(57)【要約】本発明はフィトスフィンゴシン誘導体を有効成分として含有するアポトーシス誘導用組成物に関する。本発明はフィトスフィンゴシン誘導体に加えて、ビタミンＤ3又はカルシポトリオールを有効成分として含有するアポトーシス誘導用組成物に関する。本発明の組成物はアポトーシス誘導活性を有する薬学組成物又は化粧料組成物を含む。本発明は、フィトスフィンゴシン誘導体を有効成分として含有するアポトーシス誘導用組成物を投与する段階と、患部にＵＶＢを照射する段階とからなる生体内アポトーシス活性誘導により、予防又は治療が可能な各種の皮膚疾患、各種の腫瘍、各種の癌等の予防又は治療方法を提供する。本発明の組成物は、生体内アポトーシス誘導により、予防又は治療が可能な各種の皮膚疾患、各種の腫瘍、各種の癌等の予防又は治療に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィトスフィンゴシン誘導体を有効成分として含むことを特徴とするアポトーシス誘導用薬学組成物。
【請求項２】
前記フィトスフィンゴシン誘導体が、フィトスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン−ＨＣｌ，Ｃ６−フィトスフィンゴシン、ＣＬＡ−フィトスフィンゴシン、テトラアセチルフィトスフィンゴシン及びＮ−アセチルフィトスフィンゴシンからなる群から選ばれる１種以上である請求項１に記載のアポトーシス誘導用薬学組成物。
【請求項３】
前記フィトスフィンゴシン誘導体にビタミンＤ3又はカルシポトリオールを追加して含む請求項１または２に記載のアポトーシス誘導用薬学組成物。
【請求項４】
生体内アポトーシス活性誘導により、予防又は治療が可能な各種の皮膚疾患、各種の腫瘍、各種の癌等の予防又は治療に有用である請求項１〜３のいずれかに記載のアポトーシス誘導用薬学組成物。
【請求項５】
湿疹、乾癬、魚鱗癬等のような角質異常疾患；アトピー性皮膚炎、皮膚炎症、掻痒症、細菌感染症、にきび又は瘡傷等のような皮膚疾患；長時間紫外線に露出され、誘発される角質異常皮膚疾患及び皮膚老化；皮膚癌等の予防又は治療に有用である請求項４に記載のアポトーシス誘導用薬学組成物。
【請求項６】
乾癬、魚鱗癬等のような角質異常疾患、長時間紫外線に露出され、誘発される角質異常皮膚疾患及び皮膚老化の予防又は治療に有用である請求項５に記載のアポトーシス誘導用薬学組成物。
【請求項７】
皮膚癌の予防又は治療に有用である請求項５に記載のアポトーシス誘導用薬学組成物。
【請求項８】
フィトスフィンゴシン誘導体を有効成分として含有することを特徴とするアポトーシス誘導用化粧料組成物。
【請求項９】
前記フィトスフィンゴシン誘導体はフィトスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン−ＨＣｌ，Ｃ６−フィトスフィンゴシン、ＣＬＡ−フィトスフィンゴシン、テトラアセチルフィトスフィンゴシン及びＮ−アセチルフィトスフィンゴシンからなる群から選ばれる１種以上である請求項８に記載のアポトーシス誘導用化粧料組成物。
【請求項１０】
前記フィトスフィンゴシン誘導体にビタミンＤ3又はカルシポトリオールを追加して含む請求項８または９に記載のアポトーシス誘導用化粧料組成物。
【請求項１１】
生体内アポトーシス活性誘導により、予防又は治療が可能な各種の皮膚疾患、各種の腫瘍、各種の癌等の予防又は治療に有用である請求項８〜１０のいずれかに記載のアポトーシス誘導用化粧料組成物。
【請求項１２】
湿疹、乾癬、魚鱗癬等のような角質異常疾患；アトピー性皮膚炎、皮膚炎症、掻痒症、細菌感染症、にきび又は瘡傷等のような皮膚疾患；長時間紫外線に露出され、誘発される角質異常皮膚疾患及び皮膚老化；皮膚癌等の予防又は治療に有用である請求項１１に記載のアポトーシス誘導用化粧料組成物。
【請求項１３】
乾癬、魚鱗癬等のような角質異常疾患、長時間紫外線に露出され、誘発される角質異常皮膚疾患及び皮膚老化の予防又は治療に有用である請求項１２に記載のアポトーシス誘導用化粧料組成物。
【請求項１４】
皮膚癌の予防又は治療に有用である請求項１２に記載のアポトーシス誘導用化粧料組成物。
【請求項１５】
フィトスフィンゴシン誘導体を有効成分として含有するアポトーシス誘導用組成物を投与する工程と患部にＵＶＢを照射する工程でなされる、生体内アポトーシス活性誘導により、予防又は治療が可能な各種の皮膚疾患、各種の腫瘍、各種の癌等の予防又は治療方法。
【請求項１６】
前記フィトスフィンゴシン誘導体はフィトスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン−ＨＣｌ，Ｃ６−フィトスフィンゴシン、ＣＬＡ−フィトスフィンゴシン、テトラアセチルフィトスフィンゴシン及びＮ−アセチルフィトスフィンゴシンからなる群から選ばれる１種以上である請求項１５に記載の各種の皮膚疾患、各種の腫瘍、各種の癌等の予防又は治療方法。
【請求項１７】
