(57)【要約】従来の当該分野報告されているものより向上した特性を有するアンチセンス配列（デュープレックスRNAi組成物を含む）を開示する。本発明は，最適化されたアンチセンスオリゴマー組成物，並びにその生成法とインビトロ系および治療における使用法を提供する。本発明はまた，向上されたアンチセンスオリゴマー組成物の生成法および使用法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造：
【化１】
2005515780.tif 000023
［式中，
（１）Nは長さが等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，Nの配列は標的遺伝子配列に対応しており，そして
（２）XおよびYはそれぞれ独立して以下から成る群から選択される：存在しない；約1から約20ヌクレオチドの5'オーバーハング；約1から約20ヌクレオチドの3'オーバーハング；および約4から約20ヌクレオモノマーから成るループ構造（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）］
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項２】
以下の構造：
【化２】
2005515780.tif 000024
［式中，
（１）oligoAはある数のヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチドであり；
（２）oligoBはoligoAと同数のヌクレオモノマーを有し，oligoAに相補的であるオリゴヌクレオチドであり；
（３）oligoAまたはoligoBのいずれかは標的遺伝子配列に対応しており；
（４）Xは以下から成る群から選択され：（ａ）存在しない；（ｂ）oligoAの5'末端に共有結合して5'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；（ｃ）oligoBの3'末端に共有結合して3'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；および（ｄ）oligoBの3'末端とoligoAの5'末端に共有結合してループ構造を構成する約4から約20ヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチド（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）；そして
（５）Yは以下から成る群から選択される：（ａ）存在しない；（ｂ）oligoBの5'末端に共有結合して5'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；（ｃ）oligoAの3'末端に共有結合して3'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；および（ｄ）oligoAの3'末端とoligoBの5'末端に共有結合してループ構造を構成する約4から約20ヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチド（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）］
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項３】
デュープレックスの各鎖中のヌクレオモノマーの数が約12から約40の間である，請求項１記載の組成物。
【請求項４】
oligoAおよびoligoBの各鎖中のヌクレオモノマーの数が約12から約40の間である，請求項２記載の組成物。
【請求項５】
デュープレックスの各鎖中のヌクレオモノマーの数が約27である，請求項１記載の組成物。
【請求項６】
oligoAおよびoligoBの各鎖中のヌクレオモノマーの数が約27である，請求項２記載の組成物。
【請求項７】
Xがループを形成する約4から約20ヌクレオモノマーの配列であり，ヌクレオモノマーがGおよびAから成る群から選択される，請求項１記載の組成物。
【請求項８】
XまたはYがループを形成する約4から約20ヌクレオモノマーの配列であり，ヌクレオモノマーがGおよびAから成る群から選択される，請求項２記載の組成物。
【請求項９】
２つの隣接するNが結合していない，請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
ループのヌクレオチド配列がGAAAである，請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
以下の構造：
5'−(Z)2-8-(N)15-40-(M)2-8−3'
3'−(Z)2-8-(N)15-40-(M)2-8−5'
［式中，
（１）N，Z，およびMはそれぞれ独立してヌクレオモノマーであり；
（２）Nの配列はいずれも約15から約40ヌクレオモノマーを有する長さの等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖であり；
（３）Nの配列の少なくとも１つは，場合により隣接するMまたはZの一部または全部と共に，標的遺伝子配列に対応しており；
（４）Zの配列はいずれも約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖であり；そして
（５）Mの配列はいずれも約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖である］
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１２】
ZおよびMヌクレオモノマーがそれぞれCおよびGから成る群から選択される，請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
ZまたはMの配列がCC，GG，CG，GC，CCC，GGG，CGG，GCC，GCG，CGC，CGGG，GCCC，CCCC，GGGG，GCGC，CGCG，GGGC，CCCG，CGGG，GCCC，GGCC，またはCCGGである，請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
以下の構造：
【化３】
2005515780.tif 000025
［式中，
（１）Nは長さが等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，Nの配列は標的遺伝子配列に対応しており；
（２）Xは以下から成る群から選択され：存在しない；1-20ヌクレオチドの5'オーバーハング；1-20ヌクレオチドの3'オーバーハング；約4から約20ヌクレオモノマーから成るループ構造（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）；そして，
（３）Mは，場合により標的配列に対応していてもよい，約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーである］
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１５】
以下の構造：
【化４】
2005515780.tif 000026
［式中，
（１）oligoAは5'−(N)15-40-(M)2-8−3'，oligoBは5'−(N)15-40-(M)2-8−3'であり（ここでNおよびMはそれぞれ独立してヌクレオモノマーである）；
（２）Nの配列はいずれも約15から約40ヌクレオモノマーを有する長さの等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖であり；
（３）Nの配列の少なくとも１つは，場合により隣接するMの一部または全部と共に，標的遺伝子配列に対応しており；
（４）Xは以下から成る群から選択され：（ａ）存在しない；（ｂ）oligoAの5'末端に共有結合して5'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；（ｃ）oligoBの3'末端に共有結合して3'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；および（ｄ）oligoBの3'末端とoligoAの5'末端に共有結合してループ構造を構成する約4から約20ヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチド（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）；そして
（５）Mの配列はいずれも約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖である］
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１６】
MヌクレオモノマーがCおよびGから成る群から選択される，請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
Mの配列がCC，GG，CG，GC，CCC，GGG，CGG，GCC，GCG，CGC，CGGG，GCCC，CCCC，GGGG，GCGC，CGCG，GGGC，CCCG，CGGG，GCCC，GGCC，またはCCGGである，請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
以下の構造：
【化５】
2005515780.tif 000027
［式中，
（１）Nは長さが等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，標的遺伝子配列に対応しており；
（２）Yは以下から成る群から選択され：存在しない；1-20ヌクレオチドの5'オーバーハング；1-20ヌクレオチドの3'オーバーハング；約4から約20ヌクレオモノマーの配列から成るループ構造（ここでヌクレオモノマーは全てGまたはAである）；そして，
（３）Zは約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，場合により標的配列に対応する配列を含んでいてもよい］
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１９】
以下の構造：
【化６】
2005515780.tif 000028
［式中，
（１）oligoAは5'−(Z)2-8-(N)12-40−3'，oligoBは5'−(Z)2-8-(N)12-40−3'であり（ここでNおよびZはそれぞれ独立してヌクレオモノマーである）；
（２）Nの配列はいずれも約12から約40ヌクレオモノマーを有する長さの等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖であり；
（３）Nの配列の少なくとも１つは，場合により隣接するZの一部または全部と共に，標的遺伝子配列に対応しており；
（４）Yは以下から成る群から選択され：（ａ）存在しない；（ｂ）oligoBの5'末端に共有結合して5'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；（ｃ）oligoAの3'末端に共有結合して3'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；および（ｄ）oligoBの5'末端とoligoAの3'末端に共有結合してループ構造を構成する約4から約20ヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチド（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）；そして
（５）Zの配列はいずれも約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖である］
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項２０】
ZヌクレオモノマーがCおよびGから成る群から選択される，請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
Zの配列がCC，GG，CG，GC，CCC，GGG，CGG，GCC，GCG，CGC，CGGG，GCCC，CCCC，GGGG，GCGC，CGCG，GGGC，CCCG，CGGG，GCCC，GGCC，またはCCGGである，請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
細胞における遺伝子発現を調節する方法であって，細胞を請求項１記載の二本鎖デュープレックスオリゴヌクレオチド組成物と接触させ，それによって細胞における遺伝子発現を調節することを含む上記方法。
【請求項２３】
アンチセンス配列のヌクレアーゼ耐性を向上する方法であって，二本鎖デュープレックスが生成するように請求項１記載の二本鎖オリゴヌクレオチド組成物を形成することを含み，アンチセンス配列のヌクレアーゼ耐性が対照組成物と比較して増加していることを特徴とする上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本明細書は米国仮出願第60/353,203号（2002年2月1日出願），第60/436,238号（2002年12月23日出願），および第60/438,608号（2003年1月7日出願）に基づく優先権を主張する。本明細書はまた，米国仮出願第60/353,381号（2002年2月1日出願）に基づく優先権も主張する。上記出願の全内容は明確に参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
相補的オリゴヌクレオチド配列は有望な治療薬であり，遺伝子機能の解明における有用な研究手段である。しかしながら，従来技術によるオリゴヌクレオチド分子は多くの場合，生態系に適用するとヌクレアーゼ分解を受ける。従って，それらの組成物を使用して遺伝子発現（蛋白質合成を含む）の有効な阻害を行うことは，しばしば困難である。
【０００３】
目的とする配列に相補的なオリゴヌクレオチドの有用性，例えば潜在的な治療活性およびインビトロでの有用性を最大限にするために，従来技術のオリゴヌクレオチドに改良を加えて，血清ヌクレアーゼおよび細胞ヌクレアーゼ，そして他の体液に見られるヌクレアーゼのいずれに対しても高い安定性を有するように改良されたオリゴヌクレオチドを設計することは非常に有益である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
本発明は，少なくとも一部は，アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび保護オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドが遺伝子機能を阻害する能力を有するという発見に基づいている。このように，本発明は特に細胞ヌクレアーゼによる分解に耐性のあるオリゴヌクレオチドを提供することによって，従来技術のアンチセンス配列を改善する。
【０００５】
従って，本発明は最適化したオリゴヌクレオチド組成物，並びにその合成法，そしてインビトロおよびインビボ系の両方における（例えば治療的）使用法を提供する。
【０００６】
ある観点では，本発明は以下の構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物に関する：
【化７】
2005515780.tif 000002
［式中，（１）Nは長さが等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，Nの配列は標的遺伝子配列に対応しており，（２）ＸおよびＹは以下の群からそれぞれ独立して選択される：存在しない；約１から約２０ヌクレオチドの5'オーバーハング；約１から約２０ヌクレオチドの3'オーバーハング；および約４から約２０ヌクレオモノマーから成るループ構造（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）］。
【０００７】
“オーバーハング”は二本鎖オリゴヌクレオチド分子の5'-または3'-ヒドロキシル末端上の相対的に短い１本鎖ヌクレオチド配列である（“伸長鎖”，“突出末端”，または“接着末端”とも呼ばれる）。
【０００８】
１つの態様においては，デュープレックスの各鎖のNの数は約１２から約５０の間である（すなわち上記の図中，オリゴ（N）は約１２から約５０のヌクレオモノマーを有する）。他の態様では，デュープレックスの各鎖のNの数は約１２から約４０；もしくは約１５から約３５；または更に特定すれば約２０から約３０；あるいは約２１から約２５である。
【０００９】
１つの態様においては，Ｘはループを形成する約４から約２０ヌクレオモノマーの配列であり，ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される。
【００１０】
１つの態様においては，Nのうち２つは未結合である，すなわち２つのヌクレオモノマー間にはホスホジエステル結合が存在しない。１つの態様においては，未結合のNはアンチセンス配列中に存在しない。
【００１１】
１つの態様においては，ループのヌクレオチド配列はGAAAである。
【００１２】
別の態様においては，本発明は以下の構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物に関する：
【化８】
2005515780.tif 000003
［式中，（１）Nは長さが等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであって，Nの配列は標的遺伝子配列に対応しており；（２）Zは約２から約８ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，Zの配列は場合により標的配列に対応していてもよく；そして（３）Mは約２から約８ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，Mの配列は場合により標的配列に対応していてもよい。Nヌクレオモノマーの配列は等しい長さであるべきであるが，ZおよびMヌクレオモノマーの配列は場合により等しい長さであってもよい］。
【００１３】
１つの態様においては，ZおよびMはCおよびGから成る群から選択されるヌクレオモノマーである。
【００１４】
１つの態様においては，ZまたはMの配列はCC，GG，CG，GC，CCC，GGG，CGG，GCC，GCG，CGC，CGGG，GCCC，CCCC，GGGG，GCGC，CGCG，GGGC，CCCG，CGGG，GCCC，GGCC，またはCCGGである。
【００１５】
別の観点では，本発明は以下の構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物に関する：
【化９】
2005515780.tif 000004
［式中，（１）Nは長さが等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，Nの配列は標的遺伝子配列に対応しており，（２）Ｘは以下から成る群から選択される：存在しない；１-２０ヌクレオチドの5'オーバーハング；１-２０ヌクレオチドの3'オーバーハング］。
【００１６】
１つの態様においては，Xは約４から約２０ヌクレオモノマーから成るループ構造であり，ここで，ヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される。
【００１７】
上記の構造中，Mは約２から約８ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，場合により標的配列に対応していてもよい。１つの態様においては，MはCおよびGから成る群から選択されるヌクレオモノマーである。
【００１８】
１つの態様においては，Mの配列はCC，GG，CG，GC，CCC，GGG，CGG，GCC，GCG，CGC，CGGG，GCCC，CCCC，GGGG，GCGC，CGCG，GGGC，CCCG，CGGG，GCCC，GGCC，またはCCGGである。
【００１９】
別の観点では，本発明は以下の構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物に関係する：
【化１０】
2005515780.tif 000005
［式中，（１）Nは長さが等しい相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，これは標的遺伝子配列に対応しており，（２）Ｙは以下から成る群から選択され：存在しない；１-２０ヌクレオチドの5'オーバーハング；１-２０ヌクレオチドの3'オーバーハング；約４から約２０ヌクレオモノマーの配列からなるループ（ここで，ヌクレオモノマーは全てGまたはAのいずれかである），そして（３）Zは約２から約８ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，場合により標的配列に対応してもよい配列を含む］。
【００２０】
１つの態様においては，ZはCおよびGから成る群から選択されるヌクレオモノマーである。
【００２１】
１つの態様においては，Zの配列はCC，GG，CG，GC，CCC，GGG，CGG，GCC，GCG，CGC，CGGG，GCCC，CCCC，GGGG，GCGC，CGCG，GGGC，CCCG，CGGG，GCCC，GGCC，またはCCGGである。
【００２２】
別の観点では，本発明は細胞中の遺伝子発現を調節する方法に関し，この方法は，ここに記載する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物を形成し，そして細胞を同二本鎖デュープレックスと接触させ，このことにより細胞中の遺伝子発現を調節することを含む。
【００２３】
１つの態様においては，本発明はアンチセンス配列のヌクレアーゼ耐性を向上する方法に関し，この方法は，二本鎖デュープレックスが形成されるようにここに記載する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物を形成することを含み，ここでアンチセンス配列のヌクレアーゼ耐性は未修飾の二本鎖RNA分子に比較して向上されている。
【００２４】
少なくとも３つの異なるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド組成物を形成することにより，オリゴヌクレオチド，特にアンチセンスオリゴヌクレオチドを安定化する方法は共出願中の米国特許出願（本出願と同日に出願。代理人書類番号“SRI-013”を有する。表題：“Oligonucleotide Compositions with Enhanced Efficiency”）に開示されている。この出願およびその記載内容の全ては，参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は，インビトロおよびインビボ（例えば治療的に）の両方での使用のための二本鎖オリゴヌクレオチド組成物を提供し，同二本鎖アンチセンスオリゴマー組成物を生成および使用する方法を提供することによって，従来の技術を向上させるものである。
【００２６】
二本鎖オリゴヌクレオチド組成物
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド組成物は標的遺伝子にコードされる標的蛋白質の合成を阻害する能力を有する。標的遺伝子は細胞内因性または外因性（例えばウイルスまたは組換えDNA技術の使用によって細胞内に導入したもの）であってもよい。ここで使用する“標的遺伝子”という用語は以下を含む：ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド，または複製，転写，翻訳，もしくは標的蛋白質の発現に重要な他の過程を調節するポリヌクレオチド領域；標的ポリペプチドをコードする領域および標的ポリペプチドの発現を調節する領域を含むポリヌクレオチド；または5'もしくは3'UTRまたはイントロンのような非コード領域。従って，ここで使用する“標的遺伝子”という用語は，例えば目的とする遺伝子の転写によって生成されるmRNA分子も表しうる。更に，“オリゴマーは標的遺伝子配列に対応する”というような“対応する”という用語は，２つの配列が相補的もしくは相同であること，または互いに（例えばヌクレオモノマーの配列およびそれらの塩基対形成特性に基づいた）他の生物学的に合理的な関係を有することを意味する。
【００２７】
本発明のRNA分子が向けられる“標的遺伝子”は病的状態に関係してもよい。例えば遺伝子は病因に関係する遺伝子，例えばウイルス遺伝子，腫瘍関連遺伝子，または自己免疫疾患関連遺伝子であってもよい。標的遺伝子は組換え細胞または遺伝子的に改変した生体で発現した非相同遺伝子であってもよい。それらの遺伝子の機能を測定または調節（例えば阻害）することによって，医学，獣医学，および生物学における貴重な情報および治療的利益が得られうる。
【００２８】
“オリゴヌクレオチド”という用語は，結合（例えばホスホジエステル）または置換結合によって互いに共有結合した２つ以上のヌクレオモノマーを含む。１つの態様においては，デュープレックス構造を形成する１本鎖核酸分子を使用することが望ましいであろう（例えば以下に詳細を記載する）。例えば１つの態様においては，オリゴヌクレオチドはセンスまたはアンチセンス配列中にニックを含んでもよい。
【００２９】
“アンチセンス”という用語は，転写に関してその正常な方向と逆のヌクレオチド配列を言い，これはホスト細胞内で発現される標的遺伝子mRNA分子に相補的なRNA転写物を発現する（例えばこれはワトソン-クリック塩基対形成によって標的遺伝子のmRNA分子にハイブリダイズできる）。アンチセンス鎖は，標的遺伝子の発現に干渉する能力を有する限り，多くの異なる方法で構築してもよい。例えば，標的遺伝子のコード領域（またはその一部）を転写に関してその正常な方向と逆転させてアンチセンス鎖を構築し，その相補鎖を転写させることができる（例えばアンチセンスおよびセンス遺伝子にコードされるRNAは相補的であってもよい）。更に，アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は標的遺伝子と同じイントロンまたはエクソンパターンを有する必要はなく，また，標的遺伝子の非コードセグメントは標的遺伝子発現のアンチセンス抑制を行うのに，コードセグメントと同等に有効でありうる。
【００３０】
従って本発明のある観点は，RNAi物質のdsRNA成分が遺伝子にターゲティングされるように細胞内にRNAi物質を導入することによって，標的遺伝子の活性を阻害する方法である。１つの態様においては，RNAオリゴヌクレオチド分子は修飾されたヌクレオチド類似体であるヌクレオモノマーを少なくとも１つ含んでもよい。ヌクレオチド類似体は，標的特異的活性（例えばRNAiが介在する活性）が実質的に影響を受けない位置（例えば二本鎖分子の5'末端または3'末端の領域）にあってもよく，修飾されたヌクレオチド類似体を導入することによってオーバーハングを安定化してもよい。
