(57)【要約】そのプラストムで形質転換したトランスジェニック植物又は植物細胞を産生する方法であって：（ａ）第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子を植物プラスチドへ導入すること［ここで、前記第１のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第１領域と第１の目的配列を含有し、前記第２のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第２領域と第２の目的配列を含有し、それによって、前記第１の目的配列の配列セグメントは、前記第２の目的配列の配列セグメントと相同になる］、及び（ｂ）組込み配列がプラストムに安定的に組み込まれている形質転換体を選択すること［それによって、前記組込み配列は、前記第１の目的配列の少なくとも一部と前記第２の目的配列の少なくとも一部を連続配列として含有する］を含む、前記方法。
2005534329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのプラストムで形質転換したトランスジェニック植物又は植物細胞を産生する方法であって：
（ａ）第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子を植物プラスチドへ導入すること
［ここで、前記第１のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第１領域と第１の目的配列を含有し、前記第２のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第２領域と第２の目的配列を含有し、それによって、前記第１の目的配列の配列セグメントは、前記第２の目的配列の配列セグメントと相同になる］、及び
（ｂ）組込み配列がプラストムに安定的に組み込まれている形質転換体を選択すること［それによって、前記組込み配列は、前記第１の目的配列の少なくとも一部と前記第２の目的配列の少なくとも一部を連続配列として含有する］
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子を前記植物プラスチドへ同時形質転換により導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の目的配列と前記第２の目的配列が異なっている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の目的配列と前記第２の目的配列が前記配列セグメントに加えてさらなる配列をそれぞれ含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記植物プラスチドへ、前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子に加えて１以上の追加ＤＮＡ分子を導入し、それによって前記追加ＤＮＡ分子は追加の目的配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つの追加ＤＮＡ分子が、前記第１の目的配列の配列セグメントに相同な配列セグメントと前記第２の目的配列に相同な配列セグメントを含有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の目的配列及び／又は前記第２の目的配列及び／又は追加の目的配列が１以上の目的遺伝子又は目的遺伝子の断片を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
目的遺伝子を２以上の断片へ分断して前記第１の目的配列及び／又は前記第２の目的配列及び／又は追加の目的配列が前記目的遺伝子の断片を含有し、それによって前記目的遺伝子は、前記組込み配列の形成時に前記２以上の断片より組み立てられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の目的配列が目的遺伝子の５’部分を含有し、前記第２の目的配列が前記目的遺伝子の３’部分を含有し、前記組込み配列が前記目的遺伝子をそれが発現され得るように含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的遺伝子の発現にＲＮＡトランススプライシングが含まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の目的配列が、前記目的遺伝子の前記５’部分の上流に、第２の目的配列の前記目的遺伝子の前記３’部分の下流に位置する配列因子に相同な配列因子を含有し、それによって前記配列因子は、前記目的遺伝子の前記５’部分及び／又は前記３’部分を含む前記組込み配列の一部の相同的組換えによる切除を可能にする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的遺伝子が選択可能マーカー遺伝子である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のＤＮＡ分子又は前記第２のＤＮＡ分子が、プラストムの領域に相同な領域と目的配列から成る配列単位の外側に選択可能マーカー遺伝子を含有し、前記マーカー遺伝子の欠失を可能にする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
選択可能マーカー遺伝子を第１の断片及び第２の断片へ分断し、それによって
前記第１断片を第１配列単位の外側で前記第１のＤＮＡ分子に取り込み、そして
前記第２断片を第２配列単位の外側で前記第２のＤＮＡ分子に取り込み、
それによって、前記第１配列単位は前記第１相同領域と前記第１の目的配列から成り、前記第２配列単位は前記第２相同領域と前記第２の目的配列から成る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択可能マーカー遺伝子がａｐｈＡ−６である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のＤＮＡ分子が、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な唯一の領域を含有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子が、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な唯一の領域をそれぞれ含有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１相同領域及び前記第２相同領域がともに、形質転換されるプラストムの連続配列に対応する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ホモプラストミックなトランスジェニック植物を前記形質転換体より再生する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に定義されるような第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含む部品キット。
【請求項２１】
プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な１つの領域と目的配列を含有する、プラスチド形質転換のためのＤＮＡ分子。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ分子のそれぞれが異なる目的配列を含有する請求項２１に記載のＤＮＡ分子のライブラリー。
【請求項２３】
請求項２０に記載の前記部品キットの前記ＤＮＡ分子で、又は請求項２１に記載の前記ＤＮＡ分子で形質転換された植物又は植物細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか１項の方法により入手される植物、植物細胞又は種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して植物バイオテクノロジーに関し、より詳細には植物のプラスチド形質転換のための方法及びベクターに関する。具体的には、本発明は、植物プラスチドの遺伝学的形質転換の方法、その方法のためのベクター、及び本発明の方法に従って得られたか又は得ることが可能な植物又は植物細胞を提供する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に受け入れられた知識によれば、２種類の細胞小器官、即ちプラスチドとミトコンドリアは、今日の真核細胞の祖先へ別々の共生イベントにより取り込まれた、初めは独立していた原核生物に由来する（Ｇｒａｙ、１９９１）。結果として、これらの細胞内小器官は、それ自身のＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡの形態のＤＮＡ転写物、リボソーム、及び遺伝情報の解読に必要とされる少なくともいくつかの必要なｔＲＮＡを含有する（Ｍａｒｅｃｈａｌ−Ｄｒｏｕａｒｄら、１９９１）。
【０００３】
共生取込みの直後、これらの細胞小器官は、原核生物の生活を営むのに必要な要素をすべて含有していたので遺伝的に自律していたが、この自律性は、遺伝情報の細胞核への転移により進化の間に低下した。しかしながら、その遺伝情報は、現存の細胞小器官を遺伝子技術にとって魅力的な標的とするほどに十分複雑である。このことが特にプラスチドについて正しいのは、これら小器官が依然として植物細胞の内部でのその主たる機能である光合成に必要とされるタンパク質の約５０％をコードするからである。プラスチドはまた、自らのリボソームＲＮＡ、そのｔＲＮＡ及びリボソームタンパク質の大部分をコードする。プラストム中の遺伝子の数は、全部で１２０ほどある（Ｐａｌｍｅｒ、１９９１）。しかしながら、プラスチド中に見出されるタンパク質の大多数は、核／細胞質の遺伝子コンパートメントより移入される。
【０００４】
プラスチドは遺伝的に形質転換することができる
一般的な分子クローニング技術の発展に伴って、高等植物を形質転換により遺伝的に修飾することがすぐに可能になった。植物形質転換の主たる力点がこれまで核の形質転換にあり、依然としてそうであるのは、大部分の遺伝子、シロイヌナズナの場合、約２６，０００個は、その完全配列が最近公表されたが（シロイヌナズナ・ゲノム・イニシアチブ計画２０００）、細胞の核に見出されるからである。核の形質転換を効率的に可能にするように修飾し得る、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのような生物学的ベクターが利用可能だったので、核の形質転換は達成することがより容易であった（Ｇａｌｖｉｎ、１９９８）。さらに、外来核酸にとって核がより直接的にアクセス可能であるのに対し、小器官は２層の包膜により囲まれていて、一般的に言えば、ＤＮＡのような大分子を通さない。
【０００５】
プラスチドを形質転換する能力がきわめて望まれるのは、きわめて高い発現レベルのトランス遺伝子の潜在可能性を担う、これら小器官中の高遺伝子量を利用し得るからである。さらに、プラスチド形質転換が魅力的であるのは、プラスチドでコードされる形質が花粉によって伝播可能ではなく、それ故に、トランスジェニック植物の野生近縁種への偶然のトランス遺伝子脱出の潜在的なリスクが概して低いからである。プラスチド形質転換の他の潜在的な利点には、多数の遺伝子をポリシストロン単位として同時発現させることの実施可能性と、核の形質転換に続いて生じ得る位置効果や遺伝子沈黙の消失が含まれる。
【０００６】
プラスチドの安定な形質転換を可能にする方法は、実際に、高等植物で開発することができた。今日では、２つの異なる方法が利用可能である。即ち、組織、特に、葉組織の粒子衝突法（Ｓｖａｂら、１９９０）と、好適な形質転換ベクターの存在下にプロトプラストをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で処理すること（Ｋｏｏｐら、１９９６）である。いずれの方法も、２層の包膜の通る小器官のストロマへのプラスミドＤＮＡの移入を仲介する。
【０００７】
プラスチド形質転換の慣用法は、通常、スペクチノマイシン又はストレプトマイシンのような阻害剤への耐性を与えるａａｄＡ遺伝子（酵素アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼをコードする）（ＵＳ５８７７４０２号）、又はカナマイシンへの耐性を与えるａｐｈＡ−６（酵素アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼＡ−６をコードする）（Ｈｕａｎｇら、２００２）を含有する発現カセットのような抗生物質耐性マーカーカセットのプラストムへの挿入を選択することに依存する。あるいは、完全な常在プラスチド遺伝子を選択阻害剤への耐性を与える突然変異遺伝子に置き換えることによって、選択を達成する（ＵＳ５４５１５１３号）。非形質転換細胞の莫大なバックグラウンドからのトランスジェニック植物細胞の選択に必要とされるこれらの選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性又は除草剤耐性をコードする。選択マーカー遺伝子又は突然変異プラスチド遺伝子は、プラストム組込みを指令する相同領域が隣接する組込み領域に含まれる。従って、プラスチド形質転換体の選択は、適切な阻害剤を含有する培地で形質転換した植物材料を培養することによって達成される。これらのマーカー遺伝子は、目的遺伝子と一緒にゲノムへ安定的に組み込まれるので、それらは、目的遺伝子の機能には必要とされなくても、ホモプラストミック（homoplastomic）なトランスジェニック植物に留まることになる。これらの残存するマーカー遺伝子は、植物バイオテクノロジーへの批判の主要課題である。故に、トランスジェニック植物中に耐性遺伝子をもたらすことのない選択系の構築がきわめて望ましい（Ｉａｍｔｈａｍ及びＤａｙ、２０００）。
【０００８】
慣用のプラスチド形質転換技術は、Ｈｅｉｆｅｔｚ、２０００及びＫｏｏｐら、１９９６に記載されている。プラスチド形質転換ベクターは、通常、挿入部位の２つの領域（これは、組換えられる配列を相同的組換えイベントによりプラストムへ安定導入するために必要である）に隣接する１以上の目的遺伝子を含有する（ＵＳ５８７７４０２号、ＵＳ５４５１５１３号）。しかしながら、２つのフランク（ｆｌａｎｋ）、マーカー遺伝子、１以上の目的遺伝子、及びプロモーター、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲのような調節因子又はスペーサー要素といった多数の様々な断片を含有する形質転換ベクター分子を産生するには、かなりのクローニング作業が必要となる。
