(57)【要約】栄養飢餓ではなくそしてマイコバクテリアの対数増殖を支持する培養条件下でのマイコバクテリアの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓条件下でのマイコバクテリアの定常期培養中に発現がダウンレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定する方法が提供される。上記の方法は、低ＤＯＴ条件下で同時にダウンレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定するために、必要に応じて提供される。本発明のダウンレギュレートされた遺伝子は、核酸ワクチンの主成分を形成し、またはマイコバクテリア感染に対するワクチン用の弱毒化マイコバクテリアの調製を可能にするためのターゲットを提供する。同様に、このダウンレギュレートされた遺伝子によってコードされるペプチドは、ワクチンに用いられる。さらなる実施態様では、同定された遺伝子／ペプチドは、核酸プローブまたは抗体検出によって臨床試料中のマイコバクテリア感染の存在を同定するための手段を提供する。
2005518784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたM. tuberculosisペプチド、または該ペプチドのフラグメントもしくは誘導体もしくは改変体を含むマイコバクテリア感染の治療剤であって、該ペプチドが、M. tuberculosis遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現が、栄養飢餓ではなくそして該M. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされ、そして該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５からなる群より選択される、治療剤。
【請求項２】
前記M. tuberculosis遺伝子が、栄養飢餓培養条件および３７℃で測定した場合の１０％空気飽和以下の溶存酸素圧下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされる、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記遺伝子が、接種後少なくとも２５日の時点でダウンレギュレートされる、請求項１または２に記載の治療剤。
【請求項４】
発現が微生物潜伏中にダウンレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定する方法であって、該方法が、
栄養飢餓でありそして第１のマイコバクテリアの対数増殖を支持しない培養条件下で、第１のマイコバクテリアを培養する工程；
栄養飢餓ではなくそして第２のマイコバクテリアの対数増殖を支持する培養条件下で、第２のマイコバクテリアを培養する工程；
該第１および第２のマイコバクテリアから、第１および第２のｍＲＮＡ集団をそれぞれ得る工程であって、該第１のｍＲＮＡ集団が、定常期の間に採取された該第１のマイコバクテリアから得られ、そして該第２のｍＲＮＡ集団が、対数期増殖の間に採取された該第２のマイコバクテリアから得られる、工程；
該第１および第２のｍＲＮＡ集団から、第１および第２のｃＤＮＡ集団をそれぞれ調製する工程であって、該ｃＤＮＡ調製中に、検出可能な標識が、該第１および第２のｃＤＮＡ集団のｃＤＮＡ分子に導入される、工程；
該第１および第２のｃＤＮＡ集団から、対応する第１および第２のｃＤＮＡ分子をそれぞれ単離する工程；
該単離された第１および第２のｃＤＮＡ分子に存在する標識から放出される標識または対応するシグナルの相対量を比較する工程；
該単離された第１のｃＤＮＡ分子によって提供されるよりも多い量の該単離された第２のｃＤＮＡ分子によって提供される標識またはシグナルを同定する工程；および
該第１のｃＤＮＡおよびこれに対応する栄養飢餓条件下でのマイコバクテリアの培養中にダウンレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定する工程、
を含む、方法。
【請求項５】
前記対応する第１および第２のｃＤＮＡ分子が、マイコバクテリアゲノムＤＮＡから生成され、増幅固定化されたＤＮＡ配列を含むアレイプレートへのハイブリダイゼーションによって、前記第１および第２のｃＤＮＡ集団からそれぞれ単離され、該固定化された配列が、該マイコバクテリアゲノムの各既知の遺伝子の代表であり、そして各代表的配列が、該プレート上の同定された位置に固定化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のマイコバクテリアが、３７℃で測定した場合に１０％空気飽和以下の溶存酸素圧によって規定される培養条件下で培養され、そして該第１のマイコバクテリアが、該培養条件下で採取される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
相対ダウンレギュレーションが、前記単離された第２のｃＤＮＡ分子によって提供される標識またはシグナルの量よりも、前記単離された第１のｃＤＮＡ分子によって提供される標識またはシグナルの量が、相対的に３倍以上減少することによって同定される、請求項４から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
M. tuberculosisペプチドのインヒビターであって、該ペプチドが、M. tuberculosis遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現が、栄養飢餓ではなくそして該M. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされ、そして該インヒビターが、該M. tuberculosisペプチドが本来有する生物学的効果を発揮することを抑制または阻害し得、該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５からなる群より選択される、インヒビター。
【請求項９】
前記インヒビターが、エンドグルカナーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、無機リン酸トランスポータータンパク質、転写調節タンパク質、５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３、リボソームタンパク質Ｓ１、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ４、ウロポルフィリンIII Ｃ−メチルトランスフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンIIIメチラーゼ、ウローゲンIIIメチラーゼ、クリスタチオニンγシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリン［チオール］−リアーゼ、および亜鉛メタロプロテアーゼからなる群より選択されるタンパク質を阻害し得る、請求項８に記載のインヒビター。
【請求項１０】
前記ダウンレギュレートされたM. tuberculosis遺伝子あるいはその遺伝子産物をターゲティングし得る抗生物質；および、該ダウンレギュレートされた遺伝子の少なくとも一部に相補的であるアンチセンスまたは三重鎖形成核酸配列からなる群より選択される、請求項８または９に記載のインヒビター。
【請求項１１】
遺伝子によってコードされるペプチドに、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体に結合する抗体であって、該遺伝子の発現が、栄養飢餓ではなくそしてM. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされ、そして該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５からなる群より選択される、抗体。
【請求項１２】
遺伝子が改変されてマイコバクテリアが潜伏状態に入る能力が実質的に低下する弱毒化M. tuberculosisマイコバクテリアであって、該遺伝子が、その発現が栄養飢餓ではなくそして該M. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされる遺伝子であり、そして該遺伝子が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群から選択される野生型コード配列を有する、弱毒化M. tuberculosisマイコバクテリア。
【請求項１３】
遺伝子によってコードされるペプチド、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含む弱毒化微生物キャリアであって、該遺伝子の発現が、栄養飢餓ではなくそしてM. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされ、そして該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５からなる群より選択される、弱毒化微生物キャリア。
【請求項１４】
前記弱毒化微生物キャリアが、弱毒化サルモネラ菌、弱毒化ワクシニアウイルス、弱毒化鶏痘ウイルス、または弱毒化M. bovis（例えば、ＢＣＧ株）である、請求項１３に記載の弱毒化微生物キャリア。
【請求項１５】
プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含むＤＮＡプラスミドであって、該遺伝子の発現が、栄養飢餓ではなくそしてM. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされ、該プロモーターおよびポリアデニル化シグナルが、該ＤＮＡ配列に作動可能に連結され、そして該コード配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群より選択される、ＤＮＡプラスミド。
【請求項１６】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０プロモーターからなる群より選択され、および／または前記ポリアデニル化シグナルが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルから選択される、請求項１５に記載のＤＮＡプラスミド。
【請求項１７】
遺伝子または該遺伝子のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされる単離されたＲＮＡ配列であって、該遺伝子が、栄養飢餓ではなくそしてM. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされる遺伝子であり、そして該遺伝子が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群より選択されるコード配列を有する、単離されたＲＮＡ配列。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＲＮＡ配列および宿主細胞の染色体への組込み部位を含む、ＲＮＡベクター。
【請求項１９】
マイコバクテリア感染を治療または予防するための医薬品の製造における、
単離されたM. tuberculosisペプチドまたは該ペプチドのフラグメントもしくは誘導体もしくは改変体であって、該ペプチドが、M. tuberculosis遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現が、栄養飢餓ではなくそして該M. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされ、そして該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５からなる群より選択される、単離されたM. tuberculosisペプチドまたは該ペプチドのフラグメントもしくは誘導体もしくは改変体；
請求項８から１０のいずれかに記載のインヒビター；
請求項１１に記載の抗体；
請求項１２に記載の弱毒化M. tuberculosisマイコバクテリア；
請求項１３または１４に記載の弱毒化微生物キャリア；
遺伝子または該遺伝子のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体のコード配列に対応するＤＮＡ配列であって、該遺伝子が、栄養飢餓ではなくそして該M. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされ、該コード配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群より選択される、ＤＮＡ配列；
請求項１５または１６に記載のＤＮＡプラスミド；
請求項１７に記載のＲＮＡ配列；および／または
請求項１８に記載のＲＮＡベクター；
の使用。
【請求項２０】
M. tuberculosis感染を同定するための診断試薬の製造における、
単離されたM. tuberculosisペプチドまたは該ペプチドのフラグメントもしくは誘導体もしくは改変体であって、該ペプチドが、M. tuberculosis遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現が、栄養飢餓ではなくそして該M. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされ、そして該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５からなる群より選択される、単離されたM. tuberculosisペプチドまたは該ペプチドのフラグメントもしくは誘導体もしくは改変体；あるいは
請求項１１に記載の抗体；あるいは
少なくとも８ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブであって、該プローブが、遺伝子の少なくとも一部に結合し、該遺伝子の発現が、栄養飢餓ではなくそして該M. tuberculosisの対数増殖を支持する培養条件下でのM. tuberculosisの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのM. tuberculosisの定常期培養中にダウンレギュレートされる、ポリヌクレオチドプローブ；
の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコバクテリアの潜伏中に発現がダウンレギュレートされるマイコバクテリアの遺伝子を同定する方法；単離されたペプチド産物、その改変体、誘導体、またはフラグメント、ならびにそれらのインヒビター；該ペプチド、改変体、誘導体、またはフラグメントに結合する抗体；該ポリペプチド、改変体、誘導体、またはフラグメントを発現するＤＮＡおよびＲＮＡベクター；該遺伝子の少なくとも１つの活性が改変されている弱毒化マイコバクテリア；マイコバクテリア感染に対するワクチン；およびマイコバクテリア感染の存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの微生物は、細胞内感染を形成し得る。これらとしては、サルモネラ属、 エルシニア属、シゲラ属、カンピロバクター属、クラミジア属、およびマイコバクテリア属の種によって引き起こされる感染が挙げられる。これらの感染のいくつかは、もっぱら細胞内であり、他は細胞内および細胞外成分の両方を含む。しかし、疾患の進行についての主な支援因子と思われるのは、細菌感染の細胞内生存サイクルである。
【０００３】
一般的に、これらの微生物は、体内、例えば血流中で自由に循環せず、そしてしばしば薬物治療法に従順ではない。薬物が利用可能な場合、この問題は、多剤耐性微生物の発生によって悪化している。
【０００４】
多くの因子が、微生物耐性の問題に寄与している。１つは、長期にわたる変異の蓄積およびその後の変異した遺伝子の他の生物への水平および垂直移動である。したがって、所定の病原体について、全クラスの抗生物質が、不活性になっている。さらなる因子は、近年の新しいクラスの抗生物質の不在である。多剤耐性病原性細菌の出現は、公衆衛生に対して重篤な脅威を示し、そして新しい形態の治療が緊急に必要とされる。
【０００５】
同様の理由で、ワクチン療法は、このような細胞内微生物に対して有効性が確認されていない。また、細胞内でのバイオアベイラビリティーを改善するために抗生物質の全身濃度を上昇させることにより、重篤な副作用が生じ得る。
【０００６】
Mycobacterium tuberculosis（ＴＢ）および密接に関連する種は、Mycobacterium tuberculosis複合体（ＭＴＣ）として知られるマイコバクテリアの小さな群を構成する。この群は、世界中の大部分の結核（ＴＢ）症例の原因因子である５つの種M. tuberculosis、M. microti、M. bovis、M.caneti、およびM. africanumを含む。
【０００７】
M. tuberculosisは、全世界で１年に３００万名以上の死亡の原因である。他のマイコバクテリアもヒトおよび動物において病原性であり、例えば、M. avium subsp. paratuberculosisは、反芻動物においてヨーネ病を引き起こし、M. bovisは、ウシにおいて結核を引き起こし、M. aviumおよびM. intracellulareは、免疫不全患者（例えば、ＡＩＤＳ患者、および骨髄移植患者）において結核を引き起こし、そしてM. lepraeは、ヒトにおいてハンセン病を引き起こす。他の重要なマイコバクテリア種は、M. vaccaeである。
【０００８】
M. tuberculosisは、体内のマクロファージ細胞に感染する。ほとんどのM. tuberculosis細菌は、マクロファージ感染後すぐに、細胞のファゴソーム小胞内に侵入しそして複製し、そこで細菌は宿主防御および細胞外因子から隔離される。
【０００９】
細菌感染の細胞内生存および増殖または複製は、マイコバクテリア疾患の進行のための主な支援因子と思われる。
【００１０】
M. tuberculosis感染と戦うための多くの薬物治療法が提案されており、そして現在、薬物イソニアジドを含む組み合わせ治療が最も有効であることが確認されている。しかし、このような治療法の１つの問題は、治療が長期にわたるものであり、そしてこのような治療を完了させなければ、多剤耐性微生物の発生が促進され得ることである。
【００１１】
さらなる問題は、治療すべき細胞内で薬物の適切なバイオアベイラビリティーを提供することである。薬物の全身濃度を（例えば、より高用量を投与することによって）上昇させることは可能であるが、これは、上昇した薬物濃度によって引き起こされる重篤な副作用を生じ得る。
【００１２】
M. tuberculosisに対するワクチン予防の有効性は、大きく異なっている。現在のM. tuberculosisワクチンであるＢＣＧは、M. bovisの弱毒化株である。小児におけるＴＢの重篤な合併症に対して有効であるが、成人において、特に民族群間で、その有効性は大きく異なる。ＢＣＧワクチン接種は、結核性髄膜炎を予防するために用いられており、そして肺外の部位へのM. tuberculosisの蔓延を予防することを助けるが、感染を予防しない。
【００１３】
ＢＣＧの限られた有効性およびＴＢの全世界的な流行に対して、新しくより有効なワクチンを作り出すための国際的な努力が行われている。現在のパラダイムは、その防御がＴｈ１免疫応答の刺激によって媒介されることである。
【００１４】
人間におけるＢＣＧワクチン接種は、最初に導入されたときは経口投与であったが、その経路は、胃腸管通過中の生存ＢＣＧの損失および頻繁な頚部リンパ腺症のため中止された。実験動物種においては、ＢＣＧのエアロゾルまたは気管内送達は、有害な作用なく達成されていたが、霊長類、マウス、およびモルモットにおける非経口接種よりも優れた防御効果から、他の研究においては皮下経路を超える明らかな有利性がないことまで、有効性は異なっていた。
【００１５】
ＢＣＧを含む従来のマイコバクテリアワクチンは、疾患に対して防御し、そして感染に対しては防御しない。理想的には、新しいマイコバクテリアワクチンは、無菌免疫を与え、そして潜伏性マイコバクテリアを殺すかまたは活動性の疾患を引き起こす微生物の再活性化を抑制するために免疫系をブーストし得る曝露後ワクチンはまた、潜伏性感染に対して有効であり得る。
【００１６】
したがって、マイコバクテリア感染と戦うための改良されたおよび／または代替のワクチンまたは治療剤の必要がある。
【００１７】
マイコバクテリア感染、特にM. tuberculosis感染の制御に関連するさらなる主な問題は、マイコバクテリアに感染した無症候性個体が多数存在することである。休止期のマイコバクテリアは、第一線の薬物に対してさらにより抵抗性である。
【００１８】
マイコバクテリア（例えば、M. tuberculosis）の感染は、めったに活動性の疾患には至らず、そしてほとんどの個体は長年の間持続し得る潜伏性感染にかかり、再活性化されて疾患を生じるようになる（Wayne、1994）。このような感染を制御するための現在の方策は、活動的な疾患の患者の初期検出および治療である。これは、死亡を回避しそして伝染を制御するために必須であるが、感染者を排除すること、または再活性化による疾患の新しい症例を予防するには有効ではない。
【００１９】
さらに、皮膚テストによる潜伏性マイコバクテリア感染の従来の検出方法には、疑いがあり得る。例えば、ツベルクリン皮膚テストに基づく現在のＴＢ検出方法は、ＢＣＧワクチン接種によって、および環境中のマイコバクテリアへの曝露によって、疑いを招く。
【００２０】
したがって、マイコバクテリアの潜伏性感染をより有効に診断、治療、および予防するための新しい方策が必要とされる。
【００２１】
潜伏性マイコバクテリア感染の検出に向けた特異的な方策を開発するために、これらの微生物の生理学的、生化学的、および分子特性を明らかにすることが必要である。
【００２２】
しかし、現在、マイコバクテリアの潜伏性感染を研究するために適切なインビボモデルはなく、そしてこのようなモデルは、生じる生理学的変化および分子変化の詳細な分析を可能にするために十分な微生物材料を提供しそうにもない。
【００２３】
