(57)【要約】活性、タンパク質密度、及び安定性のような優れた特性を実現するようなサイズに作製された細孔を有するマトリックス材料内部でタンパク質が結合しているようなタンパク質系を説明する。好適な具体例においては、孔径は５０〜４００オングストロームの範囲にわたる。この系中で意外なことに良好な結果を証明した１タンパク質はＯＰＨである。このタンパク質は、例えば化学兵器及び農薬中に見い出される有機リン化合物を分解することが周知である。タンパク質系を形成する新規な方法及びＯＰＨの製造方法もまた説明する。また説明するのは、多孔質マトリックス材料及び多孔質マトリックス材料内部に配置されたタンパク質を含むタンパク質系において、タンパク質系は、１グラムのマトリックス材料当り少なくとも０．０１mmolのタンパク質を含み、同一の条件下で通常のシリカマトリックス材料表面に形成されたタンパク質系の活性よりも少なくとも２倍大きな活性を示す、タンパク質系である。タンパク質を多孔質マトリックス中に取込むための非共有結合を用いたタンパク質系の製造方法もまた説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細孔容積の少なくとも９０％は５０〜４００オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成されるような前記細孔容積を有する多孔質マトリックス材料を含み、
該マトリックス材料と結合した化学的に活性なタンパク質をさらに含む、タンパク質系。
【請求項２】
前記タンパク質系は、１グラムのマトリックス材料当り０．０１〜１mmolの前記タンパク質を含み、前記タンパク質系中の前記タンパク質は、活性状態にある前記タンパク質の活性の少なくとも６５％の活性を示す、請求項１に記載の系。
【請求項３】
前記タンパク質は、平均細孔容積の５〜４０％を占有する、請求項１に記載の系。
【請求項４】
前記タンパク質系は、１グラムのマトリックス材料当り０．０１〜１mmolの前記タンパク質を含み、前記細孔容積の少なくとも９０％は、１００〜２００オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成される、請求項３に記載の系。
【請求項５】
前記タンパク質は酵素である、請求項３に記載の系。
【請求項６】
前記酵素は、０．５×１０5オングストローム3〜３×１０5オングストローム3の範囲内の体積を有する、請求項５に記載の系。
【請求項７】
前記酵素は、活性状態の活性の少なくとも５０％の活性を有する、請求項６に記載の系。
【請求項８】
前記酵素は、活性状態の活性の６０〜９５％の活性を有するＯＰＨである、請求項７に記載の系。
【請求項９】
前記タンパク質の体積は、平均細孔容積の１０〜２５％の範囲内である、請求項６に記載の系。
【請求項１０】
前記多孔質マトリックス材料の表面積は少なくとも７００m2/gである、請求項６に記載の系。
【請求項１１】
前記酵素はＯＰＨであり、前記系は立方センチメートル当り５〜２５mgのＯＰＨを含む、請求項５に記載の系。
【請求項１２】
前記酵素はＯＰＨであり、０．１５〜０．６６のＶmaxを有する、請求項５に記載の系。
【請求項１３】
前記系は、アルカリ性条件下で２４時間後に、その活性の約１０％を保持する、請求項５に記載の系。
【請求項１４】
前記マトリックスはＳＡＭＭＳである、請求項２に記載の系。
【請求項１５】
請求項１に記載の系によって触媒される化学的方法。
【請求項１６】
１グラムのマトリックス材料当り０．０１〜１mmolのタンパク質をタンパク質系が含むようなサイズに作製された多孔質マトリックス材料を含む前記タンパク質系において、前記タンパク質系中の前記タンパク質は、活性状態にある前記タンパク質の活性の少なくとも６５％の活性を示す、タンパク質系。
【請求項１７】
前記多孔質マトリックス材料は、細孔容積の少なくとも９０％は５０〜４００オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成されるような前記細孔容積を有する、請求項１６に記載のタンパク質系。
【請求項１８】
前記タンパク質は、平均細孔容積の５〜４０％を占有する、請求項１７に記載のタンパク質系。
【請求項１９】
前記酵素はＯＰＨである、請求項１７に記載のタンパク質系。
【請求項２０】
前記マトリックスはメソ細孔性酸化物材料である、請求項１７に記載のタンパク質系。
【請求項２１】
請求項１６に記載の系によって触媒される化学的方法。
【請求項２２】
タンパク質系を形成する方法であって：
細孔容積の少なくとも９０％は５０〜４００オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成されるような前記細孔容積を有する多孔質マトリックス材料を用意する工程と、
前記多孔質マトリックス材料とタンパク質とを反応させ、その結果前記タンパク質は前記多孔質マトリックス材料と化学的に結合する工程と、を含む方法。
【請求項２３】
前記多孔質マトリックス材料は表面ヒドロキシルを含み、前記表面ヒドロキシルはカップリング剤と反応して官能基化単一層を形成する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記官能基化単一層は、メルカプト、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、及びアジドからなる群から選択される反応性部分を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記カップリング剤はメルカプトプロピルトリメトキシシランを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記カップリング剤は、２〜２０個の原子を有する鎖長を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記多孔質マトリックス材料は、反応工程の前に、少なくとも９００m2/gの表面積を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法によって製造されるタンパク質系。
【請求項２９】
ＯＰＨの製造方法であって：
宿主細胞を、ＯＰＨをコード化する配列を含むベクターを用いてトランスフェクションし、前記配列は、機能し得るようにＴ７発現制御配列に結合していることと、
トランスフェクションした前記宿主細胞を、発現を可能にする条件下、前記発現制御配列の制御下で培養することと、
前記ＯＰＨを、前記細胞または前記細胞の培地から精製することと、を含む方法。
【請求項３０】
前記ベクターには、機能し得るように前記Ｔ７発現制御配列に結合した、ＯＰＨをコード化する前記配列が与えられている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＯＰＨは、約１３，０００酵素単位／mg（units/mg）の活性を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ベクターはプラスミドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ベクターはプラスミドである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞は原核細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記原核細胞は細菌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細菌は大腸菌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞は真核細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記真核細胞は酵母細胞である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記酵母細胞はピキア・パストリスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記多孔質マトリックス材料と架橋剤とを反応させて、表面と共有結合した架橋剤を有する多孔質マトリックス材料を形成することと、
前記表面と共有結合した架橋剤を有する前記多孔質マトリックス材料とタンパク質とを反応させ、その結果該タンパク質は前記多孔質マトリックス材料と化学的に結合することと、を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４１】
タンパク質系を形成する方法であって：
細孔容積の少なくとも９０％は５０〜４００オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成されるような前記細孔容積を有する多孔質マトリックス材料であって官能基化表面を有する多孔質マトリックス材料を用意する工程と、
タンパク質を加え、その結果該タンパク質は非共有結合によって前記多孔質マトリックス材料中に取り込まれる（entrapped）工程と、を含む方法。
【請求項４２】
前記多孔質マトリックス材料は、メルカプト、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、及びアジドからなる群から選択される反応性部分を含む官能基化単一層を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
得られた前記タンパク質系中の前記タンパク質が、活性状態にある前記タンパク質の少なくとも５０％である活性を有するような条件下で、前記タンパク質は加えられる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
多孔質マトリックス材料を含み、
該多孔質マトリックス材料内部に配置されたタンパク質を含むタンパク質系において、
該タンパク質系は、１グラムのマトリックス材料当り前記マトリックス材料内部に配置された少なくとも０．０１mmolのタンパク質を含み、前記タンパク質系は、同一の条件下で通常のシリカマトリックス材料表面に形成されたタンパク質系の活性よりも少なくとも２倍大きな活性を示す、タンパク質系。
【請求項４５】
前記多孔質マトリックス材料は微小チャネル中に配置される、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項４６】
請求項４５に記載のタンパク質系を含む装置。
【請求項４７】
前記タンパク質系は、同一の条件下で通常のシリカマトリックス材料表面に形成されたタンパク質系の活性よりも少なくとも１０倍大きな活性を示す、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項４８】
前記多孔質マトリックス材料は、１グラムのマトリックス材料当り０．０１〜１mmolのタンパク質を前記タンパク質系が含むようなサイズに作製され、前記タンパク質系中の前記タンパク質は、活性状態にある前記タンパク質の活性の少なくとも６５％の活性を示す、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項４９】
前記タンパク質は、４℃で１１０日間冷蔵した場合に約３０％未満の活性を失う、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項５０】
前記活性は、タンパク質分子当りで測定して、活性状態にある前記タンパク質の活性の少なくとも６０％である、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項５１】
前記タンパク質は多孔質マトリックス中で非共有結合する、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項５２】
前記タンパク質は８，０００〜３００，０００ドルトンの範囲内の分子量を有する、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項５３】
前記タンパク質は少なくとも８，０００ドルトンの分子量を有する、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項５４】
前記多孔質マトリックス材料は２〜８０％の表面被覆率で官能基化される、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項５５】
細孔容積の少なくとも９０％は５０〜４００オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成されるような前記細孔容積を有する多孔質マトリックス材料であって官能基化表面を有する多孔質マトリックス材料を用意することと、タンパク質を加え、その結果該タンパク質は非共有結合によって前記多孔質マトリックス材料中に取り込まれることと、によって製造される、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項５６】
前記タンパク質は、架橋剤を介した前記多孔質マトリックス材料との共有結合によって取り込まれる、請求項４４に記載のタンパク質系。
【請求項５７】
前記多孔質マトリックス材料はＳＡＭＭＳを含む、請求項４４に記載のタンパク質系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００１年２月２１日に出願された米国特許出願第09/791,138号の一部継続であり、これを、完全に転載するように下記に組み込む。
【０００２】
発明の分野
本発明は、多孔質担体中のタンパク質、タンパク質を担持する方法、及び担持型タンパク質を使用する方法に関する。本発明はまた、有機リンヒドロラーゼ（organophosphorous hydrolase）（“ＯＰＨ”）の改良された製造方法を提供する。
【０００３】
発明の背景
生体外で化学反応を促進するためのタンパク質の有用性は以前から周知であり、大いに効果的に使用されてきた。より様々な反応を促進し、こうした反応をより大規模に促進する上で、タンパク質のはるかに大きな用途の可能性が存在する。しかしながら、この可能性を完全に現実のものとするまでには、克服すべき多くの問題が存在する。こうした問題としては、高活性なタンパク質系が必要であること；ある範囲の条件下で高い活性を維持するタンパク質系が必要であること；及び活性なタンパク質を多孔質担体の上に高密度に配置する能力が挙げられる。
【０００４】
