(57)【要約】本発明は、単離された非ヒト霊長類のFcレセプターポリペプチド、Fcレセプターポリペプチドをコードする核酸分子、およびFcレセプターポリペプチドの融合体、変異体ならびに誘導体を含む組換え型の生成法を提供する。本発明は、非ヒト霊長類のFcレセプターポリペプチドを用い、Fc領域含有分子の安全性、有効性および生物特性を評価する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：９，配列番号：１１，配列番号：１５，配列番号：１７，配列番号：  １８，配列番号：２０，  配列番号：２５，  配列番号：２９，配列番号：６４，  配列番号：６５，配列番号：６６，配列番号：６７，配列番号：６８，配列番号：６９，配列番号：７０，配列番号：７１，配列番号：７２のアミノ酸配列を有する非ヒト霊長類のＦｃレセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸、または該断片。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチド配列が配列番号：１，配列番号：３，配列番号：５，配列番号：７，配列番号：１３，配列番号：２２，配列番号：２３または配列番号：２７のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸配列。
【請求項３】
ａ）プライマーセットを配列番号：３１と配列番号：３２，配列番号：３３と配列番号：３４，配列番号：３５と配列番号：３６，配列番号：３７と配列番号：３８，配列番号：３９と配列番号：４０，配列番号：４１と配列番号：４２，配列番号：４３と配列番号：４４，配列番号：４５と配列番号：４６，配列番号：４７と配列番号：４８，配列番号：４９と配列番号：５０，配列番号：５１と配列番号：５２および配列番号：５３と配列番号：５４からなる群から選択し、フォワードとリバースプライマーを含んでなる該プライマーセットにより非ヒト霊長類細胞由来の核酸を増幅し、
ｂ）該増幅した核酸を単離する
ことを含んでなる、Ｆｃレセプターポリペプチドをコードする核酸配列を得る方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法によって調製した単離した核酸。
【請求項５】
非ヒト霊長類細胞が脾臓細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
非ヒト霊長類細胞がカニクイザル細胞またはチンパンジー細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドがＦｃレセプターポリペプチドの細胞外断片をコードする、請求項１，２または４に記載の単離した核酸。
【請求項８】
請求項１，２または４に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１０】
細胞が哺乳類細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
Ｆｃレセプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結した異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含んでなる、請求項１，２，または４に記載の核酸。
【請求項１２】
前記異種ポリペプチドがＦｃレセプターポリペプチドの精製を供する請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記異種ポリペプチドがグルタチオンＳトランスフェラーゼ、６−Ｈｉｓタグ、チオレドキシンタグ、ヘマグルチニンタグ、Ｇｌｙｌｈ１５６タグおよびＯｍｐＡシグナル配列タグに融合したＧｌｙ／Ｈｉｓ６からなる群から選択される、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
配列番号：９，配列番号：１５，配列番号：１７，配列番号：１８，配列番号：  ２０，配列番号：２９，配列番号：２５，配列番号：１１，配列番号：６４，配列番号：６５，配列番号：６６，配列番号：６７，配列番号：６８，配列番号：６９，配列番号：７１，配列番号：７２もしくは配列番号：７０のアミノ酸配列を含んでなる単離したポリペプチド、または該断片。
【請求項１５】
配列番号：６５のアミノ酸１〜２６９番、配列番号：６６の１〜１８２番、配列番号：６８の１〜１８４番、配列番号：６９の１〜１８７番、配列番号：７１の１〜２７４番、または配列番号：７２の１〜２７４番のアミノ酸配列を有するＦｃレセプターポリペプチド断片と結合した異種ポリペプチドを含んでなる単離した融合タンパク質。
【請求項１６】
異種ポリペプチドがｇｌｙ／ｈｉｓ６−ｇｓｔタグである、請求項１５に記載の単離した融合ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載のＦｃレセプターポリペプチドと結合した異種ポリペプチドを含んでなる、単離した融合ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号：９のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチド変異体。
【請求項１９】
配列番号：１５のアミノ酸と少なくとも９０％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチド変異体。
【請求項２０】
配列番号：１７のアミノ酸と少なくとも９８％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチド変異体。
【請求項２１】
配列番号：１８のアミノ酸と少なくとも９２％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチド変異体。
【請求項２２】
配列番号：２０のアミノ酸配列と少なくとも９２％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチド変異体。
【請求項２３】
配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも９３％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチド変異体。
【請求項２４】
配列番号：２９のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する単離したポリペプチド変異体。
【請求項２５】
ａ）単離した非ヒト霊長類ＦｃレセプターポリペプチドをＦｃ領域含有分子に接触させ、
ｂ）Ｆｃ領域含有分子の少なくとも一つの生物特性に対する前記接触の効果を判定する
ことを含んでなる、Ｆｃ領域含有分子の少なくとも一つの生物特性を評価する方法。
【請求項２６】
Ｆｃ領域含有分子が抗体である、請求項２５または３５に記載の方法。
【請求項２７】
抗体がヒト化抗体である、請求項２６または３５に記載の方法。
【請求項２８】
非ヒト霊長類Ｆｃレセプターポリペプチドが可溶性レセプターである、請求項２５または３５に記載の方法。
【請求項２９】
非ヒト霊長類ＦｃレセプターポリペプチドがＦｃγＲＩα鎖、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡα鎖、ＦｃＲｎα鎖およびその混合物からなる群から選択される、請求項２８または３５に記載の方法。
【請求項３０】
非ヒト霊長類レセプターポリペプチドが細胞で発現される、請求項２５または３５に記載の方法。
【請求項３１】
生物特性が非ヒト霊長類Ｆｃレセプターポリペプチドに対するＦｃ領域含有分子の結合親和性である、請求項２５または３５に記載の方法。
【請求項３２】
生物特性がＦｃ領域含有分子の傷害性である、請求項２５または３５に記載の方法。
【請求項３３】
単離した非ヒト霊長類ＦｃレセプターポリペプチドがＦｃＲｎα鎖であり、生物特性がＦｃ領域含有分子の半減期である、請求項２５または３５に記載の方法。
【請求項３４】
非ヒト霊長類レセプターが配列番号：６５のアミノ酸１〜２６５番、配列番号：６６の１〜１７２番、配列番号：６８の１〜１７４番、配列番号：６９の１〜１７２番、または配列番号：６７の１〜１７１番のアミノ酸配列を含む、請求項２５または３５に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）Ｆｃ領域含有分子を請求項１，２または４に記載の単離した核酸により形質転換した細胞に接触させ、
ｂ）Ｆｃ領域含有分子の少なくとも一つの生物特性に対する前記接触の効果を判定する
ことを含んでなる、Ｆｃ領域含有分子の少なくとも一つの生物特性を評価する方法。
【請求項３６】
ａ）ＩＴＡＭ領域を有するポリペプチドをともなう少なくとも一つのカニクイザルＦｃレセプターポリペプチドに対する薬剤の結合親和性を判定し、
ｂ）対応するヒトＦｃレセプターポリペプチドに対する薬剤の結合親和性を判定し、
ｃ）ＩＴＡＭ領域を有するポリペプチドに関連し、対応するヒトＦｃレセプターに比し、カニクイザルＦｃγレセプターポリペプチドに対し親和性が向上した薬剤を選択すること
を含んでなる、ヒトＦｃレセプターポリペプチドに比し、ＩＴＡＭ領域を有する少なくとも一つのカニクイザルＦｃレセプターポリペプチドに対し親和性が向上した薬剤を同定する方法。
【請求項３７】
薬剤が抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
薬剤がＩｇＧ抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＦｃレセプターポリペプチドがＦｃγＲＩα鎖、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡα鎖およびその混合物からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ａ）少なくとも一つのカニクイザルＦｃγＲＩＩＢレセプターポリペプチドに対する薬剤の結合親和性を判定し、
ｂ）対応するヒトＦｃγＲＩＩＢレセプターポリペプチドに対する薬剤の結合親和性を判定し、
ｃ）対応するヒトＦｃレセプターに比し、ＩＴＩＭ領域を有するカニクイザルＦｃγＲＩＩＢレセプターポリペプチドに対し親和性が変化した薬剤を選択すること
を含んでなる、対応するヒトＦｃレセプターポリペプチドに比し、ＩＴＩＭ領域を有するカニクイザルＦｃレセプターポリペプチドに対し親和性が変化した薬剤を同定する方法。
【請求項４１】
薬剤が抗体である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本願は、2002年12月3日付で米国国内法人であるGenentech, Inc.の名において(米国を除く全ての国に対する出願人)、および両人とも米国市民ならびに居住米国人であるLeonard  G.PrestaならびにAngela  K.Namenukの名において(米国指定のみの出願人)、全ての国を指定し、PCT国際特許出願として出願するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に、単離・精製された非ヒト霊長類Ｆｃレセプターポリペプチドと、ＦｃＲポリペプチドをコードする核酸分子と、非ヒト霊長類Ｆｃレセプターポリペプチドの製造方法および治療薬の安全性・有効性と生物学的特性の評価方法に関する。
【０００３】
発明の背景
Ｆｃレセプター（ＦｃＲｓ）は、多くの免疫エフェクター細胞に発現される膜レセプターである。ＦｃＲｓは標的免疫グロブリンとの相互作用により、細胞媒介の殺傷活性化、細胞からの媒介物質放出の誘導、抗体被覆粒子の取込み・破壊、免疫グロブリンの輸送等、多くの細胞応答を媒介する。DeoらImmunology  Today第18巻127〜135頁(1997年)を参照。更に、例えばマクロファージや樹状細胞のような抗原提示細胞は、FcRの媒介により抗原抗体複合体の内部移行が生じ、抗原提示およびその結果としての免疫応答の増幅を可能にすることが示されている。このように、ＦｃＲｓは抗体の特異性およびエフェクター細胞の機能の発達において中心的な役割を果している。DeoらImmunology  Today第18巻127〜135頁(1997年)を参照。
【０００４】
ＦｃＲは免疫グロブリンアイソタイプに対する特異性により規定される。ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターはＦｃγＲ、ＩｇＥ抗体に対するＦｃレセプターはＦｃεＲ、ＩｇＡ抗体に対するＦｃレセプターはＦｃαＲというように呼ばれている。ＦｃＲｎは新生児の細胞に認められる特殊なクラスのＦｃレセプターであり、特に、母親の乳汁由来のＩｇＧを乳児の腸上皮細胞に渡り輸送することに関与する。ヒトガンマレセプターのサブクラスが三つ同定されており、それぞれＦｃγＲＩ（ＣＤ６４），ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２），ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。ヒトＦｃγＲの各サブクラスは二つまたは三つの遺伝子にコードされ、また、選択的ＲＮＡスプライシングにより複数の転写物が生じるため、Ｆｃγのイソフォームには多様性がある。ヒトＦｃγＲＩのサブクラス（ＦｃγＲＩＡ，ＦｃγＲＩＢおよびＦｃγＲＩＣ）をコードする三つの遺伝子は、第１染色体長腕の１ｑ２１．１領域に密集し、ＦｃγＲＩＩのイソフォーム（ＦｃγＲＩＩＡ，ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＣ）をコードする遺伝子、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ）をコードする二つの遺伝子は、全て１ｑ２２領域に密集している。ＦｃＲｓは、RavetchおよびKinet Annu. Rev. Immunol第9巻457〜92頁(1991年)、CapelらImmunomethods第4巻25〜34頁(1994年)、およびde  HaasらJ. Lab. Clin. Med. 第126巻330〜41頁(1995年)において検討されている。
【０００５】
ヒトFcγRIは、α鎖およびγ鎖からなるヘテロオリゴマー複合体である。α鎖は、細胞外C-2  Ig様の3ドメイン、21アミノ酸膜ドメイン、および61アミノ酸の荷電細胞質側末端部を有する70〜72kDaの糖蛋白である。van  de  WinkelらImmunology  Today第14巻215〜221頁(1993年)を参照。γ鎖はホモダイマーであり、細胞表面アセンブリ、および細胞内への細胞シグナル伝達に関与する。γホモダイマーの各鎖は細胞活性に関与するモチーフを有し、これはITAMモチーフと呼ばれる。ヒトFcγRIは、第3の細胞外C-2ドメインを介し、モノマーのIgGに高親和性（１０−７−１０−９M）にて結合する。
【０００６】
FcγRIIは40kDaの糖蛋白であり、C-2セットIg様の2細胞外ドメイン、27〜29アミノ酸膜貫通ドメイン、および44〜76の可変長アミノ酸を有する細胞質ドメインを有する。ヒトFcγRIIには既知の6イソフォームがあり、その大部分は異種細胞質ドメインの点で異なる。ヒトFcγRIIAは分子の細胞質領域にITAMモチーフを有し、レセプターの架橋により、該モチーフは細胞活性に関連する。対照的に、FcγRIIBは細胞質領域に抑制モチーフを有し、これはITIMと呼ばれる。FcγRIIBが架橋されると、細胞活性は抑制される。概して、FcγRIIはモノマーIgGとの結合力は弱いが(＞107  M-1)、複合IgGに対しては高親和性を有する。
【０００７】
ヒトFcγRIIIは主たる2イソフォームであるFcγRIIIAおよびFcγRIIIBを有し、両イソフォームとも50〜80kDaであり、C2  Ig様の2細胞外ドメインを有する。FcγRIIIAのα鎖は25アミノ酸膜貫通ドメインにより膜に固着され、ヒトFcγRIIIBはグリコシル  ホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介し、膜に結合している。FcγRIIIAは、ヘテロダイマーのγ-δ(ガンマ‐デルタ)鎖またはγ‐γ鎖により複合したα鎖を有するヘテロオリゴマー複合体である。γ鎖はITAMモチーフを有する細胞質側末端部を含む。δ鎖はα鎖と相同であり、細胞シグナル伝達および細胞表面アセンブリにも関与する。γ-δ(ガンマ‐デルタ)鎖も細胞質領域にITAMモチーフを有する。どちらの場合でも、FcγRIIIはモノマーのIgGには低親和性にて結合し、複合IgGに対しては高親和性にて結合する。
【０００８】
ヒトFcRnは、β‐2ミクログロブリン鎖およびα鎖からなるヘテロダイマーである。β‐2ミクログロブリン鎖は約15kDaであり、MHCクラスIヘテロダイマーに存在するβ‐2ミクログロブリン鎖に類似している。FcRnにβ‐2ミクログロブリン鎖が存在することにより、FcRnはMHCクラスIファミリータンパク質に含まれる唯一既知のFcレセプターである。GhetieらImmunology  Today第18巻第12号592〜598頁(1997年)を参照。α鎖は37〜40kDaの内在性膜糖蛋白であり、一つの糖鎖形成部位を有する。FcRnは母親のIgGを新生児の腸に輸送し、血清IgG濃度を調節することに関与していると、科学的根拠により示唆されている。FcRnは成人の多くの組織にも認められる。
【０００９】
上記のように、ヒトFcγRsはFcγRIIBを除き、細胞質〜26アミノ酸免疫レセプターチロシンベースの活性モチーフ(ITAM)を有する。該モチーフは、細胞シグナル伝達およびエフェクター細胞機能に関与していると考えられている。FcγRsの架橋により、srcファミリーのチロシンキナーゼ(PTKs)によりITAMモチーフ内のチロシン残基がリン酸化され、次にリン酸化されたITAMモチーフはsykファミリーのPTKsに会合し、活性化される。DeoらImmunology  Today第18巻127〜135頁(1997年)を参照。活性化が生じると、まだよく理解されていないシグナル伝達カスケードが生物反応に転換される。
【００１０】
ヒトFcγRIIBメンバーは、特徴的な13アミノ酸免疫レセプターチロシンベースの抑制モチーフ(ITIM)を細胞質ドメインに有する。ヒトFcγRIIBはBリンパ球に発現され、IgG複合体に結合する。しかし、IIBレセプターの架橋により、細胞が活性化されるというよりは、シグナル伝達抑制的にB細胞が活性化され、抗体が分泌される。(CamigoreaらScience第256巻1808頁Cytoplasmic  Domain  Heterogeneity  and  Function  of  IgG  Receptors  in  B  Lymphocytes(1992年)を参照。)
【００１１】
FcγRはトリガー分子として多くの免疫応答において中心的な役割を果すため、潜在的治療薬開発の標的になっている。例えば、現在進行中の幾つかの臨床試験は、腫瘍特異性モノクローナル抗体(Mabs)により患者を治療することによって、癌患者のエフェクター細胞を活性化させることに基づいている。腫瘍特異性抗体が一つにはFcγRとの結合を介して効果を媒介し、引続きエフェクター細胞の活性化を媒介することが同研究により示されている。AdamsらProc.Natl.Acad.Sci.第81巻3506〜3510頁(1984年)、TakahashiらGastroenterology第108巻172〜182頁(1995年)、RiethmeullerらLancet第343巻1177〜1183頁(1994年)、Clynes, R.A., Towers, T.L., Presta, L.G.およびRavetch, J.V. Nature  Med. 第6巻443〜446頁(2000年)を参照。更に、片方の腕が腫瘍細胞に特異性を有し、他方の腕が標的FcγRに特異性を有するように操作された分子である、新規の二重特異性分子抗体(BSMs)系が臨床試験中であり、FcγRの媒介によりエフェクター細胞が腫瘍細胞を破壊すべく、腫瘍を特異的に標的にしようとしている。ValoneらJ.Clin.Oncol.第13巻2281〜2292頁(1995年)、ReppらHematother第4巻415〜421頁(1995年)を参照。加えて、FcγRsは幾つかの感染症において治療標的として利用可能であり、また幾つかの自己免疫疾患でも同様である。感染症に関しては、患者のFcγR発現エフェクター細胞に対し、いくつもの微生物を標的にするBSMsが開発中であり(DeoらImmunology  Today第18巻127〜135頁(1997年)を参照)、また、アルサス反応を抑制すべく、可溶性のFcγRsが用いられており、幾つかの自己免疫疾患の重症度を低下すべく、FcγR阻害剤が用いられている。IerinoらJ.Exp.Med.第178巻1617〜1628頁(1993年)、DebreらLancet第342巻945〜949頁(1993年)を参照。
【００１２】
治療薬として抗体が使用される頻度が高くなり、この種の治療薬の毒性、有効性および薬物動態を評価するための動物モデルを開発する必要がある。抗体療法の有効性を評価するためのげっ歯類モデルに加え、治療用抗体の薬物動態、毒性および有効性を評価すべく、霊長類モデルが用いられている(Anderson,D.R.,Grillo-Lopez,A.,Varns,C.,Chambers,K.S.およびHanna,N.Biochem.Soc.Trans.第25巻705〜708頁(1997年)を参照)。しかし、ヒト抗体と霊長類Fcγレセプターとの相互作用や、該相互作用が霊長類における薬物動態、毒性および有効性の研究の解釈に及ぼす影響に関する情報は少ない。
【００１３】
FcγR活性の解明およびFcγRリガンドの同定・操作には多くの進展があったが、当技術分野において、活性作用および抑制作用の双方にて、他のFcγRsを同定し、他のFcγRリガンドを同定・操作する必要が残されている。このような新規のレセプターおよびレセプターリガンドには、腫瘍細胞や感染物質の破壊等、幾つかの疾患において潜在的治療価値があり、また、幾つかの自己免疫疾患に関与する免疫応答部分を阻害する点においても潜在的治療価値がある。抗体や他のFcγRリガンドが治療薬として用いられているため、特にインビボで該治療薬の有効性、毒性および薬物動態を試験するためのモデルを開発する必要もある。
【００１４】
発明の概要
本発明は、特に、カニクイザルやチンパンジーのような非ヒト霊長類由来のFcレセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの単離・配列決定に基づく。本発明のカニクイザルまたはチンパンジーのFcRポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、特に、霊長類においてインビボで評価する前に、カニクイザルまたはチンパンジーのFcRポリペプチドに対する抗体(如何なるサブクラスであれ、特に治療に役立つ見込みのある抗体)の結合能を評価するのに有用である。
【００１５】
本発明は、非ヒト霊長類のFcレセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、非ヒト霊長類のFcレセプターポリペプチドを、配列番号：９，配列番号：１１，配列番号：１５，配列番号：１７，配列番号：１８，  配列番号：２０，配列番号：２５，配列番号．２９，配列番号．６４のアミノ酸配列、または該配列の断片にてコードする。本発明のFcレセプターポリヌクレオチド分子は、配列番号：１，３，５，７，１３，２２および２７に示されるような核酸配列を有するポリヌクレオチド分子、および配列番号：１，３，５，７，１３，２２および２７の核酸配列とほぼ同一の核酸を有するポリヌクレオチドを含む。また、本発明のβ‐2ミクログロブリン・ポリヌクレオチド分子は、配列番号：２３に示されるような核酸配列を有する分子、および配列番号：２３の核酸配列とほぼ同一の核酸を有するポリヌクレオチドを含む。
