(57)【要約】本発明は、バイオマトリックスならびにその製造方法に関する。  生物学的にも機械的にも満足できる作用を有する、たとえば罹患した軟骨用の代替物を提供するために、マトリックスが濃化または固化されるバイオマトリックスを提案する。さらに対応する方法を提案する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマトリックスが濃化または固化されることを特徴とするバイオマトリックス。
【請求項２】
バイオマトリックスが密度勾配を有することを特徴とする、請求項１記載のバイオマトリックス。
【請求項３】
密度勾配が階段状に形成されることを特徴とする、請求項２記載のバイオマトリックス。
【請求項４】
密度勾配が連続的な移行部を有することを特徴とする、請求項２記載のバイオマトリックス。
【請求項５】
密度勾配が固定外被および軟質核を有する本体を形成することを特徴とする、請求項２ないし４のいずれか一項記載のバイオマトリックス。
【請求項６】
マトリックスが不活性材料と組み合わされることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項記載のバイオマトリックス。
【請求項７】
バイオマトリックスが配向繊維、特にコラーゲン繊維を有することを特徴とする、上記請求項のいずれか一項記載のバイオマトリックス。
【請求項８】
出発溶液がゲル溶液ｍｌあたりタンパク質１〜１０ｍｇを有し、前記出発溶液が初めのタンパク質含量の１０倍以上、好ましくは５０倍以上濃化されることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項記載のバイオマトリックス。
【請求項９】
マトリックスが濃化または固化されることを特徴とするバイオマトリックスの製造方法。
【請求項１０】
緩衝血清含有細胞培地の中にコラーゲンをリットルあたり少なくとも１．５ｍｇを含む、三次元のゲル状バイオマトリックスの中に埋め込まれた脱分化軟骨細胞が培養される脱分化軟骨細胞の再分化および／または増殖のための方法によってマトリックスが製造されることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲン含有組織の単離、酸性溶液中へのコラーゲン含有組織の移送、２〜１０℃、特に４℃での酸性溶液中に移送したコラーゲン組織のインキュベーション、溶解しないコラーゲン成分の遠心分離、２〜１０℃、好ましくは４℃での細胞培地、血清および緩衝液を含有する溶液と得たコラーゲン溶液の混合および温度上昇による混合溶液のゲル化を含む方法によりマトリックスが製造されることを特徴とする、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞を含むマトリックスが製造されることを特徴とする、請求項９ないし１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
細胞なしのマトリックスが製造されることを特徴とする、請求項９ないし１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
濃化が液体除去によって生ぜしめられることを特徴とする、請求項９ないし１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
液体除去が加圧によって開始されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
液体除去が低圧の印加によって行われることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
濃化が化学結合によって生ぜしめられることを特徴とする、請求項９ないし１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
直径０．００５〜４ｍｍ、好ましくは０．０１〜２ｍｍを有するコラーゲン糸が製造されることを特徴とする、請求項９ないし１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
コラーゲン溶液がコラーゲン糸の形成のためにノズルを通過することを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
コラーゲン糸が濃化後乾燥されることを特徴とする、請求項１８または１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマトリックスならびにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療技術、特に外科では規則的に、ヒトまたは動物の身体の欠損部分を切除し、人工的製造物によって代替する課題が出されている。そこではこの医療技術が集約的研究の目的である。多面的な種々の課題分野のために多数の特殊な解決策が必要であることが明らかである。
【０００３】
関節疾患の修復の分野において特許文献は、処置した軟骨欠損の良好な再生を可能にする軟骨代替術を記載している（たとえば特許文献ドイツ連邦共和国特許公開第１００，２６，７８９号明細書参照）。ここで前記出願は被代替欠損部に形状と大きさで適合できる三次元バイオマトリックスを使用している。