様々な有用な反応を触媒するために有用なタンパク質の１例は、有機リンヒドロラーゼ（“ＯＰＨ”）である。ＯＰＨは、化学兵器または有機リン農薬を不活性化するために使用し得る酵素である。化学兵器（すなわち、神経ガス、特にサリン及びＶＸ）及び有機リン農薬（例えば、パラチオン、パラオキソン及びアセフェート）は高等生物にとって極めて有毒である。従って、偶発的な流出または製造プラントの汚染における化学兵器及び有機リン農薬の望ましくない放出を清浄化する方法に対する必要が存在する。ＯＰＨ酵素は、複雑で高価な焼却施設の必要無しに化学兵器または有機リン農薬を不活性化する可能性を提供する。その可能性にもかかわらず、活性がありかつ安定なＯＰＨを有する系の大規模生産のための適切な方法を欠くことが、この酵素の用途を限定してきた。
【０００５】
本発明は、上記に説明した問題に良く対処することができる改良されたタンパク質系を提供する。本発明は一般に、固定化酵素系等に適用されるが、幾つかの具体的な例においては、本発明はまた、ＯＰＨ及び活性なＯＰＨを含む系の改良された製造方法を提供する。
【０００６】
発明の概要
本発明の１概念は、タンパク質のサイズを担体構造の孔径に整合させる担体構造の工学的作製である。意外なことに、十分に整合したサイズは、活性なタンパク質の高い活性、向上した安定性、及び比較的に高い密度のような望ましい品質を有するタンパク質系を製造できることが見い出された。小さすぎるかまたは大きすぎる細孔中でのタンパク質のカップリングは、劣った特性をもたらす。他のファクターの例えば表面積、細孔密度、細孔均一性及び分布、担体内部のタンパク質占有数、並びに架橋部位のタイプ及び密度もまた利用して、タンパク質系の特性を制御してよい。
【０００７】
１態様においては、本発明は、化学反応を促進する際に使用するためのタンパク質系を提供する。系は、固体マトリックス内部に細孔を有する多孔質マトリックス材料を含む。別の態様においては、タンパク質系は、細孔容積の少なくとも９０％は５０〜４００オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成されるような細孔容積を有する多孔質マトリックス材料と、マトリックス材料と結合した化学的に活性なタンパク質とを含む。“結合した”は、マトリックス材料への、共有結合付着、イオン付着及び／または静電付着を指す。好適な具体例においては、タンパク質は、カップリング基を介してマトリックスと共有結合する。
【０００８】
別の態様においては、タンパク質系は、１グラムのマトリックス材料当り０．０１〜１mmolのタンパク質をタンパク質系が含むようなサイズに作製された多孔質マトリックス材料を含み、ここで、タンパク質系中のタンパク質は、活性状態にあるタンパク質の活性の少なくとも６５％の活性を示す。
【０００９】
本発明はさらに、取り込まれたタンパク質（entrapped protein）を含む多孔質マトリックス材料を含むタンパク質系を提供し、ここで、タンパク質系は、１グラムのマトリックス材料当り少なくとも０．０１mmolのタンパク質と同一の条件下でただし通常のシリカマトリックス材料（normal silica matrix material）表面に形成されたタンパク質系の活性よりも少なくとも２倍大きな活性とを有することを特徴とする。“通常のシリカ”は、孔径３００オングストローム及び１２マイクロメートルのビーズサイズを有する未コーティングのシリカバルク材料であり、入手可能な場合、通常のシリカは、米国、メリーランド州、コロンビアのポリエルシーＩｎｃ．（PolyLC Inc., Columbia Maryland, USA）から品目番号ＢＭＳＩ  １２０３で購入できるはずである。
【００１０】
別の態様においては、本発明は、取り込まれたタンパク質を含む多孔質マトリックス材料を含むタンパク質系を提供し、ここで、タンパク質系は、１グラムのマトリックス材料当り少なくとも０．０１mmolのタンパク質と本明細書において説明する安定性試験の手順によって定義される向上した安定性とを有することを特徴とする。
【００１１】
本発明はまた、タンパク質系を形成する方法であって：
細孔容積の少なくとも９０％は５０〜４００オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成されるような細孔容積を有する多孔質マトリックス材料を用意する工程と、多孔質マトリックス材料とタンパク質とを反応させ、その結果タンパク質は多孔質マトリックス材料と化学的に結合する工程と、を含む方法を提供する。好ましくは、この方法は、多孔質マトリックス材料と架橋剤とを反応させて、表面と共有結合した架橋剤を有する多孔質マトリックス材料を形成する工程と、表面と共有結合した架橋剤を有する多孔質マトリックス材料とタンパク質とを反応させ、その結果タンパク質は多孔質マトリックス材料と化学的に結合する工程と、を含む。
【００１２】
別の態様においては、本発明は、架橋剤無しでタンパク質を多孔質マトリックス材料に加えることによってタンパク質系を製造する方法を提供する。タンパク質が非共有結合によって取り込まれているような安定でかつ活性なタンパク質系を得ることができることが見い出された。１つのこのような方法において、タンパク質系は、細孔容積の少なくとも９０％は５０〜４００オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成されるような細孔容積を有する多孔質マトリックス材料であって官能基化表面を有する多孔質マトリックス材料を用意することと、タンパク質を加え、その結果タンパク質は非共有結合によって多孔質マトリックス材料中に取り込まれることと、によって形成される。
【００１３】
本発明はまた、ＯＰＨの製造方法を提供する。この方法において、宿主細胞は、ＯＰＨをコード化する配列を含むベクターを用いてトランスフェクションされ、配列は、機能し得るようにＴ７発現制御配列に結合している。トランスフェクションした宿主細胞を、発現を可能にする条件下、発現制御配列の制御下で培養する。ＯＰＨを、細胞または細胞の培地から精製する。
【００１４】
タンパク質系を工学的に作製して個々のタンパク質のサイズを個々の細孔のサイズに整合させ、好適な具体例においては、個々のタンパク質の体積は各細孔の平均容積の５〜４０％を占有する。
【００１５】
本発明はまた、化学的方法（すなわち、化学薬品の製造方法）の例えば加水分解、酸化、水素化、及びプロテオリシスを促進する際にこうした系を使用する方法を含む。本発明はまた、個々の兵士、農薬分野の仕事に従事する人、車両、航空機、船舶並びに建築物の例えば民間用及び軍事防御用シェルターのための、解毒を実行するろ過装置内での多孔質担体中の活性な酵素の使用を包含する。
【００１６】
本発明の様々な具体例は、多孔質担体表面での高いタンパク質活性；様々な条件下での安定性；活性なタンパク質の高い密度；工業的規模での利用における能力；並びに化学兵器及び有機リン農薬を破壊するための環境にとって安全な方法を提供すること、及びこうした材料を燃焼させることに附随する危険を避けることを含む多数の利点を提供することができる。他の利点は、以下の説明及び実施例を考慮して予見することができる。
【００１７】
発明の詳細な記述
本発明のタンパク質系２の１具体例の概念図を図１に示す。マトリックス材料４は、タンパク質８を含む細孔６を有する。タンパク質８は、連結部分１０を介してマトリックスに連結する。この構造の多くの変形例が可能である。例えば、この図は各細孔中の単一のタンパク質を示すが、多くの具体例においては、幾つかの細孔は多数のタンパク質を含み、一方、他の細孔は何も含まないだろう。本発明は、図１に示す具体例に限定されない。
【００１８】
多孔質マトリックス材料は、好ましくは細孔容積の少なくとも９０％は５０〜４００オングストローム、より好ましくは１００〜２００、さらにより好ましくは１００〜１２０オングストロームの範囲内のサイズを有する細孔で構成されるような細孔容積を有する。本発明のためには、孔径分布を、従来技術において周知の手法を使用してＮ2吸着によって測定する。特に大きな細孔を有する材料の場合、正確な孔径分布を得るために、Ｎ2吸着に、水銀細孔計法（mercury porisimetry）または顕微鏡法を補足する必要があるかもしれない。従来の通り、“孔径”は、細孔直径を指す。タンパク質系において、孔径分布はマトリックス中のタンパク質無しで測定されるはずであり、測定のために、タンパク質は、プロテアーゼまたは他の適切な手段によってマトリックスから除去できる。タンパク質系に関する測定の場合、孔径分布の測定の最中、カップリング剤はマトリックスと結合したままである。本発明の方法をキャラクタリゼーションするか、または、製造方法によってタンパク質系をキャラクタリゼーションするために、多孔質マトリックス材料の孔径分布をカップリング剤無しで測定する。マトリックス材料の組成は変化し得るが、好ましくは無機酸化物含有材料である。無機酸化物に基づく材料（例えば、シリカに基づく材料）は、多くの有機担体にまさる利点を提供し、こうした利点としては、機械的強度並びに化学的及び熱安定性を挙げることができる。
【００１９】
好適な具体例においては、タンパク質系は、無機多孔質マトリックスとタンパク質との間に配置されたカップリング剤を含む。未反応（すなわち、タンパク質と反応する前）の無機酸化物担体は、典型的には表面ヒドロキシル基を有する。好ましくは、こうした表面ヒドロキシルを比較的に低分子量の有機化合物と反応させて、官能基化単一層を形成する。適切なカップリング剤を用いた処理は、多孔質担体の表面の選択された官能基化部分を生成することができる。好ましいカップリング部分は、メルカプト（−ＳＨ）、アミノ（−ＮＨ2）、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、及びアジド（−Ｎ3）である。特に好適な具体例は、Feng et al.によって"Functionalized Monolayers on Ordered Mesoporous Supports," Science, vol. 276, 923-926 (1997)において説明されている官能基化メソ細孔性担体を利用する。Feng et al.による論文において説明されているように、表面ヒドロキシルをメルカプトプロピルトリメトキシシラン、（ＭｅＯ）3Ｓｉ（ＣＨ2）3ＳＨ、と反応させて、末端メルカプト基を有する官能基化表面を形成できる。官能基化表面は、より良好かつより制御可能な化学的環境及びタンパク質との結合を提供するので、非官能基化表面よりも優れている。
【００２０】
多孔質マトリックス材料の表面が官能基化されている場合、官能基化度（degree of functionalization）（表面被覆率によって測定される。ここで、Feng et al.による上述の論文において説明されているように、表面被覆率は透過型電子顕微鏡法によって測定される）は、結合したタンパク質の活性レベルに影響を及ぼすことが見い出された。好ましくは、表面被覆率は少なくとも２％、より好ましくは約２０〜７０％、より好ましくは２０〜５０％である。多すぎるカップリング部分は活性を低下させ得るが、一方、少なすぎるとマトリックスへのタンパク質の共有結合付着を低下させ、タンパク質系の安定性を低下させ得る。
【００２１】
特に、カップリング剤を使用しない具体例の場合、多数のファクターが、タンパク質を取込む多孔質マトリックスの能力に影響を及ぼし得ることが見い出された。こうしたファクターの非網羅的な一覧としては、官能基化度、官能基化部分のタイプ（例えば、アミノ、カルボキシル等）、pH、イオン強度、緩衝、及び孔径を挙げることができる。一般に、静電相互作用は、タンパク質の取込を制御するために非常に重要となり得る。例えば、マトリックス材料の細孔中のカルボキシルは、タンパク質の表面のアミノと相互作用し得、逆の場合も同じである。同様に、親水性／疎水性相互作用を制御して、マトリックス材料をタンパク質の取込に適応させることができる；例えば、マトリックス材料の細孔中の炭化水素鎖は、タンパク質表面の疎水性領域と相互作用することができる。選択されたタンパク質を取込むための条件の特定は、本明細書において述べる説明を考慮して常用の実験によって決定することができる。
【００２２】
タンパク質は、約１００を超えるアミノ酸残基を含み、典型的には約８，０００〜約３００，０００ドルトンの範囲内の分子量を有する高分子有機化合物である。本発明において最も興味深いのは、化学的に活性なタンパク質、すなわち、化学的方法の例えば加水分解、酸化、還元、酸素輸送、光学的反転、脱水素、脱離等を促進できるタンパク質である。より好ましいのは、酵素、すなわち、化学反応を触媒するタンパク質である。１つの特に好ましいタンパク質は、有機リンヒドロラーゼ（organophosphorus hydrolase）（ＯＰＨ）であり、これは周知であり、文献に報告されている。例えば、Muchandani et al., "Biosensor for direct determination of organophosphate nerve agents. Potentiometric enzyme electrode," Biosensors & Bioelectronics, 14, 77-85 (1999)を参照されたい。
【００２３】
タンパク質は、全て共有結合を介して連結しているアミノ酸で構成され得る。タンパク質はまた、非共有結合相互作用によって一緒に保持されるサブユニットで構成され得る。例えば、ヘモグロビンは４つのサブユニットで構成されるタンパク質である。タンパク質はまた、他の構成要素の例えば金属原子、ポルフィリン環、及び他の人造のまたは天然に存在する修飾を含み得る。ＯＰＨは、直径約４５〜８０オングストローム及び体積約１．９５×１０5オングストローム3を有する二量体酵素である。従って、ＯＰＨが平均細孔容積の１０％を占有するようにタンパク質系が設計された場合、マトリックスは、平均細孔容積約１．９５×１０6オングストローム3を有すると思われる。
【００２４】
本発明におけるタンパク質のサイズを、未変性状態における回転半径に基づいて従来の意味で定義する。本発明のタンパク質系においては、好ましいタイプのタンパク質は、０．５×１０5オングストローム3〜３×１０5オングストローム3の範囲内の体積を有する酵素であり、というのは、このサイズ（体積）の範囲内のタンパク質は、本発明のタンパク質系の多孔質マトリックス中で特に好都合だからである。
【００２５】
