(57)【要約】本発明は、培養するのが簡単な新規微生物、およびＤ-アミノ酸の製造におけるその使用、特に、Ｎ-カルバモイルアミノ酸の対応するヒダントインからのＤ-アミノ酸の製造に適した微生物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ-アミノ酸の酵素合成に用いるための立体選択的酵素系を恒常的に発現する微生物の変異株の生物学的に純粋な培養物。
【請求項２】
５-置換ヒダントインのラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換する酵素を恒常的に産生することができるグルタミン欠損微生物の生物学的に純粋な培養物。
【請求項３】
Ｎ-カルバミルアミノ酸のラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換する酵素を恒常的に産生することができる微生物。
【請求項４】
Ｎ-カルバミルアミノ酸のラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換する酵素を恒常的に製造することができる微生物。
【請求項５】
微生物がアグロバクテリウム・エスピー(Agrobacterium sp.)である請求項１〜３のいずれが一項に記載の微生物。
【請求項６】
微生物が、その１６ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいてはアグロバクテリウムRU-ORから区別できないものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物から単離および精製される酵素系であって、５-置換ヒダントインラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換することができる、単離および精製された酵素系。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物から単離および精製される酵素系であって、Ｎ-カルバミルアミノ酸ラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換することができる、単離および精製された酵素系。
【請求項９】
医薬の製造に用いるためのＤ-アミノ酸の製造に用いるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
化学肥料の製造に用いるためのＤ-アミノ酸の製造に用いるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
農薬の製造に用いるためのＤ-アミノ酸の製造に用いるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
供給原料添加物の製造に用いるためのＤ-アミノ酸の製造に用いるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物による５-置換ヒダントインのＤ-アミノ酸への変換を触媒している酵素系を恒常的に産生している微生物を製造するのに用いるための生育培地。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物によるＮ-カルバミルアミノ酸のＤ-アミノ酸への変換を触媒している酵素系を恒常的に産生している微生物を製造するのに用いるための生育培地。
【請求項１５】
請求項５または６のいずれか一項に記載の酵素系を産生している請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物を製造するのに用いるための生育培地。
【請求項１６】
発酵状態中に５-置換ヒダントインからＤ-アミノ酸を製造するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の生育培地。
【請求項１７】
発酵状態中にＮ-カルバモイルアミノ酸からＤ-アミノ酸を製造するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の生育培地。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物による５-置換ヒダントインラセミ体混合物のＤ-アミノ酸への変換のための過剰発現レベルの酵素活性を達成するための発酵条件下で使用される生育培地。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物によるＮ-カルバミルアミノ酸ラセミ体混合物のＤ-アミノ酸への変換のための過剰発現レベルの酵素活性を達成するための発酵条件下で使用される生育培地。
