(57)【要約】本発明は、第１配列及び第２配列からなる複合体であって、該第１配列は輸送タンパク質からなり、該第２配列はノッチ（Notch）シグナル伝達調節のためのタンパク質又はかかるノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列からなることを特徴とする、複合体を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１配列及び第２配列からなる複合体であって、該第１配列は輸送タンパク質又は輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなり、該第２配列はノッチシグナル伝達調節のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドからなることを特徴とする、複合体。
【請求項２】
融合タンパク質の形態であることを特徴とする請求項１記載の複合体。
【請求項３】
第２配列が、ノッチシグナル伝達トランスダクションのためのポリペプチド又はポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
第２配列が、ノッチ又はノッチのシグナル伝達トランスダクション能を保持するその断片、又はノッチのシグナル伝達トランスダクション能を有するノッチのアナログ、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項３記載の複合体。
【請求項５】
第２配列が、ノッチ細胞内ドメイン（ノッチＩＣ）又はそれをコードするポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項４記載の複合体。
【請求項６】
第２配列が、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項４記載の複合体。
【請求項７】
第２配列が、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０若しくはＬＭＰ２Ａ、又はそれらをコードするポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項６記載の複合体。
【請求項８】
第２配列が、ノッチシグナル伝達活性化のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項９】
第２配列が、ノッチシグナル伝達リプレッサーのドミナントネガティブバージョン、又はノッチシグナル伝達リプレッサーのドミナントネガティブバージョンをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項８記載の複合体。
【請求項１０】
第２配列が、ノッチシグナル伝達リプレッサーの発現又は活性を阻害するポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項８記載の複合体。
【請求項１１】
第２配列が、核中で作用する作用剤又は該作用剤をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項１２】
第２配列が、ノッチシグナル伝達転写因子又はノッチシグナル伝達転写因子をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項１３】
第２配列が、ＤＮＡ結合剤又はＤＮＡ結合剤をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項１４】
第２配列が、ノッチアンキリンドメイン又はノッチアンキリンドメインをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の複合体。
【請求項１５】
第２配列が、さらにＲＡＭドメイン、ＰＥＳＴ配列若しくはＯＰＡ配列、又は該配列をコードするポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１４記載の複合体。
【請求項１６】
第２配列が、ノッチシグナル伝達阻害のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の複合体。
【請求項１７】
第２配列が、ノッチシグナル伝達の活性化因子若しくはトランスデューサーのドミナントネガティブバージョン、又はノッチシグナル伝達の活性化因子若しくはトランスデューサーのドミナントネガティブバージョンをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６記載の複合体。
【請求項１８】
第２配列が、ノッチシグナル伝達の活性化因子若しくはトランスデューサーの発現又は活性を阻害するポリペプチド又はポリヌクレオチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６記載の複合体。
【請求項１９】
第２配列が、ノッチの発現又は活性をダウンレギュレートすることができるポリペプチド、ノッチシグナル伝達経路のノッチリガンド若しくは下流コンポーネント、又はそれらをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６記載の複合体。
【請求項２０】
第２配列が、Ｔｏｌｌ様受容体、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、アクチビン、並びにそれらの誘導体、断片、変異体及び相同体、又はそれらをコードするポリヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項１９記載の複合体。
【請求項２１】
第１配列が、核移行タンパク質であることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか記載の複合体。
【請求項２２】
第１配列が、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質（ＶＰ２２）又はＶＰ２２輸送機能を保持する、その断片であることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか記載の複合体。
【請求項２３】
第１配列が、完全長ＶＰ２２配列であることを特徴とする請求項２２記載の複合体。
【請求項２４】
ＶＰ２２の断片が、完全長ＶＰ２２配列の約アミノ酸６０〜約アミノ酸３０１、又は完全長ＶＰ２２配列の約アミノ酸１５９〜約アミノ酸３０１からなることを特徴とする請求項２２記載の複合体。
【請求項２５】
第１配列が、ホメオドメイン又は輸送機能を保持する、その変異体からなることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか記載の複合体。
【請求項２６】
ホメオドメインが、アンテナペディア、フシタラズ又はエングレイルド由来であることを特徴とする請求項２５記載の複合体。
【請求項２７】
第１配列が、ＨＩＶｔａｔタンパク質又は輸送機能を保持する、その変異体であることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか記載の複合体。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか記載の複合体をコードする、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２９】
請求項２８記載のポリヌクレオチド配列からなる発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９記載の発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項３１】
複合体の発現を可能にする条件下で請求項３０記載の宿主細胞を培養することからなる、複合体の調製方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法により調製された複合体。
【請求項３３】
細胞を、請求項１〜２７又は３２のいずれか記載の融合タンパク質に曝露することからなる、ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド配列を細胞内に輸送する方法。
【請求項３４】
請求項１〜２７又は３２のいずれか記載の複合体、及び医薬的に許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体からなることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３５】
Ｔ細胞仲介疾患の治療に用いるための、請求項３４記載の医薬組成物。
【請求項３６】
疾患又は感染の予防及び／又は治療のための薬物の調製における請求項１〜２７又は３２のいずれか記載の複合体の使用。
【請求項３７】
疾患が、Ｔ細胞仲介疾患であることを特徴とする請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
添付図面を参照して実質的に請求項１〜３７に記載のとおりの複合体、ポリヌクレオチド配列、発現ベクター、宿主細胞、方法、医薬組成物又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子と、ノッチ（Notch）シグナル伝達調節のためのタンパク質をターゲティングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己抗原に対する免疫寛容は、哺乳類の免疫系が正しく機能するために不可欠である。近年、末梢性寛容を維持するための重要な機構として、胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に加え、調節性Ｔ細胞が仲介する能動的な抑制（active suppression）が同定された（国際公開公報ＷＯ９８／２０１４２号）。多発性硬化症、関節リウマチ又は糖尿病等の自己免疫疾患においては、寛容の調節が正しく行われない。自己免疫疾患においては、寛容を再確立する改善された治療方法が望ましい。同様に、アレルギー状態やドナー個体からの臓器又は組織移植においては、特定の外来性抗原又は外来性抗原のプロファイルに対する寛容の誘導が望ましい。
【０００３】
近年、抗原特異的寛容を他のＴ細胞に伝達することができる調節性Ｔ細胞のクラスの生成が可能であることが分かり、その過程は感染性寛容（infectious tolerance）と命名された（国際公開公報WO９８／２０１４２号）。これらの細胞の機能的活性は、その細胞表面又は抗原提示細胞表面にノッチリガンドタンパク質を過剰発現させることにより模倣することができる。特に、調節性Ｔ細胞は、ノッチリガンドタンパク質のデルタ（Delta）又はセラート（Serrate）ファミリーのメンバーの過剰発現により生成することができる。１つの抗原性エピトープに特異的なデルタ又はセラート誘導Ｔ細胞は、同じ又は関連する抗原の他のエピトープを認識するＴ細胞に対して寛容を移行（transfer）することができ、この現象は「エピトープ伝播（epitope spreading）」と命名されている。
【０００４】
また、国際公開公報ＷＯ００／３６０８９号は、アレルゲン又は抗原に対する寛容を有する又は寛容を誘導することができるリンパ球又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）を産生する方法を開示しており、かかる方法は、（ｉ）リンパ球及び／又はＡＰＣの中の内因性ノッチ又はノッチリガンドの発現をアップレギュレートすることができる組成物及び（ii）該アレルゲン又は抗原を用いて、ヒト又は動物患者から得たリンパ球又はＡＰＣをインキュベーションすることからなる。
【０００５】
しかしながら、かかる技術においては、Ｔ細胞仲介疾患又は障害等の疾患の検出、予防及び治療において有用な診断的又は治療的組成物のさらなる提供が必要とされている。本発明は、この問題に対し、Ｔ細胞等の細胞に効果的なノッチシグナルを直接輸送することにより対応する。
【発明の開示】
【０００６】
［発明の概要］
本発明の１つの態様においては、第１配列及び第２配列からなる複合体であって、該第１配列は輸送タンパク質又は輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなり、該第２配列はノッチ（Notch）シグナル伝達調節のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドからなることを特徴とする複合体を提供する。
【０００７】
本発明は、遺伝的融合又は化学的結合により形成され、ノッチシグナル伝達調節のための少なくとも１つのポリペプチド又はポリヌクレオチドに結合した少なくとも１つの輸送タンパク質からなる分子である、複合体に関連する。「結合した（linked）」とは、第１配列により標的細胞及び／又は標的細胞のコンパートメント（compartment）の中に第２配列を輸送できるように、第１配列と第２配列が会合することを意味する。したがって、複合体は、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子の遺伝子発現により輸送タンパク質がポリペプチド骨格を介してノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質に結合する融合タンパク質、直接的に合成するタンパク質、及び前形成（pre-formed）配列が架橋剤（cross-linking agent）により会合する結合タンパク質を含む。また、本発明において使用するこの用語は、ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質の、輸送タンパク質との会合、例えば、凝集体を含む。１つの実施態様によれば、第２配列は、ポリヌクレオチド配列、例えば、核酸結合ドメイン（例えば、転写因子結合部位）又はアンチセンス配列からなってもよい。この実施態様は、タンパク質／核酸複合体と考えることができる。
【０００８】
第２配列は、第１配列と同じ種から由来しているが自然状態とは異なる形態で本発明の複合体に存在するか、又は異なる種から由来してもよい。
【０００９】
本発明の複合体は、輸送アミノ酸配列に結合したポリペプチド配列に対応するエフェクター機能を標的細胞中で行うことができるように、細胞群による取り込み又は細胞内のコンパートメントへの誘導が可能である。
【００１０】
本発明の第２配列は、ノッチシグナル伝達調節のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドである。ノッチシグナル伝達調節は、上流及び下流の事象を含むノッチシグナル伝達経路のトランスダクション、活性化又は阻害に関与する。
【００１１】
ノッチシグナル伝達トランスダクションのためのポリペプチド又はポリヌクレオチドとしては、ノッチの活性化、ノッチシグナル伝達経路の下流の事象、下流標的遺伝子の転写制御、その他の非転写的な下流の事象（non-transcriptional downstream events）（例えば、既存タンパク質の転写後の調節）等のノッチ受容体を介したシグナル伝達に関与する分子が挙げられる。より具体的には、第２配列は、ノッチシグナル伝達経路の標的遺伝子の活性化を可能にするドメイン、又は該ドメインをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００１２】
すなわち、ノッチシグナル伝達トランスダクションの調節は、以下を含む。
ａ）（ｉ）リプレッサーのドミナントネガティブ又は阻害因子及び（ii）活性化因子によるノッチシグナル伝達経路の活性化；
及びｂ）（ｉ）活性化因子のドミナントネガティブ又は阻害因子及び（ii）阻害因子によるノッチシグナル伝達経路の遮断（blockade）。
【００１３】
ノッチ受容体／ノッチリガンド相互作用は、ノッチシグナル伝達経路の大変重要なコンポーネントである。ノッチシグナル伝達は、ノッチシグナル伝達経路膜タンパク質若しくはＧ−タンパク質、又はプロテアーゼ、キナーゼ（例えば、セリン／トレオニンキナーゼ）、ホスファターゼ、リガーゼ（例えば、ユビキチンリガーゼ）若しくはグリコシルトランスフェラーゼ等のノッチシグナル伝達経路酵素の活性の変化に関与してもよい。また、かかるシグナル伝達は、転写因子等のＤＮＡ結合要素の発現、性質、量又は活性の変化に関与してもよい。
【００１４】
本発明の好適な態様においては、シグナル伝達は、特定のシグナル伝達、すなわち、例えばサイトカインシグナル伝達等のいかなる著しい妨害又は矛盾する原因（competing cause）よりもむしろ、ノッチシグナル伝達経路、好ましくはノッチ／ノッチリガンド相互作用から実質的に又は少なくとも優性に生じるシグナル伝達であってもよい。下記にノッチシグナル伝達経路の詳細を説明する。
【００１５】
疑念を回避するため、本発明者らは、ショウジョウバエと脊椎動物の名前を同義として使用しており、両者（全てのホモログ）は本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
Enhancer of split複合体（Ｅ[ｓｐｌ]）の遺伝子は、ノッチ依存的転写活性化（Notch-dependent transcriptional activation）の重要なターゲットである。また、これらの遺伝子は、Ｓｕ（Ｈ）タンパク質による結合の直接的な標的であり、ノッチシグナル伝達に応答して転写的に活性化することが分かっている。哺乳類Ｓｕ（Ｈ）ホモログであるＣＢＦ１と相互作用してそれを転写リプレッサーから転写活性化因子に変換するウイルス性の活性化補助因子、ＥＢＮＡ２と類似して、ノッチ細胞内ドメインは、おそらく他のタンパク質と会合して、Ｓｕ（Ｈ）が他の標的遺伝子及びＥ（ｓｐｌ）の転写を活性化することができる活性化ドメインを導くためにＳｕ（Ｈ）と結合してもよい。また、Ｓｕ（Ｈ）は、全てのノッチ依存的決断（Notch-dependent decisions）に必要とされているわけではなく、それは、他のＤＮＡ結合転写因子との会合、又は細胞外シグナルをトランスダクションするための他の機構を用いることにより、ノッチがいくつかの細胞運命選択を仲介することを示す。
【００１７】
本発明の１つの態様によれば、第２配列は、ノッチポリペプチド又はポリヌクレオチド又はノッチのシグナル伝達トランスダクション能を保持するその断片、又はノッチのシグナル伝達トランスダクション能を有するノッチのアナログである。ノッチとは、ノッチ−１（図５に示す）、ノッチ−２（図６に示す）、ノッチ−３、ノッチ−４及びその他のあらゆるノッチホモログ又はアナログを意味する。特に好ましい実施態様においては、第２アミノ酸配列は、ノッチ細胞内ドメイン（ノッチＩＣ）又はそのサブ断片（sub-fragment）である。例えば、該配列は、ヒトノッチ１の少なくともアミノ酸１８４８〜２２０２を含む若しくはコードする配列、又はそのような配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有する配列であってもよい。
【００１８】
好適には、該配列は、アンキリン（Ankyrin）リピートドメイン及び任意のＬＮＲドメイン、ＲＡＭドメイン、ＯＰＡドメイン及び／又はＰＥＳＴ配列からなる。
【００１９】
ここに用いる「ノッチのアナログ」なる用語は、ノッチのシグナル伝達トランスダクション能を保持するその変異体を含む。「アナログ」なる用語は、ノッチシグナル伝達トランスダクション能を有するが通常はノッチとは異なる進化的起源を有するタンパク質を含む。ノッチのアナログとしては、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０又はＬＭＰ２Ａ等のエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質が挙げられる。
【００２０】
ノッチシグナル伝達活性化のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドとは、ノッチを活性化することができる分子、ノッチシグナル伝達経路又はノッチシグナル伝達経路の１つ以上のコンポーネントを意味する。
【００２１】
１つの実施態様においては、ノッチシグナル伝達活性化のための分子は、ノッチシグナル伝達リプレッサーのドミナントネガティブなバージョンである。別の実施態様においては、ノッチシグナル伝達活性化のための分子は、ノッチシグナル伝達リプレッサーを阻害することができる。さらに、別の実施態様においては、ノッチシグナル伝達活性化のための分子は、ノッチシグナル伝達のポジティブな活性化因子である。
【００２２】
好ましくは、該分子は、ノギン（Noggin）、コーディン（Chordin）、フォリスタチン（Follistatin）、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子、並びにそれらの誘導体、断片、変異体及びホモログから選択されるポリペプチド、又は前記のいずれか１つ以上をコードするポリヌクレオチドである。
【００２３】
