(57)【要約】ＥＧＦＲは悪性神経膠腫において過剰発現されており、活性化されると、これらの癌細胞においてアポトーシスシグナルを伝達する。ＥＧＦＲ発現細胞を特異的な標的とし、場合によってはＥＧＦＲ発現細胞においてアポトーシスを誘導するために、ＥＧＦＲリガンドと担体分子とを含むキメラ分子が用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮細胞増殖因子受容体リガンドと、免疫グロブリン分子の一部を含む担体分子とを含んでなるキメラ分子。
【請求項２】
上皮細胞増殖因子受容体リガンドがＴＧＦαである、請求項１に記載のキメラ分子。
【請求項３】
免疫グロブリン分子の一部がＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１に記載のキメラ分子。
【請求項４】
免疫グロブリン分子の一部がヒンジ領域をさらに含む、請求項１に記載のキメラ分子。
【請求項５】
上皮細胞増殖因子受容体リガンドと、ＰＥ４０Δ５５３／Δ６０９‐６１３を含む担体分子とを含んでなるキメラ分子。
【請求項６】
上皮細胞増殖因子受容体リガンドがＴＧＦαである、請求項５に記載のキメラ分子。
【請求項７】
上皮細胞増殖因子受容体リガンドと、免疫グロブリン分子の一部またはＰＥ４０Δ５５３／Δ６０９‐６１３を含む担体分子とを含んでなるキメラ分子をコードする核酸。
【請求項８】
癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量で、上皮細胞増殖因子受容体リガンドと担体分子とを含んでなるキメラ分子を含む組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項９】
上皮細胞増殖因子受容体リガンドがＴＧＦαである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
担体分子が免疫グロブリン分子の一部を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
免疫グロブリン分子の一部がＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
免疫グロブリン分子の一部がヒンジ領域をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
担体分子がＰＥ４０Δ５５３／Δ６０９‐６１３を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
担体分子がＰＥ４０Δ５５３／Δ６０９‐６１３を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
癌細胞が神経膠腫細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
神経膠腫細胞が多形性神経膠芽腫細胞である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、免疫学、および腫瘍学の分野に関する。より詳細には、本発明は、癌細胞を殺傷するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００２年３月１９日に出願された米国特許仮出願第６０／３６５，５７６号の利益を主張する。
【０００３】
（発明の背景）
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）およびトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ‐α）はサイトカインであり、両方とも、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）として知られる細胞表面受容体と相互作用する。ＥＧＦＲは細胞の分化および増殖の調節に関与している。ＥＧＦＲが活性化されると、細胞の増殖、形態、および分化を変化させることができる多種多様なシグナルが生じる。ＥＧＦＲ発現細胞によりＴＧＦαが産生されるということは、ＴＧＦαが、ＥＧＦＲが絶えず活性化されることによって細胞増殖を刺激するオートクライン形式で作用できることを示唆している。ＥＧＦＲは、ヒト上皮悪性腫瘍および悪性神経膠腫の大部分で過剰発現されている。後者に関しては、多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）患者の約５０％が、ｉｎ  ｓｉｔｕでＥＧＦＲを過剰発現することが観察された。内因性リガンド（例えば、ＥＧＦ）濃度の上昇による野生型ＥＧＦＲの活性化および構成的に活性のあるＥＧＦＲ（ＥＧＲＦｖＩＩＩ）の使用から、この受容体は、悪性神経膠腫の発症および高悪性度星状細胞腫（例えば、ＧＢＭ）への変化に重要な役割を果たすことが分かっている。
【０００４】
癌治療の目的でＥＧＦＲ機能をブロックするために、いくつかの取り組みが行われている。受容体への成長因子（例えば、ＥＧＦ）の接近を制限し、それにより増殖シグナルおよび発癌シグナルを抑制し、腫瘍増殖を阻止しようと、抗体が試験されている。同様に、活性化ＥＧＦＲのシグナル伝達を妨害しようと、低分子が開発されている。
【０００５】
正常な脳および骨髄はＥＧＦＲがあるとしてもわずかしか発現しないので、ＥＧＦＲ抗体の使用は脳悪性腫瘍の治療に非常に魅力的なアプローチである。ＥＧＦＲに対して、いくつかのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が産生されており、このうち２２５、Ｃ２２５、および４２５は、恐らく、最も詳細に特徴付けられている。ＭＡｂ  Ｃ２２５は、ＥＧＦＲを過剰発現する癌細胞においてアポトーシスを誘導し、ＭＡｂ  ４２５は、悪性神経膠腫患者の初期臨床試験において試験されている。この臨床試験では、有意な抗腫瘍反応および炎症反応が観察された。しかしながら、これらの反応は非常に強いので、付随する浮腫のために研究者らは試験の中止を余儀なくされた。この試験からは、抗腫瘍反応が（１）受容体の結合により誘発されるアポトーシス、（２）古典的な抗体による殺傷、または（３）これらの要因の組み合わせを介して起こるのかどうか分からなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
