(57)【要約】血管新生を阻害することができる薬剤をスクリーニングする方法。このような薬剤は、癌、黄斑変性、および網膜症を含む状態の処置において治療的に適用する。さらに、インテグリンサブユニットの活性化を阻害することができる薬剤を患者に投与することを含む、血管新生の増加により特徴付けられる病状を有する患者を処置する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生応答を阻害する薬剤をスクリーニングするための方法であって、
ａ）
ｉ）インテグリンαサブユニットの不活性なプロ型または変換酵素活性化された形態、
ｉｉ）血管新生を阻害する能力について試験する薬剤
ｉｉｉ）金属プロテアーゼＭＴＩ−ＭＭＰ
をその薬剤の不在かでのインテグリンαサブユニットの活性化に異おける造花を促進する条件下で接触させること、および
ｂ）インテグリンαサブユニット活性化の阻害と血管新生を阻害する薬剤の能力とを関連付けること
を含む方法。
【請求項２】
前記関連付ける工程が、電気泳動またはクロマトグラフィーにおいて、αサブユニットの不活性な形態の移動と活性化された形態の移動との差異を観察することによって行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
インテグリンαサブユニットのＭＴＩ−ＭＭＰおよびプロ形態が同じ細胞内で組み換えにより発現する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
接触させる工程が細胞内で行われる請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記αサブユニットの活性化が前記αサブユニットのプロ形態の開裂によってなされる請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記αサブユニットの活性化が該αサブユニットのプロ形態のグリコシレーションにおける変化によってなされる請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記関連付ける工程が、レポーター遺伝子の使用およびαサブユニット活性化における増加の阻害の指標としてのレポーター遺伝子発現の存在または非存在の検出を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
血管新生が少なくとも部分的な原因であるかまたは永続的な要因である状態生理学的状態をこうむっている患者を処置する方法であって、ＭＴＩ−ＭＭＰ金属プロテアーゼによるインテグリンαサブユニットの不活性なプロ形態または変換酵素活性化された形態の活性化における増加を阻害することができる薬剤を該患者に投与することを含む方法。
【請求項９】
血管新生が少なくとも部分的な原因であるかまたは永続的な要因である状態生理学的状態をこうむっている患者を処置する方法であって、α1、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、α２ｂ、αＥおよびαｖからなる群から選択される特異的なインテグリンαサブユニットのプロ形態の活性化を特異的に阻害する薬剤によって患者を処置することを含む方法。
【請求項１０】
前記特異的なインテグリンαサブユニットがαｖである請求項9に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
血管新生（angiogenesis）は、それによって動物内の血管構造から新しい血管が形成される方法である。この過程は、血管の内側の新しい内皮細胞が、肝細胞から分化するのではなく、むしろ存在する細胞の増殖によって生じるという点で脈管形成（vasculogenesis）とは区別される。この過程は侵襲性であり細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質分解、新しい内皮細胞の移動および新しいマトリックス成分の合成に依存する。血管新生は循環系の胚発達の間に起こるが、成人のヒトにおいては、血管新生は単に生理学的状態に対する応答として起きる（女性における生殖サイクルの間を除く）。
【０００２】
このように、成人において、血管新生は、創傷治癒、関節炎、腫瘍増殖および転移を含む状態、並びに網膜症、黄斑変性、および角膜の潰瘍形成および外傷性障害などの眼の状態に関連する。血管新生の進行が類似する各症例においては、刺激により内皮細胞の移動する列の形成が生じる。タンパク質分解活性は、細胞の列が浸潤して移動することを可能にするのに十分なＥＣＭを分解する、この「血管の芽」の成長する先端に焦点が当てられている。成長する先端の後ろには、内皮細胞が分化してお互いに接着し始め、膜の新しい基礎を形成する。そして、細胞は増殖を止め、最後には新しい細動脈または毛細血管の内腔を現す。
【０００３】
多くの癌、網膜症、関節炎および黄斑変性を含むある特定の病状が血管新生に依存しているという事実のために、これらの状態に関連する血管新生を阻害するための方法を見出だすことが望まれることが明白であろう。このような方法は、創傷治癒および血管新生性の刺激に対するその他の有益な応答に関わる血管新生を阻害しないことが好ましいであろう。
【０００４】
マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰＳ）は、ＥＭＣのタンパク質を特異的に分解するプロテアーゼのファミリーである。これらの分泌されたおよび膜に結合した細胞外タンパク質は血管新生に広く関与していると考えられており、恐らくは少なくとも部分的には、ＥＣＭに穴が開き、血管新生の間、その中を成長中の血管の芽が伸張する原因であると考えられる。しかしながら、それによってＭＭＰが、ＥＣＭに対する結合、脱離および移動等の他の内皮細胞の機能に影響を与えるメカニズムであるように、ＭＭＰの特異的な分子標的は議論の対象である。
【０００５】
大部分のＭＭＰは、ＥＣＭにて活性化されるチモーゲンとして分泌される。その例外は、細胞表面に結合し、細胞膜へ移動する前に細胞内でプロセシングされるＭＴＩ−ＭＭＰである。ＴＩＭＰ（金属プロテアーゼの組織インヒビター）と称するＭＭＰのインヒビターのファミリーは、抗血管新生性であるが、血管新生の過程において複数のおよび複雑な作用を有し、単なる拮抗的インヒビターの活性のほかにも活性を有するようである。
【０００６】
血管新生の間の血管の形成は、基礎となる膜において隣の内皮細胞の緊密な接着を必要とする；この接着はインテグリンスーパーファミリーの一員によって媒介される。これらの膜貫通タンパク質は、αおよびβサブユニットからなるヘテロダイマーから構成される。αおよびβサブユニットのそれぞれにはさまざまなサブタイプが存在し、αサブユニットにはα3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α2b、αEおよびαｖが含まれ、βサブユニットにはβ1、β3、β5およびβ6が含まれる。以下にさらに詳細に示すように、どのαサブタイプがどのβサブタイプと対になるかについて、多くの場合特異性が存在する。αサブユニットのすべてではないが、多くは不活性なプロ型として発現し、次いで、変換酵素と呼ばれるプロテアーゼによって開裂される。これらの変換酵素感受性のダイマー化は、変換酵素開裂を必要とするようである。
【０００７】
内皮細胞は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含むさまざまな因子に応答してインテグリンを発現する。発現したインテグリンは細胞移動、増殖、生存およびマトリックス分解の調節を媒介する。
【０００８】
