(57)【要約】例えば汚染物質のごとき外部刺激の存在下で植物において直接モニター可能な表現型の特徴を生じさせることのできるレポーター系が提供される。所望により、該系は土壌浄化能を有していてもよい。該プロモーターおよび所望により該浄化能を有する遺伝学的に修飾された植物、該遺伝学的に修飾された植物を用いる土壌汚染検出および所望により土壌のバイオレメディエーションのための方法、ならびに土壌汚染モニターおよび所望により土壌のバイオレメディエーションのための遺伝学的に修飾された植物の使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部刺激の存在下で植物において直接モニター可能な表現型の特徴を生じさせることのできるレポーター系であって、該外部刺激の存在下で該直接モニター可能な表現型の特徴の発生に関与する産物をコードする遺伝子を含むレポーター系。
【請求項２】
該直接モニター可能な表現型の特徴が、外部刺激の存在に応答した該遺伝子の変化した発現の結果である請求項１記載のレポーター系。
【請求項３】
外部刺激の存在に応答してセンサー系が該変化した遺伝子発現を引き起こすものである請求項２記載のレポーター系。
【請求項４】
センサー系が調節エレメントを含むものである請求項３記載のレポーター系。
【請求項５】
調節エレメントが、ＴＧＣＡＣＣＣ、ＴＧＣＡＣＧＣ、ＴＧＣＡＣＡＣおよびＴＧＣＧＣＡＣからなる群より選択される配列を有する金属応答エレメント（ＭＲＥ）を含むものである請求項４記載のレポーター系。
【請求項６】
センサー系がプロモーターを含むものであり、該プロモーターの活性が外部刺激の存在により影響を受けるものである請求項３〜５のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項７】
該プロモーターが該遺伝子に作動可能に連結されている請求項６記載のレポーター系。
【請求項８】
プロモーターがArabidopsis thalianaのガンマ−グルタミルシステインシンセターゼ（Ｘ８０３７７、Ｘ８１９７３およびＸ８４０９７）、Arabidopsis thalianaのフィトケラチンシンターゼ（ＰＣＳ１、ＡＦ０９３７５３）、Arabidopsis thalianaのＩＲＴ１およびＩＲＴ２金属トランスポーター（Ｕ２７５９０およびＴ０４３２４）、Arabidopsis thalianaのＡｔＰＣＳ１およびＡｔＰＣＳ２（Ｗ４３４３９およびＡＣ００３０２７）からなる群より選択されるものである請求項６または７に記載のレポーター系。
【請求項９】
遺伝子（複数も可）が植物における可視的な色の変化の生成に関与するものである請求項１〜８のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項１０】
遺伝子（複数も可）がフェニルプロパノイド代謝に関与するものである請求項１〜８のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項１１】
遺伝子（複数も可）が色素の生合成に関与するものである請求項１〜８のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項１２】
遺伝子（複数も可）がフラボノイドの生合成に関与するものである請求項１〜８のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項１３】
遺伝子（複数も可）がアントシアニンの生合成に関与するものである請求項１〜８のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項１４】
遺伝子がカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）である請求項１〜１３のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項１５】
遺伝子がカルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）である請求項１〜１３のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項１６】
遺伝子がジヒドロフラボノールレダクターゼ（ＤＦＲ）である請求項１〜１３のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項１７】
さらに前記遺伝子（複数も可）のいずれかの内在性コピーが無機能である請求項１〜１６のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項１８】
内在遺伝子（複数も可）が色素の生成に関与するものである請求項１７記載のレポーター系。
【請求項１９】
内在遺伝子（複数も可）がフラボノイド生合成経路に含まれるものである請求項１７記載のレポーター系。
【請求項２０】
内在遺伝子（複数も可）がテトラヒドロカルコン／カルコン合成に関与するものである請求項１７記載のレポーター系。
【請求項２１】
内在遺伝子がＣＨＳ遺伝子（ｔｔ４変異種）である請求項１７記載のレポーター系。
【請求項２２】
内在遺伝子（複数も可）が２Ｓ−フラバノン、ナリンゲニンおよびリグクリチゲニン（ligquritigenin）の生成に関与するものである請求項１７記載のレポーター系。
【請求項２３】
内在遺伝子がＣＨＩ遺伝子（ｔｔ５変異種）である請求項１７記載のレポーター系。
【請求項２４】
さらに転写因子の発現が変化している請求項１〜２３のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項２５】
転写因子がＭｙｂドメインを含むものである請求項２４記載のレポーター系。
【請求項２６】
転写因子がＰＡＰ１および／またはＰＡＰ２である請求項２５記載のレポーター系。
【請求項２７】
転写因子が過剰発現されるものである請求項２４〜２６のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項２８】
過剰発現が誘導可能なプロモーターにより制御されるものである請求項２７記載のレポーター系。
【請求項２９】
過剰発現が構成的なプロモーターにより制御されるものである請求項２７記載のレポーター系。
【請求項３０】
過剰発現が３５Ｓプロモーターにより制御されるものである請求項２７記載のレポーター系。
【請求項３１】
過剰発現がデュアルプロモーターにより制御されるものである請求項２７記載のレポーター系。
【請求項３２】
外部刺激が汚染物質である請求項１〜３１のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項３３】
汚染物質が無機物質である請求項３２記載のレポーター系。
【請求項３４】
汚染物質が重金属である請求項３３記載のレポーター系。
【請求項３５】
重金属がＣｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｓｅ、Ａｕ、Ａｇからなる群より選択されるものである請求項３４記載のレポーター系。
【請求項３６】
汚染物質が有機物質である請求項３２記載のレポーター系。
【請求項３７】
有機汚染物質が窒素含有化合物である請求項３６記載のレポーター系。
【請求項３８】
化合物がＮＯ２、ＮＯ３、ＮＨ２またはＮＨ３を含むものである請求項３７記載のレポーター系。
【請求項３９】
窒素含有化合物が爆薬を含むものである請求項３６または３７に記載のレポーター系。
【請求項４０】
前記遺伝子（複数も可）の発現が汚染物質の存在により直接変化するものである請求項１〜３９のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項４１】
前記遺伝子（複数も可）の発現が汚染物質の存在により間接的に変化するものである請求項１〜３９のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項４２】
１またはそれ以上の工程において汚染物質が二次因子に変換され、該二次因子が該遺伝子（複数も可）の発現を変化させるものである請求項４１記載のレポーター系。
【請求項４３】
微生物の異化酵素により変換が容易化される請求項４２記載のレポーター系。
【請求項４４】
微生物酵素が「ＴＮＴレダクターゼ」であり、ＴＮＴからのＮＯ２−の遊離を容易化するものである請求項４２または４３に記載のレポーター系。
【請求項４５】
変換が刺激の増幅を容易化させるカスケードを含むものである請求項４２または４３に記載のレポーター系。
【請求項４６】
表現型の特徴が視覚による検査により評価されうるものである請求項１〜４５のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項４７】
表現型の特徴が色である請求項４６記載のレポーター系。
【請求項４８】
系がさらにバイオレメディエーション系を含むものである請求項１〜４７のいずれかに記載のレポーター系。
【請求項４９】
バイオレメディエーション系が汚染物質の分解を含むものである請求項４８記載のレポーター系。
【請求項５０】
バイオレメディエーション系が汚染物質の蓄積を含み、かくして除去が容易化される請求項４９記載のレポーター系。
【請求項５１】
蓄積が重金属結合蛋白および／または金属輸送蛋白の１つまたは組み合わせの発現により達成される請求項５０記載のレポーター系。
【請求項５２】
バイオレメディエーション系が下記のものからなる群より選択される遺伝子を含むものである請求項５１記載のレポーター系：
フィトケラチンシンセターゼをコードするS.pombe 遺伝子 (gene bank 受託番号 Y08414)、フィトケラチンシンターゼに関するAthyrium yokoscense AyPCS1 mRNA (AB057412)、Arabidopsis thaliana の推定上のフィトケラチンシンターゼ (AY039951)、Arabidopsis thaliana のフィトケラチンシンターゼ (CAD1、AF135155)、Arabidopsis thaliana の推定上のメタロチオニン-I 遺伝子転写アクチベーター (AY04594)、Arabidopsis thaliana のフィトケラチンシンターゼ (PCS1、AF093753)、Arabidopsis thaliana のIRT1 および IRT2 金属トランスポーター (U27590 および T04324)、Arabidopsis thaliana のAtNramp1、2、3 および 4 金属トランスポーター (AF165125、AF141204、AF202539、および AF202540)、フィトケラチンシンターゼに関するBrassica juncea のmRNA (pcs1 遺伝子 AJ278627)、フィトケラチンシンセターゼ様蛋白に類似のEuphorbia esula のcDNA (BG459096)、Arabidopsis. thaliana の推定上のフィトケラチンシンセターゼに類似のLycopersicon esculentum (Tomato crown gal) l (BG130981)、Typha latifolia のフィトケラチンシンターゼ (AF308658)、Zea mays のフィトケラチンシンセターゼ様蛋白 (CISEZmG、AF160475)、Thalaspi caerulescens のZNT1 重金属トランスポーター (AF133267)。
【請求項５３】
請求項１〜５２のいずれかに記載のレポーター系を含む遺伝学的に修飾された植物。
【請求項５４】
植物が単子葉植物である請求項５３記載の遺伝学的に修飾された植物。
【請求項５５】
植物が双子葉植物である請求項５３記載の遺伝学的に修飾された植物。
【請求項５６】
植物が一年性植物である請求項５３記載の遺伝学的に修飾された植物。
【請求項５７】
植物が二年性植物である請求項５３記載の遺伝学的に修飾された植物。
【請求項５８】
植物が多年性植物である請求項５３記載の遺伝学的に修飾された植物。
【請求項５９】
植物がBrassicaceaeのグループに属するものである請求項５３記載の遺伝学的に修飾された植物。
【請求項６０】
植物が下記の種からなる群に属するものである請求項５９記載の遺伝学的に修飾された植物：
Brassica napus、B. rapa、および B. junceaas、Brassica oleracea、Brassica napus、Brassica rapa、Raphanus sativus、Brassica juncea、Sinapis alba、Armoracia rusticana、Alliaria petiolata、Arabidopsis thaliana、A. griffithiana、A. lasiocarpa、A. petrea、Barbarea vulgaris、Berteroa incana、Brassica juncea、Brassica nigra、Brassica rapa、Bunias orientalis、Camelina alyssum、Camelina microcarpa、Camelina sativa、Capsella bursa-pastoris、Cardaria draba、Cardaria pubescens、Conringia orientalis、Descurainia incana、Descurainia pinnata、Descurainia sophia、Diplotaxis、uralis,Diplotaxis tenuifolia、Erucastrum gallicum、Erysimum asperum、Erysimum cheiranthoides、Erysimum hieracifolium、Erysimum inconspicuum、Hesperis matronalis、Lepidium campestre、Lepidium densiflorum、Lepidium perfoliatum、Lepidium virginicum、Nasturtium officinale、Neslia paniculata、Raphanus raphanistrum、Rorippa austriaca、Rorippa sylvestris、Sinapis alba、Sinapis arvensis、Sisymbrium altissimum、Sisymbrium loeselii、Sisymbrium officinale、Thlaspi arvense、および Turritis glabra。
【請求項６１】
請求項５３〜６０のいずれかに記載の遺伝学的に修飾された植物からの種子をモニターすべき場所に導入し、
生じた植物の表現型をモニターし、次いで、
所望により、植物がバイオレメディエーション工程において分析対象を蓄積するものである場合には植物を除去する
ことを含む、分析対象の検出方法。
【請求項６２】
分析対象が汚染物質である請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
汚染物質が無機物質である請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
無機汚染物質が重金属である請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
重金属がＣｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｓｅ、Ａｕ、Ａｇからなる群より選択されるものである請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
検出される重金属の濃度が土壌１ｋｇあたり少なくとも０．１ｍｍｏｌである請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
汚染物質が有機物質である請求項６２記載の方法。
【請求項６８】
有機汚染物質が窒素含有化合物である請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
化合物がＮＯ２、ＮＯ３、ＮＨ２またはＮＨ３を含むものである請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
検出される窒素含有化合物の濃度が土壌１ｋｇあたり少なくとも０．１ｍｍｏｌである請求項６８または６９に記載の土壌汚染検出方法。
【請求項７１】
バイオレメディエーション工程が分析対象の濃度を少なくとも５０％低下させるものである請求項６１〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
分析対象の検出および所望によりバイオレメディエーションのための、請求項５３〜６０のいずれかに記載の遺伝学的に修飾された植物の使用。
【請求項７３】
分析対象が汚染物質である請求項７２記載の使用。
【請求項７４】
汚染物質が無機物質である請求項７３記載の使用。
【請求項７５】
無機汚染物質が重金属である請求項７４記載の使用。
【請求項７６】
重金属がＣｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｓｅ、Ａｕ、Ａｇからなる群より選択されるものである請求項７５記載の使用。
【請求項７７】
検出される重金属の濃度が土壌１ｋｇあたり少なくとも０．１ｍｍｏｌである請求項７６記載の使用。
【請求項７８】
汚染物質が有機物質である請求項７３記載の使用。
【請求項７９】
有機汚染物質が窒素含有化合物である請求項７８記載の使用。
【請求項８０】
化合物がＮＯ２、ＮＯ３、ＮＨ２またはＮＨ３を含むものである請求項７９記載の使用。
【請求項８１】
検出される窒素含有化合物の濃度が土壌１ｋｇあたり少なくとも０．１ｍｍｏｌである請求項８０に記載の使用。
【請求項８２】
バイオレメディエーション工程が分析対象の濃度を少なくとも５０％低下させるものである請求項７２〜８１のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はレポーター系に関するものであり、該レポーター系は、例えば汚染物質のごとき外的刺激の存在下において直接モニター可能な表現型の特徴を植物中に生じさせることができる、そして所望により、該植物中に存在する場合に土壌のバイオレメディエーション（bioremediation）に用いることのできる系を含むものである。また本発明は、該レポーター系および所望により該バイオレメディエーション系を含む遺伝学的に修飾された植物、土壌汚染の検出方法および所望により該遺伝学的に修飾された植物を用いることによる土壌のバイオレメディエーション方法にも関するものであり、さらには土壌汚染の生物的検出のための、所望により土壌のバイオレメディエーションのための、遺伝学的に修飾された植物の使用にも関する。
【０００２】
背景
土壌汚染は、環境ならびにヒトおよび動物の健康に重大な悪影響を及ぼす可能性がある。汚染は、工業、農業および他のヒトの活動の結果であり、重大かつ深刻化する問題を提起する。デンマークにおいて、例えば、Danish Ministry of Environmentは、デンマークの公害地域の数は１９９５年には１４０００箇所あると概算した（Miljotilstandsrapport 1997）。汚染は多数の無機的および有機的な化合物に関連している可能性がある。
【０００３】
無機汚染物質は、例えば、重金属であってよい。これらは異なるタイプの土壌において種々の濃度で見出され、有機汚染物質とは違って、化学的に変換されず、また微生物によっても分解され得ない（Zhu et al., 1999）。痕跡量の銅（Ｃｕ）や亜鉛（Ｚｎ）などの重金属は、酵素のホメオスタシスにおけるコファクターとして生存のための重要な役割を果たしているが、これらの重金属が過剰な場合には、カドミウム（Ｃｄ）、水銀（Ｈｇ）および鉛（Ｐｂ）のような非必須金属と同様に毒性がある。多くのヒトの疾病は重金属の摂取に関係しており、例えば、Ｃｄはガンの発生率を増加させることが示されている。
【０００４】
多くの有機汚染物質も土壌中に見出されている。ニトロ官能基を含む生物にとり異物である化合物が例示され、それらは農薬、医薬、色素およびプラスチックの製造に使用されている（Gorontzy et al. 1994, Spain et al. 1995, White & Snape. 1993）。かかる化合物は鉱業、農業にも利用されており、地雷を含む軍用品に多く用いられている。最も普通の残り滓は2,4,6-トリニトロトルエン(TNT),ヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン(RDX),オクタヒドロ-1,3,5,7-テトラニトロ-1,3,5,7-テトラゾシン(HMX)、ならびに関連不純物および環境を変化させる産物を含む。かかる化合物はそれらの製造および保存場所ならびに軍事施設を汚染している（Sheng et al 1998, Taha et al.,1997）。さらに、使用中の地雷の約９０％が漏れを起こしていると概算され（Boline 1999）、土壌中へのＴＮＴの拡散が生じている。他の多くの汚染物質と違って、これらの汚染物質のいくつかは土壌に対する親和性がほとんどなく、急速に移動して地下水を汚染する。高レベルのＴＮＴが生物学的活性を阻害する可能性があることが観察されているので（Gong et al.,1999）、このことは問題である。汚染自体の直接的結果のほかに、このタイプの汚染物質は爆薬の存在を示すものとなりうる。地雷は殺傷能力があり、戦場において、そして特に、世界の遠隔で貧困な地域においてヒトを不具にしているので、地雷の存在を知ることは非常に価値がある。
