(57)【要約】本発明は、補体系を活性化できる融合タンパク質、即ちレクチン-補体経路活性化タンパク質またはその機能的相同体由来の第一のポリペプチド配列；およびコレクチンまたはその機能的相同体由来の第二のポリペプチド配列(ここで該補体活性化タンパク質はコレクチンではない)を含む融合タンパク質に関する。好ましい融合タンパク質は、図１のL-フィコリン配列のアミノ酸および図２に示すMBL配列のアミノ酸を含む。融合タンパク質は、作成、再構成、補体系のオプソニンおよび／または殺菌活性の促進および／または刺激、すなわち、微生物病原菌を認識および死滅させる免疫防御の能力の促進からなる治療において使用に適当である。従って、本発明は、融合タンパク質を含む医薬、該融合タンパク質を産生する方法および疾患特に感染症を治療する方法に関する。
2005537807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)レクチン補体経路活性化タンパク質またはその機能的相同体由来の第一のポリペプチド配列、および
ii)コレクチンまたはその機能的相同体由来の第二のポリペプチド配列、
ここで、該補体活性化タンパク質はコレクチンではない、
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
該第一のポリペプチド配列は、レクチン補体経路を活性化することができる、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】
該第一のポリペプチド配列は、MASPタンパク質の少なくとも１つと結合ができる、請求項１の融合タンパク質。
【請求項４】
該第一のポリペプチド配列は、MASP-1、MASP-2 および MASP-3またはそれらの機能的相同体もしくは変異体からなる群から選択されたMASPと結合することができる、請求項１の融合タンパク質。
【請求項５】
補体活性化タンパク質がフィコリンである、請求項１の融合タンパク質。
【請求項６】
フィコリンが、L-フィコリン、H-フィコリン および M-フィコリンからなる群から選択される、請求項５の融合タンパク質。
【請求項７】
フィコリンがL-フィコリンである、請求項５の融合タンパク質。
【請求項８】
第一のポリペプチド配列が、補体活性化タンパク質またはそのタンパク質と少なくとも70%、80%など、例えば90%、95%などの同一性を有する配列の、少なくとも10、少なくとも12など、例えば少なくとも15、少なくとも20など、例えば少なくとも25、少なくとも30など、例えば少なくとも35、少なくとも40など、例えば少なくとも50の連続アミノ酸を含む、請求項１から７の何れかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
第一のポリペプチド配列がフィコリンまたはその機能的相同体もしくは変異体のコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１０】
第一のポリペプチド配列がL-フィコリンのコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１１】
第一のポリペプチド配列がフィコリンまたはその機能的相同体のシステインリッチ領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１２】
第一のポリペプチド配列がL-フィコリンのシステインリッチ領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１３】
第一のポリペプチド配列がフィコリンまたはその機能的相同体もしくは変異体のシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１４】
第一のポリペプチド配列がL-フィコリンのシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１５】
第一のポリペプチド配列が配列番号1のアミノ酸1-77を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１６】
第二のポリペプチド配列が１以上の炭水化物と結合することができる、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１７】
コレクチンが、MBL(マンノース-結合レクチン)、SP-A(肺サーファクタントプロテインA)、SP-D(肺サーファクタントプロテインD)、BK(またはBC、ウシコングルチニン) および CL-43 (コレクチン-43)からなる群から選択される、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１８】
コレクチンがMBLである、請求項１７の融合タンパク質。
【請求項１９】
第二のポリペプチド配列が、コレクチンまたはそのタンパク質と少なくとも70%、80%など、例えば90%、95%などの同一性を有する配列の、少なくとも10、少なくとも12など、例えば少なくとも15、少なくとも20など、例えば少なくとも25、少なくとも30など、例えば少なくとも35、少なくとも40など、例えば少なくとも50の連続アミノ酸を含む、請求項１から１８の何れかに記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
第二のポリペプチド配列がコレクチンまたはその機能的相同体もしくは変異体のCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２１】
第二のポリペプチド配列がMBLのCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２２】
第二のポリペプチド配列がMBLのネック領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２３】
第二ポリペプチド配列がMBLのコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２４】
第二のポリペプチド配列がMBLのネック領域およびCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２５】
第二のポリペプチド配列がMBLのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２６】
第二のポリペプチド配列が配列番号２のアミノ酸80-228を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２７】
融合タンパク質が、L-フィコリンのシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域、およびMBLのCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２８】
融合タンパク質が、L-フィコリンのシステインリッチ領域、およびMBLのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２９】
融合タンパク質が配列番号３で定義されるアミノ酸配列、またはその機能的相同体を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３０】
融合タンパク質が、配列番号３で定義されるアミノ酸配列からなる、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３１】
請求項１から３０の何れかの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項３２】
請求項３１の核酸配列を含むベクター。
【請求項３３】
請求項３２のベクターを含む細胞。
【請求項３４】
細胞が哺乳類細胞である、請求項３３の細胞。
【請求項３５】
細胞が非哺乳類細胞である、請求項３３の細胞。
【請求項３６】
医薬として使用するための請求項１から３０の何れかの融合タンパク質。
【請求項３７】
臨床症状の治療の必要がある個体におこなう治療方法であって、請求項１から３０の何れかの融合タンパク質を当該個体に投与することを含む、当該方法。
【請求項３８】
臨床症状が感染である、請求項３７の方法。
【請求項３９】
個体がヒトである、請求項３７の方法。
【請求項４０】
個体が、感染症にかかる危険性の高いヒトである、請求項３７の方法。
【請求項４１】
個体が、血清MBLレベルが正常よりも低いヒトである、請求項３７の方法。
【請求項４２】
個体が、血清MBLレベルが正常であるヒトである、請求項３７の方法。
【請求項４３】
臨床症状の治療の必要がある個体におこなう該治療用の医薬の製造のための、請求項１から３０の何れかの融合タンパク質の使用。
【請求項４４】
臨床症状が感染である、請求項４３の使用。
【請求項４５】
個体がヒトである、請求項４３の使用。
【請求項４６】
個体が、感染症にかかる危険性の高いヒトである、請求項４３の使用。
【請求項４７】
個体が、血清MBLレベルが正常よりも低いヒトである、請求項４３の使用。
【請求項４８】
個体が、血清MBLレベルが正常であるヒトである、請求項４３の使用。
【請求項４９】
請求項１から３０の何れかの融合タンパク質を含む、治療または予防の必要がある個体の、臨床症状の該治療または予防用の医薬。
【請求項５０】
臨床症状が感染である、請求項４９の医薬。
【請求項５１】
個体がヒトである、請求項４９の医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、補体系を活性化できる融合タンパク質、該融合タンパク質の作成方法、および該融合タンパク質を含む医薬組成物および該融合タンパク質による疾患、特に感染症の治療方法に関する。
【０００２】
背景技術
動物は、感染症から自己を保護するため種々の複雑なストラテジーを作り出してきた。免疫応答は主なグループに分けることができる。それは、適応が生じ、細胞が主要な役割をする適応性免疫反応、および即座に機能し、体液中に存在する分子に主に依存する先天性免疫反応である。先天性免疫系は誕生と同時に機能し、対照的に、適応性免疫防御では幼年期においてのみ体の防御能は最大となる(Janeway et al., 1999)。
【０００３】
粘膜表面や損傷した皮膚から体に進入する細菌はコレクチン(微生物の表面上に存在するが、多細胞生体の細胞には存在しない固有の炭水化物配置(distinctive carbohydrate configuration)を認識する可溶性タンパク質のファミリー)により直ちに認識される。そのため、コレクチンは、先天性免疫系のパターン認識レセプター(pattern recognition receptor)の群であって巨大で多様な群に属する。ヒトでは、３つのコレクチンが知られているが、他のコレクチンも存在する：例えば、ウシではより多くのコレクチンを保有する。コレクチンは、ある粒子(particles)を標的とし、食細胞による取り込みかまたは補体カスケードの活性化の何れかを行うために該粒子と結合する。このように、コレクチンは該粒子の破壊を仲介し得る。
【０００４】
コレクチンはすべて、以下の構造を有する：コレクチンは鎖間ジスルフィド結合を形成すると思われるシステインリッチ領域がN末端にあり、そしてコラーゲン様領域、α-ヘリカルコイルドコイル領域、そして最後にはパターン認識領域であり炭水化物認識ドメイン(CRD)と呼ばれるC型レクチンドメインへと続く。コレクチンという名前は、コラーゲンおよびレクチンドメインの両方が存在することに由来する。α-ヘリカルコイルドコイル領域では各ポリペプチドの三量体化が開始され、コラーゲントリプルコイルが形成され、それにより、３つのポリペプチドからなる各コレクチンサブユニットが形成される。その一方、N末端領域は、サブユニットのオリゴマーの形成を仲介する。種々のコレクチンは、特有の高次構造、典型的にはサブユニットの四量体またはサブユニットの六量体の何れかの構造を有する。多数の結合ドメインのグループ化により、各CRDと炭水化物との親和性は比較的低いにもかかわらず、コレクチンは細菌性細胞壁と高親和性で結合する。
【０００５】
C型CRDは、系統および機能の両方の観点において、広範にタンパク質中で見られる。種々のコレクチンの種々のCRDにより、種々の微生物上にある一連の固有の微生物表面コンポーネントが認識され得る。末端のCRDは、結合部位を提示するドメイン標的表面の３つすべてが約５３Ａの間隔を有するように分布する(Sheriff et AL., 1994; Weis & Drickamer, 1994)。「パターン認識」のこの特徴は、更に、微生物表面の選択的結合に関連し得る。コラーゲン領域、または恐らくはコレクチンN-末端テイルは、食細胞の特異的レセプターにより認識され、かつそれらはCRDドメインと標的との結合における補体カスケードの開始を活性化する関連プロテアーゼの結合部位である。
【０００６】
マンノース結合レクチンまたはマンノース結合タンパク質としても称せられるマンナン結合レクチン(MBL)は、先天性免疫系の重要部分として非常に興味のもたれるコレクチンである。MBLは、細菌、酵母、寄生原虫およびウイルスを含む一連の微生物の表面に見られる特定の炭水化物構造物と結合し、そして、末端の溶菌性補体コンポーネント(terminal, lytic complement components)の活性化を介する死滅または食菌作用の促進により抗菌活性を示すことが判った。MBL欠損は、幼少期、可能性として成人となってからも、種々の微生物による頻繁な感染症への罹患と関連する。
【０００７】
MBLのCRDは、マンノース、グルコース、N-アセチルマンノサミンおよびN-アセチルグルコセアミン(N-acetyl glucoseamin)などの、エクアトリアル性3-および4-OH基を有するヘキソースを選択的に認識する。その一方、ガラクトースおよびD-フコースなどの、立体的必要条件は満たさない炭水化物には結合しない(Weis et al., 1992)。炭水化物選択性は、MBLによる自己／非自己識別の点で明かに重要であり、微生物表面におけるマンノースおよびN-アセチルグルコセアミン残基の分布率(prevalence)の違いが恐らく関連する。１つの例として、Saccharomyces cerevisiae および Candida albicansなどの酵母の細胞壁におけるマンノースの高含有率がある。哺乳類タンパク質のグリコシル化における炭水化物構造は、通常シアル酸で終結しており、これによってMBLとこれら炭水化物のオリゴマーとの結合が阻止され、それにより、「自己」表面のMBL認識を抑制する。また、各MBLサブユニットの三量体構造は、標的認識に重要となり得る。
