(57)【要約】  バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ活性をコードするさまざまな細菌から遺伝子が単離されている。これらの遺伝子およびその産物は、ケトンを対応するエステルに変える変換に有用である。すべての遺伝子に共通の一連のモチーフを、この活性のタンパク質をコードする遺伝子に対する特性として同定する。
2005512514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号８、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズするバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）と相補である単離核酸断片、
からなる群から選択される、単離核酸断片。
【請求項２】
配列番号８に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも５５％である少なくとも５４２のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号１０に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも５３％である少なくとも５４１のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号２２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも３７％である少なくとも４３９のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項５】
配列番号２４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも４４％である少なくとも５１８のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項６】
配列番号２６に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも６４％である少なくとも５４１のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項７】
配列番号２８に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも６５％である少なくとも４６２のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項８】
配列番号３０に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも４５％である少なくとも５２３のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項９】
配列番号３２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも５５％である少なくとも４９３のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項１０】
配列番号３４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも５１％である少なくとも５３９のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項１１】
配列番号３６に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも３９％である少なくとも６４９のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項１２】
配列番号３８に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも４３％である少なくとも４９４のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項１３】
配列番号４０に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも５３％である少なくとも４９９のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項１４】
配列番号４２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも４４％である少なくとも４９３のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項１５】
配列番号４４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも５４％である少なくとも５４１のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項１６】
配列番号４６に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも４２％である少なくとも５４５のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項１７】
配列番号７、９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択される、請求項１に記載の単離核酸断片。
【請求項１８】
ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）から単離される、請求項１に記載の単離核酸断片。
【請求項１９】
請求項１に記載の単離核酸断片でコードされるポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号８、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６からなる群から選択される、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
（ａ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズするバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）と相補である単離核酸断片、
からなる群から選択される、単離核酸断片。
【請求項２２】
配列番号１１に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも５７％である少なくとも５３２のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項２３】
アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）から単離される、請求項２１に記載の単離核酸断片。
【請求項２４】
請求項２１に記載の単離核酸断片でコードされるポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号１２に記載の、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
（ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズするバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）と相補である単離核酸断片、
からなる群から選択される、単離核酸断片。
【請求項２７】
配列番号１７に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、スミス・ウォーターマン法によるアライメントでの同一性が少なくとも５７％である少なくとも５３８のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列またはこの第１のヌクレオチド配列の相補体を含んで成る第２のヌクレオチド配列を含んで成る、単離核酸分子。
【請求項２８】
アシドボラクス属（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）から単離される、請求項２６に記載の単離核酸断片。
【請求項２９】
請求項２６に記載の単離核酸断片でコードされるポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号１８からなる群から選択される請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
好適な制御配列に作動的に結合された、請求項１、１９、２５、３０または３５のいずれか１項に記載の単離核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子。
【請求項３２】
宿主細胞と請求項３１に記載のキメラ遺伝子とを含んで成る形質転換宿主細胞。
【請求項３３】
宿主細胞が、細菌と、酵母と、糸状菌類と、緑色植物と、からなる群から選択される、請求項３２に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項３４】
宿主細胞が、プロテオバクテリアと放線菌とからなる群から選択される、請求項３３に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項３５】
宿主細胞が、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）と、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）と、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）と、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）と、パンドレア属（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）と、デルフチア属（Ｄｅｌｆｔｉａ）と、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）と、からなる群から選択される、請求項３４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項３６】
宿主細胞が、ロドコッカス属と、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）と、マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）と、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）と、アルスロバクター属と、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、アシドボラクス属と、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）と、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）と、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）と、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）と、シュードモナス属と、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）と、酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）と、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）と、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）と、コルニエバクテリウム属（Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）と、からなる群から選択される、請求項３３に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項３７】
宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オーツムギ、モロコシ、コメ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜類、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、芝種子、サトウダイコン、サトウキビ、インゲンマメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹、針葉樹、牧草からなる群から選択される、請求項３３に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項３８】
（ａ）請求項１、２１または２６のいずれか１項に記載の核酸断片でゲノムライブラリを探索し、
（ｂ）請求項１、２１または２６のいずれか１項に記載の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るゲノム断片の配列を決定することを含んで成り、配列決定されたゲノム断片がバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードするものである、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする核酸断片の取得方法。
【請求項３９】
（ａ）請求項１、２１または２６のいずれか１項に記載の単離核酸配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクターに含まれるインサートを増幅することを含んで成り、
増幅されたインサートがバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードするものである、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする核酸断片の取得方法。
【請求項４０】
（ａ）モノオキシゲナーゼ活性を持つ可能性のあるポリペプチドのアミノ酸配列を取得し、
（ｂ）ステップ（ａ）のアミノ酸配列を、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９からなる群から選択されるバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼコンセンサス配列のアミノ酸配列とアライメントすることを含んで成り、
配列番号４７の位置ｐ１〜ｐ７４のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４８のｐ１〜ｐ７６のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４９のｐ１〜ｐ４１のアミノ酸残基の少なくとも８０％が完全に保存されている場合、（ａ）のポリペプチドをモノオキシゲナーゼ活性を持つものであるとして同定する、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの同定方法。
【請求項４１】
配列番号４７の位置ｐ１〜ｐ７４のアミノ酸残基の最低１００％、あるいは配列番号４８のｐ１〜ｐ７６のアミノ酸残基の少なくとも１００％、あるいは配列番号４９のｐ１〜ｐ４１のアミノ酸残基の少なくとも１００％が完全に保存されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）配列番号４７の位置ｐ１〜ｐ７４のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４８のｐ１〜ｐ７６のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４９のｐ１〜ｐ４１のアミノ酸残基の少なくとも８０％が完全に保存されているポリペプチドをコードする核酸断片でゲノムライブラリを探索し、
（ｂ）ステップ（ａ）の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るゲノム断片の配列を決定することを含んで成り、
配列決定されたゲノム断片がバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードするものである、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の同定方法。
【請求項４３】
配列番号４７の位置ｐ１〜ｐ７４のアミノ酸残基の最低１００％、あるいは配列番号４８のｐ１〜ｐ７６のアミノ酸残基の少なくとも１００％、あるいは配列番号４９のｐ１〜ｐ４１のアミノ酸残基の少なくとも１００％が完全に保存されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４０または４２の成果物。
【請求項４５】
好適な成長条件下で形質転換宿主細胞を有効量のケトン基質と接触させることで対応するエステルを生成することを含んで成り、前記形質転換宿主細胞が、好適な制御配列の制御下に請求項１、２１、２６または４４のうちのいずれかの単離核酸断片をコードする核酸断片を含んで成る、ケトン基質を対応するエステルに変換する生物変換方法。
【請求項４６】
ケトン基質が、一般式
【化１】
2005512514.tif 000148
（式中、ＲおよびＲ１は独立に、置換または未置換のフェニル、置換または未置換のアルキル、あるいは置換または未置換のアルケニル、あるいは置換または未置換のアルキリデンから選択される）で表されるケトテルペンと環状ケトンとからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ケトン基質が、ノーカンフォー、シクロブタノン、シクロペンタノン、２−メチル−シクロペンタノン、シクロヘキサノン、２−メチル−シクロヘキサノン、シクロヘキサ−２−エン−１−オン、１，２−シクロヘキサンジオン、１，３−シクロヘキサンジオン、１，４−シクロヘキサンジオン、シクロヘプタノン、シクロオクタノン、シクロデカノン、シクロウンデカノン、シクロドデカノン、シクロトリデカノン、シクロペンタ−デカノン、２−トリデカノン、ジヘキシルケトン、２−フェニル−シクロヘキサノン、オキシンドール、レボグルコセノン、ジメチルスルホキシド、ジメチ−２−ピペリドン、フェニルボロン酸、β−イオノンからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
好適な反応条件下でケトン基質を有効量のバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ酵素と接触させることを含んで成り、前記酵素が、配列番号８、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６からなる群から選択されるアミノ酸配列（ｓｅｑｅｕｎｃｅ）を有する、ケトン基質を対応するエステルに変換するｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換方法。
【請求項４９】
ケトン基質が、一般式
【化２】
2005512514.tif 000149
（式中、ＲおよびＲ１は独立に、置換または未置換のフェニル、置換または未置換のアルキル、あるいは置換または未置換のアルケニル、あるいは置換または未置換のアルキリデンから選択される）で表されるケトテルペンと環状ケトンとからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５０】
ケトン基質が、ノーカンフォー、シクロブタノン、シクロペンタノン、２−メチル−シクロペンタノン、シクロヘキサノン、２−メチル−シクロヘキサノン、シクロヘキサ−２−エン−１−オン、１，２−シクロヘキサンジオン、１，３−シクロヘキサンジオン、１，４−シクロヘキサンジオン、シクロヘプタノン、シクロオクタノン、シクロデカノン、シクロウンデカノン、シクロドデカノン、シクロトリデカノン、シクロペンタ−デカノン、２−トリデカノン、ジヘキシルケトン、２−フェニル−シクロヘキサノン、オキシンドール、レボグルコセノン、ジメチルスルホキシド、ジメチ−２−ピペリドン、フェニルボロン酸、β−イオノンからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
（ｉ）ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択される天然微生物遺伝子と、
ｂ）前記天然微生物配列とハイブリダイズするヌクレオチド断片からなる第１の集合と、
ｃ）前記天然微生物配列とハイブリダイズしないヌクレオチド断片からなる第２の集合と、を含んで成るヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、制限断片の混合物を生成させるステップと、
（ｉｉ）前記制限断片の混合物を変性させるステップと、
（ｉｉｉ）変性させたステップ（ｉｉ）の前記制限断片の混合物をポリメラーゼとともにインキュベートするステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返し、生物活性が変化したタンパク質をコードする変異微生物遺伝子を生成するステップと、を含んで成る方法によって生成される、生物活性が変化したタンパク質をコードする変異微生物遺伝子。
【請求項５２】
配列番号５に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んで成る、アシドボラクスｓｐ．（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｓｐ．）。
【請求項５３】
配列番号１に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んで成る、アルスロバクターｓｐ．（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）。
【請求項５４】
配列番号６に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んで成る、ロドコッカスｓｐ．（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）。
【請求項５５】
配列番号７０〜１１３からなる群から選択されるＢＶモノオキシゲナーゼの同定に有用な単離核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。特に、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ活性をコードするさまざまな細菌から遺伝子が単離されている。
【背景技術】
【０００２】
１８９９年、環状ケトンとペルオキシ一硫酸とを反応させてラクトンを生成することについての報告がバイヤーおよびビリガーによってなされた（非特許文献１）。それ以降、バイヤー・ビリガー（ＢＶ）反応は有機合成に広く用いられている。ＢＶ反応は、穏やかな条件下で特定の炭素−炭素結合を切断し、これによってケトンをエステルに変換するのに利用できる限られた方法のひとつである（非特許文献２）。
【０００３】
過去数十年の間、工業プロセスにおいて環境への影響を最小限に抑えることの重要性がひとつの潮流への触媒となり、すでに確立された化学的な手法が別の方法へと移行しつつある。バイヤー・ビリガー（ＢＶ）酸化の場では、バイヤー・ビリガー酸化でありながら過酸に頼らないエナンチオ選択性の形態を発見することに極めて大きな関心が寄せられている。エナンチオ選択性であることが多い酵素類であれば、再生可能かつ生分解可能な価値のある代替資源になる。
【０００４】
ケトンをエステルあるいは対応するラクトン（環状エステル）に変換する多くの微生物バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ酵素（ＢＶＭＯ）（非特許文献３）が細菌と真菌の両方のソースから同定されている。通常、微生物のＢＶ反応はモノオキシゲナーゼ（ＥＣ  １．１４．１３．ｘ）によって行われ、これにはＯ２と共還元剤としてのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれか一方とが使われる。酸素原子のうちの１つがカルボニル炭素とフランキング炭素との間のラクトン生成物に取り込まれる一方、他の酸素原子が還元ＮＡＤＰＨを酸化してＨ２Ｏを生成する反応に用いられる（非特許文献４）。周知のＢＶＭＯにはいずれも、酸化反応において機能するフラビンコエンザイムがあり、中心となるコエンザイム形態はフラビンアデニンジヌクレオチドコファクター（ＦＡＤ）である。
【０００５】
すでにキャラクタライズされているほとんどのＢＶＭＯがもともと持っている生理学的役割に、化合物を分解して小さくなった炭化水素および／またはアルコールを炭素源およびエネルギ源として利用できるようにすることがある。このため、ＢＶＭＯは目立って広い基質許容性を示し、エナンチオ選択性が高く、立体選択性および位置選択性が大きい（非特許文献５）。酵素に適した基質については、大きく分けて環状ケトン、ケトテルペン、ステロイドに分類できる。しかしながら、すでに徹底した生化学的キャラクタリゼーションがなされている酵素はほとんどない。広範囲にわたる各ケトン基質クラスに関連した重要な研究を以下にまとめておく。
【０００６】
１．環状ケトン：アシネトバクター  ｓｐ．（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＣＩＢ  ９８７１における環状ケトン基質でのシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの活性についての徹底した研究が行われている（非特許文献６の表２、非特許文献７の表４〜５にて検討がなされている）。ブレビバクテリウム  ｓｐ．（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＨＣＵでの特異性の生化学的分析も行われている（非特許文献８）。
【０００７】
２．ケトテルペン：ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＤＣＬ１４からの単環式モノテルペンケトンモノオキシゲナーゼがキャラクタライズされている（非特許文献９）。ケトテルペンに対する広い基質特異性だけでなく、この酵素には置換シクロヘキサノンに対する活性もある。
【０００８】
３．ステロイド：ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）のステロイドモノオキシゲナーゼ（非特許文献１０）が、生化学的および配列データの両方の観点から十分にキャラクタライズされている。
【０００９】
上記に列挙した遺伝子および遺伝子産物は、環状ケトン化合物、ケトテルペン化合物またはステロイド化合物を標的とした特定のバイヤー・ビリガー反応には役立つものであるが、同様の活性を持ち得る新たに発見される他のタンパク質を予測する上で、これらの酵素の能力には限界がある。
【００１０】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ  Ｂｅｒ  ３２：３６２５〜３６３３（１８９９）。
【非特許文献２】ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ  ２７：３３３〜３４３（１９８８）。
