(57)【要約】  プロテイナーゼインヒビター等の準安定タンパク質の変異体のライブラリーを、抗体に結合する野生型能力の具体的な損失についてスクリーニングして、その他では入手できない価値のある薬剤設計情報を提供できる。このアプローチにより、例えば、少なくとも１つのエピトープにおいて１つ以上の突然変異の存在が保存された野生型タンパク質またはその活性断片のアミノ酸配列を有する変異型プロテイナーゼインヒビターが得られ、変異体と抗プロテイナーゼインヒビター抗体との相互作用を変化させる。
2005512559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型プロテイナーゼインヒビターのアミノ酸配列中の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含むような該アミノ酸配列を含む変異型プロテイナーゼインヒビターであって、該突然変異により、該変異型プロテイナーゼインヒビターと抗プロテイナーゼインヒビター抗体との結合が、該野生型プロテイナーゼインヒビターと該抗プロテイナーゼインヒビター抗体との結合と比べた場合変化していることを特徴とする、変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項２】
前記抗プロテイナーゼインヒビター抗体は、前記変異型プロテイナーゼインヒビターの変異したエピトープに対する結合親和性が、該抗プロテイナーゼインヒビター抗体が野生型プロテイナーゼインヒビターに対する結合親和性より低いことを特徴とする、請求項１に記載の変異型プロテイナーゼ。
【請求項３】
前記抗プロテイナーゼインヒビター抗体は、前記野生型プロテイナーゼインヒビターの測定可能な活性に影響を及ぼすものである、請求項１に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項４】
前記測定可能な活性が、前記野生型プロテイナーゼインヒビターの標的プロテイナーゼに対する阻害活性である、請求項３に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項５】
前記抗プロテイナーゼインヒビター抗体は、前記変異型プロテイナーゼインヒビターの変異したエピトープに結合しないものである、請求項１に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項６】
前記変異型プロテイナーゼインヒビターは、野生型プラスミノゲンアクチベーターインヒビター(PAI)の変異体である、請求項１に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項７】
前記変異型PAIは、野生型PAI-1の変異体である、請求項６に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項８】
前記野生型PAI-1のアミノ酸配列が図１に示すものである、請求項７に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項９】
前記抗プロテイナーゼインヒビター抗体は、抗PAIモノクローナル抗体である、請求項８に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１０】
前記抗PAIモノクローナル抗体は、MA-33B8または31C9である、請求項９に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１１】
変異型プロテイナーゼインヒビターのアミノ酸配列が、図１に示すアミノ酸配列の、1、2、13、82、87、88、89、92、95、110、115、127、151、174、196、202、212、218、223、230、241、283、300、305、308、329、331、323、339、351および354番目のアミノ酸残基からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基において置換を含むものである、請求項８に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１２】
前記変異型プロテイナーゼインヒビターが、図１に示すアミノ酸配列の、87、88、89、174、230、232、329および331番目からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基において置換を含む、請求項１１に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１３】
前記変異型プロテイナーゼインヒビターが、図１に示すアミノ酸配列の、87、88、89、174、230、232、329および331からなる群より選択されるアミノ酸残基において置換を含む、請求項１０に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１４】
前記変異体が、87番目のアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１２に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１５】
前記87番目のアミノ酸におけるアミノ酸置換が、アスパラギンからアスパラギン酸への変化である、請求項１４に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１６】
前記変異体が、230番目のアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１２に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１７】
前記230番目のアミノ酸におけるアミノ酸置換が、グリシンからバリンへの変化である、請求項１６に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１８】
前記変異体が、331番目のアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１２に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項１９】
前記331番目のアミノ酸におけるアミノ酸置換が、セリンからアルギニンへの変化である、請求項１８に記載の変異型プロテイナーゼインヒビター。
【請求項２０】
アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１〜１９のいずれか一項の変異型プロテイナーゼインヒビターの断片。
【請求項２１】
アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む請求項１〜１９に記載の変異型プロテイナーゼインヒビターまたは該変異型プロテイナーゼインヒビターの断片をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸配列。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸配列の発現を制御する調節制御配列に作用可能に連結した該核酸配列を含む、核酸構築物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項２４】
請求項２２に記載の核酸構築物で形質転換またはトランスフェクトされた宿主。
【請求項２５】
核酸配列が発現される条件下で、請求項２４に記載の宿主を培養することを含む、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片を生成する方法。
【請求項２６】
(a)化合物を：
(i)アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１〜１９のいずれか一項の変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とインキュベートし；
そしてそれとは別に該化合物を：
(ii)野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とインキュベートすること；
(b)該変異型プロテイナーゼインヒビターまたは該断片、および該野生型プロテイナーゼインヒビターまたは該断片と、該化合物との結合を測定すること；ならびに
(c)該化合物と該変異型プロテイナーゼインヒビターまたは該断片との結合を、該化合物と該野性型プロテイナーゼインヒビターまたは該断片との結合と比較すること、
を含む、プロテイナーゼインヒビターの活性に影響を及ぼす少なくとも１つの化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
(d)前記化合物と前記野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合と比較して、前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とより弱く結合する化合物を選択すること、
をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物の前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合が、該化合物と前記野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合の約95％以下である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物の前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合が、該化合物と前記野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合の約75％以下である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物の前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合が、該化合物と前記野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合の約50％以下である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物の前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合が、該化合物と前記野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合の約24％以下である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物は、前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とは結合しないが、前記野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とは結合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
(a)化合物を：
(i)前記アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１〜１９のいずれか一項の変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とインキュベートし；
そしてそれとは別に該化合物を：
(ii)野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とインキュベートすること；
(b) 該変異型プロテイナーゼインヒビターまたは該断片の標的プロテイナーゼに対する阻害活性および該野生型プロテイナーゼインヒビターの標的プロテイナーゼに対する阻害活性に対する(a)における該化合物の影響を測定すること；ならびに
(c)該変異型プロテイナーゼインヒビターまたは該断片の阻害活性に対する(b)における該化合物の影響を、野生型プロテイナーゼインヒビターまたは該断片の阻害活性に対する該化合物の影響と比較すること、
を含む、プロテイナーゼインヒビターの阻害活性に影響を及ぼす少なくとも１つの化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３４】
