(57)【要約】構造式：Ｚ−Ｓｐａｃｅｒ−[ＮＸ−Ａ]m−ＮＹ−Ａ−ＮＸ2で示される親和性リガンド−マトリックス複合体は、水性系における内毒素の単離、分離、精製、特徴付け、同定または定量化に有用である；ここで、ｍは少なくとも１の整数であり；各Ａは、独立して、炭素数１〜６の、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状または環状の飽和炭化水素鎖を表し；各Ｘは、独立して、水素またはアルキルを表し；ＹはＸまたはＡ−ＮＸ2であり；Ｚは、任意のスペーサーアーム（Ｓｐａｃｅｒ）を介してリガンドに結合している支持マトリックスである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性系における内毒素の単離、分離、精製、特徴付け、同定または定量化のための、構造式：
Ｚ−Ｓｐａｃｅｒ−[ＮＸ−Ａ]m−ＮＹ−Ａ−ＮＸ2
［式中、
ｍは、少なくとも１の整数であり；
各Ａは、独立して、炭素数１〜６の、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状、または環状の飽和炭化水素鎖を表し；
各Ｘは、独立して、水素またはアルキルを表し；
ＹはＸまたはＡ−ＮＸ2であり；
Ｚは、任意のスペーサーアーム（Ｓｐａｃｅｒ）を介してリガンドと結合している支持マトリックスである］
で示される親和性リガンド−マトリックス複合体の使用。
【請求項２】
水性系がバッファー、タンパク質、ワクチン、抗生物質、血液、血漿、血清、核酸、医薬製剤、および他の生物学的化合物から選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
各Ａが独立して二価のＣ1-4アルキル基を表す、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
Ｓｐａｃｅｒが存在し、それが構造：
−Ｔ−Ｌ−
［式中、Ｔは、Ｏ、ＳまたはＮ−Ｒ2を表し、Ｒ2は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｌは、２〜２０個の原子を含有する、置換されていてもよいアルキル、アルキルエーテル、アルキルチオエーテル、アルキルエステルまたはアミド結合である］
を有する、請求項１〜３いずれか１項記載の使用。
【請求項５】
Ｓｐａｃｅｒが存在しない、請求項１〜３いずれか１項記載の使用。
【請求項６】
Ｚが多孔質アガロースビーズ、パーフルオロカーボン粒子および機能的な膜から選択される、請求項１〜５いずれか１項記載の使用。
【請求項７】
リガンドがジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、Ｎ,Ｎ−ビス(３−アミノプロピル)エチレンジアミンおよびＮ−(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミンから選択される、請求項１〜６いずれか１項記載の使用。
【請求項８】
リガンドがトリス(２−アミノエチル)アミンである、請求項１〜６いずれか１項記載の使用。
【請求項９】
水性系が３〜１０の範囲のｐＨを有する、請求項１〜８いずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
水性系を複合体の懸濁液または充填床と接触させる、請求項１〜９いずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
全血または血漿から内毒素を除去するための体外装置における、請求項１〜１０いずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
リガンドを内毒素のインビボ捕獲のために可溶性の高分子担体または非高分子担体と結合させる、請求項１〜１１いずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、親和性リガンド、ならびに水、水溶液、血液、血漿、医薬製剤、抗生物質、ワクチン、タンパク質、核酸および他の生物学的産物のような種々の液体から内毒素を除去するためのそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
内毒素は、イー・コリ（E. coli）のようなグラム陰性細菌の外膜にて見出されるリポ多糖（ＬＰＳ）である（Raetz, Ann. Rev. Biochem., 1990, p.129, Vol.59）。該ＬＰＳ分子は、リピドＡ領域、中心多糖領域およびＯ−抗原領域の３つの異なる化学的領域を含有している。リピドＡ領域は、リン酸基を含有するグルコサミン二糖からなり、長鎖脂肪酸で高度に置換されており、内毒素の毒作用の原因であると考えられる（Rietschel et al., Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reaction, Ed. Nowotny, A., Spitzner, J.J. and Ziegler, E.J., 1990, p.15）。
【０００３】
