(57)【要約】  本発明は、ヒトの個体中で、ＣＤ４を有する細胞を含有する細胞集団に特定の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するための、ヒトＣＤ４分子に親和性を有する診断薬を製造するための標識リガンドの使用に関する。  さらに、本発明は、ＣＤ４分子とＣＤ４を有する細胞に特異性を有する標識リガンドを含有する組成物、ならびにヒトＣＤ４を有する細胞が臨床的に重要である疾患の程度と進行を決定する方法に関する。
2005512083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの個体中でヒトＣＤ４を有する細胞を含む細胞集団の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するための診断薬を製造するためのヒトＣＤ４分子に特異性を有する標識リガンドの使用。
【請求項２】
標識リガンドは、抗体、抗体フラグメント、組換え抗体、組換え抗体フラグメント、ＣＤ４表面抗原に対して高い親和性を有する合成ペプチド、ペプチドミメティック、カーボンハイドレート、タンパク質およびグリコプロテインおよびアプタマーから成る群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
抗体、抗体フラグメント、組換え抗体または組換え抗体フラグメントは、モノクロナール抗体またはモノクロナール抗体フラグメントであるか、またはこれらから由来する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
抗体、抗体フラグメント、組換え抗体または組換え抗体フラグメントは、SEQ ID NO.1からSEQ ID NO.6に記載される配列を認識し、これに結合する、請求項２または３に記載の使用。
【請求項５】
抗体、抗体フラグメント、組換え抗体フラグメントの組換え抗体は、ヒトＣＤ４のコンフォメーションエピトープを認識し、かつこれに結合する、請求項２から４までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
抗体、抗体フラグメントまたは組換え抗体または組換え抗体フラグメントは、抗−ＣＤ４−抗体である、請求項２から５までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
リガンドの標識は、γ−エミッター、ポジトロンエミッター、磁気材料、密度コントラスト材料およびこれらの混合物から成る群から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
リガンドの標識は、インジウム−１１１、テクネチウム９９ｍ、テクネチウム−９９、ヨウ素−１３２、医学的画像提供法のための他のラジオアイソトープならびにこれらの混合物から成る群から選択される１種以上のラジオアイソトープを含むγ−エミッターである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
ラジオアイソトープがテクネチウム９９ｍまたはインジウム−１１１である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
リガンドの標識は、フッ素−１８、炭素−１１、ヨウ素−１２４、医学的画像提供法のための他のアイソトープならびにこれらの混合物から成る群から選択される１種以上のアイソトープを含むポジトロンエミッターである、請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
リガンドの標識は、ガドリニウム、超常磁性物質、水化酸化鉄粒子、医学的画像提供法のための他の材料ならびにこれらの混合物から成る群から選択される磁気材料を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項１２】
標識リガンドは、密度コントラスト材料を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項１３】
ヒト−ＣＤ４を有する細胞は、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞およびランゲルハンス細胞および好酸性顆粒から成る群から選択される、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
リンパ球は、非リンパ性細胞を含むグループまたは集団から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
細胞集団はヒトの個体から由来する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
ＣＤ４−分子およびＣＤ４を有する細胞または粒子に特異性を有する標識リガンドを含む組成物。
【請求項１７】
ＣＤ４を有する細胞または粒子は、ヒトＣＤ４を有する細胞または粒子である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
診断薬としての請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
個体中の移動パターンおよび／または分布パターンを決定するための診断薬を製造するための、請求項１６から１８までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
疾患の程度と進行を決定する方法において、ヒト−ＣＤ４を有する細胞は、臨床的に重要であり、以下の段階を有する：
ａ）  個体でのヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンのin vivo分析を用意する
ｂ）  個体でのヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンのスタンダードなin vivo分析を用意する
ｃ）  段階ａ）と段階ｂ）で用意された分析の相違を決定し、これにより疾患の程度と進行を決定する
ことを特徴とする、疾患の程度と進行を決定する方法。
【請求項２１】
疾患は、自己免疫疾患、腫瘍疾患、感染症、移植後の反発発症から成る群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階ｂ）でのスタンダードな分析は、健康な個体でのヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンの分析である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
段階ｂ）でのスタンダードな分析は、同じヒトの個体の先行する分析から得られた個体の分布パターンおよび／または移動パターンである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
段階ａ）では、付加的に疾患に対する治療を受けた個体でのヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンの分析を用意する、請求項２０から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
治療の内容は、化合物または医薬品の投与である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの個体でＣＤ４を有する細胞を含む特定の細胞集団の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するための診断薬を製造するためのヒトＣＤ４分子に特異性を有する標識リガンドの使用に関する。
【０００２】
モノマーのグリコプロテインＣＤ４は、ヘルパーＴ−リンパ球の特徴的な細胞表面分子である。これは、５５ｋＤａの分子量を有し、細胞外領域、疎水性浸透膜ならびに細胞質部分から成る。ヒトＣＤ４は、ヒトのヘルパーＴ−リンパ球上に発現するだけではなく、僅かな密度で、骨髄と胸腺内のＴ−リンパ球−前駆体上にも発現する。ヒトの場合は、単球、マクロファージ、樹状細胞および好酸性顆粒は、ＣＤ４分子［Marsh & Pelchen-Matthews, 1996］も有する。ヒトＣＤ４遺伝子は、第１２染色体の短腕上に位置している［Isobe et al., 1986］。
【０００３】