【００３１】
別の観点では，当該分野で知られる二本鎖RNA分子を本発明の方法に使用することができる。当該分野で知られる二本鎖RNA分子を，それらの方法と合わせてここでの記載に従って，例えば修飾したヌクレオモノマーを使用して，修飾してもよい。例えば以下を参照されたい：米国特許第6,506,559号；米国特許第2002/0,173,478号；米国特許出願第2002/0,086,356号；Shueyら, "RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention." Drug Discov. Today 2002 Oct 15;7(20):1040-6；Aokiら, "Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2003 Jan;30(1-2):96-102；Ciocaら, "RNA interference is a functional pathway with therapeutic potential in human myeloid leukemia cell lines." Cancer Gene Ther. 2003 Feb;10(2):125-33。
【００３２】
二本鎖RNA分子の更なる例には以下の文献に開示されるものがある：Kawasakiら, "Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells." Nucleic Acids Res. 2003 Jan 15;31(2):700-7; Cottrellら, "Silence of the strands: RNA interference in eukaryotic pathogens." Trends Microbiol. 2003 Jan;11(1):37-43; Links, "Mammalian RNAi for the masses."  Trends Genet. 2003 Jan;19(1):9-12; Hamadaら, "Effects on RNA interference in gene expression (RNAi) in cultured mammalian cells of mismatches and the introduction of chemical modifications at the 3'-ends of siRNAs." Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002 Oct;12(5):301-9; Links, "RNAi and related mechanisms and their potential use for therapy." Curr. Opin. Chem. Biol. 2002 Dec;6(6):829-34; Kawasakiら, "Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA(Val) promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells." Nucleic Acids Res. 2003 Jan 15;31(2):700-7。
【００３３】
ニックはオリゴヌクレオチド中の２つの非結合ヌクレオモノマーである。ニックはセンスまたはアンチセンスヌクレオチド配列沿いのいずれかの位置に含まれる。好ましい態様では，ニックはセンス配列中に存在する。別の好ましい態様では，ニックはオリゴヌクレオチドのデュープレックス領域の末端から少なくとも約４ヌクレオモノマーである（例えばオリゴヌクレオチドの5'もしくは3'末端から，またはループ構造から少なくとも約４ヌクレオモノマー離れて存在する）。例えば１つの態様においては，ニックはデュープレックス分子のセンス鎖の中央に存在する（例えばデュープレックスのセンス配列が３０ヌクレオモノマー長である場合，ヌクレオモノマー１４および１５，または１５および１６が未結合である）。１つの態様においては，場合によりニックをライゲートして環状核酸分子を形成してもよい。
【００３４】
例えば以下の構造においては，表示されるUヌクレオモノマーは隣接するヌクレオモノマーと，例えばホスホジエステル結合によって，結合していない。場合によりニックの5'OHをホスホリル化し，オリゴヌクレオチドを酵素的にライゲートして環状とさせてもよい。
【００３５】
【化１１】
2005515780.tif 000006
ここで使用する“ヌクレオチド”という用語は，糖部分（ペントース），リン酸，および窒素ヘテロ環塩基を含有するDNAまたはRNAの単量体ユニットを含む。塩基は通常，グリコシド炭素を介して（ペントースの1'炭素で）糖部分に結合しており，この塩基と糖の組み合わせを“ヌクレオシド”と呼ぶ。ヌクレオチドは４つの慣例的なDNA塩基，アデニン（A），グアニン（G），シトシン（C），およびチミン（T）で特徴づけられる。イノシン（I）は４つの天然に存在する塩基（A，C，G，またはT）のいずれの代替としても使用できる合成塩基の例である。４つのRNA塩基はA，G，C，およびウラシル（U）である。従ってオリゴヌクレオチドは，隣接するペントースの3'および5'炭素間のホスホジエステル結合によって結合した，直線に配列されたヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であってもよい。他の修飾型ヌクレオシド／ヌクレオチドをここに記載するが，それらを本発明のオリゴヌクレオチドに使用してもよい。
【００３６】
オリゴヌクレオチドは，例えばオリゴヌクレオチド，オリゴヌクレオシド，ポリデオキシリボヌクレオチド（2'-デオキシ-D-リボースを含む）もしくはそれらの修飾型，例えばDNA，ポリリボヌクレオチド（D-リボースまたはその修飾型を含む），RNA，あるいは，プリンもしくはピリミジン塩基または修飾型プリンもしくはピリミジン塩基のN-グリコシドまたはC-グリコシドである他の型のポリヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドという用語は，隣接するヌクレオモノマーがホスホロチオエート，アミド，または他の結合を介して結合する組成物を含む（例えばNeilsen, P.E.ら, 1991. Science. 254:1497）。一般に，“結合”という用語は，例えばリガーゼのような酵素で触媒される，２つ以上の核酸成分間の物理的連結，好ましくは共有結合を表す。
【００３７】
“オリゴヌクレオチド”という用語は，その当該分野で認識される意味（例えば，相対的に短い１本鎖または二本鎖の，ホスホジエステル結合を介して結合したデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列）に加え，オリゴヌクレオチドの塩基の足場または支持体の役割を果たす構造を含み，この足場によって配列依存的に標的核酸分子への結合が可能となる。
【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドを単離する。“単離された”という用語は（例えば化学的に，酵素的に，または組換えによって）合成した，または天然に存在するが天然の核酸源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を含む。好ましくは，天然に存在する“単離された”核酸分子は，同核酸分子が由来する生体中の核酸分子中で，同核酸分子が天然に隣接する配列（すなわち同核酸分子の5'および3'末端に位置する配列）を含有しない。
【００３９】
“ヌクレオモノマー”という用語は，第２の部分に共有結合した１つの塩基を含む。ヌクレオモノマーには，例えばヌクレオシドおよびヌクレオチドがある。ヌクレオモノマーを結合させて配列特異的に標的核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドを生成することができる。
【００４０】
１つの態様においては，修飾型（非天然型）ヌクレオモノマーをここに記載するオリゴヌクレオチドに使用することができる。例えば，塩基（プリン，ピリミジン，およびそれらの誘導体および類似体）に基づくヌクレオモノマーを置換型および未置換型シクロアルキル部分（例えばシクロヘキシルまたはシクロペンチル部分）および置換型および未置換型複素環部分（例えば６員環モルホリノ部分）を，好ましくは糖部分に結合させる。
【００４１】
糖部分には天然の修飾されていない糖（例えば単糖（例えばペントース，例えばリボース，デオキシリボース）），修飾された糖，および糖類似体がある。ヌクレオモノマー，特に糖の可能な修飾には，例えば１つ以上の水酸基のハロゲン，ヘテロ原子，脂肪族基での置換，または水酸基のエーテル，アミン，チオールなどとしての機能化がある。修飾型ヌクレオモノマーの特に有用な基は2'-O-メチルヌクレオチドであり，これは特に2'-O-メチルヌクレオチドをオリゴマー末端のヌクレオモノマーとして使用する場合に有用である。それらの2'-O-メチルヌクレオチドを“メチル化された”と呼んでもよく，対応するヌクレオチドは，メチル化されていないヌクレオチドから生成した後アルキル化するか，またはメチル化したヌクレオチド試薬から直接生成してもよい。修飾型ヌクレオモノマーを未修飾型ヌクレオモノマーと組み合わせて使用してもよい。例えば本発明のオリゴヌクレオチドはメチル化および未メチル化ヌクレオモノマーの両方を含有してもよい。
【００４２】
修飾型ヌクレオモノマーの例には糖または骨格を修飾したリボヌクレオチドがある。修飾型リボヌクレオチドは以下のような天然に存在しない塩基（天然に存在する塩基の代わりに）を含有してもよい：5-位で修飾したウリジンまたはシチジン（例えば5-（2-アミノ)プロピルウリジンおよび5-ブロモウリジン）；8-位で修飾したアデノシンおよびグアノシン（例えば8-ブロモグアノシン）；デアザヌクレオチド（例えば7-デアザ-アデノシン）；およびN-アルキル化ヌクレオチド（例えばN6-メチルアデノシン）。また，糖修飾型リボヌクレオチドはH，アルコキシ（またはOR），Rもしくはアルキル，ハロゲン，SH，SR，アミノ（例えばNH2，NHR，NR2），またはCN基で置換した2'-OH基を有してもよく，ここでRは低級アルキル，アルケニル，またはアルキニルである。
【００４３】
修飾型リボヌクレオチドは，（例えばホスホチオエート基の）修飾された基で置換された隣接するリボヌクレオチドに結合したホスホエステル基を有してもよい。更に一般的には，種々のヌクレオチドに修飾を組み合わせてもよい。
【００４４】
１つの態様においては，センスオリゴマーは末端に2'修飾を有してもよい（各末端の１つ，各末端の２つ，各末端の３つ，および各末端の４つなど；同様に，一方の末端の１つ，一方の末端の２つ，一方の末端の３つ，および一方の末端の４つなど；更に，一方の末端の１つおよび他方の末端の２つなどのような不均衡な組み合わせ）。同様に，アンチセンス鎖は末端に2'修飾を有してもよい（各末端の１つ，各末端の２つ，各末端の３つ，および各末端の４つなど；同様に，一方の末端の１つ，一方の末端の２つ，一方の末端の３つ，および一方の末端の４つなど；更に，一方の末端の１つおよび他方の末端の２つなどのような不均衡な組み合わせ）。好ましい観点では，それらの2'-修飾はセンスRNA鎖またはアンチセンス鎖以外の配列中に存在する。
【００４５】
エンドおよびエキソヌクレアーゼ耐性を更に最大限にするため，末端への2'修飾型ヌクレオモノマーの使用に加え，ホスホジエステル以外のヌクレオモノマー間結合を使用してもよい。例えばそれらの末端のブロックを単独で，または2'-O-メチル結合間のホスホロチオエート結合と合わせて使用してもよい。好ましい2'-修飾型ヌクレオモノマーは2'-修飾型CおよびU塩基である。
【００４６】
アンチセンス鎖は標的遺伝子（単数または複数）の少なくとも一部と，少なくとも塩基対形成特性の点で実質的に同一であってもよいが，（例えば標的遺伝子の表現型の発現を阻害するのに）有用であるためには，配列は完全に同一である必要はない。一般に，より高い相同性を使用することによって，より短いアンチセンス遺伝子を使用することを補うことができる。場合によってはアンチセンス鎖は一般に，標的遺伝子と実質的に同一である（アンチセンス方向ではあるが）。
【００４７】
本発明の組成物の特定の例は，センスオリゴヌクレオチドの両端，およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの3'末端のみに末端ブロックを有する。理論に拘束されることは望まないが，2'-O-修飾型センス鎖は効率的に巻きが解けないため，未修飾鎖ほど作用しないと考えられる。従って，本発明の別の態様は，センス2'-O-メチル鎖中にヌクレオモノマー−ヌクレオモノマー間ミスマッチが存在する（そして容易に巻きが解けると考えられる）デュープレックスを含む。
【００４８】
従って，本発明によれば，所定の第１のオリゴヌクレオチド鎖には多くの相補的な第２のオリゴヌクレオチド鎖が可能である。例えば以下の表で，標的および非標的オリゴヌクレオチドをいくつかの可能な相補的オリゴヌクレオチドと共に例証する。個々のヌクレオチドは2'-OH RNAヌクレオチド（R）または対応する2'-O Meヌクレオチド（M）であってもよく，またオリゴヌクレオチドそのものがミスマッチのヌクレオチド（小文字）を含んでもよい。
【００４９】
標的オリゴヌクレオチド
【表１】
2005515780.tif 000007
【００５０】
非標的オリゴヌクレオチド
【表２】
2005515780.tif 000008
【００５１】
2'-O-メチルヌクレオモノマーに関連して使用してもよい更なる修飾の別の例は，特にセンス鎖における，糖残基そのものの修飾，例えば修飾型および未修飾型の糖の変更である。
【００５２】
１つの態様においては，センス鎖の長さは29，28，27，26，25，24，23，22，21，20，19，または18ヌクレオチドで，相補的RNAデュープレックス鎖を有しており，場合によりオーバーハングを有していてもよい。
【００５３】
更なる例として，細胞のストレス反応を最小限にすることが望まれる場合には2'-O-メチルRNAの使用が有益でありうる。2'-O-メチルヌクレオモノマーを有するRNAは，未修飾RNAが認識されると考えられる細胞機構によって認識されないかもしれない。2'-O-メチル化された，または部分的に2'-O-メチル化されたRNAの使用によって，標的RNAの阻害を保持しつつ，二本鎖核酸へのインターフェロン反応が回避されうる。このRNAi（“ステルスRNAi”）は，インターフェロン反応を誘導する短鎖RNAi（例えばsiRNA）配列およびインターフェロン反応を誘導しうる長鎖RNAi配列のいずれでも，インターフェロンまたは他の細胞ストレス反応を回避するのに有用である。
【００５４】
本発明の特に有益な使用は，複数のRNAi配列を使用する遺伝子機能の研究においてである。当該分野で現在知られている方法によれば，多くの場合，どの配列がストレス反応（インターフェロン反応を含む）を誘導しうるかを予測する方法が無く，この点で，本発明は当該分野の技術水準を大いに前進させるものである。例えば複数の配列が全て部分的に2-O-メチル化されていれば，ストレス反応（インターフェロン反応を含む）を回避することによって，ある配列が標的遺伝子の阻害と無関係に細胞表現型に影響を与えるといった，識別不能な結果を回避できうる。2'-O-メチル化に加えて他の化学的修飾によってもこの効果が得られうる。
【００５５】
例えば，修飾された糖には，D-リボース，2'-O-アルキル（2'-O-メチルおよび2'-O-エチルを含む），すなわち2'-アルコキシ，2'-アミノ，2'-S-アルキル，2'-ハロ（2'-フルオロを含む)，2'-メトキシエトキシ，2'-アリルオキシ（-OCH2CH=CH2)，2'-プロパルギル，2'-プロピル，エチニル，エテニル，プロペニル，およびシアノなどがある。１つの態様においては，糖部分はヘキソースであり，報告されているようにオリゴヌクレオチド中に組み込まれてもよい（Augustyns, K.ら, Nucl. Acids. Res.  1992. 18:4711）。代表的なヌクレオモノマーは，例えば米国特許第5,849,902号（本明細書に組み込まれる）に見られる。
【００５６】
“アルキル”という用語には飽和脂肪族基が含まれ，それらには直鎖アルキル基（例えばメチル，エチル，プロピル，ブチル，ペンチル，ヘキシル，ヘプチル，オクチル，ノニル，デシルなど），分子鎖アルキル基（イソプロピル，tert-ブチル，イソブチルなど），シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル，シクロペンチル，シクロヘキシル，シクロヘプチル，シクロオクチル)，アルキル置換型シクロアルキル基，およびシクロアルキル置換型アルキル基がある。１つの態様においては，直鎖または分枝鎖アルキルはその骨格に６個以下の炭素原子を有し（例えば直鎖ではC1-C6，分枝鎖ではC3-C6），好ましくは４個以下である。同様に，好ましいシクロアルキルはその環構造中に３-８個の炭素原子を有し，好ましくは環構造中に５または６個の炭素原子を有する。C1-C6という用語は１から６個の炭素原子を含有するアルキル基を含む。
【００５７】
更に，特に記載しない限り，アルキルという用語は“未置換型アルキル”および“置換型アルキル”の両方を含み，後者は炭化水素骨格の１個以上の炭素上に水素に代わる置換基を有するアルキル部分をいう。それらの置換基には例えば以下がある：アルケニル，アルキニル，ハロゲン，ヒドロキシル，アルキルカルボニルオキシ，アリールカルボニルオキシ，アルコキシカルボニルオキシ，アリールオキシカルボニルオキシ，カルボキシラート，アルキルカルボニル，アリールカルボニル，アルコキシカルボニル，アミノカルボニル，アルキルアミノカルボニル，ジアルキルアミノカルボニル，アルキルチオカルボニル，アルコキシル，ホスフェート，ホスホナート，ホスフィナート，シアノ，アミノ （アルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アリールアミノ，ジアリールアミノ，およびアルキルアリールアミノを含む），アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，カルバモイル，およびウレイドを含む），アミジノ，イミノ，スルフヒドリル，アルキルチオ，アリールチオ，チオカルボキシラート，スルフェート，アルキルスルフィニル，スルホナート，スルファモイル，スルホンアミド，ニトロ，トリフルオロメチル，シアノ，アジド，ヘテロシクリル，アルキルアリール，または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分。シクロアルキルは，例えば上記の置換基で，更に置換することができる。“アルキルアリール”または“アリールアルキル”部分は，アリール（例えばフェニルメチル（ベンジル））で置換されたアルキルである。“アルキル”という用語は天然および非天然アミノ酸の側鎖も含む。“n-アルキル”という用語は未置換の直鎖（すなわち分枝鎖でない）アルキル基を意味する。
【００５８】
“アルケニル”という用語は，長さおよび可能な置換は上記のアルキルと類似しているが，少なくとも１つの二重結合を含有する不飽和脂肪族基を含む。例えば“アルケニル”という用語は以下を含む：直鎖アルケニル基（例えばエチレニル，プロペニル，ブテニル，ペンテニル，ヘキセニル，ヘプテニル，オクテニル，ノネニル，デセニルなど），分枝鎖アルケニル基，シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル，シクロペンテニル，シクロヘキセニル，シクロヘプテニル，シクロオクテニル），アルキルまたはアルケニル置換型シクロアルケニル基，およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換型アルケニル基。１つの態様においては，直鎖または分枝鎖アルケニル基はその骨格に６個以下の炭素原子を有する（例えば直鎖ではC2-C6，分枝鎖ではC3-C6）。同様に，シクロアルケニル基はその環構造中に３-８個の炭素原子を有してもよく，好ましくは環構造中に５または６個の炭素を有する。C2-C6という用語は２から６個の炭素原子を含有するアルケニル基を含む。
【００５９】
更に，特に記載しない限り，アルケニルという用語は“未置換型アルケニル”および“置換型アルケニル”の両方を含み，後者は炭化水素骨格の１個以上の炭素上に水素に代わる置換基を有するアルケニル部分をいう。それらの置換基には例えば以下がある：アルキル基，アルキニル基，ハロゲン，ヒドロキシル，アルキルカルボニルオキシ，アリールカルボニルオキシ，アルコキシカルボニルオキシ，アリールオキシカルボニルオキシ，カルボキシラート，アルキルカルボニル，アリールカルボニル，アルコキシカルボニル，アミノカルボニル，アルキルアミノカルボニル，ジアルキルアミノカルボニル，アルキルチオカルボニル，アルコキシル，ホスフェート，ホスホナート，ホスフィナート，シアノ，アミノ（アルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アリールアミノ，ジアリールアミノ，およびアルキルアリールアミノを含む)，アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，カルバモイル，およびウレイドを含む），アミジノ，イミノ，スルフヒドリル，アルキルチオ，アリールチオ，チオカルボキシラート，スルフェート，アルキルスルフィニル，スルホナート，スルファモイル，スルホンアミド，ニトロ，トリフルオロメチル，シアノ，アジド，ヘテロシクリル，アルキルアリール，または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分。
【００６０】
“アルキニル”という用語は，長さおよび可能な置換は上記のアルキルと類似しているが，少なくとも１つの三重結合を含有する不飽和脂肪族基を含む。例えば“アルキニル”という用語は以下を含む：直鎖アルキニル基（例えばエチニル，プロピニル，ブチニル，ペンチニル，ヘキシニル，へプチニル，オクチニル，ノニニル，デシニルなど），分枝鎖アルキニル基，およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換型アルキニル基。１つの態様においては，直鎖または分枝鎖アルキニル基はその骨格に６個以下の炭素原子を有する（例えば直鎖ではC2-C6，分枝鎖ではC3-C6）。C2-C6という用語は２から６個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。
【００６１】
更に，特に記載しない限り，アルキニルという用語は“未置換型アルキニル”および“置換型アルキニル”の両方を含み，後者は炭化水素骨格の１個以上の炭素上に水素に代わる置換基を有するアルキニル部分をいう。それらの置換基には例えば以下がある：アルキル基，アルキニル基，ハロゲン，ヒドロキシル，アルキルカルボニルオキシ，アリールカルボニルオキシ，アルコキシカルボニルオキシ，アリールオキシカルボニルオキシ，カルボキシラート，アルキルカルボニル，アリールカルボニル，アルコキシカルボニル，アミノカルボニル，アルキルアミノカルボニル，ジアルキルアミノカルボニル，アルキルチオカルボニル，アルコキシル，ホスフェート，ホスホナート，ホスフィナート，シアノ，アミノ（アルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アリールアミノ，ジアリールアミノ，およびアルキルアリールアミノを含む），アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，カルバモイル，およびウレイドを含む)，アミジノ，イミノ，スルフヒドリル，アルキルチオ，アリールチオ，チオカルボキシラート，スルフェート，アルキルスルフィニル，スルホナート，スルファモイル，スルホンアミド，ニトロ，トリフルオロメチル，シアノ，アジド，ヘテロシクリル，アルキルアリール，または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分。
【００６２】
炭素数を特に記載しない限り，ここで使用する“低級アルキル”は，上記の通りであるがその骨格構造に１から５個の炭素原子を有するアルキル基を意味する。“低級アルケニル”および“低級アルキニル”は，例えば２-５個の炭素原子の鎖長を有する。
【００６３】
“アルコキシ”という用語は，酸素原子に共有結合した置換型および未置換型アルキル，アルケニル，およびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例にはメトキシ，エトキシ，イソプロピルオキシ，プロポキシ，ブトキシ，およびペントキシ基がある。置換型アルコキシ基の例にはハロゲン化アルコキシ基がある。アルコキシ基は以下のような基で置換できる：アルケニル，アルキニル，ハロゲン，ヒドロキシル，アルキルカルボニルオキシ，アリールカルボニルオキシ，アルコキシカルボニルオキシ，アリールオキシカルボニルオキシ，カルボキシラート，アルキルカルボニル，アリールカルボニル，アルコキシカルボニル，アミノカルボニル，アルキルアミノカルボニル，ジアルキルアミノカルボニル，アルキルチオカルボニル，アルコキシル，ホスフェート，ホスホナート，ホスフィナート，シアノ，アミノ（アルキルアミノ，ジアルキルアミノ，アリールアミノ，ジアリールアミノ，およびアルキルアリールアミノを含む)，アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，カルバモイル，およびウレイドを含む)，アミジノ，イミノ，スルフヒドリル，アルキルチオ，アリールチオ，チオカルボキシラート，スルフェート，アルキルスルフィニル，スルホナート，スルファモイル，スルホンアミド，ニトロ，トリフルオロメチル，シアノ，アジド，ヘテロシクリル，アルキルアリール，または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分。ハロゲン置換型アルコキシ基の例には，限定されるわけではないがフルオロメトキシ，ジフルオロメトキシ，トリフルオロメトキシ，クロロメトキシ，ジクロロメトキシ，トリクロロメトキシなどがある。
【００６４】
“ヘテロ原子”という用語は，炭素または水素以外の元素の原子を含む。好ましいヘテロ原子は窒素，酸素，硫黄，およびリンである。
【００６５】
“ヒドロキシ”または“ヒドロキシル”という用語は-OHまたは−O-（好適なカウンターイオンと共に）を有する基を含む。
【００６６】
“ハロゲン”という用語はフッ素，臭素，塩素，ヨウ素などを含む。“ペルハロゲン化”という用語は，全ての水素がハロゲン原子で置換されている部分をいう。
