(57)【要約】本発明は、特に免疫調節性ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、組換え体材料およびそれらの製造方法に関するものである。上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、樹状細胞（ＤＣ）、単球またはリンパ球により開始される免疫応答が原因となるかまたは誘因的役割を演じる疾患の処置方法に関して興味深いものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１または配列番号３の配列を含むポリヌクレオチドによりコード化される単離ポリペプチド、
（ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド、
（ｃ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する単離ポリペプチド、および
（ｄ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列、および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）における上記ポリペプチドのフラグメントおよび変異型
から成る群の一つから選択される単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列を含む、請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号１または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１または配列番号３のポリヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性を有する単離ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１または配列番号３の配列を有する標識プローブまたは少なくとも１５ヌクレオチドを有するそのフラグメントでストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる少なくとも１００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を伴う単離ポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドと均等な内容のＲＮＡであるポリヌクレオチド、または上記単離ポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド配列および上記ポリヌクレオチドの変異型およびフラグメントであるかまたは上記ポリヌクレオチドとその全長にわたって相補的であるポリヌクレオチド
から成る群の一つから選択される単離ポリペプチド。
【請求項４】
（なし）
【請求項５】
（ａ）配列番号１または配列番号３のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１または配列番号３の単離ポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド
から成る群の一つから選択される、請求項３記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
発現ベクターが適合性のある宿主細胞に存在するときに請求項１記載のポリペプチドを生成し得るポリヌクレオチドを含む発現系。
【請求項７】
請求項１記載のポリペプチドを発現する、請求項６記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞またはその膜。
【請求項８】
ポリペプチドの製造に十分な条件下で請求項６記載の宿主細胞を培養し、培養培地からポリペプチドを採取する工程を含む、請求項１記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
免疫グロブリンＦｃ−領域および請求項１記載のいずれか一つのポリペプチドから成る融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドに免疫特異的な抗体。
【請求項１１】
請求項１記載のポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって、
（ａ）候補化合物に直接的または間接的に結合させた標識手段によりポリペプチド（またはポリペプチドを発現する細胞または膜）またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を定量的または定性的に測定または検出する、
（ｂ）標識競争物質の存在下におけるポリペプチド（またはポリペプチドを発現する細胞または膜）またはその融合タンパク質への候補化合物の結合の競合を測定する、
（ｃ）ポリペプチドを発現する細胞または細胞膜に適切な検出系を用いて、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害により発生されるシグナルを誘発するか否かを試験する、
（ｄ）請求項１記載のポリペプチドを含む溶液と候補化合物を混合して混合物を形成させ、混合物中におけるポリペプチドの活性を測定し、候補化合物を全く含まない対照混合物と上記混合物の活性を比較するか、または
（ｅ）例えばＥＬＩＳＡ検定法を用いて、細胞におけるポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたはポリペプチドの生成に対する候補化合物の効果を検出する、そして
（ｆ）生物工学的または化学的標準技術にしたがって上記化合物を製造する
ことから成る群から選択される方法。
【請求項１２】
配列番号２または配列番号４のポリペプチドの発現または活性に関連した病気または病気に対する感受性の診断方法であって、
（ａ）対象のゲノムにおいてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における突然変異の存在または不存在を測定し、および／または
（ｂ）対象から誘導された試料におけるポリペプチド発現の存在または量について分析する
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
この発明は、新たに同定されたポリペプチドおよび上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、診断および潜在的に治療上有用であるアゴニスト、アンタゴニストであり得る化合物の同定におけるそれらの使用、ならびにＧタンパク質共役受容体の種類に属する上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの製造に関するものである。
【０００２】
発明の背景
今や薬剤発見プロセスにおいては、それが「機能ゲノミクス」、すなわちハイスループットのゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を利用することから、根元的な変革がもたらされている。治療標的として遺伝子および遺伝子産物を同定する手段としてのこの方法は、「ポジショナルクローニング」に基づいた初期の方法に急速に取って代わっている。表現型、すなわち生物学的機能または遺伝疾患を同定し、次いでその遺伝地図の位置に基づいて責任遺伝子を突きとめる。
【０００３】
機能ゲノミクスは、ハイスループットＤＮＡ配列決定技術および現在利用可能な多くの分子生物学データベースから潜在的に興味の対象である遺伝子配列を同定するためのバイオインフォマティクスの様々なツールに大きく依存している。薬剤発見のための標的としての、さらなる遺伝子およびそれらの関連ポリペプチド／タンパク質の同定および特性確認が依然として要望されている。
【０００４】
発明の要約
本発明は、特に免疫調節性ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、組換え体材料およびそれらの製造方法に関するものである。上記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、樹状細胞（ＤＣ）、単球またはリンパ球により開始される免疫応答が原因または誘因となる役割を演じる疾患の処置方法に関して興味深いものである。上記疾患には、慢性炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患、自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症、移植拒絶発症、炎症性皮膚疾患、例えば接触過敏症またはアトピー性皮膚炎、ならびに重大な病理学的構成要素がエイズおよび癌を含め、それらにおける免疫抑制である疾患または症候群があるが、これらに限定されるわけではない。
【０００５】
以後、これらを「本発明疾患」と称す。さらなる態様において、本発明は、本発明により提供される材料を用いたアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、阻害剤）の同定、および同定された化合物による単球／マクロファージおよびＤＣまたはリンパ球遊走／活性化、免疫細胞分化の調節、サイトカイン生産、炎症性メディエーターの放出、炎症の調節、免疫応答の制御に関連した状態の処置方法に関するものである。さらに別の態様において、本発明は、慢性炎症状態、皮膚過敏反応、自己破壊的免疫応答および免疫抑制状態に至る、不適切な活性／レベルの単球／マクロファージ、ＤＣおよびリンパ球細胞遊走／活性化に伴う疾患を検出するための診断検定法に関するものである。
【０００６】
発明の記載
第一の態様において、本発明は、免疫調節性ポリペプチドに関するものである。上記ポリペプチドは、以下のものを含む：
（ａ）配列番号１または配列番号３の配列を含むポリヌクレオチドによりコード化される単離ポリペプチド、
（ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド、
（ｃ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド、
（ｄ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する単離ポリペプチド、
（ｅ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列、および
（ｆ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と比べて０.９５、０.９６、０.９７、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリペプチド配列を有するかまたは含む単離ポリペプチド、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）における上記ポリペプチドのフラグメントおよび変異型。
【０００７】
本発明のポリペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーのポリペプチドの構成員であると考えられている。以後、免疫調節性ポリペプチドの生物学的特性を、単球／マクロファージ遊走／活性化、樹状細胞分化の調節、リンパ球活性化の調節、増殖および分化、炎症の調節、サイトカイン生産および／または放出の調節、炎症促進メディエーター生産および／または放出の調節を含む「免疫モジュレーターの生物（学的）活性」または「免疫調節的活性」と称す。本発明のポリペプチドはまた、対立遺伝子形態およびスプライス変異型を全て含む、上記ポリペプチドの変異型を含む。上記ポリペプチドは、保存的または非保存的であり得る挿入、欠失および置換、またはそれらの組合せによりレファレンスポリペプチドから変化している。特に好ましい変異型は、幾つか、例えば５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、〜５、５〜３、３〜２、２〜１または１アミノ酸が何らかの組合せで挿入、置換または欠失されているものである。
【０００８】