金属プロテアーゼＭＴＩ−ＭＭＰはインテグリンαｖβ3と連携して、培養した乳がん細胞において、ＭＭＰ−２をプロ型からその酵素の活性型へ変換することによって活性化することが報告されている。この活性化は、αvβ3の特異的なリガンドであるビトロネクチンの導入によって阻害される。Deryugina E. I., et al., Exp Cell Res. 15; 263 (2): 209-23 (2001年2月)。さらに、ＭＴＩ−ＭＭＰは、乳がん細胞がＭＴＩ−ＭＭＰおよびβ3サブユニットでトランスフェクトしたときに、β3サブユニットを開裂することによってαvβ3を活性化することができることが報告されている。Deryugina E.I., et al., Int. J. Cancer 86(1) : 15-23 (2000年4月)。これら文献の両方は本明細書の一部を構成する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、マトリックス金属プロテアーゼＭＴＩ−ＭＭＰが、αサブユニットを開裂することにより、ある特定のインテグリンを活性化することができるという発見に関する。我々は、この金属プロテアーゼが、インテグリンαvβ3（インテグリンはＶＥＧＦが関与する血管新生に関連していると広く考えられている）のαvサブユニットを修飾することを発見した。さらに、ＭＴＩ−ＭＭＰは、変換酵素によって開裂されやすい任意のαサブユニットを活性化することまたはその活性部位を挿入することが可能である。そのようなサブユニットとしては、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α2b、αEおよびαｖが挙げられる。ＭＴＩ−ＭＭＰ基質はα鎖の不活性なプロ型であるかまたは変換酵素開裂された活性型であろう。後者の場合には、ＭＴＩ−ＭＭＰによって、既に活性なサブユニットの活性化部位が増加する。
【００１０】
このように、ＭＴＩ−ＭＭＰはインテグリンへテロダイマーが関与する血管新生活性化カスケードの一部であると考えられる。そのようなインテグリンとしては、αvβ3、αvβ3、αvβ1、αvβ5、αvβ6およびα5β１が挙げられるがこれに限定されない。インテグリンの活性化は血管新生の開始の前提条件であるので、そのような活性化を阻害する手段は価値があり、血管新生が少なくとも部分的に原因であるまたは永続的な要因である生理学的状態の処置における有用な治療ツールである。
【００１１】
このように、１つの態様では、本発明は、血管新生応答を阻害する薬剤をスクリーニングするための方法であって、不活性なまたは変換酵素活性化されたインテグリンαサブユニット、血管新生を阻害する能力について試験する薬剤、および金属プロテアーゼＭＴＩ−ＭＭＰをともに、該薬剤の不在下でインテグリンαサブユニットの修飾を促進する条件下で接触させること、およびαサブユニット活性化の増加の阻害を、血管新生を阻害する薬剤の能力とを関連付けることを含む方法に関する。好ましい態様では、ＭＴＩ−ＭＭＰおよびインテグリンαサブユニットのプロ型は同じ細部内で発現する。さらに、好ましい態様では、関連付けの工程は、前者の形態は異なる分子量でもって移動すると思われるので、αサブユニットの不活性な形態に対するＭＴＩ−ＭＭＰ活性化された形態の移動における差異を電気泳動またはクロマトグラフィーにおいて観察することによって行われる。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、ＭＴＩ−ＭＭＰ金属プロテアーゼによるαサブユニットのプロ型または変換酵素活性化された形態の増加を阻害することが可能な薬剤による、血管新生が少なくとも部分的に原因であるかまたは永続的な要因である生理学的状態をこうむっている患者を処置する方法に関する。好ましい態様では、その生理学的状態は、関節炎、腫瘍成長、転移、網膜炎、黄斑変性、網膜新生血管、角膜の潰瘍形成および角膜の外傷からなる群から選択される。
【００１３】
本発明のこの態様においては、本薬剤は、その薬剤を冒されている部位へ調達させるのに有効な任意の手段によって投与することができる。例えば、これに限定されないが、腫瘍を処置する場合、本薬剤を腫瘍組織、好ましくは腫瘍塊の周辺に直接注射することができ、関節炎の場合、本薬剤を関節に注射することができ、眼の状態の場合は、本薬剤を、網膜または角膜の直接的処置のための生体侵食性（bioerodible）またはリザーバベースのドラッグデリバリーシステム等の眼内レンズによって適用することができ、または、眼科的に許容し得る賦形剤において製剤化することができ、および眼の前部または後部内へ直接注射することができる。
【００１４】
以下の実施例は本明細書に開示した発明の一般的な考えを限定するものではない。
【００１５】
実施例
方法
雌性のsprague-dawleyラットにおける新血管新生を中心角膜のアルカリ焼灼によって誘導した。焼灼後７２時間および２８８時間のナイーブの角膜を、インテグリンα1、α2、β3、β5、内皮マーカーＣＤ３１，および金属プロテアーゼＭＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰについてＲＴ−ＰＣＲによって解析した。ナイーブ、焼灼後２４、７２、１２０および１６８時間後の動物の角膜においてタンパク質発現および金属プロテアーゼの解析を、凍結切片およびゼラチンザイモグラフィーにおいて免疫蛍光顕微鏡によって行った。
【００１６】
結果
ＲＴ−ＰＣＲは、角膜の新血管新生によるＣＤ３１、ＭＴＩ−ＭＭＰおよびインテグリンα1およびβ3の発現の間の関連を示す。免疫組織学的解析は、α1、α2、α3およびβ5およびＭＴＩ−ＭＭＰが新たに成長する脈管構造で発現し、β3インテグリンは新生血管内側で低いレベルで発現した。ＥＣＭタンパク質のラミニンで以前に見られたように、コラーゲンＩＶ型およびフィブロネクチンは成長している脈管全体に発現しているが、テナシン−Ｃは、侵襲的血管新生前部内において発現がほとんどないかまたはまったくなかった成熟脈管の選択的染色を示した。ＭＭＰ−９の発現は角膜上皮細胞の移動および新生血管新生に関連していた。
【００１７】
結論
アルカリ火傷に応答するラット角膜の血管新生中のインテグリン発現は、α1β1、α2β1およびα5β1インテグリンと連携するＶＥＧＦ／αvβ5経路による血管新生に限定される。侵襲性の血管新生前部内のＭＴＩ−ＭＭＰの発現は、ＭＴＩ−ＭＭＰと分配するαvβ5またはβ1と連携する可能性のある、ＶＥＧＦ主導の血管新生応答を媒介するのにも重要であることをさらに示唆している。この実験で観察されたインテグリン発現のパターンはＶＥＧＦ介在の血管新生応答と十分関連している。
【００１８】