【請求項２０】
本発明に従い製造されるＮ-カルバミルアミノ酸。
【請求項２１】
本発明に従い製造されるＤ-アミノ酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規微生物および、Ｄ-アミノ酸の製造におけるその使用に関する。特に、対応するヒダントインまたはＮ-カルバモイルアミノ酸の産生に適した微生物に関する。これらの新規微生物は培養するのが容易で、異なる基質から高収率でＤ-アミノ酸を得ることを可能とする。
【０００２】
（発明の背景）
光学的に純粋なアミノ酸の重要性は、主として、半合成ペニシリンおよびセファロスポリンにおける側鎖としてのＤ-アミノ酸、例えばＤ-ｐ-ヒドロキシフェニルグリシンの使用によるものである(Syldark et al, 1990)。光学的に純粋なアミノ酸は、他の医薬および風味剤（例えば甘味料におけるＤ-アラニン）、農薬（殺虫剤フルバニレートの合成におけるＤ-バリン）および動物飼料における添加物(Polastro, 1989)の製造にも適用される。これまで、Ｄ、Ｌ-５-置換ヒダントインが、Ｄ-アミノ酸の化学合成のための出発物質として用いられてきた。この方法は、化学合成はＤ-およびＬ-アミノ酸の等モル混合物を生じ、光学的に純粋なＤ-アミノ酸を得るのにラセミ体を分割することが必要なので(Syldatk et al., 1990)、煩雑で、かつ有効でない。化学合成に代わるものとしては、各アミノ酸へのヒダントイン類の酵素変換の使用がある(Olivieri et al., 1979)。生物触媒変換は大きな利点を有する。酵素系は立体選択的であり、そして反応条件が穏やかであるため工業プロセスが安くつき、副産物または排出物が環境にやさしい(Santaniello et al., 1992)。Ｄ、Ｌ-ｐ-ヒドロキシフェニルヒダントインのＤ-ｐ-ヒドロキシフェニルグリシンへの生物触媒変換は、世界市場で主要な生物触媒法の一つとして挙げられている(Palastro, 1989)。
【０００３】
ヒダントインのその対応するアミノ酸への生物触媒変換は、２つの酵素により触媒される。まず、ヒダントイナーゼが５-置換ヒダントインの開環加水分解を触媒して、Ｎ-カルバモイルアミノ酸が可逆反応にて産生される。ヒダントイナーゼはサイクリックアミダーゼ(E.C.3.5.2)として分類され、Ｄ-、Ｌ-または非立体選択的である可能性がある。二番目反応で、Ｎ-カルバミルアミノ酸がその対応するアミノ酸に、化学的に、あるいはたいてい立体選択的である第2の酵素、Ｎ-カルバモイルアミノ酸アミドヒドラーゼ(E.C. 3.5.1.6)により変換される(Olivieri et al., 1979)。ヒダントインのラセミ化はアルカリｐＨで自発的に生じるが、一定の微生物系にはＤ-ラセマーゼが含まれ、これがＬ-５-置換ヒダントインを対応するＤ-エナンチオマーに変換する(Runser et al., 1990; Hartley et al., 1998)。
【０００４】
Ｄ-選択的ヒダントイン-加水分解酵素系が、シュードモナス(Pseudomonas)単離物(Ikenaka et al., 1998)、バチラス・ステアロテルモフィラス(Bacillus stearothermophilus)(Lee et al., 1996)、バチラス・サーキュランス(Bacillus circulans)(Luksa et al., 1997)、およびいくつかのアグロバクテリウム(Agrobacterium)株(Olivieri et al., 1981; Runser et al., 1990; Hartley et al., 1998; Nanba et al., 1998)を含む種々の細菌に同定されている。１のヒダントイナーゼおよび３のＮ-カルバミルアミノ酸アミドヒドラーゼ酵素をコードしている遺伝子がアグロバクテリウム株からクローニングされ、エスケリキア・コリで過剰発現されている(Durham and Weber, 1995; Buson et al. 1996; Grifantini et al., 1998; Nanba et al., 1998)。ＤＮＡ配列の分析により、アグロバクテリアからのＮ-アルバミルアミノ酸とアミドヒドラーゼ間に高程度のアミノ酸ホモロジーが明らかにされている(Nanba et al., 1998)。
【０００５】