湿疹、乾癬、魚鱗癬等のような角質異常疾患；アトピー性皮膚炎、皮膚炎症、掻痒症、細菌感染症、にきび又は瘡傷等のような皮膚疾患；長時間紫外線に露出され、誘発される角質異常皮膚疾患及び皮膚老化；皮膚癌等用である請求項１５または１６に記載の予防又は治療方法。
【請求項１８】
乾癬、魚鱗癬等のような角質異常疾患、長時間紫外線に露出され、誘発される角質異常皮膚疾患及び皮膚老化用である請求項１７に記載の予防又は治療方法。
【請求項１９】
皮膚癌用である請求項１７に記載の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフィトスフィンゴシン誘導体を含むアポトーシス誘導用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスはプログラムされた細胞死を意味するものであって、生理及び病理的状況下で生ずる細胞死滅の一つの形態である。
【０００３】
生体内における正常細胞組織では細胞の増殖とアポトーシスが均衡をなして、組織の細胞数が一定に維持される反面、腫瘍細胞組織では急速な細胞増殖に比べてアポトーシスが適切になされないことから、細胞数が一方的に増加して癌細胞の増殖が起こるものとして知られている（Raff. M. C., Nature, 356:397, 1992）。アポトーシス誘導に関連した因子としてはｐ５３，ｂｃｌ−２，ｂｃ−ＸＬ，カスパーゼ等が知られており（Wyllie, A., Nature, 389:237, 1997）、アポトーシスプログラムが活性化すれば、細胞膜の水泡、ヌクレアーゼによる染色体のＤＮＡ分解、ＤＮＡ凝縮及び断片化が起こる。
【０００４】
アポトーシスは、胎児の発生過程、皮膚、内臓器官、免疫機関の機能に重要な役割をする。
【０００５】
炎症性皮膚疾患は、究極的にはリンパ球を初め多くの免疫細胞等が皮膚に浸透し、それと皮膚細胞の殆どを占める皮膚角質形成細胞、つまりケラチノサイトとの相互作用により引き起こされる。これらケラチノサイト等は免疫機能に関与する様々なサイトカインを分泌してこれら免疫細胞等の増殖に関与し、さらに免疫細胞等からケラチノサイトの増殖に関与する様々な因子等の供給を受ける。このような細胞等と周辺のリンパ節を含めてＳＡＬＴ（skin-associated Lymphoid tissue）と称し、このような面から皮膚は単に我々の体を保護する保護膜のみならず、一つの免疫機関と見做されている。
【０００６】
アポトーシスと関連した皮膚疾患の中で、特に乾癬は角質細胞の異常増殖、及び様々な炎症細胞、特にＴ細胞の浸潤と活性化による疾患である。乾癬は血管新生（angiogenesis）と共に皮膚角質形成細胞を速く増殖させるため、このような皮膚角質形成細胞にアポトーシスを誘導する製剤が効果的な治療薬として提示されてきた。
【０００７】
特に、スフィンゴリピド誘導体であるセラミドは、腫瘍潰死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）、ＦＡＳリガンド（ligand）及び放射線照射のような刺激等により活性化されたＳＭａｓｅ（sphingomyelinase）によりスフィンゴミエリンが分解されてなるものであり、細胞内信号伝達媒介物質として作用して細胞分化、細胞周期阻止、増殖及びアポトーシス等に関与することが知られている。
【０００８】
また、ビタミンＤ3又はカルシポトリオールは過剰増殖しているケラチノサイトにアポトーシス及び細胞毒性を誘導することが知られている。
【０００９】
さらに、紫外線照射によりＳＭａｓｅが活性化して細胞内でのセラミド形成を増加させアポトーシスを誘導するとの報告がある。のみならず紫外線照射により生成した多くの成長因子等やサイトカイン細胞表面受容体等が活性化して、サイトカインや成長因子信号伝達経路（growth factor signal transduction pathway）を活性化することが知られている。紫外線は、波長によって、ＵＶＡ（２００〜２９０ｎｍ）、ＵＶＢ（２９０〜３２０ｎｍ）及びＵＶＣ（３２０〜４００ｎｍ）に区分される。これらはin vivoや培養細胞において免疫抑制機能及びアポトーシスを起こすとの報告がある。
【００１０】
本発明者等はアポトーシス活性誘導により予防又は治療効果が現れる各種の疾病に有効な物質を検索したところ、特定のフィトスフィンゴシン誘導体がアポトーシス誘導効果を顕著に現すことを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明ではフィトスフィンゴシン誘導体を有効成分とするアポトーシス誘導用組成物を提供するものである。
【発明の開示】
【００１２】
本発明はフィトスフィンゴシン誘導体を有効成分として含有するアポトーシス誘導用組成物を提供する。
【００１３】
本発明はフィトスフィンゴシン誘導体に加えて、ビタミンＤ3又はカルシポトリオールを有効成分として含有するアポトーシス誘導用組成物を提供する。
【００１４】
