(57)【要約】  本発明の目的は、癌（例えば、前立腺癌）の予防、処置および診断において使用され得る物質をさらに提供することである。癌（例えば、前立腺癌および乳癌）の予防、処置および診断における改善を提供することが、さらなる目的である。本発明者らは、＋２リーディングフレームを利用するいくつかのものを含む、ＨＥＲＶ−Ｋゲノムのｅｎｖ領域においてスプライシングによって生じる一連のタンパク質をここで見出した。これらのタンパク質は、転写調節因子に典型的な活性を示し、そしてまた、腫瘍形成能を有する。これらのタンパク質は、癌の診断および治療において使用され得、そしてまた、例えばアジュバント治療のための、薬物標的である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌を診断する方法であって、該方法は、患者サンプルにおけるＨＭＬ−２発現産物の存在または非存在を検出する工程を包含し、ここで、該発現産物は、スプライシング事象によって生成され、ここで、ｅｎｖコード領域の５’領域および開始コドンが、ｅｎｖのリーディングフレームに対して＋２のリーディングフレームにおける下流コード領域に連結される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記患者サンプルが、前立腺組織サンプル、胸部組織サンプル、または血液サンプルである、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記発現産物が、ｍＲＮＡ転写物またはポリペプチドである、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記ｍＲＮＡ転写物が、配列番号１９、２０、２１、２４、２５、２６、３８、４０および／または４２のうちの１つ以上に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含む、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記ｍＲＮＡ転写物が、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９のうちの１つ以上に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、該方法が、前記患者サンプルからＲＮＡを抽出する工程を包含する、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、前記発現産物が、ハイブリダイゼーションによって検出される、方法。
【請求項８】
単離されたポリヌクレオチドであって、以下：（ａ）配列番号１９、２０、２１、２４、２５、２６、３８、４０、４２、５１、５２および２７８〜４７７および／または４２のヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）の少なくとも約７ヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）（ａ）に対して少なくとも５０％の同一性を有するヌクレオチド配列；または（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の相補体、を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
スプライシング事象により生成される転写物によりコードされる単離されたポリペプチドであって、ここで、ＨＥＲＶ−Ｋ  ｅｎｖコード領域の５’領域および開始コドンが、ＨＥＲＶ−Ｋゲノムにおけるｅｎｖのリーディングフレームに対して＋２のリーディングフレームにおける下流コード領域に連結される、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリペプチドであって、以下：配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６６、６７、６８および７８〜２７７からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の少なくとも５アミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）に対して少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチド配列、を含む、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドであって、ここで、（ｂ）前記フラグメントが、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６６、６７、６８および７８〜２７７の１つ以上のＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープを含む、ポリペプチド、
【請求項１２】
請求項９、請求項１０または請求項１１に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項９、請求項１０または請求項１１に記載のポリペプチドに結合する、抗体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の抗体であって、該抗体が、モノクローナル抗体である、抗体。
【請求項１５】
番号７、８および／または９のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合し得、かつ該タンパク質が転写活性化因子として作用するのを防止し得る、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項８〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体。
【請求項１７】
前立腺癌、乳癌、精巣癌、多発性硬化症および／またはインシュリン依存性糖尿病を予防または処置するための医薬の製造における、請求項８から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体の使用。
【請求項１８】
請求項９、請求項１０または請求項１１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、免疫原性組成物。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、以下の利益を主張する：２００１年１２月７日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４７８２４（ＷＯ０２／４６４７７として２００２年６月１３日に英語で公開された）；２００１年１２月７日出願の米国特許出願番号１０／０１６，６０４；２００１年１２月７日出願の米国仮出願番号６０／３４０，０６４；および２００２年６月１２日出願の米国仮出願番号６０／３８８，０４６。
【０００２】
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の文書が参考として具体的かつ個別に援用されることが示されるのと同程度に、参考として本明細書中で援用される。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、癌（例えば、前立腺癌）の診断に関する。特に、本発明は、前立腺腫瘍においてアップレギュレートされた発現を示すヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）の亜群、およびこれらのウイルスによって発現されるスプライシングされたｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景技術）
参考文献１および２は、ＨＥＲＶ−ＫファミリーのＨＭＬ−２亜群のヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）が、前立腺腫瘍においてアップレギュレートされた発現を示すことを開示している。参考文献１および２の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、癌（例えば、前立腺癌）の予防、処置および診断において使用され得る物質をさらに提供することである。癌（例えば、前立腺癌および乳癌）の予防、処置および診断における改善を提供することが、さらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
ＨＥＲＶは、長年にわたって知られており、そしてＨＥＲＶ−Ｋファミリーゲノム配列は、１９８６年以降公知である｛参考文献１８７｝。通常のｇａｇ、ｐｒｔ、ｐｏｌおよびｅｎｖのレトロウイルスタンパク質が、ｃＯＲＦまたはＲｅｃとして公知のＨＩＶ  ＲｅｖまたはＨＴＬＶ  Ｒｅｘのアナログを有するとして、ＨＥＲＶ−Ｋについて同定されているが｛３｝、他の調節タンパク質（例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質またはＨＴＬＶ  Ｔａｘタンパク質）のアナログは同定されていない。
【０００７】
Ｒｅｖ／Ｒｅｘアナログである「ｃＯＲＦ」は、ｅｎｖと同じ５’領域および開始コドンを共有するＯＲＦによってコードされているが、スプライシング事象によりｅｎｖコード配列が除去され、そしてｅｎｖのリーディングフレームに対してリーディングフレームを＋１にシフトさせる｛４、５｝。従って、ＰＣＡＶのｅｎｖ領域の最終エキソン内で、リーディングフレーム１および２は、それぞれ、ｅｎｖおよびｃＯＲＦをコードするが、第３のリーディングフレームによってコードされるタンパク質は以前に報告されておらず、そしてこの＋２リーディングフレームは、ＨＥＲＶ−Ｋにおいて既知の機能を有さない。
【０００８】
本発明者らは、＋２リーディングフレームを利用するいくつかのものを含む、ＨＥＲＶ−Ｋゲノムのｅｎｖ領域においてスプライシングによって生じる一連のタンパク質をここで見出した。これらのタンパク質は、転写調節因子に典型的な活性を示し、そしてまた、腫瘍形成能を有する。これらのタンパク質は、癌の診断および治療において使用され得、そしてまた、例えばアジュバント治療のための、薬物標的である。
【０００９】
これらの新規ポリペプチド産物の同定は、注目に値する。なぜなら、完全な配列情報は、１５年以上にわたってＨＥＲＶ−Ｋウイルスについて利用可能であったからである。
【００１０】
本発明は、癌を診断するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：患者サンプルにおける、スプライシング事象によって生成されるＨＭＬ−２発現産物の存在または非存在を検出する工程であって、ここで、ｅｎｖコード領域の５’領域および開始コドンは、ゲノム中のｅｎｖのリーディングフレームに対してリーディングフレーム＋２で、下流のコード領域に連結される。正常組織に対してより高いレベルの発現産物は、サンプルが由来する患者が癌（例えば、前立腺癌）を有していることを示す。発現産物は、ウイルス生活環において機能的であってもなくてもよい。
【００１１】
検出される発現産物は、ｍＲＮＡ転写物またはこのような転写物から翻訳されたポリペプチドのいずれかである。これらの発現産物は、直接的または間接的に検出され得る。直接的試験は、患者サンプル中でＨＭＬ−２のＲＮＡまたはポリペプチドを検出するアッセイを使用する。間接的試験は、ＨＭＬ−２からインビボで直接発現されない生体分子を検出するアッセイ（例えば、ＨＭＬ−２  ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを検出するアッセイ、またはＨＭＬ−２ポリペプチドに応答して生じた抗体を検出するアッセイ）を使用する。
【００１２】
（Ａ−患者サンプル）
本発明の診断方法は、癌の診断についてｍＲＮＡに基づくが、患者サンプルは、一般に、目的の組織由来の細胞（例えば、前立腺癌について前立腺細胞、乳癌について乳房細胞など）を含む。これらの細胞は、関連する器官から採取された組織サンプル中に存在し得るか、または（例えば、転移の間に）循環中に逃れた細胞であり得る。細胞を含むことのかわりに、または細胞を含むのと同様に、サンプルは、ＨＭＬ−２由来のｍＲＮＡを含むビリオンまたは体液を含み得る。
【００１３】
本発明の診断方法がポリペプチドに基づく場合、患者サンプルは、（ｍＲＮＡについて上記したように）細胞および／またはビリオンを含み得るか、あるいはポリペプチドを認識する抗体を含み得る。このような抗体は、代表的に、循環中に存在する。
【００１４】
従って、一般に、雄性についての患者サンプルは、前立腺サンプル（例えば、生検）または血液サンプルであり、そして雌性については、乳房サンプル（例えば、生検）または血液サンプルである。
【００１５】
患者は、一般にはヒトであり、そして好ましくは成体のヒトである。
【００１６】
発現産物は、患者サンプル自体において検出され得るか、またはサンプル由来の物質（例えば、細胞溶解物の上清またはＲＮＡ抽出物またはＲＮＡ抽出物から生成されたｃＤＮＡまたはＲＮＡ抽出物から翻訳されたポリペプチドまたは患者から抽出された細胞の培養物由来の細胞など）において検出され得る。これらは、本発明の意味において「患者サンプル」であるとなおみなされる。
【００１７】
本発明の方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る。
【００１８】
患者サンプルの他の可能な供給源としては、単離された細胞、全組織または体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、胸水、脳脊髄液、乳汁、初乳、乳房によって分泌される他の流体、精液（ｓｅｍｅｎ、ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）など）が挙げられる。
【００１９】
（Ｂ−ｍＲＮＡ発現産物）
本発明の診断方法がｍＲＮＡ検出に基づく場合、これは代表的に、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを検出することを含む。ＲＮＡは、Ｅｎｖ  ＯＲＦのＡＴＧコドンを含み、これは、図１７において示されるようにスプライシングされる、Ｅｎｖ  ＯＲＦの３’由来の配列と同じリーディングフレームにあるが、（ＨＭＬ−２のゲノムＤＮＡコピー中のＡＴＧに対して）＋２リーディングフレーム（すなわち、第３のリーディングフレーム）である。従って、本発明は、スプライシング事象によって生成されるＲＮＡを検出する工程を包含し得、ここで、ｅｎｖコード領域の５’領域および開始コドンは、ｅｎｖのリーディングフレームに対してリーディングフレーム＋２で、下流のコード領域に連結される。
【００２０】
好ましいＲＮＡは、配列番号５２に対して少なくともｓ％の配列同一性を有する配列を含む。配列番号５２は、図２２の「潜在的スプライシング部位Ｂ」の直ぐ下流のＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７）ウイルス｛参考文献６｝の５０ヌクレオチドである。
【００２１】
他の好ましいＲＮＡは、配列番号１９、２０、２１、２４、２５、２６、３８、４０および／または４２の１つ以上に対して少なくともｓ％の配列同一性を有する配列を含む。特に好ましいＲＮＡは、配列番号３８、４０および／または４２の１つ以上に対して少なくともｓ％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。
【００２２】
好ましいＲＮＡは、配列番号７、８、９、１０、１１、２１、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９の１つ以上に対して少なくともｓ％の配列同一性を有する配列を含む。特に好ましいＲＮＡは、配列番号７、８および／または９の１つ以上に対して少なくともｓ％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。
【００２３】
ｓの好ましい値は、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９など）である。
【００２４】
好ましいＲＮＡ配列は、配列番号４９を含むＲＮＡに結合し得るポリペプチドをコードする。
【００２５】
ＰＮＡはまた、通常、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つを含む：
１．配列番号４９に対して少なくとも７５％の同一性（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する上流配列；または配列番号４９に対して少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列；または配列番号４９のうちの少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または配列番号４９の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列。この配列は、代表的には、ＲＮＡの５’末端にある。配列番号４９は、「ＥＲＶＫ６」ＨＭＬ−２ウイルス（参考文献７）のＬＴＲにおけるＲ領域の初めのヌクレオチド配列である。Ｒ領域のこの部分は、ＨＭＬ−２転写物において見出され得、そしてこのＲ領域の部分を含むｍＲＮＡ分子の転写は、前立腺癌においてアップレギュレートされる。
【００２６】
２．以下の配列を含む上流領域：配列番号５０に対して少なくとも７５％の配列同一性（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または配列番号５０に対して少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列；または配列番号５０の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または配列番号５０の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列。配列番号５０は、ＥＲＶＫ６  ＬＴＲにおける配列番号４９の下流のＲＵ５領域のヌクレオチド配列である。この領域は、全長ＨＭＬ−２転写物において見出されるが、ＨＭＬ−２  ＬＴＲプロモーターから転写される全てのｍＲＮＡに存在し得るわけではない（例えば、転写が弱められる場合）。
【００２７】
３．以下の配列を含む上流領域：配列番号６に対して少なくとも７５の同一性（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または配列番号６に対して少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列；または配列番号６の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００の連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）で発現される、配列；または、配列番号６の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列。配列番号６は、Ｕ５領域と初めの５’スプライス部位との間のＥＲＶＫ６ウイルスの領域のヌクレオチド配列である。この領域は、全長ＨＭＬ−２転写物において見出されるが、いくつかの改変体により欠失されており、そして上記の領域２と同様に、ＨＭＬ−２  ＬＴＲプロモーターから転写される全てのｍＲＮＡにおいて存在し得るわけではない。
【００２８】
４．以下の配列を含む下流領域：配列番号５に対して少なくとも７５％の同一性（例えば、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または配列番号５に対して少なくとも５０％の同一性（例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列；または配列番号５の少なくとも２０の連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有する配列；または配列番号５の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメント（例えば、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００個連続したヌクレオチドなど）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、１００％の同一性）を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍（例えば、２倍、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍など）高いレベルで発現される、配列。配列番号５は、ＥＲＶＫ６の３’末端におけるＵ３Ｒ領域のヌクレオチド配列である。この配列は、代表的に、Ｔａｔコード領域の停止コドンと、任意のポリＡテイルの直前にある。
【００２９】
５．下流３’ポリＡテイル。
【００３０】
上記の配列の同一性％は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによって、デフォルトパラメーター（オープンギャップペナルティー＝−２０および伸長ペナルティー＝−５）を使用して決定される。
【００３１】
これらのｍＲＮＡ分子は、以下で、「ＰＣＡ−ｍＲＮＡ」分子（「前立腺癌関連ｍＲＮＡ」）と称され、そしてこれらのＰＣＡ−ｍＲＮＡを発現する内在性ウイルスは、ＰＣＡＶ（「前立腺癌関連ウイルス」）と称される。それにもかかわらず、これらのＰＣＡＶはまた、他のタイプの癌、特に、乳癌と関連し得る。
【００３２】
従って、一般的に、検出されるｍＲＮＡは、式Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−ポリＡを有し、ここで、
Ｎ１は、配列番号４９に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または配列番号４９に対して少なくとも５０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高く現されるか；または配列番号４９の少なくとも２０の連続したヌクレオチドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有するか；または配列番号４９の少なくとも２０の連続したヌクレオチドフラグメントくとも８０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高くされ；
Ｎ２は、配列番号５０に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または配列番号５０に対して少なくとも５０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高くされるか；または配列番号５０の少なくとも２０の連続したヌクレオチドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有するか；または配列番号５０の少なくとも２０の連続したヌクレオチドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高く現され；
