する手順と同様にして、HEK 293-EBNA細胞での一過的トランスフェクション法を用いて発現ワークをサポートする。
【００８６】
実施例４
Hu007類縁体の発現および精製
Hu007類縁体 IgG1 モノクローナル抗体を含む培養物上清をプロテイン-A Sepharoseクロマトグラフィーによって精製した。消費培養物上清を回収し、プロテイン-A Sepharoseカラムにかけた。0.1 M グリシン-HCl(pH 3.5)
を用いて抗体を溶離する前に、カラムをPBSで洗浄した。1 M Tris HCl(pH 8)で中和した後、溶離したタンパク質をPBS(２Ｌ、３回交換)で透析し、0.2μmフィルターでろ過した後４℃で保存した。280 nmでの吸光度を測定することにより抗体濃度を決定した(１mg/ml＝1.452 A280)。
【００８７】
実施例５
Mu007の発現および精製
Mu007を産生するハイブリドーマ細胞を、最初は10％FBS(HyClone)、10 mM HEPES、２mM グルタミン、0.1 mM 非必須アミノ酸、１mMピルビン酸ナトリウム、25 μg/ml ゲンタミシンを含有するRPMI-1640倍地中で増殖させ、次いで、２％ 低Ig FBS(カタログ番号30151.03, HyClone)を含有する無血清培地(Hybridoma SFM、カタログ番号12045-076, Life Technologies, Rockville, MD)中でローラー瓶中１Lまで拡大させる。Mu007を、プロテイン-G Sepharoseカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより培養物上清から精製した。EZ-連結スルホ-NHS-LC-LC-ビオチン(カタログ番号21338ZZ, Pierce, Rockford, IL)を用いて、ビオチニル化Mu007を製造した。
【００８８】
実施例６
単離したMu007、Hu007およびHu007類縁体のSDS-PAGE分析
標準的な方法に従い、４〜20％勾配ゲル(カタログ番号EC6025, Novex, San Diego, CA)でTris-グリシン緩衝液中でSDS-PAGEを行った。非還元条件下でのMu007、Hu007およびHu007類縁体のSDS-PAGE分析は、両方の抗体が約150〜160ｋDの分子量を有することを示した。還元条件下での分析は、両方の抗体が約50kDの分子量を有する重鎖および25kDの分子量を有する軽鎖からなることを示した。Hu007類縁体の純度は95％よりも高い。
【００８９】
実施例７
ELISAによる抗体発現の定量
96-ウェル ELISAプレートのウェル(Nunc-Immunoプレート、カタログ番号 439454, NalgeNunc, Naperville, IL)を、0.2 M 炭酸ナトリウム-重炭酸緩衝液(pH 9.4)中１μg/ml ヤギ抗ヒトIgG Fcフラグメント特異的ポリクローナル抗体(カタログ番号109-005-098, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)(100μl)で、一晩、４℃でコーティングした。洗浄緩衝液(0.1％ Tween 20を含有するPBS)で洗浄した後、ウェルをSuperblock Blocking Buffer(カタログ番号37535, Pierce)(400μl)で30分間ブロックし、次いで、洗浄緩衝液で洗浄した。Hu007およびHu007類縁体を含むサンプルを、ELISA緩衝液(１％ BSAおよび0.1％ Tween 20を含有するPBS)で適切に希釈し、ELISAプレート(100μl/ウェル)に適用した。基準として、ヒト化抗-CD33 IgG1モノクローナル抗体HuM195(Coら、(1992)J. Immunol. 148: 1149-1154)を用いた。ELISAプレートを、37℃で２時間インキュベートし、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、ELISA緩衝液中で1/1,000に希釈したHRP結合型ヤギ抗ヒトκポリクローナル抗体(100μl)(カタログ番号1050-05, Southern Biotechnology, Birmingham, AL)を各ウェルに適用した。37℃で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄した後、ABTS基質(カタログ番号507602および506502, KirkegaardおよびPerry Laboratories, Gaithersburg, MD)(100μl)を各ウェルに加えた。２％シュウ酸100μl/ウェルを加えることにより発色を停止させた。OPTImaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, CA)を用いて415nmで吸光度を読み取った。
