(57)【要約】本発明は第VIII因子の半減期を増大させる方法を提供する。より詳細には本発明は、第VIII因子のA2ドメインもしくはC2ドメインまたは両方のドメインのアミノ酸を置換することにより第VIII因子の半減期を増大させる方法を提供する。さらに本発明は、これらの方法により製造した第VIII因子突然変異体を提供する。さらに本発明は、レセプター関連蛋白（RAP）を使用して第VIII因子の半減期を増大させる方法を提供する。さらに本発明は、突然変異体第VIII因子をコードしているポリヌクレオチド、RAPをコードしているポリヌクレオチド、および、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用して血友病を治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Lys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、Arg(571)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置に非同類アミノ酸置換を含む突然変異体第VIII因子［ここでこの突然変異体第VIII因子は、低下したヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)依存性、レセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの突然変異体第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項２】
該突然変異体第VIII因子が低下したレセプター依存性クリアランスを有する、請求項1に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項３】
Bドメインを欠く、請求項2に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項４】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項3に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項５】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項4に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項６】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項5に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項７】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項6に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項８】
非同類アミノ酸置換がLys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびArg(571)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項3に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項９】
配列番号5を含む、請求項3に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項１０】
請求項3に記載の突然変異体第VIII因子を含む薬学上許容し得る組成物。
【請求項１１】
請求項3に記載の突然変異体第VIII因子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項１２】
有効量のレセプター関連蛋白（RAP）を投与することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
請求項3に記載の突然変異体第VIII因子をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項13に記載のポリヌクレオチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項１５】
RAPをコードしているポリヌクレオチドの有効量を投与することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
A2ドメインの1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項2に記載の突然変異体第VIII因子［ここでこの突然変異体第VIII因子は、低下したレセプター依存性クリアランスを持ち；そしてこの突然変異体第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項１７】
Bドメインを欠く、請求項16に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項１８】
484ないし509位の1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項17に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項１９】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項17に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項２０】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項19に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項２１】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項20に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項２２】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項21に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項２３】
非同類アミノ酸置換がLys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびArg(571)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項17に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項２４】
配列番号5を含む、請求項17に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項２５】
請求項17に記載の突然変異体第VIII因子を含む薬学上許容し得る組成物。
【請求項２６】
請求項17に記載の突然変異体第VIII因子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項２７】
有効量のRAPを投与することをさらに含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
請求項17に記載の突然変異体第VIII因子をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項28に記載のポリヌクレオチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項３０】
RAPをコードしているポリヌクレオチドの有効量を投与することをさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
C2ドメインの1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項2に記載の突然変異体第VIII因子［ここでこの突然変異体第VIII因子は、低下したレセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの突然変異体第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項３２】
Bドメインを欠く、請求項31に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項３３】
2303ないし2332位の1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項32に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項３４】
2311ないし2319位の1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項33に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項３５】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項32に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項３６】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項35に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項３７】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項36に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項３８】
非同類アミノ酸置換がLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項37に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項３９】
非同類アミノ酸置換がLys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびArg(571)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項32に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項４０】
配列番号5を含む、請求項32に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項４１】
請求項32に記載の突然変異体第VIII因子を含む薬学上許容し得る組成物。
【請求項４２】
請求項32に記載の突然変異体第VIII因子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項４３】
有効量のレセプター関連蛋白（RAP）を投与することをさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
請求項32に記載の突然変異体第VIII因子をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項44に記載のポリヌクレオチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項４６】
RAPをコードしているポリヌクレオチドの有効量を投与することをさらに含む、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
Lys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、Arg(571)、およびLys(659)より成る群から選ばれるA2ドメイン内の1またはそれ以上の位置にある非同類アミノ酸置換；ならびに、
(a) A2ドメイン内の1またはそれ以上の位置にあるアミノ酸置換；
(b) 配列番号1の番号付けに従ったC2ドメイン内の1またはそれ以上の位置にあるアミノ酸置換；
(c) A2ドメイン内の1またはそれ以上の位置、および配列番号1の番号付けに従ったC2ドメイン内の1またはそれ以上の位置にあるアミノ酸置換；
より成る群から選ばれるアミノ酸置換、
を含む突然変異体第VIII因子［ここでこの突然変異体第VIII因子は、低下したヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)依存性、レセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの突然変異体第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項４８】
該突然変異体第VIII因子が低下したレセプター依存性および低下したレセプター非依存性クリアランスを有する、請求項47に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項４９】
Bドメインを欠く、請求項48に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項５０】
配列番号5を含む、請求項49に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項５１】
請求項49に記載の突然変異体第VIII因子を含む薬学上許容し得る組成物。
【請求項５２】
請求項49に記載の突然変異体第VIII因子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項５３】
有効量のRAPを投与することをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
請求項49に記載の突然変異体第VIII因子をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項５５】
請求項54に記載のポリヌクレオチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項５６】
RAPをコードしているポリヌクレオチドの有効量を投与することをさらに含む、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
Lys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、Arg(571)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置の残基に非同類アミノ酸を置換することを含む、第VIII因子の半減期を増大させる方法［ここで、得られる第VIII因子は、低下したヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)依存性、レセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの得られる第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項５８】
得られる第VIII因子が低下したレセプター依存性クリアランスを持つ、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
(a) A2ドメインの1またはそれ以上の位置のアミノ酸を置換することを含む方法［ここで、得られる第VIII因子は低下したレセプター依存性クリアランスを持ち；そしてこの得られる第VIII因子はプロ凝固活性を有する］；
(b) C2ドメインの1またはそれ以上の位置のアミノ酸を置換することを含む方法［ここで、得られる第VIII因子は低下したレセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの得られる第VIII因子はプロ凝固活性を有する］；
(c) RAPのフラグメントの有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む方法［ここで、該フラグメントはLRPに結合する］；
(d) 方法(a)および(b)を含む方法；
(e) 方法(a)および(c)を含む方法；ならびに、
(f) 方法(b)および(c)を含む方法、
より成る群から選ばれる方法をさらに含む、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
Arg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、Arg(571)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置に非同類アミノ酸置換を含む突然変異体第VIII因子［ここでこの突然変異体第VIII因子は、低下したヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)依存性、レセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの突然変異体第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項６１】
該突然変異体第VIII因子が低下したレセプター依存性クリアランスを有する、請求項60に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項６２】
Bドメインを欠く、請求項61に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項６３】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項62に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項６４】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項63に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項６５】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項64に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項６６】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項65に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項６７】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびArg(571)の位置にある、請求項62に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項６８】
配列番号5を含む、請求項62に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項６９】
請求項62に記載の突然変異体第VIII因子を含む薬学上許容し得る組成物。
【請求項７０】
請求項62に記載の突然変異体第VIII因子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項７１】
有効量のレセプター関連蛋白（RAP）を投与することをさらに含む、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
請求項62に記載の突然変異体第VIII因子をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項７３】
請求項72に記載のポリヌクレオチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項７４】
RAPをコードしているポリヌクレオチドの有効量を投与することをさらに含む、請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
A2ドメインの1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項61に記載の突然変異体第VIII因子［ここでこの突然変異体第VIII因子は、低下したレセプター依存性クリアランスを持ち；そしてこの突然変異体第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項７６】
Bドメインを欠く、請求項75に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項７７】
484ないし509位の1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項76に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項７８】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項76に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項７９】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項78に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項８０】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項79に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項８１】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項80に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項８２】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびArg(571)の位置にある、請求項76に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項８３】
配列番号5を含む、請求項76に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項８４】
請求項76に記載の突然変異体第VIII因子を含む薬学上許容し得る組成物。
【請求項８５】
請求項76に記載の突然変異体第VIII因子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項８６】
有効量のRAPを投与することをさらに含む、請求項85に記載の方法。
【請求項８７】
請求項76に記載の突然変異体第VIII因子をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項８８】
請求項87に記載のポリヌクレオチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項８９】
RAPをコードしているポリヌクレオチドの有効量を投与することをさらに含む、請求項88に記載の方法。
【請求項９０】
C2ドメインの1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項61に記載の突然変異体第VIII因子［ここでこの突然変異体第VIII因子は、低下したレセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの突然変異体第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項９１】
Bドメインを欠く、請求項90に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項９２】
2303ないし2332位の1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項91に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項９３】
2311ないし2319位の1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項92に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項９４】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項91に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項９５】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項94に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項９６】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項95に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項９７】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある、請求項96に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項９８】
非同類アミノ酸置換がArg(490)の位置ならびにLys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、およびArg(571)の位置にある、請求項91に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項９９】
配列番号5を含む、請求項91に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項１００】
請求項91に記載の突然変異体第VIII因子を含む薬学上許容し得る組成物。
【請求項１０１】
請求項91に記載の突然変異体第VIII因子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項１０２】
有効量のレセプター関連蛋白（RAP）を投与することをさらに含む、請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
請求項91に記載の突然変異体第VIII因子をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
請求項103に記載のポリヌクレオチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項１０５】
RAPをコードしているポリヌクレオチドの有効量を投与することをさらに含む、請求項104に記載の方法。
【請求項１０６】
Arg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、Arg(571)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置にある非同類アミノ酸置換；ならびに、
(a) A2ドメイン内の1またはそれ以上の位置にあるアミノ酸置換；
(b) 配列番号1の番号付けに従ったC2ドメイン内の1またはそれ以上の位置にあるアミノ酸置換；
(c) A2ドメイン内の1またはそれ以上の位置にあるアミノ酸置換および配列番号1の番号付けに従ったC2ドメイン内の1またはそれ以上の位置にあるアミノ酸置換；
より成る群から選ばれるアミノ酸置換、
を含む突然変異体第VIII因子［ここでこの突然変異体第VIII因子は、低下したヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)依存性、レセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの突然変異体第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項１０７】
該突然変異体第VIII因子が低下したレセプター依存性および低下したレセプター非依存性クリアランスを有する、請求項106に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項１０８】
Bドメインを欠く、請求項107に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項１０９】
配列番号5を含む、請求項108に記載の突然変異体第VIII因子。
【請求項１１０】
請求項108に記載の突然変異体第VIII因子を含む薬学上許容し得る組成物。
【請求項１１１】
請求項108に記載の突然変異体第VIII因子の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項１１２】
有効量のRAPを投与することをさらに含む、請求項111に記載の方法。
【請求項１１３】
請求項108に記載の突然変異体第VIII因子をコードしているポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
請求項113に記載のポリヌクレオチドの有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、血友病を治療する方法。
【請求項１１５】
RAPをコードしているポリヌクレオチドの有効量を投与することをさらに含む、請求項114に記載の方法。
【請求項１１６】
Arg(490)の位置ならびにLys(380)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、Arg(571)、およびLys(659)より成る群から選ばれる1またはそれ以上の位置の残基に非同類アミノ酸を置換することを含む、第VIII因子の半減期を増大させる方法［ここで、得られる第VIII因子は、低下したヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)依存性、レセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの得られる第VIII因子はプロ凝固活性を有する］。
【請求項１１７】
得られる第VIII因子が低下したレセプター依存性クリアランスを持つ、請求項116に記載の方法。
【請求項１１８】
(a) A2ドメインの1またはそれ以上の位置のアミノ酸を置換することを含む方法［ここで、得られる第VIII因子は低下したレセプター依存性クリアランスを持ち；そしてこの得られる第VIII因子はプロ凝固活性を有する］；
(b) C2ドメインの1またはそれ以上の位置のアミノ酸を置換することを含む方法［ここで、得られる第VIII因子は低下したレセプター非依存性クリアランスを持ち；そしてこの得られる第VIII因子はプロ凝固活性を有する］；
(c) RAPのフラグメントの有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む方法［ここで、該フラグメントはLRPに結合する］；
(d) 方法(a)および(b)を含む方法；
(e) 方法(a)および(c)を含む方法；ならびに、
(f) 方法(b)および(c)を含む方法、