ＣＤ４分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーのその４つ免疫グロブリン様細胞外ドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）に基づいて分類されている［Maddon et al., 1985］。アミノ末端ドメイン１（Ｄ１）は、変化可能な免疫グロブリンドメインのような類似構造を有する。ドメイン２（Ｄ２）と一緒に、これは、全部で６０オングストロームの長さを有する固い構造を形成する。ドメインＤ１とＤ２は、柔軟なジョイントを介してドメインＤ３とＤ４に結合する。
【０００４】
最も重要な天然のＣＤ−４リガンドは、いわゆる抗原提示細胞（APZ）上の主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex, MHC）のクラスII分子である。この場合に、これは抗原構造を選別する免疫系の特殊細胞であり、これは免疫応答を識別することができる。ＣＤ４分子の細胞外ドメインＤ１とＤ２は、主にMHC−クラスII分子の２−鎖の非多形部位と結合する［Clayton et al., 1989; Cammarota et al., 1992］。おそらく、MHC−クラスII分子（MHC-II）のａ２−鎖もＣＤ４との相互作用に重要なのかもしれない［Vignali et al., 1996］。
【０００５】
それらのＤ１−ドメインを介して、ＣＤ４分子は相互に結合することができ、これによりＴ−細胞レセプター（TZR）／MHC-II-ペプチド−錯体を安定化し、シグナルトランスダクションの効果を高める官能性オリゴマーが生じる［Li et al., 1998］。隣接するドメインＤ３とＤ４を介して、ＣＤ４はTZR/CD3−錯体とも結合する［Vignali et al., 1996］。ＣＤ４分子は、TZRと抗原ペプチド提示MHC-IIとの相互作用の間に、Ｔ細胞の抗原特異性刺激を強める。よって、ＣＤ４−コレセプター系は、抗原の反応性を高めるだけではなく、高い抗原特異性の保持も可能にする［Koenig et al., 1996］。
【０００６】
ＣＤ４は、Ｔ−リンパ球中でのシグナルトランスダクションを活性化する。それらの細胞質ドメインは、いわゆるｓｒｃ−ファミリーのＴ細胞に特異的なタンパク質−チロシンキナーゼ（p56lck）と共有結合しない［Veilette et al., 1988］。細胞質ＣＤ４−ドメインの近隣部位は、システイン基を介してp56lckのＮ−末端領域と相互作用する［Turner et al., 1990］。
【０００７】
さらに天然のヒトＣＤ４のＣＤ４−リガンドは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のgp120、化学走性サイトカインIL-16、免疫グロブリンである。gp120とMHC-IIの結合部位は、同一ではなく、近くで並んで、部分的にオーバーラップして存在する。HIV gpl20は、主にＣＤ４分子のＤ１ドメインに結合する［Clayton et al., 1989］。HIVによるＣＤ４＋細胞の感染は、細胞表面上のＣＤ４−発現の傷害を招く［Hoxie et al., 1986a］。これにより、APZのMHC-IIと相互作用する感染細胞の能力が低減し、疾患の進行を促進してしまう。
【０００８】
慢性および慢性−再発性炎症が多くの疾患と共に生じ、この場合に免疫系が重要である。慢性−再発性炎症が、種々の器官もしくは組織を襲う。急性疾患とは異なり、炎症巣中に原則的に質が変化した細胞タイプが蓄積する。これは特異的表面分子を用いて同定することができる。これらの分子は、特にヘルパーＴ−リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞および好酸性顆粒上に種々の強さで発現するヒトＣＤ４分子である。これらの細胞、特にＴ−リンパ球は、慢性炎症細胞の実質的な集団である。
【０００９】
特定のモノクロナール抗体は、ヒトＣＤ４分子を高い特異性で認識することができ、このタンパク質構造に結合し、ひいては炎症中のヒトＣＤ４発現細胞に高い特性で結合する。
【００１０】
生理的条件では、これらの炎症細胞は不活性な分化状態で存在し、特徴的な移動パターンおよび／または分布パターンで、第一および第二リンパ器官ならびに循環血液を巡る。
【００１１】
さらに、ヒトＣＤ４を有する細胞からは、悪性または良性腫瘍疾患を生じる原因である腫瘍細胞が発生する。特定の腫瘍疾患、例えば、特定のリンパ腫の場合には、ヒトＣＤ４分子が発現したままであり得る。従って、ＣＤ４発現細胞の質的かつ量的検出がin vitroで確立された免疫診断法である。一方でフローサイトメトリック分析は、末梢血管中での量的な検出を可能とし、ex vivo免疫組織学的方法を用いて、すなわち、生検により疑わしい組織や、その位置的分布パターンを分析することができる。
【００１２】
しかし、両方の方法は、生きた生物中のＴ−ヘルパー細胞の移動パターンおよび／または分布パターンもしくは疾患のある組織／器官内であり得る蓄積およびそれらの程度の客観的な証言を提供できる状況にない。これは、以下の原因を有する：
１）末梢血管は、最大５％が、体のあらゆるヒトＣＤ４発現細胞の限られた代表的部分だけを有する。
２）各固体は、日を追って、末梢のヒトＣＤ４発現細胞の数に相当の多様性がある。
３）末梢のヒトＣＤ４発現細胞数は、慢性炎症巣中で空間的に限定された蓄積の同定および局在化を決して可能にできず、または局在化はヒトＣＤ４発現細胞を腫瘍へと変質させてしまう。
４）生検が、診断薬にとって決定的な炎症巣または腫瘍または転移の領域に命中する可能性が低い。
５）生検材料から、炎症領域または腫瘍または転移の実際の空間的な広がりを推論することができない。
６）経過コントロールまたは治療コントロールは、繰り返し生検によってのみ可能であり、かつ当事者自体に重大な負担をもたらす。
【００１３】
米国特許第6146614号明細書には、画像提供法を使用して哺乳類でのリンパ球分布および移動を決定する方法および種々の疾患の経過を診断するため、ならびにこのような疾患に関する種々の治療の応答を監視するため、および前記疾患を治療するための医薬品を同定するための、これらの決定の使用が記載されている。米国特許第6146614号明細書の実施例は、マウスＣＤ４抗原に対するモノクロナール抗体の使用に関する。１実施例は、ヒトの細胞を標識するためのこのような抗体の使用に関する。しかし、これらの実施例は、ヒトＣＤ４とマウスＣＤ４との間で何の交叉反応も無いという一般的に公知の事実に対して反論している。本明細書の例７は、相応する比較試験を示しており、これから米国特許第6146614号明細書に記載されているマウスＣＤ４に対する抗体がヒトＣＤ４に対して何の交叉反応も示されないことが判明する。従って、米国特許第6146614に記載された方法は、ヒトの個体でのＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび移動パターンを決定するために適切ではない。
【００１４】
上記の慣習的診断方法の制限に基づき、移動パターンおよび／または分布パターン、およびＣＤ４表面分子を有する炎症細胞と腫瘍細胞の蓄積を非侵襲的に決定するための方法、ならびに治療条件（治療コントロール）下で、それらを再分散もしくは分解する至急の必要性がある。
【００１５】
従って、本発明は、上記先行技術の欠点を克服することに課題の根底を成している。特に、侵襲性診断法を用いてヒトの個体中でヒトＣＤ４発現細胞の移動パターンおよび／または分布パターンを決定できることが本発明の課題である。
【００１６】
本発明のもう１つの課題は、慢性炎症疾患、感染疾患または腫瘍疾患またはヒトの個体が移植後に免疫抑制治療に（疑いのある）診断を有する患者においてヒトＣＤ４発現細胞の移動パターンおよび／または分布パターンを安全で効果的かつ簡単に決定することである。
【００１７】
本発明のもう１つの課題は、慢性炎症浸潤の場合に前記表面抗原を有する細胞が急性浸潤の場合よりも多く存在する認識に基づいて、慢性炎症病巣、例えば自己免疫疾患と、急性炎症、例えば、感染に条件付けられる炎症との識別を可能にすることである。よって、リウマチ様関節炎の際に慢性炎症滑膜内には、ＣＤ４発現細胞が増えていることが証明できる。ここでは、末梢血管に対してＣＤ４／ＣＤ８の比が２〜７倍に高まる［Immunology of rheumatic diseases. Hrsg. S. Grupta & N. Talal. Plenum Medical Book Company, New York and London, 1985］。さらに、ヘルパーＴ−リンパ球の抗原特異的活性は、結果としてＣＤ４−表面発現の著しい増大を伴う［Ridgeway et al., 1998, J. Immunology 161:714-720］。
