(57)【要約】ペプチド、例えば、ゲル上で分離されたぺプチドは、消化膜を通過して複合膜へと電気的ブロッティングが施され、この複合膜は、質量分析法を使用して直接的に分析される。この消化膜で生じたフラグメントの分子量を使用して、それらのぺプチドがフラグメントが由来するポリぺプチドを同定する。この消化膜は、固定された、トリプシンのようなプロテアーゼを含み、この固定されたプロテアーゼは、その後１度通過させることが十分であるような酵素の切断能および効力を用いて電気的ブロッティングを受けたタンパク質を電気的ブロッティングの間にフラグメントへと切断する。このぺプチドは、例えば、ニトロセルロースおよびＭＡＬＤＩマトリクスの混合物を添加することによって化学的に処理された複合捕捉膜上に回収され、その結果、表面近くのぺプチドを吸収して、脱離を促進し、それによって、その後のＭＡＬＤＩ質量分析法による分析の感度を向上させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質サンプルからポリぺプチドを同定および定量するための方法であって、該方法は、以下：
該タンパク質サンプルからポリぺプチドを分離して、該ポリぺプチドを含む支持体を提供する工程；
該支持体に隣接する少なくとも１つの消化膜を提供する工程であって、ここで、少なくとも１つのポリぺプチド切断試薬が、該ポリぺプチドが該膜を１度通過した後に該サンプル中のポリぺプチドのその後の同定を可能にするのに十分な量のポリぺプチドを消化する有効量で該消化膜に固定されている、工程；
少なくとも１つの捕捉膜を提供する工程であって、該捕捉膜は、該少なくとも１つの消化膜から、電気的ブロッティングの間に、該ポリペプチドのペプチドフラグメントの移動方向において、下流にある、工程；
該ポリペプチドを、該支持体から該少なくとも１つの消化膜を通って電気的ブロッティングする、工程；
該少なくとも１つの捕捉膜において該フラグメントを回収する工程；および
該回収したフラグメントを同定または定量する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記切断されたフラグメントの同定が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって実施される、方法。
【請求項３】
指向された前記フラグメントからポリぺプチドを同定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記支持体が電気泳動ゲルである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉膜にセルロースを添加することによってペプチド捕捉を促進するように該膜を改変する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ＭＡＬＤＩマトリクス材料を前記捕捉膜に添加することによって、レーザー脱離に暴露したときにペプチドのイオン化を促進するように該膜を改変する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７】
前記ＭＡＬＤＩマトリクス材料が、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリぺプチドへと分離する前に、前記タンパク質を安定な重同位体で標識する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記切断試薬は、前記消化膜に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記消化膜が、改変ＰＶＤＦ膜および改変ポリエーテルスルホン膜からなる群より選択され、そして前記切断試薬がプロテアーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記切断試薬が、前記有効量で前記消化膜に固定され、該切断試薬は、以下：
塩、プロテアーゼインヒビターを添加し、そして、該膜と該切断試薬とを反応させてシッフ塩基を生成する工程；
還元剤を用いて該シッフ塩基を還元する工程；および
該膜から該プロテアーゼインヒビターを取り除く工程；
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記膜の表面において残った活性基をキャップする工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記捕捉膜の不連続ゾーン上に前記フラグメントの捕捉したものを収束させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記フラグメントを、前記支持体と前記捕捉膜との間に非伝導性シートを提供することによって該捕捉膜の不連続ゾーンに収束させ、該シートは、該フラグメントが流れる少なくとも１つのスリットまたはホールを有する、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、前記消化膜と前記捕捉膜との間に中間捕捉膜を提供して前記ポリぺプチドのサブセットを捕捉する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、ポリぺプチドの前記捕捉されたサブセットを解放する工程および第２の捕捉膜に該サブセットを電気的ブロッティングする工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
前記支持体が切断試薬を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
複数の隣接する消化膜が存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質を含む組織サンプルから直接的にポリぺプチドを同定および定量するための方法であって、該方法は、以下：
タンパク質を含む該組織を提供する工程；
該組織に隣接する少なくとも１つの消化膜を提供する工程であって、ここで、少なくとも１つのポリぺプチド切断試薬が、該サンプル中の電気的ブロッティングされたポリぺプチドが膜を１度通過した後に、該ポリぺプチドのその後の同定を可能にするのに十分な量のポリぺプチドを消化する有効量で該消化膜に固定されている、工程；
少なくとも１つの捕捉膜を提供する工程であって、該捕捉膜は、前記少なくとも１つの消化膜から、電気的ブロッティングの間に、該ポリペプチドのペプチドフラグメントの移動方向において、下流にある、工程；
該少なくとも１つの消化膜を通って、該組織サンプルから該ポリペプチドを電気的ブロッティングする工程；
該少なくとも１つの捕捉膜において該フラグメントを回収する工程；および
該回収したフラグメントを同定または定量する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
タンパク質サンプルからポリぺプチドを同定または定量するための方法であって、該方法は、以下：
該タンパク質サンプルからポリぺプチドを分離して該ポリぺプチドを含む支持体を提供する工程；
該支持体に隣接する少なくとも１つの消化膜を提供する工程であって、ここで、少なくとも１つのポリぺプチド切断試薬が、該消化膜に固定されている、工程；
少なくとも１つの捕捉膜を提供する工程であって、該捕捉膜は、該少なくとも１つの消化膜から、電気的ブロッティングの間に該ポリペプチドのペプチドフラグメントの移動方向において、下流にあり、該捕捉膜がニトロセルロースおよびＭＡＬＤＩマトリクス材料を用いて改変される、工程；
該少なくとも１つの消化膜を介して該支持体から該ポリぺプチドを電気的ブロッティングして、該ポリぺプチドをフラグメントに効率的に切断する工程；
該少なくとも１つの改変された捕捉膜上に該フラグメントを回収する工程；ならびに
該回収されたフラグメントを同定または定量する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記ＭＡＬＤＩマトリクス材料がα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質サンプルからポリぺプチドを同定または定量するための方法であって、該方法は、以下：
該タンパク質サンプルからポリぺプチドを分離して該ポリぺプチドを含む支持体を提供する工程；
該支持体に隣接する少なくとも１つの消化膜を提供する工程であって、ここで、少なくとも１つのポリぺプチド切断試薬が、該消化膜に固定されている、工程；
該少なくとも１つの捕捉膜を提供する工程であって、該捕捉膜は、該少なくとも１つの消化膜から、電気的ブロッティングの間に該ポリぺプチドのペプチドフラグメントの移動方向において下流にある、工程；
該支持体と該捕捉膜との間に非伝導性シートを提供する工程であって、該シートは、該シートが、該フラグメントが流れる少なくと１つのスリットまたはホールを有する、工程；
少なくとも１つの消化膜を通って該支持体から該ポリペプチドを電気的ブロッティングして、該ポリペプチドをフラグメントへと効率的に切断する工程；
該フラグメントを、該少なくとも１つのスリットまたはホールを通って流し、そして、該少なくとも１つの捕捉膜の不連続領域上に回収する工程；および
該回収されたフラグメントを同定または定量する工程
を包含する、方法。
【請求項２４】
電気的ブロッティングサンドイッチであって、該電気的ブロッティングサンドイッチは、
支持体であって、少なくとも１つのポリペプチドを含み、そして、切断試薬を含まない支持体；
少なくとも１つの消化膜であって、該少なくとも１つの消化膜を１度のみ通した後に該少なくとも１つのポリペプチドを切断するのに有効な量で少なくとも１つの試薬が該消化膜上に固定される、消化膜；
該少なくとも１つのポリペプチドのフラグメントを回収するのに有効な少なくとも１つの収集膜；
を備える、電気的ブロッティングサンドイッチ。
【請求項２５】
請求項２４に記載の電気的ブロッティングサンドイッチであって、ここで、前記切断試薬が前記消化膜に固定されており、該固定は、以下；
塩、プロテアーゼインヒビターを添加し、該切断試薬を該膜と反応させて、シッフ塩基を生成する工程；
該シッフ塩基を還元剤で還元する工程；および
該膜から該プロテアーゼインヒビターを除去する工程
による、電気的ブロッティングサンドイッチ。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの収集膜が、ニトロセルロースで改変される、請求項２４に記載の電気的ブロッティングサンドイッチ。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの収集膜がＭＡＬＤＩマトリクス材料を備える、請求項２６に記載の電気的ブロッティングサンドイッチ。
【請求項２８】
ポリぺプチドを電気的ブロッティングする用途に適切なキットであって、
少なくとも１つの消化膜および少なくとも１つの回収部材
を備え、
該消化膜は、ポリぺプチドの電気的ブロッティングの用途にとって適切な少なくとも１つの消化膜であって、該消化膜上には、該ポリぺプチドを該消化膜に１度通した後に該ポリぺプチドをフラグメントへと実質的に全て切断するのに有効な量で、少なくとも１つのポリぺプチド切断試薬が固定されており；
少なくとも１つの回収部材は、電気的ブロッティングによって該回収部材上に移動されてきたフラグメントをその上に受けるのに適切なものである、
キット。
【請求項２９】
前記切断試薬が、プロテアーゼである、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記収集部材がニトロセルロースを用いて改変される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
前記回収部材がＭＡＬＤＩマトリクス材料を備える、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
質量分析法にとって適切な表面にポリペプチドを電気的ブロッティングする用途のための装置であって、該装置は、
消化膜および複合捕捉膜
を備え、
該消化膜は、ポリペプチドの電気的ブロッティングおける用途に適切な少なくとも１つの膜を備え、該消化膜は、該膜上に固定された少なくとも１つのポリペプチド切断試薬を有し、ここで、該試薬は、該分離されたポリペプチドのペプチドフラグメントの十分に高濃度のペプチドフラグメントを生じ、連続的または断続的な直流電流によって該消化膜を通るように該ポリペプチドが指向されるときに、該ポリペプチドの同定が可能となる、消化膜であり、