【００１６】
本発明は、非ヒト霊長類のFcγレセプターおよび非ヒト霊長類のβ‐2ミクログロブリンも提供する。本発明のFcγポリペプチドは、配列番号：:９，１１，１５，１７，１８，２０，２９ならびに６４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびアミノ酸配列：９，１１，１５，１７，１８，２０，２９ならびに６４とほぼ同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと該配列の有用な断片を含む。本発明のβ‐2ミクログロブリン・ポリペプチドは、配列番号:25に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号：２５のアミノ酸配列とほぼ同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドと該配列の有用な断片を含む。
【００１７】
本発明は、別の態様において、成熟した非ヒト霊長類のFcレセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、成熟した非ヒト霊長類のＦｃレセプターポリペプチドを、配列番号：６５，配列番号：６６，配列番号：６７，配列番号：６８，配列番号：６９，配列番号：７０，配列番号：７１，配列番号．７２のアミノ酸配列または該配列の断片にてコードする。本発明のＦｃレセプターポリヌクレオチド分子は、配列番号：１，３，５，７，１３，２２，２３および２７に示されるような核酸配列を有するポリヌクレオチド分子、および配列番号：１，３，５，７，１３，２２，２３および２７の核酸配列とほぼ同一の核酸を有するポリヌクレオチドを含む。
【００１８】
本発明の別の態様において、非ヒト霊長類のＦｃレセプターをコードする核酸を得る方法を提供する。該方法は、フォワードおよびリバースプライマーを含むとともに、配列番号：３１および配列番号：３２，配列番号：３３および配列番号：３４，配列番号：３５および配列番号：３６，配列番号：３７および配列番号：３８，配列番号：３９および配列番号：４０，配列番号：４１および配列番号：４２，配列番号：４３および配列番号：４４，配列番号：４５および配列番号：４６，配列番号：４７および配列番号：４８，配列番号：４９および配列番号：５０，配列番号：５１および配列番号：５２，配列番号：５３および配列番号：５４からなる群から選択されるプライマーセットにより非ヒト霊長類由来の核酸を増幅し、該増幅核酸を単離することを含む。非ヒト霊長類の細胞は、好ましくはカニクイザルの脾臓細胞またはチンパンジーの脾臓細胞である。
【００１９】
本発明は、非ヒト霊長類のFcγレセプターポリペプチドおよびβ‐2ミクログロブリンの変異体、誘導体および融合タンパク質を含む。例えば、本発明の融合タンパク質は、精製、安定性または分泌のように所望の機能を付与する異種のタンパク質またはペプチドに融合される、非ヒト霊長類のFcγレセプターポリペプチドを含む。本発明の融合タンパク質は、例えば、本発明のポリペプチドの一つをコードするポリヌクレオチド分子を、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子とインフレームに有する発現構築物から生成可能である。  
【００２０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを有するベクター、プラスミド、発現系、宿主細胞等も提供する。本発明のポリペプチドを生成するための幾つかの組換え法は、既知の方法に基づき、細胞を含まない発現系、細胞の宿主、組織、および動物モデルにおけるポリヌクレオチド分子の発現を含む。
【００２１】
非ヒト霊長類のFcγレセプターは、特にFc領域を有する薬剤の安全性、有効性および薬物動態を評価するための動物モデルにおいて有用である。本発明の1方法は、Fcレセプター結合領域を有する薬剤を非ヒト霊長類のFcレセプターポリペプチドに、好ましくは成熟した可溶性ポリペプチドに接触させ、Fc領域含有分子の、少なくとも生物特性に対する接触効果を判断することを伴う。本発明の1方法は、少なくとも一つの非ヒト霊長類のFcγレセプターポリペプチドを発現する細胞を、Fc領域を有する薬剤に接触させ、該薬剤が細胞の生物活性を変化させるか否か、または細胞に対して毒性を示すか否かを判断することを伴う。本発明は、FcRsに対する結合能および活性化能に対し、Fc領域を有する薬剤の変種をスクリーニングする方法も含む。該薬剤の変種例は、一つ以上のFcレセプタークラスに対する結合親和性を変化させる可能性がある、特定残基におけるアミノ酸置換を有する抗体を含む。
【００２２】
FcR結合ドメインを有する薬剤のスクリーニングの更なる例は、ITIM領域を有するFcγレセプターに比し、ITAM領域を有するFcγレセプターに対し変化した親和性を有する薬剤を同定することを含む。加えて、本発明は、ITIM領域を有するFcγレセプターに対し変化した親和性を有する薬剤を同定するのに有用な試薬、成分ならびに方法、またはITAM領域を有するFcγレセプターに対し結合親和性が増大した薬剤を同定する方法を提供する。
【００２３】
本発明を特徴付ける上記ならびに種々の他の特徴および利点は、後述する詳細な説明を読み、付随の特許請求の範囲を検討すれば明らかであろう。
【００２４】
発明の詳細な説明
以下の定義は、本明細書において頻繁に使用する特定の用語の理解を助けるために提供されるものであって、本開示内容を限定することを意図したものではない。
【００２５】
本明細書及び請求の範囲を通じて、IgG重鎖の残基の番号付けは、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) に規定されているEUの指針に従っており、ここに参照することにより本明細書に包含される。「Kabatに規定されているEUの指針」とは、ヒトIgG1 EU抗体の残基番号付けを指す。
【００２６】
「アミノ酸」という用語は、天然に生じる１２のアミノ酸のいずれか、及び任意の修飾アミノ酸配列を意味する。修飾は、翻訳後プロセシングを含み得るか、または当技術分野において既知の化学修飾を含み得る。修飾は、リン酸化、ユビキチン結合、アセチル化、アミド化、グリコシル化、フラビンの共有接着、ADP-リボシル化、架橋、ヨウ素化、メチル化等を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、所望の生物学的活性を示すものである限り、特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全合成抗体、及び抗体断片をカバーする。
【００２８】
「アンチセンス」という用語は、標的の「センス」ポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を意味する。
【００２９】
「相補的」または「相補性」という用語は、ポリヌクレオチド分子中のポリヌクレオチドが、第二のポリヌクレオチド分子中の別のポリヌクレオチドと塩基対を形成する能力を意味する。例えば、配列Ａ−Ｇ−Ｔは配列Ｔ−Ｃ−Ａと相補的である。ポリヌクレオチドの一部のみが塩基対により適合する塩基性が不完全な場合と、全てのポリヌクレオチドが塩基対により適合する塩基性が完全な場合がある。
【００３０】
「発現」という用語は、宿主細胞内で生じる転写又は翻訳を意味する。宿主細胞におけるＤＮＡ分子の発現レベルは、細胞に存在している対応するｍＲＮＡの量か、又は宿主細胞により生成されたＤＮＡ分子にコードされるタンパク質の量に基づいて決定されうる（Sambrook等, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88）。
【００３１】
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。IｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界には若干の変化があるかも知れないが、ヒトIｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸展する。「Ｆｃ領域含有分子」とは、抗体またはイムノアドヘシンなど、Ｆｃ領域を有する分子を意味する。IｇＧのＦｃ領域は、一般的に、二つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。ヒトIｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２」ドメイン（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常アミノ酸２３１からアミノ酸３４０まで延びている。CH2ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。Burton, Molec. Immunol.22:161-206(1985)。
【００３２】
「Ｆｃレセプター」という用語は、抗体のＦｃ領域、または分子を含むＦｃ領域に結合するレセプターを意味する。好適なＦｃレセプターは、IｇＧ抗体(ＦｃγＲ)に結合し、ＦｃγＲI、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIII、およびＦｃＲｎサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。「ＦｃＲポリペプチド」は、抗体のＦｃ領域又は分子を含むＦｃ領域に結合するレセプターを形成するポリペプチドを表すために使用される。「ＦＣレセプターポリペプチド」という用語もまた、成熟ポリペプチドおよびシグナル配列を有するポリペプチドの両方を含む。「ＦｃγＲポリペプチド」という用語は、IｇＧ抗体のＦｃ領域または分子を含むIｇＧ Ｆｃ領域に結合するレセプターを形成するポリペプチドを表すために使用される。例えば、ＦｃγＲI及びＦｃγＲIIIレセプターの各々は、γ鎖のＦｃレセプターポリペプチドホモ二量体またはヘテロ二量体及びＦｃレセプターポリペプチドα鎖を含む。ＦｃＲｎレセプターはＦｃレセプターポリペプチドα鎖およびβ- 2ミクログロブリンを含む。通常、α鎖は、作用物質を含むＦｃ領域に結合する細胞外領域を有する。ＦｃＲは、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及び de Haas等, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に解説されている。本明細書において使用する「ＦｃＲ」という用語は、未来に同定されるものを含めたその他のＦｃＲを含有する。
【００３３】
「断片」という用語は、Ｆｃレセプターポリペプチド、またはＦｃレセプターポリペプチドの核酸コード化部分を表すために使用される。好ましくは断片は分子含有Ｆｃ領域に対する結合能を有する。ＦｃγＲＩ／ＩＩＩ及びＦｃγＲＩＩＡ又はＢのＦｃγα-鎖の構造は、シグナル配列である２または３の細胞外Ｃ−２ Iｇ様ドメイン；膜貫通ドメインおよび細胞間細胞質尾部を含み、またそれを特徴とする。Ｆｃレセプターα鎖またはＦｃγＲIIＡまたはＢは、Ｆｃレセプターポリペプチドの細胞外Ｃ−２ Iｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞間ドメインのうちの１以上を有する可溶性Ｆｃレセプターポリペプチドを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
「結合ドメイン」なる用語は、他の分子に結合するポリペプチドの領域を意味する。ＦｃレセプターポリペプチドまたはＦｃＲの場合には、結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域または他のＦｃ領域含有分子への結合の原因であるそのポリペプチド鎖の一部(例えばそのα鎖)を含みうる。一つの有用な結合ドメインはＦｃレセプターα鎖ポリペプチドの細胞外ドメインである。
【００３５】
「融合タンパク質」とは、二つの部分が組み合わさったポリペプチドで、各部分は異なった特性を有するポリペプチドである。この特性は、インビトロ又はインビボにおける活性のような生物学的特性であり得る。また、特性とは、標的分子へ結合すること、反応の触媒などのような、単純な化学的又は物理的特性である。二つの部分は、一本のペプチド結合、又は一つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを通して直接に結合してもよい。融合ポリペプチドは、特に、細胞における融合タンパク質の位置を決定するため、融合タンパク質の安定性を強化するため、タンパク質のオリゴマー形成を促進するため、または融合タンパク質の精製を促進するために使用することができる。このような融合タンパク質の例には、免疫グロブリン分子の一部との融合として発現するタンパク質、ロイシンジッパー成分を有する融合タンパク質として発現するタンパク質、グルタチオンＳトランスフェラーゼに融合したＦｃレセプターポリペプチド、およびＧｌｙ６−Ｈｉｓタグなどのレセプターの検出または精製を可能にする役割を担う１以上のアミノ酸に融合したＦｃレセプターポリペプチドがある。
【００３６】
「相同性」とは、ポリヌクレオチド間の相補性の度合い、または配列同一性を指す。
【００３７】
「宿主細胞」とは、エキソビボ培地で確立された細胞を意味する。本明細書において説明する宿主細胞の特徴は、Ｆｃレセプターを発現できることである。本発明の態様に使用できる適切な宿主細胞の例として昆虫および哺乳動物の細胞を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。このような細胞の特定の例は、ＳＦ９昆虫細胞（SummersおよびSmith, 1987, Texas Agriculture Experiment Station Bulletin, 1555）、ヒト胚性腎臓細胞（293細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（Puck等, 1958, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 1275-1281）、ヒト頚癌細胞（HELA）(ATCC CCL 2)、ヒト肝細胞（Hep G2）(ATCC HB8065)、ヒト乳癌細胞（MCF-7）(ATCC HTB22)、およびヒト大腸癌細胞(DLD-1)(ATCC CCL 221)、ダウディ細胞(ATCC CRL-213）等を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、アニーリング期間に相補的ポリヌクレオチドの対形成をすることを意味する。２つのポリヌクレオチド分子間のハイブリダイゼーションの強度は、２つの分子間の相同性、使用する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融点、およびポリヌクレオチド内のＧ：Ｃの割合に影響される。
【００３９】
本明細書で使用する「イムノアドヘシン」という用語は、異種「アドヘシン」タンパク質（例えばレセプター、リガンドまたは酵素）の「結合ドメイン」と１以上の免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）以外（即ち「異種の」）に所望の結合特異性を持つアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。免疫グロブリン定常ドメイン配列は、好ましくは、免疫グロブリンのＦｃ部である。
【００４０】
「免疫複合体」は、少なくとも一つの標的分子と少なくとも一つのＦｃ領域含有ポリペプチドが互いに結合してより大きな分子量の複合体を形成する場合に生じる比較的安定した構造を意味する。免疫複合体の例は抗原-抗体凝集体及び標的分子-イムノアドヘシン凝集体である。免疫複合体は、例えば哺乳動物における免疫複合体のクリアランスを評価するために哺乳動物に投与することができるか、またはＦｃＲあるいはＦｃレセプターポリペプチドの結合特性を評価するために使用できる。
【００４１】
「単離された」という用語は、その自然環境の少なくとも一つの汚染物質から分離されたか又は回収されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一自然環境の汚染成分とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの診断又は治療への使用を妨害する物質である。通常、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００４２】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来の対応するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。この用語には、特に、ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及び自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。「成熟ポリペプチド」とは、シグナルペプチドを含まないポリペプチドを意味する。
【００４３】
「核酸配列」とう用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序により、ポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定する。よって、デオキシリボヌクレオチド配列はアミノ酸配列をコードする。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」という用語はヌクレオチドの線形配列を意味する。ヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド、或いはそれらの混合の線形配列である。本発明の範囲におけるポリヌクレオチドの例として、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡの両方の混合を有するハイブリッド分子が挙げられる。さらに、本発明のポリヌクレオチドは１以上の修飾ヌクレオチドを有してもよい。
【００４５】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、アミノ酸重合体、或いは互いに作用するか、または結合した２つ以上のアミノ酸重合体の組を表すために交換可能に使用される。
【００４６】
「精製する」、または「精製された」とは、少なくとも５〜１０％の不純タンパク質が除去された標的タンパク質を意味する。不純タンパク質からのタンパク質の精製は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含め、任意の数の周知の技術を使用して行うことができる。様々なタンパク質精製技術が、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編 (Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates)に解説されている。
【００４７】
「パーセント(％)核酸またはアミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大の配列同一性を達成するために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないものとしたときの、基準となるポリペプチド中のアミノ酸と同一である核酸配列またはアミノ酸残基のパーセントと定義される。本発明の目的のための、任意のアミノ酸配列Ｂに対する、所定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性（或いは、任意のアミノ酸配列Ｂに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する任意の配列Ａということもできる）は、以下のようにして計算できる：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、Ａ及びＢのそのプログラムのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムＡＬIＧＮ−２によって完全に一致していると判定されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは等しくならないことが理解できる。好ましくは、％配列同一性は、手作業で配列を整列させ、分率Ｘ／Ｙを再度１００倍することにより決定することができる。ここで、Ｘは手作業による比較により完全に一致すると判定されたアミノ酸の数であり、ＹはＢの全アミノ酸数である。さらに、上述の方法を％核酸配列同一性の決定のために使用することもできる。或いは、これらの目的のために共通に使用される、SmithおよびWatermanのアルゴリズム（1981, Adv. Appl. Math., 2:482-489）を使用するコンピュータプログラム、例えばGapプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin）を使用することができる。
【００４８】
特に注釈していない限り、本明細書で使用する全ての％アミノ酸配列同一性の値は、手動による整列によって獲得されたものである。しかしながら、ＡＬIＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＷＯ００／１５７９６に記載されているように使用できる。
【００４９】
「ストリンジェンシー」という用語は、ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが起こる条件（温度、イオン強度、溶媒等）を意味する。高度にストリンジェントな条件の下に行われたハイブリダイゼーション反応は、相補性の高い塩基対形成（約８５％〜１００％の配列同一性）を持つポリヌクレオチド分子間でのみ起こるものである。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば、６ Ｘ ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で約２．５時間約４２℃で夜間インキュベートした後、６５℃の１．０ Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中においてフィルタを洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の下に行われたハイブリダイゼーション反応は、中程度に相補的な塩基対形成（約５０％〜８４％の配列同一性）を持つポリヌクレオチド分子間でのみ起こるものである。
【００５０】
本明細書において使用する「変異体」という用語は、天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なる配列を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。変異体は、完全長天然配列または成熟ポリペプチド配列と比較したとき、結果として得られる変異体ポリペプチドにアミノ酸の置換、添加、および欠落を生じさせる変化を含む。
【００５１】