【００１８】
本発明のもう１つの課題は、自己免疫疾患の場合の空間的広がりおよび炎症巣の強度の局在化と決定を可能にし、ならびに自己免疫疾患の経過または自己免疫疾患の場合の治療法の影響を評価することである。
【００１９】
本発明のもう１つの課題は、造血系の悪性および良性疾患において（疑いのある）診断を有するヒトの個体中でヒトＣＤ４発現腫瘍もしくはそれらの転移を、安全に、効果的かつ簡単に局在化し、ヒトＣＤ４を有する腫瘍もしくはそれらの転移の空間的広がりを決定し、腫瘍疾患（経過コントロール）の経過と腫瘍疾患（治療コントロール）の場合の治療法を評価することである。
【００２０】
本発明によれば、これらの課題は、ヒトの個体中でヒトＣＤ４を有する細胞を含む特定の細胞集団の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するための診断薬を製造するためのヒトＣＤ４分子に特異性を有する標識リガンドを使用することにより解決された。
【００２１】
ヒトの生体での細胞集団でヒトＣＤ４を有する細胞の空間的位置もしくは配置は、本発明による意味では分布パターンと称される。ヒトＣＤ４発現細胞の位置または配置は、固有の組織内または導入された外部組織内での分布および合成材料もしくは上記外部組織および合成材料の境界面での配置に関する。
【００２２】
ヒトＣＤ４を有する粒子の分布は、ヒトの生体に投与された後に生じる。分布パターンは、全部の生体でも、生体の一部に関しても決定することができる。
【００２３】
ヒトＣＤ４を有する粒子に関しては、ヒトＣＤ４分子を組換え生成物系で製造することができる（ｒｅｃＣＤ４）。ｒｅｃＣＤ４で、様々な大きさの適切な担体を被覆することができる。担体材料は、プラスチック粒子であることができるが、しかし膜に包囲され、内部に治療上活性な物質を含有している形成物であることもできる。従って、ヒトＣＤ４分子を、担体または粒子または小胞体、例えば、リポソームに認識構造（ガイド）として取り付けることができ、これらを例えば、薬理学的物質で充填して、ＣＤ４と相互作用した分子を再び有する目的細胞の近くに持って行くことができる。これらの分子は、種々の体細胞上に発現するＭＨＣ−クラスII抗原のメンバー（ヒトHLA−クラスII抗原）、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ−細胞であり、更なる一連の細胞上で、環境因子、例えば、特定のサイトカインの影響下に調節することができる。ＭＨＣ−クラスII分子の調節（Heraufregulirung）は、病原性プロセスと関連してもたらされるため、特定の組織領域内でヒトＣＤ４に誘導された薬理学的作用物質を統制する可能性が生じる。ＣＤ４を有する粒子は、例えば、相補的構造を検出するために、例えば、HIVの表面タンパク質gp120に使用し、抗ウイルス性作用物質の局所的富化を伝えることができる。しかし、抗ＣＤ４抗体または抗体フラグメントを粒子、分子または小胞体へ結合し、次にＣＤ４を有する組織領域中に誘導されるて分子の“ガイド”として考えることもできる。
【００２４】
ヒトＣＤ４を有する細胞もしくは粒子の移動パターンとは、本発明の意味の範囲内では、組織および末梢血管を含めたヒトの生体内でのヒトＣＤ４を有する細胞もしくは粒子の移動であると解釈される。ヒトＣＤ４を有する細胞もしくは粒子の移動は、全体の生体またはその特定の部分もしくは器官に関して決定することができる。
【００２５】
ヒトＣＤ４発現細胞は、本発明の意味の範囲内では、単球、マクロファージ、樹状細胞およびランゲルハンス細胞、好酸性顆粒およびヘルパーＴ−リンパ球を含むことができる。特定の場合には、これらの細胞は、自己免疫疾患、感染症、悪性疾患の場合、または移植もしくはインプランテーションの場合の炎症性浸潤の組成物中に含有される。他の場合には、これらの細胞は、腫瘍が形成されるように、その制御を変更（変質）する。その他の場合には、器官または組織を移植した後、または合成代替物をインプランテーションした後の合併症が関係する。合併症が、移植片またはインプラントの損失を生じ得ることは共通である（免疫学的反発反応）。
【００２６】
ＣＤ４を有する細胞と特異的に相互作用できる物質／化合物は、本発明の意味の範囲内ではリガンドと称される。リガンドは、例えば、細胞表面上で発現するか、または粒子の表面上で固定される特定の分子、この場合にはＣＤ４分子と相互作用することができる。リガンドは、専らまたは広く大部分がＣＤ４表面分子と相互作用し、かつこれらに結合する特性を有する、それぞれ任意の物質または化合物であることができる。
【００２７】
本発明により使用可能な診断薬には、ヒトＣＤ４分子に特異性を有する高親和性標識リガンドが含まれる。
【００２８】
標識リガンドは、有利に、抗体、抗体フラグメント、組換え抗体、組換え抗体フラグメント、ＣＤ４表面抗原に高い親和性を有する合成ペプチド、ペプチドミメティック、カーボンハイドレートおよびグリコプロテインから成る群から選択される。標識リガンドは、特に有利にヒトＣＤ４分子のＤ１−ドメイン中のエピトープを認識するのが有利である。
【００２９】
特に、抗体、抗体フラグメント、組換え抗体および／または組換え抗体フラグメントが有利であり、その際、モノクロナール抗体またはモノクロナール抗体フラグメントまたはそれから由来する抗体または抗体フラグメントがとりわけ有利である。さらに、抗体、抗体フラグメント、組換え抗体または組換え抗体フラグメントは、有利にSEQ ID NO.1〜SEQ ID NO.6に記載された配列を認識し、かつこれに結合する。特に有利には、抗体、抗体フラグメント、組換え抗体または組換え抗体フラグメントは、ヒトＣＤ４のコンフォメーションエピトープ（図２）を認識し、かつこれに結合する。抗体、抗体フラグメントまたは組換え抗体または組換え抗体フラグメントは、抗−ＣＤ４抗体であることができる。抗体フラグメントは、本発明により特に有利に使用可能である。
【００３０】
リガンドは、ポリクロナールまたはモノクロナール抗体であることができ、その際、モノクロナール抗体が有利であり、特にモノクロナール抗体Max. 16H5が有利である。しかし、全部の抗体は、イムノゲンであることができ、ヒトの生体に投与後に、それ自体に向けられた免疫反応を誘発する。小さなリガンドは、僅かなイムノゲンであるので、これらは有利なリガンドである。
【００３１】
小さなリガンドとして、抗体フラグメント、例えば、F(ab')2、Fab'またはFabが有利である。特に、抗−ヒト−ＣＤ４−Fab'−フラグメント、とりわけモノクロナール抗体Max.16H5のものが有利である。
【００３２】
小さなリガンドの１例は、OKT3（Orthoklon）である。Orthoklonは、マウスハイブリドーマ細胞から形成されるモノクロナール抗−ヒト−ＣＤ３−抗体であり、Orthoによる製剤学的例示は、移植後の免疫学的反発反応を治療するために使用できる。他のモノクロナール抗体または抗体フラグメント（例えば、ヒトＣＤ４に対する）は、自体公知の方法でハイブリドーマテクニックを使用して製造できる。
【００３３】
リガンドとして、組換え法を用いて微生物中で製造されるような抗体または抗体フラグメント、例えば、一本鎖抗体、例えば、single chain Fv（scFv）、抗体類似構造、例えば、微抗体（minibody）、およびヒトＣＤ４（human-CD4）のような表面分子に特異的に結合できる、例えば組換え抗体のような別のフラグメントを使用できる。
【００３４】
さらに、リガンドとして、ヒトＣＤ４のような表面分子に高い特異性で結合できるタンパク質、グリコプロテイン、ペプチド、ペプチドミメティック、脂肪族および環式炭化水素化合物およびアプタマーを使用できる。ペプチドミメティックとは、ペプチドではないが、サイズ分布および電荷分布のような重要な特性について類似している化合物を意味する。アプタマーは、上記の表面分子、例えば、ヒトＣＤ４に高い親和性を有するＤＮＡ−構造またはＲＮＡ−構造である。
【００３５】
リガンドの標識は、医学的画像提供の方法を用いて標識リガンドの時間的かつ空間的に局在化を可能にする、それぞれの標識分子により行うことができる。
