(57)【要約】バイオフィルムを生成することの出来るバクテリアが生息する表面は、クロバエ、Lucilia sericataの幼虫形態の分泌物および／または排泄物から得られるN-アシルホモセリンラクトン分解活性を有する物質と接触することによって有利に処理される。さらに、その幼虫分泌物および／または排泄物を抗生物質、例えばテトラサイクリンと組み合わせて使用した場合に相乗効果が達成される。Lucilia sericataの幼虫分泌物および／または排泄物から得られるN-アシルホモセリンラクトン分解活性を有する物質は本発明の一部を形成する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムを生成することの出来るバクテリアの生息する表面の処理方法であって、前記表面をルシリア・セリカータの分泌物／排泄物から得られる、N-アシルホモセリンラクトン分解活性を有する物質と接触させることを含む前記方法。
【請求項２】
表面が金属表面、ガラス表面およびプラスチック材料の表面から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
表面が医療器具又はインプラントである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
表面が創傷表面である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
バイオフィルムを形成することの出来るバクテリアがシュードモナス・アエルギノーサまたはスタフィロコッカス・アウレウスである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
物質が更に１以上の抗生物化合物を含む組成物として提供される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
抗生物化合物がテトラサイクリンである請求項６記載の方法。
【請求項８】
ルシリア・セリカータから単離される分泌物／排泄物またはそれらの類似物、および、１以上の抗生物化合物、を含む抗微生物組成物。
【請求項９】
抗生物化合物がテトラサイクリンである請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
活性成分として、ルシリア・セリカータの分泌物／排泄物から単離される、N-アシルホモセリンラクトン分解活性を有する物質またはそれらの類似物を、担体またはビヒクルと共に含む抗微生物組成物。
【請求項１１】
活性成分として、ルシリア・セリカータの分泌物／排泄物から単離されるセリンプロテアーゼまたはそれらの類似物を担体またはビヒクルと共に含む抗微生物組成物。
【請求項１２】
活性成分として、ルシリア・セリカータの分泌物／排泄物から単離されるグリコシダーゼまたはそれらの類似物を担体またはビヒクルと共に含む抗微生物組成物。
【請求項１３】
活性成分として、ルシリア・セリカータの分泌物／排泄物から単離されるセクロピン様活性を有する物質またはそれらの類似物を担体またはビヒクルと共に含む抗微生物組成物。
【請求項１４】
更に１以上の抗生物化合物を含む請求項１０〜１３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１５】
抗生物化合物がテトラサイクリンである請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
シュードモナス・アエルギノーサの存在下で生長したルシリア・セリカータの幼虫の分泌物／排泄物から得られる無細胞血リンパ、または前記リンパの１以上の活性成分、またはそのような成分の合成類似物を含む、抗微生物組成物。
【請求項１７】
請求項８〜１６のいずれか１項記載の組成物を担体と共に含む外傷用衣料品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はルシリア・セリカータ(Lucilia sericata)(ヒロズキンバエ)幼虫の分泌物を用いた、バイオフィルムを生成することの出来るバクテリアの生息する表面の処理方法およびそのような方法のために有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは表面で発達しこびり付く生物学的な膜である。バイオフィルムは液体が輸送または処理される工業的な設備、配管において、その表面上、および、そのような設備または系に隣接する表面上に見られることがある。それらはしばしば医学的インプラントまたは体内に挿入される器具の表面上に見られる。それらは大気中に開口している身体の領域にも見られることがあり、特に創傷および肺の内壁に見られることがある。バイオフィルムは表面に接着する多糖類マトリックス内部に包埋されたバクテリア集団として既述することが出来る。
