(57)【要約】本発明は、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）に免疫賦活物質、特に非メチル化ＣおよびＧ（ＣｐＧ）を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドを担持することができるという、発見に関するものである。このようなＣｐＧ−ＶＬＰは、それらのＣｐＧを含まない相当物よりも劇的に免疫原性を示し、増強したＢおよびＴ細胞応答を誘導する。場合により結合、融合、又は他の方法でＶＬＰに付着した抗原に対する免疫応答は、ＶＬＰ自体に対する免疫応答と同様に増強される。さらに、ＶＬＰおよび抗原に対するＴ細胞応答は、Ｔｈ１型を特に対象とする。したがって、ＣｐＧ担持ＶＬＰに付着した抗原は、アレルギー、腫瘍および他の自己組織化分子、ならびに慢性ウィルス性疾患に対する予防的又は治療的ワクチン接種用の理想的なワクチンとなる可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ウィルス様粒子、及び
（ｂ）免疫賦活物質
を含んでなり、前記免疫賦活物質が前記ウィルス様粒子と結合している動物の免疫応答を高めるための組成物。
【請求項２】
少なくとも１つの抗原をさらに含んでなり、前記抗原が前記ウィルス様粒子と結合している請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記免疫賦活物質がｔｏｌｌ様レセプター活性化物質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫賦活物質がサイトカイン分泌誘導物質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｔｏｌｌ様レセプター活性化物質が、
（ａ）免疫賦活性核酸、
（ｂ）ペプチドグリカン、
（ｃ）リポ多糖、
（ｄ）リポテイコ酸、
（ｅ）イミダゾキノリン化合物、
（ｆ）フラジェリン
（ｇ）リポタンパク質、
（ｈ）免疫賦活有機分子、
（ｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び／又は（ｉ）の少なくとも１つの物質の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫賦活性核酸が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ウィルス様粒子がリポタンパク質含有エンベロープを欠いている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ウィルス様粒子が組み換えウィルス様粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ウィルス様粒子が、
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｂ）はしかウィルスの組み換えタンパク質、
（ｃ）シンビス・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｄ）ロタ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｅ）口蹄疫ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｆ）レトロ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｇ）ノーウォーク・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｈ）ヒト・パピローマ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｉ）ＢＫウィルスの組み換えタンパク質、
（ｊ）バクテリオファージの組み換えタンパク質、
（ｋ）ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、
（ｌ）Ｑβ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｍ）ＧＡ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｎ）ｆｒ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｏ）ＡＰ２０５ファージの組み換えタンパク質、
（ｐ）Ｔｙの組み換えタンパク質、および
（ｑ）（ａ）〜（ｐ）の組み換えタンパク質の任意の断片
からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ウィルス様粒子がＢＫウィルスＶＰ１タンパク質である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージの組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＲＮＡファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージＱβの組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が任意のヌクレオチドである配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ヌクレオチドＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つがリン酸骨格の修飾体を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｂ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ、
（ｃ）ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ、
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、および
（ｅ）表１に記載した「ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３」
からなる群から選択される配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパリンドローム配列である、請求項９に記載の組成物。
【請求項２４】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫賦活物質が前記ウィルス様粒子と非共有結合をしている、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが前記ウィルス様粒子と非共有結合をしている、請求項９に記載の組成物。
【請求項２８】
前記免疫賦活性核酸が、オリゴヌクレオチド結合部位、ＤＮＡ結合部位、およびＲＮＡ結合部位からなる群から選択されるウィルス様粒子部位と結合している、請求項５に記載の組成物。
【請求項２９】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド結合部位、ＤＮＡ結合部位、およびＲＮＡ結合部位からなる群から選択されるウィルス様粒子部位と結合している、請求項９に記載の組成物。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチド結合部位が非天然オリゴヌクレオチドの結合部位である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ウィルス様粒子部位がアルギニンリッチリピートを含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記免疫賦活性核酸がリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項３３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項３４】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約６〜約１００，０００個のヌクレオチドを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項３５】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約６〜約２０００個のヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約２０〜約２０００個のヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約２０〜約３００個のヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが２０〜１００個のヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが１００超〜約２０００個のヌクレオチドを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、１００超〜約１０００個のヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが１００超〜約５００個のヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが組み換えオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項４３】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがゲノムのオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項４４】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項４５】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがプラスミド由来のオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項４６】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が、少なくとも１つの共有結合によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が、少なくとも１つの共有結合によって前記ウィルス様粒子と結合しており、かつ前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウィルス様粒子と融合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項５１】
前記抗原または抗原決定基が、
（ａ）前記抗原または抗原決定基を有する天然に存在しない付着部位、及び
（ｂ）前記抗原または抗原決定基を有する天然に存在する付着部位、
からなる群から選択される少なくとも１つの第２の付着部位をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５２】
アミノ酸リンカーをさらに含み、前記アミノ酸リンカーが前記第２の付着部位を含むか、あるいはこれからなる、請求項２に記載の組成物。
【請求項５３】
前記抗原が、
（ａ）ポリペプチド、
（ｂ）炭水化物、
（ｃ）ステロイド・ホルモン、および
（ｄ）有機分子
からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記抗原が有機分子である、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記有機分子が、
（ａ）コデイン、
（ｂ）フェンタニル、
（ｃ）ヘロイン、
（ｄ）モルフィウム、
（ｅ）アンフェタミン、
（ｆ）コカイン、
（ｇ）メチレンジオキシメタンフェタミン、
（ｈ）メタンフェタミン、
（ｉ）メチルフェニデート、
（ｊ）ニコチン、
（ｋ）ＬＳＤ、
（ｌ）メスカリン、
（ｍ）サイロシビン、および
（ｎ）テトラヒドロカンナビノール
からなる群から選択される、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記抗原が組み換え抗原である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５７】
前記抗原が、
（ａ）ウィルス、
（ｂ）細菌、
（ｃ）寄生虫、
（ｄ）プリオン、
（ｅ）腫瘍、
（ｆ）自己分子、
（ｇ）非ペプチド・ハプテン分子、
（ｈ）アレルゲン、および
（ｉ）ホルモン
からなる群に由来する、請求項２に記載の組成物。
【請求項５８】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記腫瘍抗原が、
（ａ）Ｈｅｒ２、
（ｂ）ＧＤ２、
（ｃ）ＥＧＦ−Ｒ、
（ｄ）ＣＥＡ、
（ｅ）ＣＤ５２、
（ｆ）ＣＤ２１、
（ｇ）ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００、
（ｈ）ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、
（ｉ）チロシナーゼ、
（ｊ）ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質、
（ｋ）ＭＡＧＥ−３タンパク質、
（ｌ）ｐ５３タンパク質、
（ｍ）ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質、および
（ｎ）（ａ）〜（ｍ）の任意の腫瘍抗原の抗原性断片
からなる群から選択される、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記抗原が連結配列によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ウィルス様粒子がＢＫウィルスのコア・タンパク質である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
前記抗原が細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、または前記少なくとも２つのエピトープの組合せであり、かつ前記少なくとも２つのエピトープが直接または連結配列によって結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、ウィルスまたは腫瘍の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記抗原が連結配列によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６７】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端と融合している、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、連結配列によって前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端と融合している、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ウィルス様粒子がＢＫウィルスのＶＰ１タンパク質である、請求項６３に記載の組成物。
【請求項７０】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、前記ＢＫウィルスのＶＰ１タンパク質のＣ末端と融合している、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、連結配列によって前記ＢＫウィルスのＶＰ１タンパク質のＣ末端と融合している、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
（ａ）ウィルス様粒子、及び
（ｂ）免疫賦活物質、
を含んでなり、前記免疫賦活物質が前記ウィルス様粒子と結合している組成物を動物へ導入することを含んでなる、動物の免疫応答を高めるための方法。
【請求項７３】
前記組成物が、前記ウィルス様粒子と結合している抗原をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記免疫賦活物質がｔｏｌｌ様レセプター活性化物質である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記免疫賦活物質がサイトカイン分泌誘導物質である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記ｔｏｌｌ様レセプター活性化物質が、
（ａ）免疫賦活性核酸、
（ｂ）ペプチドグリカン、
（ｃ）リポ多糖、
（ｄ）リポテイコ酸、
（ｅ）イミダゾキノリン化合物、
（ｆ）フラジェリン
（ｇ）リポタンパク質、
（ｈ）免疫賦活有機分子、
（ｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、および
（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び／又は（ｉ）の少なくとも１つの物質の任意の混合物、からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記免疫賦活性核酸が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、および
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項７２に記載の方法。
【請求項８１】
前記ウィルス様粒子がリポタンパク質含有エンベロープを欠いている、請求項７２に記載の方法。
【請求項８２】
前記ウィルス様粒子が組み換えウィルス様粒子である、請求項７２に記載の方法。
【請求項８３】
前記ウィルス様粒子が、
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｂ）はしかウィルスの組み換えタンパク質、
（ｃ）シンビス・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｄ）ロタ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｅ）口蹄疫ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｆ）レトロ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｇ）ノーウォーク・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｈ）ヒト・パピローマ・ウィルスの組み換えタンパク質、
（ｉ）ＢＫウィルスの組み換えタンパク質、
（ｊ）バクテリオファージの組み換えタンパク質、
（ｋ）ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、
（ｌ）Ｑβ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｍ）ＧＡ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｎ）ｆｒ−ファージの組み換えタンパク質、
（ｏ）ＡＰ２０５ファージの組み換えタンパク質、
（ｐ）Ｔｙの組み換えタンパク質、および
（ｑ）（ａ）〜（ｐ）の組み換えタンパク質の任意の断片
からなる群から選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ウィルス様粒子がＢＫウィルスＶＰ１タンパク質である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージの組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＲＮＡファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージＱβの組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項８９】
前記ウィルス様粒子がＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質、またはその断片を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項９０】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が任意のヌクレオチドである配列、
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項９１】
前記ヌクレオチドＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つがリン酸骨格の修飾体を有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、
（ａ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ、
（ｂ）ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ、
（ｃ）ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧ、
（ｄ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、および
（ｅ）表１に記載した「ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３」
からなる群から選択される配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項８０に記載の方法。
【請求項９３】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパリンドローム配列である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９５】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＧを含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれからなる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記パリンドローム配列である非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、リン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記免疫賦活物質が前記ウィルス様粒子と非共有結合をしている、請求項７２に記載の方法。
【請求項９８】
前記ウィルス様粒子が細菌の発現系によって生成される、請求項７２に記載の方法。
【請求項９９】
前記ウィルス様粒子が酵母菌の発現系によって生成される、請求項７２に記載の方法。
【請求項１００】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが前記ウィルス様粒子と非共有結合をしている、請求項８０に記載の方法。
【請求項１０１】
前記免疫賦活物質が前記ウィルス様粒子によってパッケージ化されているか、好ましくは封入されている、請求項７２に記載の方法。
【請求項１０２】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが前記ウィルス様粒子によってパッケージ化されているか、好ましくは封入されている、請求項８０に記載の方法。
【請求項１０３】
前記免疫賦活性核酸が、オリゴヌクレオチド結合部位、ＤＮＡ結合部位、およびＲＮＡ結合部位からなる群から選択されるウィルス様粒子部位と結合している、請求項７６に記載の方法。
【請求項１０４】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド結合部位、ＤＮＡ結合部位、およびＲＮＡ結合部位からなる群から選択されるウィルス様粒子部位と結合している、請求項８０に記載の方法。
【請求項１０５】
前記オリゴヌクレオチド結合部位が非天然オリゴヌクレオチドの付着部位である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ウィルス様粒子部位がアルギニンリッチリピートを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記免疫賦活性核酸がリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがリン酸骨格の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾体を含むか、あるいは前記オリゴヌクレオチドの前記リン酸骨格のそれぞれのリン酸部分がホスホロチオエート修飾体である、請求項８０に記載の方法。
【請求項１０９】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約６〜約１００，０００個のヌクレオチドを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約６〜約２０００個のヌクレオチドを含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約２０〜約２０００個のヌクレオチドを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが約２０〜約３００個のヌクレオチドを含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが２０〜１００個のヌクレオチドを含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、１００超〜約２０００個のヌクレオチドを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項１１５】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、１００超〜約１０００個のヌクレオチドを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、１００超〜約５００個のヌクレオチドを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、組み換えオリゴヌクレオチドである、請求項７６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、ゲノムのオリゴヌクレオチドである、請求項７６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、合成オリゴヌクレオチドである、請求項７６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、プラスミド由来のオリゴヌクレオチドである、請求項７６に記載の方法。
【請求項１２１】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項７６に記載の方法。
【請求項１２２】
前記免疫賦活性核酸、および好ましくは前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項７６に記載の方法。
【請求項１２３】
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が、少なくとも１つの共有結合によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項７３に記載の方法。
【請求項１２４】
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が、少なくとも１つの共有結合によって前記ウィルス様粒子と結合しており、かつ前記共有結合が非ペプチド結合である、請求項７３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記少なくとも１つの抗原または抗原決定基が前記ウィルス様粒子と融合している、請求項７３に記載の方法。
【請求項１２６】
前記抗原または抗原決定基が、
（ａ）前記抗原または抗原決定基を有する天然に存在しない付着部位、及び
（ｂ）前記抗原または抗原決定基を有する天然に存在する付着部位、
からなる群から選択される少なくとも１つの第２の付着部位をさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項１２７】
アミノ酸リンカーをさらに含み、前記アミノ酸リンカーが前記第２の付着部位を含むか、あるいはこれからなる、請求項７３に記載の方法。
【請求項１２８】
前記抗原が、
（ａ）ポリペプチド、
（ｂ）炭水化物、
（ｃ）ステロイド・ホルモン、および
（ｄ）有機分子
からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項１２９】
前記抗原が有機分子である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記有機分子が、
（ａ）コデイン、
（ｂ）フェンタニル、
（ｃ）ヘロイン、
（ｄ）モルフィウム、
（ｅ）アンフェタミン、
（ｆ）コカイン、
（ｇ）メチレンジオキシメタンフェタミン、
（ｈ）メタンフェタミン、
（ｉ）メチルフェニデート、
（ｊ）ニコチン、
（ｋ）ＬＳＤ、
（ｌ）メスカリン、
（ｍ）サイロシビン、および
（ｎ）テトラヒドロカンナビノール
からなる群から選択される、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記抗原が組み換え抗原である、請求項７３に記載の方法。
【請求項１３２】
前記抗原が、
（ａ）ウィルス、
（ｂ）細菌、
（ｃ）寄生虫、
（ｄ）プリオン、
（ｅ）腫瘍、
（ｆ）自己分子、
（ｇ）非ペプチド・ハプテン分子、
（ｈ）アレルゲン、および
（ｉ）ホルモン
からなる群に由来する、請求項７３に記載の方法。
【請求項１３３】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記腫瘍抗原が、
（ａ）Ｈｅｒ２、
（ｂ）ＧＤ２、
（ｃ）ＥＧＦ−Ｒ、
（ｄ）ＣＥＡ、
（ｅ）ＣＤ５２、
（ｆ）ＣＤ２１、
（ｇ）ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００、
（ｈ）ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、
（ｉ）チロシナーゼ、
（ｊ）ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質、
（ｋ）ＭＡＧＥ−３タンパク質、
（ｌ）ｐ５３タンパク質、
（ｍ）ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質、および
（ｎ）（ａ）〜（ｍ）の任意の腫瘍抗原の抗原性断片
からなる群から選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記抗原が連結配列によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項７３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ウィルス様粒子がＢＫウィルスのＶＰ１タンパク質である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
前記抗原が細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、または前記少なくとも２つのエピトープの組合せであり、前記の少なくとも２つのエピトープが直接または連結配列によって結合している、請求項７３に記載の方法。
【請求項１３９】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープがウィルスまたは腫瘍の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープである、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記抗原が連結配列によって前記ウィルス様粒子と結合している、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
前記ウィルス様粒子がＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端と融合している、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、連結配列によって前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端と融合している、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記ウィルス様粒子がＢＫウィルスのＶＰ１タンパク質である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４５】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、前記ＢＫウィルスのＶＰ１タンパク質のＣ末端と融合している、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが、連結配列によって前記ＢＫウィルスのＶＰ１タンパク質のＣ末端と融合している、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記免疫応答が高められたＢ細胞応答である、請求項７２に記載の方法。
【請求項１４８】
前記免疫応答が高められたＴ細胞応答である、請求項７２に記載の方法。
【請求項１４９】
前記Ｔ細胞応答がＣＴＬ応答である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記Ｔ細胞応答がＴｈ細胞応答である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
前記Ｔｈ細胞応答がＴｈ１細胞応答である、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記動物が哺乳動物である、請求項７２に記載の方法。
【請求項１５３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記組成物を、前記動物の皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、あるいはリンパ節に直接に導入する、請求項７２に記載の方法。
【請求項１５５】
（ａ）前記ウィルス様粒子を前記免疫賦活物質と共にインキュベートすること、
（ｂ）ＲＮａｓｅを加えること、および
（ｃ）前記組成物を精製すること
を含む、 ウィルス様粒子および前記ウィルス様粒子と結合した免疫賦活物質を含んでなる動物の免疫応答を高めるための組成物を生成する方法。
【請求項１５６】
前記免疫賦活物質が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる免疫賦活性核酸である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）又はその誘導体である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５９】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ウィルス様粒子が細菌の発現系において生成される、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６１】
前記ＲＮａｓｅがＲＮａｓｅＡである、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１６２】
（ａ）前記ウィルス様粒子をＲＮａｓｅと共にインキュベートすること、
（ｂ）前記免疫賦活物質を加えること、及び
（ｃ）前記組成物を精製すること
を含む、ウィルス様粒子および前記ウィルス様粒子と結合した免疫賦活物質を含んでなる動物の免疫応答を高めるための組成物を生成する方法。
【請求項１６３】
前記免疫賦活物質が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる免疫賦活性核酸である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６７】
前記ウィルス様粒子が細菌の発現系において生成される、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６８】
前記ＲＮａｓｅがＲＮａｓｅＡである、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６９】
（ａ）前記ウィルス様粒子を分解すること、
（ｂ）前記免疫賦活物質を加えること、および
（ｃ）前記ウィルス様粒子を再構築すること
を含む、ウィルス様粒子および前記ウィルス様粒子と結合した免疫賦活物質を含んでなる動物の免疫応答を高めるための組成物を生成する方法。
【請求項１７０】
前記免疫賦活物質が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる免疫賦活性核酸である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、および
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７４】
前記分解したウィルス様粒子の核酸を除去することをさらに含んでなる、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７５】
再構築（ｃ）の後に前記組成物を精製することをさらに含んでなる、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７６】
（ａ）前記ウィルス様粒子を、前記ウィルス様粒子の核酸を加水分解することができる金属イオンを含む溶液と共にインキュベートすること、
（ｂ）前記免疫賦活物質を加えること、及び
（ｃ）前記組成物を精製すること
を含む、ウィルス様粒子および前記ウィルス様粒子と結合した免疫賦活物質を含んでなる動物の免疫応答を高めるための組成物を生成する方法。
【請求項１７７】
前記免疫賦活物質が、
（ａ）リボ核酸、
（ｂ）デオキシリボ核酸、
（ｃ）キメラ核酸、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つの核酸の任意の混合物、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる免疫賦活性核酸である、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記リボ核酸がポリ−（Ｉ：Ｃ）またはその誘導体である、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記デオキシリボ核酸が、
（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、および
（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチド、
からなる群から選択されるか、あるいはこれから本質的になる、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８０】
前記免疫賦活物質が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８１】
前記金属イオンが、
（ａ）亜鉛（Ｚｎ）イオン、
（ｂ）銅（Ｃｕ）イオン、
（ｃ）鉄（Ｆｅ）イオン、および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つのイオンの任意の混合物、
からなる群から選択される、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８２】
免疫学的に有効量の請求項１に記載の組成物、および薬剤として許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含んでなるワクチン。
【請求項１８３】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１８２に記載のワクチン。
【請求項１８４】
免疫学的に有効量の請求項１８２に記載のワクチンを前記動物に投与することを含んでなる、動物を免疫化または治療する方法。
【請求項１８５】
前記動物が哺乳動物である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
免疫学的に有効量の請求項２に記載の組成物、及び薬剤として許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含んでなるワクチン。
【請求項１８８】
アジュバントをさらに含む、請求項１８７に記載のワクチン。
【請求項１８９】
免疫学的に有効量の請求項１８７に記載のワクチンを前記動物に投与することを含んでなる、動物を免疫化または治療する方法。
【請求項１９０】
前記動物が哺乳動物である、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
免疫学的に有効量の請求項１８２に記載のワクチンを投与することによって、前記動物のＴ細胞応答を初回抗原刺激することを含んでなる動物を免疫化または治療する方法。
【請求項１９３】
前記動物の免疫応答を追加抗原刺激するステップをさらに含んでなる、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記追加抗原刺激を、免疫学的に有効量の請求項１８２に記載のワクチン、または免疫学的に有効量の異種ワクチンを投与することによって行う、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記異種ワクチンがＤＮＡワクチンである、請求項１９４に記載の方法。
【請求項１９６】
免疫学的に有効量の請求項１８２に記載のワクチンを投与することによって、前記動物のＴ細胞応答を追加抗原刺激することを含んでなる動物を免疫化または治療する方法。
【請求項１９７】
前記動物のＴ細胞応答を初回抗原刺激するステップをさらに含んでなる、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記初回抗原刺激を、免疫学的に有効量の請求項１８２に記載のワクチン、または免疫学的に有効量の異種ワクチンを投与することによって行う、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記異種ワクチンがＤＮＡワクチンである、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
免疫学的に有効量の請求項１８７に記載のワクチンを投与することによって、前記動物のＴ細胞応答を初回抗原刺激することを含んでなる、動物を免疫化又は治療する方法。
【請求項２０１】
前記動物の免疫応答を追加抗原刺激するステップをさらに含む、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記追加抗原刺激を、免疫学的に有効量の請求項１８７に記載のワクチン、又は免疫学的に有効量の異種ワクチンを投与することによって行う、請求項２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記異種ワクチンがＤＮＡワクチン又はウィルス・ワクチン又はカネリー痘瘡ワクチンである、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
免疫学的に有効量の請求項１８７に記載のワクチンを投与することによって、前記動物のＴ細胞応答を追加抗原刺激することを含んでなる動物を免疫化又は治療する方法。
【請求項２０５】
前記動物のＴ細胞応答を初回抗原刺激するステップをさらに含んでなる、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記初回抗原刺激を、免疫学的に有効量の請求項１８７に記載のワクチン、又は免疫学的に有効量の異種ワクチンを投与することによって行う、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記異種ワクチンがＤＮＡワクチン又はウィルス・ワクチン又はカネリー痘瘡ワクチンである、請求項２０６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種学、免疫学および医学の分野に関する。本発明は、免疫賦活物質、特に免疫賦活性核酸、さらに具体的には少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドをＶＬＰにパッケージ化することによって、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）に対する、あるいはＶＬＰに連結、融合、又は他の方式で付着した抗原に対する免疫応答を高めるための、組成物および方法を提供する。本発明を使用して、腫瘍および慢性のウィルス性疾患、およびアレルギーおよび他の慢性疾患を治療するのに特に有用な、強力で持続的なＴ細胞応答を誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の本質は、２つの別個の基礎杭上に成り立っている：１つは、特異的又は適応免疫であり、これは比較的遅い応答動態および記憶能力によって特徴付けられる；もう１つは、迅速な応答動態を示すが記憶が欠けている、非特異的又は先天性免疫である。リンパ球は、適応免疫系の重要な役割を果たすものである。それぞれのリンパ球は、独特の特異性の抗原−受容体を発現する。エフェクターによって抗原を認識することにより、リンパ球は増殖し、エフェクター機能が進行する。少数のリンパ球が所与の抗原又は病原体に関する特異性を示し、エフェクター応答、したがって適応免疫系の遅い動態を測定することができる前に、膨大な増殖が通常必要とされる。広がるリンパ球の大部分は生き延び、抗原の除去の後にある程度のエフェクター機能を維持することができるので、適応免疫系は、２度目に抗原に遭遇すると素早く反応する。これが、その記憶能力の基盤である。
【０００３】
リンパ球に関する状況とは対照的に、病原体に関する特異性が、機能を獲得するために広がらなければならないいくつかの細胞に限られる場合、先天性免疫系の細胞および分子は、通常多数存在し、病原体と関連がある限られた数の不変の特徴を認識する（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．ａｎｄ  Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．、Ｃｅｌｌ  ９１：２９５〜２９８（１９９７））。このような型の例には、リポ多糖（ＬＰＳ）、非メチル化状態のＣＧが豊富なＤＮＡ（ＣｐＧ）又は二本鎖ＲＮＡがあり、これらはそれぞれ細菌およびウィルス感染に特異的である。
【０００４】
免疫学における大部分の研究は、適応免疫系に焦点が当てられてきており、ごく最近、先天性免疫系が興味の焦点に入ってきている。歴史的には、適応免疫系と先天性免疫系を、ほとんど共通点がない２つの別個のものとして、処理および分析した。なぜ抗原が、先天性免疫を刺激するアジュバントと共に施用すると、特定の免疫系に関してより一層免疫原性があったのか、数人の研究者が不思議に思ったのは、この差異であった（Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ，Ｅ．Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７８０（１９９９）；Ｄｉｅｈｌ，Ｌ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７７４（１９９９）；Ｗｅｉｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１５９（１９８０））。しかしながら、この質問に出される答えは、免疫系を理解するため、および防御免疫と自己免疫の間のバランスを把握するために重要である。
【０００５】
先天性免疫系、特に自己特異的なＴ細胞応答を故意に誘導する、Ｔ細胞に関するＡＰＣの活性化の合理的な操作によって、Ｔ細胞系腫瘍を治療するための手段が与えられる。したがって、最新の療法の焦点は、持続的なＴ細胞応答を誘導するための、抗原担体としての活性化樹状細胞（ＤＣ）の使用に基づくものである（Ｎｅｓｔｌｅ他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３２８（１９９８））。同様に、先天性免疫系のインビボの活性化物質、ＣｐＧ又は抗ＣＤ４０抗体などを、腫瘍細胞と共に施して、その免疫原性を高める（Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ，Ｅ．Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７８０（１９９９）；Ｄｉｅｈｌ，Ｌ．他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：７７４（１９９９））。
【０００６】
