(57)【要約】本発明は、生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質、その断片または誘導体を次の特性を持つ１またはそれ以上のモジュールとして利用するＨＩＶ／ＡＩＤＳ，その他感染症、炎症性および血管新生疾患、並びに腫瘍の予防および／または治療ワクチン接種、並び／或いは治療および／または診断のための方法に関する：抗原、アジュバント、並びに樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含む特異抗原提示細胞に対する標的−運搬システム。具体的には、Ｔａｔは生物活性の形でのみ１またはそれ以上の他抗原と組合わせた抗原として利用でき、それ自身および他抗原に対する防御免疫反応をプライミングおよびブーストすること、並びに／或いは樹状細胞、内皮細胞、マクロファージの様なＡ  ＰＣを標的とし、そしてそれら細胞の成熟および機能を活性化し、アジュバントとしてＴｈ−１型免疫反応を高めることができる能力を利用して、これら抗原および活性化合物を樹状細胞、内皮細胞、マクロファージに運搬することができる。従って、これら特性および上記細胞の（生理学的および病理学的障害時の）体内分布を利用することで、生物活性Ｔａｔ、ＲＧＤ領域を含むその断片または誘導体を、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、その他感染症、炎症性および血管新生疾患、並びに腫瘍の予防、治療および／または診断目的に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１および／またはαｖβ３インテグリン発現抗原提示細胞を選択的に標的とし、それらの細胞膜および／または核膜を通りカーゴ分子を運搬して、それら細胞の成熟および／またはそれらの抗原提示機能を誘導することを目的とする、単離された未変性の実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その断片および誘導体の使用。
【請求項２】
単離された未変性の実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その断片または誘導体が、樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１およびαｂβ３インテグリン発現抗原提示細胞に選択的に結合したＴａｔ、断片、その誘導体およびＴａｔ、断片、その誘導体に結合したカーゴ分子の両方を取り込むために、これら細胞を選択に標的とする、請求項１記載の使用。
【請求項３】
単離された未変性の実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１  ｔａｔ、その断片または誘導体が、樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１およびαｖβ３インテグリン発現抗原提示細胞を選択的に標的として、これに結合し、侵入してそれら細胞の成熟、および／またはそれら細胞の抗原提示機能を誘導する、請求項１記載の使用。
【請求項４】
抗原および／または治療化合物を運搬することを目的として、樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むがこれらに限定されない、インテグリン介在経路および／または選択的取込を可能とするその他取込み経路を介してＴａｔを取込むことができる、α５β１およびαｖβ３インテグリンまたはその他インテグリンを発現する抗原提示細胞を選択的に標的とする、請求項２記載の使用。
【請求項５】
Ｔａｔがペプチド、タンパク質またはそれらをコードするＤＮＡの形で抗原を運搬する、請求項４記載の使用。
【請求項６】
Ｔａｔが１またはそれ以上の抗原を運搬して免疫反応を誘導する、請求項５記載の使用。
【請求項７】
抗原が、ウイルス、結核菌、カンジダ、マラリアといった細胞内病原体、または肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌細胞の様な癌細胞に由来するものであるが、ＨＩＶ抗原であるＧａｇ、Ｎｅｆ、Ｒｅｖは特に除かれる抗原から選択される、請求項６記載の使用。
【請求項８】
タンパク質、ペプチドまたはそれらをコードより選択された化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内または細胞膜に運搬する目的で、Ｔａｔを１またはそれ以上のこれら化合物と融合する、請求項４記載の使用。
【請求項９】
化合物が、ウイルス、結核菌、カンジダ、マラリアといった細胞内病原体、または肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌等の癌細胞に由来するが、ＨＩＶ抗原であるＧａｇ、Ｎｅｆ、Ｒｅｖは特に除く抗原より選択される１またはそれ以上の抗原である、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
Ｔａｔと融合する化合物が抗ウイルス化合物、抗炎症薬、抗血管新生分子、細胞傷害性抗腫瘍薬、ケモカインまたはサイトカインの様な免疫変調分子、抗体およびそれらの混合物から選択される１またはそれ以上の治療分子である、請求項８記載の使用。
【請求項１１】
Ｔａｔが単独、またはタンパク質、ペプチド若しくはそれらをコードするＤＮＡの形をしたその他化合物と組合わさり、マイクロパーティクル、ナノパーティクル、リポソームおよびその他粒子状の不活性キャリアーおよびその混合物の様なパーティクルに結合している、請求項２記載の使用。
【請求項１２】
化合物が、ウイルス、結核菌、カンジダ、マラリアといった細胞内病原体、または肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌細胞の様な癌細胞に由来するが、ＨＩＶ抗原であるＧａｇ、Ｎｅｆ、Ｒｅｖは特に除く抗原から選択される１またはそれ以上の抗原である、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
化合物が、抗ウイルス化合物、抗炎症薬、抗血管新生分子、細胞傷害性抗腫瘍薬、ケモカインまたはサイトカインの様な免疫変調分子、抗体およびそれらの混合物から選択される１またはそれ以上の治療分子である、請求項１１記載の使用。
【請求項１４】
化合物が１またはそれ以上の発現ベクターである、請求項２および１１記載の使用。
【請求項１５】
発現ベクターが１またはそれ以上の抗原を発現するプラスミドＤＮＡ、細菌またはウイルスベクターから選択される、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
１またはそれ以上の抗原を運搬して感染症および腫瘍に対する免疫反応を高め、そしてＴｈ−１型免疫反応を誘導するために、インテグリン介在経路および／または選択的取込みを可能にするその他取込み経路を介してＴａｔを取り込むことができる樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むが、これらに限定されないα５β１およびαｖβ３またはその他インテグリンを発現する抗原提示細胞を選択的に標的とする、請求項３記載の使用。
【請求項１７】
Ｔａｔがタンパク質、ペプチド若しくはそれらをコードするＤＮＡの形で抗原を運搬する、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
Ｔａｔが１またはそれ以上の抗原を運搬し、免疫反応を誘導する、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
タンパク質、ペプチドまたはそれらをコードするＤＮＡから選択された１またはそれ以上の化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内または細胞膜に運搬することを目的として、Ｔａｔをそれら化合物と融合する、請求項１６記載の使用。
【請求項２０】
化合物が１またはそれ以上のケモカインまたはサイトカインの様な免疫変調分子、抗体、およびそれらの混合物である、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
化合物がウイルス、結核菌、カンジダ、マラリアといった細胞内病原体、または肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌細胞の様な癌細胞に由来するが、ＨＩＶ抗原であるＧａｇ、Ｎｅｆ、Ｒｅｖは特に除く抗原から選択される１またはそれ以上の抗原である、請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
Ｔａｔが単独、またはタンパク質、ペプチド若しくはそれらをコードするＤＮＡの形をしたその他化合物と組合わさり、マイクロパーティクル、ナノパーティクル、リポソームおよびその他粒子状の不活性キャリアーおよびその混合物の様なパーティクルに結合している、請求項３記載の使用。
【請求項２３】
化合物が、ウイルス、結核菌、カンジダ、マラリアといった細胞内病原体、または肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌細胞の様な癌細胞に由来するが、ＨＩＶ抗原であるＧａｇ、Ｎｅｆ、Ｒｅｖは特に除く抗原から選択される１またはそれ以上の抗原である、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
化合物が、１またはそれ以上のケモカインまたはサイトカインの様な免疫変調分子、抗体およびそれらの混合物である、請求項２２記載の使用。
【請求項２５】
化合物が１またはそれ以上の発現ベクターである、請求項３および２２に記載の使用。
【請求項２６】
発現ベクターが１またはそれ以上の抗原を発現するプラスミドＤＮＡ、細菌またはウイルスベクターから選択される、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
感染症に対する予防および治療ワクチン接種用ワクチンの製造への、前記請求項に記載の使用。
【請求項２８】
腫瘍に対する予防および治療ワクチン接種用ワクチンの製造への、前記請求項に記載の使用。
【請求項２９】
感染症治療用医薬品製造への、前記請求項に記載の使用。
【請求項３０】
腫瘍治療用医薬品製造への、前記請求項に記載の使用。
【請求項３１】
炎症性および血管新生疾患を治療する医薬品の製造への、前記請求項に記載の使用。
【請求項３２】
感染症または腫瘍に対する予防および治療ワクチン接種用ワクチンの製造への、ｔａｔ  ＤＮＡ、その断片または誘導体の使用。
【請求項３３】
感染症、炎症性疾患、血管新生疾患、腫瘍から選択される疾患の治療のための医薬品製造への、ｔａｔ  ＤＮＡ、その断片または誘導体の使用。
【請求項３４】
感染症および腫瘍に対する予防および治療ワクチン接種用ワクチンの製造への、他抗原をコードするＤＮＡと融合または組合わせたｔａｔＤＮＡ、その断片および誘導体の使用。
【請求項３５】
ｔａｔ  ＤＮＡが、ウイルス、結核菌、カンジダ、マラリアの様な細胞内病原体の抗原、または肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌の抗原の様な癌細胞抗原であるが、ＨＩＶ抗原であるＧａｇ，Ｎｅｔ，Ｒｅｖを特に除いた抗原より選択された抗原と組み合わされる、請求項３２〜３４記載の使用。
【請求項３６】
ｔａｔ  ＤＮＡが単独、または他抗原ＤＮＡまたは治療用化合物と組合わさり、マイクロパーティクル、ナノパーティクル、リポソームおよびその他粒子状の不活性キャリアおよびその混合物の様なパーティクルに結合している、請求項３２〜３５記載の使用。
【請求項３７】
ｔａｔ  ＤＮＡが配列番号１、９９または１０１に記載のヌクレオチド配列を含み成る、前記請求項に記載の使用。
【請求項３８】
Ｔａｔが配列番号２、１００または１０２に記載のアミノ酸配列を含み成る、前記請求項に記載の使用。
【請求項３９】
生物活性Ｔａｔの断片またはｔａｔ  ＤＮＡが、ＲＧＤドメイン、富システインドメイン、塩基性ドメインを単独または連続する形で含み成るＴａｔペプチドまたは対応するｔａｔ  ＤＮＡから選択される、前記請求項に記載の使用。
【請求項４０】
断片が、コアドメイン：ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０内ａａ３８から４７および／またはＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０内のアミノ末端領域ａａ１から２０を含んで成る他ＨＩＶ−１  Ｔａｔペプチドまたは対応するｔａｔ  ＤＮＡと組合わされている、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
ＲＧＤドメインが：ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０内ａａ７３から８６、ａａ７４から８４、ａａ７５から８３、ａａ７６から８２、ａａ７７から８１、ａａ７７から８２、ａａ７７から８３、ａａ７６から８４を含んで成り；富システインドメインが：ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０内ａａ２２から３７を含んで成り；塩基性ドメインがＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０内ａａ４８から６１を含んで成り、並びに上記各ドメインが上記配列に対応するヌクレオチド配列を含んで成る、請求項３９〜４０に記載の使用。
【請求項４２】
生物活性Ｔａｔまたはｔａｔ  ＤＮＡの断片が、それらのアミノ酸配列または対応するヌクレオチド配列ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０または８９．６の中に、１またはそれ以上のＴ細胞エピトープを含んでいるＨＩＶ変異体（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２並びにその他の型およびサブタイプのＨＩＶ）から選択される、請求項１〜３８に記載の使用。
【請求項４３】
Ｔａｔまたはｔａｔ  ＤＮＡの誘導体が、ｃｙｓ２２および／またはｌｙｓ４１のアミノ酸配列または対応するヌクレオチド配列を含んで成るものより選択された、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のＴａｔ突然変異体を含んで成る、請求項１〜３８に記載の使用。
【請求項４４】
活性実体として有効量の生物活性ＨＩＶ  Ｔａｔまたはｔａｔ  ＤＮＡ，その断片または誘導体を、次のものの少なくとも一つと組合せてまたは融合して含んで成る、感染症および腫瘍に対する予防および治療ワクチン接種用、或いは感染症、炎症性および血管新生疾患、腫瘍から選択される疾患の治療用医薬品組成物：抗原、治療化合物、支持体パーティクル。
【請求項４５】
抗原がウイルス、結核菌、カンジダ、マラリアの様な細胞内病原体の抗原、または肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌より得た抗原の様な腫瘍細胞の抗原であるが、特にＨＩＶ抗原であるＧａｇ，Ｎｅｔ，Ｒｅｖを除いた抗原より選択されたものである、請求項４４記載の医薬品組成物。
【請求項４６】
治療化合物が、抗ウイルス化合物、抗炎症剤、抗血管新生分子、細胞傷害性抗癌剤、ケモカインまたはサイトカインの様な免疫変調分子、抗体およびこれらの混合物より選択される、請求項４４記載の医薬品組成物。
【請求項４７】
支持体粒子が：マイクロパーティクル、ナノパーティクル、リポソームおよび粒子を用いた運搬システム、ならびにそれらの混合物より選択される、請求項４４記載の医薬品組成物。
【請求項４８】
アジュバントがＡｌｕｍ、ＲＩＢＩ、ＩＳＣＯＭＳ、ＣｐＧ配列、リポペプチドおよびそれらの混合物より選択される、請求項４４記載の医薬品組成物。
【請求項４９】
感染症が、性感染症、心内膜炎、尿路感染、骨髄炎、皮膚感染または連鎖球菌およびブドウ球菌感染、肺炎双球菌感染、破傷風、髄膜炎菌感染症、結核、マラリア、カンジダ症、ヘリコバクター感染、サルモネラ、梅毒、水痘、単核細胞症およびエプスタインバー由来感染、ヒトヘルペスウイルス８型感染、サイトメガロウイルス、口唇ヘルペスおよび陰部ヘルペスを含むヘルペス感染、肝炎ウイルス感染（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ）、パピローマウイルス原因感染、インフルエンザ、リステリア、ビブリオこれらを含むヒトまたは動物のウイルス、細菌またはその他細胞内および細胞外病原体を原因とする感染より選択される、請求項４４記載の医薬品組成物。
【請求項５０】
炎症性疾患が、免疫媒介皮膚疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ関節炎、全身性硬化症、白癬、シューグレン症候群、グッドパスチャー症候群、血管炎、サルコイドーシス、骨関節症、感染性関節炎、乾癬、クローン病、直腸結腸潰瘍、甲状腺炎、軟皮症、アレルギー性疾患を含む、ウイルス、細菌または寄生虫感染を伴う或いは伴わないアレルギーまたは炎症である、請求項４４記載の医薬品組成物。
【請求項５１】
血管新生疾患が、糖尿病性網膜症、水晶体後方繊維増殖症、トラコーマ、血管性緑内障、乾癬、免疫炎症、非免疫炎症、アテローム性動脈硬化症、過度の創傷治癒、皮膚脈管炎、結腸血管形成異常、血管性浮腫および血管繊維種を含む非新生物性の血管増殖性の疾患より選択される、請求項４４記載の医薬品組成物。
【請求項５２】
腫瘍が、例えばカポシ肉腫や皮膚、肺、乳房、胃、肝臓、膵臓、内分泌組織、子宮、卵巣のその他新生物、肉腫、急性および慢性白血病、ならびにリンパ細胞の新生物であるが、これらに限定されない軟組織、骨、軟骨および血液を含む良性および悪性腫瘍より選択される、請求項４４記載の医薬品組成物。
【請求項５３】
アジュバント、希釈液、賦形剤、キャリアーを更に含む、請求項４４〜５２に記載の、医薬品組成物。
【請求項５４】
錠剤、ピル、噴霧薬、注射液、懸濁液、粉末、クリーム、軟膏の形である、請求項４４〜５２に記載の、医薬品組成物。
【請求項５５】
非腸管経路：皮下、筋肉内、皮内；または粘膜経路：膣、直腸、口腔、鼻；または局所経路より投与される、請求項４４〜５２に記載の、医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は少量の未変性で実質モノマーである生物学的に活性なＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その断片または誘導体が、（ｉ）ＲＧＤドメインを介して樹状細胞、マクロファージおよびサイトカイン活性化内皮細胞（以下ＡＰＣ）といった抗原提示細胞状に選択的に発現しているα５β１およびインテグリンに特異的に結合すること、（ｉｉ）ＡＰＣ内に効率的に入り込み、（ｉｉｉ）樹状細胞および内皮細胞の成熟および活性化を促進し、そして（ｉｖ）主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩ拘束抗原提示経路の両方にアクセスするという新規且つ予想外の発見に基づくものである。従って本発明は、上記生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その断片または誘導体に固有および相関する性質についてのこれら発見を、１）本発明の第一実施態様に於いてＰＡＣをカーゴ分子に選択的に狙わせ、これに結合させ、そして運搬すること、２）本発明の第二実施態様に於いて、樹状細胞および内皮細胞を選択的に狙わせ、そして結合させることでそれら細胞の成熟および活性化を促進し、そしてそれ自身、なかんずくは他の抗原に対するＴｈ−１型免疫反応を誘導することによって、もとより以下に限定されるものではないが感染症、炎症性や血管由来の疾患、および腫瘍等の特定ヒト疾患に関する抗原性および治療（以後ひとまとめに「カーゴ」と呼ぶ）分子両方に関する運搬システムとして、ならびに予防および治療ワクチン応用向け単価あるいは多価抗原ワクチンのアジュバントおよび免疫変調剤として利用することを目的とする。
【０００２】
具体的には、本発明は１）カーゴ分子にＰＡＣを特異的に狙わせ、そしてＰＡＣにカーゴ分子を運搬して感染症、炎症性および血管形成性疾患または腫瘍に対しヒトを免疫または治療する方法、２）１またはそれ以上の病原菌による感染に対するヒトの予防的および治療的に免疫に於いて、他抗原の免疫活性を上げる方法に関する。
【０００３】
本発明は、具体的および一義的には、本発明の薬物または抗原運搬実施態様に於いては、未変性の、実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質、その断片または誘導体の、ＡＰＣを特異的に標的として細胞外膜および核膜を通してカーゴ分子を運搬すること；並びに本発明のワクチン−アジュバントおよび免疫変調の実施態様に於いては樹状細胞および内皮細胞を特異的に標的としてそれら細胞の成熟を促進し、活性化して他抗原に対するＴｈ−１型免疫反応を誘導することへの応用に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｔａｔはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）が感染後の極めて初期に産生するウイルス遺伝子の発現、複製および感染性にとって必須な制御タンパク質である。ＨＩＶによるＴ細胞の急性感染期にＴａｔは細胞外環境にも放出され、隣接細胞によって取り込まれ、そこで濃度に応じてウイルス感染性を高める。具体的には、取り込まれたＴａｔは感染細胞の中で遺伝子の発現と複製を高め、そして未感染細胞ではマクロファージおよびＴリンパ細胞−指向性ＨＩＶ−１株の両方の伝染を媒介するβ−ケモカイン受容体であるＣＣＲ５およびＣＣＲ４の発現を高めることができる。細胞外ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質はまたＨＩＶ感染者に特に多発する血管肉腫であるカポシ肉腫（ＫＳ）の頻度増加と進行にも関わっている。具体的には、これまでの我々および他グループの研究は、ＴａｔがＫＳ患者で強く発現している血管新生および炎症性サイトカインと共同して、新血管の形成（血管新生）および内皮細胞起源の紡錘型細胞（ＫＳ細胞）や活性化内皮細胞の増殖と移動を誘導することを示した。さらにＨＩＶ−１  ＢＨ−１０  Ｔａｔタンパク質の２１から４０（コア領域）までに含まれる配列はトランスアクチベータとして機能し、ＨＩＶの複製を誘導し、そしてアポトーシスを引き起こすことが示されている。具体的には、我々のデータは生物活性ＴａｔがそのＲＧＤ領域を介してインテグリン受容体α５β１およびαｖβ３に結合すること、そしてその相互作用がＫＳ細胞および炎症性サイトカインで活性化された内皮細胞にＴａｔで誘導された接着、増殖および運動を伝達することを示している。更にＴａｔはまたこれら細胞ならびに単核細胞および樹状細胞（ＤＣ）の走化性因子としても機能する。最終的に我々のデータはＫＳおよびＨＵＶＥ細胞のＴａｔタンパク質に向かう移動および浸潤がα５β１およびαｖβ３インテグリンへのＴａｔ  ＲＧＤ領域の結合により伝達されていることを示した。
