(57)【要約】未変性抗原に対して高アフィニティーを有し、高い腫瘍選択性を備えた新規な抗−ヒトテネイシンＳＴ２１４６モノクローナル抗体を記載する。ｃＳＴ２１４６ハイブリドーマは安定に高密度の培養条件において抗体を産生し、ＳＴ２１４６に基づく産物の工業的開発に好適である。ＳＴ２１４６は治療および診断用途の両方に利用できる特性を示す。
2005534615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖および重鎖可変部配列がそれぞれ配列番号１および配列番号２であるモノクローナル抗−ヒトテネイシン抗体およびヒトテネイシンＣのＥＧＦ−様リピート中の抗原性エピトープに結合するそのタンパク分解断片。
【請求項２】
さらにマーカーおよび／または診断薬を含む請求項１の抗体およびその断片。
【請求項３】
請求項１または２の抗体およびその断片の組換え誘導体。
【請求項４】
マウス定常部がヒト対応物または生物学的または薬理学的に活性な部分と置換されている請求項３の組換え誘導体。
【請求項５】
該生物学的に活性な部分が以下からなる群から選択される請求項４の組換え誘導体：アビジンファミリーのメンバー、腫瘍指向性免疫学的エフェクターの刺激に有用な増殖因子。
【請求項６】
該薬理学的に活性な部分が以下からなる群から選択される請求項４の組換え誘導体：毒素、スーパー抗原、サイトカインまたは抗腫瘍治療効力の増強に有用なその他のタンパク質。
【請求項７】
請求項１または２の抗体およびその断片の接合体誘導体。
【請求項８】
生物学的または薬理学的に活性な部分が該抗体またはその断片に結合している請求項７の接合体。
【請求項９】
該生物学的に活性な部分が腫瘍指向性免疫学的エフェクターの刺激に有用な増殖因子からなる群から選択されるか、該薬理学的に活性な部分が毒素、スーパー抗原、サイトカインまたは抗腫瘍治療効力の増強に有用なその他のタンパク質、抗腫瘍薬、放射性同位元素からなる群から選択される請求項８の接合体。
【請求項１０】
テネイシンに特異的に結合する免疫グロブリン分子。
【請求項１１】
請求項１−１０のいずれかの抗体、またはその断片または組換え誘導体または接合体あるいは免疫グロブリンのビオチン化誘導体。
【請求項１２】
アドバンスドバイオテクノロジーセンターに２００２年１月２９日にブダペスト条約に従って寄託され、受託番号がＰＤ０２００３である請求項１の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
【請求項１３】
請求項１２のハイブリドーマを培養する工程および該抗体を単離する工程を含む請求項１の抗体の調製方法。
【請求項１４】
請求項１−１０のいずれかの抗体、またはその断片または組換え誘導体または接合体あるいは免疫グロブリン分子または請求項１１のビオチン化誘導体のテネイシンを発現する疾患の検出のための診断手段としての使用。
【請求項１５】
該疾患が腫瘍である請求項１４の使用。
【請求項１６】
該腫瘍が、神経膠腫、乳癌、肺癌、線維肉腫および扁平上皮癌からなる群から選択される請求項１５の使用。
【請求項１７】
該診断手段がインビボイメージング技術に使用される請求項１４−１６のいずれかの使用。
【請求項１８】
請求項１−１０のいずれかの抗体またはその断片または組換え誘導体または接合体あるいは請求項１１のビオチン化誘導体のテネイシンを発現する疾患の治療用薬物の調製のための使用。
【請求項１９】
該疾患が腫瘍である請求項１８の使用。
【請求項２０】
該腫瘍が、嚢胞性脳腫瘍、神経膠腫、乳癌、肺癌、線維肉腫および扁平上皮癌からなる群から選択される請求項１９の使用。
【請求項２１】
該薬物が三段階プレ標的化方法の実施に好適なキットの形態である請求項１８−２０のいずれかの使用。
【請求項２２】
５つのバイアルから構成され、第一のバイアルが請求項１１のビオチン化誘導体を含み、第二のバイアルがアビジンを含み、第三のバイアルがビオチン化アルブミンを含み、第四のバイアルがストレプトアビジンを含み、第五のバイアルが放射標識化ビオチンまたはビオチン誘導体を含む治療用キット。
【請求項２３】
該バイアルがヒト注射に好適なものである請求項２２の治療用キット。
【請求項２４】
請求項１の抗体またはその断片または請求項３または４の組換え誘導体あるいは請求項１０の免疫グロブリンをコードするＤＮＡ。
【請求項２５】
ＣＤＲからなるかＣＤＲを含む特異的ＣＤＲおよびタンパク質。
【請求項２６】
請求項２４のＤＮＡを含むベクター。
【請求項２７】
請求項２６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
サンドイッチアッセイにおける請求項１−１０のいずれかの抗体またはその断片または組換え誘導体または接合体の、第二のテネイシン−特異的抗体と組み合わせての循環しているテネイシンレベルの測定のための診断キットの生産のための使用。
【請求項２９】
請求項１−１０のいずれかの抗体またはその断片または組換え誘導体または接合体あるいは免疫グロブリンを含む診断キット。
【請求項３０】
複数の区画を含んでいてもよい容器であって、請求項１１のビオチン化抗体またはその断片あるいは免疫グロブリン、バッファーおよび三段階プレ標的化方法用の治療用キットにおける使用に好適な試薬を含む容器。
【請求項３１】
さらに優先的にＡ−Ｄ断片に向けられた別のテネイシン−特異的抗体を含む請求項３０の容器。
【請求項３２】
さらに別の腫瘍特異的抗体を含む請求項３０の容器。
【請求項３３】
第二の抗体がテネイシンの第二の抗原性エピトープに結合する条件下でのサンドイッチＥＬＩＳＡインビトロアッセイにおける第二のテネイシン−特異的抗体と組み合わせた請求項１または請求項２の抗体であって、該インビトロＥＬＩＳＡアッセイが循環しているテネイシンレベルの測定に有用である抗体。
【請求項３４】
請求項１−１０のいずれかの抗体および／またはその断片および／または組換え誘導体および／または接合体および／または免疫グロブリンを、少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤および／または媒体と組み合わせて含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗−ヒトテネイシン抗体、それを得るための方法及び材料、該抗体のテネイシンを発現する腫瘍の診断および治療のためのそれぞれ診断手段および薬物の調製のための使用、および医薬分野への使用に好適な該抗体を含む材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍療法の特異性は、治療の成功の判定においてしばしば律速段階となる。実際、毒作用の発生及び特定の抗癌剤の耐容性の低下はその使用および患者の生活の質を制限する。