成人組織の血管新生は、平穏時の脈管構造を細胞周期に誘導し、脈管化した組織の新しい領域を生じる周囲の基質に侵襲する、血管新生性および炎症性サイトカインを含むさまざまな組の刺激に対する応答である。この過程の中心は、両細胞の接着受容体とマトリックス金属プロテイナーゼ（ＭＭＰ）に属するマトリックス分解酵素の活性である。遺伝子操作または薬学的介入による細胞接着またはＭＭＰ活性のいずれかの阻害または崩壊は、血管新生応答を阻害することが可能である。多くの場合、関与する接着受容体および／またはＭＭＰは存在する血管新生因子によって決定されるようである。この因子の関係はＭＭＰについて十分に特徴付けられていないが、インテグリンによる細胞接着は、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦのいずれかによる血管新生誘導に対応する少なくとも２つの原理的な接着過程によって起きると特徴付けられている。このように、ｂＦＧＦ誘発性の応答（ＴＮＦ−αによる誘導を含む）では、血管新生がαvβ3介在の経路において起き、ＶＥＧＦ、ならびにＴＧＦ−βおよびＰＭＡによる血管新生の誘導はαvβ5を介して起きる。これら２つの経路は十分に確立されているが、最近の研究では生理学的条件下で、成長因子とインテグリン発現との間の関連が必ずしも維持されていないということが示唆されている。ＶＥＧＦが存在するいくつかの場合、αvβ3およびαvβ5の両方が発現し、最新の研究ではαvβ3介在の血管新生の機能的な有意性は、αvβ3に対するリガンドの存在を反映し得る。さらに、血管新生の態様がαvβ3またはαvβ5インテグリンの発現に依存しているわけではない。異常な血管新生に関連する胚および出生後の死亡率によって些細な血管の欠陥が存在するが、αv並びにβ3インテグリンのノックアウトマウスは、αvまたはαvβ3インテグリンいずれかの非存在下で、広範は脈管形成および血管新生を受けるようである。これらの観察は、他のインテグリンファミリーの構成員がαvまたはβ3インテグリンの機能を補完することができること、またはαvまたはβ3インテグリンとは無関係に他の接着経路が存在することを示唆している。血管新生応答の媒介に関与する他のインテグリンファミリーの構成員としては、α1β1、α2β1およびα5β1インテグリンが挙げられ、αvインテグリンと同様に、さらにｂＦＧＦ関連（α5β1）まあはＶＥＧＦ関連（α1β1、α2β1）血管新生事象に分けられている。上記の研究は、与えられた血管新生応答において、接着媒介経路がさまざまであり、単一の血管新生因子の存在に依存するだけでなく、ＥＣＭ、ならびにＭＭＰおよび炎症性サイトカインを含む関連因子の共同的な影響にも依存するようである。
【００１９】
最近、血管新生の角膜アルカリ火傷モデルは活性な血管成長の間に存在する高いレベルのＶＥＧＦを有するものとして特徴付けられており、ＶＥＧＦはこのモデル系内の主要な血管新生因子であると示唆されている。この知見と一致して、αvβ3アンタゴニストによる薬学的介入は血管新生応答に対して効果がなく、血管新生がＶＥＧＦ介在の血管新生応答と一致するαvβ3接着経路を介して起きると示唆されている。しかし、αvβ5の発現は、これらの実験において確立されておらず他の可能性のある接着受容体も同定されていない。この実験の目的は、血管新生応答がαvβ5介在の経路を介して起きるのか否かを決定するためにインテグリン発現のパターンを特徴付け、ならびにＶＥＧＦ介在の血管新生応答に頻繁に関連し得るインテグリンファミリーの他の構成員を特徴づけることであった。この実験は、コラーゲンＩＶ型、ラミニン、フィブロネクチンおよびテナシン−Ｃを含む血管新生応答に関連する細胞外マトリックス分子の空間的（spatial）および一時的な発現に関連するインテグリンの発現パターンの両方を試験することによってこれらの問題に対峙するものである。したがって、我々は、金属プロテイナーゼＭＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰの発現を調べ、それらが血管新生応答の調節にも関与しているかどうかを調べた。
【００２０】
結論として、コラーゲンＩＶ、ラミニンおよびフィブロネクチンＥＤＡドメイン発現は、新血管形成についての以前の研究と一致した。但し、テナシン−Ｃは、血管成熟に関連して独特の発現パターンを示した。ＶＥＧＦ介在の血管新生応答と一致して、新血管形成は、αvβ5、α1β1およびα2β1インテグリン、ならびにα5β1の発現と関連していた。ＭＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰは、強い炎症応答ならびに血管形成の両方に関連していた。αvβ3の不在下での成長中の血管に対するＭＴＩ−ＭＭＰの局在は、血管新生応答の媒介において、ＭＭＰ−２ならびにＭＴＩ−ＭＭＰが、αvβ3インテグリンとの関連によってこれまで認識されているよりも広範な役割を有していることを示唆している。
【００２１】
材料と方法：
試薬および抗体：Brdu (5-ブロモ-2-デオキシウリジン)はBoehringer Mannheimから購入した。TRIzol試薬およびSuperScript II 逆転写酵素は、Gibco-BRL(Rockville, MD)から入手した。ゼラチンチモーゲンゲル(10% PAGE)、再生緩衝液および展開緩衝液は、Novex (San Diego)から入手した。一次抗体は以下の会社から購入し、以下の濃度で使用した:ヤギ抗ＩＶ型コラーゲン（Southern Biotechnology Associates, Inc. (Birmingham, AL)、1: 250希釈で使用(1.6 μg／ｍL)；マウス抗フィブロネクチンEDAドメイン、FN-3E2（sigma (St. Louis, MO)、1: 300希釈で使用；ウサギ抗ヒトＶＩＩＩ因子（Dako Corporation (Carpinteria, CA)、1: 100希釈で使用；抗テナシン−Ｃポリクローナル抗体HXB 1005（generous gift from: Sharifi B. G.より寄贈）、1: 100希釈で使用；ウサギポリクローナル抗インテグリンα1サブユニット、−インテグリンα2サブユニット、−インテグリンα3サブユニット、−インテグリンα5サブユニット、−インテグリンβ5サブユニット（Chemicon International Inc. (Temecula, CA)）、αサブユニットについては1: 100希釈にて使用、β5サブユニットについては1: 500希釈で使用；マウスモノクローナル抗ラットインテグリンβ3鎖（PharMingen (San Diego, CA)）、1: 100希釈で使用、(5μg／ｍL);ウサギポリクローナル抗ＭＭＰ−２、およびＭＴＩ−ＭＭＰ１（Chemicon International Inc.）(Temecula, CA)。二次抗体はすべてローダミン(TRITC)またはフルオレセイン(FITC)に連結させたF(ab') 2フラグメントであった。これらはJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA)から購入し、１：２００希釈にて使用した。
【００２２】
動物モデル
雌性ラット(Sprague-Dawley)（体重２５０〜３００ｇ）イソフルラン（４％ｖ／ｖ）で麻酔し、プロパラカイン０．１％（Allergan Inc. (Irvine, CA)）にて角膜表面に局所適用した。アルカリ火傷は、角膜中心に硝酸銀アプリケータ（７５％硝酸銀、２５％硝酸カリウム）Grafco（商標）（Graham-Field Inc, (Hauppauge, NY)）の先端を２秒間接触させることにより作出した。示した時点で、動物を安楽死させ、種々の実験について術後２４時間から２８８時間後に眼を摘出した。免疫蛍光分析のために、眼をＯＣＴ溶液に包埋させ、した。全体の試験のために、角膜全体を取り出し定量した。実験動物はＡＲＶＯにしたがって処置し、維持した。
に関する。
【００２３】
クリオセクションおよび免疫蛍光