Ｎ３は、配列番号６に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または配列番号６に対して少なくとも５０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高くされるか；または配列番号６の少なくとも２０連続したヌクレオチドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有するか；または配列番号６の少なくとも２０個続したヌクレオチドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高く発現され；
Ｎ４は、ｅｎｖのリーディングフレームに対して＋２のリーディングフレームにおける下流コード領域にスプライシングされたｅｎｖコード領域の開始コドンを含むＲＮＡ配列を含む。
【００３３】
Ｎ５は、配列番号５に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するか；または配列番号５に対して少なくとも５０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高く発現されるか；または配列番号５の少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有するか；または配列番号５少なくとも２０個連続したヌクレオチドフラグメントに対して少なくとも８０％の同一性を有し、かつ少なくとも９５％の信頼係数で、正常（すなわち、非癌性）細胞における発現と比較して、少なくとも１．５倍高く発現され；
Ｎ１およびＮ４は存在するが、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ５およびポリＡは、必要に応じてである。
【００３４】
Ｎ１は、検出されるｍＲＮＡに存在し、より好ましくは、Ｎ１−Ｎ２が存在する。
【００３５】
Ｎ１は、好ましくは、ｍＲＮＡの５’末端（すなわち、５’−Ｎ１−．．．）にある。Ｎ１は、上記の配列番号４９を参照して規定されるが、配列番号４９の５’末端から１００ヌクレオチド（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０または１００）までは、転写の開始部位に依存して省かれてもよい（例えば、Ｎ１は、配列番号４７８に対して少なくとも７５％の配列同一性であり得る）。
【００３６】
Ｎ５が存在する場合、これは３’ポリＡテイルの直前にあることが好ましい（すなわち，．．．−Ｎ５−ポリＡ−３’）。
【００３７】
ＲＮＡは、一般に、５’キャップを有する。
【００３８】
（Ｂ．１−サンプル中のＲＮＡの富化）
診断がｍＲＮＡ検出に基づく場合、本発明の方法は、好ましくは、以下の初期工程を包含する：ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を患者サンプルから抽出する工程；（ｂ）ｍＲＮＡを除去することなく、患者サンプルからＤＮＡを除去する工程；および／または（ｃ）配列番号４を含むＲＮＡではなく、配列番号４を含むＤＮＡを、患者サンプルから除去もしくは破壊する工程。これは必要である。なぜなら、正常な細胞および癌細胞の両方のゲノムは、複数のＰＣＡＶ  ＤＮＡテンプレートを含み、一方、ＰＣＡ−ｍＲＮＡレベルの増加は、癌細胞においてのみで見出されるからである。代替として、相同なＤＮＡの存在により影響を受けないＲＮＡ特異的アッセイが使用され得る。
【００３９】
生物学的サンプルからＲＮＡを抽出する方法は、周知であり（例えば、参考文献８および１７）、この方法には、グアニジニウム緩衝液、塩化リチウム、ＳＤＳ／酢酸カリウムなどに基づく方法が挙げられる。総細胞ＲＮＡが抽出された後、ｍＲＮＡは、例えば、オリゴ−ｄＴ技術によって富化され得る。
【００４０】
ｍＲＮＡを除去することなく、生物学的サンプルからＤＮＡを除去する方法は、周知であり（例えば、添付物Ｃおよび参考文献８）、そしてこれにはＤＮａｓｅ消化が挙げられる。
【００４１】
ＰＣＲ−ｍＲＮＡ配列を含む、ＲＮＡではなくＤＮＡを除去する方法は、ＰＣＲーｍＲＮＡ内の配列（例えば、配列番号４内のＤＮＡ配列を認識する制限酵素）に特異的であるが、対応するＲＮＡ配列を切断しない、試薬を使用する。
【００４２】
サンプルからＰＣＡ−ｍＲＮＡを特異的に精製する方法もまた、使用され得る。１つのこのような方法は、ＰＣＡ−ｍＲＮＡに結合する親和性支持体を使用する。この親和性支持体は、ＰＣＡＶのＬＴＲに結合するポリペプチド配列（例えば、以下に記載のポリペプチド）を含み得る。
【００４３】
（Ｂ．２−ＲＮＡの直接検出）
サンプル中の特定のＲＮＡ配列の存在または非存在を検出するための種々の技術が利用可能である（例えば、参考文献８および１７）。サンプルが、ゲノムＰＣＡＶ  ＤＮＡを含む場合、検出技術は、一般に、ＲＮＡ特異的であり；サンプルが、ＰＣＡＶ  ＤＮＡを含まない場合、検出技術は、ＲＮＡ特異的であってもなくてもよい。
【００４４】
ハイブリダイゼーションベースの検出技術が使用され得、ここで、ＰＣＡ−ｍＲＮＡの領域に相補的なポリヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーション条件下で、ＲＮＡ含有サンプルと接触される。ハイブリダイゼーションの検出は、プローブに相補的な核酸が存在することを示す。ＲＮＡを用いて使用するためのハイブリダイゼーション技術としては、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーションおよびアレイが挙げられる。
【００４５】
サンプル中のＲＮＡ分子の配列が得られる配列決定もまた使用され得る。これらの技術は、目的の配列がサンプル中に存在するか否かを直接示す。Ｎ１に対応するＲＮＡの５’末端の配列の決定が、一般的に適している。
【００４６】
増幅をベースにした技術もまた、使用され得る。これらとしては、ＰＣＲ増幅、ＳＤＡ増幅、ＳＳＳＲ増幅、ＬＣＲ増幅、ＴＭＡ増幅、ＮＡＳＢＡ増幅、Ｔ７増幅などが挙げられる。この技術は、好ましくは、指数増幅を与える。ＲＮＡを用いる使用のために好ましい技術は、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、参考文献８の第１５章を参照のこと）である。前立腺細胞からのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、参考文献９、１０、１１、１２などにおいて報告され、そして胸部細胞からのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、参考文献１３、１４、１５、１６などにおいて報告されている。
【００４７】
（Ｂ．３  ＲＮＡの間接検出）
ＲＮＡを直接検出するよりむしろ、ＲＮＡに由来する分子を検出すること（すなわち、ＲＮＡの間接検出）が好ましくあり得る。ｍＲＮＡを検出する代表的な間接方法は、逆転写によってｃＤＮＡを調製することであり、次いでｃＤＮＡを直接検出することである。ｃＤＮＡの直接検出は、一般的にＲＮＡを直接するための、上述された技術と同じ技術を使用する（が、ＲＴ−ＰＣＲのような方法は、ＤＮＡ検出については適切ではないこと、およびｃＤＮＡが二本鎖であり、そのため検出技術が、配列、その相補体、または二本鎖分子に基づき得ることが理解される）。
【００４８】
（Ｂ．４  ポリヌクレオチド物質）
本発明は、例えば、ＰＣＡＶ核酸の検出において使用するためのポリヌクレオチド物質を提供する。
【００４９】
本発明は、以下：（ａ）上で定義されたようなヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−ポリＡ；（ｂ）上で定義されたようなヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５の少なくともｘ個のヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）上で定義されたようなヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５と少なくともｓ％の同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の相補体、を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−ポリＡの改変体（例えば、変性改変体、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、変異体など）を含む。
【００５０】
フラグメント（ｂ）は、好ましくは、Ｎ４のフラグメントを含む。
【００５１】
ｘの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００など）である。ｘの値は、２０００未満（例えば、１０００、５００、１００、または５０未満）であり得る。
【００５２】
ｓの値は、好ましくは、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９など）である。
【００５３】
本発明はまた、式５’−Ａ−Ｂ−Ｃ−３’を有する単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで：−Ａ−は、ａヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｃ−は、ｃヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；−Ｂ−は、（ａ）上で定義されたようなヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のｂヌクレオチドのフラグメントまたは（ｂ）上で定義されたようなヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のｂヌクレオチドのフラグメントの相補体のいずれかからなるヌクレオチド配列であり；そして該ポリヌクレオチドは、（ａ）ヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントでも（ｂ）ヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントの相補体のどちらでもない。
【００５４】
−Ｂ−領域は、好ましくは、Ｎ４のフラグメントである。−Ａ−および／または−Ｃ−位置は、例えば、ＴＭＡにおいて使用するためのプロモーター配列（またはその相補体）含み得る。
【００５５】
ａ＋ｃの値は、少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。ｂの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。ａ＋ｂ＋ｃの値は、少なくとも９（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であることが好ましい。ａ＋ｂ＋ｃの値は、多くても５００（例えば、多くても４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９）であることが好ましい。
【００５６】
−Ｂ−がＮ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントである場合、−Ａ−のヌクレオチド配列は、代表的にはＮ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５における配列−Ｂ−の５’であるａヌクレオチドとｎ％未満の配列同一性を共有し、そして／または−Ｃ−のヌクレオチド配列は、代表的にはＮ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５における配列−Ｃ−の３’であるｃヌクレオチドとｎ％未満の配列同一性を共有する。同様に、−Ｂ−がＮ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５のフラグメントの相補体である場合、−Ａ−のヌクレオチド配列は、代表的にはＮ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５における配列−Ｂ−の相補体の５’であるａヌクレオチドの相補体とｎ％未満の配列同一性を共有し、そして／または−Ｃ−のヌクレオチド配列は、代表的にはＮ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５における配列−Ｃ−の相補体の３’であるｃヌクレオチドの相補体とｎ％未満の配列同一性を共有する。ｎの値は、概して６０以下（例えば、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下）である。
【００５７】
本発明はまた、上述されたようなヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５を有する核酸、または上述されたようなヌクレオチド配列Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５の相補体を有する核酸に選択的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。このポリヌクレオチドは、好ましくは、少なくともＮ４にハイブリダイズする。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で実行され得る。これは、当該分野において広く公知であり、かつ公開されているハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大する条件である（例えば、参考文献１７の７．５２頁を参照のこと）。関連する条件の例としては、（ストリンジェンシーを増大する順で）：２５°Ｃ、３７°Ｃ、５０°Ｃ、５５°Ｃおよび６８°Ｃのインキュベーション温度；１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの緩衝液濃縮物（ここで、ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である）および他の緩衝系を使用する等価なもの；０％、２５％、５０％、および７５％のホルムアミド濃縮物；５分間〜２４時間のインキュベーション時間；１回、２回、またはそれ以上の洗浄工程；１分間、２分間、または１５分間の洗浄インキュベーション時間；ならびに６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。ハイブリダイゼーション技術は、当該分野において周知である（例えば、参考文献８、１７、１８、１９、２０などを参照のこと）。当業者によって理解されるように、特定のポリヌクレオチド配列およびこのポリヌクレオチド配列によってコードされる特定のドメインに依存して、本発明のポリヌクレオチドと既知のポリヌクレオチドとを比較する際のハイブリダイゼーション条件が異なり得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、低ストリンジェンシー条件下で、選択的にハイブリダイズする；他の実施形態において、この単離されたポリヌクレオチドは、中間のストリンジェンシー条件下で、選択的にハイブリダイズする；他の実施形態において、この単離されたポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で、選択的にハイブリダイズする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの例示的なセットは、５０°Ｃおよび１０×ＳＳＣである。中間のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５５°Ｃおよび１×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、６８°Ｃおよび０．１×ＳＳＣである。
【００５９】
本発明の特に好ましいポリヌクレオチドは、以下に規定されるようなポリヌクレオチドをコードする。「コード」によって、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）は翻訳されるが、以下に規定されるポリヌクレオチドのアミノ酸をコードする一連のコドンを含むことが必ずしも意味されるのではない。
【００６０】
本発明はまた、以下：（ａ）配列番号２７８〜４７７からなる群から選択されるヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の相補体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００６１】
本発明はまた、（ａ）配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３８、４０、４２、５１および５２からなる群から選択されるヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のヌクレオチドのフラグメント；（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の相補体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション反応および／または増幅反応において使用するためのプローブおよび／またはプライマーとして、特に有用である。
【００６３】
本発明の１つ以上のポリヌクレオチドは、同じ核酸標的にハイブリダイズし得る（例えば、１つ以上が単一ＲＮＡにハイブリダイズし得る）。
【００６４】
２つの核酸配列間のパーセンテージ配列同一性についての言及は、アライメントされた場合、この塩基のパーセンテージは、２つの配列を比較した際と同じであることを意味する。このアライメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野において公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献２０のセクション７．７．１８において記載されるもの）を使用して実行され得る。好ましいアライメントプログラムは、ＧＣＧ  Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．１）であり、好ましくは、以下のとおりのデフォルトパラメーターを使用する：オープンギャップ＝３；伸長ギャップ＝１。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドは、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、線状、環状、ベクター、プライマー、プローブなど）を取り得る。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドは、多くの方法（例えば、化学合成（少なくとも一部分）によって、生物自体などに由来するゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからのより長いポリヌクレオチドを、制限酵素を使用して消化することによって）において調製され得る。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドは、固形支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、樹脂など）に結合され得る。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドは、検出標識（例えば、放射性標識または蛍光標識、またはビオチン標識）を含み得る。このポリヌクレオチドが核酸検出技術において使用されるべきである場合（例えば、この核酸が、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、ｂＤＮＡなどのような技術において使用するためのプライマーであるかまたはプローブである場合）、これは特に有用である。
【００６９】
用語「ポリヌクレオチド」は、一般的に任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、これは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそのアナログを含む。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、およびＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログ（例えば、改変された骨格または塩基を含むもの）、そしてまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」は、特に示されない限り、核酸の長さまたは構造について制限することは意図されず、そして以下が、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の供給源から単離された任意のＤＮＡ、任意の供給源から単離された任意のＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、そして既知または未知の任意の機能を実行し得る。他で特定されるか、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドを含む本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を作ることが公知であるかまたは予測される２つの相補的な各一本鎖形態の両方を含む。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドは、単離されそして実質的な純度で、一般的にインタクトな染色体以外として得られ得る。通常、ポリペプチドは、他の天然に存在する核酸配列が実質的に含まない（一般的に、少なくとも約５０％（重量）の純度、通常は少なくとも約９０％の純度である）状態で得られる。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチド（特にＤＮＡ）は、代表的には、「組換え」（例えば、天然に存在する染色体には、通常会合しない１つ以上のヌクレオチドによって隣接される）である。
【００７２】
このポリヌクレオチドは、例えば：ポリペプチドを産生するために；生物学的サンプルにおける核酸検出のためのプローブとして；ポリペプチドのさらなるコピーを生成するために；リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために；そして一本鎖ＤＮＡプローブとしてまたは三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして使用され得る。このポリペプチドは、好ましくはＰＣＡ−ｍＲＮＡを検出するために使用される。