【０００３】
毒性の低減は癌細胞の治療の選択性に直接関係する。モノクローナル抗体は、腫瘍の特異的標的化のための理想的な手段であり、アビジン／ビオチン増幅システムと組み合わせると、非常に強力かつ選択的な腫瘍部位への活性部分の送達手段を構成する。
【０００４】
テネイシンは、細胞外マトリックスタンパク質の１つであり、胚発生の間に部位制限性発現を示し、成体組織においては創傷治癒および腫瘍形成、ならびに新規に形成された腫瘍血管においてみられる。テネイシンは正常な成体組織には発現していないが、様々な固形腫瘍のストローマにおいて発現している。例えば、神経膠腫(Burdon、et al.、Cancer Res. 43:2796-2805、1983)、乳癌(Chiquet-Ehrismann、et al.、1986)、肺癌(Natali et al.、Intl. J. Cancer 54:56-68、1989)、線維肉腫および扁平上皮癌(Ramos D.M. et al.、Int. J. Cancer 75:680-687、1998)など。テネイシンは神経膠腫にはみられるが、正常な脳組織にはみられない。テネイシンについては、国際特許出願第ＷＯ９２／０４４６4号（Wistar）、および関連する引用文献を参考されたい。
【０００５】
欧州特許第０４９６０７４号の教示に基づいて、G. Paganelli らは腫瘍の全身的および局所的治療のための三段階プレ標的化（pre-targeting）アプローチを開発した(Cremonesi M. et al.、Eur. J. Nucl. Med. 26(2):110-120、1999; Paganelli G. et al.、Eur. J. Nucl. Med. 26(4):348-357、1999; Paganelli G.、et al.. Cancer Biother. & Radiopharm. 16(3):227-235、2001)。
【０００６】
三段階プレ標的化方法についての別の文献としては、国際特許出願第ＷＯ９４／０４７０２号および米国特許第５５７８２８７号がある。
【０００７】
三段階プレ標的化治療は、ビオチン化抗−テネイシンモノクローナル抗体、ストレプトアビジン、および９０Ｙ−標識化ビオチンの静脈内逐次投与とそれにともなう２回のアビジンおよびビオチン化アルブミンの追跡投与（それぞれストレプトアビジンおよび９０Ｙ−標識化ビオチンの前）に基づき、それによって非特異的バックグラウンドが低減される。Paganelliらの三段階プレ標的化アプローチの選択性は、抗−テネイシンモノクローナル抗体の使用に依存する。細胞外マトリックスの標的化は、腫瘍細胞抗原の標的化と比較して、腫瘍細胞の抗原の変化によって影響されないという利点を示し、したがって、抗−腫瘍療法に理想的な標的化である。
【０００８】
三段階プレ標的化治療の用量および投与時期は最適腫瘍／非腫瘍分布比を達成するために固定されてきた。４８のグリア芽細胞腫（ＧＢＭ）または未分化星状腫（ＡＡ）患者から得たデータ（Paganelliらの研究に含まれる）は、実質的に毒性が無く、例外としてストレプトアビジンに対するアレルギー反応（アビジンの使用によって克服されうる）がみられただけであることを示し、治療効果の予備的指標となる。実際、治療終了の２ヶ月後に、２５％の患者は腫瘍サイズの減少を示し（完全な応答（腫瘍減少＞５０％）＝６％；部分的応答（腫瘍減少＜５０％）＝１１％；低い応答（腫瘍減少＜２５％）＝８％）、５２％の患者では進行しなかった。総応答比は７７％を超えた。患者のなかには、予測される余命が６ヶ月未満の者もいたが、その応答は１年以上続いた(Paganelli et al.、1999)。
【０００９】
ビオチン化抗−テネイシン抗体の役割は、腫瘍部位に局在化させること、および続くアビジンと９０Ｙ−ビオチンの蓄積を媒介するためにビオチンを表示することである。
【００１０】
抗-テネイシン抗体は例えば、米国特許第５６２４６５９号（Duke University）、日本国特許第２２１９５９０号（Rikagaku）および上記の国際特許出願第ＷＯ９２／０４４６４号に開示されている。
【００１１】
抗-テネイシン抗体は、Siri A. et al.、Nucl. Acid Res. 19(3):525-531、1991; Balza E. et al.、FEBS 332:39-43、1993 に開示されており、その治療目的での使用については前述のCremonesi M. et al.、Eur. J. Nucl. Med. 26(2):110-120、1999; Paganelli G. et al.、Eur. J. Nucl. Med. 26(4):348-357、1999;、Paganelli G. et al.、Cancer Biother. & Radiopharm. 16(3):227-235、2001に開示されている。当該技術分野において抗-テネイシン抗体の作成に用いるクローンはＢＣ４として知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本出願人は、ＢＣ４クローンが工業的開発および制御目的には好適でないことをみいだした。それは機能性でない軽鎖（おそらく親ミエローマ由来）産生によるものであり、軽鎖の発現レベルはスケールアップ培養の圧力下で増加し、大規模な抗体精製を妨げる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の概要）
このたび、上記問題を解決する抗−ヒトテネイシンモノクローナル抗体を見いだした。すなわち機能性でない軽鎖が発現せずにモノクローナル抗体が産生できる。
【００１４】
それゆえこの抗体は、該抗体を得る方法、その治療、特に、腫瘍などのテネイシンの発現によって特徴づけられる疾患の治療に有用な薬物の調製のための使用とともに本発明の目的である。
【００１５】
（発明の説明）
本発明は、さらにマーカーおよび診断薬を含んでいてもよい抗体および抗体断片、これら抗体および抗体断片を含む組成物、およびそれらを含む診断および治療用組成物、それらの治療および診断における使用ならびにかかる抗体および抗体断片の製造方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、抗体および断片をコードするＤＮＡ、ＤＮＡを含むベクター、ベクターを含む宿主細胞、配列番号１および２のタンパク質をコードするＤＮＡによってコードされるタンパク質；タンパク質および断片をコードするＤＮＡ；特異的(specific)ＣＤＲおよびＣＤＲからなるかまたはＣＤＲを含むタンパク質にも関する。
