(57)【要約】本発明は、生物学、遺伝学及び医学の分野に関連する。詳細には、本発明は、神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症の検出、性状解析及び／又は処置のための新規な方法に関する。本発明はまた、該病気において活性な化合物の同定又はスクリーニングのための方法に関する。本発明は更に、該方法を実施するために有用な、化合物、遺伝子、細胞、プラスミド又は組成物に関する。詳細には、本発明は、該病気における、ヒストンデアセチラーゼ類、そして特にヒストンデアセチラーゼ２の役割、及び処置的、診断的又は実験的な標的としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における興奮毒性又はニューロンのストレスの状態を検出するための方法であって、対象からの試料中のヒストンデアセチラーゼ（特にヒストンデアセチラーゼ２）の発現をインビトロで測定すること、あるいは対象からの試料中のヒストンデアセチラーゼ（特にヒストンデアセチラーゼ２）の突然変異型、又はその対応するＲＮＡの存在を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
発現の測定が、試料と、該ヒストンデアセチラーゼＲＮＡに特異的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより実行される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
核酸プローブが、ヒストンデアセチラーゼメッセンジャーＲＮＡの配列、又はこの配列に相補的であるか若しくはここから誘導される配列の、全部又は一部を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
発現の測定が、該ＲＮＡに特異的な核酸プライマー（又はプライマー対）を用いた、試料中の核酸の選択的増幅により実行される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
試料が、神経又は筋肉細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ又は脳虚血の診断又は検出のための、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
多発性硬化症のその初期段階での検出のための、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ニューロンのストレスの状態、更に具体的には興奮毒性状態の診断又は検出方法を実施するための、ヒストンデアセチラーゼ２遺伝子又はメッセンジャーＲＮＡから誘導される配列の全部又は一部を含む核酸の使用。
【請求項９】
核酸が、ヒストンデアセチラーゼ２、又は非欠失領域の間の結合部から生じる配列、又はこれに相補的な配列の、全部又は一部を含む、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
興奮毒性に関連する神経変性疾患の処置に使用するための組成物を調製するための、ヒストンデアセチラーゼインヒビター化合物の使用。
【請求項１１】
化合物が、ヒストンデアセチラーゼ遺伝子の転写又は対応するメッセンジャーの翻訳を阻害することができるアンチセンス核酸である、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
化合物が、天然又は合成起源の化合物である、請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
化合物が、トリコスタチンＡである、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
神経変性疾患の初期段階におけるニューロンの興奮毒性の阻害又は軽減のための、請求項１０〜１３のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症又は脳虚血の処置のための、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
ＡＬＳの処置のための、特にＡＬＳの初期段階におけるニューロンの興奮毒性の軽減のための、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１７】
特に興奮毒性又はニューロンのストレスに関連する疾患に対する活性化合物の選択、同定又は性状解析のための方法であって、試験化合物を、ヒストンデアセチラーゼ又はその断片若しくは機能性変種を発現する細胞と接触させること、及びこのタンパク質の発現又は活性を阻害する化合物の能力を測定することを特徴とする方法。
【請求項１８】
特に興奮毒性又はニューロンのストレスに関連する疾患に対する活性化合物の選択、同定又は性状解析のための方法であって、試験化合物を、ヒストンデアセチラーゼ又はその変種若しくは断片と接触させること、及び該ヒストンデアセチラーゼ、断片又は変種に結合する試験化合物の能力を測定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、遺伝学及び医学の分野に関連する。更に詳細には、本発明は、神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症の検出、性状解析及び／又は処置のための新規な方法に関する。本発明はまた、これらの疾患において活性な化合物の同定又はスクリーニングのための方法に関する。本発明はまた、上記方法を実施するために使用することができる、化合物、遺伝子、細胞、プラスミド又は組成物に関する。本発明は特に、これらの疾患における、核因子（特にヒストンに言及すべきである）のリン酸化に関与する酵素の役割の同定を前提とし、そしてこのような障害の治療的、診断的又は実験的な標的又はマーカーとしてこれらの使用を記述する。