別の実施態様においては、該分子は、ノッチリガンド又はノッチリガンドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。本発明において使用するノッチリガンドは、例えば造血幹細胞等の多様な哺乳類細胞の膜に存在するノッチ受容体ポリペプチドと通常は結合することができる内因性ノッチリガンドを含む。
【００２４】
現在までに同定されている哺乳類ノッチリガンドの具体例としては、例えば、デルタ又はデルタ様１（Genbankアクセッション番号ＡＦ００３５２２−ヒト（Homo sapiens））、デルタ−３（Genbankアクセッション番号ＡＦ０８４５７６−ドブネズミ（Rattus norvegicus））、デルタ様３（ハツカネズミ（Mus musculus））（Genbankアクセッション番号ＮＭ＿０１６９４１−ヒト）、ＵＳ６１２１０４５（ミレニアム（Millennium））、デルタ−４（Genbankアクセッション番号ＡＢ０４３８９４及びＡＦ２５３４６８−ヒト）等のデルタファミリー（Delta family）、セラート−１及びセラート−２（国際公開公報ＷＯ９７／０１５７１号、ＷＯ９６／２７６１０号及びＷＯ９２／１９７３４号）等のセラートファミリー（Serrate family）、Jagged−１（Genbankアクセッション番号Ｕ７３９３６−ヒト）及びJagged−２（Genbankアクセッション番号ＡＦ０２９７７８−ヒト）、ＬＡＧ−２が挙げられる。ファミリーメンバー間の相同性は、広範囲に及ぶ。
【００２５】
好適な実施態様においては、活性化因子は、常時活性型（constitutively active）ノッチ受容体若しくはノッチ細胞内ドメイン、又は該受容体若しくは細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドである。
【００２６】
別の実施態様においては、ノッチシグナル伝達の活性化因子は、ノッチ受容体の下流で作用する。したがって、例えば、ノッチシグナル伝達の活性化因子は、常時活性型デルテックス（Deltex）ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。本発明において使用するノッチシグナル伝達経路の他の下流コンポーネントとしては、好ましくは常時活性型の形態にある、デルテックス−１、デルテックス−２、デルテックス−３、デルテックスの抑制因子（ＳｕＤｘ）、Numb及びそのアイソフォーム、Numb会合キナーゼ（Numb associated Kinase）（ＮＡＫ）、ノッチレス（Notchless）、Dishevelled（Ｄｓｈ）、ｅｍｂ５、フリンジ遺伝子（Fringe genes）（例えば、ラジカル（Radical）、ルナティック（Lunatic）、マニック（Manic））、ＰＯＮ、ＬＮＸ、Disabled、Numblike、Ｎｕｒ７７、ＮＦｋＢ２、Mirror、Warthog、エングレイルド（Engrailed）−１及びエングレイルド−２、Ｌｉｐ１及びそのホモログ、デルテックスにより調節されるＲａｓ／ＭＡＰＫカスケードに関与するポリペプチド、プレセニリン（Presenilin）等のノッチのタンパク質分解性切断、ノッチ標的遺伝子の転写制御に関与するポリペプチド、並びにそれらのアナログ、誘導体、変異体及び断片が挙げられる。
【００２７】
また、ノッチシグナル伝達活性化のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドとは、ノッチ活性化の結果として発現するポリペプチド、及び該ポリペプチドの発現に関与するポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００２８】
また、ノッチシグナル伝達活性化は、ノッチシグナル伝達経路の阻害因子を抑制（repress）することにより達成できる。したがって、ノッチシグナル伝達活性化のためのポリペプチドは、ノッチシグナル伝達阻害因子を抑制することが可能な分子を含む。好ましくは、該分子は、ノッチ、ノッチリガンド又はノッチシグナル伝達経路の下流コンポーネントの発現又は活性を減少させることができる化合物の産生又は活性を、減少又は妨害する（interfere）ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。好適な実施態様においては、該分子は、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質ファミリーのポリペプチド及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等の増殖因子、ＢＭＰ受容体、アクチビン、それらの誘導体、断片、変異体及びホモログを抑制することができる。
【００２９】
ノッチシグナル伝達阻害のためのポリペプチド又はポリヌクレオチドとは、ノッチ、ノッチシグナル伝達経路又はノッチシグナル伝達経路の１つ以上のコンポーネントを阻害することができる分子を意味する。
【００３０】
１つの実施態様においては、ノッチシグナル伝達阻害のための分子は、ノッチシグナル伝達を活性化又はトランスダクションすることができる化合物のドミナントネガティブなバージョンである。また、別の実施態様においては、ノッチシグナル伝達阻害のための分子は、ノッチシグナル伝達を活性化又はトランスダクションすることができる化合物を抑制することができる。さらに、別の実施態様においては、ノッチシグナル伝達阻害のための分子は、ノッチシグナル伝達の阻害因子である。
【００３１】
特定の実施態様においては、分子は、ノッチ又はノッチリガンド発現を減少又は防止することができる。該分子は、ノッチ又はノッチリガンド発現を減少又は防止することができる核酸配列であってもよい。
【００３２】
好ましくは、該核酸配列は、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質ファミリーより選択されるポリペプチド、又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等の増殖因子、ＢＭＰ受容体及びアクチビンをコードする。好ましくは、かかる物質（agent）は、ノギン、コーディン、フォリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子並びにそれらの誘導体、断片、変異体及びホモログなどのノッチリガンドの発現を増加することができる化合物の産生を減少又は妨害する、ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３３】
また、該核酸配列は、ノッチリガンドより選択されたポリペプチドと、ノギン、コーディン、フォリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子並びにそれらの誘導体、断片、変異体及びホモログなどのノッチリガンドの発現をアップレギュレートすることができるポリペプチドをコードするセンス核酸配列由来のアンチセンスコンストラクトである。
【００３４】
別の好適な実施態様においては、ノッチシグナル伝達の阻害因子は、ノッチ−ノッチリガンド相互作用を調節することができる分子である。分子が、好ましくは治療効果を与えるのに十分な範囲まで、ノッチとそのリガンドとの相互作用を阻害することができる場合、該分子はノッチ−ノッチリガンド相互作用を調節すると考えられる。
【００３５】
本実施態様においては、分子は、Ｔｏｌｌ様受容体又はＢＭＰ等の増殖因子、ＢＭＰ受容体及びアクチビンより選択される、ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。好ましくは、該ポリペプチドは、ノギン、コーディン、フォリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子並びにそれらの誘導体、断片、変異体、ホモログ及びアナログなどのノッチリガンドの発現を増加することができる物質の産生を減少又は妨害する。
【００３６】
好ましくは、該阻害因子が、受容体又は受容体をコードする核酸配列である場合、該受容体は活性化される。したがって、例えば、かかる物質が核酸配列である場合、該受容体は発現したときに常時活性型である。
【００３７】
ノッチシグナル伝達の阻害因子は、ノッチシグナル伝達経路の下流阻害因子（例えば、Ｄｓｈ及びＮｕｍｂ）、ノッチ標的遺伝子の発現を防止又はノッチシグナル伝達経路により抑制される遺伝子の発現を誘導する化合物、及びノッチシグナル伝達トランスデューサー分子のドミナントネガティブなバージョン（例えば、ノッチＩＣ及びデルテックスのもの）を含む。また、ノッチシグナル伝達阻害のためのタンパク質は、その存在がシグナル伝達経路をトランスダクションするよりもむしろ遮断するように調節された、ノッチシグナル伝達経路の野生型コンポーネントの変異体も含む。かかる化合物の例としては、その細胞内ドメインのタンパク質分解性切断ができなくなるように調節された、ノッチ受容体が挙げられる。
【００３８】
また、モジュレーターは、抗体又は抗体をコードするヌクレオチド配列であってもよい。「抗体」なる用語は、インタクトな分子（intact molecules）及びその断片、例えば、エピトープの決定因子を結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等を含む。これらの抗体断片は、その抗原又は受容体と選択的に結合する能力をいくらか保持し、例えば、以下のものを含む。
（ｉ）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片であり、インタクトな軽鎖及び１本の重鎖の一部を得るために、パパイン酵素を用いて全抗体を消化することにより産生することができる。
（ii）Ｆａｂ'は、抗体分子の断片であり、インタクトな軽鎖及び１本の重鎖の一部を得るために、全抗体をペプシンで処理し、その後、還元することにより得られる。１つの抗体分子あたり２つのＦａｂ’断片が得られる。
（iii）Ｆ（ａｂ' ）2は、抗体の断片であり、全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後に還元を行わないことにより得られる。Ｆ（ａｂ' ）2は、２つのジスルフィド結合により結合する２つのＦａｂ’断片の二量体である。
（iv）ｓｃＦｖは、重鎖及び軽鎖の可変領域を融合単鎖分子として含む、遺伝子改変を行った断片を含む。
【００３９】
これらの断片を作製する一般的な方法については、当該技術においてよく知られている（例えば、引用により開示に含まれる、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)を参照のこと）。
【００４０】
本発明において使用する輸送タンパク質は、細胞膜を移動（translocate）することができる膜移動タンパク質であり、好適な実施態様においては、核膜をも移動する。該タンパク質が、細胞／核の外側又は内側のどちらから移動するかは、無関係である。すなわち、該タンパク質は、細胞質又は核の中で発生して（例えば、そこで合成さたり、そのコンパートメント内に挿入されることによる）、その発生した地点の細胞コンパートメント（細胞質又は核）の外側の位置に移動してもよい。通常、該タンパク質は、細胞外で調製され、外側の位置から細胞質へ移動し、任意に核中へと移動する。
【００４１】
ここで使用する「細胞膜移動（cell membrane translocation）」なる用語は、タンパク質の、細胞膜を貫通して細胞の細胞質ゾル／細胞質に入る能力、又は細胞の細胞質ゾル／細胞質から外側、細胞外又は間質内のスペースを貫通する能力を意味する。
【００４２】
「核膜移動（nuclear membrane translocation）」なる用語は、タンパク質の、細胞核を囲む膜構造を通過する能力、又は細胞の細胞質ゾル／細胞質から核を通過する能力を意味する。
【００４３】
使用において、ここに記載した多くの生産物は、標的細胞群の第１部分の融合タンパク質として表すことができ、そこから輸出して、該タンパク質を直接産生しない標的細胞群の第２部分により取り込まれる。第１部分及び第２部分の細胞は、同じ又は異なる種類の細胞であってよい。また、本発明においては、かかるベクターからなる哺乳類及び微生物宿主細胞、又は融合タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド、及びそれらの製造と使用が範囲に含まれる。
【００４４】
ここに記載する融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は他のベクターを、標的細胞群の第１部分の中に導入することにより、標的細胞群に輸送することができる。例えば、トランスフェクション又はマイクロインジェクションを行い、コードするポリヌクレオチドを発現して融合ポリペプチドを産生し、それを該標的集団の該第１部分から輸出し、また、融合ポリペプチドを直接産生しない標的細胞群の第２部分により取り込まれるようにする。
【００４５】
結合した生産物は、結合した生産物の調製に細胞を直接曝露（expose）して標的細胞がそれらを取り込むようにすることにより、標的細胞群中に輸送することができる。
【００４６】
好ましい輸送タンパク質としては、ＶＰ２２、アンテナペディア、ＨＩＶｔａｔ等が挙げられる。
【００４７】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」なる用語は、同義と考えてよく、内因性、改変、合成及び／又は天然配列（natural sequence）やそれらの変異体、誘導体、アナログ及び断片を意味する。「ポリヌクレオチド」なる用語は、ヌクレオチドの内因性、改変、合成及び／又は天然鎖（natural chain）（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を意味し、例えば、タンパク質コードドメイン、アンチセンス配列又はタンパク質結合ドメイン等の機能的モチーフや、それらの変異体、誘導体、アナログ及び断片を含んでもよい。また、この用語は、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを意味する。
【００４８】
本発明において有用な「タンパク質」の定義の範囲内では、特定のアミノ酸残基を、問題のタンパク質がその内因性機能の少なくとも１つを保持するように改変してもよく、かかる改変タンパク質を、「変異体」と呼ぶ。変異タンパク質は、自然発生タンパク質（naturally-occurring protein）に存在する少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により改変することができる。
【００４９】
通常、アミノ酸の置換は、改変した配列がノッチシグナル伝達を調節するための輸送活性又は能力を保持するという条件で、例えば、１、２又は３〜１０又は２０の置換から行うことができる。アミノ酸置換は、非自然発生アナログ（non-naturally occurring analogues）の使用を含んでもよい。
【００５０】
本発明において使用されるタンパク質もまた、サイレントな変化（silent change）を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を行って、機能的に同等の（equivalent）タンパク質になってもよい。輸送又は調節機能が保持される限りは、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質の類似性に基づいて、計画的な（deliberate）アミノ酸置換を行ってもよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としては、リジン、アルギニン等が挙げられ、同じ親水性の値（hydrophilicity values）を有する非荷電のpolar headグループを持つアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン等が挙げられる。
【００５１】
同類置換（conservative substitution）は、例えば、下記の表に従って行うことができる。第２カラムの同じブロックのアミノ酸、好ましくは第３カラムの同じ行にあるアミノ酸は、互いに置換することができる。
【００５２】
【表１】
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ここで使用するように、「タンパク質」なる用語は、単鎖ポリペプチド分子や、個々の構成物であるポリペプチドが共有結合又は非共有結合の方法で結合する多重ポリペプチド複合体を含む。ここで使用するように、「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、単量体がアミノ酸であってペプチド又はジスルフィド結合を介して結合する、重合体を意味する。「サブユニット」及び「ドメイン」なる用語も、生物学的機能を有するポリペプチド及びペプチドを意味してよい。本発明において有用なペプチドは、少なくとも輸送又はシグナル伝達調節を行うことができる。また、「断片」は変異体であり、この用語は、一般的には結合アッセイにおいて対象のタンパク質の選択された領域や、結合するパートナーが既知又は決定できるものを意味する。したがって、「断片」とは、完全長ポリペプチドの一部である、長さにして約８〜約７４５アミノ酸、好ましくは約８〜約３００、より好ましくは約８〜約２００アミノ酸、さらにより好ましくは約１０〜約５０又は１００アミノ酸のアミノ酸配列を意味する。「ペプチド」とは、長さにして１０〜４０アミノ酸、好ましくは１０〜３５アミノ酸の短いアミノ酸配列を意味する。
【００５３】
かかる変異体は、部位特異的変異誘発等の標準的な組換えＤＮＡ技術を用いることにより調製することができる。挿入される場所は、挿入部位のいずれかの側の自然発生配列（naturally-occurring sequence）に対応する５'及び３’フランキング領域と共に挿入をコードする合成ＤＮＡである。配列が適切な酵素により切断され、かかる切断に合成ＤＮＡが結合するように、かかるフランキング領域は、自然発生配列における部位に対応する簡便性の（convenient）制限部位を含む。その後、かかるＤＮＡは本発明に従って発現し、コードされたタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列操作に関する多数の当該技術分野において公知の標準的な技術の実例にすぎず、その他の公知の技術を用いてもよい。
【００５４】
また、ヌクレオチド配列の変異体を作製してもよい。かかる変異体は、好ましくは、コドンを最適化した配列からなる。コドンの最適化は、当該技術分野において、ＲＮＡの安定性の強化、すなわち遺伝子発現の方法として知られている。遺伝コードの重複性は、いくつかの異なるコドンが同じアミノ酸をコードしてもよいことを意味する。例えば、ロイシン、アルギニン及びセリンは、それぞれ６つの異なるコドンにコードされる。異なる生物は、異なるコドンの使用に対して優先度を示す。例えば、ＨＩＶ等のウイルスは、多数の珍しいコドンを使用する。かかる珍しいコドンが対応する一般的に使用される哺乳類コドンに置換されるようにヌクレオチド配列を変更することにより、哺乳類標的細胞における配列の発現の増加を達成することができる。哺乳類細胞においてもその他の多数の生物においても、コドン使用表（codon usage tables）が当該技術分野において知られている。
【００５５】
本発明の１つの実施態様においては、輸送タンパク質又はノッチシグナル伝達のためのタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つが、哺乳類細胞中の発現のためにコドンが最適化されている。
【００５６】
好ましい実施態様においては、配列は、完全に最適化されている。
【００５７】
自然発生又は合成配列の、膜を移動する能力、又はノッチシグナル伝達に影響を与える能力は、当該技術分野において既知のルーチン的な方法により調べることができる。
【００５８】
膜を移動する能力を保持する既知の輸送タンパク質のいくつかの変異体が当該技術分野において報告されており、これらは、利用可能になるものと共に本発明の範囲に含まれる。
【００５９】
この能力を保持する、ノッチシグナル伝達調節のための既知のタンパク質のいくつかの変異体が当該技術分野において報告されており、これらは、利用可能になるものと共に本発明の範囲に含まれる。
【００６０】
好ましくは、組換え技術を用いることにより、未変性タンパク質を調製する。
【００６１】
本発明のさらなる態様においては、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００６２】
「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はいずれかのタイプのヌクレオチドを改変した形態のいずれかの、長さにして約１０塩基から１０００塩基以上の、ヌクレオチドの重合体の形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖及び二重鎖の形態を含む。
【００６３】