【０００５】
これらの発見に一致して、Ｔａｔに対する免疫反応がＡＩＤＳやＡＩＤＳ関連疾患の進行の治療に於いて重要な役割を果たすことが示されている。実際、Ｔａｔ−特異的免疫反応がＨＩＶ−１感染者およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に感染したサルに認められており、そして感染の症候性ステージの進行とは逆相関している。更に、生物活性Ｔａｔタンパク質によるワクチン接種またはｔａｔ  ＤＮＡはＳＨＩＶ８９．６Ｐウイルスの複製、および特異的細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬｓ）を含むＴｈ−１応答の存在と相関する病気の発症とに対する防御を誘導する。最近同じ防御データがマカークにウイルスベクターを使って供与されたｔａｔ−ｒｅｖワクチンについても観察されている。これに対し不活性化ＴａｔまたはＴａｔペプチドによるワクチン接種を受けたサルでは限定的な感染抑制が観察されており、これらの名では抗体およびＴヘルパー特的反応は誘導されるが、ＣＴＬｓおよびＴｈ−１応答は共に誘導されなかった。更に低用量（５〜６μｇ）の未変性の活性Ｔａｔタンパク質のみを繰り返しサルに皮内（ｉ．ｄ．）接種すると、顕著な抗体産生なしにＴｈ−１応答および特異的ＣＴＬｓが誘導された。これら免疫学的結果は最近４匹のサルに未変性Ｔａｔのみを繰り返しｉ．ｄ．するという新たなワクチンプロトコールで確認され（未発表データ）、公開されているもの、および進行中のｔａｔＤＮＡを使ったｉ．ｍ．ワクチン接種で誘導されたものと同等であった。同様にＳＩＶ感染マカークで行われた最近の研究は、抗Ｔａｔ  ＣＴＬが初感染後の初期ウイルス複製制御にとって重要であり、ウイルスに免疫圧を及ぼして複製を遅らせ、病原性のエスケープウイルスを少なくすることを示している。最終的に、Ｔａｔは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原と共に提示され、その結果抗−Ｔａｔ  ＣＴＬを誘導する。
【０００６】
マイクロモル濃度の組換え体Ｔａｔタンパク質（生物活性が不明なことが多い）またはＴａｔの塩基性領域を含むペプチドは、多くの種類の細胞に入り込むことが示されている。実際、Ｔａｔ残基４８−５７が持つ強い塩基性負荷が、あらゆるタイプの細胞の膜に存在している硫酸ヘパランプロテオグリカンへのこのタンパク質の結合を可能にしている。細胞外Ｔａｔの分画は急性感染細胞から放出された後で、その塩基性残基を介してＨＳＰＧに結合する。これにより細胞外Ｔａｔは、複数の生長因子で既に認められている様にタンパク質分解から保護される。細胞表面ＨＳＰＧへの前記塩基性領域の結合を介して、Ｔａｔは受容体と関係のない経路を通り内部に取り込まれる。実際、Ｔａｔ残基４９〜５７（ＢＨ−１０  Ｔａｔ配列に於いて）がＤＣの細胞質内にＯＶＡペプチドを移動できること、およびこのペプチドに対しＣＤ８＋Ｔ細胞を感作できることが示されている（Ｋｉｍ、１９９７年）。更に、４７〜５７Ｔａｔ配列（ＢＨ−１０変異体由来）は複数のエフェクタータンパク質と融合しており、それらタンパク質を細胞に運ぶことができることが示唆されている。しかし、この取込みのメカニズムは高濃度（マイクロモル）のＴａｔを必要とし、いずれのタイプの細胞でも起こり、配列特異的ではない。実際、その塩基性負荷を変えないこの領域の突然変異はＴａｔ塩基性領域のこの性質に影響しない。同様に、Ｔａｔ塩基性領域をＨＩＶ  ｒｅｖまたはその他遺伝子で治験してもＴａｔの性質は変わらない。これに関し、Ｔａｔの塩基性領域が、そのメンバーの全てが多くのタイプの細胞に侵入できる「ペネトラチンズ（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｓ）」として知られるタンパク質の小ファミリーのメンバーに認められる富アルギニン領域に極めてよく似ていることが示されている。実際、アルギニンホモポリマーはＴａｔ塩基性領域に比べさらに効率的に細胞内に入ることが知られている。
【０００７】
細胞によって取り込まれるＴａｔ塩基性領域の性質は各種細胞に外来タンパク質を運び込むのに利用されている。この目的の為に、外来タンパク質には導入タンパク質のキャリアーとして用いられているＴａｔ塩基性領域が結合または融合されている（Ｆａｗｌ  １９９４年；Ｗｅｎｄｅｒ  ２０００年；およびＷＯ  ０１１９３９３）。しかし発明者はＨＳＰＧが遍在的に発現することから、Ｔａｔ塩基性領域を選択的ターゲティング、運搬および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む特定の一次細胞によるＴａｔ取込みには用いることができないと考えている。
【０００８】
ＡＰＣは外来分子と出会うこと前記免疫反応を開始し、進行する。典型的なＡＰＣとしては、単核細胞由来ＤＣ（ＭＤＤＣ）、Ｔ細胞芽細胞（ＴＣＢ）、Ｂ−リンパ芽球細胞株（ＢＬＣＬ）および単核細胞−マクロファージが挙げられる。更に、炎症性サイトカインによる活性化される場合には、内皮細胞もＡＰＣ機能を獲得する。これら炎症性サイトカインの中では、インターロイキン（ＩＬ）−１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターフェロン（ＩＦＮ）γが内皮細胞の活性化には重要である（Ｐｏｂｅｒ  １９８８年）。これらサイトカインへの曝露により内皮細胞内でのα５β１およびαｖβ３の発現は増加するが、これらは複数ある細胞表面レセプターのなかでもとりわけＴａｔに結合するレセプターである。これら全てのＰＡＣの中では、ＤＣが最も有効なＰＡＣであり、感染および腫瘍に対する免疫反応の誘導の鍵である。それらの機能はＭＨＣおよび補助刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）の高発現、並びにＴリンパ細胞を活性化することが知られているサイトカインおよびβ−ケモカインの産生と関係している。抗原と遭遇すると、ＤＣは補助刺激分子の発現増加および貪食能力と飲能力の低下を特徴とする成熟プロセスに入る。更に、ホーミング受容体であるＣＣＲ７のアップレギュレーションとＣＣＲ５のダウンレギュレーションによって、成熟ＤＣはリンパ節に移動し、そこでＤＣはＴリンパ細胞に抗原を提示する。
【０００９】
従来技術はＤＣへのＴａｔタンパク質の添加がこれら細胞に於ける細胞外カルシウムの流入、インターロイキン−１２の産生、およびアポトーシス体の取込みを阻止することを示している。その結果、抗原の取込み、処理および提示、並びにＴｈ−１反応の誘導を含む、重要なＤＣ機能が大きく障害されると推測される。更に、Ｔａｔに曝露すると末梢血単核細胞での貪食リソゾームの融合が障害を受けることが報告されており、殺菌および交点処理（および提示）機能の両方を持つこのタイプの細胞が障害されることが示唆されている。さらにＴａｔは単核細胞／マクロファージおよびリンパ細胞の両方にＩＬ−１０の分泌を誘導するが、一方単核細胞に於いてはＩＬ−１２の産生を阻害すると報告されている。最終的には、ＴａｔにＰＡＣが曝露すると、ＰＡＣの細胞クラスター形成能およびＴ細胞を適切に活性化する能力が障害を受けると報告されている。更に、従来技術はＴａｔが分裂促進である抗ＣＤ３または特異抗原に対する反応の抑制、Ｔ細胞の過剰活性化およびＴ細胞アポトーシスを含め、Ｔ細胞機能を強く障害することを示している。更に生物活性Ｔａｔの接種がｉｎ  ｖｉｖｏでは免疫抑制的であると報告されている。免疫系に及ぼすＴａｔの効果の一部は、Ｔａｔによるケモカイン受容体であるＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４のアップレギュレーション、或いはＴａｔとケモカイン受容体ＣＣＲ２およびＣＣＲ３またはＣＤ２６、Ｆｌｔ−１、ＫＤＲを含むその他受容体との直接相互作用と関係しているが、これら受容体は免疫細胞ならびに内皮細胞で発現している。従って、この従来技術によれば、ＴａｔはＴｈ−２型の免疫反応を動かし、そして／または適切なＡＰＣ機能およびＴ細胞活性化を妨害するか、または破壊すると考えられる。
【特許文献１】
ＷＯ  ００／７８９６９Ａ１
【特許文献２】
ＰＣＴ  ＷＯ９９／２７９５８
【特許文献３】
ＷＯ  ０１／１９３９３  Ａ１
【特許文献４】
ＷＯ  ０１１９３９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これに対し本発明明細書に示された、実験証拠により裏付けされている我々の新たな予想外の発見は、（ｉ）ＡＰＣがＴａｔにより特異的に標的とされ、Ｔａｔはこれら細胞を選択的に認識してピコモルからナノモル濃度でその中に入るが、それには未変性で実質モノマーであり、生物活性的なＴａｔとα５β１、αｖβ３インテグリンとのＴＡＴ  ＲＧＤ配列を介した相互作用が必要であること；（ｉｉ）および未変性で実質モノマーである生物活性ＴａｔがＡＰＣの機能を阻害するのではなく、むしろ活性化してそれ自身に対する、および特には他抗原に対するＴｈ−１型免疫反応を抑制するのではなく、むしろ誘導することを示している。具体的には、我々のデータはＴａｔが抗原としてだけでなく強力な免疫変調特性を持つアジュバントとしても機能することを示している。Ｔａｔのこれら特性は、即ちピコモル−ナノモル濃度に於いてＡＰＣにより生物活性タンパク質として選択的に取り込まれ、そしてアジュバントとして機能するという特性は、相互に密接に関係している。具体的には、我々はＴＡＴのＲＧＤ配列がα５β１およびαｖβ３インテグリン受容体を介したこれら細胞による活性Ｔａｔの取込みにとって重要であることを見いだした。事実これらインテグリンを完全に遮断する抗体または競合リガンドは、ピコモル−ナノモル濃度の取込みをそれぞれ完全に無効にするか、または大きく低下させる。この取込みは非常に早く、用量−、細胞成熟度／分化度−および時間−依存的である。さらに予想外な事に、我々は単核細胞、Ｔ細胞芽細胞、またはＢ細胞芽細胞を含む他ＡＰＣ、或いは非活性化内皮細胞については同様の結果を得なかった。従って、従来技術はＴａｔがその塩基性領域を介して、非受容体媒介経路により、より高い濃度（マイクロモル）でのみ取り込まれることを示していたことから、これら発見は全く新規のものである。この取込み経路はいずれのタイプの細胞に起こり、成熟度／分化度−依存的でない。
【００１１】
更に我々は上記全ての新規効果が観察されるにはＴａｔが未変性で、実質モノマーであり、そして生物活性型の状態にある必要があり、これら効果はＴａｔが酸化され不活性化された場合に生じないことを見いだした。事実Ｔａｔは７個のシステインを持っており、酸化に対し極めて感受性であり、酸化が起こるとタンパク質の元の立体構造を失い、その結果生物活性を失う。従ってＴａｔは、このタンパク質がその元の立体構造を維持するように特別に工夫された方法を用いて精製されない場合には、その本来の立体構造と活性を失うと考えられる。当該分野の確立された概念は、生物活性Ｔａｔは有毒であると主張しているが、これに対し発明者が利用する高度に精製された生物活性型の組換え体Ｔａｔ調製体は内皮細胞、ＤＣ、マクロファージ、試験したその他細胞、またはｉｎ  ｖｉｖｏのマウス若しくはサルに対し細胞傷害性またはプロアポトーシス効果を持たない。
【００１２】
即ち、発明者はいずれかのＨＩＶ変異体またはそのＲＧＤ領域を含むその断片若しくは誘導体完全長、野生型、未変性の実質モノマーであり生物活性であるＴａｔは、Ｔａｔ  ＲＧＤ領域により認識されるインテグリンを発現する特定タイプの細胞を選択的に標的とし、これに分子を運ぶための極めて効率的なシステムとして利用できる。人体には極めて大量のＤＣ、マクロファージおよび内皮細胞が存在し、遍在していることから、発明者は生物活性ＴａｔまたはＲＧＤ配列を含むその断片若しくは誘導体が持つ、これらＡＰＣを標的としてＴｈ−１型細胞反応を起こす能力は、本発明のワクチン−アジュバントおよび免疫変調実施態様に於いて、１）Ｔａｔ特異的標的であり、感染、病的血管新生、炎症性疾患および腫瘍により集められて活性化される細胞にカーゴ分子を運搬する；２）Ｔａｔに対してだけでなくＴａｔによってまたはＴａｔと共に運搬されるその他抗原に対しても強力な免疫反応を誘導するという特有の機会を提供すると信じている。この信念は、不活性Ｔａｔタンパク質とは対照的に、生物活性Ｔａｔをワクチンとして用いHIV複製を制御し、そして病気の発症を阻止するという発明者によるこれまでの研究の成功によって強く支持されている。
【００１３】
本発明出願は我々の先特許出願ＷＯ  ９９／２７９５８と比べると、多くの点で本質的に異なっており、そして革新的である。事実、上記出願はＨＩＶ／ＡＩＤＳに対するワクチンとして有効である生物活性型ＴａｔまたはＴａｔをコードするＤＮＡを請求している。前記特許出願がなされた時点では、我々は少量（ピコモル〜ナノモル）の生物活性Ｔａｔ、またはＲＧＤ領域を含むその断片または誘導体が、（ｉ）特異的にＡＰＣを標的とすることを知らなかったため、ＡＰＣに対しカーゴ分子を選択的に運搬するキャリアーとしての応用を請求できなかった：そして（ｉｉ）ＥＣおよびＤＣ細胞を成熟化、活性化し、様々な抗原に対するＴｈ−１型免疫反応を誘導することを知らなかったため、我々はアジュバントおよび免疫変調剤としてのその利用について請求できなかった。
【００１４】
従って本発明では、第一実施態様に於いては、生物活性ＴａｔはＡＰＣに（ｉ）様々な感染性疾患（ＨＩＶ／ＡＩＤＳだけでなく）および腫瘍に対するワクチン接種を目的とする、または１またはそれ以上の感染性疾患に対する多価ワクチン接種を目的とする各種抗原または抗原の組合せ、並びに（ｉｉ）感染性、炎症性および血管形成性疾患、および腫瘍の増殖と転移の治療を目的とする治療分子を運搬する運搬システムとして提案されており、そして第二実施態様に於いては、生物活性Ｔａｔは各種抗原に対しＴ細胞媒介免疫反応を誘導するアジュバント、具体的には生物活性ＴａｔまたはＲＧＤ領域を含むその断片若しくは誘導体と組合せることまたは融合させることによって、特定の細胞内病原菌や腫瘍細胞により発現される抗原の様に免疫原性の低い抗原の免疫原性を高めるアジュバントとして提案されている。
【００１５】
まとめると、先行技術との差を形作る最も重要な革新点は、本発明では未変性の実質モノマーである生物活性Ｔａｔを、各種機能を発揮する分子、即ちＡＰＣに抗原を、または特定組織に対し活性化合物を選択的に運搬するキャリアーとして請求していること、および他抗原に対する免疫反応を刺激するアジュバントとして請求していることである。この予想外の性質が、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔを各種感染症（ＡＩＤＳに限らない）、炎症性および欠陥性疾患、並びに腫瘍での様々な応用に好適なものにしている。
【００１６】
即ち発明者は、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔ、ＲＧＤ配列を含むその断片または誘導体は、特定ＡＰＣへの運搬システム、またはアジュバントとしての機能の少なくとも一つを果たすと信じており、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、他の感染症、炎症性疾患および欠陥性疾患の予防と治療を目的とした、予防および治療ワクチン並びに／またはドラッグデリバリーシステムとして利用可能であることを主張する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の目的の一つは、未変性の、実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その断片または誘導体を用いて、α５β１およびαｖβ３インテグリンを発現している抗原提示細胞に選択的に狙いを定めることである。
【００１８】
本発明の別の目的は、未変性の、実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その断片または誘導体を用いて、樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含む抗原提示細胞が発現するα５β１およびαｖβ３インテグリンに選択的に狙いを定め、それら細胞にＴａｔ、その断片または誘導体を取り込ませることである。
【００１９】
本発明の別の目的は、未変性の、実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その断片または誘導体を用いて、樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１およびαｖβ３インテグリンを発現している抗原提示細胞に選択的に狙いを定め、Ｔａｔ、その断片または誘導体によりそれら細胞の成熟および／または抗原提示機能を誘導することである。
【００２０】
別の目的は、未変性の、実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その断片または誘導体を、細胞内病原体（例えばウイルス、結核菌、カンジダ、マラリア）および腫瘍細胞（例えば肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌由来の細胞）由来のペプチド、タンパク質またはそれらをコードするＤＮＡの形の抗原を含むがもとよりこれらに限定されない１またはそれ以上の抗原と組合せて使用し、感染症および腫瘍に対する予防および治療ワクチン接種または治療を目的として、樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１およびαｖβ３インテグリンを発現している抗原提示細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで選択的に狙いを定めることである。
【００２１】
その他目的は、感染症、炎症性および血管形成性疾患、並びに腫瘍の予防および治療ワクチン接種または治療を目的として、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔ、その断片または誘導体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで１またはそれ以上の抗原を樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１およびαｖβ３インテグリン発現抗原提示細胞に選択的に運搬し、免疫反応を誘導することである。
【００２２】
別の目的は、感染症、炎症性および血管形成性疾患、並びに腫瘍の予防および治療ワクチン接種または治療を目的として、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔ、その断片または誘導体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにて樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１およびαｖβ３インテグリン発現抗原提示細胞に１またはそれ以上の抗原または治療様化合物（例えば抗ウイルス化合物、抗炎症剤、抗血管形成分子、細胞傷害性抗癌剤または、ケモカイン若しくはサイトカインの様な免疫変調剤、或いは抗体であるが、これらに限定されない）を、支持体粒子（例えばマクロパーティクル、ナノパーティクル、リポソームおよびＳｐｅｉｓｅｒ  １９９１年およびＴａｋｅｕｃｈｉ、２００１年に記載されているようなその他の粒子運搬システムであるが、これらに限定されない）存在下、または非存在下に選択的に運搬することである。
【００２３】
別の目的は、感染症、炎症性および血管新生疾患、並びに腫瘍の予防および治療混合ワクチン接種または治療を目的として、他のタンパク質若しくはペプチドまたは支持体粒子（上記に同じ）と融合した未変性の、実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１、その断片若しくは誘導体をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで使用し、抗原または治療用化合物を樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１およびαｖβ３インテグリン発現抗原提示細胞に選択的に運搬することである。
【００２４】
別の目的は、感染症、炎症性および血管新生疾患、並びに腫瘍の予防および治療ワクチン接種または治療を目的として、抗原または治療用分子（上記に同じ）を運搬することを目的として、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔ、その断片または誘導体を用いて、抗原提示細胞並びにインテグリン伝達経路および／またはインテグリン受容体との結合に基づくその他の取込み経路を介してＴａｔを取り込むことができるその他の細胞の様なＲＧＤ結合インテグリン受容体発現細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで選択的に狙いを付けることである。
【００２５】
別の目的は、感染症、炎症性および血管新生疾患、並びに腫瘍の予防および治療ワクチン接種または治療を目的として、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔ、その断片または誘導体を、非腸管（皮下、筋肉内、皮内）または粘膜（膣、直腸、口腔、鼻）若しくは局所経路から投与された抗体、アジュバント（例えばＡｌｕｍ、ＲＩＢＩ、ＩＳＣＯＭＳ、ＣｐＧ配列、リポペプチドであるが、これらに限定されない）または治療分子、或いは支持体粒子（上記に同じ）と組合せ使用することである。
【００２６】
別の目的は、感染症、炎症性および血管新生疾患、並びに腫瘍の予防および治療ワクチン接種または治療を目的として、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔ、その断片または誘導体を用いて、支持体粒子（上記）内にあるか、または支持体粒子に結合した抗原または治療分子（上記）をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージも含めたＲＧＤ−結合インテグリン受容体発現抗原提示細胞に選択的に運搬することである。
【００２７】
別の目的は、感染症、炎症性および血管新生疾患、並びに腫瘍の予防および治療ワクチン接種または治療を目的として、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔ、その断片または誘導体を用いて、１またはそれ以上の抗原を発現するプラスミドＤＮＡを含む発現麦ターおよび細菌またはウイルスベクターを、支持体粒子（上記）存在下若しくは非存在下に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージも含めたＲＧＤ−結合インテグリン受容体発現抗原提示細胞に選択的に運搬することである。
【００２８】
別の目的は、感染症、炎症性および血管新生疾患、並びに腫瘍の混合予防および治療ワクチン接種を目的として、支持体粒子（上記）存在下または非存在下に、ｔａｔＤＮＡまたは抗原をコードするＤＮＡと融合または組合せて未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔ、その断片または誘導体を使用することである。
