(57)【要約】オートインデューサー−２を生産しない細菌を同定する工程；及び前記細菌を調節するのに十分な量のオートインデューサー−２エフェクターと、前記細菌を接触させる工程；を含む細菌の調節方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オートインデューサー−２を生産しない細菌を同定する工程；及び
前記細菌を調節するのに十分な量のオートインデューサー−２エフェクターと、前記細菌を接触させる工程；
を含む細菌の調節方法。
【請求項２】
前記細菌が、Pseudomonas及びBurkholderiaからなる群から選択される属に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が、Pseudomonas aeruginosaまたはBurkholderia cepaciaである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌が、オートインデューサー−２またはオートインデューサー−２アゴニストの存在下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記オートインデューサー−２またはオートインデューサー−２アゴニストが、第二の細菌によって分泌される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、オートインデューサー−２またはオートインデューサー−２アゴニストを探知する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記オートインデューサー−２またはオートインデューサー−２アゴニストが、フラノンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記フラノンが、３（２Ｈ）−４−ヒドロキシ−５−メチルフラノンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が、真核生物細胞の存在下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記真核生物細胞が、免疫系の細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌が、免疫系の細胞のアポトーシスを引き起こす、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記オートインデューサー−２エフェクターが、オートインデューサー−２アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オートインデューサー−２アンタゴニストが、シクロペンテノン基を含む。請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記オートインデューサー−２アンタゴニストが、約６から約１４の炭素を有する２−アルキル−２−シクロペンテン−１−オンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オートインデューサー−２アンタゴニストが、２−ペンチル−２−シクロペンテン−１−オンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記オートインデューサー−２エフェクターが、オートインデューサー−２アゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
オートインデューサー−２を生産しない細菌に感染した患者を同定する工程；及び
前記感染のひどさを低減するのに有効な量で、前記患者にオートインデューサー−２エフェクターを投与する工程；
を含む患者の治療方法。
【請求項１８】
前記患者がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が嚢胞性線維症に罹患している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が敗血性ショックに罹患している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌が、Pseudomonas及びBurkholderiaからなる群から選択される属に属する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌が、Pseudomonas aeruginosaまたはBurkholderia cepaciaである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
オートインデューサー−２を生産しない第一の細菌と、オートインデューサー−２活性を有する化合物を生産する第二の細菌とで感染された、嚢胞性線維症に罹患しているヒトを同定する工程；及び
第一の細菌によって引き起こされる感染のひどさを低減するのに有効な量で、前記患者にオートインデューサー−２アンタゴニストを投与する工程；
を含む嚢胞性線維症の治療方法。
【請求項２４】