これらは、標準的な組換えＤＮＡ方法論を用いて構築することができる。核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであってよく、ＤＮＡであることが好ましい。該核酸がＲＮＡである場合、ｃＤＮＡ中間体を介して操作を行ってもよい。一般的に、第１領域をコードする核酸配列を調製し、５'及び／又は３’末端で適切な制限部位が与えられる。好都合なことに、該配列は、例えばpBR322又はpUC19に基づくプラスミドベクター（下記を参照のこと）等の標準的な実験ベクター中で操作する。適切な技術の詳細については、Sambrook et al.のMolecular Cloning（Cold Spring Harbor, 1989）又は同様の標準的な参考図書を参考にすることができる。
【００６４】
同様に、第２領域をコードする核酸も、類似のベクター系において提供される。
【００６５】
核酸のソースについては、既刊文献又はGenBank等のデータバンクを参考にすることにより確認することができる。所望の第１又は第２配列をコードする核酸は、材料を提供しても構わないという学問的ソース若しくは商業的ソース、又は配列データがそこからしか利用可能でない適切な配列の合成又はクローニングにより得ることができる。一般的に、問題の遺伝子のクローニングについて開示する文献ソースを参照することにより行うことができる。
【００６６】
また、利用可能な配列データが限られている場合や、既知の核酸に対して相同性あるいは関連性を有する核酸の発現が要求される場合、典型的な核酸は、当該技術分野において既知の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列として特徴づけることができる。遺伝子は、ヒト又はショウジョウバエの学名の元で同義として用いる。遺伝子への言及は、遺伝子そのもの及びそのホモログを意味する。
【００６７】
遺伝子コードの縮重（degeneracy）の結果として、多数の異なるヌクレオチド配列が、本発明において使用される同じ輸送タンパク質又はノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質をコードできることは、当業者には明らかである。また、当業者が、ルーチン的な技術を用いることにより、本発明のヌクレオチド配列によりコードされる輸送タンパク質又はノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質に影響を与えないヌクレオチド置換を行って、本発明の輸送タンパク質又はノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質を発現する特定の宿主生体のコドン使用を反映するかも知れないことは理解されるであろう。
【００６８】
一般的に、本発明において使用されるヌクレオチド配列との関連において用いる「変異体」、「ホモログ」又は「誘導体」なる用語には、配列における核酸１個（若しくは２個以上）の置換、変異、改変、交換、欠失、付加を含むものとするが、但し、それらの結果として得られるヌクレオチド配列が輸送タンパク質又はノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質をコードすることとする。
【００６９】
上記のように、配列相同性に関しては、基準配列（reference sequences）に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する。上記に従って、ヌクレオチドの相同性比較を行ってもよい。好ましい配列比較プログラムとして挙げられるのが、上記のＧＣＧウィスコンシンベストフィットプログラム（GCG Wisconsin Bestfit program）である。デフォルトスコアマトリックス（default scoring matrix）は、各同一ヌクレオチドに対しては１０、各ミスマッチに対しては−９のマッチ値（match value）を有する。各ヌクレオチドに対して、デフォルトギャップ作成ペナルティー（default gap creation penalty）は−５０であり、デフォルトギャップ延長ペナルティー（default gap extension penalty）は−３である。
【００７０】
また、本発明は、基準配列に対して選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、又はその変異体、断片若しくは誘導体、又は前記のいずれかの補体も範囲に含む。ヌクレオチド配列は、好ましくは、長さにして１５ヌクレオチド、より好ましくは、長さにして少なくとも２０、３０、４０又は５０ヌクレオチドである。
【００７１】
ここに使用する「ハイブリダイゼーション」なる用語は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）技術を用いる増幅過程を意味すると同様に、「塩基対形成（base pairing）により核酸鎖が相補鎖と結合する過程」を意味する。
【００７２】
ここに提示するヌクレオチド配列、又はその補体に選択的にハイブリダイズすることができる本発明において有用なヌクレオチド配列は、ここに提示する対応するヌクレオチド配列に対して、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５又は３０、例えば少なくとも４０、６０又は１００以上の近接したヌクレオチドの範囲で、一般的には少なくとも７５％、好ましくは８５％又は９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％又は９８％の相同性を有する。本発明における好ましいヌクレオチド配列は、配列番号２又は配列番号３に示すヌクレオチド配列に対して相同性を有する領域からなり、好ましくは配列番号２又は配列番号３に示すヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。
【００７３】
「選択的にハイブリダイズできる（selectively hybridizable）」なる用語は、プローブとして用いられるヌクレオチド配列を、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドより著しく高いレベルでプローブをハイブリダイズする条件下で使用することを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーション（background hybridization）は、存在する他のヌクレオチド配列、例えば、スクリーニングされるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーにより生じる。この場合、バックグラウンドは、１０倍以下、好ましくは標的ＤＮＡにおいて観察される特定の相互作用の強度で１００倍以下のライブラリーの非特定ＤＮＡメンバーとプローブとの間の相互作用により生じるシグナルのレベルを意味する。相互作用の強度については、例えば、プローブを32Ｐで放射標識することにより測定することができる。
【００７４】
ハイブリダイゼーション条件は、Berger and Kimmel の教示（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA）にあるように核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいて、下記に説明するように定義付けられた「ストリンジェンシー」を用いる。
【００７５】
最大限のストリンジェンシーは通常、おおよそＴｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で生じ、高度なストリンジェンシーはＴｍより約５℃〜１０℃低い温度下で生じ、中程度のストリンジェンシーはＴｍより約１０℃〜２０℃低い温度下で生じ、低度のストリンジェンシーはＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度下で生じる。当業者には明らかであるが、最大限のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、一致するヌクレオチド配列を同定若しくは検出するために用いられ、中程度（又は低度）のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、類似の若しくは関連するヌクレオチド配列を同定若しくは検出するために用いられる。
【００７６】
好適な特徴として本発明は、ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  Ｎａ3、クエン酸、ｐＨ７．０｝）で本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列の使用を含む。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖である場合、二本鎖の両方の鎖は個々に又は組み合わせで、本発明の範囲に含む。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合、そのヌクレオチド配列の相補配列も、本発明の範囲に含まれる。
【００７７】
本発明の配列に対して１００％の相同性を有さないが、本発明の範囲内にあるヌクレオチド配列は、多数の方法により得ることができる。ここに記載する配列の他の変異体は、例えば、様々なソースから作製したＤＮＡライブラリーをプローブすることにより得られる。また、他のウイルス性／細菌性ホモログ又は細胞性ホモログ、特に哺乳類細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）中の細胞性ホモログを得てもよく、かかるホモログ及びその断片は、一般的には、ここに含まれる配列表に示す配列と選択的にハイブリダイズすることができる。かかる配列は、他の動物種から作製したｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすることにより得られる。また、かかるライブラリーを中程度から高度のストリンジェンシー条件下にある基準ヌクレオチド配列の全て又は一部からなるプローブとプローブすることにより得られる。本発明において有用なアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列の種、ホモログ及び対立遺伝子変異体（allelic variants）を得る際に、同様に検討することができる。
【００７８】
変異体及び系統／種ホモログは、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする変異体及びホモログ中の配列を標的にするように設計されたプライマーを用いる、縮重ＰＣＲ法（degenerate PCR）を用いて得ることもできる。例えば、アミノ酸配列をいくつかの変異体／ホモログからアラインすることにより、保存配列を予測することができる。配列のアラインメントは、当該技術分野において既知のコンピュータソフトウエアを用いて実行することができる。例えば、ＧＣＧウィスコンシンパイルアッププログラム（GCG Wisconsin PileUp program）が広く使用されている。縮重ＰＣＲ法において用いられるプライマーは、１つ以上の縮重位置（degenerate position）を含み、既知の配列に対して単一配列プライマーを使用するクローニング配列に用いられる条件より低いストリンジェンシー条件で使用される。
【００７９】
また、かかるヌクレオチド配列は、特徴付けをした配列の部位特異的変異誘発により得ることができる。これは、例えば、ヌクレオチド配列を発現した特定の宿主細胞のコドン優先度を最適化するためにサイレントなコドンの変化が要求される場合に、有用かも知れない。制限酵素認識部位の導入、又はヌクレオチド配列がコードする輸送タンパク質若しくはノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質の活性を変化させるために、他の配列変化が必要とされるかも知れない。
【００８０】
本発明において有用なＤＮＡポリヌクレオチド等のヌクレオチド配列は、組換え、合成、又はその他の当業者が利用可能な方法により生成する。また、標準的な技術によりそれらをクローニングしてもよい。
【００８１】
一般的に、プライマーは合成的な手段により生成し、所望の核酸配列を１つずつ、段階的に製造する。自動化した技術を用いてこれを達成する技術は、当該技術分野において既に利用可能である。
【００８２】
より長いヌクレオチド配列は、組換え手段、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）クローニング技術を用いることにより生成することができる。これは、プライマーの対の作製（例えば、約１５から３０ヌクレオチド）、クローニングが要求される標的配列の領域のフランキング、該プライマーと動物細胞又はヒト細胞から得たｍＲＮＡ又はｃＤＮＡとの接触、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の実行、増幅した断片の単離（例えば、アガロースゲルの反応混合物の調製による）及び増幅したＤＮＡの回復が行われる。該プライマーは、増幅したＤＮＡが適切なクローニングベクターにクローニングできるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計してもよい。
【００８３】
本発明におけるさらなる態様によると、本発明のポリヌクレオチド配列からなる発現ベクター；本発明の発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞；融合タンパク質の発現を生じる条件下で本発明の宿主細胞を培養することからなる、本発明の融合タンパク質の調製方法；本発明の複合体に細胞を曝露（expose）することからなる、ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質を細胞内に輸送する方法；本発明の方法により調製する複合体；特に、Ｔ細胞仲介疾患（T-cell mediated disease）の治療に用いるための、本発明の複合体からなる医薬組成物；及び、疾患又は感染、特にＴ細胞仲介疾患の予防及び／又は治療の薬剤を調製するための、本発明の複合体の使用に関する。
【００８４】
本発明における多数の好ましい特徴及び実施態様を、限定のない実施例及び添付の図面を参照して、より詳細に説明する。
【００８５】
本発明の実施は、特に記載が無い限りは、通常の技能を有する者の技能の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技術を使用するものである。かかる技術は、文献において説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照のこと。これらの一般的な図書はそれぞれ、ここに引用することにより開示に含む。
【００８６】
輸送タンパク質
ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質（ＶＰ２２）
ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ２２タンパク質（ＶＰ２２）は、ＷＯ９７／０５６２５号に記載されている３８ｋＤａタンパク質であり、Elliott & O'Hareが輸送機能を示している。ＶＰ２２は、ＨＳＶ１遺伝子であるＵＬ４９（GenBankＸ１４１１２）の生産物である。ＶＰ２２は、発現する細胞の細胞質から輸送され、隣接細胞の核に蓄積する。また、ＶＰ２２は、発現しない細胞に取り込まれ、核中で蓄積する。したがって、ＶＰ２２配列のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列への融合は、有用な細胞運搬ベクター（cell delivery vector）を提供することができる。
【００８７】
本明細書において、「ＶＰ２２」は、水痘帯状疱疹ウイルスＶＺＶ、ウマヘルペスウイルスＥＨＶ、ウシヘルペスウイルスＢＨＶ等の他のヘルペスウイルス由来の輸送活性ホモログを含む、例えばＨＳＶ１等のＨＳＶのタンパク質ＶＰ２２並びに輸送活性断片及びそのホモログや、ＨＳＶ１のＶＰ２２の輸送機能に対応する輸送機能を有する変異タンパク質を意味する。
【００８８】
輸送活性を有するヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質の断片のうち、ＷＯ９７／０５２６５号は、完全ＨＳＶ１  ＶＰ２２配列（ａａ１〜３０１）のアミノ酸（ａａ）６０〜３０１及び１５９〜３０１に対応するポリペプチドが輸送活性を有することを報告している。
【００８９】
したがって、本発明は、１つの態様においては、好ましくは約ａａ１５９（又はそれ以前、自然（native）ＶＰ２２配列におけるＮ末端に向かって）から約ａａ３０１で始まり、例えば、Ｎ末端から言及した（cited）開始地点まで伸長することができるＶＰ２２配列の少なくとも一部で少なくとも１つの欠失を有する（完全ＶＰ２２配列と比較して）、例えば約ａａ１〜１５８の配列の全て又は一部を欠失した配列を含む、ＶＰ２２のサブ配列からなる結合及び融合タンパク質に関する。
【００９０】
ここで検討するＶＰ２２配列は、他のヘルペスウイルス由来のＶＰ２２タンパク質ホモログの配列に基づく相同タンパク質及び断片を包含する。例えば、本発明は、対応する誘導体や、ＶＺＶ（例えば、ａａ１〜３０２からの配列の全て又は相同性を有する部分）由来、ＭＤＶ（例えば、ａａ１〜２４９からの配列の全て又は相同性を有する部分）由来及びＢＨＶ（例えば、ａａ１〜２５８からの配列の全て又は相同性を有する部分）由来の配列の既知のＶＰ２２ホモログの使用を提供する。ＨＳ  Ｖ２、ＶＺＶ、ＳＨＶ及びＭＤＶ由来の対応するタンパク質の配列は、一般のタンパク質／核酸配列データベースにおいて利用可能である。したがって、例えば、ＥＭＢＬ／Genbankデータベースにおいては、ＨＳＶ２由来のＶＰ２２配列は、ＨＳＶ２系統であるＨＧ５２の完全ゲノムを含むアクセッション番号Ｚ８６０９９に基づき遺伝子項目（gene item）ＵＬ２９として利用可能であり、相同遺伝子／タンパク質を含むＶＺＶの完全ゲノムは、アクセッション番号Ｘ０４３７０及びＭ１４８９１に基づき利用可能である。ＢＨＶ由来の対応するタンパク質配列であるＭ１６６１２は、アクセッション番号Ｕ２１１３７の「ウシヘルペスウイルス１ビリオン外被タンパク質」として利用可能である。また、ＭＤＶの対応する配列は、「トリヘルペスウイルスタイプ１相同配列遺伝子」のアクセッション番号Ｌ１０２８３に基づく遺伝子項目ＵＬ４９として利用可能である。これらのタンパク質において、特にＨＳＶ２及びＶＺＶ由来のものは、例えば、ＨＳＶ１由来のＶＰ２２のａａ１〜１５９に対して相同性を有する配列の、対応する欠失が可能である。
【００９１】
さらに、キメラＶＰ２２タンパク質及びタンパク質配列は、本発明の背景において有用である。例えば、別のヘルペスウイルスの対応するＶＰ２２ホモログからの相同配列の一部が置換されている、ＨＳＶ１のＶＰ２２からのタンパク質配列である。例えば、ＨＳＶ１のＶＰ２２ポリペプチド１５９〜３０１の配列において、Ｃ末端配列をＨＳＶ２のＶＰ２２又はＢＨＶのＶＰ２２ホモログから置換することができる。
【００９２】
ホメオドメイン
ホメオドメインは、一般的に、効率的なトランスダクションベクターとして使用できることが提案されており（Jeon）、したがって、本発明において使用することができる。
【００９３】
ホメオタンパク質は、複数の形質学的な過程に関与するトランス活性化因子である。これらは、６０アミノ酸残基の配列、いわゆるホメオドメインを介してＤＮＡに結合する。このドメインの構造は、へリックス２と３との間のβ−turnにより妨害される３つのα−へリックスからなる（Gehring et al.）。多数のホメオタンパク質の間の系統学的関係は、ホメオドメインのレベルで著しく、特に第３のα−へリックス内において顕著である。このヘリックスは、ホメオタンパク質が非特異的に細胞膜から細胞核へと移動する能力と同様に、ＤＮＡとの相互作用の責任がある。本発明の好適な実施態様において使用してもよいホメオドメインの例としては、アンテナペディア（Antennapedia）、フシタラズ（Fushi-tarazu）及びエングレイルド（Engrailed）のホメオドメインが挙げられる。
【００９４】
特に好適な実施態様においては、アンテナペディアのホメオドメインを使用する。具体的には、遺伝子アンテナペディア（Ａｎｔｐ）は、ショウジョウバエ胚における前後の形態形成を制御することが示された転写因子をコードする。アンテナペディアのタンパク質配列は、特定ＤＮＡ標的要素（target elements）と結合する６０アミノ酸モチーフ（ホメオドメイン）の存在により特徴づけられる。多細胞生物のほとんど全てにおいてアンテナペディアホモログが見つかっており、かなり高度なアミノ酸配列同一性を示す。ヒトとショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質は、ホモドメインの配列において１つの保存的なアミノ酸置換（conservative amino acid substitution）によってのみ異なる。
【００９５】
