(57)【要約】本発明は、凝集して、リポソームを形成する高分子デスタビラーゼ複合体となり得る、単量体型の安定なデスタビラーゼ複合体に関するものであり、該デスタビラーゼ複合体は、医療用ヒルから以下の方法：適当なカラムに固定化された６−ケト−プロスタグランジン抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー；および高イオン強度でのデスタビラーゼ複合体の溶出により得ることができる。この複合体は、少なくとも７００ＡＴＵ／ｍｇの抗トロンビン活性、少なくとも８００ＡＰＣ／ｍｇの血漿カルシウム再沈着時間、少なくとも４０ｍｍ２／ｍｇの繊維素溶解活性、および免疫調節活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝集して、リポソームを形成する高分子デスタビラーゼ複合体となり得る、単量体型の安定なデスタビラーゼ複合体であって、
−  適当なカラムに固定化された６−ケト−プロスタグランジン抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー、および
−  高イオン強度でのデスタビラーゼ複合体の溶出
を含む方法により医療用ヒルから得ることができ、
少なくとも７００ＡＴＵ／ｍｇの抗トロンビン活性、少なくとも８００ＡＰＣ／ｍｇの血漿カルシウム再沈着時間、少なくとも４０ｍｍ２／ｍｇの繊維素溶解活性、および免疫調節活性を有する、デスタビラーゼ複合体。
【請求項２】
請求項１に記載のデスタビラーゼ複合体、および医薬上許容されるビヒクルを含んでなる、医薬組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のデスタビラーゼ複合体を含んでなる、化粧用組成物。
【請求項４】
薬剤としての、請求項１に記載のデスタビラーゼ複合体。
【請求項５】
抗凝固活性および免疫調節活性を有する薬剤の製造のための、請求項１に記載のデスタビラーゼ複合体の使用。
【請求項６】
少なくともその一部が、請求項１に記載のデスタビラーゼ複合体を含んでなる被覆材で被覆されている、埋め込み可能な医療用人工器官。
【請求項７】
ステント支持体である、請求項６に記載の埋め込み可能な人工器官。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、化粧品または医薬品としての特性を有する、リポソームの形態の生物活性物質の製造に関するものである。より詳細には、このリポソームは医療用ヒルから抽出された天然のリポソームである。この天然リポソームは、抗凝固活性および免疫調節活性を有する。
【０００２】
ヘパリンなどの抗凝固特性を有する化合物、および免疫調節特性を有する化合物は既に公知である。これらのタイプの化合物は治療目的に使用され、例えば「ステント」と呼ばれる、身体的に許容される支持体を介して投与される。
【０００３】
これらのステントは、心臓血管外科で頻繁に用いられる内部人工器官であり、血管、特に冠状動脈または末梢動脈に埋め込まれる。動脈が狭窄するアテローム性血管疾患は、血管拡張術と名づけられた拡張カフ法で処置できることが知られている。このカフを動脈中に挿入し、アテロームの沈着を押しつぶす圧力まで膨張させる。しかし、これらの手法は常に十分であるわけではなく、そのため、血管拡張術で処置された部分の血管には、通常、処置された領域の動脈内部に挿入されるとチューターとして働く金属製支持体からなる、ステントと呼ばれることが多い内部人工器官が埋め込まれる。例えば、カフを血管に挿入する前に、このようなステントをカフ上のいわゆる停止位置に固定する。このステントを血管内部の埋め込み領域まで移動させたら、拡張される血管の壁と接触するように、カフを拡張させることにより配置する。
【０００４】
ステントは、治療活性を有する物質、特に埋め込み領域において働くことを目的とするもので被覆できることは公知である。
【０００５】
