(57)【要約】メチル化プロファイルを測定するための方法および組成物個体のメチル化プロファイルを測定するための方法および組成物、ならびに所望の形質を有するクローンを同定するためにプロファイルを用いる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定するための方法：
a. 細胞もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な集団を提供する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつ各部分がメチル化および非メチル化ヌクレオチドを含む段階；
b. 該第二部分をメチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分へと分離する段階；
c. 該第一部分、メチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分からなる群より選択される少なくとも2つのDNA試料において、少なくとも1つの特定の配列の相対量を定量し、それにより細胞、組織または生物体由来のいくつかのそのような核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。
【請求項２】
以下の段階を含む、請求項1記載の方法：
少なくとも2つのDNA試料を異なる標識で標識し、少なくとも2つの該DNA試料を核酸へハイブリダイズさせる段階；および
ハイブリダイズしている2つの標識の比率を計算することにより、少なくとも2つの該DNA試料の特定の配列への相対的ハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項３】
定量する段階が定量的増幅を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
少なくとも2つのDNA試料がメチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
少なくとも2つのDNA試料が第一部分およびメチル化DNA下位部分である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
少なくとも2つのDNA試料が第一部分および非メチル化DNA下位部分である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ランダムに切断または剪断されたDNAがメチル感受性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、かつ分離する段階が第二部分をメチル感受性制限酵素で切断する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ランダムに切断または剪断されたDNAがメチル依存性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、かつ分離する段階が第二部分をメチル依存性制限酵素で切断する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
核酸が固体支持体に連結されている、請求項2記載の方法。
【請求項１０】
固体支持体がマイクロアレイである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
固体支持体がビーズである、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
固体支持体がマトリックスである、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
生物体が植物である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
生物体が真菌である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
生物体が原核生物である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
原核生物が細菌病原体である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
細菌病原体がグラム陽性種、グラム陰性種および放線菌からなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
生物体が動物である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
動物がヒトである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
細胞が幹細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
細胞がトランスジェニックであり、かつ核酸が導入遺伝子の挿入部位に対応している、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
組織が血液である、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
組織が生検組織である、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
組織が切除された組織である、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
組織が正常である、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
組織が前癌性である、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
細胞がトランスジェニックであり、かつ核酸が導入遺伝子の挿入部位に対応している、請求項1記載の方法。いくつかの態様において、組織は血液である。いくつかの態様において、組織は生検組織である。いくつかの態様において、組織は切除された組織である。いくつかの態様において、組織は正常である。
【請求項２８】
核酸のメチル化プロファイルを核酸の転写と比較し、それにより核酸のメチル化と転写の間の関係を測定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
核酸の転写がマイクロアレイで検出される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
細菌病原体の検体のメチル化プロファイルを病原体の参照菌株と比較する段階をさらに含み、メチル化パターンの類似性が検体および参照菌株の共通の起源を示している、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
第一および第二の標識されたDNA部分にハイブリダイズするポリヌクレオチドマイクロアレイであって、該部分が細胞もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な集団由来であり；
該第一DNA部分が第一標識で標識された非メチル化およびメチル化DNAを含み；かつ、
該第二DNA部分が非メチル化DNAまたはメチル化DNAのいずれかについて削除され、かつDNAの第二部分が第一標識とは異なる第二標識で標識されている、
ポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項３２】
第二試験DNA部分がメチル化DNAについて削除されている、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項３３】
第二試験DNA部分が非メチル化DNAについて削除されている、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項３４】
第二DNA部分が、ランダムに切断または剪断されたDNAをメチル感受性またはメチル依存性制限酵素で処理し、切断されていないDNAを選択することにより削除させられている、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項３５】
DNA集団が植物由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項３６】
DNA集団が動物由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項３７】
DNA集団が真菌由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項３８】
DNA集団が原核生物由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項３９】
原核生物が細菌病原体である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項４０】
細菌病原体がリステリア(Listeria)、大腸菌(E. coli)、サルモネラ(Salmonella)、エルシニア(Yersinia)およびナイセリア(Neisseria)からなる群より選択される、請求項39記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項４１】
DNA集団がトランスジェニック生物体またはトランスジェニック細胞由来である、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項４２】
メチル化された場合、隣接する遺伝子発現を沈黙させる遺伝子プロモーターおよび/またはポリヌクレオチド配列を含む、請求項31記載のポリヌクレオチドマイクロアレイ。
【請求項４３】
以下の段階を含む、1つまたは複数の親の個体からエピジェネティクス的に均一または多様な子孫の集団を作製するための方法：
a. 親の個体を有性生殖的または無性生殖的に繁殖させた子孫のゲノムメチル化プロファイルを測定する段階；および
b. 均一または多様なメチル化プロファイルを示す子孫を選択し、それにより、1つまたは複数の親の個体からエピジェネティクス的に均一な集団を作製する段階。
【請求項４４】
親の個体のメチル化プロファイルを測定する段階をさらに含み、かつ選択する段階が親の個体のメチル化プロファイルを示す子孫を選択する段階を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
親がF1ハイブリッドである、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
子孫が有性生殖的に繁殖される、請求項43記載の方法。
【請求項４７】
子孫が無性生殖的に繁殖される、請求項43記載の方法。
【請求項４８】
親の個体が植物である、請求項43記載の方法。
【請求項４９】
親の個体が動物である、請求項43記載の方法。
【請求項５０】
親の個体が真菌である、請求項43記載の方法。
【請求項５１】
親の個体が原核生物である、請求項43記載の方法。
【請求項５２】
子孫が親のクローンである、請求項43記載の方法。
【請求項５３】
ゲノムメチル化プロファイルが固体支持体上で測定される、請求項43記載の方法。
【請求項５４】
固体支持体が膜である、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
固体支持体がメチル結合カラムである、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
固体支持体がマイクロアレイである、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
固体支持体がビーズである、請求項53記載の方法。
【請求項５８】
測定する段階が、ランダムに切断または剪断された均一なDNA集団をメチル化および非メチル化画分へ分離する段階；メチル化または非メチル化画分を第一標識で標識する段階；ならびに、メチル化または非メチル化画分を核酸にハイブリダイズさせる段階を含む、請求項43記載の方法。
【請求項５９】
第二標識で標識された全ゲノムDNAを供給する段階、および全ゲノムDNAを核酸にハイブリダイズさせ、それにより第一標識由来のシグナルを正規化する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
ランダムに切断または剪断されたDNAがメチル感受性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、かつ削除させる段階が第二部分をメチル感受性制限酵素で切断する段階を含む、請求項43記載の方法。
【請求項６１】
ランダムに切断または剪断されたDNAがメチル依存性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、削除させる段階が第二部分をメチル依存性制限酵素で切断する段階を含む、請求項43記載の方法。
