(57)【要約】  本発明は無血清培地中で継続的に増殖する能力を有するクローン性骨髄腫細胞系に関する。本発明はまた、クローン性骨髄腫細胞系およびそれら由来のいずれかの細胞系でのタンパク質の産生にも関する。本発明はさらに、無血清培地中で増殖することが可能な細胞系の同定方法に関する。本発明はまた、顧客が本発明の細胞、細胞系および細胞培養物を提供される商取引の方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培地中で継続的に増殖すること；
無血清培地中で高細胞密度まで増殖すること；
血清の非存在下で凍結保存後に生存可能なままであること；および
遺伝子操作後に組換えタンパク質を検出可能に発現すること
が可能な、クローン性骨髄腫細胞系もしくは由来のいずれかの細胞系、
ならびに／または無血清培地中でのその後の培養物。
【請求項２】
前記発現が、検出可能な量で最低１種のタンパク質を発現するように前記細胞系もしくはそれ由来の細胞系を操作することにより達成される、請求項１記載の細胞系。
【請求項３】
前記操作が、最低１種のタンパク質をコードする核酸を前記細胞系に導入すること、ならびにこうした核酸が前記細胞系中に既に存在する場合は最低１種のタンパク質をコードする核酸の転写および翻訳を誘導することよりなる群から選択される、請求項２記載の細胞系。
【請求項４】
前記導入段階が、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法、超音波処理、トランスフェクション、形質導入、形質転換およびウイルス感染よりなる群から選択される、請求項３記載の細胞系。
【請求項５】
前記最低１種のタンパク質が、診断的タンパク質および治療的タンパク質よりなる群から選択される、請求項２記載の細胞系。
【請求項６】
前記診断的もしくは治療的タンパク質が、免疫グロブリン、サイトカイン、インテグリン、抗原、成長因子、細胞周期タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、受容体もしくはその融合タンパク質、血液タンパク質、抗菌薬、それらのいずれかのフラグメント、およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項５記載の細胞系。
【請求項７】
前記免疫グロブリンもしくはフラグメントが、げっ歯類、霊長類、キメラおよび工作されたものよりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項８】
前記免疫グロブリンもしくはフラグメントが、マウス、ヒト、キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト、ファージディスプレイ、トランスジェニックマウス産生、至適化、突然変異誘発、無作為化および組換え物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項７記載の細胞系。
【請求項９】
前記免疫グロブリンもしくはフラグメントが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ｓｌｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項８記載の細胞系。
【請求項１０】
前記フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆａｃｂ、ｐＦｃ’、Ｆｄ、Ｆｖおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項８記載の細胞系。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンもしくはそのフラグメントが、免疫グロブリン、サイトカイン、インテグリン、抗原、成長因子、細胞周期タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、受容体もしくはその融合タンパク質、血液タンパク質、抗菌薬、それらのいずれかのフラグメントおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上を結合する、請求項８記載の細胞系。
【請求項１２】
前記インテグリンが、α１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、αＤ、αＬ、αＭ、αＶ、αＸ、αＩＩｂ、αＩＥＬｂ、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α４β７、α６β４、αＤβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、αＸβ２、αＩＩｂβ３、αＩＥＬｂβ７、およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項１３】
前記抗原が、細菌、ウイルス、血液タンパク質、癌細胞マーカー、プリオン、真菌およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上由来である、請求項６記載の細胞系。
【請求項１４】
前記成長因子が、ヒト成長因子、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エリスロポエチン、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項１５】
前記細胞周期タンパク質が、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、癌抑制遺伝子、カスパーゼタンパク質、Ｂｃｌ−２、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、後期促進複合体、Ｓ期促進因子、Ｍ期促進因子およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項１６】
前記サイトカインが、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、接着分子、アンジオゲニン、アネキシン、ケモカインおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項１７】
前記ホルモンが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、黄体化ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、インスリン、プロインスリンおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項１８】
前記神経伝達物質が、エンドルフィン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、バソプレシン、ギラクチド、Ｎ−アセチルアスパルチルグルタミン酸、プレオピオメラノコルチン由来のペプチド神経伝達物質、それらのいずれかのアンタゴニストおよびそれらのいずれかのアゴニストよりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項１９】
前記受容体もしくはその融合タンパク質が、インターロイキン−１、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トロンボポエチンおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項２０】
前記血液タンパク質が、エリスロポエチン、トロンボポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、フィブリノーゲン、ヘモグロビン、トランスフェリン、アルブミン、プロテインｃおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる群の１種もしくはそれ以上から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項２１】
前記抗菌薬が、β−ラクタム、アミノグリコシド、ポリペプチド抗生物質およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物よりなる１種もしくはそれ以上の群から選択される、請求項６記載の細胞系。
【請求項２２】
前記タンパク質が前記細胞系の培地１Ｌあたり約０．０１ｍｇないし約１０，０００ｍｇで産生される、請求項２記載の細胞系。
【請求項２３】
前記タンパク質が約０．１ｐｇ／細胞／日ないし約１００ｎｇ／細胞／日のレベルで産生される、請求項２記載の細胞系。
【請求項２４】
請求項１もしくは２記載の細胞系の細胞を無血清培地中で培養すること（前記細胞は前記最低１種の所望のタンパク質を発現する）；および
前記最低１種の所望のタンパク質を前記無血清培地もしくは前記細胞から単離すること
を含んでなる、培養細胞からの最低１種のタンパク質の製造方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法に従って細胞から得られた単離されたタンパク質。
【請求項２６】
１つの型の細胞系からの細胞を最低１つの型の無血清培地中で培養する段階（前記１つの型の細胞系からの培養細胞は前記無血清培地中で増殖することが知られていない）；および
前記無血清培地中で増殖することが可能である自発的突然変異体細胞を選択する段階
を含んでなる、無血清培地中で継続的に増殖することが可能な細胞系の同定方法。
【請求項２７】
請求項２６記載の方法に従って得られた最低１種の細胞系。
【請求項２８】
請求項１記載の細胞系から得られたタンパク質。
【請求項２９】
請求項１記載の細胞系を顧客に提供する段階
を含んでなる商取引の実施方法。
【請求項３０】
請求項１記載の最低１種の細胞系由来のタンパク質を顧客に提供する段階
を含んでなる商取引の実施方法。
【請求項３１】
前記免疫グロブリンがインフリキシマブである、請求項９記載の細胞系。
【請求項３２】
前記免疫グロブリンがｒＴＮＶ１４８Ｂである、請求項９記載の細胞系。
【請求項３３】
前記フラグメントがアブシキシマブである、請求項１０記載の細胞系。
【請求項３４】
前記血液タンパク質が組織プラスミノーゲンアクチベーターである、請求項２０記載の細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えＤＮＡ技術においておよび細胞培養物中でのタンパク質の製造に有用な細胞、細胞系および細胞培養物に関し、ならびにさらに無血清培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）中で増殖することが可能なクローン性骨髄腫細胞系に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質製造のための従来技術は、活発な細胞増殖および生存率を助長するための化学的に定義されない（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ）血清および混合タンパク質のような動物由来成分を補充した細胞培地の使用に頼ってきた。多くの組換えタンパク質、とりわけモノクローナル抗体が主として研究もしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断の応用に使用され、動物由来補充成分の排除に時間および金銭を投資する制限された動機のみを残した。しかしながら、新たな技術が発展したため、細胞培養で製造されるタンパク質が潜在的なｉｎ  ｖｉｖｏヒト治療薬としてますます重要になっている。
【０００３】
細胞培養物中で製造されたタンパク質の意図される用途の変化は、それらの製造に使用される材料および方法についての新たな懸念を提起した。例えば、血清は、完全には同定されておらずまたそれらの役割もしくは作用機序も決定されていない多くの成分を含有する。従って血清はバッチごとに異なることがあり、おそらく多様な成分のレベルおよび細胞に対するそれらの影響を決定するための試験を必要とするであろう。加えて、血清はおそらくウイルス、マイコプラズマおよびおそらくプリオンのような微生物で汚染されているかもしれず、それらのいくつかは無害であるかもしれないが、しかしにもかかわらず付加的な未知の因子を表す。
【０００４】
この敏感さは畜牛の神経変性性疾患、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の出現とともに近年より深刻となった。それはヒトに伝染可能であるため、ＢＳＥの出現は生物学的に活性の製品の製造における動物由来成分の使用についての規制の問題を提起した。実際、細胞培地、およびついには動物由来材料中に存在している偶発作用物質による最終的な治療薬の汚染の微々たる可能性が、多くの規制当局が細胞培地中での動物由来材料の中断もしくは制限された使用を強く推奨するように動かした。
【０００５】
この状況に応答して、いくつかの会社が血清を含まずかつ／もしくは動物由来タンパク質を含まない哺乳動物細胞の増殖および維持のための細胞培地を開発した。広範な細胞型および培養条件に利用しうる血清補充培地と異なり、これらの血清を含まない処方は最もしばしば高度に特異的である。事実、多数の利用可能な商業的な血清を含まない培地処方が多様な必要性を示す。大部分の培地は小スケールの実験室の応用に適するが、しかし大スケールのバイオリアクターには余りにも高価になる。さらに、いくつかは細胞の増殖に適切であるがしかし生産培地として乏しく機能する。
【０００６】
細胞生物学におけるより最近の進歩は、無血清（「ＣＤ」）培地中での増殖が可能な細胞系もしくは親宿主を開発する新たな戦略につながった。これらのアプローチは、細胞周期の制御、アポトーシスおよび成長因子の調節を包含する細胞の生化学的過程の遺伝子操作を必要とする。例えば、スーパー（Ｓｕｐｅｒ）ＣＨＯ、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎ）Ｅ  ＣＨＯＫ１およびＥ２Ｆ  ＣＨＯＫ１は全部、多様な遺伝子操作の結果としてＣＤ培地中での増殖および組換えタンパク質発現の能力を有するＣＨＯＫ１誘導体である。有望とは言え、製造レベルでのこうした系の実務への応用が産業界内でのそれらの将来の使用を制限するかもしれない。
【０００７】
結果として、ＣＤ培地中で増殖しつつ大スケールの商業的能力で組換えタンパク質を製造することが可能な代替細胞系の開発に対する大きな必要性がなお存在する。
【発明の開示】
【０００８】
［発明の要約］
本発明は、組換えＤＮＡ技術においておよび細胞培養物中でのタンパク質の製造に有用な細胞、細胞系および細胞培養物に関する。とりわけ、本発明は、無血清培地中で継続的に増殖すること；無血清培地中で高細胞密度まで増殖すること；血清の非存在下で凍結保存後に生存可能なままであること；および遺伝子操作後に組換えタンパク質を検出可能に発現することが可能であるクローン性骨髄腫細胞系もしくはそれら由来のいずれかの細胞系、ならびに／または無血清培地中のその後の培養物に関する。
【０００９】
好ましい一態様において、タンパク質の発現は、検出可能な量で最低１種のタンパク質を発現させるように細胞、細胞系および細胞培養物を操作することにより達成される。該操作段階は、最低１種のタンパク質をコードする核酸を本発明の細胞、細胞系および細胞培養物に導入することにより達成されるかもしれない。最低１種のタンパク質をコードする核酸は、限定されるものでないが電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法、超音波処理、トランスフェクション、形質導入、形質転換およびウイルス感染を挙げることができるいくつかの方法の１つにより導入してよい。
【００１０】
代替の一態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は、こうした核酸が該細胞、細胞系および細胞培養物中に既に存在する場合は最低１種のタンパク質をコードする核酸の転写および翻訳を誘導することにより検出可能な量で最低１種の所望のタンパク質を発現するよう操作される。
【００１１】
好ましい一態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物中で発現されるタンパク質は診断的タンパク質である。あるいは、該タンパク質は治療的タンパク質であるかもしれない。該診断的もしくは治療的タンパク質は、免疫グロブリン、サイトカイン、インテグリン、抗原、成長因子、受容体もしくはその融合タンパク質、それらのいずれかのフラグメントまたはそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物であってよい。該診断的もしくは治療的タンパク質はまた、細胞周期タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、血液タンパク質、抗菌薬、受容体もしくはその融合タンパク質、それらのいずれかのフラグメントまたはそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物であってもよい。
【００１２】
好ましい一態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物はげっ歯類もしくは霊長類由来の免疫グロブリンもしくはそのフラグメントを産生するかもしれない。より具体的には、免疫グロブリンもしくはそのフラグメントはマウスもしくはヒト由来であってよい。あるいは、免疫グロブリンもしくはそのフラグメントはキメラもしくは工作されていてよい。事実、本発明は、ヒト化、ＣＤＲグラフト、ファージディスプレイ、トランスジェニックマウス産生、至適化、突然変異誘発、無作為化もしくは組換えられている免疫グロブリンもしくはそのフラグメントを産生する細胞、細胞系および細胞培養物をさらに企図する。
【００１３】