【００６７】
“置換された”という用語は，部分に配して分子がその意図する機能をするようにできる置換基を含む。置換基の例には以下がある：アルキル，アルケニル，アルキニル，アリール，(CR'R")0-3NR'R"，(CR'R")0-3CN，NO2，ハロゲン，(CR'R")0-3C(ハロゲン)3，(CR'R")0-3CH(ハロゲン)2，(CR'R")0-3CH2(ハロゲン)，(CR'R")0-3CONR'R"，(CR'R")0-3S(O)1-2NR'R"，(CR'R")0-3CHO，(CR'R")0-3O(CR'R")0-3H，(CR'R")0-3S(O)0-2R'，(CR'R")0-3O(CR'R")0-3H，(CR'R")0-3COR'，(CR'R")0-3CO2R'，または(CR'R")0-3OR'基；ここで，R'およびR"はそれぞれ独立して水素，C1-C5アルキル，C2-C5アルケニル，C2-C5アルキニル，もしくはアリール基であるか，またはR'およびR"は合わさってベンジリデン基もしくは-(CH2)2O(CH2)2-基である。
【００６８】
“アミン”または“アミノ”という用語は，窒素原子が少なくとも１個の炭素またはヘテロ原子に共有結合した化合物または部分を含む。“アルキルアミノ”という用語は，窒素が少なくとも１個の更なるアルキル基に結合した基および化合物を含む。“ジアルキルアミノ”という用語は，窒素原子が少なくとも２個の更なるアルキル基に結合した基を含む。
【００６９】
“エーテル”という用語は，２つの異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合した酸素を含有する化合物または部分を含む。例えば用語は“アルコキシアルキル”を含むが，これはアルキル，アルケニル，またはアルキニル基が，別のアルキル基に共有結合した酸素原子に共有結合したものをいう。
【００７０】
“塩基”という用語には，既知のプリンおよびピリミジンヘテロ環塩基，デアザプリン，並びにそれらの類似体（ヘテロ環置換型類似体，例えばアミノエチルオキシフェノキサジン），誘導体（例えば１-アルキル-，１-アルケニル-，ヘテロ芳香環-，および１-アルキニル誘導体），および互変異性体が含まれる。プリンの例にはアデニン，グアニン，イノシン，ジアミノプリン，およびキサンチン，並びにそれらの類似体（例えば８-オキソ-N6-メチルアデニンまたは７-ジアザキサンチン）および誘導体がある。ピリミジンには，例えばチミン，ウラシル，およびシトシン，並びにそれらの類似体（例えば５-メチルシトシン，５-メチルウラシル，５-（１-プロピニル）ウラシル，５-（１-プロピニル）シトシン，および４,４-エタノシトシン）がある。好適な塩基の他の例には非プリン系および非ピリミジン系塩基，例えば２-アミノピリジンおよびトリアジンがある。
【００７１】
好ましい態様では，本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーはRNAヌクレオチドである。別の好ましい態様では，本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは修飾型RNAヌクレオチドである。
【００７２】
“ヌクレオシド”という用語は，糖部分，好ましくはリボースまたはデオキシリボースに共有結合した塩基を含む。好ましいヌクレオシドの例にはリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドがある。また，ヌクレオシドにはアミノ酸またはアミノ酸類似体に結合した塩基が含まれ，これは遊離カルボキシル基，遊離アミノ基，または保護基を含んでもよい。好適な保護基は当該分野で十分知られている（例えばP.G.M. WutsおよびT.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 第２版, Wiley-Interscience, New York, 1999参照）。
【００７３】
“ヌクレオチド”という用語は，リン酸基またはリン酸類似体を更に含むヌクレオシドを含む。
【００７４】
ここで使用する“結合”という用語は，隣接するヌクレオモノマーに共有結合している天然に存在する未修飾のホスホジエステル部分（-O-(PO2-)-O-）を含む。ここで使用する“置換結合”という用語は，隣接ヌクレオモノマーに共有結合する天然のホスホジエステル基の任意の類似体または誘導体を含む。好適な結合にはホスホジエステル類似体，例えばホスホロチオエート，ホスホロジチオエート，およびP-エチルオキシホスホジエステル，P-エトキシホスホジエステル，P-アルキルオキシホスホトリエステル，メチルホスホネート，およびリン以外を含む結合（例えばアセタールおよびアミド）がある。それらの置換結合は当該分野で知られている（例えばBjergardeら, 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843；Caruthersら, 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47）。
【００７５】
ある態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは3'および5'末端を含む（環状オリゴヌクレオチドの場合は除く）。１つの態様においては，オリゴヌクレオチドの3'および5'末端は，例えば3'または5'結合の修飾によって，ヌクレアーゼから実質的に保護できる（例えば米国特許第5,849,902号および国際特許公開WO98/13526号）。例えばオリゴヌクレオチドは“ブロッキング基”を含有させることによって耐性を持たせることができる。ここで使用する“ブロッキング基”という用語は，合成のための保護基またはカップリング基のいずれかとしてオリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに結合させることができる置換基（例えばOH基以外）をいう（例えばFITC，プロピル（CH2-CH2-CH3），ホスフェート（PO32-），ハロゲンホスフェート，またはホスホルアミダイト）。また“ブロッキング基”はオリゴヌクレオチドの5'および3'末端を保護する“末端ブロッキング基”または“エキソヌクレアーゼブロッキング基”も含み，それらには修飾型ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造がある。
【００７６】
代表的な末端ブロッキング基にはキャップ構造（例えば7-メチルグアノシンキャップ），反転ヌクレオモノマー（例えば3'-3'または5'-5'末端反転）（例えばOrtiagaoら, 1992.  Antisense Res. Dev. 2:129参照），メチルホスホネート，ホスホルアミダイト，非ヌクレオチド基（例えば非ヌクレオチドリンカー，アミノリンカー，コンジュゲート）などがある。3'末端ヌクレオモノマーは修飾された糖部分を含むこともできる。3'末端ヌクレオモノマーは3'-Oを含み，これは場合によりオリゴヌクレオチドの3'-エキソヌクレアーゼ分解を阻害するブロッキング基で置換されていてもよい。例えば3'-ヒドロキシルは3'→3'ヌクレオチド間結合を介してヌクレオチドにエステル結合させることができる。例えば，アルキルオキシラジカルはメトキシ，エトキシ，またはイソプロポキシであってもよく，好ましくはエトキシである。場合により，3'末端で3'→3'結合したヌクレオチドは置換結合によって結合させることができる。ヌクレアーゼ分解を低下させるために，最も5' 側の3'→5'結合は修飾型結合，例えばホスホロチオエートまたはP-アルキルオキシホスホトリエステル結合であってもよい。好ましくは，２つの最も5' 側の 3'→5'結合は修飾型結合である。場合により，5'末端ヒドロキシ部分を，リンを含有する部分とエステル化させることができる（例えばホスフェート，ホスホロチオエート，またはP-エトキシホスフェート）。
【００７７】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドのセンス鎖は，RNAi活性を与える5'基を含有するが，これは遺伝子ターゲティングという点ではセンス鎖を不活性にする。好ましくは，それらの5'修飾基はリン酸基またはリン酸基より大きい基である。
【００７８】
別の態様においては，オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は5'リン酸基を含有する。
【００７９】
１つの態様においては，組成物に含有されるオリゴヌクレオチドは高親和性オリゴヌクレオチドである。ここで使用する“高親和性”という用語は，Tm（融点）が約60℃より高い，約65℃より高い，約70℃より高い，約75℃より高い，約80℃より高い，または約85℃より高いオリゴヌクレオチドを含む。Tmは，オリゴヌクレオチドが標的ヌクレオチド配列から分離する温度範囲の中間温度である。この温度では，コイル（ハイブリダイズしていない）に対して50%のらせん（ハイブリダイズした）型が存在する。UVスペクトルを使用してTmを測定し，ハイブリダイゼーションの生成および崩壊（溶解）を測定する。ハイブリダイゼーションの際，塩基のスタッキングが起こり，これによってUV吸収は低下する。Tmは２つの核酸分子のGC含量および配列相補性の程度に依存する。Tmは当該分野で知られる技術を使用して測定することができる（例えばMoniaら. 1993. J. Biol. Chem. 268:145；Chiangら. 1991. J. Biol. Chem. 266:18162；Gagnorら. 1987. Nucleic Acids Res. 15:10419；Moniaら. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:15481；PublisisおよびTinoco. 1989. Methods in Enzymology 180:304；Thuongら. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5129参照）。
【００８０】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドに，その標的配列へのオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる物質を含有させることができる。“親和性増強剤”という用語は，その標的へのオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる物質を含む。それらの物質には，例えばインターカレート剤および高親和性ヌクレオモノマーがある。インターカレート剤は核酸と強く，非特異的に相互作用する。インターカレート剤はRNA-DNAデュープレックスを安定化させ，それによってその標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる役割を果たす。インターカレート剤は最も一般的にはオリゴヌクレオチドの3'または5'末端に結合させる。インターカレート剤の例にはアクリジン，クロラムブシル，ベンゾピリドキノキサリン，ベンゾピリドインドール，ベンゾフェナントリジン，およびフェナジニウムがある。物質はオリゴヌクレオチドに他の特質を与えるものであってもよく，それらには例えばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼへの耐性の増加がある。
【００８１】
１つの態様においては，高親和性ヌクレオモノマーをオリゴヌクレオチド内に導入する。ここで使用する“高親和性ヌクレオモノマー”という用語は，標的核酸分子中の相補塩基に，例えば相補塩基とより多くの水素結合を形成することによって，例えば相補塩基とより好性の強い相互作用を持つことによって，未修飾塩基より高い親和性で結合する修飾型塩基または塩基類似体を含む。例えば高親和性ヌクレオモノマー類似体，例えばアミノエトキシフェノキサジン（Gクランプとも呼ばれる。グアニンと４つの水素結合を形成する）は“高親和性ヌクレオモノマー”に含まれる。高親和性ヌクレオモノマーを以下に例証する（例えばFlanaganら, 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:3513参照）。
【化１２】
2005515780.tif 000009
（すなわちグアニンおよびアミノエチオキシフェノキサジン）
【００８２】
他の代表的な高親和性ヌクレオモノマーは当該分野で知られているが，それらには7-アルケニル，7-アルキニル，7-ヘテロ芳香族，もしくは7-アルキニルヘテロ芳香族で置換された塩基などがあり，これはオリゴヌクレオチド中でアデノシンもしくはグアノシンの代わりに用いることができる（例えば米国特許第5,594,121号参照）。また，7-置換型デアザプリンはオリゴヌクレオチドへの結合性が向上されていることが発見されており，これはすなわち，未修飾のオリゴヌクレオチドに比べて高い親和性で相補的標的核酸分子に結合できることによる。高親和性ヌクレオモノマーは標準的な技術を使用して本発明のオリゴヌクレオチドに導入できる。
【００８３】
別の態様においては，標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる物質はインターカレート剤を含有する。ここで使用する“インターカレート剤”という用語は，DNA二重らせんに結合できる物質を含む。本発明のオリゴヌクレオチドに共有結合させると，インターカレート剤はオリゴヌクレオチドの相補的ゲノムDNA標的配列への結合を向上する。インターカレート剤はエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼへの耐性も向上しうる。
【００８４】
代表的なインターカレート剤はHeleneおよびThuong（1989. Genome 31:413）に記載されており，例えば以下がある：アクリジン誘導体（Lacosteら. 1997. Nucleic Acids Research. 25:1991; Kukretiら. 1997. Nucleic Acids Research. 25:4264）；キノリン誘導体（Wilsonら. 1993. Biochemistry 32:10614）；ベンゾ［f］キノ［3,4-b］キノキサリン誘導体（Marchandら. 1996. Biochemistry. 35:5022; Escudeら. 1998.  Proc. Natl. Acad. Sci. 95:3591）。
【００８５】
インターカレート剤はいずれの慣用的な結合を使用してオリゴヌクレオチドに導入してもよい。例えば，アクリジンまたはソラレンを，いずれかの可能な-OHまたは-SH基を介して，例えばオリゴヌクレオチドの末端5'位，糖部分の2'位，またはピリミジンの5位に導入したOH，NH2，COOH，もしくはSHに，標準的な方法によって結合させることができる。
【００８６】
１つの態様においては，RNaseH活性化アンチセンスヌクレオチド配列中に含まれる場合，オリゴヌクレオチドの標的への親和性を増加させる物質はオリゴヌクレオチドのRNase活性化領域に隣接させず，例えば非RNase活性化領域に隣接させる。好ましくは，オリゴヌクレオチドの標的への親和性を増加させる物質をキメラアンチセンス配列のRNase活性化ドメインからできるだけ離れた位置に配し，キメラアンチセンス配列の特異性が，インターカレート化合物がないキメラアンチセンス配列の特異性に比較して変化を受けないようにする。１つの態様においては，これはこの物質を非RNase活性化領域に隣接して配置することによって行うことができる。オリゴヌクレオチドの特異性の試験は，非標的配列，好ましくは標的と構造的に類似した非標的配列（例えば標的配列とある程度の配列相同性または同一性を有するが，標的と同じ配列ではない）の転写が，同じ標的を対象とするが親和性増強剤を含有しないオリゴヌクレオチドによる場合と比較して，親和性増強剤を含有するオリゴヌクレオチドによるほうがより大きく阻害されるということがないことを確認することによって行うことができる。
【００８７】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは，１つの自己相補的核酸鎖または２つの異なる相補的核酸鎖から生成してもよい。デュープレックスの形成は標的遺伝子を含有する細胞の内側または外側のいずれでも起こりうる。
【００８８】
ここで使用する“二本鎖”という用語は，少なくとも一部のヌクレオモノマーが相補的であり，水素結合によってデュープレックスを生成する分子領域を含む１つ以上の核酸分子を含む。
【００８９】
ここで使用する“デュープレックス”という用語は，相補配列に水素結合した二本鎖核酸分子の領域を含む。
【００９０】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは，標的遺伝子に対してセンスであるヌクレオチド配列と，標的遺伝子に対してアンチセンスである相補配列を含む。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は標的遺伝子配列に対応する。例えば，これらは，標的遺伝子配列と同一であるか，または標的遺伝子を阻害するのに十分なように実質的に同一である（例えば少なくとも約98％，96％，94％，90％，85％，または80％の同一性）。
【００９１】
２つの異なる相補的核酸分子を含む場合，個々の核酸分子は異なる長さであってもよい。
【００９２】
１つの態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドはその全長にわたって二本鎖である。すなわち分子のいずれの末端にも１本鎖のオーバーハングが無く，つまり平滑末端である。別の態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドはその全長にわたって二本鎖ではない。例えば２つの異なる核酸分子を使用する場合，分子の１つ（例えばアンチセンス配列を含む第１の分子）は，それにハイブリダイズする第２の分子より長く，分子の一部が１本鎖のままであってもよい。同様に，１つの核酸分子を使用する場合，いずれかの末端で分子の一部が１本鎖のままであってもよい。
【００９３】
１つの態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約70％にわたって二本鎖である。別の態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約80％にわたって二本鎖である。別の態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約90％-95％にわたって二本鎖である。別の態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約96％-98％にわたって二本鎖である。
【００９４】
１つの態様においては，本発明の二本鎖デュープレックスコンストラクトをヌクレアーゼに対して更に安定化するために，コンストラクトのセンスまたはアンチセンス鎖の5'または3'末端にループ構造を形成させることができる。例えばコンストラクトは以下のような形態であってもよい：
【化１３】
2005515780.tif 000010
［式中，Nは長さが等しい（例えば約12から約40ヌクレオチド長の）相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり（すなわち上段のN鎖は下段のN鎖と相補的である），XおよびYはそれぞれ独立して以下から成る群から選択される：存在しない（すなわちコンストラクトはループおよびオーバーハングを有さない平滑末端コンストラクトである）；約1から約20ヌクレオチドの5'オーバーハング；約1から約20ヌクレオチドの3'オーバーハング；GAAAループ（テトラループ）；および約4から約20ヌクレオモノマーから成るループ（ここでヌクレオモノマーは全てGまたはAである）］。
【００９５】
Nの配列は標的遺伝子配列に対応する（例えば標的遺伝子配列に対してセンスまたはアンチセンスであるヌクレオチド配列と相同または同一である）が，ループ構造のヌクレオチド配列は標的遺伝子配列に対応しない。
【００９６】
例えば，それらのループはGおよびAのみを含有し，約4から約20ヌクレオチド長であってもよい。１つの態様においては，それらのループは配列GAAAを有するテトラループであってもよい。
【００９７】
【化１４】
2005515780.tif 000011
１つの態様においては，Nの数は約27である。
【００９８】
コンストラクトの一端または両端がループで１つの態様においては，オリゴヌクレオチドに“ニック”（センスまたはアンチセンス鎖のいずれか（しかし好ましくはセンス鎖）の位置にある２つの結合していないヌクレオモノマー）を含有させて分割することができる。好ましくは，ニックはデュープレックス領域の最も近い末端から少なくとも4塩基離れている（十分な熱力学的安定性を得るために）。
【００９９】
別の態様においては，本発明のコンストラクトは以下の形態であってもよい：
【化１５】
2005515780.tif 000012
［式中，Nは長さが等しい（例えば約12-40ヌクレオモノマー長の）オリゴヌクレオチド鎖中の相補的ヌクレオモノマーであり；Zは約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，これは場合により標的配列に対応していてもよい配列を含有し；そしてMは約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，これは場合により標的配列に対応していてもよい］。
【０１００】
好ましくは，ZおよびMはCおよびGから成る群から選択されるヌクレオモノマーであり，これによってデュープレックスの末端が熱力学的により安定となる。デュープレックスの末端は一時的に１本鎖になってもよく，デュープレックスRNAは１本鎖RNAより安定であるため，末端のデュープレックスの安定性が向上することによってヌクレアーゼに対する安定性がより高くなる。
【０１０１】
アンチセンス鎖中のZまたはMの好ましい配列は2-8ヌクレオモノマー長，好ましくは3-4ヌクレオモノマー長で，例えば以下である：（5'から3'へ）CC，GG，CG，GC，CCC，GGG，CGG，GCC，GCG，CGC，CGGG，GCCC，CCCC，GGGG，GCGC，CGCG，GGGC，CCCG，CGGG，GCCC，GGCC，またはCCGG。相補鎖は対応する相補配列を有する。
【０１０２】
更に別の態様においては，本発明のコンストラクトは以下の形態である：
【化１６】
2005515780.tif 000013
［式中，Nは長さが等しい（例えば約12から約40ヌクレオモノマー長の）相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり（すなわち上段のN鎖は下段のN鎖と相補的である），Xは以下から成る群から選択され：存在しない（すなわちループまたはオーバーハングを有さない平滑末端のままである）；1-20ヌクレオチドの5'オーバーハング；1-20ヌクレオチドの3'オーバーハング；GAAAループ（テトラループ）；および約4から約20ヌクレオモノマーから成るループ（ここでヌクレオモノマーは全てGまたはAである），ここでMは約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖（場合により標的配列に対応していてもよい）中のヌクレオモノマーである。好ましくはMはCおよびGから成る群から選択されるヌクレオモノマーである］。
【０１０３】
アンチセンス鎖中のMの好ましい配列は2-8ヌクレオモノマー長，または好ましくは3-4ヌクレオモノマー長であり，例えば以下である：（5'から3'へ）CC，GG，CG，GC，CCC，GGG，CGG，GCC，GCG，CGC，CGGG，GCCC，CCCC，GGGG，GCGC，CGCG，GGGC，CCCG，CGGG，GCCC，GGCC，またはCCGG，および反対の鎖上の対応する相補配列。
【０１０４】
別の態様においては，コンストラクトは以下の形態であってもよい：
【化１７】
2005515780.tif 000014
［式中，Nは長さが等しい（例えば約12から約40ヌクレオモノマー長の）相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，Yは以下からなる群から選択され：存在しない（すなわちループおよびオーバーハングの無い平滑末端のままである）；1-20ヌクレオチドの5'オーバーハング；1-20ヌクレオチドの3'オーバーハング；GAAAループ（テトラループ）；および約4から約20ヌクレオモノマーの配列から成るループ（ここでヌクレオモノマーは全てGまたはAである），ここでZは約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖中のヌクレオモノマーであり，場合により標的配列に対応していてもよい配列を含有する。好ましくは，ZはCおよびGから成る群から選択され，これによってデュープレックスの末端はより安定となる］。
【０１０５】
アンチセンス鎖中のZの好ましい配列は2-8ヌクレオモノマー長，好ましくは3-4ヌクレオモノマー長であり，例えば（5'から3'へ）CC，GG，CG，GC，CCC，GGG，CGG，GCC，GCG，CGC，CGGG，GCCC，CCCC，GGGG，GCGC，CGCG，GGGC，CCCG，CGGG，GCCC，GGCC，またはCCGG（および反対の鎖上の対応する相補配列）である。例えば以下の構造において，末端のGGCC（およびその相補配列）は更なる安定性を与える：
【化１８】
2005515780.tif 000015
【０１０６】
本発明はまた，以下の構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物に関する：
【化１９】
2005515780.tif 000016
［式中，（１）oligoAはある数のヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチドであり；（２）oligoBはoligoAと同数のヌクレオモノマーを有し，oligoAに相補的なオリゴヌクレオチドであり；（３）oligoAまたはoligoBのいずれかは標的遺伝子配列に対応する］。
【０１０７】
この構造において，Xは以下から選択することができる：（ａ）存在しない；（ｂ）oligoAの5'末端に共有結合して5'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；（ｃ）oligoBの3'末端に共有結合して3'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；および（ｄ）oligoBの3'末端およびoligoAの5'末端に共有結合してループ構造を構成する約4から約20ヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチド（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）］。