【０００２】
多くの神経変性疾患は、興奮毒性に関連する構成要素又は段階を有するものと表現されている。これは、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症及びハンチントン舞踏病に当てはまる。
【０００３】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、レーヴィ（Lewy）小体のような種々の型の封入体に関連する神経変性疾患であり、脊髄及び皮質運動ニューロンのアポトーシスを特徴とし、その致命的な結果は、ときに前頭痴呆に関連している。突然変異が報告されていない散発型の疾患と、スーパーオキシドジスムターゼをコードするＳＯＤ１遺伝子の突然変異に関連した家族型（ＦＡＬＳ）が存在する。大部分の症例は、散発型であり、家族型（ＦＡＬＳ）は非常に稀である。臨床的症候の発現の前には、長い無症候期があるようである。発症は変わりやすく、その分類は複雑である。将来の治療法の進歩によって、症状の治療が、疾患の分子的要因に基づく方策に置き換えられよう。細胞レベルでは、これらの症状は、皮質運動ニューロン及び脊髄運動ニューロンの死に関連している。このニューロンの細胞死は、幾つかの神経変性疾患の基礎を形成する種々の現象と関連している。これは、グルタミン酸関連興奮毒性、酸化ストレス、ニューロンのマーカー（ＡＬＳの症例ではカルシウムチャネル）に向けられたある型の自己免疫疾患、並びに細胞骨格の異常について当てはまる。これらの現象は、報告されているとはいえ、ＡＬＳを含むこれらの疾患の原因は曖昧なままである。更に、ＦＡＬＳは、スーパーオキシドジスムターゼをコードするＳＯＤ１遺伝子の突然変異と関連しているとしても、ニューロンを細胞死に委ねる機序（その少なくとも１つの構成要素は、アポトーシスである）は、不明である。
【０００４】
細胞死に関与する種々の現象に関与する分子事象の同定によって、新規な治療方策を策定することができよう。ヒトの生検試料を用いてこれらの事象を研究することは容易ではない。これらの生検試料は、言うまでもなく死後標本に由来するため、その品質を検証することは困難であり、そしてこれらは、疾患の後期段階に対応する病態を表すだけである。
【０００５】
動物モデルにより、疾患の進展の種々の段階を解析したり、健常対照と比較したりできるようにする、生物学的試料が入手できる。この点に関して、ＦＡＬにおいて優勢な突然変異の１つ（突然変異Ｇ９３Ａ）を持つヒトＳＯＤ１遺伝子を発現するトランスジェニックマウスは、その使用に関するライセンスをノースウエスタン大学（NorthWestern University）から得るという条件で、ジャクソンラボラトリー（Jackson Laboratory）から入手できる。１２０日以内に、このモデルは、ヒト疾患の症状に匹敵する症状の疾患の致命的な結果を再現する。ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａ突然変異に関連するＡＬＳの症候の発現は、スーパーオキシドジスムターゼ活性の低下の結果ではなく、フリーラジカルを発生させる酵素の能力を上昇させる、機能の獲得の結果である。このような観察にもかかわらず、ＡＬＳの種々の段階の原因となる分子事象はあまり理解されていない。これらの分子事象の複雑さは、疾患の進行を反映する：試験したトランスジェニックモデルでは、ニューロンの調節不全も臨床症状発現も３０日目まで報告されていない。６０日目は、最初の症候にちょうど先立つ段階であるが、既に脳レベルで、興奮毒性に関連したミトコンドリア代謝の変質、ストレス及びニューロンの細胞死のような、細胞生理学の変化を特徴とする段階に対応する。９０日目に、５０％の皮質及び脊髄運動ニューロンは死に、星状細胞活性化と並行してニューロンのアポトーシスの活発なプロセスが開始する。興奮毒性は、この段階ではもはや見られない。ニューロンの細胞死は、ここではカスパーゼの活性化と関連しているが、これは、疾患の初期段階には関与していないと考えられる。
【０００６】
この動物モデルの他に、細胞に基づくモデルを用いて興奮毒性を研究することもできる。小脳顆粒細胞は、実験的ニューロンの細胞死を研究するための有用なモデルに相当する。実際、これらニューロンの培養物は、グリア細胞に比較してニューロンの濃縮を示すため、ニューロンの細胞死に特異的な事象を優先的に研究することができる。
【０００７】
興奮毒性のある側面を再現するために、幾つかのアプローチを構想することができる。ニューロンをグルタミン酸で処理することができるが、これはこの興奮性アミノ酸の全ての受容体（代謝調節型受容体とイオン調節型受容体）を刺激する。ＮＭＤＡ又はカイニン酸を用いる処理もまた、これらの各イオン調節型受容体を刺激するために適用することができる。これらのイオン調節型受容体を刺激することの結果の１つは、これらのチャネルが開くときのカリウムの流出である。カリウムの細胞外濃度を上昇させることにより、細胞死が低減するため、このカリウムの流出は、興奮毒性の直接の一因である。
【０００８】