エイ.ツメファシエンス(A. tumefaciens)ＲＵ-ＯＲの特徴付けにより、細胞が２-チオウラシルまたはヒダントインの存在下で生育された場合にのみ、酵素活性が高レベルで誘導されることが示された。さらに、完全培地で生育された細胞において、最大の酵素活性は初期の定常期に認められた(Hartley et al., 1988)。同様の観察が、エイ.ラジオバクター(A. radiobacter) (Deepa et al., 1993)、Agrobacterium sp. IP 1-671 (Meyer & Runse, 1993)、からのヒダントイン加水分解酵素系、およびＬ-選択的酵素系を有する他の細菌、例えばアルトロバクター・クリスタロポイエテス(Arthrobacter crystallopoietes)(Moller et al., 1988)のヒダントイン加水分解酵素系に関してなされている。ヒダントイナーゼおよびＮＣＡＡＨを誘導物質非依存的に産生するエイ.ツメファシエンス変異体がHartley et al. (1988)により単離されており、同様の変異体株、アルトロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)DWM・9771がWagner et al. (1996)により単離されている。
【０００６】
本発明で、「恒常性」なる用語は、酵素の非調節性の発現を意味することが理解され、「発現」なる用語は、転写および翻訳を経る、ＤＮＡ鋳型からのタンパク質の発現を意味することが理解され、「活性」なる用語は、ヒダントイナーゼおよびＮ-カルバモイルアミノ酸アミノヒドロラーゼ酵素がヒダントインをＮ-カルバミルアミノ酸とアミノ酸に加水分解する、またはその逆を行う能力をそれぞれ意味し、「過剰発現」なる語句は、最初に単離されたものにおける同じ条件下の酵素産生のレベルを超える酵素産生のレベルを意味し、そして、「酵素系」なる語句は、Ｄ-もしくはＬ-またはＤ,Ｌ-５-モノ置換ヒダントイン、またはＤ-もしくはＬ-またはＤ,Ｌ-Ｎ-カルバモイルアミノ酸をその対応する光学的に純粋なＤ-アミノ酸に変換することができるヒダントイナーゼ、Ｎ-カルバミルアミノ酸アミドヒドロラーゼおよびヒダントインラセマーゼ酵素を含むと理解されるべきである。
【０００７】
ヒダントイナーゼおよびＮＣＡＡＨ酵素のイー.コリにおける過剰発現のための組換え系が知られている。しかし、ＮＣＡＡＨを過剰発現している細胞において、非溶解性の集合物が産生され、およびプラスミドが不安定であるという報告により、これらの酵素のイー.コリにおける異種発現は理想的な系ではない可能性があることが示唆される。これより、酵素活性が最適生育条件下で誘導されなければならず、それが固定された生育期に限定されることが主要問題であるヒダントイナーゼおよびＮＣＡＡＨの産生に関して、同種宿主の使用に新たな関心が持たれている。これは、市販されている株における単位生物量あたりの酵素産生のレベルが未だ相対的に低いものに留まっていることを意味する。恒常性プロモーターのコントロール下での組換えＮＣＡＡＨ遺伝子をアグロバクテリウム８０／４４-２Ａに再導入することにより、高レベルの生物触媒活性が得られた。
遺伝的に修飾された生物体に関連する問題と、遺伝的に修飾されていない株の工業上明らかな経済的利点から、変異細菌株がヒダントイナーゼおよびＮＣＡＡＨ酵素を高レベルで産生する可能性を試験するに至った。
【０００８】
（本発明の目的）
本発明の目的は、５-置換ヒダントインまたはＮ-カルバミルアミノ酸のラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換し、それにより少なくとも部分的に、Ｄ-アミノ酸の化学合成に関連する問題を減らす酵素を恒常的に産生することができる微生物を単離することである。
【０００９】
（発明の概要）
本発明に従い、Ｄ-アミノ酸の酵素合成に用いることができる構造選択的酵素系を恒常的に発現するアグロバクテリウムRU-OR変異株の、生物学的に純粋な培養物が提供される。
さらに本発明に従い、５-置換ヒダントインのラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換する酵素を恒常的に産生することができるグルタミン合成欠損微生物の生物学的に純粋な培養物が提供される。
【００１０】
さらに本発明に従い、Ｎ-カルバミルアミノ酸のラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換する酵素を恒常的に産生することができる微生物が提供される。