アンテナペディアとそのホメオドメインは、哺乳類細胞の細胞質膜を貫通して移動できることが観察されている。かかる移動は、細胞エンドサイトーシスに依存せず、４℃及び３７℃で移動が生じることが報告されている。Ｄアミノ酸で生成したホメオドメイン合成ペプチドも、細胞質膜を貫通することができる。この知見により、Ａｎｔｐが受容体により仲介された機構を介して移動する可能性はなくなる。インフルエンザウイルスの核タンパク質に対するＭＨＣクラスＩで制限される細胞障害性免疫応答を誘発すると同様に、小さいウイルス配列を培養細胞の細胞質に小胞化するために、この特性は生かされている（exploited）。
【００９６】
Ａｎｔｐ遺伝子のホメオドメインは、好ましくはショウジョウバエより得ることができる。このホメオドメインに対して相同性を有する配列は、脊椎動物、哺乳類及びヒトを含む他の生物から単離されており、これらは本発明の範囲に含む。ホメオドメインは、クローニング等の標準的な技術を用いることにより調製することができる。前述のように、かかる多細胞生物の配列における違いは、一般的には自然界において保存されている（conservative in nature）。しかしながら、本発明においては必ずしもそのような状態とは限らず、他のそのような配列も含まれ、例えば、配列の同一性がショウジョウバエより入手可能な配列と比較して、約５０％又はそれ以上、例えば、６０％、７０％、８０％又は９０％の場合が挙げられる。
【００９７】
欧州特許第４８５５７８号は、ホメオドメインと特にホメオボックスペプチドのへリックス３、特にショウジョウバエのアンテナペディア由来のものは、細胞内輸送ベクターとして使用できることを開示している。かかる特許は、ショウジョウバエのアンテナペディアホメオペプチド（pAntpペプチドと称する）の特定５７アミノ酸配列が、線維芽細胞及び胚細胞を（インビボで）貫通することができることを開示した。へリックス３及び４と対応する配列の最後の２７アミノ酸が強調された。
【００９８】
その後の開示（Derossi D et al. (1994), Derossi D et al. (1996), Joliot et al., Perez F et al.）は、生理活性生産物（bioactive products）及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内送達（intracellular delivery）に使用することができる、アンテナペディアホメオドメインの第３へリックス由来の１６アミノ酸合成ペプチドに注目してきた。このペプチドのアミノ酸配列は、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫであり、ペネトラチンとしても知られている。上記著者らは、その研究の過程において、この配列のいくつかの変異体を合成し、これらはpAntpペプチドの残基４１〜６０、４１〜５５及び４６〜６０に対応する。全ての場合において、細胞中にインターナライズ（internalise）するペプチドは、残基４３〜５８を含むものだけであった（上記Derossi D et al.）。
【００９９】
このペプチドの酵素的切断を防ぐため、Brugidou J et al.は、ペネトラチンの位置３及び５の２つのイソロイシン残基をバリンと置換し、Ｃ末端にグリシン残基を付加して樹脂への結合を促進し、retro-inversoな形態（逆の順番のＤアミノ酸）を調製した。余分なグリシンを、スルフィドリルリンカー基を介して付着したコレステロール部分と交換することにより、さらなるretro-inversoな形態を調製した。分子の疎水性の増加により、コレステロール部分の追加が貫通を改善した。
【０１００】
ペネトラチンのretro-inverso形態の開発により、ＷＯ９７／１２９１２号において、いずれかの末端から６つ目のアミノ酸がトリプトファンでなければならない、６〜１０の疎水性アミノ酸からなる１６アミノ酸のペプチドが開示された。この開示は、インターナリゼーションベクターとして作用することができる配列の最小の特徴が、アミノ終端から６つ目の位置のトリプトファンの保持であり、ペプチドが６〜１０個の疎水性アミノ酸残基を含む（ＷＯ９７／１２９１２号の疎水性アミノ残基は、一般的に認められている分類とは一致していないと考えられている）ことを定義しようと試みている。
【０１０１】
上記の開示により、ＷＯ９７／１２９１２号に要約されているように、ホメオドメインペプチドの膜移動特性によって重要なのは、アミノ終端から６つ目の残基としてトリプトファン残基が存在することである。これらの要件を満たしているのが、移動能を有すると開示されている式（ＫＷＫＫ）4のペネトラチン変異体であり、それは、各ＫＷＫＫが次のリジン残基に結合する（ＫＷＫＫ）2ＫＧＧＣ等の多数の分枝膜移動ペプチド（branched membrane translocating peptides）を開示する。
【０１０２】
さらに、ＷＯ００／２９４２７号には、以下の式を有する変異体が開示されている。
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ
１                            １６
かかる式において、アミノ終端から少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失している変異体、又はその変異体が開示されている。したがって、細胞膜を移動する能力は、pAntpペプチドの残基４３〜５８を全て含まない配列によって保持されることが観察されている。
【０１０３】
ＨＩＶｔａｔタンパク質
調製したヒト免疫不全ウイルスタイプ１（「ＨＩＶ」）ｔａｔタンパク質は、培地中で増殖するヒト細胞により周囲の培地から取り込まれる（A. D. Frankel and C. O. Pabo）。Ｔａｔタンパク質は、特定のＨＩＶ遺伝子をトランス活性化し、ウイルス複製に必須である。完全長ＨＩＶ−１ｔａｔタンパク質は、８６アミノ酸残基を有する。ＨＩＶｔａｔ遺伝子は、２つのエクソンを有する。Ｔａｔアミノ酸１〜７２は、エクソン１によりコードされ、アミノ酸７３〜８６は、エクソン２によりコードされる。完全長ｔａｔタンパク質は、２つのリジン及び６つのアルギニンからなる基本領域（basic region）（アミノ酸４９〜５７）と、７つのシステイン残基からなる高システイン領域（アミノ酸２２〜２３７）により特徴づけられる。
【０１０４】
基本領域（すなわち、アミノ酸４９〜５７）は、核の局在化（nuclear localization）のために重要であると考えられている（Ruben, S. et al.; Hauber, J. et al.）。高システイン領域は、金属連結二量体（metal-linked dimers）の形成をインビトロで仲介し（Frankel, A. D. et al., and Frankel, A. D. et al.）、そのトランス活性化因子としての活性に必須である（Garcia, J. A. et al. And Sadaie, M. R. et al.）。その他の調節タンパク質のように、Ｎ末端領域は、細胞内プロテアーゼに対する保護に関与してもよい（Bachmair, A. et al.）。
【０１０５】
本発明の好ましい輸送ポリペプチドは、ｔａｔ基礎領域アミノ酸配列（自然発生ｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７）の存在、ｔａｔ高システイン領域アミノ酸配列（自然発生ｔａｔタンパク質のアミノ酸２２〜３６）の欠如、及びｔａｔエクソン２コードカルボキシ末端ドメイン（自然発生ｔａｔタンパク質のアミノ酸７３〜８６）の欠如により特徴づけられる。かかる輸送ポリペプチドの好適な実施態様は、ｔａｔ３７〜７２、ｔａｔ３７〜５８、ｔａｔ３８〜５８ＧＧＣ、ｔａｔＣＧＧ４７〜５８、ｔａｔ４７〜５８ＧＧＣ及びｔａｔＡｃｙｓである。輸送タンパク質がカーゴ部分（cargo moiety）に遺伝的に融合するとき、アミノ末端メチオニンを付加しなければならないが、スペーサーアミノ酸（例えば、ＣｙｓＧｌｙＧｌｙ又はＧｌｙＧｌｙＣｙｓ）は付加しなくてもよいことは、当該技術分野における通常の技術を有する者には明らかであろう。
【０１０６】
ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質
ａ．ノッチシグナル伝達トランスダクションのためのポリペプチド及びポリヌクレオチド
ノッチシグナル伝達経路は、胚におけるバイナリー細胞運命決定（binary cell fate decisions）を導く。ノッチは、最初にショウジョウバエにおいて、２つの異なるリガンドであるデルタ及びセラートの受容体として機能する膜貫通タンパク質として説明された。脊椎動物は、複数のノッチ受容体及びリガンド（下記に説明する）を発現する。ヒト細胞においては、現在までに少なくとも４つのノッチ受容体（ノッチ−１、ノッチ−２、ノッチ−３及びノッチ−４）が同定されている。
【０１０７】
ノッチタンパク質は、さらに加工（processed）されて成熟受容体を形成する２つのポリペプチド鎖を得るフューリン様転換酵素（Furin-like convertase）を介して切断する、単一ポリペプチド前駆体として合成する。血漿中にあるノッチ受容体は、２つのノッチタンパク質分解性切断産物のヘテロ二量体からなる。１つは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの一部からなるＮ末端断片を含み、もう１つは細胞外ドメインの大部分を含む。受容体を活性化するためのノッチのタンパク質分解性切断ステップが生じ、フューリン様転換酵素により仲介される。
【０１０８】
ノッチ受容体は、３６の上皮細胞成長因子（ＥＦＧ）様リピートを含む細胞外ドメイン及び細胞質ドメインを含む膜貫通サブユニットからなる、ジスルフィド結合ヘテロ二量体分子ととして、膜中に挿入される。ノッチの細胞質ドメインは、６つのアンキリン様リピート、ポリグルタミン伸長（ＯＰＡ）及びＰＥＳＴ配列を含む。ＲＡＭ２３と称するさらなるドメインは、アンキリンリピートと近位に位置し、ショウジョウバエにおけるSuppressor of Hairless[Ｓｕ（Ｈ）]及び脊椎動物におけるＣＢＦ１として知られる転写因子との結合に関与する（Tamura）。また、ノッチリガンドは、その細胞外ドメインにおいて、全てのノッチリガンドの特長である高システインＤＳＬ（Delta-Serrate Lag2）ドメインと共に複数のＥＧＦ様リピートを示す（Artavanis-Tsakonas）。ノッチ及びノッチ細胞内ドメインを表す概略図を、図１及び２に示す。
【０１０９】
ノッチ受容体は、デルタ、セラート、Scabrous等の細胞外リガンドと、ノッチ細胞外ドメインのＥＧＦ様リピートとの結合により活性化する。デルタは、活性化の際に切断を必要とする。デルタは、細胞表面のＡＤＡＭディスインテグリンメタロプロテアーゼKuzbanian（ADAM disintegrin metalloprotease Kuzbanian）により切断され、かかる切断の事象は、デルタの可溶性で活動的な形態を放出（releasing）する。切断型細胞外ドメインを有する、ＴＡＮ−１としても知られているヒトノッチ−１タンパク質の発癌性変異体は、常時活性型であり、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病に関与することが見い出されている。
【０１１０】
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメインリピートは、細胞内シグナルトランスダクションタンパク質との物理的相互作用を仲介する。とりわけ、ｃｄｃ１０／アンキリンリピートは、Suppressor of Hairless[Ｓｕ（Ｈ）]と相互作用する。Ｓｕ（Ｈ）は、エプスタインバーウイルスで誘発したＢ細胞の不死化に関与する哺乳類ＤＮＡ結合タンパク質である、Ｃ−プロモーター結合因子−１[ＣＢＦ−１]のショウジョウバエホモログである。少なくとも培養細胞において、Ｓｕ（Ｈ）は細胞質中のｃｄｃ１０／アンキリンリピートと会合し、ノッチ受容体とそのリガンドデルタが隣接細胞で相互作用すると、核中に移動する。Ｓｕ（Ｈ）は、いくつかの遺伝子のプロモーターにある応答配列（responsive elements）を含み、ノッチシグナル伝達経路における重要な下流タンパク質であることが分かっている。転写におけるＳｕ（Ｈ）の関与は、Hairlessにより調節されると考えられている。
【０１１１】
ノッチ（ノッチＩＣ）の細胞内ドメインも、直接的な核機能を有する（Lieber）。最近の研究により、ノッチ活性化は、ノッチ細胞内ドメインの６つのｃｄｃ１０／アンキリンリピートが核に到達して転写活性化に参加することを必要とすることが分かった。ノッチの細胞内カルボキシル末端（intracellular tail）のタンパク質分解性切断部位は、ｇｌｙ１７４３〜ｖａｌ１７４４の間であると同定された（部位３又はＳ３と称する）（Schroeter）。核の侵入のためにｃｄｃ１０／アンキリンリピートを放出するタンパク質分解性切断のステップは、プレセニリン活性に依存すると考えられている。
【０１１２】
細胞内ドメインは、核中で蓄積し、そこでＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（ショウジョウバエにおけるhairless、Ｓｕ（Ｈ）、C. elegansにおけるＬａｇ−２の抑制因子）と転写活性因子複合体を形成することが明らかになっている（Schroeter; Struhl）。その後、ノッチＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、ｂＨＬＨタンパク質であるＨＥＳ（hairy-enhancer of split like）１及び５などの標的細胞を活性化する（Weinmaster）。ノッチのこの核機能は、哺乳類ノッチホモログ（Ｌｕ）においても明らかになっている。
【０１１３】
ノッチ細胞内ドメインのプロセシング（processing）は、ノッチリガンドであるデルタ又はセラート／Jaggedの結合に応答してのみ、生じる。ゴルジ（Golgi）（Munro; Ju）中の新生ノッチ受容体の転写後の修飾は、少なくとも一部において生じ、細胞表面で２種類のリガンドのうちどれが発現するかを制御する。ノッチ受容体は、ノッチ／Ｌｉｎモチーフに結合する糖転移酵素であるフリンジ（Fringe）により、その細胞外ドメインで修飾される。フリンジは、ＥＧＦ様リピートにＯ−結合したフコース群を付加することによりノッチを修飾する（Moloney; Bruckner）。このフリンジによる修飾は、リガンド結合を妨げないが、ノッチにおけるリガンドを誘導した高次構造的変化（conformational changes）に影響を与えるかも知れない。さらに、最近の研究により、フリンジの作用がノッチを修飾して、ノッチがセラート／Jaggedリガンドと機能的に相互作用することを防ぎ、優先的にデルタと結合することを可能にすることが示唆されている（Panin; Hicks）。ショウジョウバエは、フリンジ遺伝子を１つ有するが、脊椎動物は、複数の遺伝子を発現することが知られている（ラディカル（Radical）、マニック（Manic）及びルナティック（Lunatic）フリンジ）（Irvine）。
【０１１４】
したがって、ノッチ受容体からのシグナルトランスダクションは、２つの異なる経路を介して生じる可能性があり、それを図３及び４に示す。ノッチシグナル伝達経路の標的遺伝子には、デルテックス、Ｈｅｓファミリー由来の遺伝子（特に、Ｈｅｓ−１）、Enhancer of Split[Ｅ（ｓｐｌ）]複合遺伝子（complex genes）、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、ＣＤ−４及びＤ１１−１が含まれる。
【０１１５】
細胞内ドッキングタンパク質であるデルテックスは、ノッチの細胞内カルボキシル末端と相互作用する位置を離れるに従って、Ｓｕ（Ｈ）を置換する。これを、図３に示す。デルテックスは、ジンクフィンガーを含む細胞質タンパク質である（Artavanis-Tsakonas; Osborne）。それは、ノッチ細胞内ドメインのアンキリンリピートと相互作用する。研究により、デルテックスがＧｒｂ２との相互作用及びＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路の調節によりノッチ経路の活性化を促進することが示唆されている（Matsuno）。また、デルテックスはＳｕ（Ｈ）がノッチの細胞内カルボキシル末端と結合することを防ぐドッキングタンパク質として作用する（Matsuno）。したがって、Ｓｕ（Ｈ）は、核中に放出され、転写モジュレーターとして作用する。最近得られた証拠は、脊椎動物のＢ細胞系においては、Ｅ４７機能を阻害する原因となっているのはＳｕ（Ｈ）ホモログＣＢＦ１よりむしろ、デルテックスであることを示唆している（Ordentlich）。デルテックスの発現は、ポジティブなフィードバックループにおけるノッチ活性化の結果、アップレギュレートされる。ヒトデルテックス（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡの配列は、GenBankアクセッション番号ＡＦ０５３７００に示されている。
【０１１６】
Ｈｅｓ−１（Hairy/Enhancer of Split-1）（Takebayashi）は、基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有する転写因子である。それは、ＣＤ４サイレンサー（silencer）における重要な機能的部位と結合し、ＣＤ４遺伝子発現の抑圧（repression）をもたらす。したがって、Ｈｅｓ−１は、Ｔ細胞運命に強く関係している。Ｈｅｓファミリー由来のその他の遺伝子としては、同様にノッチ活性化によりアップレギュレートされるＨｅｓ−５（哺乳類Enhancer of Splitホモログ）、及びＨｅｓ−３が挙げられる。ノッチ活性化の結果として、Ｈｅｓ−１の発現はアップレギュレートする。Ｈｅｓ−１の配列は、GenBankアクセッション番号ＡＫ００４１５及びＡＦ２６４７８５に示されている。
【０１１７】
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体[Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ]（Leimeister）は、Ｅ（ｓｐｌ）及びGrouchoのみが、変異体であるときに可視表現型を示す７つの遺伝子からなる。Ｅ（ｓｐｌ）は、Splitがノッチの別名であることから、Split変異を強化する能力から名付けられた。実際、Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子は、acaete-scute複合体遺伝子発現の制御を介してデルタを抑圧する。ノッチ活性化の結果として、Ｅ（ｓｐｌ）の発現はアップレギュレートする。
【０１１８】
ＩＬ−１０（インターロイキン−１０）は、Ｔｈ２ヘルパーＴ細胞及び調節性Ｔ細胞が生成する因子である。それは、マスト細胞増殖のコレギュレーターであり、エプスタインバーｂｃｒｆｉ遺伝子に対して広範囲の相同性を示す。それは、ノッチシグナル伝達経路の直接的な下流標的としては知られていないが、その発現はノッチ活性化と一致して高度にアップレギュレートし、そのプロモーターにはいくつかのＣＢＦ１応答配列（response elemtens）が存在することが分かっている。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列は、GenBank参照番号ＧＩ１０４１８１２に示されている。
【０１１９】
ＣＤ−２３は、Ｂ細胞活性化及び増殖の主要な分子である、ヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）である。それは、ＩｇＥの低親和性受容体である。さらに、切断された分子は、分泌して、その後、強力な分裂促進増殖因子（mitogenic growth factor）として機能してもよい。その発現は、ノッチシグナル伝達経路の直接的な下流標的ではないと考えられているが、ノッチ活性化により高度にアップレギュレートされることが確認された。ＣＤ−２３の配列は、GenBank参照番号ＧＩ１７８３３４４に示されている。
【０１２０】
ＣＴＬＡ４（細胞障害性Ｔリンパ球活性タンパク質４）は、Ｔ細胞表面に存在するアクセサリー分子であり、アレルゲン吸入後の気道の炎症細胞補充やＴヘルパー細胞分化の制御の役割を果たすと考えられている。ＣＴＬＡ４をコードする遺伝子のプロモーター領域にはＣＢＦ１応答配列があり、ノッチ活性化の結果として、その発現はアップレギュレートする。ＣＴＬＡ４の配列は、GenBankアクセッション番号Ｌ１５００６に示されている。
【０１２１】
ノッチ活性化の結果として、Ｄｌｘ−１（distalless-1）（McGuiness）発現はダウンレギュレートする。Ｄｌｘ遺伝子の配列は、GenBankアクセッション番号Ｕ５１０００−３に示されている。
【０１２２】
ノッチ活性化の結果として、ＣＤ−４発現はダウンレギュレートする。ＣＤ−４抗原の配列は、GenBankアクセッション番号ＸＭ００６９６６に示されている。
【０１２３】