バイオフィルムは一般に従来技術によっては処理が困難である安定な形成物である。これは微生物が包埋されている多糖類バイオフィルムマトリックスの保護的性質によるものである。拡散障壁またはバイオフィルム中の微生物の変化した代謝状態のために抗生物質のような通常の薬剤はあまり効果的でない。
バイオフィルム形成は、微生物による、集団感知(quorum sensing)として知られる過程による拡散性シグナル分子の生成を伴うと考えられている。これらの分子は、微生物によるエキソ多糖類(exo-polysaccharides)、エキソタンパク質(exo-proteins)および他の二次代謝物の生成を惹起すると考えられている。これらの分子過程に干渉する化合物はバイオフィルム形成を阻害、および／または既に形成されたバイオフィルムを減弱するであろう。
【０００３】
シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)（緑膿菌）は最も一般的かつ問題となる感染性バクテリアの一つである。Pseudomonas aeruginosaは通常の抗生物質では処置するのが困難なバイオフィルムを形成するという点で特に問題である。Pseudomonas aeruginosaによるバイオフィルム形成は嚢胞性繊維症の患者では問題となり、この菌が肺にコロニーを形成して、治療が困難な、しばしば究極的には致死的である感染症を引き起こす。
効率的な創傷の治癒は、制御された組織再生を促進するために協同して段階的な様式で働く、細胞遊走、生長因子分泌、血管形成、組織再構築および内在性プロテイナーゼ／プロテイナーゼ阻害因子バランスを含む多くの機構が関与する、複雑な生理学的な過程である。
外傷用医療品は現代医療においては極めて重要である、特に慢性創傷又はやけどの患者の治療のために重要である。創傷の治癒に貢献する活性を有する多数の異なる物質がこれまで提案されてきた。これらの従来提案されてきた物質には、ストレプトキナーゼ、コラゲナーゼおよびストレプトドルナーゼ（これはすべてバクテリア起源である）、ブロメライン（パイナップルから）、プラスミンおよびトリプシン（畜牛から得られる）、およびクリル酵素（甲殻類から得られる）が含まれる。臨床データはそのような物質は創傷の治癒促進において部分的にしか効果的でないことを示している。
【発明の開示】
【０００４】
クロバエ(green bottle fly)、Lucilia sericata、の幼虫（蛆）は生きた生物として創傷治癒に大いに貢献することが知られている。Lucilia sericataの幼虫を用いた壊死組織除去処置は臨床的に広く受け入れられるようになった。しかしながら、それらの幼虫が伝統的には妥協しがたい創傷が治癒される程度に創傷を清掃するという作業をどのように行うのかについて文献的に殆ど報告されていない。治癒は機械的、生化学的またはそれらの両方であり得る。我々の研究は、体外分泌物を用いてこれらの幼虫の効果を模倣できることを明らかにする。
効果的ではあるが、生きた幼虫は多くの患者には不快なものであり、生きた幼虫を傷に使用することおよびそれらの粗分泌物を傷に導入すること（幼虫を使用する場合には必然的に起こる）は多くの患者および医療実施者にとって受け入れがたいものである。生きた生物を使用することはまた患者にアレルギー反応を起こさせる危険性を増加させる。
【０００５】
Lucilia sericataの幼虫の排泄物／分泌物(ES)はトリプシン様セリンプロテイナーゼ活性を示す酵素を含むことが知られている。本発明は、生体外ESがバクテリア集団の密度を決定するためにバクテリアによって生産される低分子量シグナル分子を分解する活性をも有し、従ってバイオフィルム形成が依存するバクテリアの情報伝達ネットワークを破壊する、という発見に基づいている。
本発明は、第１の特徴において、バイオフィルムを形成し得るバクテリアが生息する表面の処理方法であって、前記表面を、Lucilia sericataの排泄物／分泌物から得られるN-アシルホモセリンラクトン分解活性を有する物質と接触させることを含む前記方法を提供する。典型的には前記バイオフィルムを形成し得るバクテリアはPseudomonas aeruginosaまたはStaphylococcus aureus（スタフィロコッカス・アウレウス）（黄色ブドウ球菌）である。