【０００８】
補体は、感染後の体内防御を目的とする血漿および組織液中に存在する一群のタンパク質である。補体系は少なくとも３つの経路により活性化される。それらは、古典的経路、第二経路、およびMBLectin経路(Janeway et al., 1999)である。古典的経路は、補体因子１(C1)が表面結合免疫グロブリンを認識するとき開始される。C1複合体は、２つのタンパク質分解酵素、C1rおよびC1s、および非酵素部分、免疫グロブリン認識ドメインを含むC1qから構成される。C1qおよびMBLは構造的特長が共通しており、その両分子は電子顕微鏡で見ると花束のように見える。また、C1qのように、MBLは、２つのタンパク質分解酵素、マンナン結合レクチン結合プロテアーゼ(mannan-binding lectin associated proteases)(MASP)との複合体となる。上記３つの経路は全て、補体因子３(C3)コンベルターゼを生じ、その酵素は、C3bと、活性化表面、すなわち標的病原菌の表面との結合を確実なものとする。表面結合C3bへのC3の変換は、食菌作用または溶菌による病原菌排除プロセスの中枢となる(Janeway et al., 1999)。
【０００９】
サルモネラの、ある0-抗原特異的オリゴサッカライドは、C4欠損モルモット血清中の補体を活性化すると報告されており、サルモネラ血清グループCは、後に、MBLと反応し、MBLectin経路により補体を活性化することが判った。その経路は補体活性化のMBL経路またはレクチン経路とも呼ばれる。
【００１０】
先天性免疫系は、感染または予防接種後の抗体反応により説明されるように、特異的免疫反応の発生において適応性免疫系と共同し得ると、しばらくの間考えられていた。Fearonのグループは、遺伝子工学の融合により、補体因子C3のC3フラグメントとタンパク質抗原との結合により抗原の免疫原性が１０００倍以上となり得ることを証明した。この技術の実用化、または多くの改良が期待されている。
【００１１】
正常な免疫反応のためには補体系が重要であることをPepysが最初に示唆した。彼は、コブラ毒因子によりC3が減少したマウスにおいてヒツジの赤血球(胸腺依存抗原)に対する抗体反応が低下することを発見した。先天性免疫と適応性免疫とがリンクするという考えは、C4、C2およびC3が欠損した患者および実験動物において、胸腺依存抗原に対する一次抗体が低下し、IgMからIgGへのスイッチングが低下するという報告により支持されていた。その機構には、抗原または抗原を有する複合体がBリンパ球または抗原提示細胞上の補体レセプターと結合するため、C3-誘導性リガンドが生ずることが含まれ得る。そのため、特異的抗CR1および抗CR2抗体または可溶性レセプタータンパク質を有するマウスではCR1 (CD35) および CR2 (CD21)のブロッキングにより、免疫化のための抗体反応が減少した。CR1およびCR2欠損のノックアウトマウスによる実験では、胸腺依存抗原に対する反応ためにこれらのレセプターが必要であることが判る。更に、CD11/CD18粘着分子CR3を欠く白血球粘着不全(leucocyte adhesion deficiency)の患者では、抗体反応が低下し、IgMからIgGへのスイッチが欠損していることが示されている。上記のようなC3-誘導性フラグメントC3d、特異的CR2リガンドでは、強力な用量依存アジュバンド作用が見られる。
【００１２】
古典的補体経路の欠損(C1、C2、C4 および C3)は、被包性細菌による感染と関連する。この主な理由は、恐らく、補体機能不全が原因のオプソニンおよび細菌防御機構の効率低下である。しかし、ポリサッカライド抗原に対する免疫反応の低下もまた考えられ得る。胸腺非依存抗原に対する反応に対する補体の影響について大規模に研究されているわけではなく、入手し得る情報に矛盾がある。そのため、胸腺非依存抗原に対する抗体反応の低下が、C3-欠損マウスおよびC3-欠損イヌで明らかにされた。一方で、C3-欠損患者は、ポリサッカライドワクチンによる免疫に正常に反応するようであるという報告もある。
【００１３】
MBLのようなフィコリンは、コラーゲン様領域を含むレクチンである。しかし、MBLとは異なり、それらは、フィブリノーゲンβ-およびγ-鎖に類似するフィブリノーゲン様ドメインを有する。フィコリンはまた構造サブユニットのオリゴマーを形成し、それらはそれぞれ、３つの同一の35kDaポリペプチドからなる。それぞれのサブユニットは、アミノ末端のシステインリッチ領域、Gly-Xaa-Yaaの３組の配列(ここで、XaaおよびYaaは任意のアミノ酸を示す)のタンデムリピートからなるコラーゲン様領域、ネック領域およびフィブリノーゲン様ドメインからなる。フィコリンのオリゴマーは、２つ以上のサブユニットを含み、特に、フィコリンの四量体形態が観察されている。
【００１４】
フィコリンには、実質的にMBLと同様の方法で補体系を活性化するものもある。補体系のこの活性化により、上記のような新規のセリンプロテアーゼ(MASP)が活性化されることとなる。
【００１５】
幾つかのレクチンのフィブリノーゲン様ドメインは、MBLを含むC-型レクチンのCRDと同様の機能を有し、それにより、パターン認識レセプターとして機能し、自己と病原体とを識別する。
【００１６】
血清フィコリンは、GlcNAc (N-アセチル-グルコサミン)、エラスチンまたはGalNAc (N-アセチル-ガラクトサミン)に対する共通の結合特異性を有する。フィブリノーゲン様ドメインは炭水化物結合を生ずる。ヒト血清では、L-フィコリン(P35、フィコリンL、フィコリン2またはフコリン(hucolin))およびH-フィコリン(Hakata抗原、フィコリン3または熱不安定性b2-マクログリコプロテイン)として知られる２つのタイプのフィコリンが同定されており、それらは２つともレクチン活性を有する。L-フィコリンはGlcNAcを認識し、H-フィコリンはGalNAcを認識する。M-フィコリンとして知られる他のフィコリン(P35-関連タンパク質、フィコリン1またはフィコリンA)は血清タンパク質とは考えられてはおらず、白血球および肺で見られる。L-フィコリンおよびH-フィコリンはMASPと関連するレクチン補体経路を活性化する。M-フィコリン、L-フィコリンおよびH-フィコリンはカルシウム非依存レクチン活性を有する。
【００１７】
MASP-1、MASP-2およびMASP-3を含むMASP(MBL-結合セリンプロテアーゼ)は、レクチン経路の活性化をになうタンパク質分解酵素である。MASPの構造は全体的に、典型的な補体経路中の第一因子の２つのタンパク質分解コンポーネント、C1rおよびC1sに似ている。そのレクチン経路は、MBL、またはMASP-1、MASP-2、MASP-3 および sMAPと結合するフィコリンが例えば細菌、酵母、寄生原虫およびウイルスの表面の炭水化物構造物と結合すると、開始される。MASP-2は、古典的経路におけるC1のように補体コンポーネントC4およびC2を切断し、C3コンベルターゼC4bC2a(レクチン-および古典的-経路活性化経路の両方に共通する)を形成する酵素コンポーネントである。
【００１８】
MASP-1、MASP-2、MASP-3 および sMAPは２つの遺伝子によりコードされている。sMAPはMASP-2のトランケート型であり、MASP-3は選択的スプライシングによりMASP-1遺伝子から産生される。MASP-1遺伝子は、MASP-1およびMASP-3に共通のH-鎖コード化領域を有し、その領域に、MASP-3およびMASP-1に特異的なプロテアーゼドメインコード化領域のタンデムリピートが続く。
【００１９】
MASPファミリーは、２つの系統、TCN型およびAGY型系統に区分される。該TCN型系統(MASP-1を含む)は、活性部位のセリンをコードするTCNコドン(ここでNはA、G、CまたはTを意味する)を有しており、ヒスチジンループおよびジスルフィド結合が存在し、幾つかのエキソンに分かれている。対照的に、AGY型系統(MASP-2、MASP-3、C1R および C1sを含む)は活性部位のセリンをコードするAGYコドン(ここでYはCまたはTを示す)により特徴付けられ、ヒスチジンループはなく、エキソンはたった１つである。
【００２０】
MASP-1、MASP-2、MASP-3、C1r および C1sは６つのドメイン：２つのC1r/C1s/Uegf/骨形成タンパク質1 (CUB)ドメイン、１つの上皮細胞増殖因子(EGF)-様ドメイン、２つの補体制御タンパク(CCP)またはショートコンセンサスリピート(short consensus repeat)(SCRs)、および１つのセリン-プロテアーゼドメインからなる。ヒスチジン(H)、アスパラギン酸(D)およびセリン(S)残基は、セリンプロテアーゼドメインの活性中心の形成に必須である。MASP-1のみが、トリプシンおよびキモトリプシン中にあるようなヒスチジンループジスルフィド結合(S-S)を形成する２つのシステイン残基を軽鎖中に更に有している。病原体の表面の炭水化物とMBLおよびフィコリンとの結合において、プロ酵素型MASPは２番目のCCPとプロテアーゼドメインとの間で切断され、重鎖および軽鎖(A鎖およびB鎖としても知られる)の２つのポリペプチドからなる活性型となる。
【００２１】
本発明の要約
本発明は、補体系を活性化できる融合タンパク質に関連する。従って、本発明は、レクチン補体経路活性化タンパク質(補体活性化タンパク質)またはその機能的相同体由来の第一のポリペプチド配列、およびコレクチンまたはその機能的相同体由来の第二のポリペプチド配列を含む融合タンパク質に関連する。ここで、該補体活性化タンパク質はコレクチンではない。
【００２２】
融合タンパク質は、補体系の作成、再構成、その系のオプソニン性および／または細菌性活性の促進および／または刺激、すなわち、微生物性病原体を認識し死滅させるための免疫防御能の促進からなる治療における使用に適する。従って、本発明は、融合タンパク質を含む医薬に関する。
【００２３】
また、他の態様として、本発明は、臨床症状の治療の必要がある個体におこなう治療方法であって、上記のような融合タンパク質を当該個体に投与することを含む、当該方法に関する。
【００２４】
他の態様として、本発明は、治療または予防の必要がある個体におこなう、感染症のような臨床症状の該治療または予防の方法であって、構造ユニット(structural units)のオリゴマーを形成することができるタンパク質由来の第一のポリペプチド配列およびマンノース-結合レクチン(MBL)由来の第二のポリペプチド配列を有する融合タンパク質を該個体に投与することを含む該治療または予防の方法に関する。ここで、該第一のポリペプチド配列および該第二のポリペプチド配列は同一のタンパク質由来ではなく、該融合タンパク質はマンノース結合セリンプロテアーゼ(mannose-associated serine protease)(MASP)と結合することができる。第一のポリペプチド配列は、好ましくは、構造ユニットの四量体、五量体および／または六量体を形成し得るタンパク質由来である。好ましい実施態様では、第一のポリペプチド配列および第二のポリペプチド配列を以下に記載する。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、臨床症状で治療が必要な個体の該治療用の医薬の製造のための、上記のような融合タンパク質の使用に関する。
【００２６】
更に、本発明は、融合タンパク質、および該融合タンパク質をコードする単離核酸配列、該配列を有するベクターおよび該ベクターを有する細胞の作成方法に関する。
【００２７】
図面
図面１はLフィコリンの配列を示す。図２はMBLの配列を示す。図３は融合タンパク質の例を示す。図４−８は実施例１に記載のプラスミドを示す。図９は実施例１で記載の融合タンパク質のアラインメントを示す。図１０は実施例２で考察する２つのウエスタンブロットを示す。
【００２８】
定義
コレクチン：マンナン結合レクチン(MBL)およびサーファクタントプロテインAおよびDを含む、先天性免疫の炭水化物認識タンパク質に構造的に関連するファミリー。その名前は、コラーゲン様領域およびC型レクチンドメインが存在することを表している。
【００２９】
補体：感染後の体内防御を目的とする血漿および組織液中に存在する一群のタンパク質。補体は、外来細胞を破壊し、体内の激突領域(the area of conflict)へ食細胞を誘引することに関与している。
【００３０】
複合化(Conjugated)：２つの化合物間で形成される結合、例えば、免疫原決定基とコレクチンおよび／またはコレクチン相同体間、または免疫原決定基およびサッカライド間である。該結合は、例えば、共有結合のような化学結合の形成により生ずる物理的結合である。
【００３１】
CRD:炭水化物認識ドメイン、コレクチンのC末端で見られるC型レクチンドメイン。
【００３２】
免疫原決定基：宿主生体の免疫系を刺激し、分泌性、体液性および／または細胞性抗原特異的反応を生ずる１以上のエピトープを含む、分子またはその部分、または脊椎中で免疫原などを作り出すことのできるDNA分子。
【００３３】
免疫反応：免疫原決定基を含む免疫原組成物との反応。免疫反応には、宿主内における、投与されたある組成物またはワクチンに対する細胞性および／または体液性免疫反応の発生が含まれる。免疫反応には、一般的に、i)生じた抗体、ii)B細胞、iii)ヘルパーT細胞、iv)サプレッサーT細胞、v)細胞障害性T細胞、およびiv)投与された免疫原組成物中に存在する免疫原決定基へ特異的または非特異的に向かう補体のうちの１以上のものの作用が含まれる。
【００３４】
レクチン：炭水化物に特異的に結合するタンパク質。
【００３５】
MASP：マンノース結合セリンプロテアーゼ。
【００３６】
MBL：マンナン結合レクチンまたはマンノース結合レクチン。
【００３７】
サブユニット複合体＝構造ユニット：MBLおよびフィコリンについて、上記考察したサブユニット複合体のような３種類の融合タンパク質の複合体。
【００３８】
本発明の詳細な説明
本発明の目的は、疾患、特に感染症の予防または治療を目的とする、補体系を活性化することができる融合タンパク質を提供することである。
【００３９】