マトリックス中のタンパク質を、“活性状態”にあるタンパク質と比較することができる。本発明においては、固定化されたタンパク質の活性（または“単位活性”）の定義は、固定化されていないタンパク質の一般に認められている定義と同じである。活性単位を、特定の緩衝液条件中、特定の温度で、指定された時間の間に、既知のまたはキャラクタリゼーション済みの基質から生成物を生じるために必要なタンパク質の量によって定義する。多くの酵素及び酵素のクラスのために、一般に認められている活性単位が存在する。一般に認められている活性単位の１つの出典は、ワーシントン酵素マニュアル（Worthington Enzyme Manual）（ザ・ワーシントン・バイオケミカル・コーポレーション、フリーホールド、ＮＪ（the Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ）から入手可能である）である。このマニュアルは、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）及びグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）を含む酵素の活性の定義を含む。本発明においては、ＯＰＨの活性を、Dumas et al., J. Biol. Chem., v. 264, p19659 (1989)において説明されているように定義する；すなわち、活性単位は、２５℃、１００mMのＣＨＥＳ中、pH９での１分間当りの１ミクロモルのパラオキソンの加水分解であり、パラオキソン基質が加水分解されてジエチルホスフェート及びｐ−ニトロフェノラート陰イオンになる場合に、吸光係数ε405＝１７，０００M-1cm-1と仮定して、典型的には吸光度の変化を４００nmでモニターする。好適な具体例においては、本発明のタンパク質は、活性状態にある活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％である。本発明者らは、ＯＰＨ含有タンパク質系の活性は、優れた活性を有することを見い出した。幾つかの好適な具体例においては、本発明の系中のタンパク質は６５〜９５％の活性を有する。幾つかの具体例においては、本発明のタンパク質系はまた、同じ官能基化条件を含む同じ条件下で製造し、試験し、ただし通常のシリカを多孔質マトリックス材料として使用した同一の質量の系と比較して定義することができる；好ましくはタンパク質系は、同一に製造し、ただし多孔質マトリックス材料中に通常のシリカを有する系と比較して、少なくとも２倍（２×）、より好ましくは少なくとも５×、さらにより好ましくは少なくとも１０×、さらにより好ましくは少なくとも５０×大きな活性を有する。本発明はまた、同じ条件下で、実施例において説明するものとほぼ同じかまたはより大きな程度に活性を維持できると定義できる。
【００２６】
本発明の様々な具体例において用いてよいタンパク質の非限定一覧は次の通り：アデノシンアミノヒドロラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デアミナーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ、ＡＴＰキナーゼ、ＡＴＰホスファターゼ、ビリルビンオキシダーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、クレアチンホスホキナーゼ、カテコラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キチナーゼ、キトデキストリナーゼ、キトサナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、コリンオキシダーゼ、コリンホスファターゼ、シトラーゼ、コカインエステラーゼ、シトクロムＣ、シトクロムＣオキシダーゼ、シトクロムＣレダクターゼ、シトクロムＰ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、シトクロムＢ5、ＤＮアーゼ、ＤＮＡジャイレース、ヘリカーゼ、ＤＮＡジョイナーゼ、リガーゼ、ヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、ＤＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ修復酵素、ＤＮＡトポイソメラーゼ、エンドペクチンリアーゼ、エンドペプチダーゼ、エンドペルオキシドイソメラーゼ、エンドプロテイナーゼ、エンドリボヌクレアーゼ、フィブリノーゲン、フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、フェロオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、ＧＩ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、ヘモグロビン、ヘパリナーゼ、ラクトースシンターゼ、ラクトペルオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、ラクターゼ、ラッカーゼ、ミオグロビン、マレエートデヒドロゲナーゼ（Malate dehydrogenase）、マリックデヒドロゲナーゼ（Malic dehydrogenase）、リンゴ酸酵素（Malic enzyme）、メタノールオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ（Microperoxidase）、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、モノフェノールオキシダーゼ、ムタロターゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ＮＡＤＰシトクロムレダクターゼ、ＮＡＤＰＨオキシドレダクターゼ、ヌクレアーゼ、ナイトレートレダクターゼ、ＯＰＨ、オキサレートデカルボキシラーゼ、オキサレートオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、プチダレドキシン、パパイン、ペプシン、プラスミン、プラスミノーゲン、ペクチナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、デカルボキシラーゼ、プルベートデヒドロゲナーゼ（Puruvate dehydrogenase）、オキシダーゼ、キナーゼ、キノンレダクターゼ、リボヌクレアーゼ、サリチレートヒドロキシラーゼ、モノオキシゲナーゼ、サルコシンデヒドロキシラーゼ、オキシダーゼ、スルファターゼ、スルファイトオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ストレプトリシンＯ、トリプシン、ウレートオキシダーゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、キサンチンデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、アクチン、ベータアガラーゼ、アルブミン、ウシ血清、アルドラーゼ、アミラーゼ、アルファアミラーゼ、ベータアスパルチルアミノト���ンスフェラーゼ、アビジン、カルボニックアンヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＹ、カゼイン、アルファセルラーゼ、コレステロールエステラーゼ、コリンエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリル、キモトリプシン、クロストリパイン、コラーゲン、コラゲナーゼ、コンカナバリンＡ、クレアチンキナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、デキストラナーゼ、ジアホラーゼ、エラスターゼ、エラスチン、ガラクトシダーゼ、ベータグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ベータグルコシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、グルタメートデカルボキシラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロールキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、リパーゼ、ルシフェラーゼ、リゾチーム、マレエートデヒドロゲナーゼ、マルターゼ、ムチン、ＮＡＤアーゼ、ノイラミニダーゼ、ミクロコッカルヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、卵白アルブミン、オキサレートデカルボキシラーゼ、ペクチナーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼＩ、ホスホジエステラーゼＩＩ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＣ、血漿アミンオキシダーゼ、アメリカやまごぼう抗ウイルス毒素、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、プロテアーゼ、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、プロテイナーゼＫ、ピルベートキナーゼ、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＴ１、リボ核酸、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７、及びキシロースイソメラーゼ。
【００２７】
様々な具体例においては、本発明を、上記に列記したタンパク質のいずれでも包含する（排他的に、実質的に、または包含する）と定義することができる。例えば、本発明を、タンパク質は排他的に（すなわち、からなる）ＯＰＨ（または、他に、上記の一覧の他のタンパク質のいずれでも）であるか、または実質的に（すなわち、本質的に〜からなる）ＯＰＨ（または、他に、上記の一覧の他のタンパク質のいずれでも）であるか、またはＯＰＨ（または、他に、上記の一覧の他のタンパク質のいずれでも）を包含する（すなわち、含む）と定義することができる。
【００２８】
非常に様々なタンパク質が存在するが、また、タンパク質の構造を構成する化学的部分には膨大な重複が存在する。同じタイプのアミノ酸は大部分のタンパク質に共通である。化学的部分におけるこの類似性が、同じカップリング手法を使用してタンパク質を担体の上に結合することを可能にする。例えば、システイン、アミノ末端アミノ酸及びカルボキシル末端アミノ酸のスルフヒドリル、並びにアルギニン及びリジンのアミノ基は、こうした部分が存在するタンパク質とは無関係に、一般的には同じように、カップリング剤またはマトリックス表面と反応することができる。
【００２９】
大部分の場合には、タンパク質は担体とは直接に結合しない。場合によっては、単数または複数の連結部分が担体及びタンパク質と結合する。例えば、カップリング剤は、担体表面のヒドロキシル部分を介してタンパク質表面のアミンと反応できる（例えば、本明細書において参考のために引用する米国特許第5,077,210号を参照されたい。）。こうした連結部分は、好ましくは２〜２０個の原子を有する鎖長、より好ましくは４〜１０個の原子を有する鎖長を有する有機部分である。好ましくは、各タンパク質は少なくとも１つのカップリング部分を介して、より好ましくは２〜１０の部分を介してマトリックスと結合する。各タンパク質と結合した部分の数を、適切な分析法によって、例えば、結合したタンパク質を開裂し、開裂した分子を質量分析法によって分析することによって測定できる。表面ヒドロキシルをタンパク質に連結するための、多数の周知のカップリング剤が存在する。例えば、カップリング剤は、表面とのオキソ結合を形成するシロキサン（−Ｓｉ（ＯＲ）x）末端基、可撓性有機鎖（例えば、（ＣＨ2）n）、及びタンパク質と結合するチオール（−ＳＨ）末端基を有することができる。
【００３０】
担体と取り込まれた（例えば、非共有結合したかまたは共有結合付着した）タンパク質とを組み合わせたタンパク質系は、化学的な正確さでキャラクタリゼーションをすることが困難となり得る。しかしながら、系は、測定可能な特性によってキャラクタリゼーションすることができる。本発明の様々な具体例を定義することができる測定可能な特性としては、孔径、細孔容積、孔径分布、表面積、活性、安定性、担体中のタンパク質の密度、系の密度、及び系の強度が挙げられる。優れた特性は、タンパク質のサイズ（またはタンパク質の体積）に相当する孔径（または細孔容積）を有する担体を工学的に作製することで得ることができることが発見された。好ましくはタンパク質の体積は、平均細孔容積（ここで、この測定基準のために、平均細孔容積は、サイズの範囲が５０〜４００オングストロームである細孔のみに基づく）の５〜４０％、より好ましくはタンパク質の体積は平均細孔容積の１０〜２５％である。このようにタンパク質のサイズを孔径に整合させることで、活性及び安定性の意外な改良を与えることができる。こうした改良された特性を生じる機構は完全に解明されたわけではないが、タンパク質の閉じ込めは、反応性種をタンパク質中に指向することを助けるかもしれず、また、タンパク質が不可逆的に変性するのを防ぐかもしれないと考えられている。タンパク質の体積は、生物物理学的方法の例えば分析用超遠心またはＸ線結晶解析によって測定できる。好ましくは、活性は、タンパク質分子当りで測定して、活性状態にあるタンパク質の活性の少なくとも６０％である。好ましくは、系は、４０体積％未満のタンパク質；より好ましくは５〜４０体積％のタンパク質；さらにより好ましくは１０〜２５体積％のタンパク質を含む。好ましくは、系は、８Mの尿素にさらすと（実施例において述べるように）、タンパク質系中のタンパク質は遊離タンパク質の少なくとも２倍安定であり、幾つかの具体例においては、約３〜約５倍安定であるような安定性を有する。他の具体例においては、タンパク質系中のタンパク質は、実施例において述べる条件のいずれの下ででも溶液中に置いた場合、遊離タンパク質の少なくとも２倍安定であり（変性の速度によって測定される）、より好ましくは少なくとも３倍安定である。
【００３１】
本発明によって得ることができるさらなる利点は、タンパク質系の高い表面積（Ｎ2吸着によって測定される）である。孔径と同様に、表面積を、タンパク質系の場合には官能基化表面に関して、方法及びこうした方法によって製造される系によって定義される本発明の場合には非官能基化マトリックス材料に関して測定する。表面積は、好ましくは少なくとも７００m2/g；より好ましくは少なくとも９００m2/gである。表面積の上限は、Feng et al.によって説明されているタイプのメソ細孔性マトリックス材料及び同様の材料の上限によって限定されるかもしれない。本発明のさらなる利点は、比較的に緻密なタンパク質系を製造できることである。好ましくは、系中のタンパク質は、密度少なくとも０．０１mmol/g；より好ましくは密度０．１〜１mmol/gを有する。本発明の系は、その特性のうちの任意の１つまたは様々な組合せにてその特性のうちの幾つかを示すことを特徴とすることができる。例えば、好適な具体例においては、タンパク質系は、活性なタンパク質の活性の６５〜９５％の活性を示し、密度０．１〜１mmol/gを有する。