先天性免疫を刺激する因子によるＡＰＣの全身活性化は、自己特異的リンパ球および自己免疫性を誘発する原因となる可能性がしばしばある。活性化は、共賦活分子又はサイトカイン、ＩＬ−１２又はＩＦＮαなどの、増大した発現をもたらす可能性がある。この考えは、ＬＰＳおよび甲状腺エキスを投与することによって、免疫寛容を圧倒し自己免疫甲状腺炎を誘発することができるという観察と、適合性がある（Ｗｅｉｇｌｅ，Ｗ．Ｏ．、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１５９（１９８０））。さらに、トランスジェニック・マウスのモデルにおいて、自己ペプチド単独の投与によって、別の経路によってＡＰＣを活性化させない限りは、自己免疫を引き起こすことはできないことが最近示された（Ｇａｒｚａ，Ｋ．Ｍ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：２０２１（２０００））。先天性免疫と自己免疫疾患の間の関連は、ＬＰＳ、ウィルス感染又はＡＰＣの全身活性化は、末梢の免疫寛容の確立を遅らせるかあるいは妨げるという観察によって、さらに強調される（Ｖｅｌｌａ，Ａ．Ｔ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：２６１（１９９５）；Ｅｈｌ，Ｓ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：７６３（１９９８）；Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２０２４（１９９９））。このようにして、先天性免疫は自己特異的リンパ球の活性化を高めるだけでなく、それらのその後の排除も阻害する。これらの発見は、腫瘍生物学および慢性のウィルス性疾患の制御に広がることができる。
【０００７】
副組織適合抗原、ＨＹ−抗原などを用いた免疫化の後の、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導には、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）の存在が必要である（Ｈｕｓｍａｎｎ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５３２：１５８（１９８８）；Ｇｕｅｒｄｅｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：５５３（１９９２））。クロス・プライミングによって、すなわちクラスＩ経路に達する外来性の抗原で初回抗原刺激を与えることによって、誘導されるＣＴＬ応答も、Ｔｈ細胞の存在を必要とすることが示されてきている（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６５（１９９７））。これらの観察は、腫瘍療法に関する重要な結果を有しており、この場合Ｔヘルパー細胞は、腫瘍細胞による防御ＣＴＬ応答を誘導するために重要である可能性がある（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ，Ｆ．他、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３（１９９８））。
【０００８】
活性化Ｔｈ細胞上の１つの重要なエフェクター分子は、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ）上のＣＤ４０と相互作用する、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である（Ｆｏｙ，Ｔ．Ｍ．他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：５９１（１９９６））。Ｂ細胞上のＣＤ４０の誘発は、イソ型を変えるため、およびＢ細胞の記憶を生み出すために必須である（Ｆｏｙ，Ｔ．Ｍ．他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：５９１（１９９６））。さらに最近、マクロファージおよびＤＣ上のＣＤ４０を刺激することによって、それらの活性化および成熟がもたらされることが示された（Ｃｅｌｌａ，Ｍ．他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１０（１９９７）；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５（１９９８））。具体的にはＤＣは、共賦活分子を上方制御し、活性化によってＩＬ−１２などのサイトカインを生成する。興味深いことに、このＣＤ４０Ｌ仲介型のＤＣの成熟は、ＣＴＬ応答に対するヘルパーの影響の原因であるようである。実際、Ｔｈ細胞によるＣＤ４０の誘発によって、ＤＣがＣＴＬ−応答を開始することができることが最近示されてきている（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４（１９９８）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８（１９９８）；Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０（１９９８））。このことは、Ｔｈ細胞がＣＴＬと同じＡＰＣ上のリガンドを認識しなければならないという初期の観察と一致し、同族の相互作用が必要とされることが示される（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６５（１９９７））。したがって、Ｔｈ細胞によるＣＤ４０Ｌ仲介型の刺激は、ＤＣの活性化をもたらし、これは後にＣＴＬ−応答を初回抗原により刺激することができる。ヒトでは、Ｉ型インターフェロン、特にインターフェロンαおよびβが、ＩＬ−１２と同じくらい重要である可能性がある。
【０００９】
これらのＴｈ依存性ＣＴＬ応答とは対照的に、ウィルスは、Ｔ細胞の助けなしで防御ＣＴＬ応答を誘導することができることが多い（概説に関しては、（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５７９１（１９９８）を参照のこと）。具体的には、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）（Ｌｅｉｓｔ，Ｔ．Ｐ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２２７８（１９８７）；Ａｈｍｅｄ，Ｒ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２１０２（１９８８）；Ｂａｔｔｅｇａｙ，Ｍ．他、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１１５（１９９６）；Ｂｏｒｒｏｗ，Ｐ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２１２９（１９９６）；Ｗｈｉｔｍｉｒｅ，Ｊ．Ｋ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８３７５（１９９６））、水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）（Ｋｕｎｄｉｇ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ５：４１（１９９６））、インフルエンザ・ウィルス（Ｔｒｉｐｐ，Ｒ．Ａ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：２９５５（１９９５））、ワクシニア・ウィルス（Ｌｅｉｓｔ，Ｔ．Ｐ．他、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：６７９（１９８９））、およびエクトロメリア・ウィルス（Ｂｕｌｌｅｒ，Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７７（１９８７））は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を欠いているか、あるいはクラスＩＩ又はＣＤ４０の発現に欠陥があるマウスにおいて、ＣＴＬ応答を誘導することができた。ウィルスによるこのＴｈ細胞依存性ＣＴＬ誘発に関する機構は、現在理解されていない。さらに、大部分のウィルスはＴｈ細胞依存性ＣＴＬ応答を完全に刺激するわけではないが、ウィルス特異的ＣＴＬ活性は、Ｔｈ細胞欠陥マウスでは低下する。したがって、Ｔｈ細胞は抗ウィルスＣＴＬ応答を高める可能性があるが、この助けの機構は今だに完全には理解されていない。ＤＣは、クロス・プライミングによりインフルエンザ由来の抗原をディスプレイすることが、最近示されてきている（Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１３５９（１９９８）；Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：８６（１９９８））。したがって、副組織適合抗原および腫瘍抗原に関して示されるのと同様に（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４（１９９８）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８（１９９８）；Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０（１９９８）；Ｔｈ細胞が、ＤＣ上でのＣＤ４０誘発によって、ＣＴＬの誘導を助長する可能性があることが考えられる。したがって、ＣＤ４０Ｌ又は抗ＣＤ４０抗体を使用してＣＤ４０を刺激することによって、ウィルス又は腫瘍細胞による刺激後に、ＣＴＬ誘導を高めることができる。
【００１０】
しかしながら、ＣＤ４０ＬはＤＣの重要な活性化物質であるが、免疫応答中にＤＣの成熟および活性化を刺激することができる、他の分子が存在するようである。実際ＣＤ４０は、ＬＣＭＶ又はＶＳＶに特異的なＣＴＬの誘導に関して測定できるほど関連があるわけではない（Ｒｕｅｄｌ，Ｃ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１８７５（１９９９））。したがって、ＶＳＶ特異的ＣＴＬ応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在に部分的に依存し（Ｋｕｉｎｄｉｇ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：４１（１９９６））、このヘルパー効果はＣＤ４０Ｌによって仲介されるわけではない。免疫応答中のＤＣの成熟を誘発する、エフェクター分子に関する候補には、ＴｒａｎｃｅおよびＴＮＦαがある（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１０２５（１９９９）；Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．，ａｎｄ  Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９（１９９４））。
【００１１】
精製タンパク質のみを投与することは、強力な免疫応答を誘導するのに通常は十分ではなく、単離抗原は一般に、アジュバントと呼ばれる補助物質と一緒に与えなければならないことは十分に認められている。これらのアジュバント中には、急速な分解に対して投与される抗原が保護されており、アジュバントによって、低レベルの抗原の長期の放出がもたらされる。
【００１２】
単離タンパク質とは異なり、ウィルスは、Ｔ細胞の助力によってかつ助力なしで、任意のアジュバントの不在下において迅速で有効な免疫応答を誘導する（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５〜２７０（１９９７））。ウィルスはいくつかのタンパク質からなることが多いが、それらはその単離要素よりも一層強力な免疫応答を誘導することができる。Ｂ細胞応答に関しては、ウィルスの免疫原性に関する１つの重要な要因は、表面エピトープの反復性および配列であることが知られている。多くのウィルスは、Ｂ細胞上でエピトープ特異的免疫グロブリンを効率よく架橋させるエピトープの通常の配列を示す、準結晶表面を示す（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １７：５５３〜５５８（１９９６））。Ｂ細胞上での表面免疫グロブリンのこの架橋は、細胞周期の進行およびＩｇＭ抗体の生成を直接誘導する、強力な活性化シグナルである。さらに、このような誘発Ｂ細胞はＴヘルパー細胞を活性化させることができ、次にＢ細胞におけるＩｇＭからＩｇＧ抗体生成の変化、および長命Ｂ細胞記憶の発生を誘導し、これらは任意のワクチン接種の目的である（Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＆  Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２３５−２７０（１９９７））。ウィルスの構造は、自己免疫疾患における、かつ病原体に対する本来の応答の一部分として、抗−抗体の生成とも関連がある（Ｆｅｈｒ，Ｔ．他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１７８５〜１７９２（１９９７）を参照のこと）。したがって、整然とした反復配列で編成されたウィルス粒子上の抗原は、非常に免疫原性がある。なぜならこれらは、Ｂ細胞を直接活性化させることができるからである。
【００１３】
強力なＢ細胞応答に加えて、ウィルス粒子は、細胞傷害性Ｔ細胞応答、免疫系の他の重要な部門の発生を誘導することもできる。これらの細胞傷害性Ｔ細胞は、ＨＩＶ又はＢ型肝炎ウィルスなどの非細胞変性ウィルスを排除するため、および腫瘍を根絶するために特に重要である。細胞傷害性Ｔ細胞は、元の抗原は認識しないが、ＭＨＣクラスＩ分子と結合するそれらの分解生成物は認識する（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ＆  Ｂｏｄｍｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１〜６２４（１９８９））。マクロファージおよび樹状細胞は、外来性ウィルス粒子を取り込み加工することができ（ただし、その可溶性、単離要素はできない）、生じた分解生成物を細胞傷害性Ｔ細胞に掲示することができ、それらの活性化および増殖をもたらす（Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４９４２〜４９４６（１９９３）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：２５９５〜２６００（１９９６））。
【００１４】
抗原としてのウィルス粒子は、その単離要素に優る２つの利点を示す：（１）それらの非常に反復的な表面構造のために、ウィルス粒子は、Ｂ細胞を直接活性化させることができ、高い抗体力価および長時間続くＢ細胞の記憶をもたらす；および（２）可溶性タンパク質ではなく、ウィルス粒子は、ウィルスが非感染性であり、アジュバントが存在しない場合でも、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための能力を有している。
【００１５】
いくつかの新しいワクチン戦略は、ウィルスの固有の免疫原性を利用するものである。これらの手法のいくつかは、ウィルス粒子の粒子的性質に焦点を当てている；たとえば、ラテックス・ビーズおよび抗原からなるワクチンを開示する、Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｖ．ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｒ．、（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５３：４９２５（１９９４））；酸化鉄ビーズおよび抗原からなるワクチンを開示する、Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．他、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４９４２〜４９４６（１９９３））；抗原でコーティングされたコア粒子を開示する、Ｋｏｓｓｏｖｓｋｙ，Ｎ．他への米国特許第５，３３４，３９４号；共有結合した１つ又は複数のタンパク質を表面上に有する合成ポリマー粒子を開示する、米国特許第５，８７１，７４７号；および前記コア粒子の表面を少なくとも部分的に覆う非共有結合コーティングを有するコア粒子、および前記コーティングされたコア粒子と接触する、少なくとも１つの生物学的に活性がある物質（たとえば、ＷＯ９４／１５５８５を参照のこと）を参照のこと。
【００１６】
他の開発では、ウィルス様粒子（ＶＬＰ）を、粒子の構造的性質および非感染性のために、ワクチン生成の分野で利用する。ＶＬＰは、多くのタンパク質分子と対称な形式で構築された、１つ又は複数の型の超分子構造体である。ＶＬＰはウィルス・ゲノムが欠けており、したがって非感染性である。ＶＬＰはヘテロ発現によって多量に生成できることが多く、容易に精製することができる。
【００１７】
さらに、非メチル化ＣＧモチーフ（ＣｐＧ）が豊富なＤＮＡは、細菌および大部分の非脊椎動物中に存在すると、インビトロおよびインビボにおいてＢ細胞、樹状細胞、および他のＡＰＣ上で、強力な刺激活性を示す。細菌ＤＮＡは多くの脊椎動物種で免疫賦活であるが、個々のＣｐＧモチーフは異なる可能性がる。実際、マウスの免疫細胞を刺激するＣｐＧモチーフが、ヒトの免疫細胞を必ずしも刺激することができるわけではなく、逆も同様である。
【００１８】
ＣｐＧモチーフが豊富なＤＮＡオリゴマーは、免疫賦活能力を示すことができるが、その有効性は制限されることが多い。なぜならそれらは、インビトロおよびインビボにおいて不安定であるからである。したがってそれらは、好ましくない薬物動態を示す。ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドをより強力にするためには、したがって、リン酸骨格をホスホロチオエートで修飾することによって、オリゴマーを安定化させることが通常は必要である。
【００１９】
免疫応答を刺激するためのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドの使用に関する第２の制限は、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと接触したすべてのＡＰＣおよびＢ細胞が刺激されるために、それらが特異性を欠いていることである。したがって、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドの有効性および特異性は、それらを安定化させること、あるいは関連抗原も提示する細胞への細胞の活性化を制限するような方法で、それらをパッケージ化することによって向上させることができる。
【００２０】
さらに、免疫賦活ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドは、マウスにおいて巨脾症およびリンパ節症を伴う髄外造血を引き起こすことによって、強い副作用を誘導する（Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）、１６２：２３６８〜７４および実施例１８）。
【００２１】
ＶＬＰは、ＭＨＣクラスＩ分子上で効率よく掲示されることが示されてきている。なぜなら、おそらくＶＬＰは、マクロピノサイトーシスによって取り込まれた後に、効率よく加工され、ＭＨＣクラスＩ上でクロス・プライミングされるからである。クロス・プライミングの機構は今日まで明らかではないが、ＴＡＰ依存性およびＴＡＰ非依存性の経路が提案されてきている。
【００２２】
近年ワクチン戦略において著しい進展がなされてきているが、既存の戦略の改善に関する必要性が依然として存在する。特に、ＡＰＣおよび他の細胞の全身活性化がない状態で元の病原体と同等に効率よく、強力なＣＴＬ免疫応答および抗病原性防御を助長する、新しい改良型のワクチンの開発の分野における必要性が存在する。
【発明の開示】
【００２３】
本発明は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を、ＶＬＰにパッケージ化し、それらをさらに免疫原性にすることができるという驚くべき発見に基づくものである。予想外に、ＶＬＰ中に存在する核酸およびオリゴヌクレオチドはそれぞれ、具体的には免疫賦活物質およびＣｐＧモチーフを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドでそれぞれ置換することができる。驚くことに、これらのパッケージ化された免疫賦活物質、特に免疫賦活性核酸、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、先天性免疫の広範囲の活性化なしで、免疫賦活能力を保持していた。本発明のＶＬＰおよび免疫賦活物質を含む組成物、特にＣｐＧ−ＶＬＰは、それらのＣｐＧを含まない相当物よりも著しく免疫原性があり、高いＢおよびＴ細胞応答を誘導する。ＶＬＰに場合によっては連結、融合、又は他の方式で付着した抗原に対する免疫応答は、ＶＬＰそのものに対する免疫応答と同様に高められる。ＶＬＰおよび抗原に対するＴ細胞応答は、Ｔｈ１型を特に対象とする。したがって、ＣｐＧ担持ＶＬＰに付着した抗原は、アレルギー、腫瘍および他の自己分子、および慢性のウィルス性疾患に対する予防的又は治療的ワクチン接種用の、理想的なワクチンである可能性がある。
【００２４】
第１の実施形態では、本発明は、動物の免疫応答を高めるための組成物であって、ウィルス様粒子および免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み、その物質、核酸又はオリゴヌクレオチドが、ウィルス様粒子に連結、融合、又は他の方式で付着、あるいは封入している、すなわち結合している、組成物を提供する。他の実施形態では、本発明の組成物は、ウィルス様粒子に結合した抗原をさらに含む。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、免疫賦活性核酸、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを、リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体によって安定化させる。他の好ましい実施形態では、免疫賦活性核酸、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを、ＶＬＰ中でのＲＮＡの消化、および選択したＣｐＧを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドの同時の添加によって、ＶＬＰ中にパッケージ化する。同等に好ましい実施形態では、ＣｐＧの存在下でＶＬＰを再構築する前に、ＶＬＰを分解することができる。
【００２６】
他の好ましい実施形態では、免疫賦活性核酸はＣｐＧモチーフを含まず、免疫賦活活性を決して示さない。このような核酸は、ＷＯ０１／２２９７２中に記載されている。その中に記載されたすべての配列は、参照によりここに組み込まれている。
【００２７】
他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、組み換えウィルス様粒子である。ウィルス様粒子がリポタンパク質のエンベロープを含まないことも好ましい。組み換えウィルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウィルス、ＢＫウィルス又は他のヒトポリオーマ・ウィルス、はしかウィルス、シンビス・ウィルス、ロタ・ウィルス、口蹄疫ウィルス、レトロ・ウィルス、ノーウォーク・ウィルス、又はヒト・パピローマ・ウィルス、ＲＮＡファージ、Ｑβ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージおよびＴｙの組み換えタンパク質を含むか、あるいはこれらからなることが好ましい。特定の実施形態では、ウィルス様粒子は、１つ又は複数の異なるＢ型肝炎ウィルスのコア（キャプシド）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）を含むか、あるいはこれらからなることが好ましい。
【００２８】
他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、又はその断片を含む。好ましいＲＮＡファージは、ＱβＲ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージである。
【００２９】
他の実施形態では、抗原は組み換え抗原である。他の実施形態では、抗原を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；および（５）家畜又はペットの免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチドからなる群から選択することができる。
【００３０】
他の実施形態では、抗原を（１）癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（２）感染病に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（３）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（４）自己抗原に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；（５）家畜又はペットの免疫応答を誘導するように適合させた有機分子；および（６）薬剤、ホルモン又は毒性化合物に対する免疫応答を誘導するように適合させた有機分子からなる群から選択することができる。
【００３１】
特定の実施形態では、抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含むか、あるいはこれからなる。関連実施形態では、ウィルス様粒子はＢ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質を含み、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープは、前記Ｂ型肝炎ウィルスのコア・タンパク質のＣ末端に融合している。一実施形態では、それらはロイシン連結配列によって融合している。
【００３２】
本発明の他の実施形態では、ヒト又は他の動物種の免疫応答を高めるための方法であって、ウィルス様粒子および免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み、組成物を動物に導入することを含む方法を提供する。その物質、好ましくは核酸、およびさらに好ましくはオリゴヌクレオチドが、ウィルス様粒子に結び付いている（すなわち結合、付着、あるいは封入）。他の実施形態では、本発明の組成物は、ウィルス様粒子に結合した抗原をさらに含む。
【００３３】
本発明の他の実施形態では、組成物を、動物の皮下、筋肉内、鼻腔内、皮内、静脈内、あるいはリンパ節に直接に導入する。同様に好ましい実施形態では、免疫増強組成物を、それに対するワクチン接種が望まれる腫瘍又は局所のウィルスの病原巣の近くに、局所的に施す。
【００３４】
本発明の好ましい態様では、免疫応答はＴ細胞応答であり、抗原に対するＴ細胞応答が高まる。特定の実施形態では、Ｔ細胞応答は細胞傷害性Ｔ細胞応答であり、抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答が高まる。
【００３５】
本発明は、免疫学的に有効量の本発明の免疫増強組成物、および薬剤として許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤を含むワクチンにも関する。好ましい実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つのアジュバント、不完全フロイント・アジュバントなどをさらに含む。本発明は、動物を免疫化及び／又は治療する方法であって、免疫学的に有効量の開示するワクチンを動物に投与することを含む方法も提供する。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、免疫賦活物質含有ＶＬＰ、好ましくは免疫賦活性核酸含有ＶＬＰ、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＶＬＰを、ＶＬＰそのものに対する、あるいは結合、融合、あるいはそれ以外の場合はＶＬＰに付着した抗原に対する、動物又はヒトのワクチン接種用に使用する。改変型ＶＬＰを使用して、たとえば、それぞれ腫瘍、ウィルス性疾患、自己分子および自己抗原、あるいは非ペプチド小分子に対してワクチン接種することができる。ワクチン接種は、予防又は治療目的、あるいはその両方であってよい。さらに、改変型ＶＬＰを使用して、アレルギーに対するワクチン接種をして、免疫偏向を誘導することができる。
【００３７】
大抵の場合、所望の免疫応答は、免疫賦活物質含有ＶＬＰ、好ましくは免疫賦活性核酸含有ＶＬＰ、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＶＬＰに、連結、融合、又は他の方式で付着した、抗原を対象とするものである。抗原は、ペプチド、タンパク質、ドメイン、炭水化物又は小分子、たとえばステロイド・ホルモン又は薬剤など、ニコチンなどであってよい。いくつかの条件下では、所望の免疫応答は、ＶＬＰそのものを対象とすることができる。この後者の適用例は、それに対するワクチン接種が望まれるウィルスに、ＶＬＰが由来する場合に使用される。
【００３８】
注射の経路は皮下又は筋肉内であることが好ましいが、ＣｐＧ含有ＶＬＰを皮内、鼻腔内、静脈内、あるいはリンパ節に直接施用することも可能であると思われる。同様に好ましい実施形態では、ＣｐＧ含有抗原結合又はそれを含まないＶＬＰを、それに対するワクチン接種が望まれる腫瘍又は局所のウィルスの病原巣の近くに、局所的に施す。
【００３９】
前述の一般的記載と以下の詳細な記載の両方は、単なる例示的かつ説明的なものであり、特許請求する本発明のさらなる説明を与えることを目的とすることを理解されたい。
【発明の詳細な説明】
【００４０】
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと、同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同等あるいは均等である任意の方法および物質を、本発明を実施又は試験する際に使用することができ、好ましい方法および物質は、本明細書で以下に記載する。
【００４１】
１．定義
アミノ酸リンカー：本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」、又は本明細書中で単に「リンカー」と呼ばれるものは、抗原又は抗原決定基を第２の付着部位と会合させるか、あるいは、必ずしもではないが典型的には、１つのアミノ酸残基として、より好ましくはシステイン残基として、既に第２の付着部位からなっているか、あるいはそれを含むことがより好ましい。しかしながら、本明細書で使用する「アミノ酸リンカー」という用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施形態である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを、示すことを目的とするものではない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。しかしながら、スルフヒドリル基又はシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも、本発明内に含まれる。このような分子は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、又はヘテロアリール部分を含むことが好ましい。しかしながら、アミノ酸リンカーに加えて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリール、又はヘテロアリール部分を好ましくは含み、任意のアミノ酸を欠いているリンカーも、本発明内に含まれるものとする。抗原又は抗原決定基、又は場合によっては第２の付着部位と、アミノ酸リンカーの間の会合は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。
【００４２】
動物：本明細書で使用するように、「動物」という用語は、たとえばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、哺乳動物、鳥類、爬虫類、魚類、昆虫、および蛛形網を含むことを意味する。
【００４３】
抗体：本明細書で使用するように、「抗体」という用語は、エピトープ又は抗原決定基と結合することができる分子を指す。この用語は、単鎖抗体を含めた、すべての抗体およびそれらの抗原結合断片を含むことを意味する。抗体はヒト抗原結合抗体断片であることが最も好ましく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬ又はＶＨドメインを含む断片だけには限られないが、これらを含む。抗体は、鳥類および哺乳動物を含めた、任意の動物起源のものであってよい。抗体は、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリであることが好ましい。本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンのライブラリーから、あるいは、たとえばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他による米国特許第５，９３９，５９８号中に記載されたような、１つ又は複数の免疫グロブリンの遺伝子が導入され、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
【００４４】
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって結合することができる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系によって認識することができ、かつ／あるいは、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができ、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に与えられることを必要とする可能性がある。抗原は、１つ又は複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。前述の特異的反応は、抗原は、典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことが好ましいことが、示されることを意味する。
【００４５】
本明細書で使用する「微生物抗原」という用語は、微生物の抗原であり、感染ウィルス、感染細菌、寄生虫および感染真菌だけには限られないが、これらを含む。このような抗原には、無傷微生物、および天然単離体およびその断片、さらに、天然微生物抗原と同一であるか類似しており、その微生物に特異的な免疫応答を誘導する、合成又は組み換え化合物がある。化合物は、それが免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を誘導する場合、天然微生物抗原と類似している。このような抗原は当分野では日常的に使用され、当業者によく知られている。
【００４６】
ヒト中で発見されてきている感染ウィルスの例には、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ヒト免疫不全ウィルス、ＨＩＶ−１など（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）；および他の単離体、ＨＩＶ−ＬＰなど）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ポリオ・ウィルス、Ａ型肝炎ウィルス；エンテロ・ウィルス、ヒト・コクサッキー・ウィルス、ライノ・ウィルス、エコー・ウィルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、胃腸炎を引き起こす菌株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ウマ脳炎ウィルス、風疹ウィルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、デング・ウィルス、脳炎ウィルス、黄熱病ウィルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、コロナ・ウィルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ（たとえば、水泡性口炎ウィルス、狂犬病ウィルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、エボラ・ウィルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、パラインフルエンザ・ウィルス、おたふくかぜウィルス、はしかウィルス、呼吸器多様体ウィルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、インフルエンザ・ウィルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、ハンタ・ウィルス、ブンガ・ウィルス、フレボ・ウィルスおよびナイロ・ウィルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウィルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、レオ・ウィルス、オルビ・ウィルス、およびロタ・ウィルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウィルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パラボ・ウィルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマ・ウィルス、ポリオーマ・ウィルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分はアデノ・ウィルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペス・ウィルス（ＨＳＶ）１および２、帯状疱疹ウィルス、サイトメガロ・ウィルス（ＣＭＶ）、ヘルペス・ウィルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（天然痘ウィルス、ワクシニア・ウィルス、ポックス・ウィルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（たとえば、アフリカブタ熱ウィルス）；および未分類ウィルス（たとえば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウィルスの欠陥付随体であると考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部に伝播、；クラス２＝非経口的に伝播（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウィルス、およびアストロ・ウィルス）があるが、これらだけには限られない。
【００４７】
グラム陰性菌およびグラム陽性菌は、脊椎動物中で抗原として働く。このようなグラム陽性菌には、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種があるが、これらだけには限られない。グラム陰性菌には、大腸菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種があるが、これらだけには限られない。感染細菌の具体例には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ．（たとえば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｒａｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＡ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＢ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉおよびＣｈｌａｍｙｄｉａがあるが、これらだけには限らない。
【００４８】
感染真菌の例には、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓがある。他の真菌生物（すなわち、原生生物）には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、たとえばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘなど、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉおよびＳｈｉｓｔｏｓｏｍａがある。
【００４９】
他の医学的に関連がある微生物は、文献中に広く記載されており、たとえばその全容が参照により本明細書に組み込まれている、Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｔｈｏｍａｓ、「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３を参照のこと。
【００５０】
本発明の組成物および方法は、癌抗原に対する抗原特異的な免疫応答を刺激することによって、癌を治療するためにも有用である。本明細書で使用する「腫瘍抗原」は、腫瘍又は癌と関係があり免疫応答を誘発することができる、ペプチドなどの化合物である。特に、ＭＨＣ分子の概念で提示されるとき、化合物は免疫応答を誘発することができる。腫瘍抗原は、たとえばＣｏｈｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５４：１０５５（１９９４）中に記載されたのと同様に、癌細胞の粗製抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、組み換え技術によって、あるいは知られている抗原の新規合成によって、癌細胞から作製することができる。腫瘍抗原は、腫瘍又は癌ポリペプチド全体であるかあるいはその抗原部分である、抗原を含む。このような抗原は、組み換えによって、あるいは当分野で知られている任意の他の手段によって、単離又は作製することができる。癌又は腫瘍には、胆管癌、脳癌、乳癌、子宮頚癌、絨毛上皮腫、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮内新生物、リンパ腫、肝臓癌、肺癌、（たとえば、小細胞および非小細胞）；メラノーマ、神経芽腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、および腎臓癌、および他の癌腫および肉腫があるが、これらだけには限られない。
【００５１】
抗原決定基：本明細書で使用するように、「抗原決定基」という用語は、Ｂ及び／又はＴリンパ球によって特異的に認識される抗原の、その一部分を指すことを意味する。Ｂリンパ球は抗体生成により外来性の抗原決定基に応答し、一方Ｔリンパ球は細胞性免疫の仲介物質である。したがって、抗原決定基又はエピトープは、抗体によって、あるいはＭＨＣの概念ではＴ細胞受容体によって認識される抗原の、その部分である。
【００５２】
抗原掲示細胞：本明細書で使用するように、「抗原提示細胞」という用語は、免疫賦活能力を有する異種群の白血球、又は骨髄由来細胞を指すことを意味する。たとえば、これらの細胞は、Ｔ細胞によって認識することができるＭＨＣ分子と結合するペプチドを、生成することができる。この用語は、用語「補助細胞」と同義であり、たとえばランゲルハンス細胞、指状突起細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞を含む。いくつかの条件下では、上皮細胞、内皮細胞、および他の非骨髄由来細胞も、抗原提示細胞として働くことができる。
【００５３】
会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）：本明細書で使用するように、「会合」という用語は、第１および第２の付着部位に適用すると、第１の付着部位と第２の付着部位の結合を指し、これは少なくとも１つの非ペプチド結合によるものであることが好ましい。会合の性質は共有性、イオン性、疎水性、極性、又はこれらの任意の組合せであってよく、会合の性質は共有性であることが好ましい。
【００５４】
第１の付着部位：本明細書で使用するように、「第１の付着部位」という用語は、抗原又は抗原決定基上に位置する第２の付着部位が会合することができる、非天然又は天然起源の要素を指す。第１の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリ核酸、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はこれらの組合せ、又は化学反応性があるこれらの群であってよい。第１の付着部位は、典型的かつ好ましくは、ウィルス様粒子の表面上に位置する。多数の第１の付着部位が、典型的には反復形状で、ウィルス様粒子の表面上に存在する。
【００５５】
第２の付着部位：本明細書で使用するように、「第２の付着部位」という用語は、ウィルス様粒子の表面上に位置する第１の付着部位が会合することができる、抗原又は抗原決定基と関係がある要素を指す。第２の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レンチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はこれらの組合せ、又は化学反応性があるこれらの群であってよい。少なくとも１つの第２の付着部位が、抗原又は抗原決定基上に存在する。したがって、少なくとも１つの第２の付着部位を有する「抗原又は抗原決定基」という用語は、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基および第２の付着部位を含む、抗原又は抗原構築体を指す。しかしながら、特に、非天然起源である、すなわち抗原又は抗原決定基中に本来存在しない第２の付着部位に関しては、これらの抗原又は抗原構築体は、「アミノ酸リンカー」を含む。
【００５６】
結合（ｂｏｕｎｄ）：本明細書で使用するように、「結合」という用語は、共有、たとえば化学的結合による、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合を指す。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。この用語は、物質の封入、又は部分的封入も含む。「結合」という用語は、「連結（ｃｏｕｐｌｅｄ）」、「融合（ｆｕｓｅｄ）」、「封入」、「パッケージ化」、および「付着（ａｔｔａｃｈｅｄ）」などより広義であり、これらを含む。たとえば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を、実際の結合の存在なしで、共有的でも非共有的でもなく、ＶＬＰによって封入することができる。
【００５７】
コート・タンパク質：本明細書で使用するように、「コート・タンパク質」という用語は、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのキャプシド集合体内に取り込むことができる、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのタンパク質を指す。しかしながら、ＲＮＡファージのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物を指すときは、用語「ＣＰ」を使用する。たとえば、ＲＮＡファージＱβのコート・タンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物は「ＱβＣＰ」と呼び、一方でバクテリオファージＱβの「コート・タンパク質」は、「ＱβＣＰ」およびＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのキャプシドは、主にＱβＣＰ、および少ない含量のＡ１タンパク質で構成される。同様に、ＶＬＰＱβのコート・タンパク質は、主にＱβＣＰ、および少ない含量のＡ１タンパク質を含む。
【００５８】
連結：本明細書で使用するように、「連結」という用語は、共有結合による、あるいは強力な非共有的相互作用による付着を指す。生物学的に活性がある物質を連結させるために、当業者により通常使用されている任意の方法を、本発明において使用することができる。
【００５９】
融合：本明細書で使用するように、「融合」という用語は、アミノ酸配列のコードヌクレオチド配列をイン・フレームで組み合わせることによる、１本のポリペプチド鎖中の異なる起源のアミノ酸配列の組合せを指す。「融合」という用語は、内部融合、すなわちポリペプチド鎖中への異なる起源の配列の挿入、さらに鎖の両端の一端への融合を明確に含む。
【００６０】
ＣｐＧ：本明細書で使用するように、「ＣｐＧ」という用語は、非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチド配列（たとえば、シトシン次にグアノシンを含み、リン酸結合によって連結している「ＣｐＧＤＮＡ」又はＤＮＡ）を含み、脊椎動物細胞によるサイトカイン発現を刺激する／活性化する、たとえばそれに対する促進効果を有する、あるいはそれを誘導するか増大させる、オリゴヌクレオチドを指す。たとえばＣｐＧは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および抗原提示細胞、たとえば、単球、樹状細胞およびマクロファージ、およびＴ細胞などの活性化において、有用であることができる。ＣｐＧは、ヌクレオチド類似体、たとえば、ホスホロチオエステル結合を含む類似体などを含むことができ、二本鎖又は一本鎖であってよい。一般に、二本鎖分子はインビボにおいてより安定性があり、一方で一本鎖分子は高い免疫活性を有する。
【００６１】