本発明ポリペプチドの好ましいフラグメントには、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からの少なくとも３０、５０または１００連続アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドまたは配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からトランケートまたは欠失された少なくとも３０、５０または１００連続アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが含まれる。好ましいフラグメントは、単球／マクロファージ遊走／活性化の生物学的活性、以後単球／マクロファージ遊走／活性化、樹状細胞分化の調節、リンパ球活性化の調節、増殖および分化、炎症の調節、サイトカイン生産および／または放出の調節、炎症促進メディエーター生産および／または放出の調節を含む「免疫モジュレーターの生物学的活性」または「免疫調節的活性」と称される免疫調節的ポリペプチドの生物学的活性を伝達する生物活性フラグメントであり、類似活性または改良された活性を有するかまたは望ましくない活性が低減化されたものも含まれる。同じく好ましいのは、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性であるフラグメントである。
【０００９】
本発明ポリペプチドのフラグメントは、ペプチド合成による対応する完全長ポリペプチドの製造に使用され得る。したがって、これらの変異型は、本発明の完全長ポリペプチドを製造するための中間体として使用され得る。本発明ポリペプチドは、「成熟」タンパク質形態または場合によっては大型タンパク質、例えば前駆体または融合タンパク質の一部であり得る。分泌または先導配列、前駆配列、精製を促す配列、例えば多数のヒスチジン残基を含む追加的アミノ酸配列、または組換え体製造中安定させるための追加的配列を含むことが有利な場合が多い。
【００１０】
本発明ポリペプチドは、適切な方法、例えば天然に存する供給源から、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞（下記参照）からの単離により、または化学合成により、例えば自動式ペプチド合成装置を用いて、または上記方法の組合せにより製造され得る。上記ポリペプチドの製造手段は、当業界では十分に理解されている。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、免疫調節的ポリヌクレオチドに関するものである。上記ポリヌクレオチドには以下のものが含まれる：
（ａ）配列番号１または配列番号３のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１または配列番号３のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号１または配列番号３のポリヌクレオチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する単離ポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号１または配列番号３の単離ポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを有する単離ポリヌクレオチド、
（ｈ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、
（ｉ）配列番号２または配列番号４のポリヌクレオチド配列と比べて０.９５、０.９６、０.９７、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を有するかまたは含む単離ポリヌクレオチド、配列番号２または配列番号４のポリペプチド配列と比べて０.９５、０.９６、０.９７、０.９８または０.９９の同一性指数を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するかまたは含む単離ポリヌクレオチド、および上記ポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異型であるか、または上記ポリヌクレオチドとその全長にわたって相補的であるポリヌクレオチド。
【００１２】
本発明ポリヌクレオチドの好ましいフラグメントは、配列番号１または配列番号３の配列からの少なくとも１５、３０、５０または１００連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、または配列番号１または配列番号３の配列からトランケートまたは欠失された少なくとも３０、５０または１００連続ヌクレオチドを有する配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む。
【００１３】
本発明ポリヌクレオチドの好ましい変異型には、スプライス変異型、対立遺伝子変異型、および１個またはそれ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を有するポリヌクレオチドを含む多型がある。
【００１４】
本発明ポリヌクレオチドはまた、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含み、幾つか、例えば５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜３、３〜２、２〜１または１アミノ酸残基が何らかの組合せで置換、欠失または付加されたポリペプチド変異型をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、本発明ＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるポリヌクレオチドを提供する。したがって、
（ａ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むか、
（ｂ）配列番号２または配列番号４のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるか、
（ｃ）配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含むか、または
（ｄ）配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物、およびそれと相補的であるＲＮＡポリヌクレオチドである
ＲＮＡポリヌクレオチドが提供される。
【００１６】
配列番号１のポリヌクレオチド配列は、配列番号２のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。配列番号３のポリヌクレオチド配列は、配列番号４のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１のポリペプチドエンコーディング配列と同一であり得るかまたは遺伝コードの重複性（縮重）の結果として同じく配列番号２のポリペプチドをコードする配列番号１以外の配列であり得る。配列番号４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３のポリペプチドエンコーディング配列と同一であり得るかまたは遺伝コードの重複性（縮重）の結果として、同じく配列番号４のポリペプチドをコードする配列番号３以外の配列であり得る。配列番号２または配列番号４のポリペプチドは、ＧＰＣＲ−ＬＹＭＳＴとの相同性および／または構造類似性を有するＧタンパク質共役受容体ファミリーの他のタンパク質と関連している（Jensen,C.P. et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９１：４８１６−４８２０、１９９４）。
【００１７】
本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特に、それらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと類似した生物学的機能／特性を有することが予測される。さらに、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば単球／マクロファージおよびＤＣまたはリンパ球遊走／活性化、免疫細胞分化の調節、サイトカイン生産、炎症性メディエーターの放出、炎症の調節、または免疫応答の調節を伴う少なくとも一活性を有する。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、成人または胎児組織の細胞におけるｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーからの標準的クローニングおよびスクリーニング技術を用いて得られる（例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）参照）。本発明のポリヌクレオチドはまた、天然供給源、例えばゲノムＤＮＡライブラリーから入手され得るかまたは熟知された市販技術を用いて合成され得る。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドを本発明ポリペプチドの組換え体製造に使用する場合、ポリヌクレオチドは、単独での成熟ポリペプチドについてのコーディング配列、または他のコーディング配列、例えば先導または分泌配列、プレ−、またはプロ−またはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードする配列とのリーディングフレームにおける成熟ポリペプチドについてのコーディング配列を含み得る。例えば、融合ポリペプチドを精製し易くするマーカー配列がコード化され得る。本発明のこの態様のある種の好ましい実施例では、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（キアゲン、インコーポレイテッド）で提供され、Gentz et al.、Proc Natl Acad Sci USA（１９８９）８６：８２１−８２４に記載されているヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはＨＡ標識である。ポリヌクレオチドはまた、非コーディング５'および３'配列、例えば転写された非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定させる配列を含み得る。
【００２０】
配列番号１または配列番号３のポリヌクレオチド配列と同一であるか、または十分な同一性を有するポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）用プライマーとして使用され得る。上記プローブおよびプライマーは、本発明ポリペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、また配列番号１または配列番号３と高い配列類似性、典型的には少なくとも９５％の同一性を有する他の遺伝子（ヒト供給源からのパラログおよびヒト以外の種からのオーソログおよびパラログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するのに使用され得る。好ましいプローブおよびプライマーは、一般的に少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含み、少なくとも５０、さもなくば少なくとも１００ヌクレオチドを有し得る。特に好ましいプローブは、３０〜５０間のヌクレオチドを有する。特に好ましいプライマーは、２０〜２５間のヌクレオチドを有する。
【００２１】