前記第一の細菌がPseudomonas aeruginosaである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記オートインデューサー−２活性を有する化合物がオートインデューサー−２である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、細菌の調節方法に関する。とりわけ本発明は、オートインデューサー−２を生産しない細菌を、オートインデューサー−２エフェクターに曝すことによる、前記細菌の調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、米国で約３０，０００の子供達及び成人が罹患している遺伝学的疾患であり、肺及び膵臓のような器官に並んだ細胞内で、ナトリウム及び塩素（塩）の不完全な輸送のため、異常に濃く粘着性の粘液の生産を身体に引き起こす。濃い粘液は膵臓を遮断し、食物の分解を助け食物を消化するために酵素が腸に到達することを妨げる。さらに、細菌が粘液でコロニー形成し、再発性の感染を生じ、それが進行的に呼吸を害する慢性の炎症を導き、場合によっては死を引き起こす。
【０００３】
これらのコロニー形成細菌の中で一番に挙げられるのは、Pseudomonas aeruginosaである。悲劇的なことに、多くの嚢胞性線維症罹患者は子供達である。１２歳までに、嚢胞性線維症患者の６０−９０％がこの細菌の感染に罹患し、ほとんどが３０歳前に死亡する。他の病原体は一般的に、嚢胞性線維症患者の呼吸管でコロニー形成するが、Pseudomonas aeruginosaは、疾患の罹患率と死亡率のほぼ９０％を引き起こす。
【０００４】
Pseudomonas aeruginosaのような細菌は、典型的に毒性因子を生産することによって部分的に宿主細胞を攻撃する病原体であり、その毒性因子は、感染の発達を促進するタンパク質及び他の化合物である。そのような毒性因子は典型的に、宿主生物から免疫応答を誘発する（即ちそれらは抗原性である）ため、多くの病原体は、細菌が免疫系の応答により良く耐え得るレベルにその集団の密度が到達するまで、これらの因子の生産を遅延している。そのような病原体は、「クオラム−センシング」として知られた機構である、オートインデューサーとして知られている低分子量化合物を分泌して探知することによって、その集団密度をモニターしている。図１は、クオラム−センシングのいくつかの特徴を模式的に説明する。そのような細菌クオラム−センシングシステムは、個々の細菌がオートインデューサーを分泌しているが、オートインデューサーが細菌の集団密度に対応する特定の域値に到達するまでそれに応答しないという、分泌／探知サーキットからなると解されている。
【０００５】
これらの各種のクオラム−センシングシステムが現在知られており、それらの分類はオートインデューサーの化学的性質に依存している。例えばPseudomonas aeruginosaは、ＡＨＬ、オートインデューサー−１、またはＡＩ−１としても知られているオートインデューサーである、Ｎ−アシルホモセリンラクトンを分泌し検出している（H. Wu等, Pseudomonas aeruginosa Mutations in lasl and rhll Quorum Sensing Systems Result in Milder Chronic Lung Infection," Microbiology, Vol. 147, pp. 1105-1113 (2001)参照 ）。ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ００／３２１５２は、オートインデューサー−２として知られている異なるタイプのオートインデューサーを使用するクオラム−センシングシステムを記載している。ＷＯ００／３２１５２は、細菌の各種の調節方法を提供することによって、当該技術分野に多大な進歩を与えている。例えば当該文献は、分泌／探知クオラム−センシングサーキットを有する細菌の同定方法、及び当該サーキットの機能化の妨害方法を開示している。さらに、ペプチドに基づくクオラム−センシングシステムも知られている。当業者は一般的に、天然に存在する細菌が、それら自体で生産するオートインデューサーのみを探知していると推測している。
【０００６】
毒性因子の生産に加えて、しばしばクオラム−センシングの制御の中では、ある細菌病原体は、クオラム−センシングとは関連しないと解される方法で感染を促進している。一つのそのような方法は、宿主の免疫系細胞にアポトーシスを誘導することによるような、宿主の免疫応答を操作することによる。アポトーシス、またはプログラムされた細胞死は、身体が、不必要な、異常な、または病的な細胞を破壊する正常なプロセスであり、細菌により誘導された宿主細胞溶解よりもずっと低い度合いで免疫系を活性化する。それ故アポトーシスの誘導は、病原体が宿主の免疫系による検出及び破壊を逃れるように機能する。例えば、Pseudomonas aeruginosaは、呼吸器系の細胞のアポトーシスを誘導し（S. Rajan等, "Pseudomonas aeruginosa Induction of Apoptosis in Respiratory Epithelial Cells," Am J. Respir. Cell. Mol. Biol., Vol. 23, pp. 304-312 (2000)参照）、その感染をより克服困難にする因子となっている。
【０００７】
【非特許文献１】
H. Wu等, Pseudomonas aeruginosa Mutations in lasl and rhll Quorum Sensing Systems Result in Milder Chronic Lung Infection," Microbiology, Vol. 147, pp. 1105-1113 (2001)
【特許文献１】
ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ００／３２１５２
【非特許文献２】