より成る群から選ばれる方法をさらに含む、請求項117に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、増大した半減期を有する突然変異体第VIII因子、その生成方法、薬学上許容し得る組成物および用途に関するものである。さらに本発明は、第VIII因子の半減期を増大させるレセプター関連蛋白を使用する方法、その生成方法、薬学上許容し得る組成物および用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血液の凝固は「内因性経路」または「外因性経路」のいずれかによって起こり、それにより或る種の血液蛋白が蛋白分解的活性化のカスケードで相互作用し、最終的に可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに変換する。このフィブリンの糸状構造が架橋して血餅の骨格を形成し、フィブリンの形成が無ければ凝固は起こり得ない。
【０００３】
内因性経路は7工程から成る：(1) 第XII因子の蛋白分解的活性化；(2) 活性化した第XII因子が第XI因子を開裂し、これを活性化；(3) 活性化した第XI因子が第IX因子を開裂し、それによりこれを活性化；(4) 活性化した第IX因子が活性化した第VIII因子と相互作用して第X因子を開裂および活性化；(5) 活性化した第X因子が膜表面の活性化した第V因子と結合し、この複合体がプロトロンビンを蛋白分解的に開裂してトロンビンを形成させる；(6) トロンビンがフィブリノーゲンを蛋白分解的に開裂してフィブリンを形成させる；(7) フィブリン単量体が集合して原線維となり、次いでこれが第XIII因子によって架橋する。
【０００４】
外因性経路は以下の工程から成る：(1) 血管の破裂時に第VII因子が、血管系外部の組織に存在するリポ蛋白である組織因子と結合する；(2) 第VII因子が蛋白分解的開裂によって第VIIa因子へと活性化する；そして、(3) 第VIIa因子-組織因子複合体が開裂し第X因子を活性化する。以後、外因性経路は内因性経路と同一であり、即ち二つの経路は上に記載した最後の3工程を共有する。
【０００５】
血漿糖蛋白第VIII因子は、フォン・ヴィルブラント因子と強固に非共有結合した不活性前駆体として血液中を循環する。第VIII因子（fVIII）は、フォン・ヴィルブラント因子（vWf）からこれを解離しカスケード中でそのプロ凝固機能を活性化するトロンビンまたは第Xa因子により蛋白分解的に活性化される。活性型において第VIIIa因子（fVIIIa）は血液凝固の内因性経路において第X因子活性化酵素複合体の補助因子として機能するが、血友病Aの患者ではこれが減少しまたは非機能的である。
【０００６】
血友病においては、或る種の血漿中の血液凝固因子の欠損により血液凝固が損なわれている。第VIII因子の欠損を有するまたは第VIII因子に対する抗体を保有する人々は、第VIII因子で治療しない限り、一連の重大な症状を惹起し得る制御不能な体内出血を経験する。症状は、関節の炎症反応から早期の死亡にまで及ぶ。実際、第VIII因子の古典的定義は、血友病Aの個体から誘導される血漿中の凝固異常を是正する、正常血漿中に存在する物質、というものである。vWfは機能的第VIII因子の必須成分であることから、vWfの欠損もまた表現型血友病Aを惹起する。これらの場合には、第VIII因子の半減期が血液凝固におけるその特別な機能をもはや遂行し得なくなる程度まで低下する。
【０００７】
fVIII蛋白は相同的なAおよびCドメインとユニークなBドメインで構成され、これらはA1-A2-B-A3-C1-C2という順に配置されている（Vehar,G.A., et al., Nature 312:337-340(1984))。これはB-A3接合点での開裂によって生成する一連のMe2+に連結したヘテロ二量体へのプロセシングを受け（Fay,P.J., et al., Biochem.Biophys.Acta. 871:268-278(1986))、酸性領域（AR）ならびにA3、C1、およびC2ドメインより成る軽鎖（LCh）と、A1、A2、およびBドメインより成る重鎖（HCh）を生成する（図1）。
【０００８】
トロンビンによるfVIIIの活性化は、vWfからの活性化fVIII（fVIIIa）の解離と、少なくとも100倍の補助因子活性の増大を導く。fVIIIaはA1/A2/A3-C1-C2ヘテロ三量体であり（Fay,P.J., et al., J.Biol.Chem 266:8957-8962(1991))、ここでドメインA1とA3は金属イオン結合を保持し（図1）、安定な二量体A1/A3-C1-C2は静電力によってA2サブユニットと弱く結合している（Fay,P.J., et al., J.Biol.Chem 266:8957-8962(1991))。ヘテロ三量体からのA2サブユニットの自然解離はfVIIIaの非蛋白分解的不活性化をもたらす。
【０００９】
A2ドメインは第VIII因子分子のプロ凝固活性に必要である。ブタ第VIII因子はヒト第VIII因子の6倍高いプロ凝固活性を持ち（Lollar,P., and E.T.Parker 266 J.Biol.Chem. 12481-12486(1991))、ヒトとブタの第VIII因子の凝固活性の差は、ヒトおよびブタのA2ドメインにある1またはそれ以上の残基のアミノ酸配列の差に基づくと思われるという事が、研究により示されている（Lollar,P., et al., 267 J.Biol.Chem. 23652-23657(1992))。
【００１０】
fVIIIを持たない重篤な血友病Aの患者（Fijnvandraat,K., et al., Thromb.Haemostas.77:298-302(1997); Morfini,M., et al., Thromb.Haemostas. 68:433-435(1992))または正常な個体（Over,J., et al., J.Clin.Invest. 62:223-234(1978))にfVIII/vWf複合体または精製した血漿または組換えfVIIIを注入すると、半減期12-14時間で類似のfVIII消失が起こる。fVIIIとvWfの間の複合体は循環中の第VIII因子の正常な半減期およびレベルにとって重要であるが、fVIII/vWf複合体のターンオーバーに関連する機構は充分に確定されていない。
【００１１】
ヒト第VIII因子遺伝子が単離され哺乳動物細胞で発現され（Toole,J.J., et al., Nature 312:342-347(1984); Gitschier,J., et al., Nature 312:326-330(1984); Wood,W.I., et al., Nature 312:330-337(1984); Vehar,G.A., et al., Nature 312:337-342(1984); WO87/04187; WO88/08035; WO88/03558; 米国特許第4757006号）、アミノ酸配列がcDNAから推定された。Capon et al.,米国特許第4965199号は、哺乳動物宿主細胞で第VIII因子を生成する組換えDNA法およびヒト第VIII因子の精製を開示している。CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞およびBHKC（仔ハムスター腎細胞）でのヒト第VIII因子の発現が報告されている。ヒト第VIII因子がBドメインの一部または全てを削除するように改変され（米国特許第4868112号）、また、ヒト第VIII因子Bドメインのヒト第V因子Bドメインへの置換が試みられた（米国特許第5004803号）。ヒト第VIII因子をコードしているcDNA配列および推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号1および2に示す。
【００１２】
米国特許第5859204号、Lollar,J.S.は、低下した抗原性および低下した免疫反応性を有するヒト第VIII因子の突然変異体を記載している。
【００１３】
ブタ第VIII因子が血漿から単離精製された（Fass,D.N., et al., Blood 59:594(1982))。セルロプラスミンおよび凝固因子Vとの相同性を有し、大部分誤って位置決定された、N末端軽鎖配列の一部に相当するブタ第VIII因子の部分アミノ酸配列がChurch, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6934(1984)に記載された。Toole,J.J., et al., Nature 312:342-347(1984)は、ブタ第VIII因子の4個のアミノ酸フラグメントのN末端の部分的配列決定を記載したが、第VIII因子分子中でのそれらの位置に関してこのフラグメントを特性決定しなかった。ブタ第VIII因子のBドメインおよびA2ドメインの一部のアミノ酸配列がToole,J.J., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5939-5942(1986)によて報告された。ブタ第VIII因子の完全なA2ドメインをコードしているcDNA配列および推定アミノ酸配列ならびに全ドメイン、全サブユニット、および特定のアミノ酸配列の置換を有するハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子が、LollarおよびRungeの米国特許第5364771号およびWO93/20093に開示された。より最近になって、ブタ第VIII因子のA1およびA2ドメイン、ならびにブタA1および／またはA2ドメインを対応するヒトドメインで置換したキメラ第VIII因子のヌクレオチドおよび対応アミノ酸配列がWO94/11503に報告された。米国特許第5859204号、Lollar,J.S.は、ブタcDNAおよび推定アミノ酸配列を開示している。
【００１４】
LRPにより仲介される細胞のエンドサイトーシスが、凝固またはフィブリン溶解に関連する幾つかの蛋白を包含する構造上無関係の幾つかのリガンドを除去する機構であることが示された。これらのリガンドは、トロンビンと抗トロンビンIII（ATIII)の複合体、ヘパリン補助因子II（HCII）(Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 271:6523-6529(1996))、プロテアーゼネキシンI（Knauer,M.F., et al., J.Biol.Chem. 272:12261-12264(1997))、ウロキナーゼ型および組織型プラスミノーゲンアクティベーター（それぞれu-PAおよびt-PA）とプラスミノーゲンアクティベーターインヒビター（PAI-1）の複合体（Nykjaer,A., et al., J.Biol.Chem. 267:14543-14546(1992); Orth,K., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 89:7422-7426(1992))、トロンボスポンディン（Mikhailenko,I., et al., J.Biol.Chem. 272:6784-6791(1997))、組織因子経路インヒビター（TFPI)(Warshawsky,I., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 91:6664-6668(1994))、および第Xa因子（Narita,M., et al., Blood 91:555-560(1998); Ho,G., et al., J.Biol.Chem 271:9497-9502(1996))である。
【００１５】
α2-マクログロブリンレセプターと同一の大きな細胞表面糖蛋白であるLRP（Strickland,D.K. et al., J.Biol.Chem. 265:17401-17404(1990))は低密度リポ蛋白（LDL）レセプターファミリーの一員であり、このファミリーはLDLレセプター、超低密度リポ蛋白（VLDL）レセプター、ヴィテロゲニンレセプターおよび糖蛋白330レセプターをも包含する。LRPレセプターは、LRPリガンドのための結合部位を含む非共有結合で連結した515kDa α鎖（Herz,J., et al., EMBO J. 7:4119-4127(1988))と、85kDa貫膜β鎖より成る。α鎖の内部では、システインに富むクラスA反復のクラスターがリガンド結合を担っている（Moestrup,S.K., et al., J.Biol.Chem 268:13691-13696(1993))。LRPの酸性リガンド結合領域とは対照的に、LRPのリガンドは、正に荷電したアミノ酸残基に富む領域を露出している（Moestrup,S.K., Biochim.Biophys.Acta 1197:197-213(1994))。LRPに存在するこの型の結合および31のクラスA反復は、その広範なリガンドの多様性と多リガンドクリアランスレセプターとして役立つ能力の原因であるかも知れない。LRPは、胎盤、肺および脳を包含する多くの細胞型および組織で発現され（Moestrup,S.K. et al., Cell Tissue Res. 269:375-382(1992))、肝臓における主要なエンドサイトーシスレセプターである（Strickland,D.K., et al., FASEB J. 9:890-898(1995))。
【００１６】
39kDaのレセプター関連蛋白（RAP）は、高い親和性（Kd=4nM(27)）でLRPに結合し、全リガンドの結合およびLRP仲介インターナライゼーションおよび分解を阻害し（Moestrup,S.K., Biochim.Biophys.Acta 1197:197-213(1994); Williams,S.E., et al., J.Biol.Chem. 267:9035-9040(1992))、故に、与えられたリガンドのエンドサイトーシスにLRPが関わっているかどうかを試験するための有用な手段として役立つ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
米国で約10000人に達する重篤な血友病患者は、ヒト第VIII因子、vWf/第VIII因子複合体またはvWfの注入で治療でき、これらは充分な頻度および濃度で投与すれば血液の正常な凝固能を回復させる。しかしながら、供給が不充分であり、また、単離精製の難しさ、免疫原性、ならびにAIDSおよび肝炎への感染の危険性を除去する必要性に起因する治療的使用での問題が存在する。
【００１８】
様々な純度のヒト血漿由来第VIII因子の幾つかの調製品が血友病Aの治療のために商業的に入手できる。これらは、ウイルスに対して熱および洗浄剤処理してあるがかなりのレベルの抗原性蛋白を含有している、プールされた多くのドナーの血液から誘導した部分精製第VIII因子；抗原性不純物およびウイルス混入のレベルがより低いモノクローナル抗体精製した第VIII因子；および、臨床試験が進行中の組換えヒト第VIII因子を包含する。都合の悪いことに、ヒト第VIII因子は生理的濃度およびpHで不安定であり、血中に極めて低い濃度（0.2μg/ml血漿）でしか存在せず、そして凝固比活性が低い。
【００１９】
一般に使用されている市販の血漿由来第VIII因子に付随する問題は、より良い第VIII因子製品開発への著しい興味を刺激した。より強力な第VIII因子；選択されたpHおよび生理的濃度で安定な第VIII因子；循環血液中でより長い半減期を有する第VIII因子に対する需要がある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、第VIII因子の半減期を増大させる方法に関するものである。より詳細には、本発明は、血漿からのクリアランスが低下した第VIII因子の突然変異体に関するものである。
【００２１】
或る態様では、この突然変異体第VIII因子はA2ドメインに1またはそれ以上のアミノ酸置換を有する。
【００２２】
好ましい態様では、A2ドメイン中の置換されたアミノ酸（群）は、第VIII因子のヘパリン硫酸プロテオグリカン(HSPG)依存性、レセプター非依存性クリアランスにとって重要であり、その結果、得られる突然変異体第VIII因子は、より長い（増大した）循環半減期を持つ。
【００２３】
好ましい態様では、A2ドメイン中の置換されたアミノ酸（群）は、第VIII因子のレセプター依存性クリアランスにとって重要であり、その結果、得られる突然変異体第VIII因子はより長い（増大した）循環半減期を持つ。
【００２４】
別の態様では、この突然変異体第VIII因子はC2ドメインに1またはそれ以上のアミノ酸置換を有する。好ましい態様では、C2ドメイン中の置換されたアミノ酸（群）は、第VIII因子のレセプター非依存性クリアランスにとって重要であり、その結果、得られる突然変異体第VIII因子はより長い（増大した）循環半減期を持つ。
【００２５】
さらに別の態様では、HSPG依存性クリアランスにとって重要なA2ドメイン中の、そしてレセプター依存性クリアランスにとって重要なA2ドメイン中のアミノ酸（群）が置換され、その結果、得られる突然変異体第VIII因子は増大した循環半減期を持つ。
【００２６】
さらに別の態様では、HSPG依存性クリアランスにとって重要なA2ドメイン中のアミノ酸（群）が置換され、且つレセプター非依存性クリアランスにとって重要なC2ドメイン中のアミノ酸（群）が置換され、その結果、得られる突然変異体第VIII因子は増大した循環半減期を持つ。
【００２７】
さらに別の好ましい態様では、HSPG依存性レセプター非依存性クリアランスにとって重要なA2ドメイン中のアミノ酸（群）が置換され、レセプター依存性クリアランスにとって重要なA2ドメイン中のアミノ酸（群）が置換され、そしてレセプター非依存性クリアランスにとって重要なC2ドメイン中のアミノ酸（群）が置換され、その結果、得られる突然変異体第VIII因子は増大した循環半減期を持つ。
【００２８】
さらに本発明は、第VIII因子の半減期を増大させるためにレセプター関連蛋白（RAP）を使用する方法に関するものである。本発明のさらなる局面は、増大した半減期を持つ第VIII因子突然変異体を製造する方法、薬学上許容し得る該第VIII因子突然変異体の組成物、および本発明に係る突然変異体第VIII因子および／またはRAPを使用して第VIII因子欠損症を治療する方法を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本明細書で使用する「第VIII因子」（または「凝固因子VIII」）とは、内因性凝固経路の一員であり血液凝固に必須の血漿糖蛋白を指す。生物活性第VIII因子の先天的X連鎖欠損は、生命を脅かす可能性のある疾患である血友病Aをもたらす。別途明記または指摘の無い限り、本明細書で使用する「第VIII因子」とは、任意のフラグメント、類似誘導体または修飾された第VIII因子を包含する、凝固の正常な役割を持つ任意の機能的ヒト第VIII因子蛋白分子を指す。ヒト第VIII因子cDNAヌクレオチドおよび推定された完全長アミノ酸配列をそれぞれ配列番号1および2に示す。本発明に係るヒト第VIII因子ペプチドは、完全長第VIII因子、完全長第VIII因子からN末端Metを除いたもの、成熟第VIII因子（からシグナル配列を除いたもの）、N末端にさらなるMetを有する成熟第VIII因子、および／またはBドメイン有りまたは無しの第VIII因子を包含する。本発明に係る第VIII因子はさらにブタ第VIII因子を包含する。ブタ第VIII因子のcDNAおよび推定アミノ酸配列は米国特許第5859204号に開示されている。
【００３０】
本明細書で使用する、第VIII因子の「サブユニット」とは、該蛋白の重鎖および軽鎖である。第VIII因子の重鎖は3個のドメイン、A1、A2、およびBを含む。第VIII因子の軽鎖もまた3個のドメイン、A3、C1、およびC2を含む。第VIII因子は「ドメイン」配列NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOHを規定する内部配列相同性を有するおよそ300kDaの一本鎖蛋白として合成される。
【００３１】
第VIII因子分子において、本明細書で使用する「ドメイン」とは、内部アミノ酸配列の実体とトロンビンによる蛋白分解的開裂部位によって定義される、アミノ酸の連続配列である。別途明記しない限り、第VIII因子ドメインは以下のアミノ酸残基を包含する：A1、残基Ala1-Arg372; A2、残基Ser373-Arg740; B、残基Ser741-Arg1648; A3、残基Ser1690-Ile2032; C1、残基Arg2033-Asn2172; C2、残基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2配列は残基Ser1690-Tyr2332を包含する。残りの配列、残基Glu1649-Arg1689は通常第VIII因子軽鎖活性化ペプチドと称する。
【００３２】
本明細書で使用する「無Bドメイン」第VIII因子もしくは「B(-)」第VIII因子、またはこれらのフラグメントとは、Bドメインを欠く本明細書に記載の第VIII因子突然変異体のいずれか１つを指す。GenBank受理番号X01179から組み立てられる成熟B(-)第VIII因子のアミノ酸配列を図12A-12B（配列番号5）に示す。本発明に係るB(-)第VIII因子は、シグナル配列有りまたは無しの、そしてN末端Met有りまたは無しのB(-)第VIII因子を包含する。
【００３３】
本明細書で使用する「突然変異体第VIII因子またはそのフラグメント」または「第VIII因子突然変異体またはそのフラグメント」とは、少なくとも1個のアミノ酸置換を含む活性な第VIII因子分子またはそのフラグメントである。
【００３４】
本明細書中使用する「RAP」とは、α2マクログロブリンレセプター関連蛋白とも呼ばれるレセプター関連蛋白を指す。RAPは第VIII因子のレセプター依存性クリアランスを低下させる。ヒトRAPの推定アミノ酸配列を図14（配列番号4；GenBank受理番号P30533）に示す。RAP cDNA配列を配列番号3およびGenBank受理番号M63959に示す。本発明に係る突然変異体RAP蛋白は、RAPの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を有していてよい。例えばRAPの327「位」におけるアミノ酸置換とは、GenBank受理番号P30533中のRAPアミノ酸配列のアミノ酸327におけるアミノ酸置換を指す。
【００３５】
「アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸を残りの19の天然に存在するアミノ酸のうちの１つに置換することを意味する。例えば「484ないし509」位のうち任意の１つにおけるアミノ酸置換は、484および509位を包含するこの範囲内の任意の位置でのアミノ酸置換を意味する。本発明に係る突然変異体第VIII因子またはRAP蛋白は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を有することができる。
【００３６】
例えば第VIII因子の499「位」におけるアミノ酸置換とは、Wood et al., Nature 312:330-337(1984)の番号付け系による、499位でのアミノ酸置換を指す。
【００３７】
本明細書で使用する「半減期」とは、例えば実施例1-3の方法を用いてマウスのような動物で決定した、循環中での第VIII因子の半減期を指す。第VIII因子は12-14時間の半減期を持つ。本明細書に示すように、第VIII因子の半減期を増大させる方法は、12-14時間より長い第VIII因子の半減期を導くであろう。
【００３８】
本明細書で使用する「レセプター依存性クリアランス」とは、レセプターが仲介する、循環からの第VIII因子の除去を指す。実施例に記載のように、レセプター依存性クリアランスはMEF細胞によって示されRAPによって阻害される。レセプター依存性クリアランスは、第VIII因子のLRP仲介クリアランスを包含するがこれに限定される訳ではない。レセプター依存性クリアランスにさらなるレセプターが関与することもある。レセプター「依存性」およびレセプター「仲介」という語は本明細書では互換的に使用する。
【００３９】
本明細書で使用する「レセプター非依存性クリアランス」とは、レセプター依存性クリアランス以外の手段による、循環からの第VIII因子の除去を指す。RAPはレセプター非依存性クリアランスを阻害しない。
【００４０】
本明細書で使用する「ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）依存性クリアランス」とは、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG）による循環からの第VIII因子の除去を指す。HSPG依存性クリアランスはヘパリン、へパリナーゼ、およびプロタミンにより阻害される。HSPG依存性クリアランスはレセプター依存性およびレセプター非依存性クリアランスの両者を包含する。「HSPG依存性レセプター非依存性クリアランス」はPEA13細胞のようなLRP欠損細胞によって示され、ヘパリン、へパリナーゼ、またはプロタミンによって阻害されるが、RAPによっては著明に阻害されない。HSPG「依存性」およびHSPG「仲介」という語は本明細書では互換的に使用する。「HSPG」および「HSPG(群)」は本明細書では互換的に使用する。
【００４１】
本明細書で使用する「第VIII因子欠損」とは、不完全な第VIII因子の産生により、または第VIII因子の不充分なもしくは皆無の産生により、またはインヒビターによる第VIII因子の部分的もしくは全体的阻害により惹起される凝固活性の欠損を包含する。血友病Aは、X連鎖遺伝子の欠陥およびそれがコードしている第VIII因子蛋白の不在または欠損に起因する、或る種の第VIII因子欠損症である。vWfは機能的第VIII因子の必須成分であるため、vWfの欠損もまた表現型血友病Aを惹起し得る。これらの場合、第VIII因子の半減期が、血液凝固におけるその特別な機能をもはや発揮できない程度にまで低下する。
【００４２】
本明細書で使用する「血漿」とは、ヒトまたは動物の血液の、凝固前に見出せる流体、非細胞部分を指す。これは凝固後に得られる血清とは区別される。
【００４３】
本明細書で使用する「薬学上許容し得る担体」とは、任意の型の非毒性固体、半固体もしくは液体の増量剤、希釈剤、カプセル化材料または調合補助物質を指す。
【００４４】
本明細書で使用する「患者」とは、医療上の看護および／または治療を受ける人間または動物の個体を指す。
【００４５】
本明細書で使用する「先天的欠損」とは、正常な個体に見出される化合物が遺伝の結果として欠失している個体の状態を指す。先天的欠損は、現時点で治癒が保証されていない、恒久的な不在の移植（permanent absent transplantation）または遺伝的介入である。
【００４６】
本明細書で使用する「後天的欠損」とは、正常な個体に見出される化合物が非先天的作用の結果として欠失している個体の状態を指す。後天的欠損はしばしば他の状態またはそれらの治療の一時的な結果であるが、にもかかわらず衰弱性であり生命を脅かす。
【００４７】
本明細書で使用する「融合蛋白」とは、その融合蛋白をコードしている遺伝子を作製するために、１つの蛋白のコード配列が、例えばその一部を別の遺伝子由来の第二の蛋白のコード配列と融合させることによって広範囲に変えられている、遺伝子産物である。本明細書で使用する融合蛋白は、本明細書に記載の第VIII因子蛋白またはRAP蛋白の部分集合である。
【００４８】
本明細書で使用する「対応する」核酸もしくはアミノ酸またはいずれかの対応配列とは、別の種の第VIII因子分子中の部位と同じ構造および／または機能を有する第VIII因子もしくは突然変異体第VIII因子分子またはそのフラグメントの部位に存在する配列であるが、その核酸またはアミノ酸の数は同一でなくともよい。
【００４９】
本明細書で使用する「プロ凝固活性」とは、ヒト第VIII因子検定で示される第VIII因子凝固活性を指す。
【００５０】
本明細書で使用する「比活性」とは、ヒト第VIII因子欠損血漿の凝固異常を是正する活性を指す。比活性は、ヒト第VIII因子欠損血漿の凝固時間を正常なヒト血漿のそれと比較する標準検定において、総第VIII因子蛋白ミリグラム当たりの凝固活性の単位で測定する。1単位の第VIII因子活性とは、正常ヒト血漿1ミリリットルに存在する活性である。この検定では、血餅形成にかかる時間が短いほど、検定される第VIII因子の活性が高い。突然変異体第VIII因子はヒト第VIII因子検定で凝固活性を有する。この活性は血漿由来または組換えヒト第VIII因子いずれかの活性より低いことも、等しいことも、または高いこともある。
【００５１】
本明細書で使用する「ポリペプチド」、「分子」および「蛋白」とは、以下に記載する全てのポリペプチドを包含する。ポリペプチドの基本構造は周知であり、当分野の多数の教科書およびその他の刊行物に記載されてきた。この状況では、この用語は本明細書中、ペプチド結合によって互いに連結して直線状鎖となっている2またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは蛋白を指すために使用する。本明細書で使用するこの用語は、例えば当分野で一般的にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称する短鎖、ならびに当分野で一般的に蛋白（これには多くの種類がある）と称する長鎖の両者を指す。
【００５２】
ポリペプチドはしばしば、一般に20の天然に存在するアミノ酸と称される20のアミノ酸以外のアミノ酸を含み、末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸は、与えられたポリペプチド中で、プロセシングおよびその他の翻訳後修飾といった天然プロセスによるばかりでなく、当分野で周知の化学的修飾技術によって修飾され得る。ポリペプチド中で天然に起こる一般的な修飾でさえ膨大すぎてここに余すところなく列挙することはできないが、それらは基本教科書およびより詳細な研究論文、ならびに大部の研究文献に詳細な記載があり、尚且つ当業者には周知である。本発明に係るポリペプチドに存在し得る既知の修飾のうち例示的な幾つかを挙げると、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、PEG化、フラビンの共有結合的付加、ヘム部分の共有結合的付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的付加、脂質または脂質誘導体の共有結合的付加、ホスホチジルイノシトールの共有結合的付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩（エステル）の形成、調合、γ-カルボキシ化、グルコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシ化、沃素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロセシング、燐酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、蛋白へのアミノ酸のトランスファーRNA仲介付加、例えばアルギニル化およびユビキチン化がある。
【００５３】
このような修飾は当業者に周知であり、また科学文献に詳細に記載されている。幾つかの特に一般的な修飾、例えばグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ-カルボキシ化、ヒドロキシ化およびADP-リボシル化は殆どの基本教科書、例えばProteins  Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E.Creighton, W.H.Freeman and Company, New York(1993)に記載されている。例えばPosttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C.Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983)中のWord,F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pp.1-12; Seifter et al., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth.Enzymol. 182:626-646(1990)およびRattan et al., Protein Synthesis: Post translational Modifications and Aging, Ann.N.Y.Acad.Sci. 663:48-62(1992)といった数多くの詳細な総説が、この主題に関して入手できる。
