(57)【要約】本発明は、補因子と電子伝達物質基との間のリンカー部分として作用するボロン酸もしくはボロン酸誘導体の使用により電荷が電子伝達物質基ないし酵素補因子の間を流れ得るような固定された酸化還元酵素を担持する電極に関する。本発明はまた、該電極がその成分の１である、バイオセンサーおよび燃料電池のような本発明の電極を利用する装置および系にも関する。
2005517164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘがボロン酸誘導体であることを特徴とする、一般式
Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ
［式中、
Ｖは電極と化学的に会合、それに結合もしくはその上に化学的に吸着し得る結合部分であり；
Ｗは電極とＹとの間で電子を伝達し得る電子伝達物質基であり；
Ｘはリンカー部分であり；
ＹはＸに結合していないときに少なくとも一対のｃｉｓヒドロキシル基を有する酸化還元酵素の補因子であり；および
Ｚは酸化還元酵素である］
を有する固定された基を担持する電極。
【請求項２】
Ｘが式
【化１】
2005517164.tif 000006
［式中、Ｒは最低１個のカルボキシ、カルボニル、アミノ、ヒドロキシもしくはチオ基により場合によっては置換されている脂肪族もしくは芳香族部分である］
を有する、請求項１記載の電極。
【請求項３】
Ｘがアミノフェニルボロン酸誘導体である、請求項１記載の電極。
【請求項４】
補因子がＦＡＤ、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋から選択される、請求項１〜３のいずれか１つに記載の電極。
【請求項５】
酵素が、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素およびリンゴ酸酵素から選択される、請求項１〜４のいずれか１つに記載の電極。
【請求項６】
酵素が、電極へのその結合を向上させるようにアミノ基と反応することが可能な二官能性架橋試薬を使用して架橋される、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の電極。
【請求項７】
前記架橋試薬がグルタルジアルデヒドである、請求項６記載の電極。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の電極を含んでなる装置。
【請求項９】
バイオセンサーである、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
電極に電圧を加えかつ応答を測定するための電子回路を含んでなる請求項９記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
燃料電池である、請求項８記載の装置。
【請求項１２】
酸化還元酵素の基質を含んでなる、請求項１１記載の燃料電池。
【請求項１３】
（ｉ）式Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ［式中Ｖは電極と化学的に会合、それに結合もしくはその上に化学的に吸着し得る結合部分であり、かつ、Ｗは電極とＹとの間で電子を伝達し得る電子伝達物質基であり、Ｙは酵素の補因子であり、およびＸはリンカー基である］の基を含んでなる電極の表面上の層を形成すること；
（ｉｉ）前記電極を、補因子を欠く１種もしくはそれ以上の酵素分子と接触させて、前記酵素と前記補因子とを複合体形成させて固定された基Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ［式中Ｚは酸化還元反応を触媒し得る触媒的に機能的な酵素である］を生じさせること
を含んでなり；
前記補因子が少なくとも一対のｃｉｓヒドロキシル基を有し、そしてボロン酸誘導体である基Ｘにより前記補因子を前記電子伝達物質基に結合させることを含んでなる、
ことを特徴とする、固定された酸化還元酵素Ｚを担持する電極の製造方法。
【請求項１４】
（ｉ）式Ｖ−Ｗ［式中Ｖは電極と化学的に会合、それに結合もしくはその上に化学的に吸着し得る結合部分であり、かつ、Ｗは電極と酵素の補因子Ｙとの間で電子を伝達し得る電子伝達物質基である］の基を含んでなる電極の表面上の層を形成すること；
（ｉｉ）Ｙを前記基に結合すること；および
（ｉｉｉ）前記電極を、補因子を欠く１種もしくはそれ以上の酵素分子と接触させて、前記酵素を前記補因子と複合体形成させて酸化還元反応を触媒し得る機能的酵素を生じさせること
を含んでなり；
前記補因子が少なくとも一対のｃｉｓヒドロキシル基を有し、そしてボロン酸誘導体である基Ｘにより前記補因子を前記電子伝達物質基に結合させることを含んでなる、
ことを特徴とする、固定された酸化還元酵素Ｚを担持する電極の製造方法。
【請求項１５】
Ｘが式
【化２】
2005517164.tif 000007
［式中、Ｒは最低１個のカルボキシ、カルボニル、アミノ、ヒドロキシもしくはチオ基により場合によっては置換されている脂肪族もしくは芳香族部分である］
を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
Ｒがフェニル、ナフチルおよびアルキル基から選択され、前記基が最低１個のカルボキシ、カルボニル、アミノ、ヒドロキシもしくはチオ基により場合によっては置換されている、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
（ｂ）が：
