(57)【要約】本発明は、種々の組織の修復および置換において有用なペプチド足場を特徴とする。本発明はまた、これらの足場を作製する方法およびそれらを使用する方法を提供する。本発明は、生細胞を組み込んだ両親媒性ペプチドを有する、肉眼で見ることができる足場を特徴とする。ペプチドは、交互に疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を有し、補完的でありそして構造的に適合性であり、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる足場へと自律的に組み立てられる。肉眼で見ることができる足場は、生細胞をカプセル化し、そしてカプセル化された細胞は、三次元配置で肉眼で見ることができる足場中に存在する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ペプチドおよび培地を含有する、肉眼で見ることができる足場であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、これらは相補的かつ構造的に適合性であり、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる足場に自律的に組み立てられ；そしてここで、前記足場は、生存細胞をカプセル化し、該細胞は三次元配置で該足場に存在する、足場。
【請求項２】
前記細胞が軟骨細胞である、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項１に記載の足場。
【請求項４】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項３に記載の足場。
【請求項５】
前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも４０ｋＰＡである、請求項１に記載の足場。
【請求項６】
前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも９０ｋＰＡである、請求項５に記載の足場。
【請求項７】
インシュリン、トランスフェリン、および／またはセレニウムを含む溶液を含有する、請求項１に記載の足場。
【請求項８】
前記溶液が、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌのインシュリンを含有する、請求項７に記載の足場。
【請求項９】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのトランスフェリンを含有している、請求項７に記載の足場。
【請求項１０】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含有している、請求項７に記載の足場。
【請求項１１】
治療上有効な化合物または化学誘引物質をさらにカプセル化している、請求項１に記載の足場。
【請求項１２】
前記ペプチドが、哺乳動物中の細胞、組織、器官、器官系、または部位への標的化を提供する接着部位、成長因子結合部位、成長因子、または配列を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項１３】
前記細胞が細胞外マトリックス成分を分泌する、請求項１に記載の足場。
【請求項１４】
前記細胞外マトリックス成分の分泌によって、前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも５０倍増大する、請求項１３に記載の足場。
【請求項１５】
前記カプセル化された細胞の少なくとも６０％が、別のカプセル化された細胞または前記足場の外側の細胞と細胞−細胞接触の状態にある、請求項１に記載の肉眼で見ることができる足場。
【請求項１６】
肉眼で見ることができる足場を形成する方法であって、以下：
（ａ）等浸透圧性溶質を含有する水溶液中で、ペプチドおよび生存細胞をインキュベートする工程であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そしてこれらは相補的かつ構造的に適合性である、工程；および
（ｂ）β−シート型の肉眼で見ることができる足場への該ペプチドの自律的な組み立てを開始するのに十分な電解質を該溶液に添加する工程であって、それによって該細胞は該足場の形成によりカプセル化され、そして三次元配置で該足場に存在する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記細胞が軟骨細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記足場を予め決定された圧縮機構に供する工程（ｃ）をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が、インシュリン、トランスフェリン、および／またはセレニウムを含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶液が、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌのインシュリンを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのトランスフェリンを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶液が、前記足場の容積または形状を決定する寸法の、予め形成された鋳型の中に含まれ；それによって予め決定された形状または容積の、肉眼で見ることができる足場を形成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
細胞を培養する方法であって、以下：
（ａ）等浸透圧性溶質を含有する水溶液中で、ペプチドおよび生存細胞をインキュベートする工程であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そしてこれらは相補的かつ構造的に適合性である、工程；
（ｂ）β−シート型の肉眼で見ることができる足場への該ペプチドの自律的な組み立てを開始するのに十分な電解質を、該溶液に添加する工程であって、それによって該細胞は該足場の形成によってカプセル化され、そして三次元配置で該足場に存在する、工程；ならびに
（ｃ）該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記細胞が軟骨細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記足場を、予め決定された圧縮機構に供する工程（ｄ）をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶液が、インシュリン、トランスフェリン、および／またはセレニウムを含む溶液を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記溶液が、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌのインシュリンを含有する、請求項３１に記載の足場。
【請求項３３】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのトランスフェリンを含有する、請求項３１に記載の足場。
【請求項３４】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含有する、請求項３１に記載の足場。
【請求項３５】
請求項１に記載の足場を哺乳動物に投与する工程を包含する、組織の再生方法。
【請求項３６】
組織の再生方法であって、以下：
両親媒性ペプチド、生存細胞、等浸透圧性溶質を含有する水溶液を哺乳動物に投与する工程であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そして相補的かつ構造的に適合性であり、ここで該ペプチドは、該投与前には実質的には自律的に組み立てられず、該ペプチドは、該投与後にβ−シート型の肉眼で見ることができる足場へと自律的に組み立てられ、それによってインビボで該細胞をカプセル化し、該細胞は三次元配置で該足場に存在する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、軟骨の欠損、結合組織の欠損、神経組織の欠損、表皮内層の欠損、内皮内層の欠損、糖尿病、または関節炎を処置または予防するために使用される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記足場を予め決定された圧縮機構に供する工程をさらに包含する。請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記圧縮機構が、前記細胞による細胞外マトリックス成分の分泌を誘導する、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも５０倍増大させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも１００倍増大させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも１５０倍増大させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記肉眼で見ることができる足場の１Ｈｚでの動剛性が、少なくとも１．０ＭＰａである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記圧縮機構が、前記足場に可変圧をかける工程を包含する。請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記圧縮機構が、静的オフセット圧縮に重ねられた、全体で０．０１Ｈｚと３Ｈｚとの間の動的圧縮に前記足場を供する工程を包含する、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記圧縮機構が、全体で０．１Ｈｚと１Ｈｚとの間の動的圧縮に前記足場を供する工程を包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ひずみの大きさが、全体で０．０１％と１０％との間である、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記ひずみの大きさが、全体で１％と５％との間である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記圧縮機構が、少なくとも１週間の間、前記足場に可変圧または定圧をかける工程を包含する、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記圧縮機構が、少なくとも３週間の間、前記足場に可変圧または定圧をかける工程を包含する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記圧縮機構が、１時間の間、前記足場に圧力をかける工程、および全体で１時間と７時間との間、圧力をかけずに該足場をインキュベートする工程を包含する、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記圧縮機構が少なくとも４回繰り返される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記圧縮機構が、４５分間、該足場に圧力をかける工程、および全体で１時間と７時間との間、圧力をかけずに該足場をインキュベートする工程を包含する。請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項５７】
前記足場が、全体で５時間と６時間との間、圧力をかけずにインキュベートされる。請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記圧縮機構が少なくとも４回繰り返される。請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記足場を予め決定された剪断荷重機構に供する工程をさらに包含する、請求項２０、３０、または３５に記載の方法。
【請求項６０】
前記カプセル化された細胞の少なくとも６０％が、別のカプセル化された細胞と細胞−細胞接触の状態にある、請求項１６、２６、３５、または３６に記載の方法。
【請求項６１】
前記工程（ａ）の溶液が１０ｍＭ未満の電解質を含み、そして前記ペプチドが工程（ｂ）の前に実質的に自律的に組み立てられない、請求項１６または２６に記載の方法。
【請求項６２】
患者の組織の欠損を処置するためのキットであって、以下：
（ａ）交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そしてこれらは相補的かつ構造的に適合性であり、そして等浸透圧性溶質を有する、ペプチド；
（ｂ）β−シート型の肉眼で見ることができる足場への該ペプチドの自律的な組み立てを開始するのに十分な電解質であって、それによって、細胞は、該足場の形成によりカプセル化され、そして三次元配置で該足場に存在する、足場；
（ｃ）該ペプチドの該足場への自律的な組み立てを開始するための指示書、
を備える、キット。
【請求項６３】
前記細胞が軟骨細胞である、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場中に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも４０ｋＰＡである、請求項６２に記載のキット。
【請求項６７】
インシュリン、セレニウム、および／またはトランスフェリンを備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項６８】
治療上有効な化合物または化学誘引物質をさらにカプセル化する、請求項６２に記載のキット。
【請求項６９】
前記ペプチドが、哺乳動物中の細胞、組織、器官、器官系、または部位への標的化を提供する接着部位、成長因子結合部位、成長因子、または配列を備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項７０】
前記ペプチドを含有する溶液への添加のために前記細胞を調製する手段を備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項７１】
前記足場に圧力をかける手段を備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項７２】
所望される外形および／または容積に前記足場を形成するための鋳型を備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項７３】
所望される細胞型の細胞および軟骨細胞を含み、ここで前記足場における軟骨細胞の存在が、該足場の硬度の増大を導く、請求項１に記載の足場。
【請求項７４】
前記足場が所望される細胞型の細胞および軟骨細胞を含み、ここで該足場における軟骨細胞の存在が、該足場の硬度の増大を導く、請求項１６、２６、３５、または３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（政府によって基金援助された研究についての記述）
本発明は、ＮＩＨ助成金番号ＡＲ４５７７９および同第ＡＲ３３２３６の下で政府の援助によって行われた。従って政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
過去の１０年間の間に、種々の組織（特に、膝関節の軟骨組織）の修復および置換のための材料を開発することに、かなりの労力が費やされてきている。詳細には、軟骨、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、および神経系に関係している加齢性障害および変性疾患の数が増大しており、医薬品だけでは効果ではない場合には、有意な組織修復または置換が必要である。種々のポリマー性生体材料が、組織修復のために開発されているが、これらの有効性には時折、免疫不適合性および応力の不適切な分布によって欠陥が生じる。さらに、動物（例えば、ウシの皮、またはブタもしくはサメの軟骨）に由来する材料の使用は、プリオンのような感染性因子の混入の可能性の懸念を生じる。多くの細胞型が、体内の三次元環境で見出されている。しかし、三次元環境（例えば、コラーゲンまたはフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分を含む環境）の物理的および化学的な特性は変化し得、従って種々の細胞型の増殖を支持する環境の能力に影響を与える場合がある。
【０００３】
従って、小さい混入のリスクを示し、そして組織修復のために適切な生化学的特徴を提供する改良された適合性を有する、生物学的起源の改良された材料が必要とされている。さらに、このような材料については、生来の組織と移植された細胞との間での相互作用を促進することが所望される。例えば、理想的に改良された細胞システムは、周辺組織に組み込むことができ、長期間にわたる組織の形成が可能であり、そして新しい細胞性調節によって組織／器官の機能を回復する。さらに、移植された細胞は、欠損の隅々までに分布されるはずであり、最終的には、力学的および生物学的に機能的である修復組織を生じる。
【０００４】
軟骨修復については、生体材料の構造的安定性は理想的には、カプセル化された細胞が、移植片の隅々までに任意の必要とされる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の連続するネットワークを堆積させるまで、生体材料によって維持されるべきである。置換軟骨は、例えば、周辺の正常組織に組み込まれるはずであり、そして新しく組み立てられたＥＣＭは、正常な関節の充填の間に生じる組織圧縮に対する組織弾性を提供するはずである。これらの材料の生体分解速度を制御する能力もまた所望される。詳細には、生体材料は、ＥＣＭネットワークが完成すると分解するべきであり、それによって全体的な生体材料の外形の隅々までに再生を誘導する。
【０００５】
体の再生能力は、肝臓（毒素によって誘導される傷害に対する部分的肝切除による範囲の傷害後に再生する完璧な能力を有することが周知である）のような特定の器官の場合に、特に顕著である。しかし、培養物中で分化した肝細胞を十分に維持することはできていない。さらに、肝臓の幹細胞についての知見は未だ限られており、そして肝臓由来の細胞の能力は、完全には研究されていない。従って、肝臓の前駆細胞および幹細胞の増殖のための改良された細胞培養系、技術、および組成物の開発、ならびにそれらの分化および分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）能力の研究が必要である。さらに、種々の他の前駆細胞または幹細胞（神経系統の細胞を含む）の増殖のための改良された細胞培養系、技術、および組成物の開発、ならびにそれらの分化および分化転換する能力の研究が必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明の目的は、組織修復または置換のための改良された生体材料および方法を提供することである。本発明者らは、生細胞が予め決定された外形の三次元配置での足場での生体分解性ペプチド足場によってカプセル化され得ることを発見した。例えば、カプセル化された細胞による細胞外マトリックス成分の分泌は、足場の硬度を有意に増大させ、それによって足場が、軟骨のような損傷している内因性細胞を修復するかまたは置き換える能力を改善する。驚くべきことに、本発明者らは、軟骨組織の置換のためにもともと開発された本発明者らの足場システムが、広い範囲の細胞型（例えば、幹細胞、ニューロン、および肝細胞）を支持することができることを見出した。種々の細胞型を支持するこの能力は、並外れた多数の重要な治療適用について、組織および器官の置換を可能にする。
【０００７】
従って、１つの局面においては、本発明は、生細胞を組み込んだ両親媒性ペプチドを有する、肉眼で見ることができる足場を特徴とする。ペプチドは、交互に疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を有し、補完的でありそして構造的に適合性であり、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる足場へと自律的に組み立てられる。肉眼で見ることができる足場は、生細胞をカプセル化し、そしてカプセル化された細胞は、三次元配置で肉眼で見ることができる足場中に存在する。種々の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、軟骨細胞以外の細胞をカプセル化する。
【０００８】
別の局面においては、本発明は、肉眼で見ることができる足場を形成する方法を特徴とする。この方法は、ペプチドと生細胞を等浸透圧性溶質を有している水溶液中で、所望される場合にはペプチドを実質的には自律的に組み立てさせない条件下で、インキュベートすることを含む。望ましくは、溶液は、１０、５、１、もしくは０．１ｍＭ未満の電解質を含むか、または実質的には電解質を含まない。ペプチドは、補完的でありそして構造的に適合性である、交互になった疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を有する。次いで、十分な電解質が、ペプチドがβ−シート型の肉眼で見ることができる足場への自律的な組み立てを開始するように溶液に添加される。それによって細胞は、肉眼で見ることができる足場の形成によってカプセル化される。カプセル化された細胞は、三次元配置で肉眼で見ることができる足場の中に存在する。種々の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、軟骨細胞を含まない。望ましくは、添加される電解質の濃度は、少なくとも５、１０、２０、または５０ｍＭである。望ましい電解質として、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣｓ＋が挙げられる。１つの望ましい実施形態においては、等浸透圧性溶質の濃度は、少なくとも５０、１５０、または３００ｍＭである。別の望ましい実施形態においては、等浸透圧性溶質の濃度は、以下の範囲の１つに含まれる：２００から２５０ｍＭ、２５０から２７０ｍＭ、２７０から３００ｍＭ、３００から４００ｍＭ、４００から５００ｍＭ、５００から６００ｍＭ、６００から７００ｍＭ、７００から８００ｍＭ、または８００から９００ｍＭ。望ましい等浸透圧性溶質として、炭水化物（例えば、モノサッカライドまたはジサッカライド）が挙げられる。足場の形成での使用に望ましい炭水化物の例として、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、およびキシロースが挙げられる。なお別の望ましい等浸透圧性溶質は、グリセロール（例えば、５から２０％（ｖ／ｖ）の間のグリセロールのグリセロールの水溶液）である。
【０００９】
なお別の局面においては、本発明は、予め決定された形状または容積の肉眼で見ることができる足場の形成方法を提供する。この方法は、ペプチドと生細胞を、等浸透圧性溶質を有している水溶液中で、望ましくはペプチドを実質的には自律的に組み立てさせない条件下でインキュベートすることを含む。望ましくは、溶液は、１０、５、１、もしくは０．１ｍＭ未満の電解質を含むか、または実質的には電解質を含まない。溶液は、肉眼で見ることができる足場の容積または形状を決定するような寸法にされた、予め形づくられた鋳型の中に含まれる。ペプチドは、補完的でありそして構造的に適合性である、交互になった疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を有する。次いで、十分な電解質が、ペプチドがβ−シート型の肉眼で見ることができる足場への自律的な組み立てを開始するように溶液に添加される。それによって細胞は、所望される立体構造での肉眼で見ることができる足場の形成によってカプセル化される。カプセル化された細胞は、三次元配置で肉眼で見ることができる足場の中に存在する。種々の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、軟骨細胞を含まない。望ましくは、添加される電解質の濃度は、少なくとも５、１０、２０、または５０ｍＭである。望ましい電解質として、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣｓ＋が挙げられる。１つの望ましい実施形態においては、等浸透圧性溶質の濃度は、少なくとも５０、１５０、または３００ｍＭである。別の望ましい実施形態においては、等浸透圧性溶質の濃度は、以下の範囲の１つに含まれる：２００から２５０ｍＭ、２５０から２７０ｍＭ、２７０から３００ｍＭ、３００から４００ｍＭ、４００から５００ｍＭ、５００から６００ｍＭ、６００から７００ｍＭ、７００から８００ｍＭ、または８００から９００ｍＭ。望ましい等浸透圧性溶質として、炭水化物（例えば、モノサッカライドまたはジサッカライド）が挙げられる。望ましい炭水化物の例として、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、およびキシロースが挙げられる。なお別の望ましい等浸透圧性溶質は、グリセロール（例えば、５から２０％（ｖ／ｖ）の間のグリセロールのグリセロールの水溶液）である。
【００１０】
別の局面においては、本発明は、細胞を培養する方法を特徴とする。この方法は、ペプチドと生細胞を、等浸透圧性溶質を有している水溶液中で、望ましくはペプチドを実質的には自律的に組み立てさせない条件下でインキュベートすることを含む。望ましくは、溶液は、１０、５、１、もしくは０．１ｍＭ未満の電解質を含むか、または実質的には電解質を含まない。ペプチドは、補完的でありそして構造的に適合性である、交互になった疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を有する。次いで、十分な電解質が、ペプチドがβ−シート型の肉眼で見ることができる足場への自律的な組み立てを開始するように溶液に添加される。それによって細胞は、所望される立体構造の肉眼で見ることができる足場の形成によってカプセル化される。カプセル化された細胞は、三次元配置で肉眼で見ることができる足場の中に存在する。カプセル化された細胞は、肉眼で見ることができる足場の中で培養される。種々の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、軟骨細胞以外の細胞をカプセル化する。望ましくは、細胞は、少なくとも１、２、３、または５時間、あるいは１、２、３、または５日間、あるいは１、２、３、または５週間培養される。望ましい実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、本明細書中に記載されているように、予め決定された圧縮機構に供される。いくつかの実施形態においては、溶液は、０．１から０．５％の間、０．５から０．７５％の間、０．７５から１．０％の間、１．０から１．５％の間、１．５から２％の間、２から３％の間、３から５％の間、または５から１０％の間のＩＴＳ培地を含む。他の実施形態においては、溶液は、少なくとも０．５、１、２、３、５、７、または１０％のＩＴＳ培地を含む。特定の実施形態においては、溶液は、約０．１ｍｇ／Ｌのインシュリン、０．０５５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、および／または０．０５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含む。望ましくは、添加される電解質の濃度は、少なくとも５、１０、２０、または５０ｍＭである。望ましい電解質として、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣｓ＋が挙げられる。１つ望ましい実施形態においては、等浸透圧性溶質の濃度は、少なくとも５０、１５０、または３００ｍＭである。別の望ましい実施形態においては、等浸透圧性溶質の濃度は、以下の範囲の１つに含まれる：２００から２５０ｍＭ、２５０から２７０ｍＭ、２７０から３００ｍＭ、３００から４００ｍＭ、４００から５００ｍＭ、５００から６００ｍＭ、６００から７００ｍＭ、７００から８００ｍＭ、または８００から９００ｍＭ。望ましい等浸透圧性溶質として、炭水化物（例えば、モノサッカライドまたはジサッカライド）が挙げられる。望ましい炭水化物の例として、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、およびキシロースが挙げられる。なお別の望ましい等浸透圧性溶質は、グリセロール（例えば、５から２０％（ｖ／ｖ）の間のグリセロールのグリセロールの水溶液）である。
【００１１】
なお別の局面においては、本発明は、体内で組織を再生する方法を特徴とする。この方法は、両親媒性ペプチドとカプセル化された生細胞を有している肉眼で見ることができる足場を哺乳動物に投与することを含む。ペプチドは、補完的でありそして構造的に適合性である交互になった疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を有し、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる足場へと自律的に組み立てられる。カプセル化された細胞は、三次元配置で肉眼で見ることができる足場の中に存在する。種々の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、軟骨細胞以外の細胞をカプセル化する。望ましくは、この方法は、軟骨の欠損、結合組織の欠損、神経組織の欠損、肝臓の欠損、表皮の内層（ｌｉｎｉｎｇ）の欠損、内皮の内層の欠損、糖尿病、または関節炎を処置または予防するために使用される。望ましい結合組織として、靭帯および腱が挙げられ、そして望ましい表皮の内層は皮膚である。いくつかの実施形態においては、細胞は自己由来であるかまたは同種異系である。望ましい投与経路として、経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、筋肉内、静脈内、皮内、および外科手術が挙げられる。望ましい外科的投与は、関節鏡手術である。望ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００１２】
関連する局面においては、本発明は、体内での組織再生の別の方法を提供する。この方法は、両親媒ペプチド、生細胞、および等浸透圧性溶質を有している溶液を哺乳動物に投与することを含む。ペプチドは、補完的でありそして構造的に適合性である、交互になった疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を有する。ペプチドは、投与の前には実質的に自律的に組み立てられないが、これらは哺乳動物への投与後に、β−シート型の肉眼で見ることができる足場へと自律的に組み立てられる。肉眼で見ることができる足場の形成によってインビボで細胞をカプセル化し、そしてカプセル化された細胞は、三次元配置で肉眼で見ることができる足場の中に存在する。種々の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、軟骨細胞以外の細胞をカプセル化する。望ましくは、投与される溶液は、１０、５、１．０、もしくは０．１ｍＭ未満の電解質を含むか、または実質的には電解質を含まない。望ましくは、等浸透性溶質の濃度は、少なくとも５０、１５０、または３００ｍＭである。別の望ましい実施形態においては、等浸透圧性溶質の濃度は、以下の範囲の１つに含まれる：２００から２５０ｍＭ、２５０から２７０ｍＭ、２７０から３００ｍＭ、３００から４００ｍＭ、４００から５００ｍＭ、５００から６００ｍＭ、６００から７００ｍＭ、７００から８００ｍＭ、または８００から９００ｍＭ。望ましい等浸透圧性溶質として、炭水化物（例えば、モノサッカライドまたはジサッカライド）が挙げられる。望ましい炭水化物の例として、スクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、およびキシロースが挙げられる。なお別の望ましい等浸透圧性溶質は、グリセロール（例えば、５から２０％（ｖ／ｖ）の間のグリセロールのグリセロールの水溶液）である。望ましくは、この方法は、軟骨の欠損、結合組織の欠損、肝臓の欠損、神経組織の欠損、表皮の内層の欠損、内皮の内層の欠損、糖尿病、または関節炎を処置または予防するために使用される。望ましい結合組織は、靭帯または腱であり、そして望ましい表皮の内層は皮膚である。望ましくは、細胞は自己由来であるかまたは同種異系である。望ましい投与経路として、経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、筋肉内、静脈内、皮内、および外科手術が挙げられる。望ましい外科的投与は、関節鏡手術である。望ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００１３】
別の局面においては、本発明は、個体の処置方法を提供する。この方法は、処置が必要である個体を同定する工程、および個体に本発明の足場中の細胞を投与する工程を包含する。ここでは、細胞は、両親媒性ペプチドを含有している細胞培養材料中にカプセル化されたそれらを培養することによって、分化または分化転換するように誘導されている。ペプチドは、実質的に等しい割合で親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸を含み、補完的でありそして構造的に適合性であり、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる構造へ自律的に組み立てることが可能であり、そしてここでは細胞は、分化促進因子に曝される。細胞は必要に応じて、投与の前に構造から抽出され得るか、または細胞／ペプチド構造が個体に導入され得る。
【００１４】
別の局面においては、本発明は、以下を含有している細胞培養キットを提供する：（ｉ）両親媒性ペプチド（ここでは、ペプチドは、補完的でありそして構造的に適合性である実質的に等しい割合の親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸を含み、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる構造に自律的に組み立てることができる）；および（ｉｉ）肉眼で見ることができる構造へのペプチドの自律的な組み立ての開始のための説明書。このキットはさらに、以下からなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含み得る：細胞の集団、細胞培養培地、予め決定された量の成長因子、予め決定された量の電解質、ペプチドヒドロゲル構造内での細胞のカプセル化のためおよびシステムの他の用途についての説明書、足場内で分化または分化転換するように細胞を誘導するための説明書、その中でカプセル化が行われ得る容器、その中にペプチドが溶解させられ得る液体、ペプチドの自律的な組み立てを開始するための電解質、組織培養のための培地、ならびに１つ以上の分化促進因子。
【００１５】
関連する局面においては、本発明は、患者の組織欠損を処置するためのキットを提供する。このキットは、補完的でありそして構造的に適合性である、交互になった疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を有するペプチド、等浸透性溶質、およびβ−シート型の肉眼で見ることができる足場へのペプチドの自律的な組み立てを開始するために十分な電解質を含有する。これにより、細胞は、足場の形成によってカプセル化され、そして三次元配置で上記の足場中に存在する。キットはまた、望ましくは、上記の足場への上記のペプチドの自律的な組み立てを開始するための説明書を含む。望ましくは、キットは、ペプチドを含有している溶液への添加のための細胞の調製のための手段、足場に圧力をかけるための手段、治療薬または成長因子、ならびに／あるいは望ましい外形および／または容積の足場の形成のための鋳型を含む。
【００１６】
本発明はまた、細胞をカプセル化する三次元ナノスケール環境の足場、およびカプセル化された細胞型を必要としている個体を処置するために（例えば、組織または器官の欠損を有している個体の処置のために）これらの足場を使用する方法を提供する。
【００１７】
従って、１つの局面においては、本発明は、三次元ナノスケール環境の足場の中に細胞をカプセル化する工程を包含する、細胞の培養方法を提供する。特定の実施形態においては、ナノスケール環境の足場は、タンパク質またはペプチドのヒドロゲルを含む。ヒドロゲルは、本明細書中に記載されているように、自律的に組み立てられるペプチドヒドロゲルであり得る。いくつかの実施形態においては、ペプチドは、両親媒性ペプチドを含む。ここでは、ペプチドは実質的に等しい割合の、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸を含み、補完的でありそして構造的に適合性であり、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる構造に自律的に組み立てることができる。いくつかの実施形態では、ナノスケール環境の足場はナノ繊維（ｎａｎｏｆｉｂｅｒ）を含む。ナノ繊維は、例えば、本明細書中に記載されているペプチドのいずれかである、自律的に組み立てられるペプチドから構成され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、前駆細胞、幹細胞、肝臓由来の細胞、または神経組織由来の細胞を含むか、またはそれらからなる。前駆細胞または幹細胞は、足場の移植前、その間、またはその後で分化を誘導するように処理され得る。例えば、細胞は、肝臓細胞系統の経路に沿って、および／または神経系統の経路に沿って分化するように指令を受けるかまたは誘導され得る。いくつかの実施形態においては、細胞は肝臓細胞（例えば、肝臓の前駆細胞、肝臓の幹細胞、肝細胞、卵型細胞（ｏｖａｌ  ｃｅｌｌ）、胆管細胞）および／または神経系統の細胞（例えば、ニューロンまたは神経組織に関係している細胞（例えば、グリア細胞））を含む。任意の細胞型が、本発明の足場に使用され得るが、特定の実施形態では、細胞は、軟骨細胞、心臓細胞、骨髄細胞、骨膜傍（ｐｅｒｉｓｔｅａｌ）細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃｅｌｌ）、肝臓細胞、および包皮細胞である。種々の実施形態においては、ナノスケール環境の足場は、移植の前または移植時に軟骨細胞を放出する。