【００１７】
本発明によると、該抗体は一つの態様において、軽鎖および重鎖可変部の配列がそれぞれ配列番号１および配列番号２であることによって特徴づけられる。これらの配列を図１０および１１に示す。簡潔に記載するため、本発明による好適な抗体をＳＴ２１４６と称する。本発明は本発明において例示されるようにＳＴ２１４６に関するものであるが、当業者であれば本開示を読むことにより、ＳＴ２１４６以外の類似の抗体および抗体断片、ならびにかかる類似の抗体の抗体断片が本発明の枠内で産生および使用することができることを理解されよう。かかる類似の抗体は当業者にとって合理的な実験量によって産生することができよう。
【００１８】
本発明はそれゆえテネイシンに特異的に結合する抗体または抗体断片または抗体キメラ（例えばマウス−ヒト・キメラ）あるいは免疫グロブリン分子を提供する。本発明は、ＳＴ２１４６の可変軽鎖のＣＤＲおよび／またはＳＴ２１４６の可変重鎖のＣＤＲの少なくとも１つを含む抗体または抗体断片または抗体キメラあるいは免疫グロブリン分子を提供する。本発明の抗体または抗体断片または抗体キメラあるいは免疫グロブリン分子は、抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、一本鎖抗体、あるいは多量体抗体のいずれであってもよい。本発明の抗体または抗体断片または抗体キメラあるいは免疫グロブリン分子は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ分子のいずれであってもよい。
【００１９】
本発明は、配列番号１、２、９、１１、１３、１５、１７、または１９の少なくとも１つを含む抗体または抗体断片または抗体キメラあるいは免疫グロブリン分子を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、本発明のアミノ酸配列（例えば、配列番号１、２、９、１１、１３、１５、１７、または１９の配列）をコードする核酸配列を提供する。それゆえ本発明は、本発明の抗体または抗体断片または抗体キメラあるいは免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡ配列を提供する。かかるＤＮＡ配列は配列番号３、４、１０、２１、１４、１６、１８または２０から選択される少なくとも１つのＤＮＡ配列またはサブ配列を含む。
【００２１】
別の態様は、本発明の抗体または抗体断片または抗体キメラあるいは免疫グロブリン分子産物をコードする精製核酸分子に関する。本発明の免疫グロブリン産物をコードする核酸分子は常套技術を用いて作ることができる。例えば、オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成機を用いて合成され、互いに連結されて本発明の免疫グロブリン産物をコードする機能的オープンリーディングフレームを形成する。核酸分子は、合成した後、核酸ベクターにクローニングすればよい。核酸ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、酵母プラスミド、ファージベクター、ＴＩプラスミドなどが当該技術分野で知られている。ベクターは発現ベクターとすればよい。発現ベクターおよび発現システムはStratagene (La Jolla、Calif.)などから市販されている。
【００２２】
本発明の別の態様は、本発明の核酸を含む細胞に関する。細胞はトランスフェクションによって作ることができる。トランスフェクション方法は公知であり、原核および真核細胞のトランスフェクション用キットは市販されている(例えば、Stratagene、La Jolla、Calif.)。
【００２３】
本発明の別の態様は、本発明の抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物の、疾患の検出又は診断に有用な手段のための使用に関し、疾患の検出又は診断は以下の工程を含む：対象からの組織サンプルと抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物とテネイシン抗原の間の複合体の形成を可能とする条件下で接触させる工程、および該複合体の形成を判定する工程。
【００２４】
本発明の別の態様は、本発明の抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物または本発明の核酸の、テネイシンを発現する疾患、特に腫瘍の治療用薬物の調製のための使用に関する。癌の免疫療法の方法は公知である。例えば、Old、L. J. Immunotherapy for Cancer、Scientific American、September 1996を参照されたい。
【００２５】
別の態様は、本発明の抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物を含む治療用組成物に関する。本発明の免疫グロブリン産物は抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物および医薬上許容される担体または希釈剤を含む組成物の形態で提供されてもよい。治療用組成物はヒトなどの哺乳類における疾患の治療に用いることができる。薬物は、治療上有効な量にて本発明の抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物を哺乳類に投与されるものである。
【００２６】