【請求項６２】
子孫を群においてスクリーニングする、請求項43記載の方法。
【請求項６３】
以下の段階を含む、雑種強勢をメチル化プロファイルと関連させる方法：
子孫を生じるために個体を交雑させる段階；
該個体および該子孫のメチル化プロファイルを測定する段階；ならびに
該子孫の形質を該個体のメチル化プロファイルと比較し、それにより該形質の出現を該メチル化プロファイルと関連させる段階。
【請求項６４】
個体が異なる雑種強勢群由来である、請求項63記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、すべての目的のために参照として組み入れられている、2002年6月26日に出願された、米国仮出願第60/392,071号に関する優先権の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、メチル化プロファイルの測定に関する。
【０００３】
連邦政府資金による研究および開発の下でなされた発明に関わる権利についての言明
本発明は、米国科学財団により授与された認可番号NSF0077774による政府援助でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
DNAメチル化は、細菌からヒトまでの範囲にわたる多様な生物体において起こる遍在性生物学的過程である。この過程の間、DNAメチルトランスフェラーゼは、アデニンのN6位へ、またはシトシンのC5もしくはN4位へ、メチル基の複製後付加を触媒し、S-アデノシルメチオニンがそのためのメチル基の普遍的供与体である。高等真核生物において、DNAメチル化は、ゲノム刷り込みおよび胚発生において役割を果たす。さらに、DNAメチル化における異常型は、老化および癌を含む様々な疾患に結びつけられてきた。
【０００５】
それゆえに、個々の細胞または生物体のメチル化プロファイルを測定する方法を必要としている。本発明は、これをはじめとする問題と取り組む。
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明は、細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、以下の段階を含む：
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつ各部分がメチル化および非メチル化ヌクレオチドを含む、段階；
b. 第二部分をメチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分へと分離する段階；
c. 第一部分、メチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分からなる群より選択される少なくとも2つのDNA試料において少なくとも1つの特定の配列の相対量を定量し、それにより細胞または生物体由来のいくつかのそのような核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。
【０００７】
いくつかの態様において、方法は、以下の段階を含む：
少なくとも2つのDNA試料を異なる標識で標識する段階、および
少なくとも2つのDNA試料を核酸へハイブリダイズさせる段階；ならびに
2つのハイブリダイズしている標識の比率を計算することにより、少なくとも2つのDNA試料の特定の配列への相対的ハイブリダイゼーションを測定する段階。
【０００８】
いくつかの態様において、定量段階は定量的増幅を含む。
【０００９】
いくつかの態様において、少なくとも2つのDNA試料は、メチル化DNA下位部分および非メチル化DNA下位部分である。いくつかの態様において、少なくとも2つのDNA試料は、第一部分およびメチル化DNA下位部分である。いくつかの態様において、少なくとも2つのDNA試料は、第一部分および非メチル化DNA下位部分である。
【００１０】
いくつかの態様において、ランダムに切断または剪断されたDNAは、メチル感受性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、分離段階は、第二部分をメチル感受性制限酵素で切断することを含む。いくつかの態様において、ランダムに切断または剪断されたDNAは、メチル依存性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含み、分離段階は、第二部分をメチル依存性制限酵素で切断することを含む。
【００１１】
いくつかの態様において、核酸は固体支持体に連結される。いくつかの態様において、固体支持体はマイクロアレイである。いくつかの態様において、固体支持体はビーズである。いくつかの態様において、固体支持体はマトリックスである。
【００１２】
いくつかの態様において、生物体は植物である。いくつかの態様において、生物体は真菌である。いくつかの態様において、生物体は原核生物である。いくつかの態様において、原核生物は細菌の病原体である。いくつかの態様において、細菌の病原体はグラム陽性およびグラム陰性種ならびに放線菌からなる群より選択される。いくつかの態様において、生物体は動物である。いくつかの態様において、動物はヒトである。
【００１３】
いくつかの態様において、細胞は幹細胞である。いくつかの態様において、細胞はトランスジェニックであり、核酸は導入遺伝子の挿入部位に対応する。いくつかの態様において、組織は血液である。いくつかの態様において、組織は生検組織である。いくつかの態様において、組織は切除された組織である。いくつかの態様において、組織は正常である。いくつかの態様において、組織は腫瘍組織である。いくつかの態様において、組織は前癌性である。
【００１４】
いくつかの態様において、方法は、核酸のメチル化プロファイルを核酸の転写と比較し、それにより核酸のメチル化と転写の間の関係を測定することをさらに含む。いくつかの態様において、核酸の転写はマクロアレイで検出される。
【００１５】
いくつかの態様において、方法は、核酸のメチル化プロファイルを核酸のコピー数と比較し、それにより、核酸のメチル化および核酸のコピー数の組み合わせの表現型への寄与を測定することをさらに含む。いくつかの態様において、核酸のコピー数はマイクロアレイで検出される。
【００１６】
いくつかの態様において、方法は、細菌の病原体の検体のメチル化プロファイルを病原体の参照菌株と比較することをさらに含み、メチル化パターンの類似性は、検体および参照菌株の共通の起源を示す。
【００１７】
本発明はまた、ポリヌクレオチドマイクロアレイを提供する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドマイクロアレイは、第一および第二の標識DNA部分にハイブリダイズし、部分は、細胞、組織または生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団由来である；第一DNA部分は、第一標識で標識された非メチル化およびメチル化DNAを含む；ならびに第二DNA部分は、非メチル化DNAまたはメチル化DNAのいずれかについて削除され、DNAの第二部分は、第一標識とは異なる第二標識で標識される。
【００１８】
いくつかの態様において、第二試験DNA部分は、メチル化DNAについて削除される。いくつかの態様において、第二試験DNA部分は、非メチル化DNAについて削除される。いくつかの態様において、第二DNA部分は、ランダムに切断または剪断されたDNAをメチル感受性またはメチル依存性制限酵素で処理し、切断されていないDNAを選択することにより削除させられる。
【００１９】
いくつかの態様において、DNA集団は植物由来である。いくつかの態様において、DNA集団は動物由来である。いくつかの態様において、DNA集団は真菌由来である。いくつかの態様において、DNA集団は原核生物由来である。いくつかの態様において、原核生物は細菌の病原体である。いくつかの態様において、細菌の病原体は、リステリア(Listeria)、大腸菌(E. coli)、サルモネラ(Salmonella)、エルシニア(Yersinia)およびナイセリア(Neisseria)を含む、グラム陰性およびグラム陽性細菌、ならびに放線菌からなる群より選択される。いくつかの態様において、DNA集団はトランスジェニック生物体、トランスジェニック細胞またはトランスジェニック組織由来である。
【００２０】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドマイクロアレイは、メチル化された場合、隣接する遺伝子発現を沈黙させる遺伝子プロモーターおよび/またはポリヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
本発明はまた、1つまたは複数の親の個体からエピジェネティクス的に均一または多様な子孫の集団を作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は以下の段階を含む：
a. 親の個体を有性生殖的または無性生殖的に繁殖させた子孫のゲノムメチル化プロファイルを測定する段階；および
b. 均一または多様なメチル化プロファイルを示す子孫を選択し、それにより、1つまたは複数の親の個体からエピジェネティクス的に均一な集団を作製する段階。
【００２２】
いくつかの態様において、方法は、親の個体のメチル化プロファイルを測定することをさらに含み、選択段階は、親の個体のメチル化プロファイルを示す子孫を選択することを含む。いくつかの態様において、親はF1ハイブリッドである。いくつかの態様において、子孫を優性で繁殖させる。いくつかの態様において、子孫を無性生殖的に繁殖させる。いくつかの態様において、親の個体は植物である。いくつかの態様において、親の個体は動物である。いくつかの態様のおいて、親の個体は真菌である。いくつかの態様において、親の個体は原核生物である。いくつかの態様において、子孫は親のクローンである。
【００２３】
いくつかの態様において、ゲノムメチル化プロファイルは、固体支持体上で測定される。いくつかの態様において、固体支持体は膜である。いくつかの態様において、固体支持体はメチル結合カラムである。いくつかの態様において、固体支持体はマイクロアレイである。いくつかの態様において、固体支持体はビーズである。
【００２４】
いくつかの態様において、測定段階は以下の段階を含む：
a. 剪断またはランダムに切断された均一なDNA集団をメチル化および非メチル化画分へ分離する段階；
b. メチル化または非メチル化画分を第一標識で標識する段階；ならびに
c. メチル化または非メチル化画分を核酸へハイブリダイズさせる段階。
【００２５】
いくつかの態様において、方法は、第二標識で標識された全ゲノムDNAを供給し、かつ全ゲノムDNAを核酸へハイブリダイズさせ、それにより第一標識からのシグナルを正規化することをさらに含む。
【００２６】
いくつかの態様において、各個体または子孫のゲノムメチル化プロファイルは、以下を含む段階により測定される：
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつ各部分がメチル化および非メチル化ヌクレオチドを含む、段階；
b. 第一部分を第一標識で標識する段階；
c. メチル化または非メチル化DNAを第二部分から削除させる段階；
d. この削除させられた第二部分を第一標識とは異なる第二標識で標識する段階；
e. 第一部分および削除させられた第二部分を核酸へハイブリダイズさせる段階；
f. 2つのハイブリダイズしている標識の比率を計算することによりDNAにおける相補核酸断片の相対的メチル化を測定し、それにより細胞、組織または生物体由来のいくつかのそのような核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。
【００２７】
いくつかの態様において、方法は以下の段階を含む：
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつDNAがメチル感受性またはメチル依存性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含む、段階；
b. DNA集団の第一部分を第一標識で標識する段階；
c. 第二部分をメチル感受性またはメチル依存性制限酵素で切断する段階；
d. メチル化または非メチル化DNAを第二部分から削除させる段階；
e. 第二部分由来の切断されていないDNAを第一標識とは異なる第二標識で標識する段階；
f. 第一および第二部分由来の標識されたDNAを核酸へハイブリダイズさせる段階；ならびに
g. 核酸にハイブリダイズしている第一および第二標識を検出することにより核酸の相対的メチル化を測定し、それにより細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定する段階。
【００２８】