「ベクター」、「染色体外ベクター」または「発現ベクター」とは、通常二本鎖のＤＮＡの第一の断片を指し、該第一の断片には、ＤＮＡの第二の断片、例えばカニクイザルＦｃγＲＩのｃＤＮＡのような異種ＤＮＡの断片が挿入されている場合がある。異種ＤＮＡは、宿主細胞中に天然に見られる、又は天然に見られないＤＮＡであり、宿主ゲノムに天然に存在する核酸配列の追加コピーを含む。ベクターは異種ＤＮＡを適切な宿主細胞中に運搬する。宿主細胞中に入ったら、ベクターは宿主細胞の染色体中に一体化できる。ベクターはまた、一体化されたＤＮＡを含む細胞を選択するために必要な要素、並びに形質移入されたＤＮＡからのｍＲＮＡ転写を促進するのに必要な要素を含むことができる。本発明の範囲に含まれるベクターの例として、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、レトロウイルス、及び人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
発明の実施の形態
本発明は、特に、カニクイザルやチンパンジーのような非ヒト霊長類由来のFcレセプターポリペプチドをコードする核酸の単離・配列決定に基づく。特に、本発明は、配列番号：９，１１，１５，１７，１８，２０，２９，６４のアミノ酸配列または該配列の断片を有するＦｃＲポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明は、配列番号：６５，６６，６７，６８，６９，７１もしくは７２のアミノ酸配列または該配列の断片を有する成熟ＦｃＲポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、配列番号：２５または配列番号：７０のアミノ酸配列を有するβ‐2ミクログロブリンをコードする、単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【００５３】
本発明のカニクイザルまたはチンパンジーのＦｃレセプターポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、霊長類においてインビボで評価する前に、カニクイザルまたはチンパンジーのＦｃＲポリペプチドに対する抗体（如何なるサブクラスであれ、特に治療に役立つ見込みのある抗体）の結合を評価するのに有用である。評価には、ＥＬＩＳＡ法型による霊長類のＦｃＲまたはＦｃレセプターポリペプチドに対する結合、または過渡的もしくは安定にトランスフェクトされたヒトもしくは霊長類の細胞（例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ）に対する結合の試験を含めることができる。カニクイザルまたは他の霊長類のＦｃＲｓまたはＦｃレセプターポリペプチドに対するヒト抗体の結合能評価は（ＥＬＩＳＡ法またはトランスフェクトされた細胞のいずれかの形式にて）、インビボで薬物動態／薬力を評価する前に、予備試験として利用可能といえる。カニクイザルのＦｃＲｎまたはＦｃＲｎポリペプチドに対する抗体または抗体変異体の結合は、インビボでより長い半減期を有し得る抗体または抗体変異体の同定に有用であろう。ＦｃＲｎに対する抗体の結合能は、インビボで半減期が延びることと相関性がある。
【００５４】
霊長類のＦｃＲまたはＦｃレセプターポリペプチドは、該レセプターまたはレセプターポリペプチドに対する結合能の向上または低下のいずれかを示す、霊長類またはヒトのＩｇＧの変異体（例えば、タンパク質配列または糖質）のスクリーニングに利用可能である。次に、該変異体は、例えばＩｇＧエフェクター機能の増大または抑止のような抗体の有効性の変化をみるべく、霊長類モデルにおいてインビボで評価可能である。加えて、カニクイザルまたはチンパンジーの可溶性Ｆｃレセプターポリペプチドは、霊長類モデルにおいて治療薬として評価可能である。
【００５５】
例えば、本発明の一態様では、標的ＦｃレセプターにおけるＩＴＡＭモチーフを選択的に活性化するが、他のＦｃレセプターにおけるＩＴＩＭモチーフを活性化させない薬剤を同定する方法を提供する。好ましくは、該薬剤は抗体であり、より好ましくは、該薬剤はモノクローナル抗体である。同定された該薬剤は、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲのみに選択的に結合するとともにこれを活性化させる（即ち、抑制ＩＴＩＭ含有レセプターと同時には結合しない）治療用抗体の設計に有用であろう。従って、治療用抗体の細胞傷害性もしくは食作用、または治療用抗体が抗原提示細胞により内部移行される作用が向上し、標的抗原に対する免疫系の応答が向上しよう。
【００５６】
最後に、本発明のカニクイザルのFcγRポリヌクレオチドおよびポリペプチドにより、ＦｃγＲが媒介する分子相互作用のより詳細な解析が可能になる。ヒトＦｃγＲと相互作用するヒトＩｇＧ１のアミノ酸がマッピングされている（Shields, R.L., Namenuk,A.K., Hong,K., Meng,Y.G., Rae,J.,Briggs,J., Xie,D., Lai,J., Stadlen,A., Li,B., Fox,J.A.およびPresta,L.G. J.Biol.Chem. 第276巻6591〜6604頁(2001年)を参照)。カニクイザルＦｃγＲに対する同一ヒトＩｇＧ１の変異体の結合能を試験することにより、ヒトＩｇＧ１の特定のアミノ酸とＦｃγＲのアミノ酸との相互作用をマッピングするのに役立ち得る。
【００５７】
本出願の範囲内において、特に記載がなければ、利用する技法は次のような幾つかの周知の文献のいずれにおいても見出すことができよう。SambrookらMolecular  Cloning:A  Laboratory  Manual(Molecular cloning: A  Laboratory  Manual(1989年))、Gene  Expression  Technology(D. Goeddel(編)Methods  in  Enzymology第185巻、Academic  Press社、カリフォルニア州サンディエゴ市(1991年))、M.P.Deutshcer"Guide  to  Protein  Purification"Methods  in  Enzymology(Academic  Press社、第3版(1990年)）、InnisらＰＣＲ  Protocols:A  Guide  to  Methods  and  Applications(Academic  Press社、カリフォルニア州サンディエゴ市(1990年)）、R.I.Freshney  Culture  of  Animal  Cells:A  Manual  of  Basic  Technique(Liss社、ニューヨーク州ニューヨーク市、第2版(1987年))、およびE.J.Murray(編)Gene  Transfer  and  Expression  Protocols,109〜128頁(The  Humana  Press社、ニュージャージー州クリフトン)。
【００５８】
ポリヌクレオチド配列
本発明の一態様は、カニクイザルおよびチンパンジー由来のＦｃレセプターポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。遺伝暗号の縮退により二つのＤＮＡ配列は異なる可能性があるが、同一のアミノ酸配列をコードする。従って、本発明は、カニクイザルのＦｃＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子を提供する。該ポリヌクレオチド配列はポリペプチドを配列番号：９または配列番号：１１または配列番号：１５または配列番号：１８または配列番号：２０または配列番号：２９または配列番号：６４のアミノ酸配列または該配列の断片によりコードする。本発明は、本発明のチンパンジーのＦｃγＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子も提供する。該ポリヌクレオチド配列はポリペプチドを配列番号：１７のアミノ酸配列または該配列の断片によりコードする。本発明は、カニクイザルのβ‐２ミクログロブリンを配列番号：２５のアミノ酸配列によりコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子も提供する。
【００５９】
本発明は、成熟した非霊長類のＦｃＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子も提供する。該ポリヌクレオチド配列はポリペプチドを配列番号：６５，６６，６８，６７，６９，７０，７１または７２のアミノ酸配列によりコードする。
【００６０】
表に示すヌクレオチド配列は、大部分の例では、Ｆｃレセプターポリペプチドのシグナル配列に対するコード配列において開始する。
【００６１】
非ヒト霊長類のレセプターのヌクレオチド配列は、ＦｃＲポリペプチドまたはβ‐２ミクログロブリンに対し、配列同一性率を定量すべく、ヒトの配列と並べられてきた。霊長類およびヒトのタンパク質のヌクレオチド配列は手作業にて並べられ、ヌクレオチドまたはタンパク質配列における相違点に留意する。同一性率は同一残基数／総残基数として計算される。配列が総残基数で異なる場合には、総残基に対し二つの異なる番号を用い、同一性率に対し２値が付与される。ヒトＦｃＲに対する核酸配列の一部は当業者には自明であり、Ｇｅｎ Ｂａｎｋの登録番号により同定される。
【００６２】
本発明は、一実施例において、カニクイザルのＦｃγＲＩのα鎖をコードするポリヌクレオチドを有する、単離された核酸分子を提供する。カニクイザルのＦｃγＲＩα鎖の一例は、表１０に示すようにシグナル配列を含むアミノ酸配列を有する（配列番号：９）。成熟したカニクイザルのＦｃγＲＩα鎖は、表１０に示すアミノ酸配列を有する（配列番号：６５）。カニクイザルのＦｃγＲＩα鎖をコードする、単離された核酸の一例を表３に示す（配列番号：１）。カニクイザルのＦｃγＲＩα鎖をコードする核酸配列は、ＦｃγＲＩα鎖をコードするヒトの核酸配列（配列番号：２）と並べた場合、表３に示すように約９１％または９６％の配列同一性を有する（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ登録番号Ｌ０３４１８）。
【００６３】
本発明は、一実施例において、カニクイザルのＦｃγＲＩ／ＩＩＩのガンマ鎖をコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸を提供する。該核酸配列の一例を表４に示す（配列番号：１３）。カニクイザルのガンマ鎖ポリペプチドの一例を表１２に示す（配列番号：１１）。カニクイザルのガンマ鎖をコードする核酸は、ＦｃＲガンマ鎖をコードするヒトの核酸配列（配列番号：１４）と並べた場合、表４に示すように約９９％の配列同一性を有する（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ登録番号Ｍ３３１９５）。
【００６４】
本発明は、一実施例において、カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡをコードするポリヌクレオチドを有する、単離された核酸分子を提供する。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡの一例は、表１１に示すようにシグナル配列を含むアミノ酸配列を有する（配列番号：１５）。成熟したカニクイザルのＦｃγＲＩＩＡは、表２１に示すようなアミノ酸配列を有する（配列番号：６６）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡをコードする、単離された核酸の一例を表５に示す（配列番号：３）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡのα鎖をコードする核酸配列は、ＦｃγＲＩＩＡをコードするヒトの核酸配列（配列番号：４）と並べた場合、表５に示すように約９４％の配列同一性を有する（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ登録番号Ｍ２８６９７）。
【００６５】
本発明は、ＦｃγＲＩＩＡレセプターをコードするポリヌクレオチドを有する、単離された核酸のような、チンパンジー由来のＦｃγＲをコードするポリヌクレオチドを有する、単離された核酸も提供する。チンパンジーのＦｃγＲＩＩＡの一例は、表１１に示すようにシグナル配列を含むアミノ酸配列を有する（配列番号：１７）。成熟したチンパンジーのＦｃγＲＩＩＡは、表１１に示すようなアミノ酸配列を有する（配列番号：６７）。チンパンジーのＦｃγＲＩＩＡをコードする、単離された核酸の一例を表５に示す（配列番号：２２）。配列番号：２２の配列を有する核酸配列は、ＦｃγＲＩＩＡをコードするヒトの核酸配列（配列番号：４）と並べた場合、表５に示すように約９９％の配列同一性を有する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２８６９７）。
【００６６】
本発明は、一実施例において、カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢをコードするポリヌクレオチドを有する、単離された核酸分子を提供する。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢの一例は、表１１に示すようなアミノ酸配列を有する（配列番号：１８）。成熟したカニクイザルのＦｃγＲＩＩＢは、表２２に示すようなアミノ酸配列を有する（配列番号：６８）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢをコードする、単離された核酸の一例を表６に示す（配列番号：５）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢをコードする核酸配列は、ＦｃγＲＩＩＢをコードするヒトの核酸配列（配列番号：６）と並べた場合、表６に示すように約９４％の配列同一性を有する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５２４７３）。
【００６７】
本発明は、一実施例において、カニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡのα鎖をコードするポリヌクレオチドを有する、単離された核酸分子を提供する。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡの一例は、表１１に示すようなアミノ酸配列を有する（配列番号：２０）。成熟したカニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡは、表２３に示すようなアミノ酸配列を有する（配列番号：６９）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡα鎖をコードする、単離された核酸の一例を表７に示す（配列番号：７）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡα鎖の核酸配列は、ＦｃγＲＩＩＩＡα鎖をコードするヒトの核酸配列（配列番号：８）と並べた場合、表７に示すように約９６％の配列同一性を有する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５２６４５）。
【００６８】
本発明は、カニクイザルのＦｃレセプター（ＦｃＲｎ）のα鎖をコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子も提供する。カニクイザルのＦｃレセプターα鎖（Ｓ３）の一例は、表１４に示すような配列番号：２９のアミノ酸配列を有する。成熟ポリペプチドの３番残基におけるセリンをアスパラギンに置換することにより、配列番号：２９のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする対立遺伝子が同定されている。該ポリペプチド配列は配列番号：６４と表示されている。ＦｃＲｎα鎖（Ｓ３）およびＦｃＲｎα鎖（Ｎ３）の成熟ポリペプチドは、それぞれアミノ酸配列番号：７１，７２を有する。カニクイザルのＦｃＲｎα鎖をコードする、単離された核酸の一例は、表９に示す配列番号：２７である。カニクイザルのＦｃＲｎをコードする核酸は、ヒトのＦｃＲｎα鎖をコードするヒトの配列（配列番号：２８）と並べた場合、表９に示すように約９７％の配列同一性を有する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１２２５５）。
【００６９】
本発明は、他の実施例において、カニクイザルのβ‐２ミクログロブリンをコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子を提供する。カニクイザルのβ‐２ミクログロブリンの一例は、表１３に示すようなアミノ酸配列を有する（配列番号：２５）。成熟β‐２ミクログロブリンは、表１３に示すような配列を有する（配列番号：７０）。カニクイザルのβ‐２ミクログロブリンをコードする、単離された核酸の一例を表８に示す（配列番号：２３）。カニクイザルのβ‐２ミクログロブリンの核酸は、β‐２ミクログロブリンをコードするヒトの配列（配列番号：２４）と並べた場合、表８に示すように約９５％の配列同一性を有する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２１２８８）。
【００７０】
本発明の非ヒト霊長類の核酸は、ｃＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより単離されたＤＮＡ、および該ＤＮＡの組合せを含む。カニクイザルまたはチンパンジーのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡも本発明に含む。カニクイザルのＤＮＡは、標準的な方法により脾臓または肝臓のような組織から得ることが可能であり、後述の例に記載のように得ることができる。チンパンジーのＦｃγＲのＤＮＡは、標準的な方法により脾臓または肝臓のような組織から得ることが可能であり、後述の例に記載のように得ることができる。
【００７１】
本発明の別の態様において、非ヒト霊長類のＦｃレセプターをコードする核酸を得る方法を提供する。該方法は、フォワードおよびリバースプライマーを含むとともに配列番号：３１および配列番号：３２，配列番号：３３および配列番号：３４，配列番号：３５および配列番号：３６，配列番号：３７および配列番号：３８，配列番号：３９および配列番号：４０，配列番号：４１および配列番号：４２，配列番号：４３および配列番号：４４，配列番号：４５および配列番号：４６，配列番号：４７および配列番号：４８，配列番号：４９および配列番号：５０，配列番号：５１および配列番号：５２，配列番号：５３および配列番号：５４からなる群から選択されるプライマーセットにより非ヒト霊長類由来の核酸を増幅し、該増幅核酸を単離することを含む。非ヒト霊長類の細胞は、好ましくはカニクイザルの脾臓細胞またはチンパンジーの脾臓細胞である。プライマーセットの一部は、ＧｌｙＨｉｓ−ＧＳＴに融合したＦｃレセプターポリペプチドの細胞外断片を増幅する。
【００７２】
本願に記載のカニクイザルおよびチンパンジーのＦｃγＲをコードする核酸分子の断片、および該核酸分子にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）におけるプローブまたはプライマーとしての利用等、幾つかの方法で利用可能である。該プローブは、例えば、インビトロアッセイおよびサザン／ノーザンブロット法にてＦｃγＲポリヌクレオチドの存在を検出するのに利用可能である。ＦｃγＲを発現する細胞型も該プローブを用いることにより同定可能である。該方法は周知であり、当業者は特定の用途に適う長さのプローブを選択することができよう。ＰＣＲに関しては、核酸分子の終端と一致する５’および３’プライマーを用い、従来の技法により該配列を単離・増幅する。プローブとして有用な断片は、通常、約１８〜２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、ＦｃγＲをコードするポリヌクレオチド全長に至る長さを含む。ＰＣＲプライマーとして有用な断片は、通常、２０〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである。
【００７３】
カニクイザルの異なるＦｃγＲポリヌクレオチドの他の有用な断片は、標的ＦｃγＲのｍＲＮＡ（センス鎖を利用）またはＤＮＡ（アンチセンス鎖を利用）配列に結合可能な一本鎖の核酸配列を有する、アンチセンスまたはセンス・オリゴヌクレオチドである。
【００７４】
他の有用な断片は、Ｆｃγレセプターポリペプチドのドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。該断片は、好ましくは、Ｆｃ領域含有分子に結合可能である。ポリヌクレオチド断片の一実施例は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインが欠失している、Ｆｃγレセプターポリペプチドの細胞外ドメインをコードする断片である。Ｆｃγレセプターの他のドメインは、例えば、表１０および表１１において同定される。一つ以上のポリペプチド・ドメインをコードする核酸断片は、本発明の範囲内に含まれる。
【００７５】
本発明は、カニクイザルならびにチンパンジーの異型ＦｃγＲ核酸分子、およびカニクイザルの異型β‐２ミクログロブリン核酸分子も提供する。変異ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：９，１１，１５，１７，１８，２０，２５，２９または６４のような未変性ポリペプチドと比較した場合、結果として生じる変異ポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加および欠失を生じる核酸配列の改変を含み得る。変異核酸配列の改変は、一つの脂肪族残基（Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＡｌａ）を別の脂肪族残基に置換し、または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、もしくは芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間における置換のように、類似の生理化学的特性を有する残基によりアミノ酸が置換されてしまう、核酸配列の改変を含み得る。本発明の変異ポリヌクレオチド配列は、未変性配列の全長をコードする核酸配列、シグナル配列を欠失したポリペプチド、ポリペプチドの細胞外ドメイン、または配列番号：１，３，５，７，２３もしくは２７のＦｃγレセプターポリペプチドもしくはβ‐２ミクログロブリンの断片をコードする核酸に対し、好ましくは少なくとも約９５％同一であり、より好ましくは少なくとも約９６％同一であり、より好ましくは少なくとも約９７％または９８％同一であり、最も好ましくは少なくとも約９９％同一である。
【００７６】
上記の配列と変異配列との配列同一性率は、例えば、ＡＬＩＧＮ−２のように該目的に対して一般的に用いられる、任意のコンピュータプログラムを用い、または手作業配列により、変異配列を対照配列と比較することにより、定量することも可能である。同一性率は［同一残基数］／［総残基数］として計算される。配列が総残基数で異なる場合には、総残基に対し二つの異なる番号を用い、同一性率に対し２値が付与される。
【００７７】
カニクイザルならびにチンパンジーのＦｃγＲポリペプチド、およびカニクイザルのβ‐２ミクログロブリンの核酸・アミノ酸の配列は、任意の幾つかの既知技法により改変可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発のような当業者には自明の方法により、特定位置に変異を導入することが可能である。前記に関しては、WalderらGene第４２巻１３３頁（１９８６年）、BauerらGene第３７巻７３頁（１９８５年）、Craik BioTechniques１２〜１９頁（１９８５年）、SmithらGenetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press社（１９８１年）、および米国特許第４，５１８，５８４号ならびに米国特許第４，７３７，４６２号に記載されている。