さらに本発明に従い、５-置換ヒダントインのラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換することができる、単離および精製された酵素系が提供される。
さらに本発明に従い、Ｎ-カルバミルアミノ酸のラセミ体混合物をＤ-アミノ酸に変換することができる、単離および精製された酵素系が提供される。
【００１１】
さらに本発明に従い、医薬、このほか化学肥料を製造するためのＤ-アミノ酸の製造に使用するための、またこれ以外に、農薬を製造するためのＤ-アミノ酸の製造に使用するための、およびさらにこれら以外に、供給原料添加物を製造するためのＤ-アミノ酸の製造に使用するための微生物が提供される。
本発明は、最適の培養条件下においてヒダントイナーゼおよび／またはＮＣＡＡＨ酵素の活性の過剰発現レベルを達成するための生育培地にも拡張される。
本発明により、本発明に従って製造されるＮ-カルバミルアミノ酸も提供される。
本発明により、本発明に従って製造されるＤ-アミノ酸も提供される。
【００１２】
（発明の一具体例の開示）
いくつかのアグロバクテリウム株がヒダントイン加水分解活性を持つことが報告されている。これらの中にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス４７Ｃ、アグロバクテリウム・ラジオバクターＢ１１２９１およびアジオバクテリウム・エスピー,ＩＰ・Ｉ−６７１が含まれる。アグロバクテリウム・ラジオバクターＢ１１２９１およびアジオバクテリウム・エスピー,ＩＰ・Ｉ−６７１は、Ｎ-カルバミルアミノ酸およびアミドヒドロラーゼ活性も持つ。本発明では、大量の酵素を産生することができる新規なアグロバクテリウム種(RU-OR)であって、該細胞の集団が本明細書に開示する方法に関して高い活性を有するアグロバクテリウム種を単離した。
【００１３】
（培養および生物触媒アッセイ条件）
ヒダントイン最少培地(HMM)ブロス中に飽和状態まで生育させたアグロバクテリウムRU-ORおよびRU-ORPN1細胞を、１％ヒダントイン(HMM)、0.01%カサミノ酸(SMM)または(NH4)2SO4(AMM)を追加した通常の最少培地(MM)(MM１リットルあたり；10gグルコース;0.011g CaCl2;0.02g MgCl2;60gNa2HPO4、30g KH2PO4、5g NaCl、0.04gホウ酸、0.04g MnSO4、0.02g (NH4)6Mo2O24.4H2O、0.01g KI、0.004g CuSO4)に、OD600nm＝0.02まで希釈する。RU-ORPN1F9細胞株を、0.002%のグルタミンを追加したHMMまたはSMMまたはAMM中で生育させる。アグロバクテリウムRU-OR細胞における酵素活性を0.1%のチオウラシルを含む培地中で生育させることにより誘導した。細胞をOD600nm=0.5-0.8にて回収し、遠心分離によりペレットとし、0.1MのPO4バッファーpH8.0にて洗浄し、ついでヒダントインまたはＮ-カルバミルグリシン反応バッファーに、最終含水生物量濃度20mg/mlで再懸濁した(反応バッファー；0.1MのPO4バッファーpH8.0中50mMのヒダントインまたは25mMのＮ-カルバミルグリシンいずれか）。ヒダントインの活性を、６時間４０℃で振とうした後の、体積にして５mlの反応液中の、50μmol/mlのヒダントインから産出されたＮ-カルバミルグリシン(μmol/ml)およびグリシン(μmol/ml)の濃度の合計として測定する。Ｎ-カルバミルアミノ酸アミドヒドロラーゼの活性は、６時間４０℃で振とうした後の体積にして５ｍｌの反応液中の、２５μmol/mlのＮ-カルバミルグリシンから産出されたグリシンの濃度として測定する。
【００１４】
（RU-OR、RU-ORPN1およびRU-ORPN1F9の単離）
東ケープ地由来の土壌サンプルをヒダントイン最少培地(HMM)ブロス（１リットル当たり、10gグルコース;0.011g CaCl2;0.02g MgCl2;60gNa2HPO4、30g KH2PO4、5g NaCl、0.04gホウ酸、0.04g MnSO4、0.02g (NH4)6Mo2O24.4H2O、0.01g KI、0.004g CuSO4、1%ヒダントイン)に接種し、次いでインキュベートし、２５℃で２４時間振とうし、その後、段階希釈したものをHMMアガーに蒔き、次いで５日間２５℃でインキュベートした。生じたコロニー、すなわち土壌窒素源としてヒダントインを利用するものをHMMアガー上に再度画線培養することにより精製した。単離された株をヒダントインおよびＮ-カルバミルアミノ酸アミドヒドロラーゼの活性の存在に関して、休止細胞生物触媒アッセイを用いて試験した。これら単離されたものの中に含まれる野生型アグロバクテリウム・エスピー株RU-ORをHartley et al. (1998)に開示されるようにその１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列(図１に示す）を決定することにより同定した。