【０００５】
検出
土壌汚染を取り扱う際の第１の必要事項は、汚染された場所を検出する能力である。広範囲での使用を容易にするためには、実用的で比較的費用のかからない検出システムが望ましい。現在利用可能な検出方法は汚染物質の検出を可能にするが、それらの方法は不便で費用がかかる。
【０００６】
土壌試料関する情報に言及する場合には、それぞれの観察結果は特定の位置および時間に関するものである。測定位置および／または時間がわからず、分析において考慮されなければ、汚染物質濃度などの属性値の知識はあまり関心がもたれない。費用的に有効で、正確な場所の特徴付けを行うために決定すべき重要なものは、収集されるべき土壌試料の数、場所およびタイプである。試料が正確に地域を示していない場合に、場所の特徴付けのエラーが起こる。汚染物質が例えば爆薬のように土壌に不均一に分布している場合に、このことが問題となる。
【０００７】
かくして、有効に場所を評価する必要のある試料が多数あるために、汚染された土壌の特徴付けに費用と時間がかかる可能性がある。環境試料を評価するための現在の研究室的方法は高感度であり、多数の化学物質を評価することができるが、かかる方法に関連する時間と費用はそれらの有効性を限定することが多い。よって、数多く適用される、汚染された土壌をマッピングするための経済的に実行可能でリアルタイムなｉｎ−ｓｉｔｕ系に対する必要性が存在している。
【０００８】
重金属の検出に現在用いられている方法には、ｉｎ−ｓｉｔｕ土壌汚染センサーＩｎ（ＬＩＢＳ）レーザー誘導ブレークダウンスペクトロスコピー（Cremers et al. 2001）がある。
【０００９】
爆薬で汚染された土壌は、伝統的には、エンザイムイムノアッセイおよび高品質液体クロマトグラフィーのごとき種々の方法により研究室で分析される試料を集めることによりモニターされている（Haas et al. 1995）。
【００１０】
通常には、地雷の検出は、金属探知器、イヌまたは人力を用いて関連エリアを探索することにより行われている。軍の地雷除去において、その目的は、非人力を用いて可能な限り迅速に地雷野から地雷を除去することであり、通常、除去率は８０〜９０％でよいとされる。一方、人力での地雷除去は、すべての地雷を除去し、その土地を通常の使用状態に戻すことが必要とされるので、より困難で危険なものである。今日、大部分の人力地雷除去は、手で扱う金属探知器を用いて行われており、それは対象中に渦電流を誘導し検出可能な地場を新たに生じさせるための、時間と共に変化する電磁場を用いることにより金属含有物体を見つけ出すものである。古い地雷は金属パーツ（例えば、点火ピン）を含んでいるが、現代的な地雷は非常に少量の金属を含むかあるいは金属を含まない。より少量の金属を検出する検出器の感度が上昇すると、地雷が存在する可能性のあるエリアにおいて見出される金属くずに対しても非常に感受性となる。さらにそのうえ、金属探知器は洗練されたものであるが、爆薬の有無に関する情報を提供せずに変化を見つけることに成功できるだけである。人力地雷除去における１の大きな問題は、「ダミー」物体と、地雷とを識別することである。無害な物体を確認し、除去することは時間の浪費であり、費用のかかるプロセスである。イヌは極めて発達した嗅覚を有し、微量な爆薬を見地するようにトレーニングできる。しかしながら、この方法は、イヌおよびそれを扱う者に厳しいトレーニングを課すものであり、イヌの注意力は限られているので連続した作業は困難である。多くの地雷検出方法が現行の方法を補うものとして出現している。それらには、地中貫通レーダー（ＧＰＲ）、赤外線サーモグラフィーおよび進歩した金属探知器が含まれる。これらの方法に共通の特徴は、それらが地中の「変化」を検出するものであるが、爆薬の存在を示すことは不可能であるということである。基本的には、ＧＰＲシステムは短い電磁パルスを広帯域アンテナから地中に放射することにより作動するものである。そして、地中からの反射を測定してベクトルを得る。アンテナを置換して連続的なベクトルを並べて表示することによりイメージを得ることができる。良好な空間的分解能を得るためには高周波が必要であるが、逆に、周波数とともに電場の貫通する深さは減少し、周波数が高すぎると数センチメートル以上では用をなさない。それゆえ、周波数レンジの選択は、分解能と貫通深さとの間のバランスによる（Borgwardt, C. 1995）。検出器は現代の地雷中の少量の金属を検出するに十分なほど高感度になりうるが、このことは実際には役に立たない。なぜなら、より小さなカスを検出することとなり、真偽不明のアラーム回数を増やすことになるからである。現在唯一の別法は、物体の形状を検出するための固い金属棒を用いて浅い角度で地面を刺すことである。これは本質的に危険な作業である。
【００１１】
植物は土地に存在する分析対象の存在を示すものとして以前から用いられている。典型的には、かかる使用は、天然に存在する植物の生活に基づくもので、分析対象の存在を粗っぽく示すものである。例えば、地中の金属の存在が植物の生活に影響するので、長時間にわたり鉱物が存在している可能性のある場所に「インジケーター」植物が用いられている。このことは、ある種の天然に存在する植物種の存在／不存在に主に基いて大量のある種の鉱物が存在するかどうかの知識を鉱物地質学者に与え、鉱物地質学者は植物種から集めた組織を分析することにより天然に蓄積された金属を知ることができる（Raines and Canney 1980）。しかしながら、より特異的で高感度の応答を与えるリファインされたインジケーター植物、例えば、遺伝学的に修飾された植物の土地における使用は、記載されたことがない。
【００１２】
研究室において、レポーター系は、検出および可能には定量分析に多年にわたり用いられている。かかる洗練された研究室用レポーター系の構築には、通常、遺伝子工学を用いる。典型的にはレポーター遺伝子を用いることにより、遺伝学的に修飾された植物系は、植物遺伝子ならびに動物、微生物等由来の遺伝子の発現の研究にも使用されている。伝統的には、レポーター遺伝子は、目的遺伝子の転写活性のレポートに用いられ、簡単にアッセイできる活性を有する酵素をコードしている。組み換えＤＮＡ法を用いて、レポーター遺伝子の本来のプロモーターが除去され、研究される遺伝子のプロモーターに置き換えられる。新たなキメラ遺伝子が生物に導入され、レポーター遺伝子産物をアッセイすることにより目的遺伝子の発現がモニターされる。レポーター遺伝子は、遺伝子産物が未知であるかあるいは同定が容易でない遺伝子の発現の研究を可能にする。環境的に、あるいは成長の上から調節されている遺伝子の発現パターンを決定するためには、興味深い成長および／またはストレス応答を示すプロモーターの転写調節下にレポーター遺伝子を置く。細菌においては、β−ガラクトシダーゼをコードするβ−ｌａｃＺ遺伝子を、本来的にはｌａｃ−である細菌中あるいは変異によりｌａｃ−である細菌中でレポーターとして用いることができる。この遺伝子は多くの動物系に使用することもできる。内在性遺伝子が存在しない場合に動物および細菌においてよく使用される他のレポーター遺伝子系としてはｃａｔ（酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコード）、ｆｕｓ（クラゲ緑色蛍光蛋白をコード）、およびｌｕｘ（酵素ホタルルシフェラ−ゼをコード）等が挙げられる。植物は内在性ｌａｃＺを含むので、一般的にはこれは植物にとり有用なレポーター遺伝子ではない。植物において広く用いられているレポーター遺伝子はｕｉｄＡ、または酵素β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｇｕｓＡ遺伝子である（Kertbundit et al., 1991）。この酵素は発色性（色を発生する）基質Ｘ−ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル）を開裂して不溶性の青色を植物細胞中に生じさせ、ＧＵＳ活性の存在を示す。植物細胞自体はＧＵＳ活性を有していないので、Ｘ−ｇｌｕｃで染色した場合の特定の細胞中の青色の生成は、特定細胞中のｇｕｓＡ−クメラ遺伝子の転写をドライブするプロモーターの活性を示すものである。かかるレポーター遺伝子を担持する植物は、原理的には、土壌汚染の検出に有用であるが、かかる使用は記載されたことがない。このことに対する可能な説明は、レポーター系は、通常、多数の試料の取得ならびに洗練された装置を用いる熟練者による分析および高価な化学薬品の使用を必要とするということである。それゆえ、土壌汚染のモニタリングに関する実際的な目的は、伝統的なレポーター系では達成できない。
【００１３】
レメディエーション
土壌汚染を取り扱う際のもう１つの必要事項は汚染を取り除く能力である。これは、通常には、汚染された土壌を単に取り除くことにより、あるいは汚染物質を化学的分解または生物学的分解することにより土壌をレメディエーションすることにより達成される。
【００１４】
重金属のごとき無機汚染物質を取り扱う際には金属の物理的除去が必要とされる。なぜならこれらの金属の大部分は土壌中で分解されないからである。それゆえ、現在かかる部位の汚染除去に用いられている実際的な方法は、表面の土を掘って他の場所に輸送し、埋め戻すことである。さらに、多くの土壌レメディエーション法が市場に出回っているが、重金属のレメディエーションに利用できるものはわずかである。より普通のレメディエーション法のいくつかは、埋め立て処分、化学的または物理的固定および廃棄、エレクトロ−レクラメーション（Electro-reclamation）、生物ベント、および土壌洗浄である。
【００１５】
フィトレメディエーション（phytoremediation）は、重金属、微量元素、有機化合物および放射性化合物のごとき環境汚染物質を、植物を用いて除去、含有あるいは無害化させるものである。このローテクで安価なクリーンアップ法は、汚染された土壌、地下水、および排水に適用可能である。慣用的なレメディエーション法と比較すると、フィトレメディエーションは安価、簡便で、環境にやさしいものである。伝統的な工学的方法を用いることにより金属汚染された場所をクリーンアップするには莫大な費用が必要である。さらにそのうえ、伝統的な方法は土壌構造を破壊し、生物学的に不活性にする。土壌の重金属汚染除去に緑色植物を用いることはフィトレメディエーションとして知られており、ｉｎ  ｓｉｔｕで、安価かつ環境を維持できるという利益を提供する新しい方法である。フィトレメディエーションのもう１つの利点は、汚染土壌を除去し、それをゴミで置き換えるかわりに、その場所を混乱させることなくクリーンアップを行うということである。植物組織に重金属が蓄積した後は、枝を集めて焼却することができる。経済的に可能であれば、灰に含まれる金属をリサイクルすることができる。さもなくば、灰を適当な埋め土中に処分する。フィトレメディエーションに関連する費用は、土の密度、汚染地域、輸送および埋め立て費用を包含する多くの因子に依存する。農業のプラクティスに普通に用いられる設備と同じ設備をフィトレメディエーションに用いる。いくつかの場合には、フィトレメディエーションの費用は植物収穫のローカルコストと同じである。フィトレメディエーションは大量の土壌を除去する必要もない。実際、植物には土壌除去の必要はない。このことは、抽出法では例えば１０エーカーの土地につき３００００トンの廃棄が行われるところを、５％未満あるいは１４００トンにまで廃棄を減らす。これは抽出法と比較すると著しい節約である。例えば１０エーカーの土地は伝統的な抽出法では３５０万ドルないし４５０万ドルがかかるが、フィトレメディエーションではわずか１００万ドルないし１２０万ドルしかかからない。典型的には、これらの節約は慣用的方法のコストの約７５ないし８５％にのぼる。経済的利益のほかに、フィトレメディエーションは、土壌が除去されず、金属が植物により環境浄化されるので、伝統的方法よりも環境破壊が少ない。フィトレメディエーションにより取り扱われる他の問題は廃水処理プラントである。廃水処理プラントは、重金属を包含する種々の毒性汚染物質が衛生に関する排水中に存在する可能性があるので、問題がある。これらの重金属は生物学的処理により分解されず、無害化もされないので、それらは受水湖や海に放出されてしまう。
【００１６】
植物による金属の取り込みに関してはかなり長い間知られているが、この知識の植物によりるレメディエーションへの適用は比較的新しい。
【００１７】
Rughら(1996)は、通常には雑草とみなされている植物に細菌遺伝子を挿入する遺伝子操作を用いて水銀のごとき金属毒性の除去を促進しうる植物を開発した。
【００１８】
ＷＯ９９２２８８５は、Pelargonium属の植物を用いて、その根および茎に金属イオンを著量蓄積させることを特徴とする、金属イオンで汚染された土壌をレメディエーションする方法に関するものである。この開示は、金属取り込み能を促進する遺伝子配列、例えば組み換えメタロチオネイン遺伝子またはフィトケラチン遺伝子あるいはこれらの遺伝子の生物学的に機能のある同等物を用いて形質転換されたPelargonium種の使用につき述べている。
【００１９】
現在、バイオレメディエーションは、街の下水管理、漏れた油のクリーンアップ、地下埋蔵物により汚染された地下水のレメディエーション、産業廃水の処理、そして種々の有害な部分の環境浄化に用いられている。
【００２０】
バイオレメディエーションの例は、農地の肥沃化に用いられる下水汚泥である（Hesselsoe et al. 2001）。遺伝子操作により微生物酵素活性を植物に導入することが可能となった。この例は、最も広く使用されている除草剤グリホサート（Glyphosate）およびラウンドアップ（Roundup）である。グリホサートは、微生物および植物における芳香族アミノ酸生合成経路の重要酵素である５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を阻害する。誘導可能な防御の造作に関連する相互作用と比較すると、適合しない植物における宿主遺伝子発現パターン：微生物病原体相互作用には著しい相違がある。トランスジェニック植物におけるキチナーゼまたはリボソーム不活性化蛋白をコードする遺伝子の構成的な発現は、真菌の攻撃に対する部分的な防御を与える（Lamb et al. 1992）。２種の細菌の抗生物質耐性遺伝子（１つはＴｎ９０３からのネオマイシンホスショトランスフェラーゼ（ＮＰＴ  Ｉ）をコードするもの、もう１つはＴｎ９からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするもの）が植物の選択可能マーカーとして用いられた。いずれの遺伝子も新しい植物発現ベクターに入れられてNicotiana tabacumのゲノムに導入された（Pietrzak et al. 1986）。
【００２１】
しかしながら、無機または有機汚染物質に対してフィトレメディエーションを適用する場合の必要事項は、通常には、汚染された場所を知ること、および伝統的な方法を適用することによりレメディエーションプロセスをモニターすることである。植物による検出およびフィトレメディエーションの組み合わせ系を適用することにより、汚染場所およびバイオレメディエーションを１工程で確認することができる。かかる組み合わせ系は以前には記載されていなかった。
【００２２】
上記観点から、本発明の目的は、土壌に存在する汚染形態のような分析対象を検出するために植物に適用されうるレポーター系を提供することであり、該レポーター系は：
・特異的かつ高感度
・研究室の設備または研究室の人員に対して何も必要とせず直接モニター可能
・野外で適用可能で、それゆえ広い領域でモニター可能でありサンプリングの問題が回避される
・比較的費用がかからない。
【００２３】
発明の概要
本発明は、外部刺激の存在下で植物において直接モニター可能な表現型の特徴を生じさせることのできるレポーター系を提供し、該レポーター系は、該外部刺激の存在下で該直接モニター可能な表現型の特徴の発生に関与する生成物をコードする遺伝子を含む。さらに本発明は、植物における直接モニター可能な表現型の特徴が該遺伝子の変化した発現の結果である、レポーター系を提供する。
【００２４】
本発明の１の態様によれば、外部刺激は植物が成長している土壌に存在する汚染物質である。
【００２５】
本発明のもう１つの態様によれば、レポーター系はさらに土壌のバイオレメディエーション系を含む。
【００２６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明のレポーター系を担持する植物が提供される。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、下記工程を含む生物による検出方法が提供される：
・本発明の植物由来の種子を撒き、
・生じた植物の表現型をモニターし、そして所望により
・植物が汚染物質を蓄積する場合には、植物を除去することにより土壌を生物によりレメディエーションする。
【００２８】
本発明もう１つの態様において、汚染物質の検出および所望によりバイオレメディエーションのための本発明の植物の使用が提供される。
【００２９】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００３０】
発明に関する詳細な説明
本発明は、新規なタイプの植物用レポーター系を提供する。該レポーターの必須成分は、天然の植物ゲノムの一部でない遺伝子、すなわち、異なる起源の遺伝子、あるいはコーディング配列、コピー数、ゲノムでの位置または発現が、天然に見出される当該植物とは異なっている植物のゲノムに由来する遺伝子であって、外部刺激の存在下で表現型の特徴の発生に関与する生成物をコードする遺伝子である。該表現型の特徴を直接モニターできること、すなわち、サンプリングおよび複雑な研究室での分析を行うことなく野外でモニターできることが必須の特徴である。本発明により提供されるレポーター系は、原理的には、例えば動物、例えば昆虫、微生物、例えば細菌、または真菌などの植物以外の生物にも適用可能である。
【００３１】
本発明のレポーター系は、２つの主要な機構により外部刺激の存在の結果としての表現型の特徴を生じさせるものであってもよい。
【００３２】
第１の可能性は、外部刺激がレポーター系に由来する特徴と相互作用することである。このレポーター系に由来する特徴は、外部刺激が存在しない場合に現れるものであってもよく、その場合、表現型の特徴は生じない。この例は、例えば、外部刺激が存在する場合に、例えば異なる色の植物を生じさせる遺伝子産物をコードする、構成的に発現される遺伝子を含む本発明のレポーター系である。
【００３３】
第２の可能性は、外部刺激が、外部刺激の存在下で該遺伝子の発現の変化の結果としての表現型の特徴を生じさせることである。表現型の特徴は該変化した遺伝子発現の結果として生じる。変化した遺伝子発現は、変化した転写または翻訳活性の結果であってもよく、また、変化したｍＲＮＡまたは遺伝子産物の安定性／半減期の結果であってもよく、１またはそれ以上のステップを含みうる。この例は、外部刺激の存在下でのみ活性があるプロモーターにより転写が調節される遺伝子を含む本発明のレポーター系であり、該遺伝子は例えば異なる植物の色を生じさせる遺伝子産物をコードする。
【００３４】
表現型の特徴を生じさせる機構にかかわらず、外部刺激は、その影響を直接及ぼすもの、すなわち分析対象自体に関連するものであってもよく、あるいはその影響を間接的に及ぼすもの、例えば形態や濃度が分析対象の存在に依存する分析対象の分解産物または他の物質の分解産物に関連するものであってもよい。
【００３５】
上記の例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の要旨から逸脱することなく異なる機構に基づいて多くの個々のレポーター系を開発することが可能であることは、当業者に明らかである。結果として、かかるレポーター系は本発明の範囲内のものである。
【００３６】
本発明の好ましい具体例において、異なる色の形態である直接モニターできる表現型の特徴を生じさせうるレポーター系が開発され、それは、該レポーター系を担持する植物の視覚による検査を可能にするものであり、さらに重金属または爆薬由来のニトロ含有化合物（これらに限らない）のごとき特定の刺激により誘導されるプロモーターを含むものであった。この特定の好ましい具体例において、植物の異なる色と該誘導可能プロモーターとの組み合わせにより、重金属汚染または爆発物の存在に関して広い範囲の土壌をスクリーニングすることが可能となる。
【００３７】
本発明は、現行の方法とは逆に、研究室でのアッセイなしに分析対象の検出を容易ならしめる。該系の主な利益は、サンプリングが必要なく、慣用的試験方法に必要な研究室の施設を用いることなく離れたエリアにおいても試験が行えることである。さらに該系は、検出可能なシグナルを得るために、ルシフェリンやＸ−ｇｌｕｃのごとき高価な基質を用いる必要もない。かくして、本発明は、現在用いられているレポーター系に代わる費用が高くつかない別系を提供する。
