(57)【要約】脳へ組成物を標的化するための方法および組成物が開示される。本発明の方法および組成物は、治療タンパク質を脳へ標的化するために、ＩＧＦ部分をその治療タンパク質と結合する工程を包含する。ＩＧＦ標的化部分を含む可溶性融合タンパク質は、血流から脳内の神経組織に輸送される。本発明の方法および組成物は、リソソーム貯蔵疾患を処置するための治療的用途を包含する。本発明はまた、ＩＧＦ融合タンパク質を発現するための核酸および細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳に対してポリペプチドを標的化するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ＩＧＦ部分に結合した過小グリコシル化ポリペプチドを哺乳動物に提供して、それによって、上記哺乳動物の脳におけるポリペプチドの蓄積を生じる工程
を包含する、方法。
【請求項２】
ＣＮＳ標的化ポリペプチドを生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
ＩＧＦ部分の結合した過小グリコシル化ポリペプチドを発現して、それによって、ＣＮＳ標的タグを有する過小グリコシル化ポリペプチドを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項３】
ＩＧＦ部分に結合した過小グリコシル化ポリペプチドを含む組成物であって、ここで、上記ＩＧＦ部分は、該組成物を脳に対して標的化する方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドおよびＩＧＦ部分は融合タンパク質として発現される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項３または４に記載の組成物であって、前記ＩＧＦ部分がＩＧＦ−Ｉ標的化部分である、組成物。
【請求項６】
過小グリコシル化治療融合タンパク質であって、以下：
過小グリコシル化治療ドメイン；
患者のＣＮＳでの該治療ドメインの局在を増大する下グリコシリ化標的化ドメインであって、該治療ドメインは治療的に活性である、ドメイン；
を含む、タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の治療融合タンパク質であって、前記標的化ドメインが、前記ＣＮＳにおける細胞の外側表面上のレセプターの細胞化ドメインにさらに結合し、そして該レセプターが内在化されたとき、細胞下画分に該治療ドメインの局在化を可能にし、ここで、該治療ドメインは治療的に活性である、治療融合タンパク質。
【請求項８】
請求項６に記載の治療融合タンパク質であって、前記標的化ドメインがＩＧＦ−Ｉ標的化部分およびＩＧＦ−ＩＩ標的化部分を含む、治療融合タンパク質。
【請求項９】
請求項６に記載の治療融合タンパク質であって、ここで、前記細胞下画分がリソソーム、エンドソーム、小胞体、およびゴルジ体からなる群より選択される、治療融合タンパク質。
【請求項１０】
前記細胞下画分がリソソームである、請求項９に記載の治療融合タンパク質。
【請求項１１】
前記レセプターが連続的なエンドサイトーシスを受ける、請求項７に記載の治療融合タンパク質。
【請求項１２】
前記治療ドメインが治療的酵素活性を有している、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記酵素活性の細胞欠失または細胞下欠失がヒト疾患と関連する、請求項１２に記載の治療融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ヒト疾患がリソソーム貯蔵性疾患である、請求項１３に記載の治療融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項６に記載の過小グリコシル化治療融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１７】
過小グリコシル化治療融合タンパク質を生成する方法であって、該方法は、該治療融合タンパク質の発現を可能にする条件を請求項１６に記載の細胞に提供する、方法。
【請求項１８】
インビトロで前記細胞を培養する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物体内で前記細胞を維持する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療融合タンパク質を収集する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
請求項６に記載の下グリコシル治療融合タンパク質を患者に投与する工程を包含する、該患者を処置する方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の核酸を患者に投与する工程を包含する、該患者を処置する方法。
【請求項２３】
請求項１６に記載の細胞を患者に投与する工程を包含する、該患者を処置する方法。
【請求項２４】
患者を処置する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）哺乳類のリソソームにおいて治療活性である治療剤および哺乳動物ＣＮＳにおいて治療剤の蓄積を生じる標的過部分を含む過小グリコシル化標的治療剤を合成する工程；および
（ｉｉ）該患者に該標的化治療剤を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記ＩＧＦ部分がＩＧＦ−Ｉ標的化部分である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記過小グリコシル化ポリペプチドが非グリコシル化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
前記過小グリコシル化ポリペプチドが脱グリコシル化されている、請求項１または請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、以下の利益を主張する：米国特許第６０／３２９，６５０号（２００１年１０月１６日出願）；同第１０／１３６，６３９号（２００２年４月３０日出願）；同第１０／１３６，８４１号（２００２年４月３０日出願）；同第６０／３８４，４５２号（２００２年５月２９日出願）、同第６０／３８６，０１９号（２００２年６月５日出願）ならびに同第６０／４０８，８１６号（２００２年９月６日出願）（これらの開示の全体は、本明細書中で参考として援用される）。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、脳にタンパク質を特異的に送達するための手段を提供する。脳に対してタンパク質を標的化する能力は、神経学的疾患の処置において大変有用である。本発明の方法および組成物は、血液脳関門をわたって細胞に対してタンパク質を標的化するのに有用であり、特に、ＣＮＳ中の細胞（ニューロン細胞、マクロファージ細胞、および他の細胞型）のリソソームにタンパク質を標的化するのに有用である。従って、本発明は、治療的に有用であるタンパク質を送達して、ＣＮＳに影響を与えるリソソーム貯蔵疾患（「ＬＳＤ」）を処置する方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
血液脳関門は、中枢神経系（ＣＮＳ）における恒常的な環境を維持する。血液を脳に供給するこれらの毛細管は、毛細管内皮膜を介して殆どの分子の通過をブロックする緊密な接合点である。これらの膜は脂溶性物質の通過を可能にするが、水溶性物質（例えば、グルコース、タンパク質、およびアミノ酸）は、血液脳関門を通過しない。グルコースおよび必須アミノ酸を、血液脳関門をわたって輸送するための媒介輸送機構が、存在する。能動輸送機構は、過剰となった、カリウムのような分子を脳から取り除く。しかし、血液脳関門は、薬物のＣＮＳへの送達を妨げる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
多くの神経学的疾患が、ＣＮＳにおける細胞性の欠陥から生じる。具体的には、多くのリソソーム貯蔵疾患は、ＣＮＳの細胞に影響を与え、そして、中程度の神経学的症状から重篤な神経学的症状を生じる。従って、ＣＮＳに治療組成物を送達する能力は、多くの疾患（リソソーム貯蔵疾患を含む）に対する効果的な処置の重要な局面である。
【０００５】
必要な薬物をＣＮＳに送達する方法（例えば、くも膜下送達によるＣＮＳ内への直接送達）が設計されてきた。しかし、血液脳関門を介して血液からＣＮＳへ薬物および特にタンパク質ベースの薬物を効果的に送達する方法は、当該分野で利用可能ではない。
【０００６】
従って、血液脳関門のＣＮＳ側における脳実質にタンパク質を送達する方法、特に、ＣＮＳにおける細胞のリソソームにタンパク質を送達する方法における、必要性が当該分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、血流から脳またはＣＮＳへ組成物を標的化するため普遍的な方法および組成物を提供する。本発明に従って、ＩＧＦ部分は、血液脳関門の他の側面における脳実質に対する血流からの分子の標的化するのに使用される。好ましい分子は、治療ポリペプチドである。
【０００８】
従って、本発明は、１局面において、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）部分またはタグに結合した治療因子を含むタンパク質に関する。１実施形態において、タンパク質は、ＩＧＦタグと共に融合タンパク質として発現される。１実施形態において、ＩＧＦタグは、ＩＧＦ−ＩＩまたはその一部分を含まない。別の実施形態において、融合タンパク質はまた、ＩＧＦ−ＩＩの２倍は十分にあるリソソーム標的化部分を含み、その結果、その標的化部分は、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合して、リソソームによる取り込みを媒介する。別の実施形態において、融合タンパク質はまた、そのタンパク質をリソソームに標的化するためにマンノース−６−リン酸を踏む。
【０００９】
好ましいＩＧＦ部分またはタグは、ＩＧＦ−ＩタグまたはＩＧＦ−ＩＩタグである。最も好ましいＩＧＦタグは、ＩＧＦ−Ｉタグである。１局面において、そのＩＧＦタグは、インタクトなＩＧＦ−Ｉタンパク質またはＩＧＩ−ＩＩタンパク質である。あるいは、ＩＧＦタグは、血液脳関門をわたって標的化するのに十分であるＩＧＦ−Ｉタンパク質またはＩＧＩ−ＩＩタンパク質の一部分である。好ましい部分は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩのいずれかのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、もしくはＤドメインまたはＣ末端領域あるいはそれらの部分のうちの少なくとも１つを含む。１つの実施形態において、ＩＧＦタグは、ＡドメインまたはＢドメインを含む。本発明に従って、そのＡドメインおよびＢドメインは、好ましいＩＧＦ部分の中心となるコア構造特徴を提供する。ＡドメインおよびＢドメインは、リンカーペプチドによって結合され得る。あるいは、そのＡドメインおよびＢドメインは、二量体形成してＩＧＦタグを形成する別個のペプチドを提供する。好ましくは、同一ＩＧＦタンパク質からのＡドメインおよびＢドメインが使用され得る。しかし、ＩＧＦ−ＩからのＡドメインは、ＩＧＦ−ＩＩからのＢドメインと結合され得る。同様に、ＩＧＦ−ＩＩからのＡドメインは、ＩＧＦ−ＩからのＢドメインと結合され得る。従って、本発明の組成物は、キメラＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−ＩＩ分子を含む。例えば、あるＩＧＦタンパク質に由来するＡドメインは、別のＩＧＦタンパク質のＣドメインおよびＢドメインと連結され得る。Ａドメイン、Ｂドメイン、およびＣドメインの代替的な組み合わせもまた、有用である。さらなる実施形態において、あるＩＧＦのＡドメインは、例えば、２アミノ酸架橋のようなアミノ酸架橋を使用することによって別のＩＧＦタンパク質のドメインに直接的に連結され得る。
【００１０】
最も好ましいＩＧＦ部分は、以下からなる群より選択されるＩＧＦ−Ｉ部分を含む：図１に示される、ＩＧＦ−Ｉ配列における、およそ残基１〜およそ残基２５からのＩＧＦ−Ｉフラグメント、およそ残基２５〜およそ残基４０からのＩＧＦ−Ｉフラグメント、およそ残基４０〜およそ残基６５からのＩＧＦ−Ｉフラグメント、ならびに、およそ残基６５〜およそ残基７０からのＩＧＦ−Ｉフラグメント。ＩＧＩ−ＩおよびＩＧＩ−ＩＩの好ましい代替的な領域は、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩのついて図１において示される領域のようなＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩとの間の相同性領域を含む。この図１に示される配列は、成熟ＩＧＦ−Ｉタンパク質および成熟ＩＧＦ−ＩＩタンパク質に関する。本明細書に記載される具体的なＩＧＦ改変体は、図１に示される成熟アミノ酸配列番号を参照する。さらなる実施形態において、ＩＧＦタグは、ＩＧＦタンパク質のＣ末端フラグメント、例えば、図２に示されるＣ末端からＤドメインの領域を含む。好ましいＩＧＦタグは、ＩＧＦ−Ｉ  Ｃ末端フラグメントを含む。さらに、本発明に従って、ＩＧＦタグは、血液脳関門をわたって脳実質へ本発明の組成物を有効に標的化するのに十分な、本明細書中に記載のＩＧＦタグの２倍はある配列を有するペプチドタグを含む。いくつかの実施形態において、ＩＧＦタグは、ＩＧＦ−Ｉタンパク質から少なくとも１つのペプチド配列、ＩＧＦ−ＩＩタンパク質から少なくとも１つのペプチド配列を含む。
【００１１】
最も好ましいＩＧＦタグは、ヒトＩＧＦタンパク質に基づく。しかし、他の哺乳動物（例えば、マウス、ラビット、サル、およびブタのＩＧＦタンパク質）に由来する、ＩＧＦタンパク質に基づくＩＧＦタグもまた、本発明に従う有用なものである。好ましいＩＧＦタグ（例えば、本明細書に記載の、ＩＧＦフラグメント、ＩＧＦペプチド、またはＩＧＦドメイン）は、１〜１００のアミノ酸長であり、より好ましくは、１０〜５０のアミノ酸長であり、そしてさらに好ましくは、２５アミノ酸長であり、そして、脳に結合するペプチドを標的化するのに十分である。好ましいＩＧＦフラグメント、ＩＧＦペプチド、またはＩＧＦドメインは、成熟ＩＧＦ−Ｉ配列および成熟ＩＧＦ−ＩＩ配列に基づく。
【００１２】
本発明のＩＧＦタグは、治療ペプチドの、Ｎ末端、Ｃ末端、その本体の中、またはこれらの組み合わせにおいて治療ペプチドと融合し得る。ＩＧＦ部分が、治療タンパク質のＮ末端に融合されるとき、ＩＧＦシグナルペプチドが好ましくはその発現構築物中に含まれる。しかし、ＩＧＦシグナルペプチドはまた、ＩＧＦ標的化部分がＣ末端または治療タンパク質の本体の中に位置付けられる場合、Ｎ末端に含まれ得る。好ましい実施形態において、ＩＧＦタグは、ペプチドのＣ末端に融合される。１実施形態において、ＩＧＦタグの第１ドメインは、治療ペプチドに融合され、そして、ＩＧＦタグの第２ドメインが、第１のドメインと二量体化して、脳に対して標的化されるタンパク質が標的化される形態で提供される。例えば、その治療ペプチドは、ＩＧＦタンパク質のＡドメインに融合され得、そして、別個に提供されたＢドメインと二量体化され得る。あるいは、治療ペプチドは、ＩＧＦタンパク質のＢドメインに融合され得、そして別個に提供されるＡドメインと二量体化され得る。
【００１３】
本発明はまた、血流から神経組織に到達し得るＩＧＦベースペプチドフラグメントを同定するための方法に関し、そして、この方法は、結合タンパク質を脳またはＣＮＳに対して標的化するのに有用である。本発明に従って、ＩＧＦベースのタグの有効性は、本明細書に記載の方法（例えば、放射性標識または組織化学染色に基づく局所アッセイ）を使用して評価され得る。
【００１４】
本発明はまた、ＩＧＦタグまたはＩＧＦタグに融合したタンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ分子）、およびこのような核酸を含む細胞（例えば、ＣＨＯ細胞培養物のような哺乳動物細胞培養物、および／または単細胞生物体（Ｅ，ｃｏｉｌまたはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ）を含むインビトロ培養細胞）に関する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、血液脳関門をわたって、特に、ＣＮＳの細胞のリソソームに標的化するため治療剤を生成するための方法に関する。この薬剤は、血液脳関門を介してタンパク質を標的化するのに有効な、治療剤およびＩＧＦタグの両方を含むタンパク質をコードする核酸を発現する細胞を培養することによって生成される。次いで、このタンパク質は、（例えば、その細胞の周辺の環境から、またはその細胞を溶解することによって）収集される。本発明はまた、本明細書に記載のタンパク質組成物に関連する。
【００１６】
従って、本発明は、一局面において、標的化部分と、治療的に活性でありかつ好ましくは哺乳動物リソソームにおいて活性である治療剤とを含む標的化治療剤に関する。「治療的に活性」は、本明細書中で使用される場合、その活性を欠損している細胞またはその区画に、酵素活性を与える、少なくともポリペプチドまたは他の分子を包含する。「治療的に活性」はまた、細胞における生化学的欠損を改善するかまたは補うことを意図されるほかのポリペプチドまたは他の分子を包含するが、化学療法剤のように、主として細胞傷害性または細胞増殖抑制性である分子は包含しない。
【００１７】
一実施形態において、標的化部分は、レセプターが標的細胞の形質膜に存在する場合に、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインに、Ｍ６Ｐ非依存性の様式で結合するための手段（例えば、分子）である。別の実施形態において、この標的化部分は、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインに結合する非グリコシル化リソソーム標的化ドメインである。いずれの実施形態においても、この標的化部分としては、例えば以下が挙げられ得る：ＩＧＦ−ＩＩ；レチノイン酸またはその誘導体；ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子レセプターのドメインに対して少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質；レセプターを認識する抗体可変ドメイン；またはこれらの改変体。いくつかの実施形態において、この標的化部分は、ｐＨ７．４（またはおよそ７．４）においてμＭ以下の解離定数（例えば、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、または１０−７Ｍと１０−１１Ｍとの間）で、およびｐＨ５．５（またはおよそ５．５）において少なくとも１０−６Ｍの解離定数で、そしてｐＨ７．４（またはおよそ７．４）における解離定数の少なくとも１０倍で、ＩＧＦレセプター（例えば、ＩＧＦ−ＩレセプターまたはＩＧＦ−ＩＩレセプター）に結合する。特定の実施形態において、結合のための手段は、レセプターの細胞外ドメインに、ｐＨ７．４（またはおよそ７．４）よりもｐＨ５．５（またはおよそ５．５）において少なくとも１０倍少ない親和性（ａｖｉｄｌｙ）で（すなわち、少なくとも１０倍大きい解離定数で）結合する；一実施形態において、ｐＨ５．５（またはおよそ５．５）における解離定数は、少なくとも１０−６Ｍである。さらなる実施形態において、結合のための手段との標的化治療剤の結合は、ｐＨ７．４（またはおよそ７．４）からｐＨ５．５（またはおよそ５．５）へのｐＨ変化により不安定化される。好ましい実施形態において、標的化部分は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対してＩＧＦ−ＩＩ様の結合親和性を保持するが、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して減少した結合親和性を有する（例えば、１０−５Ｍまたは１０−６Ｍより大きい解離定数）。
【００１８】