融合タンパク質は、レクチン補体経路活性化タンパク質(＝補体活性化タンパク質)またはその機能的相同体由来の第一のポリペプチド配列、およびコレクチンまたはその機能的相同体由来の第二のポリペプチド配列からなる。ここで、該補体活性化タンパク質はコレクチンではない。
【００４０】
レクチン補体経路活性化タンパク質由来のポリペプチド配列と、コレクチン由来のポリペプチド配列とを組み合わせることにより、種々の炭水化物、好ましくは細菌性およびウイルス性炭水化物との結合親和性を有し、同時に、補体系活性化機能(complement system activating activity)を有する融合タンパク質を設計することが可能である。
【００４１】
第一のポリペプチド配列
第一のポリペプチド配列は、いずれのレクチン補体経路活性化タンパク質由来であってよい。該レクチン補体経路活性化タンパク質は、天然で生ずるレクチン補体経路活性化タンパク質および該レクチン補体経路活性化タンパク質の変異体または相同体であり得、ここで、該変異体または相同体では、レクチン補体経路活性化機能は維持されている。
【００４２】
融合タンパク質は、上記のような３種類の融合タンパク質からなるサブユニット複合体を形成できることが好ましい。
【００４３】
また、第一のポリペプチド配列は、好ましくは、他の融合タンパク質の第一のポリペプチド配列とのオリゴマー複合体を形成できる。ここで、該他の融合タンパク質は該第一の融合タンパク質と同一種であり得る。それにより、２以上の融合タンパク質または２以上のサブユニット複合体のオリゴマー複合体が提供され得る。ここで、該オリゴマー複合体は、細菌性またはウイルス性炭水化物に対して、単量体融合タンパク質よりも高い結合活性を有する。好ましい実施態様では、オリゴマー複合体は二量体サブユニット複合体、より好ましくは三量体サブユニット複合体、より好ましくは四量体サブユニット複合体である。
【００４４】
好ましい実施態様では、レクチン補体経路活性化タンパク質は上記のようなフィコリンである。該フィコリンはL-フィコリン、H-フィコリンまたはM-フィコリンまたはそれらの変異体または相同体であり得る。好ましい実施態様では、レクチン補体経路活性化タンパク質はL-フィコリンである。
【００４５】
他の実施態様では、第一のポリペプチド配列は、レクチンのフィブリノーゲンドメイン、および／またはフィコリンまたはその相同体または変異体のようなレクチンのネック領域を含む。
【００４６】
第一のポリペプチド配列が、フィコリン、またはフィコリンの変異体または相同体由来である場合、第一のポリペプチド配列はフィコリン由来またはフィコリンの変異体または相同体由来のコラーゲン様領域を含むことが好ましい。他の実施態様では、第一のポリペプチド配列はフィコリン由来またはフィコリンの変異体または相同体由来のシステインリッチドメインを含むことが好ましい。第一のポリペプチド配列は、フィコリン由来またはフィコリンの変異体または相同体由来のコラーゲン様領域およびシステインリッチドメインを含むことがより好ましい。
【００４７】
第一のポリペプチド配列はL-フィコリン由来またはL-フィコリンの変異体または相同体由来のコラーゲン様領域を含むことがより好ましい。他の実施態様では、第一のポリペプチド配列はL-フィコリン由来またはL-フィコリンの変異体または相同体由来のシステインリッチドメインを含むことがより好ましい。第一のポリペプチド配列は２つのシステインアミノ酸残基を含むL-フィコリンのN末端領域を含むことがより好ましい。
【００４８】
第一のポリペプチド配列はL-フィコリンまたはL-フィコリンの変異体または相同体由来のコラーゲン様領域およびシステインリッチドメインを含むことがより好ましい。
【００４９】
特に好ましい実施態様では、フィコリンは、データベースおよび受け入れ番号により参照される以下に列挙の配列のうちの１つを有する。それぞれの配列において、システインリッチ領域およびコラーゲン様領域が記載されている。
【化１】
2005537807.tif 000003
【化２】
2005537807.tif 000004
【化３】
2005537807.tif 000005
【化４】
2005537807.tif 000006
【化５】
2005537807.tif 000007
【化６】
2005537807.tif 000008
【化７】
2005537807.tif 000009
【化８】
2005537807.tif 000010
【化９】
2005537807.tif 000011
【化１０】
2005537807.tif 000012
【化１１】
2005537807.tif 000013
【化１２】
2005537807.tif 000014
【化１３】
2005537807.tif 000015
【化１４】
2005537807.tif 000016
【化１５】
2005537807.tif 000017
【化１６】
2005537807.tif 000018
【化１７】
2005537807.tif 000019
【化１８】
2005537807.tif 000020
【化１９】
2005537807.tif 000021
【００５０】
第一のポリペプチドは、補体活性化タンパク質または該タンパク質の変異体または相同体の、少なくとも10、少なくとも12など、例えば少なくとも15、少なくとも20など、例えば少なくとも25、少なくとも30など、例えば少なくとも35、少なくとも40など、例えば少なくとも50の連続アミノ酸残基を含む。その変異体または相同体は、該補体活性化タンパク質と少なくとも70%、80%など、例えば90%、95%などの同一性を有するのが好ましい。
【００５１】
融合タンパク質の第一のポリペプチド配列は、好ましくは、細菌またはウイルスのような標的に直接または間接的に結合すると、レクチン補体経路を活性化することができる。好ましい実施態様では、第一のポリペプチド配列は、MASP-1、MASP-2およびMASP-3またはその機能的相同体または変異体からなる群から選択されるMASPタンパク質のような、少なくとも１つのMASPタンパク質と結合できる。特に、第一のポリペプチドは、融合タンパク質の一部であるとき、先のMASPの少なくとも１つと結合することができる。それによって、第一のポリペプチド配列は、補体系活性化機能を有する融合タンパク質を提供することができる。
【００５２】
特に好ましい実施態様では、第一のポリペプチド配列は、図１のL-フィコリン配列の1-54、図１のL-フィコリン配列の1-55など、図１のL-フィコリン配列の1-69など、図１のL-フィコリン配列の1-77など、図１のL-フィコリン配列の1-90など、図１のL-フィコリン配列の1-93など、図１のL-フィコリン配列の1-131など、図１のL-フィコリン配列の1-207などに相当するアミノ酸残基を少なくとも含む。特に、第一のポリペプチド配列は、図１のL-フィコリン配列の1-55、図１のL-フィコリン配列の1-54、図１のL-フィコリン配列の1-50、または1-77から選択されるアミノ酸残基を含む。より好ましい実施態様では、第一のポリペプチド配列は、図１のL-フィコリン配列の1-55、図１のL-フィコリン配列の1-54、図１のL-フィコリン配列の1-50、または1-77から選択されるアミノ酸残基を含む。他の実施態様では、第一のポリペプチド配列は、図１のL-フィコリン配列の60-90、図１のL-フィコリン配列の55-90など、図１のL-フィコリン配列の54-92などに相当するアミノ酸残基を少なくとも含む。
【００５３】
第一のポリペプチド配列および第二のポリペプチド配列は、好ましくは連続配列においてモチーフX-X-G-X-X-Gを少なくとも５つ、例えば少なくとも７つを含むように選択されることが好ましい。前記のモチーフがモチーフX-X-G-X-Gによって、一度、置換されるように、第一のポリペプチド配列および第二のポリペプチド配列を選択するのがより好ましい。モチーフにおいて、Xは、グリシンではない任意のアミノ酸を意味し、Gはグリシンを意味する。
【００５４】
第二のポリペプチド配列
第二のポリペプチド配列は、好ましくは１以上の炭水化物と結合できる。これは、少なくとも、あるコレクチンの炭水化物認識ドメインを組み込むことにより生じ得る。従って、第二のポリペプチド配列は、好ましくは、コレクチンまたはその相同体または変異体のCRDドメインを含む。
【００５５】
好ましくは、コレクチンは、MBL(マンノース-結合レクチン)、SP-A(肺サーファクタントプロテインA)、SP-D(肺サーファクタントプロテインD)、BK(またはBC、ウシコングルチニン) および CL-43 (コレクチン-43)からなる群から選択される。最も好ましくは、コレクチンはMBLである。
【００５６】
特に好ましい実施態様では、コレクチンは、データベースおよび受け入れ番号により参照される以下に列挙の配列のうちの１つを有する。
【００５７】
コレクチン
配列番号４２
【化２０−１】
2005537807.tif 000022
【化２０−２】
2005537807.tif 000023
【００５８】
配列番号４３
【化２１】
2005537807.tif 000024
【００５９】
配列番号４５
【化２２】
2005537807.tif 000025
【００６０】
配列番号４７
【化２３】
2005537807.tif 000026
【００６１】
配列番号４８
【化２４】
2005537807.tif 000027
【００６２】
配列番号４９
【化２５】
2005537807.tif 000028
【００６３】
配列番号５０
【化２６】
2005537807.tif 000029
【００６４】
配列番号５１
【化２７】
2005537807.tif 000030
【００６５】
配列番号５２
【化２８】
2005537807.tif 000031
【００６６】
配列番号５３
【化２９】
2005537807.tif 000032
【００６７】
配列番号４４
【化３０】
2005537807.tif 000033
【００６８】
配列番号４６
【化３１】
2005537807.tif 000034
【００６９】
配列番号５４
【化３２】
2005537807.tif 000035
【００７０】
配列番号５５
【化３３】
2005537807.tif 000036
【００７１】
配列番号５６
【化３４】
2005537807.tif 000037
【００７２】
配列番号５７
【化３５】
2005537807.tif 000038
【００７３】
配列番号５８
【化３６】
2005537807.tif 000039
【００７４】
配列番号５９
【化３７】
2005537807.tif 000040
【００７５】
配列番号６０
【化３８】
2005537807.tif 000041
【００７６】
配列番号６１
【化３９】
2005537807.tif 000042
【００７７】
配列番号６２
【化４０−１】
2005537807.tif 000043
【化４０−２】
2005537807.tif 000044
【００７８】
配列番号６３
【化４１】
2005537807.tif 000045
【００７９】
配列番号６４
【化４２】
2005537807.tif 000046
【００８０】
配列番号６５
【化４３】
2005537807.tif 000047
【００８１】
配列番号６６
【化４４】
2005537807.tif 000048
【００８２】
配列番号６７
【化４５】
2005537807.tif 000049
【００８３】
配列番号６８
【化４６】
2005537807.tif 000050
【００８４】
配列番号６９
【化４７】
2005537807.tif 000051
【００８５】
配列番号７０
【化４８】
2005537807.tif 000052
【００８６】
配列番号７１
【化４９】
2005537807.tif 000053
【００８７】
配列番号７２
【化５０】
2005537807.tif 000054
【００８８】
配列番号７３
【化５１】
2005537807.tif 000055
【００８９】
配列番号７４
【化５２】
2005537807.tif 000056
【００９０】
配列番号７５
【化５３】
2005537807.tif 000057
【００９１】
配列番号７６
【化５４】
2005537807.tif 000058
【００９２】
配列番号７７
【化５５】
2005537807.tif 000059
肺サーファクタントプロテイン
【００９３】
配列番号７８
【化５６−１】
2005537807.tif 000060
【化５６−２】
2005537807.tif 000061
【００９４】
配列番号７９
【化５７】
2005537807.tif 000062
【００９５】
配列番号８０
【化５８】
2005537807.tif 000063
【００９６】
配列番号８１
【化５９】
2005537807.tif 000064
【００９７】
配列番号８２
【化６０】
2005537807.tif 000065
【００９８】
配列番号８３
【化６１】
2005537807.tif 000066
【００９９】
配列番号８４
【化６２】
2005537807.tif 000067
【０１００】
配列番号８５
【化６３】
2005537807.tif 000068
【０１０１】
配列番号８６
【化６４】
2005537807.tif 000069
【０１０２】
配列番号８７
【化６５】
2005537807.tif 000070
【０１０３】
配列番号８８
【化６６−１】
2005537807.tif 000071
【化６６−２】
2005537807.tif 000072
【化６６−３】
2005537807.tif 000073
【化６６−４】
2005537807.tif 000074
【０１０４】
配列番号８９
【化６７−１】
2005537807.tif 000075
【化６７−２】
2005537807.tif 000076
【化６７−３】
2005537807.tif 000077
【０１０５】
配列番号９０
【化６８−１】
2005537807.tif 000078
【化６８−２】
2005537807.tif 000079
【０１０６】
配列番号９１
【化６９】
2005537807.tif 000080
【０１０７】
配列番号９２
【化７０】
2005537807.tif 000081
【０１０８】
配列番号９３
【化７１−１】
2005537807.tif 000082
【化７１−２】
2005537807.tif 000083
【０１０９】
配列番号９４
【化７２】