ボロン酸もしくはボロン酸誘導体を、電極上に固定された基Ｖ−Ｗに結合させて固定された基Ｖ−Ｗ−Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）２を生じさせること、およびその後固定された基Ｖ−Ｗ−Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）２にＹを結合させて固定された基Ｖ−Ｗ−Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）−Ｙを生じさせること
を含んでなる、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
（ｂ）が：
式Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）２の基をＹに結合させて第一の結合生成物Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）−Ｙを生じさせること、およびその後前記第一の結合生成物を固定された基Ｖ−Ｗに結合させて固定された基Ｖ−Ｗ−Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）−Ｙを生じさせること
を含んでなる、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
酵素が剛性生体触媒マトリックスに架橋するように前記電極を処理することを含んでなる、請求項１３〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全般として生体電子工学の分野にあり、かつ、電荷が電極の表面と酵素との間を流れてそれらを触媒的に活性にし得るような酸化還元酵素を担持する電気伝導性固体マトリックス（本明細書で「電極」と称されるべき）に関する。該電極の製造方法、ならびにこうした電極を利用する装置、系および方法もまた本発明により提供される。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
背景として本発明に関すると考えられる技術分野は以下よりなる：
【０００３】
【表１】
2005517164.tif 000003
【０００４】
【表２】
2005517164.tif 000004
【０００５】
上の一覧からの参考文献は該リストからそれらの番号を示すことにより認識されるであろう。
【０００６】
電極に酸化還元酵素を電気的に接触させることは、電流測定バイオセンサー（非特許文献１−３）、バイオ燃料（ｂｉｏｆｕｅｌ）電池（非特許文献４−５）および生体電子要素（非特許文献６）を開発するための主要最終目標である。一体化型の電気的に接触される酵素電極は、電極と会合させた酵素への電子伝達物質基（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｇｒｏｕｐ）の繋ぎ止め（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）（非特許文献７−８）および電極上で集成した酸化還元活性ポリマー中での酸化還元酵素の固定（非特許文献９−１０）により製造された。これらの系における電子伝達通信の有効性はしかしながらそれらの本来の基質での該酵素の電子伝達ターンオーバー速度より実質的により低い（非特許文献１１）。これは、電場応答性リレーユニットによる酸化還元タンパク質の無作為の非至適の修飾および電極支持体に関する該酵素の無作為の配向性（非特許文献３）に帰されている。電極と会合させたリレー−ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）単層上のアポフラボ酵素、アポグルコースオキシダーゼ（Ａｐｏ−ＧＯｘ）の再構成が、その本来の基質（酸素）での該酵素の電子伝達ターンオーバー速度に類似である前例のない効果的な電子伝達通信を伴う整列された電気的に接触される酵素電極を生じることが以前に示された（非特許文献１２、特許文献１、非特許文献１３）。表面で再構成される生体電子触媒と電極との間の効率的な電気的通信は、グルコースセンサー（非特許文献１２、特許文献１、非特許文献１３）およびグルコースに基づくバイオ燃料電池（非特許文献５）のための酵素電極を開発するのに利用された。これらの系においてリレー−ＦＡＤ単層を生成させるために、リレー成分への合成アミノエチルＦＡＤ単位の共有結合が重要な段階である。この補因子の複雑な合成（非特許文献１４）は、該アプローチが制限された実務的利用性のものであるようにさせた。
【特許文献１】第ＷＯ  ９７／４５７２０号明細書
【非特許文献１】Ｈａｂｅｒｍｕｌｌｅｒ，Ｌ．、Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｍ．、Ｓｃｈｕｈｍａｎｎ，Ｗ．、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｊ．；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、３６６：５６０−５６８、２０００
【非特許文献２】Ｈｅｌｌｅｒ，Ａ．、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２３：１２８−１３４、１９９０
【非特許文献３】Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．、Ｋａｔｚ，Ｅ．、Ｗｉｌｌｎｅｒ  Ｂ．、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ、９：９６５−９７７、１９９７