本発明はまた、例えば、哺乳動物ＣＮＳにおいて有効な治療剤およびこのタンパク質をＣＮＳに対して標的化するためのＩＧＦタグを含むタンパク質を投与することにより、患者（例えば、ＣＮＳにおける障害を有する患者、および好ましくはリソソーム貯蔵障害から生じるＣＮＳ障害を有する患者）を処置する方法に関する。好ましくは、このタンパク質はまた、リソソーム標的化部分（例えば、以下に記載されるもの：米国特許出願番号１０／１３６，８４１（２００２年４月３０日出願）；代理人事件番号ＳＹＭ−００７ＣＰ、表題「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２００２年１０月１６日出願）；および代理人事件番号ＳＹＭ−００９、表題「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２００２年１０月１６日出願））、またはこのタンパク質を、ＣＮＳにおける欠損細胞のリソソームに対して標的化するためのマンノース−６−ホスフェートを含む。同様に、本発明は、このようなタンパク質をコードする核酸を投与することにより、および／またはこのようなタンパク質をコードする核酸を含む細胞（例えば、ヒト細胞、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａのような生物）を投与することにより、患者を処置する方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、リソソームに標的化され、かつ／または血液脳関門を横切る治療的タンパク質、ならびに哺乳動物における循環において延長された半減期を有する治療的タンパク質を産生するための方法を提供する。この方法は、グリコシル化不全治療的タンパク質を産生することを包含する。本明細書中で使用される場合、「グリコシル化不全（の）（ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」とは、そのタンパク質が、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において産生された場合に通常は存在する１つ以上の炭水化物構造が省略されるか、除去されるか、改変されるか、またはマスクされ、それにより哺乳動物におけるそのタンパク質の半減期が延びるタンパク質をいう。従って、タンパク質は、実際には、１つ以上の炭水化物構造が存在しないことに起因してグリコシル化不全であり得るか、または循環からのクリアランスを促進する１つ以上の炭水化物構造の改変またはマスキングにより機能的にグリコシル化不全であり得る。例えば、構造は、（ｉ）マンノースレセプターまたはアシアロ糖タンパク質レセプターによる構造の認識を妨害する１つ以上のさらなる部分（例えば、炭水化物基、ホスフェート基、アルキル基など）の付加により、（ｉｉ）インビボでこれらのレセプターへの結合を妨害する、結合部分（例えば、レクチンあるいはマンノースレセプターまたはアシアロ糖タンパク質レセプターの細胞外部分）との糖タンパク質の共有結合または非共有結合により、あるいは（ｉｉｉ）炭水化物構造の全てまたは一部の存在をマスクすることにより、血液からのそのクリアランスを減少させるための、糖タンパク質のポリペプチド部分または炭水化物部分に対する任意の他の改変、によりマスクされ得る。
【００２０】
一実施形態において、治療的タンパク質は、従来の哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）がグリコシル化するようにはタンパク質をグリコシル化しない宿主（例えば、細菌または酵母）において産生される、ペプチド標的化部分（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、または標的レセプターに結合するのに有効なその部分）を含む。例えば、この宿主細胞により産生されたタンパク質は、末端マンノース残基、フコース残基、および／またはＮ−アセチルグルコサミン残基（これらは、マンノースレセプターにより認識される）を欠損し得るか、または完全にグリコシル化不全であり得る。別の実施形態において、治療的タンパク質（哺乳動物細胞で産生されても他の宿主で産生されてもよい）は、１つ以上の炭水化物残基（例えば、１つ以上のマンノース残基、フコース残基、および／またはＮ−アセチルグルコサミン残基）を除去するためか、あるいは１つ以上の炭化水素残基を改変するかまたはマスクするために化学的または酵素的に処理される。このような改変またはマスキングは、肝性マンノースレセプターおよび／またはアシアロ糖タンパク質レセプターに対する治療的タンパク質の結合を減少し得る。別の実施形態において、１つ以上の可能性のあるグリコシル化部位は、標的化治療タンパク質をコードする核酸を変異させ、それにより哺乳動物細胞またはタンパク質をグリコシル化する他の細胞において合成される場合に、このタンパク質のグリコシル化を低減することにより除去される。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
（ＣＮＳ標的化部分）
本発明によれば、ＩＧＦ部分は、血液脳関門を横切って、組成物（好ましくは、タンパク質組成物）をＣＮＳに対して標的化するために有用である。好ましくは、ＩＧＦタグは、組成物を脳実質に標的化するために使用される。本発明によれば、組成物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を直接的に横切るか、または血液脳脊髄液関門（ＢＣＢ）を間接的に横切るかのいずれかでＣＮＳまたは脳脊髄に進入し得る。ＢＢＢは、毛細管内皮細胞により形成され、そしてＢＣＢは、脈絡叢の上皮細胞により形成される。いずれかの関門を横切る輸送は、代表的にトランスサイトーシスを含む。本発明によれば、ＢＣＢを横切ってＣＳＦに標的化された組成物は、続いて、脳実質に到達し得る。ＣＳＦおよび脳実質は、上衣により隔てられており、そして拡散または大部分の流れが、これら２つの区画の間に物質を輸送し得る。
【００２２】
本発明は、［１２５Ｉ］ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが、頸動脈中に注入された場合に脳において検出され得るという認識、ならびに皮下投与されたＩＧＦ−Ｉおよびアナログが、脳脊髄液において見出され得るという認識を、一部利用する。本発明によれば、このことは、両方ともＢＢＢまたはＢＣＢを横断し得るということを示唆する。本発明によれば、輸送プロセスの観察された飽和は、このプロセスが、キャリアにより媒介されることを示唆している。しかし、一連のＩＧＦ−Ｉアナログを使用した実験的分析は、ＩＧＦ−Ｉレセプター、ＩＧＦ−ＩＩレセプター、およびＩＧＦ結合タンパク質−１、ＩＧＦ結合タンパク質−３、ＩＧＦ結合タンパク質−４、またはＩＧＦ結合タンパク質−５が、血液脳関門輸送において役割を果たさないことを示唆する。
【００２３】
本発明の一局面によれば、好ましい治療組成物は、ＩＧＦタグに融合された治療的ペプチドを含む。一実施形態において、このＩＧＦタグは、ＩＧＦ−ＩＩもその部分も含まない。好ましい治療組成物は、ＩＧＦ−Ｉタグが融合されているＬＳＤ（リソソーム貯蔵疾患）タンパク質を、血液脳関門を横切るように指向するＩＧＦ−Ｉタグを含む。この場合、このタグは、かならずしも、複数の細胞型のリソソームにタンパク質を指向させない。しかし、このような融合タンパク質を哺乳動物細胞培養系で発現することにより、本発明は、リソソーム局在化に関して内因性Ｍ６Ｐシグナルを利用し、そして血液脳関門を横断するためにＩＧＦ−Ｉタグを使用する。本発明の好ましい実施形態において、ヒトＩＧＦ−Ｉタグが使用される。代替の実施形態において、本発明の方法および組成物は、ＩＧＦ−Ｉタグの対立遺伝子改変体、種改変体または他の配列改変体の使用を含む。好ましい配列改変体は、ＩＧＦ−Ｉレセプターおよび／またはＩＧＦ結合タンパク質へのＩＧＦタグの結合を低下させる変異を含む（例えば、ＩＧＦ−Ｉレセプターへの減少した結合を有するＬｅｕ６０−ＩＧＦ−ＩもしくはＬｅｕ２４ＩＧＦ−Ｉ、またはＩＧＦ結合タンパク質への減少した結合を有するΔ１−３  ＩＧＦ−Ｉ）。さらなる有用な配列改変体としては、Ａｒｇ５５およびＡｒｇ５６のアミノ酸置換を有するＩＧＦ−Ｉが挙げられる。類似の特性を有する他の変異体ＩＧＦタンパク質タグもまた有用である。
【００２４】
ＩＧＦ−ＩＩベースのタグはまた、脳にタンパク質を標的化するのに有用である。ＩＧＦ−ＩＩは、トランスサイトーシスにより血液脳関門を横切って輸送されることが報告されている（Ｂｉｃｋｅｌら（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４６（１−３）：２４７−７９）。本発明によれば、好ましいＩＧＦ−ＩＩベースのタグは、脳にタンパク質を標的化し、そしてまた、リソソーム貯蔵疾患に関連した神経学的症状を処置するためにレセプター結合を介してリソソームにタンパク質を標的化する。ＩＧＦ−ＩＩの好ましい改変体は、Ｌｅｕ２４にアミノ酸置換を有する。
【００２５】
本発明の別の局面において、各タンパク質の好ましい機能的特性を付与する、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのフラグメントを含むキメラタグが使用される。一実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩの保持される部分は、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｍ６Ｐレセプターへの結合に重要であることが公知であるＩＧＦ−ＩＩの領域を含み、一方でＩＧＦ−ＩＩの残りの部分は、ＩＧＦ−Ｉの対応する領域と置き換えられる。この実施形態は、ＩＧＦ−Ｉが、血液脳関門を横断するためのタグとしてより活性である場合に特に有用である。この実施形態において、タグは、脳標的化に加えてリソソーム標的化に関して最適化された活性を有する。この実施形態の組換え形態は、任意の発現系で作製され得る。
【００２６】
本発明のさらなる局面において、有用な組換えＬＳＤタンパク質は、以下に記載される異なるＩＧＦベースのリソソーム標的化タグのいずれか１つを含む：米国特許出願番号１０／１３６，８４１（２００２年４月３０日出願）；代理人事件番号ＳＹＭ−００７ＣＰ、表題「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２００２年１０月１６日出願）；および代理人事件番号ＳＹＭ−００９、表題「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２００２年１０月１６日出願）。
【００２７】
好ましい実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩタグを含む本発明の組換えタンパク質は、哺乳動物発現系（例えば、ＣＨＯ細胞発現系）において発現される。本発明によれば、哺乳動物細胞培養に加えられる内因性Ｍ６Ｐシグナルは、ＩＧＦ−ＩＩタグにより与えられ得るリソソーム標的化を増強する。
【００２８】
本発明に従って、有用な最小ＩＧＦタグおよび改変体ＩＧＦタグは、既知のＩＧＦ−Ｉ配列およびＩＧＦ−ＩＩ配列に基づいて、本明細書中に記載されるようなＣＮＳ局在化アッセイにおいて最小ＩＧＦフラグメントまたは改変体ＩＧＦフラグメントを試験することによって同定され得る。
【００２９】
好ましいＩＧＦタグは、脳に対して標的化されるよう、ＩＧＦ−Ｉと十分に重複しているが、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対して減少した結合親和性を有し、それによって、ＩＧＦ−Ｉの有糸分裂特性を除去する。しかし、好ましいＩＧＦタグは、リソソームに標的化されるように、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合しない。従って、１つの実施形態において、ＩＧＦタグは、ＩＧＦ−Ｉ配列に基づくが、５４位および５５位に２つの疎水性ＩＧＦ−ＩＩ残基を、ＩＧＦ−Ｉのこれらの位置のアルギニン残基の代わりに含む。
【００３０】
（ＩＧＦ−ＩＩの構造）
ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、２つのグループにより解明された（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ記録  １ＩＧＬを参照のこと）。ＩＧＦ−ＩＩ構造の一般的特徴は、ＩＧＦ−Ｉおよびインシュリンと類似する。ＩＧＦ−ＩＩのＡドメインおよびＢドメインは、インシュリンのＡドメインおよびＢドメインに対応する。二次構造の特徴は、残基２２〜２５の逆ターンによって残基２６〜２８の短いβストランドに連結されたＢ領域の残基１１〜２１由来のαヘリックスを含む。残基２５〜２７は、小さい逆平行βシートを形成するようであり；残基５９〜６１および残基２６〜２８もまた、分子間βシート形成に関与し得る。ＩＧＦ−ＩＩのＡドメインにおいて、αヘリックスがまたがる残基４２〜４９および５３〜５９は、Ｂドメインヘリックスと垂直な逆平行構成で配置される。３つのジスルフィド架橋のうちの２つおよび保存された疎水性残基により形成される疎水性クラスターは、これらの二次構造の特徴を安定化する。Ｎ末端およびＣ末端は、残基３１〜４０の間の領域のように、ほとんど不明確なままである。
【００３１】
ＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６ＰレセプターおよびＩＧＦ−Ｉレセプターに、比較的高い親和性で結合し、そしてより低い親和性でインスリンレセプターに結合する。ＩＧＦ−ＩＩはまた、多数の血清ＩＧＦＢＰと相互作用する。
【００３２】
好ましい実施形態において、リソソーム標的化部分は、タンパク質、ペプチド、またはマンノース−６−リン酸非依存的な様式で、カチオン非依存的Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合する他の部分である。有利には、この実施形態は、ＬＳＤタンパク質の取り込みのための正常な生物学的機構を模倣し、なおマンノース−６−リン酸非依存的な様式でこれを行う。
【００３３】
例えば、成熟ＩＧＦ−ＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡを、ＬＳＤ遺伝子カセットの３’末端に融合することによって、種々の細胞型によって取り込まれ得、そしてリソソームに輸送され得る融合タンパク質が作製される。あるいは、前駆体ＩＧＦ−ＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡが、ＬＳＤ遺伝子カセットの３’末端に融合され得る；この前駆体は、哺乳動物細胞において切断されて成熟ＩＧＦ−ＩＩポリペプチドを生じるカルボキシ末端部分を含むが、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドは、好ましくは除外される（またはＬＳＤ遺伝子カセットの５’末端に移動される）。タンパク質が一旦単離されると、さらなる改変がなされる必要がないので、この方法は、グリコシル化を含む方法を超える多数の利点（単純さおよび費用効率を含む）を有する。
【００３４】
（ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩの残基４８〜５０（Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ）の、インスリン由来の対応する残基（Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ）による置換、またはＩＧＦ−ＩＩの残基５４〜５５（Ａｌａ  Ｌｅｕ）の、ＩＧＦ−Ｉ由来の対応する残基（Ａｒｇ  Ａｒｇ）による置換は、ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの結合の喪失を生じるが、ＩＧＦ−Ｉおよびインスリンレセプターへの結合の保持を生じる。
【００３５】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、残基４８〜５０の領域において、同一の配列および構造を共有するが、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する親和性においては、１０００倍の差異を有する。ＮＭＲ構造は、ＩＧＦ−ＩＩの残基５３〜５８（ＩＧＦ−Ｉの残基５４〜５９）の領域におけるＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩとの間の構造的差異を明らかにする：αヘリックスは、ＩＧＦ−ＩよりもＩＧＦ−ＩＩにおいてより良好に規定され、そしてＩＧＦ−Ｉとは異なり、残基５３および５４の周りの骨格において屈曲が存在しない。この構造的差異は、ＩＧＦ−ＩＩ中のＡｌａ５４およびＬｅｕ５５の、ＩＧＦ−Ｉ中のＡｒｇ５５およびＡｒｇ５６による置換と相関する。ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合が、この領域中の荷電した残基の存在によって直接破壊されるか、または荷電した残基によって生じた構造中の変化が、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合の変化を生じるかのいずれかの可能性がある。いずれの場合にも、ＩＧＦ−Ｉ中の２つのＡｒｇ残基への、非荷電残基の置換は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対するより高い親和性を生じる。従って、これらの位置における正に荷電した残基の存在は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合の喪失と相関する。
【００３６】
ＩＧＦ−ＩＩは、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１１に結合する。実際、リピート１１のみがカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合したミニレセプター（ｍｉｎｉｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、（全長レセプターの親和性の約１０分の１の親和性で）ＩＧＦ−ＩＩに結合し得、そしてＩＧＦ−ＩＩの内在化およびリソソームへのその送達を媒介し得る（Ｇｒｉｍｍｅら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３６９７−３３７０３）。Ｍ６Ｐレセプターのドメイン１１の構造は、既知である（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅエントリー１ＧＰ０および１ＧＰ３；Ｂｒｏｗｎら（２００２）ＥＭＢＯ  Ｊ．２１（５）：１０５４−１０６２）。推定ＩＧＦ−ＩＩ結合部位は、ＩＧＦ−ＩＩの疎水性アミノ酸と相互作用すると考えられる疎水性ポケットである；ＩＧＦ−ＩＩの候補アミノ酸としては、ロイシン８、フェニルアラニン４８、アラニン５４およびロイシン５５が挙げられる。リピート１１が、ＩＧＦ−ＩＩ結合に十分であるが、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのより大きい部分（例えば、リピート１０〜１３または１〜１５）を含む構築物は、一般に、より高い親和性および増大したｐＨ依存性で、ＩＧＦ−ＩＩに結合する（例えば、Ｌｉｎｎｅｌｌら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２６）：２３９８６−２３９９１を参照のこと）。
【００３７】
（ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩの残基Ｔｙｒ２７のＬｅｕでの置換、Ｌｅｕ４３のＶａｌでの置換、またはＳｅｒ２６のＰｈｅでの置換は、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を、それぞれ、１／９４、１／５６または１／４に減少させる。ヒトＩＧＦ−ＩＩの残基１〜７の欠失は、ヒトＩＧＦ−Ｉレセプターに対する親和性を１／３０に減少させ、そしてラットＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する親和性を同時に１２倍増大させる。ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、Ｔｈｒ７が、残基４８Ｐｈｅおよび５０Ｓｅｒの近傍、ならびに９Ｃｙｓ−４７Ｃｙｓのジスルフィド結合の近傍に位置することを示す。これらの残基とＴｈｒ７との相互作用は、ＩＧＦ−Ｉレセプター結合に必要とされる、柔軟なＮ末端ヘキサペプチドを安定化し得ると考えられる。同時に、この相互作用は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合を調節し得る。ＩＧＦ−ＩＩのＣ末端の短縮（残基６２〜６７）もまた、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を、１／５に低下させるようである。
【００３８】
（ＩＧＦ−ＩＩの欠失変異体）
ＩＧＦ−Ｉおよびカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターについての結合表面は、ＩＧＦ−ＩＩの別個の面上にある。構造的データおよび変異データに基づき、ヒトＩＧＦ−ＩＩよりも実質的に小さい機能的カチオン非依存性Ｍ６Ｐ結合ドメインが構築され得る。例えば、アミノ末端のアミノ酸１〜７および／またはカルボキシ末端のアミノ酸６２〜６７は、欠失または置換され得る。さらに、アミノ酸２９〜４０は、おそらく、このポリペプチドの残りの部分の折り畳みも、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合も変更することなく、除外または置換され得る。従って、アミノ酸８〜２８および４１〜６１を含む標的化部分が、構築され得る。アミノ酸のこれらのストレッチは、おそらく、直接連結され得るか、またはリンカーによって分離され得る。あるいは、アミノ酸８〜２８および４１〜６１は、別個のポリペプチド鎖上に提供され得る。ＩＧＦ−ＩＩに相同でありかつＩＧＦ−ＩＩの構造に密接に関連する３次構造を有する、インスリンの匹敵するドメインは、例え別個のポリペプチド鎖中に存在するとしても、適切な３次構造への適切な再折り畳みを可能にするのに十分な構造的情報を有する（Ｗａｎｇら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２７９−２８１）。従って、例えば、アミノ酸８〜２８またはその保存的置換改変体は、治療剤に融合され得る；得られた融合タンパク質は、アミノ酸４１〜６１またはその保存的置換改変体と混合されて、患者に投与され得る。本発明によれば、ＩＧＦ−Ｉの類似のフラグメントが、治療剤との融合において有用である。