該複合捕捉膜は、電気的ブロッティングによって移動されてきた該ペプチドフラグメントを該捕捉膜上に受けるのに適切であり、該複合捕捉膜は、化学的に改変されて、レーザーに曝露された場合に該ペプチドフラグメントを捕捉して、そして該フラグメントのイオン化を促進する複数ペプチド相互作用様式を備えるハイブリッド膜を生成する、複合捕捉膜である、
装置。
【請求項３４】
前記切断試薬がプロテアーゼである、請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記プロテアーゼがトリプシンである、請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
請求項３３に記載の装置であって、ここで、前記切断膜が、前記ポリペプチド切断試薬と反応可能である官能基とともに提供され、該ポリペプチド切断試薬が、該切断膜を通り、該官能基を介して該膜上に共有結合されることによって固定される、装置。
【請求項３７】
請求項３３に記載の装置であって、ここで、前記切断膜の表面に基が提供され、該基は、前記ポリペプチド切断試薬に結合されておらずかつポリペプチドと反応し得、その結果、該ポリペプチド切断試薬を該膜に共有結合させ、該ポリペプチド切断試薬に結合していない該基は、該ポリペプチドとの反応を防ぐためにキャップされる、装置。
【請求項３８】
請求項３３に記載の装置であって、前記複合捕捉膜の表面は、ニトロセルロースポリマーおよびＭＡＬＤＩマトリクス試薬を添加することによって改変される、装置。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、分離機構によって事前に分離されている、請求項３３に記載の装置。
【請求項４０】
請求項３９に記載の装置であって、前記分離機構は、１次元ゲル電気泳動、２次元ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、薄膜クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー、等電点電気泳動、および動的場勾配電気泳動からなる群より選択される、装置。
【請求項４１】
請求項３３に記載の装置であって、ここで、前記分離されたポリペプチドが、多孔性フィルターを有する１以上のウェルで回収され、該フィルターを介して、ポリペプチドは、捕捉膜上へと電気的溶出によって移動し得る、装置。
【請求項４２】
請求項４１に記載の装置であって、複数のウェルがアレイで形成され、そして、複数の電極を有するマニホールドをさらに備え、それによって、該ウェルのアレイ中のポリペプチドが同時に電気的溶出される、装置。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、多孔性支持体を使用して分離されている、請求項３９に記載の装置。
【請求項４４】
請求項４３に記載の装置であって、ここで、前記多孔性支持体が、紙、他のセルロース含有物質、シリカゲルベースの媒体、スターチおよびアガロースからなる群より選択される、装置。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが事前に分離されている、請求項３３に記載の装置。
【請求項４６】
請求項４５に記載の装置であって、ここで、前記ポリペプチドは、組織ブロット、器官ブロット、細菌コロニーのブロット、真核生物の組織培養物のブロットまたは組織スライスからなる群より選択される、装置。
【請求項４７】
タンパク質定量のために、請求項３３に記載の装置を使用する方法であって、以下の工程：安定な重同位体試薬で２つ以上のタンパク質サンプルのうちの少なくとも１つを標識することによって前記ポリペプチドを改変する工程であって、該２つ以上のサンプルは、標識後に一緒に混合し、そして、単一ユニット操作において処理される工程、を包含する、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、前記改変試薬が、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルアセテートおよび重水素、Ｃ−１３、Ｎ−１５またはＯ−１８の濃度を高めたＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジルアセテートからなる群より選択される、方法。
【請求項４９】
質量分析法に適切な表面にポリぺプチドを電気的ブロッティングする用途のための装置であって、該装置は、電気的ブロッティングの１つの経路または別々の段階において、以下のサブパラグラフ（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のもの：
（ａ）消化膜であって、該消化膜は、ポリペプチドの電気的ブロッティングにおける用途に適切な少なくとも１つの膜を備え、該消化膜は、該膜上に固定された少なくとも１つのポリペプチド切断試薬を有し、ここで、該試薬は、該分離されたポリペプチドの十分に高濃度のペプチドフラグメントを生じて、連続的または断続的な直流電流によって該消化膜を通るように該ポリペプチドが指向されるときに、該ポリペプチドの同定が可能となる、消化膜；
（ｂ）電気的ブロッティングによってその上に移動してきたペプチドのうち少なくともいくつかのものを捕捉する中間捕捉膜
（ｃ）複合捕捉膜であって、該複合捕捉膜は、電気的ブロッティングによって移動されてきた該ペプチドフラグメントを該捕捉膜上に受けるのに適切であり、該複合捕捉膜は、化学的に改変されて、レーザーに曝露された場合に該ペプチドフラグメントを捕捉して、そして該フラグメントのイオン化を促進する複数ペプチド相互作用様式を有するハイブリッド膜を生成する、複合捕捉膜
のうち任意の２つを備える、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１．発明の分野）
本発明は一般に、ポリペプチドを同定または定量するための方法および装置に関する。より具体的には、本発明は、多孔性支持体を用いて（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて）分離されたポリペプチドを同定または定量するのに使用され得る。本発明はまた、タンパク質（例えば、組織切片もしくは器官ブロット（ｂｌｏｔ）におけるような、膜に吸収されたタンパク質の任意の他の１次元もしくは２次元のタンパク質アレイから、または細菌もしくは組織培養プレート上で増殖させた細胞から、あるいは１次元もしくは２次元ゲルまたはクロマトグラフィー画分由来のタンパク質を含むマイクロタイタープレートから）の分離されていないタンパク質を同定するために使用され得る。分離されたポリペプチドに関する技術は、生化学的研究において特に有用であり、その目標は、同定されるタンパク質の最初の分子量についてのいくつかの情報を保持しながら、生物学的サンプル中の数十〜数百の最も豊富なタンパク質を迅速に同定または定量することである。分離前のポリペプチドをに影響を与えない技術は、任意の２次元タンパク質アレイの異なる切片においてどのタンパク質が最も豊富であるかを決定するのに使用され得る。１つ以上のサンプルからの分離されたタンパク質の相対的な定量化は、分離、電気的ブロッティング、消化および質量分析の前に、タンパク質の安定な同位体標識を用いることによって達成される。
【背景技術】
【０００２】
（２．関連技術の説明）
生化学者はしばしば、生物学的サンプルの主要なタンパク質成分を確立することに関心を抱き、そして、通常、実験サンプルとコントロールサンプルとの間で変化したタンパク質を知ることに関心を抱く。最近１０年間で、ゲル電気泳動およびその後のペプチド質量フィンガープリンティング（ＰＭＦ）またはタンデム（ＭＳ−ＭＳ）質量分析法が、これらの分析を行うための選り抜きの方法になってきた。代表的には、ゲル電気泳動はタンパク質を分離するために行われ、そして、ゲル全体がクマシーブリリアントブルーで染色される。ゲルパターンを調べた後、科学者は、どの切片が分析されるべきであるかを決定する。次いで、手動または自動の方法を用いて、目的のタンパク質を含むゲルの小片を切り取る。数回の洗浄工程の後、ゲル切片全体を別々にプロテアーゼ（通常はトリプシン）で消化し、この消化産物を各ゲル切片から抽出し、濃縮し、脱塩し、そして別々に質量分光分析にかける。質量スペクトルはしばしば、完全に自動化された方法で回収され、そして、自動的なタンパク質同定を行うための専用のソフトウェアが市販されている。最初のサンプル調製工程を行うロボットもまた市販されているが、高価である。さらに、科学者は、全てのこれらの工程の間、各サンプルがどのように元々のゲルと関係していたかを記録しておかなければならない。このことは、混乱の多くの機会をもたらす。多くの場合において、これらのサンプルは、これらのプロセスの間に、異なる程度で、外因性の汚染物質で偶発的に汚染される。これらのプロセスは、代表的には、行うのに数日を必要とし、代表的には、一晩のプロテアーゼ消化の工程を包含する。これらの技術は骨が折れ、かつ高度の操作者の訓練を必要とするので、この種のタンパク質同定は、主に、大きな製薬会社によって、そして、分析される切片毎にかなりの人数の元受け研究者を充てる中核研究室によって行われる。さらに、これらの技術は、切片のすぐ隣にあるタンパク質を同定するためには不十分である。なぜならば、ゲルからのポリペプチドバンドの切り出しは連続的に行わなければならず、そして、この切り出しプロセスは、ゲルを移動させ、引き続く切り出し工程を制御不能にするためである。また、ポリペプチドがチューブ壁に付着する場合、損失が生じる。
【０００３】
定量化は代表的には、タンパク質がゲル上で分離される前または分離された後のいずれかに、タンパク質について行われる。代表的に使用されている３つの方法がある：
１．クマシーまたは銀染色または蛍光染料で染色する方法：現時点で、この方法は、ゲルから過剰な染料を洗い出した後に、可視光または紫外線で可視化されるタンパク質染色化合物を含む溶液にゲルを浸漬する工程を必要とし、このプロセスは、代表的には数十分〜数時間を要する。
【０００４】
２．分離の前にタンパク質にタグ化する方法：ゲル上で分離する前に、タンパク質を蛍光染料と反応させることによって、蛍光タンパク質誘導体が作製され得る。蛍光染料の性質は、ゲル上での分離の間のタンパク質誘導体の移動度を変え得るが、それによって、誤差を生じる。分離後、例えば、Ｂｅｒｇｇｒｅｎら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １：５４−６５  ２００１；およびＴｏｎｇｅら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３：３７７−３９６  ２００１に記載されるようにして蛍光強度を測定する。
【０００５】
３．タンパク質を放射活性同位体でタグ化する方法：分離前のタンパク質の放射標識はありふれたことである。可視化は、代表的には分離された放射標識タンパク質を含むゲルを写真用フィルムに露光することによってなされる。露光の量はタンパク質の放射能の量に比例する。しかし、放射活性物質へのアクセス、暴露、および放射活性物質の廃棄に関する規制を考慮すると、放射活性タグの使用は望ましくない。さらに、多くのタンパク質（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）サンプル（例えば、血清サンプル）は、生合成的に標識され得ず、そしてさらなる化学が、このサンプル中に放射能を導入するために行わなければならない。
【０００６】
上記の方法の３つ全てが、染色、脱染色、洗浄および画像化のためのさらなる工程を必要とし、これは、結果を得るためにより時間がかかることを意味する。定量測定は、同じ様式で標識されかつ同じ様式で分離された、標準タンパク質との比較を必要とし；従って、さらなる実験がなされる必要がある。
【０００７】