(d)前記化合物が前記野生型プロテイナーゼの阻害活性に影響を及ぼす場合に、該野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片の阻害活性に対する影響よりも、(b)における前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片の阻害活性に対する影響が小さい化合物を選択すること、
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片が、前記化合物の不在下で測定した場合には標的プロテイナーゼに対する阻害活性の約5〜100％を保持する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片が、前記化合物の不在下で測定した場合には標的プロテイナーゼに対する阻害活性の少なくとも約25％を保持する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片が、前記化合物の不在下で測定した場合には標的プロテイナーゼに対する阻害活性の少なくとも約50％を保持する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片が、前記化合物の不在下で測定した場合には標的プロテイナーゼに対する阻害活性の少なくとも約75％を保持する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物が、前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片の阻害活性に対して実質的に影響を及ぼさない、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ステップ(b)の測定は、標的プロテイナーゼを、(a)の前記変異型プロテイナーゼインヒビターおよび前記化合物に添加して第１の混合物を作製し、(a)の前記野生型プロテイナーゼインヒビターに添加して第２の混合物を作製し、該第１および第２の混合物をインキュベートすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記(b)の測定は、前記標的プロテイナーゼ活性を測定することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記標的プロテイナーゼ活性の測定は、該標的プロテイナーゼの基質を添加し、該基質の酵素的転換を測定することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記スクリーニングが：
(e)ステップ(a)において化合物を添加しないこと以外は、ステップ(a)〜(d)のセットを並行して行うこと、
を含む対照試験をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
前記(a)における前記変異型プロテイナーゼインヒビターもしくはその断片および前記野生型プロテイナーゼインヒビターもしくはその断片を添加せずに、前記標的プロテイナーゼ活性を測定する対照インキュベーションを行うことをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記(a)における前記変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片、前記野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片、および前記化合物を添加せずに、前記標的プロテイナーゼ活性を測定する対照インキュベーションを行うことをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
(a)化合物を：
(i)変異型準安定タンパク質またはその断片とインキュベートし；
そしてそれとは別に該化合物を：
(ii)野生型準安定タンパク質またはその断片とインキュベートすること；
(b)該変異型準安定タンパク質または該断片および該野生型準安定タンパク質または該断片の測定可能な活性に対する(a)における該化合物の影響を測定すること；ならびに
(c)該変異型準安定タンパク質または該断片の測定可能な活性に対する(b)における該化合物の影響を、該野生型準安定タンパク質または該断片の測定可能な活性に対する該化合物の影響と比較すること、
を含む、準安定タンパク質における少なくとも１つの化合物結合部位をマッピングする方法。
【請求項４７】
(d)前記化合物が前記野生型安定タンパク質の測定可能な活性に影響を及ぼす場合に、該野生型安定タンパク質または該断片の活性に対する影響よりも、前記(b)における前記変異型準安定タンパク質またはその断片の活性に対する影響が少ない化合物を選択すること、
をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記変異型準安定タンパク質またはその断片が、前記化合物の存在下での測定可能な活性の約5〜100％を保持する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記変異型準安定タンパク質またはその断片が、前記化合物の存在下での測定可能な活性の少なくとも約25％を保持する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記変異型準安定タンパク質またはその断片が、前記化合物の存在下での測定可能な活性の少なくとも約50％を保持する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記変異型準安定タンパク質またはその断片が、前記化合物の存在下での測定可能な活性の少なくとも約75％を保持する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記化合物が、前記変異型準安定タンパク質またはその断片の阻害活性に対して実質的に全く影響がない、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記スクリーニングが：
(e)前記ステップ(a)において化合物を添加しないこと以外は、ステップ(a)〜(d)の平行セットを行うこと、
を含む対照試験をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記(a)における前記変異型準安定タンパク質またはその断片および前記野生型準安定タンパク質またはその断片を添加せずに、前記測定可能な活性を測定する対照インキュベーションを行うことをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記(a)における前記変異型準安定タンパク質またはその断片、前記野生型準安定タンパク質またはその断片、および前記化合物を添加せずに、前記測定可能な活性を測定する対照インキュベーションを行うことをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
前記野生型準安定タンパク質またはその断片のアミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を導入することにより、前記変異型準安定タンパク質またはその断片を調製する方法であって、該突然変異は、該変異型準安定タンパク質またはその断片と、該野生型準安定タンパク質またはその断片に結合する抗体との結合を変化させる、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルピン(セリンプロテイナーゼインヒビター)、特にプラスミノゲンアクチベーターインヒビター(PAI)、抗トロンビンIIIおよびα1-抗トリプシン(α1AT)等の阻害セルピンを含む、変異型プロテイナーゼインヒビターおよびその断片に関する。対象とするプロテイナーゼインヒビターは、突然変異によって変異型分子と抗プロテイナーゼインヒビター抗体との結合が、対応する野生型分子と同じ抗体との結合と比べて変化した、少なくとも１つのエピトープを有するアミノ酸配列を含む。本発明はまた、in vivoでのプロテイナーゼインヒビターのレベルの増加に伴う症状を治療するための治療薬としての可能性を持つプロテイナーゼインヒビター不活化剤または化合物をスクリーニングまたは設計するために、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片を使用することに関する。本発明は、より広くは、このような技術を使用して、理論的(rational)薬剤設計スクリーニングに反応しない準安定(metastable)タンパク質中の三次元結合エピトープを同定して、このような準安定タンパク質の体内レベルを低下させる可能性を有するインヒビター化合物または薬剤についてスクリーニングまたは設計する事に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテイナーゼインヒビター、およびそれらが体内の多くの生物学的に重要な系を調節する能力については、多くの情報が存在する。これらのインヒビターの影響は、様々な相違するプロテイナーゼを調節する能力に基づく。特に重要なプロテイナーゼインヒビターは、共通の三次構造を見かけ上共有し(Doolittle (1983), Science 222: 417-419)、および共通の進化論的原種(ancestor)を有し得るインヒビターのスーパーファミリーであるセルピンである（Huntら (1980), Biochem. Biophys, Res. Comm. 95:864-871）。認識可能な配列相同性を有するタンパク質は、脊椎動物、植物、昆虫およびウイルスにおいて同定されてきたが、原核生物においてはこれまでのところ同定されていない（Huberら, (1989). Biochem. 28: 8951-8966；Sasaki (1991), Eur. J. Biochem. 202:255-261；Komiyamaら (1994) J. Biol. Chem. 269: 19331-19337）。セルピン構造の現存のモデルは、ファミリーの一員であるα1-抗トリプシン(α1AT)の精子(seminal)Ｘ線結晶学的研究に大幅に基づいている（Huberら, (1989), 前掲）。Loebermannおよび共同研究者らは、元来の反応中心が露出したループ(緊張(strained)ループとも呼ばれる)の一部であるモデルを提示することにより、反応中心において切断された、α1ATの改変型形態の構造を解明した（Loebermannら, (1984). J. Mol. Biol. 177:531-557；PROTEINASE INHIBITORS 403-20 (Elsevier Science Publishers, 1986)に掲載のCarrellら；Sprang, S.R. (1992). Trends Biochem. Sci. 17: 49-50）。
【０００３】
反応中心ループが損なわれていないいくつかの天然型セルピンの最近の結晶学的構造は、天然型セルピン構造全体が、切断されたα1ATと非常に似ているが、反応中心ループが分子の面より上に露出しているというLoebermannの仮説と合致する（Schreuderら, (1994) Nature Structural Biology 1: 48-54；Carrellら (1994) Structure 2: 257-270；Steinら (1990) Nature 347:99-102；Weiら, (1994) Nature Structural Biology 1: 251-258；Sharpら, (1999) Structure 7:111-118）。さらなる証拠が、α1AT、抗トロンビンIII(ATIII)、またはプラスミノゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)の反応中心ループに相同な合成ペプチドが、トランスで添加された場合に、おそらくβ-シートＡの中心鎖として、それぞれの分子に取り込むという研究に由来する（Bjorkら (1992), J. Biol. Chem. 267, 19047-19050；Bjork, I. (1992), J. Biol. Chem. 267, 1976-1982；Schulzeら (1990), Eur. J. Biochem. 194: 51-56；Carrellら (1991), Nature 317:730-732；Kvassmanら (1995) Bichem. 37: 15491-15502）。これは、セルピンの反応中心における切断後に見とめられるものと同様の熱安定性の向上を導き、セルピンをその標的プロテナーゼのインヒビターから基質に変換する。
【０００４】