ヒト以外の種に由来する相同体を含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号３の配列を有する標識プローブまたは好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドのそのフラグメントでストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてライブラリーをスクリーニングし、上記ポリヌクレオチド配列を含む完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含む方法により得られる。上記ハイブリダイゼーション技術は当業者には熟知されている。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５×デンハート溶液、１０％デキストランスルフェート、および２０マイクログラム／ｍｌの変性剪断サケ精液ＤＮＡを含む溶液中４２℃で一晩インキュベーションした後、０.１×ＳＳＣ中約６５℃でフィルターを洗浄する。すなわち、本発明はまた、配列番号１または配列番号３の配列を有する標識プローブまたは好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドのそのフラグメントでストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ライブラリーをスクリーニングすることにより得られる、好ましくは少なくとも１００のヌクレオチド配列をもつ単離ポリヌクレオチドを含む。
【００２２】
当業者であれば、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域は５'末端までずっと伸長しているわけではないという点で、単離ｃＤＮＡ配列は不完全であることを容易に理解できるはずである。これは、逆転写酵素、すなわち本質的に「プロセシビティー」（酵素がポリマー化反応の間鋳型に結合したままでいる能力の尺度）の低い酵素が、第一鎖ｃＤＮＡ合成中にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完成させ得ない結果である。
【００２３】
完全長ｃＤＮＡを得るか、または短いｃＤＮＡを伸長する、当業者に利用可能であり、熟知されている幾つかの方法、例えばｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）方法に基くものがある（例えば、Frohman et al.、Proc Nat Acad Sci USA ８５、８９９８−９００２（１９８８）参照）。マラトン（Marathon、登録商標）技術（クロンテック・ラボラトリーズ、インコーポレイテッド）により例証されている、最近の技術改良により、例えば、長いｃＤＮＡについての検索が著しく簡易化された。マラトン（Marathon、登録商標）技術では、ｃＤＮＡを、選択された組織から抽出したｍＲＮＡおよび各末端へライゲーションした「アダプター」配列から調製した。次いで、核酸増幅（ＰＣＲ）を実施することにより、遺伝子特異的およびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いてｃＤＮＡの「失われた」５'末端を増幅する。次いで、「内側の」プライマー、すなわち増幅生成物（典型的にはアダプター配列においてさらなる３'をアニーリングするアダプター特異的プライマーおよび既知遺伝子配列においてさらなる５'をアニーリングする遺伝子特異的プライマー）内でアニーリングするように設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を反復する。次いで、この反応の生成物をＤＮＡ配列決定により解析し、生成物を既存のｃＤＮＡに直接結合して完全配列を与えるか、または５'プライマーの設計についての新しい配列情報を用いて別々の完全長ＰＣＲを実施することにより完全長ｃＤＮＡを構築し得る。
【００２４】
本発明の組換えポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作が加えられた宿主細胞から当業界で熟知されている方法により製造され得る。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の一ポリヌクレオチドまたは複数ポリヌクレオチドを含む発現系、上記発現系により遺伝子操作が加えられた宿主細胞および組換え技術による本発明ポリペプチドの製造に関するものである。無細胞翻訳系はまた、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いて上記タンパク質を製造するのに使用され得る。
【００２５】
組換え体を製造するため、宿主細胞は、本発明ポリヌクレオチドについての発現系またはその一部を組込むように遺伝子操作が加えられ得る。ポリヌクレオチドは、多くの標準実験マニュアル、例えばDavis et al.，Basic Methods in Molecular Biology（１９８６）およびSambrook et al.（同書）に記載された方法により宿主細胞に導入され得る。
【００２６】
宿主細胞へのポリヌクレオチドの好ましい導入方法には、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、トランスベクション、顕微注入、カチオン性脂質介在トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、スクレープローディング、バリスティック（弾道）導入または感染が含まれる。
【００２７】
適切な宿主の代表例には、細菌細胞、例えばストレプトコッカス（Streptococci）、スタフィロコッカス（Staphylococci）、エシェリキア・コリ（E.coli）、ストレプトマイシス（Streptomyces）およびバシラス・サチラス（Bacillus subtilis）細胞、真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス（Aspergillus）細胞、昆虫細胞、例えばドロソフィラ（Drosophila、ショウジョウバエ）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞、動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ヒーラ、Ｃ１ ２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびボーウェス黒色腫細胞、および植物細胞がある。
【００２８】
非常に多様な発現系、例えば染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスから誘導されたベクター、ならびにそれらの組合せから誘導されたベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメントから誘導されたもの、例えばコスミドおよびファージミドが使用され得る。発現系は、発現を調節し、生じさせる制御領域を含み得る。一般的に、宿主においてポリヌクレオチドを維持、増殖または発現することによりポリペプチドを製造し得る系またはベクターであれば全て使用され得る。適切なポリヌクレオチド配列は、様々な公知の常用技術、例えばSambrook et al（上記参照）に示された技術のいずれかにより発現系に挿入され得る。適切な分泌シグナルを所望のポリペプチドへ組込むことにより、小胞体のルーメン、周辺腔または細胞外環境において翻訳されたタンパク質が分泌され得る。これらのシグナルはポリペプチドにとって内在性であり得るかまたはそれらは異種シグナルであり得る。
【００２９】
本発明ポリペプチドをスクリーニング検定法で使用するために発現させる場合、一般的にポリペプチドは細胞表面で生成されるのが好ましい。この事象において、細胞はスクリーニング検定法での使用前に採取され得る。ポリペプチドが培地へ分泌される場合、ポリペプチドを採取および精製するために培地が回収され得る。細胞内で生成される場合、ポリペプチドを採取する前に細胞をまず溶解しなければならない。
【００３０】
本発明ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知方法により組換え細胞培養物から採取および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製に使用する。細胞内合成、単離および／または精製中にポリペプチドを変性させるとき、タンパク質再生についての公知技術が活性立体配座を再生するのに使用され得る。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、関連遺伝子における突然変異の検出を通して、診断用試薬として使用され得る。ｃＤＮＡまたはゲノム配列における配列番号１または配列番号３のポリヌクレオチドを特徴とし、機能不全に関連する遺伝子の突然変異形態の検出は、遺伝子の不十分な発現、過剰発現または改変された空間的または時間的発現から生じる病気または病気に対する感受性の診断に加わるかまたはそれを明確にし得る診断ツールを提供する。遺伝子に突然変異をもつ個体は、当業界で熟知されている様々な技術によりＤＮＡレベルで検出され得る。
【００３２】
診断用の核酸は、対象の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料から入手され得る。ゲノムＤＮＡは検出に直接使用されるか、またはそれは分析前にＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ、または他の増幅技術を用いることにより酵素的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様の方法で使用され得る。欠失および挿入は、正常表現型と比べた増幅生成物のサイズの変化により検出され得る。点突然変異は、増幅ＤＮＡを標識ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全にマッチした配列は、リボヌクレアーゼ消化または融解温度の差異により区別され得る。
【００３３】
ＤＮＡ配列差異はまた、変性剤の使用または不使用下でのゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の改変により、または直接ＤＮＡ配列決定法により検出され得る（例えば、Myers et al,Science（１９８５）２３０：１２４２参照）。また、特異的な位置における配列変化は、ヌクレアーゼ保護検定法、例えばリボヌクレアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂方法により示され得る（Cotton et al,Proc Natl Acad Sci USA（１９８５）８５：４３９７−４４０１参照）。
【００３４】
免疫調節性ポリヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブまたはそのフラグメントのアレイを構築することにより、例えば遺伝子突然変異の有効なスクリーニングが実施され得る。上記アレイは、好ましくは高密度アレイまたはグリッドである。アレイ技術方法は熟知されており、一般的適用性を有し、遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性を含む分子遺伝学における様々な疑問に取組むのに使用され得る。例えば、M.Chee et al.、Science、２７４、６１０−６１３（１９９６）およびそこに引用されている他の参考文献参照。
【００３５】
また、異常に減少または増加したレベルのポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現の検出も、本発明疾患に対する対象の感受性を診断または測定するのに使用され得る。発現の減少または増加は、ポリヌクレオチドの定量について当業界で熟知されているいずれかの方法、例えば核酸増幅、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方法を用いることにより、ＲＮＡレベルで測定され得る。宿主から誘導された試料におけるタンパク質、例えば本発明ポリペプチドのレベルの測定に使用され得る検定技術は、当業者には熟知されている。上記検定方法には、ラジオイムノアッセイ、競争的結合検定法、ウエスタンブロッティング分析およびＥＬＩＳＡ検定法がある。
【００３６】
すなわち、別の態様において、本発明は、
（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列、またはそのフラグメントまたはＲＮＡ転写物、