【００３２】
幾つかの好適な具体例においては、取り込まれたタンパク質を含む多孔質マトリックス材料は、微小チャネル内部に配置される。微小チャネルは、少なくとも１つの寸法が２mm以下、好ましくは１mm以下を有するチャネルである。微小チャネルは、向上した熱伝導及び／または物質移動及び設計の緻密さのような利点を提供することができる。幅０．２５mmのチャネル中に配置されたＳＡＭＭＳ中に架橋したＯＰＨに関する試験は、低い圧力低下（重力下での若しくは臑動ポンプでの送出下での流れまたは１bar未満）及びより大きい反応時間を証明した。従って、本発明は、取り込まれたタンパク質を含む多孔質マトリックス材料が微小チャネル内部に配置されるような装置及び方法を含む。この方法において、例えば、反応物は微小チャネルを通過して生成物を形成することができる。
【００３３】
タンパク質は周知の手順によって製造でき、好適な具体例においては、単数または複数のカップリング剤と反応して担体と結合する前に、特殊な手順を必要としない。好ましくは、マトリックス内部で結合する前に、タンパク質は、活性を安定化する水溶液中で約９５％純粋であるべきであり、緩衝液は、カップリングの化学を妨げるべきではない。
【００３４】
ＯＰＨを製造する本発明の方法において、宿主細胞は、ＯＰＨをコード化する配列を含むベクターを用いてトランスフェクションされ、配列は、機能し得るようにＴ７発現制御配列に結合している。トランスフェクションした宿主細胞を、発現を可能にする条件下、発現制御配列の制御下で培養する。ＯＰＨを、細胞または細胞の培地から精製する。好適な具体例においては、ベクターには、機能し得るようにＴ７発現制御配列に結合した、ＯＰＨをコード化する配列が与えられている。好ましくは、ＯＰＨは、約１３，０００酵素単位／mg（unit/mg）の活性を有する。好ましくは、ベクターはプラスミドである。宿主細胞は原核細胞、真核細胞、または酵母細胞とすることができる。原核細胞は好ましくは細菌、より好ましくは細菌は大腸菌である。酵母細胞は、好ましくはピキア・パストリス（Pichia pastoris）である。
【００３５】
マトリックスは好ましくは、可溶性前駆体から製造されたメソ細孔性酸化物材料である。好ましい合成の例は、米国特許第5,645,891号及び同第5,922,299号並びに米国特許出願第09/020,028号（この３つの全てを、完全に転載するように下記に組み込む。）、Liu et al.,"Molecular Assembly in Ordered Mesoporosity: A New Class of Highly Functional Nanoscale Materials," J. Phys. Chem., 104, 8328-8339 (Aug. 2000)及び上記に参照したFeng et al.の論文において提供されている。
【００３６】
マトリックス材料の典型的な合成は、Feng et al., Science, 276, p923 (1997)によって報告された。ＣＴＡＣ／ＯＨ溶液を作製するために、ＣＴＡＣ溶液と強塩基性イオン交換樹脂（ダウエックス−１（DOWEX-1）、０．２gの樹脂／１グラムの２９％ＣＴＡＣ溶液）とを接触させた。１３gのコロイドシリカ、５１gのテトラメチルアンモニウムシリケート及び２８gのメシチレンを、各々１００gのＣＴＡＨ／ＯＨ溶液に加えた。混合物をテフロンTMで内張りした容器中に密封し、１０５℃にて１週間加熱した。生成物を吸引ろ過によって回収し、雰囲気温度で乾燥し、５４０℃で１２時間、空気中でか焼した。得られたメソ細孔性材料の表面を、様々な方法で官能基化した。例えば、表面を、トリス（メトキシ）メルカプトプロピルシランと反応させることで、チオール基を用いて官能基化することができる。得られた官能基化マトリックスを“ＳＡＭＭＳ”と呼ぶ。％表面被覆率を、（ｉ）担体の表面積、（ｉｉ）官能基化単一層を付着させた後の重量変化、及び（３）平坦な表面上で実現する可能性がある理想的な負荷密度、に基づいて推定する。％表面被覆率は、電子エネルギー分散型分光法（electron energy-dispersive spectroscopy）（ＥＤＳ）によって実証することができる。
【００３７】
従来技術において周知のように、様々なアプローチを使用して、担体にタンパク質を付着させることができる。好適な具体例においては、担体を、カップリング剤の例えばビス［２−（スルホスクシンイミドキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）を用いて前処理する。過剰のカップリング剤は洗い流すことができる。それに続いてタンパク質を、カップリング剤で処理済みの表面と反応させる。他に、タンパク質をまずカップリング剤と反応させ、それに続いてマトリックスの表面と反応させることができる。過剰のタンパク質は洗い流し、回収することができる。
【００３８】
好ましい方法において、官能基化多孔質マトリックスをまず架橋剤と反応させる。例えば、アミノ誘導体化ＳＡＭＭＳをスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳまたはグルタルジアルデヒドと反応させる。過剰の架橋剤が存在する場合には除去することが望ましい。次に、タンパク質を加える。好ましくは、タンパク質は低濃度溶液中にある。この手順は、架橋剤によるタンパク質の分子間架橋の可能性を低減するかまたは無くす。
【００３９】
他の方法において、架橋剤を加えずに多孔質マトリックス材料（好ましくは官能基化多孔質マトリックス材料）をタンパク質と合わせる。このようにして、タンパク質が多孔質マトリックスと非共有結合しているようなタンパク質系を製造することができる。この方法を好ましくは、多孔質マトリックスが、選択されたタンパク質のための相補的な環境（complementary environment）を作り出す（例えば、マトリックスの細孔中のアミノ基はタンパク質表面のカルボキシル基と一致する）ように、静電相互作用を適応させることで行う。静電相互作用を適応させる際に考慮すべき可能性のあるファクターは、上記に検討した。
【００４０】
本明細書において説明するタンパク質系は、本明細書において説明する方法のいずれでも使用して製造でき、こうした方法もまた本発明の一部分である。
【００４１】
実施例
本発明者らは、ＡＴＣＣから入手可能なＯＰＨ遺伝子を得、ノバジェン（Novagen）から購入した２つのベクター、ｐＥＴ１１ａ及びｐＥＴ１５ｂ中にサブクローニングした。天然型のＯＰＨ及びＨｉｓ−ＴａｇTMを含むＯＰＨの両方を製造できるように、２つのノバジェンベクターを使用した。本発明者らは、両方のタイプの多数のクローンを作製した。こうしたノバジェンベクターは強いプロモーターを含み、所望のタンパク質の収率を最大にするように設計されている。制限消化は、本発明者らは間違いなくＯＰＨ遺伝子をサブクローニングし、得られた構成体は活性なＯＰＨタンパク質：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４（図４）を与えたことを確認した。
【００４２】
細菌発現及び精製：組み換えＯＰＨタンパク質を多孔質基体と結合した後、精製工程を実行した。実現した総発現レベルは、総タンパク質で約４g／リットルだった。本発明者らは、〜１０mg／リットルの活性なタンパク質を可溶性フラクションから精製した。従って、ＯＰＨの大部分は封入体（inclusion bodies）中にある；すなわち、これは不活性な形態で存在する。タンパク質が封入体中に存在するという事実は、精製を簡略化する。洗浄し、遠心分離した封入体から直接に精製したＯＰＨは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析して、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製したＯＰＨとほぼ同程度に純粋であるようである。封入体タンパク質から活性を回復する大規模な方法は、常用の実験によって開発できる。この簡略化された精製手順は工業用生産に適している。
【００４３】
材料及び方法
材料：
ジエチルｐ−ニトロフェニルホスフェート（パラオキソン、９０％）、様々な金属塩、グリセロール及び全ての緩衝液並びに他の塩類を、シグマ（Sigma）（登録商標）−オールドリッチ（Aldrich）（登録商標）から購入した。
【００４４】
発酵槽培地の成分（ペプトン及び酵母エキス）をギブコ  ＢＲＬ（Gibco BRL）から得、発現ベクター（ｐＥＴ１１ａTM、ｐＥＴ１５ｂTM）をノバジェンＩｎｃ．、マディソン、ＷＩ（Novagen Inc., Madison, WI）から購入した。  ＰＣＲ用のプライマーをジェノシスＩｎｃ．（Genosys Inc.）から取り寄せた。
【００４５】
タンパク質精製用のバルククロマトグラフィー媒質をパーセプティブ・バイオシステムズ（Perseptive Biosystems）から得た（ＨＳTM及びＨＱTM）。
ポリプロピルＡTM（Polypropyl ATM）カラム並びにＯＰＨ結合の比較用の非誘導体化シリカ樹脂を、ポリエルシーＩｎｃ．、コロンビア、ＭＤから得た。
【００４６】
酵素固定化用の架橋試薬をピアース・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、ＩＬ（Pierce Chemical Company, Rockford, IL）から購入した。
使用した略号：
ＣＴＡＣ、セチルトリメチルアンモニウムクロリド
ＯＰＨ、有機リンヒドロラーゼ
ＨＥＰＥＳ、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸
ＣＨＥＳ、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸
ＩＰＴＧ、イソプロピルチオガラクトシド
ＳＡＭＭＳ、メソ細孔性シリカ表面の自己集合単一層
スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、ビス［２−（スルホスクシンイミドキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン
ＤＴＳＳＰ、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート）
β−ＭＥ、β−メルカプトエタノール
マトリックス合成：
実施例において使用するメソ細孔性酸化物材料を製造するための典型的な手順は、次の通り。３００オングストロームの細孔直径を有するメソ細孔性シリカを、液晶鋳型手順によって製造した。トリブロックコポリマーであるプルロニック  Ｐ１２３（Pluronic P123）（ＢＡＳＦから入手可能なプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、Ｍav＝５，６００）を構造指向剤とし、メシチレンを細孔消費剤（pore expending agent）として使用した。２０gのプルロニック  Ｐ１２３を、１５０gの脱イオン（ＤＩ）水及び６００gの２MのＨＣｌ溶液中に４０℃で撹拌しながら溶解させた。３１．９gのメシチレンを次に加え、同じ温度で撹拌を続けた。４２．５gのＴＥＯＳを濁ったミセル溶液中に滴下し、上記の温度で２０時間撹拌しながら硬化させた。混合物を、テフロンTMで内張りしたオートクレーブ中、１００℃で一晩、撹拌せずにエージングした。白色の固体をろ過し、ＤＩ水を用いて洗浄し、空気乾燥した。この固体を、５５０℃で６時間徐々に昇温させて（１℃／分）か焼した。
【００４７】
２０％プロピルカルボン酸官能基化メソ細孔性シリカの典型的な製造において、２．０gのメソ細孔性シリカ（平均孔径＝３０nm、表面積＝５３３m2/g）をまずトルエン（６０mL）中に懸濁させ、ほぼ二層分のＤＩ水（０．６４mL）を用いて前処理した。この懸濁液を２時間撹拌して、メソ細孔性マトリックス全体にわたって水を分配させた。水和した混合物を次に２０％（０．２８８g）の１単一層分の（1 monolayer's）３−シアノプロピルトリメトキシシラン（ＣＰＴＳ）を用いて処理し、加熱して６時間還流させた。処理済みのメソ細孔性シリカを、トルエンを用いて洗浄して、いかなる未反応のシランも除去した。空気乾燥したＣＰＴＳ−ＳＡＭＭＳ材料を次に５０％Ｈ2ＳＯ4溶液を用いて処理し、３時間還流した。ＤＩ水を用いて長時間洗浄した後、白色の試料を７０℃で一晩、真空下で乾燥した。
【００４８】
２０％アミノプロピル（ＡＰＴＳ）及びメルカプトプロピル（ＭＰＴＳ）官能基化シリカの場合には、同じ手順を加水分解工程無しで適用した。２．０gのメソ細孔性シリカの懸濁液に、トルエン（６０mL）及び０．６４gの水及び０．１８８gのＡＰＴＳまたは０．２０６gのＭＰＴＳを、別々に加えた。混合物を加熱して６時間還流させ、次にろ別し、エタノールを用いて洗浄し、７０℃で一晩、真空下で乾燥した。
ＯＰＨサブクローニング：
ＯＰＨ配列を、ＰＣＲにより、ｐＣＭＳ７５プラスミドを使用し、大腸菌ＦＭ５（アムジェンＩｎｃ．（Amgen Inc.））（アメリカ培養コレクション、ロックビル、ＭＤ（American Type Culture Collection, Rockville, MD）から得た（ＡＴＣＣ（登録商標）＃６７７７８））中にクローニングした。ＰＣＲ反応用のプライマーを、プレミア・バイオソフト・インターナショナル（Premier Biosoft International）製のプライマー・プレミアTMソフトウェア、バージョン４．０４（Primer Premier software, version 4.04）を使用して選択した。使用したプライマーを以下のように列記する：
ＯＰＨ上流プライマー、２６マー：
【００４９】
【化１】
2005504505.tif 000002
【００５０】
ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を有するＯＰＨ下流プライマー（認識配列は太字の箇所）、２０マー：
【００５１】
【化２】
2005504505.tif 000003
【００５２】
ＯＰＨ配列を、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を使用してｐＥＴ１１ａ中にサブクローニングした。得られたＯＰＨ配列は、ＯＰＨ酵素の成熟部分をコード化し、すなわち、Ｎ末端の２９個のアミノ酸シグナル配列を有せず、その結果、配列の長さは１０１０bpであり、これは合計３３７個のアミノ酸またはＭＷ３６，４１９Daに相当する。
【００５３】