相互に、低濃度のカリウムの存在下でのニューロンの培養は、これらに死をもたらす。結果として、興奮毒性の構成要素の１つは、低濃度のカリウムの存在下でニューロンを培養することにより研究することができる。この現象に特異的な種々の分子事象の同定によって、新しい治療標的、並びに新しい診断マーカーが同定できるはずである。
【０００９】
本発明は次に、興奮毒性及びニューロンの細胞死現象に関与する遺伝子事象の同定を説明する。よって本発明は、これらの現象に関連した疾患への新しい治療的及び診断的アプローチ法、並びに活性化合物の同定のための新しい標的を提供する。
【００１０】
更に詳細には、当業者には既知の手法により培養したラット小脳顆粒細胞から抽出したＲＮＡを用いて定性差分分析を実行した。有利には、２５μMカリウムの存在下で培養した生存ニューロンからのＲＮＡ抽出物を、カリウム濃度を５μMに低下させることにより毒性条件下で培養したニューロンからのＲＮＡ抽出物と比較した。この分析は、ＤＡＴＡＳ法（出願番号WO 99/46403に記載されている）を利用する定性差分スクリーニング法を用いて実行した。
【００１１】
この分析によって、ヒストンデアセチラーゼのｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ断片を同定することができ、興奮毒性の進展及びニューロンの細胞死プロセスへのこの酵素の関与を証明した。更に詳細には、本出願は、興奮毒性現象の過程におけるヒストンデアセチラーゼのスプライシングの修飾の存在を証明している。得られた結果は、ＡＬＳの症候の発現時に興奮毒性にかかわった脳内のこの酵素のコード配列の変質を証明している。この変質は、対応する酵素の活性の上昇と、ヒストン及び他の核内標的の低アセチル化とを示唆する。
【００１２】
これらの標的のアセチル化のレベルは、プレｍＲＮＡの転写活性とスプライシングを調節する。ヒストン及び他の核因子のアセチル化のレベルは、２つの酵素活性：ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性とヒストンデアセチラーゼ活性の間の均衡によって調節される。
【００１３】
グルタミン付加の反復によって修飾されているタンパク質の凝集（ハンチントン舞踏病のハンチンチン（huntingtin）、ある型の脊髄性又は延髄性筋萎縮症の場合のアンドロゲン受容体）に関連する疾患の場合には、ヒストンアセチルトランスフェラーゼが、タンパク質凝集体中に隔離されていることが証明されている。出願番号WO 01/17514は、リン酸化により調節される遺伝子の発現を制御するための、遺伝子発現誘導剤及びヒストンアセチル化のモジュレーターを含む複合組成物を提案している。このような組成物は、クロマチンレベルでの非特異的作用に基づくものであり、神経毒性の機序へのヒストンデアセチラーゼの関係も、またこのような病状を治療するためのこれらの酵素の調節に基づく方策も何ら示唆しない。出願WO 00/71703は、癌の治療のための、ヒストンデアセチラーゼに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００１４】
驚くべきことに、本発明は初めて、遺伝子発現の調節に関与するヒストン及び他の核因子のアセチル化を低下させることによる、興奮毒性をもたらす遺伝子調節不全の分子機序の存在を証明している。
【００１５】
よって本発明は、興奮毒性に関連する疾患に対する治療的及び診断的アプローチの開発のための新しい分子標的を提供する。このような方策は、ヒストンアセチル化活性の調節に基づき、そして更に詳細には、ヒストンアセチル化のレベルの上昇に基づく。この調節は、種々の方法で、好ましくはヒストンデアセチラーゼインヒビターの使用により達成することができる。これらの治療方策により、神経系の種々の疾患、特にアルツハイマー病、多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関与する興奮毒性現象においてニューロンの生存率を改善することができる。
【００１６】
本発明の目的は、神経変性疾患を、特に初期段階で治療するための、更に好ましくは神経変性疾患に、特に初期段階で関連するニューロンの興奮毒性を低下させるための、組成物の調製のためにヒストンデアセチラーゼインヒビターを使用することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ニューロンのストレス、特に興奮毒性に関連する疾患の治療方法であって、対象にヒストンデアセチラーゼインヒビターを投与することを特徴とする方法を提供することである。
【００１８】
本発明において使用されるとき、興奮毒性に関連する疾患とは、更に好ましくは、ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症及び脳虚血から選択される神経変性疾患を意味する。本発明はまた、他の疾患において発生するニューロンの興奮毒性の、特にその初期段階での処置にも適用できる。
【００１９】
本発明に照らして、「処置」という用語は、予防的、治療的又は緩和的処置、並びに患者管理を意味する（苦痛の軽減、平均余命の改善、疾患の進行の減速、興奮毒性の条件下でのニューロンの生存率の改善など）。本治療は更に、他の薬剤又は治療、特にカスパーゼインヒビター又は他の活性化合物のような、疾患の後期事象に対応するものと組合せて実施することができる。
【００２０】
