(57)【要約】疼痛治療のための薬剤、該薬剤の製造方法、ならびに、治療有効量の該薬剤を患者に投与することによる疼痛の治療方法を開示する。この薬剤は、標的化成分に結合したクロストリジウム神経毒、そのフラグメントまたは誘導体を含むことができ、該標的化成分は、他の結合部位(例えば、α-２Ａアドレナリン作動性受容体サブタイプ)と比較して、α-２Ｂまたはα-２Ｂ／α-２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプにおいて選択的に結合する化合物からなる群から選択される。
2005506277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療成分および標的化成分を含む薬剤であって、該標的化成分が、α-２Ａアドレナリン作動性受容体サブタイプと比較して、α-２Ｂまたはα-２Ｂ／α-２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプにおいて選択的に結合する薬剤。
【請求項２】
治療成分が、細胞からの神経伝達物質の放出またはそのプロセスを妨げる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
治療成分が軽鎖成分を含む、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
軽鎖成分が、ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその変異体の軽鎖またはそのフラグメントを含む、請求項２に記載の薬剤。
【請求項５】
軽鎖成分が、ボツリヌス毒素Ａ型、Ｂ型、Ｃ1型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型またはその変異体の軽鎖またはそのフラグメントを含む、請求項２に記載の薬剤。
【請求項６】
軽鎖成分が、ボツリヌス毒素Ａ型またはその変異体の軽鎖またはそのフラグメントを含む、請求項２に記載の薬剤。
【請求項７】
治療成分が細胞リボソームを不活性化する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
治療成分がサポリンである、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
移行成分をさらに含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１０】
移行成分により、標的細胞の細胞質への少なくとも一部の薬剤の移動が促進される、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１１】
移行成分により、標的細胞の細胞質への治療成分の移動が促進される、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１２】
移行成分が重鎖成分を含む、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１３】
重鎖成分が、ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその変異体の重鎖またはそのフラグメントを含む、請求項１２に記載の薬剤。
【請求項１４】
重鎖成分が、ボツリヌス毒素Ａ型、Ｂ型、Ｃ1型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型またはその変異体の重鎖またはそのフラグメントを含む、請求項１２に記載の薬剤。
【請求項１５】
重鎖成分が、ボツリヌス毒素Ａ型またはその変異体の重鎖またはそのフラグメントを含む、請求項１２に記載の薬剤。
【請求項１６】
重鎖フラグメントが、重鎖のアミノ末端フラグメントの少なくとも一部を含む、請求項１２に記載の薬剤。
【請求項１７】
治療成分がボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖を含み、移行成分がボツリヌス毒素Ａ型の重鎖フラグメントを含み、該重鎖フラグメントが、細胞質への少なくとも該治療成分の移行を補助することができる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１８】
標的化成分が、式：
【化１】
2005506277.tif 000035
によって示される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項１９】
標的化成分が、式：
【化２】
2005506277.tif 000036
によって示される化合物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項２０】
標的化成分が、式：
【化３】
2005506277.tif 000037
によって示される化合物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項２１】
標的化成分が、式：
【化４】
2005506277.tif 000038
[式中、
Ｘは、Ｒ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5およびＲ4-Ｃからなる群から選択され、
ＸがＲ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5である場合、６員炭素環構造が形成され、
ＸがＲ4-Ｃである場合、５員炭素環構造が形成され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ6、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ6は、Ｈまたはメチル、エチルもしくはプロピルを含むアルキルである]
によって示される化合物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項２２】
標的化成分が、式：
【化５】
2005506277.tif 000039
によって示される化合物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項２３】
標的化成分が、式：
【化６】
2005506277.tif 000040
によって示される化合物である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項２４】
標的化成分が、式：
【化７】
2005506277.tif 000041
[式中、
点線は任意選択的な二重結合を示し；
ＲはＨまたは低級アルキルであり；
ＸはＳまたはＣ(Ｈ)Ｒ11であり、ここでＲ11は、Ｈまたは低級アルキルであるか、あるいは、ＸがＳである場合またはＸと式：
【化８】
2005506277.tif 000042
で示される環の間の結合が二重結合である場合、Ｒ11は存在せず；
Ｙは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、(Ｃ(Ｒ11)Ｘ)y(ｙは１〜３の整数である)、-ＣＨ＝ＣＨ-、または-Ｙ1ＣＨ2-(Ｙ1はＯ、ＮまたはＳである)であり；
ｘは１または２の整数であり、Ｒ12、Ｒ13またはＲ14が不飽和炭素原子に結合している場合、ｘは１であり、Ｒ12、Ｒ13またはＲ14が飽和炭素原子に結合している場合、ｘは２であり；
Ｒ12は、Ｈ、低級アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルケニル、アシルまたは低級アルキニルであるか、あるいは、飽和炭素原子に結合している場合、Ｒ12はオキソであってよく；
Ｒ13およびＲ14は、それぞれＨ、低級アルキル、ハロゲン、低級アルケニル、アシルまたは低級アルキニルであるか、あるいは、飽和炭素原子に結合している場合、Ｒ12はオキソであってよく；
Ｒ13およびＲ14は、それぞれＨ、低級アルキル、ハロゲン、低級アルケニル、アシル、低級アルキニル、アリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリール(ここで該置換基は、ハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルケニル、アシル、低級アルキニル、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、ヒドロキシまたはフェニルである)であるか、または一緒になって、-(Ｃ(Ｒ2)x)z-、-Ｙ1(Ｃ(Ｒ2)x)z'-、-Ｙ1(Ｃ(Ｒ2)x)yＹ1-、-(Ｃ(Ｒ2)x)-Ｙ1-(Ｃ(Ｒ2)x)-、-(Ｃ(Ｒ2)x)-Ｙ1-(Ｃ(Ｒ2)x)-(Ｃ(Ｒ2)x)-および-Ｙ1-(Ｃ(Ｒ2)x)-Ｙ1-(Ｃ(Ｒ2)x)- (ここで、ｚは３〜５の整数であり、ｚ'は２〜４の整数であり、ｘおよびｙは上記定義の通りである)であり、さらに、これら二価部分の各々のどちらかの末端がどちらかのＲ13またはＲ14において結合して、縮合環構造：
【化９】
2005506277.tif 000043
を形成することができ、こうして形成される環は、環炭素が４価以下、窒素が３価以下、ＯおよびＳが２価以下であるという条件のもと、完全に不飽和、部分的に不飽和、または完全に飽和であることができる]
によって示される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項２５】
標的化成分がアミノ酸成分を含む、請求項１に記載の薬剤。
【請求項２６】
アミノ酸成分が抗体である、請求項２５に記載の薬剤。
【請求項２７】
抗体が抗原成分から惹起され、該抗原成分がα-２Ｂ受容体の第２細胞外ループを含む、請求項２６に記載の薬剤。
【請求項２８】
第２細胞外ループがキーホールリンペットヘモシアニンに結合している、請求項２７に記載の薬剤。
【請求項２９】
第２細胞外ループが、アミノ酸配列：ＫＧＤＱＧＰＱＰＲＧＲＰＱＣＫＬＮＱＥ(配列番号１)を含むペプチドフラグメントを含む、請求項２７に記載の薬剤。
【請求項３０】
アミノ酸成分が、野生型ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体の変異ペプチド、変異ポリペプチド、変異タンパク質、または変異タンパク質複合体を含む、請求項２５に記載の薬剤。
【請求項３１】
アミノ酸成分が変異ポリペプチドである、請求項２５に記載の薬剤。
【請求項３２】
変異ポリペプチドが変異重鎖である、請求項３１に記載の薬剤。
【請求項３３】
治療成分および標的化成分が、互いにスペーサー成分を介して結合している、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３４】
治療成分、移行成分、および標的化成分が、互いにスペーサー成分を介して結合している、請求項９に記載の薬剤。
【請求項３５】
治療成分がボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖であり、移行成分が細胞質への少なくとも軽鎖の移行を促進することができるボツリヌス毒素Ａ型の重鎖フラグメントであり、標的化成分が式：
【化１０】
2005506277.tif 000044
[式中、
Ｘは、Ｒ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5およびＲ4-Ｃからなる群から選択され、
ＸがＲ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5である場合、６員炭素環構造が形成され、
ＸがＲ4-Ｃである場合、５員炭素環構造が形成され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ6、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ6は、Ｈまたはメチル、エチルもしくはプロピルを含むアルキルである]
によって示される、請求項３４に記載の薬剤。
【請求項３６】
スペーサー成分が、炭化水素、免疫グロブリンヒンジ領域以外のポリペプチド、および免疫グロブリンヒンジ領域と同一または類似のプロリン含有ポリペプチドからなる群から選択される部分を含む、請求項３４に記載の薬剤。
【請求項３７】
ヒトを含む哺乳動物の慢性疼痛の治療に有用である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３８】
慢性疼痛が、実質的に急性の痛覚または触覚に影響を与えることなく治療される、請求項３７に記載の薬剤。
【請求項３９】
治療成分および標的化成分を含む薬剤であって、該標的化成分が、α-２Ａアドレナリン作動性受容体サブタイプと比較して、α-２Ｂまたはα-２Ｂ／α-２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプにおいて選択的に結合する薬剤の、少なくとも１つの成分のためのコードを有する遺伝子からポリペプチドを製造する工程を含む、疼痛治療のための薬剤の製造方法。
【請求項４０】
薬剤が移行成分をさらに含む、請求項３９に記載の薬剤の製造方法。
【請求項４１】
治療成分がボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖を含み、移行成分が標的細胞の細胞質への少なくとも軽鎖の移動を促進することができる重鎖フラグメントを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
標的化成分がアミノ酸成分を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
アミノ酸成分が、野生型ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体の変異ペプチド、変異ポリペプチド、変異タンパク質、または変異タンパク質複合体を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
変異ペプチドが変異重鎖である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
治療成分および標的化成分を含む薬剤であって、該標的化成分が、α-２Ａアドレナリン作動性受容体サブタイプと比較して、α-２Ｂまたはα-２Ｂ／α-２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプにおいて選択的に結合する薬剤の治療有効量を哺乳動物に投与して疼痛を緩和する工程を含む、疼痛の治療方法。
【請求項４６】
緩和される疼痛が慢性疼痛である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
移行成分をさらに含む、請求項４５に記載の治療方法。
【請求項４８】
治療成分がボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖を含み、
移行成分が、標的細胞の細胞質への少なくとも軽鎖の移動を促進することができるボツリヌス毒素Ａ型の重鎖フラグメントを含み、
標的化成分が、一般式：
【化１１】
2005506277.tif 000045
[式中、
Ｘは、Ｒ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5およびＲ4-Ｃからなる群から選択され、
ＸがＲ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5である場合、６員炭素環構造が形成され、