バイオフィルムの研究は広範に研究されている浮遊(planktonic)系よりもバクテリアの自然な存在パターンにより密接に関連しているものだということが一般に受け入れられるようになってきた。Thomas S.ら、J. Tissue Viability, 1999年、第９巻No.4、p127-p132には浮遊バクテリア細胞に対するLucilia sericataの幼虫の分泌物の抗微生物活性が報告されている。我々はこれらの結果を再現できていない。しかしながら、我々の実験において、実験室条件下ではLucilia sericataの幼虫の分泌物はバクテリアバイオフィルムの形成を防止または低下させる活性を有することが見出された。創傷状況においてバクテリアバイオフィルムを除去することは感染と対抗するに際して有利であろう。
【０００６】
我々の実験によれば、エキソ多糖類(exo-polysaccharides)（バクテリアバイオフィルムの一部として形成される）はLucilia sericata分泌物の作用によって除去される。この効果は分泌物中のグリコシダーゼ活性の存在を示唆する。
慢性創傷の治癒はバクテリア感染があることによって損なわれていることが示されている。感染の程度は治癒と慢性性のバランスに影響する。創傷低酸素症へのバクテリアの寄与と病原性効果は効率的な治癒に障害となる。
拡散性低分子量シグナル分子により、個々のバクテリアが集団密度を決定することが可能となり、従って「定足数」が集合したときに協同した様式で行動することが可能となるということが知られている。この効果は、一般には「集団感知」(quorum sensing)として知られており、現在では病原体において病原性決定因子の生成を制御するとして知られている。この低分子量シグナル分子（集団感知分子）はN-アシルホモセリンラクトン、例えば、Pseudomonas  aeruginosaからのN-ブタノイルL-ホモセリンラクトン(BHL)およびN-(3-オキソドデカノイル)-L-ホモセリンラクトン(OdDHL)を含むことが知られている（図１）。ラクトンはまた真核生物組織においてアポトーシスも生じさせ、従って、創傷治癒に必要な組織再生と反対に作用する。そのようなシグナル分子の破壊はバクテリアが宿主組織に対して効果的な攻撃を開始する能力を低下させるであろうことは明らかである。我々の実験によれば、Lucilia sericataの幼虫の分泌物はBHLを分解する活性を含み、より程度は低いがOdDHLを分解する活性を含むことが示された。BHLはバクテリアが一旦バイオフィルムを形成した後は、より活性であると考えられている。我々はこの活性が熱安定であるがフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)および4-アミドフェニル-メタンスルホニルフルオリド(APMSF)（どちらもセリンプロテアーゼおよびエステラーゼ活性を阻害することが知られている）に感受性であることを見出した。
【０００７】
Lucilia sericataの幼虫の分泌物は、滅菌条件下で滅菌した幼虫をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、続いてろ過することによって集めることが出来る。
驚くべきことに、この幼虫分泌物はテトラサイクリンのような慣用される抗生物質と組み合わせて用いた場合、個々の幼虫分泌物および抗生物質を個別に用いた場合よりも大きな抗微生物効果を有することが見出された。従って、組み合わせた場合にこれらの個々の物質の間には相乗効果が存在する。このように、更なる特徴において、本発明はLucilia sericataの幼虫の分泌物および１以上の抗生物化合物を含む抗微生物組成物を提供する。好ましい実施態様において、この抗生物化合物はテトラサイクリンである。
研究の過程で、我々は幼虫分泌物の多くの重要な構成成分が見落とされているかも知れないことに気が付いた。なぜなら、それらは構成的に発現されるのではなく、（Drosophila melanogaster(1999)においてHoffmannらによって記載されたように）血リンパまたは他の組織において、バクテリアへの曝露によって誘導され得るかも知れないからである。従って、我々はin vitroでバクテリアへの曝露後に表現型的に変化したL.sericataの幼虫を血リンパ中の抗微生物化合物生産について調べた。