様々な種類のＥＧＦＲリガンドが使用できれば、この抗腫瘍反応の機構を解明するのに役立つはずである。このようなリガンドはまた、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍を治療するのにも役立つはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＥＧＦＲが悪性神経膠腫において過剰発現されている時に、これらの細胞においてアポトーシスシグナルを伝達するという発見に関する。ＥＧＦＲを特異的な標的にするために、ＥＧＦＲリガンドおよび担体分子の両方を含む組換えキメラ分子が開発された。ＥＧＦＲリガンドがキメラ分子を細胞表面上のＥＧＦＲに向ける役割を果たすのに対して、担体分子はＥＧＦＲリガンドの特徴を付与する、または変える役割を果たす。例えば、担体分子は、（１）キメラ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／もしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を高めることができ、（２）キメラ分子にエフェクター機能を付与することができ、ならびに／または（３）キメラ分子の精製を容易にすることができる。このようなキメラ分子の有用な例として、変異された細菌毒素または免疫グロブリン分子の一部などの担体分子に融合したＴＧＦ‐αが挙げられる。ＧＢＭ細胞などのＥＧＦＲ過剰発現細胞とこれらのキメラ分子を接触させると、アポトーシスにより細胞が死ぬ。
【０００８】
従って、本発明は、上皮細胞増殖因子受容体リガンドおよび担体分子を含むキメラ分子を特徴とする。１つの実施形態では、上皮細胞増殖因子受容体リガンドはＴＧＦαである。ある変形実施形態では、担体分子は、免疫グロブリン分子の一部（例えば、免疫グロブリンに由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含むもの）でもよい。他の変形実施形態では、担体分子はＰＥ４０Δ５５３／Δ６０９‐６１３などの細菌毒素を含む。前記のキメラ分子をコードする核酸も本発明の範囲内である。
【０００９】
別の態様では、本発明は、癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法を特徴とする。この方法は、癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量で、上皮細胞増殖因子受容体リガンドおよび担体分子（例えば、前記の１つ）を有するキメラ分子を含む組成物を投与する工程を含む。癌細胞は、多形性神経膠芽腫細胞などの神経膠腫細胞でもよい。
【００１０】
特に定めのない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に理解される分子生物学用語の定義は、リエガー（Rieger）ら、「遺伝学：古典遺伝学および分子遺伝学の用語集（Glossary of Genetics:Classical and Molecular）、第５版、ニューヨーク所在のスプリンガー出版（Springer‐Verlag）、１９９１年；およびレビン（Lewin ）、「遺伝子（Genes ）Ｖ」、ニューヨーク所在のオックスフォード大学出版（Oxford University Press ）、１９９４年に示されている。
【００１１】
用語「癌」は、周囲の健康な組織が異常な細胞により浸潤および破壊される、あらゆる細胞増殖性疾患を意味する。
本明細書で使用する「タンパク質」または「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）とは関係なく、任意のペプチド結合したアミノ酸鎖を意味する。用語「キメラ分子」および「キメラタンパク質」は、天然では起こらない配置で連結した少なくとも第１のドメインと第２のドメインとからなるタンパク質分子を意味する。
【００１２】
用語「リガンド」は、ある特定の構造上の相補的な部位に結合する分子を意味する。例えば、ＥＧＦＲリガンドはＥＧＦＲに結合する。
用語「担体分子」は、キメラ分子に言及している場合、機能特性をキメラ分子に付与する任意の分子を意味する。
【００１３】
用語「ＴＧＦ‐αタンパク質」または簡単に「ＴＧＦ‐α」は、天然のＴＧＦ‐α（トランスフォーミング成長因子‐α）、または天然ＴＧＦ‐α分子中に欠失、付加、置換、もしくは他の変異を含む任意の改変形態のＴＧＦ‐αを意味する。
【００１４】
本明細書で使用する用語「ＰＥ」は、天然のＰＥ（シュードモナス属（Pseudomonas ）
エキソトキシン）、または天然ＰＥ分子中に欠失、付加、置換、もしくは他の変異を含む任意の改変形態のＰＥ分子を意味する。
【００１５】
本明細書で使用する用語「特異的に結合する」は、ポリペプチド（抗体を含む）または受容体に言及している場合、不均一なタンパク質集団および他の生物製剤の中にタンパク質またはポリペプチドまたは受容体が存在することが確かめられる結合反応を意味する。従って、指定された条件下で（例えば、抗体の場合、イムノアッセイ条件で）、特定のリガンドまたは抗体はその特定の「標的」に結合し（例えば、ＥＧＦＲリガンドはＥＧＦ受容体に特異的に結合し）、試料中に存在する他のタンパク質にも、リガンドまたは抗体が生物体内で接触する可能性がある他のタンパク質にも有意な量では結合しない。一般的に、第２の分子に「特異的に結合する」第１の分子の結合親和性は約１０５モル／リットルより大きい（例えば、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、および１０１２モル／リットルまたはそれ以上）。
【００１６】
本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料が本発明の実施または試験において使用できるが、適切な方法および材料が以下で説明される。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はその全体が援用される。矛盾が生じる場合は本明細書（定義を含む）が優先される。さらに、以下で議論される特定の実施形態は例示にすぎず、限定することを目的としない。
【００１７】
本発明の前記の利点およびさらなる利点は、以下の説明と添付の図面とを併せて参照することによってさらに理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、腫瘍細胞表面上のＥＧＦＲに結合するキメラ分子で腫瘍細胞を標的化することによって、腫瘍細胞において細胞死を誘導する方法および組成物を提供する。多数の異なる腫瘍細胞を本明細書に記載の方法および組成物によって殺傷することができる。このような細胞の例として、ＥＧＦＲを過剰発現する細胞（例えば、上皮腫瘍から得られる細胞ならびに神経膠腫（例えば、低悪性度星状細胞腫または多形性神経膠芽腫を含む高悪性度星状細胞腫）から得られる細胞）が挙げられる。