（ｂ）（ａ）の配列と相補的であるヌクレオチド配列、
（ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２または配列番号４のポリペプチドまたはそのフラグメント、または
（ｄ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号２または配列番号４のポリペプチドに対する抗体
を含む診断キットに関するものである。
【００３７】
上記キットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は実質的な成分を構成し得るものとする。かかるキットは、病気、中でも特に本発明疾患または疾患に対する感受性の診断において有用である。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチド配列は、染色体局在性試験にとっては貴重なものである。配列は、個々のヒト染色体における特定位置に特異的にターゲッティングされ、そことハイブリダイズし得る。本発明による染色体に関連性のある配列のマッピングは、それらの配列と遺伝子関連疾患との相互関係を明らかにする上での重要な第一段階である。一旦配列が正確な染色体の位置にマッピングされると、染色体における配列の物理的位置と遺伝地図データとの相互関係が明らかにされ得る。上記データは、例えばV.McKusick、Mendelian Inheritance in Man（ジョーンズ・ホプキンズ・ユニバーシティー・ウェルチ・メディカル・ライブラリーを通じてオンラインで入手可能）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の間の関係は、連鎖分析（物理的隣接遺伝子の共遺伝）により同定される。ゲノム配列（遺伝子フラグメント等）についての正確なヒト染色体局在性は、放射線ハイブリッド（ＲＨ）マッピングを用いて測定され得る（Walter,M.Spillett、D.,Thomas,P.,Weissenbach,J.,およびGoodfellow,P.、（１９９４）「全ゲノムの放射線ハイブリッド地図の構築方法」、Nature Genetics ７、２２−２８）。若干のＲＨパネルがリサーチ・ジェネティクス（ハンツビル、アラバマ、米国）から入手され得、例としてＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ＲＨパネルが挙げられる（Hum Moi Genet １９９６年３月；５（３）：３３９−４６「ヒトゲノムの放射線ハイブリッド地図」。Gyapay G、Schmitt K、Fizames C、Jones H、Vega-Czarny N、Spilleft D、Muselet D、Prud'Homme JF、Dib C、Auffray C,Morissette J、Weissenbach J,Goodfellow PN）。このパネルを用いて遺伝子の染色体位置を決定するため、ＲＨ ＩＤＮＡにおいて興味の対象である遺伝子から設計されたプライマーを用いて９３のＰＣＲを行う。これらのＤＮＡは各々、ハムスターバックグラウンドに維持されたランダムなヒトゲノムフラグメントを含む（ヒト／ハムスターハイブリッドセルライン）。これらのＰＣＲにより、興味の対象である遺伝子のＰＣＲ産物の存在または不存在を示す９３のスコアが得られる。これらのスコアを、既知位置のゲノム配列からのＰＣＲ産物を用いて作製されたスコアと比較する。この比較は、hftp://www.genome.wi.mit.edu/で実施される。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチド配列はまた、組織発現試験用の貴重なツールである。上記試験は、組織におけるコード化されたポリペプチドの発現パターンに関する指標を与え得る本発明ポリヌクレオチドの発現パターンの決定を、それらをコードするｍＲＮＡを検出することにより可能にする。使用される技術は当業界では熟知されており、グリッド上に配置されたクローンとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術、例えばｃＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション（Schena et al、Science、２７０、４６７−４７０、１９９５およびShalon et al、Genome Res、６、６３９−６４５、１９９６）およびヌクレオチド増幅技術、例えばＰＣＲを含む。好ましい方法は、パーキン・エルマーから入手され得るＴＡＱＭＡＮ（登録商標）技術を使用する。これらの試験から得られた結果は、生物体におけるポリペプチドの正常機能の指標を提供し得る。さらに、ｍＲＮＡの正常発現パターンと同じ遺伝子の代替形態（例えば、ポリペプチドコーディングポテンシャルにおける改変または調節的突然変異を有するもの）によりコード化されたｍＲＮＡのパターンの比較試験は、疾患における本発明ポリペプチドの役割またはその不適切な発現の役割に対する貴重な洞察を提供し得る。上記の不適切な発現は、時間的、空間的または単に量的な性質を有し得る。
【００４０】
本発明ポリペプチドは、単球／マクロファージおよびＤＣまたはリンパ球遊走／活性化、免疫細胞分化の調節、サイトカイン生産、炎症性メディエーターの放出、炎症の調節または免疫応答の調節に付随し、関連した一組織および複数組織で発現される。
【００４１】
本発明のさらなる態様は抗体に関するものである。本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメント、またはそれらを発現する細胞は、本発明ポリペプチドにとって免疫特異的である抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。「免疫特異的な」の語は、本発明ポリペプチドについて抗体が有する親和力の方が、先行技術における他の関連ポリペプチドについての抗体の親和力よりも実質的に大きいことを意味する。本発明ポリペプチドに対して産生した抗体は、常用プロトコールを用いて、動物、好ましくはヒト以外の動物にポリペプチドまたはエピトープ担持フラグメント、または細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の製造については、連続セルライン培養物により抗体を産生させる技術であればいかなるものでも使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術（Kohler,G.およびMilstein,C.,Nature（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al、Immunology Today（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、７７−９６、アラン・Ｒ・リス、インコーポレイテッド、１９８５）が挙げられる。
【００４２】
一本鎖抗体の製造技術、例えば米国特許第４９４６７７８号に記載されたものもまた、この発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体の製造に適合化され得る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳類を含む他の生物体もヒト化抗体の発現に使用され得る。
【００４３】
上記抗体は、ポリペプチドを発現するクローンの単離または同定またはアフィニティークロマトグラフィーによるポリペプチドの精製に使用され得る。本発明ポリペプチドに対する抗体はまた、特に本発明疾患の処置に使用され得る。
【００４４】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、ワクチンとして使用され得る。したがって、さらなる態様において、本発明は、哺乳類における免疫学的応答の誘導方法であって、抗体産生および／または例えばサイトカイン生産性Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞の免疫応答誘導に適切である、本発明ポリペプチドを哺乳類に接種することにより、病気が個体内で既に確立されているにしてもいないにしても、動物を病気から防御することを含む方法に関するものである。哺乳類における免疫学的応答はまた、ポリヌクレオチドの発現を指令し、ポリペプチドをインビボで解読させるベクターを介して本発明ポリペプチドを送達することを含む方法により誘導され得、その結果免疫学的応答の誘導により抗体を産生させ、動物は本発明疾患から防御され得る。ベクターの一投与方法は、粒子上のコーティングとしてまたは他の手段で目的細胞へ向かってそれを加速することによるものである。上記核酸ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含み得る。ワクチンとして使用する場合、ポリペプチドまたは核酸ベクターは、通常ワクチン処方物（組成物）として提供される。さらに処方物は、適切な担体を含み得る。ポリペプチドは胃で分解され得るため、それは、好ましくは非経口的（例えば皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射）に投与される。非経口投与に適切な処方物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および処方物を受容者の血液と等張性にする溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤または増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。
【００４５】
処方物は、単位用量または多用量容器、例えば密閉アンプルおよびバイアルに製剤化され得、使用直前に滅菌液体担体を加えるだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵され得る。ワクチン処方物はまた、処方物の免疫原性を高めるアジュバント系、例えば水中油滴系および当業界で公知の他の系を含み得る。用量はワクチンの比活性により異なり、常用実験により容易に決定され得る。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、一またはそれ以上の病状、特に上記の本発明疾患における関連性を有する一つまたはそれ以上の生物学的機能を有する。したがって、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害する化合物を同定することが有用である。したがって、さらなる態様において、本発明は、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激または阻害するものを同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。上記方法は、上記本発明疾患についての治療および予防目的に使用され得るアゴニストまたはアンタゴニストを同定する。化合物は、様々な供給源、例えば細胞、無細胞調製物、化学的ライブラリー、化学的化合物のコレクションおよび天然産物の混合物から同定され得る。かくして同定された上記アゴニストまたはアンタゴニストは、場合によって、ポリペプチドの天然または修飾基質、リガンド、受容体、酵素など、その構造的または機能的ミメティクス（Coligan et al、Current Protocols in Immunology １（２）：第５章（１９９１）参照）または小分子であり得る。
【００４７】