マウスモノクローナルまたはヤギおよびウサギポリクローナル抗体による免疫染色のために、眼（外傷またはナイーブ）を８〜１３μｍの切片に矢状にクリオセクション（cryosection）した。切片を１００％アセトン中で５分間固マウントし、手短に乾燥し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で脱水し、以下の湿潤チャンバー内でインキュベーションした：ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ（Sigma）で各５分間、蛍光クロームに連結させた二次抗体で室温にて１時間、前同様に５回洗浄。サンプルをFluoromount G (Southern Biotechnology Associates)で固マウントし、Spot Digital Camera (Diagnostic Instruments Inc. Sterling Heights,MI)を取り付けたNikonE800化合物顕微鏡で観察し撮影した。血管新生に関連する分子および血管マーカーの同時局在化を、マウス、ヤギまたはウサギ一次抗体を用いて種々の組み合わせを用いて行った。使用した一次抗体ならびに二次抗体単独それぞれについての、免疫染色のためのネガティブコントロールは天然の結成または精製したＩｇＧの使用であった。すべての組織において、コラーゲンＩＶ型により同時染色して、血管の存在をマークすると同時に内部陽性のコントロールとして供する。コントロールの組織はすべて、細胞性の範囲が最も大きいので術後７２時間の角膜から得た。
【００２４】
ホールマウント免疫蛍光
完全な新鮮な角膜を４分の１にカットし、９０％メタノールおよび１０％ＤＭＳＯ中に室温にて１５分間固マウントし、ＰＢＳ（１×）で２分間３回リンスし、ＰＢＳ中２％ＢＳＡ中中でブロックし、一次抗体α２／ＣＤ３１またはβ５／ＣＤ３１、β３／Banderaea Simplicifolia (BS-1) レクチン中で４℃にて一晩インキュベーションし、ＰＢＳで１時間５回洗浄した後、蛍光色素と結合させた二次抗体中、４℃にて一晩インキュベーションし、１時間５回洗浄した。最後に角膜を平らに固マウントし、Spot Digital Camera (Diagnostic Instruments Inc. Sterling Heights, MI)を取り付けたNikon E800化合物顕微鏡または共焦点顕微鏡も用いる共焦点顕微鏡によって解析した。
【００２５】
in situ ザイモグラフィー
厚さ４〜６μｍの凍結組織切片をゼラチンコートしたスライドに固マウントし(Fuji, Pharmaceuticals Inc.)、湿潤チャンバー内で３７℃にて４〜６時間インキュベーションした後、室温で乾燥させた。固定化後、組織をAmido Black 10B溶液で１５分間染色した後、水ついでデスタイン（７０％メタノール、１０％酢酸）中で２０分間リンスした。画像を明視野顕微鏡によってキャプチャーした。
【００２６】
ＲＴ−ＰＣＲ
ナイーブの、焼灼後７２時間および２８８時間後の動物のプールした角膜組織（合計４つの角膜）から、標準的なTRIzol抽出法を用いて全ＲＮＡを単離した。TRIzol抽出法はGibcoBRL (Rockville, MD)の製造元のプロトコルにしたがって行った。単離したＲＮＡをＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅで処理し、混入しているゲノムＤＮＡを除いた。逆転写酵素不在下のＲＮＡのRT-PCR解析は、ネガティブコントロールとして用いた。全ＲＮＡを２６０ｎｍでの吸光度として分光学的に定量した。全ＲＮＡ（１μg）を２．５μg／ｍLのランダムヘキサマーおよび５００μＭ のdNTPの存在下で、５０単位のSuperScript II逆転写酵素により、４２℃にて５０分間、次いで７０℃にて１５分間逆転写させた。得られたｃＤＮＡ１μLを１ｎＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、２００μＭのｄＮＴＰおよび３．５単位のExpand（商標） High Fidelity酵素ミックスの存在下で増幅させた。ＰＣＲ条件：最初の５サイクル、９４℃にて１５秒間で変性、５８〜５５℃にて３０秒間アニーリング(各サイクルで０．５℃低下させる）、および７２℃で３０秒間。残りの2.7サイクルのＰＣＲ条件は９４℃にて１５秒間、５５℃にて３０秒間、および７２℃にて４５秒間であった。増幅したサンプルを１．５％アガロースゲルに同体積（１０μL）加えた。ＰＣＲ産物を臭化エチジウムで可視化した。増幅に用いたプライマーのペアを表１に示す。ＰＣＲ産物はすべてサブクローニングして配列を決マウントし、生成物を標的遺伝子として確認した。
【００２７】
角膜マイクロポケット分析
角膜マイクロポケット分析は、４００ｎgのｂＦＧＦ／ハイドロンペレットビーズを用いて（２３）に記載されているように行った。簡潔にいえば、雌性のラット（Sprague-Dawley）（体重２５０〜３００ｇ）を２００μL(キシラジン２０ｍg／ｍL、ケタミン１００ｍg／ｍLおよびアセプロマジン）を用いて全身麻酔し、手術の前に眼を０．５％のプロパラカインで局所麻酔した。角膜基質の半分に切り込みを入れた長さ１ｍｍの角膜切開を角膜輪部から２．５ｍｍのところに入れ、角膜輪部の血管から約１ｍｍの切開点から基質を分離することによってポケットを作成した。次いで、１４０ｎgのｂＦＧＦを含有するハイドロンビーズ０．４×０．４ｍｍをポケットに移植した。ハイドロンペレットの移植後３および５日後に、角膜をホールマウント分析のために調製した。
【表１】
2005506524.tif 000002
【００２８】
結果
個々のインテグリンおよびＭＭＰの存在下または非存在を試験するために、ナイーブ、焼灼後７２時間（３日）および２８８時間（１２日）後の角膜を用いて、インテグリンα1、α2、β3、β5および金属プロテイナーゼＭＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰを試験するＲＴ−ＰＣＲを行った。これは、初期（７２時間）および後期（２８８時間）の血管新生応答を示す組織の試験を可能にする。血管成長に対する遺伝子発現の関連は、ＣＤ３１の発現を試験することによって行った。ナイーブの角膜の分析はＣＤ３１、α1、β3およびＭＴＩ−ＭＭＰについて不在であるという情報を示した。ＭＭＰ−２、β5およびα2インテグリンについての情報は、ナイーブの角膜に存在していた（図１）。初期および後期両方の新血管形成での外傷のある角膜内では、α1、β3、ＭＴＩ−ＭＭＰおよびＣＤ３１ｍＲＮＡが検出された。ＣＤ３１発現についてのα1、β3、ＭＴＩ−ＭＭＰ間の関連性は血管新生応答についてのコードされたタンパク質の関与を示唆する。ＭＭＰ−２、β5インテグリンおよびα2インテグリンの発現の情報は、新血管形成による発現の明確な変化を示さなかった。血管新生応答についてのＭＭＰ−２、β5およびα2ｍＲＮＡ間の関連性の不在は、血管新生応答のなかでのそれらの潜在的な関与を排除するものではないが、この手段の限界とナイーブの角膜に既に存在していた比較的高いレベルを反映するものと考えられる。分析をさらに精密にするため、ゼラチナーゼザイモグラフィーと連携させた免疫組織学によりタンパク質発現を試験した。成長中の血管に対し、インテグリンおよびＭＭＰの発現をマッピングするために、最初に角膜組織切片を第ＶＩＩＩ因子で染色し、内皮細胞、ならびにＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンＥＤＡドメインおよびテナシン−Ｃを含む血管新生応答に関連した数多くの細胞外マトリックスタンパク質を同マウントした。
【００２９】