【００５４】
一般に、本明細書で使用するポリペプチドという語は、このような修飾を全て包含し、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることにより合成されるポリペプチド中に存在する修飾を包含する。
【００５５】
本発明はさらに、これらのポリペプチドのフラグメント、「誘導体」および類似体に関するものである。図12A-12B、13A-13Bまたは14のポリペプチドに言及する際の「フラグメント」、「誘導体」および「類似体」という語は、係るポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を本質的に保持しているポリペプチドを意味する。第VIII因子の突然変異体、フラグメント誘導体または類似体とは、第VIII因子のプロ凝固活性を保持しているポリペプチドを指す。RAPの突然変異体、フラグメント誘導体または類似体とは、第VIII因子のレセプター依存性クリアランスを低下させる能力を保持しているポリペプチドを指す。したがって、類似体は、プロ蛋白部分の開裂により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成できるプロ蛋白を包含する。フラグメント、誘導体および類似体は本明細書に詳細に記載する。
【００５６】
本発明に係るポリペプチドのフラグメント、誘導体または類似体は、(i) 1またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含んでいるもの、または(ii) 成熟ポリペプチドがもう一つの化合物、例えば該ポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合しているもの、または(iii) さらなるアミノ酸、例えばリーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチドもしくはプロ蛋白配列の精製に用いられる配列が、成熟ポリペプチドと融合しているもの、であってよい。このようなフラグメント、誘導体および類似体は本明細書の教示から、当業者の範囲内にあるとみなす。
【００５７】
本発明に係るポリペプチドは組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってよい。或る好ましい態様では、これは組換えポリペプチドである。
【００５８】
この点でさらなる特に好ましいものは、突然変異体、類似体およびフラグメント；ならびに図12A-12B、13A-13Bもしくは14に記載のポリペプチドの定義された活性および／またはアミノ酸配列を有する該フラグメントの突然変異体および類似体である。
【００５９】
本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは均質となるまで精製される。
【００６０】
「ポリヌクレオチド(群)」は一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、修飾されていないRNAもしくはDNAまたは修飾されたRNAもしくはDNAであってよい。したがって、例えば本明細書で使用するポリヌクレオチドとは、特に一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖またはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を指す。加えて、本明細書で使用するポリヌクレオチドとは、RNAまたはDNAまたはRNAおよびDNAの両者を含む三本鎖領域を指す。このような領域の鎖は同一分子由来であっても異なる分子由来であってもよい。この領域は該分子の1またはそれ以上の全体を包含できるが、より典型的には幾らかの該分子の1領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つはしばしばオリゴヌクレオチドである。
【００６１】
本明細書で使用するポリヌクレオチドという語は、1またはそれ以上の修飾された塩基を含む上記のようなDNAまたはRNAを包含する。したがって、安定性またはその他の理由で修飾された骨格を持つDNAまたはRNAは、この語が本明細書で意図している「ポリヌクレオチド」である。さらに、二つの例を挙げれば、イノシンのような普通でない塩基、またはトリチル化塩基のような修飾された塩基を含むDNAまたはRNAは、この語が本明細書で使用されているポリヌクレオチドである。
【００６２】
当業者が知悉する多くの有用な目的に役立つ多彩な修飾がDNAおよびRNAに施されてきたことが理解できるであろう。本明細書で使用するポリヌクレオチドという語は、このような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、ならびに、とりわけウイルスおよび細胞（単純なおよび複雑な細胞を包含する）の特徴であるDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。
【００６３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、クローニングによって得られた、または化学合成技術もしくはそれらの組み合わせによって作製された、mRNAのようなRNAの形態、または例えばcDNAおよびゲノムDNAを包含するDNAの形態であってよい。このDNAは二本鎖または一本鎖であってよい。一本鎖DNAは、センス鎖としても知られるコード鎖であってよく、或いはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってよい。
【００６４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、それ自身成熟ポリペプチドのコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなるコード配列、例えばリーダーまたは分泌配列をコードしている配列、例えばプレ-、またはプロ-またはプレプロ-蛋白配列；前述のさらなるコード配列を持つまたは持たない、加えて、例えばイントロンおよび非コード化5'および3'配列、例えば、転写、mRNAプロセシング（例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナルを包含する）、リボソーム結合およびmRNAの安定性で役割を果たす、転写された翻訳されていない配列を包含する（但しこれらに限定されない）さらなる非コード配列を持つ、成熟ポリペプチドのコード配列；さらなる官能性を提供するようなさらなるアミノ酸をコードしているさらなるコード配列、を包含し得るがこれらに限定される訳ではない。したがって、例えばこのポリペプチドは、融合したポリペプチドの精製を容易にするペプチドのようなマーカー配列と融合させることができる。本発明のこの側面の或る好ましい態様では、マーカー配列はヘキサヒスチジンペプチド、例えばとりわけpQEベクター（Qiagen,Inc.）で提供される標識であり、それらの多くは商業的に入手可能である。例えばGentz et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86:821-824(1989)に記載のように、ヘキサヒスチジンは融合蛋白の簡便な精製を可能にする。HA標識はインフルエンザへマグルチニン蛋白から誘導されるエピトープに相当し、これは例えばWilson et al., Cell 37:767(1984)に記載されている。
【００６５】
本明細書で使用する或る物質の「有効量」とは、特にその物質を動物または人間に投与した時、所望の結果を引き起こすに充分な係る物質の量である。
【００６６】
「投与」という語は、注射、経口、経腸、経皮および非経口（例えば静脈内）投与を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）医学技術で既知の適当な手段による、動物または人間への、本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの導入の包含を意味する。
【００６７】
「薬学上許容し得る塩」という語は、本発明に係る突然変異体第VIII因子またはRAPの塩の包含を意図している。このような塩は薬学上許容し得る酸または塩基、例えば硫酸、塩化水素酸、硝酸、燐酸などのような酸、または、アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物、水酸化アンモニウム、水酸化アルキルアンモニウムなどのような塩基から製造できる。
【００６８】
「薬学上許容し得る組成物」という語は、溶媒、担体、希釈剤などの包含を意図しており、これらは本発明に係る突然変異体第VIII因子またはRAPの製造に添加物または媒質として利用して、係る化合物を必要とする患者（人間または動物）への該化合物の投与のための担体またはアジュバントを提供する。このような添加物は、例えば投与にとって適切なイオン条件を提供し、突然変異体第VIII因子またはRAPを不活性化または分解に対して安定化し、そして／または突然変異体VIII因子またはRAPの半減期を増大させるといった一定の機能を遂行できる。薬学上許容し得る組成物はこれが投与される宿主と医学的に共存可能である。
【００６９】
「治療」または「治療する」という語は、医学的異常の予防、改善、防止または治癒を包含する目的のために本発明に係る突然変異体第VIII因子またはRAP（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）の有効量を含む本発明に係る薬学上許容し得る組成物を患者に投与する事の包含を意図している。
【００７０】
或る材料は、もしこれが、精製前にこれと共に通常且つ天然に見出される物質から実質的に精製されており、且つ、インビボまたはインビトロで該物質と共に通常且つ天然に見出される不純物がその材料の最終調製品に実質上存在しないならば、「実質上天然不純物を含まない」と言う。治療を必要とする対象に投与する場合、本発明に係る突然変異体第VIII因子またはRAPは、インビボ（この突然変異体第VIII因子またはRAPが単離される宿主中）またはインビトロ（化学合成の結果として）のいずれかで突然変異体第VIII因子またはRAPに付随する天然不純物を実質上含まない。「実質上存在しない」とは、このような不純物が全く存在しないか、またはそれらの存在が(1) 治療上許容し得る組成物をそれを必要とする患者に投与した時に係る組成物中の活性物質の所望治療効果を妨げず、且つ(2) 係る組成物の投与の結果、患者に害を及ぼさない、ような低い濃度で存在することを意味する。
【００７１】
最新の情報はBドメインが第VIII因子の機能に及ぼす既知の効果が無いことを示していることから、幾つかの態様においては、本明細書に記載の任意の方法で製造した突然変異体第VIII因子分子またはそのフラグメント（「B(-)第VIII因子」または「無Bドメイン第VIII因子」）のBドメインを除去する（「Bドメイン(-)」または「無Bドメイン」）。
【００７２】
延長された寿命を持つ突然変異体の作製は、fVIII注入療法の有効性を高めコストを削減するための有望なアプローチとなり得る。本発明は、第VIII因子を突然変異させることにより第VIII因子の半減期を増大させる方法を提供し、さらに、レセプター関連蛋白（RAP）を用いて第VIII因子の半減期を増大させる方法を提供する。
第VIII因子突然変異体：A2ドメイン
【００７３】
低下したレセプター依存性クリアランスおよび／または低下したレセプター非依存性クリアランスを持ち、そして／またはヒト第VIII因子に比して優れた凝固活性を有する組換え突然変異体第VIII因子は、血漿由来第VIII因子よりも製造が安価であり、且つ第VIII因子欠損の効果的治療に要する第VIII因子の量を減らすことができる。
【００７４】
本発明は、A2ドメインに少なくとも1個のアミノ酸置換を含む活性な組換え突然変異体第VIII因子分子またはそのフラグメント、それらをコードしているポリヌクレオチド、それらを製造および単離する方法、ならびにこれらの凝固および血漿クリアランス性を特性決定するための方法を提供するものである。
【００７５】
本発明者等は、循環からの第VIII因子クリアランスが二つの経路によって仲介されることを発見した。一方の経路  HSPG依存性レセプター非依存性クリアランス  はヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）を含んでいる。他方の経路  レセプター依存性クリアランス  は、HSPGおよび低密度リポ蛋白レセプター関連蛋白（LRP）を含んでいる。本発明は、A2ドメイン中の1またはそれ以上のアミノ酸を置換することでこれらの経路を介するクリアランスを低下させることにより、第VIII因子の半減期を増大させる方法を提供する。
【００７６】
HSPG依存性レセプター非依存性クリアランス。或る態様では、本発明は、第VIII因子A2ドメインの特定のアミノ酸を非同類アミノ酸で置換することによって第VIII因子の半減期を増大させる方法を提供する。別の態様では、ヒト第VIII因子を上回る増大した循環半減期を有する突然変異体第VIII因子およびそのフラグメント、ならびにそれをコードしているポリヌクレオチドを提供する。この増大した半減期は、第VIII因子のヘパリン硫酸プロテオグリカン（HSPG）依存性レセプター非依存性クリアランスの低下に起因する。実施例1に示すように、第VIII因子A2ドメイン中の特定アミノ酸がHSPG依存性クリアランス経路におけるHSPGと相互作用する。下記および実施例1に記載するように、これらのアミノ酸はA2ドメイン中の陽イオン性残基である。
【００７７】
本発明に係る第VIII因子突然変異体は、A2ドメインの陽イオン性残基に1またはそれ以上の非同類置換を有する突然変異体を包含する。したがって、本発明に係る第VIII因子突然変異体は、塩基性（陽イオン性）残基を非塩基性（陰イオン性）残基で置換した1またはそれ以上の置換をA2ドメイン内に有する突然変異体を包含する。
【００７８】
したがって、非同類A2アミノ酸置換が同類置換よりも好ましい。同類アミノ酸置換は、例えば別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換、別の疎水性アミノ酸による疎水性アミノ酸の置換、別の極性アミノ酸による極性アミノ酸の置換、または別の芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換を包含する。同類アミノ酸置換は当分野で周知である。
【００７９】
したがって、同類置換の一例は陽イオン性残基Argによる陽イオン性残基Lysの置換であり、一方好ましい非同類置換の例は、Asp、Glu、Tyr、Asn、Gln、Thr、Ser、Cys、Trp、Phe、Pro、Met、Val、Leu、Ile、Trp、GlyまたはAlaによるLysの置換である。好ましい非同類置換のさらなる例は、Asp、Glu、Tyr、Asn、Gln、Thr、Ser、Cys、Trp、Phe、Pro、Met、Val、Leu、Ile、Trp、GlyまたはAlaによるArgの置換である。
【００８０】
ドメインA2における好ましい非同類アミノ酸置換は、SerまたはGluによる陽イオン性残基LysまたはArgの置換である。本発明に係るさらなる好ましい非同類アミノ酸置換は、Leu、IleまたはValによるLysまたはArgの置換を包含する。本発明に係るさらなる好ましい非同類アミノ酸置換は、AspまたはGluによるLysまたはArgの置換である。本発明に係るさらなる好ましい非同類アミノ酸置換は、Ala、Ser、Thr、MetまたはGlyによるLysまたはArgの置換を包含する。
【００８１】
好ましい態様では、第VIII因子突然変異体は、Lys(380)、Arg(490)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、Arg(571)、および／またはLys(659)から選ばれる1またはそれ以上の位置に非同類アミノ酸置換を有する。好ましい態様ではこの非同類置換はLys(380)、Arg(490)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、および／またはLys(659)の位置にある。好ましい態様では、非同類置換はLys(380)、Arg(490)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、Lys(570)、および／またはLys(659)の位置にある。別の好ましい態様では、非同類置換はLys(380)、Arg(490)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、Arg(562)、および／またはLys(659)の位置にある。別の好ましい態様では、非同類置換はLys(380)、Arg(490)、Lys(512)、Lys(523)、Arg(527)、Lys(556)、および／またはLys(659)の位置にある。これら陽イオン性残基のいかなる組み合わせも非同類的に置換できる。
【００８２】
別の好ましい態様では、非同類置換はArg(490)および1またはそれ以上の上記位置にある。これら陽イオン性残基のいかなる組み合わせも非同類的に置換できる。
【００８３】
好ましい態様では、本発明は、558-565位またはこの近傍の陽イオン性残基における非同類置換を包含し、これはHSPG依存性レセプター非依存性クリアランスを低下させる。このような残基はLys(556)、Arg(562)、Lys(570)、および／またはArg(571)を包含する。この領域付近のさらなる残基はLys(523)およびArg(527)を包含する。これら陽イオン性残基のいかなる組み合わせも非同類的に置換できる。
【００８４】
好ましい態様では、これらの非同類置換はLRP依存性クリアランスのようなレセプター依存性クリアランスもまた低下させる。
【００８５】
レセプター依存性クリアランス。或る態様では本発明は、第VIII因子A2ドメイン中のアミノ酸を置換することによって第VIII因子の半減期を増大させる方法を提供する。別の態様では本発明は、ヒト第VIII因子を上回る増大した循環半減期を有する突然変異体第VIII因子およびそのフラグメント、ならびにそれをコードしているポリヌクレオチドを提供する。この態様では、この増大した循環半減期は第VIII因子のレセプター依存性クリアランスの低下に起因する。実施例3-4に示すように、第VIII因子A2ドメイン中のアミノ酸が血漿からのA2クリアランスと第VIII因子クリアランスを仲介する少なくとも１つのレセプターと相互作用する。
【００８６】
したがって本発明に係る第VIII因子突然変異体は、A2ドメイン内部に1またはそれ以上の置換を有する突然変異体を包含する。好ましい態様では、第VIII因子突然変異体は484から509までのうち1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を有する。この領域は以下の配列を包含する：NH2-ArgProLeuTyrSerArgArgLeuProLysGlyValLysHisLeuLysAspPheProIleLeuProGlyGluIlePhe-COOH。
【００８７】
別の好ましい態様では、第VIII因子突然変異体は484、489、490、493、496または499位のうち1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を有する。
【００８８】
特定位置のアミノ酸を19種類の他の天然に存在するアミノ酸のいずれかで置換する。本発明に係るA2アミノ酸置換は、第VIII因子とそのクリアランスレセプターの相互作用を阻害する置換である。したがって、同類置換よりも非同類A2アミノ酸置換が好ましい。同類アミノ酸置換は、例えば別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換、別の疎水性アミノ酸による疎水性アミノ酸の置換、別の極性アミノ酸による極性アミノ酸の置換、または別の芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換を包含する。同類アミノ酸置換は当分野で周知である。
【００８９】
したがって、同類置換の一例はArgによるLysの置換であり、一方好ましい非同類置換の例は、Asp、Glu、Tyr、Asn、Gln、Thr、Ser、Cys、Trp、Phe、Pro、Met、Val、Leu、Ile、Trp、GlyまたはAlaによるLysの置換である。
【００９０】
本発明に係る好ましいA2アミノ酸置換は、Leu、IleまたはValによるLysまたはArgの置換である。本発明に係るさらなる好ましいA2アミノ酸置換は、AspまたはGluによるLysまたはArgの置換である。本発明に係るさらなる好ましいアミノ酸置換は、Ala、Ser、Thr、MetまたはGlyによるLysまたはArgの置換である。
【００９１】
別の態様では、484-509の外側の位置、例えば480、481、482、483、510、511、512または513位にあるアミノ酸を置換する。これらの位置での好ましい置換は、例えばかさ高いまたは負に荷電したアミノ酸を導入して第VIII因子のレセプター依存性クリアランスを低下させる置換である。
第VIII因子蛋白およびポリヌクレオチド
【００９２】
A2ドメインに置換されたアミノ酸を有する活性な組換えヒト第VIII因子、それをコードしているポリヌクレオチド、ならびにその活性を産み出し、単離し、そして特性決定する方法が、例示的および好ましい態様として特に提供される。この突然変異体を製造する方法はまた、A2以外のドメインに置換されたアミノ酸を持つ活性組換え第VIII因子またはそのフラグメントの製造にも利用できる。当業者は、アミノ酸が置換されているその他の組換え突然変異体第VIII因子分子またはそのフラグメントを如何にして製造できるかという事をこれらの方法がさらに証明するという事が理解できるであろう。加えて、組換え法はCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel et al., eds. (1991); およびSambrook,J., et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manualに記載されている。
【００９３】
突然変異体第VIII因子は第VIII因子配列をコードしているヒトcDNA（Biogen,Inc.）から製造を開始する。好ましい態様では、このcDNAがコードしている第VIII因子はBドメイン全体を欠失するドメインA1-A2-A3-C1-C2を含んでおり、Wood et al., 312 Nature 330-337(1984)の番号付け系によれば一本鎖ヒト第VIII因子（配列番号2を参照されたい）のアミノ酸残基1-740および1649-2332に相当する。
【００９４】
Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel et al., Ids(1991)のSelden,R.F., “Introduction of DNA into mammalian cells”に記載のような確立された技術によって、突然変異体第VIII因子cDNAを、培養細胞で最終的に活性第VIII因子蛋白分子を発現させるために発現ベクター中にクローニングする。
【００９５】
好ましい態様では、突然変異体第VIII因子をコードしているcDNAを哺乳動物発現ベクター、例えばReNeoに挿入し、突然変異体第VIII因子組み立て物を作製する。この突然変異体cDNAを哺乳動物発現ベクター中に挿入し、COS-7細胞で該突然変異体蛋白を一時的に発現させることにより、突然変異体第VIII因子の予備的な特性決定を達成する。次いで、活性蛋白が発現されているかどうかの決定ができる。当分野で常套的な方法、例えばリポソーム仲介トランスフェクション（Lipofectin(登録商標)、Life Technologies,Inc.）を利用して、仔ハムスター腎細胞のような培養細胞を安定にトランスフェクトするため、さらにこの発現ベクター組み立て物を使用する。組換え突然変異体第VIII因子蛋白の発現は、例えば配列決定、ノーザンおよびウェスタンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって確認できる。蛋白を安定に発現しているトランスフェクトされた細胞が維持されている培地中の突然変異体第VIII因子蛋白を沈殿させ、ペレット化し、洗浄し、そして適当な緩衝液に再懸濁し、そしてこの突然変異体第VIII因子蛋白を、例えばモノクローナル抗A2セファロース(登録商標)を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーを包含する標準技術によって精製できる。
【００９６】
さらなる態様では、アミノ酸置換を含む突然変異体第VIII因子を組換え分子由来の融合蛋白として発現させるが、ここでは、例えば安定性、分泌、検出、単離などを増強する蛋白またはペプチドをコードしている配列を、第VIII因子コード配列と隣接する位置に挿入する。融合蛋白の製造において例えばプロモーター、オペレーター、およびレギュレーターを包含する、ホモローガスまたはヘテロローガス種の発現調節配列を使用するための確立されたプロトコルが知られており、当分野で常套的に使用されている（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F.M., et al., Ids, Wiley Interscience, N.Y.）。
【００９７】
熟練した実務家の好みと判断に応じて、真核生物細胞での組換え遺伝子組み立て物の発現に、プラスミドおよび真核生物ウイルスベクターの両者を包含するその他のベクターを使用できる（例えばSambrook et al., Chapter 16）。細菌、酵母、および昆虫細胞系を包含するその他のベクターおよび発現系も使用できるが、グリコシル化の相違または欠失のため好ましくない。
【００９８】
例えば無血漿第VIII因子検定、一段階凝固検定、および標準として精製組換えヒト第VIII因子を用いる酵素結合イムノソルベント検定を包含する標準検定によって、精製した突然変異体第VIII因子またはそのフラグメントを量および凝固活性について検定できる。
【００９９】
組換え突然変異体第VIII因子蛋白は、培養および組換え哺乳動物蛋白発現のために一般的に使用される様々な細胞で発現され得る。American Type Culture Collection, Manassas, VAから入手できる好ましいセルラインは仔ハムスター腎細胞であり、これを常套的な方法および培地を用いて培養する。
【０１００】
記載のようにA2ドメイン中の1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を有する任意の突然変異体第VIII因子組み立て物を、標準法によって凝固活性について検定し、そして本明細書に記載のように検定して、増大した凝固活性および／または低下したレセプター仲介クリアランスおよび／または低下したHSPG依存性クリアランスを持つ突然変異体第VIII因子分子を同定できる。ヒトまたはブタ第VIII因子に比して低下した凝固活性を有するのみならず低下したレセプター仲介クリアランスもしくは低下したHSPG依存性クリアランスを有する突然変異体分子もまた同定できる。当業者は、ヒトまたはブタ第VIII因子に比してより低い、等しい、またはより大きい凝固活性を持つ突然変異体第VIII因子分子もしくはそのフラグメントが、第VIII因子欠損を持つ患者の治療に有用であることが理解できるであろう。A2ドメインにアミノ酸置換を持つ活性組換え突然変異体第VIII因子を製造するための本明細書に記載の方法は、C2ドメインにアミノ酸置換を持つ活性組換え突然変異体第VIII因子蛋白またはそのフラグメントの製造に利用できる。
【０１０１】
これらの分子は上記のようにCOS-7細胞および仔ハムスター腎細胞で発現させることができる。これらは当分野で既知の方法、例えばヘパリン-セファロース(登録商標)および免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いて均質となるまで精製できる。蛋白濃度をA280での紫外光吸光度によって評価し、凝固活性（一段階凝固検定によりml当たりの単位で測定）をA280で除することにより組み立て物の比活性が決定できる。ヒト第VIII因子はおよそ3000-4000U/A280の比活性を持つが、ブタ第VIII因子はおよそ20000U/A280の比活性を持つ。好ましい態様では、凝固突然変異体第VIII因子は3000U/A280の比活性を持つ。突然変異体第VIII因子の比活性は1000-20000U/A280の範囲のどこかである。
【０１０２】
本明細書に記載のように、ヒト第VIII因子に比して増大した、等しい、または低下した（好ましくは増大した）凝固活性を持つ突然変異体蛋白の同定に位置指定突然変異誘発技術を使用する。オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発はKunkel,T.A., et al., Meth.Enzymol. 204:125-139(1991)に記載のように利用できる。
【０１０３】
本発明に係る突然変異体第VIII因子蛋白は第VIII因子の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を有していてよい。本発明に係る突然変異体第VIII因子分子は、A2ドメインとC2ドメインの両方にアミノ酸置換を持つといったように、1以上のドメインにアミノ酸置換を持っていてよい。
【０１０４】
本発明は、確立された且つ常套的な方法、例えばDNA配列決定、凝固活性検定、精製突然変異体第VIII因子のELISAおよび280nmでのUV吸光度による質量、凝固比活性（U/mg）、精製突然変異体第VIII因子のSDS-PAGE等によって、突然変異体第VIII因子のcDNAおよび蛋白を特性決定できるという事を意図している。臨床的な有効性を試験するために、その他の既知の方法、例えばアミノ酸、炭水化物、硫酸塩、または金属イオン分析が必要であるかも知れない。
第VIII因子突然変異体：C2ドメイン
【０１０５】
A2ドメインアミノ酸置換を有する突然変異体ヒト第VIII因子を製造する同じ方法を利用して、別の組換え突然変異体第VIII因子蛋白およびそのフラグメントならびにそれらをコードしているポリヌクレオチド、例えばC2ドメインにアミノ酸置換を有する突然変異体第VIII因子を製造できる。
【０１０６】
低下したまたは皆無のレセプター非依存性クリアランスを有する、C2ドメインにアミノ酸置換を持つ突然変異体ヒト第VIII因子分子が同定できる。より詳細には、この方法は、B(-)第VIII因子のC2ドメイン中のアミノ酸を置換する、A2ドメイン中のアミノ酸置換（アラニンスキャニング突然変異誘発、位置指定突然変異誘発などによる）；発現ベクター、例えばpBluescript中への挿入；培養細胞での発現；ならびに凝固活性およびレセプター非依存性クリアランスについての常套的検定に関して本明細書に記載した方法と同じまたは類似している。
【０１０７】
或る態様では本発明は、ヒト第VIII因子を上回る増大した循環半減期を有する突然変異体第VIII因子およびそのフラグメント、ならびにそれらをコードしているポリヌクレオチドを提供する。突然変異体第VIII因子の増大した循環半減期は第VIII因子のレセプター非依存性クリアランスの低下に起因する。
【０１０８】
