(57)【要約】本発明は、特定の癌の再発危険性の高まりならびに化学療法および放射線療法の一つまたは両方による処置の成功の可能性を決定するための組成物および方法を提供する。この方法は、被験者または患者から単離した目的の遺伝子の予め決められた領域に存在するゲノムの多型のタイプを決定する工程を包含する。患者の癌の危険性ならびに処置応答を決定するための核酸プローブおよびキットもまた提供する。本発明は、癌の処置プロトコールを選択するために、目的遺伝子の多型領域の対立遺伝子改変体の使用を含む。これら使用方法は、予後方法、診断方法、および治療方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の癌を処置するための治療的なレジメを選択するための方法であり、ここで化学療法の薬剤が該患者に投与され、該方法は、癌の処置結果と相関関係にあるゲノムの多型または遺伝子型について、該患者から単離した適切な細胞または組織サンプルを、スクリーニングする工程を包含する方法。
【請求項２】
前記癌は、フルオロピリミジン薬剤または白金薬剤よりなる群から選択される化学療法の薬剤の投与により処置され得る癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌は、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌および肺癌よりなる群から選択される癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌処置はさらに、放射線治療を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノムの多型は、チミジル酸シンターゼ遺伝子、除去修復相補性群遺伝子（ＥＲＣＣ１）、ＶＥＧＦ、ＥＲＣ２遺伝子、ＸＲＣＣ−１遺伝子、ヒトグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰＩ遺伝子、上皮細胞増殖因子レセプター遺伝子、マトリックスメタロプロテイナーゼ遺伝子（−１、および−３）、インターロイキン８（ＩＬ−８）遺伝子、Ｄ−ピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）ならびにＣＸＣケモカインよりなる群から選択される遺伝子内に生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝型は、チミジル酸シンターゼ、Ｄ−ピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）ＥＲＣＣ１およびＶＥＧＦであり、ならびに前記組織サンプルは、癌を処置するため癌タイプの薬剤に対応する正常組織である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者における癌化学療法に関連し化学的に誘導された神経毒性を減少させるための方法であり、該方法は、それを必要とする患者に対して有効量のＣＯＸ−２阻害剤を前記被験者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項８】
前記化学療法は、オキサリプラチンの投与を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記化学療法は、５−ＦＵの投与を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトの患者が、前記腫瘍を外科的に除去した後、腫瘍再発に陥る可能性が高いかを決定するための方法であり、該方法は、該腫瘍に隣接する正常組織から単離された細胞またはサンプル内においてＴＳ、ＤＰＤ、ＥＲＣＣ１およびＶＥＧＦよりなる群から選択された遺伝子の発現レベルを決定する工程、および該発現レベルと正常レベルを相関付ける工程であって、ここで、該遺伝子の過剰発現は、腫瘍再発の危険にある患者同定の予測となる、工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記腫瘍は、直腸癌に関連する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国特許法１１９条（ｅ）項に基づいて、以下の米国仮出願第６０／４００，２４９号；第６０／４００，２５０号；第６０／４００，２５３号；および第６０／４００，２７６号（全て２００２年７月３１日出願）に対して、優先権を主張する。これら出願の内容は、本明細書によって本開示内に参考として援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、薬理ゲノム学の分野に関連し、詳細には疾患の診断および処置へのゲノムの多型の適用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
本来、同種の生物は一般的に、いくつかの局面において互いに異なる（例えば、外観）。差異は、遺伝学的に決定され、そして多型と称される。多くの遺伝子座で、二以上の対立遺伝子が生じ得る（遺伝的多型）。遺伝的多型は、異なる対立遺伝子に起因する、二つ以上の遺伝学的に決定される選択的表現型集団の発生として定義される。多型は、全個体（ｗｈｏｌｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）（表現型）、タンパク質および血液型物質の異型（生化学的多型）、染色体の形態的特徴（染色体多型）のレベルにおいて、またはヌクレオチドの差異におけるＤＮＡのレベル（ＤＮＡの多型）で観察され得る。
【０００４】
多型は、薬剤への応答における個体差を決定する役割を果たし得る。癌化学療法は、特定集団の、薬剤毒性または乏しい薬剤応答性の性質により制限される。そのため、薬剤代謝酵素またはレセプター発現の遺伝子変化に起因し得る、抗癌剤投与に対する応答性および毒性における有意な個体間のバリエーションを理解するために例えば、薬理遺伝学（薬剤応答への遺伝的差異の影響）が、癌化学療法に適用される。本明細書中に参考として援用される、同時係属の米国出願第０９／７１５，７６４号を参照のこと。
【０００５】
多型はまた、個体の癌感受性（癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子および代謝経路において含まれる酵素の遺伝子）に関連する。３５歳よりも若い患者において、高まる癌の危険性の様々なマーカーが、同定されている。例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を、無症候性の若い男性の前立腺癌の早期検出のため使用し得、一方、特定のチトクロムＰ４５０１Ａ１およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＭｌ遺伝子型は、若い患者の前立腺癌発生の危険性に影響する。同様に、癌抑制遺伝子（ｐ５３）の変異は、若い成人の脳の癌に関連する。
【０００６】
そのため、薬剤毒性または乏しい薬剤応答性を予見するマーカー遺伝子を同定するという、要求が存在する。本発明は、この要求を満たし、およびその上、関連する利益を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（実施形態の説明）
一つの実施形態において、本発明は、癌の処置プロトコールを選択するために、目的遺伝子の多型領域の対立遺伝子改変体の使用を含む。これら使用方法は、予後方法、診断方法、および治療方法を含む。一つの局面において目的の変異体を、外科的切除の後に残存する、隣接、および対応する「正常」組織において、高発現（ｍＲＮＡの発現レベルに基づく）する遺伝子として発現される。別の局面においては、目的の変異体は、ゲノムレベルで検出され、ならびに最終的にタンパク質へ転写または翻訳される遺伝子または、されない遺伝子の領域を含み得る。例えば、このような領域は、非翻訳のプロモーター領域または非翻訳の遺伝子の３’領域を含むが、これらに限定はされない。
【０００８】
多型を検出するための方法は、被験体が、癌発生の危険性および／または化学療法に対する被験体の応答性を有するのか、もしくはその状態にあるのかを決定するためのプローブまたはプライマーとして多型領域を含む核酸を使用する工程を、包含する。あるいは、ｍＲＮＡレベルを、核酸プローブまたは核酸アレイの使用により検出し得る。
【０００９】
一つの局面において、癌は、白金療法（例えば、オキサリプラチンまたはシスプラチンまたは５−フルロウリジン（５−ＦＵ））および経口利用可能なＦＵ療法（Ｘｅｌｏｄａ（Ｒｏｃｈｅ）の名称の下市販される）により「処置可能」である癌または腫瘍を含む。このような癌の非限定的な例示としては、直腸癌、結腸直腸癌、大腸癌、胃癌、肺癌、食道癌を含むが、これらに限定はされない。一つの局面において、テストされるサンプルは、実際の腫瘍組織である。別の局面において、この方法においてテストされるサンプルは、腫瘍組織に「対応する」正常な組織である（例えば、正常な肺組織は、肺癌組織に対応する正常な組織であると考えられる）。また、さらなる例においては、サンプルは、患者の任意の組織であり、および末梢血リンパ球を含み得る。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、目的遺伝子に対してハイブリダイズ可能なプローブまたはプライマーを含む、目的遺伝子の少なくとも一部の分子構造を増幅および／または決定するためのキットならびに使用説明書を提供する。一つの実施形態において、プローブまたはプライマーは、目的遺伝子の対立遺伝子の変異体に対してハイブリダイズ可能である。
【００１１】
本発明の他の性質および利点を、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明確にする。
【００１２】
（発明実施のための形態）
本発明は、被験体の目的遺伝子における遺伝子型を決定することにより、被験体の癌の危険性および癌治療に対する応答性を決定するための方法ならびにキットを提供する。本発明の他の局面は、以下に説明されるか、または本開示の観点から当業者にとって明らかなものとなる。
【００１３】
この開示にわたって、様々な出版物、特許および公開された特許明細書を、引用表示により援用する。これら出版物、特許および公開された特許明細書の開示を、本発明の属する分野の状態をより完全に説明するために、本明細書により、参考として本開示へと援用する。
【００１４】
本発明の実施は、特に記載がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学（これらは当該分野内である）の従来技術を使用する。これらの技術は、文献（例えば、以下の出版物）により完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編集（１９８７））；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＰＣＲ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））；ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ  Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編集（１９９５））；ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ編集（１９８８））；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集（１９８７））；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集（１９８４））；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４））；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４））；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  （１９８４）；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集（１９８７）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７））；ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、編集（１９８６））；ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８６））を参照のこと。
【００１５】
（定義）
用語「対立遺伝子」を、本明細書中「対立遺伝子の変異体」と交換可能に使用し、遺伝子またはその一部の代替的な形態をいう。対立遺伝子は、相同な染色体上の同一の遺伝子座または位置を占有する。被験体が、一つの遺伝子の二つの同一な対立遺伝子を有する場合、被験体は、その遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合体であるといえる。被験体が、一つの遺伝子の二つの異なる対立遺伝子を有する場合、被験体は、その遺伝子についてヘテロ接合体であるといえる。特定遺伝子の対立遺伝子は、単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドにおいて互いに異なり得、ならびにヌクレオチドの置換、除去、および挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子はまた、変異を含む遺伝子の形態であり得る。
【００１６】
用語「目的遺伝子の多型領域の対立遺伝子改変体」は、他の個体における遺伝子領域内において見出される複数のヌクレオチド配列のうちの一つを有する目的遺伝子領域をいう。
【００１７】
「細胞」、「宿主細胞」、または「組換え宿主細胞」は、本明細書中において交換可能に使用される用語である。このような用語は、特定の被験体の細胞をいうだけではなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫のことをいうものであると理解される。特定の改変が、変異または環境的影響のいずれかに起因して後継世代に生じ得るため、このような子孫は、実際は親細胞とは同一ではあり得ないが、本明細書中において使用される場合、この用語の範囲内に含まれる。
【００１８】
表現「ポリヌクレオチドの増幅」は、例えば、ＰＣＲ、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）およびＱ−βレプリカーゼの使用の基づく増幅方法のような方法を含む。これらの方法は、当該分野において周知であり、および広く実施されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＩｎｎｉｓら、１９９０（ＰＣＲについて）；およびＷｕ，Ｄ．Ｙ．ら（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０−５６９（ＬＣＲについて）を参照のこと。一般的に、ＰＣＲ手順は、（ｉ）ＤＮＡサンプル（またはライブラリー）内の特定遺伝子に対するプライマーの配列−特異的なハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを使用する、アニーリング、伸長、および変性の複数回のラウンドを含む続く増幅、ならびに（ｉｉｉ）正確なサイズのバンドについてＰＣＲ産物をスクリーニングする、ことを包含する遺伝子増幅の方法である。使用するプライマーは、十分な長さおよび重合の開始点を提供するための適切な配列のオリゴヌクレオチドである（すなわち、各プライマーを、増幅するゲノム部位の各鎖に対して相補的になるように特別に設計する）。
【００１９】
ＰＣＲを実施するための薬剤およびハードウェアは、市販されている。特定の遺伝子領域から配列を増幅するために有用なプライマーは好ましくは、標的領域内または、その隣接領域内の配列に対して相補的であり、および特異的にハイブリダイズするものである。増幅により生じた核酸配列を、直接的に配列決定し得る。あるいは、増幅配列を、シークエンス分析をする前にクローン化し得る。酵素的に増幅させたゲノムセグメントのダイレクトクローニングおよびダイレクトシークエンス分析のための方法は、当該分野において公知である。
【００２０】
ポリヌクレオチドに適用する場合、用語「コードする（ｅｎｃｏｄｅ）」は、ポリヌクレオチドをいい、その本来の状態においてまたは、当業者に周知の方法により操作された際に、ポリペプチドおよび／もしくはそのフラグメントのｍＲＮＡを産生するため転写ならびに／または翻訳され得る場合、ポリヌクレオチドは、そのポリペプチドを「コードする」という。そのアンチセンス鎖は、このような核酸の相補体であり、コードされる配列は、そこから推定され得る。
【００２１】
用語「遺伝子型」は、細胞全体または特定の遺伝子の特定の対立遺伝子の組成をいい、ここで用語「表現型」は、特定の遺伝子型の検出可能な外面上の現れをいう。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」または「組換え遺伝子」は、オープンリーディングフレームを含み、ならびに少なくとも一つのエクソン配列および（任意に）イントロン配列を含む核酸分子をいう。用語「イントロン」は、ｍＲＮＡ成熟の間にスプライシングにより取除かれる所定の遺伝子内にあるＤＮＡ配列をいう。
【００２３】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、二つのペプチド間もしくは二つの核酸分子間の配列の類似性をいう。相同性を、比較の目的のために整列（ａｌｉｇｎｅｄ）させ得る各配列内の位置を比較することにより決定し得る。比較する配列内の位置が、同一の塩基またはアミノ酸により占められている場合、その時、その分子は、その位置において相同なものである。配列間の相同性の程度は、配列により共有される一致する位置または相同な位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同的な」配列は、本発明の配列のうちの一つと、４０％未満の相同性を共有するが、しかし好ましくは２５％未満の相同性を共有する。
【００２４】