【００７３】
「ベクター」は１つ以上の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物である。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖および複製のために設計される「クローニングベクター」、宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現のために設計される「発現ベクター」、組換えウイルスまたはウイルス様粒子を産生するために設計される「ウイルスベクター」、または「シャトルベクター」であり得、これらは、１つ以上の型のベクターの特性を含む。
【００７４】
「宿主細胞」は、外因性のポリヌクレオチドのレシピエントであり得るかまたはレシピエントであった、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異および／または変化に起因して、本来の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学的にまたは総ＤＮＡ相補体において）ではあり得ない。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドで、インビボまたはインビトロで、トンラスフェクトまたは感染された細胞を含む。
【００７５】
（Ｂ．５  核酸検出キット）
本発明は、ＰＣＡＶ核酸内に含まれるテンプレート配列を増幅するためのプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）を含むキット、第１プライマーおよび第２プライマーを含むキットを提供し、ここで第１プライマーは、該テンプレート配列に対して実質的に相補的であり、そして第２プライマーは、該テンプレート配列の相補体に対して実質的に相補的であり、ここで、実質的に相補性を有する該プライマーの部分が、増幅されるべきテンプレート配列の末端を規定する。第１プライマーおよび／または第２プライマーは、検出可能な標識を含み得る。
【００７６】
本発明はまた、一本鎖核酸または二本鎖核酸（またはそれらの混合物）中に含まれるＰＣＡＶテンプレート核酸配列の増幅を可能にする第１および第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを含みキットを提供し、以下：（ａ）第１オリゴヌクレオチドは、該テンプレート核酸配列に対して実質的に相補的であるプライマー配列を含む；（ｂ）第２オリゴヌクレオチドは、該テンプレート核酸配列の相補体に対して実質的に相補的であるプライマー配列を含む；（ｃ）第１オリゴヌクレオチドおよび／または第２オリゴヌクレオチドは、該テンプレート核酸に対して相補的ではない配列を含む；そして（ｄ）該プライマー配列は、増幅されるべきテンプレート配列の末端を規定する。特徴（ｃ）の非相補性配列は、好ましくは、このプライマー配列の上流（すなわち、５’側）である。（ｃ）配列の一方または両方は、制限部位（２１）またはプロモーター配列（２２）を含み得る。この第１オリゴヌクレオチドおよび／または第２オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含み得る。
【００７７】
本発明のキットはまた、テンプレート配列のフラグメント（またはその相補体）を含む標識化ポリヌクレオチドを含み得る。これは、増幅されたテンプレートを検出するためのハイブリダイゼーション技術において使用され得る。
【００７８】
これらのキットにおいて使用されるプライマーおよびプローブは、好ましくは、セクションＢ．４において記載されるポリヌクレオチドである。
【００７９】
標的は、セクションＢ．１において記載されるようなポリヌクレオチド配列であることが好ましい。
【００８０】
（Ｃ  ポリペプチド発現産物）
本方法がポリペプチドの検出に基づく場合、本方法は、スプライシング事象（ｅｎｖコード領域の５’領域および開始コドンが、ゲノムにおけるｅｎｖのコード領域に対して、リーディングフレーム＋２において下流コード領域に結合される）によって産生される転写物によってコードされるＨＭＬ−２ポリペプチドの発現を検出する工程を包含する。このポリペプチドは、ウイルスの生活環において機能的であっても、機能的でなくでもよい。
【００８１】
ＨＭＬ−２ポリペプチドをコードする転写物は、内因性ゲノムの全長のｍＲＮＡのコピーの選択的スプライシングによって生成される（例えば、参考文献１９５の図４；本明細書中の図１７）。
【００８２】
本発明のポリペプチドは、ｅｎｖと同じ５’領域（および開始コドン）を共有するＯＲＦによってコードされる。スプライシング事象は、ｅｎｖコード配列を除去するが、このコード配列は、ｅｎｖのコード配列に対してリーディングフレーム＋２において続く。スプライシングされたヌクレオチド配列の例としては、配列番号１８〜２７、３８、４０および４２である。コードされたポリペプチド配列の例は、配列番号７〜１２および配列番号２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９である。これらのうちのいくつか（例えば、配列番号１０〜１２）は、トランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）様式でＰＣＡＰ４の機能を阻害する。
【００８３】
（Ｃ．１  ＨＭＬ−２ポリペプチドの直接検出）
サンプル中の特定のポリペプチドの存在または非存在を検出するために、種々の技術が利用される。これらは、一般的に、抗体とポリペプチドにおける抗原性アミノ酸配列との間の特定の相互作用に基づく免疫アッセイ技術である。適切な技術としては、標準的な免疫組織学的方法、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、免疫蛍光検査法などが挙げられる。
【００８４】
それゆえ、一般的に、本発明は、生物学的サンプルにおける本発明のＴａｔポリペプチドの存在を検出し、そして／またはそのレベルを測定するための方法を提供し、本方法は、このポリペプチドに特異的な抗体を使用する。概して本方法は、以下の工程：ａ）サンプルとこのポリペプチドに特異的な抗体を接触させる工程；およびｂ）この抗体とサンプル中のポリペプチドとの間の結合を検出する工程を含む。
【００８５】
本発明のポリペプチドはまた、機能アッセイ（例えば、結合活性または酵素活性を検出するためのアッセイ）によって検出され得る。例えば、本発明の転写的に活性ポリペプチドは、本明細書中の実施例において記載されるように、ＰＣＡＶ  ＬＴＲによって駆動するレポーター遺伝子の発現を検出することによってアッセイされ得る。
【００８６】
本発明のポリペプチドを検出するための別の方法は、標準的なプロテオミクス技術（例えば、ポリペプチドの精製しそして分離する）を使用し、次いでペプチド配列決定を使用することである。配列が標的ポリペプチド中に存在するか否かを同定するために、例えば、ポリペプチドは、２Ｄ−ＰＡＧＥを使用して分離され得、そしてポリペプチドスポットが（例えば、質量分光学によって）配列決定され得る。
【００８７】
検出方法は、インビボで使用するために（例えば、癌細胞が存在する部位を位置付けるか、または同定するために）適応され得る。これらの実施形態において、標的ポリペプチドに特異的な抗体は個体に（例えば、注射によって）投与され、そして抗体は、標準的な画像化技術（例えば、磁気共鳴画像法、コンピューター連動断層撮影走査など）を使用して、位置付けられる。適切な標識（例えば、スピン標識など）が使用される。これらの技術を使用して、癌細胞は差次的に標識される。
【００８８】
免疫蛍光アッセイは、標的ポリペプチドの精製の必要なく細胞上で容易に実行され得る。まず細胞は、顕微鏡用スライドまたはマイクロタイターウェルのような固形支持体上で固定される。次いで、これらの細胞の膜は、ポリペプチドに特異的な抗体の進入を許容するために、透過可能にされる（ＮＢ：固定および透過可能化は、共に達成され得る）。次に、固定化細胞は、コードされたポリペプチドに特異的であり、そして蛍光標識された抗体に曝露される。この標識の存在（例えば、顕微鏡下で視覚化される）は、標的ＰＣＡＶポリペプチドを発現する細胞を同定する。アッセイの感受性を増大させるために、抗ＰＣＡＶ抗体に結合するような二次抗体（標識が二次抗体によって保持されている）を使用することが可能である（２３）。
【００８９】
（Ｃ．２  ＨＭＬ−２ポリペプチドの間接検出）
ポリペプチドを直接的に検出するより、ポリペプチドに応答して生体によって産生される分子を検出することが好ましくはあり得る（すなわち、ポリペプチドの間接検出）。これは、代表的には抗体の検出に関し、そのため患者サンプルは概して血液サンプルである。抗体は、従来の免疫アッセイ技術によって（例えば、本発明のＰＣＡＶポリペプチドを使用して）検出され得、これは、代表的には固定される。
【００９０】
ＨＥＲＶ−Ｋポリペプチドに対する抗体が、ヒトにおいて発見されている（１９５）。
【００９１】
（Ｃ．３  ポリペプチド物質）
本発明は、以下：（ａ）配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のアミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、機能的変異体および非機能的変異体）を含む。
【００９２】
ｘの値は、少なくとも５（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００など）である。ｘの値は、２０００未満（例えば、１０００未満、５００未満、１００未満、または５０未満）であり得る。
【００９３】
ｓの値は、好ましくは、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９など）である。
【００９４】
本発明はまた、式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨを有する単離されたポリペプチドを提供し、ここで：Ａは、ａアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｃは、ｃアミノ酸からなるポリペプチド配列であり；Ｂは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９からなる群から選択されるアミノ酸配列のｂアミノ酸のフラグメントからなるポリペプチド配列であり；そして該ポリペプチドは、ポリペプチド配列の配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８または６９のフラグメントではない。
【００９５】
ａ＋ｃの値は、少なくとも１（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。ｂの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）である。ａ＋ｂ＋ｃの値は、少なくとも９（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００など）であることが好ましい。ａ＋ｂ＋ｃの値は、多くても５００（例えば、多くても４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９）であることが好ましい。
【００９６】
−Ａ−のアミノ酸配列は、代表的には、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９における配列−Ｂ−のＮ末端であるａアミノ酸とｎ％未満の配列同一性を共有し、そして−Ｃ−のアミノ酸配列は、代表的には、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９における配列−Ｂ−のＣ末端であるｃアミノ酸とｎ％未満の配列同一性を共有する。ｎの値は、一般的に６０以下（例えば、５０、４０、３０、２０、１０以下）である。
【００９７】
（ｂ）または−Ｂ−のフラグメントは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９のＴ細胞エピトープまたは、好ましくはＢ細胞エピトープを含み得る。Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープは、実験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ方法（２４、２５）または類似の方法を使用して）同定され得るか、またはそれらは予測され得る（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標（２６）、マトリクスベースのアプローチ（２７）、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（２８）、神経ネットワーク（２９）、ＯｐｔｉＭｅｒ  ＆  ＥｐｉＭｅｒ（３０、３１）、ＡＤＥＰＴ（３２）、Ｔｓｉｔｅｓ（３３）、親水性（３４）、抗原性指標（３５）または参考文献３６などにおいて開示される方法を使用する）。これらの方法は、ＨＩＶｔａｔおよびＨＴＬＶｔａｘについてのＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを同定する際の首尾よさを証明する（例えば、３１、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４など）。
【００９８】
（ｂ）または−Ｂ−の好ましいフラグメントは、スプライシング部位の下流（すなわち、エキソン３内）に位置付けられる。そのようなフラグメントの例は、６１〜６８（またはそのサブフラグメント）である。ポリペプチドは、これらの配列の１つ以上を含み得る。例えば、これは、配列番号６２〜６５のうちの２つ以上（例えば、２、３、４）、好ましくは順番に（例えば、ＮＨ２−Ｏ１−６２−Ｏ２−６３−Ｏ３−６４−Ｏ４−６５−Ｏ５−ＣＯＯＨ、ここでＯ１〜Ｏ５は、１つ以上のアミノ酸の最適配列である）、そして必要に応じて、配列番号６１（好ましくは、配列番号６２の上流に）も含み得る。他のポリペプチドは、配列番号６６および／または配列番号６７を含み得る。
【００９９】
従って、本発明は、以下：（ａ）配列番号６１〜６８からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のアミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％の同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【０１００】
本発明はまた、以下：（ａ）配列番号７８〜２７７からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のアミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％の同一性を有するポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
【０１０１】
配列番号７、８、９、１０、１１、１２、２８、２９、３０、３１、３４、３５、３６、３９、４１、４３、６７、６８および６９からなる群の内で、好ましいサブセットは、配列番号７、８、１１および１２（ＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ３、ＰＣＡＰ４およびＰＣＡＰ４ａ）である。
【０１０２】
好ましいポリペプチドは、配列番号４９を含むＲＮＡに結合し得る。
【０１０３】
２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ配列同一性に対する参考は、整列された場合、そのアミノ酸パーセンテージは、２つの配列を比較した際に同じであることを意味する。この整列およびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野において公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献２０のセクション７．７．１８において記載されるもの）を使用して決定され得る。好ましい整列は、ギャップ開放ペナルティー１２およびギャップ伸長ペナルティー２を有するアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム（６２のＢＬＯＳＵＭマトリクス）によって決定される。このＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献４５において教示される。
【０１０４】
本発明のポリペプチドは、多くの方法で（例えば、化学合成（少なくとも一部分）によって、より長いポリペプチドをプロテアーゼを使用して消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養物（例えば、組換え発現）からの精製によって）、生物自体（例えば、前立腺組織または胸部組織からの単離物）、細胞株供給源などから調製され得る。
【０１０５】
本発明のポリペプチドは、種々の形態（例えば、ネイティブ、融合、グリコシル化、非グリコシル化など）で調製され得る。
【０１０６】
本発明のポリペプチドは、固形支持体に結合され得る。
【０１０７】
本発明のポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射性標識または蛍光標識、あるいはビオチン標識）を含み得る。
【０１０８】
一般的に、本発明のポリペプチドは、天然では存在しない環境において提供される（例えば、それらは、その天然で存在する環境から分離される）。特定の実施形態において、本ポリペプチドは、コントロールと比較してポリペプチドを富化にされた組成物中に存在する。このように、精製されたポリペプチドは提供され（精製されたとは、このポリペプチドは、他の発現されたポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在することを意味する）、（実質的に含まないとは、その組成物の９０％未満、通常は６０％未満およびより通常は５０％未満が、他の発現されたポリペプチドから作られることを意味する。
【０１０９】
用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。ポリマーは、線状または分枝であり得、これは、改変されたアミノ酸を含み得、そしてこれは、非アミノ酸によって中断され得る。この用語はまた、天然にまたは介入によって改変されたアミノ酸ポリマーを含む；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは任意の他の操作または改変（例えば、標識成分を用いる結合体化）。例えば、１つ以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）を含むポリペプチドならびに当該分野において公知の他の改変体もまた、定義内に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または関連鎖として生じ得る。本発明のポリペプチドは、天然または非天然にグリコシル化され得る（すなわち、ポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチド中に見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。
【０１１０】
変異体は、アミノ酸置換、付加または欠失を含み得る。アミノ酸置換は、非必須のアミノ酸を除去するための（例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位またはアセチル化部位を変更する）または機能のために必ずしも必要ではない１つ以上のシステイン残基の置換または欠失による誤った折り畳みを最小にするための保存的アミノ酸置換または置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の通常電荷、親水性／疎水性、および／または立体化学的な膨張性を保護する置換である。改変体は、このポリペプチドの特定領域（例えば、機能ドメインおよび／またはこのポリペプチドがポリペプチドファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列に関連する領域）の生物活性を保持するか、または高めるように設計され得る。改変体の産生のためのアミノ酸改変の選択は、アミノ酸の接近しやすさ（内部  対  外部）（例えば、ｒｅｆ．４６）、改変ポリペプチドの熱安定性（例えば、ｒｅｆ．４７）、所望のグリコシル化部位（例えば、ｒｅｆ．４８）、所望のジスルフィド結合（例えば、ｒｅｆ．４９および５０）、所望の金属結合部位（例えば、ｒｅｆ．５１および５２）、およびプロリンループにおける所望の置換（例えば、ｒｅｆ．５３）に基づき得る。システイン欠失ムテインは、参考文献５４において開示されるように産生され得る。
【０１１１】
（Ｃ．４  抗体材料）
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明はまた、単離された抗体またはまたはその抗原結合性フラグメントを提供し、これらは、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに結合する。
【０１１２】
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして任意の適切な手段によって（例えば、組換え発現によって）産生され得る。
【０１１３】
本発明の抗体は、標識を含み得る。この標識は、放射性標識または蛍光標識のように、直接的に検出可能であり得る。あるいは、この標識は、その産物が検出可能である酵素（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど）のように、間接的に検出可能であり得る。
【０１１４】
本発明の抗体は、固形支持体に結合され得る。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを適切な動物（例えば、ウサギ、ハムスター、マウスまたは他のげっ歯類）に投与する（例えば、注射する）ことによって調製され得る。
【０１１５】
抗体の抗原結合性フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などを含む。
【０１１６】
ヒト免疫系との適合性を増強するために、抗体は、キメラまたはヒト化であり得るか（例えば、ｒｅｆ．５５および５６）、あるいは完全なヒト抗体が使用され得る。ヒト化抗体は、本来の非ヒトモノクローナル抗体よりヒトにおいて免疫原性が非常に低いので、それらは、アナフィラキシーの危険性をほとんど伴わずヒトの処置のために使用され得る。従って、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療適用（例えば、腫瘍性疾患の処置のために放射能感作物質としての使用または癌治療の副作用を減少するための方法における使用）において好ましくあり得る。