エピトープ：本明細書で使用するように、「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒト中で、抗原又は免疫活性を有するポリペプチドの一部分を指す。本明細書で使用する「免疫エピトープ」は、当分野で知られている任意の方法によって決定される（たとえば、Ｇｅｙｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３９９８〜４００２（１９８３）を参照のこと）、動物中で抗体応答を誘発するかあるいはＴ細胞応答を誘導する、ポリペプチドの一部分として定義する。本明細書で使用する「抗原エピトープ」は、当分野でよく知られている任意の方法によって決定される、タンパク質の一部分として定義し、抗体はその抗原に免疫特異的に結合することができる。免疫特異的結合は非特異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性は必ずしも除外しない。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原エピトープはＴ細胞エピトープであってもよく、この場合抗原エピトープを、ＭＨＣ分子の概念でＴ細胞受容体によって免疫特異的に結合させることができる。
【００６２】
エピトープは、空間構造中に３個のアミノ酸を含むことができ、これはエピトープに特有である。一般にエピトープは、少なくとも約５個のこのようなアミノ酸からなり、少なくとも約８〜１０個のこのようなアミノ酸からなることがより普通である。エピトープが有機分子である場合、それはニトロフェニルと同じくらい小さくてよい。
【００６３】
免疫応答：本明細書で使用するように、「免疫応答」という用語は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化又は増殖をもたらす、体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を指す。しかしながら、いくつかの場合、免疫応答は強度が低い可能性があり、本発明の少なくとも１つの物質を使用するときのみ、検出可能となる可能性がある。「免疫原」は、免疫系の１つ又は複数の機能が高まり、免疫原物質を対象とするように、生物の免疫系を刺激するために使用される物質を指す。「免疫原ポリペプチド」は、アジュバントの存在下又は不在下で、単独あるいは担体と結び付いて、細胞及び／又は体液性免疫応答を誘導するポリペプチドである。
【００６４】
免疫化：本明細書で使用するように、「免疫化する」又は「免疫化」という用語、又は関連用語は、標的抗原又はエピトープに対する、十分な免疫応答（抗体又は細胞免疫、エフェクターＣＴＬなどを含む）を備えるための能力を与えることを指す。これらの用語は、完全な免疫が生み出されることは必要としないが、基底状態より大幅に免疫応答の増強が生じることを必要とする。たとえば哺乳動物は、本発明の方法の適用後に、標的抗原に対する細胞及び／又は体液性免疫応答が起こる場合、標的抗原に対して免疫化することができると考えられる。
【００６５】
免疫賦活性核酸：本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸という用語は、免疫応答を誘導する、かつ／あるいは高めることができる核酸を指す。本明細書で使用するように、免疫賦活性核酸は、リボ核酸、特にデオキシリボ核酸を含む。免疫賦活性核酸は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、たとえばＣが非メチル化状態であるＣＧジヌクレオチドを含むことが好ましい。ＣＧジヌクレオチドはパリンドローム配列の一部であってよく、あるいは非パリンドローム配列中に含まれてよい。前に記載したＣｐＧモチーフを含まない免疫賦活性核酸は、たとえばＣｐＧジヌクレオチドを欠いた核酸、ならびにメチル化ＣＧジヌクレオチドを有するＣＧモチーフを含む核酸を包含する。本明細書で使用するように、「免疫賦活性核酸」という用語は、４−ブロモ−シトシンなどの修飾体を含む核酸も指すはずである。
【００６６】
免疫賦活物質：本明細書で使用するように、「免疫賦活物質」という用語は、免疫応答を誘導する、かつ／あるいは高めることができる物質を指す。本明細書で使用するように、免疫賦活物質は、ｔｏｌｌ様レセプター（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）活性化物質およびサイトカイン分泌誘導物質だけには限られないが、これらを含む。Ｔｏｌｌ様レセプター活性化物質は、免疫賦活性核酸、ペプチドグリカン、リポ多糖、リポテイコ酸、イミダゾキノリン化合物、フラジェリン、リポタンパク質、および免疫賦活有機分子、たとえばタクソールなどだけには限られないが、これらを含む。
【００６７】
天然起源：本明細書で使用するように、「天然起源」という用語は、その全体又は一部分が合成ではなく、自然に存在するか生成することを意味する。
【００６８】
非天然：本明細書で使用するように、この用語は一般に自然からのものではないことを意味し、この用語は人間の手からのものであることを意味する。
【００６９】
非天然起源：本明細書で使用するように、「非天然起源」という用語は、一般に合成であり自然からのものではないことを意味し、より詳細には、この用語は人間の手からのものであることを意味する。
【００７０】
整然とした繰り返し抗原又は抗原決定基配列：本明細書で使用するように、「整然とした繰り返し抗原又は抗原決定基配列」という用語は、典型的かつ好ましくは、それぞれコア粒子およびウィルス様粒子に関する、抗原又は抗原決定基の均一な空間配置によって特徴付けられる、繰り返し型の抗原又は抗原決定基を一般に指す。本発明の一実施形態では、繰り返し型はゲノムの型であってよい。適切である整然とした繰り返し抗原又は抗原決定基配列の、典型的かつ好ましい例は、好ましくは０．５〜３０ナノメートル、より好ましくは５〜１５ナノメートルの空間で、厳密に繰り返される準結晶状態の抗原又は抗原決定基を有するものである。
【００７１】
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用するように、「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」という用語は、２個以上のヌクレオチド、一般に少なくとも約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約６〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約１００個のヌクレオチドを含む核酸配列を指す。「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」という用語は、１００超〜約２０００個のヌクレオチド、好ましくは１００超〜約１０００個のヌクレオチド、より好ましくは１００超〜約５００個のヌクレオチドを含む核酸配列も指す。「オリゴヌクレオチド」は一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドも指し、これは非修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいは修飾ＲＮＡ又はＤＮＡであってよい。「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、又はより典型的には、二本鎖又は一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を、非制限的に含む。さらに「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡを含む三本鎖領域を指す。さらにオリゴヌクレオチドは、合成、ゲノム又は組み換え、たとえばλ−ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、人工細菌染色体、酵母菌人工染色体、および糸状ファージ、たとえばＭ１３などであってよい。
【００７２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、１つ又は複数の修飾体を含むＤＮＡ又はＲＮＡ、および安定性又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。たとえば、適切なヌクレオチド修飾体／類似体には、ペプチド核酸、イノシン、トリチル化塩基、ホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエート、５−ニトロインドールデオキシリボフラノシル、５−メチルデオキシシトシン、および５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシデオキシチミジンがある。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡになされてきており、したがって、「オリゴヌクレオチド」は、化学的に、酵素によって、あるいは代謝によって修飾された形のポリヌクレオチド、自然界に典型的に見られるもの、およびウィルスおよび細胞に特有の化学形のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。他のヌクレオチド類似体／修飾体は、当業者に明らかであろう。
【００７３】
パッケージ化：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰと関係がある免疫賦活物質、特に免疫賦活性核酸の状態を指す。本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的連結による、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであってよい結合を含む。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。この用語は、物質の封入、又は部分的封入も含む。「パッケージ化」という用語は、「連結」、「封入」および「付着」などの用語を含む。たとえば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドなどの免疫賦活物質を、実際の結合の存在なしで、共有的でも非共有的でもなく、ＶＬＰによって封入することができる。好ましい実施形態では、特に、免疫賦活性核酸が免疫賦活物質である場合、「パッケージ化」という用語は、パッケージ化された状態の核酸が、ＤＮＡｓｅ又はＲＮＡｓｅによる加水分解に曝されないことを示す。好ましい実施形態では、免疫賦活性核酸は、ＶＬＰキャプシド中に、最も好ましくは非共有方式でパッケージ化されている。
【００７４】
本発明の組成物は、場合によっては薬剤として許容可能な担体と組み合わせることができる。本明細書で使用するように、「薬剤として許容可能な担体」という用語は、ヒト又は他の動物に投与するのに適した、１つ又は複数の適合性のある固体又は液体充填剤、希釈剤又は被包性物質を意味する。「担体」という用語は、活性成分と組み合わせて施用を容易にする、有機又は無機成分、天然又は合成物を示す。
【００７５】
有機分子：本明細書で使用するように、「有機分子」という用語は、天然又は合成起源の任意の化学的実体を指す。特に、本明細書で使用するように、「有機分子」という用語は、たとえば、天然又は合成起源の、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、多糖、リポ多糖、ステロイド、アルカノイド、テルペン、および脂肪酸の群のメンバーである、任意の分子を含む。特に、「有機分子」という用語は、乱用される薬物中に含まれる、ニコチン、コカイン、ヘロイン、又は他の薬物として活性がある分子などの分子を含む。一般に有機分子は、化学官能基を含むか、あるいは含むように改変されており、本発明に従った、有機分子のウィルス様粒子中への連結、結合、又は他の結合法が可能となる。
【００７６】
ポリペプチド：本明細書で使用するように、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結したモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの生成物を指すわけではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義中に含まれる。この用語は、たとえば、グリコシル化、アシル化、リン酸化など、発現後に修飾されたポリペプチドも指すことを目的とする。組み換え体又は誘導ポリペプチドは、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるわけではない。それらは、化学合成を含めた任意の方法で生成させることができる。
【００７７】
免疫応答を「高める」物質は、その物質を加えることによって、その物質を加えずに測定した同じ免疫応答と比較して、より高まった、あるいは増大した、あるいは任意の方向に偏向した免疫応答が観察される物質を指す。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶菌活性は、たとえばこの物質ありおよびなしで５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、測定することができる。この物質なしのＣＴＬ溶菌活性と比較して、ＣＴＬ溶菌活性が高まる物質の量が、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに十分量であると言える。好ましい実施形態では、免疫応答は、少なくとも約２倍、より好ましくは約３倍以上高まる。分泌するサイトカインの量も、変わる可能性がある。
【００７８】
有効量：本明細書で使用するように、「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要あるいは十分量を指す。組成物の有効量は、この選択した結果を得る量であると思われ、このような量は当業者により慣例として決定することができると思われる。たとえば、免疫系不全を治療するのに有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への暴露により抗原特異的な免疫応答の進行をもたらすのに必要な量であると思われる。この用語は、「十分量」とも同義である。
【００７９】
任意の個々の適用例に関する有効量は、治療する疾患又は状態、投与される個々の組成物、被験体の大きさ、及び／又は疾患又は状態の重度などの要因に応じて変わる可能性がある。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の個々の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【００８０】
自己抗原：本明細書で使用するように、「自己抗原」という用語は、宿主のＤＮＡによってコードされたタンパク質を指し、宿主のＤＮＡによってコードされたタンパク質又はＲＮＡによって生成される生成物を、自己として定義する。さらに、２つ又は数個の分子の組合せから生じるタンパク質、又は自己分子の画分であるタンパク質、および前に定義した２つの自己分子と高い相同性（＞９５％、好ましくは＞９７％、より好ましくは＞９９％）を有するタンパク質も、自己とみなすことができる。本発明の他の好ましい実施形態では、抗原は自己抗原である。本発明に関して有用な、自己抗原の非常に好ましい実施形態は、ＷＯ  ０２／０５６９０５に記載されており、その開示は参照によりその全容がここに組み込まれている。
【００８１】
治療：本明細書で使用するように、「治療」、「治療する」、「治療した」、又は「治療している」という用語は、予防及び／又は療法を指す。感染病に関して使用するとき、たとえば、この用語は、病原体による感染に対する被験者の耐性を増大させる、あるいは言い換えると、被験者が病原体によって感染するか、あるいは感染に起因する病気の徴候を示す可能性を低下させる予防的治療、および感染と戦うため、たとえば感染を低下させるか除外するため、あるいは感染が悪化するのを防ぐための、被験者が感染した後の治療を指す。
【００８２】
ワクチン：本明細書で使用するように、「ワクチン」という用語は、本発明の組成物を含み、動物に投与することができる形である調合物を指す。典型的にはワクチンは、通常の生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含み、本発明の組成物がその中に懸濁又は溶解している。この形で、本発明の組成物を都合よく使用して、疾患を予防、改善、あるいはそれ以外の場合は治療することができる。宿主に導入することによって、ワクチンは、抗体の生成、サイトカイン及び／又は他の細胞応答だけには限られないが、これらを含めた免疫応答を誘発することができる。
【００８３】
場合によっては、本発明のワクチンは、本発明の化合物に対して少量又は多量で存在することができる、アジュバントをさらに含む。本明細書で使用するように、「アジュバント」という用語は、免疫応答の非特異的刺激物質、又は宿主中でデポー作用を生み出すことができる物質を指し、これを本発明のワクチンと組み合わせると、より一層免疫応答の増強が与えられる。さまざまなアジュバントを使用することができる。その例には、不完全フロイント・アジュバント、水酸化アルミニウム、および改変型ムラミルジペプチドがある。本明細書で使用するように、「アジュバント」という用語は、典型的には免疫応答の特異的刺激物質も指し、これを本発明のワクチンと組み合わせると、より一層高く典型的には特異的な免疫応答が与えられる。その例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮαだけには限られないが、これらがある。他の例は、当業者の知識の範囲内である。
【００８４】
ウィルス様粒子：本明細書で使用するように、「ウィルス様粒子」という用語は、ウィルス粒子に似ているが、病原性であることは証明されていない構造を指す。典型的には、本発明のウィルス様粒子は、ウィルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を保有していない。一般に、ウィルス様粒子はウィルス・ゲノムを欠いており、したがって非感染性である。さらにウィルス様粒子は、異種の発現によって多量に生成できることが多く、容易に精製することができる。いくつかのウィルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。示したように、本発明のウィルス様粒子は、非反復性かつ非感染性である。なぜならそれは、ウィルス・ゲノムのすべて又は一部、特にウィルス・ゲノムの反復性かつ感染性要素を欠いているからである。本発明のウィルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含むことができる。本発明のウィルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、対応するウィルス、バクテリオファージ、又はＲＮＡファージのウィルス・キャプシドなどの、ウィルス・キャプシドである。本明細書で互換的に使用する、用語「ウィルス・キャプシド」又は「キャプシド」は、ウィルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。典型的かつ好ましくは、ウィルス・タンパク質のサブユニットは、固有の反復編成である構造を有する、ウィルス・キャプシドおよびキャプシド中にそれぞれ集合し、前記構造は典型的には球状又は管状である。たとえば、ＲＮＡファージ又はＨＢｃＡｇのキャプシドは、正二十面体様対称性の球状形を有する。本明細書で使用するように、用語「キャプシド様構造」は、前に定義した意味でキャプシドの形態に似ているが十分な程度の状態および反復性を保ちながらも、典型的な対称集合体からは逸脱する、ウィルス・タンパク質のサブユニットから構成されるマクロ分子の集合体を指す。
【００８５】
バクテリオファージのウィルス様粒子：本明細書で使用するように、用語「バクテリオファージのウィルス様粒子」は、バクテリオファージの構造に似ており、非反復性かつ非感染性であり、バクテリオファージの複製機構をコードする１つ又は複数の遺伝子を少なくとも欠いており、典型的には宿主へのウィルスの付着又は侵入を担う、１つ又は複数のタンパク質をコードする１つ又は複数の遺伝子も欠いている、ウィルス様粒子を指す。しかしながらこの定義は、前述の１つ又は複数の遺伝子が依然として存在するが不活性であり、したがって非反復性かつ非感染性であるバクテリオファージのウィルス様粒子をもたらす、バクテリオファージのウィルス様粒子も含むはずである。
【００８６】
ＲＮＡファージ・コート・タンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージ・コート・タンパク質の１８０サブユニットの自己組織化体から形成され、場合によっては宿主のＲＮＡを含むキャプシド構造を、「ＲＮＡファージ・コート・タンパク質のＶＬＰ」と呼ぶ。１つの具体例は、Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰである。この特定の場合、Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰは、ＱβＣＰサブユニット（たとえば、抑制によって大きなＡ１タンパク質の任意の発現を邪魔するＴＡＡ停止コドンを含む、ＱβＣＰ遺伝子の発現によって生じる、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６）を参照のこと）のみから集合することができるか、あるいはキャプシド集合体中にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含むことができる。
【００８７】
本明細書で使用するように、用語「ウィルス粒子」は、ウィルスの形態を指す。いくつかのウィルス型では、ウィルスはタンパク質キャプシドに囲まれたゲノムを含み、他のウィルスは追加的な構造（たとえば、エンベロープ、尾部など）を有する。
【００８８】
非エンベロープ・ウィルス粒子は、ウィルス・ゲノムを囲み保護するタンパク質キャプシドでできている。エンベロープで覆われたウィルスは、ウィルスの遺伝物質を囲むキャプシド構造も有するが、さらに、キャプシドを囲む脂質二重層エンベロープを有する。本発明の好ましい実施形態では、ＶＬＰは、リポタンパク質エンベロープ又はリポタンパク質含有エンベロープを含まない。他の好ましい実施形態では、ＶＬＰはエンベロープをまったく含まない。
【００８９】
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、又は「１つ又は複数」を意味する。
【００９０】
当業者には明らかであろうが、本発明のいくつかの実施形態は、クローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製、原核および真核細胞などにおける組み換えタンパク質の発現などの、核酸組み換え技術の使用に関するものである。このような方法は当業者によく知られており、公開されている研究室の方法マニュアル中で都合よく発見することができる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、ｅｄｓ．、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．他、ｅｄｓ．、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７））。組織培養細胞系を用いた作業に関する、基礎的な研究室の技法（Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．，ｅｄ．、ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、（１９９８））、および抗体系の技術（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」３ｒｄ  ｅｄ．、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４））も文献中に十分に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれている。
【００９１】
２．免疫応答を高めるための組成物および方法
開示する本発明は、動物中の１つ又は複数の抗原に対する、免疫応答を高めるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、ウィルス様粒子および免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、さらに好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなり、免疫賦活物質、免疫賦活性核酸、又はオリゴヌクレオチドはウィルス様粒子と結合している。さらに好都合には、本発明によって実践者は、感染病、および慢性感染病の予防及び／又は治療、たとえば癌の予防及び／又は治療を含めた、さまざまな治療及び／又は予防防止目的の、このような組成物を構築することができる。
【００９２】
本出願に述べるウィルス様粒子は、ウィルス粒子に似ているが病原性ではない構造を指す。一般にウィルス様粒子は、ウィルス・ゲノムが欠けており、したがって非感染性である。さらにウィルス様粒子は、異種発現によって大量に生成することができ、容易に精製することができる。
【００９３】
好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、組み換えウィルス様粒子である。当業者は、組み換えＤＮＡ技術、および公に容易に入手可能であるウィルス・コード配列を使用して、ＶＬＰを生成することができる。たとえば、ウィルス・エンベロープ又はコア・タンパク質のコード配列を、ウィルス・プロモーター、およびコード配列と制御配列の機能的連結を可能にする配列の適切な修飾体の制御調節下において、市販のバキュロ・ウィルス・ベクターを使用してバキュロ・ウィルス発現ベクター中で発現させるために、設計することができる。ウィルス・エンベロープ又はコア・タンパク質のコード配列を、たとえば細菌発現ベクター中で発現させるために、設計することもできる。
【００９４】
ＶＬＰの例には、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｕｌｒｉｃｈ他、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．５０：１４１〜１８２（１９９８））、はしかウィルス（Ｗａｒｎｅｓ他、Ｇｅｎｅ１６０：１７３〜１７８（１９９５））、シンビス・ウィルス、ロタ・ウィルス（米国特許第５，０７１，６５１号および５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウィルス（Ｔｗｏｍｅｙ他、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１６０３〜１６１０、（１９９５））、ノーウォーク・ウィルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１５８０〜１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６〜１４６１（１９９１））のキャプシド・タンパク質、レトロ・ウィルスＧＡＧタンパク質（ＰＣＴ特許出願Ｎｏ．ＷＯ  ９６／３０５２３）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１、Ｂ型肝炎ウィルス（ＷＯ  ９２／１１２９１）、ヒト・パピローマ・ウィルス（ＷＯ  ９８／１５６３１）、ヒトポリオーマ・ウィルス（Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ  Ｋ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０（３）：３８１〜３８６（１９９９）；Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ  Ｋ．他、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．３ｒｄ  Ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ「Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｂｅｒｌｉｎ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２６〜２９（２００１））、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージ、および特にＱβ−ファージの表面タンパク質があるが、これらだけには限られない。
【００９５】
当業者には容易に理解されるように、本発明のＶＬＰは任意の特定の形に限られない。粒子は化学的に、あるいは生物学的プロセスによって合成することができ、天然又は非天然のものであってよい。たとえば、この型の実施形態は、ウィルス様粒子又はそれに由来する組み換え体を含む。より具体的な実施形態では、ＶＬＰは、ロタ・ウィルスの組み換えポリペプチド；ノーウォーク・ウィルスの組み換えポリペプチド；アルファ・ウィルスの組み換えポリペプチド；細菌の繊毛又は繊毛様構造を形成する組み換えタンパク質；口蹄疫ウィルスの組み換えポリペプチド；はしかウィルスの組み換えポリペプチド、シンビス・ウィルスの組み換えポリペプチド、レトロ・ウィルスの組み換えポリペプチド；Ｂ型肝炎ウィルス（たとえば、ＨＢｃＡｇ）の組み換えポリペプチド；タバコモザイク・ウィルスの組み換えポリペプチド；フロックハウス・ウィルスの組み換えポリペプチド；ヒト・パピローマ・ウィルスの組み換えポリペプチド；ポリオーマ・ウィルスの組み換えポリペプチド、および特にヒトポリオーマ・ウィルスの組み換えポリペプチド、および特にＢＫウィルスの組み換えポリペプチド；バクテリオファージの組み換えポリペプチド、ＲＮＡファージの組み換えポリペプチド；Ｔｙの組み換えポリペプチド；ｆｒ−ファージの組み換えポリペプチド、ＧＡ−ファージの組み換えポリペプチド、ＡＰ２０５−ファージの組み換えポリペプチド、および特にＱβ−ファージの組み換えポリペプチドを含むか、あるいはこれらからなっていてよい。ウィルス様粒子は、このようなポリペプチドの１つ又は複数の断片、およびこのようなポリペプチドの変異体をさらに含むか、あるいはこれらからなっていてよい。ポリペプチドの変異体は、たとえば、アミノ酸レベルで野生型の相当物と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を共有することができる。
【００９６】
好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、又はその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。ＲＮＡファージは、ａ）バクテリオファージＱβ；ｂ）バクテリオファージＲ１７；ｃ）バクテリオファージｆｒ；ｄ）バクテリオファージＧＡ；ｅ）バクテリオファージＳＰ；ｆ）バクテリオファージＭＳ２；ｇ）バクテリオファージＭ１１；ｈ）バクテリオファージＭＸ１；ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；ｋ）バクテリオファージｆ２；およびｌ）バクテリオファージＰＰ７からなる群から選択されることが好ましい。
【００９７】
本発明の他の実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの、あるいはＲＮＡバクテリオファージｆｒの組み換えタンパク質、又はその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【００９８】
本発明の他の好ましい実施形態では、組み換えタンパク質は、ＲＮＡファージのコート・タンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【００９９】
キャプシド又はＶＬＰを形成するＲＮＡファージのコート・タンパク質、又はキャプシド又はＶＬＰへの自己組織化と適合性があるバクテリオファージのコート・タンパク質の断片は、したがって本発明の他の好ましい実施形態である。バクテリオファージＱβコート・タンパク質は、たとえば大腸菌中で組み換えによって発現させることができる。さらに、このような発現によって、これらのタンパク質はキャプシドを自然に形成する。さらに、これらのキャプシドは、固有の繰り返し編成である構造を形成する。
【０１００】
本発明の組成物を調製するために使用することができる、バクテリオファージのコート・タンパク質の具体的な好ましい例には、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲ  Ｄａｔａｂａｓｅ、受託番号ＶＣＢＰＱβはＱβＣＰを指し、および配列番号１１；受託番号ＡＡＡ１６６６３はＱβＡ１タンパク質を指す）、バクテリオファージＲ１７（配列番号１２；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号１３；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号１５；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ３０３７４はＳＰＣＰを指し、および配列番号１６；受託番号ＳＰＡ１タンパク質を指す）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号１７；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号１８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号１９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号２０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号２１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号２２）などのＲＮＡバクテリオファージのコート・タンパク質がある。さらに、バクテリオファージＱβのＡ１タンパク質、又はそのＣ末端から１００、１５０又は１８０個ものアミノ酸を失っているＣ末端切断形を、Ｑβコート・タンパク質のキャプシド集合体中に取り込ませることができる。一般に、キャプシド集合体中のＱβＣＰに対するＱβのＡ１タンパク質の割合は、キャプシド形成を確実にするために制限される。
【０１０１】
Ｑβコート・タンパク質は、大腸菌中で発現すると、キャプシドに自己組織化することも発見されてきている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  ＴＭ．他、ＧＥＮＥ  １３７：１３３〜１３７（１９９３））。得られたキャプシド又はウィルス様粒子は、直径２５ｎｍ、およびＴ＝３、準対称である正二十面体形ファージ様キャプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造は解明されてきている。キャプシドはコート・タンパク質の１８０のコピーを含み、これらはジスルフィド結合によって共有ペンタマーおよびヘキサマー中で連結しており（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３〜５５５４（１９９６））、Ｑβコート・タンパク質のキャプシドの著しい安定性をもたらす。しかしながら、組み換えＱβコート・タンパク質から作製されたキャプシド又はＶＬＰは、キャプシド中でジスルフィド結合によって他のサブユニットに連結していないか、あるいは不完全に連結したサブユニットを含むことができる。したがって、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて組み換えＱβキャプシドを担持することによって、モノマーＱβコート・タンパク質に対応するバンド、およびＱβコート・タンパク質のヘキサマー又はペンタマーに対応するバンドが、目に見える状態になる。不完全にジスルフィド結合したサブユニットは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてジマー、トリマー、又はさらにテトラマーのバンドとして現れると思われる。Ｑβキャプシド・タンパク質は、有機溶媒および変性剤に対して、普通ではない耐性も示す。驚くことに我々は、３０％ものＤＭＳＯおよびアセトニトリル濃度、および１Ｍものグアニジニウム濃度が、キャプシドの安定性に影響を与えないことを観察している。Ｑβコート・タンパク質のキャプシドの高い安定性は、特に本発明に従って、哺乳動物およびヒトの免疫化およびワクチン接種においてそれを使用するために、有利な特徴である。
【０１０２】
大腸菌中で発現することによって、Ｓｔｏｌｌ，Ｅ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：９９０〜９９３（１９７７）中に記載されたのと同様に、Ｎ末端をエドマンの配列決定により我々が観察したように、Ｑβコート・タンパク質のＮ末端メチオニンは通常除去される。Ｎ末端メチオニンが除去されていないＱβコート・タンパク質から構成されるＶＬＰ、又はＮ末端メチオニンが切断されているか存在するＱβコート・タンパク質の混合物を含むＶＬＰも、本発明の範囲内のものである。
【０１０３】
他のＲＮＡファージのコート・タンパク質も、細菌宿主中で発現することによって自己組織化することが示されてきている（Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ，ＲＡ．他、Ｇｅｎｅ  ２３：２４５〜２５４（１９８３）、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａｙａ，ＴＭ．他、Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ２８７：４５２  ４５５（１９８６）、Ａｄｈｉｎ，ＭＲ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：２３８〜２４２（１９８９）、Ｎｉ，ＣＺ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５：２４８５〜２４９３（１９９６）、Ｐｒｉａｎｏ，Ｃ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２８３〜２９７（１９９５））。Ｑβファージ・キャプシドは、コート・タンパク質に加えて、いわゆる読み過ごしタンパク質Ａ１、および成熟タンパク質Ａ２を含む。Ａ１はＵＧＡ停止コドンにおける抑制によって生成し、３２９ａａの長さを有する。本発明で使用するファージＱβの組み換えコート・タンパク質のキャプシドは、Ａ２溶解タンパク質を欠いており、宿主からのＲＮＡを含む。ＲＮＡファージのコート・タンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ウィルスのライフ・サイクル中に翻訳抑制物質として作用するレプリカーゼ遺伝子の、リボソーム結合部位のステム・ループとする。相互作用の配列および構造要素は知られている（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ，ＧＷ．＆  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，ＯＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：７１〜７６（１９８９）；Ｌｉｍ  Ｆ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１８３９〜３１８４５（１９９６））。一般にステム・ループおよびＲＮＡは、中に含まれることが知られているウィルス集合体（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３〜５５５４（１９９６））。
【０１０４】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、又はその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、ＲＮＡファージの変異体コート・タンパク質、好ましくは前述したＲＮＡファージの変異体コート・タンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。他の好ましい実施形態では、ＲＮＡファージの変異体コート・タンパク質は、置換により少なくとも１個のリシン残基を除去することによって、あるいは置換により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されているか；あるいは、ＲＮＡファージの変異体コート・タンパク質は、少なくとも１個のリシン残基を欠失させることによって、あるいは、挿入により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。
【０１０５】
他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組み換えタンパク質、又はその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するコート・タンパク質、又は配列番号１０および配列番号１１又は配列番号１１の変異体のアミノ酸配列を有するコート・タンパク質の混合物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、Ｎ末端メチオニンは切断されていることが好ましい。
【０１０６】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、Ｑβの組み換えタンパク質、又はその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、変異体Ｑβコート・タンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。他の好ましい実施形態では、これらの変異体コート・タンパク質は、置換により少なくとも１個のリシン残基を除去することによって、あるいは置換により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。あるいは、これらの変異体コート・タンパク質は、少なくとも１個のリシン残基を欠失させることによって、あるいは、挿入により少なくとも１個のリシン残基を添加することによって改変されている。
【０１０７】
４個のリシン残基が、Ｑβコート・タンパク質のキャプシドの表面上で露出している。露出したリシン残基がアルギニンによって置換されている、Ｑβ変異体も、本発明用に使用することができる。したがって、以下のＱβコート・タンパク質変異体、および変異体Ｑβ  ＶＬＰを、本発明を実施する際に使用することができる。：「Ｑβ−２４０」（Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号２３）、「Ｑβ−２４３」（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号２４）、「Ｑβ−２５０」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓｌ３−Ａｒｇ；配列番号２５）、「Ｑβ−２５１」（配列番号２６）および「Ｑβ−２５９」（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）。したがって、本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、変異体Ｑβコート・タンパク質の組み換えタンパク質を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、ウィルス様粒子は、ａ）配列番号２３のアミノ酸配列；ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列；ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列；ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列；およびｅ）配列番号２７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。前に示したＱβコート・タンパク質、変異体Ｑβコート・タンパク質ＶＬＰおよびキャプシドそれぞれの構築、発現および精製は、２００２年１月１８日に出願された係属中の米国出願Ｎｏ．１０／０５０，９０２中に開示されている。詳細には、前述の出願の実施例１８をここで参照する。
【０１０８】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、Ｑβの組み換えタンパク質、又はその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、その組み換えタンパク質は、前述のＱβ変異体のいずれか１個と対応するＡ１タンパク質の混合物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１０９】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えタンパク質、又はその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１０】
ＡＰ２０５のゲノムは、関連ファージ中に存在しない、成熟タンパク質、コート・タンパク質、レプリカーゼおよび２個のオープンリーディング・フレームからなり；溶解遺伝子およびオープンリーディング・フレームは、成熟遺伝子の翻訳において役割を果たしている（Ｋｌｏｖｉｎｓ，Ｊ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１５２３〜３３（２００２））。ＡＰ２０５のコート・タンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号７９）から発現される可能性があり、このプラスミドはｐＱｂ１０の誘導体であり（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｇｅｎｅ  １３７：１３３〜３７（１９９３））、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む。あるいは、ＡＰ２０５のコート・タンパク質を、ベクター中に存在するリボソーム結合部位の下流で、ｐＱｂ１８５にクローニングすることができる。その全容が参照により組み込まれている、表題「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙｓ」を有し２００２年７月１７日に出願されている、同時係属の米国仮特許出願（出願第６０／３９６，１２６号）中に記載されたように、いずれの手法も、タンパク質の発現およびキャプシドの形成をもたらす。ベクターｐＱｂ１０およびｐＱｂｌ８５は、ｐＧＥＭベクター由来のベクターであり、これらのベクター中でのクローニングされた遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターによって制御されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｇｅｎｅ  １３７：１３３〜３７（１９９３））。プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号７９）は、以下の配列中に推定ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含み、これはＸｂａＩ部位の下流、およびＡＰ２０５コート・タンパク質のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流である：ｔｃｔａｇａＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＴ  ＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＡＣａｔｇ。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位の下流、および開始コドンのすぐ上流に、シャイン・ダルガノ配列を含む（ｔｃｔａｇａＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣａｔｇ、シャイン・ダルガノ配列は下線部）。
【０１１１】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコート・タンパク質、又はその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１２】
したがって、本発明のこの好ましい実施形態は、キャプシドを形成するＡＰ２０５コート・タンパク質を含む。このようなタンパク質は組み換えによって発現されるか、あるいは天然源から作製される。細菌中で生成されたＡＰ２０５コート・タンパク質は、電子顕微鏡法（ＥＭ）および免疫拡散法によって実証されるように、キャプシドを自然に形成する。ＡＰ２０５コート・タンパク質によって形成されたキャプシド（配列番号８０）と、ＡＰ２０５  ＲＮＡファージのコート・タンパク質によって形成されたキャプシドの構造的性質は、ＥＭで見るとほとんど区別がつかない。ＡＰ２０５  ＶＬＰは免疫原性が高く、抗原及び／又は抗原決定基と連結して、反復方式で配向した抗原及び／又は抗原決定基を示す、ワクチン構築体を生成させることができる。このように示された抗原に対する高い力価が誘導され、結合した抗原及び／又は抗原決定基は、抗体分子との相互作用のために利用可能であり、免疫原性があることが示される。
【０１１３】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え変異体のコート・タンパク質、又はその断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１４】
ＡＰ２０５コート・タンパク質を含む、組織化能のある変異形のプロリンがアミノ酸５においてトレオニンに置換されたＡＰ２０５  ＶＬＰ（配列番号８１）も、本発明を実施する際に使用することができ、本発明の他の好ましい実施形態をもたらす。これらのＶＬＰ、天然源に由来するＡＰ２０５  ＶＬＰ、又はＡＰ２０５ウィルス粒子は、本発明に従って、抗原に結合して、抗原の整然とした繰り返し配列を生成させることができる。