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ，Ｔ．、Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｃ．、Ｂｉｎｙａｍｉｎ，Ｇ．、Ｇａｏ、Ｚ．Ｑ．、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．、Ｋｉｍ，Ｈ．Ｈ．、Ｈｅｌｌｅｒ，Ａ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３：８６３０−８６３１、２００１
【非特許文献５】Ｋａｔｚ，Ｅ．、Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．、Ｋｏｔｌｙａｒ，Ａ．Ｂ．、Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、４７９：６４−６８、１９９９
【非特許文献６】Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．、Ｈｅｌｅｇ−Ｓｈａｂｔａｉ，Ｖ．、Ｋａｔｚ，Ｅ．、Ｒａｕ，Ｈ．Ｋ．、Ｈａｅｈｎｅｌ，Ｗ．、Ｉ．ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２１：６４５５−６４６８、１９９９
【非特許文献７】Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．、Ｋａｔｚ，Ｅ．、Ｒｉｋｌｉｎ，Ａ．、Ｋａｈｓｅｒ，Ｒ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１０９６５−１０９６６、１９９２
【非特許文献８】Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．、Ｒｉｋｌｉｎ，Ａ．、Ｓｈｏｈａｍ，Ｂ．、Ｒｉｖｅｎｚｏｎ，Ｄ．、Ｋａｔｚ，Ｆ．、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．、５：９１２−９１５、１９９３
【非特許文献９】Ｇｒｅｇｇ，Ａ．Ａ．、Ｈｅｌｌｅｒ，Ａ．、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、９５：５９７０−５９７５、１９９１
【非特許文献１０】Ｃｏｓｎｉｅｒ，Ｓ．、Ｉｎｎｏｃｅｎｔ，Ｃ．、Ｊｏｕａｎｎｅａｕ，Ｙ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６６：３１９８−３２０１、１９９４
【非特許文献１１】Ｂａｄｉａ，Ａ．、Ｃａｒｌｉｎｉ，Ｒ．、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ａ．、Ｂａｔｔａｇｌｉｎｉ，Ｆ．、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｓ．Ｒ．、Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１５：７０５３−７０６０、１９９３
【非特許文献１２】Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．、Ｈｅｌｅｇ−Ｓｈａｂｔａｉ，Ｖ．、Ｂｌｏｎｄｅｒ，Ｒ．、Ｋａｔｚ，Ｅ．、Ｔａｏ，Ｇ．、Ｂｕｃｋｍａｎｎ，Ａ．Ｆ．、Ｈｅｌｌｅｒ，Ａ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１８：１０３２１−１０３２２、１９９６
【非特許文献１３】Ｋａｔｚ，Ｅ．、Ｒｉｋｌｉｎ，Ａ．、Ｈｅｌｅｇ−Ｓｈａｂｔａｉ，Ｖ．、Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．、Ｂｕｃｋｍａｎｎ，Ａ．Ｆ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、３８５：４５−５８、１９９９
【非特許文献１４】Ｂｕｃｋｍａｎｎ，Ａ．Ｆ．、Ｗｒａｙ，Ｖ．、Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ａ．、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｄ．Ｂ．（編），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅｓ中、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、２８０（１）：３６０、１９９７
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
本発明によると、電子伝達物質基の酵素補因子への結合の問題は、該補因子と電子伝達物質基との間のリンカー部分としてのボロン酸もしくはボロン酸誘導体の使用により解消された。ボロン酸は、ｃｉｓ−ジオールおよびとりわけ環状糖の部分であるｃｉｓ−ジオールの会合のための活性のリガンドである１６。本発明によると、ボロン酸もしくはボロン酸誘導体は、補因子の２個のｃｉｓ−ヒドロキシル基および電子伝達物質基に結合する。
【０００８】
本発明により、Ｘがボロン酸誘導体であることを特徴とする、一般式：
Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ
［式中、
Ｖは電極と化学的に会合、それに結合もしくはそれ上に化学的に吸着し得る結合部分であり；
