(57)【要約】プローブ及びマーカー部分を有する微粒子を含むアレイを、サンプル中のターゲットの検出のために使用する。微粒子は、支持体の少なくとも一部にランダムに固定化される。検出スキームが、前記微粒子及び前記プローブの一致、並びに前記プローブに結合したいずれかのターゲットに関連するマーカーを検出するために実施される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のターゲットの検出方法であって、以下のステップ：
a）（i）支持体；及び
（ii）固定化材料を介して上記支持体上にランダムに固定化された複数の微粒子（ここで、各微粒子は、その微粒子に結合した自己コーディング・マーカーとプローブを含み、各自己コーディング・マーカーとプローブは、ユニークな自己コーディング・マーカー／プローブ対を含み、そして当該プローブは、上記ターゲットに特異的に結合するよう形状化され、かつ、配置されている）を含むアレイを用意し；
b）上記ターゲットを含むと疑われるサンプルを上記アレイに適用し；
c）上記ターゲットが上記プローブに結合しうる条件下に上記サンプルと上記アレイを維持し；そして
d）上記微粒子に結合した自己コーディング・マーカーと、当該微粒子に会合したターゲット・マーカーとを検出する
を含む前記方法。
【請求項２】
前記固定化材料が反応性ポリマーを含み、当該反応性ポリマーが上記支持体に結合され、そして前記微粒子が上記反応性ポリマーを介して上記支持体上に固定化される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記反応性ポリマーが少なくとも1つの光反応基を有する光反応性ポリマーを含み、かつ、当該光反応性基が、アリール・ケトン、アリールアジド、アシル・アジド、スルホニル・アジド、ホスホリル・アジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾアセテート、及びケテンから成る群から選ばれる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記反応性ポリマーが、官能性ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリエチレン・グリコール、ポリビニル・アルコール、ポリ(HEMA)、これらのコポリマー、及びこれらの組み合わせから成る群から選ばれるポリマーを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記反応性ポリマーが、ビニルピロリドンとN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド（BBA-APMA）；及びアクリルアミドとBBA-APMAから成る光反応性コポリマーの群から選ばれる、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記反応性ポリマーが、官能性多糖、グリコサミノグリカン、ポリペプチド、及びこれらの組み合わせから成る群から選ばれるポリマーを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
前記固定化材料を上記支持体上でパターン形成して上記固定化材料のパッチを形成し、前記微粒子を固定化材料の当該パッチ上に固定化する、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の微粒子が、ユニークな自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを2つ以上含み、かつ、当該微粒子のサブセットを、前記支持体上の固定化材料の別々のパッチ上に別個に配置する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記検出ステップが前記サブセットの位置を決定する操作をさらに含み、上記自己コーディング・マーカーを検出する操作と組み合わせることにより、前記プローブの同定を少なくとも可能にする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記固定化材料が結合ペアを含み、ここで、上記結合ペアの一方は支持体に結合し、及び当該結合ペアの他方は微粒子に結合し、そして上記結合ペアのメンバー同士の相互作用によって上記支持体上に上記微粒子が固定化される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合ペアが、ストレプトアビジン：ビオチン、プロテインA/G：IgG及び抗原：抗抗原抗体、レクチン：炭水化物、並びに化学的-親和性結合ペアから成る群から選ばれる、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
前記微粒子を反応性化合物を用いて官能化し、そして当該反応性化合物を用いて上記微粒子を前記固定化材料、前記自己コーディング・マーカー、前記プローブ、あるいはこれらの任意の組み合わせに結合させる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応性化合物が、カルボン酸、スルホン酸、リン酸、ホスホン酸、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、チオール反応基、及びエポキシド基から成る群から選ばれる反応基を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルを処理して、前記ターゲット・マーカーを前記ターゲットに結合させる、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記プローブが核酸プローブであり、かつ、前記ターゲットが、サンプル中に存在していて当該核酸プローブと特異的にハイブリダイズする核酸ターゲットである、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが抗体プローブであり、かつ、前記ターゲットが、サンプル中に存在していて当該抗体によって特異的に認識される分子である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記自己コーディング・マーカーが、少なくとも1つの検出可能な粒子を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも1つの検出可能な粒子が、発蛍光団、量子ドット、放射性同位体、及び磁性粒子から成る群から選ばれる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記自己コーディング・マーカーが、検出可能な粒子の組み合わせを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
アレイの製造方法であって、以下のステップ：
a）複数の微粒子（ここで、各微粒子は、その微粒子に結合した自己コーディング・マーカーとプローブを含み、各自己コーディング・マーカーとプローブは、ユニークな自己コーディング・マーカー／プローブ対を含み、そして当該プローブは、サンプル中に存在するターゲットに特異的に結合するように形状化され、かつ配置されている）を含む混合物を調製し；
b）支持体と、場合によっては上記微粒子を固定化材料でコーティングし；そして
c）複数の微粒子を含む上記混合物を、当該微粒子が上記固定化材料を介して上記支持体上にランダムなパターンで固定化されるように当該支持体上に配置する
を含む前記方法。
【請求項２１】
前記固定化材料が反応性ポリマーを含み、当該反応性ポリマーが上記支持体に結合され、そして前記微粒子が上記反応性ポリマーを介して上記支持体上に固定化される、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記反応性ポリマーが少なくとも1つの光反応基を有する光反応性ポリマーを含み、かつ、当該光反応性基が、アリール・ケトン、アリールアジド、アシル・アジド、スルホニル・アジド、ホスホリル・アジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾアセテート、及びケテンから成る群から選ばれる、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記反応性ポリマーが、官能性ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリエチレン・グリコール、ポリビニル・アルコール、ポリ(HEMA)、これらのコポリマー、及びこれらの組み合わせから成る群から選ばれるポリマーを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
前記反応性ポリマーが、ビニルピロリドンとN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド（BBA-APMA）；及びアクリルアミドとBBA-APMAから成る光反応性コポリマーの群から選ばれる、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
前記反応性ポリマーが、官能性多糖、グリコサミノグリカン、ポリペプチド、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるポリマーを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
前記コーティング・ステップが、固定化材料を前記支持体上でパターン形成して上記固定化材料のパッチを形成する操作を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２７】
前記配置ステップが、前記の固定化材料のパッチを介して微粒子を前記支持体上に固定化する操作を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記調製ステップが、ユニークな自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを2つ以上調製する操作を含み、かつ、前記配置ステップが、前記支持体上の固定化材料の別々のパッチ上に微粒子のサブセットを別個に配置する操作を含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
前記固定化材料が結合ペアを含み、ここで、前記コーティング・ステップが、上記結合ペアの一方のメンバーを支持体と結合させ、及び当該結合ペアの他方のメンバーを微粒子と結合させる操作を含み、そして前記配置ステップが、上記結合ペアのメンバー同士を相互作用させて上記支持体上に上記微粒子を固定化する操作を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項３０】
前記結合ペアが、ストレプトアビジン：ビオチン、プロテインA/G：IgG及び抗原：抗抗原抗体、レクチン：炭水化物、並びに化学的-親和性結合ペアから成る群から選ばれる、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記調製ステップが、前記微粒子を反応性化合物でコーティングする操作であって、当該反応性化合物を用いて上記微粒子を前記固定化材料、前記自己コーディング・マーカー、前記プローブ、あるいはこれらの組み合わせに結合させる操作をさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項３２】
前記反応性化合物が、カルボン酸、スルホン酸、リン酸、ホスホン酸、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、チオール反応基、及びエポキシド基から成る群から選ばれる反応基を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記プローブが核酸プローブである、請求項20に記載の方法。
【請求項３４】
前記プローブが抗体プローブである、請求項20に記載の方法。
【請求項３５】
前記自己コーディング・マーカーが、少なくとも1つの検出可能な粒子を含み、かつ、前記調製ステップが、前記微粒子を当該少なくとも1つの検出可能な粒子に結合させる操作を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出可能な粒子が、発蛍光団、量子ドット、放射性同位体、及び磁性粒子から成る群から選ばれる、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記自己コーディング・マーカーが、検出可能な粒子の組み合わせを含み、かつ、前記調製ステップが、前記微粒子を当該検出可能な粒子の組み合わせに結合させる操作を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
以下の：
a）支持体；
b）上記支持体上にランダムに固定化された複数の微粒子（ここで、各微粒子は、その微粒子に結合した自己コーディング・マーカーとプローブを含み、それぞれの自己コーディング・マーカーとプローブは、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を含み、そして上記プローブは、サンプル中に存在するターゲットに特異的に結合するように形状化され、かつ、配置されている）；及び
c）上記微粒子を上記支持体上に固定化する固定化材料
を含むアレイ。
【請求項３９】
前記固定化材料が反応性ポリマーを含み、当該反応性ポリマーが上記支持体に結合され、そして前記微粒子が上記反応性ポリマーを介して上記支持体上に固定化される、請求項38に記載のアレイ。
【請求項４０】
前記反応性ポリマーが少なくとも1つの光反応基を有する光反応性ポリマーを含み、かつ当該光反応性基が、アリール・ケトン、アリールアジド、アシル・アジド、スルホニル・アジド、ホスホリル・アジド、ジアゾアルカン、ジアゾケトン、ジアゾアセテート、及びケテンから成る群から選ばれる、請求項39に記載のアレイ。
【請求項４１】
前記反応性ポリマーが、官能性ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリエチレン・グリコール、ポリビニル・アルコール、ポリ(HEMA)、これらのコポリマー、及びこれらの組み合わせから成る群から選ばれるポリマーを含む、請求項39に記載のアレイ。
【請求項４２】
前記反応性ポリマーが、ビニルピロリドンとN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド（BBA-APMA）；及びアクリルアミドとBBA-APMAから成る光反応性コポリマーの群から選ばれる、請求項39に記載のアレイ。
【請求項４３】
前記反応性ポリマーが、官能性多糖、グリコサミノグリカン、ポリペプチド、及びこれらの組み合わせから成る群から選ばれるポリマーを含む、請求項39に記載のアレイ。
【請求項４４】
前記固定化材料が上記支持体上でパターン形成されることで上記支持体上に固定化材料のパッチを形成している、請求項38に記載のアレイ。
【請求項４５】
前記微粒子が前記固定化材料のパッチを介して前記支持体上に固定化されている、請求項44に記載のアレイ。
【請求項４６】
前記複数の微粒子が、ユニークな自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを2つ以上含み、かつ、当該微粒子のサブセットを、前記支持体上の固定化材料の別々のパッチ上に別個に配置する、請求項45に記載のアレイ。
【請求項４７】
前記固定化材料が結合ペアを含み、ここで上記結合ペアの一方は支持体に結合し、及び当該結合ペアの他方は微粒子に結合し、そして上記結合ペアのメンバー同士の相互作用によって上記支持体上に上記微粒子が固定化される、請求項38に記載のアレイ。
【請求項４８】
前記結合ペアが、ストレプトアビジン：ビオチン、プロテインA/G：IgG及び抗原：抗抗原抗体、レクチン：炭水化物、並びに化学的-親和性結合ペアから成る群から選ばれる、請求項47に記載のアレイ。
【請求項４９】
前記微粒子が、反応性化合物から成るコーティングをさらに含み、ここで、当該反応性化合物を用いて上記微粒子を前記固定化材料、前記自己コーディング・マーカー、前記プローブ、あるいはこれらの組み合わせに結合させる、請求項38に記載のアレイ。
【請求項５０】
前記反応性化合物が、カルボン酸、スルホン酸、リン酸、ホスホン酸、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、チオール反応基、及びエポキシド基から成る群から選ばれる反応基を含む、請求項49に記載のアレイ。
【請求項５１】
前記プローブが核酸プローブである、請求項38に記載のアレイ。
【請求項５２】
前記プローブが抗体プローブである、請求項38に記載のアレイ。
【請求項５３】
前記自己コーディング・マーカーが、少なくとも1つの検出可能な粒子を含み、その少なくとも1つの検出可能な粒子が前記微粒子に結合している、請求項38に記載のアレイ。
【請求項５４】
前記検出可能な粒子が、発蛍光団、量子ドット、放射性同位体、及び磁性粒子から成る群から選ばれる、請求項53に記載のアレイ。
【請求項５５】