【０００９】
形質転換ベクターのクローニングは、（少なくとも１つの）クローニングされる遺伝子がクローニングに使用する細菌に対して有毒な効果を及ぼす場合、問題になる。さらに、一連の導入トランス遺伝子を同時発現させるきわめて望ましい潜在可能性を活用することは、形質転換するプラスミドの全体サイズにより制限される。
【００１０】
プラスチド形質転換を達成することにおける１つの重大な問題の種は、プラストムのコピー数が多いことである。ベクターＤＮＡのプラスチドへの移入の後で、プラストムと組み換わるのは、導入した分子の唯一のコピーか又はごく数個のコピーである。従って、はじめは、きわめてわずかな比率の組換えプラストム分子が大多数の野生型プラストム分子のバックグラウンド中に産生される（「ヘテロプラストミック状態」）。選択圧下での分離というきわめて時間を消費する方法によって、プラストムの元の野生型コピーを消失させて、組換えプラストム分子だけの存在を特徴とする「ホモプラストミックな組換え状態」を達成することが可能になる。ホモプラストミック状態を達成することは、適正な抗生物質を含有する選択培地での数サイクルの再生によって支援される。通常、ホモプラストミックな組換え状態を得るには、そのようなサイクルが３〜５回必要である。野生型プラストムの残存コピーの存在は、ＰＣＲ又はサザンハイブリダイゼーションのような分子解析によってモニターすることができる。１回の再生サイクルに数週間が必要とされるので、ホモプラストミックなプラスチド形質転換体を産生するには数ヶ月を要することになる。
【発明の開示】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、植物プラスチドの遺伝学的形質転換の新規で、効率的で、迅速で、きわめて多用途な方法を提供することであり、それによって遺伝的に安定したトランスジェニック植物又は植物細胞を産生することができる。
【００１２】
本発明の他の目的は、ホモプラストミック植物を達成するのに必要とされる再生サイクル数の有意な低下を可能にする、植物プラスチドの遺伝学的形質転換の方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、多数の目的遺伝子の発現（ポリシストロニック発現）を可能にする、植物プラスチドの遺伝学的形質転換の方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、モジュラー形式で使用可能であり、それによりクローニング作業とプラスミド分子の全体サイズを減らせるベクターを提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、クローニングに使用する細菌に対して有毒な効果を及ぼす配列のクローニングを可能にするベクターを提供することである。
本発明のさらなる目的は、耐性マーカー遺伝子を最終の植物又は植物細胞に持ち込まない形質転換体の産生を可能にする方法を提供することである。
【００１５】
発明の一般的な説明
上記目的は、そのプラストムで形質転換したトランスジェニック植物又は植物細胞を産生する方法により達成され、前記方法は：
（ａ）第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡ分子を植物プラスチドへ導入すること
［ここで、前記第１のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第１領域と第１の目的配列を含有し、前記第２のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第２領域と第２の目的配列を含有し、それによって、前記第１の目的配列の配列セグメントは、前記第２の目的配列の配列セグメントと相同になる］、及び
（ｂ）組込み配列がプラストムに安定的に組み込まれている形質転換体を選択すること［それによって、前記組込み配列は、前記第１の目的配列の少なくとも一部と前記第２の目的配列の少なくとも一部を連続配列として含有する］
を含む。好ましい態様を従属項により明確化する。
【００１６】
驚くべきことに、最終のトランスプラストミック植物において連続した組込み配列を生じる、重複配列を含有する少なくとも２つのＤＮＡ分子を植物プラスチドへ導入することによって、そのプラストムで形質転換したトランスジェニック植物又は植物細胞を産生することが可能であることが見出された。本発明の方法は、慣用のプラスチド形質転換法に優るいくつかの重要な利点を特徴とする。これらの利点を以下に示す。
【００１７】
本発明の方法は、形質転換される植物のプラスチドへ第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を導入することを含む。ベクターとして使用されるこれらのＤＮＡ分子は、連続的に、即ち２つの別々の工程で導入しても、同時に、即ち１工程法で導入してもよい。前記２つのＤＮＡ分子を１工程法で、例えば、前記ＤＮＡ分子の混合物を使用することによって導入することがより労力が少なく好ましい。前記ＤＮＡ分子を導入するには、公知の形質転換法を使用してよい（以下を参照のこと）。
【００１８】
前記２つのＤＮＡ分子の設計は、本発明の目的にとってきわめて重要である。前記第１のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第１領域と第１の目的配列を含有する。前記第２のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な第２領域と第２の目的配列を含有する。このように、それぞれのＤＮＡ分子には、プラストムの領域に相同な１つの領域で十分である。好ましくは、前記第１のＤＮＡ分子又は前記第２のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な唯一の領域を含有する。より好ましくは、前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子は、いずれも、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な唯一の領域を含有する。
【００１９】
前記相同領域は、プラストムの所望の部位への各ＤＮＡ分子の取込みを指令する。第１及び第２の相同領域は、一緒に、本発明の方法によるプラストムのＤＮＡ修飾のタイプ（例えば挿入、欠失）を決定する。好ましい態様において、本発明の方法を実施する目的は、プラストム配列の欠失のようなさらなるプラストム修飾を伴わずに、組込み配列をプラストムへ導入することである。好ましくは、第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子の前記相同領域はともに連続したプラストム配列に対応する。一般に、前記相同領域は、形質転換される植物種のプラストムに由来する。相同的組換えに十分な相同性が保証される限りにおいて、相同領域は他の植物種に由来してもよいが、好ましくは、近縁の植物種に由来する。
【００２０】
プラストム組込みのための各相同領域の長さは、組換え頻度が十分である限りにおいて、広範囲に変動してよい。各相同領域は、１００ｂｐ〜５０００ｂｐの長さを有することができる。通常、相同領域の長さが減少するにつれて、組換え頻度は減少する。故に、その長さは、好ましくは少なくとも２００〜３００ｂｐである。より好ましくは、その長さは、５００ｂｐ〜２０００ｂｐであり、最も好ましくは５００ｂｐ〜１０００ｂｐである。
【００２１】
前記目的配列は、プラストムへ組み込むどのヌクレオチド配列も含有してよい。典型的な例として、前記目的配列は、発現する遺伝子を含有する。前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列は、発現する遺伝子の断片をそれぞれ含有してよく、それによって前記遺伝子は、前記組込み配列において組み立てられる。本発明は、この点できわめて多用途である。しかしながら、前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列は異なることが好ましい。
【００２２】
前記第１の目的配列は、前記第２の目的配列の配列セグメントに相同な配列セグメントを含有する。従って、この相同セグメントは、前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列の重複領域である。この相同配列セグメントは、組込み配列がプラストムに形成されるような、前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列の組換えを可能にし、それによって、前記組込み配列は、前記第１の目的配列の少なくとも一部と前記第２の目的配列の少なくとも一部を連続配列として含有する（図５参照）。目的配列中の配列セグメントは、好ましくは、プラストム組込みを指令する前記相同領域に関して、目的配列の遠位端に位置づける。
【００２３】
最小の必要条件として、前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列は、前記相同配列セグメント、即ち、前記第１の目的配列と前記第２の目的配列との間の相同的組換えを可能にするのに十分相同である配列をそれぞれ含有する。好ましくは、第１の目的配列及び第２の目的配列の相同配列セグメントは同一である。
【００２４】
前記配列セグメントは、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現に関与する配列（又はその一部）であっても、それを含有してもよい。前記配列セグメントは、コード配列の転写又は翻訳の調節に関与する配列（例えば、プロモーター、５’若しくは３’非翻訳配列、リボソーム結合部位、等、又はその一部）であっても、それを含有してもよい。さらに、前記配列セグメントは、発現するタンパク質のコード配列（又はその一部）であっても、それを含有してもよい。上記の事例において、前記第１の目的配列の配列セグメントと前記第２の目的配列の配列セグメントは、前記調節配列又は前記コード配列の機能を混乱させないために、同一であることが好ましい。あるいは、前記配列セグメントは、前記組込み配列を形成するために前記第１の目的配列と前記第２の目的配列との間の組換えを可能にするという唯一の目的を有すればよく、ＲＮＡ又はタンパク質の発現に関与しなくてよい。
【００２５】
前記配列セグメントは、典型的には、本発明に従って産生されるトランスジェニック植物又は植物細胞のトランスプラストムの一部である（図５及び６参照）。前記配列セグメントは転写単位の一部であってよく、それによって前記転写単位より形成される転写物の一部になり得る。前記配列セグメント（又はその一部）がそのような転写物において望ましくない場合（例えば、発現するタンパク質をコードするコード配列が前記配列セグメントにより中断される場合）、望ましくない部分をＲＮＡスプライシングにより切除することができる。この場合、望ましくない部分をスプライスアウトするために、前記配列セグメントにイントロン、特にグループＩ又はグループＩＩイントロンのような自己スプライシングイントロンを含めてよい。多くの供給源からの自己スプライシングイントロンと遺伝子工学におけるその使用は当該技術分野で公知である。第１の目的配列がそのイントロンの５’部分を提供し、第２の目的配列がそのイントロンの３’部分を提供してよく、それによって、前記組込み配列が形成されるとき、機能的なイントロンを組み立てることができる。
【００２６】
前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列が同一であり、前記目的配列から成る組込み配列をもたらしてもよい。この限定的な事例では、それぞれの目的配列が前記相同配列セグメントから成ると考えられる。この限定的な事例は、本発明の好ましい事例ではない。好ましくは、前記第１の目的配列又は前記第２の目的配列は、前記相同配列セグメントに加えて配列を含有する。より好ましくは、前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列が前記相同配列セグメントに加えて配列をそれぞれ含有し、それによって前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列の前記追加配列は異なる。
【００２７】
ベクターの前記重複領域（相同配列セグメント）間の組換えは、プラストムの内側で起こり、前記組込み配列を形成することができる。前記組込み配列は、好ましくは、前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列からの配列部分を含む。前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列が目的遺伝子をそれぞれ含有する場合は、２つの目的遺伝子を含む組込み配列が形成されることができる。このように、本発明の方法は、前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列から所望の組込み配列を組み立てるために使用することができる。組込み配列の組立てを使用して、前記目的配列の１つに単独では存在しない新たな機能をプラスチドに発生させることができる。例えば、コード配列と様々な調節配列から成る目的遺伝子を、前記組込み配列において機能型へ組み立てることができる。さらに、前記第１の目的配列中の目的コード配列を、前記第２の目的配列で提供されるプロモーター又は他の調節配列と組み合わせてよい（又はその逆でもよい）。このようにして、前記コード配列の所望の発現を生じる調節配列を選択又はスクリーニングすることができる。
【００２８】
さらに、目的タンパク質を発現するコード配列を前記組込み配列中に組み立ててよく、それによって前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列（そして随意に、さらなるベクター由来のさらなる目的配列）は、前記コード配列の一部を前記組込み配列へそれぞれ提供する。発現するタンパク質のメッセンジャーＲＮＡレベルでの正確なリーディングフレームを達成するために自己スプライシングイントロンを使用する場合がある。
【００２９】
本発明の方法は、前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子に加えて、１以上の追加ＤＮＡ分子を前記植物プラスチドへ導入することを含んでもよい。前記追加ＤＮＡ分子は、追加の目的配列を含む。第３のＤＮＡ分子を導入する場合は、前記第３のＤＮＡ分子は、好ましくは、前記第１の目的配列の配列セグメントに相同な配列セグメントと前記第２の目的配列に相同な配列セグメントを含有する。前記第３のＤＮＡ分子は、プラストム組込みのための相同領域を有さないことが好ましい。
【００３０】