C2ドメインはアミノ酸残基2173-2332より成る。この154アミノ酸領域内部で2303-2332位が燐脂質結合およびvWf結合の両方に関与している。第VIII因子アミノ酸2310-2320（ここで残基2310と2320は共有結合している）という合成ペプチドは燐脂質結合について第VIII因子と競合する。vWfに結合しない第V因子と第VIII因子の比較は、第VIII因子にユニークな2311-2319位内部の5個のアミノ酸を明らかにしている。いかなる理論にも拘束されるものではないが、これらのユニークな位置（Gln2311、Ser2312、Val2314、His2315およびGln2316）はレセプター非依存性クラアランスにとって重要であるが、vWf結合にとっては重大でない。
【０１０９】
したがって、本発明の或る態様は、C2ドメイン内の位置2173-2332のうち1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を有する突然変異体第VIII因子である。別の好ましい態様では、突然変異体第VIII因子はC2ドメイン内の位置2311-2319のうち1またはそれ以上の位置にアミノ酸置換を有する。
【０１１０】
特定位置のアミノ酸を、他の19種類の天然に存在するアミノ酸のいずれかで置換する。本発明に係るC2アミノ酸置換は、第VIII因子と燐脂質との相互作用を阻害する置換である。したがって、同類置換よりも非同類C2アミノ酸置換が好ましい。同類アミノ酸置換は、例えば別の酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換、別の塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換、別の疎水性アミノ酸による疎水性アミノ酸の置換、別の極性アミノ酸による極性アミノ酸の置換、または別の芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換を包含する。同類アミノ酸置換は当分野で周知である。
【０１１１】
したがって、同類置換の一例はIleまたはValによるLeuの置換であり、一方好ましい非同類置換の例は、Asp、Glu、Arg、Lys、His、Tyr、Asn、Gln、Thr、Ser、Cys、Trp、Phe、Pro、Met、Trp、GlyまたはAlaによるLeuの置換である。１つの好ましい置換はAlaである。
【０１１２】
本発明のさらなる態様は、第VIII因子のC2ドメイン突然変異体、単独またはRAPと組み合わせた第VIII因子のC2ドメイン突然変異体を含む薬学上許容し得る組成物、および第VIII因子のC2ドメイン突然変異体をコードしているポリヌクレオチドを投与することによって血友病を治療する方法を包含する。
【０１１３】
さらに、C2ドメインでのアミノ酸置換をA2ドメインでのアミノ酸置換と合して、増大した半減期を持つ突然変異体第VIII因子を製造できる。
レセプター関連蛋白（RAP）
【０１１４】
本発明の好ましい態様は、RAPを投与することにより第VIII因子の半減期を増大させる方法を目的とする。好ましくはRAPはLRPと結合し、より好ましくはこのRAPは天然に存在するRAPに比してLRPに対する増大した親和性を有する。
【０１１５】
本発明に係る別の好ましい態様では、RAPはフラグメント、突然変異体または類似体である。好ましくは、このRAPフラグメント、突然変異体または類似体はLRP結合活性を保持している。より好ましくは、このRAPフラグメント、突然変異体または類似体は天然に存在するRAPに比して増大したLRPに対する親和性を有する。
【０１１６】
或る態様では、RAPはLRP結合活性を有するフラグメントである。このようなRAPフラグメントは10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、250、300もしくは350またはそれ以上の連続したアミノ酸を含んでいてよい。
【０１１７】
或る態様では、RAPは図14のアミノ酸1ないし357を含む（完全長RAP；配列番号14のアミノ酸-19ないし323）。RAPは34アミノ酸長のシグナル配列を含む。したがって別の態様では、RAPは図4のアミノ酸35ないし357を含む（成熟RAP；配列番号4のアミノ酸1ないし323）。
【０１１８】
本発明の別の態様では、RAPはN末端もしくはC末端除去、またはNおよびC末端除去の組み合わせを含む。N末端除去はしばしば安定性の増大した蛋白をもたらす。したがって例えば、成熟RAPのN末端から1および50個の間のアミノ酸を除去することは、より安定なRAPの製造に役立つ。故に、本発明のさらなる態様は、例えば図14に示されるアミノ酸36-357、37-357、38-357、39-357、40-357、41-357、42-357、43-357、44-357、45-357、46-357、47-357、48-357、49-357、50-357、51-357、52-357、53-357、54-357、55-357、56-357、57-357、58-357、59-357、60-357、61-357、62-357、63-357、64-357、65-357、66-357、67-357、68-357、69-357、70-357、71-357、72-357、73-357、74-357、75-357、76-357、77-357、78-357、79-357、80-357、81-357、82-357、83-357、84-357および85-357（配列番号4の1-323、2-323、3-323、4-323、5-323、6-323、7-323、8-323、9-323、10-323、11-323、12-323、13-323、14-323、15-323、16-323、17-323、18-323、19-323、20-323、21-323、22-323、23-323、24-323、25-323、26-323、27-323、28-323、29-323、30-323、31-323、32-323、33-323、34-323、35-323、36-323、37-323、38-323、39-323、40-323、41-323、42-323、43-323、44-323、45-323、46-323、47-323、48-323、49-323および50-323の位置）を含むRAPを包含する。
【０１１９】
LDLレセプター結合ドメインは図14のアミノ酸237ないし353を包含する（配列番号4のアミノ酸203ないし319）。したがって本発明の好ましい態様は、アミノ酸237ないし353を含むRAPである（配列番号4のアミノ酸203ないし319）。
【０１２０】
本発明の別の態様はRAPをコードしているポリヌクレオチドである。
【０１２１】
本発明の別の態様では、血友病を治療するために、RAPまたはRAPをコードしているポリヌクレオチドを単独または第VIII因子突然変異体と組み合わせて使用する。
【０１２２】
本発明のさらなる態様は、RAPを単独でまたは1もしくはそれ以上の第VIII因子突然変異体と組み合わせて含む薬学上許容し得る組成物を包含する。
薬学上許容し得る組成物
【０１２３】
突然変異体第VIII因子および／またはRAPを単独または適当な薬用安定化化合物、デリバリー媒質、および／または担体媒質と組み合わせて含む薬学上許容し得る組成物が、E.W.MartinのRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載のような既知の方法に従って製造される。
【０１２４】
一つの好ましい態様では、静脈内注入にとって好ましい担体またはデリバリー媒質は生理食塩水または燐酸緩衝化食塩水である。
【０１２５】
別の好ましい態様では、適当な安定化化合物、デリバリー媒質、および担体媒質は、アルブミンのようなその他のヒトまたは動物の蛋白を包含するがこれに限定される訳ではない。
【０１２６】
燐脂質小胞またはリポソーム懸濁液もまた薬学上許容し得る担体またはデリバリー媒質として好ましい。これらは当業者の知悉する方法に従って製造でき、例えばホスファチジルセリン／ホスファチジルコリンもしくはその他の燐脂質の組成物または共同して表面に負の電荷を付与する洗浄剤を含み得るが、それは、第VIII因子が負に荷電した燐脂質膜と結合するためである。リポソームは、適当な脂質（例えばステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロール）を無機溶媒に溶解し、次いでこれを蒸発させて容器表面に乾燥した脂質の薄膜を残すことによって製造できる。次に突然変異体第VIII因子および／またはRAPの水溶液をこの容器に導入する。次いでこの容器を手でぐるぐる回し、脂質物質を容器の側面から遊離させ、脂質凝集物を分散させ、それによりリポソーム懸濁液を生成させる。
【０１２７】
突然変異体第VIII因子および／またはRAPを、ビタミンK依存性凝固因子、組織因子、およびフォン・ヴィルブラント因子（vWf）または第VIII因子結合部位を含むvWfのフラグメントを包含する他の適当な安定化化合物、デリバリー媒質、および／または担体媒質、ならびに蔗糖のような多糖類と合することができる。
【０１２８】
突然変異体第VIII因子はこの突然変異体分子の貯蔵寿命を増大させるためvWfと結合させて保存できる。加えて、第VIII因子の凍結乾燥はvWf存在下での活性分子の収率を改善し得る。凍結乾燥はまたRAPの収率も改善する。商業的供給者が使用するヒトおよび動物第VIII因子の現行の保存方法を突然変異体第VIII因子またはRAPの保存に利用することができる。これらの方法は、(1) 部分精製状態での第VIII因子の凍結乾燥（さらなる精製を行わずに注入される第VIII因子「濃縮物」として）；(2) Zimmerman法による第VIII因子の免疫アフィニティー精製と、第VIII因子を安定化するアルブミン存在下での凍結乾燥；(3) アルブミン存在下での組換え第VIII因子の凍結乾燥を、包含する。
【０１２９】
加えて、第VIII因子は0.6M NaCl、20mM MES、および5mM CaCl2（pH6.0）中4℃で無期限に安定であり、さらにこれらの緩衝液中で凍結保存し最小限の活性の喪失と共に融解することができる。
治療の方法
【０１３０】
突然変異体第VIII因子および／またはRAPは、阻害抗体を持つまたは持たない血友病患者、および阻害抗体の生成を原因とする後天性第VIII因子欠損患者において、第VIII因子欠損に起因する制御不能の出血（例えば関節内、頭蓋内、または胃腸管出血）を治療するのに使用される。活性物質は好ましくは静脈内投与する。
【０１３１】
第VIII因子は古典的には、血友病Aの個体から誘導される血漿中の凝固異常を是正する、正常血漿中に存在する物質として定義されている。精製されたおよび部分精製された形態の第VIII因子のインビトロ凝固活性が人間患者における注入のための第VIII因子の用量算出に使用され、これは患者血漿から回収される活性とインビボ出血異常の是正との信頼し得る指標である。Lusher,J.M., et al., New Engl.J.Med. 328:453-459(1993); Pittman,D.D., et al., Blood 79:389-397(1992)、およびBrinkhous et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 82:8752-8755(1985)によれば、新規な第VIII因子分子のインビトロ標準検定と、イヌ注入モデルまたは人間患者におけるその作用との間に不一致は報告されていない。
【０１３２】
通常、突然変異体第VIII因子の投与によって患者で達成されるべき所望の血漿中第VIII因子レベルは、正常値の30-100%の範囲である。突然変異体第VIII因子の好ましい投与法では、この組成物を、約5から50単位/kg(体重)までの範囲の好ましい用量、より好ましくは10-50単位/kg(体重)の範囲、そして最も好ましくは20-40単位/kg(体重)の用量で静脈内投与し；間隔の頻度は約8から24時間までの範囲（重篤な血友病患者において）であり；そして治療の持続日数は1から10日間までの範囲、または出血エピソードが解消するまでである。例えば、Roberts,H.R., and M.R.Jones, “Hemophilia and Related Conditions  Congenital Deficiencies of Prothrombin(Factor II, Factor V, and Factors VII to XII),” Ch.153, 1453-1474, 1460, in Hematology, Williams,W.J., et al., ed.(1990)を参照されたい。
【０１３３】
有効量のRAPの投与は患者の血液に上記と同等レベルの第VIII因子を生ずる。インヒビターを持つ患者はより多くの突然変異体第VIII因子を必要とするかも知れず、また、ヒト第VIII因子より高い比活性の故に、または増大した血漿半減期の故に、患者がより少ない突然変異体第VIII因子しか必要としないかも知れない。同様に、LRPまたはその他の第VIII因子クリアランスレセプターに対するRAPの結合親和性に応じて、または循環血液中での安定性に応じて、患者はより多くのまたはより少ないRAPを必要とするかも知れない。ヒトまたはブタ第VIII因子での治療の場合と同様に、注入される突然変異体第VIII因子またはRAPの量を一段階第VIII因子凝固検定により決定し、そして選ばれた例では、注入後の患者血漿中の第VIII因子を測定することによりインビボ回復を決定する。どの特定患者についても、個体の必要性と、該組成物を投与するまたはその投与を監督する人物の専門的判断に従って、具体的な投与計画が経時的に調節されるべきである事、そして、本明細書に開示する濃度範囲は例示に過ぎず、特許請求された組成物の範囲または実施を制限すると解してはならないという事を理解せねばならない。
投与
【０１３４】
好ましい態様では、突然変異体第VIII因子またはRAPの薬学上許容し得る組成物を、単独で、または安定剤、デリバリー媒質、および／または担体と組み合わせて、ヒトまたは動物の第VIII因子の注入に用いられるのと同じ方法に従い、患者に静脈内注入する。
【０１３５】
係る治療を必要とする患者に投与されねばならない突然変異体第VIII因子またはRAPの治療用量は、第VIII因子欠損の重篤度に応じて変わる。一般に、用量レベルはそれぞれの患者の出血エピソードの重篤度および持続時間と調和させて、頻度、期間、および単位を調節する。したがって、突然変異体第VIII因子またはRAPは、標準凝固検定で測定した時に出血を停止させる治療的有効量の突然変異体を患者にデリバリーするのに充分な量で、薬学上許容し得る担体、デリバリー媒質、または安定剤に含有させる。
【０１３６】
治療は、必要に応じて該組成物の1回の静脈内投与、または、長期間にわたる周期的もしくは連続的投与の形をとることができる。これに代わり突然変異体第VIII因子またはRAPは、様々な時間間隔で1または数回の用量をリポソームを用いて皮下または経口投与できる。突然変異体第VIII因子またはRAPは、ヒト第VIII因子に対する抗体を生成した血友病患者において第VIII因子欠損に起因する制御不能の出血を治療するために使用できる。
【０１３７】
持続放出製剤の好適な例は、該蛋白を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを包含し、このマトリックスは、成型された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル類、水素類、例えばLanger et al., J.Biomed.Mater.Res. 15:167-277(1981)およびLanger, Chem.Tech. 12:98-105(1982)に記載のポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド（米国特許第3773919、EP58481）、L-グルタミン酸とガンマ エチル-L-グルタミン酸のコポリマー（Sidman et al., Biopolymers 22:547-556(19831))、非分解性エチレン-ビニルアセテート（Langer et al.、上記）、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot(登録商標)（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドより成る注射用ミクロスフェア）、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP133988）を包含する。エチレン-ビニル酢酸および乳酸-グリコール酸のようなポリマーは100日間にわたって分子を放出できるが、或る種のヒドロゲルはより短い期間蛋白を放出する。カプセル化された蛋白が長時間体内にとどまる時、37℃で水分に暴露される結果これらが変性または凝集し、生物活性の喪失およびことによると免疫原性の変化を生ずるかも知れない。関わっている機構に応じて、蛋白安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間S-S結合形成であることが判明したならば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分の調節、適当な添加剤の使用、および特別なポリマーマトリックス組成物の開発により、安定化を達成できる。
【０１３８】
持続放出血液因子組成物はさらに、リポソームに捕捉された血液因子または抗体を包含する。特許請求されている血液因子または抗体を含有するリポソームは自体既知の方法：DE3218121；Epstein et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82:3688-3692(1985)；Hwang et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77:4030-4034(1980)；EP52322；EP36676；EP88046
；EP143949；EP142641；日本国特許出願83-118008；米国特許第4485045および4544545号；およびEP102324により製造する。通常、リポソームは小さな（約200-800オングストローム）単ラメラ型であり、選択される比率は最適な血液因子療法のために調節する。増大した循環時間を有するリポソームが米国特許第5013556号に開示されている。加えて、Giles,A.R., et al., Brit.J.Hematol. 69:491-497(1988)はホスファチジルコリン-ホスファチジルセリン小胞中に入れた因子の製剤を記載している。
【０１３９】
さらに、突然変異体第VIII因子またはRAPは、下記のように、該蛋白を産生するよう遺伝子操作した細胞の移植によって、または係る細胞を含有する装置の埋め込みによって投与できる。
遺伝子療法
【０１４０】
しばしば「遺伝子療法」と呼ばれる治療様式において突然変異体第VIII因子またはRAPをインビボ発現させることにより、突然変異体第VIII因子またはRAPをコードしているポリヌクレオチドを本発明に従って使用することができる。
【０１４１】
突然変異体第VIII因子またはRAPは、ヒト第VIII因子のデリバリーと同じ方法で、レトロウイルスベクターのようなデリバリー手段を用いて、遺伝子療法によりデリバリーすることもできる。この方法は、ヒト細胞中に第VIII因子cDNAを取り込ませることから成り、その第VIII因子cDNAは、第VIII因子欠損患者に直接移植されるか、または、第VIII因子分子に対して透過性であるが細胞に対して非透過性である埋め込み可能な装置に入れ、次いで移植する。好ましい方法はレトロウイルス仲介遺伝子転移である。この方法では、外因性遺伝子（例えば第VIII因子cDNA）を、修飾されたレトロウイルスのゲノム中にクローニングする。この遺伝子/cDNAを、ウイルス機構によって宿主細胞のゲノム中に挿入し、そこでこの細胞によってこれが発現される。レトロウイルスベクターは、宿主のウイルス感染を防止してウイルスを産生しないように修飾する。この型の治療の一般原理は当業者に知られており、文献に総説がある（例えばKohn,D.B., and P.W.Kantoff, Transfusion 29:812-820(1989))。
【０１４２】
したがって、例えば患者由来の細胞をポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、例えばDNAまたはRNAを用いてex vivoで操作し、次いでこの操作した細胞を該ポリペプチドで治療しようとする患者に提供できる。例えば、本発明に係るポリペプチドをコードしているRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、細胞をex vivoで操作することができる。このような方法は当業者によく知られており、本発明におけるこれらの使用は本明細書の教示から明らかである。
【０１４３】
同様に、当分野で既知の方法により、ポリペプチドのインビボ発現のために細胞をインビボで操作することができる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドを、上記のように、複製不全レトロウイルスベクター中で発現するように操作できる。次にこのレトロウイルス発現組み立て物を単離し、パッケージング細胞中に導入し、これを本発明に係るポリペプチドをコードしているRNAを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入することができるが、その結果、このパッケージング細胞が、目的遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生するようになる。このプロデューサー細胞を、インビボでの細胞の操作およびインビボでの該ポリペプチドの発現のために患者に投与できる。このような方法により本発明に係るポリペプチドを投与するためのこれらのおよびその他の方法は、本発明の教示から、当業者にとって明らかであるに相違ない。
【０１４４】
本明細書で上に述べたレトロウイルスプラスミドベクターが誘導できるレトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーヴェイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するがこれらに限定される訳ではない。或る態様では、レトロウイルスプラスミドベクターをモロニーマウス白血病ウイルスから誘導する。
【０１４５】
このようなベクターは該ポリペプチドを発現するための1またはそれ以上のプロモーターを含むであろう。使用できる好適なプロモーターは、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびMiller et al., Biotechniques 7:980-990(1989)に記載のヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、またはその他のプロモーター（例えば、ヒストン、RNAポリメラーゼIII、およびβ-アクチンプロモーターを包含する（但しこれらに限定されない）真核生物細胞プロモーターのような細胞プロモーター）を包含する。使用できるその他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターを包含するがこれらに限定される訳ではない。適切なプロモーターの選択は本明細書に記載の教示から当業者には明らかであろう。
【０１４６】
レトロウイスルプラスミドベクターを使用してパッケージングセルラインを形質導入しプロデューサーセルラインを形成させる。トランスフェクトできるパッケージングセルラインの例は、PE501、PA317、Y-2、Y-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、YCRE、YCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、およびMiller,A., Human Gene Therapy 1:5-14(1990)に記載のDANセルラインを包含するがこれらに限定される訳ではない。このベクターは当分野で既知の任意の手段によってパッケージングセルライン中に形質導入できる。このような手段は、電気穿孔、リポソームの使用、およびCaPO4沈殿を包含するがこれらに限定されない。１つの代替法として、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソーム中にカプセル化し、または脂質とカップリングさせ、次いで宿主に投与できる。
【０１４７】
プロデューサーセルラインは感染性レトロウイルスベクター粒子を作り出すが、これは該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含んでいる。次にこのようなレトロウイルスベクター粒子をインビトロまたはインビボのいずれかで真核生物細胞への形質導入に利用できる。形質導入された真核生物細胞は該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを発現するであろう。形質導入され得る真核生物細胞は、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血性幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含するがこれらに限定されない。
【０１４８】
以下の実施例は例示であるに過ぎず、付記した請求項によって定義した本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の方法に様々な修飾および変化を施せることが当業者には明らかであろう。したがって本発明は、付記した請求項およびそれらの等価物の範囲内にある限り、本発明の修飾および変形を包含することを意図している。
【０１４９】
本明細書で言及する全ての特許、刊行物および一般に入手可能な配列は引用により特に本発明の一部とする。
【実施例１】
【０１５０】
本発明者等は、細胞培養およびインビボでfVIIIがvWfとの複合体から異化されるという事、そしてこのプロセスが低密度リポ蛋白レセプター関連蛋白（LRP）により仲介されるという事を示した（実施例2-4; Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))。低密度リポ蛋白（LDL）レセプターファミリーの一員であるLRP（Neels,J.G., et al., Fibrinol.Proteol. 12:219-240(1998))は、リポ蛋白レムナント、セリンプロテイナーゼおよびそれらのインヒビター（セルピン）との複合体の血漿クリアランスを担っている（Neels,J.G., et al., Fibrinol.Proteol. 12:219-240(1998)；Strickland,D.K., et al., FASEB J. 9:890-898(1995))。LRPは肝臓の肝細胞および血管系に顕著であり、平滑筋細胞、線維芽細胞およびマクロファージの表面に存在する（Moestrup,S.K., et al., Cell Tissue Res. 269:375-382(1992))。fVIIIに加えて、LRPは血液凝固およびフィブリン溶解に関わる幾つかの蛋白、例えば第IXa因子（Lenting,P., et al., Blood 94:455a(1999))および第Xa因子（Narita M., et al., Blood 91:555-560(1998); Kamikubo,Y., et al., Thromb.Res. 83:161-173(1996))、プラスミノーゲンアクティベーターおよびそれらのプラスミノーゲンアクティベーターインヒビターとの複合体（Warshawsky,I., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91:6664-6668(1994); Herz,J., et al., Cell 71:411-421(1992); Orth,K., et al., J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89:7422-7426(1992))のクリアランスを仲介する。高い親和性（Kd=4nM）でLRPと結合し既知の全LRPリガンドの結合とエンドサイトーシスを有効に阻害する39kDaレセプター関連蛋白（RAP）は、LRPとそのリガンドの相互作用を研究するための有用な手段である（Williams,S.E., et al., J.Biol.Chem. 267:9035-9040(1992))。
【０１５１】
LRPとの相互作用に関わるfVIIIの部位はA2ドメインの残基484-509（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))およびC2ドメインのC末端部分（Lenting,P., et al., J Biol.Chem. 274:23734-23739(1999))に位置する。fVIIIの後者の領域はC2ドメインに結合したvWf分子によりブロックされると思われることから（Lenting,P., et al., J Biol.Chem. 274:23734-23739(1999); Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 269:11601-11605(1994))、C2部位はvWfが無い時にのみfVIIIのクリアランスに寄与しているのかも知れない。この事はvWf欠損患者および動物においてfVIIIのクリアランスがより早いと報告されている事と矛盾せず（Lethagen,S., et al., Ann.Hematol. 65:253-259(1992); Fijnvandraat,K., et al., Thromb.Haemost. 77:298-302(1997); Over,J., et al., J.Clin.Invest. 62:223-234(1978))、これはLRPにより仲介されていることが示されている（Shwarz,H.P., et al., Blood 95:1703-1708(2000))。
【０１５２】
多くの蛋白について、細胞外マトリックスを構成する成分の１つである細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）によりLRP仲介エンドサイトーシスが促進される。細胞表面HSPGの一般機能の１つは蛋白と細胞の初期結合をさせ、そのようにしてその蛋白がそれらの特異的レセプターと相互作用する速度を増大させることであると現在考えられている（Lander,A.D., Matrix Biology 17:465-472(1998))。HSPGに結合するLRPのリガンドには、リポ蛋白リパーゼ（Chappell,D.A., et al., J.Biol.Chem. 268:14168-14175(1993))、アポE-含有リポ蛋白（Ji,Z.S., et al., J.Biol.Chem. 269:2764-2772(1994); Mahley,R.W. and Ji,Z.S., J.Lipid.Res. 40:1-16(1999))、トロンボスポンジン（Mikhailenko,L., et al., J.Biol.Chem. 270:9543-9549(1995))、トロンビン-プロテアーゼ ネキシン1複合体（Knauer,M.F., et al., J.Biol.Chem. 274:275-281(1999))および組織因子経路インヒビター（TFPI)(Warshawsky,I., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91:6664-6668(1994); Warshawsky,I., et al., J.Biol.Chem. 271:25873-25879(1996))がある。これらのリガンドの幾つかについては、HSPGがLRPのコ-レセプターとして働き、初期細胞表面結合とその後のLRPの提示をさせる（Strickland,D.K., et al., FASEB J. 9:890-898(1995); Mahley,R.W. and Ji,Z.S., J.Lipid.Res. 40:1-16(1999))。他のリガンドについては、HSPG自身がLRPとは独立して作用する異化レセプターとして機能する（Mikaelsson,M., et al., Thromb.Haemost. 69:1210(1993))。注目すべき事には、HSPGと相互作用するLRPは全て、HSPG分子の炭水化物部分と構造的に類似するヘパリンとも結合できる（Crisp,R.J., et al., J.Biol.Chem. 275:19628-19637(2000))。