前記自己コーディング・マーカーが、検出可能な粒子の組み合わせを含む、請求項54に記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、アメリカ合衆国の会社であるサーモディクス社の名前で2002年10月4日にアメリカ合衆国以外のすべての国を指定国としてPCT国際特許出願として出願されたものである。
【０００２】
本発明は、サンプル中に存在していると疑われるターゲットの検出に使用されるアレイに関する。さらに詳細には、本発明は、自己コーディング・マーカーを含む微粒子を利用したアレイに関する。
【背景技術】
【０００３】
過去数年間にわたり、DNAアレイと呼ばれる新しい技術が生物学者の間で興味を引いている。この技術により、生物のゲノムの一部または全部を単一のチップ上でモニターすることができる。そのため研究者は、数百個または数千個の遺伝子間の相互作用に関して以前よりも優れた画像を同時に得ることが可能になっている。この技術は、バイオチップ、DNAチップ、DNAマイクロアレイ、遺伝子アレイ、ゲノム・チップと呼ばれている。一般に、DNAアレイは、特定の相補的核酸配列が存在しているかどうかの分析、あるいはその配列の分析を行なうとき、ワトソンとクリックによって解明された塩基がペアを作るという標準的な規則に基づいている。
【０００４】
より最近になり、タンパク質アレイまたはペプチド・アレイの製造に注意が向けられるようになってきた。この分野は一般に“プロテオミクス”と呼ばれている。この方法の一例では、ペプチド・ライブラリをプローブとして用いて薬剤をスクリーニングすることができる。ペプチドをある受容体に対して曝露すると、その受容体に結合するプローブを同定することができる。一例では、10,000を超えるタンパク質のスポットがガラス・スライドに印刷された。このチップを用いてタンパク質-タンパク質相互作用やタンパク質-薬剤相互作用が同定されている（G. MacBeathとS.L. Schreiber、2000年、「高スループットで機能を決定するためのマイクロアレイとしてのタンパク質印刷」、Science、第189巻、1760〜1763ページ）。
【０００５】
さらに最近になり、複雑な混合物を高スループットでコスト効率よく分析することが要求されるようになったため、コンパクトで高密度なアレイ装置が製造されるようになっている。このようなアレイは、インク・ジェット印刷、スクリーン印刷、フォトリソグラフィ、光電着などの従来技術を利用して製造される。そのとき感知用化学物質をセンサー表面に直接会合させる。一般にアレイは、核酸またはペプチドを支持体に直接会合させることによって製造される。労働集約的で、ある程度変えることのできる多数の製造ステップが、一般に必要とされる。
【０００６】
この製造法では、サンプルを調べる前にアレイの表面にあるプローブの正確な位置がわかっている必要がある。したがってアレイの製造は、アレイの表面上にプローブを印刷する技術またはプローブをスポットとして形成する技術に依存している。そのためアレイを使用する前に各プローブのアドレスまたは位置がわかる。複合体が検出されるとその複合体の位置をアレイ表面の地図と比較し、ターゲットを同定する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、全体として、複数のプローブからなるアレイを用いてサンプル中のターゲットを検出することに関する。より詳細には、ターゲットは、支持体と、その支持体上にランダムに固定化されていてプローブに結合する複数の微粒子とを含むアレイを用いて検出することができる。各微粒子は、プローブと自己コーディング・マーカーを含んでおり、これらが、微粒子の表面に独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を形成する。独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する複数の微粒子は、固定化材料を介して支持体上に固定化される。サンプル中のターゲットの検出は、ターゲットを含むと疑われるサンプルをアレイに会合させることによって実現可能である。こうすることにより、微粒子に結合したプローブにターゲットを結合させた後、そのターゲットに結合したターゲット・マーカーを検出し、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子の自己コーディング・マーカーを検出することが可能になる。微粒子はアレイの少なくとも一部にランダムに配置されているとはいえ、ターゲットが存在しているかどうかとそのターゲットが何であるかは、自己コーディング・マーカー／プローブ対によって明らかにすることができる。
【０００８】
いくつかの実施態様では、固定化材料が反応性ポリマーを含んでいる。この反応性ポリマーは、光反応性ポリマーまたはコポリマーであることが好ましい。別の実施態様では、固定化材料が結合ペアを含んでいる。
【０００９】
いくつかの実施態様では、1つのアレイが、多重アレイ、サブアレイ群、あるいはこれらの組み合わせを含んでいる。サブアレイ群を含むアレイは、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子の特別なサブセットを製造することによって製造できる。いくつかの実施態様では、ターゲットの検出は、微粒子の特別なサブセットが何であるかをアレイ上の位置から明らかにすることと、自己コーディング・マーカー／プローブ対を検出することを組み合わせることによって実現される。
【００１０】
自己コーディング・マーカーは、少なくとも1つの検出可能な粒子を含むことができる。この検出可能な粒子は、発蛍光団、量子ドット、放射性同位体、磁性粒子を含むことができる。検出可能なこれら粒子の組み合わせを用いて独自の自己コーディング・マーカーを提供することができる。
【００１１】
本発明には、アレイの製造方法と、アレイそのものも含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この明細書では、“アレイ”とは、支持体の表面上に存在している複数の異なったプローブ分子を意味する。支持体上には微粒子がランダムに固定化されており、個々の微粒子に独自のプローブ分子が結合する。各微粒子には自己コーディング・マーカーも会合しているため、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を形成する。そのため個々の微粒子を検出することと、プローブが何であるかを検出することができる。1つのアレイは、自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のセットを1つ提供すること、あるいは自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のセットまたはサブセットを2つ以上提供することができる。そのため支持体上には、多重アレイ、サブアレイ群、あるいはこれらの組み合わせが存在できる。
【００１３】
独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子の“セット”とは、一般に、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する複数の微粒子であって、その複数の微粒子によって、支持体上に配置されるすべてのプローブ分子が提示されるものを意味する。
【００１４】
この明細書では、“多重アレイ”とは、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のセットまたはサブセットが2つ以上支持体上の所定の位置に配置されたアレイを意味する。
【００１５】
この明細書では、“サブアレイ”とは、アレイの部分のうちで微粒子のサブセットが含まれる部分であって、そのサブセットには独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する複数の微粒子が含まれており、その複数の微粒子によって、支持体上に配置されたすべてのプローブ分子の一部が提示されるようになっている部分を意味する。アレイは、一般に、異なる2つ以上のサブアレイを含んでいる。
【００１６】
この明細書では、“ランダム”または“ランダムな分布”または“ランダムに配列された”とは、本発明の方法により、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する固定化された微粒子が支持体上の自由な位置に存在していることを意味する。独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子の特定のセットまたはサブセットを考えると、そのセットまたはサブセット内における独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子の位置は、支持体上でそのセットまたはサブセットが配置されている部分においてランダムになっている。微粒子を支持体上のパターニングされた部分に向けることができる場合でも、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する個々の微粒子は、支持体の表面にランダムに固定化することが可能である。したがって微粒子は、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対に従う配置がランダムであるとはいえ、支持体上の位置に従って秩序づけることができる。この明細書ではこのような実施態様について議論する。固定化されたセットまたはサブセット内における独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子の位置は、検出ステップを実行するまで明らかにならない。
【００１７】
この明細書では、“プローブ”とは、アレイを形成するために支持体上に固定化される部分のことを意味する。一般に、本発明によれば、プローブを微粒子に結合させ、その微粒子を支持体上に固定化するため、そのプローブがアレイの一部を形成する。プローブは、特定のターゲットと特異的に相互作用する分子、粒子、細胞である。プローブとしては天然または人工の分子が挙げられ、そのままの状態で、あるいは他の種との集合体として使用することができる。一般に、プローブとターゲットの特異的相互作用は、プローブとターゲット（例えば抗体と抗原）の間に親和性相互作用を確立する化学的結合、あるいは（例えばオリゴヌクレオチドとその相補的オリゴヌクレオチドの間で）繰り返される水素結合パターンの配置に基づいて特異的相互作用を確立する化学的結合に基づいている。一実施態様では、プローブは核酸などの生物分子を含んでいる。しかしプローブとして、ターゲットと特異的に結合する他の任意の分子が可能である。例えばプローブとして、タンパク質（例えば免疫グロブリン）、細胞受容体（例えばレクチン）、これらの断片（例えばFab断片、Fab'断片）などが可能である。別の実施態様では、プローブとして細胞または粒子（例えばウイルス粒子）が可能であり、ターゲットとしては、その細胞または粒子と相互作用することのできる分子、細胞、あるいは他の粒子が可能である。
【００１８】
この明細書では、“ターゲット”とは、サンプル中に存在していると疑われる1つ以上の分子、粒子、細胞を意味する。例えばターゲットとして核酸が可能である。ターゲットは、上に具体例を示した相互作用に基づいて特定のプローブと特異的に相互作用することができる。ターゲットは、本発明の方法またはシステムにより検出および／または定量することができる。一般にターゲットは、“ターゲット・マーカー”に結合させることによって検出可能である。ターゲットは天然または人工の分子を含むことができ、それを、そのままの状態で、あるいは他の種との集合体として検出することができる。ターゲットの具体例としては、抗体、核酸、受容体、ホルモン、薬剤、代謝物、補因子、ペプチド、酵素、ウイルス粒子、細胞などが挙げられる。一実施態様では、ターゲットはサンプル中に検出される核酸を含んでいる。プローブとターゲットは、一般に特異的結合ペアのメンバーである。このペアのメンバーは互いに結合するが、他の非特異的物質とはほとんど結合しない、あるいはまったく結合しないことが知られている。
【００１９】
“サンプル”という用語は、最も広い意味で使用する。この用語には、ターゲットを含むと疑われる試料または培養物が含まれる。
【００２０】
この明細書では、“相補的”または“相補性”という用語は、核酸に関して使用する場合、中でもヌクレオチド配列（例えばプローブの核酸またはターゲットの核酸）に関して使用する場合、標準的なワトソンとクリックの塩基対を形成することのできるペア配列を意味する。例えば配列“5'-T-G-A-3'”に関しては、相補配列は“3'-A-C-T-5'”である。相補性は“部分的”でもよい。その場合、核酸の塩基のうちのほんの一部だけが塩基対の規則に従ってマッチする。逆に、核酸間の“完全な”相補性または“全体的”相補性も存在しうる。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率および強度に影響を与える。
【００２１】
“ハイブリダイゼーション”という用語は、相補的な核酸のペアに関して用いる。ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションの強さ（特に、核酸同士の結び付きの強さ）は、ペアになる核酸同士の相補性の程度、用いる条件の厳しさ、形成されるハイブリッドの融点（Tm）、核酸内の(G+C)/(A+T)の比などの因子の影響を受ける。
【００２２】
この明細書では、“核酸”とは、プリンおよびピリミジンに由来する塩基を有するポリヌクレオチド化合物の任意の集団を意味する。“核酸”という用語は、個々のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにおいて、例えば少なくとも2個のヌクレオチドが互いに共有結合した短い核酸配列の鎖に関して使用することができる。鎖の長さは一般にヌクレオチド約500個未満で、より一般にはヌクレオチド約20〜100個である。“核酸”という用語は、cDNAやPCR産物に見られるような長い核酸配列のことも意味する。それは例えば長さがヌクレオチド数百個または数千個ある配列である。本発明による核酸配列の正確なサイズは多くの因子に依存することになろう。これらの因子は、核酸の最終的な機能または用途に依存する。
【００２３】
核酸は、従来技術で現在利用可能な方法（固体支持体核酸合成、DNA複製、逆転写など）を利用して調製することができる。別の方法として、核酸は、天然の供給源から単離することもできる。核酸は適切な任意の形態（例えば一本鎖、二本鎖、核タンパク質）が可能である。核酸は、一般にホスホジエステル結合を含んでいるが、場合によってはヌクレオチドが似た骨格（例えばペプチド核酸（PNA））を持つこともできる。核酸としては、例えばジオキシリボ核酸（DNA）、相補的DNA（cDNA）、リボ核酸（RNA）、ペプチド核酸（PNA）などが挙げられる。核酸には、DNA、ゲノムのDNAとcDNAの両方、RNA、DNAとRNAの両方が含まれる。ここでの核酸には、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組み合わせが含まれる。さらに、核酸には、ウラシル、アデニン、グアニン、チミンの任意の組み合わせと、イノシン、キサンテン、ヒポキサンチンなどの塩基や、他の標準的でない塩基または人工塩基も含まれる。PNAは、生の糖リン酸DNA骨格の代わりにポリペプチドになっているDNAミミックである。
【００２４】
この明細書では、“結合”とは、少なくとも1つの結合（共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、ファン・デル・ワールス結合などがある）の形成を介して、あるいは非化学的相互作用（例えば疎水性相互作用）を介して1つの部分を別の部分に直接または間接に会合させることを意味する。例えば化合物“A”には化合物“D”を直接的に結合させることが可能であり、そのとき“A”と“D”の間には共有結合が形成される。あるいは化合物“A”には、化合物“B”と“C”の関与下で、化合物“D”を間接的に結合させることが可能である。そのとき“A”と“B”の間と、“C”と“D”の間に配位結合が存在し、“B”と“C”の間に共有結合が存在する。この説明により、2つの部分が多数の方法で互いに結合できることがわかる。そのような結合として、共有結合でない特異的親和性相互作用（例えばストレプトアビジンまたはアビジン：ビオチン相互作用、ハプテン：抗体相互作用）；疎水性相互作用；磁性相互作用；極性相互作用（例えば2つの極性表面の間またはオリゴヌクレオチド／ポリエチレン・グリコール間の“湿潤性”会合）；共有結合の形成（例えばアミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、エーテル結合、炭素-炭素結合）；他の架橋剤を通じた結合；酸不安定性リンカーを通じた結合などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。この明細書では、“結合”とは、2つの部分が一般に化学的結合を介して直接会合することを意味する。
【００２５】
この明細書では、“親水性”および“疎水性”は、水が吸引する、あるいは水が反発する組成物全般を記述するのに用いる。一般に、親水性化合物は比較的極性があってイオン化可能であることがしばしばある。そのような化合物は、通常は水分子と強く結合する。疎水性化合物は、通常は比較的非極性で非イオン性である。“疎水性”は、水に対する親和性が低いために水と容易に混合しないため、あるいは水で濡らすことが容易ではないため、一般に水をはじく材料または表面について使用する。疎水性と親水性は相対的な用語であるため、この明細書では、さまざまな組成物、液体、表面が互いに対して疎水性または親水性でありうる。