最近、マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）の分解能の上昇に起因して、定量目的のための安定な重同位体（ｈｅａｖｙ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ）の使用が可能になってきた。これらの実験において、コントロールサンプルは、正常なアミノ酸で標識されたタンパク質を含み、その一方で、実験サンプルは、重同位体（特に、重水素、Ｃ−１３、Ｎ−１５およびＯ−１８（Ｖｅｅｎｓｔｒａら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １１：７８−８２  ２０００を参照のこと））を富化した原子（また、逆も同じ）を含むタンパク質を含む。これらの２つのサンプルを、タンパク質またはペプチド分離の前に一緒に混合し、次いで質量分析計によって区別する。あるいは、Ｇｙｇｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：９９４−９９９  １９９９に記載されるように、タンパク質改変試薬を使用することによって、特定のアミノ酸側鎖に２つの異なる同位体形態でもたらされる重原子が付加される。この場合、化学改変工程がタンパク質消化の前または後のいずれかで行われ得る。多くの場合において、同位体の富化ストラテジーは、上記のサンプル処理工程が困難であることが原因で、ゲル全体を回避している。代わりに、タンパク質は、ペプチド分離の前に１つのサンプルとして消化され、そして、ＭＳ−ＭＳ技術を用いて、タンパク質同定が個々のペプチドレベルで行われる。この技術は、費用の理由のために、目標が、限られた数のタンパク質の相対的な定量化を決定することである場合、通常は用いられない。さらに、タンパク質の最初の分子量についての全ての情報は、タンパク質が実験の最初に消化されたときに失われ、そして、インタクトな分子量が、しばしば生化学者にとっての重大な目的である。
【０００８】
第２に、無関係のタンパク質分析技術は、全組織またはコロニー由来のタンパク質の直接的な同定を含む。過去に、タンパク質は、代表的には、サンプルを構成する細胞の物理的な破壊によってコロニー、組織および組織切片から抽出された。しかし、米国特許第５，８０８，３００号に開示されるように、質量分析法によって、組織から直接切除されたタンパク質を分析することが現在可能である。しかし、インタクトなタンパク質は、そのペプチド対応物と比較して同定することがほとんど不可能である。
【０００９】
最近、ゲル染色、スポット切り取りおよび抽出ならびにペプチド単離を必要としない平行してタンパク質同定を行うための技術（分子走査装置と呼ばれる）が米国特許第６，２２１，６２６号に記載された。電気泳動ゲルと、ペプチドフラグメントを吸着する疎水性の収集膜との間に配置された固定化プロテアーゼを含む親水性膜を含む電子ブロッターサンドイッチ法が、記載された。この疎水性膜は、後に、膜から直接切断されたポリペプチド固定化サンプルのＭＡＬＤＩ分析を可能にするＭＡＬＤＩイオン化可能マトリクスで処理された。従って、ゲル中に存在した全てのタンパク質は、質量分析法と適合性の技術を同時に用いて処理される。本特許において、ペプチドフラグメントを収集膜に駆動させるために用いられた電流は、パルス状であったか、または交流であったかのいずれかであり、これは、専用の電気的ブロッティング装置を必要とする。さらに、この様式の電流の使用は、望ましくない。なぜならば、サンプルを処理するのに必要な時間が増えるからである。この技術は、続いて、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ００／４５１６８号に記載されるように洗練され、ゲル中（ｉｎ−ｇｅｌ）消化工程が含められた。しかし、これらの２つの技術のいずれもが、特定の適用のために完全には満足できなかった。例えば、上記の元々の技術を用いて、一貫したかつ感度のよい質量シグナルを得ることにおいて技術的な困難性が存在した。また、同時のタンパク質同定およびタンパク質定量のための重同位体の使用を許容する技術は記載されなかった。これらの制限は、両方をそれほど望ましくなくし、かつ、生化学者が普段ベースで分子走査装置を使用することをより困難にした。上記の’６２６特許および公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ００／４５１６８号の両方が、本明細書中に参考として援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、任意の専用の装置を必要としない分子走査実験を行うための方法および装置を提供し、その結果、この技術が慣用の生化学分析に適用され得ることが望ましい。さらに、サンプル中のタンパク質の最初の分子量に関する全ての情報を失うことなく、重同位体をタンパク質定量のために用いる手段を開発することが望ましい。以下に本発明者らが記載する方法および装置は、これらの要求を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、タンパク質サンプル由来のポリペプチドの同定または定量に関する。１つの実施形態において、タンパク質は、ゲルで分離され、そして、電気的溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）の間に酵素で消化することによってペプチドフラグメントに切断される。次いで、ペプチドフラグメントが複合捕捉膜の表面に堆積され得る。
【００１２】
１つの実施形態において、ペプチドフラグメントを回収するための複合捕捉膜は、捕捉されたフラグメントが消化膜に近接した複合捕捉膜の外側表面に濃縮されるように調製される。これは、第４級アミンで改変されたＰＶＤＦ膜をニトロセルロースおよびＭＡＬＤＩマトリクスの組み合わせにより前処理することによって達成される。
【００１３】
１つの実施形態において、タンパク質は、安定な重同位体で標識されて、タンパク質の相対的な定量のために提供される。重水素化または非重水素化のアセチル基でリジン残基のアミノ基を標識する技術は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥと適合性であり、同時の相対的タンパク質定量を可能にする。
【００１４】
１つの実施形態において、電気泳動技術は、消化されたポリペプチドを捕捉膜の別々のゾーンに堆積させる。この様式において、膜全体を走査して電気堆積されたペプチドを見出すことは必要ではない。
【００１５】
本明細書中に記載される分子走査装置の１つの実施形態において、切断試薬は固定化され、そして、サンドイッチの一方の「スライス」としての支持体（例えば、分離ゲルまたは前もって動物組織と接触させたゲル）とサンドイッチの他方の「スライス」としての本発明に従って適切に改変された複合捕捉膜（従来のポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜として例示される）との間の電気的ブロッティング「サンドイッチ」中の「充填物」として挿入される。このようにして、フラグメントは、複合捕捉膜の表面上で回収され、次いで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに適した方法で処方され得る。タンパク質が、固定化された切断試薬の近くにおいて、妥当な量のフラグメントが産性されることを保証する十分長いが、望ましくない拡散を許容する程度には長くない滞留期間を有するように電気的ブロッティングが行われることのみが必要である。これは、電気的ブロッティングにおいて使用される電圧および緩衝液を調整することによって容易に達成される。さらに、高い酵素活性は、自己切断（酵素自身の切断）を最小にしつつ、切断酵素を親水性膜にしっかりと固定することによって得られる。
【００１６】
本発明はまた、本明細書中に記載される型の分析を実施するのに現在必要とされる時間を減少させ、その結果、ゲルから質量分光分析の開始までの全分析を１日で実施し得る。同じデバイスを用いて、ゲル以外の供給源（例えば、組織ブロットまたは組織切片、クロマトグラフィーの画分、２次元ゲルからの中核スポットなど）由来のポリペプチドを分析し得る。並行したタンパク質消化および直接的なＭＡＬＤＩ分析に適した表面上への捕捉を達成するためのこのシステムの単純さは、ゲルから切り取られたスポットもしくは切片の分析、または任意の種類のタンパク質画分の分析のためのサンプル調製法として、このシステムを魅力的なものにしている。
【００１７】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、切断試薬の固定化のため、および複合捕捉膜を形成するための改善した方法および装置を提供する。これは、切断されるべきポリペプチドが、１方向または２方向でのいずれかで、不連続にではなく、１つの経路で連続して切断試薬と接触して通貨することを可能にする。さらに、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ００／４５１６８号に以前に記載されているように、電気的ブロッティングの前に分離ゲル中で消化プロセスを開始する必要はない。
【００１８】
固定化切断試薬は、ペプチドフラグメント形成をもたらすのに、先行技術の固定化切断試薬よりも高い能力を有する。さらに、複合捕捉膜が、ペプチドフラグメントが複合捕捉膜の内部ではなく、親水性膜に面する複合捕捉膜の表面上で単離されることを保障する手順によって形成される。
【００１９】
本発明の特定の局面に従って、ゲル電気泳動により分離されているか、またはタンパク質（例えば、インタクトな組織または細菌細胞培養物）の１次元または２次元のアレイからの膜にブロットされたポリペプチドを同定する改善された方法が以下のように提供される：
ａ）ゲルに隣接して少なくとも１つの親水性膜を提供する工程であって、この親水性膜には、ポリペプチドを切断し得る少なくとも１種の試薬が固定化されている。プロテアーゼの場合、この親水性膜は、プロテアーゼの自己消化を最小にしながら、高濃度のプロテアーゼを堆積するために、高い塩濃度およびプロテアーゼインヒビターの添加で処理される。
【００２０】
ｂ）電気的ブロッティングにより膜上に移されるポリペプチドのフラグメントを受けるのに適した複合捕捉膜を提供する工程。複合捕捉膜は、ポリペプチドのペプチドフラグメントの移動方向（通常は陽極から陰極）にある親水性膜を超えて配置される。複合捕捉膜は、ペプチドの捕捉を促進する化合物（例えば、ニトロセルロース）および、ＭＡＬＤＩ分析のためのペプチドのイオン化を促進するマトリクス物質（例えば、αシアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸酸（ＨＣＣＡ））の添加によって改変される。
【００２１】
ｃ）ポリペプチドを切断試薬によってフラグメントに切断させるのに有効な条件下で、ポリペプチドを分離ゲルから親水性膜を通って、複合捕捉膜まで電気的ブロッティングさせる工程。この工程は、一定の一方向性の電流下の単一経路の間に生じる。
【００２２】
ｄ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ−ＭＳによって、複合捕捉膜上に回収されたフラグメントを同定する工程および、フラグメントの同定から、これらのフラグメントが発端を発するポリペプチドを同定する工程。
【００２３】
この方法は、以下の工程によってさらに延長され得る：
ｅ）分離の前に、質量分析法により区別され得る安定同位体を差次的に含有する試薬でタンパク質を標識することによって、同定されるポリペプチドの相対的定量を提供する工程。例えば、インタクトなタンパク質は、Ｎ−ヒドロキシスクシニミル（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｙｌ）−アセテート（ＮＨＳＡ）で処理され得、これは、リジン側鎖と反応する。ＮＨＳＡは、３つの重水素原子または３つの水素原子のいずれかを含有するアセテート標識基で合成され得る。次いで、これらのサンプルは、ゲル電気泳動、消化、捕捉およびＭＳ分析の前に一緒に混合される。次いで、実験サンプルと比較したコントロール中のタンパク質の相対量が、ＭＳによって測定されるような各ペプチド対の相対強度を測定することによって推論され得る。各タンパク質について、検出されるペプチドの大半は、これらの対の形態（主な例外は、アルギニン残基で終止し、また、アルギニン残基により先行されるペプチドである）であり、これは、各タンパク質の発現レベルは、多くの個々のペプチド測定値に基づくことを意味する。
【００２４】
さらに、従って記載される方法は、組織および組織切片または細胞培養由来のタンパク質の分析に同様に適用可能である。
【００２５】
別の局面において、本発明は、膜の上に固定された少なくとも１種のポリペプチド切断試薬を有する電気ブロッティングサンドイッチにおける使用に適した膜、特に、膜の上に共有結合されたプロテアーゼ（特に、トリプシン）を有する、改変ＰＤＶＦ膜またはポリエーテルスルホン膜を作製するための方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、本発明の方法における使用のためのキットとして具体化され得、このキットは以下を含む：