本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は、限定されるものでないがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ｓｌｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる免疫グロブリンもしくはそのフラグメントを産生してよい。特定の一態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物中で発現される免疫グロブリンはインフリキシマブである。あるいは、免疫グロブリンはｒＴＮＶ１４８Ｂであってよい。
【００１４】
さらに、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により産生される免疫グロブリンフラグメントは、限定されるものでないがＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆａｃｂ、ｐＦｃ’、Ｆｄ、Ｆｖおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる。特定の一態様において免疫グロブリンフラグメントはアブシキシマブである。
【００１５】
本発明はさらに、抗原、サイトカイン、インテグリン、抗原、成長因子、細胞周期タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、受容体もしくはその融合タンパク質、血液タンパク質、抗菌薬、それらのいずれかのフラグメントおよび前述のいずれかのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を結合する免疫グロブリンもしくはそのフラグメントを発現する細胞、細胞系および細胞培養物を提供する。
【００１６】
本発明の一態様において、細胞、細胞系および細胞培養物はインテグリンを産生する。本発明により企図されるインテグリンの例は、限定されるものでないがα１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、αＤ、αＬ、αＭ、αＶ、αＸ、αＩＩｂ、αＩＥＬｂ、β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α４β７、α６β４、αＤβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、αＸβ２、αＩＩｂβ３、αＩＥＬｂβ７、およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる。
【００１７】
本発明の一態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により発現される組換えタンパク質は抗原である。該抗原は、限定されるものでないが細菌、ウイルス、血液タンパク質、癌細胞マーカー、プリオン、真菌およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる多数の供給源由来であってよい。
【００１８】
なお別の態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は成長因子を検出可能に発現するかもしれない。本発明により企図される成長因子の例は、限定されるものでないが、ヒト成長因子、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エリスロポエチン、アクチビン、インヒビン、骨形態形成タンパク質、トランスフォーミング成長因子、インスリン様成長因子およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる。
【００１９】
代替の一態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は組換え細胞周期タンパク質を産生する。こうした細胞周期タンパク質は、限定されるものでないがサイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、癌抑制遺伝子、カスパーゼタンパク質、Ｂｃｌ−２、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、後期促進複合体、Ｓ期促進因子、Ｍ期促進因子およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる。
【００２０】
本発明はさらに、サイトカインを発現する細胞、細胞系および細胞培養物を提供する。本発明により企図されるサイトカインの例は、限定されるものでないが、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、接着分子、アンジオゲニン、アネキシン、ケモカインおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる。
【００２１】
別の態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により発現される組換えタンパク質は成長ホルモンである。該成長ホルモンは、限定されるものでないが、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン、プロラクチン、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、黄体化ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、インスリン、プロインスリンおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる。
【００２２】
本発明はさらに、本明細書に教示される細胞、細胞系および細胞培養物を使用する神経伝達物質の発現に関する。神経伝達物質の例は、限定されるものでないが、エンドルフィン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、バソプレシン、ギラクチド、Ｎ−アシトルアスパルチルグルタミン酸、プレオピオメラノコルチン由来のペプチド神経伝達物質、それらのいずれかのアンタゴニストおよびそれらのいずれかのアゴニストを挙げることができる。
【００２３】
別の態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は受容体もしくは融合タンパク質を産生するよう操作される。該受容体もしくは融合タンパク質は、限定されるものでないがインターロイキン−１、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、トロンボポエチンおよびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる。
【００２４】
あるいは、組換え血液タンパク質を本発明の細胞、細胞系および細胞培養物中で発現させてよい。こうした組換えタンパク質は、限定されるものでないが、エリスロポエチン、トロンボポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、フィブリノーゲン、ヘモグロビン、トランスフェリン、アルブミン、プロテインｃ、およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を挙げることができる。特定の一態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は組織プラスミノーゲンアクチベーターを発現する。
【００２５】
別の態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は組換え抗菌薬を産生する。本発明により企図される抗菌薬の例は、例えばβ−ラクタム、アミノグリコシド、ポリペプチド抗生物質、およびそれらのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を包含する。
【００２６】
好ましい一態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は培地１Ｌあたり約０．０１ｍｇないし約１０，０００ｍｇで組換えタンパク質を産生する。別の態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は約０．１ｐｇ／細胞／日ないし約１００ｎｇ／細胞／日のレベルで組換えタンパク質を産生する。
【００２７】
本発明はさらに、培養された細胞からの最低１種のタンパク質の製造方法を提供する。一態様において、最低１種の所望のタンパク質を発現する本発明の細胞を無血清培地中で培養し、そして、該タンパク質を無血清培地もしくは細胞それら自身から単離する。加えて、本発明はさらに、本方法により得られた組換えタンパク質に関する。
【００２８】
本発明はまた、無血清培地中で継続的に増殖することが可能な細胞系の同定方法も提供する。好ましい一態様において、無血清培地中で増殖することが知られていない１つの型の細胞系からの細胞を無血清培地中で培養し、そして、該無血清培地中で増殖することが可能である自発的突然変異体細胞を選択する。さらに、本発明は本方法により得られる最低１種の細胞系に関する。
【００２９】
本発明はさらに、細胞、細胞系、細胞培養物およびそれらから得られた組換えタンパク質が顧客に提供される商取引の方法に関する。特定の一態様において顧客は本発明の細胞系を提供される。別の態様において、顧客は本発明の細胞系由来の組換えタンパク質を提供される。
［発明の詳細な説明］
本発明は記述される特定の方法論、プロトコル、細胞系、動物種もしくは属、構築物および試薬に制限されずかつそれ自体変動してよいことが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は特定の態様のみを記述する目的上であり、そして本発明の範囲を制限することを意図していないこともまた理解されるべきである。
【００３０】
本明細書で使用されるところのおよび付属として付けられる請求の範囲における単数の形態「１つの（ａ）」、「および」、および「該（ｔｈｅ）」は、該状況が明白に別の方法で指令しない限り複数形の引用を包含することに注意しなければならない。従って、例えば、「１種のタンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は１種もしくはそれ以上のタンパク質への言及であり、そして当業者に既知のそれらの同等物を包含する、などである。
【００３１】
別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野の当業者に普遍的に理解されると同一の意味するところを有する。本明細書に記述されるものに類似のもしくは同等のいかなる方法、装置および材料を本発明の実務もしくは試験で使用し得るとは言え、好ましい方法、装置および材料を今や記述する。
【００３２】
本明細書で挙げられる全部の刊行物および特許は、例えば現在記述される発明とともに使用してよい刊行物に記述される構築物および方法論を記述および開示する目的上、引用することにより本明細書に組み込まれる。上におよび本文を通じて論考される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいずれも、発明者が従来の発明に基づきこうした開示に先行する権利を与えられないことの許可として解釈されるべきでない。
【００３３】
従って、本発明はＣＤ培地中で継続的に増殖する能力を有するクローン性骨髄腫細胞系に関する。これらのクローン性骨髄腫細胞系は、限定されるものでないがＳｐ２／０−Ａｇ１４（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「ＡＴＣＣ」）、バージニア州マナサス、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ番号１８５１）；Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ番号１５８０）；ＲＰＭＩ  ８２２６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ番号１５５）；およびＮＳＯ（ヨーロピアン  コレクション  オブ  セル  カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（「ＥＣＡＣＣ」）、英国ウィルトシャーソールズベリー、ＥＣＡＣＣ番号８５１１０５０３）を挙げることができるいずれかの数の商業的に入手可能な骨髄腫細胞系由来であってよい。他の骨髄腫細胞系は、ＡＴＣＣ；ＥＣＡＣＣ；Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ（「ＩＺＳＢＳ」）、イタリア・ブレシア；ヒューマン  アンド  アニマル  セル  カルチャーズ（Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（「ＤＳＭＺ」）、ドイツ連邦共和国ブラウンシュヴァイク；およびインターラブ  セル  ライン  コレクション（Ｉｎｔｅｒｌａｂ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「ＩＣＬＣ」）、イタリア・ジェノバのような細胞培養物受託所から入手可能である。
【００３４】
一態様において、クローン性骨髄腫細胞系はＣＤ培地中でＳｐ２／０−Ａｇ１４（「Ｓｐ２／０」）細胞バンクからクローン化された自発的突然変異体である。本態様において該クローン性骨髄腫細胞系はＣ４６３Ａと呼称される。Ｃ４６３Ａの特徴づけは、該細胞系が親Ｓｐ２／０細胞と関連しない多数の独特の増殖の特徴を有することを示した。例えば、Ｃ４６３Ａは血清（Ｓｐ２／０親細胞系の必要な凍結保存剤）の非存在下で凍結かつ融解してよい。加えて、親系統と異なり、Ｃ４６３ＡはＣＤ培地中で高細胞密度まで増殖し得る。さらなる特徴づけは、ＣＤ培地中で増殖させたＣ４６３Ａが、血清を補充した増殖培地中で細胞を維持する場合に観察されるものに類似のもしくはより優れている生存可能細胞密度および倍加時間を包含する増殖パラメータを表すことを示した。
【００３５】
本発明で使用されるところのＣＤ培地は、血清、血清タンパク質、加水分解物もしくは未知の組成の化合物を包含する動物起源のいかなる成分も欠く増殖培地を含んでなる。ＣＤ培地の全成分は既知の化学構造を有し、以前に論考されたバッチごとの変動性の排除をもたらす。本発明で使用されるＣＤ培地は、限定されるものでないが、
ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、インビトロジェン  コープ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）、カリフォルニア州カールスバードにより製造されるＣＤ培地（カタログ番号１１２７９−０２３）
を挙げることができる。増殖プロフィルのために、ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地に１ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３および６ｍＭの最終濃度までのＬ−グルタミンを補充した。本発明はまた、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（培養哺乳動物細胞のための無血清培地）」と題されたセントコア（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）の係属中の特許出願第６０／２６８，８４９号明細書（引用することにより明らかに組み込まれる）に記述される「ＣＤＭ培地」を包含する無血清培地の使用も企図する。
【００３６】
ＣＤ培地と対照的に、タンパク質を含まない培地は動物起源の成分（例えばヒト毛髪から抽出されたシスチン）および／または動物もしくは植物起源の定義されない成分（例えば低分子量ペプチドを与える多様な加水分解物）をなお含有してもよい。タンパク質を含まない培地は、別個のタンパク質もしくは大量のタンパク質画分を含有してもよい血清を含まない培地より、定義された処方に一歩より近い。注目すべきは、血清を含まずかつタンパク質を含まないの双方である増殖培地は事実上ＣＤ培地であるかもしれない。実際、本発明はさらに、増殖プロフィルのため８ｍＭのＬ−グルタミンを補充されたシグマ［Ｓｉｇｍａ］（Ｒ）血清およびタンパク質を含まない（Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ）培地（カタログ番号Ｓ−８２８４）、シグマ−アルドリッチ  コープ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）、ミズーリ州セントルイス中でのＣ４６３Ａの増殖を企図する。
【００３７】
上で述べられたとおり、本発明は骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０由来の自発的突然変異体を含んでなる。簡潔には、Ｓｐ２／０細胞を、シグマ［Ｓｉｇｍａ］（Ｒ）血清およびタンパク質を含まない培地（Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）を含む５枚の９ウェルクラスター皿に４０細胞／ウェルの密度で接種した。シグマ［Ｓｉｇｍａ］（Ｒ）血清およびタンパク質を含まない培地（Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）中でのサブクローニング１４日後に３７ウェル（７パーセント）が生存可能なコロニーを含有した。３７コロニーのうち２０個を６ウェルプレートに拡大（ｅｘｐａｎｄ）した。５種の一次候補系統を視覚的に同定し、そしてＴ−７５段階での増殖プロフィルを開始した。３個の二次候補細胞系を拡大し、そして残存する系統をプールかつ凍結させた。３個の二次候補細胞系のうち、２Ｄ１１と呼称されるクローンが、その増殖プロフィルにより示されるとおり最も成功裏の細胞系であり、そしてこの系統をその後Ｃ４６３Ａと呼称した。Ｃ４６３Ａをさらに拡大しそして多様なＣＤ培地中でその増殖する能力について分析した。
【００３８】