【００２６】
本発明により、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する複数の微粒子を含むアレイを用いてサンプル中のターゲットを検出する方法が提供される。本発明によれば、アレイには、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のセットまたはサブセットが含まれている。それぞれの自己コーディング・マーカー／プローブ対には、少なくとも1つの検出可能な種を含む自己コーディング・マーカーとプローブとを有する微粒子が含まれる。ただし自己コーディング・マーカーは、プローブに対応するように選択する。一実施態様では、ターゲットを含むと疑われるサンプルを処理してターゲット・マーカーをターゲットに結合させた後、ターゲット・マーカーで標識したターゲットを含むサンプルをアレイに会合させ、ターゲット・マーカーで標識したターゲットがサンプル中に存在している場合には、ターゲット・マーカーで標識したそのターゲットを、アレイに会合したプローブとハイブリダイズさせる。別の実施態様では、ターゲットをプローブに結合させた後、ターゲット・マーカーをターゲットに結合させる。その後、検出スキームを利用し、ターゲットと、自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子が会合したターゲット・マーカーとが結合したものを検出する。この検出スキームには、ターゲット・マーカーと自己コーディング・マーカーの両方を検出することが含まれる。自己コーディング・マーカーを検出するとプローブが何であるかを明らかにすることができるため、結合したターゲットが何であるかがわかる。
【００２７】
本発明によれば、アレイは、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子を支持体上にランダムに配置して固定化することによって製造する。このとき固定化材料を用い、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子を支持体上に固定化する。特定の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子がどの位置にあるかと、それがどのようなものであるかは、一般に検出ステップまでわからない。いくつかの実施態様では、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子をランダムに配置して固定化する操作は、固定化材料でパターニングした支持体の少なくとも一部の上で実行することができる。パターニングした支持体を用いて多重アレイ、サブアレイ群、あるいはその組み合わせを形成することができる。一実施態様では、支持体上に配置したポリマーを介して微粒子を支持体表面に固定化する。別の実施態様では、例えば結合ペアまたは架橋剤を介して微粒子を支持体表面に固定化する。独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のセットまたはサブセットをランダムに配置して固定化することには、アレイ製造上の利点がある。というのも、微粒子の正確な位置をあらかじめ明らかにしておく必要がないからである。さらに、微粒子を使用するとプローブを結合させるための面積が広くなる。
【００２８】
本発明では、本発明のアレイを用いてターゲットを検出する方法と、アレイの製造方法と、アレイそのものに関する。本発明では、サンプル中のターゲットを検出するためのキットにも関する。
【００２９】
本発明に従って製造するアレイは、固体支持体（この明細書では“支持体”とも呼ぶ）上に製造される。支持体は、一体となった支持体を有することが好ましい。一般に“固体支持体”または“支持体”という用語は、本発明の微粒子を固定化する2次元または3次元の表面を提供する材料を意味する。固体支持体の組成としては、微粒子を直接的または間接的に固定化することのできる適切な任意の材料が可能である。一般に、本発明の微粒子は、固定化材料を介して“支持体表面”に結合させる。支持体の組成は、固定化する個々の微粒子と、支持体上で微粒子を固定化しない領域における望ましい表面特性とに応じて変えることができる。これについてはこの明細書で後述する。
【００３０】
支持体は、プローブがターゲットと結合する能力に影響を与えないこと、大量の非特異的結合の影響を受けないことが好ましい。支持体に適した材料としては、生物材料または非生物材料、有機材料または無機材料が挙げられる。適切な固体支持体としては、プラスチック、セラミック、樹脂、多糖、ケイ素、シリカをベースとした材料、ガラス、金属、フィルム、ゲル、膜、ナイロン、天然繊維（絹、羊毛、綿など）、ポリマーなどでできたものが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。適切なポリマーとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリテトラフタル酸エチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル（PMMA）、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリプロピレン、(ポリ)テトラフルオロエチレン、(ポリ)ビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、ポリメチルペンテンなどが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。一実施態様では、支持体は、蛍光スキャナーや蛍光顕微鏡などの蛍光検出装置とともに使用するのに適した材料から製造する。この実施態様では、支持体材料が、アレイに会合している蛍光信号の検出を妨げないことが好ましい。
【００３１】
支持体は、微粒子を固定化するための一体化した表面を有することが好ましい。支持体は、“実質的に平坦”にすることができる。これは、表面が実質的に平らで、表面に凹凸がほとんどない、あるいはまったくないことを意味する。あるいは表面は、持ち上がった部分、表面の突起、エッチングした領域、窪みなどの凹凸を持っていてもよい。支持体の表面は、単一の支持体によって提供されることが好ましい。
【００３２】
支持体の大きさはさまざまなものが可能であり、アレイのサイズ、望ましいプローブの種類などの因子によって決まる。いくつかの実施態様では、支持体は、単一のアレイ、多重アレイを含むアレイ、サブアレイ群を含むアレイ、多重アレイとサブアレイ群の組み合わせを含むアレイのための表面を提供することができる。支持体上にランダムに配置された微粒子のセットまたはサブセットという構成（多重アレイまたはサブアレイ群の形態にすることができる）は、支持体表面に微粒子を固定化するのを容易にする1つまたは複数の化合物（“固定化材料”と呼ぶ）で支持体を予備コーティングまたはコーティングすることによって形成できる。この明細書では、“予備コーティング”または“コーティング”という用語は、化合物を表面に配置するプロセスを意味する。なおその化合物は、微粒子を支持体上に固定化するのに使用できる。いくつかの実施態様では、支持体を光反応基を有する化合物（例えばポリマー化合物）で予備コーティングする。光反応基を用いると、本発明のさまざまな部分を化学的結合を介して支持体に結合させることができる。光反応基の具体例は後述する。
【００３３】
本発明の微粒子は、支持体に固定化して自己コーディング・マーカーとプローブからなる部分と結合させることのできる任意の3次元構造を含むことができる。一般に微粒子は球形である。この明細書では、“球形”とは、球形、回転楕円体、丸い形、球状の形などの3次元形状を意味する。微粒子のサイズとしては、直径が約100nm〜約100μmの範囲が可能である。好ましい実施態様では、微粒子の大まかなサイズは、この明細書に記載したイメージング装置を用いて個々の粒子として検出されるサイズである。例えばイメージング装置の解像度が5μmであるならば、支持体に固定化する微粒子は10μm以上であることが好ましい。
【００３４】
本発明によれば、微粒子は適切な任意の材料から製造することができる。適切な材料としては、例えばポリマー（ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）など）；天然ポリマー（セルロース、架橋したアガロース、デキストラン、コラーゲンなど）；ガラス（細孔性ガラス（CPG）、シリカ（非多孔性ガラス）など）；金属（金、鋼鉄、銀、アルミニウム、銅、酸化鉄など）；マグネタイトなどが挙げられる。有用な微粒子は、例えばバングズ・ラボラトリーズ社、フィッシャーズ、インディアナ州から出されている『微粒子検出ガイド』に記載されている。
【００３５】
いくつかの実施態様では、微粒子が膨脹可能であって適切な溶液中に入れるとより多孔性になることが好ましい。この明細書では、“膨脹可能”とは、適切な媒体中で微粒子が拡張してより多孔性になる性能のことを意味する。したがってこの用語には、膨脹した状態の化合物または粒子も含まれる。膨脹可能な微粒子は、粒子（例えば自己コーディング・マーカーの一部となりうる検出可能な粒子）を微粒子に注入するのに役立つ。このような膨脹可能な微粒子は一般にポリスチレンまたはポリスチレンのコポリマーで構成されており、有機溶媒中で膨脹させることができる。膨脹可能な微粒子は、さまざまなタイプの検出可能材料（例えば磁性材料）を組み込むのに役立てることができる。別の実施態様では、検出可能なさまざまなタイプの材料の組み合わせを微粒子に注入することができる。
【００３６】
微粒子は市販されており、例えばバングズ・ラボラトリーズ社（フィッシャーズ、インディアナ州）、ポリサイエンシーズ社（ドイツ国）、モレキュラー・プローブズ社（ユージン、オレゴン州）、デューク・サイエンティフィック・コーポレーション社（パロアルト、カリフォルニア州）、セラディン・パーティクル・テクノロジー社（インディアナポリス、インディアナ州）、ダイナル・バイオテック社（オスロ、ノルウェー国）から入手できる。市場で入手可能な微粒子をさらに修飾し、微粒子の表面に望む自己コーディング・マーカー／プローブ部分を設けることができる。
【００３７】
本発明の微粒子は、寸法安定性や光学特性などの特性（具体的にはサイズや色）を1つ以上持つことができる。微粒子を選択し、追加の望む特性（例えば満足のゆく密度。具体的にはアレイの製造で用いる水その他の溶媒よりも大きな密度）を与えたり、微粒子を“自己コード化する”ことのできる特性を与えたりすることもできる。
【００３８】
この明細書では、“検出可能な種”とは、微粒子に会合させることのできる検出可能な部分を意味する。一般に、自己コーディング・マーカーは少なくとも1つの検出可能な種を含んでいる。
【００３９】
1つの特徴として、本発明の微粒子は“自己コード化している”と記述することができる。この明細書では、“自己コード化している”または“自己コード化された”という用語は、微粒子に付随していて、この明細書に記載した技術を利用して1つの微粒子を別の微粒子から区別することのできる独自の検出可能な特性のことを意味する。“自己コーディング・マーカー”という用語は、1つ以上の検出法で明らかにすることのできる独自の特性を微粒子に付与するのに役立つ1つの検出可能な種、または検出可能な種の組み合わせを意味する。微粒子に付随する自己コーディング・マーカーは、微粒子に自己コード化特性を付与する。本発明によれば、特定の自己コーディング・マーカーは、微粒子に会合する特定のプローブの同定子として機能する。ユーザーは、微粒子を自己コード化することにより、自己コーディング・マーカーが特定のプローブに会合した独自のマーカー／プローブ対を生み出すことができる。
【００４０】
微粒子を自己コード化するのに役立つ特性としては、蛍光、サイズ、形状、磁化率、静電特性などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。各微粒子の自己コード化特性は、微粒子に会合させる少なくとも1種類の検出可能な種（例えば蛍光化合物）に付随している。いくつかの実施態様では、自己コード化特性は、特定の微粒子に会合させる検出可能な種の組み合わせに依存する。例えば第1の微粒子には、選択した染料（例えば励起／放出の最大値が350/440nmの蛍光染料）を会合または結合させることができる。この実施態様では、この蛍光染料（350/440nm）が会合した第1の微粒子を、サンプル中に存在していると疑われる遺伝子Aの核酸と相補的なプローブ核酸配列にも結合させる。蛍光染料（350/440nm）が会合した微粒子と遺伝子Aのプローブ核酸配列は、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子を構成する。第2の微粒子には選択した別の染料を会合または結合させることができる。この染料は、励起／放出の最大値が488/520nmの蛍光染料である。蛍光染料（488/520nm）が会合したこの第2の微粒子を、サンプル中に存在していると疑われる遺伝子Bの核酸と相補的なプローブ核酸配列に結合させる。蛍光染料（488/520nm）を含む微粒子と、遺伝子Bの核酸と相補的な核酸配列は、異なる独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子を構成する。さまざまな自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する複数の微粒子を生成させて組み合わせることにより、微粒子の“セット”または“サブセット”を形成する。次に微粒子のこの“セット”または“サブセット”を支持体上に、あるいは支持体の一部の上にランダムに配置する。当業者であれば、望む蛍光染料を任意の数選択して特定の生体分子に対応させうることは明らかであろう。
【００４１】
微粒子に組み込んだり結合させたりできる他の有用なマーカーとしては、りん光体、量子ドット、放射性同位体（例えば32P、33P、35Sを含む分子）、蛍光タンパク質（例えば緑蛍光タンパク質）などが挙げられる。
【００４２】
複数の独自の自己コード化微粒子は、その中のそれぞれの微粒子について、同じ微粒子の表面に異なる自己コーディング・マーカーを組み合わせることによって生成させることができる。例えば独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子は、放出最大波長が異なる2種類以上の発蛍光団をその微粒子に組み込んだり結合させたりすることによって生成することができる。異なる発蛍光団の放出最大波長は、互いにはっきりと異なっていること、あるいは例えば帯域フィルタを用いて分離できることが好ましい。2種類以上の異なった検出可能な種（例えば発蛍光団や放射性同位体）に組み込んだり結合させたりすることによって微粒子を生成させることもできる。検出可能な種の組み合わせが異なる微粒子を調製することにより、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する多数の微粒子を調製できる。これが有効なのは、アレイがかなり多数の独自のプローブを提供するため、独自の自己コーディング・マーカーを有するかなり多数の微粒子を必要とする場合である。さらに別の実施態様では、アレイ中の微粒子は、単一の蛍光染料を含む微粒子群と、2種類以上の蛍光染料を含む微粒子群を含んでいる。
【００４３】
複数の独自の自己コード化微粒子は、その中のそれぞれの微粒子について、同じ微粒子の表面に異なる濃度の検出可能な種を組み合わせることによって生成させることもできる。放出のタイプが変化することに加え、検出可能な種の濃度が変化する結果として放出の強度も変化することで、複数の自己コーディング・マーカーにさらに変化を与えることができる。一実施態様では、5ナノモルの蛍光染料A（488/520nm）と50ナノモルの蛍光染料B（350/440nm）を微粒子Cに組み込んだり結合させたりする。微粒子Dには、50ナノモルの蛍光染料A（488/520nm）と5ナノモルの蛍光染料B（350/440nm）を組み込んだり結合させたりしてある。微粒子Cと微粒子Dには同じ蛍光染料が含まれているが、別々に検出可能である。というのも、蛍光染料AとBの放出強度が微粒子Cと微粒子Dで異なっているからである。このような蛍光染料と、これら蛍光染料の放出強度は、イメージング装置を用いて検出することができる。
【００４４】
本発明によれば、個々の自己コード化微粒子は、選択した染料のそれぞれの放出波長において平均蛍光強度から背景強度を引いた値を求めることにより、アレイ内で区別することが可能である。多数の染料でコード化された微粒子の場合には、それぞれの放出波長において平均蛍光強度から背景強度を引いた値を求めた後、それぞれの染料の最大波長における蛍光強度で割ることにより、微粒子をコード化するのに用いる個々の染料の符号を決定する。コード化用染料の独自のセットは、公式(n!/p!)(n-p)!に従って決定することができる（ただしnは染料の数であり、pは組み合わせの数である）（Michael他、1998年、Anal. Chem.、第70巻、1242ページ）。
【００４５】