慣用される抗生物質を添加した、または添加しない滅菌分泌物を、湿布のように、既知の皮膚デリバリーシステムを用いて創傷領域へデリバリーするまたは滅菌した支持体中へ取り込ませて、創傷用手当用品として創傷領域へ適用することが出来る。
【０００８】
実施例
L.sericata分泌物の調製方法
クロバエLucilia sericataの１日齢幼虫（第１齢）をSurgical Materials Testing Laboratory (SMTL) Bridgendより購入した。これらを滅菌条件下で起こし、分泌物を回収する全ての操作は滅菌器具を用いて層流キャビネット内で行った。200μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をそれぞれのバイアル（約200匹の幼虫を含む）に加えて分泌物を回収した。幼虫をPBS中で20分間洗浄し、その後取り出し（滅菌ピペット）、遠心し（1300 x g、10分間）、分泌物を凍結した（-20℃）。幼虫を40分間休ませ、２回目の洗浄を行い、この工程を３回目の洗浄について繰り返した。
集めた分泌物をタンパク質含量（BioRadタンパク質アッセイ）およびプロテアーゼ活性（フルオレセインイソチオシアネート標識(FITC)カゼインの加水分解）についてアッセイした。分泌物を滅菌濾過し（22μm）使用のために小分けして-20℃に保存した。
【０００９】
１．L.sericata ESと一般的抗生物質との相乗作用
最小阻害濃度アッセイを用いて96穴プレート中の浮遊バクテリアの増殖を阻害するESの濃度を測定した――増殖は492nmの吸光度増加によって測定した。Thomasら(1999)の観察とは対照的に、滅菌条件下で生長させたL.sericataによって産生されたESはグラム陽性バクテリアの増殖に対してもグラム陰性バクテリア（それぞれ、S.aureusおよびP.aeruginosa）の増殖に対しても抗生物作用を有しないという結果が示された（図２）。
同様に、24時間にわたって492nmにおける吸光度を追跡して、ESおよび熱変性ES（10分間煮沸）の効果をP.aeruginosaの増殖に対する一般的な抗生物質テトラサイクリンの効果と比較した（図３）。増殖は10μg/mlテトラサイクリンによって完全に停止した。対照的に、活性ESはこの方法で測定すると僅かに増殖の増強を示した（おそらくバイオフィルム剥離のためであろう−以下の図４参照）。しかしながら、致死量以下のテトラサイクリンをESと組み合わせて用いると、この２つの間に相乗効果が見られ、バクテリアの増殖がより低下した（図４）。このことは24時間後のコロニー計数によっても確認されており、テトラサイクリンと活性ESの組合せは生細胞計数を1/3に低下させることが示された。
結論−L.sericata分泌物単独では浮遊条件下でバクテリア増殖に抗生物作用を有しないが、一般的な抗生物質テトラサイクリンとの間に相乗効果が存在する。
【００１０】
２．L.sericata ES存在下におけるバイオフィルム形成の低下
より広範に研究されているが不適切である浮遊系よりも、バイオフィルムの研究はバクテリアの自然な存在パターンにより密接に関連しているということが一般に受け入れられるようになってきた。創傷状況下において、バクテリアバイオフィルムの除去は感染と戦うために有利であろう。
L.sericata ESの存在下におけるバイオフィルム形成の低下をO'TooleとKolter(199)のクリスタルバイオレット法を用いて測定した。接着した細胞を96穴プレート中で24時間培養後に定量し、浮遊細胞を取り出した（セクション３参照）。クリスタルバイオレット色素を用いて接着バクテリアを染色し、その後可溶化して540nmにおいて染色物の吸光度を測定した。S.aureusバイオフィルムについて、形成されたバイオフィルムにおける用量応答性の低下をL.sericata ES存在下において24時間にわたって測定した（図5a）。ES存在下において増殖させた培養物において、ガラスカバースリップのインキュベーション後に同様な低下がP.aeruginosaバイオフィルム形成においても見られた。微小コロニーはBaclightTM染色を用いて視覚化した（図5bおよび5c）。
結論−L.sericata分泌物は実験室条件下でバクテリアフィルムの形成阻害において活性であった。
【００１１】
３．L.sericata ES産物のグリコシダーゼ活性