2005537807.tif 000084
【０１１０】
配列番号９５
【化７３】
2005537807.tif 000085
【０１１１】
配列番号９６
【化７４】
2005537807.tif 000086
【０１１２】
配列番号９７
【化７５】
2005537807.tif 000087
【０１１３】
配列番号９８
【化７６】
2005537807.tif 000088
【０１１４】
配列番号９９
【化７７】
2005537807.tif 000089
【０１１５】
配列番号１００
【化７８】
2005537807.tif 000090
【０１１６】
配列番号１０１
【化７９】
2005537807.tif 000091
【０１１７】
配列番号１０２
【化８０】
2005537807.tif 000092
【０１１８】
配列番号１０３
【化８１】
2005537807.tif 000093
【０１１９】
配列番号１０４
【化８２】
2005537807.tif 000094
【０１２０】
配列番号１０５
【化８３−１】
2005537807.tif 000095
【化８３−２】
2005537807.tif 000096
【０１２１】
配列番号１０６
【化８４】
2005537807.tif 000097
【０１２２】
配列番号１０７
【化８５】
2005537807.tif 000098
【０１２３】
配列番号１０８
【化８６】
2005537807.tif 000099
【０１２４】
配列番号１０９
【化８７】
2005537807.tif 000100
【０１２５】
配列番号１１０
【化８８】
2005537807.tif 000101
【０１２６】
配列番号１１１
【化８９】
2005537807.tif 000102
【０１２７】
配列番号１１２
【化９０】
2005537807.tif 000103
【０１２８】
配列番号１１３
【化９１】
2005537807.tif 000104
【０１２９】
配列番号１１４
【化９２】
2005537807.tif 000105
【０１３０】
配列番号１１５
【化９３】
2005537807.tif 000106
【０１３１】
配列番号１１６
【化９４】
2005537807.tif 000107
【０１３２】
配列番号１１７
【化９５】
2005537807.tif 000108
マンノース結合レクチン
【０１３３】
配列番号１
【化９６】
2005537807.tif 000109
【０１３４】
配列番号２
【化９７】
2005537807.tif 000110
【０１３５】
配列番号３
【化９８】
2005537807.tif 000111
【０１３６】
配列番号４
【化９９−１】
2005537807.tif 000112
【化９９−２】
2005537807.tif 000113
【化９９−３】
2005537807.tif 000114
【０１３７】
配列番号５
【化１００−１】
2005537807.tif 000115
【化１００−２】
2005537807.tif 000116
【０１３８】
配列番号６
【化１０１−１】
2005537807.tif 000117
【化１０１−２】
2005537807.tif 000118
【０１３９】
配列番号７
【化１０２】
2005537807.tif 000119
【０１４０】
配列番号８
【化１０３】
2005537807.tif 000120
【０１４１】
配列番号９
【化１０４−１】
2005537807.tif 000121
【化１０４−２】
2005537807.tif 000122
【０１４２】
配列番号１０
【化１０５−１】
2005537807.tif 000123
【化１０５−２】
2005537807.tif 000124
【化１０５−３】
2005537807.tif 000125
【０１４３】
配列番号１１
【化１０６】
2005537807.tif 000126
【０１４４】
配列番号１２
【化１０７】
2005537807.tif 000127
【０１４５】
配列番号１３
【化１０８−１】
2005537807.tif 000128
【化１０８−２】
2005537807.tif 000129
【０１４６】
配列番号１４
【化１０９−１】
2005537807.tif 000130
【化１０９−２】
2005537807.tif 000131
【０１４７】
配列番号１５
【化１１０】
2005537807.tif 000132
【０１４８】
配列番号１６
【化１１１】
2005537807.tif 000133
【０１４９】
配列番号１７
【化１１２】
2005537807.tif 000134
【０１５０】
配列番号１８
【化１１３】
2005537807.tif 000135
【０１５１】
配列番号１９
【化１１４】
2005537807.tif 000136
【０１５２】
配列番号２０
【化１１５】
2005537807.tif 000137
【０１５３】
配列番号２１
【化１１６】
2005537807.tif 000138
【０１５４】
配列番号２２
【化１１７】
2005537807.tif 000139
【０１５５】
配列番号２３
【化１１８】
2005537807.tif 000140
【０１５６】
配列番号２４
【化１１９】
2005537807.tif 000141
【０１５７】
配列番号２５
【化１２０】
2005537807.tif 000142
【０１５８】
配列番号２６
【化１２１】
2005537807.tif 000143
【０１５９】
配列番号２７
【化１２２】
2005537807.tif 000144
【０１６０】
配列番号２８
【化１２３】
2005537807.tif 000145
【０１６１】
配列番号２９
【化１２４】
2005537807.tif 000146
【０１６２】
配列番号３０
【化１２５】
2005537807.tif 000147
【０１６３】
配列番号３１
【化１２６】
2005537807.tif 000148
【０１６４】
配列番号３２
【化１２７】
2005537807.tif 000149
【０１６５】
配列番号３３
【化１２８】
2005537807.tif 000150
【０１６６】
配列番号３４
【化１２９】
2005537807.tif 000151
【０１６７】
配列番号３５
【化１３０】
2005537807.tif 000152
【０１６８】
配列番号３６
【化１３１】
2005537807.tif 000153
【０１６９】
配列番号３７
【化１３２】
2005537807.tif 000154
【０１７０】
配列番号３８
【化１３３】
2005537807.tif 000155
【０１７１】
配列番号３９
【化１３４】
2005537807.tif 000156
【０１７２】
配列番号４０
【化１３５】
2005537807.tif 000157
【０１７３】
配列番号４１
【化１３６】
2005537807.tif 000158
【０１７４】
第二のポリペプチド配列は、好ましくは、コレクチンまたはそのタンパク質の変異体または相同体の少なくとも10、少なくとも12など、例えば少なくとも15、少なくとも20など、例えば少なくとも25、少なくとも30など、例えば少なくとも35、少なくとも40など、例えば少なくとも50の連続アミノ酸残基を含む。その変異体または相同体は、好ましくは、コレクチンと少なくとも70%、80%など、例えば90%、95%などの同一性を有する。
【０１７５】
好ましい実施態様では、第二のポリペプチド配列は、MBLのCRDドメインまたはMBLのネック領域またはMBLのコラーゲン様領域を含む。より好ましくは、第二のポリペプチドは、MBLのネック領域およびCRDを含む。最も好ましい実施態様では、第二のポリペプチド配列は、MBLのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む。MBLは上記の通りである。
【０１７６】
好ましくは、第二のポリペプチド配列は、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも170-200、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも160-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも150-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも140-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも130-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも120-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも110-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも100-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも90-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも80-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも70-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも60-200など、図２に示すMBL配列のアミノ酸の少なくとも80-228などを含む。
【０１７７】
好ましくは、第二のポリペプチド配列は配列番号２のアミノ酸80-228を含む。
【０１７８】
好ましい実施態様では、第二のポリペプチド配列は、MASP-1、MASP-2およびMASP-3またはその機能的相同体または変異体からなる群から選択されるMASPタンパク質のような、少なくとも１つのMASPタンパク質と結合できる。特に、第二のポリペプチドは、融合タンパク質の一部であるとき、先のMASPの少なくとも１つと結合することができる。それによって、第二のポリペプチド配列は、補体系活性化機能を有する融合タンパク質を提供することができる。好ましい実施態様では、第二のポリペプチド配列は、配列番号２の56-228、配列番号２の55-228、配列番号２の54-228、および配列番号２の50-228から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい実施態様では、第二のポリペプチド配列は、配列番号２の56-228、配列番号２の55-228、配列番号２の54-228、および配列番号２の50-228から選択されるアミノ酸を有する。
【０１７９】
他の実施態様では、第二のポリペプチドは、コレクチンのN末端領域のような、コレクチンのシステインリッチ領域を含む。
【０１８０】
融合タンパク質
融合タンパク質は、所望によりリンカー領域を介し、互いに連結する第一および第二のポリペプチドを含む。好ましい実施態様では、第一のポリペプチド配列は、融合タンパク質のN末端に位置し、第二のポリペプチド配列はC末端に位置する。
【０１８１】
融合タンパク質のコンポーネントの特定の例は、
L-フィコリンのシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域およびMBLのCRDドメインを含む融合タンパク質、
L-フィコリンのシステインリッチ領域およびMBLのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む融合タンパク質、
H-フィコリンのシステインリッチ領域およびMBLのコラーゲン様領域およびCRDドメインを含む融合タンパク質、
H-フィコリンのシステインリッチ領域およびMBLのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む融合タンパク質、
M-フィコリンのシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域およびMBLのCRDドメインを含む融合タンパク質、
M-フィコリンのシステインリッチ領域およびMBLのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む融合タンパク質、
MBLのシステインリッチ領域、およびフィコリンのCRDドメインを含む融合タンパク質、
MBLのシステインリッチ領域、およびフィコリンのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む融合タンパク質、
L-フィコリンのシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域および肺サーファクタント結合プロテインDのCRDドメインを含む融合タンパク質、
L-フィコリンのシステインリッチ領域および肺サーファクタント結合プロテインDのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む融合タンパク質、
フィコリンのシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域およびコレクチン-43のCRDドメインを含む融合タンパク質、
フィコリンのシステインリッチ領域およびコレクチン-43のコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む融合タンパク質、
である。
【０１８２】
図３に示す配列により定義されるようなアミノ酸配列、またはその機能的相同体を含む融合タンパク質、好ましくは、図３に示すアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。他の実施態様では、融合タンパク質は図１に示すアミノ酸のアミノ酸配列1-50および図２に示すアミノ酸配列のアミノ酸配列54-228を有する。
【０１８３】
上記考察のように、融合タンパク質は、好ましくは、サブユニット複合体およびサブユニット複合体のオリゴマーを形成することができる。好ましくは、融合タンパク質は、融合タンパク質のより均一な組成物を得るために、実質的に三量体、四量体、五量体および六量体サブユニットオリゴマーのみ、三量体、四量体、および五量体サブユニットオリゴマーなど、三量体または四量体サブユニットオリゴマーなど、より好ましくは実質的に四量体サブユニットオリゴマーのみを形成する。