【００３６】
標識リガンドは、有利に、γ−エミッター、ポジトロンエミッター、磁気材料、密度コントラスト材料およびこれらの混合物から成る群から選択される。
【００３７】
標識リガンドは、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍ、テクネチウム−９９、ヨウ素−１３２、医学的画像提供法のための他のラジオアイソトープならびにこれらの混合物から成る群から選択される１種以上のラジオアイソトープを含むγ−エミッターであることができる。前記ラジオアイソトープは、特に有利にはテクネチウム−９９ｍまたはインジウム−１１１である。
【００３８】
さらに有利な実施態様では、標識リガンドは、フッ素−18、炭素−１１、ヨウ素−１２４、医学的画像提供法のための他のアイソトープならびにこれらの混合物から成る群から選択される１種以上のアイソトープを含むポジトロンエミッターである。
【００３９】
もう１つの有利な実施態様では、標識リガンドは、常磁性物質、例えば、ガドリニウム、超常磁性物質、水化酸化鉄粒子、他の医学的画像提供法のための材料ならびにこれらの混合物から成る群から選択される磁気材料を含むことができる。
【００４０】
標識リガンドは、密度コントラスト材料を有することもできる。
【００４１】
ヒト−ＣＤ４を有する細胞は、有利にＴ−リンパ球およびＢ−リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞および長腕細胞ならびに好酸性顆粒から成る群から選択され、特にリンパ球は、非リンパ性細胞を含むグループまたは集団から選択されることができる。
【００４２】
ヒトＣＤ４を有する細胞を含む細胞集団の移動および／または分布パターンの分析は、診断薬とＣＤ４を有する細胞との特異的な相互作用により、ヒトの個体に標識リガンドを投与した後に行われる。in vivo-診断薬の特異的相互作用は、結果として標識された細胞中で生じる。これらの細胞は、炎症浸潤、特に慢性炎症の場合に決定的に関与する。
【００４３】
二者択一的に、ヒトＣＤ４を有する細胞を含む細胞集団の移動パターンと分布パターンの分析は、ヒトの生体から生じ、ＣＤ４を有する細胞を含有する細胞集団との特異的な相互作用により、ヒトの生体外で行うことができる。この場合にも、生体内に導入された標識細胞内で特異的な相互作用が生じる。体外の細胞の標識を同じ患者に使用することは、核医学では十分に通常である。しかし、これまでに、この方法で細胞は直接に種々のアイソトープで標識されてきた。このことは、患者の健康保護（患者に戻る前に結合していない放射能を除去する）に役立つテクニック的理由（標識に必要な十分に高い濃度）によるか、または／および経済的理由（高価な製品を標識に効果的な極めて少ない量で使用する）がある。
【００４４】
この場合に、ヒトの生体の外側での標識は、次のように行われる：患者から血液を取る。この血液から細胞を作成し、体の外側で、アイソトープで標識されたリガンド、例えば、抗ＣＤ４抗体と一緒にインキュベーションする。この後に、結合していないリガンドを除去し、かつ精製した細胞プレパレーションを同じ患者に再び注射する。次に、公知かつ記載された方法（ガンマカメラまたは検出器ソンデ）で体内の標識細胞の分布を追う。これらの方法は、例えば、手術の際に標識細胞を腫瘍または腫瘍の周囲に注射する場合に使用するのが有利である。よって、これらは流出するリンパ管と後続のリンパ節を探す。このように、鉛筆に似た検出器ゾンデを用いて、手術の間にどのリンパ節に前記細胞が優先的に流れ込むかを確認することに成功する。特によく利用されるリンパ節は、おそらく転移の場所であるので、外科医は、これらをすぐに取り除くことができる。
【００４５】
本発明による診断薬の使用によって、医学的画像提供法を用いて、ＣＤ４表面分子を有する細胞の生体内での移動パターンおよび／または分布パターンを決定することができる。前記移動パターンおよび／または分布パターンの描写の可能性は、通常かつ病理学的条件下で可能であり、疾患の程度と進行度が決定され、この場合に前記細胞は臨床的に重要である。
【００４６】
特に、本発明による診断薬の使用を用いて、ヒトＣＤ４を有する細胞の移動パターンおよび／または分布パターンの分析により、ヒトの生体内での慢性炎症巣が局在化し、かつ急性炎症と区別できる。ヒトＣＤ４を有する細胞の移動パターンおよび／または分布パターンの分析は、とりわけ疑いのある診断を解明し、臨床上の経過をモニターし、抗炎症治療の結果コントロールに適切である。
【００４７】
ヒトＣＤ４を有する細胞の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するためのもう１つの適用分野は、悪性細胞（腫瘍細胞）を見つけだすことであり、この上に前記表面分子が発現し、かつ診断薬と相互作用するため、標識された腫瘍細胞が生じる。特に、ヒトＣＤ４を有する細胞の移動パターンおよび／または分布パターンの分析は、造血系の腫瘍の局在化もしくはそれらの転移に役立ち、これらの上に、前記表面分子が発現する。
【００４８】
さらに、診断薬を用いて、いわゆる放射免疫治療（ＲＩＴ）を実施できる。このＲＩＴに関しては、診断的ラジオアイソトープは、これに対して、例えば、β−エミッターとしてのRe-186、Re-188、J-131、Y-90、Sm-153、α−エミッターとしてのBi-213のような強いα−または／およびβ−放射線と交換される。この場合に、誘導化された同じ種類の抗体、それらのフラグメントもしくはリガンドが使用される。DTPA−誘導化分子は、例えば、In-111とY-90である。J-123とJ-131ならびにTc-99とRe-188は、診断と治療のための更なるアイソトープのペアーである。治療で費やされたラジオアイソトープにより放射されたα−または／およびβ−放射線は、放射免疫治療薬の直接的な環境にあるか、またはこれにより標識される細胞を破壊する。このように、標識された腫瘍細胞もしくは有害な炎症細胞または他の不所望な細胞を選択的に破壊することができる。ここでは、ＣＤ４分子を有する細胞だけではなく、直接的に囲んでいる細胞も損害または分解されるのが有利である。広く除去されて存在する組織は妨害されない。
【００４９】
本発明による診断薬は、さらに感染症、例えば、ウイルス性疾患の場合に炎症細胞を作成および定量化するために使用できる。これにより、例えば、リンパ節膨張、特定の腫瘍疾患の段階評価、経過コントロールおよび治療コントロール、および抗ウイルス性治療のモニターが可能である。
【００５０】
特に、以下のFormenkreisの疾患に疑いのある診断の場合に、ヒトの個体中で特定の細胞集団の移動パターンと分布パターンの分析に本発明を使用することが適切である：
自己免疫疾患、感染症、造血系の悪性および良性疾患、感染症、またはＣＤ４もしくはＣＤ８を有するＴ−リンパ球の病原性の意味を仮定するための疾患。
【００５１】
自己免疫疾患は、リウマチ性関節炎、多重硬化症、全身性エリテマトーデス、乾癬、または炎症性腸疾患、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎であることができる。悪性または良性疾患は、造血系の疾患、例えば、骨髄腫、リンパ腫、または白血病または充実性腫瘍、例えば、メラノーマ、腎細胞カルチノーマ、卵巣ガンまたは肺ガンであることができる。感染症は、バクテリアまたはウイルスにより引き起こされる全ての疾患、例えば、HIVであることができる。
【００５２】
診断薬としての標識リガンドの本発明による使用は、ヒトの個体で１種以上の移植組織片、例えば、細胞、組織または器官および／またはインプラント、例えば、組織代替物または血管代替物、デポー剤、ポンプまたはフィルターが存在する場合に、ＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンを決定することもできる。
【００５３】
移動パターンおよび／または分布パターンの決定は、有利に、医学的画像提供法、例えば、放射線画像、磁気共鳴法または場合によりコンピューター制御された断層画像提供法で実施できる。画像提供は、個別または連続撮影から成る。これは、個人の完全な撮影によるか、または部分的な撮影により行うことができる（スキャンニング）。
【００５４】