これに関して、遺伝子およびタンパク質発現プロファイルを分析するための従来のマイコバクテリア培養系は、単純な粗雑なバッチタイプシステムに基づいており、例えば、Sherman, D.R.ら (2001) PNAS, 98巻, 13号, 7534-7539頁；Imboden, P. (1998) Gene, 213巻, 107-117頁；Boon, C.ら (2001) J. Bacteriol., 183巻, 8号, 2672-2676頁；Cunningham, A.F.ら (1998) J. Bacteriol., 180巻, 4号, 801-808頁；およびMurugasu-Oei, B.ら (1999) Mol. Gen. Genet., 262巻, 677-682頁に記載されている。これらの粗雑なバッチシステムでは、対数増殖期および定常期を含む代表的なシグモイド増殖曲線によりマイコバクテリアが増殖する。対数増殖期から定常期への移行は、遺伝子およびタンパク質発現に関して迅速かつ一時的なスイッチを伴い、このスイッチは、マイコバクテリアが必須栄養の飢餓になるので、全くまたはほとんど確定していない相互作用する刺激の複雑なセットによって開始される。
【００２４】
要約すると、今までの研究では、結核菌が酸素枯渇グラジエントを生じそして沈殿層で非複製持続性状態に入らせる静置培養、または攪拌密封液体培養のいずれかが用いられてきた（WayneおよびLin、1982；CunninghamおよびSpreadbury、1998；WayneおよびHayes、1996）。これらのモデルにおける非複製持続性状態への移行は、グリオキシル酸代謝へのシフトダウン、イソニアジドおよびリファンピシンに対する耐性、ならびにメトロニダゾールの嫌気性殺菌作用に対する感受性と一致する（WayneおよびHayes、1996）。
【００２５】
このような研究は、ほとんど規定および制御されず、そして自己生成酸素枯渇グラジエントによる実験により、一貫しない結果が得られる。さらに、これらの研究は、インビボで重要であり得る他の物理化学的刺激と考えられず、そして比較的短期間、多くの場合は２〜３週で行われている。
【００２６】
上記の点で、インビボ環境の重要な特徴をシミュレートする、マイコバクテリア（例えば、ＴＢ）の持続性を研究するための規定および制御されたモデルの必要がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の第１の局面によれば、単離されたマイコバクテリアペプチド、または該ペプチドのフラグメントもしくは誘導体もしくは改変体が提供され、該ペプチドは、マイコバクテリア遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現は、栄養飢餓ではなくそして該マイコバクテリアの対数増殖を支持する培養条件下でのマイコバクテリアの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのマイコバクテリアの定常期培養中にダウンレギュレートされる。
【００２８】
本発明の第１の局面について記載された以下の種々の実施態様（例えば、好ましい培養条件、およびサンプリング時間）は、本発明の第２およびその後の局面に等しく適用する。
【００２９】
感染中、マイコバクテリア（例えば、M. tuberculosis）は、動的な宿主環境に遭遇し、そして感染に必要とされる遺伝子の発現を調節する。
【００３０】
本発明の選択条件は、マイコバクテリア潜伏性の維持に必要とされないマイコバクテリア遺伝子の同定を可能にする。したがって、このような選択条件は、活性なマイコバクテリア感染中、またはマイコバクテリアの再活性化中／後に、潜伏状態からインビボで発現され得る遺伝子の同定を可能にする。活性な感染とは、マイコバクテリアが、高い代謝活性を示しそして細胞分裂を行う感染性状態をいう。潜伏性は、以下でより詳細に議論する。
【００３１】
用語潜伏性は、持続性と同義であり、そして、マイコバクテリア細胞が細胞分裂せずに長期間生存し得る低代謝活性の可逆的状態の記述である。潜伏性（すなわち、潜伏感染）の間、マイコバクテリア感染に関連する臨床症状は出現せず、そして宿主は重い病気にかかっていない。
【００３２】
しかし、潜伏性のマイコバクテリアの再活性化は、環境刺激によって誘導され得、それにより、関連する臨床症状とともに活性なマイコバクテリア感染が発現する。本発明者らは、必要に応じて局所溶存酸素濃度の上昇とともに、栄養利用可能性の増加のような刺激が、再活性化を誘導し得ると考える。
【００３３】
例えば、潜伏性のマイコバクテリアの再活性化は、これまで制限されている栄養、および必要に応じて酸素が利用可能になるときに生じ得る。これは、例えば、マイコバクテリア感染肉芽腫構造の損傷後に起こり得る。
【００３４】
ＴＢ病原性の研究により、結核菌が、肺の多くの異なる位置に、例えば、細気管支に近接し空気が供給される空洞性病変の壁の内側に；酸素利用可能性がさらに制限され得るマクロファージ内または肉芽腫内に存在することが確立されている。肉芽腫では病原菌がマクロファージおよびリンパ球の層によって包まれそして長期間持続し得る。その肉芽腫構造の研究により、科学者らは、肉芽腫内の環境がおそらく最も無酸素であるという結論を導いた。したがって、ＴＢは、伝染および吸入の時点から肉芽腫における長期の持続性までの大気条件の範囲に遭遇し得る。
【００３５】
本発明者らは、M. tuberculosisのようなマイコバクテリアが、感染を引き起こすために、栄養、および必要に応じて酸素の利用可能性の変化に順応および応答可能でなければならないと考える。伝播および食作用を含む感染の最初の段階は、好気条件下で生じ、そして結核菌は、空洞性病変の好気的環境中およびマクロファージ内で迅速に複製する。
【００３６】
インビトロ研究は、M. tuberculosisのようなマイコバクテリアが、栄養および酸素枯渇条件下で順応および生存し得、そしてある範囲の酸素圧で増殖し得ることを証明した。炭素飢餓、および必要に応じて低溶存酸素圧への順応により、インビボでの潜伏性に類似し得るインビトロでの非複製持続状態への移行を引き起こす。
【００３７】
潜伏中に抑制されそして本発明により同定されている抗原は、疾患の活性段階中の複製している病原菌に対する有効な免疫応答の発現において、初期および重要な役割を果たし得、そして結果として、良好なワクチン候補物を提示する。さらに、潜伏条件下で抑制される遺伝子は、疾患の樹立、伝播、および再活性化を予防するための重要な治療ターゲットである。同定された遺伝子は、潜伏性マイコバクテリアの再活性化、およびこの再活性化された病原菌の複製に、おそらく必要とされるべきである。したがって、これらは、潜伏性感染の再活性化を予防するための治療剤および曝露後ワクチンの開発の重要なターゲットである。あるいは、この遺伝子は、潜伏性病原菌の再活性化を引き起こすように設計された治療法に利用され得る。再活性化した場合、結核菌は治療法に対してより感受性である。したがって、本発明の抗原および遺伝子は、マイコバクテリアによる感染前および感染後に対するワクチンの基礎を形成し得る。
【００３８】
本発明において用語「栄養飢餓」とは、主要な炭素源、および好ましくは主要なエネルギー源の濃度が、マイコバクテリアの最適な「対数増殖」を支持するためには不十分であることを意味する。「栄養飢餓」は、一般的に、バッチ培養増殖曲線の定常期に、または炭素濃度が枯渇に近づきそして増殖速度を制限し始める場合の後期対数／初期定常期の開始に関連する用語である。炭素以外の必須の栄養（例えば、窒素、鉄、および酸素）も、増殖を制限し得る。このような条件下、マイコバクテリアは、増殖速度の単純な低下よりもむしろ、代謝的に抑圧される。比較すると、「栄養制限」は、連続培養に関連する用語であり、そこでは、増殖が、培養系への必須栄養の添加の速度によって制御／制限される。
【００３９】
より詳細には、対数増殖は、マイコバクテリア細胞量の対数的な増加に関連する増殖期間であり（「log」期としても知られる）、そのとき、細菌は一般的な培養条件に対して最大の比増殖速度で増加している。この増殖期間中、必須栄養濃度は最小になり、そして最終産物の濃度が上昇する。しかし、一旦主要な炭素および／または主要なエネルギー源が臨界レベルまで低下すると、培養物内のすべてのマイコバクテリア細胞は、最適細胞機能および細胞分割を支持するために必要な十分な炭素および／またはエネルギーを得ることが、もはや不可能である。一旦これが生じると、対数増殖は停止し、そしてマイコバクテリアは定常期に入る。増殖はまた、阻害性二次代謝物の蓄積により、またはｐＨ変化の結果として、中止し得る。
【００４０】
炭素飢餓とは、通常は、細菌が増殖および／または複製できるには不十分である外因性炭素の供給をいう。しかし、増殖を支持することなく必須の細胞機能および生存性を維持するために利用可能な他のエネルギー源（例えば、内因性の予備物、二次代謝物）が存在し得る。したがって、炭素飢餓は、定常期条件に関連し、そこでは、炭素源が枯渇し、そして細菌増殖が実質的に中止されている。
【００４１】
定常期の開始期中に、ＤＮＡ合成は、細胞量の正味の増加が中止した後のある時間にわたり続けられ得、そしてマイコバクテリアは分裂して、サイズが小さくかつＲＮＡ含量が低い細胞を産生し得る。細胞外酵素を含む多くのタンパク質は、定常期中に合成され得る。
【００４２】
培養容器へのマイコバクテリア種菌の添加に対する定常期の開始は、特定のマイコバクテリア種／株、培養培地の組成（例えば、特定の主要な炭素およびエネルギー源）、および用いられる物理学的培養パラメータなどの多くの因子に依存する。
【００４３】
しかし、指針として、対数増殖期の終了および定常期の開始は、一般的に、マイコバクテリアの最大数の生存カウントに関連する増殖期の時点に対応する。
【００４４】
本発明での使用において、対数増殖期マイコバクテリア細胞は、最大数の総生存カウントが達成される前の増殖期のある時点で、培養容器から採取される。増殖期におけるこの時点は、ほぼμmaxに近い定常状態増殖速度を用いそして約１８〜２４時間の世代時間を提供する連続培養条件下で模倣され得る。好適な実施態様では、対数増殖期マイコバクテリア細胞は、培養培地１mlあたりの最大数の生存カウントよりも低い培養培地１ml当たりのlog単位での２〜0.5（より好ましくは１〜0.5）の値の生存カウントが達成された場合に、採取される。したがって、「対数」増殖期細胞は、一般的に、log中期に採取される。
【００４５】
例えば、最大生存カウント値が１ml当たり１×１０１０である場合、「対数」増殖期細胞は、好ましくは、１ml当たり１×１０８〜１×１０９．５（より好ましくは１×１０９〜１×１０９．５）の生存カウントの値が達成されたときに採取される。M. tuberculosisの場合、これは、接種後約３〜１０日、好ましくは４〜７日である。
【００４６】
同様に、本発明の使用において、定常期マイコバクテリア細胞は、最大数の総生存カウントが達成された後の増殖期のある時点で培養容器から採取される。増殖期におけるこの時点は、少なくとも３日の世代時間を支持する連続培養条件下で模倣され得る。好ましい実施態様では、定常期マイコバクテリア細胞は、１mlの培養培地当たりの生存カウントが、培養培地１mlあたりの最大数の生存カウントよりも、０．５〜３（より好ましくは１．５〜２．５）のlog単位まで低下した場合に、採取される。したがって、「定常」期細胞は、一般的に、定常期の中〜後期の間に採取される。
【００４７】
例えば、最大生存カウント値が、１ml当たり１×１０１０である場合、定常期細胞は、好ましくは、生存カウント数が、１ml当たり１×１０９．５〜１×１０７（より好ましくは１×１０８．５〜１×１０７．５）の生存カウントの値まで低下した場合に採取される。M. tuberculosisの場合、これは、接種後約２５〜６０日、好ましくは３０〜５０日、より好ましくは４０〜５０日である。マイコバクテリアについては、一般的には、定常期細胞は、好ましくは、接種後少なくとも２５日、好ましくは少なくとも３０日、より好ましくは少なくとも４０日に採取される。少なくとも１００日、さらには少なくとも１５０日もの、より長い接種後採取時間が用いられ得る。上記採取時間は、本発明のすべての局面に適用する。
【００４８】
本発明で用いられる好適な培養方法は、バッチファーメンター培養の方法である。従来の粗雑なＷａｙｎｅ型の単バッチ培養システムと比較して、本発明のバッチファーメンターシステムは、ｐＨ、温度、利用可能な栄養、および溶存酸素圧（ＤＯＴ）などの増殖培養パラメータの注意深いモニタリングを可能にする。特に、温度およびＤＯＴは、厳格に制御され得る。
【００４９】
したがって、本発明の方法の使用では、用いられる主な潜伏性誘導パラメータが、主要な炭素の飢餓、および好ましくは主要な炭素およびエネルギー源の飢餓であることを確実にすることが可能である。逆に、従来の粗雑な単バッチシステムは、培養したマイコバクテリアを複雑な範囲の相互作用する環境刺激に同時に曝露し、この刺激は、単離において単一の主な刺激に関連する細胞効果を隠すかまたは改変し得る。
【００５０】
したがって、本発明は、他の環境スイッチにもっぱら応答性である遺伝子の偶発的誘導またはアップレギュレーションが、実質的に抑制され得ることを、実質的に回避する。したがって、炭素飢餓および／またはエネルギー制限に関連しない条件下でダウンレギュレートされる遺伝子の偽陽性同定は、実質的に回避され得る。
【００５１】
マイコバクテリア培養に適切な培地は、Wayne, L.G. (1994)［Tuberculosis: Pathogenesis, Protection, and Control、the American Society for Microbiology発行, 73-83頁］に記載される。これらとしては、Middlebrook 7H9培地［Barker, L.P.ら (1998) Molec. Microbiol., 29巻(5), 1167-1177頁；および本出願人のWO00/52139を参照のこと］が挙げられる。
【００５２】
この方法の使用において、主要な炭素源（および好ましくは、主要なエネルギー源）の開始濃度は、少なくとも０．５g/l培養培地、好ましくは少なくとも１g/l培養培地である。このような濃度は、一般的に、栄養飢餓ではないと考えられる。同様に、定常期の開始は、一般的に、０．５g/l培養培地未満、好ましくは０．２g/l培養培地未満、およびより好ましくは０．１g/l培養培地未満の主要な炭素およびエネルギー源濃度に関連する。
【００５３】
好ましい実施態様では、主要な炭素およびエネルギー源は、グリセロールである。この成分の開始濃度は、少なくとも１g/l培養培地、好ましくは１〜３g/l培養培地、より好ましくは約２g/l培養培地である。定常期の開始は、０．２g/l培養培地未満、好ましくは０．１g/l培養培地未満の濃度に関連する。
【００５４】
グルコース、ピルビン酸、および脂肪酸（例えば、パルミチン酸、および酪酸）などの他の主要な炭素およびエネルギー源が用いられ得る。これらの源は、グリセロールと実質的に同じ濃度で用いられ得る。
【００５５】
培養培地のｐＨは、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５、最も好ましくは約ｐＨ６．９に維持される。
【００５６】
１つの実施態様では、溶存酸素圧（ＤＯＴ）は、培養プロセスを通して、３７℃で測定される場合に少なくとも４０％空気飽和、より好ましくは３７℃で測定される場合に５０〜７０％空気飽和、最も好ましくは３７℃で測定される場合に５０％空気飽和に維持される。
【００５７】
溶存酸素圧パラメータは、３７℃における酸素電極および従来の研究室技法によって算出される。したがって、１００％空気飽和は、空気で飽和される溶液に対応するが、０％は、窒素のような不活性ガスで徹底的にパージされている溶液に対応する。較正は、標準大気圧条件下および３７℃にて行われ、そして通常の空気は、約２１％酸素を含む。したがって、本出願において引用されるＤＯＴ値は、３７℃および標準大気圧で測定された場合のＤＯＴに関する。ＤＯＴは温度および圧力によって変動し得るので、参照温度および圧力が示される。
【００５８】
本発明の他の実施態様では、潜伏は、炭素および／またはエネルギー源飢餓と低ＤＯＴとの組み合わせによって誘導され得る。
【００５９】
好ましい実施態様では、ＤＯＴは、マイコバクテリア培養がlog期の初〜中期に入るまで、少なくとも４０％空気飽和、より好ましくは５０〜７０％空気飽和に維持される。次いで、ＤＯＴは、例えば、５または６日の期間にわたる増加が制限されるように、低下され得、そして培養物は、定常期細胞が採取されるまで、０〜１０％のＤＯＴ、好ましくは約５％以下のＤＯＴに維持される。
【００６０】
本発明者らは、本発明の炭素およびエネルギー飢餓ならびに必要に応じて低酸素圧の誘導条件が、感染中にインビボで通常発現される少なくとも１つの遺伝子の発現をマイコバクテリアに促す培養条件であると考える。
【００６１】
使用において、対数増殖期の非栄養飢餓条件に対して定常期の栄養飢餓条件下で少なくとも１．５倍までダウンレギュレートされる遺伝子（すなわち、検出アッセイにおいてｃＤＮＡで表される遺伝子）を選択することが好ましい。より好ましい実施態様では、対応するダウンレギュレーション選択基準は、少なくとも２倍、より好ましくは３倍、最も好ましくは４倍である。さらなる実施態様では、少なくとも１０倍、好ましく５０倍のダウンレギュレーションレベルが用いられ得る。上記ダウンレギュレーション基準は、本発明のすべての局面に適用する。
【００６２】
マイコバクテリアは、M. phlei、M. smegmatis、M. africanum、M. caneti、M. fortuitum、M. marinum、M. ulcerans、M. tuberculosis、M. bovis、M. microti、M. avium、M. paratuberculosis、M. leprae、M. lepraemurium、M. intracellulare、M. scrofulaceum、M. xenopi、M. genavense、M. kansasii、M. simiae、M. szulgai、M. haemophilum、M. asiaticum、M. malmoense、M. vaccae、M. caneti、およびM. shimoideiの種から選択される。ＭＴＣのメンバー、好ましくはM. tuberculosisが、特に重要である。
【００６３】
本明細書全体を通して、用語ペプチドは、タンパク質と同義である。
【００６４】
本発明のマイコバクテリアペプチド組成物の使用は、マイコバクテリアに感染した患者においてマイコバクテリアをターゲティングするための優れたワクチン候補物を提供する。
【００６５】
用語「単離された」、「実質的に純粋」、および「実質的に均一」は、天然に随伴する成分から分離されているペプチドを記載するために交換可能に使用される。少なくとも約６０〜７５％の試料が単一ペプチド配列を示す場合、ペプチドは実質的に純粋である。実質的に純粋なペプチドは、代表的には約６０〜９０％w/wのタンパク質試料、より通常には約９５％を含み、そして好ましくは約９９％以上純粋である。ペプチドの純度または均一性は、例えば、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いでゲルの染色での単一のポリペプチドバンドの可視化によって示され得る。あるいは、より高い分解能が、例えば、ＨＰＬＣを用いることによって提供され得る。
【００６６】
ペプチドは、その天然の状態で随伴する夾雑物から分離される場合に、単離されたと考えられる。したがって、化学的に合成されるかまたは天然由来の細胞とは異なる細胞系で合成されるペプチドは、天然に随伴する成分を実質的に含まない。
【００６７】
本発明は、マイコバクテリアから精製され得るペプチド、ならびにこれらのペプチドをコードする組換え核酸で形質転換された他のタイプの細胞から精製され得るペプチドを提供する。
【００６８】
所望であれば、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質配列決定法によって決定され得る。
【００６９】
用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、交換可能に使用され、そして特定の長さの産物をいうわけではない。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの翻訳後改変を包含する。
【００７０】
用語「フラグメント」とは、ダウンレギュレートされた問題の遺伝子の遺伝子産物であるペプチドの、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、および最も好ましくは少なくとも３５のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。フラグメントは、好ましくは、問題の遺伝子産物の少なくとも１つのエピトープを含む。
【００７１】
用語「改変体」とは、ダウンレギュレートされた問題の遺伝子の遺伝子産物であるペプチドと、少なくとも７０、好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも９０パーセントのアミノ酸配列相同性を有するペプチドまたはペプチドフラグメントを意味する。「改変体」の例は、アミノ酸の１以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸）または置換された連結を含む、ダウンレギュレートされた遺伝子のペプチドまたはペプチドフラグメントである。用語「相同性」および「同一性」は、本明細書において同義と考えられる。さらなる実施態様では、「改変体」は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの模倣物であり得、この模倣物は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの少なくとも１つのエピトープを再生する。この模倣物は、例えば、核酸模倣物、好ましくはＤＮＡ模倣物であり得る。
【００７２】
配列比較については、代表的には、１つの配列を参照配列として用い、これに対してテスト配列が比較され得る。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テストおよび参照配列は、コンピュータに入力され、次の座標が指定され、必要であれば、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する１または複数のテスト配列についての配列同一性のパーセンテージを算出する。