S. Rajan等, "Pseudomonas aeruginosa Induction of Apoptosis in Respiratory Epithelial Cells," Am J. Respir. Cell. Mol. Biol., Vol. 23, pp. 304-312 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それ故このアポトーシスを減少することは、感染に対して免疫系を活性化し、それによって感染に対するより攻撃的な免疫系の応答を引き起こすであろう。しかしながらある場合には、免疫系は感染に対してあまりに攻撃的に応答し、それによって宿主の状態を不注意にも悪化させることがある。例えば、圧倒的な細菌感染由来の毒性因子及び他の抗原に対する免疫応答は、広範な炎症、多器官機能不全、及び敗血性ショックを引き起こすかもしれない。そのような場合は、免疫系を活性化することよりむしろ不活性化することが必要である。
【０００９】
かくして、多くの嚢胞性線維症患者の死を導くPseudomonas aeruginosa病原体の調節方法のような細菌の調節方法に対して、長期に亘る切実な必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、オートインデューサー−２を探知するが、それを生産しない細菌を発見した。これまで当業者は一般的に、クオラム−センシングは特定のオートインデューサーの分泌と検出に関与し、それ故オートインデューサーを生産できない細菌はそれを探知することもできないだろうと考えていたため、これは驚くべきことである。本発明者は、これが当たらない場合を発見した。
【００１１】
かくして、好ましい実施態様は、オートインデューサーを生産しない細菌を同定する工程、及び前記細菌を、前記細菌の調節に十分な量のオートインデューサー−２エフェクターと接触させる工程を含む、細菌の調節方法を提供する。
【００１２】
別の好ましい実施態様は、オートインデューサー−２を生産しない細菌に感染した患者を同定する工程；及び前記患者に、感染のひどさを低減するのに十分な量で、オートインデューサー−２エフェクターを投与する工程を含む、患者の治療方法を提供する。
【００１３】
別の好ましい実施態様は、オートインデューサー−２を生産しない第一の細菌と、オートインデューサー−２活性を有する化合物を生産する第二の細菌に感染した嚢胞性線維症に罹患しているヒトを同定する工程；及び前記患者に、第一の細菌によって引き起こされる感染のひどさを低減するのに有効な量で、オートインデューサー−２アンタゴニストを投与する工程を含む、嚢胞性線維症の治療方法を提供する。
【００１４】
これら及び他の実施態様は、以下により詳細に記載されている。本発明のこれら及び他の特徴点は、本発明を制限することではなく説明することを意味する以下の記載及び添付の図面から容易に明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
好ましい実施態様では、本発明は細菌の調節に関する。この文脈で「調節」は、一つ以上の細菌の機能を制御することを意味する。そのような細菌機能の例は、毒性因子の生産、及び宿主の細胞におけるアポトーシスの誘導を含む。そのような調節は、in vitroまたはin vivoで生じても良く、一つ以上の細菌機能を増大または減少することに関与しても良い。
【００１６】
好ましい実施態様では、本発明は、オートインデューサー−２を生産しない細菌の同定を含む。オートインデューサー−２は、V. harveyiにより生産される非ホモセリンラクトンオートインデューサーである。最近の報告では、オートインデューサー−２は以下の構造を有することが示されている(X. Chen, S. Schauder, N. Potier, A. Van Dorsselaer, I. Pelczer, B. Bassler, 及びF. Hughson, Nature, Vol. 415, pp. 545-549 (2002年1月31日)参照)：
【化１】
2005506953.tif 000002
好ましい実施態様では、前記細菌は、オートインデューサー−２活性を有する化合物を生産しない。オートインデューサー−２は、オートインデューサー−２活性を有する化合物の例である。オートインデューサー−２活性を有する化合物の他の例は、３（２Ｈ）−フラノン、例えば３（２Ｈ）−４−ヒドロキシ−５−メチルフラノンを含む。オートインデューサー−２を生産しない細菌の同定方法は当業者に既知であり、特異的ゲノムにおけるｌｕｘＳ遺伝子の不存在についての細菌ゲノムデーターベースの調査、ｌｕｘＳの存在／不存在を測定するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における、ｌｕｘＳ遺伝子プローブを使用する、またはｌｕｘＳ特異的ＤＮＡプライマーを使用する、ゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションを含む（ＷＯ００／３２１５２及びＷＯ０１／８５６６４に記載された方法を参照、両者とも参考としてここに取り込まれる）。オートインデューサー−２を生産しない細菌の好ましい同定方法は、問題となる細菌のセルフリー培養上清におけるオートインデューサー−２の活性を直接測定するバイオアッセイを使用することによって実施される。このアプローチは、オートインデューサー−２の存在下でのみ光を放射するように改変された、Vibrio harveyi株BB170のような生体発光細菌の使用を利用する。オートインデューサー−２を生産する細菌のセルフリー培養上清に曝された場合、株BB170は、サンプル中のオートインデューサー−２の濃度に正比例して光を放射するであろう。オートインデューサー−２を生産しない細菌から得た培養上清は、BB170からの有意な光の生産を導かないであろう。オートインデューサー−２を生産しない細菌の例は、Pseudomonas属由来の細菌、例えばPseudomonas aeruginosa、及びBurkholderia属由来の細菌、例えばBurkholderia cepaciaを含む。