用語「核酸のホモログ」は、その核酸または、その相補体のヌクレオチド配列と特定の程度の相同性をもつヌクレオチド配列を有する核酸をいう。二重鎖核酸のホモログは、特定の程度の相同性を有するヌクレオチド配列をもつ核酸またはその相補体を伴うものを含むことが意図される。一つの局面において、核酸のホモログは、核酸またはその相補体に対してハイブリダイズすることが可能である。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「相互作用」は、分子間の検出可能な相互作用（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイの使用により検出され得るような）を含むことを意味する。用語相互作用はまた、分子間の「結合」性の相互作用を含むことを意味する。相互作用は、自然状態では、例えば、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、タンパク質−小分子または小分子−核酸であり得る。
【００２６】
核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関して本明細書中で使用される場合、用語「単離」は、それぞれ天然の高分子供給源において存在する他のＤＮＡもしくはＲＮＡから、分離した分子をいう。本明細書中で使用される場合、用語単離はまた、実質的に、細胞性物質、ウィルス性物質、または組み換えＤＮＡ技術により生成される場合は培養培地を、または、化学合成される場合は化学前駆体もしくは他の化学物質を含まない核酸またはペプチドをいう。さらに、「単離した核酸」は、フラグメントとして自然に発生するものではなく、および自然状態において見出され得るものではない核酸フラグメントを含むことを意味する。用語「単離」はまた、他の細胞性タンパク質から単離したポリペプチドをいうために本明細書中にて使用され、ならびに精製したポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両者を含むことを意味する。
【００２７】
用語「不一致」は、１００％相同ではない、ハイブリダイズした核酸二本鎖をいう。全相同性の欠如は、除去、挿入、逆位、置換またはフレームシフトの変異に起因し得る。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ））のようなポリヌクレオチドをいう。この用語はまた、ヌクレオチドの類似物からなるＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの等価物、誘導体、変異体および類似体のような、ならびに記載した実施形態に適用可能であるような、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解すべきである。デオキシリボ核酸は、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを含む。明確化する目的のため、本明細書において核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る）のヌクレオチドをいう場合は、用語「アデノシン」、「シチジン」、「グアノシン」および「チミジン」を使用する。核酸がＲＮＡである場合、ウラシル塩基を有するヌクレオチドは、ウリジンであるということが理解される。
【００２９】
用語「オリゴヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」、またはそれらの「一部」もしくは「セグメント」は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子に同一な部分もしくは関連する部分を同定または増幅するために、ＰＣＲもしくは様々なハイブリダイゼーション手順において使用するのに十分に長いポリヌクレオチド残基のストレッチをいう。本発明のポリヌクレオチド組成物は、当業者により容易に理解されるように、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、ならびに混合型ポリマー（センス鎖およびアンチセンス鎖の両者）を含み、そして化学的にもしくは生化学的に改変され得、または非天然のヌクレオチド塩基もしくは誘導されたヌクレオチド塩基を含み得る。このような改変としては、例えば、標識、メチル化、アナログによる一以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、無電荷結合（例えば、メチルホスホン酸塩、リン酸トリエステル、亜リン酸アミダイト、カルバミン酸塩など）、荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキレーター（ａｌｋｙｌａｔｏｒ）、および改変結合（例えば、αアノマー核酸など））が挙げられる。また、含まれるものとしては、水素結合および他の化学的な相互作用を介して所定の配列に対して結合するポリヌクレオチドの能力を模倣する合成分子である。このような分子は、当該分野において公知であり、これらとしては例えば、分子骨格内のリン酸結合のペプチド結合への置換が挙げられる。
【００３０】
用語「配列番号：ｘに示されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列」は、配列番号：ｘを有する核酸鎖の相補鎖のヌクレオチド配列をいう。用語「相補鎖」は、本明細書中において用語「相補体」と交換可能に使用される。核酸鎖の相補体は、コード鎖の相補体または非コード鎖の相補体であり得る。２本鎖核酸をいう場合、配列番号：ｘを有する核酸の相補体は、配列番号：ｘを有する鎖の相補鎖または、配列番号：ｘの相補鎖のヌクレオチド配列を有する任意の核酸をいう。配列番号：ｘのヌクレオチド配列を有する１本鎖核酸をいう場合、この核酸の相補体は、配列番号：ｘのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸である。ヌクレオチド配列およびその相補的な配列は常に、５’から３’の方向に従う。用語「相補体」および「逆相補体」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００３１】
本発明の「非ヒト動物」は、例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、ハ虫類などのような哺乳動物を含み得る。好ましい非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含むげっ歯類のファミリー（最も好ましくはマウス）から選択されるが、Ｘｅｎｏｐｕｓ属のメンバーのようなトランスジェニック両生類、およびトランスジェニックニワトリがまた、例えば、胚形成および組織形成に影響を及ぼし得る因子を理解および同定するために重要な道具を提供し得る。用語「キメラ動物」は、動物の複数ではあるが全てではない細胞内で、外来性の配列が見出される、または外来性の配列が発現される動物をいうために本明細書中で使用される。用語「組織−特異的キメラ動物」は、いくつかの組織において外来性の配列が、存在するおよび／または発現される、もしくは破壊されるが、他の組織ではそうでないことを示す。
【００３２】
用語「多型」は、一以上の形態の遺伝子またはその一部の共存をいう。少なくとも二以上の異なる形態（つまり、二つの異なるヌクレオチド配列）が存在する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型領域」と称される。多型領域は、単一のヌクレオチドであり得、その同一性は、異なる対立遺伝子において異なる。
【００３３】
「多型遺伝子」は、少なくとも一つの多型領域を有する遺伝子をいう。
【００３４】
本発明は、治療レジメンを選択するための方法、または特定の治療レジメンが、癌を処置する可能性が高いのか、もしくはその患者が利用し得る他の化学療法よりも患者に適切な化学療法であるのかを決定するための方法を提供する。一般的に、治療は、一以上の以下の処置結果：初期治療後の癌再発の減少もしくは遅延；メディアン生存時間の増加または転移の減少、を提供する場合に、癌を「処置」すると考えられる。方法は特に、どの患者が、フルオロピリミジン薬物（ｆｌｕｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｄｒｕｇ）（例えば、５−ＦＵ）またはプラチナ薬物（例えば、オキサリプラチンあるいはシスプラチン）の投与を含む化学療法レジメンに対して好ましい処置結果を示すかもしくは、経験するかを決定するのに適している。一つの実施形態において、化学療法レジメンはさらに、放射線療法を含む。
【００３５】
この方法は、患者から適切な細胞または組織サンプルを単離する工程、および出願人により癌の処置結果と関連付けられるゲノムの多型または遺伝子型をスクリーニングする工程を包含する。一つの局面において、癌は、フルロピリミジンまたはプラチナ薬物よりなる群から選択される化学療法薬物の投与により処置され得る癌である。別の局面において、癌は、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌および肺癌よりなる群から選択される。
【００３６】
一つの局面において、多型は、遺伝子の「サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）」領域に存在し、別の局面においては、多型は、プロモーター領域内であり、およびまた別の局面においては、多型は、３’非翻訳領域内である。またさらなる実施形態においては、多型はｍＲＮＡレベルでの発現を増加する。
【００３７】
一つの実施形態において、適切な組織サンプルまたは細胞サンプルは、癌生検または癌切除の部位に隣接する正常組織を含む。例えば、直腸癌の腫瘍除去部位に隣接する正常な直腸組織を選択する。本明細書中に使用されるように、「隣接する」は、約０．５ｍｍ、または約１．０ｍｍ、または約１．５ｍｍ、または約２．０ｍｍまたは約２．５ｍｍ、または約３．０ｍｍ、または３．５ｍｍ、または４．０ｍｍあるいは約４．５ｍｍあるいは約５．０ｍｍあるいは、ただ癌または腫瘍と同一タイプの正常組織を限定する任意の距離を、意味する。
【００３８】
別の実施形態において、組織は、癌組織自体である。また、さらなる実施形態においては、例えば多型が、遺伝的なものである場合、目的遺伝子を保有すると予期される任意の細胞（例えば、患者から単離した末梢血リンパ球）が、適切な細胞サンプルまたは組織サンプルである。
【００３９】
予測的な結果であり得る遺伝的な多型は、チミジル酸合成酵素遺伝子、除去修復相補性群遺伝子（ＥＲＣＣ１）、ＶＥＧＦ、ＥＲＣ２遺伝子、ＸＲＣＣ−１遺伝子、ヒトグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１遺伝子、上皮増殖因子レセプター遺伝子、マトリックスメタロプロテイナーゼ遺伝子（−１、および−３）、インターロイキン８（ＩＬ−８）遺伝子、Ｄ−ピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）およびＣＸＣケモカインよりなる群から選択される遺伝子内に生じる多型を含むが、これらに限定はされない。
【００４０】
本発明はまた、患者における癌化学療法に関連し誘導された神経毒性を化学的に減少させるための方法を提供し、この方法は有効量のＣＯＸ−２インヒビターを患者に対して投与する工程、または、必要とする患者に対してＣＯＸ−２インヒビターの等価物を投与する工程を包含する。一つの実施形態において、神経毒性は、オキサリプラチン、シスプラチン、またはフルロピリミジン（例えば、５−ＦＵまたはＸｅｌｏｄａ）を含む化学療法の投与の結果である。
【００４１】
前記腫瘍の外科的除去の後、ヒト患者が、癌再発を被る可能性が高いものであるかを決定するための方法は、前記の腫瘍に隣接する正常な組織から単離した細胞またはサンプル内の、ＴＳ、Ｄ−ピリミジン脱水素酵素（ＤＰＤ）、ＥＲＣＣ１およびＶＥＧＦよりなる群から選択される遺伝子の発現レベルを決定する工程、ならびに該発現レベルと正常レベルとを相関づける工程であって、ここで、前記遺伝子の過剰発現は、癌再発の危険にある患者を同定するための指標となる、工程を包含する。一つの局面において、腫瘍は、直腸癌に関連する。
【００４２】
本明細書中に記載する発明は、目的位置の遺伝子に存在する対立遺伝子を決定および同定するための方法ならびに組成物に関連する。この情報は、疾患の進行の診断および予測ならびに処置の選択肢の間から最も効果的な処置を選択するのに有用である。プローブが、サンプルの遺伝子型を直接的に決定するために使用され得、または、増幅と同時にもしくは増幅後に使用され得る。用語「プローブ」は、天然に存在する、または組換えの一本鎖核酸もしくは組換え二本鎖核酸、あるいは化学的に合成した核酸を含む。これらは、ニックトランスレーション法、Ｋｌｅｎｏｗフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応法、ＰＣＲ法または、当該分野で公知である他の方法により標識され得る。本発明のプローブは、その調製法および／または標識法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前出に記載される。プローブは、本発明の多型領域を含む核酸に対して選択的にハイブリダイズするために適切な任意の長さのポリヌクレオチドであり得る。使用するプローブの長さは、一部は、使用するアッセイの性質および使用するハイブリダイゼーションの条件に依存する。
【００４３】
本発明の一つの実施形態において、プローブは、いわゆる「分子ビーコン（ｂｅａｃｏｎ）」を形成するために二つの蛍光色素分子を用いて標識される（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．および、Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−８）。色素間の分子間蛍光消沈の軽減を介して相補的な核酸配列に対して結合する、このような分子ビーコンシグナルは、オリゴヌクレオチドプローブ上の反対側の末端に結合する。遺伝子型を特定するための分子ビーコンの使用は、複数ビーコンの同時使用を有するものとして（Ｍａｒｒａｓ，Ｓ．Ａ．（１９９９）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１４：１５１−６）、記載されている（Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓ，Ｌ．Ｇ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１２２８−９）。二つが互いに近接して保持される際に（例えば、分子ビーコン内）、または約１ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドの末端に結合する際に、フルオロフォアの蛍光を実質的に阻害するために十分なスペクトル重複を有する場合には、消光分子は、特定のフルオロフォアにより有用である。
【００４４】
標識したプローブはまた、多型増幅と組み合わせて使用され得る（Ｈｏｌｌａｎｄら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７２７６−７２８０）。Ｇｅｌｆａｎｄによる、米国特許第５，２１０，０１５号は、ＰＣＲの間の増幅産物のリアルタイムの測定を提供するための、蛍光ベースのアプローチを記載する。このようなアプローチは、既存の二本鎖ＤＮＡの量を示すために、挿入色素（例えば、エチジウムブロマイド）を使用するか、または、蛍光色素−消光剤ペアを含むプローブを使用する（「Ｔａｑ−Ｍａｎ」アプローチと称される）（ここでプローブは、既存の二本鎖ＤＮＡの量と比例する濃度である蛍光分子を放出するために、増幅中に切断する）か、のいずれかである。増幅の間、プローブは、消光剤分子から分離される蛍光分子を生じるように標的配列にハイブリダイズした際、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により消化され、それによって、レポーター分子から蛍光を生じさせる。Ｔａｑ−Ｍａｎアプローチは、多型を含む標的ポリヌクレオチドの領域を特異的にアニーリングするレポーター分子−消光剤分子ペアを含むプローブを使用する。
【００４５】
プローブは、「ジーンチップ」として使用するために表面に固定され得る。このようなジーンチップは、当業者に公知である多数の技術により、遺伝子改変体を検出するために使用され得る。一つの技術において、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアプローチ（例えば、米国特許第６，０２５，１３６号、および同第６，０１８，０４１号に概略されるもの）による配列決定によりＤＮＡ配列を決定するためジーンチップ上にアレイされる。本発明のプローブはまた、遺伝子配列の蛍光を検出するために使用され得る。このような技術は例えば、米国特許第５，９６８，７４０号および同第５，８５８，６５９号に記載される。プローブはまた、核酸配列の電気化学検出のため電極表面に固定され得る（例えば、Ｋａｙｙｅｍら、米国特許第５，９５２，１７２号およびＫｅｌｌｅｙ，Ｓ．Ｏ．ら（１９９９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７：  ４８３０−４８３７により記載）。
【００４６】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、遺伝子産物をいう場合に、本明細書中において交換可能に使用される。
【００４７】
用語「組換えタンパク質」は、ＤＮＡ組換え技術により産生されるポリペプチドをいい、ここで一般的に、ポリペプチドをコードするＤＮＡが、適切な発現ベクターに挿入され、次に、このベクターが異種タンパク質を産生させるために、宿主細胞を形質転換させるのに使用される。
【００４８】
本明細書中に使用されるように、用語「処置する」は、少なくとも状態または疾患の一つの症状を治療するおよび寛解させることを含むことを意図する。例えば、癌の場合において、処置は、悪液質の減少を含む。処置の証明は、臨床的にまたは亜臨床的であり得る。
【００４９】