スクリーニング方法では、候補化合物に直接的または間接的に随伴する標識手段により、ポリペプチド、またはポリペプチドを担持する細胞または膜への候補化合物またはその融合タンパク質の結合が単に測定され得る。別法として、スクリーニング方法は、標識競争物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）に対するポリペプチドへの候補化合物の競争的結合の測定または検出（定性的または定量的）を含み得る。さらに、これらのスクリーニング方法は、ポリペプチドを担持する細胞に適切な検出系を用いて、候補化合物が、ポリペプチドの活性化または阻害により発生されるシグナルを生じさせるか否かを試験し得る。活性化阻害剤は、一般的に既知アゴニストの存在下で検定され、候補化合物の存在によりアゴニストによる活性化に対する効果が観察される。さらに、スクリーニング方法には、単に本発明ポリペプチド含有溶液と候補化合物を混合して混合物を形成させ、混合物におけるＨＧＲＬ１０１活性を測定し、そして混合物のＨＧＲＬ１０１活性を、候補化合物を含まない対照混合物の場合と比較する段階が含まれ得る。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、慣用的低キャパシティースクリーニング方法および同じくハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）フォーマットで使用され得る。上記ＨＴＳフォーマットは、十分に確立された９６およびさらに最近では３８４ウェルマイクロタイタープレートの使用だけでなく、新生方法、例えばSchullek et al、Anal Biochem.、２４６、２０−２９（１９９７）により記載されたナノウェル方法を含む。
【００４９】
上記の融合タンパク質、例えばＦｃ部分および免疫調節的ポリペプチドから製造されたものはまた、本発明ポリペプチドについてのアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニング検定法で使用され得る（D.Bennett et al、J Mol Recognition、８：５２−５８（１９９５）、およびK.Johanson et al、J Biol Chem、２７０（１６）：９４５９−９４７１（１９９５）参照）。
【００５０】
スクリーニング技術
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する抗体はまた、細胞におけるｍＲＮＡおよびポリペプチドの生産に対する加えられた化合物の効果を検出するためのスクリーニング方法を設定するのに使用され得る。例えば、ＥＬＩＳＡ検定法は、当業界で公知の標準的方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細胞関連レベルを測定するために構築され得る。これは、適切な操作が加えられた細胞または組織からのポリペプチドの生産を阻害または促進し得る薬剤（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストと称される）を発見するのに使用され得る。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、当業界で公知の標準受容体結合技術を通して、膜結合または可溶性受容体がある場合にはそれらの同定に使用され得る。これらの例としては、ポリペプチドを放射性同位元素（例えば１２５Ｉ）で標識するか、化学的に修飾（例えばビオチニル化）するか、または検出または精製に適切なペプチド配列に融合させ、推定受容体供給源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液）とインキュベーションするリガンド結合および架橋検定法があるが、これらに限定はされるわけではない。他の方法には、生物物理学的技術、例えば表面プラスモン共鳴および分光法がある。これらのスクリーニング方法はまた、ポリペプチドのその受容体への結合について競争するポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストがあればそれらを同定するのに使用され得る。上記検定法の標準的実施方法は、当業界では十分に理解されている。
【００５２】
本発明ポリペプチドのアンタゴニストの例には、抗体、または場合によっては、ポリペプチドのリガンド、基質、受容体、酵素などと密接に関連した、場合によってはオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、例えばリガンド、基質、受容体、酵素などのフラグメント、または小分子があり、それらは本発明ポリペプチドに結合するが、応答を発しないため、ポリペプチドの活性を妨げないものである。
【００５３】
スクリーニング方法はまた、トランスジェニック技術および免疫調節的遺伝子を伴い得る。トランスジェニック動物の構築技法は十分に確立されている。例えば、免疫調節性遺伝子は、受精卵母細胞の雄前核への顕微注入、着床前または着床後胚へのレトロウイルス移入、または例えば電気穿孔による、遺伝子修飾された胚性幹細胞の宿主胚盤胞への注入を通して導入され得る。特に有用なトランスジェニック動物は、動物遺伝子がその動物のゲノム内でヒトの均等内容遺伝子により置き換えられた、いわゆる「ノックイン」動物である。ノックイントランスジェニック動物は、薬剤発見過程において、化合物がヒト標的にとって特異的である場合、標的を確認するのに有用である。他の有用なトランスジェニック動物は、細胞における内在性ＤＮＡ配列によりコード化される本発明ポリペプチドの動物オーソログの発現が部分的または完全に無効にされた、いわゆる「ノックアウト」動物である。遺伝子ノックアウトは、特異的細胞または組織にターゲッティングされ得、技術限界の結果としてある種の細胞または組織でのみ起こり得るか、または動物における全てまたは実質的に全ての細胞で起こり得る。トランスジェニック動物技術はまた、導入遺伝子を発現させることにより大量の本発明ポリペプチドを与える全動物発現−クローニング系を提供する。
【００５４】
上記方法で使用されるスクリーニングキットは、本発明のさらなる態様を形成する。上記スクリーニングキットは、
（ａ）本発明のポリペプチド、
（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞、
（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜、または
（ｄ）本発明のポリペプチドであって、好ましくは配列番号２または配列番号４の配列であるポリペプチドに対する抗体
を含む。いずれかの上記キットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）は実質的成分を構成し得るものとする。
【００５５】
用語
上記で頻繁に使用されているある種の用語を理解し易くするために、以下の定義を提供する。
【００５６】
本明細書で使用されている「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、１本鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物を含むＦａｂフラグメントを包含する。
【００５７】
「単離された」とは、その自然の状態から人為的に改変されたこと、すなわち天然で存する場合、それがその本来の環境から改変または除去されたか、またはその両方が行なわれたことを意味する。例えば、生きている生物体に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドでも、その自然状態の共存物質から分離されると、この語が本明細書で使用されているところの「単離された」ことになる。さらに、形質転換、遺伝子操作または他の何らかの組換え方法により生物体へ導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その生物体に依然として存在する場合でも「単離されて」いることになり、その生物体は生きている場合も生きていない場合もあり得る。
【００５８】
「ポリヌクレオチド」は、一般的にポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）をいい、それらは非修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」は、１本および２本鎖ＤＮＡ、１本および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本および２本鎖ＲＮＡ、および１本および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には２本鎖または１本および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、限定はされない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域をいう。「ポリヌクレオチド」の語はまた、１個またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡおよびバックボーンが安定性または他の理由のために修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
【００５９】
「修飾」塩基には、例えばトリチル化塩基および特異塩基、例えばイノシンが含まれる。様々な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに加えられ得る。すなわち、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に見出されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的修飾形態、ならびにウイルスおよび細胞に特有なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと称されることも多い、比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００６０】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により互いに結合された２個またはそれ以上のアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターを含むポリペプチドをいう。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖および一般にタンパク質と称される長鎖の両方をいう。ポリペプチドは、２０遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」は、自然プロセス、例えば翻訳後プロセッシングにより、または当業界で熟知されている化学的修飾技術により修飾されたアミノ酸配列を含む。上記修飾は、基本テキストおよびより詳細なモノグラフ、ならびに多数の研究文献に詳しく記載されている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのどこにでも加えられ得る。同じタイプの修飾でも、所定にポリペプチドにおける幾つかの部位で同一または異なる程度まで存在し得るものとする。また、所定のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含み得る。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、それらは分枝状形態を伴うかまたは伴わない環状であり得る。環状、分枝状および分枝状環状ポリペプチドは、翻訳後自然プロセスから生じ得るかまたは合成方法により製造され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、閉環、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在的付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化がある（例えば、Proteins‐Structure and Molecular Properties、第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman・アンド・カンパニー、ニューヨーク、１９９３；Wold,F.、Post-translational Protein Modifications：Perspectives and Prospects、１−１２、Post-translational Covalent Modification of Proteins中、B.C.Johnson編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、１９８３；Seifter et al、「タンパク質修飾および非タンパク質補因子についての解析」（Analysis of protein modifications and nonprotein cofactors）、Meth Enzymol、１８２、６２６−６４６、１９９０、およびRattan et al、「タンパク質合成：翻訳後修飾および加齢」（Protein Synthesis:Post-translational Modifications and Aging）、Ann NY Acad Sci、６６３、４８−６２、１９９２参照）。