【００２９】
別の目的は、化学的若しくは物理的相互作用、またはその他の相互作用手段のいずれか組合せ、例えば以下に限定されるものではないがＴａｔおよびＤＮＡプラスミドのナノパーティクルへの吸着；同一医薬製剤へのＴａｔおよび合成薬の封入；化学的架橋またはその他方法によるＴａｔまたはその断片若しくは誘導体とペプチドとの結合；Ｔａｔ、その断片または誘導体とその他タンパク質またはペプチドとを、組換えＤＮＡ技術を用いてこれらポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が一つに融合されているキメラＤＮＡを細菌または真核生物内で発現させることによる融合といった組合せによって、抗原、治療分子（上記）、アジュバント（上記）または支持体粒子（上記）と結合または融合した未変性の、実質モノマーである生物活性ＨＩＶ  Ｔａｔまたはｔａｔ  ＤＮＡ、或いはその断片または誘導体である。
【００３０】
別の目的は、未変性の、実質モノマーである生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その断片または誘導体の、樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含むＲＧＤ結合インテグリン受容体発現細胞の抗原提示機能をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで活性化または高め、そしてＨＩＶ／ＡＩＤＳ、その他感染症および腫瘍に対するＴｈ−１型免疫反応を誘導するアジュバントとしての利用である。
【００３１】
別の目的は、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔタンパク質、ｔａｔＤＮＡ、その断片または誘導体の、非腸管（皮内、筋肉内、皮下）、粘膜（口腔、鼻、膣、直腸）または局所経路によるワクチン接種または治療処置に関する上記の使用である。
【００３２】
他の目的は、ＲＧＤドメイン（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ７３から８６；ａａ７４から８４；ａａ７５から８３；ａａ７６から８２；ａａ７７から８１；ａａ７７から８２；ａａ７７から８３；ａａ７６から８３）；富システインドメイン（ＨＴＬＶ０ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ２２から３７）；塩基性ドメイン（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０ではａａ４８から６１）を単独、または結合した状態で、コアドメイン（ＨＴＬＶ−ＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ３８から４７）および／またはアミノ末端領域（ＨＴＬＢ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ１から２０）を含む他ＨＩＶ−１  Ｔａｔペプチドと組合せた形、または組合せずに含んで成るＨＩＶ変異体（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびその他のタイプおよびサブタイプ）由来のＴａｔペプチドとして定義される、未変性で実質モノマーである生物活性Ｔａｔの断片である。
【００３３】
他の目的は、ＲＧＤドメイン（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ７３から８６をコードする配列；ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢ−１０のａａ７４から８４をコードする配列；ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ７５から８３をコードする配列；ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ７６から８２をコードする配列；ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ７７から８１をコードする配列；ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ７７から８２をコードする配列；ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ７７から８３をコードする配列；ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ７６から８３をコードする配列）；富システインドメイン（ＨＴＬＶ０ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ２２から３７をコードする配列）；塩基性ドメイン（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０ではａａ４８から６１をコードする配列）を単独または結合した状態で、コアドメイン（ＨＴＬＶ−ＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ３８から４７をコードする配列）および／またはアミノ末端領域（ＨＴＬＢ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のａａ１から２０をコードする配列）を含む他ＨＩＶ−１  Ｔａｔペプチドと組合せた形、または組合せずに含んで成るＨＩＶ変異体（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびその他のタイプおよびサブタイプ）由来のヌクレオチド配列として定義される、未変性で実質モノマーである生物活性Ｔａｔの断片である。
【００３４】
別の目的はそれらの前記アミノ酸配列（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０または８９．６）中に１またはそれ以上のＴ細胞エピトープを含んで成るＨＩＶ変異体（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２並びにその他のＨＩＶタイプおよびサブタイプ）に由来するＴａｔ断片。
【００３５】
別の目的はそれらのヌクレオチド配列（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０または８９．６）中に１またはそれ以上のＴ細胞エピトープを含んで成るＨＩＶ変異体（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２並びにその他ＨＩＶタイプとサブタイプ）。
【００３６】
別の目的は、次のヌクレオチド配列、またはその一部を有するものから選択されたＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢ−１０、変異体のＴａｔ突然変異を含んで成るＴａｔ誘導体である：ｃｙｓ２２突然変態のヌクレオチド配列およびｌｙｓ４１のヌクレオチド配列。
【００３７】
別の目的は以下のアミノ酸配列またはその一部を有するものから選択されたＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢ−１０、変異体のＴａｔ突然変異を含んで成るＴａｔ誘導体である：ｃｙｓ２２突然変態のヌクレオチド配列およびｌｙｓ４１のヌクレオチド配列。
【００３８】
本発明の別の目的は、上記の如くに機能し、組合わされた未変性、実質モノマーである生物活性Ｔａｔタンパク質を用いて、感染症、炎症性および血管新生疾患、腫瘍のグループに属す疾患を治療することである。
【００３９】
更なる目的は、発明の詳細な説明から明らかになるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
ＷＯ９９／２７９５８によれば、生物活性Ｔａｔは１）活性化された内皮細胞またはＤＣの核の中に入り、そこに局在でき、２）ＫＳ細胞およびサイトカインで活性化された内皮細胞の増殖、移動および浸潤を活性化でき、３）感染細胞に加え、ａ）外来タンパク質添加後のＨＬＭ−１細胞内でのＴａｔ−欠損プロウイルスのレスキュー、および／またはｂ）ＨＩＶ−１プロモーター−受容体プラスミドがトランスフェクションされた細胞でのＨＩＶ−１遺伝子のトランス活性化、により測定した時にウイルス複製を活性化でき、そして４）血管新生因子または炎症性サイトカイン存在下にマウスにＫＳ様障害の発生を誘導できるタンパク質として定義されている）。
【００４１】
本明細書では、用語「未変性」は特に、その本来の、即ち変性を受けていない立体構造を持つＴａｔを指しており、Ｔａｔのヘパリンへの結合能力を活かした技術（当業界では既知であり、本明細書の中で広く論じられている）によって非変性条件下に精製された組換えＤＮＡに関する通常技術により得られる分離Ｔａｔタンパク質を表す。
【００４２】
本明細書では、用語「実質モノマーであり」は上記により得たＴａｔタンパク質が、ＨＰＬＣ分析によって大部分（＞９５％）がモノマー型、即ち凝集していない型であると判断されることを表している。
【００４３】
本明細書では、用語「生物活性」は、上記により得たＴａｔタンパク質であり、それが１）活性化された内皮細胞または樹状細胞内に１０ｎＭまでの濃度で入ることができ、そして２）次の機能の少なくとも一つを遂行できることを表している；ｉ）カポシ肉腫（ＫＳ）細胞またはサイトカイン−活性化内皮細胞の増殖、移動および浸潤の活性化機能；ｉｉ）感染細胞に添加した場合の、ａ）外来タンパク質添加後のＨＬＭ−１細胞内でのＴａｔ−欠損プロウイルスのレスキュー、および／またはｂ）ＨＩＶ−１プロモーター−受容体プラスミドがトランスフェクションされた細胞でのＨＩＶ−１遺伝子のトランス活性化による測定でのウイルス複製の活性化機能；ｉｉｉ）血管新生因子または炎症性サイトカイン存在下に於いてマウスにＫＳ様障害発生誘導機能。
【００４４】
本明細書では、用語「ＤＣ成熟」は、ＤＣの飲／貪食活動および抗原取込みの漸進的低下を導くプロセスと、同時に起こる抗原を処理し提示するＤＣの能力の高まりを表し、このプロセスにはＤＣ成熟マーカー［（ＨＬＡ−）−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３］の発現並びにサイトカインおよびケモカイン（ＩＬ−１２およびＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１）の産生が伴う。
【００４５】
本明細書では、用語「抗原提示細胞の活性化」は、抗原の取込み、処理および／または提示能力を誘導または増加し、免疫反応のプライミングまたはむブーストを高めることを表し、このプロセスには補助刺激分子［（ＨＬＡ−）−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３、ＩＣＡＭ−１］の発現並びにサイトカインおよびケモカイン（ＩＬ−１２およびＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１）の産生が伴う。
【００４６】
本明細書では、用語「アジュバント」は、抗原と共に宿主内に導入されると、例えば上記のＤＣ成熟および／またはＡＰＣの活性化の誘導を含む複数のメカニズムによりその抗原に対する免疫反応を高める物質を表す。
【００４７】
以下簡単に記載する、従来技術に比し新規且つ予想外と考えられる新規データに基づき、我々は生物活性Ｔａｔ、その断片または誘導体を、本来および関係する新規特性の利点を活かすことで次の特徴の少なくとも１つ、またはそれ以上を発揮するシステムとしての使用を主張する：運搬（デリバリー）システムおよびアジュバント。
【００４８】
Ｔａｔタンパク質が酸化および／または不活性化されると、それは本発明の目的にとって好適ではない。実際、生物学的に活性でのみあり、酸化または不活性化されていないＴａｔタンパク質は非常に効率的に、素早く、そして選択的にＭＤＤＣ、マクロファージおよびサイトカイン−活性化内皮細胞に、用量−、時間−および成熟／分化−依存的な様式で取り込まれる。Ｔａｔの取込みは、タンパク質の濃度に依存する少なくとも２つの経路により起こる。ピコモル〜ナノモル（０．０１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）のＴａｔ濃度では、Ｔａｔの取込みの大部分はタンパク質のＲＧＤ配列との相互作用を通し、α５β１およびαｖβ３受容体を介し行われるが、より高いＴａｔ濃度ではＨＳＰＧへのＴａｔ塩基性領域の結合を介するインテグリン−非依存経路が主流である。Ｔａｔの効率的な取込みはこれらＡＰＣにのみ観察されており、ＴＣＢ、ＢＬＣＬ、単核細胞または非活性化内皮細胞には観察されない。Ｔａｔは取込まれるとＭＨＣや補助刺激分子の発現、およびＴｈ−１サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２）およびβケモカイン［Ｒａｎｔｅｓ、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１α、ＭＩＰ−１β］の産生の増加を含む、ＭＤＤＣの成熟と活性化を誘導する。これら全ての効果は、Ｔａｔを酸化し、不活性化すると消失する。更に、活性化ＴａｔはＭＤＤＣによる同種異系と抗原特異的提示の両方を高め、異種抗原に対するＴ細胞特異的免疫反応を増す。即ち活性Ｔａｔは、特定抗原提示細胞に狙いを定め、その中に効率的に入り、それらの機能を高め、そしてＴｈ−１特異的免疫反応を駆動する能力によって、Ｔａｔ自身の提示およびその他抗原の提示、並びに特異的免疫反応の誘導に有利に作用し、そして活性Ｔａｔを用いこれら細胞に活性分子を選択的に運搬するともできる。
【００４９】
これら新規データおよび後述するＴａｔの（ｉ）から（ｖｉ）の活動に関する実行能力に基づき、我々は活性Ｔａｔが樹状細胞、内皮細胞およびマクロファージを含む抗原提示細胞に抗原またはその他活性分子を選択的に運搬できる運搬システムとして、そして最も効率的な抗原提示細胞に特異的に狙いを定めること、および特異的免疫反応を作動させることによって、抗原に対するＴｈ−１免疫反応を誘導できるアジュバントとして機能すると主張する。それ故に、生物活性Ｔａｔは抗原としてだけではなく、他抗原に関するＴｈ−１型アジュバントとしても用いることができ、病原菌または腫瘍に対する免疫反応を誘導することができ、そして感染症、血管新生疾患、炎症性疾患および腫瘍に対する治療介入を目的とするＤＣ、マクロファージおよび活性化内皮細胞向け運搬システムとして利用できる。
【００５０】
本発明によれば、Ｔａｔを抗原および他活性分子をＤＣ、マクロファージおよびサイトカイン−活性化内皮細胞を含む特定抗原提示細胞に選択的に運搬する運搬システムとして用い、予防若しくは治療ワクチン接種、または感染症、炎症性および血管性疾患並びに腫瘍治療を目的として抗原に対する免疫反応を誘導し、抗原に対する免疫反応を補助する。説明を容易にするために、発明の幾つかの側面を選び出し、以下に記載する。
【００５１】
発明者は最初にＭＤＤＣがピコモル〜ナノモル濃度の可溶性活性Ｔａｔを非常に効率的に取り込む特殊能力を持つことを見いだし、次にこの取込みが細胞に与えたＴａｔの濃度に応じて５分後から１０分後にピークを持つ極めて早いプロセスであることを見いだした。これに対しＴＣＢまたはＢＣＬによる活性Ｔａｔの取込みは極めて不良であり、マイクロモル濃度のＴａｔ（１０μｇ／ｍｌ）とより長時間のインキュベーション時間を必要とし、そしてこれら条件下でさえ大部分のＴａｔは細胞表面に結合しており、細胞内には入らない。更に活性Ｔａｔは、インキュベーション３０分後の細胞内染色度の低下から示されるように、ＭＤＤＣによって素早く処理される。
【００５２】
低濃度Ｔａｔ（１００ｎｇ／ｍｌ）で観察される細胞内染色値が未成熟細胞では１または１０μｇ／ｍｌで観察されることから示されるように、成熟ＭＤＤＣは未成熟細胞に比べ１０−から１００−倍効率的にＴａｔを取り込むことができる。更にＴａｔの取込みは、このタンパク質の未変性の立体構造と完全な生物活性を必要とする。実際、光および空気への曝露によるＴａｔの酸化および不活性化は、ＭＤＤＣによる活性Ｔａｔに観察される取込みを無効または大きく減ずる（約１００倍）。興味深いことに、酸化Ｔａｔについて観察されるＭＤＤＣによる取込みのタイプは、ＴＣＢおよびＢＣＬでの未変性Ｔａｔの取込みのタイプに類似または同一である。
【００５３】
これらデータを総合すると、活性ＴａｔはＭＤＤＣを標的とすること、そしてＭＤＤＣによる選択的で効率的なＴａｔの取込はこれら細胞の高い飲／貪食活性を介するものではなく、未成熟ＭＤＤＣにより選択的に発現され、成熟ＭＤＤＣでより高いレベルで選択的に発現される特殊な取込み経路を必要とすることが示される。更に、低濃度と高濃度のＴａｔでＭＤＤＣ取込み差が観察されたことから、少なくとも２種類の取込経路、即ちピコモル〜ナノモルのＴａｔ濃度で非常に効率的に起こる第一の経路と、より高い（マイクロモル）Ｔａｔ濃度で起こる経路の存在が示された。事実、発明者は低濃度のＴａｔの取込が受容体媒介取込み経路を通したＴａｔのＲＧＤ領域への特別なインテグリン（α５β１、αｖβ３）の結合を介すること、一方高濃度Ｔａｔでは取込みがＴａｔ塩基性領域結合ＨＳＰＧを介することを見いだした。単核球はＴａｔ取込みには機能しないが、マクロファージはＤＣに近い用量および時間動態でより効率的にＴａｔを取込むことから、単核球からＤＣまたはマクロファージへの分化が選択的且つ効率的なＴａｔ取込みメカニズムを誘導することが示されている。同様に、発明者はＩＦＮγ、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αによって活性化された内皮細胞は未変性Ｔａｔを極めて効率的、そしてＭＤＤＣと同様の様式で結合して取込むが、非活性化細胞はこれを行わないことを見いだしている。活性化された内皮細胞によるＴａｔの取込みはαｖβ３およびα５β１インテグリン［ビトロネクチン（ＶＮ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）の典型的な受容体］に結合するＲＧＤドメインを介して、そして高濃度Ｔａｔでは細胞表面のＨＳＰＧおよび細胞外マトリックスに結合するＴａｔの塩基性領域を介しても起こる。更に内皮細胞に関しては、インテグリン拮抗体はピコ〜ナノモル濃度のＴａｔの取込みを阻止するが、より高濃度のＴａｔの取込みは阻止しない。同様にピコモル〜ナノモル濃度のＴａｔの取込みはＲＧＤ配列を含むＴａｔペプチドにより阻害されるが、より高濃度のＴａｔの取込みはＴａｔの塩基性領域を包含するペプチドにより阻害される。
【００５４】
即ち、少なくとも２つのＴａｔ取込み経路が存在する：第一経路はＲＧＤ領域のインテグリンへの結合を介するもので、ピコ〜ナノモル濃度の活性Ｔａｔに用いられ、そしてインテグリン競合体により遮断されるが、一方第二経路は比較的低親和性の経路であり、インテグリン拮抗体による遮断を受けず、外来Ｔａｔの濃度が高く、そして／または細胞とＴａｔとのインキュベーション時間が長い場合にのみ優性となり、Ｔａｔ塩基性ペプチドにより遮断され、全ての細胞タイプで起こるものである。この第二経路は以前観察された受容体−非依存型経路と同一と思われ、Ｔａｔ塩基性領域と細胞表面ＨＳＰＧ間相互作用の様な低親和性部位への結合を介すると思われる。この様にしてＴａｔ  ＲＧＤ領域はＤＣ、内皮細胞およびマクロファージの様なＲＧＤ結合インテグリン受容体を発現している細胞を選択的に標的とする。更に、この特殊な経路を介して、活性Ｔａｔは非常に効率的に取込まれる。
【００５５】
発明者は１）少なくとも１（ＲＧＤ）または２種類のＴａｔドメイン（塩基性およびＲＧＤ）、２）このタンパク質の生物活性、３）このタンパク質の未変性立体構造、実質モノマーである形状、および４）インテグリンメンブレン受容体を必要とする経路を、この特殊経路とする。これに対し、ＴＣＢ、ＢＬＣＬおよび単核細胞、または非活性化内皮細胞では取込みは殆ど、または全く観察されないことから、Ｔａｔは病原菌および腫瘍に対する免疫反応にとって重要である特殊な細胞タイプに狙いを定め、抗原またはカーゴを選択的に運搬することができ、或いは炎症性および血管新生疾患または腫瘍を治療できることが示される。
【００５６】
発明者は、発明者によれば、酸化Ｔａｔではなく生物活性Ｔａｔは特異的インテグリン受容体への結合を介してＤＣ、内皮細胞およびマクロファージ内に入り、そしてより重要なことはＭＤＤＣの成熟および機能を促進することを強調する。実際、活性ＴａｔはＭＤＤＣ状にヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３の表面発現の用量依存的増加を誘導する。この効果は未変性Ｔａｔには観察されるが、酸化および不活性化Ｔａｔには観察されない。更に、活性ＴａｔはＩＬ−１２およびＴＮＦ−α、Ｔｈ−１型反応の駆動に必須なサイトカイン、およびリンパ細胞反応のエフェクター相の重要な作用体であるβ−ケモカイン類のＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの用量依存的増加を誘導する。いずれの場合も、誘導されたレベルが既知活性体であるＬＰＳにより誘導されるレベルと同等であることは重要である。また、酸化および不活性化Ｔａｔはこれら効果を示さない。活性化ＴａｔはまたＭＤＤＣの抗原提示機能も高め、同種抗原および追想抗原に対するＴ細胞の増殖反応を増加する。これら性質を総合すると、活性化Ｔａｔは単に一つの抗原ではなく、強力なＴ細胞アジュバントでもあり、そして特定細胞への運搬システムでもある。発明者は、この特性が特定タイプ（Ｔｈ−１）の免疫反応の誘導および異種抗原に対しこの反応を高めることに於いて、基本的に重要なものであると信じている。このことは更に、不活性Ｔａｔによるワクチン接種がｉｎ  ｖｉｖｏに於いて予防的でない異なる免疫反応を誘導する理由も説明する。Ｔｈ−１反応およびＣＴＬの誘導は細胞内病原体による感染および腫瘍増殖を制御することから、提示したデータは未変性Ｔａｔタンパク質またはｔａｔＤＮＡが、他のＨＩＶ抗原または非ＨＩＶ抗原に対するＴｈ−１免疫反応およびＣＴＬ活性を駆動または高めて、予防または治療ワクチンとしての効果的で長期の免疫をサポートすること、同時に感染症、炎症性および血管新生性疾患、または腫瘍の治療を目的として活性分子をＤＣ、活性化内皮細胞およびマクロファージに選択的運搬することに活用できることを示している。事実、抗原、阻害化合物或いは予防若しくは治療ワクチンまたは治療にとって、並びに診断目的にとっても有用である分子を選択的に運搬できるＴａｔの特異的標的である炎症性および血管増殖性疾患、腫瘍および感染症には、活性化内皮細胞だけでなくマクロファージやＤＣも認めることができる。
【００５７】
かくして発明者によれば、生物活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、その誘導体または断片は、タンパク質、ペプチド、核酸または支持体粒子を含む他分子と組合せて以下のことに使用できる：