【０１５３】
LRPとfVIIIの相互作用について報告されたKd（116nM（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999)))はfVIIIの正常な血漿中濃度（〜1nM（Wion,K., et al., Nature 317:726-730(1985)))よりはるかに高く、LRPに対する血漿fVIII/vWf複合体の直接結合が無視できる事、そしてこのプロセスには他のレセプターが関わっているかも知れない事を示している。この実施例では、ヘパリンと相互作用するfVIIIの能力に基づき、fVIII/vWf複合体の結合と異化における細胞表面HSPGの参加を研究した（Barrow,R.T., et al., J.Biol.Chem. 269:593-598(1994))。本発明者等は、HSPGが実際に様々なLRP発現細胞の表面へのfVIII/vWf複合体の初期結合を担っており、細胞培養とインビボの両方でfVIII異化を促進することを証明した。本発明者等は、fVIII/vWf複合体のfVIII部分を介して結合が起こることを示し、そしてfVIIIの主要なヘパリン結合部位をそのA2ドメインに位置決定した。
実験方法
【０１５４】
試薬。ヘパリン（平均分子量17-19kDa）とビオチニル化ヘパリンはそれぞれSigmaおよびCelsus Laboratories Inc.から購入した。ヒト凝固因子IXa、XおよびXa（Enzyme Research Laboratories）およびへパリナーゼI（Sigma）は表示の売り主から入手した。活性部位蛍光標識化第IXa因子（F1-FFR-fIXa）はPhilip Fay博士から入手した。抗A2 mAb 8860はBaxter/Hyland Healthcare Inc.によって供給された。ウサギポリクローナル抗LRP抗体Rab 2629はDudley Strickland博士により提供された。ホスファチジルセリン（PS）およびホスファチジルコリン（PC）はSigmaから入手した。25%PSおよび75%PCを含有する燐脂質小胞はかつて記載されたように調製した（Barenholz,Y., et al., Biochemistry 16:2806-2810(1977))。合成ペプチドは9-フルオレンメトキシカルボニル法およびペンタフルオロエステル活性化化学により9050 Milligen合成機（Millipore）を用いて合成し、C18カラム（Waters）を用いる逆相HPLCにより0.1%トリフルオロ酢酸中の0-70%アセトニトリルの勾配で精製した。2.2-3.5mM溶液のペプチドを、1kDaカットオフの膜（Pierce）を用いて20mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl（HBS）に対して透析した。
【０１５５】
蛋白。方法M、American Red Cross（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 271:27424-27431(1996))によって治療用濃厚液からfVIIIを精製した。fVIIIのHChおよびLChをかつて記載されたように調製した（Saenko,E.L. and Scandella,D., J.Biol.Chem. 272:18007-18014(1997))。A1およびA2サブユニットをMono Sカラム（Amersham Pharmacia Biotech）上のイオン交換クロマトグラフィーを用いてトロンビン活性化されたfVIIIから取得した(Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))。
【０１５６】
fVIIIおよびそのA2サブユニットの放射標識化。標識化の前にfVIIIおよびA2を、5mM硝酸カルシウムを含有する0.2M酢酸ナトリウム（pH6.8）中に透析した。上の緩衝液30μlに入れたfVIII 5μgを、Na125I 5μl（100mCi/ml、Amersham Pharmacia Biotech）および0.03%H2O2 5μl（Mallincrodt）を含有するラクトペルオキシダーゼビーズ（Worthington Biochemical Corp.）に加え、室温で4分間インキュベートした。PD10カラム（Amersham Pharmacia Biotech）上のクロマトグラフィーにより未反応のNa125Iを除去した。125I標識化fVIIIおよびA2の比放射能は3-6μCi/μg(蛋白）であった。一段階凝固検定（Lollar,P., et al., Methods Enzymol. 222:128-143(1993))で決定した125I-fVIIIの活性（3650単位/mg）は非標識化fVIIIの活性（3840単位/mg）と同様であった。
【０１５７】
リガンドの細胞仲介性表面結合、インターナライゼーションおよび分解のための検定。LRPを発現するマウス胚性線維芽細胞（MEF）および遺伝的にLRP生合成が欠損しているマウス胚性線維芽細胞（PEA13）をJoachim Herz博士（University of Texas Southwestern Medical Center、Dallas, TX）から入手し、記載のように維持した（Willnow,T.E. and Herz,J., J.Cell Sci. 107:719-726(1994))。かつて記載されたように（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))細胞を2x105細胞/ウェルまで増殖させた。ヒト平滑筋細胞（SMC)(ATCC寄託番号CRL1999）および肺胞上皮細胞（T2)(ATCC寄託番号CRL2078）をAmerican Tissue Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209から取得した。SMCとT2細胞を、それぞれ10%牛胎児血清（Gibco BRL）を含有するDMEMおよびLeibovitz L-15培地で105細胞/ウェルの最終密度まで増殖させた。125I-fVIIIまたは非標識化fVIIIとvWfとの複合体を、HBS、5mM CaCl2中1:50の蛋白比で25℃で30分間インキュベートすることによって製造した。複合体の形成を、かつて記載されたように（Saenko,E.L., et al., J.Biol.chem. 274:37685-37692(1999))ゲル濾過によって検証した。
【０１５８】
fVIII取り込みにおけるHSPGの寄与を評価するため、0.005IU/ml濃度のへパリナーゼ-I（Sigma）を含有する培地と共に細胞を37℃で30分間プレインキュベートし、引き続きHBS、0.1%BSAで細胞を3回洗浄した。表面結合、インターナライゼーションおよび分解検定を、かつて記載されたように実施した（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 270:9307-9312(1995))。幾つかの実験では、エンドサイトーシスを防止するため表面結合を4℃でのインキュベーションの後に決定した（Knauer,M.F., et al., J.Biol.Chem. 272:29039-29045(1997))。放射標識されたリガンドの表面結合は、記載のように（Chappell,D.A., et al., J.Biol.Chem. 267:25764-25767(1992))、トリプシン（50μg/ml）およびプロテイナーゼK（50μg/ml)(Sigma）で細胞を処理することにより放出される放射能の量として定義した。この処理は細胞表面に結合した放射性リガンドを放出することがかつて示された（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 270:9307-9312(1995))。よって細胞に付随する残存放射能はインターナライズされていると考えられた。分解は、10%トリクロロ酢酸に可溶性の培地における放射能として定義した。分解の値は、細胞を欠く並行ウェル中の分解産物の量を差し引くことによって非細胞仲介性分解について補正した。
【０１５９】
第Xa因子生成検定。記載のように（Fay,P.J., et al., J.Biol.Chem. 273:19049-19054(1998); Fay,P.J. and Scandella,D., J.Biol.Chem. 274:29826-29830(1999))fVIIIaの代わりにそのA2サブユニットを使用する精製系において、第Xa因子への第X因子の変換速度を測定した（Lollar,P., et al., Methods Enzymol. 222:128-143(1993))。A2サブユニット（200nM）を、HBS、5mM CaCl2、0.01% Tween 20および200μg/ml BSAに入れた異なる濃度のヘパリン（0-100μg/ml）と共に30分間プレインキュベートした。この後第IXa因子（5nM）およびホスファチジルセリンホスファチジルコリン（PSPC）小胞（10μM）を10分間加え、その後第X因子（300nM）を加えた。第Xa因子生成の初期速度を決定するため、10、20、30および45分においてアリコートを取り、0.05M EDTAで反応を停止させた。第Xa因子の生成を合成基質S-2765（Chromogenix, Sweden）の変換によって記載のように測定した（Fay,P.J. and Scandella,D., J.Biol.Chem. 274:29826-29830(1999))。
【０１６０】
蛍光異方性測定。fVIII A2サブユニットとF1-FFR-fIXaの相互作用の測定を記載のように実施した（Fay,P.J. and Scandella,D., J.Biol.Chem. 274:29826-29830(1999))。実験に先立ちA2をHBS、5mM CaCl2中25℃で異なる濃度のヘパリンと共に15分間インキュベートした。第X因子（400nM）の存在下または不在下にPSPC小胞（50μM）およびFI-FFR-fIXa（30nM）を添加した時点で異方性を0.2mlセル中で測定した。この測定はSLM 8000C分光蛍光計（SLM Instrument Inc.）を使用し励起波長495nmおよび発光波長524nmで実施した。データを各反応につき5回記録し平均した。
【０１６１】
表面プラスモン共鳴（SPR）を用いる動態測定。fVIIIおよびそのフラグメントとヘパリンとの相互作用の動態をBiacore 3000（Biacore, Sweden）を用いる表面プラスモン共鳴（SPR）技術によって測定した。HBS、5mM CaCl2、0.05% Tween 20中、ビオチニル化ヘパリンを〜300共鳴単位（RU）のレベルでバイオセンサーSAチップ上に固定化した。fVIIIとそのフラグメントの結合を同緩衝液中10μl/分の流速で測定した。リガンド溶液を緩衝液に交換してリガンドの解離を測定した。チップ表面は1M NaCl、0.05% Tween 20で洗浄することにより再生した。Biacore BIAevaluation 3.1ソフトウェアを用いて速度曲線から速度パラメータを誘導した。
【０１６２】
免疫蛍光顕微鏡検査。10%FBSを含有するDMEM中、ヒト肝細胞癌細胞HEP G2（ATCC寄託番号HB8065)(American Tissue Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209）をカバーグラス上で80%密集となるまで37℃6%CO2で増殖させた。無傷の細胞または上記のようにへパリナーゼで処理した細胞を0.5ml DMEM、1%BSA中10nMのfVIII/vWf複合体と共に4℃で2時間インキュベートした。細胞を燐酸緩衝化食塩水（PBS）で2回洗浄し、2%ホルムアルデヒド含有PBS中室温で15分間固定し、三重標識免疫蛍光染色によりfVIII、LRPおよびHSPGについて染色した。
【０１６３】
マウス抗fVIII mAb 8860（A2サブユニット内部のエピトープ）、ビオチニル化抗マウス抗体およびテキサスレッドコンジュゲート化アビジンD（2.5μg/ml）と共に順次インキュベートすることにより、fVIIIについての染色を実施した。LRPについての染色は、ウサギポリクローナル抗LRP抗体Rab2629、ビオチニル化抗ウサギIgGおよびフルオレセインアビジンDCS（2.5μg/ml）と共に順次インキュベートすることにより実施した。HSPGについての染色は、マウスモノクローナル抗ヘパラン硫酸抗体10E4（Seikagaku Corporation）、ビオチニル化抗マウスIgGおよびAMCAアビジンD（5μg/ml）と共に順次インキュベートすることにより実施した。一次抗体を5μg/ml加え、細胞試料と共に25℃で1時間インキュベートした。二次ビオチニル化抗体および蛍光試薬はVector,Inc.から購入し、供給されたプロトコルに従って使用した。各蛍光プローブで染色した後アビジン／ビオチンブロッキングキット（Vector）を適用した。一次抗体の代わりに正常なマウスまたはウサギ免疫グロブリンを使用する対照実験で、染色の特異性を決定した。
【０１６４】
顕微鏡検査のため、三重染色した細胞を伴うカバーグラスをProLong Antifadeマウンティング媒質（Molecular Probes,Inc.）を用いてスライド上にマウントした。選択的蛍光フィルターブロックおよびデジタルSPOT RTカメラ（Diagnostic Instruments,Inc.）のセットを装備したEclipse E800顕微鏡（Nikon）を用いて画像を取得した。SPOT Advanced Program Modeを用いて単一色素画像を統合することにより、fVIII、LRPおよびHPGの同時視覚化を行った。
【０１６５】
マウスにおける125I-fVIII/vWf複合体のクリアランス。実験に先立ち、125I-fVIII、vWf、およびRAPをHBS、5mM CaCl2緩衝液で透析した。上の緩衝液に入れた、0.2mMプロタミンまたは150μM RAPのいずれかを単独で100μl、または0.2mMプロタミンおよび150μM RAPを合した100μlを、BALB/cマウス（12-14週齢、体重20-24g）の尾静脈に注射した。2分間の間隔をおいて、125I-fVIII（15nM）およびvWf（750nM）から生成させた125I-fVIII/vWf複合体100μlの試料をマウスに注射した。対照実験においては125I-fVIII/vWf複合体をプロタミンとRAPの不在下に注射した。選ばれた時間間隔で（1、5、10、15、30、60、120、240、360および480分）35-40μlの血液試料を眼窩後方の穿刺により各マウスから0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)15μl中に採取した。試料の放射能を測定し採取した血液容量について標準化した。循環中に残存する125I-fVIIIの百分率を、注射の1分後に採取したアリコートの放射能を100%と仮定して算出した。上の条件のそれぞれの時間経過を4匹のマウスで調べ、平均した。循環からの125I-fVIIIクリアランスの動態を、本文に記載のように過去に使用された二重指数モデル（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))に対して、Sigmaplot 3.0コンピュータープログラム（Jandel Scientific）を用いて適合させた。
結果
【０１６６】
HSPGはLRP発現細胞に対するfVHIII/vWf複合体の初期結合を招く一次レセプターである。本発明者等はかつて、LRP発現細胞による、vWfとの複合体からのfVIIIのエンドサイトーシスと分解を、RAPが阻害し、それは、LRPがfVIIIの異化に関与している事を示しているという事を証明した（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))。LRPが細胞表面への125I-fVIII/vWf複合体の初期結合に参加しているかどうかを解明するため、本発明者等はこの結合がRAPによって阻害されるかどうかを試験した。図1Aで分かるように、RAPの存在は125I-fVIII/vWf複合体の表面結合を著明に低下させず、この複合体がLRPを介してではなく他の何らかのレセプターを介して細胞表面に結合することを示唆した。次に本発明者等は、HSPGがfVIII/vWf複合体の初期結合の原因であるかどうかを、HSPGとそれらのリガンドの相互作用を阻害することが分かっているヘパリンまたはへパリナーゼの効果を試験することによって調べた。図1Aから分かるように、両物質は細胞表面結合を著明に低下させ、HSPGが細胞へのfVIII/vWf複合体の初期結合の原因である主たる表面レセプターであることを示した。fVIII/vWfの表面結合におけるHSPGの役割と一致して、fVIIIの分解は、細胞のへパリナーゼ処理によって、非処置細胞へのRAPの添加による分解と殆ど同程度低下した（図1B）。へパリナーゼ処置された細胞へのRAPの添加は分解を>95%阻害し、LRPとHSPGがこの細胞モデルにおけるfVIII異化に相乗的に関わっていることを示した。
【０１６７】
注目すべき事に、LRP欠損PEA13細胞もまたLRP発現細胞の〜25%レベルでfVIIIを分解し（図1B）、LRPにより仲介されないfVIII異化の代替経路の存在を示した。この経路がヘパリンまたはへパリナーゼによって著明に阻害された（図1B）ことから、HSPGはfVIII分解のLRP仲介経路のみならずLRP非依存性経路にも必要である。
【０１６８】
HSPGとの結合に関わる主たるfVIII部位はそのA2ドメイン内部に位置する。LRPとの相互作用の原因であるfVIII部位はfVIIIのA2ドメイン内部に位置する（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))のであるから、LRPを発現する細胞は単離されたA2ドメインと結合しこれを異化すると予想される。事実、本発明者等は、MEF細胞が単離された125I-A2ドメインに結合しこれを分解することを見出した（図1CおよびD）。注目すべき事に、125I-A2の表面結合はヘパリンおよびへパリナーゼによって阻害されるがRAPによっては阻害されず（図1C）、この事は、fVIII/vWfについて見出されたのと同様、HSPGがA2の表面結合に関わっていることを示している。表面結合とは対照的に、LRP発現細胞における125I-A2の分解はRAPにより阻害され、A2ドメイン内部にLRP結合部位が存在することと矛盾しない（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))。A2の分解はヘパリンまたはへパリナーゼによっても阻害され、へパリナーゼとRAPの組み合わせは分解の殆ど完全な抑制を導いた（図1D）。単離されたA2ドメインの異化へのHSPGの関与は、これがHSPG結合部位を含むことを示している。
【０１６９】
A2のLRP仲介異化へのHSPGの関与がLRP発現細胞の一般的特徴であるかどうかを調べるため、本発明者等は、LRPおよびHSPGを発現する肺胞上皮細胞（T2）およびヒト平滑筋細胞（SMC）に対するA2の結合を試験した（Moestrup,S.K., et al., Cell Tissue Res. 269:375-382(1992))。SMCとT2の両者においてヘパリンとへパリナーゼは125I-A2の表面結合、インターナライゼーションおよび分解を著明に阻害した（図2A-2F）。へパリナーゼ処理した細胞へのRAPの添加は125I-A2結合に影響を及ぼさなかったが、インターナライゼーションと分解のさらなる低下を導いた。したがって、MEF、SMCおよびT2におけるA2異化に及ぼすへパリナーゼとRAPの効果は同等であり、これは、LRPとHSPGが異なるLRP発現細胞によるA2異化に同時に関わっていることを示している。
【０１７０】
次に本発明者等は、A2ドメインが完全に細胞表面HSPGへのfVIII/vWf複合体の結合の原因であるかどうかを調べた。これは、200倍モル過剰のfVIIIフラグメントおよびvWfがMEFおよびPEA13細胞と125I-fVIII/vWf複合体との表面結合に及ぼす効果を研究することにより実施した。図3から分かるように、A2は両細胞型への125I-fVIII/vWf複合体の結合を、へパリナーゼ処理された細胞で観察されるレベルまで阻害した。対照的に、A1/A3-C1-C2ヘテロ二量体およびvWfはいずれも125I-fVIII/vWf複合体の結合を阻害できなかった。この事は、vWfではなくfVIIIが細胞表面HSPGへのfVIII/vWf複合体の結合の原因であり、fVIIIの主たるHSPG結合部位がA2ドメイン内にあることを示すものである。
【０１７１】
A2ドメインとfVIII/vWf複合体は類似の親和性で細胞に結合する。主要なHSPG結合部位がA2内部に存在するという事は、細胞に対するA2とfVIII/vWfの結合親和性が類似しているに違いないという事を意味する。これを確認するためまず本発明者等は、MEF細胞に対する125I-A2の結合親和性を飽和結合実験で測定した。100倍過剰の非標識化A2存在下での非特異結合は、125I-A2総結合のおよそ18%であった。特異結合は、Kd 15±2.8nMを持つ単一クラスの結合部位（細胞当たり9.6x104部位）の存在を示すモデルによって適切に表現された。対照実験では、RAP（1μM）存在下で得られた125I-A2結合曲線（データは示していない）は、RAP不在下で得られたものと同一であった（図4A）。A2とfVIII/vWf複合体が同じ部位に結合することを確認するため、本発明者等は、非標識化A2またはfVIII/vWfによる125I-A2（1nM）の置換を行った。この検定では、A2とfVIII/vWfは、それぞれ18.3±3.2nMおよび23.5±2.7nMのKi値を有する相等しい競合物質であることが判明した（図4B）。Ki値の類似性は、HSPGへのfVIII/vWf複合体の結合がfVIIIのA2ドメインによって仲介されるという結論をさらに支持する。注目すべき事に、A2の結合性は125I標識化によって変化せず、これは、直接結合またはホモローガス置換を用いて得られるA2のKdおよびKiが類似しているためである。
【０１７２】
A2内部の主要部位およびLCh内部の重要性の低い部位がヘパリンとfVIIIの結合に関わっている。A2が、HSPGとfVIIIの相互作用の原因となる唯一の部位であるかどうかを調べるため、本発明者等は、HSPGの炭水化物部分のモデル分子として使用するヘパリンへのA2および他のfVIIIフラグメントの結合を試験した。本発明者等は、SPRに基づく検定において、fVIII、そのA2ドメイン、HCh（A2を含む）はヘパリンと結合できるがA1はできず、この事はヘパリン結合部位がA2内部にある事と矛盾しない事を発見した。意外なことにLChもまたヘパリンと結合でき、これがもう一つのfVIIIヘパリン結合部位を含むことを示した。この事と一致して、fVIII動態は、fVIII分子内に2個のヘパリン結合部位（Kdは28および630nM）の存在を示すモデルに最適に合致した。図5のデータから誘導したfVIIIとそのフラグメントについての速度パラメータを表1に示す。この表から分かるように、A2に存在する部位（部位1）はヘパリンについて高い親和性を持ち（Kd=28nM）、一方LChに存在する部位（部位2）は低い親和性を有する（Kd=630nM）。20倍低いLChの親和性は、ヘパリンまたはHSPGとfVIIIの結合へのLChの寄与が著明でないことを意味する。驚くべき事に、ヘパリンについてのfVIIIおよびA2の親和性（表1）は、細胞表面HSPGについてのfVIII/vWf複合体およびA2の親和性（それぞれ18および23nM）と似通っている。全体的に見て、これらのデータはHSPGとの結合の原因である主要fVIII部位がA2ドメイン内部にある事をさらに示している。
［表１］
ヘパリンとfVIIIおよびそのフラグメントの結合についての速度パラメータ
リガンド        kon(M-1s-1)            koff(s-1)            Kd(nM)        
fVIII         1.(1.4±0.034)x104    (3.91±0.4)x10-4      27.93±2.94
2.(8.24±0.12)x104    (5.38±0.7)x10-2      652.91±12.68
HCh           (1.32±0.038)x104     (3.1±0.22)x10-4      23.48±1.79
A2ドメイン    (1.63±0.053)x104     (4.2±0.16)x10-4      25.77±1.29
LCh           (7.84±0.156)x104     (4.48±0.06)x10-2     571±13.5      
表1。固定化されたヘパリンに対するfVIIIとそのフラグメントの結合および解離を図5に示すSPRに基づく実験で評価した。fVIIIについて得られた動態データを、fVIII分子内に2種類の独立したヘパリン結合部位が存在することを示唆するモデルを用いて最適に合致させた。この表では、これらの部位を1および2と称する。ヘパリンとのHCh、A2およびLChの相互作用は、各フラグメント内に1種類のヘパリン結合部位を想定するモデルを用いて最適化された。結合速度定数（kon）、解離速度定数（koff）および親和性（Kd=kon/koff）はBiacoreソフトウェアBIAevaluation 3.1を用いてSPRデータから誘導した。
【０１７３】
残基558-565によって表されるA2ドメインの領域はヘパリンへの結合に関与している。A2ドメインのヘパリン結合部位の位置決定は、ヘパリンがXアーゼ活性を阻害し（Barrow,R.T., et al., J.Biol.Chem. 269:593-598(1994); Barrow,R.T., et al., J.Biol.Chem. 269:26796-26800(1994))、fVIIIaがXアーゼ検定においてA2で置換され得る（Fay,P.J. and Scandella,D., J.Biol.Chem. 274:29826-29830(1999))という過去の発見によって開始された。本発明者等は、さらにヘパリンがA2依存性Xアーゼ検定で阻害性であることを発見した（図6A）。この効果は用量依存性であり、10μg/ml（〜600nM）のヘパリンで90%阻害が観察された。
【０１７４】
ヘパリンはXアーゼ複合体とその基質（第X因子）の相互作用を阻害しないことがかつて示されたので（Barrow,R.T., et al., J.Biol.Chem. 269:26796-26800(1994))、本発明者等はヘパリンは第IXa因子とA2の結合を妨げることによってXアーゼの集合を阻害すると提起した。この可能性を調べるため、本発明者等は、第IXa因子とA2の結合に及ぼすヘパリンの効果を蛍光異方性技術によって試験した。この実験は、活性部位修飾FI-FFR-fIXaの異方性がA2の結合時に中等度に増大し（Fay,P.J. and Scandella,D., J.Biol.Chem. 274:29826-29830(1990))、そしてこの効果が第X因子存在下ではより著しい（Fay,P.J., et al., J.Biol.Chem. 273:19049-19054(1998); Fay,P.J. and Scandella,D., J.Biol.Chem. 274:29836-29830(1999))という過去の観察に基づいていた。本発明者等はヘパリンが第Xa因子の存在下または不在下で異方性の増大を用量依存的に阻害することを見出した（図6B）。ヘパリンの最大効果は≧30μg/mlで観察され、これは因子Xアーゼ検定を完全に抑制する濃度に類似している（図6A）。A2不在下で実施した対照実験では、ヘパリンは第X因子の存在下でも不在下でもFI-FFR-fIXaの異方性に影響を及ぼさなかった。
【０１７５】
上の発見はヘパリンがA2サブユニットと第IXa因子の相互作用をブロックすることを示しており、これはヘパリンに対する、そして第IXa因子に対するA2ドメイン結合部位の重複によるものであるかも知れない。A2ドメイン内の2個の領域、484-509および558-565は第IXa因子との相互作用に直接関与していることが知られているため（Fay,P.J. and Scandella,D., J.Biol.Chem. 274:29826-29830(1999); Fay,P.J., et al., J.Biol.Chem. 269:20522-20527(1994))、本発明者等はヘパリンとA2の結合に及ぼすこれらのペプチドの効果を試験した。SPRに基づく実験において、ペプチド558-565は800μMで結合を78%阻害した（図7A）。対照的に、同じ濃度においてペプチド484-509は結合をおよそ25%阻害し、そしてペプチド417-428は効果が無かった。この事は、A2ドメイン領域558-565がヘパリンおよび細胞表面HSPGとfVIIIの結合に関わっていることを示している。
【０１７６】
細胞表面プロテオグリカンはfVIIIの異化にインビボで参加している。HSPGがfVIIIクリアランスにインビボで寄与しているかどうかを調べるため、fVIIIクリアランス研究を、HSPGがそのリガンドと相互作用することを妨げるプロタミン存在下でマウスにおいて実施した（Warshawsky,L., et al., J.Biol.Chem. 271:25873-25879(1996); Narita,M., et al., J.Biol.Chem. 270:24800-24804(1995))。図8に示したデータを過去に使用された二重指数モデルに当てはめたが（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))、これはfVIIIクリアランスの迅速相および遅延相の存在を示した。このモデルは以下の式：
C = C1e-k1t + C2e-k2t
［式中、Cは与えられた時刻に血漿中に残存している125I-fVIIIのパーセントであり、k1およびk2はfVIIIクリアランスの迅速相および遅延相に対応する速度定数であり、そしてC1およびC2はそれぞれクリアランスの迅速相および遅延相のあいだに除去された投与された放射能の百分率である］によって表される。定数k1、k2、C1およびC2の値はC対tを上の式に当てはめることにより各クリアランス曲線について誘導した。飽和濃度のRAPにおいて、クリアランスの迅速相の速度は劇的に低下し（表2）、fVIIIの半減期が過去に示されたのと同様3.5倍に延長される結果となった（実施例2-3; Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))。プロタミンの投与はfVIII半減期を1.6倍延長し、クリアランスの両相の速度を低下させた（表2）が、これは、HSPGがfVIIIクリアランスのRAP感受性およびRAP非依存性経路の両方に寄与していることを示している。注目すべき事に、RAPとプロタミンの併用注射はRAP単独の注射（3.5倍）よりも大きなfVIII半減期の増大（5.5倍）をもたらした。上のデータはHSPGがインビボfVIIIクリアランスに参加し、RAP感受性（LRP仲介性である場合が最も多い）およびRAP非依存性異化経路に関わっていることを証明している。
［表２］マウス血漿からのfVIIIクリアランスのパラメータに及ぼすRAPおよびプロタミンの効果
添加した物質       C1(%)      C2(%)        K1(分-1)           K2(分-1)      
無し              58±3.6    42±3.7    0.0208±0.0026    0.00345±0.0009