ガンマ放射線で標識されたリガンドの移動パターンおよび／または分布パターンは、ガンマカメラまたは単光子放射型コンピューター断層撮影法（single photon emission computed tomography, SPECT）用のカメラを用いて決定できる。ポジトロンエミッターは、例えば、ポジトロン断層撮影（positron emission tomography, PET）により決定することもできる。人体中での磁気粒子の移動および／または分布パターンは、磁気共鳴断層撮影法（MRT）または“磁気共鳴画像”（MRI）により決定できる。これらの画像提供法の使用は公知である。
【００５５】
全身分析（Scan）の医学的画像提供法は、有利である。本発明は、個々の生体部分または器官のスキャンも含める。スキャンは、分、時間、日、週、またはそれ以上長く、標識リガンドの投与に応じて実施することができる。正確な時点は、種々のファクターに左右され、例えば、標識リガンドの種類、量、ヒトＣＤ４を有する細胞もしくは粒子の含量、または疾患の経過に左右される。正確な時間のファクターは、通常使用される最適アルゴリズムを用いて、経験豊かな当業者により算出することができる。医学的画像提供法は、最後に個別または連続したスキャンを行う。
【００５６】
ＣＤ４を有する細胞の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するための標識リガンドを診断薬として本発明により使用することで、前記の１種以上の疾患を患ったヒトの個体中で治療的応答または治療的効果をさらに決定することができる。各個体は、相応する疾患の治療で処置される。治療上の反応として処置された個体中でＣＤ４を有する移動パターンおよび／または分布パターンは、医学的画像提供法を用いて決定される。これは、治療がヒトＣＤ４発現細胞の移動パターンおよび／または分布パターンを変化するかどうかを決定するように行われる。
【００５７】
ＣＤ４を有する細胞の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するための標識リガンドを診断薬として本発明により使用することで、前記のような医学的画像提供法を用いることにより、化合物または医薬品がヒトの体内中でのヒトＣＤ４発現細胞の分布パターンおよび／または移動パターンを変化させるかどうかを決定することにより、ヒトの生体中でのヒトＣＤ４発現細胞の分布パターンおよび／または移動パターンを変化させる化合物もしくは医薬品のポテンシャルを見積もることができる。よって、分布パターンおよび／または移動パターンは、標準化した分布パターンおよび／または移動パターンと相違する場合に変化する。
【００５８】
ＣＤ４を有する細胞の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するための標識リガンドを診断薬として本発明により使用することで、化合物または医薬品がヒトの体内でヒトＣＤ４発現細胞の分布パターンおよび／または移動パターンを変化させるかどうかを決定することにより、自己免疫疾患、腫瘍疾患または感染症を治療するための医薬品の同定に利用できる。化合物または医薬品の投与により得られる分布パターンおよび／または移動パターンは、前記の疾患を患っていないヒトの個体のものと比較される。
【００５９】
ＣＤ４を有する細胞の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するための診断薬としての標識リガンドを本発明により使用することで、非自己を移植した後、または他の理由で、可能性のあるイムノゲン細胞、組織器官を受け取るための、ならびに組織、器官およびそれらの機能を交換もしくは援助するための合成および半合成材料をインプランテーションした後に、免疫抑制療法の最適なガイドも可能にする。このことは、前記のような医学的画像提供法を用いて、ヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンが、移植片／インプラントから連想される炎症反応もしくは免疫反応を解明するように変化するかどうかを決定することにより行われる。これらの推測を、標準化したパターンの前記の分布パターンおよび／または移動パターンとの相違によるか、または前記個人での以前の時点までに決定されたパターンとの相違により行うことができる。
【００６０】
本発明のもう１つの対象は、ＣＤ４分子およびＣＤ４を有する細胞または粒子に特異性を有する標識リガンドを含む組成物である。ＣＤ４を有する細胞またはヒトＣＤ４を有する細胞の粒子または粒子が有利である。
【００６１】
組成物が、治療または診断薬であるのが有利であり、組成物が個体、有利にはヒトの個体でＣＤ４を有する細胞もしくは粒子の分布パターンおよび移動パターンを決定するための診断薬であるのが特に有利である。
【００６２】
標識リガンドとＣＤ４を有する細胞は、有利に上記のものである。粒子は、有利に種々の材料の球状粒子から選択される。粒子は、例えば、リポソームであることができる。ＣＤ４を有する粒子は、相補的な構造を有することができ、例えば、体細胞、バクテリアまたはウイルス上で相互作用し、これで標識されるか、または作用物質を近くに運ぶ。粒子は、医薬、有利には診断薬または治療薬を含有することもできる。
【００６３】
本発明による組成物、特に診断薬は、ヒトの個体中でヒトＣＤ４発現細胞もしくは合成粒子の移動を決定するために適切である。この目的のために、ＣＤを有する細胞、例えば、炎症性細胞、または標識リガンドを有する粒子を、標識細胞または粒子を含む。
【００６４】
本発明の組成物が得られるようにインキュベーションする。標識した細胞または粒子を含有する組成物、特に診断薬は、患者に投与でき、かつそれらの分布パターンと移動パターンは、前記のように医学的画像提供法により決定することができる。
【００６５】
本発明による組成物、特に診断薬は、ＣＤ４を有する細胞および／または粒子を有する標識リガンドと接触させることにより製造することができる。ＣＤ４を有する細胞は、ＣＤ４を有する細胞の移動パターンおよび／または分布パターンを決定すべき、自体のヒトの個体から生じるか、または他のヒトの個体から生じることができる。組成物、特に診断薬の製造は、ＣＤ４を有する細胞または粒子に特異的な標識リガンドが相互作用され、その結果、標識されたヒトＣＤ４を有する細胞または粒子が生じるようにin vitroで実施することができる。本発明による組成物が、ＣＤ４を有する細胞を含む場合には、ヒトＣＤ４を有する細胞をリガンドで特異的に標識するために、分離または単離させてはならない。これらは、例えば、細胞集団で存在する。このような細胞集団は、ヒトＣＤ４を有する細胞を標識するために、標識リガンドとインキュベーションすることができ、これにより、本発明による診断薬が得られる。ヒトＣＤ４を有する細胞または粒子と相互作用された標識リガンドは、特異的な標識した細胞または粒子を生じる。この場合に、相互作用は、例えば、結合、会合、複合または共役を意味する。
【００６６】
標識リガンドをヒトの個体へ投与することは、あらゆる方法を用いて実施でき、ヒトＣＤ４を有する細胞または粒子とのその特異的相互作用がヒトの生体内で可能であり、その際、標識されたヒトＣＤ４を有する細胞または粒子が発生または形成される。方法には、注射、注入、デポー剤への封入、インプランテーション、経口摂取および直腸投与ならびに局所投与が含まれる。有利な投与法は、注射であり、例えば、これは静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹膜内で行うことができる。特定の場合には、複数または組み合わせた投与法が使用される。標識リガンドは、溶解した形またはコロイド状で存在することができ、その際、ヒトの体内に投与するための担体液、例えば、注射用の水、生理食塩水が適切である。
【００６７】
本発明による診断薬は、有利に０．０１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で使用される。リガンドが抗体の場合には、投与量は、０．２ｍｇ／診察から７ｍｇ／診察の間、もしくは０．００３ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重の間である。必要な放射能の量は、使用されるアイソトープにより決定され、経験豊かな専門家により決定することができる。リガンドを放射性アイソトープで標識する場合には、使用される活性は、インジウム−１１１の場合には１回用量で１．５〜１０．０ｍＣｉであり、テクネチウム−９９の場合に１回用量で１０〜３０ｍＣｉであり、ヨウ素−１２３の場合に１回用量で５〜１０ｍＣｉであり、ヨウ素−１２４の場合に１回用量で５〜１０ｍＣｉであり、フッ素−１８の場合に１回用量で１０〜２０ｍＣｉであり、炭素−１１の場合に１回用量で２０〜３０ｍＣｉである。