【００９０】
実施例８
ELISA競合
96-ウェルELISAプレート(Nunc-Immunoプレート、カタログ番号439454, NalgeNunc)のウェルを0.5 μg/ml of 0.2M 炭酸ナトリウム-重炭酸緩衝液(pH 9.4)中のヒトIL-1β(0.5μg/ml)100μlで４℃にて１晩、コーティングし、洗浄緩衝液で洗浄し、Superblockブロック緩衝液で37℃にて30分間ブロックし、洗浄緩衝液で再度洗浄した。ビオチニル化Mu007(最終濃度0.16 μg/ml)および競合抗体(Mu007、Hu007またはHu007類縁体；最終濃度100 μg/mlで始める、３倍の系列希釈)のELISA緩衝液中の混合物を、ウェルあたり100μlの最終体積で３連で加えた。非競合コントロールとしては、ビオチニル化Mu007(0.16μg/ml)100μlを用いた。バックグラウンドコントロールとしては、ELISA緩衝液100μlを用いた。ELISAプレートを37℃で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、HRP結合型ストレプトアビジン(１μg/ml)(Jackson ImmunoResearch)100μlを各ウェルに加えた。ELISAプレートを室温で30分間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄した。発色用に、ABTS基質(100μl/ウェル)を加えた。２％シュウ酸100μl/ウェルを加えることにより発色を停止させた。吸光度を415nmで読み取った。
Mu007、Hu007およびHu007類縁体は濃度依存的な様式でビオチニル化Mu007と競合した。濃度依存的な競合物は、競合抗体が成熟IL-1β上の同じエピトープに結合することを示した。３回の独立した試験におけるMu007およびHu007のIC50値(コンピューターソフトウェアPrism(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)を用いて得た)を表１に示す。Hu007の相対的な結合は、Mu007の相対的な結合の1.3倍(平均)であった。
【表１】
2005518802.tif 000018
【００９１】
実施例９
結合親和性および特異性
Hu007およびMu007の両方の親和性および特異性を、BIAcore測定機を用いて決定した。BIAcoreTMは分子相互作用を測定する自動バイオセンサーシステムである(Karlssonら(1991)J. Immunol. Methods 145：229-240)。これらの実験において、抗体をBIAcoreTMチップ上に低密度で固定化した。エチル-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDC)を用いて反応性アミノ基を精製ヤギ抗ヒトIgGに、またはヤギ抗ウサギIgGをカルボキシメチル(CM5)BIAcoreTMセンサーチップのフローセルにカップリングした。ヤギIgGを、酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)中で希釈し、EDCを用いてCM5チップのフローセルに固定化して1000反応ユニットを得た。未反応の部位をエタノールアミン(ehanolamine)でブロックした。60μl/分の流速を用いた。複数回の結合/溶出サイクルを、15μg/mL Mu007またはHu007の溶液(100μl)の注入、続いてヒトIL-1β、マウスIL-1β、ラットIL-1β、カニクイザルIL-1β、ブタIL-1β、ヒトIL-1レセプターアンタゴニストおよびヒトIL-1αを各サイクルについて濃度を減少(たとえば、1500、750、375、188、94、47、23.5、12および0ピコモル)させて注入することにより行った。グリシン-HCl(pH 1.5)を用いて溶離を行った。BIAevaluationTMを用いて反応速度データを分析した。表２は、ヒトおよびカニクイザルIL-1βに対するHu007およびMu007の親和性を示す。マウスIL-1β、ラットIL-1β、IL-1レセプターアンタゴニスト、およびヒトIL-1αはHu007に結合しなかった。カニクイザルおよびブタのIL-1βは、ヒトIL-1βと比較してHu007に100％結合した。