ａ）少なくとも１つの親水性膜であって、その上に、ポリペプチドを切断し得る少なくとも１種の試薬を固定化し、この切断試薬は、切断されるべきポリペプチドの通過を許容するのに十分高い活性を有し、そこからこの親水性膜を介して１つの経路でペプチドフラグメントを生じる、親水性膜；および
ｂ）電気的ブロッティングによって膜上にポリペプチドのフラグメントを受けそして捕捉するのに適した複合捕捉膜であって、この複合捕捉膜は、化学的に改変され、その結果、捕捉されたフラグメントがその表面上に濃縮される、複合捕捉膜。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「キット」とは、別々の容器中または１つの容器中で同定された成分および、親水性膜のアセンブリ、および使用できる状態の化学的に改変された複合捕捉膜の組み合わせを含む。キットはさらに、本発明の方法において有用な試薬（例えば、定量化のための同位体的に異なる標識試薬）、電気的ブロッティング緩衝液、およびポリペプチドフラグメントとの酵素の反応を補助する試薬を含み得る。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「捕捉膜」は、幅広い意味を有する。なぜならば、捕捉膜が本発明の実施に特に重要であるからである。この膜は、自己支持型または非自己支持型であり得、そして、孔性膜、フィルム、コーティングまたはプレートであり得る。この膜は、通常、緩衝液を電気的ブロッティングに対して、孔性であって、電流が電極にまたは電極から運ばれるのを可能にするが、あるいは、電極または電極との直接的な電気伝達であり得る。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「同定する」とは、配列を決定するの同意語としては解釈されず、そして、ポリペプチドを部分的に同定するかまたは既知のタンパク質と同じであるかもしくは異なるとしてポリペプチドを特徴付けることを包含する。さらに、この用語は、少数の可能性のうちの最も有望なものに基づいた仮の同定を行う工程を包含する。配列は、未知のタンパク質の同定のため、または既知のタンパク質の確認のためのタンデムＭＳ−ＭＳ法によって決定され得る。
【００３０】
本発明の１つの実施形態は、ゲル電気泳動によりすでに分離されているポリペプチドを同定および定量すること、または、電気的ブロッティングによって１次元もしくは２次元タンパク質アレイから抽出したタンパク質（例えば、組織または組織切片）を同定することに関する。同定されるポリペプチドの性質または供給源は、重要ではない。これらは、例えば、天然に存在するタンパク質、組み換えＤＮＡ技術により作製されたタンパク質、またはペプチド合成により作製されたポリペプチドもしくはポリペプチドの部分的な切断由来の大きなペプチドであり得る。略して、本発明は、これ以降にタンパク質に関して記載される。他のポリペプチドへの推定は、以下の説明を通じて理解され、そして援用されるものとして解釈される。
【００３１】
タンパク質が分離されたゲルの組成は重要ではないが、通常はポリアクリルアミドゲルである。任意の従来のゲルおよび分離条件が用いられ得、これには、還元性かつ非変性性の条件が含まれる。これらは、１次元または２次元のゲルであり得る（２次元ゲルにおいて、タンパク質は、その電荷によって１次元で分離され、そして、その分子量によってもう一方の次元で分離される）。他の適切な分離様式としては、キャピラリー電気泳動、キャピラリー電気クロマトグラフィー、動的場勾配（ｄｙｎａｍｉｃ  ｆｉｅｌｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）電気泳動、等電点電気泳動、液体クロマトグラフィー（アフィニティークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーを含む）およびアガロースゲルまたはデンプンゲルを用いる電気泳動が挙げられる。
【００３２】
本発明は、ゲル上に同時に存在する１個以上のタンパク質（例えば、１〜３０００個、好ましくは１〜２００個のタンパク質）で利用され得る。これらは、１次元ゲル上に異なる分子量で分離して存在するか、または同じ分子量であるが、１次元ゲル上の平行したレーンもしくはトラックに存在するタンパク質、ならびに、２次元ゲル電気泳動によって分離されたタンパク質を含む。大抵のタンパク質は、電気的ブロッティングに用いられるｐＨで負に荷電されているので、通常、電気的ブロッティングは、全体として陽極から陰極の方向で行われる。ポリペプチドおよびそのフラグメントが陰極に向かって移動することをさらに確証するために、ペプチドに負の電荷を与える少量の添加物（例えば、ＳＤＳなど）がトランスファー緩衝液に添加され得る。この濃度は、膜へのペプチドの結合または固定切断試薬（例えば、トリプシン）の活性を有意に干渉する必要はないが、なお、ポリペプチドと相互作用し、そのフラグメントに正味の負電荷を与えるのに十分な濃度でなければならない。好ましい濃度は通常、約０．００１〜約０．１％  ｗ／ｖの間、好ましくは、０．００５〜約０．０２％の間、最も好ましくは０．０１％  ｗ／ｖである。使用される電気的ブロッティング緩衝液のｐＨに依存して、正および負に荷電されたフラグメントが得られ得、そして、それぞれ陽極および陰極に向かって対向する方向に移動し得る。
【００３３】
図１、２ａおよび２ｂは、電気的ブロッティングに有用ないくつかのサンドイッチ構成を例示する。図１は、陽極収集層が、好ましくは、多様式の捕捉機構を有する複合捕捉膜１４である実験的な配置を示す。異なるｐＨ条件下で、いくつかのポリペプチドフラグメントが陽極収集層に向かって移動し得ることが理解される。従って、本発明は、陰極収集層および陽極収集層の各々の間に挿入される１つ以上の親水性膜１３ならびに分離ゲル１１（図２ｂ）を備える、陰極収集層および陽極収集層を提供する可能性を含む。図１において、少なくとも１つの親水性膜１３、好ましくは、適切なタンパク質切断試薬（例えば、臭化シアン、３−ブロモ−３−メチル−２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈ−インドール（ＢＮＰＳ−スカトール）など）を有する改変ポリエーテルスルホン膜、好ましくは、その上に固定化され、ゲル１１の間と陰極の複合捕捉膜１４との間に挿入されたプロテアーゼ酵素（例えば、トリプシン）が存在し、この複合捕捉膜１４は、ＰＶＤＦ、ナイロンまたはニトロセルロースのような物質から形成され得、最も好ましくは、化学的に改変されたＰＶＤＦの複合捕捉膜であり、この上にタンパク質フラグメントが回収される。図２ａにおいて、２つの連続した親水性膜１３（好ましくは、改変されたポリエーテルスルホン膜）が存在し、各々がその上に固定化されたトリプシンを有し、ゲル１１と陰極収集層との間に配置され、そして、再度、好ましくは、化学的に改変されたＰＶＤＦの複合捕捉膜である。図２ｂは、ゲル１１の両側面上の消化膜１３ならびに、陰極捕捉膜および陽極捕捉膜の両方が存在する、同様の配置を示す。
【００３４】
より詳細には、陰極および陽極は、液体を電極と電気接触したままにしながら、ブロッティング液体に浸漬される吸収層１２によって残りのサンドイッチから分離され、そして好ましくはフィルターペーパーである。この配置において使用される電極および吸収層の種類は、重要ではなく、そして、電気的ブロッティングにおいて従来用いられる任意の型であり得る。
【００３５】
サンドイッチの「充填物」は、タンパク質およびそのフラグメントが膜上に留まる傾向がないように、十分親水性の特徴を有する１つ以上の膜１３（図２ａに示されるように定義される）の形態を取り得る。この膜は、電気的ブロッティング液体に対して孔性であり、その上（その表面上または間隙もしくはその中の微洞内のいずれか）にポリペプチド切断試薬を固定し得る任意の層であり得、この試薬は電気的ブロッティング液体に対して（および、それゆえ切断されるポリペプチドに対して）アクセス可能である。この膜は、代表的には、１００〜６００μｍ厚である；例えば、Ｇｅｌｍａｎ  ＵＳ４５０膜（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、約１５０μｍ厚である。通常、サンドイッチに含まれるこのような膜の数は、１〜７である。従来の厚さの膜では、４枚の膜がよく用いられる。これらは、直接的に最もよく配置され、相互に隣接される（すなわち、１枚が別の上に配置される）。親水性膜は、好ましくは、「活性なカルボニル」基もしくはカルボン酸基、または酵素中に存在するアミノ基と反応性のその誘導体を備えて提供される。「活性なカルボニル」改変ＰＤＶＦ膜、もしくはカルボキシル改変ＰＶＤＦ膜、またはアルデヒド活性化膜を有するポリエーテルスルホンが特に好ましい。
【００３６】
アルデヒド活性化膜は、ポリペプチド切断試薬（例えば、プロテアーゼ）を固定するために用いられる。切断活性を増強するために、親水性膜上に固定される活性タンパク質分解酵素の量を増加する方法が記載される。固定化条件は、活性酵素が膜に固定されたことを確証するために、反応混合物への約０．１〜約１．５Ｍ、好ましくは約１．１〜約１．５Ｍの間の濃度での硫酸ナトリウムなどのような塩、およびベンズアミジンなどのようなプロテアーゼインヒビター（トリプシンの場合）の添加を含む。次いで、この反応の間に形成されるシッフ塩基が、シアノホウ化水素ナトリウム（または他の適切な還元剤）で還元されて、不可逆性の共有結合を生じる。次いで、１Ｍ塩化ナトリウムなどを使用して、プロテアーゼインヒビターが膜から除去され、その結果、固定化切断試薬が遊離されてポリペプチドを消化し、ペプチドフラグメントを形成する。
【００３７】
膜の表面に存在する全ての活性基を酵素と反応させるのが難しく、そして、ポリペプチドをこれらの遊離した活性基と反応させることが望ましくないため、残った活性基（これは、さもなくば遊離している）は、好ましくは、膜が例えばエタノールアミンで使用されるか、またはアルデヒド活性化膜については、Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）およびシアノホウ化水素ナトリウムで使用される前にキャップ化され、従って、比較的親水性の末端（例えば、−−ＣＯ−−ＮＨ−−ＣＨ２−ＣＨ２−−ＯＨ）を提供する。他の従来の親水性キャップ化基が利用され得る。あるいは、ＰＶＤＦ膜またはグラスファイバー紙がイソチオシアネートにより官能化され得、これが酵素中のリジン残基のε−アミノ基と反応させる。この目的のために、ＰＶＤＦ膜は、ＮａＯＨで前処理されて、ポリマー鎖中に炭素−炭素エチレン性二重結合を提供する（ＨＦの分子は除く）。次いで、前処理されたＰＶＤＦ膜は、塩基性条件下でジヌクレオフィル（ｄｉｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ）（例えば、エチレンジアミン、１，１０−ジアミノデカンまたは２−アミノエタンチオール）と反応させられ、これによって、ポリマー中の水素原子が−−Ｘ−−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基で置換され、ここでＸは−−Ｓ−−または−−ＮＨ−−であり、そして、ｎは２〜１０である。次いで、アミンで終端となる側鎖を有するこのポリマーは、１，４−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）または３，５−ジクロロ−１，４−フェニレンジイソシアネート（ＤＣＤＩＴＣ）と反応させられ、良好な収量で、必要とされるジイソチオシアネートで終端となる側鎖を得る。ＤＩＴＣと反応したグラスファイバーシートは、膜の別の形態を提供する。
【００３８】
膜の別の形態は、アリールアミン基で官能化されたＰＶＤＦであり、これは、好ましくは、カルボジイミド（例えば１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド）の存在下で、酵素のカルボン酸側鎖またはカルボキシル末端と反応する。サンドイッチ充填物として使用され得る親水性膜の別の形態は、薄膜またはアガロースゲルのコーティングである。酵素中のリジン残基のε−アミノ基は、アミノキシ基を得るために処理され、これは、アガロースゲルの緩やかな酸化によって産生されるアルデヒド基と反応し、従って、酵素がアガロースに共有結合する。
【００３９】