【００３８】
外部刺激の存在下で植物において直接モニター可能な表現型の特徴を生じさせることのできるレポーター系を提供することが本発明の１の態様であり、該レポーター系は、該外部刺激の存在に応答して該直接モニター可能な表現型の特徴の発生に関与する産物をコードする遺伝子を含む。
【００３９】
本明細書および特許請求の範囲の用語「レポーター系」は、刺激をモニターあるいは測定可能な別の特徴に変換しうる系を意味するものと解される。
【００４０】
本明細書および特許請求の範囲の用語「直接モニター可能な表現型の特徴」は、サンプリングすることなくモニターされうる物理的または化学的性質を意味するものと解される。かかる表現型は、例えば、生存可能性、成長速度、サイズ、形態、色、色のパターン、においおよび味を包含する。
【００４１】
本明細書および特許請求の範囲の用語「外部刺激」は、植物に影響する、外部で生じる化学的または物理的性質の刺激を意味するものと解される。
【００４２】
本発明のさらなる態様において、該直接モニター可能な表現型の特徴は、外部刺激の存在に応答した該遺伝子の変化した発現の結果である。該変化した遺伝子発現は、外部刺激の存在に応答したセンサー系により引き起こされる。
【００４３】
本明細書および特許請求の範囲の用語「センサー系」は、外部刺激の存在下で該遺伝子の変化した発現を１またはそれ以上の工程で引き起こす１またはそれ以上の成分を含む系を意味する。かかる系は、プロモーター、調節エレメント、エンハンサー、調節蛋白、アンチセンス−ＲＮＡ、輸送および受容体蛋白およびシグナルトランスダクション系の他の部分、ならびにｐＨ等のような物理化学的条件のごとき多くのセンサーおよび調節成分を含む。センサー系はかかる成分の１つまたはいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。
【００４４】
本発明の好ましい具体例において、センサー系は調節エレメントを含む。本発明のさらに好ましい具体例において、調節エレメントは配列ＴＧＣＡＣＣＣ、ＴＧＣＡＣＧＣ、ＴＧＣＡＣＡＣまたはＴＧＣＧＣＡＣ（Scudiero et al. 2001）を有する金属応答エレメント（ＭＲＥ）を含む。
【００４５】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、センサー系はプロモーターを含み、該プロモーターの活性は外部刺激の存在により影響される。本発明のさらに好ましい具体例において、該プロモーターは遺伝子に作動可能に連結される。本発明の最も好ましい具体例において、プロモーターはArabidopsis thalianaのガンマ−グルタミルシステインシンセターゼ（Ｘ８０３７７、Ｘ８１９７３およびＸ８４０９７）、Arabidopsis thalianaのフィトケラチンシンターゼ（ＰＣＳ１、ＡＦ０９３７５３）、Arabidopsis thalianaのＩＲＴ１およびＩＲＴ２金属トランスポーター（Ｕ２７５９０およびＴ０４３２４）、Arabidopsis thalianaのＡｔＰＣＳ１およびＡｔＰＣＳ２（Ｗ４３４３９およびＡＣ００３０２７）、ダイズマメのフェリチン（Ｍ６４３３７およびＭ５８３３６）からなる群より選択される。
【００４６】
本発明の要旨から逸脱することなく、表現型の特徴が１つよりも多い遺伝子の変化した発現の結果である、本発明の植物用のレポーター系を開発することが可能であることは、当業者に明らかであろう。したがって、かかるレポーター系は本発明の範囲内である。
【００４７】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、遺伝子（複数も可）は植物の可視的な色の変化に関与するものである。本発明のより好ましい具体例において、遺伝子（複数も可）はフェニルプロパノイド代謝、色素生合成、フラボノイド生合成またはアントシアニン生合成に関与するものである。本発明の最も好ましい具体例において、遺伝子はカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）またはジヒドロフラボノールレダクターゼ（ＤＦＲ）である。
【００４８】
上の段落および請求項９〜１３の用語「関与する遺伝子」は、対応する代謝経路の構造遺伝子ならびに該経路の調節に関与する遺伝子の両方を含む。
【００４９】
本明細書および特許請求の範囲において、例えばＣＨＳのごとき多くの特定の遺伝子、例えばｔｔ４のごとき対応変異体ならびにＰＡＰ１およびＰＡＰ２のごとき転写因子が言及される。この語法はArabidopsis thalianaにおいて用いられているものである。類似または同じ生物学的機能を有する蛋白をコードする同等の遺伝子、対応変異体および転写因子は、このなる名称にて他の植物種に見出されうる。当業者が本発明の要旨および範囲から逸脱することなく、これらの成分に基づいてレポーター系を開発しうることは明らかである。
【００５０】
植物用レポーター系に関する本発明のさらなる態様において、内在性遺伝子（複数も可）の機能的コピーが無機能化される。本発明によれば、実際のレポーター系の性質に依存して、異なる表現型の発生を妨害しうる内在遺伝子の産物の活性を除去または低下させることが必要または遊離であるかもしれない。例えば、実際のレポーター系は、必須でない植物遺伝子のコーディング配列および異なる起源のプロモーターを含むキメラ遺伝子に基づくものであり、分析対象の存在下においてより異なった表現型を得るために内在性植物遺伝子を無機能化させてもよい。当業者に知られた多くの方法により遺伝子を無機能化させることができ（Sambrook et al. 1989）、形質転換または交雑によりかかる遺伝子を植物に導入することができる。
【００５１】
したがって、本発明の好ましい具体例において、植物用レポーター系はさらに色素生成に関与する遺伝子の変異を含む。本発明のより好ましい具体例において、植物用レポーター系は、テトラヒドロキシカルコン生成／カルコン合成に関与する、あるいは２Ｓ−フラバノン、ナリンゲニンおよびリグクリチゲニン（ligquritigenin）の生成に関与する遺伝子の変異を含む。本発明の最も好ましい具体例において、植物用レポーター系はさらにＣＨＩ遺伝子の変異（ｔｔ５変異体）またはＣＨＳ遺伝子の変異（ｔｔ４変異体）を含む。
【００５２】
植物用レポーター系に関する本発明のさらなる態様において、さらに転写因子の発現が変化させられる。転写因子は転写調節に関与する蛋白である。これらを変化させることにより、本発明のレポーター系を最適化して、より異なった表現型の特徴を得ることが可能となりうる。例えば、経路を正に調節する転写因子が過剰発現され、該経路の酵素の１つをコードする遺伝子に基づくレポーター系がヌル変異体中に存在すると、外部刺激の存在下におけるそのレポーター遺伝子の発現は、該転写因子の過剰発現によって、より多くの最終生成物を生じさせ、その結果、より異なった表現型を生じさせる可能性がある。例は、正に調節され、アントシアニンの生成に向けられるフラボノイド生合成に関与する遺伝子の転写である。該系は、アントシアニン生合成がブロックされているためそれらを産生しないヌルバックグラウンドｔｔ４およびｔｔ５変異体中において開発される。
【００５３】
変異体の相補、すなわち特異的に調節されたプロモーターおよび／または調節エレメントの調節下においてＣＨＳおよび／またはＣＨＩ遺伝子の挿入により、アントシアニン生成が制御され、該プロモーターを誘導する特異的な刺激の結果として可視的な表現型が出現する。
【００５４】
本発明の好ましい具体例において、植物用レポーター系はさらにＭｙｂドメインを含む転写因子の変化した発現を含む。本発明のより好ましい具体例において、植物用レポーター系はさらに転写因子ＰＡＰ１および／またはＰＡＰ２の変化した発現を含む。本発明のさらに好ましい具体例において、植物用レポーター系は転写因子の過剰発現も含む。本発明の最も好ましい具体例において、植物用レポーター系はさらに転写因子ＰＡＰ１および／またはＰＡＰ２の過剰発現を含む。
【００５５】
転写因子の発現を変化させる際に、様々なプロモーターを選択できる。例えば３５Ｓプロモーターまたはデュアルプロモーター（Velten & Schell 1985）のごとき強力かつ構成的に発現されるプロモーターは、転写因子を過剰発現させたい場合によく選択されるが、構成的発現が不利であることが分かる場合には、外部刺激に応答する誘導可能プロモーターが有利であることがわかる。
【００５６】
したがって、本発明の好ましい具体例において、植物用レポーター系は、誘導可能なプロモーターにより制御される転写因子の過剰発現を含む。
【００５７】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、植物用レポーター系は、構成的プロモーターにより制御される転写因子の過剰発現を含む。
【００５８】
本発明のより好ましい具体例において、植物用レポーター系は、３５Ｓプロモーターにより制御される転写因子の過剰発現を含む。本発明のさらに好ましい具体例において、植物用レポーター系は、デュアルプロモーターにより制御される転写因子の過剰発現を含む。
【００５９】
原理的には、外部刺激は、本発明のレポーター系を担持している植物に接触する空気中、水中または土壌中に存在するものであってよい。本発明のレポーター系の適用目的は、例えば汚染物質のごとき有害物質、あるいは貴重な金属のごとき有益でありうる物質の位置および可能には濃度を確認し、同定するためのものであってもよい。
【００６０】
したがって、本発明の好ましい具体例において、植物用レポーター系は、無機汚染物質の存在下で発現が変化する１またはそれ以上の遺伝子を含む。本発明のより好ましい具体例において、植物用レポーター系は、重金属の存在下で発現が変化する１またはそれ以上の遺伝子を含む。本発明の最も好ましい具体例において、植物用レポーター系は、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｓｅ、Ａｕ、Ａｇからなる群に属する重金属の存在下で発現が変化する１またはそれ以上の遺伝子を含む。
【００６１】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、植物用レポーター系は、有機汚染物質の存在下で発現が変化する１またはそれ以上の遺伝子を含む。本発明のより好ましい具体例において、植物用レポーター系は、窒素含有有機化合物の存在下で発現が変化する１またはそれ以上の遺伝子を含む。本発明のさらに好ましい具体例において、窒素含有化合物はＮＯ２、ＮＯ３、ＮＨ２またはＮＨ３を含む。本発明のさらに好ましい具体例において、植物用レポーター系は、爆薬の一部であった窒素含有化合物の存在下で発現が変化する１またはそれ以上の遺伝子を含む。本発明の最も好ましい具体例において、植物用レポーター系は、爆薬の一部であった窒素含有化合物の存在下で発現が変化する１またはそれ以上の遺伝子を含む。
【００６２】
本明細書および特許請求の範囲の用語「汚染」、「土壌汚染」または「汚染された土壌」は、一定の地理的エリアについて正常とみなされるべき含量よりも多い土壌中の無機または有機化合物の含量を意味するものと解される。有害とみなされうる化合物に限らず、上記定義に含まれる場合には有用または貴重であるかもしれない化合物に関してもあてはまる。
【００６３】
遺伝子発現が汚染物質のごとき化合物の存在により変化される場合、相互作用は直接または間接的なものであってもよい。直接的な相互作用により、汚染物質は、土壌中に直接見出される形態で遺伝子発現に対して影響を及ぼす。間接的な相互作用により、汚染物質は、遺伝子発現に影響する二次刺激へと変換される。二次刺激は、汚染物質の分解産物、汚染物質またはその分解産物がその一部をなすもの、汚染物質またはその分解産物がその一部をなさない１またはそれ以上のもの（すなわち、分子、複合体または構造的特徴）であってもよく、あるいは物理的または化学的な遺伝子を取り巻く環境の変化であってもよい。汚染物質から二次刺激へのかかる変換は増幅工程を含むものであってもよく、そうでなくてもよい。一次刺激から二次刺激への変換は、植物中に通常見出される遺伝子によりコードされる遺伝子産物を必要とするものであってもよい。かかる遺伝子が機能的形態で植物に導入されると、それらは植物における該変換を容易化させうる。微生物起源の多くの遺伝子は、高等生物が変換できない化合物を変換する能力を有しており、これらは例えば一定範囲の物質の検出を容易にするために植物に導入されうる。
【００６４】
したがって、本発明の好ましい具体例において、植物用レポーター系は、汚染物質の存在下で発現が変化する１またはそれ以上の遺伝子を含み、該遺伝子（複数も可）の発現は汚染物質の存在により直接変化させられるものである。
【００６５】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、植物用レポーター系は、汚染物質の存在下において発現が変化する１またはそれ以上の遺伝子を含み、該遺伝子（複数も可）の発現は汚染物質の存在により間接的に変化するものである。本発明のさらに好ましい具体例において、汚染物質は１またはそれ以上の工程において二次因子に変換され、該二次因子は該遺伝子（複数も可）の発現を変化させる。本発明のより好ましい具体例において、汚染物質の二次因子への変換は、微生物の代謝酵素により容易化される。本発明の最も好ましい具体例において、微生物酵素は、汚染物質の還元およびＮＯ２基の遊離を可能にする「ＴＮＴレダターゼ」である。
【００６６】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、汚染物質の二次因子への変換は、刺激の増幅を容易化するカスケードを用いるものである。
【００６７】
本発明の好ましい具体例において、表現型の特徴はアッセイを行わずに評価されうる。本発明のより好ましい具体例において、表現型の特徴は視覚による検査により評価されうる。本発明の最も好ましい具体例において、表現型の特徴は色である。
【００６８】
本発明のさらなる態様において、植物用レポーター系はさらにバイオレメディエーション系を含む。バイオレメディエーション系は植物による汚染物質の分解を含んでいてもよく、その分解を容易化させる産物をコードする、例えば微生物起源の遺伝子を含んでいてもよい。バイオレメディエーション系は植物または植物の一部に汚染物質を蓄積させることを含んでいてもよく、そうすることにより、植物を除去することによりその除去が容易化される。この場合、例えば汚染物質が十分な値である場合には、その後汚染物質が植物から抽出されてもよい。
【００６９】
したがって、本発明の好ましい具体例において、バイオレメディエーション系は汚染物質の分解を含む。
【００７０】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、バイオレメディエーション系は汚染物質の蓄積を含み、かくしてその除去が容易化される。本発明のより好ましい具体例において、蓄積は重金属結合蛋白および／または金属輸送蛋白のうちの１つまたはそれらの組み合わせの発現により達成される。本発明の最も好ましい具体例において、重金属結合蛋白および／または金属輸送蛋白は下記群に属する遺伝子を含む：
【００７１】
フィトケラチンシンセターゼをコードするS.pombe 遺伝子 (gene bank 受託番号 Y08414)、フィトケラチンシンターゼに関するAthyrium yokoscense AyPCS1 mRNA (AB057412)、Arabidopsis thaliana の推定上のフィトケラチンシンターゼ (AY039951)、Arabidopsis thaliana のフィトケラチンシンターゼ (CAD1、AF135155)、Arabidopsis thaliana の推定上のメタロチオニン-I 遺伝子転写アクチベーター (AY04594)、Arabidopsis thaliana のフィトケラチンシンターゼ (PCS1、AF093753)、Arabidopsis thaliana のIRT1 および IRT2 金属トランスポーター (U27590 および T04324)、Arabidopsis thaliana のAtNramp1、2、3 および 4 金属トランスポーター (AF165125、AF141204、AF202539、および AF202540)、フィトケラチンシンターゼに関するBrassica juncea のmRNA (pcs1 遺伝子 AJ278627)、フィトケラチンシンセターゼ様蛋白に類似のEuphorbia esula のcDNA (BG459096)、Arabidopsis. thaliana の推定上のフィトケラチンシンセターゼに類似のLycopersicon esculentum (Tomato crown gal) l (BG130981)、Typha latifolia のフィトケラチンシンターゼ (AF308658)、Zea mays のフィトケラチンシンセターゼ様蛋白 (CISEZmG、AF160475)、Thalaspi caerulescens のZNT1 重金属トランスポーター (AF133267)。
【００７２】
重金属結合蛋白および／または金属輸送蛋白は、汚染物質を蓄積する所望能力が得られるように十分量の蛋白が発現されるかぎり、３５Ｓプロモーターのごとき構成的プロモーターあるいは汚染物質の存在に応答する誘導可能プロモーターのいずれにより発現されるものであってもよい。
【００７３】
本発明のさらなる態様において、本発明のレポーター系を担持する遺伝学的に修飾された植物が提供される。
【００７４】
本明細書および特許請求の範囲の用語「遺伝学的に修飾された植物」は、少なくとも部分的に遺伝子操作を用いることによる遺伝学的バックグラウンドを有する植物を意味するものと解される。かかる植物の子孫あるいはかかる植物を用いる交雑による子孫は、植物、種子、組織培養および単離組織ならびに細胞の形態で、遺伝子操作により初めに導入された修飾の少なくとも一部を担持するものも、この定義に包含される。
【００７５】
本発明の好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物は単子葉植物である。
【００７６】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物は双子葉植物である。
【００７７】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物は一年生植物である。
【００７８】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物は二年生植物である。
【００７９】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物は多年生植物である。
【００８０】
本発明の最も好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物は下記の種からなる群に属するものである：
Brassica napus、B. rapa、および B. junceaas、Brassica oleracea、Brassica napus、Brassica rapa、Raphanus sativus、Brassica juncea、Sinapis alba、Armoracia rusticana、Alliaria petiolata、Arabidopsis thaliana、A. griffithiana、A. lasiocarpa、A. petrea、Barbarea vulgaris、Berteroa incana、Brassica juncea、Brassica nigra、Brassica rapa、Bunias orientalis、Camelina alyssum、Camelina microcarpa、Camelina sativa、Capsella bursa-pastoris、Cardaria draba、Cardaria pubescens、Conringia orientalis、Descurainia incana、Descurainia pinnata、Descurainia sophia、Diplotaxis、uralis,Diplotaxis tenuifolia、Erucastrum gallicum、Erysimum asperum、Erysimum cheiranthoides、Erysimum hieracifolium、Erysimum inconspicuum、Hesperis matronalis、Lepidium campestre、Lepidium densiflorum、Lepidium perfoliatum、Lepidium virginicum、Nasturtium officinale、Neslia paniculata、Raphanus raphanistrum、Rorippa austriaca、Rorippa sylvestris、Sinapis alba、Sinapis arvensis、Sisymbrium altissimum、Sisymbrium loeselii、Sisymbrium officinale、Thlaspi arvense、および Turritis glabra。