【０１１５】
ＡＰ２０５  Ｐ５−Ｔ変異体のコート・タンパク質は、プラスミドｐＡＰ２８１−３２（配列番号８２）から発現される可能性があり、これはｐＱｂ１８５に直接由来し、変異体ＡＰ２０５コート・タンパク質の遺伝子を、Ｑβコート・タンパク質の遺伝子の代わりに含む。ＡＰ２０５コート・タンパク質の発現用のベクターを、ＡＰ２０５コート・タンパク質の発現用の大腸菌にトランスフェクトする。
【０１１６】
コート・タンパク質および変異体コート・タンパク質をそれぞれ発現させ、ＶＬＰへの自己組織化をもたらす方法は、その全容が参照により組み込まれている、表題「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙｓ」を有し２００２年７月１７日に出願されている、同時係属の米国仮特許出願（出願第６０／３９６，１２６号）中に記載されている。適切な大腸菌の菌株は、大腸菌Ｋ８０２、ＪＭ  １０９、ＲＲ１だけには限られないが、これらを含む。適切なベクターおよび菌株、およびそれらの組合せは、コート・タンパク質および変異体コート・タンパク質の発現をそれぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験することによって確認することができ、キャプシド形成および集合は、場合によっては最初にキャプシドをゲル濾過により精製し、免疫拡散アッセイ（オクタロニー試験）又は電子顕微鏡法でその後キャプシドを試験することによって確認することができる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｇｅｎｅ  １３７：１３３〜３７（１９９３））。
【０１１７】
ベクターｐＡＰ２８３−５８およびｐＡＰ２８１−３２から発現されるＡＰ２０５コート・タンパク質は、大腸菌の細胞質中でのプロセッシングのために、開始メチオニン・アミノ酸を欠いている可能性がある。切断、非切断形のＡＰ２０５  ＶＬＰ、又はこれらの混合物は、本発明の他の好ましい実施形態である。
【０１１８】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコート・タンパク質、又はその断片と、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換え変異体のコート・タンパク質、又はその断片の混合物を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１１９】
本発明の他の好ましい実施形態では、ウィルス様粒子は、ＲＮＡファージＡＰ２０５の組み換えコート・タンパク質又は組み換え変異体のコート・タンパク質の断片を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなる。
【０１２０】
ＶＬＰおよびキャプシドにそれぞれ集合することができる組み換えＡＰ２０５コート・タンパク質断片も、本発明を実施する際に有用である。これらの断片は、それぞれコート・タンパク質および変異体コート・タンパク質の内部又は末端での、欠失によって生成させることができる。ＶＬＰへの集合と適合性がある、コート・タンパク質および変異体コート・タンパク質の配列の挿入、又は抗原配列とコート・タンパク質および変異体コート・タンパク質の配列の融合は、本発明の他の実施形態であり、キメラＡＰ２０５コート・タンパク質、および粒子をそれぞれもたらす。コート・タンパク質配列の挿入、欠失および融合の結果、およびそれがＶＬＰへの集合と適合性があるかどうかは、電子顕微鏡法によって判定することができる。
【０１２１】
前に記載したＡＰ２０５コート・タンパク質、コート・タンパク質断片およびキメラ・コート・タンパク質によって形成される粒子は、その全容が参照により組み込まれている、表題「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ａｒｒａｙｓ」を有し２００２年７月１７日に出願されている、同時係属の米国仮特許出願（出願第６０／３９６，１２６号）中に記載されたように、たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ６Ｂカラム、およびこれらの組合せを使用して、沈殿による画分ステップとゲル濾過による精製ステップの組合せによって、純粋な形で単離することができる。ウィルス様粒子を単離する他の方法は当分野で知られており、これを使用して、バクテリオファージＡＰ２０５のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を単離することができる。たとえば、超遠心分離を使用して酵母のレトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰを単離することは、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９１８，１６６号中に記載されている。
【０１２２】
いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３〜５５４（１９９６））。このような情報を使用して、表面に露出した残基を確認することができ、したがって、ＲＮＡファージのコート・タンパク質を、１つ又は複数の反応性アミノ酸残基を挿入又は置換によって挿入することができるように、改変することができる。結果として、これらの改変形のバクテリオファージのコート・タンパク質も、本発明用に使用することができる。したがって、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体（たとえば、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、およびバクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージＡＰ２０５のコート・タンパク質）を使用して、本発明の組成物を調製することもできる。
【０１２３】
前に論じた変異体タンパク質の配列は、その野生型の相当物とは異なるであろうが、これらの変異体タンパク質は、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を一般に保持しているであろう。したがって本発明は、キャプシド又はキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異体をさらに含む、それぞれ組成物およびワクチン組成物、およびこのような組成物およびワクチン組成物をそれぞれ調製するための方法をさらに含み、個々のタンパク質サブユニットを使用して、このような組成物、およびこれらのタンパク質サブユニットをコードする核酸分子を調製する。したがって、本発明の範囲内に含まれるのは、キャプシド又はキャプシド様構造を形成し、キャプシド又はキャプシド様構造と会合しこれを形成する能力を保持している、変異体形の野生型タンパク質である。
【０１２４】
結果として、本発明は、野生型タンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなり、整然とした配列を形成しそれぞれ固有の反復構造を有するタンパク質を含む、それぞれ組成物およびワクチン組成物をさらに含む。
【０１２５】
他に本発明の範囲内に含まれるのは、本発明の組成物を調製するために使用するタンパク質をコードする、核酸分子である。
【０１２６】
他の実施形態では本発明は、配列番号１０〜２７の任意のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなるタンパク質を含む、組成物をさらに含む。
【０１２７】
本発明で使用するのに適したタンパク質には、キャプシド又はキャプシド様構造、又はＶＬＰを形成する、Ｃ末端切断型変異体のタンパク質もある。このような切断型変異体の具体例には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、又は１７個のアミノ酸がＣ末端から除去されている、配列番号１０〜２７のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質がある。典型的には、これらのＣ末端切断型変異体は、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１２８】
本発明で使用するのに適した他のタンパク質には、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する、Ｎ末端切断型変異体のタンパク質もある。このような切断型変異体の具体例には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、又は１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されている、配列番号１０〜２７のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質がある。典型的には、これらのＮ末端切断型変異体は、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１２９】
本発明で使用するのに適した他のタンパク質には、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する、ＮおよびＣ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、又は１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、又は１７個のアミノ酸がＣ末端から除去されている、配列番号１０〜２７のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質がある。典型的には、これらのＮ末端およびＣ末端切断型変異体は、キャプシド又はキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１３０】
本発明は、前に記載した切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなるタンパク質を含む、組成物をさらに含む。
【０１３１】
したがって本発明は、キャプシド又はＶＬＰを形成するタンパク質から調製した組成物およびワクチン組成物、個々のタンパク質サブユニットおよびＶＬＰ又はキャプシドからこれらの組成物を調製するための方法、これらの個々のタンパク質サブユニット、これらのサブユニットをコードする核酸分子を調製するための方法、および本発明のこれらの組成物を使用して、ワクチン接種および／また個体の免疫応答を誘導するための方法を含む。
【０１３２】
免疫応答を誘導する能力を保持しているＶＬＰの断片は、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００個のアミノ酸長のポリペプチドであるが、ＶＬＰを含むサブユニットの配列の長さに明らかに依存するポリペプチドを含むか、あるいはこれらからなっていてよい。このような断片の例は、免疫応答促進組成物を調製するのに適した、本明細書で論じるタンパク質の断片を含む。
【０１３３】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＶＬＰは、リポタンパク質エンベロープ又はリポタンパク質含有エンベロープを含まない。他の好ましい実施形態では、ＶＬＰはエンベロープをまったく含まない。
【０１３４】
リポタンパク質エンベロープ又はリポタンパク質含有エンベロープの欠如、および特に、エンベロープの完全な欠如は、その構造および組成がより明確なウィルス様粒子をもたらす。したがって、このようなより明確なウィルス様粒子は、副作用を最少にすることができる。さらに、リポタンパク質含有エンベロープの欠如、および特に、エンベロープの完全な欠如によって、おそらく毒性である分子および発熱物質のウィルス様粒子中への取り込みが、回避されるかあるいは最少になる。
【０１３５】
前述したように、本発明は、ウィルス様粒子又はそれに由来する組み換え体を含む。当業者は、このような粒子を生成させ抗原をそれに付着させる知識を有している。他の例を与えることによって、本明細書において本発明は、ウィルス様粒子としてのＢ型肝炎ウィルス様粒子の生成を与える（実施例１）。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の組成物中に使用する粒子は、Ｂ型肝炎キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）、又はＨＢｃＡｇの断片から構成されており、これが改変されて、遊離システイン残基の数がなくなっているかあるいは減少している。Ｚｈｏｕ他（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６６：５３９３〜５３９８（１９９２））は、改変されて本来存在するシステイン残基が除去されたＨＢｃＡｇは、会合しマルチマー構造を形成する能力を保持していることを実証した。したがって、本発明の組成物中で使用するのに適したコア粒子には、改変型ＨＢｃＡｇｓ又はその断片を含む粒子があり、その中では、１つ又は複数の本来存在するシステイン残基が欠失しているか、あるいは他のアミノ酸残基（たとえば、セリン残基）で置換されている。
【０１３７】
ＨＢｃＡｇは、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生じるタンパク質である。いくつかのイソ型のＨＢｃＡｇが同定されてきており、それらのアミノ酸配列は当業者には容易に利用可能である。たとえば、図１に示すアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇタンパク質は、１８５個のアミノ酸長であり、アミノ酸２１２個のＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生じる。このプロセッシングによって、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端から、２９個のアミノ酸の除去がもたらされる。同様に、１８５個のアミノ酸長であるＨＢｃＡｇタンパク質は、アミノ酸２１４個のＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングによって生じる。
【０１３８】
好ましい実施形態では、本発明のワクチン組成物を、プロセッシングされた形のＨＢｃＡｇ（すなわち、そこからＢ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が除去されたＨＢｃＡｇ）を使用して調製する。
【０１３９】
さらに、プロセッシングが後で起こらない条件下でＨＢｃＡｇが生成されるときは、ＨＢｃＡｇは一般に「プロセッシング済みの」形で発現されよう。たとえば、大腸菌などの細菌系は一般に、「シグナル・ペプチド」とも呼ばれる、真核細胞中で通常発現するタンパク質のリーダー配列を除去しない。したがって、タンパク質の細胞質への発現を指示する大腸菌の発現系を使用して、本発明のＨＢｃＡｇを生成させるとき、これらのタンパク質は一般に、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列が存在しないように発現されるであろう。
【０１４０】
本発明用に使用することができるＢ型肝炎ウィルス様粒子の作製は、たとえば、ＷＯ  ００／３２２２７、ここでは特に実施例１７〜１９および２１〜２４中、およびＷＯ  ０１／８５２０８、ここでは特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１および４１中、および２００２年１月１８日に出願された係属中の米国出願Ｎｏ．１０／０５０，９０２中に開示されている。後者の出願に関しては、実施例２３、２４、３１および５１に特に言及する。３つの文書はすべて、参照により本明細書に明確に組み込まれている。
【０１４１】
本発明は、改変されて１つ又は複数の追加的システイン残基が欠失しているか、あるいは置換されているＨＢｃＡｇ変異体も含む。したがって、本発明のワクチン組成物は、ＨＢｃＡｇを含む組成物を含み、その中では、図１に示すアミノ酸配列中に存在しないシステイン残基が欠失している。
【０１４２】
遊離システイン残基が、いくつかの化学的副反応と関連がある可能性があることは、当分野ではよく知られている。これらの副反応には、ジスルフィド交換、たとえば、組合せ療法において他の物質と共に注射又は形成される、化学物質又は代謝産物との反応、又は直接的酸化、およびＵＶ光への暴露によるヌクレオチドとの反応がある。ＨＢｃＡｇには核酸と結合する著しい性質がある事実を特に考慮すると、毒性の付加物が生成されると思われる。したがって毒性の付加物は、多様な種の間に分配すると思われ、これらは低濃度で個別にそれぞれ存在する可能性があるが、一緒になると毒性レベルに達する。
【０１４３】
前述の事項を鑑みると、改変されて本来存在するシステイン残基が除去されたワクチン組成物中に、ＨＢｃＡｇを使用する１つの利点は、抗原又は抗原決定基が付着すると毒性種が結合することができる部位は、数が減少するかあるいは完全になくなると思われることである。
【０１４４】
本発明を実施する際に使用するのに適した、いくつかの天然に存在するＨＢｃＡｇ変異体が同定されてきている。たとえば、Ｙｕａｎ他（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２〜１０１２８（１９９９））は、配列番号２８中の位置９７に対応する位置のイソロイシン残基が、ロイシン残基又はフェニルアラニン残基に置換されている、変異体を記載している。いくつかのＨＢｃＡｇ変異体、およびいくつかのＢ型肝炎コア抗原前駆体の変異体のアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋの報告中に開示されている。ＡＡＦ１２１２４０（配列番号２９）、ＡＦ１２１２３９（配列番号３０）、Ｘ８５２９７（配列番号３１）、Ｘ０２４９６（配列番号３２）、Ｘ８５３０５（配列番号３３）、Ｘ８５３０３（配列番号３４）、ＡＦ１５１７３５（配列番号３５）、Ｘ８５２５９（配列番号３６）、Ｘ８５２８６（配列番号３７）、Ｘ８５２６０（配列番号３８）、Ｘ８５３１７（配列番号３９）、Ｘ８５２９８（配列番号４０）、ＡＦ０４３５９３（配列番号４１）、Ｍ２０７０６（配列番号４２）、Ｘ８５２９５（配列番号４３）、Ｘ８０９２５（配列番号４４）、Ｘ８５２８４（配列番号４５）、Ｘ８５２７５（配列番号４６）、Ｘ７２７０２（配列番号４７）、Ｘ８５２９１（配列番号４８）、Ｘ６５２５８（配列番号４９）、Ｘ８５３０２（配列番号５０）、Ｍ３２１３８（配列番号５１）、Ｘ８５２９３（配列番号５２）、Ｘ８５３１５（配列番号５３）、Ｕ９５５５１（配列番号５４）、Ｘ８５２５６（配列番号５５）、Ｘ８５３１６（配列番号５６）、Ｘ８５２９６（配列番号５７）ＡＢ０３３５５９（配列番号５８）、Ｘ５９７９５（配列番号５９）、Ｘ８５２９９（配列番号６０）、Ｘ８５３０７（配列番号６１）、Ｘ６５２５７（配列番号６２）、Ｘ８５３１１（配列番号６３）、Ｘ８５３０１（配列番号６４）、Ｘ８５３１４（配列番号６５）、Ｘ８５２８７（配列番号６６）、Ｘ８５２７２（配列番号６７）、Ｘ８５３１９（配列番号６８）、ＡＢ０１０２８９（配列番号６９）、Ｘ８５２８５（配列番号７０）、ＡＢ０１０２８９（配列番号７１）、ＡＦ１２１２４２（配列番号７２）、Ｍ９０５２０（配列番号７３）、Ｐ０３１５３（配列番号７４）、ＡＦ１１０９９９（配列番号７５）、およびＭ９５５８９（配列番号７６）。これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれている。これらのＨＢｃＡｇ変異体は、配列番号７７中の位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２および１８３に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含めた、いくつかの位置でアミノ酸配列が異なる。本発明の組成物中で使用するのに適しており、本出願の開示に従ってさらに改変することができる他のＨＢｃＡｇ変異体は、ＷＯ  ００／１９８３３３、ＷＯ  ００／１７７１５８およびＷＯ  ００／２１４４７８中に記載されている。
【０１４５】
本発明で使用するのに適したＨＢｃＡｇは、それらが封入、又は結合、あるいはそれ以外の場合は付着できる限り、特にそれらが非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドをパッケージ化し、免疫応答を誘導することができる限りは、任意の生物に由来するものであってよい。
【０１４６】
前に示したように、一般的にプロセッシングされたＨＢｃＡｇ（すなわち、リーダー配列が欠けているＨＢｃＡｇ）を、本発明のワクチン組成物中に使用することができるであろう。本発明はワクチン組成物、および前に記載した変異体ＨＢｃＡｇを使用する、これらの組成物を使用するための方法を含む。
【０１４７】
他に本発明の範囲内に含まれるのは、会合してジマー又はマルチマー構造を形成することができる、他のＨＢｃＡｇ変異体である。したがって本発明は、任意の野生型アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であり、プロセッシングされており、適切な場合はＮ末端リーダー配列が除去されているこれらのタンパク質を形成する、アミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、ワクチン組成物をさらに含む。
【０１４８】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、野生型アミノ酸配列、又はそのサブ部分の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムなどの知られているコンピュータ・プログラムを使用して、従来決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔ又は他の配列アラインメント・プログラムを使用して、特定の配列が、たとえば参照アミノ酸配列と９５％同一であるかどうかを判定するとき、そのパラメータは、同一性のパーセンテージを完全長の参照アミノ酸配列に関して計算し、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％までの相同性のギャップが許容されるように設定する。
【０１４９】
配列番号２９〜７２および７３〜７６で述べるアミノ酸配列を有する、ＨＢｃＡｇ変異体と前駆体は、互いに比較的類似している。したがって、配列番号７７中の特定の位置に対応する位置に位置する、ＨＢｃＡｇ変異体のアミノ酸残基を言及することは、配列番号７７で示すアミノ酸配列中のその位置に存在する、アミノ酸残基を指す。これらのＨＢｃＡｇ変異体間の相同性は、哺乳動物に感染するＢ型肝炎ウィルスではほとんどの部分で十分高いので、当業者には、それぞれ配列番号７７および図１に示すアミノ酸配列、および特定のＨＢｃＡｇ変異体のアミノ酸配列を概説し、「対応する」アミノ酸残基を同定する際に、困難がほとんどないと思われる。さらに、ウッドチャックに感染するウィルスに由来するＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示す、配列番号７３のＨＢｃＡｇのアミノ酸配列は、配列番号７７で示すアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇと十分な相同性を有するので、３個のアミノ酸残基の挿入物が、配列番号７３中、配列番号７７のアミノ酸残基１５５と１５６の間に存在することは、容易に明らかである。
【０１５０】
本発明は、鳥類に感染するＢ型肝炎ウィルスのＨＢｃＡｇ変異体を含むワクチン組成物、およびこれらのＨＢｃＡｇ変異体の断片を含むワクチン組成物も含む。当業者によって理解されるように、これらのポリペプチド中に本来存在する、１個、２個、３個、あるいはそれより多くのシステイン残基は、それらを本発明のワクチン組成物に封入する前に、他のアミノ酸残基で置換又は欠失させることができると思われる。
【０１５１】
前に論じたように、遊離システイン残基を排除することによって、毒性成分がＨＢｃＡｇに結合することができる部位の数が減少し、同じ又は近隣のＨＢｃＡｇ分子のリシンとシステイン残基の架橋が起こる可能性がある部位も排除される。したがって、本発明の他の実施形態では、Ｂ型肝炎ウィルスのキャプシド・タンパク質の１つ又は複数のシステイン残基は、欠失しているか、あるいは他のアミノ酸残基で置換されている。
【０１５２】
他の実施形態では、本発明の組成物およびワクチン組成物はそれぞれ、Ｃ末端領域（たとえば、配列番号７７のアミノ酸残基１４５〜１８５又は１５０〜１８５）が除去されている、ＨＢｃＡｇを含む。したがって、本発明を実施する際に使用するのに適した他の改変型ＨＢｃＡｇには、Ｃ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇがある。
【０１５３】
本発明を実施する際に使用するのに適したＨＢｃＡｇには、Ｎ末端切断型変異体もある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、又は１７個のアミノ酸がＮ末端から除去された改変型ＨＢｃＡｇがある。
【０１５４】
本発明を実施する際に使用するのに適した他のＨＢｃＡｇには、ＮおよびＣ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、又は１７個のアミノ酸がＮ末端から除去され、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されたＨＢｃＡｇがある。
【０１５５】
本発明は、前に記載した切断型変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれから本質的になるか、あるいはこれらからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、それぞれ組成物およびワクチン組成物をさらに含む。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施形態では、リシン残基をＨＢｃＡｇポリペプチドに導入して、抗原又は抗原決定基とＨＢｃＡｇのＶＬＰの結合を仲介させる。好ましい実施形態では、本発明の組成物を、配列番号７７のアミノ酸１〜１４４、又は１〜１４９、１〜１８５を含むか、あるいはこれらからなり、改変されて、位置７９および８０に対応するアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列（配列番号７８）を有するペプチドで置換されている、ＨＢｃＡｇを使用して調製する。これらの組成物は、抗原決定基がＨＢｃＡｇのＶＬＰと結合する場合、これらの実施形態において特に有用である。他の好ましい実施形態では、配列番号７７の位置４８および１０７におけるシステイン残基が、セリンに変異する。本発明は、配列番号２９〜７４のいずれかで示すアミノ酸配列を有し、前に示したアミノ酸の変更もある、対応するポリペプチドを含む組成物をさらに含む。他に本発明の範囲内に含まれるのは、会合しキャプシド又はＶＬＰを形成することができ、前に示したアミノ酸の変更がある、他のＨＢｃＡｇ変異体である。したがって、本発明は、任意の野生型アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であり、プロセッシングされており、適切な場合はＮ末端リーダー配列が除去されており、前に示した変更によって改変されている、これらのタンパク質を形成するアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらからなる、ＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、それぞれ組成物およびワクチン組成物をさらに含む。
【０１５７】
本発明の組成物又はワクチン組成物は、異なるＨＢｃＡｇの混合物を含むことができる。したがって、これらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇから構成されていてよい。たとえば、「野生型」ＨＢｃＡｇ、および１つ又は複数のアミノ酸残基が変わっている（たとえば、欠失、挿入又は置換）改変型ＨＢｃＡｇを含む、ワクチン組成物を調製することができると思われる。さらに、本発明の好ましいワクチン組成物は、非常に整然とした反復抗原配列を示す組成物である。
【０１５８】
前に開示したように、本発明は、免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、およびさらに好ましくはＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＶＬＰにパッケージ化することができるという、驚くべき発見に基づくものである。予想外に、ＶＬＰ中に存在する核酸は、具体的には免疫賦活物質、好ましくは免疫賦活性核酸、およびさらに好ましくはＣｐＧモチーフを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドで置換することができる。一例として、ＣｐＧ−ＶＬＰは、それらのＣｐＧを含まない相当物よりも著しく免疫原性があり、より特異的な効果を引き起こし、高いＢおよびＴ細胞応答を誘導する。ＶＬＰに連結、融合、又は他の方式で付着した抗原に対する免疫応答は、ＶＬＰそのものに対する免疫応答と同様に高められる。さらに、ＶＬＰおよび抗原に対するＴ細胞応答は、Ｔｈ１型を特に対象とする。パッケージ化された核酸およびＣｐＧはそれぞれ、分解から保護される、すなわち、それらはより安定性がある。さらに、先天性免疫系からの細胞の非特異的活性化は、著しく低下する。
【０１５９】
先天性免疫系は、微生物病原体によって共有される不変の分子型を認識する能力を有する。最近の研究によって、この認識が効果的な免疫応答を誘導する際の重要なステップであることが、明らかになってきている。微生物体が免疫応答を高める主な機構は、ＡＰＣ、特に樹状細胞を刺激して、前炎症性サイトカインを生成させ、高レベルのＴ細胞の共賦活分子を発現させることである。これらの活性化された樹状細胞は、後に主要なＴ細胞応答を開始させ、Ｔ細胞仲介のエフェクター機能の型を指示する。
【０１６０】
２クラスの核酸、すなわち１）免疫賦活配列を含む細菌ＤＮＡ、特に特定の隣接塩基中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフと呼ばれる）、および２）さまざまな型のウィルスによって合成される二本鎖ＲＮＡが、免疫応答を高める細菌要素中の重要な構成要素である。ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）などの合成二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、樹状細胞に前炎症性サイトカインの生成を誘導させ、高レベルの共賦活分子を発現させることができる。
【０１６１】
ＴｏｋｕｎａｇａおよびＹａｍａｍｏｔｏ他による一連の研究によって、細菌ＤＮＡ又は合成オリゴデオキシヌクレオチドが、ヒトＰＢＭＣおよびマウス脾臓細胞を誘発して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）を生成させることが示されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２２：１１〜１９中に概説されている）。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、本来はＩ型ＩＦＮの強力な誘導物質として合成されたが、ＩＬ−１２などの他のサイトカインも誘導する。
【０１６２】
好ましいリボ核酸は、ポリイノシン−ポリシチジル酸の二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）を含む。リボ核酸およびその修飾体、およびそれらを生成するための方法は、Ｌｅｖｙ、Ｈ．Ｂ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１、７８：２４２〜２５１）、ＤｅＣｌｅｒｃｑ，Ｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１、７８：２２７〜２３６）、およびＴｏｒｒｅｎｃｅ，Ｐ．Ｆ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８１；７８：３２６〜３３１）、およびその中の参照によって記載されてきている。リボ核酸は、生物から単離することができる。リボ核酸は、他の合成リボ核酸、特に合成ポリ（Ｉ：Ｃ）オリゴヌクレオチドも含み、これらはリン酸ジエステル骨格の修飾によって、特にホスホロチオエートの修飾によって、ヌクレアーゼ耐性になっている。他の好ましい実施形態では、ポリ（Ｉ：Ｃ）のリボース骨格が、デオキシリボースによって置換されている。当業者は、合成オリゴヌクレオチドの合成の仕方の手順を知っている。
【０１６３】
本発明の他の好ましい実施形態では、ｔｏｌｌ様レセプターを活性化させる分子が含まれる。１０個のヒトのｔｏｌｌ様レセプターが、今日までに知られている。これらは、さまざまなリガンドによって活性化される。ＴＬＲ２はペプチドグリカン、リポタンパク質、リポテイコ酸、およびザイモサンによって活性化され、ＴＬＲ３は二本鎖ＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）などによって活性化され、ＴＬＲ４はリポ多糖、リポテイコ酸、およびタクソールによって活性化され、ＴＬＲ５は、細菌フラジェラ、特にフラジェリン・タンパク質によって活性化され、ＴＬＲ６はペプチドグリカンによって活性化され、ＴＬＲ７はイミクイモイドおよびＲ４１８などのイミダゾキノリン化合物によって活性化され、ＴＬＲ９は細菌ＤＮＡ、特にＣｐＧのＤＮＡによって活性化される。ＴＬＲ１、ＴＬＲ８およびＴＬＲ１０のリガンドは、これまで知られていない。しかしながら、近年の報告によって、同じ受容体が異なるリガンドと反応することができ、他の受容体が存在することが示されている。前述のリガンドの列挙は網羅的なものではなく、他のリガンドは当業者の知識の範囲内にある。
【０１６４】
好ましくは、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が任意のヌクレオチドである配列
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
を含む。さらにオリゴヌクレオチドは、約６〜約１００，０００個のヌクレオチド、好ましくは約６〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約２０００個のヌクレオチド、より好ましくは約２０〜約３００個のヌクレオチドを含むことができる。さらにオリゴヌクレオチドは、１００超〜約２０００個のヌクレオチド、好ましくは１００超〜約１０００個のヌクレオチド、より好ましくは１００超〜約５００個のヌクレオチドを含むことができる。
【０１６５】
好ましい実施形態では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、リン酸骨格の１つ又は複数のホスホロチオエート修飾体を含む。たとえば、リン酸骨格の１つ又は複数のリン酸の修飾体を有するか、あるいは修飾されたリン酸骨格のすべてを有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、および１個、数個、あるいはすべてのヌクレオチドのリン酸骨格の修飾体が、ホスホロチオエート修飾体であるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６６】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、組み換え体、ゲノム、合成、ｃＤＮＡ、プラスミド由来、および一本又は二本鎖であってもよい。本発明において使用するために、当分野でよく知られているいくつかの手順のいずれかを使用して、核酸を新たに合成することができる。たとえば、ｂ−シアノエチル・ホスホアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９（１９８１）；ヌクレオシドＨ−リン酸法（Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５４（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４０７（１９８６）；Ｇａｒｅｇｇ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５５〜４０５８（１９８６）、Ｇａｆｆｎｅｙ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２（１９８８））。これらの化学的方法は、市場で入手可能なさまざまな自動式オリゴヌクレオチド合成装置によって、実施することができる。あるいは、ＣｐＧをプラスミド中において大規模で生成させることができ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｔ．他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）、これは被験者に投与された後にオリゴヌクレオチドに分解される。オリゴヌクレオチドは、知られている技法、制限酵素、エクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを利用する技法を使用して、既存の核酸配列（たとえば、ゲノム又はｃＤＮＡ）から作製することができる。
【０１６７】
免疫賦活物質、免疫賦活性核酸、および非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、当分野で知られている任意の方法によってＶＬＰに結合することができ、その組成物は動物の免疫応答を高めるものとする。たとえば、オリゴヌクレオチドは、共有的又は非共有的に結合することができる。さらに、ＶＬＰは、完全あるいは部分的に、免疫賦活物質、免疫賦活性核酸、および非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを封入することができる。免疫賦活性核酸、および非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド結合部位（本来存在するもの又は本来存在しないもの）、ＤＮＡ結合部位、又はＲＮＡ結合部位などのＶＬＰ部位に結合することができることが好ましい。他の実施形態では、ＶＬＰ部位はアルギニンリッチリピートを含む。
【０１６８】
本発明の組成物の１つの具体的な使用は、抗原に対する特定の免疫応答を高める目的で、樹状細胞を活性化させることである。免疫応答は、エキソビボ又はインビボの技法を使用して、高めることができる。エキソビボの手順を、自己又は異種細胞に使用することができるが、自己細胞に使用することが好ましい。好ましい実施形態では、樹状細胞を末梢血液又は骨髄から単離するが、これは樹状細胞の任意の源から単離することができる。癌の免疫療法の目的での、樹状細胞のエキソビボでの操作は、Ｅｎｇｌｅｍａｎ，Ｅ．Ｇ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１（１９９７）；Ｖａｎ  Ｓｃｈｏｏｔｅｎ，Ｗ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ、Ｊｕｎｅ、２５５（１９９７）；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２４：８４９（１９９６）；およびＧｌｕｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１８７（１９９７）を含めた、当分野のいくつかの参照文献に記載されてきている。
【０１６９】
樹状細胞を、インビボでの方法を使用して、本発明の組成物と接触させることもできる。これを実施するために、ＣｐＧを、ＶＬＰに場合によっては連結、融合、又は他の方式で付着した抗原と組み合わせて、免疫療法を必要とする被験者に直接投与する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ／ＣｐＧを腫瘍の局所領域に投与することが好ましく、当分野で知られている任意の方法、たとえば腫瘍への直接的な注射によって、これを実施することができる。
【０１７０】
本発明の組成物は、ウィルス様粒子と結合した抗原又は抗原決定基をさらに含むことができる。本発明は、所望の治療効果を考慮して選択した抗原又は抗原決定基に従って変わる、組成物を提供する。本発明で使用するのに適した非常に好ましい抗原又は抗原決定基は、ＷＯ  ００／３２２２７、ＷＯ  ０１／８５２０８およびＷＯ  ０２／０５６９０５中に開示されており、その開示は参照によりその全容がここに組み込まれている。
【０１７１】
抗原は、知られているかあるいは今だに起源が知られていない、任意の抗原であってよい。抗原は細菌、ウィルス又は他の病原体から単離することができ、あるいはコードされている適切な核酸の発現から得られる、組み換え抗原であってよい。抗原は、プリオン、腫瘍、自己分子、非ペプチド・ハプテン分子、アレルゲンおよびホルモンから単離することもできる。好ましい実施形態では、抗原は組み換え抗原であってよい。当然ながら、抗原の選択は、所望の免疫応答および宿主に依存する。
【０１７２】
本発明の免疫増強組成物の一実施形態では、ＶＬＰそのものに対する免疫応答を誘導する。本発明の他の実施形態では、ウィルス様粒子を、それに対する免疫応答の増強が望まれる、抗原／免疫原に連結、融合、又は他の方式で付着させる。
【０１７３】
本発明の他の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基を、ウィルス様粒子に融合させる。前に略述したように、ＶＬＰは、ＶＬＰに集合する少なくとも１つのサブユニットから典型的には構成される。したがってここでも、本発明の他の好ましい実施形態では、抗原又は抗原決定基は、ＶＬＰ中に取り込まれ、キメラＶＬＰ−サブユニット−抗原融合体を生成させることができる、ウィルス様粒子又はタンパク質の、少なくとも１つのサブユニットと融合する。
【０１７４】
抗原又は抗原決定基の融合は、ＶＬＰサブユニット配列中への挿入によって、あるいはＶＬＰ中に取り込ませることができるＶＬＰサブユニット又はタンパク質のＮ又はＣ末端との融合によって、行うことができる。本明細書では以後、ペプチドとＶＬＰサブユニットの融合タンパク質を指すとき、サブユニット配列の末端との融合、又はサブユニット配列中でのペプチドの内部挿入が含まれる。
【０１７５】
抗原又は抗原決定基配列を、サブユニット配列中の一部分が欠けており切断型変異体とも呼ばれる、ＶＬＰサブユニットの変異体に挿入することによって、融合を行うこともできる。切断型変異体には、ＶＬＰサブユニットの配列の一部の、Ｎ又はＣ末端、又は内部欠失がある可能性がある。たとえば、たとえばアミノ酸残基７９〜８１が欠失している特定のＶＬＰ  ＨＢｃＡｇは、内部欠失している切断型変異体である。切断型変異体ＶＬＰサブユニットのＮ又はＣ末端との、抗原又は抗原決定基の融合も、本発明の実施形態となる。同様に、エピトープのＶＬＰサブユニットの配列への融合を、置換によって行うこともでき、たとえば、特定のＶＬＰ  ＨＢｃＡｇに関しては、アミノ酸７９〜８１を外来性のエピトープで置換する。したがって、以後本明細書で指す融合は、抗原又は抗原決定基配列をＶＬＰサブユニットの配列に挿入することによって、又はＶＬＰサブユニットの配列の一部を抗原又は抗原決定基で置換することによって、又は欠失、置換又は挿入を組み合わせることによって、行うことができる。
【０１７６】
キメラ抗原又は抗原決定基−ＶＬＰサブユニットは、ＶＬＰに自己組織化することが一般にできるであろう。それらのサブユニットと融合したエピトープをディスプレイするＶＬＰも、本明細書ではキメラＶＬＰと呼ぶ。示したように、ウィルス様粒子は、少なくとも１つのＶＬＰサブユニットを含むか、あるいはこれらから構成される。本発明の他の実施形態では、ウィルス様粒子は、キメラＶＬＰサブユニットと非キメラＶＬＰサブユニット、すなわち、融合した抗原を有しておらず、いわゆるモザイク粒子をもたらすＶＬＰサブユニットの混合物を含むか、あるいはこれらから構成される。ＶＬＰの形成、ＶＬＰへの集合を確実にするために、これが有利である可能性がある。これらの実施形態では、キメラＶＬＰサブユニットの比率は１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％以上であってよい。
【０１７７】
側面アミノ酸残基に、ＶＬＰのサブユニットの配列のいずれかの端と融合した、ペプチド又はエピトープの配列のいずれかの端に、あるいはこのようなペプチド配列をＶＬＰのサブユニットの配列に内部挿入するために、加えることができる。グリシンおよびセリン残基は、融合させるペプチドに加える側面配列中に使用するための、特に好ましいアミノ酸である。グリシン残基によって、追加的な柔軟性が与えられ、これによって外来性配列のＶＬＰサブユニットの配列への融合の、潜在的な不安定化効果を低下させることができる。
【０１７８】
本発明の特定実施形態では、ＶＬＰはＢ型肝炎コア抗原ＶＬＰである。抗原又は抗原決定基と、ＨＢｃＡｇのＮ末端（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、又はいわゆる主要免疫優性領域（ＭＩＲ）への挿入物の融合タンパク質は、記載されてきており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、ＷＯ  ０１／９８３３３）、本発明の好ましい実施形態である。本来存在するＭＩＲが欠失したＨＢｃＡｇの変異体も、記載されてきており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、参照によりその全容が明確に組み込まれている）、Ｎ又はＣ末端との融合、およびｗｔ  ＨＢｃＡｇと比較した欠失部位に対応するＭＩＲの位置における挿入は、本発明の他の実施形態である。Ｃ末端との融合も記載されてきている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））。当業者は、古典的な分子生物学の技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、ｅｄｓ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｈｏ他、Ｇｅｎｅ  ７７：５１（１９８９））を使用して、融合タンパク質の構築法に関する指針を容易に発見するであろう。ＨＢｃＡｇｇおよびＨＢｃＡｇｇ融合タンパク質をコードし、ＨＢｃＡｇｇおよびＨＢｃＡｇｇ融合タンパク質を発現させるために有用である、ベクターおよびプラスミドが記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、本発明を実施する際に使用することができる。ＨＢｃＡｇのＭＩＲ中に挿入されるエピトープの自己組織化およびディスプレイの効率を最適にするための、１つの重要な要因は、挿入部位、および挿入によってＭＩＲ中のＨＢｃＡｇ配列から欠失するアミノ酸の数（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））；ＥＰ  ０４２１６３５；米国特許第６，２３１，８６４号）、あるいは言い換えれば、ＨＢｃＡｇを形成するどのアミノ酸が新しいエピトープで置換されるかの選択である。たとえば、ＨＢｃＡｇアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５又は８０〜８１を外来性エピトープで置換することは、記載されてきている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））；ＥＰ  ０４２１６３５；米国特許第６，２３１，８６４号）。ＨＢｃＡｇは長いアルギニン尾部を含み（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、これはキャプシドの集合には必須ではなく核酸を結合させることができる（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））。このアルギニン尾部を含むＨＢｃＡｇ、およびこれが欠けているＨＢｃＡｇはいずれも、本発明の実施形態である。
【０１７９】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主なコート・タンパク質は、細菌、特に大腸菌中での発現によって、ＶＬＰ中に自然に集合する。本発明の組成物を調製するために使用することができる、バクテリオファージのコート・タンパク質の具体例には、ＲＮＡバクテリオファージ、バクテリオファージＱβ（配列番号１０；ＰＩＲ  Ｄａｔａｂａｓｅ、受託番号ＶＣＢＰＱβはＱβＣＰを指し、および配列番号１１；受託番号ＡＡＡ１６６６３はＱβＡ１タンパク質を指す）、およびバクテリオファージｆｒ（配列番号１３；ＰＩＲ受託番号ＶＣＢＰＦＲ）などのコート・タンパク質がある。
【０１８０】
より好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基は、Ｑβコート・タンパク質と融合している。エピトープが切断形であるＱβのＡ１タンパク質のＣ末端と融合したか、あるいはＡ１タンパク質に挿入された融合タンパク質構築体は記載されてきている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ａ１タンパク質はＵＧＡ停止コドンにおける抑制によって生じ、３２９ａａ、又はＮ末端メチオニンの切断を考慮する場合、３２８ａａの長さを有する。アラニン（Ｑβ  ＣＰ遺伝子によってコードされた第２のアミノ酸）の前のＮ末端メチオニンの切断は、通常は大腸菌において起こり、Ｑβコート・タンパク質のＮ末端の場合も同様である。Ａ１遺伝子の一部分、ＵＧＡアンバー・コドンの３’はＣＰ伸長部をコードし、これはアミノ酸１９５個の長さを有する。ＣＰ伸長部の位置７２と７３の間に、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基を挿入することによって、本発明の他の実施形態がもたらされる（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６））。Ｃ末端が切断されたＱβのＡ１タンパク質のＣ末端における、抗原又は抗原決定基の融合によって、本発明の他の好ましい実施形態がもたらされる。たとえば、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））は、エピトープが位置１９で切断されたＱβ  ＣＰ伸長部のＣ末端で融合している、ＱβのＡ１タンパク質融合体を記載している。