【０００４】
従来技術において、さらに上記分野で移植体について多数の別の提案が見出される。ここで使用する材料は三次元の、しかし多孔性の、たとえば構成において海綿または羊毛状物あるいは該材料は塊状であるが、三次元構造をもたない、たとえば構成において箔状物のいずれかである。
【０００５】
しかしながら機械的な身体骨格部分を代替する必要のある移植体には特別の要件が課されなければならない。一つには被補修欠損部は一般に少なくとも一定の三次元構造を有しているため、移植体は同様に三次元的に形成されなければならない。しかし他方で移植体はその密度もしくは特にその圧力安定性によって身体骨格内に使用する際に機械的負荷を考慮できるものでなければならない。特に従来公知の材料の圧力安定性は、たとえば軟骨部位に使用するには不充分である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのため本発明者は、バイオマトリックスが移植体として機械的重要性においても発生する高い負荷に適合できるように該バイオマトリックスを引き続き開発する課題を設定した。さらに本発明者は、このようなバイオマトリックスを製造できる方法を開発する課題を設定した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題は、驚くべきほど良好に、マトリックスを濃化または固化した該バイオマトリックスが解決する。
【０００８】
コラーゲンバイオマトリックスは、ドイツ連邦共和国特許公開第１００，２６，７８９号明細書に記載されているように、自体三次元的に存在しうる。コラーゲンバイオマトリックスの濃化または固化によって生物学的材料は、動力測定法の必要条件を機械的に身体骨格内で満たすことができるような高い強度を達成する。特に濃化もしくは固化した材料の圧縮強度は非常に高い要件を満たすことができる。しかしまた引張強度も公知のバイオマトリックスよりも高い圧縮強度によって必然的に上昇する横収縮に対する抵抗によって大幅に増加する。
【０００９】
従って本発明は、たとえば高い圧縮強度を有する軟骨代替物、靱帯代替物、腱代替物、半月代替物、帯板代替物、核代替物および／または輪代替物として広範囲に移植体のための使用可能性を開く。さらに骨代替物としてまたは骨−軟骨−構造体のための代替物としてこのような移植体を使用することができる。
【００１０】
本発明により濃化もしくは固化したバイオマトリックスは、好ましくは該バイオマトリックスが密度勾配を有することを特徴とすることができる。バイオマトリックスは均一に濃化して存在しうるが、コラーゲン骨格は勾配形状でも製造することができる。それによって生成される移植体は特別の方法で動力測定法の必要条件に基づく躯幹の欠損に適合させることができる。とりわけ経済的に特別の必要条件に対して増強された部位を有する移植体を製造することも可能である。
【００１１】
それに対する好ましい変形において密度勾配は階段状に形成されている。本発明によるバイオマトリックスは規則的に比較的簡単に階段状の密度勾配で製造される。
【００１２】
しかしまたその別法として、密度勾配は連続的な移行部を有してもよい。このように実施したバイオマトリックスは製造において比較的費用がかかるが、欠損箇所の機械的必要条件に卓越して適合させることができる。連続的な移行部とともに延長する密度勾配によって移植体は特に均一に周囲の身体骨格に嵌め込むことができ、−移植体の非連続的な密度勾配および連続的に変化する隣接構造の性質のように−有害なピーク応力は発生しない。
【００１３】
特に好ましくは、本発明によるバイオマトリックスは、密度勾配が固定外被および軟質核を有する本体を形成することを特徴とすることができる。軟質核とは、この場合、固有の硬さをもたない核を含む本質的に軟質の核である。たとえば、この核は流体または特に気体によって充填することもでき、それによってエアクッションと類似の機械的作用が達成される。それによって移植体の性質は特に良好に隣接構造に調節される。軟質核は使用状態でバイオマトリックスの充分な柔軟性をもたらし、他方、固定外被は特に良好にバイオマトリックスを機械的損傷から保護する。このようにバイオマトリックスは、それにもかかわらず長寿命と高い堅牢性で充分弾性的に挙動することができる。
【００１４】
密度勾配を有するバイオマトリックスがバイオマトリックスの明確な濃化または固化に係わらず有利かつ発明的であることは自明である。
【００１５】
それと係わりなく、本発明によるマトリックスが不活性材料と組み合わされる場合にも長所となる。不活性材料は、生物学的起源でも非生物学的起源であってもよい。例として、ここではコラーゲン羊毛状物を挙げることにする。
【００１６】
好ましい実施形態において、本発明によるバイオマトリックスは配向繊維、特にコラーゲン繊維を有する。濃化と同時に交番圧縮−および引張負荷の印加の組合せによってコラーゲン繊維をマトリックス内で配向させることができる。選択的および累積的に、これは物理的交番応力の印加によってまたは別の物理的方法によっても可能である。配向繊維によって特にバイオマトリックスの物理的性質が好ましい影響を受ける。そのためにコラーゲン繊維が使用されるとき、物理的および生化学的性質も明らかに改善される。