【００８１】
本発明のさらなる態様において、分析対象の検出方法は提供され、該方法は下記工程を含む：
・本発明の遺伝学的に修飾された植物由来の種子を導入し、
・生じた植物の表現型をモニターし、そして
・所望により、フィトレメディエーション工程として植物に分析対象を分解させる、あるいは植物が分析対象を蓄積する場合には、フィトレメディエーション工程として植物を除去する。
【００８２】
手動または機械を用いる慣用的な撒種法により植物種子を導入することができる。本発明の好ましい具体例において、寒天または乾燥地域の農業において水を「制御して放出する道具」として頻繁に用いられる「ドライウォーター」のごとき固化物質中に種子を懸濁させる。このことは、水や栄養の供給を確実なものとし、種子を定位置に保持し均一に分散させることを助ける。
【００８３】
本発明の好ましい具体例において、上記方法により検出される分析対象は汚染物質である。
【００８４】
本発明のさらに好ましい具体例において、上記方法により検出される汚染物質は無機汚染物質である。
本発明のさらに好ましい具体例において、上記方法により検出される汚染物質は重金属である。
【００８５】
本発明の最も好ましい具体例において、上記方法により検出される汚染物質はＣｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｓｅ、Ａｕ、Ａｇからなる群から選択される重金属である。
【００８６】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、該方法は少なくとも０．０００２５ｍＭ、例えば０．０００５、例えば０．００１、例えば０．００１５、例えば０．００２、例えば０．００２５、例えば０．００３、例えば０．００４、例えば０．００５、例えば０．００６、例えば０．００７、例えば０．００８、例えば０．００９、例えば０．０１、例えば０．０２、例えば０．０３、例えば０．０４、例えば０．０５、例えば０．０６、例えば０．０７、例えば０．０８、例えば０．０９、例えば０．１、例えば０．２、例えば０．３、例えば０．４、例えば０．５、例えば０．６、例えば０．７、例えば０．８ｍＭ、例えば０．９、例えば１、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０ｍＭの濃度の重金属を検出できるものである。
【００８７】
本発明のさらに好ましい具体例において、上記方法により検出される汚染物質は有機汚染物質である。
【００８８】
本発明のさらに好ましい具体例において、上記方法により検出される汚染物質は窒素含有化合物である。
【００８９】
本発明の最も好ましい具体例において、汚染物質はＮＯ２、ＮＯ３、ＮＨ２またはＮＨ３を含む。
【００９０】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、該方法は少なくとも０．０００２５ｍＭ、例えば０．０００５、例えば０．００１、例えば０．００１５、例えば０．００２、例えば０．００２５、例えば０．００３、例えば０．００４、例えば０．００５、例えば０．００６、例えば０．００７、例えば０．００８、例えば０．００９、例えば０．０１、例えば０．０２、例えば０．０３、例えば０．０４、例えば０．０５、例えば０．０６、例えば０．０７、例えば０．０８、例えば０．０９、例えば０．１、例えば０．２、例えば０．３、例えば０．４、例えば０．５、例えば０．６、例えば０．７、例えば０．８ｍＭ、例えば０．９、例えば１、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０ｍＭの濃度の窒素含有化合物を検出できるものである。
【００９１】
本発明のさらなる態様において、分析対象を検出するための、そして所望によりバイオレメディエーションを行うための、本発明の遺伝学的に修飾された植物の使用が提供される。
【００９２】
好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物は本発明に従って用いられて汚染物質が検出される。
【００９３】
さらに好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物が本発明に従って用いられて無機汚染物質が検出される。
【００９４】
さらに好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物が本発明に従って用いられて重金属汚染物質が検出される。
【００９５】
最も好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物が本発明に従って用いられてＣｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｓｅ、Ａｕ、Ａｇからなる群に属する重金属が検出される。
【００９６】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、少なくとも０．０００２５ｍＭ、例えば０．０００５、例えば０．００１、例えば０．００１５、例えば０．００２、例えば０．００２５、例えば０．００３、例えば０．００４、例えば０．００５、例えば０．００６、例えば０．００７、例えば０．００８、例えば０．００９、例えば０．０１、例えば０．０２、例えば０．０３、例えば０．０４、例えば０．０５、例えば０．０６、例えば０．０７、例えば０．０８、例えば０．０９、例えば０．１、例えば０．２、例えば０．３、例えば０．４、例えば０．５、例えば０．６、例えば０．７、例えば０．８ｍＭ、例えば０．９、例えば１、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０ｍＭの濃度の重金属の検出に遺伝学的に修飾された植物が用いられる。
【００９７】
さらに好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物が本発明に従って用いられて有機汚染物質が検出される。
【００９８】
さらに好ましい具体例において、遺伝学的に修飾された植物が本発明に従って用いられて窒素含有化合物が検出される。
【００９９】
最も好ましい具体例において、少なくとも０．０００２５ｍＭ、例えば０．０００５、例えば０．００１、例えば０．００１５、例えば０．００２、例えば０．００２５、例えば０．００３、例えば０．００４、例えば０．００５、例えば０．００６、例えば０．００７、例えば０．００８、例えば０．００９、例えば０．０１、例えば０．０２、例えば０．０３、例えば０．０４、例えば０．０５、例えば０．０６、例えば０．０７、例えば０．０８、例えば０．０９、例えば０．１、例えば０．２、例えば０．３、例えば０．４、例えば０．５、例えば０．６、例えば０．７、例えば０．８ｍＭ、例えば０．９、例えば１、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０ｍＭの濃度の窒素含有化合物の検出に遺伝学的に修飾された植物が用いられる。
【０１００】
法律による環境基準により定められた限度にまで、汚染された土壌を生物によりレメディエーションすることを容易にする植物を提供することが、本発明の１の目的である。本発明の植物由来の種子を撒き、生じた植物を除去することにより、このことが達成されうる。１回または数回、植物を特定の場所で増殖させ、そこから除去することで、必要な最大レベルにまで汚染物質含量が減らされる。したがって、本発明の好ましい具体例において、植物は、必要な回数だけ汚染場所にて成長させられ、その後、除去されて、土壌中の汚染物質の濃度が所望の減少をする。
【０１０１】
本発明の好ましい具体例において、植物の使用により、植物１世代あたり少なくとも１０％、例えば２０％、例えば３０％、例えば４０％、例えば５０％、例えば６０％、例えば７０％、例えば８０％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９９％の汚染物質が除去されうる。
【０１０２】
本発明のもう１つの具体例において、収穫された植物バイオマスを処理して、重金属のごとき有用あるいは貴重な化合物を得ることができる。
【０１０３】
本発明の好ましい具体例は、重金属に汚染された土壌の検出である。これは、対象エリアからすでに存在している植生を除去することを必要とする。これは、カッターのごとき機械的手段あるいはラウンドアップ（グリホサート）のごとき除草剤との組み合わせにより行われうる。土壌から植生が除去されると、種子が撒かれる。これは、例えば種子ディスペンサーを用いて、あるいはゲル化剤中に懸濁した種子を撒くことにより行われて、種子が発芽し、地中に根を伸ばすまで種子の位置が確保される。土壌の質に応じてエリアに水および栄養が維持される。例えば種子発芽から５週間後に視覚により検査を行い、赤色を示した植物が生えているエリアを調べてもよい。汚染の程度を確かめる慣用的な方法により、これらの場所からの土壌試料を分析することができる。
【０１０４】
本発明のもう１つの好ましい具体例において、汚染がレメディエーションを行うべき限界をちょうど超えた時点で、植物が色の変化を示す。このことにより、他のヒトの活動を行う前に土壌のレメディエーションを行う必要性を示すものとして植物の色合いを直接用いることができる。
【０１０５】
本発明の最も好ましい具体例において、植物において観察される色の変化に、金属結合蛋白および／または金属トランスポーターの存在に基づく汚染物質の摂取が伴う。地上の植物に一部において重金属が最大濃度になった時、その植物バイオマスが収穫され、さらなる処理のために集められる。１の好ましい処理において、植物材料が集められ、安全な埋め土の上に置かれる。より好ましい具体例において、植物材料が焼却して灰にされ、煙から汚染物質が集められる。このようにして、埋め土の上に置かれるべき材料の体積を減らすことができる。本発明の最も好ましい具体例において、バイオリアクター中で植物材料が発酵され、スラッジが電解処理されて有用な金属が回収される。
【０１０６】
本発明のもう１つの具体例において、潜在的に貴重な金属を含むエリアに種子が撒かれる。赤色植物が生えたエリアは潜在的に金属採鉱場所であり、この目的に用いられる植物の色の変化は、理想的には、有益な抽出が可能なほど金属濃度が十分である場合に生じるものでなくてはならない。
【０１０７】
もう１つの具体例において、閉じた領域に種子が撒かれ、排水が与えられる。排水が重金属を含む場合、植物は色を変え、水中の重金属濃度を減少させる工程が開始される。最も好ましい具体例において、排水を植物の生えた領域を通過させることにより濾過する。この作業に用いられる植物は、その植物の最大摂取量のわずかに下で色を変化させるものでなくてはならず、そのことにより、植物が飽和限界に達したことが示され、汚染された水をさらに流入させても、もはや植物によりレメディエーションされないことが示される。
【０１０８】
本発明の１の具体例において、人の住む地域の爆薬の存在を検出する。爆薬をモニターし除去すべきエリアに存在している植生を除去する。慣用的方法は２５ｍ ｘ ２５ｍの四角を形成するための機械的ビーカル（viecals）を用いる。周囲はからざお（すなわち、重く外装されたビヒクル）により敷設され、その後、約１２．５ｍの長いアーム上に固定されたカッターによりすべての植生が除去される。地中の地雷に当たった場合、典型的にはアームおよびカッターはダメージを受け、交換されうる。さらに、除草剤を用いて植生エリアをきれいにしてもよい。本発明のこの具体例において、除草剤、着色料およびゲル化剤の懸濁液に種子入れて撒いてもよい。除草剤を用いて望ましくない植生の抑制を維持する。赤および緑の両方からの色の相違を付加して、視覚による検査によりすべてのオープンエリアに種子が撒かれることを容易にコントロールしてもよい。種子が分散されて
土壌全体をカバーするように種子を置くためにゲル化剤を含ませてもよい。例えば５週間後に、２５ｘ２５メートルの四角を検査し、四角中に赤色植物が確認された場合には、この特定の四角は慣用的な地雷除去方法により地雷除去されなくてはならない。通常には、この具体例はＡＲ（エリアリダクション、area reduction）と呼ばれる。本発明のもう１つの具体例において、植物をＡＱＩ（エリアクオリティーインシュアランス、area quality insurance）に用いる。ＡＱＩにおいて、慣用的方法によりすでにきれいにされているエリアを再スクリーニングして、１回目で見落とされた地雷がないことを確認する。本発明のもう１つの具体例において、弾薬工場／弾薬置き場あるいはミネラルマイニングピット（mineral mining pits）のごとき爆薬で汚染された土壌をモニターする。この具体例において、潜在的に汚染されたエリアの植生が除去され、種子が撒かれる。例えば５週間後に、その場所を赤色植物に関して検査する。赤色植物の下の土壌を除去し、汚染除去処理をすることができる。
【０１０９】
以下のパラグラフにおいて本発明をさらに詳細に説明する。適用される材料および方法ならびに実施例は例示説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の要旨または範囲から逸脱することなく他の実験的手順を開発しあるいは適用しうることは、当業者に明らかであろうし、これらは結局本発明に包含されるものである。
【０１１０】
実施例
方法および材料
構築物を得る分子に関する操作に用いた基本的方法はSambrook et al. 1989に記載されたもの、および下記プロトコルであった。
【０１１１】
ＰＣＲ（ロングレンジ）
すべてのロングレンジＰＣＲを下記スキームに従って１００μｌの反応混合物としてセットアップした。試薬はPERKIN ELMER (GeneAmp XL PCR kit # No.808-0192 )から、ヌクレオチドはPharmacia Biotecから得た。ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰはすべて１００ｍＭのストック濃度とし、使用前にミリＱ水で希釈した。Eppendorf mastercycler 5330にて反応を行った。
【表１】
2005534292.tif 000002
【０１１２】
ワックス上層の融解
１）８０℃  ５分
２）２５℃  ５分
３）終了
【０１１３】
標準ロングレンジプログラム
１）９４℃  １分
２）１６回ループ
３）９４℃  ３０秒
４）６８℃  １０分
５）工程２の次へ
６）１４回ループ
７）９４℃  ３０秒
８）６８℃  １０分＋（１５秒伸長）
９）工程６の次へ
１０）７２℃  １０分
１１）６℃で３０秒ひたす
１２）終了
【０１１４】
ＰＣＲ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）
下記スキームに従ってすべてのＴａｑ  ＰＣＲ反応を１００μｌの反応混合物としてセットアップした。ＴａｑはGibcoBRL life technologiesのカタログ番号18038-026であり、ヌクレオチドはPharmacia Biotecから得た。ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰはすべて１００ｍＭのストック濃度とし、使用前にミリＱ水で希釈した。Eppendorf mastercycler 5330にて反応を行った。
【表２】
2005534292.tif 000003
【０１１５】
プラスミドＤＮＡＰＣＲのためのＴａｑ標準プログラム：６０℃
１）９５℃  ３分
２）キー（key）待機ホールド（Ｔａｑ添加）
３）３０ループ
４）９４℃  １分
５）６０℃  ２分（プライマーおよび鋳型に応じて５０−６０℃に調節可能）
６）７２℃  １分
７）工程４の次へ
８）６℃  ３０秒
【０１１６】
細菌の操作
Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞（ハナハン法）
１）細菌を新鮮プレート上に画線し一晩置く
２）５〜６個の新鮮コロニーを拾い、１ｍｌのＳＯＢを入れたエッペンドルフチューブに添加する
３）１ｍｌを用いて１リットルのフラスコ中の１００ｍｌのＳＯＢに接種する。３７℃で２〜３時間増殖させてＯＤ５９５＝０．２とする（低い密度が重要）
４）４本の５０ｍｌのディスポーザルチューブに集め、４℃で１５分間、２５００ｒｐｍで遠心分離する。上清をデカンテーションし、チューブを倒立させて過剰の液体を流し出す。８ｍｌのＲＦ１／チューブにペレットを再懸濁する（１／３体積）
５）細胞を氷上に１５分置く
６）４℃、２５００ｒｐｍで細胞を集める
７）上清をデカンテーションし、倒立させて液体を出す。１ｍｌのＲＦ２／チューブに再懸濁する（１／２５体積）。氷上に１５分置く
８）４０本のエッペンドルフチューブを前もって冷却する（−８０℃）。４０μｌの細胞を各チューブに入れ、液体窒素中で急速冷凍する。−８０℃で保存する。
【０１１７】
ＳＯＢ培地５００ｍｌ
１０ｇ  バクトトリプトン
２．５ｇ  酵母エキス
２９２ｍｇ  ＮａＣｌ
０．９ｇ  ＫＣｌ
オートクレーブ後、５ｍｌのフィルター滅菌した（０．２２μｍフィルターにて）１Ｍ  ＭｇＣｌ２および５ｍｌの１Ｍ  ＭｇＳＯ４（フィルター滅菌）を添加し、ともに最終濃度１０ｍＭとする。
【０１１８】
ＲＦ１  １００ｍｌ
１．２ｇ  ＲｂＣｌ
０．９９ｇ  ＭｎＣｌ−４Ｈ２Ｏ
３ｍｌの１Ｍ  ＫＯＡｃ，ｐＨ＝７．５（ＮａＯＨで調節）
０．１５ｇ  ＣａＣｌ−２Ｈ２Ｏ
１５ｇ  グリセロール
フィルター滅菌した（０．２２μｍフィルターにて）０．２Ｍ  ＯＡｃにてｐＨを５．８に調節する。
【０１１９】
ＲＦ２  ５０ｍｌ
６０ｍｇ  ＲｂＣｌ
１ｍｌの０．５Ｍ  ＭＯＰＳ，ｐＨ＝６．８（ＮａＯＨで調節）
０．５５ｇ  ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ
７．５ｇ  グリセロール
フィルター滅菌した（０．２２μｍフィルターにて）０．２Ｍ  ＮａＯＨにてｐＨを６．８に調節する。
【０１２０】
Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換
１）コンピテント細胞（−７０℃で保存）を氷上で融解し、倒立させて混合する
２）氷上の１３ｍｌのチューブ中のＤＮＡ試料に１５０μｌの細胞を添加する
３）時々混合しながら氷上で２５分インキュベーションする
４）３７℃で５分の熱ショック
５）氷上で５分インキュベーション
６）１ｍｌの抗生物質不含ＬＢを添加し、３７℃で１時間振盪する
７）３０分遠心分離し、吸引して２００μｌとし、１００μｌをプレートし、残りを４℃で保存する
青／白スクリーニング用にＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌをプレートに広げてから形質転換を開始する。
２００μｌ  １００ｍＭ  ＩＰＴＧ（８．３ｍｌのＨ２Ｏに０．２ｇ，０．２２μｍフィルターで滅菌）
６２．５μｌ  ４％ Ｘ−Ｇａｌ（１０ｍｌのＤＭＦに０．４ｇ，０．２２μｍフィルターで滅菌）
両方とも−２０℃で保存，少量に分けて保存するのが最良。使用するまで混合しない。
陽性対象には１０ｎｇのスーパーコイル状プラスミドを用いる。
【０１２１】
ミニプレプ−アルカリ融解
１）エッペンドルフチューブで１．５ｍｌを一晩培養し、１分間遠心分離し、上清を吸引する
２）１００μｌのミニプレプ溶液１ＭＰＳ１中で、室温にてボルテックスにより５分間再懸濁する。
３）２００μｌのＭＰＳ２を添加し、チューブを素早く３回倒立させ、氷上で５分間インキュベーションする
４）１５０μｌのＭＰＳ３を添加し、チューブを倒立させてボルテックスで１０分間処理し、氷上で５分間インキュベーションする
５）室温で５分間遠心分離する
６）エッペンドルフチューブに移す−７ａ）配列決定用
７）ＰＣＨＣｌ３抽出
８）室温で２分間遠心分離
９）エッペンドルフチューブに移す
１０）９００μｌのＥｔＯＨを添加する
１１）室温で２分間インキュベーション
１２）室温で５分間遠心分離
１３）吸引
１４）７０％ ＥｔＯＨで洗浄および遠心分離
１５）吸引、ｓｐｅｅｄｖａｃ
１６）５０μｌのＴＥに再懸濁、消化用に２本用いる
７ａ）９００μｌのＥｔＯＨを添加
８ａ）室温で５分間遠心分離
９ａ）吸引
１０ａ）１ｍｌの７０％ ＥｔＯＨを添加、遠心分離
１１ａ）吸引、２００ｍｌのＴＥ，２ｍｇ ＲＮＡｓｅＡに再懸濁、３７℃で１５分インキュベーション
１２ａ）フェノール／ＣＨＣｌ３抽出、２０ｍｌの３Ｍ ＮａＯＡｃを添加、ＥｔＯＨ沈殿し、７０％ＥｔＯＨで洗浄
１３ａ）３０ｍｌのＴＥに再懸濁
１４ａ）変性のためのセクエナーゼプロトコル参照
１６）５０μｌのＴＥに再懸濁
溶液：
2005534292.tif 000004
【０１２２】
１４ｇ／ｌのＤｉｆｃｏバクトアガーを添加した固体培地用ＬＢ液
１）２２ｇ／ｌ  Ｌａｉｎｅｒブロス  ＧｉｂｃｏＢＲＬ
２）ｍｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏを添加して１の濃度とする
３）オートクレーブ（１２０℃  ２０分）
４）使用直前に抗生物質を添加（培地は室温）
５）（ＬＢプレート用に１５ｇ／ｌのＤｉｆｃｏバクトアガーを添加）