いわゆる潜在コンホメーション(latent conformation)と呼ばれる、さらなるセルピン構造形態も同定されている。この構造では、反応中心ループは損なわれておらず、ただし、露出される代わりに、反応中心ループのアミノ末端側全体が、β-シートＡに中心鎖として挿入されている（Mottonenら (1992) Nature 355:270-273）。これは、潜在PAI-1の安定性の高さ(Lawrenceら(1994b) Biochem. 33:3643-3648)、およびその阻害活性の欠如(Hekmanら (1985) J.Bio.Chem. 260:11581-11587)についての説明となる。このコンホメーションを適応する能力は、PAI-1独自のものではなく、ATIIIおよびα1ATについても示されている（Carrellら(1994)、前掲；Lomasら (1995) J. Bio. Chem. 270:5282-5288）。これらのデータは、共に、活性セルピンが移動性反応中心ループを有し、この移動性は阻害機能のために必須であるという仮説を導いた（Carrellら (1991)、前掲；Carrellら (1992), Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 438-446；Lawrenceら (1994a) J.Bio.Chem. 269:27657-27662；Shoreら(1994) J.Bio.Chem. 270:5395-5398；Lawrenceら (1995) J.Bio.Chem. 270:25309-25312；Faら (1995) Biochem. 34: 13833-13840；Olsonら (1995) J. Bio. Chem. 270:30007-30017；Lawrenceら (1990) J.Bio.Chem. 265:20203-20301）。
【０００５】
セルピンスーパーファミリーの重要なメンバーは、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター(PAI)である。PAIは、プラスミノゲンアクチベーター(PA)系の重要なレギュレーターとして認知されてきた。内皮細胞中のt-PAの効率的なインヒビターの同定は、Loskutoffら, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2956-2960により最初報告された。４つの動態学的に関連するPAIが現在認められている：すなわち、最初「内皮細胞PAI」と説明されたPAI-1、「胎盤PAI」とも呼ばれるPAI-2、「活性化タンパク質Cインヒビター」としても知られるPAI-3、および「グリア由来神経突起促進因子」とも呼ばれるプロテイナーゼネキシン１(PN-1)。
【０００６】
最近の関心は、PAI-1に集中している。なぜなら、これは、繊溶において重要な役割を果たし、心血管疾患について確立された危険因子であるからである。PAI-1は、血漿および血小板中の主要なプラスミノゲンアクチベーター(PA)インヒビターである（Boothら (1988) Br.J.Haematol. 70:327-333；Fayら (1992) N.Engl.J.Med. 327:1729-1733；Fayら (1994) Blood 83:351-356）。
【０００７】
PAI-1遺伝子は、長さが12.3 kbであり、両方とも同じ50 kDa一本鎖糖タンパク質をコードする2 kbおよび3 kbの２つのmRNA種を産生する（Nyら(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6776-6780；Strandbergら (1988), Eur. J. Biochem. 176: 609-616；van Mourikら (1984) J. Bio. Chem. 259:14914-14921）。PAI-1は、uPAおよびtPAの両方の最も効率的なインヒビターとして知られている（Lawrenceら(1989), Eur. J. Biochem. 186: 523-533；Shermanら (1992) J.Bio.Chem. 267:7588-7595）。
【０００８】
PAI-1は、３つの相互転換可能な(interconvertible)コンホメーション：すなわち、活性、潜在および基質形態で存在する。活性コンホメーションは、安定した共有結合複合体の形成により、その標的プロテイナーゼ、組織型プラスミノゲンアクチベーター(tPA)およびウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター(uPA)を阻害する。反応部位結合(P-P'1)は、潜在形態の標的プロテイナーゼには通じないが、非阻害基質形態のPAI-1は、セリンプロテイナーゼにより反応部位結合において切断され、PAI-1の不可逆的不活化を生じ、プロテイナーゼ活性の再生を生じる。
【０００９】
活性PAI-1は、37℃にて約１時間の半減期で潜在形態に後退(decay)する。変性剤(グアニジンHCIまたはSDS)へ露出することで、潜在PAI-1を部分的に活性形態に戻すことができる。最近のX線結晶解析による発見は、これらの２つのコンホメーションの構造的基礎を示唆しているが(Mottonenら (1992)、前掲)、これらの生物学的な意義は未知のままである。負の電荷を帯びたリン脂質は、潜在PAI-1を活性形態に転換でき、細胞表面がPAI-1活性をモジュレートし得ることを示唆する(Lambersら (1987) J.Bio.Chem.262:17492-17496)。ウサギに注入された潜在PAI-1が、活性形態に見かけ上転換されるという観察は、この仮説と合致する(Vaughanら (1990) Cir.Res.67:1281-1286)。動態(kinetic)および他の証拠も、PAI-1反応中心外にある、PAI-1とtPAとの相互作用の第２の部位について提示されている（Lawrenceら (1990), 前掲；Hekmanら (1988). Arch. Biochem. Biophys. 262, 199-210）。
【００１０】
PAI-1は、繊溶系において重要な役割を果たし、この中で、プラスミノゲンアクチベーター(PA)(組織型PA(tPA)およびウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター(uPA)等)を阻害することによりフィブリンを除去する内因性能力を低下させる。また研究から、PAI-1の上昇が、血栓塞栓症の危険性の高さに関連することが示されている（Hamstenら (1985) N. Engl. J. Med. 313:1557-1563；Krishnamurtiら (1992) Semin. Thromb. Hemost. 18:67-80；Schneidermanら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6998-7002）。従って、PAI-1の不活化は、大いに治療的価値の可能性がある（Leviら (1994) Blood 83: 351-356；Fayら (1995) Circulation 91:1175-1181）。
【００１１】
PAI活性をin vivoで低下させる戦略は２つの基本的なカテゴリーに分類される。第一に、PAI-1遺伝子発現を抑制する薬剤の作用を介して、PAI-1合成を直接低下させることができる。第二に、PAI-1の特異的インヒビターとして作用する特異的な抗体または薬理学的剤により、PAI-1活性をブロックできる。PAI-1の直接的なインアクチベーターは、血漿中の合計PAI-1活性を特異的に低下させる可能性を有し、いくつかの最近の報告はそれらの効力を実証している（Leviら, 前掲；Biemondら (1995) Circulation 91: 1175-1181；Stringerら (1994) Arterioscler. Thromb. 14: 1452-1458；Charltonら (1997) Fibrinolysis and Proteolysis 11: 51-56；Friderichら (1997) Circulation 96: 916-921；van Giezenら (1997) Thromb. Haemost 77: 964-969）。
【００１２】
このアプローチを使用した最初の研究では、PAI-1活性は、特異的抗PAI-1モノクローナル抗体との反応により低下した（Leviら, 前掲；Biemondら, 前掲；Stringerら, 前掲；Debrockら (1997) Biochim. Biophys. Acta (1997) 1337:257-266；Debrockら (1997) Gene (1997) 189:83-88）。これらの研究は、抗PAI-1抗体が、in vitroおよびin vivoの両方でPAI-1活性を中和するのに効果的であることを実証し、非常に高いPAI-1レベルが有害な場合に、このような療法が例えば血栓溶解療法の補助手段として有用であり得ることを示唆している。抗体療法は、有望であるように見えるが、その長期的使用は成功しない可能性が高い。
【００１３】
より有望な療法のための関連する戦略は、PAとのPAI-1相互作用の間に反応中心ループ挿入を予防またはそれに対して少なくとも影響を及ぼして、安定した共有結合複合体の形成を予防することである。このPAI-1活性をブロックする方法は、少なくとも２つの異なる系で生じることが報告されている。第１の系では、PAI-1の反応中心ループに類似する合成ペプチドがβシートに挿入し、そこで、PAによる切断の際に天然型ループの効率的な挿入を妨げる（Kvassmanら (1995) J.Biol.Chem.270: 27942-27947）。その結果、PAI-1はPAの基質に転換され、PAによるPAI-1の不可逆的な不活化を生じる。第二の研究では、関連配列の長い方のペプチドも、PAI-1を不活化することが示された(Eitzmanら (1995) J. Clin. Invest. 95:2416-2420)。しかし、このペプチドは、基質に転換する代わりに非阻害的潜在形態に転換させる、PAI-1におけるコンホメーション的な変化を誘導すると思われた。
【００１４】
従来の技術は、プロテイナーゼインヒビター(特にPAI-1)のレベルが高いことを特徴とする心疾患および他の病理学的症状を治療する潜在的に有効な化合物を選択するための大規模かつ比較的単純な方法を提供していない。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、特定のプロテイナーゼインヒビター不活化剤についてスクリーニングするために使用できるアッセイを開示することにより、特定のプロテイナーゼインヒビター不活化剤を同定する必要に取り組む。このアッセイは、特定の抗体が、プロテイナーゼインヒビター(特に、セルピン、より具体的にはPAI、α1AT(Whisstockら, (2000) J. Mol. Biol. 296(2): 685-699)、および抗トロンビンIII(Larssonら (2000) Cancer Res. 60(23): 6723-6729)、そして最も具体的にはPAI-1)に結合するという認識を利用する。この認識により、本発明者らは、特異的な抗プロテイナーゼインヒビター抗体が結合するエピトープをマッピングすることでプロテイナーゼインヒビターを研究することになった。プロテイナーゼインヒビター中のこれらのエピトープを位置決定し、これらのエピトープを突然変異させることにより、特異的なプロテイナーゼインヒビターを阻害する化合物の設計およびスクリーニングに使用される、特定の変異型プロテイナーゼインヒビターおよびそれらの断片が生成される。本開示は、合成ペプチドを利用する従来のエピトープ同定スクリーニング、またはλgt11ファージスクリーニングもしくはタンパク質結晶形成等の従来の方法論では研究できない任意の準安定タンパク質のインヒビターのスクリーニングに適したアッセイを提供する。
【００１６】
本発明は、少なくとも１つの突然変異を野生型プロテイナーゼインヒビターアミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープに含む変異型プロテイナーゼインヒビターに関し、該突然変異は、変異型プロテイナーゼインヒビターと抗プロテイナーゼインヒビター抗体との結合を、野生型プロテイナーゼインヒビターと抗プロテイナーゼインヒビター抗体との結合に比して変化させる。
【００１７】
本発明はさらに、変異型プロテイナーゼインヒビターの断片に関し、該断片は、野生型プロテイナーゼインヒビター断片のアミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む。
【００１８】
本発明はさらに、アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープに少なくとも１つの突然変異を含む、変異型プロテイナーゼインヒビターまたは変異型プロテイナーゼインヒビターの断片をコードするヌクレオチド構築物を含む核酸配列に関する。