・予防および治療ワクチン接種または感染症、炎症性および血管新生疾患並びに腫瘍の治療を目的とする免疫反応を誘導するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにて抗原または活性化合物を、ＤＣ、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１およびαｖβ３インテグリンを発現している抗原提示細胞に選択的に運搬すること。
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏに於いてＤＣ、内皮細胞およびマクロファージを含むα５β１およびαｖβ３インテグリンを発現している細胞の抗原提示機能を活性化または高め、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、その他感染症および腫瘍に対するＴｈ−１型免疫反応を誘導するアジュバントとして。
【００５８】
本発明によれば、生物活性型のＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質は次のアミノ酸配列（配列番号２）を有し：
ＮＨ２−ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣＣＦＨＣＱＶＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱＰＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫＥ−ＣＯＯＨ
そして生物活性型のＨＩＶ−２  Ｔａｔタンパク質は以下のアミノ酸配列（配列番号１００）を持つもので、配列中、この位置に限定されるものではないが、例えば元のアミノ酸配列のアミノ酸９２と９３の間の位置にＲＧＤ配列が挿入されているもの：
ＮＨ２−ＭＥＴＰＬＫＡＰＥＳＳＬＫＳＣＮＥＰＦＳＲＴＳＥＱＤＶＡＴＱＥＬＡＲＱＧＥＥＩＬＳＱＬＹＲＰＬＥＴＣＮＮＳＣＹＣＫＲＣＣＹＨＣＱＭＣＦＬＮＫＧＬＧＩＣＹＥＲＫＧＲＲＲＲＴＰＫＫＴＫＴＨＲＧＤＰＳＰＴＰＤＫＳＩＳＴＲＴＧＤＳＱＰＴＫＫＱＫＫＴＶＥＡＴＶＥＴＤＴＧＰＧＲ−ＣＯＯＨ
または位置１０５のスレオニンが欠失しているものであり（配列番号１０２）：
ＮＨ２−ＭＥＴＰＬＫＡＰＥＳＳＬＫＳＣＮＥＰＦＳＲＴＳＥＱＤＶＡＴＱＥＬＡＲＱＧＥＥＩＬＳＱＬＹＲＰＬＥＴＣＮＮＳＣＹＣＫＲＣＣＹＨＣＱＭＣＦＬＮＫＧＬＧＩＣＹＥＲＫＧＲＲＲＲＴＰＫＫＴＫＴＨＰＳＰＴＰＤＫＳＩＳＴＲＧＤＳＱＰＴＫＫＱＫＫＴＶＥＡＴＶＥＴＤＴＧＰＧＲ−ＣＯＯＨ
そして配列番号２、１００または１０２に対し５０％より高い；好ましくは６０％より高い、さらに好ましくは７０％より高い、より好ましくは８０％より高い、更に好ましくは９０％より高い配列相同性を有する実質モノマー型であるＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のその他Ｔａｔ変異体は、ピコモルからナノモル濃度に於いて以下の判定基準の少なくとも１つを満たすことができる：
（ｉ）ピコモル〜ナノモル濃度（０．０１から１０００ｎｇ／ｍｌ）、細胞への曝露５〜１０分以内でＤＣ、内皮細胞およびマクロファージを含む抗原提示細胞により選択的且つ効率的に取り込まれる。
（ｉｉ）ピコモル〜ナノモル濃度に於いてサイトカイン−活性化内皮細胞の移動（集合）、浸潤および増殖を促進する。
（ｉｉｉ）ナノモル濃度に於いてＨＩＶ遺伝子をトランス活性化するか、またはＴａｔ欠失ＨＩＶプロウイルスをレスキューする。
（ｉｖ）ＤＣの成熟および抗原提示機能を活性化する。
（ｖ）抗原提示細胞付加後の、それ自身または異種抗原に対するＴ−ヘルパーおよび／または細胞傷害活性を含むＴ細胞媒介免疫反応を高める。
【００５９】
好ましくは判定基準（ｉ）または（ｉｉ）、好ましくはその両方を満たすべきであり、拠り好ましくは、判定基準（ｉｉｉ）ａ）および／または（ｉｉｉ）ｂ）と組合せて（ｉ）または（ｉｉ）あるいはその両方を満たすべきである。（ｉ）から（ｖ）までの全ての基準を満たす場合に最善の結果が得られる。本発明によれば、ＨＩＶ−１  ｔａｔ  ＤＮＡは次の配列（配列番号１）：
５’ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＧＡ３’
そしてＨＩＶ−２  ｔａｔ  ＤＮＡは以下に限定されるものではないが、例えば元の配列のヌクレオチド２７６と２７７の間にＲＧＤをコードする配列が挿入されている以下のヌクレオチド配列で表される（配列番号９９）：
５’ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＴＴＡＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＧＡＧＣＣＣＴＴＴＴＣＡＣＧＣＡＣＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＧＡＣＣＣＣＴＡＧＡＡＡＣＡＴＧＣＡＡＴＡＡＣＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＴＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＡＴＡＴＧＴＴＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＡＴＡＧ３’
または位置３２２〜３２４のスレオニンをコードする配列ＡＣＣが欠失している配列（配列番号１０１）：
５’ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＴＴＡＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＧＡＧＣＣＣＴＴＴＴＣＡＣＧＣＡＣＴＴＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＧＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＧＡＣＣＣＣＴＡＧＡＡＡＣＡＴＧＣＡＡＴＡＡＣＴＣＡＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＴＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＡＴＡＴＧＴＴＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＡＣＧＡＡＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＡＴＡＧ３
および配列番号１、９９または１０１に対し４０％より高い、好ましくは５０％より高い、好ましくは６０％より高い、より好ましくは７０％より高い、更に好ましくは８０％より高い、より好ましくは９０％より高い配列相同性を持ついずれかのＨＩＶタイプおよびサブタイプの他変異として表される。
【００６０】
本発明によれば、「生物活性Ｔａｔの断片」は、単独または富システインドメインを伴うＲＧＤドメイン、および／または塩基性ドメインを含むＨＩＶ変異体（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２並びにその他タイプおよびサブタイプ）由来の、ＤＮＡ配列に対応するＴａｔペプチド、並びに／またはコアドメインおよび／またはアミノ末端領域を含むその他ＨＩＶ−１  Ｔａｔペプチドとして定義されるが、この場合ＲＧＤドメインはＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０配列に内のａａ７３から８６をコードする、配列番号３で表され、同時に配列番号４で表されるアミノ酸配列；配列番号５で表されるａａ７４から８４をコードする配列および配列番号６で表されるこれに対応するアミノ酸配列；配列番号７で表されるａａ７５から８３をコードする配列および配列番号８で表されるこれに対応するアミノ酸配列；配列番号９で表されるａａ７６から８２をコードする配列および配列番号１０で表されるこれに対応するアミノ酸配列；配列番号１１で表されるａａ７７から８１をコードする配列および配列番号１２で表されるこれに対応するアミノ酸配列；配列番号１３で表されるａａ７７から８２をコードする配列および配列番号１４で表されるこれに対応するアミノ酸配列；配列番号１５で表されるａａ７７から８３をコードする配列および配列番号１６で表されるこれに対応するアミノ酸配列；配列番号１７で表されるａａ７６から８３をコードする配列および配列番号１８で表されるこれに対応するアミノ酸配列に；そして富システインドメインは配列番号１９で表されるＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０内のａａ２２から３７をコードする配列および配列番号２０で表されるこれに対応するアミノ酸配列に；塩基性ドメインは配列番号２１で表されるＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０内ａａ４８から６１をコードする配列および配列番号２２で表されるこれに対応するアミノ酸配列に；コアドメインは配列番号２３で表されるＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０内ａａ３８から４７をコードする配列および配列番号２４で表されるこれに対応するアミノ酸配列に、そしてアミノ末端領域は配列番号２５で表されるＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０内ａａ１から２０をコードする配列および配列番号２６で表されるこれに対応するアミノ酸配列に相当する。
配列番号３
５’ＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡ３’
配列番号４
ＰＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫＥ
配列番号５
５’ＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧ３’
配列番号６
ＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰ
配列番号７
５’ＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣ３’
配列番号８
ＳＱＳＲＧＤＰＴＧ
配列番号９
５’ＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡ３’
配列番号１０
ＱＳＲＧＤＰＴ
配列番号１１
５’ＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧ３’
配列番号１２
ＳＲＧＤＰ
配列番号１３
５’ＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡ３’
配列番号１４
ＳＲＧＤＰＴ
配列番号１５
５’ＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣ３’
配列番号１６
ＳＲＧＤＰＴＧ
配列番号１７
５’ＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣ３’
配列番号１８
ＱＳＲＧＤＰＴＧ
配列番号１９
５’ＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴ３’
配列番号２０
ＣＴＮＣＹＣＫＫＣＣＦＨＣＱＶＣ
配列番号２１
５’ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣ３’
配列番号２２
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧ
配列番号２３
５’ＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴ３’
配列番号２４
ＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹ
配列番号２５
５’ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧGA亜ＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴ３’
配列番号２６
ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴ
【００６１】
本発明のＴ細胞エピトープは、そのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が以下のものであることが好ましい（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０または８９．６を参照体とする）：
エピトープ１（ａａ１〜２０）：
５’ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴ３’（配列番号２７）、
ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰＷＫＨＰＧＳＱＰＫＥ（配列番号２８）、
エピトープ２（ａａ１１〜２４）：
５’ＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴ３’（配列番号２９）、
ＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴＡＣＴＮ（配列番号３０）
エピトープ３（ａａ２１〜４０）：
５’ＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡ３’（配列番号３１）、
ＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣＣＦＨＣＱＶＣＦＩＴ（配列番号３２）、
エピトープ４（ａａ３６〜５０）：
５’ＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧ３’（配列番号３３）、
ＶＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫ（配列番号３４）、
エピトープ５（ａａ８３〜１０２）：
５’ＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＣＣＧＧＴＣＣＡＴＣＡＧ３’（配列番号３５）、
５ＧＰＫＥＱＫＫＫＶＥＲＥＴＥＴＤＰＶＨＱ（配列番号３６）、
エピトープ６（ａａ１〜１５）：
５’ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡ３’（配列番号３７）
ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰＷＫＨＰＧ（配列番号３８）、
エピトープ７（ａａ６〜２０）：
５’ＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴ３’（配列番号３９）、
ＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴ３’（配列番号４０）、
エピトープ８（ａａ１１〜２５）：
５’ＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣ３’（配列番号４１）、
ＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴＡＣＴＮＣ（配列番号４２）、
エピトープ９（ａａ１６〜３０）：
５’ＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴ３’（配列番号４３）、
ＳＱＰＫＴＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣ（配列番号４４）、
エピトープ１０（ａａ２１〜３５）：
５’ＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡ３’（配列番号４５）、
ＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣＣＦＨＣＱ（配列番号４６）、
エピトープ１１（ａａ２６〜４０）：
５’ＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡ３’（配列番号４７）、
ＹＣＫＫＣＣＦＨＣＱＶＣＦＩＴ（配列番号４８）
エピトープ１２（ａａ３１〜４５）：
５’ＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣ３’（配列番号４９）、
ＣＦＨＣＱＶＣＦＩＴＫＡＬＧＩ（配列番号５０）、
エピトープ１３（ａａ３６〜５０）：
５’ＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣ３’（配列番号５１）、
ＶＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫ（配列番号５２）、
エピトープ１４（ａａ４１〜５５）：
５’ＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡ３’（配列番号５３）、
ＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲ（配列番号５４）、
エピトープ１５（ａａ４６〜６０）：
５’ＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡ３’（配列番号５５）、
ＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５６）、
エピトープ１６（ａａ５１〜６５）：
５’ＡＡＧＣＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴ３’（配列番号５７）、
ＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨ（配列番号５８）、
エピトープ１７（ａａ５６〜７０）：
５’ＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡ３’（配列番号５９）、
ＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳ（配列番号６０）、
エピトープ１８（ａａ６１〜７５）：
５’ＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣ３’（配列番号６１）、
ＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱＰＴＳ（配列番号６２）、
エピトープ１９（ａａ６６〜８０）：
５’ＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣ３’（配列番号６３）、
ＱＶＢＳＬＳＫＱＰＴＳＱＳＲＧＤ（配列番号６４）、
エピトープ２０（ａａ７１〜８５）：
５’ＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧ３’（配列番号６５）、
ＫＱＰＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫ（配列番号６６）、
エピトープ２１（ａａ７６〜９０）：
５’ＣＡＧＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧ３’（配列番号６７）、
ＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫＥＱＫＫＫ（配列番号１６８）
エピトープ２２（ａａ２１〜２９）：
５’ＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧ３’（配列番号６９）、
ＡＣＴＮＣＹＣＫＫ（配列番号７０）、
エピトープ２３（ａａ２６〜３４）：
５’ＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣ３’（配列番号７１）、
ＹＣＫＫＣＣＦＨＣ（配列番号７２）、
エピトープ２４（ａａ３１〜３９）：
５’ＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡ３’（配列番号７３）、
ＣＦＨＣＱＶＣＦＩ（配列番号７４）、
エピトープ２５（ａａ３６〜４４）：
５’ＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣ３’（配列番号７５）、
ＶＣＦＩＴＫＡＬＧ（配列番号７６）、
エピトープ２６（ａａ４１〜４９）：
５’ＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧ３’（配列番号７７）
ＫＡＬＧＩＳＹＧＲ（配列番号７８）、
エピトープ２７（ａａ４６〜５４）：
５’ＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧ３’（配列番号７９）、
ＳＹＧＲＫＫＲＲＱ（配列番号８０）、
エピトープ２８（ａａ５１〜５９）：
５’ＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴ３’（配列番号８１）、
ＫＲＲＱＲＲＲＰＰ（配列番号８２）、
エピトープ２９（ａａ５６〜６４）：
５’ＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴ３’（配列番号８３）、
ＲＲＰＰＱＧＳＱＴ（配列番号８４）
エピトープ３０（ａａ６１〜６９）：
５’ＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡ３’（配列番号８５）、
ＧＳＱＴＨＱＶＳＬ（配列番号８６）、
エピトープ３１（ａａ６６〜７４）：
５’ＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣ３’（配列番号８７）、
ＱＶＳＬＳＫＱＰＴ（配列番号８８）、
エピトープ３２（ａａ７１〜７９）：
５’ＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧ３’（配列番号８９）、
ＫＱＰＴＳＱＳＲＧ（配列番号９０）、
エピトープ３３（ａａ７６〜８４）：
ＱＳＲＧＤＰＴＧＰ（配列番号９１）
５’ＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧ３’（配列番号９２）、
エピトープ３４（ａａ８１〜８９）：
５’ＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧ３’（配列番号９３）。
ＰＴＧＰＫＥＱＫＫ（配列番号９４）。
【００６２】
本発明によれば「Ｔａｔの誘導体」は、以下のヌクレオチド配列を有するものから選択されたＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ、クローンＢＨ−１０のＴａｔ突然変異体を包含する：
ｃｙｃ２２突然変異体のヌクレオチド配列（配列番号９５）：
５’ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＧＡ３’