内毒素によって誘発される生物学的効果は、免疫系、特に、単球およびマクロファージの活性化により生じ、発熱、代謝低下、および敗血症性ショックを包含する非常に多様なものである（Martich et al., Immunobiology, 1993, p.403, Vol.187）。生物学的に誘導された産物および治療用の医薬製剤における内毒素の存在は、内毒素の強力な有害作用のため、非常に重要な分野である。滅菌プロセスを維持することにより生物学的産物が確実に内毒素を含まないようにすることができるが、このことは、特に、該生物学的産物がイー・コリのようなグラム陰性細菌源において発現される場合には、あまり起こり得ない。内毒素を不活化するための典型的なプロセスとしては、濃水酸化ナトリウム（１Ｍ ＮａＯＨ）への暴露および／または長時間の加熱処理（２５０℃）が挙げられる。しかしながら、かかる処理プロセスは、大多数の生物学的産物に適用できない。
【０００４】
生物学的産物から内毒素を除去するのに多くの技法が使用されており、該技法としては、限外濾過（Sweadner et al., Appl. Environ. Microbiol., 1977, p.382, Vol.34；Li et al., Biotechnol. Tech., 1998, p.119, Vol.12）、木炭吸着（Nagaki et al., Int. J. Artif. Organs., 1991, p.43, Vol.14）、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（Hou et al., J. Parenter. Sci. Technol., 1990, p.204, Vol.44；Hou et al., Biotechnol. Bioeng., 1990, p.315, Vol.12；Neidhardt et al., J. Chromatogr., 1992, p.255, Vol.590）およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。これらの技法は全て、特に、治療用タンパク質および他の生物学的産物から内毒素を除去するのに適用する場合に有意な欠点を示す。木炭吸着およびイオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質溶液からの内毒素レベルを減少させるが、それらはまた、生物学的成分を結合する傾向がある。
【０００５】
固定化ポリミキシンＢに対する効率的な内毒素除去は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して行われている（Talmadge et al., J. Chromatogr., 1989, p.175, Vol.476；Anspach et al., J. Chromatogr. A, 1995, p.81, Vol.711）。しかしながら、ポリミキシンＢ浸出液の毒性を有する可能性に対する懸念により、その使用は限定されている。固相マトリックスに結合しているジアミノアルカンおよびモノアミノアルカン化合物に基づく合成リガンドは、水溶液から内毒素を除去するのに使用されているが、内毒素の結合については限定された能力が示されているだけである（Hou et al., Biochim. Biophys. Acta, 1991, p.149, Vol.1073）。
【０００６】
J. Chromatography 248, 401-408 (1982)および262, 193-198 (1983)、ならびに米国特許第4381239号には、固相マトリックスに共有結合したヒスタミンおよび他の芳香族窒素複素環が記載されている。
【０００７】
米国特許第5358933号には、細菌性内毒素の解毒のための、ならびに敗血症ショックの予防および治療のための合成ペプチドが記載されている。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、生物学的治療製剤を含有する溶液から内毒素を選択的に捕獲および除去するための新規クラスの合成親和性リガンド構造の発見に関する。本発明の合成親和性リガンド−マトリックス複合体は、下記一般構造式（構造１および２）で示すことができる：
【０００９】
【化１】
2005525874.tif 000002
【００１０】
【化２】
2005525874.tif 000003
【００１１】
式中、
Ａは、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状または環状の飽和炭化水素鎖を表し、それぞれの反復単位における各Ａは、同一であっても異なっていてもよく；
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、各々、独立して、水素原子またはアルキル置換基を表し；
ｎは２またはそれ以上であり；
ｍは１またはそれ以上であり；
該リガンドは、任意のスペーサーアームを介して支持マトリックスＺに結合している。
特に、構造式２で示される複合体は新しい。
【００１２】
（好ましい実施態様の記載）
構造１または２を有するポリアミンリガンドは、少なくとも３個の塩基性窒素原子を有しており、これらの窒素原子は、好ましくは、互いに少なくとも２個の炭素原子によって隔てられている。窒素原子は、第１、第２、第３または第４アミン基の形態であってよく、対になっている窒素原子間に介在する炭素原子は、直鎖状、分枝鎖状または環状の炭化水素鎖の形態であってよい。