【００７８】
本発明は、異種ポリヌクレオチドに結合し融合タンパク質をコードする、カニクイザルならびにチンパンジーのＦｃγＲポリペプチド、カニクイザルのＦｃＲｎポリペプチド、β‐２ミクログロブリンの核酸分子、または該核酸分子の断片ならびに変異体も提供する。異種ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：１，３，５，７，１３，２２，２５または２７のように、結果として生じる、カニクイザルならびにチンパンジーのＦｃγＲ、カニクイザルのＦｃＲｎおよびβ‐２ミクログロブリンのポリペプチドのインフレーム発現に対する干渉を避けるべく、本発明の核酸分子の３’または５’末端に結合可能である。また、異種ポリヌクレオチドは本発明の核酸分子のコード化領域内に結合可能である。異種ポリヌクレオチドは、本発明のカニクイザルおよびチンパンジーのコードされたポリペプチドの分泌を付与し、安定性を向上させ、または精製を促進する、一つのアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドをコードすることが可能である。
【００７９】
好ましい実施例は、例１に記載したように得られる、Ｇｌｙ（Ｈｉｓ）６−ｇｓｔタグに融合したＦｃγＲＩ，ＦｃγＩＩＩもしくはＦｃＲｎ、またはＧｌｙ（Ｈｉｓ）６−ｇｓｔタグに融合したＦｃγＲＩＩＡもしくはＩＩＢのα鎖の細胞外ドメインをコードする核酸配列である。Ｇｌｙ（Ｈｉｓ）６−ｇｓｔタグは、核酸にコードされるポリペプチドの精製を簡便にする。
【００８０】
本発明のカニクイザルおよびチンパンジーのＦｃγＲポリペプチドおよびβ‐２ミクログロブリンの核酸分子は、原核生物の宿主細胞または真核生物の宿主細胞中にクローン化され、その結果得られる本発明のポリペプチドを発現することが可能である。本発明の標的ポリペプチドを発現する宿主細胞を作製するには、任意の組換えＤＮＡ法またはＲＮＡ法を利用することが可能であり、該方法は形質移入、形質転換または形質導入を含むが、これに限定されるものではない。断片および変異体を含む、本発明のポリヌクレオチドにより宿主細胞を遺伝子操作する方法およびベクターは、当業者には自明であり、Ausubelら(編)Current  Protocols  in  Molecular  Biology(Wiley&Sons社、ニューヨーク(1988年)および最新版)に見出し得る。本発明に用いるベクターおよび宿主細胞は、本願の例において記載する。
【００８１】
本発明は、成熟Ｆｃレセプターポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する、単離された核酸も提供する。単離された核酸は、変異シグナル配列をコードする核酸配列を更に有し得る。変異シグナル配列は、本発明の未変性配列の非ヒト霊長類のＦｃレセプターポリペプチドと異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得られる配列である。変異シグナル配列は、ヒトのＦｃレセプターポリペプチド由来のシグナル配列、および組織プラスミノゲンアクチベーターのようなポリペプチド由来のシグナル配列を含む。
【００８２】
ポリペプチド配列
本発明の別の態様は、カニクイザルおよびチンパンジーのような非ヒト霊長類由来のＦｃＲポリペプチドに関する。ＦｃγＲポリペプチドは、ＦｃγＲＩのα鎖、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡのα鎖、ＦｃＲｎのα鎖、ＦｃＲγＩ／ＩＩＩのγ鎖およびβ‐２ミクログロブリンを含む。ポリペプチドはＩｇＧ抗体またはＦｃ領域を有する他の分子に結合する。レセプターの一部は、ＩｇＧ抗体複合体に選択的に結合する低親和性レセプターである。ＦｃγＲポリペプチドは、抗体依存性細胞傷害性、細胞からの媒介物質放出の誘導、抗体被覆粒子の取込み・破壊、免疫グロブリンの輸送のようなエフェクター細胞の機能も媒介する。
【００８３】
カニクイザルおよびチンパンジー由来のＦｃγＲポリペプチドのアミノ酸配列は、ヒトのＦｃγＲポリペプチドをコードするアミノ酸配列と並べられ、ヒトの配列との配列同一性率を定量する。霊長類およびヒトのタンパク質のアミノ酸配列は手作業にて並べられ、ヌクレオチドまたはタンパク質の配列における相違点に留意する。同一性率は同一残基数／総残基数として計算される。配列が総残基数で異なる場合には、総残基に対し二つの異なる番号を用い、同一性率に対し２値が付与される。ヒトＦｃγＲポリペプチドをコードするアミノ酸配列の一部は当業者には自明であり、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号により同定される。
【００８４】
表に示すポリペプチド配列は、シグナル配列または成熟タンパク質の１番アミノ酸から開始して番号付ける。ポリペプチドのアミノ酸残基がシグナル配列から開始して番号付けられる場合、その番号は残基数および直線により同定される。また、ポリペプチドのアミノ酸残基がヒトの成熟タンパク質の１番アミノ酸から開始して番号付けられる場合、アミノ酸はその番号およびΔ記号により表される。表１１において、カニクイザルの配列のＮ末端残基１番はアステリスクにより示されるが、番号付けはヒトの成熟タンパク質に一致する番号付けである。ヒトＦｃＲポリペプチドのアミノ酸残基の番号付けは連続的である。
【００８５】
また、非ヒト霊長類のレセプターを解析し、ヒトＩｇＧおよびＩｇＧ変異体の種々のサブクラスに対する非ヒト霊長類のＦｃレセプターポリペプチドの結合能をヒトのＦｃレセプターと比較した。該サブクラスに対する結合はＩｇＧ４ｂも含んだ。ＩｇＧ４ｂはＩｇＧ４の一形態であるが、ヒンジ領域のアミノ酸残基２２８番において、セリンからプロリンへの改変を有する。Angal, S., King,D.J.,Bodmer, M.W.,Turner, A.,Lawson,D.G., Robert,G., Pedley,B. およびAdair, J. R. Molec. Immunology第30巻105〜108頁(1993年)A  single  amino  acid  substitution  abolishes  heterogeneity  of  chimeric-mouse/human(IgG4)antibodyに記載のように、該改変は鎖間ジスルフィド結合の形成増大により、未変性IgG4より安定性が高い分子を生じさせる。
【００８６】
本発明の一実施例はカニクイザルのＦｃγＲＩポリペプチドである。カニクイザルＦｃγＲＩはＩｇＧおよびＦｃ領域を有する他の分子に結合し、好ましくはヒトのモノマーＩｇＧに結合する。カニクイザルＦｃγＲＩのα鎖の一例は、配列番号：９の配列を有するポリペプチドである。ヒトの配列とのアラインメントに基づき、カニクイザルの成熟ＦｃγＲＩは配列番号：６５の配列を有する。例１に記載するように得られる細胞外断片は、表１０に示すようにΔ１〜Δ２６９のアミノ酸配列を有する。
【００８７】
また、ヒトおよびカニクイザル由来ＦｃγＲＩのアミノ酸配列α鎖のアラインメントを表１０に示す。Δ記号を付したアミノ酸の下部に示す番号は、シグナル配列を含まない成熟ポリペプチドの開始点から番号付けられる。アミノ酸残基の上部に示す番号は、シグナル配列から開始する残基の番号付けを表す。シグナル配列、細胞外ドメイン１、細胞外ドメイン２、細胞外ドメイン３、および膜貫通・細胞内配列を含む、ＦｃγＲＩα鎖の各ドメインを示す。ヒトの配列番号：１０の配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ１２３１４）に、シグナル配列から開始するカニクイザルのＦｃγＲＩα鎖配列を並べると、ヒトの配列に存在する３’伸展が算出に用いられたか否かにより、ヒトの配列に対し約９０％または９４％の配列同一性が示される。
【００８８】
カニクイザルの配列をヒトの配列に並べると、カニクイザルのＦｃγＲＩα鎖はヒトのＦｃγＲＩ配列に認められるのと同数のアミノ酸を、シグナル配列、３細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインに有することが示される（表１０）。対照的に、カニクイザルのＦｃγＲＩα鎖の細胞内ドメインは、ヒトのＦｃγＲＩα鎖の細胞内ドメインより１７アミノ酸分短い（表１０）。カニクイザルのＦｃγＲＩα鎖はヒトのモノマーサブクラスに、ＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４ｂ＞＞＞ＩｇＧ２のように結合し、これはヒトのＦｃγＲＩに類似する。
【００８９】
ＩおよびＩＩＩＡサブクラスのＦｃレセプターは、γ鎖のホモダイマーまたはヘテロダイマーのいずれかに複合化したα鎖を含む、複合分子である。本発明はカニクイザルのＦｃＲのガンマ鎖も含む。ガンマ鎖ポリペプチドの一例は、表１２に示すように、配列番号：１１のアミノ酸配列を有する。カニクイザルのガンマ鎖アミノ酸配列を、ガンマ鎖配列番号：１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ３０２７３）のヒトの配列と並べた場合、ヒトの配列と約９９％の配列同一性を有する。カニクイザルのガンマ鎖のＩＴＡＭモチーフは、ヒトのガンマ鎖のＩＴＡＭモチーフと同一である。
【００９０】
本発明の別の実施例はカニクイザルのＦｃγＲＩＩＡである。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡは、免疫グロブリン及びＦｃ領域を有する他の分子に、好ましくは抗原または相互に複合した免疫グロブリンに結合する。より好ましくは、レセプターは二量体または六量体のヒトＩｇ免疫複合体に結合する。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡの一例は配列番号：１５のアミノ酸配列を有する。カニクイザルの成熟ＦｃγＲＩＩＡは配列番号：６６のアミノ酸配列を有する（表２１）。例１のプライマーを用いて得られる細胞外断片は、表２１に示すように、Δ１〜Δ１８２のアミノ酸配列を有する。
【００９１】
カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡ配列を、表１１に示すように、ヒトのＦｃγＲＩＩＡのアミノ酸配列と並べた（配列番号：１６）（登録番号Ｐ１２３１８）。表１１において、Δ記号を付したアミノ酸の下部に示す番号は、シグナル配列を含まない成熟ヒトポリペプチドの開始点から番号付けられる。アミノ酸残基の上部に示す番号は、シグナル配列から開始する残基の番号付けを表す。カニクイザルの配列は、ヒトの配列と整列すると、アラインメントがＭＡＭＥＴＱ配列と供に開始するか否かにより、ヒトの配列に対し約８７％または８９％の配列同一性を有する。このアラインメントにより、カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡはヒトのＦｃγＲＩＩＡに認められるアミノ酸よりも少ないアミノ酸をシグナルペプチド配列に有することが示される（表１１）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡはヒトのＦｃγＲＩＩＡ配列に認められるのとほぼ同数のアミノ酸を、２細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに有する（表１１）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡは、ヒトのレセプターに認められるように二つの同一ＩＴＡＭモチーフを有することに留意されたい（表１１）。
【００９２】
カニクイザルのＦｃγＲＩＩＡは、次の結合パターンによりサブクラスのＩｇＧ六量体複合体に結合する。ＩｇＧ３＝ＩｇＧ２＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４ｂ，ＩｇＧ４。アミノ酸１３１番に対応するアミノ酸にアルギニンを有するヒトのＦｃγＲＩＩＡイソフォーム（Ｒ１３１）は、六量体のＩｇＧサブクラスに次のように結合する。ＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞＞＞ＩｇＧ２≧ＩｇＧ４。アミノ酸１３１番に対応するアミノ酸にヒスチジンを有するヒトのＦｃγＲＩＩＡイソフォーム（Ｈ１３１）は、六量体のＩｇＧサブクラスに次のように結合する。ＩｇＧ３≧ＩｇＧＩ＝ＩｇＧ２＞＞＞ＩｇＧ４。配列番号：１５のアミノ酸配列を有するカニクイザルのＦｃγＲＩＩＡはＨ１３１を有し、Ｈ１３１イソフォーム変異体を有するヒトのレセプターと同様に、ヒトＩｇＧのサブクラスに結合する。しかし、カニクイザルのＦｃレセプターはＩｇＧ３に結合するのと同様に効率的にＩｇＧ２に結合する。
【００９３】
本発明の別の実施例はチンパンジーのＦｃγＲＩＩＡである。チンパンジーのＦｃγＲＩＩＡは、免疫グロブリンおよびＦｃ領域を有する他の分子に、好ましくは抗原または相互に複合した免疫グロブリンに結合する。好ましくは、レセプターは二量体または六量体のヒトＩｇ免疫複合体に結合する。チンパンジーのＦｃγＲＩＩＩＡの一例は配列番号：１７のアミノ酸配列を有する。ヒトの配列とのアラインメントに基づき、チンパンジーの成熟ＦｃγＲＩＩＡは配列番号：６７のアミノ酸配列を有する。
【００９４】
チンパンジーのＦｃγＲＩＩＡアミノ酸配列を、表１１に示すように、シグナル配列と共に開始し、ヒトのＦｃγＲＩＩＡ配列番号：１６と並べた（登録番号Ｐ１２３１８）。チンパンジーの配列はヒトの配列と比較した場合、約９７％の配列同一性を有することもアラインメントにより示される。チンパンジーのＦｃγＲＩＩＡは、シグナルペプチド配列においてヒトのＦｃγＲＩＩＡα鎖に認められるよりアミノ酸が一つ少ない（表１１）。チンパンジーのＦｃγＲＩＩＡは、ヒトのＦｃγＲＩＩＡ配列に認められるのと同数のアミノ酸を、２細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに有する（表１１）。チンパンジーのＦｃγＲＩＩＡは、ヒトおよびカニクイザルのレセプターに認められるように二つの同一ＩＴＡＭモチーフを有することに留意されたい（表１１）。
【００９５】
本発明の別の実施例はカニクイザルのＦｃγＲＩＩＢである。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢは、免疫グロブリンおよびＦｃ領域を有する他の分子に、好ましくは抗原または相互に複合した免疫グロブリンに結合する。より好ましくは、レセプターは二量体または六量体のヒトＩｇ免疫複合体に結合する。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢの一例は配列番号：１８のアミノ酸配列を有する。カニクイザルの成熟ＦｃγＲＩＩＢは配列番号：６８のアミノ酸配列を有する（表２２）。例１のプライマーを用いて得られる細胞外断片は、表２２に示すように、Δ１〜Δ１８４のアミノ酸配列を有する。
【００９６】
カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢは表１１に示すように、ヒトＦｃγＲＩＩＢのアミノ酸配列と約９２％の配列同一性を有する（配列番号：１９）（登録番号Ｘ５２４７３）。カニクイザルの配列はヒトの配列と並べると、カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢはヒトのＦｃγＲＩＩＢ配列に認められるのとほぼ同数のアミノ酸を、シグナルペプチド、２細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインに有することが示される（表１１）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢには細胞内ドメインのＮ末端部分に３アミノ酸が挿入される（ヒトのＦｃγＲＩＩＢと比較）（表１１）。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢは、ヒトのレセプターに認められるＩＴＩＭモチーフと同一のＩＴＩＭモチーフを有することに留意されたい（表１１）。
【００９７】
カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢは、次の結合パターンにより、サブクラスのＩｇＧの六量体複合体に結合する。ＩｇＧ２≧ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４ｂ，ＩｇＧ４。ヒトのＦｃγＲＩＩＢは六量体のＩｇＧサブクラスに次のように結合する。ＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２＞ＩｇＧ４。カニクイザルのＦｃγＲＩＩＢはヒトのＦｃγＲＩＩＢより遥かに効率的にＩｇＧ２に結合する。
【００９８】
本発明の別の実施例はカニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡである。カニクイザルのレセプターＦｃγＲＩＩＩＡは、免疫グロブリンおよびＦｃ領域を有する他の分子に、好ましくは免疫グロブリン複合体に結合する。好ましくは、レセプターは二量体または六量体のヒトＩｇ免疫複合体に結合する。ＦｃγＲＩＩＩＡα鎖のアミノ酸配列の一例は配列番号：２０である。カニクイザルの成熟ＦｃγＲＩＩＩＡα鎖は配列番号：６９の配列を有する（表２３）。例１に記載のプライマーを用いて得られる細胞外断片は、表２３に示すように、Δ１〜Δ１８７のアミノ酸配列を有する。
【００９９】
カニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡα鎖の配列を、表１１に示すように、ヒトのＦｃγＲＩＩＩＡのアミノ酸配列と並べた（配列番号：２１）（登録番号Ｐ０８６３７）。表１１において、Δ記号を付したアミノ酸の下部に示すアミノ酸番号は、シグナル配列を含まない成熟ヒトポリペプチドの開始点から番号付けられる。アミノ酸残基の上部に示す番号は、シグナル配列から開始する残基の番号付けを表す。ヒトおよびカニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡの配列を並べると、該配列はヒトの配列に対し約９１％の配列同一性を有することが示される。このようにカニクイザルの配列をヒトの配列と並べることにより、カニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡα鎖はヒトのＦｃγＲＩＩＩＡ配列に認められるのとほぼ同数のアミノ酸を、シグナルペプチド、２細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに有することが示される（表１１）。カニクイザルおよびヒトの細胞内ドメインは双方ともＩＴＡＭモチーフを有さない。ヒトのＦｃγＲＩＩＩＡに対するＩＴＡＭモチーフの活性化は会合するγ鎖により付与され、カニクイザルの場合にも同様のことが生じる可能性が高い。
【０１００】
カニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡα鎖は、次の結合パターンによりサブクラスのＩｇＧ六量体複合体に結合する。ＩｇＧ１＞ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ２≧ＩｇＧ４ｂ，ＩｇＧ４。アミノ酸１５８番に対応するアミノ酸にフェニルアラニンを有するヒトのＦｃγＲＩＩＩＡイソフォーム（Ｆ１５８）は、六量体のＩｇＧサブクラスに次のように結合する。ＩｇＧ３＝ＩｇＧ１＞＞＞ＩｇＧ２，ＩｇＧ４。アミノ酸１５８番に対応するアミノ酸にバリンを有するヒトのＦｃγＲＩＩＡイソフォーム（Ｖ１５８）は、六量体のＩｇＧサブクラスに次のように結合する。ＩｇＧ１＞ＩｇＧ３＞＞＞ＩｇＧ２Ａ，ＩｇＧ４。アミノ酸配列配列番号：２０を有するカニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡは、アミノ酸１５８番に対応するアミノ酸位置にイソロイシンを有し、ヒトのＦｃγＲＩＩＩＡのＶ１５８と同様にヒトＩｇＧのサブクラスに結合する。
【０１０１】
ヒトＩｇＧ１は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｆ１５８に対してよりもヒトＦｃγＲＩＩＩＡ‐Ｖ１５８に対する方が結合し易い(Koene,H.R., Kleijer,M., Algra,J., Roos, D.,von  dem  Borne, E.G.K.およびde  Hass,M. Blood第90巻1109〜1114頁(1997年),Wu,J.,  Edberg,J.C.,Redecha,  P.B.,Bansal,V.,Guyre,P.M., Coleman, K., Salmon, J.E.およびKimberly, R.P.  J.Clin.Invest.第100巻1059〜1070頁(1997年)、Shields,R.L., Namenuk,A.K., Hong,K., Meng,Y.G.,Rae,J., Briggs,J., Xie,D.,Lai, J.,Stadlen,A.,Li,B., Fox,J.A.およびPresta,L.G.  J.Biol.Chem.第276巻6591〜6604頁(2001年)を参照)。ヒトにおいて、ＦｃγＲＩＩＩＡ‐Ｆ１５８対立遺伝子は、少なくとも一つのＦｃγＲＩＩＩＡ‐Ｆ１５８対立遺伝子を有するヒトの約90%占めるほどに優勢である(Lehrnbecher,T.,Foster,C.B.,Zhu,S.,Leitman,S.F.,Goldin,L.R.,Huppi,K.およびChanock,S.J.  Blood第94巻4220〜4232頁(1999年)を参照)。加えて、近年の研究では特定の疾患と個人のＦｃγＲＩＩＩＡ多形性との相関関係を示し始めている(Wu,J.,Edberg,J.C.,Redecha,P.B.,Bansal,V.,Guyre,P.M.,Coleman,K.,Salmon,J.E.およびKimberly,R.P.  J.Clin.Invest.第100巻1059〜1070頁(1997年)、Lehrnbecher,T.,Foster,C.B.,Zhu,S.,Venzon,D.,Steinberg,S.M.,Wyvill,K.,Metcalf,J.A.,Cohen,S.S.,Kovacs,J.,Yarchoan,R.,Blauvelt,A.およびChanock,S.J.  Blood第95巻2386〜2390頁(2000年)、Nieto,A.,Caliz,R.,Pascual,M.,Mataran,L.,Garcia,S.およびMartin,J.  Arthritis & Rheumatism第43巻735〜739頁(2000年)を参照)。チンパンジーおよびカニクイザルのＦｃγＲＩＩＩＡが１５８番位置にそれぞれバリン、イソロイシンを有することに留意されたい。カニクイザルＦｃγＲＩＩＩＡおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＡ‐Ｖ１５８（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ‐Ｆ１５８と対照的に）に対するヒトＩｇＧの４サブクラスの結合能が類似しているということは、霊長類モデルにおいてヒト抗体を評価するには、ＦｃγＲＩＩＩＡレセプターに関し、僅か少数のヒト、即ちＦｃγＲＩＩＩＡ‐Ｖ１５８／Ｖ１５８ホモ接合体を表す霊長類モデルの説明が必要であるということが示唆される。例えば、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ‐Ｖ１５８は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ‐Ｆ１５８に比し、卓越した抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示すため(Shields,R.L., Namenuk,A.K., Hong,K., Meng,Y.G.,Rae, J.,Briggs, J.,Xie,D.,Lai, J.,Stadlen, A.,Li,B., Fox,J .A.およびPresta, L.G. J.Biol.Chem.第276巻6591〜6604頁(2001年))、霊長類モデルではＦｃγＲＩＩＩＡに関連するヒト抗体のエフェクター機能の効果を過大評価する可能性がある。
