(57)【要約】本発明は、（ａ）着目組換えポリペプチドをコードし且つ宿主細胞において前記組換えポリペプチドを発現させるヌクレオチド配列を含む宿主細胞を用意し、（ｂ）（ｉ）水、植物由来ペプトン、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギー源、少なくとも１つのアミノ酸、脂質源または前駆体、鉄源、非鉄金属イオン、及び場合により１つ以上のビタミン及びコファクターを含み、（ｉｉ）完全長ポリペプチドを全く含まない無血清培地を用意し、（ｃ）前記した宿主細胞を前記培地において該組換えポリペプチドを発現させる条件下で培養することを含む着目組換えポリペプチドの産生方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
着目組換えポリペプチドの産生方法であって、
（ａ）前記組換えポリペプチドをコードし且つ宿主細胞において前記組換えポリペプチドを発現させるヌクレオチド配列を含む形質転換真核宿主細胞を用意すること、
（ｂ）（ｉ）水、植物由来ペプトン、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、脂質源または前駆体、鉄源、非鉄金属イオン、及び１つ以上のビタミン及びコファクターを含み、（ｉｉ）完全長ポリペプチドを全く含まない無血清培地を用意すること、
（ｃ）前記した形質転換真核宿主細胞を前記培地において該組換えポリペプチドを発現させる条件下で培養すること
を含む前記方法。
【請求項２】
培地が動物由来成分を完全に含まないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
着目組換えポリペプチドがヒトエリスロポエチンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
着目組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を宿主細胞のゲノムに組み込み、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結させ、宿主細胞をメトトレキサートの非存在下で培養する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
着目組換えポリペプチドがヒトエリスロポエチンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
エネルギー源がグルコースであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培地が最初少なくとも５ｇ／Ｌのグルコースを含み、濃度を培養ステップ（ｃ）中３ｇ／Ｌ以上に維持することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培地が０．３ｇ／Ｌ以上のホスフェートを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
培地が０．３ｇ／Ｌ以上のホスフェートを含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ｐＨが最初約７．１であり、培養ステップ（ｃ）中に約６．９に低下させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨの低下が少なくとも１日かかって起こることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
培地が微量元素及び１つ以上のビタミンをも含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
エネルギー源がグルコースであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
培地が０．３ｇ／Ｌ以上のホスフェートを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
培養ステップ（ｃ）中に培地に１つ以上のアミノ酸、少なくとも１つの炭水化物及び植物由来ペプトンからなる富化栄養分を供給することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
更に、培養物から着目組換えポリペプチドを回収するステップ（ｄ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
着目組換えポリペプチドを培地に分泌させ、培地から回収することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
着目組換えポリペプチドがヒトエリスロポエチンであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）水、植物由来ペプトン、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、脂質源または前駆体、鉄源、非鉄金属イオン、及び１つ以上のビタミン及びコファクターを含み、（ｉｉ）完全長ポリペプチドを全く含まないことを特徴とする無血清細胞培養培地。
【請求項２０】
培地が動物由来の成分を完全に含まないことを特徴とする請求項２０に記載の細胞培養培地。
【請求項２１】
エネルギー源がグルコースであることを特徴とする請求項１９または２０に記載の細胞培養培地。
【請求項２２】
培地が０．３ｇ／Ｌ以上のホスフェートを含むことを特徴とする請求項１９から２１のいずれかに記載の細胞培養培地。
【請求項２３】
培地が微量元素及び１つ以上のビタミンをも含むことを特徴とする請求項１９から２２のいずれかに記載の細胞培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え細胞株を用いる組換え治療用糖タンパク質、例えばヒトエリスロポエチン（Ｅｐｏ）の費用効率的な産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、赤血球前駆細胞の増殖及び分化並びに循環赤血球の生理学的レベルの維持を調節する主要ホルモンである。胎児では、Ｅｐｏは主に肝臓で産生され、その産生の約９０％は生後腎臓に変わる。ガン患者のように慢性または急性の腎不全のためにＥｐｏレベルが下がったときには、立ち上がり貧血(rising anemia)を防止するために外部からＥｐｏを投与しなければならない。Ｅｐｏ遺伝子が発見され、げっ歯類細胞で該遺伝子が発現されて以来、治療上活性なヒトエリスロポエチンが利用可能となった。
【０００３】
ヒトＥｐｏ遺伝子は、２７アミノ酸シグナルペプチド及び１８３９９ダルトンの算出分子量を有する１６６アミノ酸タンパク質をコードする。成熟タンパク質は通常１つのアミノ酸Ｎ末端欠失を有し、１６５アミノ酸長である。シグナル配列により、ペプチドは３つのＮ−グリコシル化部位及び１つのＯ−グリコシル化部位を有する成熟タンパク質をもたらす適正なグリコシル化に関与する細胞コンパートメントに指向する。全分子量の約４０％を構成する糖部分はＥｐｏの完全生物活性にとって必須である。幾つかの研究で、末端シアル酸残基の数がインビボ半減期に対してポジティブな効果を有するものの、インビトロ活性、すなわち受容体に対する結合はグリコシル化が全くまたは部分的にしかされていない形態の場合に最高であることが判明した（Ｔａｋｅｕｃｈｉ及びＫｏｂａｔａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（４）：３３７−３４６（１９９１））。シアリル化度は半減期に直接比例し、シアル酸の少ないアイソフォームは生体から非常に速く取り除かれ、よって低い活性しか示さない。
【０００４】
治療薬として使用されるＥｐｏのようなポリペプチドを産生するための費用効率的な商業的発酵方法は以下の基準：
（１）細胞培養培地は、高価な成分、例えば血清または組換えタンパク質を含んではならない；
（２）培地は、可能性あるプリオン汚染のために、動物起源の成分を含んではならない；
（３）発酵方法は封鎖可能でなければならず、高い最終濃度の着目組換えタンパク質を与える；
（４）上清は、精製中インビボ活性が低いアイソフォームの損失が減るように、高いインビボ活性を示すＥｐｏ分子を多く含まなければならない；
を満たさなければならない。
【０００５】
米国特許第５，４４１，８６８号明細書のｐ．２８〜２９の実施例１０には、３〜４ステップからなる発酵方法が記載されている。第１ステップでは、ローラーボトル（８５０ｃｍ２）中で細胞をＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ  Ｆ１２の５０：５０混合物から構成され、５％  ウシ胎仔血清を含む培地（２００ｍｌ）に接種する。３日後に細胞が集密まで増殖したときに、培地を除去し、ＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ  Ｆ１２の５０：５０混合物から構成され、ウシ胎仔血清を含まない培地と交換する。前記ボトルをインキュベーターに戻して１〜３時間置き、培地を再び除去し、新鮮な無血清培地（１００ｍｌ）と交換する。このステップを用いて、汚染血清タンパク質の濃度を低下させる。次いで、前記ローラーボトルをインキュベータに戻して７日の産生期間置く。この後、培地を収集し、第２の産生サイクルのために無血清培地（１００ｍｌ）と交換する。この産生システムの実施の例として、代表的な７日培地サンプルは約３，８９２±４０９Ｕ／ｍｌを含み、これは（１３０，０００Ｕ／ｍｇの推定特異的活性で）３０ｍｇ／Ｌに相当する。
【０００６】
高価な血清含有培地を用いている上記方法によると、上清中のＥｐｏの最終濃度は３０μｇ／ｍｌとなる。血清が厳密にコントロールされているにも関わらず、感染物質及び（最も恐らく、ＣＪＤをヒトに伝達するのに関与する）ｓｃプリオンによる汚染を排除できない。
【０００７】
米国特許第５，６８８，６７９号明細書の実施例５には、（７８，０００〜１３０，０００Ｕ／ｍｇの推定特異的活性で）４０〜８０ｍｇ／Ｌの最終Ｅｐｏ濃度をもたらす組換え細胞の作成が記載されている。他の動物由来成分の中で、培地は２０％  ウシ胎児血清及び１％  ウシ血清アルブミンを含む。前記培地は上記と同じプリオン及び感染物質関連タンパク質で汚染されている。
【０００８】
国際特許出願公開第９６／３５７１８号パンフレットは、動物由来成分を含まないエリスロポエチンの産生方法を記載している。しかしながら、培地はインスリンやトランスフェリンのような高価な機能性組換えタンパク質を含んでいる。
【０００９】
国際特許出願公開第９９／２８３４６号パンフレットは、血清を１％または０％に減じた培地を用いてエリスロポエチンを産生するための発酵方法を記載している。この明細書の記載によれば、最終Ｅｐｏ濃度は少なくとも３０〜５０ｍｇ／Ｌに達する。しかしながら、培地は依然としてインスリンやトランスフェリンのような高価な機能性組換えタンパク質を含んでいる。
【００１０】
Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６９：８５−９３（１９９９）は、統計的設計を用いて組換えヒトエリスロポエチンを産生するＣＨＯ細胞のための培養培地を開発する方法を記載している。この方法によると、２５μｇ／ｍｌの最終Ｅｐｏ濃度が得られた。しかしながら、培地は依然としてインスリンやトランスフェリンのような高価な機能性組換えタンパク質を含んでいる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、高価で望ましくない動物由来成分及びインスリンのような機能性組換えタンパク質の非存在下で組換えタンパク質を産生するのに適した培地及び条件の開発が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、血清も機能性（及び／または組換え）完全長タンパク質も含まない費用効率的培地を用いる新しい発酵プロトコルを提供する。更に、メトトレキサートの非存在下での細胞の培養のような、収率及び活性（高いシアリル化度のために）の点でタンパク質発現を最適化するために使用され得る多数のパラメーターが特定された。前記した最適化パラメーターを用いることにより、最終タンパク質濃度を最高６００ｍｇ／Ｌまたはそれ以上とすることができ、組換え産物（Ｅｐｏ）は高度のシアリル化を示す。
【００１３】
従って、本発明は着目組換えポリペプチドの産生方法を提供し、その方法は、
（ａ）前記組換えポリペプチドをコードし且つ宿主細胞において前記組換えポリペプチドを発現させるヌクレオチド配列を含む形質転換真核宿主細胞を用意すること、
（ｂ）（ｉ）水、植物由来ペプトン、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、脂質源または前駆体、鉄源、非鉄金属イオン、及び１つ以上のビタミン及びコファクターを含み、（ｉｉ）完全長ポリペプチドを全く含まない無血清培地を用意すること、
（ｃ）前記した形質転換真核宿主細胞を前記培地において該組換えポリペプチドを発現させる条件下で培養すること
を含む。
【００１４】
培地が動物起源の成分を含まないことが有利である。従って、本発明の好ましい実施態様は動物由来の成分を完全に含まない上記した培地に関する。
【００１５】
好ましくは、着目組換えポリペプチドはヒトエリスロポエチンである。宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００１６】
好ましい実施態様では、着目組換えポリペプチド（好ましくは、ヒトエリスロポエチン）をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞のゲノムに組み込み、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結させ、宿主細胞をメトトレキサートの非存在下で培養する。好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１７】
組換えタンパク質の産生レベルを改善するために以下のパラメーターの１つ以上を使用し得る：
（１）好ましいエネルギー源はグルコースである。好ましい実施態様において、培地は最初少なくとも５ｇ／Ｌのグルコースを含み、この濃度を培養ステップ（ｃ）中３ｇ／Ｌ以上に維持する；
（２）培地は好ましくはホスフェートを含み、例えば少なくとも０．２、０．４または０．６ｇ／Ｌのホスフェートを含む。本発明の好ましい実施態様において、特にエネルギー源がグルコースのときには、培地は０．３ｇ／Ｌ以上のホスフェートを含む；
（３）培地のｐＨは最初約７．１であり、その後培養ステップ（ｃ）中に約６．９に低下させる。好ましくは、ｐＨ低下は少なくとも１日かけて実施する；
（４）培地は微量元素及び１つ以上のビタミンをも含み得る。前記培地の好ましい実施態様における好ましいエネルギー源はグルコースである。前記培地が０．３ｇ／Ｌ以上のホスフェートを含むことが好ましい；
（５）培養ステップ（ｃ）中に培地に１つ以上のアミノ酸及び植物由来ペプトンを含む富化栄養濃縮物を供給することが好ましい。更に、少なくとも１つの炭水化物を存在させ得る。場合により、少なくとも１つのビタミン、微量元素及び脂質を配合し得る。
上記パラメーターを２つ以上組み合わせて使用することも可能である。
【００１８】
本発明の方法は、通常培養物から着目組換えポリペプチドを回収するステップ（ｄ）を含む。着目組換えポリペプチド（例えば、エリスロポエチン）を培地に分泌させた場合にはその組換えポリペプチドは培地から回収され得る。
【００１９】
本発明の更なる実施態様は、上記した細胞培養培地それ自体、すなわち本発明の方法において使用される細胞培養培地に関する。従って、１実施態様は、（ｉ）水、植物由来ペプトン、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、脂質源または前駆体、鉄源、非鉄金属イオン、及び１つ以上のビタミン及びコファクターを含み、（ｉｉ）完全長ポリペプチドを全く含まない無血清細胞培養培地に関する。本発明の細胞培養培地が動物源由来の成分を完全に含まないことが好ましい。好ましい実施態様では、本発明の細胞培養培地中のエネルギー源はグルコースである。同様に好ましい実施態様では、本発明の細胞培養培地は０．３ｇ／Ｌ以上のホスフェートを含む。更に好ましい実施態様では、本発明の細胞培養培地は微量元素及び１つ以上のビタミンをも含む。本発明の細胞培養培地の更に好ましい実施態様は、本発明の方法において使用され得ると記載されているものまたは本明細書に特記されているものである。
【００２０】
また、本発明は、本発明の方法により産生された着目組換えポリペプチドを含む組成物を提供する。特に、本発明は本発明の方法により産生された組換えエリスロポエチンを含む組成物を提供する。
【００２１】
本発明において、本明細書に記載した好ましいまたは特に好ましい実施態様は相互に組み合わされ得、それにより更に好ましい実施態様を構成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