本発明の細胞系の分析は、Ｃ４６３ＡがＣＤ培地中で継続的増殖を持続する能力を有することを示した。Ｃ４６３Ａ培養物をＣＤ培地（ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地およびシグマ［Ｓｉｇｍａ］（Ｒ）血清およびタンパク質を含まない（Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ）培地双方）中で樹立し、慣例の維持を実施し（細胞培養物を週あたり３回分割した）そして多様な増殖パラメータを記録した。表１は１０連続継代（１ヶ月）の経過にわたる数種の細胞増殖パラメータの平均を示す。
【００３９】
【表１】
2005512538.tif 000002
【００４０】
試験された双方の型のＣＤ培地中で、Ｃ４６３Ａはイスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（至適培地）中で増殖させたＳｐ２／０親細胞のものに匹敵する全細胞密度に達した。加えて、ＣＤ培地中で増殖させたＣ４６３Ａの生存率パーセントおよび倍加時間もまた至適培地中で増殖させたＳｐ２／０親細胞について観察されたものに類似であった。
【００４１】
Ｃ４６３Ａのさらなる特徴づけは、該細胞系がＳｐ２／０親細胞に関連しない多数の独特の増殖特徴を有することを示した。例えば、ウシ胎児血清はＣ４６３Ａ培養物を凍結、融解および樹立する場合に必要でない。簡潔には、Ｃ４６３Ａ細胞をＴ−フラスコもしくはスピナー中で指数増殖期まで増殖させた。細胞を８００〜１０００ｒｐｍで回転した後に、細胞を１×１０７ｖｃ／ｍｌ（生存可能細胞／ｍｌ）の密度で１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補充された５ｍｌのＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地に再懸濁した。１ミリリットルのアリコートを凍結バイアルに入れそして−７０℃で一夜凍結させた。バイアルを長期保存のため１週間以内に液体窒素蒸気相に移した。ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中で融解した後に、細胞の生存率を０および２４時間に測定し、そして培養物をＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中で樹立した。
【００４２】
図１を参照すれば、図１ａはＣ４６３Ａの融解後生存率が、２０％ＦＢＳの存在下に凍結された場合のＳｐ２／０親細胞（８５ないし９０パーセント、データは示されない）に同一である８５ないし９０パーセントの間の範囲にわたったことを示す。図１ｂは、シグマ［Ｓｉｇｍａ］（Ｒ）血清およびタンパク質を含まない（Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ）培地およびＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地双方中で樹立されたＣ４６３Ａ培養物の増殖プロフィルが継続培養条件において典型的であったことを示す。Ｓｐ２／０親細胞は、しかしながら不十分に増殖しかつＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中での第二継代後に中断した。
【００４３】
Ｃ４６３Ａの別の独特の特徴はＣＤ培地中で高細胞密度を達成するその能力である。図２はＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中のＳｐ２／０セミバッチ培養物の増殖プロフィルに対するＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中のＣ４６３Ａセミバッチ培養物の増殖プロフィルを具体的に説明する。セミバッチ培養物は古い培地を人的に除去することおよび全細胞を再利用することにより細胞を高密度まで蓄積するという利点を提供する。簡潔には、セミバッチ増殖プロフィル（７５パーセントの培地を接種後３日毎日交換した）をＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中で開始しかつ増殖パラメータを毎日（第３〜７日）検査した。図２（ここで「ＶＣ」は生存可能細胞／ｍｌ（１０６）を意味しかつ「ＴＣ」は全細胞／ｍｌ（１０６）を意味する）に示されるとおり、Ｃ４６３Ａの増殖および生存率は記述される条件においてＳｐ２／０親細胞を越えた。３．２７×１０６ｖｃ／ｍｌおよび４．４５×１０６細胞／ｍｌの生存可能および全細胞密度がＣ４６３Ａについて第６日に観察された一方、対照の数は第４日に１×１０６ｖｃ／ｍｌおよび１．３５×１０６細胞／ｍｌで有意により少なかった。
【００４４】
ＣＤセミバッチ条件でのＣ４６３Ａの増殖を評価するためのより厳しい陽性対照を創製するために、上述された実験を反復しそしてＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で増殖させたＳｐ２／０親細胞と比較した。図３に示されるデータは、Ｃ４６３ＡがＳｐ２／０親細胞に匹敵する細胞密度を達成したことを示す。３．７５×１０６ｖｃ／ｍｌおよび４．２５×１０６細胞／ｍｌのＣ４６３Ａの生存可能および全細胞密度が第５日に観察された一方、Ｓｐ２／０親細胞は同一期間にわたって４．７５×１０６ｖｃ／ｍｌおよび５．５×１０６細胞／ｍｌの生存可能および全細胞密度まで増殖した。加えて、細胞培養物の生存率は第５日に同一（８９パーセント、データは示されない）であり、また、倍加時間（３〜５日、データは示されない）はＳｐ２／０およびＣ４６３Ａについてそれぞれ１９および２１時間であった。この実験は、Ｃ４６３Ａが至適増殖培地中で培養されるＳｐ２／０親細胞に等しいかもしくはより優れているＣＤ培地中での細胞密度を達成し得ることを示す。
【００４５】
上述された実験は、至適培地中で少なくともＳｐ２／０親細胞と同じくらい良好にＣＤ培地中で増殖するＣ４６３Ａの能力を示す。より重要なことに、Ｃ４６３Ａは組換えタンパク質を安定に発現するよう操作してよい。一態様において、細胞系Ｃ４６３Ａは培地１Ｌあたり約０．０１ｍｇないし約１０，０００ｍｇのレベルで組換えタンパク質を産生するよう操作される。別の態様において、細胞系Ｃ４６３Ａは約０．１ｐｇ／細胞／日ないし約１００ｎｇ／細胞／日のレベルで組換えタンパク質を産生するよう操作される。
【００４６】
本発明はさらに、ＣＤ培地中で増殖する能力を有する他のクローン性骨髄腫細胞系に関する。こうした細胞系は、当該技術分野で既知もしくは本明細書で教示されるところの方法を使用することにより組換えタンパク質を安定に発現するよう操作してよい。例えば、本発明のクローン性骨髄腫細胞系は培地１Ｌあたり約０．０１ｍｇないし約１０，０００ｍｇのレベルで組換えタンパク質を産生するよう操作してよい。別の態様において、本発明のクローン性骨髄腫細胞系は約０．１ｐｇ／細胞／日ないし約１００ｎｇ／細胞／日のレベルで組換えタンパク質を産生するよう操作してよい。
【００４７】
組換えタンパク質をコードする核酸の導入は、限定されるものでないが電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法、超音波処理、トランスフェクション、形質導入、形質転換およびウイルス感染を挙げることができる当該技術分野で公知の多数の技術のいずれか１つを介して達成してよい。事実、分子技術は当該技術分野で公知である。ＳＡＭＢＲＯＯＫら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢ．ＭＡＮＵＡＬ（２００１）；ＡＵＳＢＥＬら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９５）を参照されたい。
【００４８】
多様な哺乳動物発現ベクターを使用して本明細書に教示される細胞培養物中で組換えタンパク質を発現させてよい。組換えタンパク質発現に適するかもしれない商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものでないがｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルト）、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバード）、ｐＭＣｌｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）、ｐＸＴ１（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）、ｐＳＧ５（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「ＡＴＣＣ」）、バージニア州マナサス、ＡＴＣＣ番号３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ番号３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ番号３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ番号３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ番号３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ番号３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ番号３７４６０）および１７Ｄ３５（ＡＴＣＣ番号３７５６５）を挙げることができる。
【００４９】
本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は多様な組換えタンパク質の適する宿主として使用してよい。こうしたタンパク質は、免疫グロブリン、インテグリン、抗原、成長因子、細胞周期タンパク質、サイトカイン、ホルモン、神経伝達物質、受容体もしくはその融合タンパク質、血液タンパク質、抗菌薬、またはフラグメント、あるいはそれらの構造的もしくは機能的類似物を包含する。これらの以下の記述は本発明の範囲を制限するようにはたらかず、しかしむしろ本発明の幅を具体的に説明する。
【００５０】
例えば、本発明の一態様において、免疫グロブリンはヒトもしくは非ヒトのポリクローナルもしくはモノクローナル抗体由来であってよい。とりわけ、これらの免疫グロブリン（抗体）は組換えおよび／もしくは合成のヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化もしくはＣＤＲグラフト抗体およびそれらに対する抗イディオタイプ抗体であってよい。これらの抗体は、抗体の多様な部分が遺伝子工学技術を使用して一緒に結合されている多様な短縮された形態でもまた産生し得る。現在使用されるところの「抗体」、「抗体フラグメント」、「抗体変異体」、「Ｆａｂ」などは、限定されるものでないが、本発明の細胞培養物中で発現されてよいＨもしくはＬ鎖の最低１個のＣＤＲまたはそれらのリガンド結合部分、Ｈ鎖もしくはＬ鎖可変領域、Ｈ鎖もしくはＬ鎖定常領域、枠組み領域あるいはそれらのいずれかの部分を挙げることができる免疫グロブリン分子の最低一部分を含んでなるいかなるタンパク質もしくはペプチド含有分子も包含する。こうした抗体は、場合によっては、限定されるものでないがこうした抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕおよび／もしくはｉｎ  ｖｉｖｏで最低１種の標的の活性もしくは結合または受容体の活性もしくは結合を調節、減少、増大、拮抗、作動（ａｇｏｎｉｚｅ）、緩和、軽減、遮断、阻害、廃止および／もしくは妨害するを挙げることができる特異的リガンドにさらに影響を及ぼす。
【００５１】
本発明の一態様において、こうした抗体もしくはそれらの機能的同等物は、それらがヒトにおいて実質的に非免疫原性であるような「ヒト」であってよい。これらの抗体は、ヒト抗体遺伝子を発現するように遺伝子的に工作されたトランスジェニック動物の使用を包含する本明細書に記述される方法論のいずれにより製造してもよい。例えば、完全にヒトの抗体もしくはヒト可変領域のいずれかを発現する免疫トランスジェニックマウス（ゼノマウス）が記述されている。第ＷＯ  ９６／３４０９６号明細書を参照されたい。ゼノマウスの場合、産生される抗体は完全にヒトの抗体を包含し、そして動物から直接（例えば血清から）もしくは動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることができるか、またはヒト可変領域をもつ免疫グロブリンをコードする遺伝子から回収することができ、そして発現させて直接抗体を得るかまたは例えばＦａｂもしくは一本鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似物を得るように改変し得る。Ｉｄ．これらの遺伝子をその後当該技術分野で既知のもしくは本明細書に教示されるところの方法により本発明の細胞、細胞系および細胞培養物に導入する。
【００５２】
「抗体」という用語は、抗体、消化フラグメント、抗体模倣物を包含するかまたは抗体の構造および／もしくは機能を模倣する抗体の部分を含んでなるそれらの指定された部分および変異体、あるいは本発明の細胞培養物中で発現される一本鎖抗体およびそれらのフラグメントを包含するそれらの指定されたフラグメントもしくは部分を包含することをさらに意図している。本発明は従って、限定されるものでないがＦａｂ（例えばパパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えばペプシン消化および部分的還元による）ならびにＦ（ａｂ’）２（例えばペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えばプラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えばペプシンもしくはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えばペプシン消化、部分的還元および再凝集による）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（例えば分子生物学技術による）フラグメントを挙げることができる生物学的分子（抗原もしくは受容体のような）またはそれらの部分に結合することが可能な抗体フラグメントを包含する。例えばＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、（Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ  インク（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９９４−２００１）を参照されたい。
【００５３】
抗体と同様に、特定の標的タンパク質もしくは他の生物学的分子を結合する他のペプチド（標的結合ペプチド）を本明細書に開示される細胞、細胞系および細胞培養物により産生してよい。こうした標的結合ペプチドは組織から単離しそして等質まで精製してよいか、もしくは標的結合タンパク質を含有する細胞から単離しそして等質まで精製されるかもしれない。一旦単離かつ精製されれば、こうした標的結合ペプチドは公知の方法により配列決定されうる。これらのアミノ酸配列からＤＮＡプローブを製造しかつｍＲＮＡを得るのに使用してよく、それから既知の方法によりｃＤＮＡを作成かつクローン化し得る。他の公知のｃＤＮＡ製造方法は当該技術分野で既知でありそして効果的に使用されてよい。一般に、いかなる所望のペプチドも、上述されたプローブのようなｃＤＮＡプローブを使用し、ｍＲＮＡを単離しかつｍＲＮＡをｃＤＮＡに転写してこうしたタンパク質を発現するいかなる細胞もしくは組織からも単離し得る。その後、該ｃＤＮＡをウイルス、プラスミド、コスミドのような発現ベクターもしくは他のベクターに挿入すること、該発現ベクターを細胞中に挿入すること、生じる細胞を増殖させることおよび発現された標的結合タンパク質を上述されたとおり培地もしくは細胞抽出物から単離することによりタンパク質を製造し得る。例えば米国特許第５，８０８，０２９号明細書を参照されたい。
【００５４】
あるいは、抗体を包含する組換えペプチドは多様なライブラリースクリーニング技術を使用して同定してよい。例えばペプチドライブラリースクリーニングはわずか「ペプチド」長さ（２ないし４０アミノ酸）の分子が所定の大型タンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合し得るという事実を利用する。こうしたペプチドは大型タンパク質リガンドの生物活性を模倣することができるか（「ペプチドアゴニスト」）、もしくは競合的結合により大型タンパク質リガンドの生物活性を阻害するかもしれない（「ペプチドアンタゴニスト」）。ファージディスプレイペプチドライブラリーがこうしたペプチドアゴニストおよびアンタゴニストの同定における強力な方法として出現した。こうしたライブラリーではランダムペプチド配列が繊維状ファージのコートタンパク質との融合により展示される。典型的には、展示されるペプチドは抗原もしくは受容体の固定された細胞外ドメインに対し親和性溶出される。保持されたファージは親和性精製および再増殖の連続過程により濃縮しうる。最良に結合するペプチドを配列決定して、ペプチドの１種もしくはそれ以上の構造的に関連するファミリー内の重要な残基が同定されるかもしれない。ペプチド配列はまた、ＤＮＡレベルでのアラニン走査もしくは突然変異誘発によりどの残基が安全に置き換えられうるかも示唆するかもしれない。突然変異誘発ライブラリーを創製しかつスクリーニングして最良の結合体の配列をさらに至適化しうる。例えば第ＷＯ  ００／２４７８２号；同第ＷＯ  ９３／０６２１３号；米国特許第６，０９０，３８２号明細書を参照されたい。
【００５５】