適切な蛍光染料の具体例としては、インドジカルボシアニン、テキサス・レッド・カダベリン、フルオレセイン、オレゴン・グリーン488（2',7'-ジフルオロフルオレセイン）、BODIPYをベースとした染料（4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンを含む染料）、アレクサ532、Cy3、Cy5、テトラメチルローダミン、これ以外のローダミン誘導体などが挙げられるが、これだけに限られることはない。微粒子に望む蛍光染料または蛍光染料の組み合わせを結合させ、あるいは微粒子に望む蛍光染料または蛍光染料の組み合わせを染み込ませ、自己コーディング・マーカーとなる望む蛍光特性を実現することができる。
【００４６】
別の実施態様では、本発明の微粒子を自己コード化することが、微粒子に特別な光学特性を与えるナノ結晶を微粒子の表面に会合させることによって、あるい微粒子の内部に埋め込むことによって可能になる。ナノ結晶としては量子ドットが可能である。例えば微粒子の自己コード化は、さまざまなサイズの量子ドットをはっきりと異なる比で微粒子の内部に埋め込むことによって実現可能である。量子ドットは、硫化亜鉛で被覆したセレン化亜鉛、ヒ化インジウム、テルル化カドミウムなどの化合物で構成することができる。これら量子ドットの光学特性としては、一般に、大きなルミネセンス、サイズで調節可能な放出、同時励起などが挙げられる。
【００４７】
量子ドットからさまざまな蛍光が放出されるのは、一般に量子ドットそのもののサイズが原因である。蛍光放出の波長は、量子ドットのサイズを変えることによって変えられる。単一の励起波長を利用してさまざまなサイズの量子ドットを同時に励起させることができる。
【００４８】
量子ドットを微粒子に組み込むこと、あるいは量子ドットを微粒子中で互いに離しておくことができる。互いに十分に離れている量子ドットでは、一般に、蛍光共鳴エネルギーの移動が起こらない。量子ドットは、比を正確に制御した状態で微粒子の内部に組み込むこともできる。すると各微粒子において量子ドットの組み合わせと量が異なる複数の多色微粒子が生成する。
【００４９】
スチレン、ジビニルベンゼン、アクリル酸などの材料の乳化重合によって形成される微粒子は、量子ドットに組み込むのに適している。組み込まれる量子ドットを分離させることはできるが、より大きな粒子や集合体は組み込むことができない材料からなる微粒子が好ましい。量子ドットを含む微粒子を調製するとき、一般に最大サイズの量子ドットを最初に会合させ、最小サイズの量子ドットを最後に会合させる。
【００５０】
量子ドットを含む微粒子は、ポリマー材料（例えばポリシラン層）を用いてシールすることもできる。ポリマー材料は、量子ドットの光学特性を安定化させることや、サンプルを調べるときに使用する試薬への曝露を予防することができるだけでなく、温度変化から保護することもできる。
【００５１】
一実施態様では、微粒子は、選択した蛍光染料を微粒子に組み込むことによって自己コード化される。例えば微粒子は、選択した1つまたは複数の染料を含む有機溶媒の中に浸すことができる。溶媒はポリマー製微粒子を膨脹させるため、染料が微粒子のコアの内部に侵入できる。次に、過剰な溶媒を例えば真空濾過によって除去し、染料を微粒子の内部領域に捕捉する。一実施態様では、ポリ(メチルスチレン)-ジビニルベンゼン・微粒子をジメチルホルムアミドの中でリンスする。次に、ジメチルホルムアミド中に選択した染料を含む溶液を微粒子に添加し、微粒子と溶液を撹拌しながら24時間にわたってインキュベートする。膜フィルタ（例えばミリポア社（ベンドフォード、マサチューセッツ州）のもの）を用い、過剰な染料を真空濾過によって懸濁液から除去する。次に、濾過した微粒子を超音波処理し、0.01％のトゥイーン20を含む蒸留水の中で遠心分離することによって洗浄し、微粒子の外側に残っている染料を除去する。
【００５２】
蛍光性微粒子は、市販のもの（例えばモレキュラー・プローブズ社（ユージン、オレゴン州）からのもの）を入手することもできる。モレキュラー・プローブズ社は、さまざまな蛍光性微粒子をフルオスフェア（登録商標）という製品名で提供している。この蛍光性微粒子は、励起と放出の波長が近紫外から近赤外の範囲にわたるさまざまな特性の染料を会合させたポリスチレン製の微粒子である。強度が標準的なものより低いフルオスフェア（登録商標）も調製することができる。これは、多色での用途において望ましい場合がある。本発明では、別の供給先（例えばルミネックス社（オースチン、テキサス州））からの蛍光性微粒子も使用することができる。ルミネックス社は、2種類の染料を異なる強度で混合した多数の内部色彩コード化微粒子を提供している。この微粒子は、カルボキシル化コーティングまたはアビジン・コーティングなどで表面を活性化した状態で提供することができる。
【００５３】
いくつかの実施態様では、微粒子の自己コード化は、微粒子のサイズまたは形状によって実現される。サイズの差は、例えばイメージ分析器やアレイ・センサーなどの装置を用いて視覚化することができる。微粒子をサイズに従って区別するためには、微粒子のサイズの違いが、微粒子の直径を基準として50％以下ではないことが好ましい。より大きな微粒子（例えば約50μm）に関しては、サイズの差が約20％あれば十分である。微粒子は、形状（例えば球形、いびつな形）によっても区別することができる。この明細書では、いびつな微粒子は球形から区別できる形をしているため、例えばイメージ分析器、アレイ・スキャナー、顕微鏡などの装置を用いて視覚化することができる。いびつな微粒子の形としては、例えば細長いロッドのようなものが可能である。これら実施態様では、自己コーディング・マーカーが微粒子そのものの外見的性質（例えば微粒子のサイズや形状）である。
【００５４】
いくつかの実施態様では、微粒子の自己コード化は、微粒子の磁性特性または静電特性によって実現することができる。磁性微粒子は市販されており、例えばダイナル・バイオテック社（オスロ、ノルウェー国）から入手できる。静電微粒子の検出は、例えばその微粒子を帯電した表面上に置くこと、あるいは電場の中に入れることによって実現可能である。1つの有効な方法は、少なくとも1つの電極を備えるアレイ上に静電微粒子を置くことである。電極には電荷を与えることができ、微粒子が有する電荷に応じ、微粒子がその電極の電荷に引き付けられたりその電荷から反発されたりする。磁性粒子は、磁化された領域の中に置くことによって検出可能である。微粒子の磁性特性は、適切なアッセイ表面上で、あるいは磁気テープや磁気ディスクなどの読み取り装置を用いて測定することができる。
【００５５】
蛍光染料の視覚化は、従来技術で公知の適切な任意の視覚化法を用いて実現することができる。蛍光イメージングは、改良した落射式蛍光顕微鏡または共焦点蛍光顕微鏡を用いて実現することができる。適切な顕微鏡としては、例えばオリンパス社のBX60（東京、日本国）や、他の同様の顕微鏡が挙げられる。コンピュータ・ソフトウエアを用いて顕微鏡画像からの蛍光画像を分析し、その蛍光強度を求めることができる。市販されている顕微鏡法分析用ソフトウエア（例えばイメージ-プロ・プラス（バージョン4.0）（メディア・サイバネティクス社、L.P.、シルバー・スプリング、メリーランド州））を光学的検出システムとともに用いると、蛍光信号を自動的に見つけ出してカウントすることができる。別の方法として、蛍光走査法を利用して自己コーディング・マーカーを有する微粒子を視覚化することもできる。視覚化には蛍光スキャナーとして解像度が約5μmのスキャン・アレイ5000（GSIルモニクス社、ビレリカ、マサチューセッツ州）やアクソン社のジーンピックス4000A（フォスター・シティ、カリフォルニア州）などを用いることができる。
【００５６】
この明細書を読んだ当業者にとって、1つのアレイに上記の検出可能な種を組み合わせた複数の微粒子を含めうることは明らかであろう。例えば単一のアレイにおいて、蛍光染料、外見的性質（サイズや形状など）、磁気特性、静電特性から選択した2つ以上の特別なタイプの検出可能な種を利用できる。検出可能な種の特定の組み合わせは、ユーザーが利用できる視覚化技術と装置に基づいて選択することができる。
【００５７】
いくつかの実施態様では、自己コード化微粒子の“セット”を生成させることが有効である。自己コード化微粒子“セット”のメンバーは、この明細書に記載した検出法を利用して互いに容易に区別できることが好ましい。自己コード化微粒子セットは、約2個〜10,000個の異なる自己コード化微粒子を含むことができるが、約50個〜200個の異なる自己コード化微粒子を含むことが好ましい。異なる自己コード化微粒子からなるセットを用い、後述する方法によって単一の支持体上に多重アレイまたはサブアレイ群を形成することができる。いくつかの実施態様では、微粒子セットをプローブ分子の“サブセット”に結合させることができる。
【００５８】
いくつかの実施態様では、微粒子の表面を官能性し、1つ以上のプローブを微粒子に結合させるための“反応基”、1つ以上の検出可能な部分を微粒子に結合させるための“反応基”、微粒子同士を互いに結合させるための“反応基”、微粒子を固定化材料または支持体に結合させるための“反応基”を設ける。適切な反応基は、微粒子に会合する部分の性質に応じて選択することができる。適切な反応基の具体例として、カルボン酸、スルホン酸、リン酸、ホスホン酸、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、チオール反応基、エポキシド基などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。例えば、水溶性カルボジイミド試薬を用いてタンパク質やそれ以外のアミン含有分子を共有結合させるのにカルボキシル官能化微粒子を使用することができる。穏やかな条件下で微粒子をタンパク質やそれ以外のアミンに結合させるのにアルデヒド官能化微粒子を使用することができる。微粒子をさまざまなアミン反応部分（ハプテンや薬剤のスクシンイミジルエステルとイソチオシアナート、タンパク質のカルボン酸）に結合させるのにアミン官能性微粒子を使用することができる。別の実施態様では、ユーザーが受動的にタンパク質（ウシ血清アルブミン（BSA）、IgG、アビジン、ストレプトアビジンなど）を吸収させたい場合に硫酸塩で修飾した微粒子を使用することができる。別の実施態様では、反応基として、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインAなどの結合基が挙げられる。官能性微粒子は、モレキュラー・プローブズ社（ユージン、オレゴン州）を始めとする多数の供給源から入手することもできる。
【００５９】
いくつかの実施態様では、架橋剤を用いて微粒子を他の部分と結合させることができる。例えばピアース・ケミカル社（ロックフォード、イリノイ州）から入手できる市販の架橋剤を用いると、例えばタンパク質のアミノ基を介して微粒子を互いに結合させることができる。有効な架橋剤としては、ホモ二官能架橋剤とヘテロ二官能架橋剤が挙げられる。コーティングした微粒子で使用できる架橋剤の具体例を2つ挙げると、スベリン酸ジ-スクシンイミジルと1,4-ビス-マレイミドブタンであるが、これだけに限られるわけではない。
【００６０】
本発明によれば、アレイは、支持体と、その支持体に固定化されていて、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する複数の微粒子とを備えている。この明細書に記載してあるように、プローブは、特定のターゲット（例えば独自の配列を有する核酸）を認識することのできる部分を含んでいる。別の実施態様では、プローブは、粒子、細胞、細胞の一部のいずれかを含んでいる。当業者であれば、この明細書の記述をもとに、アレイを製造するのに望ましいプローブ、あるいは望ましいプローブのセットを選択することができる。一般に、プローブは生物分子を含んでいる。
【００６１】
一実施態様では、プローブは核酸であり、アレイは、複数の異なった核酸（異なる核酸配列を有することを特徴とする）に結合する複数の独自の自己コード化粒子を含んでいる。微粒子に結合する核酸プローブは任意の長さでよいが、少なくともヌクレオチド6個の長さであることが好ましい。より好ましいのは、核酸プローブの長さがヌクレオチド8個〜200個になっていることであり、最も好ましいのは核酸プローブの長さがヌクレオチド12個〜50個になっていることである。
【００６２】
別の実施態様では、プローブとしてタンパク質分子またはタンパク質分子複合体が可能であり、アレイには独自の自己コーディング・マーカーを有する複数の微粒子が含まれる。微粒子は、それぞれのタンパク質分子がサンプル中に存在している可能性のあるターゲットに対する親和性を有する複数の異なったタンパク質分子またはタンパク質分子複合体にも結合する。タンパク質分子としては、例えば、ターゲットがサンプル中に存在している場合にそのターゲットまたはターゲットの一部を特異的に認識する抗体が可能である。したがってアレイは、さまざまな抗体分子に結合する複数の自己コード化微粒子を含むことができる。なおそれぞれの抗体分子は、サンプル中に存在している可能性のある特定のターゲットに対する親和性を有する。タンパク質プローブとしては、例えば、細胞表面受容体、細胞表面リガンド、別の分子と特異的に相互作用する細胞内タンパク質などが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。
【００６３】
いくつかの実施態様では、自己コード化微粒子の“セット”は、すでに説明したようにして調製することができ、その“セット”の各メンバーは、独自のプローブ分子に結合させることができる。いくつかの実施態様では、プローブ分子の数がセット内の個々の自己コード化微粒子の数をはるかに上回る場合、自己コーディング・マーカー／プローブ対の“サブセット”を生成させることができる。以下の具体例は、自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを調製する方法についての説明である。一実施態様では、独自な自己コード化微粒子のバッチを100個含む自己コード化微粒子のセットと、5000個の独自なプローブ核酸分子を含むプローブ分子のセットを調製する。5000個のプローブ分子をプローブのサブセット50個に分割する。それぞれのサブセットにはプローブが100個含まれる。自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子の1つのサブセットは、自己コード化微粒子のセットの1つのメンバーにプローブ・サブセットの1つのメンバーを個別に結合させることによって調製する。自己コード化微粒子のセットを繰り返し使用し、自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを50個生成させる。アレイを製造するには、自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子を含む50個のサブセットのそれぞれを、支持体上の所定の位置に互いに離して配置するとよい。特定の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子の検出は、微粒子上の検出可能な種の特徴と、支持体上のサブセットの位置の両方に基づいて行なう。
【００６４】
いくつかの実施態様では、プローブ分子の共通特性に基づき、自己コーディング・マーカーを有する微粒子をサブセットに分類するとよい。例えば、明らかにプローブに結合するターゲットの組織特異的発現または疾患特異的発現に基づき、自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを生成させるとよかろう。サブセットは、プローブ内で反応する分子のタイプまたはクラスをもとにして構成することもできる。そのような分子としては、転写因子（例えばリプレッサや活性化物質）や細胞表面の因子（例えば受容体）がある。
【００６５】
すでに説明したように、独自の自己コーディング・マーカーを有する微粒子は独自のプローブに結合する。一般に、個々の微粒子は、複数の同じプローブ分子と結合する。同じプローブ分子の多数のコピーを1個の微粒子上に用意することにより、アレイの感度を増大させることができる。例えばターゲットがプローブに結合すると、より大きな信号対雑音比が実現する。
【００６６】
それぞれの微粒子に対して提供されるプローブ分子の数は、望む効果を実現するためにユーザーが調節することができる。微粒子上のプローブ分子（例えばオリゴヌクレオチドまたはタンパク質からなるプローブ分子）の密度は、直径1μmの微粒子1個につき、プローブ分子1〜260,000個の範囲が可能である。直径1μmの微粒子1個につき、一般に40,000〜50,000個のプローブ分子が固定化される。したがって微粒子上のプローブ分子の量は、使用する微粒子のサイズにも依存する可能性がある。しかし例えば微粒子の供給源と調製方法に応じ、個々の微粒子に結合するストレプトアビジンの量と、微粒子に結合するプローブ分子の量は、変化してもよい。本発明の方法によれば、アレイ表面に存在するプローブ分子の密度は、従来のアレイ製造法よりも正確に制御することができる。
【００６７】