本明細書中に使用される場合、用語「ベクター」は、結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。好ましいベクターの一つのタイプは、エピソーム、つまり、染色体外複製を可能とする核酸である。好ましいベクターは、自律的な複製および／または結合した核酸の発現を可能とするベクターである。作動可能に結合した遺伝子の発現を導き得るベクターを、「発現ベクター」として本明細書中で称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術における発現ベクターの有用性は、多くの場合「プラスミド」の形態にある。プラスミドは一般に、そのベクターの形態では、染色体に結合しない環状二本鎖ＤＮＡのループをいう。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、交換可能に使用される。しかし、本発明は、同等の機能を果たし、かつ以下の本明細書の記載により公知となる、発現ベクターのこのような他の形態を含むことを意図する。
【００５０】
用語「野生型対立遺伝子」は、被験体内の二つのコピーの提示が、野生型の表現形を生じる場合、その遺伝子の対立遺伝子と呼ぶ。特定遺伝子の複数の異なる野生型対立遺伝子が存在し得る。これは、遺伝子内における特定のヌクレオチドの変化が、ヌクレオチドの変化を伴う遺伝子の二つのコピーを有する被験体の表現形に影響を与え得ないからである。
【００５１】
（核酸）
一つの局面において、遺伝子の対立遺伝子改変体またはその一部の核酸配列は、プローブまたはプライマーの基礎であり得る（例えば、多型領域の対立遺伝子の改変体の同一性を決定するための方法において）。そのため、これらは、被験体が結腸直腸癌を発症する危険性があるのかどうかを決定するために本発明の方法において使用され得る。
【００５２】
本発明の方法は、脊椎動物から単離した核酸を使用し得る。一つの局面において、脊椎動物の核酸は、哺乳動物の核酸である。さらなる局面においては、本発明の方法において使用される核酸は、ヒトの核酸である。
【００５３】
本発明の方法において使用するためのプライマーは、目的の領域に隣接する核酸配列（例えば、ＴＳ遺伝子の５’−非翻訳領域）または目的の領域をカバーする核酸配列および伸長される核酸配列に対してハイブリダイズする核酸である。プライマーは、検出方法において単独で使用され得、または、プライマーは、検出方法において、少なくとも一つの他のプライマーもしくはプローブと共に使用され得る。プライマーはまた、核酸の少なくとも一部を増幅するために使用され得る。本発明の方法において使用するためのプローブは、目的の領域に対してハイブリダイズする核酸、およびさらに伸長されることのない核酸である。例えば、プローブは、目的の遺伝子の多型領域に対してハイブリダイズする核酸であり、そして被験体のＤＮＡに対するハイブリダイズにより、またはハイブリダイズを欠くことにより、目的遺伝子の多型領域対立遺伝子改変体の同一性を示す。
【００５４】
一つの実施形態において、プライマーは、目的遺伝子の連続的な約６、または代替的に８、または代替的に１０、または代替的に１２、または代替的に２５、または代替的に３０、または代替的に４０、または代替的に５０、または代替的に７５のヌクレオチドに対し、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する領域を含む、ヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
プライマーは、増幅したＤＮＡの使用に依存して、互いに近接して位置するか、または、さらに離れて位置するヌクレオチド配列に対して相補的なものであり得る。例えば、プライマーは、これらが、少なくとも約１０ヌクレオチドまたは数キロベースほどのＤＮＡフラグメントを増幅するように選択され得る。好ましくは、本発明のプライマーは、約１５０〜約３５０ヌクレオチド離れて位置するヌクレオチド配列に対して選択的にハイブリダイズする。
【００５６】
核酸の少なくとも一部を増幅するために、好ましくは、フォワードプライマー（つまり５’プライマー）およびリバースプライマー（つまり３’プライマー）が使用される。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、二本鎖核酸の相補鎖に対しハイブリダイズし、その結果各プライマーからの伸長により、二本鎖核酸が増幅される。
【００５７】
本発明のまた他の好ましいプライマーは、目的遺伝子の多型領域の対立遺伝子の改変体に対して選択的にハイブリダイズすることが可能である核酸である。そのため、このようなプライマーは、目的遺伝子に対してハイブリダイズすることが可能であるヌクレオチド配列を有する限り、目的配列の遺伝子に対して特異的であり得る。
【００５８】
プローブまたはプライマーはさらに、それらに結合する、検出可能である標識を含み得、例えば、標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素の補助因子の間から選択される。
【００５９】
さらに、プローブまたはプライマーとして使用される単離した核酸は、より安定させるために改変され得る。改変された例示的な核酸分子としては、ＤＮＡのホスホラミデート、ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）およびメチルホスホネートアナログが挙げられる（米国特許第５，１７６，９９６号；同第５，２６４，５６４号；および同第５，２５６，７７５号をまた参照のこと）。
【００６０】
本発明の方法において使用される核酸はまた、例えば、分子の安定性を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸の骨格において改変され得る。核酸（例えば、プローブもしくはプライマー）は、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞のレセプターを標的化するためのもの）、または細胞膜を通過する輸送を容易にする薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；およびＰＣＴ公開番号第ＷＯ８８／０９８１０号，１９８８年１２月１５日公開を参照のこと）、ハイブリダイゼーショントリガー切断薬剤（例えば、Ｋｒｏｌら、（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６参照のこと）または、挿入剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９参照のこと）のような他の付加した群を含み得る。この目的のために、本発明の方法において使用される核酸は、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショントリガー架橋剤、輸送薬剤、ハイブリダイゼーショントリガー切断薬剤など）と結合体化させ得る。
【００６１】
本発明の方法において使用される単離した核酸はまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースが挙げられるがこれらに限定はされない群から選択される少なくとも一つの改変した糖部分を含み得るか、またはあるいは、ホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、ホスホラミドチオネート、ホスホラミデート、ホスホジアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホムアセタールあるいはそのアナログからなる群から選択される、少なくとも一つの改変されたリン酸骨格を含み得る。
【００６２】
本発明の方法において使用される核酸またはそのフラグメントを、当該分野で周知の方法、および例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前出に記載される方法に従って調整し得る。例えば、別個のＤＮＡフラグメントを、制限酵素を使用して、調製し、そしてクローン化し得る。あるいは、別個のフラグメントを、製造者の条件の下、適切な配列を有するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して調製し得る。
【００６３】
オリゴヌクレオチドを、当該分野で公知である標準的な方法により（例えば、自動ＤＮＡ合成機（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販される）の使用により）合成し得る。例えば、ホスホロチオネートオリゴヌクレオチドを、Ｓｔｅｉｎら、（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９の方法により合成し得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを、制御されたポアガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１）などの使用により調製し得る。
【００６４】
（予測的な医薬およびゲノム薬理学）
本発明はさらに、目的遺伝子の多型領域の同一性決定に、少なくとも一部基づく予測的な医薬を特徴とする。
【００６５】
例えば、本明細書中に記載される診断アッセイを使用して得られる情報は、被験体が、所定のタイプの癌処置に応答するのかを決定するのに有用である。予後の情報に基づいて、医師は、個体中の癌処置に有用な、レジメン（例えば、食事もしくは運動）または治療的プロトコルを推奨し得る。
【００６６】
さらに、個体の特定対立遺伝子の同一性の知見（遺伝子プロファイル）は、個体の遺伝子プロファイルに対する、特定疾患の治療法のカスタマイズを可能とする（「ゲノム薬理学」の目標）。例えば、個体の遺伝子プロファイルは、医師が：１）疾患もしくは状態の分子基盤に対処する薬剤をより効果的に処方すること；および２）特定の薬剤の適切な投薬量をより良く決定すること、を可能にし得る。次いで、患者個体の発現パターンを、疾患の発現プロファイルと比較して、患者に投与するため適切な薬剤および用量を決定し得る。
【００６７】
標的集団が正常なもしくは疾患の遺伝子プロファイルに基づく最高の臨床効果を示すことが予測される能力は、：１）失望的な市場結果を有する市販される薬剤の再配置；２）安全性もしくは効率性の制限の結果により臨床開発が中断された薬物候補の回収（この制限は、患者のサブグループ特異的である）；および３）薬物候補、およびより最適な薬物標識の、促進された開発ならびに低コストの開発を可能にし得る。
【００６８】
点変異の検出は、当該分野において公知の技術を使用して、特定の対立遺伝子の分子クローニングおよび続く対立遺伝子の配列決定により達成され得る。あるいは、遺伝子配列を、ＰＣＲを使用して、癌組織由来のゲノムＤＮＡ調整物から直接的に増幅し得、そして配列組成物を、増幅産物から決定する。より完全に以下に記載されるように、多数の方法を、例えば目的遺伝子のような所定の遺伝子座での変異について、被験体のＤＮＡを分析するために、利用可能である。
【００６９】
検出方法は、多型部位に重り、そして多型領域周辺の約５、あるいは１０、あるいは２０、あるいは２５、あるいは３０ヌクレオチドを有するプローブを使用する、対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションである。本発明の別の実施形態において、対立遺伝子改変体に対して特異的にハイブリダイズし得るいくつかのプローブを、固相支持体（例えば、「チップ」）に取り付ける。オリゴヌクレオチドを、リソグラフィーを含む、種々のプロセスにより固体支持体に結合し得る。例えば、チップは、２５０，０００オリゴヌクレオチドを支持し得る（ＧｅｎｅＣｈｉｐ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。オリゴヌクレオチドを含むこれらチップを使用して変異検出分析（また、「ＤＮＡプローブアレイ」と称される）は、例えば、Ｃｒｏｎｉｎら、（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ７：２４４に記載される。
【００７０】
他の検出方法において、対立遺伝子改変体を同定する前に、目的遺伝子の少なくとも一部をはじめに増幅する必要がある。増幅を、当該分野において公知の方法に従って、例えば、ＰＣＲおよび／またはＬＣＲにより、実施し得る。一つの実施形態において、細胞のゲノムＤＮＡを、二つのＰＣＲプライマーに曝し、そして必要とされる量の増幅ＤＮＡが十分に産生されるように複数サイクルの増幅をする。
【００７１】
代替的な増幅方法としては、自己持続的配列複製（ｓｅｌｆ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、または任意の他の核酸増幅方法が挙げられ、当業者に公知である技術を使用する増幅分子の検出が続く。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少数存在する場合に、これら分子の検出に有用である。
【００７２】
一つの実施形態において、当該分野で公知の任意の種々の配列決定反応は、野生型（コントロール）配列に対応するサンプル配列の配列を比較することにより、目的遺伝子の少なくとも一部分の直接的な配列決定および対立遺伝子改変体（例えば、変異）の検出のために使用し得る。例示的な配列決定反応としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら、（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７４：５４６３）により開発された技術に基づく配列決定反応が挙げられる。被験体のアッセイ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９５）１９：４４８）を実施する場合、任意の種々の自動配列決定手順を、利用し得ることがまた、企図され、この手順としては、質量分析法（例えば、米国特許第５，５４７，８３５号および国際特許出願公開番号ＷＯ９４／１６１０１、Ｈ．Ｋｏｓｔｅｒによる表題ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；米国特許第５，５４７，８３５号および国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２１８２２、Ｈ．Ｋｏｓｔｅｒによる表題「ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｖｉａ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ」；米国特許第５，６０５，７９８号および国際特許出願公開番号第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３６５１号、Ｈ．Ｋｏｓｔｅｒによる表題「ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら、（１９９３）Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏ．３８：１４７−１５９）による配列決定が挙げられる。特定の実施形態について、１，２、または３核酸塩基のみの出現が、配列決定反応において決定されることを必要とされることが当業者に明白である。例えば、Ａ−トラックなど（例えば、一つのヌクレオチドのみが、検出される）を、実施し得る。
【００７３】
さらに他の配列決定方法が、例えば米国特許第５，５８０，７３２号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  Ｏｆ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ａ  Ｍｉｘｅｄ  ＤＮＡ−Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｒｏｂｅ」および、米国特許第５，５７１，６７６号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」に、開示される。
【００７４】
いくつかの場合において、被験体に由来するＤＮＡにおける特定の対立遺伝子の存在は、制限酵素分析法によって示され得る。例えば、特定のヌクレオチド多型は、別の対立遺伝子改変体のヌクレオチド配列を欠く制限部位を含む、ヌクレオチド配列を生じ得る。
【００７５】
さらなる実施形態において、切断薬剤（例えば、ヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミンまたは無水オスミン酸およびピペリジンを用いるもの）からの保護を、ＲＮＡ／ＲＮＡ  ＤＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出するために使用され得る（例えば、Ｍｙｅｒｓら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２を参照のこと）。一般的に、「ミスマッチ切断（ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｃｌｅａｖａｇｅ）」の技術は、目的遺伝子の対立遺伝子改変体のヌクレオチド配列を含むコントロール核酸（必要に応じて標識される）（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）とサンプル核酸（例えば、組織サンプルから得られた、ＲＮＡまたはＤＮＡ）とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二重鎖を提供することにより開始する。二本鎖の二重鎖を、二重鎖（例えば、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対のミスマッチに基づいて形成された二重鎖）の一本鎖領域を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼを用いて処理し、ミスマッチ領域を酵素的に消化する。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかを、ミスマッチ領域を消化するためにヒドロキシルアミンまたは無水オスミン酸ならびにピペリジンを用いて処理し得る。ミスマッチ領域を消化した後、得られた物質を次いで、コントロール核酸およびサンプル核酸が、同一のヌクレオチド配列を有するかどうか、またはどのヌクレオチドが異なるかを決定するために変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら、（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。別の実施形態においては、コントロール核酸またはサンプル核酸を、検出のために標識する。  