Ｗは電極とＹとの間で電子を伝達し得る電子伝達物質基であり；
Ｘはリンカー部分であり；
ＹはＸに結合されていないときに少なくとも一対のｃｉｓヒドロキシル基を有する酸化還元酵素の補因子であり；および
Ｚは酸化還元酵素である］
を有する固定された基を担持する電極が提供される。
【０００９】
好ましい一態様よれば、Ｘは式
【００１０】
【化１】
2005517164.tif 000005
【００１１】
［式中、Ｒが最低１個のカルボキシ、カルボニル、アミノ、ヒドロキシもしくはチオ基により場合によっては置換されている脂肪族もしくは芳香族部分、例えばフェニル、ナフチルもしくはアルキルである］
を有する。
【００１２】
特定の一態様によれば、Ｘはアミノフェニルボロン酸誘導体である。
【００１３】
典型的な補因子はＦＡＤ、ＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋である。酵素の例は、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素およびリンゴ酸酵素（リンゴ酸脱水素酵素）、フルクトース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、コリンオキシダーゼなどである。
【００１４】
本発明はまた、下述される特定の態様に関して下に概説されるところの特徴を有する電極の製造方法にも関する。とりわけ、本発明は：
（ｉ）式Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ［式中Ｖは電極と化学的に会合、それに結合もしくはその上に化学的に吸着し得る結合部分であり、かつ、Ｗは電極とＹとの間で電子を伝達し得る電子伝達物質基であり、Ｙは酵素の補因子であり、およびＸはリンカー基である］の基を含んでなる電極の表面上の層を形成すること；
（ｉｉ）前記電極を、補因子を欠く１種もしくはそれ以上の酵素分子と接触させて、前記酵素を前記補因子と複合体形成させて固定された基Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ［式中Ｚは酸化還元反応を触媒し得る触媒的に機能的な酵素である］を生じさせること
を含んでなる、固定された酸化還元酵素Ｚを担持する電極の製造方法を提供し；前記方法は
前記補因子が少なくとも一対のｃｉｓヒドロキシル基を有し、かつ、前記方法が、ボロン酸誘導体である基Ｘにより前記補因子を前記電子伝達物質基に結合することを含んでなる、
ことを特徴とする。
【００１５】
特定の一態様により、該方法は、基Ｖ−Ｗの層を形成すること、その後Ｘの中間物によりそれにＹを結合すること、次いで固定された基Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ（酵素Ｚは酸化還元反応の触媒において触媒的に活性である）を最終的に生じるための電極上での酸化還元酵素Ｚの再構成を含んでなる。本態様による方法は：
（ｉ）式Ｖ−Ｗ［式中Ｖは電極と化学的に会合、それに結合もしくはその上に化学的に吸着し得る結合部分であり、かつ、Ｗは電極と酵素の補因子Ｙとの間で電子を伝達し得る電子伝達物質基である］の基を含んでなる電極の表面上の層を形成すること；
（ｉｉ）Ｙを前記基に結合すること；および
（ｉｉｉ）前記電極を、補因子を欠く１種もしくはそれ以上の酵素分子と接触させて、前記酵素を前記補因子と複合体形成させて酸化還元反応を触媒し得る機能的酵素を生じさせること
を含んでなり；前記方法は、
前記補因子が少なくとも一対のｃｉｓヒドロキシル基を有し、かつ、前記方法が、ボロン酸誘導体である基Ｘにより前記補因子を前記電子伝達物質基に結合することを含んでなる、
ことを特徴とする。
【００１６】
特定の一態様によれば、上の方法中の（（ｉｉ））は、ボロン酸もしくはボロン酸誘導体を電極上に固定された基Ｖ−Ｗに結合して固定された基Ｖ−Ｗ−Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）２を生じること、およびその後固定された基Ｖ−Ｗ−Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）２にＹを結合して固定された基Ｖ−Ｗ−Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）−Ｙを生じることを含んでなる。
【００１７】
別の態様によれば、（（ｉｉ））は、式Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）２の基をＹに結合して第一の結合生成物Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）−Ｙを生じること、およびその後前記第一の結合生成物を固定された基Ｖ−Ｗに結合して固定された基Ｖ−Ｗ−Ｒ−Ｂ−（ＯＨ）−Ｙを生じることを含んでなる。
【００１８】
本発明はまた、バイオセンサーおよび燃料電池のような本発明の電極を利用する装置および系にも関し、該電極はその成分の１である。例えば、本発明の電極を利用するバイオセンサー系もしくは他の装置は酸化還元酵素の基質である作用物質の検出に有用であるかもしれない。該作用物質は、例えば該バイオセンサーをカテーテルにより血管中に置くことなどによりｉｎ  ｓｉｔｕもしくはｅｘ  ｖｉｖｏでも検出されるかもしれない。
【００１９】