【非特許文献３】スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２：１９５〜２１６（１９９８）。
【非特許文献４】バネルジー・エー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ａ．）、Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌ，Ｂｉｏｃａｔａｌ．、パテル・アール・エヌ（Ｐａｔｅｌ，Ｒ．Ｎ．編、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）：ニューヨーク、２０００、第２９章、第８６７〜８７６ページ。
【非特許文献５】ミホヴィロヴィック（Ｍｉｈｏｖｉｌｏｖｉｃ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：７３３〜７３８（２００１）。
【非特許文献６】スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２：１９５〜２１６（１９９８）の表２。
【非特許文献７】ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ  ２７：３３３〜３４３（１９８８）の表４〜５。
【非特許文献８】ブルツォストヴィッチ（Ｂｒｚｏｓｔｏｗｉｃｚ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１８２（１５）：４２４１〜４２４８（２０００）。
【非特許文献９】ファン・デル・ウェルフ（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４７：６９３〜７０１（２０００）。
【非特許文献１０】モリイ（Ｍｏｒｉｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２６：６２４〜６３１（１９９９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、解決しようとする課題は、環状ケトンおよびケトテルペン化合物で酸素化反応を効率的に実施できる一連の細菌フラボタンパク質バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ酵素を提供することである。この広い基質許容性を持つ一連の酵素が似通っていることから、これらの酵素を商用利用しやすく、複数通りの反応に合わせて複数の酵素を最適化することに伴う労力を削減できるのではないかと思われる。特に、最大限の効率を得られるとすれば多くの酵素が所望の宿主生物で組換え発現されるように遺伝子操作される昨今である。さらに、多様なアミノ酸配列を持つＢＶＭＯの集合を利用して、他のＢＶＭＯ酵素におけるアミノ酸配列の保存状態に立脚した汎用的な予測モデルを作成できる可能性がある。最後に、新規な酵素のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化用の基盤として広範囲にわたるクラスのＢＶＭＯを利用できる可能性もある。
【００１２】
本願出願人らは、ＢＶＭＯ活性を持つ新規な生物をいくつか単離し、ＢＭＶＯ遺伝子を同定およびキャラクタライズし、これらの遺伝子を微生物宿主で発現させ、これらの遺伝子が環状ケトンやケトテルペンをはじめとする広範囲にわたるケトン基質に対して持つ活性を示すことで、上述した課題を解決している。アミノ酸配列アライメントを根拠にいくつかのシグネチャ配列を同定したが、これらの配列は特定のＢＶＭＯファミリに特徴的なものであり、医療診断における実用性を備えている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、
（ａ）配列番号８、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズするバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）と相補である単離核酸断片、
からなる群から選択される、ロドコッカス属から単離される単離核酸断片を提供するものである。
【００１４】
同様に、本発明は、
（ａ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズするバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）と相補である単離核酸断片、
からなる群から選択される、アルスロバクター属から単離される単離核酸断片を提供するものである。
【００１５】
さらに、本発明は、
（ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸断片、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズするバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする単離核酸分子、あるいは
（ａ）または（ｂ）と相補である単離核酸断片、
からなる群から選択される、アシドボラクス属から単離される単離核酸断片を提供するものである。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、本件配列でコードされるポリペプチドおよび本件配列の遺伝子キメラならびにこれを発現する形質転換宿主を提供するものである。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明は、
（ａ）モノオキシゲナーゼ活性を持つ可能性のあるポリペプチドのアミノ酸配列を取得し、
（ｂ）ステップ（ａ）のアミノ酸配列を、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９からなる群から選択されるバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼコンセンサス配列のアミノ酸配列とアライメントすることを含んで成り、
配列番号４７の位置ｐ１〜ｐ７４のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４８のｐ１〜ｐ７６のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４９のｐ１〜ｐ４１のアミノ酸残基の少なくとも８０％が完全に保存されている場合、（ａ）のポリペプチドをモノオキシゲナーゼ活性を持つものであるとして同定する、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドの同定方法を提供するものである。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号４７の位置ｐ１〜ｐ７４のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４８のｐ１〜ｐ７６のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４９のｐ１〜ｐ４１のアミノ酸残基の少なくとも８０％が完全に保存されているポリペプチドをコードする核酸断片でゲノムライブラリを探索し、
（ｂ）ステップ（ａ）の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るゲノム断片の配列を決定することを含んで成り、
配列決定されたゲノム断片がバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードするものである、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の同定方法を提供するものである。
【００１９】
好ましい実施形態において、本発明は、好適な成長条件下で形質転換宿主細胞を有効量のケトン基質と接触させることで対応するエステルを生成することを含んで成り、前記形質転換宿主細胞が、好適な制御配列の制御下に本件核酸配列のうちのいずれかの単離核酸断片をコードする核酸断片を含んで成る、ケトン基質を対応するエステルに変換する生物変換方法を提供するものである。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、好適な反応条件下でケトン基質を有効量のバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ酵素と接触させることを含んで成り、この酵素が、配列番号８、１０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６からなる群から選択されるアミノ酸配列（ｓｅｑｅｕｎｃｅ）を有する、ケトン基質を対応するエステルに変換するｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換方法を提供するものである。
【００２１】
さらに、本発明は、
（ｉ）ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択される天然微生物遺伝子と、
ｂ）前記天然微生物配列とハイブリダイズするヌクレオチド断片からなる第１の集合と、
ｃ）前記天然微生物配列とハイブリダイズしないヌクレオチド断片からなる第２の集合と、を含んで成るヌクレオチド配列の混合物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、制限断片の混合物が生成されるステップと、
（ｉｉ）前記制限断片の混合物を変性させるステップと、
（ｉｉｉ）変性させたステップ（ｉｉ）の前記制限断片の混合物をポリメラーゼとともにインキュベートするステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返し、生物活性が変化したタンパク質をコードする変異微生物遺伝子を生成するステップと、を含んで成る方法によって生成される、生物活性が変化したタンパク質をコードする変異微生物遺伝子を提供するものである。
【００２２】
また、本発明は、配列番号５に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んで成るアシドボラクス  ｓｐ．、配列番号１に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んで成るアルスロバクター  ｓｐ．、配列番号６に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んで成るロドコッカス  ｓｐ．それぞれのユニークな株を提供するものである。もうひとつの実施形態において、本発明は、配列番号５に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んで成るアシドボラクス  ｓｐ．を提供するものである。さらに、本発明は、配列番号１に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んで成るアルスロバクター  ｓｐ．を提供するものである。同様に、本発明は、配列番号６に記載の１６ｓ  ｒＤＮＡ配列を含んで成るロドコッカス  ｓｐ．を提供するものである。
【００２３】
さらに、本発明は、配列番号７０〜１１３からなる群から選択されるＢＶモノオキシゲナーゼを同定するのに役立つ単離核酸を提供するものである。
【００２４】
配列の説明
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明ならびに添付の配列の説明から、本発明についてなお一層深く理解することができよう。
【００２５】
以下の配列は米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（施行規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に従ったものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いる記号および形式は米国特許施行規則第１．８２２に記載の規則に準拠している。
【００２６】
配列番号１〜４９は表１に示すような全長遺伝子またはタンパク質である。
【００２７】
【表１】
2005512514.tif 000003
【００２８】
配列番号５０〜６２は１６ｓ  ｒＤＮＡシーケンシングに用いるプライマーである。
【００２９】
配列番号６３はＲＴ−ＰＣＲおよびアウト−ＰＣＲ（ｏｕｔ−ＰＣＲ）に用いるプライマーを示す。
【００３０】
配列番号６４および６５はｐＣＲ２．１内のインサートのシーケンシングに用いるプライマーである。
【００３１】
配列番号６６および６７はアシネトバクターｓｐ．ＳＥ１９からモノオキシゲナーゼ遺伝子を増幅するために用いるプライマーである。
【００３２】
配列番号６８〜１０７は全長バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼの増幅に用いるプライマーである。
【００３３】
配列番号１０８〜１１３はコスミドライブラリをスクリーニングするために用いるプライマーである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ酵素のグループを定義する核酸およびアミノ酸配列を提供するものである。これらの酵素には、大別して環状ケトンとケトテルペンという２つのクラスの化合物をはじめとする多種多様なケトン基質を利用する能力があることが分かっている。これらの酵素を、機能ならびに一連の指標となるシグネチャ配列に応じてキャラクタライズする。これらの酵素は、ケトン基質を対応するラクトンまたはエステルに変える変換用に組換え発現させることができるものである。
【００３５】
本願の開示では、学術用語および略語をいくつか用いる。これについては、以下のように定義する。
「オープンリーディングフレーム」をＯＲＦと略す。
「ポリメラーゼ連鎖反応」をＰＣＲと略す。
「ガスクロマトグラフィ質量分析」をＧＣ−ＭＳと略す。
「バイヤー・ビリガー」をＢＶと略す。
「バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ」をＢＶＭＯと略す。
【００３６】
「バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ」という用語は、ケトン基質を酸化させて対応するラクトンまたはエステルにする能力を持つ細菌酵素を示す。
【００３７】
「ケトン基質」という用語には、環状ケトンおよびケトテルペンをはじめとするクラスの化合物を含んで成るバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼの基質を含む。本発明のケトン基質は、一般式
【００３８】
【化１】
2005512514.tif 000004
【００３９】
（式中、ＲおよびＲ１は独立に、置換または未置換のフェニル、置換または未置換のアルキル、置換または未置換のアルケニル、あるいは置換または未置換のアルキリデンから選択される）で定義される。
【００４０】
「アルキル」という用語は、アルカンの任意の炭素原子から水素原子１個を除去して誘導される一価基すなわちＣｎＨ２ｎ＋１‐を意味する。非分枝アルカンの末端炭素原子から水素原子１個を除去して誘導される基は、ノルマルアルキル（ｎ−アルキル）基のサブクラスすなわちＨ［ＣＨ２］ｎ‐をなす。基ＲＣＨ２−、Ｒ２ＣＨ−（ＲはＨと等しくない）、Ｒ３Ｃ−（ＲはＨと等しくない）は、それぞれ第１級アルキル基、第２級アルキル基、第３級アルキル基である。
【００４１】
「アルケニル」という用語は、１個の炭素−炭素二重結合を有し、一般式ＣｎＨ２ｎで表される非環式の分枝炭化水素または非分枝炭化水素を意味する。２以上の二重結合を有する非環式の分枝炭化水素または非分枝炭化水素は、アルカジエン、アルカトリエンなどである。
【００４２】
「アルキリデン」という用語は、アルカンの同一炭素原子から水素原子２個を除去して形成される二価基を意味し、その遊離バリアンス（ｖａｌｉａｎｃｅｓ）は二重結合の一部（プロパン−２−イリデンとしても知られる（ＣＨ３）２Ｃなど）である。
【００４３】
本願明細書において使用する場合、「単離核酸分子」は、合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形での単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントで構成されるものであってもよい。
【００４４】
温度と溶液のイオン強度の適した条件下で一本鎖の核酸分子を他の核酸分子にアニールできる場合に、この核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」であるという。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は周知であり、その一例が、サムブルック・ジェー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ・イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス・ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）の特に第１１章と表１１．１に記載されている（その内容全体を本願明細書に援用する）。温度およびイオン強度の条件次第でハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ストリンジェンシー条件については、遠縁の生物から得られる相同配列などの適度な類似性のある断片から、近縁の生物から得られる機能的酵素を複製する遺伝子などの極めて類似性の高い断片に至るまで、スクリーニングできるように調節することが可能である。一般的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、たとえば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃でハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。通常、ハイブリダイゼーション後の洗浄でストリンジェンシー条件を判定する。好ましい条件一組では、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温にて１５分間に続いて、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃にて３０分間行い、さらに０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃にて３０分間ずつ２回繰り返す一連の洗浄を用いる。さらに好ましいストリンジェントな条件の組では上記よりも高い温度を使用する。この場合、最後に行う０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの３０分ずつ２回の洗浄時の温度を６０℃に上げること以外は上記と同じである。極めてストリンジェントな条件のもうひとつの好ましい組として、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの最後の２回の洗浄を６５℃にする形がある。ハイブリダイゼーションでは２つの核酸に相補的な配列が含まれている必要があるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間にミスマッチがあってもよい。核酸をハイブリダイズさせるのに適したストリンジェンシーは、核酸長および相補性の度合いといった従来技術において周知の変数に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きくなればなるほど、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（高めのＴｍに対応）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に低くなる。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについてはＴｍを算出するための式が得られている（上掲のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、９．５０〜９．５１を参照のこと）。これよりも短い核酸すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションではミスマ��チの位置が一層重要になり、その特異性はオリゴヌクレオチドの長さによって決まる（上掲のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１１．７〜１１．８を参照のこと）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最低長は少なくとも約１５ヌクレオチドであり、一層好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、プローブの長さなどの要因次第では、必要に応じて温度および洗浄液の塩濃度を調節してもよいことは、当業者であれば理解できよう。
【００４５】
「相補的である」という表現については、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を示す際に使用する。たとえば、ＤＮＡに関していえば、アデノシンはチミンに対して相補的であり、シトシンはグアニンに対して相補的である。したがって、本発明には、添付の配列表に記載の完全配列に対して相補的である単離核酸断片のみならず、実質的に類似の核酸配列も含まれる。
【００４６】
「同一率」という用語は、従来技術において周知のように、配列同士を比較することで求められる２以上のポリペプチド配列間または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。従来技術において、「同一性」とは、場合によってはポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列のストリング間のマッチによって求められる、このような配列間の配列の関連度を意味することもある。「同一性」および「類似性」については、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（レスク・エー・エム（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編）、オックスフォード大学出版局、ニューヨーク（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（スミス・ディ・ダブリュ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編）、アカデミックプレス、ニューヨーク（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ（グリフィン・エー・エム（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン・エイチ・ジー（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編）、ヒュマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（フォン・ハインイェ・ジー（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）編）、アカデミックプレス（１９８７）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（グリブスコフ・エム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデヴェロー・ジェー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編）、ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９９１）に記載されているものなどを含むがこれに限定されるものではない周知の方法で容易に算出することが可能である。試験配列間のベストマッチを得るべくして、同一性を求める好ましい方法が設計されている。また、同一性および類似性を求める方法が、一般利用可能なコンピュータプログラムの形で体系的にまとめられたものもある。配列アライメントと同一率の計算値については、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクスコンピューティングパッケージ（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のディエヌエースター・インコーポレイテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．））のメグアライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを利用して求めることができる。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法でのアライメント（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３）をデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で用いて配列のマルチプルアライメントを行った。クラスタル法を使う場合のペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００４７】
好適な核酸断片（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一であり、好ましくは少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。さらに好ましい核酸断片は、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸断片である。好適な核酸断片は、上記の相同性を持つだけでなく、一般には少なくとも５０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、一層好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらに一層好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を含むポリペプチドをコードするものである。
【００４８】
「コドンの縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響せずにヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝暗号の性質を示す。したがって、本発明は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６に示すような本件微生物のポリペプチドのアミノ酸配列の全体または大部分をコードするあらゆる核酸断片に関する。当業者であれば、特定のアミノ酸を表すヌクレオチドコドンを使用する特定の宿主細胞に見られる「コドンバイアス」について十分に理解していよう。したがって、宿主細胞での発現を改善した遺伝子を合成する際は、遺伝子のコドン使用頻度がその宿主細胞での好ましいコドン使用頻度に近付くように遺伝子を設計すると望ましい。
【００４９】