特記しない限り、本明細書で使用した技術及び科学用語はすべて（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学の）当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。分子、遺伝子及び生化学的方法（一般的には、援用により本明細書に含まれるとする、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニユアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，第２版，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行；Ｓｐｉｅｒら，「細胞テクノロジー事典(Encyclopedia of Cell Technology)」，第１巻及び第２巻，第１版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００年）発行；及びＡｕｓｕｂｅｌら，「分子生物学におけるショートプロトコール(Short Protocols in Molecular Biology)」，第４版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９９年）発行の「分子生物学における現在のプロトコル」と題する完全バージョン参照）及び化学的方法に対して一般的方法が使用される。
【００２３】
Ａ．  培地
哺乳動物細胞を培養するための本発明の方法において使用される培地は血清を含まない。特に、動物由来の成分、例えば（成長物質を含めた）タンパク質、アミノ酸、脂質及び炭水化物を完全に含まないことが好ましい。よって、培地の成分は主に無機物または合成物であり、よって動物源から直接得られるものではない。しかしながら、植物、細菌または酵母のような他のソースから抽出した成分を例えば植物由来ペプトンとして使用し得る。更に、培地は機能性組換えタンパク質またはポリペプチド（例えば、トランスフェリン及びインスリン）またはその機能性部分を含まない。
【００２４】
培地は水、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、脂質源または前駆体、鉄源、非鉄金属イオンを含み、場合により１つ以上のビタミン及びコファクターを含む。
【００２５】
浸透圧調節剤は通常塩である。培地中に使用され得る塩にはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２が含まれる。浸透圧を２００〜４５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ、好ましくは２９０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇの範囲に維持することが有利である。
【００２６】
緩衝剤はｐＨを６．５〜７．５、最も好ましくは約７．０に維持するために培地中に使用される。好適な緩衝剤にはＮａＨＣＯ３のような炭酸塩；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏのような塩化物、硫酸塩及びリン酸塩；ピルビン酸ナトリウムが含まれる。前記緩衝剤は通常０．０５〜５ｇ／Ｌ、好ましくは０．５〜５ｇ／Ｌ存在させる。例えば、約２．５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３を配合し得る。他の緩衝剤、例えばＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎｍｉｎ−［２−エタンスルホン酸］（別名ＨＥＰＥＳ）及び３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパンスルホン酸（別名ＭＯＰＳ）も使用し得る。
【００２７】
用語「アミノ酸」は、２０アミノ酸すべてが存在し得ることを意味する。合成起源のアミノ酸が好ましい。通常添加するアミノ酸の量はアミノ酸毎に異なるが、通常１０〜２００ｍｇ／Ｌの範囲である。しかしながら、Ｌ−グルタミンは通常非常に高濃度で、好ましくは１０００〜３５０ｍｇ／Ｌの範囲で存在する。便宜的には、アミノ酸源はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び／またはＨａｍ’ｓ  Ｆ１２のような基本培地に基づき得る。急速消費を補充するために基本培地にアミノ酸を添加することにより、富化アミノ酸補充培地が得られる。
【００２８】
用語「濃縮物」は培地よりも多い量のアミノ酸、大豆ペプトン及び炭水化物を含有する栄養液を指す。場合により、１つ以上のビタミン、脂質または微量元素を添加し得る。濃縮物の容量は通常出発容量の０．５〜３０％、最も好ましくは１．２５〜５％である。消費した栄養分を補充するために添加する。
【００２９】
培地中に使用されるエネルギー源は通常３〜１０ｇ／Ｌの量存在させ、好ましくはマンノース、フルクトース、ガラクトースまたはマルトースのような単糖類、最も好ましくはグルコース、特にＤ−グルコースである。好ましくは、培地中のグルコースの初期濃度は少なくとも４ｇ／Ｌである。
【００３０】
脂質源または前駆体は、例えば脂質ファクター、例えば塩化コリン、リポ酸、オレイン酸、ホスファチジルコリンまたはリネオレエート及び／または脂質生成に関与する化合物（脂質前駆体）、例えばエタノールアミンのようなアルコールアミンから選択され得る。エタノールアミンを添加することが好ましい。
【００３１】
鉄源は無機または有機形態であり得、通常０．０２５〜０．５ｍｇ／Ｌの量存在させる。その例には第一鉄塩及び第二鉄塩、例えばクエン酸第二鉄または硫酸第一鉄が含まれる。クエン酸第二鉄やクエン酸第二鉄アンモニウムのようなキレート化塩が好ましい。
【００３２】
培地中に任意に使用される非鉄金属イオンにはマグネシウム、銅及び亜鉛が含まれる。ナトリウム、カリウム及びセレンも含まれる。培地中に亜セレン酸イオンを例えば亜セレン酸ナトリウムの形態で０．１〜１００μｇ／Ｌ、最も好ましくは０．５〜２５μｇ／Ｌの量添加することが好ましい。
【００３３】
培地中に任意に使用するビタミン及び酵素コファクタービタミン（コファクター）には、０．００１〜１ｍｇ／Ｌの量存在させるビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）及びビタミンＫ（ビオチン）；１〜１０ｍｇ／Ｌの量存在させるビタミンＣ（アスコルビン酸）；０．１〜１０ｍｇ／Ｌの量存在させるビタミンＢ２（リボフラビン）；通常２〜２０ｍｇ／Ｌ存在させるビタミンＢ１（チアミン）、ナイアシンアミド、ビタミンＢ５（Ｄペントテン酸カルシウム）、葉酸、ｉ−イノシトールが含まれる。
【００３４】
大規模発酵槽では、哺乳動物細胞は容器へのガス散布及びインペラーによる混合により生ずる剪断力を特に受けやすい。細胞破壊の発生を最小限とするために、培地に細胞保護剤、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはプルーロニックアルコールを添加することが好ましい。好ましくは、ルトロールを通常約０．１％の濃度で使用する。
【００３５】
また、培地にペプチド消化物、加水分解物または抽出物、例えば酵母抽出物、好ましくは植物由来ペプトンを補充することも好ましい。好ましい量は０．０２５〜１％ｗ／ｖ、最も好ましくは０．２〜０．５％ｗ／ｖである。植物ペプトンは米、小麦、エンドウ豆または大豆から得られるが、これらに限定されない。
【００３６】
培地にホスフェートイオンを添加することが更に好ましい。通常１０〜１０００ｇ／Ｌ、例えば５０〜１５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１２０ｍｇ／Ｌのホスフェートを添加する。
【００３７】
Ｂ．  宿主細胞
本発明の方法に従って培養される形質転換宿主細胞は真核細胞、通常げっ歯類または霊長類細胞のような哺乳動物細胞である。好ましい宿主細胞にはＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ及びＨｅＬａ細胞が含まれる。特に好ましい細胞はＣＨＯ細胞である。１実施態様では、宿主細胞はｄｈｆｒのような遺伝子を元々欠き、前記遺伝子をコードするヌクレオチド配列を用いて選択圧（以下参照）に応答して増幅する細胞株をトランスフェクト（または、形質転換）することにより産生される。ｄｈｆｒ欠乏ＣＨＯ細胞はＵｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，ＰＮＡＳ，７７：４２１６−４２２０（１９８０）に記載されており、ＡＴＣＣからＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６として入手可能である。前記した組換え細胞はブダペスト条約に基づいて米国メリーランド州ロックビルに所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に２００１年８月２９日にＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３６７２で寄託されている。
【００３８】
本明細書中、「形質転換」は、遺伝物質が細胞内で発現されるように（“形質転換される”と言われる）前記遺伝物質を宿主細胞に導入することである。疑いを避けるために、「形質転換」はがん遺伝子または発がんウイルス等により細胞を不死化することを指さない。
【００３９】
宿主細胞は、その宿主細胞において発現させたい着目組換えポリペプチド（ＰＯＩ）をコードするヌクレオチド配列を含む。ＰＯＩは好ましくはグリコシル化ポリペプチド、特に哺乳動物によってのみ実施されるグリコシル化を必要とするグリコシル化ポリペプチドである。より好ましくは、ポリペプチドはシアリル化される。特に好ましいＰＯＩはエリスロポエチン、より具体的にはヒトＥｐｏである。ＰＯＩが細胞により培地に分泌されることも好ましい。
【００４０】
組換えＰＯＩのコード配列は、宿主細胞においてＰＯＩを発現させる調節コントロール配列に作動的に連結している。ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに組み込まれていることが好ましい。ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列を導入するかめの各種方法が当業界で公知である。例えば、上掲したＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい。
【００４１】
１実施態様では、ＰＯＩをコードするヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞ゲノムに組み込まれたなら宿主細胞が該ヌクレオチド配列を増幅させる選択剤と接触したときに増幅される第２ヌクレオチド配列に作動的に連結されている。真核細胞、特に哺乳動物細胞は選択圧（通常、酵素阻害剤）に応答してある遺伝子を増幅させ得、その結果その遺伝子コピーの数が増加し、遺伝子の発現レベルが上昇する。追加遺伝子コピーは染色体内に、または小染色体のような染色体外遺伝物質の形態で維持され得る（検討のためには、「遺伝子（Ｇｅｎｅｓ）ＩＶ」，Ｌｅｗｉｎ，ｐ．９７５−９７８，英国オックスフォードに所在のオックスフォード大学出版（１９９７年）発行を参照されたい）。十分に特徴づけられている例は、メトトレキサート（ＭＴＸ）に応答して増幅するジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）である。他の例には、トランスカルバミラーゼ阻害剤に応答して増幅する（ＵＭＰ合成の最初の３ステップに関与するタンパク質をコードする）ＣＡＤ遺伝子及びメチオニンスルホキシミンに応答して増幅するグルタミンシンターゼ（国際特許出願公開第８７／０４４６２号パンフレット参照）が含まれる。好ましくは、第２ヌクレオチド配列はｄｈｆｒをコードする。
【００４２】
Ｃ．  培養方法
本発明の方法によれば、宿主細胞を本発明の培地においてＰＯＩを発現させる条件下で培養する。哺乳動物細胞のような真核細胞が各種フォーマット及び培養容器で培養され得る。例えば、細胞はプラスチック製フラスコまたは皿の底に付着させて、撹拌式フラスコ及びバイオリアクター中に懸濁して、または回転培養で培養され得る。本発明の目的はＰＯＩを大量に産生することであるので、細胞をバイオリアクター、特にバッチ式に供給され得且つ４Ｌ以上の容量を有するバイオリアクターにおいて増殖させることが好ましい。
【００４３】
通常、細胞を約５×１０５細胞／ｍｌの密度で培地に接種する。最適さは細胞の種類により異なり、当業者により決定され得る。ｐＨは通常約７．０に設定される。温度は３７℃に設定されるが、昆虫細胞株のような幾つかの細胞株はより低温で成長する。ｐＯ２は約５０％空気飽和に設定される。
【００４４】
宿主細胞がＰＯＩをコードするヌクレオチド配列に作動的に連結させたｄｈｆｒ（または同等物）遺伝子をそのゲノムに組み込んで含んでいるときには、適当量のメトトレキサート（または同等物）を培地に添加してもよい。しかしながら、好ましい実施態様では、メトトレキサートを産生相中培地中に添加しない。なぜならば、本発明者らはメトトレキサートの非存在下で改善されたグリコシレート化パターンが得られることを知見したからである。
【００４５】
細胞は通常、細胞株及び組換えＰＯＩに依存して約７〜１４日間培養する。この間、栄養素の欠乏を防止するために新鮮培地を添加する必要がある。少なくとも１つのアミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含む富化栄養濃縮物を添加することにより培養時間を延長することが好ましい。アミノ酸は０．０５〜５０ｇ／Ｌの量、炭水化物は２〜１０００ｇ／Ｌの量、ペプトンは２〜１０００ｇ／Ｌの量添加される。最も好ましくは、アミノ酸は０．５〜５ｇ／Ｌの量、炭水化物は２５〜７５ｇ／Ｌの量、ペプトンは２５〜７５ｇ／Ｌの量添加される。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様では、グルコースのようなエネルギー源の濃度を培養中少なくとも３ｇ／Ｌ、通常３〜４ｇ／Ｌの濃度で維持する。
【００４７】
特に好ましい実施態様では、ｐＨを７．０に一定に維持する代わりに、ｐＨを最初ｐＨ７．０以上（例えば、ｐＨ７．１）とし、培養プロセス中ｐＨを７．０以下（例えば、ｐＨ６．９）に低下させる。このように、ｐＨが宿主細胞に許容され得る限界内に維持されているならば、ｐＨを中性ｐＨの上から下に変化させる。通常、ｐＨ変化は長時間かけて、例えば少なくとも６時間または９６時間、最も好ましく７２時間かけて実施する。
【００４８】
ヒトエリスロポエチンの場合、細胞により産生される組換えＰＯＩの量が少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、例えば３００または４００ｍｇ／Ｌ以上であることが有利である。
【００４９】
適当ならば、培養上清または培養細胞のペレット（Ｅｐｏ発現の場合には培養上清）から組換えタンパク質を回収してもよい。その後、組換えタンパク質は通常１つ以上の精製ステップ、例えばアフィニティークロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーにかけられる（例えば、Ｂｒｏｕｄｙら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２６５：３２９−３３６（１９８８）；Ｇｒａｎｅｍら，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４（２）：１２７−１４２（１９９４）参照）。本発明の細胞培養方法により産生したエリスロポエチンを回収するための別の方法は本明細書の実施例の欄に概説されている。
【００５０】
組換え宿主細胞において発現され、本発明の方法を用いて精製した組換えポリペプチド、特にＥｐｏを含む組成物において、前記組換えポリペプチドが実質的に純粋であること、例えば少なくとも９０％、９５％または９９％の純度を有していることが好ましい。
【００５１】
精製タンパク質の生物活性はインビトロ及び／またはインビボで測定され得る。適当なインビトロ試験はＨａｍｍｅｒｌｉｎｇら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１４（１１）：１４５５−６９（１９９６）に記載されており、この方法は真核細胞株の増殖刺激を調べることを含む。適当なインビボ試験は上掲のＧｈａｎｅｍら（１９９４）に記載されており、この方法は赤血球増加症マウスの赤血球への５９Ｆｅの取り込みを測定することを含む。
【００５２】
好ましい実施態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）着目組換えポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）選択マーカーをコードし、宿主細胞が選択剤と接触したときに増幅される第２ヌクレオチド配列を含む第１ポリヌクレオチドベクターと（ｂ）第２ヌクレオチド配列が異なる選択マーカーをコードする第３ヌクレオチド配列で置換されている以外第１ポリヌクレオチドベクターと本質的に同じヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドベクターとが宿主細胞のゲノムに取り込まれている核酸ベクター及び宿主を用いて実施され得る。
【００５３】
宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００５４】
好ましくは、第２ヌクレオチド配列はジヒドロ葉酸還元酵素ポリペプチドをコードし、選択剤はメトトレキサートである。好ましくは、着目組換えポリペプチドはヒトエリスロポエチンである。前記系は本明細書の実施例に記載されている。
【００５５】
エリスロポエチンは細胞培養物から、