ｃｙｓ２２突然変異体のアミノ酸配列（配列番号９６）：
ＮＨ２−ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴＡＧＴＮＣＹＣＫＫＣＣＦＨＣＱＶＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱＰＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫＥ−ＣＯＯＨ
ｌｙｓ４１のヌクレオチド配列（配列番号９７）：
５’ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＣＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＡＡＧＧＡＡＴＧＡ３’。
ｌｙｓ４１のアミノ酸配列：
ＮＨ２−ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴＡＣＴＮＣＹＣＫＫＣＣＦＨＣＱＶＣＦＩＴＴＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱＰＴＳＱＳＲＧＤＰＴＧＰＫＥ−ＣＯＯＨ
【００６３】
以下は本発明の範囲内にあると考えられる：
−上記ＤＮＡ配列と少なくとも６０％の相同性を、好ましくは少なくとも７０％の相同性を、より好ましくは少なくとも８０％の、更に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するＤＮＡ配列。
−上記アミノ酸配列と少なくとも４０％の相同性を、好ましくは少なくとも５０％の相同性を、好ましくは少なくとも６０％の相同性を、好ましくは少なくとも７０％の相同性を、より好ましくは少なくとも８０％の、更に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列。
【００６４】
本発明によれば、「感染症」はヒトまたは動物ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、結核菌、マラリア原虫、カンジダ、リステリア、インフルエンザウイルスを原因とするもの、および性感染症、心内膜炎、尿路感染症、骨髄炎、皮膚感染、または連鎖球菌およびブドウ球菌感染症、肺炎双球菌感染症、破傷風、髄膜炎菌感染症、結核、マラリア、カンジダ症、ヘリコバクター感染、サルモネラ、梅毒、ヘルペス感染症（水痘、単核細胞症およびエプスタインバー由来感染、ヒトヘルペスウイルス８型感染、サイトメガロウイルス、口唇ヘルペスおよび陰部ヘルペスを含む）、肝炎ウイルス感染（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ）、パピローマウイルス原因感染、インフルエンザ、リステリア、ビブリオこれらを含むがこれらに限定されない他の内因性または外因性病原体を原因とするヒトおよび動物のその他感染症を包含する。
【００６５】
本発明によれば、「炎症疾患」はウイルス、細菌または寄生虫感染に関連する、または関連しないアレルギーまたは炎症として定義され、免疫媒介皮膚疾患、全身性エリテマトーデス、リウマチ関節炎、全身性硬化症、白癬、シューグレン症候群、グッドパスチャー症候群、血管炎、サルコイドーシス、骨関節症、感染性関節炎、乾癬、クローン病、直腸結腸潰瘍、甲状腺炎、軟皮症、アレルギー性疾患が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
本発明によれば、「血管新生疾患」は糖尿病性網膜症、水晶体後方繊維増殖症、トラコーマ、血管性緑内障、乾癬、免疫炎症、非免疫炎症、アテローム性動脈硬化症、過度の創傷治癒、皮膚脈管炎、結腸血管形成異常、血管性浮腫および血管繊維種を包含する非新生物性の血管増殖性の疾患として定義される。
【００６７】
本発明によれば、「腫瘍」はカポシ肉腫や皮膚、肺、乳房、胃、肝臓、膵臓、内分泌組織、子宮、卵巣のその他新生物、肉腫、急性および慢性白血病、ならびにリンパ細胞の新生物といった軟組織、骨、軟骨および血液を含む良性および悪性腫瘍として定義されるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明によれば、「治療化合物」はその他抗原（タンパク質、ペプチド、またはＤＮＡ）或いは活性分子として定義される。
【００６９】
本発明によれば、「支持体粒子」は、マイクロパーティクル、ナノパーティクル、リポソームおよびその他粒子状の運搬システムとして定義されるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明によれば、「非ＨＩＶ抗原またはその他抗原」は、ＨＩＶ抗原ＨＩＶ−１  Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、Ｇａｇを排除する免疫細胞により認識される分子または成分を包含する。
【００７１】
本発明のＴａｔは、感染症、炎症性疾患、血管新生疾患、腫瘍の治療に使用できる。
【００７２】
上記のＴａｔの組合せはアジュバント、希釈液、エシピエント（ｅｃｃｉｐｉｅｎｔｓ）、キャリアーおよび当分野既知のその他物質と混合でき、上記目的のための医薬品を製造することができる。この様な医薬品は、疾患の種類および製剤のタイプに合った経路を利用して非腸管的（皮下、筋肉内、皮内）、粘膜（膣、直腸、口腔、鼻）に投与する、または局所経路による投与に適した錠剤、ピル、噴霧薬、注射液、懸濁液、粉末、クリーム、軟膏の形で得ることができる。
【００７３】
図面の詳細な説明
図１．生物活性Ｔａｔは用量−および時間−依存的な様式でＭＤＤＣに効率的且つ選択的に取り込まれるが、ＢＬＣＬまたはＴＣＢには取り込まれない。Ａ、ＭＤＤＣは１４名の健康人ドナーの末梢血単核細胞から、確立された方法（Ｆａｎａｌｅｓ  Ｂｅｌａｓｉｏ  １９９７年）を用い得た。簡単に述べると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は密度勾配分離法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ特級、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用い単離した。単核細胞は、抗ＣＤ１４コーティングマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベーションし、続いて磁石装置（ＭｉｎｉＭａｃｓ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いメーカー指示書に従いソーティングして更に精製した。単核細胞の純度は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓ．Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で評価した場合、常に＞９５％であった。ＧＭ−ＣＳＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）（Ｌｅｕｃｏｍａｘ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｏｒｉｇｇｉｏ、Ｉｔａｌｙ）およびＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）存在下に完全培地中で６日間培養し、単核細胞をＤＣ（ＭＤＤＣ）に分化誘導した。ＤＣへの分化は形態観察およびフローサイトメトリーによる特異的表面マーカー（ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＣＤ８０）の検出によって評価した。次にＭＤＤＣを段階濃度（０．１から１０，０００ｎｇ／ｍｌ）の活性ＨＩＶ−１  Ｔａｔまたは溶解バッファー若しくは培地のみ（陰性コントロール）存在下に、完全培地中２×１０５／ｍｌの密度で５、１０、３０または６０分間、３７度、暗所で培養した。Ｔａｔタンパク質は既報の如くにＥ．ｃｏｌｉから発現、精製し、使用前に既報の如くに細胞増殖アッセイとＨＩＶ−ＬＴＲトランス活性化を用い試験した。Ｔａｔタンパク質は０．１％ウシ血清アルブミンを含む脱気したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ＢＳＡ）に再懸濁した。他所記載の様にＴａｔが酸化され活性を失わないようにないように注意した。次に細胞を冷培地で洗浄し、１０分間３７度に於いてトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で処理し、外部に結合したタンパク質を除いた。固定および透過処理後、ＭＤＤＣをアフィニティー精製したウサギポリクローナル抗Ｔａｔ  ＩｇＧ抗体（Ｅｎｓｏｌｉ  １９９３年；Ｃｈａｎｇ  １９９７年；Ｅｎｓｏｌｉ  １９９４年）またはウサギＩｇＧコントロール抗体（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｏｐｅｒａ、Ｉｔａｌｙ）、続いてＦＩＴＣ−標識抗ウサギＩｇ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）で染色した。蛍光をフローサイトメトリーにより分析し、結果はイソタイプ染色サンプルと比較した場合の陽性細胞のパーセンテージとして表した。このタンパク質が細胞質内に特異局在していることを示すために、抗Ｔａｔ抗体による染色については非透過処理ＭＤＤＣについても必ず行った。陽性細胞のパーセンテージ（イソタイプ染色サンプルとの比較）をボックス内に示す。示したデータは試験した１４名中の１ドナー名のものであるが、この名のＴａｔ取込レベルは、１０分（０．１、１、１０、１００、１０００および１０、０００ｎｇ／ｍｌでは４９％、５２％、４９％、７０％、９４％、９８％容易性細胞）および３０分（０．１、１、１０、１００、１０００および１０、０００ｎｇ／ｍｌでは４９％、４５％、５４％、６５％、９５％、９８％陽性細胞）いずれについても、試験した全ドナーに観察された値の中央値に近かった。Ｂ、ＭＤＤＣを上記に従い活性Ｔａｔタンパク質（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）と１０または３０分間インキュベーションして透過処理細胞または非透過処理細胞の両方についてＦＡＣＳを用い分析し、Ｔａｔの特異的取込を立証した。Ｃ、ＢＬＣＬ（マル）は、２名の健康ドナーより得たヒトＰＢＭＣを、エプスタインバーウイルス産生株であるＢ９５−８マーモセット細胞株より得た上清存在下に２時間培養し、更に既報の如くに少なくとも４週間更に拡大して作製した。ＴＣＢ（三角）は４名の健康人ドナーから得たヒトＰＢＭＣを既報の如く１μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（Ｍｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃｈａｔｉｌｌｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）で３日間刺激し、更に１０  ＩＵ／ｍｌのｒＩＬ−２（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を加えた完全培地で２週間拡大して得た。ＢＬＣＬおよびＴＣＢを上記に従い５×１０５／ｍｌで、１００から１０、０００ｎｇ／ｍｌの濃度の活性Ｔａｔを含む完全培地、溶解緩衝液、または培地にて３０または６０分間、３７℃、暗所で培養してから染色し細胞内Ｔａｔを検出した。データを同一時間および同一用量のタンパク質を用い培養したＭＤＤＳのデータ（正方形）と比較し、このドナーのＴａｔ取込みレベルが試験した１１名のドナーの中央値に非常に近かったため代表とした（１０、１００および１、０００ｎｇ／ｍｌのＴａｔ、３０分培養後の陽性細胞のそれぞれ５４％、範囲１７〜９１％、６５％、範囲２７〜９１％、および９５％、範囲８３〜９９％）。
【００７４】
図２．ＭＤＤＣによる生物活性Ｔａｔの取込は細胞の成熟と共に増加し、タンパク質の酸化および不活性化により消失する。Ａ、ＬＰＳを使用して１８時ＭＤＤＣに成熟を誘導し、または誘導しなまま次に上記同様に活性Ｔａｔ（１から１０００ｎｇ／ｍｌ）存在下に１０および３０分間インキュベーションした。示したデータは試験した全ドナーの中央値に比べ低い取込みレベルを示したドナーのものであり、細胞成熟により誘導されるＴａｔ取込みの増加が良く名示されることから選ばれた。Ｂ、ＭＤＤＣを活性または酸化（光と空気に１８時間曝露して）Ｔａｔタンパク質（１０から１０００ｎｇ／ｍｌ）存在下に１０分間インキュベーションし、前記同様に処理した。この実験に使用した未変性と酸化Ｔａｔの生物活性の比較を表１に示す。
【００７５】
図３．抗α５β１および抗αｖβ３抗体はＭＤＤＣによる活性Ｔａｔの取込を遮断する。ＭＤＤＣをα５β１およびαｖβ３インテグリン（１０  ｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）に対するモノクローナル抗体を各単独、または両方存在する状態で完全培地［ＲＰＭＩ  １５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）］で２時間、４℃でインキュベーション（５×１０５／ｍｌ）した。続いて、活性Ｔａｔタンパク質を０．１から１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の用量で、１０分間、３７℃、暗所で加えた。冷完全培地で洗浄後、図１に示した様に細胞を処理し、染色した。３ドナー中１名のデータをＡに示す。Ａ、抗Ｔａｔ抗体で染色したＭＤＣＣのフローサイトメトリー分析。陽性細胞のパーセンテージ（イソタイプ染色サンプルとの比較）をボックス内に示す。全てのタンパク質用量でＴａｔの取込みが検出された（１０００ｎｇ／ｍｌで９９％まで）、この取込みは抗α５β１または抗αｖβ３抗体と細胞を前インキュベーションすることで阻害された。
【００７６】
図４．フィブロネクチンおよびビトロネクチンはＭＤＤＣによる活性Ｔａｔの取込を遮断する。ＭＤＤＣ（５×１０５／ｍｌ）をヒト由来ＦＮまたはＶＮ（２５  ｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）存在下に完全培地（ＲＰＭＩ  １５％ＦＢＳ）中で２時間、４℃にてインキュベーションした。次にＴａｔタンパク質を１０から１０００ｎｇ／ｍｌまでの用量範囲で１０分間、３７℃、暗所で加えた。冷完全培地で洗浄後、細胞を図１に記載した様に処理し、染色した。３名のドナーから１名のデータを代表として示している。Ａ、抗Ｔａｔ抗体で染色したＭＤＤＣのフローサイトメトリー分析。陽性細胞（イソタイプ染色サンプルとの比較）のパーセンテージをボックス内に示した。Ｔａｔの取込みは、全てのタンパク質用量で検出された（１０００ｎｇ／ｍｌで９９％まで）。細胞をＦＮまたはＶＮと前インキュベーションすると、この取込みは大きく低下し、最低用量のＴａｔでは完全に消失した（１０ｎｇ／ｍｌ時、それぞれ１％と２％）。Ｂ、ＦＮおよびＶＮのＭＤＤＣによるＴａｔ取込みに及ぼす阻害作用を理解しやすくするために、同じデータをドットプロットで表している。
【００７７】
図５．活性Ｔａｔは用量−および時間−依存的様式でマクロファージに効率的に取込まれるが、単核細胞には取込まれない。Ａ、プラスチック製プレートのウエルに２時間接着させてＰＢＭＣから濃縮した末梢血単核細胞を、０．１から１０、０００ｎｇ／ｍｌまでの用量のＴａｔと暗所にて６０分間、３７℃でインキュベーションし、図１のＭＤＤＣに関する記載通りに処理し、染色した。Ａ、抗Ｔａｔ抗体で染色したＭＤＤＣのフローサイトメトリー分析。陽性細胞（イソタイプ染色サンプルとの比較）のパーセンテージをボックス内に示した。有意なＴａｔの取込みが最高用量でのみ検出され（１０００および１０、０００ｎｇ／ｍｌでそれぞれ４５％および６７％）たが、細胞表面へのタンパク質も若干認められた（非透過処理細胞に於いて１０００および１０、０００ｎｇ／ｍｌでそれぞれ１９％および３３％）。Ｂ、６日齢の多核細胞由来マクロファージ（ＭＤＭ）を０．１から１０、０００ｎｇ／ｍｌまでの範囲の用量のＴａｔと、暗所で６０分間、３７℃にてインキュベーションし、図１のＭＤＤＣに関する記載と同じに処理し、染色した。Ｔａｔの取込は１０から１０、０００ｎｇ／ｍｌの範囲で検出され、陽性細胞の割合はそれぞれ３２％から７２％であった。しかし最高用量（１０、０００ｎｇ／ｍｌ）では、非透過処理ＭＤＭでも３０％の染色がることで示される様に、かなりの量のＴａｔタンパク質が細胞表面に局在している。Ｃ、同一ドナーの６日齢ＭＤＤＣを０．１から１０００ｎｇ／ｍｌの用量のＴａｔと、暗所にて３０分間、３７℃でにてインキュベーションし、図１のＭＤＤＣに関する記載と同じに処理し、染色した。Ｔａｔの取込は、全てのタンパク質濃度に於いて、同一ドナーの単核細胞およびマクロファージで得られたレベルより高いレベルで検出され（１０００ｎｇ／ｍｌでは１０および３０分後それぞれについて８０％および７３％）、細胞膜への結合は検出されなかった。
【００７８】
図６．ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質、その機能ドメインおよびＴａｔペプチド。ＨＩＶ−Ｔａｔの概略名で、利用した機能ドメイン（Ａ）および１５および３８アミノ酸長ペプチド（パネルＢおよびＣにはそれぞれ１５ｍｅｒおよび３８ｍｅｒで示す）の配列（クレードＢコンセンサス配列に基づく）を持つ、８６および１０２アミノ酸長の自然発生変異体。
【００７９】
図７．Ｔａｔの取込みはＲＧＤまたは塩基性領域を有するＴａｔペプチドにより多様な影響を受ける。Ａ、Ｔａｔ（０．１から１、０００ｎｇ／ｍｌ）を３０分間、３７℃で添加する前に、様々なＴａｔタンパク質の領域：Ｎ−末端（１〜１５＋６〜２０）、富システイン（２１〜３５＋２６〜４０）、塩基性（４６〜６０＋５１〜６５）またはＲＧＤ（６６〜８０＋７１〜８５）配列に対応する１５ｍｅｒのＴａｔペプチドが複数存在する条件下で１時間、４℃でインキュベーションしたＭＤＤＣ。ＢおよびＣ、１０（Ｂ）または１０００ｎｇ／ｍｌ（Ｃ）、１０分間、３７℃のＴａｔ添加前に、ＭＤＤＣを４００から５０、０００ｎｇ／ｍｌの４６〜６０または６６〜８０の１５ｍｅｒ  Ｔａｔを単独、または組合せて前処理した。Ｄ、１０分間、３７℃のＴａｔタンパク質（０．１から１、０００ｎｇ／ｍｌ）添加前に、ＭＤＤＣをＴａｔタンパク質の各種領域をカバーする（図６、パネルＣに規定）３８／４６−ｍｅｒのＴａｔペプチド（１〜３８、２１〜５８、４７〜８６、５７〜１０２）が存在する状態で、２時間４℃でインキュベーションした。いずれの場合も、次にＴａｔの細胞内染色を上記同様に行った。データは、３ドナー名より得たＴａｔ陽性細胞のパーセンテージの平均値（およびＳＥＭ）として表されている。
【００８０】
図８．ローダミン標識活性Ｔａｔは用量依存的な様式でサイトカイン−活性化内皮細胞に取り込まれる。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、既報に従いヒトＴリンパ球好性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）で形質転換された、またはＰＨＡにより刺激したＣＤ４＋細胞のコンディション培地存在下に５〜６日間培養して、活性化した。これらコンディション培地はＩＬ−１、ＴＮＦおよびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を包含する同一の炎症性サイトカインを含むが、これらは炎症または修復プロセス時に内皮細胞を活性化する。具体的にはＩＬ−１、ＴＮＦおよび／またはＩＦＮγは内皮細胞にインテグリン受容体であるα５β１およびαｖβ３の発現を誘導する。
【００８１】
培養５〜６日後、HUVECをトリプシン処理して懸濁し、トリプシン阻害剤で洗浄、８ウエル型チャンバースライド（Ｎｕｎｃ  Ｉｎｃ．Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に５×１０４細胞／ウエルで播き、コンディション培地無しの状態で１５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｒａｇｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）で１８時間培養した。その後細胞を無血清ＲＰＭＩで洗浄してから、既報の方法（Ｍａｎｎ  １９９１年）に実質従いリジン残基をローダミン標識した生物活性Ｔａｔタンパク質の連続希釈体を含む無血清ＲＰＭＩを用い、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で１５分間培養した。簡単に述べると、５０μｇの組換え体Ｔａｔ（２ｍｇ／ｍｌ）に２．５μｌの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を加えｐＨを９にした。次に２．５μｌの１ｍｇ／ｍｌのテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）溶液を加え、４℃で８時間反応させた。未反応のＴＲＩＴＣを、２．５μｌの０．５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌを加え消光し、ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌを持ち手７．０まで下げ、ローダミン標識Ｔａｔを５０ｎＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、1ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）に対し交換しながら２回透析して消光したＴＲＩＴＣを除いた。同様にローダミン標識したＢＳＡまたはＰＢＳを陰性コントロールとして用いた。ローダミン標識Ｔａｔを既報の様にしてＫＳ細胞増殖活性について試験し、生物活性が維持されていることを確認した。Ｔａｔ懸濁緩衝液（ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ）を同様にローダミン処理し、陰性コントロールとして用いた。次にＨＵＶＥＣを氷冷アセトン−メタノール（１：１）で固定した。Ｔａｔの取込みおよび細胞内分布は蛍光顕微鏡を用いて観察し、写真撮影した。結果は、前もってサンプルコードを知らせない状態でサンプルの蛍光を陰性コントロールの蛍光と比較し、−（陰性）から＋＋＋＋（高陽性）までスコア付して評価した。
【００８２】
インキュベーションは：緩衝液（ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ）、パネルＡ；Ｔａｔ  １０ｎｇ／ｍｌ、パネルＢ；Ｔａｔ  １００ｎｇ／ｍｌ、パネルＣ；Ｔａｔ  １μｇ/ml、パネルDで行った。
【００８３】