「合成遺伝子」は、当業者間で周知の手順で化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックからアセンブルすることが可能なものである。こうしたビルディングブロックを結合およびアニール処理して遺伝子セグメントを構成し、続いてこれを酵素的にアセンブルして完全な遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関する「化学的に合成された」とは、コンポーネントであるヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでアセンブルされたものであることを意味する。この場合、十分に確立された手順を使ってＤＮＡの化学合成を手作業で行ってもよいし、多様な市販の装置類のうちのいずれかを使って自動化学合成を行うことも可能である。したがって、ヌクレオチド配列の最適化を踏まえた最適な遺伝子発現に遺伝子の方を合わせ、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることが可能である。当業者であれば、使用されるコドンが宿主の好むコドンに偏っている場合に遺伝子発現が成功する尤度を知ることができよう。好ましいコドンについては、配列情報を得られる宿主細胞に由来する遺伝子についての調査を行い、その結果に基づいて判断することが可能である。
【００５０】
「遺伝子」とは、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する制御配列をはじめとする特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「天然遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ自然界に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含んで成るあらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含んで成るものであってもよいし、同一起源由来であるが自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含んで成るものであってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノムにおいて正常な位置にある天然遺伝子を示す。「外来遺伝子」とは、宿主生物には通常は見られないが、遺伝子移行によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子は、自然界には存在しない生物に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んで成ることができる。「トランスジーン」とは、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子のことである。
【００５１】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「好適な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響するヌクレオチド配列を示す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造があげられる。
【００５２】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を示す。通常、コード配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含んで成るものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件または生理学的条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほぼ常に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さの異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。
【００５３】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示し、ポリアデニル化認識配列ならびにｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響をおよぼすことのできる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響することが特徴である。
【００５４】
「ＲＮＡ転写物」とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写によって生じる産物を示す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これを一次転写物と呼び、一次転写物の転写後プロセシングで得られるＲＮＡ配列であれば成熟ＲＮＡと呼ぶ。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを持たず、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補であり、ｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡを示す。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡ転写物を示す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的遺伝子の発現をブロックする標的の一次転写物またはｍＲＮＡの全体または一部に対して相補であるＲＮＡ転写物を示す（米国特許第５，１０７，０６５号、ＷＯ９９２８５０８号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、５’非コード配列、３’非コード配列またはコード配列など、特定の遺伝子転写物のどの部分に対するものであってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳はされないが、それでもなお細胞プロセスに対する影響力を持つ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは他のＲＮＡを示す。
【００５５】
「作動的に結合された」という表現は、一方の機能が他方に影響するような形で１つの核酸断片上に核酸配列が会合した状態を示す。たとえばプロモーターであれば、コード配列の発現に影響をおよぼすことができる（すなわちそのコード配列がプロモーターの転写制御下にある）ときに、そのコード配列と作動的に結合されていると言う。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで制御配列への作動的な結合が可能なものである。
【００５６】
本願明細書で使用する「発現」という用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を示す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示すこともある。
【００５７】
「形質転換」とは、核酸断片が宿主生物のゲノムに移行し、遺伝的に安定した遺伝継承がなされることを示す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ぶ。
【００５８】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」の各用語は、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形で、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持っていることの多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自己複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状で一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する特定のベクターを示す。
【００５９】
「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の解析に役立つあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列解析ソフトウェア」は市販のものであってもよいし、独自開発のものであってもよい。一般的な配列解析ソフトウェアとしては、ＧＣＧパッケージのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ））、ブラストピー（ＢＬＡＳＴＰ）、ブラストエヌ（ＢＬＡＳＴＮ）、ブラストエックス（ＢＬＡＳＴＸ）（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）、ＤＮＡＳＴＡＲ（ディエヌエースター・インコーポレイテッド（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）、１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）ならびにスミス・ウォーターマンアルゴリズムを取り入れたＦＡＳＴＡプログラム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、１１１〜２０、編集者（ら）：スハイ・サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）、出版社：ニューヨーク州ニューヨーク、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ））があげられるが、これに限定されるものではない。本願の内容に関してだけ言えば、配列解析ソフトウェアを解析に利用する場合、特に明記しない限り、その解析結果は引用したプログラムの「デフォルト値」でのものとなる点は理解できよう。本願明細書において使用する「デフォルト値」とは、ソフトウェアを最初に初期化したときに最初からロードされるあらゆる値またはパラメータの組を意味するものとする。
【００６０】
「シグネチャ配列（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、進化的に関連のあるタンパク質のアライメントされた配列に沿って特定の位置で保存される一組のアミノ酸を意味する。相同なタンパク質間で他の位置にあるアミノ酸が変わる可能性はあるが、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、その構造、タンパク質の安定性または活性に不可欠なアミノ酸を示す。これらのアミノ酸は、あるファミリのタンパク質相同体のアライメントされた配列での保存の度合いが高いことで同定されるため、これを識別子すなわち「シグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」として使用し、新たに求められた配列を持つタンパク質が過去に同定されたタンパク質ファミリに属するものであるか否かを判断することができる。本発明のシグネチャ配列を、配列番号４７のｐ１〜ｐ７４と、配列番号４８のｐ１〜ｐ７６と、配列番号４９のｐ１〜ｐ４１とで構成されるシグネチャ配列を示す図６に具体的にあげておく。
【００６１】
本願明細書で利用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は従来技術において周知のものであり、サムブルック・ジェー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ・イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス・ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）（以下、「マニアティス」とする）およびシルハビー・ティ・ジェー（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン・エム・エル（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）およびエンキスト・エル・ダブリュ（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・コールド出版局スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ（１９８４）ならびにオースベル・エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７）によって説明されている。
【００６２】
バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ活性を持つ微生物の単離
バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ活性を持つ微生物はさまざまなソースから単離できるものである。好適なソースとしては、工業廃棄物流、汚染された工場用地および廃棄物流処理施設の土壌があげられる。本発明のバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ含有微生物については、廃水処理プラントの活性汚泥から単離した。
【００６３】
少なくとも１種のケトン基質を併用して好適な成長培地でインキュベーションを行うことで、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ活性を持つ微生物を含有する可能性のある試料を富化することができる。本発明で使用するのに適したケトン基質としては、一般式
【００６４】
【化２】
2005512514.tif 000005
【００６５】
（式中、ＲおよびＲ１は独立に、置換または未置換のフェニル、置換または未置換のアルキル、あるいは置換または未置換のアルケニル、あるいは置換または未置換のアルキリデンから選択される）で表されるケトテルペンおよび環状ケトンがあげられる。これらの化合物は合成物であっても天然の二次代謝物であってもよい。
【００６６】
特に有用なケトン基質としては、ノーカンフォー、シクロブタノン、シクロペンタノン、２−メチル−シクロペンタノン、シクロヘキサノン、２−メチル−シクロヘキサノン、シクロヘキサ−２−エン−１−オン、１，２−シクロヘキサンジオン、１，３−シクロヘキサンジオン、１，４−シクロヘキサンジオン、シクロヘプタノン、シクロオクタノン、シクロデカノン、シクロウンデカノン、シクロドデカノン、シクロトリデカノン、シクロペンタ−デカノン、２−トリデカノン、ジヘキシルケトン、２−フェニル−シクロヘキサノン、オキシンドール、レボグルコセノン、ジメチルスルホキシド、ジメチ−２−ピペリドン、フェニルボロン酸、β−イオノンがあげられるが、これに限定されるものではない。微生物の富化とスクリーニングに必要な成長培地および手法は従来技術において周知であり、その一例が、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、アール・ジー・イー・マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ・エヌ・コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン・ダブリュ・ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス・エー・ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル・アール・クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびジー・ブリッグズ・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン・ディーシー（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４））またはトーマス・ディ・ブラック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウアー・アソシエーツ・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）（１９８９）に記載されている。
【００６７】
バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ含有微生物のキャラクタリゼーション：
新規な細菌の分類学的同定には小サブユニットリボソームＲＮＡまたはＤＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の配列が頻繁に用いられる。今までのところ、７，０００を超える細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列をすぐに利用することができる。１６Ｓ  ｒＤＮＡの高度に保存された領域は、広範囲のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（またはＲＴ−ＰＣＲ）のプライミング部位となり、この手順の前に標的となる微生物に関する特定の情報を得る必要性がなくなる。このため、過去にキャラクタライズされた細菌を広範囲の細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡ増幅、シーケンシング、系統発生学的分析によって同定できるようになる。
【００６８】
本発明は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ分子の保存された領域に対応するプライマーを使用した１６Ｓ  ｒＤＮＡ増幅後に分類学的同定を行い（アマン・アール・アイ（Ａｍａｎｎ，Ｒ．Ｉ．）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９（１）：１４３〜６９（１９９５）、ケーン・エム・ディ（Ｋａｎｅ，Ｍ．Ｄ．）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：６８２〜６８６（１９９３））、続いてシーケンシングおよびブラスト（ＢＬＡＳＴ）分析（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、アルチュル・エス・エフ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３）、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）を実施することを基調とする、７種類の細菌の単離および同定について説明するものである。ブレビバクテリウム属、アルスロバクター属、アシネトバクター属、アシドボラクス属、ロドコッカス属の細菌との間の相同性が極めて高いものとして細菌株を同定した。
【００６９】
株ＡＮ１２から得られる１６Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド塩基配列を公共のデータベースと比較すると、ロドコッカス属に属する細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列が最も類似した既知配列（９８％相同）であることが分かる。
【００７０】
株ＣＨＸから得られる１６Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド塩基配列を公共のデータベースと比較すると、アシドボラクス属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列が最も類似した既知配列（９７％相同）であることが分かる。
【００７１】
株ＢＰ２から得られる１６Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド塩基配列を公共のデータベースと比較すると、アルスロバクター属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列が最も類似した既知配列（９９％相同）であることが分かる。株ＳＥ１９から得られる１６Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド塩基配列を公共のデータベースと比較すると、アシネトバクター属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列が最も類似した既知配列（９９％相同）であることが分かる。
【００７２】
株ｐｈｉ１およびｐｈｉ２から得られる１６Ｓ  ｒＲＮＡヌクレオチド塩基配列を公共のデータベースと比較すると、ロドコッカス属に属する細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列が最も類似した既知配列（９９％相同）であることが分かる。
【００７３】
バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ相同体の同定
本発明は、環状ケトンおよびケトテルペンを含んで成る好適なケトン基質を対応するラクトンまたはエステルに変換する能力を持つバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ遺伝子および遺伝子産物の例を提供するものである。たとえば、ＢＶＭＯをコードする遺伝子を、アルスロバクター属（配列番号１１）、ブレビバクテリウム属（配列番号１３および１５）、アシドボラクス属（配列番号１７）、アシネトバクター属（配列番号１９）、ロドコッカス属（配列番号７、９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５）から単離した。
【００７４】
アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５３２アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約５７％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００７５】
アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸ  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５３８アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約５７％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００７６】
ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５４２アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約５５％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００７７】
ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５４１アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約５３％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００７８】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１２  ＯＲＦ８  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が４３９アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約３７％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００７９】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ９  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５１８アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約４４％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８０】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１０  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５４１アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約６４％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８１】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１１  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が４６２アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約６５％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８２】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１２  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５２３アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約４５％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８３】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１３  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が４９３アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約５５％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８４】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１４  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５３９アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約５１％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８５】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１５  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が６４９アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約３９％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８６】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１６  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が４９４アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約４３％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８７】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１７  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が４９９アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約５３％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８８】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１８  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が４９３アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約４４％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００８９】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ１９  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５４１アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約５４％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００９０】
ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１  ＯＲＦ２０  ｃｈｎＢのヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列を公共のデータベースと比較すると、スミス・ウォーターマンアライメントアルゴリズム（ダブリュ・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）（上掲））で、最も類似した既知配列が５４５アミノ酸長にわたって本願明細書に記載のアミノ酸配列と約４２％同一の遠位距離からの範囲にあることが分かる。好ましいアミノ酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、なお一層好ましいアミノ酸断片は少なくとも約８０％〜９０％同一である。最も好ましいのは、本願明細書に記載のアミノ酸断片と少なくとも９５％同一の核酸断片である。同様に、本件ＯＲＦに対応する好ましいｃｈｎＢコード核酸配列は、活性タンパク質をコードし、本願明細書に記載の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸配列である。なお一層好ましいｃｈｎＢ核酸断片は、本願明細書に記載の配列と少なくとも９０％同一のものである。最も好ましいのは、本願明細書に記載の核酸断片と少なくとも９５％同一のｃｈｎＢ核酸断片である。
【００９１】
上述した配列の同定と遺伝子産物の活性の生化学的キャラクタリゼーションだけでなく、本願出願人らは、これらのモノオキシゲナーゼタンパク質の多くが同様の活性を持つ他のタンパク質の同定に利用できる共通の指標となるシグネチャ配列を持つことを発見した。たとえば、本願モノオキシゲナーゼを配列アライメントに基づいて大きく３つのファミリにグループ分けすることができる。本願明細書ではＢＶファミリ１と呼ぶ第１のグループは、図７に示すモノオキシゲナーゼ配列で構成され、配列番号４７に記載のコンセンサス配列を生成する。図７から明らかなように、図７の配列全体にわたって７４位に完全に保存されたアミノ酸のグループがある。これらの位置を図６にさらに正確に示し、ｐ１〜ｐ７４で表す。
【００９２】
同様に、ＢＶファミリ２は、図８に示すモノオキシゲナーゼ配列で構成され、配列番号４８に記載のコンセンサス配列を生成する。ＢＶファミリ２のモノオキシゲナーゼのシグネチャ配列（ｓｅｑｅｕｎｃｅ）を図６に位置ｐ１〜ｐ７６で示す。ＢＶファミリ３のモノオキシゲナーゼは図９に示すものであり、配列番号４９に記載のコンセンサス配列を生成し、図６に位置ｐ１〜ｐ４１で示すシグネチャ配列を有する。
【００９３】
ファミリによって配列に違いこそあれ、これらのファミリに含まれる個々のメンバはいずれもモノオキシゲナーゼ活性を持つことが明らかになっている。したがって、ポリペプチドが図６〜図９に定義するようなシグネチャ配列を含む場合、そのポリペプチドはモノオキシゲナーゼ活性を持つであろうと思われる。よって、
（ａ）配列番号４７の位置ｐ１〜ｐ７４のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４８のｐ１〜ｐ７６のアミノ酸残基の少なくとも８０％、あるいは配列番号４９のｐ１〜ｐ４１のアミノ酸残基の少なくとも８０％が完全に保存されているポリペプチドをコードする核酸断片でゲノムライブラリを探索し、
（ｂ）ステップ（ａ）の核酸断片とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るゲノム断片の配列を決定することを含んで成り、
配列決定されたゲノム断片がバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードするものである、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子の同定方法を提供することは本発明の範囲内である。
【００９４】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号４７の位置ｐ１〜ｐ７４のアミノ酸残基の少なくとも１００％、あるいは配列番号４８のｐ１〜ｐ７６のアミノ酸残基の少なくとも１００％、あるいは配列番号４９のｐ１〜ｐ４１のアミノ酸残基の少なくとも１００％が完全に保存されている場合に上記の方法を提供するものである。
【００９５】
配列依存性プロトコールに準じて、あるいは本願明細書に開示のシグネチャ配列に対するアライメントに従って、同様の基質特異性を持つ他のバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ遺伝子を同定し、単離できるかもしれないことは理解できよう。
【００９６】
配列依存性プロトコールを利用した相同遺伝子の単離については従来技術において周知である。配列依存性プロトコールの例としては、核酸増幅技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、タボル・エス（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１０７４（１９８５））あるいは鎖置換増幅（ＳＤＡ、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２（１９９２））のさまざまな用途にみられるような核酸ハイブリダイゼーション法ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの増幅法があげられるが、これに限定されるものではない。
【００９７】
たとえば、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５に示す核酸断片のうちの全部または一部を利用して、本バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼと同様のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を直接単離したり、あるいは当業者間で周知の方法を使って所望の細菌からライブラリをスクリーニングするためのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして単離することが可能であった。従来技術において周知の方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（上掲））で、本件核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを設計し、合成することができる。さらに、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識法などの当業者間で周知の方法で、完全配列を使ってＤＮＡプローブを直接合成したり、あるいは利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使ってＲＮＡプローブを直接合成したりすることも可能である。さらに、特定のプライマーを設計し、これを利用して本配列の一部または全長を増幅することが可能である。得られる増幅産物については、増幅反応時に直接標識してもよいし、増幅反応後に標識し、適切なストリンジェンシーの条件下で全長ＤＮＡ断片を単離するためのプローブとして利用してもよい。
【００９８】
ＰＣＲタイプのプライマーによる増幅手法では、プライマーの配列がそれぞれ違っていて互いに相補ではないのが普通である。所望の試験条件次第では、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を得られるようにプライマーの配列を設計しなければならない。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的なものであり、従来技術において周知である。（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウァランス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ケー・イー・デービス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６）第３３〜５０ページ、バージニア州ヘーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）、アイアールエル・プレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、リクリーク・ダブリュ（Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．）（１９９３）、ホワイト・ビー・エー（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．）（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻、第３１〜３９ページ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ヒューマニア・プレス・インコーポレイテッド（Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．））。
【００９９】
通常、ＰＣＲプライマーを利用してＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードする長めの核酸断片を増幅することができる。しかしながら、一方のプライマーの配列を本件核酸断片由来のものとし、他方のプライマーの配列で微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸領域の存在を利用して、クローニングされた核酸断片のライブラリでポリメラーゼ連鎖反応を行うようにしてもよい。あるいは、第２のプライマーの配列をクローニングベクター由来の配列に基づくものとしても構わない。たとえば、当業者であれば、ＲＡＣＥプロトコール（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：８９９８（１９８８））に従ってＰＣＲでｃＤＮＡを生成し、転写物中の一点と３’末端または５’末端との間の領域のコピーを増幅することができる。本件配列から、３’方向のプライマーと５’方向のプライマーとを設計することが可能である。市販の３’ＲＡＣＥ系または５’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を利用すれば、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離することができる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９）、ロウ（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９））。
【０１００】
したがって、本発明は、（ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、（ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクターに含まれるインサートを増幅することを含んで成り、増幅されたインサートがバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼをコードするものである、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼをコードする核酸分子の同定方法を提供するものである。
【０１０１】
あるいは、本件配列を相同体同定用のハイブリダイゼーション試薬として利用してもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本となる構成要素としては、プローブ、該当する遺伝子または遺伝子断片を含むのではないかと思われる試料、特異的ハイブリダイゼーション法があげられる。本発明のプローブの典型は、検出対象となる核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは検出対象となる核酸配列に「ハイブリダイズ可能」なものである。プローブ長については５塩基から数万塩基まで可変であり、その長さは実施する具体的な試験に応じて決まる。一般に、プローブ長を１５塩基から約３０塩基にするのが適している。検出対象となる核酸配列と相補的でなければならないのは、プローブ分子の一部のみである。また、プローブと標的配列との間の相補性も完全である必要はない。ハイブリダイズされた領域に含まれる塩基の画分の中には正しい相補的塩基とペアにならないものが生じるが、不完全に相補的な分子間であってもハイブリダイゼーションは起こるのである。
【０１０２】
ハイブリダイゼーション方法は十分に定義されている。一般に、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブと試料とを混合しておかなければならない。これには、適切な濃度および温度条件下にて、無機塩または有機塩の存在下でプローブと試料とを接触させる必要がある。このとき、プローブと試料の核酸との間で生じ得るハイブリダイゼーションを起こすことができる程度に十分な時間、プローブと試料の核酸とを接触させておかなければならない。ハイブリダイゼーションが起こるまでの時間は、混合物中におけるプローブまたは標的の濃度によって決まる。プローブまたは標的の濃度が高ければ高いほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーションに必要な時間は短くなる。任意にカオトロピック剤を加えてもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することで核酸を安定させる。さらに、カオトロピック剤を用いると、短いオリゴヌクレオチドプローブを使って感受性が高くストリンジェントなハイブリダイゼーションを室温にて行うことができるようになる［ヴァン・ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）（１９９１）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１］。好適なカオトロピック剤としては、特に、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム（ｒｕｂｉｄｉｕｍ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ヨウ化カリウム、トリフルオロ酢酸セシウムがあげられる。このカオトロピック剤については、一般に最終濃度を約３Ｍとして含有させる。必要があれば、ハイブリダイゼーション混合物に、一般には３０〜５０％（ｖ／ｖ）でホルムアミドを加えることもできる。
【０１０３】
さまざまなハイブリダイゼーション溶液を用いることが可能である。これらの溶液は一般に、約２０から６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶媒を含んで成る。通常のハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５から１Ｍの塩化ナトリウムと、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの約０．０５から０．１Ｍの緩衝液と、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５から０．２％の洗浄剤あるいは、０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ファルマシア・インコーポレイテッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．））（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、血清アルブミンが用いられている。また、一般的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１から５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸と、ウシ胸腺ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡなどの断片化した核ＤＮＡ、あるいは酵母ＲＮＡなどが含まれ、任意に約０．５から２％ｗｔ．／ｖｏｌ．のグリシンも含まれる。また、ポリエチレングリコールなどのさまざまな極性・水溶性または膨潤性の薬剤を含む体積排除剤、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオンポリマー、デキストラン硫酸などのアニオンサッカライドポリマー（ａｎｉｏｎｉｃ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）といった他の添加剤を含有させてもよい。
【０１０４】
したがって、本発明は、（ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５からなる群から選択される核酸分子の一部をプローブとしてゲノムライブラリを探索し、（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳという条件下で（ｉ）の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、（ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んで成るゲノム断片の配列を決定することを含んで成り、配列決定されたゲノム断片がバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼをコードするものである、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼをコードする核酸分子を同定するための方法を提供するものである。
【０１０５】
組換え発現−微生物
本ＢＶＭＯ配列の遺伝子および遺伝子産物を微生物宿主細胞に導入することができる。本件遺伝子および核酸分子を発現させるのに好ましい宿主細胞は、真菌または細菌ファミリ内で広く見られ、温度、ｐＨ値、溶媒耐性の点で広範囲にわたって成長する微生物宿主である。転写がゆえに、翻訳およびタンパク質生合成装置は細胞原料とは無関係に同じであり、細胞バイオマスの生成に用いる炭素原料とは無関係に機能的遺伝子が発現される。大規模な微生物成長および機能的遺伝子発現で広範囲にわたる単純または複雑な炭水化物、有機酸およびアルコール、メタンなどの飽和炭化水素、あるいは光合成宿主または化学合成独立栄養宿主の場合は二酸化炭素を利用することができる。しかしながら、特定の成長条件によって機能的遺伝子を調節、阻止あるいは抑制するようにしてもよく、こうした成長条件としては、窒素、亜リン酸、硫黄、酸素、炭素または小さな無機イオンをはじめとするあらゆる微量栄養素の形態および量があげられる。また、培地に添加され、一般には栄養素またはエネルギ源とはみなされない特定の調節分子の有無によって機能的遺伝子を調節してもよい。成長速度も遺伝子発現における重要な調節因子になることがある。好適な宿主株の例としては、アスペルギルス属、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、酵母菌属、ピチア属、カンジダ属、ハンゼヌラ属などの真菌種または酵母種、あるいは、プロテオバクテリアおよび放線菌のメンバなどの細菌種ならびに、特定のロドコッカス属、アシネトバクター属、アルスロバクター属、マイコバクテリア属、ノカルジア属、ブレビバクテリウム属、アシドボラクス属、バチルス属、ストレプトマイセス属、エシェリキア属、サルモネラ属、シュードモナス属、アスペルギルス属、酵母菌属、ピチア属、カンジダ属、コルニエバクテリウム属、ハンゼヌラ属があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１０６】
本発明においてモノオキシゲナーゼの宿主として特に適しているのは、プロテオバクテリアおよび放線菌のメンバである。プロテオバクテリアは生理学的に異なる微生物群をなし、５つの亜門（α、β、γ、ε、δ）がある（マディガン（Ｍａｄｉｇａｎ）ら、Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、第８版、プレンティス・ホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ）、ニュージャージー州アッパーサドルリバー（ＵｐｐｅｒＳａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ）（１９９７））。プロテオバクテリアの５つの亜門にはいずれも有機化合物を炭素源やエネルギとして利用する微生物が含まれる。本発明に適するプロテオバクテリアのメンバとしては、バークホルデリア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、パンドレア属、デルフチア属、コマモナス属があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１０７】
外来タンパク質の発現を高いレベルで指示する制御配列を含む微生物の発現系および発現ベクターが当業者間で周知である。このうちどれを使って本配列の遺伝子産物生成用のキメラ遺伝子を構築しても構わない。これらのキメラ遺伝子を形質転換によって適当な微生物に導入し、酵素を高いレベルで発現させることができる。
【０１０８】
好適な宿主細胞の形質転換に役立つベクターまたはカセットは従来技術において周知である。一般に、このベクターまたはカセットには、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、自己複製または染色体組み込みを可能にする配列が含まれる。好適なベクターは、転写開始制御部を含む遺伝子の５’の領域と転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’の領域とを含んで成る。これは両方の制御領域が形質転換宿主細胞と相同遺伝子に由来するものである場合に最も好ましいが、このような制御領域が生産宿主として選択した特定の種に固有の遺伝子に由来するものでなくてもよいことは理解できよう。
【０１０９】
所望の宿主細胞での本ＯＲＦの発現を駆動するのに役立つ開始制御領域またはプロモーターには多くのものがあり、当業者には馴染みのあるものである。これらの遺伝子を駆動できるほとんどすべてのプロモーターが本発明に適しており、その一例として、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（酵母菌属での発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア属での発現に有用）、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ｔｒｃ（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現に有用）ならびに、バシラス属での発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよびさまざまなファージプロモーターがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０１１０】
終結制御領域も好ましい宿主に固有のさまざまな遺伝子から誘導することができる。場合により、終結部位が必要ないこともあるが、終結部位を形が最も好ましい。
【０１１１】
組換え発現−植物
本発明のＢＶＭＯをコードする配列を利用して、微生物のタンパク質を発現する能力を持つトランスジェニック植物を作出することができる。好ましい植物宿主は、本件タンパク質の高い産生レベルの土台となるあらゆる種類の植物である。
【０１１２】
好適な緑色植物としては、ダイズ、ナタネ（ブラッシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アヌース（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ））、ワタ（ゴシッピウム・ヒルスーツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、トウモロコシ、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、コムギ（トリチカム  ｓｐ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ））、オオムギ（ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、オーツムギ（アベナ・サティバ・エル（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｌ））、モロコシ（ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、コメ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜類（ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、パースニップなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、芝種子、サトウダイコン、サトウキビ、インゲンマメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹、針葉樹、牧草があげられるが、これに限定されるものではない。藻類の種としては、スピルリナ属（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）およびドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）などの商業上重要な宿主があげられるが、これに限定されるものではない。所望の組織において所望の発育段階で遺伝子の発現を指示できるプロモーターにコード領域が作動的に結合されたキメラ遺伝子をまず作製することで、本発明のタンパク質を過剰発現させることができる。便宜上の理由で、キメラ遺伝子が同一の遺伝子に由来するプロモーター配列と翻訳リーダー配列を含んで成ることがある。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列もなければならない。さらに、本件キメラ遺伝子は、遺伝子発現を容易にするためにイントロンを１つまたはそれ以上含んで成るものであってもよい。