【００１５】
変異型RU-ORPN1は、以下のように選択した。アグロバクテリウム・RU-OR細胞を中期-対数期までHMMブロス中で培養し、ついでスルホン酸エチルメタン(EMS)をMiller (1992)に開示される方法に従って用いて変異形成に供した。変異細胞を、0.1%の(NH4)2SO4および0.1%の５-フルオロウラシルを追加したMMアガーに蒔いた。RU-ORPN1株をこれらのプレートから単離し、標準培地および標準アッセイ条件下で、誘導物質不在下での酵素活性を評価した。、前記のようにRU-ORPN1細胞に変更発生させることによりRU-ORPN1F9株を単離し、グルタミン依存的生育のためにペニシリンを強化した後、細胞を0.002%のグルタミンを追加したHMMアガーに蒔いた。Gln-変異株を、グルタミンを追加しないHMMに反復して蒔くことにより選択した。
【００１６】
グルタミンシンセターゼアッセイ
トータルのグルタミンシンセターゼ活性を、γ-グルタミルトランスフェラーゼアッセイを用いて測定した。細胞を、0.01%のセチル-トリメチルアンモニウムブロマイドで１０分間処理した後、回収した。細胞を次いで２回0.1Mのリン酸バッファーpH9.0で洗浄した後、５０分の１の体積の再懸濁バッファーに懸濁し、次いでBender et al. (1977)の方法に従ってアッセイした。タンパク質濃度をBradford (1976)の方法により決定した。活性は、１ミリグラムのタンパク質につき１分あたりに生成したγ-グルタミルヒドロキサム酸のμmolとして表す。グルタミンシンセターゼ酵素サブユニットのアデニル化の割合をMagasanik et al. (1995)の方法を用いて測定し、これを、マグネシウムイオンの存在下および不在下でのγ-グルタミルトランスフェラーゼと比較する。マグネシウムイオンはアデニル化酵素サブユニットの活性を阻害し、次いでその差を用いてグルタミンシンセターゼ酵素のアデニル化の割合を算定する。
【００１７】
ヒダントイナーゼおよびＮＣＡＡＨ活性の調節
エイ.ツメファシエンスRU-OR細胞におけるヒダントイナーゼとＮＣＡＡＨの活性は、完全生育培地（栄養ブロス）中でのバッチ培養中初期の定常期にのみ検出することができた。さらに、酵素活性は、ヒダントイン類似性２-チオウラシルの存在下での生育に依存した。酵素活性を調節する原因となっている栄養因子を、酵素活性が定常期に制限されない通常の培養条件を確立することにより同定した。ヒダントイナーゼとＮＣＡＡＨの活性は、RU-OR細胞が、ヒダントインおよびグルコースをそれぞれ唯一の窒素および炭素源として含む化学的に限定された最少培地(MM+0.1%ヒダントイン）中で生育している間に測定した。両酵素の活性は、初期指数期、および細胞が定常期に達した後は低く、中〜後期指数期中に最高の活性が検出された(図２）。
以下の全試験において、酵素活性は中-指数期中に、OD600=0.5-0.81で回収した細胞にて測定した。
【００１８】
ヒダントイン-加水分解酵素活性における、異なる炭素および窒素源の影響を、生育速度を調べることにより、および中-指数生育期における生物触媒活性をアッセイすることにより決定した。細胞を、グルコースまたはグリセロールを炭素源として、およびヒダントインを窒素源として含む最少培地中で生育させた。RU-OR細胞の生育速度はいずれの炭素源によっても有意に影響を受けず（図３）、ヒダントイナーゼとＮＣＡＡＨの活性にもほとんど違いは無かった（表１）。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
これに対して、RU-OR細胞の生育速度は、窒素源をどう選択するかで劇的に影響を受けるようであった。ヒダントインが最も生育速度を制限している窒素源であり、0.1%(NH4)2SO4と0.1%セリンが最も生育速度を制限していない窒素源であった。0.01%のカサミノ酸を含む培地中の細胞は、中程度の速度で生育した。0.01%カサミノ酸中で生育している細胞で最高の酵素活性が検出され、(NH4)2SO4中で生育している細胞で最低の酵素活性が検出された。セリンまたはヒダントインを窒素源として用いた細胞の生育度は、中レベルの酵素活性を示し(表1)、(NH4)2SO4を含む培地中での細胞の生育はヒダントイナーゼとＮＣＡＡＨの活性に抑制効果を有していた（窒素抑制）。