バイオフィルム形成条件下で増殖させた培養物の細胞を回収すると、培養物をL.sericata ES産物の存在下で増殖させた場合との相違が明らかになった。培養物は96穴マイクロタイタープレート中に分注した100μl中で増殖させた。これはフラスコ増殖培養と比較してプラスチック壁表面と接触する液体表面積を増加させ、従ってバイオフィルムの増殖を促進する効果がある。P.aeruginosaを一晩培養物から接種し、初期対数増殖期まで増殖させ希釈して(1/2000)１ウェルあたり〜103細胞とした。次に培養物をES、不活性化ES（10分間煮沸）またはリン酸緩衝生理食塩水（対照）の存在下で増殖させた。培養物を37℃にて一晩増殖させ、それぞれの型を集め、遠心して(13000 x g、10分間)、細胞を回収した。その結果（図６）、対照および変性ESサンプル中に「スライム層(slime layer)」の存在が示され、これは細胞を活性ESの存在下で増殖させた場合には存在しなかった。活性ESの少量をサンプルD（変性ES）に添加し、37℃にて一晩インキュベーションすると最初に形成されていたスライム層が除去された。我々は、スライム層はバイオフィルムの一部として形成されたエキソ多糖類を含んでおり、L.sericata ES中のグリコシダーゼの作用によって除去されたのであろうと提唱する。P.aeruginosaの場合は、エキソ多糖類はアルギン酸塩（ポリグルロン酸およびマンヌロン酸を含むポリマー）であると示唆されている。
結論−エキソ多糖類の酵素的除去は、バクテリアが効率的にバイオフィルムを形成し、創傷において効率的な感染を確立する能力を阻害するであろう。
【００１２】
４．L.sericata排泄/分泌産物(ES)からの熱安定性PMSF/APMSF感受性活性（ラクトナーゼ）によるP.aeruginosa集団感知シグナル分子の不活性化
BHLおよびOdDHLは薄層クロマトグラフィー(TLC)（それぞれ、RP18F245SまたはRP2 UV254プレート）を用いて定量することが出来る。クロマトグラフィー後、シグナル分子の位置及び量は、バイオセンサー生物に対するそれらの効果によって明らかにすることができる。使用する特定の生物はBHLまたはOdDHLと接触すると光を放出する。従って、TLCプレートをこのバイオセンサー生物を含む軟寒天上に上層すれば、一定期間のインキュベーション後に光の放出によってシグナル分子の位置が明らかになるであろう。ここで放出される光の強度は擬似色に変換することによって示される（最も強い光は黄色として、最も弱い強度（暗い青）へ段階的に示される。）（図７、横のバー）。
【００１３】
BHLに対するL.sericata分泌物の効果を以下をインキュベーションすることによって調べた：
１．100μl ES（120μg/mlタンパク質）＋100μM BHL
２．100μl煮沸ES（120μg/mlタンパク質）＋100μM BHL
３．APMSF（0.5mM）と予備インキュベーションした100μl ES（120μg/mlタンパク質）＋100μM BHL
４．PMSF（2mM）と予備インキュベーションした100μl ES（120μg/mlタンパク質）＋100μM BHL
５．100μl BHLバッファー（リン酸緩衝生理食塩水）溶液
【００１４】
６時間のインキュベーション後、それぞれのインキュベーション物の１μlをRP18F2545 TLCプレートに乗せ、60％（v/v）メタノール／水を用いて分離し、その後上述したようにバイオセンサー上に置いてBHLを明らかにした。
結果（図７）は幼虫ESのBHL分解に対する効果を明らかにしている。陽性対照（レーン５）はBHL単独からの光生成を示したものである。幼虫ESの存在下でインキュベーションしたBHLでは光生成の低下があり（レーン１）、これはシグナル分子の分解を示すものである。この分解は、ESをフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)（レーン４）、およびより程度は低いが4-アミジノフェニル-メタンスルホニルフルオリド(APMSF)（レーン３）（セリンプロテアーゼ活性の阻害剤）と予備インキュベーションすると阻害された。ESの煮沸（レーン２）は分解を阻害せず、従ってこの活性の熱安定性が示された。
更なる実験により、６時間インキュベーションの開示時と終了時において採取したサンプルを比較して、OdDHLに対するESの類似の効果が確認された（図８および９）。
今回はTLCをRP2/UV254プレート上で45％(v/v)メタノール／水を用いて行った。分解はOdDHL分子の開環を意味すると考えられる第２の化学種の出現を生じさせた。これはカラムクロマトグラフィー（C18カラムによる高性能液体クロマトグラフィー）によって確認しなければならない。ここでも分解は煮沸に対して安定であったが、PMSFによって阻害され、より程度は低いがAPMSFによって阻害された。