「インヒビター」という用語は、ヒストンデアセチラーゼの発現又は活性を阻害又は軽減することができる化合物又は処置を意味する。本インヒビターは、好ましくは選択的である、即ち、その活性は、本質的にヒストンデアセチラーゼに向けられ、他のどの酵素にも実質的な直接の活性を及ぼさない。詳細には、ヒストンデアセチラーゼインヒビターは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼに及ぼす直接の阻害作用を持たないことが肝心である。
【００２１】
種々のヒストンデアセチラーゼが同定、クローン化及び性状解析されている。以下を特に引用することができる：ヒストンデアセチラーゼ−１（ＨＤＡＣ１）、ヒストンデアセチラーゼ−２（ＨＤＡＣ２）及びヒストンデアセチラーゼ−３（ＨＤＡＣ３）、特にヒト酵素。これらの酵素をコードする核酸配列及び対応するアミノ酸配列は、先行技術、例えば、ジーンバンク（GenBank）のデータバンクに参照番号：ＮＭ＿００４９６４（ｈＨＤＡＣ１）；ＮＭ＿００１５２７（ｈＨＤＡＣ２）；ＮＭ＿００３８８３（ｈＨＤＡＣ３）；ＡＦ００６６０３（ｍＨＤＡｃ２）の下に記述されている。これらの配列はまた、他の公共の関係筋からも入手できる。当然のことながら、本発明はまた、これらの特異的配列の天然の変種及び／又は相同体にも関係する。
【００２２】
本発明の範囲内で、ヒトヒストンデアセチラーゼのインヒビター、特にｈＨＤＡＣ１、ｈＨＤＡＣ２及び／又はｈＨＤＡＣ３のインヒビター、更に好ましくはインヒビター化合物が優先的に使用される。
【００２３】
使用される化合物は、ヒストンデアセチラーゼの発現を阻害することができる化合物、即ち、詳細には遺伝子の転写、ＲＮＡ成熟、ＲＮＡ翻訳、翻訳後のタンパク質の修飾、分子標的へのタンパク質の結合などを阻害する化合物であってよい。
【００２４】
本化合物は、特に天然起源（例えば、植物、細菌、ウイルス、動物又は真核生物起源）又は合成（特に有機又は無機の合成又は半合成分子）のような、種々の性質及び起源のものであってよい。例えば、核酸、ポリペプチド（又はタンパク質若しくはペプチド）、脂質又は化合物などであってよい。
【００２５】
第１の実施態様では、本インヒビターは、ヒストンデアセチラーゼ遺伝子の転写又は対応するメッセンジャーの翻訳を阻害することができるアンチセンス核酸である。このアンチセンス核酸は、ヒストンデアセチラーゼ遺伝子、ヒストンデアセチラーゼメッセンジャーの配列、又はこれらに相補的な配列の、全部又は一部を含むことができる。このアンチセンス配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイムなどであってよい。これは、１本鎖でも２本鎖であってもよい。また、アンチセンス遺伝子によりコードされるＲＮＡであってもよい。検討中の遺伝子又はメッセンジャーの配列の一部を含むアンチセンス核酸が使用されるとき、特異的なハイブリダイゼーションを確保するために、配列からの少なくとも１０個（更に好ましくは少なくとも１５個）の連続塩基を含む部分を使用することが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合には、典型的には１００個未満の塩基、例えば、１０〜５０個程度の塩基を含む。このオリゴヌクレオチドは、その安定性、そのヌクレアーゼ抵抗性、その細胞浸透性などを改善するために修飾することができる。アンチセンス分子の配列と、標的遺伝子又はメッセンジャーの配列との間の完璧な相補性は、必要ではないが、一般には好ましい。
【００２６】
別の実施態様では、インヒビター化合物は、ポリペプチドである。これは、例えば、ヒストンデアセチラーゼ配列の一領域を含み、かつその活性に拮抗できるペプチドであってよい。ペプチドは、有利には検討中のデアセチラーゼの一次配列の５〜５０個（典型的には７〜４０個）の連続アミノ酸を含む。このポリペプチドはまた、抗ヒストンデアセチラーゼ抗体、又はこのような抗体の断片若しくは誘導体、例えば、Ｆａｂ断片、ＣＤＲ領域、又は更に好ましくは１本鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）であってよい。１本鎖抗体は、特異的にかつ細胞内で作用して標的タンパク質の活性を調節することができる限り、特に有利である。このような抗体、断片、又は誘導体は、動物を免疫し、血清（ポリクローナル）又は脾臓細胞（適切な細胞株との融合によりハイブリドーマを産生させるため）を回収することを含む従来法により産生することができる。
【００２７】
種々の種においてポリクローナル抗体を産生するための方法は、先行技術に報告されている。典型的には、抗原をアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）と合わせて、典型的には皮下注射により動物に投与する。反復注射を実施することができる。血液試料を回収して、免疫グロブリン又は血清を分離する。モノクローナル抗体を産生するための従来法は、動物を抗原で免疫し、続いて脾臓細胞を回収し、次にこれを骨髄腫細胞のような不死化細胞と融合する。生じたハイブリドーマは、モノクローナル抗体を産生するので、個々のクローンを単離するために限界希釈法により選択することができる。Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片は、従来法によりプロテアーゼ消化によって生成することができる。
【００２８】