クローニングの正しい生成物が得られたことの確認を、ＰＣＲ及び制限酵素消化によって行った。
ＯＰＨのプラスミドの図を図２に示す。
発現及び精製：
有機リンヒドロラーゼを、ｏｐｈ−ｐＥＴ１１ａプラスミド及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓｓTM、ノバジェンＩｎｃ．、を宿主株として使用して、大腸菌発現系から精製した。（ｐＥＴ−１５ｂプラスミド中にサブクローニングされたＮ末端Ｈｉｓ−ＴａｇTMＯＰＨ）。ＩＰＴＧを用いた誘発は、ＳＤＳゲル表面で明白な移動度を有するタンパク質を生成することを示し、Ｎ末端シグナル配列（約３６kDaまたはＮ末端Ｈｉｓ−Ｔａｇ約３８kDaを有する）を有しない成熟した天然ＯＰＨタンパク質の遺伝子配列に基づく予測と一致した。ＩＰＴＧを用いた誘発の後、組み換え生成物の素性をまた、アミノ酸分析及び未精製の細胞溶解産物中のパラオキソン加水分解活性の出現によって確認した。
【００５４】
バイオ−フロ３’０００発酵槽TM（Bio-Flo 3'000 fermenterTM）（ニューブランズウィック、Ｉｎｃ．（New Brunswick Inc.））中での細胞の増殖のために使用する一般的なプロトコールは次の通りだった：
大腸菌細胞を、１２時間、３０℃でフラスコ中で増殖させ、１００μLのグリセロールストック／１LのＬＢ培地、１００μg/mLのアンピシリン、３５μg/mLのクロラムフェニコール、及びこの出発培養を発酵槽の接種材料として使用した。ＯＤ＝０．５を有する５００mLのＯＮ培養を遠心沈殿し、新しいＬＢ培地を用いて洗浄し、再度遠心し、抗生物質を含まない２５０mLのＬＢ中に再溶解させ、発酵槽培地に加えて、総体積＝２．５Lだった。（注意：１mMのＣｏＣｌ2をＯＮ出発培養用のＬＢ培地に加えないことを確実にする。というのはこれは細胞を殺すからである）。
【００５５】
発酵槽中の細胞は、４時間後に、３７℃で、５g/Lの酵母エキス、１０g/Lのペプトン、５g/LのＮａＣｌ、１mL/Lの泡止め剤、６０mMのＫ2ＨＰＯ4、１５mMのＫＨ2ＰＯ4、１mMのＣｏＣｌ2、１．３２μg/mLのチアミン、１００μg/mLのアンピシリン、３５μg/mLのクロラムフェニコール、１０g/Lのグリセロール及び微量金属（１０μMのＮＨ4Ｍｏ7Ｏ24、ＣｕＳＯ4、Ｈ3ＢＯ3、ＭｎＣｌ2、ＺｎＣｌ2）、５０μMのＦｅＣｌ3、０．５mMのＣａＣｌ2、１mMのＭｇＳＯ4を含む培地中で、中間対数期（mid-log phase）に達した。ＤＯ−撹拌−酸素三重カスケード（DO-agitation-oxygen triple cascade）を使用し、撹拌範囲を最小２００rpm〜最大８００rpmに設定して、酸素レベルを３５％に維持した。培地中の初期グルコース濃度は１０g/Lであり、実験の間中、通常のグルコースストリップ（regular glucose strip）を使用してグルコースレベルをモニターして、２g/L以上になるように維持した。
【００５６】
撹拌が４６７rpm、ＯＤ５５０＝５に達した時に、グルコースレベルは２g/Lだった。３１mLの４０％グルコースを加えて、グルコースレベルを５g/Lにした。撹拌が７００rpm、ＯＤ５５０＝１５に達した時に、グルコースレベルは再度２g/Lに低下した。温度は２８℃に低下し、混合物を、０．２５mMのＩＰＴＧを用いて誘発し、さらに３１mLの４０％グルコースを加えた。２８℃で４時間誘発した後、さらに０．２５mMのＩＰＴＧを加えた（合計０．５mM）。グルコースレベルは再度２g/Lであり、６３mLの４０％グルコースグルコースを加えて、グルコースレベルを１０g/Lにした。さらに２時間誘発した後、細胞は明らかに増殖し続け、温度は２４℃に低下し、細胞をさらに１４時間、発酵槽ＯＮ中に残した。最後に、６，０００rpm、２０分間、４℃の遠心分離によって細胞を集めた。
【００５７】
２．５Lの細胞培養から、約１５０gの湿潤重量の細胞ペーストを単離し、細胞ペーストを−８０℃で貯蔵した。
本発明者らは、６０gの細胞（１Lの培養に対応する）から、１３，２９４．１２酵素単位／mgの活性を有する約９０mgのＯＰＨを精製することができた。この収率を文献と比較できる。Omburo G.A., Kuo J.M., Mullins L.S., and Raushel F.M., in Characterization of the Zinc Binding site of Bacterial Phosphotriesterase. JBC, 1992, v. 267 (5): 13278-13283は、１６０gの細胞から８’０２０酵素単位／mgの活性を有する約２９８mgのコバルトホスホトリエステラーゼを得たことを報告した。
【００５８】
Lai K., Dave K. I., and Wild J.R. (Bimetallic Binding Motifs in Organophosphorous Hydrolase Are Important for Catalysis and Structural Organization. JBC, 1994, 269 (24): 16579-16584)は、比較するのがより困難であるが、５mgのＯＰＨ／１Lの培養（恐らくフラスコ中で増殖させた）を精製したことを報告した。彼らは、Ｔ７のような強いプロモーターに対して、発現用に弱いプロモーター（天然のプラク（native Plac））を使用することを好み、というのは、強いプロモーター構成体を用いて彼らが得たＯＰＨ活性の収率はより低かったからである（データは示さない）。全ての精製工程を、予め冷却した装置及びレブコクロマトグラフィー冷蔵キャビネット（Revco Chromatography Refrigeration cabinet）を使用して４℃で実行した。
【００５９】
細菌細胞（６０g）を、１００mMのＨＥＰＥＳ（pH８．５）、５０μMのＣｏＣｌ2、１mMのＤＴＴ、抗プロテアーゼカクテル（ペプスタチン、ロイペプチン及びアプロチニン）を含む４２０mLの溶菌緩衝液Ａ中に懸濁させ、フレンチ圧力セル（French pressure cell）を２回使用して細胞を溶菌した。可溶性タンパク質の上澄みを、１時間の１００，０００×gの遠心分離（アバンティTM、ベックマン（AvantiTM, Bechman））によって得、１mMのＤＴＴを５mMのベータ−メルカプトエタノール（２−ｍｅ）の代わりに用いた緩衝液Ａ中で平衡化した５００mLのＨＱTM陰イオン交換カラム（パーセプティブ・バイオシステムズ（Perseptive Biosystems））に負荷した。カラム流量は２５mL／分だった。ＯＰＨを含むフロースルーを集め、１MのＭＥＳ（pH５．５）を使用してpHを７．５に調節し、０．１MのＨＥＰＥＳ（pH７．５）、５０μMのＣｏＣｌ2、５mMの２−ｍｅ中で平衡化した２５０mLのＨＳ陽イオン交換カラム（パースペクティブ・バイオシステムズ（Perspective Biosystems））に適用した。カラム流量は２５mL／分だった。ＨＳカラムのフロースルーを保持し、十分に乾燥した（ＮＨ4）ＳＯ4を加え、オリオン  １２６、セル  ０１２２１０（Orion 126, Cell 012210）導電率計を使用して、試料の最終伝導率を１Mの（ＮＨ4）ＳＯ4溶液の伝導率（すなわち、１０５mS/mL）と等しくした。試料を、１Mの（ＮＨ4）ＳＯ4、０．１MのＨＥＰＥＳ（pH７．５）、５mMの２−ｍｅ中で平衡化した１８０mLのポリプロピルＡTM（ポリエルシー、Ｉｎｃ．）カラムに負荷した。カラム流量は１０mL／分だった。
【００６０】
平衡化緩衝液を用いた３カラム体積の洗浄の後、０．１MのＨＥＰＥＳ（pH７．５）までの１０カラム体積の勾配を利用し、ＯＰＨを勾配の最末端で溶出した。本発明者らは、１００mg近くの純粋なＯＰＨを６０gの細胞（１Lの培養に対応する）から精製することができた。３０ＫＮＭＷＬ（３０kDaカットオフ）膜を用いたミリポア・ウルトラフリー（登録商標）バイオマックス（Millipore Ultrafree（登録商標） Biomax）遠心濃縮器と、２０％グリセロールに対し、０．１MのＨＥＰＥＳ（pH７．５）、５０μMのＣｏＣｌ2への透析とを使用してタンパク質を３mg/mLまで濃縮した後、タンパク質を分取し、−８０℃で貯蔵した。比活性を測定して１３，２９４．１２酵素単位／mgだった（表Ｉ及びＳＤＳゲルの要約を参照されたい）。
【００６１】
ＨＩＣからピークとして現れたタンパク質の活性と濃縮及び透析後の同じタンパク質の活性との差は恐らく、緩衝液の交換によって説明されよう。１つの場合に、緩衝液は、ＯＰＨ活性の競合阻害剤であるベータ−メルカプトエタノールを含み、ＣｏＣｌ2を含まず、他の緩衝液は５０μMのＣｏＣｌ2を含み、２−ｍｅを含まなかった。
【００６２】
【表１】
2005504505.tif 000004
【００６３】
ＯＰＨ固定化：
使用した媒質：
１．ＳＡＭＭＳ：ＳＨ−、ＣＯＯ−、ＮＨ2−活性基を用いて誘導体化し、５％及び２０％のコーティングを施した（全ての利用可能なシラン基の５％及び２０％を活性基を用いて修飾したかまたは誘導体化した）。媒質の特性：２５０オングストロームの１２〜１５μmのビーズ、表面積約４５０m2/g
２．ポリエルシーシリカ：購入した未コーティングのものであり、ＮＨ2−、ＣＯＯ−基を用いてＰＮＮＬ中に誘導体化し、２０％及び１００％のコーティングを施した。媒質の特性：３００オングストロームの１２μmのビーズ、表面積約１００m2/g。
【００６４】
結合した酵素の最高の密度並びに活性の最低の損失及び最低の拡散限度を与えると思われる最良の結合化学に関してふるい分けした後、本発明者らは、ＯＰＨのＮＨ2−基を介したＯＰＨとＮＨ2−誘導体化媒質との結合を選択した。
【００６５】
多くの架橋剤を試験し、この中で２つが特に効果的であることが見い出された：すなわち、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ（ビス［２−（スルホスクシンイミドキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン）及びＤＴＳＳＰ（ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオナート））である。こうした２つの架橋剤の利点は次の通り：
ｉ．両方の架橋剤とも、スペーサーアーム（ＤＴＳＳＰの場合には長さ１２オングストロームであり、ＢＳＯＣＯＥＳの場合には１３オングストローム）を有する。スペーサーアームは、立体障害を避けるために有益である。
【００６６】
ｉｉ．これらの両方は、スルホ官能基（functioning group）が理由となって水溶性である。
ｉｉｉ．ピアース（ロックフォード、ＩＬ）（Pierce (Rockford, IL)）は、ＰＢＳを結合緩衝液（pH７．５）として推奨していた。このpHはＯＰＨにとって好都合であり、というのは、酸性のpHで、すなわち、６．５よりも低いpHで、ＯＰＨは凝集し、活性中心から金属を失う傾向があるからである。より高いpHはさらなる利点を有する：ＮＨＳ−エステルの加水分解はより高いpHでより速く進行する。従って、より高いpHを使用した場合、本発明者らは、架橋剤／タンパク質のより高いモル比を得た。
【００６７】
ｉｖ．両方とも安定な共有結合のアミド結合を生じ、ＤＴＳＳＰの場合には、この結合は、チオール（ＤＴＴ、メルカプトエタノール等）を用いて開裂可能である。この特徴は、特定の用途のために有用である可能性がある。
ＯＰＨとＮＨ2−誘導体化表面とのスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳまたはＤＴＳＳＰカップリングのための標準的なプロトコール：
（ピアースのプロトコールをほとんど修正していないもの）
１．スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳまたはＤＴＳＳＰ架橋試薬（管入りで入荷）は、−２０℃で、好ましくは乾燥し、窒素下で貯蔵すべきである。実施においては、架橋試薬を用いて作業する（すなわち、最初の管の内容物を分取する）際には、窒素グローブボックスまたは窒素袋（冷蔵室中で窒素タンクを使用して窒素を充填した）を使用するのは良い考えである。管を開ける前に常に試薬を室温にする。
【００６８】
２．ＯＰＨに結合する予定の媒質は、水中で十分に膨潤させるべきである。一般に本発明者らは、５００mgの媒質／５mLのＨ2Ｏを使用し、ＳＡＭＭＳ用の〜５０％スラリー（v/v）を作製した。このスラリーは、＋４℃で貯蔵した際に非常に安定だった。注意：ポリエルシー媒質の場合、ＳＡＭＭＳと比較して乾燥重量で２倍多い媒質を使用するべきである（すなわち、〜１gのポリエルシー媒質／５mLのＨ2Ｏ及び〜５０％スラリー（v/v）を作製する）。
【００６９】
３．ＯＰＨ（０９／０２に精製、［３mg/mL］）を２mL分取し、−８０℃で貯蔵し、解凍させ、緩衝液を２５mMのＨＥＰＥＳ（pH８．５）、２０％グリセロール、５０μMのＣｏＣｌ2から０．１Mのカーブ／重炭酸塩（carb/bicarbonate）（pH９．０）に変更した。本発明者らが使用したＮＡＰ−２５カラムは最大体積１０mLを有した。これを用いて、本発明者らは約２．５〜３．０mLの最大試料体積を利用することができた。
【００７０】
４．新たなミリポア・バイオマックス・ウルトラフリーの４．０mLの３０ＫＣＯ膜ユニットを使用し、１０分間、＋４℃で、ソルバールＣＦ、バッカーローター（Sorvall CF, bucker rotor）を最高速度で使用して２０mg/mLまで濃縮した。
【００７１】
５．切断したイエローチップを用いて、Ｈ2Ｏ中の５０％スラリー粉末を、２mgに対して９０．１mLの体積の０．１Mのカーブ／重炭酸塩緩衝液（pH９．０）中のＯＰＨに加えた。スラリー粉末のおおよその比は１５０μlの５０％スラリー／２mgのタンパク質である：ポリエルシーシリカ、及びＮＨ2−ＳＡＭＭＳの２０％被覆の２つのタイプの誘導体化（ＮＨ2−２０％及び１００％被覆）。
【００７２】
６．１．５mgまたは３mgまたは６mgのスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳまたはＤＴＳＳＰを５９０μlの５mMのＭＥＳ（pH５）中に溶解させる。（架橋剤／タンパク質の１０×、２５×、及び５０×のモル比を得る）
７．直ちに架橋剤溶液（１２５μl/２mgのタンパク質）を各エッペンドルフ管（eppendorf tube）に滴下し、混合し、室温で４５分間、管を回転装置に取り付ける。
【００７３】
８．停止液：１mLの１MのＴｒｉｓ（pH８．１）を、１時間室温で加える。
９．ＰＢＳを用いて２回、０．５MのＮａＣｌ−ＰＢＳを用いて１回、及びＰＢＳを用いて１回洗浄する。１００mMのＨＥＰＥＳ（pH８．５）−５０μMのＣｏＣｌ2中に再懸濁させ、＋４℃で貯蔵する。
【００７４】