認識されるかもしれないとおり、該電極を利用する装置および系は、参照電極、適切な電気／電子回路などのような他構成部品もまた含む。例えば、本発明のバイオセンサーの場合は、本装置／系は典型的に電極に電圧を加え（ｅｎｅｒｇｉｚｅ）かつ応答を検出するための電極に接続されたモジュールもまた包含する。
【００２０】
本発明の電極を利用する燃料電池は、該電極に結合した酵素により実施される酸化還元反応により電圧を加えられるかもしれない。従って、こうした燃料電池は該酵素の基質を包含する媒体、典型的には水性媒体もまた含むことができる。結果の酸化還元反応の結果として、電極は電気的に電圧を加えられることができる。
【００２１】
本発明の電極は、金、白金、銀のような電気伝導性物質、外表面上に官能性化アルコキシシランをもつインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）のような伝導性ガラスから作成されるかもしくはそれらにより被覆されてよい（ＩＴＯ電極のシラン化は、例えば、電極をアルゴン雰囲気中にて無水トルエン中の３−アミノプロピルトリエトキシシランとともに還流すること、およびその後オーヴン中で乾燥することによってよい）。
［発明の詳細な説明］
ボロン酸は、ｃｉｓ−ジオール、およびとりわけ環状糖の一部分であるｃｉｓ−ジオールの会合のための活性のリガンドである１６。本発明のＦＡＤ単層は電極、例えば図１に概説されるところの金電極上に集成される。最初に、ピロロキノリンキノンＰＱＱ（１）を電極上に集成させたシスタミン単層に共有結合する。結果として生じる単層に、３−アミノフェニルボロン酸（２）１×１０−３Ｍを、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ＝７．３中の結合試薬としての１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）５×１０−３Ｍを使用して共有結合する。結果として生じる電極を１×１０−３ＭのＦＡＤ（３）で処理して単層集成体上にボロン酸−ＦＡＤ複合体を生じさせる。
【００２２】
図２Ａの曲線（ａ）はＰＱＱ−ＦＡＤから構成される結果として生じる単層のサイクリックボルタモグラムを示す。２個の酸化還元波は、ｐＨ＝７．０のそれぞれＦＡＤ（Ｅ°＝−０．５０Ｖ対ＳＣＥ）およびＰＱＱ（Ｅ°＝−０．１３Ｖ）単位の疑似可逆的応答に対応する。電場応答性単位の酸化還元波の電量分析アッセイは、ＰＱＱおよびＦＡＤ単位の表面被覆がそれぞれ１．８×１０−１０モル・ｃｍ−２および１．６×１０−１０モル・ｃｍ−２であることを示す（ＰＱＱ：ＦＡＤのモル比は約１：０．９である）。ＰＱＱ−ボロン酸誘導体−ＦＡＤ官能性化電極のａｐｏ−ＧＯｘでの処理は、官能性化電極上のタンパク質の表面再構成をもたらす。図２Ａ、曲線（ｂ）。
【００２３】
ＰＱＱ−ＦＡＤ単層で修飾された金／クォーツ圧電結晶（ＡＴ−ｃｕｔ、９ＭＨｚ）上でのａｐｏ−ＧＯｘの再構成後の微小重量測定的クォーツ結晶微量天秤測定値は、２×１０−１２モル・ｃｍ−２に対応する該酵素の表面被覆を示し、従って密に充填された単層を示す。図２Ｂは、多様な濃度のグルコースの存在下での結果として生じる表面再構成酵素電極のサイクリックボルタモグラムを示す。電子触媒陽極電流がグルコースの存在下で観察され、表面再構成した酵素が電極と電気的に接触されていることおよび該酵素がグルコースの酸化に対して生体電子触媒的に活性であることを意味する。電子触媒陽極電流がＰＱＱ単位の酸化還元電位で観察され、ＰＱＱがグルコースの酸化に際して形成されるＦＡＤＨ２の酸化を媒介することを示す。
【００２４】
図２Ｂの挿入図は、多様な濃度のグルコースでの図１の酵素電極系により伝達される電流に対応する派生較正曲線を示す。電流応答は６０ｍＭ以上のグルコース濃度で飽和する。飽和電流値は該生体触媒の最高のターンオーバー速度に対応する。該酵素の既知の表面被覆から、および電流密度の飽和値（ｉｍａｘ＝１４０μＡ・ｃｍ−２）を知れば、われわれは電子伝達ターンオーバー速度が２５℃で約７００ｓ−１であることを推定する。この値はＯ２（その本来の基質）とのグルコースオキシダーゼの電子伝達ターンオーバー速度に類似である１７。
【００２５】
再構成した酵素の効率的な電子伝達ターンオーバー速度は酵素電極の特性に対し重要な因果関係を有する。酸素はグルコースの存在下の該酵素電極の電流測定応答を妨害しない。同様に、グルコースの存在下の電極の電流測定応答（Ｅ＝０．０Ｖ対ＳＣＥ）は２０ｍＭのアスコルビン酸もしくは２０ｍＭの尿酸（グルコース検出電極に対する共通の妨害物質）により影響を及ぼされない。すなわち、妨害物質の非特異的酸化はグルコース酸化から発する電流に対し小さい影響（＜５％）を有する。
【００２６】
図３に概説される比較実験においては、金電極上に集成したシステイン酸単層に３−アミノフェニルボロン酸（２）を直接結合した。補因子ＦＡＤをその後ボロン酸リガンドに結合しそしてａｐｏ−ＧＯｘを該単層上に再構成した。結果として生じる表面再構成酵素電極は電極との直接の電気的通信を欠くが、とは言え該酵素は拡散性電子伝達物質としてのフェロセンカルボン酸（４）の存在下でのグルコースの生体電子触媒性酸化により明らかである生物学的に活性の配置で再構成されている。本対照実験は、ＰＱＱ単位が図１に図解で示される一体化型の系でのＦＡＤ酸化還元部位と電極表面との間の電子輸送を媒介することを明瞭に示す。
【００２７】