いくつかの態様において、第二部分は、メチル依存性制限酵素で切断される。いくつかの態様において、第二部分は、メチル感受性制限酵素で切断される。いくつかの態様において、子孫を群においてスクリーニングする。
【００２９】
本発明はまた、雑種強勢をメチル化プロファイルと関連させる方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、子孫を生じるために個体を交雑させる段階；個体および子孫のメチル化プロファイルを測定し、かつ子孫の形質を個体のメチル化プロファイルと比較し、それにより形質の出現をメチル化プロファイルと関連させる段階を含む。いくつかの態様において、個体は異なる雑種強勢群由来である。
【００３０】
本発明は、細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は以下の段階を含む：
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつ各部分がメチル化および非メチル化ヌクレオチドを含む、段階；
b. 第一部分を第一標識で標識する段階；
c. メチル化または非メチル化DNAを第二部分から削除させる段階；
d. 削除させられた第二部分を第一標識とは異なる第二標識で標識する段階；
e. 第一部分および削除させられた第二部分を核酸へハイブリダイズさせる段階；
f. 2つのハイブリダイズしている標識の比率を計算することによりDNAにおける相補核酸断片の相対的メチル化を測定し、それにより細胞、組織または生物体由来のいくつかのそのような核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。
【００３１】
いくつかの態様において、第二部分はメチル化DNAについて削除される。いくつかの態様において、第二部分は非メチル化DNAについて削除される。
【００３２】
いくつかの態様において、方法は以下の段階を含む：
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNAの均一な大きさに形成された集団を供給する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつDNAがメチル感受性またはメチル依存性制限酵素のメチル化および非メチル化認識配列を含む、段階；
b. DNA集団の第一部分を第一標識で標識する段階；
c. 第二部分をメチル感受性またはメチル依存性制限酵素で切断する段階；
d. メチル化または非メチル化DNAを第二部分から削除させる段階；
e. 第二部分由来の切断されていないDNAを第一標識とは異なる第二標識で標識する段階；
f. 第一および第二部分由来の標識されたDNAを核酸へハイブリダイズさせる段階；ならびに
g. 核酸にハイブリダイズしている第一および第二標識を検出することにより核酸の相対的メチル化を測定し、それにより細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定する段階。
【００３３】
いくつかの態様において、第二部分は、メチル感受性制限酵素で切断される。いくつかの態様において、第二部分は、メチル依存性制限酵素で切断される。
【００３４】
いくつかの態様において、核酸は固体支持体に連結される。いくつかの態様において、固体支持体はマイクロアレイである。いくつかの態様において、固体支持体はビーズである。
【００３５】
いくつかの態様において、生物体は植物である。いくつかの態様において、生物体は真菌である。いくつかの態様において、生物体は原核生物である。いくつかの態様において、原核生物は細菌の病原体である。いくつかの態様において、細菌の病原体は、リステリア(Listeria)、大腸菌(E. coli)、サルモネラ(Salmonella)、エルシニア(Yersinia)およびナイセリア(Neisseria)を含む、グラム陰性およびグラム陽性細菌、ならびに放線菌からなる群より選択される。いくつかの態様において、生物体は動物である。いくつかの態様において、動物はヒトである。いくつかの態様において、細胞は幹細胞である。いくつかの態様において、細胞はトランスジェニックであり、核酸は導入遺伝子の挿入部位に対応する。いくつかの態様において、組織は血液である。いくつかの態様において、組織は生検組織である。いくつかの態様において、組織は切除された組織である。いくつかの態様において、組織は正常である。いくつかの態様において、組織は腫瘍組織である。いくつかの態様において、組織は前癌性である。
【００３６】
いくつかの態様において、方法は、核酸のメチル化プロファイルを核酸の転写と比較し、それにより核酸のメチル化と転写の間の関係を測定することをさらに含む。いくつかの態様において、核酸の転写は、マイクロアレイで検出される。いくつかの態様において、細菌の病原体の検体のメチル化プロファイルを病原体の参照菌株と比較することをさらに含み、メチル化パターンの類似性は、検体および参照菌株の共通の起源を示す。
【００３７】
定義
「均一な」とは、集団内でほとんどまたは全く変異を示さない特定の形質を指す。典型的には、均一な集団内の個体は、特定の形質において、わずか約500 %しか変異しないものであり、いくつかの場合においては、集団において、特定の個体または平均個体の形質の約300 %、200 %、100 %、75 %、50 %、25 %、10 %、5 %または1 %だけ変異する。同様に、DNA集団におけるDNA断片に関連して用いられる場合、「均一な」または「均一な大きさに形成された」とは、断片長において、わずかに約500 %の変動(およびいくつかの場合、約300 %、200 %、100 %、75 %、50 %、25 %、10 %、5 %または1 %ほどの変動)をもつ集団を指す。例えば、DNA断片の平均の長さは、1,000個の塩基対であり、500 %変動をもつ均一な集団は、わずかに6,000個の塩基対をもつ個体を有するであろう。
【００３８】
「エピジェネティクス的に均一な」とは、個体メンバーが均一なエピジェネティックな形質をもつ集団を指す。例えば、エピジェネティクス的に均一な個体は、それらのゲノム間で、メチル化プロファイルにおいてほとんどまたは全く変異をもたない。
【００３９】
「メチル化」は、シトシンのC5もしくはN4位におけるシトシンメチル化、アデニンのN6位、または他の型の核酸メチル化を指す。
【００４０】
お互いからの核酸の精製に関連した「分離すること」とは、混合物における核酸を2つの物理的に異なる集団へ分けることを指す。一つの集団のあらゆるメンバーが、生じるべき分離のために第二集団から分離される必要はないことは認識されている。例えば、切断されていない非メチル化DNAをDNAの第二部分から分離することは、少なくともいくらかの非メチル化DNAを別個の集団へ分離することを含み、典型的には、非メチル化DNAの大部分を分離することを含む。あらゆる切断されていない非メチル化DNA種が、生じるべき分離のために第二部分から取り出される必要はない。もう一つの態様において、切断されたメチル化DNAをDNAの第二部分から分離することは、少なくともいくらかのメチル化DNAを別個の集団へと分離することを含み、典型的には、メチル化DNAの大部分を分離することを含む。あらゆる切断されたメチル化DNA種が、生じるべき分離のために第二部分から取り出される必要はない。「分離すること」は、制限酵素切断およびサイズ分離に限定されず、本明細書に記載されるようなアフィニティー精製および当業者に公知の他の方法も含む。
【００４１】
「ハイブリッド個体」とは、2つの親の有性交雑から結果として生じた直系の子孫である、または別なふうに少なくとも2つの個体の遺伝的複合物である個体を指す。
【００４２】
「ゲノムメチル化プロファイル」とは、個体のゲノム内のDNAのメチル化状態を表す一組のデータを指す。プロファイルは、個体におけるあらゆる塩基対のメチル化状態を示しうる、またはゲノムにおける塩基対のサブセットに関する情報(例えば、特定の制限酵素認識配列のメチル化状態)を含みうる。DNAのメチル化状態を測定するための多数の方法が当技術分野において知られており、本明細書に記載されている。
【００４３】
用語「マイクロアレイ」は、ハイブリダイズ可能なアレイエレメントの順序づけられた配置を指す。アレイエレメントは、基板表面の1 cm2あたり好ましくは少なくとも1個または複数の異なるアレイエレメント、より好ましくは少なくとも100個のアレイエレメント、および最も好ましくは少なくとも1,000個のアレイエレメントがあるように配置される。さらになお、アレイエレメントのそれぞれからのハイブリダイゼーションシグナルは、典型的には、個々に識別可能である。
【００４４】
「メチル依存性制限酵素」は、メチル化制限酵素切断配列を切断するが、その配列がメチル化されていない場合、同じ配列を切断しない制限酵素(例えば、McrBC)を指す。
【００４５】
「メチル感受性制限酵素」は、非メチル化制限酵素切断配列を切断するが、その配列がメチル化されている場合、同じ配列を切断しない制限酵素(例えば、PstI)を指す。
【００４６】
「メチル化DNAについて削除された(depleted)」試料は、対象となる配列において(例えば、メチル依存性制限酵素の認識部位において)メチル化ヌクレオチドを含む断片の大部分が取り除かれたDNA断片を指す。いくつかの態様において、メチル化DNAについて削除された集団は、対象となる少なくとも1つのメチル化配列を有する断片をわずか40 %、30 %、20 %、10 %、5 %または1 %しか含まない。削除された試料において残っている断片は、対象となる配列以外の部位においてメチル化ヌクレオチドを含みうる。
【００４７】
「非メチル化DNAについて削除された(depleted)」試料は、対象となる配列において(例えば、メチル感受性制限酵素の認識部位において)非メチル化ヌクレオチドを含む断片の大部分が取り除かれたDNA断片を指す。いくつかの態様において、非メチル化DNAについて削除された集団は、対象となる少なくとも1つの非メチル化配列を有する断片をわずか40 %、30 %、20 %、10 %、5 %または1 %しか含まない。削除させられた試料において残っている断片は、対象となる配列以外の部位において非メチル化ヌクレオチドを含みうる。
【００４８】
「抗体」とは、分析物(抗原)を特異的に結合および認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそれらの断片により実質的にコードされるポリペプチドを指す。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、カッパー、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロンおよびミュー定常部遺伝子、加えて種々の免疫グロブリン可変部遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロンとして分類され、次に、免疫グロブリンクラス、それぞれ、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを定義する。
【００４９】
典型的免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対から構成され、各対は、1つの「軽」鎖(約25 kD)および1つの「重」鎖(約50〜70 kD)を有する。各鎖のN末端は、主として抗原認識を担う約100個〜110個またはそれ以上のアミノ酸の可変部を定義する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００５０】
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼでの消化により生じる多数のよく特徴付けられた断片として存在する。このように、例えば、ペプシンは、ヒンジ部におけるジスルフィド結合より下で抗体を消化し、F(ab)'2、それ自身、ジスルフィド結合によりVH-CH1に連結された軽鎖であるFabの二量体、を生じる。F(ab)'2は、ヒンジ部におけるジスルフィド結合を切断する穏やかな条件下で還元されうり、それにより、F(ab)'2二量体をFab'単量体へ変換する。Fab'単量体は、本質的に、ヒンジ部の一部を有するFabである(Paul(編)、Fundamental Immunology、第三版、Raven Press、NY (1993)を参照)。様々な抗体断片は、無傷の抗体の消化の点から定義されるが、当業者は、そのような断片が化学的にまたは組換えDNA方法を利用することによるかのいずれかで、新たに合成されうると認識しているものと思われる。このように、本明細書に用いられる場合、抗体という用語はまた、抗体全体の改変により作製された抗体断片または組換えDNA方法を用いて新たに合成されたそれらのどちらでも含む(例えば、単鎖Fv)。
【００５１】