【００７３】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman［Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)］の局所相同性アラインメントアルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch［J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)］のアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman［Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)］の類似性方法についての検索によって、これらのアルゴリズム（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA - Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）のコンピュータ実行によって、または目視検査によって行われ得る［Current Protocols；Molecular Biology，F.M. Ausbelら編，Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubelを参照のこと］。
【００７４】
配列類似性のパーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである［Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410頁；およびthe National Center for Biotechnology Informationの「http://www.ncbi.nlm.nih.gov/」を参照のこと］。
【００７５】
好ましい相同性比較において、同一性は、少なくとも１０アミノ酸残基長、好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基長、より好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基長である配列の領域にわたり存在する。
【００７６】
用語「誘導体」とは、ダウンレギュレートされた問題の遺伝子の遺伝子産物であるペプチド（またはそのフラグメントもしくは改変体）を含むタンパク質を意味する。したがって、誘導体は、問題のペプチド、および１以上の追加のエピトープを導入し得るさらなるペプチド配列を含み得る。さらなるペプチド配列は、好ましくは、問題のペプチドの基本的なフォールディングおよびこのようなコンホメーション構造を妨害するべきではない。「誘導体」の例は、融合タンパク質、結合体、およびグラフトである。したがって、２以上のペプチド（またはフラグメントもしくは改変体）は、誘導体を形成するために一緒に連結され得る。あるいは、ペプチド（またはフラグメントもしくは改変体）は、関連のない分子（例えば、第２の関連のないペプチド）に連結され得る。誘導体は、化学的に合成され得るが、代表的には、組換え核酸方法によって調製される。脂質、および／または多糖、および／またはポリケチド成分などの追加の成分が含まれ得る。
【００７７】
分子「フラグメント」、「改変体」、および「誘導体」はすべて、共通の抗原性交差反応性、および／またはそれらが由来するダウンレギュレートされた問題の遺伝子の遺伝子産物と実質的に同じインビボ生物学的活性を有する。例えば、フラグメント、改変体、または誘導体に結合し得る抗体もまた、ダウンレギュレートされた問題の遺伝子の遺伝子産物に結合し得る。フラグメント、改変体、または誘導体がそれぞれ、ダウンレギュレートされた問題のペプチドであるペプチドの活性部位を有することが、好ましい特徴である。あるいは、本発明のペプチドの上記の実施態様のすべては、マイコバクテリア感染の抗原性成分に既に曝露されているＴリンパ球の「再現応答（recall response）」を誘導する共通の能力を有する。
【００７８】
好ましい実施態様では、ペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５からなる群より選択される。
【００７９】
本発明の第２の局面によれば、発現がマイコバクテリア潜伏中にダウンレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定する方法が提供され、この方法は、
栄養飢餓でありそして第１のマイコバクテリアの対数増殖を支持しない培養条件下で、第１のマイコバクテリアを培養する工程；
栄養飢餓ではなくそして第２のマイコバクテリアの対数増殖を支持する培養条件下で、第２のマイコバクテリアを培養する工程；
該第１および第２のマイコバクテリアから、第１および第２のｍＲＮＡ集団をそれぞれ得る工程であって、該第１のｍＲＮＡ集団が、定常期の間に採取された該第１のマイコバクテリアから得られ、そして該第２のｍＲＮＡ集団が、対数期増殖の間に採取された該第２のマイコバクテリアから得られる、工程；
該第１および第２のｍＲＮＡ集団から、第１および第２のｃＤＮＡ集団をそれぞれ調製する工程であって、該ｃＤＮＡ調製中に、検出可能な標識が、該第１および第２のｃＤＮＡ集団のｃＤＮＡ分子に導入される、工程；
該第１および第２のｃＤＮＡ集団から、対応する第１および第２のｃＤＮＡ分子をそれぞれ単離する工程；
該単離された第１および第２のｃＤＮＡ分子に存在する標識から放出される標識または対応するシグナルの相対量を比較する工程；
該単離された第１のｃＤＮＡ分子によって提供されるよりも多い量の該単離された第２のｃＤＮＡ分子によって提供される標識またはシグナルを同定する工程；および
該第１のｃＤＮＡ、およびこれに対応するマイコバクテリア潜伏中にダウンレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定する工程、を含む。
【００８０】
「ダウンレギュレートされた」という場合、スイッチオフであることを包含する。この遺伝子の転写が実質的にない場合、遺伝子はスイッチオフされている。
【００８１】
本明細書全体を通して、遺伝子という場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を包含する。
【００８２】
用語「第１および第２のｃＤＮＡ集団からの対応する第１および第２のｃＤＮＡ分子」とは、実質的に同じヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡをいう。したがって、各培養条件（すなわち、対数増殖期、および定常期）下で所定の遺伝子に関するｃＤＮＡコピーを単離することによって、各培養条件についての遺伝子のｃＤＮＡの相対コピー数を定量することが可能である。各ｃＤＮＡコピーは、ｍＲＮＡ分子から生成されているので、ｃＤＮＡコピー数は各培養条件についての対応するｍＲＮＡコピー数を反映し、したがって、ダウンレギュレートされた遺伝子を同定することが可能である。
【００８３】
１つの実施態様では、第１および第２のｃＤＮＡ分子は、特定のマイコバクテリア種のゲノム内の各公知の遺伝子（またはＯＲＦ）を代表する固定化ＤＮＡ配列を含むアレイとのハイブリダイゼーションによって、対応する第１および第２のｃＤＮＡ集団から単離される。したがって、第１のｃＤＮＡは、両方のｃＤＮＡが同じ固定化ＤＮＡ配列とハイブリダイズするならば、第２のｃＤＮＡに「対応する」と考えられ得る。あるいは、特定のマイコバクテリア株または多くの異なる種および／または株に由来する代表的なＤＮＡ配列が、アレイに用いられ得る。
【００８４】
他の実施態様では、第１および第２のｃＤＮＡは、蛍光標識の組込みによって調製される。第１および第２のｃＤＮＡは、異なる波長で蛍光を発する標識を組み込み得、それによって２つのｃＤＮＡ試料の二重蛍光および同時検出を可能にする。
【００８５】
天然に用いられる標識のタイプは、検出方法の出力が読まれる手段を決定する。蛍光標識を用いる場合、好ましくは、共焦点レーザースキャナーが用いられる。
【００８６】
１つの実施態様によれば、定常期および対数増殖期に培養したシステムからの蛍光標識したｃＤＮＡ配列は、マイコバクテリアゲノムアレイ全体とハイブリダイズすることが可能であった。第１のｃＤＮＡ集団を蛍光標識Ａで標識し、そして第２のｃＤＮＡ集団を蛍光標識Ｂで標識した。アレイを、各染料の励起可能な極大波長に対応する２つの異なる波長でスキャンし、そして発光の強度を記録した。次いで、好ましくは、各ｃＤＮＡについて複数のアレイを調製し、そして平均強度値を、各染料での各スポットについての２つのｃＤＮＡ集団にわたって算出し、それに対する相対誘導またはアップレギュレーションを定量した。
【００８７】
上記ｍＲＮＡ単離ならびにｃＤＮＡ調製および標識付けの他に、ゲノムＤＮＡは、第１および第２のマイコバクテリアから単離され得る。したがって、好ましい実施態様では、標識されたＤＮＡはまた、単離されたＤＮＡから調製される。標識されたＤＮＡは、次いで、コントロールとして各アレイ上に含まれ得る。
【００８８】
本発明の第３の局面によれば、マイコバクテリアペプチドのインヒビターが提供され、該ペプチドは、遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現は、栄養飢餓ではなくそして該マイコバクテリアの対数増殖を支持する培養条件下でのマイコバクテリアの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのマイコバクテリアの定常期培養中にダウンレギュレートされ、そして該インヒビターは、該マイコバクテリアペプチドが本来有する生物学的効果を発揮することを抑制または阻害し得る。
【００８９】
このようなインヒビターは、マイコバクテリア潜伏の開始を抑制、またはその期間において急変を引き起こす（すなわち、再活性化を誘導する）ために用いられ得る。これに関して、マイコバクテリアは、非潜伏状態である場合には、治療法に対してより感受性であり、そして潜伏性マイコバクテリア（例えば、ＴＢ）を殺すための薬物の組み合わせの使用は、新しい疾患の保有者をターゲティングすることによってマイコバクテリアの発生率を顕著に減少させ、それによって薬物耐性株の出現の問題を減少させる助けになる。
【００９０】
インヒビターは、ペプチド、炭化水素、合成分子、またはそれらのアナログであり得る。マイコバクテリアペプチドの阻害は、核酸レベル（すなわち、ＤＮＡ、またはＲＮＡ）、またはペプチドレベルで行われ得る。したがって、インヒビターは、ペプチドに直接作用し得る。あるいは、インヒビターは、例えば、ダウンレギュレートされたマイコバクテリア遺伝子の不活性化を引き起こすことによって、ペプチドに間接的に作用し得る。
【００９１】
好ましい実施態様では、インヒビターは、以下の１つ以上を阻害し得る：エンドグルカナーゼ、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、カルボキシメチルセルラーゼ、無機リン酸トランスポータータンパク質、転写調節タンパク質、５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３、リボソームタンパク質Ｓ１、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ４、ウロポルフィリンIII Ｃ−メチルトランスフェラーゼ、ウロポルフィリノーゲンIIIメチラーゼ、ウローゲンIIIメチラーゼ、クリスタチオニンγシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリン［チオール］−リアーゼ、および亜鉛メタロプロテアーゼ。
【００９２】
さらなる実施態様では、インヒビターは、本発明によって同定可能なダウンレギュレートされたマイコバクテリア遺伝子、またはその遺伝子産物をターゲティングし得る抗生物質であり得る。抗生物質は、好ましくは、遺伝子および／または遺伝子産物に特異的である。
【００９３】
さらなる実施態様では、インヒビターは、遺伝子または遺伝子産物に作用し得、後者は、ダウンレギュレートされた遺伝子と相互作用する。あるいは、インヒビターは、遺伝子またはその遺伝子産物に作用し得、そのとき、ダウンレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物が作用する。
【００９４】
本発明のインヒビターは、本明細書で提供される配列情報を利用して調製され得る。例えば、これは、ペプチドを過剰発現させ、そのペプチドを精製し、次いで精製されたペプチドについてのＸ線結晶解析を行うことによって、その分子構造が得られ得る。次に、ペプチドのすべてまたは一部あるいはその基質に類似する分子構造を有する化合物が生成される。次いで、この化合物は、ペプチドと組み合わされ、そしてペプチドに付着して１以上のその生物学的活性をブロックし得る。
【００９５】
炭素飢餓および必要に応じて低酸素圧下でのダウンレギュレーション（すなわち、ビルレンス）に関連する配列を含有するマイコバクテリア染色体の領域に結合する単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドも、本発明の範囲に包含され、アンチセンスおよび三重鎖形成ポリヌクレオチドが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「結合」とは、水素結合または他の分子力によって媒介される、オリゴヌクレオチドとターゲットヌクレオチド配列との間の相互作用または複合体生成をいう。用語「結合」とは、より詳細には、塩基−塩基水素結合によって媒介される２つのタイプのヌクレオチド間結合をいう。第１のタイプの結合は、「ワトソン−クリック−タイプ」結合相互作用であり、これは、アデニン−チミン（またはアデニン−ウラシル）およびグアニン−シトシンの塩基対が、塩基間の水素結合によって形成される。このタイプの結合の例は、ＤＮＡ二重らせんおよびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに伝統的に関連する結合であり；このタイプの結合は、通常は、ハイブリダイゼーション手順によって検出される。
【００９６】
第２のタイプの結合は、「三重鎖結合」である。一般的に、三重鎖結合とは、第３のポリヌクレオチド鎖と、ワトソン−クリック様式で既に対となっている二重鎖ＤＮＡ（またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）との、任意のタイプの塩基−塩基水素結合をいう。
【００９７】
好ましい実施態様では、インヒビターは、誘導可能またはアップレギュレート可能な遺伝子の少なくとも一部に相補的であるアンチセンス核酸配列であり得る。
【００９８】
使用するインヒビターは、核酸配列の形態である場合、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを含む。
【００９９】
本発明の第４の局面によれば、遺伝子によってコードされるペプチドに、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体に結合する抗体が提供され、該遺伝子の発現は、栄養飢餓ではない培養条件下でのマイコバクテリアの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのマイコバクテリアの定常期培養中にダウンレギュレートされる。
【０１００】
抗体は、好ましくは、問題のペプチドに特異性を有し、そしてそこへの結合によって、該ペプチドを発現しているマイコバクテリアのコーティングを開始し得る。細菌のコーティングは、好ましくは、そのオプソニン化を導く。これは、次には、細菌の破壊に至る。抗体が、ターゲティングされるマイコバクテリア（例えば、種および／または株）に特異的であることが好ましい。
【０１０１】
使用する場合、抗体は、好ましくは、単離された形態で行われる。
【０１０２】
抗体によるオプソニン化は、マクロファージにおけるレセプター媒介侵入および複製を抑制または調節することによって、食細胞および非食細胞におけるマイコバクテリアの細胞侵入および蔓延に影響し得る。
【０１０３】
本発明のペプチド、フラグメント、改変体、または誘導体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む抗体を産生するために使用され得る。ポリクローナル抗体が所望である場合は、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）に、免疫原性ポリペプチドを免疫する。免疫した動物からの血清を収集し、そして公知の手順に従って処理する。所望のマイコバクテリアエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が、他の抗原に対する抗体を含む場合、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。
【０１０４】
あるいは、ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成するための一般的方法論（例えば、細胞融合による不死化抗体産生細胞株の調製）、または他の技法（例えば、発癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−バーウイルスでのトランスフェクション）が用いられ得る。
【０１０５】
本発明のこの局面に用いられる抗体は、任意の抗体イソタイプファミリーに属し得るか、あるいはその誘導体または模倣物であり得る。本明細書全体を通して抗体というときは、組換え産生抗体、およびマイコバクテリア抗原に結合し得る抗体の任意の部分を包含する。
【０１０６】
１つの実施態様では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡイソタイプファミリーに属する。
【０１０７】
好ましい実施態様では、抗体は、ＩｇＡイソタイプファミリーに属する。本明細書全体を通してＩｇＡイソタイプというときは、この抗体の分泌形態（すなわち、ｓＩｇＡ）を包含する。ｓＩｇＡの分泌コンポーネント（ＳＣ）は、インビトロまたはインビボで付加され得る。後者の場合、患者の天然のＳＣ標識機構の使用が用いられ得る。
【０１０８】
１つの実施態様では、抗体は、ＭＴＣのメンバー由来のペプチド、好ましくはM. tuberculosisに対して惹起され得る。
【０１０９】
好ましい実施態様では、抗体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５（またはそのフラグメント、改変体、または誘導体）からなる群より選択されるペプチドに結合し得る。
【０１１０】
さらなる実施態様では、抗原は、マイコバクテリア病原菌の露出したコンポーネントである。他の実施態様では、抗原は、マイコバクテリア病原菌の細胞表面コンポーネントである。
【０１１１】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０１１２】
いかなる理論にも縛られることはないが、マイコバクテリアがマクロファージに感染した後、マクロファージは殺され、そして病原菌が放出され得る。この段階では、マイコバクテリアは、抗体攻撃に対して最も脆弱であると考えられる。したがって、本発明の抗体は、マクロファージの死後に放出された病原菌に作用し、そしてそれによって感染後効果を発揮することが可能である。
【０１１３】
マイコバクテリア病原菌上の抗原に対して本発明の抗体の接近性が増強されていることによって、本発明の受動防御局面（すなわち、抗体の送達）が容易になることが可能である。抗体結合が、そのオリゴマー構造の立体障害または破壊によってマクロファージ感染をブロックし得ることも可能である。したがって、殺されて感染したマクロファージから放出されたマイコバクテリア病原菌に作用する抗体は、新鮮なマクロファージへの再感染の蔓延を妨害し得る。この仮説は、抗体と、感染後早期に作用する細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、γδおよびＮＫＴ細胞）との間の相乗作用を含むが、後者は、ＣＤ８およびＣＤ４細胞傷害性Ｔ細胞もまた含み得る。
【０１１４】
本発明の第５の局面によれば、遺伝子が改変されてマイコバクテリアが潜伏状態に入る能力が実質的に低下する弱毒化マイコバクテリアが提供され、この遺伝子は、この遺伝子の発現が、栄養飢餓ではない培養条件下でのマイコバクテリアの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのマイコバクテリアの定常期培養中にダウンレギュレートされる遺伝子である。改変は、好ましくは、問題の遺伝子を不活性化し、そして好ましくは、マイコバクテリアを実質的に非病原性にする。
【０１１５】
用語「改変された」とは、マイコバクテリアが潜伏状態に入る能力を実質的に低下させる核酸または核酸配列の置換、欠失、または挿入などの任意の遺伝子操作をいう。１つの実施態様では、ダウンレギュレート可能な遺伝子全体が欠失され得る。
【０１１６】
好ましい実施態様では、改変されるべき遺伝子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６からなる群より選択される野生型コード配列を有する。
【０１１７】
上記野生型配列が、用いられるデータベースに依存してマイナーな改変を含み得ることが理解される。用語「野生型」は、問題の配列が天然にコード配列として存在することを示す。
【０１１８】
本発明の第６の局面によれば、弱毒化微生物キャリアが提供され、これは、遺伝子によってコードされるペプチド、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含み、この遺伝子の発現は、栄養飢餓ではない培養条件下でのマイコバクテリアの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのマイコバクテリアの定常期培養中にダウンレギュレートされる。
【０１１９】
使用する場合、ペプチド（またはフラグメント、改変体、もしくは誘導体）は、このキャリアの表面に少なくとも部分的に露出するか、またはキャリアがインビボで分解されてペプチド（またはフラグメント、改変体、もしくは誘導体）の少なくとも一部が宿主の免疫系に曝露されるかのいずれかである。
【０１２０】
好ましい実施態様では、弱毒化微生物キャリアは、弱毒化サルモネラ、弱毒化ワクシニアウイルス、弱毒化鶏痘ウイルス、または弱毒化M. bovis（例えば、ＢＣＧ株）である。
【０１２１】
