(57)【要約】本発明はインビトロでアルファシヌクレイン凝集を測定するための方法を提供する。本発明の方法は化合物の抗−凝集の可能性を決定するために、または抗−凝集もしくは分散性を有する薬剤をスクリーニングするために有用である。
2005506513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファシヌクレインの分散を促進するための化合物の能力を検出する方法であって：順序正しく
（ａ）化合物およびチオフラビンＴを、凝集したアルファシヌクレイン溶液に加え、ここでチオフラビンＴは凝集したシヌクレインに結合し、そして約４８５ｎｍで蛍光を生じ；
（ｂ）化合物がシヌクレインの凝集状態を変化させるために十分な時間、工程（ａ）の溶液をインキュベートし；そして
（ｃ）シヌクレインの減少した凝集状態の指標として、約４８５ｎｍの蛍光の減少を測定する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項２】
アルファシヌクレインが精製された組換えタンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
凝集したアルファシヌクレインがさらに配列番号３および配列番号４から成る群から選択される強化ペプチドを含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アルファシヌクレインがアルファシヌクレインの残基６１〜９０（配列番号３）を含んで成る合成ペプチドである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アルファシヌクレインの凝集を防止するための化合物の能力を検出する方法であって、順序正しく
（ａ）水溶液中で化合物、アルファシヌクレインおよびチオフラビンＴを合わせ；
（ｂ）予想されるアルファシヌクレイン凝集物を提供するために十分な時間、工程（ａ）の溶液をインキュベートし、ここでチオフラビンＴが凝集したシヌクレインに結合し、そして約４８５ｎｍで蛍光を生じ；そして
（ｃ）約４８５ｎｍで蛍光量を測定し、そして同様に完全に凝集した対照に比べて化合物がアルファシヌクレイン凝集物に及ぼす効果を比較する、
工程を含んでなる上記方法。
【請求項６】
アルファシヌクレインが精製された組換えタンパク質である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
凝集したアルファシヌクレインがさらに配列番号３および配列番号４から成る群から選択される強化ペプチドを含んでなる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アルファシヌクレインがアルファシヌクレインの残基６１〜９０（配列番号３）を含んでなる合成ペプチドである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
関連出願との関係
本出願は、２００１年１月３日に出願された米国特許仮出願第６０／２５９，４４２号の優先権を主張し、その内容は引用により本明細書に編入する。
発明の分野
本発明はインビトロでアルファシヌクレイン（ａｌｐｈａ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の凝集を測定するための方法を提供する。本発明の方法は化合物の抗−凝集の可能性（ａｎｔｉ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を決定するために、または抗−凝集もしくは分散性（ｄｉｓ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を持つ薬剤をスクリーニングするために有用である。
発明の背景
アルファシヌクレインは凝集し、そしてレビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ）として知られる高密度の細胞質内封入体に沈積し得る１４０個のアミノ酸のタンパク質であり、レビー小体はレビー小体痴呆、びまん性レビー小体病、パーキンソニズムを伴うアルツハイマー病、アルツハイマー病のレビー小体変異体、痴呆を伴うパーキンソン病およびパーキンソン病の病因に関与している。
【０００２】
散発性および家族性パーキンソン病は類似の臨床的発現および神経病理学的プロフィールを現す（黒質および他の脳の領域におけるレビー小体およびレビー神経突起（Ｌｅｗｙ ｎｅｕｒｉｔｅ））。凝集したアルファシヌクレインはレビー小体およびレビー神経突起の主要な成分である（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。実際にはレビー小体およびレビー神経突起はパーキンソン病およびレビー小体痴呆の特有症状である。アルファシヌクレイン遺伝子中に２つの異なる点突然変異（Ａ５３ＴおよびＡ３０Ｐ）が、優性にパーキンソン病を遺伝する別の家族で同定された（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８ および１９９８年１２月３０日に公開された国際公開第９８／５９５０号明細書）。