１０．ＢＣＡピアースキットを使用して３７℃で３０分間反応させて、樹脂に裏打ちしているタンパク質の量を推定する。
【００７５】
実施例１
スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳの２０％コーティングを使用し、５０×モル過剰の架橋剤／タンパク質を使用したＯＰＨとＳＡＭＭＳ−ＮＨ2誘導体化表面とのカップリング
標準的なプロトコールに次のように従った：
１．スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳを含む管から内容物のアリコートを取り出すために、窒素を充填した窒素グローブボックスを使用した。
【００７６】
２．５００mgの媒質を５mLのＨ2Ｏ中に使用し、〜５０％スラリー（v/v）を作製した。このスラリーは、＋４℃で貯蔵した際に非常に安定だった。
３．ＯＰＨ（０９／０２に精製、［３mg/mL］）を２mL分取し、−８０℃で貯蔵し、解凍させ、緩衝液を２５mMのＨＥＰＥＳ（pH８．５）、２０％グリセロール、５０μMのＣｏＣｌ2から０．１Mのカーブ／重炭酸塩（pH９．０）に変更し、ファルマシア・セファデックスＧ−２５（Pharmacia Sephadex G-25）カラムを使用した。本発明者らが使用したＮＡＰ−２５カラムは最大体積１０mLを有した。これを用いて、本発明者らは約２．５〜３．０mLの最大試料体積を利用することができた。
【００７７】
４．新たなミリポア・バイオマックス・ウルトラフリーの４．０mLの３０ＫＣＯ膜ユニットを使用し、１０分間、＋４℃で、ソルバールＣＦ、バッカーローターを最高速度で使用して２０mg/mLまで濃縮した。
【００７８】
５．切断したイエローチップを用いて、Ｈ2Ｏ中の５０％スラリー粉末を、２mgに対して９０．１mLの体積の０．１Mのカーブ／重炭酸塩緩衝液（pH９．０）中のＯＰＨに加えた。スラリー粉末のおおよその比は１５０μlの５０％スラリー／２mgのタンパク質である：ポリエルシーシリカ、及びＮＨ2−ＳＡＭＭＳの２０％被覆の２つのタイプの誘導体化（ＮＨ2−２０％及び１００％被覆）。
【００７９】
６．６mgのスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳを５９０μlの５mMのＭＥＳ（pH５）中に溶解させる。
７．直ちにスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ溶液（１２５μl/２mgのタンパク質）をエッペンドルフ管に滴下し、混合し、室温で４５分間、管を回転装置に取り付ける。
【００８０】
８．１mLの１MのＴｒｉｓ（pH８．１）を、１時間室温で加える。
９．ＰＢＳを用いて２回、０．５MのＮａＣｌ−ＰＢＳを用いて１回、及びＰＢＳを用いて１回洗浄する。１００mMのＨＥＰＥＳ（pH８．５）−５０μMのＣｏＣｌ2中に再懸濁させ、＋４℃で貯蔵する。
【００８１】
１０．ＢＣＡピアースキットを使用し、３７℃で反応させて、樹脂と結合したＯＰＨの推定される量＝２５．０mg/mLの媒質及び１２５．０mg/gの媒質だった。
【００８２】
実施例２
スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳの２０％コーティングを使用し、２５×モル過剰の架橋剤／タンパク質を使用したＯＰＨとＳＡＭＭＳ−ＮＨ2誘導体化表面とのカップリング。手順は実施例１と同様だったが、ただし、工程６において３mgのスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳを代わりに使用した。樹脂と結合したＯＰＨの推定される量＝１６．０mg/mLの媒質及び８．０mg/gの媒質。
【００８３】
実施例３
スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳの２０％コーティングを使用し、１０×モル過剰の架橋剤／タンパク質を使用したＯＰＨとＳＡＭＭＳ−ＮＨ2誘導体化表面とのカップリング。手順は実施例１と同様だったが、ただし、工程６において１．５mgのスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳを代わりに使用した。樹脂と結合したＯＰＨの推定される量＝５．０mg/mLの媒質及び２５．０mg/gの媒質。
【００８４】
実施例４
ＤＴＳＳＰの２０％コーティングを使用し、５０×モル過剰の架橋剤／タンパク質を使用したＯＰＨとＳＡＭＭＳ−ＮＨ2誘導体化表面とのカップリング。手順は実施例１と同様だったが、ただし、工程６において６mgのＤＴＳＳＰを代わりに使用した。樹脂と結合したＯＰＨの推定される量＝２５．０mg/mLの媒質及び１２５．０mg/gの媒質。
【００８５】
実施例５
ＤＴＳＳＰの２０％コーティングを使用し、２５×モル過剰の架橋剤／タンパク質を使用したＯＰＨとＳＡＭＭＳ−ＮＨ2誘導体化表面とのカップリング。手順は実施例１と同様だったが、ただし、工程６において３mgのＤＴＳＳＰを代わりに使用した。樹脂と結合したＯＰＨの推定される量＝１６．０mg/mLの媒質及び８０．０mg/gの媒質。
【００８６】
実施例６
ＤＴＳＳＰの２０％コーティングを使用し、１０×モル過剰の架橋剤／タンパク質を使用したＯＰＨとＳＡＭＭＳ−ＮＨ2誘導体化表面とのカップリング。手順は実施例１と同様だったが、ただし、工程６において１．５mgのＤＴＳＳＰを代わりに使用した。樹脂と結合したＯＰＨの推定される量＝５．０mg/mLの媒質及び２５．０mg/gの媒質。
【００８７】
実施例７
スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ及びＤＴＳＳＰを使用した２０％及び１００％のコーティング表面において、１０×、２５×、及び５０×モル過剰の架橋剤／タンパク質を使用して、ＯＰＨをポリエルシーとカップリングさせた。手順は実施例１〜６と同様だったが、ただし、工程２において５mLのＨ2Ｏ当り１０００mgのポリエルシーを使用し、〜５０％スラリー（v/v）を作製した。
【００８８】
樹脂と結合したＯＰＨの推定される量を表ＩＩに列記する。
【００８９】
【表２】
2005504505.tif 000005
【００９０】
本発明の組成物は、従来のシリカ（ポリエルシー）を用いた場合よりも高い密度の負荷が可能であることが分かる。従って、本発明の好適な具体例は、負荷密度を特徴とすることができる。好ましくはタンパク質系は、同じコーティング％を有するポリエルシーよりも２〜約７倍高い（mg/g単位で）、より好ましくは約５〜約７倍高い密度を有する。好適な具体例においては、２０％コーティングで密度を測定する。
【００９１】
実施例８−変性の影響
ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳ及び可溶性ＯＰＨの変性条件に対する安定性を、尿素を４M、６M及び８Mの濃度で変性剤として使用して調べた。実施例の節における“可溶性ＯＰＨ”または“ＯＰＨは可溶”という句は、フレンチプレスを用いた細胞破壊の最中に放出され、各精製工程で示される緩衝液中に可溶性である非封入体ＯＰＨを指す。結果を下記の表３に示す。
【００９２】
【表３】
2005504505.tif 000006
【００９３】
固定化酵素は、遊離タンパク質よりもはるかに安定である。従って、本発明の好適な具体例は、変性剤に対するその安定性を特徴とすることができる。好ましくはタンパク質系は、８Mの尿素中で、遊離タンパク質の少なくとも２倍安定であり、幾つかの具体例においては、約３〜約５倍安定であるような安定性を有する。
【００９４】
実施例９−脱水からの回復
脱水及び回復の実験を、固定化ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳ及び可溶性ＯＰＨを使用して行った。可溶性ＯＰＨはその活性の７±１％のみを保持したが、ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳはその活性を完全に保持した（１０６±８％）。
【００９５】
実施例１０−動力学的特性
動力学的研究を、ＳＡＭＭＳ表面の固定化ＯＰＨ、ポリエルシー表面の固定化ＯＰＨ、及び可溶性ＯＰＨを用いて実行した。１mMのパラオキソン溶液を２５Ｃで使用して、１００mMのＣＨＥＳ緩衝液（pH８．０）、５０μMのＣｏＣｌ2中で基質が加水分解されてジエチルホスフェート及びｐ−ニトロフェノラートになる場合に、吸光度の変化を４０５nmでモニターして（吸光係数は１７，０００M-1cm-1）、酵素活性を測定した。分析には、耐熱性セルホールダー及びセル撹拌モジュールを備えたヒューレット・パッカードモデル８４５３ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を動力学モードで（Hewlett-Packard model 8453 UV/Vis spectrophotometer in kinetics mode equipped with the Thermostable Cell Holder and Cell Stirring Module）用いた。基質の新しい希釈物は、測定前３０分以内に作製した。シグマプロット（SigmaPlot）を使用して、データの線形回帰を作図した。ポリエルシー（コロンビア、ＭＤ）シリカは購入した未コーティングのものであり、アミノ基を用いて誘導体化した。１２μmのビーズの孔径は３００オングストロームだった。ＳＡＭＭＳで固定化されたＯＰＨ及びポリエルシーで固定化されたＯＰＨの両方は、可溶性ＯＰＨと同じＫmを有するが、より低いＶmax（ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳの場合には２．８３倍低く、ＯＰＨ−ポリエルシーの場合には６．４４倍低い）を証明した。すなわち、ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳは、ＯＰＨ−ポリエルシーよりも約２．３倍大きい反応速度を有する。表の質量は、ＯＰＨの質量を指す。
【００９６】
【表４】
2005504505.tif 000007
【００９７】
実施例１１−アルカリ性pHにおける安定性
この実験において、ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳ及び可溶性ＯＰＨを、アルカリ性条件下での安定性に関して試験した。１時間のアルカリ性pH処理（１MのＴｒｉｓ、pH１２．０）の後に、ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳは、可溶性ＯＰＨの場合の０．７７％と比較して、その活性の１１．６％を保持することが見い出され、２４時間のこのアルカリ性処理の後に、ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳは、可溶性ＯＰＨの場合の０．０３％と比較して、その活性の９．９％を保持することが見い出された。この実施例における条件は、“アルカリ性条件”という用語が本出願において使用される時にこの用語が意味するものを定義する。この実施例ではＯＰＨ系を示すが、本発明のメソ細孔性マトリックスによって提供される安定性の利点は一般的なものであるということは認識できるはずであり、他のタンパク質でも同様の安定性の利点が得られるだろうということは予想される。
【００９８】
実施例１２−熱安定性
熱安定性を研究する実験は、ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳは溶液中のＯＰＨよりもかなり安定であることを示した。こうした実験の結果を下記の表に示す。
【００９９】
【表５】
2005504505.tif 000008
【０１００】
実施例１３−凍結乾燥の影響
ＯＰＨ−ＳＡＭＭＳ及び可溶性ＯＰＨを凍結乾燥条件（１MのＭＥＳ、pH５．０）にさらして、１時間後及び２４時間後にＯＰＨ−ＳＡＭＭＳはその活性の５０％を保持したが、１時間後及び２４時間後に可溶性ＯＰＨはその活性の１５％のみを保持したことが見い出された。
【０１０１】
実施例１４
（１）スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳを含む管から内容物のアリコートを取り出すために、窒素を充填した窒素グローブボックスを使用した。
【０１０２】
（２）pH７．５で０．１MのＨＥＰＥＳ／５０μMのＣｏＣｌ2中のＯＰＨを、０５／０４／０１に精製し、１mL分取し、−８０℃で貯蔵し、冷蔵庫中で解凍させた。酵素ストックは、９２２３．３０酵素単位（０．２９mgのＯＰＨタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１０３】
（３）１．８mLの管中の３００オングストロームの２％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳの２〜４mgのアリコートに、１００〜２００μLの３．２mg/mLのスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ（pH７．５で０．１MのＨＥＰＥＳ／５０μMのＣｏＣｌ2中）を加え、２分間振とうした。次に、これを１４００rpmで２分間遠心分離し、過剰の架橋剤を含む上澄みを分離し、堆積物を、１００μLの同じ緩衝液を用いて洗浄した。次にこれに１００〜８００μLのＯＰＨストックを加え、１４００分-1の速度、エッペンドルフサーモミキサー５４３６（Eppendorf Thermomixer 5436）上、２５℃で４５〜９０分間振とうした。
【０１０４】
（４）次に酵素インキュベーション溶液を分離し、得られた堆積物をｎ×４００μLのpH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ（ｎ≧１０）で洗浄した。中間段階で、これを１４Krpmで６分間遠心分離した。最後に、洗浄した堆積物を、１００μLの緩衝液／mgの初期ＳＡＭＭＳで、同じ洗浄用緩衝液中に再度再懸濁させた。徹底的な洗浄の後に懸濁液及び透明な溶液の両方を測定して、しっかり固定化されていないＯＰＨが完全に洗い流されたことを示した。
【０１０５】
（５）共有結合したＯＰＨの推定されるタンパク質の量は、ピアースＢＣＡアッセイキット（ピアース、２３２２７）によって１１．００mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性１１３８６．０７酵素単位／mgの結合したＯＰＨを有した。
【０１０６】
実施例１５
（１）１０．１７mgのＧＯＤ（シグマＧ−７０１６）を、５mLのpH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ中にＧＯＤストックとして溶解させた。酵素ストックは、３９５．０５酵素単位（１．０５mgのＯＰＨタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１０７】