【００３９】
（ＩＧＦ結合タンパク質への結合）
ＩＧＦ−ＩＩおよび関連構築物は、ＩＧＦＢＰに対する親和性を減少するように改変され、それによって、タグ化タンパク質のバイオアベイラビリティを増大させ得る。
【００４０】
ＩＧＦ−ＩＩの残基フェニルアラニン２６の、セリン残基による置換は、ＩＧＦＢＰ１〜５への結合を１／５〜１／７５に減少させる。ＩＧＦ−ＩＩの残基４８〜５０の、スレオニン−セリン−イソロイシンによる置換は、ほとんどのＩＧＦＢＰへの結合を、１／１００未満に減少させる。しかし、これらの残基はまた、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターへの結合に重要である。ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合を破壊するＹ２７Ｌ置換は、ＩＧＦＢＰ３および酸不安定性サブユニットとの３要素複合体の形成を妨害する；この３要素複合体は、循環中のＩＧＦ−ＩＩのほとんどを占める。ＩＧＦ−ＩＩの最初の６残基の欠失もまた、ＩＧＦＢＰ結合を妨害する。
【００４１】
ＩＧＦＢＰとのＩＧＦ−Ｉの相互作用についての研究は、さらに、フェニルアラニン１６のセリンによる置換は、２次構造には影響しないが、ＩＧＦＢＰ結合を、１／４０と１／３００との間に減少させることを明らかにした。グルタミン酸９をリジンに変化させることもまた、ＩＧＦＢＰ結合における有意な減少を生じた。さらに、リジン９／セリン１６の二重変異体は、ＩＦＧＢＰに対する最も低い親和性を示した。これらの変異は、ＩＧＦ−ＩＩにおいて以前に試験されていなかったが、ＩＧＦ−Ｉのこの領域とＩＧＦ−ＩＩのこの領域との間の配列保存は、類似の変異（グルタミン酸１２リジン／フェニルアラニン１９セリン）がＩＧＦ−ＩＩ中に作製される場合、類似の影響が観察されることを示唆する。
【００４２】
（ＩＧＦホモログ）
ヒトＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩまたは脳への輸送に影響を与えるそれらの一部のアミノ酸配列は、参照配列として使用されて、候補配列が、本発明の方法における合理的な成功予測を有するのに十分なアミノ酸配列類似性を有するか否かを決定し得る。好ましくは、改変体配列は、ヒトＩＧＦ−ＩまたはヒトＩＧＦ−ＩＩに対して、少なくとも７０％類似または６０％同一、より好ましくは少なくとも７５％類似または６５％同一、そして最も好ましくは８０％類似または７０％同一である。
【００４３】
候補ペプチド領域が、ヒトＩＧＦ−ＩまたはヒトＩＧＦ−ＩＩに対して、必要な％類似性または％同一性を有するか否かを決定するために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７に記載される動的プログラミングアルゴリズムを、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：１０９１５−１０９１９の図２に記載されるＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリクスと合わせて使用して、候補アミノ酸配列およびヒトＩＧＦ−ＩまたはヒトＩＧＦ−ＩＩを、最初に整列する。本発明について、ギャップ挿入ペナルティの適切な値は、−１２であり、そしてギャップ伸長ペナルティの適切な値は、−４である。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎおよびＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスのアルゴリズムを使用して整列を実行するコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージソフト（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ））は、市販され、そして当業者に広く使用されている。
【００４４】
候補配列と参照配列との間の整列が一旦行われると、％類似性スコアが算出され得る。各配列の個々のアミノ酸は、それらの類似性に従って、互いに連続して比較される。２つの整列されたアミノ酸に対応する、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスにおける値が０または負の数である場合、ペアの類似性スコアは０であり；そうでなければ、ペアの類似性スコアは１．０である。生の類似性スコアは、整列されたアミノ酸の対の類似性スコアの合計である。次いで、生のスコアを、候補配列または参照配列のより小さい方のアミノ酸の数で除算することによって、正規化する。正規化した生のスコアが、％類似性である。あるいは、％同一性を算出するために、各配列の整列されたアミノ酸は、再び連続して比較される。アミノ酸が同一でない場合、ペアの同一性スコアは０であり；そうでなければ、ペアの同一性スコアは、１．０である。生の同一性スコアは、同一の整列されたアミノ酸の合計である。次いで、生のスコアを、候補配列または参照配列のより小さい方のアミノ酸の数で除算することによって、正規化する。正規化した生のスコアが、％同一性である。挿入および欠失は、％類似性および％同一性を算出する目的のために、無視される。従って、ギャップペナルティは、この算出においては使用されないが、最初の整列には使用される。
【００４５】
（ＩＧＦの構造的アナログ）
ヒトＩＧＦタンパク質の公知の構造により、コンピュータ支援設計原理（例えば、米国特許第６，２２６，６０３号および同第６，２７３，５９８号において考察される）を使用した、ＩＧＦアナログの設計が可能である。例えば、ＩＧＦ−ＩＩの公知の原子座標は、従来のコンピュータモデリングプログラム（例えば、ＩＮＳＩＧＨＴＩＩ、ＤＩＳＣＯＶＥＲまたはＤＥＬＰＨＩ（Ｂｉｏｓｙｍ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から市販される）、あるいはＱＵＡＮＴＡまたはＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．から市販される））を備えたコンピュータに提供され得る。これらおよび他のソフトウェアプログラムは、分子構造の分析、ならびに構造および分子間相互作用に対する分子変化の影響を予測するシミュレーションを可能にする。例えば、このソフトウェアは、さらなる分子間水素結合もしくはイオン結合を形成する能力を有する改変アナログを同定して、標的レセプターに対するアナログの親和性を改善するために使用され得る。
【００４６】
このソフトウェアはまた、ＣＮＳを標的化するのに十分なＩＧＦ表面の少なくとも一部上に提示される同じ特徴を模倣する構造的特徴および化学的特徴を有する、ペプチドおよび有機分子の設計を可能にする。本発明の好ましい実施形態は、フレームワークを有する合成有機分子を設計および生成することに関し、このフレームワークは、本明細書中に記載されるようなＣＮＳ標的化に関連するとして同定されたアミノ酸側鎖上に配置された化学的部分の空間的関係を模倣する空間的関係で、化学的に相互作用する部分を保有する。
【００４７】
例えば、適切な化学的基の同定の際に、従来のコンピュータプログラムを使用する当業者は、適切なキャリアフレームワーク上に配置された適切な化学的部分を有する低分子を設計し得る。有用なコンピュータプログラムは、例えば、以下に記載される：Ｄｉｘｏｎ（１９９２）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １０：３５７−３６３；Ｔｓｃｈｉｎｋｅら（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８６３−３８７０；およびＥｉｓｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：１９９−２２１（これらの開示は、参考として本明細書中で援用される）。
【００４８】
１つの特定のコンピュータプログラム、表題「ＣＡＶＥＡＴ」は、データベース（例えば、所望の空間的配向の化学的部分を有する構造について、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を検索する（Ｂａｒｔｌｅｔｔら（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．編）ｐｐ１８２−１９６）。ＣＡＶＥＡＴプログラムは、テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）の３次元構造中の、選択されたアミノ酸側鎖の配向に基づいて、テンダミスタット（α−アミラーゼの７４残基のインヒビター）のアナログを設計するために使用される（Ｂａｒｔｌｅｔｔら（１９８９）前出）。
【００４９】
あるいは、ＣＮＳへの輸送を標的化する一連のアナログの同定の際に、当業者は、当業者を支援して、定量的構造活性関係（ＱＳＡＲ）を開発し、さらなるアナログの新規設計においてさらに支援する、種々のコンピュータプログラムを使用し得る。他の有用なコンピュータプログラムは、例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ−Ｍａｒｔｉｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：５８７−６１３；Ｄｉｘｏｎ（１９９２）前出；およびＷａｓｚｋｏｗｙｃｚら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｎｍ．３７：３９９４−４００２に記載される。
（治療剤）
本発明の方法および組成物は、任意の治療剤を生成し、そしてＣＮＳに送達するのに有用であるが、本発明は、リソソーム貯蔵疾患に関連する酵素欠損を克服する遺伝子産物について特に有用である。
【００５０】
好ましいＬＳＤ遺伝子は、表１に示される。好ましい実施形態において、野生型ＬＳＤ遺伝子産物は、同様のＬＳＤ遺伝子における欠損に罹患する患者に送達される。代替の実施形態において、ＬＳＤ遺伝子の機能的配列または機能的種が、使用される。さらなる実施形態において、ＬＳＤ遺伝子欠損を補助し得る異なる酵素をコードする遺伝子が、本発明に従って使用される。
【００５１】
【表１】
2005506340.tif 000002
【００５２】
【表２】
2005506340.tif 000003
【００５３】
【表３】
2005506340.tif 000004
１つの実施形態において、治療剤は、グルコセレブロシダーゼであり、これは、ゴーシェ病のための有効な酵素置換治療剤としてＧｅｎｚｙｍｅによって現在製造されている。現在、この酵素は、曝されたマンノース残基により調製され、これは、タンパク質をマクロファージ結合の細胞に特に標的化させる。１型ゴーシェ病患者における主要な病理学は、グルコセレブロシダーゼを集積するマクロファージに起因するが、他の細胞型にグルコセレブロシダーゼを送達することの治療上の利点が存在し得る。本発明を用いるリソソームへのグルコセレブロシダーゼの標的化は、薬剤を複数の細胞型に標的化させ、そして他の調合品と比較して治療上の利点を有し得る。
【００５４】
（標的化部分と治療部分との間の会合）
本発明の組成物の治療部分および標的化部分は、必然的に、直接的にまたは間接的に会合する。１つの実施形態において、治療部分および標的化部分は、非共有結合的に会合する。例えば、標的化部分は、ビオチン化され得、そして治療部分に会合するアビジン部分を結合する。あるいは、標的化部分および治療部分は、多量体タンパク質の異なるサブユニットに各々会合（例えば、融合タンパク質）され得る。別の実施形態において、標的化部分および治療部分は、互いに架橋される（化学的架橋剤を用いて）。
【００５５】
好ましい実施形態において、治療部分は、融合タンパク質として標的化部分に融合される。標的化部分は、融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端であり得るか、または標的化位置の存在が、治療部分の治療剤活性に過度に干渉しない位置における治療部分の配列内に挿入され得る。
【００５６】
治療上の活性部分は、ヘテロメリックタンパク質であり、このサブユニットの１つ以上は、標的化部分と会合し得る。ヒキソサミニダーゼＡ（例えば、テイ−サックス病に影響されるリソソームタンパク質）は、αサブユニットおよびβサブユニットを含む。αサブユニット、またはβサブユニット、またはその両方のいずれかは、本発明に従って標的化部分に会合し得る。例えば、αサブユニットが、標的化部分に会合し、そしてβサブユニットとともに同時発現される場合に、活性な複合体が、形成され、そしてリソソームへと標的化される。
【００５７】
（発現方法）
本発明の方法および組成物は、多くの異なる発現系の状況において有用である。例えば、本発明のタンパク質は、ＣＮＳに標的化され得、そして好ましくは、リソソームによって取り込まれ、それは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、バキュロウイルス、酵母、細菌、哺乳動物または他の発現系から発現および単離されるかのいずれかである。従って、本発明は、タンパク質産生において多大な適応性を可能にする。例えば、産生されるタンパク質が、１つ以上のジスルフィド結合を含む場合、適切な発現系が、選択および改変され得、これが適切な場合は、適切に折り畳まれたタンパク質の収率をさらに改善する。例えば、１つの有用なＩＧＦ標的化部分は、３つの分子内ジスルフィド結合を有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される本発明の融合タンパク質が構築され、タンパク質をペリプラズム間隙に指向させ得る。ＩＧＦタグは、別のタンパク質のＣ末端に融合される場合、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおいて活性な形態で分泌され得る（Ｗａｄｅｎｓｔｅｎ、Ｅｋｅｂａｃｋｅら、１９９１）。ＩＧＦ部分の最適な折り畳みを促進するために、適切な濃度の還元および酸化されたグルタチオンが、好ましくは、細胞環境に加えられ、ジスルフィド結合形成を促進する。ジスルフィド結合を有する融合タンパク質が、完全に溶解しない場合、任意の不溶性物質は、好ましくは、カオトロピック剤（例えば、尿素）により処理され、変性タンパク質を可溶化し、そして適切な濃度の還元および酸化されたグルタチオン、または他の酸化剤および還元剤を有する緩衝液中で再折り畳みされ、適切なジスルフィド結合の形成を促進する（Ｓｍｉｔｈ、Ｃｏｏｋら、１９８９）。例えば、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＩの変性および還元のために、６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌおよび０．１Ｍ  ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン還元剤を用いて再折り畳みされる（Ｙａｎｇ，Ｗｕら、１９９９）。タンパク質の再折り畳みは、１ｍＭ  酸化グルタチオン、１０ｍＭ  還元グルタチオン、０．２Ｍ  ＫＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中で達成された。
【００５８】
本発明の方法はまた、精製工程を必要とすることなく、タンパク質を哺乳動物のＣＮＳに直接的に標的化させるのに有用である。１つの実施形態において、ＩＧＦ融合タンパク質は、宿主に対して投与される共生生物または寄生生物において発現される。発現されたＩＧＦ融合タンパク質は、その生物によって血流に分泌され、そして血液脳関門を横切って送達される。
【００５９】
本発明の幾つかの実施形態において、ＣＮＳ標的化タンパク質は、感染されたマクロファージのリソソームにタンパク質を分泌する生存Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａを介して、インサイチュで送達される。この小器官から、このタンパク質は細胞を離れ、血液脳関門を横切って送達され得る。従って、ＩＧＦタグおよび治療剤は、このタンパク質が、マクロファージリソソームに存在する場合、必然的にインタクトのままである。従って、ＣＮＳにおけるリソソームへの送達のために設計されたタンパク質が、インサイチュで発現される場合、それらは、好ましくは、リソソーム環境との適合性を保証するために改変される。代替の実施形態において、本発明の治療剤は、ＢＣＢを透通し得るＴ．ｂｒｕｃｅｉにおける発現によって送達され得る。
【００６０】
（核酸および発現系）
本発明のキメラ融合タンパク質は、種々の発現系（インビトロの翻訳系およびインタクトな細胞を含む）において発現され得る。Ｍ６Ｐ改変は、標的化についての必須条件でないので、種々の発現系（酵母、バキュロウイルスを含む）およびタンパク質をグリコシル化しない原核生物系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でさえ、標的化された治療剤タンパク質の発現について適切である。実際に、非グリコシル化タンパク質は、一般的に、改善されたバイオアベイラビリティを有する。なぜなら、グリコシル化タンパク質は、肝洞様毛細血管内皮におけるマンノースレセプターへの結合を介して、循環から迅速に取り除かれるためである。
【００６１】
あるいは、哺乳動物細胞発現系におけるキメラ標的化リソソーム酵素の産生は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターについての複数の結合決定因子を有するタンパク質を産生する。２つ以上のカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターリガンド間（例えば、Ｍ６ＰとＩＧＦ−ＩＩ、またはＭ６Ｐとレチン酸）の共同作用が、利用され得る：多価リガンドは、レセプター架橋によってレセプターへの結合を増強することが実証されている。
【００６２】
一般的に、キメラ治療剤タンパク質をコードする遺伝子カセットは、特定の発現系について適合させられ、最適な発現に必要な配列（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、イントロン、またはコード配列中の変更）を組み込み得、コドン利用を最適化し得る。タンパク質は、好ましくは、産生細胞から分泌されるので、発現系に適合する、シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、内因性シグナルペプチドについて置換され得る。例えば、ＬｅｉｓｈｍａｎｉａにおけるＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩによりタグ化されたβ−グルクロニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼＡの発現について、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａシグナルペプチド（ＧＰ６３またはＳＡＰ）をコードするＤＮＡカセットが、内因性シグナルペプチドをコードするＤＮＡカセットの位置に挿入され、最適な発現を達成する。哺乳動物発現系において、内因性シグナルペプチドが使用されるが、ＩＧＦ−ＩタグまたはＩＧＦ−ＩＩタグが、コード配列の５’末端において融合される場合、ＩＧＦ−ＩシグナルペプチドまたはＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを使用することが望ましい。
【００６３】
ＣＨＯ細胞は、治療剤タンパク質の産生について好ましい哺乳動物宿主である。ＣＨＯ細胞からの高収率の発現を達成するための古典的な方法は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠損するＣＨＯ細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株ＤＵＫＸ（Ｏ’Ｄｅｌｌら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３０（７）：７６７〜７１））を使用することである。ＣＨＯ細胞のこの系統は、増殖のためにヒポキサンチンおよびチミジンを必要とする。別個のプラスミドまたは単一のプラスミド上での、ＤＨＦＲ遺伝子カセットにより過剰発現される遺伝子の同時トランスフェクションは、ＤＨＦＲ遺伝子についての選択を可能にし、そして、一般的に、選択される組換えタンパク質をまた発現するクローンの単離を可能にする。例えば、プラスミドｐｃＤＮＡ３は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期領域調節領域プロモーターを使用し、目的の遺伝子およびｐＳＶ２ＤＨＦＲの発現を推進し、ＤＨＦＲ発現を促進する。濃度が増加する葉酸アナログメトトレキサートに組換え遺伝子カセットを係留させる細胞の次の曝露は、ＤＨＦＲ遺伝子の遺伝子コピー数および同時トランスフェクトされた遺伝子の遺伝子コピー数の両方の増幅をもたらす。
【００６４】
この系における真核生物発現のための好ましいプラスミドは、ＣＭＶのような強力なプロモーターの下流に配置される目的の遺伝子を含む。イントロンが、遺伝子カセットの３’側に近接して配置され得る。ＤＨＦＲカセットは、同じプラスミド由来または別のプラスミド由来の第２のプロモーターによって駆動され得る。さらに、プラスミド内に、さらなる選択マーカー（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８に対する耐性を与える））を組み込むことが有用であり得る。
【００６５】