切断試薬は通常、そして、好ましくは、１種の酵素インヒビターの存在下で共有結合によって固定され、この酵素インヒビターは引き続いて取り除かれる。しかし、固定化の他の形態は、酵素が電気的ブロッティング液体中の溶液に、自己消化を受けるのに十分に遊離されない限りは、本発明における使用から除外されない。自己消化された酵素フラグメントの存在が分析されるタンパク質由来のフラグメントの分析に干渉し得ることが理解される）。従って、例えば、酵素が親水性ポリマーの孔性シートの孔に物理的に捕捉され得る。あるいは、膜は、アフィニティー結合を含む手段によってその上に固定化された酵素を有し得る。従って、酵素は、アビジンまたはストレプトアビジンに共有結合され得、得られた結合体は、アビジン／ストレプトアビジンとビオチンとの間のアフィニティー結合によってビオチン化された膜に結合され得る。あるいは、アビジンまたはストレプトアビジンは、膜に結合され得、そして酵素が反応されてアビジンまたはストレプトアビジンが結合された膜との反応のためにビオチン化末端を提供し得る。
【００４０】
好ましくは、切断試薬は、酵素であり、そして最も好ましくは、そして通常は、ポリペプチドの主鎖を切断する酵素（特に、トリプシン）である。トリプシンは、リジンおよびアルギニンのカルボキシル側でタンパク質を切断する。他の特異性が低いエンドプロテアーゼ（例えば、ペプシンまたはクロモトリプシン）が非常に特異的な酵素Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−ＣまたはＧｌｕ−Ｃとして使用される。リンタンパク質については、ホスファターゼが単独でかまたはプロテアーゼと組み合わせてのいずれかで使用され得、従って、酵素は、タンパク質側鎖と反応するものを含み得る。１種以上の酵素が膜に固定化され得る。例えば、ポリペプチドの終末を、例えば、エンドプロテイナーゼと組合わせて、カルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼを用いて、部分的な切断を行うことが助けになり得る。カルボキシペプチダーゼＹは、特に有用なこのような酵素の１つである。
【００４１】
本発明に従って消化膜に固定された切断試薬の濃度は、サンプルが膜を１回通過した後、サンプル中の全てまたは実質的に全てのタンパク質が消化されており、そして、サンプルが未消化のタンパク質を有さないか、または実質的に有さないように十分に高い。消化の程度を推定する企てにおいて、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物が調製されたゲルの上に広げられた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｍｉｎｉ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｌ  ｅｌｕｔｅｒを用いて、広げられた溶解物を分離ゲルから電気的ブロッティングし、画分チューブに回収した。次いで、画分を１次元ゲル分離にかけ、その後、クマシー染色を行い、分離された画分の「分子量ラダー」を示した。ｍｉｎｉ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｌ  ｅｌｕｔｅｒは電子溶出を使用するので、２回目の実験を行い、ここで、固定化切断試薬を含む膜は、分離ゲルと回収レザバーとの間に配置された。両方の実験からの単一の画分は、各画分を１次元ゲル分析にかけることによって比較した。予想は、切断膜が使用された実験において不十分な消化が存在した場合、インタクトなタンパク質が第２の１次元ゲル分析において観察される、というものであった。切断膜を用いない実験から得られた画分を段階希釈し、１次元ゲル比較においてどの程度のインタクトなタンパク質が残っていたのかの相対評価を得た。この実験のために、クマシーでの染色の代わりに、より感度の高いＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ蛍光染色を用いた。切断膜に暴露された画分に残るタンパク質の量が、切断膜を使用しない実験からの高度に希釈した画分よりも少なかったことが見出された。９５％以上のタンパク質が固定化トリプシン膜を１回通過して切断されたことが推測された。
【００４２】
さらに、以前は、サンプルが切断試薬に接触して、適度かつ効果的な消化に作用するのに十分な滞留時間を与えるために、振動電流が必要であった。本発明に従った消化膜上の増加した切断試薬の濃度の点から、振動電流はもはや必要でない。膜に固定された切断試薬の濃度の定量的な測定は困難であり、そして、使用される測定方法に依存して変化し得るが、ＢＡＰＮＡアッセイで測定した場合、約８μｇ／ｃｍ２のみ程度の従来のレベルと比較して、約２０μｇ／ｃｍ２の範囲のトリプシンのレベルが達成される。本発明に従った切断試薬のこれらの比較的高いレベルは、消化プロセスの効率の優位な上昇をもたらした。
【００４３】
特定のタンパク質の化学改変（例えば、グルコシル基、Ｎ−アセチルグルコサミニル基およびシアル基を有する炭化水素）の存在を調べるためには、これらの鎖を切断する酵素（例えば、それぞれ、グルコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼおよびノイラミニダーゼ）が、特にプロテアーゼと組み合わされて、本発明において有用である。このような場合、プロテアーゼを単独で、およびこれらのさらなる酵素と別々に組み合わせて使用して、サンプルを分析することが望ましくあり得る。
【００４４】
切断試薬は、酵素に限定されないが、孔性マトリクス内に捕捉することによって物理的に固定化され得る化学試薬（例えば、臭化シアン）を含み得る。
【００４５】
陰極の複合捕捉膜１４（および、使用される場合、陽極収集層の複合捕捉膜）は、電気的ブロッティングにおいて用いられる、修飾因子を含むかまたは含まない、任意の複合捕捉膜（例えば、ＰＶＤＦ、ナイロンまたはニトロセルロースなど）であり得る。修飾因子は、引き続く質量分析法分析を干渉しない任意の化学物質（例えば、カルボキシルまたはアミノ部分で干渉し、ペプチドフラグメントを複合捕捉膜の表面上に固定するポリマーまたは部分）を含み得る。
【００４６】
好ましい捕捉膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）からＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＣＤとして入手可能な第４級アミンで改変されたＰＶＤＦから作製された複合性膜である。本発明の重要な局面に従って、この膜は、好ましくは、ニトロセルロースおよびＨＣＣＡで改変され、例えば、ＭＡＬＤＩイオン化プロセスによるレーザー脱離に暴露された場合に、ペプチドフラグメントの捕捉およびイオン化を促進する複数のペプチド相互作用様式を有するハイブリッド膜を生じる。
【００４７】
好ましい実施形態において、捕捉膜１４は、ニトロセルロースおよびＨＣＣＡの混合物で前もって処理され、アセトンに溶解させられる。これは、新しく形成されるペプチドにより十分な捕捉基質を作製する作用を有し、それによって引き続くＭＳ検出の感度および頑強性を大きく増加させる。いくつかの分子量標準タンパク質から得られた代表的な質量スペクトルを図３ａおよび３ｂに示す。これらのタンパク質の各々は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒデータベース検索プログラム（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を用いて自動的に同定された。図４において、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲルにかけ、そして、ゲルが０．５ｍｍ下がる毎にスペクトルを得た。１２回の連続したスペクトルを示す。複数の近接した切片において、多くのペプチドが検出されているのが見られ得る。代表的なパターンは、各質量が１つの切片において最も強く、そして、近接する切片では検出されるがより弱いというものである。これは、数百のタンパク質を有したサンプルから予測したまさに、その種の分布である；各タンパク質は、おおよそ、強度  対  距離のＧａｕｓｓｉａｎ分布を有するペプチドの分布を生じ、全体的な質量スペクトルは、これらのＧａｕｓｓｉａｎ分布の合計からなる。本発明者らは、同時係属中の米国特許出願番号０９／７４５，９２０（本明細書中に参考として援用され、同一出願人に譲渡されている）に記載されたソフトウェア（これは、特に、複数のタンパク質成分のペプチド質量フィンガープリントを逆重畳積分することに指向する）を用いて、個々のスペクトルから４つ以上のタンパク質を、自信を持って同定し得た。
【００４８】
例えば、２つの異なるタンパク質分画由来のタンパク質、正常な組織  対  疾患を有する組織からの細胞から単離されたタンパク質、変異細胞  対  野生型細胞から単離されたタンパク質などの２つの異なる調製物をタグ化する目的のための安定同位体で標識した試薬が、本発明のキットと一緒に使用されて、定量的情報を得ることができる。この方法論は、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ００／１１２０８号に記載されており、この開示は、本明細書中に参考として援用される。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているＩＣＡＴＴＭ試薬は、タンパク質を別個に標識するのに用いられ得るこのような同位体標識化試薬の例である。さらに、ＩＣＡＴ試薬を用いた１次元ゲル上で分離され、発現したタンパク質の相対的定量化がまた、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ０２０９０９２９号に記載されているように示されている。ゲル切り出し、ゲル中消化およびペプチドフィンガープリントの代表的な手順は、ゲル切片中のタンパク質を同定および定量するために用いられた。他の同位体標識化試薬としては、他のアミノ酸側鎖（例えば、アミノ基またはカルボン酸基）と反応する試薬が挙げられる。例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸アミドのエステル（ここで、エステル基は、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄、ハロゲンの安定同位体の任意の組み合わせを含み、アミノ基と反応し、それによって、質量分析法によって識別可能な安定同位体標識を含む部分でタンパク質を標識する）。これらの安定同位体は、質量分析計によって測定される強度にほとんど影響を有さないので、ペプチドの軽い形態および重い形態の比は、ペプチドが２つの最初のサンプル中で分けられたタンパク質の相対量を意味する。例えば、正常な細胞と悪性の細胞のタンパク質発現プロフィールの比較は、その存在または不在が特徴的であり、悪性の診断である、タンパク質の同定をもたらし得る。
【００４９】
図５に、ペプチドの対が存在する、２つの異なるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルの小さな領域を示す。これらの実験において、プロテイントリプシンインヒビターが、２：１または１：３の比のいずれかで混合され、本発明に記載される方法および装置で処理された、非重水素化ＮＨＳＡまたは３重水素化ＮＨＳＡのいずれかで標識された。この実験由来のペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて分析され、重同位体を有するペプチドおよび重同位体を有さないペプチドの強度の比が測定され、そして、元々の最初の混合物と比較された。左のパネルにおいて、トリプシンインヒビターのサンプルがゲル電気泳動による分離および消化膜を通す電気的ブロッティングの前に、２：１の比で混合された。ペプチドの重形態および軽形態の混合物を有する捕捉膜１４がＭＳ分析に供された。右のパネルは、トリプシンインヒビターのサンプルが１：３の比で混合され、上記と同じプロセスに供した異なる実験からのものである。左のパネルは、示されたペプチドが単一のリジン残基を含み、それゆえ２つのペプチドがお互いに３質量単位離れている。Ｃ−１３および他の重同位体の天然の存在に起因して、１５８１の質量（軽同位体を有するペプチド）は、重同位体を含むペプチドの質量被膜と部分的に重なる。右パネルのペプチドは、３つのリジン残基を有する。全ての３つのリジンはアセチル化され、改変されたペプチド対を９質量単位（３つの重水素原子×３つのリジン残基）離し、これは、ペプチドの各形態についての同位体被膜が完全に重ならないために、２１７０の質量でさえ、十分である。最初のタンパク質の全てのリジン残基がアセチル化されるため、トリプシンは、タンパク質をアルギニン残基でのみ切断し、これは、最も確実なエンドプロテイナーゼであるトリプシンを用いて各タンパク質から生成され得るフラグメントの数を減少させ、そして、多くのペプチドの分子量を増加させる。これは、質量分析法によって各タンパク質の一次構造の大部分を検出することを可能にする。