【００１８】
別の局面においては、本発明は、細胞をカプセル化しているナノスケール環境の足場を提供する。細胞をカプセル化する足場は、当業者によって容易に使用される本明細書中に記載されている方法またはそのバリエーションに従って調製され得る。特定の実施形態においては、ナノスケール環境の足場は、タンパク質またはペプチドのヒドロゲルを含む。ヒドロゲルは、本明細書中に記載されているような、自律的に組み立てられるペプチドヒドロゲルであり得る。いくつかの実施形態においては、ペプチドは両親媒性ペプチドである。ここでは、ペプチドは、補完的でありそして構造的に適合性である、実質的に等しい割合の親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸を含み、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる構造へと自律的に組み立てることができる。特定の実施形態においては、ナノスケール環境は、人工の材料を含むかまたはそれから構成される。いくつかの実施形態においては、人工的な材料には、体内では自然界では見出されない材料を含むかまたはそれから構成される。人工的な材料はまた、生存している供給源によって産生される物質を単離することおよび処理することによって得られる特定の材料を含む。しかし、実質的に完全なままであり、そしてそれが生物体の体内で自然界で見出される構造を実質的に保持している材料は、人工的な材料とは考えない。任意の種々の人工的な材料が使用され得る。いくつかの実施形態においては、ナノスケール環境の足場は、ナノ繊維を含む。ナノ繊維は自律的に組み立てられるペプチド（例えば、本明細書中に記載されている任意のペプチド）から構成され得る。特定の実施形態においては、細胞は、単離された細胞（例えば、被験体の体内にそれらの天然の環境には存在しない細胞）を含む。例えば、細胞は、被検体から取り出された細胞を含み得る。このような細胞は、取り出された後に培養され得、その後、カプセル化される。細胞には細胞株が含まれ得る。いくつかの実施形態においては、細胞は前駆細胞を含むかまたはそれから構成される。特定の実施形態においては、細胞は、幹細胞を含むかまたはそれから構成される。いくつかの実施形態においては、細胞は、肝臓由来の細胞、または神経組織由来の細胞を含む。いくつかの実施形態においては、細胞は、分化するように指令を受けているかまたは分化するように誘導されている、肝細胞または前駆細胞を含む。細胞は、肝臓細胞系統の経路に沿って、および／または神経系統の経路に沿って分化するように指令を受けるかまたは誘導され得る。いくつかの実施形態においては、細胞は肝臓細胞（例えば、肝臓の幹細胞、肝臓の前駆細胞、肝細胞、卵型細胞、胆管細胞）および／または神経系統の細胞（例えば、ニューロンまたはグリア細胞のような神経組織に関係しているニューロン以外の細胞）を含む。いくつかの実施形態においては、細胞は心臓細胞、骨髄細胞、骨膜傍細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘皮細胞、顆粒細胞、胚性肝細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、および包皮細胞である。種々の実施形態においては、ナノスケール環境の足場は、移植の前または移植時に軟骨細胞を放出する。もちろん���細胞をカプセル化しているナノスケール環境の足場は、種々の細胞型の組み合わせをカプセル化する場合がある。細胞型の組み合わせが使用される場合には、軟骨細胞が必要に応じて含まれ得る。
【００１９】
別の局面においては、本発明は個体の処置方法を提供する。この方法は、処置が必要である個体を同定する工程、および個体に細胞をカプセル化しているナノスケール環境の足場を投与する工程を包含する。細胞をカプセル化しているナノスケール環境の足場は、本明細書中に記載されているナノスケール環境の足場のいずれかであり得る。特定の実施形態では、細胞をカプセル化しているナノスケール環境の足場は、幹細胞または始原（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）細胞を含むかこれらから構成される。いくつかの実施形態においては、細胞は、肝臓細胞系統の細胞または神経系統の細胞を含む。いくつかの実施形態においては、細胞は、分化するように指令されているかまたは誘導されている、幹細胞または始原細胞を含む。細胞は、肝臓細胞系統の経路に沿って、および／または神経系統の経路に沿って分化するように指令されても誘導されてもよい。いくつかの実施形態においては、細胞は肝臓細胞（例えば、肝臓の幹細胞、肝臓の始原細胞、肝細胞、卵子細胞（ｏｖａｌ  ｃｅｌｌ）、胆管細胞）および／または神経系統の細胞（例えば、ニューロンまたはグリア細胞）を含み得る。他の実施形態においては、細胞は、軟骨細胞、心臓細胞、骨髄細胞、骨膜（ｐｅｒｉｓｔｅａｌ）細胞、軟骨膜細胞（ｐｅｒｉｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃｅｌｌ）、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃｅｌｌ）、肝臓細胞、および包皮細胞である。種々の実施形態においては、ナノスケール環境の足場は、軟骨細胞以外の細胞を含む。
【００２０】
別の局面においては、本発明は、候補の化合物を試験する方法を提供する。この方法は、肉眼で見ることができる足場または本発明のナノスケール環境の足場によってカプセル化された細胞を、候補の化合物と接触させる工程、およびカプセル化された細胞によって発現される分子（例えば、タンパク質、酵素、またはｍＲＮＡ）の活性レベルまたは発現レベルを測定する工程を包含する。分子の活性または発現のレベルが候補の化合物の存在下で異なる場合は、候補の化合物は、分子の活性または発現を調節すると決定される。
【００２１】
本発明の種々の局面の望ましい実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は酵素的に分解可能である。他の望ましい実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、メタロプロテアーゼ、コラゲナーゼ、またはアグリカナーゼによってインビボまたはインビトロで切断される。望ましくは、足場を切断することができる酵素は、カプセル化されている細胞またはその付近の細胞によって産生される。なお他の望ましい実施形態においては、肉眼で見ることができる足場はさらに、治療上活性である化合物または化学誘引物質をカプセル化する。このような治療上活性である化合物の例として、合成の有機分子、自然界に存在する有機分子、核酸分子、生合成タンパク質、または改変された自然界に存在するタンパク質が挙げられる。なお他望ましい実施形態においては、肉眼で見ることができる足場はさらに、増殖因子（例えば、軟骨由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、表皮増殖因子、肝細胞増殖因子、角化細胞増殖因子、または骨形成タンパク質）をカプセル化する。増殖因子、および／または治療薬もしくは化学誘引物質の組み合わせもまた、使用され得る。望ましい肉眼で見ることができる足場は、接着部位、増殖因子結合部位、増殖因子、または哺乳動物中の細胞、組織、器官、器官系、もしくはその中の部位への標的化を提供する配列を含む、ペプチドを有する。
【００２２】
他の望ましい肉眼で見ることができる足場は、予め決定された容積または形状を有する。望ましい実施形態においては、カプセル化された細胞は、実質的に均質に分布される。他の望ましい実施形態においては、カプセル化された細胞はニューロンであり、そして肉眼で見ることができる足場は、ニューロンから軸策が伸び出ることを可能にする。望ましくは、軸策は、肉眼で見ることができる足場の表面を越えて伸びる。なお他の望ましい実施形態においては、肉眼で見ることができる足場の外側のニューロンからの軸策は、肉眼で見ることができる足場の内部へと伸びる。なお他の望ましい実施形態においては、細胞は、肉眼で見ることができる足場によるカプセル化の後に分化する。望ましくは、骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、または胚性肝細胞のような細胞は、軟骨細胞へと分化する。他の望ましい実施形態においては、細胞は多能性（ｐｏｌｙｐｏｔｅｎｔ）であるかまたは多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）である。いくつかの実施形態においては、細胞は、始原細胞であるかまたは幹細胞である。特定の実施形態においては、始原細胞は、肝臓、神経組織、軟骨、膀胱、脳、食道、輸卵管、心臓、小腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、または子宮に由来する。いくつかの実施形態においては、細胞として、分化するように指令されているかまたはそのように誘導されている始原細胞が含まれる。望ましくは、肉眼で見ることができる構造は、始原細胞の少なくとも一部を、分化促進因子に応答して分化することができるようにする。この方法はさらに、自律的な組み立ての前に、またはその中で細胞／ペプチド構造がインキュベートされる培地に対してのいずれかで、添加される、増殖因子のような分化促進因子の添加を含む。いくつかの実施形態においては、分化促進因子は、始原細胞またはそれらの子孫の一部の分化またはトランス分化（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｅ）を引き起こす。
【００２３】
なおさらなる他の望ましい実施形態においては、細胞は、肉眼で見ることができる足場によるカプセル化の前に分化され、そしてカプセル化の後は分化したままである。本発明の任意の局面の他の望ましい実施形態においては、カプセル化された細胞は、脱分化を阻害するかまたは妨げる条件下で培養される。望ましくは、カプセル化された細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％が、少なくとも１日間、２日間、３日間、もしくは５日間、または少なくとも１週間、２週間、３週間、もしくは５週間、あるいはそれ以上の間、分化したままである。
【００２４】
望ましい細胞として、心臓細胞、骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞（例えば、膵島細胞）、頸部細胞、肝臓細胞、および包皮細胞が挙げられる。いくつかの実施形態でカプセル化され得る細胞の他の例として、軟骨細胞が挙げられる。細胞は、ヒトまたはウシの細胞のような任意の適切な供給源に由来し得る。細胞の供給源としてまた、胚または胎児または成体の哺乳動物細胞株、あるいは確立された細胞株が挙げられ得る。いくつかの実施形態においては、細胞は、体内の三次元環境において通常に見出される細胞型を含む。特定の実施形態に従って、この細胞型は、体内の軟骨性の環境には通常は見出されない。いくつかの実施形態においては、軟骨細胞または軟骨細胞の前駆細胞は、他の細胞型と組み合わせの場合を除いて、足場から放出される。
【００２５】
望ましくは、カプセル化された細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％は、肉眼で見ることができる足場の形成の、１週間、２週間、４週間、６週間後、またはそれより長く生存可能である。別の望ましい実施形態においては、カプセル化された細胞の少なくとも８０％または９０％が、肉眼で見ることができる足場の形成の１日または１週間後に生存可能である。より望ましくは、カプセル化された細胞の少なくとも９０％または９５％が、肉眼で見ることができる足場の形成の６週間後に生存可能である。望ましくは、肉眼で見ることができる足場の形成の５日後に肉眼で見ることができる足場によってカプセル化されている生存細胞の数は、肉眼で見ることができる足場の容積１ｍｌあたり少なくとも１００万個、１５０万個、３００万個、５００万個、または１０００万個である。別の望ましい実施形態においては、足場の形成の３日後、５日後、１０日後、１５日後、またはそれより長く肉眼で見ることができる足場によってカプセル化されている生存細胞の数は、カプセル化された細胞の最初の数よりも、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、または２０倍多い。なお別の望ましい実施形態においては、カプセル化された細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、別のカプセル化された細胞と、または足場の外側の細胞と、細胞−細胞接触の状態にある。望ましくは、カプセル化された細胞は培養物中で維持される。いくつかの実施形態においては、この方法はまた、三次元ナノスケール環境の足場からカプセル化された細胞を除去する工程を包含する。特定の実施形態においては、ナノスケール環境の足場は、タンパク質またはペプチドヒドロゲル（例えば、自律的に組み立てるペプチドヒドロゲル）を含む。
【００２６】
本発明の任意の局面のなお他の望ましい実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、インシュリン、トランスフェリン、および／またはセレニウムを含む溶液をカプセル化する。特定の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、０．１〜０．５％の間、０．５〜０．７５％の間、０．７５〜１．０％の間、１．０〜１．５％の間、１．５〜２％の間、２〜３％の間、３〜５％の間、または５〜１０％の間のＩＴＳを含有する培地（それらを含む）を有している溶液をカプセル化する。他の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、少なくとも０．１％、０．５％、１％、２％、３％、５％、７％、または１０％のＩＴＳ培地を有している溶液をカプセル化する。なお他の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、０．０１〜１０．００ｍｇ／Ｌの間のインシュリン、０．０５〜２ｍｇ／Ｌの間のインシュリン、または０．１〜１ｍｇ／Ｌの間のインシュリン（それらを含む）を有している溶液をカプセル化する。いくつかの実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、０．００５５〜５．５ｍｇ／Ｌの間のトランスフェリン、０．０５５〜１．０ｍｇ／Ｌの間のトランスフェリン、または０．１〜０．５ｍｇ／Ｌの間のトランスフェリン（それらを含む）を有している溶液をカプセル化する。種々の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、０．００５〜５．０ｍｇ／Ｌの間のセレニウム、０．０５〜１．０ｍｇ／Ｌの間のセレニウム、または０．１〜０．５ｍｇ／Ｌの間のセレニウム（それらを含む）を有している溶液をカプセル化する。いくつかの実施形態においては、溶液は、少なくとも００．１ｍｇ／Ｌのインシュリン、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、および／または少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含む。特定の実施形態においては、溶液は、約０．１ｍｇ／Ｌのインシュリン、約０．０５５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、および／または約０．０５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含む。なお他の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、少なくとも０．１％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有している溶液をカプセル化する。なお他の実施形態においては、溶液は、０．０１〜２０％の間のＦＢＳ、０．１〜５％の間のＦＢＳ、０．１〜１％の間のＦＢＳ、０．１〜０．５％の間のＦＢＳ、または０．２〜１％の間のＦＢＳを含む。望ましくは、溶液は約１％のＩＴＳおよび０．２％のＦＢＳを含む。他の実施形態においては、靭帯または腱の細胞が、肉眼で見ることができる足場の中にカプセル化され、そしてＩＴＳを含まない培地（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、１８％、または２０％のＦＢＳを含む培地）中で培養される。そのような細胞を培養するために特に有用な培地は、１８．５％のＦＢＳである。
【００２７】
他の望ましい実施形態においては、カプセル化された細胞は、細胞外マトリックス成分を分泌する。望ましくは、細胞外マトリックス成分の分泌は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００ｋＰＡ、あるいは少なくとも２、５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、または２５０倍に、肉眼で見ることができる足場の平衡圧縮係数を増大させる。望ましくは、細胞によって分泌される細胞外マトリックスは、別の細胞によって分泌された細胞外マトリックスと接触している状態にある。より望ましくは、カプセル化された細胞の少なくとも６０、７０、８０、９０、または９５％によって分泌された細胞外マトリックスは、別のカプセル化された細胞によって分泌されたか、または足場の外側の細胞によって分泌された細胞外マトリックスと接触している状態にある。
【００２８】
望ましい肉眼で見ることができる足場はさらに、生分解性のシーラント、接着剤、または肉眼で見ることができる足場の平衡圧縮係数を増大させる肉眼で見ることができる足場の表面に接着させたポリマーを含む。望ましくは、足場は、所望される細胞型の細胞と軟骨細胞とをカプセル化し、そして足場の中での軟骨細胞の存在によって、上記の足場の硬度の増大を導く。
【００２９】
本発明の任意の方法の望ましい実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、予め決定された圧縮機構に供される。例えば、肉眼で見ることができる足場は、予め決定された量の時間の間（例えば、１、２、または３週間から、６、８週間もしくはそれ以上の長い期間）定圧または可変圧に供され得る。望ましい圧縮機構は、静的オフセット圧縮（ｓｔａｔｉｃ  ｏｆｆｓｅｔ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）に重ね合わせられた、０．０１〜３Ｈｚ、またより望ましくは、０．１〜１Ｈｚの動的圧縮が含む。典型的には、力学的ひずみの大きさは、０．０１〜１０％の間であり、望ましくは１〜５％の間であり、そしてより望ましくは、３〜５％の間であり、そして静的オフセット圧縮は、５〜１５％の間である。
【００３０】
他の実施形態においては、圧縮機構として剪断荷重が含まれる。剪断荷重についての特定の実施形態においては、肉眼で見ることができる足場は、０〜４５％、０〜４０％、０〜３０％、０〜２０％、０〜１０％、または１０〜２０％の定位オフセットに圧縮される。いくつかの実施形態においては、０．０１〜３０％、０．０５〜２０％、０．１〜１０％、１〜１０％、または２〜５％の剪断ひずみが、肉眼で見ることができる足場に適応される。種々の実施形態においては、周波数は０．００１〜２０Ｈｚ、０．００１〜１０Ｈｚ、０．０２〜１０Ｈｚ、０．１〜１０Ｈｚ、または１〜５Ｈｚである。種々の実施形態においては、剪断荷重は、持続的であるかまたは可変であり得る。
【００３１】
望ましい圧縮／荷重機構には、足場に１時間の間、圧力をかけること、そして１〜７時間の間（それらを含む）、圧力をかけずに足場をインキュベートすること（例えば、通常の大気圧で足場をインキュベートすること）を含む。別の実施形態においては、圧縮／荷重機構には、１時間未満（例えば、約１５、３０、または４５分間）の間、足場に圧力をかけること、そして以下の時間の範囲の１つの間、圧力をかけずに足場をインキュベートすることを含む：（ｉ）１時間未満、（ｉｉ）１時間から７時間の間（それらを含む）、または（ｉｉｉ）７時間を越える。別の実施形態においては、圧縮／荷重機構には、足場に１時間より長く（例えば、約２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、またはそれ以上）圧力をかけること、そして以下の時間の範囲の１つの間、圧力をかけずに足場をインキュベートすることを含む：（ｉ）１時間未満、（ｉｉ）１〜７時間の間（それらを含む）、または（ｉｉｉ）７時間を越える。特定の実施形態においては、足場は、５〜６時間の間（それらを含む）（例えば、５時間１５分または５時間４５分の間）、圧力をかけずにインキュベートされる。望ましくは、圧縮／荷重機構は、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、８回、１０回、またはそれ以上の回数繰り返される。
【００３２】
他の実施形態においては、圧縮／荷重機構には、足場に圧力をかけること、次いで圧力をかけずに足場をインキュベートすることを含む、２４時間以内に行われる（例えば、同日に行われる）１回以上のサイクルを含む。これらのサイクルには、５〜５０時間（例えば、５〜１０時間、１０〜２０時間、２０〜３０時間、３０〜４０時間、または４０〜５０時間）の圧力をかけない足場のインキュベーションが続く。これらの実施形態に従って、（ｉ）加圧と非加圧のサイクル、および（ｉｉ）それに続く圧力をかけないインキュベーションを含む順序が、所望される場合には、少なくとも１回、２回、３回、４回、６回、８回、１０回、１５回、２０回、またはそれ以上繰り返され得る。例示的な圧縮／荷重機構には、（ｉ）足場に１５分間、３０分間、４５分間、または６０分間圧力をかけること、および（ｉｉ）圧力をかけずに足場をインキュベートすること（例えば、５時間１５分または５時間４５分のインキュベーション）の１回以上のサイクルを、そして上記のサイクルの完了後に、約１５時間、２０時間、２４時間、または３０時間の圧力をかけないインキュベーションを含む。種々の実施形態においては、圧縮／荷重機構は、細胞がカプセル化された後、約２日、５日、１０日、１２日、１５日、１８日、２１日、２５日、またはそれ以上の日数で開始される。
【００３３】
望ましくは、圧縮機構は、肉眼で見ることができる足場の平衡圧縮係数を、圧縮機構に供していないコントロールの肉眼で見ることができる足場と比較して、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００ｋＰＡに、あるいは少なくとも２、５、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、または２５０倍に増大させる。他の実施形態においては、１Ｈｚに達した時の肉眼で見ることができる足場の動剛性（ｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）は、少なくとも０．０５、０．５、１．０、１．２８、１．５、２．５、または３ＭＰａである。別の望ましい実施形態においては、圧縮機構は、細胞による細胞外マトリックス成分の分泌を誘導する。別の実施形態においては、圧縮機構は、細胞によるタンパク質合成速度を、少なくとも２０％、５０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、または３００％増大させる。
【００３４】
肉眼で見ることができる足場を形成する望ましいペプチドは、８〜２００個の間のアミノ酸、８個〜３６個のアミノ酸、または８個〜１６個のアミノ酸（それらを含む）を含む。望ましくは、ペプチドの濃度は、１〜１０ｍｇ／ｍｌの間、または４〜８ｍｇ／ｍｌの間（それらを含む）である。望ましくは、肉眼で見ることができる足場は、組織欠損の内部にうまく入る（ｉｎｔｅｒｆｉｔ）ように予め形作られる。１つの望ましい実施形態においては、組織欠損は、関節（例えば、膝関節、股関節、肩、手首、指、足首、踵、肘、または頸部）にある。望ましくは、組織は、上皮組織、結合組織、筋肉組織、または神経組織である。１つの望ましい実施形態においては、軟骨は、関節、肋骨、線維性軟骨、硝子質軟骨、半月軟骨、甲状軟骨、または弾性軟骨である。別の望ましい実施形態においては、足場は、不都合な免疫または炎症性応答を誘発しない。
【００３５】
本発明の方法が、器官、筋肉、または他の体の構造の損傷を修復するために、あるいは器官、筋肉、または他の体の構造を形成するために使用され得ることもまた、企図される。望ましい器官として、膀胱、脳、神経組織、食道、輸卵管、心臓、膵臓、小腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、および子宮が挙げられる。
【００３６】
本発明の任意の局面の１つの実施形態においては、カプセル化された細胞型のみの場合には、軟骨細胞をカプセル化している肉眼で見ることができる足場が、または他の細胞型が存在しない場合には、少なくとも１つの軟骨細胞をカプセル化している肉眼で見ることができる足場が、特異的に排除される。なお別の実施形態においては、それらの唯一のペプチド成分としてｎ−ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ−ｃを含むか、または少なくとも１つのｎ−ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ−ｃペプチドを含む肉眼で見ることができる足場が、特異的に排除される。なお別の実施形態においては、インシュリン、トランスフェリン、またはセレニウムを含まない溶液をカプセル化している肉眼で見ることができる足場が、特異的に排除される。なお別の実施形態においては、インシュリン、トランスフェリン、またはセレニウムを含有しているか、あるいは１％のＩＴＳ培地を含有している溶液をカプセル化している肉眼で見ることができる足場が、排除される。別の実施形態においては、足場に１時間、圧力をかけること、そして１〜７時間の間（それらを含む）圧力をかけずに足場をインキュベートすることを含む圧縮機構が、特異的に排除される。別の実施形態においては、足場に４５分間圧力をかけること、そして５時間１５分の間、圧力をかけずに足場をインキュベートすることを４回のサイクル、それに続く２４時間の無加圧を含む圧縮機構が、特異的に排除される。
【００３７】
「足場」によって、細胞をカプセル化することができる三次元構造が意味される。足場のβ−シート型の二次構造は、約２１８ｎｍでの最少吸収をそして約１９５ｎｍでの最大吸収を検出する、標準的な循環型二色性を使用して確認され得る。望ましくは、足場は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、またはそれらの組み合わせを含むペプチドの自律的な組み立てによって形成される。Ｌ−アミノ酸が足場の中に存在する場合には、足場の崩壊によって、宿主組織によって再利用され得るアミノ酸を生じる。ペプチドが、化合物（例えば、化学誘引物質または治療上活性である化合物）に共有結合させられ得ることもまた、企図される。ペプチドは、化学合成されても、天然のもしくは組換えの供給源から精製されてもよく、そしてペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端が保護されても保護されなくてもよい。ペプチド足場は、互いに相補的でありかつ構造的に適合性であるペプチドの１つ以上の異なる分子種から形成され得る。不適合対（例えば、隣接しているペプチドによる２つの同様に荷電した残基の反発する対）を含有しているペプチドもまた、破壊力がペプチド間の相互作用を安定化させることによって抑えられる場合、足場を形成し得る。
【００３８】
今日までの本発明のトランス分化の局面の実施は、足場内の細胞のカプセル化を含むが、ペプチド構造または膜の表面上で増殖させた場合には、細胞が分化促進因子による指示に従うようになり得る能力が、足場内の細胞の三次元分布と組み合わせて使用され得る。従って、本発明はまた、ペプチドヒドロゲル足場の表面上で始原細胞およびそれらの子孫を増殖させることを含む。ここで、ペプチド足場は、足場内に三次元で分散させられた細胞と組み合わせて実行された場合には、始原細胞および／またはそれらの子孫を、分化促進因子による指示に従うようにする。
【００３９】
足場はまた、本明細書中でペプチド構造、ペプチドヒドロゲル構造、ペプチドゲル構造、またはヒドロゲル構造といわれる。
【００４０】
「相補性」によって、図１Ａで図解するような、足場内の隣接しているペプチドによる親水性残基間でのイオン結合相互作用または水素結合相互作用を形成することができることが意味される。望ましくは、ペプチド中のそれぞれの親水性残基は、隣接しているペプチド上の親水性残基と水素結合するかまたはイオン的に対合するかのいずれかであるか、あるいは溶媒に曝される。
【００４１】
「構造的に適合する」によって、足場の形成を可能にするように、十分な一定のペプチド間距離を維持することができることが意味される。望ましくは、ペプチド間距離のバリエーションは、４Å、３Å、２Å、または１Å未満である。ペプチド間距離のより多くのバリエーションによって、十分に安定化させる力が存在する場合には、足場の形成を妨げ得ることが企図される。この距離は、分子モデリングに基づいて、または以前に報告されている（米国特許第５，６７０，４８３号）単純化された手順に基づいて、計算され得る。この方法では、ペプチド間距離は、対の中のそれぞれのアミノ酸の側鎖上の分岐していない原子の数の和をとることによって計算される。例えば、リジン−グルタミン酸イオン対についてのペプチド間距離は、５＋４＝９原子であり、グルタミン−グルタミン水素結合対についての距離は、４＋４＝８原子である。１原子あたり３Åの変換係数を使用すると、リジン−グルタミン酸対を有しているペプチドのペプチド間距離と、グルタミン−グルタミン対を有しているペプチドのペプチド間距離の変量（すなわち、９対８原子）は、３Åである。
【００４２】
「三次元配置」によって、三次元に存在することが意味される。三次元配置を有している細胞は、同じ単層の全ての部分ではない。本明細書中で使用される場合には、単層は、カプセル化された細胞の平均直径と等しい厚みを有しており、そして少なくとも１つのカプセル化された細胞を含む、ペプチド足場の端から端までの断面である。１つの望ましい実施形態においては、カプセル化された細胞はニューロンであり、そしてニューロンの平均直径は、ニューロンの細胞体の平均直径を測定することによって決定される。カプセル化された細胞は、細胞の容積の少なくとも５１％が単層に含まれる場合に、単層の一部とみなされる。望ましくは、足場の形成の直後には、少なくとも１つの単層は、カプセル化された細胞の７５％、５０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％未満（好みに応じて）を含む。さらに望ましくは、足場の形成の直後には、カプセル化された細胞の７５％、５０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％未満（好みに応じて）が同じ単層の一部である。
【００４３】
「実質的に均質に分布させられる」によって、足場の形成の直後に、足場によってカプセル化された細胞の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、または１００％の集団の中心が、５００、１００、５０、２０、１０、または１μＭ未満で変化する距離によって互いに離れていることが意味される。望ましくは、足場の形成の１、２、３、または４週間後には、カプセル化された細胞の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、または１００％についての細胞クラスターまたは細胞対の集団の中心が、５００、１００、５０、２０、または１０μＭ未満で変化する距離によって互いに分けられている。
【００４４】
「等浸透圧性溶質」によって、水溶液中に溶解させられた非イオン性化合物が意味される。
【００４５】
「電解質を実質的に含まない溶液」によって、その中に電解質が添加されていないか、またはその中の電解質濃度が０．０１または０．００１ｍＭ未満である溶液が意味される。
【００４６】
「インシュリン−トランスフェリン−セレニウム培地」または「ＩＴＳ培地」によって、インシュリン、トランスフェリン、およびセレニウムを含有する培地が意味される。１００パーセントのＩＴＳ培地（「１００％  ＩＴＳ」）は、１０ｍｇ／Ｌのインシュリン、５．５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、および５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含む。１パーセントのＩＴＳ培地（「１％  ＩＴＳ」）は、０．１ｍｇ／Ｌのインシュリン、０．０５５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、および／または０．０５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含む。
【００４７】
「ナノスケール」によって、ナノメートルの言葉で表現することができる寸法を有している構造が意味される。例えば、用語「ナノスケール構造」は、約５００ｎｍまたはそれ未満、約１００ｎｍまたはそれ未満、約５０ｎｍまたはそれ未満、約２０〜５０ｎｍ、約１０〜２０ｎｍ、約５〜１０ｎｍ、約１〜５ｎｍ、約１ｎｍ、あるいは０．１から１ｎｍの間の最大寸法を有している構造をいう場合がある。「約」によって、測定値が与えられた数値から１０％離れる場合があり、そして列挙された範囲が両方の端点を含むと想定されることが、意味される。関連性のある寸法は、例えば、長さ、広さ、深さ、幅、高さ、半径、直径、円周、または球形、柱状、立方体などのような規則正しい二次元もしくは三次元の形状を有さない構造の場合には、上記のいずれかの近似値であり得る。任意の他の関連性のある寸法もまた、構造の形状に依存して、構造がナノスケール構造であるかどうかを決定するために使用され得る。
【００４８】
「ナノ繊維」によって、ナノスケール寸法の直径を有している繊維が意味される。典型的には、ナノスケール繊維は、５００ｎｍまたはそれ未満の直径を有する。いくつかの実施形態においては、ナノ繊維は１００ｎｍ未満の直径を有する。他の実施形態においては、ナノ繊維は、５０ｎｍ未満の直径を有する。一部の他の実施形態においては、ナノ繊維は２０ｎｍ未満の直径を有する。特定の他の実施形態に従うと、ナノ繊維は１０から２０ｎｍの間の直径を有する。一部の他の実施形態においては、ナノ繊維は５から１０ｎｍの間の直径を有する。他の実施形態においては、ナノ繊維は５ｎｍ未満の直径を有する。
【００４９】
「ナノスケール環境の足場」によって、ナノ繊維を含有している足場が意味される。いくつかの実施形態においては、足場が含有している繊維の少なくとも５０％がナノ繊維である。いくつかの実施形態においては、足場が含有している繊維の少なくとも７５％がナノ繊維である。特定の実施形態に従うと、足場が含有している繊維の少なくとも９０％がナノ繊維である。いくつかの実施形態においては、足場が含有している繊維の少なくとも９５％がナノ繊維である。いくつかの実施形態においては、足場が含有している繊維の少なくとも９９％がナノ繊維である。もちろん、足場は、非線維性の構成成分（例えば、水、イオン、成長誘導因子および／または分化誘導因子（例えば、成長因子、治療薬、または他の化合物））を含む場合もある。
【００５０】
「ミクロスケール」によって、マイクロメートルの言葉で最も適切に表現され得る寸法を有している構造が意味される。例えば、用語「ミクロスケール構造」は、約５００μｍまたはそれ未満、約１００μｍまたはそれ未満、約５０μｍまたはそれ未満、約２０〜５０μｍ、約１０〜２０μｍ、約５〜１０μｍ、約１〜５μｍ、約１μｍ、あるいは０．１から１μｍの間の最大寸法を有している構造をいう場合がある。
【００５１】
「マイクロ繊維」によって、マイクロスケールの寸法の直径を有している繊維が意味される。典型的には、マイクロスケール繊維は、５００μｍまたはそれ未満の直径、１００μｍ未満の直径、５０μｍ未満の直径、２０μｍ未満の直径、１０から２０μｍの間の直径、あるいは５から１０ｎｍの間の直径を有する。
【００５２】
「治療上有効（である）」によって、疾患または症状の処置、安定化、または予防に有用であることが意味される。例示的な治療上有効である化合物は、細胞の増殖、分化、細胞死、移動、接着、他のタンパク質との相互作用、酵素活性、タンパク質のリン酸化または脱リン酸化、転写、および／または翻訳を調節する。
【００５３】
本発明は、組織の修復または置換に関係する多数の利点を提供する。例えば、これらの方法は、三次元配置で、そして実質的に均質な分布のペプチド足場による生存している細胞のカプセル化を可能にする。これにより、細胞の生存請求項および増殖を促進し得る。細胞は、伝統的なプラスチック製の培養皿または他の二次元培養基中での培養において生じるものではなく、体内での天然の細胞の配置により近く近づく構造で存在する。電子顕微鏡によって示されるように、ペプチド足場は、固体マトリックスよりもむしろ介在空間とのナノ繊維のネットワークを含む。このような構造は、他の培養技術および材料によって可能にされるよりも、体内の細胞の設定にさらに近く似ている方法で、細胞の浸潤および細胞−細胞相互作用を可能にし得る。細胞が基質に接着する能力は、細胞の形態に影響を与える場合がある（例えば、Ｐｏｗｅｒｓ  Ｍ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．５３、４１５−４２６、１９９７を参照のこと）。
【００５４】
ペプチド足場はまた、哺乳動物においては検出可能免疫応答または炎症性応答は誘発しないという利点を有する。さらに、ペプチド足場は、足場が生理食塩水に添加された場合に、検出可能な膨張を示さない。この膨張性がないことは、おそらく、足場の高い水分含有量（＞９９％）に起因する。足場のこの特有の特性は、近隣組織に対する不都合な生理学的作用を導き得る足場の無秩序な膨張の可能性を軽減する。さらに、所望される場合には、足場のインビボでの分解速度は、足場へのプロテアーゼ切断部位の取り込みによって調節され得る。カプセル化された軟骨細胞による細胞外マトリックス成分の分泌は、５０倍を上回って足場の硬度を増大させ、それによって内因性の軟骨を置き換えるために使用される足場の能力を改善する。さらに、軟骨細胞を刺激するための足場への成長因子の添加、足場の圧縮、または細胞もしくはペプチドの開始濃度の増大によって、さらに足場の硬度を増大させ得る。