好ましい実施態様では、ペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５からなる群より選択される。
【０１２２】
本発明の第７の局面によれば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および遺伝子または該遺伝子のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドが提供され、この遺伝子の発現は、栄養飢餓ではない培養条件下でのマイコバクテリアの対数増殖期培養と比較した場合に、栄養飢餓培養条件下でのマイコバクテリアの定常期培養中にダウンレギュレートされ、該プロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、該ＤＮＡ配列に作動可能に連結される。遺伝子というときは、好ましくは、ダウンレギュレートされた遺伝子のペプチドコード配列を意味する。
【０１２３】
本発明で使用される用語ＤＮＡ「フラグメント」は、通常、少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチド）、より通常には少なくとも約７〜１５コドン、および最も好ましくは少なくとも約３５コドンを含む。このヌクレオチド数は、通常、このような配列と特異的にハイブリダイズする好ましいプローブに必要とされるほぼ最小長である。
【０１２４】
好ましい実施態様では、ＤＮＡ「フラグメント」は、対応するダウンレギュレートされた遺伝子のコード配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、およびより好ましくは少なくとも８０％であるヌクレオチド長を有する。
【０１２５】
用語ＤＮＡ「改変体」とは、ダウンレギュレートされた遺伝子のコード配列（またはそのフラグメント）との実質的な相同性または実質的な類似性を有するＤＮＡ配列を意味する。核酸またはそのフラグメントは、他の核酸（またはその相補鎖）と（適切なヌクレオチド挿入または欠失とともに）最適にアラインした場合に、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常は少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５〜９８％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列同一性があるならば、もう一方に「実質的に相同」（または「実質的に類似」）である。相同性決定は、ペプチドについて上記のように行われる。
【０１２６】
あるいは、ＤＮＡ「改変体」は、選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る場合、ダウンレギュレートされた遺伝子のコード配列（またはそのフラグメント）と、実質的に相同（または実質的に類似）である。ハイブリダイゼーションの選択性は、全体的に特異性がない場合よりも実質的により選択的であるハイブリダイゼーションが生じる場合に存在する。代表的には、少なくとも約１４ヌクレオチドの長さにわたって少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性がある場合に、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12: 203-213を参照のこと。上記のように、相同性比較の長さは、より長い長さにわたるものであり得、そしてある実施態様では、しばしば、少なくとも約１７ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの長さにわたる。
【０１２７】
核酸ハイブリダイゼーションが、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズしている核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度（例えば、NaCl）、温度、または有機溶媒のような条件によって影響を受けることは、当業者には容易に理解される。好ましくは、ストリンジェントな温度条件が用いられ、そして一般的には３０℃超える、代表的には３７℃を超える、および好ましくは４５℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、普通には１０００ｍＭ以下、代表的には５００ｍＭ以下、および好ましくは２００ｍＭ以下である。ｐＨは、代表的には７．０〜８．３である。しかし、パラメータの組み合わせは、任意の単一のパラメータの基準よりも非常に重要である。例えば、WetmurおよびDavidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370を参照のこと。
【０１２８】
用語ＤＮＡ「誘導体」とは、ダウンレギュレートされた遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列（またはそのフラグメントもしくは改変体）およびこのコード配列に対応するＤＮＡ配列には天然に随伴しない追加のＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡポリヌクレオチドを意味する。上記のペプチド誘導体についてのコメントもまた、ＤＮＡ「誘導体」に適用される。「誘導体」は、例えば、栄養飢餓中に誘導されるマイコバクテリアオペロンの２以上のコード配列を含み得る。したがって、コード配列間の非コード領域の存在または不在に依存して、このような「誘導体」の発現産物は、融合タンパク質、または個々のコード領域によってコードされる別々のペプチド産物であり得る。
【０１２９】
上記の用語ＤＮＡ「フラグメント」、「改変体」、および「誘導体」は、互いに共通して、得られるペプチド産物が対応する野生型ペプチドと実質的に同じ交差反応性抗原性特性を有する。好ましくは、本発明の上記ＤＮＡ分子実施態様のペプチド産物のすべては、野生型ペプチドにも結合する抗体と結合する。あるいは、上記のペプチド産物のすべては、マイコバクテリア感染の抗原性成分に既に曝露されているＴリンパ球の「再現応答」を誘導し得る。
【０１３０】
プロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、好ましくは、遺伝子が真核生物細胞中で発現されることを確実にするように選択される。強力なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが好ましい。
【０１３１】
関連の局面では、本発明は、本発明のＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされる単離されたＲＮＡ分子を提供する。
【０１３２】
「単離された」ＲＮＡは、目的の配列と天然に随伴する他のマイコバクテリア成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、ならびにＤＮＡおよび他の染色体配列のような他のマイコバクテリアポリヌクレオチド）から実質的に分離されるＲＮＡである。
【０１３３】
上記ＲＮＡ分子は、例えば、ワクチン成分のように宿主細胞に直接導入され得る。
【０１３４】
あるいは、ＲＮＡ分子は、投与前にＲＮＡベクターに組込まれ得る。
【０１３５】
本発明のポリヌクレオチド配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）としては、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列、および組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物、および化学的に合成されたアナログまたは異種系によって生物学的に合成されたアナログが挙げられる。
【０１３６】
本明細書で用いる場合、用語「組換え体」とは、その起源または操作によって、（１）天然に随伴するポリヌクレオチドのすべてまたは一部に随伴しない；または、（２）天然に連結される以外のポリヌクレオチドに連結される；および（３）天然に存在しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意図する。この人工的な組み合わせは、しばしば、化学合成手段、あるいは核酸の単離されたセグメントの人工的な操作（例えば、遺伝子操作技法）のいずれかによって達成される。通常、この操作は、コドンを、同じまたは保存的アミノ酸をコードする重複コドンで置換することが行われるが、代表的には、配列認識部位を導入または除去する。あるいは、機能の所望の組み合わせを生成するために、所望の機能の核酸セグメントを一緒に連結することが行われる。
【０１３７】
本発明の実施態様では、ポリヌクレオチドは、栄養飢餓条件下でダウンレギュレートされるペプチド（またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体）をコードし得る。核酸は、その天然の状態でまたは操作された場合に、転写および／または翻訳されて、ペプチド（またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体）を生成し得るならば、ペプチドを「コードする」という。このような核酸のアンチセンス鎖も、ペプチド（またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体）をコードするという。
【０１３８】
目的のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも、本発明の範囲内に意図される。発現ベクターは、一般的には、適切な転写および翻訳調節エレメントに作動可能に連結されるペプチドをコードする、複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターに通常含まれる調節エレメントの例は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および終止配列である。これらの調節エレメントは、翻訳される配列に作動可能に連結される。核酸配列は、他の核酸配列と機能的関連に配置される場合、作動可能に連結される。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、作動可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が連続的であり、そして２つのタンパク質のコード領域を連結することが必要な場合、連続的かつリーディングフレーム内であることを意味する。ビルレンス因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに用いられる調節エレメントは、発現に用いられる宿主細胞において機能的である。
【０１３９】
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の手段によって調製され得る。例えば、大量のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞中で複製によって産生され得る。所望のフラグメントをコードする天然または合成ＤＮＡフラグメントは、原核生物または真核生物細胞に導入およびそこで複製し得る、組換え核酸構築物、代表的には、ＤＮＡ構築物に組込まれる。通常は、ＤＮＡ構築物は、単細胞宿主（例えば、酵母または細菌）中での自律複製に適切であるが、培養された昆虫、哺乳動物、植物、または他の真核生物の細胞株のゲノム内への導入および組込みも意図され得る。
【０１４０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法によって、化学合成によって生成され得、そして市販の自動オリゴヌクレオチド合成機で合成され得る。二本鎖フラグメントは、相補鎖を合成しそして適切な条件下でこの鎖を一緒にアニールすること、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を加えることのいずれかによって、化学合成の一本鎖産物から得られ得る。
【０１４１】
原核生物または真核生物宿主ヘの導入のために調製されるＤＮＡ構築物は、代表的には、宿主によって認識される複製システムを含み、これは、所望のペプチドをコードする目的のＤＮＡフラグメントを含み、そして好ましくは、ポリペプチドコードセグメントに作動可能に連結される転写および翻訳開始調節配列も含む。発現ベクターは、例えば、複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）および発現調節配列、プロモーター、エンハンサー、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終止配列、およびｍＲＮＡ安定化配列を含み得る。選択した宿主細胞から分泌されるポリペプチド由来の分泌シグナルも、適切である場合、含まれ得、したがって細胞膜にタンパク質を交差および／または留まらせ、したがって、その機能的トポロジーを獲得しまたは細胞から分泌される。
【０１４２】
適切なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は、宿主中で機能的であるように選択され、そして、適切である場合、マイコバクテリア遺伝子に天然に随伴する配列を含み得る。ｔｒｐ、ｌａｃ、およびファージプロモーターのようなプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、ならびに解糖系酵素プロモーターは、原核生物宿主で使用され得る。有用な酵母プロモーターとしては、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ、または他の解糖系酵素（例えば、エノラーゼまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、マルトースおよびガラクトース利用に寄与し得る酵素などについてのプロモーター領域が挙げられる。
【０１４３】
適切な非天然哺乳動物プロモーターとしては、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、あるいはマウスモロニー白血病ウイルス、マウス乳癌ウイルス、トリ肉種ウイルス、アデノウイルスII、ウシパピローマウイルス、またはポリオーマ由来のプロモーターが挙げられ得る。さらに、構築物は、増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に連結され得、そのため遺伝子の複数のコピーが作成され得る。
【０１４４】
このような発現ベクターは自律複製し得るが、これらは、好ましくは、宿主細胞のゲノムに挿入されることによってはあまり複製され得ない。
【０１４５】
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカー、すなわち、ベクターで形質転換される宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。この遺伝子の存在は、挿入物を発現する宿主細胞のみの増殖を確実にする。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなどに耐性を与える；（ｂ）栄養欠失を補う；または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養を供給する、タンパク質をコードする（例えば、バシラス属についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。適切な選択可能マーカーの選択は、宿主細胞に依存する。
【０１４６】
目的の核酸を含むベクターは、インビトロで転写され得、そして得られるＲＮＡは宿主細胞に（例えば、注入によって）導入され得るか、あるいは、ベクターは、細胞宿主のタイプに依存して異なる方法によって宿主細胞に直接導入され得、これらの方法としては、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；感染（ここではベクターは、レトロウイルスゲノムのような感染性因子である）が挙げられる。上記の核酸が導入されている細胞は、このような細胞の子孫も包含することを意味する。
【０１４７】
本発明の大量の核酸およびペプチドは、適合可能な原核生物または真核生物宿主細胞においてベクターまたは他の発現ベヒクル中で核酸またはその一部を発現させることによって調製され得る。最も一般的に用いられる原核生物宿主は、Escherichia coliの株であるが、Bacillus subtilisまたはシュードモナス属のような他の真核生物も使用され得る。
【０１４８】
哺乳動物または他の真核生物宿主細胞、例えば、酵母、糸状菌、植物、昆虫、両生類、鳥類の種の細胞もまた、本発明のタンパク質の産生に有用であり得る。培養物中における哺乳動物細胞の増殖は、それ自体周知である。通常用いられる哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株であるが、例えば、より高発現、所望のグリコシル化パターンを提供するために、他の細胞株が適切であり得る。
【０１４９】
クローンは、ベクター構築物の態様に依存してマーカーを使用することによって選択される。マーカーは、同じまたは異なるＤＮＡ分子、好ましくは同じＤＮＡ分子上にあり得る。形質転換体は、スクリーニングされ、あるいは、好ましくは、当業者に周知の任意の手段によって、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンのような抗生物質への耐性によって、選択され得る。
【０１５０】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、形質転換、形質導入、およびエレクトロポレーションを含む、当該技術分野で公知の任意の手段によって、宿主細胞に挿入され得る。本明細書で使用する場合、「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および微生物または単細胞体として培養された高等真核生物細胞株を示す他のこのような用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡについてのレシピエントとして使用され得るまたは使用されている細胞をいい、そして形質転換されている元の細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、天然、偶然、または意図的な変異のため、形態学的にまたはゲノムもしくはＤＮＡ相補物全体において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。本明細書で使用する場合、「形質転換」とは、挿入に使用される方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−接合、またはエレクトロポレーションにかかわらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいう。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えば、プラスミドとして維持され得るか、あるいは、宿主細胞ゲノム中に組込まれ得る。
【０１５１】
１つの実施態様では、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡベクターは、ペプチドでのチャレンジ後に免疫応答に特異的である免疫系の成分をコードし得、該ペプチドは、栄養飢餓培養条件下でダウンレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子によってコードされる。
【０１５２】
このような成分の例は、ダウンレギュレートされる遺伝子のペプチド産物に対する抗体である。したがって、１つの実施態様では、核酸配列（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡベクター）は、問題の抗体をコードする。
【０１５３】
本発明においては、用語プラスミドは、ベクターと等価である。したがって、プラスミドは、直線状または環状核酸のいずれかであり得る。
【０１５４】
第８の局面は、マイコバクテリア感染を治療または予防するための医薬品の製造における、上記のペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体、インヒビター、抗体、弱毒化マイコバクテリア、弱毒化微生物キャリア、栄養飢餓条件下でダウンレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含むＤＮＡプラスミド、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされるＲＮＡ配列、および／または該ＲＮＡ配列を含むＲＮＡベクターの使用を提供する。
【０１５５】
用語「予防する」とは、マイコバクテリア感染の重篤度／強度、またはその開始を減少させることを包含する。
【０１５６】
用語「治療する」とは、マイコバクテリア感染の感染後治療および改善を包含する。
【０１５７】
関連の局面では、マイコバクテリア感染の治療または予防方法が提供され、この方法は、上記のペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体、インヒビター、抗体、弱毒化マイコバクテリア、弱毒化微生物キャリア、栄養飢餓条件下でダウンレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含むＤＮＡプラスミド、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされるＲＮＡ配列、および／または該ＲＮＡ配列を含むＲＮＡベクターからなる群より選択される医薬品を患者に投与する工程を包含する。
【０１５８】
本発明のペプチドのエピトープの免疫原性は、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原と結合されるような粒子形成タンパク質と融合または会合される、哺乳動物または酵母系においてペプチドを調製することによって増強され得る。ワクチンは、本発明の１以上の免疫原性ペプチドから調製され得る。
【０１５９】