先行技術では、非常に多くのステント装置が知られている。例えば、ステント型装置からの活性物質の放出のための方法や装置は、米国特許第６０９６０７０号明細書；同第５８２４０４９号明細書；同第５６２４４１１号明細書；同第５６０９６２９号明細書；同第５５６９４６３号明細書；同第５４４７７２４号明細書；および同第５４６４６５０号明細書に記載されている。薬剤放出のためのステントの使用は、例えば、国際公開第０１／０１９５７号公報、米国特許第６０９９５６１号明細書；同第６０７１３０５号明細書；同第６０６３１０１号明細書；同第５９９７４６８号明細書；同第５９８０５５１号明細書；同第５９８０５６６号明細書；同第５９７２０２７号明細書；同第５９６８０９２号明細書；同第５９５１５８６号明細書；同第５８９３８４０号明細書；同第５８９１１０８号明細書；同第５８５１２３１号明細書；同第５８４３１７２号明細書；同第５８３７００８号明細書；同第５７６９８８３号明細書；同第５７３５８１１号明細書；同第５７００２８６号明細書；同第５６７９４００号明細書；同第５６４９９７７号明細書；同第５６３７１１３号明細書；同第５５９１２２７号明細書；同第５５５１９５４号明細書；同第５５４５２０８号明細書；同第５５０００１３号明細書；同第５４６４４５０号明細書；同第５４１９７６０号明細書；同第５４１１５５０号明細書；同第５３４２３４８号明細書；同第５２８６２５４号明細書；および同第５１６３９５２号明細書に記載されている。ステント被覆法は、特に米国特許第６４０９７１６号明細書；同第６４６４８９３号明細書；および同第５３５６４３３号明細書に記載されている。
【０００６】
しかし、先行技術には、リポソームの形態のステント用被覆材を形成でき、抗凝固特性および免疫調節特性を有する物質についての記載はない。先行技術によれば、２つの別々の薬剤、すなわち抗凝固物質および免疫調節物質を患者に投与しなければならない。
【０００７】
リポソームは、有利にも、無極性および極性双方の医薬活性化合物のためのベクターとして非常に有用なものである。このために、このリポソームという形態は、上記の２つのタイプの化合物を同じ部位に投与する目的で用いることができる。
【０００８】
本発明は、先行技術の不利な点を克服すること、特に、抗凝固特性および免疫調節特性の両方を有する組成物であり、ステントのような装置と関連づけることが可能で、物質を適切に放出するためのリポソームの形態の組成物を得ることを目的とする。
【０００９】
本発明者らは、医療用ヒルからそのような物質を得ることに成功した。
【００１０】
プロトタイプと呼ばれるデスタビラーゼ複合体を得る方法は先行技術として公知であり、この方法は、固定化リジン（ＲＥＦ）を担持する水に不溶性の支持体（例えば、ＣＮＢｒ−活性化アガロース）を用いるアフィニティークロマトグラフィーを利用するものである。その抽出物は中性ｐＨよりも低いｐＨのバッファーによって移動させ、ｐＨを中性として、透析および凍結乾燥工程を行う。しかし、ｐＨが９より低いバッファーを用いて最終生成物を固定化リジンから溶出させても、求められる貯蔵条件に適し、かつ求められる十分な酵素活性を有するデスタビラーゼ複合体を生成することはできない。この方法により抽出されたデスタビラーゼ分子は不安定な単量体型の酵素複合体であり、これは構造変化しやすく、その結果、高分子型の酵素複合体を形成する能力を失う。この単量体型の酵素複合体は、もはやそれ自体に、必要に応じてリポソームを組織する高分子を構築する能力はない。医療用ヒルにより生成される既知の複合体（プロトタイプ）は、ヒルジン、プロスタグランジン、デスタビラーゼおよび血漿カリクレイン阻害剤が１：１：１：１の比率の複合体を形成する。
【００１１】
特許出願ＲＵ２１２９４２９Ｃの要約ＸＰ００２２３７１９０には、医療用ヒル由来のプロスタグランジン複合体の単離法について記載されている。この方法では、水に不溶性の支持体上に固定化された６−セトプロスタグランジン−Ｆ１抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる、混合物の精製が必要とされる。