【００１９】
本発明はさらに、アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む変異型プロテイナーゼインヒビターもしくは変異型プロテイナーゼインヒビターの断片をコードする核酸配列または構築物を含む核酸構築物あるいはベクターで、形質転換またはトランスフェクトされたベクターおよび宿主に関する。
【００２０】
本発明は、核酸配列が発現される条件下で、変異型プロテイナーゼインヒビターもしくはその断片をコードする核酸配列または構築物を含む核酸構築物あるいはベクターで宿主形質転換またはトランスフェクトされた宿主を培養することを含む、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片を生成する方法にさらに関する。
【００２１】
本発明はさらに、プロテイナーゼインヒビターの活性に影響を及ぼす少なくとも１つの化合物をスクリーニングする方法に関する。本方法は、化合物の、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合の程度を、野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合と比較することにより、少なくとも１つの化合物についてスクリーニングすることに関する。
【００２２】
本発明はさらに、プロテイナーゼインヒビターの活性、特にプロテイナーゼインヒビターの阻害活性に影響を及ぼす少なくとも１つの化合物をスクリーニングする方法に関する。本方法は、野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片の阻害活性に対する影響と比較して、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片の阻害活性に対して影響がより少ないかまたは全く無い少なくとも１つの化合物についてスクリーニングすることに関する。
【００２３】
さらなる実施形態では、本発明は、変異型準安定タンパク質またはその断片の測定可能な活性に対する化合物の影響を、野生型準安定タンパク質またはその断片の測定可能な活性と比較することにより、準安定タンパク質中の化合物結合部位をマッピングする方法にさらに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、準安定タンパク質に結合するか、または準安定タンパク質の活性に影響を及ぼす化合物についてスクリーニングするアプローチを包含する。ここで、「準安定」タンパク質とは、化合物との同時結晶化、そしてこの結合事象後の配位の決定に向かない不安定なタンパク質である。従って、準安定タンパク質は、容易に理論的薬剤設計に使用できない。本発明の意味において、および当業者にとっての準安定タンパク質とは、熱力学的に最も安定したコンホメーションではないコンホメーションに折り畳まれたタンパク質である。
【００２５】
既知のエピトープ同定技術と比較した場合の利点として、本発明のアプローチは、準安定タンパク質の変異体のライブラリー中の特異的なメンバーに対する抗体結合の消失についてスクリーニングすることにより結合部位をマッピングする。この結合は、野生型準安定タンパク質またはその変異体が有するいくらかの測定可能な活性により決定され得る。抗体に結合する能力のみを失い、野生型準安定タンパク質の他の機能は失わない変異体により、これらの特定の変異体にのみ存在する様々なアミノ酸残基を含む結合部位を同定し得る。
【００２６】
従って、本発明は、準安定性であるために、化合物との同時結晶化を伴う典型的な理論的薬剤設計計画には適用できないタンパク質を阻害する能力について化合物をスクリーニングすることを包含する。このようなタンパク質の１つのクラスは、セルピン等のプロテイナーゼインヒビター(α1AT、抗トロンビン、およびPAI(特にPAI-1)を含む)を含む。従って、本発明によれば、野生型プロテイナーゼインヒビターと、プロテイナーゼインヒビターに特異的な抗体との結合研究から収集した情報を考慮して、プロテイナーゼインヒビターの変異体(つまり、完全長タンパク質、およびその生物学的活性断片)を設計および調製することができる。
【００２７】
本発明の薬剤スクリーニングアプローチは、変異型プロテイナーゼインヒビター中の変化(突然変異)を利用して、変異型プロテイナーゼインヒビターにはより弱く結合するか、より低い程度に不活化するか、または不活化できないが、野生型プロテイナーゼインヒビターにはより強く結合するか、より高い程度で不活化するか、または不活化できる、化合物を同定する。例えば、PAI-1には、化合物について複数の可能性のある結合部位がある。単一の特異的な化合物が、野生型PAI-1阻害活性に影響を及ぼすが、変異型PAI-1は阻害できない場合、これは該化合物がPAI-1の突然変異した部位に結合していると結論付けるのが妥当であろう。この情報から、この「不活性」分子の構造に基づいて、さらなる化合物を設計できる。従って、本発明による理論的薬剤設計は、タンパク質を結晶化させることなく、進めることができる。さらに、本明細書では、PAI-1を代表的な準安定タンパク質として議論するが、上記薬剤スクリーニング方法論は、PAI-1関連分野以外にも影響を与え得る。
【００２８】
変異型タンパク質の相互作用により測定された活性は、対応する野生型タンパク質の該化合物との相互作用の活性と比較しなければならない。例えば、PAI-1の場合、PAI-1と化合物とを混合する前は、変異型および野生型PAI-1の両方が、標的プロテイナーゼに対して同等の阻害活性を有することが、このアッセイ特有のものである。あるいはまた、変異型および野生型PAI-1の阻害活性の任意の差を考慮するために、対照のアッセイを行うことができる。
【００２９】
本発明により得られる変異型プロテイナーゼインヒビターを、化合物についてのスクリーニングおよび設計に使用して、プロテイナーゼインヒビターをin vivoで生じさせ、プロテイナーゼインヒビターレベルの増加を伴う疾患を治療する治療的可能性を認識することができる。このような変異型プロテイナーゼインヒビターはまた、元来三次元であり、合成ペプチドもしくはλgt11ファージスクリーニングを利用するかまたはタンパク質結晶形成を必要とする従来のエピトープ同定技術によっては明らかにされない特異的な抗体または他の結合エピトープを同定するためにも採用できる。
【００３０】
準安定タンパク質の信頼性のあるスクリーニングを展開するために、本発明者らは、セルピン、PAI-1についての技術、およびPAI-1と抗PAI抗体との結合相互作用から結果を出した。具体的には、本発明者らは、変異型および野生型PAI-1と、抗PAI-1抗体との結合を測定し、変異型および野生型PAI-1に対する抗PAI抗体の結合の程度を比較した。本発明者らは、特定のPAI-1変異体が、野生型PAI-1との結合および不活化と比べて、抗PAI-1抗体に結合する能力を失ったこと(または低いレベルで結合すること)を見とめた。開示方法を実行可能なスクリーニングとして機能させるために、変異型と野生型PAI-1とのこの相対的な結合が測定可能であることだけが必要である。さらに、スクリーニング方法は、準安定タンパク質であるPAI-1の一部の活性を測定することに基づくこともできる。標的プロテイナーゼに対するPAI-1阻害活性は、抗PAI抗体との接触後に測定される活性であることが好ましいが、PAI-1の任意の他の測定可能な活性がスクリーニング方法に使用できる。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、対応する野生型PAI-1と比べて、抗PAI抗体との結合に関わる１つ以上のエピトープ突然変異を含むPAI-1変異体に関する。本発明のスクリーニング方法における重要な鍵は、PAI-1変異体中の突然変異を使用して、対応する野生型PAI-1に結合する同じ化合物と比べて、変異型PAI-1とより弱く結合する化合物を同定することである。この野生型PAI-1は、野生型PAI-1において抗PAI抗体が結合するエピトープが１つ以上の変化(エピトープを構成する少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失および/または付加等)を含むように改変されたこと以外は、変異型PAI-1と同じアミノ酸配列を含む。エピトープを改変して、本発明の変異型PAI-1を生成する。本発明は、変異型PAI-1中のエピトープのあらゆる改変を包含するが、エピトープ中でのアミノ酸置換が好ましい。変異体は、本発明に従って調製され、活性および抗PAI-1抗体との結合についてテストされて、スクリーニング方法における利用性を決定される。これに関して、「エピトープ」という用語は、２つの分子間の相互作用または結合の特定の部位を暗示し、例えば抗PAI抗体と変異型または野生型PAI-1との結合について説明するのに、一般的に免疫学的定義が用いられる(この場合、エピトープの定義は、抗体のFab領域内の特定の部位であるパラトープが結合する抗原上の抗原決定基である)。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法は、変異型および野生型PAI-1に対する、スクリーニングする化合物の結合を測定できる。化合物と変異型および野生型PAI-1との結合の程度を比較して、野生型PAI-1よりも変異型PAI-1との結合が弱い化合物を、PAI-1の阻害活性を生じる可能性のある化合物として選択する。
【００３３】
より具体的には、変異型PAI-1をスクリーニング方法において使用して、変異型および野生型PAI-1活性に対する影響について化合物を評価する。PAI-1阻害化合物としての可能性を有する化合物は、野生型PAI-1活性よりも変異型PAI-1活性に対する影響が少ない。測定するPAI-1活性は、PAI-1の標的プロテイナーゼに対するPAI-1の阻害活性であることが好ましく、従って、スクリーニング方法は、変異型PAI-1のPAI-1阻害活性に対する影響を測定し、野生型PAI-1のPAI-1阻害活性に対する影響と比較することが好ましい。より具体的には、変異型PAI-1活性に影響しないかまたは不活化しないが、対応する野生型PAI-1に対しては高い程度で影響を及ぼすかまたは不活化する化合物は、本スクリーニング方法で同定されるように設計された化合物である。この方法により同定される最も好ましい化合物は、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片には結合しないが、野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片には結合する化合物である。
【００３４】
PAI-1上には、化合物に対する可能性のある結合部位が複数ある。特定の化合物が、野生型PAI-1を阻害するが、変異型PAI-1は阻害できない場合、該化合物結合部位は、該特定の化合物が結合する変異型エピトープにちがいない。
【００３５】
この情報から、変異型PAI-1に対して不活性な化合物の構造に基づいて、野生型PAI-1に結合するように追加の化合物を設計する。例えば、抗PAI-1抗体の同定されたエピトープが、PAI-1を不活化させる化合物等の１つ以上の化合物についての結合ポケット(pocket)と重複する場合、本発明で開示するPAI-1変異体は、PAI-1不活化剤について有用なスクリーニングを提供する。
【００３６】
さらに、本発明のスクリーニング方法は、元来三次元であり、従って、合成ペプチドまたはλgt11ファージスクリーニングを用いるもの等の従来のエピトープ同定スクリーニングに屈折する(refractive)特定の抗体または他の結合エピトープを同定するために有用である。さらに、本スクリーニング方法は、変異型PAI-1に区別をつけて結合し得る他のタンパク質を同定するために有用である。
【００３７】
本発明はまた、準安定タンパク質(定義によれば、不安定であり、理論的薬剤設計に向いていない)の活性に影響を及ぼす少なくとも１つの化合物をスクリーニングする方法にも関する。本方法はまた、準安定タンパク質中の化合物結合部位をマッピングするためにも有用である。
【００３８】
従って、一実施形態では、本方法は、(a)以下の(i)および(ii)と別々に、化合物をインキュベートすること：すなわち、(i)変異型準安定タンパク質またはその断片、および(ii)野生型準安定タンパク質またはその断片；(b)該変異型準安定タンパク質またはその断片および該野生型準安定タンパク質またはその断片の測定可能な活性に対する(a)の化合物の影響を測定すること；ならびに(c)該変異型準安定タンパク質またはその断片の測定可能な活性に対する(b)の化合物の影響を、該野生型準安定タンパク質またはその断片の測定可能な活性に対する該化合物の影響と比較すること、を含む。化合物が、野生型安定タンパク質の測定可能な活性に影響を及ぼす場合、本方法はさらに：(d)野生型安定タンパク質または断片の活性に対する影響よりも、(b)の変異型準安定タンパク質またはその断片の活性に対する影響が少ない化合物を選択すること、を含む。