【０１８１】
Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））によって記載されたように、融合エピトープをディスプレイする粒子の集合には、Ａ１タンパク質−抗原融合体、およびモザイク粒子を形成するためのｗｔ  ＣＰの存在が典型的には必要である。しかしながら、ウィルス様粒子、ここでは特に、そこに融合した少なくとも１つの抗原又は抗原決定基を有するＶＬＰサブユニットのみから構成される、ＲＮＡファージＱβコート・タンパク質のＶＬＰを含む実施形態も、本発明の範囲内にある。
【０１８２】
モザイク粒子の生成は、いくつかの方法によって行うことができる。Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ他Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）は、３つの方法を記載しており、これらはいずれも本発明を実施する際に使用することができる。第１の手法では、ＶＬＰ上での融合エピトープの有効なディスプレイを、ＣＰとＣＰ伸長部の間にＵＧＡ停止コドンを有する、ＱβのＡ１タンパク質融合体をコードするプラスミドの発現によって、ＵＧＡコドンのＴｒｐへの翻訳をもたらすクローニングされたＵＧＡ抑制ｔＲＮＡをコードするプラスミド（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（Ｓｍｉｌｅｙ  Ｂ．Ｋ．他、Ｇｅｎｅ  １３４：３３〜４０（１９９３）））を収用する、大腸菌菌株中において仲介する。他の手法では、ＣＰ遺伝子の停止コドンをＵＡＡに改変し、Ａ１タンパク質−抗原融合体を発現する第２のプラスミドを同時形質転換する。この第２のプラスミドは異なる抗生物質耐性をコードしており、その複製起点は第１のプラスミドと適合性がある（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６））。第３の手法では、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．他、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６）の図１に記載されたように、ＣＰとＡ１タンパク質−抗原融合体が２シストロン方式でコードされており、Ｔｒｐプロモーターなどのプロモーターに動作可能に連結している。
【０１８３】
他の実施形態では、抗原又は抗原決定基を、ｆｒ  ＣＰのアミノ酸２と３（切断されるＣＰ、すなわちＮ末端メチオニンが切断される番号）の間に挿入し、したがって抗原又は抗原決定基−ｆｒ  ＣＰ融合タンパク質がもたらされる。ＶＬＰに自己組織化するｆｒ  ＣＰ融合タンパク質を構築し発現させるための、本発明を実施する際に有用なベクターおよび発現系は記載されてきている（Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。特定の実施形態では、抗原又は抗原決定基の配列を、ｆｒ  ＣＰの残基３および４が欠失している、アミノ酸２の後ろのｆｒ  ＣＰの欠失変異体に挿入する（Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．６：８８３〜８９１（１９９３））。
【０１８４】
ＲＮＡファージＭＳ−２のコート・タンパク質のＮ末端の隆起状Ｒ−ヘパリンにおけるエピトープの融合、およびその後のＲＮＡファージＭＳ−２の自己組織化ＶＬＰ上での融合エピトープのディスプレイも、記載されてきており（ＷＯ  ９２／１３０８１）、ＭＳ−２ＲＮＡファージのコート・タンパク質の挿入又は置換による、抗原又は抗原決定基の融合も、本発明の範囲内に入るものである。
【０１８５】
本発明の他の実施形態では、抗原又は抗原決定基を、パピローマ・ウィルスのキャプシド・タンパク質と融合させる。より具体的な実施形態では、抗原又は抗原決定基を、ウシ乳頭腫ウィルス１型（ＢＰＶ−１）の主要なキャプシド・タンパクＬ１と融合させる。バキュロ・ウィルス／昆虫細胞系においてＢＰＶ−１融合タンパク質を構築し発現させるための、ベクターおよび発現系は記載されてきている（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ  ００／２３９５５）。ＢＰＶ−１  Ｌ１のアミノ酸１３０〜１３６を抗原又は抗原決定基で置換することによって、ＢＰＶ−１  Ｌｌ−抗原融合タンパク質がもたらされ、これは本発明の好ましい実施形態である。バキュロ・ウィルス・ベクター中でのクローニング、およびバキュロ・ウィルス感染したＳｆ９細胞中での発現は記載されてきており、本発明を実施する際に使用することができる（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ  ００／２３９５５）。融合した抗原又は抗原決定基をディスプレイする集合粒子の精製は、たとえばゲル濾過、又はスクロース勾配超遠心分離などの、いくつかの方法によって行うことができる。（Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：２３７３〜２３７８（１９９９）、ＷＯ  ００／２３９５５）。
【０１８６】
本発明の他の実施形態では、抗原又は抗原決定基を、Ｔｙ  ＶＬＰ中に取り込ませることができるＴｙタンパク質と融合させる。より具体的な実施形態では、抗原又は抗原決定基を、ＴＹＡ遺伝子によってコードされた、ｐ１又はキャプシド・タンパク質と融合させる（Ｒｏｔｈ，Ｊ．Ｆ．、Ｙｅａｓｔ  １６：７８５〜７９５（２０００））。酵母のレトロトランスポゾンＴｙ１、２、３および４は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離されており、一方レトロトランスポゾンＴｆｌはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｏｍｂａｅから単離されている（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ，Ｓ．Ｂ．、「Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ」、ｉｎ  Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ、ｐ．１９３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））。レトロトランスポゾンＴｙ１および２は、植物および動物要素のコピア類と関連があり、一方Ｔｙ３は、レトロトランスポゾンのジプシー科に属し、植物および動物のレトロ・ウィルスと関連がある。Ｔｙ１レトロトランスポゾンでは、Ｇａｇ又はキャプシド・タンパク質とも呼ばれるｐ１タンパク質は、アミノ酸４４０個の長さを有している。Ｐ１はＶＬＰの成熟中に位置４０８で切断し、ＶＬＰの必須要素であるｐ２タンパク質がもたらされる。
【０１８７】
ｐ１との融合タンパク質、および酵母菌中で前記融合タンパク質を発現させるためのベクターは、記載されてきている（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：６８〜７０（１９８７））。したがって、たとえば、抗原又は抗原決定基を、抗原又は抗原決定基をコードする配列をｐＭＡ５６２０プラスミドのＢａｍＨ１部位に挿入することによって、ｐ１と融合させることができる（Ａｄａｍｓ，Ｓ．Ｅ．他、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：６８〜７０（１９８７））。外来性エピトープをコードする配列をｐＭＡ５６２０ベクターにクローニングによって、Ｔｙ１−１５のｐ１のアミノ酸１〜３８１を含み、Ｃ末端が外来性エピトープのＮ末端と融合した融合タンパク質の発現がもたらされる。同様に、抗原又は抗原決定基のＮ末端融合、又はｐ１配列への内部挿入、又はｐ１配列の一部分の置換も、本発明の範囲内にあることを意味する。特に、抗原又は抗原決定基の、Ｔｙタンパク質ｐ１（ＥＰ０６７７１１１）のＴｙ配列、アミノ酸３０〜３１、６７〜６８、１１３〜１１４および１３２〜１３３の間への挿入によって、本発明の好ましい実施形態がもたらされる。
【０１８８】
抗原又は抗原決定基の融合に適した他のＶＬＰは、たとえば、レトロ・ウィルス様粒子（Ｗ０９６３０５２３）、ＨＩＶ２  Ｇａｇ（Ｋａｎｇ，Ｙ．Ｃ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３５３〜３６４（１９９９））、ササゲ・モザイク・ウィルス（Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：３８７〜３９２（１９９９））、パルボ・ウィルスＶＰ２  ＶＬＰ（Ｒｕｅｄａ，Ｐ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３：８９〜９９（１９９９））、ＨＢｓＡｇ（米国特許第４，７２２，８４０号、ＥＰ００２０４１６Ｂ１）である。
【０１８９】
本発明を実施するのに適したキメラＶＬＰの例には、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：１（１９９６）中に記載されたものもある。本発明において使用するために企図されるＶＬＰの他の例は：ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ  ＧＡＧ、タバコモザイク・ウィルスである。ＳＶ−４０、ポリオーマ・ウィルス、アデノ・ウィルス、単純疱疹ウィルス、ロタ・ウィルスおよびノーウォーク・ウィルスのウィルス様粒子も作製されてきており、抗原又は抗原決定基を含むこれらのＶＬＰのキメラＶＬＰも、本発明の範囲内にある。
【０１９０】
示したように、ウィルス様粒子構成モノマーの配列中の挿入によって、ウィルス様粒子と融合した抗原を含む実施形態も、本発明の範囲内にある。いくつかの場合、欠失を含むウィルス様粒子構成モノマーの形で、抗原を挿入することができる。これらの場合、ウィルス様粒子構成モノマーは、挿入抗原の不在下では、ウィルス様構造を形成することができない。
【０１９１】
いくつかの場合、組み換えＤＮＡ技術を使用して、異種タンパク質とＶＬＰタンパク質を融合させることができる（Ｋｒａｔｚ，Ｐ．Ａ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１９１５（１９９９））。たとえば、本発明は、本発明の抗原（又はその一部分、好ましくは少なくとも１０、２０又は５０個のアミノ酸）と、組み換えによって融合するか、あるいは化学的に複合して（共有的および非共有的複合）、融合タンパク質又は複合体を生成させるＶＬＰを含む。融合は必ずしも直接的である必要はなく、連結配列を介して生じる可能性がある。より一般的には、ウィルス様粒子と融合、複合、あるいはそれ以外の場合は付着したエピトープを、本発明に従って抗原として使用する場合、スペーサー又は連結配列を、典型的にはエピトープの一端又は両端に加える。このような連結配列は、プロテアーゼ、プロテアーゼによって認識される、細胞のエンドソーム又は他の小胞区画の配列を含むことが好ましい。
【０１９２】
結合の１つの方法はペプチド結合によるものであり、その中で複合体は連続的ポリペプチド、すなわち融合タンパク質であってよい。本発明の融合タンパク質中では、異なるペプチド又はポリペプチドが、イン・フレームで互いに連結して、連続的ポリペプチドを形成する。したがって、融合タンパク質の第１の部分は抗原又は免疫原を含み、融合タンパク質の第２の部分、第１の部分に対するＮ末端又はＣ末端は、ＶＬＰを含む。あるいは、抗原の両端上でのＶＬＰへの任意選択の連結配列の内部挿入も、本発明に従って行うことができる。
【０１９３】
ＨＢｃＡｇをＶＬＰとして使用するとき、抗原をＨＢｃＡｇ粒子のＣ末端と連結させることが好ましい。リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）糖タンパク質由来のＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドｐ３３のＣ末端融合体である、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を、モデル抗原（ＨＢｃＡｇ−ｐ３３）として使用した。アミノ酸１８５個の長さの野生型ＭＢｃタンパク質を、正二十面体構造をとる１８０個のサブユニットから構成される十分に構造化された粒子に集合させる。構造化キャプシドを形成する能力を保ちながら、異なる位置での外来性配列の比較的大きな挿入物を認める際の、ＨＢｃＡｇおよび他のＶＬＰの柔軟性は、文献中に十分に記載されている。これによってＨＢｃ  ＶＬＰが、非複製型ワクチンを設計するための魅力的な候補となっている。
【０１９４】
柔軟性のある連結配列（たとえば、ポリグリシン／ポリセリン含有配列、［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］２など（Ｈｕｓｔｏｎ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２０３：４６〜８８（１９９１））を、融合タンパク質、抗原とリガンドの間に挿入することができる。さらに、融合タンパク質を構築して「エピトープ・タグ」を含ませることができ、たとえば標識又は精製目的で、融合タンパク質を抗体（たとえば、モノクローナル抗体）と結合させることができる。エピトープ・タグの一例は、モノクローナル抗体ＹＬ１／２によって認識される、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅトリペプチドである。
【０１９５】
本発明は、ＶＬＰをコードする配列および抗原／免疫原をコードする配列を含む、キメラＤＮＡにも関する。ＤＮＡは、たとえばバキュロ・ウィルスによって形質転換された昆虫細胞中で、酵母菌中で、あるいは細菌中で発現することができる。発現系に関する制限はなく、その大部分の選択品が通常の使用に利用可能である。多量のタンパク質の発現を可能にする系を、使用することが好ましい。一般に、細菌の発現系が、その有効性を考慮して好ましい。本発明の範囲内で使用するのに適した細菌の発現系の一例は、Ｃｌａｒｋｅ他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１１０９〜１１１７（１９９０）；Ｂｏｒｉｓｏｖａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３６９６〜３７０１（１９９３）；およびＳｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０〜８９（１９９０）によって記載されたものである。適切な酵母菌の発現系の一例は、Ｅｍｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：２３１〜３（１９９０）によって記載されたものであり；キャプシド・タンパク質を作製するために以前から使用されている、バキュロ・ウィルス系も適切である。構造的又は誘導的発現系を使用することができる。利用可能な発現系の選択および可能な改変によって、タンパク質が得られる形を調節することができる。
【０１９６】
本発明の特定の実施形態では、それに対する免疫応答の増強が望まれる抗原を、Ｂ型肝炎ウィルス・キャプシド（コア）タンパク質（ＨＢｃＡｇ）に、イン・フレームで連結、融合、又は他の方式で付着させる。しかしながら、本発明の融合タンパク質構築体中に、他のウィルス様粒子を使用することができることは、すべての当業者に明らかであろう。
【０１９７】
本発明の他の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基を、少なくとも１つの共有結合によってウィルス様粒子と結合させる。少なくとも１つの抗原又は抗原決定基は、少なくとも１つの共有結合によってウィルス様粒子と結合し、前記共有結合が非ペプチド結合であり、抗原又は抗原決定基の配列、および抗原又は抗原決定基−ＶＬＰ複合体をそれぞれもたらすことが好ましい。この抗原又は抗原決定基の配列および複合体はそれぞれ、典型的かつ好ましくは、繰り返し型の整然とした構造を有する。なぜなら、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基は、配向方式でＶＬＰと結合するからである。以下で明らかになるように、繰り返し型の整然とした、抗原又は抗原決定基−ＶＬＰ配列および複合体の形成はそれぞれ、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基とＶＬＰの、配向および指定され、かつ明確なそれぞれ結合および付着によって確実になる。さらに、ＶＬＰの典型的な固有の十分に繰り返され編成された構造は、非常に整然とした繰り返し方式で抗原又は抗原決定基のディスプレイに有利に貢献し、十分に編成された繰り返し型の抗原又は抗原決定基−ＶＬＰ配列および複合体をそれぞれもたらす。
【０１９８】
したがって、好ましい本発明の複合体および配列はそれぞれ、配列の表面上の抗原の、その十分に編成された構造、寸法、および反復性が、従来技術の複合体と異なる。さらに、本発明の好ましい実施形態は、発現宿主中での粒子の発現を可能にし、抗原が次いでさらに結合するＶＬＰの、正確な折りたたみおよび集合を確実にする。
【０１９９】
本発明は、抗原又は抗原決定基とＶＬＰを結合させる方法を開示する。示したように、本発明の一態様では、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基を、化学的架橋剤によって、典型的かつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用することによって、ＶＬＰと結合させる。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が、当分野で知られている。好ましい実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましい第１の付着部位、すなわち、ＶＬＰ又は少なくとも１つのＶＬＰサブユニットのリシン残基の側鎖アミノ基と反応することができる官能基、および好ましい第２の付着部位、すなわち、抗原又は抗原決定基と融合し、場合によっては還元による反応に利用することもできるシステイン残基と反応することができる、他の官能基を含む。典型的には誘導体化と呼ばれる手順の第１のステップは、ＶＬＰと架橋剤の反応である。この反応の生成物は、活性化担体とも呼ばれる活性化ＶＬＰである。第２のステップでは、ゲル濾過又は透析などの通常の方法を使用して、未反応架橋剤を除去する。第３のステップでは、抗原又は抗原決定基を活性化ＶＬＰと反応させ、このステップは典型的には結合ステップと呼ばれる。未反応の抗原又は抗原決定基を、たとえば透析によって、第４のステップで場合によっては除去することができる。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が、当分野で知られている。これらは好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、およびたとえばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から入手可能な他の架橋剤を含み、アミノ基に対して反応性がある１つの官能基、およびシステイン残基に対して反応性がある１つの官能基を有する。前述の架橋剤はいずれも、チオエーテル結合の形成をもたらす。本発明を実施するのに適した他のクラスの架橋剤は、結合時の抗原又は抗原決定基とＶＬＰの間のジスルフィド結合の導入によって特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、たとえばＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）がある。架橋剤によるＶＬＰの誘導体化の程度は、それぞれの反応パートナーの濃度、１つの試薬が他の試薬よりも過剰であること、ｐＨ、温度およびイオン強度などの実験条件を変えることによって、影響を受ける可能性がある。結合の程度、すなわちＶＬＰのサブユニット当たりの抗原又は抗原決定基の量を、前に記載した実験条件を変えることによって調節して、ワクチンの要件を整合させることができる。
【０２００】
抗原又は抗原決定基とＶＬＰを結合させる特に好ましい方法は、ＶＬＰの表面上のリシン残基を、抗原又は抗原決定基上のシステイン残基と連結させることである。いくつかの実施形態では、ＶＬＰとの結合のために、第２の付着部位として、あるいはその一部分としての、システイン残基を含むアミノ酸リンカーの、抗原又は抗原決定基との融合が必要とされる可能性がある。
【０２０１】
一般に、柔軟性のあるアミノ酸リンカーが好ましい。アミノ酸リンカーの例は、（ａ）ＣＧＧ；（ｂ）Ｎ末端ガンマ１−リンカー；（ｃ）Ｎ末端ガンマ３−リンカー；（ｄ）Ｉｇヒンジ領域；（ｅ）Ｎ末端グリシンリンカー；（ｆ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｎ、ｎ＝０〜１２かつｋ＝０〜５；（ｇ）Ｎ末端グリシン−セリンリンカー；（ｈ）（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｍ（Ｓ）１（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２；（ｉ）ＧＧＣ；（ｋ）ＧＧＣ−ＮＨ２；（ｌ）Ｃ末端ガンマ１−リンカー；（ｍ）Ｃ末端ガンマ３−リンカー；（ｎ）Ｃ末端グリシンリンカー；（ｏ）（Ｇ）ｎＣ（Ｇ）ｋ、ｎ＝０〜１２かつｋ＝０〜５；（ｐ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー；（ｑ）（Ｇ）ｍ（Ｓ）１（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ）ｏＣ（Ｇ）ｋ、ｎ＝０〜３、ｋ＝０〜５、ｍ＝０〜１０、ｌ＝０〜２、およびｏ＝０〜８からなる群から選択される。
【０２０２】
アミノ酸リンカーの他の例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ、およびグリシンリンカー（Ｇ）ｎであり、これらはいずれもシステイン残基を第２の付着部位としてさらに含み、場合によっては他のグリシン残基を含む。典型的には、前記アミノ酸リンカーの好ましい例は、Ｎ末端ガンマ１：ＣＧＤＫＴＨＴＳＰＰ；Ｃ末端ガンマ１：ＤＫＴＨＴＳＰＰＣＧ；Ｎ末端ガンマ３：ＣＧＧＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ；Ｃ末端ガンマ３：ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰＧＧＣＧ；Ｎ末端グリシンリンカー：ＧＣＧＧＧＧ、およびＣ末端グリシンリンカー：ＧＧＧＧＣＧである。
【０２０３】
疎水性抗原又は抗原決定基がＶＬＰと結合するとき、本発明を実施する際に非常に適した他のアミノ酸リンカーは、Ｎ末端リンカーに関してはＣＧＫＫＧＧ又はＣＧＤＥＧＧ、あるいはＣ末端リンカーに関してはＧＧＫＫＧＣおよびＧＧＥＤＧＣである。Ｃ末端リンカーに関しては、末端システインは、場合によってはＣ末端がアミド化されている。
【０２０４】
本発明の好ましい実施形態では、ペプチドのＣ末端ではＧＧＣＧ、ＧＧＣ又はＧＧＣ−ＮＨ２（「ＮＨ２」はアミド化を表す）リンカー、又はそのＮ末端ではＣＧＧが、アミノ酸リンカーとして好ましい。一般に、グリシン残基を、大きなアミノ酸と第２の付着部位として使用されるシステインの間に挿入して、結合反応における大きなアミノ酸の考えられる立体障害を回避する。本発明の最も好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーＧＧＣ−ＮＨ２を、抗原又は抗原決定基のＣ末端と融合させる。
【０２０５】
抗原又は抗原決定基上に存在するシステイン残基は、活性化ＶＬＰ上でヘテロ二官能性架橋剤と反応するために、その還元状態でなければならない、すなわち、遊離システイン又はシステイン残基、および遊離スルフヒドリル基が利用可能でなければならない。付着部位として機能するためのシステイン残基が酸化形である場合、たとえばそれがジスルフィド架橋を形成する場合、たとえばＤＴＴ、ＴＣＥＰ又はβ−メルカプトエタノールを用いた、このジスルフィド架橋の還元が必要とされる。ＷＯ  ０２／０５６９０に記載されたように、低濃度の還元剤が結合と適合性があり、当業者が知るように、高濃度は結合反応を阻害し、この場合、結合前に、たとえば透析、ゲル濾過、又は逆相ＨＰＬＣによって、還元剤を除去するか、あるいはその濃度を低下させなければならない。
【０２０６】
前に記載した好ましい方法に従った、ヘテロ二官能性架橋剤を使用することによる抗原又は抗原決定基とＶＬＰの結合によって、抗原又は抗原決定基とＶＬＰを配向方式で結合させることができる。抗原又は抗原決定基とＶＬＰを結合させる他の方法には、抗原又は抗原決定基を、カルボジイミドＥＤＣ、およびＮＨＳを使用してＶＬＰと架橋させる方法がある。他の方法では、抗原又は抗原決定基を、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）などのホモ二官能性架橋剤、又はＶＬＰのアミン基又はカルボキシル基に対して反応性がある官能基を有する、他の知られているホモ二官能性架橋剤を使用して、ＶＬＰに付着させる。
【０２０７】
ＶＬＰと抗原又は抗原決定基を結合させる他の方法には、ＶＬＰをビオチン化させ、抗原又は抗原決定基をストレプトアビジン−融合タンパク質として発現させる方法、又はたとえばＷＯ  ００／２３９５５に記載されたような、抗原又は抗原決定基とＶＬＰの両方をビオチン化させる方法がある。この場合、抗原又は抗原決定基を、次のステップで加えられるＶＬＰの結合用に、遊離付着部位が依然として利用可能であるように、抗原又は抗原決定基とストレプトアビジンの比を調節することによって、ストレプトアビジン又はアビジンと最初に結合させることができる。あるいは、すべての成分を「ワン・ポット」反応で混合することができる。可溶形の受容体およびリガンドが利用可能であり、ＶＬＰ又は抗原又は抗原決定基と架橋することができる、他のリガンド−受容体対を、抗原又は抗原決定基とＶＬＰを結合させるための、結合物質として使用することができる。あるいは、リガンド又は受容体を抗原又は抗原決定基と融合させることができ、したがってそれぞれ受容体又はリガンドと化学的に結合又は融合するＶＬＰとの結合を仲介することができる。挿入又は置換によって、融合を行うこともできる。
【０２０８】
既に示したように、本発明の好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＶＬＰであり、より好ましい実施形態では、ＶＬＰはＲＮＡファージのＱβコート・タンパク質のＶＬＰである。
【０２０９】
１個又は数個の抗原分子、すなわち１個又は数個の抗原又は抗原決定基を、立体的に許容される場合は、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰの露出したリシン残基を介して、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のキャプシド又はＶＬＰの１個のサブユニットに付着させることができる。ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰ、および特にＱβコート・タンパク質のＶＬＰの特異的な特徴は、したがって、１個のサブユニット当たりに数個の抗原を結合させる可能性である。これによって、高密度の抗原配列を生成させることができる。
【０２１０】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基とウィルス様粒子の、結合および付着はそれぞれ、ウィルス様粒子の少なくとも１つの第１の付着部位と抗原又は抗原決定基の少なくとも１つの第２の付着部位の間の、それぞれ相互作用および会合によるものである。
【０２１１】
Ｑβコート・タンパク質のＶＬＰ又はキャプシドは、３個のリシン残基がキャプシドの内部に向きＲＮＡと相互作用し、４個の他のリシン残基がキャプシドの外側に露出している明確な配置の、明確な数のリシン残基をその表面上に示す。これらの明確な性質によって、リシン残基がＲＮＡと相互作用する粒子の内側とではなく、粒子の外側との抗原の付着が助長される。他のＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰも、その表面上に明確な数のリシン残基、およびこれらのリシン残基の明確な配置を有する。
【０２１２】
本発明の他の好ましい実施形態では、第１の付着部位はリシン残基であり、かつ／あるいは、第２の付着部位はスルフヒドリル基又はシステイン残基を含む。本発明の非常に好ましい実施形態では、第１の付着部位はリシン残基であり、第２の付着部位はシステイン残基である。
【０２１３】
本発明の非常に好ましい実施形態では、抗原又は抗原決定基を、システイン残基を介して、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰのリシン残基と、特にＱβコート・タンパク質のＶＬＰと結合させる。
【０２１４】
ＲＮＡファージに由来するＶＬＰの他の利点は、細菌中でのその高い発現収率であり、これによって多量の物質を手ごろなコストで生成させることができる。
【０２１５】
示したように、本発明の複合体および配列はそれぞれ、配列の表面上の抗原の、その十分に編成された構造、寸法、および反復性が、従来技術の複合体と異なる。さらに、ＶＬＰを担体として使用することによって、抗原密度がさまざまである、確固とした抗原配列および複合体をそれぞれ形成することができる。特に、ＲＮＡファージのＶＬＰの使用、ここでは特にＲＮＡファージのＱβコート・タンパク質のＶＬＰの使用によって、非常に高いエピトープ密度を得ることができる。特に、ヒトＡβ１−６ペプチドとＱβコート・タンパク質のＶＬＰを結合させることによって、サブユニット当たり１．５のエピトープを超える密度に達すると思われる。高いエピトープ密度を有する、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰの組成物の調製は、本出願の教示を使用して行うことができる。本発明の好ましい実施形態では、抗原又は抗原決定基をＱβコート・タンパク質のＶＬＰと結合させるとき、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９以上の、サブユニット当たりの抗原又は抗原決定基の平均数が好ましい。
【０２１６】
本明細書で定義する第２の付着部位は、抗原又は抗原決定基と共に本来存在するものか、あるいは本来存在しないものであってよい。抗原又は抗原決定基上に適切な本来存在する第２の付着部位が存在しない場合、したがって、このような非天然の第２の付着部位は、抗原に設計しなければならない。
【０２１７】
前に記載したように、４個のリシン残基がＱβコート・タンパク質のＶＬＰの表面上で露出している。典型的には、これらの残基は、架橋剤分子との反応によって誘導体化される。露出したすべてのリシン残基が抗原と結合することができるわけではない場合、架橋剤と反応したリシン残基が、誘導体化ステップ後にε−アミノ基と結合した架橋剤分子と共に残る。これが１個又は数個の正電荷の消失をもたらし、このことはＶＬＰの溶解度および安定性に不利益である可能性がある。以下に記載した開示するＱβコート・タンパク質変異体中と同様に、いくつかのリシン残基をアルギニンで置換することによって、我々は正電荷の過剰な消失を妨げる。なぜなら、アルギニン残基は架橋剤とは反応しないからである。さらに、リシン残基をアルギニンで置換することによって、より明確な抗原配列をもたらすことができる。なぜなら、抗原との反応用に利用可能な部位はより少ないからである。
【０２１８】
したがって、露出したリシン残基は、本出願中に開示する以下のＱβコート・タンパク質変異体、および変異体Ｑβ  ＶＬＰ：Ｑβ−２４０（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２３）、Ｑβ−２５０（Ｌｙｓ  ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号２５）およびＱβ−２５９（Ｌｙｓ  ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号２７）中において、アルギニンで置換した。構築体をクローニングし、タンパク質を発現させ、ＶＬＰを精製し、ペプチドおよびタンパク質抗原との結合用に使用した。Ｑβ−２５１（配列番号２６）も構築し、Ｑβ−２５１コート・タンパク質のＶＬＰの発現、精製および結合の仕方の指針は、本出願を通じて見ることができる。
【０２１９】
他の実施形態では我々は、さらに高い密度配列の抗原を得るのに適した、１個の追加的なリシン残基を有するＱβ変異体コート・タンパク質を開示する。この変異体Ｑβコート・タンパク質、Ｑβ−２４３（Ａｓｎ  １０−Ｌｙｓ；配列番号２４）をクローニングし、タンパク質を発現させ、キャプシド又はＶＬＰを単離および精製し、追加的なリシン残基を導入することは、キャプシド又はＶＬＰへのサブユニットの自己組織化と適合性があることを示す。したがって、抗原又は抗原決定基の配列および複合体はそれぞれ、Ｑβコート・タンパク質変異体のＶＬＰを使用して作製することができる。抗原とＶＬＰ、特にＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰを結合させる、特に好ましい方法は、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰの表面上に存在するリシン残基と、抗原に加えられたシステイン残基を連結させることである。システイン残基が第２の付着部位として有効であるためには、スルフヒドリル基が結合用に利用可能でなければならない。したがって、システイン残基はその還元状態でなければならない、すなわち、遊離システイン又はシステイン残基、および遊離スルフヒドリル基が利用可能でなければならない。第２の付着部位として機能するためのシステイン残基が酸化形である場合、たとえばそれがジスルフィド架橋を形成する場合、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ又はβ−メルカプトエタノールを用いた、このジスルフィド架橋の還元が必要とされる。還元剤の濃度、および抗原に対する還元剤のモル過剰は、それぞれの抗原に関して調節しなければならない。１０μＭ以下の低い濃度から始まり、１０〜２０ｍＭ以上の還元剤濃度までの滴定範囲を、必要な場合は試験し、抗原と担体の結合を評価する。ＷＯ  ０２／０５６９０５に記載されたように、低濃度の還元剤が結合反応と適合性があるが、当業者が知るように、高濃度は結合反応を阻害し、この場合、たとえば透析、ゲル濾過、又は逆相ＨＰＬＣによって、還元剤を除去するか、あるいはその濃度を低下させなければならない。透析又は平衡化バッファーのｐＨは７未満、好ましくは６未満であることが有利である。低ｐＨバッファーと抗原の活性又は安定性の適合性を、試験しなければならない。
【０２２０】
ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰ上のエピトープ密度は、架橋剤および他の反応条件を選択することによって調節することができる。たとえば、架橋剤Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳおよびＳＭＰＨによって、高いエピトープ密度に達することが典型的には可能である。誘導体化は高濃度の還元剤によって確かに影響を受け、反応条件の操作を使用して、ＲＮＡファージのコート・タンパク質のＶＬＰ、および特にＱβコート・タンパク質のＶＬＰと結合する、抗原の数を調節することができる。
【０２２１】
非天然の第２の付着部位を設計する前に、それが融合、挿入、又は一般には設計されるべき位置を選択しなければならない。第２の付着部位の位置の選択は、たとえば抗原の結晶構造に基づくものであってよい。抗原のこのような結晶構造によって、分子のＣ又はＮ末端の利用性（たとえば溶媒に対するそれらの影響の受けやすさから決定する）に関する、あるいは第２の付着部位として使用するのに適した残基、システイン残基などの溶媒への暴露に関する、情報が与えられる可能性がある。Ｆａｂ断片の場合と同様に、露出したジスルフィド架橋も第２の付着部位の源である可能性がある。なぜなら、それらは一般に、たとえば２−メルカプトエチルアミン、ＴＣＥＰ、β−メルカプトエタノール又はＤＴＴを用いた穏かな還元によって、１種のシステイン残基に転換することができるからである。抗原の免疫原性に影響を与えない、穏かな還元条件を選択する。一般に、自己抗原による免疫化が、この自己抗原とその本来のリガンドの相互作用の阻害を目的とする場合、第２の付着部位を、それが本来のリガンドと相互作用する部位に対する抗体を生成させることができるように加える。したがって、第２の付着部位の位置は、第２の付着部位又はそれを含む任意のアミノ酸リンカーからの立体障害が回避されるように選択する。他の実施形態では、自己抗原とその本来のリガンドの相互作用部位とは異なる部位で指示される、抗体応答が望まれる。このような実施形態では、第２の付着部位は、それが自己抗原とその本来のリガンドの相互作用部位に対する抗体の生成を妨げるように、選択することができる。
【０２２２】
第２の付着部位の位置を選択する際の他の基準には、抗原のオリゴマー化状態、オリゴマー化の部位、補助因子の存在、および抗原構造および配列中の部位を示す実験の証拠の有用性があり、抗原の改変は自己抗原の機能、又は自己抗原を認識する抗体の生成と適合性がある。
【０２２３】
非常に好ましい実施形態では、抗原又は抗原決定基は、それぞれコア粒子およびＶＬＰ又はＶＬＰサブユニット上の第１の付着部位と会合することができる、１つの第２の付着部位、又は１つの反応付着部位を含む。これによって、少なくとも１個、ただし典型的には２個以上、好ましくは１０、２０、４０、８０、１２０個を超える抗原とコア粒子およびＶＬＰそれぞれの、明確で均一な結合および会合がそれぞれさらに確実になる。したがって、１つの第２の付着部位又は１つの反応付着部位を抗原上に与えることによって、１つの均一な型の結合および会合がそれぞれ確実になり、非常に整然とした繰り返し配列がもたらされる。たとえば、結合および会合がそれぞれ、リシン（第１の付着部位として）とシステイン（第２の付着部位として）の相互作用によって行われる場合、本発明のこの好ましい実施形態に従って、抗原当たり１個のシステイン残基のみが、このシステイン残基が抗原上に本来存在するかあるいは存在しないかどうかとは無関係に、それぞれＶＬＰおよびコア粒子の第１の付着部位と、それぞれ結合および会合することができることが確実になる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、抗原上での第２の付着部位の設計には、本発明の開示に従った、第２の付着部位として適切なアミノ酸を含むアミノ酸リンカーの融合が必要である。したがって、本発明の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーを、少なくとも１つの共有結合によって、抗原又は抗原決定基と結合させる。アミノ酸リンカーは第２の付着部位を含むか、あるいはこれらからなることが好ましい。他の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーは、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む。他の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーはシステインである。アミノ酸リンカーを選択するいくつかの基準、および本発明のアミノ酸リンカーの他の好ましい実施形態は、前で既に述べてきている。
【０２２５】
本発明の他の特定の実施形態では、付着部位がＨＢｃＡｇとイン・フレームで融合したリシン又はシステイン残基であるように選択する。好ましい実施形態では、３個のロイシンリンカーによって、抗原をＨＢｃＡｇのＣ末端と融合させる。
【０２２６】
抗原又は抗原決定基が、リシン残基によってＶＬＰと連結しているとき、１個又は複数個の本来存在するリシン残基、およびＨＢｃＡｇ変異体中に存在する他のリシン残基を置換するかあるいは欠失させることが、有利である可能性がある。
【０２２７】
多くの場合、本来存在するリシン残基が排除されると、抗原又は抗原決定基用の付着部位として、他のリシンがＨＢｃＡｇ中に導入される。このようなリシン残基を挿入するための方法は、当分野で知られている。既存のリシン残基を除去せずに、リシン残基を加えることもできる。
【０２２８】
ＨＢｃＡｇのＣ末端は、このタンパク質の核の局在を指示することが示されてきている（Ｅｃｋｈａｒｄｔ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５７５〜５８２（１９９１））。さらに、タンパク質のこの領域は、核酸と結合する能力をＨＢｃＡｇに与えるとも考えられている。
【０２２９】
示したように、本発明を実施する際に使用するのに適したＨＢｃＡｇは、Ｎ末端切断型変異体も含む。適切な切断型変異体は、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、又は１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されている、改変型ＨＢｃＡｇを含む。しかしながら、ウィルス様粒子を構成するサブユニットの配列内に内部欠失を含む、ウィルス様粒子の変異体も、本発明に従って適切である。ただし、それらはウィルス様粒子の整然とした、あるいは粒子状の構造と適合性があるものとする。たとえば、ＨＢｃＡｇの配列内の内部欠失が適切である（Ｐｒｅｉｋｓｃｈａｔ，Ｐ．他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１７７７〜１７８８（１９９９））。
【０２３０】
本発明を実施する際に使用するのに適した他のＨＢｃＡｇには、ＮおよびＣ末端切断型変異体がある。適切な切断型変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５、および１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５、３６、３７、３８、３９  ４０、４１、４２又は４８個のアミノ酸がＣ末端から除去されている、ＨＢｃＡｇがある。
【０２３１】
本発明のワクチン組成物は、異なるＨＢｃＡｇの混合物を含むことができる。したがって、これらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇから構成されていてよい。たとえば、１つ又は複数のアミノ酸残基が変わっている（たとえば、欠失、挿入、あるいは置換されている）、「野生型」ＨＢｃＡｇおよび改変型ＨＢｃＡｇを含む、ワクチン組成物を調製することができると思われる。しかしながら、大部分の適用例では、ただ１つの型のＨＢｃＡｇが使用される。
【０２３２】
本発明は、広くさまざまな抗原に適用することができる。好ましい実施形態では、抗原はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドである。他の実施形態では、抗原はＤＮＡである。抗原は脂質、炭水化物、又は有機分子、特にニコチンなどの小さな有機分子であってもよい。
【０２３３】
本発明の抗原は、以下の：（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｂ）感染病に対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；（ｄ）家畜又はペットの免疫応答を誘導するように適合させたポリペプチド；および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）で述べた任意のポリペプチドの断片（たとえば、ドメイン）からなる群から選択することができる。
【０２３４】
好ましい抗原には、病原体（たとえば、ウィルス、細菌、寄生虫、真菌）由来の抗原、および腫瘍由来の抗原（特に腫瘍関連抗原、すなわち「腫瘍マーカー」）がある。他の好ましい抗原は、自己抗原である。
【０２３５】
実施例中に記載した特定の実施形態では、抗原は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）由来のペプチドｐ３３である。ｐ３３ペプチドは、最もよく研究されているＣＴＬエピトープの１つである（Ｐｉｒｃｈｅｒ他、「Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｖａｒｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５５９（１９８９）；Ｔｉｓｓｏｔ他、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ａ  ｐＭＨＣ  ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ、「ＪＩｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３６：１４７（２０００）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｆｏｕｒ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｃａ２＋−ｓｉｇｎａｌｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｇｏｎｉｓｔｓ，ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：３４１４（１９９７）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５７６４（１９９７）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＣＲ−ｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ａｇｏｎｉｓｔ／ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｉｃｔｌｙ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２１９５（１９９７）；Ｂａｃｈｍａｎｎ他、「Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＬＦＡ−１  ａｎｄ  ＣＤ２８  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：５４９（１９９７）」。ｐ３３特異的Ｔ細胞は、トランスジェニック・マウスにおいて致命的糖尿病を誘導し（Ｏｈａｓｈｉ他、「Ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ“ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」、Ｃｅｌｌ  ６５：３０５（１９９１））、かつ、ｐ３３を発現する腫瘍細胞の増殖を妨げることができることが示されてきている（Ｋｕｎｄｉｇ他、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｃｔ  ａｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１３４３（１９９５）；Ｓｐｅｉｓｅｒ他、「ＣＴＬ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｃａｕｓｅ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６４５（１９９７））。したがって、この特異的なエピトープは、自己免疫、腫瘍免疫学、およびウ��ルス性疾患の研究に非常によく適合する。
【０２３６】
本発明の１つの特定の実施形態では、抗原又は抗原決定基は、感染症を予防するのに有用なものである。このような治療は、広範囲の宿主、たとえばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、他の哺乳動物種および非哺乳動物種に影響を与える、広くざまざまな感染症を治療するために有用であろう。治療可能な感染症は、当業者によく知られており、たとえばＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウィルス肝炎、エプスタインバー、ポリオ、ウィルス脳炎群、はしか、水痘、パピローマ・ウィルスなどのウィルスが病因の感染；又は細菌が病因の感染、肺炎、結核、梅毒など；又は寄生虫が病因の感染、マラリア症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などがある。したがって、本発明の組成物用に選択される抗原又は抗原決定基は、医学分野の当業者によく知られており、抗原又は抗原決定基の例には以下のものがある：ＨＩＶ抗原ｇｐ１４０およびｇｐ１６０；インフルエンザ抗原ヘマグルチニン、Ｍ２タンパク質およびノイラミニダーゼ、Ｂ型肝炎表面抗原、又はマラリアのコアおよび周辺胞子のタンパク質、又はその断片。
【０２３７】