別の実施態様では、本化合物は、ヒストンデアセチラーゼの発現又は活性を調節することができる、天然又は合成起源の化合物、特に有機又は無機分子である。このような化合物は、後述の種々の測定法により製造及び／又は選択することができる。好ましい非限定的な一例として、トリコスタチンＡ（trichostatin A）、トラポキシン（trapoxin）、アピシジン（apicidin）、ピロキサミド（pyroxamide）、バルプロエート（valproate）、ベンズアミド、酪酸ナトリウム又はフェニルブチラートのような種々のブチラート類、出願WO 98/00127に記載されているようなブチラート誘導体、並びに類似体などを引用することができる。トリコスタチンＡは、好ましい一例である。
【００２９】
ニューロンの興奮毒性の軽減に使用するための組成物を調製するために、ヒトヒストンデアセチラーゼインヒビター化合物、特に選択的インヒビターを使用することは、本発明の特定の目的である。
【００３０】
ニューロンの興奮毒性の軽減に使用するため、特にＡＬＳの処置のための組成物を調製するために、ヒトヒストンデアセチラーゼ２インヒビター化合物、特に選択的インヒビターを使用することは、本発明の特定の目的である。
【００３１】
ＡＬＳの処置用、特にＡＬＳの初期段階におけるニューロンの興奮毒性の軽減用の組成物を調製するために、ヒトヒストンデアセチラーゼインヒビター、特に選択的インヒビターを使用することは、本発明の特定の目的である。
【００３２】
ニューロンの興奮毒性の軽減に使用するための組成物を調製するため、及び／又はＡＬＳの処置用の組成物を調製するために、トリコスタチンＡを使用することは、本発明の別の特定の目的である。
【００３３】
ＡＬＳの患者におけるヒストンデアセチラーゼ２の活性の阻害に使用するための組成物を調製するために、トリコスタチンＡを使用することは、本発明の別の特定の目的である。
【００３４】
本発明はまた、ＡＬＳの処置方法であって、対象に、ヒストンデアセチラーゼ、特にヒストンデアセチラーゼ２（好ましくはヒトの）の発現又は活性を阻害する有効量の化合物を投与することを特徴とする方法に関する。
【００３５】
好ましくは、本発明は、神経変性疾患の初期段階における処置のために利用される。
【００３６】
投与は、当業者には既知の任意の方法により、好ましくは注射により、典型的には腹腔内、脳内、静脈内、動脈内又は筋肉内経路により行うことができる。このような注射される用量は、当業者ならば適合させることができる。典型的には、化学的性質のインヒビター化合物では約０．０１mg〜１００mg/kgの間が注射される。核酸化合物では、用量は、例えば、１用量当たり０．０１mg〜１００mgの間で変化させることができる。当然のことながら、反復注射は、ことによると他の活性物質又は任意の薬剤学的に許容しうる担体（例えば、安定剤などの存在下での緩衝剤、食塩水又は等張液）と組合せて行うことができる。
【００３７】
本発明は、哺乳動物、特にヒトにおいて使用することができる。
【００３８】
本発明は詳細には、ヒストンデアセチラーゼ２（ｍＨＤＡ２、ジーンバンク参照番号：ＡＦ００６６０３）のコード領域、更に詳細にはヌクレオチド２９３４〜３２４３にまたがる領域に影響するスプライシング事象の存在を示す。ニューロン生存の条件（２５μMカリウム）下で優先的に検出される、このスプライシング事象は、酵素を不活化して、生存ニューロンにおける遺伝子発現に関与するヒストンや他の因子のアセチル化の上昇を引き起こす。相互的に、同じ核因子のアセチル化の低下は、５μMカリウムの存在下でのニューロンの細胞死と関連することが証明されている。よって本発明は、カリウム流出における、詳細には興奮毒性現象における、更に詳細にはＡＬＳのような疾患におけるニューロン生存率を復元するための、ヒストンデアセチラーゼインヒビターの使用に基づく新しい治療方策の可能性を開く。本発明は、ヒストンデアセチラーゼ２を、興奮毒性に関連する分子事象を処理するための治療標的として初めて提案する。特定の実施態様により、本発明は、神経変性疾患の初期段階におけるニューロンの興奮毒性を阻害又は軽減するために利用することができる。本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、又は脳虚血の処置には特に適している。
【００３９】
本発明はまた、活性化合物を同定、認証、選択又は最適化するための新しい標的を提供する。実際本発明により、ヒストンデアセチラーゼの発現又は活性を調節するその能力に基づいて、有利な治療的又は生物学的性質を持つ化合物の選択が可能である。これらの測定法は、細胞ベース系若しくは動物系、又は無細胞系（例えば、単離タンパク質、ポリペプチド又は核酸を使用するか、あるいはインビトロ発現系において）で実施することができ、そして相互作用（例えば、結合、置換又は競合測定法など）又は機能（活性、転写など）の大きさに基づくことができる。
【００４０】
本発明の別の特定の目的は、特に興奮毒性又はニューロンのストレスに関連する疾患における、活性化合物の選択、同定又は性状解析のための方法であって、試験化合物をヒストンデアセチラーゼ又はその断片若しくは機能性変種を発現する細胞と接触させること、及びこのタンパク質の発現又は活性を阻害する化合物の能力を測定することを特徴とする方法に関する。
【００４１】
本方法は、哺乳動物起源（ヒト、ネズミなど）の初代細胞又は細胞株のような、種々の細胞集団を用いて実施することができる。有利には、当のヒストンデアセチラーゼを自然には発現しないが、目的酵素をコードする核酸でトランスフェクションされた細胞が使用される。このように、本方法の選択性は増大する。下等真核生物細胞（酵母など）又は原核生物細胞も使用することができる。非ヒトトランスジェニック動物も使用することができる。