【００６１】
ポリペプチド配列の「フラグメント」は、レファレンス配列よりも短いが、レファレンスポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチド配列をいう。ポリヌクレオチド配列の「フラグメント」は、配列番号１または配列番号３のレファレンス配列よりも短いポリヌクレオチド配列をいう。
【００６２】
「変異型」は、レファレンスポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。ポリヌクレオチドの典型的変異型は、レファレンスポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異型のヌクレオチド配列における変化は、レファレンスポリヌクレオチドによりコード化されるポリペプチドのアミノ酸配列を改変する場合もしない場合もあり得る。ヌクレオチド変化は、下記で検討されている通り、レファレンス配列によりコード化されるポリペプチドにおいてアミノ酸置換、付加、欠失、融合およびトランケートを生じさせ得る。ポリペプチドの典型的変異型は、レファレンスポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、レファレンスポリペプチドおよび変異型の配列が全体的に密接に類似しており、多くの領域で同一であるように改変は制限される。変異型およびレファレンスポリペプチドは、１個またはそれ以上の置換、挿入、欠失の何らかの組合せによりアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入アミノ酸残基は、遺伝コードによりコード化されるものである場合もされない場合もあり得る。典型的な同類置換には、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｉｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ−Ｉ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＰｈｅおよびＴｙｒがある。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異型は、天然に存する例えば対立遺伝子であり得るか、またはそれは天然に存することが知られていない変異型であり得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異型は、突然変異導入技術または直接合成により製造され得る。また、一つまたはそれ以上の翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＩＰリボシル化などを有するポリペプチドも変異型として含まれる。具体例としては、Ｎ−末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびトレオニンのリン酸化およびＣ−末端グリシンの修飾がある。
【００６３】
「対立遺伝子」とは、ゲノムにおける所定の遺伝子座で起こる遺伝子の２またはそれ以上の代替的形態の一つをいう。
【００６４】
「多型」は、集団内のゲノムにおける所定の位置でのヌクレオチド配列（および関連性がある場合、コード化されたポリペプチド配列）における変異をいう。
【００６５】
「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、集団内での、ゲノムにおける単一ヌクレオチド位置でのヌクレオチド変異性の出現をいう。ＳＮＰは、遺伝子内またはゲノムの遺伝子間領域内で出現し得る。ＳＮＰは、対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）を用いて検定され得る。このプロセスについては、少なくとも３プライマーが要求される。共通プライマーは、検定されている多型と逆相補的に使用される。この共通プライマーは、多型塩基からの５０〜１５００ｂｐ間であり得る。他の２（またはそれ以上の）プライマーは、最終３'塩基の揺らぎにより多型を構成する２（またはそれ以上の）対立遺伝子の一つとマッチすること以外は互いに同一である。次いで、２回（またはそれ以上）のＰＣＲ反応を試料ＤＮＡで実施し、各々共通プライマーおよび対立遺伝子特異的プライマーの一つを使用する。
【００６６】
本明細書で使用されている「スプライス変異型」は、最初に同じゲノムＤＮＡ配列から転写されるが、オルターナティブＲＮＡスプライシングをうけたＲＮＡ分子から製造されたｃＤＮＡ分子をいう。一次ＲＮＡ転写物がスプライシングをうけると、一般にイントロンが切除されることにより、複数のｍＲＮＡ分子を生じ、その各々が異なるアミノ酸配列をコード化し得るとき、オルターナティブＲＮＡスプライシングが起こる。スプライス変異型の語はまた、上記ｃＤＮＡ分子によりコード化されるタンパク質をいう。
【００６７】
「同一性」は、配列を比較することにより測定された、２またはそれ以上のポリペプチド配列または２またはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般に、同一性は、比較されている配列の全長にわたる、２ポリヌクレオチドまたは２ポリペプチド配列のそれぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の一致をいう。
【００６８】
「同一性％」−正確な一致が存在しない配列については、「同一性％」が測定され得る。一般に、比較すべき２配列を平行整列させることにより、配列間の最大相関関係が与えられる。これは、アラインメントの程度を高めるための、一方または両方の配列における「ギャップ」の挿入を含み得る。同一性％は、比較されている配列の各々の全長にわたって測定され得（いわゆるグローバルアラインメント）、この場合は特に同じかまたは非常に類似した長さの配列に適切であり、または短い限定された長さにわたって測定され得（いわゆるローカルアラインメント）、この場合は長さが等しくない配列により適切である。
【００６９】
「類似性」は、２ポリペプチド配列間の関係のさらなる、より精巧な尺度である。一般に、「類似性」は、比較されている（同一性についての場合と同様）配列の各々からの一つについて、残基対間の正確な一致だけでなく、正確な一致が無い場合、進化的根拠に基づいて、一残基が他方に取って代わる見込みがあるか否かをも考慮に入れた、残基１個１個に基づいた２本のポリペプチド鎖のアミノ酸間の比較を意味する。この見込みは付随した「スコア」を有し、２配列の「類似性％」がそれから測定され得る。
【００７０】
２またはそれ以上の配列の同一性および類似性の比較方法は、当業界では熟知されている。すなわち、例えば、ウィスコンシン・シーケンス・アナリシス・パッケージ、バージョン９.１（Devereux J et al、Nucleic Acids Res、１２、３８７−３９５、１９８４、米国ウィスコンシン、マディソンのジェネティクス・コンピューター・グループから入手可能）において利用可能なプログラム、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰは、２ポリヌクレオチド間の同一性％および２ポリペプチド配列間の同一性％および類似性％を測定するのに使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、SmithおよびWaterman（J Mol Biol、１４７、１９５−１９７、１９８１、Advances in Applied Mathematics、２、４８２−４８９、１９８１）の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを使用し、２配列間における最良の単一類似性領域を見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが異なる２ポリヌクレオチドまたは２ポリペプチド配列を比較するのにより適しており、短い方の配列が長い方の一部分を表すことを仮定するプログラムである。これと比べて、ＧＡＰは２つの配列を平行整列させ、NeddlemanおよびWunsch（J Mol Biol、４８、４４３−４５３、１９７０）のアルゴリズムにしたがって「最大類似性」を見出す。ＧＡＰは、ほぼ同じ長さである配列の比較に適しており、アラインメントは全長にわたって予測される。好ましくは、各プログラムで使用されるパラメーター「ギャップ・ウェイト」および「レングス・ウェイト」は、それぞれポリヌクレオチド配列については５０および３、およびポリペプチド配列については１２および４である。好ましくは、比較されている２配列が最適な形で整列されたときに、同一性および類似性％を測定する。
【００７１】
配列間における同一性および／または類似性を測定するための他のプログラムは当業界では公知であり、例えばＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Altschul S F et al、J Mol Biol、２１５、４０３−４１０、１９９０、Altschul S F et al、Nucleic Acids Res.、２５：３８９−３４０２、１９９７、米国メリーランド、ベセズダのナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＣＢＩ）から入手可能、ＮＣＢＩのホームページからwww.ncbi.nlm.nih.govでアクセス可能）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R、Methods in Enzymology、１８３、６３−９９、１９９０、Pearson W RおよびLipman D J、Proc Nat Acad Sci USA、８５、２４４４−２４４８、１９８８、ウィスコンシン・シーケンス・アナリシス・パッケージの一部として入手可能）がある。
【００７２】
好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（Henikoff SおよびHenikoff J G、Proc.Nat.Acad Sci.USA、８９、１０９１５−１０９１９、１９９２）は、ヌクレオチド配列が比較前にまずアミノ酸配列に翻訳される場合も含め、ポリペプチド配列比較で使用される。
【００７３】
好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴは、レファレンスポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関するクエリーポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の同一性％を測定するのに使用され、上記の通り、クエリーおよびレファレンス配列を最適な形に整列させ、プログラムのパラメーターをデフォルト値に設定する。
【００７４】
「同一性指数」は、候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）およびレファレンス配列の比較に使用され得る配列関連性の尺度である。すなわち、例えば、レファレンスポリヌクレオチド配列と比べて例えば０.９５の同一性指数を有する候補ポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチド配列がレファレンス配列の各１００ヌクレオチドにつき平均して５個以下の差異を含み得ること以外、レファレンス配列と同一である。上記差異は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入から成る群から選択される。これらの差異は、レファレンスポリヌクレオチド配列の５'または３'末端位置またはこれらの末端位置間におけるいずれかの場所で、レファレンス配列におけるヌクレオチド間で個々に、またはレファレンス配列内において一つまたはそれ以上の連続群で散在した形で出現し得る。言い換えれば、レファレンスポリヌクレオチド配列と比べて０.９５の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を得るためには、上記の通り、レファレンス配列における１００ヌクレオチド毎に平均５〜２５以下に対し欠失、置換または挿入、またはそれらの組合せが行なわれ得る。同じことは、必要な変更を加えて同一性指数の他の値、例えば０.９６、０.９７、０.９８および０.９９についても適用される。