代表的には、このようなワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能薬物として調製され；注射前に溶液または懸濁液とするのに適切な固体形態も調製され得る。調製物はまた、乳化され得、あるいはペプチドはリポソーム中にカプセル化される。活性な免疫原性成分は、しばしば、薬学的に受容可能でありそして活性成分と適合可能な賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効果を増強するアジュバントなどの少量の補助物質を含み得る。効果的であり得るアジュバントの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰという）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥという）、およびＲＩＢＩ（これは、２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含む）。
【０１６０】
ワクチンは、従来どおり、注射によって、例えば、皮下または筋肉内のいずれかに、非経口投与される。他の態様の投与に適切であるさらなる処方物としては、坐剤、およびある場合には、経口処方物、またはエアロゾルのような散布に適切な処方物が挙げられる。坐剤については、伝統的な結合剤およびキャリアとして、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得；このような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。経口処方物は、例えば、医薬品用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物、または粉剤の形態をとり、そして１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。
【０１６１】
ペプチドは、中性または塩形態としてワクチン中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などのような有機酸とともに形成される。遊離のカルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。
【０１６２】
ワクチンは、投与処方物と適合可能な様式で、および予防的および／または治療的に有効な量で投与される。投与されるべき量は、一般的には、用量あたり５μｇから２５０μｇ抗原の範囲であるが、治療されるべき被験者、被験者の免疫系が抗体を合成する能力、および所望の防御の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、主治医の判断に依存し、そして各被験者に特有であり得る。
【０１６３】
ワクチンは、単回投与スケジュールで、好ましくは多回投与スケジュールで投与され得る。多回投与スケジュールは、ワクチン接種の初回のコースは１〜１０の別々の投与量であり得、次いで免疫応答を維持およびまたは再強化するために必要なその後の時間間隔で他の投与が行われ、例えば、２回目の投与については１〜４カ月目であり、必要ならば、数カ月後にその後の１または複数回の投与が行われる。投与方法はまた、少なくとも一部は、個体の必要性によって決定され、そして主治医の判断に依存する。
【０１６４】
さらに、１または複数の免疫原性マイコバクテリア抗原を含むワクチンは、他の免疫調節剤（例えば、免疫グロブリン）および抗生物質とともに投与され得る。
【０１６５】
医薬品は、従来の経路、例えば、静脈内、腹腔内、鼻内経路によって投与され得る。
【０１６６】
抗体含有組成物の投与の成果は、感染の部位への抗体の伝搬の効率に依存し得る。マイコバクテリア呼吸器感染（例えば、M. tuberculosis感染）の場合、これは、肺への抗体の効率的な伝搬によって容易にされ得る。
【０１６７】
１つの実施態様では、医薬品は、鼻内（i.n.）に投与され得る。この送達の態様は、M. tuberculosis感染の送達の経路に対応し、そして、抗体送達の場合、抗体が感染部位に存在して、細菌が細胞内に入る前および細胞間に広がる期間中にも、細菌と戦うことを確実にする。
【０１６８】
鼻内組成物は、１００〜５０００μm、好ましくは５００〜４０００μm、より好ましくは１０００〜３０００μmの範囲のおおよその直径を有する液滴形態で投与され得る。あるいは、容量では、液滴は、０．００１〜１００μl、好ましくは０．１〜５０μl、より好ましくは１．０〜２５μlのおおよその範囲である。
【０１６９】
鼻内投与は、鼻液滴を塗布することによって、または鼻噴霧によって達成され得る。
【０１７０】
鼻液滴の場合、液滴は、代表的には、約１０００〜３０００μmの直径および／または１〜２５μlの容量を有し得る。
【０１７１】
鼻噴霧の場合、液滴は、代表的には、約１００〜１０００μmの直径および／または０．００１〜１μlの容量を有し得る。
【０１７２】
抗体のi.n.送達後、肺への移行は、粘膜分泌の逆流によって容易にすることが可能であるが、気道における粘膜繊毛作用は、粘液内の粒子を肺から取り除くと考えられる。肺洗浄における比較的長い持続、胆汁からの速いクリアランス、およびいくつかの抗体の唾液ヘの輸送の欠損は、粘膜部位特異的なメカニズムの役割を示唆する。
【０１７３】
異なる実施態様では、医薬品は、エアロゾル処方物で送達され得る。エアロゾル処方物は、粉剤、懸濁剤、または液剤の形態をとり得る。
【０１７４】
エアロゾル粒子のサイズは、エアロゾルの送達能力に関連する１つの因子である。したがって、より小さい粒子は、より大きな粒子よりも、肺胞に向かって気道をさらに下方へ移動し得る。１つの実施態様では、エアロゾル粒子は、気管支、細気管支、および肺胞の全長に沿った送達を容易にするための直径分布を有する。あるいは、粒子サイズ分布は、気道の特定の部分、例えば、肺胞をターゲティングするために選択され得る。
【０１７５】
エアロゾル粒子は、噴霧吸入器または鼻噴霧によって送達され得る。
【０１７６】
医薬品のエアロゾル送達の場合、粒子は、０．１〜５０μm、好ましくは１〜２５μm、より好ましくは１〜５μmのおおよその範囲の直径を有し得る。
【０１７７】
本発明の医薬品のエアロゾル処方物は、必要に応じて、噴射剤および／または界面活性剤を含み得る。
【０１７８】
患者に投与されるべき液滴のサイズを本発明の所定の範囲に制御することによって、肺胞への不注意の抗原送達を回避／最小化し、したがって、肺の炎症および線維形成瘢痕化のような肺胞に関連する病理学的問題を回避できる。
【０１７９】
i.n.ワクチン接種は、鼻および気管支関連粘膜組織におけるＴおよびＢ細胞の両方が媒介するエフェクターメカニズムに適合し、これは、他の粘膜関連リンパ様組織とは異なる。
【０１８０】
鼻内経路の投与によって誘起される防御メカニズムとしては、優先的な肺ホーミングを有するＴリンパ球の活性化；共刺激性分子、例えば、Ｂ７．２のアップレギュレーション；および／またはマクロファージまたは分泌性ＩｇＡ抗体の活性化が挙げられ得る。
【０１８１】
抗原の鼻内送達によって、粘膜抗体応答が容易に誘起され得るが、これは、Ｔ細胞応答における抗体産生を助けるＴｈ２表現型へのシフトによる。粘膜応答は、増強されたＩｇＡ産生によって特徴づけられ、そしてＴｈ２応答は、増強されたＩＬ−４産生によって特徴づけられる。
【０１８２】
マイコバクテリア抗原の鼻内送達は、抗原を呼吸器系の粘膜下Ｂ細胞にターゲティングさせる。これらのＢ細胞は、哺乳動物において主要な局所ＩｇＡ産生細胞であり、そして鼻内送達は、マイコバクテリア抗原に対するこれらの細胞によるＩｇＡ産生の迅速な増加を容易にする。
【０１８３】
１つの実施態様では、マイコバクテリア抗原を含む医薬品の投与は、ＩｇＡ抗体産生を刺激し、そしてＩｇＡ抗体は、マイコバクテリア抗原に結合する。他の実施態様では、粘膜および／またはＴｈ２免疫応答が刺激される。
【０１８４】
他の実施態様では、モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を惹起するために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、防御が所望される感染性因子の抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。これらの抗イディオタイプ抗体も、マイコバクテリア感染の治療、ワクチン接種、および／または診断に有用であり得る。
【０１８５】
本発明の第９の局面によれば、本発明のペプチド（そのフラグメント、改変体、および誘導体を含む）およびそれに結合する抗体は、生物学的試料において、マイコバクテリアに対する抗体の存在、またはビルレンスに関連する抗原の存在を検出するためのイムノアッセイに有用である。イムノアッセイの設計は、非常に多くのバリエーションがあり得、そして多くの形式が当該技術分野で知られている。イムノアッセイは、本発明のペプチドに由来する少なくとも１つのエピトープを利用し得る。１つの実施態様では、イムノアッセイは、このようなエピトープの組み合わせを使用する。これらのエピトープは、同じまたは異なる細菌のペプチドに由来し得、そして別々の組換えまたは天然のペプチド中に、あるいは同じ組換えペプチド中に一緒に存在し得る。
【０１８６】
イムノアッセイは、例えば、１または複数のビルレンス関連ペプチドエピトープに対する１つのモノクローナル抗体、１つのマイコバクテリア抗原の複数のエピトープに対する複数のモノクローナル抗体の組み合わせ、複数の異なるマイコバクテリア抗原のエピトープに対する複数のモノクローナル抗体、同じ抗原に対する複数のポリクローナル抗体、または複数の異なる抗原に対する複数のポリクローナル抗体を使用し得る。プロトコルは、例えば、競合、または直接反応、またはサンドイッチタイプアッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、あるいは免疫沈降によるものであり得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を包含し；標識は、例えば、酵素、蛍光、化学発光、放射活性、または染料分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも公知であり；その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびにＥＬＩＳＡアッセイのような酵素で標識および媒介されるイムノアッセイである。
【０１８７】
代表的には、ペプチドに対する１または複数の抗体についてのイムノアッセイは、生物学的試料のような抗体を含むと思われるテスト試料を選択および調製する工程、次いで抗原−抗体複合体を形成することが可能な条件下で１または複数の抗原性（すなわち、エピトープ含有）ペプチドと共に試料をインキュベートする工程、およびこのような複合体の形成を検出する工程を包含する。イムノアッセイは、標準または競合タイプであり得る。
【０１８８】
ペプチドは、代表的には、インキュベーション後に試料とペプチドとの分離を容易にするために固体支持体に結合されている。使用され得る固体支持体の例は、ニトロセルロース（例えば、メンブランまたはマイクロタイターウェル形態で）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェルで）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートで）、ポリフッ化ビニリデン（Immulonとして公知）、ジアゾ化紙、ナイロンメンブラン、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズである。例えば、Dynatech Immulonマイクロタイタープレートまたは６０mm直径のポリスチレンビーズ（Precision Plastic Ball）が使用され得る。抗原性ペプチドを含む固体支持体は、代表的には、テスト試料からの分離後、および結合した抗体の検出の前に、洗浄される。
【０１８９】
抗体を含む形成された複合体（または、競合アッセイの場合は、競合抗体の量）は、形式に応じて、公知の多くの技法のいずれかによって検出される。例えば、複合体中の非標識抗体は、標識（例えば、酵素標識）と複合体化した抗異種Ｉｇの結合体を用いて検出され得る。
【０１９０】
ペプチドが被分析物であるイムノアッセイでは、テスト試料、代表的には生物学的試料は、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でペプチドに対する抗体と共にインキュベートされる。テスト前に生物学的試料を処理して、推定される細菌成分を放出させることが所望であり得る。種々の形式が用いられ得る。例えば、「サンドイッチアッセイ」が用いられ得、ここでは、固体支持体に結合された抗体は、テスト試料とともにインキュベートされ；洗浄され；被分析物に対する第２の標識された抗体とともにインキュベートされ、そして支持体は再度洗浄される。被分析物は、第２の抗体が支持体に結合されるかどうかを測定することによって検出される。競合形式では、テスト試料は、通常、抗体とともにインキュベートされ、そして標識された競合抗原も、連続的にまたは同時にインキュベートされる。
【０１９１】
適切な容器にパッケージされた、本発明の１以上のペプチド、または該ペプチドに対する１以上の抗体、および緩衝液を含むイムノアッセイキットも、本発明の実施態様として包含される。
【０１９２】
本発明で使用する場合、「生物学的試料」とは、個体から単離された組織または液体の試料をいい、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器管、腸管、および泌尿生殖器管の外切片、涙液、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官、ならびにインビトロ細胞培養構成物の試料（細胞培養培地中の細胞の増殖から得られる馴化培地、推定ウイルス感染細胞、組換え細胞、および細胞構成成分が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
関連の診断アッセイにおいて、本発明は、マイコバクテリア感染を検出するための核酸プローブを提供する。
【０１９４】
主剤として本発明のポリヌクレオチドを使用して、約８ヌクレオチド以上のオリゴマーが、組換えポリヌクレオチドからの切り出しによってまたは合成によってのいずれかで調製され得、これは、マイコバクテリア配列とハイブリダイズし、そしてマイコバクテリアの同定に有用である。プローブは、ダウンレギュレートされた配列のハイブリダイゼーションによる検出を可能にする長さである。６〜８ヌクレオチドは活用可能な長さであり得るが、１０〜１２ヌクレオチドの配列が好ましく、そして少なくとも約２０ヌクレオチドが最適なようである。これらのプローブは、自動化オリゴヌクレオチド合成方法を含むルーチンの方法を用いて調製され得る。プローブとしての使用には、完全な相補性が望ましいが、フラグメントの長さが増加するにつれて、完全な相補性は必ずしも必要でなくてもよい。
【０１９５】
このようなプローブの診断剤としての使用について、血液または血清のような分析されるべき生物学的試料は、所望であれば、それが含まれる核酸を抽出するために処理され得る。試料から得られた核酸は、ゲル電気泳動または他のサイズ分離技法に供せられ得；あるいは、核酸試料はサイズ分離せずにドットブロットされ得る。プローブは通常標識される。適切な標識、およびプローブを標識するための方法は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、ニックトランスレーションまたはキナーゼ操作によって組込まれる放射性標識、ビオチン、蛍光プローブ、および化学発光プローブが挙げられる。次いで、試料から抽出された核酸は、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、標識されたプローブで処理される。
【０１９６】
プローブは、ビルレンスをコードするポリヌクレオチドに完全に相補的になり得る。したがって、通常、高ストリンジェンシーの条件は、偽陽性を防止するために所望される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション中および洗浄手順中の、温度、イオン強度、時間の長さ、およびホルムアミドの濃度を含む多くの因子によって決定される。
【０１９７】
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅技法を使用することが所望であり得る。このような技法は当該技術分野で公知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法が挙げられる。
【０１９８】
プローブは、診断キット中にパッケージングされ得る。診断キットは、標識され得るプローブＤＮＡを含み；あるいは、プローブＤＮＡは非標識であり得、そして標識用の成分が別々の容器でキットに含まれ得る。キットはまた、特定のハイブリダイゼーションプロトコルに必要な他の適切なパッケージングされた試薬および材料、例えば、標準薬、ならびにテストを行うための指示書を含み得る。
【０１９９】
好ましい実施態様では、本発明のペプチド（またはフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体）は、患者においてＴリンパ球がマイコバクテリア感染の抗原性成分に既に曝露されているＴリンパ球の存在を検出するための診断アッセイに使用される。
【０２００】
より詳細には、特定の抗原に既に曝露されているＴリンパ球は、同じ抗原によるその後のチャレンジで活性化される。この活性化は、マイコバクテリア感染の陽性診断を同定するための手段を提供する。逆に、同じ活性化は、特定の抗原にまだ曝露されていないＴリンパ球によっては達成されない。
【０２０１】
Ｔリンパ球の上記の「活性化」は、時々、「再現応答」といい、そして例えば、活性化したＴリンパ球からのインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）の放出を測定することによって測定され得る。したがって、患者におけるマイコバクテリア感染の存在は、本発明のペプチド（またはフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体）でのＴリンパ球のインビトロチャレンジ後の所定の時間後の、Ｔリンパ球からの最小濃度のインターフェロンの放出によって決定され得る。
【０２０２】
使用する場合、Ｔリンパ球を含む生物学的試料は患者から採取され、次いで本発明のペプチド（またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体）でチャレンジされる。
【０２０３】
上記Ｔリンパ球診断アッセイは、問題の患者によって発現される少なくとも１つの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み得る。ＡＰＣは、生物学的試料中に本来的に提供され得、または外因的に添加され得る。１つの実施態様では、Ｔリンパ球は、ＣＤ４ Ｔリンパ球である。
【実施例】
【０２０４】
２つの別のマイコバクテリア培養方法を用いて、マイコバクテリア潜伏中にダウンレギュレートされる遺伝子を研究した。第１の方法を実施例１〜８に記載し、第２の方法を実施例１８に記載する。
【０２０５】
実施例１−好気的栄養飢餓条件下におけるマイコバクテリア持続性のインビトロモデル
材料および方法
株
M. tuberculosisの代表的な株である、M. tuberculosis H37Rv株（NCTCカタログ番号7416）を用いて研究を行った。ストック培養物を、Middlebrook 7H10＋OADC中で37±２℃にて３週間増殖させた。
【０２０６】
培養培地
持続性培養を、Middlebrook ADC富化、0.2％Tween（登録商標）80、および0.2％グリセロールを追加したMiddlebrook 7H9培地中で樹立した（表１）。Millepore水精製システムで得た高品質水を用いて培地を調製し、そして0.1μm孔サイズの酢酸セルロースメンブランフィルターカプセル（Sartorius Ltd.）を通過させて濾過滅菌した。ｐＨを、濃塩酸で6.6に調整した。
【０２０７】
Middlebrook 7H10＋OADC寒天を用いて、接種培養物を調製し、試料中の培養可能な細菌の数を計数し、そして培養純度を評価した。
【０２０８】
培養システム
発明者らは、これまでに、制御および規定された条件下でのマイコバクテリアの培養のためのプロセスを開発した（特許出願番号PCT/GB00/00760（WO00/52139））。発明者らは、マイコバクテリア持続性の以下の研究のために、バッチファーメンターとして操作されるこの培養システムを使用した。
【０２０９】
培養実験を、１リットルのガラス容器中で行い、750mlの使用容量で操作した。容器の下に配置したマグネチックスターラーに連動する培養容器中に入れたマグネチックバーによって培養液を攪拌した。トッププレート中の密封部分を通して培養液中に挿入したセンサープローブを連結したAnglicon Microlab Fermentation System（Brighton Systems, Newhaven）を用いて、培養条件を連続的にモニターした。酸素濃度を、ガルバーニ酸素電極（Uniprobe, Cardiff）によってモニターし、そして空気と酸素を含まない窒素との混合物を培養液に吹き込むことによって制御した。温度を、Anglicon温度プローブによってモニターし、そして培養容器の下に配置した加熱パッドによって維持した。培養ｐＨを、Ingold ｐＨ電極（Mettler-Toledo, Leicester）を用いて測定した。
【０２１０】
接種および培養
容器を750mlの滅菌培養培地で満たし、そしてパラメータを、37℃±２℃、pH6.9±0.3、および約70％空気飽和の溶存酸素圧で安定化させた。37℃±２℃にて３週間増殖させたMiddlebrook寒天培地培養物を滅菌脱イオン水に再懸濁させることによって、高密度接種懸濁液を調製した。種菌を、培養容器に無菌的に植菌して、540nmで約0.25の初期培養濁度とした。
【０２１１】
培養物を、500〜750rpmの攪拌速度で37℃にて維持した。溶存酸素圧を、培養液へのスパージングによって50〜70％空気飽和に維持した。開始培養ｐＨを約6.7にセットし、そして実験全体を通してモニターした。培養を50日間維持し、そして試料を規則的に取り出して、増殖および生存、栄養利用、ならびに遺伝子発現をモニターした。
【０２１２】
増殖および生存