【０１１７】
ヒト化抗体は、種々の方法によって達成され得、この方法は、例えば：（１）非ヒト抗体からの１つ以上のフレームワーク残基の必要に応じた転移を伴う、ヒトフレームワーク領域および定常領域上に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植する工程（「ヒト化」）；（２）表面残基の置換によってヒト様表面で非ヒト可変ドメインを「覆うこと」ではなく、非ヒト可変ドメイン全体を移植する工程（「被膜化」（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ））を包含する。本発明において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体および「被膜化」抗体の両方を含む（５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３）。
【０１１８】
ＣＤＲは、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の結合親和性およびＦｖ領域の特異性をともに規定するアミノ酸配列である（例えば、ｒｅｆ．６４および６５）。
【０１１９】
用語「定常領域」とは、エフェクター機能を供与する抗体分子の一部をいう。キメラ抗体において、マウスの定常領域は、ヒト定常領域によって置換される。ヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖の定常領域は、５個のアイソタイプ（α、δ、ε、γまたはμ）のいずれかから選択され得る。
【０１２０】
抗体をヒト化する１つの方法は、ヒト重鎮配列およびヒト軽鎖配列に対して非ヒト抗体の重鎖配列および軽鎖配列を整列する工程、非ヒトフレームワーク残基を、このようなアライメントに基づくヒトフレームワーク残基で置換する工程、非ヒト親抗体のコンホメーションと比較するヒト化配列のコンホメーションの分子モデリング、およびヒト化配列モデルにおけるＣＤＲの予測されるコンホメーションが、親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲのコンホメーションを密接に近づけるまでの、非ヒトＣＤＲの構造を分配するフレームワーク領域内の残基の繰り返し復帰変異を包含する。このようなヒト化抗体は、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌレセプター（ｒｅｆ．６６および６７）を介して、さらに吸収およびクリアランスを促進するように誘導され得る。
【０１２１】
ヒト化抗体または完全なヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座を含むように操作されるトランスジェニック動物を使用して産生され得る。例えば、ｒｅｆ．６８は、ヒトＩｇ座を有するトランスジェニック動物を開示し、この動物は、内因性の重鎖座および軽鎖座の不活化に起因して、機能的な内因性免疫原を産生しない。ｒｅｆ．６９はまた、免疫原に対する免疫応答をマウントし得るトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示し、この抗体は、霊長類の定常領域および／または可変領域を有し、そして内因性免疫グロブリンをコードする座が置換されるか、または不活化される。ｒｅｆ．７０は、哺乳類における免疫グロブリン座の改変するための（例えば、改変された抗体分子を形成するために、定常領域および可変領域の全てまたは一部分を置換するための）Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示する。ｒｅｆ．７１は、不活化内因性Ｉｇ座および機能的なヒトＩｇ座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示する。ｒｅｆ．７２は、トランスジェニックマウス（このマウスは、内因性の重鎖を欠失し、そして１つ以上の外因性（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）の定常領域を含む外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）の免疫グロブリン座を発現する）を作る方法を開示する。
【０１２２】
上記のトランスジェニック動物を使用して、ＰＣＡＶポリペプチドに対する免疫応答が生じられ得、そして抗体産生細胞は動物から除去され得、そしてヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用され得る。免疫化プロトコル、アジュバントなどは当該分野において公知であり、そして例えば、ｒｅｆ．７３において記載されるように、トランスジェニックマウスの免疫化において使用される。モノクローナル抗体は、対応するポリペプチドの生物活性または生理的効果を阻害するか、または中和する能力について試験され得る。
【０１２３】
（Ｄ  コントロールサンプルとの比較）
（Ｄ．１  コントロール）
ＨＭＬ−２転写物は、腫瘍においてアップレギュレートされる。このようなアップレギュレーションを検出するために、基準点（すなわち、コントロール）が必要とされる。コントロールサンプルの分析は、患者のサンプルが比較され得る標準レベルのＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を与える。
【０１２４】
ネガティブコントロールは、患者サンプルが比較され得る発現のバックグラウンドレベルまたはベースレベルを与える。寿命ベースラインまたはプールされた正常サンプルのようなネガティブコントロールに関して発現産物のより高いレベルは、サンプルが得られた患者は、腫瘍を有することを示す。逆に言えば、発現産物の同レベルは、患者がＨＭＬ−２関連腫瘍を有さないことを示す。
【０１２５】
ポジティブコントロールは、患者サンプルが比較され得る発現のレベルを与える。ポジティブコントロールに関して同レベルまたは発現産物のより高いレベルは、サンプルが得られた患者は、腫瘍を有することを示す。逆に言えば、発現産物のより低いレベルは、患者がＨＭＬ−２関連腫瘍を有さないことを示す。
【０１２６】
直接的または間接的なＲＮＡ測定のために、あるいは直接的なポリペプチド測定のために、ネガティブコントロールは、一般的に腫瘍細胞に由来しない細胞（例えば、胸部腫瘍または前立腺腫瘍）を含む。間接的なポリペプチド測定のために、ネガティブコントロールは、一般的に腫瘍を有さない患者由来の血液サンプルである。ネガティブコントロールは、ＨＭＬ−２発現がアップレギュレートされない組織（例えば、雄性の非腫瘍性の非前立腺細胞、または雌性の非腫瘍性の非胸部細胞）ではなく、この患者サンプルと同じ患者由来のサンプルであり得る。ネガティブコントロールは、この患者サンプルと同じ患者由来の前立腺細胞または胸部細胞であり得るが、これらは、患者の生命における初期ステージで得られる。ネガティブコントロールは、腫瘍のない患者由来の細胞であり得る。この細胞は、前立腺／胸部細胞であってもなくてもよい。ネガティブコントロール細胞は、ＢＰＨを有する患者由来の前立腺細胞であり得る。ネガティブコントロールは、正常な精液（ｓｅｍｅｎ）、精液（ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、初乳、乳ミルクなどであり得る。
【０１２７】
直接的または間接的なＲＮＡ測定のために、あるいは直接的なポリペプチド測定のために、ポジティブコントロールは、一般的に問題の腫瘍の型に由来する細胞を含む。間接的なポリペプチド測定のために、ネガティブコントロールは、一般的に前立腺腫瘍または胸部腫瘍を有する患者由来の血液サンプルである。ネガティブコントロールは、この患者サンプルと同じ患者由来の前立腺腫瘍細胞または胸部腫瘍細胞であり得るが、これらは、例えば、寛解をモニタリングするために、患者の生命における初期ステージで得られる。ポジティブコントロールは、前立腺腫瘍または胸部腫瘍を有する別の患者由来の細胞であり得る。ポジティブコントロールは、前立腺細胞株または胸部細胞株であり得る。
【０１２８】
他の適切なポジティブコントロールまたはネガティブコントロールは、当業者に理解される。
【０１２９】
コントロールにおけるＨＭＬ−２発現は、患者サンプルにおける発現として同時に評価され得る。あるいは、コントロールにおけるＨＭＬ−２発現は、別個に（初期または後期に）評価され得る。
【０１３０】
しかし、２つのサンプルを実際に比較するよりも、コントロールは、正確なコントロール（すなわち、例えば、通常の条件下での腫瘍患者から得られたサンプルから経験的に決定された（）発現レベル）であり得る。
【０１３１】
（Ｄ．２  アップレギュレーションの程度）
コントロール（１００％）に関するアップレギュレーションは、通常少なくとも１５０％（例えば、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％以上）である。
【０１３２】
（Ｄ．３  診断）
本発明は、癌を診断するための方法を提供する。本発明に従う「診断」は、疾患の一定の臨床診断から、患者が一定の診断を導き得るさらなる試験を受けるべきであるという指標の範囲にあり得ることが理解される。例えば、本発明の方法は、さらなる分析に供されるポジティブサンプルを有するスクリーニングプロセスの一部として使用され得る。
【０１３３】
さらに、診断は、癌を有することが既知である患者中の癌の進行のモニタリングを含む。癌はまた、本発明の方法によって段階付けられ得る。
【０１３４】
例えば、その効力を決定するために、癌の処置レジメンの効力（テラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ））もまた、本発明の方法によってモニタリングされ得る。
【０１３５】
例えば、発現のアップレギュレーションが生じる場合、癌が発症する前だけでなく、癌に対する感受性もまたは検出され得る。予後法もまた含まれる。
【０１３６】
種々の癌の型のうち、本発明は、前立腺癌（前立腺上皮内腫瘍を含む）および胸部癌（乳腺癌を含む）に対して、特に研究される。
【０１３７】
これらの技術の全ては、本発明における一般的な意味の「診断」に含まれる。
【０１３８】
（Ｅ．推定ＴＡＲ）
ＨＩＶ  Ｔａｔは、転写因子として作用し、そしてそのＲＮＡ標識は、ＴＡＲである。配列番号１４および４９は、推定のＨＭＬ−２ＴＡＲを含む１５０個のヌクレオチドのＲＮＡの例である。ＨＩＶに関する限りでは、ＴＡＲにおける最小のｔａｔ−結合モチーフは、これら２つの分子より短くあり得る。
【０１３９】
本発明は、以下：（ａ）配列番号１４または４９のヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のヌクレオチド配列のフラグメント；（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％の同一性を有するヌクレオチド配列；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の相補体を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０１４０】
単離されたポリヌクレオチドは、好ましくは、２５０個のヌクレオチドより短い（例えば、２４０個のヌクレオチド、２３０個のヌクレオチド、２２０個のヌクレオチド、２１０個のヌクレオチド、２００個のヌクレオチド、１９０個のヌクレオチド、１８０個のヌクレオチド、１７０個のヌクレオチド、１６０個のヌクレオチド、または１５０個のヌクレオチドより短い）。
【０１４１】
ｘの値は、少なくとも７（例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００など）である。ｘの値は、２０００未満（例えば、１０００、５００、１００、または５０未満）であり得る。
【０１４２】
ｓの値は、好ましくは、少なくとも５０（例えば、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．９など）である。
【０１４３】
単離されたポリヌクレオチドは、好ましくはアミノ酸配列（配列番号７、８および／または９）（推定ｔａｔアナログ）を含むタンパク質に結合し得る。
【０１４４】
（Ｆ．阻害性のＰＣＡＰ機能）
Ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用の阻害はＨＩＶ治療のために使用され、そしてＴａｘ機能の阻害はＨＴＬＶ治療のために使用される。類推によって、ＰＣＡＶにおける同等の機能の阻害は、癌の処置、および／またはＨＥＲＶ−Ｋウイルスに結合する他の疾患（例えば、精巣癌（１９４）、多発性硬化症（７４）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）（７５）など）を処置するための方法を提供する。
【０１４５】
種々の方法が、Ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用を阻害するために提唱されてきた（例えば：
Ｔａｔを隔離するような複数のＴＡＲを含むおとりＲＮＡの使用（７６）
アンチセンスＴａｔ（７７）
優位なネガティブＴａｔ変異体（７８）
Ｔａｔリボザイム（７９）
抗ＴＡＲハンマーヘッドリボザイム（８０）
Ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用の低分子インヒビターの使用（８１、８２、８３）
アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）の使用（８４）
ＲＮＡ干渉のための阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用（８５））。
【０１４６】
類似のアプローチが、Ｔａｘ機能を阻害するために使用されている（８６、８７、８８）が、ＴａｘとＴａｔとの間の有意な差異は、Ｔａｔが核酸に直接結合することである。これらの方法の全ては、推定のＰＣＡＶ  ｔａｔ／ＴＡＲ相互作用またはＴａｘ機能に適用され得る。
【０１４７】
従って、本発明は、医薬としてのそれらの使用および前立腺癌、精巣癌、多発性硬化症および／またはインスリン依存性糖尿病を処置するための薬の製造における使用とともに以下を提供する：
推定のＨＭＬ−２  ＴＡＲの２つ以上のコピーをコードするか、またはこれらを含むポリヌクレオチド；
推定のｔａｔ−コード配列と相補的なポリヌクレオチド；
機能的な推定のｔａｔに結合し、そしてトランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）方法で作用し得るポリペプチド；
ｔａｔ配列および／またはｔａｒ配列を攻撃し得るリボザイム；
推定のＴａｔ／ＴＡＲ相互作用の低分子インヒビター；
推定のｔａｔに特異的に結合する抗体またはオリゴ体（ｏｌｉｇｏｂｏｄｙ）（８９、９０）；および
推定のＴａｔ／ＴＡＲ相互作用のアプタマーインヒビター；
推定のＴＡＲ配列に対して相補的な低阻害性ＲＮＡ（例えば、ｒｅｆ．９１〜９６）。
【０１４８】
推定のｔａｔ機能のトランスドミナントインヒビターに関して、本発明は、上記のセクションＣ３において規定されたようなタンパク質を提供し、これは、以下：（ａ）配列番号１０、１１、１２および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列；（ｂ）（ａ）の少なくともｘ個のアミノ酸のフラグメント；または（ｃ）（ａ）と少なくともｓ％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。配列番号１０、１１、１２および１３のアミノ酸を有するタンパク質は全て、最も強く優位にネガティブである配列番号１３（ｃＯＲＦ）を有する推定のｔａｔの活性を抑制することが見出されてきた。
【０１４９】
（スクリーニング方法および薬剤設計）
本発明はまた、癌に対して活性を有する化合物についてのスクリーニング方法を提供し、該方法は、以下：試験化合物を推定のＴａｔポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、あるいは推定のＴＡＲポリヌクレオチドとを接触させる工程；および試験化合物とこれらのポリヌクレオチド／ポリペプチドとの間の結合相互作用を検出する工程を包含する。結合相互作用は、試験化合物の潜在的な抗癌効果を示す。
【０１５０】
本発明はまた、前立腺癌に対して活性を有する化合物についてスクリーニング方法を手供し、該方法は、以下：試験化合物を本発明の推定のＴａｔポリペプチドと接触させる工程；およびポリペプチドの機能をアッセイする工程を包含する。このポリペプチドの機能の阻害（例えば、本明細書中の実施例において記載されるような、ＰＣＡＶ  ＬＴＲによって作動されるレポーター遺伝子の発現の消失）は、試験化合物の潜在的な抗癌効果を示す。
【０１５１】
代表的な試験化合物としては、ペプチド（環状ペプチド（８２）を含む）、ペプトイド、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、低有機分子（９７）、抗生物質、ポリアミン、ならびにこれらの組み合わせおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。低有機分子は、５０ダルトン以上および約２，５００ダルトン未満、そして最も好ましくは、約３００ダルトンと約８００ダルトンとの間の分子量を有する。天然の産物または混合されたコンビナトリアル合成の産物を含む抽出物のような基質の複合混合物がまた試験され、そして標的ＲＮＡに結合する化合物が、引き続く工程において、この混合物から精製され得る。
【０１５２】
試験化合物は、合成化合物または天然の化合物の巨大ライブラリーに由来され得る（９８）。例えば、合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）またはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から市販される。あるいは、天然化合物のライブラリーは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態で使用され得る。さらに、試験化合物は、個々の化合物または混合物のいずれかとして、コンビナトリアル化学を使用して合成的に産生され得る。
【０１５３】
本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、当該分野において公知の任意に利用可能な方法（例えば、シグナル伝達、抗体結合、レセプター結合、マイトジェンアッセイ、走化性アッセイなど）を使用してスクリーニングされ得る。アッセイ条件は、理想的には、ネイティブの活性がインビボで示される下での（すなわち、生理的ｐＨ、温度、およびイオン強度の下での）条件と似ているべきである。適切なアゴニストまたはアンタゴニストは、被験体において有毒な副作用を引き起こさない濃度で、ネイティブな活性の強い阻害または増加を示す。ネイティブなポリペプチドへの結合に関して競合するアゴニストまたはアンタゴニストは、ネイティブな濃度と同等な濃度またはより高い濃度を必要とし得るが、ポリペプチドに不可逆的に結合し得るインヒビターは、ネイティブな濃度のオーダーに類似するように濃縮して添加され得る。
【０１５４】
そのようなスクリーニングおよび実験法は、ＨＭＬ−２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの同定を導き得る。このようなアゴニストまたはアンタゴニストは、ＨＭＬ−２の発現および／または機能を調節するか、増強するか、または阻害するために使用され得る（９９）。
【０１５５】
本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、組換え的に産生されたＨＭＬ−２ポリペプチド）を使用して、結合するか、そうでなければＨＭＬ−２ポリペプチドの活性を調節する（例えば、阻害する）能力について、化合物をスクリーニングし、従って、例えば、ＨＭＬ−２ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る化合物を同定する方法に関連する。１つのスクリーニングアッセイにおいて、ＨＭＬ−２ポリペプチドは、試験化合物の存在または非存在下でＨＭＬ−２の増殖刺激活性に対して感受性のある細胞とともにインキュベーションされる。ＨＭＬ−２活性の改変または試験化合物の結合効力が測定される。次いで、細胞増殖が決定される。試験サンプルにおける細胞増殖の減少は、この試験化合物がＨＭＬ−２ポリペプチドに結合し、それによってＨＭＬ−２ポリペプチドを不活化するか、そうでなければＨＭＬ−２ポリペプチド活性を阻害することを示す。
【０１５６】
ＨＭＬ−２遺伝子を過剰発現するように形質転換されたトランスジェニック動物（例えば、げっ歯類）は、ＨＭＬ−２の過剰発現から生じる腫瘍発生を阻害する能力または一旦発生したそのような腫瘍を処置する能力について、インビボで化合物をスクリーニングするために使用され得る。増大した侵襲性の前立腺腫瘍または悪性の可能性のある前立腺腫瘍を有するトランスジェニック動物は、ＨＭＬ−２ポリペプチドの効果を阻害する能力について、化合物（抗体またはペプチドを含む）をスクリーニングするために使用され得る。そのような動物は、例えば、本明細書中の実施例において記載されるように生成され得る。
【０１５７】
上で記載されるようなスクリーニング手順は、前立腺癌処置の際の薬理学的な介入ストラテジーにおける潜在的な使用のための薬剤を同定するために有用である。さらに、ＨＭＬ−２に対応するポリヌクレオチド配列（ＬＴＲを含む）は、高められた遺伝子発現のインヒビターについてアッセイするために使用され得る。
【０１５８】
ＨＥＲＶ−Ｋプロテアーゼの強力なインヒビターは、既知である（１００）。ＨＩＶ−１プロテアーゼインヒビターによるＨＥＲＶ−Ｋプロテアーゼの阻害もまた報告されている（１０１）。これらの化合物は、前立腺癌治療における使用のために研究され得、そしてまた薬物設計のための有用なリード化合物であり得る。
【０１５９】
ｃＯＲＦのトランスドミナント（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）ネガティブ変異体もまた報告されている（１０２、１０３）。トランスドミナントｃＯＲＦ変異体は、前立腺癌治療における使用のために研究され得る。
【０１６０】