【００１７】
驚くべきことに、オートインデューサー−２を生産しない細菌が、オートインデューサー−２エフェクターと前記細菌を接触させることによって調節できることを、我々は発見した。Pseudomonas aeruginosaは、そのような細菌の例である。本発明は理論的に説明されるものではないが、これらの細菌は、オートインデューサー−２を探知する能力、及び／またはそれに応答する能力を有するが、それを分泌する能力を欠いていると解される。本質において、これらの細菌は、通常のクオラム−センシングサーキットの半分である分泌を欠いており、半分である探知のみ所有している。天然に存在する細菌の病原性効果が、オートインデューサー−２またはオートインデューサー−２活性を有する化合物によって影響される範囲で、本発明は、オートインデューサー−２エフェクターとそのような細菌を接触させることによる、当該病原体性効果の制御のための方法を提供する。オートインデューサー−２を生産しないが、オートインデューサー−２に応答する細菌は、ここで「標的」細菌と称されても良い。
【００１８】
この文脈では、「オートインデューサー−２エフェクター」は、オートインデューサー−２アゴニストまたはアンタゴニストであり、つまりそれぞれある細菌においてオートインデューサー−２活性を有する化合物、またはオートインデューサー−２自体によるそのような活性をブロックする化合物である。
【００１９】
標的細菌は、オートインデューサー−２を探知するレセプターを有し、それ故標的細菌が、各種の病原性細菌機能を実施することによってオートインデューサー−２に応答することを可能にする。オートインデューサー−２アンタゴニストは、オートインデューサー−２（例えば、標的細菌の存在下で第二の細菌によって合成されるＡＩ−２）の検出を阻害することによって、またはそのようなレセプターをブロックすることによって機能し、かくして結果として病原性効果を阻害すると解される。さらに、オートインデューサー−２アゴニストは、毒性因子の生産を刺激することによってオートインデューサー−２と同様に機能し、オートインデューサー−２と同様な態様でレセプターに結合することによってこれを実施すると解される。
【００２０】
オートインデューサー−２エフェクターの同定方法は、オートインデューサー−２の発現を調節する一つ以上のタンパク質の発現に、化合物がどのように影響するかを測定することを含む（ＷＯ００／３２１５２及びＷＯ０１／８５６６４に記載の方法参照、両者の方法とも参考としてここに取り込まれる）。オートインデューサー−２アゴニストは、そのようなタンパク質の発現のレベルを増大する一方で、オートインデューサー−２アンタゴニストはそれを減少する。オートインデューサー−２エフェクターの好ましい同定方法は、オートインデューサー−２によって調節される発現を有するレポータータンパク質または他の分子の活性を測定することを含む。そのようなシステムの例は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼ（ｌｕｘ）レポーターシステムである。そのようなシステムでは、レポーターをコードする遺伝子が、オートインデューサー−２によって調節される遺伝子のフレーム中及び下流にクローン化される。次いで、オートインデューサー−２によって誘導される遺伝子の発現が、生成した蛍光（ＧＦＰ）または生体発光（ｌｕｘ）の定量によって測定される。
【００２１】
オートインデューサー−２アンタゴニストによって抑制できる細菌機能の好ましい例は、毒性因子の生産、宿主細胞のアポトーシス、及びより好ましくは宿主免疫系細胞のアポトーシスを含む。好ましいオートインデューサー−２アンタゴニストは、シクロペンテノン基を含み、例えば以下の式（Ｉ）のような、約６から約１４の炭素を有する２−アルキル−２−シクロペンテン−１−オンを含む。式（Ｉ）では、ｎは好ましくは３から５の範囲の整数である。好ましい２−アルキル−２−シクロペンテン−１−オンの例は、２−ペンチル−２−シクロペンテン−１−オン[式中ｎ＝４]である。
【化２】
2005506953.tif 000003
【００２２】
オートインデューサー−２エフェクターは、オートインデューサー−２アゴニストであっても良い。好ましいオートインデューサー−２アゴニストは、オートインデューサー−２の存在によって通常開始される細菌機能を開始または促進する。そのような機能の好ましい例は、宿主細胞の治療的なアポトーシス、より好ましくは宿主免疫系細胞の治療的なアポトーシスを含む。オートインデューサー−２アゴニストの例は、３（２Ｈ）−フラノン、例えば３（２Ｈ）−４−ヒドロキシ−５−メチルフラノン、３（２Ｈ）−４−ヒドロキシ−２，５−メチルフラノン、及び３（２Ｈ）−４−メトキシ−２，５−メチルフラノンを含む。
【００２３】
標的細菌は好ましくは、前記細菌を調節するのに十分な量のオートインデューサー−２エフェクターに前記細菌を曝すことによって調節される。そのような量は、興味ある細菌機能を同定し、制御された条件の下で各種の量のオートインデューサー−２エフェクターに前記細菌を曝し、オートインデューサー−２エフェクターの量の関数として興味ある細菌機能の変化を測定することによって決定できる。前記細菌をオートインデューサー−２エフェクターに曝すことは、in vitroまたはin vivoで実施されて良い。前記細菌を調節するのに十分なオートインデューサー−２エフェクターの量は、細菌機能を測定する条件に依存して変化して良い。例えば、細菌を調節するのに十分である添加されるオートインデューサー−２エフェクターの量が変化するように、事前に存在する量のオートインデューサー−２、オートインデューサー−２アゴニスト、及び／またはオートインデューサー−２アンタゴニストの存在下に、細菌を配置しても良い。