【００５５】
本明細書中に記載されるペプチド足場は、いくつかの理由のために他の生体ポリマーに基づく生体材料とは有意に異なる。ほとんどの生体材料は、一般的には、多くの細胞型の大きさ同様のスケールの、１０〜２０ミクロンの範囲（ミクロスケール）の直径の繊維の大きさを有する。このようなミクロスケール繊維を含有している環境で増殖させると、細胞は、湾曲しながらミクロ繊維に接着する。典型的な生体ポリマーに基づく生体材料中での細胞増殖もまた、本明細書中に記載される自律的に組み立てるペプチド足場によって作成されるナノスケール環境中で増殖させた場合よりも、少なく水和される。特定の実施形態においては、本明細書中で記載されている自律的に組み立てるペプチドは、約５ｎｍの長さと約１ｎｍの直径を有する。このようなペプチドは、ナノ繊維（例えば、約１０〜２０ｎｍの直径を有している繊維）を形成するように自律的な組み立てを受ける。いかなり理論にも束縛されることは望まないが、本発明者らは、このような環境下では、細胞は、細胞の寸法に関係しているスケールで、三次元の空間的囲いを真に経験することを示唆している。ペプチドは、高度に水和された（例えば、９９．５〜９９．９％（１〜５ｍｇ／ｍｌ）までの水）ナノ繊維を形成するように自律的な組み立てを受ける。足場は、このような極端に高い水分含有量を有するので、細胞は自由に移動し、そして細胞間接触を形成し、そして本明細書中に記載されているスフェロイドのような構造を形成する。このような環境もまた、タンパク質を含有している低分子の分散およびシグナル伝達分子の交換を可能にする。
【００５６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、そして特許請求の範囲から明らかである。
【００５７】
（詳細な説明）
本発明者らは、本明細書中に記載されているペプチド足場が驚くべきことに、実質的に全ての細胞型のカプセル化のために機能するようであることを見出した。例えば、本来は、軟骨組織の置き換えのために開発された本発明者らの足場システムは、幹細胞、ニューロン、および肝細胞のような広い範囲の細胞型を支持することができる。従って、これらの足場は、種々の組織および器官の修復または置き換えに有用である。
【００５８】
（軟骨細胞のような細胞のカプセル化）
それらの表現型を維持するためには、軟骨細胞は典型的には、三次元環境で培養される。このような配置内では、軟骨細胞は力学的に機能性である細胞外マトリックスを生じ、そして定位的および動的な圧縮荷重に適切に応答する。従って、軟骨の修復に適切な足場の選択における主要な難題は、軟骨細胞の速い増殖速度および表現型的に特異的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の高分子の速い速度での軟骨細胞合成を、修復が安定した状態になるまで維持することができる材料の同定である。
【００５９】
本発明者らは、三次元配置内に生存している細胞をカプセル化するペプチド足場を、最初に細胞とペプチドとを、細胞の生存性を維持するために必要な浸透圧を有している溶液中で混合し、次いで足場の自律的な組み立てを開始するために十分な電解質を添加することによって形成することができることを発見した。長期間の培養（例えば、４週間の培養）は、この足場によってカプセル化された軟骨細胞が安定な軟骨細胞の表現型の指標であるプロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲン中に持続的に多くのマトリックスを蓄積させ、丸型の形態を維持し、そしてタンパク質およびプロテオグリカンの有意な合成速度を有したことを示した。ペプチド足場内の生存可能な分化した軟骨細胞の含有量は、十分に定義された参照の軟骨細胞培養系である、同時に軟骨を接種したアガロース培養物についての対応する速度よりも４倍速い速度に増大した。これらの結果は、軟骨細胞をカプセル化しているペプチドゲル足場が、軟骨組織を修復または置き換えるために使用され得ることを示す。
【００６０】
ＥＣＭの時間依存性の蓄積は、力学的に機能性である新しい組織（ｎｅｏ−ｔｉｓｓｕｅ）の蓄積の指標である、材料の硬度の増大と平行して起こる。詳細には、カプセル化された軟骨細胞による細胞外マトリックス成分の分泌は、足場の強度の測定値である平衡係数を、足場の形成の２８日後に５０倍にまで増大させた。１Ｈｚでの動剛性もまた、培養物中での時間とともに増大し、２６日目にはネイティブな組織の約５％の値を有した。さらに、３０×１０６個の細胞／ｍｌでペプチド足場中に接種され、そしてＩＴＳ／ＦＢＳ培地中で培養された細胞は、圧縮硬度においてなおさらに大きな増大を示した。平衡係数は、２８日で９３ｋＰａに達し、そして１Ｈｚでの動剛性は１．２８ＭＰａに達した。これらの値の両方ともは、ネイティブなヒトおよび動物の関節軟骨の約１／５から１／３である。
【００６１】
所望される場合には、足場の硬度はさらに、ジスルフィド結合され得るシステインの取り込みによって、または足場の中にＵＶ架橋され得る芳香族残基を取り込むことによって、増大させられ得る。加えて、ペプチドの長さまたは濃度を変化させることによって、さらに、足場の硬度が増大し得る。さらに、成長因子の存在下（その結果、これらは足場にカプセル化される）での足場の形成、足場を取りまく培地への成長因子の添加（その結果、これらは足場の内部に拡散する）、またはカプセル化された細胞を改変するための標準的な分子生物学的技術の使用（その結果、これらは異種成長因子を発現するか、または内因性の成長因子を過剰発現する）が、カプセル化された細胞の増殖を促進し、そして細胞による細胞外マトリックス成分の分泌を増大させると予想される（ｖａｎ  Ｏｓｃｈら、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ６：１８７−１９５、１９９８）。例えば、ペプチドの合成による製造によって、ペプチド単位のサブ集団に対して成長因子を鎖で繋ぐことが可能であり、これによってカプセル化された細胞に対して直接送達される成長因子の濃度の制御が可能となる。足場の硬度もまた、栄養素の輸送を増大させるバイオリアクターの中でこの細胞を培養することによって増大させられ得る（Ｇｒａｎｄｅら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３４：２１１−２２０、１９９７；Ｍｉｚｕｎｏら、前出；およびＶｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．１７：１３０−１３８、１９９９）。さらに、足場を外圧に曝すことによって、細胞による細胞外マトリックス成分の分泌をさらに促進し得、これによってさらに高い平衡係数を生じる（Ｆｒａｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．３３：１５２３−１５２７、２０００；およびＭａｕｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ．１２２：２５２−２６０、２０００）。また、足場の硬度は、それがインビボで移植された後にさらに増大し得る。従って、ペプチド足場の平衡圧縮係数は、関節軟骨の５００ｋＰＡ値に近づき得る。
【００６２】
さらに、軟骨細胞とペプチドマトリックスとの間での相互作用は、ペプチド配列中に結合部位を設計することによって調節され得る。さらに、ペプチドは、軟骨細胞によって自然界で合成されるマトリックスメタロプロテイナーゼおよびアグリカナーゼによる酵素分解が可能な特異的部位を含むように設計することができる。この様式では、足場の生分解能力の空間的および時間的制御が得られ得る。このような可撓性は、適切な組織修復応答を生じるための複数のアプローチに適応する広く一般的な機会を提供する。
【００６３】
まとめると、本発明者らの研究は、分化した軟骨細胞を維持し、そして三次元細胞培養物中での力学的に機能性である軟骨様ＥＣＭの合成および蓄積を刺激する、自律的に組み立てるペプチド足場の能力を実証する。本研究で使用したペプチド（ＫＬＤ１２）は、分子操作を通じて作製された特別に設計された自律的に組み立てるペプチドの１つのクラスを提示し、そして以下を包含する一連の特有の特徴によって特徴付けられる：（ｉ）目的の特異的細胞および組織適用、ならびに細胞のシグナル伝達および生分解性にぴったり合わせることができる個々の単位を使用した、単一のアミノ酸レベルでの設計、（ｉｉ）９９％〜９９．９％の水を含有している５０〜２００ｎｍの孔を有している１０〜２０ｎｍの直径のナノ繊維のネットワーク（すなわち、ほとんどのポリマーマイクロ繊維よりもほぼ３桁小さい大きさであるナノ繊維のネットワーク）を形成するような、標準的な培養培地によって開始される自律的な組み立て、ならびに（ｉｉｉ）いずれの毒性処理手順をも伴わない標準的な培養培地の添加による足場の自律的な組み立て。
【００６４】
（多様な範囲の細胞型のカプセル化）
これらのペプチド足場は、種々の哺乳動物細胞型に対して無毒であることが以前に示されているので、本発明の方法はまた、他の組織型を含む適応のために他の細胞型に適応され得る（Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １６：１３８５−１３９３、１９９５）。若い男性の大腿部および前腕の皮（これらはそれぞれ、１．９９と１．５１ｋＰａの平衡圧縮係数を有する）のような柔組織を修復または置き換えるために必要な足場の強度は、軟骨に必要な強度よりもはるかに低い。加えて、ペプチド足場の外表面上の単層中で増殖させたニューロンは、広範囲な神経突起の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を示すことが以前に示されている。従って、本発明の方法を使用してこれらのペプチド足場によってカプセル化されるニューロンは、カプセル化された細胞と近隣の内因性のニューロンとの間での細胞−対−細胞接触を可能にする軸策を突き出し得る。
【００６５】
（前駆細胞のカプセル化および分化）
さらに、前駆細胞または幹細胞は、本明細書中に記載されているペプチド足場のいずれかを使用してカプセル化され得る。所望される場合には、細胞はまた、細胞の分化を促進する試薬で処理され得る。
【００６６】
以下のさらなる詳細に示すように、ペプチド足場は、変更された表現型および分化の経路がその中で培養される肝臓の前駆細胞（ＬＰＣ）によって採用される環境を提供した。例えば、伝統的なプラスチック培養皿上で培養された場合には、ラットの肝臓の前駆細胞は、均質な平坦な形態を維持し、そして機能性の肝細胞へは十分には分化しない。このような細胞は、成熟した肝細胞によって産生される酵素であるチトクロームＰ４５０１Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）の有意な量を発現することはできない。対照的に、三次元ペプチドヒドロゲル中で培養したラットの肝臓の前駆細胞は、特定の培養条件下で成熟肝細胞の作用を暗示するスフェロイドクラスターを形成するように分化する。さらに、ヒドロゲル中で維持された細胞の一部は、ＣＹＰ１Ａ１を発現する。
【００６７】
この現象をさらに研究するために、ペプチドヒドロゲル中の細胞は、定義された肝細胞増殖培地へと変えられた。驚くべきことに、培地を交換した後の２４時間までに、細胞の相当の割合が細胞形態の劇的な変化を獲得し、これらは、未発達のプロセスを伴う非常に細長くなった細胞体を示している。これらの細胞の表現型は、ニューロン系統の細胞と似ていた。ニューロン系統の細胞の特徴である種々のマーカーについての染色はさらに、細胞が肝細胞ではない経路に沿って発達したことを示した。結果は、これらの細胞がニューロン前駆体の特徴を有するという結論と一致した。
【００６８】
以下の実施例は本発明を説明するためのものである。これらは、いかなる方法でも本発明を限定することにはならない。
【００６９】
（ペプチド足場）
交互の親水性アミノ酸および疎水性アミノ酸からなる特定のペプチドは、電解質（例えば、１価のアルカリ陽イオン）の存在下で極めて安定なβ−シート型の肉眼で見ることができる足場を形成するように自律的に組み立てる（米国特許第５，９５５，３４３号、および同第５，６７０，４８３号；図１Ａおよび１Ｂ）。例えば、５ｍＭから５Ｍの間の濃度のＮａＣｌは、数分間で足場の組み立てを誘導する。より低いＮａＣｌ濃度もまた、より遅い速度ではあるが、組み立てを誘導し得る。足場中のペプチドの側鎖は、２つの面（荷電したイオン性側鎖を有する極性の面と、アラニンまたは他の疎水性基を有する非極性の面）に分けられる。これらのイオン性側鎖は、正に荷電したアミノ酸残基と負に荷電したアミノ酸残基が相補的なイオン対を形成することができる点で、互いに自己相補的である。従って、これらのペプチドは、イオン性自己相補的ペプチド、またはＩ型の自律的に組み立てるペプチドと呼ばれる。イオン性残基が１つの正に荷電した残基と１つの負に荷電した残基との交互である（−＋−＋−＋−＋）場合は、ペプチドは「モジュールＩ」と記載され、イオン性残基が２つの正に荷電した残基と２つの負に荷電した残基との交互である（−−＋＋−−＋＋）場合には、ペプチドは「モジュールＩＩ」と記載される。
【００７０】
同一の組成および長さを有する多くのモジュールＩおよびＩＩの自己相補的ペプチド；例えば、ＥＡＫ１６、ＫＡＥ１６、ＲＡＤ１６、ＲＡＥ１６、およびＫＡＤ１６；が、以前に分析されている（表１）。１６個のアミノ酸を含有しているモジュールＩＶのイオン性自己相補的ペプチド；例えば、ＥＡＫ１６−ＩＶ、ＫＡＥ１６−ＩＶ、ＤＡＲ１６−ＩＶ、およびＲＡＤ１６−ＩＶ；もまた、研究されている。これらの自律的に組み立てるペプチド中の荷電した残基が置換される（すなわち、正に荷電したリジンは正に荷電したアルギニンによって置換され、そして負に荷電したグルタミン酸は負に荷電したアスパラギン酸によって置換される）場合には、自律的に組み立てるプロセスには本質的な有意な影響はない。しかし、正に荷電した残基であるリジンおよびアルギニンが、負に荷電した残基であるアスパラギン酸およびグルタミン酸によって置換される場合には、ペプチドは肉眼で見ることができる足場を形成するような自律的な組み立てを受けることはもはやできない；しかし、これらはなお、塩の存在下でβ−シート型の構造を形成することができる。水素結合を形成する他の親水性残基（例えば、アスパラギンおよびグルタミン）は、荷電した残基の代わりに、またはそれに加えて、ペプチド中に取り込まれ得る。ペプチド中のアラニンがより疎水性の残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、またはチロシン）に交換される場合には、これらのペプチドは、自律的に組み立て、そして増大した強度を有してペプチドマトリックスを形成するより大きな傾向を有する。上記のペプチドと同様の組成および長さを有する一部のペプチドは、β−シートよりもむしろα−へリックスおよびランダムコイルを形成し、そして肉眼で見ることができる構造を形成しない。従って、自己相補性に加えて、ペプチドの長さ、分子間相互作用の程度、およびずれた並び（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ａｒｒａｙ）を形成する能力のような他の因子が、肉眼で見ることができる足場の形成に、おそらく重要である。
【００７１】
【表１】
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「β」は、β−シートを示す；「α」は、α−ヘリックスを示す；「ｒ．ｃ．」は、ランダムコイルを示す；「Ｎ／Ａ」は、あてはまらないことを示す。＊ＶＥ２０およびＲＦ２０の両方は、これらがＮａＣｌを含有している溶液中でインキュベートされた場合にβ−シートを形成する；しかし、これらは、肉眼で見ることができる足場を形成するようには、自律的に組み立てない。
【００７２】
他の自律的に組み立てるペプチドは、単一のアミノ酸残基によるかまたは複数のアミノ酸残基による、任意の自律的に組み立てるペプチドのアミノ酸配列の変更によって作製され得る。さらに、特異的細胞認識リガンド（例えば、ＲＧＤまたはＲＡＤ）のペプチド足場への取り込みは、カプセル化された細胞の増殖を促進し得る。インビボでは、これらのリガンドはまた、足場の外側から足場へと細胞を攻撃し得、ここでこれらは、足場に押し寄せるかまたはそうでなければカプセル化された細胞と接触する。足場の力学的強度を増大させるためには、システインがジスルフィド結合の形成を可能にするようにペプチド中に取り込まれ得るか、または芳香族環を有する残基が取り込まれ得、そしてＵＶ光への露光によって架橋され得る。足場のインビボでの半減期はまた、足場へのプロテアーゼ切断部位の取り込みによって調節され得、これによって足場を酵素分解させる。上記の変更の任意の組み合わせもまた、同じペプチド足場に対して行われ得る。
【００７３】
架橋され得るペプチドは、標準的なｆ−ｍｏｃ化学を使用して合成され得、そして高速液体クロマトグラフィーを使用して精製され得る（表２）。ペプチド足場の形成は、本明細書中に記載されているように、電解質の添加によって開始され得る。芳香族側鎖を有する疎水性残基は、ＵＶ照射への暴露によって架橋され得る。架橋の程度は、ＵＶ光への予め決定された長さでの露光、および予め決定されたペプチド濃度によって正確に制御され得る。架橋の程度は、光散乱、ゲル濾過、または標準的な方法を使用する走査電子顕微鏡写真によって決定され得る。さらに、架橋の程度はまた、プロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ）での消化後の足場のＨＰＬＣまたは質量分析計での分析によって試験され得る。足場の材料強度は、本明細書中に記載されているように、架橋前および架橋後に決定され得る。
【００７４】
【表２】
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表３に下線で示したもののようなアグリカンプロセシング部位が、ペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端に、またはアミノ末端とカルボキシ末端の間に付加され得る。同様に、他のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位（例えば、コラゲナーゼについての切断部位）が、同じ様式で導入され得る。これらのペプチドによって形成されたペプチド足場は、単独でまたは架橋され得るペプチドと組み合わせて、種々の時間の長さについて、そして種々のプロテアーゼ濃度および足場濃度で、種々のプロテアーゼに曝され得る。足場の分解速度は、種々の時点で上清中に放出された消化されたペプチドのＨＰＬＣ、質量分析計、またはＮＭＲ分析によって決定され得る。あるいは、放射標識ペプチドが足場の形成に使用される場合は、上清中に放出された放射標識ペプチドの量が、シンチレーションカウンターによって測定され得る。架橋および切断の実験は、２００１年２月６日に提出された表題「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」の、係属中の米国特許出願番号第０９／７７８２００号にさらに記載されている。
【００７５】
【表３】
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所望される場合には、ペプチド足場はまた、予め決定された形状または容積で形成され得る（図９Ａ〜９Ｃ）。所望される外形または寸法を有する足場を形成するためには、水性のペプチド溶液が、予め成型された鋳造鋳型に添加され、そして本明細書中に記載されているように、電解質の添加によってペプチドが足場へと自律的に組み立てるように誘導される。得られる肉眼で見ることができるペプチド足場の外形および寸法は、適用されるペプチド溶液の濃度および量、足場の組み立てを誘導するために使用される電解質の濃度、ならびに鋳造装置の寸法によって左右される。ペプチド構造または足場が体内に移植される場合には、形状は、例えば、意図される移植部位に基づいて選択され得る。
【００７６】
所望される場合には、任意の上記のペプチドから形成されたペプチド足場は、種々の生物物理学的および光学的機器（例えば、円偏光二色性（ＣＤ）、力学的光散乱、フーリエ変換赤外線分光光度計（ＦＴＩＲ）、原子間力顕微鏡（ＡＴＭ）、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、および透過電子顕微鏡（ＴＥＭ））を使用して特徴付けられ得る（例えば、Ｌｅｏｎら、前出；Ｈｏｌｍｅｓら（２０００）前出を参照のこと）。例えば、生物物理学的方法が、ペプチド足場中のβ−シート型の二次構造の程度を決定するために使用され得る。さらに、単繊維および孔の大きさ、繊維の直径、長さ、弾力性、ならびに体積百分率が、走査電子顕微鏡および透過電子顕微鏡の定量的画像分析を使用して決定され得る。足場はまた、膨張の程度、足場の形成に対するｐＨおよび電解質濃度の作用、種々の条件下での水和のレベル、ならびに張力強度を測定するためのいくつかの標準的な機械的試験技術を使用して試験され得る。
【００７７】
カプセル化された細胞は、三次元配置で肉眼で見ることができる構造中に存在する。細胞の密度は約１０５／ｍｌ、５×１０５／ｍｌから５×１０６／ｍｌの間（両端を含む）、５×１０４／ｍｌから５×１０５／ｍｌの間、５×１０５／ｍｌから５×１０６／ｍｌの間であり得る。他の範囲もまた使用され得る。培養のための条件は、生理学的条件に近づけるべきである。培養培地のｐＨは、生理学的なｐＨ（望ましくはｐＨ６〜８の間、例えば、約ｐＨ７から７．８、特に、ｐＨ７．４）に近づけるべきである。生理学的温度は、約３０℃から４０℃の間の範囲である。哺乳動物細胞は、望ましくは、約３２℃から約３８℃の間（例えば、約３５℃から約３７℃の間）の温度で培養される。
【００７８】
細胞は、所望される細胞数および密度、細胞の増殖速度、ならびに所望される場合は、分化および／または分化転換が生じるために必要な時間に依存して、任意の適切な時間の間、ペプチド足場内で培養され得る。これらのパラメーターは、それについて本発明が使用される特定の前駆細胞および目的に依存して変化し得る。当業者は、足場内の培養物中で細胞を維持するために最適な時間を決定するために、これらのパラメーターを変化させ、そして生じる作用を観察することができる。特定の実施形態においては、細胞は約３日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、５６日間、または９０日間培養される。特定の実施形態においては、細胞は、１日から３日の間（両端を含む）、４日から７日の間（両端を含む）、８日から１４日の間（両端を含む）、１５日から２１日の間（両端を含む）、２２日から２８日の間（両端を含む）、２９日から５６日の間（両端を含む）、または５７日から９０日の間（両端を含む）培養される。より長いまたはより短い培養期間もまた使用され得る。
【００７９】
所望される場合は、分化促進因子は、自律的な組み立ての開始前に、ペプチド溶液にまたは電解質溶液に添加され得る。この場合は、この因子の濃度はおそらく、組み立てられた足場内で実質的に均質である。特定の実施形態においては、この因子は、ペプチド足場が細胞のカプセル化後にそれとともにインキュベートされる培地に添加される。培地への添加後、分化促進因子の一部は、例えば拡散によりペプチド足場に侵入する。このプロセスは、分化促進因子の勾配を作成し得る。足場の異なる領域にある細胞は、細胞の位置での因子の濃度に依存して、この因子に対して異なる応答を示し得る。
【００８０】
特定の実施形態においては、ペプチド構造は、カプセル化された細胞が分化促進因子による指示に従うようにする。これらの実施形態においては、カプセル化された前駆細胞および／またはそれらの子孫は、分化促進因子の存在下では分化および／または分化転換するように誘導される。成長因子は典型的には、約１ｆｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間の範囲の濃度で使用される。頻繁には、成長因子は、低いナノモルの範囲（例えば、１〜１０ｎＭ）の濃度で使用される。特定の実施形態においては、成長因子は、先行技術においては典型的には使用されていない濃度で、または通常の条件下ではインビボでは典型的には見出されない濃度で使用される。例えば、成長因子は、作用を生じるために典型的に必要とされるよりも、またはインビボで典型的に生じるよりも、５倍大きい、１０倍大きい、２０倍大きい、１００倍大きいなどの濃度で使用され得る。滴定実験が、所望される特定の増殖、分化、および／または分化転換効果に依存して、成長因子のような特定の分化促進因子の最適濃度を決定するために行われ得る。
【００８１】
特定の実施形態においては、ペプチド足場内で増殖させられた、分化させられた、および／または分化転換させられた前駆細胞および／またはそれらの子孫が、足場から抽出される。抽出は、足場の機械的な分解、インビトロでの足場の酵素分解などを含む任意の適切な手段によって達成され得る。特定の実施形態においては、選択される方法は、約２５％、細胞の２５％から５０％の間（両端を含む）、細胞の５１％から７５％の間（両端を含む）、または細胞の７６％から１００％の間（両端を含む）の抽出を生じる。もちろん、任意の都合の良い範囲を生じる複数の方法が選択され得る。選択される方法は、細胞が使用される目的、必要な細胞数などに依存し得る。特定の実施形態においては、抽出された細胞の生存性は、細胞の約１０％、１０％から２５％の間（両端を含む）、細胞の２６％から５０％の間（両端を含む）、細胞の５１％から７５％の間（両端を含む）、細胞の７６％から１００％の間（両端を含む）である。もちろん、任意の都合の良い範囲を生じる複数の方法が選択され得る。選択される方法は、細胞が使用される目的、必要な細胞数などに依存し得る。
【００８２】
抽出された細胞はさらに、ペプチドヒドロゲル構造中で、または任意の他の培養容器中のいずれかでインビトロで培養され得る。抽出された細胞は、任意の適切な経路（静脈内、皮下、経口、皮内、筋肉内、または外科手術を含む）によって被検体に投与され得る。投与された細胞は、組織の欠損を満たすかまたは修復するために、あるいはそうでなければ、器官または体の構造を補うために使用され得る。投与された細胞は、治療因子を合成するかまたはそうでなければ供給し得る。例えば、投与された細胞は、タンパク質（例えば、個体に不足している酵素）を供給し得る。投与された細胞は遺伝的に改変され得、従って、遺伝子治療を果たすための手段として使用され得る。
【００８３】
（軟骨細胞をカプセル化しているペプチド足場）
アミノ酸配列ｎ−ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ−ｃ（ＫＬＤ１２）を有しているペプチドを、ペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して合成し、そして粉末になるように凍結乾燥させた。０．５％のペプチド鋳造溶液を、２９５ｍＭのスクロースおよび１ｍＭのＨＥＰＥＳの溶液中にＫＬＤ１２を溶解させることによって得た。仔ウシの大腿膝蓋の溝軟骨（ｇｒｏｏｖｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）から新しく単離した軟骨細胞を、鋳造溶液中に１５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。この懸濁物を、濾紙と多孔性メッシュによって両方の面の上に支持された４０×４０×１．５ｍｍのウィンドウから構成される鋳造フレーム中に注入した。鋳造フレームを、１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、これはｐＨ７．４で１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有している）浴中に、足場へのペプチドの自律的な組み立てを誘導するために１５分間入れた。望ましくは、細胞を、ＰＢＳを添加する前に、５分未満、またはより好ましくは１分未満、スクロース溶液中でインキュベートする。所望される場合には、ペプチド足場の形成は、位相差顕微鏡を使用して確認され得る。コントロールとして、細胞をまた、暖かいアガロース（２％の溶液、ｗ／ｗ）中に懸濁し、鋳造フレーム中に注入し、そして冷却した１×ＰＢＳ浴中に５分間入れた。ペプチドおよびコントロールのアガロースゲルの両方を、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｆｃｏ）および１０％のＦＢＳ（これは、一日おきに交換した）中で維持した。
【００８４】
最初の細胞の生存性を、標準的なＦＤＡアッセイ（Ｊｏｎｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３（１）：７７−７９、１９８５；Ｂｅｌｅｔｓｋｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３４（２）：２０１−２０５、１９９０）を使用してエチジウムブロマイド染色に基づいて決定した。ペプチド足場とアガロースゲルの両方について、最初の細胞生存性は同等であった（２時間後には８０〜９５％、そして２４時間後には約７５％）。
【００８５】
タンパク質およびプロテオグリカンの合成、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積、および免疫組織化学の以下研究のために、１．５ｍｍの厚みの円筒形プラグによる３ｍｍの直径の穴を、放射標識の添加、消化、または固定の直前に空けた。足場によるプラグの中での細胞外タンパク質の産生を、培地への［３Ｈ］−プロリンの添加によって測定した。放射標識したプロリンを細胞から取り出し、そして新しく合成したタンパク質中に取り込ませた。放射標識した培地中での１６〜２４時間後に、このプラグを遊離の［３Ｈ］−プロリンを除去するために緩衝液でリンスした。細胞外タンパク質を約６０℃で一晩のプロテイナーゼＫ溶液中でのインキュベーションによって消化し、そして消化したタンパク質中に存在する放射活性を、シンチレーションカウンティングによって定量した。プロテオグリカンの産生を、［３５Ｓ］−硫酸塩を［３Ｈ］−プロリンの代わりに培地に添加したことを除いて、同様に測定した。プロテオグリカン成分であるＧＡＧの全蓄積を、結合したＤＭＭＢ色素の量の蛍光分析に基づいて測定した（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １６１（１）：１０３−１０８、１９８７）。ペプチド足場中の細胞によるタンパク質およびプロテオグリカンの合成速度は、アガロースゲル中の細胞による速度と同様であった（図２）。全ＧＡＧの蓄積が増大するに伴って（ＤＭＭＢ結合の測定に基づく、図３）、以前に見られたように、ＧＡＧの合成速度は低下した（放射標識の取り込みに基づく、図２）。
【００８６】
ＧＡＧ、コラーゲンＩ、およびコラーゲンＩＩの組織学的分析のために、サンプルを２１日目に固定した。ＧＡＧを視覚化するために、トルイジンブルー色素を標準的な手順を使用して塗布した（図４）。この染色に基づくと、プロテオグリカンの蓄積はゲルの隅々にわたり、細胞周辺の領域でより高い彩度を有した。標準的な手順を使用するコラーゲンＩの免疫組織化学的染色は、ゲルの隅々までにわたって明るいバックグラウンドの染色を生じ、細胞周辺の領域では増大しなかった（Ｉｏａｎｎｉｄｉｓら、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２９７：１４１−１４７、１９９９；Ｄｏｍｍら、Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｅ  ２９：９１−９９、２０００）。ＤＭＰでのコラーゲンＩＩの染色は、ＧＡＧ染色のパターンと同様の蓄積パターンを示したが、あまり顕著ではない細胞周辺での染色を有した（Ｉｏａｎｎｉｄｉｓら、前出；Ｄｏｍｍら、前出）（図５）。この結果は、コラーゲンの既知のより少ない細胞周辺での蓄積と一致する。
【００８７】
ペプチド足場の機械的試験のために、２８日目に、直径６ｍｍ×厚み１．５ｍｍの円筒状のプラグを、足場から採取した。このプラグを種々のレベルの圧縮に供し、そして以前に記載されたようにして（Ｂｕｓｃｈｍａｎｎら、前出）ひずみのレベルを測定した。（図６および７）。これらの結果に基づくと、軟骨細胞を含有している足場の平衡係数（ｅｑｕｉｌｉｂｉｒｉｕｍ  ｍｏｄｕｌｕｓ）は、細胞を含有していない足場、または軟骨細胞のカプセル化の直後の足場についてのわずか約０．５ｋＰａと比較して、２７ｋＰａであった。
【００８８】
所望する場合には、ペプチド足場の剛性（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）をさらに、標準的な方法（例えば、Ｂｕｓｃｈｍａｎｎら（前出）に記載されている方法）を使用して定位的圧縮または動的圧縮に足場を供することによって増大させ得る。例えば、静的オフセット圧縮に重ね合わせた０．０１から３Ｈｚでの動的圧縮が使用され得る。典型的には、力学的なひずみの大きさは、０．０１から１０％の間であり、静的オフセット圧縮は５から１５％の間である。
【００８９】
ペプチド足場中に軟骨細胞をカプセル化するための上記の方法をまた、約０．５×１０６細胞／ｍＬのより低い最初の細胞密度を使用して繰り返した。ペプチド足場の形成後、細胞を、足場の中に実質的に均一に分散し、そして細胞の生存性は、足場の形成の２４時間後には約８０％であった。図８に示すように、単一の細胞に起源を有する細胞の対およびクラスターはまた、その形成の５日後に足場中に実質的に均質に分散していた。さらに、細胞の総数は、５日で約３倍に増大した。
【００９０】
他の自律的に組み立てるペプチドを、生存している軟骨細胞または他の細胞型をカプセル化するためにこの方法において使用し得る。所望する場合は、種々のペプチド足場の潜在的な細胞毒性もまた、ＤＮＡ複製、またはアクチンもしくはチューブリンのような遺伝子のＲＮＡの発現速度に起因する、３Ｈ−チミジンの取り込み速度を測定することによって決定し得る。あるいは、特異的マーカー遺伝子（例えば、特異的プロモーターの制御下で増大させられた緑色蛍光タンパク質）が、遺伝子発現および細胞の生存性のモニタリングを容易にするために細胞中に導入され得る。タンパク質（例えば、フィブロネクチンおよびフィブロネクチンレセプター）の発現はまた、特異的抗体を使用して分析され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第９章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００を参照のこと）。
【００９１】
（細胞のカプセル化のための代替の培地および条件）
インシュリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ、これは、インシュリン、トランスフェリン、およびセレンを含有する）培地補充物は、通常の細胞機能を維持しながら血清濃度を低下させることを可能にする。細胞増殖、ならびにマトリックスの合成および蓄積の両方についての最適な条件を明らかにするために、ＩＴＳを補充した培地を、ペプチド足場中にカプセル化した軟骨細胞を培養するために使用した。詳細には、細胞増殖およびＩＩ型コラーゲンの産生を、１０％のＦＢＳと比較して、ＩＴＳ培地＋／−０．２％のＦＢＳ中で培養した接種したペプチド足場中で早い時間で評価した。コントロールとして、ＩＴＳ培地中での十分に定義されたアガロース培養系中での細胞の生合成を、５週間にわたる１０％のＦＢＳ培養物と比較して評価した。この研究のプロセスにおいて、本発明者らは、ペプチド足場中の生存可能な細胞の数を定量するための新規の方法を開発した。
【００９２】
（ペプチド足場およびコントロールのアガロースゲルの形成）
軟骨を、屠殺後数時間以内に、１〜２週齢のウシの大腿膝蓋溝から回収した。組織を細かく切り刻み、そして軟骨細胞を、供給培地（１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  ＵＴ）、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．４ｍＭのプロリン、２０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した高グルコースＤＭＥＭ）中でのプロナーゼおよびコラゲナーゼでの連続的な処理によって抽出した。組織を最初に、２０Ｕ／ｍｌのプロナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）培地中で２時間インキュベートし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、次いで２００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、２型）中で一晩インキュベートした。細胞を、消化物を４０μｍの細胞ストレーナーに通すこと、それに次ぐ、１００×ｇで８分間の遠心分離によって、細胞を単離した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、アスコルビン酸塩を含まない供給培地中に再懸濁し、そしてゲル鋳造の前に数時間、４℃で保存した。細胞数および生存性を、血球計でトリパンブルー排除法を使用して決定した。
【００９３】
ペプチドＫＬＤ−１２を、ペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ合成装置４３１Ａ）を使用して合成し、そして粉末になるように凍結乾燥させたか、またはこれは商業技術によって特別な注文に応じて合成された（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＡＬ）（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ＫＬＤ１２の粉末を、０．５６％（ｗ／ｖ）のペプチド濃度で２９５ｍＭのスクロース溶液中に溶解させた。単離した軟骨細胞を最終的なペプチド／細胞懸濁容量の１０％に等しい容量のスクロース溶液中に再懸濁した。ペプチド溶液を、０．５％の最終ペプチド濃度および１５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度を生じるように添加した。この状況ではスクロースを、生理学的浸透圧を維持するために使用した。懸濁物を軽くボルテックスし、そしてＲａｇａｎら（Ｒａｇａｎら．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８３：２５６−２６４、２０００）によって記載されているものと同様の、濾紙と多孔性メッシュによって両面を支持された、４０×４０×１．６ｍｍのウィンドウから構成されるステンレス鋼の鋳造フレーム中に注入した。鋳造フレームを、スラブ構造へのペプチド足場の自律的な組み立てを開始させるために、１×ＰＢＳ浴中に入れた。２５分後、１．６ｍｍの厚みで接種したペプチド足場を、長期間の培養のためにペトリ皿に移した。