【０１０８】
同様に，Yは以下から選択することができる：（ａ）存在しない；（ｂ）oligoBの5'末端に共有結合して5'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；（ｃ）oligoAの3'末端に共有結合して3'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；および（ｄ）oligoAの3'末端およびoligoBの5'末端に共有結合してループ構造を構成する約4から約20ヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチド（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）。
【０１０９】
同様に，本発明は以下の構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物を含む：
【化２０】
2005515780.tif 000017
［式中，（１）oligoAは5'−(N)15-40-(M)2-8−3'，oligoBは5'−(N)15-40-(M)2-8−3'であり（ここでNおよびMはそれぞれ独立してヌクレオモノマーである）；（２）Nの配列はいずれも，約15から40ヌクレオモノマーを有する等しい長さの相補的オリゴヌクレオチド鎖であり；（３）Nの配列の少なくとも１つが（場合により隣接するMの一部または全部と共に）標的遺伝子配列に対応する。Mの配列はいずれも約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖である］。
【０１１０】
曲線で示す基Xは以下から選択される：（ａ）存在しない；（ｂ）oligoAの5'末端に共有結合して5'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；（ｃ）oligoBの3'末端に共有結合して3'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；および（ｄ）oligoBの3'末端およびoligoAの5'末端に共有結合してループ構造を構成する約4から約20ヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチド（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）。
【０１１１】
同様に，本発明は以下の構造を有する二本鎖オリゴヌクレオチド組成物に関する：
【化２１】
2005515780.tif 000018
［式中，（１）oligoAは5'−(Z)2-8-(N)12-40−3'，oligoBは5'−(Z)2-8-(N)12-40−3'であり（ここでNおよびZはそれぞれ独立してヌクレオモノマーである）；（２）Nの配列はいずれも，約12から40ヌクレオモノマーを有する等しい長さの相補的オリゴヌクレオチド鎖であり；（３）Nの配列の少なくとも１つが（場合により隣接するZの一部または全部と共に）標的遺伝子配列に対応する。Zの配列はいずれも約2から約8ヌクレオモノマー長の相補的オリゴヌクレオチド鎖である。２つのZ鎖は場合により等しい長さであってもよい］。
【０１１２】
ここで，Yは以下から選択される：（ａ）存在しない；（ｂ）oligoBの5'末端に共有結合して5'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；（ｃ）oligoAの3'末端に共有結合して3'オーバーハングを構成する約1から約20ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド；および（ｄ）oligoAの3'末端とoligoBの5'末端に共有結合してループ構造を構成する約4から約20ヌクレオモノマーのオリゴヌクレオチド（ここでヌクレオモノマーはGおよびAから成る群から選択される）。
【０１１３】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドの二本鎖デュープレックスは約12から約50ヌクレオモノマー長である。すなわち二本鎖オリゴヌクレオチドの相補配列にハイブリダイズして二本鎖デュープレックス構造を形成する二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は約12から約50ヌクレオモノマー長である。別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドの二本鎖デュープレックスは約12から約40ヌクレオモノマー長である。
【０１１４】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドの二本鎖デュープレックスは少なくとも約25ヌクレオモノマー長である。１つの態様においては，二本鎖デュープレックスは約25ヌクレオモノマー長より長い。１つの態様においては，二本鎖デュープレックスは少なくとも約26，約27，28，29，30，少なくとも約40，少なくとも約50，または少なくとも約60，少なくとも約70，少なくとも約80，もしくは少なくとも約90ヌクレオモノマー長である。別の態様においては，二本鎖デュープレックスは約25ヌクレオモノマー長より短い。１つの態様においては，二本鎖デュープレックスは少なくとも約10，少なくとも約15，少なくとも約20，少なくとも約22，少なくとも約23，または少なくとも約24ヌクレオモノマー長である。
【０１１５】
１つの態様においては，デュープレックスの各鎖のNの数は約12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，または27である。別の態様においては，デュープレックスの各鎖のNの数は約30，35，40，45，または50である。１つの態様においては，デュープレックスの各鎖のNの数は約19である。好ましい態様では，デュープレックスの各鎖のNの数は約27である。別の態様においては，デュープレックスの各鎖のNの数は約27（例えば26，27，または28）である。別の態様においては，デュープレックスの各鎖のNの数は27である。
【０１１６】
１つの態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの個々の核酸分子は少なくとも約25ヌクレオモノマー長である。例えば，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドが１つの核酸分子を含む場合，その個々の分子は少なくとも約25ヌクレオモノマー長であり，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドが２つの異なる核酸分子を含む場合，個々の核酸分子の少なくとも１つの長さは少なくとも約25ヌクレオモノマー長である。
【０１１７】
種々の異なる長さのヌクレオチドを使用してもよい。１つの態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む個々の核酸分子は約25ヌクレオモノマー長より長い。１つの態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む個々の核酸分子は少なくとも約26，27，28，29，30，少なくとも約40，少なくとも約50，または少なくとも約60，少なくとも約70，少なくとも約80，もしくは少なくとも約90ヌクレオモノマー長である。別の態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む個々の核酸分子は約25ヌクレオモノマー長より短い。１つの態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む個々の核酸分子は少なくとも約10，少なくとも約15，少なくとも約20，少なくとも約22，少なくとも約23，または少なくとも約24ヌクレオモノマー長である。
【０１１８】
本発明の二本鎖分子は標的遺伝子の少なくとも一部に対してアンチセンスである第１のヌクレオチド配列，および第１のヌクレオチド配列に相補的な（すなわち標的遺伝子の少なくとも一部に対してセンスである）第２のヌクレオチド配列を含有する。１つの態様においては，二本鎖分子の第２のヌクレオチド配列はアンチセンス分子に対して少なくとも約100％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１９】
別の態様においては，二本鎖分子の第２のヌクレオチド配列はアンチセンス分子に対して少なくとも約95％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖分子の第２のヌクレオチド配列はアンチセンス分子に対して少なくとも約90％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖分子の第２のヌクレオチド配列はアンチセンス分子に対して少なくとも約80％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖分子の第２のヌクレオチド配列はアンチセンス分子に対して少なくとも約60％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，二本鎖分子の第２のヌクレオチド配列はアンチセンス分子に対して少なくとも約100％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２０】
２つの核酸配列の同一性（％）を確認するために，最適な比較を目的として配列のアラインメントを行う（例えば，最適なアラインメントのために，ギャップを第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入し，非同一配列を比較から除外することができる）。第１の配列のある位置に第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドが存在すれば，分子はその位置に関して同一である。２つの配列の同一性（％）は配列間で共通する同一位置の数の関数であり，２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れる。相補性（％）は同様に測定できる；配列中のある位置に他の配列中のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドがあれば，分子はその位置に関して相補的である。
【０１２１】
配列の比較および２つの配列間の同一性（％）の確認は数学的なアルゴリズムを使用して行うことができる。好ましい態様では，２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）の測定を，例えばGCGソフトウェアパッケージの中のGAPプログラムを用い，例えばNWSgapdnaを使用して行う。CMP マトリクスおよびギャップ重みは，40, 50, 60, 70, または80 であり，長さ重みは1, 2, 3, 4, 5, または6である。別の態様においては，２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）の測定を，E. MeyersおよびW. Miller（Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)）のアルゴリズムを使用して行うが，これはALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれており，PAM120重み残基表，ギャプ長ペナルティー12，およびギャップペナルティー4を用いる。
【０１２２】
更に本発明の核酸配列を“クエリー配列”として使用し，公共のデータベース中の配列に対してアラインメントを行うことができる。それらの検索はAltschulら, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）を使用して行うことができる。BLASTヌクレオチド検索はNBLASTプログラム（スコア＝100，ワード長＝12）を使用して実施できる。比較のためのギャップを有するアラインメントを得るために，Gapped BLASTをAltschulら, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載されるように使用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合，それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（例えばXBLASTおよびNBLAST）を使用できる。例えばNIHのウェブサイトを参照されたい。
【０１２３】
更に別の態様においては，二本鎖分子の第１のアンチセンス配列は，ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で二本鎖分子の相補的な第２の配列にハイブリダイズする。ここで使用する“ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする”という用語は，少なくとも60％の相補性を有するヌクレオチド配列が一般に互いにハイブリダイズしたままであるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を述べることを意図する。好ましくは，条件は少なくとも約70％，より好ましくは少なくとも約80％，更に好ましくは少なくとも約85％または90％の相補性を有する配列が一般に互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。
【０１２４】
そのようなストリンジェントな条件は当業者に知られており，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見られる。非制限的な好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は以下である：6X塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）（約45℃）でハイブリダイゼーション，次いで0.2 X SSC，0.1% SDSで１回以上洗浄（50℃，好ましくは55℃，より好ましくは60℃，更に好ましくは65℃）。上記の数値の中間の範囲，例えば60-65℃または55-60℃も本発明の範囲に含まれることを意図する。あるいはまた，当該分野で周知の方法および条件を使用してホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に含有させることができる。
【０１２５】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列（または分子）の一つは標的遺伝子に対してアンチセンスである。ここで使用する“アンチセンス配列”という用語は，標的遺伝子（例えばポリヌクレオチド，例えばDNA，mRNA（プレmRNAを含む））分子のヌクレオチド配列の“センス”鎖に結合するヌクレオチド配列を含む。本発明のアンチセンス配列が核酸分子に結合する場合，それらは核酸分子のいずれの領域にも結合できる（例えばイントロン，エクソン，5'または3'非翻訳領域）。標的への結合およびRNaseHの活性化によって作用するアンチセンス配列は，好ましくは核酸標的分子のイントロン，エクソン，5'非翻訳領域，または3'非翻訳領域内に結合する。
【０１２６】
好ましくは，本発明のオリゴヌクレオチド組成物はインターフェロン経路を活性化せず，これは例えば二本鎖RNA，インターフェロン誘導性プロテインキナーゼ，PKRが誘導されないことで示される。
【０１２７】
１つの態様においては，通常，インターフェロン経路を活性化する二本鎖RNA分子を修飾し，インターフェロン経路が活性化されないようにする。例えばインターフェロン経路は未修飾の二本鎖RNAによって活性化される。二本鎖RNAの細胞認識は高度に特異的であり，二本鎖デュープレックスの鎖の一方または両方を修飾することによって二本鎖RNA分子は細胞の二本鎖RNA認識機構を回避できるようになるが，それでもRNAi経路を活性化することが可能である。
【０１２８】
二本鎖オリゴヌクレオチドがインターフェロンを活性化する能力は，当該分野で周知の方法を使用して二本鎖RNA，インターフェロン誘導性プロテインキナーゼ，PKRの発現を試験し，二本鎖分子が標的遺伝子を阻害する能力を試験することによって評価できる。従って１つの態様においては，本発明は，オリゴヌクレオチドがPKRを活性化する能力を試験することによって二本鎖RNA分子がインターフェロンを誘導する能力を試験する方法を提供する。次いでPKRを活性化しない（すなわちインターフェロン経路を活性化しない）組成物を，例えば治療または機能性ゲノミクスにおいて，細胞における遺伝子の転写の阻害に使用するために選択する。
【０１２９】
特定の作用機構に制限されることはないが，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド組成物に使用されるアンチセンス配列であって標的遺伝子内のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズできるもの（すなわち標的遺伝子内のヌクレオチド配列に相補的なもの）は，例えば以下に基づいてその作用を生じてもよい：（１）標的mRNAへの結合，およびリボソーム複合体のmRNAの翻訳の立体傷害的阻止；（２）標的mRNAへの結合およびRNaseHによるmRNA切断の誘引；（３）核における二本鎖DNAへの結合および三重らせんの形成；（４）RNAポリメラーゼによって生成したオープンDNAループへのハイブリダイゼーション；（５）mRNAスプライシングへの干渉；（６）mRNAの核から細胞質への輸送への干渉；または（７）開始因子の結合の阻害またはリボソームサブユニットの組立を介する（すなわち開始コドンでの）翻訳への干渉。
【０１３０】
１つの態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス配列は，アンチセンス配列の長さの少なくとも約80％にわたって標的核酸配列に相補的である。別の態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス配列は，アンチセンス配列の長さの少なくとも約90-95％にわたって標的核酸配列に相補的である。別の態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス配列は，アンチセンス配列の全長にわたって標的核酸配列に相補的である。
【０１３１】
更に別の態様においては，二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス配列は，ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズする。
【０１３２】
１つの態様においては，本発明のアンチセンス配列は，標的核酸配列と実質的に相補的である。１つの態様においては，アンチセンスRNA分子は標的遺伝子の一部と少なくとも約100％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，アンチセンスRNA分子は標的遺伝子の一部と少なくとも約90％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，アンチセンスRNA分子は標的遺伝子の一部と少なくとも約80％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，アンチセンスRNA分子は標的遺伝子の一部と少なくとも約60％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。別の態様においては，アンチセンスRNA分子は標的遺伝子の一部と少なくとも約100％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。好ましくはオリゴヌクレオチドおよび標的間の相補的でない領域で，約8ヌクレオチドを超えるループは形成されない。
【０１３３】
１つの態様においては，本発明のアンチセンスヌクレオチド配列は，アンチセンス配列の長さの少なくとも約80％にわたって標的核酸配列に相補的である。別の態様においては，本発明のアンチセンス配列は，アンチセンス配列の長さの少なくとも約90-95％にわたって標的核酸配列に相補的である。別の態様においては，本発明のアンチセンス配列は，アンチセンス配列の全長にわたって標的核酸配列に相補的である。
【０１３４】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物に使用されるアンチセンス配列はいずれのタイプであってもよく，それらには例えばモルホリノオリゴヌクレオチド，RNaseH活性化オリゴヌクレオチド，またはリボザイムがある。
【０１３５】
１つの態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは，DNAである核酸分子１つおよびRNAである核酸分子１つ（すなわちそれらのデュープレックス）を含有してもよい。
【０１３６】
本発明のアンチセンス配列はRNA様およびDNA様領域を含む“キメラオリゴヌクレオチド”であってもよい。“RNaseH活性化領域”という用語は，RNaseHをリクルートしてオリゴヌクレオチドが結合する標的RNA鎖を切断する能力があるオリゴヌクレオチド，例えばキメラオリゴヌクレオチドの領域を含む。一般に，RNase活性化領域はDNAまたはDNA様ヌクレオモノマーの最小限のコア（少なくとも約3-5，一般に約3-12，更に一般的には約5-12，そしてより好ましくは約5-10の連続するヌクレオモノマー）を含有する（例えば米国特許第5,849,902号参照）。好ましくは，RNaseH活性化領域は，約9つの連続するデオキシリボース含有ヌクレオモノマーを含む。
【０１３７】
１つの態様においては，連続するヌクレオモノマーは置換結合，例えばホスホロチオエート結合によって結合する。１つの態様においては，本発明のアンチセンス配列は，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する第２の鎖（または自己相補配列）の非存在下では不安定である。すなわち細胞内で分解する。例えば１つの態様においては，キメラアンチセンス配列はホスホロチオエートDNAではなく，未修飾のDNAヌクレオモノマーをギャップ内に含有する。
【０１３８】
“非活性化領域”という用語は，RNaseHをリクルートまたは活性化しないアンチセンス配列，例えばキメラオリゴヌクレオチドの領域を含む。好ましくは，非活性化領域はホスホロチオエートDNAを含まない。本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの非活性化領域を含む。１つの態様においては，非活性化領域を標的に相補的であるようにして，オリゴヌクレオチドが結合すべき標的核酸分子と水素結合を形成させることによって，ヌクレアーゼに対して安定化させるか，または標的への特異性を提供することができる。
【０１３９】
本発明のアンチセンス配列は“モルホリノオリゴヌクレオチド”を含んでもよい。モルホリノオリゴヌクレオチドは非イオン性であり，RNaseH依存的機構により機能する。モルホリノオリゴヌクレオチドの４つの遺伝子塩基（アデニン，シトシン，グアニン，およびチミン／ウラシル）はそれぞれ６員モルホリン環に結合する。モルホリノオリゴヌクレオチドは，例えば非イオン性ホスホロジアミダイトサブユニット間結合によって，４つの異なる型のサブユニットを結合させることによって生成する。２サブユニットのモルホリノオリゴヌクレオチドの例を以下に示す。
【化２２】
2005515780.tif 000019
【０１４０】
モルホリノオリゴヌクレオチドは以下のような多くの利点を有する：ヌクレアーゼに対する完全な耐性（Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1996. 6:267）；予測可能なターゲティング（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；細胞内での確実な活性（Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:63）；優れた配列特異性（Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:151）；最低限の非アンチセンス活性（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；および容易な浸透または摩擦（scrape）運搬（Antisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:291）。モルホリノオリゴヌクレオチドは高用量でも無毒性であるという理由からも好ましい。モルホリノオリゴヌクレオチドの調製についての検討はAntisense & Nuc. Acid Drug Dev. 1997. 7:187に見られる。
【０１４１】
細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込み
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物を１またはそれ以上の細胞または細胞溶解物と接触させ（すなわち，接触するようにする，本明細書においては投与する，またはデリバリーするとも称される），これに取り込ませる。"細胞"との用語には，原核生物細胞および真核生物細胞，好ましくは脊椎動物細胞，およびより好ましくは，哺乳動物細胞が含まれる。好ましい態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物はヒト細胞と接触させる。
【０１４２】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，インビトロで，例えば試験管または培養ディッシュで（被験者に導入してもしなくてもよい），またはインビボで，例えば，哺乳動物被験者等の被験者中で，細胞と接触させることができる。オリゴヌクレオチドはエンドサイトーシスによりゆっくりと細胞に取り込まれるが，エンドサイトーシスされたオリゴヌクレオチドは一般に隔離されており，例えば，標的核酸分子とのハイブリダイゼーションには利用可能ではない。１つの態様においては，細胞取り込みは，エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿により促進させることができる。しかし，これらの方法はインビトロまたはエクスビボの態様でのみ有用であり，便利ではなく，場合によっては細胞毒性を伴う。