アルファシヌクレインのこれらの点突然変異によりアルファシヌクレインは凝集する能力を増し（Ｎａｒｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、そして突然変異したアルファシヌクレインの分解が遅れることが示された（Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。アルファシヌクレインの量および凝集を上昇させるこれら突然変異の一貫した効果は、これらのプロセスが種々の神経変性障害の病態生理学において重要な役割を果たしていることを示唆している。実際に、野生型のアルファシヌクレインの過剰発現は、細胞毒性と関連している（Ｏｓｔｒｅｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。すなわちアルファシヌクレインの凝集を阻害する化合物は、神経変性に関して疾患修飾剤（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として新規治療法を表す。
【０００３】
アルファシヌクレインが高齢または損傷における系の不具合により傷害を受けた時、このタンパク質は他のシヌクレイン分子に強いる（ｉｍｐｒｅｓｓｅｄ）ことができる異常型の形状および構造を取ると考えられている。次いでこれらの分子は互いに結合し、そしてタンパク質凝集物がニュローンの内側に蓄積そして沈積し、ここでそれらはサイズの上昇に伴い酸化的傷害を発揮する。このプロセスは最初にニューロンが脳機能においてその必要な役割を達成することを妨げ、そして進行すると最終的にはニューロンを殺す。アルファシヌクレインの病理学的凝集を特異的に防止し、かつ／または毒性凝集物を分散させる新規薬剤を開発することが望まれる。
【０００４】
アルファシヌクレインフラグメントはアルツハイマー病のアミロイドプラークの構成成分であり、故に別名非−アミロイド成分（ｎｏｎ−ａｍｙｌｏｉｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：ＮＡＣ）である。アルファシヌクレインの別の病態生理学的かかわりは、これまでに認識されていないレビー小体痴呆の高い発症に関する。神経病理学的証拠の不在から、レビー小体痴呆はアルツハイマー病と誤診されることが多い。
【０００５】
Ｂｉｅｒｅ ｅｔ ａｌにより、そして２０００年４月６日に公開された国際公開第００／１８９１７号明細書は、アルファシヌクレイン突然変異体（Ａ３０Ｐ／Ａ５３Ｔ−既知の自然に存在する突然変異体、Ｅ８３Ｑ／Ａ９０Ｖ、Ｈ５０Ｙ／Ａ５３ＴおよびＨ５０Ｔ／Ａ５３Ｔ／Ａ７６Ｔの二重突然変異体）を記載する。これらの突然変異体は凝集を確認するために遠心法により試験される。
【０００６】
Ｍａｓｌｉａｈにより、そして２０００年４月１３日に公開された国際公開第００／２００２０号明細書はアルファシヌクレイン抗−凝集化合物のスクリーニング法を記載する。金属が誘導するアルファシヌクレインの凝集が行われ、そしてチオフラビン−Ｓ染色により測定される。
【０００７】
Ｗａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌにより、そして１９９９年２月１１日に公開された国際公開第９９／０６５４５号明細書はポリグルタミンポリペプチドとのＧＳＴ融合タンパク質、およびチオフラビンＴ凝集の使用を含むポリグルタミン反復ドメインの凝集を監視するためのアッセイを記載する。
発明の要約
本発明は蛍光色素、チオフラビンＴの蛍光を測定することによりアルファシヌクレインの凝集状態における変化を検出するための方法を提供する。
【０００８】
本発明の１つの態様は同様な完全に凝集した対照に対して、化合物を含有するサンプル中のチオフラビンＴの蛍光の程度を比較することにより、アルファシヌクレインの分散を促進する化合物の能力を検出する方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、完全に凝集することができる同様のサンプルに対して、化合物を含有するサンプル中のチオフラビンＴの蛍光の程度を比較することにより、アルファシヌクレインの凝集を防止する化合物の可能性を試験する方法を提供する。
詳細な説明
本発明は、パーキンソン病、多系統萎縮症、レビー小体痴呆、びまん性レビー小体病、パーキンソニズムを伴うアルツハイマー病、アルツハイマー病のレビー小体変異体、痴呆を伴うパーキンソン病、およびアルファシヌクレイン（ａｌｐｈａ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）の神経毒的凝集物の分散が関与する関連障害の処置に対する取り組み、ならびにアルファシヌクレイン凝集物を分散する能力を持つ化学物を同定するために設計された技術の応用を含んでなる。分散性を有する薬剤を同定するための取り組みには、凝集したアルファシヌクレインと会合した時に蛍光を発する化合物であるチオフラビン（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ）Ｔの使用が関与する。上に挙げた神経変性的障害の処置に有用な薬剤は、シヌクレイン凝集物／チオフラビンＴ複合体により発する蛍光に減少を引き起こし、そして高速および高処理量で標準的な蛍光計を用いて読むことができる。
インビトロ抗−凝集アッセイ