第ＶＩＩＩ因子、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンＥＤＡドメイン、ラミニンおよびテナシン−Ｃを用いた焼灼後７２時間の角膜の凍結組織切片における染色を図２に示す。全体の血管構造ならびに成長中の血管の遠位の領域は、第ＶＩＩＩ因子について陽性であり、ＩＶ型コラーゲンによる同時免疫染色は、第ＶＩＩＩ因子について見られる血管染色の同様のパターンを示したが、第ＶＩＩＩ因子による免疫染色によって認識されるより遠位の領域はＩＶ型コラーゲンによって染色されず（図２Ｂ、矢頭）、侵襲性の前部が著明なＩＶ型コラーゲン発現に進行するが第ＶＩＩＩ因子陽性である。ＩＶ型コラーゲンによる染色と同時にフィブロネクチンＥＤＡおよびラミニンについて染色を行った（図２Ｃ〜２Ｆ）。ＩＶ型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンＥＤＡドメインの間で観察された染色に対する１つの例外は、輪部または前から存在する血管におけるフィブロネクチンＥＤＡドメインの不在であった（図２Ｃおよび２Ｄ星印）。テナシン−Ｃ発現（図２Ｇおよび２Ｈ）は、輪部の血管において存在するが、最初の発現は、ＩＶコラーゲン陽性の領域とテナシン−Ｃ院生の領域が血管形成のより遠い領域で認識されるＩＶ型コラーゲンについて見られた最初の発現とほぼ同じであった（図２Ｈ，矢頭の間）。基質において見られたかなり高いレベルのテナシン−Ｃは、焼灼後最初の２４時間の間に急速に分解される強膜棘からのテナシン−Ｃの残物を示す。単純な角膜創傷（debriment）が、強膜棘内のテナシンの分解に対して効果がなかった（データ示さず）ので、この応答は焼灼火傷の外傷に限られている。ECMの染色パターンはIV型コラーゲン、フィブロネクチンEDAおよびラミニンについて以前に報告されたパターンと一致するが、テナシン−Ｃは成長中の血管のより末端の領域に局在することはこれまで報告されていなかった。ＩＶ型コラーゲンに対するテナシン−Ｃのこの独特な染色パターンは、血管発達において前成熟期を示し得る独特な領域の同定を可能にする。このパターンおよび相対的な蛍光強度に基づき、インテグリンとＭＭＰ発現を調べる以下の試験において、ＩＶ型コラーゲンを用い、成長中の血管をマーキングした。
【００３０】
インテグリン発現の分析のために、与えられたインテグリンのペアを同定するための免疫学的試薬を選択した。本実験において試験したヘテロダイマーペアは、α1β1、α2β1、α5β1、αvβ3およびαvβ5であった。各へテロダイマーの同定は、α1、α2、α3、β3およびβ5インテグリンサブユニットについての組織染色によって行った。α1、α2、α3をβ3インテグリンサブユニットのみと対にし、β5をαvインテグリンサブユニットのみと対にするので、ほとんどの場合、個別のヘテロダイマーペアの同定が可能である。抗β3抗体がαvβ3およびαiibβ3ヘテロダイマーペアの両方を認識することだけが例外である。しかしながらαiibβ3は、細胞形態学と組織分布に基づいて除外することが可能な血小板および巨核芽球でのみ発現する。角膜は、それぞれのインテグリンについて、別個な３つの時間経過で試験し、角膜染色試験を焼灼後２４、７２、１２０および１６８時間後に行った。全体の時間経過を通じて観察された染色のスペクトルを示しており、血管新生応答の初期および中期の両方を示すと考えられるので、７２および１２０時間の染色パターンをそれぞれ示した。試験した各インテグリンについてのナイーブの角膜にける染色を図３に示す。角膜上皮において、α1、α2、α3およびβ3の染色が大きかった。基質の染色も観察したが、程度が限られ、はっきりとは認められなかった（図３）。β3インテグリンについては免疫反応性が認めらなかった（示さず）。
【００３１】
焼灼後７２時間および１２０時間後のα1、α2およびβ5についての染色パターンを図４に示す。焼灼後７２時間後のα1、α2およびβ5についての試験結果は、輪部の血管での染色による発現と同様のパターンを示し、成長中の血管全体にわたってＩＶ型コラーゲン免疫染色により同時局在化されている。新血管と直接関連してないα1、α2およびβ5についての基質内での細胞の染色もまた観察された（図４）。後者の染色パターンは、この時点で基質内に非常に豊富に存在している基質の繊維芽細胞または炎症性細胞での発現を示しているようである。成長している血管におけるα1の発現は、血管の成長を通じて一様な染色パターンを示したのに対して、α2についての染色パターンは変化し、点状である。１２０時間の時点では、α2は、血管の前部先端で染色の減少を示した（図４Ｇおよび４Ｈ、星印）、血管内で著明な染色が観察された（図４Ｇ矢印）。後者の染色は、新生血管内に存在する血小板または炎症性細胞でのα2発現を反映し得る。成長する血管におけるβ5インテグリン染色はα1と同様であった、血管が成長している間を通じて発現が認められた（図４Ｉ〜４Ｌ）。１２０時間の時点で、β5は血管が成長している間継続して染色を示した（図４Ｋおよび４Ｌ）。しかしながら、成長している血管のより遠位の領域で優先的に染色されているのが観察された。
【００３２】
α5はβ1インテグリンサブユニットとのみ対になることが知られているので、α5インテグリンサブユニットについての染色によってα51へテロダイマーの存在は同定される。皓インテグリンへテロダイマーペアは、複数の細胞のタイプにおいて発現し、ナイーブおよび外傷のアル角膜における上皮および内皮ならびに基質細胞において観察されるα5のこの発現パターンと一致する。α１と同様に、α5染色は７２時間の時点で成長している血管全体に一様であった（図５Ａおよび５Ｂ）。１２０時間の時点で、α5は、新生血管のより遠位の領域で局在化した染色を示し（図５Ｃおよび５Ｄ）、１６８時間までにこの染色パターンの違いはより顕著になった（５Ｅおよび５Ｆ）。α1、α２、α５およびβ5の染色から得られた結果は、血管成長に関与するより遠位の領域内で接着がαvβ3、α5β1およびα1β5を介して起こっていることを示唆している。α2染色のパターンは、血管新生応答の初期におけるその潜在的な関与を示唆しているが、１２０時間までには血管の成熟と改造に関与する領域において優先的に発現する。
【００３３】
β3インテグリンサブユニットについての染色は、αvβ3またはαiibβ3ヘテロダイマーのいずれかの存在を示す。ナイーブの角膜内では、β3免疫染色は見られない（示さず）。焼灼後７２時間後に弱いβ3染色が成長している血管全体に観察され、著明なβ3免疫蛍光の点が認められる（図５Ｇ〜５Ｊ）。前マウント角膜組織の共焦点顕微鏡は、著明なβ3免疫染色が血小板でのβ3の発現に関連していることを示している（図６Ａおよび６Ｂ）。β3の染色パターンが血管新生と無関係であることを確認するため、我々は、角膜マイクロポケット分析を用いて角膜の血管新生がｂＦＧＦによって誘導されるβ3の発現を試験した。ｂＦＧＦ誘導の血管新生の発現は、β3発現が血管の先頭に限られ（図６Ｃおよび６Ｄ）、内皮細胞で発煙が著明であることを示している（図６Ｅおよび６Ｆ）。これらの結果は、新生血管組織のαvβ3発現についての前の実験と一致し、角膜アルカリ火傷モデルにおいて見られる観察されたβ3染色と大きく異なっている。これらのデータは、細胞外マトリックスに対する内皮細胞接着を媒介することにおける関連性に一致するような様式でβ3が発現していないことおよび観察されたβ3発現が、αiibβ3のように主として血小板で観察されることを示している。
【００３４】
ＲＴ−ＰＣＲ解析によって同定されるインテグリンの発現に加え、ＭＴＩ−ＭＭＰに関する情報もまた検出され、この情報の存在は角膜の血管新生と関連付けられた。ＭＴＩ−ＭＭＰはＭＭＰ−２の活性化と緊密に関連するため１8,１9、我々は、ゼラチンザイモグラフィーによりＭＭＰ−２のプロ型および活性化型の存在について調べることによって、ＭＴＩ−ＭＭＰの潜在的な関与について最初に試験した。ゼラチンザイモグラフィーは、ナイーブ、焼灼後２４時間、７２時間、１２０時間および１６８時間後の角膜にたいして行った。血管成長によるＭＭＰ発現を関連付けるために、角膜を図７Ａに示すように切断した。これは、新しい血管成長に対するＭＭＰ活性の比較のための参照となる。ナイーブの角膜においては、プロ型のＭＭＰ−２のみが存在した（図７Ｂ）。焼灼後２４時間で、ＭＭＰ−２の活性型が、すべての切片において、輪部と創傷部分に高いレベルで検出された（図７Ｂ、切片１および４）。７２時間ではＭＭＰ−２の活性型が輪部でさらに広がり、隣接する領域で輪部の領域を最高のレベルとする勾配を形成し（図７B、切片１および２）、MMP-2の活性型の存在と新血管形成との間の関連を示唆した。１２０時間では、MMP-2の活性型のこの勾配は角膜中心にまで広がり、１６８時間までにはこの勾配が逆転して角膜中心で最も高いレベルが見られた（図７B、切片４）。これらのデータは、血管の成長と、血管新生過程におけるＭＴＩ−ＭＭＰの活発な役割が関わるMMP-2活性化との関連を示唆している。