RAP(150μM)       7.4±3.8   92.6±6.2  0.00107±0.0008   0.00367±0.0012
プロタミン(0.2mM) 63±6.5    37±7.6    0.0118±0.0007    0.00225±0.0004
RAP+プロタミン    12±3.4    88±6.5    0.0007±0.0006    0.00232±0.0006 
表2。fVIIIクリアランスの迅速相および遅延相に対応する速度定数k1およびk2の値ならびにこれらの相の間に除去された合計放射能のパーセント（それぞれC1およびC2）は、結果の項に記載したように図7Aに示したクリアランスデータを当てはめることによって決定した。
【０１７７】
fVIIIはLRPを発現する肝臓細胞の表面でHSPGと共存する。本発明者等は過去に、マウスへの125I-fVIII/vWf複合体の注射が、LRPが大量に存在する肝臓（Moestrup,S.K., et al., Cell Tissue Res. 269:375-382(1992)）に殆どの放射能の蓄積を導くことを発見した（実施例2および3; Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))。HSPGが肝臓細胞への初期fVIII結合に関与しているかどうかを解明するため、本発明者等はLRPとHSPGの両者を発現する肝臓細胞HEP G2においてfVIII、HSPGおよびLRPの直接視覚化を実施した（Butzow,R., et al., J.Cell.Biol. 122:721-727(1993))。細胞をfVIII/vWf複合体と共に4℃でインキュベートし、その後fVIII、LRPおよびHSPGを三重標識免疫蛍光染色した（図9A-9L）。各調製物について、fVIII、HSPGまたはLRPの分布をそれぞれ赤、青および緑の画像で示す。対照細胞について、fVIII、HSPGおよびLRPについての個別的染色をそれぞれ図9A、9Bおよび9Cの画像で表す。fVIIIは、細胞表面については典型的であるが細胞質染色についてはそうでない灰色のパターンで細胞表面に分布していた。それぞれfVIIIおよびHSPGについての赤および青色染色の重ね合わせから生ずる紫色の領域によって分かるように、図9Dの統合した画像はfVIIIが専らHSPGと共存することを証明している。表面結合したfVIIIとLRPの共存は無視でき、何故なら統合画像中の広い領域が緑のままであって、赤と緑の画像の重ね合わせで予想される黄色ではないためである。この事に一致して、HSPGからグリコサミン残基を除去するためのへパリナーゼによる細胞の処理（図9F）は、結合したfVIIIの劇的な低下（図9E）と統合画像上での紫色領域の欠失を導いた（図9H）。対照的に、RAPによるLRPのブロック（図9I-9L）は、対照細胞（図9A）に比して認め得る程にはfVIII結合を変化させなかった（図9I）。統合画像（図9L）においてfVIIIは依然としてHSPGと共存しており、fVIII/vWf複合体の初期表面結合におけるLRPの無視し得る程度の役割と矛盾しなかった。このように顕微鏡検査は、HSPGが、LRP発現細胞の表面へのfVIII/vWf複合体の初期結合の原因である主要レセプターであることを確認した。
考察
【０１７８】
この研究において本発明者等は、細胞表面HSPGが、vWfとの複合体からのfVIIIのLRP仲介異化を細胞培養およびインビボで促進することを発見した。LRP発現細胞において、細胞とのfVIII/vWf複合体の初期結合の大半はHSPGを介して起こり、これが後のfVIII分子のインターナライゼーションにおいてLRPレセプターと協力する。マウスにおいてHSPGとLRPの同時ブロックは、HSPGとLRPが個々にブロックされた場合に比してfVIII半減期の著明な延長を導いた。
【０１７９】
LRP発現細胞において(i) A2サブユニットはこの結合を強力に阻害するがfVIIIの他の部分または単離されたvWfはそうでない；(ii) A2サブユニットおよびfVIII/vWf複合体は同じような親和性で細胞表面に結合する；そして、(iii) A2とfVIIIは精製系におけるヘパリンとの結合について同じような親和性を有する、という知見に基づくと、fVIII/vWf複合体とHSPGの相互作用はfVIIIのA2ドメインを介して起こる。vWfはヘパリンと相互作用することがかつて示されたが、この結合に対する寄与が見掛け上欠失しているという事は、ヘパリンに対するその弱い親和性と矛盾せず（Kd 2μM、78μM（Poletti,L.F., et al., Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 17:925-931(1997); Maruch,D., et al., Thromb.Haemost. 71:141-146(1994))、この親和性はヘパリンとのfVIIIおよびA2相互作用についてこの研究において決定された親和性よりも2ないし3桁低い（〜28nM）。ヘパリンとの結合に関わっているA2部位は、A2とヘパリンの結合を阻害する、この領域を包含する合成ペプチドの能力に基づくと、領域558-565に位置する。注目すべき事に、かつて位置決定されたLRP結合部位に相当するペプチド484-509（実施例3-4; Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))は、認め得る程にはこの結合を阻害せず、この事は、LRPおよびHSPGとの結合の原因であるA2ドメイン部位が明確であることを示している。
【０１８０】
蛋白のヘパリン結合部位は一般にArgおよび／またはLysにより形成される陽イオン性クラスターで表され、これがヘパラン硫酸グリコサミノグリカン分子の陰イオン部分と相互作用する（Mann,D., et al., J.Biol.Chem. 269:23661-23667(1994))。かつて公表されたA2ドメインの3Dモデルによると、558-565領域内部およびその近傍に、A2表面上に暴露したLys556、Lys562、Lys570およびArg571がある（Pemberton,S., et al., Blood 89:2413-2421(1997))。本発明者等はLCh内部にfVIIIのもう１つのヘパリン結合部位を発見したが、この低親和性結合部位はfVIIIとHSPGの相互作用に著しい寄与をせず、加えてfVIIIのLChに結合するvWfによってブロックされ得る（Saenko,E.L. and Scandella,D., J.Biol.Chem. 272:18007-18014(1997))。
【０１８１】
fVIIIの異化におけるHSPGとLRPの協力は、殆どのヘパリン結合LRPリガンドの異化におけるそれらの役割に類似している（Warshawsky,I., et al., Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A. 91:6664-6668(1994); Chappell,D.A., et al., J.Biol.Chem. 268:14168-14175(1993); Knauer,M.F., et al., J.Biol.Chem. 274:275-281(1999); Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 270:9307-9312(1995); Knauer,M.F., et al., J.Biol.Chem. 272:29039-29045(1997); Mikhailenko,I., et al., J.Biol.Chem. 272:6784-6791(1997))。細胞表面のリガンドの濃縮およびそれらをLRPに提示することによるその後のインターナライゼーションの促進においてHSPGに対して提起された役割（Strickland,D.K., et al., FASEB J. 9:890-898(1995); Knauer,M.F., et al., J.Biol.Chem. 274:275-281(1999))は本発明者等のデータと矛盾せず、何故ならHSPGとヘパリンについてのfVIII/vWf複合体の親和性（Kd=15-30nM）はLRPについての親和性（Kd=116nM（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999)))より高いためである。
【０１８２】
LRP発現細胞においてRAPがfVIIIのインターナライゼーションと分解を有効に阻害したという事実は、LRPがfVIIIの異化に関与しているという本発明者等の過去のデータと矛盾しない（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))。同時に、LRP欠損細胞もまたfVIIIのインターナライゼーションと分解ができ、このプロセスがへパリナーゼによって強力に阻害されるという発見は、HSPGによっても仲介されるfVIII異化のLRP非依存性経路が存在することを示すものである。この事は、fVIII異化に二つの異なる経路が存在する事を反映する、fVIIIの二相性インビボクリアランスと矛盾しない。本発明者等の発見によれば、fVIIIクリアランスの迅速相および遅延相の両者がプロタミンによって阻害される事によって示されるように、いずれの経路もHSPGが関与している。fVIIIクリアランスの迅速相はRAP感受性でもあることから、本発明者等は、この相においてはfVIII/vWf複合体が細胞表面HSPGと結合し、その後LRPにより仲介されるfVIIIのエンドサイトーシスが起こると結論付けた。fVIIIクリアランスの遅延相はLRP非依存性であるが、細胞培養でのLRP非依存性経路に似てHSPGによっても促進される。注目すべき事に、それぞれプロタミンおよびRAPによるHSPGおよびLRPの同時ブロックは、マウスにおいてfVIIIクリアランスを完全にはブロックしなかった。細胞モデル系およびインビボにおける実験に基づいたHSPGの役割を図10に示すが、ここでは、vWfとの複合体からのfVIIIの異化はHSPGとこの複合体の初期結合を介して起こり、その後fVIIIの、LRP仲介性およびLRP非依存性エンドサイトーシスと分解が共に起こる。本発明者等は過去にvWfがエンドサイトーシス経路でfVIIIに随伴しない事を示しているので、このモデルはfVIIIインターナライゼーションに先立ってvWfが解離することを示す（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))。
【０１８３】
fVIIIの単離されたA2ドメインがHSPG-およびLRP-仲介性機構によって異化され得るという発見は、活性化されたfVIIIの特別なクリアランス経路の存在を反映している。ヘテロ三量体fVIIIa（A1/A2/A3-C1-C2）はその迅速な、但し可逆的なA2およびA1/A3-C1-C2部分への解離のため、不安定な分子である（Fay,P.J., et al., J.Biol.Chem. 266:8957-8962(1991); Fay,P.J. and Smudzin,T.M., J.Biol.Chem. 267:13246-13250(1992))。A2サブユニットはA1/A3-A3-C1と再集合してfVIII活性を回復させることができ、そして単離されたA2はXアーゼを支持する弱いfVIIIa様能力を保持しているため、血管系の不適当な部位でのXアーゼ複合体の形成を防止するための機構として、単離されたA2サブユニットのクリアランスが発達した。
【０１８４】
要約すると、本発明者等は、vWfとの複合体からのfVIIIの異化は細胞表面HSPGへの該複合体の初期結合を含み、これは、HSPGの多糖類部分とfVIII A2ドメイン中のヘパリン結合部位との相互作用によるものであることを証明した。HSPGとfVIII/vWf複合体の結合の際、fVIII分子はLRP仲介性およびLRP非依存性という二つの経路を介して異化される。最後に、HSPGおよびLRPの両者はインビボfVIIIクリアランスに関わっており、何故ならこれらのレセプターの同時ブロックは循環中のfVIIIの半減期を劇的に延長するためである。
【実施例２】
【０１８５】
活性化された第VIII因子（fVIIIa）は、血液凝固の内因性経路において第X因子から活性化第X因子（Xa）への変換において第IXa因子の補助因子として機能する。IXaが膜およびfVIIIに結合する時、第X因子から第IXa因子への変換速度は100000-1000000倍増大する。fVIIIaのプロ凝固活性は、A1/A3C1C2二量体からのA2サブユニットの迅速且つ恐らくは可逆的な解離によって、そして残存するfVIIIaの活性化プロテインC（APC）蛋白分解によって調節される。A2とA1/A3C1C2フラグメントの除去は、血液凝固の部位において第VIIIa因子活性を制御する、さらなるインビボ機構である。
【０１８６】
低密度リポ蛋白レセプター関連蛋白（LRP）多リガンドエンドサイトーシスレセプターを発現するマウス胚性線維芽細胞（MEF）および遺伝的にLRPを欠損しているPEA13線維芽細胞を用いるモデル系でこれを試験した。上のモデル系を用いてトロンビン活性化されたfVIIIサブユニットの細胞取り込みと分解の機構を研究し、fVIIIaレベルの調節におけるこれらの機構の役割を評価した。
方法
【０１８７】
細胞仲介性リガンドインターナライゼーションおよび分解検定。細胞を24ウェル皿に蒔き、37℃で24時間増殖させた。5%CO2MEFおよびPEA13細胞を、図面の凡例に記載のように、非標識化競合物質の存在下および不在下に、37℃で125I標識化fVIIIaフラグメントと共に選択された時間インキュベートした。10%トリクロロ酢酸（TCA）で沈殿化の後に可溶性となった細胞培養基中に現れる放射能を、分解されたリガンドを表すものとみなした。細胞を欠く対照ウェル中に出現した10%TCA可溶性放射能の量を差し引くことにより、合計のリガンド分解を補正した。細胞表面に結合した、または細胞によってインターナライズされた標識化リガンドの量を以下のようにして決定した。細胞を冷燐酸緩衝化食塩水で洗浄し、トリプシンEDTAプロテイナーゼK溶液で処理した。表面結合した物質を、この処理によって放出された放射性リガンドの量と定義し、また、インターナライズされたリガンドの量を、処理後に細胞ペレットに付随したままである放射能の量と定義した。
【０１８８】
LRPに対するA2親和性の決定。0.1M NaHCO3(pH9.6)中のLRP（3.5μg/ml）をImmulon I微量定量ウェルストリップ中、4℃で16時間インキュベートした。TBS、5mM CaCl2、0.05%Tween20緩衝液（TBS-T）での洗浄および3%BSAでのブロック後、125I-A2（5nM）および漸増濃度の非標識化A2（0-1750nM）を加えた。37℃で1時間のインキュベートおよびTBS-Tでの洗浄後、ウェルに結合した放射能を計数した。非標識化A2存在下での125I-A2結合をコンピュータープログラム「Ligand」を用いてプロットした。A2/LRP結合についてのKd値を置換曲線から算出したが、これは単一クラスの部位に対してデータの最適な合致を示した。
【０１８９】
マウス血漿からの125I-A2ドメインのクリアランスに及ぼすRAPの効果。血漿からのA2ドメインのインビボクリアランスにおけるLRPレセプターの役割を解明するため、本発明者等は、RAPの存在下および不在下での125I標識化A2の血漿レベルをマウス尾静脈への注射後に調べた。RAP（267μM）の存在下および不在下でA2（36nM）250μl試料をBALB/cマウスの尾静脈に注射した。示された時刻に血液（50μl）を0.5M EDTA 10μl中に採取し、その125I含有量を計数した。RAPはA2ドメインの血漿からの排除を著明に遅延させる。この実験は、RAP依存性肝臓レセプターLRPが循環からのA2の除去に主要な役割を果たしていることを示している。
【０１９０】
線維芽細胞によるLRPレセプター仲介性125I-A2ドメインのインターナライゼーションおよび分解。活性化された第VIII因子フラグメントの細胞取り込みと分解を、低密度リポ蛋白レセプター関連蛋白（LRP）、多リガンドエンドサイトーシスレセプターを発現するマウス胚性線維芽（MEF）細胞を用いて研究し、PEA13細胞はLRPを欠失する線維芽細胞である。線維芽細胞は血管損傷時に凝固部位に暴露されるようになるため、MEFおよびPEA13細胞とのfVIIIaサブユニットの相互作用はインビボプロセスのための適切なモデルである。凝固カスケードに関与する、幾らかの蛋白のLRP仲介インターナライゼーションおよび分解（トロンビン：ATIII複合体およびトロンビンとインヒビター、組織因子経路インヒビター（TFPI）とのその他の複合体）が知られている。
【０１９１】
125I-A2（10nM）を細胞と共に示された時間インキュベートし、表面結合した、インターナライズされた、そして分解された125I標識化蛋白を「方法」に記載のように測定した。A2ドメインはMEF細胞によってインターナライズおよび分解されたがPEA13細胞によってはされず、これらのプロセスにとってLRPレセプターの発現が必要であることを示唆した。A2のインターナライゼーションと分解は、リガンドに対するLRP結合のインヒビターであるRAPによってブロックされた。
【０１９２】
LRPを提示するMEF細胞およびLRPを欠失する対照PEA13細胞による、125I-A2およびAPC開裂されたA2ドメインのインターナライゼーション。APCによるfVIIIaの不活性化はArg562でのA2の開裂を導く。補助因子の活性はA2N/A2CおよびA1/A3C1C2二量体からは再構成され得ないため、本発明者等は循環からのA2N/A2Cの除去は無傷のA2とは異なる機構によって起こるのかも知れないという事を提起した。A2ドメインの細胞インターナライゼーションに及ぼすAPCによる蛋白分解の効果を調べるため、本発明者等はMEFとPEA13細胞による125I-A2および125I-A2N/A2Cの取り込みを比較した。本発明者等は、A2ドメインとは対照的に、125I-A2N/A2CのインターナライゼーションはLRPレセプターによっては仲介されない事を見出した。
【０１９３】
固定化されたLRPへのA2ドメインの結合。固定化LRPを伴う微量定量ウェルに125I-A2（5nM）および漸増濃度の非標識化A2（0-1750nM）を加えた。37℃で1時間のインキュベート後、ウェルをTBS-Tで洗浄し、ウェルに結合した放射能を計数した。非標識化A2存在下での125I-A2結合を、競合物質を添加しなかった場合の125I-A2結合の百分率として表す。データをコンピュータープログラム「Ligand」を用いて解析した。置換データから算出したA2/LRP結合についてのKd値は130nMであった。
【０１９４】
線維芽細胞による125I標識化A1/A3C1C2およびA1336/A3C1C2のインターナライゼーション。本発明者等は、かつてfVIII軽鎖のC2ドメインに位置決定された燐脂質結合部位がA1/A3C1C2およびA1336/A3C1C2二量体の細胞表面結合およびインターナライゼーションを仲介すると提起した。この仮説を試験するため本発明者等は、C2ドメインの膜結合部位をブロックする、抗C2ドメインモノクローナル抗体NMC-VIII/5の存在下および不在下で、MEF細胞による125I-A1/A3C1C2および125I-A1336/A3C1C2のインターナライゼーションを測定した。
【０１９５】
2x105MEF細胞を入れたウェルを30nMモノクローナル抗体NMC-VIII/5の存在下または不在下に3nMの125I-A1/A3/C1C2または3nMの125I-A1336/A3C1C2と共に37℃でインキュベートした。対照実験では、LRPを欠失するPEA13細胞を上記のように125I-A1/A3/C1C2および125I-A1336/A3C1C2と共にインキュベートした。二量体のインターナライゼーションを「方法」に記載のように何回か測定した。
【０１９６】
125I-A1/A3C1C2および125I-A1336/A3C1C2二量体いずれのインターナライゼーションもfVIII C2ドメインの膜結合部位を認識するモノクローナル抗体NMC-VIII/5により完全に阻害されたため、本発明者等はC2の膜結合が上記二量体のインターナライゼーションに必要な重要工程であると結論付けた。インターナライゼーションの速度はMEFおよびPEA13細胞について似通っており、この事はLRPレセプターがこのプロセスに関わっていないことを示す。
【０１９７】
MEF細胞による125I-A1/A3C1C2および125I-A1336/A3C1C2の分解。MEF細胞をPAP（1μM）の存在下および不在下で125I-A1/A3C1C2（3nM）または125I-A1336/A3C1C2（3nM）と共に37℃で22時間インキュベートした。二量体の分解を「方法」に記載のように測定した。
【０１９８】
A1/A3C1C2二量体の分解はRAP依存性である。対照的に、APC開裂されたA1336/A3C1C2二量体の分解はRAP非依存性でありLRP発現と相関しない。
結論
【０１９９】
低密度リポ蛋白レセプター関連蛋白（LRP）、多リガンドエンドサイトーシスレセプターを発現するマウス胚性線維芽細胞（MEF）によってA2ドメインがインターナライズおよび分解された。A2のインターナライゼーションと分解は、リガンドへのLRP結合のインヒビターであるRAPによりブロックされた。マウスにおけるインビボクリアランス研究は、RAPが循環からの125I-A2のクリアランスを阻害することを証明した。放射能はRAP不在下では専ら肝臓に蓄積したが、RAP存在下ではそうでなかった。この事は、RAP感受性肝臓レセプター（LRPである可能性が最も高い）が、循環からの125I-A2の除去において主たる役割を果たしていることを示している。
【０２００】
かつてfVIII軽鎖のC2ドメインに位置決定された燐脂質結合部位は、A1/A3C1C2およびA1336/A3C1C2二量体の細胞膜結合とインターナライゼーションを仲介する。
【０２０１】
LRPレセプターは、APCによるfVIIIaの不可逆的不活性化で産生されるフラグメントA2N/A2CおよびA1336/A3C1C2の細胞取り込みおよび分解に参加しない。fVIIIaの可逆的不活性化で産生されるA2およびA1/A3C1C2フラグメントはそれぞれLRP仲介性およびLRP非依存性機構によって除去される。LRPは、そこから活性第VIIIa因子が再構成され得るフラグメントであるA2ドメインおよびA1/A3C1C2二量体の除去により、凝固プロセスのインビボ調節に関わっている。
【実施例３】
【０２０２】
血漿糖蛋白第VIII因子（fVIII）は内因性血液凝固経路において第X因子活性化複合体の補助因子として働く。fVIIIはその担体蛋白フォン・ヴィルブラント因子（vWf）との堅固な非共有結合的複合体として血漿中を循環する。vWfとfVIIIの複合体の形成は循環中でのfVIIIの正常な半減期およびレベルの維持にとって決定的なものであるが、fVIIIの代謝回転に関連する機構は充分に明確化されていない。この研究では本発明者等は、fVIIIの異化が、幾つかの構造的に関連の無いリガンドのインビボクリアランスの原因である肝臓エンドサイトーシスレセプターである、低密度リポ蛋白レセプター関連蛋白/α2-マクログロブリンレセプター（LRP）によって仲介されることを発見した。fVIIIとLRPの特異的結合がホモローガスリガンド競合実験によって証明され、そこでLRPへのfVIII結合についてKd 116nMが決定された。39kDaのレセプター関連蛋白（RAP）、LRPによるリガンド結合のアンタゴニストは、精製されたLRPへのfVIIIの結合を完全に阻害した。LRPとの結合に関与するfVIIIの領域は、LRPとfVIIIの相互作用を妨げる、単離されたA2ドメインおよび合成A2ドメインペプチド484-509の能力に基づいて、A2ドメイン残基484-509に位置決定された。vWfはLRPとfVIIIの結合を阻害しなかったので、本発明者等はLRPレセプターがvWfとの複合体からfVIIIをインターナライズするのかも知れないと提起した。これに一致して、LRPを発現するマウス胚性線維芽細胞（MEF）は125I-fVIII/vWf複合体をインターナライズおよび分解できたが、LRPを遺伝的に欠損する線維芽細胞（PEA13）はできなかった。後者のプロセスはRAPおよびfVIIIのA2サブユニットにより競合を受け、この事は、細胞性インターナライゼーションとその後の分解がfVIIIのA2ドメインとLRPとの相互作用によって仲介されていることを示している。MEF細胞は125I-vWf/fVIII複合体から125I-vWfをインターナライズできなかった。これは、vWfがLRP仲介経路でfVIIIに随伴せず、エンドサイトーシスの初期段階でfVIIIから解離することを示している。マウスにおける125I-fVIII/vWf複合体のインビボクリアランス研究は、RAPが循環中の125I-fVIIIの半減期を2.5倍延長することを証明し、これは、RAP感受性レセプター（LRPが最も可能性が高い）がfVIIIの血漿クリアランスの原因であることを示すものである。
序論
【０２０３】
血漿糖蛋白第VIII因子（fVIII）は内因性血液凝固経路において第X因子活性化酵素複合体の補助因子として働き、血友病Aの患者において低下しているかまたは非機能的である。第fVIII因子蛋白はホモローガスなAおよびCドメインならびにユニークなBドメインで構成され、これらはA1-A2-B-A3-C1-C2の順に配置されている（Vehar,G.A., et al., Nature 312:337-340(1984))。これはB-A3結合点での開裂により生成した一連のMe2+結合したヘテロ二量体への加工を受け（Fay,P.J., et al., Biochem.Biophys.Acta. 871:268-278(1986))、酸性領域（AR）およびA3、C1、およびC2ドメインより成る軽鎖（LCh）ならびにA1、A2およびBドメインより成る重鎖（HCh）を生成する（図1）。
【０２０４】
動物および人間いずれにおける移植研究でも、肝臓の肝実質細胞が主要なfVIII産生細胞であることが証明された（Lewis,J.H., et al., N.Engl.J.Med 312:1189-1191(1985); Bontempo,F.A., et al., Blood 69:1721-1724(1987))。循環中に放出後直ちにfVIIIはその担体蛋白vWfと高い親和性で結合して（Kd<0.5nM（MacGregor,I.R., et al., Vox.Sang. 69:319-327(1995); Saenko,E.L. and Scandella,D., J.Biol Chem 272:18007-18014(1995))堅固な非共有結合複合体を形成し、これが循環における正常なfVIIIレベルの維持に必要とされる。vWfとの複合体形成はfVIII分子内でLChとHChの結合を安定化し（Wise,R.J., et al., J.Biol.Chem. 266:21948-21955(1991))、fVIIIが燐脂質膜とC2ドメイン仲介結合する事（Gilbert,G.E., et al., J.Biol.Chem. 267:1586115868(1992))、活性化された第X因子による活性化（Koppelman,S.J., et al., J.Lab.Clin.Med. 123:585-593(1994))そしてプロテインCで触媒される不活性化（Fay,P.J., et al., J.Biol.Chem 266:2172-2177(1991))を防止する。vWfは分子量の値が2x107Daもある一連の高分子量のジスルフィド結合した多量体を含み（Hoyer,L.W. and Shainoff,J.R., Blood 55:1056-1059(1980))、vWf単量体の分子量が270kDaであると仮定すると血漿中を10μg/mlまたは50nMで循環する（Girma,J.-P., et al., Biochemistry 25:3156-3163(1986))。血漿中のfVIII濃度はおよそ1nMであり（Wion,K., et al., Nature 317:726-730(1985))、1個のfVIII分子は50のvWf単量体に結合する（Vlot,A.J., et al., Blood 85:3150-3157(1995))。
【０２０５】
トロンビンによるfVIIIの活性化は、vWfからの活性化fVIII（fVIIIa）の解離と、この補助因子活性の少なくとも100倍の増大を導く。fVIIIaはA1/A2/A3-C1-C2ヘテロ三量体であり（Fay,P.J., et al., J.Biol.Chem 266:8957-8962(1991))、ここでドメインA1とA3は金属イオン結合を保持し（図1）、安定な二量体A1/A3-C1-C2は静電力によってA2サブユニットと弱く結合している（Fay,P.J., et al., J.Biol.Chem 266:8957-8962(1991))。ヘテロ三量体からのA2サブユニットの自発的な解離はfVIIIaの非蛋白分解的不活性化をもたらす。
【０２０６】
fVIIIを持たない重篤な血友病A患者（Fijnvandraat,K., et al., Thromb.Haemostas. 77:298-302(1997); Morfini,M., et al., Thromb.Haemostas. 68:433-435(1992))または正常個体（Over,J., et al., J.Clin.Invest. 62:223-234(1978))へのfVIII/vWf複合体または精製した血漿または組換えfVIIIの注入は、半減期12-14時間で類似のfVIII消失をもたらす。fVIIIとvWfの複合体は循環中のfVIIIの正常な半減期およびレベルにとって重要であるが、fVIII/vWf複合体の代謝回転に関連する機構は十分明確となっていない。本発明者等は、fVIII/vWf複合体がクリアランスレセプターによって血漿から排除されるという事を提起し、このレセプターが低密度リポ蛋白関連蛋白レセプター（LRP）である可能性を試験した。LRPで仲介される細胞エンドサイトーシスは、凝固またはフィブリン溶解に関連する数種の蛋白を包含する幾つかの構造的に関連のないリガンドの除去機構であることが示された。これらのリガンドは、トロンビンと抗トロンビンIII（ATIII）の複合体、ヘパリン補助因子II（HC11）（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 271:6523-6529(1996))、プロテアーゼネキシンI（Knauer,M.F., et al., J.Biol.Chem. 272:12261-12264(1997))、ウロキナーゼ型および組織型プラスミノーゲン活性化因子（それぞれu-PAおよびt-PA）とプラスミノーゲン活性化因子インヒビター（PAI-1）の複合体（Nykjaer,A., et al., J.Biol.Chem. 267:14543-14546(1992); Orth,K., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 89:7422-7426(1992))、トロンボスポンジン（Mikhailenko,I., et al., J.Biol.Chem. 272:6784-6791(1997))、組織因子経路インヒビター（TFPI)(Warshawsky,I., et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 91:6664-6668(1994))、および第Xa因子（Narita,M., et al., Blood 91:555-560(1998); Ho,G., et al., J.Biol.Chem 271:9497-9502(1996))である。
【０２０７】