【００１３】
例としては、Ａは、式−(ＣＨ2)x−ＣＨＲ−(ＣＨ2)y−を有していてよく、ここで、ｘおよびｙは、独立して、０、１または２であり、Ｒは、ＨまたはＣ1-4アルキル、例えば、水素、メチル、エチル、プロピルまたはブチルである。特に、Ａは、二価のＣ1-4アルキル基、すなわち、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチルまたはtert−ブチル、またはトランス−１,４−ジアミノシクロヘキサンから誘導されるような１,４−シクロヘキシレンであってよい。より一般的には、Ａは原子を６個までまたは１０個まで有してよい。
【００１４】
ｍおよびｎは、各々、好ましくは、１、２、３または４である。Ｘは、原子を６個まで、または１０個まで有してよい。
【００１５】
支持マトリックスＺは、内毒素親和性リガンドの固定化に使用して、内毒素リガンド−マトリックス複合体を形成し、それにより、接触溶液から内毒素を除去する好都合な手段を提供することができる、粒状または非粒状で、可溶性または不溶性で、多孔質または非多孔質の、いずれもの化合物または物質であってよい。粒状の支持マトリックスの例としては、アガロース、デキストラン、セルロースまたはデンプンのような天然高分子、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、パーフルオロカーボンおよびポリメチルメタクリレートのような合成高分子および共重合体、ならびにシリカ、ガラス、アルミナおよび金属酸化物のような無機化合物が挙げられる。可溶性担体の例としては、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールおよび加水分解されたデンプンのような高分子が挙げられる。支持マトリックスはまた、上記高分子ならびにニトロセルロース、ポリエーテルスルホンおよびナイロンのような他の高分子を含む膜またはシートの形態であってもよい。
【００１６】
リガンドの支持マトリックスＺへの共有結合は、臭化シアノ、エピクロロヒドリン、１,４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１,２,７,８−ジエポキシオクタン、トシルクロリド、トレシルクロリド、ジビニルスルホンおよび塩化シアヌルが挙げられるがこれらに限定されるものではない種々の活性化剤の使用により行うことができる。
【００１７】
スペーサーアームは存在しなくてもよい。存在する場合には、活性化方法の一部として導入することができ、好ましくは、構造式：
−Ｔ−Ｌ−
［式中、Ｔは、酸素原子、硫黄原子、または基Ｎ−Ｒ2を表し、ここで、Ｒ2は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｌは、炭素数２〜２０の、置換されていてもよいアルキル、アルキルエーテル、アルキルチオエーテル、アルキルエステルまたはアミド結合である］
で示される。
【００１８】
本発明の特に好ましい複合体としては、以下のものが挙げられる：
Ｚ−(Ｓｐａｃｅｒ)−ＮＨ(ＣＨ2)2Ｎ[(ＣＨ2)2ＮＨ2]2              （Ａ）
Ｚ−(Ｓｐａｃｅｒ)−ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ2               （Ｂ）
Ｚ−(Ｓｐａｃｅｒ)−ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ2    （Ｃ）
Ｚ−(Ｓｐａｃｅｒ)−ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ(ＣＨ2)3ＮＨ2               （Ｄ）
Ｚ−(Ｓｐａｃｅｒ)−ＮＨ(ＣＨ2)3ＮＨ(ＣＨ2)3ＮＨ(ＣＨ2)3ＮＨ2    （Ｅ）
Ｚ−(Ｓｐａｃｅｒ)−ＮＨ(ＣＨ2)3ＮＨ(ＣＨ2)2ＮＨ(ＣＨ2)3ＮＨ2    （Ｆ）
Ｚ−(Ｓｐａｃｅｒ)−ＮＨ(ＣＨ2)2Ｎ[(ＣＨ2)3ＮＨ2]2               （Ｇ）
ここで、Ｚおよび(Ｓｐａｃｅｒ)は、上記と同じ意味を有する。
【００１９】
本発明の一の実施態様において、本発明の親和性複合体は、好都合には、適当なポリアミンを、前活性化した水不溶性マトリックスと共有結合させることにより製造することができる。例えば、ポリアミンリガンド（Ａ）のエピクロロヒドリン活性化アガロースマトリックスへの結合は、下記反応スキーム（スキーム１）に従って行うことができる：
【化３】
2005525874.tif 000004
【００２０】
Ｚとポリアミンリガンドとの間の介在基はスペーサーアームを形成する。
【００２１】
本発明の好ましい態様によると、内毒素を含有する溶液から内毒素を捕獲および除去するためのプロセスは、好ましくは、１.０〜１３.０の範囲のｐＨで、上記定義の親和性複合体を該溶液と接触させることを含む。かかる溶液の例としては、水、水溶液、血液、血漿、医薬製剤、抗生物質、タンパク質、核酸および他の生物学的産物のような液体が挙げられる。本発明の内毒素結合性リガンド−マトリックス複合体の別の使用は、全血または血漿からの内毒素の体外除去のためである。エンドトキシシン結合性リガンド−マトリックス複合体は、好都合には、カラム中に該複合体を充填し、重力または他の機械的手段を使用して内毒素汚染溶液を該カラムに通すことにより使用することができる。別法としては、該複合体を内毒素含有溶液と混合し、回分的に使用することができる。