【０１０２】
しかし、カニクイザルの他のＦｃＲｓ、特にＦｃγＲＩに対するヒトＩｇＧのサブクラスの結合パターンは、Ｆｃ領域結合分子の安全性、有効性および薬物動態を評価するのに、非ヒト霊長類を効果的に用い得ることを示す。
【０１０３】
本発明はＦｃＲｎと同定されるＦｃレセプターポリペプチドも提供する。表１４にカニクイザルのＦｃＲｎのアミノ酸配列を示す。表１４において、アミノ酸の下部に示すとともにΔ記号で表す番号は、成熟ポリペプチドの開始点から番号付けられる。２対立遺伝子が同定され、これを表１４に示す。カニクイザルのＦｃＲｎα鎖は、成熟ポリペプチドの３番残基においてセリンを有するアミノ酸配列配列番号：２９を有する。カニクイザルのＦｃＲｎα鎖は配列番号：６４の配列を有し、成熟ポリペプチドの３番残基においてアスパラギンを有する。ＦｃＲｎα鎖Ｓ３およびＦｃＲｎα鎖Ｎ３の成熟ポリペプチドは、それぞれ配列番号：７１，７２の配列を有する。例１に記載するプライマーを用いて得られるようなＦｃＲｎの細胞外断片は、表１４に示すように、Δ１〜Δ２７４のアミノ酸配列を有する。
【０１０４】
ヒトＦｃＲｎα鎖の配列（配列番号：２０）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１２２５５）に対し、カニクイザルＦｃＲｎα鎖の配列を整列させると、カニクイザルの配列はヒトの配列と約９７％同一であることが示される。カニクイザルのＦｃＲｎ（Ｓ３）およびＦｃＲｎ（Ｎ３）のα鎖は、次の結合パターンにてＩｇＧのサブクラスに結合する。ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２＞ＩｇＧ１。該結合パターンはヒトＦｃＲｎα鎖の結合パターンに類似している。
【０１０５】
本発明はカニクイザルのβ‐２ミクログロブリン・ポリペプチドも含む。表１３に示すように、カニクイザルのβ‐２ミクログロブリン・ポリペプチドは配列番号：２５を有する。成熟β‐２ミクログロブリン・ポリペプチドは配列番号：７０を有する。カニクイザルのβ‐２ミクログロブリン配列をヒトのβ‐２ミクログロブリン（配列番号：２６）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０１８８４）配列と並べると、カニクイザルの配列はヒトβ‐２ミクログロブリンに対し約９２％の配列同一性を有することが示される。
【０１０６】
変異体、誘導体、融合タンパク質、およびＦｃＲｓの任意の生物活性を保持する、カニクイザルならびにチンパンジーの異なるＦｃγＲポリペプチドの断片も、本発明の範囲内である。例３に後述するように、通常の当業者であれば、変異体、誘導体またはＦｃγＲポリペプチドの断片を免疫グロブリン結合アッセイにかけることにより、変異体、誘導体またはＦｃγＲポリペプチドの断片が活性を示すか否かを容易に判断でき得るということに留意されたい。
【０１０７】
カニクイザルおよびチンパンジーの異なるＦｃγＲｓの誘導体は、グリコシル基、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）基、脂質、リン酸、アセチル基等の他の化学成分を用いて共有結合性または集合性の共役を形成することにより改変されたポリペプチドにすることが可能である。
【０１０８】
別の実施例において、本発明のポリペプチドは、例えば成熟ポリペプチドのアミノ酸残基のように、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの一部もしくは全部を欠失したポリペプチドの断片を含む。該アミノ酸残基には次のようなものがある。配列番号：６５のＦｃγＲＩα鎖アミノ酸残基２７０〜３３６番、配列番号：６６のＦｃγＲＩＩＡアミノ酸残基１８３〜２８２番、配列番号：６７のチンパンジーＦｃγＲＩＩＡアミノ酸残基１７２〜２８１番、配列番号：６８のＦｃγＲＩＩＢアミノ酸残基１８５〜２５２番、配列番号：６９のＦｃγＲＩＩＩＡα鎖アミノ酸残基１８８〜２３４番、または配列番号：７１もしくは配列番号：７２のＦｃＲｎアミノ酸残基２７５〜３４２番。可溶性ＦｃγＲポリペプチドは、ポリペプチドを産生する細胞からポリペプチドが分泌されているのであれば、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインの一部を含み得る。好ましくは、該断片はＦｃ領域含有分子に結合可能である。
【０１０９】
ポリペプチド断片は、表１０または表１１にて同定されるポリペプチドの一つ以上のドメインも含み、これにはシグナルペプチド、ドメイン１、ドメイン２、ドメイン３、膜貫通／細胞内ドメイン、またはＩＴＡＭモチーフもしくはＩＴＩＭモチーフを含む細胞質ドメインが含まれる。ポリペプチドの典型的な断片は、対応する成熟ＦｃγＲポリペプチドのアミノ酸配列のドメイン１、ドメイン２およびドメイン３のみを有する可溶性ポリペプチドも含む。例えば、該断片はカニクイザルＦｃγＲＩのアミノ酸残基Δ１〜Δ２６９番（表１０）、カニクイザルＦｃγＲＩＩＡのアミノ酸残基Δ１〜Δ１８２番（表２１）、カニクイザルＦｃγＲＩＩＢのアミノ酸残基Δ１〜Δ１８４番（表２２）、カニクイザルＦｃγＲＩＩＩＡのアミノ酸残基Δ１〜Δ１８７番（表２３）およびカニクイザルＦｃＲｎのアミノ酸Δ１〜Δ２７４番（表１４）である。
【０１１０】
本発明の範囲内のカニクイザルまたはチンパンジーのＦｃγＲ変異体は、控えめに置換された配列を有することがあるが、これは各ポリペプチドの一つ以上のアミノ酸残基が、ポリペプチドの二次及び／又は三次構造を改変しない、異なる残基に置換されることがある、ということである。該置換には、一つの脂肪族残基（Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＡｌａ）を別の脂肪族残基に置換、または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、もしくは芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間における置換のような、類似の生理化学的特性を有する残基によるアミノ酸置換が含まれ得る。表現型的にサイレントなアミノ酸交換をすることに関する更なる情報は、ＢｏｗｉｅらＳｃｉｅｎｃｅ第２４７巻１３０６〜１３１０頁（１９９０年）に見出し得る。タンパク質の生物活性をほぼ保持する可能性がある他の変異体は、タンパク質の機能領域外の部位にてアミノ酸が置換されている変異体である。
【０１１１】
本発明は、カニクイザルおよびチンパンジーの変異型ＦｃＲポリペプチドも提供する。変異ポリペプチドは、例えば、配列番号：９，１５，１７，１８，２０，２５，２９または６４のような未変性ポリペプチドと比較した場合、結果として生じる変異ポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加および欠失を生じる、ポリペプチド配列の改変を含み得る。変異ポリペプチドの改変は、一つの脂肪族残基（Ｉｌｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＡｌａ）と別の脂肪族残基の置換、または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、もしくは芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間における置換のように、類似の生理化学的特性を有する残基によりアミノ酸が置換されてしまう、核酸配列の改変を含み得る。本発明の変異ポリペプチド配列は、未変性配列の全長、シグナル配列を欠失したポリペプチド、ポリペプチドの細胞外ドメイン、または配列番号：９，１５，１７，１８，２０，２５，２９もしくは６４の配列のＦｃγレセプターもしくはβ‐２ミクログロブリンの断片に対し、好ましくは少なくとも約９０％同一であり、より好ましくは少なくとも約９１％同一であり、より好ましくは少なくとも９２％または９３％同一であり、より好ましくは約９４％同一であり、より好ましくは９５％または９６％同一であり、より好ましくは９７％または９８％同一であり、最も好ましくは少なくとも約９９％同一である。
【０１１２】
本発明の別の実施例は、変異型のアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドに融合したポリペプチドである。該アミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドは、好ましくはポリペプチドの精製を促進する。そのような機能に対して用いられて得られるペプチドの多くは、結合パートナーに対する融合タンパク質の選択的結合を可能にする。例えば、配列番号：９に示すような配列を有する、カニクイザルのＦｃγＲＩポリペプチドは、改変されてペプチド、即ちペプチドタグを有し、結合パートナーに特異的に結合する融合タンパク質を形成し得る。該ペプチドタグの非限定的例には、６−Ｈｉｓタグ、Ｇｌｙ／Ｈｉｓ６／ＧＳＴタグ、チオレドキシンタグ、ヘマグルチニンタグ、Ｇｌｙｌｈ１５６タグおよびＯｍｐＡシグナル配列タグが含まれる。本発明の全長ポリペプチド、変異ポリペプチドおよび切断ポリペプチドは、このような異種のアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドに融合し得る。例えば、カニクイザルＦｃγＲＩＡの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、Ｈｉｓ２７１として融合したＧｌｙ／Ｈｉｓ６／ＧＳＴタグをコードするＤＮＡにより置換可能である。当業者には理解されるであろうが、ペプチドを認識するとともにペプチドに結合する結合パートナーは、任意の分子または化合物でよく、金属イオン（例えば金属アフィニティーカラム）、抗体もしくはこれらの断片、およびＦＬＡＧタグのようなペプチドに結合する任意のタンパク質もしくはペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、抗体の免疫グロブリンの定常ドメインに融合され、イムノアドヘシン分子も形成し得る。
【０１１３】
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形状にて提供され、好ましくは精製される。ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により、組換え細胞培養から回収・精製し得る。好ましい実施例において、精製には高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)が用いられる。
【０１１４】
ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子を有するベクター、および該ベクターにより形質転換される宿主細胞にも関する。本発明のポリヌクレオチド分子はいずれもベクターに結合可能であり、通常、ベクターは宿主内にて増殖すべく、選択可能なマーカーおよび複製開始点を含む。宿主細胞は遺伝子操作され、本発明のポリペプチドを発現する。ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子由来の調節配列のような、転写または翻訳の適切な調節配列に機能可能に連結した、上記または下記の任意のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。調節配列の例には、転写プロモーター、転写オペレーター、転写エンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写ならびに翻訳を制御する適切な配列が含まれる。調節配列が標的タンパク質をコードするＤＮＡに機能的に関連すると、ヌクレオチド配列は機能可能に連結する。従って、プロモーターのヌクレオチド配列がＦｃγＲ配列の転写を指示すれば、プロモーターのヌクレオチド配列は、カニクイザルもしくはチンパンジーのＦｃγＲのＤＮＡ配列、ＦｃＲｎα鎖のＤＮＡ配列、またはβ‐２ミクログロブリンのＤＮＡ配列に機能可能に連結する。
【０１１５】
本発明の非ヒト霊長類のレセプターの発現は、シグナル配列をコードする未変性核酸を除去し、または未変性核酸のシグナル配列を異種シグナル配列に置換することによっても可能である。異種シグナル配列は、ヒトＦｃレセプターポリペプチド、または組織プラスミノゲンアクチベーターのような他のポリペプチド由来のシグナル配列を含む。異種源由来のシグナル配列をコードする核酸は当業者には自明である。
【０１１６】
本発明の標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子のクローニングに用いるのに妥当なベクターを選択するには、ベクターが形質転換される宿主細胞、および、適用可能な場合、標的ポリペプチドが発現される宿主細胞により決定される。本発明のポリペプチドの発現に妥当な宿主細胞は、原核生物、酵母菌および高等真核生物の細胞を含み、該細胞の各々に関しては後述する。
【０１１７】
本発明のカニクイザルまたはチンパンジーの機能性ＦｃγＲポリペプチドを発現させるには、二つ以上のポリペプチド分子を同時に発現させるべく、宿主細胞の遺伝子操作が必要になる。前述したように、大部分のＦｃγＲｓは、ＩｇＧ結合およびシグナル変換ポリペプチド鎖の双方の発現を必要とする複合分子である。二つ以上のポリペプチド鎖複合体は機能性レセプターを形成する。上記のように、例えば、宿主細胞は、第一の選択マーカーを有しＦｃγＲＩα鎖を発現させる第一のベクター、および第二の選択マーカーを有しＦｃγＲＩγ鎖を発現させる第二のベクターにより同時形質移入されよう。両ベクターを得るとともに両ポリペプチドを発現させる宿主細胞のみが生き残り、機能性ＦｃγＲＩを発現させよう。標的宿主細胞にポリペプチド複鎖を同時形質移入する他の方法も想定され、これには同一ベクター由来の標的ポリペプチドの連鎖発現が含まれる。
【０１１８】
上記のような宿主細胞に発現される、カニクイザルまたはチンパンジーのＦｃγＲ、ＦｃＲｎまたはβ‐２ミクログロブリンのポリペプチドは、異種タンパク質由来の領域を含む融合タンパク質でもよい。該領域は、例えば、ポリペプチドの分泌、安定性向上または精製促進を可能にするように含まれよう。例えば、妥当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに組み込むことが可能である。シグナルペプチド（分泌リーダー）に対するＤＮＡ配列が標的配列にインフレームに融合され、標的タンパク質が該シグナルペプチドを有する融合タンパク質として翻訳されよう。シグナルペプチドに対するＤＮＡ配列はシグナルペプチドをコードする未変性核酸を置換し、またはこれに加えて未変性シグナルペプチド配列をコードする核酸配列を置換し得る。対象宿主細胞内にて機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。好ましくは、シグナル配列は細胞から分泌される際に標的ポリペプチドから切断される。本発明を実施するのに利用可能なシグナル配列の非限定的な例には、酵母菌のＩ因子、および昆虫細胞Ｓｆ９中のミツバチのメラチンリーダーが含まれる。
【０１１９】
本発明の標的ポリペプチドを発現させるのに妥当な宿主細胞は、原核生物、酵母菌および高等真核生物の細胞を含む。該ポリペプチドの発現に用いるのに妥当な原核生物宿主は、エシェリキア属、バシラス属ならびにサルモネラ属の細菌、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属ならびにスタフィロコッカス属のメンバーを含む。例えば大腸菌における発現には、標的ポリペプチドは原核生物宿主において組換えポリペプチドの発現を促進すべく、N末端のメチオニン残基を含むことがある。次に、N末端のMetが発現されたポリペプチドから任意に切断される。
【０１２０】
通常、原核生物の宿主において用いられる発現ベクターは、一つ以上の選択可能な表現型マーカー遺伝子を有する。通常、該遺伝子は、例えば抗菌剤耐性または栄養要求量を付与するタンパク質をコードする。この種のベクターは広範囲にわたり市販品から容易に入手可能である。この例として、pSPORTベクター、pGEMベクター(Promega社)、pPROEXベクター(LTI社、メリーランド州ベセズダ)、Bluescriptベクター(Stratagene社)およびpQEベクター(Qiagen社)が含まれる。
【０１２１】
カニクイザルまたはチンパンジーのＦｃγＲ、ＦｃＲｎまたはβ‐2ミクログロブリンは、サッカロマイセス属、ピキア属およびクリュイベロミセス属を含む酵母菌宿主細胞においても発現され得る。好ましい酵母菌宿主はサッカロマイセス・セレビシエおよびピキア・パストリスである。酵母菌のベクターは、2T酵母菌プラスミド由来の複製開始点、自己複製配列(ARS)、プロモーター領域、ポリアデニル化配列、転写終了配列、および選択可能なマーカー遺伝子を有する場合が多い。酵母菌および大腸菌の双方において複製可能なベクター(シャトルベクターと呼ぶ)を用いることも可能である。酵母菌のベクターの上記特徴に加え、シャトルベクターは大腸菌において複製・選択配列も含む。酵母菌宿主において発現される標的ポリペプチドを直接分泌させるには、カニクイザルのFcγRをコードするヌクレオチド配列の5’末端において酵母菌のI因子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含むことにより可能である。
【０１２２】
本発明のポリペプチドを発現させるには、昆虫の宿主細胞培養系を用いることも可能である。好ましい実施例において、本発明の標的ポリペプチドはバキュロウイルス発現系を用いて発現される。昆虫の細胞において異種タンパク質を発現させるバキュロウイルス系の利用に関する更なる情報については、LuckowおよびSummers  Bio/Technology第6巻47頁(1988年)により検討されている。
【０１２３】
別の好ましい実施例において、カニクイザルＦｃγＲポリペプチドは哺乳類宿主細胞において個々に発現される。妥当な哺乳類細胞株の非限定的な例には、サルの腎臓細胞ＣＯＳ−７(GluzmanらCell第23巻175頁(1981年))、チャイニーズハムスターの卵巣細胞(CHO)(PuckらProc. Natl. Acad. Sci. USA第60巻1275〜1281頁(1958年)、CV‐1およびヒト頚部癌細胞(HELA)(ATCC  CCL  2)が含まれる。好ましくは、本発明の標的タンパク質の発現にはHEK293細胞が用いられる。
【０１２４】
本発明の標的ポリペプチドを発現させるのに妥当な発現ベクターを選択するには、使用する個々の哺乳類宿主細胞により決定されるのは当然であり、通常の当業者の技術範囲内である。妥当な発現ベクターの例には、pｃＤＮＡ3.l/Hygro(Invitrogen社)、409およびpSVL(Pharmacia  Biotech社)が含まれる。カニクイザルFcγRポリペプチドを発現させるのに好ましいベクターは、pRKである。Eaton,D.L.,Wood, W.I.,Eaton,D.,  Hass,P.E., Hollingshead,P., Wion,K., Mather,J., Lawn,R.M., Vehar,G.A.およびGorman,C.  Biochemistry第25巻8343〜47頁(1986年)を参照。哺乳類宿主細胞において用いられる発現ベクターは、ウイルスゲノム由来の転写・翻訳制御配列を含み得る。本発明において用いられ得る、一般的に用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)、アデノウイルス2型、ポリオーマウイルスおよびシミアンウイルス40(SV40)を含むが、これに限定されるものではない。哺乳類発現ベクターの作製法は、例えばOkayamaおよびBerg(Mol.Cell.Biol.第3巻280頁(1983年))、Cosmanら(Mol.Immunol.第23巻935頁(1986年))、およびCosmanら(Nature第312巻768頁(1984年))により開示されている。
【０１２５】
Fc領域含有分子の生物特性、安全性および有効性の評価法
本発明の一態様は、霊長類においてインビボで評価する前に、カニクイザルまたはチンパンジーのＦｃレセプターと、ヒト化抗体のようなＦｃＲ結合分子の薬物動態／薬力を評価する方法を含む。本発明の該態様は、カニクイザルおよびチンパンジーのＦｃＲポリペプチドがヒトＦｃレセプターポリペプチドとの高度な配列同一性を有し、同様にしてＩｇＧサブクラスに結合するという知見に基づく。評価には、例えばＥＬＩＳＡ法型アッセイにて任意のサブクラスのヒト化抗体（特に治療に役立つ見込みのある抗体）を本発明の標的Ｆｃレセプターに接触させ、または過渡的に発現する細胞に曝す試験を含み得る。
【０１２６】
本発明の一方法は、Ｆｃ領域含有分子をカニクイザルまたはチンパンジーのＦｃレセプターポリペプチドに接触させることにより、カニクイザルまたはチンパンジーのＦｃレセプターポリペプチドに対するＦｃ領域含有ポリペプチドまたは薬剤の結合評価を伴う。カニクイザルまたはチンパンジーのＦｃレセプターポリペプチドは可溶性で良く、または過渡的に感染した細胞上に膜結合タンパク質として発現可能である。カニクイザルまたはチンパンジーのＦｃレセプターポリペプチドに対するＦｃ領域含有分子の結合能は、霊長類においてインビボに評価する上でＦｃ領域含有分子またはポリペプチドが妥当であることを示す。カニクイザルＦｃＲｎ分子に対する結合能は、Ｆｃ領域含有分子またはポリペプチドがインビボで半減期が延びることを示す。
【０１２７】
本発明は、生物特性、安全性および薬物動態の点から、抗体変異体のようなＦｃ領域含有分子変異体のスクリーニングも提供する。通常、抗体変異体は一つ以上の残基において改変されており、次に該変異体はＦｃレセプターに対する結合親和性の変化を含む生物活性上の変化につき解析される。変異体による生物活性変化のスクリーニングは、インビボおよびインビトロの双方にて試験可能である。例えば、本発明のレセプターポリペプチドは、ＥＬＩＳＡ法型アッセイまたは過渡的感染細胞において用い得る。ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩまたはＦｃＲｎまたはＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢのα鎖のような、カニクイザル及び／又はチンパンジーのＦｃＲポリペプチドに結合する抗体変異体は、治療薬として霊長類におけるインビボ評価に妥当な変異体である。
【０１２８】