ＨＭＬ−２  ｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を選択的に減少させるか、またはオブレート（ｏｂｌａｔｅ）するために使用され得る。より詳細には、アンチセンス構築物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前立腺腫瘍細胞中でのＨＭＬ−２ポリペプチドの産生を阻害するために使用され得る。アンチセンスｍＲＮＡは、標的癌細胞に本発明のＨＭＬ−２ポリヌクレオチド（ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡ転写の方向に関してアンチセンスの方向で配向される）を有する発現ベクターでトランスフェクトすることによって産生され得る。適切なベクターとしては、ウイルスベクター（レトロウイルスベクターを含む）および非ウイルスベクターが挙げられる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じ目的を達成するために直接標的細胞に導入され得る。オリゴヌクレオチドは、最大レベル特異性を達成し、そして例えば、イニシエーターＡＴＧでＰＣＡＶ−ｍＲＮＡに結合するために選択／設計され得る。
【０１６１】
ＨＭＬ−２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、ポリペプチドの作用をブロックし、そしてこれによって癌細胞の増殖を制御するために使用され得る。これは、ＨＭＬ−２ポリペプチドに結合し、そしてその作用をブロックする抗体の注入によって達成され得る。
【０１６２】
本発明はまた、Ｔａｔおよび／またはＴＡＲに結合する化合物を同定するためのハイスループットのスクリーニング方法を提供する。好ましくは、このアッセイのための全ての生化学的工程は、単一溶液中で、例えば、試験管またはマイクロタイタープレートにおいて実行され、そして試験化合物は、初めに単一の化合物濃度で分析される。ハイスループットのスクリーニングの目的の為に、実験条件は、スクリーニングされた総化合物の中から「ポジティブ」化合物として同定された試験化合物の比を達成するように調整される。このアッセイは、好ましくは、例えば、巨大な化合物ライブラリーからの０．１％〜１％の総試験化合物が、１０μＭ以下（例えば、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭまたはそれより下）のＫｉで所定の標的に結合することが示される場合、標的に対して測定可能な親和性を有する化合物を同定するために設定される。
【０１６３】
本発明はまた、推定の相互作用をブロックし得る化合物を同定するために、推定のＴａｔおよび／または推定のＴＡＲの構造表示に対して適用され得る構造ベースの薬物設計技術を提供する。種々の適切な技術（例えば、ｒｅｆ．１０４）が当業者に利用可能である。
【０１６４】
構造ベースの薬物設計において使用するために分子モデルリング技術を実行するためのソフトウェアパッケージとしては、ＳＹＢＹＬ（１０５）、ＡＭＢＥＲ（１０６）、ＣＥＲＩＵＳ２（１０７）、ＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩ（１０７）、ＣＡＴＡＬＹＳＴ（１０７）、ＱＵＡＮＴＡ（１０７）、ＨＹＰＥＲＣＨＥＭ（１０８）、ＣＨＥＭＳＩＴＥ（１０９）などが挙げられる。このソフトウェアは、ファン・デル・ワールス接触、静電相互作用、および／または水素結合機会のような特徴を明らかにするために、推定のＴａｔおよび／または推定のＴＡＲの結合性表面を決定するために使用され得る。
【０１６５】
本発明はまた、推定のＴａｔおよび／またはＴＡＲに結合する化合物を同定するための
インシリコでのスクリーニング方法を提供する。潜在的リガンドの構造表示は、ＳＤ形式またはＭＤＬ形式のようなコンピューターで読み取り可能な形態で保存される。リガンドの３Ｄ構造は、好ましくは、ＣＯＲＩＮＡ、ＣＯＮＣＯＲＤＥまたはＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのようなプログラムを使用する２Ｄ表示から作成される。一旦インシリコでレセプターと相互作用するリガンドが同定されれば、これは、提供され得（例えば、合成され得るか、精製され得るか、または購入され得る）、そしてこの相互作用は、実験的に証明され得る。本発明は、本発明の方法を使用して同定されるリガンドを提供する。
【０１６６】
構造ベースのインシリコスクリーニングは、ＨＩＶのＴａｔ／ＴＡＲ相互作用のインヒビターを同定するために使用されている（１１０）。
【０１６７】
これらの種々の方法の効力は、本発明の組成物の投与後、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現をモニタリングすることによって試験され得る。ｔａｔベースのＨＩＶ免疫においてこれまで首尾よく使用されている本発明の全てが、使用され得る。
【０１６８】
（Ｇ．ワクチン）
Ｔａｔタンパク質は、ＨＩＶ治療のためのワクチン抗原として使用されており、そしてＴａｘタンパク質は、ＨＴＬＶ治療のためのワクチン抗原として使用されている。ポリペプチドワクチン（１１１、１１２、１１３、１１４、１１５）およびＤＮＡワクチン（１１６、１１７）が提唱されてきた。類推によって、本発明のポリペプチドは、前立腺癌または乳癌に対して免疫するために使用され得、そしてまたＨＥＲＶ−Ｋウイルスに関連する他の疾患（例えば、精巣癌、多発性硬化症、ＩＤＤＭなど）を処置するために使用され得る。
【０１６９】
それゆえ、本発明は、以下を含む組成物を提供する：（ａ）上のセクションＣ．３において規定されるようなポリペプチドおよび（ｂ）薬学的に受容可能キャリア。本発明はまた、以下を含む組成物を提供する：（ａ）上で規定されるようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび（ｂ）薬学的に受容可能キャリア。
【０１７０】
さらに組成物は、アジュバントを含み得る。例えば、組成物は、１つ以上の以下のアジュバントを含み得る：（１）水中油型のエマルジョン処方（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特異的な免疫刺激剤のあるまたはなしで）（例えば、（ａ）マイクロフルダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してミクロン以下の粒子で処方される、５％  Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５（必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含む）を含むＭＦ５９ＴＭ（１１８：ｒｅｆ．１１９における第１０章）、（ｂ）１０％  Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）でブロックされたポリマー（Ｌ１２１）を含むＳＡＦ、およびミクロン以下の粒子にマイクロフルダイズされるか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するためにボルテックスされるｔｈｒ−ＭＤＰ、ならびに（ｃ）２％  Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０およびモノホスホリリピッドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）からなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分、ならびに細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ））；（２）ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、あるいはそれから生成された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体））（ＩＳＣＯＭＳは、さらなる界面活性剤を含まなくてよい）（１２０）；（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのようなサイトカイン；（５）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、１２１、１２２）；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ（例えば、１２３、１２４、１２５）；（７）ＣｐＧモチーフ（すなわち、必要に応じて５−メチルシトシンがシトシンの代わりに使用される、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む）を含むオリゴヌクレオチド；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（１２６）；（９）オクトキシノールとの組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（１２７）またはオクトキシノールのような少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤との組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤あるいはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（１２８）；（１０）免疫刺激性のオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン（１２９）；（１１）免疫刺激剤および金属塩の粒子（１３０）；（１２）サポニンおよ��水中油型エマルジョン（１３１）；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（１３２）；（１４）アルミニウム塩（好ましくは水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム）（しかし任意の他の適切な塩がまた、使用され得る（例えば、ヒドロキシリン酸アルミニウム、オキシ水酸化アルミニウム、オルトリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど（ｒｅｆ．１１９の第８章および第９章））。異なるアルミニウム塩の混合物がまた使用され得る。この塩は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、アモルファスなど）を採り得る；（１５）キトサン；（１６）コレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉの熱不安定性毒素、あるいはそれらの無毒化された変異体（１３３）；（１７）ＰＬＧのようなポリ（ａ−ヒドロキシ）酸の微粒子；（１８）組成物の効力を高めるために免疫刺激剤として作用する他の物質。アルミニウム塩および／またはＭＦ５９ＴＭが好ましい。
【０１７１】
組成物は、好ましくは、無菌であり、そして／または発熱物質を含まない。それは、代表的には、ｐＨ７周辺に緩衝化される。
【０１７２】
組成物は、好ましくは免疫原性の組成物であり、そしてより好ましくはワクチン組成物である。組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）において抗体を生成するために使用され得る。
【０１７３】
本発明のワクチンは、予防薬（すなわち、疾患を防止するため）であり得るか、または治療薬（すなわち、疾患の症状を減少させるか、または除去するため）であり得る。
【０１７４】
効力は、本発明の組成物の投与後、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現をモニタリングすることによって試験され得る。ｔａｔベースのＨＩＶ免疫において以前から使用されている方法の全てが、使用され得る。
【０１７５】
（Ｈ．薬学的組成物）
本発明は、上記で定義されたようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、また抗体を含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、薬としての使用および癌を処置するための薬の製造におけるそれらの使用を提供する。本発明はまた、免疫応答を生じるための方法を提供し、この方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの免疫原性用量を動物に投与する工程を包含する。
【０１７６】
本発明によって含まれる薬学的組成物は、活性薬剤として、本明細書中で開示される本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体を薬学的有効量で含む。「有効量」とは、有益または所望の結果（臨床結果を含む）をもたらすために十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。本発明の目的のために、有効量は、癌の症状および／または進行を軽減するか、改善するか、安定にするか、後退させるか、遅らせるか（ｓｌｏｗ）または遅らせる（ｄｅｌａｙ）ために十分である量である。
【０１７７】
組成物は、癌および原発性癌の転移を処置するために使用され得る。さらに、薬学的組成物は、癌処置の従来の方法（例えば、腫瘍を放射線療法または従来の化学療法に感作するような）とともに使用され得る。用語「処置」「処置している」「処置する」などとは、本明細書中で概して、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることをいうために用いられる。この効果は、その疾患および／またはこの疾患に起因し得る副作用または症状を完全にまたは部分的に予防する点では予防であり得、そして／あるいは疾患のための部分的または完全な安定化または治療の点では治療であり得る。本明細書中で使用される場合、「処置」は、哺乳動物（特に、ヒト）における疾患の任意の処置を含み、そして以下を含む：（ａ）疾患または症状の素因があり得るが、まだそれらを有していると診断されていない被験体において、疾患または症状が生じるのを防ぐこと；（ｂ）疾患の症状を阻害すること（すなわち、その発症を阻止すること）；または（ｃ）疾患の症状を軽減すること（すなわち、疾患または症状の後退を引き起こすこと）。
【０１７８】
薬学的組成物が、差示的に発現したポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物に特異的に結合する抗体を含む場合、抗体は処置部位への送達のための薬物に結合され得るか、または前立腺癌細胞のような癌細胞を含む部位の画像化を促進するために検出可能な標識に結合され得る。抗体を薬物および検出可能な標識に結合する方法は、検出可能な標識を使用して画像化するための方法のように、当該分野において周知である。
【０１７９】
本明細書中で使用される場合、用語「治療的に有効な量」とは、所望の疾患もしくは状態を処置するか、改善するか、もしくは予防するような、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すような治療剤の量をいう。この効果は、例えば、化学的マーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、身体的症状の減少を含む。被験体のための正確な有効量は、被験体のサイズおよび健康、状態の特性および程度、ならびに投与のために選択される治療法または治療法の組み合わせに依存する。所定の状態のための有効量は、慣用的な実験によって決定され、そして医師の判断にある。本発明の目的のために、有効用量は、該して、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇもしくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの本発明の組成物である。
【０１８０】
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療剤のような治療剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、それ自体は組成物を受け入れる個体に対して有害な抗体の産生を誘導せず、そして過度な毒性なしに投与され得る任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような、巨大でゆっくりと代謝される高分子であり得る。そのようなキャリアは、当業者に周知である。治療組成物中の薬学的に受容なキャリアは、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。湿潤剤または乳化剤のような補助物質、ｐＨ緩衝物質などもまた、そのようなビヒクル中に存在し得る。代表的に、治療組成物は、注射可能物（液体の溶液または懸濁液のいずれか）として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するに適切な固形形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義内に包含される。例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩のような薬学的に受容可能な塩もまた、薬学的組成物中に存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の一貫した考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９５）  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＷｉｌｋｉｎｓ、または参考文献１３４で入手可能である。
【０１８１】
一旦処方されたならば、本発明によって企図される組成物は、（１）被験体に直接投与され得るか（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、低分子アゴニストまたは低分子アンタゴニストなどとして）；または（２）被験体に由来する細胞にエクスビボで送達され得る（例えば、エクスビボでの遺伝子治療として）。組成物の直接送達は、一般的に非経口の注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋内、腫瘍内あるいは組織の間隙空間に対して）によって達成される。他の投与形態としては、経口投与および肺への投与、坐剤、ならびに経皮への塗布、針、かつ遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）またはハイポスプレーが挙げられる。投薬処理は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。
【０１８２】
エクスビボで送達し、そして形質転換された細胞を被験体に再移植するための方法は、当該分野において公知である（例えば、ｒｅｆ．１３５）。エクスビボでの適用において有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞（特に、造血幹細胞）、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が挙げられる。一般的に、エクスビボでの適用およびインビトロでの適用の両方についての核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介性のトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）媒介性のトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接の微量注入によって達成され得、これらは全て当該分野において周知である。
【０１８３】
ＰＣＡＶポリヌクレオチドの差示的発現は、腫瘍と相関することが見出されてきた。腫瘍は、提供されたポリヌクレオチド、対応するポリペプチドまたは他の対応する分子（例えば、アンチセンス、リボザイムなど）をベースにした治療剤の投与による処置を受けやすくあり得る。他の実施形態において、障害は、例えば、正常細胞と比較して癌細胞中で発現が増加した遺伝子のコードされた遺伝子産物の機能のインヒビター（アンタゴニスト）として、または癌細胞中で発現が増加した遺伝子産物についてアゴニスト（例えば、腫瘍サプレッサーとして作用する遺伝子産物の活性を促進するような）として作用する低分子薬物の投与による処置手順を受けやすくあり得る。
【０１８４】
本発明の薬学的組成物の投与の用量および方法は、治療組成物の特定の質、患者の状態、年齢、および体重、疾患の進行、および他の関連因子に基づいて決定される。例えば、ポリヌクレオチド治療組成物薬剤の投与は、局所投与または全身投与を含み、これは、注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル投与、および局所投与を含む。好ましくは、治療ポリヌクレオチド組成物は、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結するプロモーターを含む発現構築物を含む。種々の方法が、治療組成物を直接体内の特定部位に投与するために使用され得る。例えば、小さい転移性の病巣が位置付けられ、そして治療組成物が腫瘍体のいくつかの異なる位置において数回注射される。あるいは、腫瘍に供給する動脈が同定され、そして組成物を直接腫瘍内へ送達するために、治療組成物がそのような動脈中に注射される。壊死性中心を有する腫瘍が吸引され、そして組成物が、今や空の腫瘍中心に直接注射される。アンチセンス組成物は、例えば、組成物の局所適用によって、直接腫瘍表面に投与される。Ｘ線画像化が、特定の上記の送達方法を補助するために使用される。
【０１８５】
アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノムのポリヌクレオチド、または抗体を含む治療組成物の特定の組織への標的化送達もまた使用され得る。レセプター媒介性ＤＮＡ送達技術が、例えば、参考文献１３６〜１４１において記載される。ポリヌクレオチドを含む治療組成物は、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与について、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡがまた、遺伝子治療プロトコルの間に使用され得る。作用方法（例えば、コードされた遺伝子産物のレベルを上昇させるか、または阻害するために）のような要素ならびに形質転換および発現の効力は、アンチセンスサブゲノムポリヌクレオチドの最終的効力に必要とされる投薬量に影響を与える考慮すべき問題である。より多い発現が、組織のより広い領域にわたって所望される場合、連続投与のプロトコルにおいて再投与されたものより多い量のアンチセンスサブゲノムのポリヌクレオチドもしくは同量のアンチセンスサブゲノムのポリヌクレオチド、または例えば腫瘍部位とは異なる隣接の組織部分、もしくは近い組織部分への数回の投与が、ポジティブな治療の結果をもたらすために必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験における慣用的な実験は、最適な治療効果のための特定範囲を決定する。
【０１８６】