別のＣＨＯ発現系（Ｕｌｍａｓｏｖら、（２０００）ＰＮＡＳ９７（２６）：１４２１２−１４２１７）は、上記のＤＨＦＲ／メトトレキセート系の代わりに、Ｇ４１８を使用する、目的の遺伝子の増幅に依存する。弱いプロモーターによって駆動されるわずかに欠損性のネオマイシンホスホトランスフェラーゼを有するｐＣＸＮベクター（例えば、Ｎｉｗａら（１９９１）Ｇｅｎｅ１０８：１９３−２００を参照のこと）は、単一工程で高いコピー数（＞３００）を有するトランスフェクタントについて選択することを可能にする。
【００６６】
あるいは、組換えタンパク質は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製系に基づいて、発現系を使用してヒトＨＥＫ２９３細胞株において産生され得る。これは、ＥＢＶ複製起点ｏｒｉＰおよびＥＢＶ  ｏｒｉ結合タンパク質、ＥＢＮＡ−１からなる。ＥＢＮＡ−１のｏｒｉＰへの結合は、染色体外プラミスドの複製および引き続く増幅を開始する。次いで、この増幅は、プラスミド内に収容される遺伝子カセットの高レベルの発現を生じる。ｏｒｉＰを含むプラスミドは、ＥＢＮＡ−１形質転換ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販される）にトランスフェクトされ得るか、あるいはｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販される）のようなプラスミド（ＥＢＮＡ−１の発現を駆動し、そしてＥＢＶ  ｏｒｉＰを含む）が使用され得る。
【００６７】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、治療タンパク質は、好ましくは、細胞周辺腔内に分泌される。これは、ＬＳＤタンパク質の内因性シグナルペプチドをコードするＤＮＡの代わりに、細菌シグナルペプチド（例えば、ｏｍｐＡシグナル配列）をコードする核酸カセットを使用することによって達成され得る。発現は、多数の強力な誘導性プロモーター（例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはｔａｃプロモーター）のいずれかによって駆動され得る。１つの適切なベクターは、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販される）であり、これは、Ｇｅｎｅ  ＩＩＩシグナルペプチドおよびａｒａＢＡＤプロモーターを使用する。
【００６８】
（インビボ発現）
治療タンパク質（好ましくは、分泌治療タンパク質）をコードする核酸は、有利に、疾患に苦しむ患者に直接的に提供され得るか、またはエキソビボで細胞に提供され、続いて、患者に生きた細胞が投与され得る。当該分野において公知のインビボ遺伝子治療法は、精製ＤＮＡ（例えば、プラスミド中として）を提供する工程、ウイルスベクター中でＤＮＡを提供する工程、またはリポソームまたは他のベシクル中でＤＮＡを提供する工程を包含する（例えば、遺伝子治療において使用するための脂質キャリアを開示する米国特許第５，８２７，７０３号、および遺伝子治療において有用なアデノウイルスベクターを提供する米国特許第６，２８１，０１０号を参照のこと）。
【００６９】
組換えタンパク質を発現するように改変された細胞を移植することによって疾患を処置するための方法もまた、周知である。例えば、ヒトに導入するための１次ヒト細胞内に核酸を導入するための方法を開示する、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。エキソビボ治療のためのヒト細胞の使用は、いくつかの実施形態において好ましいが、他の細胞（例えば、細菌細胞）は、患者の脈管系に移植され得、治療剤を連続的に放出する。例えば、米国特許第４，３０９，７７６号および同第５，７０４，９１０号を参照のこと。
【００７０】
本発明の方法は、精製工程を必要とすることなしに、タンパク質を亜細胞（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）成分に直接標的化するために特に有用である。１つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質は、宿主に投与される共生寄生生物または減弱化寄生生物において発現される。発現されるＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質は、その生物によって分泌され、宿主細胞によって摂取され、そしてそれらのリソソームに標的化される。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態において、ＩＧＦ融合タンパク質（例えば、ＧＩＬＴタンパク質）は、感染されたマクロファージのリソソーム内に、タンパク質を分泌する生きたＬｅｉｓｈｍａｎｉａを介して、インサイチュで送達される。この細胞小器官から、これは、細胞を放出し、マクロファージ系統ではない隣接細胞によって摂取される。従って、ＩＧＦタグおよび治療剤は、必ずインタクトなままであるが、一方、タンパク質は、マクロファージリソソーム内にある。従って、ＧＩＬＴタンパク質がインサイチュで発現される場合、これらは、好ましくは、リソソーム環境との適合性を保証するために改変される。ヒトβ−グルクロニダーゼ（ヒト「ＧＵＳ」）（例示的な治療タンパク質）は、通常、リソソーム中において、またはリソソームへの輸送の間のいずれかにおいて、Ｃ末端ペプチド切断を受ける（例えば、ＧＵＳの残基６３３と６３４との間）。従って、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ構築物がマクロファージリソソームにおいてＬｅｉｓｈｍａｎｉａによって発現される実施形態において、ヒトＧＵＳは、好ましくは、そのタンパク質を切断に対して耐性にするために改変されるか、または残基６３３に続く残基が、好ましくは、ＧＩＬＴ融合タンパク質から単純に省かれる。同様に、本発明の任意のＩＧＦタグは、好ましくは、タンパク質分解に対するその耐性を増加するように改変されるか、または最小結合ペプチド（例えば、ファージディスプレーまたは酵母ツーハイブリッドによって同定される）は、野生型ＩＧＦ部分の代わりに使用される。
【００７２】
（過小グリコシル化）
標的治療タンパク質は、好ましくは、過小グリコシル化される：タンパク質が哺乳動物細胞において産生される場合に通常存在する１つ以上の炭水化物構造が、好ましくは、省かれるか、除去されるか、改変されるか、またはマスクされ、哺乳動物におけるタンパク質の半減期を延長する。過小グリコシル化は、多くの方法で達成され得、これらのいくつかは、図５に図示される。図５に示されるように、タンパク質は、実際に過小グリコシル化され得るか、１つ以上の炭水化物構造を実際に欠失し得るか、あるいは１つ以上の炭水化物構造の改変またはマスキングによって機能的に過小グリコシル化され得る。タンパク質は、実施例１２において議論されるように、合成される場合に、実際に過小グリコシル化され得、そして完全に非グリコシル化され得る（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて合成される場合）か、部分的に非グリコシル化され得る（部位特異的変異誘発によって１つ以上のグリコシル化部位を破壊した後の哺乳動物系において合成される場合）か、または非哺乳動物グリコシル化パターンを有し得る。実際の非グリコシル化はまた、合成後のタンパク質の脱グリコシル化によって達成され得る。実施例１２において議論されるように、脱グリコシル化は、化学的処理または酵素的処理によってであり得、そして完全に脱グリコシル化され得るか、または炭水化物構造の一部のみが除去される場合、部分的に脱グリコシル化される。
【００７３】
（投与）
本発明に従って産生される標的治療剤は、任意の経路によって哺乳動物宿主に投与され得る。従って、適切な場合、投与は、経口または非経口（静脈内および腹腔内の投与経路を含む）であり得る。さらに、投与は、ボーラスの治療剤の周期的注射によってであり得るか、または外部であるレザバ（例えば、ｉ．ｖ．バッグ）からの静脈内投与または腹腔内投与によってより連続的になされ得る。特定の実施形態において、本発明の治療剤は、薬学的グレードであり得る。すなわち、特定の実施形態は、ヒトへの投与に必要とされる純度および品質管理の基準に適合する。獣医学的適用もまた、本明細書中で使用される意図される意味の中にある。
【００７４】
本発明に従う治療剤の処方物（獣医学的使用およびヒト医療使用の両方のため）は、代表的に、このような治療剤を、それらに対する薬学的に受容可能なキャリアおよび任意の他の成分とともに含む。キャリアは、処方物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに対して有害でないという意味で、「受容可能」であり得る。これに関して、薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的投与に適合性の、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が、企図される。補助的な活性化合物（本発明に従って同定され、そして／または当該分野において公知である）もまた、組成物中に組み込まれ得る。処方物は、簡便には、投薬単位形態で存在し得、そして薬理学／微生物学の分野で周知のいずれかの方法によって調製され得る。一般的に、いくつかの処方物は、治療剤を、液体キャリアもしくは微細に分割された固体キャリアまたはその両方と関連させ、次いで、必要な場合、その生成物を所望の処方物に成形することによって調製される。
【００７５】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例としては、経口または非経口（例えば、静脈内投与、皮内投与、吸入投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与）が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注入のための水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、アセテート、シトレート、またはホスフェート）および張性の調節のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロール）。Ｐｈは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）によって調節され得る。
【００７６】
経口投与または非経口投与のために有用な溶液は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ編）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，１９９０に記載される、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。非経口投与のための処方物はまた、頬投与のためのグリココレート、直腸投与のためのメトキシサリチレート、または膣投与のためのクツル酸（ｃｕｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）を含み得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨て可能シリンジまたは複数用量のバイアル内に封入され得る。直腸投与のための坐剤はまた、ココアバター、他のグリセリドまたは室温において固体であり、体温において液体である他の組成物のような非刺激性の賦形剤とその薬物を混合することによって調製され得る。処方物はまた、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含み得る。直接的投与のための処方物は、グリセロールおよび高い粘度の他の組成物を含み得る。これらの治療剤のための他の潜在的に有用な非経口キャリアとしては、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能注入システム、およびリポソームを含み得る。吸入投与のための処方物は、賦形剤（例えば、ラクトース）を含み得るか、または例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む水溶液、または点鼻薬の形態での投与のための油状溶液、または経鼻的に適用されるゲルとしてであり得る。保持浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｎｅｍａｓ）はまた、直腸送達のために使用され得る。
【００７７】
経口投与のために適切な本発明の処方物は、別個の単位の形態（例えば、カプセル、ゼラチンカプセル、サシェ剤（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、トローチ剤、またはロゼンジ）（各々が、所定量の薬物を含有する）；粉末または顆粒の形態；水性液体または非水性液体の溶液または懸濁液の形態；あるいはｏ／ｗエマルジョンまたはｗ／ｏエマルジョンの形態であり得る。治療剤はまた、ボーラス、舐剤またはペーストの形態で投与され得る。錠剤は、必要に応じて、１つ以上の補助成分とともに、薬物を圧縮または調節することによって作製され得る。圧縮錠剤は、適切な機械において、薬物を自由流動形態（例えば、粉末または顆粒）で、必要に応じて、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤によって混合して、圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、適切な機械において、粉末化薬物および不活性液体希釈剤で湿らされた適切なキャリアの混合物を成形することによって作製され得る。
【００７８】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得る。マウスウオッシュとしての使用のための流体キャリアを使用して調製された経口組成物は、流体キャリア中の化合物を含み、そして経口適用され、すすがれ（ｓｗｉｓｈｅｄ）、吐き出されるかまたは嚥下される。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、スターチまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑り剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ矯味矯臭薬）。
【００７９】
注射可能使用に適切な薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液の即時の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＳＡＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌であり得、そして容易な注射可能性が存在する程度に流体であり得る。これは、製造および保存の条件下で安定であり得、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保護され得る。キャリアは、溶媒または分散媒体であり得、これには、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散液の場合、必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、等張性剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、および塩化ナトリウム））を組成物中に含むことが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含むことによってもたらされ得る。
【００８０】
滅菌注射可能溶液は、活性化合物を、上記に列挙された成分の一種またはその組み合わせを有する、適切な溶媒中に必要とされる量で取り込み、必要とされる場合、その後滅菌濾過することによって調製され得る。一般的には、分散物は、活性化合物を滅菌ビヒクル中に取り込むことによって調製され、この滅菌ビヒクルは、基本的な分散媒体および上記に列挙された成分からの必要とされる他の成分を含む。滅菌注射可能溶液の調製用の滅菌粉末の場合において、調製の方法としては、真空乾燥および凍結乾燥が挙げられ、この凍結乾燥は、活性成分と事前に滅菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望成分との粉末を生じる。
【００８１】
関節内投与に適切な処方物は、治療剤の滅菌水性調製物の形態であり得、これは、微結晶形態（例えば、水性微結晶懸濁液の形態）であり得る。リポソーム処方物または静分解ポリマー系はまた、関節内投与および眼動脈投与の両方のための治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）を提供するために使用され得る。
【００８２】
局所投与に適切な処方物としては、液体または半液体の調製物（例えば、リニメント、ローション、ゲル、塗布剤（ａｐｐｌｉｃａｎｔ））、クリーム、軟膏もしくはペーストのような水中油系エマルジョンもしくは油中水系エマルジョン；または点眼薬（ｄｒｏｐ）のような溶液もしくは懸濁液を含む、眼の治療薬（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）が挙げられる。皮膚表面への局所投与用の処方物は、治療剤を皮膚科学的に受容可能なキャリア（例えば、ローション、クリーム、軟膏または石鹸）を用いて分散させることによって調製され得る。いくつかの実施形態において、皮膚の上にフィルムまたは層を形成し得、塗布を局部に制限しそして除去を防止するキャリアが有用である。組織表面への付着が所望される場合、この組成物は、フィブリノゲン−トロンビン組成物または他の生物接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）中に分散された治療剤が挙げられ得る。次いで、この治療剤は、着色され、噴霧されるかまたはそうでなければ所望の組織表面に塗布され得る。内部組織表面への局所投与のために、この薬剤は、液体組織接着剤または組織表面への吸着を増強することが公知の他の物質中に分散され得る。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノゲン／トロンビン溶液が有利なように使用され得る。あるいは、組織コーティング溶液（例えば、ペクチン含有処方物）が使用され得る。
【００８３】
吸入処置（例えば、喘息用）のために、噴霧缶、噴霧器、またはアトマイザーで投薬された粉末（自己推進処方物または噴霧処方物）の吸入が使用され得る。このような処方物は、粉末吸入デバイスからの肺投与のために微細に細分された散剤形態であり得るかまたは自己推進散剤投薬処方物であり得る。自己推進溶液および噴霧処方物の場合において、この効果は、所望の噴霧特性（すなわち、所望の粒子サイズを有する噴霧を生成し得る）を有する値の選択によってかまたは制御された粒子サイズの懸濁された粉末として活性成分を取り込むことによってかのいずれかで達成され得る。吸入による投与のために、治療剤はまた、圧力容器またはディスペンサーからのエアロゾル噴霧の形態で送達され得、この容器またはディスペンサーは、適切な推進剤（例えば、二酸化炭素のような気体）、または噴霧器を備える、点鼻薬（ｎａｓａｌ  ｄｒｏｐ）もまた、使用され得る。
【００８４】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によってであり得る。経粘膜投与または経皮投与のために、浸透されるべき関門に適切な浸透剤が、処方物中で使用され得る。このような浸透剤は、一般的には当該分野で公知であり、例えば、経粘膜投与用には洗浄剤、胆汁酸塩誘導体、およびフィルシディック酸（ｆｉｌｓｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のために、治療剤は、代表的には、一般的には当該分野で公知のような軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリーム中に処方される。
【００８５】
１つの実施形態において、治療剤は、キャリアと共に調製され、このキャリアは、身体からの迅速な排出に対して保護し、移植物およびマイクロカプセル化送達系を含む、制御された放出処方物のようなものである。生分解性で生体適合性のポリマー（例えば、酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかである。材料もまた、Ａｌｚａ  ＣｏｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．から市販入手され得る。リポソーム懸濁物もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような方法）に従って調製され得る。ミクロソームおよびミクロ粒子もまた、使用され得る。
【００８６】
経口組成物または非経口組成物は、投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投薬単位形態で処方され得る。投薬単位形態とは、処置されるべき被験体のための単位投薬として適した、物理的に別々の単位のことをいう。各単位は、所望の治療効果をもたらすために計算された、所定の量の活性化合物を、必要とされる薬学的キャリアと結合させて含んでいる。本発明の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の特有の特性、達成されるべき特定の治療効果、個々の処置のための活性化合物のような化合物合成の分野に固有の制限存在によって決められ、そしてこれら直接依存する。