【００１２】
Nikonov Gl et alの文献(Destabilase complexes - natural liposome produced by medicinal leeches hirudo medicinalis" Fundamental & Clinical Pharmacology, Elsevier, Paris, FR, vol. 13, No. 1, 1999, pages 102-106)には、医療用ヒルから得られるデスタビラーゼ複合体ベースの天然のリポソームを製造する方法が記載されている。ミセル型の特性を有するデスタビラーゼ複合体を得るために、以下に示す手順が実行される：
−  有機溶媒を用いるヒル頭部からの抽出、
−  ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ基質上に固定化された抗セト−ＰＦＧ抗体を含むアフィニティークロマトグラフィー。
【００１３】
溶出液は電気泳動で分析される。得られた画分は、デスタビラーゼ単量体の凝集体からなり、ミセルタンパク質の特性を有し、安定な脂質−タンパク質複合体として表される。
【００１４】
デスタビラーゼ単量体は、リポソームを形成する高分子デスタビラーゼ複合体の形態を取り得る。このリポソームは、細胞膜をすばやく貫通する能力を有し、抗血栓活性を有する。
【００１５】
特許出願ＷＯ９２／０２２０６には、酒さの処置のための化粧品処方を含む凍結乾燥天然コラーゲンシートが記載されている。この化粧品製剤の活性成分は、ヒル由来の抗凝固タンパク質であるヒルジンを含むことができる。
【００１６】
特許出願ＷＯ９８／１６６０４には、グルタミンとリジンとの間の結合を触媒的に破壊できるイソペプチダーゼ型酵素を含む洗浄組成物、好ましくは洗剤のための界面活性組成物が記載されている。
【００１７】
特許出願ＷＯ０１／４７５７２には：
抗血栓および抗炎症活性を有する活性化合物を含む装置の供給、および
血管の再狭窄を阻止するための、血管への該装置の埋め込み
を含む、血管再狭窄を阻止する方法が記載されている。
【発明の概要】
【００１８】
本発明者らは、先行技術による組成物よりも高い生物活性を有する安定なデスタビラーゼの複合体を得ることを目的とした。
【００１９】
本発明者らは、安定で、かつ、それら自体で凝集して、リポソームを組織できる高分子となり得る単量体デスタビラーゼ複合体を得ることに成功した。
【００２０】
従って、本発明の第一の態様の目的は、凝集して、リポソームを形成する高分子デスタビラーゼ複合体となり得る、単量体型の安定なデスタビラーゼ複合体であって、
−  適当なカラムに固定化された６−ケト−プロスタグランジン抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー、および
−  高イオン強度でのデスタビラーゼ複合体の溶出
を含む方法により医療用ヒルから得ることができるものであり、
少なくとも７００ＡＴＵ／ｍｇの抗トロンビン活性、少なくとも８００ＡＰＣ／ｍｇの血漿カルシウム再沈着時間、少なくとも４０ｍｍ２／ｍｇの繊維素溶解活性、および免疫調節活性を有する、デスタビラーゼ複合体である。
【００２１】
この精製方法は、クロマトグラフィー、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーにより行われる。この方法は、
−  適当なカラムに固定化された、好ましくは６−ケト−ＰＧＦ１αにより作製された６−ケト−プロスタグランジン抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー、および
−  高イオン強度でのデスタビラーゼ複合体の溶出
を含んでなる。
【００２２】