【００３９】
より具体的には、本発明は、準安定タンパク質またはその断片中の少なくとも１つの化合物結合部位をマッピングする方法に関し、該方法は：(a)変異型準安定タンパク質またはその断片を化合物とインキュベートすること；(b)該変異型準安定タンパク質の測定可能な活性に対する(a)における化合物の影響を測定すること；(c)ステップ(a')においては変異型準安定タンパク質を野生型準安定タンパク質に置き換えること以外は(a)および(b)と同じステップからなるステップ(a')および(b')の平行セットを行うこと；(d)(b)における該変異型準安定タンパク質と、(b')における野生型準安定タンパク質の影響を比較すること；ならびに(e)(b')の野生型準安定タンパク質または断片の測定可能な活性に対する影響よりも、(b)における該変異型準安定タンパク質またはその断片の測定可能な活性に対する影響が少ない化合物を選択すること、を含む。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法はまた：(f)ステップ(a)または(a')において化合物を添加しないこと以外は、ステップ(a)〜(d)に対応するステップ(a'')〜(d'')の平行セット、およびステップ(a')〜(d')に対応するステップ(a''')〜(d''')の平行セットを行うこと；ならびに(g)(b)および(b'')における変異型準安定タンパク質と、(b')および(b''')における野生型準安定タンパク質との測定可能な活性を比較して、変異型準安定タンパク質と野生型準安定タンパク質との測定可能な活性に対する相対的な影響を決定すること、を含む対照試験を必要とし得る。
【００４１】
本方法はさらに、上記(a)および(a')において変異型準安定タンパク質または野生型準安定タンパク質を添加しないで、測定可能な活性を測定する対照インキュベーションを行うことを含む。本方法は、(a)および(a')において変異型準安定タンパク質、野生型準安定タンパク質、または化合物を添加しないで、測定可能な活性を測定する対照インキュベーションを行うことをさらに含む。本方法は、上記野生型準安定タンパク質またはその断片のアミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープに少なくとも１つの突然変異(この突然変異は、変異型準安定タンパク質またはその断片と、野生型準安定タンパク質またはその断片に結合する抗体との結合を変化させる)を導入することにより調製する変異型準安定タンパク質またはその断片をさらに含む。
【００４２】
上記方法において使用する変異型準安定タンパク質またはその断片は、野生型準安定タンパク質またはその断片のアミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異(この突然変異は、変異型準安定タンパク質またはその断片と、変異型準安定タンパク質よりも野生型準安定タンパク質または断片により高い程度で結合する抗体との結合を変化させる)を導入することにより調製する。
【００４３】
本発明の変異型準安定タンパク質またはその断片は、化合物の存在下で、測定可能な活性の約5〜100％を保持する、より好ましくは該化合物の存在下で測定可能な活性の少なくとも約25％を保持する。本発明の変異型準安定タンパク質またはその断片は、化合物の存在下で測定可能な活性の少なくとも約50％を保持することがより好ましく、化合物の存在下で測定可能な活性の少なくとも約75％を保持することがさらに好ましい。化合物は、変異型準安定タンパク質またはその断片、および準安定タンパク質の阻害活性に実質的に全く影響がないことが最も好ましい。上記したような測定可能な活性の保持は、化合物の存在下で測定した。
【００４４】
本発明は、プロテイナーゼインヒビターの活性に影響を及ぼす少なくとも１つの化合物をスクリーニングする方法に関することがより好ましく、該方法は：(a)化合物を：(i)本明細書に記載の変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片(該インヒビターまたは断片は、アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む)とインキュベートすること；そしてそれとは別に該化合物を(ii)野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とインキュベートすること；(b)化合物と、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片および野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合を測定すること；ならびに(c)化合物と変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合を、化合物と野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合と比較すること、を含む。本方法はさらに：(d)化合物と野生型プロテイナーゼインヒビターまたは断片との結合と比較して、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片と弱く結合する化合物を選択すること、を含む。
【００４５】
化合物と野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合の約95％以下で、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片と結合する化合物が好ましく、化合物と野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合の約75％以下で、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片と結合する化合物がより好ましい。化合物と野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合の約50％以下で、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片と結合する化合物がより好ましく、化合物と野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片との結合の約24％以下で、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片と結合する化合物がさらに好ましい。しかし、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とは結合しないが、野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片とは結合する化合物が最も好ましい。
【００４６】
変異型および野生型プロテイナーゼインヒビターに対する化合物の結合を測定することにより化合物をスクリーニングするのに加えて、本スクリーニング方法は、プロテイナーゼインヒビターの測定可能な活性に対する少なくとも１つの化合物の影響をさらに測定することができる。この態様では、本方法は：(a)化合物と：(i)アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープに少なくとも１つの突然変異(この突然変異は、野生型プロテイナーゼインヒビターと抗プロテイナーゼインヒビター抗体との結合と比べて、変異型プロテイナーゼインヒビターと抗プロテイナーゼインヒビター抗体との結合を変化させる)を含む野生型変異体プロテイナーゼインヒビターアミノ酸配列を含む変異型プロテイナーゼインヒビターとインキュベートすること(ここで、該インヒビターまたは断片は、アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープに少なくとも１つの突然変異を含む)；そして、それとは別に該化合物を(ii)野生型インヒビターまたはその断片とインキュベートすること；(b)変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片および野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片の阻害活性に対する(a)における化合物の影響を測定すること；ならびに(c)変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片に対する化合物の影響を、野生型プロテイナーゼインヒビターまたは断片に対する化合物の影響と比較すること、を含む。化合物が、野生型プロテイナーゼの阻害活性に影響を及ぼす場合、本方法はさらに：(d)(b)における変異型プロテイナーゼインヒビターまたは断片の阻害活性に対する影響が、野生型プロテイナーゼインヒビターまたは断片の阻害活性に対する影響よりも少ない化合物を選択すること、を含む。
【００４７】
化合物の不在下で阻害活性の約5〜100％を保持する変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片も、本発明において有用であり、阻害活性の少なくとも約25％を保持する変異型プロテイナーゼインヒビターおよびその断片がより好ましい。しかし、その阻害活性の少なくとも約50％を保持する変異型プロテイナーゼインヒビターおよびその断片がより好ましく、阻害活性の少なくとも約24％を保持する変異型プロテイナーゼインヒビターおよびその断片がさらに好ましい。本方法により同定される最も好ましい化合物は、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片に対しては阻害的影響が全くないが、野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片は阻害する化合物である(ここで、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片はその阻害活性の100％を保持する)。上記したような標的プロテイナーゼに対する変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片の阻害活性の保持は、化合物の不在下で測定する。
【００４８】
より好ましくは、本発明の方法は、変異型プロテイナーゼインヒビターに影響を及ぼす化合物をスクリーニングすることを含み、該方法は：(a)アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異(この突然変異は、野生型プロテイナーゼインヒビターと抗プロテイナーゼインヒビター抗体またはその断片との結合と比べて、変異型プロテイナーゼインヒビターと抗プロテイナーゼインヒビターとの結合を変化させる)を有する野生型プロテイナーゼインヒビターアミノ酸配列を含む変異型プロテイナーゼインヒビターを、化合物とインキュベートさせること；(b)標的プロテイナーゼに対する変異型プロテイナーゼインヒビターの阻害活性に対する(a)における化合物の影響を測定すること；(c)ステップ(a')における変異型プロテイナーゼインヒビターを野生型プロテイナーゼインヒビターに置き換えること以外は(a)および(b)と同じステップからなるステップ(a')および(b')の平行セットを行うこと；(d)(b)における変異型プロテイナーゼインヒビターおよび(b')における野生型プロテイナーゼインヒビターの阻害活性に対する影響を比較すること；ならびに(e)(b)における変異型プロテイナーゼインヒビターの阻害活性に対する影響が、(b')における野生型プロテイナーゼインヒビターに対する影響よりも少ない化合物を選択すること、を含む。
【００４９】
ステップ(b)および(b')の測定に関して、本方法は、標的プロテイナーゼを、(a)における変異型プロテイナーゼインヒビターおよび化合物に添加して第１の混合物を作製し、(a')における野生型プロテイナーゼインヒビターおよび化合物に添加して第２の混合物を作製して、該第１および第２の混合物をインキュベートすることを含むことがより好ましい。(b)および(b')の測定は、標的プロテイナーゼの基質を添加し、該基質の酵素的転換を測定することを含む、標的プロテイナーゼ活性の測定を含む。
【００５０】