【００８７】
一般的には、本発明に従って同定される治療剤は、ヒトまたは他の哺乳動物に、非経口投与または経口投与するために、例えば、治療有効量（例えば、所望の効果を誘導するのに十分な時間、標的組織に対して適切な濃度の薬物を提供する量）で処方され得る。さらに、本発明の治療剤は、単独でかまたは特定の疾患または目的の適応症に対して有益な効果を有することが知られている他の分子と組み合わせて投与され得る。例示のみの目的として、有用な補因子としては、症状緩和補因子（防腐薬、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬および鎮痛薬および麻酔薬を含む）が挙げられる。
【００８８】
治療剤組成物中に送達される、本発明に従って同定される治療剤の有効濃度は、因子（投与される薬物の最終的な所望投薬量および投与経路を含む）の数に依存して変化する。投与される好ましい投薬量はまた、疾患の型および程度または処置されるべき適応症、特定の患者の全体的な健康状態、送達される治療剤の相対生物学的効率、治療剤の処方、処方物中の賦形剤の存在およびその型、ならびに投与経路のような変数に依存するようである。いくつかの実施形態において、本発明の治療剤は、非ヒト霊長類およびゲッ歯類を使用する、前に記載した哺乳動物研究から推測された代表的な投薬単位を使用して、個体に提供され得る。上記のように、投薬単位とは、まとまっている（すなわち、患者に投与され得、そして容易に扱われて詰められ、治療剤それ自体または固体もしくは液体の薬学的希釈剤もしくはキャリアとの混合物のいずれかを含む、物理的にかつ生理学的に安定な単位用量のままである単用量）といわれる。
【００８９】
特定の実施形態において、生物は、本発明に従って同定される治療剤を生成するために操作される。これらの生物は、採取のために治療剤を放出し得るか、または患者に直接導入され得る。別の一連の実施形態において、細胞は、本発明に従って同定される治療剤のキャリアとして作用するために利用され得る。
【００９０】
本発明の治療剤はまた、「プロドラッグ」誘導体を含む。プロドラッグという用語は、親分子の薬理学的に不活性な（または部分的に不活性な）誘導体をいい、これは、活性成分を放出または活性化させるために、生物内で自発的または酵素的のいずれかで生体内変化を必要とする。プロドラッグは、本発明の治療剤の改変体または誘導体であって、これは、代謝条件下で切断可能な基を有している。プロドラッグは、本発明の治療剤となり、これは、これらが生理学的条件下で加溶媒分解を引き起こすかまたは酵素分解を引き起こす場合、インビボで薬学的に活性である。本発明のプロドラッグは、生物内の活性薬物成分を放出または活性化するのに必要な生体内変化段階の数に依存してシングル、ダブル、トリプルなどと呼ばれ得、これは、前駆体型形態で存在する官能基の数を示している。プロドラッグ形態は、しばしば、可溶性、組織適合性、または哺乳動物生物中で遅れた放出の利益を供与する（Ｂｕｎｄｇａｒｄ，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｐｐ．７−９，２１−２４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９８５およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ，ｐｐ．３５２−４０１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９２を参照のこと）。さらに、本発明に従うプロドラッグ誘導体は、他の特徴とあわされてバイオアベイラビリティーを増強し得る。
【実施例】
【００９１】
（実施例１．構築物を発現する融合タンパク質）
本発明の治療用タンパク質融合物を発現するための核酸構築物は、当該分野で公知の方法に従って組み換え的に作製され得る。例えば、本明細書中に記載される、異なる成分をコードする遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを使用して、合成遺伝子が作製され得るかまたは天然遺伝子および構築物遺伝子融合物を増幅し得る。好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、シグナル配列を含む組換え遺伝子から発現される。有用な核酸の例としては、本発明の部分を標的化するＩＧＦをコードする核酸が挙げられる。このような核酸は、図３に示されるＩＧＦ−１の配列に基づき得る。
【００９２】
（実施例２．発現方法および精製方法）
発現産物はまた、他のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種を含む他の原生動物亜界を使用して、血漿を含まない培地から単離され得る。一般的には、発現株は、血漿を含む培地中で増殖され、血漿を含まない培地中に希釈され、そしていくつかの世代（好ましくは２〜５世代）成長させて、その後発現産物を単離する。例えば、分泌された組換えＬＳＤタンパク質生成物は、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａプロマスティゴートから単離され得、これは、２７℃にて、７５ｃｍ２のフラスコ中の１×Ｍ１９９培地（５０ｍＬ）中でまず培養される。細胞密度が１〜３×１０７／ｍＬに達すると、この培養物を使用して１．２ＬのＭ１９９培地を播種する。この培養物の密度が約５×ｌ０６／ｍＬに達すると、細胞を遠心分離によって収集し、１８０ｍＬの上清中に再懸濁し、そしてこれを使用して、１６Ｌのスピナーフラスコ中の１２Ｌの「Ｚｉｍａ」培地を播種した。この培養物の最初の細胞密度は、代表的には、約５×１０５／ｍＬである。この培養物を、約１．０〜１．７×１０ｅ７細胞／ｍＬの密度まで増殖する。この細胞密度が達成されると、細胞を遠心分離によって培養培地から分離し、そして上清を０．２μのフィルターを介して４℃で濾過し、残りのプロマスティゴートを除去する。濾過した培地を、タンジェンシャル流濾過デバイス（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ−ＴＦＦカートリッジ）を使用して、１２．０Ｌ〜５００ｍＬまで濃縮した。
【００９３】
この方法に好ましい増殖培地は、Ｍ１９９および「Ｚｉｍａ」増殖培地である。しかし、他の血清含有培地および血清を含まない培地も有用である。Ｍ１９９増殖培地は、以下のとおりである：（１Ｌバッチ）＝２００ｍＬの５×Ｍ１９９（フェノールｐＨ指示薬を含む）（５倍で混合される）＋６３７ｍＬのＨ２Ｏ、５０．０ｍＬのＦＢＳ、５０．０ｍＬのＥＦ、２０．０ｍＬの５０ｇ／ｍＬ  ＳＡＴ、２．０ｍＬの５０％トリエタノールアミン中の０．２５％ヘミン、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中の１０ｍＭアデニン（１０ｍＬ）、４０．０ｍＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＬの９５％エタノール中の０．１％ビオチン、１０．０ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン。使用される全ての血清は、熱によって不活性化される。最終容積は１Ｌであり、滅菌濾過される。「Ｚｉｍａ」改変Ｍ１９９培地は、以下の通りである：（２０．０Ｌバッチ）＝２１７．８ｇのＭ１９９粉末（−）フェノールレッド＋７．０ｇの炭酸水素ナトリウム、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）中の２００．０ｍＬの１０ｍＭアデニン、８００．０ｍＬのＨｅｐｅｓを含まない酸（ｐＨ７．５）、２０．０ｍＬの９５％エタノール中の０．１％ビオチン、２００．０ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２７８０．０ｍＬのＨ２Ｏ。最終濃度は２０．０Ｌであり、滅菌濾過される。
【００９４】
本発明の１つの局面に従って、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａから分泌され、末端マンノース残基を有する炭水化物を含有するＬＳＤタンパク質は、以下のように精製され得る。例えば、プラスミドｐＸＳＡＰ０−ＧＵＳを含有する、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎ由来の組換えβ−グルクロニダーゼは、少量の血清タンパク質を含むＭ１９９培養培地中で増殖された。この培養物が＞１．０×１０７プロマスティゴート／ｍＬの密度に達すると、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎを遠心分離（１０分間、５００×ｇ）によって除去した。採取された培養培地を０．２μｍのフィルターを通過させ、微粒子を除去し、その後コントロールカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）−アガロースカラム（４％架橋されたビーズのアガロース、Ｓｉｇｍａ）上に直接充填した。このＣｏｎＡ−アガロースカラムを、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２（各５ｍＭ）で予め処理し、その後、５容量のカラム緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＣａＣｌ２、および１ｍＭのＭｎＣｌ２）で平衡化した。培養培地中の（２Ｌ中の）ＧＵＳ活性の全ての１７９，８００単位（ｎｍｏｌ／時間）を、２２ｍＬのＣｏｎＡアガロースカラム上に充填した。フロースルーまたは洗浄中に、活性は検出されなかった。このＧＵＳ活性を、２００ｍＭのメチルマンノピラノシドを含有するカラム緩衝液で溶出した。活性ピークを含む溶出された画分をプールし、そして濃縮した：１４３９００単位のＧＵＳ活性を、カラムから回収した（カラムに負荷された活性の８０％を回収）。このことは、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａから分泌される組換えβ−ＧＵＳが、末端マンノース残基を有する炭水化物を保有し、そしてさらに親和性精製工程のための基礎として、マンノースのＣｏｎＡとの相互作用を使用するための可能性を指摘することを示す。従って、高いマンノース炭水化物の存在は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーを使用する組換えＬＳＤタンパク質の精製におけるアフィニティー工程の基礎として作用し得る。
【００９５】
（実施例３．血液脳関門を通過するアッセイ）
本発明に従って、ＩＧＦタグで誘発されたタンパク質（特に、ＬＳＤタンパク質）が、血液脳関門を通過するかどうかを決定するために有用なモデル系は、ＭＰＳＶＩＩマウスモデルである（ＷｏｌｆｅおよびＳａｎｄｓ（１９９６）Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２０：２６３−２７３）。例えば、ＩＧＦタグに融合された組換えヒトβグルクロニダーゼは、任意の都合の良い発現系（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、酵母、哺乳動物、バキュロウイルスおよび他の発現系）において産生され得る。β−ＧＵＳを発現し、分泌するＬ．ｍｅｘｉｃａｎａは、１００ｍｌの標準的プロマスティゴート培地（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭアデニン、０．０００５％ヘミン、０．０００１％ビオチン、５％ウシ胎仔血清、５％胎芽液（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌ  ノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）を含むＭ１９９）において２６℃で増殖される。約５×１０６  プロマスティゴート／ｍｌの密度に到達した後、プロマスティゴートを、室温にて１０００×ｇで、１０分間遠心分離することによって回収し；これらのプロマスティゴートを、室温で１Ｌの低タンパク質培地（０．１ｍＭアデニン、０．０００１％ビオチン、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭ１９９）に播種するために使用した。１Ｌ培地を、滅菌攪拌子を含む２Ｌの蓋付きフラスコに入れ、それによって、穏やかに攪拌しながら２６℃でインキュベートし得る。１Ｌの培養物を、層流フード移動させ、蓋を取り外し、そして蓋を交換する前に、勢いよくかき混ぜることによって１日に２回通気する。培養が、２〜３×１０７プロマスティゴート／ｍｌの密度に達する場合、培養物を、プロマスティゴートペレットを捨て、培地を滅菌フラスコに注いだ以外は、上記されるように遠心分離する。１Ｌ当たり４３４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加によって、培地から活性ＧＵＳタンパク質を沈殿させ；塩析培地を、４℃で一晩保存する。沈殿したタンパク質を、１０，５００×ｇで３０分の遠心分離またはＧｅｌｍａｎ  Ｓｕｐｏｒ−８００膜を通しての濾過のいずれかによって回収し；タンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２中に再懸濁し、透析まで−８０℃で保存する。数Ｌの培地からの粗調製物を、解凍し、プールし、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ−７、ＭＷＣＯ  ２５，０００）中に配置し、そして重炭酸塩を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）の１Ｌ容量の２つに対して、一晩透析する。硫酸アンモニウム画分を、ＣｏｎＡカラム上でさらに精製する。
【００９６】
Ｂ６．Ｃ−Ｈ−２ｂｍｌ／ＢｙＢＩＲ−ｇｕｓｍｐｓ／＋マウスの異型交配によって作製されたＧＵＳマイナスマウスを、酵素置換治療におけるＧＵＳ−ＩＧＦ融合タンパク質または誘導体の効果を評価するために使用する。２つの形式を使用する。１つの形式において、３〜４匹の動物に、１００μｌの酵素希釈緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））中の２０，０００Ｕの酵素の単回注射を与える。マウスを、７２〜９６時間後に殺傷し、治療の効力を評価する。第２の形式において、マウスに、３〜４週間にわたって毎週、２０，０００単位の注射を与え、そして最終注射の１週間後に、このマウスを殺傷する。肝臓、脾臓および脳の組織化学的分析および組織病理学的分析を、刊行された方法によって実施する。治療の非存在下において、ＧＵＳマイナスマウスの細胞（例えば、マクロファージおよびＫｕｐｆｆｅｒ細胞）は、リソソーム中の老廃物の蓄積に由来する大きな細胞内蓄積区画を作り出す。本発明のＧＵＳ融合構築物で処置されたマウス中の細胞において、光学顕微鏡でもはや可視ではないまで、これらの区画のサイズは、視覚的に減少されるか、または区画が縮小されることが予想される。
【００９７】
本発明に従うと、新生マウスは、完全な血液脳関門を保有しない。しかし、１５日目までに、血液脳関門は、β−グルクロニダーゼが、脳においてもはや検出され得ない点まで形成される。従って、上記実験は、好ましくは、１５日目以上であるマウスに対して実施される。
【００９８】
本発明の１つの実施形態に従って、実験は、まず、完全なＩＧＦ−ＩタグおよびＩＧＦ−ＩＩタグの血液脳関門を超えてタンパク質を指向する能力を評価する。次に、レセプターまたはＩＧＦ結合タンパク質の結合を破壊するタンパク質の特異的変異バージョンを、アッセイする。ドメイン交換について、ＩＧＦ−ＩＩ（成熟タンパク質の残基１〜２８）のＢドメインは、血液脳関門Ｇ１１およびＴ１６を超えて輸送を変更することが考えられ得るＩＧＦ−Ｉとほんの２つの差異を含む。ＩＧＦ−ＩＩにおいてこれらの残基を変更することは、本質的にドメインＢの交換である。ＩＧＦ−ＩＩの残基２８および４１とＩＧＦ−Ｉの対応する領域との間の領域の別の交換もまた、試験され得る。これは、２つのタンパク質の最も分岐した領域を含む、２つのタンパク質のＣドメインを本質的に交換する。代替的交換は、Ｃ末端の１５残基をＩＧＦ−Ｉの対応する領域と切り替える。これらの３つのキメラは、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩとの間の血液脳関門を超える取り込みの差異が、２つのタンパク質の間の配列の差異／構造の差異とどのように相関するかの本質的に完全な図を提供する。
【００９９】
（実施例４．脳またはＣＮＳ中のタンパク質の蓄積についてのアッセイ）
放射性アッセイは、タンパク質産物の脳中での蓄積をモニターするために使用され得る。例えば、脳実質中の放射標識されたタンパク質の取り込みおよび蓄積を、ＲｅｉｎｈａｒｄｔおよびＢｏｎｄｙ（１９９４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：１７５３−１７６１に開示されるようにアッセイし得る。
【０１００】
酵素アッセイを、脳中のタンパク質産物の蓄積をモニターするためにまた使用し得る。酵素アッセイは、治療タンパク部分が、組織化学染色に適用可能なアッセイのための酵素である場合、特に有用である。リソソーム蓄積疾患タンパク質に対して有用な酵素アッセイは、Ｓｌｙら、（２００１）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９８（５）：２２０５−２２１０およびＷｏｌｆｅおよびＳａｎｄｓ（１９９６）Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２０：２６３−２７３に開示されるアッセイが挙げられる。
【０１０１】
（実施例５．インビボ療法）
Ｂ６．Ｃ−Ｈ−２ｂｍｌ／ＢｙＢＩＲ−ｇｕｓｍｐｓ／＋マウスの異型交配によって作製されたＧＵＳマイナスマウス（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ，Ｄａｖｉｓｓｏｎら、１９８９）を、酵素置換治療における本発明の組成物の有効性を評価するために使用する。２つの形式を使用する。１つの形式において、３〜４匹の動物に、１００μｌの酵素希釈緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５））中の２０，０００Ｕの酵素の単回注射を与える。マウスを、７２〜９６時間後に殺傷し、治療の効力を評価する。第２の形式において、マウスに、３〜４週間にわたって毎週、２０，０００単位の注射を与え、最後の注射の１週間後、このマウスを殺傷する。肝臓、脾臓および脳の組織化学的分析および組織病理学的分析を、刊行された方法（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ，Ｂａｒｋｅｒら、１９９１；Ｓａｎｄｓ，Ｖｏｇｌｅｒら、１９９４；Ｄａｌｙ，Ｖｏｇｌｅｒら、１９９９）によって実施する。治療の非存在下において、ＧＵＳマイナスマウスの細胞（例えば、マクロファージおよびＫｕｐｆｆｅｒ細胞）は、リソソーム中の老廃物の蓄積に由来する大きな細胞内蓄積区画を作り出す。本発明の組成物で処置されたマウス中の細胞において、光学顕微鏡でもはや可視ではないまで、これらの区画のサイズは、視覚的に減少されるか、または区画が縮小されることが予想される。
【０１０２】
同様に、リソソーム蓄積性疾患を有するヒトは、彼らのＣＮＳに対して（特に、ＣＮＳ内のリソソームに対して）適切な治療部分を標的化する構築物を使用して処置される。いくつかの例において、処置は、本発明の融合タンパク質の規則的な注射形態（例えば、１週間に１回）をとる。他の例において、処置は、融合タンパク質を持続的にインビボ発現させるために核酸を投与することによってか、または患者において融合タンパク質を発現する細胞（例えば、ヒト細胞、または単細胞生物）の投与によって、達成される。例えば、本発明のタンパク質は、２０００年２月１日に発行された米国特許第６，０２０，１４４号および２００１年１１月３０日に出願されたＰＣＴシリアル番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４９３５に記載されるようにＬｅｉｓｈｍａｎｉａベクターを使用して、インサイチュで発現され得る。
【０１０３】
（実施例６．酵素アッセイ）
ＧＵＳ活性に対するアッセイを、実施例３に記載されるように、および／または下記されるように実施する。
【０１０４】
ガラスアッセイチューブを、３連で番号付けし、１００μＬの２×ＧＵＳ反応混合液を、各チューブに添加する。２×ＧＵＳ反応混合液を、１００ｍｇの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄグルクロニドを１４．２ｍＬの２００ｍＭ酢酸ナトリウムに添加し、酢酸を用いてｐＨを４．８に調整することによって調製する。１００μＬまでのサンプルを、各チューブに添加し；水を、２００μＬの最終反応容量に添加する。反応チューブを、パラフィルムで覆い、３７℃の水浴で１〜２時間インキュベートする。反応を、１．８ｍＬの停止緩衝液（１０．６ｇのＮａ２ＣＯ３および１２．０１ｇのグリシンを、最終容量５００ｍＬの水に溶解し、ｐＨを１０．５に調整し、そして反復ディスペンサー中に濾過滅菌することによって調製する）の添加によって停止する。次いで、蛍光光度計を、ブランクとして２ｍＬの停止溶液を使用して較正し、蛍光を、残りのサンプルから読み取る。標準曲線を、２ｍＬの最終容量の停止緩衝液中、１、２、５、１０、および２０μＬの１６６μＭの４−メチルウンベリフェロン標準を使用して調製する。