ＸがＲ4-Ｃである場合、５員炭素環構造が形成され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ6、およびＨからなる群から選択され、
Ｒ6は、Ｈまたはメチル、エチルもしくはプロピルを含むアルキルである]
によって示される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
治療成分および移行成分がボツリヌス毒素の一部である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
ボツリヌス毒素がＡ型である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
薬剤が約１単位〜約５００単位のボツリヌス毒素を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
薬剤が約１０単位〜約３００単位のボツリヌス毒素を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
疼痛緩和が約２〜約２７ヶ月持続する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
薬剤を鞘内投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
薬剤を中枢神経系の頭蓋領域に鞘内投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
薬剤を中枢神経系の頸部領域に鞘内投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
薬剤を中枢神経系の胸郭領域に鞘内投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
薬剤を中枢神経系の腰椎領域に鞘内投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
薬剤を中枢神経系の仙椎領域に鞘内投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
薬剤を筋肉内投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
薬剤を皮下投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
疼痛が慢性疼痛である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
疼痛が内臓痛である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
疼痛が神経痛である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６５】
疼痛が関連痛である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６６】
疼痛が異痛型疼痛である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６７】
異痛型疼痛が、実質的に急性の痛覚または触覚に影響を与えることなく緩和される、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛治療のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、神経毒を含む薬剤、該薬剤の製造方法、および該薬剤を使用する疼痛の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「結局のところ、人類が得ることができる幸福は、快楽ではなく苦痛からの解放である」[John Dryden (1631〜1700)]。
ヒトの疼痛を、２つの一般的なカテゴリー(急性および慢性)に分類するのが好都合である。任意の有害な刺激(例えば、高温または鋭利物体)により、急性疼痛を惹起することができる。このような刺激に起因する疼痛は、通常、比較的短期間で鎮静する。また、急性疼痛は、いずれかの疾患の過程においても存在することができる。しかし、このような疼痛は、自己限定的でもあり、時間または適切な治療により鎮静する。
【０００３】
慢性疼痛は、第２の主カテゴリーの疼痛である。これは、数週間以上にわたって持続する有意な疼痛と定義することができ、根元的な問題の治療に利用可能な適切な治療法は存在しない。世界的に、現在無数の慢性疼痛患者が存在する。例えば、合衆国のみでも、国立衛生研究所は、９０００万人のアメリカ人が片頭痛、背中の痛み、関節炎、外傷、異痛症、または災害的な疾病由来の慢性疼痛に罹患していると見積られている。
【０００４】
一般に、末梢由来の急性または慢性疼痛シグナルの感覚それ自体への変換は、多ニューロン経路および脳の情報処理中心によって行われる。感覚刺激の伝達に関与する経路の第１の神経細胞を、一次感覚求心と称する。頭部およびいくつかの内部器官に由来する一次感覚求心の細胞体は、脳神経、特に三叉神経核および孤束核に関連する種々の神経節に存在する。残りの身体の一次感覚求心の細胞体は、脊柱の背根神経節に存在する。一次感覚求心およびその突起(プロセス)は、組織学的に分類されており、細胞体は以下の２つのクラスに分類されている。即ち、Ａ型は大きく(直径６０〜１２０μｍ)、Ｂ型は比較的小さく(直径１４〜３０μｍ)、かつ比較的多数である。同様に、突起は、以下の２つのカテゴリーに分類されている。即ち、ミエリン鞘を欠くＣ線維とミエリン鞘を有するＡ線維である。さらにＡ線維は、十分に発達したミエリンを有する直径の大きいＡβ線維および発達が不十分なミエリンを有する比較的細いＡδ線維に分類することができる。一般に、Ａβ線維はＡ型細胞体から生じ、Ａδ線維およびＣ線維はＢ型細胞体から生じると考えられている。
【０００５】
一次感覚求心の活性化に続く、次の感覚シグナル変換工程は、中枢神経系の高次部分(例えば視床核)に脊髄視床路を介してシグナルを運ぶ投射ニューロンの活性化である。これらニューロンの細胞体(脳神経に関連するもの以外)は、脊髄背角に存在する。またこれは、一次求心と投射ニューロンの間のシナプスが存在するところである。背角は、積重なった一連の層(最も背側の層Ｉ、それに続く層IIなど)に組織化される。異なるクラスの一次求心は、異なる層のシナプスを構成する。皮膚一次求心のために、Ｃ線維は層ＩおよびIIにおいてシナプスを構成し、Ａδ線維は層Ｉ、IIおよびＶにおいてシナプスを構成し、Ａβ線維は層III、IVおよびＶにおいてシナプスを構成する。より深い層(Ｖ〜VII、Ｘ)は、より深い組織(例えば、筋肉および内臓)から到達する感覚経路に関与していると考えられている。
【０００６】
一次求心と投射ニューロンの間のシナプスにおける支配的な神経伝達物質は、サブスタンスＰ、グルタミン酸塩、カルシトニン-遺伝子関連ペプチド(ＣＧＲＰ)、および神経ペプチドＹである。これらシナプスの伝達効率を、脊髄中の介在ニューロンによっておよび下行経路によって変化させることができる。これらの調節ニューロンは、阻害性(例えば、オピオイドペプチド、グリシン、ノルエピネフリン)または興奮性(例えば、酸化窒素、コレシストキニン、ノルエピネフリン)である多数の媒介伝達物質を放出して、感覚認識の増強または減少のための機構を与える。
【０００７】
現在利用可能な急性疼痛の治療法は一般に扱い易いが、慢性疼痛の治療法は、不適切かつ期待はずれである。例えば、オピオイド(モルヒネおよびフェンタニルなど)の脊髄内投与は、疼痛を緩和しうることが既知である。例えば、Gianno,J.らの「痙縮および疼痛の鞘内薬物療法」[Springer-Verlag、1996](この刊行物は、その全体が本明細書中で参考として援用される)を参照。しかし、脊髄内または鞘内注射で使用されるこれらの薬物は、通常、短期間の抗侵害受容効果を有しているにすぎない。この結果、これらの薬物は、連続注入用ポンプを用いるなどにより、頻繁に投与しなければならない。例えば、よく使用されるポンプの１つは、Medtronic,Inc.(ミネアポリス、ミネソタ州)から販売されているプログラム可能な移植ポンプであるSynchroMed(登録商標)Infusion Systemである。しかし、ポンプ使用のためには外科手術移植が必要になるので合併症が伴われ、疼痛のための既知の鞘内投与薬物(オピオイドなど)は、依存性および呼吸低下の可能性という欠点を有する。
長期作用の鎮痛薬も知られている(例えば、フェノール注射による遮断)。しかし、このような治療法は、不可逆性の機能障害のリスクが大きくなる。
【０００８】
ボツリヌス毒素
嫌気性のグラム陽性細菌であるClostridium botulinum(ボツリヌス菌)は、ボツリヌス中毒と称されるヒトおよび動物の神経麻痺疾患を引き起こす強力なポリペプチド神経毒であるボツリヌス毒素を産生する。Clostridium botulinumの胞子は土壌中に見い出され、不適切に滅菌され密封された家庭用の食品容器において成長することができ、多くのボツリヌス中毒の原因となる。通常、ボツリヌス中毒の作用は、Clostridium botulinumの培養物または胞子に感染した食品を食して１８〜３６時間後に現れる。ボツリヌス毒素は、腸内壁を弱毒化されずに通過することができ、末梢運動ニューロンを攻撃するようである。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行、嚥下、および会話の困難から呼吸器筋肉の麻痺および死に至ることがある。
【０００９】
ボツリヌス毒素Ａ型は、ヒトに対して知られている最も致命的な天然の生物学的物質であり、極めて強いＬＤ50値を有する。ある種の動物種の集団の５０％に対して致命的である特定の毒素量をＬＤ50と言う。例えば、ヒトにおけるボツリヌス毒素Ａ型[精製した神経毒複合体として、商標名ＢＯＴＯＸ(登録商標)のもとでAllergan,Inc.、Irvine、カリフォルニアから販売されている]のおよそのＬＤ50は、約１５０,０００ピコグラムまたは約３,０００単位である。興味深いことに、モル濃度ベースでは、ボツリヌス毒素Ａ型は、ジフテリア毒素の約１８億倍、シアン化ナトリウムの約６億倍、コブラ毒の約３０００万倍、およびコレラ毒素の約１２００万倍致命的である。Singhの「細菌タンパク質毒素の危険性」[B.R.Singhら編の「天然毒素II」の第63〜84頁(第4章)、Plenum Press、ニューヨーク、1996]。
【００１０】
７つの免疫学的に異なるボツリヌス神経毒が特徴付けられている。これらは、それぞれボツリヌス神経毒の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ1、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇであり、それぞれは、型特異的抗体による中和によって区別される。異なる血清型のボツリヌス毒素は、それらが作用する動物種およびそれらが引き起こす麻痺の重篤性および持続時間が異なる。例えば、ラットにおける麻痺の発症率で測定すると、ボツリヌス毒素Ａ型は、ボツリヌス毒素Ｂ型よりも５００倍強力であることが測定されている。ボツリヌス毒素は、高い親和性でコリン作動性運動ニューロンに結合し、ニューロン中に移行し、アセチルコリンの放出を遮断するようである。
【００１１】
本発明をいかなる理論または作用機構にも限定することを望むものではないが、毒素中毒の分子機構は、血清型に関係なく類似しており、少なくとも３つの工程または段階が含まれるようである。ボツリヌス毒素による中毒の可能性ある分子機構をここに記載するが、他の毒素(例えば、ブチリカム毒素、破傷風毒素、またはその変異体)も、同一または実質的に同じ機構を有するであろう。過程の第１工程において、毒素は、重鎖(Ｈ鎖)と細胞表面受容体の間の特異的相互作用を介して標的ニューロンのシナプス前膜に結合する(この受容体は、各ボツリヌス毒素型および破傷風毒素によって異なると考えられる)。Ｈ鎖のカルボキシ末端セグメント(Ｈc)が、細胞表面への毒素の標的化に重要なようである。
【００１２】
第２工程において、毒素は、毒を与えられた細胞の原形質膜を通過する。毒素は、最初に受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ、毒素を含むエンドソームが形成される。次いで、毒素はエンドソームから細胞質に脱出する。この工程は、Ｈ鎖のアミノ末端セグメント(ＨN)によって媒介されると考えられる(これにより、約５.５またはそれ以下のｐＨに応答して毒素のコンホメーション変化が誘発される)。エンドソームは、エンドソーム内ｐＨを低下させるプロトンポンプを有することが知られている。コンホメーション変化は、毒素中の疎水性残基を露出させ、これがエンドソーム膜中への毒素の埋め込みを可能にする。次いで、毒素(または最低でも軽鎖)が、エンドソーム膜を通って細胞質に移行する。
【００１３】
ボツリヌス毒素活性の機構の最終工程は、重鎖(Ｈ鎖)および軽鎖(Ｌ鎖)を連結するジスルフィド結合の還元が関与するようである。ボツリヌス毒素および破傷風毒素の全毒性活性は、ホロトキシンのＬ鎖に含まれ、このＬ鎖は、亜鉛(Ｚｎ++)エンドペプチダーゼであり、神経伝達物質含有小胞の認識およびそれと原形質膜の細胞質表面とのドッキングならびに小胞と原形質膜との融合に不可欠なタンパク質を選択的に切断する。破傷風神経毒、ボツリヌス毒素／Ｂ／Ｄ／Ｆおよび／Ｇは、シナプトソーム膜タンパク質であるシナプトブレビン[小胞関連膜タンパク質(ＶＡＭＰ)とも称される]の分解を引き起こす。シナプス小胞の細胞質表面に存在するほとんどのＶＡＭＰは、これらの切断現象のいずれかの結果として除去される。血清型ＡおよびＥは、ＳＮＡＰ-２５を切断する。血清型Ｃ1は、当初はシンタキシンを切断すると考えられていたが、シンタキシンおよびＳＮＡＰ-２５を切断することが見い出された。各毒素は、異なる結合を特異的に切断する(同一の結合を切断する破傷風およびＢ型を除く)。
【００１４】
ボツリヌス毒素は、比較的長い神経毒作用を有することが発見されているので、疼痛(特に慢性疼痛)の治療に適用されている[例えば、Fosterらの米国特許第５,９８９,５４５号(その開示全体が本明細書中で参考として援用される)]。
【００１５】
しかし、疼痛(例えば慢性疼痛)の治療に現在使用されているほとんどの薬物は、依然として不適当である。例えば、慢性疼痛の１つの型は異痛症である。異痛症は、正常な有害ではない刺激が疼痛を誘発する状態である。現在知られている化合物は、異痛症の症状を部分的に緩和することができるが、それと同時に、患者が全ての疼痛(有害刺激によって引き起こされる急性疼痛など)を感じる能力を失わせる。有害刺激に起因する疼痛を検知する能力は重要であり、これにより自己保存が可能となる。また、多数の薬剤は、望ましくない副作用(例えば、鎮静、気分の変化、および／または低血圧)を有する。最後に、このような薬剤のほとんどは、治療持続時間が短い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
このように、疼痛(好ましくは慢性疼痛)の治療に対して選択的および／または長期作用性の化合物が、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明によれば、治療成分および標的化成分(これは細胞表面において、α-２Ａアドレナリン作動性受容体サブタイプと比較して、α-２Ｂまたはα-２Ｂおよびα-２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプのいずれかにおいて選択的に結合する)を含む薬剤が提供される。好ましくは、このような細胞はニューロンである。１つの態様において、この薬剤は、移行成分をさらに含む。