スクリーニング方法は：ステップ(a'')または(a''')において化合物が添加されないこと以外は、ステップ(a)〜(d)に対応するステップ(a'')〜(d'')の平行セット、およびステップ(a')〜(d')に対応するステップ(a''')〜(d''')の平行セットを行うこと；ならびに(g)(b)および(b'')における変異型プロテイナーゼインヒビター、ならびに(b')および(b''')における野生型プロテイナーゼインヒビターの阻害活性を比較して、変異型プロテイナーゼインヒビターおよび野生型プロテイナーゼインヒビターの相対的阻害活性を決定すること、を含む対照試験をさらに含む。本方法ではさらに、(b'')および(b''')の測定ステップが、標的プロテイナーゼを、(a'')の変異型プロテイナーゼインヒビターに添加して第３の混合物を作製し、(a''')の野生型プロテイナーゼインヒビターに添加して第４の混合物を作製し、該第３および第４の混合物をインキュベートすることを含む。(b'')および(b''')の測定ステップが標的プロテイナーゼ活性を測定することを含む方法は、標的プロテイナーゼの基質を添加し、該基質の酵素的転換を測定することを含む。
【００５１】
本方法は、(a)および(a')において変異型プロテイナーゼインヒビターまたは野生型プロテイナーゼインヒビターを加えずに、標的プロテイナーゼ活性を測定する対照インキュベーションを行うことをさらに含む。
【００５２】
本方法は、(a)および(a')において変異型プロテイナーゼインヒビター、野生型プロテイナーゼインヒビター、および/または化合物を加えずに、標的プロテイナーゼ活性を測定する対照インキュベーションを行うことをさらに含む。
【００５３】
本発明は、本発明の化合物スクリーニング方法において使用する変異体に関する。本発明の変異型プロテイナーゼインヒビターは、野生型プロテイナーゼインヒビターアミノ酸配列またはその断片の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異(この突然変異は、野生型プロテイナーゼインヒビターと抗プロテイナーゼインヒビター抗体との結合と比べて、変異型プロテイナーゼインヒビターと抗プロテイナーゼインヒビター抗体との結合を変化させる)を有する野生型プロテイナーゼインヒビターアミノ酸配列を含む。
【００５４】
変異型プロテイナーゼインヒビターは、抗プロテイナーゼインヒビター抗体が野生型プロテイナーゼインヒビターに対して有する結合親和性よりも、抗体に対して低い結合親和性を有することが好ましい。変異型プロテイナーゼインヒビター抗体は、変異型プロテイナーゼインヒビターの変異型エピトープに結合しないことがより好ましい。
【００５５】
変異型プロテイナーゼインヒビターは、野生型プラスミノゲンアクチベーターインヒビター(PAI)の変異体であり、より好ましくは野生型PAI-1の変異体である。変異型プロテイナーゼインヒビターは、図１に示す野生型PAIのアミノ酸配列を含むことが最も好ましい。
【００５６】
適切な抗プロテイナーゼインヒビター抗体は、変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片は阻害せず、野生型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片は阻害するモノクローナル抗体であることが好ましい。より好ましくは、抗体は、抗PAIモノクローナル抗体、より好ましく抗PAI-1モノクローナル抗体である。最も好ましい抗PAIモノクローナル抗体としては、マウスモノクローナル抗体であるMA-33B8または31C9(Molecular Innovations, Inc.(Southfield, Michigan)から市販されている)が挙げられるがこれらに限定されない。しかし、変異型プロテイナーゼインヒビターの測定可能な活性を阻害するあらゆる抗体が、本発明に従い、プロテイナーゼインヒビターを阻害する可能性を有する化合物について同定するために使用できる。
【００５７】
本発明の変異型プロテイナーゼインヒビターは、1、2、13、82、87、88、89、92、95、110、115、127、151、174、196、202、212、218、223、230、241、283、300、305、308、329、331、323、339、351および354からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基において置換を含む、図１A〜１Dのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、変異型プロテイナーゼインヒビターは、87、88、89、174、230、232、329および331からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸残基において置換を含む。図２は、これらのアミノ酸残基における具体的なアミノ酸置換を示す表を開示し、図３は複数の置換を含む本発明のPAI-1変異体を示す表を開示する。
【００５８】
より好ましくは、本発明の変異型プロテイナーゼインヒビターは、アミノ酸87において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、そしてより好ましくはアミノ酸87におけるアミノ酸置換は、アスパラギンをアスパラギン酸に変えるものである。このような置換の表示は、野生型アミノ酸をアミノ酸番号の前に、そして置換または変化したアミノ酸をアミノ酸番号の後に記してN87Dとする。さらに、別の好ましい変異型プロテイナーゼインヒビターは、アミノ酸89において少なくとも１つのアミノ酸置換(ここで、アミノ酸89におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸からグリシンへの変化)であるD89Gを含む。別の好ましい変異型プロテイナーゼインヒビターは、アミノ酸230において少なくとも１つのアミノ酸置換(ここで、アミノ酸230におけるアミノ酸置換はグリシンからバリンへの変化)であるG230Vを含む。別の変異型プロテイナーゼインヒビターは、アミノ酸331において少なくとも１つのアミノ酸置換(ここで、アミノ酸331におけるアミノ酸置換はセリンからアルギニンへの変化)であるS331Rを含む。
【００５９】
本発明は、上述した変異型プロテイナーゼインヒビターの断片も含む。「断片」という用語は、完全長のプロテイナーゼインヒビターよりも短い変異型または野生型プロテイナーゼインヒビターの一部を意味する。断片は、アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含むことが重要であり、またスクリーニング方法において変異型プロテイナーゼインヒビター断片を使用する場合には、その阻害活性を対応する野生型プロテイナーゼインヒビター断片から完全長野生型プロテイナーゼインヒビターにかけて比較することが重要である。
【００６０】
本発明はさらに、本明細書に記載する、アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む変異型プロテイナーゼインヒビターまたは変異型プロテイナーゼインヒビターの断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列に関する。核酸配列は、野生型プラスミノゲンアクチベーターインヒビター(PAI)の変異体をコードすることが好ましく、野生型PAI-1の変異体であることがより好ましい。核酸配列は、図１に示す野生型PAIのアミノ酸配列を含む変異型プロテイナーゼインヒビターをコードすることが最も好ましい。
【００６１】
本発明はまた、核酸配列の発現を生じる調節制御配列に作用可能に連結した、上述したような核酸配列を含む核酸構築物にも関する。本発明はさらに、アミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む、本明細書に記載の変異型プロテイナーゼインヒビターまたは変異型プロテイナーゼインヒビターの断片をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む。本発明はさらに、上述したようにアミノ酸配列の少なくとも１つのエピトープにおいて少なくとも１つの突然変異を含む本明細書に記載の変異型プロテイナーゼインヒビターまたは変異型プロテイナーゼインヒビターの断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列の核酸構築物で形質転換またはトランスフェクトされた宿主に関する。
【００６２】
本発明の変異型プロテイナーゼインヒビターまたはその断片は、核酸配列が発現される条件下で核酸配列の発現を生じさせる調節制御配列に作用可能に連結した核酸配列を含む宿主を培養することにより、作製される。
【００６３】
野生型タンパク質の変異体を調製するために、当業者は、突然変異させるタンパク質のアミノ酸およびDNA配列を知っている必要がある。
【００６４】
好ましいタンパク質の場合、PAI-1 cDNAは、典型的な分泌シグナル配列を含む402のアミノ酸からなるタンパク質をコードする(Nyら, 1986；Ginsburgら, 1986)。細胞培養物から単離された成熟ヒトPAI-1は、ほぼ等しい割合の381および379のアミノ酸からなる２つの変異体から構成される。分泌シグナル配列の交互の切断から生じ易いこれらの２つの形態は、Ser-Ala-Val-His-HisおよびVal-His-His-Pro-Proの重複アミノ末端配列を有するタンパク質を提供する(図１を参照、およびLawrenceら, 1989に開示されている)。この後者の配列は、成熟PAI-1と概して呼ばれる。PAI-1の完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列も、図１ａ〜１ｄに開示しており、23アミノ酸シグナル配列を含むアミノ酸配列が402のアミノ酸の長さを有し、成熟アミノ酸配列が379のアミノ酸の長さを有することを示している。
【００６５】
PAI-1は、15〜20％の炭水化物を含む３つの可能性のあるN-連結グリコシル化部位を有する糖タンパク質である(Van Mourikら, 1984)。成熟PAI-1は、システイン残基を含まず、大腸菌からの組換えPAI-1の効率的な発現および単離を円滑にしている。大腸菌中で生成されるPAI-1は、グリコシル化されていないにも関わらず、天然型PAI-1に機能的に非常に似ている。組換えPAI-1は、本質的に活性な形態で大腸菌から単離でき、これは哺乳動物細胞培養物から精製されるPAI-1と対照をなす(Lawrenceら, 1989；Hekmanら, 1988)。
【００６６】
米国特許第6,103,498号(参照により本明細書に全体的に援用する)は、改変型PAI-1またはPAI-1変異体をどのように作製するかを開示しており、これらの方法は、本発明の変異型PAI-1を調製するために有用である。部位特異的突然変異誘発および他の方法を使用して、PAI-1反応中心ループ(RCL)中の多数の突然変異を作成および特徴決定する(Shermanら, 1992、Shermanら, 1995)。この先行特許出願は、PAI-1に新規かつ有用な性質(特に、(a)エラスターゼと相互作用し、阻害する能力(天然型PAI-1では欠如している活性)および(b)ビトロネクチン関連細胞移動を阻害する能力)を与えるような、PAI-1のRCLにおける新規変異体の作製および同定方法を開示しているが、本発明のスクリーニング方法において使用する変異型PAI-1の調製は示唆していない。
【００６７】
本開示は、主にヒトPAI-1またはその変異体に関するが、上記開示した特徴を有する他の種由来のPAI-1の相同体およびその変異体も、本発明の範囲内にあることを意図することが理解されよう。特に、他の哺乳動物種由来のPAI-1タンパク質(またはDNA)は、本発明の方法においてヒトPAI-1と同じ目的のために使用され得る。
【００６８】
上記したように、本発明のPAI-1は、大腸菌または他の宿主細胞において、または当業者に公知の方法を用いたトランスジェニック植物もしくは動物の使用を含む、DNA配列からタンパク質を作製するその他の公知の方法により組換え的に作製できる。本発明はまた、１つ以上の置換を含み、かつ必須の生化学的および生物学的活性を有する配列部分を少なくとも含むペプチドも含む。このようなペプチドは、固相支持体上の所望の配列のポリペプチドを合成するための周知の合成方法を採用し、その後、支持体から分離されて作製される。固相ペプチド合成のための方法は、例えば：Merrifield, (1963)；Merrifield, (1986)；Wadeら, (1986)；Fields, (1990)；MilliGen Report Nos. 2および2a (1987)に詳しく記載されている。例えば、「tBoc法」または改善された「F-moc」技術を使用してもよい(Athertonら, 1981)。
【実施例】
【００６９】
大腸菌中での組換えPAI-1の発現および精製によるPAI-1変異体の作製