形質転換後、所望の組込み配列を含有する形質転換体を選択する。選択は、典型的には、マーカー遺伝子により形質転換体がそれに対して耐性である阻害剤又は抗生物質によって支援される。選択は、形質転換された区分と形質転換されていない区分の分離（例えば葉の上で）を可能にすることをさらに含んでもよい。形質転換体又は形質転換された区分は、分子解析、例えばＰＣＲ及びサザンブロッティングによって同定することができる。さらに、形質転換体又は形質転換された区分は、表現型により、例えばトランス遺伝子の発現により同定することができる。トランス遺伝子は、例えば、ウェスタンブロッティングにより、特徴的な酵素活性により、又は光学特性、特に蛍光特性といった別の特徴的な性質により検出することができる。
【００３１】
形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子は、前記第１の目的配列又は前記第２の目的配列とともにプラストムへ導入することができる。
上記のように、前記第１の目的配列が前記組込み配列へマーカー遺伝子の断片を提供し、前記第２の目的配列が前記マーカー遺伝子の別の断片を提供する場合があり、それによって、前記断片を前記組込み配列において機能的なマーカー遺伝子へ組み合わせる。好ましくは、前記第１の目的配列がマーカー遺伝子の５’部分を含有し、前記第２の目的配列が前記マーカー遺伝子の３’部分を含有する。従って、前記組込み配列は、前記マーカー遺伝子を、それが発現し得るように含有することができる。この態様は、両方のベクターの組込みの選択と前記組込み配列を形成する組換えを可能にする。
【００３２】
選択可能マーカーを含まないトランスジェニック植物又は植物細胞は、Ｉａｍｔｈａｍ及びＤａｙ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００）１８、１１７２−１１７６）に記載されるのと同様に、組込み配列中の選択可能マーカー遺伝子が互いに相同な配列因子に隣接されてマーカー遺伝子の相同的組換えによる切除が可能となるように、前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子の前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列をそれぞれ設計することによって本発明の方法において入手することができる。この態様において、前記第１の目的配列は、前記マーカー遺伝子の５’部分の上流に、第２の目的配列上の前記マーカー遺伝子の３’部分の下流に位置する配列因子に相同な配列因子を含有してよく、それによって前記配列因子は、前記マーカー遺伝子の前記５’部分及び／又は前記３’部分を含む前記組込み配列の一部を相同的組換えにより切除することが可能になる。マーカー遺伝子の切除には、典型的には、前記マーカー遺伝子がそれに対して耐性を提供する選択圧の解除が必要となる。
【００３３】
前記第１の目的配列及び前記第２の目的配列は、それぞれ完全なマーカー遺伝子を含有してもよい。しかしながら、好ましくは、前記第１の目的配列は、前記マーカー遺伝子の前記５’部分を含有し、前記第２の目的配列は前記マーカー遺伝子の前記３’部分を含有してよく、それによって、前記５’部分も前記３’部分もそれぞれ前記３’部分又は前記５’部分の非存在下では耐性を与えることが可能でない。例えば、前記５’部分は、前記マーカー遺伝子のプロモーター、５’−非翻訳配列、及びコード配列であり得る。前記３’部分は、前記マーカー遺伝子のコード配列、及び３’−非翻訳配列であり得る。
【００３４】
本発明は、マーカーを含まないトランスプラストミック植物の産生を可能にするさらなる態様を提供する。このことは、前記ＤＮＡ分子の１つにおいて、プラストムの領域に相同な前記領域と前記目的配列から成る配列単位の外側に選択可能マーカー遺伝子を含むことによって達成することができる。マーカー遺伝子のそのようなポジショニングにより、生じる組換えイベントの経過において前記マーカー遺伝子の欠失が可能になる。選択可能マーカー遺伝子は、記載の形式で前記第１のＤＮＡ分子又は前記第２のＤＮＡ分子に含まれても、前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子に含まれてもよい。選択可能マーカー遺伝子が前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子に含まれる場合、これらの選択可能マーカー遺伝子は、同じであっても、異なる選択可能マーカー遺伝子であってもよい。前記マーカー遺伝子の前記配列単位の外側でのポジショニングは、本発明において想定される組換えイベントの経過において、マーカー遺伝子のプラストムからの切除をもたらし、鋭敏なマーカーを含まないトランスプラストミック植物を作製する。当業者には、使用するマーカー遺伝子への阻害剤又は抗生物質が工程（ｂ）の選択においてほんの一過的に適用されることが明らかである。後の段階で、抗生物質を培地から除外し、ベクター組込みの間に産生された複製配列により仲介される相同的組換えイベントによるマーカー遺伝子の欠失を可能にする。
【００３５】
マーカーを含まないトランスプラストミック植物を産生する方法の特定の態様において、選択可能マーカー遺伝子を第１断片及び第２断片へ分断して、それによって前記第１断片を第１配列単位の外側で前記第１のＤＮＡ分子に取り込み、そして前記第２断片を第２配列単位の外側で前記第２のＤＮＡ分子に取り込む。前記第１配列単位は、前記第１相同領域と前記第１の目的配列から成る。前記第２配列単位は、前記第２相同領域と前記第２の目的配列から成る。
【００３６】
本発明の方法は、すべての植物に適用することができる。好ましくは、それは多細胞植物へ適用される。最も好ましくは、本発明の方法は、農作物へ適用される。農作物の例は定義に示す。
【００３７】
さらに本発明は、本明細書に定義されるような第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含む部品キットを提供する。さらに本発明は、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な１つの領域と目的配列を含有する、プラスチド形質転換のためのＤＮＡ分子を提供する。さらに、本明細書に定義されるようなＤＮＡ分子のライブラリーが提供され、それによって前記ＤＮＡ分子のそれぞれが異なる目的配列を含有する。そのようなライブラリーは、目的ＤＮＡ配列の混合物を、プラストム組込みを指令するプラストムの領域に相同な領域を含有するベクターへクローニングすることによって創出することができる。このライブラリーは、細菌（例えば大腸菌）又は植物細胞のような細胞へこのＤＮＡ分子を形質転換することによって維持することができる。また、前記部品キットの前記ＤＮＡ分子又は本発明のＤＮＡ分子で形質転換される植物又は植物細胞が提供される。本発明はまた、本発明の方法により入手されるか又は入手可能な植物細胞及び植物に関する。
【００３８】
本発明の方法の利点
本明細書に記載の方法は、遺伝子若しくは調節配列のような目的配列を導入すること、又は点突然変異、挿入又は欠失のような突然変異をプラストムへ導入することに適用することができる。
【００３９】
本発明の方法は、トランスプラストミック植物の産生を可能にし、それによって、先行技術の方法より少ない再生サイクルの後でホモプラストミック状態に達することができる。特別な態様に依存して、ホモプラストミック植物は、０〜４回の再生サイクルの後で、好ましくは２回のサイクルの後で、より好ましくは１回の再生サイクルの後で達成することができる。特定の態様において、ホモプラストミック状態は、１次形質転換体において再生サイクルなしに達成される。このように、本発明の方法は、ホモプラストミックなトランスプラストミック植物を達成するのに必要とされる時間の大幅な短縮を可能にする。この驚くべき効率改善の理由は今もって明らかではない。慣用のプラスチド形質転換に比較して、本明細書に記載の方法がより速いのは、ホモプラストミック植物を得るのにより少ない工程しか必要でないためである。
【００４０】
本方法は、慣用のプラスチド形質転換ベクターの場合よりクローニングが単純である、より小さな形質転換ベクターの使用を可能にする。
本方法は、重複配列がある無制限数の形質転換ベクターを使用し得るので、導入すべき配列の数又はサイズに関するどんな制限からもプラスチド形質転換を解放する。
【００４１】
本方法は、有毒な配列のそれぞれが、それらがあるタンパク質配列に発現されたとしても、別々では有毒になり得ないやり方で２つの異なるベクター分子へクローニングされ得るので、クローニングに使用する細菌にとって有毒な配列によって課されるどんな制限からもプラスチド形質転換を解放する。
【００４２】
さらに、本明細書に記載の方法は、コンビナトリアルベクターライブラリーの使用を可能にし、それによってライブラリーのベクターは、様々な目的配列を含有する。
本方法は、形質転換体を産生するために適用することができ、それによって最終植物は、いかなる耐性マーカー遺伝子も保有しない。
【００４３】
この新規方法の上記側面のいずれも慣用のプラスチド形質転換に比較して実質的な利点を提供する。まとめると、本発明の方法及びベクターは、速度、使用可能性及び融通性のいずれでもプラスチド形質転換全般に対する多大な進歩を構成する。
【００４４】
諸定義
３’−ＵＴＲ：（→）コード領域の下流にある、転写されるが翻訳されない（→）遺伝子の領域；
５’−ＵＴＲ：（→）コード領域の上流にある、転写されるが翻訳されない（→）遺伝子の領域；（→）プラスチド（→）遺伝子において、５’−ＵＴＲは、その３’端の近傍に翻訳開始のための配列情報（リボソーム結合部位、（→）ＲＢＳ）を含有する。
【００４５】
ａａｄＡ：細菌アミノグリコシド・アデニル・トランスフェラーゼの（→）コード領域、抗生物質の（→）選択阻害剤、スペクチノマイシン及び／又はストレプトマイシンを解毒化する、頻繁に使用されるタンパク質である；
ａｐｈＡ−６：細菌アミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼＡ−６の（→）コード領域、抗生物質の（→）選択阻害剤：カナマイシンを解毒化するタンパク質である；
葉緑体：葉緑素を含有する（→）プラスチド；
コード領域：ａ）ポリペプチドのアミノ酸配列、又はｂ）機能性ＲＮＡのヌクレオチドについての情報を含有するヌクレオチド配列；コード領域は、１以上の（→）イントロンにより随意に中断される；
フランク、フランキング領域：慣用の（→）プラスチド（→）形質転換（→）ベクター中のインサートの５’端及び３’端のＤＮＡ配列であり、フランク間の配列の２重逆位（→）相同的組換えによる標的（→）プラストムへの組込みを仲介する。同じ機序により、種々の配列を修飾するか又は、標的（→）プラストムより除去することができる。このように、（→）プラスチド（→）形質転換（→）ベクターのフランクにより、標的（→）プラストム中の変化が（→）形質転換によりどこで産生されるかが決定される；
遺伝子発現：配列情報を機能へ変換するプロセス；ポリペプチドをコードする（→）遺伝子では、遺伝子発現は、ＲＮＡポリメラーゼ活性を始動して指令する（→）プロモーター活性を必要とし、それがメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらし、続いて、ポリペプチドへ翻訳される；ＲＮＡをコードする（→）遺伝子では、（→）プロモーター仲介性のＲＮＡポリメラーゼの活性により、コードされたＲＮＡが産生される；
遺伝子：機能、例えば発現を独立して確保するのに必要とされるすべての要素をコードするヌクレオチド配列；遺伝子は、少なくとも１つの完全な（→）コード領域を含有する（→）オペロンにおいて組織され；ポリペプチドをコードする（→）遺伝子では、これらの要素は：（１）（→）プロモーター、（２）５’非翻訳領域（（→）５’−ＵＴＲ）、（３）完全な（→）コード領域、（４）３’非翻訳領域（（→）３’−ＵＴＲ）であり；ＲＮＡをコードする（→）遺伝子では：（→）５’−ＵＴＲと（→）３’−ＵＴＲが欠落し；１より多い（→）コード領域から成る（→）オペロンでは、２つの続いた完全な（→）（→）コード領域が（→）スペーサーにより分離されて、（→）プロモーター、（→）５’−ＵＴＲ、及び（→）３’−ＵＴＲの要素は、その（→）オペロンの（→）コード領域により共有され；遺伝子の断片は、遺伝子の上記に列挙した要素の少なくとも１つを完全に又は一部失っている；
目的遺伝子：修飾されるか又は新たに導入される配列：（→）形質転換の試みの目的；
ゲノム：細胞の核又は細胞小器官の完全なＤＮＡ配列；
ＧＦＰ：グリーン蛍光タンパク質
相同的組換え：（→）ゲノム中の標的部位に対して十分な配列相同性のある１以上の（→）フランクの存在により、配列の交換、挿入又は欠失をもたらす方法；
イントロン：（→）コード領域を中断する配列
オペロン：プロモーターを共有するいくつかの（→）遺伝子の組織構造；
植物：その（それらの）細胞中に（→）プラスチドを含有する生物；本発明は、特に、多細胞（→）植物に関する；これらには、裸子植物（マツ、トウヒ及びモミ等のような）と被子植物（単子葉類作物のトウモロコシ、小麦、大麦、コメ、ライ麦、ライコムギ、サトウモロコシ、サトウキビ、アスパラガス、ニンニク、ヤシの木等と非作物の単子葉類、そして双子葉類作物のタバコ、ジャガイモ、トマト、ナタネ、サトウダイコン、カボチャ、キュウリ、メロン、コショウ、柑橘類、ナス、ブドウ、ヒマワリ、ダイズ、アルファルファ、ワタ等と非作物の双子葉類のような）の群、並びにシダ、苔綱コケ、蘚綱コケ、及び多細胞の緑藻、紅藻及び褐藻が含まれる；
プラスチド：それ自身の遺伝機構のある、（→）植物細胞中の小器官であり、機能的及び形態学的に様々な異なる形態で存在する。例えば、アミロプラスト、（→）葉緑体、有色体、黄色体、老化体（gerontoplasts）、白色体、原色素体等；
プラストム：（→）プラスチドの完全なＤＮＡ配列；
プロモーター：転写の開始及び調節に機能するヌクレオチド配列；
ＲＢＳ、リボソーム結合部位：（→）コード領域の（→）翻訳開始コドンの上流にあるＤＮＡ配列因子であり、リボソーム結合と各ＲＮＡ転写物からの翻訳開始を仲介する；ＲＢＳ要素は、（→）５’−ＵＴＲ又は（→）スペーサーのいずれかの部分である；
選択阻害剤：形質転換されていない細胞又は小器官の増殖及び発達を、形質転換されたものより強く抑制する化学化合物；
目的配列：修飾されるか又は新たに導入されるあらゆる長さの配列：（→）形質転換の試みの目的；配列の導入が企図されていない場合、目的配列の長さは０であってよく、即ち、目的配列を有さないことが目的になり得る。本発明において、ベクターとして使用するＤＮＡ分子の目的配列は、ベクターとして使用する他のＤＮＡ分子の配列セグメントに相同な少なくとも１つの配列セグメントを有する；
形質転換ベクター：（→）ゲノムの（→）形質転換を仲介するために産生した、クローニングされたＤＮＡ分子；