【００９４】
軟骨細胞を接種したアガロースゲルスラブを、同様の様式で鋳造した。遠心分離した細胞を、供給培地中に再懸濁し、そして２％の最終アガロース濃度および１５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度を生じるように、３％の低融点アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）と混合した。鋳造フレームを、ゲル化を開始させるために室温の１×ＰＢＳ浴中に入れた。５分後、ゲルスラブを、４℃の培地を含有しているペトリ皿に移し、続いて３７℃のインキュベーターに入れた。ペプチドおよびアガロースゲルを、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地（「ＦＢＳ培地」）中で培養した。さらなるゲルの調製物を、１％のＩＴＳ（０．１ｍｇ／Ｌのインシュリン、０．０５５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、および０．０５ｍｇ／Ｌのセレン；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ；「ＩＴＳ培地」）、または１％のＩＴＳと２％のＦＢＳ（「ＩＴＳ／ＦＢＳ培地」）のいずれかを補充したＤＭＥＭ培地（図２１）中で維持した。このスラブを、１５×１０６細胞／ｍｌまたは３０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で接種した。それぞれのスラブに、一日おきに１２ｍｌの培地を供給した。
【００９５】
（細胞外マトリックス高分子の細胞による合成）
細胞外マトリックス高分子の細胞による合成速度を測定するために、培養の５、１０、１５、２１、および２８日目に、一群の直径３ｍｍ×厚み１．６ｍｍの６個のプラグを、ステンレス鋼の表皮（ｄｅｒｍａｌ）パンチを使用して、細胞を接種したペプチドスラブおよびアガロースゲルスラブから打ち抜いた。プラグのそれぞれのグループを、２ｍｌの供給培地および５μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−硫酸塩および１０μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−プロリンを含有している１２ウェル皿の１つのウェルに移した。上記のように、３５Ｓ−硫酸塩および３Ｈ−プロリンの取り込みは、それぞれ、硫酸化プロテオグリカンおよび全タンパク質の合成速度の尺度である（Ｈａｓｃａｌｌら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２２４：２０６−２２３、１９８３）。２０時間後、このプラグを放射標識培地から除去し、そして標準のＰＢＳと１ｍＭの未標識のプロリンおよび硫酸塩中で９０分以上にわたって５回洗浄した。次いで、それぞれの細胞を接種したプラグを、１ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｒｏｃｈｅ）ＴＲＩＳ  ＨＣｌ溶液に移し、そして６０℃で一晩消化させた。放射標識の取り込みを、１００μｌの消化物を２ｍｌのシンチレーション液（Ｅｃｏｌｕｍｅ−ＬＣＮ）と混合すること、そしてあふれ出たものおよび希釈クエンチングを補正した放射活性（Ｒａｃｋ−Ｂｅｔａ  １２１１シンチレーションカウンター、ＬＫＢ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を計数することによってアッセイした。全ての蓄積した硫酸化ＧＡＧの含有量を、２０μｌの消化物を２００μｌのジメチルメチレンブルー色素（ＤＭＢ）溶液と９６ウェルマイクロプレート中で反応させ、そして分光光度計（Ｖｍａｘプレートリーダー，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって分析することによって別々に評価した。標準曲線を、コンドロイチン硫酸（サメの軟骨、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して作成した。
【００９６】
別のコントロール実験を、以下を評価するために、培養の３５日目に行った：（ｉ）低分子量形態に対する、高分子であるペプチド足場プラグ内での放射活性の割合、および（ｉｉ）培地に放出されたものに対する、ペプチド足場内で保持された全ての新しく合成されたＥＣＭ高分子の割合。ペプチド足場抽出物と培地画分から得た放射標識種を、１％のＳＤＳ、１０ｍＭのジチオスレイトール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５（Ｓａｈら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．７：６１９−６２３、１９８９）を含有している溶出緩衝液の０．５ｍｌ部分中で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（１〜５，０００の分子量カットオフ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のＰＤ１０ゲル濾過カラム上で高分子量成分と低分子量成分に分けた。培地中に放出された高分子成分は、それぞれ、全てのペプチド足場に蓄積した３５Ｓ−硫酸塩および３Ｈ−プロリンの約２％および約１１％であった。プロテイナーゼＫで消化したペプチド足場プラグは、９５％の高分子３５Ｓ−硫酸塩を含有していた。足場に蓄積した３Ｈ−プロリンを、ＳＤＳ抽出後に分析した。細胞を接種したペプチド足場を、２％のＳＤＳ、１０ｍＭのジチオスレイトール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５の中で、１００℃で１５分間インキュベートした。抽出した３Ｈ−プロリン分子は、８９％が高分子であった。まとめると、これらのデータは、ヒドロゲル足場が、ネイティブの軟骨器官の培養において観察したものと同様に、新しく合成されたプロテオグリカンおよびタンパク質高分子のそれぞれ、約９３％および約７８％を保持することを示した。ヒドロゲル足場中での高分子の高い保持力に起因して、放射標識培地は、生合成産物について日常的に行なうようには分析されなかった。
【００９７】
細胞外マトリックス成分の生合成速度およびタンパク質の生合成速度の測定として、３５Ｓ−硫酸塩および３Ｈ−プロリンの取り込みを、細胞を接種したペプチド足場とアガロース培養物の両方の培養物中での４週間の培養の間に、上記に記載するように測定した（図１１Ａ）。１０％のＦＢＳ培地を用いた、ペプチド足場中の細胞によるプロテオグリカン（３５Ｓ−硫酸塩）およびタンパク質（３Ｈ−プロリン）の合成速度は、早い時点（５日目）では最初は高く、次いで１５日目までにネイティブの軟骨組織のものと同程度の値に低下した。それに続く２８日間にわたる取り込みは、比較的一定に保たれた。細胞を接種したアガロースヒドロゲル中での放射性同位元素の取り込み（図１１Ａ）は、ペプチド足場中でのレベルと同様の生合成レベルを明らかにし、これは、仔ウシの軟骨細胞を使用するアガロース培養物について文献中で以前に報告された値に匹敵する。アガロースヒドロゲルについては、ＦＢＳおよびＩＴＳ培養物中よりも、ＩＴＳ／ＦＢＳ培養物中では、１５〜１２５％さらに多い３５Ｓ−放射標識が取り込まれた。プロリンの取り込みは、試験した全ての時点でＩＴＳ／ＦＢＳ培養物中で最も高かった（図１１Ｂ）。同様のレベルのプロリンの取り込みを、アガロースヒドロゲルのＦＢＳおよびＩＴＳ培養物中で観察した。明らかに、最少培地（ＩＴＳ／ＦＢＳ）中で培養しそして２８日目に放射標識した、細胞を接種したペプチドプラグが、１０％のＦＢＳを補充した富化培地（ｒｉｃｈ  ｍｅｄｉｕｍ）を使用したアガロースおよびペプチド足場中での生合成速度と同様の生合成速度を示した。
【００９８】
細胞外マトリックスの生合成の別の測定として、全グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積を、放射標識した細胞を接種した全てのプラグ中、およびＩＴＳ／ＦＢＳで培養したペプチド足場からの未標識のプラグ中で、４週間の培養の間に定量した（図１２Ａ）。１０％のＦＢＳ培地を使用したペプチド足場中でのＧＡＧの蓄積は、培養物中で時間とともに増大し、２８日目には約７０μｇ／プラグに達した。アガロース培養物は、アガロース培養物について以前に報告されたデータと一致する、同様のＧＡＧの蓄積を示した。ＩＴＳ／ＦＢＳ培地中では、ペプチド足場中でのＧＡＧの蓄積は、１５日間にわたるアガロース培養物および１０％のＦＢＳペプチド足場培養物の両方の中でのものよりも、最初は低かった；しかし、２１日目から２８日目までは、ＧＡＧの蓄積は、全ての３つの場合において同等であった。アガロースヒドロゲルについては、全ての培地条件での全ＧＡＧ蓄積（図１２Ｇ）は、２１日間の培養を通じて同様であった。３５日目までには、ＩＴＳ／ＦＢＳサンプル中でのＧＡＧの蓄積は、ＩＴＳおよびＦＢＳ培養物中でのＧＡＧの蓄積よりも約５０％高かった（ｐ＜０．００１）。
【００９９】
ＦＢＳ培地中で培養したペプチド足場のトルイジンブルー染色によって、２６日目にペプチド足場マトリクスの隅々までのＧＡＧの蓄積を明らかにした（図１２Ｂ）。軟骨細胞の大部分は丸型を示し、そして持続的なＧＡＧを多く含むマトリックス中に完全にカプセル化され、テリトリー間マトリックスと比較してより高い細胞周辺での染色を有した。
【０１００】
（ペプチド足場を用いた軟骨細胞および新しく合成されたＥＣＭによって形成されたコラーゲンの分析）
軟骨細胞の組織学的試験のために、選択した３ｍｍの細胞を接種したペプチドプラグに穴を空け、そしてＰＢＳ（ｐＨ７）中の４％のパラホルムアルデヒド溶液中に一晩４℃で固定した。プラグをＰＢＳで洗浄し、段階的な濃度（７５％、９６％、および１００％）のイソプロパノールで脱水し、キシロールに移し、そしてパラフィン中に包埋した。切片（７μｍの厚み）をスレッジマイクロトーム（Ｌｅｉｔｚ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して作製し、そしてｃｈｒｏｍｅａｌａｕｎ−ゼラチン［４．５％（ｗ／ｖ）のゼラチン、３００ｍＭのカリウム硫酸クロム１２水和物］でコーティングしたスライド上に広げた。ペプチド足場の選択したパラフィン切片を、キシロール中で脱パラフィンし、そしてエタノール濃度を低下させることを使用して蒸留水中に移した。これらの切片を、トルイジンブルー色素溶液［０．０７１４％のトルイジンブルー（Ｍｅｒｃｋ、Ｎｏ．１５９３０）、０．０７１４％のピロニンＹ（Ｆｌｕｋａ，Ｎｏ．８３２００）、およびホウ砂（０．１４３％の四ホウ酸二ナトリウム，Ｍｅｒｃｋ、Ｎｏ．６３０６）］とともに６分間インキュベートし、蒸留水、９６％のエタノール、３×プロパノール（それぞれ２分間）、３×キシロール（それぞれ１５分間）で洗浄し、そしてＤｅＰｅＸ（Ｓｅｒｖａ，Ｎｏ．１８２４３）を使用して顕微スライド上に固定した。
【０１０１】
コラーゲンの免疫組織化学のために、細胞を接種したペプチド足場の選択した脱パラフィン切片を、ペプシン（０．５％の酢酸中の３．９ｋＵ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で３０分間処理し、次いでＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液中の０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。非特異的ペルオキシダーゼを、メタノール中の０．６％のＨ２Ｏ２での２０分間の処理によってブロックした。サンプルをＴＢＳでリンスし、そして一次抗体で６０分間処理した（マウスの坑ＩＩ型コラーゲン、Ｃｌｏｎｅ  ＣＩＩ  Ｃ１、ＤＳＨＢ、Ｉｏｗａ，ＴＢＳ中の１：１０００；ネガティブコントロールを、一次抗体を含まないＴＢＳとともにインキュベートした）。ＴＢＳ中でのリンス後、サンプルを３０分間二次抗体で処理し（ウサギ坑マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合、Ｄａｋｏ  Ｐ−０２６０、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；１％のウシ血清を含有しているＴＢＳ中の１：２００）、リンスし、そして三次抗体とともに３０分間インキュベートした（ヤギ坑ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合、Ｄａｋｏ  Ｐ−０４４８；１％のウシ血清を含有しているＴＢＳ中の１：１００）。サンプルを、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ−Ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）で染色した。細胞核を、Ｍｅｙｅｒのヘマラム（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して対比染色し、そして染色したサンプルを、Ａｑｕａｔｅｘ（Ｍｅｒｃｋ）を使用して顕微スライド上に包埋した。ウシの関節軟骨の切片を、ポジティブコントロールとして使用した。
【０１０２】
コラーゲンの分析のために、ＩＴＳ／ＦＢＳ培地中で培養した選択した３ｍｍの細胞を接種したペプチドプラグ（最初の接種密度１５×１０６細胞／ｍｌ）に、３５日目に穴を空け、そして凍結乾燥した。コラーゲンを、４℃で４８時間かけてペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，０．２ＭのＮａＣｌ、０．５Ｍの酢酸中で１ｍｇ／ｍｌ）を用いて抽出した。抽出物を、１０ＮのＮａＯＨで中和し、そしてＮａＣｌを用いてナトリウム濃度を１Ｍに上昇させた。抽出物を一晩４℃で攪拌し、次いで６０００×ｇで２０分間遠心分離した。コラーゲンを、４．５ＭのＮａＣｌを用いて沈殿させ、そして１６，０００×ｇで１時間、４℃で遠心分離した。沈殿を洗浄溶液（３部の９５％エタノール、１部の０．４ＭのＮａＣｌ、および０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７）中で２回洗浄し、凍結乾燥させ、Ｔｒｉｓ緩衝液中に再懸濁し、そしてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｍｉｎｉ−ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって分析した。ニワトリの軟骨およびマウスの皮膚から抽出したコラーゲン（Ｐ．Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｕｅｎｓｔｅｒから懇意によって提供された）を、それぞれ、自然界の軟骨細胞によって合成されたＩＩ型コラーゲン、および脱分化した線維芽細胞の表現型によって合成されたＩ型コラーゲンについての標準として細胞を接種したペプチド抽出物と同時に泳動した（Ｂｒｕｃｋｎｅｒ  Ｐ．、私信）。
【０１０３】
上記のように、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンについての免疫組織化学およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動分析を、軟骨細胞表現型の発現を研究するために使用した。詳細には、ＦＢＳ培地中で培養した細胞を接種したペプチド足場を、ＩＩ型コラーゲンの免疫染色のために１５日目に固定した。ＩＩ型コラーゲン（図１２Ｃ）は、ＧＡＧの蓄積と同様の染色パターンを示し、マトリックスの隅々までにわたって（特に、細胞周辺環境において）ポジティブな染色を有した。ＩＴＳ培地中で培養した細胞を接種したペプチド足場から、３５日目にコラーゲンを抽出し、そしてＳＤＳゲル電気泳動を使用して分析した（図１２Ｄ）。細胞を接種したペプチド足場から抽出したタンパク質は、ＩＩ型コラーゲンのα１鎖、ならびにＸＩ型コラーゲンのα１および２鎖についてバンドを示した。Ｉ型α２鎖は、皮膚のコラーゲン中で見た場合には存在しなかった。
【０１０４】
１３日目には、ＦＢＳ培地中でのＩＩ型コラーゲンの免疫染色は、細胞に関係している領域中で大きく（図１２Ｅ）、そして時折、細胞間で形成されつつある連続的なネットワークを形成した。ＩＴＳ／ＦＢＳ培地およびＩＴＳ培地（図１２Ｆ）中では、ＩＩ型コラーゲンは、細胞内でしか見られなかった。ＩＩ型コラーゲンは、ＢｒｄＵが取り込まれた細胞中またはその細胞の周辺では見られなかった。
【０１０５】
これらの結果は、ペプチド足場中に接種された細胞が、４週間のインビトロでの培養期間にわたってそれらの軟骨細胞表現型を維持したことを明確に示した。
【０１０６】
（ペプチド足場およびアガロース培養物の力学的特性）
材料特性の測定のために、３個の６ｍｍの直径の細胞を接種したペプチドプラグのグループを、１０％のＦＢＳ培養物から０、６、および２６日目に穴あけ機で切り取った。さらに、ペプチド足場に、３０×１０６細胞／ｍｌを接種し、そしてＩＴＳ／ＦＢＳ培地中で維持し、そして３個の３ｍｍの直径のプラグのグループを、材料特性の評価のために穴あけ機で切り取った。それぞれのプラグの平衡圧縮係数および動的圧縮係数を、以前に記載されているように（Ｆｒａｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．２０：６１５−６２７、１９８７）、Ｄｙｎａｓｔａｔ機械式分光光度計（ＩＭＡＳＳ、Ｈｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を使用して放射状に閉じ込めた一軸圧縮において測定した。簡潔には、それぞれのスペクトルを、拘束円筒チャンバーのウェル中に入れた。拘束円筒チャンバーを、Ｄｙｎａｓｔａｔの口部にクランプした（ｃｌａｍｐ）。上部の口に取り付けた多孔性の圧板を、プラグに３％のランプアンドホールド圧縮ひずみを加えるために使用し（１０秒間にわたる３％の圧縮、それに続く１分から５分間の保持）、これによって圧縮応力の最初の増大およびそれに続く弛緩を生じた。この順序を、４回から６回繰り返し（１２〜３０％までのひずみ）、そしてひずみの操作に対する弛緩した平衡応力の比を、平衡係数を算出するために使用した。１８％の圧縮オフセットひずみでは、１％の振幅のシヌソイドひずみが、１．０Ｈｚで加えられた。シヌソイド応力とひずみの信号を、コンピューターによって継続的に記録し、そして別々のフーリエ変換を、基本調和の振幅および４次の高い調和の振幅を計算するために実行した。動的圧縮硬度を、ひずみに対する応力の基本振幅の比として計算した。
【０１０７】
ＦＢＳ培地中で培養した細胞を接種したペプチド足場プラグの拘束（ｃｏｎｆｉｎｅｄ）圧縮平衡係数および動剛性を、０、６、および２６日目に測定した（図１３）。０日目の平衡係数の値は、１ｋＰａ未満であり、これは非細胞性のペプチド足場自体の非常に弱い圧縮抵抗性（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）に対応する。持続的なＧＡＧマトリックスの発生は、培養物中での経時的な力学的特性の劇的な増大において反映された。２６日目までには、平衡係数は、自然界の組織の係数の約１０％の値である２６ｋＰａに増大した。１Ｈｚでの動剛性もまた培養物中で増大し、２６日目には自然界の組織のものの約５％の値を有した。興味深いことに、３０×１０６細胞／ｍｌでペプチド足場中に接種し、そしてＩＴＳ／ＦＢＳ培地中で培養した細胞は、圧縮硬度においてなおさらに大きな増大を示した。平衡係数は、２８日目には９３ｋＰａに達し、そして１Ｈｚでの動剛性は１．２８ＭＰａに達した（図１３）。これらの両方の値は、自然界でのヒトおよび動物の関節軟骨の値の約１／５から１／３である。
【０１０８】
アガロース培養物についての生合成の結果と一致して、ＦＢＳの平衡係数（４４ｋＰａ）およびＩＴＳアガロースゲルの平衡係数（４２．８ｋＰａ）は、ＩＴＳ／ＦＢＳアガロースゲルの平衡係数（５９．８ｋＰａ）よりも有意に低かった（ｐ＝０．０１２）。
【０１０９】
（ペプチド足場によってカプセル化された軟骨細胞の増殖）
ペプチド足場内での軟骨細胞の増殖をもまた測定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素分析を使用した細胞を接種したペプチド足場のＤＮＡの定量は、Ｋｉｍらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７４：１６８−１７６、１９８８）を使用すると、ペプチド足場に関係する妨害に起因して不明瞭であった。それに代わるべきものとして、化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に基づく生存可能な細胞キットを、接種したペプチド足場中の生存可能な細胞密度を決定するために使用した。ＭＴＳキットを用いて得た値を解釈するために、三次元培養物についての較正曲線を、最初に、アガロース培養物を使用して設定した（図１４Ｅ）。５個のアガローススラブを、１０〜３０×１０６細胞／ｍｌの間の範囲の細胞密度で接種した。サンプルを穴あけ機で切り出し、そして２、３、および５日目に分析した。１１個のプラグのそれぞれのグループについて、６個を震盪板上で約２時間、ＭＴＳ培地中でインキュベートした。ＳＤＳを、ＭＴＳ反応を停止させるために２％の最終濃度で添加した。３０分後、培地サンプルを光学密度について試験した。残りの５個のプラグを消化し、そしてＤＮＡ含有量について分析した。平均のＭＴＳ出力を、較正曲線を設定するために平均のＤＮＡ含有量に対してプロットした。次いで、ＭＴＳデータを、確立された方法を使用して細胞を接種したペプチドプラグについて得た。生存可能な細胞数を、ＭＴＳ含有量から決定し、そして細胞密度を、生存可能な細胞数／プラグ容積として記録した。
【０１１０】
ＭＴＳの結果をさらに試験しそして確認するために、細胞を接種したペプチドサンプルを、２４時間の５’−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを使用して、３、７、および１３日目に分析した。ＢｒｄＵを２４時間の間、１０μＭの最終濃度で培養培地に添加した。ＢｒｄＵへの暴露の後、サンプルをＰＢＳで数回洗浄し、そしてＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２％のパラホルムアルデヒド中に、室温で２時間、ゆっくりと震盪させながら固定した。サンプルをＰＢＳ中で数回洗浄し、続いてＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温で２時間処理した。ＤＮＡを変性させるために、サンプルをＰＢＳ中の２ＭのＨＣｌを用いて３７℃で３０分間処理した。ＨＣｌ処理後、ｐＨ７．４に回復するまで、ＰＢＳを用いて数回の洗浄を行った。この時、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の２０％の仔ウシ血清、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１％のＤＭＳＯ）をサンプルに添加した。次いでサンプルを、ゆっくりと震盪させながら４℃で４時間インキュベートした。ＦＩＴＣを結合させた坑ＢｒｄＵマウスモノクローナル抗体ＩｇＧ１（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カタログ番号３３２８４Ｘ）を、４℃で１時間、ブロッキング緩衝液（１：４０希釈）中で予備インキュベートし、次いでサンプルに、ゆっくりと震盪させながら４℃で一晩添加した。インキュベーション期間の後、サンプルを、２時間にわたってブロッキング緩衝液で３回洗浄し、そしてＰＢＳ中での最後の洗浄もまた、さらに１時間行った。サンプルを、位相差および蛍光を用いるＮｉｋｏｎ  ＴＥ  ３００倒立型顕微鏡下で、Ｈａｍａｍａｔｓｕデジタルカメラを取り付けたＯｐｅｎＬａｂデータ獲得システムを使用してモニターした。得られた写真は、位相差および蛍光を用いて観察した単一の光学層を示す。
【０１１１】
細胞を接種したアガロースプラグ中でのＭＴＳ生存可能細胞アッセイの較正は、細胞密度の範囲全体にわたって直線的な性質を示した（図１４Ａ、図１４Ｅ）。ＦＢＳ培地中で培養した細胞を接種したペプチド足場およびアガロースゲルを、ＭＴＳアッセイを使用して生存可能な細胞の密度について評価した（図１４Ｂおよび１４Ｆ）。アガロースゲル中では、生存可能な細胞の密度は、培養の２日目から７日目の間に２０％増大し、これはＤＮＡ（Ｈｏｅｃｈｓｔ色素）分析を使用して以前に報告した増大と同様の増大であった。対照的に、ペプチド足場は、ＦＢＳおよびＩＴＳ／ＦＢＳ培地について培養の２日目から９日目の間に、それぞれ、生存可能な細胞の密度についてさらに劇的な８０％または６０％の増大を示した。増殖は、ＩＴＳ培地を使用した場合に最も遅く、９日目にはペプチド足場についての２日目よりも約３０％高い値であった。細胞を接種したペプチド足場中でのＢｒｄＵの取り込みはさらに、ＭＴＳの結果の輪郭をたどった（図１４Ｃおよび１４Ｄ）。ペプチド足場内の細胞の有意な画分は、２〜３日目および７〜８日目の２４時間のインキュベーション期間の間にＢｒｄＵの取り込みについてポジティブに標識され、このことはさらに、これらの培養物中での増殖している細胞の高い割合を示している。細胞はＦＢＳゲルの表面で脱分化しそして増殖する傾向にあるので、ＦＢＳ値は、ゲル内の軟骨細胞の集団の大きさを過大評価する場合がある。わずかな脱分化または脱分化がないことにより、ＩＴＳ／ＦＢＳおよびＩＴＳゲルの表面で可視であった（図１５Ａ〜Ｆ）。１３日目には、ＢｒｄＵの取り込みは全ての培地条件においてサンプル中でまばらであった。
【０１１２】
ＤＮＡ分析もまた、アガロース培養物の３５日間にわたる培養を通じて、全ての培地中で同様の細胞密度を示した。３５日目のＨ＆Ｅ切片は、単一の細胞および対の同様の集団を示した。ＦＢＳ培養物についてのＤＮＡ値もまた、ゲル表面での分化および増殖に起因して、ＦＢＳ中のペプチド足場について上記で議論したように、ゲル内の軟骨細胞の集団を過大評価する場合がある。
【０１１３】
（細胞の形態）
それぞれのペプチド足場中の細胞対は、典型的な軟骨細胞の球形の形態の外形をとった。対照的に、ペプチド足場よりも約２０倍硬い材料である２％のアガロース中の細胞対は、単一の鋳造細胞のほぼ容積において半球体の形態をとった。アガロースヒドロゲルの培養の間に、連続する単層が形成され、これは、３５日までのサンプルの穴あけ機での切り取りの間に、ゲル表面から部分的に引き剥がされる。肉眼で見ることができる単層は、いずれのＩＴＳ培地においても観察されなかった。
【０１１４】
（結果のまとめ）
本明細書中に記載した鋳造手順は、高い細胞生存性（＞８０％）を維持したまま、ペプチド足場内での軟骨細胞の迅速でありそして十分なカプセル化を可能にする。スクロース中に溶解させたペプチドは、溶液の粘性を有意には増大させず、そして軟骨細胞は気泡を形成することなく迅速にそして均質に再懸濁され得る。結果として、カプセル化された細胞は、足場の隅々まで均質に分布させられる。この実験では、細胞を接種した足場を、生体力学的特性の定量化、ならびにＥＣＭの生合成および一定のプラグ容積に対する蓄積量の較正を可能にするために、平坦なスラブの外形に鋳造した。しかし、この鋳造技術は一般的には任意の外形の足場および他の細胞型について適応することができ、組織修復の適用の非常に重要な特徴である。本発明者らのアプローチはまた、すでに予め形成された足場の中に細胞を接種した場合に遭遇し得る問題点を回避する。ここでは、ペプチドは、約５０〜２００ｎｍの繊維間空間を有する十分に規則正しいナノ繊維に自律的に組み立て、そして同時に、細胞−ペプチド溶液中のそれぞれの個々の軟骨細胞の周辺に肉眼で見ることができる足場ネットワークに組み立てる。この密接な細胞−足場構造は、ペプチド−細胞のシグナル伝達および細胞によって媒介されるペプチドの生体分解性に関して特有の利点を与え得る。
【０１１５】
ＩＴＳ培地に対する低濃度のＦＢＳの添加は、ほぼ１０％のＦＢＳ培地のものにまで増殖を増大させたが、一方、足場表面での脱文化をなおも制限する。ＩＩ型コラーゲンの免疫染色（１３日目）は、１０％のＦＢＳ培地と比較して、両方のＩＴＳ培地中でのＩＩ型コラーゲンのより少ない蓄積を示した。１３日目には、ＦＢＳで培養した足場の取り扱い特性は、細胞を含まない足場の特性を有意に上回って増大した。ＩＴＳ／ＦＢＳサンプルは、周辺での強度の増大を示したが、ＩＴＳサンプルは、非細胞性の足場と同じぐらい壊れやすかった。ＩＴＳおよびＩＴＳ／ＦＢＳ培地補充物は、ほかに、アガロースゲル中の軟骨細胞の培養のための１０％のＦＢＳに適応することができる。ＤＭＥＭ＋１％のＩＴＳは、１０％のＦＢＳと同様の生合成を可能にする完全に確立された培地である。０．２％のＦＢＳのＩＴＳ培地への添加は、両方の一成分培地を上回るように生合成を増大させた。ペプチド培養物において観察したように、表面での脱分化は、両方のＩＴＳ培地を用いた場合に制限され、このことは、プラグＤＮＡの生合成の標準化のための可能性のある人工産物を減少させる。アガロースの結果は、ＩＴＳ培地が生合成について１０％のＦＢＳと同等であるかまたはそれよりも優れている可能性があることを示した。
【０１１６】
（細胞外マトリックスおよびタンパク質の細胞による生合成）
軟骨の修復のための適切な足場の選択における主要な難題は、速い速度での軟骨細胞の増殖を刺激することができ、同時に表現型特異的なＥＣＭ高分子の速い速度での軟骨細胞による合成を刺激することができる材料の同定である。ペプチド足場マトリックスは、両方に好都合と見られる。カプセル化された軟骨細胞の増殖は、アガロースコントロール培養物と比較して、ペプチド足場中で実質的に高かった。細胞分裂を経験している豊富な細胞対を、培養物中で３日目のような早い時期に、足場内で観察した（図１５Ｂ〜１５Ｄ）。アガロースと比較したペプチド足場中でのより早い増殖は、細胞−ペプチド相互作用、物理的環境、または他の因子に関係し得る。増殖している軟骨細胞は、アガロースよりも大きな範囲にまでペプチド足場マトリックスにとってかわった。
【０１１７】
（細胞外マトリックス高分子の細胞による生合成）
放射標識の取り込みおよび全ＧＡＧの蓄積データ（図１１Ａおよび１２Ａ）を、もとのスラブゲルから穴あけ機で切り出した、プラグあたりの規準で標準化した。この様式では、生合成を、所定の最初の足場の外形と細胞接種密度についての修復応答の代表として報告する。ＤＮＡ含有量による細胞あたりの規準に基づく直接の標準化は、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素アッセイを用いたペプチド消化の妨害に起因して、不明瞭である。放射標識の取り込み（図１１Ａ）は、初代ウシ軟骨細胞によるプロテオグリカンおよび全タンパク質の合成が、３−Ｄアガロースおよび３−Ｄペプチド足場培養物中で同様であったことを示した。従って、ペプチドとアガロース足場との間での足場組成と微視的物理学的環境における特異的な差異は、ＥＣＭ高分子の細胞による合成の正味の速度には有意な影響を与えなかった。
【０１１８】
細胞を接種したペプチド足場中での全ＧＡＧの蓄積もまた、足場濃度（０．５％対２％ｗ／ｗ）の差異をのぞいて、アガロース培養物中での蓄積と同様であった（図１２）。文献中の他の研究との比較のために、１５日目のデータ（図１２Ａ）を、図１４Ｂの傾向によって最初の接種密度の約２倍であると推定した、１５日目の細胞密度の概算に基づいて、ＤＮＡ含有量について標準化した（７．７ｐｇのＤＮＡ／細胞（Ｋｉｍら、前出））。従って、１５日目の算出したＧＡＧ密度は約２２μｇ／μｇＤＮＡであった。この値は、アルギン酸培養物中（約５０μｇ／μｇ）中で報告された（Ｒａｇａｎら、前出）値よりも低かったが、Ｉ型コラーゲンスポンジ中（４．８μｇ／μｇ）（Ｍｉｚｕｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５６：３６８−３７５、２００１）、ＰＧＡ（約８μｇ／μｇ）およびＰＬＡ（約５μｇ／μｇ）（Ｆｒｅｅｄら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．２７：１１−２３、１９９３）よりも大きかった。さらに、ＧＡＧの割合を、ＰＥＯ（約０．２３％、６週、５０×１０６細胞／ｍｌの最初の接種密度）に対して比較した、ペプチド足場中での湿重量（約０．９％と概算した、４週）に対して標準化した（Ｂｒｙａｎｔら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２：６１９−６２６、２００１）。直接的な比較は、接種密度および培養培地のような一致しない因子に起因して困難であるが、本発明者らのペプチド足場中でのＧＡＧの蓄積は、他のポリマーおよび足場（単数または複数）の範囲内にあると考える。
【０１１９】
この実験においては、実験の大部分を、１０％のＦＢＳを含有している培養培地中で１５×１０６細胞／ｍｌのペプチドおよびアガロースヒドロゲル接種密度で行った。このような条件は、以前に公開された研究との比較に便利であるが、修復組織のインビトロでの発達に必ずしも最適ではない。種々の培地および細胞密度を使用した実験もまた、インビトロでの培養条件についての選択肢を示すために行った。ＩＴＳをベースとすると、低血清培地（０．２％のＦＢＳ）は、全ＧＡＧの蓄積および放射性同位元素の取り込みに関して、１０％のＦＢＳ＋ＤＭＥＭに匹敵することを見出した（２８日目、図１１Ａ）。しかし、ＩＴＳ／ＦＢＳ培地中での培養と組み合わせた細胞接種密度の２倍の増大は、平衡圧縮係数において４倍の増大を、そして動剛性においては１０倍を上回る増大を生じ、接種密度のみの場合の比例的増大から予想されるものよりもはるかに大きかった。従って、なお高い細胞接種密度を、軟骨の修復における臨床的使用のための軟骨細胞／ペプチド足場システムをさらに最適化するために使用することができる。
【０１２０】
（ペプチド足場を用いて軟骨細胞および新しく合成されたＥＣＭによって形成されたコラーゲンの分析）
ＩＩ型コラーゲンについての免疫組織化学的分析は、持続的な様式でペプチド足場の隅々までにわたるポジティブ染色を示したが、Ｉ型コラーゲンの染色は、ゲル内の細胞周辺でバックグランドのレベルでのみ現れた。１０％のＦＢＳを補充した培地を用いた場合には、ポジティブなＩ型コラーゲン染色を、ゲルの外表面上でのみ培養物中で時間とともに細胞数が増大を示した、線維芽細胞様の細胞の薄層中で観察した。興味深いことに、ＩＴＳ／ＦＢＡ培地中で培養した細胞を接種したペプチド足場は、表面上では非常に少ない脱分化および線維芽細胞様細胞の蓄積を有することを観察した（図１５Ａ〜Ｆ）。従って、細胞サンプルを、コラーゲン含有量の分析のためにＩＴＳ／ＦＢＳ培養物から選択した。ＳＤＳ−ゲル電気泳動によって、細胞を接種したペプチド足場培養物中での圧倒的なＩＩ型コラーゲンの蓄積を確認した（図１２Ｄ）。
【０１２１】
（ペプチド足場およびアガロース培養物の力学的特性）
接種したペプチド足場中でのＧＡＧの蓄積は、細胞を伴う空間およびテリトリー間の空間の両方において、足場の隅々までにわたって分布した（図１２Ｂ）。持続的なＥＣＭの発生は、培養物中での時間の関数としての圧縮硬度の増大において反映された（図１３）。１５×１０６細胞／ｍｌを接種したペプチド足場の０日目の力学的特性は非常にこわれやすく、極端に低い圧縮抵抗性（自然界の軟骨よりも１００〜１０００倍低い）を有した。培養の６日後、プラグの取り扱い特性は顕著に改善され、平衡係数はほぼ一桁増大した。２６日目までには、試験サンプルを自由に扱うことができ、そして２６ｋＰａの平衡係数（０日目と比較して３０倍の増大）に達した。比較のために、約１２５×１０６細胞／ｍｌで初代仔ウシ軟骨細胞を接種し、そして自由に膨張する条件下で培養したＧＰＡ足場の平衡係数は、４２日後には約５２ｋＰａであり（Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃら、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１７：１３０−１３８、１９９９）、そしてＩＴＳ／ＦＢＳ中の３０×１０６細胞／ｍｌを用いたペプチド足場の係数は９３ｋＰａであった（図１３）。アガロースヒドロゲルについては、ＦＢＳ培養物の平衡係数（４４ｋＰａ）とＩＴＳ培養物の平衡係数（４２．８ｋＰａ）は、ＩＴＳ／ＦＢＳ培養物の平衡係数（５９．８ｋＰａ）よりも有意に低かった（ｐ＝０．０１２）。
【０１２２】
（ペプチド足場の硬度を増大させるための例示的な圧縮機構）
移植の前の細胞を接種した組織を操作した足場のインビトロでの馴化は、自由に膨張する培養物と比較して、生合成を増大させそしてマトリックスの蓄積を加速させる、長期間（例えば、２４時間以上）の力学的荷重により利点を得る場合がある。動的圧縮荷重の種々のデューティ（ｄｕｔｙ）サイクルを、軟骨細胞を接種した自己構築ペプチド足場において、そしてアガロース培養系において試験した。
【０１２３】
（軟骨細胞をカプセル化しているペプチド足場の形成および処理）
軟骨細胞をカプセル化したペプチド足場の形成のために、ウシの軟骨細胞を、プロナーゼとコラゲナーゼでの連続的な消化によって、１〜２週齢のから仔ウシから単離した。細胞を、本明細書中に記載したように、１５×１０６細胞／ｍｌの濃度で１．６ｍｍの厚みの平坦なスラブ構造として、２％のアガロースまたは自己構築ペプチド足場に接種した。ペプチド足場は、０．５％の濃度で、１２アミノ酸の配列ｎ−ＫＬＤＬＫＬＤＬＫＬＤＬ−ｃから構成される。接種したゲルを、１％のＩＴＳ＋０．２％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【０１２４】
新しいチャンバーを、接種したペプチド足場の長期間の機械的圧縮のために設計した（図１６）。塩基構成成分のうち、６個のウェルを、１つの１２ｍｍの直径のサンプルをそれぞれが保持するように設計した。多孔性の圧板（４０％の空隙、１２０μｍの孔の大きさ、１３ｍｍの直径）を蓋に取り付け、ウェルの中心を同軸上に並べた。蓋は、塩基構成成分中の非培養物のウェルとともに並んでいる中心に取り付けたばねを含んだ。この様式では、ばねは、蓋が降りていない場合には、圧板とサンプルとの間に４００〜８００μｍのギャップを作った。チャンバーを、接種したペプチド足場への動的圧縮荷重を加えるために、インキュベーターを収容した荷重システム（Ｆｒａｎｋら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．２０００）の中に入れた（図１７）。
【０１２５】