細菌増殖および生存を、特定の時点で培養システム中の生存細胞の数を測定することによって評価した。測定は、試料の滅菌水による10分の１希釈系列を調製し、そしてMiddlebrook 7H10＋OADCプレート上に100μlアリコートをプレーティングすることによって行った。４週間まで、プレートを37℃にてインキュベートし、形成されたコロニー数を計数した。
【０２１３】
栄養利用
グリセロールは、主要な炭素およびエネルギー源であり、ADC、0.2％Tween（登録商標）、および0.2％グリセロールを含むMiddlebrook 7H9培地に存在する。グリセロールが利用される割合は、Glycerol Determination Kit、カタログ番号148 270、Boehringer Mannheimを用いて測定した。
【０２１４】
マイクロアレイ実験
ＲＮＡを、実験期間中の種々の時点で採取した培養試料から抽出した。次いで、蛍光標識したｃＤＮＡを、ＲＮＡの各試料から転写した。ｃＤＮＡを、Cy3またはCy5のいずれかで標識したｄＣＴＰ（染料は、Amersham Pharmacia Biotechにより供給される）の組込みによって標識した。
【０２１５】
M. tuberculosisゲノム全体のアレイを、ＯＲＦ特異的プライマーを用いてM. tuberculosisゲノムＤＮＡから調製した。各ＯＲＦに対応するＰＣＲ産物を、標準顕微鏡ガラススライド上のグリッドに、BioRobotics microgridロボット（MWG Biotech）を用いて4000スポット／ｃｍ２より高い分解能でスポットした。
【０２１６】
各マイクロアレイ実験において、全ゲノムのアレイを、１つの培養試料からの標識したｃＤＮＡとハイブリダイズした（テスト試料）。各アレイをまた、異なるCy染料を組込んでいるコントロールＤＮＡとハイブリダイズし、そしてM. tuberculosis H37Rv株から抽出したＤＮＡから調製した（コントロール試料）。
【０２１７】
各アレイを、各染料の励起極大に対応する２つの異なる波長でスキャンし、そして発光強度を記録した。テストおよびコントロール試料についての強度値の割合を、各アレイについて決定した。スライドを、Affymetrix 428スキャナーを用いてスキャンした。最初に、生データをImaGeneソフトウエアによって分析した。次いで、スキャンしたイメージをGeneSpringとして公知の他のソフトウエアパッケージに移して、各遺伝子の発現を分析した。
【０２１８】
結果
接種後、培養物は、対数増殖に入り、そして接種後10日目まで指数関数的に増殖し続けた（図１を参照のこと）。対数増殖の停止は、主要な炭素およびエネルギー源であるグリセロールの枯渇と一致した（図２を参照のこと）。培養が定常期に入ると、生存力が下降し始め、そして研究期間にわたり絶えず下降し続けた。定常期の40日後、約１％の培養物が、Middlebrook寒天上でなお培養可能であった。
【０２１９】
５日目および50日目に採集した試料についての遺伝子発現プロファイルを比較した。各試料について３つのアレイを調製し、そしてテストデータを、各チップのコントロールデータに対して標準化した。次いで、各アレイのセットについて標準化したデータを平均し、そして２つのデータセットを比較した。５日目に対して、50日目に少なくとも1.5倍少なく発現した遺伝子を選択した。この方法によって同定した配列番号１〜２０を、コードされた各ペプチドについて割り当てられた生物学的機能とともに、表２に示す。
【０２２０】
これらの遺伝子についてのコード配列（核酸配列は転写開始部位から終止コドンまで示す）およびその対応するアミノ酸配列を、添付の配列表に挙げ、その１番目の配列番号は、アミノ酸配列であり、そして２番目の配列番号は、対応する核酸コード配列である。
【０２２１】
【表１】
2005518784.tif 000003
【０２２２】
【表２】
2005518784.tif 000004
【０２２３】
実施例２−マイクロアレイ分析のためのM. tuberculosisからのＲＮＡ抽出
材料および方法
Trizol（Life Technologies）−これは、フェノールおよびチオシアン酸グアニジンの処方物である。
【０２２４】
ＧＴＣ溶解溶液−これは、５Mのチオシアン酸グアニジン、0.5％のＮ−ラウリルサルコシン、25mMのクエン酸三ナトリウム、0.1Mの２−メルカプトエタノール、および0.5％のTween（登録商標）80を含む。
【０２２５】
クロロホルム
イソプロパノール
３M  酢酸ナトリウム
70％  エタノール
マイクロ遠心機
リボライザー（ribolyser）
【０２２６】
滅菌プラスチック製品−Falconチューブ、スクリューキャップ付きエッペンドルフ、ギルソンチップ−これらはすべてＲＮａｓｅを含まない。
【０２２７】
ガラス製品−これは、160℃にて少なくとも16時間焼いた。
【０２２８】
方法
封じ込めレベル３で行われる工程；クラスIIIの微生物安全キャビネット内である。
【０２２９】
10または20mlの培養物（109/ml）を取り出し、そしてこれをすぐにプラスチック試料ポット中の４容量のＧＴＣ溶解緩衝液に添加する。ポットを堅く密封する。
【０２３０】
ＧＴＣ溶解緩衝液中の細胞を室温にて１時間インキュベートする。５％のHycolinで５分間プラスチックポットの表面の汚染を除去する。試料をパスボックスに移し、そして密封可能な蓋を有するプラスチックの運搬用容器に入れる。容器を確実に閉じ、そしてこれを非毒性キャビネットであるＣＬ３キャビネットに移す。
【０２３１】
溶解混合物をFalconチューブに等しく分配する。これらのチューブを遠心分離バケットに入れ、そしてバケットを堅く密封する。５％のHycolinで５分間バケットの表面の汚染を除去する。次いで、これらを遠心分離機（Baird and Tatlock Mark IV冷却ベンチトップ遠心分離機）に移す。チューブを3,000rpmにて30分間回転させる。
【０２３２】
未開封のバケットをキャビネットに戻す。遠心チューブを取り出し、そして上清をＧＴＣ溶解緩衝液用の廃棄瓶に注ぐ。
【０２３３】
各ペレットを１mlのTrizol（フェノールおよびＧＴＣの処方物、カタログ番号15596-026）に再懸濁する。製造業者のガイドラインは、繰り返しのピペット操作によって細胞を溶解することを推奨する。この操作のみではM. tuberculosisは溶解しないが、Trizol中にペレットを完全に再懸濁させるためには重要である。
【０２３４】
１mlの細胞をFastRNAチューブに移し、そしてパワーセッティング6.5にて45秒間、細胞をリボライズ（ribolyse）する。
【０２３５】
チューブを室温にて５分間インキュベートさせる。
【０２３６】
チューブから水層を取り出し、そしてこれをスクリューキャップ付きのエッペンドルフチューブ中の200μlのクロロホルムに添加する。各チューブを約15秒間激しく振盪する。室温にて２〜３分間インキュベートする。
【０２３７】
チューブを13,000rpmにて15分間回転させる。遠心分離後、液体は、赤いフェノール／クロロホルム相、界面、および澄明な水相に分離する。
【０２３８】
水相を注意深く取り出し、そしてこれを500μlのクロロホルム／イソアミルアルコール（24：１）を含む新鮮なエッペンドルフチューブに移す。このチューブを、13,000rpmにて15分間回転させる。
【０２３９】
水相を、50μlの酢酸ナトリウムおよび500μlのイソプロパノールを含むエッペンドルフチューブに移す。
【０２４０】
エッペンドルフチューブを５％のHycolinで５分間処理し表面の汚染を除去する。チューブをＣＬ３研究室から取り出し、そして研究室157で手順を続ける。
【０２４１】
封じ込めレベル２で行われる工程：
ＲＮＡを−70℃にて少なくとも30分間沈殿させる−この工程は一晩行われ得る。
【０２４２】
沈殿したＲＮＡを13,000rpmにて10分間回転させて落とす。上清を除去し、そしてペレットを70％エタノールで洗浄する。遠心分離を繰り返す。
【０２４３】
70％エタノールを除去し、そしてペレットを空気乾燥させる。ペレットを、ＲＮＡｓｅを含まない水に溶解させる。
【０２４４】
ＲＮＡを−70℃にて凍結させて保存する。
【０２４５】
実施例３−ケモスタット培養で増殖したMycobacterium tuberculosisからのゲノムＤＮＡの単離。次いで、ＤＮＡを使用して、マイクロアレイ実験におけるコントロールとしての使用のために、Ｃｙ３またはＣｙ５標識したＤＮＡを生成する。
【０２４６】
材料および方法
0.5mmの直径のビーズ
ビーズビーター
ベンチトップ遠心分離機
プラットホームロッカー
熱ブロック
Falcon 50ml遠心チューブ
Sorvall RC-5C遠心分離機
250mlポリプロピレン遠心分離ポット
スクリューキャップ付きのエッペンドルフチューブ
１ml、200μl、10ml、５mlのピペット
【０２４７】
破壊緩衝液
50mM Tris HCl pH8.0
10mM EDTA
100mM NaCl
【０２４８】
手順
M. tuberculosis細胞の機械的破壊
＊  150mlのケモスタット細胞（540nmで2.5のO.D.）を、遠心分離機Sorvall RC-5Cを用いて250mlポリプロピレンポット中で15,000rpmにて15分間回転させて落とす。
＊  上清を捨てる。
＊  細胞を、50ml Falconチューブ中の５mlの破壊緩衝液に再懸濁し、そして15,000rpmにてさらに15分間遠心分離する。
＊  上清を除去し、そしてさらなる破壊緩衝液を５mlの容量で添加する。ビーズを用いて細胞を破砕する。これらは、１mlの細胞に対して１mlのビーズの量で使用される。試料を適切なサイズのチャンバー中に置く。ビーズビーター中に置き、そして（氷を含む）外側のユニットを固定し、そして所望のスピードで30秒間処理する。
＊  ビーズを10分間沈殿させ、そして細胞ライセートを50mlのFalcon遠心チューブに移す。
＊  ビーズ上で洗浄緩衝液をピペットで上下させることによって、２〜５mlの破壊緩衝液でビーズを洗浄する。
＊  この洗浄溶液を、Falconチューブ中のライセートに添加する。
【０２４９】
タンパク質および細胞成分の除去
＊  0.1容量の10％ＳＤＳおよび0.01容量のプロテイナーゼＫを添加する。
＊  反転によって混合し、そして熱ブロック中で55℃にて２〜３時間加熱する。
＊  得られる混合物は均一かつ粘性であるべきである。これを助けるために、0.2％までの濃度になるようにさらなるＳＤＳが添加され得る。
＊  25/24/1の比のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの等容量を添加する。
＊  プラットホームロッカー上で均一になるまで穏やかに混合する。
＊  3,000rpmにて20分間回転して落とす。
＊  水相を取り出し、そして新鮮なチューブに入れる。
＊  水相を等容量のクロロホルムで抽出して、ごく少量の細胞破砕物およびフェノールを除去する。クロロホルム抽出は、すべての破砕物を除去するまで繰り返す必要があり得る。
＊  0.3M酢酸ナトリウムおよび等容量のイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させる。
＊  ガラス棒でできるだけ多くのＤＮＡを巻き取る。
＊  巻き取ったＤＮＡを70％エタノール、次いで100％エタノールで洗浄する。
＊  空気乾燥させる。
＊  滅菌脱イオン水（500μl）にＤＮＡを溶解する。
＊  ＤＮＡを４℃にて約16時間溶解させる。
＊  溶解したＤＮＡにＲＮａｓｅ１（500Ｕ）を添加する。
＊  37℃にて１時間インキュベートする。
＊  等容量のフェノール／クロロホルムで再抽出し、次いでクロロホルム抽出し、上記のように沈殿させる。
＊  13,000rpmにてＤＮＡを回転して落とす。
＊  上清を除去し、そして70％エタノールでペレットを洗浄する。
＊  空気乾燥させる。
＊  200〜500μlの滅菌水に溶解する。
【０２５０】
実施例４−ＤＮＡからのＣｙ３またはＣｙ５で標識されたＤＮＡの調製
ａ）マイクロアレイスライド当たり１つのＣｙ３または１つのＣｙ５で標識されたＤＮＡ試料を調製する。
各試料：
ＤＮＡ                            ２〜５μg
ランダムプライマー（３μg/μl）      １μl
水                                41.5μlにする。
【０２５１】
95℃にて５分間加熱し、氷上で急激に冷却し、そして短時間遠心分離する。
【０２５２】
それぞれに以下のものを加える：
10×REact 2緩衝液．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５μl
ｄＮＴＰ（５mM dA/G/TTP、２mM dCTP）．．．．．．．．．． １μl
Ｃｙ３またはＣｙ５ ｄＣＴＰ．．．．．．．．．．．．．．．1.5μl
クレノウ（５U/μl）．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１μl
暗所で37℃にて90分間インキュベートする。
【０２５３】
ｂ）スライドをプレハイブリダイズする
コプリンジャー（Coplin jar）中でプレハイブリダイゼーション溶液を混合し、そして標識付け反応が平衡化する間、65℃にてインキュベートする。
プレハイブリダイゼーション：20×ＳＳＣ．．．．8.75ml（3.5×ＳＳＣ)
20％ＳＤＳ．．．．．．．．．．．．．．．．．．250μl（0.1％ＳＤＳ）
ＢＳＡ（100mg/ml）．．．．．．．．．．．．．．５ml（10mg/ml）
水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50mlにする。
【０２５４】
マイクロアレイスライドを、予め加熱したプレハイブリダイゼーション溶液中で65℃にて20分間インキュベートする。スライドを、400mlの水中で１分間全体的にリンスし、次いで400mlのプロパン−２−オール中で１分間リンスし、そしてスライドを、50mlの遠心チューブ中で1,500rpmにて５分間遠心分離して乾燥させる。スライドを暗所の無塵ボックス中でハイブリダイゼーションまで保存する（１時間未満）。
【０２５５】
ｃ）Ｃｙ３／Ｃｙ５標識したＤＮＡを精製する−Qiagen MinElute Purification
＊  Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したＤＮＡ試料を１つのチューブに合わせ、そして500μlの緩衝液ＰＢを添加する。
＊  コレクションチューブ中でMinEluteカラムにかけ、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに500μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに250μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  13,000rpmにてさらに１分間遠心分離して、残りのエタノールを取り出す。
＊  新鮮な1.5mlチューブ中にMinEluteカラムを配置する。
＊  メンブランの中心に10.5μlの水を添加し、そして１分間放置する。
＊  13,000rpmにて１分間遠心分離する。
【０２５６】
実施例５−ＲＮＡからのＣｙ３またはＣｙ５で標識されたｃＤＮＡの調製
ａ）マイクロアレイスライド当たり１つのＣｙ３および１つのＣｙ５で標識されたｃＤＮＡ試料を調製する
各試料：
ＲＮＡ                             ２〜10μg
ランダムプライマー（３μg/μl）    １μl
水                                 11μlにする。
【０２５７】
95℃にて５分間加熱し、氷上で急激に冷却し、そして短時間遠心分離する。
それぞれに以下のものを加える：５×First Strand Buffer．．５μl
ＤＴＴ（100mM）．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2.5μl
ｄＮＴＰ（５mM ｄＡ／Ｇ／ＴＴＰ、２mM ｄＣＴＰ）．．．．2.3μl
Ｃｙ３またはＣｙ５ ｄＣＴＰ．．．．．．．．．．．．．．．1.7μl
SuperScript II（200U/μl）．．．．．．．．．．．．．．． 2.5μl
【０２５８】
暗所で25℃にて10分間、次いで暗所で42℃にて90分間インキュベートする。
【０２５９】
ｂ）スライドをプレハイブリダイズする
コプリンジャー（Coplin jar）中でプレハイブリダイゼーション溶液を混合し、そして標識付け反応が平衡化する間、65℃にてインキュベートする。
プレハイブリダイゼーション：
20×ＳＳＣ．．．．．．．．．．．．．．．．．．8.75ml（3.5×ＳＳＣ)
20％ＳＤＳ．．．．．．．．．．．．．．．．．．250μl（0.1％ＳＤＳ）
ＢＳＡ（100mg/ml）．．．．．．．．．．．．．．５ml（10mg/ml）
水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50mlにする。
【０２６０】
マイクロアレイスライドを、予め加熱したプレハイブリダイゼーション溶液中で65℃にて20分間インキュベートする。スライドを、400mlの水中で１分間全体的にリンスし、次いで400mlのプロパン−２−オール中で１分間リンスし、そしてスライドを、50mlの遠心チューブ中で1500rpmにて５分間遠心分離して乾燥させる。スライドを暗所の無塵ボックス中でハイブリダイゼーションまで保存する（１時間未満）。
【０２６１】
ｃ）Ｃｙ３／Ｃｙ５標識したｃＤＮＡを精製する−Qiagen MinElute Purification
＊  Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したＤＮＡ試料を１つのチューブに合わせ、そして250μlの緩衝液ＰＢを添加する。
＊  コレクションチューブ中でMinEluteカラムにかけ、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに500μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに250μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  13,000rpmにてさらに１分間遠心分離して、残りのエタノールを取り出す。
＊  新鮮な1.5mlチューブ中にMinEluteカラムを配置する。
＊  メンブランの中心に10.5μlの水を添加し、そして１分間放置する。
＊  13,000rpmにて１分間遠心分離する。
【０２６２】
実施例６−スライドをＣｙ３／Ｃｙ５で標識されたｃＤＮＡ／ＤＮＡとハイブリダイズする
プレハイブリダイズしたマイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションカセット中に置き、そしてカセット中のウェルに15mlアリコートの水を２回添加する。再懸濁したＣｙ３／Ｃｙ５標識したｃＤＮＡ／ＤＮＡ試料を、ハイブリダイゼーション溶液と混合する。
【０２６３】
ハイブリダイゼーション：Ｃｙ３／Ｃｙ５標識したｃＤＮＡ試料..10.5ml
20×ＳＳＣ.......................3.2ml（４×ＳＳＣ）
２％ＳＤＳ.......................2.3ml（0.3％ＳＤＳ）
【０２６４】
ハイブリダイゼーション溶液を95℃にて２分間加熱する。氷上で急激に冷却せず、徐々に冷却し、そして短時間遠心分離する。気泡形成を避けながらスライド上のアレイされた領域の端にハイブリダイゼーション溶液をピペットで載せる。ピンセットを用いて、カバーグラスの端をスライドの表面に沿って、アレイされた領域の方へ、およびアレイの端のハイブリダイゼーション溶液中に、注意深くドラッグする。一旦決まった位置に置くとさらなる移動を避けながら、カバーグラスをアレイ上に注意深く下げる。ハイブリダイゼーションカセットを密封し、そして60℃の水浴中に16〜20時間沈める。
【０２６５】
スライドを洗浄する。
【０２６６】
ハイブリダイゼーションカセットからマイクロアレイスライドを取り出し、そして最初に、Wash Aの染色トラフ中でスライドを注意深く洗浄して、カバーグラスを除去する。一旦カバーグラスをスライドラック中のスライドの位置に移動し、そしてWash A中でさらに２分間攪拌を続ける。
【０２６７】
Wash A：
20×ＳＳＣ．．．．．．．．20ml（１×ＳＳＣ）
20％ＳＤＳ．．．．．．．．１ml（0.05％ＳＤＳ）
水．．．．．．．．．．．．400mlにする。
【０２６８】
スライドをクリーンなスライドラックに移し、そしてWash Bの第１のトラフ中で２分間攪拌する。Wash Bの第２のトラフ中で２分間攪拌しながら洗浄する。
【０２６９】
Wash B（×２）：20×ＳＳＣ．．．．．．．1.2ml（0.06×ＳＳＣ）
水．．．．．．．．．．．400mlにする。
【０２７０】
スライドを50mlの遠心チューブに入れ、そして1500rpmにて５分間遠心分離して、スライドを乾燥させ、次いでScanArray 3000二重レーザー共焦点スキャナーを用いて蛍光をスキャンし、そしてデータを分析する。
【０２７１】
実施例７−アレイの調製
ＯＲＦ特異的プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅した産物を、M. tuberculosisゲノムＤＮＡから調製した。ゲノムの各遺伝子を示す。これらを、標準的な顕微鏡ガラススライド上のグリッドに、BioRobotics microgridロボット（MWG Biotech）を用いて4000スポット／ｃｍ２より高い分解能でスポットする。
【０２７２】
実施例８−スキャンニングおよびデータの分析
スライドを、Affymetrix 428スキャナーを用いてスキャンした。
【０２７３】
２つのｃＤＮＡ試料の同時検出を可能にする二重蛍光を用いる。アレイの出力を、共焦点レーザースキャナー（MWG Biotech製のAffymetrix 428スキャナー）を用いて読み取る。より詳細な情報は、ウェブサイトwww.sghms.ac.uk/depts/medmicro/bugs；Mujumdar, R.B. (1993) Bioconjugate Chemistry, 4(2), 105-111頁；Yu, H. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3226-3232頁；およびZhu, Z. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3418-3422頁で見られ得る。