【００１９】
下記の好ましい実施形態は、これらの組成物および方法の応用を例示する。それでもなお、これらの実施形態の説明から、本発明の他の態様を下記の説明に基づいて行う、および／または実施することができる。
【００２０】
（生物学的方法）
従来の分子生物学的技法を含む方法が本明細書で説明される。このような技法は当該分野において一般に知られており、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual ）」第２版、１‐３巻、サンブルック（Sambrook）ら編、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバー出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press ）、１９８９年、および「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、アウスベル（Ausubel ）ら編、ニューヨーク所在のグリーン出版およびワイリー・インターサイエンス（Greene Publishing and Wiley-Interscience）、１９９２年（定期的な更新あり）などの方法論の専門書において詳細に説明されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた様々な技法は、例えば、イニス（Innis ）ら、「ＰＣＲプロトコール：方法および応用のガイド（PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications ）、サンディエゴ所在のアカデミック出版（Academic Press）、１９９０年に記載されている。ＰＣＲ‐プライマー対は、既知の技法によって（例えば、それを目的としたコンピュータプログラム（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ，バージョン０．５、（著作権）１９９１年、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在の
ホワイトヘッド研究所（Whitehead Institute for Biomedical Research ））を用いて、既知配列から入手することができる。核酸を化学合成する方法は、例えば、ビューケイジ（Beaucage）およびカルター（Carruthers）、テトラヒドロン・レターズ（Tetra.Letts.）第２２巻、ｐ．１８５９−１８６２、１９８１年ならびにマテウシ（Matteucci ）ら，ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（J.Am.Chem.Soc.）第１０３巻、ｐ．３１８５、１９８１年で議論されている。核酸の化学合成は、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置で行うことができる。免疫学的方法（例えば、抗原特異的抗体の調製、免疫沈降、およびイムノブロッティング）は、例えば、「免疫学の最新プロトコール（Current Protocols in Immunology ）」、コリガン（Coligan ）ら編、ニューヨーク所在のジョン・ワイリーアンドサンズ（John Wiley & Sons ）、１９９１年、および「免疫学的分析方法（Methods of Immunological Analysis ）、マセイエフ（Masseyeff ）ら編，ニューヨーク所在のジョン・ワイリーアンドサンズ（John Wiley & Sons ）、１９９２年に記載されている。遺伝子導入および遺伝子療法の従来法もまた本発明での使用に合うようにすることができる。例えば、「遺伝子療法：原理および応用（Gene Therapy:Principles and Applications）、Ｔ．ブラッケンステイン（Blackenstein）編、スプリンガー出版（Springer Verlag ）、１９９９年；「遺伝子療法プロトコール（分子医学の方法）（Gene Therapy Protocols（Methods in Molecular Medicine ））、Ｐ．Ｄ．ロビンス（Robbins ）編、ヒュマーナ出版（Humana Press）、１９９７年；および「ヒト遺伝子療法のためのレトロベクター（Retro-vectors for Human Gene Therapy）」、Ｃ．Ｐ．ホジソン（Hodgson ）編、スプリンガー出版（Springer Verlag ）、１９９６年を参照のこと。
【００２１】
（キメラ分子）
本発明は、ＥＧＦＲリガンドおよび担体分子を含むキメラ分子を提供する。ＥＧＦＲリガンドは、キメラ分子の標的を癌細胞上のＥＧＦＲに定めるために用いられ、担体分子はキメラ分子に機能特性を付与する。例えば、担体分子は、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの保存もしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの送達のために）キメラ分子の安定性を高めるように；エフェクター機能（例えば、免疫応答刺激、細胞傷害性など）をキメラ分子に付与するように；またはキメラ分子の精製を容易にするように機能することができる。
【００２２】
本発明に有用なＥＧＦＲリガンドとして、ＥＧＦＲに結合することができる任意の分子が挙げられる。分子は天然のものでもよく、人工的に作製されてもよい。例えば、天然に生じるＥＧＦＲリガンドとして、ＴＧＦ‐α、ＥＧＦ、ＥＧＦ様タンパク質、およびＥＧＦＲに結合することが知られている他の天然に生じるポリペプチド鎖が挙げられる。人工的に作製されるＥＧＦＲリガンドの例として、ＥＧＦＲ結合抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメント）ならびに天然に生じるＥＧＦＲリガンドを人為操作したバリアントまたは変異体が挙げられる。本発明に有用なＥＧＦＲリガンドには、ＥＧＦＲを活性化するリガンドおよびＥＧＦＲを活性化しないリガンドが含まれる。
【００２３】