【０１１３】
このキメラ遺伝子配列では、コード領域の発現を誘導できるどのようなプロモーターとターミネーターとをどのように組み合わせて用いてもよい。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの好適な例として、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子から得られるものがあげられる。使用できる効率的な植物プロモーターのタイプのひとつに高等植物のプロモーターがある。このようなプロモーターは、遺伝子配列または本発明と作動的に結合された際に、本願遺伝子産物の発現を促進できるものでなければならない。本発明において使用できる高等植物のプロモーターとしては、ダイズからの例から得られるリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー・ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．Ｇｅｎ．１：４８３〜４９８、１９８２））ならびにクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターがあげられる。これらの２種類のプロモーターは植物細胞において光誘導されることが知られている（たとえば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、エー・キャッシュモア（Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク（１９８３）、第２９〜３８ページ、コルッチ・ジー（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．）ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５８：１３９９（１９８３）、ダンスミア・ピー（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２：２８５（１９８３）を参照のこと）。
【０１１４】
このようにして、本件キメラ遺伝子を含んで成るプラスミドベクターを作製することができる。どのプラスミドベクターを選択するかは、宿主植物の形質転換に使用する方法によって決まる。当業者であれば、キメラ遺伝子を含む宿主細胞を形質転換し、選択し、増殖させる過程を成功させるにはプラスミドベクターにどのような遺伝因子を存在させておく必要があるか分かるであろう。また、当業者であれば、互いに独立した異なる形質転換イベントでは得られる発現のレベルやパターンが異なる（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８（１９８５）、デ・アルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６（１９８９））ため、所望の発現レベルとパターンとを呈する系統を得るには複数のイベントをスクリーニングしなければならないことも理解できよう。このようなスクリーニングについては、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））によって行うことができる。ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロックツェック（Ｋｒｏｃｚｅｋ）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３））、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型の分析。
【０１１５】
用途によっては、本件タンパク質を異なる細胞区画に向けると有用である。したがって、コード配列を変更し、トランジット配列（キーグストラ・ケー（Ｋｅｅｇｓｔｒａ，Ｋ．）、Ｃｅｌｌ  ５６：２４７〜２５３（１９８９））シグナル配列、あるいは、小胞体局在化シグナルをコードする配列（クリスピールズ・ジェー・ジェー（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｊ．Ｊ．）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１））または核局在化シグナルをコードする配列（ライケル・エヌ（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｎ．）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２（１９９２））などの適当な細胞内標的配列を追加および／またはすでに存在する標的配列を除去した状態で酵素をコードすることで、上述したキメラ遺伝子をさらに補うことができると思われる。上記にて引用した参考文献にはそれぞれの例があげられているが、この一覧は網羅的なものではなく、本発明において利用できる有用な他の標的シグナルが将来的に発見される可能性もある。
【０１１６】
ケトン基質からラクトンおよびエステルを生成するプロセス
組換え生物で適切な核酸配列が発現されれば、この生物を対応するエステルの生成に適したケトン基質と接触させることができる。本発明のバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼは、環状ケトンおよびケトテルペンを含んで成るさまざまなケトン基質に作用し、対応するラクトンまたはエステルを生成する。エステルへの変換に適したケトン基質は一般式
【０１１７】
【化３】
2005512514.tif 000006
【０１１８】
（式中、ＲおよびＲ１は独立に、置換または未置換のフェニル、置換または未置換のアルキル、あるいは置換または未置換のアルケニル、あるいは置換または未置換のアルキリデンから選択される）で定義される。特に有用なケトン基質としては、ノーカンフォー、シクロブタノン、シクロペンタノン、２−メチル−シクロペンタノン、シクロヘキサノン、２−メチル−シクロヘキサノン、シクロヘキサ−２−エン−１−オン、１，２−シクロヘキサンジオン、１，３−シクロヘキサンジオン、１，４−シクロヘキサンジオン、シクロヘプタノン、シクロオクタノン、シクロデカノン、シクロウンデカノン、シクロドデカノン、シクロトリデカノン、シクロペンタ−デカノン、２−トリデカノン、ジヘキシルケトン、２−フェニル−シクロヘキサノン、オキシンドール、レボグルコセノン、ジメチルスルホキシド、ジメチ−２−ピペリドン、フェニルボロン酸、β−イオノンがあげられるが、これに限定されるものではない。
【０１１９】
あるいは、ケトン基質を対応するエステルに変える転換に本発明の酵素をｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用できると思われる。モノオキシゲナーゼ酵素については、組換え的に生成または天然ソースから単離し、精製し、ｐＨおよび温度が好適な条件下で適当な基質と反応させることができる。
【０１２０】
ラクトンまたはエステルの大規模な量産が望まれる場合、さまざまな培養法を適用することができる。たとえば、バッチ培養法または連続培養法のどちらでも組換え微生物宿主からの大規模生産品を製造することができる。
【０１２１】
従来からのバッチ培養法は、培地の組成物を培養開始時に仕込み、培養工程の途中で人工的に変化させることのない閉じた系のひとつである。このため、培養工程開始時に所望の生物または複数の生物を培地に播種し、系に何も加えずに成長または代謝活性を引き起こさせる。しかしながら、一般に「バッチ」培養では炭素源の追加という意味ではまとめて処理が行われるため、ｐＨおよび酸素濃度などの要因を制御しようとする試みがなされることが多い。バッチ系では、培養を停止させるまで系の代謝物とバイオマス組成が絶えず変化する。バッチ培養では、細胞は動きのない誘導期から大きく成長する対数期へと移り、最後に静止期において成長率が低下または停止する。未処理の状態では、静止期の細胞は最終的には死んでしまう。系によっては、最終生成物または中間体の大半が対数期の細胞によって作られることが多い。他の系では静止期または対数増殖期後に生産品を得ることが可能である。
【０１２２】
標準的なバッチ系のバリエーションのひとつにＦｅｄ−バッチ系がある。Ｆｅｄ−バッチ培養プロセスも本発明において好適であり、培養が進むにつれて基質を増やしながら加えること以外は一般的なバッチ系で構成される。Ｆｅｄ−バッチ系は、カタボライト抑制によって細胞の代謝が阻害されやすい場合や、培地に含まれる基質の量を制限するのが望ましい場合に有用なものである。Ｆｅｄ−バッチ系で実際の基質濃度を測定するのは困難であるため、ｐＨ、溶存酸素、ＣＯ２などの廃ガスの分圧といった測定可能な要因の変化に基づいて濃度を推測する。バッチ培養法およびＦｅｄ−バッチ培養法は一般的かつ従来技術において周知のものであり、その一例が、本願明細書に援用するトーマス・ディ・ブラック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）シナウアー・アソシエーツ・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）またはデシュパンド・ムカンド・ヴイ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７（１９９２）に記載されている。
【０１２３】
連続培養を用いて本発明のラクトンおよびエステルを量産することもできる。連続培養は、処理時に一定の培養液を連続してバイオリアクターに加えると同時に、これと同じ量の条件培地を取り出す開いた系のひとつである。連続培養では細胞が主に成長の対数期にある一定の高い液相密度に細胞を維持するのが普通である。あるいは、炭素と栄養素とが連続的に加えられる固定化細胞を利用し、価値のある生成物、副生物または廃棄物を細胞塊から連続的に取り出す連続培養を行うようにしても構わない。細胞の固定化については、天然および／または合成の材料からなる広い範囲の固体担体を使って行うことができる。
【０１２４】
連続培養または半連続培養では、細胞の成長または最終生成物の濃度に影響する要因をひとつまたはいくつでも加減することができる。たとえば、ひとつの方法では、炭素源などの限られた栄養素または窒素濃度を一定率に維持し、他のすべてのパラメータを加減できるようにする。他の系では、培地の混濁度で測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響する多数の要因を連続して変化させることができる。連続系は定常状態の成長条件を維持することを目指すものであるため、培養時における細胞の成長率と培地除去による細胞喪失とのバランスを保つようにしなければならない。連続発酵プロセスで栄養素と成長因子とを調節する方法ならびに、生成物の形成速度を最大限にするための手法は工業用微生物学の従来技術において周知であり、ブラック（Ｂｒｏｃｋ）（上掲）によってさまざまな方法が詳細に説明されている。
【０１２５】
活性を亢進させたバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ
本願ＢＶＭＯ配列を使用して、活性を亢進または変化させた遺伝子産物を生成できると考えられる。天然遺伝子の配列を突然変異させ、活性を変化または亢進させた遺伝子産物を生成する方法にはさまざまなものが周知であり、その一例として、ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（１９９９年２月１５日）第２７巻、Ｎｏ．４、第１０５６〜１０６２ページ）、部位特異的突然変異誘発（クームス（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８）、２５９〜３１１、１プレート、編集者（ら）：アンゲレッチ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ）、ルース・オーグ（Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ）。出版社：カリフォルニア州サン・ディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ））、「遺伝子シャッフリング」（本願明細書に援用する、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３７，４５８号）があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１２６】
遺伝子シャッフリングの方法は、実現しやすく、突然変異誘発率が高く、かつスクリーニングが容易であることから、特に魅力的である。遺伝子シャッフリングの方法では、該当する遺伝子と類似のＤＮＡ領域と異なるＤＮＡ領域からなる別の集合が存在する状態で該当する遺伝子を制限エンドヌクレアーゼで特定サイズの断片に切断する必要がある。こうした断片のプールを変性させた後、再アニールして変異遺伝子を作り出す。この変異遺伝子の活性の変化をスクリーニングする。
【０１２７】
本発明のＢＶＭＯ配列については、この方法を使って変異させ、活性の変化または亢進をスクリーニングすることができる。この配列は二本鎖でなければならず、５０ｂｐから１０ｋｂのさまざまな長さのものとすることが可能である。この配列を従来技術において周知（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（上掲））の制限エンドヌクレアーゼでランダムに消化し、約１０ｂｐから１０００ｂｐの範囲の断片を得る。本件微生物配列だけでなく、微生物配列の全部または一部とハイブリダイズ可能な断片の集合を加えてもよい。同様に、本件配列とハイブリダイズできない断片の集合を加えてもよい。一般に、こうして断片の集合を追加する場合は、全核酸に対して重量で約１０から２０倍過剰になるようにして行う。通常、このプロセスを続けると、混合物中の異なる特異的核酸断片は約１００から約１０００になる。ランダムな核酸断片の混合集合を変性させて一本鎖核酸断片を形成した後、再アニール処理をほどこす。他の一本鎖核酸断片と相同な領域を持つ一本鎖核酸断片のみが再アニールされる。このとき、ランダムな核酸断片を加熱によって変性させることができる。当業者であれば、二本鎖核酸を完全に変性させるのに必要な条件を決めることができよう。好ましくは、温度を８０℃から１００℃とする。また、核酸断片を冷却によって再アニールさせてもよい。好ましくは、温度を２０℃から７５℃とする。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩を加えれば再生を加速することが可能である。好適な塩濃度については０ｍＭから２００ｍＭの範囲とすることができる。次に、アニール後の核酸断片を核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の存在下でインキュベートする。この核酸ポリメラーゼは、クレノー断片やＴａｑポリメラーゼであってもよいし、従来技術において周知の他のどのようなＤＮＡポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼをランダム核酸断片に加える作業は、アニーリングの前に行ってもよいし、アニーリングと同時またはアニーリング後に行ってもよい。上記のポリメラーゼの存在下における変性、再生、インキュベーションのサイクルを、所望の回数繰り返す。好ましくは、サイクルを２から５０回繰り返し、一層好ましくは、シーケンスを１０から４０回繰り返す。このようにして得られる核酸は、約５０ｂｐから約１００ｋｂの範囲の大きめの二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準的なクローニングおよび発現のプロトコールを使って発現および活性の変化についてのスクリーニングが可能なものである。（マナティス（Ｍａｎａｔｉｓ）（上掲））。
【０１２８】
さらに、遺伝子シャッフリング（エキソンシャッフリング）法（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、ＰＮＡＳ、９４：１０６９〜１０７３（１９９７））を用いる機能ドメインの融合によってハイブリッドタンパク質をアセンブルすることが可能である。また、本件遺伝子の機能ドメインを他の遺伝子の機能ドメインと組み合わせ、所望の触媒機能を持つ新規な酵素を作り出すことが可能である。ＰＣＲオーバーラップ伸長法を用いてハイブリッド酵素を構築し、当業者間で周知の方法でさまざまな発現ベクターにクローニングすることができる。
【実施例】
【０１２９】
以下の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示目的であげたものにすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から本発明に不可欠な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施してこれをさまざまな用途および条件に合わせることができる。
【０１３０】
一般法
実施例で用いる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング法は従来技術において周知であり、サムブルック・ジェー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ・イー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス・ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））およびティ・ジェー・シルハヴィ（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、エム・エル・ベンナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）およびエル・ダブリュ・エンキスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）著、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８４）ならびにオースベル・エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版（１９８７）に記載されている。
【０１３１】
細菌培養の管理と成長に適した材料および方法が従来技術において周知である。以下の実施例において使用するのに適した手法が、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、アール・ジー・イー・マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ・エヌ・コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン・ダブリュ・ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス・エー・ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル・アール・クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびジー・ブリッグズ・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン・ディーシー（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４））またはトーマス・ディ・ブラック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウアー・アソシエーツ・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）（１９８９）に記載されている。特に明記しない限り、細菌細胞の成長および管理に用いる試薬、制限酵素、材料はいずれも、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ））、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ））、ギブコ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））から入手したものである。
【０１３２】
細菌株およびプラスミド：  工業廃水処理施設から入手した活性汚泥を富化したものから、ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１２、ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸ、アシネトバクター  ｓｐ．ＳＥ１９を単離した。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αおよびＤＨ１０Ｂのマックス・エフィシエンシー（Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）コンピテント細胞をギブコ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））から購入した。発現プラスミドｐＱＥ３０をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ））から購入し、一方、クローニングベクターｐＣＲ２．１および発現ベクターｐＴｒｃ／Ｈｉｓ２−Ｔｏｐｏについてはインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州サン・ディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ））から購入した。
【０１３３】
１６Ｓ  ｒＤＮＡ分子の保存された領域に対応するプライマーを使用し、染色体ＤＮＡから１６Ｓ  ｒＤＮＡをＰＣＲ増幅して、ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１２、ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸ、アシネトバクター  ｓｐ．ＳＥ１９の分類学的同定を行った（表２）。これには、９５℃（５分）で１サイクルに続き、９５℃（１分）、５５℃（１分）、７２℃（１分）を２５サイクル、さらに最終伸長に７２℃（８分）の温度プログラムを使用した。（後述する方法での）ＤＮＡシーケンシング後、各単離物の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子配列を、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）で類似配列を求めるブラスト（ＢＬＡＳＴ）検索（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７））用のクエリ配列として使用した。
【０１３４】
【表２】
2005512514.tif 000007
【０１３５】
シーケンシング
ベクターおよびインサート特異的プライマーを用いるダイターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号、ＥＰ２７２００７号）を使用し、ＡＢＩ自動シーケンサで配列を生成した。シークエンチャ（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）のジーン・コーズ・コーポレーション（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．））またはウィスコンシン・ジーシージー（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ）プログラム（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ））とコンセド（ＣＯＮＳＥＤ）パッケージ（バージョン７．０）のいずれかを使用して、配列編集を行った。すべての配列が両方向に少なくとも２倍のカバレッジを示している。
【０１３６】
ジェネティクス・コンピュータ・グループ・インコーポレイテッド（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）から入手可能なプログラムパッケージ（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ））を使用して、遺伝子配列のマニピュレーションを実施した。ＧＣＧプログラムの「Ｐｉｌｅｕｐ」を使用する場合、ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎのデフォルト値に１２、ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎのデフォルト値に４を使用した。ＧＣＧの「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムを使用する場合、デフォルトのｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙに５０、デフォルトのｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙに３を使用した。これらのプログラムまたは他のいずれのＧＣＧプログラムにおいても、ＧＣＧプログラムのパラメータの指示のない場合はデフォルト値を使用した。
【０１３７】
略号の意味は以下のとおりである。「ｓｅｃ」は秒（単数または複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数または複数）を意味し、「ｈ」は時間（単数または複数）を意味し、「ｄ」は日（単数または複数）を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル」を意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモル（単数または複数）を意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｍＵ」はミリ単位を意味し、「ｐｐｍ」は百分率を意味し、「ｐｓｉ」は１平方インチ当たりの圧力ポンドを意味し、「ｋＢ」はキロ塩基を意味する。
【０１３８】
実施例１
混合された微生物集合におけるモノオキシゲナーゼ遺伝子の発見