形質転換：少なくとも１つの（→）形質転換ベクターの使用が含まれる、（→）植物又は植物細胞の処理によりＤＮＡ配列の導入、切除又は修飾をもたらす方法；
トランス遺伝子：ある（→）ゲノムに由来して、他のゲノムへ導入されるＤＮＡ配列；
ｕｉｄＡ：頻繁に使用されるレポータータンパク質である、細菌β−グルクロニダーゼの（→）コード領域。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
詳細な説明と好ましい態様
慣用のプラスチド形質転換ベクターを使用するとき、ホモプラストミック形質転換体を達成するには多数の再生サイクルが必要とされる
慣用のプラスチド形質転換ベクターは、通常組込み配列を含有し、野生型植物には存在しない、選択可能マーカー遺伝子、１以上の目的遺伝子、並びにプロモーター、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ又はスペーサー要素のような調節因子を含有する。このベクターにおいて、組込み配列には、標的化プラストムに相同であり、それによりプラストム組込みの位置を指令する２つの配列が隣接する。組込み領域の標的プラストムへの挿入は、２重逆位相同的組換えイベントにより達成される。簡略モデルは、各フランクで１つのイベントという２つの相同的組換えイベントを介して組込みが起こることを示唆する（図１）。しかしながら、実際の分子プロセスはモニターすることが困難で、種々の中間体が関与してより複雑であるかもしれない。我々の研究室で得た実験データは、２つのフランクの１つにより仲介される第１の組換えイベントが形質転換ベクター全体の組込みをもたらし、それによりフランキング配列が重複することを示唆する（図２）。実際、環状プラスミドベクター全体の組込みをＰＣＲとサザンハイブリダイゼーション解析により証明することができた（図３）。異なる時点で、第２の組換えイベントは、第１の組込みの逆転を引き起こすこともある。あるいは、２つの他の重複フランキング配列間の第２の組換えが、プラスミド骨格と重複断片の切除を引き起こし、組込み配列をプラストム中に残す（図２）。
【００４７】
慣用のプラスチド形質転換ベクターを使用すると、５サイクルまでの再生が必要なため、ホモプラストミックなプラスチド形質転換体を達成するのに数ヶ月かかる。ヘテロプラストミック細胞を分離によりホモプラストミック細胞へ転換するには、相当数の細胞産生が必要となる。プラストムの所望の配置への分離は、選択条件を適用することによって推進される。
【００４８】
本発明のベクターは、１以下の相同領域を含有する
慣用のプラスチド形質転換法とは対照的に、本発明は、少なくとも２つの異なるタイプのＤＮＡ分子（例えば形質転換ベクター）を、好ましくは同時に、プラスチドへ導入する、トランスプラストミック植物又は植物細胞を産生する方法を開示する。プラストム組込みを指令するには、前記ベクターのそれぞれについて１つの相同領域で十分であり、好ましくは、各ベクターは、プラストム組込みを指令する１以下の相同領域を含有する。さらに、各ベクターは、好ましくは野生型植物に存在しない目的配列を含有する。前記ベクターの目的配列は、入手されるトランスプラストミック植物において組込み配列をもたらすであろう。
【００４９】
組込み配列は、マーカー遺伝子や他の目的配列のような外来遺伝子を含有してよい。マーカー遺伝子は、ａｐｈＡ−６のような抗生物質耐性遺伝子やｂａｒのような除草剤耐性遺伝子といった阻害剤への耐性を与えるいかなる遺伝子でも、ＧＦＰのような可視マーカー遺伝子でもよい。
【００５０】
他の目的配列の例は、プロインスリン、インターフェロン、ヒト血清アルブミン、ヒト成長因子、ワクチンとして作用するペプチド（Ｂ型肝炎に対するワクチンのような）のような有用なタンパク質をコードするか又は発現することが可能なあらゆる遺伝子、又はテクニカル酵素の遺伝子である。しかしながら、産生される組込み配列は、例えば特定の突然変異体を産生するために、プラスチド配列の欠失したものであってもよい。
【００５１】
本発明の方法において、プラストムの組込み部位を規定する相同領域をそれぞれ含有する、少なくとも２つのＤＮＡ分子（例えばベクター）をプラスチド中へ放出する。好ましくは、前記第１のＤＮＡ分子又は前記第２のＤＮＡ分子は、プラストム組込みを指令する１より多い相同領域を有さない。より好ましくは、前記第１のＤＮＡ分子も前記第２のＤＮＡ分子も、プラストム組込みを指令する１より多い相同領域を有さない。このことは、プロモーターや調節因子のようなプラストム配列や他のプラスチド配列に相同性を有する要素の目的配列における使用を排除しない。プラスチド配列に相同なそのような要素を目的配列において使用する場合、それらは、原理的にはプラストム組込み配列としても作用し、望ましくない組込みイベントをもたらすかもしれない。例えば、それらが安定な形質転換体も、利用する選択可能マーカーにより選択され得る形質転換体ももたらさない場合、そのような望ましくない組込みイベントは、多くの場合、さほど問題ではないかもしれない。さらに、望ましくない形質転換体は、例えば組込み配列の分子解析によって検出することができる。
【００５２】
プラスチド配列に相同な要素は、プラストム組込みのための相同配列より有意に短いことが好ましい。この基準により、前記相同要素では、前記相同領域より有意に低い組換え頻度が達成される。あるいは、プラスチド配列に相同なそのような要素は、望ましくない組換えイベントを妨げるために、ＤＮＡ分子の所望の組込み部位からかなり離れて位置するプラストム配列より取ることが好ましい。
【００５３】
この少なくとも２つの異なるベクター分子は、同時に、又は２以上の異なる形質転換工程で放出する。少なくとも２つのタイプの分子を同時に形質転換することは、同時形質転換と呼ばれている。少なくとも２つのベクター分子の同時形質転換の後で、所望のプラストム修飾のあるプラスチドを含有する第１の再生物は、適用する形質転換法に依存して、適切な選択及び培養条件下で約３週間の培養後に出現する。同時形質転換の方法は、プラスチド形質転換体の産生に適しているどの形質転換法でも使用してよい。好適なプラスチド形質転換法の例は、微粒子銃形質転換、ＰＥＧ仲介性形質転換、化学薬品を使用する他のトランスフェクション法、又は核酸の電場仲介性トランスフェクションである。
【００５４】
あるいは、少なくとも２つのベクター分子を別々の形質転換工程で適用してよい。少なくとも２つの形質転換工程による連続形質転換は、同時形質転換の間に観測されるのと同じ組込み結果をもたらす。
【００５５】
前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子に加えて第３のベクターを使用する場合、ベクターの目的配列が組換えに十分な重複領域を含有する限り、第３のベクターは、標的プラストムに由来する相同配列を含有する必要はない。同じことは、３つより多いベクターを使用する場合も当てはまる。
【００５６】
マーカー遺伝子の断片を異なるベクター上に位置づけてよく、それによってマーカー遺伝子は、組換えプロセスにより組み立てられる。
本発明のベクターは、ホモプラストミック植物の産生をごく短時間で可能にする
驚くべきことに、本明細書に記載の方法を使用すると、わずか２サイクルの再生後でホモプラストミックなプラスチド形質転換体を回収することが可能であることがわかった。好ましくは、１回の再生サイクルでも十分である。多くの場合、植物組織又は植物細胞を形質転換した後に回収した再生物は、再生サイクルを実施せずとも、ホモプラストミックである。慣用のプラスチド形質転換ベクターとは対照的に、わずか数週間というごく短期間の後でホモプラストミック植物を得ることが可能である。故に、本明細書に記載の本発明は、莫大なプロセスの加速化と組織培養に必要とされる作業の劇的な軽減を提供する。
【００５７】
ホモプラストミック形質転換体は、いかなる野生型プラストムも含有しない。野生型プラストムの存在は、サザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ解析のような方法によってモニターすることができる。植物組織又は細胞の形質転換後に出現する１次再生物より回収したトランスプラストミック植物材料において定型的なサザン解析を実施して、組換えプラストムを同定し、残る野生型プラストムを検出した。これら１次再生物由来の解析材料の４０％は、残存する野生型プラストムを少しも含有しない。慣用の形質転換ベクターを使用すれば５回までのサイクルの継代培養が必要とされるのに対し、わずか１工程の継代培養で他の再生物より野生型プラストムを消失させることができた。
【００５８】
本発明による外来配列の導入についての仮説機序を図４に記載する。このモデルによれば、相同領域を含有する２つのベクター分子のうち１つがそれぞれのプラストム配列と組み換わる。この相同的組換えイベントは、プラスミド骨格が含まれるベクター全体の組込みをもたらす。それは、相同領域の重複ももたらす。このプロセスは可逆的であり、このプロセスが別の組込みイベントにより安定化されていなければ、重複した相同領域により仲介される相同的組換えによる組換え配列の切除をもたらす。発現され得る選択可能マーカー遺伝子を組込み配列が含有する場合、このベクターは、選択圧がかかっていれば、組み込まれた状態でいる傾向がある。選択圧の非存在時には、１つの組込みベクターを有するプラストムは、きわめて不安定である。しかしながら、第２の組換えイベントは、少なくとも１つの他の分子の組込みをもたらす場合がある。この他の分子が別の相同領域を含有する場合、プラストムのそれぞれの相同領域との組換えが起こり得る。あるいは、ベクター骨格のような他の反復配列やこの分子の重複領域によって組換えが仲介されることもあり得る。第２の組換えイベントは、遊離の第１のベクターと組み込まれた第２ベクターとの間で起きても（図４に示す）、遊離の第２ベクターと組み込まれた第１ベクターとの間で起きても（図４に示していない）、組み込まれた第１ベクターと異なるプラストム分子上に位置する組み込まれた第２ベクターとの間で起きてもよい（図４に示していない）。相同プラスチド領域を含有しないベクター分子は、他の反復配列とのみ組み換わることができる。いずれの場合でも、第２ベクター分子全体の組換えが出現するであろう。２つより多いベクター分子を使用する場合、すべての分子が相同領域の１つにより組み込まれる。異なる分子のプラストムへの組込みの後で、反復配列のいずれの間でも多大な系列の２次分子内組換えが可能になる。結果として、すべての反復領域が消失するだろう。上記の様々な組換えイベントの最終結果は、組込み配列と呼ばれる連続した組換え領域の産生である。
【００５９】
本発明のベクターは、コンビナトリアルアプローチにおいて使用することができる
プラスチドにおける発現は、植物における栄養組成物の改変から医薬品の高レベル発現に及ぶ広範囲の様々な目的に有用である。その目的のためには、強度や発現様式において異なる相互交換可能なプロモーターと調節因子のセットを入手することが必要である。このことにより、様々な目的（弱い、強い、構成的、又は調節された発現、等）のために発現ベクターを構築することが可能になる。その要素は、発現レベルを改変するために相互交換可能であるべきである。多くの事例において、様々な遺伝子由来のプロモーター、５’−ＵＴＲ及び３’−ＵＴＲを使用することが好ましいのは、挿入された遺伝子が同一の５’−ＵＴＲ及び３’−ＵＴＲを介して内因性遺伝子と交換される内部の組換えが排除されるからである。一方、５’−ＵＴＲ及び３’−ＵＴＲは、時々相互作用して、一緒に翻訳活性を決定する。故に、特別な組合せの効果を推定することは、必ずしも可能ではない。５’調節因子又は３’調節因子のみを含有する本発明のモジュラーベクターは、様々な調節因子を組み合わせる容易で迅速な方法を可能にし、組込み配列において所望の発現カセットを産生する。様々な要素のあるベクターは、ライブラリー中に保存して随意に組み合わせることができる。さらに、様々な要素の最適な組合せが知られていない場合、様々なベクター上の様々な調節因子の混合物を形質転換に使用してよい。次いで、所望の特性のある形質転換体の選択と、それに続く随意の分子解析により、所望の特性のある発現カセットを入手する。
【００６０】
本発明のベクターにより、過剰なクローニング作業が回避される
慣用のプラスチド形質転換ベクターは、通常、形質転換体の選択に必要とされる選択可能マーカー遺伝子、１以上の目的遺伝子、及びプロモーター、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ又はスペーサー要素のような調節因子を含有する。多くの異なる要素から成るこれらのきわめて複雑なプラスミドを産生するには、実質的な努力を必要とする。しかしながら、異なる形質転換ベクターでは、多くの同一の要素を使用する。本発明の方法を使用して、相同領域、選択マーカー遺伝子及び調節因子のようなこれらの同一要素を１つの分子に含有するベクターを構築することが可能である。この少なくとも１つの他の形質転換ベクターは、プラストムへ導入される様々な目的配列を担う。第１のベクター分子を所望の配列のいずれかを含有する他の適切なベクターと組み合わせることによって、プラスミドの複雑性と、結果的にこれらの分子を構築するための努力が軽減される。
【００６１】
本発明のベクターは、慣用のプラスチド形質転換ベクターより小さいので、より多くの目的配列の挿入を可能にする
形質転換ベクターの構築は、挿入サイズの限界によりしばしば制限される。慣用のプラスチド形質転換ベクターは、通常、２つの相同領域、選択可能マーカー、及び調節因子を含有する。それ故、ごく限定された数の追加配列しか導入し得ない。しかしながら、プラスチドにおいて複雑な代謝経路を操作することが望ましい場合があり、それはいくつかの異なる酵素の発現に依存する。本発明のベクターは、慣用のベクターよりも必須配列の含有が少ないため、より長い目的配列を挿入することが可能である。さらに、ずっと大きな組込み配列を導入してプラスチド中で組み立てるためには、重複領域のある２つより多い形質転換ベクターを使用してもよい。
【００６２】
本発明のベクターにより、クローニングに使用する細菌に対するある配列の有毒作用に由来する問題が回避される
遺伝子工学は、莫大な数の有機物質を産生するための自己増殖可能な工場として植物の潜在能力を使用することができる。酵素、診断薬又は治療薬のような物質の植物における経済的で環境に優しい生産が可能であることが示されている。
【００６３】