（ａ）ディスクスタック分離機を用いて遠心後デプスフィルトレーションステップにより細胞培養物から宿主細胞、細胞成分及び破片を除去して、清澄化培地上清を得；（ｂ）前記上清の伝導率を５ｍＳ／ｃｍ以下、ｐＨを約７．０〜８．０に調節し；（ｃ）ステップ（ｂ）からの上清をアニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムにかけ、前記カラムを洗浄し、前記カラムからｒｈＥｐｏを溶離させ、ｒｈＥｐｏ含有ピークフラクションを収集し；（ｄ）ステップ（ｃ）からの合わせたピークフラクションに、中圧（＜１０バール）で操作可能であり且つ高濃度のＮａＯＨに対して耐性のポリスチレン樹脂を用いる逆相クロマトグラフィーを施し、ｒｈＥｐｏを有機溶媒の直線勾配を用いて溶離させ；（ｅ）ステップ（ｄ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをセファロースアニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムにかけ、前記カラムを洗浄し、直線塩勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させ；（ｆ）ステップ（ｅ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択し；（ｇ）ステップ（ｆ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションにゲル濾過培地を用いるサイズ排除クロマトグラフィーステップを１回以上施して、存在し得る二量体及びそれ以上の多量体凝集物を除去し、ｒｈＥｐｏ含有溶離物を収集する；
ことにより精製され得る。
【００５６】
ステップ（ｃ）で用いるアニオン交換媒体としてはＢｉｏＳｅｐｒａから入手可能なセラミックを主成分とするイオン交換媒体Ｑ−ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ（商標）が有利である。ステップ（ｄ）で用いるポリスチレン樹脂としてはＳｏｕｒｃｅ  ３０ＲＰＣ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が有利であり、ステップ（ｅ）で用いるアニオン交換媒体としてはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（商品名）が好ましい。ステップ（ｇ）で用いるゲル濾過媒体としてはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（商品名）が好ましい。
【００５７】
前記方法は本明細書の実施例の欄に記載されている。
【００５８】
本発明を下記実施例を参照して更に説明する。これらの実施例は例示にすぎず、非限定的である。特に、実施例は本発明の好ましい実施態様に関する。
【００５９】
（実施例）
材料
［宿主細胞株］
ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）。ブダペスト条約に基づいて米国メリーランド州ロックビルに所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に２００１年８月２９日にＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３６７２で寄託されている。
【００６０】
［細胞培養培地］
培養培地：４ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１０％  ＦＣＳ及び１×  ＨＴ（ヒポキサンチンチミジン）を補充したＤＭＥＭ。
【００６１】
選択培地：４ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１０％  透析ＦＣＳ及び０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ。
【００６２】
増幅培地：４ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１０％  透析ＦＣＳ，０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８及び４．８×１０−８Ｍ〜１．５４×１０−６Ｍ  ＭＴＸ（メトトレキサート）を補充したＤＭＥＭ。
【００６３】
凍結培地：４ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１０％  ＦＣＳ及び１０％  ＤＭＳＯを補充したＤＭＥＭ。
【００６４】
組換え細胞株のための無血清適応培地：６ｍＭ  Ｌ−グルタミン，０．２５％  大豆ペプトン／ＵＦ，１×  ハイブリドーマ補充物，０．１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８及び１．５４×１０−６Ｍ  ＭＴＸを補充したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）。
【００６５】
無血清産生培地：０．２５％  大豆ペプトン／ＵＦ，１×  ハイブリドーマ補充物，０．１％  ルトロール，１．５４×１０−６Ｍ  ＭＴＸ，１ｇ／Ｌ  グルコース及び２．５ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３を補充したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）。
【００６６】
組換え細胞株のための無血清凍結培地：ＰＢＳ，２０％  ＰＶＰ−１０，５％  ＤＭＳＯ。
【００６７】
ハイブリドーマ補充物：１００×  ２．５×１０−３Ｍ  エタノールアミン，２．５×１０−２Ｍ  クエン酸第二鉄，２．０×１０−３Ｍ  Ｌ−アスコルビン酸、５．０×１０−６Ｍ  亜セレン酸ナトリウム。
【００６８】
［プラスミド構築物］
ｐＥｐｏ／ｎｅｏ：このプラスミドは、それぞれＳＶ４０初期プロモーター／ターミネーター配列の制御下で２つの異なる発現カセットとしてＥｐｏのコード領域及びネオマイシン耐性遺伝子をコードする。構築の詳細は実施例１に示す。
【００６９】
ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ：このプラスミドは、それぞれＳＶ４０初期プロモーター／ターミネーター配列の制御下で２つの異なる発現カセットとしてＥｐｏのコード領域及びｄｈｆｒをコードする。構築の詳細は実施例２に示す。
【００７０】
細胞培養方法
［ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−の増殖］
ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら，ＰＮＡＳ，７７（７）：４２１６−４２２０（１９８０））（ＣＨＯ  ｄｈｆｒと称する）をＤＭＥＭ培養培地において１週間に２回１：１０の分裂比で培養する。
【００７１】
［ＣＨＯ細胞のトランスフェクション］
リポフェクチントランスフェクションを実施する前日に２５ｃｍ２容量のＴフラスコボトルまたは９６ウェルプレートに１〜５×１０４細胞／ｃｍ２を接種する。対応プラスミドを適当な比で混合し、０．５〜１μｌ／ｃｍ２のリポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を製造業者のプロトコルに従って添加する。次いで、無血清ＤＭＥＭにおいて細胞にトランスフェクションカクテルを４〜１６時間載せた後ＤＮＡ含有培地を培養培地と交換する。血清含有培地において２４〜４８時間培養した後、細胞を選択培地に移す。トランスフェクトした細胞プールをまず選択培地において集密まで培養し、次いで増幅培地（４．８×１０−８Ｍ  ＭＴＸ）において培養した後細胞培養上清をＥＬＩＳＡによりＥｐｏ産生についてスクリーニングする。最高手順を決定し、ＭＴＸ濃度を２倍に上昇させ、最良の手順を更なる培養のために使用する。
【００７２】
分析方法
各種マトリックスにおけるＥｐｏを検出するＥＬＩＳＡ
（抗体）
ポリクローナル血清：家兎抗Ｅｐｏビオチニル化（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号ＡＢ−２８６−ＮＡ）；
モノクローナル抗体：マウス抗Ｅｐｏ（Ｇｅｎｅｚｙｍｅ；カタログコードＡＥ７Ａ５）。
【００７３】
（ＥＬＩＳＡ緩衝液）
コーティング緩衝液：８．４ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３，４．２ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＣＯ３，ｐＨ９．６−９．８；
洗浄緩衝液：０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ，１．１５ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ，０．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４，８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．１％  ツイーン２０；
希釈緩衝液：洗浄緩衝液中２％  ＰＶＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＰＶＰ−４ＯＴ）；
サンプル緩衝液：希釈緩衝液中０．５％  α−モノチオグリセロール；
染色緩衝液：７．３ｇ／Ｌ  クエン酸・２Ｈ２Ｏ，１１．８６ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ，ｐＨ４．８−５．０；
染色溶液：１００μｌ  ＯＰＤ溶液／１０ｍｌ  染色緩衝液、５μｌ  Ｈ２Ｏ２／１０ｍｌ  染色緩衝液；
ＯＰＤストック溶液：ＰＰ：Ｌ００１７。
【００７４】
（方法）
使用したＥＬＩＳＡ方法はｎｇ／ｍｌ濃度範囲でＥｐｏを、特に約１０ｎｇ／ｍｌの範囲の検出限界で、５００ｎｇ／ｍｌから始めて８回倍数希釈で検出する。Ｅｐｏの最初の２６アミノ酸に対する１つのモノクローナル抗体はＥｐｏに結合するコーティング層として機能する。次のステップで、Ｅｐｏは捕捉抗体に特異的に結合する。ビオチニル化Ｅｐｏ認識家兎抗血清を用いて検出する。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼをプレートにカップリングした後ＯＰＤで染色することにより可視化する。
【００７５】
イムノフルオレッセンス
Ｅｐｏ発現ＣＨＯ細胞を６ウェルプレートのカバーガラス上に５×１０４細胞／２００μｌで接種し、２４〜７２時間インキュベートする。付着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、−２０℃メタノールで５分間固定し、風乾した後ＰＢＳ中に再び浸す。ＰＢＳ中２０％  ＦＣＳと１５分間インキュベートすることにより非特異的タンパク質を飽和した後、抗−Ｅｐｏを１時間インキュベートする。反応物をコンジュゲートした抗−マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣを用いて可視化する。フルオレッセンスを４８８ｎｍの励起波長及び５１５ｎｍ以上の発光波長で共焦点顕微鏡により検出する。
【００７６】
核サイズ測定
（材料）
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）モデルＺＭ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）；
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｈａｎｎｅｌｙｚｅｒ（登録商標）モデル２５６；
インキュベーション溶液；０．１Ｍ  クエン酸，２％  トリトンＸ  １００；
Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｉｓｏｔｏｎ  ＩＩ（カタログ番号８４４  ８０１１；Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｕｒｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ）。
【００７７】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒは電導性流体中に懸濁されている粒子をサイズ及び数の点で定量する。前記流体は両側に電極を有している毛細管を介して真空により吸着される。抵抗の変化により、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｈａｎｎｅｌｉｚｅｒによりデジタル化され得る電圧インパルスが誘導される。核サイズは細胞のＤＮＡ含量に相関し、染色体の二倍体及び多倍体を区別することができる。
【００７８】
（方法）
約１×１０６ＣＨＯ細胞をＰＢＳで１回洗浄し、インキュベーション溶液（２ｍｌ）中に再懸濁し、４〜５時間放置する。以下のステップはＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒに特有である。
【００７９】
ＳＤＳポリアクリルアミド−電気泳動及びウェスタンブロッティング
（材料）
ＳＤＳゲル：４〜２０％  Ｎｏｖｅｘトリス−グリシン；
サンプル緩衝液：トリスグリシンＳＤＳ  ２×（Ｎｏｖｅｘ  ＬＣ２６７６）；
ランニング緩衝液：トリスグリシンＳＤＳ（Ｎｏｖｅｘ  ＬＣ２６７５）；
ブロッティング緩衝液：５０ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ，０．１％  ＳＤＳ，２０％  メタノール；
ブロッティングマトリックス：ＰＶＤＦ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ  ０．４５μＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｋ８ＪＭ８２３８Ｈ）；
洗浄緩衝液：ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液参照；
希釈緩衝液：洗浄緩衝液中１％  粉乳；
検出緩衝液：０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）。
【００８０】
（方法）
Ｅｐｏを含むサンプルを１％  α−ＭＴＧ含有１×サンプル緩衝液中で３０ｎｇ／２０μｌに調節し、ＳＤＳゲルに適用する。ランニング後、タンパク質をＰＶＤＦ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜に２時間ブロッティングし、Ｅｐｏの最初の２６アミノ酸を検出するモノクローナル抗体を用いてＥｐｏを特異的に染色する。アルカリホスファターゼにコンジュゲートした抗−マウスＩｇＧ及びＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色により可視化する。
【００８１】
等電点電気泳動
（材料）
システム：Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；
ＩＰＧゲル：ｐＨ２．５−７；
再膨潤緩衝液：９ｇ  尿素，０．５ｇ  ＣＨＡＰＳ，０．０４ｇ  ＤＴＥ，０．５ｍｌ  ｒｅｓｏｌｙｔｅｓ（ｐＨ３．５−１０），１０μｌ  ブロモフェノールブルー（０．１％）、Ｈ２Ｏで２５ｍｌに調節；
サンプル緩衝液：６２５μｌ  Ｈ２Ｏ中２５μｌ  ＩＰＧサンプル緩衝液（ｐＨ３−１０）；
ブロッティング緩衝液：２．９３ｇ  グリシン，５．８１ｇ  トリス，２０ｍｌ  メタノール，０．３７５ｇ  ＳＤＳ、Ｈ２Ｏで１０００ｍｌに調節；
ブロッティングマトリックス：ＰＶＤＦ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ  ０．４５μＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｋ８ＪＭ８２３８Ｈ）；
洗浄緩衝液：ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液参照；
希釈緩衝液：洗浄緩衝液中１％  粉乳；
検出緩衝液：０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）。
【００８２】
（方法）
Ｅｐｏを含有するサンプルを５００〜１０００ｍｇ／５０μｌに調節し、脱塩し、サンプル緩衝液で１：１希釈し、再膨潤ＩＰＧゲルに適用する。ランニング条件は最初３００Ｖで１分間、その後３５００Ｖまで直線的に上昇させ、最後に３５００Ｖで１時間とする。全電気泳動中、１０ｍＡ及び１０Ｗの限界を設定する。その後、タンパク質を一晩拡散するかまたはエレクトロブロッティングすることによりＰＶＤＦ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜にブロッティングし、その後Ｅｐｏの最初の２６アミノ酸を検出するモノクローナル抗体を用いてＥｐｏを特異的に染色する。コンジュゲートした抗−マウスＩｇＧ  Ａｐ及びＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色により可視化する。
【００８３】
ＤＮＡ含量の測定
組換え細胞株のＤＮＡ含量をＦＡＣＳ分析によりＣＨＯ−ｄｈｆｒ−宿主細胞株と比較する。
【００８４】
（材料）