治療薬としての使用において、本発明の抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物を薬剤と結合させてもよい。結合は共有結合によるものでも抗体−エピトープ結合によるものでもよい。例えば、抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物を第二の抗体と架橋してもよく、ここで第二の抗体は薬剤に対するアフィニティーを有するものである。薬剤は細胞毒性薬剤であってもよい。本明細書において使用する「細胞毒性薬剤」の語は、細胞の機能を阻害または阻止する物質および／または細胞を破壊する物質を意味する。この語には放射性同位元素（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）、化学治療薬、および毒素（例えば細菌、真菌、植物または動物由来の酵素的に活性な毒素やその断片）が含まれる。薬剤は化学治療薬であってもよい。化学治療薬とは癌の治療に有用な化学物質である。化学治療薬の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン（Cytoxin）、タキソール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン（Vinorelbine）、カルボプランチン、テニポシド（Teniposide）、ダウノマイシン、カルミノマイシン（Carminomycin）、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、エスペラミシン類（Esperamicins）(米国特許第４６７５１８７号を参照されたい）、メルファランおよびその他の関連する窒素マスタードが挙げられる。薬剤はサイトカインであってもよい。サイトカインの語は、一の細胞集団から放出され、細胞間媒介物質として別の細胞に対して作用する、タンパク質の総称である。かかるサイトカインの例としては、リンホカイン類、モノカイン類および伝統的なポリペプチドホルモン類が挙げられる。サイトカイン類としては、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン）；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ））；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子；ミュラー(mullerian)−阻害物質；マウス生殖腺刺激ホルモン−関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；血小板産生因子（ＴＰＯ）；神経増殖因子（例えば、ＮＧＦ）；血小板−増殖因子；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン−様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子（osteoinductive factor)；インターフェロン（例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ、および−ガンマ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ９、ＩＬ−１１���ＩＬ−１２）；腫瘍壊死因子；およびその他のポリペプチド因子（例えばＬＩＦおよびキットリガンド（kit ligand）（ＫＬ））が挙げられる。本明細書で用いる場合、サイトカインの語は、天然のタンパク質または組換え細胞培養物由来のタンパク質および生物学的に活性な未変性配列サイトカインの均等物を含む。
【００２７】
診断のためには、本発明の抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物に標識（例えば、抗体に直接または間接的に結合した検出可能な化合物または組成物）を結合させてもよい。標識はそれ自体で検出可能なものであってもよいし（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒するものであってもよい。
【００２８】
本発明はまた、ＣＤＲの配列において１または複数のアミノ酸を突然変異させることによる開示されたＣＤＲの突然変異体の作成も含む。ＣＤＲの適当な位置の一アミノ酸置換により十分にアフィニティーを上昇させることができることが知られている。研究者らは部位特異的突然変異誘発を用いてある種の免疫グロブリン産物のアフィニティーを約１０倍上昇させた。このＣＤＲの突然変異による抗体のアフィニティーを増減する方法は一般常識である(例えば、Chapter 23、Paul、W. E.、Fundamental Immunology、Raven Press、NY、N.Y. 1993を参照されたい)。したがって、結合アフィニティーまたは特異性を増減させるための本発明のＣＤＲのアミノ酸の置換、欠失、または付加もまた本発明に含まれる。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、腫瘍（例えば嚢胞性脳腫瘍、神経膠腫、乳癌、肺癌、線維肉腫または扁平上皮癌）を患う固体の治療薬の提供である。これには腫瘍、例えば嚢胞性脳腫瘍（テネイシンを発現する一例）を患うヒト対象への治療上有効量の本発明のテネイシンに結合する抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物の投与を伴う。投与工程は、腫瘍の窩洞に抗体を沈着させることにより行えばよい。
【００３０】
本明細書においてまた、固形腫瘍の治療方法を開示し、該方法は以下の工程を含む：第一に、患者であるヒト対象の固形組織器官（例えば脳）から固形腫瘍（テネイシンを発現する一例）を取り出す；次いで固形腫瘍が取り出された位置において対象の器官に封入された（enclosed）切除窩洞を形成する；そして、対象に抗腫瘍薬剤、例えば固形腫瘍の細胞に選択的に毒性である本発明の抗体、抗体断片、抗体キメラあるいは免疫グロブリン産物（例えば、テネイシンに結合する抗体）を治療上有効量投与する。本発明の一つの態様において、投与工程は切除窩洞に抗腫瘍薬剤を沈着させることによっておこなう。
【００３１】
本発明の別の目的は、ヒトテネイシンＣのＥＧＦ−様リピートにある抗原性エピトープに結合する該抗体のタンパク分解断片である。本発明の明細書の記載において、抗体断片とはヒトテネイシンＣのＥＧＦ−様リピートにある抗原性エピトープに結合する断片を意味する。
【００３２】
本発明の別の態様において、抗体およびその断片はさらにマーカーおよび／または診断薬を含んでいてもよい。該マーカーおよび／または診断薬は本発明の関与する分野の当業者に周知である。
【００３３】
本発明の好適な態様によると、該抗体またはそのタンパク分解断片はビオチン化されたものである。
【００３４】
本発明の別の目的はｃＳＴ２１４６と称する該抗体を産生するハイブリドーマ細胞系である。
【００３５】
ハイブリドーマ細胞系は、アドバンスドバイオテクノロジーセンター（Advanced Biotechnology Center）、L.go Rosanna Benzi、10 16132 GENOVA- Italyに２００２年１月２９日にブタペスト条約に従って寄託されており、受託番号はＰＤ０２００３である。