【０１０５】
４−メチルウンベリフェロン標準溶液を、２．５ｍｇの４−メチルウンベリフェロンを１ｍＬのエタノール中に溶解し、９９ｍＬの滅菌水を添加することによって調製し、約２００ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度を得る。正確な濃度を、分光光度的に決定する。３６０ｎｍでの吸光係数は、１９，０００ｃｍ−１Ｍ−１である。例えば、１００μＬを、９００μＬの停止緩衝液に添加し、３６０ｎｍの吸光度を読み取る。読み取りが、０．３３７である場合、標準溶液の濃度は、０．３３７×１０（希釈）／１９，０００＝１７７μＭであり、次いで、これを、適切な量の滅菌水の添加によって１６６μＭに希釈し得る。
【０１０６】
（実施例７．哺乳動物細胞におけるタンパク質産生）
（ＣＨＯ細胞）
１つの例において、ＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７（Ｎ末端７アミノ酸の欠失を有するＩＧＦ−ＩＩ標的化部分）およびＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＵＳΔＣ１８が、ＧＩＬＴΔ１−７のＮ末端に融合された融合タンパク質）を、Ｕｌｍａｓｏｖら、（２０００）ＰＮＡＳ  ９７（２６）：１４２１２−１４２１７の系を使用してＣＨＯ細胞中で発現した。適切な遺伝子カセットを、ｐＣＸＮベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、これを、０．４ｃｍキュベット中、５０μＦおよび１，２００ＶでＣＨＯ細胞中にエレクトロポレートした。コロニーの選択および増幅を、２〜３週間、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８によって媒介した。ＣＨＯ細胞を、１５％  ＦＢＳ、１．２ｍＭ  グルタミン、５０μｇ／ｍＬ  プロリン、および１ｍＭ  ピルビン酸を補充したＭＥＭ培地中に伝播した。酵素産生のために、細胞を、多層フラスコにおいてＭＥＭ中にプレートした。一旦、細胞がコンフルエンスに達すると、回収培地（２％  ＦＢＳ、１．２ｍＭ  グルタミンおよび１ｍＭ  ピルビン酸を補充したＷｅｙｍｏｕｔｈ培地）を細胞に適用した。分泌された組換え酵素を含む培地を、２４〜７２時間ごとに回収した。ＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７細胞株に対する代表的な分泌レベルは、４０００〜５０００単位／ｍＬ／２４時間であった。
【０１０７】
多くのＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７  ＣＨＯ株を、産生された分泌酵素の量についてアッセイした。６つの最大産生体は、８６００と１４９００単位／ｍＬ／２４時間との間で分泌した。この最大産生株を、タンパク質の回収のために選択した。
【０１０８】
（ＨＥＫ  ２９３細胞）
ＧＵＳ−ＧＩＬＴカセットを、ＨＥＫ  ２９３細胞中での発現のためにｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。使用されたカセットは、野生型ＧＵＳ−ＧＩＬＴ；ＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７；ＧＵＳ−ＧＩＬＴＹ２７Ｌ；ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７；ＧＩＬＴＹ２７Ｌ、およびＧＵＳ−ＧＩＬＴＦ１９Ｓ／Ｅ１２Ｋを含んだ。
【０１０９】
ＨＥＫ  ２９３細胞を、４ｍＭ  グルタミンおよび１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を含む１２ウェルプレート中で、５０〜８０％のコンフルエンシーまで培養した。細胞を、製造業者によって記載されるようにＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ｐＣＥＰ−ＧＵＳ−ＧＩＬＴ  ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした。１ウェル当たり、０．５μｇ  ＤＮＡおよび２μＬのＦｕＧＥＮＥ  ６を、添加した。細胞を、トランスフェクションから２〜３日後、トリプシンを使用してウェルから除去し、次いで、１００μｇ／ｍＬ  ハイグロマイシンを含む上記ＤＭＥＭ培地を含むＴ２５ｃｍ２の培養フラスコ中で培養し、トランスフェクトされた細胞の安定な集団を選択した。ハイグロマイシンを含有する培地を、２〜３日毎に交換した。この培養物を、１〜２週間以内にＴ７５ｃｍ２培養フラスコに拡大した。酵素産生について、細胞を、多層フラスコにおいて、ＤＭＥＭ中にプレートした。一旦、細胞がコンフルエンスに達すると、回収培地（２％  ＦＢＳ、１．２ｍＭ  グルタミンおよび１ｍＭ  ピルビン酸を補充したＷｅｙｍｏｕｔｈ培地）を細胞に適用した。この培地を、ＣＨＯ細胞について最適化したが、２９３細胞について最適化しなかった。従って、ＨＥＫ  ２９３株を用いた分泌レベルは、代替の培地において有意により高いことが示され得る。
【０１１０】
分泌された酵素のレベルを、表２に示す。
【０１１１】
（表２）
【０１１２】
【表４】
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（実施例８．ＧＵＳ融合タンパク質の精製）
クロマトグラフィー（従来のクロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含む）を、使用し、ＧＵＳ融合タンパク質（例えば、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質および本発明の他の融合タンパク質）を精製し得る。
【０１１３】
（従来のクロマトグラフィー）
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａにおいて産生されるＧＵＳ融合タンパク質を精製するための１つの手順を、実施例２に記載する。代替的手順を、以下のパラグラフに記載する。
【０１１４】
ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合物を発現するＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ細胞株由来の培養上清を、収集し、遠心分離し、そして０．２μのフィルターを通過させて、細胞細片を取り除いた。この上清を、１００，０００分子量のカットオフを有する接線限外濾過を使用して濃縮し、−８０℃にて保存した。濃縮した上清を、ビーズ状アガロースに固定化されたＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（ＣｏｎＡ）を含むカラムに直接充填した。このカラムを、ＣｏｎＡカラム緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）で洗浄し、その後、ＣｏｎＡカラム緩衝液中、マンノシル化されたタンパク質（ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合物を含む）を、０〜０．２Ｍメチル−α−Ｄ−ピラノシドの勾配を使用して溶出した。グルクロニダーゼ活性を含む画分をプールし、濃縮し、そしてその緩衝液を、次のカラムのための調製において、ＳＰカラム緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に交換した。濃縮した画分を、同じ緩衝液で平衡化されたＳＰ高速カラムに充填し、そしてこのカラムを、さらなるＳＰカラム緩衝液で洗浄した。そのＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合物を、以下の２工程でこのカラムから溶出した：１）０〜０．１５Ｍグルクロン酸の勾配（２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）および１０％グリセロール中）、続いて、０．２Ｍグルクロン酸の勾配（２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）、１０％グルセロール）。グルクロニダーゼ活性を含む画分をプールし、そしてその緩衝液を、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）に交換した。これらのプールした画分を、同じ緩衝液で平衡化したＨＡ過剰ゲル（ｕｌｔｒｏｇｅｌ）カラムに充填した。そのＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を、リン酸緩衝液の漸増勾配（１４５〜３４０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４））で溶出した。グルクロニダーゼ活性を含む画分をプールし、濃縮し、そして２５％グリセロールを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中で−８０℃にて保存した。
【０１１５】
哺乳動物細胞中で産生されるＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を精製するための簡便なクロマトグラフィー方法は、以下のパラグラフにおいて記載される。
【０１１６】
ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を過剰発現する哺乳動物細胞を、Ｎｕｎｃ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｆｌａｓｋｓ中でコンフルーエンシーになるまで増殖させ、次いで、２％ウシ胎仔血清を補充した無血清培地（Ｗａｙｍｏｕｔｈ  ＭＢ  ７５２／１）を供給して、精製のための酵素を収集する。この培地を収集し、そしてフラスコに、２４時間間隔で再供給する。数個のフラスコからの培地をプールし、そして５０００×ｇにて２０分間、４℃にて遠心分離し、分離された細胞などを取り除く。この上清を取り除き、そしてアリコートを、β−ＧＵＳアッセイ用に採取する。ここで、この培地を、精製のために直接使用し得るかまたは後の使用のために−２０℃にて凍結させ得る。
【０１１７】
１Ｌの分泌培地を、３７℃にて解凍し（凍結している場合）、０．２μフィルターを通して濾過し、そして４Ｌのビーカーに移す。この培地の容量を、３Ｌのｄｄ水を加えることによって４倍に希釈し、塩濃度を低下させる；この希釈培地のｐＨを、１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基を使用して９．０に調整する。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で予め平衡化された５０ｍＬのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌをこの希釈培地に加え、そして４℃にて２時間、大きい撹拌棒を用いてゆっくりと攪拌する（小さいアリコートを取り除き、微量遠心し（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）、そしてその上清をアッセイして、結合をモニタリングする）。結合が完了した際に、その樹脂を、フリットガラス漏斗によって収集し、そしていくつかのバッチにおいて、７５０ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で洗浄する。この樹脂を、２．５ｃｍカラムに移し、そして１２０ｍＬ／時間の流速にて、さらに７５０ｍＬの同じ緩衝液で洗浄する。そのＤＥＡＥカラムを、０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）中）の線形勾配で溶出する。そのＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を含む画分を、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ）グルクロニドアッセイによって検出し、プールし、そして２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ  β−グリセロールホスフェート、０．１５Ｍ塩化ナトリウムで平衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００の６００ｍＬカラムに充填し、そして同じ緩衝液で溶出する。
【０１１８】
そのＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を含む画分をプールし、そして３×４Ｌの２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭ  β−グリセロールホスフェート、０．０２５％アジ化ナトリウムで透析する。透析した酵素を、３６ｍＬ／時間の流速にて、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭ  β−グルセロールホスフェート、０．０２５％アジ化ナトリウムで平衡化されたＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの１５ｍＬカラムに充填する。次いで、このカラムを、１０カラム容量のこの同じ緩衝液で洗浄する。このＣＭカラムを、平衡緩衝液中、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムの線形勾配で希釈する。そのＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を含む画分をプールし、そして４８ｍＬ／時間の流速にて、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  β−クリセロールホスフェート、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００の２．４×７０ｃｍ（ベッド容量＝３１７ｍＬ）カラムに充填する。その融合タンパク質を含む画分をプールし；そのプールを、ＧＵＳ活性およびタンパク質濃度についてアッセイして、比活性を決定する。アリコートにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後、クマシー染色または銀染色を行って、純度を確認する。より高濃度の酵素が必要とされる場合、ＸＭ−５０膜（５０，０００分子量カットオフ）またはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｃ−３０ユニット（３０，０００分子量カットオフ）を備えるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔｓを使用して、その融合タンパク質を濃縮し得る。この融合タンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  β−グルセロールホスフェートナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中、−８０℃にて保存する。
【０１１９】
（アフィニティークロマトグラフィー）
アフィニティークロマトグラフィー条件は、本質的に、Ｉｓｌａｍら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３０）：２２６２７−２２６３３に記載される通りである。ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を過剰発現する哺乳動物細胞由来の馴化培地（従来型のクロマトグラフィーについて上記されるように、収集および遠心分離される）を、０．２２μフィルターを通して濾過する。塩化ナトリウム（結晶性）を、０．５Ｍの最終濃度になるまで加え、そして１／４００容量の１０％ストック溶液を加えることによって、アジ化ナトリウムを０．０２５％の最終濃度になるまで加える。この培地を、抗ヒトβ−グルクロニダーゼ−Ａｆｆｉｇｅｌ  １０（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２５％アジ化ナトリウムで予め平衡化されている）の５ｍＬカラムに、２５ｍＬ／時間の速度で４℃にて適用する。画分を収集し、そしてフロースルーで、任意のＧＵＳ活性についてモニタリングする。このカラムを、３６ｍＬ／時間にて、１０〜２０カラム容量のＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄する。画分を収集し、そしてＧＵＳ活性についてモニタリングする。このカラムを、３６ｍＬ／時間にて、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）＋３．５Ｍ  ＭｇＣｌ２（５０ｍＬ）で溶出する。４ｍＬの画分を収集し、そしてＧＵＳ活性についてアッセイする。融合タンパク質を含む画分をプールし、等容量のＰ６緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  β−グリセロールホスフェート、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２５％アジ化ナトリウム）で希釈し、そしてＢｉｏＧｅｌ  Ｐ６カラム（Ｐ６緩衝液で予め平衡化されている）に通して脱塩して、ＭｇＣｌ２を取り除き、この緩衝液を、保存用のＰ６緩衝液に交換する。その融合タンパク質を、Ｐ６緩衝液で溶出し、ＧＵＳ活性を含む画分をプールし、そしてこのプールした画分を、ＧＵＳアッセイおよびタンパク質についてアッセイする。クマシーブルー染色または銀染色によって染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、純度を確認する。この融合タンパク質を、長期間の安定性のために、Ｐ６緩衝液中で−８０℃にて凍結して保存する。
【０１２０】
（実施例９．哺乳動物産生タンパク質に対する取り込み実験）
ＧＵＳ構築物またはＧＵＳ−ＧＩＬＴ構築物を産生するＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株由来の培養物上清を、０．２μｍフィルターを通して収集して、細胞を取り除いた。ＧＭ  ４６６８線維芽細胞を、５％  ＣＯ２中３７℃にて１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中、１２ウェルの組織培養プレートで培養した。細胞を、取り込み培地（ＤＭＥＭ＋２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０））で、３７℃にて１回洗浄した。次いで、線維芽細胞を、取り込み培地１ｍＬあたり１０００〜４０００単位の酵素とともに培養した（３〜２１時間）。数回の実験において、取り込みのための競合物（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）を加えた。マンノース−６−ホスフェート（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４４４１００）を、２〜８ｍＭの濃度にていくつかの培地に加え、そして純粋な組換えＩＧＦ−ＩＩ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＯＵ１００）を、２．８６ｍＭの濃度にて、いくつかの培地に加えた。これは、投入酵素の量に依存して、１０〜１００倍のモル過剰を表した。取り込みを、代表的に、三重のウェルで測定した。
【０１２１】
インキュベーション後、この培地をウェルから取り出し、そしてＧＵＳ活性について、二重でアッセイした。ウェルを、１ｍＬの３７℃リン酸緩衝化生理食塩水で５回洗浄し、次いで、０．２ｍＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％  ＮＰ−４０）中、室温にて１５分間インキュベートした。細胞溶解物を、微量遠心管に移し、そして１３，０００ｒｐｍにて５分間回転させて、細胞細片を取り除いた。標準的な蛍光比色アッセイを使用して、溶解物の１０μＬの２つのアリコートを、ＧＵＳ活性についてアッセイした。溶解物の、１０μＬの３つのアリコートを、タンパク質濃度についてアッセイした（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ）。
【０１２２】
初期実験は、ＣＨＯ産生ＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７の取り込みを、ＣＨＯ産生ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７の取り込みと比較した。表３に示されるように、このＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質（これは、潜在的なプロテアーゼ切断部位を排除するように操作された）は、ＩＧＦ−ＩＩおよびＭ６Ｐによって阻害され得る取り込みレベルよりも、有意に高い取り込みレベルを有する。対照的に、ＩＧＦ−ＩＩタグを欠損した、哺乳動物細胞において産生される組換えＧＵＳの取り込みは、過剰なＩＧＦ−１１の存在によって影響を受けなかったが、過剰なＭ６Ｐによって完全に無効にされた。この実験において、取り込みを１８時間行った。