「雑種強勢(heterosis)」または「雑種強勢(hybrid vigor)」は、F1ハイブリッドの、それの2つの異なる近交系親と比較して向上した能力として、顕在化される。雑種強勢は、2つの親の値の平均に基づく両親の平均の上方偏差として量的に定義されうる。Shull, G. 1909、Am Breed Assoc Rep 5:51-59/Johnsonら、Genetics 134(2):465-474 (1993)を参照されたい。例えば、30 lbsおよび40 lbsの体重をもつ異なる血統由来の2つの個体が交配されると仮定する。それらの子孫は、それらが50 lbsの体重である場合には、各個々の親より上のレベルで行った。子孫能力レベルと個々の親との間の差として定義される、余分の体重は、雑種強勢によるものと想定される。
【００５２】
「雑種強勢群」とは、もう一つの雑種強勢群または集団由来の個体と交雑された場合、一貫して、集団内交雑を能力で凌ぐ遺伝子型の集団である。Hallauerら、QUANTITATIVE GENETICS IN MAIZE BREEDING(Iowa State Univ.、エームズ、IA 1988)；Hallauerら、「Corn Breeding」、CORN AND CORN IMPROVEMENT 3rd (ASA-CSSA-SSSA、マディソン、WI、1988)、p. 463-564；Leeら、Crop. Sci. 29、pp 1067-1071 (1989)；Livini C.ら、Theor. Appl. Genet. 84、pp 17-25 (1992)；Smithら、Maydica 37、pp 53-60 (1992)を参照されたい。
【００５３】
発明の詳細な説明
1. 序論
DNAメチル化の遺伝子発現への影響は、領域性および深在性の両方である。ゲノムメチル化における変化は、隣接する遺伝子の不適当な発現を起こす。従って、ゲノムの複数領域のメチル化状態を調査する(または「メチル化プロファイル」）を測定する能力は、特定のメチル化状態の、遺伝子発現および/または形質との関連を可能にする。
【００５４】
本発明は、類似したまたは同一のゲノムメチル化をもつ個体を同定かつ選択し、それにより、所望の表現型を有する個体の集団を選択するために有用な方法および組成物を提供する。これらの方法および組成物は、例えば、所望の形質を保有する集団(例えば、有性生殖的または無性生殖的に繁殖した子孫)由来の個体を選択するために有用である。さらに、方法および組成物は、雑種強勢をもつ子孫の発生のために最適の交配ペアおよび最適の雑種強勢群を同定するために有用である。さらに、方法および組成物は、癌の診断、予測的生物マーカーの同定、ならびに新しい薬物標的の発見のために有用である。癌およびメチル化の役割は、JonesおよびBaylin、Nat Rev Genet. 3(6):415-428 (2002)に考察がある。
【００５５】
本発明は、組換え遺伝学の分野における日常的技術に頼っている。本発明における使用の一般的な方法を開示する基本的なテキストは、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3版、2001)；Kriegler、Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編、1994)を含む。
【００５６】
2. メチル化プロファイルの測定
本発明は、全ゲノムのメチル化プロファイルを含む、核酸のメチル化プロファイルを測定する方法を提供する。本発明の方法は、断片化DNAの均一な大きさに形成された集団を作製すること、ならびにメチル化および/または非メチル化DNAからなるDNA試料を作製することを含む。核酸のメチル化プロファイルは、その後、以下のいずれか2つの間の核酸の相対量を定量することにより測定されうる：全DNA、メチル化DNAまたは非メチル化DNA、すなわち、それぞれ、非メチル化またはメチル化DNAについて削除された試料。
【００５７】
一般的に、これらの試料は、断片化DNAを2つの等しい部分(「第一部分」および「第二部分」)へ分け、その後、第二部分をメチル化および非メチル化DNA下位部分へ分離することにより作製される。核酸配列を含む断片の相対量は、その後、以下のいずれかにおいて測定される：
a. メチル化DNA下位部分と比較した第一部分；
b. 非メチル化DNA下位部分と比較した第一部分；または
c. メチル化DNA下位部分と比較した非メチル化DNA下位部分；
d. 第一部分と比較したメチル化DNA下位部分と比較した非メチル化DNA下位部分。
【００５８】
断片化DNA
上で考察されているように、多くの態様において、出発のゲノムDNAは断片化される。断片化は、当業者に公知の任意の方法により(例えば、機械的な剪断、制限酵素またはデオキシリボヌクレアーゼIによる切断など)、行われうる。いくつかの態様において、断片の均一な大きさに形成された集団が単離される(例えば、アガロースゲル電気泳動および特定の範囲の断片サイズの溶出により)。例えば、断片の平均サイズは、例えば、約0.1 kb、0.5 kb、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kbまたはそれ以上でありうる。いくつかの態様において、断片の平均サイズは、例えば、0.1〜1 kb、1〜2 kb、1〜3 kb、1〜5 kb、2〜4 kbまたは1〜10 kbの間の範囲である。
【００５９】
メチル化および非メチル化DNAの分離
多数の方法がDNAをメチル化または非メチル化DNA下位部分へ分離するために用いられうる。
【００６０】
いくつかの態様において、これは、例えば、均一な長さの断片化ゲノムDNAをメチル感受性(または代わりにメチル依存性)制限エンドヌクレアーゼで切断して、1つまたは2つの下位部分：切断されていないDNA分子の下位部分および切断されたDNA分子の下位部分を分離することにより達成されうる。メチル依存性制限酵素が用いられる(メチル化配列を切断するが、非メチル化配列を切断しない)場合、切断されていないDNA断片の下位部分が非メチル化制限酵素切断配列を表し、切断されたDNA断片の下位部分がメチル化制限酵素切断配列を表す。逆に、メチル感受性制限酵素が用いられる場合、切断されていないDNA断片の下位部分がメチル化制限酵素切断配列を表し、切断されたDNA断片の下位部分が非メチル化制限酵素切断配列を表す。
【００６１】
多数のメチル依存性およびメチル感受性制限酵素が当業者に知られている。制限酵素は、一般的に、例えば、New England Biolabs(ベヴァリー、MA)またはRoche Applied Sciences(インディアナポリス、IN)から入手されうる。典型的なメチル依存性制限酵素は、例えば、McrBC、McrA、MrrAおよびDpnIを含む。典型的なメチル感受性制限酵素は、例えば、PstI、BstNI、FseI、MspI、CfoIおよびHpaIIを含む。例えば、McClelland, Mら、Nucleic Acids Res. 1994年9月；22(17):3640-3659およびhttp://rebase.neb.comを参照されたい。
【００６２】
DNA分子の2つの下位部分(すなわち、切断された集団および切断されていない集団)は、当業者に公知の多数の方法を用いて分子量により分離されうる。例えば、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ示差遠心分離(例えば、ショ糖勾配において)が、切断された断片を切断されていないより重い断片から分離するために用いられうる。
【００６３】
メチル化および非メチル化集団を分離し、それによりメチル化または非メチル化DNAの試料を削除させる他の方法もまた用いられうることを当業者は認識しているものと思われる。例えば、メチル化核酸およびメチル化核酸と付随したタンパク質に特異的な抗体または他の試薬(例えば、MeCP2)は、メチル化核酸を親和精製し、それによりメチル化DNAを非メチル化DNAから分離するために用いられうる。例えば、Meehanら、Nucleic Acids Res. 20(19):5085-5092 (1992)を参照されたい。この場合、DNAは、必要ではないが、メチル化を感知する制限エンドヌクレアーゼで切断されうる。いくつかの態様において、例えば、メチル化DNAに特異的なタンパク質を含むアフィニティーカラムが、メチル化および非メチル化画分を分離するために用いられる。画分へ分離したら、いずれかの画分または両方の画分は、ハイブリダイゼーションのために標識されうる。
【００６４】
他の態様において、単独での、またはメチル化核酸を特異的に切断することができる酵素と協力する化学的試薬が、メチル化および非メチル化集団を作製するために用いられる。その後、集団は上記のように分離されうる。
【００６５】
下位部分の事前増幅
いったんDNA断片が全DNAならびにメチル化DNAおよび非メチル化DNA下位部分を含む第一部分へ分離されたならば、いずれかの特定の核酸が下位部分内で定量される前に各下位部分において断片を均一に増幅するための当業者に公知の多数の方法がある。例えば、断片の事前増幅は、下位部分内においていずれか特定の核酸からのシグナルを増加させ、存在する痕跡量の出発DNAにおいて特定の配列のメチル化プロファイリングを可能にする。そのような技術は、生検組織または切除された腫瘍からの試料においてのように、ゲノムDNAの小さい試料だけが利用可能である場合、有用である。一つの例において、二本鎖DNAアダプターが下位部分におけるDNA断片末端に連結される。その後、DNAアダプターへ特異的なオリゴヌクレオチドが各下位部分へ添加され、その後、下位部分におけるDNA断片の集団は、例えば、リニア(例えば、ローリングサークル)または指数関数的(例えば、PCR)DNA増幅技術を用いて増幅される。
【００６６】
DNAの定量
DNA試料における核酸(すなわち、第一部分、メチル化DNA下位部分および/または非メチル化下位部分)の定量は、当業者に公知の任意の方法により行われうる。
【００６７】
ハイブリダイゼーション
例えば、簡単なハイブリダイゼーションがDNA試料において核酸配列を定量するために用いられうる。一つの例において、2つまたはそれ以上の試料が異なる標識(例えば、蛍光または別なふうに検出可能な標識)で標識され、異なる標識の相対的シグナルが、標識された試料の核酸へのハイブリダイゼーションの後に標準的方法により測定される。与えられたDNAプローブの特定のメチル化配列へのハイブリダイゼーションは、配列がメチル化していることを示す。プローブハイブリダイゼーションの非存在は、配列がメチル化されていないことを示す。同様に、個体由来の非メチル化DNAがターゲットとして用いられることができ、ハイブリダイゼーションは、配列が個体においてメチル化されていないことを示す。
【００６８】
いくつかの態様において、試料はマイクロアレイ上でプローブにハイブリダイズされる。この態様は、例えば、全ゲノムを含む部位のセットを含む多数の配列のメチル化プロファイルを測定するために特に有用である。
【００６９】
いくつかの態様において、メチル化DNAの与えられたプローブへの、および非メチル化DNAの与えられたプローブへのハイブリダイゼーションが測定され、これらの測定は、お互いに比較される。これは、例えば、与えられたプローブにおける非メチル化およびメチル化ターゲットDNAの相対的ハイブリダイゼーション強度の測定を可能にする。
【００７０】
いくつかの態様において、メチル化または非メチル化下位部分の与えられたプローブへのハイブリダイゼーションが測定され、全ゲノムDNA、すなわち、「第一部分」、の与えられたプローブへの測定されたハイブリダイゼーションと比較される。全ゲノムDNAは、メチル化または非メチル化DNA下位部分のハイブリダイゼーションからのデータを正規化するために参照としての役割を果たす。これは、例えば、メチル化ターゲットDNAおよび全ターゲットDNAの間での与えられたプローブにおける相対的ハイブリダイゼーション強度の測定を可能にする。全ターゲットDNAがゲノムにおいて1つより多い配列にハイブリダイズする場合において、全ターゲットDNAのハイブリダイゼーションは、その配列のいくつのコピーがハイブリダイズしているかの測定を可能にする。メチル化DNAのハイブリダイゼーションが結果として、全DNAターゲットにより生じたシグナルの画分のみを生じるならば、ユーザーは、ハイブリダイズしている配列のどの画分がメチル化されているかを算定することができる。
【００７１】
プローブ核酸は、ターゲットがハイブリダイズされる核酸配列を表す。典型的には、プローブ核酸は、少なくともゲノムDNAの断片である。ディファレンシャルハイブリダイゼーション(2つまたはそれ以上の異なる標識をモニターすることにより測定される場合)は、特定のゲノム配列における相対的メチル化を示す。
【００７２】
プローブ核酸は任意の配列でありうる。いくつかの態様において、多数の異なるターゲット核酸が探索され、それにより各ターゲットのメチル化状態についての情報を提供する。いくつかの態様において、プローブ核酸は、既知のメチル化部位または他の対象となる核酸配列(例えば、メチル化が癌のような表現型と関連している配列)を表す。または、プローブ核酸は、ランダムな、または発現された配列である。