本発明の組成物において、フィトスフィンゴシン誘導体は、フィトスフィンゴシン（phytosphingosine，ＰＳ），フィトスフィンゴシン−ＨＣｌ（ＰＳ−ＨＣｌ），Ｃ６−フィトスフィンゴシン（Ｃ６−ＰＳ），ＣＬＡ−フィトスフィンゴシン（ＣＬＡ−ＰＳ），テトラアセチルフィトスフィンゴシン（ＴＡＰＳ）及びＮ−アセチルフィトスフィンゴシン（ＮＡＰＳ）からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の組成物はアポトーシス誘導活性を有する薬学組成物又は化粧料組成物を含む。
【００１６】
本発明は、フィトスフィンゴシン誘導体を有効成分として含有するアポトーシス誘導用組成物を投与する工程と、患部にＵＶＢを照射する工程とからなる生体内アポトーシス活性誘導により、予防又は治療が可能な各種の皮膚疾患、各種の腫瘍、各種の癌等の予防又は治療方法を提供する。
【００１７】
前記予防又は治療方法において、フィトスフィンゴシン誘導体はフィトスフィンゴシン、フィトスフィンゴシン−ＨＣｌ，Ｃ６−フィトスフィンゴシン，ＣＬＡ−フィトスフィンゴシン，テトラアセチルフィトスフィンゴシン及びＮ−アセチルフィトスフィンゴシンから選ばれる１種以上であることを特徴とする。
【００１８】
本発明の組成物は、ヒト角質形成細胞株、ヒト皮膚ガン細胞株、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、脾臓内免疫細胞及び末梢血液単核細胞において全て細胞毒性効果を示す。
【００１９】
本発明の組成物の中でＴＡＰＳ又はＮＡＰＳを有効成分とする場合、ヒト角質形成細胞株に対して顕著なアポトーシス効果を示す。
【００２０】
本発明の組成物の中でＴＡＰＳ、ＮＡＰＳ又はＰＳを有効成分として含有する場合には、特に乾癬誘発と関連のあるＴｈ１細胞の活性化を抑制する効果がある。
【００２１】
本発明の組成物の中で、効果的な乾癬治療剤及び症状緩和剤として用いられているビタミンＤ3又はカルシポトリオールを追加の有効成分として含有した組成物は、フィトスフィンゴシン誘導体を単独で含有する本発明の他の組成物に比べてアポトーシス効果が顕著に向上する。
【００２２】
本発明の組成物を投与し、ＵＶＢを照射するとフィトスフィンゴシン誘導体を単独で投与した時よりアポトーシス効果が顕著に向上する。
【００２３】
本発明の組成物を投与し、患部にＵＶＢを照射する本発明の乾癬治療方法において、ＵＶＢ照射量は５０ｍＪ／ｃｍ2〜２Ｊ／ｃｍ2である。
【００２４】
本発明の組成物によるアポトーシス誘導に関与する蛋白質は、カスパーゼ−３，ｐ５３，Ｃｈｋ１である。
【００２５】
本発明の組成物で処理した後３時間でカスパーゼ−３が最高に発現され、卓越したアポトーシス誘導能を示す。
【００２６】
本発明の組成物は、生体内アポトーシス誘導により、予防又は治療が可能な各種の皮膚疾患、各種の腫瘍、各種の癌等の予防又は治療に有用である。
【００２７】
本発明の組成物で予防又は治療が可能な疾患は、具体的には湿疹、乾癬、魚鱗癬等のような角質異常疾患；アトピー性皮膚炎、皮膚炎症、掻痒症、細菌感染症、にきび又は瘡傷等のような皮膚疾患；長時間紫外線に露出されて誘発する角質異常皮膚疾患及び皮膚老化；皮膚癌等である。
【００２８】
特に、本発明の組成物は乾癬、魚鱗癬等のような角質異常疾患、長時間紫外線に露出されて誘発する角質異常皮膚疾患及び皮膚老化；皮膚癌の予防又は治療に有用である。
【００２９】
本発明の組成物は、追加して同一又は類似した機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。
【００３０】
本発明の組成物は、追加して他の機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。
【００３１】
本発明の組成物は、投与のために前記された有効成分以外に追加して薬剤学的に供与可能な担体を１種以上含むことができる。薬剤学的に供与可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノール及びこれらの内１成分以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤等の他の通常の添加剤を添加できる。さらに、希釈剤、分散剤，界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して製剤化できる。さらには当分野の適正な方法で、又はRemington's Pharmaceutical Science（最近版）、Mack Publishing Company, Easton PAに開示されている方法を利用して各疾患により又は成分によって好ましく製剤化できる。
【００３２】
本発明の組成物は局部投与が好ましく、皮膚及び粘膜治療用として軟膏、クリーム、乳液、膏薬、パウダー、含浸パッド、溶液、ゲル、スプレー、ローション又は懸濁液状で提供できる。
【００３３】
本発明の組成物において、フィトスフィンゴシン誘導体は組成物の総重量に対して０．０５〜１０．０重量部、好ましくは０．１〜５．０重量部を含む。
【００３４】
本発明の組成物は、１回約１０〜３０ｍｌ又は１０〜３０ｇずつ数回にわたって患部に適用する。