【０１２３】
（表３）
【０１２４】
【表５】
2005506340.tif 000006
引き続く実験は、ＭＰＳＶＩＩ患者由来のヒト線維芽細胞によるＣＨＯ産生酵素およびＨＥＫ２９３産生酵素の取り込みを評価した。この実験において、取り込みは２１時間であった。
【０１２５】
（表４）
【０１２６】
【表６】
2005506340.tif 000007
さらなる実験は、ＩＧＦ−ＩＩ、８ｍＭ  Ｍ６Ｐ、または両方のインヒビターの存在下での選択された酵素の取り込みを評価した。取り込みを２２．５時間の期間にわたって測定した。
【０１２７】
（表５）
【０１２８】
【表７】
2005506340.tif 000008
上記の実験は、ＣＨＯ産生系およびＨＥＫ２９３産生系が、機能的な組換えタンパク質を分泌する能力において、本質的に等しいことを示している。この実験はまた、過剰なＩＧＦ−ＩＩの存在が、タグ化タンパク質の取り込みを７０〜９０＋％減少させるが、非タグ化タンパク質（４．５％）の取り込みに顕著に影響を与えないことを示している。これは、哺乳動物産生タンパク質の特異的なＩＧＦ−ＩＩ媒介取り込みを示している。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ産生タンパク質とは異なり、哺乳動物細胞において産生される酵素は、Ｍ６Ｐを含むと予測される。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターを介して取り込みを指向する能力を有するこれらのタンパク質上の２つのリガンドの存在は、過剰なＩＧＦ−ＩＩも過剰なＭ６Ｐのいずれもが完全に取り込みを無効にするはずがないことを意味する。さらに、これら２つのリガンドは、そのレセプター上の別々の位置に結合するので、１つのリガンドを介するこのレセプターへの結合は、過剰な他の競合物の存在によって顕著に影響を受けるはずがない。
【０１２９】
線維芽細胞上での、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへのＧＵＳ−ＧＩＬＴタンパク質の結合を測定し、そしてその取り込み速度を、公開された方法（Ｙｏｒｋら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２）：１１６４−７１）と同様に評価する。上記のように、１２ウェルの培養皿で培養したＧＭ４６６８線維芽細胞を、血清を含まない氷冷培地（１％  ＢＳＡを含む）中で洗浄する。リガンド（ＧＵＳ、ＧＵＳ−ＧＩＬＴもしくはＧＵＳ−ΔＧＩＬＴ、またはコントロールタンパク質のいずれか）を、血清を含まない冷培地（＋１％  ＢＳＡ）中、細胞に加える。リガンドの添加の際に、このプレートを、３０分間氷上でインキュベートする。３０分後、リガンドを取り除き、そして細胞を、氷冷培地で、迅速に５回洗浄する。０時点のウェルに、１ｍｌの氷冷ストリッピング（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）緩衝液（０．２Ｍ酢酸（ｐＨ３．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を入れる。次いで、このプレートを、３７℃の水浴中で浮遊させ、そして０．５ｍｌの予熱培地を加えて、取り込みを開始する。停止点毎に、１ｍｌのストリッピング緩衝液を加える。実験が終了した際に、このストリッピング緩衝液のアリコートを、実施例３に記載されるように、β−グルクロニダーゼ活性の蛍光比色アッセイのために保存する。次いで、細胞を上記のように溶解し、そしてこの溶解物を、β−グルクロニダーゼ活性についてアッセイする、あるいは、免疫学的方法を使用して、標的化された治療タンパク質の存在についてこの溶解物を試験し得る。
【０１３０】
ＧＵＳ−ＧＩＬＴは、一旦温度が３７℃にシフトすると、数分足らずで線維芽細胞によって迅速に取り込まれ（Ｙｏｒｋら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２）：１１６４−７１）、そしてその酵素活性は、長時間にわたってこの細胞内で持続すると、予測される。
【０１３１】
（実施例１０．インビボ治療）
最初に、ＧＵＳを含まないマウスを使用して、酵素置換療法におけるＧＵＳ−ＧＩＬＴおよびそれらの誘導体の有効性を評価し得る。ＧＵＳを含まないマウスを、Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ８３（４）：１２５８−６によって記載されるように、Ｂ６．Ｃ−Ｈ−２ｂｍｌ／ＢｙＢＩＲ−ｇｕｓｍｐｓ／＋マウスのヘテロ接合性交配によって作製する。好ましくは、このマウスは、ヒトβ−ＧＵＳに対して耐性である。このマウスは、ヒトβ−ＧＵＳの欠損コピーを有するトランスジーンを保有し、ヒトタンパク質に対する免疫耐性を誘導し得る（Ｓｌｙら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：２２０５−２２１０）。あるいは、ヒトβ−ＧＵＳ（例えば、ＧＵＳ−ＧＩＬＴタンパク質）を新生マウスに投与して、免疫耐性を誘導し得る。しかし、血液脳関門はマウスにおいて約１５日目まで見出されないので、１５日齢より上のマウスにおいて注射を開始した場合、ＧＩＬＴ−ＧＵＳが血液脳関門を通過するか否かを決定することは、より簡単である；従って、トランスジェニックマウスが好ましい。
【０１３２】
最初の実験は、標的化された治療用タンパク質の組織分布を決定することである。少なくとも３匹のマウスに、ＣＨＯ産生ＧＩＬＴタグ化β−ＧＵＳタンパク質（本明細書中でＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７と呼ばれ、ここで、ＧＵＳΔ１８（タンパク質の最後の１８のアミノ酸を欠失しているβ−ＧＵＳタンパク質）は、Δ１−７ＧＩＬＴ（成熟タンパク質の最初の７のアミノ酸を欠くＩＧＦ−ＩＩタンパク質）のＮ末端に融合している）を投与する。他のマウスに、β−ＧＵＳ、緩衝液コントロール、または実施例１２に記載されるようにして過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムで処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質のいずれかを投与する。一般に、好ましい用量は、０．５〜７ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。１つの例において、酵素用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内投与され、そして酵素濃度は、約１〜３ｍｇ／ｍＬである。さらに、少なくとも３匹のマウスに、５ｍｇ／ｋｇ体重のＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質（過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムで処理した）を投与する。２４時間後、これらのマウスを、屠殺し、そして以下の器官および組織を単離する：肝臓、脾臓、腎臓、脳、肺、筋肉、心臓、骨および血液。各組織の部分を、ホモジナイズし、そしてタンパク質１ｍｇあたりのβ−ＧＵＳ酵素活性を、Ｓｌｙら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：２２０５−２２１０に記載されるようにして決定する。組織の部分を、公開された方法により実施される組織化学および／または組織病理学のために調製する（例えば、Ｖｏｇｌｅｒら（１９９０Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：２０７−２１７を参照のこと）。
【０１３３】
さらなる実験は、多重注射プロトコールを包含し、ここでマウスに、１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、週毎に注射する。さらに、過ヨウ素酸塩改変酵素の半減期の測定を、実施例１２に記載されるようにして、未処理の酵素と比較して決定する。
【０１３４】
２つの他のアッセイ様式が使用され得る。一方の様式において、３〜４匹の動物に、１００μｌの酵素希釈緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中の２０，０００Ｕの酵素を一回注射する。７２〜９６時間後に、マウスを殺傷し、治療の効果について評価する。第２の様式において、マウスに、３〜４週間かけて、２０，０００単位で、週毎に注射し、そして最後の注射の１週間後に屠殺する。肝臓、脾臓および脳の組織化学分析および組織生理学分析を、公開された方法（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒら（１９９１）Ｂｌｏｏｄ  ７８（１１）：３０８１−９２；Ｓａｎｄｓら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９３（６）：２３２４−３１；Ｄａｌｙら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（５）：２２９６−３００）によって実施する。治療しない場合、ＧＵＳを有さないマウスの細胞（例えば、マクロファージおよびＫｕｐｆｆｅｒ細胞）は、リソソームにおける排出生成物の構築から生じる大きな細胞内貯蔵成分を発生する。ＧＵＳ−ＧＩＬＴ構築物で処置したマウスにおける細胞において、これらの成分の大きさは、目に見えるほど減少し、またはこれらの成分は、もはや光学顕微鏡では見えなくなるまで、収縮することが理解される。
【０１３５】
同様に、リソソーム貯蔵疾患を有するヒトは、そのリソソームに適切な治療的部分を標的化する構築物を使用して処置される。いくつかの場合において、処置は、ＧＩＬＴタンパク質の定期的な（例えば、毎週）の注射の形態をとる。他の場合において、処置は、ＧＩＬＴタンパク質の持続的なインビボ発現を可能にする核酸の投与によって、または患者においてＧＩＬＴタンパク質を発現する細胞（例えば、ヒト細胞または単細胞生物）の投与によって、達成される。例えば、ＧＩＬＴタンパク質は、米国特許第６，０２０，１４４号（２０００年２月１日発行）；米国仮出願６０／２５０，４４６（２００１年１１月３０日出願）；米国仮出願６０／２９０，２８１（２００１年５月１１日出願）；およびＰＣＴ番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４９３５号（２００１年１１月３０日出願）に記載されるような、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａベクターを使用して、インサイチュで発現され得る。
【０１３６】
本発明の標的化治療用タンパク質もまた、投与され得、そしてその効果が、ＧＵＳと共に使用するために以前に記載された方法（酵素アッセイ、組織化学アッセイ、神経学的アッセイ、生存アッセイ、生殖アッセイなど）を使用して、モニタリングされる。例えば、Ｖｏｇｌｅｒら（１９９３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓ．３４（６）：８３７−８４０；Ｓａｎｄｓら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：２３２４−２３３１；Ｓａｎｄｓら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１５９６−１６０５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１３９４−１４００；およびＳｏｐｅｒら（１９９９）４５（２）：１８０−１８６を参照のこと。
【０１３７】
（実施例１１）
これらの実験の目的は、ファブリー疾患のための酵素置換治療としての、ＧＩＬＴ改変α−ガラクトシダーゼＡ（α−ＧＡＬ  Ａ）の効果を評価することである。
【０１３８】
ファブリー病は、α−ＧＡＬ  Ａ（ＧＬ−３および他の天然のスピンゴリピドからの末端ガラクトースの除去を担う酵素）の不十分な活性から生じるリソソーム貯蔵疾患である。減少した酵素活性は、ｘ連鎖遺伝子における種々のミスセンス変異およびナンセンス変異に起因して生じる。ＧＬ−３の蓄積は、心臓、肝臓、腎臓、皮膚および脳の血管上皮細胞のリソソームにおいて最も多く存在するが、他の細胞および組織においても存在する。血管上皮細胞におけるＧＬ−３構築は、最終的に、心臓疾患および腎不全に至る。
【０１３９】
酵素置換治療は、ファブリー病のための効果的な処置であり、そしてその成功は、ＧＬ−３が蓄積する細胞のリソソームによって取り込まれる治療用酵素の能力に依存する。Ｇｅｎｚｙｍｅ産物のＦａｂｒａｚｙｍｅは、ＤＵＫＸ  Ｂ１１  ＣＨＯ細胞において産生される組換えα−ＧＡＬ  Ａであり、これはその証明された効力に起因して、欧州におけるファブリー病患者の処置のために承認されている。
【０１４０】
Ｆａｂｒａｚｙｍｅが細胞によって取り込まれ、そしてリソソームに輸送される能力は、Ｎ結合炭水化物上のマンノース６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）の存在に起因する。Ｆａｂｒａｚｙｍｅは、ほとんどの細胞型の細胞表面上に存在する、マンノース−６−ホスフェート／ＩＧＦ−ＩＩレセプター（Ｍ６Ｐ／Ｉｇｆ−Ｉｉｒ）への結合、およびその後のレセプター媒介性エンドサイトーシスによって、リソソームに送達される。Ｆａｂｒａｚｙｍｅは、報告によれば、ＡＳＮ残基１０８、１６１および１８４において、３個のＮ結合グリコシル化部位を有する。これらの位置における優勢な炭水化物は、それぞれ、フコシル化された二触角二シアリル化複合体、モノホスホリル化マンノース−７オリゴマンノース、およびビスホスホリル化マンノース−７オリゴマンノースである。
【０１４１】
本発明のグリコシル化非依存的リソソーム標的化（ＧＩＬＴ）技術は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−Ｉｉｒとの異なる相互作用を介して、治療用タンパク質をリソソームに直接標的化する。標的化リガンドは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ由来であり、これもまた、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−Ｉｉｒに、高い親和性で結合する。現在の用途において、ＩＧＦ−ＩＩタグは、治療用タンパク質へのｃ末端融合物として提供されるが、架橋を含む他の構成が可能である。細胞への取込みのためのＧＩＬＴ改変酵素の能力が、ＧＩＬＴ改変βグルクロニダーゼを使用して達成されており、このＧＩＬＴ改変β−グルクロニダーゼは、過剰のＩＧＦ−ＩＩと競合するプロセスにおいて、線維芽細胞によって効率的に取り込まれる。ＧＩＬＴ改変の利点は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合の増加、標的細胞のリソソームへの取込みの増加、薬物動態学の変更もしくは改善、および組織分布の範囲の拡大、変更もしくは改善である。組織分布の改善された範囲は、血液脳関門を横切るＧＩＬＴ改変α−ＧＡＬ  Ａの送達を含み得る。なぜなら、ＩＧＦタンパク質は、血液脳関門を明らかに横切るからである。
【０１４２】
ＧＩＬＴ系の別の利点は、Ｍ６Ｐ改変が生じない非哺乳動物発現系における取込み能力のあるタンパク質（ｕｐｔａｋｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を生成する能力である。特定の実施形態において、ＧＩＬＴ改変タンパク質は、ＣＨＯ細胞において主に産生される。特定の他の実施形態において、ＧＩＬＴタグは、α−ＧＡＬ  Ａのｃ末端に配置されるが、本発明はこのように限定されない。
【０１４３】
（実施例１２．過小グリコシル化（ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）治療用タンパク質）
標的治療剤の効力を、この標的治療剤の血清半減期を伸ばすことによって、増大させ得る。肝臓マンノースレセプターおよびアシアロ糖タンパク質レセプターは、特定の炭水化物構造を認識することによって、循環から糖タンパク質を排除する（Ｌｅｅら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５（５５６１）：１８９８−１９０１；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４５）２７８０３−６）。いくつかの実施形態において、本発明は、炭水化物に依存せず、ポリペプチドまたはそのアナログに依存する様式で、リソソームへのおよび／または血液脳関門を横切る治療剤の標的化を可能にする。これらのタンパク質の実際の過小グリコシル化は、マンノースおよびアシアロ糖タンパク質レセプターによる循環からのそれらの除去を最小にすることによって、循環におけるその半減期を大きく増加させることが予測される。同様に、機能的脱グリコシル化（例えば、治療用タンパク質上の炭水化物残基を、例えば、過ヨウ素酸塩／水素化ホウ素ナトリウムの処理によって、改変することによって）は、１つ以上のクリアランス経路により炭水化物の認識を妨害することによって、類似の効果を達成する。それにもかかわらず、タンパク質の標的化は、ほとんどの実施形態において、炭水化物−レセプター相互作用ではなく、タンパク質−レセプター相互作用に依存するので、グリコシル化の改変または排除は、リソソームへのおよび／または血液脳関門を横切るタンパク質の標的化に悪影響を与えないはずである。
【０１４４】
本発明の任意の融合タンパク質（例えば、任意のＩＧＦ−Ｉタグ化タンパク質）、またはペプチド標的化シグナルを使用する任意のリソソーム酵素（例えば、ＩＧＦ−ＩＩ）は、化学的または酵素的に脱グリコシル化されるかまたは改変されて、特定のリソソーム標的化の所望の特性および長い血清半減期を有する治療剤を生成し得る。マンノースレセプターを介してマクロファージまたは関連の細胞型に治療剤を送達することが重要であり得るいくつかのリソソーム貯蔵疾患の場合、十分にグリコシル化された治療剤が、過小グリコシル化標的治療剤と組み合わせて使用されて、多種多様な細胞型の標的化を達成し得る。
【０１４５】
（合成された場合に過小グリコシル化されるタンパク質）
いくつかの場合において、十分にグリコシル化されたタンパク質を産生しない系において、最初に標的化治療用タンパク質を生成することが好ましい。例えば、標的化治療用タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生され得、それにより、完全にはグリコシル化されていないタンパク質を生成する。あるいは、グリコシル化されていないタンパク質は、ツニカマイシン（Ｄｏ１−ＰＰ−ＧｌｃＮＡｃ形成のインヒビター）で処理した哺乳動物細胞において産生される。しかし、特定の標的化治療剤が、グリコシル化の非存在下で、正確に折り畳まれない場合、これは好ましくは、最初に、グリコシル化タンパク質として産生され、そして引き続いて脱グリコシル化されるか、または機能的に過小グリコシル化にされる。
【０１４６】
過小グリコシル化標的治療用タンパク質はまた、標的治療用タンパク質をコードする遺伝子を操作することによって調製され得、その結果、通常はグリコシル化のためのアクセプターとして働くアミノ酸が、異なるアミノ酸に変化する。例えば、Ｎ結合グリコシル化のためのアクセプターとして働くアスパラギン残基は、グルタミン残基、またはグリコシル化アクセプターではない別の残基に変化し得る。この保存的変化は、この部位におけるグリコシル化を排除しつつ、酵素構造に対する最小の影響を有する可能性が最も高い。あるいは、グリコシル化アクセプター付近の他のアミノ酸が改変され得、通常はグリコシル化されているアミノ酸を変化させる必要なく、グリコシル化酵素に対する認識モチーフを破壊する。
【０１４７】
ＧＵＳの場合、４個の潜在的なグリコシル化部位の任意の１つの除去が、大きな酵素活性を保持しつつグリコシル化の量を減少させる（Ｓｈｉｐｌｅｙら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１６）：１２１９３−８）。２つのグリコシル化部位のいくつかのセットの、ＧＵＳからの除去はなお、有意な酵素活性を許容する。４つ全てのグリコシル化部位の除去は、ツニカマイシンでの細胞の処理と同様に、酵素活性を排除するが、精製された酵素の脱グリコシル化は、酵素的な活性な物質を生じる。従って、グリコシル化部位の除去に伴う活性の損失は、酵素の不正確な折り畳みに起因するようである。
【０１４８】
しかし、他の酵素は、グリコシル化がない場合でさえ、正確に折り畳む。例えば、細菌β−グルクロニダーゼは、天然ではグリコシル化されておらず、そして本発明の標的化部分を使用して、哺乳動物リソソームに、および／または血液脳関門を横切って標的化され得る。このような酵素は、例えば、この酵素をグリコシル化タンパク質として合成し、そしてこれを引き続いて脱グリコシル化するのではなく、グリコシル化されていない状態で合成され得る。
【０１４９】
（脱グリコシル化）
標的治療剤が、哺乳動物細胞培養系で生成される場合、これは好ましくは増殖培地に分泌され、収集され、標的治療剤の引き続く精製（例えば、クロマトグラフィー精製プロトコール（例えば、イオン交換を含むクロマトグラフィー精製プロトコール）、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、ＣｏｎＡクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーまたはイムノアフィニティクロマトグラフィーによって）を可能にする。