前に論じたように、抗原は、天然源に由来するかあるいは合成的な、ウィルス、細菌および真菌、およびこれらの断片などの、感染性微生物を含む。ヒトおよびヒト以外の脊椎動物の感染性ウィルスは、レトロ・ウィルス、ＲＮＡウィルスおよびＤＮＡウィルスを含む。レトロ・ウィルスの群は、単純レトロ・ウィルスおよび複合レトロ・ウィルスを含む。単純レトロ・ウィルスは、Ｂ型レトロ・ウィルス、Ｃ型レトロ・ウィルスおよびＤ型レトロ・ウィルスの亜群を含む。Ｂ型レトロ・ウィルスの一例は、マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）である。Ｃ型レトロ・ウィルスは、Ｃ型群Ａ（ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、鳥類白血病ウィルス（ＡＬＶ）、および鳥類骨髄芽球病ウィルス（ＡＭＶ）を含む）、およびＣ型群Ｂ（ネズミ白血病ウィルス（ＭＬＶ）、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ネズミ肉腫ウィルス（ＭＳＶ）、テナガザル白血病ウィルス（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウィルス（ＲＶ）およびサル肉腫ウィルス（ＳＳＶ）を含む）の亜群を含む。Ｄ型レトロ・ウィルスは、Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒサル・ウィルス（ＭＰＭＶ）およびサルの１型レトロ・ウィルス（ＳＲＶ−１）を含む。複合レトロ・ウィルスは、レンチ・ウィルス、Ｔ細胞白血病ウィルス、および泡沫状ウィルスの亜群を含む。レンチ・ウィルスはＨＩＶ−１を含むが、ＨＩＶ−２、ＳＩＮ、ビスナ・ウィルス、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＮ）、およびウマ伝染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）も含む。Ｔ細胞白血病ウィルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウィルス（ＳＴＬＶ）、およびウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）を含む。泡沫状ウィルスは、ヒト泡沫状ウィルス（ＨＦＶ）、サル泡沫状ウィルス（ＳＦＶ）、およびウシ泡沫状ウィルス（ＢＦＶ）を含む。
【０２３８】
脊椎動物における抗原であるＲＮＡウィルスの例には、以下のものがあるが、これらだけには限られない：オルトレオ・ウィルス属（多数の血清型の哺乳動物および鳥類レトロ・ウィルス）、オルビ・ウィルス属（ブルータング・ウィルス、ユージェニア・ウィルス、ケメロボ・ウィルス、アフリカ馬疫ウィルス、およびコロラド・ダニ熱ウィルス）、ロタ・ウィルス属（ヒト・ロタ・ウィルス、ネブラスカ子ウシ下痢ウィルス、ネズミ・ロタ・ウィルス、サル・ロタ・ウィルス、ウシ又はヒツジ・ロタ・ウィルス、鳥類ロタ・ウィルス）を含むレオ・ウィルス科のメンバー；腸内ウィルス属（ポリオ・ウィルス、コクサッキー・ウィルスＡおよびＢ、ＥＣＨＯ（ｅｎｔｅｒｉｃ  ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｐｈａｎ）ウィルス、Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ型肝炎ウィルス、サル腸内ウィルス、ネズミ脳脊髄炎（ＭＥ）ウィルス、ポリオウィルス・ムリス、ウシ腸内ウィルス、ブタ腸内ウィルス、カルジオ・ウィルス属（脳心筋炎ウィルス（ＥＭＣ）、メンゴ・ウィルス）、ライノ・ウィルス属（少なくとも１１３の亜型を含むヒト・ライノウィルス；他のライノ・ウィルス）、アプト・ウィルス属（口蹄病（ＦＭＤＶ）を含むピコルナ・ウィルス科；ブタ小水泡性発疹ウィルス、サンミゲル・アシカウィルス、ネコ・ピコルナウィルスおよびノーウォーク・ウィルスを含むカルシ・ウィルス科；アルファ・ウィルス属（東部ウマ脳脊髄炎ウィルス、セムリキ森林ウィルス、シンビス・ウィルス、チクングンヤ・ウィルス、Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇウィルス、ロスリバー・ウィルス、ベネズエラ・ウマ脳脊髄炎ウィルス、西部ウマ脳脊髄炎ウィルス）、フラビ・ウィルス属（蚊媒介黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本脳炎ウィルス、セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイル・ウィルス、クンジン・ウィルス、中央ヨーロッパ・ダニ媒介ウィルス、極東ダニ媒介ウィルス、キャサヌール森林ウィルス、跳躍病（ｌｏｕｐｉｎｇ  Ｉｌｌ）ウィルス、ポワッサン・ウィルス、オムスク出血性熱ウィルス）、ルビ・ウィルス属（風疹ウィルス）、ペスチ・ウィルス属（粘膜病ウィルス、豚コレラ・ウィルス、ボルダ−病ウィルス）を含むトガ・ウィルス科；ブンヤ・ウィルス属（ブンヤムウェラおよび関連ウィルス、カリフォルニア脳炎群ウィルス）、フレボ・ウィルス属（シシリアサシチョウバエ・ウィルス、リフトバレー熱ウィルス）、ナイロ・ウィルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウィルス、ナイロビ・ヒツジ病ウィルス）、およびユーク・ウィルス属（ユークニエミおよび関連ウィルス）を含むブンヤ・ウィルス科；インフルエンザ・ウィルス属（インフルエンザ・ウィルスＡ型、多くのヒト亜型）；ブタ・インフルエンザ・ウィルス、および鳥類およびウマ・インフルエンザ・ウィルス；インフルエンザＢ型（多くのヒト亜型）、およびインフルエンザＣ型（考えられる別の属）を含むオルトミクソ・ウィルス科；パラミクソ・ウィルス属（パラインフルエンザ・ウィルス１型、センダイ・ウィルス、赤血球吸着ウィルス、パラインフルエンザ・ウィルス２〜５型、ニューキャッスル病ウィルス、おたふくかぜウィルス）、麻疹ウィルス属（はしかウィルス、亜急性硬化性全脳炎���ィルス、ジステンパー・ウィルス、牛疫ウィルス）、ニューモ・ウィルス属（ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウィルス、およびマウスの肺炎ウィルス）森林ウィルス、シンビス・ウィルス、チクングンヤ・ウィルス、Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇウィルス、ロスリバー・ウィルス、ベネズエラ・ウマ脳脊髄炎ウィルス、西部ウマ脳脊髄炎ウィルス）、フラビ・ウィルス属（蚊媒介黄熱病ウィルス、デング熱ウィルス、日本脳炎ウィルス、セントルイス脳炎ウィルス、マレーバレー脳炎ウィルス、西ナイル・ウィルス、クンジン・ウィルス、中央ヨーロッパ・ダニ媒介ウィルス、極東ダニ媒介ウィルス、キャサヌール森林ウィルス、跳躍病ウィルス、ポワッサン・ウィルス、オムスク出血性熱ウィルス）、ルビ・ウィルス属（風疹ウィルス）、ペスチ・ウィルス属（粘膜病ウィルス、豚コレラ・ウィルス、ボルダ−病ウィルス）を含むパラミクソ・ウィルス科；ブンヤ・ウィルス属（ブンヤムウェラおよび関連ウィルス、カリフォルニア脳炎群ウィルス）、フレボ・ウィルス属（シシリアサシチョウバエ・ウィルス、リフトバレー熱ウィルス）、ナイロ・ウィルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウィルス、ナイロビ・ヒツジ病ウィルス）、およびユーク・ウィルス属（ユークニエミおよび関連ウィルス）を含むブンヤ・ウィルス科；インフルエンザ・ウィルス属（インフルエンザ・ウィルスＡ型、多くのヒト亜型）；ブタ・インフルエンザ・ウィルス、および鳥類およびウマ・インフルエンザ・ウィルス；インフルエンザＢ型（多くのヒト亜型）、およびインフルエンザＣ型（考えられる別の属）を含むオルトミクソ・ウィルス科；パラミクソ・ウィルス属（パラインフルエンザ・ウィルス１型、センダイ・ウィルス、赤血球吸着ウィルス、パラインフルエンザ・ウィルス２〜５型、ニューキャッスル病ウィルス、おたふくかぜウィルス）、麻疹ウィルス属（はしかウィルス、亜急性硬化性全脳炎ウィルス、ジステンパー・ウィルス、牛疫ウィルス）、ニューモ・ウィルス属（ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウィルス、およびマウスの肺炎ウィルス）を含むパラミクソ・ウィルス科；ベシクロ・ウィルス属（ＶＳＶ）、キャンディピュラ・ウィルス、フランダース−ハートパーク・ウィルス）、リッサ・ウィルス属（狂犬病ウィルス）、魚類ラブド・ウィルスおよびフィロ・ウィルス（マールブルグ・ウィルスおよびエボラ・ウィルス）を含むラブド・ウィルス科；リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭ）、タカリベ・ウィルス複合体、およびラッサ・ウィルスを含む；コロナ・ウィルス科、伝染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウィルス、ヒト腸内コロナ・ウィルス、およびネコ伝染性腹膜炎（ネコ・コロナ・ウィルス）を含むアレナ・ウィルス科。
【０２３９】
脊椎動物における抗原である例示的なＤＮＡウィルスの例には、以下のものがあるが、これらだけには限られない：オルトポックス・ウィルス属（大痘そう、小痘そう、サル痘ポックス・ワクシニア、牛痘、野牛痘、ウサギ痘、エクトロメリア）、レポリポックス・ウィルス属（ミキソーマ、繊維腫）、アビポックス・ウィルス属（鶏痘、他の鳥類ポックス・ウィルス）、カプリポックス・ウィルス属（ヒツジ痘、ヤギ痘）、スイポックス・ウィルス属（豚痘）、パラポックス・ウィルス属（接触伝染性推定皮膚炎ウィルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウィルス）を含むポックス・ウィルス科；イリド・ウィルス科（アフリカ豚コレラ・ウィルス、カエル・ウィルス２および３、魚類のリンホシスチス・ウィルス）；アルファ−ヘルペス・ウィルス（単純ヘルペス１および２型、水痘−帯状疱疹、ウマ流産ウィルス、ウマ・ヘルペス・ウィルス２および３、仮性狂犬病ウィルス、伝染性ウシ角結膜炎ウィルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウィルス、ネコ鼻気管炎ウィルス、伝染性咽頭気管炎ウィルス）、ベータ−ヘルペス・ウィルス（ヒト・サイトメガロ・ウィルス、およびブタ、サルおよびげっ歯類のサイトメガロ・ウィルス）；ガンマ−ヘルペス・ウィルス（エスタイン−バー・ウィルス（ＥＢＶ）、マレック病ウィルス、リスザル・ヘルペス・ウィルス、クモザル・ヘルペス・ウィルス、ワタオウサギ・ヘルペス・ウィルス、モルモット・ヘルペス・ウィルス、リュッケ腫瘍ウィルス）を含むヘルペス・ウィルス科；マスト・アデノウィルス属（ヒト亜群Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ、および非分類種；サル・アデノウィルス（少なくとも２３の血清型）、伝染性イヌ肝炎、およびウシ、ブタ、ヒツジ、カエル、および多くの他の種のアデノ・ウィルス、アビアデノ・ウィルス属（鳥類アデノ・ウィルス）；および非培養性アデノ・ウィルスを含むアデノ・ウィルス科；パピローマ・ウィルス属（ヒト・パピローマ・ウィルス、ウシ・パピローマ・ウィルス、ショープラビット・パピローマ・ウィルス、および他の種のさまざまな病原性パピローマ・ウィルス）、ポリオーマ・ウィルス属（ポリオーマ・ウィルス、ＳＶ−４０（ｓｉｍｉａｎ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ＲＫＶ（ｒａｔ  ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、Ｋウィルス、ＢＫウィルス、ＪＣウィルス、および他の霊長類のポリオーマ・ウィルス、リンパ親和性パピローマ・ウィルスなど）を含むパポ・ウィルス科；パルボ・ウィルス科、アデノ関連ウィルス属、パルボ・ウィルス属（ネコ汎白血球減少症ウィルス、ウシ・パルボ・ウィルス、イヌ・パルボ・ウィルス、アリューシャンミンク病ウィルスなど）を含む。最後に、ＤＮＡウィルスは、前述の科と一致しないウィルス、クルおよびクロイツフェルト−ヤコブ病ウィルス、および慢性的な伝染性神経障害物質（ＣＨＩＮＡウィルス）などを含むことができる。
【０２４０】
それぞれの前述の列挙は例示的なものであり、制限を目的とするものではない。
【０２４１】
本発明の特定の実施形態では、抗原は１つ又は複数の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、又はこの２つのエピトープの組合せを含む。
【０２４２】
ヒトの抗原特異的な免疫応答を高めることに加えて、好ましい実施形態の方法は、他の哺乳動物又は動物、たとえば、鳥類、メンドリ、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジなどを治療するのに非常によく適している。鳥類は、多くの型の感染の主な標的である。
【０２４３】
ニワトリにおける一般的な感染の一例は、ニワトリ伝染性貧血ウィルス（ＣＩＡＶ）である。ＣＩＡＶは、マレック病ワクチン接種の中断の調査中に、１９７９年に日本で最初に単離された（Ｙｕａｓａ他、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．２３：３６６〜３８５（１９７９））。そのとき以来ＣＩＡＶは、あらゆる主要な家禽類製造国で、商業用の家禽類において検出されてきている（ｖａｎ  Ｂｕｌｏｗ他、ｐｐ．６９０〜６９９「Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ」中、９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）。
【０２４４】
鳥類のワクチン接種は、他の脊椎動物と同様に、任意の年齢で行うことができる。通常ワクチン接種は、生きている微生物に関しては１２週齢までで、不活性微生物又は他の型のワクチンに関しては１４〜１８週の間で行う。卵内ワクチン接種に関しては、ワクチン接種は、胚分化の最後の４分の１で行うことができる。ワクチンは、皮下に、スプレーによって、経口的に、眼内に、気管内に、鼻に、卵内に、あるいは本明細書に記載した他の方法によって、投与することができる。
【０２４５】
畜牛および家畜も、感染を受けやすい。これらの動物に影響を与える疾患によって、重大な経済的損失が、特に畜牛において生じる可能性がある。本発明の方法を使用して、家畜、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよびヤギなどの感染に対して保護することができる。
【０２４６】
ウシは、ウシ・ウィルスによって感染される可能性がある。ウシ・ウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）は、小さな被包されたプラス鎖ＲＮＡウィルスであり、豚コレラ・ウィルス（ＨＯＣＶ）およびヒツジ・ボルダ−病ウィルス（ＢＤＶ）と共にペスト・ウィルス属に分類される。ペスト・ウィルスは以前はトガ・ウィルス科に分類されていたが、いくつかの研究によって、フラビ・ウィルスおよびＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）属と共にフラビ・ウィルス科へのそれらの再分類が示唆されてきている。
【０２４７】
ウマ・ヘルペス・ウィルス（ＥＨＶ）は、無症状から致死的疾患まで、ウマ中でさまざまな感染を引き起こす、抗原性が異なる生物学的物質の群を含む。これらは、ウマの偏在的な病原体である、ウマ・ヘルペス・ウィルス−１（ＥＨＶ−１）を含む。ＥＨＶ−１は、流産、呼吸管疾患、および中枢神経系障害の多発と関連がある。他のＥＨＶには、ＥＨＶ−２、又はウマ・サイトメガロ・ウィルス、ＥＨＶ−３、ウマ交疹ウィルス、および以前はＥＨＶ−１の亜型２として分類されたＥＨＶ−４がある。
【０２４８】
ヒツジおよびヤギは、ビスナ−マエディを含めた、さまざまな危険な微生物によって感染される可能性がある。
【０２４９】
サル、類人猿およびマカークなどの霊長類は、サル免疫不全ウィルスによって感染される可能性がある。細胞−ウィルスおよび無細胞の全サル免疫不全不活化ワクチンは、マカークを保護することが報告されてきている（Ｓｔｏｔｔ他、Ｌａｎｃｅｔ  ３６：１５３８〜１５４１（１９９０）；Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：６３５３〜６３５７（１９８９）；Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２９３〜１２９７（１９８９）；およびＣａｒｌｓｏｎ他ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：１２３９〜１２４６（１９９０））。組み換えＨＩＶ  ｇｐ１２０ワクチンは、チンパンジーを保護することが報告されてきている（Ｂｅｒｍａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：６２２〜６２５（１９９０））。
【０２５０】
飼育用および野生型のネコは、さまざまな微生物の感染を受けやすい。たとえば、ネコ伝染性腹膜炎は、飼育用および野生型のネコ科動物、ライオン、ヒョウ、チーター、およびジャガーなどにおいて発生する疾患である。ネコ科動物においてこの型および他の型の病原性微生物による、感染を予防することが望ましいときは、本発明の方法を使用してネコ科動物をワクチン接種して、それらを感染に対して予防することができる。
【０２５１】
飼育用ネコ科動物は、ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウィルス（ＦｅＳＶ）、内因性Ｃ型腫瘍ウィルス（ＲＤ−１１４）、およびネコ融合細胞形成ウィルス（ＦｅＳＦＶ）だけには限られないが、これらを含めた、いくつかのレトロ・ウィルスによって感染状態になる可能性がある。ネコＴリンパ親和性レンチ・ウィルス（ネコ免疫不全ウィルスとも呼ばれる）の発見は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：７９０〜７９３（１９８７）中で最初に報告された。ネコ伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、飼育用および野生型ネコ科動物において、予測外に生じる散在性疾患である。ＦＩＰは主に飼育用ネコ科動物の疾患であるが、それがライオン、クーガー、ヒョウ、チーター、およびジャガーにおいて診断されてきている。ＦＩＰに苦しめられているより小さな野生型のネコ科動物には、オオヤマネコおよびカラカル、サバクネコおよびマヌルネコがある。
【０２５２】
魚類、甲殻類、又は他の水生生命体のウィルス性および細菌性疾患は、水産養殖産業の重大な問題となる。孵化用タンク又は閉じられた海洋養殖領域中の動物の密度が高いために、感染症が、たとえば魚類、甲殻類、又は他の水生生命体の設備中の、多量の在庫を根絶する可能性がある。疾患の予防は、ひとたび疾患が進行した後の介入よりも、魚類へのこれらの脅威に対する望ましい救済策である。魚類をワクチン接種することが唯一の予防法であり、これによって免疫性による長期の保護を与えることができる。核酸系の魚類のワクチン接種は、たとえば米国特許第５，７８０，４４８号中に記載されている。
【０２５３】
魚類の免疫系は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、リンパ球、補体、および免疫グロブリンの存在などの、哺乳動物の免疫系と類似した多くの特徴を有する。魚類は、哺乳動物のＢおよびＴ細胞のそれと多くの点で類似していると思われる役割がある、リンパ球亜群を有する。ワクチンは経口的に、あるいは液浸又は注射によって、投与することができる。
【０２５４】
水生種には、魚類、甲殻類、又は他の水生動物があるが、これらだけには限られない。魚類はあらゆる脊椎動物魚類を含み、これらは硬骨魚又は軟骨魚、たとえばサケ、コイ、ナマズ、イエローテイル、タイおよびハタ科の魚などであってよい。サケ科は、マス（ニジマスを含む）、サケおよびアルプスイワナを含む、魚類の科である。甲殻類の例には、クラム、ロブスター、小エビ、カニおよびカキがあるが、これらだけには限られない。他の養殖水生動物には、ウナギ、イカおよびタコがあるが、これらだけには限られない。
【０２５５】
ウィルス性の水産養殖病原体のポリペプチドには、ウィルス出血性敗血症ウィルス（ＶＨＳＶ）の糖タンパク質又は核タンパク質；伝染性造血壊死ウィルス（ＩＨＮＶ）のＧ又はＮタンパク質；伝染性膵臓壊死ウィルス（ＩＰＮＶ）のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３又はＮ構造タンパク質；コイ・スプリング・ウィルス血症（ＳＶＣ）のＧタンパク質；およびアメリカナマズ・ウィルス（ＣＣＶ）の膜関連タンパク質、外被又はキャプシド・タンパク質又は糖タンパク質があるが、これらだけには限られない。
【０２５６】
細菌性病原体のポリペプチドには、フランケル症を引き起こすＡｅｒｏｍｏｎｉｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの、鉄制御型外膜タンパク質、（ＩＲＯＭＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、およびＡ−タンパク質、細菌性腎臓病（ＢＫＤ）を引き起こすＲｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍのｐ５７タンパク質、Ｙｅｒｓｉｎｉｏｓｉｓの主要表面結合抗原（ｍｓａ）、表面発現細胞毒素（ｍｐｒ）、表面発現溶血素（ｉｓｈ）、およびべん毛抗原；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｏｓｉｓの細胞外タンパク質（ＥＣＰ）、鉄制御型外膜タンパク質、（ＩＲＯＭＰ）、および構造タンパク質；Ｖｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍおよびＶ．ｏｒｄａｌｉｉのＯＭＰおよびべん毛タンパク質；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｏｓｉｓ  ｉｃｔａｌｕｒｉおよびＥ．ｔａｒｄａのべん毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、アロＡ、およびプルＡ；およびＩｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原；およびＣｙｔｏｐｈａｇａ  ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造および調節タンパク質；およびＲｉｃｋｅｔｔｓｉａの構造および調節タンパク質があるが、これらだけには限られない。
【０２５７】
寄生虫病原体のポリペプチドには、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原があるが、これだけには限られない。
【０２５８】
本発明の他の態様では、「自己」遺伝子産物（たとえば、腫瘍壊死因子）によって引き起こされるか悪化させられる疾患又は状態を、予防するかつ／あるいは低下させるための方法で使用するのに適した、ワクチン組成物を提供する。したがって、本発明のワクチン組成物は、「自己」遺伝子産物によって引き起こされるか悪化させられる疾患又は状態を、予防するかつ／あるいは低下させる抗体の生成をもたらす、組成物を含む。このような疾患又は状態の例には、移植片と宿主の疾患、ＩｇＥ仲介型アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸障害症候群、クローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキン・リンパ腫（ＮＨＬ）、グレーブス病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性自己免疫疾患、重症筋無力症、免疫増殖性疾患リンパ節症（ＩＰＬ）、血管性免疫増殖性リンパ節症（ＡＩＬ）、免疫芽細胞リンパ節症（ＩＢＬ）、慢性関節リウマチ、糖尿病、プリオン病、多発性硬化症、アルツハイマー病および骨粗しょう症がある。
【０２５９】
関連する特定の実施形態では、本発明の組成物は、アレルギー、癌又は薬物中毒を治療及び／又は予防するために使用することができる、免疫療法剤である。
【０２６０】
組成物を調製するため、およびアレルギーを治療する方法において使用するための、抗原又は抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原又は抗原決定基の代表的な例には、以下のもの：ハチ毒素ホスホリパーゼＡ２、ＢｅｔｖＩ（カバノキ花粉アレルゲン）、５ＤｏｌｍＶ（スズメバチ科のハチの毒素アレルゲン）、およびＤｅｒｐＩ（室内埃ダニ・アレルゲン）、およびそれぞれの断片があり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【０２６１】
癌を治療する組成物および方法に関する、抗原又は抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われ（参照により組み込まれている、Ｒｅｎｋｖｉｓｔ他、Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：３〜１５（２００１）を参照のこと）、このような抗原又は抗原決定基は本発明の範囲内に含まれる。このような型の抗原又は抗原決定基の代表的な例には、以下のもの：Ｈｅｒ２（乳癌）；ＧＤ２（神経芽細胞腫）；ＥＧＦ−Ｒ（悪性神経こう腫）；ＣＥＡ（延髄甲状腺癌）；ＣＤ５２（白血病）；ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００；ヒト・メラノーマ・タンパク質ｇｐ１００エピトープ、アミノ酸１５４〜１６２（配列：ＫＴＷＧＱＹＷＱＶ）、２０９〜２１７（ＩＴＤＱＶＰＦＳＶ）、２８０〜２８８（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ）、４５７〜４６６（ＬＬＤＧＴＡＴＬＲＬ）および４７６〜４８５（ＶＬＹＲＹＧＳＦＳＶ）など；ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ヒト・メラノーマ・タンパク質メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１エピトープ、アミノ酸２７〜３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）および３２〜４０（ＩＬＴＶＩＬＧＶＬ）など；チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質（たとえば、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２）；チロシナーゼ・エピトープ、アミノ酸１〜９（ＭＬＬＡＶＬＹＣＬ）および３６９〜３７７（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）など；ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質；ＮＡ１７−Ａ  ｎｔタンパク質エピトープ、アミノ酸３８−６４（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）など；ＭＡＧＥ−３タンパク質；ＭＡＧＥ−３タンパク質エピトープ、アミノ酸２７１〜２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）など；他のヒト腫瘍抗原、たとえばＣＥＡエピトープ、アミノ酸５７１〜５７９（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ）など；ｐ５３タンパク質；ｐ５３タンパク質エピトープ、アミノ酸６５〜７３（ＲＭＰＥＡＡＰＰＶ）、１４９〜１５７（ＳＴＰＰＰＧＴＲＶ）および２６４〜２７２（ＬＬＧＲＮＳＦＥＶ）など；Ｈｅｒ２／ｎｅｕエピトープ、アミノ酸３６９〜３７７（ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ）および６５４〜６６２（ＩＩＳＡＶＶＧＩＬ）など；ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド１５７〜１６５および１５７〜１６７、１５９〜１６７；ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質；ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質エピトープ、アミノ酸８６〜９３（ＴＬＧＩＶＣＰＩ）など；およびそれぞれの断片があり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【０２６２】
薬物中毒、特に興味半分の薬物中毒を治療する組成物および方法に関する、抗原又は抗原決定基の選択は、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原又は抗原決定基の代表的な例には、たとえばオピオイドおよびモルフィン誘導体、コデイン、フェンタニル、ヘロイン、モルフィウムおよびオピウムなど；刺激剤、アンフェタミン、コカイン、ＭＤＭＡ（メチレンジオキシメタンフェタミン）、メタンフェタミン、メチルフェニデートおよびニコチンなど；幻覚剤、ＬＳＤ、メスカリンおよびサイロシビンなど；およびカンナビノイド、ハシシおよびマリファナなどがある。
【０２６３】
自己抗原と関連がある他の疾患又は状態を治療する組成物および方法に関する、抗原又は抗原決定基の選択も、このような障害を治療する医学分野の当業者には知られていると思われる。このような抗原又は抗原決定基の代表的な例は、たとえばリンフォトキシン（たとえば、リンフォトキシンα（ＬＴα）、リンフォトキシンβ（ＬＴβ）、およびリンフォトキシン受容体、核因子ｋａｐｐａＢリガンドの受容体活性化物質（ＲＡＮＫＬ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、インターロイキン１７およびアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）、ＴＮＦα、ＭＩＦ、ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、Ｒａｎｋ−Ｌ、Ｍ−ＣＳＦ、アンギオテンシンＩＩ、エンドグリン、エオタキシン、グレーリン、ＢＬＣ、ＣＣＬ２１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ブラジキニン、レジスチン、ＬＨＲＨ、ＧＨＲＨ、ＧＩＨ、ＣＲＨ、ＴＲＨおよびガストリン、およびそれぞれの断片であり、これらを使用して免疫応答を誘導することができる。
【０２６４】
本発明の特定の実施形態では、抗原又は抗原決定基は（ａ）ＨＩＶの組み換えポリペプチド；（ｂ）インフルエンザ・ウィルスの組み換えポリペプチド（たとえば、インフルエンザ・ウィルスＭ２ポリペプチド又はその断片）；（ｃ）Ｃ型肝炎ウィルスの組み換えポリペプチド；（ｄ）Ｂ型肝炎ウィルスの組み換えポリペプチド；（ｅ）Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａの組み換えポリペプチド；（ｆ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの組み換えポリペプチド；（ｇ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘの組み換えポリペプチド；（ｈ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅの組み換えポリペプチド；（ｉ）Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅの組み換えポリペプチド；（ｊ）乳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｋ）腎臓癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｌ）前立腺癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｍ）皮膚癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｎ）脳癌細胞の組み換えポリペプチド；（ｏ）白血病細胞の組み換えポリペプチド；（ｐ）組み換えプロファイル；（ｑ）ハチ刺されアレルギーの組み換えポリペプチド；（ｒ）ナッツ・アレルギーの組み換えポリペプチド；（ｓ）花粉の組み換えポリペプチド；（ｔ）室内埃の組み換えポリペプチド；（ｕ）ネコ又はネコの毛アレルギーの組み換えポリペプチド；（ｖ）食物アレルギーの組み換えタンパク質；（ｗ）喘息の組み換えタンパク質；（ｘ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａの組み換えタンパク質；および（ｙ）（ａ）〜（ｘ）に述べた任意のタンパク質の断片からなる群から選択される。
【０２６５】
本発明の他の実施形態では、ウィルス様粒子に連結、融合、又は他の方式で付着している抗原は、Ｔ細胞エピトープ、細胞傷害性又はＴｈ細胞エピトープである。他の好ましい実施形態では、抗原は少なくとも２つの、好ましくは異なるエピトープの組合せであり、かつ少なくとも２つのエピトープは直接結合しているか、あるいは連結配列によって結合している。これらのエピトープは、細胞傷害性およびＴｈ細胞エピトープからなる群から選択されることが好ましい。
【０２６６】
モザイク型ウィルス様粒子、たとえば、それぞれ異なる抗原およびエピトープと結合したサブユニットから構成されるウィルス様粒子は、本発明の範囲内にあることも理解されるべきである。このような本発明の組成物は、たとえば、それぞれ異なる抗原およびエピトープと融合したウィルス様粒子から構成されるサブユニットをコードする２個の適合性のあるプラスミドで、大腸菌を形質転換することによって得ることができる。この場合、モザイク型ウィルス様粒子を、細胞中に直接、あるいは細胞溶解後に組み立てる。さらに、このような本発明の組成物は、それぞれ異なる抗原およびエピトープの混合物を、単離したウィルス様粒子と結合させることことによって得ることもできる。
【０２６７】
本発明の抗原、および特に示した１個又は複数個のエピトープは、組み換えＤＮＡ技法を使用して、合成、あるいは組み換えによって発現、ウィルス様粒子と結合、あるいはウィルス様粒子と融合することができる。抗原とウィルス様粒子の結合を記載する代表的な手順は、ＷＯ  ００／３２２２７中、ＷＯ  ０１／８５２０８中、およびＷＯ  ０２／０５６９０５中に開示されており、それらの開示は、その全容が参照によりここに組み込まれている。
【０２６８】
本発明は、動物の免疫応答を高めるための組成物を生成する方法であって、前記組成物がＶＬＰ、およびＶＬＰと結合した免疫賦活物質、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み、前記方法が免疫賦活物質およびオリゴヌクレオチドそれぞれと共にＶＬＰをインキュベートすること、ＲＮａｓｅを加えること、および前記組成物を精製することを含む方法も提供する。同等に好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＶＬＰをＲＮａｓｅと共にインキュベートすること、免疫賦活物質およびオリゴヌクレオチドそれぞれ加えること、および組成物を精製することを含む。一実施形態では、ＶＬＰは細菌発現系で生成される。他の実施形態では、ＲＮａｓｅはＲＮａｓｅ  Ａである。
【０２６９】
本発明は、動物の免疫応答を高めるための組成物を生成する方法であって、前記組成物が免疫賦活物質、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと結合したＶＬＰを含み、前記方法がＶＬＰを分解すること、免疫賦活物質およびオリゴヌクレオチドそれぞれ加えること、およびＶＬＰを再構築することを含む方法をさらに提供する。この方法は、分解されたＶＬＰの核酸を除去すること、及び／又は再構築後に組成物を精製することをさらに含むことができる。
【０２７０】
本発明は、疾患又は状態を予防する、かつ／あるいは低下させるために使用することができる、ワクチン組成物も提供する。本発明のワクチン組成物は、免疫学的に有効量の本発明の免疫増強組成物、および薬剤として許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤を含むか、あるいはこれらからなる。ワクチンは、アジュバントも場合によっては含むことができる。
【０２７１】
本発明は、動物の疾患又は状態を予防する、かつ／あるいは低下させるための、ワクチン接種法をさらに提供する。一実施形態では、本発明は、広範囲の動物種、特に哺乳動物種、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの、感染症を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンを設計して、ウィルスが病因の感染、ＨＩＶ、インフルエンザ、ヘルペス、ウィルス肝炎、ＥＢ（エプスタインバー）、ポリオ、ウィルス脳炎群、はしか、水痘など；又は細菌が病因の感染、肺炎、結核、梅毒など；又は寄生虫が病因の感染、マラリア症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、トリコモナス症、アメーバ症などを治療することができる。
【０２７２】
他の実施形態では、本発明は、広範囲の種、特に哺乳動物種、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなどの、癌を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンを設計して、リンパ腫、癌腫、肉腫、およびメラノーマだけには限られないが、これらを含めたあらゆる型の癌を治療することができる。
【０２７３】
当業者は理解されていると思われるが、本発明の組成物を動物に投与するとき、それらは、組成物の有効性を向上させるのに望ましい、塩、バッファー、アジュバント又は他の物質を含む、組成物の形であってよい。薬剤組成物の調製において使用するのに適した物質の例は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｏｓｏｌ，Ａ，ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、（１９９０））を含めた多数の源中に与えられる。
【０２７４】
さまざまなアジュバントを使用して、宿主の種類に応じて免疫応答を高めることができ、アジュバントにはフロイントのアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱質ゲル、表面活性化物質、リゾレシチン、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールなど、および潜在的に有用なヒト用アジュバント、ＢＣＧ（カルメット−ギランかん菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどがあるが、これらだけには限られない。このようなアジュバントも、当分野ではよく知られている。本発明の組成物と共に投与することができる他のアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術品があるが、これらだけには限られない。アジュバントは、これらの物質の混合物を含むこともできる。
【０２７５】
本発明の組成物は、その投与がレシピエント個体によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能である」と言える。さらに、本発明の組成物は、「治療上有効量」（すなわち、望ましい生理学的効果を生み出す量）で投与される。
【０２７６】
本発明の組成物は、当分野で知られているさまざまな方法によって投与することができる。選択される個々の形式は、選択される個々の組成物、治療される状態の重度、および治療効果のために必要とされる用量に、当然ながら依存するであろう。本発明の方法は、一般的に述べると、医学的に許容される任意の投与形式、すなわち臨床上許容されない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物を生成する、任意の形式を使用して行うことができる。このような投与形式には、経口、直腸、非経口、脳槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌ）、膣内、腹膜内、局所（粉末、軟膏、滴下剤又は経皮パッチによって）、頬投与、あるいは経口又は鼻部スプレーとしての投与がある。本明細書で使用する、用語「非経口的」は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入を含む、投与形式を指す。本発明の組成物は、リンパ節に直接注射することもできる。
【０２７７】
投与用の組成物の成分には、滅菌水溶液（たとえば、生理食塩水）又は非水溶液および懸濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体又は密封包帯を使用して、皮膚の浸透性を高め、抗原吸着を増大させることができる。
【０２７８】
付随的に、たとえば混合物として、あるいは別々に、組合せを投与することができるが、一斉にすなわち同時に、あるいは順次に投与することもできる。このことは、組合せ物質が治療用混合物と共に投与されること、および組合せ物質が一斉にではなく別々に、たとえば別の静脈内経路によって同じ個体に投与される手順の表示を含む。「組合せ」投与は、所与の成分又は物質の１つを最初に、次に第２のものを別々に投与することをさらに含む。
【０２７９】
用量レベルは、投与形式、被験者の性質、および担体／アジュバント製剤の質に依存する。典型的な量は、被験者当たり約０．１μｇ〜約２０ｍｇの範囲内である。好ましい量は、被験者当たり少なくとも約１μｇ〜約１００μｇである。被験者を免疫化するために多重投与が好ましく、プロトコルは、問題の被験者に適合させた当分野の標準的なものである。
【０２８０】
本発明の組成物は、好都合なことに単位用量の形で存在することができ、製薬の分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。それらの方法は、本発明の組成物と１つ又は複数の追加成分を構成する担体を結合させるステップを含む。一般に、これらの組成物は、本発明の組成物を均一かつ完全に、液状担体、微細固形担体、又はこの両方と結合させ、次いで必要な場合は、生成物の形状を整えることによって調製する。
【０２８１】
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤又はトローチ剤などの、分離した単位として存在することができ、それぞれが所定量の本発明の組成物を含む。他の組成物には、水性の液体又は非水性の液体に懸濁させた懸濁液、シロップ、エリキシル剤又はエマルジョンなどがある。
【０２８２】
他の送達系は、時間放出、遅延放出又は徐放送達系を含んでよい。このような送達系によって、前に記載した本発明の組成物の繰り返しの投与を避けることができ、被験者および医者に対する利便性が高まる。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。
【０２８３】
本発明の他の実施形態は、本発明の組成物を生成するための方法、および前記組成物を使用する癌およびアレルギーの医学的な治療の方法を含む。
【０２８４】
本発明の他の態様および実施形態は、以下の実施例および添付の特許請求の範囲で明らかになるであろう。
【０２８５】
以下の実施例は単なる例示的なものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限することを目的とするものではない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更形態および変形形態を本発明の方法で作製することができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、本発明の変更形態および変形形態を、それらが添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内に入るという条件で、含むことが考えられる。
【０２８６】
本明細書で言及するすべての特許及び刊行物は、その全容を参照により明確に組み込んである。
【実施例１】
【０２８７】
ｐ３３−ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰの生成
ＬＣＭＶ由来のペプチドｐ３３を含むＨＢｃＡｇのＤＮＡ配列を、図１Ｂ中に与える。ｐ３３−ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ（ｐ３３−ＶＬＰ）を、以下のように生成させた：Ｂ型肝炎ウィルスの完全なウィルス・ゲノムを含む、Ｂ型肝炎クローンｐＥｃｏ６３を、ＡＴＣＣから購入した。ＨＢｃＡｇをコードする遺伝子を、強力なｔａｃプロモーターの制御下において、発現ベクターｐｋｋ２２３．３（ファルマシア）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に導入した。リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）由来のｐ３３ペプチド（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ）を、標準的なＰＣＲ法によって、３個のロイシンリンカーを介してＨＢｃＡｇのＣ末端（１〜１８５）と融合させた。良い発現用に選択した大腸菌Ｋ８０２のクローンをプラスミドでトランスフェクトし、細胞を増殖させ、５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０）中に再懸濁させた。２００μｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。超音波処理の後、４μｌのベンゾナーゼおよび１０ｍＭのＭｇＣ１２を加え、懸濁液を室温で３０分間インキュベートし、４℃において１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄みは保持した。
【０２８８】
次に、２０％（ｗ／ｖ）（０．２ｇ／ｍｌの溶解物）硫酸アンモニウムを、上澄みに加えた。氷上での３０分間のインキュベーション、および４℃において２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄みを捨て、ペレットを２〜３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。２０ｍｌのＰＢＳ溶液を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ゲル濾過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテクノロジーＡＧ）に担持し、画分をＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルに担持し、精製したｐ３３−ＶＬＰキャプシドを含む画分を集めた。集めた画分は、ヒドロキシアパタイト・カラムに担持した。流動物（精製したｐ３３−ＶＬＰキャプシドを含む）を回収した（図２Ｂ）。電子顕微鏡法は、標準的なプロトコルに従って行った。代表的な例を、図２Ａに示す。
【実施例２】
【０２８９】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
組み換えｐ３３−ＶＬＰに、純粋なアガロース・ゲルの電気泳動（１％アガロース）を行い、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質を検出するために臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色した（図３）。細菌生成ＶＬＰは高レベルの一本鎖ＲＮＡを含み、これはおそらく、ＨＢｃＡｇタンパク質のＣ末端の近くに現れ、Ｘ線結晶解析によって示されるように、形状的にはＶＬＰの内側に位置している、アルギニン反復配列と結合している。汚染したＲＮＡは容易に消化し、ＶＬＰとＲＮａｓｅ  Ａをインキュベートすることによって排除することができる。非常に活性があるＲＮａｓｅ  Ａ酵素は、約１４ｋＤａの分子量を有しており、ＶＬＰに入り望ましくないリボ核酸を排除するほど、おそらく十分小さい。
【０２９０】
組み換えｐ３３−ＶＬＰに、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化前に、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（図１Ａ）を補った。図４に示すように、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドの存在によって、未処理ｐ３３−ＶＬＰと比較した同様の移動によって示されるように、キャプシド構造が保たれた。ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド含有ＶＬＰを、透析（３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜を使用して、２４時間かけてＰＢＳに４５００倍希釈）によって、非結合オリゴヌクレオチドから精製した（図５）。
【実施例３】
【０２９１】
ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅによりＲＮＡを除去し、その後オリゴヌクレオチドをＶＬＰにパッケージ化することによって、ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
ｐ３３−ＶＬＰ（細菌一本鎖ＲＮＡを含む）を、ＲＮａｓｅ  Ａと共に最初にインキュベートしてＲＮＡを除去し、第２のステップでは、免疫賦活ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（通常のリン酸ジエステル結合を含むだけでなく、リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体も含む）を、サンプルに補った（図６）。この実験によって、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドがＲＮＡ分解反応中に必ずしも同時に必要とされるわけではなく、後で加えることができることが明らかに示される。
【実施例４】
【０２９２】
ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体又は通常のリン酸ジエステル結合を含む）を含むＶＬＰは、高い抗ウィルス保護を誘導する