実験には、１．０Ｈｚの周波数で５〜７％の定位オフセットひずみを重ねられた、２．５〜３％のひずみの大きさを用いたシヌソイド動的圧縮プロトコールを使用した。荷重を、４５分から１時間の間加え、その後、サンプルを、ゲルを数百マイクロメートル離して圧板に戻すことによって、示した「オフ」時間の間、自由に膨張する条件で維持した。このようなデューティサイクルを、荷重の間の「オン」と荷重を加えない期間の間の「オフ」と呼ぶ。
【０１２６】
（アガロース培養物についての結果）
実験によって、アガロースゲル培養物を使用して、１時間の「オン」／１から７時間の「オフ」の反復的なデューティサイクルプロトコールを研究した。それぞれのデューティサイクルについて、サンプルを、荷重の前の鋳造後の０〜２８日間に、自由に膨張する条件で維持した。荷重を、４〜８日間加え、荷重期間の終わりに２０時間、放射標識を取り込ませた（３Ｈ−プロリンまたは３５Ｓ−硫酸塩の放射標識の取り込み）。
【０１２７】
それぞれの１２ｍｍのサンプルの分析のために、７個までの３ｍｍのプラグに穴をあけた。全ＧＡＧの蓄積（ＤＭＭＢ色素の結合）および全タンパク質、ならびにプロテオグリカンの合成（３Ｈ−プロリンおよび３５Ｓ−硫酸塩の放射標識の取り込み）を、本明細書中に記載するように、プロテイナーゼＫ消化後に測定した。放射標識培地を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム上での分配によって高分子含有物について分析した。接種したペプチド足場を、サンプル消化物、およびＳＤＳで抽出した高分子をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムに供することによって、足場が取り込んだ高分子および低分子量の含有物について分析した（Ｓａｈら、Ｊ．Ｏ．Ｒ．７（５），１９８９）。全ての結果について、荷重をかけたサンプルを、自由に膨張するコントロール培養物と比較した。
【０１２８】
全ての反復的なデューティサイクルによって、放射標識の取り込みは自由に膨張するコントロールの約３０〜８０％にまで減少した。例えば、図１８は、１時間のオン／７時間のオフ、および１時間のオン／１時間のオフのデューティサイクルについてのアガロースゲル中への放射標識の取り込みを示す（コントロール値＝１）。取り込みは、一日おきに荷重をかけた場合に増大した（図１９）。ここでは、３個のサンプルに、鋳造の１２日後に荷重をかけた。４５分のオン／５時間１５分のオフの４回のサイクル、それに続く荷重を加えない２４時間から構成される荷重プロトコールを、１２日目までに適用した。サンプルを、１５日目（荷重期間なし）、２２日目（荷重期間）、および２３日目（非荷重期間）に２０時間放射標識した。非荷重期間は、自由に膨張するコントロールの値（コントロール＝１）に対して較正した、増大した硫酸塩の取り込み、および同等のまたはそれよりも減少したプロリンの取り込みを示した。荷重の間の放射標識は、同様の硫酸塩の取り込み、およびプロリンの取り込みの減少を示した。１５日目には、標識期間の間に培地に放出された標識された３５Ｓ−高分子は、荷重をかけられたサンプルおよびコントロールサンプルの両方において、アガロースゲル中に取り込まれた標識のわずか１〜２％であった。多量の硫酸塩の取り込み（図１９）にもかかわらず、全ＧＡＧの蓄積は、全ての時点で同様であった。
【０１２９】
（ペプチド足場についての結果）
軟骨細胞を接種したペプチド足場に、自由に膨張する培養の２１日後に、図１９の別の日に荷重をかけるプロトコールを使用して荷重をかけた。サンプルを、荷重期間（３２日目）ならびに非荷重期間（２７日目および３３日目）の間に放射標識した。硫酸塩の取り込みは、全ての時点で（特に荷重期間の間に）、自由に膨張するコントロールサンプルよりも高かった。プロリンの取り込みは、コントロールの値と同様であるかまたはそれよりも少なかった。全ＧＡＧ含有量を、３２日目および３３日目に測定した。いずれの場合も、ＧＡＧ含有量は、荷重をかけたサンプルよりも９％高かった（ｐ＝０．００５、０．０３５）。この差異は、１２日および１３日の荷重期間の間のＧＡＧ含有量における約２０〜３０％の増大を示す。培地を、全ての時点で、硫酸塩およびプロリンで標識した高分子の放出について分析した。荷重をかけたサンプルとコントロールサンプルの両方について、３５Ｓ−高分子の放出は、足場が取り込んだ硫酸塩標識の約１〜３％であった。３Ｈ−高分子の放出は、荷重をかけたサンプル中で足場が取り込んだ標識の４〜６％であり、そして自由に膨張するコントロールについての放出の１０〜１２％であった。足場が蓄積した放射標識の分析を、３３日目に行った。測定した値は、荷重をかけたグループとコントロールのグループの両方において同様であり、足場の中の高分子硫酸塩の約９５％および高分子プロリンの約８６％であった（図２０）。
【０１３０】
（結果のまとめ）
軟骨細胞を接種したペプチド足場培養物のモデルシステムとして、アガロースゲルは、自由に膨張する培養物を上回って硫酸塩の取り込みを増大させるために、別の日の荷重を必要とした。しかしプロリンの取り込みは、コントロールサンプルと同様に最大であり、そしてＬｅｅら（Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．１５（２），１９９７）と一致して約５０％未満までであった。アガロース培養物についての結果と比べて、接種したペプチド足場中への硫酸塩の取り込みは荷重期間の間に最大となり、そして全ＧＡＧの蓄積は、自由に膨張するコントロールと比較して高かった。プロリンの取り込みは荷重に伴って減少したが、アガロース培養物中よりもその程度は少なくなった。３５Ｓ−高分子の放出は最少であり、そして荷重の影響は受けなかった。しかし、３Ｈ−プロリン高分子の放出は、荷重をかけた培養物中では低く、自由に膨張するコントロールと比較して全タンパク質（足場が取り込んだもの＋放出された高分子）の生合成は減少した。足場の中に取り込まれた標識された高分子の割合は、アガロースゲル中（Ｂｕｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０８、１９９５）および外移植培養物中（Ｓａｈら、前出）での割合と同様である。細胞を接種したペプチド足場は、プロテオグリカンの合成をさらに増大させるため、およびタンパク質合成を増大させるかまたは維持するための、より頻繁なまたは毎日の荷重サイクルに有利に応答し得る。
【０１３１】
（別の圧縮機構）
足場の硬度を増大させるために、剪断荷重をもまた加えた（Ｊｉｎら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３９５（１）：４１−８、２００１）。剪断荷重を加えそして剪断による変形を生じるためには、牽引力を生じるために十分な摩擦が、サンプルと荷重圧板との間に存在しなければならない。次いで、牽引力は、表面を置き換え、剪断による変形を生じる。圧縮荷重を加えることによって、サンプルと圧板との間の摩擦を増大させる。この摩擦は、サンプルと圧板との間でのすべりを防ぐために必須であり得る。特に、剪断荷重は典型的には、圧縮オフセットがサンプルと圧板との間での適切な摩擦に到達させられた後に、加えられる。周波数は、剪断荷重または圧縮荷重について同じ範囲にある。動的剪断荷重は、動的圧縮荷重を伴わずに加えられ得るか、あるいは、動的圧縮と動的剪断の別の期間が加えられるか、あるいは特定のシステムを用いて同時に加えられる。
【０１３２】
例えば、肉眼で見ることができる足場は、０から４５％、０から４０％、０から３０％、０から２０％、０から１０％、または１０から２０％の定位オフセットについて圧縮され得る。剪断ひずみ（例えば、０．０１から３０％、０．０５から２０％、０．１から１０％、１から１０％、または２から５％の剪断ひずみ）が、肉眼で見ることができる足場に加えられる。種々の実施形態においては、周波数は０．００１から２０Ｈｚ、０．００１から１０Ｈｚ、０．０２から１０Ｈｚ、０．１から１０Ｈｚ、または１から５Ｈｚである。剪断荷重は持続的であり得るかまたは可変であり得る。
【０１３３】
（軟骨細胞または他の細胞型をカプセル化している足場についてのインビボでの免疫応答および炎症性応答）
２つの自己構築ペプチドに対するインビボでの免疫応答および炎症性応答を分析した。ＲＡＤ１６ペプチドまたはＥＡＫ１６ペプチドの両方ともが、単独で、またはＢＳＡのような他の高度に免疫原性のタンパク質と組み合わせても、ウサギまたはヤギに注射した場合に、検出可能な免疫学的応答を誘発しなかった（Ｈｏｌｍｅｓら（２０００）、前出）。有意な抗体力価も得られなかった。これらペプチドによって誘発される炎症性応答を測定するために、このペプチドをラットの脚の筋肉および脳に注射した（Ｈｏｌｍｅｓら、（２０００）前出）。注射後２週間の間、これらまたは近隣の領域では炎症は観察されなかった。他の自己構築ペプチドを、それらが生じる免疫応答および炎症性応答を測定するために同様に試験することができる。
【０１３４】
種々の哺乳動物中においてこれらのペプチドに対する免疫または炎症性応答がないことは、これらのペプチドがヒトに投与された場合に有害な免疫または炎症性応答を誘発しない場合があることを示唆する。さらに、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子によるペプチド提示の構造モデルおよび理論的分析もまた、本発明の自己構築ペプチドはおそらく、荷電した残基と荷電していない残基のそれらの別の分布に起因して、強力な免疫応答は誘発しないことを示唆する。
【０１３５】
（軟骨細胞または他の細胞型をカプセル化している足場についてのインビボでの動物モデルの実験）
いくつかの以前の研究では、関節軟骨の欠損の中で形成される再生組織を比較するために、イヌモデルを使用した（例えば、Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３３１：８８９−８９４、１９９４；Ｂｒｅｉｎａｎら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｔ．Ｓｕｒｇ．７９−Ａ：１４３９−１４５１、１９９７；Ｂｒｅｉｎａｎら、Ｔｉｓｓ．Ｅｎｇｒ．４：１０１−１１４、１９９８；Ｎｅｈｒｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９：２３１３−２３１２８、１９９８を参照のこと）。最初の実験のために、４匹のイヌをそれぞれのペプチド足場について試験した。２つの欠損をそれぞれの膝に作成し、そしてそれぞれの欠損を軟骨細胞をカプセル化しているペプチド足場で満たす。以前の研究では未処置のコントロールのグループについてのデータが得られているので、未処置のコントロールのグループはこの実験には必要がない（Ｂｒｅｉｎａｎら（１９９７）前出）。しかし、所望する場合には、１つ以上の膝の欠損が足場で満たされていないかまたは細胞を含まない足場で満たされているイヌを、コントロールとして使用することができる。
【０１３６】
これらの実験グループについて必要なサンプルの大きさを決定するための能力の計算は、全ての充填の平均の値、ヒアリン軟骨の面積の割合、および特異的な力学的特性の値における３０％の差異の検出に基づき、これによって２５％の標準偏差をとる。結果の変量における３０％の変化は、別のものを上回る１つの処置グループの利点の重要な同定と予想される。０．８０の出力（β＝０．２０）およびα＝０．０５の有意性のレベルのためには、ｎ＝８の種が必要である。統計学的分析を、同じ膝の中の２つの欠損についての値を平均し、そして１つの観察として平均値を計算することによって行った。しかし、この動物モデルを使用する本発明者らの以前の研究では、動物の同じ膝の中の２つの欠損の間には、体系的な関係は存在しなかった。従って、所望する場合には、個々の欠損を別々の観察として処理し得る。
【０１３７】
この研究のために、成体の雑種のイヌまたは猟犬（それぞれ、約２５〜３０ｋｇの体重）を使用する。操作の前に、膝関節を退行性の関節疾患を有する動物を排除するためにＸ線撮影法によって試験する。全ての操作を、以前に記載されているように（Ｂｒｅｉｎａｎら（１９９７）、前出）、全身麻酔および滅菌条件下で行う。２つの４ｍｍの直径の欠損を、右側の後膝（膝）関節の滑車切痕中に作成する。これらの欠損を、頚骨の顆間の切痕の近く約１．２５および２．２５ｃｍに配置する。これらのそれぞれは、中線からわずかに外側であるかまたはその内側にある。４ｍｍの直径の表皮の穴を、欠損の輪郭を描くために使用する。ルーペによる視覚化を使用して、石灰化した軟骨に亀裂を生じることなく、カスタマイズしたキューレットで石灰化した軟骨の表面を引っ掻くことによって、全ての石灰化していない軟骨を欠損から取り除く試みを行う。目的は、全ての関節軟骨を除去すること、および石灰化した軟骨が有する修復組織の完成を促進するために、石灰化した軟骨を穏やかに引っ掻くことである。カプセル化した軟骨細胞を有するペプチド足場またはそれを有さないペプチド足場を、それぞれの欠損の中に入れる。カプセルを閉じる前に、出血している欠陥をクランプし、そしてカテーテルを入れる。膝関節を、ゼロ点縫合によって閉じる。手術後、手術した膝を、外部固定（ＩＭＥＸ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｌｏｎｇｖｉｅｗ，Ｔｅｘａｓ）によって１０日間固定する（Ｂｒｅｉｎａｎら、（１９９７）、前出）。手術した膝は、ペプチド足場に硬度を増大させることが必要である場合には、より長い期間の間固定することができることもまた、意図される。なぜなら、細胞外間トリックス成分は、カプセル化された細胞および／またはその付近の細胞によってインビボで分泌されるからである。最初の外科手術手順の６ヵ月後、２つの欠損を、同じ手順を使用して左膝に作成する。イヌを最初の外科手術手順の１２ヶ月後に屠殺し、これによって右膝については１２ヶ月、そして左膝については６ヶ月の手術後の評価期間を生じる。他の手術後の期間（例えば、数時間、数日、またはさらに数年）を使用することができることもまた、意図される。さらに、他のイヌの中の欠損を、早期の移植片の置き換えが生じているかどうかを決定するために、より早い時点（例えば、３０分後、数時間、または数日）で分析することができる。
【０１３８】
ホルマリン固定後、標本を１５％のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムの石灰質除去溶液（ｐＨ７．４）中に浸す。サンプルを、４週間の間、４℃の震盪装置上に置き、そしてこのインキュベーションの間、石灰質除去溶液を１週間ごとに交換する。サンプルを徹底的にリンスし、脱水し、そして６０℃でパラフィン中に包埋する。７マイクロメートルの厚みの切片を、ヘマトキシリン、エオシン、および／またはサフラニンＯ／ファストグリーンで染色する。選択したパラフィン切片を、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩ型コラーゲンに対する抗体で染色する。
【０１３９】
欠損を充填している特異的組織型を、それぞれ以下の組織型によって占有されている欠損の端から端までの中央の断面積の割合を評価することによって決定する：関節軟骨、非間接性ヒアリン軟骨、繊維性軟骨、および繊維性組織（Ｂｒｅｉｎａｎら（１９９７）、前出）。これらの割合は、欠損の中央部分を通る代表的な組織学的横断面のみについていう。これらは、欠損中の組織の実際の容量の割合に等しい値は意味しない。エッジ効果（再生組織が欠損の周辺で形成する傾向にあること）に起因して、欠損の直径の６０％またはそれ以上を示す切片のみが分析される。欠損の淵の極めて近くから採取された切片は、優先的に再生を示し、これはまぎらわしいデータを生じ得る。特異的組織型の面積の割合に対する処理と時間の効果を、２元配置ＡＮＯＶＡ（２−ｗａｙ−ＡＮＯＶＡ）によって決定する。グループの比較を、適切な補正を用いてＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を使用して行う。
【０１４０】
さらに、隣接している組織の全ての分解、ならびに肋軟骨下の皿および隣接している軟骨への修復された組織の結合が、評価され得る。欠損の基部に存在する再建されてつつある肋軟骨下の骨の中で形成された新しい組織の存在もまた決定され得、そして欠損の周辺領域が、炎症の兆候について分析され得る。所望される場合には、足場の分解速度が測定され得る。インビボでの分解速度のこの決定のために、放射標識したペプチド（例えば、１４Ｃ−、３Ｈ−、または３５Ｓ−で標識したペプチド）が、放射標識したペプチド足場に構築され、そして本発明の方法を使用して哺乳動物に投与され得る。放射活性足場の投与後の１つ以上の時点で、尿および血液サンプルが哺乳動物から得られる。サンプル中の放射活性の量が、足場から放出されている分解産物の量を決定するために測定される。
【０１４１】
他の動物モデルは、インビボで組織を修復または置き換える能力について生存している細胞をカプセル化しているペプチド足場を試験するために使用され得る。例えば、軟骨細胞をカプセル化している足場はまた、軟骨欠損のウサギモデルを使用して試験され得る（例えば、Ｐｅｒｋａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ３７８：２４５−２５４、２０００；Ｓｏｌｃｈａｇａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（５）：７７３−７８０、２０００を参照のこと）。標準的な骨組織の操作用の動物モデルが、骨細胞のような細胞をカプセル化している足場のインビボでの研究に使用され得る（例えば、Ｌｅｎｎｏｎら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１９（１）：２１１−２２２、１９９５；Ｓｏｌｃｈａｇａら、前出；Ｂｏｙａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７（２）：２４６−５５、１９９９を参照のこと）。インビボで靭帯組織を修復または置き換える能力についてペプチド足場を試験するために使用され得る靭帯組織の操作用の動物モデルの例として、Ａｗａｄら（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５（３）：２６７−２７７、１９９９）およびＫａｔｏら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（Ａｍ）７３（４）：５６１−５７４、１９９１）によって記載されているモデルが挙げられる。任意の他の細胞型をカプセル化しているペプチド足場もまた、適切な動物モデルにおいて慣用的な手順で試験され得る。標準的な医学的手順が、他の哺乳動物（例えば、ヒト）の処置のために、これらの動物モデルにおいて組織を修復または置き換えるために使用される方法に適応するように使用され得る。
【０１４２】
（前駆細胞のカプセル化および／または分化）
（概要）
幹細胞を、自己再生する（すなわち、分裂しそしてさらなる幹細胞を生じる）こと、および特殊化された経路（単数または複数）に沿って分化を受けることができる細胞をもまた生じることの両方が可能である細胞として定義されている（例えば、Ｆｕｃｈｓ，Ｅ．およびＳｅｇｒｅ，Ｊ．，「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｌｅａｓｅ  ｏｎ  Ｌｉｆｅ」、Ｃｅｌｌ，１００、１４３−１５５、２０００；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．，「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｕｎｉｔｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｕｎｉｔｓ  ｏｆ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｎｉｔｓ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ、１００、１５７−１６８、２０００を参照のこと）。従って、幹細胞自体は未分化の状態にあるが、体内で特異的な機能を有する１つ以上の特殊化された細胞型を生じることが可能である。分化は、新しい遺伝子産物の合成の結果である細胞の表現型の質的変化をいう（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｍ．およびＰｏｔｔｅｎ，Ｃ．、「Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｅｄｉｇｒｅｅｓ  −  ａ  ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｐｏｔｔｅｎ，Ｃ．（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９７）。
【０１４３】
分化は、細胞の形態学的変化によって、あるいは酵素活性またはタンパク質組成の変化を検出することによって、認識され得る。特定の分化経路または状態を特徴付けるために使用され得るこのようなタンパク質をコードするタンパク質（酵素を含む）およびｍＲＮＡは、本明細書中でマーカーと呼ばれる。このようなマーカーは、特定の分化した細胞型に特有ではない場合があるが、種々の分化した細胞型において見出され得る。例えば、チトクロームＰ４５０酵素は成熟肝細胞によって産生され、従って、肝細胞の分化についてのマーカーである。しかし、これらの酵素のいくつかはまた、小腸の細胞によっても産生され、従ってこれらの小腸細胞のマーカーでもある。特定の分化した細胞型であるとして細胞を同定するために十分な適切なマーカーまたはマーカーの組み合わせを選択することは、当業者に容易に行われ得る。
【０１４４】
２つの異なるタイプの幹細胞が認識されている。胚性胚盤胞中に存在する胚性幹細胞は、十分に未分化であり、これはあらゆる細胞型を生じることができる。体性幹細胞は、特異的な成体組織中で見出される。ここでは、これらは無限に分裂することができると考えられる。最近までは、体性幹細胞は、限定されたインビボでの分化能力（例えば、これらは、それらが見出された組織の特徴である分化した細胞を生じることができるだけである）を有すると広く考えられていた。しかし、最近の結果は、体性幹細胞が以前に考えられていたよりもはるかに広い範囲の分化能力を有し得ることを示唆した。例えば、神経幹細胞は、インビボで造血細胞を生じることができると考えられる（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３：５３４−５３７）が、造血幹細胞は、肝細胞へと分化することができる（Ｌａｇａｓｓｅ，Ｅ．ら、「Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｈｅｐａｔｐｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６：１２２９−１２３４，２０００）。インビボでの実験に広く基づくこれらおよび他の同様の結果は、細胞の適応性の表現型の重要性を高めた。
【０１４５】
本明細書中で使用する場合は、用語「前駆細胞」は、完全には分化していないが、完全に分化することが可能である娘細胞（単数または複数）を生じる能力を有する細胞をいう。従って、幹細胞は、前駆細胞の１つのタイプである。当該分野で公知であるように、幹細胞は一般的には、他のタイプの前駆細胞よりも広い分化の可能性を有するとみなされる。幹細胞は一般的には、自己再生能力を有するとみなされる。用語「前駆細胞」はまた、分化の経路（例えばこれは、１つ以上の分化のマーカーを発現する）に沿って１つ以上の工程を受け得る細胞を含む。用語「前駆細胞」および「前駆細胞」は本明細書中で互換的に使用される。
【０１４６】
前駆細胞および幹細胞の能力をより完全に活用するために、それらの分化を制御しそして操作することができることが所望される。詳細には、細胞の分化転換を制御することが所望される。本明細書中で使用される場合には、用語「分化転換」は、（１）異なる体組織または器官において通常見出されるタイプの細胞に分化するか、またはそのようになることが可能である娘細胞（単数または複数）を生じるようにのいずれかの、特定の体組織または器官から単離された前駆細胞の能力、あるいは（２）その発生運命を変化させ、そして代替の分化経路を取るように、特定の細胞系統の特徴である細胞形態を示すかまたは特定の細胞系統に特徴的である１つ以上の分化マーカーを発現する細胞の能力をいう。これらの代替の定義は互いに両立し、そして多くの場合重複する。細胞の分化または分化転換の変更は、細胞の再プログラミングと呼ばれ得る。
【０１４７】
本発明は、分化および分化転換を促進するための組成物および方法を含む、前駆細胞または幹細胞の細胞外環境を操作するための組成物および方法を提供する。このような組成物および方法は、特定の分化経路に沿って細胞を指示に従うようにする物理的条件下で細胞を増殖させることを含む。物理的条件は、特に、三次元ペプチドヒドロゲル内に前駆細胞をカプセル化することを含み得る。指示は、１つ以上の増殖因子または分化因子に対して細胞を暴露することを含み得る。本発明の組成物および方法により、新しくそして有用な方法で前駆細胞の固有の再生能力を利用することが可能である。
【０１４８】
体の再生能力は、特に、特定の器官（例えば、肝臓）の場合に顕著である。肝臓は、部分肝切除から毒素によって誘導された損傷までの範囲の傷害の後に再生する、広範な能力を有することが周知である。他の再生組織（例えば、骨髄および皮膚）とは異なり、肝臓の再生は、前駆細胞の小さいグループに依存するとは考えられない。その代わりに、再生は、以下を含む成熟細胞集団の分裂によって生じる：幹細胞（肝臓の主要な機能性細胞、これは、外因性化合物および内因性化合物の代謝において重要な役割を果たす酵素を含む、広範囲のタンパク質を合成する）；胆管上皮細胞（これは、胆管を裏打ちする）；内皮細胞；クップファー細胞（マクロファージ）；および星状細胞（伊藤細胞とも呼ばれる）（これは、肝臓のシヌソイド下に配置され、長い突起を有する肝細胞を取り囲み、そして細胞外マトリックスタンパク質および増殖因子を分泌する）。肝臓の再生は、Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．およびＤｅＦｒａｎｃｅｓ，Ｍ．，「Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６、６０−６６、１９９７で徹底的に検討されている。
【０１４９】
それにもかかわらず、幹細胞特性または前駆細胞特性を有する細胞は、成熟肝細胞が増殖を妨げられる場合に、多数出現する。これらの細胞は、肝臓中で見出される成熟細胞型のいくらかまたは全てを、インビボで生じることが可能である。肝臓由来の細胞をインビトロで培養することが可能であるが、完全に分化した機能的な肝細胞の長期間の培養物を維持することの成功には限界がある。培養された肝細胞は、成熟肝細胞の表現型の特定の局面を失う傾向にある。この特徴は、Ｂ型肝炎ウイルス（これは、成熟肝細胞中で複製する）のような肝臓向性ウイルスを研究するための細胞培養系の開発を妨げる。さらに、これは、組織の操作（例えば、人工肝臓）、細胞移植治療、および遺伝子治療のような医学的適用における肝臓由来細胞の有用性を制限する。
【０１５０】
中枢神経系とは異なり、肝臓は、組織の切除のために容易にアクセスできる器官を代表する。肝臓の生来有している再生能力、および正常な肝臓クラスターの画分でさえ、体の必要性を満たすことができるという事実は、肝臓がインビトロでの培養および医学的適用（必ずしも肝臓に関係している状態の処置には限定されない）のための細胞の便利な供給源として作用し得ることを示唆する。
【０１５１】
本発明は、幹細胞および前駆細胞の細胞生物学の分野での研究、ならびに生物学的材料の分野での技術および研究の収束を示す。新しい生物学的材料（特に、細胞の増殖、分化、および生物学的機能について許容性の材料として作用する生物学的に適合性である材料）の開発は、医学的技術の進歩、および細胞の基本的な生物学的特徴を理解するのための広範囲を意図する。本発明者らは、イオン性の自己相補的ペプチドの自己アセンブリによって作成される生体材料のクラスを以前に記載した（Ｚｈａｎｇ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０、３３３４−３３３８、１９９３；Ｚｈａｎｇ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１６、１３８５−１３９３、１９９５；米国特許第５，９５５，３４３号および同第５，６７０，４８３号）。これらの材料はヒドロゲルであり、これは特定の実施形態においては、約９９％またはそれ以上の水分含有量を含む。これらは、十分なイオン濃度へと曝されると、膜または三次元構造へと自己アセンブルする。自己アセンブリの際にこれらによって形成されるペプチドおよび構造の配列、特徴、および特性を、さらに本明細書中で記載する。
【０１５２】
本発明者らは、これらのペプチド構造が、細胞をこの構造の表面上で培養した場合に、細胞の接着、生存性、および増殖を支持することができることを示した。さらに、この構造（本明細書中で足場とも呼ぶ）は、その表面上でニューロンを増殖させた場合には、神経突起の成長およびシナプス形成のための基材として作用することが可能である（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（１２）、２０００）。さらに、本発明者らは、ペプチドヒドロゲル内に細胞をカプセル化し、これによってペプチド構造内の三次元配置中に細胞を入れることが可能であること、および、そのようにカプセル化される場合には、細胞が生存性および機能を維持することを示した（係属中の、２００１年２月６日に出願された、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題した、米国特許出願番号第０９／７７８２００号を参照のこと）。本発明者らは、例えば、ペプチド構造内にカプセル化された軟骨細胞が、本明細書中に記載するように、細胞外マトリックス成分を合成することができることを示した。
【０１５３】
細胞の可塑性の現象をさらに調査するため、およびインビトロでの前駆細胞の分裂、分化、および分化転換を調節および制御する方法を開発するために、本発明者らは、これらのパラメーターについてペプチドヒドロゲル構造内でのカプセル化の効果を試験することを決定した。本発明者らは、このペプチド構造が、カプセル化された細胞の分化および分化転換を促進することができるという、このペプチド構造の新規のそして予想しなかった特性をここで発見した。このペプチド構造は、これらが標準的な培養条件下で応答しないか、またはこのような因子に対する細胞の分化応答を変更する、分化促進因子による指示に、前駆細胞が従うようにすることができる。
【０１５４】
体細胞（ＬＰＣ）を、本明細書中で記載するように肝臓から単離し、そして種々の培地中で、そして異なる増殖因子の存在下で、三次元ペプチド構造（ペプチドヒドロゲル）中で培養した。これらの細胞によって示される細胞の可塑性に起因して、これらを「肝臓前駆細胞」（ＬＰＣ）と呼ぶ。名称ＬＰＣを、起源の組織を示すように選択したが、それらの分化および／または自己再生能力についての予想を限定するわけではない。ペプチドヒドロゲル構造を、以下にさらに詳細に記載する。以下にさらに詳細に示すように、ペプチドヒドロゲルは、その中で培養された細胞によって採用される表現型および分化経路を変更した環境を提供した。例えば、伝統的なプラスチック培養皿上で培養した場合には、ラット肝臓前駆細胞は、一様な平坦な形態を維持し、そして機能的な肝細胞には十分には分化しない。このような細胞は、成熟肝細胞によって産生される酵素であるチトクロームＰ４５０１Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）の有意な量を発現することができない。対照的に、三次元ペプチドヒドロゲル中で培養したラット肝臓前駆細胞は、特定の培養条件下で成熟肝細胞の挙動を想起させる、球状クラスターを形成するように分裂する。さらに、ヒドロゲル中で維持された細胞の一部は、ＣＹＰ１Ａ１を発現する。
【０１５５】
この現象をさらに研究するために、ペプチドヒドロゲル中の細胞を、規定された肝細胞増殖培地に切り替えた。驚くべきことに、培地交換後２４時間までに、相当の割合の細胞が、細胞形態において劇的な変化を獲得し、未発達の突起を有する非常に長くなった細胞体を示した。これらの細胞の表現型は、ニューロン系統の表現型と似ていた。神経系統の細胞の特徴である種々のマーカーについての染色はさらに、細胞が非肝細胞経路に沿って発達したことを示した。結果は、これらの細胞がニューロン前駆体の特徴を有するという結論と一致した。ニューロン様の表現型の獲得は、培養培地中の種々の増殖因子（ＥＧＦまたはＥＧＦ／ＮＧＦ）の存在に依存し、そして細胞を同一の培地中でプレート上で培養した場合には生じなかった。従って、ヒドロゲル内では、肝臓前駆細胞は、肝細胞様の経路および正常な肝細胞によってとられるものとは異なる経路の両方で、分裂および分化するように指示される。従って、ペプチドヒドロゲル構造内でのカプセル化は、細胞を種々の増殖因子による指示に従うようにする。ＥＧＦまたはＥＧＦ／ＮＧＦのいずれかの存在下では、ペプチドヒドロゲル構造内で培養した肝臓前駆細胞は、肝細胞様系統に沿って分化し、そしてニューロン系統に沿って分化転換する能力を示した。柔寒天中で増殖させた細胞は増殖しなかったか、または肝細胞様の表現型もしくはニューロン様の表現型のいずれかを示した。このことは、三次元中の細胞の単なる配置では、これらの効果を可能にするためには十分ではないことを示唆している。
【０１５６】
本明細書中で示したデータは、ペプチドヒドロゲルを含有している三次元ナノスケール環境が、肝細胞前駆体、肝臓の幹細胞、肝細胞、および卵型細胞の特性を有している細胞の増殖および分化を支持することができることを示す。さらに、ヒドロゲルは、神経系統の細胞の特性を有している細胞の増殖、分化転換、および分化を支持することができる。これらのような細胞型は、広範囲の種々の体内の三次元環境に存在する。従って、ヒドロゲルは、広範囲の細胞型（例えば、体内の種々の異なる三次元環境に存在し得る細胞型）の増殖、分化転換、および／または分化を支持することができる。このような細胞には、肝臓組織に由来する細胞および神経組織に由来する細胞が含まれる。
【０１５７】
従って、本発明は、前駆細胞および増殖因子のような分化促進因子をカプセル化しているペプチドヒドロゲル構造を含有している組成物を提供する。分化促進因子は、この構造が培養される培地中に存在し得るかまたはそれに添加され得る。特定の実施形態においては、前駆細胞は、肝臓前駆細胞（すなわち、完全に分化した肝臓特異的表現型は発現しないが、適切な条件下で、肝臓特異的細胞形態をとりそして／または肝臓特異的細胞の特徴であるマーカーを発現する細胞を生じる能力を有する細胞）である。特定の実施形態においては、肝臓前駆細胞を肝臓から単離する。特定の他の実施形態においては、肝臓の前駆細胞を、例えば骨髄のような別の器官から単離し得る。
【０１５８】
本発明はさらに、細胞の分化を促進するための方法を提供する。この方法は、ペプチドヒドロゲル構造内に前駆細胞をカプセル化する工程、および増殖因子のような１種以上の分化促進因子の存在下で、カプセル化された細胞を、分化または分化転換を生じさせるために十分な時間の間培養する工程を包含する。特定の実施形態においては、前駆細胞は、肝臓の前駆細胞である。分化または分化転換のプロセスは、細胞内でか、またはその細胞の子孫もしくは末孫内で生じ得る。分化は、例えば、肝細胞様の表現型の方向へと、肝臓特異的系統の経路に沿う場合がある。分化転換は、ニューロン前駆体、ニューロン、またはグリア細胞の方向へと、ニューロン様の経路に沿う場合がある。他の実施形態においては、前駆細胞は、以下の細胞型の１つについての前駆細胞である：軟骨細胞、心臓細胞、骨髄細胞、骨膜（ｐｅｒｉｓｔｅａｌ）細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞。分化転換および分化の両方が、カプセル化された細胞の子孫の間で生じ、そしてペプチド構造内の異なる細胞は、異なる系統の経路に沿って分化転換し得る。
【０１５９】
本発明者らは、ペプチド構造がそれらの効果を発揮する正確な機構を未だ同定しておらず、そしていかなる理論にも束縛されることは望まないが、本発明者らは、体系的に調査し得る多数の可能性、ならびに本明細書中に記載する発見および発明をさらに精密にしそして拡張するために変化され得るパラメーターを提起する。例えば、ペプチドの配列、長さ、および濃度を変化させ得る。これらは、順番に、剛性、酸素張力、ゲルと接触している細胞表面の画分、および／または構造内の増殖因子の勾配に影響を与え得る。全てのこのような改良および改善が、本発明の範囲内にある。
【０１６０】
以下のセクションでは、細胞分裂および表現型に対する種々の効果を達成するために、ペプチド構造、本発明の実施において使用し得る細胞、本発明のペプチド構造内に細胞をカプセル化する方法、およびペプチド構造内またはペプチド構造上で培養された細胞の状況で使用し得る本発明の培養技術を含む本発明の種々の局面を扱う。細胞分裂および表現型に対するペプチド構造および培養条件の影響をモニターするための方法をもまた示す。本発明の実施形態には、以下が存在する：（ｉ）幹細胞および前駆細胞、ならびにそれらの分化特性および分化転換特性を研究するための、インビトロの培養系；（ｉｉ）肝細胞様細胞および／または成熟肝細胞を増殖させるためのインビトロでの培養系（これは例えば、肝臓向性ウイルスを増殖させるために使用され得る）；（ｉｉｉ）細胞が抽出され得、次いでインビトロで維持されるかまたは被検体に投与されるかのいずれかであり得る、インビトロでの細胞の分化および分化転換を制御および操作するための系；ならびに（ｉｖ）被検体内に移植されるべき構造内で、インビトロでの細胞の分化および分化転換を制御および操作するための系。細胞培養キットおよびアッセイ系のような本発明の種々の他の実施形態もまた、記載される。
【０１６１】
（カプセル化および／または分化のための例示的な細胞型）
あらゆるタイプの前駆細胞が、本発明での使用に適切である。これらの細胞の供給源にはまた、胎児または成体の哺乳動物、あるいは確立された細胞株も含まれ得る。多数の確立された細胞株が当該分野で公知であり、それらの多くは、これらの細胞株を記載している参考文献をもまた提供するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）を通じて入手することができる。細胞、前駆細胞、幹細胞、および細胞株の議論においては、句「由来する」は、細胞が特定の供給源から得られること、または細胞がその供給源から得られた細胞の末孫であることを示す。例えば、肝臓由来の細胞は、肝臓から得られる細胞であるか、あるいはそのような細胞の子孫または末孫である。用語「子孫」が本明細書中で使用される場合は、これは、細胞分裂の中間産物だけではなく、引き続く細胞分裂の産物、すなわち、特定の細胞の末孫である細胞をもまたいう。細胞株に由来する細胞は、その細胞株のメンバーであるか、あるいはその細胞株のメンバーである細胞の子孫または末孫である。器官、組織、個体、細胞株などに由来する細胞は、それを得た後にインビトロで改変され得る。このような細胞は、なお、もとの供給源に由来すると考えられる。