【００３５】
ＭＭＰ−２発現に加え、ＭＭＰ−９発現と活性もまた、ゼラチナーゼザイモグラフィーによって観察された。創傷および隣接組織を示す切片３および４に見られるように、焼灼後２４時間以内にプロ型および活性型のＭＭＰ−９が角膜から高いレベルで検出された。７２時間および１２０時間までには、もともとの角膜の創傷の領域内で検出されたプロ型のみについてＭＭＰ−９レベルが大きく減少した。ＭＭＰ−９発現のこのパターンは角膜の上皮細胞が移動している間のＭＭＰ−９の発現と一致している。
【００３６】
観察されたＭＭＰ−２活性化の複雑なパターンは、酵素を活性化し、不活性な複合体としてのＴＩＭＰＳと関連することを反映しているようである。さらに、ＭＭＰ−２活性は炎症または基質繊維芽細胞と関連しているようであり、血管新生の過程と直接関連はしてないようである。内因性の角膜内の活性なＭＭＰ−２を同定するために、in situ ザイモグラフィーを行った（図８）。ゼラチナーゼザイモグラフィーと一致して、 in situ ザイモグラフィーによって測定されたゼラチナーゼ活性のパターンは非常に類似していた。ナイーブ組織では、ゼラチナーゼ活性は観察されず、２４時間までにゼラチナーゼ活性の小さい増加が輪部に（図８Ｃ、矢頭）と周辺の領域（図８Ｃ、矢印）に認められ、ゼラチナーゼザイモグラフィーにおいて観察されたＭＭＰ−２の活性型の勾配をを反映した。角膜基質に広がるぜラチナーゼ活性の程度は、ＩＶ型コラーゲン免疫染色によって前に測定された新血管形成と関連している。さらに、著明なぜラチナーゼ活性が基質内の個々の細胞内に観察された（図８Ｃ、星印）。１２０時間では、ゼラチナーゼ活性は、血管の成長と関連する角膜基質へさらに広がるゼラチナーゼ活性に関連した基質の領域について７２時間で観察された活性と同様であった（図８Ｄ）。焼灼後１６８時間では、ゼラチナーゼ活性の大部分は、創傷に隣接する胞に限定されていた。ゼラチンザイモグラフィーによって観察されたＭＭＰ−２の活性が他のレベル（図７、１６８時間）と比較した、１６８時間でin situ ザイモグラフィーにおいて観察された輪部と中心の創傷との間の比較的低いレベルのゼラチナーゼ活性は、輪部と角膜中心との間のゼラチナーゼ活性が内因性のＴＩＭＰＳによって緊密に調節されていることを示唆しており、血管成熟の領域内でのＭＭＰ活性のダウンレギュレーションと一致している22。最後に、 in situ ザイモグラフィーにおいて、ゼラチナーゼ活性は、角膜上皮細胞との関連においてほとんどまたはまったく見られず、このことは、ＭＭＰ−９シグナルを可視化するのに適切な展開時間が得られないことを反映しているかもしれない。長い展開時間がゼラチナーゼ活性における解像度の損失をもたらすことは多い。
【００３７】
さらにＭＭＰ−２の局在およびＭＴＩ−ＭＭＰの発現を明瞭にするために、免疫組織学染色を凍結した角膜切片について行った。分析は、成長している血管に関連して見られる低いレベルの染色としてin situ ザイモグラフィーによって見られる発現と類似した、基質内の個々の細胞におけるＭＭＰ−２発現を示した（図９Ａおよび９Ｂ）。成長している血管に関連して高いレベルが観察されたが、ＭＴＩ−ＭＭＰ発現はＭＭＰ−２で見られるものと類似していた（図９Ｃおよび９Ｄ）。ＭＭＰ−２についての基質内の個々の細胞の強い染色は、 in situ ザイモグラフィーにおいて見られるゼラチナーゼ活性が、活性なＭＭＰ−２を反映していることを示唆する。血管成長に関連するゼラチナーゼ活性は、ＭＭＰ−２ならびにＭＴＩ−ＭＭＰと関連するゼラチナーゼ活性を反映し、in situ ザイモグラフィーに関連して成長する血管について著明な染色を示す。
【００３８】
考察
我々は、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫蛍光およびゼラチンザイモグラフィーによる血管新生応答を比較して角膜アルカリ火傷モデルにおけるインテグリンおよびＭＭＰ発現のパターンを調べた。ＲＴ−ＰＣＲによるインテグリンと金属プロテアーゼ発現の最初の分析は、このモデルにおいて見られた血管新生応答と関連して、ＣＤ３１、インテグリンα1およびβ3およびＭＴＩ−ＭＭＰが外傷を有する角膜において発現したことを示した。α2、β5およびＭＭＰ−２は、血管新生と比較して発現のパターンの変化は示されなかった。α2インテグリン、β5インテグリンおよびＭＭＰ−２に関して情報の変化を検出することができないことは、ナイーブ組織に存在する豊富な情報の存在を反映しているようである。ナイーブ組織におけるＭＭＰ−２、β5およびα2の発現は、角膜上皮におけるβ5およびα２についての、または角膜基質におけるＭＭＰ−２についてのこれら遺伝子の発現を反映しているようである。
【００３９】
ＲＴ−ＰＣＲによる血管新生応答に関連する潜在的な接着および金属プロテアーゼを同マウントし、我々は、次に、免疫組織学的分析により血管形成との関連においてそれらの発現を調べた。これは、内皮細胞マーカー因子ＶＩＩＩならびに新生血管の発達に関連する数多くのＥＣＭタンパク質を用いて、血管の発達を最初に調べることによって行った。これにはＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンＥＤＡドメイン、テナシン−Ｃおよびラミニンが含まれる。この分析から、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチンＥＤＡドメインおよびラミニンにより、成長中の新生血管全体が染色され、例外的により遠位の領域が第ＶＩＩＩ因子についてのみ陽性に染色された。成長している血管のより遠位の領域での透明な基礎膜の不在は、基礎膜が血管の芽の侵襲性の先端において認められないというPakuおよびPaweletz, 1991の観察結果と一致している。ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチン発現のパターンは、成人の組織における血管新生の間の基礎膜形成についての他の試験によって報告されたものと同様であるが、マウスにおけるアルカリ火傷誘発角膜血管新生の間に、Form et al., 1986が報告しているようなラミニンの発現がＩＶ型コラーゲンよりも優先的であることは認められなかった。ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンならびに第ＶＩＩＩ因子はいずれも、もともと存在していた輪部の血管を染色したが、フィブロネクチンＥＤＡドメインについては染色は認められなかった。これは、成人組織において新たに成長した血管においてまたは大きな血管内でのみ発現するフィブロネクチンの胚形態と一致する。ＩＶ型コラーゲンによる最初の染色との類似は、成長する血管全体におよびもともと存在している輪部の血管内に広がるテナシン−Ｃの染色であった。テナシン−Ｃ染色のこのパターンは、第ＶＩＩＩ因子染色によって同定されるより遠位の領域とテナシン−Ｃについて陽性であるがＩＶ型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンＥＤＡドメインについては陰性であるより近位の領域との間の血管発達の個体発生におけるサブドメインを示している。このサブドメインは著明なテナシン−Ｃ染色によってマーキングされるより安定な血管の形成の前の前成熟期を示し得る。テナシン−Ｃは、平滑筋細胞または周皮細胞と成長している血管との安定な結合を支援し得る。但し、いくつかの報告では、テナシン−Ｃ発現は内皮の出芽や活性化に関連しており、テナシン−Ｃが初期の毛細血管床の活性な改造ならびに周皮細胞会合の安定化を調節しうることを示唆している。