本発明の担体分子として、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの保存もしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの送達のために）キメラ分子の安定性を高める分子；エフェクター機能（例えば、免疫応答刺激、細胞傷害性など）をキメラ分子に導入する分子；またはキメラ分子の精製を容易にする分子が挙げられる。天然のリガンドと比較してキメラ分子の安定性を高めるために、担体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの保存またはｉｎ  ｖｉｖｏでの送達の状況でＥＧＦＲリガンドに類似の分子を安定化することが示されているタンパク質でもよい。例えば、キメラ分子の安定性を高める担体分子として、ＰＥ、ＰＥ誘導体、および免疫グロブリン分子に由来する１または複数の重鎖定常領域ドメイン（例えば、ＣＨ２‐ＣＨ３フラグメント）が挙げられる。キメラ分子を安定化するのに使用することができる他の担体分子は、実験により特定することができる。例えば、分子とＥＧＦＲリガンドを結合し、結合し
た生成物をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ安定性アッセイで試験することによって、担体分子としての適合性があるかどうか分子をスクリーニングすることができる。
【００２４】
ある用途では、本発明の範囲内の担体分子は、エフェクター機能をキメラ分子に導入するのに使用することができる。エフェクター機能をキメラ分子に導入するために、担体分子は、細胞傷害性または免疫応答刺激性を有することが示されているタンパク質でもよい。例えば、細胞傷害機能をキメラ分子に導入する担体分子として、ＰＥ、ＰＥ誘導体、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、サポリン、アメリカヤマゴボウ（pokeweed）ウイルスタンパク質、および免疫グロブリン分子（例えば、細胞性細胞傷害に関する抗体）に由来する定常領域ドメインが挙げられる。細胞傷害性担体分子を含むキメラ分子は、細胞を選択的に殺傷するのに使用することができる。このような細胞傷害性キメラ分子の代表例として、ＴＧＦ‐αとＰＥの変異形態が融合したもの、ならびにＴＧＦ‐αと免疫グロブリン分子に由来する定常領域ドメイン（例えば、ＣＨ２‐ＣＨ３フラグメント）が融合したものが挙げられる。
【００２５】
免疫応答刺激性をキメラ分子に導入するための、本発明の範囲内の担体分子として、免疫系成分を活性化することが知られている任意のものが挙げられる。例えば、Ｆｃ受容体に結合する、または補体成分を活性化する担体分子として、抗体および抗体フラグメント（例えば、ＣＨ２‐ＣＨ３）を使用することができる。担体分子としても使用され得る多数の他の免疫系活性化分子（例えば、微生物スーパー抗原、アジュバント成分、リポ多糖（ＬＰＳ）、および分裂促進活性を有するレクチン）が知られている。エフェクター機能をキメラ分子に導入するのに使用することができる他の担体分子は、既知の方法を用いて特定することができる。例えば、分子とＥＧＦＲリガンドを融合し、キメラ分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞傷害性アッセイおよび液性免疫応答アッセイで試験することによって、担体分子として適合性があるかどうか分子をスクリーニングすることができる。
【００２６】
他の用途では、本発明の範囲内の担体分子はキメラ分子の精製を容易にする。キメラ分子の精製を容易にすることが知られている任意の分子を使用することができる。このような担体分子の代表例として、抗体フラグメントおよび親和性タグ（例えば、ＧＳＴ、ＨＩＳ、ＦＬＡＧ、およびＨＡ）が挙げられる。親和性タグを含むキメラ分子は、イムノアフィニティ法（例えば、アガロース親和性ゲル、グルタチオン‐アガロースビーズ、抗体、およびニッケルカラムクロマトグラフィー）を用いて精製することができる。担体分子として免疫グロブリンドメインを含むキメラ分子は、当該分野で周知のイムノアフィニティクロマトグラフィー法（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィー）を用いて精製することができる。
【００２７】
キメラ分子を精製するために使用することができる本発明の範囲内の他の担体分子は、機能アッセイで分子を試験することによって容易に特定することができる。例えば、分子とＥＧＦＲリガンドを融合し、融合物の純度および収率をｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで試験することによって、担体分子として適合性があるかどうか分子をスクリーニングすることができる。組換えタンパク質の純度は、従来法によって（例えば、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥの後にクマシーブルーによるゲル染色を行うことによって）評価することができる。
【００２８】
エフェクター機能をキメラ分子に付与するために、多数の他の担体分子を使用することができる。これらの担体分子として、他の細胞毒素、薬物、検出可能な標識、標的化リガンド、および送達ビヒクルが挙げられる。これらの担体分子の例が、米国特許第６，５１８，０６１号および米国特許出願公開第２００２０１５９９７２号に記載されている。
【００２９】
担体分子とＥＧＦＲリガンドを、このような２つの分子を一緒に結合するための当該分
野で周知の任意の方法によって結合（例えば、共有結合）させることができる。例えば、ＥＧＦＲリガンドを、直接またはリンカー（スペーサー）を用いて担体分子で化学的に誘導体化することができる。この結合を媒介する、いくつかの方法および試薬（例えば、クロスリンカー）が知られている。例えば、ピアスケミカルカンパニー（Pierce Chemical Company ）のカタログ；ならびにミーンズ（Means ）およびフェネイ（Feeney) 、「タンパク質の化学修飾（Chemical Modification of Proteins ）、米国カリフォルニア州サンフランシスコ所在のホールデン・デイ社（Holden-Day Inc. ）、１９７１年を参照のこと。放射性核種金属キレート、毒素、および薬物を含む様々な化合物をタンパク質（例えば、抗体）に取り付けるための様々な手順およびリンカー分子が、例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８号；同第４，６５９，８３９号；同第４，４１４，１４８号；同第４，６９９，７８４号；同第４，６８０，３３８号；同第４，５６９，７８９号；および同第４，５８９，０７１号；ならびにボルリングハウス（Borlinghaus ）ら、キャンサー・リサーチ（Cancer Res. ）第４７巻、ｐ．