【００３５】
本発明の化粧料組成物はその剤形において特別に限定されず、例えば柔軟化粧水、収儉化粧水、栄養化粧水、アイクリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パウダー、エッセンス、パック、乳液、ローション、軟膏、ゲル、高分子又は脂質小泡又はナノスフェア又はマイクロスフェア、石鹸又はシャンプー等の剤形を有することができる。さらに、各剤形の化粧料組成物において、フィトスフィンゴシン誘導体の他に他の成分等はその他の化粧料の剤形又は使用目的等によって当業者が適宜選定して配合できる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の理解に供するため好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は本発明をより容易に理解できるように提供するのみで、実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：細胞毒性測定（ＭＴＴアッセイ）
フィトスフィンゴシン（phytosphingosine，ＰＳ），フィトスフィンゴシン−ＨＣｌ（ＰＳ−ＨＣｌ），Ｃ６−フィトスフィンゴシン（Ｃ６−ＰＳ），ＣＬＡ−フィトスフィンゴシン（ＣＬＡ−ＰＳ），テトラアセチルフィトスフィンゴシン（ＴＡＰＳ）及びＮ−アセチルフィトスフィンゴシン（ＮＡＰＳ）をＤＭＳＯに溶解して最終１〜１００μＭ濃度で使用した。
【００３８】
１．本発明組成物がヒト角質形成細胞株の細胞毒性に及ぼす影響
本発明組成物がヒト角質形成細胞株（Human kerationcyte cell line）のＨａＣａＴ細胞の細胞毒性に及ぼす影響を調べるために、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイで細胞生存率を分析した。
ＨａＣａＴ細胞はドイツ癌研究所（German Cancer Research, Germany）のＮ．Ｆｕｓｅｎｇ教授から供給を受けた。
ＨａＣａＴ細胞は１００ｍｍディッシュに１×１０6の個数で接種した後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯ），１００ユニット／ｍｌのペニシリン，１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地）で４８時間培養した。トリプシンで処理し、再度９６ウェルプレートにウェル当り１〜２×１０4個の細胞を無血清培地を利用して接種した後、約３時間後にフィトスフィンゴシン誘導体を処理して培養した。２４時間培養後ＭＴＴ試薬を２ｍｇ／ｍｌの濃度に入れて４時間培養後、培地を完全に除去しＤＭＳＯに懸濁させ５４０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定した。
比較群にはＣ２−セラミドを使用した。
測定結果は表１及び図１に示した。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１と図１に示した通り、本発明の６種類のフィトスフィンゴシン誘導体全てが細胞増殖を抑制した。特に、３０μＭでＮＡＰＳ及びＴＡＰＳはいずれも８３％の細胞毒性を示した反面、Ｃ２−セラミドは６７％の細胞毒性を示し、ＮＡＰＳ及びＴＡＰＳがＣ２−セラミドより１６％の優れた細胞毒性効果のあることが分かる。
【００４１】
２．本発明組成物がヒト皮膚ガン細胞株の細胞毒性に及ぼす影響
本発明組成物がヒト皮膚ガン細胞株のＡ４３１細胞の細胞毒性に及ぼす影響を調べるために、ＭＴＴアッセイを利用して観察した。
細胞培養方法及びＭＴＴアッセイは前記１の方法と同様にした。
比較群にはＣ２−セラミドを使用した。
測定結果は表２に示した。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
表２に示した通り、５０μＭでＰＳ，ＰＳ−ＨＣｌ，ＮＡＰＳ及びＴＡＰＳは９５〜９８％の細胞毒性を示した反面、Ｃ２−セラミドは２６％の細胞毒性を示し、ＰＳ，ＰＳ−ＨＣｌ，ＮＡＰＳ及びＴＡＰＳがＣ２−セラミドより６９〜７２％の優れた細胞毒性効果のあることが分かる。
【００４４】
３．本発明組成物がヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞毒性に及ぼす影響
本発明組成物がヒト臍帯静脈血管内皮細胞の細胞毒性に及ぼす影響を調べるためにＭＴＴアッセイを利用して観察した。
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞はヒト臍帯血管から初代培養して使用した。
細胞培養方法及びＭＴＴアッセイ方法は前記１の方法と同様にした。
比較群にはＣ２−セラミドを使用した。
測定結果は表３に示した。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