本発明の１つの態様では、凝集したアルファシヌクレインの分散（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を促進するための化合物の能力を検出するための方法が提供され、この方法は順序正しく：
（ａ）化合物およびチオフラビンＴを、凝集したアルファシヌクレイン溶液に加え、ここでチオフラビンＴは凝集したシヌクレインに結合し、そして約４８５ｎｍで蛍光を生じ；
（ｂ）化合物がシヌクレインの凝集状態を変化させるために十分な時間、溶液をインキュベートし；そして
（ｃ）シヌクレインの減少した凝集状態の指標として、約４８５ｎｍの蛍光の減少を測定する、
工程を含んでなる。
【００１０】
本発明の別の態様では、本発明の方法は化合物によるアルファシヌクレインの凝集を防止する可能性を試験するために使用することができる。この方法は、順序正しく
（ａ）水溶液中で化合物、アルファシヌクレインおよびチオフラビンＴを合わせ；
（ｂ）予想されるアルファシヌクレイン凝集物を提供するために十分な時間、溶液をインキュベートし、ここでチオフラビンＴが凝集したシヌクレインに結合し、そして約４８５ｎｍで蛍光を生じ；
（ｃ）約４８５ｎｍの蛍光量を測定し、そして同様に完全に凝集した対照に比べて化合物がアルファシヌクレイン凝集物に及ぼす効果を比較する、
工程を含んでなる。
【００１１】
本発明のアルファシヌクレインは、天然のタンパク質、細胞中で生産されるタンパク質でよく、組換えで生産され、そして精製されてもよく、またはアルファシヌクレインのフラグメント、好ましくは合成ペプチドでよい。本発明で使用するために特に好適であるのは、天然のアルファシヌクレインタンパク質の残基約６１〜約９０、ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ（配列番号３）を含んでなるアルファシヌクレインの合成ペプチドである。さらにアルファシヌクレインはアルファシヌクレインの数種の異なる形態の組み合わせでもよい。例えば、しかし限定するわけではないが天然のタンパク質を合成ペプチドと組み合わせることができ、あるいはアルファシヌクレインに由来する２以上のペプチドを組み合わせることができる。特に合成ペプチドはアルファシヌクレインの凝集の速度を強化するために使用することができる。使用する「強化ペプチド（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）の」量は、本明細書に記載する方法を使用して種々のペプチド濃度でアルファシヌクレインの凝集速度を試験することにより決定する。アルファシヌクレインの凝集速度を強化するために有用である２つの特別なペプチドは、ヒトのアルファシヌクレインの残基約６１〜約９０および約６１〜約７５に由来し、以下の配列：
（ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ）（配列番号：３）または
（ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴ）（配列番号：４）
を有する。
【００１２】
凝集したアルファシヌクレインは、タンパク質を生理学的にバランスが取れたバッファー中で約０〜約５０℃の温度でインキュベートすることにより生成される。本発明はベータシートの凝集物を形成することが可能な適切なｐＨおよび塩濃度を維持する任意のバッファーの使用を可能とする。適切なバッファーはチオフラビンＴの存在下でアルファシヌクレインをインキュベートし、そして増加した蛍光を監視することにより試験することができる。一般に好適なバッファーは、約２００ｍＭ ＫＣｌを含有する約６．０〜約８．０のｐＨ範囲のリン酸緩衝化生理食塩水である。
【００１３】
本明細書で使用する用語「化合物」は、凝集を防止することにより、または凝集したアルファシヌクレインを破壊することによりいずれかでアルファシヌクレインの凝集状態を変化させる可能性を有する有機分子を称する。例えば本発明の範囲を限定するわけではないが、化合物には低有機分子、他の合成または天然アミノ酸ペプチド、タンパク質または合成もしくは天然の核酸配列、または前述の任意の化学的誘導体を含むことができる。本発明の方法で使用する化合物の好適な濃度は、約０．００１〜約５００マイクロモル、好ましくは約０．００１〜約１００マイクロモルの範囲である。
【００１４】
チオフラビンＴの蛍光は当該技術分野では周知である。用語「約」は、４８５ｎｍの発光最大付近の発光波長を称する。発光スペクトルは、例えばＬａｋｅｏｗｉｃｚ、プレナム出版（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）（１９８３）による「蛍光分光学の原理（Ｐｒｉｎｃｅｐｌｅ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」における当該技術分野で周知の技術を使用して得ることができる。
【００１５】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するが、それを限定するものではない。
【００１６】
【実施例】
実施例１
可溶性アルファシヌクレインのクローニングおよび発現