他のディスプレイライブラリースクリーニング方法が同様に既知である。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ディスプレイはｌａｃリプレッサーのＣ末端もしくはペプチドグリカン会合リポタンパク質のいずれかに融合されかつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現されるペプチドライブラリーを使用する。リボソームディスプレイはリボソーム遊離前にランダムＲＮＡの翻訳を停止させることを必要とし、それらの会合されたＲＮＡがなお結合されるポリペプチドのライブラリーをもたらす。ＲＮＡ−ペプチドスクリーニングはＲＮＡへのペプチドの化学結合を使用する。加えて、ペプチドがポリエチレン製ロッドもしくは溶媒浸透性樹脂のような安定な非生物学的素材上に固定されている化学的に誘導されたペプチドライブラリーが開発されている。別の化学的に誘導されたペプチドライブラリーは、スライドガラス上に固定されたペプチドを走査するのに光食刻法を使用する。これらの化学的ペプチドスクリーニング方法は、それらがＤ−アミノ酸および他の非天然の類似物ならびに非ペプチド要素の使用を可能にするために有利であるかもしれない。第ＷＯ  ００／２４７８２号明細書を参照されたい。
【００５６】
さらに、タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析はまた、大型タンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを示唆するのにも使用されるかもしれない。こうした分析において、結晶構造が、ペプチドがそれから設計されうる大型タンパク質リガンドの決定的に重要な残基の本質および相対的方向を示唆するかもしれない。これらの分析方法は、受容体タンパク質とファージディスプレイにより選択されるペプチドとの間の相互作用を検討するのにもまた使用してよく、それは結合親和性を増大させるためのペプチドのさらなる修飾を示唆するかもしれない。従って、概念上、ファージディスプレイおよび上で挙げられる他の方法を使用していずれかのタンパク質のペプチド模倣物を発見しうる。例えば、これらの方法はタンパク質−タンパク質相互作用における決定的に重要なアミノ酸の同定のため、および新たな治療薬の発見のためのリード化合物としてのエピトープマッピングを提供する。第ＷＯ  ００／２４７８２号明細書を参照されたい。
【００５７】
本発明の細胞、細胞系および細胞培養物中で発現される組換えタンパク質の性質および起源は制限されない。以下は本明細書の教示に従って使用しうる多様なタンパク質、ペプチドおよび生物学的分子の一般的論考である。これらの記述は本発明の範囲を制限するようはたらかず、しかしむしろ本発明の幅を具体的に説明する。
【００５８】
従って、本発明の一態様は１種もしくはそれ以上の成長因子の産生を包含しうる。簡潔には、成長因子は、細胞の増殖および／もしくは分化の活性化という主な結果を伴う細胞表面上の受容体に結合するホルモンもしくはサイトカインタンパク質である。多くの成長因子は極めて多才であり多数の異なる細胞型において細胞分裂を刺激する一方；他者は特定の１細胞型に特異的である。以下の表２は数種の因子を提示するが、しかし包括的もしくは完全であることを意図しておらず、それでもなおより普遍的に既知の因子のいくつかおよびそれらの主な活性を紹介する。
【００５９】
【表２】
2005512538.tif 000003
【００６０】
本発明に従って産生しうる付加的な成長因子はインスリンおよびプロインスリン（米国特許第４，４３１，７４０号明細書）；アクチビン（Ｖａｌｅら、３２１  ＮＡＴＵＲＥ  ７７６（１９８６）；Ｌｉｎｇら、３２１  ＮＡＴＵＲＥ  ７７９（１９８６））；インヒビン（米国特許第４，７４０，５８７号；同第４，７３７，５７８号明細書）；および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（米国特許第５，８４６，９３１号明細書；ＷＯＺＮＥＹ、ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＆  ＭＯＬＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＢＯＮＥ  １３１−１６７（１９９３））を包含する。
【００６１】
上で論考された成長因子に加え、本発明は他のサイトカインの産生に有用であるかもしれない。主として白血球から分泌されるサイトカインは体液性および細胞性双方の免疫応答、ならびに貪食細胞の活性化を刺激する。リンパ球から分泌されるサイトカインはリンホカインと命名される一方、単球もしくはマクロファージにより分泌されるものはモノカインと命名される。サイトカインの大きな１ファミリーが身体の多様な細胞により産生される。リンホカインの多くはインターロイキン（ＩＬ）としてもまた知られる。それらは白血球により分泌されるのみならず、しかしまた白血球の細胞応答にも影響を及ぼすことが可能であるためである。とりわけ、インターロイキンは造血起源の細胞に標的を向けられた成長因子である。同定されたインターロイキンの一覧は継続的に大きくなっている。例えば米国特許第６，１７４，９９５号、同第６，１４３，２８９号明細書；Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１８  ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．５９３（２０００）；Ｋｕｎｋｅｌら、５９  Ｊ．ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＢＩＯＬ．８１（１９９６）を参照されたい。
【００６２】
本発明に包含される付加的な成長因子／サイトカインはヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ、ＦＳＨ  αおよびＦＳＨ  β）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ、ＨＣＧ  α、ＨＣＧ  β）、ｕＦＳＨ（ウロフォリトロピン）、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧＲＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、黄体化ホルモン（ＬＨ、ＬＨ  α、ＬＨ  β）、ソマトスタチン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ、ＴＳＨ  α、ＴＳＨ  β）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、副甲状腺ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロンのような下垂体ホルモンまたはそれらの構造的もしくは機能的類似物を包含する。これらのタンパク質およびペプチドの全部は当該技術分野で既知である。
【００６３】
サイトカインファミリーは腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子およびインターフェロンもまた包含する。例えばＣｏｓｍａｎ、７  ＢＬＯＯＤ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＣＨＥＭ．（Ｗｈｅｔｔｅｎら編、プレナム  プレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９６）；Ｇｒｕｓｓら、８５  ＮＬＯＯＤ  ３３７８（１９９５）；Ｂｅｕｔｌｅｒら、７  ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．６２５（１９８９）；Ａｇｇａｒｗａｌら、２６０  Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２３４５（１９８５）；Ｐｅｎｎｉｃａら、３１２  ＮＡＴＵＲＥ  ７２４（１９８４）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍのＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＹＴＯＫＩＮＥ  ＭＩＮＩ−ＲＥＶＩＥＷＳを参照されたい。
【００６４】
数種のサイトカインを下の表３に簡潔に紹介する。
【００６５】
【表３】
2005512538.tif 000004
【００６６】
本明細書に記述される本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により産生されうる目的の他のサイトカインは、接着分子（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍのＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡＤＨＥＳＩＯＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  Ｉ（１９９６））；アンジオゲニン（米国特許第４，７２１，６７２号明細書；Ｍｏｅｎｅｒら、２２６  ＥＵＲ．Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．４８３（１９９４））；アネキシンＶ（Ｃｏｏｋｓｏｎら、２０  ＧＥＮＯＭＩＣＳ  ４６３（１９９４）；Ｇｒｕｎｄｍａｎｎら、８５  ＰＮＡＳ  ３７０８（１９８８）；米国特許第５，７６７，２４７号明細書）；カスパーゼ（米国特許第６，２１４，８５８号明細書；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、２８１  ＳＣＩＥＮＣＥ  １３１２（１９９８））；ケモカイン（米国特許第６，１７４，９９５号；同第６，１４３，２８９号明細書；Ｓａｌｌｕｓｔｏら  １８  ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．５９３（２０００）；Ｋｕｎｋｅｌら、５９  Ｊ．ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＢＩＯＬ．８１（１９９６））；エンドセリン（米国特許第６，２４２，４８５号；同第５，２９４，５６９号；同第５，２３１，１６６号明細書）；エオタキシン（米国特許第６，２７１，３４７号明細書；Ｐｏｎａｔｈら、９７（３）Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．６０４−６１２（１９９６））；Ｆｌｔ−３（米国特許第６，１９０，６５５号明細書）；ヘレグリン（米国特許第６，２８４，５３５号；同第６，１４３，７４０号；同第６，１３６，５５８号；同第５，８５９，２０６号；同第５，８４０，５２５号明細書）；レプチン（Ｌｅｒｏｙら、２７１（５）Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２３６５（１９９６）；Ｍａｆｆｅｉら、９２  ＰＮＡＳ  ６９５７（１９９５）；Ｚｈａｎｇ  Ｙ．ら  ３７２  ＮＡＴＵＲＥ  ４２５−３２（１９９４））；マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）（米国特許第６，２４８，５６０号；同第６，０３０，９４９号；同第５，３１５，０００号明細書）；プレイオトロフィン／ミッドカイン（ＰＴＮ／ＭＫ）（Ｐｅｄｒａｚａら、１１７  Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．８４５（１９９５）；Ｔａｍｕｒａら、３  ＥＮＤＯＣＲＩＮＥ  ２１（１９９５）；米国特許第５，２１０，０２６号明細書；Ｋａｄｏｍａｔｓｕら、１５１  ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．１３１２（１９８８））；ＳＴＡＴタンパク質（米国特許第６，０３０８０８号；同第６，０３０，７８０号明細書；Ｄａｒｎｅｌｌら、２７７  ＳＣＩＥＮＣＥ  １６３０−１６３５（１９９７））；腫瘍壊死因子ファミリー（Ｃｏｓｍａｎ、７  ＢＬＯＯＤ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＣＨＥＭ．（Ｗｈｅｔｔｅｎら編、プレナム  プレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９６）；Ｇｒｕｓｓら、８５  ＢＬＯＯＤ  ３３７８（１９９５）；Ｂｅｕｔｌｅｒら、７  ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．６２５（１９８９）；Ａｇｇａｒｗａｌら、２６０  Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２３４５（１９８５）；Ｐｅｎｎｉｃａら、３１２  ＮＡＴＵＲＥ  ７２４（１９８４））を包含する。
【００６７】
本発明は組換え形態の血液タンパク質（一般に血漿中を循環しかつ凝固および凝血塊溶解を調節するのに重要な巨大な一群のタンパク質の包括的名称）を製造するのにもまた使用しうる。例えば、ｗｗｗ．ｈａｅｍｔｅｃｈ．ｃｏｍのヘマトロジック  テクノロジーズ  インク（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＨＴＩカタログ（ＨＴＩ  ＣＡＴＡＬＯＧ）を参照されたい。表４は本発明により企図される血液タンパク質のいくつかを制限しない様式で紹介する。
【００６８】
【表４】
2005512538.tif 000005
【００６９】
【表５】
2005512538.tif 000006
【００７０】
【表６】
2005512538.tif 000007
【００７１】
【表７】
2005512538.tif 000008
【００７２】
【表８】
2005512538.tif 000009
【００７３】
本明細書で企図される付加的な血液タンパク質は、タンパク質の別の範疇（ホルモンもしくは抗原のような）にもまた入れられるかもしれない以下のヒト血清タンパク質、すなわちアクチン、アクチニン、アミロイド血清Ｐ、アポリポタンパク質Ｅ、Ｂ２−ミクログロブリン、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、コレステリルエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、補体Ｃ３Ｂ、セルプラスミン、クレアチンキナーゼ、シスタチン、サイトケラチン８、サイトケラチン１４、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、サイトケラチン２０、デスミン、デスモコリン３、ＦＡＳ（ＣＤ９５）、脂肪酸結合タンパク質、フェリチン、フィラミン、グリア繊維酸性タンパク質、グリコーゲンホスホリラーゼイソ酵素ＢＢ（ＧＰＢＢ）、ハプトグロブリン、ヒトミオグリビン、ミエリン塩基性タンパク質、神経フィラメント、胎盤ラクトゲン、ヒトＳＨＢＧ、ヒト甲状腺過酸化酵素、受容体関連タンパク質、ヒト心トロポニンＣ、ヒト心トロポニンＩ、ヒト心トロポニンＴ、ヒト骨格トロポニンＩ、ヒト骨格トロポニンＴ、ビメンチン、ビンキュリン、トランスフェリン受容体、プレアルブミン、アルブミン、α−１−酸性糖タンパク質、α−１−アンチキモトリプシン、α−１−アンチトリプシン、α−フェトプロテイン、α−１−ミクログロブリン、β−２−ミクログロブリン、Ｃ−反応性タンパク質、ハプトグロブリン、ミオグロブリン、プレアルブミン、ＰＳＡ、前立腺酸性ホスファターゼ、レチノール結合タンパク質、サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原、サイロキシン結合グロブリン、トランスフェリン、トロポニンＩ、トロポニンＴ、前立腺酸性ホスファターゼ、レチノール結合グロブリン（ＲＢＰ）を包含する。これらのタンパク質およびそれらの起源の全部は当該技術分野で既知である。
【００７４】
本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は神経伝達物質もしくはそれらの機能的部分の産生にもまた使用されるかもしれない。神経伝達物質はニューロンにより作成されかつそれらが刺激する他のニューロンもしくは非ニューロン細胞（例えば骨格筋、心筋、松果体細胞）にシグナルを伝達するためにそれらにより使用される化合物である。神経伝達物質は、それらの起源のニューロンが発火する（すなわち脱分極されたようになる）場合にシナプス中に放出されること、およびその後シナプス後細胞の膜中の受容体に結合することによりそれらの影響を生じさせる。これはその膜を横断する特定のイオンの流動の変化を引き起こして、該神経伝達物質がたまたま興奮性である場合はより多くありそうに、もしくはそれが阻害性である場合はより少なくありそうに細胞を脱分極されたようにする。神経伝達物質はまた、シナプス後細胞中の他のシグナル伝達分子（「二次メッセンジャー」）の産生を調節することによってもそれらの影響を生じさせ得る。全般として、ＣＯＯＰＥＲ、ＢＬＯＯＭとＲＯＴＨ、ＴＨＥ  ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＮＥＵＲＯＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ（第７版  オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク市、１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｉｎｄｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｔｈｃｍｅ／ｍｗｋｉｎｇ／ｎｅｒｖｅｓを参照されたい。本発明で企図される神経伝達物質は、限定されるものでないが、エンドルフィン（ロイシンエンケファリン、モルヒセプチン、サブスタンスＰのような）、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、バソプレシン、ギラクチド、プレオピオメラノコルチン由来のペプチド神経伝達物質およびＮ−アセチルアスパルチルグルタミン酸（哺乳動物の神経系において最も優勢かつ広範に分布されるペプチド神経伝達物質）を挙げることができる。Ｎｅａｌｅら  ７５  Ｊ．ＮＥＵＲＯＣＨＥＭ．４４３−５２（２０００）を参照されたい。