表３に示した通り、３０μＭでＰＳ，ＮＡＰＳ及びＴＡＰＳは８６〜９１％の細胞毒性を示した反面、Ｃ２−セラミドは６６％の細胞毒性を示し、ＰＳ，ＮＡＰＳ及びＴＡＰＳがＣ２−セラミドより２０〜２５％の優れた細胞毒性効果のあることが分かる。
【００４７】
４．本発明組成物がマウス脾臓から分離した免疫細胞の細胞毒性に及ぼす影響
本発明組成物が免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球等）の細胞毒性に及ぼす影響を調べた。
正常マウス（ＢＤＦ）から脾臓を摘出した後、物理的方法を利用して脾臓から単核細胞を得た。この細胞をＰＢＳに溶解した後、フィコール・ハイパック（Ficoll-Hypaque）溶液に重畳させ、遠心分離し、フィコール・ハイパック溶液の境界部位に集まった細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。
前記細胞に本発明組成物の内ＮＡＰＳ，ＴＡＰＳ及びＰＳを１，１０，５０，１００μＭとなるように添加した後、２４時間培養して、細胞増殖の程度をＭＴＴアッセイを通じて確認した。
比較群にはＣ２−セラミドを使用した。
【００４８】
結果は図２に示した。
図２に示した通り、Ｃ２−セラミド及びＮＡＰＳ，ＰＳのＩＣ50は約７５μＭ，ＴＡＰＳのＩＣ50は１００μＭであり、本発明の組成物がマウスの脾臓細胞から得た免疫細胞に対して毒性を示すことが分かった。
【００４９】
５．本発明組成物が人の血液からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞毒性に及ぼす影響
本発明組成物が人の血液内に存在する免疫細胞の細胞毒性に及ぼす影響を調べた。
正常人から採血した血液をフィコール・ハイパック溶液に重畳させた。遠心分離の後、フィコール・ハイパック溶液の境界部位に集まった細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。別々の人から得たそれぞれ２×１０5個ずつのＰＢＭＣを混合し、９６−ウェルプレート上で５日間培養した。培地は血清を１０％含むＲＰＭＩ培養液を使用した。
前記細胞に本発明の組成物の中でＮＡＰＳ，ＴＡＰＳ及びＰＳを１，１０，５０，１００μＭとなるように添加した後、２４時間培養して、細胞増殖の程度をＭＴＴアッセイを通じて確認した。
比較群にはＣ２−セラミドを使用した。
【００５０】
結果は図３に示した。
図３に示した通り、Ｃ２−セラミドは１００μＭまで処理しても毒性効果は現れなかった。それに対して、ＮＡＰＳ，ＴＡＰＳ，ＰＳはヒト末梢血単核細胞に対して毒性を示した。ＮＡＰＳの場合には１００μＭより、ＴＡＰＳとＰＳの場合には５０μＭより強い細胞毒性を示した。
【００５１】
６．本発明組成物が乾癬誘発と関連のあるＴｈ１細胞活性化に及ぼす影響
６−１．混合白血球反応（Mixed Leukocyte Reaction；ＭＬＲ）
本発明組成物がＴＮＢＳＯ3（ヘプタン）に反応してＩＦＮ−γ及びＩＬ−１２等を遊離するＴｈ１細胞の活性化を抑制する効果の有無を調べた。
前記４で得た細胞を応答細胞（responder cell）として用い、ＴＮＢＳＯ3が結合した細胞を刺激細胞（stimulator cell）として用いた。
刺激細胞の準備は次のようにした。単核細胞を２×１０7cell／mlとなるように準備した後、同量の２０ｍＭ  ＴＮＢＳＯ3を添加して３７℃で反応させた。反応後、ＰＢＳで３回洗浄した。
応答細胞と刺激細胞をそれぞれ２×１０5個ずつ混合して、９６−ウエルプレートで５日間培養した。培地は血清を１０％含むＲＰＭＩ培養液を使用した。
前記細胞に本発明の組成物の中でＮＡＰＳ，ＴＡＰＳ及びＰＳを１，１０，５０，１００μＭとなるように添加した後、２４時間培養して、細胞増殖の程度をＭＴＴアッセイを通じて確認した。
比較群にはＣ２−セラミドを使用した。
【００５２】
結果は図４に示した。
図４に示した通り、Ｃ２−セラミド，ＮＡＰＳ及びＰＳは５０μＭで抑制効果を示し、ＴＡＰＳは１０μＭで抑制効果を示した。
従って、本発明の組成物は全てＴＮＢＳＯ3に対する細胞活性化を抑制する機能を有することが分かった。
【００５３】
６−２．異種細胞（allogenic cell）間の反応
本発明組成物が異種細胞間の反応による人のＴｈ１細胞の活性化を抑制する効果の有無を調べた。
異種細胞間の反応を調べるために、前記５の方法によって二人から得たＰＢＭＣをそれぞれ応答細胞と刺激細胞として用いた。刺激細胞としてのＰＢＭＣはＸ線照射後に用いた。応答細胞と刺激細胞は前記６−１での通り、混合培養した後、本発明の組成物の中でＮＡＰＳ，ＴＡＰＳ及びＰＳを１，１０，５０，１００μＭとなるように添加し、２４時間培養して、細胞増殖の程度をＭＴＴアッセイを通じて確認した。
比較群にはＣ２−セラミドを使用した。
【００５４】
結果は図５に示した。
図５に示した通り、Ｃ２−セラミドは抑制効果が殆ど無く、ＮＡＰＳは５０μＭ以上で異種細胞に対して活性化され増殖する反応を抑制する抑制効果があった。ＴＡＰＳとＰＳは５０μＭで細胞増殖を完全に抑制することが分かった。