組換えヒトα−シヌクレインタンパク質の発現および精製系は、当該技術分野で周知の標準的技法を使用して開発した。（例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．モレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版（コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９を参照にされたい）。α−シヌクレインはヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））から増幅し、そして配列を確認した。
プライマー５’−ＣＴＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＣＧＡ−’３（配列番号１）および
５’−ＧＧＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＣ−’３（配列番号２）を設計してヒトアルファ−シヌクレインｃＤＮＡのフラグメントを増幅した。増幅は１００μｌの最終容量で製造元のプロトコールに従いＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより行った；これを３５サイクルの９５℃で６０秒の変性および６０℃で９０秒のアニーリング−伸長にかけた。ＰＣＲ産物はＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）により精製し、そして製造元のプロトコールに従い（ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）クローニングキット、ストラタジーン クローニング システム（Ｓｔｒａｙａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）、ラジョラ、カリフォルニア州）、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ベクターのＳｒｆＩ部位に連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’Ｋａｎ スーパーコンピテント（ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（ストラタジーン）の形質転換後、別れたコロニーを選択し、一晩成長させ、そしてプラスミドＤＮＡをＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（プロメガ）により精製した。挿入物の同定は個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡをシークエンシングすることにより確認した。
【００１７】
α−シヌクレインｃＤＮＡをｐＴＹＢ１細菌発現ベクターにクローン化した。ＥＲ２５６６大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞（ニューイングランド バイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）の形質転換および３７℃で６時間の誘導後、組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して変性条件下で単離した。適当な条件下で組換えヒトα−シヌクレインは、本明細書に記載するチオフラビンＴ（ＴＦＴ）アッセイにより測定される予想された凝集物を形成した。
【００１８】
実施例２
チオフラビンＴスクリーニングアッセイ
蛍光に基づくＴＦＴ高処理量スクリーニングアッセイを、α−シヌクレイン凝集について開発した。チオフラビンＴは４５０ｎｍで吸収し、そして４８５ｎｍで発光する；蛍光はベータシート構造の存在下で４０倍上昇する（ＬｅＶｉｎｅ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｔｅｎ）。チオフラビンＴはフルカケミカ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ）から得た。アッセイバッファー（０．２Ｍ 塩化カリウム ｐＨ＝６；０．０７５％アジ化ナトリウム）中に２４マイクログラム（２４μｇ）のアルファシヌクレインタンパク質を、１０μＬを保持するマイクロ容量のマルチウェルプレートに加えた。次いでチオフラビンＴ（ＴＦＴ）を２０μＭの最終濃度で各ウェルに加え、そして内容物を徹底的に混合した。アルファ−シヌクレインは分散アッセイを行う前に完全に凝集させた。凝集の程度はチオフラビンＴ蛍光の上昇により測定した。アルファ−シヌクレイン凝集はシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）（凝集の速度を強化するためのペプチドを使用して）の有無で行った。以下のペプチドがシヌクレイン凝集の速度を上げることが分かった：
ｓｙｎ ６１−９０（ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ）（配列番号：３）
および ｓｙｎ ６１−７５（ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶＶＴＧＶＴ）（配列番号：４）
アルファシヌクレインは、４８５ｎｍでチオフラビンＴの蛍光の上昇により測定されるベータシート構造の形成を通して凝集した。この迅速で、廉価で、そして均一なスクリーニングアッセイは４〜８％の変動係数を表す。