【００６８】
診断薬がヒトＣＤ４を有する粒子を含有する場合には、これを前記のように標識リガンドが特異的に粒子と相互作用し、標識されたヒトＣＤ４を有する粒子を含有する本発明による診断薬が得られるようにin vitroで製造することができる。
【００６９】
ヒトの生体内でのヒトＣＤ４を有する標識粒子の投与は、ＣＤ４を有する細胞と標識リガンドを含有する本発明による診断薬に関して上記したように、種々の方法により行うことができる。
【００７０】
本発明による組成物の移動パターンと分布パターンの決定、特に本発明による診断薬の決定は、本発明によるヒトＣＤ４分子に対して特異性を有する標識リガンドの本発明の使用に関して上記したように、自体の適用分野において有利に使用可能である。
【００７１】
さらなるアスペクトにおいて本発明は、疾患の程度と進行を決定する方法に関し、その際、ヒトＣＤ４を有する細胞は、下記の段階を含み臨床的に重要である。
ａ）  個体中でヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンのin vivo分析を用意する。
ｂ）  個体中でヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンのスタンダードなin vivo分析を用意する
ｃ）  段階ａ）と段階ｂ）で用意された分析の相違を決定し、これにより疾患の程度と進行を決定する。
【００７２】
段階ａ）および／または段階ｂ）で用意された分析は、標識リガンドまたは本発明による診断薬を前記のように個人に投与し、同様に前記のような医学的画像提供法を用いて、個体中でＣＤ４を有する細胞または診断薬の分布パターンおよび／または移動パターンを決定することにより有利に得られる。
【００７３】
段階ａ）で用意された分析は、有利に病気にかかったヒトの個体からのものである。疾患は、有利に前記のような移植後の自己免疫疾患、腫瘍疾患、感染症および反発発症から成る群から選択される。
【００７４】
段階ｂ）でのスタンダードな分析は、有利に病気にかかっていない個体中でヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンの分析である。
【００７５】
さらに有利な実施態様では、段階ｂ）でのスタンダードな分析は、同じヒトでの前記分析から得られる個体の分布パターンおよび／または移動パターンである。
【００７６】
段階ａ）では、付加的に疾患に対する治療を受けた個人でのヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンの分析も用意できる。治療の内容は、有利に化合物または医薬品の投与である。治療における個人の応答は、医学的画像提供法を用いて、治療がヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンを変化させるかどうかを決定することに特徴付けられる。有利には、これらのパターンを、病気の個体のものと、例えば、治療開始前もしくは以前の治療の時点までと比較するか、または病気ではない個体のものと比較する。
【００７７】
以下に本発明を図と実施例を用いて説明する。
【００７８】
図の説明
図１は、マウスとヒトヘルパーＴ−リンパ球の特異的染色のドット−ブロットを示す。ドット−ブロットは、次の二重染色を示している：Ａ．マウス細胞：マウスＣＤ３／マウスＣＤ４（ＧＫ  １．５）；Ｂ．ヒトの細胞；ヒトＣＤ３／ヒトＣＤ４（最大１６Ｈ５）；Ｃ．マウス細胞：マウスＣＤ３／ヒトＣＤ４（最大１６Ｈ５）；Ｄ．ヒトの細胞：ヒトのＣＤ３／マウスＣＤ４（ＣＫ１．５）。
【００７９】
図２は、ヒトＣＤ４のコンフォメーションアイソトープの図式を半球体モデルの形で示す。
【００８０】
実施例
例１：抗−ヒトＣＤ４の製造とFab'-フラグメントへの酵素的分離
実施例は、ヒトＣＤ４に特異性を有するモノクロナールマウス抗体の製造と精製ならびにFab'−フラグメントへの酵素的分離を記載する。
【００８１】
モノクロナール抗体Max.16H5は、ヒトＣＤ４のＤ１ドメイン中のエピトープを認識する。イムノグロブリン（IgG1）は、プロテイン−A−アフィニティークロマトグラフィにより、ハイブリドーマの上澄みから単離した。タンパク質Aカラムの溶出液を中和し、ＰＢＳで透析し、かつイムノグロブリン濃度を１ｍｇ／ｍｌに調節した。モノクロナール抗体の同一性と特異性は、ＳＤＳ−ゲル電気泳動により、Maus-IgG1をコントロールとして使用して、ウエスタンブロットでリコンビナントヒトＣＤ４を用いて検出した。天然に発現するヒトＣＤ４への結合（生物活性）は、フローサイトメトリー（FACS）によりFACScan（Becton-Dickinson）を使用して検出した。指標細胞として、ヒトＣＤ４発現ヘルパーＴリンパ球の（個々に種々の）割合を含有する凍結貯蔵したヒト末梢単球細胞（PBMZ）を使用した。これは解凍後に抗−ヒト−ＣＤ４でインキュベーションし、洗浄し、かつ結合したマウス−IgGを蛍光（FITC）標識した目的の抗−マウスイムノグロブリン−Fab2−フラグメント（DAKO F 0479）をFACScan中で定量的に測定した。
【００８２】
抗−ＣＤ４の全てのIgGを、パパインでFab'−フラグメントとFc−フラグメントまで消化した。酵素による分離は、予め相応して最善の状態にした反応時間で分解し、反応混合物をカラムクロマトグラフィーによりプロテイン−Aを分画した。この場合に、プロテイン−A に結合し、かつ溶出液中にFab'−フラグメントが現れた。溶出されたFab'−フラグメントのサイズ（約５０kD）と割合（約９０％）をＳＤＳ−ゲル電気泳動により決定した。抗−ヒトＣＤ４−Fab'−フラクションの生物活性、すなわち、選択的に天然に発現するヒトＣＤ４に結合するそれらの能力を、FACS分析により定量的に測定した。このために、ヒトとPBMZを相互にFab'−フラグメントとFITCで標識した目的の抗−マウス−イムノグロブリンとインキュベーションし、ヒト−ＣＤ４発現細胞をフローサイトメトリー中で分析した。
【００８３】
例２：１１１−Inを用いる抗−ヒトＣＤ４−Fab'−フラグメントの放射化学的標識
この実施例は、キレート形成剤を用いる抗−ヒトＣＤ４−Fab'−フラグメントの誘導化を説明する。
【００８４】
抗−ヒトＣＤ４−Fab'を０．１ＭのNaHCO３緩衝液中で、サイクリックジエチレントリアミン−ペンタ酢酸（cDTPA）と脱水反応により反応させた。次に、このFab'−DTPA−誘導体を０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ５．４に変え、１０ｋＤの濾過フィルターを介して大型交換クロマトグラフィーにより精製した。誘導化したフラグメントの分取を０．５〜１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで調節し、放射化学的に標識されるまで＋４℃で貯蔵した。
【００８５】
１１１−インジウム（半減期：２．６日、約２４７keVの平均エネルギーガンマ放射）を用いる抗−ヒトＣＤ４−Fab'−DTPA−誘導体の標識により、放射線診断薬を注射の直前に調製した。このために、約１０ｇのDTPAで誘導化したフラグメントを、３００Ｃｉ  １１１−塩化インジウムと室温で３０分間インキュベーションした。遊離塩化インジウムを、PD−１０−カラムにより、放射線診断薬（１１１−インジウムで標識された抗−ヒトＣＤ４−Fab'−）から分離した。
【００８６】
例３：抗−ＣＤ４−Fab'−DTPAとの結合アッセイ
この実施例は、例１からの抗−ＣＤ４−Fab'と例２からのDTPAで共役した抗−ＣＤ４−Fab'−DTPAの特異性と生物活性が相違しないことを証明する。
【００８７】
指標細胞を、徐々に濃度を上げた抗−ヒト−ＣＤ４のFab'−もしくはDTPAで誘導化したFab'とインキュベーションし、結合しないリガンドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。指標細胞（ヒトPBMZ）に結合したリガンドを蛍光（FITC）で標識した目的の抗−マウス−イムノグロブリン−Fab2−フラグメント（DAKOF0479）とインキュベーションし、再び洗浄し、かつヒトＣＤ４発現細胞の蛍光をFACS中で定量的に算出した。