【００１７】
配向繊維、特にコラーゲン繊維の存在がバイオマトリックス内で明確な濃化または固化なしに達成でき、またそれに係わりなく有利かつ発明的であることも自明である。
【００１８】
最後に本発明によるバイオマトリックスの実施変形体は、出発溶液がゲル溶液ｍｌあたりタンパク質１〜１０ｍｇを有し、この出発溶液が初めのタンパク質含量の１０倍以上、好ましくは５０倍以上に濃化されることが特に好ましい。タンパク質含量は濃化過程においてさらに初めのタンパク質含量の１００倍まで増加させることができる。それによって高い強度をもつ非常に圧力安定性のマトリックスが生じる。
【００１９】
設定した課題は、さらにマトリックスを濃化または固化するバイオマトリックスの製造方法が解決する。濃化または固化によってバイオマトリックスは上記の有利な性質を達成する。
【００２０】
好ましくは、本発明による方法は、緩衝血清含有細胞培地の中にコラーゲンを少なくとも１．５ｍｇ／ｌを含む、三次元のゲル状バイオマトリックスの中に埋め込まれた脱分化軟骨細胞が培養される脱分化軟骨細胞の再分化および／または増殖のための方法によってマトリックスが製造されることを特徴とする。変性または外傷性の関節疾患の主問題は、損傷した関節軟骨が再生に対して僅かな能力しか示さないことにある。大きな課題は、その限りにおいて、欠損箇所に移植体を用いて持続的に軟骨の再生を可能にする軟骨細胞を取り込むことにある。マトリックスが上記方法で製造されるとき、脱分化軟骨細胞をバイオマトリックス内で再分化することができ、その細胞型の物質代謝作用を再び受け入れることができる。そのためにバイオマトリックスは、好ましくは新鮮な、コラーゲン溶液から新規に組成された、バイオマトリックスｍｌあたりコラーゲンを少なくとも１．５ｍｇの濃度をもつコラーゲン基質を含有しなければならない。
【００２１】
本発明との関連において、用語「細胞培養」とは、好適な環境で、たとえば物質代謝溶離物および−生成物の供給および排出下に、好ましくはインビトロで実施される細胞の生命機能の維持、特に細胞の増殖である。軟骨細胞とは、もちろん生成されるまたは遺伝子技術的に変えられた軟骨細胞あるいは、動物またはヒト由来としてよい該軟骨細胞の前駆体である。
【００２２】
特に好ましい変形において、本発明による方法は、コラーゲン含有組織の単離、酸性溶液中へのコラーゲン含有組織の移送、２〜１０℃、特に４℃での酸性溶液中に移送したコラーゲン組織のインキュベーション、非溶解コラーゲン成分の遠心分離、２〜１０℃、好ましくは４℃での細胞培地、血清および緩衝液を含有する溶液と得たコラーゲン溶液の混合および温度上昇による混合溶液のゲル化を含む方法によりマトリックスが製造されることを特徴とする。この方法は非常に効率的であり、少ない出発量でも軟骨組織に充分に軟骨移植組織の製造用の細胞材料を提供することができる。とりわけバイオマトリックス内の細胞の均一な分布は簡単かつ確実な方法で達成される。生成する材料の強度は、この場合、コラーゲン溶液の出発体積によって調節することができる。
【００２３】
それぞれの適用事例に応じて、本発明による方法で細胞を含むマトリックスが製造される場合に有利とすることができる。濃化もしくは固化した材料は細胞ありまたはなしで製造できる。細胞を含む製造は、上記方法で生成する移植体の生物両立性を支援する。
【００２４】
その別法において本発明による方法で細胞なしのマトリックスが製造される。これは特にマトリックス製造用の好適な細胞が提供されない場合に提示される。とりわけ生成する移植体は製造において簡単かつコスト的に有利であるが、同様に機械的な可負荷性に対する要件を満たす。
【００２５】
本発明による方法で濃化が液体除去によって生ぜしめられる場合に好ましく提供される。マトリックスが液体余剰分を有するとき、まさにこの余剰分の液体の除去は、マトリックスを濃化もしくは固化する最も簡単な可能性である。ここで実務上の実施の多面的な可能性が提供される。物理的方法では、マトリックスに、たとえば圧力を付勢するかまたは低圧を印加することができる。また毛管力を介してまたは上記可能性の組合せによってもマトリックスから確実に液体を除去することができる。大抵の場合、ここで水分を除去することが最も簡単な手段であろう。このような液体除去は加圧や低圧の印加によって特に効率的に達成することができる。
【００２６】
選択的かつ累積的に、濃化が化学結合によって生ぜしめられる場合に長所である。化学結合は、バイオマトリックスから水分および／またはその他の液体を除去し、それによって所望の性質を達成するためにバイオマトリックスを濃化もしくは固化する別の可能性である。
【００２７】
さらに、本発明による方法によって直径０．００５〜４ｍｍ、好ましくは０．０１〜２ｍｍを有するコラーゲン糸を製造することもできる。このようなコラーゲン糸はヒトまたは動物の身体内に使用する際に多くの新規の可能性を開く。特に該コラーゲン糸はそれに加えて結合機能を有することができる。
【００２８】