【００７３】
ゲノムにおける多数のDNA配列(すなわち、プローブ)についての情報を処理するために、2つの標識された集団をマイクロアレイまたは他のアドレスによるプローブのアレイにハイブリダイズさせることが便利でありうる。スクリーニングされるプローブの数は、例えば、少なくとも約2個、5個、10個、20個、50個、100個、500個、1000個、10000個またはそれ以上の断片でありうる。いくつかの態様において、プローブ核酸は、固体支持体上に表示される。典型的固体支持体は、例えば、ビーズまたはマイクロアレイを含む。いくつかの態様において、ターゲット配列が、固体支持体上に表示される。
【００７４】
以下の考察の目的のために、プローブは、マイクロアレイ上の核酸エレメントを指し、ターゲット核酸は、メチル化もしくは非メチル化核酸画分または全ゲノム核酸を指す。プローブがマイクロアレイ上のハイブリダイズ可能なアレイエレメントとして用いられる場合、アレイエレメントは、各エレメントが基板上の指定された位置に存在するように、順序づけられた様式で配置される。アレイエレメントは基板上の指定された位置にあるため、ターゲットのディファレンシャルハイブリダイゼーション(固有の発現プロファイルを共に作成する)を含むハイブリダイゼーションパターンおよび強度が、メチル化プロファイルの点から解釈されうり、表現型(例えば、雑種強勢または癌)と相関しうる。
【００７５】
全DNAおよびメチル化DNA、全DNAおよび非メチル化DNA、非メチル化DNAおよびメチル化DNA、または全DNAおよびメチル化DNAおよび非メチル化DNAのディファレンシャルハイブリダイゼーションが分析されうる。ディファレンシャルハイブリダイゼーションについて、少なくとも2つの異なるターゲットDNAにおける試料が調製され、異なる標識部分で標識される。2つまたはそれ以上の標識されたDNA試料の混合物がマイクロアレイへ添加される。その後、マイクロアレイは、2つまたはそれ以上の異なる標識のそれぞれからの放射が個々に検出可能である条件下で調べられる。
【００７６】
いくつかの態様において、標識は、リスアミン結合ヌクレオチド類似体およびフルオレセイン結合ヌクレオチド類似体のような識別可能な放射スペクトルをもつ蛍光標識である。もう一つの態様において、Cy3/Cy5フルオロフォア(Amersham Pharmacia Biotech)が用いられる。例えば、マイクロアレイ適用について、容易に検出される蛍光標識(例えば、Cy3またはCy5)を用いることが便利でありうる。しかしながら、検出可能な標識のいずれの型も用いられうることを当業者は認識しているものと考えられる(例えば、放射性、蛍光性、酵素的、または当業者に公知の他の方法)。
【００７７】
ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイは、非ハイブリダイズ化核酸を削除するために洗浄され、ハイブリダイズ可能アレイエレメントとプローブの間の複合体形成が検出される。複合体形成を検出するための方法は、当業者によく知られている。上で考察されているように、いくつかの態様において、ターゲットポリヌクレオチドは、蛍光標識で標識され、複合体形成を示す蛍光のレベルおよびパターンの測定が、共焦点蛍光顕微鏡のような蛍光顕微鏡により達成される。アルゴンイオンレーザーが蛍光標識を励起し、放射が光電子増倍管へ向けられ、放射光線の量が検出かつ定量される。検出されるシグナルは、マイクロアレイの各位置におけるプローブ/ターゲットポリヌクレオチド複合体の量に比例するべきである。蛍光顕微鏡は、ハイブリダイゼーション強度の定量的二次元画像を作成するコンピューター操作型スキャナー装置を付随しうる。スキャンされた画像は、各ハイブリダイズされたターゲットポリヌクレオチドの存在量を測定するために調べられる。
【００７８】
ディファレンシャルハイブリダイゼーション実験において、2つまたはそれ以上の異なる生物学的試料由来のターゲットポリヌクレオチドは、異なる放射波長をもつ2つまたはそれ以上の異なる蛍光標識で標識される。蛍光シグナルは、特定の波長を検出する異なる光電子倍増管セットで別々に検出される。2つまたはそれ以上の試料におけるターゲットポリヌクレオチドの相対的存在量/発現レベルが得られる。
【００７９】
典型的には、マイクロアレイ蛍光強度は、1つより多いマイクロアレイが同様の試験条件下で用いられる場合、ハイブリダイゼーション強度における変動が考慮して正規化されうる。いくつかの態様において、個々のポリヌクレオチドプローブ/ターゲット複合体ハイブリダイゼーション強度は、各マイクロアレイ上に含まれる内部正規化対照から、または全ゲノムDNAのハイブリダイゼーションの強度から得られる強度を用いて正規化される。
【００８０】
定量的増幅
DNA試料(例えば、下位部分の第一部分)内の核酸配列はまた、当業者に公知の多数の定量的増幅技術のいずれかにより測定されうる(例えば、定量的PCRまたは定量的リニア増幅)。定量的増幅の方法は、例えば、米国特許第6,180,349号；第6,033,854号；および第5,972,602号に、加えて、例えば、Gibsonら、Genome Research 6:995-1001 (1996)；DeGravesら、Biotechniques 34(1):106-110, 112-115 (2003)；Deiman Bら、Mol Biotechnol. 20(2):163-179 (2002)に開示されている。
【００８１】
増幅産物の検出のための一つの方法は、5'ヌクレアーゼPCRアッセイ法(TaqMan(商標)アッセイ法とも呼ばれている)である(Hollandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280 (1991)；Leeら、Nucleic Acids Res. 21:3761-3766 (1993))。このアッセイ法は、増幅反応の間の二重に標識された蛍光発生的なプローブ(「TaqMan(商標)」プローブ)のハイブリダイゼーションおよび切断により特定のPCR産物の蓄積を検出する。蛍光発生的なプローブは、蛍光レポーター色素および消光剤色素の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる。PCRの間、このプローブは、増幅されることになっているセグメントにそれがハイブリダイズした場合かつその場合に限り、DNAポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性により切断される。プローブの切断は、レポーター色素の蛍光強度における増加を生じる。
【００８２】
エネルギー移動の使用に頼る増幅産物を検出するもう一つの方法は、TyagiおよびKramer(Nature Biotech. 14:303-309 (1996))により記載されている「ビーコンプローブ」法であり、それはまた米国特許第5,119,801号および第5,312,728号の主題でもある。この方法は、ヘアピン構造を形成することができるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用する。ハイブリダイゼーションプローブの一方の末端(5'末端または3'末端のいずれか)上にドナーフルオロフォア、および他方の末端上にアクセプター部分がある。TyagiおよびKramer法の場合において、このアクセプター部分が消光剤である、すなわち、アクセプターはドナーにより放出されたエネルギーを吸収するが、その時、それ自身は蛍光を発しない。このように、ビーコンが開放性高次構造である場合、ドナーフルオロフォアの蛍光は検出可能であるが、ビーコンがヘアピン(閉鎖性)高次構造である場合、ドナーフルオロフォアの蛍光は消光される。PCRに使用される場合、PCR産物の鎖の一つにハイブリダイズする、分子ビーコンプローブは、「開放性高次構造」になっており、蛍光が検出されるが、ハイブリダイズしないままであるものは、蛍光を発しない(TyagiおよびKramer、Nature Biotechnol. 14:303-306 (1996))。結果として、PCR産物の量が増加するにつれて、蛍光の量は増加し、このように、PCRの進行の測定として用いられうる。定量的増幅の他の方法も利用可能であることを当業者は認識しているものと思われる。
【００８３】
追加のメチル化プロファイリング方法
メチル化プロファイルは、当業者に公知の多数の追加の方法において検出されうる。例えば、メチル感受性またはメチル依存性制限エンドヌクレアーゼで切断される核酸の簡単なハイブリダイゼーション分析(例えば、サザンブロッティング)が、メチル化パターンを検出するために用いられうる。典型的には、これらの方法は、メチル化されうる少なくとも1つの配列にハイブリダイズする1つまたは複数のターゲットの使用を含む。制限酵素切断配列のメチル化の存在または非存在は、プローブにハイブリダイズしているポリヌクレオチドの長さにより測定される。亜硫酸水素塩シーケンシングのような、DNAメチル化を検出するためのこれを始めとする方法は、例えば、Thomassinら、Methods 19(3):465-475 (1999)に記載されている。
【００８４】
3. メチル化プロファイリングの使用
A. 一般的方法
メチル化プロファイリングは、特定のメチル化パターンに関連した任意の表現型を予測するために有用である。いったんそのような関係が確立されたならば、メチル化プロファイリングは、所望の表現型を有する個々の細胞または生物体を同定するために有効な方法である。例えば、メチル化プロファイルは、植物もしくは動物において栽培学的に有用な形質と関連しうる、または医学的分野において、特定の癌型と関連しうり、それにより診断または治療を可能にする。
【００８５】
所望の表現型のメチル化パターンとの関連は、かなり多数の様式で起こりうる。簡単な例において、個体(例えば、細胞または生物体)の特定の表現型が集団(例えば、個体の子孫またはクローン)に望まれる。そのような場合、個体のメチル化プロファイルが測定され、所望の表現型をもつ個体と同じまたは類似したプロファイルを有する、集団における個体が選択される。または、特定のメチル化プロファイルが、親の細胞または生物体のメチル化プロファイルを欠く個体を選択することにより避けられうる。他の態様において、子孫またはクローンが、いずれの親とも異なるメチル化パターンを有するように選択される。
【００８６】
所望の表現型をメチル化プロファイルと相関させるための有用な方法は、メチル化の転写との相関を測定することを含む。このように、転写物の1つまたは1組の転写は、異なる個体または細胞について測定され、その後、転写は、特定のメチル化パターンと相関させられる。転写は、当業者に公知の任意の方法により測定されうる。多数の遺伝子の転写を測定するための特に有用な方法は、マイクロアレイ(例えば、「GeneChip」)分析を含む。
【００８７】
さらに、本発明のメチル化プロファイリング方法は、比較遺伝子競合法(comparative genome hybridization)(CGH)と組み合わせられうる。CGHは、ゲノムDNAの一つの試料における削除および増幅をもう一つの個体試料に対して検出するための方法である。これは、マイクロアレイフィーチャー(feature)の各ターゲット試料へのハイブリダイゼーションの強度を比較することによりなされ、それぞれ、異なる蛍光色素で標識されている。
【００８８】
CGHは、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションのために標識されたターゲットの一つは全DNAの試料であるため、本発明のメチル化プロファイリング方法と組み合わせることができ、もう一つのメチル化プロファイリング実験からのもう一つのそのような試料と比較されうる。
【００８９】
この適用において、2つの異なる個体、例えば、細胞系または生物体、由来のゲノムDNAは、均一な大きさにされたDNA断片を作製するように剪断またはランダムに切断される。その後、各試料の一部(例えば、半分)は、本明細書に記載されているように、メチル化感受性またはメチル化依存性酵素で消化される。その後、すべての4つの試料は、各個体から全DNA、およびメチル化または非メチル化のいずれかのDNA下位部分を単離するために再断片化される。その後、これらの4つの試料は、核酸、例えば、マイクロアレイ、にハイブリダイズさせられうる。いくつかの態様において、4つの試料は、4つの異なる標識(例えば、蛍光色素)で標識される。全DNA試料の比率は、CGHプロファイルを提供するが、削除させられた試料と全試料の比率は、各個体由来のメチル化プロファイルを提供する。
【００９０】