【００５０】
図６ａにおいて、ｏＭＡＬＤＩイオン源を備えるＱＳＴＡＲＲＭＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて得られたＭＳ−ＭＳスペクトルを、ＩＤゲルを用いて分離したＥ．ｃｏｌｉ溶解物のタンパク質由来のトリプシンペプチドの１つについて示す。問題のスペクトルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍの慣用的なＭＳ−Ｔａｇを用いてＥ．ｃｏｌｉの３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１のペプチドＤＲＶＥＤＡＴＬＶＬＳＶＧＤＥＶＥＡＫに適合した。図６ｂにおいて、タンデムの飛行時間型ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、ＴＯＦ−ＴＯＦＴＭＯｐｔｉｃｓを備える４７００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて得られた１次元ゲル上で分離された血清タンパク質由来のペプチドイオンのＭＳ−ＭＳスペクトルを示す。このスペクトルは、ヒト血清アルブミンペプチドＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲに適合した。
【００５１】
米国特許第６，２２１，６２６号および公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ００／４５１６８とは異なり、酵素を消化膜に固定化する工程の改善は、切断活性を促進し、従って、パルス電流発生器または交流発生器の必要はない。従って、電気的ブロッティングに適用される電流は、好ましくは連続的な直流である。あるいは、パルス電流（すなわち、電流が流れない間隔がある直流）か、または陰極から陽極方向に偏った交流（すなわち、主に陽極から陰極への電流であるが、電流が逆方向に流れる間隔がある電流）もまた使用され得る。これらの体制の改変は、通常の電気的ブロッティングよりも遅い実施の概念の一般的な精神内で可能であり、これは、過度の側面（脇道）拡散をもたらす、分離ゲルから収集膜へのタンパク質およびフラグメントの移動の多大な遅れを生じずに、切断時間が親水膜で起こることを可能にし、これは、分解能の損失をもたらす。ペプチドが複合捕捉膜に移動する時間が実質的に減少し、そして、これを達成するための装置が広範に入手可能であるため、パルス化されたかまたは連続的な直流を使用することが好ましい。
【００５２】
電気的ブロッティング液体は、好ましくは、界面活性剤を含む緩衝化溶液であり、そして、この目的のための任意の従来の緩衝液（例えば、メタノールを含むＴｒｉｓ／グリシン、ＳＤＳまたはメタノールを含む３−（シアノへキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ））であり得る。フラグメントの移動方向は、本質的に緩衝液のｐＨおよび界面活性剤の濃度に依存する。大半の目的に関して、アルカリ性緩衝液が好ましい。なぜならば、多くの加水分化性酵素がアルカリ性のｐＨで最も良く機能するからである。しかし、いくつかの酵素（例えば、ペプシン）は、酸性ｐＨを必要とする。このような条件化において、フラグメントは、陽極に移動し、そして、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ（セチルトリメチル臭化アンモニウム））が好ましい。
【００５３】
タンパク質の主鎖由来のペプチドは、捕捉膜に回収される。次いで、これらは、好ましくは、従来の方法でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳまたはタンデムＭＳ／ＭＳによって分析される。このようなＭＳ技術の例は、米国特許第ＲＥ  ３７４８５号；同第５，７６０，３９３号、および同第６，３４８，６８８号に記載され、これらの開示の各々は、本明細書中に参考として援用される。この分析は、膜にマトリクスで２回目の処理をする、さらなる工程を包含し得る。サンプルは、ＵＶまたはＩＲレーザー光によりＭＡＬＤＩ質量分析計の気相に励起される。気化によりイオンが生じ、イオンプルーム（ｉｏｎ  ｐｌｕｍｅ）を形成する。イオンが電場で加速され、そして、所定の距離に沿うその移動時間に従って分離され、非常に感度の高い質量／電荷（ｍ／ｚ）の読みを得る。この分析に適したＭＡＬＤＩ質量分析計は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から市販されている。
【００５４】
本発明において、上記の方法は、多くのタンパク質のフラグメントを一度に走査するのに適用される。従って、多くのタンパク質は、ＰＡＧＥにより同時に本発明の方法に供され得、収集膜上のアレイスポットを産生し、その後にアレイ分析が続く。複合捕捉膜が切り出され、そして、シリコーングリース、導電性テープ、両側テープまたは硬化接着剤でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳサンプルプレート上に固定される。有機マトリクス形成試薬がサンプルプレート上の膜に添加され、次いで、サンプルが空気乾燥される。サンプルプレートがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳまたはタンデムＭＳ／ＭＳ装置に挿入される。第１の位置から第２の位置へのサンプルプレートの自動化された動きは、コンピュータープログラムによって整えられる。各位置において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルが作製され、デジタル形式で回収されたスペクトル情報および観察されたペプチドのデータまたは質量リストがダウンロードされてペプチドマッチングのためのアルゴリズムを検索する。タンデムＭＳ／ＭＳ質量分析計において、ペプチド配列データは、衝突が誘導するペプチドイオンの解離によって駆動され、質量が第２の質量分析計において観察されるペプチドイオンフラグメントを形成する。
【００５５】
従って、得られたリストの自動化された出力を得ることは簡単であり、タンパク質がＭＳ装置の製造業者によって提供されるソフトウェアおよび市販のデータベース検索エンジンを使用することによって同定される。１つの市販のプログラムは、前で議論したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒである。
【００５６】
従って、本発明が、多くのタンパク質の同時の、自動化された同定および／または部分的な特徴付けのための莫大な潜在性を有していることは明らかである。実際において、本発明は、この好ましい実施形態において、慣用的な生化学的分析に有用な、実用的な「分子走査装置」を提供する。
【００５７】
質量分析計が電気的にブロッティングされたタンパク質の画像を得るために用いられる場合、捕捉膜の大きな表面が空っぽであり得ることが予想される。これは、電気的にブロッティングされたゲルの対応する領域に、ポリペプチドがほとんど存在しなかったからである。データ取得のレベルで時間を節約するため、そして、感度を上げるために、図７は、消化されたポリペプチドを捕捉膜の別々のゾーンに集めるのに有用な別の実施形態を示す。示すように、スリットまたは穴を備える非導電性シート１５が、ゲル１１と捕捉膜１４との間に配置されて、捕捉膜の特定の領域に集めるかまたは限定的に電気的ブロッティングし得る。１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、空間的な分解能は、スリットの方向が電気泳動の方向と平行である限りは、この手段によっては犠牲とならない。従って、理想的な非導電性シートは、１次元ゲルの各レーンの中心に位置したスリットを有する。２次元ゲルのための対応するデバイスは、一連の規則的に配置された穴からなる。このシートは、ある空間的な分解能の費用で、走査される必要がある領域を減らす。非導電性シート１５は、どの位置が最も有意義であると見出されたかに依存して、切断膜１３の前または後のいずれかに配置され得る。
【００５８】
生化学において、２つのサンプル間でのタンパク質の量の差異を定量する能力は、重要な目的である。１つの実施形態において、本発明は、タンパク質またはタンパク質の混合物中のタンパク質の機能の迅速かつ定量的な分析のために、分析用試薬およびこれらの試薬を用いる質量分析法ベースの方法と共に利用され得る。この分析法は、細胞および組織における全体的なタンパク質発現プロフィールの定量的分析のため、すなわち、プロテオソームの定量的分析のために、定性的および特に定量的に使用され得る。この方法はまた、細胞、組織または生物学的流体中の発現レベルが刺激（例えば、薬物の投与、または潜在的に毒性のある物質との接触）によって、環境の変化（例えば、栄養レベル、温度、時間経過）によって、または、サンプルの起源である細胞、組織もしくは生物体の状態または細胞状態の変化（例えば、疾患状態、悪性度、部位指向性変異、遺伝子ノックダウンおよび遺伝子ノックアウト）によって影響されるタンパク質のスクリーニングおよび同定に使用され得る。このようなスクリーニングにおいて同定されたタンパク質は、変化した状態のマーカーとして機能し得る。例えば、正常な細胞と悪性な細胞とのタンパク質発現プロフィールの比較は、その存在または不在が特徴的であり、悪性の診断であるタンパク質の同定を生じ得る。
【００５９】
本発明にとっての別の好ましい用途は、組織または組織薄片から直接的に電気的ブロッティングされたタンパク質の分析である。近年、組織からのインタクトなタンパク質が、米国特許５，８０８，３００号（これは、本明細書中で参考として援用される）において開示される組織からのタンパク質の直接剥離によるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析される。一旦、イオン化されると、このインタクトなタンパク質の質量、および好ましい例においては、質量分析法において無作為に生成されるフラグメント質量が、測定される。したがって、これらの質量は、タンパク質の同定に使用される。しかし、多くの例において、このような好ましいフラグメントは、検出不可能であると予測され、そして、これらのタンパク質をプロテアーゼが切断することを助けて、そのタンパク質の同定において使用され得るぺプチドをより効率よく生成することが必要とされる。分子スキャナの適用の際に、タンパク質が、本発明にしたがって、電気的にブロッティングされ、ポリペプチド切断膜１３を通過して、ペプチドを生成し、このぺプチドが同定の目的で捕捉膜１４において回収される。インタクトなタンパク質質量と同様に、その組織の画像が、本発明の装置を用いて電気的ブロッティングされ、消化され、そして捕捉されたタンパク質に由来するペプチドの質量の分析に基づいて再構築され得る。図８ａおよび図８ｂは、ニワニワトリの心臓の薄片の画像であり、これは、この組織薄片が本発明として記載される方法および装置に供された後に観察される、任意のペプチドイオン（ｍ／ｚ  １２５３および２４４８）の分布に基づいて再構築されたことを示す。総じて、６５６１（８１×８１）のスペクトルが取得され、そして分析された。このイオン強度は、図８ａおよび図８ｂにおけるグレースケールを使用して、そのぺプチドの各々について反映さている。これらの一次的な結果は、ペプチド１２５３および２４４８の別個の分布が観察され得ることを示す。使用される質量分析器は、従来型のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器であり得るか、または、これは、所望の親イオンを選択するタンデム型質量分析器とその後のＭＳ−ＭＳフラグメンテーションであり得る。
【００６０】