【０１４３】
別の態様においては，オリゴヌクレオチドの細胞内へのデリバリーは，当該技術分野において認識されている適当な方法，例えば，リン酸カルシウム，ＤＭＳＯ，グリセロールまたはデキストラン，エレクトロポレーションにより，またはトランスフェクション，例えば，カチオン性，アニオン性または中性の脂質組成物またはリポソームを用いて当該技術分野において知られる方法により増強することができる（例えば，ＷＯ９０／１４０７４；ＷＯ９１／１６０２４；ＷＯ９１／１７４２４；米国特許４，８９７，３５５；Ｂｅｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２１：３５６７を参照）。オリゴヌクレオチドの増強されたデリバリーはまた，ベクター（例えば，Ｓｈｉ，Ｙ．２００３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ２００３  Ｊａｎ  １９：９；Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓｉｓ．２００２．３４（１−２）：１６０−４，Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７；Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：５５１５を参照），ウイルス，ポリアミン，またはポリリジン，プロタミン，またはＮ１，Ｎ１２−ビス（エチル）スペルミン等の化合物を用いるポリカチオンコンジュゲートの使用により媒介することができる（例えば，Ｂａｒｔｚａｔｔ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１３３；Ｗａｇｎｅｒ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：４２５５を参照）。
【０１４４】
コンジュゲート化剤
コンジュゲート化剤はオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合する。１つの態様においては，オリゴヌクレオチドをコンジュゲート化剤に結合させることにより誘導化するかまたは化学的に修飾して，細胞取り込みを容易にすることができる。例えば，コレステロール成分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることにより，細胞取り込みを５から１０倍改良し，これは次に，ＤＮＡ結合を約１０倍改良することができる（Ｂｏｕｔｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２５４：１２９−１３２）。オクチル，ドデシル，およびオクタデシル残基のコンジュゲーションは，未修飾オリゴヌクレオチドと比較して，細胞取り込みを３，４，および１０倍増強させる（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１９７：９５−１０８）。同様に，オリゴヌクレオチドをポリ−Ｌ−リジンで誘導化すると，細胞によるオリゴヌクレオチド取り込みを助けることができる（Ｓｃｈｅｌｌ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ３４０：３２３，およびＬｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔａ  ｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６４８）。
【０１４５】
ある種の蛋白質担体もまたオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを容易にすることができ，これには，例えば，血清アルブミン，核への輸送のシグナルを有する核蛋白質，および細胞膜を浸透しうるウイルスまたは細菌蛋白質が含まれる。したがって，蛋白質担体は，オリゴヌクレオチドと会合させるか連結させたときに有用である。したがって，本発明は，細胞取り込みを容易にすることができる基，例えば，炭化水素および非極性基，コレステロール，長鎖アルコール（すなわち，ヘキサノール），ポリ−Ｌ−リジンおよび蛋白質，ならびに同様の有益な効果を有する他のアリールまたはステロイド基およびポリカチオン，例えば，フェニルまたはナフチル基，キノリン，アントラセンまたはフェナントラセン基，脂肪酸，脂肪酸アルコールおよびセスキテルペン，ジテルペンおよびステロイドによるオリゴヌクレオチドの誘導化を提供する。コンジュゲート化剤を用いることの主な利点は，最初の膜との相互作用を増加させることであり，これはオリゴヌクレオチドの細胞内蓄積を高めることにつながる。
【０１４６】
カプセル化剤
カプセル化剤は，オリゴヌクレオチドをベヒクル中に封入する。本発明の別の態様においては，オリゴヌクレオチドは，担体またはベヒクル，例えば，リポソームまたはミセルと結合させることができるが，当業者により理解されるように，他の担体を用いてもよい。リポソームは，生物学的膜と類似する構造を有する脂質二重層から構成されるベヒクルである。そのような担体を用いて，オリゴヌクレオチドの細胞取り込みまたはターゲティングを容易にすることができ，またはオリゴヌクレオチドの薬物動力学または毒性学的特性を改良することができる。
【０１４７】
例えば，本発明のオリゴヌクレオチドはまた，リポソーム中にカプセル化して，活性成分が脂質層に付着した水性の同心の層から構成されるカプセル中に分散されているかまたは様々に存在する医薬組成物として投与することができる。オリゴヌクレオチドは，その溶解性に依存して，水性層および脂質層の両方に，あるいは，一般にリポソーム性懸濁液と称されるものの中に存在することができる。疎水性層は，限定されないが，一般にリン脂質，例えばレクチンおよびスフィンゴミエリン，ステロイド，例えば，コレステロール，幾分イオン性の界面活性剤，例えば，ジアセチルリン酸，ステアリルアミン，またはホスファチジン酸，または疎水性の性質を有する他の物質を含む。リポソームの直径は，一般に約１５ｎｍ−約５ミクロンの範囲内である。
【０１４８】
リポソームを薬剤デリバリーベヒクルとして使用することにより，いくつかの利点が得られる。リポソームは，細胞内安定性を増加し，取り込み効率を高め，生物学的活性を改良する。リポソームは，細胞膜を構成する脂質と同様の様式で配置されている脂質からなる中空の球形の小胞である。これらは，水溶性化合物を封入するための内部水性空間を有し，直径０．０５−数ミクロンの範囲のサイズである。いくつかの研究により，リポソームは核酸を細胞にデリバリーしうること，および核酸が生物学的に活性なままであることが示されている。例えば，元々研究ツールとして設計されたリポソームデリバリーベヒクル，例えばリポフェクチンは，無傷の核酸分子を細胞にデリバリーすることができる。
【０１４９】
リポソームを使用することの特定の利点には，以下のものが含まれる：組成物中で非毒性であり生分解性である；長い循環半減期を示す；および組織へのターゲティングのために認識分子を容易にその表面に結合させることができる。最後に，リポソーム系医薬品を液体懸濁液または凍結乾燥製品として製造する費用対効果の優れた方法は，許容しうる薬剤デリバリーシステムとしてのこの技術の価値を示す。
【０１５０】
複合体化剤
複合体化剤は，強いが非共有結合的な力（例えば，静電的，ファンデルワールス，パイスタッキング相互作用等）で本発明のオリゴヌクレオチドに結合する。１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドを複合体化剤を用いて複合体化させて，オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増加させることができる。複合体化剤の例には，カチオン性脂質が含まれる。カチオン性脂質は，オリゴヌクレオチドを細胞にデリバリーするために用いることができる。
【０１５１】
"カチオン性脂質"との用語は，極性と非極性の両方のドメインを有し，生理学的ｐＨまたはその周辺で正に荷電することができ，核酸等のポリアニオンに結合し，核酸の細胞内へのデリバリーを容易にする脂質および合成脂質を含む。一般に，カチオン性脂質には，飽和および不飽和アルキルおよび脂環式エーテルおよびアミンのエステル，アミド，またはこれらの誘導体が含まれる。カチオン性脂質の直鎖または分枝鎖のアルキルおよびアルケニル基は，例えば，１−約２５個の炭素原子を含むことができる。好ましい直鎖または分枝鎖のアルキルまたはアルケン基は，６またはそれ以上の炭素原子を有する。非環状基には，コレステロールおよび他のステロイド基が含まれる。カチオン性脂質は，種々のカウンターイオン（アニオン），例えば，Ｃｌ-，Ｂｒ-，Ｉ-，Ｆ-，アセテート，トリフルオロアセテート，硫酸，亜硝酸，および硝酸とともに調製することができる。
【０１５２】
カチオン性脂質の例としては，以下のものが挙げられる：ポリエチレンイミン，ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）星形デンドリマー，リポフェクチン（ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとの組み合わせ），リポフェクターゼ，リポフェクタミン，ＤＯＰＥ，サイトフェクチン（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ），およびユーフェクチン（ＪＢＬ，ＳａｎＬｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，ＣＡ）。例示的カチオン性リポソームは，以下のものから製造することができる：塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレオールオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ），硫酸Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル（ＤＯＴＡＰ），３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ），２，３，−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ），臭化１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）。例えば，カチオン性脂質である塩化Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）は，ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を１０００倍増加させることが見いだされている（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１９７：９５−１０８）。オリゴヌクレオチドはまた，ポリ（Ｌ−リジン）またはアビジンと複合体化してもよく，この混合物には，脂質が含まれていても含まれていなくてもよい（例えば，ステリル−ポリ（Ｌ−リジン）。
【０１５３】
カチオン性脂質は，当該技術分野において，オリゴヌクレオチドを細胞にデリバリーするために用いられている（例えば，米国特許５，８５５，９１０；５，８５１，５４８；５，８３０，４３０；５，７８０，０５３；５，７６７，０９９；Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：３１７６；Ｈｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１５：１を参照）。本発明のオリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするために用いることができる他の脂質組成物を本発明の方法と関連して用いることができる。上述したものに加えて，他の脂質組成物も当該技術分野において知られており，例えば，米国特許４，２３５，８７１；米国特許４，５０１，７２８；４，８３７，０２８；４，７３７，３２３に教示されている。
【０１５４】
１つの態様においては，脂質組成物は，オリゴヌクレオチドの脂質媒介性トランスフェクションを促進するために，ウイルス蛋白質等の試薬をさらに含むことができる（Ｋａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：５３６）。別の態様においては，例えば米国特許５，７３６，３９２に教示されるように，オリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチド，ペプチド，および脂質を含む組成物の一部として細胞と接触させる。血清に対する耐性を有する改良された脂質も記載されている（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：３１７６）。カチオン性脂質および他の複合体形成試薬は，エンドサイトーシスにより細胞内に運ばれるオリゴヌクレオチドの数を増加させるよう作用する。
【０１５５】
別の態様においてはＮ−置換グリシンオリゴヌクレオチド（ペプトイド）を用いて，オリゴヌクレオチドの取り込みを最適化することができる。ペプトイドは，トランスフェクション用のカチオン性脂質様化合物を作成するために用いられている（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１５１７）。ペプトイドは，標準的な方法を用いて合成することができる（例えば，Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０６４６；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４０：４９７）。また，カチオン性脂質と，ペプトイド，リプトイドとの組み合わせを用いて，対象とするオリゴヌクレオチドの取り込みを最適化することができる（Ｈｕｎａｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．５：３４５）。リプトイドはペプトイドオリゴヌクレオチドを合成し，アミノ末端サブモノマーをそのアミノ基を介して脂質にカップリングさせることにより，合成することができる（Ｈｕｎａｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．５：３４５）。
【０１５６】
当該技術分野においては，正に荷電したアミノ酸を用いて非常に活性の高いカチオン性脂質を作成しうることが知られている（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：３１７６）。１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドをデリバリーするための組成物は，親油性成分に結合した多くのアルギニン，リジン，ヒスタジンまたはオルニチン残基を含む（例えば，米国特許５，７７７，１５３を参照）。
【０１５７】
別の態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドをデリバリーするための組成物は，約１−約４個の塩基性残基を有するペプチドを含む。これらの塩基性残基は，例えば，ペプチドのアミノ末端，Ｃ末端，または内部領域に存在することができる。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において明確に定められている。これらのファミリーには，塩基性側鎖（例えば，リジン，アルギニン，ヒスチジン），酸性側鎖（例えば，アスパラギン酸，グルタミン酸），非荷電極性側鎖（例えば，グリシン（これはまた非極性であるとも考えられる），アスパラギン，グルタミン，セリン，トレオニン，チロシン，システイン），非極性側鎖（例えば，アラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，プロリン，フェニルアラニン，メチオニン，トリプトファン），ベータ分枝側鎖（例えば，トレオニン，バリン，イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば，チロシン，フェニルアラニン，トリプトファン，ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。塩基性アミノ酸とは別に，ペプチドの他の残基の大部分またはすべてを非塩基性アミノ酸，例えば，リジン，アルギニン，またはヒスチジン以外のアミノ酸から選択することができる。好ましくは，長い中性側鎖を有する多数の中性アミノ酸を用いる。例えば，（Ｎ−末端）Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−（Ｃ−末端）（配列番号１）等のペプチドを用いることができる。１つの態様においては，そのような組成物は，当該技術分野においてよく知られるように，融合誘導性脂質ＤＯＰＥと混合することができる。
【０１５８】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させるべき細胞を，オリゴヌクレオチドと脂質（例えば上述の脂質または脂質組成物の１つ）を含む混合物とを含む混合物と約１２時間から約２４時間接触させる。別の態様においては，オリゴヌクレオチド組成物と接触させるべき細胞を，オリゴヌクレオチドと脂質（例えば上述の脂質または脂質組成物の１つ）を含む混合物とを含む混合物と約１日から約５日間接触させる。１つの態様においては，細胞を，脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と約３日間から約３０日間程度の長い期間まで接触させる。別の態様においては，脂質を含む混合物を，少なくとも約５−約２０日間細胞と接触させたままにする。別の態様においては，脂質を含む混合物を少なくとも約７−約１５日間細胞と接触させたままにする。
【０１５９】
例えば，１つの態様においては，本明細書に記載されるようなより長いインキュベーション期間のために，オリゴヌクレオチド組成物を脂質，例えばサイトフェクチンＣＳまたはＧＳＶ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから入手可能），ＧＳ３８１５，ＧＳ２８８８の存在下で細胞と接触させることができる。
【０１６０】
１つの態様においては，細胞と脂質およびオリゴヌクレオチド組成物を含む混合物とのインキュベーションは，細胞の生存率を低下させない。好ましくは，トランスフェクション期間の後，細胞は実質的に生存可能である。１つの態様においては，トランスフェクション後，細胞は少なくとも約７０から少なくとも約１００パーセント生存可能である。別の態様においては，細胞は少なくとも約８０から少なくとも約９５％生存可能である。さらに別の態様においては，細胞は少なくとも約８５％から少なくとも約９０％生存可能である。
【０１６１】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドを，本明細書において"輸送ペプチド"と称される，オリゴヌクレオチドを細胞内に輸送するペプチド配列を結合させることにより修飾する。１つの態様においては，組成物は，蛋白質をコードする標的核酸分子に相補的な，輸送ペプチドに共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。
【０１６２】
"輸送ペプチド"との用語には，オリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を容易にするアミノ酸配列が含まれる。これらと連結している成分を細胞内に輸送することを容易にするペプチドの例は当該技術分野において知られており，例えば，ＨＩＶ  ＴＡＴ転写因子，ラクトフェリン，ヘルペスＶＰ２２蛋白質，および線維芽細胞成長因子２が挙げられる（Ｐｏｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１６：８５７；およびＤｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．８：８４；Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ．１９９７．Ｃｅｌｌ８８：２２３）。
【０１６３】
例えば，１つの態様においては，輸送ペプチドは，アンテナペディア蛋白質に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは，ペプチドは，アンテナペディア蛋白質のアミノ酸４３−５８（Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号２），またはオリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を容易にするその一部または変種を含む（例えば，ＷＯ９１／１８９８；Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：８４を参照）。変種の例は，Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（上掲）に記載される。
【０１６４】
１つの態様においては，輸送ペプチドは，トランスポータン，ガラニン（１−１２）−Ｌｙｓ−マストパラン（１−１４）アミド，蛋白質に由来するアミノ酸配列を含む（Ｐｏｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：８５７）。好ましくは，ペプチドは，配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３）で示されるトランスポータン蛋白質のアミノ酸，またはオリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を容易にするその一部または変種を含む。
【０１６５】
１つの態様においては，輸送ペプチドは，ＨＩＶ  ＴＡＴ蛋白質に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは，ペプチドは，ＨＩＶ  ＴＡＴ蛋白質のアミノ酸３７−７２，例えば，Ｃ（Ａｃｍ）ＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（配列番号４）（ＴＡＴ３７−６０；式中，Ｃ（Ａｃｍ）はＣｙｓ−アセトアミドメチルである）で示される配列またはその一部または変種，例えば，オリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を容易にするＣ（Ａｃｍ）ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（配列番号５）（ＴＡＴ４８−４０）またはＣ（Ａｃｍ）ＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＰＰＱＣ（配列番号６）（ＴＡＴ４３−６０）を含む（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０）。別の態様においては，ペプチド（Ｇ）ＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱ（配列番号７）を用いることができる。
【０１６６】
輸送ペプチドの一部または変種を試験して，これらの活性，例えば，蛍光標識したオリゴヌクレオチドを細胞に輸送する能力を，天然のペプチドの活性と比較することにより，これらのペプチド部分と同等であるか否かを容易に判定することができる。天然の輸送ペプチドがオリゴヌクレオチドを細胞内に輸送する能力を維持しているフラグメントまたは変種は，機能的に同等であり，天然のペプチドの代わりに用いることができる。
【０１６７】
オリゴヌクレオチドは，既知の手法を用いて輸送ペプチドに結合させることができる（例えば，Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ａ．１９９６．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：６２９；Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：８４；Ｔｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：２５３），Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０）。例えば，１つの態様においては，活性化されたチオール基を有するオリゴヌクレオチドは，そのチオール基を介して輸送ペプチド中に存在するシステイン（例えば，Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：８４；Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ．１９９６に教示されるような，アンテナペディアホメオドメインの第２ヘリックスと第３ヘリックスとの間のβターンに存在するシステイン）に結合させる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：６２９；Ａｌｌｉｎｑｕａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２８：９１９）。別の態様においては，Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−（Ｎｐｙｓ）ＯＨ基を輸送ペプチドに最後（Ｎ末端）のアミノ酸として結合させ，ＳＨ基を有するオリゴヌクレオチドをこのペプチドに結合させることができる（Ｔｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：２５３）。
【０１６８】
１つの態様においては，連結基をヌクレオモノマーに結合させることができ，輸送ペプチドをリンカーに共有結合させることができる。１つの態様においては，リンカーは，輸送ペプチドのための結合部位として機能することができ，ヌクレアーゼに対する安定性を与えることができる。抵当なリンカーの例としては，置換または未置換のＣ1−Ｃ20アルキル鎖，Ｃ2−Ｃ20アルケニル鎖，Ｃ2−Ｃ20アルキニル鎖，ペプチドおよびヘテロ原子（例えば，Ｓ，Ｏ，ＮＨ，等．）が挙げられる。他の例示的リンカーには，二官能性架橋剤，例えば，スルホスクシンイミジル−４−（マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）（例えば，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９１．２７６：４１７−２を参照）が含まれる。