【００４０】
血管形成のマーカーとしてＩＶ型コラーゲンを用いて、インテグリン発現のパターンを調べた。凍結切片から得られたデータ解析はβ3インテグリンが主として成長中の血管内の血小板で発現することを示した。血小板では染色されないが内皮細胞では染色されないことは角膜火傷モデルのβ3染色を角膜マイクロポケット分析におけるｂＦＧＦにより誘発されたβ3染色との比較によって確認された。これらの分析に基づけば、αvβ3インテグリンは、このモデル系内での内皮細胞画介在の移動および血管新生において本質的役割を担ってはいないようである。ｂＦＧＦ誘発のラット角膜における血管新生において、ＬＭ６０９による大きくはないが十分に有意の阻害が見られたが、αvβ3特異的阻害抗体であるLM609がこのモデル系において血管新生を阻害できなかったというKlotzらによる最近の報告は、この結論をさらに支持するものである。ＲＴ−ＰＣＲ分析におけるβ3特異的結合の存在は、試験した時間にわたって豊富に存在するマクロファージでのαvβ3の発現を示し得る。あるいは、内腔表面に局在する低いレベルの染色を示すＲＴ−ＰＣＲによって検出されるβ3ｍＲＮＡの情報は、内皮細胞における発現の結果かもしれない。これは、ＶＥＧＦの高いレベルも存在している虚血性発作に応答して観察されるのと同様に、このモデルでの内皮細胞の応答を反映し得る。本質的にこれは、成長している新生血管内での血小板または白血球接着を促進しうる。
【００４１】
成長している新生血管では、α1、α2およびα3インテグリン発現が、７２時間で血管形成と関連してＩＶ型コラーゲンとともに局在していた。後の時点では（１２０〜１６８時間）、α1インテグリンは、成長している新生血管内で一様に発現したが、α2は血管成熟の領域においてより優勢であると思われる。α3インテグリンは、血管形成のより遠位の領域で優先的に局在していることを示し、このモデル系におけるナイーブおよび血管形成の成熟初期および改造期のα5β1インテグリンに関する役割を示唆している。血管形成および成熟の間のα1およびα2の役割は、ＭＭＰ活性の調節およびの新しい基礎膜が形成されるのでコラーゲン合成の増加と関連しているかもしれない。α1およびα2はいずれもＶＥＧＦ介在の血管新生には必須ではないことが示され、ＶＥＧＦに応答する血管新生において早期に発現することが示唆された。これは、また、このモデル系での場合であると思われるが、血管新生応答の後の段階ではα1のみが、芽の形成および内皮細胞侵襲に関連する血管形成のより遠位の領域において依然として検出される。
【００４２】
β5インテグリン染色は、血管形成の早期および後期に成長中の血管全体にみられたが、β5インテグリンは成長している血管のより遠位の領域内でより優勢であると思われる。これらのデータはこのモデル系において、αvβ5インテグリンが血管成長と関連しαvβ3は関連していないことを示唆している。角膜アルカリ火傷における血管新生応答におけるα1、α2およびβ5インテグリンの会合は、ＶＥＧＦ介在の血管新生の事象１2および以前に観察された角膜血管新生に関連するＶＥＧＦ発現の調節と一致している。しかしながら、発生期の血管内のα5インテグリンの存在は、また、もしかすると内皮細胞侵襲および毛細血管形成の媒介において、α5β1が重要な役割も担っていることも示唆している。内皮細胞移動および毛細血管形成の両方におけるα5β1の関与は、in vitroのモデル系で示されている。しかし、ＶＥＧＦ主導の経路における機能的な解析は、α5β1の本質的な役割を実証することはできなかった。
【００４３】
試験した血管新生のその他の態様は、ＭＭＰの発現および活性化であった。この試験において、３つのＭＭＰの活性を試験した。これにはＭＭＰ−９，ＭＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰが含まれた。ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の活性はゼラチナーゼザイモグラフィーおよび in situ ザイモグラフィーによって実証されたが、ＭＴＩ−ＭＭＰは活性なＭＭＰ−２および陽性の免疫染色の存在によって推測された。ＭＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰはいずれもこのモデル系内の存在していることが分かり、およびザイモグラフィーおよび免疫組織学的分析の両方に基づいて血管新生応答に関連していることが示された。ＭＭＰ−２活性化とＭＴＩ−ＭＭＰ免疫反応性の関連性は、ＭＴＩ−ＭＭＰがこのモデル系においてＭＭＰ−２の活性化と関連していることを示唆している。データはＭＴＩ−ＭＭＰがＭＭＰ−２活性化に関与していることを示唆しているが、ＭＭＰ−２の他のメカニズムも存在し得る。現在、ＭＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰは、細胞表面でαvβ3およびＴＩＭＰ−２とともに機能的な複合体を形成すると考えられており、内皮細胞の移動方向および侵襲を促進するＥＣＭの局在化した細胞周囲のタンパク質分解を媒介する。この複合体形成の阻害は血管新生応答を阻害することが示され、血管新生応答の媒介におけるＭＴＩ−ＭＭＰおよびＭＭＰ−２の機能的な重要性がさらに確認された。しかしながら、アルカリ誘発角膜血管新生モデルでは、αvβ3は、血管新生応答の媒介において主要な役割は担っていないようであり、このモデルにおけるＭＴＩ−ＭＭＰおよびＭＭＰ−２の役割は、αvβ3との関連以外で機能しているかもしれない。最近、ＭＴＩ−ＭＭＰがＭＭＰ−２とは独立に、インテグリン活性の調節を介して細胞移動および接着を直接媒介することが示された。もしかすると、このモデル系では、αvβ3が存在していない場合、ＭＴＩ−ＭＭＰが、新生血管においてＭＴＩ−ＭＭＰとともに分布するαvβ5またはβ1インテグリンを調節することにより、内皮細胞活性を直接調節しているのかもしれない。
【００４４】
ＭＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰに加え、我々は、プロ型および活性化型の両方についてＭＭＰ−９の増加したレベルも観察した。ＭＭＰ−９発現および活性の一次的なおよび空間的なパターンは、創傷治癒および角膜上皮細胞の移動との関連を示唆した。しかしながら、これは、アンギオスタチンの精製またはぷラオ血管新生因子のマトリックスからの放出による血管新生応答の調節におけるＭＭＰ−９の潜在的な役割を排除するものではない。ＭＭＰ−９がこのモデル系においてプロ血管新生または抗血管新生の役割を担っているかどうかはまだ分かっていない。プロ血管新生因子の放出に関連する可能性のある活性は、創傷後２４時間以内に観察された強膜棘におけるテナシン−Ｃの早期の分解に関連しているかもしれない。単純な角膜の残余物は強膜棘におけるテナシン−Ｃの分解をもたらさないので、この応答は、血管新生応答の特異的であるようである。
【００４５】