【表２】
2005518802.tif 000019
【００９２】
実施例１０
抗体有効性
低レベルのIL-1βを増殖に必要とするマウス細胞を用いて、Hu007およびMu007のヒトIL-1βを中和する能力を測定した。すでにlog増殖期にはないT1165.17細胞を、10％ウシ胎仔血清(GibcoBRLカタログ番号10082-147)、１mMピルビン酸ナトリウム、50μM β-メルカプトエタノールおよび抗生物質/抗微生物薬(GibcoBRLカタログ番号15240-062)を補充したRPMI 1640(GibcoBRLカタログ番号22400-089)で３回洗浄した。細胞を96ウェルプレートに１ウェルあたり5,000細胞でプレーティングした。ヒトIL-1βは0.3pMの一定レベルで入っており、抗体の希釈系列を加えた。希釈サンプルを加え、細胞を37℃/5％ CO2インキュベーター中で20時間インキュベートし、ウェルあたり１μCi 3H-チミジンを添加した時点で、プレートをさらに４時間、インキュベーター中でインキュベートした。細胞を回収し、組み込まれた放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。図５はMu007およびHu007によるIL-1β刺激増殖の阻害を示す。３回の個別の実験から計算したMu007およびHu007に対する平均のIC50値はそれぞれ220 pMおよび480 pMであった。さらに、種々のHu007類縁体をそれらのヒトIL-1β刺激増殖を中和する能力についてアッセイした（表３）。
【表３】
2005518802.tif 000020
【００９３】
実施例１１
インビボでのヒトIL-1βの中和
ヒトIL-1βはマウスIL-1βレセプターに結合し、刺激することができ、これによりマウスIL-6の上昇が生じる。実験にわたる時間および用量は、ヒトIL-1βの最適の用量、およびマウスIL-6の誘導に最適な時間を同定するために行った。これらの実験は、ヒトIL-1βの用量３μg/kgおよびIL-1β投与後２時間がマウス血清中最大レベルのIL-6を与えることを示した。Mu007およびHu007をマウスに投与(IV)し、１時間後にヒトIL-1βをIP注射した。IL-1β投与の２時間後、マウスを屠殺し、ELISAによりIL-6レベルを決定した。イソタイプが適合した抗体をネガティブコントロールとして用いた。Mu007およびHu007の両方が、マウスIL-6のヒトIL-1β誘導を、用量依存様式で阻害する。
【００９４】
実施例１２
Hu007の脱アミド
最初、カチオン交換クロマトグラフィーおよびIEFゲル分析によって脱アミドをモニターした。次いで、ペプチドマッピングおよび質量分析を用いて、重鎖CDR2のAsn55領域
【数１７】
2005518802.tif 000021
における脱アミドを同定し、確認した。脱アミドにおけるpHおよび温度の影響を種々の溶媒条件下でさらに調査した。最初のサンプル約1.6 mg/mLをPBS、pH 7.4中に冷蔵温度で保管した。種々の緩衝液を用いてこのサンプルを少なくとも１０倍に希釈し、続いて10,000 MWCO(Millipore Corporation、Bedford、MA)によるミリポア濾過ユニットを用いて濃縮して、表４に列挙した条件に溶媒を交換する。カチオン交換クロマトグラフィーを用いて脱アミドの程度を測定する。0〜30%の10mMリン酸ナトリウム、250mM NaCl、pH 6.5勾配を用いて、Hu007サンプルを流速1mL/分でDionex Propac WCX-10カラムに通した。カチオン交換クロマトグラフィーにより、少なくとも６つの分離したピークが観察された。主たるピーク（ピーク３）は、両方の重鎖からC末端リシン残基を欠くHu007に対応する。37℃にて７日間インキュベートした後、カチオン交換クロマトグラフィーおよびIEFによって評価されたように、より酸性形態のHu007の増加量が観察され、主たるピーク（ピーク３）の相対的ピーク領域は減少した。同時に、ピーク１およびピーク２の相対的ピーク領域有意な増加が観察された。この転換は、pHに大きく依存し、塩基が触媒した。