プローブ分子は、一般に、微粒子を支持体に堆積させて支持体に会合させる前に微粒子と結合させる。例えばプローブは、適切な液体媒体（例えばリン酸緩衝溶液）中で微粒子と結合させることができる。微粒子を堆積させる前にプローブを微粒子に結合させることは、アレイの製造にとって好ましい可能性がある。例えば平坦な表面を有する従来の支持体にプローブを結合させるよりも高密度でプローブを微粒子に結合させることができる。これは、この明細書に記載した任意の結合法を利用して実現することができる。微粒子が望むタイプのプローブと望む量で結合すると、このようにして調製した微粒子を支持体に会合させて支持体に結合させることができる。このようにして調製した微粒子の結合により、プローブがサンプル中に存在する適切なターゲットと結合する能力が阻害されないことが好ましい。溶液中でプローブが微粒子に結合するほうが、平坦な表面を有する従来の支持体にプローブが結合するよりも一般に効率的である。その結果、結合中にプローブが消失することが少なくなる。さらに、溶液中でプローブを微粒子に結合させる場合には、結合プロセスの自由度をより大きくすることができる。プローブの結合プロセスに特別な条件が必要とされる場合（例えば溶液中でプローブを撹拌してプローブが結合できるようにする、あるいは結合したプローブが適切に提示されるようにする場合）には、微粒子を用いることによってその特別な結合条件が満たされるようにすることができる。
【００６８】
本発明によれば、プローブは、任意の方法で微粒子と結合させることができる。例えば微粒子の表面には、上記のように反応基を設けることができる。選択した反応基が何であるかに応じ、プローブを微粒子に会合させる前にプローブを修飾すること、あるいは修飾しないことが可能である。
【００６９】
プローブを微粒子に結合させる操作は、微粒子とプローブの一方または両方に反応基を設けることによって実現できる。いくつかの反応基については微粒子の修飾に関してすでに説明した。
【００７０】
いくつかの実施態様では、プローブを微粒子に結合させる前にプローブを修飾することができる。例えば核酸を結合ペアの一方のメンバーに結合させ、微粒子をその結合ペアの他方のメンバーに結合させることができる。適切な結合ペアとしては、アビジン：ビオチン、ストレプトアビジン：ビオチン、抗体：ハプテンなどが挙げられるが、これだけに限られるわけではない。抗体：ハプテン結合ペアの具体例としては、抗ジゴキシゲニンAb：ジゴキシゲニン、または抗トリニトロフェニルAb：トリニトロフェニルなどが挙げられる。例えばビオチニル化したヌクレオチドを酵素を用いて組み込むことにより、あるいは従来法を用いてビオチンを核酸に架橋させることにより、核酸をビオチニル化することができる。次に、ビオチニル化した核酸を、微粒子の表面にあるストレプトアビジンに結合させることができる。
【００７１】
核酸をさまざまな方法で修飾して微粒子に結合させることができる。例えば核酸を修飾して3'末端または5'末端に反応部分を設けることができる。あるいは修飾した塩基を用いて核酸を合成することもできる。さらに、ヌクレオチドの3'位置と5'位置以外の位置における糖部分は、従来法で修飾することが可能である。また、核酸塩基の修飾は、例えばN7-デアザプリン・ヌクレオシドまたはN9-デアザプリン・ヌクレオシドを用いることによって、あるいはdTのC-5をリンカー・アームで修飾することによって実現できる。これについては例えばF. Eckstein編、『オリゴヌクレオチドとアナログ：実際的アプローチ』、IRLプレス社、1991年に記載されている。骨格が修飾された核酸（例えばホスホラミデートDNA）を用い、修飾されたリン酸骨格が提供する窒素中心に反応基が結合できるようにすることが可能である。
【００７２】
プローブ（例えば核酸）の修飾によってそのプローブまたは核酸がそれと相補的な相手にハイブリダイズする能力が実質的に阻害されないことが好ましい。核酸の場合には、修飾によってワトソン-クリックの塩基対にとって重要な核酸の機能が実質的に変化するのを阻止できるようになっていることが好ましい。
【００７３】
一実施態様では、1つ以上の光反応基をプローブ核酸に対し、例えば骨格に沿って、あるいはその3'末端または5'末端に、ランダムに会合させる。例えばヌクレオチド上に存在していて核酸を構成する塩基は、塩基との結合に適した光反応基と熱化学的反応基の両方を有するヘテロ二官能光反応性化合物を用いて誘導体化することのできる多数の反応基を備えている。この実施態様では、この明細書に記載した熱化学的反応基を用い、核酸上に存在する反応基を介して光反応基をプローブに結合させることができる。一般に、この方法により、骨格に沿っての位置と、核酸分子1個あたりの光反応基の数の両方に関し、核酸の誘導体化が比較的非選択的になされる。
【００７４】
別の実施態様では、オリゴヌクレオチドを合成し、そのオリゴヌクレオチドの特異的部位（例えば骨格に沿った位置、あるいは3'末端または5'末端）に化学的反応基を組み込むことができる。例えばオリゴヌクレオチドのこれら位置の任意のところにアミノ基を組み込むことのできる市販の試薬または固体支持体が利用可能である。次に、熱化学的反応基を有する光反応性化合物とアミノ基をこの明細書に記載したようにして反応させると、アミド結合が光反応基とオリゴヌクレオチドの間に形成される。他の求電子種や求核種でも似たような結合法を提供することができる。
【００７５】
別の実施態様では、オリゴヌクレオチドの合成に一般に使用される1つ以上のヌクレオチド構成ブロックそのものを、光反応基を含む試薬をそのヌクレオチドの残基上に存在する反応性官能基の1つに会合させることにより、誘導体化することができる。得られる誘導体化されたヌクレオチド試薬を通常の反応条件下で自動化された合成装置の中で使用すると、オリゴヌクレオチドの鎖に沿った指定位置に、あるいはオリゴヌクレオチドのいずれかの末端に光反応基を組み込むことができる。さらに、化学的反応基を組み込むのに使用される市販の非ヌクレオチド試薬を光反応性化合物と反応させ、光反応基を組み込むことができる。その後その試薬を自動化した合成装置の中で使用し、光活性化可能な核酸を調製することができる。
【００７６】
核酸の修飾にはさまざまな試薬を利用することができる。別の実施態様では、光誘導体化されたヌクレオチドを合成し、酵素技術を利用してその光誘導体化されたヌクレオチドを核酸に組み込むことができる。例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン（DIG）で核酸を標識するのに使用できるさまざまな試薬を利用することが可能である。末端基転移酵素を用いて光反応性のジデオキシリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドで核酸に標識し、その核酸の3'末端に1個または複数の光反応基を設けることができる。例えば、DNAにDIG-11-UTPでランダム・プライミング法により標識するのに用いる“DIG-ハイ・プライム”と呼ばれるDIG標識キットも利用可能である。“ビオチン・ハイ・プライム”（ベーリンガー・マンハイム社）と“フルオレセイン-ハイ-プライム”という製品も利用できる。同様に、クレノウ酵素を利用し、光反応性デオキシリボヌクレオチドを含むDNAをランダム・プライマー法で合成することができる。
【００７７】
光反応基をオリゴヌクレオチドに組み込むのに酵素であるDNAポリメラーゼIを用いることもできる。光反応性デオキシリボヌクレオチドをデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs）混合物の中に含めることにより、得られる重合産物が1つ以上の光反応基を長さ方向に沿って含むことになる。さらに、増幅産物を標識するため、光反応性デオキシリボヌクレオチドをdNTPの混合物の中に含めたものをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の間に用いることができる。例えばRNAポリメラーゼ（SP6やT7など）と標準的な転写プロトコルを用いて光リボヌクレオチドをRNAに組み込むことも可能である。
【００７８】
別の方法として、ポリペプチド（例えばタンパク質）を微粒子に受動的に吸収させた後、必要に応じて微粒子に架橋させることができる。ポリペプチドは、そのポリペプチドの疎水性部分と微粒子が最も強く相互作用するのを促進する条件下で微粒子に吸収されることが好ましい。
【００７９】
一般にアレイは、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する複数の微粒子を支持体の表面に配置し、その微粒子を支持体上に固定化させることによって製造される。微粒子の固定化は、微粒子を支持体表面に結合させうる固定化材料を提供することによって実現できる。
【００８０】
この明細書では、“固定化材料”とは、微粒子を支持体表面に固定化するのに用いられる化合物を意味する。いくつかの実施態様では、固定化材料として、支持体表面と微粒子の両方に直接接触する架橋剤やポリマー材料などの単一の化合物が可能である。別の実施態様では、固定化材料を少なくとも2種類の化合物にすることができる。それは例えば結合ペアの2つのメンバーである。2種類以上の化合物が固定化材料に含まれる場合には、それらの化合物が順番に相互作用して微粒子を支持体の表面に結合させる。好ましい一実施態様では、反応性固定化材料（RIM）を用いて支持体を微粒子に結合させる。反応性固定化材料としては、化学的反応基（例えば光反応基）または熱的反応基が挙げられる。一般にこれら反応基は、適用された媒体（光や熱など）に応答する。これらの基を活性化させることにより、処理可能な固定化材料を、支持体、微粒子、あるいは他の望ましい部分に結合させることができる。
【００８１】
一実施態様では、支持体を有機シラン材料で予備コーティングすることができる。有機シラン材料での予備コーティングは、他の固定化材料との結合を形成しうる支持体表面を提供するのに有効である可能性がある。この実施態様では、微粒子を会合させる前に支持体を清浄にする、あるいは予備処理する、あるいは清浄にして予備処理する。支持体（例えば顕微鏡用ソーダ石灰ガラス・スライド）をアセトン中の1％のp-トリジメチルクロロシラン（T-シラン）と1％のn-デシルジメチルクロロシラン（D-シラン、ユナイテッド・ケミカル・テクノロジーズ社、ブリストル、ペンシルヴェニア州）の混合物に1分間にわたって浸すことにより、この支持体をシランで処理する。空気乾燥させた後、支持体をアセトンで洗浄し、次いで蒸留水の中に浸す。支持体を炉の中で5〜10分間にわたってさらに乾燥させる。他の予備処理ステップまたは洗浄ステップは、この明細書を見れば明らかであろう。オプションとして、支持体の一部を化合物で予備処理し、異なる表面特性を有する領域（例えば疎水性または親水性が異なる領域）を設けることができる。
【００８２】
別の実施態様では、この明細書の説明から明らかなように、支持体の予備処理が必要ない。これら実施態様では、支持体を化合物（例えばポリマー化合物）で直接に予備コーティングすることができる。
【００８３】
別の実施態様では、ポリマーを用いて微粒子を支持体上に固定化することができる。この実施態様では、微粒子を配置するステップの前またはこのステップの間に、支持体を適切なポリマーでコーティングする。適切なポリマーとして合成ポリマーが挙げられる。合成ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリエチレン・グリコール、ポリビニル・アルコール、ポリ(HEMA)、これらのコポリマー、これらポリマーとコポリマーの任意の組み合わせが挙げられる。天然ポリマーや天然ポリマーの組み合わせも使用できる。天然ポリマーとしては、多糖（例えばポリデキストラン）、グリコサミノグリカン（例えばヒアルロン酸）、ポリペプチド（例えば可溶性タンパク質であるアルブミンやアビジン）などが挙げられる。天然化合物と合成化合物の組み合わせも使用できる。上記のポリマーとコポリマーも反応基（例えば熱反応基や光反応基）で誘導体化することができる。
【００８４】
好ましい実施態様では、少なくとも1つの光反応基を含むポリマー（この明細書では“光反応性ポリマー”と呼ぶ）またはコポリマーで支持体をコーティングする。このような光反応性ポリマーは、光反応基で官能性モノマーを重合させることによって調製できる。別の方法として、光反応性ポリマーは、光反応基で官能性モノマーと別の非官能性ポリマーとを重合させて形成することもできる。この場合には光活性化可能なコポリマーが形成される。
【００８５】
この実施態様によれば、光反応基をポリマーに設けることができる。この明細書では、“光反応性ポリマー”は1つ以上の“光反応基”を含むことができる。“光反応基”は、適用された特別な外部エネルギー源（例えば照射）に応答して活性な種（例えばニトレン、カルベン、励起したケトン状態などの活性種）を生成させる1つ以上の反応部分を含んでいる。その結果、ターゲットとする隣接した化学構造に対する共有結合が形成される。このような光反応基の具体例はアメリカ合衆国特許第5,002,582号（Guire他、本発明の譲受人によって所有されている）に記載されており、その内容が全体としてこの明細書に組み込まれているものとする。光反応基は、電磁スペクトルのさまざまな部分（一般にはスペクトルの紫外光、可視光、赤外光の部分）に応答するように選択できる。“照射”は、電磁照射を表面に与えることを意味する。
【００８６】
光反応性アリール・ケトンは光反応性ポリマー上の好ましい光反応基である。光反応性アリール・ケトンとしては、例えばアセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン、アントロン様複素環（すなわちアントロンの複素環アナログであり、例えば10位にN、O、Sのいずれかを有するもの）、あるいはこれらに関する置換された誘導体（例えば環が置換された誘導体）が可能である。好ましいアリール・ケトンの具体例としては、アントロンの複素環誘導体（アクリドン、キサントン、チオキサントン）と、その環が置換された誘導体が挙げられる。特に好ましいのは、励起波長が約360nmを超えるチオキサントンとその誘導体である。
【００８７】
アジドも光反応性ポリマーの表面にある光反応基の適切なクラスである。アジドとしては、アリールアジド（C6R5N3）（例えばフェニルアジド、中でも4-フルオロ-3-ニトロフェニルアジド）、アシル・アジド（-CO-N3）（例えばアジドギ酸エチル、アジドギ酸フェニル）、スルホニル・アジド（-SO2-N3）（例えばベンゼンスルホニル・アジド）、ホスホリル・アジド（(RO)2PON3）（例えばジフェニルホスホリル・アジド、ジエチルホスホリル・アジド）などが挙げられる。
【００８８】
ジアゾ化合物は、光反応性ポリマーの表面にある光反応基の別の適切なクラスである。ジアゾ化合物としては、ジアゾアルカン（-CHN2）（例えばジアゾメタン、ジフェニルジアゾメタン）、ジアゾケトン（-CO-CHN2）（例えばジアゾアセトフェノン、1-トリフルオロメチル-1-ジアゾ-2-ペンタノン）、ジアゾアセテート（-O-CO-CHN2）（例えばジアゾ酢酸t-ブチル、ジアゾ酢酸フェニル）、β-ケト-α-ジアゾアセテート（-CO-CN2-CO-O-）（例えば3-トリフルオロメチル-3-フェニルジアジリン）、ケテン（-CH=C=O）（例えばケテン、ジフェニルケテン）などが挙げられる。
【００８９】
光反応基の具体例を表1に示す。
【００９０】
【表１】
2005506527.tif 000002
【００９１】
いくつかの実施態様では、光反応性ポリマーに光反応性コポリマーが含まれる。ポリマーまたはコポリマーは、例えばポリアクリルアミド骨格を含むこと、あるいはポリエチレンオキシドをベースとしたポリマーまたはコポリマーであることが可能である。光反応性ポリマーおよび光反応性コポリマーの具体例として、ビニルピロリドンとN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド（BBA-APMA）のコポリマーが挙げられる。別の具体例は、アクリルアミドとBBA-APMAのコポリマーである。光反応基と、ポリマーに対するその光反応基の会合の別の具体例は、この明細書の説明の中に見いだすことができる。支持体の表面に微粒子を固定化させることのできるこの明細書に記載した材料を利用し、多彩な光反応性ポリマーと光反応性コポリマーを合成できることがわかる。
【００９２】
光反応性ポリマーの光反応基によって支持体と光反応性ポリマーの間に共有結合を形成することができ、その結果としてそのポリマーを支持体の表面に結合させることができる。光反応性ポリマーの光反応基は、近傍のポリマー鎖に対して架橋させるのにも役立つ。すると微粒子を固定化させるのに役立つポリマー鎖が共有結合で架橋したネットワークが形成される。いくつかの実施態様では、非光反応性架橋剤を用い、架橋したポリマー鎖の形成を促進することができる。使用する架橋剤（例えばビス-アクリルアミド）は、ポリマー鎖の上に存在している光反応基の位置と数に応じて異なる可能性がある。
【００９３】
ポリマー・マトリックスを形成する際、ポリマーを支持体に会合させた後に処理を行なってそのポリマーを架橋させることができる。一実施態様では、微粒子とポリマーを含むスラリーを支持体上に配置した後、例えばポリマーの反応基を活性化させる処理をポリマーに対して行なってポリマーを架橋させる。
【００９４】
スラリーにはさまざまな濃度のポリマーが存在していてよいが、一般に濃度は、微粒子の固定化が可能な十分に大きな値でなくてはならない。ポリマーの濃度も使用する微粒子のサイズに依存する可能性がある。ポリマー・マトリックスの中に微粒子を安定に捕捉するには、ポリマーの濃度は例えば1.0μmの微粒子に関して少なくとも0.625mg/mlである。
【００９５】