【００４２】
阻害作用は、詳細にはＲＮＡの検定、タンパク質の検定、活性の測定などにより、種々の方法で測定することができる。これらは、任意の従来の免疫酵素法（ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡなど）を用いて、又は標識プローブ若しくはチップを使用するハイブリダイゼーション法により、又は特異的プライマーを使用する増幅などにより測定することができる。
【００４３】
選択法はまた、無細胞系でも、ヒストンデアセチラーゼ又はその変種若しくは断片に結合する試験結合の能力を測定することにより実施することができる。これに関連して、本発明の別の特定の目的は、特に興奮毒性又はニューロンのストレスに関連する疾患に対する活性化合物の選択、同定又は性状解析のための方法であって、試験化合物をヒストンデアセチラーゼ又はその変種若しくは断片と接触させること、及び該ヒストンデアセチラーゼ、断片又は変種に結合する試験化合物の能力を測定することを特徴とする方法に関する。ヒストンデアセチラーゼ、断片又は変種は、単離及び精製した形で、可溶性の形で、又はマトリックス（例えば、ビーズ又はカラムなど）に結合して、又は膜若しくは小胞に取り込まれて使用することができる。ヒストンへの試験化合物の結合は、任意の既知の方法により、特に標識対照リガンドの置換により、ゲル移動又は電気泳動などにより測定することができる。
【００４４】
「変種」という用語は、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の、１つ又は幾つかの突然変異、置換、欠失及び／又は付加を含み、かつ実質的に同じ抗原特異性又は活性を持ち、かつヒストンを脱アセチル化する能力を大いに保持しているポリペプチドを含む。誘導体の典型例は、ヒストンデアセチラーゼ多型による、スプライシングによるなどの配列変化物を含む。特に好ましい誘導体は、野生型配列に存在するアミノ酸とは異なる、多くとも５個のアミノ酸残基を含む。「断片」という用語は、ヒストンデアセチラーゼアミノ酸配列由来の５〜１００個（好ましくは１０〜１００個）の連続残基を含むポリペプチドを意味する。断片は有利には、酵素の活性部位を含む。
【００４５】
試験化合物は、天然又は合成化合物、脂質、核酸、ポリペプチド、化学製品などのような、多様な性質と起源のものであってよい。これらは、単離化合物であっても、又は混合物、コンビナトリアルライブラリーなどであってもよい。本発明の方法において、幾つかの試験化合物を、並行して、例えば、マルチウェルプレート、箱などのような適切な装置で試験することができる。
【００４６】
本発明の別の目的は、ヒストンデアセチラーゼのスプライス変種、並びにこのようなポリペプチドをコードする核酸、同核酸を含むベクター、組換え細胞、及びこれらの使用に関する。ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス、人工染色体などであってよい。好ましいベクターは、例えば、市販のプラスミド（ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなど）から誘導されたベクターのような、プラスミドベクターである。このようなベクターは、有利には選択遺伝子及び／又は複製の起点及び／又は転写プロモーターを含む。他の特定のベクターは、例えば、ウイルス又はファージ、特に、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスなどから誘導されたウイルスのような、複製欠損の組換えウイルスである。ベクターは、例えば、原核生物又は真核生物細胞のようなコンピテント宿主で使用することができる。これらは、細菌（例えば、大腸菌（E. coli））、酵母（例えば、サッカロミケス（Saccharomyces）又はクルイベロミケス（Kluyveromyces））、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、特にヒト細胞などであってよい。これらは、細胞株、初代細胞、混合培養などであってもよい。
【００４７】
本発明はまた、特に初期段階で、興奮毒性の状態を診断するために使用することができる。本発明は、対象における興奮毒性状態、特にこのような状態と関連した、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ又は脳虚血のような疾患の存在、素因又は進展を検出するのに特に有用である。本発明は、多発性硬化症又はＡＬＳを初期段階で検出するために特に適合する。
【００４８】
よって本出願の別の態様は、生物学的試料中の、ヒストンデアセチラーゼ（又はそのスプライス変種若しくは他の遺伝子改変物）の存在を検出するための、又はその相対量を投与又は決定するための方法及び手段に関する。
【００４９】
本発明の特定の目的は、対象における興奮毒性又はニューロンのストレスの状態を検出するための方法であって、インビトロ又はエクスビボで、対象からとった試料中の１種（又は数種）のヒストンデアセチラーゼ、特にヒストンデアセチラーゼ２の発現を測定することを特徴とする方法に関する。
【００５０】
別の特定の目的は、対象における興奮毒性又はニューロンのストレスの状態を検出するための方法であって、対象からとった試料中の、突然変異型の１種（又は数種）のヒストンデアセチラーゼ、特にヒストンデアセチラーゼ２、又は対応するＲＮＡの存在（又は非存在）を検出することを特徴とする方法に関する。