４０７１−４０７５（１９８７年）に記載されている。特に、様々なイムノトキシンの作製は当該技術で周知であり、例えば、「モノクローナル抗体‐毒素結合体：魔法の弾丸をめざして（Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet ）」、トルペ（Thorpe）ら、「臨床医学におけるモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine）」、アカデミック出版（Academic Press）、ｐ．１６８−１９０（１９８２年）；ワルドマン（Waldmann）、１９９１年、サイエンス（Science ）第２５２巻、ｐ．１６５７；ならびに米国特許第４，５４５，９８５号および同第４，８９４，４４３号に示されている。
【００３０】
担体分子がポリペプチドである場合、ＥＧＦＲリガンドおよび担体分子を含むキメラ分子は融合タンパク質でもよい。融合タンパク質は、２つの遺伝子をインフレームで連結して１つの核酸にし、次いで、この核酸を適切な宿主細胞において融合タンパク質が産生される条件下で発現させる分子生物学の従来法を用いて調製することができる。
【００３１】
ＥＧＦＲリガンドは、様々な方向で１または複数の担体分子に結合されてもよい。例えば、担体分子はＥＧＦＲリガンドのアミノ末端に連結されてもよく、カルボキシ末端に連結されてもよい。ＥＧＦＲはまた担体分子の内部領域に連結されてもよく、反対に、担体分子がＥＧＦＲリガンドの内部に連結されてもよい。
【００３２】
場合によっては、キメラ分子がその標的部位に到達した時に、担体分子がＥＧＦＲリガンドから離れることが望ましい。従って、標的部位で担体分子を放出させようとする場合、標的部位付近で切断可能な連結を含むキメラ結合体を使用してもよい。担体分子をＥＧＦＲリガンドから放出させる連結切断は、酵素活性、または標的細胞内もしくは標的部位付近で結合体が受ける条件によって誘発されてもよい。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存在する条件の下で（例えば、腫瘍関連酵素または酸性ｐＨに暴露された時に）切断可能なリンカーを使用してもよい。多数の異なる切断可能なリンカーが当業者に周知である。例えば、米国特許第４，６１８，４９２号；同第４，５４２，２２５号；および同第４，６２５，０１４号を参照のこと。これらのリンカー基から薬剤を放出させる機構として、例えば、感光性結合への照射および酸に触媒される加水分解が挙げられる。例えば、米国特許第４，６７１，９５８号には、患者の補体系のタンパク質分解酵素によりｉｎ
ｖｉｖｏにおいて標的部位で切断されるリンカーを含む免疫複合体について記載されている。様々な放射線診断用化合物、放射線治療用化合物、薬物、毒素、および他の薬剤を抗体に取り付ける方法が数多く報告されていることを考慮すれば、当業者は、ある特定の担体分子をＥＧＦＲリガンドに取り付けるための適切な方法を決定することができるだろう。
【００３３】
（ＥＧＦＲリガンドを細胞に送達する方法）
本発明はまた、ＥＧＦＲリガンドを細胞に送達する方法を提供する。この方法は、特に、担体分子がその機能を発揮することができるように、ＥＧＦＲリガンドおよび担体分子を含むキメラ分子を細胞に向けるのに有用である。例えば、細胞毒素に結合したＥＧＦＲリガンドを、キメラ分子を含む組成物とＥＧＦＲリガンドに結合する受容体を発現している標的細胞とを混合することによって、殺傷しようとする標的細胞に送達することができる。別の例として、検出可能な標識に結合したＥＧＦＲリガンドを、キメラ分子を含む組成物とＥＧＦＲリガンドに結合する受容体を発現している標的細胞とを混合することによって、標識しようとする標的細胞に向けることができる。
【００３４】
本発明のキメラ分子は任意の既知の方法によって細胞に送達可能である。例えば、キメラ分子を含む組成物を、培地に懸濁された細胞に添加することができる。あるいは、キメラ分子を、ＥＧＦＲリガンドに結合する受容体を発現している細胞にｉｎ  ｓｉｔｕで結合するように、同細胞を有する動物に（例えば、非経口経路によって）投与することができる。特に、本発明のキメラ分子は、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞（例えば、上皮腫瘍細胞および神経膠腫細胞）に結合するための標的化部分として非常に適している。従って、本発明の方法を、様々な癌を担体分子の標的とするために使用することができる。
【００３５】
（動物への組成物の投与）
ｉｎ  ｓｉｔｕでＥＧＦＲ発現細胞を標的とするために、前記の組成物を、任意の適切な処方で動物（ヒトを含む）に投与することができる。例えば、ＥＧＦＲ発現細胞を標的とするための組成物を、薬学的に許容可能な担体またな希釈剤（例えば、生理食塩水もしくは緩衝塩溶液）に含めて処方することができる。適切な担体および希釈剤は、投与形式および投与経路ならびに標準的な薬務に基づいて選択することができる。薬学的に許容可能な担体および希釈剤の例ならびに薬学的処方物についての説明は、この分野の標準的な教科書である「レミングトンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences ）」およびＵＳＰ／ＮＦに示されている。組成物を安定化および／または保存するために、他の物質を組成物に添加してもよい。
【００３６】
本発明の組成物は、任意の従来法によって動物に投与することができる。組成物は、例えば、内部標的部位もしくは外部標的部位への外科的送達によって、または血管から接近可能な部位へはカテーテルによって、標的部位に直接投与することができる。他の送達法（例えば、リポソーム送達または組成物を注入した装置からの拡散）が当該分野で周知である。組成物を、単回のボーラス投与、複数回の注射、または（例えば、静脈内への）連続注入の形で投与することができる。非経口投与の場合、発熱物質を含まない滅菌された形で組成物を処方することが好ましい。
【００３７】
本発明に従って、局所間隙薬物送達を用いた全身投与（静脈内投与）を使用することができる。運搬性強化送達（convection-enhanced delivery）の概念が脳への有効な薬物送達経路としていっそう魅力的になっている（ラスケ（Laske ）ら、ネイチャー・メディシン（Nature Medicine ）第３巻、ｐ．１３６２−１３６８（１９９７年））。従って、局所送達は、腫瘍塊の中に直接および腫瘍塊の近くで高濃度に達する可能性があるので、臨床的に評価すべき好ましいアプローチである。