【０１５０】
糖タンパク質の化学的脱グリコシル化は、多数の方法（トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）での処理、またはフッ化水素（ＨＦ）での処理を含む）で達成され得る。
【０１５１】
ＴＦＭＳによる化学的脱グリコシル化（Ｓｏｊａｒら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（５）：２５５２−９；Ｓｏｊａｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３４１−５０）：１ｍｇのＧＩＬＴ−ＧＵＳを、減圧下で一晩乾燥させる。この乾燥したタンパク質を、時折振盪しながら、窒素下で、０．５〜２時間、０℃で、１５０μｌのＴＦＭＳで処理する。この反応混合物を、ドライアイス−エタノール浴中で、−２０℃より下に冷却し、そしてこの反応物を、予め冷却した（−２０℃）、水中６０％のピリジンの溶液を徐々に添加することによって、中性にする。次いで、この中性の反応混合物を、４℃で、ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ７．０）（数回交換する）に対して、透析する。ＴＦＭＳを用いる化学的脱グリコシル化は、処理されたタンパク質に対する改変（メチル化、スクシンイミド形成およびアスパラギン酸残基の異性化を含む）を生じ得る（Ｄｏｕｇｌａｓｓら（２００１）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０（７）：５７１−６）。
【０１５２】
ＨＦによる化学的脱グリコシル（Ｓｏｊａｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３４１−５０）：この反応を、閉鎖反応系（例えば、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から得られ得るようなもの）で実施する。１０ｍｇのＧＩＬＴ−ＧＵＳを減圧乾燥し、そして反応容器に入れ、次いで、この容器を、ＨＦ装置に接続する。ＨＦの全ラインが排気された後に、１０ｍＬの無水ＨＦを、反応容器を撹拌しながらレザバから留去する。この反応を、０℃で１〜２時間継続する。その後、水流吸引器でＨＦを１５〜３０分間除去する。残った微量のＨＦを、高真空下で除去する。この反応混合物を、２ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＯＨに溶解して、残りの全てのＨＦを中和し、そして冷０．２Ｍ  ＨＣｌでｐＨを７．５に調整する。
【０１５３】
酵素脱グリコシル化（Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０−９）：Ｎ結合炭水化物を、タンパク質Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）Ａまたはタンパク質Ｎ−グリコシダーゼＦを使用して、糖タンパク質から完全に除去し得る。１つの実施形態において、糖タンパク質は、グリコシダーゼでの処理の前に変性されて、糖タンパク質に対する酵素の活性を促進する；その後、この糖タンパク質は、上記「インビトロリフォールディング」の節において議論されたように、リフォールディングされる。別の実施形態において、過剰のグリコシダーゼが、ネイティブの糖タンパク質を処理して効果的な脱グリコシル化を促進するために使用される。
【０１５４】
実際に脱グリコシル化されない標的の治療タンパク質の場合には、減少したグリコシル化が、標的治療タンパク質におけるプロテアーゼ感受性部位（これは、このタンパク質の半減期を短縮する）を露出させることが可能である。Ｎ結合グリコシル化は、リソソーム酵素のサブセットをタンパク質分解から保護することが公知である（Ｋｕｎｄｒａら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４３）：３１０３９−４６）。このようなプロテアーゼ感受性部位は、好ましくは、タンパク質から（例えば、部位特異的変異誘発によって）操作される。以下に議論されるように、プロテアーゼ感受性部位または潜在的なエピトープを露出させる危険性は、脱グリコシル化を組み込むこと、または炭水化物を全く省略するよりむしろ炭水化物構造を改変することによって、最小化され得る。
【０１５５】
（炭水化物構造の改変または部分的な脱グリコシル化）
１つの実施形態において、治療タンパク質は、部分的に脱グリコシル化される。例えば、治療タンパク質は、エンドグリコシダーゼ（例えば、エンドグリコシダーゼＨ）で処理され得、これは、Ｎ結合した高マンノース炭水化物を切断するが、複雑な型の炭水化物を切断せず、アスパラギンに結合した単一のＧｌｃＮＡｃ残基を残す。この様式で処理された治療タンパク質は、高マンノース炭水化物を欠き、肝マンノースレセプターとの相互作用を減少する。このレセプターは、末端ＧｌｃＮＡｃを認識するが、タンパク質表面上の単一のＧｌｃＮＡｃとの増殖性相互作用の可能性は、インタクトな高マンノース構造との相互作業の可能性ほど大きくない。治療タンパク質が哺乳動物細胞中で産生される場合、このタンパク質上に存在する任意の複雑な炭水化物は、ｅｎｄｏＨ処理によって影響を受けないままであり、そして末端をシアリル化され得、これによって、肝炭化水素認識応答との相互作用を低下させ得る。従って、このようなタンパク質は、増加した半減期を有する用である。同時に、残っている炭水化物による立体障害は、タンパク質表面上の潜在的エピトープを免疫系から遮断し、そしてタンパク質表面へのプロテアーゼの接近を低下させ得る（例えば、プロテアーゼリッチなリソソーム環境内で）。
【０１５６】
他の実施形態において、治療タンパク質のグリコシル化は、例えば、酸化、還元、脱水、置換、エステル化、アルキル化、シアリル化、炭素−炭素結合の切断などによって改変されて、血液からの治療タンパク質のクリアランスを減少させる。いくつかの好ましい実施形態において、治療タンパク質は、シアリル化されていない。例えば、過ヨウ化物および水素化ホウ素ナトリウムでの処理は、大部分の糖タンパク質の炭水化物構造を改変するために効果的である。過ヨウ化物での処理は、ビシナルジオールを酸化し、炭素−炭素結合を切断し、そしてヒドロキシル基をアルデヒド基で置き換える；ホウ素化水素は、これらのアルデヒドをヒドロキシルに還元する。多くの糖残基は、ビシナルジオールを含み、従って、この処理によって切断される。図４Ａに示されるように、タンパク質は、アスパラギン残基の近くにＮ−アセチルグルコサミン残基およびこの構造の他の箇所にマンノース残基を含む高マンノース炭水化物で、アスパラギン残基でグリコシル化され得る。図４Ｂに示されるように、末端マンノース残基は、ヒドロキシル基を有する３つの連続する炭素を有する；関与する両方の炭素−炭素結合は、過ヨウ化物処理によって切断される。いくつかの非末端マンノース残基はまた、ビシナルジオールを含み、これらは、同様に切断される。それにもかかわらず、この処理は、環状炭水化物を直鎖炭水化物に切断する一方で、これは、この炭水化物を完全には除去せず、潜在的にプロテアーゼ感受性な部位または抗原性ポリペプチド部位の露出の危険性を最小にする。
【０１５７】
リソソーム酵素β−グルクロニダーゼの半減期は、過ヨウ化物およびホウ素化水素ナトリウムでの連続的な処理の後に、１０倍より大きく増加することが公知である（Ｈｏｕｂａら（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７（５）：６０６−１１；Ｓｔａｈｌら（１９７６）ＰＮＡＳ  ７３：４０４５−４０４９；Ａｃｈｏｒｄら（１９７７）Ｐｅｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１１：８１６−８２２；Ａｃｈｏｒｄら（１９７８）Ｃｅｌｌ  １５（１）：２６９−７８）。同様に、リシンは、可溶化物とシアノホウ素化水素ナトリウムの混合物で処理された（Ｔｈｏｒｐｅら（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７：１９７）。ラットへの注射後、肝臓によって吸収されたリシンの割合は、化学処理と共に注射された用量の４０％（未処理リシン）から２０％（修飾リシン）まで減少した。対照的に、血液中のリシンの量は、２０％（未処理リシン）から４５％（処理したリシン）まで増加した。従って、処理されたリシンは、より広い組織分布および循環におけるより長い半減期を享受する。
【０１５８】
本発明の標的化部分と結合された、β−グルクロニダーゼ構築物（または他の糖タンパク質）は、過ヨウ化物およびホウ素化水素ナトリウムでの連続的な処理によって脱グリコシル化または修飾されると、半減期の類似の（例えば、２倍より大きいか、４倍より大きいか、または１０倍より大きい）増加を享受するが、カチオン依存性Ｍ６Ｐレセプターに対する高い親和性は保持するままであり、このレセプターを有する全ての細胞型のリソソームに、この構築物を標的化させる。この構築物はまた、血液脳関門を効率的に横切ることが予測される。対照的に、リソソーム標的化のためにＭ６Ｐに依存するβ−グルクロニダーゼ調製物は、過ヨウ化物およびホウ素化水素ナトリウムで脱グリコシル化または処理され、これは、上昇した血清半減期を享受するが、リソソームを標的化し得ない。なぜなら、Ｍ６Ｐ標的化シグナルがこの処理によって改変されたからである。
【０１５９】
過ヨウ化物およびホウ素化水素ナトリウムでの連続的な処理による、炭水化物の修飾は、以下のように実施され得る：精製されたＧＩＬＴ−ＧＵＳが、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中４０ｍＭのＮａＩＯ４と共に、４℃で２時間インキュベートされる。この反応は、過剰のエチレングリコールの添加によって停止され、そして未反応試薬が、この反応マトリックスを、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）と平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍに通すことによって除去される。この処理に続いて、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中４０ｍＭのＮａＢＨ４と共に、３７℃で３時間インキュベートされ、次いで、４℃で１時間インキュベートされる。この反応混合物をＰＢＳ（ｐＨ７．５）で溶出するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラムに通し、この反応を終結させる。
【０１６０】
過ヨウ化物およびホウ素化水素ナトリウムでの処理のための別のプロトコルは、Ｈｉｃｋｍａｎら（１９７４）ＢＢＲＣ  ５７：５５−６１に記載されている。精製されたタンパク質が、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、０．１５ＭのＮａＣｌ中に透析される。過ヨウ素酸ナトリウムが、最終濃度０．０１Ｍまで添加され、そしてこの反応は、４℃、暗所で少なくとも６時間進行する。β−ヘキソサミニダーゼの、これらの条件下での過ヨウ化物での処理は、線維芽細胞によるタンパク質の取り込みを防止するために十分である；取り込みは、通常、Ｍ６Ｐレセプターを線維芽細胞表面に有するβ−ヘキソサミニダーゼのＭ６Ｐ部分に依存する。従って、過ヨウ化物での酸化は、Ｍ６Ｐを、Ｍ６Ｐレセプターと相互作用するその能力を廃止するために十分に改変する。
【０１６１】
あるいは、炭水化物は、Ｔｈｏｒｐｅら（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７：１９７−２０６に開示されるように、過ヨウ化物およびシアノボロヒドリドでの、１工程反応の処理によって修飾され得る。
【０１６２】
部分的に脱グリコシル化したタンパク質または修飾されたグリコシル化パターンを有するタンパク質における、炭水化物の存在は、グリコシル化の完全な非存在によっておそらくカバーされない、潜在的なポリペプチドエピトープを遮蔽するはずである。治療タンパク質が免疫応答を実際に刺激する場合、免疫抑制治療剤が、治療タンパク質と組み合わせて使用され得る（Ｂｒｏｏｋｓ（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ６８：２６８−２７５）。例えば、アルグルセラーゼで処置されたゴシェ病患者の約１５％が、免疫応答を発生させたことが報告された（Ｂｅｕｔｌｅｒら，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，第８版（２００１），Ｓｃｒｉｖｅｒら編，３６３５−３６６８頁）。運良く、アルグルセラーゼに対する抗体を産生した患者の多く（８２／１４２）は、通常の処置レジメンによって許容化された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９３：２０８１−２０８８）。従って、免疫応答を発生させ得る少数の患者の役に立つために、治療タンパク質を受けている患者はまた、本発明のいくつかの実施形態において、免疫抑制治療を受ける。
【０１６３】
（試験）
タンパク質が過少にグリコシル化されていることを確認するために、ＣｏｎＡに曝露することによって試験され得る。過少グリコシル化タンパク質は、対応する完全にグリコシル化したタンパク質と比較される場合に、ＣｏｎＡ−セファロースに対する減少した結合を示すと予測される。
【０１６４】
実際に過少グリコシル化されたタンパク質はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解され得、そして対応する完全にグリコシル化したタンパク質と比較され得る。例えば、化学的に脱グリコシル化されたＧＵＳ−ＧＩＬＴは、未処理の（グリコシル化）ＧＵＳ−ＧＩＬＴおよびＰＮＧａｓｅ  Ａで処理された酵素的に脱グリコシル化されたＧＵＳ−ＧＩＬＴと比較され得る。過少グリコシル化タンパク質は、完全にグリコシル化されたタンパク質と比較される場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるより大きい移動能を有すると予測される。
【０１６５】
過少グリコシル化された標的化治療タンパク質は、標的化ドメインに依存する取り込みを示す。過少グリコシル化タンパク質は、マンノースまたはＭ６Ｐに依存する、減少した取り込みを示す（そして好ましくは、実質的に取り込みを示さない）はずである。これらの特性は、細胞取り込み実験において、実験的に確認され得る。
【０１６６】
例えば、哺乳動物細胞中で合成され、引き続いて過ヨウ化物およびボロヒドリドで処理された、ＧＵＳ−ＧＩＬＴタンパク質は、Ｍ６Ｐ依存性取り込みおよびマンノース依存性取り込みを試験することによって、機能的脱グリコシル化に対して試験され得る。Ｍ６Ｐ依存性取り込みが減少したことを示すために、取り込みアッセイが、ＧＭ４６６８線維芽細胞を使用して実施される。競合物質の非存在下では、処理された酵素および未処理の酵素は、各々、有意な取り込みを示す。過剰のＩＧＦ−ＩＩの存在は、処理された酵素および未処理の酵素の取り込みをかなり減少させるが、未処理の酵素は、Ｍ６Ｐ依存性の経路を介する残余の取り込みを保持する。過剰のＭ６Ｐは、未処理の酵素の取り込みを減少させるが、機能的に脱グリコシル化されたタンパク質の取り込みの減少においては、さほど効果的ではない。処理された酵素および未処理の酵素について、両方の競合物質の同時の存在は、実質的に取り込みを廃止するはずである。
【０１６７】
マンノース依存性の取り込みを評価するための取り込みアッセイは、Ｊ７７４−Ｅ細胞（マンノースレセプターを有するが、Ｍ６Ｐレセプターを存在するならば少数有する、マウスマクロファージ様細胞株）を使用して実施される（Ｄｉｍｅｎｔら（１９８７）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．４２：４８５−４９０）。これらの細胞は、低グルコースのＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、４ｍＭグルタミン、および抗生物質、抗真菌溶液を補充された）（Ｓｉｇｍａ，Ａ−５９５５）中で培養される。これらの細胞を用いる取り込みアッセイは、線維芽細胞を用いて実施されるアッセイと同一の様式で実施される。過剰のＭ６ＰおよびＩｇＦ−ＩＩの存在下（これは、任意の残余のＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに起因して、取り込みを排除する）で、完全にグリコシル化された酵素は、マンノースレセプターとの相互作用に起因して、かなりの取り込みを示す。過少グリコシル化酵素は、これらの条件下では、かなり減少した取り込みを示すと予測される。完全にグリコシル化された酵素の、マンノースレセプター依存性の取り込みは、過剰の（１００μｇ／ｍＬ）マンナンの添加によって競合され得る。
【０１６８】
脱グリコシル化ＧＵＳ−ＧＩＬＴの薬物速度論は、１時点あたり、２０，０００酵素単位の静脈内注射を、３匹のＭＰＳＶＩＩマウスの群に与えることによって、決定され得る。各時点について、５０μＬの血液を、酵素活性について評価する。
【０１６９】
（均等物）
本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施され得る。従って、上記実施形態は、全ての局面において、本明細書中に記載される本発明の限定ではなく例示であるとみなされるべきである。従って、本発明の範囲は、上記記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、そしてこの特許請求の範囲の意味および均等の範囲内に入る全ての変化は、本発明に含まれることが意図される。
【０１７０】
（参考としての援用）
本明細書中に開示される特許文献および科学刊行物、ならびにＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２５０，４４６（２０００年１１月３０日出願）；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２５０，４４４（２０００年１１月３０日出願）；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２９０，２８１（２００１年５月１１日出願）；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２８７，５３１（２００１年４月３０日出願）；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３０４，６０９（２００１年７月１０日出願）；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３２９，４６１（２００１年１０月１５日出願）、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３５１，２７６（２００２年１月２３日出願）；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／１３６，８４１（２００２年４月３０日出願）；代理人文書番号ＳＹＭ−００７ＣＰ、発明の名称「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２００２年１０月１６日出願）；代理人文書番号ＳＹＭ−００９、発明の名称「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２００２年１０月１６日出願）；およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４９３５（２００１年１１月３０日出願）の各々の開示は、その全体が、本願に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１は、成熟ヒトＩＧＦ−Ｉ（配列番号１）およびＩＧＦ−ＩＩ（配列番号２）の配列アラインメントを示し、相同領域ならびにＡドメイン、Ｂドメイン、ＣドメインおよびＤドメインを示す。
【図２】図２は、ＩＧＦタンパク質の２次元表示であり、シグナル配列、Ａドメイン、Ｂドメイン、ＣドメインおよびＤドメイン、ならびにＣ末端配列を示す。
【図３】図３は、ヒトＩＧＦ−ＩｍＲＮＡについてのタンパク質（図３Ａ、配列番号３）配列および核酸（図３Ｂ、配列番号４）配列を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、アスパラギン残基を介して糖タンパク質に連結された、リン酸化高マンノース炭水化物構造の一形態を示し、そしてマンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の構造も示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、より高レベルに詳細な高マンノース炭水化物構造の一部を示し、そして過ヨウ素酸塩処理による切断を受けやすい位置を示す。この炭水化物構造内の糖残基の位置は、丸で囲んだ大文字Ａ〜Ｈで表示し；リン酸基は、丸で囲んだ大文字Ｐで示される。
【図５】図５は、グリコシル化不全のいくつかの型を示す。
【図１】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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