結論−L.sericataの幼虫ESは、P.aeruginosaバイオフィルム形成および感染に関与する、従って創傷治癒に関連するであろう２つのシグナル分子であるBHLおよびOdDHLを分解する、熱安定でPMSFおよびAPMSFに感受性の活性を含んでいる。
【００１５】
５．L.sericataにおいて誘導される抗微生物活性
L.sericataの滅菌幼虫をSurgical Materials Testing Laboratory SMTL (Princess of Wales Hospital, Bridgend CF31 1RQ)から入手した。幼虫はSherman(1995)に記載された培地（ブタ肝臓分解物およびバクトアガーを含み、容器の内部と外部でガスおよび湿気の交換が可能だがバクテリアの容器中への侵入は阻止される密閉容器中でオートクレーブ滅菌した）で生長させた。幼虫のために、栄養培地の薄層を容器の底部に供給した。
滅菌した第１齢幼虫（200）を200μlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水中に懸濁し、容器に移した。滅菌条件下、湿チャンバー中、28℃にて約48時間生長させ、幼虫を安定させた。Pseudomonas aeruginosa、変異体PAO P47、を10mlルリア・ベルターニ(LB)培地へ接種し、37℃にて振盪しながら一晩増殖させた。この容器に1mlの培養物（〜108個の生カウント）を接種し、幼虫をバクテリア存在下で生長させた。更に48時間後、幼虫を犠牲にし、背側前部切開して血リンパを集めた。血リンパを微量遠心（13000 x g、10分間）して細胞を除去した。
大腸菌D31の細菌ローンにおいて、２μl血リンパを含むウェルの周囲の無バクテリアプラークの形成によって抗微生物活性を評価した。このプレートは、１μlの培養物（600nm吸光度＝0.4）を10μg/mlストレプトマイシンおよび５mg/mlのリゾチームを含む７mlの溶解（50℃）１％LB寒天に接種することによって調製した。このプレートは、滅菌ペトリ皿中で形成させた。鋳型を用いてプレートの縁から等距離に規則的なパターンでウェル（８つ）を形成した。抗微生物活性は、100μg/ml、10μg/ml、１μg/mlおよび0.1μg/mlの２μlセクロピンＢ（シグマ）によって形成されたプラークと比較することによって評価した（図１０）。P.aeruginosaによる48時間のインキュベーション後に取り出した血リンパは直径5mmの抗微生物プラークを形成させた−これは10μg/mlセクロピン標準品によって形成されたもの（4.25mm）よりも大きかったが、100μg/ml標準品によるもの（８mm）よりも小さかった。
結論−生長中にP.aeruginosaへの曝露によって誘導すると、L.sericata血リンパ中に抗微生物活性が見出された。
【００１６】
参考文献
O’Toole, G.A. and Kolter, R. (1999)  Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways:  a genetic analysis.  Molecular Microbiology 28: 449-461. 
Sherman, R.A. and Tran, J.M. (1995)   A simple, sterile food source for rearing the larvae of Lucilia sericata (Diptera;  Calliphoridae).  Medical and Veterinary Entomology 9: 393-398.  
Thomas, S.,  Andrews, A.M.,  Hay, N.P. and  Bourgoise, S. (1999)  The anti-microbial activity of maggot secretions:  results of a preliminary study.  J. Tissue Viability 9: 127-132.
Hoffmann, J.A., Kefatos, F.C., Janeway, C.A. and Ezekowitz, R.A.B. (1999), Phylogenetic perspectives in innate immunity, Science;  284;  1313-1318.