このような糸を製造するために、コラーゲン溶液がノズルを通過することが提案されている。ノズル内の断面狭隘部に伴ってバイオマトリックスも強制的に濃化される。そのために液状コラーゲンは緩衝液ありまたはなしで、コラーゲンから液体を除去するノズルを通して圧縮することができる。これは過圧または低圧の印加によって行ってよい。濃化後、コラーゲン糸を乾燥することができ、残留水分は約１０％の割合が難なく可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明による方法は以下２つの実施例を利用して説明する。しかしながらここでは、本特願が−実施例のように−軟骨細胞に関係するだけでなく、骨細胞、株細胞、線維芽細胞、内皮細胞、筋細胞、上皮細胞、腺細胞、知覚細胞および前記細胞類の組合せにも関係する。本発明は難なく前記細胞種に適用することができる。
【実施例１】
【００３０】
出発材料として、ドイツ連邦共和国特許公開第１００，２６，７８９号明細書に記載されているように、タンパク質濃度６ｍｇ／ｍｌゲル溶液を有するコラーゲン溶液を用いる。同時に酸性コラーゲン溶液の緩衝のための緩衝液を使用する。
【００３１】
両液体は４℃で同部を結合させ、互いに混合する。それによって混合溶液中に約３ｍｇ／ｍｌのコラーゲン濃度が生ずる。ここでこの溶液を直径約２ｃｍのガラスシリンダに満たす。ここでコラーゲン緩衝液混合物約３５ｍｌをシリンダに満たすと、充填高さは約１０ｃｍになる。
【００３２】
そこでガラスシリンダをその下側開口部と共に確実な密閉を保証するガラス基台に立てる。とりわけガラスシリンダはその下端部を多孔性の液体透過膜で閉塞する。
【００３３】
コラーゲン緩衝液混合物はシリンダの中に入れて２０分間３７℃でインキュベートし、完全にゲル化する。続いてゲル化したマトリックスにガラスシリンダの上部開放端を通して該ガラスシリンダの中に挿入されるピストンを載せ、マトリックスがシリンダ軸に沿って圧力を付勢される。圧力は、この場合、主に約０．２Ｐａになり、２０分間維持される。
【００３４】
この圧力によってマトリックスが圧縮され、液体が該マトリックスから押し出される。これはまず圧力を初めに取り込むマトリックスの上端部で行われる。少し時間をおいて下端部の液体透過膜によって閉塞した開口部でも液体流出が生じる。ピストンは、取り込む圧力を可能な限り減少しないように維持するために、圧縮したマトリックスと連動する。
【００３５】
マトリックスの濃化によって、つまりマトリックスカラム高さの減少によってコラーゲンのタンパク質含量が大きくなり、バイオマトリックスが本発明により固化される。加圧後、ピストンを取り除き、ガラスシリンダを基台から取り外す。流出する液体は簡単に流れ出し、濃化したマトリックスが残留する。本試験においてマトリックスは濃化後にまだ約２ｃｍの高さがあり、タンパク質含量はそれによって出発混合物中のタンパク質含量に対して５倍になり、約１５ｍｇ／ｍｌになる。さらに圧縮することによりコラーゲンのタンパク質含量は難なく、たとえば３０ｍｇ／ｍｌゲルおよびそれ以上を達成することもできる。
【００３６】
濃化したマトリックスを最後に機械的に洗浄し、後の適用に応じて成形たとえば切断する。移植組織はそこで培養用として完成する。
【００３７】
立形シリンダの内壁は、この場合、非多孔性材料たとえばガラスから、または多孔性材料たとえば限外濾過膜から構成してよい。シリンダ形状は、この場合、強制的ではなく、バイオマトリックスの濃化もしくは固化は何らかの別の形状付与形態、たとえば球形または押出形状で行ってもよい。濃化マトリックスの形状付与は、この場合、後の応用に従って行われる。
【００３８】
しかしまた濃化マトリックスは、たとえば切断または穿孔のような機械的方法によって、ならびにたとえばレーザーのような物理的方法によって後々の形状に適合させることもできる。濃化マトリックスの直径および厚さはこの場合可変的である。直径は１ｍｍ〜２００ｍｍとし、厚さは１ｍｍ〜５０ｍｍとしてよい。
【実施例２】
【００３９】
本発明による方法の前記実施例を具体的に示すために図面を参照する。
【００４０】
出発材料として再度上記コラーゲン溶液１を用いる。このコラーゲン溶液は、ポンプ２で管３ａ、３ｂを介し円筒形部分５と円錐形部分６とを有するノズル４を通して圧縮される。別法として、補助ポンプ７を介して貯蔵容器８から緩衝液９を管３ｂの中に導入し、コラーゲン溶液１と一緒にノズル４を通して案内してもよい。
【００４１】
ノズル４の円錐形部分６内の断面狭隘部によってコラーゲン溶液が強い濃化を受け、その液体の枠内で除去される（図中見本例として１０の符号をつけた矢印で暗示した）。ノズル４の流出開口部１１で、本質的に流出開口部１１の断面を有するコラーゲン糸１２が流出する。コラーゲン糸１２は続いて乾燥させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】概略的なコラーゲン糸の製造のための試験構造である。
【図１】
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【国際調査報告】
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