【００１８】
さらに本発明によれば、本発明の薬剤は、ヒトを含む哺乳動物における疼痛(特に慢性疼痛)の治療に有用であることができる。さらに、本発明の薬剤を使用して、実質的に急性の痛覚または触覚に影響を与えることなく、慢性疼痛(例えば異痛症)を治療することができる。
【００１９】
さらに本発明によれば、治療成分は、細胞からの神経伝達物質の放出またはそのプロセスを実質的に妨げる。例えば、１つの態様において、治療成分は、細胞からの神経伝達物質の放出を阻害しうる軽鎖成分を含む。この軽鎖成分は、クロストリジウム毒素、例えばボツリヌス毒素Ａ型、Ｂ型、Ｃ1型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその変異体の軽鎖またはそのフラグメントであってよい。別の態様において、治療成分は、細胞リボソーム機能の不活性化を介する神経毒(例えばサポリン)であってもよい。
【００２０】
さらに本発明によれば、標的化成分は、分子またはアミノ酸成分であってよい。アミノ酸成分には、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、および抗体が含まれる(これらの種が、α-２Ｂまたはα-２Ｂ／α-２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプにおいて選択的に結合するとき)。１つの態様において、分子は、イミロキサン、ＡＲＣ２３９、プラゾシン、または式：
【化１】
2005506277.tif 000003
[式中、Ｘは、Ｒ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5およびＲ4-Ｃからなる群から選択される]
で示される分子であってよい。ＸがＲ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5である場合には、６員の炭素環構造が形成される。ＸがＲ4-Ｃである場合には、５員の炭素環構造が形成される。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ6、およびＨからなる群から選択され、ここでＲ6は、Ｈまたはメチル、エチルもしくはプロピルを含むアルキルである。１つの態様において、アミノ酸成分は、抗原成分から惹起した抗体であってよい。抗原成分は、α-２Ｂ受容体の第２細胞外ループを含むことができ、これはさらにキーホールリンペットヘモシアニンに結合することができる。１つの態様において、第２細胞外ループは、アミノ酸配列：ＫＧＤＱＧＰＱＰＲＧＲＰＱＣＫＬＮＱＥ(配列番号１)を含むペプチドフラグメントを含む。別の態様において、アミノ酸成分は、野生型の変異体であるペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、または抗体を含むことができる。例えば、アミノ酸成分は、運動ニューロン細胞表面タンパク質に高親和性を有する野生型とは対照的に、α２Ｂ受容体に選択的に結合するボツリヌス毒素Ａ型の突然変異Ｈ鎖であってよい。Goeddelらの米国特許第５,２２３,４０８号(その開示全体が本明細書中で参考として援用される)を参照。
【００２１】
さらに本発明によれば、移行成分は、標的細胞の細胞質への治療成分(例えば、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖)の移動を促進することができる。１つの態様において、移行成分は、重鎖成分を含む。重鎖成分は、クロストリジウム毒素、例えばボツリヌス毒素Ａ型、Ｂ型、Ｃ1型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、ブチリカム毒素、破傷風毒素またはその変異体の重鎖またはそのフラグメントを含むことができる。重鎖フラグメントは、重鎖のアミノ末端フラグメントを含むことができる。別の態様において、重鎖成分は、２つの異なる神経毒の少なくともフラグメントを含むことができる。例えば、重鎖成分は、ボツリヌス毒素Ａ型の重鎖のアミノ末端フラグメントおよびボツリヌス毒素Ｂ型の重鎖のカルボキシル末端フラグメントを含むことができる。
【００２２】
さらに本発明によれば、治療成分、移行成分および標的化成分は、１つまたは複数のスペーサー成分によって連結される。例えば、治療成分を、スペーサー成分を介して移行成分に連結し、治療成分を、スペーサー成分を介して標的化成分に連結することができる。１つの態様において、スペーサー成分は、炭化水素、免疫グロブリンヒンジ領域以外のポリペプチド、および免疫グロブリンヒンジ領域と同一または類似のプロリン含有ポリペプチドからなる群から選択される部分を含む。別の態様において、治療成分を、スペーサー成分を介して移行成分に連結し、治療成分を、ジスルフィド架橋を介して標的化成分に連結することができる。
【００２３】
さらに本発明によれば、本発明の薬剤の製造方法であって、少なくとも１つの薬剤成分(例えば、治療成分、移行成分、および／または標的化成分)をコードする遺伝子からポリペプチドを産生させる工程を含む方法が提供される。
【００２４】
さらに本発明によれば、疼痛の治療方法であって、哺乳動物(好ましくはヒト)に治療有効量の本発明の薬剤を投与する工程を含む方法が提供される。１つの態様において、薬剤の治療成分および移行成分は、共にボツリヌス毒素(例えば、ボツリヌス毒素Ａ型)において見い出される。本発明の薬剤を、例えば、疼痛位置またはその近くに鞘内、筋肉内、または皮下投与することができる。
【００２５】
さらに本発明によれば、薬剤を使用して慢性疼痛を治療することができる。より好ましくは、薬剤を使用して異痛症を治療することができる。さらにより好ましくは、薬剤を使用して、実質的に急性の痛覚または触覚に影響を与えることなく、異痛症を治療することができる。本発明をいかなる特定の理論または作用機構にも限定することを望むものではないが、上記のような、急性の痛覚または触覚に影響を与えることのない異痛症治療の選択性は、α２Ｂおよび／またはα２Ｃ受容体に対して選択的に作用する薬剤によるものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、疼痛、好ましくは慢性疼痛、例えば異痛症および他の神経障害痛、内臓痛、癌に関連する疼痛、および過敏性腸症候群に関連する疼痛(これらに限定されない)を治療するための薬剤および方法を包含する。
【００２７】
定義
軽鎖成分は、クロストリジウム神経毒の軽鎖および／またはそのフラグメントを含む。軽鎖の分子量は約５０ｋＤａであり、Ｌ鎖またはＬと称することもある。軽鎖またはそのフラグメントは、タンパク質分解活性を有することができる。
重鎖成分は、クロストリジウム神経毒の重鎖および／またはそのフラグメントを含む。重鎖全長の分子量は約１００ｋＤａであり、Ｈ鎖またはＨと称することもある。重鎖フラグメントを、ＨCまたはＨNと称することもある。
【００２８】
ＨCは、Ｈ鎖のカルボキシル末端フラグメントまたは細胞表面への結合に関与する無傷Ｈ鎖中の該フラグメントに対応する部分にほぼ等価(例えば、機能的に等価)であるクロストリジウム神経毒のＨ鎖由来のフラグメントを意味する。
ＨNは、Ｈ鎖のアミノ末端セグメントまたは細胞内エンドソーム膜を通過する細胞質への少なくともＬ鎖の移行に関与する無傷Ｈ鎖中の該フラグメントに対応する部分にほぼ等価(例えば、機能的に等価)であるクロストリジウム神経毒のＨ鎖由来のフラグメントを意味する。
ＬＨNは、ＨNドメインに結合したＬ鎖またはその機能的フラグメントを含むクロストリジウム神経毒由来のフラグメントを意味する。これは、ＨCドメインを除去または改変するためのタンパク質分解によって無傷クロストリジウム神経毒から得ることができる。
【００２９】
広い態様において、本発明の薬剤は、治療成分ならびに標的化成分(これは、α-２Ａアドレナリン作動性受容体サブタイプと比較して、α-２Ｂおよび／またはα-２Ｃ、好ましくはα-２Ｂアドレナリン作動性受容体サブタイプにおいて選択的に結合する)を含む。１つの態様において、標的化成分は、他の結合部位(例えば、α-２Ａ受容体)よりもα-２Ｂおよび／またはα-２Ｃに対して、少なくとも約５倍高い選択性を示す。好ましい態様において、標的化成分は、他の結合部位よりもα-２Ｂおよび／またはα-２Ｃに対して、少なくとも約１０倍高い選択性を示す。より好ましい態様において、標的化成分は、他の結合部位よりもα-２Ｂおよび／またはα-２Ｃに対して、少なくとも約５０倍高い選択性を示す。別の態様において、標的化成分は、他の結合部位(例えば、α-２Ｃ受容体)よりもα-２Ｂに対して、少なくとも約５倍高い選択性を示す。好ましい態様において、標的化成分は、他の結合部位よりもα-２Ｂに対して、少なくとも約１０倍高い選択性を示す。より好ましい態様において、標的化成分は、他の結合部位よりもα-２Ｂに対して、少なくとも約５０倍高い選択性を示す。本発明の薬剤は、疼痛(好ましくは慢性疼痛)の治療に有効である。
【００３０】
１つの態様において、治療成分は、神経細胞からの神経伝達物質(好ましくは、疼痛シグナル伝達に関与する神経伝達物質)の放出を実質的に妨げる。好ましい態様において、治療成分は軽鎖成分を含む。軽鎖成分は、ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素、またはこれら毒素の生物活性変異体の軽鎖を含むことができる。また、軽鎖成分は、上記軽鎖のフラグメントを含むことができる(該フラグメントが生理学的環境下で生物学的に活性であるとき)。即ち、これらのフラグメントは、細胞からの神経伝達物質の放出またはそのプロセスを実質的に妨げることができる。好ましい態様において、軽鎖成分には、ボツリヌス毒素Ａ型、Ｂ型、Ｃ1型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、またはこれら血清型の生物活性変異体が含まれる。別の好ましい態様において、軽鎖成分は、ボツリヌス毒素Ａ型、Ｂ型、Ｃ1型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、またはこれら血清型の生物活性変異体のフラグメントであることもできる(該フラグメント自体が生物活性であるとき、例えば、該フラグメントが細胞からの神経毒の放出を妨げることができるとき)。本明細書中で使用される「変異ポリペプチド」(例えば、変異ポリペプチド)は、改変ポリペプチド(例えば改変軽鎖)を意味することもできる。
【００３１】
別の態様において、治療成分は、不利益に細胞機能を妨げる。例えば、治療成分は、細胞リボソームを不活性化し、タンパク質合成を妨げることができる。好ましい態様において、治療成分はサポリンを含む。
【００３２】
さらに別の態様において、治療成分は神経阻害剤である。ある種の神経阻害剤は神経伝達物質の産生を妨げることができ、一方、他の阻害剤は活動電位を実質的に妨げることができる。さらに、本発明の神経阻害剤は、細胞内部および／または細胞外部からその治療活性を発揮することができる。これら治療成分のいくつかの非限定的な例は、アコニチン、アデノシンアゴニスト／アンタゴニスト、アドレナリン作動薬、アナトキシンＡ、抗痙攣薬、バクロフェン、バトラコトキシン、ブレフェルジンＡ、ブレボトキシン、カプトプリル、クラーレ、ダントロレン、ドキソルビシン、ジアゼパム、グラヤノトキシン、リドカイン、メトカルバモール、メチルリカコニチン、ネオサキシトキシン、フィゾスチグミン、プシコシン、ＴＨＡ、テトロドトキシン、ベサミコール、ビガバタム、およびプロスタグランジン受容体アゴニストおよびアンタゴニストである。好ましくは、治療成分(例えば、上記の非限定的な例)は、疼痛(好ましくは慢性疼痛)の感覚に関与する細胞またはニューロンを妨げることができる。
【００３３】
広い態様において、本発明の薬剤は、治療成分および標的化成分を含む。１つの態様において、治療成分は、細胞またはニューロンの外部から、細胞またはニューロンに対して神経毒作用または阻害作用を発揮することができる。例えば、治療成分には、活動電位を妨げることによってニューロン小胞の放出を妨げる分子、ペプチド、または抗体が含まれる。１つの態様において、治療成分は、抗体またはその一部を含む。このような抗体は、ニューロン外部のナトリウムチャンネルを塞いで活動電位に必要なナトリウム流入を防止し、こうして疼痛シグナル伝達のための神経伝達物質の放出を妨げることができる。
【００３４】
好ましい態様において、治療成分は、細胞内部(例えば細胞質)からその効果を発揮することができる。例えば、Ｌ鎖成分(治療成分)は、ニューロン内部からその治療効果を発揮する。このような場合、薬剤は移行成分をさらに含むのが好ましい。移行成分は、標的細胞の細胞質への薬剤の少なくとも一部の移動を促進することができる。好ましい態様において、移行成分は重鎖成分を含む。重鎖成分には、ボツリヌス毒素、ブチリカム毒素、破傷風毒素、またはその変異体の重鎖またはそのフラグメントが含まれる。好ましくは、重鎖成分には、ボツリヌス毒素Ａ型、Ｂ型、Ｃ1型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、またはその変異体の重鎖またはそのフラグメントが含まれる。より好ましくは、重鎖成分は、ボツリヌス毒素Ａ型の重鎖フラグメントを含む。さらに好ましくは、フラグメントは、小胞内部から細胞質への薬剤の少なくとも一部(例えば治療成分)の移行を促進することができるボツリヌス毒素Ａ型の重鎖のアミノ末端(または末端)フラグメントである。
【００３５】
好ましい態様において、本発明の薬剤は、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖を含む治療成分およびボツリヌス毒素Ａ型の重鎖(好ましくはそのフラグメント)を含む移行成分を含み、重鎖(またはそのフラグメント)は、細胞質への少なくとも治療成分の移行を補助することができる。別の好ましい態様において、本発明の薬剤は、破傷風毒素の軽鎖を含む治療成分および破傷風毒素の重鎖(好ましくはそのフラグメント)を含む移行成分を含み、重鎖(またはそのフラグメント)は、細胞質への少なくとも治療成分の移行を補助することができる。さらに別の態様において、本発明の薬剤は、ある型のボツリヌス毒素の軽鎖を含む治療成分および別のボツリヌス毒素の重鎖(好ましくは、ＨNなどの重鎖フラグメント)を含む移行成分を含み、キメラタンパク質を構成する。例えば、１つの好ましい態様において、本発明の薬剤はＬＨNを含み、そのＬ鎖はボツリヌス毒素Ｂ型に由来し、Ｈ鎖フラグメントのアミノ末端セグメントは、ボツリヌス毒素Ａ型に由来する。ボツリヌス毒素Ａ型のＨNフラグメントは、Shone C.C.、Hambleton,P.およびMelling,J.[1987、Eur.J.Biochem.、167、175〜180]の方法に従って製造し、ボツリヌス毒素Ｂ型のＬ鎖は、Sathyamoorthy,V.およびDasGupta,B.R.[1985、J.Biol.Chem.、260、10461〜10466]の方法に従って製造する。次いで、ボツリヌス毒素Ａ型のＨ鎖フラグメントのアミノ末端セグメント上の遊離システインを、１０倍モル過剰のジピリジルジスルフィドの添加およびその後の４℃での一晩のインキュベートによって誘導体化する。次いで、過剰のジピリジルジスルフィドおよびチオピリドン副生成物を、ＰＤ１０カラム(Pharmacia)でのタンパク質の脱塩によってＰＢＳ中に除去する。次いで、この誘導体化したＨNを、１ｍｇ／ｍｌを超えるタンパク質濃度まで濃縮し、等モル濃度のボツリヌス毒素Ｂ型由来のＬ鎖部分(＞１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液)と混合する。室温で一晩のインキュベートの後、混合物をSuperose 6(Pharmacia)によるサイズ排除クロマトグラフィーによって分離し、分画をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析する。次いで、このキメラＬＨNを使用して、標的化コンジュゲートを製造することができる。