異なるＦｃ領域含有分子間における直接結合および結合親和性の判定は、好ましくはカニクイザルＦｃγＲポリペプチドの可溶性細胞外ドメインに対して為される。例えば、標的ＦｃγＲの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ６タグまたはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするＤＮＡに置換され得る（例３を参照）。Ｇｌｙ−Ｈｉｓ６タグまたはＧＳＴは、レセプターのＦｃ結合領域を固定化する簡便な方法を提供し、レセプターと標的抗体変異体との結合親和性の同定及び／又は判定に有用である。利用可能なアッセイは、ＥＬＩＳＡ法型アッセイ、共沈殿型アッセイ、およびカラムクロマトグラフィー型アッセイを含む。同定されたＦｃ領域含有分子はカニクイザルの可溶性ＦｃγＲと直接相互作用し、対応するヒトＦｃγＲに比し、カニクイザルＦｃγＲに対して同等以上の結合親和性を有する。
【０１２９】
本発明の別の態様は、ＩＴＡＭ及び／又はＩＴＩＭ領域を有するカニクイザルＦｃγＲに対する結合能が変化した薬剤を同定する方法を提供する。本発明の一方法は、ＩＴＡＭ領域を有するＦｃＲに対し結合親和性が向上し、ＩＴＩＭ領域を有するＦｃＲに対し親和性が低下した薬剤の同定を伴う。
【０１３０】
標的薬剤は、Ｆｃ領域を有する分子、好ましくは抗体、より好ましくはＩｇＧ抗体を含む。標的薬剤が抗体であれば、抗体の未変性配列に比し、改変されたアミノ酸配列を有する変異抗体となり得る。好ましくは、変異抗体は、Ｆｃγレセプターに対する結合能に関連する抗体の領域にアミノ酸置換が生じており、該置換にはヒトＩｇＧのアミノ酸２２６〜４３６番に対応するアミノ酸が含まれる。前述したような部位特異性オリゴヌクレオチドまたはＰＣＲ媒介法のような標準方法により、変異抗体は調製可能である。変異抗体の例には、ShieldsらJ.Biol.Chem.第276巻6591頁(2001年)に記載のように調製される、ヒトIgG1のアラニン変異体、抗IgE  E27が含まれる。
【０１３１】
抗体及び／又は変異抗体の結合親和性は、ShieldsらJ.Biol.Chem.第276巻6591頁(2001年)、および後述する例３〜７に記載のような標準方法により判定される。好ましくは、結合親和性は、解析される型のＦｃγレセプターを発現させる細胞に対する結合能により判定される。しかし、抗体またはＦｃ領域含有分子の結合親和性は、可溶性Ｆｃγレセプターまたは宿主細胞に発現されるとともに宿主細胞から分泌されるＦｃγレセプターを用いて判定される。
【０１３２】
ヒトＦｃγＲＩＩＡに比し、カニクイザルＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が向上した変異抗体は、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸２９８番に対応する位置にてアミノ酸配列が改変されている抗体である。この種の一変異体はセリンからアラニンまでの位置に改変が生じ、Ｓ２９８Ａと表される。該位置に改変が生じている別の変異抗体はＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４と表され、未変性配列のＩｇＧ１のアミノ酸２９８，３３３および３３４番に対応する位置にてアラニンを有する変異抗体である。この種の変異抗体はヒトＦｃγＲＩＩＡに比し、カニクイザルＦｃγＲＩＩＡに対する結合親和性が向上している。
【０１３３】
本発明の別の方法において、ヒトＦｃγＲＩＩＢに比し、カニクイザルＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性が変化した標的薬剤が同定される。好ましくは、該薬剤は未変性配列抗体の変異体である。結合親和性は上記および後述の例に示すように判定される。ＦｃγＲＩＩＢに対する結合能が向上した薬剤は、ＩＴＩＭ抑制機能を選択的に刺激する。カニクイザルＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が低下した薬剤は、抑制機能の刺激作用が低下し得る。
【０１３４】
ヒトＦｃγＲＩＩＢに比し、カニクイザルＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性が低下した変異抗体は、Ｒ２５５Ａ，Ｅ２５８Ａ，Ｓ３７Ａ，Ｄ２８０ＡおよびＲ３０１Ｍである。
【０１３５】
本発明の別の実施例は、ＩＴＡＭを有するＦｃγレセプターを活性化し得るがＩＴＩＭ領域を有するＦｃγレセプターには結合しない薬剤を同定すべく、変異抗体Ｓ２９８ＡまたはＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４の使用を伴う。
【０１３６】
Ｓ２９８ＡおよびＳ２９２Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４変異抗体は、カニクイザルＦｃγＲＩＩＡに対する結合親和性が向上し、カニクイザルＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性が低下する。この種の方法はインビボまたはインビトロで実施可能である。
【０１３７】
この種の方法は、ＩＴＡＭ領域を有するＦｃＲポリペプチド、好ましくはヒトおよびカニクイザルのＦｃγＲに対する抗体の結合能を向上させ、及び／又はＩＴＩＭ領域を有するＦｃγＲに対する結合親和性を低下させるべく、改変可能な未変性配列抗体のアミノ酸位置を同定するのに有用である。同定位置におけるアミノ酸配列の改変は、標準方法により調製可能である。
【０１３８】
以上、本発明の概要を記載したが、例として提供したのであって限定的ではない次の例を参照することにより、前記内容がより容易に理解されよう。
【実施例】
【０１３９】
実施例1：  カニクイザル・チンパンジーのFcレセプターＤＮＡおよびβ‐2ミクログロブリンの分子クローニング
材料および方法:
カニクイザルFcγRのクローニング
カニクイザルＤＮＡはヒトＤＮＡに対し約90%の相同性を有するため、対応するヒトレセプターの配列に基づき、各FcγRに対する一連のＰＣＲプライマーが設計された。各センスプライマーはコード化領域の5’直近部位、またはコード化領域の開始点にて開始する。アンチセンスプライマーも同様に、即ちC末端の停止コドンの3’直近、またはC末端の停止コドンにて開始するように設計された。プライマーは、ＰＣＲ産物をpRKベクターにサブクローニングするのに用いられるエンドヌクレアーゼ制限部位を組み込んだ(Eatonら)。このプライマーの配列は、表１に示されている。
【０１４０】
2005512574.tif 000002
2005512574.tif 000003
2005512574.tif 000004
【０１４１】
表1に示すようなプライマーを用い、オリゴ(dT)の初回刺激を受けたＲＮＡの逆転写酵素ＰＣＲ法(GeneAmp, PerkinElmer  Life  Sciences社)により、カニクイザルの脾臓細胞からFcRに対するｃＤＮＡを単離した。EatonらBiochemistry第25巻8343〜8347頁(1986年)に記載のように、ｃＤＮＡは前述のpRK哺乳類細胞の発現ベクターにサブクローニングした。製造者の指示に従い、カニクイザルの脾臓由来のｃＤＮＡベクターライブラリ200ng、およびExTaq  Premix(Panvera社、ウィスコンシン州マジソン)を用い、ＰＣＲ反応を設定した。90℃で30秒間変性させた後、55℃で1分間のアニーリングにて25サイクルを行い、72℃で3分間伸長させ、98℃で30秒間変性させた。予想サイズ(FcγRI,FcγRIIIA,FcRn：1100塩基対、FcγRIIA,FcγRIIB：1000塩基対、Fcγ鎖：300塩基対、β-2ミクログロブリン：400塩基対)にて移動するＤＮＡバンドを単離し、pRKベクターにクローニングし、次に大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ(Stratagene社、カリフォルニア州サンディエゴ)に形質転換した。個々のクローンを選別し、Qiagen  mini-prep  ＤＮＡキット(Qiagen社、カタログNo.27106)を用い、各クローンの二重鎖ＤＮＡを精製した。Big-Dye  Terminator  Cycleシークエンシングキット(Applied  Biosystems社、カリフォルニア州フォスター  シティー)を用い、Applied  Biosystems377型シークエンサーにＤＮＡシークエンシングを行った。
【０１４２】
FcγRIIAに対する初回のＰＣＲ反応ではＰＣＲ産物を示さなかった。カニクイザルにFcγRIIAが存在するか否かを判定すべく、ヒトFcγRIIA、ヒトFcγRIIBおよびカニクイザルFcγRIIBの間に保存された領域にセンスプライマーを設計した(OF1、表2)。ヒトFcγRIIAのITAMをコードする領域の共通配列に基づき、アンチセンスプライマーを設計した(OR1、表2)。上記二つのＰＣＲプライマー(OF1, OR1)および上記のＰＣＲプロトコルを用い、約700塩基対のＰＣＲ産物を得た。上記のようにＰＣＲバンドを単離し、pRKベクターにサブクローニングし、個々のクローンを単離し、シークエンスした。配列解析により、断片はヒトFcγRIIAに対し90%の同一性を有することが示された。
【０１４３】
レセプターの5’末端におけるＤＮＡ配列を決定すべく、入れ子ＰＣＲ（nestedＰＣＲ）反応を用いた。入れ子ＰＣＲ反応の第一段階として、センスＰＣＲプライマー(OF2、表2)をベクタークローニング部位のpRKベクター5’に固着するように設計した。該プライマーをリバースプライマーOR1と共に用いた。上記のようなｃＤＮＡライブラリにＰＣＲ反応を実施し、産物を1:500にて希釈し、入れ子ＰＣＲ反応の第ニ段階用テンプレートとして1μL用いた。プライマーOF2がｃＤＮＡライブラリの全てのメンバーに固着すると考えられる事実により（全てのメンバーが別のpRKベクターにクローニングされている）、僅か少量のＰＣＲ断片が得られ、従ってこれを第二段階の増幅用テンプレートとして用いた。第ニ段階用のセンスプライマー(OF3、表2)をOF2のpRKベクター配列3’に固着するように設計し、リバースプライマー(OR2、表2)は上記のように決定したFcγRIIAの部分配列に基づいた。入れ子ＰＣＲ反応の第ニ段階は約600塩基対のバンドを示した。上記のように該バンドを単離し、個々のクローンを調製しシークエンスした。
【０１４４】
レセプターの3’末端におけるＤＮＡ配列を同様に決定した。FcγRIIA断片の配列から設計したフォワードプライマーOF4、およびFcγRIIA端部からpRKベクター3’に固着するように設計したリバースプライマーOR3を用い、ｃＤＮＡライブラリに初回のＰＣＲ反応を実施した。結果的に生じた断片は入れ子ＰＣＲ反応の第二段階用テンプレートとして用いた。第二段階では、FcγRIIA断片の配列から設計したフォワードプライマーOF5、およびプライマーOR3からpRKベクター5’に固着するように設計したリバースプライマーOR4を用いた。入れ子ＰＣＲ反応の第二段階は約800塩基対のバンドを示した。上記のように該バンドを単離し、個々のクローンをシークエンスした。入れ子ＰＣＲ反応から得た情報に基づき、FcγRIIA全長に対するＰＣＲプライマーを設計した。他の全てのレセプターにつき記載した方法により、FcγRIIA全長をクローニングした。表2に上記プライマーの配列を示す。
【０１４５】
2005512574.tif 000005
【０１４６】
実施例2：カニクイザル、チンパンジーおよびヒトのFcγRのヌクレオチド・アミノ酸配列のアラインメント
ヒト、カニクイザルおよびチンパンジー由来FcRポリペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を並べ、配列同一性率を算出した。
【０１４７】
霊長類およびヒトのタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を手作業にて並べ、ヌクレオチドまたはタンパク質配列における相違に留意した。同一性率は[同一残基数]／[総残基数]として計算した。配列が総残基数で異なる場合には、総残基に対し二つの異なる番号を用い、同一性率に対し2値を付与する。ヌクレオチド配列はシグナル配列のコード化配列から開始する。
【０１４８】
ヒト(配列番号:2)およびカニクイザル(配列番号:1)のFcγRIα鎖の核酸配列を後述の表3に示す。ドットはヌクレオチド配列の相違位置を示す。配列同一性率の解析により、FcγRIα鎖をコードするヒトとカニクイザルのヌクレオチド配列は、3’伸展のヌクレオチドが算出に含まれるか否かにより、約91%または96%の配列同一性を有することが示される。
【０１４９】
2005512574.tif 000006
2005512574.tif 000007
2005512574.tif 000008
【０１５０】
表3に示すヒトＤＮＡ配列はGenBank登録番号L03418を有する。Porges,A.J.,Redecha,P.B.,Doebele,R.,Pan,L.C.,Salmon,J.E.およびKimberly,R.P.,Novel  Fc  gamma  receptor  I  family  gene  products  in  human  mononuclear  cells,J.Clin.Invest.第90巻2102〜2109頁(1992年)を参照。
【０１５１】
ヒト(配列番号:14)およびカニクイザル(配列番号:13)のガンマ鎖をコードする核酸配列のアラインメントを表4に示す。
【０１５２】
配列同一性率の解析により、ヒトとカニクイザルのＦｃγＲＩ／ＩＩＩガンマ鎖をコードする核酸配列は、約９９%の同一性を有することが示される。
【０１５３】
2005512574.tif 000009
2005512574.tif 000010
【０１５４】
ヒトガンマ鎖のＤＮＡ配列はGenBank登録番号M33195  J05285として表される。Kuester,H.,Thompson,H.およびKinet,J.-P.,Characterization  and  expression  of  the  gene  for  the  human  receptor  gamma  subunit:Definition  of  a  new  gene  family,J.Biol.Chem.第265巻6448〜6452頁(1990年)を参照。
【０１５５】
FcγRIIAをコードするヒト（配列番号：4）、チンパンジー（配列番号：22）およびカニクイザル（配列番号：3）の核酸配列のアラインメントを表５に示す。％配列同一性の分析により、FcγRIIAをコードするヒトの配列およびカニクイザルの配列が約９４％の配列同一性を有していることが示された。FcγRIIAをコードするチンパンジーの配列とヒトの配列を比較したところ、約９９％の配列同一性を有していた。
【０１５６】
2005512574.tif 000011
2005512574.tif 000012
2005512574.tif 000013
2005512574.tif 000014
【０１５７】
ヒトFcγRIIAレセプターの配列はGenBank登録番号M28697を有する。Seki,T.,Identification  of  multiple  isoforms  of  the  low-affinity  human  IgG  Fc  receptor,Immunogenetics第30巻5〜12頁(1989年)を参照。
【０１５８】
ヒト(配列番号:6)およびカニクイザル(配列番号:5)のFcγRIIBをコードする核酸配列のアラインメントを表6に示す。
【０１５９】
配列同一性率の解析により、FcγRIIBをコードするヒトとカニクイザルの配列は、約94%の同一性を有することが示される。
【０１６０】
2005512574.tif 000015
2005512574.tif 000016
2005512574.tif 000017
【０１６１】
FcγRIIBのヒト配列はGenBank登録番号X52473を有する。Engelhardt,W.,Geerds,C.およびFrey,J.,Distribution,inducibility  and  biological  function  of  the  cloned  and  expressed  human  beta  Fc  receptorII,Eur.J.Immunol.第20巻第6号1367〜1377頁(1990年)を参照。
【０１６２】
ヒト(配列番号:8)およびカニクイザル(配列番号:7)のFcγRIIIAをコードする核酸配列のアラインメントを表7に示す。
【０１６３】
配列同一性率の解析により、FcγRIIIAをコードするヒトとカニクイザルの核酸配列は、約96%の同一性を有することが示される。
【０１６４】
2005512574.tif 000018
2005512574.tif 000019
2005512574.tif 000020
【０１６５】
ＦｃγＩＩＩのヒト配列はGenBank登録番号X52645  M31937を有する。Ravetch,J.V.およびPerussia,B.,Alternative  membrane  forms  of  Fc  gamma  RIII(CD16)  on  human  natural  killer  cells  and  neutrophils.Cell  type-specific  expression  of  two  genes  that  differ  in  single  nucleotide  substitutions,J.Exp.Med.第170巻第2号481〜497頁(1989年)を参照。
【０１６６】
ヒト(配列番号:24)およびカニクイザル(配列番号:23)のβ‐2ミクログロブリンをコードする核酸配列のアラインメントを表8に示す。
【０１６７】
配列同一性率の解析により、β‐2ミクログロブリンをコードするヒトとカニクイザルの核酸配列は、約95%の同一性を有することが示される。
【０１６８】
2005512574.tif 000021
2005512574.tif 000022
【０１６９】
ヒトβ‐2ミクログロブリンのＤＮＡ配列はGenBank登録番号ABO21288を有する。Matsumoto,K.,Minamitani,T.,Human  mＲＮＡ  for  beta2‐microglobulin,DDBJ/EMBL/GenBank  databases(1998年)を参照。
【０１７０】
ヒト(配列番号:28)およびカニクイザル(配列番号:27)のFcRnα鎖をコードする核酸配列のアラインメントを表9に示す。
【０１７１】
配列同一性率の解析により、FcRnα鎖をコードするヒトとカニクイザルの核酸配列は、約97%の同一性を有することが示される。
【０１７２】
2005512574.tif 000023
2005512574.tif 000024
2005512574.tif 000025
【０１７３】
ヒトFcRnα鎖のＤＮＡ配列はGenBank登録番号U12255を有する。Story,C.M.,Mikulska,J.およびSimister,N.E.,A  major  histocompatibility  complex  classI-like  Fc  receptor  cloned  from  human  placenta:Possible  role  in  transfer  of  immunoglobulin  G  from  mother  to  fetus,J.Exp.Med.第180巻2377〜2381頁(1994年)を参照。
【０１７４】
ヒト(配列番号:10)およびカニクイザル(配列番号:9)のFcγRIα鎖の核酸配列のアラインメントを表10に示す。前述したように、FcγRIのα鎖は、シグナルペプチド、3細胞外C-2  Ig様ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む種々のドメインを有する。Δ記号を付したアミノ酸の下部に示すアミノ酸番号は、シグナル配列を含まない成熟ポリペプチドの開始点から番号付けられている。ヒト配列との配置に基づき、カニクイザルの成熟FcγRIはアミノ酸残基Δ1〜Δ336の配列を有する(配列番号:65)。カニクイザルFcγRIの配列のn末端配列は、以下に示す配列と異なる可能性がある。カニクイザルFcγRIの配列をコードする核酸配列を発現させ、n末端配列を同定するのは当業者の範囲内であろう。例1のプライマーを用いて得られるカニクイザルFcγRIの細胞外断片は、Δ1〜Δ269のアミノ酸配列を有する。アミノ酸残基上部のいずれの番号も、シグナル配列から開始する残基の番号付けを表す。
【０１７５】
配列同一性率の解析により、ヒトとカニクイザルのFcγRIのアミノ酸配列は、3’伸展を考慮に入れた場合に約90%、3’伸展を含まない場合に約94%の同一性を有することが示される。
【０１７６】
2005512574.tif 000026
2005512574.tif 000027
【０１７７】
ヒトFcγRIのアミノ酸配列は登録番号P12314, P12315, EMBL, X14356, CAA32537.1.EMBL, X14355, CAA32536.1.PIR, S03018.PIR, S03019.PIR, A41357.PIR, B41357.HSSP, P12319, 1ALT.MIM, 146760,-.InterPro,IPR003006,-.Pfam,PF00047を有する。Allen  J.M.,Seed  B.,Nucleic  Acids  Res.第16巻11824〜11824頁(1988年)Nucleotide  sequence  of  three  ｃＤＮＡs  for  the  human  high  affinity  Fc  receptor(FcRI),Allen  J.M.,Seed  B.,Science第243巻378〜381頁(1989年)Isolation  and  expression  of  functional  high-affinity  Fc  receptor  complementary  ＤＮＡsを参照。
【０１７８】
ヒト、カニクイザルおよびチンパンジーのFcγRIIA(カニクイザル／配列番号:15、ヒト／配列番号:16、チンパンジー／配列番号:17)、FcγRIIB(カニクイザル／配列番号:18、ヒト／配列番号:19)、およびFcγRIIIA(カニクイザル／配列番号:20、ヒト／配列番号:21)の配列のアミノ酸配列のアラインメントを表11に示す。
【０１７９】
配列を前記のようにドメイン、即ちシグナルペプチド、3細胞外C-2様ドメインおよび膜貫通細胞内ドメインに分割する。表11において、Δ記号を付したアミノ酸の下部に示すアミノ酸番号は、シグナル配列を含まない成熟ヒトポリペプチドの開始点から番号付けられている。カニクイザルおよびチンパンジーのFcγRIIA、カニクイザルFcγRIIBおよびカニクイザルFcγRIIIAの成熟ポリペプチドは、表11においてアステリスクにて同定されるアミノ酸から開始し、これを表21,22および23に別々に示し、以下のようになる。
1．カニクイザルFcγRIIAアミノ酸Δ1〜Δ282(配列番号:66)、N末端配列TAPPKA(表21)
2.チンパンジーFcγRIIAアミノ酸Δ1〜Δ249(配列番号:67)(ヒト配列との配置に基づく)
3.カニクイザルFcγRIIBアミノ酸Δ1〜Δ252(配列番号:68)、N末端配列TPAAPP(表22)
4.カニクイザルFcγRIIIAアミノ酸Δ1〜Δ234(配列番号:69)、N末端配列EDLPKA(表23)
表11において、アミノ酸残基上部の番号はいずれもシグナル配列から開始する残基の番号付けを表す。表中のアステリスクは、カニクイザルのFcγRIIA,FcγRIIBおよびFcγRIIIAを示す。
【０１８０】
Fcレセプターポリペプチドの細胞外断片は、例1に記載したプライマーを用いて得た。例1のプライマーを用いて得られるFcγRIIAの細胞外断片は、表21に示すようにΔ1〜Δ182のアミノ酸配列を有する。例1のプライマーを用いて得られるFcγRIIBの細胞外断片は、表22に示すようにΔ1〜Δ184のアミノ酸配列を有する。例1のプライマーを用いて得られるFcγRIIIAの細胞外断片は、表23に示すようにΔ1〜Δ187のアミノ酸配列を有する。