この実施例は、混合された微生物集落を富化することにより、シクロヘキサノン分解生物であるアルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２を単離することについて説明するものである。微生物の混合集合を含む培養にディファレンシャルディスプレイ法を適用したところ、モノオキシゲナーゼ遺伝子を発見することができた。
【０１３９】
シクロヘキサノン分解体の富化
廃水バイオリアクターから混合された微生物集落を得て、微量の酵母エキスカザミノ酸およびペプトン（ＹＥＣＡＡＰ）を濃度０．１％で含み、かつ０．１％のシクロヘキサノールおよびシクロヘキサノンを炭素源として添加した最小培地（５０ｍＭ  ＫＨＰＯ４（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３、１μＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、０．０００１％ＦｅＳＯ４）で保持した。シクロヘキサノンの存在下で培養の成長が増したことから、シクロヘキサノンを変換できるメンバを含む微生物の集合であることが明らかになった。
【０１４０】
菌株の単離
Ｒ２Ａ寒天（メリーランド州コッキーズビル（Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ）のベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ））に３０℃で培養を展開し、集落から個別の７菌株を単離した。これらの菌株をコンタミネーションを発生させずに同じ培地に画線した。これらの７菌株のうち、アルスロバクター種のＢＰ２として同定された菌株が淡黄色の大きなコロニーを形成した。種ｐｈｉ１として同定されたロドコッカス属の菌株は色がオレンジの小さなコロニーを形成した。種ｐｈｉ２で示す他のロドコッカス属の菌株は色が赤の小さなコロニーを形成した。
【０１４１】
１６ｓ  ｒＤＮＡ配列をジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列データベースに収録された既知の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と比較することで、個々の菌株を同定した。株ＢＰ２由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号１）は、アルスロバクター属に属する細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列との間で少なくとも９９％相同であった。株ｐｈｉ１およびｐｈｉ２由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は各々、グラム陽性菌であるロドコッカス属に属する細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列との間で少なくとも９９％相同であった。ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１の完全な１６ｓ  ＤＮＡ配列を配列番号２として示し、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２については配列番号３にあげておく。
【０１４２】
シクロヘキサノン酸化遺伝子の誘導
この集落のメンバ内でシクロヘキサノン酸化遺伝子を誘導するために、廃水バイオリアクターから得た種菌１ｍｌを、ＹＥＣＡＡＰ０．１％を加えた最小培地２５ｍｌに懸濁させ、攪拌しながら３０℃で一晩インキュベートした。翌日、ＹＥＣＡＡＰ０．１％を加えた全容量５０ｍｌの最小培地に一晩培養１０ｍｌを再懸濁させた。この培養の光学密度は６００ｎｍで０．２９吸光度単位であった。３０℃で３０分の平衡化後、培養を２つに分けて容量２５ｍｌずつにした。これらの培養の一方に、シクロヘキサノン（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））２５μｌ（０．１％）を加えた。両方の培養をさらに３時間インキュベートした。この時点で、培養を氷上に移し、４℃での遠心分離によって回収し、最小塩培地２容量で洗浄し、光学密度が１．０吸光度単位（６００ｎｍ）になるまで希釈した。酸素電極（オハイオ州イエロー・スプリングス（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ）のイエロー・スプリングス・インスツルメンツ・カンパニー（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．））を装着した水冷ジャケット式の呼吸測定セルに３０℃で培養約６ｍｌを入れ、シクロヘキサノン酵素が誘導されることを確認した。各細胞懸濁液で基線の呼吸（ｂａｓｅｌｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ）が確立された後、最終濃度が０．１％になるようにシクロヘキサノンを加え、Ｏ２消費速度をさらに監視した。対照培養では、シクロヘキサノンの２００秒後に２ｍＭ  酢酸カリウムを加えた。
【０１４３】
全集落ＲＮＡの単離
上述したシクロヘキサノンを用いる３時間の誘導時間経過後、対照試料と誘導試料（各２ｍＬ）とを４℃の遠心機にて１４００ｒｐｍで回収し、緩衝液ＲＬＴ（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））９００μｌに再懸濁させた。容量３００μＬのジルコニアビーズ（オクラホマ州バートルズビル（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ）のバイオスペック・プロダクツ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））を加え、ビーズビーター（バイオスペック・プロダクツ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））を使用して１分あたり２４００拍で３分かけて細胞を破壊した。アールエヌイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキット（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用し、これらの試料を核酸単離用に各々６つのアリコートに分け、各々をキットに同梱されていた１００  ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｄＨ２Ｏで溶出した。１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ  ＫＣｌ、２Ｕ  ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）のアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を使用して、３７℃で４時間かけて試料中でＤＮＡを分解した。ＲＴ−ＰＣＲに使用した任意のオリゴヌクレオチドのうちのひとつを用いるＰＣＲで全ＤＮＡ分解を試験した後、アールエヌイージー（ＲＮｅａｓｙ）ミニキットを使用してＲＮＡを精製し、１００μｌのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｄＨ２Ｏ中で上述したようにして溶出した。
【０１４４】
任意に逆転写した全ＲＮＡからのＲＡＰＤの生成
配列ＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＶＶＶＶ（配列番号６３）ここで、ＶＶＶＶはＡとＧとＣの３つの塩基のあらゆる組み合わせを示す）を有する２４４のプライマーからなる組を、対照細胞または誘導細胞のいずれかから得られたＲＮＡと同様に別のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用した。スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＴＭ  ワンステップ（Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ）ＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ギブコＢＲＬ）反応混合物を全ＲＮＡ２〜５ｎｇと合わせて全反応容量２５μｌで使用した。以下の温度プログラムでＰＣＲを実施した。
１サイクル：４℃（２分）、３７℃まで一定の率で５分上昇（１時間）に続いて９５℃でインキュベーション（３分）、
１サイクル：９４℃（１分）、４０℃（５分）および７２℃（５分）、
４０サイクル：９４℃（１分）、６０℃（１分）および７２℃（１分）、
１サイクル：７０℃（５分）、電気泳動（ｅｌｅｃｔｏｒｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離されるまで４℃で保持。
【０１４５】
これらのＰＣＲ増幅の産物（基本的にはＲＡＰＤ断片）をポリアクリルアミドゲル（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のアマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））上での１Ｖ／ｃｍの電気泳動で分離した。対照ｍＲＮＡ（シクロヘキサノン誘導なし）から得られた産物と誘導ｍＲＮＡ断片から得られた産物を、自動ゲル染色機（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のアマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））での銀染色によって可視化した。
【０１４６】
差次的発現させたＤＮＡ断片の再増幅
ディファレンシャルディスプレイ断片の切り出したゲルバンドを使用して、９５℃で２０分、シアン化ナトリウム溶出緩衝液（ＮａＣＮ１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％ＮＰ４０）を２５μｌの容量でインキュベートした。断片の生成元になったプライマーを使用して２５μｌの反応液中で溶出混合物５μｌでＰＣＲ反応時にこのＤＮＡ断片を再増幅させた。再増幅の温度プログラムについては、９４℃（５分）、さらには９４℃（１分）、５５℃（１分）および７２℃（１分）を２０サイクルに続いて、７２℃（７分）とした。再増幅産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に直接クローニングし、ＡＢＩモデル３７７を用いてエービーアイ・ビッグダイ（ＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅ）ターミネーターシーケンシング化学試薬（マサチューセッツ州フラミンハム（Ｆｒａｍｉｎｈａｍ）のパーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で配列を決定した。それぞれの再増幅バンドごとに８つのクローンをシーケンシングに供した。ブラストエックス（ＢｌａｓｔＸ）プログラム（ＮＣＢＩ）を使用して、クローニングされた断片のヌクレオチド配列を非冗長なジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースと比較した。
【０１４７】
シクロヘキサノン酸化経路遺伝子のシーケンシング
差次的発現された個々の断片をＰＣＲによって増幅するために、オリゴヌクレオチドを設計した。個々の菌株からＤＮＡを単離した後、これらのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、差次的発現された個々の断片をコードするＤＮＡがどの菌株に含まれているかを判断した。既知のシクロヘキサノン分解遺伝子に対する相同性でディファレンシャルディスプレイされた断片に対して設計したプライマーを用いて、コスミドをＰＣＲでスクリーニングした。コスミドクローン（１．０μｌ）を持つ組換えエシェリキア・コリの各細胞培養を２５ｕｌのＰＣＲ反応混合物中でのテンプレートとして使用した。Ａ１０２ＦＩ（配列番号１０８）とＣＯＮＲ（配列番号１０９）のプライマー対を使用してアルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２のライブラリをスクリーニングし、Ａ２２８ＦＩ（配列番号１１０）とＡ２２８ＲＩ（配列番号１１１）のプライマー対を使用してロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２のライブラリをスクリーニングし、Ａ２ＦＩ（配列番号１１２）とＡ３４ＲＩ（配列番号１１３）のプライマー対を使用してロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１のライブラリをスクリーニングした。ＰＣＲ反応での産物サイズが正しかった組換えエシェリキア・コリからのコスミドを単離し、Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、この部分消化物からの１０〜１５ｋＢの断片を青／白のスクリーニングベクターｐＳＵ１９（バルトロメ・ビー（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ，Ｂ．）ら、Ｇｅｎｅ．１０２（１）：  ７５〜８（１９９１年６月１５日）、マルティネス・イー（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｅ．）ら、Ｇｅｎｅ．６８（１）：１５９〜６２（１９８８年８月１５日））にサブクローニングした。これらのサブクローンをキアゲンターボ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｕｒｂｏ）９６ミニプレップキットを使用して単離し、上述したようにしてＰＣＲで再スクリーニングした。正しい配列断片を持つサブクローンを、ＧＰＳ−１ゲノムプライミング・システム（Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）キット（マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）のニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．））を用いてｐＧＰＳ１．１でトランスポーズした。これらのトランスポーズされた複数のプラスミドをトランスポソンの各末端から配列決定し、キロ塩基長のＤＮＡ断片を得た。シークエンチャ（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）プログラム（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）のジーン・コーズ・コーポレーション（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．））で配列アセンブリを行った。
【０１４８】
実施例２
シクロヘキサノンの酸化に関与するブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵモノオキシゲナーゼ遺伝子の単離
この実施例は、シクロヘキサノールおよびシクロヘキサノン分解体ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵを単離することについて説明するものである。ディファレンシャルディスプレイ法を使用して生物からのＢＶモノオキシゲナーゼ遺伝子を発見した。
【０１４９】
菌株の単離
微量の酵母エキスおよびカザミノ酸とを含有（各０．００５％）する好塩性の最小培地（１リットルあたり：寒天１５ｇ、ＮａＣｌ  １００ｇ、ＭｇＳＯ４  １０ｇ、ＫＣｌ  ２ｇ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ５０ｍｇ、ＦｅＳＯ４  ２ｍｇ、トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７）８ｇ）の寒天プレート上でシクロヘキサノールおよびシクロヘキサノンを分解する耐塩性細菌を選択し、シクロヘキサノン蒸気下で３０℃にてインキュベートした。工業廃水処理プラントから得た汚泥の再懸濁物を種菌とした。２週間後、ベージュ色のコロニーが観察されたため、同じ条件下で成長させた新鮮な寒天プレートにコンタミネーションを発生させずに画線した。
【０１５０】
単離したブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵの完全な１６ｓ  ＤＮＡ配列はユニークなものであることが分かった。これを配列番号４として示す。ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列データベースに収録された他の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と比較したところ、菌株ＨＣＵ由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ブレビバクテリウム属に属する細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列との間で少なくとも９９％相同であった。
【０１５１】
シクロヘキサノン分解経路の誘導
低塩培地での呼吸測定によりシクロヘキサノン経路の誘導性を試験した。ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵのコロニー１つを、０．００５％酵母エキスを含有するＳ１２鉱物培地（５０ｍＭ  ＫＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｕＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３、１μＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、０．０００１％  ＦｅＳＯ４）３００ｍｌに接種した。この培養を、それぞれ１０ｍＭ  アセテートと１０ｍＭ  シクロヘキサノンとが入った２つのフラスコに分けた。各フラスコを３０℃で６時間インキュベートし、シクロヘキサノン分解遺伝子を誘導させた。次に、この培養を氷上で冷却し、遠心分離によって回収し、微量の酵母エキスを欠いた氷冷Ｓ１２培地で３回洗浄した。最後に細胞を６００ｎｍでの光学密度が２．０になるように再懸濁させ、アッセイ時まで氷上にて保持した。
【０１５２】
酸素電極（オハイオ州イエロー・スプリング（Ｙｅｌｌｏｗ  ｓｐｒｉｎｇ）のイエロー・スプリング・インスツルメンツ・カンパニー（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．））を装着し、空気飽和させたＳ１２培地５ｍｌの入った水冷ジャケット式の呼吸測定セルに３０℃で各培養０．５ｍｌを入れた。各細胞懸濁液で基線の呼吸が確立された後、最終濃度が０．０２％になるようにアセテートまたはシクロヘキサノンを加え、Ｏ２消費速度をさらに監視した。
【０１５３】
シクロヘキサノン酸化遺伝子の同定
シクロヘキサノンの酸化に関与する遺伝子の同定では、この酸化経路が誘導可能なものである点を利用した。対照培養のｍＲＮＡ集合とシクロヘキサノン誘導培養のｍＲＮＡ集合とを、逆転写によるＤＮＡ断片のランダムな増幅とこれに続いてＰＣＲを行う手法で比較した。
【０１５４】
全細胞ＲＮＡの単離
Ｓ１２培地で成長させたブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵの２つに「分けた」１０ｍｌの培養のうちの一方に０．１％のシクロヘキサノンを加え、シクロヘキサノン酸化経路を誘導した。各培養を氷水浴中で急冷し、１５ｍｌ容のチューブに移した。−４℃まで冷却したローターにて１２，０００×ｇで２分間の遠心分離で細胞を回収した。上清を破棄し、１％ＳＤＳと１００ｍＭ  酢酸ナトリウムのｐＨ５の氷冷溶液０．７ｍｌにペレットを再懸濁させ、水性フェノール（ｐＨ５）０．７ｍｌと０．５ｍｍのジルコニアビーズ（オクラホマ州バートルズビル（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ）のバイオスペック・プロダクツ（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））０．３ｍｌの入った２ｍｌ容のチューブに移した。これらのチューブをビーズビーター（バイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ））に入れ、１分あたり２，４００拍で２分かけて破壊した。
【０１５５】
細胞の破壊後、チューブの液相を新たな微量遠心管に移し、１５，０００×ｇで３分間の遠心分離によって相同士を分離させた。全ＲＮＡを含有する水性相をｐＨ５のフェノールで２回以上抽出し、フェノール／水の界面に沈殿物が全く見えなくなるまでｐＨ７．５のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの混合物で２回抽出した。次に、３容量のエタノールを用いるエタノール沈殿によって水性相から核酸を回収し、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）処理水０．５ｍｌにペレットを再懸濁させた。６単位のＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡｓｅ（インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）のベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））で３７℃にて１時間でＤＮＡを消化した。続いて全ＲＮＡ溶液をｐＨ７．５のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回抽出し、エタノール沈殿によって回収し、おおよその濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるようにＤＥＰＣ処理水１ｍｌ中に再懸濁させた。
【０１５６】
任意に逆転写した全ＲＮＡからのＲＡＰＤパターンの生成
ウォン・ケー・ケー（Ｗｏｎｇ  Ｋ．Ｋ．）ら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９１：６３９（１９９４））に記載のプロトコールに従い、対照細胞および誘導細胞の全ＲＮＡから任意に増幅させたＤＮＡ断片を生成した。ＲＴ−ＰＣＲオリゴヌクレオチドセットを用いて一連の平行逆転写（ＲＴ）／ＰＣＲ増幅実験を行った。このセットは、各々が配列ＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＶＶＶＶ（配列番号６３）（ここで、ＶＶＶＶは３’末端の最後の４つの位置でのＡとＧとＣの３つの塩基のあらゆる組み合わせを示す）で設計された８１のプライマーで構成されていた。
【０１５７】
対照細胞および誘導細胞から得た全ＲＮＡについて、各々単一のＲＴ−ＰＣＲオリゴヌクレオチドを用いて一連の平行ＲＴ−ＰＣＲ増幅実験を行った。簡単に説明すると、１００Ｕのモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用し、ｄＮＴＰ各０．５ｍＭとオリゴヌクレオチドプライマー各１ｍＭを用いて５０μｌの逆転写（ＲＴ）反応を全ＲＮＡ２０〜１００ｎｇで行った。反応物を氷上にて調製し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１５８】
ＲＴ反応（０．２５μＭ）で使用したものと同じプライマー、ｄＮＴＰ（各０．２ｍＭ）、酢酸マグネシウム（４ｍＭ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼストッフェル断片（カリフォルニア州フォスター・シティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）のパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））２．５Ｕを含む５０μｌのＰＣＲ反応物でのテンプレートとして、各ＲＴ反応物から５μｌずつ使用した。以下の温度プログラムを使用した。９４℃（５分）、４０℃（５分）、７２℃（５分）を１サイクルに続き、９４℃（１分）、６０℃（１分）、７２℃（５分）を４０サイクル。
【０１５９】
アクリルアミドゲル（１５ｃｍ×１５ｃｍ×１．５ｍｍ、６％アクリルアミド、２９：１アクリル：ビスアクリルアミド、１００ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）、９０ｍＭ  ホウ酸塩、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）上での電気泳動によってＲＡＰＤ断片を分離した。対照ＲＮＡおよび誘導ＲＮＡから得られた反応物を用いて、各プライマーを並べて走らせて各ＰＣＲ反応物から５μｌずつを分析した。電気泳動については１Ｖ／ｃｍで実施した。へーファー（Ｈｏｅｆｅｒ）自動ゲル染色機（ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のアマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））のプラス・ワン（Ｐｌｕｓ  Ｏｎｅ）（Ｒ）ＤＮＡ銀染色キットを用いる銀染色によって、ＤＮＡ断片を可視化した。
【０１６０】
差次的発現させたＤＮＡの再増幅
染色したゲルを蒸留水で１時間しっかりと水洗した。シクロヘキサノン誘導細胞のＲＮＡでは生成されたが対照細胞のＲＮＡの反応物には見られなかったバンドをゲルから切り出し、１０ｍＭ  ＫＣｌおよび１０ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）５０μｌの入ったチューブに入れ、１時間かけて９５℃まで加熱し、ＤＮＡの一部が拡散してゲルから出るようにした。２００倍の範囲での溶出液の連続希釈物を、Ｔａｑポリメラーゼを用いる新たなＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。それぞれの再増幅にはパターンが生成されたプライマー（０．２５μＭ）を用いた。
【０１６１】
各再増幅断片を青／白クローニングベクターｐＣＲ２．１（カリフォルニア州サン・ディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）のインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングし、ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマー（Ｍ１３リバースプライマー（配列番号６４）およびＭ１３（−２０）フォワードプライマー（配列番号６５）を使用して配列決定した。
【０１６２】
アウト−ＰＣＲによるモノオキシゲナーゼ断片の伸長