【０１６９】
１つの態様においては，本発明のオリゴヌクレオチドは，遺伝子を細胞内にデリバリーするためにレセプター媒介性エンドサイトーシスメカニズムを利用する分子コンジュゲートとして合成する（例えば，Ｂｕｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１８：５５９およびこの中に引用されている文献を参照）。
【０１７０】
ターゲティング剤
オリゴヌクレオチドのデリバリーはまた，オリゴヌクレオチドを細胞レセプターにターゲティングすることにより改良することができる。ターゲティング成分をオリゴヌクレオチドにコンジュゲート化するか，またはオリゴヌクレオチドに結合した担体基（すなわち，ポリ（Ｌ−リジン）またはリポソーム）に結合させることができる。この方法は，特定のレセプター媒介性エンドサイトーシスを示す細胞によく適している。
【０１７１】
例えば，６−ホスホマンノシル化蛋白質とコンジュゲート化させたオリゴヌクレオチドは，マンノース６−リン酸特異的レセプターを発現する細胞により，遊離オリゴヌクレオチドより２０倍高い効率で内在化される。オリゴヌクレオチドはまた，生分解性リンカーを用いて細胞レセプターのリガンドに結合させることができる。別の例においては，デリバリーコンストラクトはマンノシル化ストレプトアビジンであり，これはビオチニル化オリゴヌクレオチドと密接な複合体を形成する。マンノシル化ストレプトアビジンは，ビオチニル化オリゴヌクレオチドの内在化を２０倍増加させることが見いだされた（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１９７：９５−１０８）。
【０１７２】
さらに，特定のリガンドをポリリジン系デリバリーシステムのポリリジン成分にコンジュゲート化することができる。例えば，トランスフェリン−ポリリジン，アデノウイルス−ポリリジン，およびインフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ−２Ｎ末端融合誘導性ペプチド−ポリリジンコンジュゲートは，真核生物細胞においてレセプター媒介性ＤＮＡデリバリーを非常に増強する。アベオラーマクロファージにおいてオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強するためにポリ（Ｌ−リジン）にコンジュゲート化したマンノシル化糖蛋白質が用いられている（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  ５４：５５９−５６６）。
【０１７３】
悪性細胞は必須栄養素，例えば葉酸およびトランスフェリンの必要性が増加しているため，これらの栄養を用いてオリゴヌクレオチドを癌性細胞にターゲティングすることができる。例えば，葉酸をポリ（Ｌ−リジン）に結合させると，前骨髄球白血病（ＨＬ−６０）細胞およびヒト黒色腫（Ｍ−１４）細胞において，増強されたオリゴヌクレオチド取り込みが見られる（Ｇｉｎｏｂｂｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：２９）。別の例においては，マレイル化ウシ血清アルブミン，葉酸，またはプロトポルフィリンＩＸ第二鉄でコーティングしたリポソームは，ネズミマクロファージであるＫＢ細胞，および２．２．１５ヒト肝癌細胞におけるオリゴヌクレオチドの細胞取り込みの増強を示す（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｐｈａｒｍａｚｉｅ  ５４：５５９−５６６）。
【０１７４】
リポソームは自然には肝臓，脾臓，および細網内皮系において蓄積される（いわゆる受動ターゲティング）。リポソームを種々のリガンド，例えば，抗体またはプロテインＡと結合させることにより，これらを特定の細胞集団に能動的にターゲティングすることができる。例えば，プロテインＡ含有リポソームを，Ｌ細胞で発現されるマウス主要組織適合性複合体をコードするＨ−２Ｋ蛋白質を標的とするＨ−２Ｋ特異的抗体で前処理することができる（Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１９７：９５−１０８）。
【０１７５】
オリゴヌクレオチド安定性のアッセイ
好ましくは，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを安定化する。すなわち，エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性とする。オリゴヌクレオチドは，内因性細胞ヌクレアーゼによる攻撃に対して対応する一本鎖オリゴヌクレオチドより少なくとも約３倍耐性が高い場合，ヌクレアーゼに対して実質的に耐性であり，少なくとも約６倍耐性が高い場合，高度にヌクレアーゼ耐性であると定義される。これは，当該技術分野において知られる手法を用いて，本発明のオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して実質的に耐性であることを示すことにより示すことができる。
【０１７６】
実質的な安定性を示すことができる１つの方法は，蛋白質レベルを測定することにより，またはｍＲＮＡの切断を測定することにより，本発明のオリゴヌクレオチドが細胞にデリバリーされたときに機能すること，例えば，標的核酸分子の転写または翻訳を低下させることを示すことである。標的ＲＮＡの安定性を測定するアッセイは，トランスフェクションの約２４時間後に行うことができる（例えば，当該技術分野において知られるノザンブロット手法，ＲＮａｓｅ保護アッセイ，またはＱＣ−ＰＣＲアッセイを用いて）。あるいは，標的蛋白質のレベルを測定することができる。好ましくは，目的とするＲＮＡまたは蛋白質レベルを試験することに加えて，特異性の対照として対照である非標的遺伝子（例えば，アクチン，または好ましくは標的に類似する配列を有する対照）のＲＮＡまたは蛋白質レベルを測定する。ＲＮＡまたは蛋白質の測定は，当該技術分野において認められている任意の手法を用いて行うことができる。好ましくは，測定はトランスフェクションの約１６−２４時間後から始める（Ｍ．Ｙ．Ｃｈｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６６：１８１６２−７１；Ｔ．Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２１  ３８５７）。
【０１７７】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物が蛋白質合成を阻害する能力は，当該技術分野において知られる手法を用いて，例えば遺伝子転写または蛋白質合成の阻害を検出することにより，測定することができる。例えば，ヌクレアーゼＳ１マッピングを行うことができる。別の例においては，ノザンブロット分析を用いて，特定の蛋白質をコードするＲＮＡの存在を測定することができる。例えば，塩化カルシウムのクッション上で総ＲＮＡを調製することができる（例えば，Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照）。次に，ＲＮＡを用いてノザンブロットを行い，探索することができる（例えば，上掲を参照）。別の例においては，標的蛋白質により生成される特定のｍＲＮＡのレベルを，例えばＰＣＲを用いて測定することができる。さらに別の例においては，ウエスタンブロットを用いて，存在する標的蛋白質の量を測定することができる。さらに別の態様においては，蛋白質の量によって影響を受ける表現型を検出することができる。ウエスタンブロットを行う手法は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２５９を参照）。
【０１７８】
別の例においては，標的遺伝子のプロモーター配列をレポーター遺伝子と連結し，レポーター遺伝子の転写をモニターすることができる（例えば，以下により詳細に記載されるように）。あるいは，標的核酸分子の一部をレポーター遺伝子と融合させて，レポーター遺伝子が転写されるようにすることにより，プロモーターを標的としないオリゴヌクレオチド組成物を同定することができる。オリゴヌクレオチド組成物の存在下でレポーター遺伝子の発現の変化をモニターすることにより，オリゴヌクレオチド組成物がレポーター遺伝子の発現を阻害する有効性を判定することが可能である。例えば，１つの態様においては，有効なオリゴヌクレオチド組成物は，レポーター遺伝子の発現を低下させるであろう。
【０１７９】
"レポーター遺伝子"とは，検出可能な遺伝子産物を発現する核酸であり，遺伝子産物はＲＮＡであっても蛋白質であってもよい。ｍＲＮＡ発現の検出はノザンブロッティングにより行うことができ，蛋白質の検出は蛋白質に特異的な抗体を用いる染色により行うことができる。好ましいレポーター遺伝子は，容易に検出可能な産物を産生する。レポーター遺伝子は，レポーター遺伝子産物の検出が制御配列の転写活性の測定値を与えるように，制御ＤＮＡ配列に動作可能なように連結させることができる。好ましい態様においては，レポーター遺伝子の遺伝子産物は，その産物に伴う固有の活性により検出される。例えば，レポーター遺伝子は酵素活性により色，蛍光，または発光に基づく検出可能なシグナルを生じる遺伝子産物をコードすることができる。レポーター遺伝子の例としては，限定されないが，クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ），ルシフェラーゼ，β−ガラクトシダーゼ，およびアルカリホスファターゼをコードするものが挙げられる。  
【０１８０】
当業者は，本発明において用いるのに適した多くのレポーター遺伝子を容易に認識するであろう。これらには，限定されないが、，クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ），ルシフェラーゼ，ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ），およびベータ−ガラクトシダーゼが含まれる。そのようなレポーター遺伝子の例は，Ｆ．Ａ．Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８９））に見いだすことができる。検出可能な産物，例えば，検出可能な酵素活性を有するか，これに対して特異的な抗体を生成することができる任意の産物をコードする任意の遺伝子を，本発明の方法においてレポーター遺伝子として用いることができる。
【０１８１】
１つのレポーター遺伝子システムは，蛍ルシフェラーゼレポーターシステムである（Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．１９８８．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７：４０４−４０８；本明細書の一部としてここに引用する）。ルシフェラーゼアッセイは迅速であり感度が高い。このアッセイにおいては，試験細胞の溶解物を調製し，ＡＴＰおよび基質であるルシフェリンと混合する。コードされる酵素ルシフェラーゼは，基質の急速なＡＴＰ依存性酸化を触媒して，発光性の生成物を生成する。総光出力を測定し，これは広範な酵素濃度の範囲で，存在するルシフェラーゼの量に比例する。
【０１８２】
ＣＡＴはしばしば用いられる別のレポーター遺伝子システムである。このシステムの主な利点は，これが広範囲に確認されプロモーター活性の尺度として広く受け入れられていることである（Ｇｏｒｍａｎ  Ｃ．Ｍ．，Ｍｏｆｆａｔ，Ｌ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｈ．１９８２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２：１０４４−１０５１）。この系においては，試験細胞をＣＡＴ発現ベクターでトランスフェクトし，最初のトランスフェクションから２−３日間，候補物質とともにインキュベートする。その後，細胞抽出物を調製する。抽出物をアセチルＣｏＡおよび放射活性クロラムフェニコールとともにインキュベートする。インキュベーションの後，薄層クロマトグラフィーにより，アセチル化されたクロラムフェニコールをアセチル化されていない形から分離する。このアッセイにおいては，アセチル化の程度は特定のプロモーターによるＣＡＴ遺伝子活性を反映する。
【０１８３】
別の適当なレポーター遺伝子システムは，ｈＧＨの免疫学的検出に基づくものである。このシステムもまた迅速であり使用が容易である（Ｓｅｌｄｅｎ，Ｒ．，Ｂｕｒｋｅ−Ｈｏｗｉｅ，Ｋ．Ｒｏｗｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．（１９８６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，６：３１７３−３１７９；本明細書の一部としてここに引用する）。ｈＧＨシステムは，発現されたｈＧＨポリペプチドを細胞抽出物ではなく培地中でアッセイしうるという利点を有する。すなわち，このシステムは，試験細胞の破壊を必要としない。このレポーター遺伝子システムの原理はｈＧＨに限定されるものではなく，これに対して許容しうる特異性を有する抗体が入手可能であるかまたは製造可能である任意のポリペプチドの使用に適合しうることが理解されるであろう。
【０１８４】
１つの態様においては，本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性を測定し，対照，例えば，当該技術分野において典型的に用いられるＲＮＡｉ分子（例えば，２５ヌクレオチドより短い長さであり２ヌクレオチド塩基オーバーハングを含むデュープレックスオリゴヌクレオチド），または平滑末端を有する未修飾ＲＮＡデュープレックスと比較する。
【０１８５】
オリゴヌクレオチドの合成
本発明のオリゴヌクレオチドは，当該技術分野において知られる任意の方法により，例えば，酵素的合成および化学合成を用いて製造することができる。オリゴヌクレオチドは，インビトロ（例えば，酵素合成および化学合成を用いて），またはインビボ（当該技術分野においてよく知られる組換えＤＮＡ技術を用いて）で合成してもよい。
【０１８６】
好ましい態様においては，化学合成を用いる。直鎖状オリゴヌクレオチドの化学合成は当該技術分野においてよく知られており，溶液相または固相手法により行うことができる。好ましくは，合成は固相法により行う。オリゴヌクレオチドは，いくつかの異なる合成方法，例えば，ホスホルアミダイト，ホスファイトトリエステル，Ｈ−ホスホネート，およびホスホトリエステル方法のいずれを用いて製造してもよく，典型的には自動化合成法により製造する。
【０１８７】
オリゴヌクレオチド合成のプロトコルは当該技術分野においてよく知られており，例えば，米国特許５，８３０，６５３；ＷＯ９８／１３５２６；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．１９８４．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．１９８５．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：３９０８；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．１９８５．３２６：２６３；ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８６．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９８６．１４：９０８１；ＦａｓｍａｎＧ．Ｄ．，１９８９．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９８９．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；Ｌａｍｏｎｅ．１９９３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２１：１；米国特許５，０１３，８３０；米国特許５，２１４，１３５；米国特許５，５２５，７１９；Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：８３１；ＷＯ９２／０３５６８；米国特許５，２７６，０１９；米国特許５，２６４，４２３に見いだすことができる。
【０１８８】
選択される合成方法は，所望のオリゴヌクレオチドの長さによって異なり，そのような選択は当業者の能力の範囲内である。例えば，ホスホルアミダイトおよびホスファイトトリエステル法により，１７５またはそれ以上のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを製造することができ，一方，Ｈ−ホスホネート法は１００ヌクレオチドより短いオリゴヌクレオチドについてよく作用する。修飾塩基をオリゴヌクレオチド中に取り込む場合，特に修飾ホスホジエステル結合を用いる場合には，既知の方法にしたがって必要に応じて合成方法を変更する。この点に関して，Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５８４）は，修飾塩基および修飾ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドを製造する方法の参考文献および概要を提供する。オリゴヌクレオチドを製造する他の例示的方法は，Ｓｏｎｖｅａｕｘ（１９９４．"Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"；Ａｇｒａｗａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６：１）に教示されている。例示的合成方法は，"Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ"（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．１９８４）にも教示されている。さらに，規定された配列の直鎖状オリゴヌクレオチド，例えば修飾 ヌクレオチドを有するいくつかの配列はいくつかの商業的起源から容易に入手可能である。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドは，ポリアクリルアミドゲル電気泳動により，または多くのクロマトグラフィー法，例えば，ゲルクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーのいずれかにより精製することができる。ヌクレオチド配列を確認するためには，オリゴヌクレオチドを，既知の方法のいずれか，例えば，マキサム−ギルバートシークエンシング，サンガーシークエンシング，キャピラリー電気泳動シークエンシング，ワンダリングスポットシークエンシング法により，またはハイボンド紙に結合したオリゴヌクレオチドの選択的化学分解を用いることにより，ＤＮＡシークエンシングに供することができる。また，短いオリゴヌクレオチドの配列は，レーザー脱着質量分析または高速原子衝撃により分析することができる（ＭｃＮｅａｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：９７６；Ｖｉａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４：８３；Ｇｒｏｔｊａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１０：４６７１）。シークエンシング法はＲＮＡオリゴヌクレオチドについても利用可能である。
【０１９０】
合成したオリゴヌクレオチドの質は，キャピラリー電気泳動および変性強アニオンＨＰＬＣ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）で，ＢｅｒｇｏｔおよびＥｇａｎの方法（１９９２．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．５９９：３５）を用いてオリゴヌクレオチドを試験することにより確認することができる。
【０１９１】
他の例示的合成手法は当該技術分野においてよく知られている（例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（ＤＮＧｌｏｖｅｒＥｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪＧａｉｔＥｄ，１９８４；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  ＳＪ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；または，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照）。
【０１９２】
オリゴヌクレオチドの使用
本発明はまた，細胞を上述のオリゴヌクレオチド組成物と接触させることを含む，細胞において蛋白質の発現を阻害する方法を特徴とする。
【０１９３】
本発明のオリゴヌクレオチドを，種々のインビトロおよびインビボ状況で用いて，蛋白質発現を特異的に阻害することができる。本発明の方法および組成物は，インビトロおよびインビボの両方の用途に適している。
【０１９４】
本発明の方法は，細胞または生物における遺伝子の機能を決定するために，または細胞および生物においてＲＮＡ干渉に応答しうるかまたはこれを媒介しうる遺伝子の機能を調節するために用いることができる。細胞は好ましくは真核生物細胞または細胞株，例えば，哺乳動物細胞等の動物細胞，例えば，胚細胞，多能性幹細胞，奇形癌細胞等の腫瘍細胞，またはウイルス感染細胞である。生物は好ましくは真核生物，例えば，哺乳動物等の動物，特にヒトである。
【０１９５】
本発明は，インビトロで細胞における標的遺伝子の発現を阻害する方法を含む。例えば，そのような方法は，標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量のＲＮＡを細胞内に導入することを含み，ここで，ＲＮＡは本発明の二本鎖分子である。さらに例を挙げると，そのようなＲＮＡ分子は，標的遺伝子のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列から本質的になる第１の鎖，標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なリボヌクレオチド配列から本質的になる第２の鎖を有することができ，ここで，第１および第２の鎖は別々の相補的鎖であるかまたはループにより結合されており，これらは，デュープレックス組成物が標的遺伝子の発現を阻害するように，互いにハイブリダイズして前記二本鎖分子を形成する。デュープレックス組成物は上述したように修飾ヌクレオモノマーを含んでいてもよい。
【０１９６】
本発明はまた，無脊椎動物において標的遺伝子の発現を阻害する方法に関する。そのような方法は，標的遺伝子を含む標的細胞を含む無脊椎動物を用意することを含み，ここで，標的細胞はＲＮＡ干渉に感受性であり，標的細胞中で標的遺伝子が発現されている。そのような方法はさらに，無脊椎動物を本発明のＲＮＡ組成物と接触させることを含む。例えば，ＲＮＡは，標的遺伝子のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列から本質的になる第１の鎖，および標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なリボヌクレオチド配列から本質的になる第２の鎖を有する二本鎖分子であってもよい。そのような場合，第１および第２のリボヌクレオチド配列は，別々の相補的鎖であってもよく，またはループにより結合されていてもよく，これらは互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。最後に，そのような方法は，デュープレックスＲＮＡ組成物を標的細胞中に導入し，このことにより標的遺伝子の発現を阻害する工程を含む。
【０１９７】
１つの態様においては，遺伝子の機能を同定する方法において，本発明のオリゴヌクレオチドを用いて，インビトロで遺伝子機能を阻害することができる。このようにして，同定されているがその機能が示されていない遺伝子の転写を阻害して，遺伝子が転写されないとき細胞の表現型がどのように変化するかを決定することができる。そのような方法は，例えば，オリゴヌクレオチドを用いるかまたは他の療法を用いる臨床治療の標的として遺伝子を評価するのに有用である。
【０１９８】
本発明の組成物の効力を決定するためには，種々のエンドポイントを用いることができる。上述したアッセイに加えて，例えば，核酸プローブ（例えば，アレイの形で）を用いて，細胞により生成する転写パターンを評価することができる。また，プローブはペプチド，蛋白質，または蛋白質ドメインに向けてもよく，例えば，特定の蛋白質の発現を検出するために抗体を用いることができる。さらに別の態様においては，蛋白質の機能（例えば酵素活性）を測定することができる。さらに別の態様においては，細胞の表現型を評価して，標的蛋白質が発現されているか否かを判定することができる。例えば，組成物が癌に関連する細胞の表現型に影響を及ぼす能力を試験することができる。
【０１９９】
１つの態様においては，１またはそれ以上の追加の薬剤（例えば，活性化剤，誘導剤，増殖促進剤，腫瘍プロモーター）を細胞に加えることができる。
【０２００】
別の態様においては，本発明の組成物を用いて，生化学反応，例えば，蛋白質，核酸，小分子等の間の相互作用をモニターすることができる（例えば，抗原と抗体との間；またはレセプター（例えば，精製されたレセプターまたは細胞膜に結合しているレセプター）とそのリガンド，アゴニストまたはアンタゴニストとの間；または酵素（例えば，プロテアーゼまたはキナーゼ）とその基質との間の相互作用の効力または特異性，または生成物に変換された基質の量の増加または減少；ならびに他の多くのもの）。そのような生化学的アッセイは，プローブまたは標的の特性を特徴決定するために，またはスクリーニングアッセイの基礎として用いることができる。例えば，特定のプロテアーゼ（例えば，血液凝固に関与するプロテアーゼ，例えばプロテアーゼＸａおよびＶＩＩａ）の存在についてサンプルをスクリーニングするためには，例えば，目的とする各プロテアーゼに特異的な蛍光発生性基質であるプローブを用いてサンプルをアッセイすることができる。標的プロテアーゼが基質に結合してこれを切断すれば，通常は２つのエネルギー転移対の間の切断および分離の結果として基質から蛍光が発生し，シグナルを検出することができる。別の例においては特定のキナーゼ（例えば，チロシンキナーゼ）の存在についてサンプルをスクリーニングするためには，目的とするキナーゼの１つにより選択的にリン酸化されることができるペプチドをプローブとして用いることにより，目的とする１またはそれ以上のキナーゼを含むサンプルをアッセイすることができる。当該技術分野において認められ日常的に測定可能な条件を用いて，サンプルを必要な補因子を含む適当な緩衝液中で基質のアレイとともに，経験的に決定される時間インキュベートする。必要ならば洗浄等により反応を停止し，例えば，これらを検出可能な試薬，例えば，フルオレセイン標識抗ホスホチロシンまたは抗ホスホセリン抗体とともにインキュベートしてシグナルを検出することにより，リン酸化された基質を検出することができる。