Numb、Mastermind、Ｄｓｈ等の、ノッチシグナル伝達経路に関与するその他の遺伝子や、ノッチ活性化により発現が調節される全ての遺伝子は、本発明の範囲に含むものとする。
【０１２４】
ノッチＩＣのアナログ
上記のように、ノッチ受容体ファミリーは、Ｔ細胞運命決定に影響を与える細胞−細胞シグナル伝達事象に関与する。このシグナル伝達において、ノッチＩＣは核に局在化し、活性化した受容体として機能する。哺乳類ノッチＩＣは、転写リプレッサーであるＣＢＦ１と相互作用する。この相互作用において、ノッチＩＣ  ｃｄｃ１０／アンキリンリピートが必須であることが示唆されている。Hseih et al.は、マウスノッチＩＣのＮ末端１１４アミノ酸領域が、ＣＢＦ１相互作用ドメインを含むことを示唆している。また、ノッチＩＣは、核中でＤＮＡ結合ＣＢＦ１をターゲティングすることにより作用し、抑圧ドメイン（repression domain）をマスキング（masking）することによりＣＢＦ１仲介抑圧を消滅させることができると提案されている。タンパク質ＥＢＮＡ''を不死化するエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、ＣＢＦ１抑圧Ｂ細胞遺伝子の発現をアップレギュレートするためにＣＢＦ１テザー（tethering）及びマスキングを使用することが知られている。したがって、ノッチシグナル伝達トランスダクションの模倣（mimicry）は、ＥＢＶ誘導不死化に関与している。同様に、Strobl et al.は、「したがって、ＥＢＮＡ２は活性化したノッチ受容体と機能的に同質のものと考えられる」と報告している。この分類に含まれる他のＥＢＶタンパク質としては、ＢＡＲＦ０（Kusano and Raab-Traub）及びＬＭＰ２Ａが挙げられる。
【０１２５】
ｂ．ノッチシグナル伝達活性化のためのポリペプチド及びポリヌクレオチド
現在までに同定されている哺乳類ノッチリガンドの具体的な例としては、例えば、デルタ−１（GenBankアクセッション番号ＡＦ００３５２２−ヒト）、デルタ−３（Genbankアクセッション番号ＡＦ０８４５７６−ドブネズミ（Rattus norvegicus））、デルタ−様３（ハツカネズミ（Mus musculus））、デルタ−４（Genbankアクセッション番号ＡＢ０４３８９４）等のデルタファミリー、セラート−１及びセラート−２（ＷＯ９７／０１５７１号、ＷＯ９６／２７６１０号及びＷＯ９２／１９７３４号）のセラートファミリー、Jagged−１及びJagged−２（Genbankアクセッション番号ＡＦ０２９７７８−ヒト（Homo sapiens））、ＬＡＧ−２が挙げられる。ファミリー間の相同性は、広範囲に及ぶ。例えば、ヒトJagged−２はセラートに対し、４０．６％の同一性及び５８．７％の類似性を示す。
【０１２６】
さらに、既知の哺乳類ノッチリガンドのホモログは、標準的な技術を用いて同定することができる。「ホモログ」とは、例えば、上記のように、既知のノッチリガンドのいずれかに対するアミノ酸配列相同性又は核酸配列相同性のいずれかの配列相同性を示す遺伝子産物を意味する。一般的に、既知のノッチリガンドのホモログは、少なくとも２０％、好ましくは３０％が、既知のノッチリガンドに対応するアミノ酸レベルで同一である。２つ以上のアミノ酸又は核酸の間の配列同一性を計算するための技術やソフトウエアは、当該技術分野において周知である（例えば、 HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov" http://www.ncbi.nlm.nih.gov及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと）。
【０１２７】
現在までに同定されているノッチリガンドは、タンパク質のアミノ末端で２０〜２２アミノ酸及び細胞外表面で３〜８ＥＧＦ様リピートからなる、特徴的なＤＳＬドメイン（Ｄ．デルタ、Ｓ．セラート、Ｌ．Ｌａｇ２）を有する。したがって、ノッチリガンドのホモログが、Ｎ末端でＤＳＬドメイン及び細胞外表面で３〜８ＥＧＦ様リピートを含むことが好ましい。
【０１２８】
また、適切なホモログは、ノッチ受容体に結合することができる。インビトロ結合アッセイを含む、当該技術分野において周知の様々な技術を用いることにより、結合を評価することができる。
【０１２９】
ノッチリガンドのホモログは、多数の方法により同定することができる。例えば、中程度〜高度のストリンジェンシー条件下（例えば、約５０℃〜約６０℃で０．０３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）で、ノッチリガンドをコードする核酸の全て又は一部からなるプローブを用いて遺伝子又はｃＤＮＡライブラリーをプローブすることができる。また、保存されたアミノ酸配列をコードする変異体及びアナログの中で配列をターゲティングするように設計されたプライマーを一般的に使用する、縮重ＰＣＲ法を用いることにより、ホモログを得ることができる。該プライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、既知の配列に対して単一配列プライマーを使用するクローニング配列に用いられる条件より低いストリンジェンシー条件で使用される。
【０１３０】
ノッチシグナル伝達経路を活性化することができるその他の物質としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の活性を減少又は中和するポリペプチドなど、ノッチリガンド発現をアップレギュレートすることができる化合物を含む。細胞外ＢＭＰ（Wilson and Hemmati-Brivanlou, Hemmati-Brivanlou and Melton）がその受容体に結合すると、achaete／scute複合体の転写因子の発現の阻害により、デルタ転写がダウンレギュレートする。この複合体は、デルタ発現の制御に直接関与すると考えられている。したがって、ＢＭＰ発現及び／又はＢＭＰとその受容体との結合を阻害する物質は、デルタ及び／又はセラート等のノッチリガンドの発現を増加させることができる。該阻害因子の具体的な例としては、ノギン（Valenzuela）、コーディン（Sasai）、フォリスタチン（Iemura）、Ｘｎｒ３並びにそれらの誘導体及びアナログが挙げられる。ノギン及びコーディンはＢＭＰと結合し、デルタ転写の減少をもたらすそれらのシグナル伝達カスケードの活性を防止する。結果として、ノギン及びコーディンのレベルの上昇は、ノッチリガンド、特にデルタの発現の上昇をもたらすかも知れない。
【０１３１】
さらに、achaete／scute複合体の転写因子の発現をアップレギュレートする物質は、ノッチリガンド発現もアップレギュレートするかも知れない。
【０１３２】
ノッチリガンド発現をアップレギュレートするために使用してもよいその他の適切な物質としては、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーなど、形質転換成長因子が挙げられる。ＦＧＦは、哺乳類塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、又はＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７等の他のＦＧＦファミリーメンバーであってもよい。好ましくは、ＦＧＦは酸性ＦＧＦではない（ＦＧＦ−１、Zhao）。最も好ましくは、ＦＧＦは、ＡＰＣに対するセラートポリペプチドの発現のアップレギュレーションを刺激することにより作用する、ＦＧＦファミリーのメンバーである。ＦＧＦファミリーのメンバーは、ＡＰＣにおいてセラート−１遺伝子発現をアップレギュレートすることができることが分かっている。
【０１３３】
ノッチ又はノッチリガンドの発現をアップレギュレートすることができる物質は、合成及び天然化合物を含む、ポリペプチド及びその断片、リニアペプチド（linear peptide）、環状ペプチドから選択されてもよい。ノッチリガンドの発現をアップレギュレートすることができる物質は、細胞外マトリックスのコンポーネント等の生物学的物質から由来したものであってよい。適切な細胞外マトリックスのコンポーネントは、眼などの免疫学的な特権部位（privileged sites）由来である。例えば、眼房水又はそのコンポーネントを使用してもよい。
【０１３４】
ノギン、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β等のポリペプチド物質は、適切な宿主細胞の組換え発現により得た哺乳類細胞から調製するか、又は市販のものから得ることができる。また、ポリペプチドをコードする核酸構築物を使用してもよい。さらなる例として、デルタ又はセラート等のノッチ又はノッチリガンドの過剰発現は、セラート又はデルタ遺伝子等の内在性遺伝子を活性化することができる核酸構築物を導入することによって誘発することができる。特に、遺伝子活性化は、相同組替えを用いて、標的細胞のゲノムにおいて、セラート又はデルタプロモーター等の自然プロモーター（natural promoter）の代わりに異種プロモーターを挿入することにより達成することができる。
【０１３５】
本発明の活性分子は、別の実施態様においては、細胞膜又はシグナル伝達経路における、ノッチ−タンパク質発現又は提示を修正することができる。標的細胞表面の完全に機能的なノッチ−タンパク質の提示を強化する剤（agent）としては、ショウジョウバエのKuzbanian遺伝子（Ｄｋｕｚ）及び他のADAMALYSIN遺伝子ファミリーメンバーの生産物等のマトリックスメタロプロテイナーゼが挙げられる。
【０１３６】
ｃ．ノッチシグナル伝達阻害のためのポリペプチド及びポリヌクレオチド
ノッチリガンド発現を阻害するために使用できる物質としては、ノッチリガンドをコードする遺伝子の発現に影響を与えるポリペプチドをコードする核酸配列が挙げられる。例えば、デルタ発現においては、細胞外ＢＭＰ（骨形成タンパク質、Wilson and Hemmati-Brivanlou；Hemmati-Brivanlou and Melton）がその受容体に結合すると、achaete／scute複合体の転写因子の発現の阻害により、デルタ転写がダウンレギュレートする。この複合体は、デルタ発現の制御に直接関与すると考えられている。したがって、ＢＭＰ発現をアップレギュレートする及び／又はＢＭＰとその受容体との結合を刺激するポリペプチドは、デルタ及び／又はセラート等のノッチリガンドの発現を減少することができる。例えば、ＢＭＰ自体をコードする核酸が挙げられる。さらに、achaete／scute複合体の転写因子の発現を阻害するいかなる物質も、ノッチリガンド発現をダウンレギュレートするかも知れない。
【０１３７】
ＢＭＰファミリーのメンバーとしては、ＢＭＰ１〜ＢＭＰ６、ＯＰ１とも呼ばれるＢＭＰ７、ＯＰ２（ＢＭＰ）等が挙げられる。ＢＭＰは、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属し、それはＴＧＦ−βに加え、アクチビン／インヒビン（例えば、α−インヒビン）、ミューラー阻害物質及びグリア細胞株由来神経栄養因子を含む。
【０１３８】
デルタ及び／又はセラートの発現を阻害するその他のポリペプチドとしては、Ｔｏｌｌ様受容体（Medzhitov）又は先天性免疫反応系（innate immune system）（例えば、ＣＤ１４、補体受容体、スカベンジャー受容体又はデフェンシンタンパク質）と結合する他の受容体、並びにノギン（Valenzuela）、コーディン（Sasai）、フォリスタチン（Iemura）、Ｘｎｒ３やそれらの誘導体及び変異体（Hoyne）の産生を減少又は妨害するポリペプチドが挙げられる。ノギン及びコーディンは、ＢＭＰと結合し、デルタ転写の減少をもたらすそれらのシグナル伝達カスケードの活性化を防ぐ。したがって、ノギン及びコーディンのレベルを減少させることは、ノッチリガンド、特にデルタの発現の減少をもたらすかも知れない（Hoyne et al, 2000）。
【０１３９】
具体的には、ショウジョウバエにおいては、Ｔｏｌｌ膜貫通受容体は、とりわけ自然で非特異的な免疫反応（innate nonspecific immune response）を制御するシグナル伝達経路における中心的な役割を果たす。このＴｏｌｌ仲介免疫反応は、広範囲の生物の相同的なコンポーネントを有する先祖の（ancestral）保存されたシグナル伝達システムを反映する。ヒトＴｏｌｌホモログは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）遺伝子及び／又はＴｏｌｌ／インターロイキン−１受容体様（ＴＩＬ）遺伝子の間で同定され、特徴的なＴｏｌｌモチーフを含む。すなわち、細胞外の高ロイシンリピートドメイン及び細胞質インターロイキン−１受容体様領域である。Ｔｏｌｌ様受容体遺伝子（ＴＩＬ遺伝子を含む）には、現在、ＴＬＲ４、ＴＩＬ３、ＴＩＬ４及びその他４つの同定されたＴＬＲ遺伝子が含まれる。
【０１４０】
ノッチリガンドの発現をダウンレギュレートするために使用してもよいその他の適切な配列としては、免疫共刺激分子（immune costimulatory molecules）（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＳＬＡＭ）をコードするものや、免疫増強（immune potentiation）（例えば、ＣＤ２、ＬＦＡ−１）と会合するその他のアクセサリー分子が挙げられる。
【０１４１】
ノッチリガンド発現をダウンレギュレートするために使用してもよいその他の適切な物質としては、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー等の形質転換成長因子の効果を阻害する核酸が挙げられる。ＦＧＦは、哺乳類塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、又はＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７等の他のＦＧＦファミリーのメンバーであってもよい。好ましくは、ＦＧＦは、酸性ＦＧＦではない（ＦＧＦ−１、Zhao et al., 1995）。最も好ましくは、ＦＧＦは、ＡＰＣに対するセラートポリペプチドの発現のアップレギュレーションを刺激することにより作用するＦＧＦファミリーのメンバーである。本発明者らは、ＦＧＦファミリーのメンバーが、ＡＰＣにおいてセラート−１遺伝子発現をアップレギュレートできることを示した。
【０１４２】
適切な核酸配列としては、アンチセンス構築物、例えば、ノッチリガンド発現のアップレギュレーターの発現を減少又は阻害するように設計された、アンチセンス及びアンチセンスノッチリガンド構築物をコードする核酸配列が挙げられる（上記参照のこと）。アンチセンス核酸配列は、合成一本鎖ＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドであってもよい。しかしながら、より好ましくは、アンチセンスは、遺伝子ベクターを導入した結果、患者の自己細胞中で産生されるアンチセンスＲＮＡである。該ベクターは、ベクターを宿主細胞中に導入する際に、要求された特異性のアンチセンスＲＮＡを産生する責任を有する。
【０１４３】
好ましくは、本発明における使用のための核酸配列は、セラート及びデルタ、好ましくはセラート１及びセラート２、並びに樹状細胞等のＡＰＣの発現におけるデルタ１、デルタ２、デルタ３及びデルタ４の発現を阻害することができる。特に、核酸配列は、セラート発現を阻害することができるが、ＡＰＣにおけるデルタ発現を阻害できないかも知れない。また、本発明における使用のための核酸配列は、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞等のＴ細胞におけるデルタ発現、又はデルタを発現する免疫系の他の細胞を阻害することができる（例えば、細胞表面受容体の刺激に応答する）。特に、核酸配列はデルタ発現を阻害することができるかも知れないが、Ｔ細胞におけるセラーと発現を阻害しない。特に好ましい実施態様においては、核酸配列は、Ｔ細胞及びＡＰＣの両方におけるノッチリガンド発現、例えば、ＡＰＣにおけるセラート発現及びＴ細胞におけるデルタ発現を阻害することができる。
【０１４４】
ノッチリガンド発現をダウンレギュレートするために使用してもよい好適な物質としては、成長因子及びサイトカインが挙げられる。より好ましくは、可溶性タンパク質成長因子（soluble protein growth factors）を用いてノッチ又はノッチリガンド発現を阻害するために使用してもよい。例えば、ノッチリガンド発現は、ＢＭＰ又はアクチビン（ＴＢＦ−βスーパーファミリーのメンバー）の付加により減少又は阻害してもよい。また、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α等の炎症型サイトカインの存在下で、単独又はＢＭＰと組み合わせることによりＴ細胞、ＡＰＣ又は腫瘍細胞を培養することができる。
【０１４５】
ノッチシグナル伝達を阻害するための分子としては、ポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、それは細胞膜又はシグナル伝達経路のノッチ−タンパク質発現又は提示を修正することができる。完全な機能的細胞膜タンパク質としての提示を減少又は妨害する分子としては、ヒドロキシメート性（hydroxymate-based）阻害因子等のＭＭＰ阻害因子を含んでもよい。
【０１４６】
ノッチとノッチリガンドとの間の相互作用を減少するために使用してもよいその他の物質としては、内在性ノッチ又はノッチリガンド又はそれらの機能的誘導体が挙げられる。該ノッチリガンド誘導体は、好ましくは、Ｎ末端にＤＳＬドメイン及び細胞外表面に３〜８ＥＧＦ様リピートを有する。Hjagged１のデルタ／セラート／ＬＡＧ−２ドメインに対応するペプチド及びhJagged１の細胞外部分の可溶性形態を発現するＣＯＳ細胞の上清は、ノッチ１（Ｌｉ）を阻害する際のJagged１の効果を模倣することが分かった。
【０１４７】
ある物質が、ノッチ−ノッチリガンド発現を調節するために使用できるか否かについては、適切なスクリーニングアッセイを用いることにより決定することができる。
【０１４８】
ノッチシグナル伝達は、タンパク質アッセイ又は核酸アッセイのいずれかによりモニターすることができる。ノッチ受容体の活性化は、その細胞質ドメインのタンパク質分解性切断及びその細胞核への移動を導く。ここで使用する「検出可能なシグナル（detectable signal）」なる用語は、ノッチの切断された細胞内ドメインの存在に起因する、検出可能な出現（manifestation）であってもよい。したがって、ノッチシグナル伝達の増加は、切断ノッチドメインの細胞内濃度を測定することによりタンパク質レベルを評価することができる。ノッチ受容体の活性化は、一連の下流反応を触媒して詳細に定義された遺伝子の発現レベルを変化させる。したがって、ノッチシグナル伝達の増加は、例えば、特定のｍＲＮＡの細胞内濃度を測定することにより核酸レベルで評価することができる。本出願の好適な１つの実施態様において、アッセイはタンパク質アッセイである。本発明の別の好適な実施態様において、アッセイは核酸アッセイである。
【０１４９】
核酸アッセイを用いることの利点は、感受性が高く、小さい試料を分析することができることである。
【０１５０】
与えられた時間に測定された、特定のｍＲＮＡの細胞内濃度は、その時間の対応する遺伝子の発現レベルを反映する。したがって、ノッチシグナル伝達経路の標的遺伝子の下流にあるｍＲＮＡレベルは、免疫系のＴ細胞の非直接的なアッセイにより測定することができる。特に、デルテックス、Ｈｅｓ−１及び／又はＩＬ−１０  ｍＲＮＡのレベルの増加は、例えば、誘導したアネルギーを表示し、また、ＤＩＩ−１又はＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡレベルの増加、又はＩＬ−２、ＩＬ−５及びＩＬ−１３等のサイトカインをコードするｍＲＮＡのレベルの増加は、改善した反応性を示すかも知れない。
【０１５１】
多様な核酸アッセイが知られている。既知又はその後開示される従来技術を使用することができる。適切な核酸アッセイの例を以下に記載するが、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護（Rnase protection）、ブロット法、分光測定、レポーター遺伝子アッセイ、遺伝子チップアレイ及びその他のハイブリダイゼーション法を含むものである。
【０１５２】
特に、遺伝子の有無、増幅及び／又は発現は、直接試料において測定することができ、例えば、ｍＲＮＡの転写を定量化するためには従来のサザンブロット法、ノーザンブロット法を用いることができ、ドットブロット法（dot blotting）（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーション法を適切に標識したプローブを用いることにより行うことができる。当業者は、必要である場合には、これらの方法をどのように修正するべきか簡単に予想することができる。
【０１５３】