ディファレンシャルディスプレイで同定した配列断片を伸長しているキロ塩基長のＤＮＡ断片を、「アウト−ＰＣＲ」すなわち配列特異的プライマーに加えて任意のプライマーを用いるＰＣＲ手法で生成した。このＰＣＲベースのジーンウォーキング法の第１ステップは、ストリンジェンシーの低い条件下での１ラウンドの増幅で、任意配列のプライマーを用いて染色体ＤＮＡを無作為に複製することで構成されている。アウト−ＰＣＲで使用するプライマーについては、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイで使用したプライマーセットから選択し、その配列はＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＶＶＶＶ（配列番号６３）（ここで、ＶＶＶＶはＡ、ＧまたはＣ）であった。任意配列のプライマーを毎回１つずつ使用してアウト−ＰＣＲ反応を１０回行った。反応液（５０μｌ）は、製造業者（カリフォルニア州フォスター・シティ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）のパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））から提供を受けた１×濃度のｒＴｔｈ  ＸＬ緩衝液、酢酸マグネシウム１．２ｍＭ、ｄＮＴＰ各０．２ｍＭ、１０〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、任意のプライマー１つを０．４ｍＭ、ｒＴｔｈ  ＸＬポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））１単位を含むものであった。アニーリング（４５℃）を５分と伸長サイクル（７２℃）１５分で任意の部位にゲノムＤＮＡが複製され、３’末端に任意であるが既知の配列のプライマーが取り込まれた。
【０１６３】
こうした最初の低ストリンジェンシーでのアニーリングおよび複製ステップの後、各反応液を２本のチューブに分けた。一方のチューブには、伸長対象となる配列の末端に対して設計して外方に向けられた特定のプライマー（０．４ｍＭ）を入れ、２本目のチューブには水を入れて対照として利用した。ストリンジェンシーの条件を厳しくし、９４℃で変性（１分）、６０℃でアニーリング（０．５分）、７２℃で伸長（１０分）のＰＣＲサイクルをさらに３０回行った。長い範囲のｒＴｔｈ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼによる長いＤＮＡ断片の合成が可能なように、伸長時間を長く設計した。アガロースゲルの隣り合ったレーンで各反応物ペアの産物を分析した。
【０１６４】
特定のプライマーを用いた試料には存在するが対照試料には見られなかったバンドをアガロースゲルから切り出し、Ｈ２Ｏ０．５ｍｌ中で溶かして新たなＰＣＲ反応セットでのテンプレートとして使用した。これらの反応には、１×濃度のｒＴｔｈ  ＸＬ緩衝液、酢酸マグネシウム１．２ｍＭ、ｄＮＴＰ各０．２ｍＭ、プライマー０．４ｍＭ、解かしたスライスの１／１０００希釈物、ｒＴｔｈ  ＸＬポリメラーゼ１単位を使用した。ＰＣＲについては、１サイクルあたり９４℃（１分）、６０℃（０．５分）、７２℃（１５分）を２０サイクル実施した。該当するバンドの再増幅に特定のプライマーと任意のプライマーの両方が必要である旨を確認するために、これらの再増幅反応には、それぞれ任意のプライマーまたは特定のプライマーのいずれかを欠いた対照反応を２回含めた。増幅に特定のプライマーと任意のプライマーの両方を必要としたＤＮＡ断片を配列決定した。シーケンシングの目的で、アウト−ＰＣＲで得られた長い断片をＭｂｏＩで部分消化し、ｐＣＲ２．１（カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。ベクター配列に対して設計したプライマーを使用し、これらの部分断片の配列を得た。
【０１６５】
実施例３
シクロヘキサンの分解に関与するアシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸのモノオキシゲナーゼ遺伝子の単離
この実施例は、シクロヘキサン分解体アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸを単離することについて説明するものである。ディファレンシャルディスプレイ法を使用してＢＶＭＯ遺伝子を発見した。
【０１６６】
菌株の単離
テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）ライニングをほどこしたねじ蓋で密閉した１２５ｍｌ容のエルレンマイヤーフラスコ内の鉱物培地（５０ｍＭ  ＫＨＰＯ４（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３、１μＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、０．０００１％ＦｅＳＯ４）２０ｍｌに工業廃水汚泥５ｍｌを加え、シクロヘキサンを唯一の炭素源として成長する細菌の富化を開始した。鉱物油とシクロヘキサンとの混合物（８／１  ｖ／ｖ）１ｍｌの入った試験管をフラスコ内に取り付け、低蒸気圧のシクロヘキサン（純粋なシクロヘキサンの蒸気圧の約３０％）を提供した。富化物を３０℃で１週間インキュベートした。定期的に、低シクロヘキサン蒸気下で０．００５％酵母エキスを補って同じ鉱物培地で富化物を１０分の１に希釈した。何回か移動すると、シクロヘキサン蒸気下の富化物中に白色のフロックが認められた。シクロヘキサンを省くとフロックは成長しなかった。
【０１６７】
何回か移動すると、フロックは液状シクロヘキサノン４μｌを培地１０ｍｌに直接加えた状態で成長可能であった。コロニーを単離するために、フロックを培地で洗浄し、ビーズビーター内で強く振盪して破壊した。破壊されたフロックから遊離した細胞をＲ２Ａ培地寒天プレートに画線し、シクロヘキサン蒸気下でインキュベートした。ピンポイントコロニーを解剖顕微鏡下で釣菌し、０．０１％酵母エキスとシクロヘキサン４μｌとを補った鉱物培地１０ｍｌに接種した。フロックを成長させ、破壊し、純粋な培養が得られるまで再度画線した。
【０１６８】
この単離物の分類学的同定を、一般法で説明したようにして１６Ｓ  ｒＤＮＡのＰＣＲ増幅によって行った。株ＣＨＸ由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、未培養細胞の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列受入番号ＡＦ１４３８４０）との間で少なくとも９８％相同であり、アシドボラクス・テルメペランス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｒｍｐｅｒａｎｓ）の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（受入番号ＡＦ０７８７６６）との間で９５％相同であった。単離したアシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸの完全な１６ｓ  ＤＮＡ配列を配列番号５として示す。
【０１６９】
シクロヘキサン分解遺伝子の誘導
シクロヘキサン分解遺伝子を誘導するために、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸのコロニーをＲ２Ａ寒天プレートから掻き取り、Ｒ２Ａブロス２５ｍｌに接種した。この培養を３０℃で一晩インキュベートした。翌日、新鮮なＲ２Ａブロス２５ｍｌを加え、１５分間成長を続けた。培養を２つの別々のフラスコに分け、各々に２５ｍｌずつ入れた。これらのフラスコのうちの一方に、純粋なシクロヘキサン５μｌを加えてシクロヘキサン分解遺伝子の発現を誘導した。もう一方のフラスコは対照として保持した。ディファレンシャルディスプレイを使用してアシドボラクスｓｐ．ＣＨＸのモノオキシゲナーゼ遺伝子を同定した。シクロヘキサン誘導遺伝子配列の同定と菌株からのシクロヘキサノン酸化遺伝子のシーケンシングを実施例１で説明したのと同様の方法で行った。
【０１７０】
実施例４
シクロヘキサノールの分解に関与するアシネトバクターｓｐ．ＳＥ１９モノオキシゲナーゼ遺伝子の単離
この実施例は、シクロヘキサノール分解体アシネトバクターｓｐ．ＳＥ１９を単離することについて説明するものである。コスミドライブラリをスクリーニングした後、ショットガンライブラリのシーケンシングを行って、ＢＶモノオキシゲナーゼ遺伝子を発見した。
【０１７１】
菌株の単離
シクロヘキサノールで成長する細菌の富化物をシクロペンタノール集積培養から単離した。集積培養については、密閉した１２５ｍＬ容のねじ蓋式エルレンマイヤーフラスコで活性汚泥１ｍＬをＳ１２培地（１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｕＭ  ＭｎＣｌ２、１ｕＭ  ＦｅＣｌ３、１ｕＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２ｕＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３ｕＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２ｕＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、０．０００１％ＦｅＳＯ４）２０ｍＬに接種して構築した。シクロペンタノール１００ｐｐｍを培養液に直接加えて集積培養を補い、揺動しながら３５℃でインキュベートした。２〜３日ごとにシクロペンタノール１００ｐｐｍを加えて集積培養を維持した。培養１０ｍＬを同容量のＳ１２培地に交換することで、培養を２〜１０日ごとに希釈した。１５日間のインキュベーション後、集積培養の連続希釈物をＬＢプレートに展開した。シクロヘキサノールを唯一の炭素源およびエネルギ源として利用してＳ１２液で成長する能力について、シングルコロニーをスクリーニングした。培養を密閉したチューブ内で３５℃で成長させた。単離物のうちのひとつである株ＳＥ１９を以後のキャラクタリゼーション用に選択した。
【０１７２】
一般法に記載の方法に従い、ＳＥ１９単離物の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅した。すべての単離物で得られた結果から、株ＳＥ１９はアシネトバクター・ヘモリティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）およびアシネトバクター・ジュニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｊｕｎｉｉ）に近い相同性を持つことが明らかになった（各々ヌクレオチド同一性９９％）。
【０１７３】
アシネトバクター属のコスミドライブラリの作成
ＬＢ培地２５ｍｌでエアレーションしながら３７℃にて６時間、アシネトバクター  ｓｐ．ＳＥ１９を成長させた。ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ５Ｃ遠心機を使用し、６，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間、細菌細胞を遠心処理した。上清をデカントした後、細胞ペレットを−８０℃で凍結させた。ＤＮＡの剪断が発生しないように特別な注意を払いながら、以下に概要を説明するようにして染色体ＤＮＡを調製した。５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）５ｍｌ中に細胞ペレットを静かに再懸濁させ、リゾチームを最終濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように加えた。懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした。次にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が１％になるように加え、プロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌの量で加えた。この懸濁液を５５℃で２時間インキュベートした。懸濁液が透明になり、同容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で透明なライゼートを抽出した。１２，０００ｒｐｍで２０分の遠心処理後、水性相を慎重に取り出して新しいチューブに移した。２容量のエタノールを加え、密閉したガラス製パスツールピペットを使用してＤＮＡを静かにプールした。７０％エタノールの入ったチューブにＤＮＡを浸漬した。空気乾燥後、ＲＮａｓｅＡ（１００μｇ／ｍｌ）を含むＴＥ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）４００μｌ中にＤＮＡを再懸濁させ、４℃で保管した。ＤＮＡの濃度と純度とをＯＤ２６０／ＯＤ２８０で分光測光的に求めた。ＤＮＡの希釈アリコートを０．５％アガロースゲルで泳動し、無傷性（ｉｎｔａｃｔ  ｎａｔｕｒｅ）を判断した。
【０１７４】
スーパーコス（ＳｕｐｅｒＣｏｓ）  １コスミドベクターキットの取扱説明書に概説されているようにして、染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）のギブロ（ＧＩＢＲＯ）／ＢＲＬ）で部分消化した。反応容量１００μｌで室温にてＳａｕ３ＡＩ０．５単位を用いてＤＮＡ（１０μｇ）を消化した。０、３、６、９、１２分などのさまざまな消化時点で２０μｌのアリコートを抜き取った。ＤＮＡローディング緩衝液を加え、０．５％アガロースゲルで試料を分析し、消化の度合いを判断した。Ｓａｕ３ＡＩでの消化時間が長くなるのに対応して、染色体ＤＮＡのサイズが小さくなった。１単位のＳａｕ３ＡＩで消化したＤＮＡ５０μｇを使用し、室温にて３分間予備反応を実施した。８ｍＭのＥＤＴＡを加えて消化を停止させた。ＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで１回抽出し、クロロホルムで１回抽出した。水性相を０．３Ｍ  ＮａＯＡｃに調整し、エタノール沈殿させた。部分消化されたＤＮＡを仔ウシ腸管粘膜由来アルカリホスファターゼで脱リン酸処理し、スーパーコス（ＳｕｐｅｒＣｏｓ）  １コスミドベクターキットでの指示に従って処理しておいたスーパーコス（ＳｕｐｅｒＣｏｓ）  １ベクターにライゲートした。次に、ギガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）  ＩＩＩ  ＸＬパッケージング用エキスをストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（製造業者の指示を遵守）で推奨しているとおりに使用し、ライゲートされたＤＮＡをλファージにパッケージングした。パッケージング後のアシネトバクター属ゲノムＤＮＡライブラリは、エシェリキア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲでトランスフェクトして求めた場合のＤＮＡ１μｇあたりのファージ力価が５．６×１０４コロニー形成単位であった。無作為に選択した６つのエシェリキア・コリ形質転換体からコスミドＤＮＡを単離したところ、ＤＮＡの大きなインサート（２５〜４０ｋｂ）が含まれていることが分かった。
【０１７５】
シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子を含むコスミドクローンの同定とキャラクタリゼーション
シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子の相同性に基づいて、アシネトバクター  ｓｐ．ＳＥ１９のコスミドライブラリをスクリーニングした。また、アシネトバクター  ｓｐ．ＮＣＩＢ  ９８７１のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子の公表されている配列に基づいて、ｍｏｎｏＬ：ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＴＡＴＧＴＣＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧ（配列番号６６）とｍｏｎｏＲ：ＧＡＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＣＴＴＧＡＴ（配列番号６７）の２つのプライマーを設計した。ｍｏｎｏＬプライマーとｍｏｎｏＲプライマーを使用して、コスミドライブラリをＰＣＲでスクリーニングした。スクリーニング対象とした約１０００のクローンの中から５つの陽性クローン（５Ｂ１２、５Ｆ５、８Ｆ６、１４Ｂ３、１４Ｄ７）を同定した。これらのクローンにはいずれも、ｍｏｎｏＬプライマーとｍｏｎｏＲプライマーによって増幅されたシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子との間で相同性を示す３５〜４０ｋｂのインサートが含まれていた。この遺伝子断片をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、コスミドクローン５Ｂ１２にはモノオキシゲナーゼ遺伝子の約２０ｋｂの領域があり、コスミドクローン８Ｆ６にはモノオキシゲナーゼ遺伝子の下流に約３０ｋｂあることが分かった。コスミドクローン１４Ｂ３では、再編成されたアシネトバクター属のＤＮＡがモノオキシゲナーゼ遺伝子に隣接して含まれている。
【０１７６】
ショットガンシーケンシングライブラリの作成
５Ｂ１２および８Ｆ６のショットガンライブラリを作成した。コスミドＤＮＡをネブライザ（イリノイ州シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ）のインハレーション・プラスティックス・インコーポレイテッド（Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．））にて２０ｐｓｉで４５秒間剪断し、１〜３ｋｂの部分をゲル精製した。精製ＤＮＡを製造業者（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ）の指示どおりにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理した。ポリッシュしたインサートを、レイディ・トゥ・ゴー（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ）  ｐＵＣ１８ＳｍａＩ／ＢＡＰ＋Ｌｉｇａｓｅ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ）を用いてｐＵＣ１８ベクターにライゲートした。ライゲートされたＤＮＡをエシェリキア・コリＤＨ５α細胞に形質転換し、アンピシリンおよびＸ−ｇａｌ加ＬＢに蒔いた。形質転換体の大半が白色であり、インサートを含むものについてｐＵＣ１８のユニバーサルプライマーおよびリバースプライマーを用いて標準的なシーケンシング法で配列決定した。
【０１７７】
ｐＵＣ１８ユニバーサルプライマーとリバースプライマーを使用し、ショットガンライブラリインサートを配列決定した。各ライブラリから得られた２００〜３００クローンの配列をシークエンチャ（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）  ３．０プログラムでアセンブルした。シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ遺伝子を含む１７４１９ｂｐのコンティグを形成した。
【０１７８】
実施例５
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２の単離とシーケンシング
この実施例は、ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２菌株を廃水流の汚泥から単離することについて説明するものである。ショットガンシーケンシングストラテジーの手法を用いることで、微生物のゲノム全体をシーケンシングすることができた。
【０１７９】
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２の単離
アニリンを唯一の炭素源およびエネルギ源として成長する能力をもとに、ロドコッカス・エリスロポリスの株ＡＮ１２を単離した。アニリンで成長する細菌を集積培養から単離した。集積培養については、１２５ｍｌ容のねじ蓋エルレンマイヤーフラスコで活性汚泥１ｍｌをＳ１２培地（１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３、１μＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、０．０００１％ＦｅＳＯ４）１０ｍｌに接種して構築した。活性汚泥の方はデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）の廃水処理施設から入手した。１００ｐｐｍのアニリンを培養液に直接加えて集積培養を補い、揺動しながら２５℃でインキュベートした。２〜３日ごとにアニリン１００ｐｐｍを加えて集積培養を維持した。培養９．９ｍｌを同容量のＳ１２培地に交換することで、培養を１４日ごとに希釈した。集積培養の試料をＳ１２寒天に展開し、アニリンを唯一の炭素源およびエネルギ源として利用する細菌を単離した。アニリンを各ペトリ皿の蓋の内側に付けた。このペトリ皿をパラフィルムで密閉し、上下を逆さまにして室温（２５℃）にてインキュベートした。続いて、代表的な細菌コロニーについてアニリンを唯一の炭素源およびエネルギ源として使う能力を試験した。最初の単離に使用したもとのＳ１２寒天プレートから新しいＳ１２寒天プレートにコロニーを移し、各ペトリ皿の蓋の内側にアニリンを補った。このペトリ皿をパラフィルムで密閉し、上下を逆さまにして室温（２５℃）にてインキュベートした。
【０１８０】
一般法で説明したようにして株ＡＮ１２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を配列決定（配列番号６）し、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）配列データベースに収録された他の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と比較した。株ＡＮ１２由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ロドコッカス属に属する高Ｇ＋Ｃグラム陽性菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列との間で少なくとも９８％相同であった。
【０１８１】
シーケンシングおよび配列生成用のゲノムＤＮＡの調製
公開されているプロトコール（フラッシャー（Ｆｒａｓｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０（５２３５）：３９７〜４０３（１９９５））に従って、ゲノムＤＮＡおよびライブラリの構築物を調製した。１００ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する溶液に、細胞ペレットを再懸濁させた。
【０１８２】
ゲノムＤＮＡの調製  再懸濁後、細胞を静かに１０％ＳＤＳに溶解させ、５５℃で３０分間インキュベートした。室温でのインキュベーション後、プロテイナーゼＫ（インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）のベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を１００μｇ／ｍｌまで加え、懸濁液が透明になるまで３７℃でインキュベートした。ＤＮＡをトリス（Ｔｒｉｓ）平衡化フェノールで２回抽出し、クロロホルムで２回抽出した。７０％エタノール中でＤＮＡを沈殿させ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌと１ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡとを含有するｐＨ７．５の溶液（ＴＥ緩衝液）に再懸濁させた。このＤＮＡ溶液をＲＮＡａｓｅの混合物で処理した後、トリス（Ｔｒｉｓ）−平衡化フェノールで２回抽出し、クロロホルムで２回抽出した。これに続いてエタノール中での沈殿とＴＥ緩衝液への再懸濁を行った。
【０１８３】
ライブラリの作成  ３００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、３０％グリセロールの溶液に染色体ＤＮＡ２００から５００μｇを再懸濁させ、エアロモイスト・ダウンドラフト（Ａｅｒｏｍｉｓｔ  Ｄｏｗｎｄｒａｆｔ）ネブライザチャンバ（イリノイ州シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ）のアイビーアイ・メディカル・プロダクツ（ＩＢＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ））にて１２ｐｓｉで６０秒間剪断した。ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁させ、Ｂａｌ３１  ヌクレアーゼ（マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）のニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））で処理した。サイズ分画後、画分（２．０ｋｂまたは５．０ｋｂ）を切り出し、洗浄し、二段ライゲーション法を使用してシングルインサート９９％を上回る高力価のライブラリを生成した。
【０１８４】
シーケンシング  微生物の全ゲノムのシーケンシングにショットガンシーケンシングストラテジーの手法を採用した（フライッヒマン・アール（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｒ．）ら、Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｐｌｙ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９（５２２３）：４９６〜５１２（１９９５））。
【０１８５】
実施例６
細菌遺伝子の同定とキャラクタリゼーション
ブラスト（ＢＬＡＳＴ）「ｎｒ」データベース（非冗長なジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造のブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンク由来の配列、スイス−プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースをすべて含んで成る）に収録された配列に対する類似性についてのブラスト（ＢＬＡＳＴ）（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ、アルチュル・エス・エフ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）検索を実施し、それぞれのモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を同定した。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供しているブラストエヌ（ＢＬＡＳＴＮ）アルゴリズムで、「ｎｒ」データベースに収録された公共利用可能なあらゆるＤＮＡ配列との間の類似性について、実施例１、２、３、４、５で得られた配列を分析した。これらのＤＮＡ配列をすべての読み枠で翻訳し、ＮＣＢＩから提供されているブラストエックス（ＢＬＡＳＴＸ）  ＢＬＯＳＵＭ６２アルゴリズムでｇａｐ  ｅｘｉｓｉｔｅｎｓｅ  ｃｏｓｔを１１、ｐｅｒ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔを２、ｆｉｌｔｅｒｅｄ、ｇａｐ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（ギッシュ・ダブリュ（Ｇｉｓｈ，Ｗ．）およびステーツ・ディ・ジェー（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６〜２７２（１９９３））として、「ｎｒ」データベースに収録された公共利用可能なあらゆるタンパク質配列との類似性を比較した。