すべての構築物をエレクトロポレーションによるアグロバクテリウムに移した。
【０１２３】
アグロバクテリウムコンピテント細胞
１）２ｍｌのＹＥＰ＋抗生物質につまようじで植菌し、振盪器を用いて２８℃で一晩増殖させる  ＡＢＩ−５０ＫＡＮ＆２５Ｃｈｌｏｒ，ｇｖ３１０１−２５ＧＥＮ
２）一晩培養物を滅菌５００ｍｌフラスコ中の２００ｍｌのＹＥＰに移し、ＯＤが０．３になるまで２５０ｒｐｍで振盪する（４〜５時間）
３）５０ｍｌのスクリューキャップ付きチューブに入れて４℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。細胞がペレット化されていることを確認。そうでない場合には、さらに高速で繰り返す。
４）上清を吸引し、２０ｍｌの氷冷１ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７（フィルター滅菌したもの）にペレットを再懸濁し、再遠心分離する。
５）工程４を２回以上繰り返す。
６）吸引後、２ｍｌの氷冷１０％グリセロール（フィルター滅菌したもの）にペレットを再懸濁する。
７）即座に４０μｌをプレチルドされた滅菌エッペンドルフチューブに入れ、液体窒素中で凍結し、−７０℃で保存する。
【０１２４】
アグロバクテリウムのエレクトロポレーション
ＤＮＡ調製物
エレクトロポレーション用ＤＮＡは塩、ＲＮＡまたは蛋白を含んでいてはならない。最初にＤＮＡ（ＴＥバッファー中）をＲＮａｓｅで処理し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出すべきである。これにより蛋白およびＲＮＡが除去される。塩を除去するために、ＤＮＡをエタノール沈殿させ、７０％エタノールで２回洗浄する。ＤＮＡを再懸濁させて０．４〜１μｇ／ｍｌとする。
【０１２５】
エレクトロポレーティング
混合する前に、エレクトロコンピテント細菌細胞、ＹＥＰ培地およびＤＮＡ溶液を氷上に保たなければならない。下記工程を１分以内に行うべきこと、メガネおよび手袋をつけるべきことに注意。
１６．１〜２ｍｌのＤＮＡ（６００ｎｇ）を４０ｍｌの細胞と混合する
１７．ＤＮＡ／細胞混合物を氷上のキュベットに移し、キュベットをゆるやかに撹拌することにより気泡の発生を回避する
１８．ティッシュペーパーでキュベットの外側を拭き、キュベットチャンバーにキュベットを入れてノッチを測定者側に向ける
１９．キュベットチャンバーのふたを閉める
２０．Ａｒｍ／ＤｉｓａｒｍをＡＲＭにセットする（アームライトが近づく）
２１．Ｃｈａｒｇｅ／Ｐｕｌｓｅをｐｕｌｓｅにセットするとライトがすぐに近づく
２２．パルスライトがオフの場合、Ａｒｍ／ＤｉｓａｒｍをＤＩＳＡＲＭにセットする（アームライトが近づく）、次いで、キュベットを取り除く
２３．ＤＮＡ／アグロバクテリウム混合物はまだキュベット中にあり、５００ｍｌの冷ＹＥＰ（抗生物質不含）を添加し、ゆるやかにピペッティングすることにより溶液を混合する
２４．細胞をエッペンドルフチューブに移し、２８℃で２〜４時間インキュベーションする
２５．エレクトロポレーターのスイッチをＰＵＬＳＥ位置にしたままにしておく
２６．２００ｍｌをＹＥＰ＋抗生物質にプレートする
２７．２８℃でインキュベーションすると、２〜３日でコロニーが出現する
【０１２６】
キュベットの再使用
使用したキュベットに０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を満たし、１５分放置する。蒸留水で６回すすぎ、次いで、９６％エタノールで２回すすぐ。十分にカバーをして７０％エタノール中で保存する。
【０１２７】
アグロバクテリウムミニプレプ
植物の形質転換に用いるアグロバクテリウムを、植物の形質転換について、Ｔｉプラスミドの存在およびトランスジェニック植物を調べることは時間のかかる仕事である。好ましい方法は、アグロバクテリウムミニプレプを作成し、ＰＣＲを用いて細胞が正しい構築物を含むかどうかを調べることであった。Ｔｉプラスミドが単一コピーであり、アガロースゲル上でかろうじて見えるものなので、ＰＣＲを行った。
１）５ｍｌのＬＢまたはＹＥＰ中で一晩増殖させる。ＡＢＩ中のｐＭＯＭについては−  ５０μｇ／ｍｌ ＫＡＮ，５０μｇ／ｍｌ Ｓｐｅｃ，２５μｇ／ｍｌ Ｃｈｌｏｒ。ｇｖ３０１中のｐＢＩタイプについては−  ５０μｇ／ｍｌ ＫＡＮ，２５μｇ／ｍｌ ＧＥＮ。
２）１ｍｌの細胞を２本の微量遠心チューブに移す。
３）４５秒間遠心分離し、吸引により上清を除去する。
４）１ｍｌの細胞を両方のチューブに添加し、工程３を繰り返す。
５）ペレットをボルテックス処理し、１００μｌのＭＰＳ１溶液を添加し、再度ボルテックス処理し、次いで、チューブを室温で５分間インキュベーションする。
６）２０μｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液を添加し、１秒間ボルテックススピン処理し、３７℃で１５分インキュベーションする。
７）２００μｌのＭＰＳ２溶液（新たに調製）を添加し、ラックを３〜４回回転させてゆるやかに混合し、氷上で５分間インキュベーションする。
８）１５０μｌのＭＰＳ３を添加し、少なくとも１０秒間ボルテックス処理し、氷上で５分間インキュベーションする。
９）５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移す。
１０）４００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を添加し、５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移す
１１）工程１０を繰り返す
１２）クロロホルムのみを用いて工程１０を繰り返す
１３）３００μｌのイソプロパノールを添加し、氷上で１０分間インキュベーションする
１４）５分間遠心分離し、ペレットを７０％エタノールで洗浄する。
１５）ペレットを乾燥させ、２本のチューブ、合計５０μｌのＴＥバッファー＋ＲＮａｓｅ中に再懸濁し、２μｌをＰＣＲに用い、残りを凍結する。
【０１２８】
2005534292.tif 000005
構築物をアグロバクテリウムに移した後、下記プロトコルを用いて構築物を植物中に形質転換した。
すべての構築物をAgrobateria thumefasiens中に移し、減圧浸潤により植物に移した。
Bechtold & Pelletier 1998に基づいて改変されたプロトコルを用いて減圧浸潤を行った。
【０１２９】
植物の成長
１．ブラシのついた種子を取り、土を満たした８ｃｍ角のポットに撒く。土を強く押さえつけないようにし、ポットの２〜３倍の体積の水をポットにまんべんなく与え、過剰の栄養分を除去する。各ポットに１２〜１６個の種子を撒く。ポットを冷所に２日間置き、その後、ポットを成長チャンバーに移す。昼間を短くして（１０時間またはそれ以下）３週間植物を成長させて、植物および種子の収量を増加させる。ポットを長い昼間に移行させてボルト形成（bolting）を誘発する。ボルト（bolt）の高さが約１０ｃｍとなる段階まで植物を成長させる。
２．ロゼッタ様の葉（rosette leaves）の近くに出現するボルトを刈って多数のボルトの成長を促進する。刈り込み後７ないし９日で浸潤（infiltration）を行う（植物の高さが１０〜１５ｃｍとなり、最大の開花が最初の小さなさやを形成するであろう）。減圧浸潤（vacuum infiltration）の前に植物に水を与えてはならない。
【０１３０】
減圧浸潤
３．−８０℃のストックまたはプレートから植菌することにより４ｍｌのアグロバクテリウム培養物（ＹＥＰ＋抗生物質）を開始する。この培養物を２５０ｍｌのＹＥＰ＋抗生物質に添加する（２５０ｍｌの培養物は６ポットの浸潤に十分な細胞を与えるであろう）。培養物を一晩ないし２日間（株による）増殖させてＯＤ６００＝１．２〜１．８にする。培養物は真珠様外観（塊状あるいは黒色でない）の母体（mother）を有するであろう。
４．２５０ｍの遠心管でアグロバクテリウムを５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈降させ、浸潤培地に再懸濁して最小体積３００ｍｌ中ＯＤ６００＝０．８とする。
５．アグロバクテリウム懸濁液を適当なサイズ（４００ｍｌで可）のビーカーに注ぐ。ビーカーを減圧ジャー中に置く。気泡が生じるまで減圧することにより溶液を脱気する。ビーカーの底にペーパータオルを敷いて、ビーカーが減圧ジャーの底に付着するのを避ける。
６．浸潤５分前に植物に水を散布し（所望による）、次いで、植物を逆さにして培養液中に入れる。すべての花が浸るようにし、ロゼッタ様の葉とアグロバクテリウム懸濁液との間を２ｃｍあける。植物の死滅を避けるため、培養物をロゼッタ様の葉または土に接触させないようにする。減圧にしている間、溶液が沸騰しないようにする。土がわずかに湿るようにし、ポットからの水が培養懸濁液に入らないようにする（それゆえ、浸潤前に植物に水を与えないことが推奨される）。ＷＳの場合には１５〜２０分間、Ｃｏｌ−０の場合には３０分間、０．０５バール付近に減圧する（オイルポンプを使用）。
７．減圧ジャーから植物を取り除く前に、プラスチックバッグをポットおよびビーカーにかぶせる。ビーカーから植物を引き出して取り除き、ポットをそれらの横に置く（過剰の浸潤培地が土中に流れるのを防止する）。プラスチックバッグの上端を折り、ホッチキスで２度とめる。ポットを横にしてトレイ中に置き、バックス全体をサランラップで包んでもよい。植物を成長チャンバーに一晩入れる。翌日、植物をグリーンハウスに移す。植物を縦に置き、バッグを開く。翌日、バッグを取り除く。植物がトレイ中にある場合、やはり植物を縦に置き、棒とサランラップを用いて植物周囲にある種の傾きを作る。翌日、プラスチックを取り除く。暑い夏には、植物を縦に置いた後、水を植物に散布することが推奨される（この目的は、浸潤培地から糖分を除去して真菌感染を抑制することである）。
８．約４週間植物を成長させ、各ポットからのボルトが一緒になるようにし、隣のポットから離しておく。
９．さやが黄色になり始めたら、ポットを横にして置き、植物を大きな袋に入れる。植物を１週間乾燥させておき、植物を刈り取る。袋の中で種子を乾燥させ、１０日後に取る（１のポットからのすべての種子を一緒にする）。種子を冷所に１週間保存し、次いで、それらを撒く。
【０１３１】
カナマイシン選択プロトコル
１．種子の滅菌：
１５ｍｌのファルコンチューブ中の種子（チューブ１本あたり約７００個の種子、９ｃｍｘ９ｃｍの四角を紙に描き、その上に種子を広げることにより種子の量を見積もることができる）。１０ｍｌの次亜塩素酸塩溶液を添加する。チューブを１０分間振盪する。溶液を除去し、１０ｍｌの７０％エタノールを添加する。２分間待つ。エタノールを捨て、１０ｍｌの滅菌水で種子を２〜３回洗浄する。８ｍｌの０．７％トップアガー（top agar）に種子を再懸濁する（５５℃を超えないようにする）。
２．選択プレート（ＭＳ＋Ｋａｎ）上に種子を撒く。トップアガーが固化するまでラミナーフローフード中でプレートを乾燥させる。
３．プレートを４℃の冷所に二晩置く。プレートを成長チャンバーに移す（２１℃で連続照明）。
４．約７日後、形質転換体は健全な二次葉（secondary leave）および選択培地中に伸びた根を有する濃緑色植物として明確に確認されるはずである。根の成長は初期段階で形質転換体を同定するための最も明確なマーカーである。
形質転換体がポジティブであることを確認するために、それらを新たなＭＳ＋Ｋａｎプレートに移し、２〜３日放置する（黄色になれば偽陽性である）。形質転換体を土に移す。
この工程でプレート上にコンタミネーションがあれば、形質転換体をできるだけ早く土に移す。
５．植物を成長させ、種子を集める。
【０１３２】
浸潤培地
１／２ｘMurashige＆Skoog塩（Sigma #5524）
１ｘＢ５ビタミン（１０００ｘストック１ｍｌ）Gamborgのビタミン粉末、１０００ｘストック調製には１１．２ｇを１００ｍｌの水に溶解
５％ショ糖
オートクレーブ前にｐＨを５．７に調節
オートクレーブ後に下記を添加：
−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌストックを１リットルあたり１０μｌ、該ホルモンを使用直前に添加、浸潤前少なくとも１週間はストックとして浸潤培地を保存可能。
−Landsbergおよびcolombiaエコタイプに関しては０．０１％のsilwetを浸潤培地に添加して形質転換効率を向上させることが推奨される。
（silwetはLEHLE SEEDSのカタログ番号VIS-01 VAC-IN-STUFF (silwet L-77)）
【０１３３】
カナマイシン／ヒグロマイシン選択プロトコル：
１．種子を滅菌する。
２．滅菌された７％の５５Ｃのトップアガー（１ｍｌあたり種子１２５個）に再懸濁し、回転させて混ぜながら選択プレートに注ぐことにより種子をピレートに撒く（ファージをプレートに撒くように）。プレートに触れても種子がもはや流れなくなるまでプレートをラミナーフロー中で乾燥させる。通常の９ｘ９ｃｍプレートでは、６２５個の種子が良い（５ｍｌ）。より高い密度は陽性植物のスポットを困難にする。なぜなら抗生物質選択があまり効果的でなくなるからである。
３．植物を４℃の冷所に二晩置く。プレートを成長チャンバーに移す。
４．約７日後、形質転換体は健全な二次葉および選択培地中に伸びた根を有する濃緑色植物として明確に確認されるはずである。根の成長は最良のマーカーである。
５．苗を土に移植し、成長させ、種子を集める。移植の成功率は、ａ）寒天の塊を伴わずあるいは根を破損することなく根を抜くことが容易なので、選択プレート中７％寒天を用いる、ｂ）移植後、土を水で飽和させる、そしてｃ）ドーム下で植物を成長させる（Aracon種子コレクターを用いて最初の日あるいは次の日に高湿度を維持する）ことにより改善される。根が破損した場合、苗を新たな選択プレートに２〜３日置き、その後移植する。
【０１３４】
選択プレート：
１ｘMurashige & Skoog塩
１％ショ糖
ＫＯＨでｐＨ５．７に調節
０．７％ Ｄｉｆｃｏアガー
オートクレーブ、冷却、次いで、下記を添加：
１ｘＭＳビタミン（ＳＩＧＭＡ＃Ｍ−７１５０、１０．３ｇを１００ｍｌの水に溶解することにより調製した１０００ｘストック１ｍｌを取る）
抗生物質（カナマイシン５０ｍｇ／ｌ）
【０１３５】
トップアガー：
１ｘMurashige & Skoog塩
１％ショ糖
１Ｍ ＫＯＨでｐＨ５．７に調節
０．７％ Difcoアガー
オートクレ−ブ
使用前にマイクロウェーブで沸騰させ、５０〜５５℃の水浴中に保つ
【０１３６】
ＹＥＰ培地（液体）：
１０ｇ／ｌ  Bacto ペプトン（Difco）
１０ｇ／ｌ酵母エキス（Difco）
５ｇ／ｌ ＮａＣｌ
ＹＥＰプレートの場合、１５ｇ／ｌのDifco Bactoアガーを添加する
【０１３７】
次亜塩素酸塩溶液：
５０ｍｌ調製に：
４ｍｌ １５％次亜塩素酸ナトリウム
２５５ｌ Ｔｗｅｅｎ−２０
水を添加して５０ｍｌとする
【０１３８】
ＬＵＣイメージング
ルシフェラーゼアッセイ用ＣＣＤカメラ
プロトコルはMeier et al. 2000に記載のもの
【０１３９】
ルシフェリン調合物：
Ｄ−ルシフェリン−カリウム（Hemica ALTA Ltd #0572）
ストック：５０μＭ（分子量３１８．４）０．１５９ｇをＨ２Ｏに溶解し、各エッペンドルフチューブに１ｍｌずつ分取（−８０℃で保存）
使用濃度：５μＭ
【０１４０】
１０ｍｌワーキング溶液の調製
１ｍｌ ストック
９ｍｌ Ｈ２Ｏ
５μｌ ２０％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００
フィルター滅菌（２０μｍフィルター）
４℃でワーキング溶液を調製し、２週間以内に使用
スプレーすることによりルシフェリンをプレートに適用する。９ｃｍのプレートの場合、２００μｌのワーキング溶液を用いる。これをフローフード内で行うべきである。
得られたすべてのＧＭＯ植物を下記条件で維持した。
【０１４１】
土壌および成長条件
土壌混合物：
１００リットル  Ｋ−Ｓｏｉｌ（weillbell, Sweeden）
６リットル  Ｐｅｒｌｉｔｅ
６リットル  Ｖｅｒｍｉｃｕｌｉｔｅ
３００ｇ  Osmocote（Scotts  放出時間３〜４ヶ月  ＮＰＫ１５−１５−１１）
ポット：減圧浸潤用の四角の９ｘ９ｃｍプラスチックポット
ポット：単一植物用の４．５ｘ４．５ｃｍ
単一植物の成長および種子収集には、Araconsystem（# AS-0007 Betha Tech）を用いた。
【０１４２】
成長条件：
組織培養：２１℃の部屋
温度：２１℃
湿度：６０％
ロングデイ（Long day）：２０時間／４時間  明／暗
【０１４３】
グリーンハウス：
温度：
湿度：９５％
ロングデイ  １３時間
【０１４４】
成長チャンバー１：
ショートデイ（Short day）  ８時間
温度：２０℃
湿度：６０％
【０１４５】
成長チャンバー２：
ロングデイ  １４時間
温度：２０℃
湿度：６０％
【０１４６】
Arabidopsis植物の交雑
（繁殖のための花のemmansculationおよび花の調製）
上記実験を行う前に、成熟した花がボルト形成Arabidopsis植物に存在しなければならない。
１．レシピエント花（子房）の調製
目的は、子房以外の花のすべての部分を除去することである。
花序を選択し、若すぎる花および白色花弁をすでに示している花をすべて除去する（開花した花は自家受粉を開始する傾向がある）。若すぎる花および古すぎる花の両方を花序から切り、中ほどに３〜１０個の花を残す。
間近にある他のすべての部分、特にさやの部分を切る。可能な限り作業環境をやりやすくするためである。
花からパーツを切る際、パーツを引き裂いてはならない。植物はデリケートで簡単にダメージを受ける。どれくらいの量のパーツを取ることができるかは実行して感触をつかむことである。
非常に細かい鉗子ＩＮＯＸ１を用いてこの手順を行うことができる。
９５％エタノール、次いで蒸留水に浸したきれいな鉗子を花と花との間に用いる。
解剖顕微鏡で花を観察する間、表面にキムワイプを用いる。このことにより、鉗子ではなく紙の上に花のパーツを保持することが容易となる。
２．花粉の取得
完全に成熟した花を得て、雄ずいを取る。これらの雄ずいを用いて、調製された子房をこする。この操作を少なくとも２回繰り返して、十分な花粉を花の先端に付ける。解剖顕微鏡で観察した場合、緑色の子房の上に花粉が灰色がかった褐色表面を形成することで、このことが容易に確認できる。
３．適宜交配を表示し、Raynolds 905サランラップで子房を包んでクロスコンタミネーションが起こるようにする。
４．黄色くなり始めるまで子房を発達させ、その後集める。乾燥しすぎている場合、子房は種子を脱落させている可能性がある。
【０１４７】
実施例１  プラスミド構築物中の選択マーカー
相同組み換えを用いて抗生物質選択マーカー（カナマイシン／ヒグロマイシン）を他の選択系（ＬＵＣ、ＧＦＰ）で置換した（Court et al., 2002）。選択マーカーとしてカナマイシン／ヒグロマイシンのみでプラスミドを説明する（図１〜図３０）。
ｐａｐ１（アントシアニン色素１の生成、gene bank受託番号ＡＦ３２５１２３）およびｐａｐ２（アントシアニン色素２の生成、gene bank受託番号ＡＦ３２５１２４）ＭＹＢ転写因子（）ｃＤＮＡを、ＲＴｔｈポリメラーゼおよび下記プライマー：pap1 FW  5'AAGGATCCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGCTGCGA 3' および RW   5'AACCTAGGCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC 3' ならびに PAP2 FW 5'AAGGATCCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGTGAGG 3' および RW AACCTAGGCAGACTCCAAAGTTGCTCAACGTCAAACGC 3'を用いるＬＲ−ＰＣＲ（ロングレンジ）により得た。増幅された配列を制限酵素消化により試験し、得られた配列をテイリング処理し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクター（Promega kit #A1360）中に連結した。ABI Capillary Sequencer および the big dye system (#A016)を用いて陽性クローンを配列決定して、正しい配列が増幅され、ミスが導入されていないことを確認した。ＥｃｏＲＩを用いて両方の遺伝子を末端切断し、分離されたフラグメントをＭｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼを用いて平滑末端化させ、フラグメントをＣａｍｂｒｉａ形質転換ベクター１３０２に連結した。ＰＡＰ１（図１）およびＰＡＰ２（図２）を３５Ｓプロモーターの３’側に挿入した。１３０２ベクターはＢｇｉＩＩ／ＮｈｅＩでの消化によりすでに調製されており、該消化によりｇｆｐ＊５遺伝子が切断されていた。該ベクターを平滑末端化させ、製造者のプロトコルに従ってＣＩＰ（仔牛腸ホスファターゼ）で処理した。ｔｔ４蛋白をコードするＣＨＳ（ナリンゲニン−カルコンシンセターゼ）遺伝子（バンク受託番号ＡＹ０４４３３１）のｃＤＮＡを、FW プライマー 5' ATGGTGATGGCTGGTGCTTCTTCTT 3' および RW 5' TTAGAGAGGAACGCTGTGCAAGAC 3'を用いて、ＰＡＰ１およびＰＡＰ２遺伝子に関する説明と同様にして得た。ＰＣＲ生成物をテイリング処理し、Ｐｇｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。次いで、ＮｏｔＩでの消化によりＣＨＳ遺伝子を切り出し、精製されたフラグメントをＭｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼを用いて平滑末端化させ、Ｐｂｓ３５Ｓ−Ｅ９クローニングベクター中に連結した（図３）。この構築物はプロモーターのクローニング用に得たものである。次に、ＳｍａＩを用いて３５Ｓ−ＣＨＳ−Ｅ９カセットを切り出し、ＳｍａＩで切断されたｃａｍ１３０２ベクター中に該フラグメントを連結し、ＣＩＰ処理することによりＣａｍ  ３５Ｓ−ＣＨＳ−Ｅ９形質転換構築物を得た（図４）。