マウスを、１００μｇのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド含有ｐ３３−ＶＬＰで、皮下を初回抗原刺激した。免疫化の前に、ｐ３３−ＶＬＰ調製物を、透析によって非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドから十分に精製した（実施例２および図５を参照のこと）。コントロールとして、マウスを１００μｇのｐ３３−ＶＬＰ単独で、これを２０ｍｎｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと混合して、２０ｍｎｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド単独で、皮下を初回抗原刺激し、あるいは未処理のままにした。Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｉ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中に記載されたように、２１日後、マウスをＬＣＭＶで感染させ（２００ｐｆｕ、静脈内）、脾臓中のウィルス力価を５日後に評価した。これらの結果は、図７、８および９に示す。
【実施例５】
【０２９３】
ＢＫＶポリオーマ・キャプシドの生成
ＢＫウィルス（ＢＫＶ）は、パポ・ウィルス科のポリオーマ・ウィルス亜科に属する、非エンベロープ型の二本鎖ＤＮＡウィルスである。ＶＰ１は主要なキャプシド・タンパク質である。ＶＰ１は３６２個のアミノ酸を有し（図１０）、４２ｋＤａの大きさである。大腸菌、昆虫細胞又は酵母菌ＶＰ１中で生成されると、キャプシド構造を自然に形成する（Ｓａｌｕｎｋｅ  Ｄ．Ｍ．他、Ｃｅｌｌ  ４６（６）：８９５〜９０４（１９８６）；Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ，Ｋ．他、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０（３）：３８１〜６（１９９９）；Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ，Ｋ他、３ｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ「Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｂｅｒｌｉｎ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２６〜２９（２００１）；Ｔｏｕｚｅ，Ａ．他、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８２（Ｐｔ１２）：３００５〜９（２００１））。このキャプシドは、正二十面体構造を形成する７２のＶＰ１ペンタマーで編成されている。このキャプシドは、約４５ｎｍの直径を有する。
【実施例６】
【０２９４】
フルオレセイン標識したＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを、ＢＫＶ  ＶＬＰにパッケージ化することができる
酵母菌において生成されるＶＬＰは、容易に消化し、したがってＶＬＰとＲＮａｓｅ  Ａをインキュベートすることによって排除することができる、少量のＲＮＡを含む。非常に活性があるＲＮａｓｅ  Ａ酵素は、約１４ｋＤａの分子量を有しており、ＶＬＰに入り望ましくないリボ核酸を排除するほど、おそらく十分小さい。組み換えによって生成させたＢＫＶ  ＶＬＰを、ＰＢＳバッファーｐＨ７．２中に１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＲＮａｓｅ  Ａ（２００μｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下又は存在下において３７℃で３時間インキュベートし、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化の後、ＢＫＶ  ＶＬＰに７５ｎｍｏｌ／ｍｌのフルオレセイン標識したホスホロチオエートＣｐＧ−ＦＡＭオリゴヌクレオチドを補い、３７℃で３時間インキュベートした。その後ＢＫＶ  ＶＬＰには、３７℃で３時間ＤＮａｓｅＩによる消化を行ったか（４０ｕ／ｍｌのＡＭＰＤ１、Ｓｉｇｍａ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、あるいはＤＮａｓｅＩによる消化は行わなかった。サンプルに６倍濃縮したＤＮＡ−ローディング・バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０％ｖ／ｖグリセロール、０．４％オレンジＧ）を補い、０．８％の純粋なトリス酢酸ｐＨ７．５アガロース・ゲル中において、１時間６５ボルトにした。
【０２９５】
図１２は、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化、およびその後の蛍光ＣｐＧ−ＦＡＭオリゴヌクレオチド（５’−フルオレセイン標識を有する図１Ａからのオリゴヌクレオチド）とのインキュベーション後の、臭化エチジウムによる染色を行ったか、あるいは臭化エチジウム染色を行わなかった、純粋な０．８％アガロース・ゲルの電気泳動におけるＢＫＶ  ＶＬＰを示す。臭化エチジウムの存在下では核酸が検出されるが、一方その不在下では、ＵＶ励起によってＣｐＧ−ＦＡＭ中のフルオレセイン標識の蛍光がもたらされる。
【０２９６】
ＲＮａｓｅ  Ａによる消化によって、ＶＬＰの移動の変化がもたらされ、これはクーマシー染色したアガロース・ゲル上で見ることができ、おそらくＲＮＡからの負電荷の欠如によるものである（図１３および１４）。ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを加えることによって、ＢＫＶ  ＶＬＰの移動が元通りになり、未処理ＶＬＰ中に存在したＲＮＡバンドと移動が同じである、蛍光バンドがもたらされる。これによって、ＣｐＧ−ＦＡＭオリゴヌクレオチドがＶＬＰにパッケージ化されたことが明らかに示される。
【実施例７】
【０２９７】
大きな二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＢＫＶ  ＶＬＰにパッケージ化することができる
二本鎖（ｄｓ）ヌクレオチド配列を導入するために、ＲＮａｓｅ  Ａ処理した組み換えＢＫＶ  ＶＬＰ（実施例６）に、５０μｇ／ｍｌ（ｄｓ）ＤＮＡ断片（長さ２４６ｂｐ、図１１）を補い、３７℃で３時間インキュベートした。サンプルに６倍濃縮したＤＮＡ−ローディング・バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０％ｖ／ｖグリセロール、０．４％オレンジＧ）を補い、０．８％の純粋なトリス酢酸ｐＨ８．０アガロース・ゲル中において、１時間６５ボルトにした。
【０２９８】
図１３は、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化、および臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色した（ｄｓ）ＤＮＡとの、その後のインキュベーション後の、純粋な０．８％アガロース・ゲルの電気泳動におけるＢＫＶ  ＶＬＰ（１５μｇ）を示し、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価する。パッケージ化されたＤＮＡ分子は、クーマシーブルーによって見ることができるＶＬＰバンドと移動が同じであるバンドとして、臭化エチジウムの存在下で見ることができる。
【０２９９】
（ｄｓ）ＤＮＡを加えることによって、ＢＫＶ  ＶＬＰの移動が元通りになり、クーマシーブルーで染色したＶＬＰと移動が同じである、ＤＮＡバンドがもたらされる。これによって、（ｄｓ）ＤＮＡがＢＫＶ  ＶＬＰにパッケージ化されたことが明らかに示される。
【実施例８】
【０３００】
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを、ＢＫＶ  ＶＬＰにパッケージ化することができる
免疫賦活ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを導入するために、ＲＮａｓｅ  Ａ処理した組み換えＢＫＶ  ＶＬＰ（実施例６）に、リン酸ジエステル骨格又はホスホロチオエートの骨格を有するＣｐＧ−オリゴヌクレオチド１５０ｎｍｏｌ／ｍｌを補い、３７℃で３時間インキュベートした。マウス免疫化用のＶＬＰ調製物を、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．２（１０，０００倍希釈）で２４時間かけて十分に透析して、ＲＮａｓｅ  Ａおよび過剰なＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを排除した。サンプルに６倍濃縮したＤＮＡ−ローディング・バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１０％ｖ／ｖグリセロール、０．４％オレンジＧ）を補い、０．８％の純粋なトリス酢酸ｐＨ７．５アガロース・ゲル中において、１時間６５ボルトにした。
【０３０１】
図１４は、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化、および臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色したＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸ジエステル骨格を有するか、あるいはホスホロチオエート骨格を有する）との、その後のインキュベーション後の、純粋な０．８％アガロース・ゲルの電気泳動におけるＢＫＶ  ＶＬＰ（１５μｇ）を示し、透析後のＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の存在、および非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドの減少を評価する。非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドは、低分子量の臭化エチジウム染色されたバンドとして見ることができる。
【０３０２】
ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを加えることによって、ＢＫＶ  ＶＬＰの移動が元通りになり、クーマシーブルーで染色したＶＬＰと移動が同じである、ＤＮＡバンドがもたらされる。これによって、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドがＢＫＶ  ＶＬＰにパッケージ化されることが明らかに示される。
【実施例９】
【０３０３】
ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体を含む）を含むＶＬＰは、Ｔｈ１指向型の高められた免疫応答を誘導する
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり３匹のマウス）に、ホスホロチオエートＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（図１Ａ）を含むＢＫＶ  ＶＬＰ１０μｇを皮下注射した。コントロールとして、マウスに１０μｇのＲＮａｓｅ処理したＢＫＶ  ＶＬＰを単独で、又は０．３ｎｍｏｌ又は２０ｎｍｏｌのホスホロチオエートＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを２００μｌのＰＢＳ  ｐＨ７．２に混合したＢＫＶ  ＶＬＰを皮下注射し、あるいは未処理のままにした。ＢＫＶ  ＶＬＰは実施例８に記載したように調製し、免疫化の前に、透析によって非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドから十分に精製した。免疫化後第１４日に、血液を採取し、ＢＫＶ  ＶＬＰに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の応答を決定した。
【０３０４】
図１５は、免疫化後第１４日の、ＢＫＶ  ＶＬＰに対するＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の応答を示す。ホスホロチオエートＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを含む、ＲＮａｓｅ処理したＢＫＶ  ＶＬＰによる免疫化によって、ＢＫＶ  ＶＬＰと混合した同じ量（０．３ｎｍｏｌ）のＣｐＧ−オリゴヌクレオチド、あるいはＢＫＶ  ＶＬＰ単独による免疫化と比較して、低いＩｇＧ１および高い抗ＢＫＶ  ＶＬＰ  ＩｇＧ２ａ力価がもたらされる。２０ｎｍｏｌのホスホロチオエートＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと混合したＢＫＶ  ＶＬＰで免疫化したマウスは、非常に低いＩｇＧ１および高いＩｇＧ２ａ力価を示す。コントロールと比較した、ＩｇＧ１力価の低下およびＩｇＧ２ａ力価の増大によって、ＢＫＶ  ＶＬＰにパッケージ化されたホスホロチオエートＣｐＧ−オリゴヌクレオチドによって誘導される、Ｔｈ１細胞指示型免疫応答が実証される。図１５によって、ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと混合しただけのＢＫＶ  ＶＬＰと比較して、粒子内にパッケージ化されたＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを含むＢＫＶ  ＶＬＰの高い効能が明らかに実証される。
【実施例１０】
【０３０５】
線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、最初にＲＮＡｓｅによる消化、およびその後ｄｓＤＮＡを加えることによって、ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
ｐ３３−ＶＬＰ調製物（細菌ＲＮＡを含む）（実施例１）を、ＲＮａｓｅ  Ａと共に最初にインキュベートしてＲＮＡを除去し、第２のステップでは、線状ｄｓＤＮＡ（長さ３５０ｂｐ）を、サンプルに補った（図１６）。ｄｓＤＮＡをパッケージ化したｐ３３−ＶＬＰの移動は、ＲＮＡを含むｐ３３−ＶＬＰのそれと類似していた。この実験によって、長さが少なくとも３５０塩基対の線状ｄｓＤＮＡを、ウィルス様粒子中にパッケージ化することができることが示される。
【実施例１１】
【０３０６】
免疫賦活性核酸は、融合タンパク質および抗原を含むＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰは、Ｂ型肝炎コア抗原融合タンパク質ＨＢｃ３３（実施例１）又はペプチドＰ１Ａ（ＨＢｃＰ１Ａ）との融合タンパク質を発現することによって大腸菌中で生成されると、ＲＮＡを含み、このＲＮＡを消化し、ＶＬＰとＲＮａｓｅ  Ａをインキュベートすることによって排除することができる。
【０３０７】
遺伝子Ｐ１Ａは、肥満細胞腫瘍細胞系Ｐ８１５によって発現される、タンパク質をコードしている。Ｐ１Ａペプチドという名称の、主要なＣＴＬエピトープは、ＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）と結合し、その複合体は特異的なＣＴＬクローンによって認識される（Ｂｒａｎｄｌｅ他、１９９８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４０１０〜４０１９）。ペプチドＰ１Ａ−１（ＬＰＹＬＧＷＬＶＦ）とＨＢｃＡｇのＣ末端（ａａ１８５、実施例１参照）の融合は、標準的な分子生物学の技法を使用して、適切なプライマーを使用することによりＰＣＲによって行った。ＨＢｃＡｇとペプチド配列の間の３個のロイシンリンカーをクローニングした。発現は実施例１に記載したように行った。ＨＢｃＰ１Ａという名称の、ＨＢｃＡｇとＰ１Ａの融合タンパク質は、大腸菌中で発現されると、キャプシドを形成し、これは実施例１に記載した手順と同様に精製することができると思われる。
【０３０８】
酵素によるＲＮＡ加水分解：１×ＰＢＳバッファー（ＫＣＩ  ０．２ｇ／Ｌ、ＫＨ２Ｐ０４  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ８ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰ０４  １．１５ｇ／Ｌ）ｐＨ７．４中に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度である、組み換えによって生成させたＨＢｃＡｇ−ｐ３３（ＨＢｃ３３）およびＨＢｃＡｇ−Ｐ１Ａ（ＨＢｃＰ１Ａ）ＶＬＰを、サーモ・ミキサー中において６５０ｒｐｍで、３７℃で３時間、３００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下において、インキュベートした。
【０３０９】
免疫賦活性核酸のパッケージ化：ＲＮＡｓｅ  ＡによりＲＮＡを消化した後、ＨＢｃＡｇ−ｐ３３  ＶＬＰに、１３０ｎｍｏｌ／ｍｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドＢ−ＣｐＧ、ＮＫＣｐＧ、Ｇ１０−ＰＯ（表Ｉ）を補った。同様に、いずれもＣｐＧモチーフの多数のコピーを含む、１５０量体一本鎖Ｃｙ１５０−１、および２５３量体二本鎖ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３を、それぞれ１３０ｎｍｏｌ／ｍｌ又は１．２ｎｍｏｌ／ｍｌで加え、サーモ・ミキサー中において３７℃で３時間インキュベートした。二本鎖ＣｙＣｐＧ−２５３  ＤＮＡは、ＣｙＣｐＧの二本鎖マルチマーをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ−のＥｃｏＲＶ部位にクローニングすることによって生成させた。大腸菌ＸＬｌ−ｂｌｕｅにおいて生成され、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔを使用して単離した、生成したプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＸｂａＩによって消化し、生成した制限酵素産物を、アガロースの電気泳動によって分離した。２５３ｂｐの挿入物を、エレクトロ−エリューションおよびエタノール沈殿によって単離した。両方の鎖の配列決定によって、配列を確認した。
【０３１０】
表Ｉ：実施例中で使用した免疫賦活性核酸の配列
小文字はホスホロチオエート結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示し、一方で大文字はリン酸ジエステル結合によって結合したデオキシヌクレオチドを示す。
2005517632.tif 000002
【０３１１】
ＤＮＡｓｅ  Ｉ処理：パッケージ化されたＨＢｃＡｇ−ｐ３３  ＶＬＰに、後に３７℃で３時間ＤＮａｓｅＩによる消化（５Ｕ／ｍｌ）を行い（ＤＮａｓｅＩ，ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４（２００倍体積に対して２倍）で２４時間かけて十分に透析して、ＲＮＡｓｅ  Ａおよび過剰なＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを排除した。
【０３１２】
ベンゾナーゼ処理：いくつかの一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、ＤＮＡｓｅ  Ｉ処理に部分的に耐性があったので、ベンゾナーゼ処理を使用して、調製物から遊離オリゴヌクレオチドを排除した。１００〜１２０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）および５ｍＭのＭｇＣｌ２を加え、透析前に３７℃で３時間インキュベートした。
【０３１３】
透析：マウスの免疫化実験で使用する、免疫賦活性核酸をパッケージ化したＶＬＰ調製物を、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４（２００倍体積に対して２倍）で２４時間かけて十分に透析して、加えた酵素および遊離核酸を排除した。
【０３１４】
パッケージ化の分析：パッケージ化された免疫賦活性核酸の放出：５０μｌのキャプシド溶液に、１μｌのプロテイナーゼＫ（６００Ｕ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、３μｌの１０％  ＳＤＳ溶液、および６μｌの１０倍プロテイナーゼ・バッファー（０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４）を加え、その後３７℃で一晩インキュベートした。このような条件下で、ＶＬＰを加水分解させる。プロテイナーゼＫは、６５℃で２０分間加熱することによって不活性化させた。１μｌのＲＮＡｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ、１００μｇ／ｍｌ、２５０倍希釈）を、２５μｌのキャプシドに加えた。２〜３０μｇのキャプシドを、１体積の２×ローディング・バッファー（１×ＴＢＥ、４２％ｗ／ｖ尿素、１２％ｗ／ｖ  ブロモフェノールブルー、０．０１％  ブロモフェノールブルー）と混合し、９５℃で３分間加熱し、１０％（約２０ｎｔ長のオリゴヌクレオチドの場合）又は１５％（４０量体より小さい核酸の場合）ＴＢＥ／尿素ポリアクリルアミド・ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に担持した。あるいはサンプルを、６×ローディング染料（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１０％ｖ／ｖグリセロール、０．４％オレンジＧ）を含む１％アガロース・ゲルに担持した。ＴＢＥ／尿素ゲルはＣＹＢＲＧｏｌｄで染色し、アガロース・ゲルは臭化エチジウムで染色した。
【０３１５】
図１７、１８および１９は、Ｂ−ＣｐＧ、ＮＫＣｐＧおよびＧ１０−ＰＯオリゴヌクレオチドのＨＢｃ３３へのパッケージ化を示す。ＶＬＰ中のＲＮＡ含量はＲＮａｓｅＡ処理後に大幅に減少したが（図１７Ａ、１８Ａ、１９Ａ）、大部分のキャプシドは、おそらく負に帯電したＲＮＡが除去されたために、緩慢な移動物質として移動した（図１７Ｂ、１８Ｂ、１９Ｂ）。過剰のオリゴヌクレオチドと共にインキュベーションした後、これらのキャプシドは、ＲＮａｓｅＡ処理したキャプシドよりも多量の核酸を含んでおり、したがって未処理キャプシドと同じ速度で移動した。ＤＮＡｓｅ  Ｉ又はベンゾナーゼを用いた他の処理によって、遊離オリゴヌクレオチドが分解したが、キャプシド中にパッケージ化されたオリゴヌクレオチドは分解せず、オリゴヌクレオチドのパッケージ化が明らかに示された。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのパッケージ化は、ＤＮＡｓｅＩ／ベンゾナーゼ処理および透析の後に、（実施例１５および１６に記載したように）プロテイナーゼＫによる消化によって確認された。前に記載した手順によってキャプシドから放出されたオリゴヌクレオチドは、パッケージ化用に使用したオリゴヌクレオチドと同じ大きさであったという発見によって、オリゴヌクレオチドのパッケージ化が明らかに実証された（図１７Ｃ、１８Ｃ）。
【０３１６】
図２０は、大きな一本鎖オリゴヌクレオチドＣｙ１５０−１のＨＢｃ３３へのパッケージ化を示す。Ｃｙｌ５０−１はＣｙＣｐＧの７．５個の反復配列を含み、標準的なオリゴヌクレオチド合成法（ＩＢＡ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って合成した。キャプシド中のＲＮＡ含量はＲＮａｓｅＡ処理後に大幅に減少したが、大部分のキャプシドは緩慢な移動物質として移動した（図２０Ａ、Ｂ）。キャプシドを４倍体積の水で希釈し、１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。過剰のＣｙ１５０−１と共にインキュベーションした後、これらのキャプシドはより多量の核酸を含んでおり、したがって未処理キャプシドと同じ速度で移動した。ＤＮＡｓｅ  Ｉを用いた他の処理によって、遊離した、非パッケージ化型オリゴヌクレオチドが分解したが、キャプシド中のオリゴヌクレオチドは分解されなかった（図２０Ａ）。ＴＢＥ／尿素ローディング・バッファー中での９５℃で３分間の加熱による、パッケージ化されたＶＬＰからのＤＮＡｓｅＩ耐性核酸の放出によって、１５０量体の存在が明らかになった（図２０Ｃ）。
【０３１７】
図２１は、オリゴヌクレオチドＮＫＣｐＧｐｔのＨＢｃＰ１Ａへのパッケージ化を示す。ＲＮＡｓｅを用いた処理によって核酸含量が減少し、キャプシドの移動が遅くなった。ＮＫＣｐＧｐｔを添加することによって、キャプシド中の核酸含量が元通りになり、移動が速くなった。
【０３１８】
図１７は、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロース・ゲル上における、Ｂ−ＣｐＧのＨＢｃ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは５０μｇの以下のサンプルである：１．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、未処理；２．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；３．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつＢ−ＣｐＧをパッケージ化したもの；４．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、Ｂ−ＣｐＧをパッケージ化し、かつＤＮａｓｅＩで処理したもの；５．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、Ｂ−ＣｐＧをパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し、かつ透析したもの；６．１ｋｂのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤＮＡラダー。（Ｃ）は、臭化エチジウムで染色した１．５％アガロース・ゲル上における、ＶＬＰから抽出されたパッケージ化されたオリゴの量の分析を示す：ゲルに担持したのは以下のサンプルである：１．０．５ｎｍｏｌのＢＣｐＧコントロール；２．０．５ｎｍｏｌのＢ−ＣｐＧコントロール；３．Ｂ−ＣｐＧオリゴ含有ＨＢｃ３３、フェノール／クロロホルム抽出後のもの；４．Ｂ−ＣｐＧオリゴ含有ＨＢｃ３３、フェノール／クロロホルム抽出後の、ＲＮａｓｅ  Ａ処理したもの；５．Ｂ−ＣｐＧオリゴ含有ＨＢｃ３３、フェノール／クロロホルム抽出後の、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理したもの；６．空；７．ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  １００ｂｐのＤＮＡラダー。
【０３１９】
図１８は、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロース・ゲル上における、ＮＫＣｐＧのＨＢｃ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは１５μｇの以下のサンプルである：１．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、未処理；２．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；３．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつＮＫＣｐＧをパッケージ化したもの；４．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ＮＫＣｐＧをパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し、かつ透析したもの；５．１ｋｂのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤＮＡラダー。（Ｃ）は、ＣＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した１５％ＴＢＥ／尿素ゲル上における、ＶＬＰからのパッケージ化されたオリゴ抽出物の量の分析を示す：ゲルに担持したのは以下のサンプルである：１．ＮＫＣｐＧオリゴ含有ＨＢｃ３３、プロテイナーゼＫで消化した後の、ＲＮａｓｅ  Ａ処理したもの；２．２０ｐｍｏｌのＮＫＣｐＧコントロール；３．１０ｐｍｏｌのＮＫＣｐＧコントロール；４．４０ｐｍｏｌのＮＫＣｐＧコントロール。
【０３２０】
図１９は、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロース・ゲル上における、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯのＨＢｃ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは１５μｇの以下のサンプルである：１．１ｋｂのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤＮＡラダー；２．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、未処理；３．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；４．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯをパッケージ化したもの；５．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯをパッケージ化し、ベンゾナーゼで処理し、かつ透析したもの。
【０３２１】
図２０は、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロース・ゲル上における、ＣｙＣｐＧ−１５０のＨＢｃ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは１５μｇの以下のサンプルである：１．１ｋｂのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤＮＡラダー；２．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、未処理；３．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；４．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつＣｙＣｐＧ−１５０をパッケージ化したもの；５．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ＣｙＣｐＧ−１５０をパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し、かつ透析したもの；６．ＨＢｃ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ＣｙＣｐＧ−１５０をパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し、かつ透析したもの。（Ｃ）は、ＣＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した１０％ＴＢＥ／尿素ゲル上における、ＶＬＰから抽出されたパッケージ化されたオリゴの量の分析を示す：ゲルに担持したのは以下のサンプルである：１．２０ｐｍｏｌのＣｙＣｐＧ−１５０コントロール；２．１０ｐｍｏｌのＣｙＣｐＧ−１５０コントロール；３．４ｐｍｏｌのＣｙＣｐＧ−１５０コントロール；４．ＣｙＣｐＧ−１５０オリゴ含有４μｇＨＢｃ３３、１体積のＴＢＥ／尿素サンプル・バッファーで９５℃において３分間処理した後のもの。
【０３２２】
図２１は、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロース・ゲル上における、ＮＫＣｐＧｐｔのＨＢｃＰ１Ａ  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは１５μｇの以下のサンプルである：１．１ｋｂのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤＮＡラダー；２．ＨＢｃＰ１Ａ  ＶＬＰ、未処理；３．ＨＢｃＰ１Ａ  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；４．ＨＢｃＰ１Ａ  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつＮＫＣｐＧｐｔをパッケージ化したもの。
【実施例１２】
【０３２３】
免疫賦活性核酸は、抗原と結合させたＨＢｃＡｇ−ｗｔ中にパッケージ化することができる
組み換えによって生成させたＨＢｃＡｇ−ｗｔ  ＶＬＰを、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）由来の、ペプチドｐ３３（ＣＧＧ−ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ）と結合させた後に、パッケージ化した。ＨＢｃＡｇ−ｗｔとの結合用に、ＶＬＰ（２ｍｇ／ｍｌ）を、サーモ・ミキサー中において２５℃で１時間、２５倍モル過剰のＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［（β−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノエート］、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて誘導体化させた。誘導体化させたＶＬＰを、４℃においてＭＷＣＯ  １０．０００ｋＤ透析膜を使用して２×２時間、Ｍｅｓバッファー（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）ｐＨ７．４に透析した。ＶＬＰ（５０μＭ）を、サーモ・ミキサー中の２５℃での２時間のインキュベーション中に、ｐ３３ペプチド（２５０μＭ）のＮ末端のシステインと次いで結合させた。サンプルを１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４に十分に透析して（ＭＷＣＯ  ３００．０００）、望ましくない遊離ペプチドを排除した。
【０３２４】
図２２は、ＳＭＰＨによるＨＢｃＡｇ  ｗｔ  ＶＬＰ誘導体化およびｐ３３ペプチドとの結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。サンプルは１６％ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析し、クーマシーブルーで染色した。ＨＢｃＡｇ−ｗｔは、２１ｋＤのタンパク質バンドとして見ることができた。ＳＭＰＨの分子量が小さいために、誘導体生成物はわずかに大きいだけであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって識別することができない。ペプチドのみは３ｋＤのバンドとして見ることができ、ＨＢｘ３３と名付けた結合型生成物は、ＨＢｃＡｇ−ｗｔ全体の５０％を超える割合を占める、約２４ｋＤの強烈な二次的バンドを示した。
【０３２５】
酵素によるＲＮＡ加水分解：ＲＮａｓｅ  Ａ（３００μｇ／ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下において、ＨＢｘ３３  ＶＬＰ（０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ、１×ＰＢＳバッファー  ｐＨ７．４）を、４倍体積のＨ２Ｏで希釈して、塩濃度を最終０．２×ＰＢＳ濃度に低下させ、サーモ・ミキサー中において６５０ｒｐｍで、３７℃において３時間インキュベートした。
【０３２６】
免疫賦活性核酸のパッケージ化：ＲＮＡｓｅ  Ａによる消化の後、ＨＢｘ３３  ＶＬＰを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ又はＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ濃縮装置を使用して濃縮し、次いで１３０ｎｍｏｌ／ｍｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドＢ−ＣｐＧｐｔを補い、サーモ・ミキサー中で３７℃において３時間、０．２×ＰＢＳ  ｐＨ７．４中でインキュベートした。次に、反応混合物にＤＮａｓｅＩ（５Ｕ／ｍｌ）による消化を３７℃において３時間行った（ＤＮａｓｅＩ，ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。マウス免疫化用のＶＬＰ調製物を、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４（２００倍体積に対して２倍）で２４時間かけて十分に透析して、ＲＮＡｓｅ  Ａおよび過剰なＣｐＧ−オリゴヌクレオチドを排除した。図２３は、ＲＮＡｓｅ処理によってキャプシドの核酸含量が減少し、それらの移動速度が低下したことを示す。Ｂ−ＣｐＧｐｔを加えることによって、核酸含量およびキャプシドの速い移動が元通りになった。ＤＮＡｓｅ  Ｉは遊離オリゴヌクレオチドのみを消化し、一方パッケージ化されたオリゴヌクレオチドは、透析後もＶＬＰ中で元の状態であった（図２３）。
【０３２７】
図２２は、クーマシーブルー染色の後の、ｐ３３とＨＢｃ  ＶＬＰの結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルに担持したのは以下のサンプルである：１．ＮＥＢ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ、Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（＃  ７７０８Ｓ）、１０μｌ；２．ＣＧＧ−ｐ３３ペプチド；３．ＨＢｃ  ＶＬＰ、ＳＭＰＨで誘導体化させた、透析前のもの；４．ＨＢｃ  ＶＬＰ、ＳＭＰＨで誘導体化させた、透析後のもの；５．ＨＢｃ  ＶＬＰ、ＣＧＧ−ｐ３３と結合させたもの、上澄み；６．ＨＢｃ  ＶＬＰ、ＣＧＧ−ｐ３３と結合させたもの、ペレット。
【０３２８】
図２３は、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロース・ゲル上における、Ｂ−ＣｐＧｐｔのＨＢｘ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは５０μｇの以下のサンプルである：１．ＨＢｘ３３  ＶＬＰ、未処理；２．ＨＢｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；３．ＨＢｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつＢ−ＣｐＧｐｔをパッケージ化したもの；４．ＨＢｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、Ｂ−ＣｐＧｐｔをパッケージ化し、かつＤＮａｓｅＩで処理したもの；５．ＨＢｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、Ｂ−ＣｐＧｐｔをパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し、かつ透析したもの；６．１ｋｂのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤＮＡラダー。
【実施例１３】
【０３２９】
免疫賦活性核酸は、抗原と結合させたＱβ  ＶＬＰ中にパッケージ化することができる
ｐ３３ペプチドとＱβ  ＶＬＰの結合：
組み換えによって生成させたＱβ  ＶＬＰを、Ｎ末端ＣＧＧ又はおよびＣ末端ＧＧＣ延長部（ＣＧＧ−ＫＡＶＹＮＦＡＴＭおよびＫＡＶＹＮＦＡＴＭ−ＧＧＣ）を含む、ｐ３３ペプチドと結合させた後に使用した。組み換えによって生成させたＱβ  ＶＬＰを、２５℃で０．５時間、１０倍モル過剰のＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて誘導体化させ、次に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２で４℃において透析して、未反応ＳＭＰＨを除去した。５倍モル過剰のペプチドを加え、３０％アセトニトリルの存在下で、サーモ・ミキサー中において２５℃で２時間反応させた。図２４は、多数の結合バンドが、Ｑβモノマーと結合した１個、２個又は３個のペプチドからなることを実証する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す（矢印、図２４）。
【０３３０】
Ｑβ  ＶＬＰは、バクテリオファージＱβキャプシド・タンパク質を発現することによって大腸菌中で生成されると、ＲＮＡを含み、このＲＮＡを消化し、ＶＬＰとＲＮａｓｅ  Ａをインキュベートすることによって排除することができる。
【０３３１】
低いイオン強度および低いＱβ濃度が、ＲＮａｓｅ  ＡによるＱβ  ＶＬＰのＲＮＡ加水分解を可能にする：
２０ｍＭのＨｅｐｅｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファー（ＨＢＳ）ｐＨ７．４中に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のＱβ  ＶＬＰを、ＲＮａｓｅ  Ａ（３００μｇ／ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を加えることによって直接消化し、あるいは４倍体積のＨ２Ｏで希釈して、最終０．２×ＨＢＳ濃度にし、次いでＲＮａｓｅ  Ａ（６０μｇ／ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と共にインキュベートした。インキュベーションは、サーモ・ミキサー中において６５０ｒｐｍで、３７℃において３時間行った。図２５は、１×ＨＢＳ中では、ＲＮＡ含量の非常にわずかな減少のみが観察されたが、一方０．２×ＨＢＳ中では、大部分のＲＮＡが加水分解されたことを実証する。これと一致して、１×ＨＢＳ中に溶かしたＲＮＡｓｅ  Ａを加えた後、キャプシドの移動は変化がなかったが、一方０．２×ＨＢＳ中に溶かしたＲＮＡｓｅ  Ａを加えた後には、移動が遅くなった（図２５Ｂ、Ｄ）。
【０３３２】
低いイオン強度が、Ｑβ  ＶＬＰ中の核酸のパッケージ化を増加させる：
ＲＮａｓｅ  Ａによる消化の後、０．２×ＨＢＳ中に、Ｑβ  ＶＬＰを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ又はＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ濃縮装置を使用して１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、等分試料を１×ＨＢＳ又は０．２×ＨＢＳで透析した。Ｑβ  ＶＬＰに１３０ｎｍｏｌ／ｍｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドＢ−ＣｐＧを補い、サーモ・ミキサー中で３７℃において３時間インキュベートした。その後Ｑβ  ＶＬＰに、ベンゾナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）による消化を３７℃において３時間行った。サンプルは、臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色した後、１％アガロース・ゲル上で分析した。図２６は、１×ＨＢＳ中では、非常に少量のオリゴヌクレオチドのみをパッケージ化することができたが、一方０．２×ＨＢＳ中では、強烈な臭化エチジウム染色バンドが検出可能であり、これがキャプシドのクーマシーブルー染色部分と同時局在していたことを示す。
【０３３３】
異なる免疫賦活性核酸を、Ｑβ  ＶＬＰ中にパッケージ化することができる：
ＲＮａｓｅ  Ａによる消化の後、０．２×ＨＢＳ中に、Ｑβ  ＶＬＰを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ又はＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓ濃縮装置を使用して１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１３０ｎｍｏｌ／ｍｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドＢ−ＣｐＧｐｔ、ｇ１０ｇａｃｇａおよび２５３量体ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３（表Ｉ）を補い、サーモ・ミキサー中で３７℃において３時間インキュベートした。その後Ｑβ  ＶＬＰに、ＤＮＡｓｅ  Ｉによる消化（５Ｕ／ｍｌ）又はベンゾナーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）による消化を、３７℃において３時間行った。サンプルは、臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色した後、１％アガロース・ゲル上で分析した。図２７は、異なる核酸Ｂ−ＣｐＧｐｔ、ｇ１０ｇａｃｇａおよび２５３量体ｄｓＤＮＡを、Ｑｂｘ３３中にパッケージ化することができたことを示す。パッケージ化された核酸はＤＮＡｓｅ  Ｉによる消化に耐性があり、透析中パッケージ化されたままであった（図２７）。Ｂ−ＣｐＧｐｔのパッケージ化は、プロテイナーゼＫによる消化による核酸の放出、次にアガロースの電気泳動および臭化エチジウム染色によって確認した（図２７Ｃ）。
【０３３４】
図２４は、クーマシーブルー染色の後の、ｐ３３とＱβ  ＶＬＰの結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。担持したのは以下のサンプルである：（Ａ）１．ＮＥＢ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ、Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（＃  ７７０８Ｓ）、１０μｌ；２．Ｑβ  ＶＬＰ、１４μｇ；３．Ｑβ  ＶＬＰ、ＳＭＰＨで誘導体化させた、透析後のもの；４．Ｑβ  ＶＬＰ、ＣＧＧ−ｐ３３と結合させたもの、上澄み。（Ｂ）１．ＮＥＢ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ、Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（＃  ７７０８Ｓ）、１０μｌ；２．Ｑβ  ＶＬＰ、１０μｇ；３．Ｑβ  ＶＬＰ、ＧＧＣ−ｐ３３と結合させたもの、上澄み。
【０３３５】
図２５は、臭化エチジウム（Ａ、Ｃ）およびクーマシーブルー（Ｂ、Ｄ）で染色した１％アガロース・ゲル上での、低および高イオン強度下における、ＲＮａｓｅ  ＡによるＱβ  ＶＬＰからのＲＮＡ加水分解の分析を示す。ゲルに担持したのは以下のサンプルである：（Ａ、Ｂ）１．ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓの１ｋｂのＤＮＡラダー；２．Ｑβ  ＶＬＰ、未処理；３．Ｑβ  ＶＬＰ、１×ＨＢＳバッファーｐＨ７．２に溶かしたＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの。（Ｃ、Ｄ）１．ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓの１ｋｂのＤＮＡラダー；２．Ｑβ  ＶＬＰ、未処理；３．Ｑβ  ＶＬＰ、０．２×ＨＢＳバッファーｐＨ７．２に溶かしたＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの。
【０３３６】
図２６は、臭化エチジウム（Ａ）およびクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロース・ゲル上での、低および高イオン強度下における、Ｂ−ＣｐＧのＱβ  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは以下のサンプルである：１．Ｑβ  ＶＬＰ、未処理；２．Ｑβ  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；３．Ｑβ  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、０．２×ＨＢＳバッファーｐＨ７．２に溶かしたＢ−ＣｐＧをパッケージ化し、かつベンゾナーゼで処理したもの；４．ＨＢｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、１×ＨＢＳバッファーｐＨ７．２に溶かしたＢ−ＣｐＧをパッケージ化し、かつベンゾナーゼで処理したもの。
【０３３７】
図２７は、臭化エチジウム（Ａ）およびクーマシーブルー（Ｂ）で染色した１％アガロース・ゲル上での、Ｂ−ＣｐＧｐｔのＱｂｘ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは以下の５０μｇのサンプルである：１．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、未処理；２．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；３．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつＢ−ＣｐＧｐｔをパッケージ化したもの；４．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、Ｂ−ＣｐＧｐｔをパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し、かつ透析したもの；５．１ｋｂのＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＤＮＡラダー。（Ｃ）は、ＣＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した１５％ＴＢＥ／尿素上における、ＶＬＰから抽出されたパッケージ化されたオリゴの量の分析を示す：ゲルに担持したのは以下のサンプルである：１．ＢＣｐＧｐｔオリゴ含有２μｇＱｂｘ３３  ＶＬＰ、プロテイナーゼＫで消化した後の、ＲＮａｓｅ  Ａ処理したもの；２．２０ｐｍｏｌのＢＣｐＧｐｔコントロール；３．１０ｐｍｏｌのＢＣｐＧｐｔコントロール；４．５ｐｍｏｌのＢＣｐＧｐｔコントロール。