（２）実施例１４と同様だが、ＧＯＤストック及び３００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳを代わりに使用した。
（３）ＧＯＤ活性を、シグマ標準法（０８／３０／９６に改訂）を使用して測定した。
【０１０８】
（４）共有結合したＧＯＤの推定されるタンパク質の量は１４．８５mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性１１４．３１酵素単位／mgの結合したＧＯＤを有した。
【０１０９】
実施例１６
（１）９．９５mgのＧＯＤ（シグマＧ−７０１６）を、５mLのpH７．０で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ中にＧＯＤストックとして溶解させた。酵素ストックは、３７２．２５酵素単位（１．０８mgのＯＰＨタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１１０】
（２）実施例１５と同様だが、共有結合剤（covalent linker）源としてスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ溶液の代わりに２００〜４００μLの５％グルタルジアルデヒド（オールドリッチ、３４０８５−５）（pH７．０で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ中）を使用した。
【０１１１】
（３）洗浄溶液は、実施例１５において使用したpH７．５の代わりにpH７．０だった。
（４）共有結合したＧＯＤの推定されるタンパク質の量は８１．６４mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性７２．３４酵素単位／mgの結合したＧＯＤを有した。
【０１１２】
実施例１７
（１）ストレプトミセス・ルビギノサス（Streptomyces rubiginosus）から精製したＧＩを、ハンプトン・リサーチ、Ｉｎｃ．（Hampton Research, Inc.）から得た。これを、pH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ／１mMのＭｇＳＯ4中で透析し、１mL分取し、−８０℃で貯蔵し、使用前に冷蔵庫中で解凍させた。ＧＩストックは、１８０．２２酵素単位（４．１１mgのＧＩタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１１３】
（２）実施例１５と同様だが、ＧＯＤストックの代わりにＧＩストックを使用した。インキュベーションを４０℃で実行した。
（３）洗浄溶液は、pH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ／１〜２０mMのＭｇＳＯ4だった。
【０１１４】
（４）本条件でのＧＩ活性の定義：１酵素単位は、pH７．５、６０℃、１．９２３MのＤ−フルクトース濃度にて、１分間でＤ−グルコースに転換される１ミクロモルのＤ−フルクトースである。活性を以下のような一般的な手順で測定した：５〜２０μLのＧＩ−ＳＡＭＭＳ懸濁液に、０．５mLの２MのＤ−フルクトース（フルカ４７７３９（Fluka 47739））（pH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ／２０mMのＭｇＳＯ4中）を加え、次に１４００分-1の速度、エッペンドルフサーモミキサー５４３６上、６０℃の制御された温度で１５分間振とうした。次に、１０μLの１．８MのＨ2ＳＯ4によって反応を停止した。次に、５〜２０μLの反応溶液に、２．０mLのグルコース（ＧＯ）アッセイ試薬（シグマ、Ｇ３６６０）を加え、湯浴中、３７℃で３０分間インキュベートさせた。インキュベーション反応を１．０mLの６MのＨ2ＳＯ4によって停止し、吸光度を５４０nmで測定した。グルコース標準曲線から、フルクトースのＧＩ触媒転換によって生じたグルコースの量を得た。
【０１１５】
（５）共有結合したＧＩの推定されるタンパク質の量は４８．４７mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性５３．４０酵素単位／mgの結合したＧＯＤを有した。
【０１１６】
実施例１８
（１）実施例１７と同様だが、共有結合剤源としてスルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ溶液の代わりに２００〜４００μLの５％グルタルジアルデヒド（オールドリッチ、３４０８５−５）（pH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ中）を使用した。
【０１１７】
（２）共有結合したＧＩの推定されるタンパク質の量は３０．４５mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性３９．１９酵素単位／mgの結合したＧＯＤを有した。
【０１１８】
実施例１９
（１）pH７．５で０．１MのＨＥＰＥＳ／５０μMのＣｏＣｌ2中の精製されたＯＰＨを、１mL分取し、−８０℃で貯蔵し、冷蔵庫中で解凍させた。酵素ストックは、９２２３．３０酵素単位（０．２９mgのＯＰＨタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１１９】
（２）１．８mLの管中の３００オングストロームの２％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳの２〜４mgのアリコートに、１００〜８００μLのＯＰＨストックを加え、１４００分-1の速度、エッペンドルフサーモミキサー５４３６上、２５℃で２〜３時間振とうした。
【０１２０】
（３）次に酵素インキュベーション溶液を分離し、得られた堆積物をｎ×４００μLのpH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ（ｎ≧１０）で洗浄した。中間段階で、これを１４，０００rpmで６分間遠心分離した。最後に、洗浄した堆積物を、１００μLの緩衝液／mgの初期ＳＡＭＭＳで、同じ洗浄用緩衝液中に再度再懸濁させた。徹底的な洗浄の後に懸濁液及び透明な溶液の両方を測定して、しっかり固定化されていないＯＰＨが完全に洗い流されたことを示した。
【０１２１】
（４）取り込まれたＯＰＨの推定されるタンパク質の量は、ピアースＢＣＡアッセイキットによって９．５２mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性１６３７８．７４酵素単位／mgの取り込まれたＯＰＨを有した。
【０１２２】
実施例２０
（１）１０．１７mgのＧＯＤ（シグマＧ−７０１６）を、５mLのpH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ中にＧＯＤストックとして溶解させた。酵素ストックは、３９５．０５酵素単位（１．０５mgのＯＰＨタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１２３】
（２）実施例１９と同様だが、ＧＯＤストック及び３００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳを代わりに使用した。
（３）ＧＯＤ活性を、シグマ標準法（０８／３０／９６に改訂）を使用して測定した。
【０１２４】
（４）取り込まれたＧＯＤの推定されるタンパク質の量は１３．３５mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性９９．３３酵素単位／mgの取り込まれたＧＯＤを有した。
【０１２５】
実施例２１
（１）実施例２０と同様だが、９．９５mgのＧＯＤ（シグマＧ−７０１６）を、５mLのpH７．０で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ中にＧＯＤストックとして溶解させた。酵素ストックは、３７２．２５酵素単位（１．０８mgのＯＰＨタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１２６】
（２）洗浄溶液は、プロトコール７において使用したpH７．５の代わりにpH７．０だった。
（３）取り込まれたＧＯＤの推定されるタンパク質の量は１４．５９mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性１３６．２８酵素単位／mgの取り込まれたＧＯＤを有した。
【０１２７】
実施例２２
（１）ストレプトミセス・ルビギノサスから精製したＧＩを、ハンプトン・リサーチ、Ｉｎｃ．から得た。これを、pH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ／１mMのＭｇＳＯ4中で透析し、１mL分取し、−８０℃で貯蔵し、使用前に冷蔵庫中で解凍させた。ＧＩストックは、１８０．２２酵素単位（４．１１mgのＧＩタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１２８】
（２）実施例２０と同様だが、ＧＯＤストックの代わりにＧＩストックを使用した。インキュベーションを４０℃で実行した。
（３）洗浄溶液は、pH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ／１〜２０mMのＭｇＳＯ4だった。
【０１２９】
（４）ＧＩ活性を、プロトコール４において行ったものと同じ方法で測定した。
（５）取り込まれたＧＩの推定されるタンパク質の量は９４．９４mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性４３．２６酵素単位／mgの取り込まれたＧＯＤを有した。
【０１３０】
実施例２３
（１）精製されたＯＰＨを、２mL分取し、−８０℃で貯蔵し、冷蔵庫中で解凍させ、pH８．５で２５mMのＨＥＰＥＳ／２０％グリセロール／５０μMのＣｏＣｌ2からpH７．２で０．１MのＨＥＰＥＳへと透析した。酵素ストックは、４８３０．００酵素単位（０．３９mgのＯＰＨタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１３１】
（２）５０mLの管中の３００オングストロームの２％ＨＯＯＣ−ＳＡＭＭＳの８２．４５mgのアリコートに、１２mLのＯＰＨストックを加え、３５０rpmの速度、イノヴァ４３３０冷蔵インキュベーター振とう機（Innova 4330 refrigerated incubator shaker）上、２５℃で２時間４７分間振とうした。次いで、得られた懸濁液を０．４mL分取した。
【０１３２】
（３）次に酵素インキュベーション溶液を分離し、得られた堆積物をｎ×４００μLのpH７．５で２０mMのＨＥＰＥＳ（ｎ≧１０）で洗浄した。中間段階で、これを１４，０００rpmで６分間遠心分離した。最後に、洗浄した堆積物を、１００μLの緩衝液／mgの初期ＳＡＭＭＳで、同じ洗浄用緩衝液中に再度再懸濁させた。徹底的な洗浄の後に懸濁液及び透明な溶液の両方を測定して、しっかり固定化されていないＯＰＨが完全に洗い流されたことを示した。
【０１３３】
（４）取り込まれたＯＰＨの推定されるタンパク質の量は、４６．７３mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性２６７６６．７８酵素単位／mgの取り込まれたＯＰＨを有した。
【０１３４】
実施例２４
（１）３１．０７mgのＧＯＤ（シグマＧ−７０１６）を、１１mLのpH７．０で２０mMのホスフェート中にＧＯＤストックとして溶解させた。酵素ストックは、３９３．０８酵素単位（１．７１mgのＧＯＤタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１３５】
（２）実施例２３と同様だが、ＧＯＤストック及び９８．６７mgの３００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳを代わりに使用した。
（３）洗浄溶液はpH７．０で２０mMのホスフェート緩衝液である。
【０１３６】
（４）ＧＯＤ活性を、シグマ標準法（０８／３０／９６に改訂）を使用して測定した。
（５）取り込まれたＧＯＤの推定されるタンパク質の量は１０７．９４mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性７６．２２酵素単位／mgの取り込まれたＧＯＤを有した。
【０１３７】
実施例２５
（１）ストレプトミセス・ルビギノサスから精製したＧＩを、ハンプトン・リサーチ、Ｉｎｃ．から得た。これを、pH７．５で２０mMのホスフェート／０．１５MのＮａＣｌ／１mMのＭｇＳＯ4中で透析し、１mL分取し、−８０℃で貯蔵した。６つのアリコートを使用前に冷蔵庫中で解凍させ、２２．５mLのpH７．０で２０mMのナトリウム／１mMのＭｇＳＯ4によって一緒に希釈してＧＩストックとした。ＧＩストックは、４２．１０酵素単位（０．８６mgのＧＩタンパク質の量）／mLを含んだ。
【０１３８】
（２）実施例２４と同様だが、ＧＩストック及び１００．９８mgの３００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳを使用した。インキュベーションを４０℃で実行した。
（３）洗浄溶液は、pH７．５で２０mMのホスフェート／１〜２０mMのＭｇＳＯ4だった。
【０１３９】
（４）ＧＩ活性を、実施例１７において行ったものと同じ方法で測定した。
（５）取り込まれたＧＩの推定されるタンパク質の量は７７．２６mg/gのＳＡＭＭＳであり、初期比活性４５．０６酵素単位／mgの取り込まれたＧＩを有した。
比較例及び様々な条件を含む試験の結果
ポリエルシーＩｎｃ．から市販されている通常のシリカ（品目番号：ＢＭＳＩ  １２０３）をＳＡＭＭＳの場合と同様の方法で官能基化し、比較のために同じ実験条件下で上述のプロトコールにおけるＳＡＭＭＳに代えて使用した。
【０１４０】
孔径、官能性のタイプ及び被覆の影響を調べるために、様々な孔径、官能性単一層のタイプ及び被覆を使用して、同じ実験条件下で上述のプロトコールにおけるＳＡＭＭＳに代えた。
【０１４１】
緩衝液組成、pH、安定性及びイオン強度の影響を調べるために、様々な異なる洗浄溶液を、同じ実験条件下で上述のプロトコールにおける洗浄溶液に代えて使用した。