【００３６】
本発明はまた抗体またはその断片をコードするＤＮＡ、特異的ＣＤＲおよびＣＤＲを含むかそれからなるタンパク質、該ＤＮＡを含むベクターおよび該ベクターを含む宿主細胞も含む。
【００３７】
本発明の別の目的は該抗体の組換え誘導体である。特に好ましい組換え誘導体はマウス定常部がヒト対応物で置換されたもの(Ferrer C. et al. J. Biotechnol. 52: 51-60、1996)またはマウス定常部が生物学的に活性な部分、例えば、アビジンファミリーのメンバー(Manuel L. et al.、 J.  Immunol.、163: 4421-4426、1999)、腫瘍指向性免疫学的エフェクターの刺激に有用な増殖因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）で置換されたもの、あるいはマウス定常部が薬理学的に活性な部分、例えば、毒素、スーパー抗原、サイトカインまたはその他の抗腫瘍治療効力の増強に有用なタンパク質で置換されたものである(Di Massimo A.M. et al.、British J. Cancer 75(6):822-828、1997; Parente D. et al.、Anticancer Research 17(6A):4073-4074、1997)。
【００３８】
該組換え誘導体を得る方法は当該技術分野で周知である。
【００３９】
本発明の別の目的は該抗体の接合体(conjugate) 誘導体である。
【００４０】
特に好適な接合体誘導体は常套方法によって抗体に生物学的に活性な部分が結合したものである。生物学的に活性な部分の例は、アビジンファミリーのメンバー、腫瘍指向性免疫学的エフェクターの刺激に有用な増殖因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）であり、薬理学的に活性な部分は例えば、毒素、スーパー抗原、サイトカインまたはその他の抗腫瘍治療効力の増強に有用なタンパク質、抗腫瘍薬、放射性同位元素などである。
【００４１】
本発明によると、モノクローナル抗−ヒトテネイシンまたはその断片の組換え誘導体または接合体は「誘導体」とも称される。
【００４２】
本発明のもっとも好適な態様において、抗体およびその断片以外では、その誘導体もビオチン化されている。
【００４３】
本発明のさらに別の目的は上記抗体を産生するハイブリドーマ細胞系である。該ハイブリドーマはアドバンスドバイオテクノロジーセンター に２０００年１月２９日にブダペスト条約に従って寄託されており、受託番号ＰＤ０２００３である。
【００４４】
本発明のさらなる目的として、モノクローナル抗体の調製方法が提供され、該方法は、上記ハイブリドーマ細胞系を培養する工程と抗体を単離する工程を含む。
【００４５】
本発明の別の目的は、テネイシンを発現する疾患、特に腫瘍の治療用の薬物の調製のためのモノクローナル抗体である抗−ヒトテネイシンの使用である。
【００４６】
テネイシンを発現する腫瘍としてはこれらに限定されるわけではないが、神経膠腫、乳癌、肺癌、線維肉腫および扁平上皮癌が挙げられる。
【００４７】
本発明のさらに別の態様は、腫瘍の放射免疫療法用の薬物であり、これはテネイシンを発現する腫瘍を患う対象に投与され、該モノクローナル抗体またはタンパク分解断片あるいはその誘導体を含む。好適な態様において、該モノクローナル抗体またはタンパク分解断片あるいはその誘導体はビオチン化されており、より好適な態様において、薬物は放射免疫療法に適したものであり、特に三段階プレ標的化方法の実施に適したものである。この方法については、例えば欧州特許第０４９６０７４号、European Journal of Nuclear Medicine Vol.26、No 4; April 1999; 348-357 および米国特許第５９６８４０５号などの文献に記載されている。この後者の態様において、本発明による薬物はキットの形態とすればよく、該キットは５つのバイアルから構成され、ここで第一のバイアルは、ビオチン化抗体またはその断片あるいは誘導体を含み；第二のバイアルはアビジンを含み、第三のバイアルはビオチン化アルブミンを含み、第四のバイアルはストレプトアビジンを含み、第五のバイアルは放射標識化ビオチンまたはビオチン誘導体を含む。このような種類のキットは、European Journal of Nuclear Medicine Vol.26、No 4; April 1999; 348-357において提供されている。アビジンには、アビジン、ストレプトアビジン、ＰＥＧ−アビジンまたはＰＥＧ−ストレプトアビジン、ジ−またはポリアビジンあるいはジ−またはポリストレプトアビジンが含まれる。放射標識化ビオチンには放射性核種が含まれ、例えば、欧州特許第０４９６０７４号に開示されたものであり、好ましくは９０Ｙである。ビオチン誘導体は、例えば国際特許出願第ＷＯ０２／０６６０７５号に開示されている。このような種類のキットは、European Journal of Nuclear Medicine Vol.26、No 4; April 1999; 348-357において開示されている。好ましくはバイアルはヒト注射に適したものである。
【００４８】
本発明の抗体の組換え誘導体およびその接合体は常套方法により腫瘍療法に用いられる。本発明の抗体およびその断片、誘導体ならびに接合体はテネイシン−関連腫瘍、特に免疫療法による治療に好適に用いられるが、放射免疫療法が本発明の好適な態様である。
【００４９】
ビオチン化形態の抗体またはその断片を含む、特定の容器、好ましくは注射に好適なバイアルの形態の容器は、本発明のさらなる目的である。
【００５０】
本発明の別の態様において、治療用キットにおいて、ビオチン化抗体は別の優先的にＡ−Ｄ断片に向けられたテネイシン−特異的抗体と組み合わされる。あるいはビオチン化抗体はその他の腫瘍特異的抗体と組み合わされる。かかる種類のキットに関する一般的教示は、欧州特許第０４９６０７４号、European Journal of Nuclear Medicine Vol.26、No 4; April 1999; 348-357および米国特許第５９６８４０５号に提供されている。
【００５１】
特に、本発明には容器も含まれ、所望により容器は複数の区画を含み、かかる容器はビオチン化抗体またはその断片あるいは誘導体、バッファーおよび三段階プレ標的化方法での治療用キットでの使用に好適な試薬を含む。