【０２０１】
別の態様においては，本発明の組成物を用いて，遺伝子発現のパターンを調節する試薬をスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドのアレイを用いて，例えば，１組の遺伝子からのその発現のパターンが特定の生理学的状態または発生段階，または疾病状態と相関するｍＲＮＡ種を同定することができる（"相関的"遺伝子，ＲＮＡｓ，または発現パターン）。"相関する"または"相関的"との用語は，ＲＮＡの合成パターンが細胞の生理学的状態と関連していることを意味するが，所与のＲＮＡの発現が特定の生理学的状態の原因であるかまたはこれを引き起こすことは必要ではない。例えば，特定の疾病状態のモデルとして働く細胞中で調節される（例えば，アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされる）ｍＲＮＡの小さい集合を同定することができる。病原的表現型を示さない正常細胞におけるものと比較して変更しているこの発現のパターンは，疾病状態の指標として働くことができる（"指標"または"相関的"遺伝子，ＲＮＡ，または発現パターン）。
【０２０２】
選択された指示体の発現パターンを調節する（例えば，オリゴヌクレオチドと逆のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド，またはミスマッチ塩基を含む対照組成物と比較して）組成物は，特定の標的遺伝子が治療的介在の潜在的標的であることを示すことができる。さらに，そのような組成物は，インビトロ発現系でまたはインビボ療法において，細胞の発現パターンを調節する治療剤として有用でありうる。本明細書において用いる場合，"調節する"とは，測定可能な反応に関与する分子等の量または活性の増加または減少を引き起こすことを意味する。１つの態様においては，一連の細胞（例えば疾病モデルから）を一連の薬剤と接触させ（例えば，約１０分間−約４８時間またはそれ以上の時間），日常的な当該技術分野において認められている方法（例えば市販のキット）を用いて，総ＲＮＡまたはｍＲＮＡ抽出物を作成することができる。ＲＮＡの量を増幅することが望ましい場合には，標準的な方法，例えば，ＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いることができる（例えば，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（１９９６）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。抽出物（またはこれから増幅された生成物）は，適当な指示体ＲＮＡ用のプローブと接触させて（例えば共にインキュベートして），指示体の発現パターンの変化に関連する薬剤を同定することができる。
【０２０３】
同様に，特定の生理学的状態または発生段階に関連する発現パターンを調節する薬剤を同定することができる。そのような薬剤は，人工的なまたは天然に生ずる物質，例えば，胚発生または生理学的反応の制御に関与する物質等の環境因子でありうる。
【０２０４】
１つの態様においては，本明細書に記載される方法は，多数の標的遺伝子（例えば，用いる特定のフォーマットにより，約１０００またはそれ以上の数）を迅速に同時にアッセイする"ハイスループット"の様式で実施することができる。さらに，多くのアッセイフォーマット（例えば，プレートまたは表面）を一度に加工することができる。例えば，本発明のオリゴヌクレオチドは，これらを組成物中に組み込む前に個々に試験する必要がないため，容易に合成することができ，多数の標的遺伝子を一度に試験することができる。例えば，それぞれが標的核酸分子を含む生物学的サンプル（例えば細胞）を含む多数のサンプルおよび本発明の組成物をアッセイフォーマットの別々の領域に加えて，各サンプルについてアッセイを行うことができる。
【０２０５】
オリゴヌクレオチド組成物の投与
オリゴヌクレオチドの投与またはデリバリーの最適な経路は，所望の結果および／または治療すべき被験者によって様々である。本明細書において用いる場合，"投与"とは，細胞をオリゴヌクレオチドと接触させることを表し，これはインビトロで行ってもよく，インビボで行ってもよい。オリゴヌクレオチドの投与量は，標的核酸分子から翻訳される蛋白質の発現，例えば，過度の実験を行うことなくＲＮＡ安定性の読み出しによりまたは治療上の応答により測定される発現を，最適に減少させるように調節することができる。
【０２０６】
例えば，核酸標的によりコードされる蛋白質の発現を測定して，これにしたがって投与計画を調節する必要があるか否かを判定することができる。さらに，細胞中のまたは細胞により産生されるＲＮＡまたは蛋白質のレベルの増加または減少は，当該技術分野において認められている任意の手法を用いて測定することができる。転写が減少したか否かを判定することにより，オリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの切断を誘導する効力を判定することができる。
【０２０７】
上述のいずれのオリゴヌクレオチド組成物も，単独で用いてもよく，薬学的に許容しうる担体と組み合わせて用いてもよい。本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる担体"には，適当な溶媒，分散媒体，コーティング剤，抗菌剤および抗真菌剤，等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体および薬剤を用いることは，当該技術分野においてよく知られている。活性成分と適合性でない場合を除き，任意の慣用の媒体または薬剤を治療用組成物において用いることができる。補充的活性成分もまた組成物中に含有させることができる。
【０２０８】
オリゴヌクレオチドは，非経口投与用に，リポソームまたはポリエチレングリコールで修飾したリポソーム中に取り込むか，またはカチオン性脂質と混合することができる。追加の物質，例えば，特定の標的細胞上に見いだされる膜蛋白質に対して反応性の抗体をリポソーム中に取り込み，特定のタイプの細胞へのオリゴヌクレオチドのターゲティングを助けることができる。
【０２０９】
さらに，本発明は，オリゴヌクレオチドを連続的に注入する浸透圧ポンプ，例えば，Ｒａｔａｉｃｚａｋら（１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１８２３−１１８２７）に記載されるものを用いて，被験者にオリゴヌクレオチドを投与することを提供する。そのような浸透圧ポンプは，例えば，Ａｌｚｅｔ  Ｉｎｃ．（ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。カチオン性脂質担体中での局所投与および非経口投与が好ましい。
【０２１０】
インビボ用途に関しては，本発明の処方は，選択された投与経路に適合した種々の形態で，例えば，非経口的に，経口的に，または腹膜内に，患者に投与することができる。非経口投与（これが好ましい）には，以下の経路による投与が含まれる：静脈内；筋肉内；間質；動脈内；皮下；眼内；滑液包内；経上皮，例えば経皮；吸入により肺に；眼；舌下および頬；局所的に，例えば，眼；皮膚；眼球；直腸；および吸入剤による鼻吸入。
【０２１１】
非経口投与用の医薬製剤には，水溶性または水分散性の形の活性化合物の水性溶液が含まれる。さらに，活性化合物の懸濁液を適当な油性注射用懸濁液として投与することができる。適当な親油性溶媒，またはベヒクルには，脂肪油，例えば，ゴマ油，または合成脂肪酸エステル，例えば，エチルオレエートまたはトリグリセリドが含まれる。水性注射用懸濁液は，懸濁液の粘度を高める物質，例えば，ナトリウムカルボキシメチルセルロース，ソルビトール，またはデキストランを含んでいてもよく，懸濁液はまた任意に安定化剤を含んでいてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは，液体溶液，好ましくは生理学的に適合性の緩衝液，例えばハンクス溶液またはリンゲル溶液中に処方することができる。さらに，オリゴヌクレオチドは，固体形に処方して使用直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥形もまた本発明に含まれる。
【０２１２】
局所投与用の医薬製剤には，経皮パッチ，軟膏，ローション剤，クリーム，ゲル，滴剤，噴霧剤，坐剤，液体および粉剤が含まれる。さらに，局所投与用の医薬製剤においては，慣用的な医薬担体，水性，粉体または油性の基剤，または増粘剤を用いることができる。
【０２１３】
経口投与用の医薬製剤には，粉末剤または顆粒剤，水または非水性媒体中の懸濁液または溶液，カプセル，サシェ剤または錠剤が含まれる。さらに，経口投与用の医薬製剤においては，増粘剤，香味剤，希釈剤，乳化剤，分散補助剤，または結合剤を用いることができる。
【０２１４】
経粘膜または経皮投与のためには，浸透すべきバリアに適した浸透剤を処方中で用いる。そのような浸透剤は当該技術分野において知られており，例えば，経粘膜投与用には胆汁酸およびフシジン酸誘導体および界面活性剤が挙げられる。経粘膜投与は鼻腔噴霧剤によりまたは坐剤を用いて行うことができる。経口投与用には，オリゴヌクレオチドを慣用の経口投与形，例えば，カプセル，錠剤およびトニック剤として処方する。局所投与用には，本発明のオリゴヌクレオチドを当該技術分野において知られる軟膏，塗剤，ゲル，またはクリームとして処方する。
【０２１５】
薬剤デリバリーベヒクルは，例えば，インビトロ投与用に，全身投与用に，または局所投与用に選択することができる。これらのベヒクルは，徐放リザーバーとして働くように，またはその内容物を標的細胞に直接デリバリーするように，設計することができる。ある種の直接デリバリー薬剤ベヒクルを用いることの利点は，１回の取り込みあたり多くの分子がデリバリーされることである。そのようなベヒクルは，さもなくば血流から急速に除かれるであろう薬剤の循環半減期を長くすることが示されている。このカテゴリーに属するそのような専門の薬剤デリバリーベヒクルのいくつかの例は，リポソーム，ハイドロゲル，シクロデキストリン，生分解性ナノカプセル，および生物接着性マイクロスフェアである。
【０２１６】
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは，被験者に全身投与することができる。全身吸収とは，薬剤が血流中に入り，次に身体全体にわたって分配されることを表す。全身吸収につながる投与経路には，静脈内，皮下，腹膜内，および鼻腔内がある。これらの投与経路はそれぞれオリゴヌクレオチドをアクセス可能な疾病細胞にデリバリーする。皮下治療剤は，投与の後，局所リンパ節に排出され，リンパネットワークを通って進み，循環中に入る。循環中に入る速度は分子量またはサイズの関数であることが示されている。リポソームまたは他の薬剤担体を用いることにより，オリゴヌクレオチドをリンパ節に局在化させることができる。細胞内に拡散するようオリゴヌクレオチドを修飾することができ，またはリポソームを用いて，未修飾または修飾オリゴヌクレオチドのいずれかを直接細胞内にデリバリーすることができる。
【０２１７】
選択されたデリバリー法により，細胞内への侵入が生ずる。好ましいデリバリー法としては，リポソーム（１０−４００ｎｍ），ハイドロゲル，制御放出ポリマー，および他の薬学的に許容しうるベヒクル，およびマイクロインジェクションまたはエレクトロポレーション（エクスビボ処置用）が挙げられる。
【０２１８】
本発明の医薬製剤はエマルジョンとして調製し処方してもよい。エマルジョンは，通常は，一方の液体が通常は直径０．１μｍを越える液滴の形で他方の液体中に分散している不均一系である。
【０２１９】
本発明のエマルジョンは，賦形剤，例えば，乳化剤，安定化剤，染料，油脂，油，ワックス，脂肪酸，脂肪酸アルコール，脂肪酸エステル，湿潤剤，親水性コロイド，保存剤を含んでいてもよく，必要に応じてエマルジョン中に抗酸化剤が存在していてもよい。これらの賦形剤は水性相，油性相のいずれかの中の溶液として，またはそれ自身別の相として存在することができる。
【０２２０】
本発明のエマルジョン処方において用いることができる天然に生ずる乳化剤の例としては，ラノリン，蜜蝋，ホスファチド，レシチンおよびアラビアゴムが挙げられる。細かく分割された固体はまた，特に界面活性剤と組み合わせた場合および粘稠な製剤において，優れた乳化剤として用いられている。乳化剤として用いることができる微細分割固体の例としては，極性無機固体，例えば重金属水酸化物，非膨潤性粘土，例えば，ベントナイト，アタパルガイト，ヘクトライト，カオリン，モンモリロナイト，コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウム，顔料および非極性固体，例えば，炭素またはグリセリルトリステアレートが挙げられる。
【０２２１】
エマルジョン処方中に含めることができる保存剤の例としては，メチルパラベン，プロピルパラベン，４級アンモニウム塩，塩化ベンズアルコニウム，ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル，およびホウ酸が挙げられる。エマルジョン処方中に含めることができる抗酸化剤の例としては，フリーラジカルスカベンジャー，例えば，トコフェロール，没食子酸アルキル，ブチル化ヒドロキシアニソール，ブチル化ヒドロキシトルエン，または還元剤，例えば，アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム，および抗酸化剤共同薬，例えば，クエン酸，酒石酸およびレシチンが挙げられる。
【０２２２】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドの組成物は，マイクロエマルジョンとして処方される。マイクロエマルジョンは水，油および両親媒性化合物の系であり，これは光学的に等方性かつ熱力学的に安定な単一の液体溶液である。典型的には，マイクロエマルジョンは，まず油を水性界面活性剤溶液中に分散させ，次に十分な量の第４の成分，一般に中間鎖長のアルコールを加えて，透明系を形成することにより製造される。
【０２２３】
マイクロエマルジョンの製剤において用いることができる界面活性剤としては，限定されないが，イオン性界面活性剤，非イオン性界面活性剤，Ｂｒｉｊ９６，ポリオキシエチレンオレイルエーテル，ポリグリセロール脂肪酸エステル，テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０），テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０），ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０），ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００），デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０），デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０），デカグリセロールセキオレエート（Ｓ０７５０），デカグリセロールデカオレエート（ＤＡ０７５０）が挙げられ，これらは単独でも共界面活性剤と組み合わせてもよい。共界面活性剤（通常は短鎖アルコール，例えば，エタノール，１−プロパノール，および１−ブタノール）は，界面活性剤フィルム中に浸透し，次に界面活性剤分子の間に生ずる空隙のために乱れたフィルムを形成することにより，界面流動性を増加させるように働く。
【０２２４】
しかし，マイクロエマルジョンは，共界面活性剤を用いずに製造することができる。無アルコール自己乳化マイクロエマルジョン系が当該技術分野において知られている。水性相は，典型的には，限定されないが，水，薬剤の水性溶液，グリセロール，ＰＥＧ３００，ＰＥＧ４００，ポリグリセロール，プロピレングリコール，およびエチレングリコールの誘導体である。油性相としては，限定されないが，Ｃａｐｔｅｘ３００，Ｃａｐｔｅｘ３５５，Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ，脂肪酸エステル，中鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ，ジ，およびトリグリセリド，ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル，脂肪酸アルコール，ポリグリコール化グリセリド，飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド，植物油およびシリコーン油等の物質が挙げられる。
【０２２５】
マイクロエマルジョンは，薬剤溶解性および増強された薬剤吸収の観点から特に興味深い。脂質系マイクロエマルジョン（油／水および水／油の両方）は，薬剤の経口での生物学的利用性を増強すると提唱されている。
【０２２６】
マイクロエマルジョンは，薬剤溶解性を改良し，薬剤を酵素的加水分解から保護し，界面活性剤により誘導される膜流動性および透過性の変化により薬剤吸収を増強させる可能性があり，製造が容易であり，固体投与形態より経口投与が容易であり，臨床的効力が改良され，毒性が低下する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１：１３８５；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５：１３８−１４３）。マイクロエマルジョンはまた，化粧品および医薬品の両方の用途における活性成分の経皮デリバリーにおいて有用である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および処方は，胃腸管からのオリゴヌクレオチドの全身吸収の増加を促進し，ならびに胃腸管，膣，口腔および他の投与部位におけるオリゴヌクレオチドの局所的細胞取り込みを改良すると予測される。
【０２２７】
１つの態様においては，本発明は，核酸，特にオリゴヌクレオチドを動物の皮膚に効率よくデリバリーするために種々の浸透促進剤を用いる。横切るべき膜を浸透促進剤で処置すると，非親油性薬剤であっても細胞膜を横切ることができる。浸透剤は，非親油性薬剤の細胞膜を越える拡散を増加させることに加え，親油性薬剤の透過性を増強するようにも作用する。
【０２２８】
本発明において用いることができる浸透促進剤の５つのカテゴリーには，界面活性剤，脂肪酸，胆汁酸，キレート剤，および非キレート性非界面活性剤が含まれる。投与されたオリゴヌクレオチドの浸透を促進するために使用することができる他の薬剤には，エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール，２−１５ピロール等のピロール，アゾン，およびリモネンおよびメントン等のテルペンが含まれる。
【０２２９】
オリゴヌクレオチド，特に脂質処方中のオリゴヌクレオチドは，医療器具，例えば，血管形成用バルーンカテーテル等のカテーテルをカチオン性脂質処方でコーティングすることにより投与してもよい。コーティングは，例えば，医療器具を脂質処方または脂質処方と適当な溶媒（水性緩衝液，水性溶媒，エタノール，塩化メチレン，クロロホルム等）との混合物に浸漬することにより行うことができる。ある量の処方が器具の表面に自然に接着し，その後これは患者に適切に投与される。あるいは，脂質処方の凍結乾燥混合物は，器具の表面に特異的に結合するかもしれない。そのような結合手法は，例えば，Ｋ．Ｉｓｈｉｈａｒａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．１３０９−１３１４（１９９３）；この開示の全体を本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。
【０２３０】
投与すべき有用な投与量および投与の特定の様式は，当業者には明らかなように，細胞のタイプ，またはインビボ用途の場合には，年齢，体重および処置すべき特定の動物および領域，用いる特定のオリゴヌクレオチドおよびデリバリー方法，企図される治療または診断用途，および処方形態，例えば，懸濁液，乳濁液，ミセルまたはリポソーム等の因子によって異なる。典型的には，より低いレベルの投与量で投与し，所望の効果が達成されるまで増加させる。オリゴヌクレオチドをデリバリーするために脂質を用いる場合には，投与する脂質化合物の量は様々であることができ，一般に，投与するオリゴヌクレオチド薬剤の量によって異なる。例えば，脂質化合物とオリゴヌクレオチド薬剤との重量比は，好ましくは，約１：１−約１５：１であり，約５：１−約１０：１の比率がより好ましい。一般に，投与されるカチオン性脂質化合物の量は，約０．１ミリグラム（ｍｇ）から約１グラム（ｇ）まで様々であろう。一般的指標として，典型的には約０．１ｍｇ−約１０ｍｇの特定のオリゴヌクレオチド薬剤，および約１ｍｇ−約１００ｍｇの脂質組成物（それぞれ患者の体重１ｋｇあたり）を投与するが，より高いまたはより低い量を用いることも可能である。
【０２３１】
本発明の薬剤は，薬剤の投与に適した生物学的に適合性の形で被験者に投与するか，または細胞と接触させる。"投与に適した生物学的に適合性の形"とは，オリゴヌクレオチドの治療効果が毒性効果よりまさる形でオリゴヌクレオチドを投与することを意味する。１つの態様においては，オリゴヌクレオチドを被験者に投与することができる。被験者の例としては，哺乳動物，例えば，ヒトおよび他の霊長類，ウシ，ブタ，ウマ，および農業用（農耕用）動物；イヌ，ネコ，および他の飼育ペット；マウス，ラット，およびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。
【０２３２】
活性量の本発明のオリゴヌクレオチドの投与とは，所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効である量として定義される。例えば，オリゴヌクレオチドの活性量は，細胞のタイプ，用いるオリゴヌクレオチド，およびインビボ用途の場合には，個体の疾病状態，年齢，性別，および体重，およびオリゴヌクレオチドが個体の所望の応答を引き出す能力等の因子によって様々であろう。細胞内における治療レベルのオリゴヌクレオチドの確立は，取り込みおよび流出または分解の速度に依存する。分解の程度を減少させれば，オリゴヌクレオチドの細胞内半減期が長くなる。すなわち，化学的に修飾したオリゴヌクレオチド，例えば，リン酸骨格に修飾を有するものは，異なる投与量を必要とするであろう。
【０２３３】
オリゴヌクレオチドの正確な投与量および投与する回数は，実験的におよび臨床試験において得られたデータによって異なるであろう。いくつかの因子，例えば，所望の効果，デリバリーベヒクル，疾病適応症，および投与の経路が投与量に影響を与えるであろう。当業者は投与量を容易に決定することができ，本発明の医薬組成物として処方することができる。好ましくは，治療の期間は少なくとも疾病症状の経過期間にわたる。
【０２３４】
投与計画は，最適な治療応答を与えるように調節することができる。例えば，オリゴヌクレオチドは，繰り返し投与することができる，例えば，毎日数回投与してもよく，治療状況の緊急性により示されるものに比例して投与量が減少してもよい。当業者は，オリゴヌクレオチドを細胞に投与する場合でも被験者に投与する場合でも，目的のオリゴヌクレオチドの適当な投与量および投与のスケジュールを容易に決定することができる。
【０２３５】
疾病または疾患の治療
本発明のオリゴヌクレオチド組成物は，遺伝子の発現を阻害することにより，蛋白質の発現が関与する任意の疾病を治療するために用いることができる。オリゴヌクレオチド組成物により治療することができる疾病の例には以下のものが含まれる：癌，網膜症，自己免疫疾患，炎症性疾病（例えば，ＩＣＡＭ−１関連疾患，乾癬，潰瘍性大腸炎，クローン病），ウイルス性疾病（例えば，ＨＩＶ，Ｃ型肝炎），および心臓血管疾病。
【０２３６】
１つの態様においては，オリゴヌクレオチドによる細胞のインビトロでの処置を，被験者から取り出した細胞のエクスビボ療法に（例えば，白血病またはウイルス感染の治療），または被験者に由来するものではないが被験者に投与されるべき細胞の治療に（例えば，被験者に移植されるべき細胞上の移植抗原発現を排除するため），用いることができる。さらに，細胞のインビトロ処置は，治療以外の状況において，例えば，遺伝子機能を評価するため，遺伝子制御および蛋白質合成を研究するため，または遺伝子発現または蛋白質合成を調節するよう設計されたオリゴヌクレオチドに加えられた改良を評価するために用いることができる。細胞のインビボ治療は，蛋白質の発現を阻害することが望ましいある種の臨床状況において有用でありうる。アンチセンス療法が適していると報告されている多くの医学的状態（例えば，米国特許５，８３０，６５３を参照），ならびにＲＳウイルス感染（ＷＯ９５／２２５５３），インフルエンザウイルス（ＷＯ９４／２３０２８），および悪性疾患（ＷＯ９４／０８００３）がある。アンチセンス配列の臨床的使用の他の例は，例えば，Ｇｌａｓｅｒ．１９９６．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ１６：１に概説されている。オリゴヌクレオチドによる切断の標的の例には，例えば，蛋白質キナーゼＣａ，ＩＣＡＭ−１，ｃ−ｒａｆキナーゼ，ｐ５３，ｃ−ｍｙｂ，および慢性骨髄性白血病において見いだされるｂｃｒ／ａｂｌ融合遺伝子が含まれる。
【０２３７】
本発明の実施には，特に断らない限り，細胞生物学，細胞培養，分子生物学，微生物学，組換えＤＮＡ，および免疫学の慣用の手法を用い，これらは当業者の技術の範囲内である。そのような手法は，文献に完全に説明されている。例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（Ｗｉｌｅｙ，ＮＹ（１９９５））；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．（１９８４））；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．（１９８４））；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７））；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．（１９８６））；およびＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９７２））を参照。