ＰＣＲは元々、不純試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。この技術は反応液を繰り返し熱したり冷却したりの温度サイクルを基礎とし、それによりプライマーを標的配列にアニーリングさせ、これらプライマーを伸張することにより、娘鎖の複製を形成するものである。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素を用いて第１鎖ｃＤＮＡを作製する際にＲＮＡ鋳型を使用する。次に、このｃＤＮＡを標準的なＰＣＲプロトコールにより増幅する。合成と変性のサイクルをリピートして行うことにより、作製する標的ＤＮＡの複製数が指数関数的に増加する。しかしながら、反応成分が限られてくるに従って増幅速度が低下し、やがて停滞期に達し、ＰＣＲ産物における純増加はほとんど又は全く認められなくなる。反応開始時点における核酸標的の複製数が多いほど、かかる「終点」に早く到達する。
【０１５４】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグ又は蛍光色素で標識したプローブを使用し、定量化アッセイにおいては、サイクル定数の後の蓄積した産物の測定ではなく、ＰＣＲ産物が蓄積するに従ってそれを検出するために使用する点で、終点ＰＣＲとは異なる。反応は、標的配列の増幅が著しい蛍光の増加により最初に検出されるときに、サイクルの最中の時間により特徴づけられる。
【０１５５】
リボヌクレアーゼ保護（ribonuclease protection）（ＲＮａｓｅ保護）アッセイは、溶液中の特定のＲＮＡの定量化を行う非常に繊細な技術である。リボヌクレアーゼ保護アッセイは、全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）選択ｍＲＮＡを標的として行うことができる。リボヌクレアーゼ保護アッセイの感受性は、high specific活性に放射能標識した、相補的なインビトロ転写プローブの使用に由来する。プローブ及び標的ＲＮＡを、溶液中でハイブリダイズし、その後、混合物を希釈してリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で処理し、残った全ての一本鎖ＲＮＡを分解する。プローブのハイブリダイズされた部分は、消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上の混合物の電気泳動により可視化が可能であり、次にオートラジオグラフィーを行う。保護した断片は、高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析するため、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて正確にｍＲＮＡ特性をマッピングすることができる。標的ＲＮＡに関して、プローブがモル過剰でハイブリダイズされる場合、結果として得られるシグナルは、試料中の相補ＲＮＡの量と直接比例するものになる。
【０１５６】
遺伝子発現は、レポーターシステムを使用することにより検出することもできる。該レポーターシステムは、発現系の制御下にある簡単に同定することが可能なマーカー、例えば、モニターされている遺伝子を含んでもよい。ＦＡＣＳを用いることにより検出及びソート（sort）が可能な蛍光マーカーを使用することが好ましい。特に、ＧＦＰ及びルシフェラーゼが好ましい。また、別の好ましいレポーターの種類としては細胞表面マーカー、すなわち、細胞表面に発現するタンパク質であり、したがって、簡単に同定可能である。
【０１５７】
一般的に、レポーター遺伝子を発現させてノッチシグナル伝達を測定する上で有用なレポーター構築物は、Sambrook et al (1989) の一般的教示に従って構築してよい。本発明における構築物は通常、目的とする遺伝子のプロモーター、並びにＧＦＰやルシフェラーゼなどの所望のレポーター構築物をコードするコーディング配列を有している。ＧＦＰ及びルシフェラーゼをコードするベクターは当技術分野では公知であり市販もされている。
【０１５８】
遺伝子の発現を検出することによる細胞ソーティングは、当技術分野で公知の上記いずれの手法で実施してもよい。例えば、細胞をフローサイトメトリー又はＦＡＣＳでソーティングしてもよい。全般的な内容に関しては、Flow Cytometry and Cell Sorting: A Laboratory Manual (1992) A. Radbruch (Ed.), Springer Laboratory, New York を参照のこと。
【０１５９】
フローサイトメトリーは、細胞の研究及び精製において強力な手法である。フローサイトメトリーは広範に、特に免疫学や細胞生物学の分野において利用されているが、ＦＡＣＳの能力は、生物学の他の多くの分野において利用できる。頭文字のＦ．Ａ．Ｃ．Ｓ．は、Fluorescence Activated Cell Sorting を表し、「フローサイトメトリー」と互換性のある用語である。ＦＡＣＳの原理は、液体の細い流れに保持された個別の細胞を１若しくは２以上のレーザービームに通すことにより光を散乱させ、種々の頻度で蛍光染色を発光させるというものである。光電子増倍管（ＰＭＴ）は光を電子シグナルに転換し、この電子シグナルをソフトウエアで解析して細胞のデータを作成する。定義付けされた特徴を有する細胞サブ集団が同定され、極めて高純度（〜１００％）にて懸濁液から自動的にソーティングされる。
【０１６０】
ＦＡＣＳは、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトした細胞における遺伝子の発現を測定するために用いられる。これは、かかるタンパク質産物を標識することにより直接、又は構築物中のレポーター遺伝子を使用して間接的に行うことができる。レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼやグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が例示される。β−ガラクトシダーゼの活性は、フルオレセインジガラクトシダーゼ（ＦＤＧ）等の蛍光基質を用いるＦＡＣＳによる検出が可能である。ＦＤＧは、低張性ショックを与えることによって細胞内に導入され、酵素によって開裂して蛍光産物を作り出す。この蛍光産物は細胞内に留め置かれる。したがって、１種の酵素で大量の蛍光産物を産出できる。ＧＦＰ構築物を発現する細胞は、基質を加えることなく蛍光発色する。励起頻度が異なっても同一チャネルで蛍光発色するＧＦＰ変異体は利用可能である。Two-laserＦＡＣＳ機器では、異なるレーザー光線によって励起される細胞の識別が可能であり、よってトランスフェクション２種類のアッセイを同時に行うことができる。
【０１６１】
別のセルソーティング法を利用してもよい。例えば、本発明には、ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブの使用も含まれる。かかるプローブは、別々にポリペプチドを発現する細胞を同定することに用いられ、それらの細胞はその後マニュアルソーティング法又はＦＡＣＳソーティング法によりソーティングされる。ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブは、Sambrook et al (1989) の一般的なプロトコルを用いる上述の教示に従って調製する。
【０１６２】
好適な実施態様において、本発明には、ＦＡＣＳセルソーティング法で用いてもよい蛍光体に結合させ、標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子の使用も含まれる。
【０１６３】
所謂遺伝子チップアレイや高密度ＤＮＡアレイを使用して、遺伝子の発現や同一性に関する情報を得る各種方法についての記載もある（Chee）。これらの高密度アレイは、診断及び予防の目的で特に有用である。In Vivo Expression Technology（ＩＶＥＴ）（Camilli）も使用してもよい。ＩＶＥＴでは、例えば治療や疾患の過程において実験培養の場合と比較してアップレギュレートされた標的遺伝子を同定する。
【０１６４】
タンパク質アッセイを使用することの利点は、ノッチの活性を直接測定できることである。ポリペプチドのレベルを測定するために利用可能なアッセイ技術は、当該技術分野の専門家には十分公知である。そのようなアッセイ法には、放射免疫測定法、競合結合測定法、ウエスタンブロット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出法、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡが含まれる。
【０１６５】
調製、発現ベクター及び宿主細胞
本発明の複合体は、当該技術分野において周知のいかなる方法を用いてもよい。
【０１６６】
本発明はまた、本発明に有用なポリヌクレオチドを有するベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的手法で作製した宿主細胞、及び本発明に有用なポリペプチドをかかる手法により作製することに関する。
【０１６７】
組換え作製法では宿主細胞に、本発明の発現系又はポリヌクレオチドを取り込むように遺伝子工学に基づく操作を施すことができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入法としては、Davis et al and Sambrook et al等、多くの標準的実験室マニュアルに記載されている。例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、感染等の方法が有効である。
【０１６８】
好適な宿主の代表的な例としては、レンサ球菌（streptococci）、ブドウ球菌（staphylococci）、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞や、酵母細胞、アスペルギルス細胞等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、Bowesメラノーマ細胞等の動物細胞や、植物細胞が挙げられる。
【０１６９】
本発明に有用なポリペプチドの作製には極めて多様な発現系が使用できる。このようなベクターとしては例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来するベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、また、バキュロウイルス、ＳＶ４０等のパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにこれらの組合せに由来するベクター、例えばコスミドやファージミドのようにプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものが含まれる。この発現系構築物は、発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。宿主内でポリヌクレオチドを保持、増殖又は発現させる、及び／又は宿主内でポリペプチドを発現させるのに適していれば通常いかなる系又はベクターでも使用してよい。例えば、Sambrook et al の方法等、十分公知のルーティンな方法に従って適切なＤＮＡ配列を発現系に挿入してよい。
【０１７０】
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、ペリプラズム空間に、又は細胞外環境に分泌するためには、発現したポリペプチドに適切な分泌シグナルを取り込めばよい。かかるシグナルは、ポリペプチドに対し内因性でも異種シグナルでもよい。
【０１７１】
本発明の複合体は、広く公知の方法を用いることにより、組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。これらの方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどがある。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチドが単離及び／又は精製の過程で変性した場合は、十分公知の方法によりタンパク質の再折りたたみを行って活性構造を再生する。
【０１７２】
化学的に結合した配列は、個々のタンパク質配列から調製することができ、公知の化学的結合技術を用いて結合することができる。複合体は、従来の溶液又は固体フェーズペプチド合成法を用いて構築することができ、末端アミノ基のみが保護されない反応形態（deprotected reactive form）にある完全に保護された前駆体が得られる。この機能は、ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質又はその適切な反応性誘導体と直接反応させることができる。また、このアミノ基は、カーゴ部分又はリンカーとの反応に適切な異なる官能基に変換してもよい。したがって、例えば、アミノ基と無水コハク酸との反応により、選択的にアドレス可能な（addressable）カルボキシル基が得られ、システイン誘導体を用いたさらなるペプチド鎖伸長（chain extension）により、選択的にアドレス可能なチオール基が得られる。誘導ベクター前駆体（delivery vector precursor）において適切な選択的にアドレス可能な官能基が得られると、ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質又はその誘導体は、例えばアミド、エステル又はジスルフィド結合形成により付着する。使用してもよい架橋結合試薬については、Neans, G. E. and Feeney, R. E., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp. 39-43に記載されている。
【０１７３】
上記のように、輸送タンパク質及びノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質は、切断可能なリンカー部分を介して直接的又は非直接的に結合することができる。直接結合は、ヒドロキシ、カルボキシル又はアミノ基等のノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質の有用な官能基で生じる。好ましい非直接結合は、結合部分を通して生じる。適切な結合部分としては、二機能性及び多機能性のアルキル、アリール、アラルキル又はペプチド部分、アルキル、アリール又はアラルキルアルデヒド、酸、エステル及び無水物、スルフヒドリル（sulphydryl）又はカルボキシル基、例えばマレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体及びsuccinimido誘導体又は、臭化シアヌル又は塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、succinimidylエステル又はスルホンハライド等が挙げられる。一方では、ノッチシグナル伝達調節のためのリンカーとタンパク質との間の共有結合と、もう一方ではリンカーと輸送タンパク質の結合に使用されるリンカー部分の官能基は、２つ以上の、例えば、アミノ、ヒドラジノ（hydrazino）、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル及びカルボキシル基であってもよい。リンカー部分は、リンカー部分が輸送タンパク質に結合するシステイン残基を任意に含む１〜４アミノ酸残基の短い配列を含んでもよい。
【０１７４】
本発明によると、各輸送タンパク質は、ノッチシグナル伝達調節のための少なくとも１つのタンパク質と結合していてもよい。さらなる実施態様において、輸送タンパク質は、ノッチシグナル伝達調節のための各タンパク質が同じ又は異なる、ノッチシグナル伝達調節のための１つ以上のタンパク質の結合を促進するように調製される。輸送タンパク質は、例えば、コンポーネントそのものが、例えば自然発生アミノ酸の誘導体のノッチシグナル伝達調節のための１つ以上のタンパク質の付着又は多価合成アミノ酸の挿入を促進するコンポーネントを含んでもよい。あるいは、結合グループ（linking group）として輸送タンパク質に付着してもよく、ノッチシグナル伝達調節のタンパク質に付着されてもよい分枝リジン残基のネットワークにより行うことができる。このように、単一の輸送タンパク質はノッチシグナル伝達調節のために３２個のタンパク質まで、好ましくはノッチシグナル伝達調節のために２〜１０個以上、より好ましくは４〜５個のタンパク質を輸送（carry）することができる。このさらなる実施態様において、ノッチシグナル伝達調節のための各タンパク質は、直接的又は非直接的に輸送部分（carrier moiety）に結合してもよい。ノッチシグナル伝達調節のための１つ以上の異なるタンパク質が付着されると、個々の薬剤の割合や用量を調整して特定のタンパク質の組み合わせの投与を促進することができる。
【０１７５】
粒子の大きさが、例えば０．１〜５ミクロンの範囲にある安定した凝集体は、ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質と輸送タンパク質とを混合することにより形成することができる。輸送タンパク質とノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質との割合が、２：１〜１：１であることが好ましい。
【０１７６】
さらなる実施態様において、複合体はさらにターゲティング部分（targeting moiety）を含んでもよい。ターゲティング部分は、輸送タンパク質をノッチシグナル伝達調節のタンパク質が機能する際に好ましい、特定の細胞タイプに誘導することができる。したがって、ターゲティング部分は、薬剤の身体の自然分配（natural distribution）又は特定の細胞タイプの複合体を偏らせるアドレスシステムとして作用する。ターゲティング部分は、ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質、又は好ましくは輸送タンパク質に付着してもよく、輸送タンパク質がノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質の細胞インターナリゼーションを促進すると、複合体を所望の部位に導く。適切なターゲティング部分としては、例えば、ファージディスプレイＳｃＦｖ等の細胞特異的抗体又は抗体断片、及び米国特許第５,６２２,６９９号のE Ruoslahti et al.、Pasqualini R, Ruoslahti E、Ruoslahti E、Arap W, Pasqualini, R, Ruoslahti Eにより同定された、その他のペプチド配列が挙げられる。
【０１７７】
複合体の安定と取込みを増加させる安定剤は、任意に細胞と接触させることができ、複合体と組み合わせて接触させることができる。例えば、ｔａｔタンパク質と結合してその安定と取込みを増加させる金属イオンは、この目的のために使用することができる。
【０１７８】
本発明のさらなる実施態様において、細胞による取込みを強化するために、lysosomotrophic剤を、細胞外に複合体と組み合わせて提供する。Lysosomotrophic剤は、単独又は安定剤と組み合わせて使用することができる。例えば、クロロキン、モネンシン、アマンタジン、メチルアミン等のlysosomotrophic剤は、いくつかの細胞においてｔａｔの取込みに対して数百倍の増大を示しており、この目的のために使用することができる。
【０１７９】
別の実施態様においては、ｔａｔ３８〜５８又はプロタミン等の塩基性ペプチドは、その取込みを強化するために複合体の細胞外にある。かかる塩基性ペプチドは、単独、組み合わせ、又は安定剤若しくはlysosomotrophic剤と一緒に使用することもできる。
【０１８０】
抗体の作製
本発明の複合体は、例えば、複合体そのもの又はそのコンポーネントの局在化のモニタリングなど、従来の技術を用いて診断及びモニタリング特異的結合アッセイに用いることができる抗体を生成するために使用してもよい。
【０１８１】
本発明の別の実施態様によると、本発明の複合体を特異的に認識及び結合する抗体を提供する。しかしながら、より好ましくは、該抗体は複合体の第２配列に特異的である。複合体の第２配列は、自然状況にある抗体により認識される。したがって、第２配列がノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質由来の単離された断片又はドメインである場合、該断片又はドメインは、より大きなタンパク質全体との関連で、本発明の抗体に認識される。
【０１８２】
また、本発明は、以下のステップからなる免疫グロブリンの調整方法を提供する。
ａ）本発明の複合体を用いて動物を免疫し、
ｂ）動物の血清由来の複合体の領域に特異的な免疫グロブリンを回復する。
【０１８３】
抗体（又は免疫グロブリン）は粗製の形態で単離してもよい。すなわち、複合体に対するアフィニティークロマトグラフィーによる抗血清である。また、当該技術分野における標準的な技術を用いてモノクローナル抗体を調製し、精製してもよい。
【０１８４】
治療における使用