【０１８４】
相同体
本明細書において、相同体または変異体または機能的相同体なる用語は同義語として使用される。ここで、タンパク質の相同体では１以上のアミノ酸残基の１以上の置換、欠失および／または付加が見られる。フラグメント群とは相同体のサブグループであり、それらはタンパク質をトランケーションしたものである。
【０１８５】
タンパク質の相同体は、１以上の保存アミノ酸置換、少なくとも２の保存アミノ酸置換など、例えば少なくとも３の保存アミノ酸置換、少なくとも５の保存アミノ酸置換など、例えば少なくとも１０の保存アミノ酸置換、少なくとも２０の保存アミノ酸置換など、例えば少なくとも５０の保存アミノ酸置換、少なくとも７５の保存アミノ酸置換など、例えば少なくとも１００の保存アミノ酸置換を含み得る。本発明において意味する保存アミノ酸置換とは、事前に決定したアミノ酸グループのうちの１のアミノ酸を、その事前に決定したグループ内であって類似または実質的に類似の特徴を有する他のアミノ酸に置換することをいう。その事前に決定したグループは、例えば、極性側鎖(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr、およびCys)、非極性側鎖(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、およびMet)、脂肪族側鎖(Gly、Ala、Val、Leu、Ile)、環状側鎖(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)、芳香族側鎖(Phe、Tyr、Trp)、酸性側鎖(Asp、Glu)、塩基性側鎖(Lys、Arg、His)、アミド側鎖(Asn、Gln)、水酸基側鎖(Ser、Thr)、硫黄含有側鎖(Cys、Met)、およびモノアミノ-ジカルボン酸またはモノアミノ-モノカルボン酸-モノアミドカルボン酸(monoamino-monocarboxylic-monoamidocarboxylic acids)のアミノ酸(Asp、Glu、Asn、Gln)である。
【０１８６】
保存置換は、好ましいタンパク質の任意の位置に導入され得る。しかし、非保存置換を導入することが望ましい場合もある。非保存置換は、タンパク質の相同体であって、該タンパク質の機能に類似する機能を発揮できるタンパク質が形成されるようにするべきである。その置換は、例えば、i)実質的な疎水性の相違、例えば、Arg、Lys、TrpまたはAsnなどの親水性残基に置換される疎水性残基(Val、Ile、Leu、PheまたはMet)、またはThr、Ser、His、Gln、Asn、Lys、Asp、GluまたはTrpなどの疎水性残基に置換される親水性残基、および／またはii)他の残基へのProまたはGlyの置換またはProまたはGlyへの置換のようなポリペプチドバックボーン方向(polypeptide backbone orientation)における実質的な作用の相違、および／またはiii)荷電の実質的な相違、例えば、GluまたはAspのような陰性荷電残基の、Lys、HisまたはArgのような陽性荷電残基への置換(およびその逆)、および／またはiv)立体障害となる大きさ(steric bulk)の実質的相違、例えば、His、Trp、PheまたはTyrのような巨大残基(bulky residue)の、小さな側鎖を有するもの、例えば、Ala、GlyまたはSerへの置換(およびその逆)であり得る。
【０１８７】
更なる実施態様では、本発明は好ましいタンパク質の相同体に関する。ここで、その相同体は、以下の親水性またはヒドロパシーの指標を有する置換アミノ酸を含む。置換されたアミノ酸の値においてその指標は、+/-2.5の範囲内、例えば、+/-2.3の範囲内、+/-2.1の範囲内など、例えば、+/-2.0の範囲内、+/-1.8の範囲内など、例えば、+/-1.6の範囲内、+/-1.5の範囲内など、例えば、+/-1.4の範囲内、+/-1.3の範囲内など、例えば、+/-1.2の範囲内、+/-1.1の範囲内など、例えば、+/-1.0の範囲内、+/-0.9の範囲内など、例えば、+/-0.8の範囲内、+/-0.7の範囲内など、例えば、+/-0.6の範囲内、+/-0.5の範囲内など、例えば、+/-0.4の範囲内、+/-0.3の範囲内など、例えば、+/-0.25の範囲内、+/-0.2の範囲内などになる。
【０１８８】
相互作用性の生体機能をタンパク質に付与する上で親水性およびヒドロパシーアミノ酸の指標の重要性は、当分野において十分に理解されている(Kyte & Doolittle, 1982 およびHopp, 米国特許番号4,554,101、それぞれ引用により本明細書に含める)。
【０１８９】
本明細書で使用するアミノ酸ヒドロパシー指標の値は、イソロイシン (+4.5) ; バリン (+4.2) ; ロイシン (+3.8) ; フェニルアラニン (+2.8) ; システイン/シスチン (+2.5) ; メチオニン (+1.9) ; アラニン (+1.8) ; グリシン (-0.4) ; トレオニン (-0.7); セリン (-0.8) ; トリプトファン (-0.9) ; チロシン (-1.3) ; プロリン (-1.6) ; ヒスチジン (-3.2) ; グルタミン酸 (-3.5) ; グルタミン (-3.5) ; アスパラギン酸 (-3.5) ; アスパラギン (-3.5) ; リシン (-3.9) ; およびアルギニン (-4.5)である(Kyte & Doolittle, 1982)。
【０１９０】
アミノ酸親水性値は、アルギニン (+3.0) ; リシン (+3.0) ; アスパラギン酸 (+3.0. +-.1); グルタミン酸 (+3.0. +-.1); セリン (+0.3) ; アスパラギン (+0.2) ; グルタミン (+0.2) ; グリシン (0); トレオニン (-0.4) ; プロリン (-0.5.+-.1) ; アラニン (-0.5) ; ヒスチジン (-0.5) ; システイン (-1.0) ; メチオニン (-1.3) ; バリン (-1.5) ; ロイシン (-1.8) ; イソロイシン (-1.8) ; チロシン (-2.3) ; フェニルアラニン (-2.5) ; トリプトファン (-3.4)である(米国4,554,101)。
【０１９１】
そのため、ある実施態様では、アミノ酸の置換は、疎水性および親水性値ならびに荷電、大きさなどを含むアミノ酸側鎖置換基の類似性に基づき得る。前述の種々の特性を考慮した典型的なアミノ酸置換は当業者に既知であり、アルギニンとリシン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン、ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンの置換が含まれる。
【０１９２】
更に、相同体は、アミノ酸の付加または欠失を含み得、例えば、２から１００アミノ酸、２から５０アミノ酸など、例えば、２から２０アミノ酸、２から１０アミノ酸など、例えば２から５アミノ酸、２から３アミノ酸などの付加または欠失である。しかし、１００を超えるアミノ酸の付加、１００から５００のアミノ酸の付加もまた本発明内に含まれる。
【０１９３】
好ましいタンパク質と少なくともある程度相同性のあるタンパク質は、該好ましいタンパク質と少なくとも約４０％相同性または好ましくは同一性、少なくとも５０％相同性または好ましくは同一性など、例えば、少なくとも６０％相同性または好ましくは同一性、少なくとも約７０％相同性または好ましくは同一性など、例えば、少なくとも約７５％相同性または好ましくは同一性、少なくとも約８０％相同性または好ましくは同一性など、例えば、少なくとも約８５％相同性または好ましくは同一性、少なくとも約９０％相同性または好ましくは同一性など、例えば、９２％相同性または好ましくは同一性、少なくとも９４％相同性または好ましくは同一性など、例えば少なくとも９５％相同性または好ましくは同一性、少なくとも９６％相同性または好ましくは同一性など、例えば９７％相同性または好ましくは同一性、少なくとも９８％相同性または同一性など、例えば少なくとも９９％相同性または好ましくは同一性のとき、本発明の範囲内にあるといえる。
【０１９４】
好ましいタンパク質は、コレクチンおよびレクチンおよびそれらの相同体を含む補体活性化タンパク質である。
【０１９５】
コレクチンの相同体
本発明の範囲内のMBLを含むコレクチンの相同体は、コレクチンの機能に類似する機能を有し、上記の１以上の変異体を含み得る任意のタンパク質として理解すべきである。特にその機能は、１以上の炭水化物への結合の際の補体の活性化能である。
【０１９６】
本明細書で使用するコレクチンの機能的相同体という用語は、機能的均等物または事前に決定したアミノ酸配列を含むコレクチンのフラグメントに関連し、その相同体は、A)単独または上記のような複合化したサブユニットであるときの何れかにおいてピラノース環（すなわち、Man、Glc、FucまたはGlcNAc）の3-および4-ヒドロキシル基に糖を含むグルカン、リポホスホグリカンおよびグリコイノシトールホスホリピッドを認識およびそれらに結合できるアミノ酸配列を含む相同体および／またはb)単独または上記のような複合化したサブユニットであるときの何れかにおいてMASP-1、MASP-2、MASP-3および/またはsMAPに結合する(該結合はレクチン／MBL経路を活性化する)ようなレクチン／MBL経路のコンポーネントと結合を形成し得るアミノ酸配列を含む相同体、および／またはc)２以上のサブユニット（サブユニットは、システインリッチ領域、コラーゲン様領域、ネック領域および炭水化物認識ドメインの３つの同一のポリペプチドを含む）のオリゴマー構造を形成するコラーゲン様領域による、可能性あるアミノ酸配列を含む相同体と定義される。
【０１９７】
レクチンの相同体
本発明の範囲内のフィコリンを含むレクチンの相同体は、レクチンの機能に類似する機能を有し、上記の１以上の変異体を含み得る任意のタンパク質と理解すべきである。特に、その機能は、１以上の炭水化物との結合の際に補体を活性化する能力である。
【０１９８】
本明細書で使用するレクチンの機能的相同体という用語は、事前に決めたアミノ酸配列を含むレクチンのフラグメントの機能的均等物に関し、その相同体は、a)単独または上記のような複合化したサブユニットであるときの何れかにおいてN-アセチル-グルコサミン(GlcNAc)、またはN-アセチル-ガラクトサミン(GalNAc)、またはエラスチンを認識およびそれらに結合できるアミノ酸配列を含む相同体、および／またはb)単独または上記のような複合化したサブユニットであるときの何れかにおいてMASP-1、MASP-2、MASP-3および／またはsMAPに結合する(該結合はレクチン／MBL経路を活性化する)ようなレクチン／MBL経路のコンポーネントと結合を形成し得るアミノ酸配列を含む相同体、および／またはc)２以上のサブユニット（サブユニットは、システインリッチ領域、コラーゲン様領域、ネック領域およびフィブリノーゲン様ドメインの３つの同一のポリペプチドを含む）のオリゴマー構造を形成するコラーゲン様領域による、可能性あるアミノ酸配列を含む相同体と定義される。
【０１９９】
レクチン／MBL経路の活性化、すなわち、補体系を活性化する融合タンパク質の活性は、融合タンパク質またはそのサブユニット複合体もしくは複合体のオリゴマーのC4切断作用を評価し、その後、融合タンパク質を事前に決定した量およびMASP-1、MASP-2またはMASP-3を事前に決定した量含むサンプルを適用すること、少なくとも１つの補体因子をサンプルに適用すること、切断した補体因子の量を検出すること、切断した補体因子の量を融合タンパク質の量と相関させること、および融合タンパク質の活性を測定することを含む方法を行うことにより評価し得る。
【０２００】
本発明の方法において好ましくは使用する補体因子は、C4などのMBL/MASP-2複合体により切断可能な補体因子である。しかし、補体因子はまた、C3およびC5から選択され得る。
【０２０１】
切断した補体因子は、種々の手段により、その切断した補体因子に対する抗体によるなどの手段により検出され得る。
【０２０２】
そのアッセイは、典型的な補体活性化経路および他の補体活性化経路からの障害を最小化または排除する条件で行う。
【０２０３】
好ましくは、コレクチンおよび／またはレクチンの相同体は、上記の２つの機能、より好ましくは上記の３つの機能を有する。
【０２０４】
融合タンパク質の作成
融合タンパク質は当業者に既知の任意の適当な方法により作成され得る。以下に、融合タンパク質を作成するための方法を幾つか記載するが、その記載は本発明を限定するものではない。
【０２０５】
合成的な作成
特に融合タンパク質の大きさに関して適当であれば、融合タンパク質は合成的に作成され得る。ペプチドの合成的作成の方法が当分野に既知である。合成ペプチドの作成のための詳細および実施上のアドバイスとしてSynthetic Peptides: A User's Guide (Advances in Molecular Biology), Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002、またはPharmaceutical Formulation : Development of Peptides and Proteins, Frokjaer and Hovgaard eds., Taylor and Francis, 1999があり得る。
【０２０６】
組み換え的な作成
本発明の融合タンパク質は、好ましくは組み換えDNA技術を使用することにより作成される。融合タンパク質の各部分をコードするDNA配列は、全長タンパク質をコードするDNA配列(ゲノムDNAまたはcDNA)のフラグメント化により作成され得、そしてその融合タンパク質の部分は標準的なプロトコール(Sambrook et al., Molecular cloning : A Laboratory manual. 2 rd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)に従いDNAase Iを用いることにより得られる。融合タンパク質のそれぞれの部分をコードする、得られたDNA配列を互いに融合し得る。
【０２０７】
DNA配列は、例えば、米国特許番号4,683,202またはSaiki et al., 1988, Science 239: 487-491に記載のように、特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によっても作成され得る。