【００１９】
凝集したアルファシヌクレインは、抗凝集性に関して化合物をスクリーニングするためにアッセイする。３０％のＤＭＳＯ中に希釈した２μＬの推定される抗凝集化合物（４０μＭの化合物の最終濃度）をウェルに加える。凝集したアルファシヌクレイン／ＴＦＴ複合体および化合物を含む混合物を、室温で４時間インキュベートする。複合体の分散を促進する化合物は、アルファシヌクレイン／ＴＦＴ複合体を含有するウェルと比べて蛍光の減少により観察される。
【００２０】
実施例３
方法：
アッセイ前に、約５対１のシグナル対ノイズが達成されるように濃縮したアルファシヌクレインペプチド６１−９０（配列番号３）はチオフラビンＴ（２０μＭ）を含有するアッセイバッファーで希釈した。リファンピシンを２ｍＭの濃度で８％ＤＭＳＯ中に維持した。超凝集物（ｓｕｐｅｒ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を壊すために、溶液はマイクロプローブを具備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍ ソニケーターで超音波処理した。サンプルは２５についてコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の５０ｍｌ遠心管中、３０ｍｌで超音波処理し、３秒バーストした。アッセイはＬＪＬ ＨＥ（ＬＪＬ バイオシステムズ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））プレート中で以下のように行った：１８μｌのアルファシヌクレイン／チオフラビンＴ混合物をウェルに加え、続いて２μｌの３０％ＤＭＳＯまたは３０％ＤＭＳＯに希釈したリファンピシンを加えた。対照としてチオフラビンＴを含むバッファーをアルファシヌクレインを含まない別のウェルに加えた。サンプルを室温で図１に示す時間インキュベートし、そして次いで４４０ｎｍおよび４８５ｎｍの波長を使用してＬＪＬリーダーで読んだ。
結果
インキュベート時間：
アルファシヌクレインの分散に及ぼすインキュベート時間の効果を試験するために、アルファシヌクレインを０．１μＭ〜１００μＭにわたる濃度曲線のリファンピシンと２および５時間インキュベートした。濃度応答曲線を図１に示し、そしてＥＣ５０値およびバックグラウンドに対するシグナルを表１に示す。このデータは各時点での１１サンプルの平均±標準偏差である。
【００２１】
【表１】
2005506513.tif 000003
【００２２】
バックグラウンドに対するシグナルは、４連のサンプルバッファー（低い値）およびアルファシヌクレイン／ＴＦＴバッファー（高い値）からのものである。ＥＣ５０は各時点の１１サンプルから作成した。
【００２３】
これらのデータは２時間および５時間のインキュベート時間が、バックグラウンドに対するシグナルならびにリファンピシンＥＣ５０に関して同一であったことを示す。しかし図１に示す濃度応答曲線は、リファンピシンが１μＭ〜１００μＭの濃度範囲のみで効果があったことを示す。
【００２４】
インキュベート時間を狭め、ならびに使用のためのリファンピシンの濃度を確認するために、上記実験を５分〜２時間にわたるインキュベート時間および１．５６μＭ〜１５μＭのリファンピシン濃度を使用して繰り返した。濃度応答を図２に示す。ＥＣ５０およびバックグラウンドに対するシグナルを表２に示す。
【００２５】
【表２】
2005506513.tif 000004
【００２６】
データはリファンピシンが１５分までにアルファシヌクレインシートが分散し始めることを示す。１時間までに完全と見える分散があり：さらに２時間のインキュベート時間で分散はない。バックグラウンドに対するシグナルはインキュベート時間にかかわらず妥当なままであった。６０および１２０分のインキュベートに関するＥＣ５０は同一のようである。
【００２７】
【表３】
2005506513.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】
２時間（黒丸）および５時間（白丸）のインキュベート時間でのリファンピシン濃度曲線；ＲＦＵ＝相対蛍光単位（カウント／秒×減衰因子として算出）。
【図２】
リファンピシンによるアルファシヌクレインの分散に及ぼす時間の効果。黒丸＝５分、白丸＝１５分、黒三角＝３０分、白三角＝６０分、黒四角＝１２０分。
【図１】
2005506513.tif 000006
【図２】
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【国際公開パンフレット】
2005506513.tif 000008
2005506513.tif 000009
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2005506513.tif 000024
2005506513.tif 000025
2005506513.tif 000026
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506513.tif 000027
【国際調査報告】
2005506513.tif 000028
2005506513.tif 000029
2005506513.tif 000030