【００５５】
実施例２：アポトーシス誘導測定
本発明の組成物によるＨａＣａＴ細胞のアポトーシス誘導は、In situ cell death detection kit, POD（Enzo,1684817,Boeringer Mannhein）を利用して、ＴＵＮＥＬアッセイ（TdT-mediated dUTP nick end labeling-assay）で観察した。
ＴＣチャンバ（Lab-TEK chamber Slide w/cover Permanox Slide sterile 1 well,177410）にＨａＣａＴ細胞を１×１０6の個数で接種してＤＭＥＭ倍地で１８時間以上培養した後、フィトスフィンゴシン誘導体を処理した。薬物処理後２４時間で細胞を固定した後、遮断溶液（blocking solution，3% H2O2 in MeOH）で内因性ペルオキシダーゼを遮断して透過溶液（permeabilization solution，0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate）で細胞の透過を増大させた後、ＴＵＮＥＬ反応混合物を利用してアポトーシスを起こした細胞を標識化し、ＤＡＢ基質（ＤＡＫＯ，Ｋ３４６５）を用いて発色させた。発色した細胞は顕微鏡により観察した。
【００５６】
測定結果は図６と図７に示した。
図６は１０μＭと３０μＭ濃度のフィトスフィンゴシン誘導体を２４時間処置してＴＵＮＥＬアッセイを実施した結果を示した図であって、フィトスフィンゴシン誘導体全てが細胞死滅を生じさせ、特にＮＡＰＳとＴＡＰＳが最も顕著な細胞死滅効果を示した。
図７はＮＡＰＳとＴＡＰＳ３０μＭ濃度における時間に伴うアポトーシス誘導効果を示した図であって、ＮＡＰＳとＴＡＰＳを３０μＭ濃度で処置した後、４時間からアポトーシスが誘導されることが分かる。
【００５７】
実施例３：本発明の組成物が細胞周期に及ぼす効果
１．細胞周期観察１（Flow cytometric analysis）
与えられた時間帯別に細胞をトリプシンで処理して収去した後、ＰＢＳで洗浄した。細胞は８０％エタノールを用いて固定化し、ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）とＲＮａｓｅを添加した後、フローサイトメーターを利用して細胞周期を分析した。
【００５８】
結果は図８に示した。
図８に示した通り、ＴＡＰＳ処理後１２時間まではＳ期（S phase）が減少し相対的にＧ2／Ｍ期（G2/M phase）が増加する傾向を示した。以後２４時間までＧ2／Ｍ期は継続して減少しながら相対的にｓｕｂ Ｇ1期（sub G1 phase）が増加する傾向を示した。Ｓｕｂ Ｇ1期はアポトーシスを起こした細胞を示すものであって、フィトスフィンゴシン誘導体によるアポトーシス誘導が２４時間経った時に急激に増加するのが見られる。このようなアポトーシスを起こした細胞の増加は同一時間帯にその分布が減少するＧ2／Ｍ期の細胞から由来したものと見られる（２４時間経過した時にＧ1期の増加はアポトーシスを起こした細胞を除いた生きている細胞のみを分析した結果である。）。
【００５９】
２．細胞周期観察２（免疫蛍光法；Immunnofluorescence）
ＴＡＰＳによるアポトーシス誘導がＧ2／Ｍ期のいずれの段階から誘導されるのかを調査するために、β−チューブリン（β−tubulin）を利用して体細胞分裂（mitosis）を観察した。
ＨａＣａＴ細胞をカバースリップ（coverslip）が置かれたデイシュで培養した後、ＴＡＰＳ（３０μＭ）で処理した。時間帯別に細胞をＰＢＳで洗浄した後、５％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定化させ、β−チューブリン抗体（１：１００）と１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｃｙ３が結合した抗マウスＩｇＧ抗体（Cy3-conjugated anti-mouse IgG）で２次反応を実施した。ＤＮＡ染色のため、０．３μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を添加した後、蛍光顕微鏡を利用して細胞を観察した。
【００６０】
結果は図９に示した。
図９に示した通り、ＴＡＰＳ処理後１２時間経過時より２４時間経過時の方が染色体が凝縮された体細胞等がより多く観察された。従って、体細胞分裂中期にアポトーシスが起こるのが分かる。
【００６１】
実施例４：本発明の組成物とビタミンＤ3（ＶｉｔＤ3）又はカルシポトリオールとの併用投与による細胞毒性の上昇効果
本発明の組成物とＶｉｔＤ3又はカルシポトリオールとの併用投与した時、細胞毒性上昇効果を調べるために、ヒト角質形成細胞株のＨａＣａＴ細胞を用いてＭＴＴアッセイで細胞生存率を分析した。