タンパク質を含むほかのサンプルもまた、本願発明を用いる際に使用され得る。例えば、細菌細胞または真核細胞のコロニーは、そのキットを使用することによって組み換えタンパク質の発現についてスクリーニングされ得る。この実施形態において、はじめに、それらのコロニーは、膜にブロッティングされ得、そして、その膜は、ポリアクリルアミドゲル１１に代わって、そのカセットに配置され得る。十分な量のペプチドが捕捉され得る限りにおいて、そのタンパク質がブロッティング膜に対して効率的に移動されるということは決定的な事項ではないことに留意のこと。第２の適用は、環境サンプルから単離した微生物の個々のコロニーの種を決定するレベルにある。細菌プレート上のサンプルのすべては、並列に処理され得る。あるいは、多くのプレートからのコロニーは、第２のプレートに移動され、コロニーの２次元アレイを生成し得る。このようにして、大量のコロニーが、同時に処理され得、そして、この質量分析器は、２次元アレイの既知の座標からスペクトルを回収するように操作され得る。
【００６１】
図９ａおよび図９ｂを参照して記載される別の実施形態において、それらのタンパク質は、それぞれウェル２２の下のフィルタが備え付けられたマイクロタイタープレート２４中に発し得る。例えば、９６導線を有する電極マニホルド２５は、図９ｂに示されるように、その頂部から９６ウェルの各々に浸され得る。それらのウェルがブロッティングに適切な緩衝液を含んでいる限り、それらのフィルタを介してプロテアーゼ含有切断膜１３へ、そして、捕捉膜１４へとタンパク質含有溶液２３を電気的溶出することが可能である。このタンパク質含有溶液２３は、細胞溶解物および組織溶解物、フィルタープレート２４に配置され得る液体クロマトグラフィー（アフィニティークロマトグラフィーおよびキャピラリー電気クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動分離を含む）から回収される画分を含む、１以上のタンパク質を含む任意の溶液であり得る。あるいは、所望する場合、これらのタンパク質は、固相樹脂に吸収され得、電気的ブロッティングの前に適切な緩衝液へと緩衝液を交換することを容易にする。そのフィルタの下にはじめにトラップされた気泡（バブル）は、過剰の移相緩衝液を使用する下方向からの陽圧によって取り除かれ、電気的な接触を開始し得る。その移動が完了したあとに、その質量分析器は、フィルタの各々の出口と整列した捕捉膜１４のそれらの領域に集中され得る。非常に類似する工程は、タンパク質を含むバンドまたは従来型の１次元ゲルまたは２次元ゲルからのスポットの切り出しの後のように、タンパク質がはじめにポリアクリルアミド２１の切片中にトラップされている場合に、履行され得る。この場合に、上部電極マニホルド２５は、小さないくつかの背圧を提供して、フィルタプレート２４の下からの陽圧を加えることによってトラップされた気泡を除去するタスクを容易にするように設計された小開口部で備え付けられ得る。
【００６２】
必要に応じて、成分の任意の組み合わせが、特に以下の任意の１つと一緒にまたは別々に使用され得る：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦのためのマトリクス形成試薬、電気的ブロッティング緩衝液、プロテアーゼ切断層、収集層、好ましくは、ニトロセルロースおよびＭＡＬＤＩマトリクスのようなポリマーで前もって処理された膜を含む複合性の捕捉層およびＰＡＧＥ物質。他の任意の成分としては、マイクロタイターフィルタープレートおよび上記マイクロタイタープレートからの電気ブロッティングを促進する電極マニホールドが挙げられ得る。膜および１、２またはそれ以上の上記の任意の成分を含むキットは、ここで、本発明の範囲内であると具体的に示す。キットの成分は、別々の容器で提供され得るが、全体としてはキットとして包装されている。
【００６３】
本発明の別の局面において、中程度のアフィニティー捕捉膜が消化膜と捕捉膜との間に配置される。この中程度の膜は、電気的ブロッティングされたペプチドのサブセット（例えば、ビオチンで改変されたペプチドのサブセット）を捕捉する。次いで、これらのペプチドは、中程度の膜から放出され、２周目の電気的ブロッティングにおいて第２の捕捉膜に移される。ペプチドのサブセットの選択は、その特定の試薬（例えば、抗体、ストレプトアビジン、金属キレート、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡ）との相互作用に基づく。例えば、タンパク質は、１次元または２次元のゲル電気泳動による分離の前にＩＣＡＴ試薬（ビオチンを含有する）で標識される。分離されたタンパク質の電気的ブロッティングおよび親水性膜に固定されたトリプシンを用いる同時の酵素的切断の際に、得られたビオチン含有ペプチドは、ストレプトアビジンが固定された中程度の膜上で選択され得る。非ビオチン含有ペプチドは、分析のためのニトロセルロース／マトリクス改変捕捉膜に移動する。改変された捕捉膜を新しい第２の改変された捕捉膜で交換することによって、そして、電気的ブロッティング条件（すなわち、緩衝液またはｐＨの変化）を変更することによって、ビオチン含有ペプチドが中程度のストレプトアビジン膜から除去され、そして、質量分析のための新しい改変された捕捉膜上に捕捉される。その物理的特性および化学特性に基づく特定のペプチドのこの選択は、２工程のプロセスでのこれらのペプチドのサブ分画を可能にし、ＩＣＡＴ試薬標識化ペプチドを同一性定量および相対的定量について単離する。
【００６４】
以下の実施例は、本発明を例示する。「Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ」、「Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ」および「Ｖｏｙａｇｅｒ」との語は商標である。
【実施例】
【００６５】
（材料および方法）
（化学物質）
ポリエーテルスルホンを含有するＧｅｌｍａｎ  ＵＳ４５０膜をＰａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から購入した。低範囲ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準ＰＶＤＦ膜をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＴｒｉｓおよびトリプシンをＳｉｇｍａ（Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）から購入した。このトリプシンは、ウシの膵臓由来であり、そして、Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）で処理して、通常トリプシンに存在するキモトリプシン様活性を低減させた。アセトトリル（ＨＰＬＣグレード）、塩化カルシウム、エタノールアミン、グリシンおよびＬ−ＢＡＰＮＡ（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリドヒドロクロリド）をまたＳｉｇｍａから購入した。
【００６６】
（１次元ＰＡＧＥおよび２次元ＰＡＧＥ）
１次元  ＰＡＧＥ法のために、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を用いた。ＢｉｏＲａｄ製の１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：６８０−６８５  １９７０に記載されるような方法に本質的に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ｍｉｎｉ  ｗｈｏｌｅ  ｇｅｌ  ｅｌｕｔｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて電気的に溶出したタンパク質を回収した。用いたタンパク質サンプルは、Ｓｉｇｍａ製の広範囲ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標準であった。これらは、ダイズトリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、ウシ炭酸脱水酵素（２８．９ｋＤａ）、トリオブアルブミン（４２．７ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６．４ｋＤａ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）およびミオシン（２０５ｋＤａ）であった。フルオレセインイソチオシアネートで標識することによってＦＩＴＣ−ＢＳＡを蛍光にした。ＦＩＴＣ標識化ＢＳＡを用いてゲル電気泳動への暴露後のタンパク質の消化および移動を、定性的および定量的に評価した。タンパク質の移動は、１００Ｖで６０〜９０分間、単一のレーンで行った。
【００６７】
（トリプシンおよびＧｅｌｍａｎ  ＵＳ４５０膜の骨格の共有結合）
ベンズアミジンＨＣｌ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＴＰＣＫ処理したトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）およびＮａＢＨ３ＣＮ（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．５Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４、１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４に溶解し、Ｇｅｌｍａｎ／Ｐａｌｌ  ＵＳ４５０ポリエーテルスルホン膜ｃｍ２あたり０．１ｍｌでコーティングした。このアルデヒド活性化膜は、最近紹介されている、市販の改変ポリエーテルスルホン膜である。これらの基は、タンパク質またはペプチド由来のアミン基のようなヌクレオフィルに対して反応性である。等量の１．５Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４、１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４の緩衝液を加え、そして、室温で１６〜１８時間、７５ｒｐｍで揺らしながら反応させた。０．２ＭＴｒｉｓおよび５ｍｇ／ｍｌ  ＮａＢＨ３ＣＮを添加することによってキャップ化を達成した。この膜を湿った状態で冷蔵保存するか、またはグリセロール溶液を使用して乾燥させた。
【００６８】
（トリプシン活性の測定：ＢＡＰＮＡアッセイ：）
直径８ｍｍのトリプシン消化膜のディスク（０．５ｃｍ２）を３ｍｌの０．９２ｍＭ  ＢＡＰＮＡに添加し、軌道混合器上で、室温で３０分間インキュベートした。反応を０．５ｍｌの３０％  酢酸でクエンチし、トリプシン活性を４１０ｎｍでモニタリングし、そして、既知のトリプシン活性の溶液と比較した。
【００６９】
（複合性の膜捕捉膜の調製：）
Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＣＤ（第４級アンモニウム官能基を有するＰＶＤＦ膜であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から市販されている）を、２０ｍｇ／ｍｌ  ニトロセルロース、１０ｍｇ／ｍｌ  ＨＣＣＡ、５０％  イソプロパノールおよび５０％  アセトンの溶液に浸漬した。次いで、膜を完全に乾燥させ、トランスブロッティング緩衝液（以下に記載する）で再び湿らせた。
【００７０】
用いたトランスブロッティング緩衝液は、１２ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１００ｍＭ  グリシンおよび０．０１％  ＳＤＳ、ｐＨ８．３であった。ブロッティングは、Ｍｉｎｉ−Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ電気泳動トランスファーセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）上、室温、６〜７Ｖで、３〜３．５時間行った。
【００７１】
（トランスブロッティングプロトコール：）
電気的ブロッティングの間にタンパク質の酵素的消化を行うために、７層までのトリプシン固定化膜を、トランスブロット−消化サンドイッチ（図１および２ａおよび２ｂ）を作製するための回収表面として、ポリアクリルアミドゲル（タンパク質の供給源）と複合捕捉膜との間に配置した。電気的ブロッティングトランスファー手順の後、消化されたタンパク質のフラグメントが回収される複合性の収集膜を、ＭＳ分析の前に、脱イオン水で１０〜３０分間洗浄した。
【００７２】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の前の膜の調製：）