ＦＡＤ補因子はリボース単位および直鎖状グリセロール単位のジオール官能性を包含する。以前の研究１７は、ボロン酸リガンドに対する糖単位の会合定数が直鎖状多価アルコールのものより実質的により大きいことを示した。ボロン酸リガンドへのＦＡＤ補因子の単結合様式は時間電流測定実験により確認された。３−アミノフェニルボロン酸成分を金電極と会合させたチオール化システイン酸単層に共有結合し、そして該単層をＦＡＤと相互作用させてボロン酸複合体を生じた。結果として生じる単層をエタノール溶液中Ｃ１４Ｈ２９ＳＨで剛化した（１ｍＭ、２時間）（図３（ｂ））。単層配置における電場応答性単位に対する界面電子伝達速度定数は、電極からのそれらの空間的分離および結合の様式に対し感受性であることが以前に示された１８。該可能な２様式によるボロン酸リガンドへのＦＡＤの会合は、ＦＡＤ単位の該２様式の結合に対する電子伝達速度定数に対応する双指数的（ｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）キネティクスをもつ時間電流測定的過渡電流を生じるとみられる。
【００２８】
図４はＦＡＤ単位の還元に対応する時間電流測定的過渡電流を示す。単指数減衰に従う電流の過渡応答（図４、挿入図）はＦＡＤ単位の単一会合様式を示唆する。
【００２９】
補因子の特定の例は分子中にｃｉｓ−ヒドロキシル基を有する天然のＦＡＤおよびＮＡＤ（Ｐ）＋補因子である。これらのヒドロキシル基が、本発明により、ｃｉｓ−ヒドロキシル基に特異的に結合するボロン酸もしくはアミノフェニルボロン酸のようなボロン酸誘導体の使用により、修飾された電極に補因子を共有結合するのに使用される。それぞれの補因子とともに機能する酵素のさらなる再構成後に、電極上の固定された酵素を包含する構造が得られる。
【００３０】
本発明の一態様により使用されるＦＡＤ補因子は、再構成過程に際してそれ自身を酵素分子内深くに挿入し、従って電極への酵素分子の強い（しかしなお非共有的）結合を提供する。
【００３１】
ＮＡＤ（Ｐ）＋（（すなわちＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋）補因子はそれぞれの酵素の内側に浸透せず、そして電極で酵素の弱い一時的結合のみを提供する。酵素との一時的親和性複合体を安定化するために、会合された酵素分子は、好ましくは、それらが電極表面上の補因子単層と複合体形成した後に、アミノ基と反応することが可能な二官能性架橋試薬（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）、例えばグルタルジアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｉｃ  ｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）を使用して架橋される。
【００３２】
本発明の生体触媒電極の制限しない例は：（ａ）金電極、（ｂ）該系の第一の酸化還元成分の結合にアミノ基を提供するシスタミン単層、（ｃ）補因子から電極への電子伝達を提供する系中の第一の酸化還元成分であるＰＱＱ単層、（ｄ）ＰＱＱにより提供されるカルボキシル基と補因子により提供されるｃｉｓ−ヒドロキシル基との間を特異的に結合するアミノフェニルボロン酸、（ｅ）それぞれの酵素の結合および生体触媒作用を提供する補因子（ＦＡＤ、ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＰ＋）単層、（ｆ）補因子単層上で再構成された酵素より構成される。ＦＡＤおよびグルコースオキシダーゼの場合、相互作用は独力で十分強いが、しかしＮＡＤ＋およびリンゴ酸酵素もしくはＮＡＤＰ＋および乳酸脱水素酵素の場合は、相互作用は十分に強くなく、そしてＮＡＤ（Ｐ）＋補因子単層との酵素複合体を安定化させるのにさらなる架橋が適用される。
【００３３】
シスタミン／ＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸／ＮＡＤＰ＋／リンゴ酸酵素より構成される系の集成を、図１に示されるシスタミン／ＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸／ＦＡＤ／グルコースオキシダーゼと比較して以下の変化、すなわち（ａ）ＮＡＤＰ＋をＦＡＤの代わりにアミノフェニルボロン酸との結合に使用する；（ｂ）リンゴ酸酵素１ｇ  ｍＬ−１をＮＡＤＰ＋官能性化電極上に１０分間堆積させ、そして結果として生じる酵素層をグルタルジアルデヒド１０％（ｖ／ｖ）の溶液中で１０分間架橋し；その後電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄した、を伴い図５に図解で示す。
【００３４】
シスタミン／ＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸／ＮＡＤ＋／乳酸脱水素酵素より構成される系は、以下の変化すなわち（ａ）ＮＡＤ＋をアミノフェニルボロン酸との結合に使用した。（ｂ）乳酸脱水素酵素１ｇ  ｍＬ−１をＮＡＤ＋官能性化電極上に１０分間堆積させ、そして結果として生じる酵素層をグルタルジアルデヒド１０％（ｖ／ｖ）の溶液中で１０分間架橋し；その後電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄した、を伴い類似の方法で集成する（図６）。ＦＡＤおよびＮＡＤＰ＋補因子は分子中にただ一対のｃｉｓ−ヒドロキシル基を有し、従ってそれらはアミノフェニルボロン酸へのただ１つの可能な結合様式を有することに注目すべきである。しかしながら、ＮＡＤ＋補因子は、図６に示されるとおり２つの異なる結合様式を提供し得る２対のｃｉｓ−ヒドロキシル基を有する。
【００３５】