または、標識された試料は、交替する対においてマイクロアレイにハイブリダイズさせられうる。そのような設計において、試料のそれぞれは、2つの色素のそれぞれで標識され、削除およびメチル化変化についてすべての試料の同時的分析を可能にする。この型の分析は、時々、ループ設計と呼ばれる(例えば、Craigら、2001「Designing microarray experiments: chips, dips, flips, and skips」 in PROCEEDINGS OF APPLIED STATISTICS IN AGRICULTURE、2001(George Milliken編)を参照)。
【００９１】
そのような設計の例は、下に図示されている。下の例において、2つの個体はAおよびBとして表されている。
2005537029.tif 000002
この設計によって、各試料は各色素で標識され、相対的な色素の取り込みが考慮されるのを可能にする。4つのアレイのみが用いられ、従って、個体間におけるゲノム全体に渡るメチル化プロファイル差異を分析するために必要とされる時間および物資の量を最小限にする。または、4つの異なる色素を用いることは、同じデータが単一のアレイのハイブリダイゼーションから生じることを可能にするものと思われる。
【００９２】
B. 所望の集団の選択
エピジェネティクス的に均一な集団は、個体のメチル化プロファイルを測定し、その後、類似したプロファイルをもつそれらの個体を選択することにより、同定かつ選択されうる。これらの方法は、例えば、所望の表現型をもつ個体の無性生殖によるクローンを単離し、それにより同じ表現型をもつクローンを同定するのに有用である。いくつかの態様において、選択されたクローンの少なくとも約80 %、85 %、90 %、95 %、98 %または99 %が、無性の親と実質的に同一のメチル化プロファイルを有する。
【００９３】
所望の表現型(例えば、雑種強勢)をもつ個体と類似または同一のメチル化プロファイルを有するクローンまたは子孫は、所望の表現型をもつ可能性が高い。無性生殖による子孫が個体から産生されるところにおいて(例えば、強勢のハイブリッド植物または動物の無性生殖的繁殖を通して、核移植による、微細繁殖、幹細胞の細胞分裂によるなど)、クローンは、個体と遺伝子的に同一であるが、エピジェネティクス的に異なる。ハイブリッドと類似または同一のメチル化プロファイルをもつクローンを選択することにより、ハイブリッドの強勢の表現型を維持するクローンを選択することができる。無性生殖的に繁殖した子孫は、ハイブリッドと遺伝子的に同一である。それゆえに、本明細書に記載される方法は、親と、遺伝子的およびエピジェネティクス的に同じであり、かつそれゆえに同じ表現型を有する無性生殖による子孫を同定するために有用である。
【００９４】
クローンの選択された集団の均一性は、ハイブリッドと選択されたクローンの集団との間のプロファイルがどれくらい類似しているかに依存するものであることを当業者は認識しているものと思われる。例えば、ユーザーは、すべての遺伝子座におけるハイブリッドとの絶対的同一性が要求されないと決定することができ、それゆえに、同一である遺伝子座を所望のパーセンテージで含む子孫が選択されうる。例えば、測定された遺伝子座の少なくとも約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、98 %、99 %または100 %がハイブリッドと同じメチル化状態を有する場合にクローンが選択されうる。または、個体の遺伝子座の質が、雑種強勢における特定の遺伝子座の相対的重要性を測定するために集団(例えば、子孫)においてモニターされうる。この場合、ユーザーは、所望の表現型を制御するまたは影響を与えることが知られている重要な遺伝子座と完全な同一性をもつが、他の遺伝子座において少なくともいくらかの、および時々は完全な、不一致を許す、クローンを選択するように選びうる。
【００９５】
個体は、個々にまたは群(すなわち、プール)において、本発明の方法に従ってスクリーニングされうる。個体のグループ化は、多数の個体の迅速な処理を可能にする。
【００９６】
本発明は、真菌、動物および植物を含む生物体の広い範囲に渡って用いられうる。例えば、任意の農業用生物が用いられうる。典型的動物は、ブタ、ウシ、家禽、他の鳥、ウマ、動物園の動物、ほとんど絶滅した種などを含む、畜産が従事してきたものである。
【００９７】
本発明は、アナカルディウム(Anacardium)属、ラッカセイ(Arachis)属、クサスギカズラ(Asparagus)属、ベラドンナ(Atropa)属、カラスムギ(Avena)属、アブラナ(Brassica)属、ミカン(Citrus)属、スイカ(Citrullus)属、トウガラシ(Capsicum)属、ベニバナ(Carthamus)属、ココヤシ(Cocos)属、コーヒーノキ(Coffea)属、キュウリ(Cucumis)属、カボチャ(Cucurbita)属、ニンジン(Daucus)属、アブラヤシ(Elaeis)属、オランダイチゴ(Fragaria)属、ダイズ(Glycine)属、ワタ(Gossypium)属、ヒマワリ(Helianthus)属、ヘテロカリス(Heterocallis)属、オオムギ(Hordeum)属、ヒヨス(hyoscyamus)属、アキノゲシ(Lactuca)属、アマ(Linum)属、ドクムギ(Lolium)属、ルピナス(Lupinus)属、トマト(Lycopersicon)属、リンゴ(Malus)属、マニホット(Manihot)属、ハナハッカ(Majorana)属、ウマゴヤシ(Medicago)属、タバコ(Nicotiana)属、オリーブ(Olea)属、イネ(Oryza)属、パニエウム(Panieum)属、パネセタム(Pannesetum)属、アボカド(Persea)属、インゲン(Phaseolus)属、ピスタチア(Pistachia)属、エンドウ(Pisum)属、ナシ(Pyrus)属、サクラ(Prunus)属、ダイコン(Raphanus)属、トウゴマ(Ricinus)属、ライムギ(Secale)属、セネシオ(Senecio)属、カラシ(Sinapis)属、ナス(Solanum)属、モロコシ(Sorghum)属、テオブロマス(Theobromus)属、トリゴネラ(Trigonella)属、コムギ(Triticum)属、ソラマメ(Vicia)属、ブドウ(Vitis)属、ササゲ(Vigna)属およびトウモロコシ(Zea)属由来の種を含む、植物の広い範囲に渡って使用がある。いったんクローンまたは子孫が選択されたならば、それらは栽培されることができ、それにより、均一な所望の形質を示す植物の収穫物を産生する。
【００９８】
一つの態様において、無性生殖的に繁殖した植物(例えば、ヤシ)のメチル化プロファイルは、類似または同一のメチル化パターンをもつ植物を含む均一な集団を選択するために用いられる。
【００９９】
本発明はまた、所望の表現型について細胞集団をスクリーニングするために用いられうる。典型的細胞は、成体もしくは胎児の幹細胞を含む幹細胞、または体細胞繁殖系の変異が集団内に発生しうる任意の他の細胞もしくは生物体を含む。このように、本発明は、変異の存在についてモニターすること、およびその変異を有するまたは欠く個体を選択することを可能にする。同様に、癌細胞メチル化プロファイルは、例えば、診断および治療における使用のために測定されうる。
【０１００】
もう一つの態様において、トランスジェニック細胞またはトランスジェニック生物体は、導入遺伝子のメチル化への影響を、もしあれば、測定するためにスクリーニングされる。これらの個体のメチル化プロファイルは、ゲノムワイドで測定されうる、または導入遺伝子の挿入に隣接しているゲノムの領域において測定されうる。この方法は、例えば、導入遺伝子挿入により引き起こされる有害な突然変異または染色体の影響を有しない可能性が最も高い形質転換体を効率的に選択するために用いることができる。
【０１０１】
C. 育種におけるさらなる使用
伝統的育種技術は、可能性のある育種ペアのメチル化プロファイルを測定することにより向上しうる。メチル化パターンを雑種強勢形質と関連させることにより、育種家は、子孫に所望のメチル化パターンを生じさせる育種ペアを選択することができ、それゆえに、結果として強勢の子孫を生じる。
【０１０２】
さらに、メチル化プロファイル、または個体の配列が同定され、かつ最適なペアを設計するために用いられることができる。雑種強勢群は、もう一つの雑種強勢群または集団由来の個体と交雑された場合、一貫して、集団内交雑を能力で凌ぐ個体の集団である。各雑種強勢群に関連した(すなわち、結びつけられた)メチル化状態を比較し、かつ雑種強勢を示す子孫のプロファイルを測定することにより、メチル化プロファイルは最適な育種ペアについて決定されうる。いったんメチル化プロファイルが特定の雑種強勢群について決定されたならば、群内での新しい個体は、大量の交雑なしに決定されうる。
【０１０３】
本明細書に引用されているすべての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が明確にかつ個々に示されて、参照として組み入れられているかのように、参照として本明細書に組み入れられている。
【０１０４】
前記の発明は、理解の明快さを目的として、図示および例を通してかなり詳細に記載されてきたが、ある特定の変化および改変が添付された特許請求の範囲の真意または範囲から逸脱することなくそれらになされうることは、本発明の教示に照らして、当業者にとって容易に明らかであると思われる。
【０１０５】
実施例
以下の実施例は、例証としてのみ提供され、限定として提供されない。当業者は、本質的に類似した結果を生じるために変化または改変されうる様々な重要ではないパラメーターを容易に認識するものと思われる。
【０１０６】
実施例1：メチル化プロファイルの測定
20マイクログラムの全ゲノムDNAを1〜10 kbのサイズ範囲へ剪断する。剪断されたDNAを2つの等しい部分へ分け、その一つを80ユニットのmcrBCで、少なくとも12時間、37 Cで消化し完了させる。噴霧の目的は、ゲノム全体が、すべての断片サイズ1 kb〜10 kbに等しく表されるようにゲノムDNAをランダムに剪断することである。さらに、小さい断片サイズはまた、ゲル精製およびCy-色素取り込みを容易にする(下記参照)。その後、2つの試料をサイズ標準と共に0.8 % アガロースゲル上で分解する。その後、1 kbおよびそれより大きいサイズ範囲におけるゲルスライスを切り取り、DNAをQiagen Qiaquickゲル抽出スピンカラムを用いて、製造会社のプロトコールに従い、精製する。
【０１０７】
消化されたおよび消化されていないゲル精製試料をMegaprime DNAラベリングキット、Amersham Pharmaciaを用いてCy3およびCy5でそれぞれ標識し、3xSSC 0.3 % SDSにおいて65 Cで一晩、マイクロアレイにハイブリダイズさせる。スライドを12〜16時間後、1xSSC 0.1 % SDS(1X)および0.2xSSC(2X)において50 Cで洗浄し、その後、Axon Instruments Genepix Pro 4000A Dual Laser Scannerのような市販用のスキャナーを用いてスキャンする。
【０１０８】
バックグラウンドおよび他の補正後、Cys3およびCy5チャネルにおけるシグナル強度の比率を計算する。それぞれ、Cy5およびCy3で標識された同一の試料とのハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、色素交換分析が実験的変動を考慮に入れるために用いられる。
【０１０９】
mcrBCでの消化は、サイズ画分からメチル化DNAを削除し、標識およびハイブリダイゼーション後のシグナルを低下させる。このように、Cy5対Cy3の比率は、マイクロアレイ上のスポットにより表される配列における相対的メチル化を表す。この工程は、比率がコピー数を考慮に入れるため、高コピー反復配列が低コピーのものと同時に分析されるのを可能にする。
【０１１０】
約50 μgの全RNAを標準的方法を用いて単離する。その後、RNAをオリゴdTまたはランダムプライマーを用いて第一鎖cDNAへ変換する。変換されたcDNAを商業的に入手可能なランダムプライミングキットを用いてCy3/Cy5で標識する。蛍光で標識されたcDNAを、その後、対象となる遺伝子を含むマイクロアレイにハイブリダイズさせ、上記の条件と類似した条件を用いて洗浄かつスキャンする。バックグラウンドおよび他の補正後、Cys3およびCy5チャネルにおけるシグナル強度の比率を計算する。それぞれ、Cy5およびCy3で標識された同一の試料とのハイブリダイゼーションを繰り返すことにより、色素交換分析が実験的変動を考慮に入れるために用いられ、同一の領域におけるDNAメチル化との相関は、データセットを得られたチップを比較することにより確立されうる。
【０１１１】
実施例2：メチル化プロファイルの転写との相関