洗浄緩衝液：０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％  トリトン  Ｘ１００；
染色緩衝液：洗浄緩衝液中０．３μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。
【００８５】
（方法）
５×１０５細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷７０％  エタノールで固定する。次いで、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄した後室温において染色緩衝液中で３０分間インキュベートする。ＤＮＡ含量をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて３５９ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長で測定する。
【００８６】
インビトロ特異性試験
ヒト赤白血病細胞株ＴＦ−１（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）をＩＬ３またはｈＧＭ−ＣＳＦ依存的に増殖させる。前記サイトカインは増殖に対して相乗的効果を示したのに対して、Ｅｐｏは一時生存度を維持し得る。前記細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＥｐｏを含有する培養培地において通常通り培養する。
【００８７】
（試験補充物）
培養培地：４ｍＭ  Ｇｌｎ，１０％  ＦＣＳ，２０μｇ／ｍｌ  トランスフェリン，１０μＭ  β−メルカプトエタノール，１２ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＧＭ−ＣＳＦ，３Ｕ／ｍｌ  ｒｈＥｐｏを補充したＲＰＭＩ  １６４０；
試験培地：４ｍＭ  Ｇｌｎ，１００μｇ／ｍｌ  トランスフェリン，２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを補充したＲＰＭＩ  １６４０。
【００８８】
（方法）
機能性試験を９６ウェルプレートにおいてＭＴＴ生存度として実施する（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１４（１１）：１４５５−６９（１９９６））。サンプルを試験培地１ｍｌ中１００ｎｇ  Ｅｐｏから始めて８回倍数希釈する。５０μｌの各サンプル希釈物、標準希釈物またはブランクを９６ウェル試験プレートに移す。ＴＦ−１細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、試験培地１ｍｌ中２×１０５細胞に調節する。９６ウェル試験プレートの各ウェルに細胞懸濁液（５０μｌ）を載せ、前記細胞をＣＯ２インキュベータにおいて７２時間置く。次いで、１０μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ１ｍｌ中６ｍｇ）を添加し、３７℃において４時間インキュベートする。暗所において色素をＳＤＳ／ＨＣｌ（０．１Ｍ  ＨＣｌ中１０％  ＳＤＳ）（１００μｌ）で更に４時間溶解し、Ｅｐｏ依存性生存度を５５０／６９０ｎｍで光度計にて測定する。
【実施例１】
【００８９】
プラスミドＥｐｏ／ｎｅｏの構築
１．  ｐ２−ｎｅｏの構築
（１．１）  ＳＶ４０初期プロモーターを含むｐＳＶ２ｎｅｏからのベクター断片の作成
ベクター構築の土台はｐＳＶ２ｎｅｏ中に含まれるｐＢＲ３２２プラスミド骨格である。より小さいＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ制限断片はこのｐＢＲ３２２骨格を含み、ＳＶ４０由来の隣接ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片はＳＶ４０初期プロモーターの関連断片を有している。
【００９０】
プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７４１９）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断する。生じた２つの断片は３０９２ｂｐ及び２６３７ｂｐのサイズを有している。２６３７ｂｐ断片は、ｐＢＲ３２２骨格を含むＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ制限断片及びＳＶ４０初期プロモーターの断片を含む隣接ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片からなる。２６３７ｂｐを作成し、ゲル電気泳動により精製する。
【００９１】
（１．２）  ネオマイシン耐性遺伝子の作成
ｎｅｏ遺伝子をｐＳＶ２ｎｅｏのトランスポゾンＴｎ５から得る。この遺伝子を遺伝子のコード領域のみを含む断片として増幅させる。クローニング戦略の一部として、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を両末端に導入する。ＨｉｎｄＩＩＩ部位は上流増幅プライマー中に構築し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ部位は下流プライマー中に構築する。増幅領域はｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ０２４３４）の配列中のヌクレオチド２８４６〜１９３８に対応する。このオリゴヌクレオチドを以下のように設計する。
【００９２】
【化１】
2005517391.tif 000002
【００９３】
プライマー２００４−０１及び２００４−０２の増幅産物をＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。このプロセスのパラメーターは、供給された緩衝液中２０ｎｇのｐＳＶ２ｎｅｏ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、１０ミリモルのｄＮＴＰｓ及び２．５ＵのＰｗｏポリメラーゼ、総容量は５０μｌとし、温度プロフィールは５分×９５℃、３５回（３０秒×９５℃，２０秒×６５℃，９０秒×７２℃）、３分×７２℃、次の使用まで４℃に冷却する。
【００９４】
生じた９３５ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラム（Ｍｉｎｉ，Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｍｂＨ）により精製し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲルにより精製し、Ｓｐｉｎカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて溶離させる。
【００９５】
（１．３）  ｐ１−ｎｅｏの構築
増幅させたＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｎｅｏ遺伝子断片をｐＳＶ２−ｎｅｏ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片にＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてライゲートし、大腸菌宿主（大腸菌ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を５０ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させることにより選択する。
【００９６】
プラスミドＤＮＡをクローンから単離し、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩ（それぞれ２５２７ｂｐ、７８０ｂｐ及び２５１ｂｐの３断片）を用いる制限酵素分析によりチェックする。予想断片を示すプラスミドＤＮＡを構築物の該当部分の配列を決定することにより更にチェックする。確認されたＳＶ４０初期プロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをｐ１−ｎｅｏと呼称する。
【００９７】
（１．４）  ＳＶＳ終止領域ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳの作成
ｐＳＶ２ｎｅｏ中に存在するＳＶ４０終止領域の断片（ヌクレオチド７５１〜１５９８）を増幅させるようにＰＣＲプライマーを設計する。上流プライマーはＳｐｅＩに対する制限部位をも含む。ｐＳＶ２−ｎｅｏの７５１位に既に含まれるＢａｍＨＩ部位に加えて、ＥｃｏＲＩ部位をＢａｍＨＩから６ヌクレオチドスペース領域だけ離れた下流プライマーに導入する。２つのプライマーの配列は以下の通りである。
【００９８】
【化２】
2005517391.tif 000003
【００９９】
プライマー２００４−０５＋２００４−０６の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた８７３ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで消化し、ゲル精製する。
【０１００】
（１．５）  ｐ２−ｎｅｏの作成
ｐ１−ｎｅｏプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ＋ＳｐｅＩで消化する。生じた直線化断片を精製し、ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳを含む増幅断片とライゲートし、大腸菌宿主に形質転換する。形質転換体を５０ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させることにより選択する。
【０１０１】
プラスミドＤＮＡをクローンから単離し、ＥｃｏＲＩ（４４１１ｂｐの１断片）、ＮｃｏＩ（３６３１ｂｐ及び７８０ｂｐのサイズの２断片）及びＳｐｅＩ（３４９９ｂｐ、８４０ｂｐ及び７２ｂｐのサイズの３断片）を用いる制限酵素分析によりチェックする。構築物の関連部分の配列を決定することにより予想断片を示すプラスミドＤＮＡを更にチェックする。実証されたＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳを含むプラスミドＤＮＡをｐ２−ｎｅｏと呼称する。
【０１０２】
２．  プラスミドｐ３の構築
（２．１）  ＳＶ４０初期プロモーター断片の作成
プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏをＳＶ４０初期プロモーター断片のソースとして使用する。この断片のサイズはｐ２プラスミドを構築する際に使用したものとほぼ同一である。しかしながら、前記断片の末端はＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩに対する認識部位を導入するように修飾されている。プロモーターを増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは以下のように設計する。
【０１０３】
【化３】
2005517391.tif 000004
【０１０４】
プライマー２００４−０７＋２００４−０８の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた３６５ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、ゲル精製する。
【０１０５】
（２．２）  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター部分の作成
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて順次制限する。ＤＮＡをアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化する。ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片を小断片からアガロースゲル電気泳動により精製した後、ライゲートする。
【０１０６】
（２．３）  プラスミドｐ３の作成及び検証
ＳＶ４０初期プロモーターを含む増幅ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を、作成したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクターにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｍｂＨ）を用いてライゲートする。大腸菌ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを単離し、１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地を用いてコロニーから精製する。
【０１０７】
生じたＤＮＡをＥｃｏＲＩ＋ＮｃｏＩ（３０３９ｂｐ及び２５３ｂｐのサイズの２断片）を用いる制限酵素分析によりチェックする。
【０１０８】
予想断片を示す２つのプラスミドＤＮＡを更に配列決定によりチェックする。各位置を実証できるようにＳＶ４０初期プロモーターの２つの鎖を配列決定する。このプラスミドをｐ３と呼称する。
【０１０９】
３．  ヒトＥｐｏ  ｃＤＮＡの単離
（３．１）  ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を用いる総ＲＮＡの単離
Ｌａｉｎｚｅｒ  Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓ病院から得たヒト腎臓組織からＥｐｏ  ＲＮＡを単離するために使用するＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬はフェノールとグアニジンイソチアシネートの単相溶液である。細胞溶解中、グアニジンイソチアシネートはＲＮＡと水溶性複合体を形成するが、その間に細胞は破壊される。クロロホルムを添加した後遠心すると、溶液をＲＮＡ含有水性相及び有機相に分離する。水性相を分離した後、ＲＮＡをイソプロピルアルコールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、風乾し、ＲＮＡａｓｅ非含有水中に再懸濁する。
【０１１０】
ヒト腎臓組織断片を小片に切断し、１００μｍ細胞ストレーナに通し、１７９×ｇで１０分間遠心し、生じたペレットをＰＢＳで３回洗浄する。次いで、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、滅菌チューブに分取し、−１９６℃に凍結し、次に使用するまで−８０℃で保存する。
【０１１１】
凍結した組織をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（１ｍｌ）を添加することにより溶解し、ホモジナイズし、完全に解離させるために１５〜３０℃において５分間インキュベートする。クロロホルム（２００μｌ）を添加し、チューブを振とうし、１５〜３０℃において２〜３分間インキュベートした後、チューブを１２０００×ｇで１０分間遠心する。遠心後、上部水性相を新しいチューブに注意深く移し、イソプロピルアルコール（５００μｌ）と混合し、１５〜３０℃において１０分間インキュベートする。沈殿したＲＮＡを１２０００×ｇで１０分間遠心し、ペレットをエタノールで洗浄し、再び遠心し、風乾し、ＲＮＡｓｅ非含有ＤＰＥＣ水に溶解させる。総ＲＮＡ含量を２６０ｎｍで光度計にて測定する。
【０１１２】
１ＯＤ２６０ｎｍ＝４０μｇ  ＲＮＡ／ｍｌ
ＯＤ２６０ｎｍ及びＯＤ２８０ｎｍ（タンパク質の最大吸光度）の比を調べることにより、ＲＮＡ単離物の純度を推定することができる。その範囲は１．６〜１．８の間でなければならない。
【０１１３】
（３．２）  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５を用いるｍＲＮＡ単離
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５ｍＲＮＡ  ＤＩＲＥＣＴキットを用いて、真核ｍＲＮＡのポリアデノシン尾ＲＮＡを表面に共有結合させたデオキシチミジレートの２５ヌクレオチド長鎖を含む超磁性ポリスチレン粒子にハイダリダイズする。磁気粒子に結合したｍＲＮＡはＤｙｎａｌ磁気粒子濃縮機（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ（登録商標））を用いて分離することができる。
【０１１４】
洗浄緩衝液：１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１５ｍＭ  ＬｉＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ；
２×結合緩衝液：２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＬｉＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【０１１５】