【０２７４】
最初に、スキャナーとともに供給されるImaGeneとして公知のソフトウエアを用いて生データを分析した。次いで、スキャンしたイメージを、GeneSpringとして公知の他のソフトウエアパッケージに移した。これは、非常に強力なツールであり、多くのデータベースから情報を引き出して、各遺伝子の発現の完全な分析を可能にする。
【０２７５】
実施例９−免疫原性を保持しながらビルレンスを減弱させるためにM. tuberculosis由来の１以上の遺伝子を欠失させる
同定されている１以上の遺伝子は、対立遺伝子交換を用いて破壊され得る。簡単に言えば、目的の遺伝子を、いずれかの側に隣接する１〜２kbのＤＮＡを用いてクローニングし、そしてコード領域の一部の欠失およびハイグロマイシンなどの抗生物質耐性マーカーの挿入によって不活性化する。
【０２７６】
次いで、操作したフラグメントを、適切な自殺ベクター（例えば、pPR23）に移し、そしてM. tuberculosisの野生型親株を形質転換する。抗生物質耐性株について選択することによって、変異体を回収する。遺伝子型分析（目的の遺伝子に特異的なフラグメントとのサザンブロッティング）を、選択した株で行って、遺伝子が破壊されていることを確認する。
【０２７７】
次いで、変異株を研究して、表現型における遺伝子破壊の影響を決定する。これをワクチン候補物として使用するために、弱毒化されたビルレンスを証明することが必要である。これは、モルモットまたはマウスのいずれかの感染モデルを用いて行われ得る。動物に、変異体株を感染させ、そして疾患の進行を、種々の器官、特に、肺および脾臓において、感染後の、代表的には16週までの特定の時点で、細菌負荷を測定することによりモニターする。
【０２７８】
種々の器官において非常に高い細菌負荷を有すべき野生型株に感染した動物に対して比較を行う。長期生存研究および組織病理学も、ビルレンスおよび病原性を評価するために使用し得る。
【０２７９】
一旦弱毒化したビルレンスが樹立されると、防御および免疫原性研究を行って、この株のワクチンとしての可能性を評価し得る。対立遺伝子交換およびＴＢ変異体の調製に適切な参考文献は、McKinneyら、2000およびPelicicら、1997［1、2］である。
【０２８０】
実施例１０−本発明により同定可能な、免疫原性であるタンパク質をコードする１以上の遺伝子を選択し、そしてその全体の免疫原性を増強するためにＢＣＧまたはM. tuberculosisの弱毒化株にそれらの遺伝子を導入する
目的の遺伝子を、ＰＣＲによってM. tuberculosisゲノムから増幅する。増幅した産物を精製し、そしてプラスミド（pMV306）にクローニングする。このプラスミドは、マイコバクテリアゲノム中のマイコバクテリオファージL5の付着部位（attB）に部位特異的に組込まれる［3］。
【０２８１】
ＢＣＧを、エレクトロポレーションによってプラスミドで形質転換する。この方法は、高電圧電気パルスで細胞エンベロープを傷害し、その結果、ＤＮＡの取り込みを生じさせる工程を含む。プラスミドは、attB部位でＢＣＧ染色体中に組込まれ、安定な組換え体を生成する。組換え体を選択し、そしてＰＣＲまたはサザンブロッティングによってチェックして、遺伝子が組込まれていることを確認する。次いで、組換え体株を、防御研究に用いる。
【０２８２】
実施例１１−ＴＢ遺伝子を発現および提示させるための、弱毒化サルモネラ菌およびワクシニアウイルスなどの組換えキャリアの使用
このタイプのアプローチの最良の例の１つは、改変ワクシニアウイルスAnkara（ＭＶＡ）の使用である［4］。目的の遺伝子を、ワクシニアウイルスシャトルベクター、例えば、pSC11にクローニングする。次いで、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を、野生型ＭＶＡで感染させ、そして組換えシャトルベクターでトランスフェクトする。次いで、組換えウイルスを、適切な選択マーカーおよびウイルスプラークを用いて選択し、そして選択および精製する。
【０２８３】
組換えウイルスは、通常、初回ブースト方法の一部として送達され、そこでは動物を、最初に、構成的プロモーターの制御下で目的のＴＢ遺伝子をコードするＤＮＡワクチンでワクチン接種する。目的の遺伝子を有する組換えＭＶＡを少なくとも２週間後に動物に投与することによって、免疫応答をブーストする。
【０２８４】
実施例１２−単一ペプチド／タンパク質またはタンパク質の組み合わせを含むサブユニットワクチン
１以上のペプチドまたはタンパク質を有するサブユニットワクチンを調製するために、まず第１に、ワクチンを調製するためのタンパク質またはペプチドの供給を得ることが必要である。現在まで、マイコバクテリア研究において、これは、主として、ＴＢ培養物から目的のタンパク質を精製することによって行われてきた。しかし、目的の遺伝子をクローニングしそして組換えタンパク質を産生することがより一般的になっている。
【０２８５】
目的の遺伝子のコード配列を、Ｎ末端およびＣ末端に挿入した制限部位を用いてＰＣＲによって増幅して、pET-15bのようなタンパク質発現ベクター中へのインフレームでのクローニングを可能にする。遺伝子を、lacZのような誘導性プロモーターの下流に挿入する。次いで、ベクターを、培養により増殖するE. coliに形質転換する。組換えタンパク質を過剰発現させ、そして精製する。
【０２８６】
普通の精製方法の１つは、Ｎ末端のHisタグを有する組換えタンパク質を産生することである。次いで、タンパク質をNi-NTAカラム上で金属イオンに対するHisタグの親和性に基づいて精製し得、その後Hisタグを切断する。次いで、適切なアジュバント中の精製したタンパク質を、動物に投与する［5］。
【０２８７】
実施例１３−１以上の同定された遺伝子を有するプラスミドＤＮＡワクチン
特定の遺伝子をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、精製し、そしてpVAX1のようなワクチン開発のために開発された特殊ベクターに挿入する。これらのベクターは、真核生物細胞において導入されたＤＮＡ（候補抗原をコードする）の強力な発現を指示するプロモーター配列（例えば、CMVまたはSV40プロモーター）、およびｍＲＮＡ転写物を安定化するためのポリアデニル化シグナル（例えば、SV40またはウシ成長ホルモン）を含む。
【０２８８】
ベクターをE. coliに形質転換し、そして形質転換体を、プラスミドによってコードされるカナマイシン耐性のようなマーカーを用いて選択する。次いで、プラスミドを、形質転換したコロニーから回収し、そして配列決定して、目的の遺伝子が存在しそしてＰＣＲで生じた変異なく正確にコードされることをチェックする。
【０２８９】
次いで、大量のプラスミドをE. coliで産生し、そしてプラスミドを回収しそして市販のキット（例えば、Qiagen Endofree-plasmid preparation）を用いて精製する。次いで、ワクチンを、アジュバントの存在または不在下で、例えば、筋肉内注射によって、動物に投与する。
【０２９０】
実施例１４−ＤＮＡ発現ベクターの調製
ＤＮＡワクチンは、細菌プラスミドにクローニングした本発明の核酸配列からなる。ＤＮＡワクチンの調製には、通常、プラスミドベクターpVAX1を使用する。このベクターは、E. coliにおける高コピー数複製、およびほとんどの哺乳動物細胞における目的のペプチドの高レベル一過性発現を容易にするように設計される（詳細については、pVAX1についての製造業者のプロトコルを参照のこと（カタログ番号V260-20、www.invitrogen.com））。
【０２９１】
ベクターは、以下のエレメントを含む：
＊  種々の哺乳動物細胞における高レベル発現のためのヒトサイトメガロウイルス前初期（CMV）プロモーター
＊  センス配向でのインビトロ転写および挿入物全体の配列決定を可能にするT7プロモーター／プライミング部位
＊  有効な転写終止およびｍＲＮＡのポリアデニル化のためのウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナル
＊  E. coliにおける選択のためのカナマイシン耐性遺伝子
＊  マルチクローニング部位
＊  E. coliにおける高コピー数複製および増殖のためのpUC起点
＊  挿入物全体の配列決定を可能にするためのBGH逆プライミング部位。
【０２９２】
ベクターは、標準的な組換え技法によって調製され得、これは当該技術分野で公知であり、例えば、Sambrookら（1989）である。ワクチンの調製において重要な段階は、以下のとおりである：
＊  目的の遺伝子をマルチクローニング部位の１つによってpVAX1にライゲートする。
＊  次いで、ライゲーション混合物をコンピテントE. coli株（例えば、TOP10）に形質転換し、そして50μg/mlのカナマイシンを含むLBプレートを用いて形質転換体を選択する。
＊  クローンを選択し、そして配列決定して目的の遺伝子の存在および配向を確認し得る。
＊  一旦遺伝子の存在が確認されると、ベクターを用いて、タンパク質発現についてチェックするために哺乳動物細胞株をトランスフェクトし得る。トランスフェクションのための方法は当該技術分野で公知であり、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、およびリポフェクションが挙げられる。
＊  一旦ペプチド発現が確認されると、適切な細胞宿主、例えば、E. coliで大量のベクターを産生し、そして精製し得る。
【０２９３】
pVAX1は、宿主染色体に組込まれない。組込みの可能性を最小にするためにすべての非必須配列が除去されている。特定のベクターを構築する場合、真核生物細胞内で発現される場合にコードされたタンパク質の分泌を指示するために、リーダー配列が含まれ得る。
【０２９４】
使用されている他のベクターの例は、V1Jns.tPAおよびpCMV4である（Lefevreら、2000およびVordermeierら、2000）。
【０２９５】
宿主のゲノムに組込まれる発現ベクターが使用され得るが、組み込まれないベクターを使用することが、より通常でありそしてより好ましい。pVAX1の例は組込まれない。組込みは、他の問題を生じる遺伝学的に改変された宿主を生成する。
【０２９６】
実施例１５−ＲＮＡワクチン
米国特許第5,783,386号の15頁で議論されるように、１つのアプローチは、宿主に直接ＲＮＡを導入することである。
【０２９７】
したがって、ベクター構築物（実施例１４）は、インビトロでＲＮＡを生成するために使用され得、次いで精製されたＲＮＡを宿主に注入する。次いで、ＲＮＡは、宿主細胞における翻訳のテンプレートとして用いる。この実施態様では、通常、組込みは起こらない。
【０２９８】
他の選択肢は、目的の遺伝子に対応するＲＮＡを有するレトロウイルスゲノムのような感染性因子を使用することである。この実施態様では、宿主ゲノムへの組込みが起こる。
【０２９９】
他の選択肢は、シンドビスウイルスまたはセムリキ森林熱ウイルスのようなウイルスベクターに由来し得るＲＮＡレプリコンワクチンの使用である。これらのワクチンは、自己複製および自己制限しており、そしてＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとして投与されて、次いでインビボでＲＮＡレプリコンに転写され得る。ベクターは、最終的には、トランスフェクトされた細胞の溶解を引き起こし、それによって宿主ゲノムへの組込みの可能性を減少させる。ＲＮＡワクチン構築についてのプロトコルは、Chengら（2001）に詳述される。
【０３００】
実施例１６−Ｔ細胞応答を評価することに基づく診断アッセイ
Ｔ細胞応答を評価することに基づく診断アッセイのために、患者からの血液の試料を得ることが必要である。単核細胞（単球、ＴおよびＢリンパ球）は、Ficollグラジエントのような密度グラジエントを用いて血液から分離され得る。
【０３０１】
単球およびＢリンパ球は両方とも、抗原を提示し得るが、樹状細胞のような専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）よりも効率が劣る。後者は、リンパ様組織により多く局在する。
【０３０２】
最も単純なアプローチは、分離した単核細胞に抗原を添加し、そして１週間インキュベートし、次いで増殖の量を評価することである。個体が感染によって既に抗原に曝露されているならば、抗原に特異的なＴ細胞クローズは、試料中により多く存在しており、そして応答すべきである。
【０３０３】
異なる細胞集団を分離することも可能であり、Ｔ細胞対ＡＰＣの比を制御することが所望されるべきである。
【０３０４】
このタイプのアッセイの他のバリエーションは、応答の尺度として応答しているリンパ球によるサイトカインの産生を測定することである。以下の実施例１７に記載のELISPOTアッセイは、このバリエーションの適切な例である。
【０３０５】
実施例１７−潜伏性マイコバクテリアの検出
結核の制御についての主な問題は、結核菌に感染した無症候性個体が多数存在することである。停止期病原菌は、第一線の薬物に対してより抵抗性である。
【０３０６】
潜伏性マイコバクテリア関連抗原の存在は、血液試料中の抗原特異的抗体またはＴ細胞のいずれかを検出することによって間接的に検出され得る。
【０３０７】
以下の方法は、Lalvaniら（2001）に記載の方法に基づき、ここでは、分泌された抗原ESAT-6を、M. tuberculosis複合体のメンバーによって発現されるが、M. Bovis BCGワクチン株およびほとんどの環境中のマイコバクテリアには不在であると同定した。60〜80％の患者も、ESAT-6に対して強力な細胞免疫応答を有する。エクスビボELISPOTアッセイを用いて、ESAT-6特異的Ｔ細胞を検出した。
【０３０８】
本発明に適用した場合：
96ウェルプレートを、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、IL-2）特異的抗体でコーティングする。次いで、末梢血単球を患者の全血から単離し、そしてウェルに塗布する。
【０３０９】
抗原（すなわち、本発明のペプチド、フラグメント、誘導体、または改変体の１つ）を添加して、存在し得る特異的Ｔ細胞を刺激し、そしてプレートを24時間インキュベートする。抗原は、サイトカイン産生を刺激し、次いで特異的抗体に結合する。
【０３１０】
プレートを洗浄してフットプリントを残し、そこには抗原特異的Ｔ細胞が存在した。
【０３１１】
次いで、適切な検出システム（例えば、酵素）とカップリングさせた第２抗体を添加し、そして適切な基質を添加した後、スポットの数を計数する。
【０３１２】
単一の抗原特異的なＴ細胞にそれぞれ対応するスポットの数は、最初に添加された細胞の総数に関連する。
【０３１３】
上記の実施例も、ＴＢ感染した個体をＢＣＧワクチン接種した個体と区別するために使用され得る抗原の使用を記載する。これは、より区別的な診断アッセイで使用され得る。
【０３１４】
実施例１８−炭素飢餓および酸素制限の合同条件下でのマイコバクテリア持続性のインビトロモデル（実施例１〜８のバリエーション）
材料および方法
研究を、M. tuberculosisの代表的な株である、M. tuberculosis H37Rv株（NCTCカタログ番号7416）を用いて行った。ストック培養物を、Middlebrook 7H10＋OADC中で37±２℃にて３週間増殖させた。
【０３１５】
培養培地
持続性培養を、Middlebrook ADC富化、0.2％Tween（登録商標）80、および0.2％グリセロールを追加したMiddlebrook 7H9培地中で樹立した（以下を参照のこと）。Millipore水精製システムで得た高品質水を用いて培地を調製し、そして0.1μm孔サイズの酢酸セルロースメンブランフィルターカプセル（Sartorius Ltd.）を通過させて濾過滅菌した。ｐＨを、濃塩酸で6.6に調節した。
【０３１６】
Middlebrook 7H10＋OADC寒天を用いて、接種培養物を調製し、試料中の培養可能な細菌の数を計数し、そして培養純度を評価した。
【０３１７】
培養システム
発明者らは、バッチファーメンターとして操作される、WO00/52139に記載の培養システムを、本実施例に使用した。
【０３１８】
培養実験を、１リットルのガラス容器中で行い、750mlの使用容量で操作した。容器の下に配置したマグネチックスターラーに連動する培養容器中に入れたマグネチックバーによって、培養液を攪拌した。トッププレート中の密封部分を通して培養液中に挿入したセンサープローブと連結したAnglicon Microlab Fermentation System（Brighton Systems, Newhaven）を用いて、培養条件を連続的にモニターした。酸素濃度を、ガルバーニ酸素電極（Uniprobe, Cardiff）によってモニターし、そして空気と酸素を含まない窒素との混合物を培養液に吹き込むことによって制御した。温度を、Anglicon温度プローブによってモニターし、そして培養容器の下に配置した加熱パッドによって維持した。培養ｐＨを、Ingold ｐＨ電極（Mettler-Toledo, Leicester）を用いて測定した。
【０３１９】
接種および培養
容器を750mlの滅菌培養培地で満たし、そしてパラメータを、37℃±２℃、pH6.9±0.3、および約70％空気飽和の溶存酸素圧で安定化させた。37±２℃にて３週間増殖させたMiddlebrook寒天培地培養物を滅菌脱イオン水に再懸濁させることによって、高密度接種懸濁液を調製した。種菌を、培養容器に無菌的に移して、540nmで約0.25の初期培養濁度を提供した。培養液を、500〜750rpmの攪拌速度で37℃にて維持した。
【０３２０】
接種後、培養液の溶存酸素圧（ＤＯＴ）を、培養物が対数増殖初期に入るまで37℃にて約40％空気飽和で維持した。次いで、ＤＯＴを、６日間かけて１％空気飽和まで低下させた（図３）。次いで、培養液を、接種後50日まで０〜５％のＤＯＴで維持し、そして試料を規則的に取り出して、増殖および生存、栄養利用、ならびに遺伝子発現をモニターした。
【０３２１】
増殖および生存
細菌増殖および生存を、特定の時点で培養システム中の生存細胞の数を測定することによって評価した。これを、滅菌水で10分の１希釈系列の試料を調製し、そしてMiddlebrook 7H10＋OADCプレート上に100μlアリコートをプレーティングすることによって行った。プレートを37℃にて４週間までインキュベートし、形成されたコロニー数を計数した。
【０３２２】
栄養利用
グリセロールは、主要な炭素およびエネルギー源であり、ADC、0.2％Tween（登録商標）、および0.2％グリセロールを含むMiddlebrook 7H9培地に存在する。グリセロールが利用される割合は、Glycerol Determination Kitカタログ番号148 270、Boehringer Mannheimを用いて測定した。
【０３２３】
マイクロアレイ実験
ＲＮＡを、実験期間中の種々の時点で採取した培養試料から抽出した。次いで、蛍光標識したｃＤＮＡを、ＲＮＡの各試料から転写した。ｃＤＮＡを、Cy3またはCy5のいずれかで標識したｄＣＴＰ（染料は、Amersham Pharmacia Biotechにより供給される）の組込みによって標識した。
【０３２４】
M. tuberculosisゲノム全体のアレイを、ＯＲＦ特異的プライマーを用いてM. tuberculosisゲノムＤＮＡから調製した。各ＯＲＦに対応するＰＣＲ産物を、標準顕微鏡ガラススライド上のグリッドに、BioRobotics microgridロボット（MWG Biotech）を用いて4000スポット／ｃｍ２より高い分解能でスポットした。アレイは、Dr P Butcher、St George's Hospital Medical School Londonによって供給された。
【０３２５】
各マイクロアレイ実験において、全ゲノムアレイを、１つの培養試料からの標識したｃＤＮＡとハイブリダイズした（テスト試料）。各アレイをまた、異なるCy染料を組込んでおり、そしてM. tuberculosis H37Rv株から抽出したＤＮＡから調製されたコントロールＤＮＡとハイブリダイズした（コントロール試料）。各アレイを、Affymetrix 428スキャナーを用いて、各染料の励起極大に対応する２つの異なる波長でスキャンし、そして発光強度を記録した。生データをImaGeneソフトウエアによって加工し、次いで、GeneSpringを用いて比較分析を行った。
【０３２６】
結果
生存カウントデータの分析は、培養物が感染後10〜12日目まで指数的に増殖したことを示した（図４）。培養物が定常期に入ると、生存力は下降し始め、そして研究期間にわたり絶え間なく下降し続けた。定常期の40日後、約0.1％の培養物が、Middlebrook寒天上でなお培養可能であった。グリセロール利用速度は、好気条件下で樹立された培養物で観察したよりも遅く、これは、低酸素培養物の代謝活性が、制限された酸素アベイラビリティーによって制限されたことを示す。それにもかかわらず、主要な炭素およびエネルギー源は、接種後15日以内に枯渇した（図２）。
【０３２７】
試料を、概説したようにマイクロアレイ分析用に収集した。５および50日目に収集した試料についての遺伝子発現プロファイルを比較した。各試料について３つのアレイを調製し、各チップ上のコントロールデータに対して、テストデータを標準化した。次いで、各セットのアレイについて標準化したデータを平均化し、そして２つのデータセットを比較した。50日目に対して５日目には５倍高く発現した遺伝子を選択した。次いで、遺伝子リストを、炭素飢餓モデルから得たリスト（すなわち、表２）と比較し、そして炭素飢餓および酸素制限の組み合わせ条件下でのみダウンレギュレートされた遺伝子のサブリストを得た（表３を参照のこと）。
【０３２８】
持続性培養物用の液体培地処方−ADC、0.2％Tween（登録商標）80、および0.2％グリセロールを追加したMiddlebrook 7H9培地
１リットル当たりの組成：
Na2HPO4                                    2.5 g
KH2PO4                                     1.0 g
グルタミン酸一ナトリウム                  0.5 g
(NH4)2SO4                                  0.5 g
クエン酸ナトリウム                        0.1 g