【００３８】
本発明において用いられる組成物を、定位マイクロインジェクション（stereotactic microinjection ）法を用いて腫瘍部位（例えば、神経膠腫）に正確に送達することができる。例えば、標的とされた特定の腫瘍の三次元位置を確かめるために、哺乳動物の被検体をＭＲＩに対応した定位フレームベースの中に配置し、次いで高解像度ＭＲＩを用いて画像化することができる。この技法によれば、その後ＭＲＩ画像が適切な定位ソフトウェアを備えるコンピュータに転送され、多数の画像が、標的部位および組成物マイクロインジェクションの経路を確かめるために用いられる。このようなソフトウェアを用いて、マイ
クロインジェクション経路が、定位フレームに適した三次元座標に変換される。頭蓋内送達の場合、頭蓋骨を露出させ、進入部位の上にバーホールを空け、定位装置が配置され、針が予め決められた深さに埋め込まれる。
【実施例】
【００３９】
本発明を、以下の特定の実施例によってさらに例示する。本実施例は例示のためだけに示され、本発明の範囲または概念を何らかのかたちで限定すると解釈されるべきでない。
（実施例１‐融合タンパク質）
図１および２を参照すると、いくつかのＥＧＦＲ結合性融合タンパク質が図示されている。図１は、ＥＧＦＲ結合ドメインとしてＴＧＦ‐αと、細菌毒素（例えば、ＰＥまたはその変異体）とを含む２つの融合タンパク質を示す。２つともＥＧＦＲリガンドとしてＴＧＦ‐αを含む。ＴＧＦ‐α‐ＰＥ４０Δ５５３は、５５３位のアミノ酸が欠失したＰＥ４０の変異形態を含み、ＴＧＦ‐α‐ＰＥ４０Δ５５３／Δ６０９‐６１３は、５５３位のアミノ酸および６０９‐６１３位のアミノ酸が欠失したＰＥ４０の変異形態を含む。
【００４０】
図２は、ＴＧＦ‐α‐免疫グロブリン融合タンパク質を示す。２つの異なるこのようなタンパク質が作製された。第１のタンパク質では、ＴＧＦ‐αを、ヒンジ領域、重鎖定常領域２（ＣＨ２）、およびＣＨ３からなるヒト免疫グロブリンＧと融合させた（図２）。第２のタンパク質では、ＴＧＦ‐αを、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３からなるマウス免疫グロブリンＧ（ヒトＩｇとアイソタイプが適合している）と融合させた（ＴＧＦ‐α‐ｍＩＧ）。これらの２つのタンパク質は、Ｉｇの軽鎖および重鎖の抗原結合領域が、抗原（ＥＧＦＲ）結合ドメインとしてＴＧＦ‐αで置換されている「イムノグロブノイド（immunoglobunoid ）」である（図２）。従って、これらのイムノグロブノイドには、ヒンジ領域ならびに補体およびマクロファージ結合などの免疫グロブリン機能があり、保存されている（図２）。
【００４１】
ＴＧＦ‐α‐ＩｇＧキメラ分子を調製するために、ＴＧＦ‐αおよびヒトＩｇＧドメイン（すなわち、ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードするプラスミドを、３つのＤＮＡ断片を用いる連結プロセスで作製する。第１の断片ＴＧＦ‐αをプラスミドＴＧＦα‐ＰＥ４０Ｄ５５３からＰＣＲ増幅して、ＮｈｅＩおよびＢｌｐＩ付着末端を有する断片を得る。ヒト免疫グロブリンヒンジ領域ならびに重鎖の第２および第３の定常領域からなる第２の断片もまたＰＣＲによって作製される。この断片はＢｌｐＩおよびＸｂａＩ末端を含み、停止コドンはＸｂａＩ部位の前にある。第３の断片は、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼによりポリリンカー領域内で消化した市販のベクター（ｐＶＡＸ‐１）である。制限消化物から遊離した大きな断片を単離し、第１および第２の断片に連結する。この連結により、Ｎ末端にＴＧＦ‐α、Ｃ末端にＣＨ３ドメインがあることを特徴とするタンパク質をコードする遺伝子が得られる。キメラ分子をコードするプラスミドを増やし、タンパク質を発現させる。目的のタンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドは、細菌毒素発現について以前に説明されたようなＴ７プロモーターに基づく発現系の制御下にある（デビンスキー（D ebinski）ら、モレキュラー・セルラー・バイオ
ロジー（Mol.Cell.Biol.）第１１巻第３号、ｐ．１７５１‐１７５３、１９９１年；デビンスキーおよびパスタン（Pastan）、キャンサー・リサーチ（Cancer Res. ）第５２巻、ｐ．５３７９‐５３８５、１９９２年；ならびにデビンスキーら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Clin.Invest.）第９０巻、ｐ．４０５‐４１１、１９９２年。
【００４２】
これらの高コピー数プラスミドを増やすために、形質転換効率の高い大腸菌株（例えば、ＨＢ１０１またはＤＨ５α（ギブコ（Gibco ）‐ＢＲＬ））を使用する。ＢＬ２１（λＤＥ３）は、イソプロピル‐１チオ‐β‐ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導型のＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有し、組換えタンパク質発現用の宿主として使用される。
タンパク質は、ファルマシア（Pharmacia ）のＦＰＬＣ（fast protein liquid chromatography）システムを用いて精製する。組換えタンパク質の純度は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、次いでクマシーブルーを用いたゲル染色によって評価する。エンドトキシンの除去はアフィニティクロマトグラフィー（例えば、ピアスケミカル（Pierce Chemical ）社のＤｅｔｏｘｉ‐ｇｅｌ（商標））によって行う。
【００４３】
（実施例２‐精製キメラ分子の分析）