図９．サイトカイン−活性化内皮細胞による１００ｎｇ／ｍｌローダミン標識活性Ｔａｔ取込みの時間−経過分析。図８の説明に従いＨＵＶＥＣを活性化し、８ウエルチャンバースライドに播いた。次に細胞を１００ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔに以下に示す時間曝露した。ＢＳＡ（フラクションＶ，Ｓｉｇｍａ）をＴａｔと同様にローダミン標識し、陰性コントロールとして使用した。インキュベーションを：Ｔａｔ  １００ｎｇ／ｍｌ、曝露時間１５’、パネルＡ；ＢＳＡ、曝露時間１５’、パネルＢ；Ｔａｔ  １００ｎｇ／ｍｌ、曝露時間６０’、パネルＣ；ＢＳＡ、曝露時間６０’、パネルＤ。
【００８４】
図１０．サイトカイン−活性化内皮細胞による１μｇ／ｍｌローダミン標識活性Ｔａｔ取込みの時間−経過分析。サイトカイン−活性化ＨＵＶＥＣを図８の説明に従い処理し、次に１μｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔと１５分間、パネルＡ；３０分間、パネルＢ；６０分間、パネルＣ；１２０分間、パネルＤ、インキュベーションした。
【００８５】
図１１．サイトカイン−活性化内皮細胞対非活性化細胞による活性Ｔａｔタンパク質取込の用量−反応分析。ＨＵＶＥＣ（７×１０４細胞／６ウエル型ゼラチン処理プレートのウエル）を上記同様（図８の説明）に完全培地で増殖し、組合せ組換え体炎症性サイトカイン（ＩＦＮγ  １０Ｕ／ｍｌ、ＩＬ−１β  ５ｎｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−α  ２ｎｇ／ｍｌ）存在下（ＩＣ−ＥＣ）、または非存在下（ＥＣ）に５日間インキュベーションした。次に細胞を２回洗浄し、活性Ｔａｔタンパク質の連続希釈体（０．０１から１０００ｎｇ／ｍｌ）またはＴａｔ希釈緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）存在下または非存在下に１５％ＦＣＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０の中、暗所、１０’、３７℃でインキュベーションした。次に細胞を冷ＲＰＭＩ  １６４０で洗浄し、トリプシン処理後ＦＡＣＳ溶解液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い４℃で１０’固定し、ウサギ抗Ｔａｔ抗体またはウサギＩｇＧコントロール抗体で染色、ＭＤＤＣと同様（図１の説明）にしてＦＡＣＳを用い分析した。未変性Ｔａｔの取込みは、非活性化細胞に比べサイトカイン−活性化細胞で増加していた。実施した３回の実験から代表１回の実験について、未変性Ｔａｔタンパク質の濃度の増加に伴う１０’インキュベーション後の陽性細胞のパーセンテージを示す。
【００８６】
図１２．サイトカイン−活性化内皮細胞による活性Ｔａｔの取込みの用量−および時間−経過分析。細胞を図１１記載の通りに活性化し、取込み実験を行った。インキュベーションは５’、１０’、３０’、または６０’であった。更にタンパク質が特異的的に細胞質内に局在することを示すために、非透過処理ＨＵＶＥＣについて抗Ｔａｔ抗体による染色も行った。活性化内皮細胞による未変性Ｔａｔの取込みは、時間−および用量−依存的であり、０．０１ｎｇ／ｍｌという低濃度で既に検出される。陽性細胞のパーセンテージ（イソタイプ抗体染色サンプルと比べた）をボックス内に示した。データは４回行った実験の中の代表１回についてのものである。
【００８７】
図１３．未標識Ｔａｔタンパク質によるサイトカイン−活性化内皮細胞による１０ｎｇ／ｍｌローダミン標識活性Ｔａｔの取込み阻害。サイトカイン−活性化ＨＵＶＥＣを図８記載通りに処理し、緩衝液または１μｇ／ｍｌの未標識Ｔａｔを含む無血清培地で前インキュベーションした後、１０ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔまたはローダミン標識ＢＳＡと３７℃で１５分間インキュベーションした。
パネルＡ、緩衝液と前インキュベーションした後、ＢＳＡとインキュベーションした。
パネルＢ、緩衝液と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
パネルＣ、１μｇ／ｍｌの未標識Ｔａｔと前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
【００８８】
図１４．抗α５β１および抗αｖβ３抗体による、サイトカイン−活性化内皮細胞による１０ｎｇ／ｍｌローダミン標識活性Ｔａｔ取込み阻害。図８の説明に記載の通りにＨＵＶＥＣをＰＨＡ刺激またはＨＴＬＶ  ＩＩ形質転換Ｔ細胞から得たコンディション培地を使って活性化（ＩＣ−ＨＵＶＥＣ）し、８ウエルチャンバースライドに播いた。次にＩＣ−ＨＵＶＥＣをα５β１受容体のα鎖（抗ＣＤ４９ｗＥ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）およびα５β１受容体受容体のβ鎖（抗ＣＤ２９）、またはαβ３受容体のα鎖（抗ＣＤ５１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびαｖβ３受容体のβ鎖（抗ＣＤ６１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する抗体と共に、回転装置上で２時間、４℃にて無血清培地中でインキュベーションした。内皮細胞マーカーである第ＶＩＩＩ因子関連抗原（抗ＦＶＩＩＩＲＡ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対するモノクローナル抗体を特異性に関するコントロールに用いた。全ての抗体は５μｇ／ｍｌで使用した。抗体希釈緩衝液（０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を陰性コントロールとして用いた。抗体と前インキュベーションした後、１０ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔを細胞に加えた。ローダミン標識ＢＡＳを陰性コントロールとして用いた。ＩＣ−ＨＵＶＥＣをＣＯ２インキュベーター内で１５’、３７℃に維持してから、氷冷アセトン−メタノール（１：１）で固定した。蛍光顕微鏡を用いてＴａｔの取込みと細胞内分布を観察し、写真撮影した。結果は、サンプルの蛍光と陰性コントロールの蛍光を比較し、サンプルコードを教えない状態で取込量を−（陰性）から＋＋＋＋（高陽性）までの間でスコア付けして評価した。
パネルＡ、緩衝液と前インキュベーションした後、ＢＳＡとインキュベーションした。
パネルＢ、緩衝液と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
パネルＣ、抗α５および抗β１モノクローナル抗体と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
パネルＤ、抗αｖおよび抗β３モノクローナル抗体と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
パネルＥ、抗ＦＶＩＩＩ抗体（コントロール抗体）と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
【００８９】
図１５．抗α５β１および抗αｖβ３抗体による、サイトカイン−活性化内皮細胞による１００ｎｇ／ｍｌローダミン標識活性Ｔａｔ取込み阻害。図８の記載に従いＩＣ−ＨＵＶＥＣを処理した後、緩衝液または抗体を含む無血清培地で前インキュベーションし、更に１００ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔまたはローダミン標識ＢＳＡと１５分間、３７℃でインキュベーションした。
パネルＡ、緩衝液と前インキュベーションした後、ＢＳＡとインキュベーションした。
パネルＢ、緩衝液と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーション。
パネルＣ、α５β１インテグリンのα鎖およびβ鎖に対するモノクローナル抗体と前インキュベーションした後Ｔａｔとインキュベーションした。
パネルＤ、αｖβ３インテグリンのα鎖およびβ鎖に対するモノクローナル抗体と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
パネルＥ、抗ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体（コントロール抗体）と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
【００９０】
図１６．細胞をＴａｔと１５分間インキュベーションした場合、１μｇ／ｍｌのローダミン標識活性Ｔａｔの取込は抗α５β１および抗αｖβ３抗体により部分的に阻害される。図８の記載に従いＨＵＶＥＣを活性化し、抗α５および抗β１または抗αｖおよび抗β３モノクローナル抗体、或いは緩衝液で前インキュベーションした後、１μｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔまたはローダミン標識ＢＳＡと１５分間、３７℃でインキュベーションした。
パネルＡ、緩衝液と前インキュベーションした後、ＢＳＡとインキュベーションした。
パネルＢ、緩衝液と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーション。
パネルＣ、抗α５および抗β１モノクローナル抗体と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
パネルＤ、抗αｖおよび抗β３モノクローナル抗体と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
【００９１】
図１６．細胞をＴａｔと６０分間インキュベーションした場合、１μｇ／ｍｌのローダミン標識活性Ｔａｔの取込は抗インテグリン抗体により阻害されない。図８の記載に従いＨＵＶＥＣを活性化し、抗α５および抗β１または抗αｖおよび抗β３モノクローナル抗体、或いは緩衝液で前インキュベーションした後、１μｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔと６０分間、３７℃でインキュベーションした。
パネルＡ、緩衝液と前インキュベーションした後、ＢＳＡとインキュベーションした。
パネルＢ、抗α５および抗β１モノクローナル抗体と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
パネルＣ、抗αｖおよび抗β３モノクローナル抗体と前インキュベーションした後、Ｔａｔとインキュベーションした。
【００９２】
図１８．活性ＴａｔはＭＤＤＣによるサイトカインであるＩＬ−１２およびＴＮＦ−α、ならびにβケモカインであるＭＩＰー１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳの産生を高める。８名のドナーより得たＭＤＤＣを、連続濃度（２０から２０、０００ｎｇ／ｍｌ）の未変性または酸化Ｔａｔを含むまたは含まない完全培地中に１×１０５／ｍｌの密度で１８時間培養した。Ｔａｔ溶解用緩衝液を陰性コントロールとして使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ、血清型０５５：Ｂ５のＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）を陽性コントロールに用いた。１８時間号、細胞上清を集め、市販のキットをメーカー指示書（Ｃｙｔｏｓｃｒｅｅｎ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａおよびＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡキット、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｎｉｖｅｌｌｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ；Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）に従い使用してＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−αおよびＭＩＰ−１βの存在についてアッセイした。グレーの、中空および黒の印は、それぞれＴａｔ、緩衝液またはＬＰＳで処理された細胞の値を示している。データは８名のドナーの平均値（±ＳＥＭ）として報告されており、ｐｇ／ｍｌ単位で表示されている。酸化−不活性化Ｔａｔタンパク質によるサイトカインまたはβケモカイン産生は非常に低かった。
【００９３】
図１９．活性ＴａｔはＭＤＤＣによる同種抗原提示を高める。ＭＤＤＣ（２×１０５細胞／ｍｌ）をＬＰＳ（陽性コントロール）（黒丸）、活性化Ｔａｔタンパク質（黒三角）、溶解用緩衝液（白三角）または培地（白丸）と１８時間インキュベーションした。次にＭＤＤＣを洗浄し、９６ウエルプレートの培地（５％ＦＢＳを含む）の中で、１：１０から１：６４０までの割合の単核細胞欠失同種ＢＰＬと共に培養した。リンパ細胞の増殖を評価するために、６日後に３［Ｈ］チミジンをウエルに加えてから更に１６時間培養し、サンプルをガラスファイバーフィルター（Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ  Ａ、Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）上に集め、Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（Ｗａｌｌａｃ）を用い測定し、値をｃｐｍ単位で表した。データは代表実験のものであるが、残り３名のドナーについても再現された。平均値とＳＥＭを報告する。
【００９４】
図２０．活性ＴａｔはＭＤＤＣによるプライミ処理されたＰＢＬに対するＴＴ特異的提示を増加し、特異的Ｔ細胞反応を高める。３名の健康ドナー、増殖アッセイでＴＴに反応した２名（Ｂ１６およびＢ４２）、および反応しなかった１名（Ｂ４５）のＭＤＤＣ（２×１０５細胞／ｍｌ）を、活性Ｔａｔタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）、溶解用緩衝液、または培地と１８時間インキュベーションし、次に５μｇ／ｍｌのＴＴ（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、Ｗｉｌｌｏｗｄａｌｅ、Ｃａｎａｄａ）非存在下（中空カラム）または存在下（グレーカラム）に、１：２０の割合の自己ＰＢＬ（２×１０５細胞／ウエル）と共に完全培地（５％ＦＢＳを含む）で培養した。リンパ細胞分化を評価するために、上記同様に６時間後に３［Ｈ］チミジンを加え更に１６時間培養し、サンプルを集め、ｃｐｍ測定をおこなった。データはＤＣ−ＰＢＬ共培養の測定値とＰＢＬ単独の場合の測定値との比を示す、刺激指数（Ｓ．Ｉ．）で表されている。
【００９５】
図２１．生物活性Ｔａｔタンパク質のアジュバント活性を評価するためのプライム−ブーストワクチンプロトコール。２グループのＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。第一グループ（１群）はＧａｇのみを用いて２回皮内免疫（プライミング）した後、さらに粘膜アジュバントＭａｌｐ−２とＧａｇを用いて２回鼻内免疫（ブースティング）を行った。第二グループ（２群）は、ＧａｇとＴａｔの混合体を用いて２回皮内免疫（プライミング）してから、更にＴａｔとＧａｇとの混合体に加えて粘膜アジュバントＭａｌ−２を用い２回鼻内免疫（ブースティング）した。ワクチン接種は表示した時間に行われた。
【００９６】
図２２．Ｇａｇに対する抗体反応。両群のマウスの血清について、市販Ｅｌｉｓａ（ＥＬＡＶＩＡ  ＡＢ  ＨＩＶ２、ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｓｒｌ、ＭＩ、Ｉｔａｌｙ）をメーカー指示書通りに用い抗Ｇａｇ抗体を測定した。血清は試験前に１：１００に希釈された。カットオフ値は光学密度０．３であった。
【００９７】
図２３．抗Ｇａｇ細胞傷害活性。両群のマウスの脾臓細胞を、ＩＬ−２（エフェクター）存在下に６日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧａｇペプチドを用い刺激した後、Ｇａｇペプチドでパルス処理した５１Ｃｒ標識ｐ８１５細胞（標的細胞）と、表示の比率で混合しインキュベーションした。特異溶解率を標準的な方法に従い決定した。５１Ｃｒの自然放出は最大放出の１０％を越えなかった。１０％を越える特異的５１Ｃｒ放出を陽性とした。
【実施例】
【００９８】
以下実施例により本発明をより詳しく描写するが、これら実施例は発明の範囲を限定するものと考えてはならない。
【００９９】
［実施例１］
活性ＴａｔはＭＤＤＣにより効率的に取込まれるが、ＴＣＢおよびＢＬＣＬには取り込まれない。
【０１００】
ＭＤＤＣ、ＴＣＢおよびＢＬＣＬによる活性Ｔａｔの取込みを、透過処理した細胞に対し特異的アフィニティー精製ポリクローナル抗体を用い、サイトフローメトリーでの細胞内免疫蛍光から評価した。図１はそのＴａｔ取込みレベルが試験した１４名のドナーの中央値であった代表ドナーの結果を示している。ＭＤＤＣによるＴａｔ取込みは非常に効率的であり、用量−および時間−依存的様式であった（図１Ａ）。取込みは、使用したＴａｔの最低用量（０．１ｎｇ／ｍｌ）でも明瞭であった。試験したＴａｔ濃度に関係なく、染色レベルは常にインキュベーション５分後にピークを形成し、そして６０分後には減少したが、これはタンパク質処理によると思われる。しかし用いた最高用量のＴａｔでは、Ｔａｔ取込はインキュベーション６０分まで高い（９８％）ままであった。培地のみ、あるいは溶解用緩衝液でインキュベーションした細胞では染色は認められなかった（図１Ａ）。更に、透過処理されていない細胞とＴａｔとのインキュベーションでは１０分または３０分後でも染色が観察されなかったことから、検出されたＴａｔは殆ど全てが細胞内であった（図１Ｂ）。ＭＤＤＣによるＴａｔ取込みの同様の用量−および時間−動態が異なるタンパク質ロットについても繰り返し観察された。
【０１０１】
ＭＤＤＣとは対照的に、ＴＣＢおよびＢＬＣＬによる活性Ｔａｔの取込みは極めて低効率であった。実際両細胞では、１０μｇ／ｍｌまでのＴａｔ濃度に関しインキュベーション３０または６０分後に特異的細胞内染色は殆ど、または全く観察されず、最高用量のＴａｔの値でさえＭＤＤＣで得られた値に比べ遙かに低かった（ＢＬＣＬおよびＴＣＢについてそれぞれ０〜１５％および３〜１０％であったのに対し９８％）（図１Ｃ）。従って活性Ｔａｔの効率的取込みはＭＤＤＣ特有の性質である。
【０１０２】
［実施例２］
ＭＤＤＣによる活性Ｔａｔの取込は細胞の成熟に伴い増加し、タンパク質の酸化および不活性化により消失する
未成熟なＭＤＤＣは抗原を貪食反応および飲反応によって取込む。成熟したＤＣはこれら活性を失うが、その一方で強い抗原提示能を獲得する。細胞の成熟が未変性Ｔａｔの取込みに影響するか実証するために、ＬＰＳを用いてＭＤＤＣを成熟させた。未成熟ＭＤＤＣと比較し、成熟ＭＤＤＣは高レベルのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ８６表面マーカーを発現した。次に未成熟または成熟細胞を使用して取込み実験を行った。試験した全てのタンパク質濃度に於いて、ＭＤＤＣの成熟によりＴａｔの取込みは大きく増加した（図２Ａ）。実際、成熟ＭＤＤＣと低濃度のＴａｔとのインキュベーションでは、最高濃度のＴａｔと未成熟細胞とのインキュベーションに観察されたレベルの細胞内染色が認められた（図１Ａおよび２Ａ）。
【０１０３】
Ｔａｔは７個のシステインを含んでおり、立体構造を変化させて生物活性を失わせる酸化に対し非常に敏感である。ＭＤＣＣによる取込みプロセスでのＴａｔの立体構造および生物活性の役割を検証するために、タンパク質を空気および光に曝し、生物活性の消失について試験し（表１）、次に活性または不活性Ｔａｔタンパク質を取込み実験で比較した。図２Ｂに示す様に、酸化Ｔａｔの場合１μｇ／ｍｌより低いタンパク質濃度では染色は観察されず、１μｇ／ｍｌの濃度で未変性Ｔａｔに比べて非常に低いＴａｔ特異的染色が観察された。従って、ＴａｔはＭＤＤＣにより効率的に取込まれるには、未変性の立体構造と生物活性を有している必要がある。
【０１０４】
ＭＤＤＣの成熟はＴａｔ取込みを増し、これに伴って飲／貪食活性は低下するが、一方このタンパク質の酸化および不活性化はＴａｔ取込みをＢＬＣＬおよびＴＣＢに観察されたレベルに匹敵するレベルまで大きく下げることから、ＭＤＤＣによる未変性Ｔａｔの取込みは特異的受容体、および細胞の飲／貪食活性とは関係がなく、ＭＤＤＣの成熟により増す取込みメカニズムにより行われると考えられる。
【表１】
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Ｔａｔは空気および光に１８時間曝露し酸化した。それからＨＬＭ−１細胞株でのＴａｔ欠失ＨＩＶプロウイルスの複製救済能を測定するか、ＬＴＲ−ＣＡＴ構築体を含むＨＬ３Ｔ１細胞株へのＣＡＴ活性誘導能を測定することにより、未変性および酸化タンパク質の生物活性を試験した。ＨＬＭ−１細胞培養上清のｐ２４（ｐｇ／ｍｌ）およびＨＬ３Ｔ１細胞抽出物のＣＡＴ活性（％アセチル化／１００μｇタンパク質）の値を示している。
【０１０５】
［実施例３］
抗α５β１および抗αｖβ３モノクローナル抗体またはその天然リガンドであるＦＮ若しくはＶＮによるＭＤＤＣの活性Ｔａｔ取込み阻止
ＭＤＤＣによる未変性Ｔａｔの取込みが特異的受容体介在エンドサイトーシス経路を辿るか検証するために、インテグリン受容体α５β１およびαｖβ３に対する特異的モノクローナル抗体または競合リガンドを用いて実験を行った。これら受容体は各種タイプの細胞にある複数のＴａｔ結合受容体から選ばれたものであるが、それはこれら受容体が活性化された内皮細胞やＫＳ細胞で強く発現しており、そしてこれら細胞がＴａｔ存在下に増殖、移動および接着し、それがα５β１およびαｖβ３インテグリンへのＴａｔのＲＧＤ領域の結合を介し行われているからである。図３Ａ、Ｂに示すように、ＭＤＤＣによるＴａｔの取込みは、抗α５β１および抗αｖβ３モノクローナル抗体により阻害され、この阻害はこれら抗体が両方存在するとき完全である（図３Ａ、Ｂ）。これら受容体の天然リガンド、即ちＦＮおよびＶＮは同様の様式でＴａｔ取込みを阻止する（図４Ａ、Ｂ）。即ち、α５β１およびαｖβ１インテグリンはＭＤＤＣに於けるＴａｔの侵入を介在する。この取込み経路はピコモル〜ナノモルのタンパク質濃度の時に主流であるが、これより高いＴａｔ濃度ではまだこのＴａｔ侵入阻止は認められるものの完全ではない（図３ＡおよびＢ）。このことはＭＤＤＣがＴａｔ取込み関して少なくとも２つの経路を利用しており、低Ｔａｔ濃度（ピコモル〜ナノモル）で機能する第一経路はインテグリン介在エンドサイトーシスであり、一方より高いＴａｔ濃度では低親和性の細胞表面相互作用も共存する。
【０１０６】
［実施例４］
活性ＴａｔはＭＤＭおよびＭＤＤＣに用量−および時間−依存的様式で効率的に取り込まれるが、単核細胞には取り込まれない。