【００２４】
オートインデューサー−２エフェクターは、標的細菌とそれを接触させるための所望される方法に依存して、それを他の物質と組み合わせることによって製剤化されても良い。好ましくは、製薬学的に許容可能な組成物は、以下に記載されるようなオートインデューサー−２エフェクターを含む。ここに記載されるような、オートインデューサー−２エフェクターを標的細菌と接触させる各種の方法のここでの記載は、オートインデューサー−２エフェクターを含む製薬組成物に適用されると解される。
【００２５】
標的細菌は、宿主細胞のアポトーシスを誘導しても良い。そのようなアポトーシスは、宿主の防御機構であるか、または感染の病原を反映するかのいずれかであり、かくして宿主に有利または不利であって良い。M. Behnia等, "Lung Infections - Role of Apoptosis in Host Defense and Pathogenesis of Disease, Chest, Vol. 117 (6), pp. 1771-1777 (2000)参照。例えば、宿主の防御細胞のアポトーシスは、病原体が宿主のマクロファージ内に存在する場合に嗜好される一方、細胞外の感染については、宿主の炎症細胞のアポトーシスが病原体を嗜好すると解される。さらに、ある場合（敗血性ショックのような）では、免疫系の応答を抑制することが所望されて良く、その場合標的細菌は、真核生物細胞、好ましくは免疫系の細胞のアポトーシスを増大するように好ましくは調節される。かくして、標的細菌のタイプと患者の状態に依存して（in vivoの応用について）、オートインデューサー−２エフェクターとの接触による有効な調節は、標的細菌が宿主細胞のアポトーシスを誘導する程度を増大または減少することを含む（図２参照）。
【００２６】
一つの実施態様では、前記細菌は、オートインデューサー−２またはオートインデューサー−２アゴニストの存在下に配置される。オートインデューサー−２またはオートインデューサー−２アゴニストは、故意に添加されていてもよく、または第二の細菌によって分泌されていても良い。例えば、嚢胞性線維症では、肺は、Pseudomonas aeruginosaと、オートインデューサー−２またはオートインデューサー−２アゴニストを分泌する第二の細菌の両者によって感染されていて良い。そのような第二の細菌の例は、α−溶血性Streptococcus、Staphylococcus aureus、M. tuberculosis、Haemophilus influenzae、及びS. pneumoniaeを含む。本発明は理論的に説明されるものではないが、標的細菌（オートインデューサー−２に応答するが、それを分泌しない）の病原性活性は、第二の細菌によって開始または促進されても良いと解される。有効な調節なくして、第二の細菌は、それに毒性因子の生産を引き起こす、オートインデューサー−２、及び／または標的細菌によって探知されるオートインデューサー−２活性を有する化合物を分泌し、宿主細胞のアポトーシス等を誘導する。これらの病原性活性は、オートインデューサー−２エフェクター、好ましくは病原性活性を抑制または妨げるのに十分である量のオートインデューサー−２アンタゴニストと、標的細菌を接触させることによって調節できる。
【００２７】
標的細菌はしばしば、真核生物細胞の存在下に配置される。例えば、嚢胞性線維症では、肺はしばしばPseudomonas aeruginosaによって感染され、かくして標的細菌は、呼吸器系及び免疫系由来のものを含む、数多くのタイプの真核生物細胞の存在下に配置される。Pseudomonas aeruginosaは毒性因子を生産し、呼吸器系の細胞のアポトーシスを誘導し、それはさらに免疫系の細胞のアポトーシスをも誘導できると解される。嚢胞性線維症患者におけるPseudomonas aeruginosaの肺感染は、前記細菌が毒性因子を生産するだけでなく、有効に応答する免疫系の能力を抑制するため、特に破壊的である。
【００２８】
好ましい実施態様では、二つ以上の病原性活性、例えば毒性因子の生産と真核生物細胞のアポトーシス、を有する標的細菌が、二つ以上の病原性活性の効果を低減するオートインデューサー−２エフェクターと、前記細菌を接触させることによって調節される。この実施態様は、標的細菌が宿主に感染している場合、宿主は毒性の低減から利益を受けるだけでなく、細菌を減少する完全な免疫系の維持によっても利益を受けるため、特に有利である。この実施態様が、細胞性標的の代わりに非必須シグナリング機構を標的とすることによって、細菌にかなり穏やかな選択圧の適用をしばしば引き起こし、細菌が耐性機構を形成する可能性を減少する場合に、さらなる利益が存在する。
【００２９】
好ましい実施態様は、一つ以上の標的細菌と、任意に一つ以上の第二の細菌とによって感染された患者の治療方法を提供する。この方法は好ましくは、第一に標的細菌で感染された患者を同定する工程を含む。そのような患者は、数多くの方法で同定されて良い。典型的に嚢胞性線維症患者は、Pseudomonas aeruginosaと、「通常の叢」と称されるＡＩ−２生産細菌の混合集団とで慢性的に感染されている。嚢胞性線維症患者に対する現在存在する抗菌治療は、Pseudomonas（または緊密に関連するBurkholderia cepacia）の存在を想定している。プレーティング及びコロニーの特徴または顕微鏡観察のような古典的な微生物学的方法が、標的細菌の存在を確認するために使用できる。そのような方法は、標準的なテキストに記載されている（"Clinical and Pathogenic Microbiology": Howard, B.J., Keiser, J.F., Smith, T.F., Weissfeld, A.S., Tilton, RC. (編） Mocby-Year Book, Inc., St. Louis, MO, 第２版 (1994年1月)参照）。