【００７６】
他の実施形態において、電気泳動の移動度の変化を、特定の対立遺伝子改変体を同定するために使用する。例えば、一本鎖のコンホメーション多型（ＳＳＣＰ）を、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用し得る（Ｏｒｉｔａら、（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：２７６６，またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ  ９：７３−７９を参照のこと）。サンプル核酸およびコントロール核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生可能である。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従い変化し、電気泳動の移動度において生じた変化は、単一塩基の変化でさえ検出可能である。ＤＮＡフラグメントを、標識プローブを用いて標識または検出し得る。アッセイの感度は、ＲＮＡ（むしろＤＮＡよりも）を使用することにより高められ得、その二次構造は、配列における変化に対してより感度が高い。別の好ましい実施形態において、対象の方法は、電気泳動の移動度の変化に基づいて、二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離するために、ヘテロ二重鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎら、（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５）。
【００７７】
なお別の実施形態において、対立遺伝子改変体の同一性は、勾配した変性剤を含むポリアクリルアミドゲルにおいて、多型領域を含む核酸の移動度を分析する（変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用することによってアッセイされる）ことにより得られる（Ｍｙｅｒｓら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）。ＤＧＧＥを、分析の方法として使用する場合、ＤＮＡを、完全に変性しないことを保証するために、例えば、ＰＣＲにより高融解ＧＣリッチＤＮＡの約４０ｂｐのＧＣクランプを付加することによって改変する。さらなる実施形態において、温度勾配を、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤の勾配に代えて使用する（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１２７５）。
【００７８】
二つの核酸の間の少なくとも一つのヌクレオチドの差異を検出するための技術の例としては、選択的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、選択的な増幅、または選択的なプライマー伸長が挙げられるが、これに限定はされない。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを、公知の多型ヌクレオチドが、中心に位置するように調製し得（対立遺伝子特異的プローブ）、そして次いで、完全一致を見つけた場合にのみハイブリダイゼーションが可能である条件の下、標的ＤＮＡに対してハイブリダイズさせ得る（Ｓａｉｋｉら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：６２３０；およびＷａｌｌａｃｅら、（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３５４３）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術は、目的遺伝子の多型領域におけるヌクレオチド変化の検出のために使用され得る。例えば、特定の対立遺伝子改変体のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイズ膜に結合させ、そして次いでこの膜を、標識したサンプル核酸を用いてハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションシグナルの分析は次いで、サンプル核酸のヌクレオチドの同一性を明らかにする。
【００７９】
あるいは、選択的なＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と共に使用され得る。特異的な増幅のためプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に目的の対立遺伝子改変体を保有し得（その結果異なる増幅は、ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、または適切な条件の下、ミスマッチが、ポリメラーゼの伸長を防止し得るか、もしくは減少させ得る、一つのプライマーの３’終末端において、目的の対立遺伝子改変体を保有し得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８；Ｎｅｗｔｏｎら、（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５０３）。この技術はまた、Ｐｒｏｂｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂａｓｅ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（プローブオリゴベースの伸長）であるため、「ＰＲＯＢＥ」と称される。さらに、切断ベースの検出を行うため変異の領域内に、新しい制限部位を導入することが望ましくあり得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。
【００８０】
別の実施形態において、対立遺伝子改変体の同定を、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を使用して、例えば、米国特許第４，９９８，６１７号、およびＬａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０  １９８８）に記載されるように実施する。ＯＬＡプロトコルは、一本鎖の標的の隣接する配列に対してハイブリダイズし得るように設計される二つのオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドの一つを、分離マーカーに対して結合させ（例えば、ビオチン化）、そして他方を、検出可能に標識する。正確に相補的な配列が、標的分子において見出される場合、オリゴヌクレオチドは、その末端に隣接するようにハイブリダイズし、そしてライゲーション基質を作製する。次いでライゲーションは、標識したオリゴヌクレオチドが、アビジンまたは別のビオチンリガンドを使用して元の状態に戻ることを可能とする。Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．らは、ＰＣＲおよびＯＬＡの特質と組み合わせる、核酸検出アッセイを記載した（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８７：８９２３−８９２７）。この方法においては、ＰＣＲを、標的ＤＮＡの指数関数的な増幅を達成するために使用し、この標的をその後ＯＬＡを使用して検出する。
【００８１】
このＯＬＡ方法に基づく複数の技術は開発され、そして、目的遺伝子の多型領域の特異的な対立遺伝子改変体を検出するために使用され得る。例えば、米国特許第５，５９３，８２６号は、ホスホラミデート結合を有する結合体を形成するための３’−アミノ基および５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを使用するＯＬＡを開示する。Ｔｏｂｅら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：３７２８に記載されるＯＬＡの別のバリエーションにおいては、ＰＣＲと組み合わせるＯＬＡは、単一のマイクロタイターウェル内の二つの対立遺伝子の分類を可能とする。唯一のハプテン（すなわち、ジゴキシゲニンおよびフルオレセイン）を有する、各対立遺伝子特異的プライマーをマーキングすることにより、各ＯＬＡ反応を、異なる酵素レポーター、アルカリホスファターゼまたは、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて標識されるハプテン特異的抗体を使用することにより検出し得る。この系は、二つの異なる色彩の産生を引き起こす高スループット様式を使用して二つの対立遺伝子の検出を可能にする。
【００８２】
本発明はさらに、目的遺伝子における単一ヌクレオチド多型を検出するための方法を提供する。単一ヌクレオチド多型は、不変の配列領域が隣接した変動部位からなるため、これらの分析は、変動部位に存在する単一ヌクレオチドの同一性の決定を要するに過ぎず、そして各患者の完全な遺伝子配列を決定に必要ではない。複数の方法が、このような単一ヌクレオチド多型の分析を容易にするために開発される。
【００８３】
一つの実施形態において、単一塩基多型は、特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを使用することにより、例えば、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７号）に記載されるように検出し得る。この方法に従って、３’直後の対立遺伝子配列から多型部位に対する相補的なプライマーは、特定の動物またはヒトから得た標的分子に対してハイブリダイズすることが可能である。標的分子上の多型部位が、既存する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に対して相補的なヌクレオチドを含む場合、次いでこの誘導体は、ハイブリダイズしたプライマーの末端に組み込まれる。このような組み込みは、プライマーにエキソヌクレアーゼ耐性を与え、それによって、その検出を可能にする。サンプルのエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同一性が、既知であるので、プライマーがエキソヌクレアーゼ耐性になったという知見は、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応内で使用したヌクレオチド誘導体の多型部位に相補的であることを明らかにする。この方法は、大量な無関係の配列データの決定を必要としないという利点を有する。
【００８４】
本発明の別の実施形態において、溶液ベースの方法を、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために使用する（Ｃｏｈｅｎ，  Ｄ．ら、（仏国特許２，６５０，８４０号；ＰＣＴ  Ａｐｐｌｎ．番号ＷＯ９１／０２０８７））。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法のように、３’直後の対立遺伝子配列から多型部位に対して相補的であるプライマーを使用する。この方法は、標識したジデオキシリボヌクレオシドの誘導体を使用して、この部位のヌクレオチドの同一性を決定し、多型部位のヌクレオチドに対して相補的である場合プライマーの末端に組み込まれる。
【００８５】
Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  ＡｎａｌｙｓｉｓまたはＧＢＡＴＭとして公知の代替方法が、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ら、（ＰＣＴ  Ａｐｐｌｎ．番号９２／１５７１２）により記載される。この方法は、標識されたターミネーターおよび３’配列から多型部位に対して相補的なプライマーの混合物を使用する。組み込まれた標識されたターミネーターは、従って、評価される標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって、決定され、そして、このヌクレオチドに対して相補的である。Ｃｏｈｅｎら、（仏国特許第２，６５０，８４０号；ＰＣＴ  Ａｐｐｌｎ．番号ＷＯ９１／０２０８７）の方法と対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ら（前出）の方法は、プライマーまたは標的分子を、固相に固定化される不均質相のアッセイが好ましい。
【００８６】
近年、ＤＮＡの多型部位をアッセイするためのプライマー誘導ヌクレオチドを組み込むためのいくつかの手順が、記載された（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３６７１；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ら、（１９９０）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ら、（１９９２）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ら、（１９９２）ＧＡＴＡ  ９：１０７−１１２；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ら、（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５）。これらの方法は、多型部位の塩基間の差異を見分けるために、標識したデオキシヌクレオチドの組み込みに全て依存する点で、ＧＢＡＴＭとは異なる。このようなフォーマットにおいて、シグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同一ヌクレオチドの走向内に生じる多型は、走向の長さに対して比例するシグナルを生じ得る（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ら、（１９９３）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９）。
【００８７】
多型領域が、目的遺伝子のコード領域に位置する場合、上記のこれらの方法とはまた他の方法を、対立遺伝子改変体の同一性を決定するために使用し得る。例えば、変異したシグナルペプチドをコードする対立遺伝子改変体の同定は、例えば、免疫組織化学または免疫沈降において変異タンパク質を特異的に認識する抗体を使用することにより、実施され得る。野生型シグナルペプチドタンパク質または変異シグナルペプチド形態のシグナルペプチドタンパク質に対する抗体を、当該分野で公知の方法に従って調製し得る。
【００８８】
目的遺伝子の対立遺伝子改変体によりコードされる野生型ペプチドまたは変異ペプチドに対する抗体はまた、疾患の診断および予後に使用し得る。このような診断方法は、ペプチドの発現レベルの異常性、またはペプチドの構造および／もしくは組織、細胞、あるいは亜細胞のペプチドの位置における異常性を検出するために使用され得る。分析するための組織タイプまたは細胞タイプ由来のタンパク質を、当業者に周知の技術（ウェスタンブロット分析を含むが、限定はされない）を使用することにより容易に検出もしくは単離し得る。ウェスタンブロット分析実施方法の詳細な説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）前出、Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照のこと。本明細書中で使用するタンパク質検出方法および単離方法はまた、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）前出に記載されるようなものであり得る。これは、例えば、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出または蛍光定量検出を伴う、蛍光標識した抗体（下記参照のこと）を使用する免疫蛍光検査技術により達成し得る。本発明において有用な抗体（またはそれらのフラグメント）をさらに、ぺプチドまたはこれらの対立遺伝子改変体のインサイチュ検出のため、免疫蛍光検査法もしくは免疫電子顕微鏡法のように、組織学的に使用し得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的標本を取り出し、そしてそれに対して本発明の標識抗体を適用することにより達成し得る。抗体（またはフラグメント）は好ましくは、標識抗体（またはフラグメント）で生体サンプル上を覆うことにより適用する。このような手順の使用によって、対象のポリペプチドの存在だけではなく、検査する組織内におけるその分布をも決定することが可能である。本発明を使用することにより、当業者は、このようなインサイチュ検出を達成するため、様々な組織学的方法の任意のもの（例えば、染色手順）を、改変し得るということを、容易に認識する。
【００８９】
しばしば固相支持体またはキャリアーを、抗原もしくは抗体に結合し得る支持体として使用する。周知の支持体またはキャリアーとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、ならびに磁鉄鉱が挙げられる。キャリアーの性質は、本発明の目的のため、ある程度可溶性であるか、不溶性のいずれかであり得る。支持体物質は、結合した分子が、抗原または抗体に対して結合し得る限り、実質的にあらゆる可能な構造配置を有し得る。そのため、支持体の立体配置は、球状（ビーズのような）、または円柱状（試験管の内側表面もしくは、ロッドの外部表面のような）のものであり得る。あるいは、その表面は、例えば、シート、テストストリップなどのように平坦であり得るか、または、あるいは、ポリスチレンビーズであり得る。当業者は、結合する抗体または抗原のための多くの他の適切なキャリアを知り、または、慣用的な実験の使用により、同一のものを突き止めることが可能である。
【００９０】
さらに、遺伝子または遺伝子産物または多型変異体における変化を検出する上記の任意の方法は、処置もしくは治療の経過をモニターするために使用され得るということを理解する。
【００９１】