この方法により得られた前記デスタビラーゼ複合体は単量体型であり、デスタビラーゼと、ヒルジン、プロスタグランジン、カリクレイン阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つの化合物とを含む。
【００２３】
抗６−ケト−ＰＧＦ１α抗体の作用およびセファロースリジンを組み合わせることもできる。
【００２４】
このリポソームデスタビラーゼ複合体は、単量体デスタビラーゼ複合体と同様に非常に有用な医薬特性を有し、すなわち、典型的には、少なくとも５００、好ましくは少なくとも６００または７００ＡＴＵ／ｍｇの抗トロンビン活性、少なくとも８００ＡＰＣ／ｍｇの血漿カルシウム再沈着時間、および少なくとも４０ｍｍ２／ｍｇの繊維素溶解活性を有する。この抗血栓作用および血栓溶解作用は、対照およびプロトタイプの作用よりも顕著に優れたものである。
【００２５】
本発明はまた、本発明によるリポソームデスタビラーゼ複合体、および医薬上許容されるビヒクルを含んでなる医薬組成物に関する。
【００２６】
「医薬上許容されるビヒクル」という用語は、毒性がなく、活性成分と反応せず、よって活性成分の効果を損なうことのない、固体もしくは液体の希釈材料またはカプセル化材料を意味するために用いられる。
【００２７】
本発明はまた、本発明によるリポソームデスタビラーゼ複合体を含んでなる化粧用組成物に関する。
【００２８】
本発明はまた、薬剤としての前記リポソームデスタビラーゼ複合体、ならびに抗凝固活性および免疫調節活性を有する薬剤の製造のための、単量体または高分子リポソームデスタビラーゼ複合体の使用に関する。
【００２９】
本発明はまた、抗６−ケト−プロスタグランジン抗体を充填したアフィニティーカラムを含んでなる、医療用ヒル由来のデスタビラーゼ複合体の精製のための装置に関する。
【００３０】
本発明はまた、少なくともその一部が、本発明によるデスタビラーゼ複合体を含んでなる被覆材で被覆されている、埋め込み可能な医療用人工器官に関する。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、前記埋め込み可能な人工器官はステント支持体とされる。
【００３２】
本発明のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明により明らかとなろう。
【発明の具体的説明】
【００３３】
本発明による安定なデスタビラーゼ複合体の精製方法は、水に不溶性の支持体上に固定化された６−ケト−ＰＧＦ１α（６−ケト−プロスタグランジンＦ１α）抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー工程を含む。免疫アフィニティークロマトグラフィーの原理は当業者に公知であり、それは複雑な天然抽出物に由来する特定のタンパク質抗原を捕捉するためのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の特異性に基づいている。しかし、本発明者らは、非常に驚くべきことに、抗凝固および免疫調節生物活性が保存されたまま、それ自体リポソームを組織できるデスタビラーゼ複合体を得ることに成功した。
【００３４】
この抗体は、固体マトリックスを形成させるために、クロマトグラフィー固定相、典型的にはアガロース、に共有結合（例えば、臭化シアンＣＮＢＲ）を介して、または免疫グロブリンのアミノ、ヒドロキシル、カルボキシルまたはスルフヒドリル基を標的とする他の化学結合を介して結合させる。次いで、この抗体を結合させた固定相をアフィニティークロマトグラフィーのカラム中に配置する。標的抗原と混入物の混合物を、結合バッファーで希釈し、次いでカラムに載せる。吸着されない混入物は、別のバッファーを用いて洗浄することにより除去される。次に、例えば極端なｐＨ条件、イオン強度の変化を用いて、標的タンパク質抗原を溶出させる。
【００３５】
ヒルジンおよびカリクレイン阻害剤は、水相においてのみ活性を有する。デスタビラーゼは、非水性相においてのみ活性を有する。