【００５１】
タンパク質、ＲＮＡ又は発現の測定又は検出のために適切な手段は、特にプローブ又は核酸プライマー、抗体又は他の特異的リガンド、キット、装置、チップなどを含む。検出方法は、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、クロマトグラフィー又は免疫学的方法などを含んでよい。これらの方法は、本明細書に上述されたような疾患の進行又は同疾患における処置の効力の検出、性状解析、モニターに、あるいは疾患の素因の測定に特に適している。
【００５２】
本方法は、血液、血漿、尿、血清、唾液、生検試料又は培養細胞などのような、種々の生物学的試料を使用して実施することができる。好ましくは、神経又は筋肉細胞を含む試料であってよい。利用される手法に応じて、試料は前処理することができ、例えば、核酸をハイブリダイゼーション及び／又は増幅反応に利用可能にし、かつ／あるいはタンパク質を免疫又は酵素反応に利用可能にすることができる。
【００５３】
特定の実施態様では、ヒストンデアセチラーゼをコードするｍＲＮＡの試料における発現が測定されるか、あるいはｍＲＮＡの存在又は量が検出又は検定される。幾つかのヒストンデアセチラーゼは、並行して検出又は検定することができる。
【００５４】
この測定、検出又は検定は、試料と、検討中のＲＮＡに特異的な核酸プローブ、詳細にはヒストンデアセチラーゼのメッセンジャーＲＮＡからの配列又は相補的若しくは誘導された配列の全部又は一部を含むプローブとのハイブリダイゼーションにより実行することができる。特定の実施態様では、このプローブは、ハイブリダイゼーション生成物の検出を容易にするために、１本鎖であり、かつ／又は標識されている。標識付けは、放射活性、蛍光、ルミネセントなどであってよい。プローブは、マトリックスに固定化することができる。
【００５５】
ニューロンのストレスの状態、そして更に詳細には興奮毒性状態の診断、検出、スクリーニング又は性状解析のための方法、特に興奮毒性又はニューロンのストレスに関連する構成要素又は段階による神経変性疾患の診断、検出、スクリーニング又は性状解析のための方法を実施するために、ヒストンデアセチラーゼの遺伝子又はメッセンジャーＲＮＡから誘導された配列、とりわけこの配列に特異的、相補的又はここから誘導された配列の全部又は一部を含む核酸を使用することは、本発明の特定の目的である。
【００５６】
本明細書に上述されているように、本出願は、神経毒性プロセスに関与しているある種の組織における非スプライス型の存在を証明しており、そして本発明により、試料中のスプライス型と非スプライス型の検出又は相対量決定が可能になる。非スプライス種の発現、存在又はレベルの上昇は、興奮毒性状態の進展と相関している。よって特定の変法では、本発明の方法は、ヒストンデアセチラーゼＲＮＡのスプライス型及び／又は非スプライス型の存在の分析を含む。この検出は、例えば、ＲＮＡの非欠失（即ち、非スプライス）領域の間の結合部に由来する配列に特異的な核酸プローブを用いることにより、行うことができる。スプライス型と非スプライス型の間の比の変化は、疾患の進行（又は治療の効力）のインジケーターとしてモニターすることができる。
【００５７】
測定、検出又は検定はまた、検討中のＲＮＡに特異的な核酸プライマー（又はプライマー対）を用いる、試料中の核酸の選択的増幅により行うことができる。特定の実施態様では、プライマー（又は対のプライマーの一方）は、ＲＮＡの非欠失（即ち、非スプライス）領域の間の結合部に由来する配列に特異的である。増幅は、例えば、ＰＣＲを利用して実行することができる。増幅生成物は、任意の既知の手法により検出又は検定することができる。このようなプライマー（又はプライマー対）は、本出願の別の目的を構成する。
【００５８】
別の特定の実施態様では、試料中のヒストンデアセチラーゼの存在又は量が検出又は検定される。この検出は、特異的抗体、又は任意の他の特異的リガンドを用いて実行することができる。
【００５９】
本発明の別の目的は、本明細書に上述された、１つ又は幾つかの核酸（ベクター、プローブ、プライマー、オリゴヌクレオチド、アンチセンス配列を含む）、ポリペプチド（抗体を含む）又は細胞が固定化されている、マトリックス（を含む産物）に関する。このマトリックスは、例えば、ナイロン、ガラス、プラスチックなど、又は任意の他の互換性の材料のように、固体で、扁平か又はそうでなく、均質か又はそうでなくてもよい。ポリペプチド又は核酸は、好ましくは一方の末端により、抗体又はプローブのような特異的リガンドとの相互作用に関与する反応にその分子を接近させる条件下で固定化される。このポリペプチド又は核酸は、マトリックス上に正確なやり方で配置させ、そして幾重にも沈積させることができる。
【００６０】
本発明はまた、組織及び虚血状態を性状解析するために使用することができる。この使用法もまた、組織におけるヒストンデアセチラーゼ又は改変型の検出又は検定に基づく。
【００６１】
本発明の他の態様及び利点は、具体例であって非限定的と考えるべき以下の実施例を読めば、明らかとなろう。
【００６２】
実施例
実施例１：興奮毒性の分子標的としてのヒストンデアセチラーゼ２の同定
疾患の異なる段階に対応する動物脳の試料からのポリアデニル化（ポリＡ＋）ＲＮＡ抽出物を用いて、定性差分分析を行った。ニューロンは、疾患の進展に関連した最大数の代替スプライシング事象に配慮するために、前もって単離しなかった。
【００６３】