本明細書中に記載する方法は、例えば、被験体が結腸直腸癌を有するか、もしくは、結腸直腸癌発生の危険性にあるのかを決定するために、都合よく使用し得る、本明細書中に記載するプローブ核酸またはプライマー核酸の少なくとも一つを含む、包装済みの診断キット（例えば、以下に記載される）を利用することにより、実施され得る。
【００９２】
上記の診断方法および予測方法に使用するためのサンプル核酸は、被験体の任意の細胞タイプまたは組織から得られ得る。例えば、被験体の体液（例えば、血液）は、公知の技術（例えば、静脈穿刺）により得られ得る。あるいは、核酸テストは、乾燥サンプル（例えば、毛髪または表皮）で実施され得る。胎児核酸サンプルは、母体血液から得られ得る（国際特許出願番号ＷＯ９１／０７６６０、Ｂｉａｎｃｈｉに記載される）。あるいは、羊膜細胞または絨毛膜絨毛を、出生前検査の実施のため得られ得る。
【００９３】
診断手順はまた、核酸精製の必要性がないように、生検または切除から得られた患者組織の組織切片（固定化および／もしくは凍結）について直接的にインサイチュで実施され得る。核酸試薬は、このようなインサイチュ手順のために、プローブおよび／またはプライマーとして使用され得る（例えば、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．（１９９２）「ＰＣＲ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと）。
【００９４】
一つの核酸配列の検出に主に注力する方法に加えて、プロファイルをまた、このような検出スキームにおいて評価し得る。例えば、フィンガープリントプロファイルは、ディファレンシャルディスプレイ法、ノーザン分析法および／またはＲＴ−ＰＣＲ法を利用することにより、生じ得る。
【００９５】
（処置の方法）
本発明はさらに、癌を有する被験体の処置方法を提供する。一つの実施形態において、この方法は、（ａ）対立遺伝子改変体の同一性を決定する工程；および（ｂ）特定の対立遺伝子改変体について治療的な利点を提供する有効量の組成物を被験体に対して投与する工程、を包含する。
【００９６】
（キット）
本明細書中に示すように、本発明は、例えば、目的遺伝子（例えば、ヒトＴＳ遺伝子）内に存在する多型領域の対立遺伝子改変体のタイプを決定するための方法（例えば、診断方法および治療方法）を提供する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、目的遺伝子の多型領域に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブまたはプライマーを使用する。従って、本発明は、これらの方法を実施するためのキットを提供する。
【００９７】
実施形態において、本発明は、被験体が、癌治療また、あるいは様々な処置法の選択肢の内の一つに対して応答するか、否かを決定するためのキットを提供する。このキットは、一以上の上記の組成物および使用説明書を含む。例示としてのみで、本発明はまた、ＴＳ遺伝子の多型領域（すなわち、５’非翻訳領域）に対して特異的な第一および第二のオリゴヌクレオチドを含む、癌処置に対する応答を決定するためのキットを提供する。遺伝子座「に対して特異的」オリゴヌクレオチドは、多型領域の位置または多型領域に隣接する位置のいずれかに対して、結合する。増幅のためにプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドであるため、プライマーが、その多型領域を含むポリヌクレオチドを産生するために使用されるのに十分なほど近接している場合、プライマーは、隣接する。一つの実施形態において、オリゴヌクレオチドが、多型から約１〜２ｋｂ、および好ましくは１ｋｂ未満内において結合する場合、オリゴヌクレオチドは、隣接する。特異的オリゴヌクレオチドは、配列に対してハイブリダイズし得、および適切な条件の下では、単一のヌクレオチドだけ異なる配列に対しては結合しない。
【００９８】
本キットは、目的遺伝子の多型領域に対して特異的にハイブリダイズし得る少なくとも一つのプローブまたはプライマーを含み、および使用説明書を備える。これらのキットは、好ましくは、少なくとも一つは上記核酸を含む。目的遺伝子の少なくとも一部を増幅するための好ましいキットは、二つのプライマーを含み、それらのプライマーのうち少なくとも一つのプライマーは、その対立遺伝子改変体の配列に対してハイブリダイズし得る。このようなキットは、例えば、蛍光検出法、電気化学検出法、または他の検出法による、遺伝子型の検出に適している。
【００９９】
キットに含まれるオリゴヌクレオチドは（プローブとして、またはプライマーとして使用しようと）、検出可能に標識され得る。標識は、直接的（例えば、蛍光標識）、または間接的のいずれかで検出し得る。間接的検出法には、ビオチン−アビジン相互作用、抗体結合などを含む、当業者に公知の任意の検出方法を含み得る。蛍光標識したオリゴヌクレオチドはまた、消光分子を含み得る。オリゴヌクレオチドは、表面に対して結合し得る。一つの実施形態において、好ましい表面は、シリカまたはガラスである。別の実施形態においては、その表面は、金属アーク溶接棒である。
【０１００】
また、本発明のなお他のキットは、アッセイを実施するために必要な少なくとも一つの薬剤を含む。例えば、キットは、酵素を含み得る。あるいはそのキットは、緩衝液、または任意の他の必要な薬剤を含み得る。
【０１０１】
テストサンプルと共に核酸プローブをインキュベートするための条件は、アッセイ内で使用するフォーマット、使用する検出方法ならびにアッセイで使用される核酸プローブのタイプおよび性質に依存する。当業者は、一般的に利用可能なハイブリダイゼーションアッセイ、増幅アッセイ、または免疫学的アッセイのフォーマットの内の任意の一つを、本発明における使用のために核酸プローブを利用するために容易に適合させ得ることを認識する。これらのアッセイの例示は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ．（１９８６）「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ら、「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ  Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．、（１９８５）「Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにおいて、見出され得る。
【０１０２】
診断キットにおいて使用するテストサンプルは、細胞、細胞のタンパク質抽出物もしくは膜抽出物、または唾液、血液、血清、血漿、あるいは尿のような生体の体液を含む。上記方法において使用するテストサンプルは、アッセイのフォーマット、検出方法の性質およびサンプルとして使用されてアッセイされる組織、細胞または抽出物に基づいて変わる。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物の調製方法は、当該分野において公知であり、そして利用するシステムに適合するサンプルを得るため容易に適合させ得る。
【０１０３】
これらのキットは、目的遺伝子の多型領域における被験体の遺伝子型を決定するための本明細書中に記載するポジティブコントロール、ネガティブコントロール、薬剤、プライマー、配列決定マーカー、プローブおよび抗体の全てまたは、いくつかを含み得る。
【０１０４】
受け入れられるように、これら提示するキットの構成要素を、当業者による使用のため慣用的な様式で包装し得る。例えば、これら提示するキットの構成要素は、溶液中または液体分散（ｌｉｑｕｉｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）としてなどにより、提供し得る。
【０１０５】
（本発明の核酸の他の使用）
目的遺伝子の対立遺伝子の同定はまた、同一種に由来する他の個体の間から一個体を同定するために有用であり得る。例えば、ＤＮＡ配列を、同一種内の異なる個体検出のためのフィンガープリントとして使用し得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．およびＴｈｏｍｐｓｏｎ，編集（１９９１）「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｗ  Ｂ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）。これは、法医学的研究において有用である。
【０１０６】
本発明はさらに、以下の実施例（決して限定されるものとして解釈されるべきではない）により、例示される。前述の全ての参考文献（本願にわたる前述のような文献参考文献、特許公報、特許出願公報を含む）の内容は、参考文献として本明細書により明示的に援用される。本発明の実施は、特に断りのない限り、当該分野内における、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用する。
このような技術は、文献内に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら、（１９８９）を参照のこと。
【０１０７】
本発明を今回概ね記載したが、参考文献により、本発明の特定の局面および実施形態の例示の目的のみのために含まれ、かつ発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって容易に理解する。
【実施例】
【０１０８】
（実施例１−正常組織における遺伝子発現プロファイルによって、アジュバント化学放射線療法での直腸癌処置を受けた患者における骨盤内再発が予測される）
結腸直腸癌の発生率は、この１０年内で増加し、そして現在、米国において、１年間で、新症例として４１，０００人程であると推定され、そして死者８，５００人である。直腸癌のＩＩ期〜Ｖ期において、局所的な再発は、２０％〜７０％の外科手術のみで処置した患者において発生する（Ｋａｐｉｔｅｉｊｎ  Ｅ．ら、（２００１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：６３８−６４６）。アジュバント放射性−化学療法は、危険度の高い直腸癌に対して外科的な切除を行った患者に対する標準的な治療法として、米国において一般的に認可されている（ＮＩＨ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｌｏｎ  Ａｎｄ  Ｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（１９９０）ＪＡＭＡ  ２６４：１４４４−１４５０）。
【０１０９】
直腸癌におけるこれまでの研究は、ＴＳおよびＤＰＤを含む特定遺伝子のレベルの増加（Ｓａｌｏｎｇａ  Ｄ．ら、（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６：１３２２−１３２７およびＩｓｈｉｋａｗａら、（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：８８３−８８９）と５−ＦＵを伴うネオアジュバント処置後のより悪い結果との間の関連を示す。
【０１１０】
そのため、直腸癌をアジュバント化学−放射線を用いて処置した患者における骨髄内の再発を予測するマーカーを同定することは有益である。この目的で、腫瘍組織と隣接する正常組織における決定遺伝子の推定反応のｍＲＮＡレベルを測定した。調べた遺伝子は、５−ＦＵ経路（ＴＳ、ＤＰＤ）、ＤＮＡ修復（ＥＲＣＣ１、ＲＡＤ５１）、および血管新生（ＶＥＧＦ）に含まれた。
【０１１１】
（方法）局所的に進行した直腸癌（ＵＩＣＣ  ＩＩ期およびＩＩＩ期）の患者７３人を選択した。彼らは、骨盤全体に対する４５Ｇｙのアジュバンド放射線照射を受け、外科手術において腫瘍組織の切除の後に５４Ｇｙまでのさらなる放射線照射および５−ＦＵ注入療法を用いる処置を以前に行っている。ＱＲＴ−ＰＣＲ（蛍光基盤、定量的リアルタイム検出方法（Ｔａｑｍａｎ（登録商標））は、遺伝子発現レベルを確立するために、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、レーザー−キャプチャー−マイクロダイセクション処理した組織から抽出したＲＮＡで実施された。そのｍＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写し、そして目的遺伝子およびコントロールとしての内部基準遺伝子（β−アクチン）も同様に定量した。全ての遺伝子発現レベルは、分析する前にｌｏｇ変換処理した。Ｍｉｌｌｅｒ、Ｓｉｅｇｍｕｎｄ（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｒ．およびＳｉｅｇｍｕｎｄ  Ｄ．Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ（１９８２）３８：１０１１−１０１６）ならびにＨａｌｐｅｒｎ（Ｈａｌｐｅｒｎ  Ｊ．（１９８２）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ３８：１０１７−１０２３）のｃ２の方法を使用して、どの遺伝子発現が、患者を、乏しい予後の部分群と良好な部分群に最もよく分離するかを決定した。２０００回のブーストラップ型のシミュレーションを使用して、最大ｃ２統計量の分布を、相関のないとする帰無仮説のもとで推定した。
【０１１２】
【表１】
2005534686.tif 000002
（結果）５−ＦＵ代謝およびＤＮＡ修復に関連する遺伝子の腫瘤内ｍＲＮＡレベルは、直腸癌の患者におけるアジュバント放射線−化学療法後の結果に関連しなかった。腫瘍に隣接する正常組織におけるＴＳ、ＤＰＤ、ＥＲＣＣ１、およびＶＥＧＦの遺伝子発現レベルは、臨床結果に関連し、ならびに骨盤再発のより大きな危険にある患者を同定するために有益であり得る。これらの結果は、腫瘍組織の遺伝子発現ではないが、腫瘍に隣接する正常組織の遺伝子発現は、局所的な腫瘍の再発を引き起こし得る、外科処置後に残存する腫瘍細胞の生物学的挙動を表すものである。
【０１１３】
（実施例２−プロモーター領域内のＴＳの多型は、処置した癌患者における骨盤再発を予測する）
酵素のチミジル酸生成酵素（ＴＳ）は、デオキシチミジル酸（ＤＮＡ合成に必須の前駆体、チミジル酸の唯一のデノボソースである）へのデオキシウリジレートの細胞内変化を触媒する（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ  Ｃ．ら、（１９５７）Ｎａｔｕｒｅ（１７９）：６６３−６６６）。ヒトチミジル酸生成酵素遺伝子（ｈＴＳ）は、調節領域の５’末端のキャップ部位の下流２８塩基対配列の、２重タンデムリピートまたは３重タンデムリピートのいずれかを有する多型である（Ｈｏｒｉｅ  Ｎ．ら、（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２０：１９１−１９７）。
【０１１４】
ＴＳ遺伝子内の多型および、５−ＦＵ処置の効率とのその相関は、共有に係る米国特許出願第０９／７１５，７６４号（この内容全体は、本明細書中に参考として援用される）に、以前に記載された。この開示の中で報告された予測多型は、チミジル酸生成酵素遺伝子の５’ＵＴＲ内のタンデムに繰り返された２８塩基対配列である。ＴＳ有効性薬物（例えば、５−フルオロウラシル）処置に対する応答性があまり高くない患者は、タンデムに繰返された配列の、この３重リピートに関してホモ接合性であるということが決定された。タンデムに繰返された配列の、２重リピートおよび３重リピートのヘテロ接合性遺伝子型を示す患者。ＴＳ有効性薬物（例えば、５−フルオロウラシル）の投与に対し最も応答しがちな患者は、タンデムに繰り返された配列２重リピートに関してホモ接合性である。
【０１１５】
成功した処置の後であっても、直腸癌患者の局所的再発は、重大な医療問題である。局所的な直腸癌患者を、局所の再発危険性を減じるため放射線療法を用いて処置する。手術前または手術後いずれかの、局所的に進行した直腸癌に対する標準的な治療法は、５−ＦＵ化学療法および放射線療法である。腫瘍再発の危険性は、病理学的分類に応じて、１０％と６０％との間である。腫瘍再発の大きな危険にある患者を同定することは、大きな危険にある患者に対するより良い処置方法の開発を可能とする。このために、ＴＳ遺伝子内の２８ｂｐのタンデムリピート多型は、手術前の化学放射線療法または手術後の化学放射線療法のいずれかで処置した直腸癌患者における、局所的再発の危険性の予測であることが見出されたということを開示する。
【０１１６】
（方法）局所的に進行した直腸癌患者４３人（彼らは、手術前か、または手術後のいずれかに５−ＦＵおよび骨盤の放射線照射を用いて処置された）を、分析した。ゲノムＤＮＡを、パラフィンで包埋した組織サンプルから抽出した。患者のＴＳ多型の遺伝子型を、ＴＳプロモーター領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により決定した。ＰＣＲ産物を次いで、電気泳動すると２２０ｂｐ（２／２）、２４８ｂｐ（３／３）または、両方（２／３）のバンドが現れた。遺伝子型の特定を、局所的再発が発生した２４人の患者および、発生しなかった１９人の患者の間で、繰り返し実施した。
【０１１７】
（結果）手術前か、または手術後のいずれかの化学放射線療法の後、骨盤再発が、３重タンデムリピートに関してホモ接合性（３／３）の遺伝子型患者の８７％で見出された（（２／２）および（２／３）を有するヘテロ接合性患者の３７％に対して）。Ｐ値は、０．０１未満である。しかし、（３／３）遺伝子型は、進行したＴ段階またはＮ段階にも、高度組織学（ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）にも、ポジティブの周縁にも、血管腔浸潤にも関連しなかったため、骨盤再発については無関係の予測因子である。
【０１１８】
そのため、３／３ＴＳ多型の直腸患者は、５−ＦＵおよび放射線照射の両者に対する彼ら耐性が原因で、５−ＦＵおよび骨盤の放射線照射の組み合わせの後、局所的に制御される可能性は低い。放射線照射との組み合わせにおける、他の化学療法薬剤（例えば、ＣＰＴ−１１、またはオキサリプラチン）は、代替的な治療法である。
【０１１９】
（実施例３−５−ＦＵおよびオキサリプラチンに対する応答ならびに延命を予測するためのＴＳ３の多型）