【０１６２】
これらの実施例は、肝臓の前駆細胞の単離およびカプセル化を記載するが、本発明は、そのような実施形態に限定されない。幹細胞および前駆細胞は、広範囲の種々の組織中に存在することが公知である（例えば、上記で引用されている参考文献を参照のこと）。細胞は、任意の体組織、器官、または構造から得られ得る。従って、細胞は、例えば、脳、神経組織、骨髄、食道、輸卵管、心臓、膵臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膀胱、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、または子宮に由来し得る。胚性幹細胞を使用し得る。上記で議論したように、成熟肝細胞および他の成熟した肝臓の細胞型は、分裂しそして同じタイプの娘細胞を生じることができる。しかし、肝臓の幹細胞または肝臓の前駆細胞の存在、正体、および起源、ならびに肝臓の再生におけるそれらの役割は、不明なままである（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｂ，ら、「Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｏｖａｌ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４、１９９９年５月１４日；Ｐａｋｕ，Ｓ．，ら、「Ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｏｖａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｌｉｖｅｒ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５８（４）、２００１を参照のこと）。本明細書中に記載するように、肝臓の前駆細胞は、都合の良いことに、ラットの肝臓から回収し得る。ヒトの場合は、肝臓細胞を外科的に、または侵襲性の肝臓生検技術を使用して回収し得る。肝臓の前駆細胞は、肝臓中に残っている細胞の混合された集団から単離し得る。骨髄はおそらく、広範囲の分化転換能力（すなわち、複数の異なる細胞型に分化する能力）を有している前駆細胞の良好な供給源である。従って、本発明は特に、骨髄由来の前駆細胞の使用を意図する。
【０１６３】
個体から回収した細胞を、培養物中での増殖期間を伴ってかまたはそれを伴わずにかのいずれかで使用し得る。あるいは、安定な細胞株として培養物中で増殖させた細胞を使用し得る。特定の実施形態においては、これらの細胞は、自己由来であるかまたは同種異型である。特定の実施形態においては、細胞を、被検体（例えば、患者）から回収し、そしてクローン細胞株は、１つ以上のこれらの細胞に由来する。前駆細胞のクローン株（体性組織幹細胞を含む）は、限界希釈プレーティングまたは単一細胞の分離によって獲得し得る。クローン細胞株を誘導するための方法は当該分野で周知であり、そして例えば、以下に記載されている：Ｐｕｃｋ，Ｔ．Ｔ．およびＭａｒｃｕｓ，Ｐ．Ｉ．Ｊ．（１９５６）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０３、６５３；Ｎｉａｓ，Ａ．Ｈ．Ｗ．およびＬａｊｔｈａ，Ｌ．Ｇ．（１９６５）「Ｃｌｏｎｅ  ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｎｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃ．Ｖ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ編（Ｗ．Ｊｕｎｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ博士、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ならびにＬｅｏｎｇ，Ｐ．−Ｍ．，Ｔｈｉｌｌｙ，Ｗ．Ｇ．，およびＭｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｓ．（１９８５）Ｖａｒｉａｎｃｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ  ａｔ  ４  ｇｅｎｅ  ｌｏｃｉ。細胞株由来の細胞を、本発明の実施において使用し得る。特定の患者の処置について意図される場合は、適合するドナー由来の細胞を、有利に使用し得る。個体から単離された細胞、または細胞株として維持された細胞は、本発明での実施におけるそれらの使用の前に、標準的な細胞培養技術を含む任意の適切な技術に従って培養され得る。
【０１６４】
本発明でのそれらの使用の前に、細胞を遺伝的に改変することが所望される場合がある。細胞中に外因性の遺伝物質を導入するための多数の方法が、当該分野で周知である。特定の実施形態においては、細胞に選択マーカーを導入することが所望され得る。特定の実施形態においては、選択マーカーをコードする遺伝子（例えば、薬物耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子）、または検出マーカー（例えば、ＧＦＰ）をコードする遺伝子を、組織特異的プロモーターの制御下に導入することが、所望され得る。次いで、検出マーカーの発現を、細胞またはその子孫がその組織に特徴的である特定の細胞系統の経路に沿って分化したかまたは分化転換したかどうかを決定するための手段として、使用し得る。マーカーはまた、特定の経路に沿って分化または分化転換した細胞の単離手段（例えば、免疫学的方法、ＦＡＣＳなどを使用することによって）としても使用することができる。このような他の方法は、当該分野で周知である。多数の選択マーカーおよび検出マーカーが、当該分野で公知である。さらに、組織特異的、器官特異的、および系統特異的プロモーターが周知である。遺伝子は、構成的または誘導性のいずれかのプロモーターの制御下に導入され得る。そのようなプロモーターの多くが当該分野で公知である。
【０１６５】
特定の実施形態においては、治療上所望される遺伝的改変が行われ得る。例えば、個体が特定の遺伝子中に変異を有している場合は、遺伝子治療の目的のために前駆細胞中に遺伝子の野生型コピーを導入することが所望され得る。このアプローチは、特定の肝臓疾患の場合に特に有用であり得る（例えば、これらの疾患のいくつかの議論については、Ｇｒｏｍｐｅ，Ｍ．、「Ｌｉｖｅｒ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．，２４、２３１−２４４、２００１を参照のこと）。特定の実施形態においては、細胞が増殖因子に応答することを可能にすることによって、特定の分化能力または分化転換能力を与えるかまたはそれを増大させるために、特定のレセプター（例えば、増殖因子レセプター）をコードする遺伝子を導入することが所望され得る。
【０１６６】
特定の実施形態においては、前駆細胞について富化させることが所望される。種々の富化方法が使用され得る。例えば、特定のマーカーの存在が、それらが前駆細胞としては適格ではない時点に分化したかまたはその時点に達した細胞を除去するかまたはそうでなければ排除するために、使用され得る。細胞を除去または細胞を分類するための技術は、当該分野で周知であり、そしてこれには、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）の使用および特定の細胞型を認識する抗体を使用する種々の他の方法が含まれる。
【０１６７】
特定の実施形態においては、２００１年７月１０日に出願された、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」と題された米国仮特許出願（本発明者らのうちの一人（Ｊａｍｅｓ  Ｓｈｅｒｌｅｙ博士）が共同発明者である）に詳細に記載されているように、非対称の細胞動態が抑制されている細胞を使用することが所望され得る。非対称性の細胞動態の抑制（ＳＡＣＫ）は、幹細胞が別の幹細胞およびより完全に分化した細胞の両方を生じる条件下で必然的に生じる、希釈を伴わない幹細胞集団の増殖を可能にする。この技術は、個体または細胞株から回収された細胞に適応され得る。クローン細胞株は、ＳＡＣＫが適応されている細胞から確立され得る。
【０１６８】
（前駆細胞の分化を促進する分化促進因子および試薬）
当該分野で周知であるように、多数の環境因子が、細胞の分化および分化転換において重要な役割を果たすようである。これらには、圧縮力、基質との接触などのような、物理的または機械的な因子が含まれ得る。細胞外マトリックスは、細胞の発達に重大な効果与えることが公知である。さらに、細胞−細胞接触が重要な役割を果たし得る。さらに、多数の特異的増殖因子および／または分化因子が記載されている。これらには、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インシュリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）などがある。上記のリストは、単なる代表例である。２０００を超える増殖因子が同定されており、そして当業者は所望される分化または分化転換の特性に基づいてこれらの因子を適切に選択しそして試験することができる。増殖因子は、純粋な形態で、または血清のようなより複雑な生物学的混合物の成分として、提供され得る。増殖因子は、その中で細胞がカプセル化され、そして／またはそれ自体の構造の中にカプセル化され得る、ペプチドヒドロゲル構造の培養培地中に存在し得る。さらに、種々の濃度の特定の増殖因子が、標的細胞に対して種々の作用を発揮し得ることが、当該分野で周知である。当業者は、所望される効果を達成するために、濃度の範囲および組み合わせを試験し得る。
【０１６９】
増殖因子に加えて、種々の他の化学的刺激、または条件は、細胞の分化または分化転換に影響を与え得、そしてこれらの任意のものが、本発明の状況で使用され得る。このような刺激の中には、ホスファチジルイノシトール経路の活性化因子、またはイノシトール３リン酸のレベルおよび／もしくは細胞内Ｃａ濃度を増大させる他の因子、プロテインキナーゼＣおよび／もしくは他の細胞性キナーゼの活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）などがある。小さい有機分子または金属イオンを含む低分子の存在もまた、細胞の分化または分化転換に影響を与え得、そして本発明の実施において使用され得る。
【０１７０】
（細胞分裂および表現型をモニターするための方法）
当該分野で周知であるように、細胞分裂をモニターし、そして細胞の挙動および表現型の種々の局面を評価するための多数の方法が存在する。一般的には、任意の適切な方法が、本明細書中に記載されるペプチド構造中またはその上での培養細胞の影響を研究しそして評価するために使用され得る。さらに、細胞／ヒドロゲルアセンブリの全体の組成および特性に対する細胞の影響がモニターされ得る。タンパク質含有量、強度などのような特徴が試験され得る。
【０１７１】
細胞の生存性は、生命維持に必要な色素の排除を試験すること（例えば、トリパンブルー排除法）によって評価され得る。細胞分裂は光学顕微鏡によって観察され得、そしてこれは、有糸分裂の形状の存在によって示される。ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質合成はまた、当該分野で周知の技術によって測定され得る。分裂に伴う細胞数の増大はまた、例えば、血球計での計数によって観察され得る。細胞が丸くなることのような形態学的変化もまた、分裂に伴い得る。ＤＮＡ合成は、放射標識ヌクレオチド（例えば、３［Ｈ］チミジン）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）などの種々の基質の、ＤＮＡへの取り込みを検出および／または測定することによってモニターされ得る。
【０１７２】
細胞の分化および分化転換は、形態学を含む多数のパラメーターに基づいて評価され得る。細胞の分化および分化転換はまた、遺伝子発現をモニターすることによって（例えば、ノーザンブロット分析、マイクロアレイ分析などによってｍＲＮＡを検出および／または測定することによって）、あるいは、マーカーとして一般的に公知である特定のポリペプチドの存在を検出および／または測定することによって、評価され得る。後者のアプローチは広範囲で使用されており、そして多数の異なる細胞型の特徴であるマーカーが同定されている。いくつかの場合には、このようなマーカーが、限られた数の細胞型の１つに属する細胞を同定するが、正確な細胞型を唯一同定することはない。他の場合には、マーカーの存在は、特定の細胞型であってそして他ではない細胞を同定すると考えられる。細胞型の同定を可能にすることに加えて、特定のマーカーは、特定の特徴または機能的な能力を欠失しているかまたはそれを有している細胞（例えば、有糸分裂後の細胞）の特徴である。
【０１７３】
種々のマーカーはすばらしく、そして新規のマーカーが日常的に同定されている。本発明の状況において特に意味があることは、成熟した肝臓の特徴である細胞型へ分化または分化転換し得る細胞を同定するために使用され得るマーカー、およびそのような細胞へと分化した細胞を同定するために使用され得るマーカーである。また、本発明の状況において特に意味があることは、ニューロン系統の経路（すなわち、ニューロンまたはグリア細胞の産生を最終的に生じる経路）に沿って分化または分化転換し得る細胞を同定するために使用され得るマーカーである。肝臓の前駆細胞について、および成熟した肝臓で見いだされる細胞に対する種々のマーカーが当該分野で公知であり、そして例えば、Ｇｒｉｓｈａｍ，Ｊ．およびＴｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ，Ｓ．，「Ｌｉｖｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」、Ｐｏｔｔｅｎ，Ｃ．（編）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９７記載されている。肝臓細胞系統に沿った分化を評価するために適切なマーカーの選択には、以下が含まれる：胚性肝臓細胞および卵細胞（ｏｖａｌ  ｃｅｌｌ）マーカーである、α−フェトプロテイン（Ｓｈｉｏｊｉｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１、２６１１−２６２０、１９９１）；肝細胞および卵細胞マーカーである、アルブミン（Ｈｏｕｓｓａｉｎｔ，Ｅ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．９、２６９−２７９、１９８０）；種々のチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ａ２を含む（非特異的ではあるが、肝細胞中に存在する））；Ｃ／ＥＢＰα（肝細胞および他の内皮組織中で高度に発現される、ＣＣＡＡＴによって促進される結合タンパク質）（Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９、１１０８−１１１２、１９９５）；全ての肝細胞（肝細胞、胆管、および卵細胞）についてのマーカー、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）（Ｖａｎ  Ｅｙｋｅｎ，Ｐ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５９、５２−５９、１９８８）；ならびに特異的胆管マーカーサイトケラチン１９（ＣＫ１９）（Ｂｏｕｗｅｎｓ，Ｌ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３、１２７９−１２８３、１９９４）。ニ核細胞の存在は、肝細胞の指標である。ニューロン系統の細胞についての種々のマーカーが、Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６１：３６４−３７０、２０００において、そしてＭａｈｅｎｄｒａ  Ｓ．Ｒａｏ（編）Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＣＮＳ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００１で言及されている。中でも、ニューロン系統の経路に沿った分化または分化転換を評価するために適切なマーカーは、ネスチン、ＧＦＡＰ、およびＮｅｕＮである。これらのマーカーが、以下でさらに議論される。
【０１７４】
ネスチンは、神経上皮のニューロン前駆体幹細胞で発現される、中間径フィラメントタンパク質であり、そしてその発現は、ニューロンの成熟に伴って減少する（Ｌｅｎｄａｈｌ，Ｕ．ら、「ＣＮＳ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｃｅｌｌ、６０：５８５−５９５、１９９０）。ＮｅｕＮは、有糸分裂後の細胞で発現されるニューロン特異的マーカーである（Ｓａｒｎａｔ，Ｈ．ら、「Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＮｅｕＮ）：ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍｕｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０：８８−９４、１９９８）。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、伝統的なグリア星状細胞のマーカーである。これらのマーカーは、本発明の特定の実施形態の適用可能性を実証するために使用されている。ニューロン系統の細胞についての多数の他のマーカーが、当該分野で公知である。
【０１７５】
（分化を促進するためのキットおよび方法）
本発明は、細胞の分化および／または分化転換を促進するために使用され得るキットを提供する。このキットは、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供され得る、本発明のペプチドヒドロゲルを備える。このキットはさらに、１つ以上の、以下のエレメントを含み得る：ペプチドヒドロゲル構造中に細胞をカプセル化するため、およびシステムの他の用途についての説明書、足場内で細胞が分化または分化転換するように誘導するための説明書、カプセル化が行われ得る容器、ペプチドが溶解させられ得る液体、ペプチドの自己組み立てを開始するための電解質、組織培養のための培地、カプセル化され得る細胞、分化促進因子など。さらなるエレメントもまた含まれ得る。
【０１７６】
さらに、本発明は、化合物を試験するためのアッセイシステムおよび方法を提供する。肝臓は、薬物を含む広範囲の外来化合物および内因性化合物を代謝する主要な器官であるので、肝臓に対するこのような化合物の作用（例えば、肝臓の酵素を誘導するそれらの能力、およびそのような薬物を代謝する肝臓の能力）を決定することは非常に重要である。伝統的なこのような評価は、最初に、ミクロソームのようなインビトロシステム、またはインビボの動物モデルを使用して行われている。しかし、これらのアプローチは、かなりの欠点を有する。ミクロソームシステムは、細胞膜バリア、またはインタクトな細胞の他の特徴の見込みのある作用を含む試験を可能にしない。動物モデルは、使用するためには高価であり、そして時間がかかる。さらに、動物の肝臓細胞は、例えば、種々のチトクロームＰ４５０プロフィールに起因して、ヒトの肝臓細胞とは異って化合物を代謝し得る。インビトロで肝細胞を培養することの難しさは、細胞に基づくアッセイシステムの開発を阻む。
【０１７７】
本発明は、肝臓の前駆細胞（ヒト以外の動物、またはヒト）をカプセル化しているペプチドヒドロゲル構造を含有している化合物についてのアッセイシステムを提供する。ここでは、肝臓の前駆細胞は、肝細胞経路に沿って分化するように誘導されており、そしてチトクロームＰ４５０酵素のような代謝酵素の発現のような、成熟肝細胞の特徴を示す。本発明に従うと、化合物がこのシステムに適用され、そして種々のパラメーターが試験される。例えば、カプセル化された細胞の化合物を代謝する能力が、試験され得る。Ｐ４５０酵素を誘導するかまたは阻害する化合物の能力は、例えば、蛍光またはそうでなければ本明細書中に記載されているような便利に検出可能な基質を使用して、評価され得る。他の肝臓のパラメーター（例えば、アルブミン、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼなどのタンパク質の合成）に対する化合物の作用が評価され得る。正常な肝臓によって合成される広範囲の種々のタンパク質を測定するための方法は、当該分野で周知である。多くの薬物および他の外来化合物が、肝臓の酵素を誘導または阻害することが公知であり、そしてこのような作用は、薬物の開発に関する有意な安全性の懸念を示す。肝臓の酵素に対する新規の医薬品候補の作用を試験することが、所望される。本発明は、インビトロでこのような試験を行う方法を提供し、これは、新規の薬物候補、薬物相互作用などによって示される危険の可能性を予想するために、使用され得る。
【０１７８】
（ペプチドヒドロゲル中の成体ラットの肝臓前駆細胞のカプセル化）
以下に記載する方法を、ペプチド足場に成体ラットの肝臓前駆細胞をカプセル化するために使用した。これらの方法は、任意の他の細胞型に適用し得る。
【０１７９】
（ラットの体性肝臓前駆細胞による方法）
肝臓前駆細胞の単離および調製は、２００１年７月１０日に出願された、米国特許仮出願「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｘ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」に詳細に記載されている。本発明者らのうちの一人（Ｊａｍｅｓ  Ｓｈｅｒｌｅｙ博士）が共同発明者である。簡潔には、キサントシン（Ｘｓ）を、組織幹細胞によって通常示されるデフォルト非対称動態からの指数動態へのスイッチを可能にする薬理学的試薬として使用した。キサントシンを除去した場合に、非対称の細胞動態によって分裂する能力を保持している、クローンであるラットの肝臓上皮幹細胞株を単離した。インサイチュでコラゲナーゼを灌流した肝臓から遠心分離した細胞の低速での上清中で見出したラットの肝臓上皮細胞を、Ｘｓの非存在下または存在下での限界希釈クローニングによって単離した。この作業で使用した細胞株（本明細書中の別の場所、および上記の仮特許出願において、ＬＰＣ−８，ＬＰＣ−８．１（ＬＰＣ−８のサブクローン）、またはＸｓ−Ｄ８、またはＤ８と呼ばれる）は、現在、８０倍を超える細胞の倍加のために、培養物中で継続して維持されている。初期の継代細胞を液体窒素中で凍結保存し、そして融解後に培養物に再建し得る。
【０１８０】
（ＬＰＣ−８細胞のカプセル化のための方法）
細胞を、１０％の透析したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭを用いて、プラスチックの培養皿中で維持した。細胞が８０％のコンフルエンスに達した場合、それらをトリプシンでの処理によって回収した。細胞懸濁物を、ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐで洗浄し、次いで１０％スクロースの水溶液中に再懸濁した。細胞を、血球計を使用して計数した。
【０１８１】
ＲＡＤ１６−Ｉペプチド（配列ＡｃＮ−ＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡＲＡＤＡ−ＣＮＨ２）［理論上のＭＷ＝１７１２．７４、および質量スペクトルによるＭＷ＝１７１２．６４］を、ＲｅｓＧｅｎ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。ＲＡＤ１６−Ｉペプチド溶液を、脱イオン化し、蒸留し、滅菌した水中に０．５％ｗ／ｖの濃度でペプチドを溶解させることによって調製した。ＲＡＤ１６−Ｉ溶液を、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で１×の最終濃度になるように平衡化し、その後、生理学的範囲のｐＨを生じるように細胞懸濁物と混合した。
【０１８２】
細胞を、ＲＡＤ１６−Ｉ溶液と、約１００，０００細胞／ｍｌの最終濃度で混合した。細胞／ペプチド混合物を、５０μｌ／ウェルでマルチウェル（９６ウェル）プレートに充填した。充填の直後、２００μｌの培養培地（ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）をそれぞれのウェルに添加し、それによって、ゲルの三次元構造への自律的な組み立てを可能にするために十分な電解質濃度を提供した。ゲルの自律的な組み立て後、培地を３回から４回交換して、細胞／ヒドロゲルアセンブリを適切な平衡にした。最終的な細胞密度は、ヒドロゲルの１〜２×１０５細胞／ｍｌの間であった。マルチウェルプレートを、５％のＣＯ２で平衡化した加湿チャンバーを備える標準的なインキュベーター中で３７℃で培養した。細胞の生存性を、標準的な技術に従って、トリパンブルーでの染色によって測定した。カプセル化の２４時間後の生存性は、典型的には８５％より大きかった。
【０１８３】
（コントロールの細胞）
ＬＰＣ−８．１細胞のコントロール培養を、細胞／スクロース懸濁物の一部を使用してカプセル化と同時に開始した。細胞を、ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中でのプラスチック製の培養皿上で、５％のＣＯ２で平衡化した加湿チャンバーを備える標準的なインキュベーター内で３７℃で維持した。細胞の生存性を、標準的な技術に従ってトリパンブルーでの染色によって測定した。プレーティングの２４時間後の生存性は、典型的には９０％より大きかった。  
【０１８４】
ＬＰＣ−８細胞をまた、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で、組み立てたＲＡＤ１６−Ｉヒドロゲルでコーティングしたプレートの表面上で増殖させ、そして５％のＣＯ２中で３７℃で維持した。
【０１８５】
柔寒天中のＬＰＣ−８培養物をまた、標準的なプロトコールに従って調製した。
【０１８６】
（ＢｒｄＵ染色方法）
組み立てたペプチドヒドロゲル内での細胞分裂を、５’−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みをモニターすることによって評価した。ＢｒｄＵを、１８時間の期間にわたって１０μＭの最終濃度で培養培地に添加した。インキュベーション後、ヒドロゲル培養物を、２時間、ＢｒｄＵを含まない培地中でインキュベートした。次いで、ヒドロゲルをＰＢＳ中で洗浄し、続いて２時間、室温で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２％のパラホルムアルデヒドで固定した。固定後、ヒドロゲルをＰＢＳ中で数回洗浄し、次いで室温で２時間、ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した。次いで、ＤＮＡ変性を行うために、ヒドロゲルをＰＢＳ中の２ＮのＨＣｌで３７℃で３０分間処理した。この処理後、ＰＢＳでの数回の洗浄を、洗浄溶液中のｐＨが７．４に達するまで行った。次いで、ヒドロゲルを、ゆっくりと震盪させながら室温で４時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の２０％のＦＢＳ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＤＭＳＯ）中でインキュベートした。
【０１８７】
ＦＩＴＣを結合体化した坑ＢｒｄＵマウスモノクローナル抗体ＩｇＧ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号３３２８４Ｘ）を、１：４００の希釈で室温で１時間、ブロッキング緩衝液中で予めインキュベートし、次いでゆっくりと震盪させながら４℃で一晩、サンプルに添加した。インキュベーション後、ヒドロゲルを２時間かけてブロッキング緩衝液で３回洗浄し、その後、ＰＢＳで最後の１時間の洗浄を行った。
【０１８８】
（光学顕微鏡および写真撮影方法）
コントロールの細胞およびヒドロゲルを、Ｈａｍａｍａｔｓｕビデオカメラを取り付けたＯｐｅｎｌａｂ獲得システムを使用して、位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡ＴＥ３００下で観察した。得られた写真は、位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて観察した１つの光学平面を示す。
【０１８９】
（結果）
カプセル化した細胞およびコントロールの細胞を、光学顕微鏡で毎日観察した。組み立てたペプチド構造の透明度によって、カプセル化した細胞の観察および写真撮影は容易に可能である。カプセル化の直後は、細胞は実質的には、グループまたはクランプの中ではなくむしろ単離された単一の細胞として、ゲルの隅々までにわたって均質に分散させられていた。図２２Ａは、カプセル化の直後のカプセル化されたＬＰＣを示し、これは均質な単一細胞の分散を示す。細胞が三次元で対称に分裂すると、これらはコンパクトなスフェロイドクラスターを形成する傾向にある。しかし、細胞分裂が非対称である場合には、最初のクラスターの１つの細胞のみが分裂するので、直線状のクラスターまたは時折は分枝したクラスターが形成される。図２２Ｂは、カプセル化の２日後のカプセル化したＬＰＣを示す。図２２Ｂに示すように、培養の最初の２日間に、カプセル化した細胞は小さい直線状のクラスターの形成を開始し、このことは、いくらか非対称な有糸分裂活性を示唆している。次の２〜３日にわたって、クラスターは伸長し、そして球形の形状をとる。図２２Ｃは、カプセル化の４〜５日後のスフェロイド形成を示す。
【０１９０】
ＲＡＤ１６−Ｉペプチドヒドロゲルでコーティングしたプレート上で培養した細胞は、プラスチック製プレートの表面上で直接培養したものと同様に挙動し、分裂し続け、そして分化またはクラスターの形成の証拠は示さない。クラスターの形成または細胞分裂の他の証拠は、柔寒天培養物中では観察できず、このことは、三次元環境のみでは細胞分裂が可能ではないことを示している。
【０１９１】
ＢｒｄＵの取り込みは、ペプチド構造中で生じたクラスター中の細胞の画分が活性に分裂していることを示した。図２２Ｄは、ＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みについての染色後の、図３ｃと同じスフェロイドを示す。クラスターは典型的には、約２０〜３０個の平均細胞数に達し、その時点では、クラスターの大きさのさらなる増大は観察されなかった。しかし、クラスターの中の１つまたは２つの細胞が、遅い速度で分裂し続ける可能性は、排除することができず、実際、クラスター中の全ての細胞がＣＹＰ１Ａ１についてポジティブでないという事実（以下に記載する）、ならびにクラスターがヒドロゲルから取り出され、そして細胞分裂に付随する形態学的変化を容易に観察できる平たい皿上にプレートした場合には、１つまたは２つの細胞が分裂し続けるという事実によって示唆される。
【０１９２】
（カプセル化された細胞の分化特性）
以下に記載するように、カプセル化した細胞の分化特性を評価した。
【０１９３】
（細胞培養方法）
細胞を、標準的なプラスチック製の培養皿中で培養し、そして先のセクションに記載したようにペプチドヒドロゲル中にカプセル化した。コントロールおよびカプセル化した細胞を最初に、同一の培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）中で、そして同一の培養条件下で維持した。一部の実験については、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で１週間培養した細胞を、定義された肝細胞増殖培地に移した（ＨＧＭ：Ｂａｓｅ  ｍｅｄｕｉｍ；Ｇｉｂｃｏ社製のＤＭＥＭ、＃１１０５４−０２０（５００ｍｌ）、０．０１５ｇのＬ−プロリン、Ｓｉｇｍａ＃Ｐ４６５５、０．０５ｇのＬ−オルニチン、Ｓｉｇｍａ＃Ｏ−６５０３、０．３０５ｇのナイアシンイミド、Ｓｉｇｍａ＃Ｎ−０６３６、０．５ｇのＤ−（＋）−グルコース、Ｓｉｇｍａ＃Ｇ−７０２１、１ｇのＤ−（＋）−ガラクトース、Ｓｉｇｍａ＃Ｇ−５３８８、１ｇのウシ血清アルブミン、ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、Ｓｉｇｍａ＃Ａ−９６４７；５００ｍｌの微量金属溶液：ＺｎＣｌ２；０．０２７２ｇ、ＺｎＳＯ４−７  Ｈ２Ｏ：０．０３７５ｇ、ＣｕＳＯ４−５  Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ、ＭｎＳＯ４：０．００１２５ｇ：１２．５ｍｌのＬ−グルタミン、最終濃度［５ｍＭ］、Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０−０８１、０．５ｍｌのインシュリントランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム、Ｒｏｃｈｅ＃１０７４５４７、０．４ｍｌのデキサメタゾン、最終濃度［０．１μＭ］、Ｓｉｇｍａ＃Ｄ−８８９３、５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（１００×溶液）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、最終濃度［２０ｎｇ／ｍｌ］、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ＃４０００１）。他の実験のために、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で１週間培養した細胞を、１％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐに移した。一部の実験については、ＬＰＣ−８．１細胞を、１０６細胞／３０ｍＬの密度でガラス製のスピナーフラスコ中にトリプシン化した細胞を再懸濁することによって、浮遊するスフェロイドを形成するように誘導した。
【０１９４】
（チトクロームＰ４５０  １Ａ１活性の評価）
２週間後、培養物を、その切断によって蛍光残基レソフリン（ｒｅｓｏｆｕｒｉｎ）（励起：５７４ｎｍ、発光：５９６ｎｍ）を生じる酵素の特異的基質である７−エトキシレソフリンの存在下でインキュベートした。このインキュベーションを、３７℃で３０分間行った。インキュベーション後、ヒドロゲルを培養培地で３回洗浄した。次いで、細胞を、Ｈａｍａｍａｔｓｕビデオカメラを取り付けたＯｐｅｎｌａｂデータ獲得システムを使用して、位相差および蛍光を用いる、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡ＴＥ３００下で観察した。得られた写真は、位相差および蛍光を用いて観察した単一の光学平面を示す。全ての実験について、複数のクラスターを観察し、そして結果は典型的な観察を示す。
【０１９５】
ＣＹＰ１Ａ１活性の定量的測定のために、７−エトキシレソフリン  Ｏ−デエチラーゼ活性（ＥＲＯＤ）を、以前に記載されているように培養上清中で測定した（Ｔｏｋｕｄｏｍｅ，Ｓ．、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．およびＫｕｒｏｉｗａ，Ｙ．、Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＹＰ１Ａ２  ｉｎ  ｍｅｘｉｌｅｔｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｂｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４６、５５−６２、１９９８）。簡潔には、２つのタイプの培養物を、０．１ｍＭの７−エトキシレソフリンの存在下で３０分間、３７℃でインキュベートした。その後、上清を回収した。生成物であるレソフリンの存在を蛍光定量的に測定した。標準（レソフリン）の既知濃度を、標準曲線を作成するために使用した。培養皿中およびペプチドヒドロゲル中の両方に存在している細胞の総数を、血球計を使用して決定した。ＥＲＯＤ活性を、レソフリン／細胞／時間のｐＭとして示した。約１００個のクラスターを分析した。
【０１９６】
（結果）
細胞が肝臓系統に分化していたかどうかを決定するために、完全に分化した肝細胞の特徴であるチトクロームＰ４５０  １Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）酵素活性を、視覚的、ならびにプラスチック製培養皿上で増殖させた細胞中、およびペプチドヒドロゲル構造内にカプセル化した細胞中での定量的アッセイの両方を使用して経時的に分析した。図２３Ａに示すように、標準的なプラスチック製培養皿上で単層として増殖しているＬＰＣは、プレーティングの２週間後では検出可能なＥＲＯＤ活性を示さなかった。対照的に、図２３Ｂに示すように、組み立てたペプチド構造中で同じ期間の間増殖させたスフェロイド中のＬＰＣは、細胞内で見られる赤色の染色によって示されるように、２週間で豊富なＥＲＯＤ活性を示した。試験した全てのスフェロイドが、ＥＲＯＤポジティブ細胞を含んだ。クラスター内のポジティブ細胞の割合は、約５０から８０％の間の範囲であった。
【０１９７】
カプセル化したＬＰＣ−８．１細胞の培養物中のＥＲＯＤ活性は、カプセル化の１日後には検出できなかったが、３日目までに劇的に増大し、７日目までに約０．１４ｐｍｏｌ／細胞／時間の最大に到達した。活性はその後わずかに減少したが、１５日目において約０．０８ｐｍｏｌ／細胞／時間で維持されていた。図２２Ｃは、カプセル化の２４時間後に開始した２週間の時間経過の間に組み立てたペプチド構造中で増殖しているＬＰＣスフェロイドのＥＲＯＤ活性を示すグラフである。グラフの傾きは、ＥＲＯＤ活性がカプセル化後２週間まででプラトーに達したことを示唆する。
【０１９８】