MgSO4・7H2O                                0.05 g
クエン酸第二鉄アンモニウム                0.04 g
CuSO4・5H2O                                1.0 mg
ピリドキシン                              1.0 mg
ZnSO4・7H2O                                1.0 mg
ビオチン                                  0.5 mg
CaCl2・2H20                                0.5 mg
Middlebrook ADC富化                       100 ml
グリセロール                              2.0 ml
Tween 80                                  2.0 ml
Middlebrook ADC富化−100 ml当たり
ウシ血清アルブミン                        5.0 g
グルコース                                2.0 g
カタラーゼ                                3.0 mg
【０３２９】
マイクロアレイプロトコル
１．マイクロアレイ分析用のM. tuberculosisからのＲＮＡ抽出
材料および方法
＊  Trizol（Life Technologies）−フェノールおよびチオシアン酸グアニジンの処方物。
＊  ＧＴＣ溶解溶液−５Mのチオシアン酸グアニジン、0.5％のＮ−ラウリルサルコシン、25mMのクエン酸三ナトリウム、0.1Mの２−メルカプトエタノール、および0.5％のTween（登録商標）80を含む。
＊  クロロホルム
＊  イソプロパノール
＊  ３M  酢酸ナトリウム
＊  70％  エタノール
＊  マイクロ遠心機
＊  リボライザー（ribolyser）
＊  滅菌プラスチック製品−Falconチューブ、スクリューキャップ付きエッペンドルフ、ギルソンチップ−これらはすべてＲＮａｓｅを含まない。
＊  ガラス製品−これは、160℃にて少なくとも16時間焼いた。
【０３３０】
方法
＊  封じ込めレベル３で行われる工程；クラスIIIの微生物安全キャビネット内である。
＊  10または20mlの培養物（109/ml）を取り出し、そしてこれをすぐにプラスチック試料ポット中の４容量のＧＴＣ溶解緩衝液に添加する。ポットを堅く密封する。
＊  ＧＴＣ溶解緩衝液中の細胞を室温にて１時間インキュベートする。５％のHycolinで５分間プラスチックポットの表面の汚染を除去する。試料をパスボックスに移し、そして密封可能な蓋を有するプラスチックの運搬用容器に入れる。容器を確実に閉じ、そしてこれを非毒性キャビネットであるＣＬ３キャビネットに移す。
＊  溶解混合物をFalconチューブに等しく分配する。これらのチューブを遠心分離バケットに入れ、そしてバケットを堅く密封する。５％のHycolinで５分間バケットの表面の汚染を除去する。次いで、これらを遠心分離機（Baird and Tatlock Mark IV冷却ベンチトップ遠心分離機）に移す。チューブを3,000rpmにて30分間回転させる。
＊  未開封のバケットをキャビネットに戻す。遠心チューブを取り出し、そして上清をＧＴＣ溶解緩衝液用の廃棄瓶に注ぐ。
＊  各ペレットを５mlのTrizol（フェノールおよびＧＴＣの処方物、カタログ番号15596-026）に再懸濁する。製造業者のガイドラインは、繰り返しのピペット操作によって細胞を溶解することを推奨する。この動作のみではM. tuberculosisを溶解しないが、Trizol中にペレットを完全に再懸濁させるためには重要である。
＊  １mlの細胞を各FastRNAチューブに移し、そしてパワーセッティング6.5にて45秒間、細胞をリボライズ（ribolyse）する。
＊  チューブを室温にて５分間インキュベートする。
＊  各チューブから水層を取り出し、そしてこれをスクリューキャップ付きのエッペンドルフチューブ中の200μlのクロロホルムに添加する。各チューブを約15秒間激しく振盪する。室温にて２〜３分間インキュベートする。
＊  チューブを13,000rpmにて15分間回転させる。遠心分離後、液体は、赤いフェノール／クロロホルム相、界面、および澄明な水相に分離する。
＊  水相を注意深く取り出し、そしてこれを500μlのクロロホルム／イソアミルアルコール（24：１）を含む新鮮なエッペンドルフチューブに移す。このチューブを、13,000rpmにて15分間回転させる。
＊  水相を、50μlの酢酸ナトリウムおよび500μlのイソプロパノールを含むエッペンドルフチューブに移す。
＊  エッペンドルフチューブを５％のHycolinで５分間表面の汚染を除去する。チューブをＣＬ３研究室から取り出し、そして研究室157で手順を続ける。
＊  封じ込めレベル２で行われる工程：
＊  ＲＮＡを−70℃にて少なくとも30分間沈殿させる（必要に応じて、一晩）。
＊  沈殿したＲＮＡを13,000rpmにて10分間回転させて落とす。上清を除去し、そしてペレットを70％エタノールで洗浄する。遠心分離を繰り返す。
＊  70％エタノールを除去し、そしてペレットを空気乾燥させる。ペレットを、ＲＮＡｓｅを含まない水に溶解させる。
＊  ＲＮＡを−70℃にて凍結させて保存する。
【０３３１】
２．ケモスタット培養で増殖したMycobacterium tuberculosisからのゲノムＤＮＡの単離。次いでＤＮＡを用いて、マイクロアレイ実験においてコントロールとして使用するためにCy3またはCy5標識したＤＮＡを生成する。
【０３３２】
材料および方法
0.5mmの直径のビーズ
ビーズビーター
ベンチトップ遠心分離機
プラットホームロッカー
熱ブロック
Falcon 50ml遠心チューブ
Sorvall RC-5C遠心分離機
250mlポリプロピレン遠心分離ポット
スクリューキャップ付きのエッペンドルフチューブ
１ml、200μl、10ml、５mlのピペット
【０３３３】
破壊緩衝液
50mM Tris HCL pH8.0
10mM EDTA
100mM NaCl
【０３３４】
手順
Ｍｔｂ細胞の機械的破壊
＊  150mlのケモスタット細胞（540nmで2.5のO.D.）を、遠心分離機Sorvall RC-5Cを用いて250mlポリプロピレンポット中で15,000rpmにて15分間回転させて落とす。
＊  上清を捨てる。
＊  細胞を、50ml Falconチューブ中の５mlの破壊緩衝液に再懸濁し、そして15,000rpmにてさらに15分間遠心分離する。
＊  上清を除去し、そしてさらなる破壊緩衝液を５mlの容量で添加する。ビーズを用いて細胞を破砕する。これらは、１mlの細胞に対して１mlのビーズ量で使用される。試料を適切なサイズのチャンバー中に置く。ビーズビーター中に置き、そして（氷を含む）外側のユニットを固定し、そして所望のスピードで30秒間処理する。
＊  ビーズを10分間沈殿させ、そして細胞ライセートを50mlのFalcon遠心チューブに移す。
＊  ビーズ上で洗浄緩衝液をピペットで上下させることによって、２〜５mlの破壊緩衝液でビーズを洗浄する。
＊  この洗浄溶液を、falconチューブ中のライセートに添加する。
【０３３５】
タンパク質および細胞成分の除去
＊  0.1容量の10％ＳＤＳおよび0.01容量のプロテイナーゼＫを添加する。
＊  反転によって混合し、そして熱ブロック中で55℃にて２〜３時間加熱する。
＊  得られる混合物は均一かつ粘性であるべきである。そうでないならば、0.2％までの濃度になるようにさらにＳＤＳを添加する。
＊  25/24/1の比のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの等容量を添加する。
＊  プラットホームロッカー上で均一になるまで穏やかに混合する。
＊  3,000rpmにて20分間回転して落とす。
＊  水相を取り出し、そして新鮮なチューブに入れる。
＊  水相を等容量のクロロホルムで抽出して、ごく少量の細胞破砕物およびフェノールを除去する。クロロホルム抽出は、すべての破砕物を除去するまで繰り返す必要があり得る。
＊  0.3M酢酸ナトリウムおよび等容量のイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させる。
＊  ガラス棒でできるだけ多くのＤＮＡを巻き取る。
＊  巻き取ったＤＮＡを70％エタノール、次いで100％エタノールで洗浄する。
＊  空気乾燥させる。
＊  滅菌脱イオン水（500μl）にＤＮＡを溶解する。
＊  ＤＮＡを４℃にて約16時間溶解させる。
＊  溶解したＤＮＡにＲＮａｓｅ１（500Ｕ）を添加する。
＊  37℃にて１時間インキュベートする。
＊  等容量のフェノール／クロロホルムで再抽出し、次いでクロロホルム抽出し、上記のように沈殿させる。
＊  13,000rpmにてＤＮＡを回転して落とす。
＊  上清を除去し、そして70％エタノールでペレットを洗浄する。
＊  空気乾燥させる。
＊  200〜500μlの滅菌水に溶解する。
【０３３６】
３．ＤＮＡからのCy3またはCy5標識したＤＮＡの調製
ａ）マイクロアレイスライド当たり１つのCy3または１つのCy5で標識されたＤＮＡを調製する。
各試料：ＤＮＡ                      ２〜５μg
ランダムプライマー（３μg/μl）        １μl
水                                  41.5μlにする。
95℃にて５分間加熱し、氷上で急激に冷却し、そして短時間遠心分離する。
それぞれに以下のものを加える：10×REact 2緩衝液．．．．．５μl
ｄＮＴＰ（５mM dA/G/TTP、２mM dCTP）．．．．．．．．．． １μl
Cy3またはCy5 ｄＣＴＰ．．．．．．．．．．．．．．．．．．1.5μl
クレノウ（５U/μl）．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１μl
暗所で37℃にて90分間インキュベートする。
【０３３７】
ｂ）スライドをプレハイブリダイズする
コプリンジャー（Coplin jar）中でプレハイブリダイゼーション溶液を混合し、そして標識付け反応が平衡化する間、65℃にてインキュベートする。
プレハイブリダイゼーション：20×ＳＳＣ．．．．8.75ml（3.5×ＳＳＣ)
20％ＳＤＳ．．．．．．．．．．．．．．．．．．250μl（0.1％ＳＤＳ）
ＢＳＡ（100mg/ml）．．．．．．．．．．．．．．５ml（10mg/ml）
水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50mlにする。
【０３３８】
マイクロアレイスライドを、予め加熱したプレハイブリダイゼーション溶液中で65℃にて20分間インキュベートする。スライドを、400mlの水中で１分間全体的にリンスし、次いで400mlのプロパン−２−オール中で１分間リンスし、そしてスライドを、50mlの遠心チューブ中で1,500rpmにて５分間遠心分離して乾燥させる。スライドを暗所の無塵ボックス中でハイブリダイゼーションまで保存する（１時間未満）。
【０３３９】
ｃ）Cy3/Cy5標識したＤＮＡを精製する−Qiagen MinElute Purification
＊  Cy3およびCy5で標識したＤＮＡ試料を１つのチューブに合わせ、そして500μlの緩衝液ＰＢを添加する。
＊  コレクションチューブ中でMinEluteカラムにかけ、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに500μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに250μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  13,000rpmにてさらに１分間遠心分離して、残りのエタノールを取り出す。
＊  新鮮な1.5mlチューブ中にMinEluteカラムを配置する。
＊  メンブランの中心に10.5μlの水を添加し、そして１分間放置する。
＊  13,000rpmにて１分間遠心分離する。
【０３４０】
４．ＲＮＡからのCy3またはCy5で標識されたｃＤＮＡの調製
ａ）マイクロアレイスライド当たり１つのCy3または１つのCy5で標識されたｃＤＮＡ試料を調製する。
各試料：ＲＮＡ．．．．．．．．．．．．． ２〜10μg
ランダムプライマー（３μg/μl）．．．．．１μl
水．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 11μlにする。
95℃にて５分間加熱し、氷上で急激に冷却し、そして短時間遠心分離する。
それぞれに以下のものを加える：５×First Strand Buffer．．５μl
ＤＴＴ（100mM）．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2.5μl
ｄＮＴＰ（５mM ｄＡ／Ｇ／ＴＴＰ、２mM ｄＣＴＰ）．．．．2.3μl
Cy3またはCy5 ｄＣＴＰ．．．．．．．．．．．．．．．．．．1.7μl
SuperScript II（200U/μl）．．．．．．．．．．．．．．． 2.5μl。
暗所で25℃にて10分間、次いで暗所で42℃にて90分間インキュベートする。
【０３４１】
ｂ）スライドをプレハイブリダイズする
コプリンジャー（Coplin jar）中でプレハイブリダイゼーション溶液を混合し、そして標識付け反応が平衡化する間、65℃にてインキュベートする。
【０３４２】
プレハイブリダイゼーション：
20×ＳＳＣ．．．．．．．．．．．．．．．．．．8.75ml（3.5×ＳＳＣ)
20％ＳＤＳ．．．．．．．．．．．．．．．．．．250μl（0.1％ＳＤＳ）
ＢＳＡ（100mg/ml）．．．．．．．．．．．．．．５ml（10mg/ml）
水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50mlにする。
【０３４３】
マイクロアレイスライドを、予め加熱したプレハイブリダイゼーション溶液中で65℃にて20分間インキュベートする。スライドを、400mlの水中で１分間全体的にリンスし、次いで400mlのプロパン−２−オール中で１分間リンスし、そしてスライドを、50mlの遠心チューブ中で1500rpmにて５分間遠心分離して乾燥させる。スライドを暗所の無塵ボックス中でハイブリダイゼーションまで保存する（１時間未満）。
【０３４４】
ｃ）Cy3/Cy5標識したｃＤＮＡを精製する−Qiagen MinElute Purification
＊  Cy3およびCy5で標識したＤＮＡ試料を１つのチューブに合わせ、そして250μlの緩衝液ＰＢを添加する。
＊  コレクションチューブ中でMinEluteカラムにかけ、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに500μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに250μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  13,000rpmにてさらに１分間遠心分離して、残りのエタノールを取り出す。
＊  新鮮な1.5mlチューブ中にMinEluteカラムを配置する。
＊  メンブランの中心に10.5μlの水を添加し、そして１分間放置する。
＊  13,000rpmにて１分間遠心分離する。
【０３４５】
５．スライドをCy3/Cy5で標識されたｃＤＮＡ／ＤＮＡとハイブリダイズする
プレハイブリダイズしたマイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションカセット中に置き、そしてカセット中のウェルに15μlアリコートの水を２回添加する。再懸濁したCy3/Cy5標識したｃＤＮＡ試料を、ハイブリダイゼーション溶液と混合する。
【０３４６】
ハイブリダイゼーション：Ｃｙ３／Ｃｙ５標識したｃＤＮＡ試料..10.5μl
20×ＳＳＣ.......................3.2μl（４×ＳＳＣ）
２％ＳＤＳ.......................2.3μl（0.3％ＳＤＳ）
【０３４７】
ハイブリダイゼーション溶液を95℃にて２分間加熱する。氷上で急激に冷却しないが、徐々に冷却し、そして短時間遠心分離する。気泡形成を避けながらスライド上のアレイされた領域の端にハイブリダイゼーション溶液をピペットで載せる。ピンセットを用いて、カバーグラスの端をスライドの表面に沿って、アレイされた領域の方へ、およびアレイの端のハイブリダイゼーション溶液中に、注意深くドラッグする。一旦決まった位置に置くとさらなる移動を避けながら、カバーグラスをアレイ上に注意深く下げる。ハイブリダイゼーションカセットを密封し、そして65℃の水浴中に16〜20時間沈める。
【０３４８】
スライドを洗浄する。
【０３４９】
ハイブリダイゼーションカセットからマイクロアレイスライドを取り出し、そして最初に、65℃まで予め加熱したWash Aの染色トラフ中でスライドを注意深く洗浄して、カバーグラスを除去する。一旦カバーグラスをスライドラック中のスライドの位置に移動し、そしてWash A中でさらに２分間攪拌を続ける。
【０３５０】
Wash A：  20×ＳＳＣ．．．．．．．．20ml（１×ＳＳＣ）
20％ＳＤＳ．．．．．．．．１ml（0.05％ＳＤＳ）
水．．．．．．．．．．．．400mlにする。
【０３５１】
スライドをクリーンなスライドラックに移し、そしてWash Bの第１のトラフ中で２分間攪拌する。Wash Bの第２のトラフ中で２分間攪拌しながら洗浄する。
【０３５２】
Wash B（×２）：20×ＳＳＣ．．．．．．．1.2ml（0.06×ＳＳＣ）
水．．．．．．．．．．．400mlにする。
【０３５３】
スライドを50mlの遠心チューブに入れ、そして1500rpmにて５分間遠心分離して、スライドを乾燥させ、次いで蛍光をスキャンする。
【０３５４】
実施例１８に従って同定した遺伝子を、表３に挙げる。表２と重複する遺伝子は、表３から省略した。これらの遺伝子のコード配列（核酸配列は転写開始部位から終止コドンまで示す）および対応するアミノ酸配列を、配列番号２１から始まる添付の配列表に挙げる（アミノ酸配列の直後に、各遺伝子の対応するコード配列を伴う）。
【０３５５】
【表３】
2005518784.tif 000005
【０３５６】
参考文献：
１．McKinney, J.D.ら、Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase [コメントを参照のこと]. Nature, 2000. 406(6797): 735-8頁。
２．Pelicic, V.ら、Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(20): 10955-60頁。
３．Lee, M.H.ら、Site-specific integration of mycobacteriophage L5: integration- proficient vectors for Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, and bacille Calmette-Guerin. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(8): 3111-5頁。
４．McShane, H.ら、Enhanced immunogenicity of CD4(+) t-cell responses and protective efficacy of a DNA-modified vaccinia virus Ankara prime-boost vaccination regimen for murine tuberculosis. Infect Immun, 2001. 69(2): 681-6頁。
５．Movahedzadeh, F., M.J. Colston, およびE.O. Davis、Characterization of Mycobacterium tuberculosis LexA: recognition of a Cheo (Bacillus-type SOS) box. Microbiology, 1997. 143(Pt 3): 929-36頁。
【０３５７】
追加の参考文献:
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Lalvani, A.ら、2001. Enhanced contact tracing and spatial tracking of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. The Lancet 357:2017-2021。
Rook, G. A. W.およびB. R. Bloom、1994. Mechanisms of pathogenesis in tuberculosis, 460-485頁. In B. R. Bloom (編), Tuberculosis- pathogenesis, protection and control. ASM Press, Washington DC.。
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【図面の簡単な説明】
【０３５８】
【図１】５０％空気飽和のＤＯＴ（３７℃）でのバッチ発酵条件下で培養中のM. tuberculosisについての生存カウントを示す。
【図２】０．５％および５０％空気飽和の別々のＤＯＴ濃度（３７℃）でのバッチ発酵条件下におけるM. tuberculosisの培養中の、グリセロール（主要な炭素およびエネルギー源として）の濃度を示す。
【図３】実施例１８に記載のマイコバクテリア培養物の培地内のＤＯＴを示す。
【図４】実施例１８のバッチ発酵条件（すなわち、炭素飢餓、および酸素制限条件）中のM. tuberculosisについての生存カウントを示す。
【配列表】
2005518784.tif 000006
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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