この実施例は、ＴＳ遺伝子に関連する多型が、癌患者における５−ＦＵ／オキサリプラチン化学療法に対する臨床反応ならびに延命に関連することを示す。実施例２（前出）は、ＴＳプロモーター内の多型が、正常組織および腫瘍組織におけるＴＳ遺伝子発現に関連していることを報告する。この知見は、末梢血球細胞のＴＳ多型を測定することにより、腫瘍内のＴＳ遺伝子発現を予測することが可能であるということを示す。最近、多型が、腫瘤内の遺伝子発現に関連するとして見出された遺伝子の３’末端にあると記載された。このＴＳ多型は、オキサリプラチンおよび５−ＦＵで処置した患者の全ての延命に関連し、結果の独立予測因子である。
【０１２０】
化学療法に基づく５−ＦＵに対する応答の予測および５−ＦＵの適切な用量の予測は、治療効果を最大化し、ならびに処置の危険性を最小化する。抗癌剤の標的および抗癌剤の代謝に関連する遺伝子多型は、腫瘍内遺伝子発現レベルの予測となり得る。多型プロファイルはそのため、化学療法の薬物の選択または投薬に影響し得る。任意の説により制限されることを望まないが、本明細書中に報告した結果はまた、これら多型の多くは、人種群に関連する特有の遺伝子頻度を有することが示されたので、異なる人種群における抗癌剤薬物の毒性および抗癌剤の有効性の差異を説明する。
【０１２１】
（方法）この多型に関連する機能を調べるために、第２ラインまたは第３ラインの化学療法にて、５−ＦＵおよびオキサリプラチン処置した、進行した結腸直腸癌の患者１０２人における、相対的なＴＳｍＲＮＡレベルおよび、ＴＳ遺伝子の３’非翻訳領域における多型を、評価した。ポリメラーゼ連鎖反応増幅／ＲＦＬＰ分析法を、当該分野において公知である、公知の方法を使用することによりＴＳ遺伝子を同定するために実施した。ＴＳ  ｍＲＮＡを、当該分野で公知である定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を使用することにより定量した（Ｈａｎｋｏｓｈｉ  Ｔ．ら、（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１０８−１１６に記載）。
【０１２２】
野生型改変体（＋６ｂｐ／＋６ｂｐ）は、５．４２のＴＳレベル（９５％ＣＩ：３．５７，８．２４）を有するヘテロ接合性改変体（＋６ｂｐ／−６ｂｐ）および、ＴＳ  ２．７１（９５％ＣＩ：１．１８，５．２６）を有するホモ接合性変異改変体と比較した場合、腫瘍内における最高のＴＳ  ｍＲＮＡ発現に関連した（１１．３５，９５％ＣＩ：６．４３，２０．０３）（ｐ＝０．０１７，Ｆ−検定，表１参照のこと）。
【０１２３】
【表２】
2005534686.tif 000003
野生型改変体（＋６ｂｐ／＋６ｂｐ）は、ヘテロ接合性改変体（＋６ｂｐ／−６ｂｐ）および、ホモ接合性変異改変体と比較した場合、有意な延命効果に関連した（ＥＣＯＧにより分けられるコックス比例ハザードモデルおよび多変量解析に基いてｐ＝０．０４０）。そのため、３’非翻訳領域におけるこの多型は、幾人かの患者の臨床反応および臨床結果の予測となる。
【０１２４】
（実施例４−５−ＦＵ／オキサリプラチン化学療法に対する応答および延命を予測するためのＥＲＣＣ１遺伝子多型）
以下に示す結果は、ＥＲＣＣ１遺伝子（ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｒｅｐａｉｒ  ｃｒｏｓｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｇｒｏｕｐ  １）に関連する多型が癌を有する患者における５−ＦＵ／オキサリプラチン化学療法に対する臨床応答および延命に関連し、ならびにＥＲＣＣ  １ｍＲＮＡレベルに関連することを確立する。
【０１２５】
ＥＲＣＣ１は、高保存された酵素であり、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）１経路に特異的であり、および、この欠失は、生命と相容れない。ＮＥＲに関連するタンパク質のなかで、ＥＲＣＣ１の欠損は、最も重篤なＤＮＡ修復欠損に関連するようである。
【０１２６】
白金化合物は、とりわけ、胃癌、卵巣癌、および直腸結腸癌の主要な化学療法処置となりつつある。白金化合物の耐性の機構のなかで、増加されたＤＮＡ修復は、最も重要な機構であるようである。
【０１２７】
研究は、増加させたＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡレベルが直接的に、ヒト卵巣癌および子宮頸癌におけるシスプラチンに対する臨床耐性に関連することを示した。ＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡレベルはまた直接的に、胃癌患者における、５−ＦＵおよびシスプラチンに対する臨床耐性に関連することを以前示した。腫瘤内ＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡレベルはまた、５−ＦＵ／オキサリプラチンを用いて処置した転移性（ｍｅｔａｔａｓｔａｔｉｃ）結腸直腸癌患者における、臨床応答および全延命を予測することが可能であることを、最近示した。
【０１２８】
ＥＲＣＣ１遺伝子は、第１１８コドン（エクソン４）の非常に一般的な多型を含む。この多型は、同一のアミノ酸（アスパラギン）を生じる、ＣからＴへの単一ヌクレオチドの変化である。この変化は、一般的な遺伝子使用法（ｃｏｍｍｏｎ  ｕｓａｇｅ）のコドン（ＡＡＣ）を、あまり使用されないコドンへ（ＡＡＴ）と変換する。後者の報告された遺伝子使用法頻度は、前者よりも２倍少ない。卵巣癌の細胞株を使用する研究は、「野生型」と比べて、多型を含む細胞株のＤＮＡ付加物の修復おける、５０％の減少を示した。しかし、この卵巣癌細胞株は、白金に対して等しく耐性であることが分かった。
【０１２９】
この研究において、５−ＦＵ／オキサリプラチンを用いて処置した転移性結腸直腸癌患者３２人の第１１８コドンでのＥＲＣＣ１多型および腫瘤内ＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡレベルを、評価した。ｍＲＮＡレベルの中央値は、２．９５であった。Ｃ／Ｃ遺伝子型を有する患者１１人の内３人（２７．３％）が、２．９５よりも大きなＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡレベルを有した一方、それぞれ、Ｃ／Ｔ遺伝子型を有する患者１２人の内５人（４１．７％）および、Ｔ／Ｔ遺伝子型を有する患者９人の内７人（７７．８％）が２．９５よりも大きなＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡレベルを有した。Ｃ対立遺伝子を有する患者のｍＲＮＡレベルを、Ｃ対立遺伝子を含まないものと比較した場合、その差異は、統計学的に有意であった（ｐ＝０．０４９）。
【０１３０】
関連する研究においては、５−ＦＵ／オキサリプラチンを用いて処置した転移性結腸直腸癌患者６０人の第１１８コドンでのＥＲＣＣ１多型および全延命をまた、評価した。患者の延命中央値は、Ｃ／Ｃ遺伝子型を有する患者については、５３１日、Ｃ／Ｔ遺伝子型については２５４日、および、Ｔ／Ｔ遺伝子型については、２５６日であった（傾向ｐ＝０．０８９）。死亡についての相対危険度は、Ｃ／Ｔ遺伝子型については２．１２および、Ｔ／Ｔ遺伝子型については２．３６であった。Ｔ対立遺伝子を有する患者の延命中央値は、２５６日であり、および有さないものは、５３１日であった（ｐ＝０．０５６）。
【０１３１】
文献検索は、どのように「サイレント」多型（より少ない使用頻度のコドンを生じる）が、より高レベルのｍＲＮＡレベルに関連し得るのかという説明を提供することができなかった。任意の説により制限されることはないが、出願人は、この多型が、ＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡレベルに関連し、そしてそのため、５−ＦＵ／オキサリプラチンを用いて処置した転移性結腸直腸癌患者の延命を予測し得ることを記載する。
【０１３２】
（実施例５−白金ベースの化学療法に対する応答および延命を予測するための多型−ＸＰＤ（ＥＲＣ２）遺伝子）
以下に示す結果は、ＸＰＤ遺伝子に関連する多型が癌患者の白金ベースの化学療法に対する臨床応答および延命に関連することを確立した。
【０１３３】
ＸＰＤタンパク質は、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）経路における転写および主要な関与に必須である。ＸＰＤ遺伝子における複数の多型が、同定された。しかし、その機能的なシノニリカンス（ｓｉｏｎｉｌｉｃａｎｃｅ）は、明らかになっていない。コドン７５１の単一ヌクレオチドの多型（ＡからＣ）は、ＬｙｓからＧｌｎへのアミノ酸変化を生じる。コドン７５１での多型は、ＤＮＡ修復能力をもたらし得るという証拠が存在するが、しかし、この問題に関するこれまでの研究は、相矛盾する結果を示した（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．ら、（１９５７）Ｎａｔｕｒｅ  １７９：６６３−６６６およびＨｏｒｉｅ，Ｎ．ら、（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２０：１９１−１９７参照のこと）。
【０１３４】
増幅したＤＮＡ修復は、白金ベースの化合物（例えば、オキサリプラチン）に対する化学耐性のため、よく療法された機構である。本明細書内に報告される結果は、ＥＲＣＣ１（ＮＥＲ酵素ファミリーのメンバー）の増加した遺伝子発現は、胃癌患者の５−ＦＵおよびシスプラチン化学療法に対する耐性に関連することを示す。
【０１３５】
（方法）これまでに５−ＦＵベースの化学療法に失敗し、および５−ＦＵ／オキサリプラチンの組み合わせ処置に対する応答ならびに全延命を決定した転移性結腸直腸癌患者６９人のＸＰＤのコドン７５１の多型の状態。遺伝子型の特定は、ＲＦＬＰ−ＰＣＲ法を使用することにより白血球で行った。
【０１３６】
６７人の患者を、応答について評価した。全応答率は、１５％（１０／６７）であった。Ｌｙｓ／Ｌｙｓ遺伝子型を有する２５％（５／２０）の患者が、それぞれＬｙｓ／Ｇｌｎ遺伝子型を有する患者の１１％（４／３７）およびＧｌｎ／Ｇｌｎ遺伝子型を有する患者の１０％（１／１０）と比較して、応答した（ｐ＝０．００７フィッシャーの直接確率検定、両側検定）。さらに注目すべきは、Ｇｌｎ／Ｇｌｎ遺伝子型を有する患者の間で、５０％（５／１０）のものが、それぞれＬｙｓ／Ｌｙｓ遺伝子型を有する患者の１０％（２／２０）およびＬｙｓ／Ｇｌｎ遺伝子型を有する患者の５％（２／３７）と比較して、進行性疾患を有した。
【０１３７】
全延命およびその多型との関連性をまた、評価した。Ｌｙｓ／Ｌｙｓ遺伝子型を有する患者についての生存期間の中央値は、５３０日であった。Ｌｙｓ／Ｇｌｎ遺伝子型を有する患者は、３５６日の生存期間の中央値を有した。最後に、Ｇｌｎ／Ｇｌｎ遺伝子型を有する患者は、１８６日の生存中央値を有した（傾向についてｐ＝０．０６）。そのため、死者のＲ．Ｒ．は、Ｌｙｓ／Ｌｙｓ群の１．００、Ｌｙｓ／Ｇｌｎを有する群についての１．４９、およびＧｌｎ／Ｇｌｎを有する群についての３．０１であった。
【０１３８】
（結果）ＤＮＡ修復能力および化学療法に対する耐性にＸＰＤ遺伝子のＬｙｓ７５１Ｇｌｎ多型が影響を与える機構は、知られていない。事実、ＤＮＡ修復能力におけるまさにその役割は、いまだ議論されている。研究は、多型が、増加したＤＮＡ修復能力に関連するのか、または減少したＤＮＡ修復能力に関連するのかについて、相矛盾する結果を示した（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．ら、（１９５７）Ｎａｔｕｒｅ  １７９：６６３−６６６およびＨｏｒｉｅ，Ｎ．ら、（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２０：１９１−１９７参照のこと）。
【０１３９】
これらの結果は、ＸＰＤ遺伝子が、化学療法耐性および遺伝子型の特定において重要な役割を果たすことを示す。７５１多型は、臨床応答、延命、および白金ベースの化学療法に対する臨床毒性、ならびにＸＰＤ機能を調節する新規薬剤設計の予測において有用である。ＸＰＤはまた、薬物開発の重要な標的である。
【０１４０】
（実施例６−ＸＲＣＣ１は、白金ベースの化学療法で処置した患者における応答の予測的なものである）
最近、Ｄｉｖｉｎｅら（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ、２０００年３月、５９１ページ）は、ＸＲＣＣ−１多型が、より高いＡＦＢ１−付属物およびＧＰＡ体細胞変異に関連し、またエジプト人の肺癌の危険、大腸癌の危険（Ａｂｄｅｌ−Ｒａｈｍａｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ＡＡＣＲ，  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、２０００年３月、５９５ページ）ならびに前立腺癌の危険（Ｈｕら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、２０００年３月、５９６ページ）に関連することを示した。エクソン６内の多型は、膀胱癌の発生に対する保護的効果を有することを示した（Ｓｔｅｒｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ、２０００年３月、５９２ページ）。
【０１４１】
ＸＲＣＣ−１は、一本鎖切断修復および、塩基除去修復において中心的役割を果たす。さらに、哺乳動物における一本鎖切断修復に必要とされる遺伝子産物の少なくとも一つ、ＸＲＣＣ１ポリペプチドは、マウスの生存に必要とされ、ＸＲＣＣ−１を欠損する変異細胞は、電離放射線およびアルキル化剤に対する細胞の感受性を示し、ならびに染色体異常の高い自発性頻度を示す（Ｃａｌｄｅｃｏｔｔら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、２０００年３月、８９１ページ）。
【０１４２】
（方法）５−ＦＵおよびオキサリプラチンを用いた、進行した結腸直腸癌の患者４５人（以前に化学療法レジメに少なくとも一度失敗した）を、選択した。ＸＲＣＣ１の多型および、５−ＦＵならびにオキサリプラチンを用いて処置した転移性結腸直腸癌患者における臨床結果とのＸＲＣＣ１の関連を、研究した。これらの患者は、念入りに前処置されたが、しかし、最初にプラチナ化合物を受けた。ＸＲＣＣ−１  ＤＮＡ修復遺伝子におけるバリエーションが、宿主のＤＮＡ損傷に関連するのか、について決定するために、ＸＲＣＣ１の多型（コドン３９９）と姉妹染色分体の変換（ＳＣＥ）の頻度（ｎ＝７６）およびポリフェノールＤＮＡ付加物（ｎ＝６１）との間の関係を、研究した。ＸＲＣＣ１遺伝子型を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰを使用することにより同定した。
【０１４３】
（結果）患者４５人のうち、患者６人（１３％）に部分的な反応が生じ、患者３０人（６７％）が安定した疾患を有し、および９人（２０％）が進行性疾患を有した。患者１８人はＡ／Ａ多型を有し、２２人がＡ／Ｇ多型および５人がＧ／Ｇ多型を有した。６人の反応した患者のうち、５人はＡ／Ａ多型を有し、および一人がＡ／Ｇ多型を有した。進行性疾患を有する９人の患者のうち３人がＧ／Ｇ多型を有し、およびこれら９人のうち４人がＡ／Ｇ多型を有した。ヨンキー・テラプストラ検定（モンテカルロ両側検定）を使用するとｐ値は、０．００４３と０．００８３の９９％の信頼区間を有する０．００６３を伴い、統計的に有意であった。これらのデータは、Ａ／Ａ多型が、化学療法に対する応答に関連し、およびＧ／Ｇ多型を有する患者がプラチナ化合物に対する耐性に関連することを示す。
【０１４４】
ＸＲＣＣ１の３９９Ｇｌｎ対立遺伝子のホモ接合性キャリアーである現喫煙者間のＳＣＥ頻度の平均値は、３９９Ａｒｇ／Ａｒｇの現喫煙者の平均値よりも大きかった。ＸＲＣＣ１  ３９９Ｇｌｎおよび検出可能なＤＮＡ付加物への可能な遺伝子投与効果を記載し、そして、３９９Ａｒｇ／Ａｒｇ遺伝子型を有する若い患者よりも、３９９Ｇｌｎ対立遺伝子の保有者である高齢の被験体の間で有意に多い付加物は、多型のＸＲＣＣ１  ３９９Ｇｌｎ対立遺伝子の保有者が、ＤＮＡ損傷のより大きな危険にあり得ることを示す。（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（Ｏｘｆｏｒｄ）２１（５）（２０００）：９６５−９７１）。
【０１４５】
出願人は、ＸＲＣＣ−１遺伝子が、白金ベースの化学療法で処置した患者の応答を予測することを見出した。ＸＲＣＣ−１の多型の同定は、プラチナが有益であるかを決定するためだけではなく、またプラチナを用いる副作用の危険性を決定し得ることを可能とした。ＸＲＣＣ−１の多型は、治療のための方法の個体化−この事前選別の使用に基づく抗癌剤の用量および選択の個体化、を可能とした。本明細書中の研究報告はまた、白金ベースの化学療法から利得を有する者、およびプラチナ薬剤の副作用をうける可能性を有する者であり得る個体を同定する。
【０１４６】
（実施例７−ヒトグルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１多型は、５−ＦＵ／オキサリプラチン化学療法を用いて処置した進行型結腸直腸癌患者の延命を予測する）