しかしながら、ある場合には、植物へ導入する遺伝子がクローニングに使用する細菌に対して有毒作用を及ぼすことがある。これらの場合、形質転換ベクターの構築は制限される。細菌に有毒作用を及ぼす配列の例は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原をコードするＨｂｓＡｇ遺伝子である。この遺伝子の植物プラスチドにおける発現は、例えば肝炎に対するワクチンの供給源になり得るため、望ましいであろう。しかしながら、慣用の形質転換ベクターにおいて使用する調節因子が含まれる全長遺伝子のクローニングは、プラスチドの調節因子が細菌中でも活性であるため、制限される。本発明のベクターを使用すると、このベクターのいずれも単独では発現可能なカセットを含有しないやり方で、ＨｂｓＡｇのような遺伝子の全発現カセットを２つの分子間に分断することが可能である。このアプローチを使用すると、細菌に有毒な遺伝子の制限効果が克服される。
【００６４】
本発明のベクターは、耐性マーカーを含まない植物の産生を可能にする
耐性マーカー遺伝子を欠くプラスチド形質転換体を入手する方法は、マーカー遺伝子の環境への望ましくない拡散を防ぐために、きわめて望ましい。慣用のプラスチド形質転換ベクターは、通常、形質転換体の選択に必要である好適な耐性マーカー遺伝子を含有する。この耐性マーカーは形質転換ベクターの組込み配列に位置しており、この耐性遺伝子の最終植物における安定したプラストム組込みをもたらす。
【００６５】
本発明に記載の方法及びベクターを使用して、そのような耐性マーカー遺伝子を、相同領域と目的配列から成る配列単位の外側に配置することが可能である。形質転換後、完全な形質転換ベクターの組込みが起こり（図２）、それにより選択マーカーのプラストムへの一過的な挿入がもたらされる。この組換えイベントは、相同領域の重複を引き起こす。形質転換された細胞を、適切な阻害剤を含有する培地でその段階の間に選択することができる。植物材料を阻害剤のない培地へ移したらすぐに、完全なベクター組込みを維持するための選択圧を解除する。先に産生した重複相同領域により仲介されるさらなる組換えイベント（図４に記載するような）は、選択マーカー遺伝子の切除をもたらす。その結果として、最終植物は、形質転換体の選択に使用した耐性マーカー遺伝子をもたない。
【００６６】
耐性マーカー遺伝子は、それぞれが異なるベクターに位置する２以上の重複断片へ分断してもよく、それによって耐性は、その断片が完全な発現可能マーカー遺伝子へ組み換わる場合にのみ仲介される。
【００６７】
本発明のいくつかの態様において、イントロンスプライシングを１次転写物のプロセシングに使用して、例えば目的タンパク質を正確に翻訳するために、所望の２次転写物を得ることができる。この目的のために、イントロンの５’部分を前記第１の目的配列に含め、イントロンの３’部分を前記第２の目的配列に含めてよく（又はその逆でもよい）、それによって前記組込み配列の形成とプラスチド中での転写の際に、機能性イントロンが形成される。前記５’イントロン部分及び前記３’イントロン部分は、天然のイントロンでもその誘導体に由来してもよい。グループＩイントロン及びグループＩＩイントロンのような自己スプライシングイントロンは、プレｍＲＮＡより自らスプライスアウトする能力を有する。グループＩイントロンもグループＩＩイントロンも人工の系においてスプライスする（トランススプライシングが含まれる）ことが可能である（Ｂｅｅｎら、１９８６、Ｃｅｌｌ、４７、２０７−２１６；Ｊａｃｑｕｉｅｒら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４、１０９９−１１９４；Ｊａｒｒｅｌｌら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８、２３６１−２３６６）。また、トランススプライシングは、グループＩＩイントロンでは葉緑体のスプリット遺伝子において（Ｋｏｈｃｈｉら、１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６、１００２５−１００３６）、グループＩイントロンでは大腸菌の人工スプリット遺伝子において（Ｇａｌｌｏｗａｙ−Ｓａｌｖｏら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１１、５３７−５４９）見出された。グループＩイントロンは、テトラヒメナ好熱菌のｒＲＮＡにおいて初めて発見された（Ｃｅｃｈ、Ｔ．Ｒ．、１９９０、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９、５４３−５６８）。それらは、切断部位の５’近傍の標的配列にＵを必要とし、切断部位の５’側で４〜６ヌクレオチドと結合する。今日まで、このグループには７５を超えるメンバーが知られている。それらはまた、真菌及び植物のミトコンドリア（Ｒｉｃｈａｒｄ＆Ｄｕｊｏｎ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、３２、１７５−１８１；Ｃｈｏら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１４２４４−１４２４９）、葉緑体（Ｔｕｒｍｅｌら、１９９３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３２、４４６−４６）、Ｔ４ファージ（Ｇａｌｌｏｗａｙら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１１、５３７−５４９）、藍藻類、及び他の生物にも見出された。グループＩテトラヒメナイントロン（ＵＳ６，０１５，７９４号；Ａｙｒｅら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、３５０７−３５１２）又はグループＩＩイントロン仲介性のトランススプライシング（Ｍｉｋｈｅｅｖａ＆Ｊａｒｒｅｌｌ、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７４８６−７４９０；ＵＳ５，４９８，５３１号）を基に操作したリボザイムを本発明に使用することができる。
【００６８】
本発明の好ましい態様を以下に詳しく記載する。
態様１：２つのベクターの同時形質転換
モジュラーベクターと呼ぶ前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子でプラスチドを同時に形質転換する（図５）。ベクター１（前記第１のＤＮＡ分子）は、プラストム領域に相同な１つの領域（前記第１相同領域）を含有する。目的配列の組込みは、このプラストム領域の下流で起こるべきである。この相同領域は、典型的には長さ５００〜１０００ｂｐである。所望により、より短い配列又はより長い配列を使用してもよい。ベクター１では、第１の目的配列がこの相同領域の下流に位置する。組込み配列の上流部分は、この相同領域の下流で第１の目的配列に含まれる。
【００６９】
ベクター２（前記第２のＤＮＡ分子）は、プラストム領域に相同な１つの領域（前記第２相同領域）を含有する。目的配列の組込みは、このプラストム領域の上流で起こるべきである。この相同領域も、典型的には長さ５００〜１０００ｂｐである。ベクター２では、第２の目的配列がこの相同領域の上流に位置する。組込み配列の下流部分は、この相同領域の上流で第２の目的配列に含まれる。
【００７０】
この好ましい態様において、２つのベクターの２つの相同領域は、プラストム上で互いに隣り合って存在し、介在配列を伴わない。ベクター１上の第１の目的配列の下流領域の配列セグメントは、ベクター２上の第２の目的配列の上流領域の配列セグメントに相同である。この相同配列セグメントは、重複領域とも呼ばれる。典型的には、この相同配列セグメントは、長さ５００〜１０００ｂｐである。本発明に記載の組換えイベントの後、この２つのベクターの同時形質転換は、相同領域として使用する２つのプラストム領域間に組み込まれる連続した組込み配列をもたらす。典型的には、それぞれのベクターは、組込み配列の一部のみを含有する。
【００７１】
より長い相同領域でもより短い相同領域でも組換えが起こることが示されているが、効率的な組換えには５００〜１０００ｂｐの長さで十分であり、標準のＰＣＲ手順で容易に増幅することができる。
【００７２】
形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子は、２つのベクター上の２つの断片として、即ち各ベクター上に１つの断片として位置づけることができる。マーカー遺伝子は、いくつかのやり方で２つの断片へ分断することができる。その分断の非限定的な例は：
ａ）プロモーターと５’−ＵＴＲをベクター１に位置づける。コード配列をベクター１及びベクター２の重複領域に位置づける。３’−ＵＴＲをベクター２に位置づける。
【００７３】
ｂ）プロモーター、５’−ＵＴＲ、及びコード配列の５’部分をベクター１に位置づける。コード配列の中央部分をベクター１及びベクター２の重複領域に位置づける。コード配列の３’部分と３’−ＵＴＲをベクター２に位置づける。
【００７４】
内因性プロモーターにより転写されるプラストム領域に組込み配列を組み込むようにベクターの相同領域を選択する場合、プロモーターをマーカー遺伝子の前に含める必要はない。ベクター１又はベクター２又はその両方の目的配列のいずれにも、マーカー遺伝子以外に、追加の目的遺伝子を含めてよい。
【００７５】
態様２：２つのベクター上の断片化遺伝子の同時形質転換
プラスチドと細菌は同様の発現系を有するため、プラスチド形質転換ベクターを大腸菌においてクローニングすることは、その遺伝子産物が大腸菌にとって有毒な遺伝子が関与する場合、時に困難であるか又は不可能ですらある。この問題は、態様１のマーカー遺伝子について記載されるように、このような遺伝子を２以上の断片へ分断することによって解決する。従って、有毒な遺伝子は、不完全な遺伝子として、又は非毒性の断片として、各ベクター上に存在する。次いで、態様１に記載のように、プラスチドを２つのモジュラーベクターで同時に形質転換すると、そのとき、機能上完全な目的遺伝子がプラスチド内に再構築される。
【００７６】
態様３：３つのベクターの同時形質転換
いくつかの目的では、安定なプラスチド形質転換に必要な組込み配列を３つのベクターに分配することが有利である（図６）。非限定的な例は：非常に長い組込み配列（例えば遺伝子クラスター）の挿入、形質転換ベクターの連続構築、等である。
【００７７】
ベクター１は、プラストム領域に相同な第１領域とその下流に第１の目的配列を含有する。組込み配列の組込みは、このプラストム領域の下流で起こるべきである。第１相同配列の下流には、組込み配列の上流部分が第１の目的配列中に存在する。
【００７８】
ベクター２は、プラストム領域に相同な第２領域と第２の目的配列を含有する。組込み配列の組込みは、このプラストム領域の上流で起こるべきである。この相同配列の上流には、組込み配列の下流部分が第２の目的配列中に存在する。態様１に記載したように、相同配列は典型的には長さ５００〜１０００ｂｐであるが、この長さに限定されない。
【００７９】
ベクター３は、第３の目的配列を含有し、その上流部分はベクター１の目的配列に相同であり、下流部分は、ベクター２の目的配列に相同である。ベクター３は、プラストムへ組み込むべき完全な組込み配列を含有してもしなくてもよい。
【００８０】
態様４：選択可能マーカーを含まないトランスプラストミック植物
選択可能マーカー遺伝子が組込みのために設計された領域の外側に位置する場合、マーカー遺伝子は、完全なベクター組込み中間体中に存在するであろう（図７）。選択圧を解除するとき、マーカー遺伝子はベクター配列とともに切除される。相同プラスチド配列と目的配列は、態様１に記載のように配置する。態様１とは反対に、マーカー遺伝子は目的配列中に含まれない。その代わり、それはベクター１又はベクター２のどこかに位置する。好ましくは、ベクター配列によって、相同領域と目的配列から成る単位からマーカー遺伝子を分離する。好ましくは、ベクター１とベクター２は、それぞれこの形式でマーカー遺伝子を含有し、それによってこれらのマーカー遺伝子は異なる（例えば、ａａｄＡとａｐｈＡ６）。次いで、２つのそれぞれの抗生物質、例えば、５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシン＋２５ｍｇ／ｌのカナマイシンの組合せを使用することによって選択を行う。あるいは、マーカー遺伝子の断片をベクター１に位置づけ、マーカー遺伝子の他の断片をベクター２に位置づけ、それによって両方の断片を上記に定義した単位の外側にする。このとき、両方の断片が相同セグメント（重複領域）を共有し、両方の断片の組換えにより、両ベクターのプラストムへの挿入後に完全な機能性マーカー遺伝子を組み立てることを可能にすることが先行条件である。可能な組換えイベントのごく一部だけが機能性マーカーを生ずるため、選択圧により、前記機能性マーカーを含有する中間体が維持される。選択圧が除かれるとき、マーカー遺伝子は、残存するベクター配列とともに、反復ベクター配列による組換えによって除去されるだろう。
【００８１】
態様５：選択可能マーカーを含まないトランスプラストミック植物
第１のＤＮＡ分子上の耐性マーカー遺伝子の５’と第２のＤＮＡ分子上の耐性マーカー遺伝子の３’に相同配列因子を含有する一方で、前記第１のＤＮＡ分子及び前記第２のＤＮＡ分子上に耐性マーカー遺伝子又はその断片が存在するモジュラーベクターを使用することによって、耐性マーカーを含まない植物を入手することができる。図４に記載の組換えイベントの後で、２つの相同配列因子が隣接した耐性マーカー遺伝子をプラストムへ挿入する。選択マーカーの挿入配列中での存在は、選択圧によって維持することができる。この植物材料を阻害剤を含まない培地へ移したとき、耐性マーカー遺伝子を維持するための選択圧が解除される。２つの相同配列用により仲介されるさらなる組換えイベントにより、選択マーカー遺伝子の切除をもたらすことができる。結果として、最終植物は、形質転換体の選択に使用した耐性マーカー遺伝子を担わない。
【００８２】
本発明の方法は、好ましくは、裸子植物（マツ、トウヒ及びモミ、等のような）と被子植物が含まれる作物で行う。被子植物がより好ましい。被子植物には、トウモロコシ、小麦、大麦、コメ、ライ麦、ライコムギ、サトウモロコシ、サトウキビ、アスパラガス、ニンニク、ヤシの木、等のような単子葉植物と、タバコ、ジャガイモ、トマト、ナタネ、サトウダイコン、カボチャ、キュウリ、メロン、コショウ、柑橘類、ナス、ブドウ、ヒマワリ、ダイズ、アルファルファ、ワタ、等のような双子葉植物が含まれる。ナス科植物（例えばジャガイモ、トマト、コショウ、ナス、タバコ）が最も好ましい。
【００８３】
本発明に使用する分子生物学の方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「分子クローニング」とＡｕｓｕｂｅｌら（１９９９）「分子生物学の簡略プロトコール」に記載されている。
【実施例１】
【００８４】
完全なベクターの（１つのフランクを介した）プラスチドゲノムへの組込みのＰＣＲ解析
プラスチド形質転換ベクター：ｐＫＣＺ