染色体4上のシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ヘテロクロマチンの瘤領域の1.7 Mbのひと配列のメチル化プロファイルは、実施例1において特定された技術を用いて確立された。ここで、本発明者らは、この領域のDNAメチル化パターンがそれの遺伝子発現のパターンと相関したことを実証する。本発明者らはまた、突然変異分析を用いて、その領域についてのDNAメチル化のパターンを遺伝子的に改変することがその遺伝子座からの遺伝子発現のパターンを著しく改変することを示す。最後に、本発明者らは、その領域におけるクロマチン改変(異なる分析により測定される)が、DNAメチル化と遺伝子発現の本発明者らの相関を独立して確認することを示す。
【０１１２】
シロイヌナズナ染色体4は、短腕上にヘテロクロマチンの領域または瘤を含む。本発明者らは、瘤領域に及ぶ連続した1 kbの単位複製配列を増幅し、その領域を表す堆積マイクロアレイを作製した。本発明者らは、その領域のメチル化プロファイル、加えて、沈黙DNAの中に濃縮される修飾されたヒストン(H3K9)との関連を測定した。最後に、本発明者らは、遺伝子発現を測定し、その領域についての転写プロファイルを決定した。
【０１１３】
メチル化プロファイルは、実施例1に記載されているように測定された。簡単には、ゲノムDNAを一定の大きさに噴霧し、その後、mcrBCでの消化によりメチル化DNAを削除させた。メチル化されていないDNAを表す大きい断片を精製した。消化されていないおよび消化されたDNAを精製し、それぞれを異なる標識で標識し、染色体4上のゲノムを表すマイクロアレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションターゲットの比率をその後、測定した。
【０１１４】
本発明者らの瘤領域内でのメチル化損失の、遺伝子発現およびクロマチン状態の両方への影響を調べた。本発明者らは、対象となる本発明者らの領域を脱メチルするddm1突然変異を用いることを選択する。ddm1突然変異は、SWI/SNFと関係するクロマチン再構築複合体の破壊を通してゲノムDNAを低メチル化する。例えば、Jeddelohら、Nat Genet. 22(1):94-97 (1999)を参照されたい。
【０１１５】
本発明者らは、ヘテロクロマチンがddm1において抑制解除されることを測定した。上記の方法を用いて、本発明者らは、染色体4の1.7 Mbの瘤領域全体の地図を構築する。推定の遺伝子の位置および転写方向を決定した。DNAメチル化の量は、その領域を通しての位置によるメチル化プロファイリングを用いて検出された。さらに、転写の量は、その領域を通しての各位置について検出され、非メチル化でもあるほんの一握りの活性遺伝子を明らかにした。
【０１１６】
位置による転写プロファイルもまた、ddm1突然変異体植物から得られた。野生型植物とは対照的に、ddm1突然変異体は、大部分、トランスポゾンに対応している、その領域における多数のオープンリーディングフレームを発現した。
【０１１７】
クロマチン免疫沈降(ChIP)もまた、野生型および突然変異体植物において行われた。クロマチン免疫沈降は、以下の段階を含んだ。稚苗をホルムアルデヒドで処理し、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質相互作用をインビボの架橋により固定した。クロマチンを抽出、超音波処理、免疫沈降、および溶離した。溶離液は、架橋を逆戻りするように処理され、DNAは、溶離液から精製された。その結果生じたDNAをPCRおよびサザン/マイクロアレイ分析により分析した。
【０１１８】
これらの方法を用いて、クロマチンのタンパク質成分を同定し、それらの存在量を配列あたりを基本として定量した。ヒストンH3(H3)をリシン4位またはリシン9位のいずれかにおいてメチル化した。いずれかにおけるメチル化による修飾は、分子についての異なる運命を特定する。H3mK4は、発現される遺伝子で豊富であり、H3mK9は、転写的に沈黙の遺伝子で豊富である。H3mK9を含むゲノム領域は、ゆるくパッケージされたH3mH4とは違って、高度にコンパクトにされて示された。
【０１１９】
上記のように引き出されたデータを用いて、本発明者らは、ヒストンメチル化がDNAメチル化と相関することを決定した。メチル化ヒストンH3(mK9)は、発現された遺伝子への取り込みから排除された。同様に、メチル化ヒストンH3(mK4)は、沈黙遺伝子から排除された。野生型植物において、その領域において発現された遺伝子は、H3mK4と付随していた。沈黙遺伝子のみがH3mK9を含んだ。
【０１２０】
本発明者らはまた、ヘテロクロマチンのDNAメチル化がヒストンH3のリシン-9メチル化と相関することを測定した。DNAメチル化状態は、ゲノムDNAのクロマチンパッケージング状態と密接に整合した。
【０１２１】
ヘテロクロマチンのH3mK9およびDNAメチル化は、ddm1突然変異体において協調的に失われた。ddm1突然変異体は、メチル化シグナルおよびクロマチンパッケージングシグナルの両方を失った。
【０１２２】
全部で、これらのデータは、特定のゲノム、または遺伝子の領域、のメチル化プロファイルを同定することが、遺伝子発現およびクロマチンパッケージング状態の両方のその遺伝子座についての情報を与えることを実証している。転写プロファイリングは、遺伝子発現データを立証すること、および相関の程度を同定することを助ける。ChIPは同様の情報を提供することができるが、よりずっと大きな労働力を要し、相関の程度を決定するためにより多くのデータ操作を必要とする。
【０１２３】
実施例3：大きく複雑なゲノムのマイクロアレイへのDNA/DNAハイブリダイゼーションの検出
女性の胎盤のヒトゲノムDNA(Sigma)をGeneMachines Hydroshearを用いて1 Kbと4 Kbの間の均一な大きさの範囲へ剪断した。DNAを電気泳動後、低融解アガロースゲルのスライスから単離した。溶離されたDNAの濃度をNanodropスキャニング分光光度計を用いて測定した。約1 μgのDNAをBioprime-kit(Invitrogen)でのCy3-dCTPの直接的取り込みを用いてランダム-プライム標識をし、並行反応はCy5-dCTPを取り込んだ。標識されたDNAを合成反応後、精製し、Cy色素の取り込みをスペクトルスキャニング1000(NanoDrop)を用いてモニターした。ハイブリダイゼーション反応混液は、両方の合成反応、バックグラウンドを抑制するための非標識ヒトC0t-1 DNA(Invitrogen)、Agilent/Operon陽性対照オリゴヌクレオチド、およびcDNA上に存在する任意のポリA(またはT)へのハイブリダイゼーションを抑制するためのオリゴヌクレオチドを含んだ。Agilentヒト1カタログcDNAアレイを65℃でAgilentの使用説明書に従って、一晩、ハイブリダイズさせた。
【０１２４】
その後、アレイを、変動する量のSSCおよびSDSにおいて5分間のインキュベーションを用いて3回洗浄した。アレイを遠心分離機において空気乾燥し、その後、Agilentスキャナーおよびソフトウェア(vA6.1)を用いてスキャンした。各フィーチャーのハイブリダイゼーション強度をAgilent Feature Extraction Software(vA6.1)を用いてTIFFファイルから抽出した。その後、データファイルを視覚化のためにGenespring 5.0(Silicon Genetics)へインポートした。実験は3つのアレイ上で行われ、Lowess正規化(スポット対スポットおよびアレイ対アレイの正規化)および平均化されたデータセットを決定した。
【０１２５】
アレイは、12,814個のESTを表す、18,560個のフューチャーを含む(〜5000個の残っているフューチャーはAgilentの専売対照である)。結果は、標識された全ヒトゲノムターゲットを用いてのコード配列の検出が可能であることを実証している。全体的に見て、いずれのチャネルにおいても100 U未満の蛍光強度が測定されたことから、プローブの5.5 %(1,022個/18,560個のフューチャー)が不十分な性能を示した。しかしながら、1,022個のフューチャーのこのセット内において、たった260個のみが実際にはESTであり、一方、残っている762個は、Agilent対照フューチャーであった。十分に機能しない遺伝子のフューチャーは、アレイ上のもののたった2 %を示した(260/12,814)。データは広いシグナル範囲(3 log)に渡る1.0予測に従うため、実験は成功と考えられる。
【０１２６】
実施例4：DNAマイクロアレイを用いるメチル化プロファイリング
メチル化プロファイリング技術は、同じヒト女性胎盤のゲノムDNAに適用された。メチル化プロファイリングは、比率が1.0直線(紺青色)からはずれる場合メチル化(赤色)を予想し、t検定は、フューチャーの75 %より多くが、容認できる小さい標準偏差(SD)をもつことを明らかにした。これらの観察は、その技術がヒトゲノムにおいてメチル化されている配列を再現性をもって検出していることを示唆している。
【０１２７】
メチル化プロファイリング実験において、前で明確にされているように、たった845個のフューチャーが不十分な性能を示した。十分に機能しないフューチャーは、アレイ上における全ESTのたった1.2 %をあらわした(148/12814)。前のように、ESTシグナル強度の大部分は、3 logとほぼ合致し、コピー数における大きな差異を示している。
【０１２８】
実施例5：本発明の方法により検出されたヒトメチル化対立遺伝子の生物学的関連性
メチル化プロファイリングが予想どおりに働く場合には、色素比率シグナルは、メチラーゼでDNAをインビトロ前処理をし、それにより人工的に5mC含有量を増加させることにより変化するはずである。メチル化プロファイリングは、3ポイントのメチラーゼ反応混液タイムコース(1 U/μgあたり0分、3分、および15分)にかけられたヒト女性胎盤のゲノムDNAにおいて行われた。DNAは、メチル基をCpG配列におけるシトシンへ転移するM.SssI、および同様に、メチル基をゲノムのCCGG部位の外側のシトシンへ転移するM.MspIに曝された(http://rebase.neb.com)。定量的測定は、メチラーゼ反応が完了に達する前のタイムポイントを選択することにより検査された。工程は、色素交換はないが、前に記載されているように行われた。未処理の試料は、各アレイについて赤色(Cy5)に標識された。4つの異なるアレイ上における同じ1,500個のフューチャーの結果は、本発明のメチル化プロファイリング方法がインビトロでメチル化された一連のDNA試料内におけるメチル化の増加している存在を検出したことを明らかに実証している。さらに、多くの遺伝子座は、内因性メチル化を含む。表1は、女性胎盤のゲノム内にメチル化を含むと予想される上位16個の遺伝子座を列挙している。
【０１２９】
（表１）女性胎盤由来の5mC含有フューチャー予想
2005537029.tif 000003
＊表1は、各フューチャーから得られた平均(n=8(4つの色素交換))5mC強度比率をt検定p値により、およびその後、全体の比率により選別されたものを列挙している。比率は、メチル化削除の色素チャネルで割られた未処理の色素チャネルから得られた平均強度を反映している。比率範囲もまた示されている。
＊＊t検定p値は、GeneSpring(v5.0)内のシグナルチャネル精度(ピクセルハイブリダイゼーション強度/フューチャーのSD)を利用することにより決定された。それとして、表は、16個の最も再現性が高く得られた測定からのフューチャー同定および対応するメチル化分配を示す。
【０１３０】
表1におけるフューチャーの注釈を調べることにより、興味深い、生物学的に関連性のある遺伝子座は明らかであった。例えば、T細胞ガンマ受容体遺伝子ファミリーおよび嗅覚受容体-偽遺伝子-クラスター遺伝子座は、容易に同定された。T細胞受容体遺伝子座は、本来のT細胞受容体機能に必須である大量のDNAメチル化を含む(Dennis, K.ら、Genes Dev 15(22):2940-2944 (2001)；Geiman, T.M.ら、Biochim Biophys Acta 1526(2):211-220 (2001)；Geiman, T.M.およびK. Muegge、Proc Natl Acad Sci USA 97(9):p. 4772-4777 (2000))。
【０１３１】
二番目の興味深い遺伝子座は、嗅覚受容体-偽遺伝子-クラスターである。偽遺伝子クラスターは、偽遺伝子が転写的に沈黙しているため、メチル化配列を含むことが予想される。さらに、マウスにおいて、発現された嗅覚受容体対立遺伝子および付随した遺伝子クラスターが、起源の親の特異的な様式でのエピジェネティックなジーンサイレンシングに感受性が高いことが実証された(Ishii, T.ら、Genes Cells 6(1):71-78 (2001))。三番目の配列は、雄の血液においてそれのメチル化のおかげで以前にクローニングされたCpGアイランドに対応した(Cross, S.H.ら、Nat Genet、6 (3):p. 236-244 (1994))。同じ偽遺伝子クラスター由来の異なるフューチャーは、異なる比率を示し、アッセイ法の定量的性質を示している。メチル化を含むことが予想された個々の遺伝子座は、その後、独立した方法により立証された。