【００２２】
本発明の別の実施態様において、該複合体を多孔質膜に結合させ、溶液から内毒素を選択的に除去するための使い捨て濾過装置として使用できる。
【００２３】
本発明のさらに別の実施態様において、例えば、内毒素のインビボ捕獲および解毒のために、本発明の内毒素結合性リガンドを、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールまたは加水分解されたデンプンのような可溶性の高分子または非高分子担体に結合させることができる。
【００２４】
本発明の複合体は、抗生物質およびタンパク質の緩衝化または非緩衝化溶液からの内毒素の除去が高度に効率的かつ選択的であるが、生物学的成分に対して低い選択性を示すことが見出された。
【００２５】
以下の実施例により本発明を例示する。実施例１〜３は複合体の調製を示し、実施例４〜６は内毒素除去におけるそれらの使用を示す。
【実施例１】
【００２６】
工程１ − エピクロロヒドリン活性化ＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬの調製
保存剤を含まないＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬ（沈殿した重量２００ｇ）、ＲＯ水（１２８ｍｌ）および１０Ｍ水酸化ナトリウム（３.２ｍｌ）のスラリーをエピクロロヒドリン（１４.４ｍｌ）と４０℃で１時間反応させた。エポキシ活性化ＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬをＲＯ水（１０×２００ｍｌアリコート）で徹底的に洗浄して過剰の反応体を除去し、すぐに、工程２に使用した。
【００２７】
工程２ − トリス(２−アミノエチル)アミン−ＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬの調製
工程１からのエポキシ活性化ＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬ（沈殿した重量２００ｇ）をアリコートに分けて、トリス(２−アミノエチル)アミンの水溶液（ＲＯ水８０ｍｌ中１５.９７ｇ）に添加し、反応混合物を４０℃で１６時間撹拌した。得られたアミノ化吸着剤をＲＯ水（１０×２００ｍｌアリコート）で洗浄し、次に使用するまで、２０％（ｖ／ｖ）の水性エタノール中にて貯蔵した。
【実施例２】
【００２８】
工程１ − エピクロロヒドリン活性化ＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬの調製
保存剤を含まないＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬ（沈殿した重量２００ｇ）、ＲＯ水（１２８ｍｌ）および１０Ｍ水酸化ナトリウム（３.２ｍｌ）のスラリーをエピクロロヒドリン（１４.４ｍｌ）と４０℃で１時間反応させた。エポキシド活性化ＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬをＲＯ水（１０×２００ｍｌアリコート）で徹底的に洗浄し、すぐに工程２に使用した。
【００２９】
工程２ − トリエチレンテトラアミン−ＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬの調製
工程１からのエポキシ活性化ＰｕｒａＢｅａｄR ６ＸＬ（沈殿した重量２００ｇ）をアリコートに分けて、トリエチレンテトラアミンの水溶液（ＲＯ水６０ｍｌ中８.０４ｇ）に添加し、得られたスラリーを４０℃で１６時間攪拌した。アミノ化吸着剤を多量のＲＯ水（１０×２００ｍｌ部分）で洗浄して過剰のポリアミンを除去した。
【実施例３】
【００３０】
Ｐｕｒａｂｅａｄ ６ＸＬを総容積の１０倍のＲＯ水で洗浄し、排出したゲル３００ｇをＲＯ水１９２ｍｌでスラリー化した。１０Ｍ ＮａＯＨ（４.８ｍｌ）を添加し、該混合物を３６℃に加温し、その後、エピクロロヒドリン２１.６ｍｌを添加した。反応温度を４０℃に上昇させ、この温度で１時間維持し、その後、活性化Ｐｕｒａｂｅａｄを総容積の１０倍のＲＯ水で洗浄し、重力下にて排水させた。水６０ｍｌ中のＮ,Ｎ'−ビス(３−アミノプロピル)エチレンジアミン（９.５８６ｇ）を添加し、該混合物を４０℃に加熱し、それにエポキシ活性化アガロース１００ｇをいくつかに分けて３０分間にわたって添加した。該反応スラリーを４０℃で１６時間攪拌し、総容積の１０倍の水で洗浄して過剰のアミンを除去した。
【実施例４】
【００３１】
実施例１〜３により調製した脱パイロジェン複合体（１ｍｌ）（複合体Ａ、ＣおよびＧ）を、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）＃０１１３：Ｈ１０：Ｋ陰性内毒素（１.０×１０3ＥＵ）を含有するゲンタマイシンの水溶液（２ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ）に添加し、得られたスラリーを２５℃で１時間攪拌した。Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃアッセイを使用して内毒素の存在について上清をアッセイした（表１を参照）。