ｐＫＣＺは、慣用のプラスチド形質転換ベクターであり、選択マーカーが相同的組換えに使用する２つのフランクの間でクローニングされる。タバコのプラスチドゲノムの逆反復領域中のｔｒｎＲとｔｒｎＮとの間で中間挿入をするように、ベクターを設計する（Ｚｏｕ、２００１）。ｐＫＣＺは、相同的組換えのための２つのフランキング配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ０００４４のＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのプラストム配列：３１１０６〜１３２２７７と１３２２７８〜１３３３９６に対応）と、１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーターの制御下にあるａａｄＡプラスチド発現カセット（Ｋｏｏｐら、１９９６）を含む。このプラスミド構築体の概略図を図８に示す。
【００８５】
１次形質転換体の産生とそれに続くホモプラストミック株の選択
粒子銃仲介性のプラスチド形質転換とそれに続く選択をＭｕｈｌｂａｕｅｒら、２００２に記載のように行なった。形質転換体の選択は、ａａｄＡ遺伝子産物により付与される、抗生物質スペクチノマイシン／ストレプトマイシンへの耐性に基づいている。形質転換されたプラスチドゲノムを増幅して、野生型ゲノムを消失させるために、１次形質転換体（サイクル０）を、スペクチノマイシンを含有する選択培地でのさらに数ラウンドの再生（小葉の外植片より）に処した（ここでは、サイクル−Ｉ、サイクル−ＩＩ、等と呼称する）。
【００８６】
１次形質転換体のＰＣＲによる解析
ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）で単離した全ＤＮＡを使用して、ＰＣＲによりプラスチド形質転換体（サイクル−０）を同定した。ａａｄＡ遺伝子の存在を判定するために、プライマーのｏＳＨ８１（５’−ＣＴＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＧＴＣ−３’）及びｏＦＣＨ６０（５’−ＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣ−３’）を使用した。ＰＣＲプログラムは以下の通りである：９４℃で３分、１サイクル；９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で２分、３０サイクル；７２℃での最終伸張、１０分。結果は、解析した５４株のうち４８株（６つは衝突された葉）に予測される５０４ｂｐの増幅産物があることを示した。ａａｄＡカセットがタバコのプラストム内に正確に組み込まれていることを証明するために、プライマーのｏＳＨ５８（５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’）及びｏＦＣＨ６０（５’−ＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣ−３’）を使用した。プライマーのｏＳＨ５８は、タバコプラストム中のｐＫＣＺの右フランクの外側（下流）に位置しており、ｏＦＣＨ６０との組合せでのみ、ａａｄＡ発現カセットの逆反復中のｔｒｎＲとｔｒｎＮの間での組込み時に２１０６ｂｐの予測産物を与えることができる。ＰＣＲプログラムは以下の通りである：９４℃で５分、１サイクル；９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で３．５分、３５サイクル；７２℃で７分間の最終伸張。ａａｄＡ  ＰＣＲ陽性の４８株すべてにおいて予測される２１０６ｂｐの右フランクａａｄＡ産物が示された。このサイクル−０形質転換体のうち１０個（１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、２：１、２：４、２：５、２：６及び２：７）をさらなる解析のために選択した。
【００８７】
完全な組込み配列を含有する形質転換体のＰＣＲ解析
通常、安定なプラスチド形質転換体の産生は、形質転換する分子の左フランク及び右フランクとプラストムとの間で起こる２つの同時組換えイベントを介して起こると考えられている（図１に図示するように）。代替機序を図２に提示する。ここでは、ベクターの完全な組込みが、プラストムとの１つのフランクのみ（左又は右のいずれか）での組換えを介して最初に起こり、仮説の不安定中間体を生ずる。次いで、後続の追加の組換えイベントがこの分子中の重複フランク間で起こり、野生型の状態か又は安定に組み込まれたａａｄＡカセットのいずれかを産生する。この可能性を検証するために、プライマーのｏＳＨ３（５’−ＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧ−３’）及びｏＳＨ５８（５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’）を使用してＰＣＲを実施した。プライマーのｏＳＨ３は、ｐＫＣＺ（ｐＵＣ１８）のベクター骨格内に位置し、プライマーのｏＳＨ５８は、タバコプラストム中のｐＫＣＺの右フランクの外側（下流）に位置する。図２に示すように、２６３８ｂｐの産物は、完全なｐＫＣＺ組込みが起こったときにのみこれら２つのプライマーで得ることができる。ｏＳＨ３の結合部位が存在しないため、野生型プラストム断片（左フランク及び右フランクを含む）からは予測サイズのＰＣＲ産物は得られない。ＰＣＲプログラムは以下の通りである：９４℃で５分、１サイクル；９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で３．５分、３５サイクル；７２℃で７分間の最終伸張。解析した１０個のサイクル−０形質転換体のうち９つが、これらの株内のプラスチドゲノムへのｐＫＣＺの完全な組込みに一致する、２．６ｋｂのＰＣＲ産物を示した（図３Ａ）。野生型の対照や試料１：１には、正確なサイズの産物は観察されなかった。ｐＫＣＺの完全な組込みは不安定な中間体の形成をもたらすため、時間が増すとともに、この分子中の重複フランク間のさらなる組換えイベントにより、野生型状態又は安定組込みａａｄＡカセットのいずれかをもたらすと予測される。サイクルＩ及びサイクルＩＩから調製したＤＮＡ試料のように、植物材料をプライマーのｏＳＨ３及びｏＳＨ５８を用いたＰＣＲで解析した。図２に提示するモデルが正確であれば、２６３８ｂｐのバンドをプライマーのｏＳＨ３及びｏＳＨ５８で増幅する確率は、選択の際の再生サイクルごとに低下するはずである。上記の結果は、予測サイズの多量のＰＣＲ産物を与えたのは、解析した１０個のサイクルＩ株のうち５つのみであったため、これがまさにそうであることを示唆する（図３Ｂ）。さらに、サイクルＩＩでは、予測される２６３８ｂｐバンドの明瞭な増幅を示す株の数がさらに減少した。
【００８８】
図２に提示するモデルは、完全なベクター組込みについて陰性であるすべてのサイクルＩＩ株が依然として、先に記載した分子再配列により安定に組み込まれたａａｄＡカセットに一致するＰＣＲシグナルを示すべきことも予測する。ａａｄＡカセットのタバコプラストム内の組込みを証明するために、プライマーのｏＳＨ５８（５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’）及びｏＦＣＨ６０（５’−ＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣ−３’）を使用した。ＰＣＲプログラムは以下の通りである：９４℃で５分、１サイクル；９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で３．５分、３５サイクル；７２℃で７分間の最終伸張。１０個のサイクルＩＩ形質転換体のすべてが予測される２１０６ｂｐの右フランクａａｄＡ産物を示し（図３Ｄ）、これは図２に示すシナリオに一致した。
【実施例２】
【００８９】
重複モジュラーベクターの構築
モジュラーベクターのｐＩＣＦ７４２（図９）は、タバコのプラストムに相同な右フランキング領域、タバコｒｐｌ３２プロモーター、タバコｐｓｂＡ−５’−ＵＴＲ及びａａｄＡマーカー遺伝子を含む。
【００９０】
右フランキング領域は、５’端にＳａｃＩ認識部位、３’端にＥｃｏＲＩ認識部位を導入する、修飾プライマーの５’−ＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＡＡＴＧ−３’及び５’−ＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＧＧＣＧＡＧＡＣ−３’を用いて、タバコのプラスチドＤＮＡ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプラストムのｂｐ１３２２７９〜ｂｐ１３３３９０）より増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＵＣ１８プラスミドへ連結した。ｒｐｌ３２プロモーターは、５’端にＰｓｔＩ認識部位、３’端にＢａｍＨＩ認識部位を導入する、修飾プライマーの５’−ＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＣＡＡＡＴＡＧＣＣ−３’及び５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧ−３’を用いて、タバコのプラスチドＤＮＡ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプラストムのｂｐ１１３９１７〜ｂｐ１１４０５５）より増幅した。ＰＣＲ産物を、修飾プライマーの５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧ−３’及び５’−ＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＣ−３’を用いて再増幅し、５’端にＳａｃＩ認識部位を含有する新たなマルチクローニング部位を導入した。生じたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化し、右フランキング領域を含有する、同様に制限処理したｐＵＣ１８ベクターへ連結した。ｐｓｂＡ−５’−ＵＴＲは、５’端にＢａｍＨＩ認識部位、３’端にＮｃｏＩ認識部位を導入する、修飾プライマーの５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴ−３’及び５’−ＴＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＡＴＣＴＴＧＧＴＴＴＡＴＴ−３’を用いて、タバコのプラスチドＤＮＡ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプラストムのｂｐ１５９８〜ｂｐ１６８０に相補的）より増幅した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化した。大腸菌由来のａａｄＡ配列を、５’端にＮｃｏＩ認識部位を導入する修飾プライマーの５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧ−３’及び５’−ＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＡＧＴＧＡＴＣＴＣ−３’を用いて、プラスミドｐＦａａｄＡＩＩ（Ｋｏｏｐら、１９９６）より増幅した。ＰＣＲ産物を、プライマーの５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧ−３’及び５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＧＣＣ−３’を用いて再増幅し、３’端にＨｉｓ−タグとＸｂａＩ認識部位を導入した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化した。右フランキング領域及びｒｐｌ３２プロモーターを含有するｐＵＣ１８ベクターをＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、消化したｐｓｂＡ−５’−ＵＴＲと消化したａａｄＡとともに連結した。生じたプラスミドをＸｂａＩ及びＮｄｅＩで消化し、残存するｐＵＣ１８マルチクローニング部位を除去した。この消化したプラスミドをアガロースゲルで精製した。４６００ｂｐのバンドを抽出して精製し、両端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで充填した。次いで、このプラスミドを再連結して、ｐＩＣＦ７４２を得た。
【００９１】
モジュラーベクターのｐＩＣＦ７４３（図１０）は、タバコのプラストムに相同な左フランキング領域、大腸菌由来αオペロン・ターミネーター、及びａａｄＡマーカー遺伝子を含む。
【００９２】
ＰａｅＩとＳａｐＩとの間にあるｐＵＣ１８のマルチクローニング部位を除去し、（５’→３’）ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ及びＮｃｏＩから成る新たなマルチクローニング部位に置き換えた。左フランキング領域を、５’端にＢａｍＨＩ認識部位、３’端にＫｐｎＩ認識部位を導入する、修飾プライマーの５’−ＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＧＣＡＴＣＧＡＡＡＧＡＧ−３’及び５’−ＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＴＣＧＧＧＡＧＡＡＴＣ−３’を用いて、タバコのプラスチドＤＮＡ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプラストムのｂｐ１３１１０６〜ｂｐ１３２２７７）より増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、新たなマルチクローニング部位があるｐＵＣ１８プラスミドへ連結し、これを同じ酵素で消化した。生じたプラスミドをＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化した。この消化したベクターを、大腸菌のαオペロン・ターミネーターをコードする、１本鎖オリゴヌクレオチドの５’−ＧＡＴＧＴＣＴＡＧＡＡＧＣＡＡＣＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＣＣＧＴＡＧＴＡＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣ−３’と連結した。この相補鎖をＴａｑポリメラーゼで充填し、ＸｂａＩで消化して再連結した。生じたベクターをＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、ｐＩＣＦ７４２由来のａａｄＡ  ＰＣＲ産物と連結して、ベクターｐＩＣＦ７４３を得た。