１０μｇの総ＲＮＡにつき、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（１００μｌ）をＤｙｎａｌ  ＭＰＣ（登録商標）において分離し、２×洗浄緩衝液で２回洗浄する。その間、総ＲＮＡを１×洗浄緩衝液を用いて２００μｌの容量に調節し、６５℃において４分間インキュベートすることにより変性させる。次いで、ＲＮＡをビーズと混合し、室温において５分間インキュベートし、Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ（登録商標）において分離する。ビーズを１×洗浄緩衝液で２回洗浄する。ポリアデニル化ＲＮＡを、６５℃において溶離緩衝液（２×１０μｌ）と４分間インキュベートすることによりＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５から溶離させる。ＤｙｎａｂｅａｄｓをＤｙｎａｌ  ＭＰＣ（登録商標）において分離し、上清を直ちに新しいＲＮＡｓｅ非含有遠心管に移す。溶離液を直接逆転写のために使用する。
【０１１６】
（３．３）  逆転写
Ｅｐｏの特異的プライマーは８０℃において４分間インキュベートすることにより変性し、ｍＲＮＡは６５℃において５分間インキュベートすることにより変性する。以下の成分を氷上で滅菌した１．５ｍｌ容量の微量遠心管に添加する。
【０１１７】
【表１】
2005517391.tif 000005
インキュベーション：３７℃において６０分間；
不活化：１００℃において５分間。
【０１１８】
（３．４）  ポリメラーゼ連鎖反応
以下の成分を４℃において滅菌した１．５ｍｌ容量の微量遠心管に添加する。ＰＣＲ条件を以下にリストする。
【０１１９】
【表２】
2005517391.tif 000006
【０１２０】
ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析する。
【０１２１】
（３．５）  アガロースゲル電気泳動
６×ＢＸ緩衝液：０．２５％プロモフェノールブルー，０．２５％  キシレンシアノール，３０％  グリセロール；
ＴＡＥ緩衝液：２４２ｇ  トリス塩基，５７．１ｍｌ  氷酢酸，１００ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、Ｈ２Ｏで１０００ｍｌに調節；
Ｌａｍｄａ−Ｍａｒｋｅｒ  ＩＩＩ：１０μｇ  バクテリオファージラムダ−野生型−Ｄａｎｎ（２．５μｌ  ＨｉｎｄＩＩＩ＋２．５μｌ  ＥｃｏＲＩ＋２０μｌ  緩衝液Ｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、Ｈ２Ｏで２００μｌまで充填；３７℃で１時間消化、６５℃で２０分間不活化、４０μｌ  ＢＸ充填緩衝液を補充）。
【０１２２】
アガロース（１ｇ）及び１×ＴＡＥ緩衝液（９９ｇ）を電子レンジで溶融し、約６０℃に冷却し、１０ｍｇ／ｍｌ  臭化エチジウムストック溶液（３μｌ）を補充する。ゲルを１×ＴＡＥ緩衝液を用い、分離しようとするＤＮＡ断片の長さに応じて１００〜３００Ｖで約３０分間流す。各レーンは６×ＢＸ緩衝液（２μｌ）と混合したサンプル（１０μｌ）を含む。Ｌａｍｄａ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化分子量標準物質との比較に基づいてＤＮＡ断片を同定する。
【０１２３】
（３．６）  ＰＣＲ産物及びライゲーション用ベクターの作成
（３．６．１）  粘着末端クローニングのためのベクターＤＮＡ及びインサートの制限
制限酵素（１０ｕｌ）及び適当な制限緩衝液を製造業者の指示に従ってベクターＤＮＡ（１μｇ）及びインサートと混合する。混合物を３７℃（Ｓｍａｌの場合には３０℃）で使用した酵素、ベクター及びインサートに応じて３０〜６０分間インキュベートする。次いで、酵素を６５℃まで１０分間加熱することにより不活化し、反応化合物をアガロースゲル電気泳動により分析する。
【０１２４】
（３．６．２）  ライゲーション
ｐＩＲＥＳｎｅｏＳＶ４０ベクター
ｐＩＲＥＳｎｅｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、１つのメッセンジャーＲＮＡから２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能とする脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ｐＩＲＥＳｎｅの発現カセットはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモーター／エンハンサの後に複クローニング部位（ＭＣＳ）、ＥＣＭＶ  ＩＲＥＳの後にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む。このベクターでは、ＣＭＶプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターで置換されている。
【０１２５】
ベクター及びＰＣＲ産物をＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートする。最適ライゲーションのために、（長さに応じて）約２０ｎｇのベクター及び２００ｎｇのインサートを約１：１０のモル比で使用し、総容量１０μｌのＨ２Ｏ中で以下の試薬を混合する。１５℃で一晩、室温で３時間インキュベースする。次いで、６５℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱不活化する。
【０１２６】
【表３】
2005517391.tif 000007
【０１２７】
（３．６．３）  細菌及び培地
ＪＭ１０９：（米国のＰｒｏｍｅｇａ）；
ＬＢ培地：カゼイン由来のペプトン（１０ｇ），酵母抽出物（５ｇ），ＮａＣｌ（１０ｇ）、Ｈ２Ｏで１０００ｍｌに調節し、５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．０に設定；
ＬＢ寒天：ＬＢ培地（１０００ｍｌ）中寒天（１５ｇ）；
ＬＢ−Ａｍｐ：ＬＢ培地（１０００ｍｌ）中１００ｍｇ／ｍｌ  アンピシリン（１００）；
ＳＯＣ培地：バクトトリプトン（２０ｇ），酵母抽出物（５ｇ），１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＫＣｌ，１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ  グルコース，１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４。
【０１２８】
（３．６．４）  ＣａＣｌ２を用いる形質転換
コンピテント細菌（ＪＭ１０９）の作成
ＬＢ培地（１０ｍｌ）に大腸菌（ＪＭ１０９）を接種し、３７℃で一晩増殖させる。細菌培養物（４ｍｌ）をＬＢ培地で１：１００希釈し、ＯＤ２６０ｎｍが０．８になるまで増殖させる。細菌を４℃において４５００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞ペレットを０．１ＭＣａＣｌ２（４℃）（１０ｍｌ）／使用した細菌懸濁液（５０ｍｌ）中に再懸濁する。細胞を遠心し、ペレットを０．１Ｍ  ＣａＣｌ２（２ｍｌ）中に再懸濁し、１００μｌの総容量まで分取し、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存する。
【０１２９】
形質転換
予冷した１７×１００ｍｍポリプロピレン培養チューブにおいて、ＪＭ１０９コンピテント細菌にプラスミドＤＮＡ（５〜１０ｎｇ）を添加し、やさしく混合し、氷上に３０分間置く。次いで、細胞を正確に４２℃の水浴中で振とうせずに４５秒間熱ショックを加え、直ちに氷上に２分間置く。次いで、ＳＯＣ培地（９００μｌ）をチューブに添加し、３７℃において３０分間インキュベートした後ＬＢ−Ａｍｐプレートにおいて細菌懸濁液（１００μｌ）を平板培養する。
【０１３０】
（３．６．５）  グリセリン培養物のスクリーニング及び定着
アンピシリン耐性コロニーをＰＣＲ技術を用いて挿入したＤＮＡ断片についてスクリーニングする。アンピシリン耐性コロニーの一部をＰＣＲ反応混合物及びクローン化ＤＮＡ断片（以下参照）に対する特定プライマーと混合する。ポジティブコロニーはアガロースゲル電気泳動においてＰＣＲ増幅ＤＮＡバンドを示す。次いで、更なる分析及びプラスミド精製のために前記コロニーをＬＢ−Ａｍｐ培地において増殖させる。更なる使用及び保存のために、所望の細菌培養物（１ｍｌ）を８７％  グリセリン（５００μｌ）と混合し、−８０℃で保存する。
【０１３１】
（３．６．６）  Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ精製系
細胞再懸濁溶液：５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００μｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅ  Ａ；
細胞溶解溶液：０．２Ｍ  ＮａＯＨ，１％  ＳＤＳ；
中和溶液：４．０９ｍＭ  グアニジン塩酸塩，０．７５９Ｍ  酢酸カリウム，２．１２Ｍ  氷酢酸（ｐＨ４．２）；
カラム洗浄溶液：６０ｍＭ  酢酸カリウム，１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６０％  エタノール。
【０１３２】
ＬＢ−Ａｍｐ培地（２〜３ｍｌ）に単一コロニーを接種し、３７℃において一晩インキュベートする。溶液を１２０００×ｇで５分間遠心し、生じたペレットを順次懸濁溶液（２５０μｌ）及び細胞溶解溶液（２５０μｌ）中に十分に再懸濁し、チューブを４回反転させることにより混合し、室温において１〜５分間インキュベートする。その後、（室温で５分間インキュベートした）アルカリプロテアーゼ溶液（１０μｌ）及び中和溶液（３５０μｌ）を添加する。直ちにチューブを４回反転することにより混合し、細菌ライゼートを室温において１２０００×ｇで１０分間遠心する。清澄化したライゼートをＳｐｉｎカラムに移し、１２０００×ｇで５分間遠心し、カラムを洗浄溶液（７５０μｌ／２５０μｌ）で２回洗浄する。ＤＮＡをヌクレアーゼ非含有水（１００μｌ）で溶離させる。
【０１３３】
（３．６．７）  プラスミドの配列決定
挿入された配列を特定プライマーとＩＢＬ（オーストリアのＧｅｒａｓｄｏｒｆ）及びＧｅｎＸｐｒｅｓｓ（オーストリアのＭａｒｉａ  Ｗｏｒｔｈ）を用いて配列決定する。Ｅｐｏ及びＳＶ４０初期プロモーターの増幅のため及び配列分析のためのオリゴヌクレオチドプライマーを以下にリストする。
【０１３４】
【表４】
2005517391.tif 000008
【０１３５】
４．  プラスミドｐ５の構築
（４．１）  Ｅｐｏ遺伝子断片の作成
Ｅｐｏ（ヒトエリスロポエチン）の構造遺伝子を鋳型ＤＮＡとしてｐＳＶＧＰＩＲＮＥＯを用いてＰＣＲにより増幅する。Ｅｐｏの配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１１３１９．１で寄託されている。ＮｏｔＩ及びＫｓｐＩの認識部位をそれぞれ上流及び下流プライマーに導入する。プライマーは以下のように設計する：
【０１３６】
【化４】
2005517391.tif 000009
【０１３７】
プライマー２００４−０９＋２００４−１０の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた６０４ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＫｓｐＩ及びＮｏｔＩで消化し、ゲル精製する。生じた５９２ｂｐ  ＫｓｐＩ／ＮｏｔＩ断片を下記するトリプルライゲーションに使用する。
【０１３８】
（４．２）  終止領域ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳの作成
ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳの終止領域を、ｐ２−ｎｅｏの構築についてセクション１．４に上記した方法と同様にしてｐＳＶ２ｎｅｏからＰＣＲにより再クローン化する。ただし、プライマーを異なる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いて設計する。Ｋｓｐに対する部位（＝ＳａｃＩＩ）を上流プライマーに導入し、ＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩに対する部位を下流プライマーに導入する。
【０１３９】
【化５】
2005517391.tif 000010
2005517391.tif 000011
【０１４０】
プライマー２００４−１１＋２００４−１２の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた８７３ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＫｓｐＩ及びＳａｃＩで消化する。次いで、生じた８５８ｂｐのＤＮＡをゲル精製する。
【０１４１】
（４．３）  ｐ３ベクター部分の作成
ｐ３プラスミドＤＮＡをＮｏｔＩ及びＳａｃＩで順次消化する。ＤＮＡをアルカリホスファターゼで処理し、ベクター断片をゲル精製する。
【０１４２】
（４．４）  プラスミドｐ５のトリプルライゲーション及び単離
プラスミドｐ３のＮｏｔＩ／ＳａｃＩベクター部分、ＫｓｐＩ／ＮｏｔＩ  Ｅｐｏ遺伝子及びＫｓｐ／ＳａｃＩ終止領域ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳを１つのライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でライゲートする。形質転換体を１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地において選択する。
【０１４３】
挿入した両断片を含むポジティブ形質転換体を、標識プローブとして増幅断片２００４−０９／２００４−１０及び２００４−１１／２００４−１２を用いてコロニーハイブリダイゼーションすることによりスクリーニングする。両プローブでポジティブハイブリダイゼーションシグナルを与える１０クローンを“中間”規模プラスミド作成（Ｑｉａｇｅｎ）のために選択する。
【０１４４】
制限分析を酵素ＢａｍＨＩ（４７２３ｂｐの１断片）、ＥｃｏＲＩ（２９１３ｂｐ及び１８１０ｂｐの２断片）及びＰｖｕＩ（２５１３ｂｐ、１２０４ｂｐ、９０３ｂｐ及び１０３ｂｐの４断片）を用いて実施する。適正な制限断片を示す２つのコロニーを選択し、配列決定によりチェックする。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋にクローン化した全カセットを配列決定し、予想ヌクレオチド配列と比較する。単一ヌクレオチドはそれぞれ成功裏に確認され得る。このプラスミドをｐ５と呼称する。
【０１４５】
５．  ｐＥｐｏ／ｎｅｏの構築
（５．１）  ｐＥｐｏ／ｎｅｏ  １２−１の構築
ｐ５プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＳＶ４０プロモーター／Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶターミネーターのカセットを表す生じた１７９２ｂｐ断片をゲル精製する。
【０１４６】
プラスミドｐ２−ｎｅｏもＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、直線化ベクターをゲル精製する。更に、ＤＮＡをアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ酵素リムーバーを用いて精製する。
【０１４７】
４４１１ｂｐ  ｐ２−ｎｅｏベクター及びｐ５由来の１７９２ｂｐ  カセットの両断片をライゲートし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、大腸菌ＳＵＲＥに形質転換する。プラスミドＤＮＡを７０ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させた各種形質転換体から単離し、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩを用いる消化により分析する。
【０１４８】
予想断片（ＥｃｏＲＩ：６１９１ｂｐ、ＮｃｏＩ：４０８５ｂｐ，１３２６ｂｐ及び７８０ｂｐ、ＰｖｕＩＩ：３２７３ｂｐ，２１３０ｂｐ，６８５ｂｐ及び１０３ｂｐ）を示すクローンを選択し、ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２と呼称する。
【０１４９】
追加精製のために、ＤＮＡを大腸菌ＳＵＲＥ（上記参照）に再形質転換し、プラスミドＤＮＡを単一コロニー（ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２−１）を接種した培養物から“Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ”手順（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて作成する。酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ及びＮａｒＩを用いて制限分析を実施する。予想される断片及びサイズを見つけることができ、このクローンが適正なｐＥｐｏ／ｎｅｏクローンであることが確認される。
【０１５０】
（５．２）  ｐＥｐｏ／ｎｅｏの最終構築
ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２−１中のＥｐｏ遺伝子の上流領域をスタートＡＴＧから−３位で変化させる。追加ヌクレオチドＡを導入すると、スタートＡＴＧから−３位にプリン塩基Ｇが生ずる。この位置のプリンは遺伝子の発現レベルを向上させ得る。このために、Ｅｐｏ遺伝子を適応上流プライマー２００４−０９ａを用いて再増幅させる：
オリゴ２００４−０９−ａ：    長さ  ４６量体
５’−ｇｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃａａｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｃｇａａｔｇｔｃｃｔｇｃｃｔｇｇｃｔｇｔｇｇ−３’                                        配列番号３２。
【０１５１】
プライマー２００４−０９＿ａ＋２００４−１０の増幅産物を上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた６０５ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＫｓｐＩ及びＮｏｔＩで消化する。次いで、生じた５９３ｂｐのＤＮＡをゲル精製する。
【０１５２】
ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２−１プラスミドＤＮＡをＫｓｐＩ及びＮｏｔＩで消化して、Ｅｐｏ遺伝子を除去する。次いで、５５９９ｂｐ断片をゲル精製する。作成した両ＤＮＡを相互にライゲートする（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを単離し、７０ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地においてコロニーから精製する。ＤＮＡを第１スクリーニングにおいてＮｃｏＩを用いる制限により分析する。
【０１５３】
“Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ”手順（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを分離するためにポジティブクローンを選択する。ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｔｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを用いて延長制限分析を実施する。予想される断片及び大きさを見つけることができ、クローンが適正なＥｐｏ／ｎｅｏとして確認される。ｐＢＲ３２２ベクター部分に挿入された全カセット（ＳＶ初期＿プロモーター−ｎｅｏ遺伝子−ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ−ＳＶ４０初期＿プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ）の単一ヌクレオチドも配列決定により確認する。
【実施例２】
【０１５４】
プラスミドＥｐｏ／ｄｈｆｒの構築
１．  ｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳの構築
（１．１）  ｄｈｆｒ遺伝子の作成
ベクター構築のために使用されるｄｈｆｒ遺伝子はプラスミドｐＬＴＲｄｈｒｆ２６（ＡＴＣＣ  ３７２９５）中に存在するマウスｃＤＮＡから採取する。マウスｄｈｆｒ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＭＵＳＤＨＦＲ）はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２６３１６として入手可能である。
【０１５５】
ｄｈｆｒをＮｏ．５６のスタートコドンＡＴＧからＮｏ．６１９のストップコドンＴＡＡのコード領域を含む断片を生ずるように設計したプライマーを用いてｐＬＴＲｄｈｆｒ２６から増幅させる。上記したネオマイシン耐性遺伝子の増幅のように、ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＳｐｅＩ部位をそれぞれ上流及び下流増幅プライマーに導入する。ＥｃｏＲＩ部位もＳｐｅＩ部位のそばに逆プライマーに導入する。オリゴヌクレオチド配列は次の通りである：
【０１５６】
【化６】
2005517391.tif 000012
【０１５７】
プライマー２００４−１３＋２００４−１４の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた５８８ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製する。
【０１５８】
（１．２）  ｐ１−ｄｈｆｒ−ＣＤＳの作成
増幅させたＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｈｆｒ遺伝子断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｐＳＶ２−ｎｅｏ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片にライゲートし、大腸菌宿主に形質転換する。形質転換体を５０ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させることにより選択する。形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを単離し、５０ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地でコロニーから精製する。
【０１５９】
プラスミドＤＮＡをクローンから単離し、ＥｃｏＲＩ＋ＳｃａＩを用いる制限分析によりチェックする（２２２５ｂｐ、５１４ｂｐ及び４７３ｂｐのサイズの３断片）。
【０１６０】
予想断片を示すプラスミドＤＮＡを更に構築物の関連部分を配列決定することによりチェックする。確認されたＳＶ４０初期プロモーター及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをｐ１−ｄｈｆｒ−ＣＤＳと呼称する。配列の分析から、ＭＵＳＤＨＦＲの公開された配列からｄｈｆｒ遺伝子内の１つの偏位、特にＭＵＳＤＨＦＲ配列のＮｏ．４５１でのＴのＣへの変化が分かった。その後の配列決定で、この変化がソースプラスミド中にも存在することが判明した。しかしながら、ＣＴＴ及びＣＴＣがいずれもロイシンをコードするので生じた変化はヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない。
【０１６１】
（１．３）  ｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳの作成
ｐ１−ｄｈｆｒ−ＣＤＳプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ＋ＳｐｅＩで消化する。生じた直線化断片を精製し、（上記した）ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳを含む増幅断片とライゲートする。形質転換及び選択後、生じた断片をＡｃｃＩを用いる制限分析により分析する（２９９４ｂｐ、８５５ｂｐ及び２１６ｂｐの３断片）。少数を選択し、更にＨｉｎｃＩＩ（それぞれ３４６６ｂｐ及び５９９ｂｐの２断片）、ＡｆｌＩＩＩ（それぞれ２８７２ｂｐ及び１１９３ｂｐの２断片）及びＢｇｌＩ（それぞれ２３７１ｂｐ及び１６９４ｂｐの２断片）を用いて分析する。
【０１６２】
適正なサイズで予想断片を示すプラスミドＤＮＡを配列決定することにより更にチェックする。確認されたプラスミドをｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳと呼称する。
【０１６３】
２．  ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒの構築
（２．１）  ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ  ２１の作成
ｐ５プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＳＶ４０プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０ターミネーターのカセットを表す生じた１７９２ｂｐ断片をゲル精製する。
【０１６４】
プラスミドｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳもＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、直線化ベクターをゲル精製し、Ｓｕｐｅｌｃｏスピンカラムを用いて溶離させる。更に、ＤＮＡをアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ酵素リムーバーを用いて精製する。
【０１６５】
４０５３ｂｐ  ｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳベクターとｐ５由来の１７９２ｂｐカセットの両断片をライゲートし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、大腸菌ＳＵＲＥに形質転換する。７０ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させた形質転換体コロニーをＥｐｏ遺伝子（ＰＣＲ産物）をプローブとして用いてハイブリダイズさせる。プラスミドＤＮＡを各種ポジティブクローンから単離し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩを用いて消化することにより分析する。
【０１６６】
予想断片（ＮｃｏＩ：４０８５ｂｐ及び１７６０ｂｐ）を示すクローン選択し、Ｅｐｏ／ｄｈｆｒ−２１と呼称する。更なる精製のために、ＤＮＡを（上記した）大腸菌ＳＵＲＥに形質転換し、単一コロニー（ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１−１）を接種した培養物から“Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ”手順（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを作成する。
【０１６７】
制限分析を酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｔｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを用いて実施する。予想される全ての断片及びサイズを見つけることができ、前記クローンが適正なｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１として確認される。
【０１６８】
（２．２）  ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒの最終構築
ｐＥｐｏ／ｎｅｏと同様にして、Ｅｐｏ／ｄｈｆｒ−２１中のＥｐｏ遺伝子の上流領域をスタートＡＴＧから−３の位置で変化させる。追加のヌクレオチドＡを導入するとスタートＡＴＧから−３の位置にプリン塩基Ｇが生ずる。Ｅｐｏ遺伝子を実施例１のセクション４．２に記載されているように再増幅させる。
【０１６９】
ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１プラスミドＤＮＡをＫｓｐＩ及びＮｏｔＩで消化してＥｐｏ遺伝子を除去する。次いで、５２５９ｂｐ断片をゲル精製する。
【０１７０】
作成した両ＤＮＡを相互にライゲートする（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを単離し、７０ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地でコロニーから精製する。ＤＮＡを第１スクリーニングにおいてＮｃｏＩを用いる制限により分析する。
【０１７１】
“Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ”手順（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを単離するためにポジティブクローンを選択する。延長制限分析をＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを用いて実施する。予想される断片及びサイズを見つけることができ、前記クローンが適正なｐＥｐｏ／ｄｈｆｒとして実証される。
【０１７２】
ｐＢＲ３２２ベクター−部分に挿入した全カセット（ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０Ｌ  ＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ−ＳＶ４０初期プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０Ｌ  ＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ）の単一ヌクレオチドもすべて配列決定により確認する。
【実施例３】
【０１７３】
ｐＥｐｏ／ｎｅｏ及びｐＥｐｏ／ｄｈｆｒから作成した組換えＣＨＯ細胞
１〜５×１０４／ｃｍ２の細胞を２５ｃｍ２容量のＴフラスコまたは９６ウェルプレートに接種した後リポフェクチントランスフェクションを実施する。２つのプラスミドを５０：１＝Ｅｐｏ／ｎｅｏ：Ｅｐｏ／ｄｈｆｒの比で混合し、リポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に製造業者のプロトコルに従って吸着させる。
【０１７４】
簡単に説明すると、０．２５μｇ／ｃｍ２のＤＮＡ及び１．５μｌ／ｃｍ２のリポフェクチン試薬を用い、このＤＮＡ／脂質カクテルを２００μｌ／ｃｍ２−細胞層に調節する。次いで、無血清ＤＭＥＭ中で細胞にトランスフェクションカクテルを４時間載せた後、ＤＮＡ含有培地を培養培地で交換する。血清含有培地で２４時間培養した後、選択培地に交換する。トランスフェクトした細胞プールをまず選択培地において集密まで、次いで増幅培地（４．８×１０−８Ｍ  ＭＴＸ）において培養した後、細胞培養上清をＥＬＩＳＡによりＥｐｏ産生についてスクリーニングする。最高の手順を決定し、ＭＴＸ濃度を２倍に増加させ、最良の手順を更なる培養のために使用する。７個の組換え細胞プールを選択し、増殖性、Ｅｐｏ生産性、タンパク質パターン（ウェスタンブロット分析により）、Ｅｐｏ機能性及び染色体安定性を比較する。
【０１７５】
Ｔ２５フラスコでのトランスフェクションは、１つのＴ２５フラスコあたり２．５μｇ  ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、０．０５μｇ  ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び１５μｌ  リポフェクチンを用い（０９／Ｔ２５／１及び０９／Ｔ２５／２）、１つのＴ２５フラスコあたり２μｇ  ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、０．４μｇ  ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び１５μｌ  リポフェクチンを用いて実施する（０９／Ｔ２５／３及び０９／Ｔ２５／４）。
【０１７６】
更に、５プレートにそれぞれ１プレートあたり１０μｇ  ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、０．２μｇ  ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び６０μｌ  リポフェクチンをトランスフェクトし（０９／９６／１−０９／９６／５）、５プレートにそれぞれ１プレートあたり８μｇ  ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、１．６μｇ  ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び６０μｌ  リポフェクチンをトランスフェクトする（０９／９６／１−０９／９６／５）。プレート１１及び１２にはそれぞれ６．２５μｇ  ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、０．０８μｇ  ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び３７．５μｌ  リポフェクチンをトランスフェクトする。
【０１７７】
簡単に説明すると、０．２５μｇ／ｃｍ２  ＤＮＡ及び１．５μｌ／ｃｍ２  リポフェクチン試薬を用い、このＤＮＡ／脂質カクテルを２００μｌ／ｃｍ２−細胞層に調節する。  一連のトランスフェクションは主にミクロタイタープレートにおいて実施する。なぜならば、以前の実験で１つの培養ユニットでのクローン数が多くとも３〜５であるからである。このことは、Ｔフラスコにおいて数百のクローンから単離するよりもモノクローナルトランスフェクタントがより簡単に単離されることを意味する。表１に、９６ウェルプレートあたりのクローンの数及び増幅圧の存在または非存在下でのＥＬＩＳＡ力価を示す。トランスフェクトした細胞プールをまず選択培地において集密まで、次いで増殖培地（４．８×１０−８Ｍ  ＭＴＸ）において培養した後、細胞培養上清をＥＬＩＳＡによりＥｐｏ産生についてスクリーニングする。約１０００個の増殖ウェルをスクリーニングし、５０個の培養物をＭＴＸ濃度を漸増させて特異的Ｅｐｏ産生力について試験する。最高の手順を決定し、ＭＴＸ濃度を２倍に増加し、最良の手順を更なる培養のために使用する。