【００３６】
本発明者らにより得られた安定なデスタビラーゼ複合体は、プロスタグランジン成分による疎水性、およびリポソームポリペプチドによる親水性を有する。
【００３７】
デスタビラーゼ複合体の単量体型は分子量２５ｋＤａであり、安定で、リポソームの形成をもたらす凝集能力を有する。それは、全ヒル抽出物、または特にヒルの唾液腺からの分泌物の画分、もしくは消化管の血液から得られる。アフィニティークロマトグラフィーによる精製の後、得られたデスタビラーゼ複合体は、以下の化合物：ヒルジン、プロスタグランジン（プロスタサイクリン類似物質）、カリクレイン阻害剤、デスタビラーゼを含む。このデスタビラーゼ複合体は、以下に示す特性を有する：ヒルジンによる抗血栓活性、カリクレイン阻害剤による血漿カルシウム再沈着時間の延長、プロスタサイクリン類似物質による粘着および血小板凝集の阻止、デスタビラーゼによる安定化されたフィブリンの分解。
【００３８】
デスタビラーゼ複合体のこれらの特性により、その抗血栓、血栓溶解効率（プロトタイプより２.５倍優れている）、そしてその免疫調節活性、およびプロトタイプでは完全に欠けているその降圧作用が決定づけられる。
【００３９】
以下、精製されたヒル抽出物およびリポソームの形態の生物活性を測定する方法を示し、次いで４つの実施例により、本発明によるデスタビラーゼ複合体の抗凝固活性および免疫調節活性を実証する。
【００４０】
１／抗トロンビン活性は、トロンビンによるフィブリノーゲンの沈殿時間の延長により決定される。沈殿物形成のための時間は、０．２ｍｌの０．３％フィブリノーゲン溶液および０．１ｍｌのデスタビラーゼ複合体を含む系において、１単位のトロンビン活性を含むトロンビン溶液０．１ｍｌを固定化した後に測定する。ヒルジンの活性は、国際抗トロンビン単位（ＡＴＵ  ＮＩＨ）で表す。
【００４１】
２／血漿カルシウム再沈着時間は、０．１ｍｌのクエン酸血漿および０．１ｍｌのデスタビラーゼ複合体を含む系において、０．１ｍｌの０．０２５Ｍ ＣａＣｌ２溶液を固定化した後に測定する。このパラメーターが倍増すると、１ＡＰＣ単位に相当する。
【００４２】
３／プロスタグランジン中の６−ケト−ＰＧＦ１α含量は、Ａｍｅｒｓｈａｍ社から入手した放射免疫−テストＸを用いて測定する。
【００４３】
４／デスタビラーゼ複合体の抗血栓作用は、Ｗｅｓｓｌｅｒの血栓形成法（５）を用いてラットで測定する。血栓形成阻止レベルを、対照に対して評価する。これは、デスタビラーゼ複合体の注射と、風邪により活性化されたヒト血清の注射を４時間あけて行った後に、その結果を検討することにより行う。この阻止の程度は、対照（等容量の通常の生理食塩液）に対する百分率として表す。
【００４４】
５／降圧作用は、ＳＨＲ系統（自然発症高血圧）のラットに０．２ｍｌのデスタビラーゼ複合体を経口投与した後に測定する。最初の血圧は、１６５±５ｍｍであった。１０時間の分析後、ラットの血圧を尾静脈で測定した。降圧効果レベルは、対照（等投与容量の通常の生理食塩液）に対する百分率として表す。
【００４５】
６／好中球のサイトファージ活性は、公知のＣｈｅｒｎｕｓｈｅｎｋｏ法（６）により測定する。この実験は、２０匹の軟毛期のラット（軟毛でおおわれたラット）について行った。０．５ｍｌのデスタビラーゼ複合体水溶液を、１０日間、毎日静脈内注射した（ｎ＝１０）。対照動物（ｎ＝１０）には、等容量の０．８５％ＮａＣｌ溶液を注射した。適当な時間が経過した後、動物の血液を採取し、好中球のサイトファージ活性を試験した。ファゴサイトーシス指数を、サイトファージ指数（ＣＩ）およびファゴサイトーシス率（Ｐｈ）として定義した。
【００４６】
７／補体系の構成成分活性の阻害を測定することにより、細胞活性に及ぼす影響を試験した。ヒト希釈血清の溶血活性を明らかにする方法（７）も用いた。
【００４７】
これらの結果を以下に示す。
【実施例】
【００４８】
実施例１
プロトコールを以下に示す：