【００２１】
誘導されたRU-OR細胞（SMM+0.1%チオウラシル中で生育させた）をAMM+２-チオウラシル中に再懸濁し、そして生育させた(アンモニアショック）。３０分以内に、ヒドロラーゼの活性は３倍低下し、対応する２倍の低下がＮＣＡＡＨの活性に認められた（図４）。
誘導された細胞をグルタミンシンセターゼ阻害物質、Ｄ,Ｌ-メチオニン、Ｄ,Ｌ-スルホキシイミン（MSX)を含むAMMに再懸濁および生育させた場合、ヒダントイナーゼの活性にもＮＣＡＡＨの活性にも、非常にわずかな低下しかなく（図４）、アンモニアショック後のRU-OR細胞におけるヒダントイナーゼとＮＣＡＡＨの活性の低下がグルタミンシンセターゼの活性に依存することが示唆される。誘導された細胞をアンモニアショックに３０分間供し、その後、それらを洗浄し、SMM＋チオウラシルに再懸濁し、次いでさらに６０分間生育させた後、酵素活性をアッセイした。ヒダントイナーゼとＮＣＡＡＨの活性はアンモニアショック以前に認められたレベルまで回復し、アンモニアショックの影響が(NH4)2SO4の不在下で急速に回復したことが示される。同時に、このデータは、野生型アグロバクテリウムRU-ORにおけるヒダントイナーゼとＮＣＡＡＨの活性が、生育培地中のａ）誘導物質およびｂ）窒素源の存在に依存することを示す。
【００２２】
変異株の特定
誘導物質非依存性ヒダントイナーゼとＮ-カルバミルアミノ酸アミドほどロラーゼの活性を、２-チオウラシルを含まないSMM中で生育させた細胞における酵素活性を測定することにより評価した。RU-ORPN1細胞は、アグロバクテリウムRU-OR細胞中で誘導されるレベルに対し、ヒダントイナーゼの活性に関して有意な（３倍の）増加を示し、ＮＣＡＡＨの活性は同等であった。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
窒素源として(NH4)2SO4を含む最少培地で生育されたRU-ORPN1細胞は、野生型、RU-OR細胞に認められるもの同様、ヒダントイナーゼの活性に関して抑制されたレベルを示したが、RU-ORとは対照的にRU-ORPN1細胞において、NCAAHの活性は野生型で誘導されたレベルよりも高かった(図６）。SMM中で６０分間生育させた後、変異型RU-ORPN1細胞におけるヒダントイナーゼの活性は、誘導された野生型細胞に正常に認められるレベルまで回復したが、SMM中で生育させた後の野生型アグロバクテリウムRU-OR細胞におけるヒダントイナーゼの活性に増加は無かった。つまり、野生型と異なり変異株は、窒素抑制条件下でも、ヒダントイナーゼおよびＮ-カルバミルアミノ酸両方を発現するが、ヒダントイナーゼ酵素が(NH4)2SO4の存在下で不活性なのである。
【００２５】
グルタミン合成の阻害によりRU-OR細胞において、アンモニアショックに対するヒダントイナーゼの活性の感度が落ちる（図４）。それゆえ、gln-要求性変異株RU-ORPN1F9をアンモニアショックに供し、次いでヒダントイナーゼをこのgln−要求性変異株において測定した。図７は、変異体RU-ORPN1F9が、野生型アグロバクテリウムRU-ORおよび変異体RU-ORPN1のものと比較して、アンモニアショックに対してもはや感受性を示さないことを示す。
【００２６】
全３株の、アンモニアショック前後のグルタミンシンセターゼアッセイは、RU-ORPN1F9において、アグロバクテリウムRU-ORおよびRU-ORPN1細胞のものと比較した場合にグルタミンの合成が６０％少なかった。つまり、RU-ORPN1F9細胞が(NH4)2SO4中で生育されるとグルタミンの合成が低下し、結果的にアンモニアショックに対してヒダントイナーゼの活性が非感受的になる。
【００２７】
(NH4)2SO4における生育中の制御性変異体におけるヒダントイナーゼおよびＮＣＡＡＨの活性
RU-ORPN1およびRU-ORPN1F9のヒダントイナーゼ活性およびＮＣＡＡＨ活性を、SMM中でのバッチ培養中に評価し、次いで、２-チオウラシルを追加した同じ培地中で生育させた野生型アグロバクテリウムRU-ORの酵素活性と比較した。