【０２３８】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが，これは本発明を限定するものと解釈してはならない。
【０２３９】
実施例
実施例１．キメラアンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチド組成物
２’−Ｏ−メチルＲＮＡアームおよび未修飾ＤＮＡギャップを含むギャップ含有アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。未修飾ＲＮＡを用いて相補的オリゴヌクレオチドも合成した。二本鎖デュープレックスが形成され，組成物は標的遺伝子の発現を阻害することが見いだされた。
【０２４０】
実施例２．二本鎖オリゴヌクレオチドの長さおよびオーバーハングの存在または非存在は機能に影響を及ぼさない
ｐ５３分子の２つの部位（８９−９０部位，および９３−９４部位）のそれぞれを標的とする２１−ｍｅｒおよび２７−ｍｅｒを設計した。二本鎖分子は，３’−デオキシＴＴオーバーハングを有するかまたは有しないよう設計した。試験オリゴヌクレオチドは，２ヌクレオチド３’デオキシＴＴオーバーハングを有する，およびオーバーハングを有しない（平滑末端）２１−ｍｅｒ；および２ヌクレオチド３’デオキシＴＴオーバーハングを有する，およびオーバーハングを有しない（平滑末端）２７−ｍｅｒであった。実験には２つの陽性対照（ｐ５３）が含まれ，２つの陰性対照（ＦＩＴＣ）も含まれた。
【０２４１】
Ａ５４９細胞を１００ｎＭの二本鎖分子および２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後にＡ５４９細胞を調べた。ＦＩＴＣ標識分子は細胞によく取り込まれた。２１−ｍｅｒ（オーバーハング有りまたはなし）および２７−ｍｅｒ（オーバーハング有りまたはなし）のいずれも細胞に対して毒性はなかった。図１は，種々のオリゴヌクレオチドコンストラクトがｐ５３を阻害する能力を比較した実験の結果を示す。長さまたは３’デオキシＴＴオーバーハングの存在または非存在はオリゴヌクレオチドの活性に影響を及ぼさなかったことがわかった。図１の結果は，無関係なメッセージであるＧＡＰＤＨの量に対して標準化されたｐ５３ｍＲＮＡの量を示す。ｍＲＮＡのレベルは，ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて決定した。観察されたｐ５３発現のパーセント阻害を以下に示す。
【０２４２】
【表３】
2005515780.tif 000020
【０２４３】
β−３−インテグリンについても同様の結果が観察された。２１−ｍｅｒおよび２７−ｍｅｒ二本鎖分子のいずれも，インテグリンｍＲＮＡを阻害することが認められた。β−３−インテグリン遺伝子の同じ部位を標的とするよう設計した２つの二本鎖ＲＮＡ複合体をＨＭＶＥＣ細胞にトランスフェクトした。いずれの複合体も２ヌクレオチド（ＴＴ）オーバーハングを含んでいた。一方の複合体は２１−ｍｅｒ（標的遺伝子に相補的な１９ヌクレオチドを有する）であり，他方は２７−ｍｅｒ（標的遺伝子に相補的な２５ヌクレオチドを有する）であった。ＲＴ−ＰＣＲ分析は，２つの複合体が標的遺伝子を同じ程度にを阻害したことを示した。ＨＭＶＥＣ細胞は，２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化させた１００ｎＭオリゴマーを用いて，血清を含む培地で２４時間トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後，細胞を溶解させ，ＲＮＡを単離して，ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。有意な毒性は認められなかった。図１Ｂの結果は，ＲＴ−ＰＣＲ分析により決定した，ＧＡＰＤＨの量に対して標準化されたβ−３−インテグリンｍＲＮＡの量を示す。
【０２４４】
実施例３．二本鎖ＲＮＡ，インターフェロン誘導性蛋白質キナーゼ，ＰＫＲの活性化
ＰＫＲは二本鎖ＲＮＡ分子により活性化される。活性なＰＫＲは蛋白質合成，転写の活性化，および他の種々の細胞の効果，例えば，シグナル伝達，細胞分化，細胞成長阻害，アポトーシス，および抗ウイルス効果の阻害を引き起こす。ｐ５３を標的とする二本鎖ＲＮＡ分子がＰＫＲ発現に及ぼす影響を調べた。ｍＲＮＡのレベルはＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて決定した。図２に示されるように，二本鎖オリゴヌクレオチドの長さとＰＫＲ誘導のレベルとの間に相関は認められなかった。したがって，インターフェロン誘導のマーカーであるＰＫＲを活性化することなく長いオリゴヌクレオチドを用いることができる。
【０２４５】
図２Ｂに示されるように，２１−ｍｅｒおよび２７−ｍｅｒをＨＭＶＥＣ細胞にトランスフェクションした後のＰＫＲ  ｍＲＮＡの相対量の分析は，未処理と比較してｓｉＲＮＡ対照配列のＰＫＲ  ｍＲＮＡの約２倍の増加を示し，２７−ｍｅｒのＰＫＲ  ｍＲＮＡは２１−ｍｅｒ標的二本鎖ＲＮＡ複合体と比較して約２倍の増加を示した。
【０２４６】
実施例４．５’および３’修飾が二本鎖オリゴヌクレオチドの活性に及ぼす影響
オリゴヌクレオチドデュープレックスを３’末端または５’末端のいずれかでＦＩＴＣ基で修飾した。修飾は，アンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかに行った。センス鎖の５’または３’修飾はｐ５３  ｍＲＮＡのパーセント阻害に影響を及ぼさなかった。アンチセンス鎖の３’修飾は活性にほとんど影響しなかったが，アンチセンス鎖の５’修飾は活性を有意に低下させた。両方の鎖の３’修飾も活性にほとんど影響しなかったが，両方の鎖の３’および５’修飾は活性を低下させた。図３を参照。
【０２４７】
５’末端を修飾するために用いた基の大きさの影響を調べた。この実験の結果は図４に示される。５’リン酸基の含有は活性にほとんど影響しなかったが，アンチセンス鎖または両方の鎖の修飾はより大きく影響した。プロピル基の含有はより大きく影響し，アンチセンス鎖上の５’プロピル基はより大きい活性の低下を示した。この基を両方の鎖に加えた場合にも影響があった。同様に，アンチセンス分子（または両方の分子）の５’末端でのＦＩＴＣ基の含有もまた，ＲＮＡデュープレックスの活性を有意に低下させた。
【０２４８】
実施例５．２’−Ｏ−Ｍｅ修飾および未修飾二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの効力の比較
Ａ５４９細胞は，１００ｎＭで２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体化させた修飾したまたは修飾してないＲＮＡデュープレックスで２４時間トランスフェクトした。Ａ５４９細胞を２０，０００／ウエルで４８ウエルプレートに播種した。２４時間後，Ａ５４９細胞でＦＩＴＣ標識二本鎖オリゴヌクレオチドが見られた。２’−Ｏ−Ｍｅ基を含有することは取り込みに影響を及ぼさなかった。以下の表はこの実験の結果を示す。
【０２４９】
【表４】
2005515780.tif 000021
【０２５０】
二本鎖ＲＮＡ分子の一方または両方の鎖の２’−Ｏ−Ｍｅ修飾の影響は図５に示される。
【０２５１】
実施例６．ｐ５３を標的とするｓｉＲＮＡのＡ５４９細胞における毒性
ｐ５３を標的とする２７−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡは，３’デオキシＴＴオーバーハングを有する標準的２１−ｍｅｒと比較して，細胞に対して毒性ではなかった。この実験においては，いずれのｓｉＲＮＡコンストラクトもｐ５３を同じ程度に阻害した（２７−ｍｅｒでは８３％阻害，２１−ｍｅｒでは９０％阻害）。ｓｉＲＮＡは，ｐ５３を標的とするよう設計し，平滑末端２７−ｍｅｒまたは３’デオキシＴＴオーバーハングを有する２１−ｍｅｒとして構築した。トランスフェクションの前日，Ａ５４９細胞を２０，０００細胞／ウエルで４８ウエルプレートに播種した。トランスフェクションの日，細胞は約６０−７０％コンフルエントであった。細胞を２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化した１００ｎＭのｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトした。トランスフェクション後，細胞をＤｅａｄＲｅｄ染料で染色して，細胞死の程度を可視化した。用いたｓｉＲＮＡ配列は以下のとおりである。
オーバーハングを有する標的21-mer (5'-3'):
ACCUCAAAGCUGUUCCGUCTT  (配列番号##)
GACGGAACAGCUUUGAGGUTT  (配列番号##)
平滑末端 標的27-mer (5'-3'):
ACGCACACCUCAAAGCUGUUCCGUCCC  (配列番号##)
GGGACGGAACAGCTTTGAGGTGTGCGT  (配列番号##)
【０２５２】
実施例７．ｐ５３を標的とする平滑末端２７−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡのＡ５４９細胞における毒性
ｐ５３を標的とする標的平滑末端２７−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡの毒性は，対照核酸または未処理と有意に異ならないことが認められた。ｓｉＲＮＡはｐ５３を標的とするよう設計し，平滑末端２７−ｍｅｒとして構築した。対応する対照は，類似の塩基対組成を有する化学的にマッチした，スクランブル化配列からなるものであった。トランスフェクションの前日にＡ５４９細胞を２０，０００細胞／ウエルで４８ウエルプレートに播種した。トランスフェクションの日，細胞は約６０−７０％コンフルエントであった。細胞を２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化した１００ｎＭのｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトした。トランスフェクション後，細胞をＤｅａｄＲｅｄ染料で染色して，細胞死の程度を可視化した。用いたｓｉＲＮＡ配列は以下のとおりである。
平滑末端 27-mer 標的 (5'-3' 上):
ACGCACACCUCAAAGCUGUUCCGUCCC  (配列番号##)
GGGACGGAACAGCTTTGAGGTGTGCGT  (配列番号##)
対応する対照(5'-3' 上):
CCCTGCCTTGTCGAAACTCCACACGCA  (配列番号##)
TGCGTGTGGAGTTTCGACAAGGCAGGG  (配列番号##)
【０２５３】
実施例８．ｐ５３を標的とする平滑末端３２−ｍｅｒのｓｉＲＮＡのＡ５４９細胞における毒性
同様に，ｐ５３を標的とする平滑末端３２−ｍｅｒのｓｉＲＮＡは，ＤｅａｄＲｅｄ染色により判定して，対照核酸および未処理と比較して細胞に対して毒性を有しないことが認められた。ｓｉＲＮＡはｐ５３を標的とするよう設計し，平滑末端３２−ｍｅｒとして構築した。対応する対照は，類似する塩基対組成を有するマッチした化学のスクランブル化配列からなるものであった。トランスフェクションの前日にＡ５４９細胞を４８ウエルプレートに２０，０００細胞／ウエルで播種した。トランスフェクションの日に，細胞は約６０−７０％コンフルエントであった。細胞は，２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化した１００ｎＭのｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトした。トランスフェクション後，細胞をＤｅａｄＲｅｄ染料で染色して，細胞死の程度を可視化した。用いたｓｉＲＮＡ配列は以下のとおりである。
標的平滑末端 32-mer (5'-3' 上:)
CCCTCACGCACACCUCAAAGCUGUUCCGUCCC  (配列番号##)
GGGACGGAACAGCTTTGAGGTGTGCGTGAGGG  (配列番号##)
対応する対照(5'-3' 上):
CCCTGCCTTGTCGAAACTCCACACGCACTCCC  (配列番号##)
GGGAGTGCGTGTGGAGTTTCGACAAGGCAGGG  (配列番号##)
【０２５４】
実施例９．３２−ｍｅｒおよび３７−ｍｅｒ平滑末端ｓｉＲＮＡによるｐ５３の阻害
図６は，種々の対照実験と比較した３２−ｍｅｒおよび３７−ｍｅｒ平滑末端ｓｉＲＮＡによるｐ５３の阻害の結果を示す。ｓｉＲＮＡは，ｐ５３のコーディング領域に沿って２つの部位（９３−９３部位および８９−９０部位）のそれぞれを標的とするよう設計した。ｓｉＲＮＡは，平滑末端３２−ｍｅｒまたは平滑末端３７−ｍｅｒとして構築した。陽性対照ｓｉＲＮＡは，３’デオキシＴＴオーバーハングを有する２１−ｍｅｒであった。対応する対照は類似の塩基対組成を有する化学的にマッチした，スクランブル化配列からなるものであった。トランスフェクションの前日にＡ５４９細胞を４８ウエルプレートに２０，０００細胞／ウエルで播種した。トランスフェクションの日に，細胞は約６０−７０％コンフルエントであった。細胞を２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化した１００ｎＭのｓｉＲＮＡで２４時間トランスフェクトした。トランスフェクション後，細胞を溶解させ，ＲＴ−ＰＣＲ用にポリ（Ａ）ｍＲＮＡを回収した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）分析によりｐ５３発現の阻害を決定した。ｐ５３の発現は，核サンプルについてＧＡＰＤＨを定量することにより標準化した。図６のデータは，二重に分析し，内部対照（ＧＡＰＤＨ）に対して標準化した３つの別々のトランスフェクションを表す。用いたｓｉＲＮＡ配列は以下のとおりである（５’−３’鎖を上に示す）。
32-mer標的  (89-90 部位):
CCCTCACGCACACCUCAAAGCUGUUCCGUCCC  (配列番号##)
GGGACGGAACAGCTTTGAGGTGTGCGTGAGGG  (配列番号##)
32-mer 対照 (89-90 部位):
CCCTGCCTTGTCGAAACTCCACACGCACTCCC  (配列番号##)
GGGAGTGCGTGTGGAGTTTCGACAAGGCAGGG  (配列番号##)
32-mer標的 (93-94 部位):
CCCUUCUGUCUUGAACAUGAGTTTTTTATGGC  (配列番号##)
GCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGG  (配列番号##)
32-mer 対照 (93-94 部位):
CGGTATTTTTTGAGTACAAGTTCTGTCTTCCC  (配列番号##)
GGGAAGACAGAACTTGTACTCAAAAAATACCG  (配列番号##)
37-mer 標的 (93-94 部位):
CCCTTCTGTCTTGAACATGAGTTTTTTATGGCGGGAG  (配列番号##)
CTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGG  (配列番号##)
37-mer 対照 (93-94 部位):
GAGGGCGGTATTTTTTGAGTACAAGTTCTGTCTTCCC  (配列番号##)
GGGAAGACAGAACTTGTACTCAAAAAATACCGCCCTC  (配列番号##)
21-mer 標的 (89-90 部位):
ACCUCAAAGCUGUUCCGUCTT  (配列番号##)
GACGGAACAGCUUUGAGGUTT  (配列番号##)
21-mer 標的 (93-94 部位):
CCCUUCUGUCUUGAACAUGTT  (配列番号##)
CAUGUUCAAGACAGAAGGGTT  (配列番号##)
【０２５５】
実施例１０．二本鎖２’−Ｏ−メチルＲＮＡの細胞安定性の増強
この実施例においては，一本鎖対照オリゴマーを８００ｎＭでトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後核内での蓄積が観察されたが，２５時間までに一本鎖オリゴマーの蛍光はほとんど放散し，このことは，オリゴマーがもはや無傷ではないことを示す（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｔ．，Ｔ．Ｔｅｒｈｏｒｓｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．"Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．"ＮＡＲ  ２１：３８５７−３８６５）。Ａ５４９細胞にトランスフェクトした蛍光標識したオリゴマーの相対的蛍光は以下のパターンに一致することが認められた。
【０２５６】
【表５】
2005515780.tif 000022
【０２５７】
第２鎖が２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡである二本鎖オリゴマーデュープレックスを１００ｎＭでトランスフェクトし，これもまたトランスフェクションの６時間後に依然として明らかに見ることができた。しかし，一本鎖オリゴマーとは異なり，二本鎖は，トランスフェクトした濃度が８倍少ない場合でも，２４時間で依然として核内でほとんど無傷であり，このことから，２’−Ｏ−メチル第２鎖が細胞においてオリゴマーを安定化させたことが示される。
【０２５８】
オリゴマーは５’ヒドロキシルに連結した６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）を含むホスホジエステル骨格を有する全２’−Ｏ−ＣＨ3であった。一本鎖対照オリゴマーは８００ｎＭで４μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化してトランスフェクトし，二本鎖は１００ｎＭで１μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化してトランスフェクトした。
【０２５９】
トランスフェクションの６時間後，蛍光シグナルは核に蓄積していることが認められたが，２４時間までに一本鎖オリゴマーは有意に放散され，このことからオリゴマーはもはや無傷ではないことが示された。二本鎖デュープレックス（第２鎖は５’６−ＦＡＭを有する２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡである）は１００ｎＭでトランスフェクトし，これもまた，トランスフェクションの６時間後に明らかに見ることができた。一本鎖オリゴマーとは異なり，二本鎖は，トランスフェクトした濃度が８倍少ない場合でも，２４時間で依然として核内でほとんど無傷であった。この実験は，２’−Ｏ−メチル第２鎖が細胞においてデュープレックスを安定化させることを示す。
【０２６０】
実施例１１．２’−Ｏ−メチルＲＮＡとハイブリダイズしたＲＮＡの細胞における増強された安定性および細胞質における蓄積
ＦＩＴＣ標識ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡデュープレックスの取り込みに対応する蛍光シグナルを６および２４時間に測定した。ＲＮＡ複合体を，以下に記載されるように２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００と複合体化した１００ｎＭのオリゴマーとともにＡ５４９細胞にトランスフェクトした。細胞を２４時間連続してトランスフェクトし，６および２４時間に蛍光の取り込みを評価した。オリゴマーは，５’６−ＦＡＭを有する２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡ（ＦＩＴＣ−２’−ＯＭｅ），５’６−ＦＡＭを有し３’末端に２つのデオキシヌクレオチドを有する１９−ｍｅｒＲＮＡ（ＦＩＴＣ−ＲＮＡ），または３’末端に２つのデオキシヌクレオチドを有する１９−ｍｅｒＲＮＡ（ＲＮＡ）を複合体化した。６時間において，ＦＩＴＣ−２’−Ｏ−メチルデュープレックスは核における局在を示し，ＦＩＴＣ−２’−Ｏ−メチル／ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチル／ＦＩＴＣ−ＲＮＡ複合体はより拡散したパターンの取り込みを示した（これらのＲＮＡ／２’−Ｏ−メチル複合体はＲＩＳＣ複合体の基質であり，したがって，ＲＩＳＣ複合体が活性であると報告されている細胞質に保持される）。２４時間において，ＦＩＴＣ−２’−Ｏ−メチル／ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチル／ＦＩＴＣ−ＲＮＡ複合体はなお細胞中に見ることができたが，典型的には，一本鎖ＦＩＴＣ−２’−Ｏ−であっても，有意に高い濃度でトランスフェクトした場合であっても，見ることができなかった。このことは，２’−Ｏ−メチルＲＮＡは細胞中でＲＮＡ鎖を分解から保護することを示す。
【０２６１】
２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むホスホジエステル骨格を有するＲＮＡオリゴマーを標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成した。オリゴマーは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製した。オリゴマーの純度を（ＰＡＧＥ）および質量分析により確認した。すべてのオリゴマーは全長の９０％より長く，得られた質量分析データは予測値と一致した。標的特異的ｓｉＲＮＡデュープレックスは，対称の２−ｎｔ３’デオキシＴＴオーバーハングを有する２１−ｎｔセンスおよび２１−ｎｔアンチセンス鎖からなるものであった。２１−ｎｔＲＮＡは，ホスホルアミダイト化学を用いて化学的に合成した。デュープレックスの製造のためには，センスおよびアンチセンスオリゴマー（各５０μｍ）をアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０，１００ｍＭ酢酸カリウム，および２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で等量で混合し，９０℃で１分間熱変性し，３７℃で１時間アニーリングした。デュープレックスは使用するまで８０℃で保存した。
【０２６２】
Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１８５）は，２ｍＭのＬ−グルタミン，１００ユニット／ｍＬのペニシリン，１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン，および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１１９６０−０４４）で３７℃で培養した。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２）は，２ｍＭＬ−グルタミン，１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム，１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム，１００ユニット／ｍＬのペニシリン，１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン，および１０％ＦＢＳを補充した最小必須培地（ＭＥＭ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１０３７０−０２１）で３７℃で培養した。細胞は定期的に継代して対数増殖を維持した。トランスフェクションの前日に，細胞をトリプシン処理し，計数し，４８ウエルプレートに２５０μＬの新鮮な培地中２０ｘ１０3細胞／ウエルの密度で播種した。トランスフェクションの日に，典型的には細胞は６０−６５％コンフルエントであった。ｓｉＲＮＡデュープレックスおよびオリゴマーのトランスフェクションは，リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。簡単には，リポフェクタミン２０００の１０ＸストックをＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に調製し，室温で１５分間インキュベートした。等量のＯｐｔｉ−Ｍｅｍ中のｓｉＲＮＡデュープレックスまたはオリゴマーの１０Ｘストックを加え，室温で１５分間複合体を形成させた。次に，複合体を完全成長培地で５倍に希釈した。培養培地を各ウエルから除去した後，２５０μＬ／ウエルの複合体を加えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ2で６または２４時間インキュベートした後，取り込みを評価した。
【０２６３】
均等物
当業者は，日常的な実験を越えるものを使用せずに，本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの均等物を理解するかまたは確認することができる。そのような均等物は添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。本明細書に引用されるすべての特許，公開特許出願および他の参考文献の全内容は，明示的にその全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【図面の簡単な説明】
【０２６４】
【図１】図１は，二本鎖オリゴヌクレオチドの長さおよびオーバーハングの存在または不在が機能に影響を与えないことを示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは，β-3-インテグリンを標的とするsiRNAの有効性に対する構造変化の影響を示す。
【図２】図２は，所定の配列について二本鎖オリゴヌクレオチドの長さとPKR誘導レベルとの間に相関関係が無かったことを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは，HMVEC細胞でのPKR発現に及ぼすβ-3-インテグリンを標的とする２１量体および２７量体の効果を示す。
【図３】図３は，二本鎖RNAデュープレックスの活性に及ぼす5'または3'修飾の効果を示す。
【図４】図４は，二本鎖RNAデュープレックスの活性に及ぼす修飾基のサイズの影響を示す。
【図５】図５は，二本鎖RNAデュープレックスの活性に及ぼす2'-O-Me修飾の結果を示す。
【図６】図６は，32および37量体平滑末端siRNAによるp53の阻害を示す。
【図１】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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