脱アミドが起こると、重鎖のCDR2部位のAsn55が、Asp55またはIsoasp55のいずれかに変換された。PBS中、pH 7.4、4℃および37℃にて７日間インキュベートした後、ピーク３の領域は減少し、したがって、総ピーク領域に対するピーク３の相対的ピーク領域のパーセンテージを用いて、異なる条件下における脱アミドのレベルをモニターした。これらの緩衝条件下で、抗体サンプルは、４℃にて少なくとも７日間は比較的安定である。しかし、脱アミドが、37℃にて起こり、pH 6において最少の影響においてpH上昇にともなって増加する（表４）。
【表４】
2005518802.tif 000022
【００９５】
実施例１３
Hu007類縁体の結合親和性および特異性
BIAcore測定法を用いて、数種のHu007類縁体の親和性および特異性を決定した。BIAcoreTMは、分子間相互作用を測定する自動バイオセンサーシステムである(Karlssonら、(1991)J. Immunol. Methods 145: 229-240)。これらの実験において、BIAcoreTMチップに抗体を低密度で固定した。エチルジメチルアミノプロピル−カルボジイミド(EDC)を用いて、カルボキシメチル(CM5)BIAcoreTMセンサーチップのフローセルに対し、反応性アミノ基をプロテインＡにカップリングさせた。プロテインＡを酢酸緩衝液（pH 4.5）で希釈し、EDCを用いてCM5チップのフローセルに固定して、約1000反応単位を得た。未反応の部位をエタノールアミンでブロックした。60 μＬ/分の流速を用いた。5 μｇ/mL Hu007溶液および重鎖CDR2類縁体N55D、N55S、N55Q、G56AおよびG56Vを10μＬ注入し、次いでヒトIL-1βを各サイクルについて濃度を減少させながら（たとえば、1500、750、375、188、and 0 pM）注入することによってマルチプル結合／溶離サイクルを行った。グリシン-HCl（pH 1.5）により溶離を行った。BIAevaluationTMを用いて動力学的データを分析した。表５は、Hu007および種々のHu007類縁体のヒトIL-1βに対する親和性を表す。
【表５】
2005518802.tif 000023
【００９６】
実施例１４
安定性分析
カチオン交換クロマトグラフィーによってモニターされるHu007脱アミド速度における温度の影響について、本発明の類縁体を分析した。Hu007 WTおよび数種の重鎖CRD2類縁体を25℃または37℃にて14日間インキュベートした。10mMリン酸ナトリウム、250mM NaCl、pH 6.5の0〜30%勾配を用い、流速1mL/分でサンプルをDionex Propac WXC-10カラムにかけた。安定性サンプルからのアリコートの緩衝液を10mMリン酸、pH 6.5に交換した後、ミリポア濾過ユニットを用いて、添加する。完全にもとのままの抗体または類縁体、脱アミド体もしくはそのフラグメントのいずれかを含むものとして重要なピークを同定した。インキュベーション時間後にもとのままの抗体のフラクションとして安定性を決定した。もとのままおよび脱アミド抗体の総ピーク領域で割った、もとのままの抗体のピーク領域を用いてもとのままの抗体のフラクションを計算した（表６）。Hu007類縁体G56AおよびG56Vは、時間を通じて脱アミドの量を減少させたが、一方、55位における類縁体は脱アミドの発生を防止した。
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Mu007、Hu007および生殖細胞L1およびJκ2セグメント由来の可変軽鎖アミノ酸配列のアラインメント。Kabatの定義に基づくCDR配列は、Mu007可変軽鎖配列中、下線を引いている。アクセプターヒト可変軽鎖セグメント中のCDR配列は削除する。
【図２】Mu007、Hu007および生殖細胞DP5およびJH4セグメント由来の可変重鎖アミノ酸配列のアラインメント。Kabatの定義に基づくCDR配列は、Mu007可変重鎖配列中、下線を引いている。アクセプターヒト可変重鎖セグメント中のCDR配列は削除する。
【図３】ヒト、カニクイザルおよびマウス由来の成熟IL-1βタンパク質配列のアラインメント。
【図４】Hu007類縁体の発現のためのプラスミド構築物。Hu007可変軽鎖および重鎖遺伝子は、ミニ−エクソンとして構築された。
【図５】Mu007（黒丸）およびHu007（黒四角）のIL-1β-依存性細胞株の増殖を阻害する能力を示すグラフ)。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月19日(2004.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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