【０１４８】
実施例２  重金属検出用プラスミド構築物
ＧＳＨ１ ５’ＵＴＲ
重金属検出系の例を以下に示すが、これらの重金属により調節されるプロモーターに限定されない。ＧＳＨ（ガンマ−グルタミルシステインシンセターゼ、gene bank受託番号ＡＦ０６８２２９９）（Cobbett et al., 1994）の５’ＵＴＲ（プロモーター）を、下記プライマーを用いるＬＲ ＰＣＲにより得た：FW プライマー 5' GGTGATATATAGCCATAATTGTGTT 3' および RW 5' GGTATATATAGCTCCTGCAATTATA 3'。増幅された配列−１１８３から＋２までの１１８５ｂｐにテイリング処理を施し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクター中に連結し、配列決定した。
ＧＳＨプロモーターフラグメントをＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとしてオメガリーダーおよびｆｆ−ＬＵＣ遺伝子の前のＢａｍＨＩカットした部位中に挿入し、ＣＩＰ処理した（Ｖｉｐ１１−Ｏｍｅｇ−ＬＵＣベクター）。そしてプロモーターの調節を調べた（図５）。
ＧＳＨプロモーターフラグメントをＮｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてＴｅａｓｙベクターから切り出した。ｃａｍ１３０２ベクターをＮｃｏＩ／ＳａｌＩで切り、３５Ｓプロモーターを遊離させ、ＧＳＨフラグメントとの連結用にＧＦＰ−Ｎｏｓを残した。構築物ＧＳＨ−ＧＦＰ−Ｎｏｓを得た（図６）。
ＧＳＨ１プロモーターフラグメントをＴｅａｓｙベクターからＮｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントとして切り出し、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼでにより平滑末端化させた。平滑末端化フラグメントをＳｔｉＩ部位に挿入し、カセットｐＧＳＨ１−ＣＨＳ−Ｅ９を得た。ＫｐｎＩでの消化によりカセットを遊離させ、フラグメントをｃａｍ２２００形質転換ベクターのＫｐｎＩ部位中に組み込んだ（図７）。
【０１４９】
ＧＳＨ２ ５’ＵＴＲ（グルタチオンシンセターゼ、遺伝バンク受託番号Ｘ８３４１１）を、下記のプライマーの組み合わせ：FW 5'- GATATC AAGAGGATAAGAGGATTGTGTTGGA-3' (EcoR V リンカー) および RW 5'-AGATCTCTTAAATGATCTCCCACACCTCAAA-3'(Bgl II リンカー)により増幅した。ｐＧＳＨ２の−７１２から−１までのプロモーターフラグメント（７１１ｂｐ）を、ＥｃｏＲＶ／ＢｇｌＩＩでの消化によりｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターから遊離させた。得られたフラグメントをＢｒａｃｏｎ３プラスミドの３５Ｓプロモーターと置き換えて、ｐＢｓ−ｐＧＨＳ２−ＣＨＳ−Ｅ９カセットを得た。カセットをＫｐｎでの消化により切り出し、このカセットをｃａｍ２２００形質転換ベクター中のＫｐｎＩ部位中に連結した。このようにして下記の構築物を得た（図８）。
【０１５０】
ＰＣＳ１ ５’ＵＴＲ（gene bank受託番号ＡＦ４６１１８０）を、下記プライマーを用いてゲノムＤＮＡから増幅した：FW 5'- GATATCAACTTTTTTGCTTCTCCTTTTTCAA-3' (EcoR V リンカー) および RW 5'-AGATCTTTTTCACTGCTTGTTTTGGTATCTA-3'(Bgl II リンカー)。得られた−９１５から−１までのフラグメント（９１４ｂｐ）をテイリング処理し、ｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結し、次いで、配列決定して、正しい遺伝子が増幅されたことを確認した。ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩを用いる消化によりインサートを遊離させた。あらかじめＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで３５Ｓプロモーターを切り出しておいた。ベクターをゲル精製した。連結により、カセットＰｂｓ ｐＰＣＳ１−ＣＨＳ−Ｅ９を得て、ｐＢｓ−ｐＰＣＳ１−ＣＨＳ−Ｅ９プラスミドをＫｐｎＩで消化することにより、このカセットをｃａｍ２２００形質転換ベクターに移し、該カセットをＣａｍ２２００ベクターのＫｐｎＩ部位中に連結した（図９）。
【０１５１】
ＰＣＳ２ ５’ＵＴＲ（gene bank受託番号ＡＹ０４４０４９）プロモーターを、下記のプライマーの組み合わせを用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した：Fw プライマー 5'-GTTAACGATTCGACTCGGTCACGTGATATAC-3' (Hpa I リンカー) および RW 5'-AGATCTGTCAGAGTTTGACTATGGAGCAAAC-3'(Bgl II リンカー)。−８７５から−２までの得られたフラグメント（９７３ｂｐ）をテイリング処理し、ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中に連結した。制限酵素ＨｐａＩおよびＢｇｌＩＩでの消化によりｐＰＣＳ２フラグメントを遊離させた。ＨｐａＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントをＢｒａｃｏｎ３プラスミド中に連結し、そのことにより３５Ｓプロモーターと置き換えた。Ｂｒａｃｏｎ３をＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで消化して３５Ｓプロモーターを切り出しておいた。ベクターをゲル単離した。連結により、カセットＰｂｓ ｐＰＣＳ２−ＣＨＳ−Ｅ９を得て、プラスミドをＫｐｎＩで消化することによりこのカセットを切り出し、そのフラグメントをＣａｍ２２００  ＴＤＮＡベクターのＫｐｎＩ部位中に連結した（図１０）。
【０１５２】
ＧＳＴ３０ ５’ＵＴＲ（トウモロコシＢｒｏｎｚｅ２遺伝子に相同的なArabidopsis thalianaのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼファミリー、gene bank受託番号ＡＦ２８８１９１）を、FW 5'- GATATCATAATTATGTCAATCTTGCGTGTTT-3' (EcoR V リンカー) および RW 5'-AGATCTTTTCTCTTCAAAATCCAAAACAGAG-3'(Bgl II リンカー)の組み合わせを用いて増幅した。増幅生成物である−１０５１から−１まで（１０５０ｂｐ）を制限酵素消化でチェックし、テイリング処理し、ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中に連結した。次工程において、ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩでの消化によりプロモーターフラグメントｐＧＳＴ３０を遊離させた。あらかじめＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで３５Ｓプロモーターを切り出し、ゲルによる単離により調製されていたＢｒａｃｏｎ３のＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩ部位中にこの粘着末端フラグメントを連結した。連結により、カセットｐＧＳＴ３０−ＣＨＳ−Ｅ９を得て、ＫｐｎＩにより該カセットを形質転換ベクター中に移行させた（図１１）。
【０１５３】
ＣＡＤ１ ５’ＵＴＲ（フィトヘラチンシンターゼ、gene bank受託番号ＡＦ１３５１５５）を、下記プライマー
FW 5'- GATATCTAGGCCTTGTAATATTTTTGATGAA-3' (EcoR V リンカー) および RW 5'-AGATCTTTTTCACTGCTTGTTTTGGTATCTA-3'(Bgl II リンカー)
を用いるＬＲ−ＰＣＲにより、ゲノムＤＮＡから増幅した。増幅されたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中に連結した。ＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩの組み合わせでプラスミドを消化することにより８１９から−１までのプロモーターフラグメント（８１８ｂｐ）を切り出し、精製されたフラグメントをＢｒａｃｏｎ３の対応部位中に連結した。３５Ｓ−ＣＨＳ−Ｅ９を含むＢｒａｃｏｎ３構築物はあらかじめプラスミドをＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで消化することにより調製されていた。該消化により３５Ｓプロモーターが遊離された。ベクターはゲル精製された。連結により３５ＳプロモーターがＣＡＤ１遺伝子のプロモーターと置き換えられた。ＫｐｎＩで消化することによりカセットｐＣＡＤ１−ＣＨＳ−Ｅ９を切り出し、このカセットをｃａｍ２０００のＫｐｎＩ部位中に連結した（図１２）。
【０１５４】
実施例３  重金属結合用プラスミド構築物
ＧＳＨ−１ ｃＤＮＡ（グルタメート−システインリガーゼクロロプラストイソフォーム、gene bank受託番号Ｚ２９４９０）を、FW 5'- GTTAACATGGCGCTCTTGTCTCAAGCAGGAG-3'(Hpa I リンカー) および RW 5'-GTTAACTTATAGACACCTTTTGTTCACGTCC-3'(Hpa I リンカー)を用いて増幅した。増幅されたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。ＨｐａＩで消化することによりＧＳＨ１ ｃＤＮＡを遊離させ、フラグメントをＰｂｓ３５Ｓ−Ｅ９クローニングベクターのＳｔｕＩ部位中に連結した。プラスミドをＳｍａＩで消化することによりカセット３５Ｓ−ＧＳＨ１−Ｅ９を得た。ＳｍａＩフラグメントを形質転換ベクターＣａｍ２３００のＳｍａＩ部位に挿入した（図１３）。
【０１５５】
ＧＳＨ−２ ｃＤＮＡ（グルタチオンシンセターゼ、gene bank受託番号Ｘ８３４１１）を、花のｃＤＮＡライブラリー中のFW 5'-GTTAACATGGAATCACAGAAACCCATTTTCG-3' (Hpa I リンカー) および RW 5'-GTTAACTCAATTCAGATAAATGCTGTCCAAG-3'(Hpa I リンカー)の組み合わせを用いるロング−レンジＰＣＲにより増幅した。得られたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。プラスミドをＨｐａＩで消化することによりインサートを切り出し、平滑末端フラグメントをカスタムメードベクターＰＢＳ ３５Ｓ−Ｅ９に挿入した。カセット３５Ｓ−ＧＳＨ２−Ｅ９をＳｍａＩ消化により移動させた。ＳｍａＩフラグメントをＣａｍ２３００のＳｍａＩ部位中に連結した（図１４）。
【０１５６】
ＣＡＤ−１ ｃＤＮＡ（フィトケラチンシンターゼ  Ha et al. 1999  gene bank受託番号ＡＦ１３５１５５）ｃＤＮＡを、リンカーを付したプライマーFW 5'- GGATCCATGGCTATGGCGAGTTTATATGC-3'(BamHI リンカー) および RW 5'- GCTAGCCTAATAGGCAGGAGCAGCGAGAT-3'(NheI リンカー)を用いるＬＲ  ＰＣＲにより得た。花から作成されたｃＤＮＡライブラリーを用いてｃＤＮＡを増幅した。得られたｃＤＮＡをテイリング処理し、ｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター中に組み込み、次いで、配列決定して、正しい遺伝子が増幅されたことを確認した。ＥｃｏＲＩによりＣＡＤ１ ｃＤＮＡを切り出し、遊離されたフラグメントをＭｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼを用いて平滑末端化させた。この平滑末端フラグメントを、ＳｔｕＩで前処理したＰｂｓ  ３５Ｓ−Ｅ９ベクター中に連結し、ＣＩＰ処理して、脱リン酸化された平滑末端ベクターを得た。ＳｍａＩ消化により３５Ｓ−ＣＡＤ１−Ｅ９カセット全体を遊離させ、Ｃａｍ２３００のＳｍａＩ部位中に移して図１５に示す構築物を得た。
【０１５７】
Ｎｒａｍｐ−１  ｃＤＮＡ（gene bank受託番号ＡＦ１６５１２５）を、リンカーを付したFW 5'- AGATCTATGGCGCTACAGGATCTGGACG-3' (Bgl II リンカー) および RW 5'- GCTAGCTCAGTCAACATCGGAGGTAGATA 3'(NheI リンカー)を用いるＬＲ−ＰＣＲにより得た。増幅生成物をｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター系（Promega）に組み込み、配列決定した。配列決定後、ＮｏｔＩ制限酵素で消化することによりｃＤＮＡを遊離させ、ｍｕｎｇ  ｂｅａｎヌクレアーゼで平滑末端化させた。この平滑末端フラグメントを、ＳｔｕＩで前処理されたＰｂｓ  ３５Ｓ−Ｅ９ベクター中に連結し、ＣＩＰ処理して、脱リン酸化された平滑末端ベクターを得た。ＳｍａＩによりカセット３５Ｓ−Ｎｒａｍｐ１−Ｅ９を切り出し、２３００ＣａｍｂｒｉａベクターのＳｍａＩ部位中に連結した。この構築物を図１６に示す。
【０１５８】
Ｎｒａｍｐ−２ ｃＤＮＡ（gene bank受託番号ＡＦ１４１２０４、Alonso et al. 1999）を、上記と同じ方法を用いて、FW 5'- CCATGGATGGAAAACGACGTCAAAGAGAA-3' (NcoI リンカー) および RW 5'- GCTAGCCTAGCTATTGGAGACGGACACTC-3'(NheI リンカー)を用いることにより得た。ＮｏｔＩによりＮｒａｍｐ２ ｃＤＮＡを切り出し、平滑末端化させ、平滑末端フラグメントをＰｂｓ３５Ｓ−Ｅ９ベクターのＳｔｕＩ部位中に連結した。ベクターをＫｐｎＩで消化することにより、カセット３５Ｓ−Ｎｒａｍｐ２−Ｅ９を切り出した。図１７に示すように、このカセットをＣａｍｂｒｉａ２３００ベクターのＫｐｎＩ部位中に連結した。
【０１５９】
ＰＣＳ−１ ｃＤＮＡ（gene bank受託番号ＡＦ４６１１８０）
FW 5'- GGATCCATGGCTATGGCGAGTTTATATCG-3' (BamH I リンカー) および RW 5'- GCTAGCCTAATAGGCAGGAGCAGCGAGAT-3' (Nhe I リンカー)を用いるＬＲ−ＰＣＲにより全長ｃＤＮＡを得た。ＰＣＲ生成物をＴａｑポリメラーゼでテイリング処理し、次いで、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ中に連結し、配列決定し、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎヌクレアーゼでフラグメントを平滑末端化させ、フラグメントをＳｔｕＩ部位中に連結することにより、クローニングベクターＰｂｓ３５Ｓ−Ｅ９中に移行させた。ベクターをＳｍａＩで消化することによりカセット３５Ｓ−ＰＣＳ１−Ｅ９を遊離させ、図１８に示すように、カセットをＣａｍ２３００形質転換ベクターのＳｍａＩ部位中に組み込んだ。
【０１６０】
ＰＣＳ−２ ｃＤＮＡ（gene bank受託番号ＡＹ０４４０４９）を、FW プライマー 5'-GTTAACATGTCTATGGCGAGTTTGTATCGG-3' (Hpa I リンカー) および RW 5'-GTTAACTTAGGCAGGAGCAGAGAGTTCTTC-3'(Hpa I リンカー)の組み合わせを用いるＬＲ−ＰＣＲにより増幅した。得られたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。Ｈｐａでの消化によりＰＣＳ２ ｃＤＮＡを遊離させ、単離したフラグメントをＰｂｓ３５Ｓ−Ｅ９のＳｔｕＩ部位中に連結した。プラスミドをＫｐｎで消化することによりカセット３５Ｓ−ＰＣＳ２−Ｅ９を抽出し、カセットをＣａｍ２３００形質転換ベクターのＫｐｎＩ部位中に連結した（図１９）。
【０１６１】
実施例４  ニトロ含有化合物検出用のプラスミド構築物
Ｎｒ−１ ５’ＵＴＲ（ニトレートレダクターゼ１、gene bank受託番号ＡＣ０１２１９３）を、FW  5'-GATATCCTTGAGTCATACATCTATGATA-3'(EcoR I リンカー) および RW (5' AGATCTCCATGGTTTAGTGATTGAACCGGTG-3'(BglI I リンカー)のプライマーの組み合わせを用いて増幅した。増幅されたフラグメント（ｐＮＲ１）は−１５７４から−１までのゲノム配列からなる１５７３ｂｐのフラグメントであった。増幅されたフラグメントｐＮｒ１をテイリング処理し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。プラスミドをＥｃｏＲＶ／ＢｇｌＩＩで消化することによりプロモーターフラグメントを遊離させた。同時に、Ｐｂｓ  ３５Ｓ−ＣＨＳ−Ｅ９のプラスミド（図４参照）をＥｃｏＲＶ／ＢｇｌＩＩで消化し、このことにより３５Ｓプロモーターが遊離された。ベクターをゲル精製し、ｐＮｒ１フラグメントをＰｂｓ−ＣＨＳ−Ｅ９ベクター中に連結した。構築物をＫｐｎＩで消化し、カセットｐＮｒ１−ＣＨＳ−Ｅ９を切り出した。得られたカセットフラグメントをｃａｍ２２００のＫｐｎＩ部位中に連結し、図２０に示す構築物を得た。
【０１６２】
Ｎｒ−２ ５’ＵＴＲ（ニトレートレダクターゼ２、gene bank受託番号Ｘ１３４３５）を、下記プライマー：FW 5'-GATATCGATAATTCTTTAATTTACTGG (EcoR V リンカー) および RW 5'- GGATCCGCTAATATGTGAAAGGTTGTAC-3'(BamH I リンカー)を用いるＬＲ−ＰＣＲによりゲノムＤＮＡから増幅した。増幅されたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中に連結した。−８０５から＋３までのプロモーターフラグメントｐＮｒ２を、ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩで消化することによりｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターから遊離させた。得られたフラグメントによりＢｒａｃｏｎ３プラスミドの３５Ｓプロモーターが置換され、Ｐｂｓ−ｐＮｒ２−ＣＨＳ−Ｅ９カセットが得られた。ＫｐｎＩでの消化によりカセットを切り出し、このカセットをｃａｍ２２００形質転換ベクターのＫｐｎＩ部位中に連結した。このようにして下記の構築物を得た（図２１）。
【０１６３】
Ｎｉｉ ５’ＵＴＲ（ニトレートレダクターゼ、gene bank受託番号５１１６５５）プロモーターを、Fw primer 5'-GTTAACCCCTAATGACCACATCAACCTTG-3' (Hpa I リンカー) および RW 5'AGATCTGATGATGGCGGAAGAAGGAG (Bgl II リンカー)の組み合わせを用いてゲノムＤＮＡから増幅した。得られたフラグメントはゲノム配列の−９９９から−１までであり（９９８ｂｐ）、これをテイリング処理し、ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中に連結した。制限酵素ＨｐａＩおよびＢｇｌＩで消化することによりｐＮｉｉフラグメントを遊離させた。Ｂｒａｃｏｎ３プラスミドを調製して、ＥｃｏＲＶ／ＢｇｌＩでの消化により連結を行った。これにより３５Ｓプロモーターが除去され、ｐＮｉｉプロモーターが所定部位に連結されて、カセットｐＮｉｉ−ＣＨＳ−Ｅ９が得られた。カセットを含むプラスミドをＫｐｎＩで消化し、カセットをｃａｍ２２００形質転換ベクターのＫｐｎＩ部位中に連結した（図２２）。
【０１６４】