目的の領域を含む複合捕捉膜の小片（１×１ｍｍ）および大きな片（少なくとも４０ｍｍ四方）を複合性の捕捉収集膜から切り出し、適切なサンプルＭＡＬＤＩプレートに、硬化接着剤またはシリコーン真空グリースで固定した。さらなるマトリクスを以下のようにして捕捉膜に添加した：５０％アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ溶液中１μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＨＣＣＡを陰極の複合捕捉膜に添加したか、あるいは、ＭＡＬＤＩプレートに付着させる前に、さらなるマトリクス溶液を捕捉膜に噴霧した。
【００７３】
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ装置および実験条件：）
複合性の膜を、３３７ｎｍの窒素レーザーを備えるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計Ｖｏｙａｇｅｒ  ＳＴＲまたはＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で分析した。この分析計は、２０ｋＶの加速された電圧、１２５ｎｓのイオン抽出遅延時間および８００Ｄａで固定化された低質量ゲートで、反射体モードにて使用した。レーザー出力は、分子イオン生成の閾値をわずかに超えて設定した。任意の平滑化手順を行うことなく、１０〜１０００回の連続したレーザー発射の刺激によってスペクトルを得た（図４）。図６ａについて、直交性のＭＡＬＤＩイオン源を備えるＱＳＴＡＲ  ＰＵＬＳＡＲハイブリッドＱ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でスペクトルを得；図６ｂについては、４７００  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でスペクトルを得た。
【００７４】
（手順）
１）  まず、１次元ゲルまたは２次元ゲルを作動させる
２）  ゲル、切断膜、捕捉膜およびフィルターペーパーパッドをトランスファー緩衝液に２〜５分間浸す
３）  以下の順序で、陰極の最下層から開始するサンドイッチを調製する：フィルターペーパーパッド、捕捉膜、切断膜、ゲル、フィルターペーパーパッド
４）  組み立て、そして７Ｖで３．５時間トランスファーする
５）  分解し、捕捉膜を水でリンスし、マトリクス溶液で乾式噴霧する
６）  捕捉膜を乾燥させ、そして、真空グリースでＭＡＬＤＩプレートに適用する
７）  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにて走査する（２５０μｍの分解能、２０Ｈｚのレーザーで、１６１スペクトルを得るのに、１レーンあたり約２０分）
（結果）
トリプシンは、Ｇｅｌｍａｎ  ＵＳ４５０アルデヒド活性化膜に共有結合した。表面の酵素密度をＢＡＰＮＡ試験によって、ｃｍ２あたり４．６〜１０．９μｇの活性トリプシンであると決定した。４℃で１ヶ月までの期間、２０％グリセロールを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＣａＣｌ２／ＮａＮ３溶液中に保存される場合、トリプシンが結合したＧｅｌｍａｎ  ＵＳ４５０膜の活性は安定なままであった。
【００７５】
２つ以上のトリプシンが結合した膜が、ポリアクリルアミドゲルと陰極の複合捕捉膜との間に、一方の上にもう一方が挿入される実験は、電気的トランスファー手順の間に、タンパク質の明らかな損失も分解能の損失もないことを示した。
【００７６】
ＦＩＴＣ標識化ＢＳＡを用いて、ゲル電気泳動に暴露した後のタンパク質の消化および移動を定性的および定量的に評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の後、４つのタンパク質（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、トリオボアルブミン、ウシ炭酸脱水酵素およびミオシン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥの同じトラックにかけ、ポリエーテルスルホン膜上の７本のトリプシン結合膜までトランスブロットした。例を図３ａおよび３ｂに示す。上記のタンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒで自動的に解釈した場合、そのペプチドフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＳＴＲ）スペクトルから正確に同定された。Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物を１次元ゲル電気泳動を用いて分離し、そして、本発明において記載される方法および装置を用いる電気的ブロッティングおよび消化の後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって捕捉膜の種々の位置で分析した。ゲルの９２位（捕捉膜上の開始点からの相対距離）で回収した代表的なスペクトルおよびペプチド同定データを図１０および表１に示し、これらは、それぞれ、同時係属中の米国特許出願番号０９／７４５，９２０に記載されているようなＣｈｅｍＡｐｐｌｅｘソフトウェアを用いている。ＣｈｅｍＡｐｐｌｅｘソフトウェアにより同定した９２位のタンパク質を表２に列挙する。ニワトリの心臓を凍結し、そして、剃刀の刃を用いて横断切片を得た。組織を直接切断膜に配置し、そして、上記のように「サンドイッチ」を組み立てた。捕捉膜を走査し、そして、２つのペプチドイオンの分布を図８ａおよび８ｂに示す。
【００７７】
【表１−１】
2005534284.tif 000002
【００７８】
【表１−２】
2005534284.tif 000003
【００７９】
【表２】
2005534284.tif 000004
表１および２の行の表題は、以下によって表される：
（表１）
＃                タンパク質リスト順序
ａｃｃ            Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号
ａｃｃＭ          代替的なＳｗｉｓｓＰｒｏｔの受入番号（低いランクのタンパク質に
対する）
＃ｍ              代替的な受入番号についてのタンパク質リスト番号
＃ｒ              強度によりソートした質量のランク；１が最も強い質量である
ｉｎｔ            質量の強度
ｔｒｉ            強度、ＣｈｅｍＳｃｏｒｅおよびペプチドレベルでの質量誤差を組み
合わせた適合性のための複合的スコア
ｃｈ              ペプチドのＣｈｅｍＳｃｏｒｅ
ｔｈｅｏ          その配列に基づいたペプチドの分子量
ｍａｌｄｉ        質量の測定された分子量
ｐｐｍ            「ｔｈｅｏ」と「ｍａｌｄｉ」との間の１００万あたりの部分の誤差
＜                タンパク質配列中の予定のペプチドの直前のアミノ酸
ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ペプチドの配列
＞                タンパク質配列中のペプチドの後のアミノ酸
ｍｏｄ            ペプチド中の残基への改変の略称
ｐ                ペプチド中で切断し損ねたトリプシンの数
（表２）
＃                タンパク質リスト順序
ａｃｃ            Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号
タンパク質        タンパク質の名前
ｍｗ              タンパク質の分子量
ｍ                タンパク質に対して適合するペプチドの数
ｔｒｉ            強度、ＣｈｅｍＳｃｏｒｅおよびタンパク質レベルでの質量誤差を組
み合わせた適合性のための複合的スコア
％  Ｃｈ          タンパク質と適合したＣｈｅｍＳｃｏｒｅの百分率
％  Ｉ            適合した強度の百分率
ｐｐｗ            適合したペプチドについての強度−加重平均ｐｐｍ誤差
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、本発明において使用され得るブロッティング「サンドイッチ」の１つの実施形態の模式図である。
【図２Ａ】図２ａは、本発明において使用され得るブロッティング「サンドイッチ」の他の実施形態の模式図である。
【図２Ｂ】図２ｂは、本発明において使用され得るブロッティング「サンドイッチ」の他の実施形態の模式図である。
【図３Ａ】図３ａは、４つの異なる標準タンパク質（すなわち、ミオシン、ＢＳＡ、オボアルブミンおよび炭酸脱水酵素）から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す。
【図３Ｂ】図３ｂは、４つの異なる標準タンパク質（すなわち、ミオシン、ＢＳＡ、オボアルブミンおよび炭酸脱水酵素）から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを示す。
【図４】図４は、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の１次元  ＳＤＳ  ＰＡＧミニゲルの連続した場所から得られた１２のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。各スペクトルは５００ミクロン離れていた。
【図５】図５は、同位体で標識したタンパク質の定量に使用され得るペプチド対のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルの２つの異なる例を示す。図５の左のパネルは、アセテートの水素形態およびアセテートの重水素化形態で別々に標識された後、２：１の比で混合されたタンパク質（トリプシンインヒビター）からの１つのアセチル化リジン残基を含む、ペプチド対を示す。図５の右パネルは、アセテートの水素形態およびアセテートの重水素化形態で別々に標識され、１：３の比で混合された、同じタンパク質（トリプシンインヒビター）からの３つのアセチル化リジン残基を含む、別のペプチドを示す。
【図６Ａ】図６ａは、３０Ｓリボソームタンパク質（Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ０２３４９）由来のＥ．ｃｏｌｉペプチドの直交性の（ｏ）−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ−ＭＳスペクトルを示す。
【図６Ｂ】図６ｂは、１次元ゲル電気泳動により血清から分離されたヒト血清アルブミン由来のペプチドイオン（１６３９．９４  ｍ／ｚ）から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ−ＭＳスペクトルを示す。
【図７】図７は、捕捉膜の別々のゾーンに消化されたポリペプチドを集めるために有用な別の実施形態の模式図である。
【図８】図８ａおよび８ｂは、本発明の使用で誘導されたニワトリの心臓の組織像を示す。
【図９】図９ａおよび９ｂは、マイクロタイタープレートで有用な別の実施形態の模式図を示す。
【図１０】図１０は、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の１次元ゲルの９２位で見出されたペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2005534284.tif 000011
【図６Ａ】
2005534284.tif 000012
【図６Ｂ】
2005534284.tif 000013
【図７】
2005534284.tif 000014
【図８】
2005534284.tif 000015
【図９ａ】
2005534284.tif 000016
【図９ｂ】
2005534284.tif 000017
【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月13日(2005.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005534284000001.app
【国際調査報告】
2005534284.tif 000019
2005534284.tif 000020
2005534284.tif 000021