【００３６】
上記のＬＨまたはＬＨNをさらに標的化成分に結合させて、本発明の薬剤を形成させることができる。治療-移行成分(例えば、ＬＨN)への標的化成分のカップリングを、当業者に既知の試薬および技術を使用して化学的カップリングによって行う。即ち、ＰＤＰＨ／ＥＤＡＣおよびTraut試薬の化学を使用することができるが、当業者に既知である他の成分に薬剤の標的化成分を共有結合させうる任意の他のカップリング化学が、本発明の範囲内である。
【００３７】
１つの態様において、標的化成分は分子またはアミノ酸成分である。アミノ酸成分には、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、および抗体、またはその部分が含まれる(これらが、α-２Ｂまたはα-２Ｂおよびα-２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプにおいて選択的に結合するとき)。これらの分子、ペプチドまたはアミノ酸成分は、α-２Ｂまたはα-２Ｂ／α-２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプのアゴニストまたはアンタゴニストであってよい。１つの好ましい態様において、分子は、イミロキサン(式Ｉ)、ＡＲＣ２３９(式II)、およびプラゾシン(式III)であってよい。これらの分子は、以下の一般式によって示される：
【化２】
2005506277.tif 000004
【化３】
2005506277.tif 000005
【化４】
2005506277.tif 000006
【００３８】
また、分子は、一般式IV：
【化５】
2005506277.tif 000007
[式中、Ｘは、Ｒ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5およびＲ4-Ｃからなる群から選択される]
によって示される一群の化合物であってよい。ＸがＲ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5である場合には、６員の炭素環構造が形成される。ＸがＲ4-Ｃである場合には、５員の炭素環構造が形成される。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ6、およびＨからなる群から選択され、ここでＲ6は、Ｈまたはアルキル(メチル、エチルもしくはプロピルを含む)である。１つの好ましい態様において、標的化成分は、一般式Ｖ：
【化６】
2005506277.tif 000008
によって示される化合物である。
【００３９】
別の好ましい態様において、標的化成分は、一般式VI：
【化７】
2005506277.tif 000009
によって示される化合物である。
【００４０】
さらに別の態様において、標的化成分は、米国特許出願番号０９／５４８,３１５号(その開示全体が本明細書中で参考として援用される)中に見い出すことができる化合物(または分子)である。これらの化合物または分子には、分子が２Ａアドレナリン作動性受容体サブタイプと比較してα２Ｂまたはα２Ｂ／２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプにおいて選択的結合活性を有するならば、以下の一般式VIIで示されるものが含まれる：
【化８】
2005506277.tif 000010
[式中、点線は、２つの二重結合が共通の炭素原子を共有することができない場合、任意選択的な結合を示し；
ＲはＨまたは低級アルキルであり；
ＸはＳまたはＣ(Ｈ)Ｒ11であり、ここでＲ11は、Ｈまたは低級アルキルであるが、Ｘと式：
【化９】
2005506277.tif 000011
で示される環の間の結合が二重結合である場合、Ｒ11は存在せず；
Ｙは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、(Ｃ(Ｒ11)2Ｘ)y(ｙは１〜３の整数である)、-ＣＨ＝ＣＨ-、または-Ｙ1ＣＨ2-(Ｙ1はＯ、ＮまたはＳである)であり；
ｘは１または２の整数であり、Ｒ12、Ｒ13またはＲ14が不飽和炭素原子に結合している場合、ｘは１であり、Ｒ12、Ｒ13またはＲ14が飽和炭素原子に結合している場合、ｘは２であり；
Ｒ12は、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシ、低級アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、アルキニルであるか、あるいは、飽和炭素原子に結合している場合、Ｒ12はオキソであってよく；
Ｒ13およびＲ14は、それぞれＨ、ハロゲン、低級アルキル、アルケニル、アシル、アルキニル、アリール(例えば、フェニルまたはナフチル)、ヘテロアリール(例えば、フリル、チエニル、またはピリジル)、および置換されたアリールまたはヘテロアリール(ここで該置換基は、ハロゲン、低級アルキル、アルコキシ、アルケニル、アシル、アルキニル、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、ヒドロキシなどである)であるか、または一緒になって、-(Ｃ(Ｒ12)x)z-、-Ｙ1(Ｃ(Ｒ12)x)z'-、-Ｙ1(Ｃ(Ｒ12)x)yＹ1-、-(Ｃ(Ｒ12)x)-Ｙ1-(Ｃ(Ｒ12)x)-、-(Ｃ(Ｒ12)x)-Ｙ1-(Ｃ(Ｒ12)x)-(Ｃ(Ｒ12)x)-および-Ｙ1-(Ｃ(Ｒ12)x)-Ｙ1-(Ｃ(Ｒ12)x)- (ここで、ｚは３〜５の整数であり、ｚ'は２〜４の整数であり、ｘおよびｙは上記定義の通りである)であり、さらに、これら二価部分の各々のどちらかの末端がどちらかのＲ3またはＲ4において結合して、一般に、
【化１０】
2005506277.tif 000012
で示される縮合環構造を形成することができ、こうして形成される環は、環炭素が４価以下、窒素が３価以下、ＯおよびＳが２価以下であるという条件のもと、完全に不飽和、部分的に不飽和、または完全に飽和であることができる]。国際特許出願ＷＯ９８／２５６６９号(その開示全体が本明細書中で参考として援用される)を参照。
【００４１】
別の態様において、標的化成分は、一般式：
【化１１】
2005506277.tif 000013
[式中、ＸはＣ(Ｈ)Ｒ11であってよく、Ｒ11はＨである]
によって示される。
【００４２】
好ましくは、式VIIIのＲ12はＨであってよく、式：
【化１２】
2005506277.tif 000014
はフラニル基であってよい。
【００４３】
式IIのこのようなフラニル誘導体において、Ｒ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)4であることができるか、Ｒ13がＨかつＲ14がｔ-ブチルであることができるか、Ｒ13およびＲ14がＨであることができるか、あるいは、Ｒ13がＨかつＲ14がメチルまたはエチルであることができる。
【００４４】
また式VIIIにおいて、Ｒ11はメチルであってよく、式：
【化１３】
2005506277.tif 000015
はフラニル基であってよい。
【００４５】
また式VIIIの化合物において、Ｒ12はＨであってよく、式：
【化１４】
2005506277.tif 000016
はチエニル基であってよい。
【００４６】
式IIのこのようなチエニル誘導体において、Ｒ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ2)4であることができるか、Ｒ13がフェニルかつＲ14がＨであることができるか、Ｒ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ2)3Ｓであることができるか、Ｒ13およびＲ14がＨであることができるか、Ｒ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)4であることができるか、Ｒ13がＨかつＲ14がメチルであることができるか、Ｒ13がブロモかつＲ14がＨであることができるか、Ｒ13が水素かつＲ14がクロロであることができるか、あるいは、Ｒ13がメチルかつＲ14が水素であることができる。
【００４７】
また式VIIIの化合物において、式：
【化１５】
2005506277.tif 000017
はシクロヘキシル基であってよい。
【００４８】
式VIIIのこのようなシクロヘキシル誘導体において、Ｒ12が水素かつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)4であることができるか、Ｒ12がオキソかつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)4であることができるか、Ｒ12が水素またはオキソかつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)2Ｓであることができるか、Ｒ12が水素かつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ2)4である(オクタヒドロナフタレンを形成する)ことができるか、Ｒ12がオキソかつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ2)4であることができるか、Ｒ12がオキソかつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)2Ｃ(ＣＨ3)(ＣＨ)であることができるか、Ｒ12が水素かつＲ13とＲ14が一緒になってＳ(ＣＨ2)2であることができるか、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14がＨであることができるか、Ｒ12がオキソかつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)2Ｃ(ＯＣＨ3)ＣＨであることができるか、あるいは、Ｒ13とＲ14が一緒になって-Ｙ1-Ｃ(Ｒ2)x-Ｃ(Ｒ2)x-Ｙ1-であることができる(ここで、Ｙ1はＮであり、テトラヒドロキノキサリンを形成し、この場合、Ｒ12は水素またはオキソであってよい)。
【００４９】
また式VIIIの化合物において、式：
【化１６】
2005506277.tif 000018
はテトラヒドロキノリン基であることができる。この場合、Ｒ13とＲ14は一緒になって-Ｙ1-Ｃ(Ｒ2)x-Ｃ(Ｒ2)x-Ｃ(Ｒ2)x-であり、Ｙ1はＮである。このようなテトラヒドロキノリン誘導体において、(Ｒ12)xは水素またはオキソであってよい。また、テトラヒドロイソキノリン基であることもでき、この場合、Ｒ13とＲ14は一緒になって-Ｃ(Ｒ2)x-Ｙ1-Ｃ(Ｒ2)x-Ｃ(Ｒ2)x-であり、Ｙ1はＮであり、(Ｒ12)xは水素またはオキソであってよい。
【００５０】
また式VIIIの化合物において、式：
【化１７】
2005506277.tif 000019
はシクロペンチル基であることができる。
【００５１】
式VIIIのこのようなシクロペンチル誘導体において、Ｒ12がＨかつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)4であることができるか、Ｒ12がオキソかつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)4であることができるか、あるいは、Ｒ12が水素かつＲ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ2)3であることができる。
【００５２】
本発明の別の態様において、Ｙが(ＣＨ2)3であり、ＸがＣＨかつＲ12がオキソであることができるか、あるいは、ＸがＣＨ2かつＲ12がＨであることができ、Ｒ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)4であることができる。また、Ｒ13とＲ14が一緒になって(ＣＨ)4であることができ、ＹがＣＨ2Ｃ(Ｃ(Ｒ11)2)2[ここでＲ11は水素である]あることができるか、あるいは、Ｙが-ＣＨ2Ｃ(Ｍｅ)-であることができ、Ｒ12が水素またはオキソであることができる。
【００５３】
最後に、式VIIIの化合物において、式：
【化１８】
2005506277.tif 000020
はフェニル基であることができる。
【００５４】
式VIIのこのようなフェニル誘導体において、ＸはＣＨ2であることができ、ＲはＨまたはＣＨ3であることができ、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14はＨであることができるか、あるいは、Ｒ13とＲ14が一緒になってＯ(ＣＲ2)2Ｏであるか(１,４-ベンゾジオキサン誘導体を与える)、あるいは、ＸはＳであることができ、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14はＨであることができる。
【００５５】
本発明の別の態様において、化合物は、一般式IX：
【化１９】
2005506277.tif 000021
[式中、ＹはＳまたはＯである]
で示される。
式IIIのこのような化合物において、ＸはＣ(Ｈ)Ｒ11であってよく、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ13およびＲ14はＨであってよく、ＹはＯまたはＳであってよい。
【００５６】
本発明の別の態様において、化合物は、式Ｘ：
【化２０】
2005506277.tif 000022
[式中、Ｒ13とＲ14は一緒になって(ＣＨ)4である]
で示される。
式Ｘのこのような化合物において、Ｙ1はＯであってよく、Ｒ12はオキソであってよく、ＸはＣＨまたはＣＨ2であるか、またはＲ12の１つがヒドロキシであり、かつその他がＨであってよいか、またはＲ12がＨであってよい。
式IVのこのような化合物において、Ｙ1はＳであってよく、ＸはＣＨ2であってよく、Ｒ12はオキソであってよいか、またはＲ12はＨであってよく、かつＸはＣＨであってよく、かつＲ12はオキソであってよい。
【００５７】
本発明の別の態様において、２Ａアドレナリン作動性受容体サブタイプと比較して、２Ｂまたは２Ｂおよび２Ｃアドレナリン作動性受容体サブタイプにおいて選択的結合活性を有する化合物は、以下の式XIによって示される：
【化２１】
2005506277.tif 000023
[式中、Ｗは、式：
【化２２】
2005506277.tif 000024
(式中、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ17およびＲ18は、Ｈおよび低級アルキルからなる群から選択される；ただし、Ｒ15およびＲ16またはＲ16およびＲ17の少なくとも１つは、ＯＣ(Ｒ19)Ｃ(Ｒ19)Ｎ(Ｒ) (式中、Ｒ19はＨ、低級アルキルまたはオキソである)であって、式：
【化２３】
2005506277.tif 000025
との縮合環を形成する)；
および式：
【化２４】
2005506277.tif 000026