結論として、αvβ5インテグリンは、炎症介在の血管新生の角膜アルカリ火傷モデルにおいて内皮細胞に関連する主たるαvであると考えられる。αvβ5、α1β1、α2β1およびα5β1インテグリンに加え、成長している血管床に一貫して局在していることが示された。とりわけ重要なのは、成長している血管のより遠位の領域にα5β1が局在していることであった。テナシン−Ｃ染色の試験は、テナシン−Ｃ発現が血管成熟と関連していることを示唆しており、テナシン−Ｃ陰性であるがＩＶ型コラーゲン陽性である侵襲性の前部と推定される血管成熟との間の新しい領域の同定が可能である。最後に、このモデルでは、ＭＴＩ−ＭＭＰおよびＭＭＰ−２の活性はαvβ3との機能的複合体の形成とは無関係であるようにみえるが、いずれも血管新生応答の媒介に関与していると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ナイーブ角膜（レーン１）、角膜焼灼後７２時間および２８８時間（それぞれレーン２および３）に存在するｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅によって生じた核酸のゲル電気泳動図を示す。用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、各行の表示に対応しており、表１に示す。
【図２】Ａ、Ｃ、ＥおよびＧは、焼灼後72時間に凍結され、それぞれ第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、ラミニン、およびテナシン−Ｃによって免疫染色された角膜組織切片の顕微鏡写真である。Ｂは、焼灼後72時間に凍結され第ＶＩＩＩ因子およびコラーゲンＩＶ型によって同時免疫染色された角膜組織切片の顕微鏡写真である。Ｄは、焼灼後72時間に凍結され、コラーゲンＩＶ型およびフィブロネクチンＥＤＡによって免疫染色された角膜組織切片の顕微鏡写真である。Ｆは、焼灼後72時間に凍結され、コラーゲンＩＶ型およびラミニンによって同時免疫染色された角膜組織切片の顕微鏡写真である。Ｈは、焼灼後72時間に凍結され、コラーゲンＩＶ型およびテナシン−Ｃによって同時免疫染色された角膜組織切片の顕微鏡写真である。
【図３】Ａ、Ｃ、ＥおよびＧは、α1、α2、α3およびβ3インテグリンサブユニットについてそれぞれ免疫染色した、ナイーブ角膜の輪部領域の組織切片の顕微鏡写真である。Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨは、α1、α2、α3およびβ3インテグリンサブユニットについてそれぞれ免疫染色した、ナイーブ角膜の中心の角膜領域の顕微鏡写真である。
【図４】Ａ、ＥおよびＩは、焼灼後72時間後に凍結され、α１、α２およびβ5インテグリンサブユニットについてそれぞれ免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｃ、ＧおよびＫは、焼灼後１２０時間後に凍結され、α１、α２およびβ5インテグリンサブユニットについてそれぞれ免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｂ、ＦおよびＪは、焼灼後７２時間後に凍結され、ａ）コラーゲンＩＶ型、およびｂ）α１、α２およびβ5インテグリンサブユニットについてそれぞれ免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｄ、ＨおよびＬは、焼灼後１２０時間後に凍結され、ａ）コラーゲンＩＶ型、およびｂ）α１、α２およびβ5インテグリンサブユニットについてそれぞれ免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。
【図５】Ａは、焼灼後７２時間後に凍結され、インテグリンα5サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｂは、焼灼後７２時間後に凍結され、コラーゲンＩＶ型およびインテグリンα5サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｃは、焼灼後１２０時間後に凍結され、インテグリンα5サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｄは、焼灼後１２０時間後に凍結され、コラーゲンＩＶ型およびインテグリンα5サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｅは、焼灼後１６８時間後に凍結され、インテグリンα5サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｆは、焼灼後１６８時間後に凍結され、コラーゲンＩＶ型およびインテグリンα5サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｇは、焼灼後７２時間後に凍結され、インテグリンα3サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｈは、焼灼後７２時間後に凍結され、コラーゲンＩＶ型およびインテグリンα3サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｉは、焼灼後１２０時間後に凍結され、インテグリンα3サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。Ｊは、焼灼後１２０時間後に凍結され、コラーゲンＩＶ型およびインテグリンα3サブユニットについて免疫染色された角膜組織サンプルの顕微鏡写真である。
【図６】Ａは、血管新生が角膜においてｂＦＧＦによって誘導される、アルカリ火傷モデルにおけるレクチンおよびインテグリンβ3サブユニットについて免疫染色されたホールマウントした角膜組織の共焦点顕微鏡写真である。Ｂは、血管新生が角膜においてｂＦＧＦによって誘導される、アルカリ火傷モデルにおけるレクチンおよびインテグリンβ3サブユニットについて免疫染色されたホールマウントした角膜組織の共焦点顕微鏡写真である。Ｃは、血管新生が角膜においてｂＦＧＦによって誘導される、アルカリ火傷モデルにおけるレクチンについて免疫染色されたホールマウントした角膜組織の共焦点顕微鏡写真である。（Ｌ）はlimbusであり、（Ｐ）はｂＦＧＦを含有するペレットの位置である。Ｄは、血管新生が角膜においてｂＦＧＦによって誘導される、アルカリ火傷モデルにおけるインテグリンβ3について免疫染色されたホールマウントした角膜組織の共焦点顕微鏡写真である。（Ｌ）はlimbusであり、（Ｐ）はｂＦＧＦを含有するペレットの位置である。Ｅは、血管新生が角膜においてｂＦＧＦによって誘導される、アルカリ火傷モデルにおけるインテグリンβ3について免疫染色されたホールマウントした角膜組織の共焦点顕微鏡写真である。Ｆは、血管新生が角膜においてｂＦＧＦによって誘導される、アルカリ火傷モデルにおけるインテグリンβ3について免疫染色されたホールマウントした角膜組織の共焦点顕微鏡写真である。（Ｌ）はlimbusであり、（Ｐ）はｂＦＧＦを含有するペレットの位置である。
【図７】Ａはナイーブおよび外傷のある角膜から得た切片のグラフを示す。Ｂは、外傷から２４、７２、１２０および１６８時間後のナイーブおよび外傷のある角膜から得られたゼラチンザイモグラフィーを示す。
【図８】Ａ〜Ｅは、外傷から２４、７２、１２０および１６８時間後のナイーブおよび外傷のある角膜から得られた in situ ゼラチンザイモグラフィーを示す。
【図９】Ａ〜Ｄは、外傷から７２時間後に凍結した角膜切片の免疫組織学である。Ａは染色された形態のＭＭＰ−２であり、ＣはＭＴＩ−ＭＭＰについて染色している。ＢおよびＤは、それぞれレクチン、ならびにＭＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰについての染色である。
【図１】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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