【００５２】
本発明の別の目的は、モノクローナル抗体またはその断片、あるいはその組換え誘導体または接合体あるいはそれらのビオチン化誘導体の診断手段の調製のための使用であり、ここで診断手段はテネイシンを発現する疾患を検出するためのものであり、特に腫瘍のインビボイメージングのためのものである。
【００５３】
本発明の特別の態様において、該モノクローナル抗体またはその断片あるいは誘導体は第二のテネイシン−特異的抗体と組み合わされて診断キットの生産のためのサンドイッチアッセイにおいて用いられる。診断キットは、循環しているテネイシンレベルを測定するためのものである。サンドイッチアッセイは、例えば、第二の抗体がテネイシンの第二の抗原性エピトープに結合する条件下でのＥＬＩＳＡインビトロアッセイであり、該インビトロＥＬＩＳＡアッセイは循環しているテネイシンレベルの測定に有用である。
【００５４】
抗体またはその断片あるいは誘導体を含む診断用または治療用キットは本発明のさらなる目的である。
【００５５】
これらのおよびその他の本発明の目的は以下の実施例および図面による詳細な説明において詳しく開示される。
【００５６】
（発明の詳細な説明）
以下の実施例において詳細に説明するように、ＳＴ２１４６は対応するハイブリドーマ細胞クローンｃＳＴ２１４６から得られる。
【００５７】
本発明の工業的側面に関しては、本明細書において開示する抗体は、この技術分野で通常行われているように医薬組成物または診断キットとして好適に製剤することができる。
【００５８】
医薬組成物はこの技術分野において常套のものであり、当業者によって基本的知識に基づいて製造することができる。医薬組成物の例は本発明において引用する参考文献に例示されている。診断キットについても同様である。腫瘍の放射免疫療法用のキットにおいて特に好適なものは、上記 Paganelli et alの文献および欧州特許第０４９６０７４号に開示されている。
【００５９】
少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤および／または媒体と混合して抗体および／またはその断片および／またはその組換え誘導体および／またはその接合体を含む医薬組成物も本発明の枠内に含まれる。
【００６０】
以下の実施例によってさらに詳細に本発明を説明する。
【実施例１】
【００６１】
ＢＣ４の特異性を有するが機能性でない軽鎖を発現しない新規なハイブリドーマ細胞クローンを作成するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスをｐＴｎ２８大腸菌ファージ可溶化液で免疫した。ｐＴｎ２８はＢＣ４エピトープを含むことが以前に示されているヒトテネイシンのＥＧＦ−様リピートの断片をコードするλｇｔ１１組換えクローンである(Balza E. et al.、1993)。ヒトテネイシンＣの模式図、関連する組換え抗原性断片および試薬、ならびにＢＣ−４様抗体の作成に用いた戦略を図１に示す。ｐＴｎ２８で免疫した脾細胞を標準的方法によってＳｐ２／０Ａｇ１４非産生性ミエローマ細胞と融合させ (Cianfriglia M. et al.、Methods Enzymol. 121:193210、1986)、ハイブリドーマ集団をＳＫ−ＭＥＬ−２８（ヒトメラノーマ細胞系）で精製されたテネイシンに対するＥＬＩＳＡでスクリーニングした。テネイシン特異的ハイブリドーマを２回のＦＣＳ含有培地、３回のタンパク質非含有培地での限界希釈によりクローニングした (Animal Derived Component Free Medium Hyclone、HyQR Perbio)。ｃＳＴ２１４６／Ｄ３ｄ／Ｆ６ｅサブクローンをｃＳＴ２１４６マスター細胞バンク（ＭＣＢ）およびワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）の産生のために選択した。
【００６２】
ＳＴ２１４６参照物質の産生は、２Ｌのバイオリアクター中でｃＳＴ２１４６ハイブリドーマ細胞を培養することにより行い、ｃＳＴ２１４６ポスト産生細胞バンク（ＰＰＣＢ）の安定性をＦＡＣＳ分析および限界希釈により確認した。ＳＴ２１４６はＩｇＧ２ｂ／ｋアイソタイプのマウス免疫グロブリンである。
【００６３】
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示されるようにＳＴ２１４６は軽鎖組成については均質であった。該分析は重鎖はある程度不均一であることを示した。この観察はマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプについて以前に報告されているようなＯ−結合型グリコシル化の可変性と矛盾しない(Kim H. et al.、J. Biol. Chem. 269(16):12345-12350、1994)。ＦＣＳ含有培地またはタンパク質−非含有培地から得た３つのバッチからのＳＴ２１４６重鎖のバンドパターンが一致することが観察された。ＳＴ２１４６の重鎖のグリコシド化の可変性を該抗体をシアリダーゼで消化することにより確認した。ＳＴ２１４６を、HiTrap 脱塩カラム(Amersham-Pharmacia)によってバッファーを１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有、ｐＨ６．４）に交換した。Ｍａｂをセントリコン（centricons）１００，０００ＭＷＣＯ(Millipore) によって終濃度約１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１．５Ｕ／ｍｌのシアリダーゼ(Sigma)で３７℃で２４時間消化した。サンプルを１２％ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動にかけた。ゲル染色はクーマシーブリリアントブルーによって行った。予測されたように、この消化の結果、高分子量のバンドが除去された（図２）。ＳＴ２１４６の全体の均一性をヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーによって確認したところ、ＳＴ２１４６については単一のピークが示され、ＢＣ４については３つのピークが示された（図３、ここでＢＣ４について、完全に機能的なものはピーク３に対応する）。
【００６４】