複合体を投与することによって生じる治療効果は、リンカー、リンカーの一部若しくはリンカー及び輸送タンパク質の一部と結合して、又は単独で、インタクトな複合体又はノッチシグナル伝達調節のための分離タンパク質によりもたらされる。
【０１８５】
本出願人によるＷＯ９８／２０１４２号、ＷＯ００／３６０８９号及びＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１号において、ノッチシグナル伝達経路及びそれが与える影響に関する詳細が記載されている。
【０１８６】
Ｔ細胞介在型であると説明される疾患や感染症状には、喘息、アレルギー、移植片拒絶反応、自己免疫、腫瘍が誘発するＴ細胞系の異常、或いはマラリヤ病原虫、ミクロフィラリア、蠕虫、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコックス、ヘモフィルスインフルエンザＢ型、麻疹、Ｃ型肝炎、トキソカラによって引き起こされる感染症のいずれか１若しくは２以上が含まれるが、それらに限定されることはない。Ｔ細胞介在型で、治療や予防を行う具体的な病気には多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病が含まれる。本発明は臓器移植又は骨髄移植にも使用される。
【０１８７】
本発明はまた、細胞中のノッチ経路機能を変化させることにより、細胞運命、組織又は器官のタイプを変更させる方法においても有用である。したがって、本発明は、悪性及び前癌疾患の治療に適用できる。本発明は従って、例えば本発明は、小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、直腸癌、乳癌等の腺癌に有用である。例えば、本発明により治療可能な悪性疾患としては、急性及び慢性白血病、リンパ腫、骨髄腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、lymphangioendotheliosarcoma、血管肉腫、内皮性肉腫（endotheliosarcoma）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑肉腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、精上皮腫、胎生期癌、頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、聴神経腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、neutroblastoma及び網膜芽腫等の肉腫が挙げられる。
【０１８８】
本発明はまた、神経系疾患の治療に応用できる。本発明により治療が可能な神経系疾患としては、物理的な損傷による外傷性障害、虚血性疾患、悪性病変、ＨＩＶ、ヘルペス帯状疱疹、単純ヘルペスウイルス、ライム病、結核、梅毒等による感染病変、変性病変及び疾患及び脱髄する疾患等を含む神経性障害が挙げられる。
【０１８９】
本発明は、例えば、糖尿病（糖尿病性神経障害、ベル麻痺を含む）、全身性エリデマトーデス、サルコイドーシス、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス会合脊髄症、横断性脊髄症又は多数の病因、進行性多巣性白質脳症、橋中心髄鞘壊死、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脳梗塞又は虚血、脊髄梗塞又は虚血、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、小児性及び若年性筋萎縮賞、幼児期の進行性延髄麻痺（小児進行性球麻痺（Fazio-Londe syndrome））、灰白髄炎、ポリオ後症候群及び遺伝性体性感覚神経障害（シャルコーマリーツース病）の治療に用いることができる。
【０１９０】
さらに、本発明は、組織の再生及び修復に有用である。したがって、本発明は、例えば、肝硬変、肥大性瘢痕形成、乾癬などの欠損組織修復及び再生に関連した疾患を治療するために用いてもよい。また、本発明は、好中球減少又は貧血症の治療及び器官再生及び組織工学においても有用であろう。
【０１９１】
運搬方法
本発明は、ノッチシグナルの調節のためのタンパク質を、細胞、特に細胞核中に、インビトロ又はインビボで運搬するために使用できる。インビトロの適用の場合、複合体を、標的細胞の培養培地に添加してもよい。複合体は、固体から得られた細胞試料と組み合わせて、ノッチシグナル伝達調節のためのタンパク質を試料中に存在する細胞に導入することができる。このような処理を施した後、該試料を固体に戻すこともできる。複合体を、インビボで投与することもできる。例えば、複合体を合成する細胞を作製し、固体に移植することができる。さらなる実施態様において、複合体を従来の治療剤として使用し、医薬組成物のコンポーネントとすることもできる。
【０１９２】
例えば、複合体を合成する細胞の作製又は複合体を有する固体から得た試料（例えば、血液、骨髄）の組み合わせにより、複合体を培養細胞に添加することにより運搬することができる。したがって、標的細胞はインビトロ細胞であってもよい。すなわち、培養した動物細胞、ヒト細胞又は微生物であってもよい。複合体を、診断、予防又は治療目的のために使用する固体に、インビボで投与することにより運搬することができる。標的細胞は、インビボ細胞であってもよい。すなわち、生きた動物又はヒトの器官又は組織からなる細胞、又は生きた動物又はヒトに存在する微生物であってもよい。
【０１９３】
投与
本発明の複合体は、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と共に医薬組成物に処方して患者に投与することが一般的である。処方は同定した化合物の性質や投与経路によって異なるが、局部、全身性、経口、局所、非経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔吸入、肺吸入、粘膜、皮内、又は関節内に投与する処方が一般的である。複合体は、注入可能な剤型で用いてもよい。従って、注入可能処方とするため、全身性の投与でもよいが、好ましくは治療部位に直接注入するため、医薬的に許容可能な媒体を複合体と混合してもよい。
【０１９４】
医薬的に許容可能な担体若しくは希釈剤は、例えば、無菌の等張生理食塩水若しくはリン酸緩衝生理食塩水のような他の等張溶液でよい。本発明の複合体は、好適な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤と混合してもよい。化合物を経口で活性な剤型に処方することも好ましい。
【０１９５】
一般的に、本発明の結合体を経口又は静脈内投与する場合の治療上有効な１日用量は、治療対象者の体重換算で０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇであり、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇが好ましい。また、複合体を、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲の投与量で静脈内投与してよい。
【０１９６】
複合体の錠剤又はカプセル剤は、必要に応じて同時に１個若しくは２個若しくは３個以上投与してよい。また、複合体を徐放性の処方として投与することも可能である。
【０１９７】
通常医師は、個々の患者にとって最適な実際の投与量を決めるが、それは個別の患者の年齢、体重、反応性によって異なる。上述の投与量は、平均的なケースを挙げたものである。個々の症例に応じて当然平均より高量投与若しくは低量投与が奏功する場合もあり、それらもまた本発明の範囲に該当する。
【０１９８】
また、本発明の複合体を吸入により、又は座剤やペッサリーの剤型で、又はローション、液剤、クリーム、軟膏、又は粉剤の剤型で局所的に塗布することにより投与してもよい。経皮投与の別の方法としては、スキンパッチを用いる方法がある。例えば、ポリエチレングリコール水性乳剤又は液体パラフィンからなるクリームに化合物を含有させることができる。また、白ワックス又は白色軟パラフィン基剤からなる軟膏に化合物を重量濃度１〜１０％の範囲で、必要に応じて安定剤や保存料と共に含有させることもできる。
【０１９９】
適用例によっては複合体を、澱粉又はラクトース等の賦形剤を含む錠剤の剤型で、カプセル剤若しくは胚珠（ovule）剤を単独で又は賦形剤と混合して、或いは香料又は色素を含有するエリキシル剤、液剤又は懸濁剤の剤型で、経口投与することが好ましい。
【０２００】
複合体は、非経口に注入することも可能であり、陰茎海綿体内、静脈内、筋肉内、又は皮下への注入が例示できる。注入する場合、複合体は適切な担体又は希釈剤を有する。
【０２０１】
非経口投与の場合は、複合体を無菌水性溶液の剤型で使用することが最適であり、かかる溶液を血液と等張とするために例えば十分量の塩又は単糖類など、他の物質を含んでいてもよい。
【０２０２】
口腔内又は舌下に投与する場合、常法により処方可能な錠剤又はトローチ剤の剤型で複合体を投与してよい。
【０２０３】
対象（患者など）に経口、非経口、口腔内又は舌下投与する場合、本発明の複合体、その医薬的に許容可能な塩及び溶媒和物の１日用量は、通常１０〜５００ｍｇ（１回又は複数回に分けて）である。従って錠剤やカプセル剤には、例えば一度に１、２又は３錠以上を適宜に投与するため、活性化合物を５〜１００ｍｇ含有させてよい。上述したように、医師は個々の患者にとって最適な実際の投与量を決めるが、それは個々の患者の年齢、体重、反応性によって異なる。上記の投与量は平均的なケースであり、個々の症例に応じて当然平均より高量投与若しくは低量投与が奏功する場合もあり、そのような投与量の範囲もまた本発明の範囲に該当することに留意されたい。
【０２０４】
専門家であれば個々の患者にとって、例えば年齢、体重及び症状に応じて最適な投与経路や投与量を容易に決めることができるので、これまでに説明した投与経路及び投与量は単に指針としてのものである。
【０２０５】
ここに用いる治療や療法という用語は、診断及び予防をも含意するものと理解される。
【０２０６】
本発明の治療には、ヒトと動物の両方への適用が含まれる。
【０２０７】
本発明の複合体は、公知の運搬系（delivery system）に対するいくつかの利点がある。これらの利点としては、従来の治療と比較した効率性の改善、治療剤の細胞取込みの改善、水溶性の改善、副作用の減少及び細胞バイオアベイラビリティや薬剤耐性の減少が挙げられる。
【実施例１】
【０２０８】
ｍＨＥＳ１−Ｌｕｃレポーターベクター（pLOR3）の作製
以下の２つのアンプリマーを用いて、マウスゲノムＤＮＡからＰＣＲにより、マウスＨＥＳ１プロモーター断片（約３５０ｂｐ）の断片を作製した。
５'  ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＧＧＣＣ  ３'  及び
５'  ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＡＣＧＴＣＣＴＴＴＴＡＣＴＴＧＡＣ  ３'
ＰＣＲ産物をＫｐｎＩ及びＢＧＩＩで消化し、pGL3-Basic（Promega社製）にクローニングし、ＫｐｎＩ及びＢｇＩＩＩで切断してｍＨＥＳ１−Ｌｕｃ（pLOR3）を作製した。
【実施例２】
【０２０９】
４×ＣＢＦ−１レポーターベクターの作製
（ｉ）pGL3−ＡｄＴＡＴＡ構築物（pLOR44）の作製
オリゴヌクレオチドをアニールしてアデノウイルス主要後期プロモーター（major late promoter）ＴＡＴＡ−ｂｏｘモチーフを作製し、以下のＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの突出末端を有するものを構築した。
2005504518.tif 000003
次に、構築物をpGL3-Basic（Promega社製）にクローニングし、pGL3−ＡｄＴＡＴＡを作製した。
【０２１０】
（iii）４×ＣＢＦ１−Ｌｕｃ構築物（pLOR45）の作製
オリゴヌクレオチドをアニールしてＣＢＦ−１プロモーター四量体を作製し、以下のＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩの突出末端を有するものを構築した。
2005504518.tif 000004
次に、この構築物をpGL3−ＡｄＴＡＴＡ（pLOR44；あらかじめＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで切断されている）にクローニングし、pLOR45を作製した。
【実施例３】
【０２１１】
ＮＩＣ２２０２のクローニング並びにpBluescriptSK（＋）、pcDNA3.1（＋）及びpVP22ベクターへの挿入
以下のとおりＰＣＲアンプリマーを構築して、アミノ酸１７５９の前に開始コドン（ＮＩＣ１７５９アンプリマーにおいて、強調表示）を置き、アミノ酸２２０２のコドンの直後に停止コドン（ＮＩＣ２２０２アンプリマーにおいて、強調表示）を置いた、アミノ酸１７５９〜２２０２に及ぶヒトノッチ１ｃＤＮＡの切断された断片を作製した。ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位もオリゴ内に組み込み、約１．３ｋｂ断片のクローニング（下線表示）を行った。
ＮＩＣ１７５９  ５'−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＧＣＡＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＧＴＣＡＴ−３'
及び
ＮＩＣ２２０２  ５'−ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＣＣＡＣＧＧＧＣＧＡＧＡＧＣＡＴ−３'
上記アンプリマーを用いてテンプレートとしてヒトノッチ１遺伝子の部分的なｃＤＮＡ配列を含むIMAGE Consortium（アクセッション番号Ｒ４０９７７）から得たプラスミドと、AdvantageIIＤＮＡポリメラーゼ（Clontech社製）を用いて、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲの条件は、以下のとおりである。
９５℃で１分のサイクルを１回
９５℃で３０秒、６８℃で３分のサイクルを３０回
６８℃で３分のサイクルを１回
１６℃の浸漬。
【０２１２】
ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩでノッチ２２０２ＰＣＲ断片を切断し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断したpcDNA3.1（＋）（Invitrogen社製）と結合してpcDNA3.1−ＮＩＣ２２０２（pLOR34）を作製し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断したpBluescriptIISK（＋）（Stratagene社製）と結合してpBS−ＮＩＣ２２０２（pLOR33）を作製した。
【０２１３】
ＮＩＣ２２０２断片をVoyager Vectors pVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ及びpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２（Invitrogen社製）にクローニングするためには、ｍｙｃ−Ｈｉｓタグを介した転写を可能にするために配列から停止コドンを除去しなければならなかった。停止コドンを除去するため、オリゴを構築し、pBS−ＮＩＣ２２０２配列ポリリンカー（polylinker）におけるＸｈｏＩ部位を介して独特のＳｔｕＩ部位からＮＩＣ２２０２配列の３'末端を再構築した。ＸｈｏＩ部位（下記のアニールしたオリゴにおいて下線で示す）に隣接したオリゴの３'末端に、ＮｏｔＩ部位を組み込んだ。
【０２１４】
アニールした５'＋３'ＮＩＣＳｔｕＩ−ＸｈｏＩオリゴは、以下のとおりである。
【０２１５】
2005504518.tif 000005
ＳｔｕＩはｄｃｍメチル化に感受性があるため、pBS−ＮＩＣ２２０２を大腸菌のｄｃｍ株であるＳＣＳ１１０（Stratagene社製）に形質転換した。次に、ＳｔｕＩ及びＸｈｏＩでpBS−ＮＩＣ２２０２を切断し、より大きなベクターバンドをゲル精製した。アニールした５'＋３'ＮＩＣＳｔｕＩ−ＸｈｏＩオリゴをこのベクターに結合し、pBS−ＮＩＣ２２０２−停止と名付けられたpBS−ＮＩＣ２２０２の修正したバージョンを作製した。停止コドンを持たないＮＩＣ２２０２の修正バージョンを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いてこのベクターから切断し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで切断したpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２と、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで切断したpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２にクローニングし、ＶＰ２２  ＯＲＦ、pVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＮＩＣ２２０２（pLOR56）及びpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２−ＮＩＣ２２０２（pLOR57）のそれぞれを用いてＮＩＣ２２０２Ｃ末端及びＮ末端融合物を得た。
【実施例４】
【０２１６】
ＮＩＣ構築物のＣ２Ｃ１２及びジャーカット細胞へのトランスフェクション並びにルシフェラーゼアッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞及びジャーカット細胞（ヒトＴ細胞株）の両方に、２つの異なるレポーターベクター、ｍＨＥＳ１−Ｌｕｃ（pLOR3）及びｐ（４×ＣＢＦ１）−Ｌｕｃ（pLOR45）を用いて、pcDNA3.1−ＮＩＣ２２０２及びpcDNA3.1（コントロール）をトランスフェクトした。
【０２１７】
（ｉ）Ｃ２Ｃ１２トランスフェクション
完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ、１０％熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン）でＣ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞株）を培養し、細胞がコンフルエントになったり分化したりしないように定期的に（regularly）分割した。トランスフェクションを設定する前日に、Ｃ２Ｃ１２細胞を、１ｍｌの完全ＤＭＥＭ中の２４ウエルプレートの１ウエルあたり２．０×１０4細胞で播種した。
【０２１８】
トランスフェクションの当日、各ウェルから培地を取り出し、３００μｌの新鮮な完全ＤＭＥＭと置き換えた。Ｃ２Ｃ１２細胞の各ウエルを、Effecteneトランスフェクション試薬（Qiagen社製）を用いて、０．２μｇのレポーターベクターＤＮＡ（pLOR3又はpLOR45）及び０．２μｇのpcDNA3.1（＋）又はpcDNA3.1（＋）−ＮＩＣ２２０２（pLOR34）でトランスフェクトした。全てのベクターＤＮＡ調製において、Qiagen maxiprepＤＮＡキットを用いた。トランスフェクションは、２４ウエルプレートの四つ組ウエルで設定した。ＤＮＡにEffectene EC緩衝液を添加して最終量を１トランスフェクションあたり６０μｌにし、各トランスフェクションあたり１．６μｌのEffectene エンハンサーを添加した。混合液を１秒ボルテックスして室温で５分インキュベーションした。チューブを簡単にスピンし、１トランスフェクションあたり５μｌのEffectene試薬を添加した。混合液を上下に５回ピペットし、５秒ボルテックスし、室温で１０分放置し、トランスフェクション複合体を形成した。チューブの全量を、３００μｌの完全ＤＭＥＭを含むＣ２Ｃ１２細胞の２４ウエルプレートのウエルに添加した。
【０２１９】
Steady-Glo試薬（Promega社製）を用いたルシフェラーゼアッセイを行う前に、トランスフェクトした細胞を３７℃で２４時間インキュベーターに放置した。各ウエルの培地を取り出して１５０μｌのＰＢＳと置き換えた。次に、ホワイト９６ウエルプレート（Nunc社製）の各ウエルに内容物を取り出してTopCount（Packard社製）でルミネッセンスシグナルを読み取る前に、各ウエルに対し、Steady-Glo試薬を添加し、室温で５分プレートを放置した。
【０２２０】
（ii）ジャーカットトランスフェクション