【０２０８】
本発明の融合タンパク質をコードするDNA配列は、確立された標準的方法、例えば、Beaucage and Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1869に記載のホスホアミジン法、またはMatthes et al., 1984, EMBO J. 3: 801-805に記載の方法により、合成的に作成され得る。ホスホアミジン法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成機で合成され、精製され、アニール化され、ライゲーションされ、適当なベクター中にクローニングされる。
【０２０９】
次いで、該DNA配列は、組み換え発現ベクター中に挿入される。ここで、そのベクターは、組み換えDNA作成に都合のよい任意のものである。ベクターの選択は、時折、導入する宿主細胞に依存する。それ故、そのベクターは自己複製ベクター、すなわち、染色体外に存在するベクターであり得、その複製は染色体複製に非依存であり、例えば、プラスミドである。他に、そのベクターは、宿主細胞中に導入したとき宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであり得る。
【０２１０】
該ベクターにおいて、融合タンパク質をコードするDNA配列は、操作可能なように適当なプロモーター配列に連結すべきである。該プロモーターは、選択した宿主細胞中で転写活性があり、そして該宿主細胞にとって同種的かまたは異種的の何れかのタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる任意のDNA配列であり得る。哺乳類細胞中のコーディングDNA配列の転写に適当なプロモーターの例はSV 40プロモーター(Subramani et al., 1981, Mol. Cell Biol. 1: 854-864)、MT-1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-814)またはアデノウイルス２主要後期プロモーター(adenovirus 2 major late promoter)である。昆虫細胞での使用に適当なプロモーターはポリヘドリンプロモーター(Vasuvedan et al., 1992, FEBS Lett. 311: 7-11)である。酵母宿主細胞における使用に適当なプロモーターには、酵母糖分解遺伝子(Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 12073- 12080; Alber and Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419-434)由来のプロモーターまたはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al., 1982, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al, eds. , Plenum Press, New York)、またはTPI1(米国特許番号4,599,311)またはADH2-4c(Russell et al., 1983, Nature 304: 652-654)プロモーターである。糸状菌宿主細胞における使用に適当なプロモーターは、例えば、ADH3プロモーター(McKnight et al., 1985, EMBO J. 4: 2093-2099)またはtpiAプロモーターである。
【０２１１】
コーディングDNA配列はまた、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al., op. cit.)などの適当なターミネーター、または(菌類宿主では)TPI1(Alber and Kawasaki, op. cit.)またはADH3(McKnight et al., op. cit.)プロモーターに操作可能なように連結され得る。ベクターは、更に、ポリアデニル化シグナル(例えば、SV 40またはアデノウイルス5 Elb領域由来)、転写促進配列(例えば、SV 40エンハンサー)および翻訳促進配列(例えば、アデノウイルスVA RNAをコードするもの)などのエレメントを含み得る。
【０２１２】
組み換え発現ベクターは、更に、関連の宿主細胞中でベクターが複製し得るＤＮＡ配列を含み得る。その配列の例(宿主細胞が哺乳類細胞であるとき)は、SV 40の複製起点である。ベクターはまた、選択マーカー、例えば、宿主細胞の欠損を相補する産物の遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードする遺伝子または薬物、例えばネオマイシン、ヒドロマシンまたはメトトレキサートに対する耐性を供与する遺伝子など、を含み得る。
【０２１３】
融合タンパク質をコードするDNA配列、プロモーターおよびターミネーター、それぞれのライゲーションに使用する手順およびそれらの遺伝子を適当なベクター(複製に必要な情報を含む)に挿入する手順は、当業者に既知である(例えば、Sambrook et al., op. cit.参照)。
【０２１４】
組み換え融合タンパク質の合成は、インビトロまたはインビボ培養の使用により行う。宿主細胞培養物は、好ましくは、真核宿主細胞培養物である。本明細書では、真核細胞培養物の形質転換とは、組み換えDNAが細胞中に導入されることを意味する。その過程で使用される発現コンストラクトは、ヒト遺伝子およびそれと非常に似た遺伝子、例えばチンパンジー由来の遺伝子などを含む哺乳類遺伝子から選択されるコード領域を有することを特徴とする。使用される発現コンストラクトは、更に、ウイルスまたは哺乳類細胞および昆虫細胞を含む真核生物の遺伝子から選択されるプロモーター領域により特徴付けられる。
【０２１５】
本発明の組み換えMBLを産生する方法は、宿主細胞培養物が好ましくは真核、例えば哺乳類細胞培養物である点が特徴的である。好ましい宿主細胞培養物はヒト腎細胞の培養物であり、より好ましい形態では、宿主細胞培養物は、組み換えヒトMBLの産生のための、ヒト胚腎細胞(HEK細胞)、HEK 293細胞系などの培養物である。「HEK 293細胞系」とは、ヒト胚腎臓組織由来の何れかの細胞系、American Type Culture Collectionに番号CRL-1573およびCRL-10852として寄託されている細胞系など(これに限らない)を意味する。
【０２１６】
他の細胞には、ヒヨコ胚繊維芽細胞、ハムスター卵細胞、仔ハムスター腎細胞、ヒト子宮頚癌細胞、ヒト黒色腫細胞、ヒト腎細胞、ヒト臍帯血管内皮細胞、ヒト脳内皮細胞、ヒト口腔腫瘍細胞、サル腎細胞、マウス繊維芽細胞、マウス腎細胞、マウス結合組織細胞、マウスオリゴ樹状細胞(oligodendritic cell)、マウスマクロファージ、マウス繊維芽細胞、マウス神経芽腫細胞、マウスプレB細胞、マウスBリンパ腫細胞、マウスプラズマ細胞腫細胞、マウス奇形癌細胞、ラット星状細胞腫細胞、ラット乳房上皮細胞、COS、CHO、BHK、VERO、HeLa、MDCK、W138、およびNIH 3T3細胞があり得る。
【０２１７】
他に、菌類細胞(酵母細胞を含む)は宿主細胞として使用し得る。適当な酵母細胞の例には、Saccharomyces spp.またはSchizosaccharomyces spp.の細胞が含まれ、特にSaccharomyces cerevisiaeの株が含まれる。他の菌類細胞の例には、糸状菌、例えば、Aspergillus spp.またはNeurospora spp.の細胞、特にAspergillus oryzaeまたはAspergillus nigerの株が含まれる。タンパク質の発現におけるAspergillus spp.の使用が例えばEP 238 023に記載されている。
【０２１８】
更に、宿主細胞株は、挿入配列の発現をモジュレートするか、または特定の望ましい形態に遺伝子産物を修飾およびプロセッシングするように、選択し得る。タンパク質産物のその修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、切断)は該タンパク質の機能に重要であり得る。別の宿主細胞では、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾に特徴的で特別の機構を有する。適当な細胞系または宿主系は、発現した外来タンパク質の修飾およびプロセッシングが正確となるように選択され得る。この目的のために、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、およびリン酸化という適当なプロセッシングための細胞機構を保有する真核性宿主細胞を使用し得る。上記列挙の哺乳類細胞型は、適当な宿主細胞としての役割を果たし得るものである。
【０２１９】
哺乳類細胞のトランスフェクトおよび細胞に導入されるDNA配列の発現の方法は、例えば、Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, PP. 601-621 ; Southern and Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341; Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 422-426; Wigler et al., 1978, Cell 14: 725; Corsaro and Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7, p. 603; Graham and van der Eb, 1973, Virol. 52 : 456; および Neumann et al., 1982, EMBO J. 1: 841-845に記載されている。
【０２２０】
トランスジェニック植物または動物における融合タンパク質の産生など、他の真核性産生系も本発明で想定されている。
【０２２１】
他の態様では、本発明は、融合タンパク質をコードする上記のような遺伝子発現コンストラクトを作成すること、該コンストラクトで宿主細胞培養物を形質転換すること、宿主細胞培養物を培養し、それによって、ポリペプチドを発現させ、培養培地に分泌させ、その後、組み換え融合タンパク質を含む培養培地を得ること、そして該融合タンパク質を精製することにより、融合タンパク質を作成する方法を提供する。
【０２２２】
細胞の培養に用いる培地は、哺乳類細胞の増殖に適当な任意の培地、適当な添加物を含んでいる血清含有または非含有培地など、または昆虫、酵母または菌類細胞の増殖に適当な培地であり得る。適当な培地は、市場の販売者から入手可能であり、また、刊行されているレシピにより調製し得る(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)。培養培地の例は、例えば、インシュリン、トランスフェリン、セレニウムおよび胎児ウシ血清を加えたRPMI-1640またはDMEMである。
【０２２３】
次いで、細胞により組み換え的に産生される融合タンパク質は、遠心分離または濾過により宿主細胞を培地から分離すること、塩、例えば硫酸アンモニウムによりその上清または濾液のタンパク質コンポーネントを沈殿させること、種々のクロマトグラフィー法、例えばHPLC、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる精製を含む通常の方法により培養培地から回収され得る。
【０２２４】
好ましい実施態様では、融合タンパク質は、上記のような炭水化物親和性クロマトグラフィーを使用することにより精製する。本発明の好ましい実施態様では、親和性クロマトグラフィーは、マンノース、ヘキソースまたはN-アセチル-グルコセアミン誘導化マトリクスのマトリクス(親和性クロマトグラフィーに適当なものである)により行う。特に、マトリクスがマンノースで誘導体化されているアフィニティークロマトグラフィーを用いる。
【０２２５】
本明細書では、精製した組み換え融合タンパク質は、例えば、炭水化物親和性クロマトグラフィーを用いることにより、細胞培養物の上清または体液またはトランスジェニック動物由来の組織から精製した組み換え融合タンパク質であると理解される。
【０２２６】
培養培地の適用後、カラムは、好ましくは、融合タンパク質は溶出させることなくタンパク質を除去する組成物、pHおよびイオン強度を有する非変性緩衝液を用いることにより、洗浄する。その緩衝液はTBSであり得る。融合タンパク質の溶出は、融合タンパク質を効率的に溶出できる選択的吸着剤、EDTA(例えば5 mM)またはマンノース(例えば50 mM)などの吸着剤を含むTBSなどで行い、融合タンパク質を回収する。
【０２２７】
医薬組成物および治療
本発明により得られる融合タンパク質は、種々の疾患または病状の予防および／または治療のための医薬組成物の製造に使用し得る。本明細書では、医薬組成物という用語は医薬と同義的に使用する。
【０２２８】
融合タンパク質に加えて、医薬組成物は、医薬的に許容される担体物質および／またはビヒクルを含み得る。
【０２２９】
特に、安定化剤は、融合タンパク質を安定化するために加えられ得る。該安定化剤は糖アルコール、サッカライド、タンパク質および／またはアミノ酸であり得る。安定化剤の例はアルブミンまたはマルトースであり得る。
【０２３０】
他の都合のよい添加物も、例えば投与形態に依存して医薬組成物に添加され得る。
【０２３１】
ある実施態様では、該医薬組成物は注射に適した形態である。通常の担体物質、等張性生理食塩水などを使用し得る。
【０２３２】
他の実施態様では、医薬組成物は、肺投与(pulmonal administration)に適当な形態、吸入用パウダーなど、または局所適用用クリームもしくは液体の形態を有する。
【０２３３】
本明細書において、治療は、例えば、ヒトなどで作用する機能単位を有するヒトおよび動物による免疫系および生殖系の治癒および／または予防を含み得る。治療される病状とは、治療の必要があると現在判っている病状を必ずしも意味するものではないが、治療の現在の必要性および／または必要になるとの予測と関連する任意の病状、または正常な状態の向上と関連する任意の病状が一般的に含まれる。特に、該治療は、レクチンの欠損、MBL欠損などの病状の治療である。