グルタチオントランスフェラーゼは、還元されたグルタチオンの結合を触媒する第二相の代謝酵素のスーパーファミリーに属する。これら反応の解毒特性は、発癌性薬剤および細胞毒性薬剤により引き起こされる損傷からの細胞マクロ分子の保護によるものである（Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ，Ｂ．（１９８５）Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５７：３５７−４１７を参照のこと）。ＧＳＴＰ１−１は、ヒト上皮組織において広範に発現し、および大腸癌を含む多くの腫瘍において過剰に発現することが示された（Ｔｅｒｒｉｅｒ  Ｐ．ら、（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３７：８４５−８５３；Ｍｏｓｃｏｗ  Ｊ．Ａ．ら、（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：１４２２−１４２８；Ｈｏｗｉｅ  Ａ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １１：４５１−４５８；Ｐｅｔｅｒｓ  Ｗ．Ｍ．ら、（１９９２）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０３：４４８−４５５；およびＳｉｎｇｈ  Ｓ．Ｖ．ら、（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．５１：４３−４８）。腫瘍における増加レベルは、多くの腫瘍において見出されたように、化学療法に対して見出された耐性に一部起因し得るが、この機構はいまだ、知られていない（Ｔｓｕｃｈｉｄａ  Ｓ．ら、（１９９２）Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７：３３７−３８４）。ＧＳＴＰ１の発現レベルに影響する因子は、特定の薬剤または薬剤の組合せを用いて処置した患者の治療応答および延命を予測するための重要な道具となり得る。エキソン５における第３１３位のヌクレオチドにおけるＧからＡへの転移は、タンパク質におけるイソロイシンからバリンへのアミノ酸置換を引き起こす（Ｂｏａｒｄら、（１９８９）Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５３：２０５−２１３によりこれまでに報告された）。インビトロでのｃＤＮＡ発現の研究は、このアミノ酸変更とＧＳＴＰ１酵素の減少した活性レベルとの間の相関性を示した（Ｚｉｍｎｉａｋ  Ｐ．ら、（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：８９３−８９９）。最近、ＧＳＴＰ１遺伝子の対立遺伝子改変体のエクソン５の第１０５番目Ｖａｌが、正常肺組織および食道のバレット上皮組織におけるＧＳＴ酵素の低活性に関連していることが見出された（Ｗａｔｓｏｎ  Ｍ．Ａ．ら、（１９９８）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９：２７５−２８０およびＶａｎ  Ｌｅｉｓｈｏｕｔ，Ｅ．Ｍ．Ｍ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５８８−５８９）。さらに、第１０５番目Ｖａｌ対立遺伝子が、精巣癌、膀胱癌および食道癌についての危険性増加に関連するが、しかし大腸癌または乳癌については関連しないことが示された（Ｈａｒｒｉｅｓ  Ｌ．Ｗ．（１９９７）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １８：６４１−６４４）。
【０１４７】
さらに、このＩｌｅ１０５Ｖａｌの置換は、化学療法（シクロホスファミド、５−ＦＵ、アドリアマイシン）を受けた乳癌の女性における延命の改善に関連することが示された（Ｓｗｅｅｎｅｙ  Ｃ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：５６２１−５６２４）。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ．ら、（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１１１：１８７−１９８）は、白金ベースの化学療法を受けている頭頚部の癌を有する患者の応答速度が、ＧＳＴタンパク質の低発現を伴う患者について有意に高いものであったことを示した。これら明るいデータに基づいて、５−ＦＵ／オキサリプラチンの組合せの化学療法を受けた進行型結腸直腸癌の患者８１人の、遺伝子型を特定した。
【０１４８】
（方法および結果）本研究において、５−ＦＵおよびＣＰＴ−１１に失敗した後、第３ラインの処置として５−ＦＵ／オキサリプラチン化学療法を受けた進行型結腸直腸癌の患者８１人を、ＧＳＴＰ１遺伝子のエクソン５での多型についてスクリーニングした。全生存時間中央値は、１１ヶ月の経過観察時間の中央値（９５％ＣＩ：１．１，１５．３）を伴い１０．２ヶ月であった（９５％Ｃ１：７．９，１３．３）。ＶＡＬ／ＶＡＬ遺伝子型を有する患者は、ヘテロ接合性またはホモ接合性のＩＬＥ対立遺伝子の患者と比べて、有意な延命効果を有した（ｐ＝０．０２８，ログランク検定）。ホモ接合性のＶＡＬ対立遺伝子である患者は、ヘテロ接合性ＩＬＥ対立遺伝子の患者についての０．４０およびホモ接合性ＩＬＥ対立遺伝子の患者についてのわずか０．０６と比較して、１８ヶ月で０．８９の生存率を有した。ホモ接合性ＩＬＥ対立遺伝子の患者は、ＶＡＬ／ＶＡＬ群と比較した場合、５．４倍増加した相対危険度を示した（表３）。ホモ接合性ＩＬＥ対立遺伝子の患者は、ヘテロ接合性についての１３．３ヶ月（９５％ＣＩ：８．４，２３．７）と比較して、７．９ヶ月の延命中央値を有した（９５％ＣＩ：５．９，１２．８）。ホモ接合性ＶＡＬ対立遺伝子の患者は、２４＋ヶ月延命した（９５％ＣＩ：ＮＡ）（ｐ＝０．０２８、ログランク検定、表４）。
【０１４９】
【表３】
2005534686.tif 000004
【０１５０】
【表４】
2005534686.tif 000005
出願人は、延命とＧＳＴＰ１遺伝子のエクソン５でのｌｌｅ１０５Ｖａｌ多型との間の有意な関連性を示す。ホモ接合性アミノ酸置換の患者は、有意な延命効果を有した。これまでのインビトロでの報告および異なるヒト組織における研究によると、Ｖａｌ／Ｖａｌ遺伝子型は、ヘテロ接合性遺伝子型およびＩＬＥ／ＩＬＥ遺伝子型と比べて、ＧＳＴ酵素の低活性に関連する（Ｚｉｍｎｉａｋ  Ｐ．ら、（１９９４）上記；Ｗａｔｓｏｎ  Ｍ．Ａ．ら、（１９９８）上記；およびＶａｎ  Ｌｉｅｓｈｏｕｔ（１９９９），上記）。これらの結果を考慮すると、ＶＡＬ／ＶＡＬ遺伝子型およびそれぞれのＧＳＴ酵素の低活性を伴う患者は、ヘテロ接合性ならびにＩＬＥ／ＩＬＥ遺伝子型群と比較して、５−ＦＵ／オキサリプラチンを用いる処置から恩恵を受ける。ＧＳＴ酵素の低活性は、薬物媒介性のグルタチオン結合体において、低効率であると考えられ、より長くおよび、おそらくより効率的な腫瘍細胞への活性薬剤の暴露を引き起こす。これは、ＩＬＥ／ＩＬＥ遺伝子型と比較して、２または少なくとも１つのＶＡＬ対立遺伝子を有する患者についての延命効果を説明し得る。
【０１５１】
出願人が知る限り、これが、ＧＳＴＰ１遺伝子のＩＬＥ１０５ＶＡＬ多型の役割についておよび、５−ＦＵ／オキサリプラチン化学療法を受けた転移性結腸直腸癌患者についての初めての報告である。このＧＳＴＰ１多型は、第３ラインの化学療法に失敗するという高まる危険性を伴う患者を同定するための有益なマーカーとなり得、そのため事前処置した患者の５−ＦＵ／オキサリプラチン療法のひどい副作用をなくし得、他の治療法をかれらに指示し得る。単純な血液検査の方法を、臨床家がより個体化した化学療法の設計のために使用し得る。
【０１５２】
（実施例８−ＥＧＦＲ遺伝子のイントロン１における多型のジヌクレオチドリピートは、進行型結腸直腸疾患患者における白金ベースの化学療法に対する臨床応答に関連する）
ＥＧＦＲは、１７０ｋＤの膜貫通型糖タンパク質であり、その遺伝子は、ヒト染色体７ｐ１２の短腕上に位置する。これは、上皮成長因子ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、およびＴＧＦ−αを含む、複数の細胞外成長因子リガンドを有するレセプタータンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。ＥＧＦＲは頻繁に、多くの型のヒトの癌（ＣＲＣ（結腸直腸癌）およびそれらの過剰発現を含む）において過剰発現し、そしてこの過剰発現は典型的に、より悪性の臨床行動を与える（Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｄ．ら、（１９９５）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １９：１８３−２３２）。
【０１５３】
ＥＧＦＲの発現レベルは主に、そのｍＲＮＡの存在量により調節され、およびＥＧＦＲ過剰発現の性質は、ＥＧＦＲの転写速度の高まりに起因すると考えられる（Ｇｒａｎｄｉｓ，Ｊ．Ｒ．およびＴｗｅａｒｄｙ，Ｄ．Ｊ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３５７９−３５８４）。最近、研究が、ＥＧＦＲ遺伝子転写活性は、イントロン１における高多型のジヌクレオチドリピート（ＣＡリピート）の数の増加に伴い減少することを示した（Ｇｅｂｈａｒｄｔ  Ｆ．ら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７４：１３１７６−１３１８０）。
【０１５４】
５−ＦＵベースの化学療法に以前失敗した転移性結腸直腸癌患者７８人のＥＧＦＲの多型ジヌクレオチドリピート（ＣＡリピート）を、５−ＦＵ／オキサリプラチンの組み合わせ療法に対する、かれらの応答および全延命を決定するために評価した。ＣＡリピートの数は、フォワードプライマー５’−ＧＴＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＧＣＣＡＡＡＣ−Ｃ３’（配列番号）およびリバースプライマー５’−ＴＴＣＴＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＴＧＧＣＡＣ３’（配列番号）を使用する、５’末端標識化ポリメラーゼ連鎖反応により決定した。この反応を、９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長を伴う２８サイクルの間、インキュベートした。反応産物を、Ｃｈｉ，Ｄ．Ｄ．ら、（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １：１３５に記載されるように周知の方法を使用することにより、６％変性ポリアクリルアミドＤＮＡ配列決定ゲルで分離し、真空ブロットし、そして一晩Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲフィルムに曝した。
【０１５５】
患者３８人を、応答について評価した。全応答率は、１８％であった（７／３８）。患者の５６％（４／９）は、それぞれ１６／１８リピートを有する患者の６％（１／１７）および１６／２０リピートを有する患者の８％（１／１２）と比較して、進行した１６／１６リピートを有することが見出された（ｐ＝０．００８フィッシャーの直接確率検定、両側）。全延命およびそれに関連する多型をまた、評価した。１６／１６リピートを有する患者については、延命中央値は、６６日であった。１６／１８リピートを有する患者は、１７９日の延命中央値を有した。最後に、１６／２０リピートを有する患者は、８０５日の延命中央値を有した（傾向についてはｐ＝０．１）。
【０１５６】
本報告は、短いＣＡリピート（１６／１６）が、ＥＧＦＲ遺伝子の転写および過剰発現した遺伝子を増加することを示す。そのため短いＣＡリピート（１６／１６）は、長いＣＡリピート（１６／２０）と比較して、乏しい予後を有する。
【０１５７】
（実施例９−上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）遺伝子発現および多型は、化学放射線処置した直腸癌患者における骨盤再発を予測する）
ＥＧＦＲは頻繁に、結腸直腸癌を含む多くのタイプの癌において過剰発現され、または変異される。ＥＧＦＲの過剰発現は、より攻撃性の腫瘍の動きならびに細胞毒性の薬剤および放射線に対する乏しい腫瘍の反応に関連する。インビトロおよび臨床研究は、ＥＧＦＲの過剰発現を放射線耐性に関連付けた。上記実施例８は、ＥＧＦＲ遺伝子のイントロン１におけるジヌクレオチドの繰り返しの長さの多型が、転移性結腸直腸癌患者における５−ＦＵ／オキサプラチンに対する応答に関連することを示す。インビボデータはまた、このゲノム多型が、ＥＧＦＲの発現レベルに関連することを示す。
【０１５８】
（方法）局所的な進行型直腸癌（ＵＩＣＣ  ＩＩ段階およびＩＩＩ段階）患者７３人を、アジュバント放射線化学療法で処置した。年齢中央値５２歳（２５歳〜７９歳の範囲）の女性２５人（３４．２％）および男性４８人（６５．８％）が存在した。患者３１人（４２．５％）が、経過観察期間の間に局所的な腫瘍再発が発生した。腫瘍を、高度に分化したもの（Ｇ１；患者１人）、中程度に分化したもの（Ｇ２；患者５６人）、および低分化したもの（Ｇ３；患者１６人）として、組織病理学的に分類した。組織学的段階は、患者２２人がＴ２段階、患者５１人がＴ３段階を示した。患者３５人は、リンパ節陰性であって、３８人がリンパ節転移を有した。どの患者も、最初の診断の時に全身性転移を有していなかった。人種背景：白色人種の患者５０人、ヒスパニック系１３人、アジア系８人、アフリカ系−アメリカ人２人。患者のデータを、遡及的に集めた。インフォームドコンセントを、本研究に関わる全ての患者に、署名承認させた。下部前方切除（ＬＡＲ；ｎ＝４４），腹部会陰切除（ＡＰＲ；ｎ＝２０）、または経肛門部切除を受けた患者を、５−ＦＵ注入と骨盤放射線照射により追従した。骨盤放射線照射を、全骨盤に対して４５Ｇｙの線量で与え、および５４Ｇｙまでの追付上昇を与える。
【０１５９】
遺伝子発現分析のためのサンプルを、外科処置をしながら得た。全てのサンプルは、ホルマリン固定され、およびパラフィン包埋された。全てのパラフィン包埋された標本を、腫瘍組織および隣接する正常組織からＲＮＡを単離するためにレーザーカプチャー顕微解剖を行なった。切除後のＲＮＡ単離は、米国特許第６，２４８，５３５号に従って行なった。ＲＮＡ単離に続いて、ｃＤＮＡを、各サンプルから調製した。ｃＤＮＡおよび内部標準遺伝子（β−アクチン）の定量を蛍光ベースのリアルタイム検出法（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ［ＴａｑＭａｎ（登録商標）］；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用することにより実施した。ＰＣＲ混合液は、６００ｎｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２００ｎｍｏｌ／Ｌプローブ（使用される配列を、以下に示す）、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ５単位、各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの２００μｍｏｌ／Ｌ、ｄＴＴＰの４００μｍｏｌ／Ｌ、３．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、およびレファレンス色素を含む１×ＴａｑＭａｎ（登録商標）緩衝液Ａ、最終容量２０μＬより構成された（全ての薬剤は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより供給された）。サイクル条件は、５０℃で１０秒間および９０℃で１０分間、続く９５℃で１５秒ならびに６０℃で１分間での４６サイクルであった。大腸、肝臓、および肺のＲＮＡ（全てＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．）を、各プレート上にコントロール検定物質として使用した。血液サンプルを、各個体から採取し、およびゲノムＤＮＡをＱｉａＡｍｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用することにより末梢血リンパ球から抽出した。ＥＧＦＲマイクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）分析法を周知の手順に従って行なった。簡単に述べると、標準的なＰＣＲ反応を５’−３３Ｐ−γＡＴＰ末端標識化フォワードプライマーを用いる周知の方法に従って実施し、および反応産物を６％変性ポリアクリドアミドＤＮＡ配列決定ゲル上で分離し、真空ブロットしならびに一晩ＸＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ）に暴露した。ＥＧＦＲ  ＣＡリピートの正確な個数をＰＣＲ産物の直接配列決定により確定した。
【０１６０】
（結論）骨盤再発とＥＧＦＲ遺伝子発現レベルとの間の有意な関連性を直腸の正常組織において見出した。高ＥＧＦＲ遺伝子発現レベルの患者は化学放射線処置した低ＥＧＦＲ遺伝子発現レベル（ｐ＝０．０２２  ログランク検定）を有する患者と比較して、骨盤再発についてのより高い相対的危険度（３．８倍）を有した。あり得る関連性の傾向（Ｐ＝０．１７ログランク検定）は、ＥＧＦＲ遺伝子のイントロン１におけるジヌクレオチド繰り返しの長さの多型と直腸癌患者における局所的再発までの時間との間に存在する。短い（ＣＡ）ｎリピート（ＣＡリピート＜２０両者）の患者は、長い（ＣＡ）ｎリピート（ＣＡリピート≧２０両者）の患者に比べて、局所的再発までの短い時間を有する。腫瘍組織におけるＥＧＦＲ遺伝子発現レベルは、化学照射療法処置した患者の直腸における局所的再発までの時間を予測するための統計学的有意性を有しない。
【０１６１】
これは、正常直腸組織におけるＥＧＦＲ遺伝子発現レベルおよびＥＧＦＲ遺伝子のイントロン１におけるジヌクレオチドの繰り返しの長さの多型が、化学照射療法処置した患者の直腸癌における局所再発までの時間に関連し得ることを示す。これらのデータは、正常直腸組織におけるＥＧＦＲ遺伝子発現レベルおよびＥＧＦＲ遺伝子の多型が骨盤再発の大きな危険にある患者を同定し得ることを示す。
【０１６２】
（実施例１０−ＣＯＸ−２は、化学療法に関連する臨床毒性を防ぐ）
プロスタグランジン（ＰＧ）は、サイクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の作用により形成される。二つの関連アイソフォーム（ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２）は、アラキドン酸をプロスタグランジンへと変えるが、これらの生理的役割および分布において異なる（Ｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｌ．ら、（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１：３３１５７−３３１６０）。ＣＯＸ−１（構成的アイソフォーム）は、ヒトの体にわたり多くの細胞型に存在し、および細胞保護プロスタノイドの産生による胃粘膜の維持、適切な血小板機能ならびに腎臓の血流に、特異的に担う。