【００７５】
同様に、ポリペプチドについては、例えば、レファレンスポリペプチド配列と比べて例えば０.９５の同一性指数を有する候補ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列がレファレンス配列の各１００アミノ酸につき平均して５個以下の差異を含み得ること以外、レファレンス配列と同一である。上記差異は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、同類および非同類置換を含む置換、または挿入から成る群から選択される。これらの差異は、レファレンスポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端位置またはこれらの末端位置間におけるいずれかの場所で、レファレンス配列におけるアミノ酸間で個々に、またはレファレンス配列内において一つまたはそれ以上の連続群で散在した形で出現し得る。言い換えれば、レファレンスポリペプチド配列と比べて０.９５の同一性指数を有するポリペプチド配列を得るためには、上記の通り、レファレンス配列における１００アミノ酸毎に平均５以下に対し欠失、置換または挿入、またはそれらの組合せが行なわれ得る。同じことは、必要な変更を加えて同一性指数の他の値、例えば０.９６、０.９７、０.９８および０.９９についても適用される。
【００７６】
ヌクレオチドまたはアミノ酸差異の数および同一性指数間の関係は以下の等式で表され得る：
【数１】
2005520498.tif 000002
（式中、
ｎａは、ヌクレオチドまたはアミノ酸差異の数であり、
ｘａは、配列番号１または配列番号３におけるヌクレオチド、または配列番号２または配列番号４におけるアミノ酸のそれぞれ総数であり、
Ｉは同一性指数であり、
・は掛け算の記号であり、ｘａおよびＩの積が整数ではない場合、ｘａからそれを引く前に端数を切り捨てて最も近い整数にする）。
【００７７】
「相同体」は、レファレンス配列と高度の配列関連性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を示すのに当業界で使用される総称的な語である。上記関連性は、上記の通り２配列間における同一性および／または類似性の程度を測定することにより定量され得る。「オーソログ」および「パラログ」の語は、この総称的な語に包含される。「オーソログ」は、別種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的均等内容のものであるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。「パラログ」は、機能的に類似した同種内におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。
【００７８】
「融合タンパク質」は、２種の非関連性の融合遺伝子またはそのフラグメントによりコード化されたタンパク質をいう。実例は、米国特許第５５４１０８７、５７２６０４４号に開示されている。Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−３の場合、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を用いることは、Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−３またはＰＧＰＣＲ−３のフラグメントの機能的発現を遂行することにより、治療に使用する場合にかかる融合タンパク質の薬物動態特性を改良し、二量体Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−３を生成させるのに有利である。Ｆｃ−ＰＧＰＣＲ−３ ＤＮＡ構築物は、５'〜３'方向で、分泌カセット、すなわち哺乳類細胞からの輸送を誘発するシグナル配列、融合パートナーとして、免疫グロブリンＦｃ領域フラグメントをコードするＤＮＡ、およびＦｃ−ＰＧＰＣＲ−３またはそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む。使用法によっては、機能性Ｆｃ側鎖に突然変異を導入し、融合タンパク質の残りについては無傷のままにしておくかまたは発現後Ｆｃ部分を完全に削除することにより、固有の機能特性（補体結合、Ｆｃ−受容体結合）を改変し得るのが望ましい場合もある。
【００７９】
この明細書で引用されている、限定されるわけではないが特許および特許出願を含む全ての出版物および参考文献については、個々の各出版物または参考文献が具体的で個々に示され、完全に述べられているものとして引用されて説明の一部となっているかのごとく出典明示で援用されている。この出願が優先権を主張している特許出願があれば、出版物および参考文献について上述したのと同様にそれらも出典明示で援用される。
【実施例】
【００８０】
実施例１
哺乳類細胞の発現
本発明の受容体は、ヒト胚性腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞または接着性ｄｈｆｒＣＨＯ細胞で発現される。受容体発現を最大にするため、典型的には全５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）を受容体ｃＤＮＡから除去した後、ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクターへ挿入する。細胞をリポフェクチンにより個々の受容体ｃＤＮＡでトランスフェクションし、４００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で選択する。選択の３週間後、個々のクローンを選抜し、さらなる分析用に拡大する。ベクター単独でトランスフェクションされたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞は、陰性対照としての役割を果たす。個々の受容体を安定して発現するセルラインを単離するため、約２４クローンを典型的に選択し、ノーザンブロット分析により分析する。受容体ｍＲＮＡは、一般的に分析されたＧ４１８耐性クローンの約５０％で検出され得る。
【００８１】
実施例２
結合および機能検定用リガンドバンク
６００を越える推定受容体リガンドのバンクがスクリーニング用に構築されている。このバンクは、ヒト７回膜貫通型（７ＴＭ）受容体を介して作用することが知られている伝達物質、ホルモンおよびケモカイン、ヒト７ＴＭ受容体についての推定アゴニスト、哺乳類対応物質がまだ同定されていない非哺乳類生物学的活性ペプチドであり得る天然に存する化合物、および天然では見出されないが未知の天然リガンドにより７ＴＭ受容体を活性化する化合物を含む。このバンクを用いて、機能性（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理学など、下記参照）および結合検定法の両方を用いることにより最初に既知リガンドについての受容体をスクリーニングする。
【００８２】
実施例３
リガンド結合検定法
リガンド結合検定法は、受容体薬理学の直接的確認方法を提供し、ハイスループットフォーマットに適用され得る。受容体についての精製リガンドを、結合試験用に高比活性（５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に放射性標識する。次いで、放射性標識方法がその受容体に向かうリガンドの活性を減じることのない測定を実施する。緩衝液、イオン、ｐＨおよび他のモジュレーター、例えばヌクレオチドについての検定条件は、膜および全細胞受容体供給源の両方についての実行可能なシグナル対ノイズ比を確立するように最適化される。これらの検定法については、特異的受容体結合を、全てを合計した放射能から過剰の非標識競合的リガンドの存在下で測定された放射能を引いたものとして定義する。可能な場合、複数の競合的リガンドを用いて、残留非特異的結合を特定する。
【００８３】
実施例４
アフリカツメガエル卵母細胞における機能性検定法
本発明の受容体ｃＤＮＡをコードする線状プラスミド鋳型からのキャップＲＮＡ転写物を、標準的手順にしたがってＲＮＡポリメラーゼによりインビトロで合成する。インビトロ転写物を０.２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で水に懸濁する。卵巣葉を成体雌ヒキガエルから除去し、第Ｖ期脱卵胞（defolliculated）卵母細胞を得、ＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を、顕微注入装置を用いて５０ｎｌボーラス中で注射する。２電極電圧固定法を用いて、アゴニスト暴露に応答した個々のアフリカツメガエル卵母細胞からの電流を測定する。Ｃａ２＋不含有バース培地中において室温で記録を作成する。アフリカツメガエル系は、既知リガンドおよび組織／細胞抽出物をリガンド活性化についてスクリーニングするのに使用され得る。
【００８４】
実施例５
マイクロフィジオメーター検定法
広く多様な二次メッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸が押出される。形成された酸は、主として細胞内シグナル伝達プロセスを活気づけるのに要求される代謝活性増加の結果である。細胞周囲の培地におけるｐＨ変化は非常に小さいが、サイトセンサー（ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲ）マイクロフィジオメーター（モレキュラー・ディヴァイシーズ・リミテッド、メンロパーク、カリフォルニア）により検出可能である。すなわち、サイトセンサーは、細胞内シグナル伝達経路を利用してエネルギーに結合される受容体、例えば本発明のＧ−タンパク質共役受容体の活性化を検出し得る。
【００８５】
実施例６
抽出物／細胞上清スクリーニング
現時点ではまだ同族活性化リガンド（アゴニスト）が無いままである多数の哺乳類受容体が存在する。すなわち、これらの受容体についての活性リガンドは、現在までに同定されているリガンドバンク内には含まれ得ない。
【００８６】
したがって、同じく本発明の７ＴＭ受容体を組織抽出物に対して機能的にスクリーニングする（カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理学等、機能性スクリーンを使用）ことにより、天然リガンドが同定される。
【００８７】
正の機能性応答を生じる抽出物は、活性化リガンドが単離同定されるまで連続的にさらに小分画化され得る。
【００８８】
実施例７
カルシウムおよびｃＡＭＰ機能性検定法。ＨＥＫ２９３細胞で発現される７ＴＭ受容体は、機能的に結合されることによりＰＬＣの活性化およびカルシウム動態化および／またはｃＡＭＰ刺激または阻害を誘導することが示された。受容体−トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞またはベクター対照細胞における基礎カルシウムレベルは、正常な１００ｎＭ〜２００ｎＭ範囲であることが観察された。組換え受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞にｆｕｒａ−２をローディングし、１日で１５０を越える選択されたリガンドまたは組織／細胞抽出物を、アゴニスト誘導カルシウム動態化について評価する。同様に、組換え受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を、標準ｃＡＭＰ定量検定法を用いてｃＡＭＰ生産の刺激または阻害について評価する。カルシウム一時的またはｃＡＭＰの揺らぎを呈するアゴニストをベクター対照細胞で試験することにより、応答が受容体を発現するトランスフェクション細胞に特有なものであるか否かを測定する。