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Pseudomonas aeruginosaの集団感知シグナル分子
【図２】P.aeruginosaおよびS.aureusの浮遊性増殖に対するESの効果。96穴プレート中、初期対数増殖期バクテリア（〜1000個体/ウェル）を37℃にて24時間、ESのPBS希釈物の存在下で増殖させた。増殖は492nmにおける吸光度によって測定した。
【図３】24時間にわたる492nmの吸光度測定による、ES、変性ESまたはテトラサイクリンのP.aeruginosaの浮遊性増殖に対する効果。変性型と比較したES存在下の24時間後における高い吸光度は、ウェルからの付着生物の酵素的剥離によるものであろう。
【図４】24時間にわたる492nmの吸光度測定による、活性ESおよび変性ESと一緒の2.5μg/mlテトラサイクリンのP.aeruginosaの浮遊性増殖に対する効果。
【図５】L.sericata ESの存在下におけるバイオフィルム形成。  ａ）接着細胞に結合した可溶化クリスタルバイオレットの540nmにおける吸光度モニタリングによって定量した、Staphylococcus aureusバイオフィルムに対するL.sericata ESの作用。  b,c)BaclightTM染色を用いて視覚化した、ガラスカバースリップ上のPseudomonas aeruginosaバイオフィルムの生長に対するESの作用。ｂ）は20時間増殖後の対照バイオフィルムを表す。ｃ）はL.sericata ES産物(22μg/ml)の存在下における生長を表す。
【図６】活性Lucilia sericata分泌物(ES)または変性Lucilia sericata分泌物(D)を含むバイオフィルム生成条件においてPseudomonas aeruginosa（96穴プレート中、100μl）を24時間増殖させ、回収し、10分間微量遠心（13,000 x g）した。濃フェノール硫酸を用いて炭水化物についてテストしたところ、スライム層は約500μg/mlグルコース（当量）濃度を示した。対照(D)スライム層は2.5μgの活性ESとインキュベーション（37℃にて17時間）することによって除去された。
【図７】L.sericata ESによるBHLの分解――煮沸、および、阻害剤PMSFまたはAPMSFとの予備インキュベーションの効果。  L.sericata ES（総タンパク質 100μl−120μg/ml）と６時間インキュベーション後の１μlの100μM BHLの薄層クロマトグラフィー。１：ES、２：煮沸ES、３：APMSF(0.5mM)と予備インキュベーションしたES、４：PMSF（2mM）と予備インキュベーションしたES、５：リン酸緩衝生理食塩水中の対照BHL。
【図８】L.sericata ESによるOdDHLの分解−煮沸の効果。  L.sericata ES（総タンパク質 100μl−120μg/ml）とインキュベーション後の１μlの100μM OdDHLの薄層クロマトグラフィー。１：煮沸ES（t=0h）、２：煮沸ES（t=6h）、３：ES(t=0h)、４：ES(t=6h)。
【図９】L.sericata ESによるOdDHLの分解−PMSFおよびAPMSFとの予備インキュベーションの効果。  L.sericata ES（総タンパク質 100μl−120μg/ml）とインキュベーション後の１μlの100μM OdDHLの薄層クロマトグラフィー。１：APMSF(0.5mM)と予備インキュベーションしたES、t=0h、２：APMSF(0.5mM)と予備インキュベーションしたES、t=６h、３：PMSF(2mM)と予備インキュベーションしたES、t=0h、４：PMSF(2mM)と予備インキュベーションしたES、t=６h。
【図１０】Pseudomonas aeruginosaによる誘導後に得られるL.sericataの幼虫の血リンパによる大腸菌D31の増殖阻害。  P.aeruginosaによる攻撃後のL.sericata血リンパの抗微生物活性。抗微生物ペプチドセクロピンＢ(Sigma)の標準品を使用した。大腸菌D31のローン内の透明なプラークは抗微生物活性を示す。直径の測定値はサンプル中の抗微生物ペプチド濃度の指標となる。１：セクロピンＢ 100μg/ml、２：セクロピンＢ 10μg/ml、３：セクロピンＢ 1μg/ml、４：セクロピンＢ 0.1μg/ml、５：対照 ４ｈ、６：P.aeruginosa 4h、７：P.aeruginosa 48h、８：対照48h。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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