ＨａＣａＴ細胞にＶｉｔＤ3又はカルシポトリオールを１μＭの濃度で、ＮＡＰＳ及びＴＡＰＳをそれそれ１０μＭの濃度で単独あるいは併用投与して２４時間培養後、ＭＴＴアッセイによりこれらの薬剤が単独あるいは併用投与により細胞毒性に及ぼす効果を観察した。
比較群にはＣ２−セラミドを使用した。
結果は表４に示した。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
表４に示した通り、ＶｉｔＤ3又はカルシポトリオールを１μＭの濃度で、２４時間投与した時はそれぞれ１９％及び２３％の毒性を示した。
ＮＡＰＳ１０μＭ単独では１４％の細胞毒性、ＴＡＰＳ１０μＭ単独では２４％の細胞毒性を示した反面、ＶｉｔＤ3又はカルシポトリオールと併用投与した時、ＮＡＰＳの場合それぞれ６６％及び７６％以上の細胞毒性効果を示し、ＴＡＰＳ１０の場合にはそれぞれ６６％及び６４％の細胞毒性効果を示し、ＶｉｔＤ3又はカルシポトリオールあるいはＮＡＰＳ及びＴＡＰＳ単独による細胞毒性より、同時投与による細胞毒性効果が顕著に上昇するのが観察された。
【００６４】
実施例５：本発明の組成物の投与とＵＶＢ照射の併用処置による細胞毒性上昇効果
本発明の組成物の投与とＵＶＢ照射の併用処置による細胞毒性上昇効果を調べるために、ＨａＣａＴ細胞を用いてＭＴＴアッセイで細胞生存率を分析した。
ＨａＣａＴ細胞は１００ｍｍディシュに１×１０6の個数で接種した後、１０％牛胎児血清、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭで４８時間培養した。トリプシンで処理して、さらに９６−ウェルプレートにウェル当たり１〜２×１０4個の細胞を無血清培地を利用して接種した後、約３時間後に培地を除き、ＰＢＳでＨａＣａＴ細胞を３回洗浄し、プレート当たりＰＢＳを３．５ｍｌを加えてＵＶＢ２００Ｊ／ｍ2の容量で照射した。ＵＶＢ照射後、培地をＤＭＥＭ培地に換えた後、本発明のフィトスフィンゴシン誘導体等で処理し、２４時間培養し、ＭＴＴ試薬を２ｍｇ／ｍｌの濃度で加えた後、４時間培養した。培地をすべて取除き、細胞をＤＭＳＯに懸濁させ５４０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定した。
測定結果は表５に示した。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
表５に示した通り、ＵＶＢを単独で照射した場合には約６１〜７０％の細胞毒性を示し、ＮＡＰＳのみを１０μＭ処理した場合には３３％、ＴＡＰＳのみを１０μＭ処理した場合には５７％の細胞毒性を示した。ＮＡＰＳ又はＴＡＰＳの投与と、ＵＶＢの照射を併用した場合には細胞毒性効果がそれそれ９８％以上となった。
従って、ＮＡＰＳ又はＴＡＰＳ組成物の投与とＵＶＢの照射を併用処置した場合は、これらをそれぞれ単独で処置した場合と比べて細胞毒性効果が顕著に上昇することが観察された。
【００６７】
実施例６：本発明組成物によるアポトーシスに関与する遺伝子及び蛋白質の確認
１．遺伝子確認
本発明組成物により誘導されるアポトーシスに関与する遺伝子を見出すために、ＴＡＰＳ３０μＭの濃度で２４時間処置し、ｍＲＮＡを分離した後、アポトーシスアレイキットを利用して観察した。
ヒトアポトーシス発現アレイ（Human Apoptosis Expression Array）（R&D system, Minneapolis，ＭＮ）で提供されるアポトーシス−特異的プライマー（apoptosis-specific primers）を利用して標識ｃＤＮＡを合成し、これをプローブとして２μｇの総ＲＮＡと６５℃で一夜恒温培養後、洗浄溶液Ｉ（０．５×ＳＳＰＥ，１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）で常温で３回、洗浄溶液II（０．１％ＳＳＰＥ，１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）で６５℃で１時間洗浄した。洗浄されたメンブレン（membrane）をＸ線フィルムに露出させ７０℃で被曝させた後現像した。
【００６８】
結果は図１０に示した。
図１０に示した通り、アポトーシス関連遺伝子ではＣＯＸ−２及びＰＩＮ遺伝子の発現が増加し、アポトーシス抑制遺伝子であるsurvivin遺伝子が減少し、Ｂｃｌ−２関連遺伝子のＭｃｌ−１とＢｃｌ−１０が増加した。さらに、サイトカインではＩＬ−１βが増加し、細胞周期調節因子のｐ２１が増加し、反面ｐ５３は減少した。
【００６９】
２．アポトーシス関連蛋白質の確認
本発明組成物がアポトーシス誘導に関連したカスパーゼ−３，ｐ５３，Ｃｈｋ１蛋白質の発現に及ぼす影響を調べるために、免疫ブロット法により分析した。
ＨａＣａＴ細胞を１００ｍｍデイシュに培養した後、時間帯別に収集した。５００μｌのRIPA lysis buffer（1% Nonidet P-40, 1%sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.15M SDS,0.01M sodium phosphate, pH7.2, 2mM EDTA, 50mM sodium fluoride,0.2mM sodium vanadate）を添加して蛋白質を抽出した後、ブラッドフォード法を利用して濃度を測定した。