【０１８６】
比較はいずれもブラストエヌエヌアール（ＢＬＡＳＴＮｎｒ）アルゴリズムまたはブラストエックスエヌアール（ＢＬＡＳＴＸｎｒ）アルゴリズムのどちらかを使用して行った。各配列に対する類似度が最も高い配列をまとめた表３にブラスト（ＢＬＡＳＴ）比較の結果をあげておく。表３はブラストエックスエヌアール（ＢＬＡＳＴＸｎｒ）アルゴリズムに基づくデータを示し、表記の値は期待値である。期待値とは、このサイズのデータベースの検索で全く偶然に期待される、特定のスコアで、マッチ数を指定する、マッチの統計的な有意性を推定したものである。
【０１８７】
【表３】
2005512514.tif 000008
【０１８８】
【表４】
2005512514.tif 000009
【０１８９】
【表５】
2005512514.tif 000010
【０１９０】
【表６】
2005512514.tif 000011
【０１９１】
実施例７
エシェリキア・コリへのモノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニングと発現
この例は、ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、アシネトバクターＳＥ１９、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２およびアシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸから単離した全長ＢＶＭＯ遺伝子のエシェリキア・コリでの発現について示すものである。
【０１９２】
テンプレートとしての染色体ＤＮＡと以下の表４に示すプライマーとを使用して、全長ＢＶＭＯをＰＣＲ増幅した。
【０１９３】
【表７】
2005512514.tif 000012
【０１９４】
増幅後、ベクター配列によって得られるようなＮ末端領域またはＣ末端領域のいずれか（ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２のモノオキシゲナーゼではＮ末端領域、アシネトバクター  ｓｐ．ＳＥ１９、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸのモノオキシゲナーゼではＣ末端領域）で、ｃｈｎＢ遺伝子断片をｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ  ＴＡベクターにクローニングした。アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）とリボフラビン（０．１ｕｇ／ｍｌ）とを補ったルリア栄養ブロスで形質転換体を３０℃で成長させた状態で、６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００）が０．５に達するまで上記のベクターをエシェリキア・コリに形質転換した。Ａ６００が達成されたら、温度を１６℃までシフトさせた。
【０１９５】
温度を１６℃までシフトさせた３０分後に、ＩＰＴＧを培養液に加えるとコードされたモノオキシゲナーゼ配列が発現された。培養をさらに一晩（１４時間）成長させ、冷遠心機での遠心分離によって回収した。細胞を氷上にてリゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、音波処理をほどこした。音波処理後、細胞抽出液を遠心処理し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて４℃で１時間かけて上清を平衡化した。該当するタンパク質が樹脂から遊離するまでイミダゾール緩衝液の濃度を高めながらタンパク質結合樹脂を連続的に洗浄した。この精製タンパク質を濃縮し、緩衝液を交換してイミダゾールを除去した。タンパク質の濃度を１ｕｇ／ｍｌに調整した。
【０１９６】
実施例８
ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、アシネトバクターＳＥ１９、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸのｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ活性のアッセイ
実施例７から過剰発現させた各酵素のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ活性をさまざまなケトン基質（シクロブタノン、シクロペンタノン、２−メチルシクロペンタノン、シクロヘキサノン、２−メチルシクロヘキサノン、シクロヘキサ−２−エン−１−オン、１，２−シクロヘキサンジオン、１，３−シクロヘキサンジオン、１，４−シクロヘキサンジオン、シクロヘプタノン、シクロオクタノン、シクロデカノン、シクロウンドデカノン、シクロドデカノン、シクロトリデカノン、シクロペンタデカノン、２−トリデカノン、２−フェニルシクロヘキサノン、ジヘイル（ｄｉｈｅｙｌ）ケトン、ノーカンフォー、β−イオノン、オキシンドール、レボグルコセノン、ジメチルスルホキシド、ジメチル−２−ピペリドン、フェニルボロン酸）でアッセイした。化合物の選択については、ファン・デル・ウェルフ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ）（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４７：６９３〜７０１（２０００））および宮本ら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２５１：１１５〜１２４（１９９５））による過去の観察結果に基づいて、ケトンの部分構造式を検索することで行った。
【０１９７】
２つの例外だけを除き、いずれの化合物もシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手した。レボグルコセノンをトロント・レスイーチ・ケミカルズ・インコーポレイテッド（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）から入手し、ジメチル−２−ピペリドンを米国特許第６，０７７，９５５号に従って調製した。酵素アッセイを行うために、ノーカンフォー（酢酸エチルに溶解）、シクロドデカノン、シクル（ｃｙｃｌ）トリデカノンおよびシクロペンタデカノン（プロパノールに溶解）、レボグルコセノン（アセトンで溶解）以外のすべての化合物を、濃度が０．１Ｍになるようにメタノールに溶解させた。
【０１９８】
過剰発現させた各酵素のモノオキシゲナーゼ活性を、ＮＡＤＰＨの酸化を監視して３４０ｎｍで分光測光的にアッセイした。アッセイについては、光路長１ｃｍの個別の石英キュベットで行った。酵素アッセイを実施するにあたり、以下の成分をキュベットに加えた。３３．３ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＥＰＥＳ−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）３８０ｕｌ、０．１Ｍ基質（最終濃度１．２５ｍＭ）５μｌ、１μｇ／μｌ酵素溶液（合計１０ｎｇ、０．０２５ｎｇ／μｌ）１０μｌ、ＮＡＤＰＨ（１．２Ｍ、最終濃度１５ｍＭ）５ｕｌ。ウルトロスペック（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ）  ４０００（英国ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）のファルマシア・バイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を使用して２から１０分間試料の吸光度を読み取り、スウィフト（ＳＷＩＦＴ）（ファルマシア・バイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））プログラムを用いて吸光度の経時的減少の勾配を算出した。ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ  ｃｈｎＢ２については比率に３．２５を乗じ、文献（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２０００．１８２：ｐ．４２４１〜４２４８）から想起されるような貯蔵による活性の低下を調整した。過剰発現させた各酵素のモノオキシゲナーゼ活性を各ケトン基質との対比で表５に示す。表に記載の比活性値はｕｍｏｌ／分／ｍｇ単位の値である。「ＮＤ」の表示は「活性検出せず」を示す。
【０１９９】
表５に示すデータをグラフで表したものを図１、図２、図３、図４および図５にあげておく。
【０２００】
【表８】
2005512514.tif 000013
【０２０１】
【表９】
2005512514.tif 000014
【０２０２】
【表１０】
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【０２０３】
実施例９
エシェリキア・コリへのロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２モノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
この例は、各々がロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２由来の全長ＢＶＭＯを含む一連の組換えエシェリキア・コリを作出することについて示すものである。
【０２０４】
テンプレートとしての染色体ＤＮＡと以下の表６に示すプライマーとを使用して、全長ＢＶモノオキシゲナーゼをＰＣＲ増幅した。
【０２０５】
【表１１】
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【０２０６】
増幅後、ベクター配列によって提供されるようなＮ末端領域またはＣ末端領域のいずれかをもつ遺伝子断片をｐＴｒｃＨｉｓ−ＴＯＰＯ  ＴＡベクターにクローニングした。アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）を補ったルリア栄養ブロスで形質転換体を成長させた状態で、上記のベクターをエシェリキア・コリに形質転換した。
【０２０７】
実施例１０
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ活性のアッセイ
実施例９から発現させた各酵素のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ活性を、これらの酵素がシクロヘキサノンをカプロラクトンに変換する能力に応じて活性について試験した。
【０２０８】
シクロヘキサノンからカプロラクトンへの変換
１０ｍＭグリセロール、アンピシリン５０ｕｇ／ｍＬ、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、シクロヘキサノン５００ｍｇ／Ｌを含むＭ６３最小培地（ＧＩＢＣＯ（ギブコ））５ｍＬに、全長モノオキシゲナーゼ遺伝子を含むクローンをＬＢ寒天プレートから移した。全長モノオキシゲナーゼを含むクローンだけでなく、インサートのないプラスミドと「無細胞」対照もアッセイした。培養液にＩＰＴＧを加え、コードされたモノオキシゲナーゼ配列を発現させた。培養を室温（２４℃）にて一晩インキュベートした。接種後と一晩のインキュベーション後にすみやかに分析用の試料（１．２５ｍＬ）を採取し、遠心分離（４℃、１３，０００ｒｐｍ）によって細胞を取り出した。
【０２０９】
カプロラクトンのＧＣ−ＭＳ検出
クローニングされたモノオキシゲナーゼの作用により形成されたカプロラクトンをエチルアセテート（水性１．０ｍｌ／エチルアセテート０．５ｍＬ）によって水性相から抽出した。アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）  ６８９０ガスクロマトグラフシステムを用いるガスクロマトグラフィ質量（ＧＣ−ＭＳ）分析により、カプロラクトンを検出した。
【０２１０】
酢酸エチル相１ｕＬをＧＣに注入し、エチルアセテート相を分析した。インレット温度を１１５℃とし、カラム温度プロファイルを５０℃で４分、２０℃／分の一定率で２５０℃まで上昇させ、トータルの実施時間を１４分とした。ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）  ＨＰ−５ＭＳ（５％フェニルメチルシロキサン）カラム（長さ３０ｍ、直径２５０ｕｍ、膜厚０．２５ｕｍ）で化合物同士を分離した。質量分析計については電子イオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）モードで動作させた。カプロラクトン保持時間（９．８５７分）のスペクトルから、バックグラウンドの質量スペクトルを引いた。試験反応と、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））から入手した実証済みの標準とを比較し、カプロラクトンが存在していることを確認した。
【０２１１】
これらのアッセイの結果を、発現された各ＢＶモノオキシゲナーゼ酵素の活性に基づいて検出可能なカプロラクトン形成の有無で以下の表７に示す。
【０２１２】
【表１２】
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【０２１３】
実施例１１
ＢＶモノオキシゲナーゼファミリ間のシグネチャ配列の同定
上記の例で同定した、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼをコードする２０の遺伝子の配列を分析すると、アミノ酸の類似性に基づいて３種類のＢＶシグネチャ配列ファミリを定義することができる。各ファミリはいくつかのメンバ遺伝子を持ち、この酵素のシクロヘキサノンを酸化できる機能的ＢＶ酵素としての生化学的な検証結果を立証した（実施例（上掲））。クラスタルダブリュー（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）アライメント（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３）で各ファミリの相同体の配列アライメントを行った。これにより、利用できるすべての配列から作成されるアライメントの特定の位置で保存される一組のアミノ酸を同定することができる。
【０２１４】
これらのクラスタルダブリュー（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）アライメントの結果を、ＢＶファミリ１、ＢＶファミリ２、ＢＶファミリ３について図７、図８および図９に示す。いずれの場合も、「＊」は保存されたシグネチャアミノ酸位置を示す。各ファミリで保存されたアミノ酸のシグネチャ配列を、シグネチャ配列Ｐ−番号の位置とともに図６に示してある。この保存されたアミノ酸／位置の組が各ファミリのシグネチャになる。このファミリの既存メンバの配列とアライメント可能で、シグネチャ配列アミノ酸の少なくとも８０％を特定の位置に含む配列を有する新たなタンパク質はいずれも、この特定のファミリのメンバであるとみなすことができる。
【０２１５】
ＢＶファミリ１
このファミリは、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２（配列番号１２）、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１（配列番号８）、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２（配列番号１０）、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸ（配列番号１４）、ブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ（配列番号１６および１８）、ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２  ＯＲＦ１０、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１９およびＯＲＦ２０（配列番号２６、３４、４４および４６）のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ配列を含んで成る。５４０アミノ酸長以内に、合計で７４の位置が保存されている（１００％）。このファミリ１のＢＶモノオキシゲナーゼのシグネチャ配列をタンパク質の各アライメントの下に示し（図７）、配列番号４７としてあげてある。このファミリのタンパク質内のシグネチャ配列を同定する能力は、１）ＢＶモノオキシゲナーゼの配列数、２）そのＢＶ−モノオキシゲナーゼとしての活性のキャラクタリゼーションによって可能になった。
【０２１６】
生化学的なデータも利用できる公知となっている限られた数（合計４）のＢＶモノオキシゲナーゼ配列に基づくと、これらの配列のうちの３つがファミリ１で発見されたシグネチャ配列とアライメントされる。該当する配列は以下のとおりである。
（１）チェン・ワイ・シー（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃ．）ら（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０（２）：７８１〜７８９（１９８８））を踏まえ、アシネトバクター  ｓｐ．ＮＣＩＭＢ９８７１  ｃｈｎＢ（ＮＣＢＩ受入番号ＡＢ０２６６６８。このタンパク質のキーになる生化学的キャラクタリゼーションは、ドノグー（Ｄｏｎｏｇｕｅ）ら（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６；６３（１）：１７５〜９２（１９７６））、トラッドギル（Ｔｒｕｄｇｉｌｌ）ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８８：７０〜７７（１９９０））、イワキ（ｉｗａｋｉ）ら（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５（１１）：５１５８〜６２（１９９９））により行われた。この酵素では、ファミリ１のＢＶモノオキシゲナーゼのシグネチャ配列にある７４の保存されたアミノ酸のうち７２が共通である。
（２）バービラート（Ｂａｒｂｉｒａｔｏ）ら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３８（３）：２９３〜２９６（１９９８））ならびにファン・デル・ウェルフ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ）ら（Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３７）：２６２９６〜２６３０４（１９９９））の研究を踏まえ、ロドコッカス・エリスロポリスｌｉｍＢ（ＮＣＢＩ受入番号ＡＪ２７２３６６。このタンパク質のキーになる生化学的なキャラクタリゼーションは、ファン・デル・ウェルフ・エム・ジェー（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ，Ｍ，Ｊ．）ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６（Ｐｔ  ５）：１１２９〜４１（２０００）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１；３４７  Ｐｔ  ３：６９３〜７０１（２０００）、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５（５）：２０９２〜１０２（１９９９））により行われた。この酵素はカルボンモノオキシゲナーゼとして知られている。
（３）ロドコッカス・ロドクラウス・エスエムオー（ｓｍｏ）（ＮＣＢＩ受入番号ＡＢ０１０４３９）。この酵素は、モリイ・エス（Ｍｏｒｉｉ，Ｓ．）ら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２６（３）、６２４〜６３１（１９９９））によってシーケンシングおよびキャラクタリゼーションがなされた。この酵素はステロイドモノオキシゲナーゼとして知られている。この酵素では、ファミリ１のＢＶモノオキシゲナーゼのシグネチャ配列にある７４の保存されたアミノ酸のうち７４が共通である。
【０２１７】
グループ１との類似性が最も高い配列を有する、パブリックドメインに記載された酵素が、ジメチルアニリンヒドロキシラーゼとしてキャラクタライズされている。
【０２１８】
ＢＶファミリ２
このファミリは、ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１２  ＯＲＦ９、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ  １６、ＯＲＦ１８（配列番号２４、３０、３６、３８、４２）のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ配列を含んで成る。４９７アミノ酸長以内に、合計で７６の位置が保存されている（１００％）。このファミリ２のＢＶモノオキシゲナーゼのシグネチャ配列をタンパク質の各アライメントの下に示し（図８）、配列番号４８としてあげてある。このファミリのタンパク質内のシグネチャ配列を同定する能力は、１）ＢＶモノオキシゲナーゼの配列数、２）そのＢＶ−モノオキシゲナーゼとしての活性のキャラクタリゼーションによって可能になった。
【０２１９】
生化学的なデータも利用できる公知となっている限られた数（合計４）のＢＶモノオキシゲナーゼ配列に基づくと、これらの配列のうちのわずか１つがファミリ２で発見されたシグネチャ配列とアライメントされる。この配列は、シュードモナス・プチダＪＤ１である。このタンパク質のキーになる生化学的キャラクタリゼーションは、タナー・エー（Ｔａｎｎｅｒ  Ａ．）ら（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（２３）：６５６５〜６５６９（２０００））により行われた。この酵素はアセトフェノンモノオキシゲナーゼとして知られている。この酵素では、ファミリ２のＢＶモノオキシゲナーゼのシグネチャ配列にある７６の保存されたアミノ酸のうち６９が共通である。
【０２２０】
ＢＶファミリ３
このファミリは、ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１２  ＯＲＦ８、ＯＲＦ  １１、ＯＲＦ  １３、ＯＲＦ１７（配列番号２２、２８、３２、４０）のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ配列を含んで成る。４７１アミノ酸長以内に、合計で４１の位置が保存されている（１００％）。このファミリ３のＢＶモノオキシゲナーゼのシグネチャ配列をタンパク質の各アライメントの下に示し（図９）、配列番号４９としてあげてある。このファミリのタンパク質内のシグネチャ配列を同定する能力は、１）ＢＶモノオキシゲナーゼの配列数、２）そのＢＶ−モノオキシゲナーゼとしての活性のキャラクタリゼーションによって可能になった。
【０２２１】
このグループに属する、ここで実証されたＢＶ活性を持つ公知の配列はない。ジメチルアニリンＮ−オキシダーゼがシグネチャ配列で発見された４１の保存されたアミノ酸のうち３０のアミノ酸だけしか共通でないが、これは保存された位置の８０％未満である。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】さまざまなケトン基質に対してアッセイした、エシェリキア・コリで過剰発現させたブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、アシネトバクターＳＥ１９、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸ遺伝子のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ活性を示している。
【図２】さまざまなケトン基質に対してアッセイした、エシェリキア・コリで過剰発現させたブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、アシネトバクターＳＥ１９、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸ遺伝子のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ活性を示している。
【図３】さまざまなケトン基質に対してアッセイした、エシェリキア・コリで過剰発現させたブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、アシネトバクターＳＥ１９、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカスｓｐ．ｐｈｉ２、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸ遺伝子のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ活性を示している。
【図４】さまざまなケトン基質に対してアッセイした、エシェリキア・コリで過剰発現させたブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、アシネトバクターＳＥ１９、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカスｓｐ．ｐｈｉ２、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸ遺伝子のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ活性を示している。
【図５】さまざまなケトン基質に対してアッセイした、エシェリキア・コリで過剰発現させたブレビバクテリウム  ｓｐ．ＨＣＵ、アシネトバクターＳＥ１９、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ１、ロドコッカス  ｓｐ．ｐｈｉ２、アルスロバクター  ｓｐ．ＢＰ２、アシドボラクス  ｓｐ．ＣＨＸ遺伝子のｃｈｎＢモノオキシゲナーゼ活性を示している。
【図６】図７、図８および図９のアライメント由来のコンセンサス配列に基づく３つのＢＶＭＯ群のシグネチャ配列を示している。
【図７】バイヤー・ビリガーモノキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）のファミリ（ファミリ１）と関連のシグネチャ配列とのクラスタルダブリュー（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）でのアライメントを示している。
【図８】バイヤー・ビリガーモノキシゲナーゼのファミリ（ファミリ２）と関連のシグネチャ配列とのクラスタルダブリュー（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）でのアライメントを示している。
【図９】ＢＣモノキシゲナーゼのファミリと（ファミリ３）関連のシグネチャ配列とのクラスタルダブリュー（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）でのアライメントを示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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