【０１７８】
選択ステップ及び第１回増幅ステップを９６ウェルプレートで実施し、４．８×１０−８Ｍ  ＭＴＸで増殖させた全てのクローンをスクリーニングした後、７つのクローンを選択し、それぞれ０９／９６／１Ｆ５、０９／９６／３Ｄ５、０９／９６／３Ｈ５、０９／９６／５Ｄ４、０９／９６／５Ｈ１、０９／９６／６Ｃ５及び９６／９６／７Ｅ６と呼称し、その増殖性、Ｅｐｏ生産力、ウェスタンブロットにおけるタンパク質パターン、Ｅｐｏ機能性試験及び染色体安定性を比較する。
【０１７９】
細胞倍化時間は全てのクローンで同一のようであり、１週間に２回１：２〜１：５分裂され得る。ＭＴＸ濃度を９．６×１０−８Ｍから１．９×１０−７Ｍに増加させても生産性が向上するが、ＭＴＸ濃度を更に倍化してもＥＬＩＳＡ値に変化はない。そこで、サブクローニングを３．８×１０−７Ｍ  ＭＴＸで実施する。イムノフルオレッセンスを、単一培養物に有意な差がない１．９×１０−７Ｍ  ＭＴＸで分析する。
【０１８０】
細胞形態を光学顕微鏡及びＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ核ＤＮＡ分析により比較する。クローン０９／９６／７Ｅ９、０９／９６／６Ｃ５、０９／９６／５Ｈ１、０９／９６／５Ｄ４及び０９／９６／３Ｄ５は宿主細胞株ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−と同じ核サイズ分布
を示す。対照的に、細胞株０９／９６／１Ｆ５及び０９／９６／３Ｈ５は大きな核を有している。以前の実験から、これは染色体の数が増えた結果生ずることは公知である。従って、更なる安定性のためにクローン０９／９６／３Ｄ５を使用することに決めた。
【０１８１】
ＥｐｏについてのＴＦ−１細胞に対する機能性試験は組換え医薬産物に比較して７つ全ての培養上清で同じ勾配を示す。
【０１８２】
組換えタンパク質を各ＭＴＸ濃度でＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより試験し、全ての組換え培養上清で僅かの変化しか見られない。このクローンはＥｐｏを産生する。
【０１８３】
要約及び検討：
真核発現ベクターの構築から哺乳動物細胞のトランスフェクションまでの組換えＥｐｏ発現ＣＨＯ細胞株の選択及びポリクローナルＥｐｏ発現細胞プールの単離を記載している。分析は主にＥＬＩＳＡ、イムノフルオレッセンス、ウェスタンブロッティング及びインビトロ機能性試験に基づく。これらの方法は全て、ｎｇ／ｍｌ量で低産生細胞プール培養上清及びより安定な組換え細胞をスクリーニングし得る濃度範囲で確立されている。
【０１８４】
遺伝子コピー数を最高３．８×１０−７Ｍ  ＭＴＸで段階的に増幅させた組換えＣＨＯプールを作成する。これらの細胞は１週間に２回１：３〜１：４分裂され得、毎回高レベルのＥｐｏがＥＬＩＳＡで検出される。
【実施例４】
【０１８５】
組換え細胞株の更なる選択
更なる安定化のために組換え細胞プール０９／９６／３Ｄ５を使用する。ＭＴＸ濃度を段階的に０．３８μＭ  ＭＴＸまで増加させる。この増幅レベルで、組換え３Ｄ５細胞を１０及び２０細胞／ウェルでサブクローニングする。ウェルの培養上清の単一クローンでのスクリーニングはＥＬＩＳＡにより実施する。表２に、サブクローニング条件及び０．３８μＭ  ＭＴＸの存在下での組換え細胞プール３Ｄ５の効率を示す。単一クローンの３００上清を試験する。継代から４日後高いＥｐｏ力価を有するクローンを２４ウェルプレートにおいて０．７７μＭ  ＭＴＸを用いて選択する。
【０１８６】
前記クローンのうち７個のクローンを液体窒素中で保存し、ＭＴＸ濃度を１．５４μＭまで増加させることにより遺伝子コピー数を更に増幅させるために選択する。
【０１８７】
表３は、平板培養条件及び第２回安定化の効率を示す。ここで、クローン０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９及び０９／９６／３Ｄ５／１８Ｅ５を１．５４μＭ  ＭＴＸで最後にサブクローン化する。１ウェルあたりの細胞数を４細胞に減ずる。２６０単一クローンをスクリーニングし、そのうち各サブ培養の２０以上のクローンをＴフラスコに移し、特異的生産性についてスクリーニングする。最終産生クローンを特異的発現率、増殖条件及び核サイズ分布のような基準により決定する。四倍性を示すクローンは経験からバイオリアクターにおいて複雑な増殖パターンを示す傾向にあるので、このような細胞は捨てる。スクリーニング後、６つのサブクローン（４つの１Ｈ９サブクローン及び２つの１８Ｅ５サブクローン）、すなわち０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／４Ｃ２、０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／６Ｃ２、０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／６Ｄ４、０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／１５Ｂ４、０９／９６／３Ｄ５／１８Ｅ５／７Ａ６及び０９／９６／３Ｄ５／１８Ｅ５／１５Ｃ３を選択し、液体窒素中で凍結する。
【実施例５】
【０１８８】
無血清培養培地への適応
実施例４からの最終６個の組換え細胞株を最後のサブクローニングステップ後無血清培養条件への適応のために選択する。
【０１８９】
細胞をＴ２５フラスコに約５×１０４／ｃｍ２の細胞でサブクローニングから７〜１２継代で接種し、集密まで３〜４日培養する。この時点で培地を無血清適応培地で完全に交換し、その後培地の８０％を毎日新しくする。全ての懸濁細胞を培養物に戻す。ほぼすべての細胞が懸濁増殖する適応時間後、クローンを１週間に２回継代し、懸濁液培養として培養する。
【０１９０】
クローンを無血清適応培地で１１〜１３継代培養した後、凍結保存する。それぞれ５×１０６細胞を含む６本のアンプルを液体窒素中無血清凍結培地と一緒に細胞株毎に凍結させる。融解後、クローンを無血清産生培地において培養する。産生クローンを選択するための分析特性付けは融解後第２または第３継代の上清で実施する。
【０１９１】
分析試験には、
特異的増殖率［μ］−（μ＝Ｉｎ（Ｘ２／Ｘ１）／日数）、
特異的生産性［ｑｐ］−（Ｑｐ＝産物産生×１０６／（細胞数×日数））、
ウェスタンブロット、
等電点電気泳動、
ＤＮＡ含量及び安定性、
クローン安定性
が含まれる。
【０１９２】
６つ全ての細胞株を無血清増殖培地で増殖させることができ、１週間に２回分裂させる。血清なしでも凍結保存し、融解後培養培地を無血清産生培地に交換する。この調合物は高いグルコース及びアミノ酸濃度を有する。
【０１９３】
５継代後、異なるタンパク質及び細胞パラメーターを測定し、１つの産生クローン（０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／６Ｃ２；６Ｃ２と省記）及び１つのバックアップクローン（０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／４Ｃ２；４Ｃ２と省記）を選択する。
【実施例６】
【０１９４】
組換え細胞株の比較
実施例４及び５からの６個の細胞株の増殖特性を、培養物中の細胞数及び継代中の分裂比を測定することにより数週間にわたり調べる。Ｅｐｏ生産性をＥＬＩＳＡにより試験する。これらのデータから、上記した特異的生産性及び特異的増殖率を計算する。
【０１９５】
表４に、３日の培養後１：３の分裂比で標準培養条件下で得たデータが要約されている。
【０１９６】
分裂後及び更に３日後の細胞数（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒで測定）を示す。
【０１９７】
還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
６個の細胞株の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、分子量の違いについて比較する。６個の上清は、通常高度にグリコシル化したタンパク質中に見られるスミアと同一のＳＤＳパターンを示す（データ示さず）。
【０１９８】
類似の市販品は、多分下流プロセシング中に分離するばらばらのバンドから生ずるより明確なバンドとして移動する。
【０１９９】
ＩＥＦ−ウェスタンブロット
ＩＥＦ−ウェスタンブロット分析は糖タンパク質の可能性あるタンパク質ミクロ不均質性を反映しなければならない。ゲルに充填されるタンパク質の量に従って１４個のバンドが目に見えるようになる。ゲルのほぼ真ん中にウェスタンブロットで見られる１つの特徴的な二重バンドが存在する。この二重バンドの下の次のバンドはバンド番号１として規定され、９〜１０バンドがゲルの酸性部分で肉眼で観察可能である。類似の市販品は異質産物中のバンド番号６〜９に相当する４つの主要バンドを与える。
【０２００】
組換え細胞のＤＮＡ含量
ＤＮＡ含量は細胞株の染色体の数に比例する。組換え細胞株の安定性は部分的に染色体数に影響され、ＤＮＡ含量の同一性は宿主細胞株（ＣＨＯ  ｄｈｆｒ）と比較することにより証明される。
【０２０１】
要約及び検討：
組換えＥｐｏ発現ＣＨＯ細胞株の単離について記載する。２回のサブクローニング後、６個の細胞株を１つの最終産生クローンの呼称の基礎として諸特性について比較する。分析の基準は主にＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング及びＩＥＦ試験、並びにＦＡＣＳ分析によるＤＮＡ測定である。
【０２０２】
組換え培養上清のウェスタンブロットパターンは、市販の精製タンパク質に比較して幾つかの追加低分子量バンドを示す。１つの説明は、これらの追加バンドは比較の市販物につながる下流プロセシング中に除去されるアイソフォームを示すことである。別の可能性は、ＳＤＳの不完全取り込みのために人為的バンドが検出されることである。等電点電気泳動はそのＱｐに関係なくすべての細胞培養上清で同一のアイソフォーム分布を示す。
【０２０３】
最良の産生クローン及び最も簡単なハンドリングのクローンは産生クローンとして選択されたクローン６Ｃ２である。バックアップとしてクローン４Ｃ２を選択する。両クローンはローラーボトルにおいて増殖され得る。
【実施例７】
【０２０４】
ＴフラスコにおけるＣＨＯ細胞の培養
組換えヒトエリスロポエチンをＴフラスコ中無血清条件下でチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）において産生させる。培養物に２．６７×１０５／ｍｌの細胞を接種する。３日のインキュベーション期間後、最終細胞密度は９．３５×１０５細胞／ｍｌに達する（＝＞μ＝０．４２日−１）。
【０２０５】
実施例１〜６はＥｐｏを発現する多数のＣＨＯクローンの作成を記載している。実施例４及び５で得た６クローンのうち、クローンＣＨＯ  ６Ｃ２を優れた高い細胞特異的生産性及び高い特異的増殖率を有するために選択する。
【実施例８】
【０２０６】
バイオリアクターにおけるＣＪＯ細胞の培養
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を１５０Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｔ４３Ｃ６Ｃ２）モードで培養する。アミノ酸補充した５０：５０  ＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ  Ｆ１２から構成され、０．２５％  植物ペプチド、０．１％  ルトロール、１．５４μＭ  メトトレキサート（ＭＴＸ）、４ｇ／Ｌ  グルコース、２．５ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、エタノールアミン、クエン酸第二鉄、アスコルビン酸及び亜セレン酸ナトリウムを含有する細胞培養培地を用いる。この培地は高価な機能性タンパク質（組換えまたは天然源由来のもの）を含んでいない。動物起源の成分を存在させる。細胞を５６Ｌ培地に約５×１０５細胞／ｍｌで接種する。ｐＯ２を５０％空気飽和、温度を３７℃、ｐＨ７．０に設定し、発酵中一定に保つ。
【０２０７】
グルコース濃度を１ｇ／Ｌ以上に保つ。４日後、リアクターに新鮮な培地を１５０Ｌまで充填する。９日後に１８７５ｍｌのアミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含有する栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。１０日後、更に１８７５ｍｌの栄養濃縮物を添加する。２日後（１２日目）にエリスロポエチンを含む上清を収集する。
【実施例９】
【０２０８】
メトトレキサートの非存在下でのバイオリアクターにおけるエリスロポエチンの産生
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を５Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｋａｍｐ  ４  Ｂ５−１及び２）モードで培養する。培地は実施例９と同じである。第１バイオリアクター（Ｋａｍｐ  ４  Ｂ５−１）には培地中に１．５４μｍ  ＭＴＸを存在させ、第２バイオリアクター（Ｋａｍｐ  ４  Ｂ５−２）にはＭＴＸを存在させない。
【０２０９】
グルコース濃度を１ｇ／Ｌ以上に保つ。細胞を１２５０ｍＬ培地に約５×１０５細胞／ｍｌで接種する。ｐＯ２を５０％空気飽和、温度を３７℃、ｐＨを７．０に設定し、発酵中一定に保つ。２日後、リアクターに新鮮培地を５Ｌまで充填する。６、７、８、９及び１０日後５０〜１２２ｍｌのアミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含有する栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。１１日目にエリスロポエチンを含む上清を収集する。
【０２１０】
メトトレキサートなしの培養はより優れたグリコシル化パターンのために優れていることがわかる。
【実施例１０】
【０２１１】
富化培地を含むバイオリアクターにおけるエリスロポエチンの産生
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を５Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｋａｍｐ  １１  Ｂ５−１及び２）モードで培養する。バイオリアクター１は実施例１０（Ｋａｍｐ  ４  Ｂ５−２）と同様に操作し、バイオリアクター２では富化アミノ酸を補充した５０：５０  ＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ  Ｆ−１２から構成され、０．３２５％  植物ペプチド、０．１％  ルトロール、６．４ｇ／Ｌ  グルコース、２．５ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、エタノールアミン、クエン酸第二鉄、アスコルビン酸及び亜セレン酸ナトリウム及び０．６ｇ／Ｌ  ホスフェートを含有する細胞培養培地を用いる。ｐＯ２を５０％空気飽和、温度を３７℃、ｐＨを最初７．０に設定する。発酵中ｐＨを段階的に６．９に低下する。
【０２１２】
培養中、バイオリアクター２中のグルコース濃度を３〜４ｇ／Ｌに保つ。２．５日後、リアクターに新鮮培地を５Ｌまで充填する。６、７、８、９及び１０日後、アミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含有する富化栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。１１日目にＥｐｏを含む上清を収集する。
【０２１３】
栄養富化培地（アミノ酸、グルコース、植物ペプトン及びホスフェート）を用いる培養及び７から６．９へのｐＨ変化が同様のグリコシル化プロフィールで最終Ｅｐｏ濃度を２倍以上とすることが分かる。
【実施例１１】
【０２１４】
動物由来成分を含まないバイオリアクターにおけるエリスロポエチンの産生
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を５Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｋａｍｐ  １７  Ｂ５−１及び３）モードで培養する。パラメーターはすべて特記しない限り実施例１０（Ｋａｍｐ  ４  Ｂ５−２）のように設定する。バイオリアクター２では、動物由来の成分を全く含まない細胞培養培地を用いる。例えば、通常（サケまたはヒト毛髪のような）動物由来のアミノ酸チロシンまたはシステインを合成アミノ酸で置換する。
【０２１５】
２．５日後、リアクターに新鮮培地を５Ｌまで充填する。６、７、８、９及び１０日後、アミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含有する栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。９〜１０日目にエリスロポエチンを含む上清を収集する。