ＭＤＤＣは単核細胞由来であること、そして単核細胞およびＭＤＭはリンパ細胞に対し抗原を効率的に提示することが知られていることから、これら細胞からの活性Ｔａｔの取込みを分析し、同一ドナーより得たＭＤＤＣの取込みと比較した。単核細胞を末梢血から精製し、ＭＤＤＣまたはＭＤＭへ分化誘導した（図１および図５の記載の通りにして）。図５に示すように、単核細胞は活性Ｔａｔを最高用量時のみ取り込んだ（１、０００および１０、０００ｎｇ／ｍｌでそれぞれ４５％および６７％）が、同時に細胞表面への結合も認められた（非透過処理細胞でそれぞれ１９％および３３％）。ＭＤＭはＴａｔを単核細胞に比べより効率的に取込み、比較的低容量（１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌでそれぞれ３２％および４３％）でも、そして表面へのタンパク質結合が観察されるものの（非透過処理細胞で３０％）試験した最高Ｔａｔ用量まで（１０、０００ｎｇ／ｍｌで７２％）染色が認められた。同一ドナーのＭＤＤＣは１０分および３０分の両時点において、試験した最低用量（０．１ｎｇ／ｍｌ）でも単核細胞およびＭＤＭより効率的にＴａｔを取込んだ（それぞれ２２％および１３％）。最高用量では（１０００ｎｇ／ｍｌ）Ｔａｔへ曝露した１０分および３０分後に、ＭＤＤＣの８０％および７３％が陽性であった。全てのタンパク質用量於いて、ＭＤＤＣおよびＭＤＭは単核細胞に比べより効率的にＴａｔを顕著に取込んだ。ＭＤＤＣおよびＭＤＭは共に単核細胞から分化することから、これらデータは細胞分化が特異的にＴａｔタンパク質を標的とし取込むメカニズムを持った細胞をもたらすことを示している。
【０１０７】
［実施例５］
ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質の塩基性領域およびＲＧＤドメインを包含するペプチドによる活性Ｔａｔ取込み阻害。
Ｔａｔのどのドメインがこの生物活性タンパク質の取込みに関係しているか検証するために、ＭＤＤＣをＮ末端領域Ｎ−末端（１〜１５＋６〜２０）、富システイン領域（２１〜３５＋２６〜４０）、塩基性領域（４６〜６０＋５１〜６５）、ＲＧＤ領域（６６〜８０＋７１〜８５）（図６、パネルＡおよびＢ）をカバーする各種Ｔａｔペプチド（１５ｍｅｒ）と前インキュベーションして阻止実験を行った。Ｎ末端領域と富システイン領域をカバーするペプチドは試験したいずれの用量（０．１〜１、０００ｎｇ／ｍｌ）のＴａｔ取込みにも影響しなかった（図７、パネルＡ）。塩基性領域をカバーするペプチドは高用量（１００および１０００ｎｇ／ｍｌ）のＴａｔの取込みを大きく低下したが、低濃度（０．１〜１０ｎｇ／ｍｌ）の生物活性Ｔａｔタンパク質の取込みには影響しなかった。これとは逆に、ＲＧＤ領域をカバーするペプチドは１０ｎｇ／ｍｌまでの用量のＴａｔの取込を無効にし、そして１００と１０００ｎｇ／ｍｌの取込を顕著に低下させた。Ｔａｔペプチド４６〜６０と６６〜８０の組合せが１０および１００ｎｇ／ｍｌ用量の生物活性Ｔａｔの取込を無効にしたことに注意（図７、パネルＢおよびＣ）。同一実験条件下に於いてＮ末端とシステイン領域の両方をカバーする長いＴａｔペプチド（１〜３８）（図６、パネルＣ）は生物活性Ｔａｔの取込みに影響しなかったが、システインと塩基性領域の両方をカバーするＴａｔペプチド２１〜５８は、１００および１０００ｎｇ／ｍｌのＴａｔ取込みを顕著に低下させ、そしてＲＧＤ領域もカバーするＴａｔペプチド５７〜１０２は１００ｎｇ／ｍｌ以下の用量のＴａｔ取込みを無効にした（図７、パネルＤ）。従って、ＲＧＤモチーフを包含するペプチドによるα５β１およびαｖβ３インテグリンの遮断は、ピコモル〜ナノモル濃度の生物活性Ｔａｔの取込みを無効にし、一方より高濃度（ナノからマイクロモル、１０〜１、０００ｎｇ／ｍｌ）濃度のＴａｔ取込みはヘパリン結合プロテオグリカンとの相互作用を介してＴａｔ塩基性領域により仲介されている。これと関連し、塩基性およびＲＧＤ領域を共に包含するペプチドの組合せは、生物活性Ｔａｔタンパク質の結合経路と取込み経路の両方を妨害することで、試験した用量全てに於いてＴａｔ取込みを完全に無効にする。従って、これらデータは最適なＴａｔ取込みには両方のドメインが必要であることを示すが、同時に効率的（即ち低濃度での）および選択的な｛（即ちＭＤＤＣおよび活性化ＥＣ（以下参照）の様なα５β１およびαｖβ３インテグリン発現型細胞｝Ｔａｔ取込みにとってはＲＧＤ領域が重要であり、塩基性領域は高濃度Ｔａｔの取込みのみに関係していること、そしてこれはあらゆるタイプの細胞に見られることから標的特異性を欠くものであることも示している。
【０１０８】
［実施例６］
炎症性サイトカインによる細胞活性化前後での初代内皮細胞による活性Ｔａｔの取込み  内皮細胞による活性Ｔａｔの取込みを分析するために、ＨＵＶＥＣを炎症性サイトカインで活性化し、または活性化しないままローダミン標識Ｔａｔによる取込み試験に用いた。ローダミン標識Ｔａｔが未標識Ｔａｔと同一濃度域に於いてＫＳ細胞の増殖をまだ促進できることから、ローダミン標識後もＴａｔは活性であった。このことは蛍光ラベルの結合がその生物機能を害さないことを示している。細胞を広に濃度範囲のＴａｔに曝露した。更に、取込み阻害実験（以下参照）に合わせるために、細胞をウシ胎児血清を含まない培地と４℃、２時間前インキュベーションした。この前インキュベーションはその後のローダミン標識Ｔａｔの取込みに影響しない。ローダミン標識Ｔａｔを用いた場合、活性化ＨＵＶＥＣ（ＩＣ−ＨＵＶＥＣ）の核または仁へのタンパク質の取込みおよび移動は１０ｎｇ／ｍｌローダミン標識Ｔａｔとのインキュベーション１５分以内に明瞭に検出できるようになった（図８）。細胞内Ｔａｔ活性は用量−依存的（図８）および時間−依存的様式（図９および１０）で増加した。ローダミン標識ＢＳＡまたは緩衝液（陰性コントロール）は殆ど、または全く取込を示さなかった（図８、９、１０）。
【０１０９】
未標識活性Ｔａｔについて同様のデータが得られるか検証するために、細胞内染色とＦＡＣＳ分析を用いて実験を繰り返した（図１１、１２）。未変性Ｔａｔの取込は、非活性化細胞に比べＩＣ−ＨＵＶＥＣでより効率的であり（図１１）、また０．０１ｎｇ／ｍｌ以下の用量のＴａｔはＭＤＤＣと同様または同一の動態で用量−および時間−依存的様式で細胞に極めて迅速に取込まれた（図１２）。非透過処理細胞では染色が観察されなかったことから、Ｔａｔの全てまたは大部分は細胞によって取り込まれたことが示された。即ちＭＤＤＣ、ＩＣ−ＨＵＶＥＣおよびＭＤＭはＴａｔを非常に効率的に取り込む特有のメカニズムを有している。
【０１１０】
［実施例７］
未標識タンパク質による活性Ｔａｔの取込み阻害
ローダミン標識Ｔａｔタンパク質のＩＣ−ＨＵＶＥＣによる取込が固有な飽和経路を介したものであるか検証するために、１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌの濃度域のローダミンＴａｔとインキュベーションする前に、ＩＣ−ＨＵＶＥＣを１μｇ／ｍｌの未標識Ｔａｔとインキュベーションした。この操作によりローダミン標識Ｔａｔの取込みはほぼ完全に阻害され（図１３および表ＩＩ）、その蛍光レベルは陰性コントロール（ＢＳＡ）のレベルと同等であった。このことは、ＩＣ−ＨＵＶＥＣによるＴａｔタンパク質の取込は特異的且つ飽和型であることを示しており、このプロセスに受容体が関係していることを示唆している。
【表２】
2005505520.tif 000003
ＩＣ−ＨＵＶＥＣを１μｇ／ｍｌの未標識活性Ｔａｔを含まないまたは含む無血清培地と２時間前インキュベーションし、その後１００ｎｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔと６０分間インキュベーションした。Ｔａｔの取込みは図６の説明に記載のようにして蛍光顕微鏡で視覚化した。陰性コントロール（＋／−取込み）は無血清培地と前インキュベーションしてから、ローダミン標識ＢＳＡとインキュベーションした。
【０１１１】
［実施例８］
α５β１およびαｖβ３インテグリンに対するモノクローナル抗体、またはそれらのリガンドであるＦＮおよびＶＮによるピコモル濃度（１０から１００ｎｇ／ｍｌ）の活性Ｔａｔの取込み阻害。
【０１１２】
ＩＣ−ＨＵＶＥＣによるＴａｔ取込みがＭＤＤＣについて特定されたものと同一のリガンドを介しているか決定するために、ＩＣ−ＨＵＶＥＣをこれら受容体に対する生理学的リガンドであるＦＮまたはＶＮと前インキュベーションするか、或いは細胞をα５β１およびαｖβ３受容体のＲＧＤ結合領域に対するモノクローナル抗体と前インキュベーションして阻害実験を行った。次に細胞を１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌの濃度範囲のローダミン標識Ｔａｔとインキュベーションした。
【０１１３】
１０ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔの取込みおよび核内局在は、細胞を共に１００ｎｇ／ｍｌのＦＮまたはＶＮを用い事前処理することで阻害された（表ＩＩＩ）。同様に、１０から１００ｎｇ／ｍｌのＴａｔの取込は、細胞をＦＮ受容体であるα５β１およびＶＮ受容体であるαｖβ３両方のＲＧＤ結合領域に対するモノクローナル抗体で前処理することで阻害された（図１４、１５）。細胞の蛍光強度は陰性コントロールのレベルまで低下した（図１２、１３）。これらの結果は、ピコモル濃度のＴａｔはＭＤＤＣが認識するものと同一のインテグリンを介し取り込まれることを示している。これに対し、ＩＣ−ＨＵＶＥＣを陰性コントロールとして用いた第ＶＩＩＩ因子に対するモノクローナル抗体と事前にインキュベーションしても阻害は見られなかったことから、抗インテグリン抗体によるＴａｔ取込み阻害は特異的であることが示された。
【表３】
2005505520.tif 000004
ＩＣ−ＨＵＶＥＣをヒトＦＮまたはＶＮ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍｏｎｚａ、Ｉｔａｌｙ）を含まないまたは含む無血清培地と２時間前インキュベーションしてから、次に１０ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔと６０分間インキュベーションした。Ｔａｔの取込みは図８の説明に記した通りに蛍光顕微鏡を使った視覚化した。陰性コントロール（＋／−取込）は、無血清培地と前インキュベーションした後、ローダミン標識ＢＳＡとインキュベーションした。
【０１１４】
［実施例９］
１μｇ／ｍｌの活性Ｔａｔ取込へのインテグリン受容体の介在は部分的である
より高濃度（ナノモルからマイクロモル）の活性Ｔａｔの取込みへのインテグリンの関与を決定するために、ＩＣ−ＨＵＶＥＣを１μｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔとインキュベーションした。１５分以内に細胞内に非常に強い蛍光シグナルが観察された（図８パネルＤ、図１０パネルＡおよび図１６パネルＢ）。インキュベーションのこの時点で、細胞をα５β１（図１６パネルＣ）またはαｖβ３（図１６パネルＤ）に対するモノクローナル抗体で前処理すると、若干のＴａｔ取込み阻害が見られたが、それは１０または１００ｎｇ／ｍｌのＴａｔに観察されたものより低かった。ＩＣ−ＨＵＶＥＣを１μｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔとより長時間インキュベーションすると（６０分）、抗α５β１または抗αｖβ３モノクローナル抗体と前インキュベーションしてもＴａｔ取込みは阻害されなかった（図１７）。これらの結果は、この濃度とインキュベーション時間ではインテグリン依存型の取込は飽和しており、別のＴａｔ取込経路が主流であることを示している。
【０１１５】
［実施例１０］
活性Ｔａｔの取込を介在するＴａｔドメイン
どのＴａｔドメインがピコモル〜ナノモルおよびマイクロモル濃度のタンパク質取込みを担っているか検証するために、ＩＣ−ＨＵＶＥＣをＲＧＤ領域（Ｔａｔ６５〜８０）および塩基性領域（Ｔａｔ４６〜６０）をカバーするＴａｔペプチドと前インキュベーションして阻害実験を行った（表ＩＶ）。Ｔａｔペプチド１１〜２４を陰性コントロールに使用した。ローダミン標識Ｔａｔを細胞に加えた場合、ピコモル濃度のＴａｔの取込はＴａｔペプチド６５〜８０によって阻害されたが、Ｔａｔ４６〜６０または１１〜２４では阻害されなかった（表ＩＶ）。これに対し細胞外Ｔａｔが高濃度（１μｇ／ｍｌ）の場合、取込みはＴａｔ６５〜８０では阻害されなかったが、Ｔａｔ４６〜６０に若干の阻害作用が認められた。このことから、ピコモル〜ナノモル濃度のＴａｔはＴａｔ  ＲＧＤ領域とα５β１およびαｖβ３インテグリンとの相互作用を介していることが確認される。これに対し高濃度（ナノからマイクロモル）のＴａｔの取込は、ヘパリン結合プロテオグリカンとの相互作用を介してＴａｔ塩基性領域が媒介する。即ち、ＲＧＤ領域は効率的なＴａｔ取込みとって重要であるのに対し、塩基性領域は高濃度のＴａｔ取込みに関係しているが、ｋの取込はいずれのタイプの細胞にも認められることから標的特異性を欠いたものである。
【表４】
2005505520.tif 000005
ＩＣ−ＨＵＶＥＣを、無血清培地の中で過剰量（１０μｇ／ｍｌ）の（１１〜２４）Ｔａｔ、（４６〜６０）Ｔａｔまたは（６５〜８５）Ｔａｔと、回転装置上、２時間、４℃でインキュベーションした。ペプチド懸濁緩衝液（ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ）を陰性コントロールとして使用した。競合ペプチドと前インキュベーションした後、ローダミン標識Ｔａｔを細胞に１０、１００および１０００ｎｇ／ｍｌ加え、細胞をＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で１５’放置した。次に細胞を氷冷アセトンメタノール（１：１）で固定した。Ｔａｔの取込みおよび細胞内分布を図８の説明文に従い蛍光顕微鏡を用い観察し、写真撮影した。
【０１１６】
［実施例１１］
活性ＴａｔはＭＤＤＣの活性化および成熟化を誘導するが、酸化・不活性化Ｔａｔは誘導しない。
ＭＤＤＣの活性化と成熟化への活性Ｔａｔタンパク質の作用を評価するために、ＭＨＣ、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲの表面発現、並びに補助刺激分子ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３の表面発現を、タンパク質、完全培地、溶解用緩衝液またはＬＰＳ（陽性コントロール）存在下に１８時間培養した細胞をサイトフローメトリーで分析した。１０名のドナーについて得られた結果からは、Ｔａｔが細胞毒性なしにＭＨＣおよび補助刺激分子の発現増加を用量−依存的に誘導することが示された（表Ｖ、パネルＡ）。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の顕著な増加がＨＬＡ−ＡＢＣ（３／６ドナー、平均３７％）、ＨＬＡ−ＤＲ（１０／１０、平均４９％）、ＣＤ４０（６／１０、平均３５％）、ＣＤ８０（８／８、平均５０％）、ＣＤ８３（９／１０、平均１６４％）およびＣＤ８６（１０／１０、平均１４０％）について観察された。溶解用緩衝液または培地単独では、分析した分子の発現レベルに変化は生じなかった。注目すべきことに、Ｔａｔの酸化および不活性化（表Ｉ）によって、このタンパク質が持つＭＤＣＣに対するＭＨＣおよび補助刺激分子のアップレギュレーション能力が顕著に低下した（表Ｖ、パネルＢ）。即ち、活性ＴａｔのみがＭＤＤＣの活性化と成熟化を促進する。
【表５】
2005505520.tif 000006
【表６】
2005505520.tif 000007
それぞれ緩衝液または培地と比較した場合のＴａｔまたはＬＰＳにより誘導されたＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ抗原の発現の％増加。
細胞を未変性または酸化し不活性化したＴａｔ、溶解用緩衝液、完全培地、またはＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）に１８時間曝露し、次の蛍光色素標識モノクローナル抗体：ＦＩＴＣ−またはＰＥ標識ＩｇＧイソタイプ、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４およびＨＬＡ−ＤＲ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣ標識抗−ＣＤ４０、−ＣＤ８０、−ＣＤ８３抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ８６抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した後フローサイトメトリーを用い解析した。パネルＡには１０名のドナーより得たＭＤＤＣでの表面分子の発現がＴａｔ緩衝液（Ｔａｔについて）または培地（ＬＰＳについて）とインキュベーションした細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）と比較した場合のＭＦＩの％増加として報告されている。１例の代表ドナーの酸化型と未変性Ｔａｔ（２０μｇ／ｍｌ）比較データをパネルＢに示す。ＨＬＡおよび補助刺激分子の誘導に関しては、ＬＰＳと共に培養したＭＤＤＣを陽性コントロールとして使用した。
未変性または酸化Ｔａｔ存在下に培養したＭＤＤＣは常に生存可能であり、培地または溶解用緩衝液で処理したＭＤＤＣと異なる点はなかった（データ未提示）。
【０１１７】
［実施例１２］
未変性ＴａｔはＭＤＤＣを活性化し、ＭＤＤＣによるＴｈ−１型サイトカインおよびβ−ケモカインの産生を高めるが、酸化され不活性化されたＴａｔはしない。
ＤＣ活性化に及ぼす活性Ｔａｔの影響を評価するために、免疫細胞を活性化しＴｈ−１型反応を誘導することが知られているサイトカインＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生、並びに免疫反応の既知メディエイターであるβ−ケモカインであるＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの産生を、タンパク質、溶解用緩衝液（陰性コントロール）またはＬＰＳ（陽性コントロール）と共に１８時間培養した細胞の上清をＥＬＩＳＡにかけ調べた。（図１８）。活性ＴａｔとのインキュベーションはＩＬ−１２およびＴＮＦαのレベルの用量依存的増加を誘導し、最高用量のＴａｔでは緩衝液のみで処理した細胞に比べＩＬ−１２については２３倍（ｐ＜０．０２）、ＴＮＦ−αについては２０倍（ｐ＜０．０３）増加した。同様に、Ｔａｔは用量依存的様式でＰＡＮＴＥＳ（１０倍、ｐ＜０．０２）、ＭＩＰ−１α（９７倍、ｐ＜０．００５）０．００５）およびＭＩＰ−１β（１５倍、ｐ＜０．０１）の産生を顕著に高めた。溶解用緩衝液は影響を及ぼさなかったが、ＬＰＳ（陽性コントロール）はサイトカインとβ−ケモカインの両方の産生を高めた。
【０１１８】
未変性Ｔａｔタンパク質の作用に対し、酸化し不活性化したＴａｔはＩＬ−１２またはＴＮＦ−αの産生を増加しなかった。即ち未変性の活性ＴａｔのみがＭＤＤＣによるＴｈ−１サイトカインおよびβケモカインの産生と分泌を増加した。
【０１１９】
［実施例１３］
活性ＴａｔはＭＤＣＣによる同種提示を増加する
ＭＤＤＣの抗原提示能力に及ぼすＴａｔの作用を評価するために、細胞をＴａｔタンパク質、溶解用緩衝液、完全培地またはＬＰＳ（陽性コントロール）に曝露し、連続する細胞対細胞比で同種ＰＢＬと共培養した（図１９）。このアッセイを選んだ理由は、特定抗原に特異的ではないが、ＭＤＤＣの抗原提示機能全体について適切な情報を提供するかである。未処理のＭＤＤＣは同種リンパ細胞の増殖を、使用したＡＰＣ数に応じて若干増加した。しかし同種ＰＢＬの増殖反応はＴａｔでパルス処理したＭＤＤＣにより顕著に増加し（３．３倍、ｐ＜０．０１、最高ＤＣ／ＰＢＬ比時）、ＬＰＳによる誘導（同一細胞対細胞比で３．８倍、ｐ＜０．００５）と同レベルに達した。これに対しＭＤＤＣを溶解用緩衝液で処理した場合には同種リンパ細胞の増殖促進は観察されなかった（図１９）。即ち、未変性ＴａｔはＤＣの提示機能を高める。
【０１２０】
［実施例１４］
活性ＴａｔはＭＤＤＣの異種抗原提示および特異的Ｔ細胞反応を高める
ＭＤＤＣの抗原特異的提示能力に及ぼす活性Ｔａｔの作用を、細胞をＴａｔタンパク質、溶解用緩衝液または完全培地で一過性に処理し、追想抗原ＴＴ存在下に自己リンパ細胞と一緒に培養し評価した。図２０に示すように、未処理ＭＤＤＣは解析した３名中２名のドナーで自己リンパ細胞のＴＴ特異的増殖を誘導し（それぞれＳ．Ｉ．１５．４および７．３）、そしてこの作用が活性Ｔａｔ処理により高まる（それぞれＳ．Ｉ．  ２７．９および１２．５）が、溶解用緩衝液による処理では高まらなかった（それぞれＳ．Ｉ．１３および５．９）。Ｔａｔ処理ＭＤＤＣはＴＴに反応しなかった被験者ではＴＴに対するリンパ細胞増殖を誘導しなかった。即ち、Ｔａｔは他の抗原に対する特異的Ｔ細胞反応を高めることができる。
【０１２１】
［実施例１５］
ＳＩＶ  Ｇａｇ＋ＭＡＬＰ−２粘膜アジュバントと組合わせて生物活性Ｔａｔでマウスを免疫すると、Ｇａｇ＋ＭＡＬＰ−２によるワクチン接種に比べより強力な液性および細胞性免疫反応を誘導する。
ＭＤＤＣ活性に対する作用から明らかなように生物活性Ｔａｔには強力なアジュバント活性があることから、名目抗原と共に粘膜投与した場合に粘膜粘膜および全身免疫反応の両方を高めることが期待される（図２１の２群）。この目的のために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（図２１の２群）に生物活性Ｔａｔ（１０μｇ）と混合した１０μｇのＳＩＶ  Ｇａｇタンパク質を用いて２回皮内プライミングを行った後、Ｔａｔ＋Ｇａｇ＋Ｍａｌｐ−２で鼻内ブーストを２回行った。Ｅｌｉｓａにより決定されたこれら動物に誘導された抗Ｇａｇ抗体のレベルは、Ｇａｇ単独で免疫された動物（図２１および２２の１群）に見られたレベルに比べ高かった（図２２の２群）。より重要なことは、古典的な５時間の５１クロム放出アッセイを用い、エフェクター細胞（外来性ＩＬ−１２存在下にＧａｇペプチドのプールと共に６日間培養した脾臓細胞）を加える前に３〜４時間Ｇａｇペプチド（標的）のプールでパルス処理されたｐ８１５マウス肥満細胞腫細胞の殺滅度を測定したところ、Ｔｈ−１型Ｔ細胞免疫反応が誘導されたと判定されたことである。液性および細胞性免疫反応は共にＴａｔなしに上記免疫を行ったコントロールグループに誘導されたものより強力であった（図２３）。即ち、生物活性Ｔａｔを組合わせた名目抗原による免疫は、名目抗原のみで免疫したマウスに比べより優れた免疫反応を生じた。具体的には、実質的に高い名目抗原に対する血清ＩｇＧの力価およびＣＴＬ反応が認められた。同様に生物活性Ｔａｔによる粘膜免疫反応（即ち肺や膣洗浄液からの分泌性ＩｇＡ）も増加することが予想される。
【０１２２】
［予想実施例１６］
ベクターＤＮＡ単独または他のＨＩＶ抗原を発現するDNA結合タンパク質と組合せ発現させた生物活性Ｔａｔでサルを全身免疫すると、他抗原に対するＴｈ−１反応を増し、ウイルス攻撃に対しより効果的な感染制御ができる。