標準的な組織培養プレート上で増殖しているコントロール細胞を肝細胞増殖培地に移すことは、ＥＲＯＤ活性には影響を与えなかった。これは、ＨＧＭ中での１週間の培養後、本質的には検出不可能なレベルのままであった。対照的に、カプセル化した細胞をＨＧＭへ移すことによって、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で維持したカプセル化した細胞中のＥＲＯＤ活性のレベルと比較して、培養の１週間後のＥＲＯＤ活性において３から４倍の増大を生じた。カプセル化した細胞をＨＧＭに移すことはまた、以下の節に記載するように、細胞の１つの画分において細胞形態の劇的な変化を生じた。ＥＲＯＤ活性をまた、血清枯渇条件（１％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ）下で標準的な組織培養皿上で増殖させたＬＰＣ−８．１細胞中で、そして浮遊しているスフェロイドを形成するように誘導したＬＰＣ−８．１細胞中で試験した。血清を枯渇させた細胞および浮遊しているスフェロイドを形成した細胞中のＥＲＯＤ活性は、プレーティングの１週間後に測定した場合には、極端に低いレベルにとどまった。図２２Ｄは、これらの種々の培養条件下で維持したＬＰＣ−８．１細胞の比較ＣＹＰ１Ａ１活性のデータをまとめるグラフである：低い（１％）の血清の濃度を有している（血清枯渇）プラスチック製の皿上の単層；高密度の液体培養物中でＬＰＣを増殖させることによって得たスフェロイド培養物；１０％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ中で増殖させた組み立てられたペプチド構造中のスフェロイド培養物；ＨＧＭ中で増殖させた組み立てられたペプチド構造中のスフェロイド培養物。
【０１９９】
本発明者らが知る限りでは、このＬＰＣ−ペプチドヒドロゲルシステムは、培養物中での長期間の増殖後に分化特性を残しているクローンの幹細胞による分化転換についての最初に記載されたインビトロモデルである。
【０２００】
（ペプチドヒドロゲル構造中にカプセル化された細胞に対する成長因子（増殖因子）の作用）
以下に記載するように、カプセル化された細胞の分化に対する成長因子（増殖因子）の作用をもまた決定した。
【０２０１】
（細胞および細胞培養方法）
ＬＰＣ−８．１細胞を、上記のＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中、または肝細胞増殖培地中のいずれかで増殖させた。一部の実験については、２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度の表皮成長因子（ＥＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号：２３６−ＥＧ−２００）、５ｎｇ／ｍＬの最終濃度のラットのβ−神経成長因子（β−ＮＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号：５５６−ＮＧ−１００）、および１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号：１２０−ＨＤ−００１）を、培地（ＤＭＥＭまたはＨＧＭのいずれか）に添加した。
【０２０２】
Ｐ１９およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇを参照のこと）に以前に記載されているような標準的なプロトコールに従って培養した。ニューロン／グリア細胞への分化を誘導するためのＰ１９細胞のレチノイン酸処理を、以前に記載されているように行った（Ｂａｉｎ，Ｇ．ら、「Ｎｅｕｒｏｎｌｉｋｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  Ｐ１９  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ、第２版、Ｂａｎｋｅｒ，Ｇ．およびＧｏｓｌｉｎ，Ｋ．（編）、１９９８）。
【０２０３】
（免疫染色方法）
免疫染色実験を、以下のニューロンマーカー：ニューロン前駆体についてのネスチンおよびβ−チューブリンＩＩＩ、有糸分裂後のニューロンについてのＮｅｕＮ、ならびにグリア細胞（星状細胞）についてのＧＦＡＰを使用してラミニンでコーティングしたカバーガラス上の、ヒドロゲル培養物上でまたは細胞培養物中で行った。サンプル（ヒドロゲルまたは培養細胞を含有しているラミニンでコーティングしたカバーガラス）を最初に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２％のパラホルムアルデヒド中に室温で２時間固定し、続いて、ＰＢＳ中で数回洗浄した。次いでこれらを、ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温で２時間処理した。処理後、サンプルを、ゆっくりと震盪させながら、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の２０％のウシ胎児血清；０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；１％のＤＭＳＯ）中で最低２時間インキュベートした。それぞれの場合の一次抗体を、室温で１時間、ブロッキング緩衝液中で予めインキュベートし（通常は、１μｇ／ｍｌの最終濃度で）、次いでサンプルに添加し、そしてゆっくりと震盪させながら４℃で一晩インキュベートした。使用した一次抗体は、以下であった：ヤギポリクローナルＩｇＧ抗ＧＦＡＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ、カタログ番号：ｓｃ−６１７０）；マウスモノクローナルＩｇＧ１抗ＮｅｕＮ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，カタログ番号：ＭＡＢ３７７）；マウスモノクローナルＩｇＧ１抗ネスチン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，カタログ番号ＭＡＢ３５３）；およびマウスモノクローナル抗β−チューブリンＩＩＩ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）。インキュベーション後、サンプルをブロッキング緩衝液で数回洗浄し、続いて適切な二次抗体（ブロッキング緩衝液中で１／５００希釈）とともに、ゆっくりと震盪させながら４℃で一晩インキュベートした。使用した二次抗体は以下であった：ローダミン結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；およびＦＩＴＣ結合体化ロバ抗ヤギ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。次いで、サンプルを、ブロッキング緩衝液で２時間かけて３回洗浄した。さらに１時間のＰＢＳでの１回の最後の洗浄で処理を終わらせた。次いで、ヒドロゲルを、Ｈａｍａｍａｔｓｕビデオカメラを取り付けたＯｐｅｎｌａｂデータ獲得システムを使用して、位相差および蛍光を用いてＮｉｋｏｎ顕微鏡ＴＥ３００下で観察した。全部で約１００個の細胞を含む３個の別々のクラスターを、それぞれの染色について観察した。得られた写真は、ＦＩＴＣおよびローダミンについての位相差および蛍光を用いて観察した単一の光学平面を示す。
【０２０４】
（ＢｒｄＵ染色方法）
ＢｒｄＵ染色を、上記のように行った。
【０２０５】
（結果）
カプセル化したＬＰＣ−８．１細胞を肝細胞増殖培地に移した後の２４時間までに、細胞の有意な割合（１０〜２０％）が、細胞の形態において劇的な変化を獲得した。これは、非常に長くなった細胞体からなり、ニューロン系統に似ている未発達のプロセスを有する。図２４Ａ〜２４Ｇは、種々のニューロンマーカーについての染色後の、組み立てられたペプチド構造中で増殖しているＬＰＣ−８．１細胞を示す。ニューロン様の細胞形態は、図の左側のパネル（２４Ａ、Ｃ、Ｄ，およびＧ）の位相差顕微鏡写真において明確に見ることができる。対照的に、標準的な組織培養プレート上の培養物中で維持した細胞は、ＨＧＭに移した場合に、同様の形態の変化は示さなかった。
【０２０６】
ニューロン様の表現型をさらに調査するために、ペプチドヒドロゲル構造中で増殖している細胞を、ニューロン系統の細胞の特徴であるマーカーに対する種々の抗体を用いて染色した。図２４Ｂおよび２４Ｄは、カプセル化したＬＰＣ  ８．１細胞がニューロン前駆体のマーカーであるネスチンおよびβ−チューブリンＩＩのそれぞれについてポジティブに染色されたことを示す。ニューロンの形態を示す細胞のほとんどが、ネスチンおよびβ−チューブリンＩＩＩについてポジティブに染色された。しかし、カプセル化されたＬＰＣ  ８．１細胞は、分化した有糸分裂後のニューロンについてのマーカーであるＮｅｕＮについて、ほんのわずかしか染色されなかった（図２４Ｆ）。カプセル化されたＬＰＣ８．１細胞は、成熟した分化したグリア細胞（星状細胞）についてのマーカーであるＧＦＡＰについてはネガティブであった。これらの結果は、ニューロンの形態を有するヒドロゲル中の細胞が、グリア細胞の成熟したニューロンよりも、初期のニューロン前駆細胞により近く関係している表現型を有することを示した。ＨＧＭ中の標準的な組織培養プレート上で維持した細胞は、全ての４つのマーカーについてネガティブであった。
【０２０７】
形態学的分析およびマーカー染色の結果は、ペプチドヒドロゲル構造中へのカプセル化が、細胞がＨＧＭ中に存在する細胞外因子に応答するそれらの分化能力を変更することを可能にする環境を提供することを示唆した。この結果は、ヒドロゲルの環境が、細胞を分化誘導因子（例えば、成長因子）による指示に従うようにすることを示唆した。規定されたＨＧＭは、２０ｎｇ／ｍｌの表皮成長因子（ＥＧＦ）を含むので、形態学的変化がＥＧＦによって誘導されるという可能性を、ＥＧＦを含まないＨＧＭ、ＥＧＦを添加していないＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（すなわち、標準培地）、または２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを添加したＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳのいずれかで培養したカプセル化された細胞を用いてＨＧＭ中で培養したカプセル化された細胞を比較することによって、調査した。
【０２０８】
カプセル化した細胞を、ＥＧＦを含まないＨＧＭ中で培養した場合には、細胞形態の変化は観察されず、そして細胞のほとんどが、最初の４８時間以内に死亡した（表４を参照のこと、これは、細胞を種々の因子を添加したＤＭＥＭまたはＨＧＭのいずれかの中で、プレート上でまたはペプチドヒドロゲル構造中のいずれかで培養した場合の、細胞の生存性、形態、およびニューロンマーカーについての染色に対する効果を含む、上記の結果をまとめる）。この結果は、細胞が生存性についてＥＧＦに依存することを示し、そしてＦＢＳ中に存在することが公知である低い濃度のＥＧＦが生存性を支持するために適切であるが、カプセル化した細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で培養する場合には、ニューロンの分化は誘導しないことを示唆した。
【０２０９】
ＮＧＦもＰＤＧＦも、カプセル化した細胞をＥＧＦを含まないＨＧＭまたは血清を含まないＤＭＥＭ中で培養した場合には、細胞の生存性を支持することも、形態変化を誘導することもできなかった。しかし、ＮＧＦのみを、１０％のＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ中の増殖しているカプセル化したヒドロゲル培養物に添加した場合には、ＨＧＭ培地中で生じたものと同様の細胞形態の劇的な変化が観察された。すなわち、２４時間以内に細胞の約１０〜２０％が、未発達のプロセスを有する長くなった細胞体のニューロン様の外形を示した。さらに、ＮＧＦがＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ／ＥＧＦ、またはＨＧＭ／ＥＧＦのいずれかの中に存在する場合には、ニューロン形態を示す細胞およびクラスターの数が明らかに増大し、このことは、ＮＧＦ／ＥＧＦの組み合わせが、ＥＧＦ単独よりも大きなニューロン誘導作用を発揮することを示唆している。ＰＤＧＦの存在は、ＥＧＦの存在下または非存在下のいずれにおいても、同様の形態変化を誘導しなかった。細胞形態に変化がないことを、ＬＰＣ  ８．１細胞をＥＧＦ、ＮＧＦ、または両方を添加したまたは添加していないＨＧＭまたはＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳのいずれかで、プラスチック製の組織培養プレート上で並行して培養した場合に観察した。
【０２１０】
これらの結果は、ペプチドヒドロゲル構造の状況で、ＥＧＦ（この場合、細胞の生存性を支持するために低い濃度で必要である）が、高用量で分化誘導因子として作用することができることを示唆した。対照的に、ＮＧＦは、細胞の生存性を支持することはできなかったが、細胞を生存させるために十分なＥＧＦの存在下では、分化誘導因子として作用することができた。成長因子および培地条件の同一の組み合わせが、細胞を標準的な培養皿上で増殖させた場合に、形態変化もニューロン前駆体についてのマーカーの発現も誘導しなかったという事実は、ペプチドヒドロゲル構造が、細胞をＥＧＦ、ＮＧＦ、または２つの組み合わせによる指示に従うようにする環境を提供したことを示唆した。
【０２１１】
多くの場合、ニューロン形態を有する細胞は、小さいクラスターの中ではニューロンの表現型を示さない他の細胞に関係しており、このことは、自己再生するニューロン前駆体の存在を示唆している。進行中の細胞分裂の可能性を研究するために、ＥＧＦまたはＥＧＦおよびＮＧＦの存在下でＨＧＭ中で培養した細胞を、ネスチンまたはＢｒｄＵのいずれかについて別々に染色した。図２５Ａ〜２５Ｈに示すように、ニューロン形態を有している細胞を含有しているクラスターは、ネスチン（２５Ｂ、２５Ｆ）およびＢｒｄＵ（２５Ｄ、２５Ｈ）の両方についてポジティブに染色された。ネスチンのポジティブ染色は、ニューロンの表現型を示す細胞に主に関係している（図２５Ａ、Ｂ、Ｅ、およびＦ）が、ほとんどのＢｒｄＵポジティブ細胞は、ネスチンポジティブではなかった。ＢｒｄＵポジティブ細胞は、クラスターの内部にランダムに配置される傾向があり、そしてより球形の形態を示した。いくつかの場合では、ＢｒｄＵ染色は、ニューロン形態を示す細胞において観察された。ＮＧＦの存在は、ニューロンの表現型を示す細胞の数の増大を生じた。
【０２１２】
（表４．体細胞性肝臓前駆細胞の分化を可能にするペプチドヒドロゲル培養物）
【０２１３】
【表４】
2005515796.tif 000006
＊位相差に対する顕微鏡観察による。
【０２１４】
＊＊特定のニューロンマーカー（ネスチン、β−チューブリンＩＩＩ）に対して異なる抗体を用いる免疫染色によってか、または７−エトキシレソフリンを用いてインビボでのＣＹＰ１Ａ１活性を分析することによる。
【０２１５】
（ペプチドヒドロゲル構造から抽出した細胞の分析）
細胞を、以下に記載するようにペプチドヒドロゲルから回収し得る。
【０２１６】
（ヒドロゲルからの細胞およびスフェロイドの抽出のための方法）
ヒドロゲル培養物から細胞およびスフェロイドを単離するために、これらを、顕微鏡下での視覚的試験によって判断した場合に、約５０％の細胞／クラスターが抽出されるまで、数回吸い上げたり戻したりすることによって、パスツールピペットで機械的に破壊した。抽出した混合物を、ラミニンでコーティングしたカバーガラス（Ｂｅｃｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上に置き、そしてそれらが培養されている同じ培地中で一晩インキュベートした。抽出後次の日に、残っているヒドロゲルの断片を、新しい培地でカバースライドを洗浄することによって除去し、そして付着した細胞／クラスターを、５％のＣＯ２で平衡化した３７℃のインキュベーター中で１週間インキュベートした。典型的には、ヒドロゲル中に残っている細胞の数を計数し（血球系を使用する）、そしてカバーガラス上に付着した細胞を計数することによって判断した場合に、約５０％の細胞／クラスターが、ヒドロゲルから除去された。
【０２１７】
（結果）
ペプチドにカプセル化された細胞の性質および表現型をより詳細に研究し、そしてヒドロゲルの効果が可逆的であるかどうかを調査するために、ＥＦＧおよびＮＧＦを含有しているＨＧＭ中のペプチドヒドロゲル構造中で１週間増殖させたＬＰＣ−８細胞を、機械的な破壊を用いてヒドロゲルから抽出し、そしてヒドロゲルとともに使用した同じ培地および成長因子の組み合わせを用いてラミニンでコーティングしたプレート上にプレートした。プレート上の細胞は、１週間の経過にわたって２つの基本的な形態を獲得した：（１）拡大した細胞体、および１または２つの核を有する外形を有する伝統的な肝細胞の形状（図２６Ａ）；（２）いくつかのプロセスを伴った平坦に拡大した形状（図２６Ｂ）。プレーティングの１週間後、プレート上の全ての細胞が、ネスチンおよびβ−チューブリンＩＩＩについてネガティブに染色された。クラス１の細胞（肝細胞様形態）は、ＮｅｕＮおよびＧＦＡＰの両方についてネガティブに染色されたが、ＣＹＰ１Ａ１活性は示さなかった。対照的に、クラス２（グリア様）の細胞は、ＧＦＡＰについてはポジティブに染色され（図２６Ｄおよび２６Ｆ）、そしてＮｅｕＮについてはネガティブに染色され、そしてＣＹＰ１Ａ１活性は示さなかった。大量の細胞分裂がプレート上で生じ、このことはおそらく、未分化の前駆細胞の分裂を示しているが、完全に分化した肝細胞またはグリア細胞ではない。
【０２１８】
これらの結果は、ＬＰＣに由来する前駆体ニューロン様細胞が、明らかにグリア細胞経路に沿って、ゲルからの抽出後にさらなる分化プロセスを受けることを示唆した。ＮｅｕＮの発現がないことと一致して、典型的な成熟ニューロンの形態を有する細胞（すなわち、小さい細胞体および多量の神経突起を有する細胞）の形成は観察されなかった。ＣＹＰ１Ａ１活性の持続的な発現およびクラス１細胞の肝細胞様形態は、上記に記載した培地および成長因子の条件下でのペプチドヒドロゲル構造中でのＬＰＣの培養が、細胞の一部を、成熟した肝細胞を最終的に導く経路に沿って分化するように誘導したという結論と一致する。従って、ペプチドヒドロゲル構造中での培養は、ＬＰＣ形成を指示（例えば、成長因子および／または分化因子による）に従うようにし、肝細胞またはニューロンの特性のいずれかを有する細胞を生じる。この結果は、ヒドロゲル環境の特有の特性が、このタイプの決定転換（ｔｒａｎｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）を可能にしたという結論と一致する。
【０２１９】
（ヒドロゲルカプセル化後のＬＰＣ−８細胞の増殖速度分析）
カプセル化したＬＰＣ−８の増殖速度をまた、以下に記載するように測定した。
【０２２０】
（細胞、細胞培養物、およびカプセル化方法）
ＬＰＣ８．１細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびＸｓ（４００μＭ）を含有するＤＭＥＭ中で培養し、そして４日間モニターした。コントロール細胞を、従来のポリスチレン製組織培養皿上で増殖した。細胞を、上記のように、ＲＡＤ１６−Ｉヒドロゲル（０．５％ｗ／ｖ）中にカプセル化した。一部の実験については、細胞を機械的な破壊によってヒドロゲルから除去し、そして従来の組織培養皿に移し、これらを同じ培地中で維持した。酵素消化を使用しなかったので、スフェロイドを、分析を容易にするほぼ完全にインタクトな状態で、従来の組織培養皿に移すことに成功した。細胞を、血球計を使用して計数した。
【０２２１】
（ＢｒｄＵ染色方法）
ＢｒｄＵ染色を、本明細書中に記載するように行った。
【０２２２】
（結果）
培養の最初の２４時間の後、従来の培養皿上で増殖したコロニー中の細胞の数（コントロール）は、２４時間の適切な倍加時間で指数的に増大した。細胞分裂を、コロニーあたりの細胞の平均集団が２４時間ごとに倍増する相対的増殖率（Ｒｇｒ）を計算することによって定量した。コントロール培養物については、細胞数は、１日目には５．３±１．８細胞／コロニーから１１．０±２．０細胞／コロニーに増大し（Ｒｇｒ＝２．１）、そして３日目には４０．６±５．４に増大し（Ｒｇｒ＝７．７）、平均集団は、ほぼ８倍に増大した（表５）。ペプチドヒドロゲル培養物中では、細胞増殖速度論は極めて異なっていた。最初に、３から６個の細胞の小さいクラスターを、培養の２４時間後に観察した（４．１４±１．９細胞／クラスター）（図２７Ａおよび２７Ｂならびに表５）。翌日、クラスターは増殖を続け、そしてスフェロイド形態をとった（図２７Ｃおよび２７Ｄ）。スフェロイド中の細胞の平均数は、コントロール培養物と比較してゆっくりと増大した（表５）。ヒドロゲルで培養したスフェロイドについては、細胞密度は、２４時間後に、４．１４±１．９細胞／クラスターから６．３３±１．９細胞／クラスター（Ｒｇｒ＝１．５）に、そして３日後には１５±３．８細胞／クラスター（Ｒｇｒ＝３．６）に増大した（表５）。増殖速度論におけるこの劇的な差異は、世代時間がペプチドヒドロゲル培養物中で有意に増大したことか、またはスフェロイドあたりの減少した数の細胞のみが有糸分裂活性を維持し、残りは細胞周期の停止を受けたことかのいずれか、あるいはこれらの両方であることを示唆した（表５）。ＬＰＣ−８の増殖に対するヒドロゲルの作用は、Ｘｓの存在にはかかわらずに生じ、このことは、異なる細胞分裂制御の機構が、三次元足場との相互作用によって生じたことを示唆する。
【０２２３】
より詳細にスフェロイドの有糸分裂活性を研究するために、本発明者らは、チミジンアナログである５’−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いて分裂細胞を標識した。ＢｒｄＵは、細胞周期のＳ期の間にＤＮＡ中に取り込まれる。細胞を、分裂細胞の集団全体を検出するために、２４時間（すなわち、約１世代時間）標識した。三次元環境に起因して、視覚的観察によってスフェロイド中のＢｒｄＵ＋細胞の正確な数を計数することは困難であった。従って、本発明者らは、ヒドロゲルの機械的な破壊によって培養物からそれらを抽出し、そして分析のために従来の細胞培養皿にそれらを移し、そこで、それらは、細胞培養皿の表面上に、さらなる視覚的分析に適切な小さなコロニー（スフェロイドコロニー）を形成した。本発明者らは、４８時間経過した従来の培養皿、および９６時間経過したペプチドヒドロゲル培養スフェロイドにおけるＢｒｄＵの取り込みを比較した。予想したように、皿上で培養したコロニーにおける細胞のＢｒｄＵポジティブ（ＢｒｄＵ＋）画分は非常に多かった（＞９５％）（図２７Ｅおよび２７Ｆ）。対照的に、スフェロイドコロニーにおける細胞の小さい画分が（＜５０％）ＢｒｄＵを取り込んでおり、このことは、多くの細胞がヒドロゲル培養物中で４日後に停止したことを示す（図２７Ｇおよび２７Ｈ）。スフェロイドコロニーにおける停止した細胞の表現型は異常であった；これらは、細胞の大きさの増大を示し、しばしばＢｒｄＵ−である二核細胞の高い発生率を有した（図２７Ｇおよび２７Ｈ）。図２７Ａ〜２７Ｈの青色の矢印は、二核細胞を示す。
【０２２４】
【表５】
2005515796.tif 000007
１ＬＰＣ−８細胞を、通常の６−ウェル培養皿上で培養し（ｎ＝３）、そして約１０，０００細胞／ｃｍ２の開始密度でプレートしたか、または培養挿入物中に含まれる、約１００，０００細胞／ｍｌの開始濃度でＲＡＤ１６−Ｉペプチドヒドロゲル（０．５％ｗ／ｖ）中にカプセル化した（ｎ＝８）（方法を参照のこと）。使用した培地は、ＬＰＣ−８細胞の指数増殖を誘導するための１０％のウシ胎仔血清およびキサントシン（４００μＭ）を含有するＤＭＥＭであった。細胞を、２４時間培養し、そしてコロニーあたりの細胞数を、実体顕微鏡下で視覚的観察によって計数した。２データを、平均値±標準偏差（ＳＤ）で示す。３相対増殖率（Ｒｇｒ）を、以下のように、４８時間および９６時間からの各平均値（Ｍｖｔ、ここで、ｔ＝４８時間または９６時間）を、２４時間からの初期平均値（Ｍｖｉ）で除算した後に計算した：Ｒｇｒ＝Ｍｖｔ／Ｍｖｊ。
【０２２５】
（ＤＭＥＭ中での増殖後にヒドロゲルから抽出した細胞の表現型の特徴付け）
ペプチドヒドロゲルから抽出した細胞をまた、以下に記載するように特徴付けた。
【０２２６】
（細胞、細胞培養物、およびカプセル化方法）
ＬＰＣ−８．１細胞を、上記のように、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で増殖させた。細胞を、上記のようにＲＡＤ１６−Ｉヒドロゲル中にカプセル化した。
【０２２７】
（ヒドロゲルからの細胞およびスフェロイドの抽出）
ＬＰＣ−８．１細胞を、通常の（すなわち、従来の）細胞培養皿上で、約１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で４８時間（コントロール）、または約１００，０００細胞／ｍｌの密度でＲＡＤ１６−Ｉヒドロゲル（０．５％  ｗ／ｖ）へのカプセル化後９６時間培養した。カプセル化した細胞は、通常の細胞培養皿上で増殖させた細胞よりもゆっくりと増殖するので、通常のプレート上で４８時間の培養後に存在する細胞数は、カプセル化した細胞を９６時間培養した後に存在する細胞数とほぼ同じである。スフェロイド構造を、機械的破壊によってヒドロゲル培養物から抽出し、そして上記で使用した同じ培地を含有する通常のプレート上に置いた。このプロセスでは酵素処理を使用しないので、ほとんどのスフェロイドをほぼ完全にインタクトな状態で単離され得る。懸濁物を一晩インキュベートしてスフェロイドコロニーを形成させた。
【０２２８】
（免疫染色方法）
免疫染色を、４％のパラホルムアルデヒドを使用したことを除いて、上記の通り実施した。使用した一次抗体は以下の通りであった：ウサギポリクローナル坑ラットチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ａ２（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号：ＡＢ１２５５）、ウサギＩｇＧ坑ラットアルブミン−ＨＲＰ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＹＮＧＲＡＡＬＢＰ）、ウサギＩｇＧ坑ラットＣ／ＥＢＰα（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：ｓｃ−６１）；マウスＩｇＧ１モノクローナル坑サイトケラチン１８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｓｃ−６２５９）；マウスＩｇＧ１モノクローナル坑サイトケラチン１９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ、ｓｃ−６２７８）。使用した二次抗体は以下の通りであった：ヤギ坑マウスＩｇＧローダミン結合体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：ｓｃ−２０２９）；ロバ坑ウサギローダミン結合体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：ｓｃ−２０９５）。
【０２２９】
（ＣＹＰ１Ａ１活性の測定）
ＣＹＰ１Ａ１活性の測定を、本質的には上記の通りに行った。
【０２３０】
（光学顕微鏡および顕微鏡写真撮影方法）
光学顕微鏡および顕微鏡写真撮影を、上記の通りに行った。
【０２３１】
（結果）
上記のデータは、増殖環境中の種々の成長因子の存在が、ヒドロゲル中で培養した細胞の分化および分化転換特性に影響を与えることを示唆した。この現象をさらに研究するために、ＬＰＣ−８細胞を、従来の組織培養皿（コントロール）上のＤＭＥＭ／ＦＢＳ中でか、またはＲＡＤ１６−Ｉペプチドヒドロゲル中でのいずれかで、４８時間（コントロール）または９６時間（カプセル化）のいずれかの間培養した。この時点で、細胞数はほぼ等しかった、次いで、細胞を、トリプシン処理によって（コントロール培養物について）、または機械的破壊によって（ヒドロゲルから単離したスフェロイドについて）のいずれかで、それらのそれぞれの培養環境から取り出した。次いで、細胞を、従来の組織培養皿上で一晩、同じ培地中で培養し、スフェロイドコロニーを形成させた。次いで、スフェロイドを、種々のマーカーの発現について免疫染色した。
【０２３２】
図２８Ａ〜２８Ｌは、通常の培養条件からの単離後、またはペプチドヒドロゲル培養物からの単離後のいずれかの、従来の培養皿上での指数増殖の間のＬＰＣ細胞の表現型分析を示す。図２８Ａ、２８Ｃ，２８Ｅ、２８Ｇ、２８Ｉ、および２８Ｋは、コントロールまたはスフェロイドに由来するコロニーの位相差顕微鏡写真を示す。図２８Ｂ、２８Ｄ、２８Ｆ、２８Ｈ、２８Ｊ、および２８Ｉは、Ｃ／ＥＰＢα、アルブミン、またはＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２の発現を示すように免疫染色した同じコロニーを示す。表６は、コントロールおよびスフェロイドに由来するコロニー中でのこれらの発現、ならびにさらなるマーカーであるα−フェトプロテイン、サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、およびサイトケラチン１９（ＣＫ１９）の準定量的比較を示す。表６はまた、コントロールおよびスフェロイドに由来するコロニー中でのＣＹＰ１Ａ１活性および二核細胞数（肝細胞の表現型と一致する）を比較する。
【０２３３】
α−フェトプロテインの発現は、ヒドロゲル中でのＬＰＣ−８細胞の培養後には変化しなかった。このことは、この処理が胎児のマーカーの発現には影響を与えなかったことを示唆する（表６）。対照的に、発達マーカーであるＣ／ＥＢＰαは、コントロールコロニー中での発現と比較して、２および１０日が経過したスフェロイドに由来するコロニーのほとんどの核において高度に発現された。このことは、ヒドロゲル中にカプセル化されたＬＰＣ−８細胞が、肝臓系統の細胞と一致する経路に沿って分化を開始するという証拠を提供する（図２８および表６）。アルブミンおよびＣＫ１８のような他の肝臓マーカーは、スフェロイドコロニー中でアップレギュレートされたが（図２８Ｅ〜２８Ｈ、および表６）、検出可能なレベルのＣＫ１９は、コントロールまたはヒドロゲルに由来する培養物のいずれにおいても全ての時間で観察されなかった（表６）。アルブミンの発現は、予想したように、細胞質中ではっきりと見ることができた（図２８Ｈ）。これらの結果は、スフェロイドコロニーが、明確な肝細胞または卵型細胞の表現型を示すことを示唆した。なぜなら、胆管上皮のマーカー（ＣＫ１９）が観察されなかったからである（表４）。肝細胞ならびに肝臓の卵型細胞中で発現される共通の細胞マーカー（例えば、アルブミン、ＣＫ１８，およびα−フェトプロテイン）のＬＰＣ−８ヒドロゲルに由来するスフェロイドコロニー中での存在（図２８および表６）は、肝臓の幹細胞ＬＰＣ−８が、成人肝臓の分化について以前に示唆されたように、肝細胞から卵型細胞中間体へとヒドロゲル中で段階的に分化するという解釈と一致する。それにもかかわらず、試験した全ての培養条件においてＣＫ１９（ラットの肝臓の卵型細胞のマーカー）の発現がないこと、主に肝細胞中で発現されるＣ／ＥＢＰαのヒドロゲル由来のスフェロイドコロニー中での高い発現（図２８および表６）、および二核細胞および拡大した細胞体の存在の増加（肝細胞に見られる一般的な表現型）は、肝細胞への最後の分化プロセスが生じ得ることを示唆する。さらに、ヒドロゲルに由来するスフェロイドコロニー中に存在する二核細胞の大部分もまた、ＢｒｄＵ−であった。このことは、これらが有糸分裂後の分化した細胞であることを示唆する（図２７および２８、ならびに表６）。図２８中の青色の矢印は、二核細胞を示す。
【０２３４】
チトクロームＰ４５０  １Ａ１および１Ａ２酵素（ＣＰＹ１Ａ１およびＣＹＰ１Ａ２）の発現もまた、ヒドロゲルに由来するスフェロイドコロニー中で劇的にアプレギュレートされた。このことは、ヒドロゲル培養物の中での肝臓機能の存在の可能性を示する（図２８Ｉ〜２８Ｌ、表６）。これらの結果を考慮して、本発明者らは、２週間の期間にわたってコントロールおよびヒドロゲル培養物中でのＣＹＰ１Ａ１の活性を試験した。低いＣＹＰ１Ａ１活性（０．０２±０．０１ｐｍｏｌ／細胞／時間）を、従来の培養皿上で指数的に増殖している細胞中で検出した（表６）。しかし、ヒドロゲル培養のわずか２日後に、ＣＹＰ１Ａ１活性の増大（０．０９±０．０１ｐｍｏｌ／細胞／時間）を観察した。この活性は１０日間維持され（０．０９〜０．０１ｐｍｏｌ／細胞／時間）、そして２週間まで維持された（０．０８±０．０１ｐｍｏｌ／細胞／時間）（表６）。ＣＹＰ１Ａ１活性におけるこの３倍から４倍の増大は、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ａ２タンパク質の発現の増大と十分に相関する（図２８Ｉ〜２８Ｌ）。全般的に、本発明者らは、上記の結果が、ＬＰＣ−８が、ナノスケール繊維を含有するナノスケール環境中での培養によって肝臓細胞系統に分化するように指示され得る、クローンの体性（肝臓に由来する）幹細胞であることを示すことを示唆する。特に、本発明者らは、本明細書中に記載した結果が、ＬＰＣ−８細胞が自律的に組み立てるペプチドヒドロゲルを含有する三次元ナノ繊維環境中でそれらを培養することによって、肝臓細胞系統に分化するように指示され得ることを示すと示唆する。先の節に記載したように、種々の因子（例えば、成長因子）の影響下では、ＬＰＣ−８細胞はまた、ナノスケール繊維を含有するナノスケール環境中でそれらを培養することによって（例えば、自律的に組み立てるペプチドヒドロゲルを含有する三次元ナノ繊維環境中でそれらを培養することによって）、神経系統へと分化するようにも指示され得る。
【０２３５】
【表６】
2005515796.tif 000008
３マーカーの発現または表現型に関する定量化：（−）検出されなかった；（−／＋）、非常に低い；（＋）低い；（＋＋）中程度；（＋＋＋）高い。２通常のポリスチレン製の培養皿。４ＣＹＰ１Ａ１活性を、７−エトキシレソフリンの存在下での培養物のインキュベーション後にレソフリンの放出を測定することによって検出した（材料および方法を参照のこと）。１α−フェトプロテインは、胎児の肝細胞および肝臓の卵型細胞中に存在する；Ｃ／ＥＢＰαは、肝細胞、小腸の上皮細胞、および脂肪細胞についてのマーカーである；アルブミンは、肝細胞および肝臓の卵型細胞についてのマーカーである；ＣＫ１８は、肝細胞、胆管上皮、および肝臓の卵型細胞中で発現される；ＣＫ１９は、胆管上皮および肝臓の卵型細胞中で発現される；ＣＹＰ１Ａ１／ＣＹＰ１Ａ２は、肝細胞および他の細胞中に存在する；二核細胞は、肝細胞における一般的な表現型である。
【０２３６】
（他の実施形態）
本明細書中で言及した全ての刊行物は、個々の刊行物の各々が、詳細かつ個々に、参考として援用されることが意図されているのと同程度に、本明細書中で参考として援用される。
【０２３７】
本発明は、その特定の実施形態と共に記載されているが、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、概して、本発明の原則に従って、任意の変形、用途、または適応を網羅し、そして本発明が属する当該分野で公知であるかまたは習慣的な実施の範囲内での本開示からのそのような逸脱を含み、そして本明細書中で先に示した本質的な特徴に対して適用され得ることが意図される。
【０２３８】
他に示されない限り、本発明は、以下のような参考の研究において見出されるような、標準的な細胞培養技術および培地、ならびに標準的な分子生物学的および免疫学的プロトコールを使用し得る：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．、Ｌａｎｅ，Ｅ．、およびＨａｒｌｏｗ，Ｅ．（編）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９９８。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１Ａ】図１Ａは、ペプチド足場中のペプチド間での相互作用の模式図である。交互の疎水性残基と親水性残基のアミノ酸配列を有している種々のペプチドは、生理学的に等価な電解質の溶液に曝された場合に、β−シート型の安定な足場を形成するように自律的に組み立てる（米国特許第５，９５５，３４３号および同第５，６７０，４８３号）。ペプチド足場は、ペプチド間の多数の相互作用によって安定化させられる。例えば、隣接しているペプチドによる正に荷電したアミノ酸側鎖と負に荷電したアミノ酸側鎖は、相補的なイオン対を形成し、そして親水性残基（例えば、アスパラギンおよびグルタミン）は、水素結合相互作用に関与する。隣接しているペプチド上の疎水基は、ファンデルワールス相互作用に関与する。ペプチド骨格上のアミノ酸基およびカルボニル基もまた、分子間水素結合相互作用に関係する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ペプチド足場中のペプチド間での相互作用の模式図である。交互の疎水性残基と親水性残基のアミノ酸配列を有している種々のペプチドは、生理学的に等価な電解質の溶液に曝された場合に、β−シート型の安定な足場を形成するように自律的に組み立てる（米国特許第５，９５５，３４３号および同第５，６７０，４８３号）。ペプチド足場は、ペプチド間の多数の相互作用によって安定化させられる。例えば、隣接しているペプチドによる正に荷電したアミノ酸側鎖と負に荷電したアミノ酸側鎖は、相補的なイオン対を形成し、そして親水性残基（例えば、アスパラギンおよびグルタミン）は、水素結合相互作用に関与する。隣接しているペプチド上の疎水基は、ファンデルワールス相互作用に関与する。ペプチド骨格上のアミノ酸基およびカルボニル基もまた、分子間水素結合相互作用に関係する。
【図２】図２は、アガロースゲル中に懸濁された軟骨細胞中での対応する速度と比較した、ペプチド足場によってカプセル化された軟骨細胞中でのタンパク質とプロテオグリカンの合成速度を示す棒グラフである。
【図３】図３は、ペプチド足場によってカプセル化されたか、またはアガロースゲル中に懸濁された軟骨細胞によって合成された、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量を示すグラフである。
【図４】図４は、軟骨細胞をカプセル化しているペプチド足場中のグリコサミノグリカンのトルイジンブルー染色の写真である。
【図５】図５は、軟骨細胞をカプセル化しているペプチド足場中のコラーゲンＩＩについて免疫組織化学的染色の写真である。
【図６】図６は、ペプチド足場の力学的試験に使用した装置の模式図であり、そしてこれは、所望される場合には、カプセル化された細胞による細胞外マトリックス成分の分泌を刺激するように足場を圧縮するために使用され得る（Ｂｕｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８：１４９７−１５０８、１９９５）。