【００３０】
好ましくは、同定された患者はヒトである。好ましい方法は、嚢胞性線維症または敗血性ショックに罹患しているヒトの治療を含む。嚢胞性線維症または敗血性ショックに罹患しているヒトの同定方法は、当業者に既知である。より好ましい方法は、Pseudomonas及びBurkholderiaからなる群から選択される属に属する標的細菌、最も好ましくはPseudomonas aeruginosaまたはBurkholderia cepaciaで感染されたヒトの治療を含む。そのような細菌感染は、既知の培養法を通じて同定されて良い。特に好ましい方法は、オートインデューサー−２を生産しない第一の細菌と、オートインデューサー−２またはオートインデューサー−２活性を有する化合物を生産する第二の細菌とで感染された、嚢胞性線維症に罹患している患者の治療を含む。標的細菌の同定方法は前述の通りであり、第二の細菌は標的細菌ではないものとして同定される。
【００３１】
ここに開示されるオートインデューサー−２エフェクターは、好ましくはオートインデューサー−２エフェクターを含む製薬組成物の形態で患者に投与される。例えば、オートインデューサー−２エフェクターの投与の好ましい態様は、オートインデューサー−２エフェクターを含む吸入エアゾールを介して実施される。米国特許第５，５０８，２６９号は、その開示が参考として完全にここに取り込まれるが、嚢胞性線維症患者を治療することに特に参考にされる、エアゾールの吸入を通じて肺に治療薬を投与する方法を記載している。
【００３２】
オートインデューサー−２エフェクターの投与の別の好ましい態様は経口である。経口組成物は好ましくは、不活性な希釈剤、及び／または食用のキャリアーを含む。オートインデューサー−２エフェクターは、ゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に圧縮することができる。経口治療用投与の目的のため、オートインデューサー−２エフェクターは、賦形剤と混合することができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用できる。製薬学的に適合的な結合剤及び／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は、以下の成分、または同様な性質の化合物をいずれかを含むことができる：バインダー、例えばマイクロクリスタリンセルロース、トラガカントゴム、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプン、またはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogel、またはトウモロコシデンプン；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、またはSterotes；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロース、またはサッカリン；及び／または香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー。投与量単位形態がカプセルである場合、それは前述のタイプの物質に加えて、脂肪油のような液体キャリアーを含むことができる。さらに、投与量単位形態は、投与量単位の物理的形態を改変する各種の他の物質、例えば糖、シェラック、または他の腸溶性試薬のコーティングを含むことができる。前記化合物は、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハー、チューインガム等の成分として投与することができる。シロップは、活性化合物に加えて、甘味剤としてのスクロース、及び特定の防腐剤、色素、着色料、及びフレーバーを含むことができる。
【００３３】
オートインデューサー−２エフェクターはまた、所望の作用を損なわない他の活性物質と、または所望の作用を補う物質と、例えば抗生物質と混合することができる。この目的のための好ましい抗生物質は、アミノグリコシド、例えばトブラマイシン、グリコペプチド、例えばバンコマイシン、ベータラクタム、例えばアモキシリン、キノロン、例えばシプロフロキシン、マクロリド、例えばアジトロマイシン、テトラサイクリン、スルホンアミド、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、またはクロラムフェニコールを含む。非経口的、皮膚内、皮下、または局所的な適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：滅菌希釈液、例えば注射水、塩水溶液、固形化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール、またはメチルパラベン；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸、クエン酸、またはリン酸、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性を調節するための試薬。非経口的調製物は、アンプル、廃棄可能なシリンジ、またはガラス若しくはプラスチックで形成された複数投与量バイアルに封入できる。もし静脈内に投与されるのであれば、好ましいキャリアーは、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００３４】