本発明の治療ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達され得る。この遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る（一般的には、参考文献１４２、１４３、１４４および１４５を参照のこと）。そのようなコード配列の発現は、内在性の哺乳動物プロモーターまたは異種のプロモーターを使用して誘導され得る。このコード配列の発現は、構成的または調節的のいずれかであり得る。
【０１８７】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞中での発現のためのウイルスベースのベクターは、当該分野において周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとしては、組換えレトロウイルス（例えば、参考文献１４６〜１５６）、αウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７４）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献１５７〜１６２を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。殺傷されたアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与（１６３）もまた、用いられ得る。
【０１８８】
非ウイルス送達ビヒクルおよび方法もまた使用され得、これらとしては、殺傷されたアデノウイルスに連結しているか、または連結していない単独の、多陽イオン性（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ）の縮合ＤＮＡ（例えば、１６３）、リガンド連結ＤＮＡ（１６４）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、ｒｅｆ．１６５〜１６９）および核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられるが、これらに限定されない。裸のＤＮＡがまた使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法が、ｒｅｆ．１７０および１７１において記載される。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、ｒｅｆ．１７２〜１７６において記載される。さらなるアプローチが、ｒｅｆ．１７７および１７８において記載される。
【０１８９】
さらに、使用に適切な非ウイルス送達としては、ｒｅｆ．１７８において記載されるアプローチのような機械的な送達系が挙げられる。そのうえ、そのようなコード配列および発現産物は、光重合性ヒドロゲル物質の沈積または電離放射線の使用を介して送達され得る（例えば、ｒｅｆ．１７９および１８０）。コード配列の送達のために使用され得る遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、携帯型遺伝子移入粒子銃の使用（１８１）または移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（１７９および１８２）が挙げられる。
【０１９０】
（Ｉ  ヒト内因性レトロウイルスのＨＭＬ−２ファミリー）
全真核生物のゲノムは、感染性レトロウイルスに関連する配列の複数のコピーを含む。これらの内在性レトロウイルスは、実際の感染形態および何千もの欠損レトロウイルス様エレメント（例えば、ＩＡＰおよびＥｔｎ配列ファミリー）の両方が存在するマウスにおいて十分研究されてきた。生殖細胞系突然変異または腫瘍形成形質転換を引き起こすこれらのエレメントの挿入が証明されてきたので、ＩＡＰおよびＥｔｎファミリーのいくつかのメンバーは、「活性」なレトロトランスポゾンである。
【０１９１】
内在性レトロウイルスは、ヒトゲノムＤＮＡにおいて、他の脊椎動物のレトロウイルスとのその相同性によって同定された（１８３、１８４）。ヒトゲノムは、おそらく内在性のプロウイルスＤＮＡの多数のコピーを含むと考えられているが、その機能についてはほとんど未知である。ほとんどのＨＥＲＶファミリーは、相対的に数個のメンバー（１〜５０個）を有するが、１つのファミリー（ＨＥＲＶ−Ｈ）は、全ての染色体について分配されるハプロイドゲノムあたり約１０００個のコピーからなる。胚細胞株および腫瘍細胞株における大多数のＨＥＲＶおよびＨＥＲＶの普遍的な転写活性は、それらが、疾患を引き起こす挿入突然変異として作用し得るか、または中立的の方法または有益な方法で隣接する遺伝子の発現に影響を及ぼし得ることを示唆する。
【０１９２】
ヒト内在性レトロウイルスのＫファミリー（ＨＥＲＶ−Ｋ）は、周知である（１８５）。これは、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）と関連し、そしてヒト、サル（ａｐｅ）、および旧世界ザルのゲノム中に存在するが、いくつかのヒトＨＥＲＶ−Ｋプロウイルスは、ヒトに独特である（１８６）。ＨＥＲＶ−Ｋファミリーは、ハプロイドヒトゲノムあたり３０〜５０個の全長コピーで存在し、そして潜在的にウイルスのタンパク質中へ翻訳される長型オープンリーディングフレームを保持する（１８７、１８８）。２つの型のプロウイルスゲノムが公知であり、これは、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の重複する境界における２９２個のヌクレオチドのストレッチの存在（２型）または非存在（１型）によって異なる。ＨＥＲＶ−Ｋファミリーのいくつかのメンバーは、ｇａｇタンパク質およびレトロウイルス粒子をコードすることが公知であり、これは、生殖細胞腫瘍および誘導細胞株の両方において検出可能である（１９０）。全長ＨＥＲＶ−ＫのＲＮＡ発現パターン分析はまた、ＨＩＶのＲｅｖタンパク質と機能的に等価な配列特異的な核ＲＮＡエクスポート因子である中心ＯＲＦ（ｃＯＲＦ）と命名された１０５個のアミノ酸タンパク質をコードする二重スプライシングＲＮＡを同定する（１９１）。ＨＥＲＶ−Ｋ１０は、全長ｇａｇと相同的な７３ｋＤａのタンパク質および機能的なプロテアーゼをコードすることが示されてきた（１９２）。
【０１９３】
生殖細胞腫瘍に罹患する患者は、腫瘍検出時にＨＥＲＶ−Ｋｇａｇおよびｅｎｖタンパク質に対する高い抗体力価を示す（１９３）。正常な精巣および精巣腫瘍において、ＨＥＲＶ−Ｋ膜貫通エンベロープタンパク質は、生殖細胞および腫瘍細胞の両方において検出されるが、周辺組織では検出されない。精巣腫瘍の場合、ｅｎｖに特異的なｍＲＮＡの発現、膜貫通ｅｎｖの存在、ｃＯＲＦと、患者の血漿中のｇａｇタンパク質およびＨＥＲＶに特異的なペプチドに対する抗体との間の相関が、報告されてきた。参考文献１９４は、ＨＥＲＶ−Ｋ１０ｇａｇタンパク質および／またはｅｎｖタンパク質は、セミノーマ細胞中で合成されること、およびその腫瘍を有する患者は、相対的にｇａｇおよび／またはｅｎｖに対して高い抗体力価を示すことを報告する。
【０１９４】
ＨＥＲＶ−Ｋから粒子の形態で放出されるＧａｇタンパク質は、奇形癌由来細胞株Ｔｅｒａ  １の細胞培養上清中で同定された。これらのレトロウイルス様粒子（「ヒト奇形癌由来ウイルス」またはＨＴＤＶと命名された）は、ＨＥＲＶ−Ｋ１０ゲノムと９０％の配列相同性を有することが示されてきた（１９０、１９５）。
【０１９５】
ＨＥＲＶ−Ｋファミリーが、ヒト細胞ごとのゲノムにおいて存在する一方で、ｍＲＮＡの高レベル発現、タンパク質および粒子は、ヒト奇形癌細胞株においてのみ観察される（１９６）。他の組織および細胞株において、非常に感度の高い方法を使用してでも、ｍＲＮＡの基底レベルの発現が証明されただけであった（１９７）。レトロウイルスのプロウイルスの発現は、一般的に５’長末端反復（ＬＴＲ）のエレメントによって調節される。ＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲの活性は、転写因子によってアップレギュレートされることが公知である。さらに、内因性レトロウイルスの発現の活性化は、腫瘍性作用の引き金となる下流遺伝子の発現の引き金となり得る。
【０１９６】
ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）の配列（第３染色体に位置する）が開示されてきた（１９８）。
【０１９７】
ＨＭＬ−２は、ＨＥＲＶ−Ｋファミリーのサブグループである（１９９）。ＨＭＬ−２小群のメンバーであるＨＥＲＶ単離体としては、ＨＥＲＶ−Ｋ１０（１８９、１９４）、参考文献２００の図面４において示された２７個のＨＭＬ−２ウイルス、ＨＥＲＶ−Ｋ（Ｃ７）（２０１）、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＩＩ）（１９８）、およびＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）が挙げられる。
【０１９８】
ＨＭＬ−２は十分認識されたファミリーであるため、当業者は、任意の特定の内因性レトロウイルスがＨＭＬ−２であるか否かを困難なく決定し得る。本発明に従って使用するために好ましいＨＭＬ−２ファミリーのメンバーは、そのプロウイルスゲノムが配列番号４４と少なくとも７５％の配列同一性を有するＬＴＲ（ＨＭＬ−２．ＨＯＭ（７）に由来するＬＴＲ配列）を有するメンバーである。ＬＴＲの例としては、配列番号４５〜４８が挙げられる。
【０１９９】
（否認（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ））
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６９〜７６のアミノ酸配列のうちの１つを有するポリペプチド、または配列番号６９〜７６を含むポリペプチドを含み得ない（２０４）。
【０２００】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下を含み得ない：（ｉ）参考文献１において開示されるヌクレオチド配列を含む核酸；（ｉｉ）参考文献１における配列１〜２２５内のヌクレオチド配列を含む核酸；（ｉｉｉ）公知の核酸；（ｉｖ）参考文献１において開示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｖ）参考文献１における配列１〜２２５内のアミノ酸配列を含むポリオペプチド；（ｖｉ）公知のポリペプチド；（ｖｉｉ）２００１年１２月７日の核酸またはポリペプチドとして公知の核酸またはポリペプチド（例えば、その配列は、２００１年１２月７日以前のＧｅｎｅＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑのような公開のデータベースで利用可能である）；または（ｖｉｉｉ）２００２年６月１０日のポリペプチドまたは核酸として公知のポリペプチドまたは核酸（例えば、その配列は、２００２年６月１０日以前のＧｅｎｅＢａｎｋまたはＧｅｎｅＳｅｑのような公開のデータベースで利用可能である）。
【０２０１】
（定義）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」（例えば、Ｘを「含む」組成物は、独占的にＸからなり得るか、またはさらなる何か（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含み得る）を意味する。
【０２０２】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２０３】
用語「腫瘍性細胞」、「新形成」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」（交換可能に使用される）とは、相対的に自立性増殖を示す細胞をいい、そのため、これらは、細胞増殖の制御の有意な消失（すなわち、統制解除された細胞分裂）によって特徴付けられる異常な増殖の表現型を示す。腫瘍性細胞は、悪性または良性であり得、そして前立腺癌または乳癌に由来する組織を含む。
【０２０４】
単語「実質的に」は、「完全に」を排除しない（例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まない状態であり得る。必要な場合、単語「実質的に」は、本発明の定義から削除され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２０５】
（本発明を実行するための様式）
本発明の特定の局面は、以下に続く非限定的な例においてより詳細に記載される。当業者に本発明の作製方法および使用方法の完全な開示および記載を提供するように、実施例が示され、そして本発明者らが、その発明であるとみなすものの範囲に限定することが意図されなければ、以下の実験が実行された全ての実験および実行された実験のみであることを示すことも意図されない。使用される数（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するための努力が為されるが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他で示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、そして圧力は大気圧であるか、または大気圧周辺である。
【０２０６】
（ＨＭＬ−２配列の前立腺関連発現）
参考文献１は、前立腺癌とＨＥＲＶ−Ｋ内因性レトロウイルスのＨＭＬ−２サブグループの発現のアップレギュレーションとの関連を記載する。
【０２０７】
（ｍＲＮＡのスプライシングパターン）
前立腺癌細胞株のノーザンブロットは、それらがいくつかのサイズ（全長ウイルスゲノム配列およびサブゲノムのスプライシングされた転写物の両方に対応する）のＰＣＡＶ転写物の発現することを示す（図１４）。そのような転写物の発現はまた、図１４のレーン１において示されるように、奇形癌細胞株においても観察される（４）。さらに、ＰＣＡＶのスプライシングパターンを特徴付けるために、取り込まれたプロウイルス配列の隣接するＬＴＲ間の任意のスプライス事象を検出し得るＲＴ−ＰＣＲストラテジーを使用した。統合ＰＣＡＶゲノムの一般的な特徴に対して、このアプローチにおいて使用された順方向プライマー（配列番号１５）および逆方向プライマー（配列番号１６および１７）のおよその位置は、図１５中の矢印によって示される。
【０２０８】
逆転写酵素がＲＴ−ＰＣＲ反応物中に含まれる場合のみ（図１６中のレーン１、３、５、７、および９）、ｅｎｖおよび他のＯＲＦの転写物に対応するＤＮＡフラグメントは、これらの実験において検出され得、これは、このＤＮＡフラグメントがスプライシングされたＰＣＡＶ  ｍＲＮＡに由来されることを示す。これらのスプライシングされたｍＲＮＡは、奇形癌細胞株Ｔｅｒａ１（図１６、レーン１）ならびに前立腺癌細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、およびＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ（図１６）において検出された。類似の結果がまた、前立腺癌患者から得られたいくつかの腫瘍サンプルにおいて観察された。
【０２０９】
正確なスプライシングパターンを決定するために、細胞株および患者組織から得られたＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定した。ｅｎｖのスプライシングされたｍＲＮＡに加えて、多くの他のスプライス改変体が見られた（図１７および１８においてスプライスＡ〜Ｊと命名された；これらのスプライス改変体のコンセンサス配列について、以下を参照のこと）。これらの結果の詳細な分析は、４つのエキソン（エキソン１、１．５、２および３）およびＨＭＬ−２ゲノム配列の全域で１３個のスプライス連結（図１７〜２２においてＩ〜ＸＩＩＩと命名された）を同定する。
【０２１０】
図１７において略図で示されるように、エキソン１は、ＬＴＲにおける転写開始部位からスプライス部位Ｉの配列を含む。スプライス連結Ｉは、ＨＭＬ−２の全ての統合されたコピーの間で保存され、そしてｇａｇについての開始メチオニンの上流（図１９、ヌクレオチド１５０２とヌクレオチド１５０３との間）に位置する。試験された全てのスプライシングされたｍＲＮＡは、スプライスＪのｍＲＮＡ（エキソン２とエキソン３との間のイントロンのみを除去するようである）を除いて、正確にこの部位でスプライシングされる。
【０２１１】
エキソン１．５は非常に小さく、そしてスプライスＤのｍＲＮＡにおいて検出されるのみであった（図１７）。このエキソンは、ｇａｇコード配列（ヌクレオチド２６２４と２６６８との間、図２０を参照のこと）に位置し、そして潜在的な開始メチオニンをコードする。ＰＣＡＶゲノムの統合されたコピーのうちのいくつかのみが、原型Ｙ１７８３２ゲノムの２６２２位〜２６２３位で見出されるＡＧ３’スプライス連結コンセンサス配列を含む。おそらくこれは、ウイルスを含まない進化の間に、統合ウイルスゲノムとしての霊長類の進化の間に、いくつかのＰＣＡＶ改変体におけるこのイントロンの獲得または消失のいずれかを示す。
【０２１２】
エキソン２は非常に異質性であり、これは、エキソンの５’末端に２個の異なる３’スプライス連結（スプライス部位ＩＶおよびＶ、図１８および２１を参照のこと）およびエキソンの３’末端に７個の５’スプライス連結（スプライス部位ＶＩ〜ＸＩＩ、図１９および２１を参照のこと）を含む。さらに、エキソン２は、実験の分析で検出されなかった他の潜在的なプライス部位を含む。これらの潜在的な部位のうちの１つ（図２１において、「潜在的なスプライス部位Ａ」として示される）は、ＨＩＶｔａｔまたはＨＴＬＶｔａｘと等価なものをコードするｍＲＮＡを生成するために使用され得る（以下を参照のこと）。
【０２１３】
各スプライス改変体におけるエキソン２のサイズは、いずれのスプライス部位がそれぞれ個々のスプライス事象において使用されるかに依存する。図１８は、観察されたスプライス改変体（配列番号１８〜４３もまた参照のこと）の全てを要約するが、原則として、２つ以上のエキソンを有するｍＲＮＡにおける内部エキソンについて非常に巨大であるエキソンを潜在的に除いて、任意の他の組み合わせが可能である。複雑性のレベルに加えて、これらのスプライス部位のうちの４つが、ヒトゲノム中に統合されたことが見出された２つのＰＣＡＶ配列改変体に特異的である。Ｉ型ウイルス（図２１における配列ＡＢ０４７２４０、Ｙ１８８９０およびＭ１４１２３）は、ｅｎｖのＮ末端領域における約３００個のヌクレオチドの欠失、２つの潜在的な開始メチオニンの後ろに続く約３５〜４３個のヌクレオチドの欠失を含む（図１８を参照のこと）。この欠失部位に近位のスプライス部位ＶＩは、Ｉ型ウイルスにおいてのみ見出される（図２１を参照のこと）。それらを含む配列がＩ型ウイルスにおいて欠失されるので、スプライス部位ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸは、ＩＩ型ウイルスにおいて見出されるのみである（図２１における配列Ｙ１７８３２、ＡＦ０７４０８６−Ｔ１、ＡＦ０７４０８６−Ｔ２、Ｙ１７８３３、Ｙ１７８３４、ＡＰ０００３４６およびＡＬ０３５５８７）。従って、エキソン２によってコードされるペプチドのサイズは、スプライシングのパターンおよびそのｍＲＮＡが由来するウイルスの型の両方に依存する。ｅｎｖについての開始メチオニンは、全てのエキソン２の検出される形態で存在し、そしてそのオープンリーディングフレームは、特徴付けられた全てのスプライス部位をとおって開いている。
【０２１４】
エキソン３配列は、第２のＬＴＲの前にある約９０個のヌクレオチド（原型配列Ｙ１７８３２の８８１７位で、図２２を参照のこと）で始まり、そしてＬＴＲ内に含まれるポリアデニル化部位に続く。検出される全てのスプライス形態は、８８１６位と８８１７位との間のスプライス部位ＸＩＩＩを使用する（図２２）。第２の潜在的なスプライス部位コンセンサス部位は、８８２４位と８８２５位との間に位置する（図２２、潜在的なスプライス部位Ｂ）が、分析されたｃＤＮＡクローンのいずれにおいても観察されなかった（すなわち、それは、低頻度で使用され得る）。このスプライス部位はまた、ＰＣＡＶ  ｔａｔまたはｔａｘ等価物を生成するために使用され得る（以下を参照のこと）。このエキソンにおいて、３つのリーディングフレーム全てが開放されている。フレーム１がエキソン２の配列を有するフレームにある場合、フレームＩは、８８７１位（図２２）で終わり、そして１８個のアミノをこのコードされたポリペプチドに添加する。このリーディングフレームは、スプライス部位ＩＸにおけるエキソン２が、ＰＣＡＶｒｅｖポリペプチドをコードするようにスプライス部位ＩＸがスプライス部位ＸＩＩＩでエキソン３に連結される、前もって特徴付けられたスプライス形態（ｃＯＲＦと呼ばれる）で使用される。エキソン２を有するフレームにある場合、フレーム２は、８９９５位（図９）で終わり、そして５９個のアミノ酸をコードされたポリペプチドに添加する。このフレームは、以下に記載されるＰＣＡＶｔａｔ／ｔａｘ等価物をコードする。エキソン３における第３のフレームは、ＰＣＡＶ  ｅｎｖのＣ末端に対応し、そして図２２における整列内の８９５４位で終わる。
【０２１５】
このスプライシングのパターンおよびいずれのスプライシング部位が利用されるかに依存する複数の産物をコードする能力は、一般的にＨＩＶおよびＨＴＬＶのスプライシングパターンに類似する。これは、ＰＣＡＶがレトロウイルスのレンチウイルス型に属することを示唆する。全ての可能なスプライス改変体は、配列番号１８〜４３（コンセンサス配列）として同定され、そして表１において記載される。
【０２１６】
（ｔａｔまたはｔａｘに類似のポリペプチドの同定）
レンチウイルスの明確な特徴は、それらがウイルスＬＴＲプロモーターからの転写を活性化し得るポリペプチドをコードすることである。ＨＩＶのｔａｔポリペプチドは、これらのアクチベーターの最も理解される例である。ｔａｔ遺伝子は、ＨＩＶにおけるｒｅｖ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子と物理的に重複し、そしてｅｎｖ領域にわたるＨＩＶのｍＲＮＡの変更スプライシングを介して作られる。Ｔａｔポリペプチドは、ＴＡＲと呼ばれる特定部位でＨＩＶのｍＲＮＡの５’末端に結合し、そしてＨＩＶに特定の活性化を提供する。
【０２１７】
全長ＨＥＲＶ−ＫのｍＲＮＡは、２度スプライスされ得る（１度は、ｇａｇ−ｐｒｔ−ｐｏｌを除去するためであり、１度は、大部分のｅｎｖ遺伝子を除去するために）（図３）。二重にスプライシングされるＲＮＡによってコードされるポリペプチドが同定され、そして「ｃＯＲＦ」と呼ばれる。このポリペプチドは、ＨＩＶｒｅｖと類似の活性を有すると考えられるが、ｔａｔポリペプチドは、ＨＥＲＶ−Ｋファミリーのメンバーについて以前に同定されていない。潜在的なｔａｔホモログをコードするスプライシングＰＣＡＶのｍＲＮＡが、これまでに同定されてきた。
【０２１８】
ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡにおける複数の変更スプライシング部位が同定されてきた（図４および５）。これらは、ｅｎｖ領域における最後のエキソンが、３つのリーディングフレーム全てにおいて使用され得ることを示す。フレーム１および２は、それぞれ、ｅｎｖおよびｃＯＲＦをコードするが、第３のフレームは、３つのうちの最長のオープンリーディングフレームを含む。いくつかの変更ｍＲＮＡは、第１のコードエキソンとこのリーディングフレームを結合させる。