Ｔａｔ−ＤＮＡ発現ベクター単独または他抗原発現ＤＮＡとの組合せによるサルの全身免疫は、免疫抗原に対するＴ細胞免疫反応およびＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔ（Ｔｈ−１型）を誘導し、そしてＴａｔ無しで他の抗原によりワクチン接種を行った場合に比べ他抗原に対するＴｈ−１反応を増加することが期待される。更に、Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌの様な他のＨＩＶ抗原とＴａｔとの組合わせは、病原性ＳＨＩＶ８９．６Ｐによる攻撃に対しＴａｔ単独でのワクチン接種に比べより優れた予防を提供することが期待される。
【０１２３】
具体的には、子供のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）をＨＩＶ−１  ｔａｔＤＮＡ（０．５ｍｇ）単独、またはＨＩＶ−１  ｅｎｖおよびＳＩＶｍａｃ２３９ｇａｇ  ＤＮＡ（各０．５ｍｇ）で筋肉内免疫（６週間に３回接種）し、更に生物活性Ｔａｔタンパク質（２５μｇ）とＩＳＣＯＭｓのみ、または２５μｇのＨＩＶ−１  Ｅｎｖと２５μｇのＳＩＶｍａｃ２３９Ｇａｇタンパク質と組合せて２回筋肉内ブーストすることによって、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−４用Ｅｌｉｓｐｏｔで確認できる特異抗体の産生、リンパ細胞増殖反応およびＣＴＬを含む特異的Ｔｈ−１免疫反応を、生物活性Ｔａｔタンパク質および／またはそのペプチドに対して単独で、或いは生物活性Ｔａｔタンパク質および／またはそのペプチド並びにＨＩＶ−１  ＥｎｖおよびＳＩＶｍａｃ２３９Ｇａｇタンパク質およびそのペプチドに対し生ずることが期待される。
【０１２４】
更に、Ｔａｔに比べＥｎｖおよびＧａｇ／Ｐｏｌ抗原が免疫優性であり、そしてＴａｔ自体が固有のアジュバント活性を持つと考えると、全ての免疫原に対し同等の免疫反応を得るには、前者抗原によるワクチン接種を開始する前に少なくとも２回後者を使った免疫が必要になると予想される。従って、ＨＩＶ−１  ｔａｔ（０．５ｍｇ）ＤＮＡ単独、または各０．５ｍｇのＨＩＶ−１  ｅｎｖおよびＳＩＶｍａｃ２３９  ｇａｇ／ｐｏｌ  ＤＮＡとの組合せ（３回目の接種より開始）（３０週間に７回接種）による子供アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）へのワクチン接種（３６週間に９回接種）とその後２回の生物活性Ｔａｔタンパク質（２５μｇ）およびＩＳＣＯＭｓ単独または各２５μｇのＨＩＶ−１  ＥＮＶとＳＩＶｍａｃ２３９Ｇａｇ／Ｐｏｌタンパク質およびＩＳＣＯＭｓとの組合せによる筋肉内ブーストによって、ワクチン抗原全てに対し（前者によるより短期間の免疫スケジュールに比べ）より強力且つ広範囲の特異的免疫反応、特に生物活性Ｔａｔタンパク質および／またはそのペプチド単独に対する、または生物活性Ｔａｔタンパク質および／またはそのペプチド、並びにＨＩＶ−１  ＥｎｖおよびＳＩＶｍａｃ２３９Ｇａｇタンパク質および／またはそのペプチドに対する、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−４用Ｅｌｏｓｐｏｔにより確認可能なＣＴＬ反応を生ずるだろう。
【０１２５】
最後に、Ｔａｔ、ＥｎｖおよびＧａｇ／Ｐｏｌに対するワクチン接種は、ＴａｔまたはＧａｇ／Ｐｏｌ単独のワクチン接種を受けた動物に比べてＳＨＩＶ８９．６Ｐの静脈内攻撃による感染をより良く制御することが予見される。
【０１２６】
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４２．ホワン、エルら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９５２、１９９８年
４３．イトー、エムら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １４：８４５、１９９８年。
４４．キム、ディー、ティーら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１１６６、１９９７年。
４５．コルソン、ディー、エルら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ９：６７７、１９９３年。
【０１３５】
４６．ラフレニー、アール、エムら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：９５４，１９９６年。
４７．リー、シー、ジェイら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：４２９、１９９５年。
４８．リー、シー、ジェイら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：８１１６，１９９７年。
４９．マン、ディー、エイとエイ、ディー、フランケル、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１７３３、１９９１年。
５０．マソード、アールら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２：３７４、１９９４年
【０１３６】
５１．マクロスキー、ティー、ダブリュら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１０１４、１９９７年。
５２．ミシュレッティ、エフら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.２９：２５７９，１９９９年。
５３．ミラーニ、ディーら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２９６１，１９９９年。
５４．ミトーラ、エスら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３４４、２０００年。
５５．ミトーラ、エスら、Ｂｌｏｏｄ  ９０：１３６５、１９９７年。
【０１３７】
５６．モリーニ、エムら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７３：２６７、２０００年。
５７．モーゼル、ビーとピー、レスチャー、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１２３、２００１年。
５８．モイ、ピーら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１０５、１９９６年。
５９．オスターハウス、エイ、ディーら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：２７１３、１９９９年。
６０．オッツ、エムら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１４８１、１９９７年。
【０１３８】
６１．パウザ、シー、ディーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３５１５、２０００年。
６２．ピティス、エム、ジーら、Ｖｉｒａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ。９：１６９、１９９６年。
６３．ポーバー、ジェイ、エス、「内皮細胞」、ウナ、エス、リャン（編集）  Ｃ．Ｒ．Ｃ．Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９９８年。
６４．ポギー、エイら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７０２５、１９９８年。
６５．パルビス、エス、エフら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １１：４４３、１９９５年。
【０１３９】
６６．ラインズ、イー、ダブリュとアール、ロス、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ。１１６：５３３、１９９２年。
６７．リー、エム、シーら、Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ，  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．１０：４０８、１９９５年。
６８．レイズ、ピーら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３０：１６３、１９９０年。
６９．ロッドマン、ティー、シーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７７１９、１９９３年。
７０．ロマーニャイ、エス、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：２６３、１９９７年。
【０１４０】
７１．ロバッテリ、エイら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１９８３、１９９７年。
７２．ラスナッチ、エムら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６０２７、１９９８年。
７３．サバティエ、ジェイ、エムら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：９６１、１９９１年。
７４．サファイ、ビーら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１０３：７４４、１９８５年。
７５サマニエゴ、エフら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２：４３３、１９９８年。
【０１４１】
７６．セッチエロ、ピーら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２４２７、１９９９年。
７７．シュパイサー、ピー、ピーら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３：３３７、１９９１年。
７８．サブラマンヤム、エムら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：２５４４、１９９３年。
７９．タケウリ、エイチら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４７：３９、２００１年。
８０．チャギ、エムら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２５４、２００１年。
【０１４２】
８１．ヴァン  バーレン、シー、エイら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１９１３、１９９７年。
８２．ベネット、エイら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２８８９、１９９２年。
８３．ビシディ、アール、ピーら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１６０６、１９８９年。
８４．フォーゲル、ビー、イーら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：４６１、１９９３年。
８５．ウイークス、ビー、エスら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５２７９、１９９３年。
【０１４３】
８６．ヴェンダー、ピー、エイら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３、２０００年。
８７．ウエステンドロップ、エム、オーら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：４９７、１９９５年。
８８．レンジャー、エスら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３８３：１４５、１９９６年。
８９．レンジャー、エスら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０２８３、１９９７年。
９０．ウー、エム、エックスとエス、エフ、シュロスマン。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３８３２、１９９７年。
【０１４４】
９１．ザグリー、ディーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：３８５１、１９９８年。
９２．ザグリー、ジェイ、エフら、Ｊ．Ｈｕｍ．Ｖｉｒｏｌ．１：２８２、１９９８年。
９３．ザウリ、ジーら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４４８１、１９９３年。
９４．ザウリ、ジーら、Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．１０：３０６、１９９５年ａ。
９５．ザウリ、ジーら、Ｂｌｏｏｄ  ８６：３８２３、１９９５年ｂ。
【０１４５】
９６．ゾッチ、エム、アールら、ＡＩＤＳ  １１：１２２７、１９９７年。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１．Ａ】図１Ａに図示されるように、未変性で、実質モノマーである生物活性Ｔａｔは用量−および時間−依存的な様式で効率的且つ選択的にＭＤＤＣによって取り込まれるが、ＢＬＣＬまたはＴＣＢには取り込まれない。
【図１．Ｂ】図１Ｂに図示されるように、未変性で、実質モノマーである生物活性Ｔａｔは用量−および時間−依存的な様式で効率的且つ選択的にＭＤＤＣによって取り込まれるが、ＢＬＣＬまたはＴＣＢには取り込まれない。
【図１．Ｃ】図１Ｃ１および図１Ｃ２に図示されるように、未変性で、実質モノマーである生物活性Ｔａｔは用量−および時間−依存的な様式で効率的且つ選択的にＭＤＤＣによって取り込まれるが、ＢＬＣＬまたはＴＣＢには取り込まれない。
【図２．Ａ】図２Ａに図示されるように、ＭＤＤＣによる未変性で実質モノマーの生物活性Ｔａｔの取込みは、細胞成熟に伴い増加し、タンパク質の酸化／不活性化により消失する。
【図２．Ｂ】図２Ｂに図示されるように、ＭＤＤＣによる未変性で実質モノマーの生物活性Ｔａｔの取込みは、細胞成熟に伴い増加し、タンパク質の酸化／不活性化により消失する。
【図３．Ａ】図３Ａに図示されるように、ＭＤＤＣによる未変性で実質モノマーの生物活性Ｔａｔの取込みは、抗−α５β１および抗−αｖβ３抗体により阻止される。
【図３．Ｂ】図３Ｂに図示されるように、ＭＤＤＣによる未変性で実質モノマーの生物活性Ｔａｔの取込みは、抗−α５β１および抗−αｖβ３抗体により阻止される。
【図４．Ａ】図４Ａに描写されるように、ＭＤＤＣによる未変性で実質モノマーの生物活性Ｔａｔの取込みは、フィブロネクチンおよびビトロネクチンにより阻止される。
【図４．Ｂ】図４Ｂに描写されるように、ＭＤＤＣによる未変性で実質モノマーの生物活性Ｔａｔの取込みは、フィブロネクチンおよびビトロネクチンにより阻止される。
【図５．Ａ】図５Ａに図示されるように、未変性で実質モノマーの生物活性Ｔａｔはマクロファージよって用量−および時間−依存的な様式で効率的に取り込まれるが、単核細胞には取り込まれない。
【図５．Ｂ】図５Ｂに図示されるように、未変性で実質モノマーの生物活性Ｔａｔはマクロファージよって用量−および時間−依存的な様式で効率的に取り込まれるが、単核細胞には取り込まれない。
【図５．Ｃ】図５Ｃに図示されるように、未変性で実質モノマーの生物活性Ｔａｔはマクロファージよって用量−および時間−依存的な様式で効率的に取り込まれるが、単核細胞には取り込まれない。
【図６】図６Ａ、図６Ｂおよび図６ＣはＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質、その機能ドメインおよび用いたＴａｔペプチドの配列の概略図である。
【図７】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄに図示されるように、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔの取込みは、ＲＧＤまたは塩基性領域を有するＴａｔペプチドにより様々な影響を受ける。
【図８】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃおよび図８Ｄに図示されるように、ローダミン標識Ｔａｔはサイトカインで活性化された内皮細胞によって用量−依存的な様式で取り込まれるが、非活性化細胞には取り込まれない。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃおよび図９Ｄには、サイトカインで活性化された内皮細胞による１００ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔ取込みの経時経過が図示されている。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃおよび図１０Ｄには、サイトカインで活性化された内皮細胞による１μｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔ取込みの経時経過が図示されている。
【図１１】サイトカインで活性化された内皮細胞と非活性化細胞との比較による、未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔ取込みに関する用量−反応分析。
【図１２】サイトカインで活性化された内皮細胞による未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔの取込みに関する用量−および時間−経過分析。
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂおよび図１３Ｃに図示されるように、サイトカインで活性化された内皮細胞による１０ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔ取込みは未標識Ｔａｔタンパク質により阻害される。
【図１４】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄおよび図１４Ｅに図示されるように、サイトカインで活性化された内皮細胞による１０ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔの取込みは、α５β１およびαｖβ３インテグリン受容体に対する抗体によって阻害される。
【図１５】図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄおよび図１５Ｅに図示されるように、サイトカインで活性化された内皮細胞による１００ｎｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔの取込みは、α５β１およびαｖβ３インテグリン受容体に対する抗体によって阻害される。
【図１６】図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃおよび図１６Ｄに図示されるように、細胞をＴａｔと１５分間インキュベーションすると、１μｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔの取込みは、抗α５β１および抗αｖβ３抗体によって部分的に阻害される。
【図１７】図１７Ａ、図１７Ｂおよび図１７Ｃに図示されるように、細胞をＴａｔと６０分間インキュベーションすると、１μｇ／ｍｌのローダミン標識Ｔａｔの取込みは、抗インテグリン抗体による阻害を受けなかった。
【図１８】図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃおよび図１８Ｄに図示されるように、未変性の実質モノマーである生物活性Ｔａｔは、ＭＤＤＣによるサイトカインＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生、並びにＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−βおよびＲＡＮＴＥＳの産生を高める。
【図１９】未変性の実質モノマーである生物活性Ｔａｔは、ＭＤＤＣによる同種抗原提示を高める。
【図２０】図２０Ａ、図２０Ｂおよび図２０Ｃに図示されるように、未変性の実質モノマーである生物活性Ｔａｔは、初回抗原刺激を受けたＰＢＬに対するＭＤＤＣによる破傷風毒素（ＴＴ）−特異的提示を増加し、特異的Ｔ細胞反応を高める。
【図２１】未変性の、実質モノマーである生物活性Ｔａｔのアジュバントとしての役割を評価するためのプライム−ブースト（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）ワクチンプロトコールの概略図。
【図２２】ＧａｇとＴａｔでマウスをワクチン接種すると、ｇａｇ単独でワクチン接種したマウスに比べ高いＧａｇに対する抗体反応を誘導する。
【図２３】ＧａｇとＴａｔでマウスをワクチン接種すると、ｇａｇ単独でワクチン接種したマウスに比べ高い抗Ｇａｇ細胞傷害活性を誘導する。
【図１．Ａ】
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【図１．Ｂ】
2005505520.tif 000009
【図１．Ｃ】
2005505520.tif 000010
【図２．Ａ】
2005505520.tif 000011
【図２．Ｂ】
2005505520.tif 000012
【図３．Ａ】
2005505520.tif 000013
【図３．Ｂ】
2005505520.tif 000014
【図４．Ａ】
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【図４．Ｂ】
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【図５．Ａ】
2005505520.tif 000017
【図５．Ｂ】
2005505520.tif 000018
【図５．Ｃ】
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【図６】
2005505520.tif 000020
【図７】
2005505520.tif 000021
【図８】
2005505520.tif 000022
【図９】
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【図１０】
2005505520.tif 000024
【図１１】
2005505520.tif 000025
【図１２】
2005505520.tif 000026
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2005505520.tif 000029
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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