【図７】図７は、軟骨細胞をカプセル化しているペプチド足場についての、種々の圧縮重荷の値での平衡圧力値のグラフである。このグラフに基づいて、２７ｋＰａの平衡係数が計算された。これは、細胞が存在しない場合の約０．５ｋＰａの平衡係数よりも有意に高い。
【図８】図８は、足場の形成の５日後の軟骨細胞の分布を示す写真である。細胞のそれぞれのクラスターまたは対は１つの細胞から生じ、そして実質的に均質に分散させられる。
【図９】図９Ａから９Ｃは、テープ状（図９Ａ）、ロープ状（図９Ｂ）、およびシート状（図９Ｃ）を含む、種々の予め決定された形状に形成されたペプチド足場の写真である（Ｈｏｌｍｅｓら、ＰＮＡＳ  ９７：６７２８−６７３３、２０００）。テープ状に成型された肉眼で見ることができるペプチド足場を形成するためには、ＲＡＤ１６−ＩＩペプチドを水中に溶解させ、そして５ｍｍの間隔を空け、そして２つのガラススライドの間にサンドイッチした細長いワイヤーの２つの切片から構成されるデバイスを通じて、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に注入した。次いで、足場をコンゴレッドで染色した。図９Ａに示したテープは、長さ約８ｃｍ、幅０．５ｃｍ、そして厚み０．３ｍｍである。同様の手順をまた、ロープ状の形状のペプチド足場を形成するために使用した。この場合には、水性のペプチド溶液を３ｍＬのシリンジを使用してＰＢＳ中に導入した。図９Ｂに示すペプチド足場ロープは、長さ１８ｃｍおよび直径２ｍｍである。図９Ｃに示すように、ペプチド足場をまた、シート状の形状に作り上げた。センチメートル目盛を、図９Ｃのシート構造の下に示す。
【図１０】図１０Ａは、単一のＫＬＤ−１２自律的な組み立てペプチドの分子モデルを示す。骨格上の交互の疎水性残基と親水性残基が、β−シートの形成を促進する。正に荷電したリジン（Ｋ）と負に荷電したアスパラギン酸（Ｄ）はβ−シートの下側に存在し、そして疎水性ロイシン（Ｌ）は上側に存在する。この分子構造は、分子間相互作用によって自律的な組み立てを促進する。図１０Ｂは、１．６ｍｍの厚みのスラブによって穴を空けた、１２ｍｍの軟骨細胞を接種したペプチド足場プラグの写真である。図１０Ｃは、ペプチド足場中にカプセル化した軟骨細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、細胞を接種されたペプチド足場内の軟骨細胞による、タンパク質合成および硫酸化プロテオグリカンのそれぞれの合成の測定値としての、３Ｈ−プロリンと３５Ｓ−スルフェートの放射標識の取り込みの棒グラフである。それから本発明者らの軟骨細胞が得たもとの仔ウシの軟骨移植片を使用した同様の実験では、約７５〜８０％の３Ｈプロリンが新しく合成されたコラーゲン分子中に取り込まれ、一方、本質的に全ての高分子３５Ｓ−スルフェートの取り込みは、硫酸化プロテオグリカンに関係していた（Ｓａｈら、前出）。軟骨細胞を接種したアガロース足場を、十分に定義した参照の軟骨細胞培養系と同時に分析した。ＩＴＳ培地に補充したものは、インシュリン、トランスフェリン、およびセレニウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、アガロースヒドロゲル中への放射活性プロリンの取り込みの棒グラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、軟骨細胞を接種したペプチド足場中でのマトリックスの蓄積を示す。図１２Ａは、ＦＢＳおよびＩＴＳ／ＦＢＳ培地中で培養した細胞を接種したペプチド足場の中での全グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積のグラフである。軟骨細胞を接種したアガロースヒドロゲルを、十分に定義した参照の軟骨細胞培養系と同時に分析した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、軟骨細胞を接種したペプチド足場中でのマトリックスの蓄積を示す。図１２Ｂは、１５日目の、１０％のＦＢＳ中で培養した軟骨細胞を接種したペプチド足場のトルイジンブルー染色の写真である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、軟骨細胞を接種したペプチド足場中でのマトリックスの蓄積を示す。図１２Ｃは、１５日目の、１０％のＦＢＳ中で培養した細胞を接種したペプチド足場のＩＩ型コラーゲンについての免疫組織化学的染色の写真である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、軟骨細胞を接種したペプチド足場中でのマトリックスの蓄積を示す。図１２Ｄは、０．２％のＦＢＳを含有している１％のＩＴＳ中で培養した軟骨細胞を接種したペプチド足場の、３５日目のサンプルから抽出したコラーゲンのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。若い軟骨を、コラーゲンＩＩおよびＸＩの移動についての標準として使用した。マウスの皮膚を、コラーゲンＩα−へリックス２についての標準として使用した。これは、所望される分化した軟骨細胞の表現型ではなく、脱分化した線維芽細胞の表現型のコラーゲン発現の指標である。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、軟骨細胞を接種したペプチド足場中でのマトリックスの蓄積を示す。図１２Ｅは、それぞれ１３日目の、ＦＢＳまたはＩＴＳ培地中で培養した細胞を接種したペプチド足場中のＩＩ型コラーゲンについての免疫組織化学的染色の写真である。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、軟骨細胞を接種したペプチド足場中でのマトリックスの蓄積を示す。図１２Ｆは、それぞれ１３日目の、ＦＢＳまたはＩＴＳ培地中で培養した細胞を接種したペプチド足場中のＩＩ型コラーゲンについての免疫組織化学的染色の写真である。
【図１２Ｇ】図１２Ｇは、軟骨細胞を接種したペプチド足場中でのマトリックスの蓄積を示す。図１２Ｇは、アガロースヒドロゲル中でのＧＡＧの蓄積のグラフである。
【図１３】図１３は、軟骨細胞を接種したペプチド足場の力学的特性の棒グラフである。平衡係数と動剛性を、１５×１０６細胞／ｍｌの密度で最初に接種し、そして１０％のＦＢＳ培地中で培養したゲルについて、およびＩＴＳ／ＦＢＳ培地（＊）中で培養した３０×１０６細胞／ｍｌの密度で接種したゲルについて、一軸方向に閉じ込めた圧縮のもとで測定した。後者の条件は、ヒトおよび動物の軟骨のものよりも２０〜３３％高い、硬度の値の顕著な増大を生じた。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ペプチド足場の中に接種した軟骨細胞の増殖を示す。図１４Ａは、軟骨細胞を接種したアガロースヒドロゲル中でのＭＴＳアッセイについての較正曲線である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ペプチド足場の中に接種した軟骨細胞の増殖を示す。図１４Ｂは、軟骨細胞を接種したペプチド足場中の細胞の密度のＭＴＳ測定のグラフである。軟骨細胞を接種したアガロースヒドロゲルを、十分に定義した参照の軟骨細胞培養系と同時に分析した。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ペプチド足場の中に接種した軟骨細胞の増殖を示す。図１４Ｃは、軟骨細胞を含有しているペプチド足場の接種後３日目（図１４Ｃ）の終わりでの、２４時間の間のＢｒｄＵの取り込みを示す写真である。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ペプチド足場の中に接種した軟骨細胞の増殖を示す。図１４Ｄは、軟骨細胞を含有しているペプチド足場の接種後７日目（図１４Ｄ）の終わりでの、２４時間の間のＢｒｄＵの取り込みを示す写真である。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、ペプチド足場の中に接種した軟骨細胞の増殖を示す。図１４Ｅは、軟骨細胞を接種したアガロースヒドロゲル中でのＭＴＳアッセイについての較正曲線である。
【図１４Ｆ】図１４Ｆは、ペプチド足場の中に接種した軟骨細胞の増殖を示す。図１４Ｆは、ペプチド足場中での生存可能な細胞の密度の棒グラフである。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、１２日目の、それぞれ、軟骨細胞のペプチド足場の表面への移動、ならびにそれに続く線維芽細胞の表現型への脱分化および増殖を制限するかまたは排除する、１％のＩＴＳおよび０．２％のＦＢＳ培地（ＩＴＳ／ＦＢＳ、図１５Ｂ）ならびに１％のＩＴＳ培地（ＩＴＳ、図１５Ｃ）の能力を示す写真である。図１５Ｄ〜１５Ｆは、アガロースヒドロゲル中での１９日目の、脱分化した軟骨細胞／線維性カプセルの形成の横断面の写真である。
【図１６】図１６は、圧縮荷重に使用した圧縮キャンバー（上部）とふた（下部）の写真である。
【図１７】図１７は、インキュベーターを収容した荷重システムの写真である。
【図１８】図１８は、８日間または４日間の反復的な機関サイクル（ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ）後のアガロースヒドロゲル中での放射標識の取り込みの棒グラフである。
【図１９】図１９は、別の日に荷重を使用した、アガロースヒドロゲル中での放射標識の取り込みの棒グラフである。
【図２０】図２０は、別の日に荷重を使用した、ペプチド足場中での放射標識の取り込みの棒グラフである。
【図２１】図２１は、１×ＤＭＥＭ培地の成分のリストである。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｄは、組み立てられたペプチド構造中での成熟したＬＰＣのカプセル化を示す。図２２Ａは、カプセル化の直後のカプセル化されたＬＰＣを示す。図２２Ｂは、カプセル化の２日後のカプセル化されたＬＰＣを示す。図２２Ｃは、カプセル化の４日から５日目の組み立てられたペプチド構造中にカプセル化された成熟したＬＰＣによるスフェロイド形成を示す。図２２Ｄは、ＢｒｄＵのＤＮＡ中への取り込みについての染色後の、図３ｃと同じスフェロイドを示す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、種々の培養条件下でのＬＰＣ増殖についてのＣＹＰ１Ａ１活性のデータを示す。図２３Ａは、標準的なプラスチック培養皿上の単層として、ＬＰＣ増殖についてのＣＹＰ１Ａ１活性を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、種々の培養条件下でのＬＰＣ増殖についてのＣＹＰ１Ａ１活性のデータを示す。図２３Ｂは、カプセル化の２週間後の組み立てられたペプチド構造中でのＬＰＣスフェロイド増殖についてのＣＹＰ１Ａ１活性を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、種々の培養条件下でのＬＰＣ増殖についてのＣＹＰ１Ａ１活性のデータを示す。図２３Ｃは、カプセル化の２４時間後に開始した、２週間の時間経過の間の組み立てられたペプチド構造中でのＬＰＣスフェロイド増殖についてのＣＹＰ１Ａ１活性を示すグラフである。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、種々の培養条件下でのＬＰＣ増殖についてのＣＹＰ１Ａ１活性のデータを示す。図２３Ｄは、以下の種々の培養条件下で維持したＬＰＣのＣＹＰ１Ａ１活性の比較を示すグラフである：低い（１％）血清濃度（血清枯渇）を有しているプラスチック皿上の単層；高密度の液体培養物中で増殖しているＬＰＣによって得られるスフェロイド培養物；１０％のＦＢＳを有しているＤＭＥＭ中の増殖している組み立てられたペプチド構造中のスフェロイド培養物；ＨＧＭ中の増殖している組み立てられたペプチド構造中のスフェロイド培養物。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｈは、種々のニューロンのマーカーについての染色後の組み立てられたペプチド構造中で増殖しているＬＰＣを示す。図２４Ｂは、ネスチンについて染色したＬＰＣを示す。図２４Ｄは、β−チューブリンＩＩＩについて染色したＬＰＣを示す。図２４Ｆは、ＮｅｕＮについて染色したＬＰＣを示す。図２４Ｈは、ＧＦＡＰについて染色したＬＰＣを示す。図２４Ａ、２４Ｃ、２４Ｅ、および２４Ｇは、対応している位相差顕微鏡写真である。
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｈは、ＥＧＦ（２５Ａ〜２５Ｄ）またはＥＧＦとＮＧＦ（２５Ｅ〜２５Ｈ）の存在下での、ＨＧＭ中の組み立てられたペプチド構造中で培養したＬＰＣクラスターから生じたニューロン前駆体様細胞のＮｅｓｔｉｎ（２５Ｂ、２５Ｆ）およびＢｒｄＵ（２５Ｄ、２５Ｈ）染色を示す。２５Ａ、２５Ｃ、２５Ｅ、および２５Ｇは、２５Ｂ、２５Ｄ、２５Ｆ、および２５Ｈの位相差顕微鏡写真である。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｆは、組み立てられたペプチド構造からの抽出の１週間後の、ＥＧＦおよびＮＧＦを含有しているＨＧＭ中でラミニンコーティングしたプレート上で培養したＬＰＣ細胞の表現型を示す。図２６Ａは、伝統的な肝細胞の形状をとる細胞を示す。図２６Ｂは、ＣＹＰ１Ａ１活性についての染色後の２６ａと同じ細胞を示す。図２６Ｃは、同じプロセスを用いて平坦な拡大した形状をとった細胞を示す。図２６Ｄは、ＧＦＡＰについての染色後の、２６ｃと同じ細胞を示す。図２６Ｅは、同じプロセスを用いて平坦な拡大した形状をとった細胞の別の例を示す。図２６Ｆは、ＧＦＡＰについての染色後の２６ｅと同じ細胞を示す。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｈは、従来の培養皿上でのＬＰＣの細胞分裂の、またはペプチドヒドロゲル中でのカプセル化後の分析を示す。図２７Ａは、カプセル化の直後の細胞を示す位相差顕微鏡写真である（４００×の倍率）。図２７Ｂはカプセル化の２４時間後の細胞を示す位相差顕微鏡写真である（４００×の倍率）。図２７Ｃはカプセル化の４８時間後の細胞を示す位相差顕微鏡写真であり、これはスフェロイド形態をとることを示す（約５〜６個の細胞、４００×の倍率）。図２７Ｄは、カプセル化の９６時間後の細胞を示す位相差顕微鏡写真であり、これは約１０〜１４個の細胞を含有しているスフェロイドを示す（４００×の倍率）。図２７Ｅは、４８時間の従来の組織培養皿上で増殖させたコントロールコロニーの位相差顕微鏡写真を示す（２００×の倍率）。図２７Ｆは、ＢｒｄＵについて免疫染色した２７Ｅと同じコロニーを示す（２００×の倍率）。図２７Ｇは、ペプチドヒドロゲル中にカプセル化した、増殖の９６時間後のスフェロイドコロニーの位相差顕微鏡写真を示す（２００×の倍率）。図２７Ｈは、ＢｒｄＵについて免疫染色した２７Ｇと同じコロニーを示す（２００×の倍率）。
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｉは、通常の培養条件からの単離後、またはペプチドヒドロゲル培養物からの単離後のいずれかの、従来の培養皿上での指数増殖の間のＬＰＣ細胞の表現型分析を示す。図２８Ａは、コントロールコロニーの位相差顕微鏡写真である。図２８Ｂは、Ｃ／ＥＰＢαについての染色後の、２８Ａと同じ細胞を示す。図２８Ｃは、ペプチドヒドロゲルから単離した細胞を含有しているスフェロイドの位相差顕微鏡写真である、図２８Ｄは、Ｃ／ＥＰＢαについての染色後の、２８Ｃと同じ細胞を示す。図２８Ｅは、コントロールコロニーの位相差顕微鏡写真である。図２８Ｆは、アルブミンについての染色後の、２８Ｅと同じ細胞を示す。図２８Ｇは、ペプチドヒドロゲルから単離した細胞を含有しているスフェロイドの位相差顕微鏡写真である。図２８Ｈは、アルブミンについての染色後の、２８Ｇと同じ細胞を示す。図２８Ｉは、コントロールコロニーの位相差顕微鏡写真である。図２８Ｊは、ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２についての染色後の、２８Ｇと同じ細胞を示す。図２８Ｋは、ペプチドヒドロゲルから単離した細胞を含有しているスフェロイドの位相差顕微鏡写真である。図２８Ｌは、ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２についての染色後の２８Ｇと同じ細胞を示す。
【図１Ａ】
2005515796.tif 000009
【図１Ｂ】
2005515796.tif 000010
【図２】
2005515796.tif 000011
【図３】
2005515796.tif 000012
【図４】
2005515796.tif 000013
【図５】
2005515796.tif 000014
【図６】
2005515796.tif 000015
【図７】
2005515796.tif 000016
【図８】
2005515796.tif 000017
【図９】
2005515796.tif 000018
【図１０】
2005515796.tif 000019
【図１１Ａ】
2005515796.tif 000020
【図１１Ｂ】
2005515796.tif 000021
【図１２Ａ】
2005515796.tif 000022
【図１２Ｂ】
2005515796.tif 000023
【図１２Ｃ】
2005515796.tif 000024
【図１２Ｄ】
2005515796.tif 000025
【図１２Ｅ】
2005515796.tif 000026
【図１２Ｆ】
2005515796.tif 000027
【図１２Ｇ】
2005515796.tif 000028
【図１３】
2005515796.tif 000029
【図１４Ａ】
2005515796.tif 000030
【図１４Ｂ】
2005515796.tif 000031
【図１４Ｃ】
2005515796.tif 000032
【図１４Ｄ】
2005515796.tif 000033
【図１４Ｅ】
2005515796.tif 000034
【図１４Ｆ】
2005515796.tif 000035
【図１５】
2005515796.tif 000036
【図１６】
2005515796.tif 000037
【図１７】
2005515796.tif 000038
【図１８】
2005515796.tif 000039
【図１９】
2005515796.tif 000040
【図２０】
2005515796.tif 000041
【図２１】
2005515796.tif 000042
【図２２Ａ】
2005515796.tif 000043
【図２２Ｂ】
2005515796.tif 000044
【図２２Ｃ】
2005515796.tif 000045
【図２２Ｄ】
2005515796.tif 000046
【図２３Ａ】
2005515796.tif 000047
【図２３Ｂ】
2005515796.tif 000048
【図２３Ｃ】
2005515796.tif 000049
【図２３Ｄ】
2005515796.tif 000050
【図２４Ａ】
2005515796.tif 000051
【図２４Ｂ】
2005515796.tif 000052
【図２４Ｃ】
2005515796.tif 000053
【図２４Ｄ】
2005515796.tif 000054
【図２４Ｅ】
2005515796.tif 000055
【図２４Ｆ】
2005515796.tif 000056
【図２４Ｇ】
2005515796.tif 000057
【図２４Ｈ】
2005515796.tif 000058
【図２５Ａ】
2005515796.tif 000059
【図２５Ｂ】
2005515796.tif 000060
【図２５Ｃ】
2005515796.tif 000061
【図２５Ｄ】
2005515796.tif 000062
【図２５Ｅ】
2005515796.tif 000063
【図２５Ｆ】
2005515796.tif 000064
【図２５Ｇ】
2005515796.tif 000065
【図２５Ｈ】
2005515796.tif 000066
【図２６Ａ】
2005515796.tif 000067
【図２６Ｂ】
2005515796.tif 000068
【図２６Ｃ】
2005515796.tif 000069
【図２６Ｄ】
2005515796.tif 000070
【図２６Ｅ】
2005515796.tif 000071
【図２６Ｆ】
2005515796.tif 000072
【図２７Ａ】
2005515796.tif 000073
【図２７Ｂ】
2005515796.tif 000074
【図２７Ｃ】
2005515796.tif 000075
【図２７Ｄ】
2005515796.tif 000076
【図２７Ｅ】
2005515796.tif 000077
【図２７Ｆ】
2005515796.tif 000078
【図２７Ｇ】
2005515796.tif 000079
【図２７Ｈ】
2005515796.tif 000080
【図２８Ａ】
2005515796.tif 000081
【図２８Ｂ】
2005515796.tif 000082
【図２８Ｃ】
2005515796.tif 000083
【図２８Ｄ】
2005515796.tif 000084
【図２８Ｅ】
2005515796.tif 000085
【図２８Ｆ】
2005515796.tif 000086
【図２８Ｇ】
2005515796.tif 000087
【図２８Ｈ】
2005515796.tif 000088
【図２８Ｉ】
2005515796.tif 000089
【図２８Ｊ】
2005515796.tif 000090
【図２８Ｋ】
2005515796.tif 000091
【図２８Ｌ】
2005515796.tif 000092
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月4日(2005.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ペプチドおよび培地を含有する、肉眼で見ることができる足場であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、これらは相補的かつ構造的に適合性であり、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる足場に自律的に組み立てられ；そしてここで、前記足場は、生存細胞をカプセル化し、該細胞は三次元配置で該足場に存在する、足場。
【請求項２】
前記細胞が軟骨細胞である、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項１に記載の足場。
【請求項４】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項３に記載の足場。
【請求項５】
前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも４０ｋＰＡである、請求項１に記載の足場。
【請求項６】
前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも９０ｋＰＡである、請求項５に記載の足場。
【請求項７】
インシュリン、トランスフェリン、および／またはセレニウムを含む溶液を含有する、請求項１に記載の足場。
【請求項８】
前記溶液が、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌのインシュリンを含有する、請求項７に記載の足場。
【請求項９】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのトランスフェリンを含有している、請求項７に記載の足場。
【請求項１０】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含有している、請求項７に記載の足場。
【請求項１１】
治療上有効な化合物または化学誘引物質をさらにカプセル化している、請求項１に記載の足場。
【請求項１２】
前記ペプチドが、哺乳動物中の細胞、組織、器官、器官系、または部位への標的化を提供する接着部位、成長因子結合部位、成長因子、または配列を含む、請求項１に記載の足場。
【請求項１３】
前記細胞が細胞外マトリックス成分を分泌する、請求項１に記載の足場。
【請求項１４】
前記細胞外マトリックス成分の分泌によって、前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも５０倍増大する、請求項１３に記載の足場。
【請求項１５】
前記カプセル化された細胞の少なくとも６０％が、別のカプセル化された細胞または前記足場の外側の細胞と細胞−細胞接触の状態にある、請求項１に記載の肉眼で見ることができる足場。
【請求項１６】
肉眼で見ることができる足場を形成する方法であって、以下：
（ａ）等浸透圧性溶質を含有する水溶液中で、ペプチドおよび生存細胞をインキュベートする工程であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そしてこれらは相補的かつ構造的に適合性である、工程；および
（ｂ）β−シート型の肉眼で見ることができる足場への該ペプチドの自律的な組み立てを開始するのに十分な電解質を該溶液に添加する工程であって、それによって該細胞は該足場の形成によりカプセル化され、そして三次元配置で該足場に存在する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記細胞が軟骨細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記足場を予め決定された圧縮機構に供する工程（ｃ）をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が、インシュリン、トランスフェリン、および／またはセレニウムを含有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶液が、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌのインシュリンを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのトランスフェリンを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶液が、前記足場の容積または形状を決定する寸法の、予め形成された鋳型の中に含まれ；それによって予め決定された形状または容積の、肉眼で見ることができる足場を形成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
細胞を培養する方法であって、以下：
（ａ）等浸透圧性溶質を含有する水溶液中で、ペプチドおよび生存細胞をインキュベートする工程であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そしてこれらは相補的かつ構造的に適合性である、工程；
（ｂ）β−シート型の肉眼で見ることができる足場への該ペプチドの自律的な組み立てを開始するのに十分な電解質を、該溶液に添加する工程であって、それによって該細胞は該足場の形成によってカプセル化され、そして三次元配置で該足場に存在する、工程；ならびに
（ｃ）該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記細胞が軟骨細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記足場を、予め決定された圧縮機構に供する工程（ｄ）をさらに包含する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶液が、インシュリン、トランスフェリン、および／またはセレニウムを含む溶液を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記溶液が、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌのインシュリンを含有する、請求項３１に記載の足場。
【請求項３３】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのトランスフェリンを含有する、請求項３１に記載の足場。
【請求項３４】
前記溶液が、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌのセレニウムを含有する、請求項３１に記載の足場。
【請求項３５】
請求項１に記載の足場を哺乳動物に投与する工程を包含する、組織の再生方法。
【請求項３６】
組織の再生方法であって、以下：
両親媒性ペプチド、生存細胞、等浸透圧性溶質を含有する水溶液を哺乳動物に投与する工程であって、ここで、該ペプチドは、交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そして相補的かつ構造的に適合性であり、ここで該ペプチドは、該投与前には実質的には自律的に組み立てられず、該ペプチドは、該投与後にβ−シート型の肉眼で見ることができる足場へと自律的に組み立てられ、それによってインビボで該細胞をカプセル化し、該細胞は三次元配置で該足場に存在する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、軟骨の欠損、結合組織の欠損、神経組織の欠損、表皮内層の欠損、内皮内層の欠損、糖尿病、または関節炎を処置または予防するために使用される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記足場を予め決定された圧縮機構に供する工程をさらに包含する。請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記圧縮機構が、前記細胞による細胞外マトリックス成分の分泌を誘導する、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも５０倍増大させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも１００倍増大させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞外マトリックス成分の分泌が、前記足場の平衡圧縮係数を少なくとも１５０倍増大させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記肉眼で見ることができる足場の１Ｈｚでの動剛性が、少なくとも１．０ＭＰａである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記圧縮機構が、前記足場に可変圧をかける工程を包含する。請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記圧縮機構が、静的オフセット圧縮に重ねられた、全体で０．０１Ｈｚと３Ｈｚとの間の動的圧縮に前記足場を供する工程を包含する、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記圧縮機構が、全体で０．１Ｈｚと１Ｈｚとの間の動的圧縮に前記足場を供する工程を包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ひずみの大きさが、全体で０．０１％と１０％との間である、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記ひずみの大きさが、全体で１％と５％との間である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記圧縮機構が、少なくとも１週間の間、前記足場に可変圧または定圧をかける工程を包含する、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記圧縮機構が、少なくとも３週間の間、前記足場に可変圧または定圧をかける工程を包含する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記圧縮機構が、１時間の間、前記足場に圧力をかける工程、および全体で１時間と７時間との間、圧力をかけずに該足場をインキュベートする工程を包含する、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記圧縮機構が少なくとも４回繰り返される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記圧縮機構が、４５分間、該足場に圧力をかける工程、および全体で１時間と７時間との間、圧力をかけずに該足場をインキュベートする工程を包含する、請求項２０、３０、または４１に記載の方法。
【請求項５７】
前記足場が、全体で５時間と６時間との間、圧力をかけずにインキュベートされる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記圧縮機構が少なくとも４回繰り返される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記足場を予め決定された剪断荷重機構に供する工程をさらに包含する、請求項２０、３０、または３５に記載の方法。
【請求項６０】
前記カプセル化された細胞の少なくとも６０％が、別のカプセル化された細胞と細胞−細胞接触の状態にある、請求項１６、２６、３５、または３６に記載の方法。
【請求項６１】
前記工程（ａ）の溶液が１０ｍＭ未満の電解質を含み、そして前記ペプチドが工程（ｂ）の前に実質的に自律的に組み立てられない、請求項１６または２６に記載の方法。
【請求項６２】
患者の組織の欠損を処置するためのキットであって、以下：
（ａ）交互の疎水性アミノ酸および親水性アミノ酸を有し、そしてこれらは相補的かつ構造的に適合性であり、そして等浸透圧性溶質を有する、ペプチド；
（ｂ）β−シート型の肉眼で見ることができる足場への該ペプチドの自律的な組み立てを開始するのに十分な電解質であって、それによって、細胞は、該足場の形成によりカプセル化され、そして三次元配置で該足場に存在する、足場；
（ｃ）該ペプチドの該足場への自律的な組み立てを開始するための指示書、
を備える、キット。
【請求項６３】
前記細胞が軟骨細胞である、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
軟骨細胞以外の細胞がまた前記足場中に存在する場合を除いて、前記細胞が軟骨細胞ではない、請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
前記細胞が骨髄細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、線維芽細胞、ニューロン細胞、海馬細胞、表皮細胞、内皮細胞、角化細胞、基底細胞、棘状細胞、顆粒細胞、胚性幹細胞、卵巣細胞、膵臓細胞、頸部細胞、肝臓細胞、または包皮細胞である、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
前記足場の平衡圧縮係数が少なくとも４０ｋＰＡである、請求項６２に記載のキット。
【請求項６７】
インシュリン、セレニウム、および／またはトランスフェリンを備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項６８】
治療上有効な化合物または化学誘引物質をさらにカプセル化する、請求項６２に記載のキット。
【請求項６９】
前記ペプチドが、哺乳動物中の細胞、組織、器官、器官系、または部位への標的化を提供する接着部位、成長因子結合部位、成長因子、または配列を備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項７０】
前記ペプチドを含有する溶液への添加のために前記細胞を調製する手段を備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項７１】
前記足場に圧力をかける手段を備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項７２】
所望される外形および／または容積に前記足場を形成するための鋳型を備える、請求項６２に記載のキット。
【請求項７３】
所望される細胞型の細胞および軟骨細胞を含み、ここで前記足場における軟骨細胞の存在が、該足場の硬度の増大を導く、請求項１に記載の足場。
【請求項７４】
前記足場が所望される細胞型の細胞および軟骨細胞を含み、ここで該足場における軟骨細胞の存在が、該足場の硬度の増大を導く、請求項１６、２６、３５、または３６に記載の方法。
【請求項７５】
両親媒性ペプチドおよび前駆細胞を含有する、肉眼で見ることができる構造であって、ここで該ペプチドは、実質的に等しい割合の疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸を含み、これらは相補的かつ構造的に適合性であり、そしてβ−シート型の肉眼で見ることができる構造に自律的に組み立てることができ；そしてここで、該前駆細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、神経前駆細胞、および肝臓前駆細胞からなる群より必要に応じて選択され、ここで該構造は、上皮増殖因子、神経成長因子、トランスフォーミング増殖因子β、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子−Ｉ、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、脳由来神経栄養因子、角化細胞増殖因子、骨形成タンパク質または軟骨由来増殖因子からなる群より選択される、増殖因子または分化促進因子を必要に応じて含み；そしてここで該前駆細胞は、必要に応じて該構造内にカプセル化され；そして該前駆細胞またはそれらの子孫の少なくとも一部は、成熟肝細胞またはニューロンのマーカーを発現する細胞へ分化または分化転換する、肉眼で見ることができる構造。
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月22日(2005.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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