【００８９】
実施例８
組織発現
プライマー設計
プライマーエクスプレス・プログラム（アプライド・バイオシステムズ）を用いるかまたは手動的に、オーファンＧＰＣＲ配列に対しプライマーを設計する。増幅手順は、定量的リアルタイム（ＴａｑＭａｎ）ＰＣＲについての最新式プロトコールに従う。各反応混合物は、１×ＴａｑＭａｎユニバーサル・マスターミックス（アプライド・バイオシステムズ）、０.２５単位の白金Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（−ギブコ）、５０ｎｇのｃＤＮＡ（プロメガ）、４５０ｎＭの各プライマー、２００ｎＭのＦＡＭ−標識ＴａｑＭａｎプローブおよび脱イオン水を２５μｌの総量で含む。ＡＢＩ７７００ ＰＣＲ器具を用いて、９６ウェルの光学反応プレート（アプライド・バイオシステムズ）でサイクリングを実施する。サイクリング条件は以下の通りであった：５０℃で２分間前活性化、１サイクル、９４℃で１０分間変性、次いで４５サイクルの９５℃１５秒間の変性、６０℃で１分間アニーリングおよび伸長。反応速度を４８８ｎｍ励起および５１８ｎｍ発光波長で記録する。
【００９０】
細胞、ＲＮＡの調製および第一鎖ｃＤＮＡ合成
ＳＮＡＰ（登録商標）抽出キット（インビトロジェン）を用い、製造業者のプロトコールにしたがってＲＮＡを細胞から調製する。使用細胞は、一次ヒト末梢血単球、ＬＰＳ、ＩＬ−１０または両方の組合せにより活性化された単球、ヒト末梢血Ｔ細胞、ＰＨＡにより活性化されたリンパ球、ヒト末梢血Ｂ細胞、抗ＣＤ４０ライゲーションにより活性化されたＢ細胞、ヒト単球由来の樹状細胞（ＤＣ）、ＬＰＳ、ＩＬ−１０またはその両方の組合せにより活性化されたＤＣである。標準手順にしたがって一次ヒト単球を水簸により単離する。標準手順にしたがってＴおよびＢ細胞を末梢血から単離する。標準プロトコールにしたがってインビトロ分化ヒト末梢血単球からヒト樹状細胞を調製する。
【００９１】
第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）で提供されている試薬およびプロトコールを用いて、第一鎖ｃＤＮＡを細胞から単離された全ＲＮＡから調製する。
【００９２】
ＲＴ−ＰＣＲ
選択された配列を、組織から誘導されたｃＤＮＡおよび上記の種々の細胞型において、製造業者のプロトコールにしたがって定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ）または半定量的ＰＣＲによりプロファイリングする。ハウスキーピング遺伝子ＥＦ１αに特異的なプライマーにより対照反応を行わせる。ＲＴ−ＰＣＲプロファイリングに使用する組織ｃＤＮＡをクロンテックから購入する。半定量的ＰＣＲでは、各反応混合物は、０.２ｍＭのｄＮＴＰ、１×１.５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＰＣＲ緩衝液、０.５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、５０ｐｍｏｌの各プライマーおよび脱イオン水を総量２５μｌで含む。使用する鋳型ｃＤＮＡは、クロンテックのパネルＩおよびIIからの組織試料から誘導された市販のｃＤＮＡ（２.５μｌ）または前項記載の細胞型から調製されたｃＤＮＡ（１μｌ）からのものである。最適に決定されたアニーリング温度によりバイオメトラ・トリオＰＣＲ機を用いて、０.２ｍｌ管でサイクリングを実施する。サイクリング条件は以下の通りである：１サイクル、９４℃で１分４５秒間変性、次いで３５サイクルの９４℃１５秒間の変性、１５秒間アニーリング、７２℃で３０秒間伸長。反応を１.５％アガロースゲルで分析し、臭化エチジウムで染色する。対照ＲＴ−ＰＣＲ反応をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに特異的なプライマーで遂行する。
【００９３】
ポリヌクレオチドＯＲＰ＿９６３１についてのプライマー配列は、配列番号５（フォワードについて）および配列番号６（リバースについて）および配列番号７（ＴａｑＭａｎプローブについて）である。組織分布を表１に示す。
【００９４】
ＰＣＲ産物の配列決定
ＰＣＲ産物をアガロースゲルから切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンゲル抽出キット（キアゲン）を用い、製造業者の使用説明書にしたがって精製する。ＰＣＲ産物を３０μｌの滅菌水中で溶離する。典型的には、増幅に使用されるプライマーの一つを用い、ＢｉｇＤｙｅターミネーター・サイクル・シーケンシング・ミックス（アプライド・バイオシステムズ）を用い、製造業者の使用説明書にしたがって、１０ｎｇの精製ＰＣＲ産物を配列決定する。配列決定反応をＡＢＩ３１０シーケンサーで解析する。
【００９５】
ノーザンブロット分析
１２レーン多組織ノーザンブロット（クロンテック）を用い、製造業者の使用説明書にしたがってノーザンブロット分析を実施する。簡単に述べると、ゲル精製ｃＤＮＡフラグメント（２５ｎｇ）を、Ｒｅａｄｉｐｒｉｍｅ標識キット（アマーシャム）を用い、製造業者の使用説明書にしたがって新しい[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰで標識した。標識プローブを５分間９５℃で変性させ、次いで使用直前５分間氷上で冷却する。ハイバイド（Hybaid）オーブンにおいて６８℃で３０分間０.１ｍｇ／ｍｌの変性ニシン精液ＤＮＡを含む５ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（クロンテック）中でプレハイブリダイゼーションを実施する。ニシン精液ＤＮＡ（０.１ｍｇ／ｍｌ）を含む新しいＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液および変性プローブによりハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーションを６８℃で約２時間遂行する。ブロットをＲＴで１０分間、２×ＳＳＣ、０.０５％ＳＤＳで４回洗浄し、続いて５０℃で２０分間０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで２回洗浄する。ブロットをプラスチック袋中に密閉し、ホスホイメージャースクリーン（モレキュラー・ダイナミクス）に一晩露光する。ストームホスホイメージャー機（モレキュラー・ダイナミクス）を用いて、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ５.０ソフトウェアで画像処理する。ブロットを０.５％ＳＤＳ中で１０分間煮沸することにより剥し、βアクチン（クロンテック）３２Ｐ標識プローブと再ハイブリダイゼーションする。
【００９６】
【表１】
2005520498.tif 000003
【００９７】
組織発現スコア
−      検出されず
＋      弱いシグナル
＋＋    良好なシグナル
＋＋＋  強いシグナル
組織発現値は、ハウスキーピング遺伝子ＥＦ１αの発現レベル（＝１０００００）に正規化された試験遺伝子Ｘの発現レベルを表す。
【００９８】
実施例９
ＢＬＡＳＴ相同性検索
同定されたかまたは推定の遺伝子ＯＲＰ＿９６３１：ＧＥＮＥＭＢＬデータベースと比較したヌクレオチドおよびアミノ酸レベルでの相同性パーセント：
‐染色体２（ＡＣ０２１０１６）からのＢＡＣクローンＲＰ１１−３７８Ａ１３、９９％同一性
【００９９】
ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースにおけるＦＡＳＴＡ相同性検索：
‐マウス胃ヒスタミンＨ２受容体（Ｐ９７２９２）、２７７ａａオーバーラップにおいて２８.５％同一性（ｚ−スコア：２５６.３）
‐ヒト胃ヒスタミンＨ２受容体（Ｐ２５０２１）、２９９ａａオーバーラップにおいて２６.４％同一性（ｚ−スコア：２４３.５）
‐ヒトスフィンゴシン−１リン酸受容体ＥＤＧ８（Ｑ９Ｈ２２８）、２９０ａａオーバーラップにおいて３０.３％同一性（ｚ−スコア：２２８.１）
‐ヒトスフィンゴシン−１リン酸受容体ＥＤＧ６（Ｏ９５９７７）、２６９ａａオーバーラップにおいて３０.５％同一性（ｚ−スコア：２２０.８）
‐ヒトスフィンゴシン−１リン酸受容体ＥＤＧ１（Ｑ９ＮＹＮ８）、２３９ａａオーバーラップにおいて２９.７％同一性（ｚ−スコア：２１６.６）
【０１００】
実施例１０
受容体ＯＲＰ＿９６３１を安定して発現するＣＨＯ−Ｋ１およびＨＥＫセルラインの発生
新規受容体ＯＲＰ＿９６３１を発現する安定したセルラインを発生させるため、プラスミドＨＥＤＧ９６３１.ｎ３１Ｄ＃５を、アンピシリン耐性遺伝子内でプラスミドを開裂する制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩを用いて線状化した。次いで、最終濃度の０.３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.０および６６％エタノールを用いて、線状化されたプラスミドを沈澱させる。遠心分離にかけ、７０％エタノールを用いて洗浄後、ＤＮＡペレットを１００μｌの水に溶かし、バイオサイジング１２０００チップ（アギレント）を用いて定量する。
【０１０１】
トランスフェクションするため、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）およびＨＥＫ（ＡＴＣＣ；ヒト胚性腎臓）細胞を、トランスフェクション前日ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地中において６ウェル培養プレート（コスター）の１ウェルにつき５×１０５細胞の細胞密度で平板培養し、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃でインキュベーションする。
【０１０２】
トランスフェクション当日、２μｇのＰｖｕＩ−線状化ＨＥＤＧ９６３１.ｎ３１Ｄ＃５プラスミドを、胎児ウシ血清および抗生物質を含まない１００μｌのＲＰＭＩ培地に加える。１０μｌのスーパーフェクト（SuperFect）トランスフェクション試薬（キアゲン、３０１３０５）をＤＮＡ溶液に加え、１０秒間渦状に攪拌後、試料を１０分間インキュベーションして複合体を形成させる。ＤＮＡ−スーパーフェクト複合体を追加の６００μｌのＲＰＭＩと混合し、次いで予めＰＢＳで１回洗浄しておいた細胞単層に移す。３時間のインキュベーション後、トランスフェクション培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄する。１０％ＦＣＳを補った新鮮なＲＰＭＩ培地を加え、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で２日間インキュベーションする。安定した形質転換体についての選別は、培地を、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ライフテクノロジーズ）を含む新しい培地と置き換えることにより行なわれる。約１２〜１４日後、選別後も生残っている個々のコロニーを拡大させ、ＦＡＣＳｔａｒ Ｐｌｕｓ細胞選別装置（ベクトン・ディッキンソン）を用いて９６ウェル細胞培養プレートの個々のウェル中へ単一細胞を選別することにより個々の細胞クローンを得る。個々のクローンは、拡大されており、適切な脂質および小分子量化合物を用いてＯＲＰ＿９６３１ｍＲＮＡの転写およびＧタンパク質結合シグナル変換について試験される。
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月26日(2004.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005520498000001.app
【国際調査報告】
2005520498.tif 000004
2005520498.tif 000005
2005520498.tif 000006
2005520498.tif 000007
2005520498.tif 000008