α2-マクログロブリンレセプターと同一の大きな細胞表面糖蛋白であるLRP（Strickland,D.K., et al., J.Biol.Chem. 265:17401-17404(1990))は低密度リポ蛋白（LDL）レセプターファミリーの一員であるが、このファミリーはさらにLDLレセプター、超低密度リポ蛋白（VLDL）レセプター、ヴィテロゲニンレセプターおよび糖蛋白330レセプターを包含する。LRPレセプターは、LRPリガンドのための結合部位を含む非共有結合した515kDaα鎖（Herz,J., et al., EMBO J. 7:4119-4127(1988))、および85kDa貫膜β鎖で構成される。α鎖内部ではシステインに富むクラスA反復のクラスターがリガンド結合の原因である（Moestrup,S.K., et al., J.Biol.Chem 268:13691-13696(1993))。LRPの酸性リガンド結合領域とは対照的に、そのリガンドは正に荷電したアミノ酸残基に富む領域を露出している（Moestrup,S.K., Biochim.Biophys.Acta 1197:197-213(1994))。この型の結合およびLRPに存在する31のクラスA反復が、その広範なリガンド多様性と、多リガンドクリアランスレセプターとして働く能力の原因であるかも知れない。LRPは、胎盤、肺および脳を包含する多くの細胞型および組織で発現され（Moestrup,S.K., et al., Cell Tissue Res. 269:375-382(1992))、肝臓にある主要なエンドサイトーシスレセプターである（Strickland,D.K., et al., FASEB J. 9:890-898(1995))。39kDaのレセプター関連蛋白（RAP）は高い親和性（Kd=4nM(27))でLRPに結合し、全てのリガンドの結合ならびにLRP仲介性インターナライゼーションおよび分解を阻害し（Moestrup,S.K. Biochim.Biophys.Acta 1197:197-213(1994); Williams,S.E., et al., J.Biol.Chem. 267:9035-9040(1992))、故にLRPが与えられたリガンドのエンドサイトーシスに関わっているかどうかを試験する有用な手段として働く。
【０２０８】
この研究では、本発明者等はfVIIIがLRPに特異的に結合する事、そしてLRPが培養線維芽細胞においてfVIIIのインターナライゼーションとその後の分解を仲介し、循環からのfVIIIのインビボクリアランスの原因であるらしい事を証明した。さらに本発明者等は、fVIIIのA2ドメインとLRPの相互作用がfVIIIの異化の仲介を担っている事を証明した。
実験方法
【０２０９】
モノクローナル抗体。モノクローナル抗体（mAb）C4（fVIII軽鎖残基1670-1684内のエピトープ（Foster,P.A., et al., J.Biol.Chem 263:5230-5234(1988)))、C5（A1残基351-361内のエピトープ）およびT5（残基701-740内のエピトープ（Fulcher,C.A., et al., J.Clin.Invest. 76:117-124(1985)))はCarol Fulcher博士（Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA）の好意により提供された。抗A2 mAb8860はBaxter/Hylandにより惜しみなく提供された。Mab413（A2ドメイン残基484-509内のエピトープ（Healey, et al., J.F., J.Biol.Chem 270:14505-14509(1995)))は過去に記載されたように製造した（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem 269:11601-11605(1994))。
【０２１０】
蛋白。LRPは記載のようにヒト胎盤から単離した（Ashcom,J.D., et al., J.Cell Biol. 110:1041-1048(1990))。ヒトRAPは細菌で発現させ記載のように精製した（Williams,S.E., et al., J.Biol.Chem. 267:9035-9040(1992))。fVIIIは方法M、American Res Crossの治療用濃縮物から精製した（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem 271:27424-27431(1996))。HChおよびLChは過去に記載されたようにfVIIIから製造した（Saenko,E.L. and Scandella,D., J.Biol chem 272, 18007-18014(1995))。A1/A3-C1-C2二量体およびA2サブユニットの精製は、Resource Sカラム（Pharmacia）上でトロンビン活性化fVIIIのイオン交換クロマトグラフィーを用いて実施した（Fay,P.T., et al., J.Biol.Chem 268, 17861-17866(1993))。A1/A3-C1-C2調製物に存在する残存A2は、20mM Tris、 pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2で平衡化した固定化mAb8860カラムを通過させることにより除去した。
【０２１１】
fVIIIおよび合成ペプチドの放射能標識。沃素化に先立ちfVIIIとA2を0.2M酢酸ナトリウム、5mM硝酸カルシウム、pH6.8（沃素化緩衝液）中に透析した。沃素化緩衝液30μlに入れたfVIII 5μgをラクトペルオキシダーゼビーズ（Worthington Biochemical Corp.）、Na125I 5μl（100mCi/ml、Amersham）、および0.03%H2O2 5μl（Mallincrodt）に加え、4分間インキュベートした。PD10カラム（Pharmacia）上のクロマトグラフィーによって遊離のNa125Iを除去した。fVIIIとA2の比放射能は3.5-5μCi/μg(蛋白)であった。一段階凝固検定で決定された125I-fVIIIの活性（3740単位/μg）は非標識化fVIIIと同様であった。
【０２１２】
固相結合検定。過去に記載のようにホモローガスおよびヘテロローガスリガンド置換検定を実施した（Williams,S.E., et al., J.Biol.Chem. 267:9035-9040(1992))。50mM Tris、0.15M NaCl、pH8.0、に入れた精製LRPまたはBSA（3μg/ml）で微量定量ウェルを16時間被覆し、次いでTBS中の3%BSAでブロックした。被覆したウェルを、非標識化競合物質の存在下または不在下に、5mM CaCl2、0.05%Tween-20を含有する20mM Tris緩衝化食塩水(pH7.4)中の125I-A2または125I-fVIIIと共に37℃で1時間インキュベートした。ウェルに結合した放射能をγ-カウンター（Pharmacia）を用いて計数した。コンピュータープログラムLIGANDを用いてホモローガスおよびヘテロローガス置換データから親和定数を導き出した（Munson,PT and Rodbard,D. Anal.Biochem. 107:220-239(1980))。
【０２１３】
細胞仲介性リガンドインターナライゼーションおよび分解検定。正常なマウス胚性線維芽細胞ライン（MEF）およびLRP生合成を遺伝的に欠失するマウス胚性線維芽細胞セルライン（PEA13）をJoachim Herz博士（University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX）より入手し、記載のように維持した（Willnow,T.E. and Herz,J., J.Cell Sci. 107:719-726(1994))。細胞を1x105細胞/ウェルで蒔き、37℃、5%CO2で24時間増殖させた。細胞性インターナライゼーションおよび分解検定を過去に記載されたように実施した（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 270:9307-9312(1995))。2%BSAを含有するダルベッコ改変培地（Gibco BRL）0.5ml中37℃で指定された時間インキュベートした後、125I標識化fVIIIおよびA2のインターナライゼーションおよび分解を測定した。インターナライゼーションは、5mM EDTAを含有する緩衝液中、トリプシン（50μg/ml）およびプロテイナーゼK（50μg/ml)(Sigma）による細胞からの放出に抵抗する放射能として定義した。この処理は細胞表面に結合した放射性リガンドを放出することが過去に示されており（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 270:9307-9312(1995))、故に、この処理の後に細胞に結合したままのリガンドはインターナライズされていると考えられる。分解は、10%トリクロロ酢酸に可溶性である培地中の放射能として定義した。分解の値は細胞を欠く並行ウェルで生成した分解産物量を差し引くことにより、非細胞仲介性分解について補正した。
【０２１４】
マウス血漿からの125I-A2ドメインおよび125I-fVIII/vWf複合体のクリアランス。RAP（合計容量250μl）の存在下または不在下で125I標識化fVIIIとvWfの複合体を、BALB/Cマウスの尾静脈におよそ20秒間かけて注射した。注射後選ばれた時間に（1、3、6、および18分）眼窩叢から血液（50μl）を100mM EDTA 10μl中に採取し、アリコートの放射能を測定した。注射1分後に採取したアリコートの放射能を100%と考えて、循環中に残存するリガンドの百分率を算出した。各調製物のクリアランスを2匹のマウスで調べ、結果を平均した。実験終了時に動物を殺し、肝小葉と腎臓を摘出して秤量し、その後これらの組織の放射能を測定した。
結果
【０２１５】
第VIII因子はLRPに結合し、その結合はRAPにより妨げられる。fVIIIがインビトロでLRPに結合する能力をホモローガス置換結合検定で調べた。この検定では、精製LRPへの125I-fVIII（1nM）の結合が過剰の非標識化fVIIIによる競合を受けた（>90%）が、BSA被覆されたウェルへの結合は競合を受けなかった（図15A）。LRPとfVIIIの相互作用に関する定量的データは非標識化fVIIIによる125I-fVIIIのホモローガス置換から誘導し、これは、Kd 116nMを有する単一クラスのfVIII結合部位を含むモデルによって適切に表された。vWfとの複合体であるfVIIIもまたLRPと結合できるかどうかを解明するため、本発明者等は、固定化したLRPへの125I-fVIIIの結合に及ぼすvWfの効果を試験した。この実験では、125I-fVIIIをvWfと共に37℃で30分間プレインキュベートして複合体を形成させ、その後これをLRP被覆ウェルに添加した。図15Aに示すように、LRPへの125I-fVIIIの結合はvWfによっては1000nMの濃度まで阻害されなかったが、これはその血漿中濃度の20倍である（50mM（Vlot,A.J., et al., Blood 85:3150-3157(1995)))。これはvWfとの複合体形成が、LRPに結合するfVIIIの能力に影響しないことを示している。
【０２１６】
LRP-リガンド結合のアンタゴニストであるRAPは2.5nMのKi（図15B）でLRP被覆したウェルと125I-fVIIIの結合を完全に阻害したが、この値はかつて決定されたLRPに対するRAPの親和性（4nM）に類似していた（Strickland,D.K., et al., J.Biol.Chem. 265:17401-17404(1990))。全体としてこれらの結果はLRPへの特異的fVIII結合を証明している。
【０２１７】
fVIII A2ドメイン内のアミノ酸残基484-509は精製LRPへのfVIIIの結合の原因である。LRPとの相互作用に関与するfVIII領域を位置決定するため、125I-fVIIIと固定化LRPの結合を非標識化fVIIIフラグメントによって競合させた。図16に示すように、fVIIIのHChとA2ドメインはヘテロローガスリガンド置換検定においてLRPから125I-fVIIIを置換したが、LCh（AR-A3-C1-C2）またはA1/A3-C1-C2二量体はそうでなかった。HChおよびA2について決定されたKi値は似通っており、それぞれ120nMおよび132nMであった。LRPとfVIIIの結合についての上のKd値と、単離されたA2サブユニットによるこの結合の阻害についてのKi値の類似性は、HChのA2ドメインがLRPとfVIIIの結合の原因であることを示している。
【０２１８】
LRPとの相互作用の原因であるA2ドメインの領域を位置決定するため、本発明者等は、fVIII/LRP結合に及ぼす、既知エピトープを有する抗A2モノクローナル抗体の効果を試験した。図17Aは、mAb413（A2ドメイン残基484-509内のエピトープ（Healey,J.F., et al., J.Biol.Chem 270:14505-14509(1995)))はfVIII/LRP相互作用をブロックできるがmAb T5（A2ドメイン残基701-740内のエピトープ（Fulcher,C.A., et al., J.Clin.Invest. 76:117-124(1985)))はそうでない事を示している。125I-fVIII/LRP結合の50%阻害に要するmAb413の濃度は2.5nMであった。fVIII/LRP結合の50%阻害に要するのはfVIIIに比して低モル過剰（2.5倍）のmAb413であるという事は、過去に報告されたfVIIIに対するmAbの高い親和性と矛盾しない（Lollar,P., et al., J.Clin.Invest. 93:2497-2504(1994))。対照実験において、mAbC5（A1残基351-361内のエピトープ）およびC4（LCh残基1670-1684内のエピトープ（Foster,P.A., et al., J.Biol.Chem 263:5230-5234(1988)))はLRPとfVIIIの結合に影響を及ぼさなかった（データは示していない）が、この事はLRPとfVIIIの結合においてA1とLChの参加が無い事と矛盾しない。
【０２１９】
mAb413がヒトfVIII配列484-509を持つ合成ペプチドを認識することがかつて証明されたため（Healey,J.F., et al., J.Biol.Chem 270:14505-14509(1995))、本発明者等は、ペプチド484-509が包含するA2ドメインの領域がLRPとの結合に関わっているかどうかを試験した。図17Bから分かるように、合成ペプチド484-509はLRPとfVIIIの結合を用量依存的に阻害したが対照A2ペプチド423-456は阻害せず、この事は、A2ドメインの領域484-509がLRPとfVIIIの結合にとって重要な残基を含む事を示している。対照実験では、BSA被覆ウェルと125I-fVIIIの結合はペプチド484-509の存在下で観察されなかった（図17B）。
【０２２０】
培養線維芽細胞によるvWfと125I-fVIIIの複合体のインターナライゼーションおよび分解はLRPによって仲介される。上に示したデータはfVIIIとLRPの特異的相互作用を証明し、そしてvWfはこの相互作用を妨害しないことから、本発明者等は、LRPはvWfとの複合体からの125I-fVIIIの細胞インターナライゼーションを仲介することもできるという仮説を立てた。この仮説を調べるため、LRPを発現するマウス胚性線維芽細胞（MEF）およびLRPを遺伝的に欠失するPEA13線維芽細胞で細胞取り込みおよび分解の実験を行った（Willnow,T.E. and Herz,J. J.Cell Sci. 107:719-726(1994))。125I-fVIII/vWf複合体は、それぞれ1nMおよび50nMというそれらの血漿中濃度で125I-fVIIIとvWfを30分間（37℃）インキュベートすることによって製造した。図18A-18Bに示すように、MEF細胞はvWf存在下で125I-fVIIIをインターナライズおよび分解することができたが、LRPを欠くPEA13細胞はできなかった。さらに、MEFによる125I-fVIIIのインターナライゼーションおよび分解は、LRPへのリガンド結合のアンタゴニストであるRAPにより阻害されたがPEA13線維芽細胞によっては阻害されなかった。RAPがMEF細胞における125I-fVIII/vWfの取り込みと分解をブロックする能力、および、PEA13細胞が取り込みと分解を有効に仲介できないという事は、LRPが125I-fVIII/vWf異化の仲介物質であることを示している。MEF細胞におけるfVIIIの分解経路をさらに特性決定するため、本発明者等は125I-fVIII分解に及ぼすクロロキン（リソソーム分解をブロックする物質）の効果を試験した。図18Bから分かるように、125I-fVIIIの分解はクロロキンによって完全に阻害された。
【０２２１】
vWf不在下でのfVIIIインターナライゼーションもまたLRPにより仲介されているのかどうかを解明するため、本発明者等は単離された125I-fVIIIのインターナライゼーションと分解を測定した（図19A-19B）。図19A-19Bから分かるように、MEF線維芽細胞による単離された125I-fVIIIのインターナライゼーションおよび分解は、いずれもvWf存在下よりおよそ2倍高い。RAPは125I-fVIIIのインターナライゼーションと分解を125I-fVIII/vWf複合体のそれより低い程度で阻害し、さらに、LRP欠損PEA線維芽細胞は単離された125I-fVIIIをインターナライズおよび分解することができた。これは、LRP仲介経路がvWf不在下でのfVIIIインターナライゼーションおよび分解の唯一の機構ではないことを示している。
【０２２２】
fVIIIに結合したvWfもまたMEF細胞によりインターナライズおよび分解を受けるかどうかを決定するため、fVIIIと複合体形成した125I標識化vWfのインターナライゼーションと分解を測定した。図19A-19Bに示すように、MEFおよびPEA13細胞の両者によってインターナライズおよび分解を受けた125I-vWfの量は、同じ実験条件下でvWfとの複合体から異化された125I-fVIIIの対応量の5%未満であった。これは、vWfがLRP仲介経路においてfVIIIに随伴せず、複合体がエンドソームコンパートメントに入る前に、恐らくはエンドサイトーシスの初期段階でfVIIIから解離することを示している。
【０２２３】
fVIIIのA2サブユニットは、MEF細胞による125I-fVIII/vWfのエンドサイトーシスと分解を阻害する。本発明者等はfVIIIのA2サブユニットがLRPとfVIIIのインビトロ相互作用を妨害することを上記のように証明したので、A2が、MEF細胞によるfVIII/vWf複合体のLRP仲介インターナライゼーションおよび分解をも阻害するかどうかを調べた。図20A-20Bは、125I-fVIII/vWf複合体の1000倍過剰のA2サブユニットが、この複合体のインターナライゼーション（4時間後に>70%）および分解（4時間後に>60%）を有効に阻害することを証明している。対照的に、上記実験において精製LRPとfVIIIの相互作用を阻害しなかったA1/A3-C1-C2ヘテロ二量体は、MEF細胞による125I-fVIIIエンドサイトーシスおよび分解に何ら影響を及ぼさなかった（図20A-20B）。
【０２２４】
A2サブユニットの阻害効果がLRP仲介性インターナライゼーションおよび分解についての125I-fVIII/vWf複合体との直接的競合に起因する事を確認するため、本発明者等はMEF細胞が、単離されたA2サブユニットをインターナライズおよび分解できるかどうかを試験した。図21A-21Bに示すように、125I-A2はLRPを発現するMEF細胞により容易にインターナライズおよび分解される。125I標識化A2のインターナライゼーションと分解はいずれもRAPの存在下でブロックされた。対照的に、LRP欠損PEA13細胞は125I-A2をインターナライズおよび分解できず（図21A-21B）、この事が、A2サブユニットの異化がLRP仲介性であることを立証した。
【０２２５】
A2ドメインのLRP仲介性インターナライゼーションおよび分解がMEF細胞のユニークな特徴ではなかったことを検証するため、本発明者等は、LRPをも表面に発現する平滑筋細胞（SMC）および肺胞上皮細胞（T2）による125I標識化A2のインターナライゼーションおよび分解を試験した（Moestrup,S.K., Cell Tissue Res. 269:375-382(1992))。図11CおよびDに示すように、RAPはSMCおよびT2による125I-A2のインターナライゼーション（それぞれ81%および64%）およびその分解（78%および68%）のいずれをも有効に阻害し、これらのプロセスがLRPによって仲介されることを示した。
【０２２６】
このように、図20A-20Bおよび21A-21Bに示すデータは、LRPがA2ドメインを介してfVIIIに結合でき、そしてfVIIIエンドサイトーシスを仲介することができ、リソソームの分解を導くことを証明する。
【０２２７】
125I-fVIIIおよび125I-A2の血漿クリアランスに及ぼすRAPの効果。LRPが、単離されたfVIII A2サブユニット、およびvWfとの複合体由来のfVIII全体をインビボで異化できるかどうかを決定するため、マウスにおける125I-fVIII/vWf複合体および125I-A2のクリアランス速度に及ぼすRAPの効果を試験した。図22Aに示すように、RAPはマウス血漿における125I-A2と125I-fVIII両者の半減期をそれぞれおよそ4および2.5倍増大させた。加えて、RAP不在下では殆どの放射能が肝臓に見出され腎臓には見出されず、この事は肝臓組織にLRPが大量に存在する事と矛盾しなかった（Strickland,D.K., et al., FASEB J. 9:890-898(1995))。このように本発明者等のデータは、RAP感受性肝臓レセプター、LRPが、循環からのfVIIIおよびそのA2サブユニットの除去に主たる役割を果たしていることを示す。
考察
【０２２８】
この研究では本発明者等は、LRPがLRP発現細胞を用いるモデル系においてヒトfVIIIのインターナライゼーションと分解を仲介している事、そしてそれがfVIIIのインビボクリアランスの原因である事を証明した。この結論は幾つかの独立した観察に基づいている。第一に、本発明者等は、fVIIIが、微量定量ウェルに固定化した精製LRPに直接結合する事、そしてこの結合がLRPとのリガンド結合のアンタゴニストであるRAPによって競合される事を発見した。第二に、125I-fVIIIはLRPを発現するマウス線維芽細胞（MEF細胞）によってvWfとの複合体からインターナライズされるが、LRPを遺伝的に欠損するマウス線維芽細胞（PEA13細胞）によってはインターナライズされない。第三に、本発明者等はRAPがMEF細胞によるvWfとの複合体からの125I-fVIIIの細胞取り込みおよび分解と、マウスの循環からの125I-fVIIIのインビボクリアランスとを有効に阻害することを証明した。
【０２２９】
本発明者等の研究は、A2ドメインとA2ドメインを含むHChのみが精製系においてLRPと125I-fVIIIの相互作用を阻害できたという事から、fVIIIのA2ドメインがLRPとの相互作用の原因であることを明らかにした。したがって、A2がLRPとfVIIIの結合の原因であると結論付けられた。vWfはLRPとfVIIIの結合を阻害しなかったという知見に基づき本発明者等は、LRPがvWfとの複合体からfVIIIをインターナライズしているのかも知れないと提唱した。事実、LRPを発現するマウス胚性線維芽細胞（MEF）はvWf存在下で125I-fVIIIをインターナライズおよび分解できたが、LRPを遺伝的に欠損する線維芽細胞はできなかった。これらのプロセスはRAPおよびfVIIIのA2サブユニットにより競合を受けたが、これは細胞性インターナライゼーションおよび分解がLRPとfVIIIのA2ドメインの相互作用により仲介される事を示すものである。LRP発現細胞モデル系を利用する観察の生理学的関連性は、マウスにおける125I-fVIII/vWf複合体のインビボクリアランス研究により支持され、この研究は、RAPが循環中の125I-fVIIIの半減期を2.5倍延長することを証明し、RAP感受性レセプター（LRPが最も可能性が高い）が血漿からのfVIIIのクリアランスの原因であることを示した。
【０２３０】
精製LRPとの結合の原因であるA2ドメイン中の領域のさらなる位置決定は、A2ドメイン残基484-509内のエピトープを有するモノクローナル抗体がLRPとfVIIIの相互作用を完全に阻害するという発見によって開始された。ヒトfVIII配列484-509を有する合成ペプチドによるfVIII/LRPの阻害は、A2ドメインの領域は精製LRPとfVIIIの結合に直接関わっているらしいことを示した。
【０２３１】
残基484-509は、493、496および499位のLysならびに484、489および490位のArgという6個の正に荷電した残基を含んでいる。かつてリポ蛋白リパーゼ（Chappell,D.A., et al., J.Biol.Chem. 268:14168-14175(1993))、u-PA-PAI-1複合体（Rodenburg,K.W., et al., Biochem.J. 329:55-63(1998))、およびα2-マクログロブリン（Howard,G.C., et al., J.Biol.Chem 271:14105-14111(1996))中の塩基性残基がLRPとの静電的相互作用にとって重要であることが示された。リポ蛋白リパーゼ（Williams,S.E., et al., J.Biol.Chem. 269:8653-8658(1994))、u-PA/PAI-I複合体（Rodenburg,K.W., et al., Biochem.J. 329:55-63(1998))およびα2-マクログロブリン由来のレセプター結合フラグメント（Howard,G.C., et al., J.Biol.Chem 271:14105-14111(1996))における塩基性アミノ酸残基のアラニン置換は、LRPとのリガンド結合についての親和性の少なからぬ低下、および、該突然変異体のインターナライゼーションおよび分解の部分的（Rodenburg,K.W., et al., Biochem.J. 329:55-63(1998))または完全な（Howard,G.C., et al., J.Biol.Chem 271:14105-14111(1996))阻害を導く。故に、組換えfVIIIの484-509領域内でのAlaまたはその他のアミノ酸置換は、LRP仲介性エンドサイトーシス速度の低下と、循環中でより長い寿命を持つfVIII突然変異体の作製にとって有用である。
【０２３２】
fVIIIは116nMの親和性で精製LRPに結合するが、これは血漿中のfVIII/vWf複合体濃度よりはるかに低い（1nM; Wion,K., et al., Nature 317:726-730(1985))。LRPについてのfVIIIの親和性は、ATIII/トロンビン（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 271:6523-6529(1996))、HCII/トロンビンおよびα1-抗トリプシン/トリプシン（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 271:6523-6529(1996)) のようなセリンプロテアーゼとインヒビターの複合体の親和性に類似しており、これらもまた他のLRPリガンドについて測定された値より低い80-120nMの親和性でLRPに結合する。MEF細胞による、1nM濃度での上記低親和性LRPリガンドのインターナライゼーションと分解は、高い親和性（Kd<1nM）でLRPと結合するu-PA/PAI-I複合体より低い速度で起こることが示された（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 271:6523-6529(1996))。故に、LRPについての比較的低いfVIIIの親和性がMEF細胞によるfVIIIインターナライゼーションと分解の速度が遅い事の原因であり、その速度は各リガンド濃度が1nMの時のATIII/トロンビン、HCII/トロンビンおよびα1-抗トリプシン/トリプシンの分解速度と同等である。LRPについてのfVIIIの低い親和性は正常個体の血漿における比較的長いfVIII半減期（12-14時間）にとっての必要条件でもあろう（Over,J., et al, J.Clin.Invest. 62:223-234(1978))。或いはまた、LRPについての低いfVIII親和性は、例えば、リポ蛋白リパーゼ（Chappell,D.A., et al., J.Biol.Chem. 268:14168-14175(1993))、肝臓リパーゼ（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 270:9307-9312(1995))、およびトロンボスポンジン（Mikhailenko,I., et al., J.Biol.Chem. 270:9543-9549(1995); Mikhailenko,I., et al., J.Biol.Chem. 272:6784-6791(1997))を包含する幾つかのLRPリガンドの取り込みを促進することが示されている細胞表面プロテオグリカンとの相互作用を介して、LRP発現細胞の膜上のfVIII分子の濃度によって補償されるかも知れない。
【０２３３】
本発明者等は、MEF細胞による単離されたfVIIIのインターナライゼーションと分解が、vWfに結合したfVIIIについての対応プロセスよりも大きいことを見出した。さらに、MEF細胞による単離されたfVIIIの異化はRAPによって部分的にしか阻害されず、この事は、fVIIIのLRP仲介性エンドサイトーシスがvWf不在下でのfVIIIクリアランスの唯一の機構でないことを示している。本発明者等のデータは、燐脂質膜へのC2ドメイン仲介性fVIII結合をブロックするvWfの存在下では（Saenko,E.L. and Scandella,D., J.Biol.Chem 270:13826-13833(1995)) fVIIIはLRPだけに結合し、一方vWf不在下ではfVIIIはLRPと未同定細胞膜成分の両方に結合することを示唆している。後者の結合はRAP非依存性経路を介するfVIIIインターナライゼーションを導き、それはかつて肝臓リパーゼについて提唱されたように未同定レセプターにより仲介されているのかも知れない（Kounnas,M.Z., et al., J.Biol.Chem. 270:9307-9312(1995))。125I-vWfがMEF細胞によってインターナライズされないことを発見したので本発明者等は、fVIII/vWf複合体がLRPに結合し、次にfVIIIエンドサイトーシスの初期段階、即ち被覆小孔の形成中にvWfがfVIIIから解離するという、fVIIIエンドサイトーシスのモデルを提唱する。fVIII/vWf複合体の解離半減期は約1時間である（Saenko,E.L. and Scandella,D., J.Biol Chem 272:18007-18014(1995))から、vWfはこの提唱されたモデルに従ってfVIIIのLRP仲介性エンドサイトーシスを遅延させることができる。
【０２３４】
vWf不在下でのfVIIIのより迅速な異化は、正常レベルのvWfを持つ血友病A患者よりも、血漿vWfを欠失する重篤なフォン・ヴィルブラント病（vWD）患者の方がより短いfVIII半減期が示された事と矛盾しない（Morfini,M., et al., Thromb.Haemostas. 70:270-272(1993); Lethagen,S., et al., Ann.Hematol. 65:253-259(1992))。さらに、vWD患者のfVIII半減期は、注入されたfVIII調製物にvWfが存在することにより延長された（Lethagen,S., et al., Ann.Hematol. 65:253-259(1992))。上記の知見は、vWfに結合することによるfVIIIのvWf仲介性安定化（Wise,R.J., et al., J.Biol.Chem. 266:21948-21955(1991))および内因性fVIIIの二次的vWf仲介性放出（Wise,R.J., et al., J.Biol.Chem. 266:21948-21955(1991); Kaufman,R.J., Mol.Cell.Biol. 9:1233-1242(1989))によってかつて説明された。本発明者等のデータは、上記の効果に加えて、vWfがLRP非依存性経路を妨害しfVIIIクリアランスをLRP仲介性経路に限定させることにより、fVIIIクリアランス速度を低下させ得ることを示唆している。