【０１８１】
配列同一性率の解析により次のことが示される。
1.チンパンジーとヒトのFcγRIIAのアミノ酸配列は約97%同一である。
2.カニクイザルとヒトのFcγRIIAのアミノ酸配列は、配置にMAMETQ(シグナルペプチドの予想部分)を伴うと約87%同一であり、MAMETQを伴わなければ約89%同一である。
3.カニクイザルとチンパンジーのFcγRIIAのアミノ酸配列は、配置にMAMETQを含むと約87%同一であり、配置にMAMETQを伴わなければ約89%同一である。
4.カニクイザルとヒトのFcγRIIBのアミノ酸配列は約92%同一である。
5.カニクイザルとヒトのFcγRIIIAのアミノ酸配列は約91%同一である。
【０１８２】
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2005512574.tif 000029
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【０１８３】
ヒトのFcγRIIAのアミノ酸配列は次の登録番号を有する。P12318,EMBL,M31932,AAA35827.1.EMBL,Y00644,CAA68672.1.EMBL,J03619,AAA35932.1.EMBL,A21604,CAA01563.1.PIR,A31932.PIR,JL0118.PIR,S02297.PIR,S00477.PIR,S06946.HSSP,P12319,1ALT.MIM,146790,-.InterPro,IPR003006,-.Pfam,PF00047。Brooks  D.G.,Qiu  W.Q.,Luster  A.D.,Ravetch  J.V.,J.Exp.Med.第170巻1369〜1385頁(1989年),Structure  and  expression  of  human  IgG  FcRII(CD32).Functional  heterogeneity  is  encoded  by  the  alternatively  spliced  products  of  multiple  genes,Stuart  S.G.,Trounstine  M.L.,Vaux  D.J.T.,Koch  T.,Martens  C.L.,Moore  K.W.,J.Exp.Med.第166巻1668〜1684頁(1987年),Isolation  and  expression  of  ｃＤＮＡ  clones  encoding  a  human  receptor  forIgG(Fc  gamma  RII)、Hibbs  M.L.,Bonadonna  L.,Scott  B.M.,Mckenzie  I.F.C.,Hogarth  P.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.第85巻2240〜2244頁(1988年),Molecular  cloning  of  a  human  immunoglobulin  G  Fc  receptor、Stengelin  S.,Stamenkovic  I.,Seed  B.,EMBO  J.第7巻1053〜1059頁(1988年),Isolation  of  ｃＤＮＡs  for  two  distinct  human  Fc  receptors  by  ligand  affinity  cloning,Salmon  J.E.,Millard  S.,Schachter  L.A.,Arnett  F.C.,Ginzler  E.M.,Gourley  M.F.,Ramsey-Goldman  R.,Peterson  M.G.E.,Kimberly  R.P.,J.Clin.Invest.第97巻1348〜1354頁(1996年),Fc  gamma  RIIA  alleles  are  heritable  risk  factors  for  lupus  nephritis  in  African  Americans.を参照。
【０１８４】
ヒトのFcγRIIBの配列は登録番号X52473を有する。Engelhardt,W.,Geerds,C.およびFrey,J.,Distribution,inducibility  and  biological  function  of  the  cloned  and  expressed  human  beta  Fc  receptor  II,Eur.J.Immunol.第20巻第6号1367〜1377頁(1990年)を参照。
【０１８５】
ヒトのFcγRIIIAの配列は登録番号P08637,EMBL;X52645,CAA36870.1.EMBL,Z46222,CAA86295.1.PIR,JL0107.MIM,146740,-.InterPro,IPR003006,-.Pfam,PF00047を有する。Ravetch  J.V.,Perussia  B.,J.Exp.Med.第170巻481〜497頁(1989年),Alternative  membrane  forms  of  Fc  gamma  RIII(CD16)  on  human  natural  killer  cells  and  neutrophils.Cell  type-specific  expression  of  two  genes  that  differ  in  single  nucleotide  substitutions,Gessner  J.E.,Grussemneyer  T.,Kolanus W.,Schmidt  R.E.,J.Biol.Chem.第270巻1350〜1361頁(1995年),The  human  low  affinity  immunoglobulin  G  Fc  receptor  III-A  and III-B  genes:Molecular  characterization  of  the  promoter  regions,de  Haas  M.,Koene  H.R.,Kleijer  M.,de  Vries  E.,Simsek  S.,van  Tol  M.J.D.,Roos  D.,von  dem  Borne  A.E.G.K.,J. Immunol.第156巻3948〜3955頁(1996年),A  triallelic  Fc  gamma  receptor  type  IIIA  polymorphism  influences  the  binding  of  human  IgG  by  NK  cell  Fc  gamma  RIIIa,Koene  H.R.,Kleijer  M.,Algra  J.,Roos  D.,von  dem  Borne  A.E.G.K.,de  Haas  M.,Blood第90巻1109〜1114頁(1997年),Fc  gamma  RIIIa-158V/F  polymorphism  influences  the  binding  of  IgG  by  natural  killer  cell  Fc  gammaRIIIa,independently  of  the  Fc  gammaRIIIa-48L/R/H  phenotype,Wu  J.,Edberg  J.C.,Redecha  P.B.,Bansal  V.,Guyre  P.M.,Coleman  K.,Salmon  J.E.,Kimberly R.P.,J.Clin.Invest.第100巻1059〜1070頁(1997年),A  novel  polymorphism  of  FcgammaRIIIa(CD16)alters  receptor  function  and  predisposes  to  autoimmune  disease.を参照。
【０１８６】
2005512574.tif 000031
【０１８７】
2005512574.tif 000032
【０１８８】
2005512574.tif 000033
【０１８９】
ヒト(配列番号:12)およびカニクイザル(配列番号:11)のFcγRI/IIIのガンマ鎖をコードする核酸配列のアラインメントを表12に示す。
【０１９０】
配列同一性率の解析により、ヒトとカニクイザルのFcγRI/IIIガンマ鎖をコードする核酸配列は、約99%の同一性を有することが示される。
【０１９１】
2005512574.tif 000034
【０１９２】
ヒトのガンマ鎖のアミノ酸配列は登録番号P30273, EMBL, M33195, AAA35828.1.EMBL, M33196,-.PIR, A35241.MIM, 147139,-.を有する。Kuester  H.,Thompson  H.,Kinet  J.-P.,J.Biol.Chem.第265巻6448〜6452頁(1990年),Characterization  and  expression  of  the  gene  for  the  human  Fc  receptor  gamma  subunit.Definition  of  a  new  gene  family.を参照。
【０１９３】
ヒト(配列番号:26)およびカニクイザル(配列番号:25)のβ‐2ミクログロブリンのアミノ酸配列のアラインメントを表13に示す。成熟β‐2ミクログロブリンはアミノ酸Δ1〜Δ99(配列番号:70)のアミノ酸配列を有する。
【０１９４】
配列同一性率の解析により、ヒトとカニクイザルのβ‐2ミクログロブリンのアミノ酸配列は削除や挿入がなく、約92%の同一性を有することが示される。
【０１９５】
2005512574.tif 000035
【０１９６】
ヒトβ‐2ミクログロブリンのアミノ酸配列は登録番号P01884, EMBL, M17987, AAA5181l.l.EMBL, M17986, AAA51811.1.EMBL, AB021288, BAA35182.1.EMBL, AF072097, AAD48083.1.EMBL, V00567, CAA23830.1.EMBL, M30683, AAA87972.1.EMBL, M30684, AAA88008.1.PIR, A02179.PIR, A28579.PDB, 1HLA.を有する。Guessow  D.,Rein  R.,Ginjaar  I.,Hochstenbach  F.,Seemann  G.,Kottman  A.,Ploegh  H.L.,The  human  beta2-microglobulin  gene.Primary  structure  and  definition  of  the  transcriptional  unit,J.Immunol.第139巻3132〜3138頁(1987年)、Matsumoto  K.,Minamitani  T.,Human  mＲＮＡ  for  beta  2-microglobulin,Medline:Embl/genbank/ddbj  database(1998年)、Zhao  Z.,Huang  X.,Li  N.,Zhu  X.,Cao  X.,A  novel  gene  from  human  dendritic  cell,Embl/genbank/ddbj  databases(1998年)、Rosa  F.,Berissi  H.,Weissenbach  J.,Maroteaux  L.,Fellous  M.,Revel  M.,The  beta-2-microglobulin  mＲＮＡ  in  human  Daudi  cells  has  a  mutated  initiation  codon  but  is  still  inducible  by  interferon,EMBO  J.第2巻239〜243頁(1983年)、Suggs  S.V.,Wallace  R.B.,Hirose  T.,Kawashima  E.H.,Itakura  K.,Use  of  synthetic  oligonucleotides  as  hybridization  probes:isolation  of  cloned  ｃＤＮＡ  sequences  for  human  beta2-microglobulin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA第78巻6613〜6617頁(1981年)、Cunningham  B.A.,Wang  J.L.,Berggard  I.,Peterson  P.A.,The  complete  amino  acid  sequence  of  beta2-microglobulin,Biochem.第12巻4811〜4822頁(1973年)、Lawlor  D.A.,Warren  E.,Ward  F.E.,Parham  P.,Comparison  of  classI  MHC  alleles  in  human  and  apes,Immunol.Rev.第113巻147〜185頁(1990年)、Bjorkman  P.J.,Saper  M.A.,Samraoui  B.,Bennett  W.S.,Strominger  J.L.,Wiley  D.C.,Structure  of  the  human  class  I  histocompatibility  antigen,HLA-A2,Nature第329巻506〜512頁(1987年)、Saper  M.A.,Bjorkman  P.J.,Wiley  D.C.,Refined  structure  of  the  human  histocompatibility  antigen  HLA-A2  at  2.6  A  resolution,J.Mol.Biol.第219巻277〜319頁(1991年)、Collins  E.J.,Garboczi  D.N.,Karpusas  M.N.,Wiley  D.C.,The  three-dimentional  structure  of  a  class  I  major  histocompatibility  complex  molecule  missing  the  alpha  3  domain  of  the  heavy  chain,Proc.Natl.Acad.Sci  USA第92巻1218〜1221頁(1995年)を参照。
【０１９７】
ヒト(配列番号:30)およびカニクイザル(配列番号:29)のFcRnα鎖の核酸配列のアラインメントを表14に示す。カニクイザルFcRnの2対立遺伝子を同定した。一つの配列は配列番号:29であり、成熟ポリペプチドの位置3(S3)にセリンを有する。別の配列は配列番号:64であり、成熟ポリペプチドの位置3(N3)にアスパラギンを有する。FcRnS3α鎖の成熟ポリペプチドはΔ1〜Δ342のアミノ酸配列を有する(配列番号:71)。FcRnN3α鎖の成熟ポリペプチドはΔ1〜Δ342の配列を有する(配列番号:72)。例1の方法により調製したFcRnの細胞外断片はΔ1〜Δ274のアミノ酸配列を有する。
【０１９８】
配列同一性率の解析により、ヒトとカニクイザルのFcRnアミノ酸配列は、削除や挿入がなく、約97%の同一性を有することが示される。
【０１９９】
2005512574.tif 000036
2005512574.tif 000037
【０２００】
ヒトのFcRnアミノ酸配列は登録番号U12255を有する。Story  C.M.,Mikulska  J.,Simister  N.E.,A  major  histocompatibility  complex  classI-like  Fc  receptor  cloned  from  human  placenta:Possible  role  in  transfer  of  immunoglobulin  G  from  mother  to  fetus,J.Exp.Med.第180巻2377〜2381頁(1994年)を参照。
【０２０１】
実施例3：カニクイザルFcγRIとヒトFcγRIはヒトIgGサブクラスに同レベルで結合する
材料および方法
ヒトの脾臓ｃＤＮＡライブラリ由来の妥当な重鎖Fc  ｃＤＮＡを、E27重鎖可変ドメインを有するpRKベクターにサブクローニングすることにより、E27(IgG1)のヒトIgG2,IgG3およびIgG4イソフォームを作製した。Shields,R.L., Namenuk,A.K., Hong, K., Meng, Y.G., Rae, J., Briggs, J., Xie, D., Lai, J., Stadlen, A., Li, B., Fox, J.A.およびPresta,L.G. J.Biol.Chem.第276巻6591〜6604頁(2001年)、または米国特許第6,194,551号に記載のものと同一のE27κ軽鎖を用い、全てのIgGサブクラスおよび変異体が発現された。
【０２０２】
重鎖と軽鎖のプラスミドを293細胞に同時形質移入した後、タンパク質AクロマトグラフィーによりIgG1, IgG2, IgG4および変異体を精製した。IgG3はタンパク質Gクロマトグラフィーにより精製した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ELISA法および分光法を組み合わせて用い、全てのタンパク質製剤を分析した。
【０２０３】
α鎖細胞外ドメインをコードする断片を生成するプライマーを用い、U937細胞由来のオリゴ(dt)の初回刺激を受けたＲＮＡの逆転写酵素ＰＣＲ法(GeneAmp, PerkinElmer  Life  Sciences社)により、ヒトFcγRIに対するｃＤＮＡを単離した。Shields,R.L., Namenuk,A.K., Hong,K., Meng,Y.G., Rae,J., Briggs,J., Xie,D., Lai,J., Stadlen,A., Li,B., Fox,J.A.およびPresta,L.G.  J. Biol. Chem.第276巻6591〜6604頁(2001年)、または米国特許第6,194,551に記載のように、Gly/6-His/GST融合に結合したヒトFcγR細胞外ドメインを調製した。EatonらBiochemistry第25巻8343〜8347頁(1986年)に記載のように、ｃＤＮＡを前記のpRK哺乳類細胞発現ベクターにサブクローニングした。カニクイザルFcγRIに対するｃＤＮＡは例1に記載のように単離した。
【０２０４】
発現されたヒトおよびカニクイザルのFcγRIの精製を促進すべく、各々の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを、Gly-His6タグおよびヒトグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)をコードするＤＮＡに置換した。GST配列はＰＣＲ法により、5’末端、3’末端にそれぞれNheI制限部位、XbaI制限部位を有するpGEX-4T2プラスミド(Amersham  Pharmacia  Biotech社)から得た。発現されたFcγRIは、His271においてGly/His6/GSTに融合したα鎖の細胞外ドメインを有した。カニクイザルFcγRIα鎖の細胞外部分をサブクローニングするのに用いられるプライマーを表1に示す。
【０２０５】
リン酸カルシウム沈殿法(Gorman,C.,M., Gies,D.R.およびMcCray,G.  ＤＮＡ  Prot.Engineer.Tech.第2巻3〜10頁(1990年))により、カニクイザルおよびヒトのFcγRIプラスミドをヒトの胚性腎細胞に形質移入した。10mg/L組換えウシインスリン、1mg/Lヒトトランスフェリン、および微量元素により補充された無血清PSO4培地に転換後72時間にて上澄みを回収した。ニッケル・ニトリロ三酢酸クロマトグラフィー(Qiagen社、カリフォルニア州Valencia)によりタンパク質を精製した。精製タンパク質は4〜20％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ELISA法およびアミノ酸分析法を組み合わせて分析した。
【０２０６】
カニクイザルFcγRIまたはヒトFcγRIと、ヒトIgG1, IgG2, IgG3またはIgG4との相互作用を検出・定量すべく、標準的な酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を実施した(表15)。PBSにて1.5μg貯蔵液のカニクイザルFcγRIまたはヒトFcγRIを100μL加えることにより、4℃にて48時間、ELISAプレート(Nunc)を150ng/ウェルにて被覆した。洗浄緩衝液(PBS,pH7.4,0.5%Tween-20含有)にてプレートを5回洗浄後、25℃にて1時間、250μLのアッセイ緩衝液(50mMトリス緩衝生理食塩水、0.05%Tween-20、0.5%RIAグレードウシ血清アルブミン、2mM  EDTA、pH7.4)にてプレートをブロックした。プレートは洗浄緩衝液にて5回洗浄した。
【０２０７】
モノマー抗体の連続3倍希釈液(10.0-.0045μg/ml)をプレートに加え、2時間インキュベートした。アッセイ緩衝液にて5回洗浄した後、検出試薬を加えた。幾つかの異なる西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)抱合試薬を用い、IgG‐FcγRIの相互作用を検出した。該試薬にはHRP‐タンパク質G(Bio-Rad社)、ヤギHRP-抗ヒトIgG(Boehringer-Mannheim社、インディアナ州インディアナポリス)、およびマウスHRP-抗ヒトカッパ軽鎖が含まれる。25℃にて90分間、検出試薬にてインキュベーションした後、洗浄緩衝液にてプレートを5回洗浄し、0.4mg/ml  o-フェニレンジアミン二塩酸塩(Sigma社、ミズーリ州セントルイス)を100μl加えた。Vmaxプレートリーダー(Molecular  Devices社、カリフォルニア州Mountain  View)を用い、490nmにて吸着度を読み取った。表15にて報告した数値は、IgG濃度0.370μg/mlにおけるヒトIgG1の結合に対する平均偏差であることに留意されたい。カニクイザルFcγRI(図1B)およびヒトFcγRI(図1A)に対し、検出試薬としてマウスHRP-抗ヒトカッパ軽鎖を用いたヒトIgGの摘定プロットを図に示す。
【０２０８】
結果および論考
表15に示すように、ヒトIgGの4サブクラスに対するカニクイザルFcγRIとヒトFcγRIの結合パターンは、検出試薬に関わらず、類似していた。各例において、ヒトまたはカニクイザルはIgG3に対し最高水準の結合能を、IgG2に対し最低水準の結合能を示した。特に、ヒトおよびカニクイザルの双方のレセプター−IgG相互作用パターンは、IgG3≧IgG1＞IgG4＞＞＞IgG2であった。ヒトFcγRIIgG結合相互作用のデータが、前記データに一致することに留意されたい。GessnerらAnn.Hematol.第76巻231〜248頁(1998年)、DeoらImmunology  Today第18巻127〜135頁(1997年)、Van  de  Winkel  Immunology  Today第14巻215〜221頁(1993年)を参照。
【０２０９】
2005512574.tif 000038
ａ  検出用試薬は、ＨＲＰ複合タンパク質Ｇ（ProtG）、ＨＲＰ複合マウス抗ヒトIｇＧ、重鎖用（抗huIgG）、またはＨＲＰ複合マウス抗ヒトカッパ軽鎖（抗kappa）であった。値は、０．３７μｇ／ｍｌにおけるＯＤ４９０ｎｍ（E27IgG1）に対するＯＤ４９０ｎｍ(E27IgGサブクラス)の割合である。