(式中、Ｒ20はＨ、低級アルキル、フェニル、または低級アルキル置換されたフェニルである)
からなる群から選択される二環式基であり、
ＺはＯまたはＮＨである]。
Ｗがノルボルニルである化合物は、１９９８年１月７日提出の同一出願人の同時係属出願第０９／００３９０２号(その全体が本明細書中で参考として援用される)に開示され、特許請求されている。
【００５８】
本発明の１つの態様において、ＺはＯであってよく、Ｗは、式：
【化２５】
2005506277.tif 000027
[Ｒ20は、Ｈ、フェニル、およびｏ-メチルフェニルからなる群から選択することができ、例えば、Ｒ20はｏ-メチルフェニルであってよい]
であってよい。
【００５９】
本発明の別の態様において、Ｗは、式：
【化２６】
2005506277.tif 000028
[式中、ＺはＮＲであってよく、Ｒはメチルまたは水素であってよく、(Ｒ19)xの１つはＨであってよく、Ｒ15はＨであってよい]
であってよい。
【００６０】
また、Ｗは、式：
【化２７】
2005506277.tif 000029
[式中、ＲはＨであってよく、Ｒ18はメチルであってよい]
であってよい。
【００６１】
上記において、低級アルキル、アルコキシ、アルケニル、またはアルキニルに言及が為されている場合、それは、１〜８個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を有する基を意味することが意図されているものと解される。上記においてアリールに言及が為されている場合、それは、６〜１４個の炭素原子、好ましくは６〜１０個の炭素原子の基を意味することが意図されている。ハロゲンに言及が為されている場合、フルオロおよびクロロが好ましい。
【００６２】
１つの態様において、標的化成分はアミノ酸成分であることができる。アミノ酸成分は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、抗体、またはこれらの一部であることができる。アミノ酸成分は、好ましくはタンパク質、より好ましくは抗体、さらに好ましくは抗体の一部(α-２Ｂおよび／またはα-２Ｃ受容体に選択的に結合する)である。１つの態様において、抗体の一部はＦａｂ部分であることができる。１つの態様において、アミノ酸成分は抗体であることができる。抗体は、抗原成分から惹起することができる。抗原成分には、α-２ＢまたはＣ受容体の細胞外ループが含まれ、これをキーホールリンペットヘモシアニンにさらに結合することができる。１つの態様において、この細胞外ループは、アミノ酸配列：ＫＧＤＱＧＰＱＰＲＧＲＰＱＣＫＬＮＱＥ(配列番号１)を含むペプチドフラグメントを含んでなる。
【００６３】
別の態様において、アミノ酸成分は、対応する野生型の変異体ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、抗体、またはその一部を含んでなる。例えば、天然のボツリヌス毒素の重鎖は、野生型ポリペプチドである。好ましくは、野生型の変異体を含んでなる標的化成分は、α-２Ｂおよび／またはＣ受容体に選択的に結合することができ、野生型アミノ酸配列の少なくとも１つの望ましくない結合特性を欠いている。例えば、１つの態様において、野生型の変異体を含んでなる標的化成分は、α-２Ｂおよび／またはＣ受容体に選択的に結合し、運動ニューロンの細胞表面に結合しない。
【００６４】
１つの態様において、本発明の薬剤あたり１つの標的化成分が存在する。別の態様において、本発明の薬剤あたり１つを越える標的化成分が存在する。例えば、軽鎖などの治療成分を含んでなる薬剤は、軽鎖に結合したペプチドフラグメントをさらに含むことができ、１つまたは複数の標的化成分を結合させることができる。本発明の単一の薬剤は、追加した標的化成分が薬剤の有効性を増強する(例えば、薬剤を、より選択的におよび／または高親和性で-２Ｂおよび／またはＣに結合させる)限り、任意の数の標的化成分を含むことができる。１つの態様において、単一の薬剤は、２つの標的化成分を含んでなる。別の態様において、単一の薬剤は、３つの標的化成分を含んでなる。
【００６５】
野生型の変異体を製造する方法は既知である。例えば、Goeddelらは米国特許第５,２２３,４０８号において、野生型タンパク質の少なくとも１つの所望の結合特性を保持し、少なくとも１つの望ましくない結合特性が排除された変異タンパク質の製造方法を開示している。Goeddelらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。一般に、Goeddelらの方法は、次の工程を含んでなる：(a)選択された野生型タンパク質上の異なるエピトープに結合することができる少なくとも第１および第２のレポーター分子を獲得する工程、(b)該選択された野生型タンパク質をコードするＤＮＡを突然変異させて、関連の変異体ＤＮＡ分子のライブラリーを創製する工程、(c)工程(b)で創製した各ＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入する工程(該ベクターは、膜貫通アンカードメインをコードするＤＮＡを含み、これによりベクターのライブラリーを創製する)、(d)工程(c)のベクターで真核細胞(好ましくは哺乳動物細胞)をトランスフェクトする工程、(e)工程(d)の細胞を、ＤＮＡの発現を誘導する条件下で培養して、細胞膜上に固定されたキメラ融合タンパク質を産生させる工程、(f)工程(e)の培養細胞を、培養細胞の少なくとも一部が第１または第２のレポーター分子に結合する条件下で、第１および第２のレポーター分子と接触させる工程、(g)接触させた細胞を、第１または第２のレポーター分子との所望の結合パターンに基づいて、好ましくは蛍光活性化細胞選別(ＦＡＣＳ)によって選別する工程、ならびに、(h)工程(g)の選別細胞から所望の結合パターンを有する変異タンパク質を得る工程。好ましい結合パターンは、細胞と第１レポーター分子との結合があること、および、細胞と第２レポーター分子との結合がないことを含んでなる。
【００６６】
第１および第２のレポーター分子は、一般に、野生型タンパク質に結合することができる抗体、リガンド、および可溶性受容体から選択される分子に結合した検出可能なマーカーを含んでなる。第１および第２のレポーター分子は、典型的には、異なる蛍光団(フルオロフォア)にそれぞれ結合したモノクローナル抗体(Ｍａｂ)である。通常、蛍光団は、フルオレセインまたはフィコエリトリンである。
【００６７】
１つの態様において、薬剤の成分は、スペーサー成分によって連結されている。スペーサー成分は、本発明の範囲内で多数の機能を有する。例えば、スペーサー領域の機能の１つは、成分が実質的に内部立体障害を伴うことなく独立して自由に動くことができるように、種々の成分間に適切な距離を供することである。このようなスペーサーは、例えば、ボツリヌス毒素ＨC配列の一部(好ましくは、この部分は運動ニューロンまたは求心性感覚ニューロンに結合する能力を保持しない)、別のアミノ酸配列、または炭化水素部分を含みことができる。また、スペーサー成分は、プロリン、セリン、トレオニン、および／またはヒト免疫グロブリンヒンジ領域に類似または同一のシステインが豊富なアミノ酸配列を含むことができる。好ましい態様において、スペーサー領域は、免疫グロブリンγ１ヒンジ領域のアミノ酸配列を含む[このような配列は、配列(Ｎ末端からＣ末端の方向)：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ(配列番号２)を有する]。１つの態様において、治療成分は、スペーサー成分を介して移行成分に結合し、移行成分は、スペーサー成分を介して標的化成分に結合する。好ましい態様において、治療成分は、スペーサー成分を介して移行成分に結合し、治療成分は、スペーサー成分あるいはジスルフィド結合を介して標的化成分に結合する。さらに好ましい態様において、治療成分は、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖であり、移行成分は、細胞質への少なくとも軽鎖の移行を促進することができるボツリヌス毒素Ａ型の重鎖またはそのフラグメントであり、標的化成分は、α-２Ｂおよび／またはＣ受容体に選択的に結合することができる分子である。例えば、このような選択的に結合する分子は、α-２Ｂおよび／またはＣ受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであってよい。このような分子の例を、式：
【化２８】
2005506277.tif 000030
[式中、ＸはＲ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5およびＲ4-Ｃからなる群から選択される]
によって示すことができる。ＸがＲ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5である場合には、６員の炭素環構造が形成される。ＸがＲ4-Ｃである場合には、５員の炭素環構造が形成される。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ6、およびＨからなる群から選択され、Ｒ6は、Ｈまたはアルキル(メチル、エチルもしくはプロピルを含む)である。
【００６８】
１つの態様において、治療成分および移行成分は、ボツリヌス毒素(例えば、ボツリヌス毒素Ａ型)の一部である。このような場合、天然の、化学修飾した、組換えの、または部分的組換えのボツリヌス毒素Ａ型を標的化成分に結合させて、本発明の薬剤を形成することができる。さらに、神経毒分子(例えばボツリヌス毒素Ａ型)のＨCを、Ｈ鎖の他のセグメント(ＨN)から、ＨNフラグメントが神経毒分子のＬ鎖にジスルフィド結合したままであるように除去して、ＬＨNとして知られているフラグメントを得ることができることが当該分野で既知である。従って、本発明の１つの態様において、クロストリジウム神経毒(例えばボツリヌス毒素Ａ型)のＬＨNフラグメントを、スペーサー成分を使用して標的化成分に共有結合させて、本発明の薬剤を形成する。本発明の別の態様において、クロストリジウム神経毒(例えばボツリヌス毒素Ａ型)のＨC部分を、突然変異または修飾(例えば、化学修飾)して、神経筋接合部での神経毒の受容体への結合能力を減少させるか、または好ましくは不能にすることができる。次いで、この改変クロストリジウム神経毒(例えばボツリヌス毒素Ａ型)を、１つまたは複数のスペーサー成分を使用して標的化成分に共有結合させて、本発明の薬剤を形成する。１つの態様において、リンカーを使用して、種々の成分を互いに連結することができる。例えば、リンカーを使用して、治療成分にスペーサー成分を連結することができる。さらに、リンカーを使用して、治療成分を標的化成分と連結することができる。リンカーの使用を含む種々の非限定的な態様を、後記の実施例において示す。
【００６９】
本発明の別の広い態様によれば、組換え技術を使用して、少なくとも１つの薬剤成分を製造する。例えば、国際特許出願ＷＯ９５／３２７３８号(その開示全体が本明細書中で参考として援用される)を参照。この技術は、いずれかの成分(例えば、治療、移行、および／または標的化成分)のコードを有する、合成オリゴヌクレオチド配列または天然供給源からクローン化したＤＮＡから遺伝物質を得る工程を包含する。初めに、この遺伝子構築物をクローニングベクター(例えば、ファージまたはプラスミド)と融合させることによって、遺伝子構築物を、増幅のため宿主細胞に導入する。次いで、クローニングベクターを、宿主(好ましくは大腸菌)中に挿入する。宿主細胞中での組換え遺伝子の発現の後、得られたタンパク質を、通常の技術を使用して単離することができる。発現させたタンパク質は、薬剤の３つ全ての成分を含むことができる。例えば、発現させたタンパク質は、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖(治療成分)、ボツリヌス毒素Ａ型の重鎖、好ましくはＨN(移行成分)、ならびに、生理学的条件下でα-２Ｂアドレナリン作動性受容体に選択的に結合する抗体のＦａｂ部分を含むことができる。１つの態様において、発現させたタンパク質は、薬剤の３つ全て未満の成分を含むことができる。このような場合、成分を、好ましくはスペーサー領域を介して化学的に連結することができる。
【００７０】
これらの薬剤を組換えによって製造することには多数の利点が存在する。例えば、嫌気性クロストリジウム培養物からの神経毒の製造は、面倒かつ時間のかかる方法であり、いくつかのタンパク質沈殿工程ならびに長時間および反復の毒素結晶化または数段階のカラムクロマトグラフィーのいずれかを必要とする多工程の精製プロトコールを包含する。特に、生成物の高毒性は、操作を厳格な封じ込め(ＢＬ-３)のもとで行わなければならないことを強制する。発酵過程中に、折り畳まれた一本鎖神経毒が、ニッキングと称される過程により、内因性クロストリジウムプロテアーゼによって活性化される。これには、一本鎖から約１０個のアミノ酸残基を除去して、二本鎖形態(２つの鎖が鎖内ジスルフィド結合によって共有結合したままである)を創製することが含まれる。
【００７１】
ニッキングされた神経毒は、ニッキングされていない形態よりも活性が高い。ニッキングの量および正確な位置は、毒素を産生する細菌の血清型または外側ループで行われる修飾によって変化する。一本鎖神経毒の活性化、即ち、ニッキングされた毒素の収率の相違は、所与の菌株によって産生されるタンパク質分解活性の種類および量の変動による。例えば、Clostridial botulinum Ａ型の一本鎖神経毒の９９％以上は、Clostridial botulinumのＨall Ａ菌株によって活性化されるが、Ｂ型およびＥ型菌株は、より低い活性化量で毒素を産生する(発酵時間に依存して０〜７５％)。即ち、成熟神経毒の高い毒性が、治療薬としての神経毒の商業生産で重要な部分を占める。
【００７２】
従って、操作されたクロストリジウム毒素の活性化の程度は、これらの物質の製造のための重要な検討項目である。神経毒(例えば、ボツリヌス毒素および破傷風毒素)を、安全であり、単離が容易であり、かつ完全活性形態への変換が簡単な比較的非毒性の一本鎖(または毒活性を減少させた一本鎖)として、迅速に増殖する細菌(例えば、異種の大腸菌細胞)において高収率で組換えにより発現させることができるなら、これは大きな利点となるであろう。
【００７３】
安全を第一に考慮して、従来の研究は、破傷風毒素およびボツリヌス毒素の個々のＨ鎖およびＬ鎖の大腸菌での発現および精製に集中していた[これらの単離した鎖自体は無毒である；Liら、Biochemistry、33、7014〜7020 (1994)、Zhouら、Biochemistry、34、15175〜15181 (1995)を参照(これらは、本明細書中で参考として援用される)]。これらペプチド鎖の個別の製造後、厳格に制御された条件下で、Ｈ鎖およびＬ鎖のサブユニットを、酸化的ジスルフィド結合によって組合わせて、神経麻痺性の二本鎖を形成することができる。
【００７４】
１つの態様において、治療成分および移行成分を含んでなる薬剤を、ニッキングされていない一本鎖として組換えによって製造する。Dollyらの米国特許出願０９／６４８,６９２号(その開示全体が本明細書中で参考として援用される)を参照。好ましい態様において、薬剤は、一本鎖としての発現後にインビトロでの特異的切断に感受性であるアミノ酸配列を含む。このようなタンパク質には、クロストリジウム神経毒およびその誘導体、例えば米国特許第５,９８９,５４５号および国際特許出願ＷＯ９５／３２７３８号(これらは、本明細書中で参考として援用される)に開示されたタンパク質が含まれる。
【００７５】