【００８８】
抗−ＣＤ４−Fab'−フラグメント（ヒトＣＤ４の）の特異性は、DTPAの誘導化により影響しなかった。DTPAで誘導化され、かつDTPAで誘導化されていない抗−ヒトＣＤ４−Fab'−フラグメントが、同じサイズの蛍光を発するヒト−ＣＤ４を有する指標細胞のフラクションと同一であった。両方のリガンドの生物活性は、この場合に比較可能であり、同じ濃度のFab'もしくはFab'-DTPAの場合に、蛍光染色の飽和度が達成された。同様に、リガンドの濃度が減少する場合に、蛍光損失が比較可能であった。
【００８９】
例４：１１１−インジウムで標識された抗−ヒト−ＣＤ４−Fab'−フラグメントの生物内分布
この実施例は、高いヒト−ＣＤ４発現を有する組織内での１１１−インジウムで標識された抗−ヒト−ＣＤ４−Fab−DTPA（放射線診断薬）の選択的富化を示した。
【００９０】
放射線診断薬の生物内分布をin vivoで試験するための症状発現前モデルとして、ヒトＣＤ４のトランスジェニック発現を有するマウスモデルを使用した（ＣＤ４／ＤＲ３−マウス）。固有の（“野生型”−）ＣＤ４の代わりに、ＣＤ４／ＤＲ３−マウスモデル中でヒトＣＤ４を発現させ、その際、ヒトＣＤ４の発現パターンを、レセプターの自然な分布に正しく適応させた（Laub 2001）。
【００９１】
ＣＤ４／ＤＲ３−マウスと野生型−マウス（C57/BL6）に放射線診断薬それぞれ２０Ciを静脈内注射した：注射の１、４、２４および４８時間後にリンパ性およびリンパ性ではない器官を取り出し、計量し、かつ組み込まれた放射能をガンマーカウンターで測定した（LKB model 1282, Wallac-Perkin Elmer, Turku Finland）。半減期を校正するために、放射線診断薬の分取を手元に残しておき、同時にプローブを測定した。生物内分布を分析するために、放射性シグナル（Counts）を、グラム組織ごとの注射活性（％）に換算した。
【００９２】
ＣＤ４／ＤＲ３−マウスでは、リンパ節、脾臓および骨髄において著しく高い活性が測定された。リンパ性ではない器官（肝臓、筋肉、肺および心臓）では、１１１−インジウムで標識された抗−ヒト−ＣＤ４−Fab'−フラグメント（Laub 2000）の富化は何も行われなかった。腎臓では、放射線診断薬の腎排除を言及するシグナルが見つかった。
【００９３】
生物内分布の試験は、ＣＤ４／ＤＲ３−マウスのリンパ組織内の放射線診断薬の分布が、トランスジェニック発現したヒトＣＤ４と、１１１−インジウムで標識された抗−ヒト−ＣＤ４−Fab'の間での特異的相互作用に基づくことを示した。
【００９４】
例５：ヒトＣＤ４発現への特異的富化の依存性
この実施例を用いて、放射線診断薬の特異的シグナルがヒトＣＤ４の存在が必要であることが証明される。
【００９５】
マウス−ＣＤ４の正常発現を有するBalb/c−マウス（野生型）では、例２からの放射線診断薬の２０Ciを静脈内に注射した。１、４、２４および４８時間後に、それぞれ３つのBalb/c−マウスから、例４のようにプローブを取り出し、組み込まれた放射能を測定した。腎臓だけで、全ての時間で高いシグナルが算出され、このことは、放射線診断薬もしくは放射性核種の腎排除を示している。脾臓、リンパ節、骨髄のようなリンパ性器官が、２０％までのマウス−ＣＤ４−発現細胞を含有するにもかかわらず、ここでは何のシグナルも把握できなかった。結果は、１１１−Inで標識された抗−ヒト−ＣＤ４−Fab'がヒトＣＤ４に特異的に結合し、マウスのリンパ性器官内では非特異的に富化しないことを示している。
【００９６】
例６：ヒトＣＤ４のトランスジェニック発現を用いるマウスモデルでのヘルパーＴ−リンパ球のin vivoでの局在化
この例は、放射線診断薬を用いて、ヒトＣＤ４発現細胞の高い割合を有する器官と組織をin vivoで局在化できることを証明する。
【００９７】
放射線診断薬のそれぞれ２０Ciを、野生型マウスと、野生型ＣＤ４の代わりにヒトＣＤ４を発現させたトランスジェニックＣＤ４／ＤＲ３−マウスの尾の静脈に注射した。注射の１、２４、４８時間後に、動物に麻酔をかけ、腹臥位にガンマカメラ（Siemens lcon）の計測範囲内に置いた。平均エネルギーγ線に平面のコリメーターを用いて、γ光子のシグナルを３０分間富化し、平面の全身シンチグラムにまとめた。シンチグラムの使用は、医学的画像提供法用のソフトウェア（Osiris, Universitaetshospital Genf, Schweiz）を用いて行った。
【００９８】
放射線診断薬を注射した１時間後に、ヒトＣＤ４を有し、野生型マウスにおいて特に強いシグナルが腎臓中で証明された。野生型マウスでは、僅かに分化可能なバックグランドが持続し、かつ腎臓シグナルが全体の測定時間にわたり残り、このことは、他の器官での特異的富化を生じない放射線診断薬の腎臓排除を証明する。ヒトＣＤ４のトランスジェニック発現を有するＣＤ４／ＤＲ３−マウスでは、注射の４時間後に、腎臓シグナルの他に、脾臓の範囲内でも見つかった。著しいシグナルは、さらに前と後の四肢で測定され、これは骨髄中のヒトＣＤ４発現細胞から生じた（例えば、ヘルパーＴリンパ球、好酸顆粒）。バックグランドシグナルは、強く構造化され、かつ造血系とリンパ系のコンパートメントを証明したが、これは明瞭なリンパ節または血管の描写を生じず、このことは、１１１−インジウム−シンチグラム（約４ｍｍ）の場合には、僅かな溶解を説明した。放射線診断薬を注射した２４と４８時間後のＣＤ４／ＤＲ３−マウスのシンチグラムは、腎臓シグナルの著しい減少を示し、これから改善された脾臓の描写が得られた。結果は、ヒト−ＣＤ４発現細胞の高い割合を証明している。ＣＤ４／ＤＲ３−マウスのFACS−分析は、ヒト−ＣＤ４を発現するヘルパーＴリンパ球の高い割合を、特に脾臓において確認した［Laub 2001, JIM］。
【００９９】
分化シグナルは、ヒト−ＣＤ４発現細胞を有する器官中で放射線診断薬の選択的富化を証明した。この富化は、特異的である。それというのも、これらはトランスジェニックヒトＣＤ４のない野生型マウス中では目的分子として生じず、かつ特異的相互作用により、ヒトＣＤ４と１１１−インジウムで標識された抗−ヒトＣＤ４−Fab'フラグメントの間で決定されるからである。
【０１００】
例７：マウスとヒトヘルパーＴリンパ球の特異的染色
この実施例により、モノクロナール抗体がヒトもしくはマウスＣＤ４に対して相互に交叉反応しないことが証明される。
【０１０１】
ヒトとマウスの末梢血管をフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識された、マウスＣＤ４（Klon GK 1.5;US 6,146,614参照）とヒトＣＤ４（Klon Max. 16H5）に対するモノクロナール抗体と一緒にインキュベーションした。Ｔリンパ球を検出するために、この細胞懸濁液を、付加的にフィコエリトリン（PE）で標識された、マウスもしくはヒトＣＤ３に対する抗体と一緒にインキュベーションした。３０分間のインキュベーション時間の後に、前記細胞懸濁液を洗浄し、フローサイトメトリー（FACScan, Becton Dickinson）により分析した。
【０１０２】
マウスの細胞懸濁液中では、ＣＤ３−陽性またはＣＤ３−陰性の細胞が見つかり、Max. 16H5（Quadranten UR und UL in Blot C）にも結合した。反対に、ヒト細胞では、GK 1.5（Quadrandten UR und UL in Blot D）に結合した細胞は見つからなかった。よって、図１の染色は、GK 1.5がマウスのヘルパーＴリンパ球（Blot A）だけに結合し、、かつMax. 16H５がヒトヘルパーＴリンパ球（Blot B）だけに結合することを示している。
【０１０３】
例８：ヒトＣＤ４（エピトープマッピング）へのMax.16H5（抗−ヒト−ＣＤ４）の結合部位の分析
この実施例は、ヒトＣＤ４の細胞外領域へのMax. 16H5−結合部位の同定を示す。
【０１０４】
このために、Auto-Spot Robot(ASP222)177を用いて、PEG−スペーサーで誘導化した膜の点状の面積（スポット）に、ヒトＣＤ４−分子のドメイン１〜４（Ｄ１〜Ｄ４）の線状アミノ酸配列からペプチドを合成した。スポット中のペプチド配列は、１２個のアミノ酸配列の長さであり、それぞれ前記配列の最後のアミノ酸１０個（スキャンニング：１２個のうち１０個がオーバーラップ）が得られた。
【０１０５】