Ｎｔｒ−２−１ ５’ＵＴＲ（高アフィニティーニトレートトランスポーターＡＣＨ２、gene bank受託番号ＡＦ０１９７４９）を、下記プライマー：FW 5'-GATATCCCAAAGCAGCAACCATTTTTCC-3' (EcoR V リンカー) および RW 5'-'AGATCTGTATTTTAAACGTATCAAGTTCC -3'(Bgl II リンカー)を用いるＬＲ−ＰＣＲによりゲノムＤＮＡから増幅した。増幅されたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中に連結した。−９７４から−１までのプロモーターフラグメントｐＮｔｒ２−１を、ＥｃｏＲＶ／ＢｇｌＩＩでの消化によりｐＧＥＭＴｅａｓｙベクターから遊離させた。得られたフラグメントによりＢｒａｃｏｎ３プラスミド中の３５Ｓプロモーターが置換された。Ｂｒａｃｏｎ３プラスミドをＥｃｏＲＶ／ＢｇｌＩＩで消化し、ベクターを単離することにより、このことを行った。ｐＮｔｒ−２−１フラグメントを単離ベクター中に連結してカセットＰｂｓ−ｐＮｔｒ２−１−ＣＨＳ−Ｅ９を得た。ＫｐｎＩでの消化によりカセットを切り出し、ｃａｍ２２００形質転換ベクターのＫｐｎＩ部位中に連結した。以下の構築物はこのようにして得られた（図２３）。
【０１６５】
実施例５  ニトロ含有化合物還元用プラスミド構築物
Ｎｒ−１ ｃＤＮＡ（ニトレートレダクターゼ１、gene bank受託番号ＡＣ０１２１９３）を、プライマーの組み合わせFW  5'- GTTAACATGGCGACCTCCGTCGATAAC-3' (HpaI リンカー) および RW プライマー 5'- GTTAACCTAGAAGATTAAGAGATCCTCC-3' (HpaI リンカー)を用いて増幅した。増幅されたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。ＨｐａＩでの消化によりＮｒ１ ｃＤＮＡを遊離させ、Ｐｂｓ３５Ｓ−Ｅ９クローニングベクターのＳｔｕＩ部位中に連結した。プラスミドをＫｐｎＩで消化することによりカセット３５Ｓ−Ｎｒ１−Ｅ９を得た。ＫｐｎＩフラグメントを形質転換ベクターＣａｍ２３００のＫｐｎＩ部位に挿入した（図２４）。
【０１６６】
Ｎｒ−２ ｃＤＮＡ（ニトレートレダクターゼ２、gene bank受託番号Ｘ１３４３５）を、ｃＤＮＡライブラリーを用いてＬＲ−ＰＣＲにより得た。鋳型およびＦＷプライマー5'- GTTAACTCGGCTGACGCGCCTCCTAGTC-3' (HpaI リンカー)をＲＷプライマー5'-GTTAACGAATATCAAGAAATCCTCCTTG-3' (HpaI リンカー)と組み合わせた。増幅されたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。ＨｐａＩでの消化によりＮｒ−２ ｃＤＮＡを遊離させて平滑末端フラグメントを得た。このフラグメントをＰｂｓ３５Ｓ−Ｅ９クローニングベクターのＳｔｕＩ部位中に連結した。Ｐｂｓ３５Ｓ−Ｎｒ２−Ｅ９プラスミドをＫｐｎＩで消化することによりカセット３５Ｓ−Ｎｒ２−Ｅ９を得た。ＫｐｎＩフラグメントを形質転換ベクターＣａｍ２３００のＫｐｎＩ部位中に挿入した（図２５）。
【０１６７】
Ｎｉｉ ｃＤＮＡ（Arabidopsis thalianaニトライトレダクターゼ、gene bank受託番号５１１６５５）を、花のｃＤＮＡライブラリーのFW プライマー 5'- GTTAACATGACTTCTTTCTCTCTCACTTTCA-3' (HpaI リンカー)と RW プライマー 5'-GTTAACTCAATCTTCATTCTCTTCTCTTTCT-3' (HpaI リンカー)との組み合わせを用いて増幅した。得られたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧｅｎ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。ＨｐａＩでプラスミドを消化することによりインサートを切り出し、平滑末端フラグメントをカスタムメードのベクターＰＢＳ３５Ｓ−Ｅ９に挿入した。カセット３５Ｓ−Ｎｉｉ−Ｅ９をＳｍａＩでの消化により移動させた。ＳｍａＩフラグメントをＣａｍ２３００のＳｍａＩ部位中に連結した。
【０１６８】
Ｎｒｔ−２−１ ｃＤＮＡ（Arabidopsis thaliana高アフィニティーニトレートトランスポーターＡＣＨ２、gene bank受託番号ＡＦ０１９７４９）を、FW プライマー 5'- GTTAACATGGGTTCTACTGATGAGCCCAGAA 3' (HpaI リンカー) および RW 5'-GTTAACTCAAGCATTGTTGGTTGCGTTCCCT-3' (HpaI リンカー)を用いるＬＲ−ＰＣＲにより増幅した。得られたフラグメントをテイリング処理し、Ｐｇｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。ＨｐａＩでの消化によりインサートを遊離させ、平滑末端フラグメントをカスタムメードのベクターＰＢＳ  ３５Ｓ−Ｅ９に挿入した。ＳｍａＩを用いてカセット３５Ｓ−ＡＣＨ２−Ｅ９を切り出し、Ｃａｍｂｒｉａ２３００形質転換ベクターに移行させた（図２７）。
下記のｃＤＮＡについて同じ手順を行った。
【０１６９】
ＸｅｎＡ ｃＤＮＡ（XenobioticレダクターゼＡ、gene bank受託番号ＡＦ１５４０６１）を、Fw プライマー 5'-GTTAACATGTCCGCACTGTTCGAACCCTACA-3'(HpaI リンカー) および RW 5'-GTTAACTCAGCGATAGCGCTCAAGCCAGTGC-3'(HpaI リンカー)を用いて増幅した。増幅したフラグメントをテイリング処理し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。プラスミドをＨｐａＩで消化することによりＸｅｎＡ ｃＤＮＡを遊離させて平滑末端フラグメントを得て、このフラグメントをＰｂｓ５３Ｓ−Ｅ９クローニングベクターのＳｔｕＩ部位中に連結した。Ｐｂｓ３５Ｓ−ＸｅｎＡ−Ｅ９プラスミドをＫｐｎＩで消化することによりカセット３５Ｓ−ＸｅｎＡ−Ｅ９を切り出した。該ＫｐｎＩフラグメントを形質転換ベクターＣａｍ２３００のＫｐｎＩ部位に挿入した（図２８）。
【０１７０】
ＸｅｎＢ ｃＤＮＡ（XenobioticレダクターゼＢ、gene bank受託番号ＡＦ１５４０６２）を、Fw プライマー 5'-GTTAACATGGCAATCATTTTCGATCCGATCA-3'(HpaI リンカー) および RW 5'-GTTAACTTACAGCGTCGGGTAGTCGATGTAG-3'(HpaI リンカー)を用いて増幅した。得られたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。ＨｐａＩでの消化によりインサートを遊離させ、平滑末端フラグメントをカスタムメードのベクターＰＢＳ  ３５Ｓ−Ｅ９に挿入した。ＳｍａＩを用いてカセット３５Ｓ−ＸｅｎＢ−Ｅ９を切り出し、Ｃａｍｂｒｉａ２３００形質転換ベクターに移した（図２９）。
【０１７１】
Ｏｎｒ ｃＤＮＡ（ペンタエリトリトールテトラニトレートレダクターゼ、gene bank受託番号Ｕ６８７５９）を、プライマーの組み合わせFW 5'-GTTAACATGGCCGCTAAAAG-3'(HpaI リンカー) および RW 5'-GTTAACGCTATCAATGTACAAAGC-3'(HpaI リンカー)を用いて増幅した。得られたフラグメントをテイリング処理し、ｐＧｅｍ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結した。ＨｐａＩでの消化によりインサートを遊離させ、平滑末端フラグメントをカスタムメードのベクターＰＢＳ  ３５Ｓ−Ｅ９に挿入した。ＫｐｎＩを用いてカセット３５Ｓ−Ｏｎｒ−Ｅ９を切り出し、カセットをＣａｍ２３００形質転換ベクターのＫｐｎＩ部位中に連結することにより、Ｃａｍｂｒｉａに移行させた（図３０）。
【０１７２】
実施例６  植物の形質転換
下記の構築物を野生型バックグラウンド（デンマークのコペンハーゲンおよびその付近で成長しているエコタイプＢｒａ  Ｗ＋）中に形質転換した。
ＰＡＰ１  ｃＤＮＡ        ３５Ｓ−ＰＡＰ１−Ｅ９
ＰＡＰ２  ｃＤＮＡ        ３５Ｓ−ＰＡＰ２−Ｅ９
ヒグロマイシンにてＴ１系統を選択し、赤色植物を選択した。抗生物質により選択した系統２を植えかえて、バスタマーカーに関して１：３（感受性植物２５％、耐性植物７５％）にセグレゲーションする植物系統を将来の研究のために増やした。１：３はＴ−ＤＮＡ組み換えの単一部位を示す。１２の耐性植物を土に移し、種子を付けさせた。Ｔ３の種子を撒き、１００％耐性を示した植物（選択マーカーに関してホモ接合）をｔｔ４変異種と交雑させた。この交雑において、ｔｔ４ｘ３５Ｓ−ＰＡＰ１−Ｅ９のＦ１種子をバスタ（basta）上にプレートし、１２のｂａｒｒ植物を土に植えかえた。交雑した株のセグレゲーションしている集団は明確な赤色または緑色の表現型を示した。Ｆ２世代において、着色を示さない植物およびヒグロマイシン耐性植物を選択し、増やして種子を付けさせた。ｆ２集団のセグレゲーションの分析により、Ｔ−ＤＮＡに関する３：１の割合からの逸脱が示され（３５Ｓ−ＰＡＰ１−Ｅ９が優性）、したがって、ｔｔ４変異とＴ−ＤＮＡが独立である場合には集団のうち７５％が赤色であると期待された。２３０：１６３の緑色：赤色の割合が観察され、セグレゲーションが独立でないことが示された。セグレゲーションしている集団の緑色個体はｂａｒｒおよびｂａｒｓの両方の表現型を示し、緑色個体中のＴ−ＤＮＡの存在は、ｔｔ４変異がこれらの植物における色素（アントシアニン）の産生をブロックするという基本原理を支持するものであることがわかった。ｆ２集団由来の２３９の緑色個体におけるｂａｒｒおよびｂａｒｓ植物の分布は１６２：７７であった。緑色ｂａｒｒ個体の種子は特徴的なｔｔ４表現型の種子コートを示した。Ｆ３を植えかえ、選択マーカーに対して１００％耐性を示す植物を最終的に選択した。このようにして、下記の遺伝子型を有する植物を得た：ｔｔ４／ｔｔ４／／３５Ｓ−ＰＡＰ１／３５Ｓ−ＰＡＰ１。３５Ｓ−ＰＡＰ２についても同じ手順を用いて最終植物系統ｔｔ４／ｔｔ４／／３５Ｓ−ＰＡＰ２／３５Ｓ−ＰＡＰ２を得た。２つの系統を交雑させ、両方の植物系統がｔｔ４に関してホモ接合なので、すべての子孫はｔｔ４であり、ＦＷ ３５ＳプライマーならびにＰＡＰ１およびＰＡＰ２に関して逆方向プライマーを用いるＰＣＲにより遺伝子型ｔｔ４／ｔｔ４／／３５Ｓ−ＰＡＰ１／３５Ｓ−ＰＡＰ１／／３５Ｓ−ＰＡＰ２／３５Ｓ−ＰＡＰ２を有する系統を選択した。この系統をＢｒＣ系統（Bracifeae Cassette Line）と命名した。
【０１７３】
下記の構築物をＢｒＣ系統中に形質転換した：
重金属検出
GSH1-CHS
GSH2-CHS
PCS1-CHS
PCS2-CHS
GST30-CHS
CAD1-CHS
重金属結合
35S-GSH1-E9
35S-GSH2-E9
35S-CAD1-E9
35S-Nramp1-E9
35S-Nramp2-E9
35S-PCS1-E9
35S-PCS2-E9
ニトロ検出
Nr1-CHS
Nr2-CHS
Nii-CHS
Ntr2-1-CHS
ニトロ代謝
35S-Nr1-E9
35S-Nr2-E9
35S-Nii-E9
35S-Nrt12-1-E9
35S-XenA-E9
35S-XenB-E9
35S-Onr-E9
【０１７４】
下記の構築物をＢｒａＷ＋系統およびＣｏｌ−０系統中に形質転換する：
重金属検出
GSH1-CHS
GSH2-CHS
PCS1-CHS
PCS2-CHS
GST30-CHS
CAD1-CHS
GSH1-LUC
GSH2-LUC
PCS1-LUC
PCS2-LUC
GST30-LUC
CAD1-LUC
GSH1-GFP
GSH2-GFP
PCS1-GFP
PCS2-GFP
GST30-GFP
CAD1-GFP
重金属結合
35S-GSH1-E9
35S-GSH2-E9
35S-CAD1-E9
35S-Nramp1-E9
35S-Nramp2-E9
35S-PCS1-E9
35S-PCS2-E9
ニトロ検出
Nr1-CHS
Nr2-CHS
Nii-CHS
Ntr2-1-CHS
Nr1-LUC
Nr2-LUC
Nii-LUC
Ntr2-1-LUC
Nr1-GFP
Nr2-GFP
Nii-GFP
Ntr2-1-GFP
ニトロ代謝
35S-Nr1-E9
35S-Nr2-E9
35S-Nii-E9
35S-Nrt12-1-E9
35S-XenA-E9
35S-XenB-E9
35S-Onr-E9
実施例７  植物における重金属検出系の試験
下記の構築物をＢｒＣ毛糸中に形質転換する：
GSH1-CHS
GSH2-CHS
PCS1-CHS
PCS2-CHS
GST30-CHS
CAD1-CHS
得られた形質転換系統を、ＭＳプレート中の下記の重金属の量を増加させていくことによりＭＳプレート上で試験する：Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｓｅ、Ａｕ、Ａｇ。これらの濃度範囲は０．０００２５、０．０００５、０．００１、０．００１５、０．００２、０．００２５、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、例えば０．７、０．８、０．９、１、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭである。このようにして、重金属の異なる濃度において色を変化させる植物を選択する。同時に、異なるプロモーターからの種々の重金属に対する応答、すなわち個々のプロモーターの特異性を調べる。さらに同時に、土を入れた９インチのポットでの実験を行い、これらのポットにプレートでの植物実験と同じ濃度およびタイプの重金属の溶液を与える。
【０１７５】
実施例８  植物におけるニトロ検出系の試験
下記の構築物をＢｒＣ系統中に形質転換する：
Nr1-CHS
Nr2-CHS
Nii-CHS
Ntr2-1-CHS
得られた形質転換系統を、ＭＳプレート中の下記のニトロ化合物の量を増加させていくことによりＭＳプレート上で色の変化につき試験する：ＴＮＴ（２，４，６−トリニトロトルエン）、ＰＥＴＮ（ペンタエリトリトールテトラニトレート）またはＲＤＸ（シクロトリメチレントリニトロアミン）。これらの濃度範囲は０．０００２５、０．０００５、０．００１、０．００１５、０．００２、０．００２５、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、例えば０．７、０．８、０．９、１、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭである。異なる濃度において観察された色の変化に基づいて系統を選択する。９インチのポットで成長する植物について同様の実験を行う。ポットに土を入れて、土のバッファー効果を調べる。
【０１７６】
実施例８ａ
ＢｒＣ系統をＮＩＩ−ＣＨＳ  Ｅ９構築物で形質転換した。ＮＩＩ−ＣＨＳ−Ｅ９（Ｔ１）植物系統を、０．０１ｍＭ ＴＮＴを補足したＭＳプレート上で成長させた。植物は明確な赤色色素を生じた。２週間後、植物をＴＮＴ不含土壌に移し、その後色素精製が除々に消失した。
【０１７７】
実施例９  重金属結合の試験
重金属蓄積能を向上させるために、下記の構築物をＢｒＣ系統中に形質転換する：
35S-GSH1-E9
35S-GSH2-E9
35S-CAD1-E9
35S-Nramp1-E9
35S-Nramp2-E9
35S-PCS1-E9
35S-PCS2-E9
重金属結合構築物を担持する形質転換系統を、植物の地上部分における重金属濃度を増加させる能力に関して試験した。種子をＭＳ上に撒き、下記の重金属の濃度を増加させていく：Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｓｅ、Ａｕ、Ａｇ。これらの濃度範囲は０．０００２５、０．０００５、０．００１、０．００１５、０．００２、０．００２５、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、例えば０．７、０．８、０．９、１、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭである。重金属分析のための標準的な方法により試料を分析する。高、中、低結合能を示す系統を選択し、重金属検出植物との交雑用とする。
【０１７８】
実施例１０  ニトロ代謝試験
下記の構築物をＢｒＣ系統中に形質転換する：
35S-Nr1-E9    
35S-Nr2-E9      
35S-Nii-E9    
35S-Nrt12-1-E9    
35S-XenA-E9    
35S-XenB-E9    
35S-Onr-E9 
得られた形質転換系統を、下記のニトロ化合物の濃度を上昇させてＭＳプレート上で試験する：ＴＮＴ（２，４，６−トリニトロトルエン）、ＰＥＴＮ（ペンタエリトリトールテトラニトレート）またはＲＤＸ（シクロトリメチレントリニトロアミン）。これらの濃度範囲は０．０００２５、０．０００５、０．００１、０．００１５、０．００２、０．００２５、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、例えば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、例えば０．７、０．８、０．９、１、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍＭである。爆薬に対してより高い／より低い耐性を示す植物を選択し、さらなる分析およびニトロ検出系統との交雑用とする。
【０１７９】
実施例１１  重金属の検出および結合を得るための植物の交雑
高濃度の重金属を示す系統を検出用系統と交雑させて下記の雑種を得る：
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9    
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9   
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9  
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
GSH1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9    
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9   
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9  
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
GSH2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9    
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9   
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9  
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
PCS1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9    
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9   
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9  
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
PCS2-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9    
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9   
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9  
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
GST30-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9    
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9   
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9  
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9
CAD1-CHS/35S-GSH1-E9/35S-GSH2-E9/ 35S-CAD1-E9/35S-Nramp1-E9/35S-Nramp2-E9/35S-PCS1-E9/35S-PCS2-E9