組換えタンパク質を、標準的なＩｏｄｏ‐Ｇｅｎ（登録商標）法に従って１２５Ｉで標識する。放射性標識組換えＥＧＦＲリガンドの結合は、Ｕ‐８７ＭＧおよびＵ‐２５１ＭＧ神経膠腫細胞でのスキャッチャード（Scatchard ）分析によって評価する。ＮＩＨリガンドプログラムを用いてデータを分析して、以前に説明されたようにＫｄおよびＢｍａｘ値を求める（デビンスキーら、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clin.Cancer Res.）第１巻、（アドバンス・イン・ブリーフ（Advances in Brief)）、ｐ．１２５３‐１２５８、１９９５年；デビンスキーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２７１巻、ｐ．２２４２８‐２２４３３、１９９６年）。放射性標識組換えＥＧＦＲリガンドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの安定性は、等量のアリコート（５０〜１００μｌ）を、２つのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４，５００μｌ）に添加し、４℃および３７℃で回転装置で混合することによって評価する。それぞれの試料（２０μｌ）を、特定の時間間隔すなわち６、１２、１８、２４、７２、および１２０時間で取り出し、サイズ排除ＨＰＬＣでスクリーニングする。
【００４４】
（実施例３‐ｉｎ  ｖｉｔｒｏで癌細胞のアポトーシスを誘導する能力についてＥＧＦＲリガンドを試験する方法）
様々な濃度のＥＧＦ（１〜５０ｎｇ／ｍｌ）または対応する量のＥＧＦＲリガンドで様々な期間（１〜３日）処理された細胞において、ＥＧＦＲリガンドの増殖特性／抗増殖特性をモニターし、アポトーシス指数の分析を行う。アッセイにはＥＧＦＲを過剰発現する癌細胞を使用する。Ｕ‐８７ＭＧ細胞を含む数種類の悪性神経膠腫細胞が、この現象について評価されている。これらの細胞は、２０ｎｇ／ｍｌではなく５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦが培地に添加された時にアポトーシスで死ぬことが示されている。この結果には再現性があり、同様の現象がＳＮＢ‐１９細胞において観察されている。従って、アポトーシスを誘導する能力についてＥＧＦＲリガンドを試験する方法において、これらの細胞を使用することができる。さらに、Ｕ‐２５１ＭＧ、Ｔ‐８９Ｇ、Ａ‐１７２ＭＧ、およびＳＦ‐２９５（これらは全てＥＦＧＲを過剰発現することが知られている）、ならびにＵ‐３７３ＭＧ（ＥＧＦＲ濃度は比較的低い）およびＵ‐１３８ＭＧ（ＥＧＦＲ濃度は低い）などの他の脳腫瘍細胞を使用することができる。一般に用いられている類表皮癌Ａ４３１細胞などの非脳腫瘍細胞も使用することができる。これらの細胞は多数のＥＧＦＲを有し、わずかに高い濃度のＥＧＦ存在下でアポトーシスになる。Ａ４３１細胞も腫瘍形成性であるので、ｉｎ  ｖｉｖｏ比較試験において使用することができる。負の対照として正常細胞が用いられる。
【００４５】
細胞増殖活性は、デビンスキー（Debinski）ら、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clin.Cancer Res.）第５巻、ｐ．９８５‐９９０、１９９９年に記載のように、比色用ＭＴＳ［３‐（４，５‐ジメチルチアゾ‐ル‐２‐イル）‐５‐（３‐カルボキシメトキシフェニル）‐２‐（４‐スルホフェニル）‐２Ｈ‐テトラゾリウム，分子内塩] ／ＰＭＳ（フェナジンメタサルフェート（phenazine methasulfate）］細胞増殖アッセイを用いて試験する。クロモジェニック・アッセイを、３つのゼラチン処理した１００ｍｍペトリ皿でプレート培養された５×１０２個の正常細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ）または悪性細胞を用いて行う。翌日、非処理対照との比較のために、様々な濃度の組換えＥＧＦを添加する。プレートを１０〜１４日間インキュベートした後、培地を除去し、２５％エチルアルコールに溶解した０．２５％クリスタルバイオレットでコロニーを固定および染色する。５
０個より多い細胞を含むコロニーを記録する。
【００４６】
アポトーシスの尺度の１つとしてＤＮＡ断片化を分析する。ＤＮＡを、様々な濃度のＥＧＦまたはＥＧＦＲリガンドで処理された悪性細胞および正常細胞から単離し、アガロースゲル上で電気泳動する。二本鎖ＤＮＡ断片化の定量分析のためにパルスフィールドゲル電気泳動を使用する。カスパーゼ‐８および‐９経路によるアポトーシス開始の後の段階であるカスパーゼ‐３活性化の記録をとるために、ポリ（ＡＤＰ）‐リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断断片の出現を測定する。
【００４７】
（実施例４‐ＤｅａｄＥｎｄ（商標）蛍光ＴＵＮＥＬ法）
以下のようにＤｅａｄＥｎｄ（商標）蛍光ＴＵＮＥＬ法を用いて、細胞のアポトーシスを測定した。細胞を、オートクレーブした滅菌スライドの上に１０，０００個／スポット（１スポットあたり２５μｌ体積）でプレート播種した。スライドあたり２スポットとした。スライドが覆われるほどまで細胞を付着および増殖させ、３７℃で２４時間そのままの状態にした。翌日、培地を交換し、ＰＢＳで洗浄し、無血清培地７ｍｌを３７℃で２４時間添加した。２４時間後、様々なタンパク質１ｍｌを添加した。すなわち、２ｎＭおよび８ｎＭヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）（それぞれ、１０ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＧＦαＰＥ４０ΔＡｓｐ５５３（７０ｎｇ／ｍｌおよび３５０ｎｇ／ｍｌ）、ならびにＴＧＦαヒンジＣＨ２ＣＨ３ＩｇＧ（ｈＩＧＤ）（５０ｎｇ／ｍｌおよび２５０ｎｇ／ｍｌ）を１〜３日間である。スライドを、振盪せずに、コプリンジャーの中で、室温にてＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、振盪せずに、コプリンジャーの中で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した４％パラホルムアルデヒド溶液で４℃にて２５分間固定し、次いで、ＰＢＳで２回（それぞれ５分間）室温にて洗浄した。スライドを、ＰＢＳに溶解した０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液に室温で１５分間入れた。スライドをＰＢＳですすいだ。スライドを軽くたたいて過剰量の液体を取り除き、各スポットを平衡緩衝液１００μｌで覆って、室温で１０分間、加湿チャンバーに入れた。ＴｄＴインキュベーション緩衝液を取扱説明書（プロメガ（Promega ））に従って作製した。過剰量の液体を取り除き、スポット１つにつき２５μｌの混合物を３７℃で１時間、暗所で添加した。