別の実施態様では、結合ペアのメンバー（例えば結合パートナーAとB）を用いて微粒子を支持体の表面に結合させることができる。結合ペアの一方のメンバーは支持体上の望む位置に結合させることができ、結合ペアの他方のメンバーは微粒子に結合させることができる。結合ペアのメンバーと支持体または微粒子の間の相互作用は、共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、あるいはこれらの組み合わせによって実現することができる。結合ペアのパートナー（例えば結合パートナーAとB）の具体例を表2に示してあるが、これだけに限られるわけではない。
【００９６】
【表２】
2005506527.tif 000003
【００９７】
本発明の部分を結合させる別の方法は、Chumura他（2001年、Proc. Natl. Acad. Sci.、第98巻、8480ページ）が記載しているように、化学的相互作用と親和性相互作用を組み合わせること（この明細書では“化学-親和性”相互作用と呼ぶ）である。結合の特異性が大きくて解離定数が無視できるほど小さい結合ペアは、反応して共有結合を形成する基をそのペアの親和性結合部位の近傍において用いてその結合ペアの各メンバーを官能性することによって作り出せる。例えば官能性各メンバーの置換基は、例えばマイケル添加または求核置換によって反応して共有結合（例えばチオエーテル結合）を形成することができる。抗原：抗抗原抗体のペア、互いに相補的な核酸、炭水化物：レクチンのペアは、官能性して化学的-親和性結合ペアを提供することのできる結合ペアの具体例である。
【００９８】
別の実施態様では、支持体上に固定化材料を配置し、必要に応じてそれをさらに処理し、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のセットまたはサブセットが支持体上にランダムに配置されるようにする。
【００９９】
一実施態様では、支持体表面の全体または一部を反応性固定化材料でコーティングし、その反応性固定化材料を処理して固定化材料を支持体に結合させる。例えば光反応性ポリマーを支持体にコーティングして照射を行ない、支持体と光反応性ポリマーの間に共有結合を形成する。別の実施態様では、結合ペアの一方のメンバー（例えばビオチン）を、ビオチンと反応する化学基が存在するように修飾した支持体表面に配置する。するとその化学基がビオチンを表面と結合させる。ストレプトアビジンに結合した微粒子は、ビオチンが結合した表面に固定化させることができる。この実施態様で使用可能な結合ペアのメンバーの具体例を表2に示してある。さらに別の実施態様では、架橋剤を支持体にコーティングし、その架橋剤を用いて微粒子を支持体に結合させる。いくつかの実施態様では、固定化材料の濃度を調節し、望む量の固定化材料が支持体表面に提供されるようにすることもできる。これは、結合した固定化材料の量によって微粒子同士の間隔が制御されるアレイ表面を提供するのに好都合である可能性がある。これら実施態様では、固定化材料でコーティングした支持体上に微粒子を配置し、その固定化材料を介して微粒子を支持体上にランダムに固定化することができる。
【０１００】
別の実施態様では、固定化材料のパターンを支持体上に形成し、支持体上で固定化材料が存在している場所に微粒子が結合できるようにすることが可能である。支持体上に固定化材料のパターンを形成すると、微粒子の多重アレイまたはサブアレイ群を含む支持体を製造するのに役立つ可能性がある。支持体上に形成された固定化材料のパターンは、任意の形状またはサイズのものが可能である。図1に示したように、固定化材料は、支持体の表面上で多数の正方形にパターニングすることができる。すると固定化材料110の“パッチ群”が形成される。微粒子を支持体上に配置したとき、微粒子がパッチ上またはパッチ内に固定化される。
【０１０１】
パターンは、さまざまな方法で表面上に形成することができる。図1に示したように、一実施態様では、光反応基を有する固定化材料（IM）で支持体102をコーティングし、光反応性IMでコーティングされた支持体104を形成することができる。光反応性IMでコーティングされた支持体104の上にマスク106を置いた後、光源に曝露して光反応基を活性化させ、固定化材料を支持体上でマスク106に保護されていない領域に結合させる。結合しない光反応性IMは、例えば洗浄ステップによって除去することができる。その結果、結合した固定化材料のパッチ110を含むパターニングされた支持体108が得られる。この実施態様では、好ましい光反応性固定化材料は光反応性ポリマーであり、具体的には、ビニルピロリドンとN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド（BBA-APMA）のコポリマー；あるいはアクリルアミドとBBA-APMAのコポリマーが挙げられる。
【０１０２】
図2に示した別の実施態様では、マスク106を支持体102の上に置いた後、固定化材料（IM）をスプレーして支持体104の表面と反応させる。マスク106を除去して固定化材料のパターンを残すことができる。すると結合した固定化材料のパッチ120を含むパターニングされた支持体118が得られる。固定化材料が反応基を含んでいる場合には、パターニングされた支持体118を処理することができる。
【０１０３】
パターニングされた支持体を用い、サブアレイ群または多重アレイを含むアレイを製造することができる。図3に示した一実施態様では、サブアレイを含むアレイの製造方法が示してある。図3aには、検出可能な種のさまざまな組み合わせを微粒子に結合させることによる自己コード化微粒子セットの調製方法が示してある。図3aの自己コード化微粒子セットは、100種類の異なる自己コード化微粒子を含んでいる。しかしこのセットは、自己コード化の異なる組み合わせの数によって決まる任意の数の自己コード化微粒子を含むことができる。図3aと図3bには、プローブの2つの異なる“サブセット”が示してある。各サブセットは一般に異なるプローブ群を含んでいるが、サブセット同士の間でプローブの重複があってもよい。この実施態様では、図3aからの自己コード化微粒子を図3bからのプローブに結合させ、図3dに示したように、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを生成させる。独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する別のサブセットは、図3aの微粒子セットを図3cのプローブ・サブセットと結合させることによって生成させる。自己コーディング・マーカー／プローブの組み合わせを有する微粒子のサブセットは、任意の数だけ調製することができる。一般に、アレイ上に提示するサブセットの数は、独自のプローブ分子の数によって決まる。
【０１０４】
自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを調製するとき、このセットのメンバーを互いに混合し、パターニングされた支持体128に配置することができる。微粒子のサブセットを配置するには、許容可能な任意の方法を用いることができる。例えばピン印刷または針を用いた会合法が利用される。
【０１０５】
この実施態様では、固定化材料のパッチを含むパターニングされた支持体128をこの明細書で説明した任意の方法で製造することができる。好ましい方法は、光反応性ポリマーのパターンを有する支持体を用意することである。自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する混合微粒子のサブセットは、パターニングされた支持体128の別々のパッチ上に個別に堆積させることができる。第1のサブセットからの微粒子（図3d）は、支持体上の第1のパッチ124上に配置され、パッチ124上のサブアレイを形成する。このパッチにおけるサブセットの微粒子はランダムに分布している。ランダムに分布した微粒子122の一例が示してある。第2のサブセットからの微粒子（図3e）は、別の第2のパッチ130上に配置することができる。一般にパッチは、コーティングされていない支持体の縁126によって互いに分離される。この縁126の幅は、少なくとも個々の微粒子122の直径と同じであることが好ましく、より好ましいのは微粒子の直径の少なくとも2倍になっていることである。
【０１０６】
独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを堆積させるプロセスを繰り返すと、あるいはこの方法を同時に複数の場所で実行すると、望む数のサブアレイを有する支持体を提供することができる。一般に、堆積されたサブセットまたはパターンの位置を記録し、検出ステップのときにプローブが何であるかに関する情報をユーザーに提供する。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを2回以上支持体に堆積させ、多重サブアレイを有するアレイを製造することができる。
【０１０８】
図4に示した別の実施態様では、固定化材料を支持体130上でパターニングし、望む数の微粒子が収容されるようにサイズを決めた複数のパッチが提供されるようにする（例えばパッチ1つにつき微粒子1個）。自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子セットを配置するとき、個々の微粒子を支持体上で空間的に離すことができる。支持体上の微粒子の大部分は互いに離れていることが好ましい。それは、図示した微粒子が1個のパッチ132である。しかし微粒子のないパッチ134、微粒子が2個のパッチ136、微粒子を3個以上含むパッチも示してある。
【０１０９】
図5は支持体の顕微鏡写真であり、パターニングされた支持体の表面に微粒子が分散している。支持体をパターニングし、パッチを作った。パッチは、パッチ1つにつき微粒子が約1個収容されるサイズにした。図6は支持体の顕微鏡写真であり、パターニングされた支持体の表面に微粒子が分散している。支持体をパターニングし、パッチを作った。パッチは、パッチ1つにつき複数個の微粒子が収容されるサイズにした。
【０１１０】
図7に示した別の実施態様では、固定化材料を支持体上でパターニングし、支持体上の所定の位置に群化した複数のパッチが提供されるようにすることができる。例えば図7aに示したように、パッチの1つの群は、支持体上の座標（Xa, Ya）に位置している。一般に、これら群は、コーティングされておらず微粒子が固定化されない支持体の縁によって分離される。この縁は、パッチ少なくとも2つ分の幅よりも広いことが好ましい。図7bに示したように、自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のセットまたはサブセットをパッチの群上に堆積させる。この実施態様では、パッチは、パッチ1つにつき約1個の微粒子が収容されるサイズにし、群内のパッチの数は、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のセットまたはサブセットの数以上にする。したがってセットまたはサブセットの全体がパッチの1つの群の中に提示される。
【０１１１】
例えばパターンは、例えば印刷ピンまたはジェット・プリンタを用いて表面に印刷することができる。好ましい一実施態様では、パターンは、支持体表面に生成されることになるそのパターンのネガ画像を有するマスクを用いて生成させる。パターン生成にマスクを利用することは、マトリックス形成ポリマーが光反応基を含んでいて、活性化された基が支持体と結合を形成してポリマーを支持体表面に結合させることのできるアレイの製造に特に有効である。
【０１１２】
さらに別の実施態様では、複数の微粒子を支持体に結合させた後、プローブ分子を備えることになる微粒子を会合させる。この実施態様によれば、複数の“非結合”微粒子を支持体に堆積させて支持体に結合させた後、1つ以上のプローブ分子に結合することになる微粒子を会合させる。非結合微粒子をこのように会合させると、支持体と、プローブ分子を備えることになる微粒子の間に中間層ができる。この実施態様によれば、この中間層によってマーカー／プローブ対が会合する表面領域が広くなるため、アレイの充填密度が増加する。非結合微粒子のコーティングで支持体表面の一部または全体を覆うことができる。さらに、“非結合”微粒子を用いると、互いに離れた微粒子上の自己コーディング・マーカーおよびターゲット・マーカーから信号を区別するための合理的な空間が得られる。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子が支持体上に固定化される間隔を変えることが望ましい場合がある。これは、望ましい任意の方法で（例えばプローブ分子を含まない微粒子を提供することによって）実現することができる。微粒子同士の間隔は、微粒子の堆積中に、溶媒中の微粒子の量に対するポリマーの量の比を変えることによって調節できることが好ましい。微粒子同士の間隔を大きくすることは、ポリマーの量を増やすことによって、あるいは微粒子の量を減らすことによって、あるいはこの2つを組み合わせることによって実現可能である。
【０１１４】
別の実施態様では、プローブ分子を含む微粒子の間隔は、“非結合”微粒子（すなわちどのプローブ分子とも結合しない微粒子）を提供することによって変えることができる。非結合微粒子をプローブ分子に結合する微粒子の数に対して適切な比となるように提供し、望む間隔を実現することができる。本発明によれば、プローブ分子を含む微粒子：非結合微粒子の比は、1：1〜1：20の範囲にすることが可能である。
【０１１５】
本発明のいくつかの実施態様では、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する特別な微粒子の多数のコピーを単一のアレイ上に提供することが望ましい可能性がある。独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のアレイ上におけるこの“冗長性”により、得られるアレイの感度を向上させることができる。というのも、プローブがアレイ上の2箇所以上に位置することになるからである。この冗長性の結果、特定のターゲットがアレイの少なくとも一部に結合できるようになる。例えば一実施態様では、アレイにおいて、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する特定の微粒子を支持体上の異なる1〜10箇所に固定化させることができる。この実施態様では、独自の自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する冗長な微粒子が会合したターゲットは、アレイ上の多数の異なる場所で検出されることになる。
【０１１６】
一実施態様では、ターゲットを含んでいると疑われるサンプルを処理してターゲットに標識する。この明細書では、“ターゲット・マーカー”とは、サンプル中に存在している可能性のあるターゲットに結合してそのターゲットの存在を明らかにするのに使用される検出可能な部分を意味する。本発明では、ターゲット・マーカーは、従来技術で標準的な方法を用いて検出できる部分を含んでいる。適切な標識の具体例は、発蛍光団、りん光体、放射性同位体であるが、これだけに限られるわけではない。
【０１１７】
検出するターゲットがRNAを含んでいる場合には、分子生物学の方法（例えばインビトロ・ランオフ転写法）においてRNAポリメラーゼ（例えばT7、T3、SP6というRNAポリメラーゼ）を用いてそのRNAターゲットを標識し、標識したRNAを生成させることができる。RNAに標識するためのキットがさまざまな供給源（例えばアンビオン社、オースチン、テキサス州）から入手できる。この方法は、例えばRNAポリメラーゼ転写を行なうのに適切なプロモータを用いてベクターにクローニングしたcDNAライブラリから標識したRNAを生成させるのに特に有効である可能性がある。標識したRNAを生成させるのに、ニックトランスレーション、PCR増幅、ランダム・プライミング、プライマー伸長などの方法を用いることもできる。これらの方法は、例えばcDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリから標識したRNAを生成させるのに特に有効である可能性がある。標識として使用するための修飾したDNAヌクレオチドも逆転写酵素反応から生成させることができる。例えば、逆転写酵素と、ポリTオリゴヌクレオチド・プライマーと、修飾したヌクレオチドとを含む反応においてRNAサンプル（例えばポリA-RNAサンプル）を鋳型として使用し、標識したcDNAを生成させることができる。DNAを標識する方法は、さまざまな技術文献に見いだすことができる。例えば『分子生物学における最新プロトコル』（Ausbel他編、1990年、グリーン・パブリケーション・アソシエイツ・アンド・ワイリー-インターサイエンス：ジョン-ワイリー社、ニューヨーク）が挙げられる。
【０１１８】