ジャーカット細胞（ヒト細胞株）[クローンＥ６．１（ＡＴＣＣ）]を完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ、１０％熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン）で培養し、細胞を急速かつ確実に分割させるためにトランスフェクションの前日に継代させた。トランスフェクションの当日、ジャーカット細胞をスピンして新鮮な完全ＲＰＭＩで１．０×１０6細胞／ｍｌで再度懸濁した。ジャーカット細胞を、９６ウエルプレートの１００μｌ／ウエルにプレートし、細胞を０．５μｇのレポーターベクターＤＮＡ（pLOR3又はpLOR45のいずれか）及び０．５μｇのpcDNA3.1（＋）又はpcDNA3.1（＋）−ＮＩＣ２２０２（pLOR3）のいずれかで、SuperFectトランスフェクション試薬（Qiagen社製）を用いてトランスフェクションした。全てのベクターＤＮＡ調製において、Qiagen maxiprep ＤＮＡキットを用いた。トランスフェクションは、９６ウエルプレートの四つ組ウエルで設定した。ベクターＤＮＡを無血清ＲＰＭＩで最終量３０μｌまで希釈し、２μｌのSuperFect試薬を添加した。混合物を上下に５回ピペットし、５秒ボルテックスし、室温で１０分放置し、トランスフェクション複合体を形成させた。次に、チューブの全量を、ジャーカット細胞の９６ウエルプレートのウエルに添加した。
【０２２１】
（iii）ルシフェラーゼアッセイ
Steady-Glo試薬（Promega社製）を用いたルシフェラーゼアッセイを行う前に、トランスフェクトした細胞をインキュベーターに３７℃で２４時間放置した。次に、ホワイト９６ウエルプレート（Nunc社製）の各ウエルに内容物を取り出してTopCount（Packard社製）カウンターでルミネッセンスシグナルを読み取る前に、各ウエルに対し、同量（１３０μｌ）のSteady-Glo試薬を添加し、室温で５分プレートを放置した。
【０２２２】
結果を図７に示す。結果は、ＮＩＣ２２０２構築物が、両方の細胞株における両方のレポーターをトランス活性化することを示している。ジャーカット細胞においては、ＨＥＳ１−Ｌｕｃベクターからの高いバックグラウンドがあり、したがって、トランス活性化の比率は１．９×だけである。Ｃ２Ｃ１２細胞において、ＨＥＳ１−Ｌｕｃベクターは著しくトランス活性化した。
【実施例５】
【０２２３】
ＶＰ２２／ＮＩＣ構築物からＣ２Ｃ１２細胞及びジャーカット細胞へのトランスフェクション並びにルシフェラーゼアッセイ
（ｉ）トランスフェクション
ｍＨＥＳ１−Ｌｕｃベクター（pLOR3）を用いて、pVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＮＩＣ２２０２及びpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２−ＮＩＣ２２０２をＣ２Ｃ１２細胞にコトランスフェクトした。完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ、１０％熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン）でＣ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞株）を培養し、細胞がコンフルエントになったり分化したりしないように定期的に分割した。トランスフェクションを設定する前日に、Ｃ２Ｃ１２細胞を、１ｍｌの完全ＤＭＥＭ中の２４ウエルプレートの１ウエルあたり２．０×１０4細胞で播種した。
【０２２４】
トランスフェクションの当日、各ウェルから培地を取り出し、３００μｌの新鮮な完全ＤＭＥＭと置き換えた。Ｃ２Ｃ１２細胞の各ウエルを、Effecteneトランスフェクション試薬（Qiagen社製）を用いて、０．１μｇのレポーターベクターＤＮＡ、pmHES1−Ｌｕｃ（pLOR3）、単独又は０．１μｇのpLOR3及び０．２μｇのpcDNA3.1（＋）−ＮＩＣ２２０２（pLOR34）又は０．２μｇのpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＮＩＣ２２０２（pLOR56）又は０．２μｇ  のpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２−ＮＩＣ２２０２（pLOR57）でトランスフェクトした。全てのベクターＤＮＡ調製において、Qiagen maxiprep ＤＮＡキットを用いた。トランスフェクションは、２４ウエルプレートの四つ組ウエルで設定した。ＤＮＡにEffectene EC緩衝液を添加して最終量を１トランスフェクションあたり６０μｌにし、各トランスフェクションあたり１．６μｌのEffecteneエンハンサーを添加した。混合液を１秒ボルテックスして室温で５分インキュベーションした。チューブを簡単にスピンし、１トランスフェクションあたり５μｌのEffectene試薬を添加した。混合液を上下に５回ピペットし、５秒ボルテックスし、室温で１０分放置し、トランスフェクション複合体を形成させた。チューブの全量を、３００μｌの完全ＤＭＥＭを含むＣ２Ｃ１２細胞の２４ウエルプレートのウエルに添加した。アッセイにおいて、トランスフェクトしていないコントロールを含めた。
【０２２５】
（iii）ルシフェラーゼアッセイ
Steady-Glo試薬（Promega社製）を用いたルシフェラーゼアッセイを行う前に、トランスフェクトした細胞をインキュベーターに３７℃で２４時間放置した。各ウエルの培地を取り出し、１５０μｌのＰＢＳと置き換えた。次に、ホワイト９６ウエルプレート（Nunc社製）の各ウエルに内容物を取り出してTopCount（Packard社製）でルミネッセンスシグナルを読み取る前に、各ウエルに対し、Steady-Glo試薬を添加し、室温で５分プレートを放置した。
【０２２６】
結果を図８に示す。結果は、Ｃ２Ｃ１２細胞にコトランスフェクトすると、２つのＶＰ２２−ＮＩＣ２２０２融合ベクターがＨＥＳ１−Ｌｕｃベクターをトランス活性化することを示した。これは、ＶＰ２２−ＮＩＣ２２０２及びＮＩＣ２２０２−ＶＰ２２融合タンパク質も、ＮＩＣ２２０２単独の場合と比較してレポーターベクターをトランス活性化できることを示している。
【実施例６】
【０２２７】
ＶＰ２２／ＧＦＰ構築物の作製
ＶＰ２２融合タンパク質が細胞から細胞へ広がる能力を視覚的にモニターするために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いて対応するＶＰ２２融合物を作製した。pVP22ベクター中に挿入するため、停止コドンを持たないＧＦＰ遺伝子を増幅するために、ＰＣＲを用いた。結果として得られたＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで切断したpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ及びＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで切断したpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２にクローニングし、ＶＰ２２  ＯＲＦ、pVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＧＦＰ（pLOR56）及びpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２−ＧＦＰ（pLOR57）のそれぞれを用いてＧＦＰのＣ末端及びＮ末端融合物を得た。
【実施例７】
【０２２８】
安定ＣＨＯ細胞トランスフェクション
ＣＨＯ細胞を、両方のＶＰ２２−ＮＩＣ２２０２融合ベクター、コントロールとしてのpcDNA3.1−ＮＩＣ２２０２及び２つのＶＰ２２−ＧＦＰ融合ベクターとトランスフェクトし、安定した細胞株を作製した。
【０２２９】
ＤＭＥＭ、１０％熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）で培養した野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、６ウエルプレートの５×１０5細胞／ウエルに置き、Lipofectamine2000（Invitrogen社製）を用いて翌日のトランスフェクション前に９０％のコンフルエント状態にした。各トランスフェクションにおいて、２つのチューブをセットした。１つは、２４５μｌのOptiMemと混合した、５μｇの各maxiprepベクターＤＮＡを含み、２つ目は２４５μｌのOptiMem中に５μｌのLipofectamine2000試薬を含む。次に、２つのチューブを組み合わせ、混合し、室温で２０分放置した。また、６ウエルプレートの各ウエルの培地を取り出し、１．５ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ、１０％の熱非働化ＦＣＳ及びグルタミン（Ｐ／Ｓは含まない）を添加した。ベクターＤＮＡとLipofectamine2000との混合液を２０分インキュベーションした後、各トランスフェクション混合液の全量を、１．５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％の熱非働化ＦＣＳ及びグルタミン（Ｐ／Ｓは含まない）を含むＣＨＯ−Ｋ１細胞のウエルに添加した。細胞をＣＯ2インキュベーター中に３７℃で一晩放置した。翌日、培地を２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ、１０％の熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びＰ／Ｓと置き換え、さらにＣＯ2インキュベーター中に３７℃で２４時間放置した。
【０２３０】
トランスフェクションから４８時間後、細胞を６ウエルプレートからトリプシン処理し、スピンし、再度懸濁し、数えた。次に、安定したトランスフェクタントを選択するため、トランスフェクトされた細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８[Geneticin（Invitrogen社製）]を含む完全ＤＭＥＭ中で限界希釈によりクローニングした。１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む２００μｌの完全ＤＭＥＭ中の３０、３及び０．３細胞／ウエルで細胞をプレートし、１０〜１４日間放置して３〜４日毎に培地を交換してコロニーを育てた。ウエルあたりの細胞において単一の増殖コロニーを有するウエルを、２４ウエルプレートのウエルに広げ（expanded）、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む完全ＤＭＥＭ中のＴ25フラスコにプレートした。Ｔ25フラスコ中で十分な密度にし、クローンを液体窒素で凍結し、Ｔ80フラスコに広げた（expanded）。
【０２３１】
pcDNA3.1−ＮＩＣ２２０２、pVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＮＩＣ２２０２及びpVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２−ＮＩＣ２２０２を用いて作製した代表的なＣＨＯ細胞クローンを、pLOR3（ｍＨＥＳ１−Ｌｕｃ）及びpLOR45（４×ＣＢＦ１−Ｌｕｃ）の両方のレポーターベクターを用いて、トランスフェクションによりテストした。
テストしたクローンは、以下のとおりである。
ＣＨＯ−ＮＩＣ２２０２            pcDNA3.1−ＮＩＣ２２０２で作製  クローン＃８
ＣＨＯ−ＶＰ２２−ＮＩＣ２２０２  pVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＮＩＣ２２０２で作製  クローン＃１４
ＣＨＯ−ＮＩＣ２２０２−ＶＰ２２  pVP22／ｍｙｃ−Ｈｉｓ２−ＮＩＣ２２０２で作製  クローン＃１８
ＣＨＯ−Ｋ１                      野生型親細胞株コントロール
【０２３２】
各細胞株を、１ｍｌの完全ＤＭＥＭ中でウエルあたり１．０×１０5の２４ウエルプレートに置いた。翌日、細胞を１ｍｌのＤＭＥＭ、１０％の熱非働化ＦＣＳ及びグルタミン（Ｐ／Ｓは含まない）で洗浄し、０．５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％の熱非働化ＦＣＳ及びグルタミン（Ｐ／Ｓは含まない）を元に戻した。Lipofectamine2000（Invitrogen社製）を用いて各レポーターベクターに対し２つずつトランスフェクションをセットした。各トランスフェクションに対し、２つのチューブをセットした。１つ目は、１μｇの各maxiprepレポーターベクターＤＮＡをOptiMemと混合して最終量で５０μｌ含み、２つ目は４９μｌのOptiMem中の１μｌのLipofectamine2000試薬を含む。次に、２つのチューブを組み合わせ、混合し、室温で２０分放置した。ベクターＤＮＡとLipofectamine2000との混合液を２０分インキュベーションした後、各トランスフェクション混合液の全量を、０．５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％の熱非働化ＦＣＳ及びグルタミン（Ｐ／Ｓは含まない）を含むＣＨＯ細胞のウエルに添加した。Steady-Glo試薬（Promega社製）を用いたルシフェラーゼアッセイを行う前に、トランスフェクトした細胞をＣＯ2インキュベーター中に３７℃で２４時間放置した。各ウエルの培地を取り出し、１５０μｌのＰＢＳと置き換えた。次に、各ウエルの培地を取り出して１５０μｌのＰＢＳと置き換えた。次に、ホワイト９６ウエルプレート（Nunc社製）の各ウエルに内容物を取り出してTopCount（Packard社製）でルミネッセンスシグナルを読み取る前に、各ウエルに対し、１５０μｌのSteady-Glo試薬を添加し、室温で５分プレートを放置した。
【０２３３】
結果を図９に示す。
【０２３４】
レポーターのトランス活性化レベルは、トランジェントなコトランスフェクション実験に見られる高レベルと比較して、安定ＣＨＯ細胞クローンのものは低かったが、ＣＨＯ細胞コントロールよりは著しく高かった。
【実施例８】
【０２３５】
安定ＣＨＯクローンを用いた共培養
Ｃ２Ｃ１２細胞をｍＨＥＳ１−Ｌｕｃ（pLOR3）とトランジェントにトランスフェクトし、実施例７の安定ＣＨＯ細胞と４８時間共培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞を、以下のとおりトランスフェクトした。
【０２３６】
Ｃ２Ｃ１２細胞を、ＤＭＥＭ、１０％熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びＰ／Ｓ中に維持し、筋芽細胞の分化を誘導する過剰なコンフルエント状態にならないように定期的に分裂させた。Ｃ２Ｃ１２細胞は、ＣＨＯ細胞クローンを含む２４ウエルプレートに添加する前日に、Effecteneトランスフェクション試薬（Qiagen）を用いて、pLOR3（ｍＨＥＳ１−Ｌｕｃ）でトランスフェクトした。トランスフェクション時、Ｃ２Ｃ１２細胞は〜５０％コンフルエントであった。Ｃ２Ｃ１２細胞のＴ80フラスコの培地を、７ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ、１０％の熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びＰ／Ｓと置き換えた。８μｇのpLOR3（８μｌ）を、４６０μｌのEffectene EC緩衝液と混合し、３２μｌのEffecteneエンハンサーを添加した。チューブを１秒ボルテックスし、室温で５分放置した。次に、１００μｌのEffecteneトランスフェクション試薬を添加し、１０秒ボルテックスしながらチューブを混合し、室温で１０分放置した。３ｍｌのＤＭＥＭ、１０％の熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びＰ／Ｓを添加し、７ｍｌの培地を含むＴ80フラスコに全量を添加した。
【０２３７】
細胞をトリプシン処理、スピニング及び１０ｍｌのＤＭＥＭ、１０％の熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びＰ／Ｓで再度懸濁する前に、トランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞のフラスコをＣＯ2インキュベーターに一晩放置した。１０μｌの細胞を数え、新鮮なＤＭＥＭ、１０％熱非働化ＦＣＳ、グルタミン及びＰ／Ｓを用いて細胞密度を２．０×１０5細胞／ｍｌに調整した。トランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞をＣＨＯ細胞クローンと混合して、２４ウエルプレートにおけるＣ２Ｃ１２細胞／pLOR3細胞とＣＨＯ細胞クローンの割合を１：１又は５：１にした。レポーター細胞とＣＨＯ細胞クローンの割合が５：１であると最適な結果が出ることが分かり、１ｍｌ容の完全ＤＭＥＭ中で１×１０5レポーター細胞と２×１０4ＣＨＯ細胞を混合した。レポーター細胞とＣＨＯ細胞クローンの割合が５：１の場合に最もよい結果が出ることを示したため、１ｍｌの完全ＤＭＥＭ中で１×１０5レポーター細胞を２×１０4ＣＨＯ細胞と混合した。ルシフェラーゼアッセイを行う前に、第１実験では細胞を４８時間共培養して放置し、又は第２実験では、２４、４８及び７２時間放置した。各ウエルの培地を取り出し、１５０μｌのＰＢＳと置き換えた。次に、ホワイト９６ウエルプレート（Nunc社製）の各ウエルに内容物を取り出してTopCount（Packard社製）でルミネッセンスシグナルを読み取る前に、各ウエルに対し、１５０μｌのSteady-Glo試薬を添加し、室温で５分プレートを放置した。
【０２３８】
図１０は、共培養実験における伝播をモニターする２つの別々の実験結果を示す。
【０２３９】
図１１は、ＣＨＯ細胞クローンをＣ２Ｃ１２細胞で共培養した、これら全ての実験による結果を要約したものである。ＣＨＯ細胞からＣ２Ｃ１２細胞中にＧＦＰ−ＶＰ２２コントロール融合タンパク質（Ｎ末端及びＣ末端融合）が伝播したようである（蛍光顕微鏡の視覚測定）。
【０２４０】
本明細書中で言及した刊行物は、引用することにより開示に含むものとする。当業者であれば、本発明の要旨から逸脱することなく、ここに記載した本発明の方法及びシステムに多様な改良及び変更を加えるのは容易である。本発明を、特定の好ましい実施態様に関連して記述してきたが、クレーム記載の本発明がそうした特定の実施態様に不当に制限されるべきではないことは、承知されてしかるべきである。特に、ここに記述した、本発明を実施する形態に対して種々の改良を施すことは、分子生物学分野又は関連分野の者にとっては自明であるが、そのような改良を施したものについても、下記のクレームの範囲に含まれるものとする。
【０２４１】
参考文献（この引用により開示に含む）
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Hoyne et al. (2000)  reference in press（印刷中）.
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図１は、ノッチを表す概略図である。
【図２】図２は、ノッチＩＣを表す概略図である。
【図３】図３及び４は、ノッチシグナル伝達経路を表す概略図である。
【図４】図３及び４は、ノッチシグナル伝達経路を表す概略図である。
【図５】図５は、ヒトノッチ１のアミノ酸配列を示す（GenBankＡＦ３０８６０２）。
【図６】図６は、ヒトノッチ２のアミノ酸配列を示す（GenBankＡＡＡ３６３７７）。
【図７】図７は、実施例４（iii）の結果を示すものであり、レポーターベクターとＮＩＣ２２０２とのトランス活性化の比較である。
【図８】図８は、実施例５（ii）の結果を示すものであり、Ｃ２Ｃ１２細胞とｍＨｅｓ１−Ｌｕｃ及びノッチＩＣ発現ベクターとのコトランスフェクションに関する。
【図９】図９は、実施例７の結果を示すものであり、ルシフェラーゼレポーターベクターの安定したＣＨＯ細胞クローンへのトランスフェクションに関する。
【図１０】図１０は、実施例８の結果を示すものであり、ｍＨｅｓ１−Ｌｕｃを用いて４８時間トランスフェクションしたＣ２Ｃ１２細胞と安定したＣＨＯ細胞クローンの共培養に関する。
【図１１】図１１は、実施例８の結果を示すものであり、ｍＨｅｓ１−Ｌｕｃを時間経過的実験（time course experiment）を用いてトランスフェクションしたＣ２Ｃ１２細胞と安定したＣＨＯ細胞クローンの共培養に関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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2005504518.tif 000096
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504518.tif 000097
2005504518.tif 000098
【国際調査報告】
2005504518.tif 000099
2005504518.tif 000100
2005504518.tif 000101
2005504518.tif 000102
2005504518.tif 000103