【００７５】
多数の他のタンパク質もしくはペプチドが本明細書に記述される本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により産生されるかもしれない。表５は、こうした細胞により産生されうるいくつかの薬理学的に活性のペプチドの制限しない一覧および記述を提示する。
【００７６】
【表９】
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【００７７】
【表１０】
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【００７８】
【表１１】
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【００７９】
慢性関節リウマチの病因において２種の中枢のサイトカインすなわちＩＬ−１およびＴＮＦ−αが存在する。それらは相互、他のサイトカインおよびＣＯＸ−２を誘導するよう相乗的に作用する。研究は、ＩＬ−１が慢性関節リウマチ患者における骨および軟骨破壊の主媒介物質である一方、ＴＮＦ−αが炎症の主媒介物質であると思われることを示唆する。
【００８０】
好ましい一態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により産生される１種のタンパク質は、炎症前サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合する。米国特許第６，２７７，９６９号；同第６，０９０，３８２号明細書。抗ＴＮＦα抗体は治療薬として大きな有望性を示している。例えば、セントコア  インク（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）（ペンシルバニア州マルバーン）によりレミケード［ＲＥＭＩＣＡＤＥ］（Ｒ）として商業的に提供されるインフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）はクローン病および慢性関節リウマチのような数種の慢性自己免疫疾患の治療に使用されている。セントコア（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）の係属中の米国特許出願第０９／９２０，１３７号；同第６０／２３６，８２６号；同第６０／２２３，３６９号明細書を参照されたい。Ｔｒｅａｃｙ、１９（４）ＨＵＭ．ＥＸＰ．ＴＯＸＩＣＯＬ．２２６−２８（２０００）もまた参照されたい；Ｃｈａｎｔｒｙ、２（１）ＣＵＲＲ．ＯＰＩＮ．ＡＮＴＩ−ＩＮＦＬＡＭＭＡＴＯＲＹ  ＩＭＭＵＮＯＭＯＤＵＬＡＴＯＲＹ  ＩＮＶＥＳＴ．ＤＲＵＧＳ  ３１−３４（２０００）；Ｒａｎｋｉｎら、３４（４）ＢＲＩＴ．Ｊ．ＲＨＥＵＭＡＴＯＬＯＧＹ  ３３４−４２（１９９５）もまた参照されたい。好ましくは、本発明の細胞培養物により産生されるタンパク質のＴＮＦα結合部分のいずれの露出されたアミノ酸も、ヒトもしくはヒト化アミノ酸配列のようなヒトにおいて最小限の抗原性を伴うものである。これらのペプチドの本質は、上述されたところのライブラリーをスクリーニングすること、マウス由来パラトープ（Ｓｉｅｇｅｌら、７（１）ＣＹＴＯＫＩＮＥ  １５−２５（１９９５）；第ＷＯ  ９２／１１３８３号明細書）もしくはサル由来パラトープ（第ＷＯ  ９３／０２１０８号明細書）上にヒトアミノ酸配列をグラフトすること、またはゼノマウス（第ＷＯ  ９６／３４０９６号明細書）を利用することにより生成されるかもしれない。あるいは、マウス由来抗ＴＮＦα抗体は有効性を表している。Ｓａｒａｂｏｌａｔｚら、１６９（１）Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．２１４−１７（１９９４）。
【００８１】
あるいは、抗体に由来することの代わりに、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物中で産生されたタンパク質のＴＮＦα結合部分は、ＴＮＦα受容体由来であってもよい。例えば、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）は、皮下に投与されかつ患者血清中のＴＮＦαに結合してそれを生物学的に不活性にする組換えの可溶性ＴＮＦα受容体分子である。エタネルセプトはヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に結合されたヒトの７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分よりなる二量体融合タンパク質である。エタネルセプトのＦｃ成分はＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含有するがしかしＣＨ１ドメインを含有しない。エタネルセプトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系において組換えＤＮＡ技術により産生される。それは９３４アミノ酸よりなりかつおよそ１５０キロダルトンの見かけの分子量を有する。エタネルセプトはイミュネックス  コープ（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）（ワシントン州シアトル）により製造されるエンブレル［ＥＮＢＲＥＬ］ＴＭとして得られうる。エタネルセプトは慢性関節リウマチにおいて有効でありうる。Ｈｕｇｈｅｓら、１５（６）ＢＩＯＤＲＵＧＳ  ３７９−９３（２００１）。
【００８２】
ｐ５５として同定される別の形態のヒトＴＮＦ受容体が同様に存在する。Ｋａｌｉｎｋｏｖｉｃｈら、Ｊ．ＩＮＦＥＲＯＮ  ＆  ＣＹＴＯＫＩＮＥ  ＲＥＳ．１５７４９−５７（１９９５）。この受容体もまた治療における使用について探究されている。例えばＱｉａｎら  １１８  ＡＲＣＨ．ＯＰＨＴＨＡＬＭＯＬ．１６６６−７１（２０００）を参照されたい。可溶性のｐ５５  ＴＮＦ受容体の以前の処方はポリエチレングリコールに結合されており［ｒ−ｍｅｔＨｕＴＮＦｂｐ  ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）二量体（ＴＮＦｂｐ）］そして臨床的有効性を示したが、しかし、複数投与に際しての発達抗体（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（該薬物の増大された消失をもたらした）により慢性適応症に適しなかった。第二世代の分子はＴＮＦｂｐの抗原性エピトープを除去するよう設計され、そして慢性関節リウマチを伴う患者の治療において有用であるかもしれない。Ｄａｖｉｓら、ＡＮＮ．ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＣＯＮＧ．ＲＨＥＵＭＡＴＯＬＯＧＹ、フランス・ニース（２０００年６月２１〜２４日）にて発表。
【００８３】
ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は慢性関節リウマチにおいてＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの破壊的影響の均衡を図ることにより抗炎症の特性を示すがしかしいかなる細胞内応答も誘発しない、天然に存在するサイトカインアンタゴニストである。これゆえに、本発明の好ましい一態様において、該細胞培養物はＩＬ−１Ｒａまたはそのいずれかの構造的もしくは機能的類似物を産生してよい。ＩＬ−１Ｒａの２種の構造変異体、すなわち単球、マクロファージ、好中球および他の細胞から分泌される１７ｋＤａの形態（ｓＩＬ−１Ｒａ）、ならびにケラチノサイトならびに他の上皮細胞、単球および線維芽細胞の細胞質中に留まる１８ｋＤａの形態（ｉｃＩＬ−１Ｒａ）が存在する。ＩＬ−１Ｒａの付加的な１６ｋＤａの細胞内アイソフォームが好中球、単球および肝細胞中に存在する。ＩＬ−１Ｒａの主要なアイソフォームの双方が代替の第一エキソンの使用により同一遺伝子から転写される。ＩＬ−１Ｒａの産生は、付着性ＩｇＧ、他のサイトカインおよび細菌もしくはウイルス成分を包含する多くの物質により刺激される。マウスでのＩＬ−１Ｒａの組織分布は、ｓＩＬ−１Ｒａが主として末梢血液細胞、肺、脾および肝で見出される一方、ｉｃＩＬ−１Ｒａは皮膚で大量に見出されることを示す。トランスジェニックおよびノックアウトマウスにおける研究は、ＩＬ−１Ｒａがエンドトキシン誘発性傷害に対する宿主防禦において重要であることを示す。ＩＬ−１Ｒａは急性期タンパク質の特徴を伴う肝細胞により産生される。内因性ＩＬ−１Ｒａはヒト自己免疫および慢性炎症疾患において産生される。中和する抗ＩＬ−１Ｒａ抗体の使用は、内因性ＩＬ−１Ｒａが関節炎、大腸炎および肉芽腫性肺疾患における重要な天然の抗炎症タンパク質であることを示した。６ヶ月間ＩＬ−１Ｒａで治療された慢性関節リウマチを伴う患者は臨床パラメータおよび関節損傷のＸ線撮影の証拠の改善を表した。Ａｒｅｎｄら、１６  ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．２７−５５（１９９８）。
【００８４】
本明細書に記述される細胞、細胞系および細胞培養物により産生されうるＩＬ−１Ｒａのなお別の例は、インターロイキン−１  １７．３Ｋｄ  ｍｅｔ−ＩＬ１ｒａと呼ばれる組換えのヒトバージョン、すなわち名称キネレット［ＫＩＮＥＲＥＴ］ＴＭでアムジェン（Ａｍｇｅｎ）（カリフォルニア州サンフランシスコ）により製造されるアナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）である。アナキンラはまた慢性関節リウマチを伴う患者を伴う臨床試験においても有望性を示した。６５ＴＨ  ＡＮＮ．ＳＣＩ．ＭＥＥＴＩＮＧ  ＯＦ  ＡＭ．ＣＯＬＬＥＧＥ  ＲＨＥＵＭＡＴＯＬＯＧＹ（２００１年１１月１２日）。
【００８５】
本発明の別の態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により産生されるタンパク質はインターロイキン１２（ＩＬ−１２）もしくはそのアンタゴニストである。ＩＬ−１２はジスルフィド結合される３５および４０ｋＤのグリコシル化ポリペプチド鎖よりなるヘテロ二量体サイトカインである。該サイトカインは、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞およびケラチノサイトを包含する抗原提示細胞、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により合成かつ分泌される。ＩＬ−１２は多様な生物学的過程を媒介しかつＮＫ細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、Ｔ細胞刺激因子、細胞傷害性Ｔリンパ球成熟因子およびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系因子と称されている。Ｃｕｒｆｓら、１０  ＣＬＩＮ．ＭＩＣＲＯ．ＲＥＶ．７４２−８０（１９９７）。インターロイキン−１２は細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞）の原形質膜上で発現されるＩＬ−１２受容体に結合し得、それにより生物学的過程を変える（例えば開始する、予防する）。例えば、ＩＬ−１２受容体へのＩＬ−１２の結合は、前活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を刺激し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ＮＫ細胞およびＬＡＫ（リンホカイン活性化キラー）細胞の細胞溶解活性を高め、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるγインターフェロン（ＩＦＮγ）の産生を誘導しそしてナイーブなＴｈ０細胞のＴｈ１細胞（ＩＦＮγおよびＩＬ−２を産生する）への分化を誘導し得る。Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ、１３  ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  ２５１−７６（１９９５）。とりわけ、ＩＬ−１２は細胞溶解細胞（例えばＮＫ、ＣＴＬ）の生成および細胞免疫応答（例えばＴｈ１細胞媒介性の免疫応答）の装備に不可欠である。従って、ＩＬ−１２は保護免疫（例えば感染の根絶）および病因となる免疫応答（例えば自己免疫）双方の生成および調節において決定的に重要である。Ｈｅｎｄｒｚａｋら、７２  ＬＡＢ．ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＩＯＮ  ６１９−３７（１９９５）。従って、免疫応答（例えば保護的もしくは病因となる）は、例えば抗体によってｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１２の生物学的活性の操作により高め、抑制しもしくは予防し得る。
【００８６】
別の態様において、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物はインテグリンを産生する。インテグリンは、腫瘍に栄養素および酸素を提供し、廃棄産物を運び去りかつ遠隔部位への腫瘍細胞の転移のための導管として作用する新たな血管を腫瘍細胞が形成する血管新生過程に関与している。Ｇａｓｔｌら、５４  ＯＮＣＯＬ．１７７−８４（１９９７）。インテグリンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への細胞接着において決定的に重要な役割を演じるヘテロ二量体膜貫通タンパク質であり、それは順に細胞内シグナル伝達により細胞の生存、増殖および移動を媒介する。ヘテロ二量体のインテグリンは１個のαサブユニットおよび１個のβサブユニットより構成される。現在、１６種の既知のαサブユニットが存在し、それらはα１、α２、α３、α４、α５、α６、α７、α８、α９、αＤ、αＬ、αＭ、αＶ、αＸ、αＩＩｂ、αＩＥＬｂを包含する。８種の既知のβサブユニットが存在し、それらはβ１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８を包含する。インテグリンのヘテロ二量体のいくつかは、限定されるものでないが、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、α８β１、α９β１、α４β７、α６β４、αＤβ２、αＬβ２、αＭβ２、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、αＸβ２、αＩＩｂβ３、αＩＥＬｂβ７を挙げることができる。全般的に、Ｂｌｏｃｋら、１３  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  １３５−１４５（１９９５）；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１（１）ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＣＥＬＬ  ＤＥＶ．ＢＩＯＬ．５４９−５９９（１９９５）；Ｈｙｎｅｓ、６９  ＣＥＬＬ  １１−２５（１９９２）を参照されたい。
【００８７】
血管新生の間に、活性化された内皮細胞の表面上で発現される多数のインテグリンが、細胞の移動、増殖および分化のような全く別の生物学的事象を調節するための多様なＥＣＭタンパク質との決定的に重要な接着相互作用を調節する。とりわけ、緊密に関連するがしかし全く別のインテグリンａＶｂ３およびａＶｂ５が血管新生過程における独立した経路を媒介することが示された。αＶβ３に対し生成された抗体は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）誘発性の血管新生を阻害した一方、αＶβ５に特異的な抗体は血管内皮細胞成長因子誘発性（ＶＥＧＦ誘発性）の血管新生を阻害した。Ｅｌｉｃｅｉｒｉら、１０３  Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．１２２７−３０（１９９９）；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、２７０  ＳＣＩＥＮＣＥ  １５００−０２（１９９５）。
【００８８】
本発明の別の好ましい態様において、該細胞、細胞系および細胞培養物は糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニストを産生する。より具体的には、血小板凝集の最後の必須の段階は、活性化された膜結合型糖タンパク質複合体ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａへのフィブリノーゲンの結合である。トロンビン、コラーゲン、エピネフリンもしくはＡＤＰのような血小板活性化因子は組織損傷の結果として生成される。活性化の間に、ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａはコンホメーションの変化を受け、それはフィブリノーゲンの隠れた結合部位の露出をもたらす。ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａについてフィブリノーゲン内に６個の推定の認識部位が存在し、そして従って、フィブリノーゲンは潜在的に、隣接する血小板上の交差するＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ分子に対する六価のリガンドとして作用し得る。フィブリノーゲンもしくはＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａいずれかの欠乏は、血小板を活性化するのに使用されるアゴニストに関係なく正常な血小板凝集を予防する。その血小板受容体へのフィブリノーゲンの結合は正常な凝集の必須の成分であるため、ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａは抗血栓薬の魅力的な標的である。