【０２１９】
機能的な発現アッセイは、最後のｅｎｖエキソンにおける第３のリーディングフレームが、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡの転写を活性化する能力を有するポリペプチドをコードするか否かを決定するために設計された。このアッセイの第１成分は、ＧＦＰ発現を駆動させるＰＣＡＶ  ＬＴＲ（配列番号４５）を有するアデノウイルスベクターである（図６）。種々のヒト細胞株にこのウイルスで感染させ、そして蛍光を、蛍光顕微鏡またはＦＡＣＳのいずれかによって測定した。ポジティブコントロールとして、ＧＦＰ発現がＥＦαプロモーターによって駆動されるベクターを使用した。これは、全ての真核生物細胞において活性であるべきである。
【０２２０】
このＬＴＲからのＧＦＰ発現は、卵巣癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞および肝臓癌細胞においては最小であった。それはまた、２９３細胞（不死化腎臓細胞株）および初代前立腺上皮細胞においても最小であった。ＧＦＰは、種々の前立腺癌細胞株（ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＭＤＡ２Ｂ  ＰＣＡ、ＤＵ１４５）において容易に検出された。代表的なデータが、図７において示される。ＧＦＰ発現パターンは、正確に患者サンプルからのゲノム結果とマッチする。これらのデータは、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡ  ＬＴＲから駆動される発現が、前立腺癌についてのマーカーであることを示す。
【０２２１】
ＬＴＲからのＧＦＰ発現が、初代前立腺細胞においてサイレントであり、そして前立腺癌において活性であることが明白であったので、ｅｎｖ領域からのポリペプチドを、初代前立腺細胞における発現を活性化する能力について試験した。図５において示されるコード配列が発現カセット中に挿入され、そしてこれらは、アデノウイルスベクターに組み込まれた。第１のコードエキソンは、ｅｎｖ産物、ｒｅｖ産物および５個のＰＣＡＰ産物と共通である。このエキソンは、核局在シグナル（ＮＬＳ）としても機能するＲＮＡ結合ドメイン、ポリペプチド二量化領域、および高度に疎水性の配列を含む。ｃＯＲＦポリペプチドは、末端エキソンにおける非常に短い領域に融合するこれらのドメインの３つ全て含む（図４）。ＰＣＡＰ１転写物は、正常部位の５７塩基上流にある変更５’スプライス部位を使用するポリペプチドをコードし、そしてｃＯＲＦからの疎水性ドメインを欠く。ＰＣＡＰ２は、３つのドメイン全てを破壊するが、最後のエキソンにおいてｅｎｖ  ＡＴＧが第３のフレームと連結するＩ型ＨＥＲＶ−Ｋ欠失に由来する。ＰＣＡＰ３は、ＰＣＡＰ２と類似であるが、欠失の代わりに変更スプライシングが産物を作る異なるウイルスに基づく。ＰＣＡＰ４は、正常なｃＯＲＦ部位の５２塩基上流にある潜在的な５’スプライス部位が、ｃＯＲＦにおいて使用される３’スプライス部位に連結されるゲノム配列に基づき、そしてこれは、最後のエキソンにおいて第３のコードフレームと融合するＲＮＡ結合ドメインおよび二量化領域を含む。別の実験において、３’スプライス部位は、ｃＯＲＦ部位の７塩基下流に存在することが見出された。この部位は、ｃＯＲＦ５’スプライス部位およびこの部位から５７塩基上流にある部位にマッチした。この上流部位を有する産物は、ＰＣＡＰ４ａと呼ばれ、そしてＰＣＡＰ４と同じ構造を有するが、４個のアミノ酸が欠けている。変更に対して曲げられたｃＯＲＦ５’スプライス部位は、ＰＣＡＰ５と呼ばれ、そして第３のコードフレームに対して曲げられた３個のドメインを有する。図５における標識「ｓａｇ」は、「スプライスＡ」産物に対応する（以下参照のこと）。
【０２２２】
ｃＯＲＦまたは５個のＰＣＡＰ産物をコードするベクター（図８）は、ＧＦＰベクターにより初代前立腺上皮細胞に共感染させられた。代表的なＦＡＣＳデータは、図９において示される。３個のＰＣＡＰ産物（すなわち、ＰＣＡＰ４、ＰＣＡＰ４ａおよびＰＣＡＰ５）は、発現を活性化し得る一方で、ＰＣＡＰ１、ＰＣＡＰ２およびＰＣＡＰ３ならびにｃＯＲＦは全て、発現を活性化しなかった。ＰＣＡＰ４ａは、このアッセイにおいて、最大活性を示した。
【０２２３】
ＰＣＡＰ４産物および非活性なＰＣＡＰ産物の相互作用が、細胞をＧＦＰベクター、ＰＣＡＰ４ベクター、および非活性な産物をコードする過剰なベクターで感染することによって試験した。ＰＣＡＰ１、ＰＣＡＰ２およびＰＣＡＰ３ならびにｃＯＲＦは全てＰＣＡＰ４の活性を抑制し得、ｃＯＲＦは、最も強い優位なネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）であった。
【０２２４】
これらのデータは、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡが、ＲＮＡ結合ドメイン（ＮＬＳ）、ポリペプチド二量化領域および第３のリーディングフレームを含むｔａｔホモログをコードする。このポリペプチド産物を作るヌクレオチド配列は、１９８６以来公知であったが、変更スプライシングを介するその機能的な連結は、以前に報告されていなかった。
【０２２５】
ＨＩＶにおいて、ｔａｔポリペプチドのＲＮＡリガンドは、ＴＡＲである。ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡのＬＴＲにおける潜在性ＴＡＲ部位が、調査されている（図１０）。ＬＴＲにおける欠失は、Ｒでの領域が発現に対してとても強い影響を有することを示し（図１１）、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡの５’末端は規定ＴＡＴＡ配列の３０塩基下流を脱落すると推定している（図１２）。従って、変異体ＬＴＲ５７０および変異体ＬＴＲ６４１（図１０）における欠失は、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡの５’末端に位置し、そしてこれらの効果は、ＴＡＲでの効果と一致する。さらに、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡ（配列番号１４）の最初の１５０ヌクレオチドは、ＨＩＶ  ＴＡＲのように、高度に安定した二次構造（図１３）を有するＲＮＡを形成をし得る。
【０２２６】
しかし、他の研究では、ＰＣＡＶ−ｍＲＮＡの５’末端がさらに下流であることを示唆する。図２３は、５’末端をマップするために使用されるＲＴ−ＰＣＲスキャニングアッセイの結果を示す。５’ＬＴＲのｃＤＮＡを、プロウイルスゲノム（配列番号５３）における９９７〜９７２を占めるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、全Ｔｅｒａｌ  ＲＮＡをプライムすることにより調製した。次いで、このｃＤＮＡを分離し、そして、おそらく５’末端を含むように設計されたプライマーセット由来のセンスプライマーと共に、９６８〜９５０（配列番号５４）由来のアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ分析で電気泳動した：１）５７１＜配列番号５５＞、２）６００＜配列番号５６＞、３）６２６＜配列番号５７＞、４）６６０＜配列番号５８＞、５）７１２＜配列番号５９＞。１μｇのゲノムＨｅＬａ  ＤＮＡでの二重のＰＣＲ反応をポジティブコントロールとして使用し、そしてこれらの反応は、全てのプライマー対が有効であったことを示した。ｃＤＮＡでプライムした反応は、プライマー６００およびプライマー６２６との間で著名な差異を示し、それは、５’末端がプロウイルスゲノムにおいて、６２６位に密接に位置することを示唆している。
【０２２７】
この結果を、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを用いて確認した（図２４）。プロウイルスゲノムにおいて、塩基（２４Ｂ）５０９〜７３５および塩基（２４Ｃ）６００〜７３５を含む標識アンチセンスＲＮＡプローブを、Ｔｅｒａｌ細胞由来の全ＲＮＡとハイブリダイズし、標準的な条件下でＲＮａｓｅを用いて消化した。プロセシングおよび尿素含有ＰＡＧＥによる検出後、両プローブは１００塩基の生成物を与えた。これらの二つの結果は一致し、そして、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＲＮＡの５’末端は、プロウイルスゲノムにおいて約６３５塩基（すなわち、ＴＡＴＡ依存性遺伝子にとって通常３０ｂｐというよりむしろ、ＴＡＴＡシグナルの約１００ｂｐ下流）であることを示す。
【０２２８】
これらの二つの実験は、初期のデータを作成するために使用された欠失は、プロモーター配列および転写された配列の欠失を生じ得ることを示唆する。
【０２２９】
不一致を解決するために、予測されるＴＡＲ構造（図１３）のステム配列およびループ配列を、ＬＴＲ６０で欠失した。ＰＣＡＶが転写のｔａｔ／ＴＡＲシステムを使用する場合、これらの欠失は、翻訳を大きく縮小する。ステムおよびループのそれぞれの欠失（図２５）を、各ＬＴＲ欠失変異体を動因するＧＦＰを有するＥ１欠失アデノウイルスベクターを用いて試験した。ＰＣ−３細胞を、５０の感染多重度（ｍｏｉ）で、各ベクターを用いて感染し、そして、３日後、蛍光をＦＡＣＳにより測定した（図２６）。全長および全欠失は、類似のＧＦＰ発現を示した。ＰｒＥＣ細胞での同時感染アッセイにおいて、各変異体ＬＴＲがＰＣＡＰ４によって誘発される能力をまた、試験し（図２６）、そして、再度、全ＬＴＲを同じ範囲まで誘発した。
【０２３０】
従って、これらのデータは、ステム領域およびループ領域がＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲ−駆動発現に関与しないことを示し、このことは、ＰＣＡＶが、レンチウイルス様ｔａｔ／ＴＡＲ系を用いて制御されないことを示唆している。ウイルス発現に対して感染細胞を活性化するために、複合レチノウイルスで使用される別のメカニズムは、ｔａｘ型であり、ＨＴＬＶＩおよびＨＴＬＶＩＩにより使用される。Ｔａｘは、感染Ｔ細胞において多数のレベルで作用する（２０２）。いくつかの転写因子およびコアクチベーターに結合することによって、これは、ＨＴＬＶの転写をアップレギュレートし、そしてＣＤＫ４／６インヒビターに結合することによって、細胞周期をデレギュレートする。この組み合わせは、ウイルスが活性化される感染細胞の異常な分化を導き、最終的に感染した個体に、成体Ｔ細胞白血病を導入する手段であると考えられている。ｔａｘ型活性化の特徴の一つは、ＨＩＶ  ＴＡＲに対する高い特異性のｔａｔに対して、多数のプロモーターがｔａｘに反応することである。
【０２３１】
ＰＣＡＰ４は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ＬＴＲではなく、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲ（ＬＴＲ６０）を活性化する（図２７）。驚くことに、ＰＣＡＰ４はまた、ＨＩＶ  ＬＴＲからの発現を誘導することが発見された（図２８）。ＨＩＶ  ＬＴＲ駆動ＧＦＰ、アデノウイルスベクターで感染させたＰｒＥＣ細胞において、ＧＦＰの発現は、ＰＣＡＰ４を発現するベクターで共感染させることにより、誘導され（１０倍）、そして、ＨＩＶ  ＬＴＲ発現は、ｔａｔベクターで同時感染することにより、とても強く活性化され（１００倍）、一方、ｌａｃＺベクターでの同時感染は、効果を有さなかった。さらにＡ５４９細胞での実験において、伸長因子１Ａプロモーター（ＥＦ１Ａ）はまた、誘導されることが発見された（図２９Ａ）が、ＣＭＶプロモータ−では発見されなかった（図２９Ｂ）。
【０２３２】
別個の実験において、主なＰｒＥＣ継代（老化をアプローチする）は、古い型のＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲ（‘ＭＤＡＬＴＲ’配列番号７７）からＧＦＰを発現するアデノウイルスベクター、および約２０のｍｏｉにおいてＰＣＡＰ３またはＰＣＡＰ４を発現する第二ベクターとを同時感染した。３日後、蛍光強度をＦＡＣｓにより測定し、ＰＣＡＰ３およびＰＣＡＰ４による活性を認めた（図４３）。しかしながら、ＬＴＲ６０およびＰＣＡＰ３を用いた類似の実験においては、活性化が無かった。
【０２３３】
従って、本発明のＰＣＡＰタンパク質は、ｔａｔよりもｔａｘにより類似してると考えられるが、これらの活性の正確なメカニズムは、本発明の基本的な実施では重要でない。
【０２３４】
（ＰＣＡＰ２）
ＰＣＡＶのｅｎｖ領域内の最終エキソン内において、リーディングフレーム１およびリーディングフレーム２は、それぞれｅｎｖおよびｃＯＲＦをコードする（図４および５）。配列番号１１、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３１は、ＰＣＡＰ２であり、それは、同一の５’領域および開始コドンをｅｎｖとして共有するが、１型ウイルスで発見された欠失は、下流３’スプライス部位に連結する５’スプライス部位を誘導する（図４）。
【０２３５】
従って、ＰＣＡＰ２をコードする配列の大部分は、スプライス後に位置され、３’ＬＴＲを含むエキソン内である。＋２リーディングフレームは、ＨＥＲＶ−Ｋでの公知の機能を有さないが、前立腺癌から調製されたｃＤＮＡは、ＰＣＡＰ２をコードする転写物を含有した。
【０２３６】
種々の整列されたＨＥＲＶ−Ｋゲノムの検査は、ＰＣＡＰ２が元のタンパク質の変異形態であることを示唆する。従って、このタンパク質は、元の容量において機能がありそうもないが、癌遺伝子活性は、機能ドメインの保持力を通じて生じ得た。フラグメントによる活性の保持力は、ｔａｔというよりむしろｔａｘに一致する別な特性である。
【０２３７】
（ＰＣＡＰ２細胞成分の局在）
ＰＣＡＰ２の細胞成分の局在を試験するために（その役割をより理解するために）、Ｃ末端Ｖ５タグ（配列番号６０）を用いてＰＣＡＰ２を発現するアデノウイルスを、始原前立腺上皮細胞に感染に使用した。このタンパク質は、高度に発現しなかったが、抗Ｖ５を用いて、より広汎的に、全ての細胞にわたる核小体内を明らかにした（図３０）。この細胞内に位置する小タンパク質の濃度は、核内にあるものと特に相互作用することを示す。
【０２３８】
これらの結果は、ＰＣＡＰ２におけるＮＬＳモチーフの存在と一致する。
【０２３９】
（ＰＣＡＰ２および前立腺細胞増殖）
ＰＷＰＥ１細胞を、ヒトパピローマウイルス１８（２０３）を用いて正常前立腺内皮細胞を不朽化することによって、作製した。この細胞は，ヌードマウスにおいては非腫瘍形成性であり、そして、正常前立腺内皮細胞のマーカーおよび増殖特性を有する。
【０２４０】
ＥＦ１ＡカセットからＰＣＡＰ２を発現するプラスミドを、プロマイシン選択マーカーを用いてＰＷＰＥ１へコトランスフェクトした。個々の耐性コロニーを拡大し、全ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲの分析に基づいて陽性クローンを拾った。増殖特性を評価するために、親細胞、ＤＵ１４５前立腺癌細胞、または選択されたクローンを、マトリゲルプラス完全ケラチノサイト無血清培地（完全ＫＳＦＭは、ウシ下垂体抽出物およびＥＧＦ補給を含む培地である）へプレーティングした。プレーティングされた細胞を、図３１に示す。
【０２４１】
正常前立腺内皮細胞およびＲＷＰＥ１細胞は、マトリゲルへのプレーティングの際に、互いに向かって移動し、そして、これらの凝集物は、１週間にわたり、腺を暗示する中空構造を形成した。対照して、ＤＵ１４５癌細胞は、明白な移動も分化もなく、中実コアコロニーを播種した。試験した細胞株において、ＧＦＰ株の両方は、親ＰＷＰＥ１に似ており、このことは、ベクターの導入選択過程およびこの培養条件は、この細胞を変化させないことを示す。ＰＣＡＰ１を発現する細胞はまた、ＰＷＰＥ１と類似に機能した。ｃＯＲＦを発現するクローンは、初めはＲＷＰＥ１のように凝集したが、次いで、この構造は溶解し、そしてこの細胞はさらなるコロニーの形態をとった。三つの独立したＰＣＡＰ２コロニーは、凝集しなかったが、その代わりに、ＤＵ１４５癌細胞のようなコロニーを播種した。これらのデータは、ＰＣＡＰ２が、正常前立腺細胞の増殖および分化を妨げることを示唆する。
【０２４２】
同一の細胞株を用いて、ＲＷＰＥ１の足場独立性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）増殖に対するＰＣＡＰ２の効果を試験した。ＲＷＰＥ１細胞は、０．３５％軟寒天で増殖しないが、これらは、より低い寒天濃度（例えば、０．３％）で増殖し、各型の１，０００細胞を、完全ＫＳＦＭプラス軟寒天（０．３５％）へ播種した。図３２へ示すように、ＰＣＡＰ２を発現する細胞は、ポジティブコントロールＰＣ−３細胞と同じような範囲で、軟寒天内で増殖した。
【０２４３】
（腫瘍組織および形質転換細胞株におけるＰＣＡＰ２の発現）
ＰＣＡＰ２発現は、正常非形質転換細胞には関連していないが、各種の腫瘍組織および形質転換細胞株に関連することが発見されている（２０４）。特に、発現は、乳癌細胞株および乳癌患者組織において認められている。
【０２４４】
参考文献２０４に記載されるように、組織または細胞株から抽出されたＲＮＡは、確立された細胞株、腫瘍生検、白血病および正常個体由来のリンパ球、ならびに正常非形質転換細胞のパネルで、ＲＴ−ＰＣＲによって分析されている。図３３は、ＰＣＡＰ２が乳癌およびセミノーマ生検、および形質転換Ｂ細胞およびＴｅｒａ−１奇形癌細胞において発現されることを示す。発現は、形質転換細胞株（ｎ＝１５）の＞９０％で認められた。ＰＣＡＰ２は、サンプルの＞４５％で検出され得たが、腫瘍型に共通して一様には分布されていない。これは、乳癌細胞（５２％；ｎ＝２１）において最も頻繁に認められるが、腫瘍原基細胞（３７％；ｎ＝８）および白血病血リンパ球（３３％；ｎ＝６）ではあまり頻繁に認められなかった。二つの卵巣癌は、ネガティブと試験された。同時に、健康な組織（ｎ＝１４；リンパ球、線維芽細胞、腸、胎盤および胃）は、ＰＣＡＰ２を発現していなかった。野生型ｐ５３を欠失する不死化非形質転換ヒト０４１線維芽細胞およびこれらの１７５Ｈ形質導入誘導体がポジティブと同様に、正常な複相体ヒト線維芽細胞ＫＨ５１０９およびｐ５３腫瘍サプレッサの優性ネガティブ変異体１７５Ｈを発現するように設計された非形質転換誘導体もまた、ポジティブと試験されなかった。従って、ＰＣＡＰ２発現は、形質転換と密接に相関する。
【０２４５】
図４１におけるＲＴ−ＰＣＲの結果は、さらに、乳房癌のＰＣＡＰ２発現の証拠を与える。ＲＮＡを調製し、腫瘍組織および腫瘍周囲の正常組織において、レーザー捕獲顕微鏡を用いて、七つの乳房癌生検サンプルから増幅した。ｃＤＮＡをｄＴプライマーおよびＰＣＡＰ２で調製するか、または、ｇｕｓＢ配列を３０サイクル（ｇｕｓＢ)もしくは３５サイクル（ＰＣＡＰ２）のＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＡＰ２は、乳房癌組織（４１Ａ）で認められるが、正常乳房組織（４１Ｂ）には認められない。
【０２４６】
（ＰＣＡＰ３）
配列番号１２および配列番号３６は、ＰＣＡＰ３であり、これは、ｅｎｖとして同一の５’領域および開始コドンを共有するが、スプライシングは、ｅｎｖをコードする配列で除去し、そして以下のｅｎｖのリーディングフレームに対して＋２のリーディングフレームへシフトする。以下：
【０２４７】
【化１】
2005512525.tif 000002
従って、ＰＣＡＰ３は、ＰＣＡＰ２に類似であるが、ＰＣＡＰ３に対して＋２のリーディングフレームへのシフトは、ＰＣＡＰ２に対する１型ゲノムで認められた大きな欠失というよりむしろ、２型ゲノムにおける小さな欠失によって引き起こされる。
【０２４８】
例えば、７９％の患者サンプルにおいて２倍以上、そして５３％の患者サンプルにおいて５倍以上の、前立腺癌ｍＲＮＡが調製される場合、前立腺癌細胞株ＭＤＡ  Ｐｃａ−２ｂから調製されるｃＤＮＡは、ＰＣＡＰ３転写物を含有した。これらの図は、ＰＣＡＰ３が多数の前立腺癌に含有されるという見解を支持する。さらに、この図は、癌発現とＰＣＡＰ３発現との間で、全体の関連性を示さない。患者がＧｌｅａｓｏｎグレードに従ってグループ化される場合、グレード３の腫瘍は、ＰＣＡＰ３の高いアップレギュレーションを示すが、さらに発達したグレード４の腫瘍は、ＰＣＡＰ３抑制を示すと思われる（図１８）。同様なパターンは、ｇａｇ発現で認められ（図４２）、ＰＣＡＶ発現は、早期前立腺癌に関与することを示唆している。
【０２４９】
ＰＣＡＰ３の細胞成分の局限化は、ＰＣＡＰ２に対して上記に記載されるのと同じ方法で試験された。このタンパク質は、相対的に安定であり、核質に認められた。この細胞位置におけるこの小タンパク質の濃度は、核内の標的と特異的な相互作用があることを示す。
【０２５０】
（ＰＣＡＰ４）
上記に言及されるように、ＰＣＡＰ４は、ＰＣＡＶ  ＬＴＲからの発現を活性化し、また、ＨＩＶ  ＬＴＲからの発現を活性化する。ＰＣＡＰ４は、正常ｃＯＲＦスプライス部位の５２塩基上流の５’スプライス部位を含む、スプライシング後に生成する。このスプライシングは、最終エキソンにおいて、３番目のリーディングフレームへのシフトの原因となる。
【０２５１】
ＰＣＡＰ２およびＰＣＡＰ３に対して上記に記載されるように、ＰＣＡＰ４の染色は、核小体の位置を示す（図３４）。核の位置を保持することにおいて、ＰＣＡＰ４は、細胞分裂における役割を示唆する他の活性を示す。一つの実験において、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＧＦＰ、Ｖ１２活性化変異を有するｒａｓ、ｃＯＲＦ、ＰＣＡＰ１、ＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ４またはＰＣＡＰ４ａ（ＰＣＡＰ４のスプライシング改変体）をコードする発現プラスミドを用いて、一過性にトランスフェクトした。次いで、これらの細胞を３週間培養し、そして、細胞増殖に対する全体的な効果を、細胞をメチレンブルーで染色することにより測定した（図３５）。比較目的のためにＧＦＰを用いて、ＰＣＡＰ４および４ａを、活性化ｒａｓと同じ方法で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を誘発したが、他の遺伝子では、効果が無いかもしくは細胞増殖を阻害したかのいずれかであった。
【０２５２】
さらに、この発見を調査するために、外部遺伝子である、ＰＣＡＰ４もｃＯＲＦも発現しない安定なＮＩＨ３Ｔ３細胞株をｐＣＥＰ４（ハイグロマイシンマーカーを有するプラスミド）に遺伝子を挿入することにより、作製した（図３６）。各々の安定な細胞プールを回収し、計数し、そして二重のウェルで、４日間増殖させた。一つのウェルを染色し、そして写真を撮り、また、もう一つのウェルをトリプシンで処理し、そして計数した（図３７）。再び、ＰＣＡＰ４は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を促進し、そしてｃＯＲＦは、わずかに抑制された増殖を有し得る。ＰＣＡＰ３を用いた類似の実験は、拡張しない細胞集団を与えたが、代わりに、予定外の高い死亡率および高い分裂率が現れた。