図７はＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸／ＮＡＤＰ＋／リンゴ酸酵素で官能性化した電極によるリンゴ酸の生体電子触媒的酸化を示す（スキーム３を参照されたい）。曲線ａ−ｄは、多様な濃度のリンゴ酸すなわち（ａ）０ｍＭ、（ｂ）０．２５ｍＭ、（ｃ）０．５ｍＭ、（ｄ）１ｍＭの存在下の該酵素電極のサイクリックボルタモグラムを示す。該サイクリックボルタモグラムは電位走査速度５ｍＶ  ｓ−１でアルゴン下に背景電解質としての０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中で記録した。挿入図は多様な濃度のリンゴ酸で測定された電流測定応答の較正プロット（Ｅ＝０．３Ｖ対ＳＣＥで）を示す。
【実施例】
【００３６】
電極の製造：
金／シスタミン／ＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸／ＦＡＤ／グルコースオキシダーゼ電極の集成。
【００３７】
金（Ａｕ）ワイヤ電極（０．３ｃｍ２の幾何学的面積、１．３の粗さ係数）を、水中０．０２Ｍシスタミン溶液中に該電極を２時間浸積することによりシスタミン単層で修飾し；その後電極を水で５回洗浄した。シスタミン修飾した電極を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、５ｍＭの存在下に０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中のピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）１ｍＭ溶液と２時間反応させ；その後電極を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３で２回洗浄した。ＰＱＱ官能性化金電極をＥＤＣ、５ｍＭの存在下に０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中でアミノフェニルボロン酸、１ｍＭと２時間反応させ；その後電極を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３で２回洗浄した。ＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸官能性化金電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中でＦＡＤ、１ｍＭと２時間反応させ；その後電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄した。ＦＡＤ官能性化金電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中でアポグルコースオキシダーゼ（ａｐｏ−ＧＯｘ）、１ｇ  ｍＬ−１と５時間相互作用させ；その後酵素再構成電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄した。この手順を図１に具体的に説明する。
金／シスタミン／ＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸／ＮＡＤＰ＋／リンゴ酸酵素電極の集成。
【００３８】
金（Ａｕ）ワイヤ電極（０．３ｃｍ２の幾何学的面積、１．３の粗さ係数）を、水中０．０２Ｍシスタミン溶液中に該電極を２時間浸積することによりシスタミン単層で修飾し；その後電極を水で５回洗浄した。シスタミン修飾した電極をＥＤＣ、５ｍＭの存在下に０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中のピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）１ｍＭ溶液と２時間反応させ；その後電極を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３で２回洗浄した。ＰＱＱ官能性化金電極をＥＤＣ、５ｍＭの存在下に０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中でアミノフェニルボロン酸、１ｍＭと２時間反応させ；その後電極を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３で２回洗浄した。ＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸官能性化金電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中でＮＡＤＰ＋、１ｍＭと２時間反応させ；その後電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄した。ＮＡＤＰ＋官能性化金電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中でリンゴ酸酵素（ＭａｌＥ）、１ｇ  ｍＬ−１と１０分間相互作用させ；その後酵素電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中１０％（ｖ／ｖ）グルタルジアルデヒド溶液で１０分間処理し；その後架橋した酵素電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄した。この手順を図５に具体的に説明する。
金／シスタミン／ＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸／ＮＡＤ＋／乳酸脱水素酵素電極の集成。