【００８９】
ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤の臨床試験からの結果はこの仮説を支持している。ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を遮断するモノクローナル抗体７Ｅ３が高リスクの血管形成集団に対する有効な治療であることが示された。それは、治療された冠動脈血管の突然の閉鎖について高リスクの患者における急性心虚血合併症の予防のための経皮経管的冠動脈形成術もしくは粥腫切除術に対する補助治療として使用される。７Ｅ３はＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体およびαｖβ３受容体双方を遮断するとは言え、血小板凝集を阻害するその能力はＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体結合阻害剤としてのその機能に帰されている。ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニストは、限定されるものでないが抗体、抗体のフラグメント、ペプチドもしくは有機分子を挙げることができる。例えば、標的結合部分は７Ｅ３すなわち糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニスト活性をもつ抗体由来であってよい。７Ｅ３はｃ７Ｅ３（セントコア  インク（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）（ペンシルバニア州マルバーン）により製造されるレオプロ［ＲＥＯＰＲＯ］（Ｒ）として商業的に知られるアブシキシマブとして知られるＦ（ａｂ’）２フラグメント）の親抗体である。アブシキシマブは接着性受容体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびαｖβ３を結合かつ阻害して血小板凝集およびトロンビン生成の阻害ならびにその後の血栓形成予防につながる。米国特許第５，９７６，５３２号；同第５，８７７，００６号；同第５，７７０，１９８号明細書；Ｃｏｌｌｅｒ、７８  ＴＨＲＯＭ．ＨＡＥＭＯＳＴ．７３０−３５（１９９７）；ＪＯＲＤＡＮら、ＮＥＷ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＧＥＮＴＳ  ＩＮ  ＴＨＲＯＭＢＯＳＩＳ  ＆  ＴＨＲＯＭＢＯＬＹＳＩＳ中（ＳａｓａｈａｒａとＬｏｓｃａｌｚｏ編  マルセル  ケッカー  インク（Ｍａｒｃｅｌ  Ｋｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）ニューヨーク、１９９７）；ＪＯＲＤＡＮら、ＡＤＨＥＳＩＯＮ  ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ  ＡＳ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＴＡＲＧＥＴＳ中  ２８１−３０５（Ｈｏｒｔｏｎ編  ＣＲＣ  プレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９６）。
【００９０】
あるいは、本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により産生されるタンパク質は血栓溶解薬であるかもしれない。例えば、該血栓溶解薬はｔＰＡもしくはその機能的変異体であるかもしれない。セントコア  インク（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）（ペンシルバニア州マルバーン）により製造されるレタベース［ＲＥＴＡＶＡＳＥ］（Ｒ）は延長された半減期をもつ変異体ｔＰＡである。興味深いことに、マウスにおいて、レタベースおよびＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニスト７Ｅ３Ｆ（ａｂ’）２の組合せ剤は肺塞栓の溶解を顕著に増大した。米国仮出願第６０／３０４４０９号明細書を参照されたい。
【００９１】
本発明の細胞、細胞系および細胞培養物はまた受容体もしくはそれらのフラグメント、および活性化型受容体、すなわちそれらの対応する受容体と会合するリガンドを模倣する組換えペプチド、もしくはそれらのフラグメントを産生するのにも使用されるかもしれない。これらの複合体は活性化型受容体を模倣しそして従って特定の一生物学的活性に影響を及ぼしうる。あるいは、活性化型コンホメーションを採用するように該受容体を遺伝子的に再工作し得る。例えば、フィブリノペプチドＡのトロンビン結合型コンホメーションは、残基Ｇｌｕ−１１およびＧｌｙ−１２にβターンの中心を置かれる鎖−ターン−鎖モチーフを表す。分子モデリング解析は、公表されたフィブリノペプチドのコンホメーションがトロンビンに合理的に結合し得ないこと、しかし、ウシ膵トリプシンインヒビターとの整列による２残基の再位置付けが、深いトロンビンの間隙内での良好な適合を提供しかつ実験的核オーバーハウザー効果データの全部を満足することを示す。この解析に基づき、研究者は、提案されたβターン構造を模倣するハイブリッドペプチド模倣物の基質および阻害剤を成功裏に設計かつ合成することが可能であった。該結果は、ターンのコンホメーションがトロンビンの特異性の重要な一局面であること、およびターン模倣物の設計がフィブリノペプチドのトロンビン結合型コンホメーションを成功裏に模倣することを示す。Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、８９（５）ＰＮＡＳ  １７０５−０９（１９９２）。
【００９２】
活性化型受容体部分の別の例はエリスロポエチン（Ｅｐｏ）受容体のペプチド模倣物に関する。背景として、Ｅｐｏ受容体（ＥｐｏＲ）へのＥｐｏの結合は成熟赤血球の産生に決定的に重要である。Ｅｐｏが結合した活性化型ＥｐｏＲは二量体である。例えばＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕら、９８  ＰＮＡＳ  ４３７９−８４（２００１）を参照されたい。その天然の状態で、二量体中の第一のＥｐｏＲは高親和性でＥｐｏを結合する一方、第二のＥｐｏＲ分子は該複合体に低親和性で結合する。二価の抗ＥｐｏＲ抗体が、おそらくＥｐｏＲの二量体化によりＥｐｏＲを活性化することが報告されている。加えて、Ｅｐｏ分子といかなる配列の相同性も有しない小型合成ペプチドもまたＥｐｏの生物学的影響をしかし低親和性で模倣することが可能である。それらの作用機序もまたおそらくＥｐｏＲの二量体化を生じさせる能力に基づく。これゆえに、本発明の一態様は開示される細胞培養系を使用する活性化型ＥｐｏＲ模倣物の製造方法を提供する。
【００９３】
本発明の別の態様において、該細胞、細胞系および細胞培養物を使用して抗菌薬もしくはそれらの部分が製造されるかもしれず、それらは、抗細菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗ミコバクテリア薬および抗寄生虫薬を包含する。抗細菌薬は、限定されるものでないが−ラクタム抗生物質（ペニシリンＧ、アンピシリン、オキサシリン）、アミノグリコシド（ストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびゲンタマイシン）ならびにポリペプチド抗生物質（コリスチン、ポリミキシンＢ）を挙げることができる。本細胞培養物により産生されうる抗ミコバクテリア薬はストレプトマイシンを包含する。ＳＡＮＦＯＲＤら、ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＴＨＥＲＡＰＹ（第２５版、アンチミクロバイアル  セラピー  インク（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．）、テキサス州ダラス、１９９５）。
【００９４】
本発明の別の態様において、該細胞、細胞系および細胞培養物を使用して細胞周期タンパク質もしくは細胞周期タンパク質の機能上活性の一部分が産生されるかもしれない。これらの細胞周期タンパク質は当該技術分野で既知であり、そしてＧ１サイクリン、Ｓ期サイクリン、Ｍ期サイクリン、サイクリンＡ、サイクリンＤおよびサイクリンＥのようなサイクリン；Ｇ１  ＣＤＫ、Ｓ期ＣＤＫおよびＭ期ＣＤＫ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４ならびにＣＤＫ６のようなサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）；ならびにＲｂおよびｐ５３のような癌抑制遺伝子を包含する。細胞周期タンパク質は、Ｂｃｌ−３およびカスパーゼタンパク質のようなアポトーシスに関与するもの；Ｃｄｃ４２シグナル伝達、ｐ７６  Ｓ６キナーゼおよびＰＡＫ調節に関連するタンパク質；ならびに別の場所で論考されるインテグリンもまた包含する。後期促進複合体（ＡＰＣ）および他のタンパク質分解酵素もまた本発明の細胞周期タンパク質に包含される。ＡＰＣは、コヒーシンの破壊に至りそして従って姉妹染色分体を分離させる事象を誘発し、かつ有糸分裂（Ｍ期）サイクリンを分解する。細胞周期タンパク質はｐ１３、ｐ２７、ｐ３４、ｐ６０、ｐ８０、ヒストンＨ１、中心体タンパク質、ラミンおよびＣＤＫ阻害剤もまた包含する。他の関連する細胞周期タンパク質はＳ期促進因子、ＡＰＣを活性化するＭ期促進因子を包含する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｌｔｒａｎｅｔ．ｃｏｍ／〜ｊｋｉｍｂａｌｌ／ＢｉｏｌｏｇｙＰａｇｅｓのＫｉｍｂａｌｌ、Ｋｉｍｂａｌｌ’ｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐａｇｅｓ。
【００９５】
本発明の細胞、細胞系および細胞培養物は特定の抗原もしくはその部分もまた産生するかもしれない。抗原は広範な意味において抗体もしくはその機能的フラグメントが結合するいかなる分子も包含してよい。こうした抗原は病原体由来であることができ、また、ＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩいずれかの反応と関連するかもしれない。これらの抗原はタンパク質性でありうるか、または多糖、糖タンパク質もしくは脂質のような炭水化物を包含してよい。炭水化物および脂質抗原は、正常ヒト血液細胞および外来の細菌細胞壁もしくはウイルス膜を包含する全部の型の細胞の細胞表面上に存在する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙでオンラインで利用可能なＳＥＡＲＳ、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｗ．Ｈ．フリーマン  アンド  カンパニー  アンド  サマナス  インク（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．ａｎｄ  Ｓｕｍａｎａｓ，Ｉｎｃ．））を参照されたい。
【００９６】
例えば、組換え抗原はウイルス、細菌、マイコプラスマ、真菌、寄生虫のような病原体もしくはトキシンのような別の外来物質由来であってよい。こうした細菌抗原は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス  テタニ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｔａｎｉ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｉｓ）；ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）スピーシーズ、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コクシエラ  ブルネチイ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）スピーシーズ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）を包含してよいかもしくはそれら由来であってよい。しばしば、これらの微生物の外側の細胞壁のオリゴ糖構造は優れた保護免疫を提供するが、しかしその効果のためには適切な担体に結合されなければならない。
【００９７】
本発明の範囲内にあるウイルスおよびウイルス抗原は、限定されるものでないが、ＨｂｅＡｇ、Ｂ型肝炎コア、Ｂ型肝炎表面抗原、サイトメガロウイルスＢ、ＨＩＶ−１  ｇａｇ、ＨＩＶ−１  ｎｅｆ、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１−１、ＨＩＶ−１  ｐ２４、ＨＩＶ−１  ＭＮ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ−２  ｅｎｖ、ＨＩＶ−２  ｇｐ  ３６、ＨＣＶコア、ＨＣＶ  ＮＳ４、ＨＣＶ  ＮＳ３、ＨＣＶ  ｐ２２ヌクレオキャプシド、ＨＰＶ  Ｌ１キャプシド、ＨＳＶ−１  ｇＤ、ＨＳＶ−１  ｇＧ、ＨＳＶ−２  ｇＧ、ＨＳＶ−ＩＩ、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ型（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ型、パラインフルエンザウイルス１型、エプスタイン−バーウイルスキャプシド抗原、エプスタイン−バーウイルス、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）大痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）小痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ  ｍｉｎｏｒ）、ロタウイルス、ルベラウイルス、ＲＳウイルス、梅毒（Ｓｙｐｈｉｌｉｓ）のスピロヘータの表面抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  Ｖｉｒｕｓ）抗原およびフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）を挙げることができる。
【００９８】
トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびトキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）のような他の寄生性病原体もまた本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により産生される組換え抗原の供給源を提供するかもしれない。
【００９９】
さらに、組換えトキシン、トキソイドもしくはいずれかの抗原部分が本明細書に提示される細胞、細胞系および細胞培養物により産生されるかもしれない。これらは、ジフテリアトキシン、破傷風トキシン、ボツリヌストキシンおよびエンテロトキシンＢのような細菌により本来は産生されるトキシン、ならびにヒマシＲｉｃｉｎｕｓ  ｃｕｍｍｕｎｉｓからのリシントキシンのような植物により本来は産生されるものの組換えの形態を包含する。組換え的に生成されうる他のトキシンおよびトキソイドは、他の植物、蛇、魚類、カエル、クモ、サソリ、藍藻、真菌およびカタツムリ由来のものを包含する。
【０１００】
本発明の細胞、細胞系および細胞培養物により産生されうるなお他の抗原は、特定の細胞型のマーカー、もしくはその細胞型と相互作用する作用物質の標的としてはたらくものであるかもしれない。例は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡマーカー）、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ、Ｔ細胞およびそれらの生理学的状態の同定に有用な多数のＣＤマーカーを包含する。あるいは、抗原は特定の疾患もしくは状態の「マーカー」、または治療薬の標的としてはたらくかもしれない。例は、前立腺特異的抗原、妊娠特異的β１糖タンパク質（ＳＰ１）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、甲状腺ミクロソーム抗原および尿タンパク質１を包含する。抗原は自己免疫疾患に関与する「自己」と定義されるものを包含しうる。ハプテン、すなわちそれらがはるかにより大きな実体と結合されない限り免疫応答を引き起こすには小さすぎるペプチドもしくは抗生物質のような低分子量化合物は、より大型の担体分子に結合される場合に抗原としてはたらくかもしれず、そして従って本発明の範囲内にある。ＲＯＩＴＩら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（第５版、１９９８）；ＢＥＮＪＡＭＩＮＩら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ａ  ＳＨＯＲＴ  ＣＯＵＲＳＥ（第３版、１９９６）を参照されたい。
【０１０１】
本発明はさらに、細胞、細胞系、細胞培養物およびそれら由来の組換えタンパク質が顧客に提供される商取引の方法に関する。特定の一態様において、顧客は本発明の細胞、細胞系もしくは細胞培養物を提供される。別の態様において、顧客は組換えタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされている本発明の細胞、細胞系もしくは細胞培養物を提供される。なお別の態様において、顧客は本発明の細胞、細胞系もしくは細胞培養物の細胞系から精製された組換えタンパク質を提供される。
【０１０２】