本発明の１つの態様において、タンパク質は、単一のポリペプチド鎖中にクロストリジウム神経毒Ｈ鎖の機能的ドメインおよびクロストリジウム神経毒Ｌ鎖の機能の一部または全部を含み、ＨドメインとＬドメインの間に位置する挿入タンパク質分解部位を有しており、これにより、一本鎖タンパク質を切断して個々の鎖(好ましくは、ジスルフィド結合によって共有結合した鎖)を製造することができる。タンパク質分解部位は、特定の酵素によって選択的に認識および切断されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００７６】
本発明の好ましい態様において、発現させた一本鎖タンパク質は、クロストリジウム神経毒のＨ鎖およびＬ鎖の生物活性ドメインを含んでなる。従って、鎖ドメインを隔離する内部タンパク質分解部位の切断により、完全な活性を有する神経毒の活性化が得られる。
【００７７】
本発明の別の態様において、一本鎖タンパク質は、運動ニューロンによって生成される細胞受容体以外の細胞受容体に標的化された標的化成分を含んでなる。このような結合ドメインは、例えば、α-２Ｂおよび／またはアドレナリン作動性受容体に特異的に結合することができる。一本鎖タンパク質は、クロストリジウム神経毒の移行成分に類似した移行成分および治療成分を含むであろう。治療成分は、クロストリジウム神経毒の軽鎖であるか、または異なる治療成分(例えば、酵素、転写可能なヌクレオチド配列、成長因子、アンチセンスヌクレオチド配列など)であることができる。
【００７８】
好ましくは、本発明の毒素および毒素ベースのタンパク質を加工して、毒素タンパク質の迅速な単離を促進するように、十分に高い効率で標的化合物に結合することができる結合タグを含む追加のアミノ酸配列を含有させる。このような結合部位を含むタンパク質は多数存在し、当業者に周知であり、モノクローナル抗体、マルトース結合タンパク質、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ、プロテインＡ、Ｈｉｓ6タグなどを含み得るが、これらに限定されない。
【００７９】
神経毒の取扱いに付随する安全性リスクを最小にするために、本発明のこの態様の薬剤または毒素を、低活性(または不活性)の一本鎖プロ形態として発現させ、次いで、インビトロでの注意深く制御されたタンパク質分解反応によって、好ましくは元の天然神経毒と同レベルの効力に活性化する。タンパク質分解切断の効率および速度を改善するために、操作したタンパク質分解切断部位を、ホロトキシン基質へのプロテアーゼの接近性を促進する一本鎖アミノ酸鎖のＨ部分とＬ部分との間の特別に設計されたループ中に存在するように設計することができる。
【００８０】
ヒトまたは通常のプロテアーゼによる毒素の意図しない活性化のリスクを減少させるために、切断部位のアミノ酸配列を、好ましくは、ヒトにおいて通常は存在しないタンパク質分解酵素に対して高い特異性を有するように設計する(ヒトプロテアーゼとして、または予知可能なヒト動物相および植物相の一部において存在するものとして)。このようなプロテアーゼの非限定的な例には、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫを切断するウシエンテロキナーゼ、配列ＥＸＸＹＸＱＳ／Ｇを切断するタバコetchウイルス(ＴＥＶ)プロテアーゼ、配列ＨＹまたはＹＨを切断するBacillus amyliquifaciens由来のGENENASE(登録商標)、およびアミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰを切断するヒトライノウイルス３Ｃ由来のPRESCISSION(登録商標)プロテアーゼが含まれる。上記で使用する文字Ｘは、任意のアミノ酸を示す。特記しない限り、本明細書中に示した全アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への方向であり、全ヌクレオチド配列は、５'から３'への方向(左から右)である。
【００８１】
本発明の別の態様において、ボツリヌス菌のサブタイプＥ神経毒の鎖間ループ領域(通常、これは細菌および哺乳動物におけるタンパク質分解ニッキングに耐性である)を修飾して、挿入タンパク質分解切断部位を含有させ、このループ領域を、本発明の一本鎖毒素または改変毒素分子中の鎖間ループ領域として使用する。ボツリヌス菌サブタイプＥ由来のループの使用により、ニッキングされていない毒素分子がインビボで安定化され、選択したプロテアーゼの使用によって活性化されるまで、望ましくない切断に対してそれを耐性にするものと考えられる。
【００８２】
広い態様において、本発明の薬剤を使用して、哺乳動物(好ましくはヒト)の疼痛を治療することができる。本発明において記載した薬剤を、疼痛治療のために、直接配合するかまたは薬学的に許容しうる塩としてインビボで使用することができる。好ましくは、薬剤を使用して慢性疼痛を治療することができる。より好ましくは、薬剤を使用して異痛症を治療することができる。さらに好ましくは、薬剤を使用して、実質的に急性の痛覚または触覚に影響を与えることなく異痛症を治療することができる。本発明をいかなる特定の理論または作用機構にも限定することを望むものではないが、上記のような急性の痛覚または触覚に影響を与えることのない異痛症治療の選択性は、α２Ｂおよび／またはα２Ｃ受容体に選択的に作用する薬剤によると考えられる。
【００８３】
１つの態様において、疼痛の治療方法は、哺乳動物(好ましくはヒト)に治療有効量の本発明の薬剤を投与する工程を含んでなる。本発明に従って治療することができる疼痛の種類の種々の非限定的な例は、慢性疼痛、異痛症、内臓痛、神経痛、および関連痛である。好ましい態様において、投与される薬剤は、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖を含む治療成分、標的細胞の細胞質への少なくとも軽鎖の移動を促進することができるボツリヌス毒素Ａ型の重鎖フラグメントを含む移行成分、および一般式IV：
【化２９】
2005506277.tif 000031
[式中、Ｘは、Ｒ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5およびＲ4-Ｃからなる群から選択される]
によって示される標的化成分を含有する。ＸがＲ4-Ｃ＝Ｃ-Ｒ5である場合には、６員の炭素環構造が形成される。ＸがＲ4-Ｃである場合には、５員の炭素環構造が形成される。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、およびＲ5は、それぞれ独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ6、およびＨからなる群から選択され、Ｒ6は、Ｈまたはアルキル(メチル、エチルもしくはプロピルを含む)である。
【００８４】
薬剤の投与量は多数の因子に依存する。例えば、各成分がそれぞれの機能を良好に発揮することができるほど、所望の治療効果を得るために必要な薬剤の用量が少なくなる。当業者は、それぞれの特定の薬剤のための特定の用量を容易に決定することができる。治療成分および移行成分として、天然、突然変異、または組換えのボツリヌス毒素を使用する薬剤については、薬剤の有効な投与量は、約１単位〜約５００単位のボツリヌス毒素であってよい。好ましい態様において、投与される薬剤は、約１０単位〜約３００単位のボツリヌス毒素を含んでなる。
【００８５】
１つの態様において、本発明の投与の経路には、経皮、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、直腸内、および脊髄内投与が含まれるが、これらに限定はされない。本明細書中で使用する「脊髄内」は、硬膜外腔、鞘内腔、脊髄の白質もしくは灰質、または関連構造(例えば、背根および背根神経節)の内部または内側を意味する。脊髄内投与を鞘内によって行うのが好ましいが、これは、比較的大きな鞘内腔を利用するのが比較的容易であるため、ならびに、好ましい薬剤が一般に、脂質に富む硬膜外環境において低い溶解性を示すためである。さらに、本発明の薬剤の脊髄内投与を、カテーテル挿入または脊髄穿刺注射などの種々の経路で行うことができる。本発明の治療効果の長期持続性により、長期の抗侵害受容性薬物投与の必要性が実質的に無くなるので、本方法は、薬剤の低頻度の脊髄穿刺注射によって有利に実施される。さらに、鞘内脊髄穿刺薬剤投与経路は、他のＣＮＳの位置に接近するためにカテーテルを動かすことと比較して、ＣＮＳ損傷の危険性がより少ないまま、より正確かつ局所的な薬剤の供給を容易にする。例えば、薬剤を、中枢神経系の頭蓋領域、頸部領域、胸郭領域、腰椎領域、および／または仙椎領域に鞘内投与することができる。薬剤の投与の後、疼痛(好ましくは慢性疼痛、より好ましくは異痛症型の疼痛)の緩和は、約２〜約２７ヶ月間持続する。さらに好ましくは、異痛症型の疼痛が、実質的に急性の痛覚または触覚に影響を与えることなく緩和される。
【００８６】
本発明で開示した薬剤の投与のための脊髄内経路を、選択した薬剤の溶解性ならびに薬剤の投与量などの基準に基づいて選択することができる。薬剤の投与量は、治療を受ける特定の障害、その重症度、および他の種々の患者の変数(例えば、サイズ、体重、年齢、治療応答性)によって大きく変化することができる。例えば、影響を受ける求心性ＣＮＳ疼痛ニューロン体細胞の領域の範囲は、注射した薬剤の体積に比例すると考えられ、一方、ほとんどの用量範囲について無痛覚の量は、注射した薬剤の濃度に比例すると考えられる。さらに、薬剤投与のための特定の脊髄内の位置は、治療を受ける疼痛のデルモソーム(dermosome)位置に依存することができる。一般に、適切な投与経路および投与量の決定方法は、担当医によって個別に決定される。このような決定は、当業者には日常的である[例えば、「ハリソンの内科学の原理 (1998)」、Anthony Fauciら編、第14版、McGraw Hill出版を参照]。
【００８７】
以下の実施例は、治療成分(例えば、クロストリジウム毒素の軽鎖)を組換えによって製造し、移行成分(例えば、クロストリジウム毒素の重鎖)に再結合させる方法を説明するものである。また、これらの実施例は、本発明の薬剤の種々成分を互いに連結する方法を例示するものである。
【実施例１】
【００８８】
ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖遺伝子のサブクローニング
実施例１は、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖をコードするポリヌクレオチド配列をクローン化する方法を記載する。ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖をコードするＤＮＡ配列を、配列：５'-ＡＡＡＧＧＣＣＴＴＴＴＧＴＴＡＡＴＡＡＡＣＡＡ-３'(配列番号３)および５'-ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＡＴＴＧＴＡＴＣＣＴＴＴＡ-３'(配列番号４)を有する合成オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲプロトコールによって増幅することができる。これらプライマーの使用により、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖遺伝子フラグメントの５'および３'末端に、それぞれＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を導入することができる。次いで、これらの制限部位を使用して、増幅生成物の一定方向のサブクローニングを容易にすることができる。さらに、これらのプライマーは、Ｌ鎖コード配列のＣ末端に終止コドンを導入する。ボツリヌス菌(６３Ａ株)由来の染色体ＤＮＡを、増幅反応における鋳型として使用することができる。
【００８９】
ＰＣＲ増幅を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.３)、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.２ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸(ｄＮＴＰ)、５０ｐモルの各プライマー、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、および２.５単位のＴａｑポリメラーゼ(Promega)を含む１００μｌの体積中で行う。反応混合物を、３５サイクルの変性(９４℃で１分間)、アニーリング(３７℃で２分間)、および重合(７２℃で２分間)に供した。最後に、反応物を７２℃でさらに５分間伸長する。
【００９０】
ＰＣＲ増幅生成物を、ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で精製し、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ*にライゲートして、プラスミドｐＳＡＬを得ることができる。このプラスミドを保有する細菌形質転換体を、常法によって単離することができる。クローン化Ｌ鎖ポリヌクレオチドの同一性を、製造元の説明書に従ってSEQUENASE(United States Biochemicals)を使用する二本鎖プラスミド配列決定によって確認する。必要に応じて、重複配列決定を行うために合成オリゴヌクレオチド配列決定プライマーを調製する。クローン化配列は、Binzら[J.Biol.Chem.、265、9153 (1990)]およびThompsonら[Eur.J.Biochem.、189、73 (1990)]によって開示された配列と同一であることが見い出される。
【００９１】
また、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の酵素活性を損なうように設計した部位指向性の突然変異体を創製することもできる。
【実施例２】
【００９２】
ボツリヌス毒素Ａ-Ｌ型(ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ)鎖融合タンパク質の発現
実施例２は、ｐＣＡ-Ｌプラスミドを保有する細菌中での野生型Ｌ鎖(これは治療成分として使用することができる)の発現を確認する方法を記載する。ｐＣＡＬを保有する十分に単離した細菌コロニーを使用して、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％(w／v)グルコースを含むＬ-ブロスに接種し、震盪しながら３０℃で一晩増殖させる。この一晩培養物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新鮮なＬ-ブロスで１０倍に希釈し、２時間インキュベートする。融合タンパク質の発現を、最終濃度０.１ｍＭへのＩＰＴＧの添加によって誘導する。３０℃でさらに４時間のインキュベートの後、細菌を、６,０００ｘｇで１０分間の遠心によって集める。
【００９３】
小規模ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により、ＩＰＴＧ誘導した細菌由来のサンプルにおいて、９０ｋＤａのタンパク質バンドの存在を確認した。このＭrは、ＭＢＰ(約４０ｋＤａ)成分およびＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖(約５０ｋＤａ)成分を有する融合タンパク質の推定サイズと一致する。さらに、対照培養物から単離したサンプルと比較すると、ＩＰＴＧ誘導したクローンは、実質的により大量の融合タンパク質を含んでいた。