【０２１６】
動物起源の成分を含まない培地は同様の最終Ｅｐｏ濃度を生ずることが分かる。しかしながら、培養物はよりゆっくり増殖し、追加の栄養濃縮物の添加が必要である。
【実施例１２】
【０２１７】
富化培地（ビタミン、微量元素）を含むバイオリアクターにおけるエリスロポエチンの産生
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を１０Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｋａｍｐ  １２Ｃ）モードで培養する。バイオリアクターを以下の例外を除き実施例１１（Ｋａｍｐ  １１  Ｂ５−２）のように操作する。
【０２１８】
富化アミノ酸を補充した５０：５０  ＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ  Ｆ１２から構成され、０．３２５％  植物ペプチド、０．１％  ルトロール、６．４ｇ／Ｌ  グルコース、２．５ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、エタノールアミン、クエン酸第二鉄、ビタミン、微量元素及び亜セレン酸ナトリウム及び０．６ｇ／Ｌ  ホスフェートを含有する細胞培養培地を用いる。濃縮物中の濃度を倍とし、ビタミンで富化する。
【０２１９】
細胞を４５００ｍｌ培地に約５×１０５細胞／ｍｌで接種する。ｐＯ２を５０％空気飽和、温度を３７℃に設定する。ｐＨを最初７．１に設定する。発酵中ｐＨは段階的に６．９に低下する。
【０２２０】
培養中、バイオリアクター中のグルコース濃度を３〜４ｇ／Ｌに保つ。３日後、リアクターに新鮮培地を１０Ｌまで充填する。６、７、８、９、１０、１１及び１２日後、富化栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。１３日目にエリスロポエチンを含む上清を収集する。
【実施例１３】
【０２２１】
Ｅｐｏの分離
細胞分離
組換えヒトエリスロポエチンを不連続フェッド−バッチ発酵により無血清条件下でチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）において産生させる。発酵（２つの異なるバイオリアクターにおいて４×約１＋２バッチモード延長ステージ）後、約２００〜３００ｍｇ／ＬのｒｈＥｐｏを含む収集ブロスを２〜８℃に冷却し、暫定保存期間を置かずにまずディスクスタッグ分離機を用いて遠心し、次いでデプス（ＰＰ  Ｐｏｌｙｇａｒｄ  ０．１μｍ，Ｓｅｉｔｚ  Ｂｉｏ  １０またはＣｕｎｏ  Ａ９０Ｍ０８，処理量約３００Ｌ／ｍ２濾過面積）及び０．２μ  濾過（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＤｕｒｏｐｏｒｅ  ０．２２μ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により清澄化する。高い細胞溶解及びその結果のＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）による高い産物汚染を避けるために、まず最適時点（主培養において約１２日，酸素消費滞留）で収集し、次いで脆い真核細胞を分離するように特別設計された細胞分離装置、例えば水密性供給入口を有するＣＳＣ６（６０００ｍ２  ＥＣＡ，１５５００×ｇ，約２００Ｌ／時，Ｗｅｓｔｆａｌｉａ）または一般的なディスク入口及び転針出口を有するＢＴＰＸ  ２５０（１１０００ｍ２  ＥＣＡ，１３０００×ｇ，３００Ｌ／時，Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ）を用いることが重要である。接線流濾過及び遠心を含めた各種分離方法の比較から、剪断応力（細胞内マーカー酵素ＬＤＨの放出により測定）による細胞溶解の違いが示される。遠心が最も穏和な分離（＜３Ｕ  ＬＤＨ／ｍｇ  ｒｈＥｐｏ）を与え、好ましい。
【０２２２】
或いは、上記したディスクスタック分離機を用いる遠心のみ（デプス濾過ステップなし）を細胞分離ステップで用いる。或いは、上記したデプス濾過ステップ（遠心ステップなし）を用いる。
【０２２３】
アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによる捕捉
清澄後、粗な上清を５ｍＳ／ｃｍ以下の最終伝導率に達するように約３容量の水で希釈し、トリス塩基でｐＨ７．５に調節した後、ＡＥＸ−捕捉樹脂にかける。
【０２２４】
使用したＡＥＸカラムは約１０〜２０ｃｍベッド高を有し、良好な流動性を有するＱ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）が充填されている。２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５）及び５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化されている。次いで、希釈した細胞上清をカラムに４〜８ｃｍ／分の流速で充填し（１０〜１５ｍｇ  ｒｈＥｐｏ／ｍｌ樹脂）、カラムを１０〜１５カラム容量（ＣＶ）の平衡緩衝液で洗浄する。産物を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５）の高伝導度緩衝液に交換することにより達成される段階溶離により溶離させる。ピークフラクションをプールし、約５０〜６０％の収率を得る。
【０２２５】
或いは、中間容量に減量し、次の沈殿条件を標準化するためにフラクションプールを限外濾過により濃縮する。好ましくは、５〜１０ｋＤａカットオフ膜を使用し、標的産物濃度を約２０ｍｇ／ｍｌに調節する。
【０２２６】
硫酸アンモニウム沈殿
前ステップからの捕捉プールは、典型的には汚染宿主細胞タンパク質を２．４Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４で沈降させることにより更に精製される。このＡＳ濃度では、沈殿中に殆ど産物は認められず、純粋なＨＣＰ非含有上清が残る。この上清は以下のＲＰＣ精製の前にＲＰＣ充填物中＜２４０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４に希釈しなければならない。
【０２２７】
１容量の捕捉プールに対して１．５容量の硫酸アンモニウムストック溶液（４Ｍ  ＮＨ４）２ＳＯ４，２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５））を添加して沈殿させ、１０〜１５℃において３０分間インキュベートし、沈殿をデプス（Ｓｅｉｔｚ  Ｂｉｏ  １０またはＣｕｎｏ  Ａ９０Ｍ０８）及び０．２μ濾過（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＤｕｒｏｐｏｒｅ  ０．２２μ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により分離する。高溶離容量＝希釈ｒｈＥｐｏ溶離プール（＜５ｍｇ  ｒｈＥｐｏ／ｍｌ）の場合、ＨＣＰ沈殿は任意のＵＦ濃縮ステップ（１０ｋＤａカットオフ）により改善され得る。
【０２２８】
硫酸アンモニウム沈殿は疎水性相互作用クロマトグラフィーより有効である。
【０２２９】
前沈殿ステップからの硫酸アンモニウム含量を低減させるために、産物を含む上清を上記したように希釈しなければならない。代替方法は限外濾過／デプス濾過ステップである。好ましくは、５〜１０ｋＤａカットオフ膜を使用し、標的硫酸アンモニウム濃度を２４０ｍＭ未満、産物濃度を約３０ｍｇ／ｍｌに調節する。ダイアフィルトレーションステップのために使用した緩衝液は２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）である。
【０２３０】
逆相クロマトグラフィー
次の精製ステップは逆相クロマトグラフィーである。この逆相クロマトグラフィーは、ａ）異なるアイソフォームがその糖骨格（高度にグリコシル化／シアリル化した溶離物の後に低度にグリコシル化／シアリル化した形態）に従って分離される；ｂ）残留宿主細胞タンパク質がこの高速クロマトグラフィーにより除去される；及びｃ）クロマトグラフィーがウイルス除去及び有機溶媒によるウイルス不活化のためのロバストなステップである点で有用である。Ｓｏｕｒｃｅ  ３０ＲＰＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ａ）中圧（＜１０バール）で操作可能であり且つｂ）高濃度ＮａＯＨで衛生処理され得るポリマー樹脂である。好ましいベッド高は１０〜１５ｃｍであり、推奨される負荷物は充填樹脂１ｍｌあたり８〜１２ｍｇのｒｈＥｐｏである。
【０２３１】
ＲＰＣステップの前に、産物を含む上清を０．２４Ｍ未満の硫酸アンモニウムの最終濃度に調節しなければならない。このコンディショニングは、ＲＰＣ充填中にその後のオンライン希釈ステップ（２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中１容量のｒｈＥｐｏ−上清＋４容量の２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）＋５容量の５０ｖｖ％  ＡＣＮ）により、または高価な有機溶媒を節約するために充填ステップの前に優先的に再度の２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対するダイフィルトレーション／濃縮（１０ｋＤａカットオフのＵＦ）ステップにより実施し得る。カラムを予め平衡化し、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．０）中２５ｖｖ％  アセトニトリル（ＡＣＮ）を充填後洗浄する。産物をＡＣＮ濃度を２５％から５０％へ直線勾配させて溶離し、凝集を誘導する恐れがあり、次のＡＥＸクロマトグラフィーを害する溶媒濃度を直ちに減ずるために４容量の希釈緩衝液（５０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．０））を予め充填した小フラクション（特に、約０．２ＣＶ、或いは約０．３〜０．５ＣＶ）で集める。溶離ピークのほぼ前半部分のフラクションをプールして、ＲＰＣプールを得、これは更にプロセシングする。このプールは好ましい高度のグリコシル化を有するアイソフォームを含む。Ｓｅｒ１２６でＯ−グリカンを欠く脱−Ｏ−グリコシル化ｒｈＥｐｏ産物は細胞培養物中に最高２０％のレベルで存在するが、この産物は上記分画レジメにより除去される。
【０２３２】
代替方法では、有機溶媒に曝すことによりウイルス不活化を誘導するために、フラクションに４容量の上記したと同じ緩衝液の代わりに０．５容量の２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．０）を予備充填し、２０〜４０分間またはそれ以上インキュベートする。このインキュベーションステップ後、元の非希釈フラクションを指す別の３．５容量の２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．０）を添加し、よってウイルス不活化を停止する。
【０２３３】
ウイルス不活化を伴うまたは伴わないフラクションを更なる精製のためにプールする。プーリングは通常上行部位では最大ＯＤの５０〜１００％で始め、下行部位では７０〜８０％以上でほぼ終わらす。最初に溶離するフラクションは宿主細胞タンパク質を含む可能性があるのに対して、後から溶離するフラクションは低シアリル化で低活性のアイソフォームを含む。更に、ＣＺＥ分析をあるアイソフォームのプーリングを裏付けるために実施し得る。
【０２３４】
アニオン交換クロマトグラフィー
次いで、希釈したＲＰＣプールを、特定アイソフォームを選択し、宿主細胞タンパク質を除去するのを助ける高速ＡＥＸカラムに充填する。この時、アイソフォームは等電点に従って、すなわちグリコシル化のグレードに比例するシアル酸の数に従って分離される。優れた分離効率を示すＱ−Ｓｅｐａｒｏｓｅ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の高性能樹脂を使用する。ベッド高は１５〜２０ｃｍである。充填、勾配及びベッド高のような全ての条件はかなり低い産物濃度を保つように規定される。さもなければ、溶離中産物の溶媒誘導凝集により有意なポスト−ピークが生ずる。
【０２３５】
ＲＰＣプールに、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰに対して２〜４ｍｇ／ｍｌのＥｐｏを充填する。平衡緩衝液での洗浄ステップ後、産物を平衡緩衝液中０から３００ｍＭ  ＮａＣｌの１０ＣＶ直線塩勾配で溶離させる。溶離ピークを０．１ＣＶまたは０．２５ＣＶフラクションで集め、分析プールをＣＺＥにより分析して、所望エリスロポエチンアイソフォームを含む適正なフラクションプールを見つける。ＡＥＸプールは典型的には溶離ピークの後半部分から構成され、ここに高度にグリコシル化及びシリル化されたアイソフォームが溶離されている。
【０２３６】
インプロセスコントロールとして細管ゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いることにより、異なる発酵条件及び宿主系のためにソースが高シリル化アイソフォームを僅かに含んでいるとしてもエリスロポエチンアイソフォームの正確に規定された混合物を産生することができる。
【０２３７】
ＣＺＥは異なる電荷を有するアイソフォームを分離することができる高分離法である。各フラクションで１つのアイソフォーム毎に定量的な結果を与える。この情報により、バッチ毎に一定のアイソフォームプロフィールをもたらす特定フラクションをプールすることができる。典型的には、遅れて溶離するフラクションをプールすることにより最初に溶離する低シアリル化アイソフォームが排除される。
【０２３８】
サイズ排除クロマトグラフィー
最後のクロマトグラフィーステップでは、存在する恐れがある二量体以上の多量体凝集物を除去し、最終処方物のために緩衝液交換を実施するサイズ排除によりＡＥＸプールを研磨する。このステップで使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）はカラム容量の１５％までの高い充填容量でも良好な分離を有する。好ましいベッド高さは６０〜８０ｃｍである。
【０２３９】
ＡＥＸプール中の産物濃度を高めるように前ステップのＡＥＸクロマトグラフィーを実施することは不可能であるので、前記プールを濃縮した後ゲル濾過しなければならない。これは５〜１０ｋＤａ  ＵＦ膜を用いる限外濾過ステップにより実施され、これにより約１０ｍｇ／ｍｌのエリスロポエチンを含む約１０倍濃縮されたＵＦ保持物が得られる。
【０２４０】
ＵＦ保持物の約３〜７ＣＶ％を直接、予め２０ｍＭ  Ｎａ−ホスフェート（ｐＨ７．０）、７５ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇカラムに充填する。約１〜１．５ＣＶ後、産物がカラムから溶離し始め、溶離ピークを集めてＳＥＣプールを得る。
【０２４１】
ナノ濾過
可能性あるウイルス負荷物を除去するために、追加のデッドエンド（dead-end）ウイルス濾過ステップを実行する。この濾過は、１５ｎｍくらいの小さい粒子を除去するように設計された特定膜、例えばＰｌａｎｏｖａ  １５Ｎ（Ａｓａｈｉ）を用いて実施する。或いは、デッドエンドナノ濾過ユニットはＰＡＬＬ  Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＶＦ  Ｇｒａｄｅ  ＤＶ２０またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＰカットリッジまたはカプセルである。特にパルボウイルスのような小さい非外被ウイルスの場合には、ウイルス除去または不活化の別の道具はほとんどない。
【０２４２】
滅菌濾過したＳＰＥプールを適当な膜を有するデッドエンドフィルターに通し、濾液は最終バルク状薬物である。或いは、ナノ濾過をＵＦ濃縮とサイズ排除クロマトグラフィーの間に挿入してもよい。
【０２４３】
【表５】
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【０２４４】
【表６】
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【０２４５】
【表７】
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【０２４６】
【表８】
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【０２４７】
本明細書において言及した刊行物はすべて参照により本明細書に含まれるとする。本明細書に記載した本発明の方法及びシステムに本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく各種修飾及び変更を加えることは当業者に自明である。本発明を特定の好ましい実施態様に関連して説明してきたが、本発明はこれらの実施態様に不当に限定されるべきではないと理解されたい。実際、分子生物学または関連分野の当業者に自明の本発明を実施するための本発明の各種修飾は請求の範囲の範囲内であると意図される。
【国際調査報告】
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