ＳＴ２１４６はウェスタンブロット（図４）および競合的ＥＬＩＳＡ（図５）によって示されるように、ＢＣ４の抗原性エピトープと同一ではないが非常によく関連するエピトープへの結合によってヒトテネイシンに結合する。図５において、ビオチン化ＢＣ４を様々な濃度のコンペティターとしてのＢＣ４、ＳＴ２０７７またはＳＴ２１４６と混合し、テネイシンコーティングしたプレートに入れた。結合はＨＲＰ−ストレプトアビジンおよび関連する色素生産性物質の添加により測定した。ＳＴ２０７７はテネイシンのＥＧＦ−様リピート中のエピトープを認識する抗体であり、該エピトープは部分的にＢＣ４エピトープと共通する。
【００６５】
ＳＴ２１４６の免疫反応性をＢＣ４の完全に活性なピーク（ピーク３）と比較してＥＬＩＳＡによって評価した。図６は、最適抗原濃度のＥＬＩＳＡにおいてＯＤ１．０が得られるＳＴ２１４６の量（パネルＡ）はＢＣ４の完全に反応性のピーク３のおよそ２０分の１であり、ＢＣ４のおよそ１００分の１であることを示す。この相違は、抗原制限条件下では劇的に増幅されパネルＢに示すように、ＳＴ２１４６のみが良好な免疫反応性を維持した。
【００６６】
ＳＴ２１４６のアフィニティーをBIAcoreにより評価した。ＳＴ２１４６のＫＤは１．４ｘ１０−９であった（Ｋａ３．０ｘ１０５；ｋｄ４．１ｘ１０−４）。ＳＴ２１４６のアフィニティーデータをＢＣ４と比較した。ＢＣ４のＫＤは４．９ｘ１０−９（Ｋａ１．９ｘ１０５；ｋｄ９．３ｘ１０−４）であることが示された。
【００６７】
ビオチン化された場合の免疫反応性の維持はプレ標的化に用いるモノクローナル抗体の基本的特性である。ビオチン化ＳＴ２１４６の挙動を評価するため、様々な抗体：ビオチン比について調べ、ビオチン化抗体の免疫反応性をＢＣ４およびＳＴ１８９７を比較してＥＬＩＳＡによって測定した。ＳＴ１８９７はアフィニティーが低いテネイシン−特異的モノクローナル抗体である。表１の結果は低いビオチン化（２−３ビオチン／モル）はそのアフィニティーにかかわらずモノクローナル抗体の免疫反応性にわずかに影響を及ぼすことを示す。２０ビオチン／モルまでの高いビオチン化は免疫反応性の減少と関連していた。この減少幅がより大きいほど、抗体アフィニティーは低い。
【００６８】
【表１】
2005534615.tif 000003
【００６９】
％免疫反応性は、２−３回の独立した実験の平均＋／−標準偏差である。
【００７０】
ビオチン化ＳＴ２１４６のアフィニティーをBIAcoreによって測定した結果、結合したビオチン数にかかわらず実質的に維持された。
【００７１】
様々な腫瘍（乳癌、神経膠腫、大腸癌）に対する免疫組織化学は、ＢＣ４とＳＴ２１４６が類似の選択性を有することを示した。
【００７２】
腫瘍塊への局在化能力をしらべるためにビオチン化ＳＴ２１４６の薬理学的挙動を評価した。１２５Ｉ−標識化ＳＴ２１４６およびＢＣ４ビオチン化抗体の体内分布研究を、図７のプロトコールにしたがってテネイシンを発現するヒト腫瘍を移植されたヌードマウスについて行った。マウスに皮下に０．１ｍｌの無菌溶液中の４ｘ１０６のＨＴ２９ヒト大腸癌細胞を与えた。１５日後、腫瘍塊がおよそ１００ｍｇとなったときに、５マウスの群に静脈内に１２５Ｉ−標識化ＢＣ４、ＳＴ２１４６または標準マウス免疫グロブリン（ｎＭＩｇ）を０．１ｍｌの無菌ＰＢＳ中、１０、２、０．５または０．１μｇ／マウスにて与えた。すべての抗体はビオチン化されており（７−１０ビオチン／モル）、ＳＴ２１４６ビオチン化ＭａｂおよびＢＣ４ビオチン化Ｍａｂはともに約８０％の免疫反応性を示した。各動物には以下の量のＣＰＭを与えた。
【００７３】
【表２】
2005534615.tif 000004
【００７４】
図８の結果は、ＢＣ４とＳＴ２１４６はともに腫瘍塊に特異的に局在化することを示す。腫瘍部位における両抗体の量（％注射用量／組織グラムとして表す）は用量依存的であり、ＳＴ２１４６がより多く蓄積する傾向にあった。さらに、ＳＴ２１４６は図９に示すようにＢＣ４と比較して良好な腫瘍／非腫瘍比を示した。
【００７５】
カッパ軽鎖可変部を環状ｃＤＮＡから以下のプライマーを用いて増幅した(5'-TGTCAAGAGCTTCAACAGGA (配列番号５)、5'-AAGATGGATACAGTTGGTGC (配列番号６))。これはM. Sassano et al.、Nucl. Ac. Res. (1994) 22、1768-1769に記載のように抗体定常部にアニーリングする。
【００７６】
ガンマ重鎖可変部を環状ｃＤＮＡから以下のプライマーを用いて増幅した:オリゴマウス γ2bCH1 GTCACTGACTCAGGGAAGTAGCC (配列番号７); オリゴマウス γ2bCH3 GCAACGTGAGACACGAGGGTCTG (配列番号８)。これはM. Sassano et al. Nucl. Ac. Res. (1994) 22、1768-1769に記載のように抗体定常部にアニーリングする。
【００７７】
ＰＣＲを以下の条件を用いて行った：９４℃１分、６０℃１．５分、７２℃２分、３０サイクル。
【００７８】
増幅した断片をＳｍａＩで切断したプラスミドｐＵＣ１８に直接クローニングした。カッパ軽鎖を含む２つのクローンおよびガンマ重鎖可変部を含む４つのクローンを配列決定した。配列決定はMWG Biotech、Germanyにて行った。両鎖を配列決定した。不明瞭な点はなかった。
【００７９】
図１０は、ＳＴ２１４６可変軽鎖（ＶＬ）の配列を示す。
【００８０】
図１１は、ＳＴ２１４６可変重鎖（ＶＨ）の配列を示す。
【００８１】
ＢＣ４と比較したＳＴ２１４６の全体的な比較特徴付けによりＳＴ２１４６が以下の特徴を有することが示される。
−エピトープ特異性についてはＢＣ４−様のモノクローナル抗体である；
−重鎖および軽鎖の組成については均質である；
−重鎖グリコシル化については不均質である；
−ＢＣ４の不均一性から予測されるように免疫反応性についてはＢＣ４より優れている；
−アフィニティーについては約３倍ＢＣ４よりすぐれている；
−ビオチン化の際の免疫反応性の維持についてはＢＣ４より優れている；
−免疫組織化学における選択性についてはＢＣ４と同様である；
−腫瘍標的化についてはＢＣ４より優れている。
【００８２】
（参考文献）
Balza E., Siri A., Ponassi M., Caocci F., Linnala A., Virtanen I., Zardi L. Production and characterization of monoclonal antibodies specific for different epitopes of human tenascin. FEBS 332:39-43, 1993.