【００９４】
また、ＩＰＴＧ誘導した細菌抽出物中の所望の融合タンパク質の存在も、Cenci di Belloら[Eur.J.Biochem.、219、161 (1993)]により記載されたポリクローナル抗Ｌ鎖プローブを使用するウェスタンブロットによって確認される。ＰＶＤＦメンブラン(Pharmacia、Milton Keynes、英国)上の反応性バンドを、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ウサギ免疫グロブリン(Bio-Rad、Hemel Hempstead、英国)およびＥＣＬ検出システム(Amersham、英国)を使用して視覚化する。ウェスタンブロットの結果により、支配的な融合タンパク質の存在が、完全サイズの融合タンパク質よりも低いＭrのタンパク質に対応するいくつかのかすかなバンドと共に確認された。この観察により、融合タンパク質の限定的な分解が、細菌中または単離操作中に起こることが示唆された。単離操作中の１ｍＭおよび１０ｍＭのベンズアミジン(Sigma、Poole、英国)のいずれによっても、このタンパク質分解は排除されなかった。
【００９５】
上記操作によって単離された無傷の融合タンパク質の収率は、本明細書中に記載した全ての操作に対して完全に当てはまった。染色されたＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルからの概算に基づくと、ＩＰＴＧで誘導された細菌クローンは、１リットルの培養物あたり５〜１０ｍｇの全ＭＢＰ野生型または突然変異Ｌ鎖融合タンパク質を産生した。即ち、本明細書中に開示したＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖融合タンパク質の製造方法は、限定的なタンパク質分解が起こるにもかかわらず、効率が高い。
【００９６】
ｐＣＡＬおよびｐＣＡＬ-ＴｙｒＵ７発現プラスミドによってコードされるＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質を、アミロースアフィニティークロマトグラフィーによって細菌から精製する。次いで、組換え野生型または突然変異のＬ鎖を、Ｘ2因子による部位特異的な切断によって、融合タンパク質の糖結合ドメインから分離する。この切断操作により、遊離ＭＢＰ、遊離Ｌ鎖、および少量の未切断融合タンパク質が得られた。このような混合物中に存在する得られたＬ鎖は、所望の活性を有することを示し、本発明者は追加の精製工程を使用した。即ち、切断生成物の混合物を、第２のアミロースアフィニティーカラムに供する(このカラムはＭＢＰおよび未切断融合タンパク質の両方を結合した)。遊離Ｌ鎖はアフィニティーカラムに保持されず、これを下記の実験において使用するために単離する。
【実施例３】
【００９７】
融合タンパク質の精製および組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の単離
実施例３は、細菌クローンから野生型組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖を製造および精製する方法を記載する。野生型ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖タンパク質を発現する細菌の１リットル培養物からのペレットを、１ｍＭフェニル-メタンスルホニルフロオリド(ＰＭＳＦ)および１０ｍＭベンズアミジンを含むカラム緩衝液[１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴ]に再懸濁し、超音波処理によって溶解する。この溶解物を、４℃における１５,０００ｘｇで１５分間の遠心によって透明にする。この上清を、アミロースアフィニティーカラム[２×１０ｃｍ、樹脂３０ｍｌ](New England BioLabs、Hitchin、英国)に適用する。２８０ｎｍでの安定な吸光度の読み値によって判定したときに溶出液がタンパク質を含まなくなるまで、未結合タンパク質を、カラム緩衝液により樹脂から洗浄する。次いで、結合したＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質を、１０ｍＭマルトースを含むカラム緩衝液によって溶出させる。融合タンパク質を含む分画をプールし、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、および１ｍＭ ＤＴＴを補足した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)に対して４℃で７２時間透析する。
【００９８】
融合タンパク質を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、および１ｍＭ ＤＴＴを補足した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)緩衝液に対して透析しながら、酵素：基質＝１：１００の比のＸ2因子(Promega、Southampton、英国)で切断することができる。透析を４℃で２４時間行う。この切断工程で得られたＭＢＰおよび野生型または突然変異Ｌ鎖のいずれかの混合物を、カラム緩衝液で平衡化した１０ｍｌのアミロースカラムにかける。通過した分画の一部を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析用に調製し、Ｌ鎖を含むサンプルを同定する。通過した分画の残りの部分を、−２０℃で保存する。全大腸菌抽出物または精製タンパク質を、ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解し、常法に従ってＰＡＧＥに供する。この操作の結果は、サンプルの約９０％のタンパク質が組換え毒素フラグメントであることを示した。
【００９９】
上記の結果は、本明細書中に記載したＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質の創製アプローチを使用して、野生型および突然変異の組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖を有効に製造することができることを示す。さらに、これらの結果は、組換えＬ鎖を、融合タンパク質のマルトース結合ドメインから分離し、その後に精製しうることを示す。
【０１００】
組換えＬ鎖生成物およびその天然の対応物の酵素活性を比較するために、高感度の抗体に基づくアッセイを開発する。このアッセイは、ＢｏＮＴ／Ａ切断部位に対応するＳＮＡＰ-２５の無傷のＣ末端領域に特異性を有する抗体を使用した。ＳＮＡＰ-２５のＢｏＮＴ／Ａ切断の反応生成物のウェスタンブロットは、抗体がＳＮＡＰ-２５サブフラグメントに結合することができないことを示した。従って、以下の実施例において使用した抗体試薬は、無傷のＳＮＡＰ-２５のみを検出した。抗体結合がないことを、添加したＢｏＮＴ／Ａ軽鎖およびその組換え誘導体によって媒介されるＳＮＡＰ-２５タンパク質分解の指標として使用した。
【実施例４】
【０１０１】
ＳＮＡＰ-２５基質に対する組換えＬ鎖のタンパク質分解活性の評価
天然および組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の両方は、ＳＮＡＰ-２５基質をタンパク質分解することができる。定量アッセイを使用して、野生型およびその組換え類似体のＳＮＡＰ-２５基質の切断能力を比較することができる。このアッセイに使用する基質を、トロンビンの切断部位を含むグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)-ＳＮＡＰ-２５融合タンパク質を調製することによって獲得し、ｐＧＥＸ−２Ｔベクターを使用して発現させ、グルタチオンアガロースにおけるアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。次いで、ＳＮＡＰ-２５を、酵素：基質の比＝１：１００において、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２.５ｍＭ ＣａＣｌ2を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.５)中のトロンビン[Smithら、Gene、67、31 (1988)]を使用して、融合タンパク質から切断した。未切断融合タンパク質および切断グルタチオン結合ドメインは、ゲルに結合した。組換えＳＮＡＰ-２５タンパク質を、後者の緩衝液で溶出させ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.５)に対して４℃で２４時間透析する。総タンパク質濃度を、常法によって測定する。
【０１０２】
ＳＮＡＰ-２５のＣ末端領域に特異的なウサギポリクローナル抗体を、アミノ酸配列：ＣＡＮＱＲＡＴＫＭＬＧＳＧ(配列番号７)を有する合成ペプチドに対して惹起する。このペプチドは、シナプス原形質膜タンパク質の残基１９５〜２０６および天然ＳＮＡＰ-２５において見い出されないＮ末端システイン残基に対応する。合成ペプチドを、架橋剤としてマレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢＳ)(Sigma、Poole、英国)を使用してウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)(Sigma、Poole、英国)に結合させて、抗原性を改良する[Liuら、Biochemistry、18、690 (1979)]。抗ペプチド抗体のアフィニティー精製を、架橋剤エチル３-(３-ジメチルプロピル)カルボジイミドを使用してヨード酢酸で活性化した、アミノアルキルアガロース樹脂(Bio-Rad、Hemel Hempstead、英国)にＮ末端システイン残基を介して結合させた抗原ペプチドを有するカラムを使用して行う。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.４)および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液でカラムを連続洗浄した後、ペプチド特異的な抗体を、１００ｍＭグリシン(ｐＨ２.５)および２００ｍＭ ＮａＣｌの溶液を使用して溶出させ、０.２ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)中和緩衝液を含む試験管に集める。
【０１０３】
野生型Ｌ鎖を含む全ての組換え調製物を、０.０２％ Lubrolおよび１０μＭ酢酸亜鉛を含む１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.５)中に４℃で一晩透析し、次いで、その酵素活性を評価する。３７℃で３０分間、２０ｍＭ ＤＴＴで予め還元したＢｏＮＴ／Ａならびにこれらの透析サンプルを、１ｍＭ ＤＴＴを補足した後者のＨＥＰＥＳ緩衝液で異なる濃度に希釈する。
【０１０４】
反応混合物は、５μｌの組換えＳＮＡＰ-２５基質(最終濃度８.５μＭ)および２０μｌの還元ＢｏＮＴ／Ａまたは組換え野生型Ｌ鎖のいずれかを含む。全サンプルを、３７℃で１時間インキュベートし、次いで２５μｌの２％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)および５ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液により反応を停止させる[Foranら、Biochemistry、33、15365 (1994)]。各サンプルの一部を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加および煮沸によってＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびポリクローナルＳＮＡＰ-２５抗体を用いるウェスタンブロットのために調製する。抗ＳＮＡＰ-２５抗体の反応性を、ＥＣＬ検出システムを使用してモニターし、デンシトメトリースキャニングによって定量する。
【０１０５】
ウェスタンブロットの結果は、精製した突然変異Ｌ鎖および天然または組換えの野生型ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖のいずれかのタンパク質分解活性の間の明らかな相違を示す。具体的には、組換え野生型Ｌ鎖は、ＳＮＡＰ-２５基質を切断するが、還元ＢｏＮＴ／Ａ天然Ｌ鎖(この操作においてポジティブ対照として働く)よりも効率が若干低い。従って、ＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の酵素活性形態を、組換え法によって製造し、次いで単離する。さらに、Ｌ鎖タンパク質中の１個のアミノ酸の置換により、シナプス終末タンパク質を分解する組換えタンパク質の能力がなくなる。
【０１０６】
野生型組換えＢｏＮＴ／Ａ-Ｌ鎖の生物活性の予備試験として、ジギトニン透過性にしたウシアドレノクロマフィン細胞からのＣａ2+誘発カテコールアミン放出を減少させるＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質の能力を調べる。一致して、野生型組換えＬ鎖融合タンパク質(無傷であるか、または、Ｘ2因子で切断して遊離ＭＢＰおよび組換えＬ鎖を含む混合物を生成させたかのいずれか)は、天然ＢｏＮＴ／Ａによって引き起こされる阻害と等価なＣａ2+刺激放出の用量依存的阻害を誘導した。
【実施例５】
【０１０７】
天然Ｌ鎖、組換え野生型Ｌ鎖と精製Ｈ鎖との再構成
天然のＨ鎖およびＬ鎖を、２Ｍ尿素を使用してＢｏＮＴ／Ａ(List Biologicals Inc.、Campbell、米国)から解離させ、１００ｍＭ ＤＴＴで還元し、次いで、確立されたクロマトグラフィー法に従って精製する[Kozakiら、Japan.J.Med.Sci.Biol.、34、61 (1981)；Maiseyら、Eur.J.Biochem.、177、683 (1988)]。精製したＨ鎖を、等モル量の天然Ｌ鎖または組換え野生型Ｌ鎖のいずれかと組合わせる。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ８.０)、５０μＭ酢酸亜鉛、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液に対してサンプルを４℃で４日間にわたり透析することによって再構成を行う。透析の後、ジスルフィド結合した１５０ｋＤａの二本鎖を形成させるための組換えＬ鎖および天然Ｈ鎖の会合を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによってモニターし、デンシトメトリースキャニングによって定量する。組換えＬ鎖を使用して形成された二本鎖分子の比率は、天然Ｌ鎖を使用したときに得られる分子よりも低い。実際のところ、約３０％の組換え野生型または変異Ｌ鎖のみが再構成され、一方、＞９０％の天然Ｌ鎖がＨ鎖と再会合した。この低い再構成効率にもかかわらず、組換えＬ鎖を一体化した十分な材料が、その後の機能試験で使用するために容易に製造される。
【実施例６】
【０１０８】
マルトース結合タンパク質-ＴｅＴｘ-Ｌ鎖構築物の調製