さらなる詳述を伴わずに、当業者は先行する記述を使用して本発明を最も完全な程度まで利用し得ると考えられる。以下の実施例は具体的に説明するのみであり、そしていったい何であれどのような様式でも該開示の残部の制限でない。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：Ｃ５２４Ａと呼称されるＣ４６３Ａ由来のｒＴＮＶ１４８Ｂ産生細胞系を創製するための腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に対するヒト抗体ｒＴＮＶ１４８Ｂでの細胞系Ｃ４６３Ａのトランスフェクション
細胞系Ｃ４６３Ａを組換えタンパク質の発現のための適する宿主としてさらに試験した。本実施例はＣ５２４Ａと呼称されるＣ４６３Ａ由来のｒＴＮＶ１４８Ｂ産生細胞系のトランスフェクションおよびその後の発展（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を記述する。ｒＴＮＶ１４８ＢはＴＮＦαに対し向けられた完全にヒトのモノクローナル抗体であり、その遺伝子はハイブリドーマ技術およびトランスジェニックマウスを使用して得た。
トランスフェクションおよびスクリーニング
プラスミドｐ１８６５と呼称されるｒＴＮＶ１４８Ｂ  Ｈ鎖発現ベクターをＸｈｏ１での消化により直鎖状にし、また、プラスミドｐ１８６０と呼称されるｒＴＮＶ１４８Ｂ  Ｌ鎖発現ベクターはＳａｌＩ制限酵素を使用して直鎖状にした。およそ１×１０７個のＣ４６３Ａ細胞を電気穿孔法（２００Ｖおよび１１８０μＦ）により約１０μｇの予め混合した直鎖状プラスミドでトランスフェクトした。Ｋｎｉｇｈｔら、３０  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  １４４３（１９９３）を参照されたい。トランスフェクション後、ＩＭＤＭ、１５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンを含む９６ウェル組織培養皿中に１×１０４細胞／ウェルの生存可能細胞密度で細胞を接種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で約４０時間インキュベートした後に、等容量のＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび２×ＭＨＸ選択培地を添加した。コロニー（一次トランスフェクタント）が目に見えるようになるまでプレートを３７℃、５％ＣＯ２で約２週間インキュベートした。
【０１０４】
目に見えるコロニーが存在したウェルからの細胞上清を、プロテインＡカラムで精製したｒＴＮＶ１４８Ｂヒト抗ＴＮＦから生成された標準曲線を使用するＥＬＩＳＡによりヒトＩｇＧについてアッセイした。簡潔には、ＥＩＡプレート（コスター［ＣＯＳＴＡＲ］（Ｒ））を１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃで４Ｃで一夜被覆した。１×ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（Ｗ／Ｖ））で洗浄した後、プレートを約５０μｌの９６ウェル上清の５倍希釈物とともに室温で１時間インキュベートした。プレートを１×ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で洗浄した後にアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＨおよびＬ鎖）（ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）１０９−０５５−０８８）およびその基質（シグマ［Ｓｉｇｍａ］（Ｒ）アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）１０４−１０５）を使用して、プレート上に被覆された抗Ｆｃ抗体に結合されたヒトＩｇＧを検出した。
【０１０５】
試験されたコロニーのおよそ１／３（すなわち最高の産生体）をそれらの発現レベルのさらなる定量および比較のために２４ウェルプレートに移した。細胞をＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび１×ＭＨＸ中で維持した。消耗した（ｓｐｅｎｔ）２４ウェル培養物からの上清を上述されたとおりＥＬＩＳＡによりアッセイした。最高の産生する親クローン（一次トランスフェクタント）を２４ウェルの消耗した培養物での力価に基づき同定した。
【０１０６】
７個の最高の産生するクローンをサブクローニングしてより多く産生するより均質な細胞系を同定した。９６ウェル組織培養皿にＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび１×ＭＨＸ中で５細胞／ｍｌおよび２０細胞／ｍｌで接種した。細胞をコロニーが見えるようになるまで約１４日間インキュベートした。増殖する単一コロニーが存在したウェルからの細胞上清を上述されたとおりＥＬＩＳＡによりアッセイした。より多く産生するコロニーを２４ウェル組織培養皿に移し、そして消耗した培養物からの上清をＥＬＩＳＡによりアッセイした。８クローンを最高の産生体と同定し、そしてこれらを最高に産生する第１回のサブクローンが同定された方法と同一の様式で第２回のサブクローニングにかけた。
【０１０７】
表６は選択された細胞系の抗体産生力価を示す。力価はＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中の消耗した２４ウェル上清でのＥＬＩＳＡにより測定された値を表す。力価の有意の改善は、ＩｇＧ力価が倍加した親クローン１のサブクローンを除き、第１回のサブクローンで親に比較して観察されなかった。第２回のサブクローニングは力価のいかなる実質的な増大も生じなかった。最高に産生する第２回のサブクローンのうち６個をさらなる特徴づけに選択した。従って、６個の培養物に容易な追跡のためクローン番号を割り当てた。表６は、さらなる特徴づけに選ばれた６個の第２回のサブクローンの追跡の呼称および細胞系コードを示す。
【０１０８】
【表１２】
2005512538.tif 000013
【０１０９】
化学的に定義されない培地および無血清培地中での細胞系の発展
以下の型の培地を、Ｃ５２４Ａと呼称されるＣ４６３Ａ由来のｒＴＮＶ１４８Ｂ産生細胞系の発展に関して使用した。
１．ＳＦＭ８培地：化学的に定義されない培地。この血清を含まないがしかしタンパク質を含まなくない培地はＩＭＤＭ、プリマトン［Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ］（Ｒ）（シェフィールド  プロダクツ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  Ｐｒｏｄｓ．）、イリノイ州ホフマンエステーツ）、アルブミンおよびエキサイト［Ｅｘｃｙｔｅ］（Ｒ）（バイエル（Ｂａｙｅｒ）、イリノイ州カンカキー）を含んでなる。
２．ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ培地（至適増殖培地）：化学的に定義されない培地。ＩＭＤＭは例えばＪＲＨ  バイオサイエンシーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉ．）（カンザス州レネクサ）、カタログ５１４７１から入手可能である。ウシ胎児血清は例えばインタージェン  カンパニー（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．）（ニューヨーク州パーチェース）、カタログ１０２０−０１もしくはハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）（ユタ州ローガン）、カタログＳＨ３００７１から入手可能である。
３．ＣＤＭ培地：このＣＤ培地はＳＦＭ８培地由来である。ＣＤＭ培地はプリマトン［Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ］（Ｒ）、アルブミンもしくはエキサイト［Ｅｘｃｙｔｅ］（Ｒ）（その全部がＳＦＭ８培地中に存在する）を含有しない。ＣＤＭ培地（プリマトン［Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ］（Ｒ）、アルブミンおよびエキサイト［Ｅｘｃｙｔｅ］（Ｒ）枯渇ＳＦＭ８培地）はその場合、２×最終濃度の微量元素Ａ（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、バージニア州ヘルドン、カタログ９９  １８２−Ｃ１、１０００×ストック）、２×最終濃度の微量元素Ｂ（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、カタログ９９−１７５−Ｃ１、１０００×ストック）、２×最終濃度の微量元素Ｃ（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、カタログ９９−１７６−Ｃ１、１０００×ストック）および１×最終濃度のビタミン（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、カタログ２５−０２０−Ｃ１、１００×ストック）を補充して完全なＣＤＭ培地とする。微量元素およびビタミンは動物起源の成分を含有しない。
４．ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地：インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバードにより製造されるＣＤ培地（カタログ１１２７９−０２３）。ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地は１ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３および６ｍＭの最終濃度までのＬ−グルタミンを補充した。
【０１１０】
形質転換された細胞系の増殖プロフィルおよび抗体力価を細胞系Ｃ４６６Ｄのものと比較した。Ｃ４６６Ｄはマウス骨髄腫細胞由来である別のｒＴＮＶ１４８Ｂ産生細胞系である。Ｃ４６６Ｄ細胞はＴ−フラスコおよびスピナーフラスコスケールでＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で約３０μｇ／ｍｌのＩｇＧを産生する。
【０１１１】
６個の選択した培養物をＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で拡大させた。各細胞系からの２ないし３バイアルをＣＤ培地へのウィーニング前に安全凍結物として凍結させた。拡大およびウィーニングの過程の間に各細胞系からの数個のＴ−フラスコ培養物を完全に消耗するまで（１２〜１４日）過剰増殖させるため別にした。ＩｇＧ力価を比濁法により測定してＩｇＧを産生する各クローンの能力を評価した。
【０１１２】
表７は発展の初期段階の多様な培地中の６個の第２回のサブクローンからの消耗した培養物中に存在するＩｇＧ力価を示す。ＩｇＧ力価に基づき、クローン＃２から＃４はさらなる発展から終了した。３個の残存するクローンはそれぞれＳＦＭ８培地中で１００μｇ／ｍｌを越えるＩｇＧを産生した。しかしながらＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中では、クローン＃１のみがＣ４６６Ｄにより産生された３０μｇ／ｍｌに比較して９０〜１００μｇ／ｍｌのＩｇＧを産生した。従って、Ｃコード番号Ｃ５２４Ａ、Ｃ５２５ＡおよびＣ５２６Ａをそれぞれクローン＃１、クローン＃５およびクローン＃６に割り当て、そして研究細胞バンク（ＲＣＢ）を各細胞系についてＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で作成した。
【０１１３】
【表１３】
2005512538.tif 000014
【０１１４】
ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地へのＣ４６６Ｄ細胞の移動は数回の試みにおいて失敗した。培養物は、細胞を洗浄しかつＩＭＤＭ、５％ＦＢＳからＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地に移した直後に衰えた、しかしながら、Ｃ５２４Ａ、Ｃ５２５ＡおよびＣ５２６Ａ細胞はＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中での増殖において困難を示さず、そしてＣ５２４ＡおよびＣ５２６ＡからＲＣＢを作成するためにスピナーフラスコに迅速に拡大させた。Ｃ５２４Ａ、Ｃ５２５ＡおよびＣ５２６Ａのおよその倍加時間およびＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培養物の過剰増殖させたＩｇＧ力価を表７に上に示す。
【０１１５】
Ｃ５２４ＡがＩＭＤＭ、５％ＦＢＳおよびＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中でほぼ１００μｇ／ｍｌのＩｇＧを産生したという観察結果を追跡するために、バッチ培養物型の増殖プロフィルを実施して、これらの２培養物をＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で増殖させたＣ４６６Ｄと比較した。２５０ｍｌスピナーフラスコ中の二重の培養物をＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で２×１０５ｖｃ／ｍｌ、およびＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中で３×１０５ｖｃ／ｍｌの細胞密度で接種した。各スピナーフラスコは１５０ｍｌの培地を含有し、そしてスピナー速度を６０ｒｐｍに設定した。毎日の細胞計数およびＩｇＧ力価のため各スピナーフラスコから１個の２．５ｍｌサンプルを収集した。生存率が２０パーセントより下に下落した後に培養を停止した。
【０１１６】
図４に具体的に説明されるデータは、ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地もしくはＩＭＤＭ、５％ＦＢＳいずれか中で増殖させたＣ５２４Ａ培養物が少なくともＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で増殖させたＣ４６６Ｄと同じくらい良好に増殖したことを示す。全３種の培養物の全細胞密度は２．２×１０６細胞／ｍｌから２．４×１０６細胞／ｍｌまでの範囲にわたり（図４ｃ）、また、全生存可能細胞密度は１．２×１０６細胞／ｍｌ（ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中Ｃ５２４ＡおよびＣ４６６Ｄ双方）から２．２×１０６細胞／ｍｌ（ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中Ｃ５２４Ａ）までの範囲にわたった（図４ｂ）。ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中のＣ５２４Ａは生存率が２０パーセントより上に留まった日数に基づけば他の２種より長く持続した（図４ａ）。ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地もしくはＩＭＤＭ、５％ＦＢＳいずれか中のＣ５２４Ａの最終ＩｇＧ力価は、ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中のＣ４６６Ｄにより産生された３０μｇ／ｍｌに比較して約８０μｇ／ｍｌであった。該結果はＣ５２４ＡがＣ４６６Ｄより良好なｒＴＮＶ１４８Ｂ産生細胞系であることを示す。
【０１１７】
ＣＤＭ培地へのＣ５２４Ａ、Ｃ５２５ＡおよびＣ５２６Ａの移動はＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地への移動より困難であった（Ｃ４６６ＤはＣＤＭ培地中に移動することに失敗した）。細胞は最初の２〜３継代の間増殖せず、そして生存率は約４０パーセントもしくはそれ以下に下落した。その後生存細胞を収集し、そして、生存率が約９０パーセントに復帰するまで数継代の間ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中に接種した。その後レスキューされた細胞を洗浄しかつＣＤＭ培地に再度接種した。大部分の場合に、良好な生存率（＞８０％）および３０ないし４０時間の倍加時間を伴う培養物を得る前にこの選択−レスキュー−選択過程を２ないし３回反復した。ＣＤＭ培地中のＣ５２５ＡおよびＣ５２６ＡのＩｇＧ力価は、同一培地中のＣ５２４Ａにより産生された１３０μｇ／ｍｌに比較して約６０〜７０μｇ／ｍｌのみであった。Ｃ５２４Ａ、Ｃ５２５ＡおよびＣ５２６Ａのさらなる特徴づけはＣ５２４Ａが優れた産生細胞系であることを示した。
【０１１８】
上述された増殖プロフィルのプロトコルを利用して、ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地およびＣＤＭ培地中のＣ５２４Ａの増殖プロフィルを構築してＣＤＭ培地中での高ＩｇＧ産生表現型を確認した。図５はＣ５２４Ａ細胞がＣＤＭ培地中でよりもＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中でより迅速に増殖したことを示す（図５ａ）。これらの細胞は、ＣＤＭ培地中でＣ５２４Ａが産生した１３０μｇ／ｍｌに比較して、ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中でわずか約７０μｇ／ｍｌのＩｇＧを産生した（図５ｄ）。双方の培地中のＣ５２４Ａ培養物は、最終的に同一の全細胞密度および全生存可能細胞密度に達した（図５ｂ、５ｃ）。
【０１１９】
ＲＣＢを作成した後に１０継代安定性試験を実施してＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地およびＣＤＭ培地中のＣ５２４Ａの細胞増殖およびＩｇＧ産生の安定性を検査した。各ＲＣＢからの１凍結バイアルを融解しかつＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地もしくはＣＤＭ培地いずれか中で拡大して二重のスピナーフラスコに接種した。６０ｒｐｍのスピナーフラスコ中の二重の培養物は３×１０５ｖｃ／ｍｌの接種密度を伴い１０継代の間２〜３日ごとに継代した。毎週、３×１０５ｖｃ／ｍｌで各スピナーフラスコから三重のＴ−２５フラスコを立ち上げ、そして７〜８日間過剰増殖させた。各週のＩｇＧ力価を上述されたとおり測定した。