【０１８０】
実施例１２  増加したＮＯ２遊離を得るための植物の交雑
爆薬からのＮＯ２遊離を増加させるために、下記の雑種を得る：
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9
Nr1-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9/35S-Onr-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9
Nr2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9/35S-Onr-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9
Nii-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9/35S-Onr-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9
Ntr1-2-CHS/35S-Nr1-E9/35S-Nr2-E9/35S-Nii-E9/35S-Nrt12-1-E9/35S-XenA-E9/35S-XenB-E9/35S-Onr-E9
【０１８１】
実施例１３  重金属プロモーターの調節
プロモーター−ＬＵＣについてより詳細な説明を行うために、野生型ＢｒａＷ＋およびＣｏｌ−０中において系統：
GSH1-LUC
GSH2-LUC
PCS1-LUC
PCS2-LUC
GST30-LUC
CAD1-LUC
を得て、下記の重金属を含むＭＳプレートに撒いた：対照、Ｃｕ＋＋、Ｎｉ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ａｇ＋＋、Ｈｇ＋＋、Ｃｄ＋＋およびＰｂ＋＋。Meier et al. 2000に記載されたようにＮ２冷却ＣＣＤカメラで映像を得た。重金属処理後に明確な誘導を示す系統を、個々の金属に対する特異性に関して試験した。
【０１８２】
実施例１３ａ
ＧＳＨ１−ＬＵＣ−Ｅ９構築物をＢｒＣ系統中に形質転換した。（ｔ２）植物の葉を、Ｈ２Ｏまたは１００μＭ Ｃｄ２＋または１００μＭ Ｃｕ２＋のいずれかで３０分処理したところ、両方の重金属は３０分後にプロモーターを誘導することがＮ２冷却ＣＣＤカメラの映像により示された。ヒグロマイシンプレートでの形質転換植物の選択により、関連種Capsella Bursa-pastorisもまたＧＳＨ１−プロモーター構築物で形質転換されうることが示された。
【０１８３】
実施例１４  重金属プロモーターの発現パターン
プロモーターの発現パターンを得るために、ＢｒａＷ＋およびＣｏｌ−０バックグラウンド中に下記の構築物
GSH1-GFP
GSH2-GFP
PCS1-GFP
PCS2-GFP
GST30-GFP
CAD1-GFP
を有する系統を得て、共焦点顕微鏡観察により分析して、プロモーターの発現パターンを調べる。
【０１８４】
実施例１５  ニトロ−プロモーターの調節
ニトロ−プロモーター−ＬＵＣの調節をより詳細に説明するために、野生型ＢｒａＷ＋およびＣｏｌ−０中において系統：
Nr1-LUC
Nr2-LUC
Nii-LUC
Ntr2-1-LUC
を得る。下記の爆薬を含有するＭＳプレートに種子を撒いた：ＴＮＴ（２，４，６−トリニトロトルエン）、ＰＥＴＮ（ペンタエリトリトールテトラニトレート）またはＲＤＸ（シクロトリメチレントリニトロアミン）。爆薬濃度は０．０１μＭ、０．０２μＭ０．０３μＭ０．０４μＭ０．０５μＭであった。プレートに撒いてから１０日後にＮ２冷却ＣＣＤカメラで植物の画像を得た。
【０１８５】
実施例１５ａ
ＢｒＣ系統をＮＩＩ−ＬＵＣ−Ｅ９構築物で形質転換した。
ＮＩＩ−ＬＵＣ−Ｅ９構築物で形質転換した植物を、ＴＮＴ（２，４，６−トリニトロトルエン）濃度を増加させて（０．０１μＭ〜０．０５μＭ）ＭＳプレート上で成長させた。高濃度において植物の生長が遅延された。図３１に示す棒グラフによれば、異なる処理についてのＬＵＣ発現／エリアの値はプロモーターの誘導を示すことがわかる。
【０１８６】
実施例１６  ニトロ−プロモーターの発現パターン
プロモーターの発現パターンを得るために、下記の構築物を担持する系統をＢｒａＷ＋およびＣｏｌ−０バックグラウンドにおいて分析する。共焦点顕微鏡を用いてプロモーターの発現パターンを調べる。
【０１８７】
実施例１７
E. coli（Ｃ）、Pseudomonas putita（ＰＵ）、Pseudomonas syringae（ＳＹ）、Pseudomonas fluorescens（ＦＬ）の細菌細胞を、ＴＮＴおよびＲＤＸ濃度を増加させつつＬＢプレート上で増殖させた。ＰＵおよびＦＬは爆薬に対してより耐性があり、レダクターゼＥｘｅｎＡおよびＥｘｅｎＢの存在が示された。その後、これらをクローニングし、植物の形質転換に使用した。
【０１８８】
参考文献
Alonso, J.M., Hirayama, T., Roman G., Nourizadeh, S, Ecker J.R.
EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science 1999 Jun 25;284(5423):2148-52
Bechtold, N. and Pelletier, G.
In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods Mol Biol 82, 259-66 (1998)
Boline F.
Leveling land mines with biotechnology. Nat Biotechnol. 1999 Aug;17(8):732
Borevitz, J.O., Xia, Y., Blount, J., Dixon, R.A., Lamb, C.
Activation tagging identifies a conserved MYB regulator of phenylpropanoid
biosynthesis. Plant Cell  2000 Dec;12(12):2383-2394
Borgwardt, C.
ODIS - Ordnance Detection and Identification System. In Proceedings of WAPM'95, Lausanne, Switzerland, June 30-July 1st, 1995, pp. 37-43.
Court, D.L., Sawitzke, J.A. and Thomason, L.C.
Genetic engineering using homologous recombination. Annu Rev Genet 36, 361-688 (2002)
Cremers, D.A., Ebinger, M.H., Breshears D.D., Unkefer, P.J., Kammerdiener, S.A., Ferris, M.J., Catlett, K.M. and Brown, J.R.
Measuring Total Soil Carbon with Laser-Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) Journal of Environmental Quality 30:2202-2206 (2001)
Gallie, D.R., Sleat, D.E., Watts, J.W., Turner, P.C., and Wilson, T.M. 
The 5'-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo. Nucleic Acids Res 15, 3257-73 (1987)
Gong, P., Wilke, B., Fleischmann, S.
Soil-based phytotoxicity of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) to terrestrial higher plants. Arch Environ Contam Toxicol. 1999 Feb;36(2):152-7
Gorontzy, T., Drzyzga, O., Kahl, M. W.,  Bruns-Nagel, D., Breitung, J., von Loew, E., and Blotevogel, K.H. 
Microbial degradation of explosives and related compounds. Crit. Rev. Microbiol. 20:265-284 (1994)
Ha, S.B., Smith, A.P., Howden, R., Dietrich, W.M., Bugg, S., O'Connell, M.J., Goldsbrough, P.B., Cobbett, C.S.
Phytochelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast Schizosaccharomyces pombe. Plant Cell 1999 Jun;11(6):1153-64
Haas, R.J., and Simmons, B.P.  
Measurement of Trinitrotoluene (TNT) and Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX) in Soil by Enzyme Immunoassay and High Performance Liquid Chromatography (EPA Method 8330). California Environmental Protection Agency, Department of Toxic Substances Control, Hazardous Materials Laboratory, March. (1995) 
He, M., Yang, Z.Y., Nie, Y.F., Wang, J., Xu, P.
New type of class I bacterial 5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutants with enhanced tolerance to glyphosate. Biochim Biophys Acta 2001 Nov 7;1568(1):1-6.
Hesselsoe, M., Jensen, D., Skals, K., Olesen, T., Moldrup, P., Roslev, P., Mortensen, G.K., Henriksen.
Degradation of 4-nonylphenol in homogeneous and nonhomogeneous mixtures of soil and sewage sludge. Environ Sci Technol 2001 Sep 15;35(18):3695-700.
Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., Bevan, M.W.
GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 1987 Dec 20;6(13):3901-7. 
Jefferson, R.A., Bevan, M., Kavanagh, T.
The use of the Escherichia coli beta-glucuronidase as a gene fusion marker for
studies of gene expression in higher plants. Biochem Soc Trans. 1987 Feb;15(1):17-8. 
Kertbundit, S., De Greve, H., Deboeck, F., Van Montagu, M., Hernalsteens, J.P.
In vivo random beta-glucuronidase gene fusions in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Jun 15;88(12):5212-6.
Lamb, C.J., Ryals, J.A., Ward, E.R., Dixon, R.A.
Emerging strategies for enhancing crop resistance to microbial pathogens.
Biotechnology (N Y) 1992 Nov;10(11):1436-45
May, M.J., Leaver, C.J.
Arabidopsis thaliana gamma-glutamylcysteine synthetase is structurally unrelated to mammalian, yeast, and Escherichia coli homologs. Proc Natl Acad Sci U S A  1994 Oct 11;91(21):10059-63
Meier, C., Bouquin, T., Nielsen, M.E., Raventos, D., Mattsson, O., Rocher, A., Schomburg, F., Amasino, R.M., Mundy, J.
Gibberellin response mutants identified by luciferase imaging. Plant J  2001 Mar;25(5):509-19 
Miljotilstandsrapport: "Natur og miljo 1997. Pavirkninger og tilstand", Danmarks Miljoundersogelser (DMU) (National Environmental Research Institute, Denmark)
Pietrzak, M., Shillito, R.D., Hohn, T., Potrykus, I.
Expression in plants of two bacterial antibiotic resistance genes after protoplast transformation with a new plant expression vector. Nucleic Acids Res 1986 Jul 25;14(14):5857-68
Raines, G. L., and Canney, F. C.
Vegetation and geology in Siegal, B. S., and Gillespie, A. R., eds., Remote Sensing in Geology: New York, John Wiley and Sons, Inc., p. 365-380 (1980)
Rugh, C.L., Wilde, H.D., Stack, N.C., Thompson, D.M., Summers, A.O. and Meagher, R.B.
Mercuric ion reduction and resistance in transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a modified bacterial merA gene. 1996. Proceedings, National Academy of Sciences, 93:3182-3187.
Sambrook et al. 1989 
Molecular cloning a laboratory manual second edition cold spring habor laboratory  press 1989
Scudiero et al. 2001
Structural and function analysis of metal regulatory elements in the promotor region of genes encoding mtallothionein isoforms in the Antarctic fish Chionodraco hamatus (icefish) Gene (274) 199-208
Shen, C.F., Guiot, S.R., Thiboutot, S., Ampleman, G., Hawari, J.
Fate of explosives and their metabolites in bioslurry treatment process. Biodegradation 1998; 8: 339-347.
Spain, J.C.  
Biodegradation of nitroaromatic compounds. Annu. Rev. Microbiol. 49:523-555 (1995)
Taha, M.R., Soewarto, H., Acar, Y.B., Gale, R.J., Zappi, M.E.
Surfactant enhanced desorption of TNT from soil. Water, Air and Soil pollution 1997; 100: 33-48
Velten, J., Schell, J.
Selection-expression plasmid vectors for use in genetic transformation of higher plants. Nucleic Acids Res  1985 Oct 11;13(19):6981-98
White, G.F. and Snape, J.R. 
Microbial cleavage of nitrate esters: defusing the environment. J. Gen. Microbiol. 139:1947-1957 (1993)
Zhu, Y.L., Pilon-Smits, E.A., Tarun, A.S., Weber, S.U., Jouanin, L., Terry, N.
Cadmium tolerance and accumulation in Indian mustard is enhanced by overexpressing gamma-glutamylcysteine synthetase. Plant Physiol. 1999 Dec;121(4):1169-78
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
原文に記載なし。
【図１】
2005534292.tif 000006
【図２】
2005534292.tif 000007
【図３】
2005534292.tif 000008
【図４】
2005534292.tif 000009
【図５】
2005534292.tif 000010
【図６】
2005534292.tif 000011
【図７】
2005534292.tif 000012
【図８】
2005534292.tif 000013
【図９】
2005534292.tif 000014
【図１０】
2005534292.tif 000015
【図１１】
2005534292.tif 000016
【図１２】
2005534292.tif 000017
【図１３】
2005534292.tif 000018
【図１４】
2005534292.tif 000019
【図１５】
2005534292.tif 000020
【図１６】
2005534292.tif 000021
【図１７】
2005534292.tif 000022
【図１８】
2005534292.tif 000023
【図１９】
2005534292.tif 000024
【図２０】
2005534292.tif 000025
【図２１】
2005534292.tif 000026
【図２２】
2005534292.tif 000027
【図２３】
2005534292.tif 000028
【図２４】
2005534292.tif 000029
【図２５】
2005534292.tif 000030
【図２６】
2005534292.tif 000031
【図２７】
2005534292.tif 000032
【図２８】
2005534292.tif 000033
【図２９】
2005534292.tif 000034
【図３０】
2005534292.tif 000035
【図３１】
2005534292.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月2日(2005.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005534292000001.app
【国際調査報告】
2005534292.tif 000037
2005534292.tif 000038
2005534292.tif 000039
2005534292.tif 000040
2005534292.tif 000041