スライドに、Ｈ２Ｏに溶解した２×ＳＳＣ溶液を室温で１５分間、暗所で添加した。次いで、スライドをＰＢＳで３回（それぞれ５分間）暗所にて洗浄した。過剰量の液体を取り除き、細胞を、１．５％ＮＧＳ／ＰＢＳに溶解したヘキスト（Hoechst ）３３２５８番の核対比染色液（ＤＡＰＩ）（１：１０００）で１５分間、暗所で対比染色した。スライドを水で３回（それぞれ５分間）暗所にて洗浄した。過剰量の液体を軽くたたいて取り除き、各スライドを、ゲルマウント（Ｇｅｌ−Ｍｏｕｎｔ）（米国カリフォルニア州フォスター所在のバイオメダ社（Biomeda Corp. ））でマウントし、室温で一晩乾燥させた。全例について４０倍の倍率を用いて、写真をハママツ（Hamamatsu ）Ｃ２４００デジタルカメラで撮影した。各試料についてバックグラウンドを標準化した。画像は全て同じ条件で撮影した。画像を、ペイントショッププロ（Paint Shop Pro、商品名）Ｖ６．０（米国ミネソタ州エデンプレーリー（Eden Prairie）所在のジャスクソフトウェア社（Jasc Software Inc.））で処理した。
【００４８】
一組の実験において、結果から、Ｇ４８ａ  ＧＢＭ細胞においてＥＧＦまたはＴＧＦα‐ｈＩＧＤによってアポトーシスが誘導されることが分かった。緑色免疫蛍光は断片化ＤＮＡに対応し、アポトーシスを受けている細胞の核において観察された（ＴＵＮＥＬアッセイ）。比較のために、ＤＡＰＩによる核の染色を分析した。細胞を２ｎＭまたは８ｎＭの組換えタンパク質で処理した。２ｎＭ処理細胞より８ｎＭ処理細胞において強い緑色免疫蛍光が観察された。別組の実験では、８ｎＭのＥＧＦ、ＴＧＦαＰＥ４０ΔＡｓｐ５５３、またはＴＧＦαヒンジＣＨ２ＣＨ３による処理への応答としてＧＢＭ細胞（Ｇ４８ａおよびＵ８７）でアポトーシスが誘導されたが、グリア細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＵＶＥＣでは誘導されなかった。
【００４９】
（実施例５‐ｉｎ  ｖｉｖｏで癌細胞のアポトーシスを誘導する能力についてＥＧＦＲリガンドを試験する方法）
脳腫瘍（例えば、高悪性度星状細胞腫（ＨＧＡ））へ特異的に送達するための組換えＥＧＦＲリガンドの適性は、動物実験において決定することができる。免疫無防備状態のｎｕ／ｎｕマウスにおいて、腫瘍（正の対照としてＵ‐８７ＭＧ、Ｕ‐２５１ＭＧ、およびＡ４３１）を皮下（ｓ．ｃ．）および頭蓋内（ｉ．ｃ．）に導入する。皮下の腫瘍の場合、マウス一匹につき６×１０６個の腫瘍細胞を、賦形剤（通常、無血清組織培地に溶解した５％メチルセルロース）０．１ｍｌの体積で右わき腹に接種する。腫瘍を、デジタル式ノギスを用いて得られる長さおよび幅の測定値からの計算によって求められるように２００〜２５０ｍｍ３まで成長させる。体積計算の式は０．４ａｂ２である。式中、ａは長さであり、ｂは、長さに対して垂直かつ最大の幅である。
【００５０】
最大許容投与量（ＭＴＤ）を、マウスにおいて２種類の経路、すなわち静脈内（ｉ．ｖ．）および脳内（ｉ．ｃ．）によって確かめる。ＭＴＤは、マウスにおいて２１日以内に１０％の死亡率をもたらす用量（ＬＤ１０）として評価され、投与経路によって変わる。ＬＤ１０値の７５％以下の値が、後のｉｎ  ｖｉｖｏ試験の最大用量として用いられるが、毒性は、高用量の組換えＥＧＦＲリガンドの場合でさえ観察されないことがある。標的器官を特定するために、および毒性の機構を立証／確認するために、組換えＥＧＦＲリガンドの毒性で瀕死になっている動物から採取した血液および様々な組織の病理組織学的試験を行う。
【００５１】
組換えＥＧＦＲリガンドの抗腫瘍活性は神経膠腫異種移植マウスモデル系でも評価することができる。様々な組換えＥＧＦＲリガンドの抗腫瘍剤としての効力を定量および比較するために、同系腫瘍を有するマウスの生存を調べる。効力の直接的な試験は、組換えＥＧＦＲリガンドの単回注射と複数回注射とが、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍の増殖および進行に明らかに影響を及ぼす能力の比較に基づいている。わき腹に神経膠腫腫瘍（またはＡ４３１）を移植したマウス群を、ｉ．ｔ．またはｉ．ｖ．経路で投与された組換えＥＧＦＲリガンドの抗腫瘍効果を反映するように、毎日または一日おきに腫瘍の寸法をとってモニターする。腫瘍体積が約２，０００ｍｍ３に達するまで、一群あたり１０〜１３匹のマウスからなる生存群を追跡する。腫瘍体積が約２，０００ｍｍ３に達した時点で、マウスを屠殺し、解剖する。病理組織学的試験のために関連組織を提出する。組換えＥＧＦＲリガンドの、ｎｕ／ｎｕマウスの脳に移植した神経膠腫の増殖に影響をおよぼす能力の研究を評価する。この送達計画は、様々な組換えＥＧＦＲリガンドの単回局所注射から始まる。腫瘍誘導の５日後にマウスを処理する。これらの試験の最終目的は、生存の中央値である。
【００５２】
組換えＥＧＦＲリガンドの抗腫瘍効力を調べるために、生存分析法を使用する。ビヒクルおよび組換えＥＧＦＲリガンドのカプラン‐マイヤー（Kaplan‐Meier ）生存曲線をログランク検定によって比較する。トレンド検定は、通常、ビヒクルおよび漸増量の組換えＥＧＦＲリガンドをコード化し、生存に及ぼす組換えＥＧＦＲリガンド投与の効果を評価する比例ハザードモデルにおいて使用される。効力仮説の多くは本質的に非常に試験的なものであるので、標本の大きさの計算は厳密でない。１．０とは有意に（統計的に有意に）異なる３．２５のハザード比を検出するためには（目的の事象（死）を観察する確率が０．９であると仮定して）、検出力８０％の両側α水準検定には一群あたり１３匹のマウスが必要とされる。
【００５３】
（他の実施態様）
本発明について本発明の詳細な説明と共に説明してきたが、前述の説明が例示を目的とし、本発明の範囲を限定することを目的としないことが理解されるべきである。本発明の
範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、および変更は特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】天然のシュードモナス属毒素（ＰＥ）、その誘導体（ＰＥ４０Δ５５３）、およびＴＧＦα‐ＰＥキメラ分子の模式図。
【図２】組換えＴＧＦα‐免疫グロブリン定常領域ドメインキメラ分子の模式図。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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