以下の方法は、好ましいものであり、本発明のプロテイナーゼインヒビター変異体を作製するための排他的な手段を示すものではない。オリゴヌクレオチドプローブを合成する技術は当該分野で周知であり、例えば、Wuら, 1987またはGait編(Current Eddition)に開示されている。適切なプロモーターおよび他の制御エレメント、選択マーカー等を含む本発明による組換え分子を構築および発現するための手順は、Sambrook, J.ら, 1989；Ausubel, F.M.ら, 1987(参照により本明細書に援用する)に開示されている。
【００７０】
本発明には、本明細書に開示するような適切なヌクレオチド配列置換を有して変異型タンパク質をコードするcDNAであることが好ましい、PAI-1変異体をコードするDNAが含まれる。このような分子は、従来方法を用いて調製される。本明細書には、上記DNA分子を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた原核生物または真核生物宿主細胞も含まれる。DNAを形質導入、DNAを発現、および宿主細胞を培養するために使用する方法は、同じく当該分野において周知であり、上記引用した参考文献に記載されている。真核生物宿主細胞は、樹立した細胞系の哺乳動物細胞であることが好ましいが、昆虫細胞または植物細胞も包含される。ウイルス等の適切なベクター、ベクター配列、宿主細胞の種に適したプロモーター等の制御配列は、従来的なもので、当業者に周知であり、従って本明細書中で特に詳細には記載しない。センスDNAに加えて、変異型PAI-1コード配列に対するアンチセンスDNAおよびアンチセンスRNA分子も本明細書において提供する。PAI-1変異体をコードするRNA分子も含む。
【００７１】
実施例１
材料
マウス抗ヒトPAI-1モノクローナル抗体(mAb)33B8および31C9、ならびにウサギ抗ヒトPAI-1ポリクローナル抗体(pAb)は、Molecular Innovations (Southfield, Michigan, USA)から入手した。高分子量tPAおよびuPAは、Genetech (South San Francisco, CA)およびMolecular Innovations (Southfield, Michigan, USA)からそれぞれ入手した。発色tPA基質pGlu-Gly-Arg p-ニトロアニリドは、Sigma (St.Louis, MO, USA)から購入した。タンパク質を移すために使用したニトロセルロースフィルタおよび膜は、Schleicher and Schuell, Inc. (Keene, New Hampshire, USA)製のものであった。SDS-PAGE用の全ての補給品および試薬(プレキャストゲル(precast gel)を含む)は、Novex(San Diego, CA, USA)製のものであった。ヒトPAI-1野生型または変異型遺伝子のサブクローニング、複製または発現のために使用した全ての大腸菌株は、Stratagene(La Jolla, CA, USA)、Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, USA)およびNovagen(Madison, WI, USA)からコンピテントな細胞として購入した。部位特異的突然変異誘発のために、TransformerTM部位特異的突然変異誘発キットを、Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, USA)から購入した。使用した全ての配列決定および変異原プライマーは、Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA, USA)により、合成およびPAGE精製された。DNA制限エンドヌクレオアーゼ(Sca IおよびMlu I)は、Life Technologies(Gaithersburg, MD, USA)およびNew England Biolabs, Inc. (Beverly, MA, USA)からそれぞれ購入した。DNA配列決定は、ABI PRISMTM310遺伝子分析器上で、Applied Biosystems(Foster City, CA, USA)製のBigDyeTMターミネーターサイクル配列決定既製反応キットを使用して行った。DNA配列の分析は、Vector NTITMSuite 6.0 Molecular Biology Software for WindowsTMを用いて行った。BIAcore 3000TMバイオセンサでの結合アッセイのための全ての補給品および緩衝液は、Biacore AB(Uppsala, Sweden)から購入した。ウシ血清アルブミン(BSA)、アジ化ナトリウム(NaN3)、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)、カルバニシリン(carbanicilin)、テトラサイクリンおよびカナマイシンはSigma(St.Louis, MO, USA)から入手した。研究で使用したその他の全ての化学試薬は、Fisher Scientific (Pittsburg, PA, USA)から購入した。
【００７２】
変異型PAI-1ライブラリーの構築およびスクリーニング
2×107を上回る個別のクローンを有するランダムPAI-1変異体のライブラリーを、Berkenpasら, 1995(参照により援用する)に記載されるように変異性PCRにより、λファージ発現ベクターλEXlox中で構築した。簡単に言うと、成熟PAI-1のコード配列全体を、Lawrenceら, J. Biol. Chem.(1994)269:16223-16228(参照により全体的に援用する)に記載されるように４サイクルの変異性PCRにより増幅した。突然変異させた生成物を、鋳型からゲル精製し、標準的PCR条件下で再度増幅させて、ランダムに突然変異させたPAI-1 cDNAの増幅プールを作製した。PCR生成物を、XbaIおよびEcoRIで切断し、同様に制限したλEXloxアームにライゲートさせ、Novagen(Madison, WI, USA)製のPhagePrepでパッケージングした。
【００７３】
ファージ感染性大腸菌BL21(DE3)の平地を、0.02％マルトースを含むルリアブロス(LB)に入った指数培養された細胞から調製した。変異型PAI-1分子を有するファージプラークを選択するために、前培養されたファージプラークを、１時間以内で37℃にて、重ねたIPTG(10 mM)＋tPA(10μg/ml)飽和ニトロセルロースフィルターとインキュベートさせることにより、タンパク質発現を起こした。取上げたフィルターを0.5％SDS含有TBS中で徹底的に一度洗浄し、次に１％BSA/５％ミルク/TBS溶液でブロックし、一次抗体である33B8 mAbとインキュベートさせた。フィルターに結合したtPA:PAI-1:33B8 mAb複合体を、向上型化学発光(ECL)アッセイにおいて、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートしたヤギ抗マウス免疫グロブリンで免疫学的に検出した。ECLハイパーフィルム上に現れた暗い点は、33B8 mAbに結合可能なPAI-1分子を発現するプラークを示した。次に、フィルターを水およびTBSで何度か洗浄し、一次抗体としてウサギ抗PAI-1 pAbとインキュベートし、二次抗体としてヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体とインキュベートした。NBT/BCIP色反応の後に、フィルター上に現れた濃い紫の点は、全ての機能的に活性なPAI-1分子を発現するプラークに対応する。33B8結合陰性プラークを選択するために、ECLハイパーフィルムを、元のNBT/BCIP現像(developed)ニトロセルロースフィルターと重ねた。33B8 mAb結合陰性表現型を発現するプラークを、関連する細菌プレートから採取し、一次スクリーニングと同じステップを含む２つの連続ラウンドの富化にかけた。
【００７４】
合計で、30万のλEXlox粒子が、hPAI-1ライブラリーのL5ランダム突然変異からスクリーニングされ、最初のスクリーニングで採取された活性PAI-1表現型を発現する22の粒子からは、２つのスクリーニング後には11個のみが陽性と思われ、従ってこれらを単離し、Novagen(Madison, WI, USA)プロトコールに従いλEXloxベクターからプラスミドDNAをCre仲介型切除して自動的にサブクローニングして、さらなる分析にかけた。
【００７５】
10の個別のpEXmutPAI-1プラスミド中のPAI-1コード領域全体(1137ヌクレオチド)のDNA配列分析により、１つの変異体につき平均で約３つのアミノ酸置換を生じる1：366の突然変異頻度が実証された。
【００７６】
部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発により、所望の突然変異のDNA配列および十分な数の隣接ヌクレオチドをコードする特異的オリゴヌクレオチド配列を使用して、横断する欠失接合部位の両側に安定した二本鎖を形成するのに十分な大きさおよび配列複雑性を有するプライマー配列を生じさせて、ペプチド変異体が生成される。典型的に、約20〜30ヌクレオチドの長さで、配列の接合部位の両側の約5〜10残基が変化したプライマーが好ましい。部位特異的突然変異誘発の技術は、Adelmanら, DNA 2:183 (1983)(参照により本明細書に援用する)等の文献に例示されるように、当業者に周知である。
【００７７】
個々のPAI-1部位特異的変異体は、Clontech Laboratories, Inc.(Palo Alto, CA, USA)製のTransformerTM部位特異的突然変異誘発キットのプロトコールに従って構築した(ただし、他の同様のキットを使用して変異体を構築してもよい)。プロトコールにおいて使用したプライマーは、図１に示すPAI-1 DNA配列、および本明細書に記載の33BAモノクローナル抗体に結合しなかったクローンについてライブラリーの最初のスクリーニングで同定された既知の突然変異を用いて設計する。所望の突然変異をPAI-1DNA配列に導入するために使用した具体的な変異原プライマーは、図６に開示する。
【００７８】
変異型PAI-1 DNA配列を有する、Stratagene(La Jolla, CA, USA)製の大腸菌XL-10Goldコンピテント細胞における最終的な形質転換の後、各個別の変異体のいくつか(少なくとも４つ)のクローンを選択し、３〜５配列決定プライマーを使用して、PAI-1コード領域全体を通じて選択および配列決定した。最終的に、PAI-1分子の87、88、89、174、230、232、329および331位において単一アミノ酸置換を有する、８つの部位特異的変異体が構築され、これらを本明細書に開示するように評価した。
【００７９】
PAI-1分子の機能的分析
複数の33B8結合陰性および単一アミノ酸置換hPAI-1変異型遺伝子および野生型のものを、pEXプラスミド中でクローニングし、Novagen(Madison, WI, USA)製の大腸菌BL21(DE3)Tuner株中で発現させた。OD600＝0.5 O.Uまで前培養した細胞から、細胞を含まない溶解物を調製し、その後２時間以内にIPTG(1 mM)により誘導させた。1.5 ml培養培地から得たペレットを、0.001 M EDTA、0.15 M NaClおよび0.02％ NaN3を含む0.4 mlの0.05 M KPi緩衝液(pH 5.1)に再懸濁させ、次いで、冷却しながら、UltrasonicプロセッサーXL(Misonix Inc., Farmingdale, NY)を使用して50％パルス体制で１分間超音波にかけた。14,000 rpmにて15分間のホモゲネート遠心分離後に得られた上清画分を、細胞非含有抽出物(CE)と指名し、PAI-1活性アッセイにおいて使用した。0.15 M NaCl、0.01％BSA、0.0001％Tween 20、0.02％SAを含む0.05 M Tris HCl(pH 7.5)緩衝液の1：40〜1：2560の連続希釈液に入った野生型PAI-1および各変異型CEのアリコートを、記載されるように一段階発色基質アッセイを用いて、高分子量uPAに対する阻害活性を測定することで機能的活性について分析した(Lawrenceら, 1989 Eur. J. Biochem. 186: 529-539；Berkenpasら, 1995)。さらに、変異型PAI-1形態のtPA阻害活性を、37℃にて20分間の等モル量のtPAおよびPAI-1インキュベーション後のtPA:PAI-1複合体の直接形成により評価した。反応混合液を、4〜20％Tris-グリシン勾配ゲル中、還元条件下で、シーブルータンパク質マーカーを基準として前染色し、その後タンパク質バンドのクーマシーブリリアントブルー-250染色を行って、SDS-PAGEにより分析した。