本実施例は、野生型Ｌ鎖のマルトース結合融合タンパク質をコードする組換えプラスミドの創製方法を記載する。大腸菌Ｋ-１２株ＴＧ１を、下記の全プラスミド構築物の増殖のための宿主として使用する。プラスミドｐＭＡＬ-Ｌ(野生型Ｌ鎖遺伝子)を、Fairweatherら[FEBS Lett.、323、218 (1993)]が記載したプラスミドｐＴｅｔ８７由来のＬ鎖をコードする１４１７ｂｐフラグメントのポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)増幅によって構築する。このＰＣＲ増幅に使用する２つのポリヌクレオチドプライマー(ａおよびｄと称する)は、それぞれ配列：５'-ＡＧＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＣＡＡＴＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴ-３'(配列番号５)および５'-ＡＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＴＣＴＡＴＴＡＴＡ-３'(配列番号６)を有する。この反応の増幅生成物をＳａｌＩおよびＨｉｎｄIII(Promega)で消化し、同一の酵素で消化しておいたベクターｐＭＡＬ-ｃ２(New England BioLabs)にライゲートして(図１Ａ)、野生型ＴｅＴｘ配列を保有するプラスミドｐＭＡＬ-Ｌを創製する。MAGIC DNA CLEAN-UP SYSTEM(Promega)で精製した後、サンプルをＳａｉＩおよびＨｉｎｄIIIで切断しておいたｐＭＡＬ-ｃ２にライゲートして、突然変異ＴｅＴｘ配列を保有するプラスミドｐＭＡＬ-ＬＣ-Ａｌａ２Ｕを創製する。
【０１０９】
サブクローニングの後、プラスミドＤＮＡを、アンピシリン耐性形質転換体の培養物から精製し、構築物の構造を、挿入体の制限マッピングおよびＤＮＡ配列決定を使用して確認する。ＳａｌＩおよびＨｉｎｄIII消化により、アガロースゲル電気泳動によって測定したときに１４１７ｂｐの予想長さを有するフラグメントが得られる。ＤＮＡ配列決定により、Ｌ鎖遺伝子の５'末端、多クローニング部位(ＭＣＳ)、Ｘ因子、切断部位、Ｌ鎖、およびＭＢＰ暗号配列の接合点におけるヌクレオチド配列が、全て正しい読み取り枠で存在することが確認される(図１Ａ)。上記プラスミド構築物が利用可能であることにより、組換え野生型および突然変異Ｌ鎖融合タンパク質の製造が可能になる。具体的には、プラスミドｐＭＡＬ-Ｌを保有する細菌クローンの培養物を、イソプロピル-Ｄ-チオガラクトシド(ＩＰＴＧ)で誘導して、組換え融合タンパク質の高レベル合成を刺激する。２つの融合タンパク質の大量精製を、細菌抽出物のアミロースアフィニティー樹脂でのアフィニティークロマトグラフィーによって行う。
【実施例７】
【０１１０】
ＴｅＴｘ融合タンパク質の発現および野生型Ｌ鎖タンパク質の精製
本実施例は、先の実施例Ｂに記載したプラスミド構築物によってコードされる組換えＬ鎖融合タンパク質を産生および精製するための方法を記載する。プラスミドｐＭＡＬ-Ｌを保有する大腸菌クローンを、１０ｇ／ｍｌアンピシリンおよび２ｍｇ／ｍｌグルコースにしたＬブロス中、３７℃で約２×１０8細胞／ｍｌ(Ａ500nmが約０.５)の密度まで増殖させる。誘導を、最終濃度０.３ｍＭまでＩＰＴＧを添加することによって開始させる。細胞を、６０００ｘｇで３０分間の遠心によって回収する。次いで、得られたペレットを、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)を含むカラム緩衝液[１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、1ｍＭエチレングリコールビス(アミノエチルエーテル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-四酢酸、および１ｍＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)(ｐＨ７.４)]中に再懸濁し、超音波処理によって溶解する。遠心の後、粗抽出物をアミロースアフィニティーカラム(２.５×１０ｃｍ、樹脂４０ｍｌ)に適用する。緩衝液での洗浄によって未結合タンパク質を除去した後、結合ＭＢＰ-Ｌ融合タンパク質を、Mainaら[Gene、74、365 (1998)]が記載した方法に従って、１０ｍＭマルトースを含むカラム緩衝液で溶出させる。単離した融合タンパク質を、AmiconのCENTRICONを使用して０.５〜１ｍｇ／ｍｌに濃縮する。次いで、タンパク質サンプルを、抗ＭＢＰポリクローナル抗体および抗Ｌ鎖モノクローナル抗体を使用して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)およびウェスタンブロットによって分析する。両細胞抽出物のＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、未誘導培養物のクーマシー染色パターンでは存在しない誘導タンパク質バンド(Ｍrは約９０,０００)の存在が示された。タンパク質バンドの分子量は、ＭＢＰとＬ鎖(Ｍrがそれぞれ約４０,０００および５０,０００)の融合物から予想される分子量に一致する。ｐＭＡＬ-ｃ２ベクター系を使用した組換えＬ鎖の発現用に確立された最適条件は、ＩＰＴＧとの３７℃で２時間の誘導である。誘導時間をより長くしてもプロテアーゼインヒビターを含有させても、生成物収率は増加しなかった。両融合タンパク質は水性緩衝液に可溶性(０.５ｍｇ／ｍｌまで)であり、−２０℃で保存したときに８ヶ月間まで安定である。
【０１１１】
この最初の精製工程の後、両ＭＢＰ-Ｌ鎖調製物を、酵素：タンパク質の比＝０.５〜１：１００(w／w)で、Ｘ因子により２３℃で２４時間切断する。ＳＤＳ-ＰＡＧＥで確認したところ、この切断により、融合タンパク質がそれぞれの野生型Ｌ鎖に、ＭＢＰの遊離を伴って完全に変換された。カラム緩衝液に対して徹底的に透析を行ってマルトースを除去した後、Ｌ鎖を、新しいアフィニティーカラムでの再吸着によってさらに精製する。この精製工程からの所望の生成物は、カラム洗浄分画において見い出される。カラム洗浄分画を、Ａ280nmでモニターし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより再度チェックする。
【０１１２】
アミノ酸配列決定のために、Tousら[Anal.Biochem.、179、50 (1989)]の記載のように、組換え野生型をＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけ、ポリ(ビニリデンジフルオリド)メンブランに移し、モデル４０００タンパク質シークエンサー(Chelsea Instruments、ロンドン)で自動化エドマン分解を行う。２つの生成物の微量配列決定により、図１Ａに示すように、ベクターの多クローニング部位によってコードされる１１個のアミノ酸によって先行される天然Ｌ鎖のＮ末端の残基と同一の４個の残基が明らかとなった。この所望の構造を有する組換えＬ鎖タンパク質の産生に成功して、次にこれら組成物の酵素活性を試験した。
【０１１３】
天然Ｌ鎖の亜鉛依存性プロテアーゼ活性の測定を、組換えＬ鎖タンパク質の活性のためのアッセイとして使用する。２つの異なるタンパク質基質をこのアッセイにおいて使用する。第１の場合、ウシシナプス小胞(ＳＳＶ)を使用する。基質のタンパク質分解切断のためのアッセイは、タンパク質ゲルのクーマシー染色およびウェスタンブロットに基づく。
組換えＬ鎖タンパク質のタンパク質分解活性の評価方法および天然および組換えＬ鎖のインビトロ活性の定量方法は既知であり、これらを使用してこれら組換えＬ鎖を評価および定量することができる。
【実施例８】
【０１１４】
天然Ｈ鎖および組換えＬ鎖からのＴｅＴｘの再会合
実施例７は、天然Ｌ鎖または組換え野生型Ｌ鎖のいずれかを一体化したＴｅＴｘ二本鎖の製造方法を記載する。Wellerら[Eur.J.Biochem.、182、649 (1989)]の記載のようにＴｅＴｘから精製した天然Ｈ鎖を、等モル量の天然Ｌ鎖または組換え野生型Ｌ鎖のいずれかと組合わせる。この混合物を、２Ｍ尿素、２０ｍＭ ＤＴＴ、１Ｍ ＮａＣｌ、および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８.４)に対して撹拌しながら１８時間透析し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌおよび６００ｍＭグリシン(ｐＨ８.４)に対して撹拌せずに７２時間さらに透析する。その一部(３００ｇ)を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８.４)中でＨＰＬＣ ＤＥＡＥカラムにかけ、同一緩衝液中のＮａＣｌ勾配(０〜１Ｍ)で溶出させる。共有結合再構築の程度を、非還元性ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよび銀染色によってチェックする。
【０１１５】
二本鎖種の再会合を、天然ＴｅＴｘと同時移動する染色された高Ｍrタンパク質バンドの存在によって確認する。組換え野生型および突然変異Ｌ鎖について、二本鎖種の相対量は、銀染色ゲルのデンシトメトリースキャニングで測定したときに、それぞれ５５.１％および５６.８％である。天然のＨ鎖およびＬ鎖は、同等の再構成レベルを与えた。毒素として鎖間ジスルフィド形成に関与する後者は、ＤＴＴによる還元によって遊離のＨ鎖およびＬ鎖に元のように変換される。
【実施例９】
【０１１６】
標的化成分への治療成分の連結方法
本発明に従って、治療成分(例えば軽鎖)を、標的化成分に結合させることができる。標的化成分を結合させる軽鎖は、他の結合を含まなくてもよく、また、既に移行成分に結合されていてもよい。多くのアプローチが、化合物をタンパク質鎖に連結するために知られている。例えば、リンカー分子を使用して、Ｌ鎖ペプチドから標的成分を隔離することができる。１１個のアミノ酸を、ＴｅＴｘ-Ｌ鎖のＮ末端に、実質的にその機能に影響を与えることなく結合させうることが既知である。このために、ボツリヌス毒素または破傷風毒素のＬ鎖のいずれかのＮ末端部分が、標的化成分結合点として使用される。
【０１１７】
基質または結合性分子(例えば標的化成分)として作用するほとんどの分子は、立体障害に感受性ではない位置を有することが知られている。さらに、結合過程は、標的化成分にキラリティを導入すべきではない。さらに、リンカーおよび標的化成分を、共有結合によって結合させるべきである。Ｌ鎖と標的化成分の間の距離を、スペーサー成分の挿入によって調整することができる。好ましいスペーサーは、リンカー、薬物およびＬ鎖に結合することができ、これらをコンジュゲート化するのに役立つことができる官能基を有する。好ましいスペーサー成分には、以下のものが含まれる：
１) ＨＯＯＣ-(ＣＨ2)n-ＣＯＯＨ (ｎ＝１〜１２)：これは、ペプチドのアミノ末端に挿入して、それを標的化成分上のリンカーと結合させるのに適する；
２) ＨＯ-(ＣＨ2)n-ＣＯＯＨ (ｎ＞１０)：これは、ペプチドのアミノ末端に結合させて、Ｌ鎖を標的化成分上のリンカーと結合させるのに適する；
３) (Ｃ5Ｈ6)n (ｎ＞２)：これは、Ｌ鎖を標的化成分上のリンカーと結合させるのに適する。ベンゼン環は、標的化成分とＬ鎖の間の硬いスペーサーを与える。勿論、適当な官能基(例えば、以下のＸによって示されるような官能基)が、薬物とＬ鎖を連結するためにベンゼン環上に存在するであろう。
【０１１８】
種々のタイプのリンカーが想定される。例えば、１つのタイプにおいては、標的化成分-リンカー-Ｌ鎖分子は、細胞に導入された後に無傷のままである。別のタイプにおいては、標的化成分-リンカー-Ｌ鎖分子は、細胞に導入された後に代謝されて薬物を遊離する。さらに別のタイプにおいては、標的化成分-リンカー-Ｌ鎖分子は、細胞表面の外側で代謝されて薬物を遊離する。
【０１１９】
導入後に無傷のままであるリンカー
１つの態様において、当該分野で周知の方法によって、システイン残基をＬ鎖分子の末端に結合させる。例えば、Ｌ鎖分子を有する遺伝子構築物を、タンパク質のＮ末端部分にシステイン残基を含むように突然変異させることができる。次いで、マレイミドリンカーを、周知の方法によってシステイン残基に結合させる。
【０１２０】
別の態様において、リンカーを標的化部分に直接結合させる。標的化成分-Ｘ部分は、以下の基を有することができる：Ｘは、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2、ＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ30(Ｒ30はアルキル基である)であってよいが、これらに限定されない。勿論、適切な基は、活性部位中に存在せず、また、立体障害性でもない。以下に、標的化成分-Ｘをリンカー分子に連結する１つの反応例を挙げる。
【化３０】
2005506277.tif 000032
【０１２１】
標的化成分がリンカー結合されると、以下の反応を使用して、標的化成分を軽鎖(例えば、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖)に連結することができる。この反応において、軽鎖(好ましくは、ボツリヌス毒素Ａ型の軽鎖)は、標的化成分の結合点として使用される接近可能なリジン基を有する。上記したように、余分のアミノ酸(例えばリジン)を、Ｌ鎖遺伝子のＮ末端部分に容易に付加することができ、標的化成分の結合点として使用することができる。以下の反応においては、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用して、Ｌ鎖分子上のリジン基にリンカーを結合させる。
【化３１】
2005506277.tif 000033
本発明における使用が想定される標的化成分には、遊離の-ＸＨ基を有するもの、ならびに、α-２Ｂ受容体に結合することができるものが含まれる。
【０１２２】
導入後に切断されるリンカー
細胞に導入した後に標的化成分がＬ鎖から放出されることは重要であり得る。この方法においては、標的化成分は、遊離の-ＸＨ基を有し、これがリンカーを用いる合成のための活性部位となる。-ＸＨ基は、アルコール、フェノール、アミン、カルボン酸、またはチオール基であることができる。
導入後に代謝されるように、標的化成分を毒素に連結するための一般式を以下に示す。
【化３２】
2005506277.tif 000034
【０１２３】
本発明を、ある種の好ましい方法に関連して詳しく記載したが、本発明の範囲内で他の態様、変形および修飾が可能である。例えば、本発明の薬剤は、α-２Ｂアドレナリン作動性受容体によって調節される任意の他の障害の治療で有効であり得る。さらに、本発明を種々の特定の実施例および態様に関連して記載したが、本発明はこれらに限定されず、特許請求の範囲の範囲内で様々に実施することができると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】軽鎖およびマルトース結合タンパク質を含む融合タンパク質(本明細書中ではＭＢＰ-Ｌ鎖融合タンパク質と称する)の発現に使用した破傷風毒素(「ＴｅＴｘ」)およびＤＮＡ構築物(ｐＭＡＬ-Ｌ)を示す図である。図の第１部分の１文字コードは、Ｎ末端ミクロ配列決定によって決定した精製組換えＬ鎖の最初の数個の残基のアミノ酸配列を示すものである。図の第２部分は、Ｌ鎖にジスルフィド結合したＨ鎖を示すものである。亜鉛結合ドメインの位置も図に示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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