これらのを粉乳２％でブロックし、かつ１０μｇ／ｍｌのMax. 16H5と室温で１２０分間インキュベーションした。この後に、膜を洗浄し、過酸化水素で標識した目的の抗−マウス抗体（ZAM-POD, Dianova）と室温で７５分間インキュベーションした。さらなる洗浄工程の後に、化学発光物質（Super Single Wes Dura, Pierce）を用いてZAM-PODの検出を行った。膜上の化学発光物質−シグナルを、蛍光イメージリーダー（Fujifilm LAS-1000）を用いて検出し、かつデジタル化した。
【０１０６】
スポットしたペプチドへのMax.16H5の結合は、以下のアミノ酸配列に基づく：
【０１０７】
【化１】
2005512083.tif 000003
【０１０８】
ポジティブのスポットから、Max.16H5の結合に使用されたアミノ酸配列をヒトＣＤ４の三次元モデルにより再構築した。この場合に、Max.16H5は空間的に構築された結合部位（コンフォメーションエピトープ）と相互作用することが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、マウスとヒトヘルパーＴ−リンパ球の特異的染色をドット−ブロットで示した図である。
【０１１０】
【図２】図２は、ヒトＣＤ４のコンフォメーションアイソトープを半球体モデルの形で示した図である。
【配列表】
2005512083.tif 000004
2005512083.tif 000005
【図１】
2005512083.tif 000006
【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月3日(2004.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの個体中で、ヒトＣＤ４を有する細胞を含む細胞集団の移動パターンおよび／または分布パターンを分析するための診断薬を製造するための、抗体フラグメントおよび組換え抗体フラグメントから成る群から選択されるヒトＣＤ４分子に特異性を有する標識リガンドの使用。
【請求項２】
抗体フラグメントまたは組換え抗体フラグメントは、モノクロナール抗体またはモノクロナール抗体フラグメントであるか、またはこれらから由来する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
抗体フラグメントまたは組換え抗体フラグメントは、SEQ ID NO.1からSEQ ID NO.6に記載される配列を認識し、これに結合する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
抗体フラグメントまたは組換え抗体フラグメントは、ヒトＣＤ４のコンフォメーションエピトープを認識し、かつこれに結合する請求項１から３までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
抗体フラグメントまたは組換え抗体フラグメントは、抗−ＣＤ４−抗体である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
リガンドの標識は、γ−エミッター、ポジトロンエミッター、磁気材料、密度コントラスト材料およびこれらの混合物から成る群から選択される、請求項１から５までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
リガンドの標識は、γ−エミッター、ポジトロンエミッター、磁気材料、密度コントラスト材料およびこれらの混合物から成る群から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
リガンドの標識は、インジウム−１１１、テクネチウム９９ｍ、テクネチウム−９９、ヨウ素−１３２、医学的画像提供法のための他のラジオアイソトープならびにこれらの混合物から成る群から選択される１種以上のラジオアイソトープを含むγ−エミッターである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
ラジオアイソトープがテクネチウム９９ｍまたはインジウム−１１１である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
リガンドの標識は、フッ素−１８、炭素−１１、ヨウ素−１２４、医学的画像提供法のための他のアイソトープならびにこれらの混合物から成る群から選択される１種以上のアイソトープを含むポジトロンエミッターである、請求項７に記載の使用。
【請求項１１】
リガンドの標識は、ガドリニウム、超常磁性物質、水化酸化鉄粒子、医学的画像提供法のための他の材料ならびにこれらの混合物から成る群から選択される磁気材料を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項１２】
標識リガンドは、密度コントラスト材料を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項１３】
ヒト−ＣＤ４を有する細胞は、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞およびランゲルハンス細胞および好酸性顆粒から成る群から選択される、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
リンパ球は、非リンパ性細胞を含むグループまたは集団から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
細胞集団はヒトの個体から由来する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
ＣＤ４−分子およびＣＤ４を有する細胞または粒子に特異性を有する標識リガンドを含む組成物。
【請求項１７】
ＣＤ４を有する細胞または粒子は、ヒトＣＤ４を有する細胞または粒子である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
診断薬としての請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
個体中の移動パターンおよび／または分布パターンを決定するための診断薬を製造するための、請求項１６から１８までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２０】
疾患の程度と進行を決定する方法において、ヒト−ＣＤ４を有する細胞は、臨床的に重要であり、以下の段階を有する：
ａ）  個体でのヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンのin vivo分析を用意する
ｂ）  個体でのヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンのスタンダードなin vivo分析を用意する
ｃ）  段階ａ）と段階ｂ）で用意された分析の相違を決定し、これにより疾患の程度と進行を決定する
ことを特徴とする、疾患の程度と進行を決定する方法。
【請求項２１】
疾患は、自己免疫疾患、腫瘍疾患、感染症および移植後の反発発症から成る群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階ｂ）でのスタンダードな分析は、健康な個体でのヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンの分析である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
段階ｂ）でのスタンダードな分析は、同じヒトの個体の先行する分析から得られた個体の分布パターンおよび／または移動パターンである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
段階ａ）では、付加的に疾患に対する治療を受けた個体でのヒトＣＤ４を有する細胞の分布パターンおよび／または移動パターンの分析を用意する、請求項２０から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
治療の内容は、化合物または医薬品の投与である、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】
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