変異株RU-ORPN1におけるヒダントイナーゼの活性は、野生型アグロバクテリウムRU-ORにおけるものと同じ傾向にあった（図８）が、RU-ORPN1F9細胞の対数生育期において最高レベルの活性が検出された。RU-ORPN1およびRU-ORPN1F9株におけるＮＣＡＡＨの活性は対数生育期で最も高く、これらのレベルは定常期中に低下した。RU-ORPN1F9細胞は、対数生育期中、全３株の中で最も高いヒダントイン総加水分解活性を達成し(図８および９）、gln-表現型がこのRU-OR株におけるヒダントイナーゼまたはＮＣＡＡＨの産生に有害な影響を持たないことを示す。アグロバクテリウムRU-OR株は、D,L-p-ヒドロキシフェニルヒダントインのＤ-ｐ-ヒドロキシフェニルグリシンへのその有効な変換のため、選択された。高レベルのＤ,Ｌ-ｐ-ヒドロキシフェニルヒダントインの加水分解も達成された。野生型アグロバクテリウムRU-ORおよびRU-ORPN1細胞による最高のD,L-ｐ-ヒドロキシフェニルヒダントイン変換は、定常生育期中に検出された。RU-ORPN1F9株において、対数生育期中のヒダントイナーゼとＮＣＡＡＨの活性は共に、アグロバクテリウムRU-ORまたはRU-ORPN1細胞いずれかで検出されるものを超えた。４５％までのＤ,Ｌ-ｐ-ヒドロキシフェニルヒダントインがＮ-カルバミル-ｐ-ヒドロキシフェニルグリシンまたはＤ-ｐ-ヒドロキシフェニルグリシンいずれかに、RU-ORPN1F9細胞により６時間以内に変換された。RU-ORPN1F9細胞は６時間後に、Ｄ,Ｌ-ｐ-ヒドロキシフェニルヒダントインの２５％の変換に対応するおよそ６μmol/mlのD-p-ヒドロキシフェニルグリシンを産生した。
【００２８】
図１０（Ａ-Ｃ）はＤ,Ｌ-ｐ-ヒドロキシフェニルヒダントインを基質として用いた、１ミリグラムの乾燥細胞質量当たりの特異的ヒダントイナーゼ活性を示す。RU-ORPN1株は、野生型アグロバクテリウムRU-ORと比較して、５０％のヒダントイナーゼの総合的な増加を示す。変異型RU-ORPN1F9は最高のヒダントイナーゼ活性を示し、アグロバクテリウムRU-ORおよび変異体RU-ORPN1それぞれよりも３００％および２００％高かった。最も重要なのは、単位生物質量当たりの最高の特異的ヒダントイナーゼ活性が、中期-対数生育期中のRU-ORPN1F9細胞に認められ(0.015ユニット）、これに対して、同じ生育期中でRU-ORおよびRU-ORPN1細胞ではそれぞれ0.002ユニットおよび0.003ユニットであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はアグロバクテリウムRU-ORの１６Ｓ・ｒＲＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図２】  図２はＨＭＭにおける生育中の中期-対数相中のアグロバクテリウムRU-OR細胞におけるヒダントイナーゼおよびＮ-カルバミルアミノ酸アミドヒドロラーゼ活性を示す。
【図３】  図３は、RU-OR細胞におけるヒダントイナーゼおよびＮ-カルバミルアミノ酸アミドヒドロラーゼの活性における、炭素源および窒素源の影響を示す。
【図４】  図４は、野生型のアグロバクテリウムRU-OR細胞における酵素活性が、アンモニアショックにより抑制されることを示す。
【図５】  図５は、RU-ORPN1細胞がヒダントイナーゼ酵素を恒常的に発現するが、ヒダントイナーゼ酵素は生育培地中のアンモニウムによる抑制のために不活性であることを示す。
【図６】  図６は、RU-ORPN1細胞が活性Ｎ-カルバミルアミノ酸アミドヒドロラーゼ酵素を恒常的に発現するが、野生型酵素は抑制されることを示す。
【図７】  図７は、RU-ORPN1F9細胞におけるヒダントイナーゼの活性は、アンモニアショックに感受性がないことを示す。
【図８】  図８は、中期-対数生育期中のRU-ORPN1F9細胞におけるヒダントイナーゼの活性のレベルを野生型RU-ORおよび変異型RU-ORPN1におけるレベルと比較したものを示す。ここで、細胞は最適生育条件下で生育させた。
【図９】  図９は、中期-対数生育期中のRU-ORPN1およびRU-ORPN1F9両細胞におけるN-カルバミルアミノ酸アミドヒドロラーゼの活性のレベルを野生型RU-ORにおけるレベルと比較したものを示す。ここで、細胞は最適生育条件下で生育させた。
【図１０】  図１０は、中期-対数生育期のRU-ORPN1F9細胞の単位生物量あたりの、D,L-p-ヒドロキシフェニルヒダントインを基質とする特異的ヒダントイナーゼ活性の増加を、野生型RU-OR細胞およびRU-ORPN1細胞において定常期中に達成される特異的ヒダントイナーゼ活性と比較したものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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