【０２３４】
本発明の他の態様では、例えば、ヒトなどで作用する機能単位を有するヒトおよび動物による免疫系および生殖系の疾患および異常の治癒および／または予防を含む病状の治療を目的とした融合タンパク質の医薬組成物からなる医薬の製造を提供する。
【０２３５】
本発明の化合物による治療の必要な該疾患、異常および／または病状には、例えば、MBL欠損の病状の治療、免疫抑制化学療法と関連する癌および感染症(癌治療による病状または器官の移植および／または移植手術と関連することが判っている特定の感染症を含む)の治療が含まれる。本発明はまた、再発性の流産と関連する病状の治療を含む。
【０２３６】
そのため、特に医薬組成物は、感染症、MBL欠損、癌、感染症のような化学療法と関連する異常、ヒト免疫疾患ウイルス(HIV)と関連する疾患、先天性または後天性の免疫疾患と関連する疾患から選択される臨床症状の治療および／または予防に使用され得る。より特に、慢性炎症性脱髄多発性神経炎(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)(CIDP)、多病巣性運動性(Multifocal motoric neuropathy)、多発性硬化症、重症筋無力症、Eaton-Lambert's症候群、Opticus神経炎、てんかん; 原発性抗リン脂質症候群(Primary antiphospholipid syndrome); リュウマチ性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬皮症、脈管炎、Wegner's肉芽腫症、Sjogren's症候群、若年性リュウマチ性関節炎; 自己免疫好中球減少症、自己免疫法血性貧血、好中球減少症; クローン病、潰瘍性大腸炎(Colitis ulcerous)、セリアック病; 喘息、敗血性ショック症候群、慢性疲労症候群、乾癬、毒性ショック症候群、糖尿病、静脈洞炎、拡張性心筋症、心内膜炎、アテローム性動脈硬化症、一般変異型免疫不全症、Wiskott-Aldrich症候群および重症複合免疫不全症(SCID)を含む原発性低／無ガンマグロブリン血症、慢性リンパ性白血病(CLL)および多発性骨髄腫の患者における二次性低／無ガンマグロブリン血症、急性および慢性特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、同種骨髄移植(BTM)、川崎病、およびGuillan-Barre's症候群。
【０２３７】
投与経路は、任意の適当な経路であり得、静脈、筋肉内、皮下または皮内などであり得る。また、肺または局所投与が本発明では想定されている。
【０２３８】
特に、融合タンパク質を投与し、先天性または後天性MBL疾患に関連する症状を有しまたはその症状が進行する危険性を有する患者における感染症を予防および／または治療し得る。化学療法または他の細胞毒性治療、癌、AIDS、遺伝的気質、慢性感染症および好中球減少症など、様々な病状により、MBL欠損の個体で感染症の罹患率が高まり得る。
【０２３９】
そのため、医薬組成物は、化学療法などの開始前および少なくとも化学療法中に投与され得る。
【０２４０】
融合タンパク質は、化学療法前の一般的な「ブースター」として投与され得るか、またはMBL欠損が進行する危険性がある者にのみ投与され得る。その危険性の高い患者のグループにおいて、治療前にMBLレベルを測定し、事前に測定したレベルよりMBLレベルの低い患者のみを治療し得る。
【０２４１】
融合タンパク質を適当な用法・用量で投与し、特に、通常、適当な間隔、例えば、化学療法の間に週に一度または二度、投与する。
【０２４２】
通常、用量あたり1-100mg、2-10mgなど、最も好ましくは用量あたり5-10mgを投与する。最も好ましくは約0.1 mg/kg体重を投与する。
【０２４３】
更に、本発明の態様では、他の医薬を更に含むキットの一部として本発明の組み換え組成物を使用する。特に、その他の医薬は、抗微生物性医薬、抗菌剤などであり得る。
【０２４４】
流産に関しては、患者のMBLの血漿レベルが低くなりやすくなると報告されている。でなければ、流産の再発の説明がつかない。それが、そのような場合に組み換えMBLを投与することによりMBLレベルが上昇し流産の確率は低下するという背景である。
【０２４５】
本発明の化合物の特性に関して、広範の意味においては、本発明は、オプソニンとして作用し得る、すなわち、該化合物とマクロファージとの間で直接相互作用か、または標的表面の補体沈着を介するか何れかでマクロファージの取り込みを促進し得る化合物に関するといえる。
【実施例】
【０２４６】
実施例
実施例１
FCNMBL-r1、-r2、-r3、-r4、-r5、-r6および-r7のプラスミドクローニング
1.1 要約
一連のプラスミドは、組み換えヒトマンノース結合レクチン2遺伝子(rhMBL)とヒトフィコリン2 (FCN2)との間でのタンパク質融合の哺乳類細胞内での発現用に構築した。ベクターは、多コピー数のColE1に基づくプラスミドから得られ、哺乳類系でタンパク質発現できるように設計されたものである。該融合タンパク質の発現は、構成的な発現を促進するヒトサイトメガロウイルス(CMV)初期(immediate early)プロモーターにより行われる。選択は、原核のβ-ラクタマーゼプロモーターのコントロールのもとアンピシリン耐性遺伝子により細菌中で行われ得る。ネオマイシン耐性遺伝子は、哺乳類細胞中でG418により安定な選択が提供され、SV40初期プロモーターにより駆動される。
【０２４７】
1.2 コントラストおよび実験
フィコリン2とMBLの融合タンパク質を発現するために、一連のプラスミドを設計し構築した。その新しい組み換えプラスミドは、先にクローニングしたpcDNA2001-cintMBLcDNAに基づいている。このプラスミドはヒトMBL用のcDNAと供に合成イントロンを含む。
【０２４８】
以下の融合物を設計した(アンダーライン部分は融合タンパク質のFCN2を示し、イタリック部分はMBL部分を示す)。
【０２４９】
FCN2MBLr1(配列番号118): 
【化１３７】
2005537807.tif 000159
【０２５０】
FCN2MBLr2(配列番号119):
【化１３８】
2005537807.tif 000160
【０２５１】
FCN2MBLr3 (配列番号120):
【化１３９】
2005537807.tif 000161
【０２５２】
FCN2MBLr4 (配列番号121):
【化１４０】
2005537807.tif 000162
【０２５３】
FCN2MBLr5 (配列番号122): 
【化１４１】
2005537807.tif 000163
【０２５４】
FCN2MBLr6 (配列番号123) : 
【化１４２】
2005537807.tif 000164
【０２５５】
FCN2MBLr7 (配列番号124) : 
【化１４３】
2005537807.tif 000165
【０２５６】
全ての構築に用いる親プラスミド: 
・pcDNA2003-cintMBLcDNA
・Invitrogen Genestorm clone RG000632 (Cat. No. H-K1000 INVITROGEN)
構築は、BDのBD In-FusionTM PCR Cloning Kit(Cat. No. 631774)を用い、組み換えにより行った。BD In-Fusion Kitは、ベクターとPCR産物との間の2x15bpの相同領域のみに基づきPCR産物をクローニングし得る。このキットでクローニングするときはリガーゼまたはホスファターゼは必要ない。In-Fusion酵素がDNAフラグメント末端を捕捉し、ベクターと挿入物を結合する。
【０２５７】
PCR反応に使用するプライマーを表１に示す。
組み換えのためのPCR反応およびベクターの直鎖化
PCR反応は、Bstz171 (N135-20B)で消化したプラスミド"Genestorm RG000632" batch N135-15Cで行った。プライマー対を下記のように使用した。PCR反応用のキット: PfuUltraTM Hotstart PCR Master Mix Stratagene #600630。PCR反応チューブは、表２に示す温度プロファイルを用いBioRAD i-cyclerで行った。
【０２５８】
組み換え反応の場合、ベクターpcDNA2001-cintMBLcDNAを、以下に列挙の酵素で制限酵素消化することにより直鎖化した。
【０２５９】
FCN2MBLr1 : 
PCRに使用するプライマー: Pr1-xho-MBLFCN + Pr4-Xmn-FCNMBL-rev (産物463 bp)
pcDNA2001-cintMBLcDNAの消化: XhoI + XmnI (部分的)
【０２６０】
FCN2MBLr2: 
PCRに使用するプライマー: Pr1-xho-MBLFCN + Pr5-Xmn-FCNMBL-rev
pcDNA2001-cintMBLcDNAの消化: XhoI + XmnI (部分的)
【０２６１】
FCN2MBLr3: 
PCRに使用するプライマー: Pr1-xho-MBLFCN + Pr6-b-Bsp-FCNMBL-rev
pcDNA2001-cintMBLcDNAの消化: XhoI + BspEI
【０２６２】
FCN2MBLr4: 
PCRに使用するプライマー: Pr1-xho-MBLFCN + Pr2-apa-FCNMBL-rev
pcDNA2001-cintMBLcDNAの消化: XhoI + ApaI
【０２６３】
FCN2MBLr5: 
PCRに使用するプライマー: Pr1-xho-MBLFCN + Pr3-apa-FCNMBL-rev
pcDNA2001-cintMBLcDNAの消化: XhoI + ApaI
【０２６４】
FCN2MBLr6: 
PCRに使用するプライマー: Pr8-BstAP-MBLFCN + Pr6-b-Bsp-FCNMBL-rev
pcDNA2001-cintMBLcDNAの消化: 部分的にBstAPI + BspEI
【０２６５】
FCN2MBLr7: 
PCRに使用するプライマー: Pr7-AIw-MBLFCN + Pr6-b-Bsp-FCNMBL-rev
pcDNA2001-cintMBLcDNAの消化: 部分的にAIwNI + BspEI
【０２６６】
In-Fusion PCR組み換え反応
In-Fusion PCR 組み換え反応は、Quiagen Mineluteで精製した直鎖状pcDNA2001-cintMBLcDNA 50-100 ngと共に、Quiagen Mineluteで精製したPCR産物約50-100 ngを用い開始した。
【０２６７】
組み換え反応物の1/10を、MAX efficiency DH5αコンピテントセル(INVITROGEN Cat. No. 18258-012)に形質転換した。それぞれの形質転換体の1/10から9/10を、200 μg/mlアンピシリンを含む別々のLBプレートに広げた。プレートは37℃で一夜インキュベートした。
【０２６８】
陽性クローンのスクリーニング
それぞれの実験プレートから少なくとも６クローンをミニプレッププラスミドDNA単離のためピックした。挿入物の存在の確認のため、DNAは、酵素PstIによる制限酵素消化分析により分析した。反応ごとに陽性クローンを３つずつ選択し、その後の操作に用いた。
【０２６９】
制限酵素分析
最初のスクリーニング後に、選択した各組み換えプラスミドを確認するため、単離プラスミドDNAに、強力な制限酵素消化分析を行った。組み換え体のプラスミドDNAは表３に示す酵素で消化した。予測されるフラグメントもまた該表に列挙する。被検組み換え体クローンにおいては全て、予測されるパターンが見られた。EcoRIによる消化は予想と異なった。更なるフラグメントが組み換え体および親プラスミドの両方の消化において観察された。その矛盾は親プラスミドにおける更なるEcoRI部位により説明できる。
【０２７０】
結果
得られた組み換えプラスミドを、図４から８でコンストラクトr1、-r2、-r3、-r4、および-r5として図示する。
【０２７１】
実施例２
ヒトMBLおよびヒトFCN2の組み換え融合タンパク質の一過性発現の実験
2.1 要約
HEK293およびPer. C6細胞内での組み換えヒト融合タンパク質FCNMBLr1、FCNMBLr4、FCNMBLr5およびMBLの発現を報告する。一過性トランスフェクション実験での細胞系は、MBLオリゴマー型３および４に主に類似する構造を有する活性オリゴマーにアセンブルした融合タンパク質FCNMBLr4およびFCNMBLr5を少なくとも産生し得ることが判った。融合タンパク質FCNMBLr4 および FCNMBLr5は、炭水化物表面への結合および補体カスケードの活性化においてMBLのような役割をする。
【０２７２】
2.2 導入
本研究の目的は、ヒトのフィコリン2のコラーゲン部分とヒトのマンノース結合レクチン(MBL)からなるハイブリッドタンパク質が作成できることを示すことであった。更に、その分子が、複合体炭水化物構造体に対する結合能を依然として保有するか、そして依然として補体を活性化することができるかを明らかにすることが目的であった。
【０２７３】
２つの真核細胞系、ヒト起源のHEK293およびPer. C6を、それぞれの発現プラスミドによる一過性トランスフェクションの宿主細胞系として使用した。転写は、CMV-IEプロモーターエンハンサーにより行った。
【０２７４】
2.3 実験
材料および方法
トランスフェクション実験に用いるプラスミド
pME607-FCNMBL-r1、-r2、-r3、-r4、-r5、-r6 および-r7 (実施例１に記載)
【０２７５】
使用する細胞のオリジン
PerC6細胞はCrucellから得た。
HEK 293 Freestyle細胞はInVitrogenから得た。
【０２７６】
培養培地
PerC6細胞は、血清の入っていない培地中で単層で保持され、37℃10%(vol/vol)CO2で培養した。
HEK 293 Freestyleは、InVitrogen Freestyle培地中で懸濁で保持され、37℃8%(vol/vol)CO2で培養した。
【０２７７】
培地のトランスフェクションおよび回収
血清含有培地中のPer. C6細胞は、トランスフェクション試薬Lipofectamineを用い、DNAでトランスフェクションした。トランスフェクションして１日後、培地を、血清の入っていない培地で交換した。
血清の入っていないFreestyle培地中のHEK293細胞は、トランスフェクション試薬293fectを用い、DNAでトランスフェクトした。トランスフェクション後、約４日インキュベーションし、培地を回収した。