ターゲットRNAとターゲットDNAは、そのDNAまたはRNAを検出できるようにするため、修飾したヌクレオチドを用いて標識することができる。修飾したヌクレオチドとしては、例えば発蛍光団が結合したヌクレオチド（例えばフルオレセイン-5[6]-カルボキシアミドカプロイル-[5-(3-アミノアリル)ウリジン 5'-三リン酸]（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州））、ビオチンが結合したヌクレオチド（例えばN6-[N-(ビオチニル-ε-アミノカプロイル)-6-アミノヘキシルカルバモイルメチル]アデノシン 5'-三リン酸）、あるいは修飾した別のヌクレオチド（例えば5-(3-アミノアリル)ウリジン 5'-三リン酸（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州））が挙げられる。発蛍光団が結合した第2の試薬（例えばストレプトアビジン-Cy3（カルタグ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州））を用い、修飾した核酸を間接的に検出することができる。放射性ヌクレオチド（例えば32P、33P、35Sで標識したリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチド）をサンプル中に存在するターゲットDNAまたはターゲットRNAに組み込むことができる。修飾したこれらヌクレオチドを用いて別の方法で（例えば5'末端または3'末端をポリヌクレオチド・キナーゼや末端基転移酵素などの酵素で標識することにより）サンプル核酸を標識することもできる。オプションとして、修飾したヌクレオチドを核酸サンプルに結合させるためのキットおよび指示書は、例えばカルバイオケム社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から市販品として入手することができる。オプションとして、ゲル濾過、ゲル精製、スピン・カラム、選択的沈殿などの方法で標識したターゲットを精製することができる。
【０１１９】
別の実施態様では、サンプルは、タンパク質ターゲットを含むと疑われるタンパク質サンプルである。タンパク質サンプルは、組織サンプル（例えばバイオプシー）、細胞を含む液体サンプル（例えば血液や骨髄）、他の体液（例えば血漿、汗、唾液、尿）から得ることができる。タンパク質サンプルは、さまざまな方法（例えば沈殿、濾過、透析）で体液から回収することができる。細胞からのタンパク質サンプルは、洗剤の中で細胞を溶解させ、必要に応じて超音波処理や均一化などの方法を利用することによって調製できる。イオン系洗剤または非イオン系洗剤を利用することができる。そのような洗剤として、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、トリトンX-100、デオキシ塩酸ナトリウム、CHAPSなどがある。細胞はカオトロピック試薬（例えば尿素、グアニジン塩）の存在下で破壊することもできる。他の試薬として、緩衝溶液（例えばトリス、HEPES）や塩（例えばKCl、NaCl）などを洗剤またはカオトロピック試薬に添加することができる。タンパク質サンプルを安定化させる他の化合物として、例えばプロテアーゼ阻害剤（PMSF、ペプスタチン、EDTAなど）を用いることができる。しかしタンパク質を抽出するために細胞を溶解または破壊するのにさまざまな方法と緩衝組成物が利用できる。これらの方法と緩衝組成物は従来技術において公知であり、その情報はさまざまな参考文献に見いだすことができる。例えば『タンパク質の科学における最新プロトコル』（Coligan他編、1996年、ジョン・ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、ニューヨーク州）が挙げられる。
【０１２０】
タンパク質サンプルは標識することが好ましい。そのとき、タンパク質ターゲットの検出が可能になるように、また、そのタンパク質ターゲットが、微粒子と結合するプローブと相互作用する能力を保持するように標識する。発蛍光団をタンパク質ターゲット上のアミノ酸残基に結合させうる試薬を利用できる。アミン反応基として、例えばスクシンイミジルエステル（スルホスクシンイミジルエステルを含む）、イソチオシアナート、スルホニルクロリド、ジクロロトリアジン、ハロゲン化アリール、アシル・アジドが発蛍光団プローブとして利用可能であり、タンパク質ターゲットの標識に使用することができる。多彩なこれらのアミン反応性発蛍光団プローブは市販されており、例えばアレクサ・フルオア（登録商標）350カルボン酸, スクシンイミジルエステル；4,4-ジフルオロ-5-(2-チエニル)-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸, スクシンイミジルエステル（BODIPY（登録商標）558/568、SE）；6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2'-7'-ジメトキシフルオレセイン, スクシンイミジルエステル（6-JOE、SE）（モレキュラー・プローブズ社、ユージン、オレゴン州）などがある。別の状況では、タンパク質ターゲットをチオール反応性蛍光誘導体（例えばN,N'-ジダンシル-L-シスチン（モレキュラー・プローブズ社、ユージン、オレゴン州））で標識すると望ましい可能性がある。別の試薬（例えばヒドラジン基、芳香族ジアゾニウム塩、アミノ基のいずれかを含む蛍光染料）を用いてタンパク質サンプルに標識することもできる。
【０１２１】
タンパク質ターゲットは、市販されている二官能架橋剤（例えばNHS-ASA（ピアース・ケミカル社、ロックフォード、イリノイ州））を用いて蛍光タンパク質（例えば緑蛍光タンパク質（GFP））に結合させることもできる。アミノ基、スルフヒドリル基、炭水化物、カルボキシル基、ヒドロキシル基と反応する別の二官能架橋剤が市販されており（例えばピアース・ケミカル社、ロックフォード、イリノイ州）、興味の対照であるタンパク質をタンパク質ターゲットに結合させるのに使用できる。タンパク質ターゲットを1次試薬に結合させて2次発蛍光団を検出することもできる。いくつかの実施態様では、タンパク質を例えばスルホ-NHS-ビオチンで修飾した後、2次発蛍光団試薬（例えばストレプトアビジン-Cy3）に結合させることができる。
【０１２２】
検出のためにタンパク質サンプルを標識するのに別の方法を利用できる。そのような方法として、例えば125Iを用いたタンパク質ヨウ素化、32Pまたは33Pを用いたタンパク質リン酸化などがあり、リン酸化にはタンパク質キナーゼを使用することができる。
【０１２３】
ターゲットとしては、粒子（例えばウイルス粒子）、細胞の一部、細胞、細胞群の一部が可能である。これらのターゲットは、アレイ中に存在している可能性のある特定のプローブと結合可能な分子を表面に提示することができる。プローブと、ウイルス粒子、細胞の一部、細胞、細胞群の一部のいずれかに存在する分子との結合は、サンプル中に存在している可能性のあるターゲットを同定し定量するのに役立つ可能性がある。例えばアレイは、サンプル中に存在するリンパ球のさまざまなサブタイプの存在と量を明らかにする上で役に立つ可能性がある。検出のため、ウイルス粒子、細胞の一部、細胞をさまざまな方法で（例えば発蛍光団に結合した抗体で標識することによって）標識することができる。標識した抗体を選択し、ターゲットと特異的に反応させることができる。ターゲットとしては、ウイルス粒子、細胞の一部、細胞、細胞群の一部が可能である。別の方法として、蛍光染料をターゲットの一部（例えば膜）に組み込むことによってターゲットを標識することができる。そのような染料（例えばPKH-67 GL（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州））または親油性蛍光プローブCM-DiI（モレキュラー・プローブズ社（ユージン、オレゴン州））は市販されており、細胞やそれ以外のターゲットに標識するのに使用できる。
【０１２４】
当業者であれば、タンパク質を標識するのに多彩な方法が利用できることと、選択した方法が、サンプル中にあって標識のターゲットとなるタンパク質が何であるかに依存する可能性があることが理解できよう。
【０１２５】
当業者であれば、この明細書の説明をもとに、検出するターゲットが何であるかに応じて望む標識スキームを選択することができる。核酸とタンパク質について特に説明したが、この明細書の説明が、小分子などの他のタイプのターゲットを含むと疑われるサンプルを標識するのにも適用できることは明らかであろう。
【０１２６】
本発明のアレイが形成されると、サンプル中に含まれると疑われるターゲットを検出するのに使用できる。この明細書に説明したように、使用する際にはサンプルを修飾して標識されたターゲットが提供されるようにする。次に、修飾したサンプルをアレイに会合させ、プローブとターゲット（もし存在しているのであれば）の間に特異的結合（例えば互いに相補的なヌクレオチドのハイブリダイゼーション）が起こるのに適した条件下にアレイとサンプルを維持する。このような特異的結合条件は、検出するターゲットが何であるかに応じ、従来技術で公知の方法を利用して決定することができる。
【０１２７】
結合後、過剰なサンプルを例えば洗浄によって除去し、残っているハイブリダイズしたターゲットを調べることができる。本発明のアレイを用い、サンプル中に存在していると疑われる望む任意のターゲットを検出することができる。サンプルの検査には、ターゲットと微粒子の検出に使用するマーカーのタイプが何であるかに応じ、1つ以上の視覚化ステップが含まれる可能性がある。ターゲットと検出用マーカーは、同じ装置を用いてそれぞれを検出できるように選択することが可能である。例えばCCDカメラまたは適切な蛍光読み取り装置が使用できるが、必ずしもそれを使用する必要はない。
【０１２８】
一般に、本発明のアレイを用いたアッセイ結果の視覚化には1つ以上のステップが関与する。ターゲット・マーカーからの分析信号を視覚化するとともに、自己コーディング・マーカーを介して微粒子が何であるかを視覚化することにより微粒子に付随するプローブ分子が何であるかを明らかにする操作は、1つのステップまたは2つ以上のステップで実現することができる。マーカーの視覚化法は、使用するマーカーのタイプが何であるかによって異なる。
【０１２９】
一実施態様では、ターゲットに付随するターゲット・マーカーと、特定の微粒子に付随する自己コーディング・マーカーは、蛍光顕微鏡法を利用して視覚化される。この実施態様では、ターゲット・マーカーの存在は、そのターゲット・マーカー用に選択した蛍光粒子に付随する第1の波長を利用して明らかにすることができる。特定の微粒子が何であってそれがどの位置にあるかは、その微粒子に結合する自己コーディング・マーカー用またはその微粒子に組み込まれる自己コーディング・マーカー用に選択した蛍光粒子に付随する第2の波長に切り換えることによって明らかにできる。分析信号を発生させる微粒子だけを本発明に従って検出してデコードできるようになっていることが好ましい。
【０１３０】
市販されている上記の蛍光スキャナーは、異なる4つの波長を走査する能力を有する。そのため少なくとも2つの自己コード化波長と1つのターゲット蛍光波長を検出できる可能性がある。市販されている自己コード化微粒子（例えばルミネックス社が製造しているもの）は、市販されているスキャナーに共通する波長の1つである532nmのターゲット励起波長で動作するように設計されている。市販されている1つのスキャナー・システムであるパッカード・バイオサイエンシーズ社（ビレリカ、マサチューセッツ州）のスキャンアレイ5000は、励起に4つの波長（488nm、543nm、594nm、633nm）を利用することができる。単純な自己コード化微粒子システムを作るには、1つの波長（488nmが好ましい）で標識したターゲットを使用する必要があろう。というのも、多数の一般的なオリゴヌクレオチド染料（フルオレセインとそのミミック）がこの波長に存在しているからであり、自己コード化染料と重なる可能性がより小さいからでもある。次に、自己コード化染料のために少なくとも2つの別の波長を利用する。一例は、微粒子の標識を、フルオレセインとほとんど、またはまったく重ならないテキサス・レッド染料（T-6134、モレキュラー・プローブズ社、ユージン、オレゴン州、励起596nm／放出620nm）と、より長い波長の染料である例えばBODIPY630/650（D-10000、モレキュラー・プローブズ社、ユージン、オレゴン州、励起630nm／放出650nm）を用いて行なうというものである。蛍光の吸収スペクトルと放出スペクトルに基づくと、BODIPY630/650は、テキサス・レッド染料を励起する596nmの光のわずかな部分を吸収するが、488nmのターゲット波長はまったく吸収しないはずである。対応するスペクトルのプロファイルを明らかにするため、所定の比になったテキサス・レッド／BODIPY染料を用いて自己コード化微粒子のそれぞれのバッチを594nmと633nmで励起した蛍光を確認した後、マイクロアレイの構成と重なりを調べる。このシステムは、波長543nmの染料も含まれるところまで拡張できる可能性がある。というのも、この波長ではフルオレセイン誘導体が光をほとんど吸収しないからである。少なくとも2つ、場合によっては3つの異なる染料を異なる比にしてあることで、独自の自己コード化微粒子の数が、少なくとも1000個という多い数になる（それぞれの染料に10種類の異なる比）。
【０１３１】
視覚化技術としては、分光法（例えばUV/VIS、IR、蛍光、化学ルミネッセンス、質量分析）、従来技術で公知の他の方法、あるいはこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１３２】
当業者にとって、請求項に示した本発明の範囲から逸脱することなくこの明細書に記載した実施態様に対して変更を施しうることは明らかであろう。以下の実施例は本発明を説明するために提示したのであり、本発明の範囲をこれら実施例に制限することは意図していない。
【実施例１】
【０１３３】
アレイの製造において支持体を準備する際に、ポリプロピレン・スライドと、シラン処理したガラス・スライド（1×3インチ×1mm）とを用いた。顕微鏡用ガラス・スライドは、エリー・サイエンティフィック社、ポーツマス、ニューハンプシャー州（カタログ番号2950-W）から入手した。この顕微鏡用ソーダ石灰ガラス・スライドを1％v/vのp-トリルジメチルクロロシラン（T-シラン）と1％v/vのn-デシルジメチルクロロシラン（D-シラン、ユナイテッド・ケミカル・テクノロジーズ社、ブリストル、ペンシルヴェニア州）の混合物を溶かしたアセトンに1分間にわたって浸すことにより、シラン処理した。空気乾燥の後、スライドを120℃の炉の中で1時間にわたって硬化させる。次にスライドをアセトンで洗浄した後、脱イオン水に浸す。炉の中でスライドをさらに5〜10分間乾燥させる。ポリプロピレン・スライドは、キャディラック・プラスチック社（ミネアポリス、ミネソタ州）から入手した。
【０１３４】
次に、シラン処理したガラス・スライドまたはポリプロピレン・スライドをアセトンまたはイソプロパノールで洗浄した。次に、洗浄したスライドを、フォト-ポリスチレン（pPS）を1mg/mlの割合でトルエンに溶かした溶液の中で浸漬コーティングした。pPSは、3.05gのポリスチレンMW500（ポリサイエンシーズ社、ウォーリントン、ペンシルヴェニア州）を乳鉢と乳棒を用いてすりつぶした後、そのすりつぶしたポリスチレンを約50mlの二硫化炭素（オールドリッチ社、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）に溶かすことによって調製した。反応フラスコにアルゴン・ガスを流して無水雰囲気にし、溶かしたポリスチレンをそのフラスコの中に入れた。2.91gの塩化アルミニウム（オールドリッチ社、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）をこの溶かしたポリスチレンに添加した後、2.5mlの塩化ベンゾイル（オールドリッチ社、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）を一滴ずつ添加した。次に、この反応混合物をアルゴン雰囲気下で室温にて30分間にわたって撹拌した後、この混合物を12時間にわたって還流させた。次にこの混合物を冷却し、溶媒をデカントすると、反応したポリマーが残った。このポリマーをメタノール中で粉末にしたところ、黄色い固形物が形成された。この固形物をメタノールで洗浄した後、クロロホルムに溶かし、メタノールを添加することによって溶液から沈殿させた。この方法により黄色い固形物が1.16g得られた。別の方法として、スライドをベンゾイルポリスチレン（カタログ番号7917、ランカスター・シンテシス社、ウィンドハム、ニューハンプシャー州）の中で浸漬コーティングすることもできる。コーティングしたスライドを空気乾燥させ、典型的な出力が2mW/cm2のダイマックス・ライトウェルダーPC-2（ダイマックス・エンジニアリング・アドヒーシブズ社、トーリントン、コネチカット州）を用いて2分間にわたって広いスペクトルの紫外光（320〜390nm）を照射した。このランプは、スライドから約10cm離した。照射の後、スライドをトルエンでリンスし、結合しなかったpPSを除去した。次に、pPSでコーティングしたこのスライドを、5mg/mlのビオチニル化したトリブロック（ダウ・ポリグリコールB40-2500）水溶液に5分間にわたって浸した後、2分間にわたって照射を行ない、イソプロパノールの中でリンスした。pPSでコーティングした表面は、ビオチニル化したトリブロック界面活性剤と効果的に結合し、ビオチン部分が均一に分布した表面が得られた。そのことは、ストレプトアビジンでコーティングした微粒子の結合によって明らかになった。ビオチン部分が均一に分布していることは、蛍光標識したアビジン溶液を結合させ、スライド上の蛍光パターンを測定することによっても明らかになった。
【０１３５】