好ましい実施態様では、オートインデューサー−２エフェクターは、インプラント及びマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む制御放出製剤のような、身体からの迅速な除去に対して化合物を保護するキャリアーと共に調製される。エチレンビニルアセタート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸のような生分解性、生適合性ポリマーが使用できる。そのような製剤の調製方法は、当業者に既知である。
【００３５】
リポソーム性懸濁液（特異的細胞の表面抗原に対するモノクローナル抗体で標的化されたリポソームを含む）もまた、製薬学的に許容可能なキャリアーである。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に既知の方法に従って調製されて良く、この文献は参考としてここに完全に取り込まれる。例えばリポソーム製剤は、無機溶媒中に適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、及び／またはコレステロールのような）を溶解し、次いで無機溶媒を蒸発し、容器の表面に乾燥脂質の薄膜を残存することによって調製されて良い。次いで、オートインデューサー−２エフェクターの水溶液を容器に導入する。次いで容器を手でぐるぐるかき混ぜ、容器の側面から脂質物質を遊離させ、脂質凝集物を分散し、それによってリポソーム懸濁液を形成する。
【００３６】
非経口的投与のために、活性化合物は好ましくは、製薬学的に許容可能な非経口ビヒクルと会合させて、単位投与量注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルション）に製剤化される。そのようなビヒクルは好ましくは、非毒性であり非治療性である。そのようなビヒクルの例は、水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンである。固形化油及びエチルオレアートのような非水性ビヒクルもまた使用されて良い。リポソームがキャリアーとして使用されても良い。ビヒクルは、等張性及び化学的安定性を促進する物質、例えば緩衝液及び防腐剤のような微量の添加剤を含んで良い。オートインデューサー−２エフェクターは好ましくは、約１０ナノグラム／ｍｌから約１００ミリグラム／ｍｌ、より好ましくは約１０マイクログラム／ｍｌから約１０ミリグラム／ｍｌの濃度でそのようなビヒクルに製剤化される。
【００３７】
ここに開示されるオートインデューサー−２エフェクター（これらの化合物を含む製薬組成物を含む）は好ましくは、治療上の有効量で患者に投与される。治療上の有効量は、標的細菌の病原性効果を減少する、例えば第一の細菌によって引き起こされる感染のひどさを低減する、及び／または患者が罹患している病状の症状を緩和するのに有効である量である。好ましい治療上の有効量は、広範囲で変化できる。投与量及び投与摂生は好ましくは、標的細菌の調節に対する患者の必要性の性質、特定のオートインデューサー−２エフェクターの特徴、例えばその治療インデックス、患者、患者の履歴、及び当業者に既知の他の因子を考慮することによって選択される。オートインデューサー−２エフェクターの好ましい一日の投与量は典型的に、患者の体重のｋｇ当たり約１マイクログラムから約１０００ミリグラムの範囲であるが、より高いまたはより低い投与量が適切な環境において使用されて良い。より好ましくは、オートインデューサー−２エフェクターの一日の投与量は典型的に、患者の体重のｋｇ当たり約１０マイクログラムから約１０ミリグラムの範囲であるか、等価的な持続放出投与量である。
【００３８】
治療上の有効量は、臨床試験のような方法によって当業者により決定できる。投与量は、標的細菌の調節の所望される度合いを達成するのに必要なように、個々の場合で調節されて良い。持続放出投与量及び吸入が特に企図される。活性化合物は、液体または固体形態で、全身性、局部的、または局所的な送達のための適切な経路、例えば経口的、非経口的、静脈内、皮膚内、皮下、口内、鼻腔内、吸入、膣内、直腸内、または局所的に投与することができる。ここに記載される化合物の投与方法は、特定の投与量により、または制御された放出ビヒクルにより実施されても良い。嚢胞性線維症において経験されるような肺感染の治療のためには、吸入が好ましい。
【００３９】
オートインデューサー−２エフェクターは、一度に投与されても良く、変化する時間間隔で投与される複数回の少量の投与量に分割されても良い。いずれかの特定の患者に対して、特異的な投与量摂生は、個々の必要性と、オートインデューサー−２エフェクターを投与する、またはその投与を監督するヒトの専門的な判断に従って経時的に調節されるべきであること、及びここに示されている濃度範囲は単なる例示であり、特許請求の範囲の方法の範囲または実施を制限することは企図しないことがさらに理解される。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例は、ラット慢性呼吸器感染のアガービーズモデルにおけるPseudomonas aeruginosa感染に対する、通常の叢の効果、及びオートインデューサー−２（ＡＩ−２）の存在を説明する。１５のラット（オスのSprague-Dawley 180-200グラム）を、アガービーズに埋没された０．０５ｍＬの細菌懸濁液で気管内で植菌した。感染の７日後、各群を以下のように処理した：（１）５匹のラット−定量的な微生物観察のため肺の切除；（２）５匹のラット−気管支洗浄液（ＢＡＬ）を得て、全細胞数、好中球、好中球エラスターゼ、及びＡＩ−２活性を分析した；及び（３）５匹のラット−組織化学（定量的病理データ）のため肺の切除。図４−７に示された顕微鏡写真では、黒い領域が、組織損傷の指標である硬化の領域を示す。嚢胞性線維症患者から得たα−溶血性Streptococcus単離物（ＣＦＸ５と称される）を、in vivoでの天然で合成されるＡＩ−２を供給するために使用した。