ｂ  平均±Ｓ．Ｄ．，ｎ＝４
【０２１０】
図1Aおよび図1Bに示すように、ヒトとカニクイザルのFcγRIの結合親和性は、試験を行った各IgGサブクラスに対し類似している。ヒトとカニクイザルのレセプターは、双方ともIgG4およびIgG2に比し、IgG3およびIgG1に対し顕著に高い親和性を示した。図1Aおよび図1Bは、FcγRIに対するIgGサブクラスの結合が濃度依存性かつ飽和性であることも示す。
【０２１１】
ヒトとカニクイザルは各IgGサブクラスに対し互いに類似した親和性を有し、類似した結合相互作用パターンを示すため、IgGサブクラスの検出にあたりヒトFcγRIの代わりにカニクイザルFcγRIを用いることが可能なことを本データは示す。
【０２１２】
例4：カニクイザルFcγRIIAはヒトIgG2に結合する  材料および方法
例3に記載の方法を本質的に用い、カニクイザルFcγRIIAに対するヒトIgGサブクラスの結合を分析するELISAアッセイ法を実施した。しかし、FcγRIIAは低親和性FcγRであるため、Fcレセプターに加える前にヒトIgGの各サブクラスの六量体複合体を形成した。モル比1:1にてヒトIgGサブクラスとヒトIgGとを混合し、六量体複合体を形成した。Liu,J.,Lester,P.,Builder,S.およびShire,S.J.  Biochemistry第34巻10474〜10482頁(1995年)を参照。六量体複合体の調製、およびFcγRII・FcγRIIIアッセイにおけるその使用法に関しては、Shields,R.L., Namenuk,A.K., Hong,K., Meng,Y.G.,Rae,J., Briggs,J., Xie,D., Lai,J., Stadlen,A., Li,B., Fox,J.A.およびPresta,L.G.  J.Biol.Chem.第276巻6591〜6604頁(2001年)に記載された。ヒトFcγRIIA(R131)をコードするプラスミドは、GenBankや他の刊行物に記載のような配列情報を用い、容易に調製可能であり、WarmerdamらJ.of  Immunology第147巻1338〜1343頁(1991年)、およびClarkらJ.of  Immunology第21巻1911〜1916頁(1991年)を参照されたい。
【０２１３】
結果および論考
表16に示すように、ヒトIgGサブクラスの六量体複合体に対するカニクイザルFcγRIIAの結合パターンは、IgG3=IgG2＞IgG1＞IgG4であった。ヒトFcγRIIA多形型二種に対するヒトIgGサブクラスの結合に関する以前の分析では、次のパターンを示した。ヒトFcγRIIA(R131)-IgG3≧IgG1＞＞＞IgG2≧IgG4、およびFcγRIIA(H131)-IgG3≧IgG1=IgG2＞＞＞IgG4である。GessnerらAnn.Hematol.第76巻231〜248頁(1998年)、Deoら  Immunology  Today第18巻127〜135頁(1997年)、Van  de  Winkel  Immunology  Today第14巻215〜221頁(1993年)を参照。これら結合パターンは、アミノ酸131番にヒスチジンを有するカニクイザルFcγRIIAが、ヒトFcγRIIA(H131)に匹敵することを示すものであり、双方ともヒトIgG2に結合する。対照的に、ヒトFcγRIIA(R131)はヒトIgG2に対する結合が弱いと報告されている。カニクイザルFcγRIIAはヒトIgG3に結合するのと同様に効率的にヒトIgG2に結合し、これはヒトFcγRIIA(H131)レセプターとの相違点であることにも留意されたい。
【０２１４】
2005512574.tif 000039
ａ  検出用試薬は、ＨＲＰ複合タンパク質Ｇ（ProtG）、ＨＲＰ複合マウス抗ヒトIｇＧ、重鎖用（抗huIgG）、またはＨＲＰ複合マウス抗ヒトカッパ軽鎖（抗kappa）であった。値は、０．１２３μｇ／ｍｌにおけるＯＤ４９０ｎｍ（E27IgG1）に対するＯＤ４９０ｎｍ(E27IgGサブクラス)の割合である。
ｂ  平均±ＳＤ，ｎ＝３
【０２１５】
通例、各IgGサブクラスに対するカニクイザルFcγRIIAの結合能は、各IgGサブクラスの濃度が上昇するに従い、向上した(図2)。
【０２１６】
表16および図2のデータは、カニクイザルFcγRIIAがヒトIgG2およびIgG3に高親和性にて結合し、ヒトFcγRIIA多形型二種のいずれよりも、該ヒトサブクラスを検出するのに用いる好ましい薬剤といえることを示す。
【０２１７】
実施例5：カニクイザルFcγRIIBはヒトIgG2に結合する  材料および方法
ヒトIgGサブクラスに対するFcγRIIBの結合を検出するのに用いる方法は、本質的に例3および例4に示した。ヒトFcγRIIBをコードするプラスミドは周知であり、当業者はこれを容易に得ることができる。KuruczらImmunol.Lett第75巻第l号33〜40頁(2000年)を参照されたい。表17に報告するデータは、IgG1濃度0.370μg/mlにおけるヒトIgG1の結合に対する平均偏差を表す。
【０２１８】
結果および論考
表17は、ヒトおよびカニクイザルのFcγRIIBに対するヒトIgGサブクラス六量体複合体の結合を示す。IgGサブクラスとヒトFcγRIIBとの結合パターンは、IgG3≧IgG1＞IgG2＞IgG4であり、IgGサブクラスとカニクイザルFcγRIIBとでは、IgG2≧IgG3＞IgG1＞IgG4である。該結合パターンは、IgGの一定濃度範囲内においてヒト(図3A)およびカニクイザル(図3B)の双方にて同様であった。
【０２１９】
本データは、カニクイザルFcγRIIBがヒトFcγRIIBより結合親和性が高いことを示す。
【０２２０】
2005512574.tif 000040
ａ  検出用試薬は、ＨＲＰ複合タンパク質Ｇ（ProtG）、ＨＲＰ複合マウス抗ヒトIｇＧ、重鎖用（抗huIgG）、またはＨＲＰ複合マウス抗ヒトカッパ軽鎖（抗kappa）であった。値は、０．３７μｇ／ｍｌにおけるＯＤ４９０ｎｍ（E27IgG1）に対するＯＤ４９０ｎｍ(E27IgGサブクラス)の割合である。
ｂ  平均±ＳＤ，ｎ＝８
ｃ  平均±ＳＤ，ｎ＝５
ｄ  平均±ＳＤ，ｎ＝３
【０２２１】
実施例6：カニクイザルFcγRIIIAとヒトFcγRIIIA-V158は、ヒトIgGサブクラスに対し同等の結合能を示す
材料および方法
ヒトIgGサブクラスに対するFcγRIIIAの結合を検出するのに用いる方法は、本質的に例3および例4に示す通りであった。前述したようにFcγRIIAα鎖のヒトＤＮＡ配列は周知であり、当業者であれば用意に入手可能である。表18に報告するデータは、IgG1濃度0.370μg/mlにおけるヒトIgG1の結合に対する平均偏差を表す。
【０２２２】
結果および論考
表18に示すようにカニクイザルFcγRIIIAおよびヒトFcγRIIIA-V158は、双方とも本質的に同パターンIgG1＞IgG3＞＞IgG2≧IgG4にてヒトIgGサブクラスに結合し、IgG3=IgG1＞＞＞IgG2=IgG4のパターンにて結合するヒトFcγRIIIA-F158と対照的である。ヒトFcγRIIIA-F158−ヒトIgGサブクラスの結合データは以前の報告に一致する。GessnerらAnn.Hematol第76巻231〜248頁(1998年)、Deoら  Immunology  Today第18巻127〜135頁(1997年)、Van  de  Winkel  Immunology  Today第14巻215〜221頁(1993年)を参照。図4A、図4Bおよび図4Cは、それぞれヒトFcγRIIIA-F158、ヒトFcγRIIIA-V158、カニクイザルFcγRIIIAの結合パターンを、各IgGサブクラスの濃度上昇に対応して示すとともに、結合相互作用が特異的、濃度依存的かつ飽和性であることを示す。
【０２２３】
本データは、カニクイザルFcγRIIIAとヒトFcγRIIIA-V158がヒトIgGサブクラスとの同等の結合相互作用を有し、特にヒトFcγRIIIAに比し、カニクイザルFcγRIIIAがIgG2サブクラスに対する好ましい結合能を有することを示す。
【０２２４】
2005512574.tif 000041
ａ  検出用試薬は、ＨＲＰ複合タンパク質Ｇであった。値は、カニクイザルFcγRIIIAおよびヒトFcγRIIIA(V158)については０．３７μｇ／ｍｌ、ヒトFcγRIIIA(F158)については１．１１μｇ／ｍｌにおける、ＯＤ４９０ｎｍ（E27IgG1）に対するＯＤ４９０ｎｍ(E27IgGサブクラス)の割合である。
ｂ  平均±ＳＤ，ｎ＝４
ｃ  ヒト(F158)およびヒト（V158）は、レセプター位置１５８にフェニルアラニンまたはバリンを有するヒトFcγRIIIAの多型形態である。
【０２２５】
実施例7：カニクイザルFcγRIIAはヒトIgG1変異体S298AおよびS298A/E333A/K334Aに結合する
材料および方法
E27  IgG1における部位特異的変異誘発は、本質的にShieldsらJ.Biol.Chem.第276巻6591〜6604頁(2001年)に記載の通りであった。簡潔に述べると、部位特異的変異誘発は、CH2およびCH3ドメインにおける溶剤曝露残基の幾つかが個々にアラニンに改変されたIgG1変異体を生成するために用いた。アラニン変異体はD265A,S298A,S37A,R292A,D280AおよびS298A/E333Aであった。
【０２２６】
ELISA反応は本質的に例3〜例6に記載の通りであり、未変性IgGタンパク質ではなく、FcレセプターにてIgG変異体をインキュベートした。表19に示す数値につき、ヒトレセプターは1μg/mlであり(吸着変異体／吸着未変性IgG1)、カニクイザルレセプターでは数値は0.370μg/mlであった(吸着変異体／吸着未変性IgG1)。
【０２２７】
結果および論考
表19および図5〜図7に示すように、カニクイザルFcγRIに対する全てのIgG変異体の結合パターンは、ヒトFcγRIに対する結合パターンに類似した。カニクイザルFcγRIIAに対するIgG変異体に関しては、通常、結合パターンはヒト多形体FcγRIIA(H131)と同一のパターンに従った(図5)。上記のように、このことはカニクイザルFcγRIIAが残基131番にヒスチジンを有するという事実を表すと考えられる。しかし、留意すべき二つの例外があり、変異体S298Aおよび変異体S298A/E333A/K334Aは未変性ヒトIgG1に比し、カニクイザルFcγRIIAに対する結合能が向上し、これら同じ変異体がヒトFcγRIIAに対し結合しにくかったことに留意されたい。
【０２２８】
表19および図6につき、カニクイザルFcγRIIBに対する変異IgGの結合パターンは、ヒトFcγRIIBに対する結合パターンと幾つか異なる点を示した。特に、変異体R255A,E255A,E258A,S37A,D280AおよびR301Aは、未変性ヒトIgGを有するためカニクイザルFcγRIIBに対し同等に結合したが、これら同じ変異体が全て、未変性ヒトIgGに比し、ヒトFcγRIIBに対し結合能が向上したことを示した。
【０２２９】
表19および図7につき、カニクイザルFcγRIIIAに対する変異IgGの結合パターンは、ヒト多形体FcγRIIIA-F158に対する結合パターンに比し、ヒト多形体FcγIIIA-V158にて確立した結合パターンに従った。このことは、カニクイザルFcγRIIIAがヒトFcγRIIIA-V158のように位置158に類似したアミノ酸残基のイソロイシン(FcγRIIIA-F158内に位置するフェニルアラニンに比し)を有するという事実を表していると考えられる。
【０２３０】
Fcレセプターに媒介される活性化シグナル(例えばITAM含有FcγRI,FcγRIIAおよびFcγRIIIA)を平衡させる、Fcレセプターに媒介される抑制シグナル(例えばITIM含有FcγRIIB)を阻止すれば、抗体の治療効果が向上するであろう。表19に示す予期しない結果は、S298Aを有する変異体がカニクイザルFcγRIIAに対し向上した結合能を示し、カニクイザルFcγRIおよびFcγRIIIAに対し未変性様の結合能を維持し、カニクイザルFcγRIIBに対し著明に低下した結合能を示したことである。ニ変異体、詳細にはS298AおよびS298A/E333A/K334Aは、活性化ITAM含有Fcレセプターに選択的に結合すると同時に、抑制的ITIM含有FcγRIIBには結合しないように用いることが考えられる。
【０２３１】
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【０２３２】
実施例8：カニクイザルFcRnとヒトFcRnはヒトIgGサブクラスに同等に結合する
材料および方法
ヒトの脾臓ｃＤＮＡライブラリ由来の妥当な重鎖Fc  ｃＤＮＡを、E27可変重鎖ドメインを有するpRKベクターにサブクローニングすることにより、E27(IgG1)のヒトIgG2,IgG3およびIgG4イソタイプを作製した。同一のE27κ軽鎖を用い、全てのIgGサブクラスおよび変異体を発現させた。
【０２３３】
重鎖および軽鎖プラスミドを293細胞に同時形質移入した後、タンパク質AクロマトグラフィーによりIgG1,IgG2,IgG4および変異体を精製した。IgG3はタンパク質Gクロマトグラフィーにより精製した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ELISA法および分光法を組み合わせて用い、全てのタンパク質製剤を分析した。
【０２３４】
本質的にCoussensらScience第230巻1132〜39頁(1985年)に記載のように、HerceptinTM  IgG1を作製した。HerceptinTM  IgG1は組換えＤＮＡ由来のモノクローナル抗体であり、IgG1κ鎖を有する。該κ鎖は、HER2に結合するマウス抗体(4D5)の相補性決定領域とコンセンサスなアミノ酸フレームワークを有する。
【０２３５】
例1に記載のように、α鎖細胞外ドメインをコードする断片を生成するプライマーを用い、オリゴ(dt)の初回刺激を受けたＲＮＡの逆転写酵素ＰＣＲ法(GeneAmp,PerkinElmer  Life  Sciences社)により、カニクイザルの脾臓細胞からカニクイザルFcRnのｃＤＮＡを単離した。EatonらBiochemistry第25巻8343〜8347頁(1986年)に記載のように、前述のpRK哺乳類細胞の発現ベクターにｃＤＮＡをサブクローニングした。77番塩基にて異なる二本のＤＮＡ配列が同定・確認され、一配列はG塩基を有し成熟ポリペプチドにて3番Serを付与し、他方の配列はA塩基を有し成熟ポリペプチドにて3番アスパラギンを付与した。本質的に例1に記載のように、カニクイザルのFcRn(S3)およびFcRn(N3)のｃＤＮＡを単離した。
【０２３６】
リン酸カルシウム沈殿法(Gorman,C.,M.,Gies,D.R.およびMcCray,G.  ＤＮＡ  Prot.Engineer.Tech.第2巻3〜10頁(1990年))により、カニクイザルおよびヒトのFcRnプラスミドをヒト胚性腎細胞に形質移入した。10mg/L組換えウシインスリン、1mg/Lヒトトランスフェリン、および微量元素にて補充した無血清PSO4培地に転換後72時間にて上澄みを回収した。ニッケル・ニトリロ三酢酸クロマトグラフィー(Qiagen社、カリフォルニア州Valencia)によりタンパク質を精製した。精製タンパク質は4〜20％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ELISA法およびアミノ酸分析法を組み合わせて分析した。
【０２３７】
カニクイザルFcRn(S3),FcRn(N3)またはヒトFcRnと、ヒトIgG1(herceptin  gG1を含む),IgG2,IgG3またはIgG4との相互作用を検出・定量すべく、標準的な酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を実施した(表20)。4℃にて一晩、50mM炭酸緩衝液pH9.6にて、2μg/mlストレプトアビジン(Zymed  Laboratories社、カリフォルニア州サンフランシスコ)にてELISAプレート(Nunc)を被覆した。PBS,0.5%  BSA,10ppm  Proclin300(Supelco社、ペンシルベニア州Bellefonte)を用い、25℃にて1時間、pH7.2にてプレートをブロックした。標準的プロトコルにより、biotin-X-NHS(Research  Organics社、オハイオ州クリーブランド)を用い、FcRn-Gly-His6をビオチニル化し、PBS,0.5  BSA,0.05%  polysorbate-20(試料緩衝液)、pH7.2、25℃にて1時間、ストレプトアビジン被覆したプレートに固着させた。次にpH6.0にて試料緩衝液でプレートを洗浄した。pH6.0にて試料緩衝液におけるE27標準型または変異体の8連続2倍希釈液を2時間インキュベートした。pH6.0にて試料緩衝液でプレートを洗浄し、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（Kirkegaard  &  Perry  Laboratories社、メリーランド州Gaithersburg）を基質として用い、pH6.0試料緩衝液にてペルオキシダーゼ抱合ヤギF(ab’)2抗ヒトIgG  F(ab’)2（Jackson  ImmunoResearch社）により結合IgGを検出した。Vmaxプレートリーダー(Molecular  Devices社)に450nmにて吸着度を読み取った。
【０２３８】
図20に示すデータは飽和結合曲線として表した。
【０２３９】
結果および論考
表20、および対応する図8〜図10に示すように、ヒトIgGの4サブクラスに対するカニクイザルFcRn(S3),FcRn(N3)およびヒトFcRnの結合パターンは類似していた。各例において、ヒトおよびカニクイザルのFcRnはIgG3に対し最高水準の結合能を、IgG1に対し最低水準の結合能を示した。特に、ヒトおよびカニクイザルの双方のレセプター−IgG相互作用パターンは、IgG3＞＞IgG4＞IgG2＞IgG1であった。ヒトFcRn−IgG結合相互作用のデータが、以前報告したデータに一致することに留意されたい。AP  West  Jr.およびP.J.Bjorkman  Biochemistry第39巻9698頁(2000年)を参照。
【０２４０】
加えて、ヒトとカニクイザルのFcRnsの結合親和性はIgG1,IgG2およびIgG3に対し類似しており、IgG4に対するヒトFcRnに比し、カニクイザルFcRnがIgG4に対し僅かに親和性が高いことを本データは示す。図8〜図10に示すように、ヒトIgGサブクラスに対するヒトおよびカニクイザルのFcRnsの結合は濃度依存性かつ飽和性である。
【０２４１】
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ａ  プレートをNeutrAvidinで被覆した後FcRn−ビオチンで被覆し、次いで試料で被覆し、ＨＲＰ複合ヤギ抗ヒトF(ab’)2を用いて検出するアッセイ。値は、２回のアッセイについて、[mAb]＝５０ｎｇ／ｍｌにおけるＯＤ４９０ｎｍ（E27IgG1）に対するＯＤ４９０ｎｍ(E27IgGサブクラス)の割合である。カニクイザルＳ３及びＮ３のアミノ酸は、位置３においてのみ異なる。
ｂ  プレートをNeutrAvidinで被覆した後FcRn−ビオチンで被覆し、次いで試料で被覆し、ＨＲＰ複合ヤギ抗ヒトF(ab’)2を用いて検出するアッセイ。値は、５回のアッセイについて、[mAb]＝５０ｎｇ／ｍｌにおけるＯＤ４９０ｎｍ（E27IgG1）に対するＯＤ４９０ｎｍ(E27IgGサブクラス)の割合である。第２の、E27IgG1の別個のロットは、標準として使用したE27IgG1と比較して、０．８１±０．０３（平均±Ｓ．Ｄ．，ｎ＝３）を示した。
ｃ  プレートをヒトIｇＥで被覆した後試料で被覆し、次いでFcRn−ビオチンで被覆し、ＨＲＰ複合ストレプトアビジンを用いて検出するアッセイ。値は、４回のアッセイについて、[mAb]＝５０ｎｇ／ｍｌにおけるＯＤ４９０ｎｍ（E27IgG1）に対するＯＤ４９０ｎｍ(E27IgGサブクラス)の割合である。第２の、E27IgG1の別個のロットは、標準として使用したE27IgG1と比較して、０．９２および０．８８を示した。
【０２４２】
ヒトとカニクイザルのFcRnは各IgGサブクラスに対し互いに類似した親和性を有し、類似した結合相互作用パターンを示すため、IgGサブクラスの検出にあたり、ヒトFcRnの代わりにカニクイザルFcRnを用いることが可能であることを本データは示す。
【０２４３】
本発明は上記の目的ならびに利点、および内在する目的ならびに利点を実現するように良く適合されていることは自明であろう。本発明を開示する目的で現在好ましい実施例を記載しているが、本発明の範囲内であれば種々の変更および改変が可能である。当業者に容易に示唆され、本願において開示するとともに添付したクレームにて明示するような本発明の精神に含まれれば、他の多くの変更が可能である。
【０２４４】
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【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１Ａ】ヒトFcγRIに結合したモノマーのIgGサブクラスの説明図
【図１Ｂ】カニクイザルFcγRIに結合したモノマーのIgGサブクラスの説明図
【図２】カニクイザルFcγRIIAに結合した六量体免疫複合体の説明図
【図３Ａ】ヒトFcγRIIBに結合した六量体免疫複合体の説明図
【図３Ｂ】カニクイザルFcγRIIBに結合した六量体免疫複合体の説明図
【図４Ａ】ヒトFcγRIIIA-F158に結合した六量体免疫複合体の説明図
【図４Ｂ】ヒトFcγRIIIA-V158に結合した六量体免疫複合体の説明図
【図４Ｃ】カニクイザルFcγRIIIAに結合した六量体免疫複合体の説明図
【図５】ヒトIgG1変異体をカニクイザルFcγRIIAに結合した六量体免疫複合体の説明図
【図６】ヒトIgG変異体をカニクイザルFcγRIIBに結合した六量体免疫複合体の説明図
【図７】ヒトIgG変異体をカニクイザルFcγRIIIAに結合した六量体免疫複合体の説明図
【図８】ヒトFcRnに結合した濃度依存性モノマーIgGサブクラスの説明図
【図９】カニクイザルFcRn(S3)に結合した濃度依存性モノマーIgGサブクラスの説明図
【図１０】カニクイザルFcRn(S3)に結合した濃度依存性モノマーIgGサブクラスの説明図
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2005512574.tif 000055
【図４Ｃ】
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【図５】
2005512574.tif 000057
【図６】
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【図７】
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【図８】
2005512574.tif 000060
【図９】
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【図１０】
2005512574.tif 000062
【配列表】
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【国際調査報告】
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2005512574.tif 000064
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