ポリＡ＋ＲＮＡは、当業者には既知の手法を用いて調製した。詳細には、チオシアン酸グアニジニウムのようなカオトロピック剤での処理、これに続く溶媒（例えば、フェノール又はクロロホルム）による総ＲＮＡの抽出を含むことができる。このような方法は、当業者には周知であり（Maniatisら, Chomczynsliら, Anal. Biochem. 162 (1987) 156を参照のこと）、市販のキットを用いて容易に実施することができる。
【００６４】
ポリＡ＋ＲＮＡは、この総ＲＮＡから、当業者に知られており、かつ市販のキットの形で利用可能な従来法により調製した。
【００６５】
このポリＡ＋ＲＮＡは、逆転写酵素を用いる逆転写反応の鋳型として使用した。有利には、使用する逆転写酵素は、ＲＮアーゼＨ活性を持たず、このため得られる相補ＤＮＡの最初の鎖は、従来の逆転写酵素により得られる鎖よりも長くなる。このようなＲＮアーゼＨ活性のない逆転写酵素調製物は市販されている。
【００６６】
疾患の進展の動態の各時点（３０日、６０日及び９０日）で、ポリＡ＋ＲＮＡ及び１本鎖ｃＤＮＡをトランスジェニック動物（Ｔ）及び同系対照動物（Ｃ）から調製した。
【００６７】
ＤＡＴＡＳ法により、動態の各時点でｍＲＮＡ（Ｃ）とｃＤＮＡ（Ｔ）の間のハイブリダイゼーションを、逆のｍＲＮＡ（Ｔ）とｃＤＮＡ（Ｃ）との間のハイブリダイゼーションと同様に実行した。
【００６８】
これらｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ２本鎖を、次にＤＡＴＡＳ法プロトコールにより精製した。
【００６９】
相補ＤＮＡと対形成しないＲＮＡ配列を、ＲＮアーゼＨの作用によって（この酵素は、不対ＲＮＡ配列を分解するため）これらのヘテロ２本鎖から取り除いた。このような不対配列は、他の点では相同なＲＮＡ分子の間に存在する定性的な差を表す。このような定性的な差は、ＲＮＡ分子の配列内のどこか、配列の５’、３’又は中央のいずれか、そして特にコード配列に位置を特定することができる。これらの局在性に応じて、これらの配列は、スプライシングによる修飾というだけでなく、転座又は欠失の結果でもありうる。
【００７０】
定性的な差を表すＲＮＡ配列は、次に当業者には既知の手法、そして特にＤＡＴＡＳ法特許に記述された手法によりクローン化した。
【００７１】
これらの配列は、定性差分ライブラリーを構成するｃＤＮＡライブラリーに分類した。これらのライブラリーの１つは、健常状態に特異的なエクソンとイントロンを含む；他のライブラリーは、病的症状の特徴を示すスプライシング事象を含む。
【００７２】
クローンの発現の差は、試験した種々の状態から抽出したメッセンジャーＲＮＡ分子の逆転写により得られたプローブとのハイブリダイゼーションにより照合した。ハイブリダイゼーションの差を示すクローンは、後の分析のために保持した。ＤＡＴＡＳにより同定した配列は、そのスプライシングに関して、健常状態に比較して疾患状態において差をつけて発現するイントロン及び／又はエクソンに対応する。これらのスプライシング事象は、疾患の進展の所定の段階に特異的であっても、あるいは健常状態に典型的であってもよい。
【００７３】
これらの配列をデータバンクと比較することにより、得られた情報を分類することができ、そしてその診断的又は治療的価値により、配列の健全な選択を提案することができる。
【００７４】
得られた結果は、ヒストンデアセチラーゼ２（ｍＨＤＡ２、ジーンバンク参照番号：ＡＦ００６６０３）のコード領域、更に詳細にはヌクレオチド２９３４〜３２４３にまたがる領域に影響するスプライシング事象の存在を示した。ニューロン生存の条件（２５μMカリウム）下で優先的に検出される、このスプライシング事象は、酵素を不活化して、ヒストンや生存ニューロンにおける遺伝子発現に関与する他の因子のアセチル化の増加を引き起こした。相互的に、同じ核因子のアセチル化の低下は、５μMカリウムの存在下でのニューロンの細胞死と関連することが証明された。
【００７５】
実施例２：ヒストンデアセチラーゼインヒビターによる興奮毒性の阻害
この実施例のために、ラット小脳顆粒細胞を、当業者には既知の手法により培養した。興奮毒性は、２つの型の処理により（第１には、１００μM  ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）と１０μMセリンの合同投与により、そして第２には、５０μMカイニン酸の投与により）これらの細胞において誘導した。採用した実験条件下で、３０〜４０％の毒性が観測され、当業者には知られているＭＴＴ試験を用いてこれを測定した。
【００７６】
興奮毒性の阻害は、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、特にトリコスタチンＡの存在下で証明することができる。よって本発明は、興奮毒性機序における、特にＡＬＳモデルにおけるヒストンデアセチラーゼ２の関与を、また興奮毒性に関連するストレスの中でニューロンの生存を維持するこの酵素のインヒビターの能力を立証する。
【００７７】
本発明の他の態様及び応用は、以下にある：
−  このような疾患の患者におけるヒストンデアセチラーゼ２発現を阻害することを目的とした、アンチセンスＲＮＡを含む核酸断片の使用、
−  このような疾患の患者におけるヒストンデアセチラーゼ２発現を阻害することを目的とした、化合物、トリコスタチンＡ、又はこれを含む任意の薬剤組成物の使用。
【国際調査報告】
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