誘導可能なアイソフォームＣＯＸ−２は正常な状態の下では欠失しているが、しかし、サイトカイン、成長因子、分裂促進剤および腫瘍促進剤により誘導され、ならびに炎症、発熱、腫瘍成長、そして、痛みの介在を担う（Ｈｌａ  Ｔ．およびＮｅｉｌｓｏｎ  Ｋ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：７３８４−７３８８およびＪｏｎｅｓ  Ｄ．Ａ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：９０４９−９０５４）。
【０１６３】
標準的なＮＳＡＩＤは、標準的な抗炎症投与量で両アイソフォームを阻害する。ＣＯＸ−２の阻害は、痛みおよび炎症を仲介するＰＧの形成に関与するので治療効果の説明になる。しかし、併発するＣＯＸ−１の阻害により、望まない副作用（例えば、胃の毒性、中度出血特異体質（ｍｉｌｄ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）および腎不全）をまた生じる（Ｄａｎｎｈａｒｄｔ  Ｇ．および  Ｋｉｅｆｅｒ  Ｗ（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１０９−１２６）。最近、サイクロオキシゲナーゼ−２の選択的なインヒビターが、これら望まない副作用のない治療効果をもたらすことが証明された（Ｒｅｄｄｙ  Ｂ．Ｓ．ら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：  ４５６６−４５６９）。
【０１６４】
癌患者（特に疾患の進行段階にある）はしばしば、ひどい痛みを経験するため、効果的な軽減を与える薬物が、必要とされる。しかし、これら痛み止めからの副作用は、必要な化学療法により生じる毒性に干渉し得ることを考慮しなくてはならない。プロスタグランジン経路は、分泌性下痢において重要な役割を果たすため、ＣＯＸ−２の阻害は、化学療法により引き起こされる下痢を実際に減少させ得る（Ｂｅｕｂｌｅｒ  Ｅ．およびＳｃｈｕｌｉｇｏｉ  Ｒ．（２０００）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．９１５：３３９−４６）。動物のデータは、ＣＯＸ−２の阻害がつまり、神経毒性におけるＣＯＸ−２の潜在的役割を示すラット脳内に化学的に引き起こされる神経毒性を阻害または防止し得ることを示唆する（Ｋｕｎｚ  Ｔ．およびＯｌｉｗ  Ｅ．Ｈ．（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３（３）：５６９−７５およびＨｅｗｅｔｔ  Ｓ．Ｊ．ら、（２０００）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２９３（２）：４１  ７−２５）。
【０１６５】
選択的なＣＯＸ−２インヒビターは、二つの理由のため化学療法を受ける患者の最も効果的な症状の処置である。第一に、ＣＯＸ−２インヒビターがプロスタグランジンが媒介する痛みおよび炎症の形成を妨げるため、患者の痛みを減少させる。第二に、胃腸管における細胞保護プロスタグランジンの形成は変化しない。
化学療法レジメンに由来する酸および薬物のような攻撃的化合物に対する生理的保護は、保持される。これは化学療法由来の少ない副作用を生じ得る。さらに多くの腫瘍において高発現されるＰＧ経路の律速酵素（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）（ＣＯＸ−２）（Ｂａｅ  Ｓ．Ｈ．ら（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：１４１０−１４１８）は、結腸直腸癌の発癌過程に関連することが示唆された（Ｓａｎｏ  Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３７８５−３７８９およびＨａｏ  Ｘ．（１９９９）ら（１９９９）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８７：２９５−３０１）。アゾキシメタンによる結腸直腸腫瘍の誘導は、選択的なＣＯＸ−２の阻害によりほぼ完全に抑制されることが示され（Ｋａｗａｍｏｒｉ  Ｔ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４０９−４１２）、および結腸ポリープは、非選択的ＮＳＡＩＤ処置後、軽減を示した（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ  Ｆ．Ｍ．ら（１９９３）  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２８：１３１３−１３１６）。
【０１６６】
遡及的な分析において、出願人は２００ｍｇ日と４００ｍｇ日との間の用量のセレブレックスは、オキサリプラチン処置した患者の神経毒性に対して保護していることを同定した。患者１５６人の分析において、そのうちの９０人の患者は、オキサリプラチンと５−ＦＵとの組み合わせにおけるセレブレックス処置を有さず、これらの患者のうちの２６人はＩＩ段階またはＩＩＩ段階の細胞毒性を発生し、オキサリプラチン／５−ＦＵ化学療法との組み合わせにおけるセレブレックス治療を有する患者５６人から、３人のみが、ＩＩ段階または活性化された（ｌｉｔ）神経毒性を発生した。これは大いに統計学的優位である（ｐ＜０．０１）。
【０１６７】
（実施例１１−マトリックスメタロプロテイナーゼの機能的多型は、進行型結腸直腸癌患者の遠隔転移を予測するのが可能である）
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解に関する亜鉛依存性酵素ファミリーのメンバーである。インビトロの研究は、ＭＭＰが結合組織タンパク質の配列を分解することが可能であり、これらの酵素が、癌の侵潤および転移を含む様々な病理の工程に関連する結合組織の分解および形成、関節炎における軟骨分解、アテローム硬化のプラーク破裂、ならびに動脈瘤の発生に関わり得ることを示唆する。
【０１６８】
天然に存在する種々の配列変異は、ＭＭＰ−１（−１６０７  １Ｇ／２Ｇ）、ＭＭＰ−３（−１６１  ２５Ａ／６Ａ）、およびＭＭＰ−９（−１５６２  Ｃ／Ｔ）を含む、多数のＭＭＰ遺伝子のプロモーター内に見出された。これら生殖系列の多型は、これらＭＭＰ遺伝子プロモーター転写活性に対する対立遺伝子特異的効果を有することを示した。
【０１６９】
つまり、ＭＭＰ−１（コラゲナーゼ−１）遺伝子のプロモーター内の２Ｇ対立遺伝子を保有する患者に由来する卵巣腫瘍組織は、２Ｇ対立遺伝子を保有しない患者に由来する卵巣腫瘍組織と比較して、より多くのＭＭＰ−１を発現することを示した（Ｋａｎａｍｏｒｉ  Ｙ．ら、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：４２２５−４２２７）。不十分なＭＭＰ−３（ストロメライン−１）の発現は、血管のマトリックスを引き起こす遺伝子プロモーター内の６Ａ対立遺伝子の存在に起因し、および研究は、６Ａ／６Ａ遺伝子型が、非侵襲性の超音波検査を使用して測定した、増加した頚動脈壁の厚さに関連することを示した（Ｇｎａｓｓｏ  Ａ．ら（２０００）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：１６００−１６０５）。冠状アテローム硬化症の白人患者のコホート研究において、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）遺伝子のＣ−１５６２Ｔ多型と疾患の重篤度との関連性が、同定され、およびこの関連性は、Ｔ対立遺伝子を保有する個体のアテローム発生の間の、血管の平滑筋の移動能ならびに増殖能の増加のためであり得る（Ｚｈａｎｇ  Ｂら、（１９９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９９：１７８８−１７９４）。
【０１７０】
（方法）１９９８年から２０００年を通して、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／Ｎｏｒｒｉｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒで処置された進行型結腸直腸癌患者４７２人を、同定した。これら４７２人の患者のうち、本研究の分析法に適任な６０人の患者における、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、およびＭＭＰ−９の多型と転移の部位との間の関連性を、調べた。本研究は、Ｎｏｒｒｉｓ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒで調査し、およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）により証明した。各被験体の年齢、人種および経過観察情報を遡及的な病歴審査から得た。
【０１７１】
血液サンプルを各患者から採取し、および対応するゲノムＤＮＡを、ＱｉａＡｍｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用することにより末梢血リンパ球から抽出した。全てのサンプルをＰＣＲ−ＲＦＬＰ技術を使用することにより評価した。制限酵素分解の後、ＰＣＲ産物を、４％アガロースゲル上で視覚化し、そして分析した。
【０１７２】
（結果）本研究の関与者については患者１０人のみが、腫瘍進行の前に１７ヵ月の経過観察中央値（９５％ＣＩ，１０．６−２５．３ヶ月）を伴う腹膜癌腫症を有し；および肝臓ならびに／または肺の転移を示した患者５０人は、腫瘍進行前３４．３ヶ月の経過観察中央値（９５％ＣＩ，１１．６−６１．３ヶ月）を有した。これらの患者の年齢の中央値は５５．３歳であり（３６．２−９１．１歳）および経過観察の中央値は、３０．１ヶ月であった（９５％ＣＩ，１０．６−６１．３ヶ月）。
【０１７３】
ＭＭＰ−３、およびＭＭＰ−９の多型の分析は、統計学的優位を示すに至らなかった（それぞれｐ＝０．１８およびｐ＝０．６９）。しかし、ＭＭＰ−１の高い転写速度に関連した２Ｇ対立遺伝子の存在は、腹膜疾患の患者を遠隔転移の患者と比較した場合に転移の部位に関連した（ｐ＝０．０８）。
【０１７４】
患者１４人（２３％）はＭＭＰ−１  １Ｇ／１Ｇ遺伝子型を保有し、患者１５人（２５％）は、２Ｇ／２Ｇ遺伝子型を有し、および患者３０人（５０％）はこの改変体に関してヘテロ接合性であった。腹膜癌腫症のみの本研究参加人のうち、４０％（４／１０）は、１Ｇ／１Ｇ遺伝子型を有し、一方、２Ｇ／２Ｇ遺伝子型の参加人０％（０／１０）およびヘテロ接合性の参加人６０％（６／１０）は局所的疾患の症候を示した。遠隔転移を有した患者のうち、２０％（１０／４９）は、ホモ接合性２Ｇ対立遺伝子を有する３１％（１５／４９）および異型遺伝子型を有する４９％（２４／４９）と比較して、ホモ接合性１Ｇ対立遺伝子を保有した。
【０１７５】
２Ｇ対立遺伝子は、深部侵襲性の原発性腫瘍、それゆえの、皮膚悪性黒色腫（ＣＭＭ）患者の乏しい予後に関連し、ＣＭＭの攻撃性が、ＭＭＰ−１遺伝子プロモーターの変動により影響を受けることを示唆する（Ｙｅ  Ｓ．ら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：１２９６−１２９８）。ＭＭＰ−１発現は、結腸直腸癌の血液性の転移についての新規マーカーとして関係し、その阻害は、転移予防のための方法であり得ることを示す（Ｓｕｎａｍｉ  Ｅ．ら（２０００）Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ５：１０８−１１４）。ＭＭＰ−１免疫応答はまた、リンパ節および肝転移、腫瘍増殖パターンに有意に関連し、そしてさらに、リンパ侵襲、静脈侵襲、ならびに神経侵襲の存在に関連した（Ｓｈｉｏｚａｗａ  Ｊ．らＴｈｅ  Ｕ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３（９）：９２５−９３３）。
【０１７６】
そのため、２Ｇ対立遺伝子の遺伝は、結腸直腸癌および遠隔転移の侵襲に関連付けられることが示された。特に、ホモ接合性２Ｇ対立遺伝子を保有する患者は、増加したＥＣＭの分解に起因する遠隔転移の発生、血管新生の促進により遺伝的に感受性であり得る。
【０１７７】
（実施例１２−インターロイキン−８（ＩＬ−８）の遺伝子多型とそのレセプターＣＸＣＲ１との間の関連性および５ＦＵ／オキサリプラチン処置した転移性結腸直腸癌患者の延命）
ＣＸＣケモカインファミリーのメンバーであるインターロイキン８（ＩＬ−８）は腫瘍細胞の増殖および結腸直腸癌の転移に関与していることが知られている（Ｘｉｅ  Ｋ．（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  １２（４）：３７５−９１．）。そのレセプターＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２は、腫瘍の進行ならびに血管新生において欠く事のできない役割を有する（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｌ．Ｊ．ら（１９９８）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８（１Ａ）：７７−８１）。研究は、ＩＬ−８、ＣＸＣＲ１、およびＣＸＣＲ２の発現が、インビトロおよびインビボにおける腫瘍の進行そして転移の一因となることを示す（Ｂｒｅｗ  Ｒ．ら（２０００）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １２（１）：７８−８５）およびＬｉ  Ａ．ら（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（１０）：３２９８−３０４）。ＩＬ−８遺伝子のプロモーター領域の多型（Ｔ−２５１Ａ）およびＣＸＣＲ１遺伝子のエクソン２における新規の多型（Ｓｅｒ＋２６０７Ｔｈｒ）は、ＩＬ−８およびそのレセプターの発現に影響し得、そのため転移性結腸直腸癌患者の臨床結果に影響し得る（Ｈｕｌｌ  Ｊ．Ａ．ら（２０００）Ｔｈｏｒａｘ  ５５（１２）：１０２３−７およびＲｅｎｚｏｎｉ  Ｅ．ら（２０００）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４３（７）：１６３３−４０）。インターロイキンの高発現または活性に関連する遺伝子多型を伴う患者は、乏しい予後を有するという仮説をテストした。
【０１７８】
患者を１９９８年から２０００年の間Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／Ｎｏｒｒｉｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒでやさしいオキサリプラチンプロトコル３Ｃ−９８−３に登録した。化学療法レジメンは、以下：３週間毎にオキサリプラチン１３０ｍｇ／ｍ２および５−ＦＵ（２００ｍｇ／ｍ２／ｄ）の連続注入、であった。全ての患者は、以前に５−ＦＵ処置に失敗しており、および７９％は付加的な第２ラインのイリノテカン（ＣＰＴ−１１）処置に失敗した。延命を、５−ＦＵ／オキサリプラチン化学療法の開始日から死亡までで決定した。進行までの時間を、化学療法の開始日から、患者が疾患の進行により研究を離れるまでで決定した。最終の経過観察の評価の際に生存していた患者をこの時に検閲した。治療に応答したものを腫瘍の負担が少なくとも６週間で５０％以上減少した患者として分類した。進行型疾患を腫瘍の負担において２５％以上増加したものとして、または、新しい病巣の出現として定義した。５−ＦＵ／オキサリプラチンの開始の後、最初の１２週間以内に、応答しなかった患者および進行しなかった患者を、安定した疾患を有するとして分類した。患者４人は応答を評価するには、あまりにも早く、本研究から脱退したが、しかし彼らを、延命の決定に含めた。
【０１７９】
血液サンプルを、各個体から収集し、およびゲノムＤＮＡをＱｉａＡｍｐ  キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用することにより、末梢血リンパ球から抽出した。ＩＬ−８およびＣＸＣＲ１の多型を、ＰＣＲ−ＲＦＬＰを使用することにより行なった。
【０１８０】
（結果）患者群の全応答率は、９％であった。患者１６人のみが、生存し続け、ならびに６ヶ月から１８ヶ月までの経過観察期間を続ける。延命の中央値は、９．４ヶ月であり（９５％Ｃ．Ｉ．７．６−１２．８）、および進行までの時間の中央値は、５．０ヶ月であった（９５％Ｃ．Ｉ．４．４−６．５）。
【０１８１】
有意な関係（Ｐ＜０．０５）を、ＣＸＣＲ１エクソン２のＳｅｒ  ＋２６０７  Ｔｈｒ多型と、ＥＣＯＧ、組織学、または、以前のＣＰＴ−１１処置により層化された後、５−ＦＵ／オキサリプラチン処置した結腸直腸癌患者の全延命との間に見出した。
【０１８２】
ＣＸＣＲ１  ＧＣ遺伝子型を有する患者は、ＥＣＯＧ、組織学、または、以前のＣＰＴ−１１処置により層化された後のＧＣ遺伝子型を有する患者と比較して２．３５倍の死亡の相対危険度を有した。ＩＬ−８プロモーターの多型と全延命との間に優位な関係は、存在しない。また、臨床応答と両多型との間に優位な関係は存在しない。
【０１８３】
これは、ＩＬ−８レセプターのＣＸＣＲ１  Ｓｅｒ＋２６０７Ｔｈｒ多型が白金ベースの化学療法処置した結腸直腸癌患者の全延命に関連し得ることを示す始めての研究である。
【０１８４】
前述の実施例は、本明細書に記載した発明を例示することを意図するが、限定はされない。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１は、分子パラメーターに基づいて直腸癌における局所的再発までの時間を示す。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｂは、直腸癌患者の再発のない生存の推定確率対正常な直腸組織におけるＴＳ、ＤＰＤ、ＥＲＣＣ１およびＶＥＧＦの遺伝子発現を示す。実験の詳細について実験番号１を参照のこと。
【図２−２】図２Ｃ〜２Ｄは、直腸癌患者の再発のない生存の推定確率対正常な直腸組織におけるＴＳ、ＤＰＤ、ＥＲＣＣ１およびＶＥＧＦの遺伝子発現を示す。実験の詳細について実験番号１を参照のこと。
【図３】図３は、直腸癌患者の再発のない生存の推定確率対直腸癌組織におけるＶＥＧＦの遺伝子発現を示す。実験の詳細について実験番号１を参照のこと。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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