幾つかの結果を図に示す。以下の表記を使用したことに注意されたい：３００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳは、トリス−（メトキシ）アミノプロピルシランから誘導体化されたＮＨ2−官能性単一層の２０％被覆を有する孔径３００オングストロームのメソ細孔性シリカを意味し、一方、３００オングストロームの２％ＨＯＯＣ−ＳＡＭＭＳは、トリス−（メトキシ）カルボキシルエチルシランから得たＨＯＯＣ−官能性単一層の２％被覆を有する同じメソ細孔性シリカを意味する。
【０１４２】
図５は、５つの異なるマトリックス表面に固定化されたＯＰＨの比較データを示す。通常のシリカを使用した３つの実施例は４８酵素単位／mgのシリカの活性を有し、一方、ＳＡＭＭＳ表面に固定化されたＯＰＨは１５６及び１２５の活性を証明した。実施例１４及び１９を参照されたい。従って、通常のシリカから製造されたタンパク質系はかなりより低い活性を証明した。
【０１４３】
官能基のタイプ及び官能基化度は、タンパク質系を形成する際に重要なファクターであることが見い出された。２％ではなく２０％官能基化（１００オングストローム、１７０オングストロームまたは３００オングストロームのＳＡＭＭＳの表面で）を用いて実施例１９（活性１５６）を繰り返すと、１未満の活性を得た。同様に、２％ではなく２０％官能基化（１００オングストローム、１７０オングストロームまたは３００オングストロームのＳＡＭＭＳの表面で）を用いて実施例１４（活性１２５）を繰り返すと、２０未満の活性を得た。ＯＰＨを用いて処理した３００オングストロームの２０％ＨＯＯＣ−ＳＡＭＭＳは９７の活性を証明し、一方、ＯＰＨを用いて同様に処理した３００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳは１未満の活性を有した。
【０１４４】
実施例の節におけるデータは、タンパク質の共有結合固定化を利用するかまたは非共有結合取込を利用するかに関係なく（とはいえ、結合のタイプは制御できる別のファクターである）、個々のタンパク質に関し適切な密度で陰イオンまたは陽イオン官能基化を適応させることの重要性を証明した。この適応可能性は、高濃度の活性なタンパク質を多孔質マトリックス中に取り入れることを促進する。得られたタンパク質系は、その活性または他の測定可能な特性によって定義することができる。
【０１４５】
図６及び９は、様々な緩衝液濃度で取り込まれたタンパク質（図６）及び、様々な緩衝液濃度で取り込まれたタンパク質の比活性（pH７．２のＯＰＨの溶液と比較して）（図９）の両方の場合に、活性は緩衝液濃度（イオン強度）に敏感であることを示す。
【０１４６】
図７及び８に示すように、pH７．０で作製した試料は、より高いpHで作製した試料よりも多くのＯＰＨを含んだが、タンパク質系の比活性はほぼpH７．５で最適化されるようである。図８の比活性は、pH７．２のＯＰＨの対照液の比活性で割った固定化ＯＰＨの比活性である。
【０１４７】
非共有結合で保持されようと共有結合で保持されようと、取り込まれたＯＰＨは、溶液中のＯＰＨと比較してかなり良好な安定性を証明した。図１０に示すように、４℃で１１０日間冷蔵した場合に、取り込まれたタンパク質は約３０％未満の活性の損失を示した。室温でさらに４０日経た後に、恐らく再生によって若干の活性を回復した。
【０１４８】
図１１は、６つの異なるマトリックス表面に固定化されたＧＯＤの比較データを示す。通常のシリカを使用した３つの実施例は０．２、０．３及び０．４の活性を有し、一方、ＳＡＭＭＳ表面に固定化されたＧＯＤは２．０及び５．９の活性を証明した。実施例２０及び１５を参照されたい。従って、通常のシリカから製造されたタンパク質系はかなりより低い活性を証明した。同じ条件下で処理した“３００オングストロームのメソシリカ”と名付けられた非官能基化ＳＡＭＭＳ（すなわち、０％ＮＨ2）は、わずか０．３の活性を示した。１００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳから製造したＧＯＤタンパク質系は、３００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳと同じ活性を示したが、共有結合架橋剤を用いて１００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳから製造したＧＯＤタンパク質系は、３００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ中に共有結合で架橋された同様に製造したタンパク質の活性５．９と比較して、４．０の活性を示した。図１２に示すように、ＧＯＤの場合、２０％アミノ表面被覆率を有する多孔質マトリックスは、２％表面被覆率よりもかなり良好に機能した。０．１５Mの塩化ナトリウムの存在は、ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ系中のＧＯＤの活性のかなりの低下を引き起こした。図１３に示すように、ＧＯＤ−ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ系の製造の最中にpHを上昇させると、活性の低下をもたらす；しかしながら、ＧＯＤの比活性はより高いpH範囲で低下しなかった（図１４を参照されたい）。再度、図１５に示すように、タンパク質系は、ＧＯＤ溶液と比較して向上した安定性を示し、意外なことに、４℃で冷蔵した後に、非共有結合したタンパク質系は共有結合した系と比較してより良好な安定性を示した。
【０１４９】
従って、官能基化の他にまたは官能基化に加えて、各タンパク質系を共有結合及び非共有結合の点でキャラクタリゼーションするのが望ましいことがある。幾つかの好適な具体例においては、本明細書において説明する手順に従って試験した場合、非共有結合したタンパク質は、共有結合で架橋した系と比較して優れた安定性を有する。
【０１５０】
図１６は、８つの異なるマトリックス表面に固定化されたＧＩの比較データを示す。通常のシリカを使用して同様の条件下で作製した４つの実施例は０．０、０．０、０．３及び０．０の活性を有し、一方、ＳＡＭＭＳ表面に固定化されたＧＩはそれぞれ４．１、１．２及び２．６の活性を証明した。実施例２２、１７及び１８を参照されたい。従って、再度、通常のシリカから製造されたタンパク質系はかなりより低い活性を証明した。同じ条件下で処理した“３００オングストロームのメソシリカ”と名付けられた非官能基化ＳＡＭＭＳ（すなわち、０％ＮＨ2）は、０．０の活性を示した。ＧＩの場合、孔径に基づいてかなり大きな影響が見られ（図１７）、これは、ＧＩの大きなサイズを考慮すると予想外だったわけではない。図１８に示すように、共有結合した２０％ＮＨ2−通常のシリカ表面に固定化されたＧＩは、比活性７０を証明し、一方、共有結合した３００オングストロームの２０％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ表面に固定化されたＧＩは、比活性８９を証明した。ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ中のＧＩは、０．１５Mの塩化ナトリウムの存在によってほとんど影響されないことが見い出された。３００オングストロームの２％ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ及び３００オングストロームの２０％ＨＯＯＣ−ＳＡＭＭＳは、活性がほとんどまたは全く無いことが見い出された。
【０１５１】
ＧＩは頑健な酵素（robust enzyme）であり、ＳＡＭＭＳ中への取込は、試験した期間及び条件に関して比較的にわずかな安定性の向上を示した。しかしながら、ＯＰＨタンパク質系における安定性試験に基づいて、変性剤にさらす等のより困難な条件下での試験を行えば、好ましい本発明のタンパク質系、特にＳＡＭＭＳに基づく系の優れた安定性特性を明らかにすると思われると結論するのは合理的である。本発明を、一般に様々な試験条件下での安定性に関して説明することができる。
【０１５２】
本発明は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく様々な修正及び変更を含むことができる。従って、本発明を特定の説明及び実施例に限定すべきではなく、請求の範囲及び請求の範囲において述べる要素の同等物において述べる限定によって制御されるべきであることは理解できるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】多孔質基体中に配置された酵素の概念化された断面図である。
【図２】ＯＰＨプラスミドのリボン図である。
【図３】Ｔ７プロモーターの直ぐ前からＯＰＨ停止コドンの直ぐ向こうまでを包含する、構成体のＢａｍＨ  ＩからＢｇｌ  ＩＩ部位までの関連ＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ：２）である。
【図４】ＯＰＨのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ：１）である。
【図５】ＯＰＨ固定化に関する通常のシリカとＮＨ2−ＳＡＭＭＳとの比較を示す。
【図６】ＨＯＯＣ−ＳＡＭＭＳ中に取り込まれたＯＰＨにイオン強度が及ぼす影響を示す。
【図７】ＨＯＯＣ−ＳＡＭＭＳ中へのＯＰＨ取込にpHが及ぼす影響を示す。
【図８】様々なpHでのＨＯＯＣ−ＳＡＭＭＳ中のＯＰＨの固定化効率を示す。
【図９】ＨＯＯＣ−ＳＡＭＭＳ中のＯＰＨ固定化効率にイオン強度が及ぼす影響を示す。
【図１０】ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ中に固定化されたＯＰＨの安定性を示す。
【図１１】グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）固定化に関する通常のシリカとＮＨ2−ＳＡＭＭＳとの比較を示す。
【図１２】ＧＯＤ取込にＮＨ2−ＳＡＭＭＳの官能基の被覆が及ぼす影響を示す。
【図１３】ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ中へのＧＯＤ取込にpHが及ぼす影響を示す。
【図１４】様々なpHでのＮＨ2−ＳＡＭＭＳ中のＧＯＤの固定化効率を示す。
【図１５】ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ中に固定化されたＧＯＤの安定性を示す。
【図１６】ＧＩ固定化に関する通常のシリカとＮＨ2−ＳＡＭＭＳとの比較を示す。
【図１７】ＧＩ固定化とＮＨ2−ＳＡＭＭＳの孔径の影響との比較を示す。
【図１８】ＮＨ2−ＳＡＭＭＳ中のＧＩの固定化効率を示す。
【図５】
2005504505.tif 000009
【図６】
2005504505.tif 000010
【図７】
2005504505.tif 000011
【図８】
2005504505.tif 000012
【図９】
2005504505.tif 000013
【図１０】
2005504505.tif 000014
【図１１】
2005504505.tif 000015
【図１２】
2005504505.tif 000016
【図１３】
2005504505.tif 000017
【図１４】
2005504505.tif 000018
【図１５】
2005504505.tif 000019
【図１６】
2005504505.tif 000020
【図１７】
2005504505.tif 000021
【図１８】
2005504505.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2005504505.tif 000023
2005504505.tif 000024
2005504505.tif 000025
2005504505.tif 000026
2005504505.tif 000027
2005504505.tif 000028
2005504505.tif 000029
2005504505.tif 000030
2005504505.tif 000031
2005504505.tif 000032
2005504505.tif 000033
2005504505.tif 000034
2005504505.tif 000035
2005504505.tif 000036
2005504505.tif 000037
2005504505.tif 000038
2005504505.tif 000039
2005504505.tif 000040
2005504505.tif 000041
2005504505.tif 000042
2005504505.tif 000043
2005504505.tif 000044
2005504505.tif 000045
2005504505.tif 000046
2005504505.tif 000047
2005504505.tif 000048
2005504505.tif 000049
2005504505.tif 000050
2005504505.tif 000051
2005504505.tif 000052
2005504505.tif 000053
2005504505.tif 000054
2005504505.tif 000055
2005504505.tif 000056
2005504505.tif 000057
2005504505.tif 000058
2005504505.tif 000059
2005504505.tif 000060
2005504505.tif 000061
2005504505.tif 000062
2005504505.tif 000063
2005504505.tif 000064
2005504505.tif 000065
2005504505.tif 000066
2005504505.tif 000067
2005504505.tif 000068
2005504505.tif 000069
2005504505.tif 000070
2005504505.tif 000071
2005504505.tif 000072
2005504505.tif 000073
2005504505.tif 000074
2005504505.tif 000075
2005504505.tif 000076
2005504505.tif 000077
2005504505.tif 000078
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504505.tif 000079
【国際調査報告】
2005504505.tif 000080
2005504505.tif 000081
2005504505.tif 000082
2005504505.tif 000083
2005504505.tif 000084