【０１３２】
フューチャー性能を統計的に検定するために、メチル化プロファイリングからの強度比率は、系における固有ノイズの指標としての自己-自己実験間のフューチャー性能により平均された。この様式におけるモデリングは、統御するプローブ性能が各実験において異なりうるため、最適ではない。データは再プロットされた。2つの遺伝子座が、5mCを含むことが予想されたこのデータセットから選択された：T細胞受容体、比率=1.38；p値=0.019、およびCpGアイランドクローンZ62622、比率=1.26；p値=0.017。メチル化を含まないことが予想された2つの遺伝子座もまた選択された（CpGアイランドクローンも同様）：Z65427、比率=1.03；p値=0.99、およびZ59762、比率=0.91；p値=0.87。各遺伝子座についてのGenBankアクセッションは検索され、PCRプライマーは、各ゲノムターゲットの最も3'側のエキソンの増幅を与えるように選択された。
【０１３３】
独立した立証について、女性胎盤のゲノムDNAをMcrBCでの部分的消化にかけ、ゲノムのメチル化および非メチル化領域由来のプライマーを用いて増幅した。PCR反応は、同様のMcrBC消化された鋳型濃度で確立され、同様の数のサイクルの間、増幅された。理論的には、非メチル化配列由来の産物の数は、一定のままのはずであり、一方、メチル化配列由来の産物の数は、McrBC消化の量に比例して減少するはずである。並行二連分析からの結果は、メチル化プロファイリングにより予想されたメチル化遺伝子座が、実際、内因的にメチル化されていることをきちんと確認した。同様に、内因的にメチル化されていないとメチル化プロファイリングにより予想された遺伝子座は、メチル化されていないことを独立して確認された。
【０１３４】
結論として、ヒトゲノム内において、本発明のメチル化プロファイリング方法は、インビトロのメチル化の定量的検出、およびゲノムの内因性DNAメチル化の定性的検出を示した。
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月27日(2005.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、細胞、組織または生物体のメチル化プロファイルを測定するための方法：
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNA断片の集団を提供する段階；
b. 対象となる非メチル化断片のパーセントを集団における最初のパーセントの40%以下まで低下させる段階、または対象となるメチル化断片のパーセントを集団における最初のパーセントの40%以下まで低下させる段階；および
c. 細胞、組織または生物体由来の少なくとも1つの核酸配列のメチル化プロファイルを測定するために段階(b)からの少なくとも1つのDNA配列の量を定量化する段階。
【請求項２】
段階bが対象となる非メチル化断片のパーセントを集団における最初のパーセントの40%以下まで低下させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階bが対象となるメチル化断片のパーセントを集団における最初のパーセントの40%以下まで低下させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
定量化する段階が定量的増幅を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
DNA断片の平均サイズが0.1 kb〜10 kbの間である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
段階bが、ランダムに切断もしくは剪断されたDNAからメチル化または非メチル化DNAを削除する段階を含み；かつ以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
c. 削除されているメチル化または非メチル化DNAから少なくとも1つのDNA配列の量を定量化し、それにより、細胞、組織または生物体由来の少なくとも1つの核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。
【請求項７】
削除する段階が以下を含む、請求項6記載の方法：
ランダムに切断または剪断されたDNAをメチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素で消化し、制限酵素により消化されたDNAおよび制限酵素により消化されないDNAを生じる段階；ならびに
未消化DNAから消化DNAを分離する段階。
【請求項８】
以下をさらに含む、請求項7記載の方法：
未消化または消化DNAを標識で標識する段階；
標識DNAを核酸にハイブリダイズさせる段階；および
核酸にハイブリダイズしている標識DNAを検出することにより少なくとも1つの核酸配列のメチル化状態を測定する段階。
【請求項９】
以下を含む、請求項6記載の方法：
a. 細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNA断片の集団を提供する段階であって、DNAが第一部分および第二部分を含み、かつ各部分がメチル化および非メチル化断片を含む、段階；
b. 第二部分からメチル化または非メチル化DNAを削除する段階；ならびに
c. 以下の少なくとも2つから少なくとも1つの配列の相対的量を定量化する段階：
第一部分、
第二部分におけるメチル化DNA、および
第二部分における非メチル化DNA。
【請求項１０】
削除する段階が以下を含む、請求項9記載の方法：
第二部分をメチル化感受性制限酵素またはメチル化依存性制限酵素で断片化し、消化DNAおよび未消化DNAを生じる段階；ならびに
未消化DNAから消化DNAを分離する段階。
【請求項１１】
以下をさらに含む、請求項10記載の方法：
第一部分を標識で標識する段階；
第二部分由来の消化または未消化DNAを標識で標識する段階；
第一および第二部分由来の標識DNAを核酸にハイブリダイズさせる段階；
核酸にハイブリダイズしている第一および第二標識を検出することにより核酸の相対的メチル化を測定し、それにより、細胞、組織または生物体由来の少なくとも1つの核酸配列のメチル化プロファイルを測定する段階。
【請求項１２】
メチル化DNAがランダムに切断または剪断されたDNAから削除されている、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
非メチル化DNAがランダムに切断または剪断されたDNAから削除されている、請求項6記載の方法。
【請求項１４】
定量化段階が、メチル化または非メチル化されたDNAが減少したDNAを、固体支持体に連結された核酸にハイブリダイズさせる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
固体支持体がマイクロアレイ、ビーズおよびマトリックスからなる群より選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
生物体が植物、動物、真菌および原核生物から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
核酸のメチル化プロファイルを核酸の転写プロファイルと比較し、それにより、核酸のメチル化プロファイルと転写プロファイルとの間の関係を測定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
核酸の転写プロファイルがマイクロアレイで検出される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
核酸のメチル化プロファイルを核酸のクロマチンパッケージング状態プロファイルと比較し、それにより、核酸のメチル化プロファイルとクロマチンパッケージング状態プロファイルとの間の関係を測定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
細菌病原体の検体のメチル化プロファイルを病原体の参照菌株と比較する段階であって、メチル化パターンの類似性が検体および参照菌株の共通の起源を示している、段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
核酸のメチル化プロファイルを核酸のコピー数と比較し、それにより、核酸のメチル化および核酸のコピー数の組み合わせの表現型への寄与を測定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
核酸のコピー数がマイクロアレイで検出される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも第一および第二DNA試料のメチル化プロファイルが比較され、
段階aが、DNA試料からランダムに切断または剪断されたDNA断片の集団を提供する段階を含み；
段階bが以下の：
(i)第一DNA試料のランダムに切断もしくは剪断されたDNAからメチル化または非メチル化DNAを削除する段階、および
(ii)任意で、第二DNA試料の切断もしくは剪断されたDNAからメチル化または非メチル化DNAを削除する段階；を含む、請求項1記載の方法であって、かつ、
以下をさらに含む方法：
c. 削除されている第一DNA試料由来の少なくとも1つの配列の量を切断もしくは剪断された第二DNA試料または削除されている第二DNA試料におけるその配列の量と比較する段階。
【請求項２４】
試料それぞれが第一部分および第二部分を含み、かつ各試料由来の第二部分がメチル化または非メチル化DNA断片について削除されている；ならびに
第一試料由来の第一部分、第一試料由来の第二部分、第二試料由来の第一部分および第二試料由来の第二部分がそれぞれ、標識されかつ核酸にハイブリダイズしており、第一部分のハイブリダイゼーションの比率がCGHプロファイルを提供し、かつ各試料についての第一および第二部分のハイブリダイゼーションの比率が各試料についてのメチル化プロファイルを提供している、
請求項23記載の方法。
【請求項２５】
試料それぞれが第一部分および第二部分を含み、かつ各試料由来の第二部分がメチル化または非メチル化DNA断片について削除されている；ならびに
2つの部分が標識されかつ核酸にハイブリダイズし、2つの部分が以下のいずれかである、請求項23記載の方法：
第一試料由来の第一部分および第一試料由来の第二部分；
第一試料由来の第二部分および第二試料由来の第一部分；
第二試料由来の第一部分および第二試料由来の第二部分；または
第二試料の第二部分および第一試料の第一部分。
【請求項２６】
削除する段階が以下を含む、請求項23記載の方法：
ランダムに切断または剪断されたDNAをメチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素で消化し、制限酵素により消化されたDNAおよび制限酵素により消化されないDNAを生じる段階；ならびに
未消化DNAから消化DNAを分離する段階。
【請求項２７】
以下をさらに含む、請求項26記載の方法：
消化または未消化DNAを標識で標識する段階；
標識DNAを核酸にハイブリダイズさせる段階；および
核酸にハイブリダイズしている標識DNAを検出することにより少なくとも1つの核酸配列のメチル化状態を測定する段階。
【請求項２８】
ポリヌクレオチドを示している固体支持体であって、ポリヌクレオチドが標識DNA部分にハイブリダイズしており、その部分が細胞、組織もしくは生物体由来のランダムに切断または剪断されたDNA断片の集団由来であり；
その部分が、対象となる非メチル化断片のパーセントにおいて集団における最初のパーセントの40%以下まで低下している、または対象となるメチル化断片のパーセントにおいて集団における最初のパーセントの40%以下まで低下している、固体支持体。
【請求項２９】
DNA部分が、集団における最初のパーセントと比較して非メチル化断片の40%以下しか有していない、請求項28記載の固体支持体。
【請求項３０】
DNA部分が、集団における最初のパーセントと比較してメチル化断片の40%以下しか有していない、請求項28記載の固体支持体。
【請求項３１】
DNA部分が以下の段階によりメチル化または非メチル化断片について削除されている、請求項28記載の固体支持体：
ランダムに切断または剪断されたDNAをメチル化感受性またはメチル化依存性制限酵素で処理する段階；および
以下のいずれかの段階：
制限酵素により断片化されないDNAを選択する段階；または
制限酵素により断片化されたDNAを選択する段階。
【国際調査報告】
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2005537029.tif 000005
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