【００９３】
１２．５μｇのベクターｐＩＣＦ７４２と１２．５μｇのベクターｐＩＣＦ７４３を混合し、金粒子上にロードして、Ｍｕｈｌｂａｕｅｒら、２００２に記載のような粒子衝突によりＮ．ｔａｂａｃｕｍプラスチドへ形質転換した。形質転換体の選択は、ａａｄＡ遺伝子産物により付与される、抗生物質のスペクチノマイシン／ストレプトマイシンへの耐性に基づいた。形質転換したプラスチドゲノムを増幅して、野生型ゲノムを消失させるために、１次形質転換体（サイクル０）を、スペクチノマイシンを含有する選択培地でのさらに数ラウンドの再生（小葉の外植片より）に処した（ここでは、サイクルＩ、サイクルＩＩ、等と呼称する）。サイクル０からの２つのスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性カルスをＰＣＲで解析し、形質転換を証明した。３つの異なるプライマー対を使用した（図１１）：
Ａ）  ５’−ＣＡＧＡＣＴＡＡＴＡＣＣＡＡＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプラストムの左フランキング領域の外側で結合）及び５’−ＣＴＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＧＴＣ−３’（マーカー遺伝子で結合）
Ｂ）  ５’−ＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣ−３’（マーカー遺伝子で結合）及び５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプラストムの右フランキング領域の外側で結合）
Ｃ）  ５’−ＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＴＣＴＡＧ−３’（左フランキング領域で結合）及び５’−ＡＣＡＣＡＴＡＧＴＡＴＧＣＣＣＧＧＴＣ−３’（右フランキング領域で結合）。
【００９４】
３種のプライマーすべてでＰＣＲが増幅産物を示し、両方のベクターの組込みが１つの連続した組込み領域をもたらすことを証明した（図１２）。算出された増幅産物のサイズは、２１３９ｂｐ（Ａ）、２０３５ｂｐ（Ｂ）、及び１４５０ｂｐ（Ｃ）であり、これは観測サイズによく一致する。注目すべきことに、プライマー対  Ｃでは野生型シグナル（２９０ｂｐ）が見えず、このような初期段階にあっても、非形質転換体が存在しないことを示唆している。
【００９５】
次いで、サイクル０及びサイクルＩからの５つのスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性カルスを、３つの独立したサザンブロット実験において解析した（図１３）。２つの株が完全に正確な組込みａａｄＡ遺伝子のみの存在を示した（株１と株３：Ｂｓｐ１２０Ｉ制限処理では３．８ｋｂ、ＡｃｃＩＩＩ制限処理では６．７ｋｂ）。１つの株（株２）は、組込みａａｄＡ遺伝子と、中間の組換えに対応する追加のシグナル（Ｂｓｐ１２０Ｉ制限処理では４．９ｋｂ、ＡｃｃＩＩＩ制限処理では３．５ｋｂ）を示した。２つの株（株４と株５）は、中間の組換えシグナル（Ｂｓｐ１２０Ｉ制限処理で４．９ｋｂ）と野生型シグナル（Ｂｓｐ１２０Ｉ制限処理で２．６ｋｂ）を示した。この結果は、解析した５株のうち２株がごく短時間のうちにホモプラストミック組込み状態に達したことを示す。
【実施例３】
【００９６】
重複モジュラー翻訳ベースベクターの構築
翻訳ベースのベクターは自身のプロモーター要素を含有しないが、所望の組込み部位の上流にあるプラストムの内因性プロモーター要素に依存する。
【００９７】
本実施例は、２つのモジュラーベクター（ｐＩＣＦ１０３３及びｐＩＣＦ１０３４）を提示するが、これは、組合せにおいて、大腸菌での高い発現レベルのために数回の試みにもかかわらず構築し得なかった翻訳ベースベクター（ｐＩＣＦ９８６）の代わりになる。使用したリボソーム結合部位（Ｔ７Ｇ１０）は、大腸菌だけでなくプラスチドにあっても高発現を仲介する。このベクターはプラスチドのプロモーター要素を含有しないが、相同的組換えに必要な左フランキング領域は、大腸菌においてプロモーター活性を有する配列因子を含有する。
【００９８】
ｐＩＣＦ９８６（図１４）とは反対に、２つのモジュラーベクター、ｐＩＣＦ１０３３（図１５）及びｐＩＣＦ１０３４（図１６）は、問題なく構築することができた。左フランキング領域を含有するモジュラーベクター（ｐＩＣＦ１０３３）は、発現される完全な遺伝子を含有しないため、このモジュラーベクターは、問題の多い大腸菌での高発現を回避する。
【００９９】
モジュラーベクターｐＩＣＦ１０３３は、タバコプラストムに相同な左フランキング領域、Ｔ７ファージ由来の遺伝子１０のリボソーム結合部位、及びｕｉｄＡレポーター遺伝子のＮ末端部分を含有する。
【０１００】
左フランキング領域は、５’端にＢｓｐ１２０Ｉ認識部位、３’端にＰｓｔＩ認識部位を導入する、修飾プライマーの５’−ＴＡＴＡＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＡＧＧＴＴＴＡＣＡＴＴＴＴＴＡＣＣＣ−３’及び５’−ＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＧ−３’を用いて、タバコのプラスチドＤＮＡ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  プラストムのｂｐ５３４〜ｂｐ１３３６に相補的）より増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、Ｂｓｐ１２０Ｉ及びＰｓｔＩで消化し、ｐＩＣＦ５００１ベクターへ連結し、これを同じ酵素で消化した。プラスミドｐＩＣＦ５００１は、改変マルチクローニング部位：５’−ＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＴＧＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴ−３’を含有するｐＵＣ１８誘導体である。この連結は、左フランキング領域を有するｐＩＣＦ５００１を生ずる。Ｔ７ファージ由来の遺伝子１０のリボソーム結合部位と翻訳活性を高めるＮ末端融合タグは、左フランキング領域を有するｐＩＣＦ５００１のＰｓｔＩ及びＮｃｏＩ部位の間に、合成ヌクレオチド配列：５’−ＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＧ−３’を挿入することによって導入した。生じたベクターをＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ｕｉｄＡのＮ末端断片は、５’端にＮｃｏＩ認識部位、３’端にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を導入する、修飾プライマーの５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡ−３’及び５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＴＴＣＴＴＴＣＧＧＣＴＴＧＴＴＧＣＣＣ−３’を用いて、大腸菌ＤＮＡより増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次いで、ＰＣＲ産物をベクターへ挿入し、同じ酵素で消化して、ｐＩＣＦ１０３３を得た。
【０１０１】
モジュラーベクターｐＩＣＦ１０３４は、Ｔ７ファージ由来の遺伝子１０のリボソーム結合部位、完全なｕｉｄＡレポーター遺伝子、第２の合成リボソーム結合部位、ａａｄＡマーカー遺伝子、及び右フランキング領域を含有する。
【０１０２】
Ｔ７ファージ由来の遺伝子１０のリボソーム結合部位は、上記のようにｐＩＣＦ５００１へ導入した。修飾プライマーの５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡ−３’及び５’−ＣＴＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧ−３’を使用して完全なｕｉｄＡ遺伝子を増幅する一方で、５’端にＮｃｏＩ認識部位、３’端にＫｐｎＩ認識部位を導入した。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで消化し、Ｔ７リボソーム結合部位を含有するベクターへ連結し、同じ酵素で消化した。大腸菌由来のａａｄＡ配列を、修飾プライマーの５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＴＴＡＴＣＧＣＣＧ−３’及び５’−ＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＡＧＴＧＡＴＣＴＣ−３’を用いて、プラスミドｐＦａａｄＡＩＩ（Ｋｏｏｐら、１９９６）より増幅した。ＰＣＲ産物を、修飾プライマーの５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＴＴＧＴＡＧＧＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣ−３’及び５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＴＧＣＣ−３’を用いて再増幅し、３’端にＨｉｓ−タグとＸｂａＩ認識部位を、５’端に合成リボソーム結合部位とＫｐｎＩ認識部位を導入した。ＰＣＲ産物を精製し、ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化した。右フランキング領域を、５’端にＸｂａＩ認識部位を導入する修飾プライマーの５’−ＣＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴＣＧＴＣＴＡＴＡＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＧ−３’及びタバコプラストム中のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の後方に結合する正確なプライマー：５’−ＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＧＣＴＴＴＧＧ−３’を用いて、タバコのプラスチドＤＮＡ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍプラストムのｂｐ１５５３７０〜ｂｐ５３３に相補的）より増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。Ｔ７リボソーム結合部位及びｕｉｄＡ遺伝子を含有するベクターをＫｐｎＩ及びＨｉｄＩＩＩで消化してから、２つのＰＣＲ産物（それぞれ、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩとＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化）と連結し、ベクターｐＩＣＦ１０３４を得た。
【０１０３】
１２．５μｇのベクターｐＩＣＦ１０３３と１２．５μｇのベクターｐＩＣＦ１０３４を混合し、金粒子上にロードして、Ｍｕｈｌｂａｕｅｒら、２００２に記載のような粒子衝突によりＮ．ｔａｂａｃｕｍプラスチドへ形質転換した。形質転換体の選択は、ａａｄＡ遺伝子産物により付与される、抗生物質のスペクチノマイシン／ストレプトマイシンへの耐性に基づいた。形質転換したプラスチドゲノムを増幅して、野生型ゲノムを消失させるために、１次形質転換体（サイクル０）を、スペクチノマイシンを含有する選択培地でのさらに数ラウンドの再生（小葉の外植片より）に処した（ここでは、サイクルＩ、サイクルＩＩ、等と呼称する）。タバコのプラストム内に１つの連続した組込み領域を生ずる両方のベクターの正確な組込みをＰＣＲで確認した。
【実施例４】
【０１０４】
モジュラーベクターを使用する、Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍのプラスチド形質転換
モジュラーベクター系は、タバコだけでなく、他の重要な作物種でも使用することができる。本実施例は、実施例２に記載のベクターを使用する、プロトプラスト由来ミクロコロニーの粒子衝突後の、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）における効率的なプラスチド形質転換を例示する。タバコとジャガイモのプラストム間の高度の相同性により、タバコのフランキング配列を含有するベクターをジャガイモにも使用することができる。
【０１０５】
Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  ｃｖ．Ｗａｌｌｉの植物を、無菌苗条培養（２０±１℃、１６時間／日、光強度：７５±１０μモル／ｍ２／秒）としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで生長させた。茎頂（ほぼ２ｃｍの長さ）をガラス管（２．５×２０ｃｍ）中のＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６２）へ移すことによって、２ヶ月ごとに新たな培養を開始した。３〜４週齢の植物から十分に伸長した若葉を選択し、プロトプラストの単離に使用した。葉を小刀で１ｍｍ切片へ切断し、１０ｍｌのＭＭＭ−５５０培地においてプレ原形質分離（preplasmolysed）させた。ＭＭＭ−５５０培地は、４．０６６ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．９５２ｇ／ｌの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、及び約８６ｇ／ｌのマンニトールを含有する（５５０ｍＯｓ及びｐＨ５．８へ調整）。暗所で１時間のインキュベーション後、ＭＭＭ−５５０を除去し、０．４％（ｗ／ｖ）マセロザイム  Ｒ１０及び０．４％セルラーゼ  Ｒ１０を含有する、１０ｍｌのＭＭＳ−５５０培地に置き換えた。ＭＭＳ−５５０培地は、４．０６６ｇ／ｌのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．９５２ｇ／ｌのＭＥＳ、及び約１５０ｇ／ｌのスクロースを含有する（５５０ｍＯｓ及びｐＨ５．８へ調整）。葉の外植片を、酵素溶液中、暗所で２５℃１６時間、振盪ぜずにインキュベートした。翌日、消化物を１００μｍの篩いを通して遠心管へ濾過し、２ｍｌのＭＭＭ−５５０培地を慎重に重層して、遠心分離した（１０分、７０×ｇ）。界面のバンドよりインタクトなプロトプラストを採取し、１０ｍｌのジャガイモ・プロトプラスト培地に再懸濁させることによって１回洗浄し、続いて遠心分離した（１０分、５０×ｇ）。プロトプラスト培地は、１３３．７５ｍｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ、９５０ｍｇ／ｌのＫＮＯ３、２２０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１８５ｍｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、８５ｍｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、Ｂ５微量元素（Ｇａｍｂｏｒｇら、１９６８）、ＭＳ  Ｆｅ−ＥＤＴＡ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６２）、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、１００ｍｇ／ｌのグルタミン、１００ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、１ｍｇ／ｌのニコチン酸、１０ｍｇ／ｌの塩酸チアミン、１ｍｇ／ｌの塩酸ピリドキシン、２５０ｍｇ／ｌのキシロース、９７５ｍｇ／ｌのＭＥＳ、２ｍｇ／ｌの酢酸ナフタレン（ＮＡＡ）、０．２ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、０．５ｍｇ／ｌの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、及び約９４ｇ／ｌのグルコースを含有する（５５０ｍＯｓ及びｐＨ５．８へ調整）。プロトプラストを計数し、プロトプラスト培地において必要とされる最終プレート培養密度の２倍（２．０×１０５／ｍｌ）で再懸濁し、ＭＭＭ−５５０培地中に調製した等量の１．２％（ｗ／ｖ）アルギン酸と混合した。Ｄｏｖｚｈｅｎｋｏら（１９９８）に記載のように、ポリプロピレングリッド中に薄層アルギン酸塩培養物を作製した。このアルギン酸塩マトリックスの固化に続き、２ｍｌのプロトプラスト培地を含有する５ｃｍペトリ皿においてグリッドを培養した。プロトプラストを暗所（２６±１℃）で１日インキュベートした後、さらなる生育のために標準の培養室条件（２６±１���、１６時間／日、光強度：７５±１０μモル／ｍ２／秒）へ移した。
【０１０６】
埋め込んでから１２〜１５日後、ジャガイモの微小コロニー（ほぼ８つの細胞）を含有するグリッドを、０．４％（ｗ／ｖ）Ｇｅｌｒｉｔｅで固化したＳＨ−１培地を含有する９ｃｍの皿へ移した。ＳＨ−１培地は、２６７．５ｍｇ／ｌのＮＨ４Ｃｌ、１９００ｍｇ／ｌのＫＮＯ３、４４０ｍｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３７０ｍｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１７０ｍｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、ＭＳ微量元素及びＦｅ−ＥＤＴＡ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６２）、Ｎｉｔｓｃｈビタミン（Ｎｉｔｓｃｈ及びＮｉｔｓｃｈ、１９６９）、４０ｍｇ／ｌの硫酸アデニン、１００ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、９７５ｍｇ／ｌのＭＥＳ、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ｌのＢＡＰ、１０ｇ／ｌのスクロース、及び５０ｇ／ｌのマンニトールを含有する（ｐＨ５．８へ調整）。固形培地でのプレート培養から２日後、Ｍｕｈｌｂａｕｅｒら（２００２）に記載の粒子コーティング及び衝突条件を使用して、プロトプラスト由来コロニーを、１２．５μｇのベクターｐＩＣＦ７４２と１２．５μｇのベクターｐＩＣＦ７４３をロードした金のアリコートと衝突させた。モジュラーベクターのｐＩＣＦ７４２及びｐＩＣＦ７４３の構築は、すでに記載した（実施例２）。形質転換体の選択は、ａａｄＡ遺伝子産物により付与される、抗生物質スペクチノマイシンへの耐性に基づいた。衝突から１日後、Ｇｅｌｒｉｔｅ固化ＳＨ−１培地＋５００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含有する皿へグリッドを移し、３週ごとに新鮮な選択皿へ継代培養した。プラスチド形質転換体は、８〜１２週の選択後、緑色微小コロニーとして観察された（非形質転換組織は、スペクチノマイシン含有ＳＨ−１培地上で白くなる）。個々のコロニー（ほぼ直径１ｍｍ）を、ＳＨ−１培地＋１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含有する５ｃｍ皿へ移した。再生のために、１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含有する、０．４％（ｗ／ｖ）Ｇｅｌｒｉｔｅで固化したＳＨ−２培地へカルス（ほぼ直径５ｍｍ）を移した。ＳＨ−２培地は、ＮＡＡを０．１ｍｇ／ｌのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）に換え、ＢＡＰを１ｍｇ／ｌのゼアチンに換えて、マンニトール含量を５０ｇ／ｌから３６ｇ／ｌへ減らす以外は、ＳＨ−１培地（上記参照）と同一である。ＳＨ−２培地で６〜８週の培養後、再生カルスより苗条を取り出し、根付けとさらなる生育のために、抗生物質を含まないＭＳ培地へ移した。
【０１０７】
スペクチノマイシン耐性のジャガイモ苗条をＰＣＲで解析し、正確なプラスチド形質転換を証明した。タバコ形質転換体の解析に記載のように（実施例２）、３つの異なるプライマー対を使用した：
Ａ）  ５’−ＣＡＧＡＣＴＡＡＴＡＣＣＡＡＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍプラストム内の左フランキング領域の外側で結合）及び５’−ＣＴＡＴＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＧＴＣ−３’（ａａｄＡマーカー遺伝子内で結合）
Ｂ）  ５’−ＣＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＣＧＣＣ−３’（ａａｄＡマーカー遺伝子内で結合）及び５’−ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍプラストム内の右フランキング領域の外側で結合）
Ｃ）  ５’−ＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＣＧＧＴＣＴＡＧ−３’（左フランキング領域内で結合）及び５’−ＡＣＡＣＡＴＡＧＴＡＴＧＣＣＣＧＧＴＣ−３’（右フランキング領域内で結合）。
【０１０８】
上記の３つのプライマー対を使用するＰＣＲにより、両方のベクターの正確な組込みがジャガイモ・プラストム内に１つの連続した組込み領域をもたらすことが示された。
参考文献：
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】慣用のプラスチド形質転換における組換えイベントの概略図：形質転換ベクター配列のプラストムへの組込みは、２つの相同フランクにより仲介される２つの相同的組換えイベントにより起こる。プラストムに由来する対応の野生型領域がプラスミドベクターへ移動する。
【図２】我々の観察に基づいた、慣用のプラスチド形質転換における組換えイベントの想定モデル：左フランク又は右フランクを介した第１の相同的組換えにより、形質転換ベクター全体の一過性（可逆性）の挿入をもたらし、それぞれのフランキング配列の重複を生ずる。右フランク又は左フランクを介した第２の相同的組換えにより、それぞれ、重複配列の切除をもたらす。プラストム由来の対応する野生型領域は、プラスミドベクターへ移動する。
【図３】３回までの再生サイクル後にｐＫＣＺで形質転換したタバコ形質転換体のＰＣＲ解析（参照実施例）。ゲルＡ（サイクル０）、ゲルＢ（サイクルＩ）、ゲルＣ（サイクルＩＩ）及びゲルＤ（サイクルＩＩＩ）は、完全なｐＫＣＺ組込みを検出するのに特異的なプライマー：ｏＳＨ３及びｏＳＨ５８を使用して入手した産物を示す。ゲルＥは、ｏＦＣＨ６０とｏＳＨ５８のプライマーの組合わせを用いて、サイクルＩＩＩラインのすべてが完全なベクター挿入イベントを担うわけではないが、依然としてａａｄＡ選択カセットを含有することを示めす。
【図４】本発明のモジュラーベクター（ベクター１及びベクター２）を使用することによる組換えイベントの想定モデル。第１の組込み工程をベクター１又はベクター２のいずれかについて示す。次の第２の組込み工程は、ベクター２をすでに含有するプラストム領域へのベクター１（右側）の組込みについてのみ示す。ベクター１をすでに含有するプラストム領域へのベクター２の第２の組込み工程（図示していない）も、類似した形式で進行する。両ベクターの完全なベクター組込み後、相同の反復配列の欠失イベントにより最終形質転換プラストム（下部）を得る。
【図５】相同的組換えによるプラストム組込みを指令するベクター１（ｈｐｒ１）及びベクター２（ｈｐｒ２）の相同領域を示すスキーム。ｈｐｒは、相同プラストム領域を表す。さらに、両ベクター中の目的配列を示す（白いボックス＋縦線ボックス）。縦線ボックス（重複領域をｏｌｒで示す）は、前記第２の目的配列（ｓｏｉ）の配列セグメントに相同な前記第１の目的配列（ｓｏｉ）の配列セグメントを表す。これらの相同配列セグメント又は重複領域により、ベクター２及びベクター１のプラストム中での組換えが可能になる。目的配列内で、相同配列セグメントは、ｈｐｒ配列に対して好ましくは遠位に位置づけられる。下部に、組込み配列を含有する、入手されるトランスプラストムを示す。
【図６】本発明の前記第１ベクター及び前記第２ベクターに加えて、さらなるベクター（ベクター３）の使用を示すスキーム。ベクター３は、プラストム組込み用の相同領域を含有する必要はない。ベクター３は、２つの相同セグメント又は重複領域（縦線ボックス）を有する。一方の重複領域（ｏｌｒ１）は、ベクター１の相同配列セグメントと相同性を共有する。他方の重複領域（ｏｌｒ２）は、ベクター２の相同配列セグメントと相同性を共有する。ｏｌｒ１とｏｌｒ２は、好ましくは、同一でない。ｈｐｒ：相同プラストム領域；ｓｏｉ：目的配列；ｏｌｒ：重複領域。
【図７】マーカーを含まないトランスプラストミック植物の産生を示すスキーム。ベクター２は、相同領域と目的配列から成る配列単位の外側に選択可能マーカー遺伝子を含有する。ベクター１及びベクター２の組込みは、ベクター１及びベクター２の挿入後にトランスプラストムをもたらし、好適な抗生物質を一過的に適用することによってこれを選択することができる。反復配列を介した組換えは、このマーカー遺伝子を含めた配列の切除をもたらす。ｈｐｒ：相同プラストム領域；ｓｏｉ：目的配列；ｏｌｒ：重複領域。
【図８】慣用のプラスチド形質転換ベクター、ｐＫＣＺ。ａａｄＡ：アミノグリコシド・アデニル・トランスフェラーゼ；ＩＮＳＬ：ｂｐ１３１１０６〜１３２２７７由来のＮ．ｔａｂａｃｕｍプラストム配列；ＩＮＳＲ：ｂｐ１３２２７８〜１３３３９６由来のＮ．ｔａｂａｃｕｍプラストム配列；ＡＰｒ：β−ラクタマーゼ。
【図９】モジュラープラスチド形質転換ベクター、ｐＩＣＦ７４２。ａａｄＡ：アミノグリコシド・アデニル・トランスフェラーゼのコード配列；ＬｐｓｂＡ：Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  ｐｓｂＡ遺伝子由来の５’−ＵＴＲ；Ｐｒｐｌ３２：Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  ｒｐｌ３２遺伝子由来のプロモーター；ＩＮＳＬ：ｂｐ１３２２７９〜１３３３９０由来のＮ．ｔａｂａｃｕｍプラストム配列；ＡＰｒ：β−ラクタマーゼ。
【図１０】モジュラープラスチド形質転換ベクター、ｐＩＣＦ７４３。ａａｄＡ：アミノグリコシド・アデニル・トランスフェラーゼのコード配列；Ｔα：大腸菌由来のα−オペロン・ターミネーター；ＩＮＳＬ：ｂｐ１３１１０６〜１３２２７７由来のＮ．ｔａｂａｃｕｍプラストム配列；ＡＰｒ：β−ラクタマーゼ。
【図１１】ｐＩＣＦ７４２及びｐＩＣＦ７４３の同時形質転換からのタバコ形質転換体をＰＣＲ解析するためのプライマー結合部位。Ａ：プライマー対  Ａ；Ｂ：プライマー対  Ｂ；Ｃ：プライマー対  Ｃ。
【図１２】ｐＩＣＦ７４２及びｐＩＣＦ７４３の同時形質転換からのタバコ形質転換体のＰＣＲ解析。１：株１；２：株２；Ａ：プライマー対  Ａ；Ｂ：プライマー対  Ｂ；Ｃ：プライマー対  Ｃ；左３つのレーン：ＤＮＡのない対照。
【図１３】ｐＩＣＦ７４２及びｐＩＣＦ７４３の同時形質転換からのタバコ形質転換体のサザンブロット。Ａ及びＣ：Ｂｓｐ１２０Ｉでの制限処理；Ｂ：ＡｃｃＩＩＩでの制限処理；１〜５：株１〜５；Ｍ：マーカーレーン（上から：１０ｋｂ、８ｋｂ、６ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２．５ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ）；ＷＴ：野生型対照。
【図１４】翻訳ベースのプラスチド形質転換ベクター、ｐＩＣＦ９８６。ａａｄＡＨｉｓタグ：Ｃ末端Ｈｉｓタグのあるアミノグリコシド・アデニル・トランスフェラーゼ；ＩＮＳＬ：ｂｐ５３４〜ｂｐ１３３６に相補的なＮ．ｔａｂａｃｕｍのプラストム配列；ＩＮＳＲ：ｂｐ１５５３７０〜ｂｐ５３３に相補的なＮ．ｔａｂａｃｕｍのプラストム配列；ＡＰｒ：β−ラクタマーゼ；Ｔ７Ｇ１０：Ｔ７ファージ由来の遺伝子１０のリボソーム結合部位；ＲＢＳ：合成リボソーム結合部位；ｕｉｄＡ：β−グルクロニダーゼ。
【図１５】モジュラー翻訳ベースのプラスチド形質転換ベクター、ｐＩＣＦ１０３３。ＩＮＳＬ：ｂｐ５３４〜ｂｐ１３３６に相補的なＮ．ｔａｂａｃｕｍのプラストム配列；ＡＰｒ：β−ラクタマーゼ；Ｔ７Ｇ１０：Ｔ７ファージ由来の遺伝子１０のリボソーム結合部位；ｕｉｄＡ（Ｎ−断片）：β−グルクロニダーゼのＮ末端３７３アミノ酸のコード配列。
【図１６】モジュラー翻訳ベースのプラスチド形質転換ベクター、ｐＩＣＦ１０３４。ａａｄＡ  Ｈｉｓタグ：Ｃ末端Ｈｉｓタグのあるアミノグリコシド・アデニル・トランスフェラーゼ；ＩＮＳＲ：ｂｐ１５５３７０〜ｂｐ５３３に相補的なＮ．ｔａｂａｃｕｍのプラストム配列；ＡＰｒ：β−ラクタマーゼ；Ｔ７Ｇ１０：Ｔ７ファージ由来の遺伝子１０のリボソーム結合部位；ＲＢＳ：合成リボソーム結合部位；ｕｉｄＡ：β−グルクロニダーゼ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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