【００８０】
結合アッセイ
ウェスタンブロットアッセイ
選択されたPAI-1変異体の33B8結合陰性表現型を評価するために、少なくとも5 ngの組換えhPAI-1を含む大腸菌BL21(DE3)TunerのCEのアリコートを、還元条件下でSDS PAGEで分離し；ニトロセルロース膜に電気的に移し、１％BSA/５％ミルク/TBS溶液でブロックし、マウス33B8 mAbおよびウサギ抗hPAI-1 pAbを一次抗体としてでプローブした。ライブラリースクリーニング(上述)と同じ手順に従ったECL法により、HRPコンジュゲートヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ免疫グロブリンで、形成された複合体を検出した。
【００８１】
表面プラスモン共鳴
精製されたhPAI-1変異型タンパク質および大腸菌BL21(DE3)Tuner CEと、特異的なマウス抗hPAI-1 33B8 mAbとの結合も、BIAcoreTM3000光学バイオセンサ(BiacoreAB, Uppsala, Sweden)を用いて、表面プラスモン共鳴(SPR)法により分析した。この方法は、生物特異的表面における屈折率の変化を測定することにより、結合相互作用をリアルタイムで検出して、会合および解離速度定数の計算を可能にする。典型的に、33B8 mAbを、NHS/EDC活性化CM-5研究級センサチップフローセルに共役させ、約1000の共鳴単位(RU)応答を作製した。個別に、活性形態、潜在形態、切断形態およびuPA/tPAと複合化されたコンホメーション形態の野生型h PAI-1、ならびにHBS-P緩衝液(pH 7.4)に入った単一アミノ酸置換および複数変異型hPAI-1タンパク質(0.001〜1μM)を、５分間、20μl/分の流速で注入し、その後10分間解離させた。20μl 0.2 Mグリシン緩衝液(pH 1.5)のパルスでセンサチップ表面の再生を行った。全ての測定を25℃にて行った。BIAcore 3000 Bioevaluationソフトウェア(Biacore AB, Uppsala, Sweden)プログラムパッケージを、データ分析および親和定数計算のために使用した。
【００８２】
高い親和性で33B8抗体に結合しなかったPAI-1の同定された変異体は、33B8で不活化もされなかった。これは図５に示す：抗体MA-33B8(2.33 mN)を、精製した野生型および変異型組換えhPAI1(室温にて1 mM)と前インキュベートさせ、その後、残ったPAI-1活性を表示の間隔で測定した。これらのデータは、野生型PAI-1、および先に同定したPAI-1の変異体、すなわち14-1b(Lawrenceら1989 Eur. J. Biochem. 186: 529-539；Berkenpasら, 1995)の両方が、抗体によりすぐに不活化されたことを示す。対照的に、スクリーニングにおいて同定され、図２に示す２つの新たに構築した単一点突然変異(S331RおよびD89G)は、33B8によりすぐに不活化されない。これは、33B8とPAI-1との結合を妨害する突然変異が、33B8にPAI-1をすぐに不活化させないことも実証する。
【００８３】
新規化学実体によるPAI-1変異体活性の阻害の影響を決定する方法
新規化学実体(NCE)を、様々な濃度にて、PAI-1変異体を含む緩衝液に添加する。室温での混合およびインキュベーションに続いて、標的プロテアーゼ(組織プラスミノゲンアクチベーター(tPA)またはウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター(uPA)のいずれか)を添加し、NCE、PAI-1変異体およびtPA/uPAの組み合わせを、室温にてさらにインキュベートする。第２の混合およびインキュベーションに続いて、tPA/uPAについての発色基質を添加し、異なる時間にて分光光度計で吸光度を読み取る。相対的なPAI-1阻害活性は、変異体のみの存在下での活性と比べて、NCE/変異型PAI-1処置における残留tPA/uPA活性に等しい。これらのデータを、NCEの存在下で変異型PAI-1を野生型PAI-1に置き換えて生成された同様のデータと比べることにより、変異型PAI-1内の固有のエピトープについてのNCEの相対的親和性が決定できる。対照試験は、tPA/uPA活性のみに対するNCEの任意の影響の不在を含む。野生型PAI-1に対して阻害活性を有することが示された化合物のみを、変異型PAI-1に対してさらにテストする。野生型PAI-1に対するNCEの阻害活性を、様々な濃度のNCEを用いて決定し、標準的薬理学的分析を用いて50％阻害影響に必要なモル濃度を推定する。アッセイの条件下では、全ての化合物の上位25％にランク入りしている化合物が好ましいが、26〜75％にランク入りしている化合物も利用性はある。
【００８４】
より具体的には、NCEである化合物Ａを、野生型PAI-1と混合すると、uPAに対するPAI-1の作用の100％の低減をもたらす。同じくNCEである化合物Ｂを、野生型PAI-1と混合すると、同じくuPAに対するPAI-1の作用の100％の低減をもたらす。化合物Ａを、変異型PAI-1 S331Rと混合すると、uPAに対するこの変異体の作用の50％の低減をもたらす。化合物Ｂを、変異型PAI-1 S331Rと混合すると、uPAに対するこの変異体の作用の0％の低減をもたらす。変異型PAI-1 S331Rに対する化合物Ｂの作用の低減が完全に不在であることは、化合物Ｂが変異型PAI-1S331Rと結合しないことを示す。一方、変異型PAI-1 S331Eに対する化合物Ａの作用の50％の低減は、化合物Ａが変異型PAI-1 S331Rに結合することを示す。化合物Ｂの結合部位は、変異型PAI-1 S331R中のアミノ酸置換により同定され、これはPAI-1に対するMA33B8中の結合エピトープに対応する。
【００８５】
本実施例は、他の突然変異または結合部位を含むように拡張され得る。PAI-1中のMA33B8エピトープに結合する目的の化合物は、uPAに対するPAI-1の変異体の作用の50〜100％の低減、25〜49％の低減、または0〜24％の低減のいずれかを示す。uPAに対するPAI-1変異体の作用の0〜24％の低減を有する化合物は、活性を示すと考慮される。
【００８６】
本実施例は、PAI-1の標的プロテアーゼとしてuPAを含むがこれに限定されない。同じ意味で、本実施例は、化合物結合の標的である準安定タンパク質であるPAI-1およびPAI-1の変異体に対する意義に限定されない。活性の測定のためのPAI-1に対する化合物の作用の低減％の範囲は、例示の目的で示すものであり、変化し得る。
【００８７】
本発明のスクリーニング方法論を介して同定される化合物は、PAI-1のインヒビターであり、従って、哺乳動物(好ましくはヒト)における、PAI-1の生成および/または作用を伴うプロセスを治療、阻害、妨害または予防するのに有用である。従って、本発明の化合物は、以下のことに関して有用であり得る：すなわち
・非インスリン依存型糖尿病の治療または予防；
・冠状動脈および脳血管疾患に伴う血栓事象の予防；
・アテローム硬化性プラークの形成、静脈および動脈血栓、心筋虚血、心房性細動、深静脈血栓、凝固症候群、肺線維症、脳血栓症、手術(関節置換等)の血栓塞栓合併症、および末梢性動脈閉塞を含むがこれらに限定されない、血栓および血栓前(prothrombotic)状態を伴う疾患進行の阻害；
・慢性閉塞性肺疾患、多嚢胞性卵巣症候群、再狭窄、腎血管疾患および器官移植拒絶を含むがこれらに限定されない、細胞外マトリックス蓄積に伴う疾患の治療
・糖尿病性網膜症等の新脈管形成に伴う悪性疾患および疾患の治療；
・血管手術、血管移植片およびステント開通性を含む血管開通性、ならびに器官、組織および細胞の組織移植および移植を維持するかまたは生じ得るプロセスまたは手順と共に使用し、これらに従うこと；
・感染に伴う炎症性疾患、敗血症性ショックおよび血管障害の治療
・透析および流体相での血液保存で使用する血液および血液生成物(特に、ex vivo血小板凝集)の治療；
・化合物をヒト血漿に添加して、その繊溶能力を決定する、病院内での血液化学物質の分析の間；
・血栓崩壊前、繊溶および抗凝固剤との組み合わせ；
・乳癌および子宮癌(ただし、これらに限定されない)を含む癌の治療、および転移性癌の同定における造影剤；
・基質細胞過形成を調節し、細胞外マトリックスタンパク質の増加を生じることによって、骨髄様化生を伴う骨髄線維症の治療
・繊溶欠陥および過剰凝固に由来する、(例えば、以下の療法を受けているHIV-1感染患者における)疾患を治療するために、プロテアーゼインヒビターを含有する高活性抗レトロウイルス療法(HAART)との使用；ならびに
・糖尿病ネフロパシーの治療、およびネフロパシーを伴う腎臓透析。
【００８８】
より一般的には、本発明の化合物は、凝固恒常性を改善、および敗血症、肥満症、インスリン抵抗性、乾癬および他の増殖性疾患、脳血管疾患、微小血管疾患、高血圧、痴呆、骨粗鬆症、関節炎、喘息、心不全、不整脈、およびアンギナを治療するのに有用である。本発明の化合物はまた、例えば、アテローム硬化症、骨粗鬆症、および骨減少症を治療、予防またはそれらの進行を逆転させる際のホルモン置換剤としても採用され得る。これはまた、炎症性マーカーを減少、Ｃ反応性タンパク質を減少、および低級血管炎症、発作、痴呆および冠動脈心臓疾患を治療、また、心筋梗塞、安定性および不安定性アンギナを一次的および二次的に予防、心臓血管事象を一次的および二次的に予防、末梢血管疾患、末梢性動脈疾患、急性血管症候群を緩和、心筋血管再新生過程を経る危険性を低下、ネフロパシー、ニューロパシー、網膜症およびネフローゼ症候群等の微小血管疾患、高血圧、Ｉおよび２型糖尿病および関連疾患、高血糖症、高インスリン血症、悪性病巣、前悪性病巣、胃腸悪性疾患、脂肪肉腫および上皮腫瘍ならびに全ての形態の脳血管疾患を治療、ならびに内皮機能を改善するためにも採用され得る。
【００８９】
本発明の化合物は、アルツハイマー病の治療においても有用である。このアプローチは、本発明によれば、(特に、アルツハイマー病を患っているかまたはその危険性にさらされている)被検体におけるプラスミンレベルを増加または標準化する方法を特徴とし得る。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、特定のクローン由来の5'および3'非翻訳領域を有する、ヒトPAI-1をコードするヌクレオチド配列を示す。シグナル配列を含む完全長ヒトPAI-1のアミノ酸配列も示す。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図１Ｃ】図１Ｂの続きである。
【図１Ｄ】図１Ｃの続きである。
【図２】ヒトPAI-1上のMA-33B3モノクローナル抗体結合部位をマッピングするための、ヒトPAI-1分子中で生成される具体的な部位特異的突然変異の一覧表を示す。
【図３】図１に示すアミノ酸配列中で見とめられたアミノ酸置換を示す11の個別のヒトPAI-1クローン、およびこれらの変異型クローンの対応する機能活性をまとめた表を示す。
【図４】野生型および変異型ヒトPAI-1のMA-33B8誘導型不活化を示す。●＝野生型PAI-1；黒三角＝141B；◆＝S331R；および■＝D89G。
【図５】BIAcore 3000バイオセンサで測定した、不活化マウスモノクローナル33B8抗体と、複数(multiple)(A)および部位特異的(B)hPAI-1変異体とのリアルタイムでの結合を示す。マウスモノクローナル33B8抗体は、アミン共役法により、研究級チップCM5(BIAcore)上に固定化した。62 nM活性PAI-1を含むHBS-P緩衝液(pH 7.4)(BIAcore)に入った大腸菌細胞非含有抽出物のサンプルを、20μl/分の流速でHBS-P緩衝液に注入した。会合および解離を、５分間、リアルタイムで観察した。パネルＡ：1-wt hPAI-1；2-mm1；3-mm1M；4-mm3；5-mm3M；6-mm4M；7-mm5；8-mm7；9-mm8；10-mm9；11-mm10。パネルＢ：1-wt hPAI-1；2-N87Dsdm；3-K88Esdm；4-D89Gsdm；5-Q174Rsdm；6-G230Vsdm；7-T232Ssdm；8-N329Isdm；9-S331Rsdm。
【図６】モノクローナル抗体33B8の結合に特に欠陥のあるPAI-1変異体を作製するために構築された８つの部位特異的突然変異を、生じさせた特定のヌクレオチド置換、およびこれらの置換を導入するために使用した突然変異プライマーと共に示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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