蛍光ブルー染料（励起／放出の最大値490/515nm）とストレプトアビジンとが結合したポリスチレン被覆磁性微粒子をバングズ・ラボラトリーズ社（製品番号CM01F；フィッシャーズ、インディアナ州）から入手した。ストレプトアビジンの濃度をビオチン共役体の結合によって測定した。製造者の測定によると、マイクロビーズ1mgにつきビオチン-アルカリホスファターゼが9.86μgと、ビオチン-FITCが0.77μgであることがわかった。微粒子は直径が0.96μm、密度が1.7g/cm3（1.305×10+12個/g）であった。調製した微粒子を、pH4.6のリン酸緩衝溶液（PBS）に0.1％のウシ血清アルブミン（BSA）と0.1％のトゥイーン20が含まれたもの（PBS-B-T）で1回洗浄した。洗浄後、微粒子を再びPBS-B-Tに分散させた。上記のようにして調製したビオチニル化したスライドを室温にて30分間にわたってPBS-B-Tに浸した。次に脱イオン水でリン酸緩衝溶液を軽くリンスして除去し、遠心乾燥させた。
【０１３６】
次に、ビオチニル化したスライドに対し、洗浄した微粒子を1mg/ml（約1.305×10+9個/ml）の濃度で添加した。微粒子とスライドを数分ごとに手で軽く三次元的に混合しながら室温にて20〜30分間にわたってインキュベートした。
【実施例２】
【０１３７】
架橋剤の存在下で支持体に微粒子を固定化することによってアレイを形成した。そのとき微粒子は親和性によって支持体に束縛され、架橋剤の存在によって互いに結合する。pPSでコーティングしたスライド（実施例1で調製したもの）と、ストレプトアビジンおよび発蛍光団でコーティングした微粒子（実施例1に記載したもの）をこの実施例で使用した。
【０１３８】
アミン反応性N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル架橋剤であるスベリン酸ジスクシンイミジル（DSS：カタログ番号21555；ピアース・ケミカル社、ロックフォード、イリノイ州）貯蔵溶液を、ジメチルホルムアミド（DMF）にDSSを濃度10mg/mlとなるように溶かすことによって調製した。次にDSS貯蔵溶液をPBSで希釈し、DSSの濃度が0.05、0.025、0.25、0.38mg/mlになるようにした。次にPBS／DSS溶液を、洗浄した微粒子の懸濁液（実施例1に記載したもの）に添加した。最終溶液中の微粒子の濃度は1mg/mlであった。DMFの最終濃度を5％未満に維持し、溶液がポリスチレン・微粒子とストレプトアビジンに対してダメージを与えないようにした。
【０１３９】
ビオチニル化したスライドに対し、PBS／DSS／微粒子混合物をスラリーとして添加した。PBS／DSS／微粒子混合物とスライドを数分ごとに手で軽く三次元的に混合しながら室温にて20〜30分間にわたってインキュベートした。このステップにより、さまざまな微粒子に共有結合しているストレプトアビジン分子にDSSが架橋することができ、したがってマイクロスフェア-微粒子結合が形成された。DSSは、ストレプトアビジン分子の利用可能な第一級アミンを利用し、同じ微粒子上のストレプトアビジン分子にも架橋した。微粒子上のストレプトアビジン分子は、スライド表面のビオチンとも親和性結合をしたが、DSSの架橋によってこの親和性結合が弱くなることはなかった。
【０１４０】
微粒子とスライドをインキュベートした後、スライドを0.1％のトゥイーン20溶液で軽く洗浄し、次いで脱イオン水でリンスする。次に、臨床用遠心分離機（ロータの直径=8cm）のスライド・ラック・ホルダの中で、スライドを500〜1000rpmの範囲の速度で遠心乾燥させる。このようにして準備した支持体を保管しておき、周囲条件で使用した。
【実施例３】
【０１４１】
まず最初に単層の微粒子を支持体上に設け、次いで次の微粒子層を設け、架橋剤の存在下で架橋させて微粒子層を支持体上に固定化することにより、アレイを形成した。pPSでコーティングしたスライド（実施例1で調製したもの）と、ストレプトアビジンおよび発蛍光団でコーティングした微粒子（実施例1に記載したもの）をこの実施例で使用した。実施例2で調製したDSS架橋剤をこの実施例で使用した。
【０１４２】
ストレプトアビジンでコーティングした微粒子を支持体に会合させてインキュベートし、ストレプトアビジンを支持体上のビオチンに対して共有結合ではなく親和性結合させた。このコーティングにより、ストレプトアビジンをコーティングされた単層の微粒子が提供される。コーティングされたこの支持体を洗浄して結合しなかった微粒子を除去した。その後、微粒子を含む溶液を、スラリーとして、ストレプトアビジンをコーティングされた単層の微粒子を含む支持体に会合させた。
【０１４３】
基質とスラリーを数分ごとに手で軽く三次元的に混合しながら室温にて20〜30分間にわたってインキュベートした。微粒子とスライドをインキュベートした後、スライドを0.1％トゥイーン20溶液で軽く洗浄し、次いで脱イオン水でリンスする。次に、臨床用遠心分離機（ロータの直径=8cm）のスライド・ラック・ホルダの中で、スライドを500〜1000rpmの範囲の速度で遠心乾燥させる。このようにして準備した支持体を保管しておき、室温の周囲条件で使用した。
【実施例４】
【０１４４】
この実施例では、支持体表面の予備処理をせずにアレイを製造した。プローブを微粒子に結合させた後、光反応性ポリマーとプローブが結合した微粒子を含むスラリーを調製することによって微粒子を調製した。次に、調製した微粒子を支持体に会合させてアレイを形成した。
【０１４５】
実施例1〜3に記載したように、ストレプトアビジンでコーティングした磁性蛍光微粒子（0.96μm）をバングズ・ラボラトリーズ社（フィッシャーズ、インディアナ州）から入手した。この微粒子を脱イオン水で2回洗浄し、25mMのリン酸緩衝溶液（pH8）の中に10mg/mlとなるように再び分散させた。
【０１４６】
ストレプトアビジンでコーティングした微粒子をオリゴヌクレオチドBN30に結合させた。BN30は、5'末端がビオチンで修飾され、3'末端がアミンになった30量体（インテグレイティッドDNAテクノロジーズ社、コラルヴィル、アイオワ州）である。結合は、5ナノモル/mlのBN30と1mg/mlの微粒子（供給者の言うビオチン結合能力からするとビオチニル化したオリゴヌクレオチドが5倍過剰）を含む25nMのPBS（pH8）を用いて実行した。コーティングした微粒子とオリゴヌクレオチドを軽く撹拌しながら室温にて30分間にわたってインキュベートした。インキュベート後、微粒子を脱イオン水で洗浄し、脱イオン水の中に20mg/mlとなるように再び分散させた。
【０１４７】
水に37mg/mlの光反応性ポリ(ビニルピロリドン)（PV01；サーモディクス社、エデン・プレリー、ミネソタ州）を含むスラリーを微粒子溶液と9：1の比で混合した（微粒子溶液をPV01で10倍に希釈）。マイクログリッドIIアレイヤー（バイオロボティクス社、ケンブリッジ、イギリス国）を用い、このスラリーをアクリル表面に、1mm2につき約16スポットの割合で印刷した。スポットの平均サイズは100μm、中心間の距離は250μmである。この印刷された支持体に対し、実施例1で説明したようにして照射を2分間にわたって行ない、PV01溶液をゲル化させた。ただしカットオフ・フィルタ（315nm）を下に取り付け、核酸がダメージを受けないようにした。照射後、0.1％トゥイーン20を含む1×PBSで支持体をリンスした。
【０１４８】
上記の方法で製造したアレイは、洗浄や接触に対して安定であった。それに対して照射を行なわなかったサンプルは安定ではなかった。蛍光走査と光顕微鏡法を利用し、微粒子の存在とその位置を明らかにした。
【０１４９】
上記のようにして製造したアレイのプローブと相補的な核酸を含むサンプルを以下のようにして調べた。実施例5で説明したようにしてターゲット核酸を含むサンプルをアレイに会合させ、インキュベートした。
【０１５０】
ターゲットは、スキャンアレイ5000蛍光スキャナー（パッカード・バイオサイエンシーズ社、ビレリカ、マサチューセッツ州）を用いてアレイ上で検出した。
【実施例５】
【０１５１】
ポリマーでパターニングした表面を有する支持体に微粒子の懸濁液を会合させることによってアレイを製造した。オリゴヌクレオチドまたは他の生体分子と結合できる親水性微粒子を水溶液中でポリマーに捕捉し、乾燥時にそのまま捕捉されたままになるようにした。ビーズの直径とほぼ同じサイズのポリマー・パターンを形成した。アレイを形成するのにサイズの広がりが100nm〜50μmの微粒子を使用できるが、好ましい広がりは約1〜50μmである。互いに離れたポリマー・スポットを形成した。ポリマー・スポット1つにつき約1個の微粒子が存在していた。
【０１５２】
この方法により、自己コード化微粒子を利用してDNAマイクロアレイを製造することができる。そのとき独自の自己コード化微粒子のそれぞれは、唯一のオリゴヌクレオチド配列と結合する。オリゴヌクレオチドが結合したさまざまな独自の自己コード化微粒子を懸濁液の中で混合すると、単一の微粒子からなるランダムなアレイが得られよう。そのとき各微粒子／スポットは異なるオリゴヌクレオチド配列を含むため、検出することができる。
【０１５３】
実施例1で詳しく説明したようにして、10mg/mlの光反応性ポリ(ビニルピロリドン)（PV01；サーモディクス社、エデン・プレリー、ミネソタ州）の水溶液を疎水性ガラス・スライドにコーティングした。PV01溶液は、スライド上で空気乾燥させることができる。次に、コーティングしたスライドに対し、構造特性が1〜100μmのオーダーであるパターニングしたマスク（ミネソタ大学で製造、ミネアポリス、ミネソタ州）を通じ、実施例5に詳しく説明した紫外光（ダイマックス・ライドウェルダー）を2分間にわたって照射した。使用したマスクは、サイズの異なるパターン（200μmのスポット、中心間の距離が500μm；100μmのスポット、中心間の距離が250μm；50μmのスポット、中心間の距離が100μm；10μmのスポット、中心間の距離が50μm）を有する4つのアレイを備えており、どのパターンもアレイの製造に使用することができる。4つのアレイのそれぞれは、大きさが7.4×7.4mm2である。
【０１５４】
照射により、PV01同士が架橋するとともに、PV01がスライドの表面に共有結合する。照射後、スライドを脱イオン水とイソプロパノールで洗浄し、過剰なPV01をパターンの非照射領域から除去した。
【０１５５】
ストレプトアビジンでコーティングしたシリカ・微粒子（カタログ番号SS06N、バングズ・ラボラトリーズ社、フィッシャーズ、インディアナ州）を1.0mg/mlの割合で含む懸濁液を、0.5MのNaCl水溶液中で上記のようにして形成したスライドのパターニングした領域に載せた。微粒子を15分間にわたって載せた後、水で軽く洗浄し、ポリマー・マトリックスの中に入らなかった微粒子を除去した。この時点で可視光顕微鏡法によって微粒子の画像を図5に示したように取得し、アレイ内に単一の微粒子が形成されていることを確認した。
【０１５６】
オリゴヌクレオチドが結合した微粒子がポリマーのパターン中に固定化されたものを用いる場合には、アレイを脱イオン水で洗浄した後、0.5％トゥイーン-20を含む1×PBSで洗浄することができる。次にアレイを4×SSCの中で45℃にて2時間にわたってインキュベートした後、脱イオン水で最終的に洗浄することができる。次に、完全に洗浄したアレイに対し、ターゲット核酸をハイブリダイズさせるための標準的なプロトコルを実施することができる。
【０１５７】
典型的なハイブリダイゼーションとしては、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝溶液（5×SSC、0.1％SDS、0.1mg/mlのサケ精子DNA）に発蛍光団が結合したターゲット核酸を33fM含む溶液をカバースリップとアレイ表面の間に1cm2（アレイ領域）につき1.5μl入れたものが挙げられる。次に、スライドをハイブリダイゼーション・チェンバーの中に入れ、水浴の中で45℃にて2時間にわたって加熱することができる。次に、カバースリップを除去するため4×SSC緩衝溶液を流し、スライドを45℃にて2×SSC／0.1％SDSで5分間にわたって洗浄した後、室温にて0.2×SSCで1分間にわたって洗浄し、最後に室温にて0.1×SSCで1分間にわたって洗浄した。次にスライドをスピン乾燥させると、ターゲットオリゴヌクレオチドを以下に説明する方法で検出することができた。
【０１５８】
蛍光ターゲットオリゴヌクレオチドは、市販されている蛍光顕微鏡（オリンパス社のBX60、東京、日本国）を用いて、あるいは共焦点蛍光顕微鏡法を利用した市販の蛍光スキャナー（パッカード・バイオサイエンシーズ社、スキャンアレイ5000、ビレリカ、マサチューセッツ州）を用いてマイクロアレイ上で検出することができる。アレイの製造に用いる微粒子は、検出装置の解像度に応じて選択することができる。現在のところ、標準的な蛍光顕微鏡を用いると、直径が1〜50μmの微粒子を検出することができる。蛍光スキャナーは、現在のところ解像度が5μm以下である。スライドの焦点面内の5μmの領域を照射する。この領域が1つの画素を表わす。単一の微粒子は、直径が約10μmであれば検出できよう。
【実施例６】
【０１５９】
さまざまなマトリックス形成材料を用いて微粒子を支持体上に固定化した。これは、さまざまな反応性ポリマーを利用したアレイの製造方法を示している。まず最初に、固定化材料を支持体の表面に提供するため、さまざまなポリマーを支持体上に配置して処理した。その後、微粒子を支持体上に配置し、処理したポリマーを介してその微粒子を固定化した。異なる4種類の光反応性ポリマーを用い、直径が9.9μmのシリカ・微粒子を支持体に固定化した。これらの光反応性ポリマーPA04、PA05、PV01、PV05はすべて、サーモディクス社（エデン・プレリー、ミネソタ州）から入手可能である。PA04とPA05はアクリルアミド（AA）とN-[3-(4-ベンゾイルベンズアミド)プロピル]メタクリルアミド（BBA-APMA）のコポリマーであるが、それぞれBBA-APMA：AAの値が異なっている。同様に、PV01とPV05はビニルピロリドン（VP）とBBA-APMAのコポリマーであるが、それぞれBBA-APMA：VPの値が異なっている。さらに、対照材料として光反応性非ポリマー化合物PR03（エチレン(4-ベンゾイルベンジルジメチルアンモニウム)ジブロミド；サーモディクス社、エデン・プレリー、ミネソタ州；Swanらに1998年2月3日に付与され、本発明の譲受人に所有されているアメリカ合衆国特許第5,714,360号；この特許の内容は、その全体がこの明細書に組み込まれているものとする）を評価した。
【０１６０】
それぞれの光反応性化合物を脱イオン水に溶かし、2.5mg/mlの濃度にした。25ゲージの使い捨て針（プレシジョングライド針、ベクトン・ディキンソン社、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）とx-yプログラム可能なステージ（CAMM-3、ローランド・ディジタル・群、アーヴィン、カリフォルニア州）を用い、それぞれの溶液を、実施例1のようにシランで官能性してある顕微鏡用ガラス・スライドの表面と、アクリル・スライド（キャディラック・プラスチック社、ミネアポリス、ミネソタ州）の表面に印刷した。この印刷により、直径が約300〜400μmの複数のスポットからなるパターンが支持体上に形成される。
【０１６１】
実施例1で詳しく説明したようにして、パターニングされたスライドに紫外光を2分間にわたって照射した。照射後、直径9.9μmのシリカ微粒子（SS06N、バングズ・ラボラトリーズ社、フィッシャーズ、インディアナ州）が2mg/mlの割合で溶けた水溶液500μlをパターニングされた領域の上に1分間にわたって載せ、微粒子がポリマー・マトリックスによって固定化されるようにした。次にスライドを0.1％v/vのトゥイーン-20水溶液でリンスし、遊離した微粒子をすべて除去した。
【０１６２】
その後、支持体を洗浄してゆるやかに結合した微粒子を除去した。0.1％v/vのトゥイーン-20を含む1×PBS（pH7.4）で支持体を3回洗浄した後、脱イオン水でリンスした。この時点でそれぞれについて蛍光顕微鏡（オリンパス社のBX60、東京、日本国）を用いて画像を取得し、さまざまな光反応性ポリマー・マトリックス中の微粒子の消失を調べた。画像取得後、支持体を50℃にてDB02洗浄緩衝溶液（サーモディクス社、エデン・プレリー、ミネソタ州）中で1時間にわたってインキュベートした後、脱イオン水で2回リンスした。次に支持体を50℃にて4×SSC／0.1％SDS溶液中で2時間にわたってインキュベートし、脱イオン水でリンスした。これが最終ステップであり、このステップにおいて、それぞれのポリマーを評価するためのイメージングを行なった。結果を表3にまとめてある。
【０１６３】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】アレイの概略図と、そのアレイの製造方法である。
【図２】アレイの概略図と、そのアレイの製造方法である。
【図３】自己コーディング・マーカー／プローブ対を有する微粒子のサブセットを調製する方法と、サブアレイの製造方法の概略図である。
【図４】アレイの概略図と、このアレイの製造方法である。
【図５】微粒子を含むアレイの一部に関する顕微鏡写真である。
【図６】微粒子を含むアレイの一部に関する顕微鏡写真である。
【図７】サブアレイの概略図と、そのサブアレイの製造方法である。
【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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