抽出された蛋白質は１２％ポリアクリルアミドゲルを利用して電気連動を実施した後、ニトロセルロースメンブレンへ転写した。５％脱脂乳で遮断したメンブレンを１次抗体（カスパーゼ−３，ｐ５３，Ｃｈｋ１）と反応させ、メンブレンを洗浄した後、ＨＲＰを結合した二次抗体と反応させた。
ＥＣＬキットを利用して蛋白質強度（protein intensity）を分析した。
【００７０】
結果は図１１、図１２及び図１３に示した。
図１１に示される通り、時間帯別にＮＡＰＳ，ＴＡＰＳ及びＣ２−セラミドによるカスパーゼ−３誘導を観察した結果、カスパーゼ−３はＮＡＰＳで処置した後、３０分から顕著に増加し３時間で最高６倍の誘導発現を現わし、増加発現されたカスパーゼ−３は１２時間まで維持された後、２４時間で対照群水準に落ちた。
反面ＴＡＰＳはＮＡＰＳに比べて比較的遅く誘導発現し始めたものの、薬処置３時間で最高５倍の誘導発現を示した後、２４時間まで誘導発現が持続した。
Ｃ２−セラミドもやはり、薬処置３時間でカスパーゼ−３を最高誘導発現させたが、その増加倍数はＮＡＰＳ及びＴＡＰＳに比べて顕著に弱かった（２．５倍増加）。
このような結果を通じてフィトスフィンゴシン誘導体は卓越なアポトーシス誘導能を有し、アポトーシス誘導に関する効能において既知のＣ２−セラミドに比べて優れていることが分かる。
【００７１】
図１２及び図１３に示される通り、ｐ５３とＣｈｋ１蛋白質は８時間の時にはＴＡＰＳ処理により、大きな変化は無かったものの、アポトーシスが起こる２４時間の時には急激に減少する傾向を示した。このような結果はセラミドによるアポトーシス誘導にｐ５３とＣｈｋ１経路が関与していることを意味する。特に、Ｃｈｋ１はＤＮＡ損傷によるＧ2／Ｍ阻止に関与する蛋白質であることが分かる。
【００７２】
実施例７：本発明の組成物による乾癬治療の効果
本発明組成物の有効成分であるＮＡＰＳを０．５％濃度にし、下記成分の組成比でクリーム製剤を製造し、試料として使用した。
【００７３】
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【００７４】
２０〜４０才の男性患者４人、女性患者４人を実験群とした。前記で製造した試料を８人の患者の病変部位に塗った後、変化を観察した。各病変部位別に好転された症状を図１４に示した（ケース１：肘、ケース２：額、ケース３：膝）。８人の患者の内７人が本発明組成物のクリーム製剤を塗った後、５〜７日後にかなり好転したことが確認された。従って、本発明の組成物が乾癬治療において、効果があることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明に用いられた６種のフィトスフィンゴシン誘導体は細胞毒性及びアポトーシス誘導において、卓越な効果を示した。従って、これらフィトスフィンゴシン誘導体を有効成分として含有する本発明の組成物は生体内アポトーシス誘導により予防又は治療が可能な各種の皮膚疾患、各種の腫瘍、各種の癌等の予防又は治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明組成物の有効成分であるフィトスフィンゴシン誘導体の濃度と細胞毒性効果の関係を示す図。
【図２】本発明組成物がマウス脾臓細胞から分離した免疫細胞の細胞毒性に及ぼす影響を観察した図。
【図３】本発明組成物がヒト末梢血液単核細胞の細胞毒性に及ぼす影響を観察した図。
【図４】本発明組成物が混合白血球反応によるヒトＴｈ１細胞の活性化に及ぼす影響を観察した図。
【図５】本発明組成物が異種細胞間の反応によるヒトＴｈ１細胞の活性化に及ぼす影響を観察した図。
【図６】本発明組成物がＴＵＮＥＬアッセイによるアポトーシス効果を示す図。
【図７】本発明組成物の有効成分であるＮＡＰＳ又はＴＡＰＳ３０μＭ濃度における時間に伴うアポトーシス誘導効果を示す図。
【図８】本発明組成物の有効成分であるＴＡＰＳが細胞周期に及ぼす効果を示す図。
【図９】本発明組成物の有効成分であるＴＡＰＳ処理による体細胞分裂を観察した図。
【図１０】本発明組成物の有効成分であるＴＡＰＳ処理により誘導されるアポトーシスに関与する遺伝子を観察した図。
【図１１】本発明組成物の有効成分であるＮＡＰＳ又はＴＡＰＳがカスパーゼ−３の発現誘導に及ぼす影響を時間別に観察した図。
【図１２】本発明組成物の有効成分であるＴＡＰＳの３０μＭ濃度におけるｐ５３とＣｈｋ１蛋白質の発現を示す図。
【図１３】本発明組成物の有効成分であるＮＡＰＳ，ＴＡＰＳ処理時のＣｈｋ１蛋白質の発現を示す図。
【図１４】本発明組成物の有効成分であるＮＡＰＳを病変部位に塗った５〜７日後に治療効果を観察した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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