【０２５３】
ＰＣＡＰ２のように、ＰＣＡＰ４は、ＤＵ１４５癌細胞のように作用するＲＷＰＥ１細胞を作製し得た（図３１）。
【０２５４】
（ＰＣＡＰタンパク質および老化）
上記のデータは、ＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ３およびＰＣＡＰ４（これらの全てが、エキソン３の第３番目のリーディングフレームを利用する）が、不死化細胞株（ほとんどの正常ヒト前立腺内皮細胞に含む）の増殖特性に強い効果を有することを示す。この癌遺伝子の潜在能は、正常組織ではなく腫瘍組織における発現と結合し、癌との明らかな関連を示唆する。
【０２５５】
前立腺癌は、管腔内皮層に生じると考えられているが、正常管腔内皮細胞は、とてもわずかの細胞分裂しか受けない。対照的に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＲＷＰＥ１細胞は、不死である。ＰＣＡＶは、早期癌（上記を参照のこと）に含まれると思われるので、始原前立腺内皮細胞（ＰｒＥＣ）（通常は急速に老化する）に対するＰＣＡＰポリペプチドの効果を試験した。
【０２５６】
始原ヒト内皮細胞は、かなり限定された分裂潜在能を有する。特定数の分裂後、この細胞は、老化に入る。老化は、休止（ポジティブな増殖シグナルが取り消される場合、または阻害シグナル、例えば細胞と細胞との接触が受け取られる場合、不死化細胞またはプレ老化細胞は、休止に入るが、増殖因子を付加することにより、もしくは低濃度で細胞を再び播種することにより、再度分裂を誘導され得る）とは異なり、そして分裂においての永久の停止であるが、増殖培地を定期的に新しくする場合、老化細胞は、分裂しないで数ヶ月間生存し得る。
【０２５７】
特定の遺伝子は、特にウイルス性の癌遺伝子（例えば、ＳＶ４０Ｔ抗原）は、細胞に老化シグナルを無視させる。Ｔ抗原は、「複製クリーゼ」と称される拡大バリア（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｂａｒｒｉｅｒ）に対して、分裂を続けるために、細胞を刺激する。二つの過程は、クリーゼで生じる；細胞は分裂し続けるが、細胞は、平行して、累積された遺伝子損傷によってとても高い割合で死ぬ。細胞死が分裂を超える場合、実質的に、全ての細胞は、短期間で死ぬ。クリーゼ後に増殖する珍しい細胞は、不死化細胞株および産出細胞株になる。代表的に、細胞株は、明らかな遺伝子再配列を有す：これらは、しばしば四倍体に終結し、たびたび非相互性の染色体転座があり、そして、多くの染色体が多数の位置で欠失および増幅を有する（２０５、２０６、２０７）。
【０２５８】
前立腺癌は、高いゲノム不安定性（老化後の複製によって、引き起こされ得た）を表すので、クリーゼを導く遺伝子産物は、特に興味がもたれる。最近の理論では、前立腺癌は前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）と称される病変から生じると考える（２０８）。ＰＩＮの遺伝子分析は、多くの前立腺癌の特有の遺伝子再配列が、この段階で既に生じていることを示す（２０９）。従って、このウイルスが、早期前立腺癌で役割を果たし得るかどうかを決定するために、ＰＩＮ細胞をＰＣＡＶの発現について試験した。ＰＣＡＶｇａｇが多く発現されることを発見し、このことは、前立腺癌と関連する遺伝子変化が生じる場合、ＰＣＡＶがこの時期に高く発現することを示している。ＰＣＡＰ２  およびＰＣＡＰ３は、前立腺腫瘍において発現されることが認められているので、老化後にＰｒＥＣにおける細胞分裂の誘導を受けやすい場合、これらの役割を、検査することによって調査した。
【０２５９】
ＰＣＡＰ発現プラスミドを用いてトランスフェクション後、薬剤耐性ＰｒＥＣを選択するための最初の試みは、失敗した。ＧＦＰ、ＰＣＡＰ２またはＰＣＡＰ３を発現するアデノウイルスベクターで感染後、ＰｒＥＣの分析は、感染４日目にＰＣＡＰ細胞において、多くの細胞死を示した。ニックＤＮＡで核をマークするために、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ末端標識（ＴＵＮＥＬ）における用量依存性の増加は、細胞がアポトーシスを受けていることを確証した（図３８）。このアポトーシスは、薬剤耐性ＰｒＥＣを単離する失敗を明らかにし得、そして、不平衡の増殖シグナルがアポトーシス誘導因子である場合に、ＰＣＡＰ３による細胞分裂のしくみの進入機序と一致する。
【０２６０】
これらの結果は、ＰｒＥＣにおけるＰＣＡＰ発現の効果を評価し得る前に、アポトーシスをブロックしなければならないことを示唆した。従って、ＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ３およびＰＣＡＰ４をコードするプラスミド＋ネオマイシンマーカーは、アポトーシスをブロックするために、ｂｃｌ-２またはｂｃｌ-ＸＬのいずれかをコードする発現プラスミドで同時感染した。コントロールとして、細胞を、単独でタンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。選択下で２週後、ｂｃｌ-２ディッシュおよびｂｃｌ-ＸＬディッシュ全てが、ディッシュの分画内に十分に増殖した多数の耐性細胞を有した。これらの細胞を分割した場合、これらはさらに分裂しなかったが、生存可能であり、そして老化親細胞に似ていた。対照して、抗アポトーシスタンパク質存在下でＰＣＡＰ２、ＰＣＡＰ３またはＰＣＡＰ４を発現した細胞は、開始プレートで十分に分裂した小細胞、および分割する場合に分裂し続ける小細胞を作製するコロニーを産出した。
【０２６１】
上記の薬剤選択に平行して、細胞の増殖潜在能を評価した。親ＰｒＥＣは、老化に達する前に倍増する七つの集団を検討した。対照して、抗アポトーシス遺伝子とＰＣＡＰとで同時感染させた薬剤耐性細胞は、増殖が終わる前に、老化ポイントに及び十分に拡大した。
【０２６２】
【化２】
2005512525.tif 000003
ＰＣＡＰ４でトランスフェクトした細胞は、約２週間の間、早く増殖した。次いで、細胞の拡大は遅くなり、そして最終的には終了した。同時に、浮遊細胞の数および死細胞の数は増殖し、そして、細胞の出現は変化した。これらは、もはや内皮細胞の規則的な「玉石」の出現ではないが、代りにいくつかの形態を有し、そして多くの多核性細胞が存在した。２週後、細胞は死んだが、ｌａｃＺまたはｌａｃＺ＋ｂｃｌ−２でトランスフェクトした細胞は、１ヵ月後もまだ生存していた。
【０２６３】
ＰＣＡＰ２細胞およびＰＣＡＰ３細胞は、同様に作用した。図３９は、培養は、補充前立腺内皮増殖培地（ＰｒＥＭ）を、一週間に２回取り換えて、維持したことを示す（トランスフェクトされた細胞はＧ４１８を含む）。図３９Ｂは、コントロール細胞と比較して拡大が終了している段階においての、ＰＣＡＰ２＋ｂｃｌ−ＸＬ細胞を示す。老化ＰｒＥＣ（図３９Ａ）細胞およびｌａｃＺをトランスフェクトした細胞（図３９Ｃ）は、規則的な出現であり、そして各細胞内に単一の核を中心に有するが、ＰＣＡＰ２細胞は、不規則の形をとり、そして多くは多数の核を有する。
【０２６４】
老化細胞またはクリーゼをアプローチする細胞のいずれも、集団で拡大しない。しかし、これらの間での一つの差異は、クリーゼをアプローチする細胞は、かなりの割合で分裂および染色しているため、細胞分裂は、二つの段階の間で区別し得る。ブロモデオキシウリジンで標識後、１０％のＰｒＥＣがＰＣＡＰ２またはＰＣＡＰ３（＋抗アポトーシスタンパク質）のいずれかでトランスフェクトされた場合、３０％のプレ老化ＰｒＥＣを標識したが、老化のｌａｃＺまたはｃＯＲＦ＋ｂｃｌ−２コントロールを標識したものは一つもない（図４０）。
【０２６５】
これらの結果は、ＰＣＡＰタンパク質が、前立腺内皮細胞において増殖を誘発し得、そして、この増殖が前立腺癌の根本の原因であり得たことを示す。老化以上に細胞を駆動する能力は、ｔａｔよりむしろｔａｘに適合する別の特性である。
【０２６６】
（他のＨＥＲＶ−Ｋウイルス由来のＰＣＡＰ産物）
ヒトゲノムにおいて発見された各種のＨＥＲＶ−Ｋに対して、エキソン３の第３番目のリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列は、配列番号７８〜配列番号２７７として与えられる。他のヌクレオチド配列（ヒトゲノムにおいて天然に発見されたか、または人工的に設計されたかのいずれか）は、コドン縮重に起因して同一のアミノ酸配列をコードし得るが、これらの２００アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２７８〜配列番号４７７として与えられる。アミノ酸配列を、以下に整列させる。：
【０２６７】
【化３】
2005512525.tif 000004
【０２６８】
【化４】
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【０２６９】
【化５】
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【０２７０】
【化６】
2005512525.tif 000007
【０２７１】
【化７】
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【０２７２】
【化８】
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【０２７３】
【化９】
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それぞれの個々の公開または特許出願は、具体的および個別に参考として援用されるかのように、本明細書中にて言及された全ての公開物および特許出願物は、本明細書中で同じ範囲で参考として援用される。
【０２７４】
本発明の好ましい実施形態の前述の説明は、例示ならびに明白な目的および理解に対する実施例によって表されている。これは、明確に開示された形態に対して、徹底的であること、または本発明を限定することを意図しない。これは、本発明（多くの変化および改変が、本発明の意図から離れることなく、作製され得る）の技術の見地において、当業者にとって容易に明らかである。本発明の範囲は、追加の特許請求の範囲およびこれらの同義語によって、定義されることを意図する。
【０２７５】
【表１−１】
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【０２７６】
【表１−２】
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【０２７７】
【表２−１】
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【０２７８】
【表２−２】
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【０２７９】
【数１】
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【０２８０】
【数２】
2005512525.tif 000016
【０２８１】
【数３】
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【０２８２】
【数４】
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【０２８３】
【数５】
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【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】図１は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＣＨ）ポリヌクレオチドの描写を有するヒト内在性レトロウイルスおよびこのレトロウイルスに関連する位置の概略図である。
【図２】図２は、ＨＥＲＶ−Ｋ（ＨＭＬ−２．ＨＯＭ）（「ＥＲＶＫ６」としても公知）ゲノム内のオープンリーディングフレームの概略図である（７）。
【図３】図３は、ＨＥＲＶ−Ｋ  ｍＲＮＡについて先行技術で記載されたスプライシング事象である。
【図４】図４は、ｅｎｖ  ＯＲＦの５’末端およびお３’末端の付近の、同定された複数のスプライス部位を示す。３つのリーディングフレームは、別々に影を付けられている。５つの多重スプライシング産物は、ｅｎｖ  ＯＲＦの下に示され、これはまた、図５において、図４の上において矢印で示されるプライマーから生じるＰＣＲ産物を示すゲルと共に示されている。
【図６】図６は、ｔａｔ活性について試験するための発現アッセイにおいて使用されるアデノウイルスベクターを示す。
【図７】図７は、上記ベクターから駆動されるＧＦＰ発現の結果を示す。
【図８】図８は、ＰＣＡＰポリペプチドの活性を試験するために使用されるベクターを示す。
【図９】図９は、図６のベクターと共に、上記ベクターを使用して得られたＦＡＣＳデータを示す。
【図１０】図１０は、ＰＣＡ−ｍＲＮＡのＬＴＲにおいて作製される欠失を示す。
【図１１】図１１は、上記ＬＴＲから駆動されたＧＦＰ発現を示す。
【図１２】図１２は、ＰＣＡ−ｍＲＮＡの５’末端のＲＮＡマッピングについてのデータを示す。
【図１３】図１３は、配列番号１４の推定二次構造を示す。
【図１４】図１４は、癌細胞株におけるＰＣＡＶ転写物のノーザンブロット分析を示す。左上の矢印は、ゲノムｍＲＮＡ転写物の位置を示す。隣の矢印は、ｅｎｖ転写物の位置を示す。下の２つの矢印は、他のＯＲＦの位置を示す。これらのレーンは、以下の細胞株由来のＲＮＡを含む：（１）Ｔｅｒａ  １；（２）ＤＵ１４５；（３）ＰＣ３；（４）ＭＤＡ  Ｐｃａ−２ｂ；（５）ＬｎＣａＰ。Ｔｅｒａ  １は、奇形癌細胞株であり；他は、前立腺癌細胞株である。
【図１５】図１５は、ＬＴＲの間のスプライス事象を検出するために使用されるＰＣＲストラテジーを例示する。図１５において、横線は、ＨＭＬ−２ゲノムを表し、ゲノムの上の縦線は、スプライス部位であり、そしてゲノムの下の縦線は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのＡＴＧコドンである。順方向（Ｆ）および逆方向（Ｒ）ＰＣＲプライマーのおおよその位置もまた示される。
【図１６】図１６は、上記ストラテジーの結果を示す。
【図１７】図１７は、ＨＭＬ−２におけるスプライシングのパターンを示す。
【図１８】図１８は、エキソン２における様々なスプライス結合部を示す。
【図１９】図１９は、スプライス結合領域におけるエキソン１のアライメントを示す。
【図２０】図２０は、エキソン１．５のアライメントを示す。
【図２１−１】図２１−１は、エキソン２のアライメントを示す。
【図２１−２】図２１−２は、エキソン２のアライメントを示す。
【図２１−３】図２１−３は、エキソン２のアライメントを示す。
【図２２】図２０は、エキソン３のアライメントを示す。全てのアライメント中の数字は、プロトタイプＨＥＲＶ−Ｋ配列のＧｅｎＢａｎｋエントリーＹ１７８３２の位置を表す。
【図２３】図２３は、ＰＣＡＶ  ｍＲＮＡの５’末端をマッピングするために使用されるＲＴ−ＰＣＲ走査アッセイの結果を示す。
【図２４】図２４は、ＲＮａｓｅ保護アッセイの詳細を示す。２つのアンチセンスプローブ（長いプローブ（２４Ｂ）および短いプローブ（２４Ｃ））を使用した。両方のプローブは、２４Ａで示される領域を保護した。２４Ｂにおいて、ＴＡＴＡシグナルの位置に基づいて「通常の」５’末端に基づいて予測されるバンドの位置、および達成される実際のバンドが示される。２４Ｂにおける３つのレーンは、（１）Ｔｅｒａ１；（２）ＲＮＡなし、（３）プローブ、ＲＮａｓｅなしである。２４Ｃにおける２つのレーンは、（１）Ｔｅｒａ１；（２）プローブ、ＲＮＡなしである。
【図２５】図２５は、ｍＲＮＡの５’領域について試験するための、図１３で削除された領域を示す。
【図２６】図２６は、欠失変異体から駆動されたＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図２７】図２７は、ＰＣＡＰ４が、ＨＥＲＶ−Ｋ  ＬＴＲ（「ＬＴＲ６２」）を活性化するが、マウス白血病ウイルスＬＴＲ（「ＭｏＬＴＲ」）を活性化しないことを示す。
【図２８】図２８は、ＰＣＡＰ４が、ＨＩＶ  ＬＴＲを活性化し得ることを示す。
【図２９】図２９Ａは、ＰＣＡＰ４がＥＦ１Ａプロモーターを活性化することを示し、そして図２９Ｂは、ＰＣＡＰ４が、ＣＭＶプロモーターを活性化しないことを示す。
【図３０】図３０は、ＰＣＡＰ２の細胞成分局在化を示す。
【図３１】図３１は、マトリゲルにプレーティングされた種々の細胞を示す。
【図３２】図３２は、軟寒天で培養された細胞を示す。
【図３３】図３３は、種々の細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す（２０４）。レーン１は、２００、３００、４００、および５００ｂｐのマーカーを含む。他のレーンについて、偶数のレーンが、ＲＴを用いて得られ、そして奇数は、ＲＴを用いずに得られる：（２および３）一次ヒトリンパ球；（４および５）形質転換されたＢ細胞；（６および７）Ｔｅｒａ１細胞；（８および９）乳癌生検；（１０および１１）セミノーマ生検；（１２および１３）コントロール。
【図３４】図３４は、ＰＣＡＰ４の細胞成分局在化を示す。
【図３５】図３５は、３週間の培養後、メチレンブルーで染色された細胞を示す。
【図３６】図３６は、空のｐＣＥＰ４ベクターを示す。
【図３７】図３７は、種々のベクターでの形質転換の４日後の増殖後のＮＩＨ３Ｔ３細胞を示す。細胞密度をグラフに示し、これらの細胞自体は、１×および２００×の倍率で示される。
【図３８】図３８は、（Ａ）ＰＣＡＰ２、（Ｂ）ＰＣＡＰ３、または（Ｃ）非感染を発現する細胞のＴＵＮＥＬ分析を示す。
【図３９】図３９は、ＰＣＡＰ２でトランスフェクトしたＰｒＥＣ（図３９Ｂ）およびコントロールＰｒＥＣ（３９ＡおよびＣ）を示す。アスタリスクは、１つより多い核を有する細胞を示す。
【図４０】図４０は、細胞増殖を検出するための、ＰｒＥＣのブロモ−デオキシウリジン標識を示す。
【図４１】図４１は、乳癌組織（４１Ａ）および正常胸部組織（４１Ｂ）のＲＴ−ＰＣＲを示す。ＰＣＡＰ２およびｇｕｓＢ（βグルクロニダーゼ）転写物の位置を示す。
【図４２】図４２は、前立腺癌患者から採取した組織の染色部分に対する抗ｇａｇモノクローナル抗体５Ｇ２を使用する免疫蛍光実験を示す。図４２Ｂは、萎縮組織を示し、図４２Ｃは、グリーソン分類３の癌を示し、そして図４２Ｄは、グリーソン分類４の癌を示す。
【図４３】図４３は、ＭＤＡＬＴＲからのＧＦＰ発現を示すＦＡＣＳスペクトルである。左から右への３つのトレースは、以下である：（１）非感染細胞；（２）ＰＣＡＰ３；（３）ＰＣＡＰ４。
【配列表】
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2005512525.tif 000042
2005512525.tif 000043
【図１】
2005512525.tif 000044
【図２】
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【図３】
2005512525.tif 000046
【図４】
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【図５】
2005512525.tif 000048
【図６】
2005512525.tif 000049
【図７】
2005512525.tif 000050
【図８】
2005512525.tif 000051
【図９】
2005512525.tif 000052
【図１０】
2005512525.tif 000053
【図１１】
2005512525.tif 000054
【図１２】
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【図１３】
2005512525.tif 000056
【図１４】
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【図１５】
2005512525.tif 000058
【図１６】
2005512525.tif 000059
【図１７】
2005512525.tif 000060
【図１８】
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【図１９】
2005512525.tif 000062
【図２０】
2005512525.tif 000063
【図２１−１】
2005512525.tif 000064
【図２１−２】
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【図２１−３】
2005512525.tif 000066
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2005512525.tif 000071
【図２７】
2005512525.tif 000072
【図２８】
2005512525.tif 000073
【図２９】
2005512525.tif 000074
【図３０】
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【図３１】
2005512525.tif 000076
【図３２】
2005512525.tif 000077
【図３３】
2005512525.tif 000078
【図３４】
2005512525.tif 000079
【図３５】
2005512525.tif 000080
【図３６】
2005512525.tif 000081
【図３７】
2005512525.tif 000082
【図３８Ａ】
2005512525.tif 000083
【図３８Ｂ】
2005512525.tif 000084
【図３８Ｃ】
2005512525.tif 000085
【図３９Ａ】
2005512525.tif 000086
【図３９Ｂ】
2005512525.tif 000087
【図３９Ｃ】
2005512525.tif 000088
【図４０】
2005512525.tif 000089
【図４１Ａ】
2005512525.tif 000090
【図４１Ｂ】
2005512525.tif 000091
【図４２Ａ】
2005512525.tif 000092
【図４２Ｂ】
2005512525.tif 000093
【図４２Ｃ】
2005512525.tif 000094
【図４２Ｄ】
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【図４３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月11日(2005.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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