【０２７８】
MBLの定量
マンナン被覆プレートまたはmAb-131-01被覆プレートを用いる組み換え体MBLアッセイ(TRIMA)
MBLの定量では、時間分解免疫蛍光測定(time-resolved immunofluorometry)を行った。
【０２７９】
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析
SDS-PAGEし、その後、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜に電気的にトランスファーし、モノクローナル抗MBL抗体を用いMBL検出を行った。
【０２８０】
C4アッセイ
該アッセイは、補体系のMBLレクチン経路を開始するMBLおよびrMBLの能力を測定するように設計される。MBLと結合した、MBL結合セリンプロテアーゼ(MASP 2)は、補体因子C4を切断し、C4a および C4bを放出する。マンナン被覆ELISAプレート上のC4bの沈着を、C4bに対するビオチン標識化抗体およびユーロピウム標識化ストレプトアビジンで検出する。
【０２８１】
2.4 結果
ここで記載の実験では、血清の入っていない条件下で、HEK293およびPer. C6細胞の両方において一過性にFCN2MBLr4、FCN2MBLr5 および MBLを発現することができた。
【０２８２】
融合タンパク質のオリゴマー型
オリゴマー型融合タンパク質を非還元型の変性SDS PAGEで試験し、その後、ウエスタンブロットで試験した。検出抗体は、MBLのCDR部分を認識する(およびコイル−コイル領域部分であり得る)。結果を図１０に示す。融合タンパク質FCN2MBLr4およびFCN2MBLr5の最も顕著な型は約250 kDaであり、それは、３つの単一タンパク質鎖(24 kDa)からなる3-または4-mereのサブユニットに相当することが図からわかる。オリゴマー型の出現は、使用する宿主細胞に依存するわけではない。MBLは広範囲のオリゴマー型で産生された。
【０２８３】
結合特性
融合タンパク質は、マンナン表面に結合することによるMBL炭水化物結合ドメインの機能について、MBLのCRD部分を認識する(およびコイル−コイル領域の部分であり得る)抗体による検出により試験した。表４に結果を示す。FCN2MBLr4およびFCN2MBLr5、およびMBLが宿主細胞中で発現され、融合タンパク質がマンナン表面に結合すると結論づけることができる。
【０２８４】
MASP-2結合およびC4切断
融合タンパク質を、MASP-2結合能およびMASP-2のセリンプロテアーゼの活性化に関し更に試験した。これは、融合タンパク質とマンナン表面との結合におけるMASP-2基質補体因子C4の切断を測定することにより行った。結果を表５に示す。これらの結果から、融合タンパク質FCN2MBLr4およびFCN2MBLr5は、MASP-2との結合能およびそれを活性化する能力を保持していると結論づけることができる。
【０２８５】
考察
本明細書に記載の結果により、以下の特徴を有するFCN2およびMBLの融合タンパク質を構築することが可能であることが明らかとなる。
1. 融合タンパク質のオリゴマー構造は、MBLタンパク質の場合よりも単純である。
2. 融合タンパク質は、密集した炭水化物構造との結合における補体カスケードのMBL活性化の本質的特性を保持する。
【０２８６】
表１. PCR反応に使用するプライマー
太字の配列は、ベクター中への組み込みに必要な15 bpの相同配列を示す。
【表１】
2005537807.tif 000166
【表２】
2005537807.tif 000167
【表３】
2005537807.tif 000168
【表４】
2005537807.tif 000169
【表５】
2005537807.tif 000170
【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１】図１はLフィコリンの配列を示す。
【図２】図２はMBLの配列を示す。
【図３】図３は融合タンパク質の例を示す。
【図４】図４は実施例１に記載のプラスミドを示す。
【図５】図５は実施例１に記載のプラスミドを示す。
【図６】図６は実施例１に記載のプラスミドを示す。
【図７】図７は実施例１に記載のプラスミドを示す。
【図８】図８は実施例１に記載のプラスミドを示す。
【図９−１】図９−１は実施例１で記載の融合タンパク質のアラインメントを示す。
【図９−２】図９−２は実施例１で記載の融合タンパク質のアラインメントを示す。
【図１０】図１０は実施例２で考察する２つのウエスタンブロットを示す
【図１】
2005537807.tif 000171
【図２】
2005537807.tif 000172
【図３】
2005537807.tif 000173
【図４】
2005537807.tif 000174
【図５】
2005537807.tif 000175
【図６】
2005537807.tif 000176
【図７】
2005537807.tif 000177
【図８】
2005537807.tif 000178
【図９−１】
2005537807.tif 000179
【図９−２】
2005537807.tif 000180
【図１０】
2005537807.tif 000181
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月20日(2004.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)レクチン補体経路活性化タンパク質または該レクチン補体経路活性化タンパク質と少なくとも７０％同一性を有する機能的相同体由来の第一のポリペプチド配列、ここで、該第一のポリペプチド配列は、レクチン補体経路を活性化することができる、そして
ii)コレクチンまたは該コレクチンと少なくとも７０％同一性を有する機能的相同体由来の第二のポリペプチド配列、ここで、該第二のポリペプチド配列は、１以上の炭水化物と結合することができる、
ここで、該補体活性化タンパク質はコレクチンではない、
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
第一のポリペプチド配列は、MASPタンパク質の少なくとも１つと結合ができる、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】
第一のポリペプチド配列は、MASP-1、MASP-2 および MASP-3またはそれらの機能的相同体もしくは変異体からなる群から選択されたMASPタンパク質と結合することができる、請求項１の融合タンパク質。
【請求項４】
補体活性化タンパク質がフィコリンである、請求項１の融合タンパク質。
【請求項５】
フィコリンが、L-フィコリン、H-フィコリン および M-フィコリンからなる群から選択される、請求項４の融合タンパク質。
【請求項６】
フィコリンがL-フィコリンである、請求項４の融合タンパク質。
【請求項７】
第一のポリペプチド配列が、補体活性化タンパク質またはそのタンパク質と少なくとも70%、80%など、例えば90%、95%などの同一性を有する配列の、少なくとも10、少なくとも12など、例えば少なくとも15、少なくとも20など、例えば少なくとも25、少なくとも30など、例えば少なくとも35、少なくとも40など、例えば少なくとも50の連続アミノ酸を含む、請求項１から６の何れかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
第一のポリペプチド配列がフィコリンまたはその機能的相同体もしくは変異体のコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項９】
第一のポリペプチド配列がL-フィコリンのコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１０】
第一のポリペプチド配列がフィコリンまたはその機能的相同体のシステインリッチ領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１１】
第一のポリペプチド配列がL-フィコリンのシステインリッチ領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１２】
第一のポリペプチド配列がフィコリンまたはその機能的相同体もしくは変異体のシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１３】
第一のポリペプチド配列がL-フィコリンのシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１４】
第一のポリペプチド配列が図１のL-フィコリン配列のアミノ酸1-77(配列番号125)を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１５】
コレクチンが、MBL(マンノース-結合レクチン)、SP-A(肺サーファクタントプロテインA)、SP-D(肺サーファクタントプロテインD)、BK(またはBC、ウシコングルチニン) および CL-43 (コレクチン-43)からなる群から選択される、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１６】
コレクチンがMBLである、請求項１５の融合タンパク質。
【請求項１７】
第二のポリペプチド配列が、コレクチンまたはそのタンパク質と少なくとも70%、80%など、例えば90%、95%などの同一性を有する配列の、少なくとも10、少なくとも12など、例えば少なくとも15、少なくとも20など、例えば少なくとも25、少なくとも30など、例えば少なくとも35、少なくとも40など、例えば少なくとも50の連続アミノ酸を含む、請求項１から１６の何れかに記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
第二のポリペプチド配列がコレクチンまたはその機能的相同体もしくは変異体のCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項１９】
第二のポリペプチド配列がMBLのCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２０】
第二のポリペプチド配列がMBLのネック領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２１】
第二ポリペプチド配列がMBLのコラーゲン様領域を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２２】
第二のポリペプチド配列がMBLのネック領域およびCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２３】
第二のポリペプチド配列がMBLのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２４】
第二のポリペプチド配列が図２に示すMBL配列のアミノ酸80-228(配列番号１２６)を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２５】
融合タンパク質が、L-フィコリンのシステインリッチ領域およびコラーゲン様領域、およびMBLのCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２６】
融合タンパク質が、L-フィコリンのシステインリッチ領域、およびMBLのコラーゲン様領域、ネック領域およびCRDドメインを含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２７】
融合タンパク質が図３に示される配列(配列番号１２７)で定義されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する機能的相同体を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２８】
融合タンパク質が図３に示される配列(配列番号１２７)で定義されるアミノ酸配列からなる、請求項１の融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項１から２８の何れかの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項３０】
請求項２９の核酸配列を含むベクター。
【請求項３１】
請求項３０のベクターを含む細胞。
【請求項３２】
細胞が哺乳類細胞である、請求項３１の細胞。
【請求項３３】
細胞が非哺乳類細胞である、請求項３１の細胞。
【請求項３４】
医薬として使用するための請求項１から２８の何れかの融合タンパク質。
【請求項３５】
感染症の予防および／または治療の必要がある個体におこなう該予防および／または治療の方法であって、請求項１から２８の何れかの融合タンパク質を該個体に投与することを含む、該方法。
【請求項３６】
個体がヒトである、請求項３５の方法。
【請求項３７】
個体が、感染症となる危険性が増大しているヒトである、請求項３５の方法。
【請求項３８】
個体が、血清MBLレベルが正常よりも低いヒトである、請求項３５の方法。
【請求項３９】
個体が、血清MBLレベルが正常であるヒトである、請求項３５の方法。
【請求項４０】
感染症の予防および／または治療の必要がある個体におこなう該予防および／または治療用の医薬の製造のための、請求項１から２８の何れかの融合タンパク質の使用。
【請求項４１】
個体がヒトである、請求項４０の使用。
【請求項４２】
個体が、感染症となる危険性が増大しているヒトである、請求項４０の使用。
【請求項４３】
個体が、血清MBLレベルが正常よりも低いヒトである、請求項４０の使用。
【請求項４４】
個体が、血清MBLレベルが正常であるヒトである、請求項４０の使用。
【請求項４５】
請求項１から２８の何れかの融合タンパク質を含む、臨床症状の予防または治療の必要がある個体におこなう該予防または治療用の医薬。
【請求項４６】
臨床症状が感染症である、請求項４５の医薬。
【請求項４７】
個体がヒトである、請求項４５の医薬。
【国際調査報告】
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