【００３２】
【表１】
2005525874.tif 000005
【００３３】
結果は、硫酸ゲンタマイシンの水溶液からの内毒素の非常に効率的かつ選択的な除去、および１００％のゲンタマイシン回収率を示している。
【実施例５】
【００３４】
エシェリキア・コリ＃０１１３：Ｈ１０：Ｋ陰性内毒素（３.０×１０2ＥＵ）を含有するヒト血清アルブミンの緩衝（１５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７.４）溶液（２ｍｌ、２７ｍｇ／ｍｌ）に脱パイロジェン複合体（コンジュゲートＡ、１ｍｌ）を添加し、２５℃で１時間攪拌した。Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃアッセイを使用して未結合内毒素について上清をアッセイし、較正して適当な濃度のヒト血清アルブミン中の内毒素を検出した。結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
2005525874.tif 000006
【００３６】
結果は、ヒト血清アルブミンの存在下での９９％を超える内毒素の除去、および、１００％の適用されたタンパク質の回収率の維持を示している。
【実施例６】
【００３７】
実施例１および２に従って調製した脱パイロジェン複合体（コンジュゲートＡおよびＣ、１ｍｌ）をそれぞれガラスカラム（内径１０ｍｍ×高さ３０ｍｍ）中に充填し、内毒素を含まない水２０ｍｌで平衡化した。エシェリキア・コリ＃０１１３：Ｈ１０：Ｋ陰性内毒素（７.５×１０2ＥＵ）を含有する硫酸ゲンタマイシンの水中溶液（１ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ）を６１ｃｍ／時の線流れ速度でカラムに負荷した。次いで、該カラムを内毒素を含まない水（９ｍｌ）で洗浄していずれもの未結合内毒素を除去し、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅアッセイを使用して内毒素含有量について、合わせたフロースルーをアッセイした。結果を表３に示す。
【００３８】
【表３】
2005525874.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月20日(2005.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性系における内毒素の単離、分離、精製、特徴付け、同定または定量化のための、構造式：
Ｚ−(Ｓｐａｃｅｒ)−[ＮＸ−Ａ]m−Ｎ[Ａ−ＮＨ2]2
［式中、
各Ａは、独立して、置換されていてもよい直鎖状、分枝鎖状、または環状の飽和炭化水素基を表し；
Ｘは、水素またはアルキルであり；
ｍは、１またはそれ以上であり；
リガンドは任意のスペーサーアームを介して支持マトリックスＺと結合している］
で示される親和性リガンド−マトリックス複合体の使用。
【請求項２】
Ｓｐａｃｅｒが存在し、それが構造：
−Ｔ−Ｌ−
［式中、Ｔは、Ｏ、ＳまたはＮ−Ｒ2を表し、Ｒ2は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し；
Ｌは、２〜２０個の原子を含有する、置換されていてもよいアルキル、アルキルエーテル、アルキルチオエーテル、アルキルエステルまたはアミド結合である］
を有する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
Ｓｐａｃｅｒが存在しない、請求項１記載の使用。
【請求項４】
各Ａが独立して二価のＣ1-4アルキル基を表す、請求項１〜３いずれか１項記載の使用。
【請求項５】
Ｚが多孔質アガロースビーズ、パーフルオロカーボン粒子および機能的な膜から選択される、請求項１〜４いずれか１項記載の使用。
【請求項６】
リガンドがトリス(２−アミノエチル)アミンである、請求項１〜５いずれか１項記載の使用。
【請求項７】
水性系がバッファー、タンパク質、ワクチン、抗生物質、血液、血漿、血清、核酸、医薬製剤、および他の生物学的化合物から選択される、請求項１〜６いずれか１項記載の使用。
【請求項８】
水性系が３〜１０の範囲のｐＨを有する、請求項１〜７いずれか１項記載の使用。
【請求項９】
水性系を複合体の懸濁液または充填床と接触させる、請求項１〜８いずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
全血または血漿から内毒素を除去するための体外装置における、請求項１〜９いずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
リガンドを内毒素のインビボ捕獲のために可溶性の高分子担体または非高分子担体と結合させる、請求項１〜１０いずれか１項記載の使用。
【国際調査報告】
2005525874.tif 000008
2005525874.tif 000009
2005525874.tif 000010