【００３９】
金（Ａｕ）ワイヤ電極（０．３ｃｍ２の幾何学的面積、１．３の粗さ係数）を、水中０．０２Ｍシスタミン溶液中に該電極を２時間浸積することによりシスタミン単層で修飾し；その後電極を水で５回洗浄した。シスタミン修飾した電極をＥＤＣ、５ｍＭの存在下に０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中のピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）１ｍＭ溶液と２時間反応させ；その後電極を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３で２回洗浄した。ＰＱＱ官能性化金電極をＥＤＣ、５ｍＭの存在下に０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３中でアミノフェニルボロン酸、１ｍＭと２時間反応させ；その後電極を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．３で２回洗浄した。ＰＱＱ／アミノフェニルボロン酸官能性化金電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中でＮＡＤ＋、１ｍＭと２時間反応させ；その後電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄した。ＮＡＤ＋官能性化金電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中で乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、１ｇ  ｍＬ−１と１０分間相互作用させ；その後酵素電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中１０％（ｖ／ｖ）グルタルジアルデヒド溶液で１０分間処理し；その後架橋した酵素電極を０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で２回洗浄した。この手順を図６に具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
本発明を理解しかつ実際にそれがどのように実施されうるかを知るために、好ましい一態様を、付随する図面に関して制限しない例としてのみ今や記述することができ、ここで：
【図１】再構成ＧＯｘ電極の集成および本電極上でのグルコースの生体電子触媒的酸化を具体的に説明する。
【図２Ａ】（ａ）再構成前、（ｂ）ＧＯｘでの再構成後の電位走査速度２００ｍＶ  秒−１でのＰＱＱ−ＦＡＤ官能性化金電極のサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２Ｂ】多様な濃度のグルコースすなわち（ａ）０ｍＭ、（ｂ）５ｍＭ、（ｃ）１０ｍＭ、（ｄ）１５ｍＭ、（ｅ）２０ｍＭ、（ｆ）２５ｍＭ、（ｇ）３５ｍＭ、（ｈ）４０ｍＭ、（ｉ）５０ｍＭの存在下；電位走査速度２ｍＶ・ｓ−１のＰＱＱ−ＦＡＤ官能性化金電極（幾何学的面積０．３ｃｍ２、粗さ係数約１．３）上のＧＯｘ再構成物（ｔｈｅ  ＧＯｘ−ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）サイクリックボルタモグラムを示す。データはＡｒ下０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中で記録した。挿入図：多様なグルコース濃度での電子触媒電流の較正プロット（Ｅ＝０．２Ｖ対ＳＣＥ）。
【図３】中間のＰＱＱ基を伴わずにボロン酸リンカー基を電極に直接結合した比較実験の図を示す：（ａ）ＧＯｘでの非剛化ＦＡＤ単層の再構成、および拡散性伝達物質としてのフェロセンカルボン酸（４）の存在下の酵素電極によるグルコースの生体触媒酸化；（ｂ）剛化ＦＡＤ単層の集成およびその時間電流測定的還元。
【図４】−０．４Ｖから−０．６Ｖまでの電位段階の適用に際しての剛化ＦＡＤ単層の還元に対応する時間電流測定電流の過渡応答を示すグラフである。挿入図：時間電流測定過渡電流の半対数プロット。データはＡｒ下０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中で記録した。
【図５】再構成したリンゴ酸酵素（リンゴ酸脱水素酵素）電極の集成および本電極でのリンゴ酸の生体電子触媒的酸化を具体的に説明する。
【図６】再構成した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）電極の集成および本電極での乳酸の生体電子触媒的酸化を具体的に説明する。
【図７】図５の電極のサイクリックボルタモグラムを示すグラフである。曲線ａ−ｄは、多様な濃度のリンゴ酸すなわち（ａ）０ｍＭ、（ｂ）０．２５ｍＭ、（ｃ）０．５ｍＭ、（ｄ）１ｍＭの存在下の酵素電極のサイクリックボルタモグラムを示す。該サイクリックボルタモグラムは、電位走査速度５ｍＶ  ｓ−１でアルゴン下に背景電解質として０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中で記録した。挿入図は多様な濃度のリンゴ酸で測定した電流測定応答の較正プロット（Ｅ＝０．３Ｖ対ＳＣＥで）を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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