Chinol M., Casalini P., Maggiolo M., Canevari S., Omodeo E.S., Caliceti P., Veronese F.M., Cremonesi M.,Chiolerio F., Nardone E., Siccardi A.G., Paganelli G. Biochemical modifications of avidin improve pharmacokinetics and biodistribution, and reduce immunogenicity. British Journal of Cancer 78(2): 189-197, 1998.
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Ferrer C., Anastasi A.M., Di Massimo A.M., Bullo A., Di Loreto M., Raucci G., Pacilli A., Rotondaro L., Mauro S., Mele A. and De Santis R. Expression and characterization of a mouse/human chimeric antibody specific for EGF receptor.  J. Biotechnol. 52: 51-60, 1996
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Paganelli G., Grana C., Chinol M., Cremonesi M., De Cicco C., De Braud F., Robertson C., Zurrida S., Casadio C., Zoboli S., Siccardi A. G., Veronesi U. Antibody-guided three step therapy for high grade glioma with yttrium-90 biotin. Eur J Nucl Med 26(4):348-357, 1999.
Paganelli G., Bartolomei M., Ferrari M., Cremonesi M., Broggi G., Maira G., Sturiale C., Grana C., Prisco G., Gatti M., Caliceti P., Chinol M. Pre-targeted locoregional radioimmunotherapy with 90Y-biotin in glioma patients: Phase I study and preliminary therapeutic results. Cancer Biother & Radiopharm 16(3):227-235, 2001.
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【００８３】
本明細書において引用されたすべての文献は引用によりその内容全体を本出願に含める。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ヒトテネイシンＣ、関連する組換え抗原性断片および試薬、ならびにＢＣ−４様抗体の作成に用いた戦略の模式図を示す。
【図２】図２は、シアリダーゼで抗体を消化することによるＳＴ２１４６重鎖の可変性のグリコシドの性質の確認を示す。
【図３】図３は、ＢＣ４に対するＳＴ２１４６の全体の均一性を示す。
【図４】図４は、ＢＣ４の抗原性エピトープと比較したヒトテネイシンエピトープに結合しているＳＴ２１４６のウェスタンブロットを示す（レーンＤは空である）。
【図５】図５は、競合的ＥＬＩＳＡを示す。ここでＳＴ２１４６はヒトテネイシンへの結合においてＢＣ４と強く競合しており、ＳＴ２０７７は部分的な競合しか示さない。ＳＴ２０７７はＳＴ２１４６を作成する手順において得られたテネイシン特異的モノクローナル抗体である。ＳＴ２０７７はＳＴ２１４６同様に特異性を示したが（ヒトテネイシンのＥＧＦ−様リピート領域）、ＢＣ４／ＳＴ２１４６エピトープを部分的にしか阻害しない抗原性エピトープに向けられたものである。
【図６】図６は、ＢＣ４の完全に活性なピークと比較したＥＬＩＳＡによるＳＴ２１４６の免疫反応性を示す。
【図７】図７は、ＳＴ２１４６の体内分布研究のプロトコールを示す。
【図８】図８は、ＢＣ４と比較したＳＴ２１４６の体内分布を示す（ｂｉｏｔ＝ビオチン化；ＩＲ＝ＥＬＩＳＡにおいて１．０のＯ．Ｄを得るための抗体量として表した免疫反応性）。
【図９】図９は、ＢＣ４と比較したＳＴ２１４６の腫瘍／非腫瘍比を示す。
【図１０】図１０は、ＳＴ２１４６可変軽鎖（ＶＬ）の配列を示す（配列番号１（全長アミノ酸）、３（アミノ酸をコードするＤＮＡ）、９（ＣＤＲ１の軽鎖アミノ酸）、１０（ＣＤＲ１の軽鎖ＤＮＡ）、１１（ＣＤＲ２の軽鎖アミノ酸）、１２（ＣＤＲ２の軽鎖ＤＮＡ）、１３（ＣＤＲ３の軽鎖アミノ酸）、１４（ＣＤＲ３の軽鎖ＤＮＡ）および２１（全長ＤＮＡ））。
【図１１】図１１は、ＳＴ２１４６可変重鎖（ＶＨ）の配列を示す（配列番号２（全長アミノ酸）、４（アミノ酸をコードするＤＮＡ）、１５（ＣＤＲ１の重鎖アミノ酸）、１６（ＣＤＲ１の重鎖ＤＮＡ）、１７（ＣＤＲ２の重鎖アミノ酸）、１８（ＣＤＲ２の重鎖ＤＮＡ）、１９（ＣＤＲ３の重鎖アミノ酸）、および２０（ＣＤＲ３の重鎖ＤＮＡ）および２２（全長ＤＮＡ））。
【配列表】
2005534615.tif 000005
2005534615.tif 000006
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2005534615.tif 000013
2005534615.tif 000014
【図１】
2005534615.tif 000015
【図２】
2005534615.tif 000016
【図３】
2005534615.tif 000017
【図４】
2005534615.tif 000018
【図５】
2005534615.tif 000019
【図６】
2005534615.tif 000020
【図７】
2005534615.tif 000021
【図８】
2005534615.tif 000022
【図９】
2005534615.tif 000023
【図１０】
2005534615.tif 000024
【図１１】
2005534615.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月22日(2004.10.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005534615000001.app
【国際調査報告】
2005534615.tif 000026
2005534615.tif 000027
2005534615.tif 000028
2005534615.tif 000029