１０匹の医療用ヒル（合計１２ｇ）をとり、ホモジナイズして、総ホモジナイズ容積が２４ｍｌとなるように蒸留水と混合し（容積比１：１）、次いで粉砕してその上清を回収する。
【００４９】
ホモジネートの上清を、抗６−ケト−ＰＧＦ１α固定化抗体を含むアガロースカラムに載せる。
【００５０】
０.２Ｍグリシンと、０.１５ＭのＨＣｌおよび０.５ＭのＮａＣｌと共に含むバッファーを用いて溶出液を得る。溶出容積は３５ｍｌである。
【００５１】
表１に示すように、最終生成物は、繊維素溶解活性、抗トロンビン活性を有し、カルシウム再沈着時間が増し、プロスタグランジンを含有し、強い抗血栓溶解能力（抗血栓および血栓溶解能力）に加えて、血圧を２５％下げる降圧作用（ほぼ正常な血圧まで降圧）を有する。
【００５２】
実施例２
５ｍｌのヒル唾液腺分泌物を、抗６−ケト−ＰＧＦ１α固定化抗体を含むアガロースカラムに加えた。ｐＨ６.４の０．５Ｍリン酸バッファーを用いて溶出液を得る。溶出容積は１０ｍｌである。
【００５３】
表１に示すように、最終生成物は、抗トロンビン活性、繊維素溶解活性を有し、カルシウム再沈着時間が増し、プロスタグランジンを含有し、強い抗血栓および血栓溶解能力に加えて、血圧を２５％下げる降圧作用（ほぼ正常な血圧まで降圧）を有する。デスタビラーゼ複合体は、サイトファージ指数およびファゴサイトーシス率を増加させ（表１）、免疫刺激作用を示す。
【００５４】
実施例３
医療用ヒルの消化管由来の１０ｍｌの血液（最終食餌から３ケ月後）を、Ｌ−グルタミン−セファロースカラムに載せる。１ＭのＫＣｌ溶液を用いて溶出液を得る。溶出容積は２０ｍｌである。表１に示すように、最終生成物は、抗トロンビン、繊維素溶解活性を有し、カルシウム再沈着時間が増し、プロスタグランジンを含有し、強い抗血栓および血栓溶解能力に加えて、血圧を２５％下げる降圧作用（ほぼ正常な血圧まで降圧）を有する。デスタビラーゼ複合体は、サイトファージ指数およびファゴサイトーシス率を増加させ（表１）、免疫刺激作用を示す。
【００５５】
実施例４
プロトコールを以下に示す：２０匹の医療用ヒル（合計２１ｇ）をとり、ヒルの前部分から抽出し、ホモジナイズして、水性抽出物を回収する。１０ｍｌの抽出物を、Ｌ−リジン−セファロースカラムに載せる。１ＭのＫＣｌ溶液を用いて溶出液を得る。溶出容積は２０ｍｌである。
【００５６】
表１に示したように、最終生成物は抗トロンビン、繊維素溶解活性を有し、カルシウム再沈着時間が増し、プロスタグランジンを含有し、強い抗血栓および血栓溶解能力に加えて、血圧を２５％下げる降圧作用（ほぼ正常な血圧まで降圧）を有する。デスタビラーゼ複合体は、サイトファージ指数およびファゴサイトーシス率を増加させ（表１）、免疫刺激作用を示す。
【００５７】
【表１】
2005534331.tif 000002
【００５８】
当業者ならば、精製された前記抽出物をステントに適用するための多くの異なる方法を用いることができる。こうして、本発明者らは、非常に多くの異なるタイプのデスタビラーゼ複合体支持体ステントを得た。たとえば、あるステントは、外側がゼラチン状マトリックスが配置される高分子表面であり、このマトリックスには、デスタビラーゼ複合体がリポソームの形態で含まれている。一つの実施態様によれば、この高分子表面は、ゼラチン状マトリックスと共有結合により結合する。例えば、この高分子ゲルは、非圧縮状態で１０〜５０μｍの厚さであってよい。例えば、このゲルは、ポリカルボン酸、セルロースポリマー、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、無水マレイン酸ポリマー、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、およびポリアクリル酸からなる群から選択することができる。
【国際調査報告】
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