【００４１】
実施例１
Pseudomonas aeruginosa単独を含むアガービーズで植菌されたラットは、図３（ＰＡＯ）に示された定量的病理データと、図４の顕微鏡写真に示された組織化学的観察を生じた。
【００４２】
実施例２
Pseudomonas aeruginosa単独を含むアガービーズで植菌され、合成ＡＩ−２に曝されたラットは、図３（ＰＡＯ／ＡＩ−２）に示された定量的病理データと、図５に示された組織化学的観察を生じた。
【００４３】
実施例３
Pseudomonas aeruginosa＋α−溶血性Streptococcus(ＣＦＸ５)を含むアガービーズで植菌されたラットは、図３（ＰＡＯ／ＮＦ）に示された定量的病理データと、図６に示された組織化学的観察を生じた。
【００４４】
実施例４
ＡＩ−２アンタゴニストであるエアゾール化ＱＸ０１８（２−ペンチル−２−シクロペンテン−１−オン）で毎日６日間処理された、Pseudomonas aeruginosa＋α−溶血性Streptococcus(ＣＦＸ５)を含むアガービーズで植菌されたラットは、図３（ＰＡＯ／ＮＦ／ＱＸ０１８）に示された定量的病理データと、図７に示された組織化学的観察を生じた。
【００４５】
実施例１−４で得られた結果（図３に要約される）は、ＡＩ−２がPseudomonas aeruginosaによって引き起こされる肺の病理を増大し、ＡＩ−２アンタゴニストがこの増大を顕著に減少することを示す。特に、実施例１（「ＰＡＯ」）と２（「ＰＡＯ／ＡＩ−２」）の比較は、外因的に供給されたＡＩ−２がPseudomonas aeruginosaによって引き起こされる肺の病理を増大することを示す。実施例３（「ＰＡＯ／ＮＦ」）は、ＡＩ−２（ＡＩ−２を分泌する例示的な通常の叢、α−溶血性Streptococcus単離物（ＣＦＸ５）によって内因的に供給される）が、さらに肺の病理を増大することを示す。実施例４は、ＡＩ−２アンタゴニストの２−ペンチル−２−シクロペンテン−１−オン（「ＰＡＯ／ＮＦ／ＱＸ０１８」）が、内因的に供給されたＡＩ−２から生じる増大した肺の病理を顕著に減少することを確立する。
【００４６】
本発明の範囲から離れることなく、前述の方法に各種の省略、付加、及び変更をなし得ることが当業者に予測され、全てのそのような変更及び変化は、添付された特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に存在すると企図される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、オートインデューサーが、病原性細菌において毒性因子の生産を介在できる方法を示す。
【図２】図２は、ＡＩ−２が、Pseudomonas aeruginosaが好中球のアポトーシスまたは壊死を誘導するか否かに影響できる方法を表す。
【図３】図３は、各種の条件の下でのPseudomonas aeruginosa(ＰＡＯと称される)でのラットの肺の感染から観察された免疫応答を反映する定量的病理データ（硬化を示す肺組織のパーセントとして）のプロットである。ケース１：Pseudomonas aeruginosa単独（ＰＡＯ）；ケース２：Pseudomonas aeruginosa＋ＡＩ−２（ＰＡＯ／ＡＩ−２）；ケース３：α−溶血性Streptococcus単離物ＣＦＸ５（ＡＩ−２を分泌する、ＮＦと称される通常の呼吸管叢を表す）とのPseudomonas aeruginosa共感染（ＰＡＯ／ＮＦ）；並びにケース４：ＱＸ０１８（３（２Ｈ）−４−ヒドロキシ−５−メチルフラノン）で処理されたα−溶血性Streptococcus単離物ＣＦＸ５（ＡＩ−２を分泌する通常の呼吸管叢を表す）とのPseudomonas aeruginosa共感染（ＰＡＯ／ＮＦ／ＱＸ０１８）。
【図４】図４は、Pseudomonas aeruginosaでの感染の７日後で回収されたラット肺組織の組織変化を示す顕微鏡写真である。
【図５】図５は、ＡＩ−２の存在下でPseudomonas aeruginosaでの感染の７日後で回収されたラット肺組織の組織変化を示す顕微鏡写真である。
【図６】図６は、Pseudomonas aeruginosa及びα−溶血性Streptococcus単離物ＣＦＸ５（ＡＩ−２を分泌する通常の呼吸管叢を表す）での感染の７日後に回収されたラット肺組織の組織変化を示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、３（２Ｈ）−４−ヒドロキシ−５−メチルフラノンのエアゾールでの処理の５日後の、Pseudomonas aeruginosa及びα−溶血性Streptococcus単離物ＣＦＸ５（ＡＩ−２を分泌する通常の呼吸管叢を表す）での感染の７日後に回収されたラット肺組織の組織変化を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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