【０１２０】
図６は、全４種の細胞培養物（ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地およびＣＤＭ培地中の二重のＣ５２４Ａ培養物）の倍加時間が２０〜３５時間の間の範囲にわたり（図６ｂ）、また、細胞の生存率は継代２と１１との間で一貫して８５ないし９０パーセントの間であった（図６ａ、６ｂ、６ｃ）ことを示す。安定性試験の終了時のＩｇＧ力価はＣＤＭ培地中でＣ５２４Ａについて開始培養物の８３パーセントであり、また、ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中のＣ５２４Ａについて９０％以上であった（図６ｄ）。
【０１２１】
これらの培養物が継代１１に達した場合に、該細胞を使用して別の増殖プロフィルのため二重のスピナーに接種した。第二の増殖プロフィルの細胞増殖は、１０継代安定性試験の開始時に実施された第一のプロフィルよりわずかにより速かった（図７ａ、７ｂおよび７ｃ）。その結果はＳＦＭ８培地中で得られたものに類似である（データは示されない）。ＳＦＭ８と対照的に、ＩｇＧ力価にわずかな減少（約１０％）が存在した。ＣＤＭ培養物およびＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培養物のＩｇＧ力価は、以前の増殖プロフィル試験からの１３０μｇ／ｍｌおよび７０μｇ／ｍｌに比較して（図５ｄ）この増殖プロフィル試験でそれぞれ約１２０μｇ／ｍｌおよび８０μｇ／ｍｌであった（図７ｄ）。
実施例２：ヒトモノクローナル抗体（ｈ−ｍＡｂ）をコードするプラスミドでのＣＤ培地中のＣ４６３Ａ細胞のトランスフェクション
ｈ−ｍＡｂ  Ｈ鎖発現ベクターを適切な制限酵素での消化により直鎖状にし、また、ｈ−ｍＡｂ  Ｌ鎖発現ベクターもまた適切な制限酵素を使用して直鎖状にする。トランスフェクション前に、Ｃ４６３ＡをＣＤ培地中で融解しそして数継代の間増殖させる。およそ１×１０７のＣ４６３Ａ細胞を電気穿孔法（２００Ｖおよび１１８０μＦ）により約１０μｇの予め混合した直鎖状プラスミドでトランスフェクトする。Ｋｎｉｇｈｔら、３０  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  １３３２（１９９３）を参照されたい。トランスフェクション段階は全部トランスフェクション前に使用したものと同一のＣＤ培地を使用して実施する。トランスフェクション後、ＣＤ培地を含む９６ウェル組織培養皿中に１×１０４細胞／ウェルの生存可能細胞密度で細胞を接種する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で約４０時間インキュベートした後に、等容量のＣＤ培地および２×ＭＨＸ選択を添加する。コロニーが目に見えるようになるまでプレートを３７℃、５％ＣＯ２で約２週間インキュベートする。
【０１２２】
トランスフェクタントのコロニーからの細胞上清を実施例１および４に記述される方法を使用して２週間後にアッセイする。ＥＬＩＳＡにより測定されるところの最高量のＩｇＧを産生するクローンをＣＤ培地を含有する２４ウェルプレートに移し、そしてＩｇＧ発現レベルのさらなる定量および比較のため拡大する。産生される抗体の量に基づき、９６ウェルプレートのウェルあたり平均で１個の細胞を接種することにより、独立したＣ４６３Ａトランスフェクタントをサブクローニングする。サブクローンにより産生される抗体の量を、個々のサブクローンのコロニーからの上清をアッセイすることにより再度測定する。至適のサブクローンをさらなる分析のため選択する。
【０１２３】
増殖曲線分析を実施例１および４に記述されるとおりＣＤ培地中で増殖させた選択した細胞系で実施し、そして至適培地中で増殖させた選択した細胞系および対照細胞系と比較する。加えて、ＣＤ培地中で増殖させた選択した細胞系の安定性試験を実施例１および４に記述されるとおり実施し、そして至適培地地中で増殖させた選択した細胞系および対照細胞系と比較する。
【０１２４】
ＣＤ培地中で増殖させた選択した細胞系によるｈ−ｍＡｂの産生は、量および質に関して、至適培地中で増殖させたかもしくは実施例１でのとおりトランスフェクトかつ維持されたかのいずれかの対照細胞系による抗体産生に匹敵する。加えて、ＣＤ培地中で増殖させた選択した細胞系は、対照細胞系と少なくとも同じくらいもしくはより長くｈ−ｍＡｂを安定に産生することが観察される。
実施例３：ｒＴＮＶ１４８Ｂの製造のためのＣ５２４Ａの商業的スケールの培養。
【０１２５】
１バイアルのＣ５２４Ａ細胞を液体窒素から取り出しかつ無菌の３７℃水浴中で融解する。その後細胞を取り出し、滅菌ＣＤ培地に入れそしてその後３７℃でスピナーフラスコ中で拡大させる。標準的な質のアッセイおよびさらなる拡大後に、細胞培養物をプールしかつ無菌的に滅菌の５００リットルもしくは１，０００リットルのバイオリアクターに導入する。滅菌ＣＤ培地を最終の所望の容量までバイオリアクターに添加し、そしてバイオリアクター系をｒＴＮＶ１４８Ｂ産生に従事させる。バイオリアクター系は、好ましくは産物を含有する培地がスピンフィルターにより篩過されかつ細胞を含有する保持液から収集される連続灌流系である。新鮮な滅菌ＣＤ培地をバイオリアクターに補給してリアクター容器中のほぼ一定の容量を維持する。温度、溶解酸素、ｐＨおよび細胞密度をモニターする。細胞密度および生存率は製造稼働の間観察し、細胞が規制当局により許容される最大倍加を経た場合もしくは生存率が２０パーセントより下に下落した場合にそれを終了する。ｒＴＮＶ１４８Ｂ産物は当該技術分野で既知の方法により精製してもよい。ｒＴＮＶ１４８Ｂの収量は平均で約５０μｇ／ｍｌから約１２０μｇ／ｍｌまでである。
実施例４：Ｃ４６３Ａ由来のヒト抗ＩＬ−１２モノクローナル抗体（ｈＩＬ−１２  ｍＡｂ）産生細胞系を製造するためのｈＩＬ−１２  ｍＡｂでのＣ４６３Ａ細胞のトランスフェクション。
【０１２６】
Ｈ鎖発現ベクターを適切な制限酵素での消化により直鎖状にし、また、Ｌ鎖発現ベクターもまた適切な制限酵素を使用して直鎖状にする。Ｃ４６３Ａ細胞を、実施例１に記述されるとおり、電気穿孔法により約１０μｇの予め混合した直鎖状プラスミドでトランスフェクトし、そして細胞を培養しかつトランスフェクタントを選択する。トランスフェクタントのコロニーからの細胞上清をおよそ２週間後にヒトＩｇＧ（すなわちｈＩＬ−１２  ｍＡｂ）についてアッセイする。簡潔には、細胞上清をヒトＩｇＧのＦｃ部分に特異的なヤギ抗体で被覆されている９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートする。被覆されたプレートに結合されるヒトＩｇＧを、記述されたところのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ鎖＋Ｌ鎖）抗体およびアルカリホスファターゼ基質を使用して検出する。
【０１２７】
より多く産生するクローンの細胞を標準培地中で２４ウェル培養皿に移しかつ拡大させる（ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１×ＭＨＸ）。産生される（すなわち消耗した培養物の培地中に分泌される）抗体の量を、精製ｈＩＬ−１２  ｍＡｂを標準として使用するＥＬＩＳＡにより慎重に定量する。その後、選択したクローンをＴ−７５フラスコ中で拡大しそしてこれらのクローンによるヒトＩｇＧの産生をＥＬＩＳＡにより定量する。これらの値に基づいて独立したＣ４６３Ａトランスフェクタントをサブクローニングし（９６ウェルプレートのウェルあたり平均で１個の細胞を接種することにより）、該サブクローンにより産生される抗体の量を個々のサブクローンのコロニーからの上清をアッセイすること（ＥＬＩＳＡ）により測定する。至適のサブクローンすなわちＣ４６３Ａトランスフェクタントをさらなる分析のため選択する。
ｈＩＬ−１２  ｍＡｂ抗原結合についてのアッセイ
選択した細胞系をサブクローニングする前に、親系統からの細胞上清を使用してｈＩＬ−１２  ｍＡｂの抗原結合の特徴を試験する。細胞上清サンプル中のｈＩＬ−１２  ｍＡｂの濃度を最初にＥＬＩＳＡにより測定する。その後、滴定（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）量の上清サンプルもしくは精製ｈＩＬ−１２  ｍＡｂ陽性対照を２μｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１２で被覆された９６ウェルプレート中でインキュベートする。その後、結合されたｍＡｂをアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ鎖＋Ｌ鎖）抗体および適切なアルカリホスファターゼ基質を用いて検出する。Ｃ４６３Ａ細胞中で産生されるｈＩＬ−１２  ｍＡｂは、好ましくは、精製ｈＩＬ−１２  ｍＡｂと識別可能な様式でヒトＩＬ−１２に特異的に結合することが観察される。
選択した細胞系の特徴づけ
Ｔ−７５フラスコにＩＭＤＭ、５％ＦＢＳもしくはＣＤ培地中の２×１０５ｖｃ／ｍｌの開始細胞密度で接種することにより、選択した細胞系で増殖曲線分析を実施する。細胞数およびｈＩＬ−１２  ｍＡｂ濃度を培養物が消耗するまで毎日モニターする。ｈＩＬ−１２  ｍＡｂでトランスフェクトしたＳｐ２／０親細胞を対照としてＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中で増殖させそして増殖曲線分析を実施する。ＣＤ培地中で増殖させた選択した細胞系によるｈＩＬ−１２  ｍＡｂ産生は、好ましくは、ｈＩＬ−１２  ｍＡｂでトランスフェクトしかつ至適培地中で増殖させたＳｐ２／０親細胞によるｈＩＬ−１２  ｍＡｂ産生に等しいかもしくはより優れていることが観察される。さらに、ＣＤ培地中で増殖させた選択した細胞系によるｈＩＬ−１２  ｍＡｂ産生は、好ましくは、至適増殖培地中で増殖させた選択した細胞系によるｈＩＬ−１２  ｍＡｂ産生に等しいかもしくはより多いことが観察される。
【０１２８】
選択した細胞系についての時間にわたるｈＩＬ−１２  ｍＡｂ産生の安定性は、ＣＤ培地もしくは至適増殖培地を含む２４ウェル皿中で細胞を変動する時間の期間培養することにより評価する。選択した細胞系によるｈＩＬ−１２  ｍＡｂの産生もまた、ｈＩＬ−１２  ｍＡｂでトランスフェクトしかつ至適培地中で増殖させたＳｐ２／０親細胞による産生と比較する。ＣＤ培地中で増殖させた選択した細胞系によるｈＩＬ−１２  ｍＡｂ産生は、質および量に関して、ｈＩＬ−１２  ｍＡｂでトランスフェクトしかつ至適培地中で増殖させたＳｐ２／０親細胞によるｈＩＬ−１２  ｍＡｂ産生に匹敵する。加えて、ＣＤ培地中で増殖させた選択した細胞系は、ｈＩＬ−１２  ｍＡｂでトランスフェクトしかつ至適培地中で増殖させたＳｐ２／０親細胞のものに匹敵する期間、安定にｈＩＬ−１２  ｍＡｂを産生する。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１ａは０時間および２４時間の細胞系Ｃ４６３Ａの融解後生存率を描く。図１ｂは、１０％ＤＭＳＯを含むＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）中で凍結／融解後のシグマ［Ｓｉｇｍａ］（Ｒ）血清およびタンパク質を含まない培地（Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＣＤ培地）ならびにＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地（ＣＤ培地）双方中で増殖させたＣ４６３Ａの増殖プロフィルを描くグラフである。図１ｂは、ＩＭＤＭ、２０％ＦＢＳ中で凍結／融解後のＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中で増殖させたＳｐ２／０親細胞の増殖プロフィルの結果を示す。
【図２】ＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中のＳｐ２／０セミバッチ培養物の増殖プロフィルに対するＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中のＣ４６３Ａセミバッチ培養物の増殖プロフィルを示すグラフである。全（ＴＣ）および生存可能細胞（ＶＣ）密度を示す。
【図３】ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ（化学的に定義されない培地）中のＳｐ２／０セミバッチ培養物の増殖プロフィルに対するＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中のＣ４６３Ａセミバッチ培養物の増殖プロフィルを具体的に説明するグラフである。第３〜７日の間の全細胞（ＴＣ）および生存可能細胞（ＶＣ）密度を示す。
【図４】ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ中のＣ４６６Ｄの増殖プロフィルに対するＩＭＤＭ、５％ＦＢＳおよびＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地の双方中の細胞系Ｃ５２４Ａの増殖プロフィルを具体的に説明する４つのグラフを提示する。図４ａはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞についての時間にわたる生存率パーセントを描く。図４ｂはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる生存可能細胞密度を具体的に説明する。図４ｃはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる全細胞密度を示す。図４ｄはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたるＩｇＧ力価を描写する。
【図５】双方ともＣＤ培地であるＣＤＭ培地およびＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中のＣ５２４Ａの増殖プロフィルを比較する４つのグラフを含有する。図５ａはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる生存率パーセントを具体的に説明する。図５ｂはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる生存可能細胞密度を示す。図５ｃはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる全細胞密度を描写する。図５ｄはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたるＩｇＧ力価を描写する。
【図６】ＣＤＭ培地およびＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地の双方中で増殖させたＣ５２４Ａの１１継代安定性試験の間に生成されたデータを表す４つのグラフを提示する。図６ａはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる生存率パーセントを示す。図６ｂはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる平均倍加時間を描写する。図６ｃはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる全細胞密度を描く。図６ｄはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたるＩｇＧ力価を具体的に説明する。
【図７】１１継代安定性試験後のＣＤ−ハイブリドーマ（ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）培地中のＣ５２４Ａの増殖プロフィルとＣＤＭ培地中のＣ５２４Ａの増殖プロフィルを比較する４つのグラフを含有する。図７ａはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる生存率パーセントを描写する。図７ｂはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる生存可能細胞密度を描く。図７ｃはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたる全細胞密度を具体的に説明する。図７ｄはスピナーフラスコ中で増殖させた細胞の時間にわたるＩｇＧ力価を示す。
【図１ａ−ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ−ｂ】
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【図４ｃ−ｄ】
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【図５ａ−ｂ】
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【図５ｃ−ｄ】
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【図６ａ−ｂ】
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【図６ｃ−ｄ】
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【図７ａ−ｂ】
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【図７ｃ−ｄ】
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【国際調査報告】
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