【０２３５】
膜結合した活性化fVIIIaと第IXa因子から成る第X因子活性化複合体（因子Xアーゼ）の活性はfVIIIaの不活性化によってダウンレギュレーションを受ける。後者は、活性化プロテインC、第Xa因子および第IXa因子によるfVIIIの蛋白分解的分解を介して、そしてfVIIIヘテロ三量体からのA2サブユニットの自発的且つ可逆的解離を介して起こる（Fay,P.J. and Smudzin,T.M., J.Biol.Chem 267:13246-13250(1992))。fVIIIaヘテロ三量体の解離はA2ドメインのLRP仲介性インターナライゼーション、故に凝固部位でのfVIIIa活性の補体調節により加速される。LRPは単球およびマクロファージ表面に露出し（Moestrup,S.K., et al., Exp.Cell.Res. 190:195-203(1990); Moestrup,S.K., et al., Cell Tissue Res. 269:375-382(1992))、血管損傷時には線維芽細胞および平滑筋細胞上に露出する（Moestrup,S.K., et al., Cell Tissue Res. 269:375-382(1992))ことから、この仮説はこれらの部位におけるLRPの利用可能性によって支持される。加えて、活性化fVIIIの単離されたA2は、第IXa因子により触媒される第X因子の変換をおよそ100倍加速することができるが、単離されたA1およびA3-C1-C2サブユニットはこれができない（Fay,P.J. and Koshibu,K., Blood 92:353a(抄録)(1998))。A2による第X因子活性化の加速がヘテロ三量体型活性化fVIII（A1/A2/A3-C1-C2）存在下におけるそれのわずか1%であったとしても（Fay,P.J. and Koshibu,K., Blood 92:353a(抄録)(1998))、LRPの仲介する、凝固部位の燐脂質膜に結合したfVIIIaから解離したA2の除去は、凝固事象の場に無い第X因子の活性化の防止に重要である可能性がある。
【０２３６】
要約すると、この研究はLRPがfVIII/vWf複合体に結合してそこからのfVIIIの取り込みを仲介できることを証明するものである。インビボクリアランス研究は、LRPが実際に血漿からfVIIIを除去するよう機能していることを示している。
【実施例４】
【０２３７】
循環での延長された寿命を持つ組換えfVIII分子の開発についての実験。組換えfVIII生成物は、低下したまたは非機能的fVIIIを持つ血友病患者におけるfVIII置換療法に広く使用されていることから、延長された寿命を持つ突然変異体の作製は、有効性を増大させfVIII注入療法のコストを低減する有望なアプローチである。39kDaレセプター関連蛋白（RAP）はLRPに可逆的に結合して他のリガンドの結合を阻害し、故にLRPが与えられたリガンドのエンドサイトーシスにLRPが関与しているかどうかを試験する有用な手段として働く。本発明者等は、LRPとfVIIIの結合がRAPにより阻害されることを見出し、この相互作用の特異性を確認した。循環中でfVIIIに結合したフォン・ヴィルブラント因子（vWf）は精製LRPとfVIIIの結合を阻害しないことから、本発明者等は、循環からのfVIII/vWf複合体の除去もまたLRP仲介性であるかも知れないと提唱した。このLRPの役割は、マウスにおけるヒト125I-fVIII/vWf複合体の半減期がRAP存在下で2.5倍延長されるという本発明者等の発見により支持された。
【０２３８】
fVIIIアミノ酸484-509がLRPとfVIIIの結合にとって重要であるという本発明者等の発見に基づくと、これらのアミノ酸はLRP仲介性エンドサイトーシスにとっても重要である。エンドサイトーシスに必要な鍵となるfVIIIアミノ酸を同定するため、単一残基484-509を、Bドメインが除去されたfVIII（B(-)fVIII）においてAlaに突然変異させた。LRPとのリガンド結合には通常塩基性残基が含まれているため、484-509内部の6個の塩基性残基（3個のLysと3個のArg）を突然変異させた。米国特許第55859204号はこれら残基のうち3個（Arg484、Lys493およびArg490）をAlaに置換することを開示しているが、他の3個の残基  Arg490、Lys496およびLys499  は置換しなかった。mailto:dqt@Zwしたがって、個別的および組み合わせたこれらの残基をAlaに突然変異させる。特に、3個のArgの各々および3個のLysの各々は対で突然変異させる（これは、9種類のさらなるfVIII Ala二重突然変異体の製造を意味する）。
【０２３９】
次に、B(-)fVIII突然変異体とvWfの複合体のLRP発現細胞によるエンドサイトーシスが、野生型B(-)fVIII/vWfに比して低下するかどうかを決定する。幾つかの突然変異は、マウス血漿中でvWfとB-fVIII突然変異体の複合体に、野生型B-fVIII/vWf複合体に比して低下した速度のインターナライゼーションとより長いインビボ半減期をもたらす。正常およびfVIII欠損マウスで実施したインビボ実験のデータを、二相性経時クリアランスモデルおよび、人間のfVIII半減期予想を可能にする、種間スケーリングを近似する式を用いて数学的に解析する（Toxicology and Applied Pharmacology 136:75-78(1996))。
【０２４０】
循環中のfVIIIを欠失するvWf欠損マウス（重篤なフォン・ヴィルブラント病のためのマウスモデルがProc.Natl.Acad.Sci.USA 95:9524-9529(1998)に記載されている）における突然変異体fVIIIのクリアランスもまた分析する。これらの実験は、vWf不在下での突然変異体fVIIIの延長した半減期を判定することを目指している。内皮細胞と第VIII因子の相互作用はfVIIIインターナライゼーションを導くことから、この作用もまた分析する。蛍光顕微鏡技術を用いる実験で本発明者等は、内皮細胞によるfVIIIの取り込みを観察した。vWfと結合したfVIIIおよび内皮細胞に結合およびインターナライズされたfVIIIの間に循環内で明らかな平衡が存在したことから、燐脂質内皮細胞膜とfVIIIの相互作用は、fVIII注射後に循環内のfVIII濃度に（よってその半減期にも）影響を及ぼす重要因子である。
【０２４１】
故に、vWfとの、そして燐脂質とのfVIIIの結合に役割を果たしている個々のアミノ酸が、先に位置決定されたfVIII燐脂質結合部位の内部に同定される（C2ドメイン領域2303-2332）。本発明者等は、このアミノ酸が燐脂質とfVIIIの結合では重要な役割を果たすがvWfとの結合ではそうでないことを同定している。vWfとのそして燐脂質とのfVIIIの結合に参加するアミノ酸を、以下の観察に基づいて選択する。fVIIIのC2ドメインならびにいわゆるDSドメインを含むディスコイジンおよびホモローガス蛋白のファミリーの対応領域間の相同性探索は、fVIII C2ドメイン配列がβ構造の形成に関わっていることを明らかにした。加えて、残基2310および2320が共有結合してC2ドメイン内に対応ループ構造を再生産している合成fVIIIペプチド2310-2320は、vWfまたは燐脂質とfVIIIの結合について競合していることが示された。故に、2311-2319領域内の残基をAlaおよびその他のアミノ酸に突然変異させる。fVIII相同体であるfVはvWfに結合しないため本発明者等は、fVIIIの2311-2319領域内でユニークな5残基のみを突然変異させる。この突然変異体をvWfおよび燐脂質との結合について試験したところ、fVIII残基がこれらのリガンドとの結合で鍵となる役割を果たすことが確定した。
【０２４２】
燐脂質結合が低下しているfVIII突然変異体のクリアランスを、正常なおよび血友病のマウスにおけるwt-fVIIIのクリアランスと比較して、燐脂質依存性fVIIIクリアランス成分のfVIII総クリアランスへの寄与を決定する。
【０２４３】
C2ドメイン領域2310-2320内の突然変異は循環におけるfVIII寿命の延長に有効であることが判明し、そこで本発明者等は、C2ドメイン突然変異（2310-2320位）とA2（484-509位）内の突然変異を両方組み合わせた突然変異体fVIIIを作製する。
【０２４４】
遺伝子治療目的のために設計した延長寿命fVIIIを試験するため、突然変異させたfVIII遺伝子をウイルスに基づくベクターに挿入し、血友病Aマウス中にデリバリーする。fVIIIインビボ発現レベルの時間経過を以下のように評価する：細胞（肝臓細胞）当たりの遺伝子コピー数、遺伝子転写レベル、fVIII活性および抗原レベルを測定する。高力価の抗体はfVIIIクリアランスを増大させることが示されたため（Br.J.Hematol. 93:688-693(1996))、本発明者等は、延長した寿命のfVIIIに対する免疫反応を調べる。さらに本発明者等は、野生型fVIIIに対する抗体を形成した血友病Aマウスの循環内でのその半減期を比較する。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１】図1A-1Dは、マウス胚性線維芽細胞（MEF）における125I-fVIII/vWfおよび125I-A2の表面結合と分解に及ぼすRAP、ヘパリンおよびへパリナーゼの効果を示す図である。2x105のLRP発現MEF細胞（塗りつぶした棒）またはLRP欠損PEA13細胞（白抜きの棒）を入れたウェルを、実施例1に記載のようにヘパリナーゼ有りまたは無しでプレインキュベートした。その後、RAP（1μM）またはヘパリン（100μg/ml）の存在下または不在下で1nM125I-fVIII/vWf複合体（図1A-1B）または1nM125I-A2（図1C-1D）のいずれかを添加し、37℃で6時間インキュベートした。続いて125I-fVIIIおよび125I-A2の表面結合（図1Aおよび1C）ならびに分解（図1Bおよび1D）を実施例1に記載のように測定した。各データの点は二重の測定値の平均値と標準偏差を表す。
【０２４６】
【図２】図2A-2Fは、平滑筋細胞（SMC）および肺胞上皮細胞（T2）による、fVIIIの125I-A2サブユニットの表面結合、インターナライゼーションおよび分解に及ぼす、RAP、ヘパリンおよびへパリナーゼの効果を示す図である。105のSMC細胞（灰色の棒）およびT2細胞（陰影の付いた棒）を入れたウェルを、実施例1に記載のようにヘパリナーゼ有りまたは無しでプレインキュベートした。RAP（1μM）またはヘパリン（100μg/ml）の存在下または不在下で1nM125I-A2と共に細胞を37℃で6時間インキュベートした後、125I-A2の表面結合（図2AおよびD）、インターナライゼーション（図2Bおよび2E）および分解（図2Cおよび2F）を実施例1に記載のように測定した。各データの点は二重の測定値の平均値と標準偏差を表す。
【０２４７】
【図３】図3は、MEF細胞表面へのfVIII/vWf複合体の結合に及ぼすfVIIIフラグメントおよびvWfの効果を示す図である。2x105のLRP発現MEF細胞（塗りつぶした棒）または対照のLRP欠損PEA13細胞（灰色の棒）を入れたウェルを、実施例1に記載のようにヘパリナーゼ有りまたは無しでプレインキュベートした。競合物質の不在下（対照）または200nMのA2、A1/A3-C1-C2、もしくはvWfの存在下で細胞に1nM125I-fVIII/vWf複合体を添加し、4℃で2時間インキュベートし、表面に結合した放射能を実施例1に記載のように測定した。各データの点は二重の測定値の平均値と標準偏差を表す。
【０２４８】
【図４】図4A-4Bは、MEF細胞表面へのA2の結合についてのパラメータの決定を示す図である。（図4A）MEF細胞への125I-A2の直接結合。細胞を、100倍モル過剰の非標識化A2の不在下（●）または存在下（△）で、漸増濃度の125I-A2と共に4℃で2時間インキュベートした。総結合（●）から非特異結合（△）を差し引くことにより、特異結合（○）を算出した。（図4B）非標識化A2、fVIII/vWf複合体またはvWfによる125I-A2の置換。MEF細胞を、漸増濃度の非標識化A2（□）、vWf（△）または、異なるfVIII濃度（4-512nM）と固定したvWf濃度（1000nM）を用いて製造したfVIII/vWf複合体（●）の存在下で、125I-A2（2nM）と共に上記のようにインキュベートした。この後、細胞への125I-A2の結合を測定した。各データの点は二重の測定値の平均値と標準偏差を表す。この曲線は、LIGANDプログラムを使用した、単一クラスの結合部位からのホモローガスまたはヘテロローガスリガンド置換を表すモデルへの、当該データの最適な合致を示す。
【０２４９】
【図５】図5は、SPR技術を用いたヘパリンへのfVIIIおよびそのフラグメントの結合を示す図である。ヘパリンを実施例1に記載のようにバイオセンサーチップに固定化した。500nMのfVIII（曲線1）、HCh（曲線2）、LCh（曲線3）、A2（曲線4）、およびA1（曲線5）の結合を10μl/分の流速で5分間測定した。リガンド溶液に代えて緩衝液を使用した際の解離動態を測定したが、これは流速10μl/分で連続的に変化した。固定化ヘパリン不在下で得られたシグナルを差し引くことによりこの速度曲線を非特異結合について補正したが、これはヘパリン被覆されたチップへの結合の6%未満であった。
【０２５０】
【図６】図6A-6Bは、A2依存性第Xa因子生成およびA2と第IXa因子の相互作用に及ぼすヘパリンの効果を示す図である。（図6A）第Xa因子生成検定に及ぼすヘパリンの効果。第IXa因子（5nM）、PSPC小胞（10μM）、A2ドメイン（200nM）および示された濃度のヘパリンを含む混合物を10分間インキュベートし、第X因子（300nM）の添加によって反応を開始させた。第Xa因子生成の初速度（△）を実施例1に記載のように決定した。（図6B）A2ドメインと第IXa因子の相互作用に及ぼすヘパリンの効果。A2サブユニット（300nM）を示された濃度のヘパリンと共に15分間プレインキュベートした。第X因子（400nM）の存在下（■）または不在下（●）で、PSPC小胞（50μM）およびFI-FFR-第IXa因子（30nM）の添加時に実施例1に記載のように異方性を測定した。対照実験においては、第X因子有り（□）または無し（○）の混合物からA2サブユニットを取り除いた。各点は5個の測定値の平均値±SDを表す。
【０２５１】
【図７】図7A-7Bは、A2-ヘパリン結合に及ぼす合成ペプチドの効果を示す。（図7A）ヘパリンに対するA2の結合に及ぼすA2ドメインペプチド558-565の効果をSPR技術によって測定した。ヘパリンを実施例1に記載のようにチップ表面に固定化した。ヘパリンに対するA2サブユニット（200nM）の結合を、異なる濃度のペプチド（25、50、100、200、400および800μM、それぞれ曲線2-7）の存在下または不在下（曲線1）で測定した。（図7B）ヘパリンに対するA2サブユニットの結合に及ぼすA2ペプチド432-456（△）、484-509（○）および558-565（●）の効果。各ペプチドの示された濃度における固定化ヘパリンとA2の平衡結合を図7Aのように測定した。ペプチド存在下のA2結合を、ペプチドが添加されなかった時のA2結合の百分率として表す。
【０２５２】
【図８】図8は、マウス血漿からの125I-fVIII/vWfのクリアランスに及ぼすプロタミンの効果を示す図である。BALB/cマウスに、100μlの0.2mMプロタミン（△）もしくは150μM RAP（○）を別々に、または100μlの0.2mMプロタミンおよび150μM RAPを合したもの（▲）を、125I-fVIII（15nM）およびvWf（750nM）を含有する試料100μlを注射する前に注射した。対照実験（●）では、何も試薬を添加せずに125I-fVIII/vWf複合体のクリアランスを調べた。示された時点において血液試料を採取し放射能を計数した。循環中に残存するリガンドの百分率を、注射1分後に採取したアリコートの放射能を100%として算出した。125I-fVIIIクリアランスは上の条件の各々につき4匹のマウスで調べた。曲線は、fVIIIの二相性指数クリアランスを表す式1に対する、当該実験データの最適な合致を示す（実施例1を参照されたい）。
【０２５３】
【図９】図9A-9Lは、HEP G2細胞による、vWfとの複合体からのfVIIIの表面結合の顕微鏡検査を示す図である。対照である非処置HEP G2細胞（図9A-9D）およびへパリナーゼ（図9E-9H）またはRAP（図9I-9L）で処置した細胞を、10nMのfVIII/vWf複合体と共に4℃で2時間インキュベートした。この後細胞を固定し、実施例1に記載のようにテキサスレッドでfVIIIを（図9A、9E、9Iの赤色像）、AMCAでHSPGを（図9B、9F、9Gの青色像）およびFITCでLRPを（図9C、9G、9Kの緑色像）染色した。それぞれの型の染色を選択的蛍光フィルターブロックを用いて視覚化した。単染色画像を実施例1に記載のように統合することにより、合併した画像（図9D、9H、9I）を得た。
【０２５４】
【図１０】図10は、fVIII/vWf複合体の細胞表面結合とこれに続くfVIIIの異化作用の分子モデルを示す図である。fVIII/vWf複合体の初期結合は主としてHSPGとの相互作用を介して起こり、続いてクラスリン被覆小孔を介して起こるLRP仲介エンドサイトーシス（Chen,W.J., et al., J.Biol.Chem. 265:3116-3123(1990))およびHSPGによって直接仲介されるLRP非依存性エンドサイトーシスが起こる。vWfは細胞培養実験においてエンドサイトーシス経路のfVIIIに随伴しない（Saenko,E.L., et al., J.Biol.Chem. 274:37685-37692(1999))ことから、これはこの複合体がエンドソーム区画に入る前にfVIIIから解離すると思われる。
【０２５５】
【図１１】図11は、fVIIIおよびそのフラグメントのドメイン構造を示す図である。成熟したfVIII蛋白のドメイン構造を第1列に示す。LCh酸性領域をARと表示する。トロンビン開裂を受けたLCh（A3-C1-C2）、ヘテロ三量体fVIIIa（A1/A2/3-C1-C2）およびヘテロ二量体A1/A3-C1-C2を第2、3および4列に示す。
【０２５６】
【図１２】図12A-12Bは、成熟した無BドメインfVIIIのアミノ酸配列を示す図である（配列番号5；GenBank受理番号X01179から組み立てた）。fVIII内部のA2配列に下線を施し、A2内部のLRP結合部位（残基484-509）の配列を星印で示す。アミノ酸残基は一文字アミノ酸略語で示す。
【０２５７】
【図１３】図13A-13Bは、完全長第VIII因子の推定アミノ酸配列を示す図である（配列番号2；GenPep受理番号CAA25619.1およびGenBank受理番号X01179より）。
【０２５８】
【図１４】図14は、RAPの推定アミノ酸配列を示す図である（配列番号4；GenBank受理番号M63959）。シグナル配列（アミノ酸1-34）に下線を施し、LDLレセプター結合領域（アミノ酸237-353）を星印で示す。
【０２５９】
【図１５】図15A-15Bは、リガンド競合検定による、精製LRPへの125I-fVIIIの結合を示す図である。漸増濃度の非標識化競合物質、fVIII（●、○）またはvWf（△)(図15A）およびRAP（●、○)(図15B）の存在下に、LRP（●）またはBSA（○）で被覆したウェル中で125I-fVIII（1nM）を37℃で1時間インキュベートした。実験（△）において、125I-fVIIIはこれをウェルに添加する前にvWfと共に37℃で30分間プレインキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、125I-fVIII結合を測定した。非標識化fVIII、vWf、またはRAP存在下での125I-fVIIIの結合を、競合物質を添加しなかった場合の125fVIII結合の百分率として表す。各点は三重の測定値の平均値を表し、誤差の棒は標準偏差を表す。この曲線は、LIGANDプログラムを使用した、単一クラスの結合部位からのヘテロローガスリガンド置換を表すモデルに対する、当該データの最適な合致を示す。
【０２６０】
【図１６】図16は、fVIIIのフラグメントの、LRPへの結合に及ぼす効果を示す図である。125fVIII（1nM）および漸増濃度の非標識化HCh（●）、A2（▲）、LCh（○）またはA1/A3-C1-C2（△）を図15に記載のようにLRPと共にインキュベートした。各点は三重の測定値の平均値と標準偏差を表す。図15A-15Bのようにしてこのデータを、単一クラスの結合部位からのヘテロローガスリガンド置換を表すモデルに合致させた。Ki値はHChおよびA2についてそれぞれ120および132nMであった。
【０２６１】
【図１７】図17A-17Bは、精製LRPへの125fVIII結合に及ぼすモノクローナル抗体および合成ペプチドの効果を示す図である。（図17A）125fVIII（1nM）および漸増濃度のmAb413（●）またはT5（○）を、図15A-15Bに記載のようにしてLRP被覆したウェルに加えた。対照実験（△）では、125If-VIIIおよび漸増濃度のmAb413をBSA被覆ウェルに加えた。（図17B）125I-fVIII、および、A2ドメイン残基484-509（●）または432-456（○）より成る漸増濃度の合成ペプチドをLRP被覆ウェルに加えた。対照実験（△）では、125I-fVIIIおよび漸増濃度のペプチド484-509をBSA被覆ウェルに加えた。抗体またはペプチド存在下での125I-fVIIIの結合を、競合物質を添加しなかった時の結合の百分率として表す。三重の測定値の平均および標準偏差を示す。
【０２６２】
【図１８】図18A-18Bは、LRP発現（MEF）およびLRP欠損（PEA13）線維芽細胞による125I-fVIII/vWf複合体のインターナライゼーションと分解を示す図である。それぞれ2x10のMEF（○、●）またはPEA13細胞（△、▲）を入れたウェルを、RAP（1μM）の存在下（白抜きの記号）または不在下（塗りつぶした記号）で1nMの125I-fVIII/vWfと共にインキュベートした。125I-fVIII/vWf複合体は、125I-fVIIIを非標識化vWfと共にモル比1:50で37℃で30分間インキュベートすることにより製造した。示された時間において、MEFおよびPEA13線維芽細胞によってインターナライズされた125I-fVIII（図18A）および分解された125I-fVIII（図18B）の量を、実験方法で記載したように測定した。実験（▽）では、クロロキン存在下（0.1mM）におけるMEF細胞による125I-fVIII（1nM）の分解を示す。各データの点は二重の測定値の平均および標準偏差を表す。
【０２６３】
【図１９】図19A-19Bは、単離された125I-fVIIIとfVIII/vWf複合体の成分とのインターナライゼーションの比較を示す図である。それぞれ2x105のMEFおよびPEA13細胞を入れたウェルを、単離された125I-fVIII 1nMと共に、または、125I-fVIII（1nM）と非標識化vWf（50nM）もしくは125I-vWf（50nM）と非標識化fVIII（1nM）のいずれかを混合して作製したfVIII/vWf 1nMと共にインキュベートした。RAP不在下で（白抜きの棒）または1μM RAPの存在下で（塗りつぶした棒）MEF細胞と共に6時間インキュベートした後、または、PEA13細胞と共にインキュベート（陰影を付けた棒）した後、インターナライズされた（図19A）または分解した（図19A）単離125I-fVIII、およびfVIII/vWf複合体由来の125I-fVIIIまたは125I-vWfの量を図18A-18Bに記載のようにして決定した。示したデータは二重の測定値の平均±標準偏差である。
【０２６４】
【図２０】図20A-20Bは、fVIIIのA2ドメインがMEF線維芽細胞による125I-fVIII/vWf複合体のインターナライゼーションおよび分解を阻害することを示す図である。1nMの125I-fVIII/vWf複合体を図18A-18Bのようにして製造し、1μMのA2（○）、1μMのA1/A3-C1-C2（△）の存在下で、または競合物質の不在下で（●）、2x105のMEF細胞と共にインキュベートした。示された時間において、インターナライズされた（図20A）および分解した125I-fVIII（図20B）の量を、図18A-18Bのようにして決定した。各データの点は二重の測定値の平均および標準偏差を表す。
【０２６５】
【図２１】図21A-21Dは、MEF線維芽細胞による、ならびにLRP発現平滑筋細胞（SMC）および肺胞上皮細胞（T2）による、125I-A2のインターナライゼーションおよび分解を示す図である。図21A-21Bでは、2x105のMEF（○、●）またはPEA13細胞（△、▲）を、RAP（1μM）の存在下（白抜きの記号）または不在下（塗りつぶした記号）で10nM125I-A2と共にインキュベートした。示された時間において、MEFおよびPEA13線維芽細胞によってインターナライズされた125I-A2（図21A）および分解した125I-A2（図21B）の量を、図18A-18Bに記載のように測定した。実験（▽）では、クロロキン存在下（0.1mM）におけるMEF細胞による125I-A2の分解を示す。各データの点は二重の測定値の平均および標準偏差を表す。図21C-21Dでは、125I-A2（10nM）を、RAP（1mM）の存在下または不在下で、3x105 SMC（塗りつぶした棒）またはT2（白抜きの棒）細胞を入れたウェル中37℃で4時間インキュベートした。細胞によってインターナライズされた（図21C）または分解した（図21D）125I-A2の量を図18A-18Bのようにして決定した。示されたデータは二重の測定値の平均±標準偏差である。
【０２６６】
【図２２】図22A-22Bは、マウス血漿からの125I-A2（A）または125I-fVIII/vWf（B）のクリアランスに及ぼすRAPの効果を示す図である。BALB/cマウスの尾静脈に、RAP（267μM）の存在下（○）または不在下（●）で125I-A2（36nM)(図22A）または125I-fVIII/vWf（20nM)(図22B）を含有する試料を注射した。示された時点で、血液（50μl）を100mM EDTA 10μl中に採集し、アリコート（50μl）の放射能を計数した。循環中に残存するリガンドの百分率を、注射の1分後に採取したアリコートの放射能を100%と考えて算出した。各々の調製物のクリアランスを2匹のマウスで調べ、プロットしたデータは平均値±標準偏差を表す。
【配列表】
2005518181.tif 000002
2005518181.tif 000003
2005518181.tif 000004
2005518181.tif 000005
2005518181.tif 000006
2005518181.tif 000007
2005518181.tif 000008
2005518181.tif 000009
2005518181.tif 000010
2005518181.tif 000011
2005518181.tif 000012
2005518181.tif 000013
2005518181.tif 000014
2005518181.tif 000015
2005518181.tif 000016
2005518181.tif 000017
2005518181.tif 000018
2005518181.tif 000019
2005518181.tif 000020
2005518181.tif 000021
2005518181.tif 000022
2005518181.tif 000023
2005518181.tif 000024
2005518181.tif 000025
2005518181.tif 000026
2005518181.tif 000027
2005518181.tif 000028
2005518181.tif 000029
2005518181.tif 000030
2005518181.tif 000031
2005518181.tif 000032
2005518181.tif 000033
2005518181.tif 000034
2005518181.tif 000035
2005518181.tif 000036
2005518181.tif 000037
【図１Ａ】
2005518181.tif 000038
【図１Ｂ】
2005518181.tif 000039
【図１Ｃ】
2005518181.tif 000040
【図１Ｄ】
2005518181.tif 000041
【図２Ａ】
2005518181.tif 000042
【図２Ｂ】
2005518181.tif 000043
【図２Ｃ】
2005518181.tif 000044
【図２Ｄ】
2005518181.tif 000045
【図２Ｅ】
2005518181.tif 000046
【図２Ｆ】
2005518181.tif 000047
【図３】
2005518181.tif 000048
【図４Ａ】
2005518181.tif 000049
【図４Ｂ】
2005518181.tif 000050
【図５】
2005518181.tif 000051
【図６Ａ】
2005518181.tif 000052
【図６Ｂ】
2005518181.tif 000053
【図７Ａ】
2005518181.tif 000054
【図７Ｂ】
2005518181.tif 000055
【図８】
2005518181.tif 000056
【図９】
2005518181.tif 000057
【図１０】
2005518181.tif 000058
【図１１】
2005518181.tif 000059
【図１２Ａ】
2005518181.tif 000060
【図１２Ｂ】
2005518181.tif 000061
【図１３Ａ】
2005518181.tif 000062
【図１３Ｂ】
2005518181.tif 000063
【図１４】
2005518181.tif 000064
【図１５Ａ】
2005518181.tif 000065
【図１５Ｂ】
2005518181.tif 000066
【図１６】
2005518181.tif 000067
【図１７Ａ】
2005518181.tif 000068
【図１７Ｂ】
2005518181.tif 000069
【図１８Ａ】
2005518181.tif 000070
【図１８Ｂ】
2005518181.tif 000071
【図１９Ａ】
2005518181.tif 000072
【図１９Ｂ】
2005518181.tif 000073
【図２０Ａ】
2005518181.tif 000074
【図２０Ｂ】
2005518181.tif 000075
【図２１Ａ】
2005518181.tif 000076
【図２１Ｂ】
2005518181.tif 000077
【図２１Ｃ】
2005518181.tif 000078
【図２１Ｄ】
2005518181.tif 000079
【図２２Ａ】
2005518181.tif 000080
【図２２Ｂ】
2005518181.tif 000081
【手続補正書】
【提出日】平成15年9月12日(2003.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005518181000001.app
【国際調査報告】
2005518181.tif 000082
2005518181.tif 000083
2005518181.tif 000084
2005518181.tif 000085
2005518181.tif 000086
2005518181.tif 000087
2005518181.tif 000088