【０３３８】
図２７ＤおよびＥは、臭化エチジウム（Ｄ）およびクーマシーブルー（Ｅ）で染色した１％アガロース・ゲル上での、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯのＱｂｘ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは以下の１５μｇのサンプルである：１．ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓの１ｋｂのＤＮＡラダー；２．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、未処理；３．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；４．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、かつｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯをパッケージ化したもの；５．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯをパッケージ化し、ベンゾナーゼで処理し、かつ透析したもの。
【０３３９】
図２７ＥおよびＦは、臭化エチジウム（Ｅ）およびクーマシーブルー（Ｆ）で染色した１％アガロース・ゲル上での、ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３のＱｂｘ３３  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。ゲルに担持したのは以下の１５μｇのサンプルである：１．ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓの１ｋｂのＤＮＡラダー；２．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、未処理；３．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理したもの；４．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３をパッケージ化し、かつＤＮａｓｅＩで処理したもの；５．Ｑｂｘ３３  ＶＬＰ、ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ｄｓＣｙＣｐＧ−２５３をパッケージ化し、ＤＮａｓｅＩで処理し、かつ透析したもの。
【実施例１４】
【０３４０】
Ｑβの分解、再構築、および免疫賦活性核酸のパッケージ化
Ｑβ  ＶＬＰの分解および再構築
分解：７０ｍｇの純粋な凍結乾燥Ｑβ  ＶＬＰは、以下の３つの式によって得られた平均的結果を使用する吸光光度定量法に従って、約３５ｍｇのタンパク質含量を与えた：１．（１８３＊ＯＤ２３０ｎｍ−７５．８＊ＯＤ２６０ｎｍ）＊体積（ｍｌ）−２．（（ＯＤ２３５ｎｍ−ＯＤ２８０ｎｍ）／２．５１）×体積−３．（（ＯＤ２２８．５ｎｍ−ＯＤ２３４．５ｎｍ）＊０．３７）×体積。純粋な凍結乾燥Ｑβ  ＶＬＰを、７ｍｌの６Ｍ  ＧｕＨＣｌに溶解させ、４℃で一晩インキュベートした。溶液は、１５分間６０００ｒｐｍで浄化した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０  Ｒ、固定角ローターＦ３４−６−３８中、以下のステップすべてで使用した）。無視できるほどの沈殿物を捨て、上澄みを、２００〜３００ｍｌのＮＥＴバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、および５ｍＭのＥＤＴＡ、および１５０ｍＭのＮａＣｌ）で、３日間かけて５回透析した。あるいは上澄みを、３〜４日間かけて１．５ｌのＮＥＴバッファーによって連続形式で透析した。生成した懸濁液を、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけた。ペレットを２〜３ｍｌの８Ｍ尿素に再溶解させ、一方上澄みは、６０％飽和の固体硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた。飽和硫酸アンモニウム溶液を、尿素中に事前に再溶解させたペレットに加え６０％飽和にし、その溶液を４℃で４日間沈殿させ、その後１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけた。このペレット、および最初の上澄みのペレットを再溶解させ、７Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴの合計体積３ｍｌにした。この物質をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラムに充填し、２ｍｌ／ｈで７Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴを溶出した。２つのピーク物質を単離した。高分子量のピーク物質が、みかけの分子量が小さいピーク物質に先行した。同じ溶出バッファーの、キモトリプシンによるカラムの検量によって、第２のピーク物質のみかけの分子量が、二量体形であるＱβコート・タンパク質と一致することが明らかになった。この二量体物質を含む画分を集め、硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた（２日間、４℃で）。ペレットを数滴の水で洗浄し、再度遠心分離にかけ、２ｍｌの７Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴに溶解させた。次いでこの物質を、短い（１．５×２７ｃｍ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムで精製した。カラムから溶出した１つのピーク物質および画分を集め、体積１０ｍｌのタンパク質調製物、および２８０ｎｍでの吸光度と２６０ｎｍでの吸光度の０．６８／０．５という比をもたらし、約４５０ｎｍｏｌのＱβコート・タンパク質（ＶＬＰ中に１８０のサブユニットが存在することを考慮すると、再構築後に最大２．５ｎｍｏｌの  ＶＬＰを与える）、および６３０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度（前に記載した吸光光度法を使用して計算した）を与えた。
【０３４１】
再構築：β−メルカプトエタノールを１０ｍｌの二量体画分に加えて、最終濃度１０％にし、１２．３ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドを含む、（ＣｐＧ）２０ＯｐＡオリゴデオキシヌクレオチドの溶液３００μｌを加えた。再構築混合物を、１０％β−メルカプトエタノールを含む３０ｍｌのＮＥＴバッファーで、４℃で２時間最初に透析し、次いで８ｍｌ／ｈというＮＥＴバッファーの流速で、４℃で４日間かけて連続形式で透析した。次いで再構築混合物を、透析によって水で脱塩し、６回バッファー交換した（４回は１００ｍｌ、２回は１リットル）。
【０３４２】
２８０ｎｍでの吸光度と２６０ｎｍでの吸光度の比は、０．１６７／０．２４であった。タンパク質は凍結乾燥によって乾燥させた。乾燥させたタンパク質を水に再溶解させ、ＳＷ  ５０．１ローター２２０００ｒｐｍ、４℃において１７時間、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ  ８−８０遠心分離機中でのスクロース勾配超遠心分離によって精製した。スクロース勾配による精製は以下のように行った。以下のスクロース濃度（ｗ／ｖ）の１ｍｌの５層を遠心分離チューブに分注した：５０％、４３％、３６％、２９％および２２％。このようにして形成した一連の層を、一晩４℃で放置した。０．５ｍｌのタンパク質サンプルを勾配で層状にし、前に示したように１７時間遠心分離にかけた。勾配物を遠心分離チューブの底部から溶出し、５ｍｌの勾配物を約３００μｌの１６の画分に分けた。勾配中の画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２８）およびオクタロニー分析によって分析した。画分６〜９はＱβコート・タンパク質を含んでおり、オクタロニー分析においてＱβ  ＶＬＰに典型的な沈殿バンドを与えた。みかけの密度が低くＱβタンパク質を含んでいた画分１１〜１５は、オクタロニー分析においてキャプシドのバンドは与えなかった。再構築型Ｑβは、実験誤差内でｗｔ  Ｑβと同じみかけの密度を有していた。スクロース勾配の画分６〜９を集め、水で透析し、凍結乾燥させた。次いでこの物質を、電子顕微鏡写真（ＥＭ）分析（図２９）およびオクタロニー分析（図３０ＡおよびＢ）用に再溶解させた。ＥＭ手順は以下の通りであった：タンパク質の懸濁液を、カーボン−ホルムバール被覆型グリッドに吸収させ、２％リンタングステン酸（ｐＨ６，８）で染色した。グリッドは、ＪＥＭ  １００Ｃ（ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）電子顕微鏡を用いて８０ｋＶの加速電圧で調べた。写真による記録（ネガ）をＫｏｄａｋ電子画像フィルム上に行い、Ｋｏｄａｋ  Ｐｏｌｙｍａｘ紙上にネガをプリントすることによって、電子顕微鏡写真を得た。両方の方法によって、再構築型ＶＬＰは、完全なＱβ  ＶＬＰと同じマクロ分子的性質を有することが示される。さらに、精製された再構築型Ｑβ  ＶＬＰによって示されるジスルフィド結合の型は、未処理Ｑβ  ＶＬＰによって示されるジスルフィド結合の型、ペンタマーおよびヘキサマーの典型的な型と区別不能である（図３１Ａ）。
【０３４３】
核酸含量の分析：再構築型Ｑβ  ＶＬＰを、膵臓ＤＮＡｓｅ  Ｉによって以下のように消化した。（ＣｐＧ）２０ＯｐＡオリゴデオキシヌクレオチドと再構築したＱβ  ＶＬＰの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液２００μｌに、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｆｌｕｋａ）１Ｕ／μｌの溶液２０μｌ、およびＤＮＡｓｅ  Ｉバッファー（２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．３）２２μｌを加えた。反応混合物を３７℃において２時間３０分インキュベートした。サンプルの核酸含有物を、フェノール／クロロホルム抽出によってその後単離し、臭化エチジウムで染色した２％アガロース・ゲルに担持した（図３１Ｂ）。パッケージ化されたオリゴデオキシヌクレオチドの大きさのバンドを、ゲル上で検出した。大きな見かけの分子量で移動するバンドも見ることができた。我々は、この大きさのバンドをもたらすと思われる、（ＣｐＧ）２０ＯｐＡオリゴデオキシヌクレオチドのマルチマーの存在を結論付けることはできない。したがってゲルによって、適切な大きさのＤＮＡｓｅ  Ｉ保護型オリゴデオキシヌクレオチドが、再構築型Ｑβ  ＶＬＰ中に存在したことが示される。なぜならオリゴデオキシヌクレオチドを、その後ＤＮＡｓｅ  Ｉによって消化することができたが、ＲＮＡｓｅ  Ａによって消化することはできなかったからである。したがってオリゴデオキシヌクレオチドは、ＶＬＰの最初の分解、核酸由来の分解したコート・タンパク質の精製、およびその後のオリゴデオキシヌクレオチドの存在下でのＶＬＰの再構築の後に、Ｑβ  ＶＬＰ中に首尾よくパッケージ化されると思われる。
【０３４４】
図２８は、スクロース勾配遠心分離からの、画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルに担持したのは以下のサンプルであった。レーン１〜１０：スクロース勾配超遠心分離の画分６〜１５。
【０３４５】
図２９は、（Ａ）完全なＱβ  ＶＬＰおよび（Ｂ）（ＣｐＧ）２０ＯｐＡオリゴヌクレオチドの存在下での分解および再構築、およびその後のスクロース勾配超遠心分離による精製後のＱβ  ＶＬＰの、ＥＭ写真を示す。キャプシドの濃い表面層が観察され、これらのキャプシドは、完全なＱβ  ＶＬＰと同じ構造的特徴および性質を示す。
【０３４６】
図３０は、再構築したＱβ  ＶＬＰのオクタロニー分析（免疫拡散）を示す。図３０Ａでは、（ＣｐＧ）２０ＯｐＡオリゴヌクレオチドと再構築したＱβ  ＶＬＰを、完全なＱβ  ＶＬＰの隣に担持した。その２つの特徴的な沈殿バンドを、黒矢印によって示す。この２つの沈殿バンドは一致し、再構築したＱβ  ＶＬＰは完全なＱβ  ＶＬＰとして拡散することが示される。図３０Ｂでは、サンプル１はリボソームＲＮＡの存在下で再構築したＱβ  ＶＬＰであり、一方サンプル２は、完全なＱβ  ＶＬＰであり、サンプル３はオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）２０ＯｐＡと再構築したＱβ  ＶＬＰである。沈殿バンドは白矢印によって示す。
【０３４７】
図３１Ａは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、未処理および再構築Ｑβ  ＶＬＰの分析を示す。Ｑβ  ＶＬＰのペンタマーおよびヘキサマーを、矢印によって示す。
【０３４８】
図３１Ｂは、（ＣｐＧ）２０ＯｐＡオリゴヌクレオチドと再構築したＱβ  ＶＬＰのＤＮＡｓｅ  Ｉによる消化後に抽出した、ヌクレオチド含有物のアガロース・ゲルの電気泳動分析を示す。核酸含有物は未処理であったか（レーン１）、あるいはその後ＤＮＡｓｅ  Ｉ（レーン２）又はＲＮＡｓｅ  Ａ（レーン３）により消化したか；３３μｇの再構築Ｑβ  ＶＬＰをそれぞれのレーンに担持した。３００ｎｇの５０ｂｐオリゴヌクレオチドをレーン４に担持し、一方１０μｌのＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  １００ｂｐ  ＤＮＡラダーおよびマーカー（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）をレーン５に担持した。
【実施例１５】
【０３４９】
異なる免疫賦活性核酸を有するＱβの分解、再構築
さまざまな配列のオリゴデオキシヌクレオチドを有するＱβ  ＶＬＰの分解および再構築
Ｑβ  ＶＬＰの分解を、本質的に実施例１に記載したように行った。ただし、７Ｍ尿素ではなく８Ｍ尿素を使用して、硫酸アンモニウムのペッレトを再懸濁させた。
【０３５０】
オリゴＣｙＯｐＡ、ＣｙＣｙＣｙ、（ＣｐＧ）２０−ＯｐＡおよびＣｙＣｐＧとのＱβ  ＶＬＰの再構築を、本質的に実施例１に記載したように行った。ただし、以下のことを変えた。４℃で１時間の、１０％β−メルカプトエタノールをＮＥＴバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、および５ｍＭのＥＤＴＡおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ）に溶かしたものでの透析ステップを、オリゴデオキシヌクレオチド溶液を透析バッグ中の二量体溶液に加える前に、手順に加えた。次いでオリゴデオキシヌクレオチドを二量体溶液に加え、前に記載したようにキャプシド（１８０サブユニット）に対して約１０倍モル過剰のオリゴヌクレオチドを生成させた。再構築混合物を、４℃で１時間、１０％β−メルカプトエタノールを含む３０ｍｌのＮＥＴバッファーで最初に透析し、次いで８ｍｌ／ｈというＮＥＴバッファーの流速で、４℃で４日間かけて連続形式で透析した。オリゴデオキシヌクレオチドＣｙＯｐＡを含むＱβ  ＶＬＰの再構築した反応混合物のサンプルを、ＥＭ分析（図３２）用に再構築反応の終期に採取した。リンタングステン酸を使用する前に記載したＥＭ手順を使用した。次いで再構築混合物を、透析によって水で脱塩し、乾燥させた。
【０３５１】
乾燥させたタンパク質を水に再溶解させ、スクロース勾配超遠心分離によって精製した。精製した再構築型Ｑβ  ＶＬＰは、ＥＭによっても分析した（図３３Ａ〜Ｄ）。電子顕微鏡写真によって、再構築型ＶＬＰは、完全なＱβ  ＶＬＰと同じマクロ分子的性質を有することが示される。精製によって、再構築した粒子の調製物が著しくブロモフェノールブルーする。したがってＱβ  ＶＬＰは、さまざまな長さおよび配列のオリゴデオキシヌクレオチドと首尾よく再構築した。
【０３５２】
ｐ３３ペプチドと再構築型Ｑβ  ＶＬＰの結合：オリゴデオキシヌクレオチドＣｙＯｐＡと再構築したＱβ  ＶＬＰを、１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、架橋剤の最終濃度が５３６μＭであるＤＭＳＯのストック溶液から希釈した架橋剤ＳＭＰＨと、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４中において２６℃で３５分間反応させた。誘導体化させたＱβ  ＶＬＰを、１０００倍体積の２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で２×２時間透析した。１．４ｍｇ／ｍｌの濃度の透析した誘導体化Ｑβ  ＶＬＰを、ペプチドの最終濃度が２５０μＭであるｐ３３ＧＧＣペプチド（配列：ＫＡＶＹＮＦＡＴＭＧＧＣ）と、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中において１５℃で２時間、その後反応させた。図３４のゲルは、ｐ３３ペプチドとＱβ  ＶＬＰの首尾良い結合を示す。サブユニット当たりに結合した１個、それぞれ２個のペプチドに対応する結合バンドは、図中に矢印によって示す。
【０３５３】
核酸含量の分析：再構築した結合型のＱβ  ＶＬＰの核酸含量を、プロテイナーゼＫによる消化、フェノール／クロロホルム抽出、および抽出したオリゴヌクレオチドをＴＢＥ／Ｕｒｅａ  ＰＡＧＥゲルにその後担持することによって分析した。分析手順は以下の通りであった。２５μｌの再構築型のＱβ  ＶＬＰ（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ）に、０．５μｌのプロテイナーゼＫ、１．５μｌの１０％  ＳＤＳ、および３μｌの１０×プロテイナーゼ・バッファー（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４）を補った。３７℃において一晩インキュベーションした後、６５℃で２０分間加熱することによってプロテイナーゼＫを不活性化させ、１×フェノールおよび１×クロロホルム抽出によって、核酸含有物をサンプルから抽出させた。その後サンプルを、１μｌのＲＮＡｓｅＡ（Ｑｉａｇｅｎ、１００μｇ／ｍｌ、２５０倍希釈）と共に、３７℃において２時間インキュベートした。等量の２μｇの出発タンパク質を、１倍体積の２×ローディング・バッファー（１ｍｌの１０×ＴＢＥ、４．２ｇの尿素、１．２ｇのブロモフェノールブルー、１ｍｌの０．１％ブロモフェノールブルー、１０ｍｌまでのＨ２Ｏ）と共に、９５℃で３分間加熱し、１５％  ＴＢＥ／尿素ポリアクリルアミド・ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に担持した。このゲルを１．５時間１８０Ｖにし、１０％酢酸／２０％エタノール中に固定し、ＣＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ、ＵＳＡ）で染色した。定量化用に、再構築用に使用した１０および２０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを、参照としてゲルに施した。ＲＮＡｓｅに対する核酸含有物の耐性、およびその大きさによって、パッケージ化されていた核酸が再構築用に使用したオリゴヌクレオチドであったことが証明された。パッケージ化されていたオリゴデオキシヌクレオチドの定量化は、抽出したオリゴヌクレオチドのバンド強度を、同じゲルに担持した参照量の同じオリゴヌクレオチドのバンド強度と比較することによって行った。１．７５ｎｍｏｌ  ＣｙＯｐＡ／１００μｇ  Ｑβ  ＶＬＰという数字が得られ、ＶＬＰ当たり平均して４４個というオリゴヌクレオチドの割合であった。
【０３５４】
図３２は、精製前のＱβ  ＶＬＰとオリゴヌクレオチドＣｙＯｐＡの再構築反応の電子顕微鏡写真を示す。倍率は２０００００倍であった。
【０３５５】
図３３Ａ〜Ｄは、Ｑβ  ＶＬＰとオリゴデオキシヌクレオチドＣｙ（ＣｐＧ）２０（Ａ）、ＣｙＣｙＣｙ（Ｂ）、ＣｙＣｐＧ（Ｃ）およびＣｙＯｐＡ（Ｄ）の、精製した再構築反応混合物の電子顕微鏡写真を示す。倍率は２０００００倍であった。
【０３５６】
図３４は、オリゴデオキシヌクレオチドＣｙＯｐＡと再構築したＱβ  ＶＬＰとｐ３３ＧＧＣペプチドの結合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ゲルに担持したのは以下のサンプルである：１．Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ、Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ（＃  ７７０８Ｓ）、１０μｌ；２．Ｑβ  ＶＬＰ、ＣｙＯｐＡと再構築したもの［１．５ｍｇ／ｍｌ］１０μｌ；３．Ｑβ  ＶＬＰ、ＣｙＯｐＡと再構築し［１．５ｍｇ／ｍｌ］、かつＳＭＰＨで誘導体化させたもの、１０μｌ；４．Ｑβ  ＶＬＰ、ＣｙＯｐＡと再構築し［１．５ｍｇ／ｍｌ］、ＳＭＰＨで誘導体化させ、かつｐ３３−ペプチドと結合させたもの、１０μｌ；５．Ｑβ  ＶＬＰ、ＣｙＯｐＡと再構築し［１．５ｍｇ／ｍｌ］、ＳＭＰＨで誘導体化させ、かつｐ３３−ペプチドと結合させたもの、５分の１体積のペレット。
【０３５７】
図３５は、ＣＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した尿素ポリアクリルアミド・ゲルの電気泳動によって抽出した、パッケージ化型オリゴデオキシヌクレオチドの分析を示す。以下のサンプルをゲルに担持した：１．Ｑβ  ＶＬＰ、オリゴヌクレオチドＣｙＯｐＡと再構築し、ｐ３３ＧＧＣペプチドと結合させたもの、ゲルに担持した２μｇのタンパク質。２．Ｑβ  ＶＬＰ、オリゴヌクレオチドＣｙＯｐＡと再構築し、ｐ３３ＧＧＣペプチドと結合させ、ゲルに担持する前に凍結および解凍させたもの、２μｇのタンパク質。３．Ｑβ  ＶＬＰ、オリゴヌクレオチドＣｙ（ＣｐＧ）２０と再構築し、ｐ３３ＧＧＣペプチドと結合させ、ゲルに担持する前に凍結および解凍させたもの；２μｇのタンパク質。４．ＣｙＯｐＡオリゴヌクレオチド、２０ｐｍｏｌ。５．ＣｙＯｐＡオリゴヌクレオチド、１０ｐｍｏｌ。
【実施例１６】
【０３５８】
Ｑβの分解、再構築およびパッケージ化
Ｑβ  ＶＬＰの分解および再構築
分解：１０ｍｇのＱβ  ＶＬＰ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって測定したもの）を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌに溶かしたものを、最終飽和度６０％の固体硫酸アンモニウムを用いて沈殿させた。沈殿は４℃で一晩行い、沈殿したＶＬＰを４℃で６０分間の遠心分離によって沈殿させた（ＳＳ−３４ローター）。ペレットを、１００ｍＭのＤＴＴ（最終濃度）を含む１ｍｌの６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣＩ）に再懸濁させ、４℃で８時間インキュベートした。
【０３５９】
サイズ排除クロマトグラフィーによるＱβコート・タンパク質の精製：溶液は、１０分間１４０００ｒｐｍで浄化し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１７Ｒ、固定角ローターＦ４５−３０−１１中、以下のステップすべてで使用した）、７Ｍ尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＤＴＴを含むバッファー（２０００ｍｌ）で一晩透析した。透析バッファーを１度交換し、さらに２時間透析を続けた。生成した懸濁液を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。無視できるほどの沈殿物を捨て、分解したコート・タンパク質およびＲＮＡを含む上澄みを、「充填用画分」として保存した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定し、５ｍｇの合計タンパク質を、７Ｍ尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１０ｍＭのＤＴＴを用いて平衡状態にした、ＨｉＬｏａｄ（商標）ＳｕｐｅｒｄｅＸ（商標）７５調製用カラム（２６／６０、アマシャム  バイオサイエンシズ）に施した。サイズ排除クロマトグラフィーは、平衡化バッファー（７Ｍ尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭのＤＴＴ）を用いて１２℃において、０．５ｍｌ／分の流速で行った。溶出中に、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定した。２つのピーク物質を単離した。高分子量のピーク物質が、みかけの分子量が小さいピーク物質に先行した。ピーク物質を１．５ｍｌの画分で回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にクーマシー染色、およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色によって、等分試料を分析した（図３６）。
【０３６０】
イオン交換クロマトグラフィーによるＱβコート・タンパク質の精製：あるいは、浄化した上澄みを、７Ｍ尿素、２０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．０を含むバッファー（２０００ｍｌ）で一晩透析した。透析バッファーを１度交換し、さらに２時間透析を続けた。生成した懸濁液を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。無視できるほどの沈殿物を捨て、分解したコート・タンパク質およびＲＮＡを含む上澄みを、「充填用画分」として保存した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定し、合計１０ｍｇの合計タンパク質を、バッファーＡ（以下参照）を用いて１０ｍｌの最終体積に希釈し、１ｍｌ／分の流速で、７Ｍ尿素、２０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．０のバッファーＡを用いて平衡状態にした、１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ  ＨＰカラム（アマシャム  バイオサイエンシズ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−１１５１−０１）に施した。ＲＮＡを含んでいた流動物を、１つの画分として回収した。カラムをバッファーＡ（３０ＣＶ）で十分に洗浄した後、結合したＱβコート・タンパク質を、０％〜１００％のバッファーＢの直線勾配（勾配長は５ＣＶであった；バッファーＡ：前を参照、バッファーＢ：７Ｍ尿素、２０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で溶出させた。充填、洗浄および溶出中に、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定した。１ｍｌのピーク画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にクーマシー染色、およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染色によって分析した。Ｑβコート・タンパク質を含むがＲＮＡを含まない画分を識別し、１００μｌの１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えることによって、ｐＨを調節した。
【０３６１】
Ｑβコート・タンパク質を含むがＲＮＡを含まないサンプルを集め、０．８７Ｍ尿素、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ、１０ｍＭのＤＴＴ（２０００ｍｌ）で一晩透析し、バッファーを１度交換し、さらに２時間透析を続けた。生成した懸濁液を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。無視できるほどの沈殿物を捨て、上澄みを、「分解したコート・タンパク質」として保存した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定した。
【０３６２】
再構築：０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の精製したＱβコート・タンパク質を、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下においてＶＬＰの再構築用に使用した。再構築反応用に、Ｑβ−ＶＬＰキャプシドの計算した理論上の量（１８０で割ったモノマー濃度）より１０倍過剰な、オリゴデオキシヌクレオチドを使用した。Ｑβコート・タンパク質を、再構築反応中に、パッケージ化するオリゴデオキシヌクレオチドと混合した後、この溶液（５ｍｌまでの体積）を、４℃において１０％β−メルカプトエタノールを含む５００ｍｌのＮＥＴバッファーで２時間最初に透析し、次いで８ｍｌ／ｈというＮＥＴバッファーの流速で、４℃で７２時間かけて連続形式で透析し、最後にさらに７２時間、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌから構成されるバッファーを用いて、同じ連続形式で透析した。生成した懸濁液を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。無視できるほどの沈殿物を捨て、上澄みは、再構築しパッケージ化されたＶＬＰを含んでいた。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定し、必要な場合は、再構築しパッケージ化されたＶＬＰを、遠心分離濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＶ４ＢＣＣ２５、５Ｋ  ＮＭＷＬ）を用いて濃縮して、最終タンパク質濃度３ｍｇ／ｍｌにした。
【０３６３】
再構築しパッケージ化されたＶＬＰの精製：１０ｍｇまでの合計タンパク質を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡状態にした、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商品名）ＣＬ−４Ｂカラム（１６／７０、アマシャム  バイオサイエンシズ）に担持した。サイズ排除クロマトグラフィーは、平衡化バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を用いて室温において、０．４ｍｌ／分の流速で行った。溶出中に、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定した。２つのピーク物質を単離した。高分子量のピーク物質が、みかけの分子量が小さいピーク物質に先行した。０．５ｍｌの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次にクーマシーブルー染色によって分析した（図３７）。大腸菌由来の完全な十分に精製されたＱβキャプシドに関する、カラムの検量によって、主要な第１のピーク物質のみかけの分子量が、Ｑβキャプシドと一致することが明らかになった。
【０３６４】
オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβ  ＶＬＰの分析：
Ａ）キャプシドの全体的構造：以下のオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｙＯｐＡ、Ｃｙ（ＣｐＧ）２０ＯｐＡ、Ｃｙ（ＣｐＧ）２０、ＣｙＣｙＣｙ、（ＣｐＧ）２０ＯｐＡ）の１つの存在下、又は大腸菌由来のｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９５４１）の存在下で、再構築したＱβ  ＶＬＰを、電子顕微鏡法（酢酸ウラニルｐＨ４．５によるネガティブ染色）によって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰと比較した。ネガティブコントロールとして、核酸が除去された再構築反応混合物が働いた。再構築型キャプシドは、完全なＱβ  ＶＬＰと同じ構造的特徴および性質を示した（図３８）。
Ｂ）再構築したキャプシドの流体力学的大きさ：オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβキャプシドを、動的光散乱装置（ＤＬＳ）によって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰと比較した。再構築したキャプシドは、完全なＱβ  ＶＬＰと同じ流体力学的大きさ（質量および立体配座の両方に依存する）を示した。
Ｃ）再構築したキャプシド中のジスルフィド結合の形成：再構築したＱβ  ＶＬＰを、純粋なポリアクリルアミド・ゲルの電気泳動によって分析し、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰと比較した。再構築したキャプシドは、完全なＱβ  ＶＬＰと同じジスルフィド結合型を示した（図３９）。
Ｄ）アガロース・ゲルの電気泳動による、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析：５μｇの再構築したＱβ  ＶＬＰを、２５μｌの合計反応体積で、０．３５単位のＲＮａｓｅ  Ａ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１９１０１）、１５単位のＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｆｌｕｋａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３１１３６）と共に、あるいは他の酵素は一切加えずに、３７℃において３時間インキュベートした。大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰがコントロールとして働き、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したキャプシドに関して記載したのと同じ条件下で、これらをインキュベートした。次いで反応混合物を、最初に臭化エチジウム（図４０Ａ）、次にクーマシーブルー（図４０Ｂ）で染色した０．８％アガロース・ゲルに担持した。臭化エチジウム染色によって、加えた酵素はいずれも、再構築したＱβキャプシド中の核酸含有物を消化することができなかったことが示され、核酸含有物（すなわち、オリゴデオキシヌクレオチド）が保護されることが示される。この結果は、加えたオリゴデオキシヌクレオチドが、再構築反応中に新しく形成されたキャプシドにパッケージ化されたことを示す。対照的に、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰ中の核酸含有物は、ＲＮａｓｅ  Ａを加えることによって分解し、このＶＬＰ中の核酸含有物はＲＮＡからなることが示される。さらに、アガロース・ゲルの臭化エチジウム染色およびクーマシーブルー染色によって、核酸含有Ｑβ  ＶＬＰ（それぞれ大腸菌から再構築および精製したもの）が、ほぼ同じ大きさで移動していることが示され、再構築反応によって、大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰに匹敵する大きさの、Ｑβ  ＶＬＰがもたらされたことが示される。
【０３６５】
したがってゲルによって、ＤＮＡｓｅ  Ｉ保護型オリゴデオキシヌクレオチドが、再構築したＱβ  ＶＬＰ中に存在したことが示される。さらに、パッケージ化されたオリゴデオキシヌクレオチドを、フェノール／クロロホルムによって抽出させた後、それらはＤＮＡｓｅ  Ｉによって消化可能であったが、ＲＮＡｓｅ  Ａによって消化することはできなかった。したがってオリゴデオキシヌクレオチドは、ＶＬＰの最初の分解、核酸由来の分解したコート・タンパク質の精製、およびその後のオリゴデオキシヌクレオチドの存在下でのＶＬＰの再構築の後に、Ｑβ  ＶＬＰ中に首尾良くパッケージ化することができた。
【０３６６】
Ｅ）変性ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲルの電気泳動による、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析：４０μｇの再構築したＱβ  ＶＬＰ（０．８ｍｇ／ｍｌ）を、６０μｌの合計反応体積で、０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ＰＣＲ−ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１９６４３６４）、および反応バッファーと共に、製造者の指示に従って、３７℃において３時間インキュベートした。大腸菌から精製した完全なＱβ  ＶＬＰがコントロールとして働き、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したキャプシドに関して記載したのと同じ条件下で、これらをプロテイナーゼＫと共にインキュベートした。次いで反応混合物を、ＴＢＥ−尿素のサンプル・バッファーと混合し、１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ６８８５）に担持した。定性および定量標準として、１ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌおよび１０ｐｍｏｌの、再構築反応用に使用したオリゴデオキシヌクレオチドを、同じゲルに担持した。このゲルを１０％酢酸、２０％メタノールで固定し、中性ｐＨに平衡化し、ＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ−１１４９４）で染色した。ＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄによる染色によって、再構築したＱβキャプシドは、再構築反応で使用したオリゴデオキシヌクレオチドと同時に移動した核酸を含んでいたことが示された（図４１）。（大腸菌から精製した）完全なＱβ  ＶＬＰは、同じ大きさの核酸を含んでいなかったことに留意されたい。まとめると、オリゴデオキシヌクレオチドの存在下で再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析によって、オリゴデオキシヌクレオチドがＤＮａｓｅ  Ｉによる消化から保護されたことが示され、それらがパッケージ化され、加えたオリゴデオキシヌクレオチドが、適切な手段（たとえば、プロテイナーゼＫによるＱβ  ＶＬＰの消化）によって、再び単離された可能性があることを意味している。
【０３６７】
図３６は、サイズ排除クロマトグラフィーによる、分解されたＱβコート・タンパク質の精製を示す。５μｌの示した画分（＃）をサンプル・バッファーと混合し、１６％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）  ｂｙ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ６４９５２）に担持した。展開を終えた後、ゲルを最初にクーマシーブルー（Ａ）で染色し、染色が示された後、同じゲルをＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄ（Ｂ）で染色した。第１の高分子量ピーク物質（画分＃１５〜＃２０）は、タンパク質ではなく核酸を含んでいたことに留意されたい。一方、みかけの分子量が小さい第２のピーク物質は、分解されたコート・タンパク質を含んでおり、これらはしたがって核酸から分離されたものである。
【０３６８】
図３７は、サイズ排除クロマトグラフィーによる、再構築したＱβ  ＶＬＰの精製を示す。１０μｌの示した画分（＃）をサンプル・バッファーと混合し、１６％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）  ｂｙ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ６４９５２）に担持した。展開を終えた後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。還元条件のために、ジスルフィド結合が還元され、再構築したＶＬＰのタンパク質性モノマーは、１４ｋＤａのコート・タンパク質として見ることができた。
【０３６９】
図３８は、異なるオリゴデオキシヌクレオチドの存在下において再構築した、Ｑβ  ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。ＶＬＰは示したオリゴデオキシヌクレオチドの存在下、又はｔＲＮＡの存在下で再構築したが、サイズ排除クロマトグラフィーによって均質な懸濁液に精製したわけではなかった。ポジティブコントロールとして、大腸菌から精製した「完全な」Ｑβ  ＶＬＰの調製物が働いた。重要なことに、任意の示した核酸を再構築反応中に加えることによって、「ポジティブ」コントロールと比較すると、大きさおよび立体配座が適切であるＶＬＰを形成することができた。これによって、再構築プロセスは一般に、使用するオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列および長さとは無関係であることが示される。核酸を再構築反応中に加えることは、Ｑβ  ＶＬＰを形成するために必要であることに留意されたい。なぜなら、再構築反応から核酸が除去された場合、粒子が形成されなかったからである。
【０３７０】
図３９は、再構築および精製したＱβキャプシド中の、ジスルフィド結合型の分析を示す。５μｌの示したキャプシドを、還元剤を含むかあるいは含まないサンプル・バッファーと混合し、１６％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲルに担持した。展開を終えた後、ゲルをクーマシーブルーで染色した。大腸菌から精製した「完全な」キャプシドと比較すると、再構築したＱβ  ＶＬＰは同じジスルフィド結合型を示した。
【０３７１】
図４０は、ヌクレアーゼ処理およびアガロース・ゲルの電気泳動による、再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析を示す：５μｇの再構築および精製したＱβ  ＶＬＰ、および５μｇの大腸菌から精製したＱβ  ＶＬＰをそれぞれ、示したように処理した。この処理の後、サンプルをローディング染料と混合し、０．８％アガロース・ゲルに担持した。作業の後、ゲルを最初に臭化エチジウム（Ａ）で染色し、染色が示された後、同じゲルをクーマシーブルー（Ｂ）で染色した。再構築および精製したＱβ  ＶＬＰの核酸含有物は、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化に対して耐性があったが、一方大腸菌から精製したＱβ  ＶＬＰの核酸含有物は、ＲＮａｓｅ  Ａと共にインキュベートすると消化されたことに留意されたい。これによって、再構築したＱβキャプシドの核酸含有物はデオキシヌクレオチドからなっていることが示され、このデオキシヌクレオチドは当然ながら、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化から保護されている。したがって、オリゴデオキシヌクレオチドは、再構築反応中にＱβ  ＶＬＰ中にパッケージ化された。
【０３７２】
図４１は、プロテアーゼＫ処理およびポリアクリルアミドＴＢＥ／尿素ゲルの電気泳動による、再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析を示す：プロテアーゼＫ処理によって消化した等量の１μｇのＱβ  ＶＬＰを、ＴＢＥ−尿素のサンプル・バッファーと混合し、１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ−尿素ゲル（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ６８８５）に担持した。定性および定量標準として、１ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌおよび１０ｐｍｏｌの、再構築反応用に使用したオリゴデオキシヌクレオチドを、同じゲルに担持した。展開を終えた後、ゲルを固定し、中性ｐＨに平衡化し、ＳＹＢＲ（登録商標）−Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ−１１４９４）で染色した。（大腸菌から精製した）完全なＱβ  ＶＬＰは、再構築したＱβキャプシドから抽出されたＶＬＰと、同じ大きさの核酸を含んでいなかったことに留意されたい。さらに、再構築したＶＬＰから単離した核酸は、再構築反応で使用したオリゴデオキシヌクレオチドと同時に移動した。この結果によって、使用したオリゴデオキシヌクレオチドが、再構築したＱβキャプシド中にパッケージ化されたことが確認された。
【実施例１７】
【０３７３】
ＡＰ２０５の分解−精製−再構築、および免疫賦活性核酸のパッケージ化
Ａ．オリゴヌクレオチドを加えずに再構築することができる物質由来の、ＡＰ２０５  ＶＬＰの分解および再構築
分解：４０ｍｇの凍結乾燥させ精製したＡＰ２０５  ＶＬＰを、４ｍｌの６Ｍ  ＧｕＨＣｌに再溶解させ、４℃で一晩インキュベートした。分解混合物を、８０００ｒｐｍで遠心分離にかけた（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０  Ｒ、固定角ローターＦ３４−６−３８中、以下のステップすべてで使用した）。ペレットを７Ｍ尿素に再溶解させ、一方上澄みは、ＮＥＴバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、および５ｍＭのＥＤＴＡ、および１５０ｍＭのＮａＣｌ）で３日間かけて透析し、バッファーは３回交換した。あるいは透析を、４日間かけて連続形式で行った。透析した溶液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけ、ペレットを７Ｍ尿素に再溶解させ、一方上澄みは、硫酸アンモニウム（６０％飽和）によってペレット状にし、１０ｍＭのＤＴＴを含む７Ｍ尿素バッファーに再溶解させた。７Ｍ尿素に再溶解させた前のペレットすべてを一緒にし、硫酸アンモニウム（６０％飽和）を用いて沈殿させ、１０ｍＭのＤＴＴを含む７Ｍ尿素バッファーに再溶解させた。１０ｍＭのＤＴＴを含む７Ｍ尿素バッファーに再溶解させた物質を一緒にし、平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラムに充填し、２ｍｌ／ｈで１０ｍＭのＤＴＴを含む７Ｍ尿素バッファーで溶出した。１ピークの物質がカラムから溶出した。３ｍｌの画分を回収した。ＡＰ２０５コート・タンパク質を含むピーク画分を集め、硫酸アンモニウム（６０％飽和）を用いて沈殿させた。８０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって、ペレットを単離した。それを７Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴに再溶解させ、短いＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（１．５×２７ｃｍ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、２ｍｌ／ｈ、７Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴ、溶出バッファーとして）に充填した。ショルダー値が小さい、主に１ピークの物質が、カラムから溶出した。ＡＰ２０５コート・タンパク質を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって識別し、ショルダー値のものを除き集めた。これによって１０．３ｍｌのサンプルを生成させた。タンパク質濃度は、測定用に２５倍希釈したタンパク質の等分試料を測定することにより、分光測定法によって測定した。以下の式：（１．５５×ＯＤ２８０−０．７６×ＯＤ２６０）×体積を使用した。平均濃度は、ＶＬＰ（２．６ｍｇ／ｍｌ）１ｎｍｏｌ／ｍｌであった。２８０ｎｍでの吸光度と２６０ｎｍでの吸光度の比は、０．１２／０．１０５であった。
【０３７４】
再構築：１．１ｍｌのβ−メルカプトエタノールをサンプルに加え、以下の再構築反応物を設定した：
１．１ｍｌのＡＰ２０５コート・タンパク質、核酸含まず
２．１ｍｌのＡＰ２０５コート・タンパク質、ｒＲＮＡ（約２００  ＯＤ２６０単位、１０ｎｍｏｌ）
３．９ｍｌのＡＰ２０５コート・タンパク質、ＣｙＣｐＧ（２２５ｐｍｏｌ／ｕｌの溶液３７０ｕｌ、すなわち８３ｎｍｏｌ）
【０３７５】
これらの混合物を、１０％β−メルカプトエタノールを含む３０ｍｌのＮＥＴバッファーで１時間透析した。核酸を含まない混合物は別に透析した。その後透析を連続形式で続け、１リットルのＮＥＴバッファーを３日間にわたって交換した。反応混合物は、水でその後十分に透析し（バッファー５回交換）、凍結乾燥させた。これらを水に再溶解させ、ＥＭによって分析した。臭化エチジウム染色を使用したアガロース・ゲル電気泳動によって測定したように、混合物はすべて、キャプシドを含んでおり、ＡＰ２０５  ＶＬＰの再構築は検出可能な核酸の存在と無関係であることが示される。ＣｙＣｐＧと再構築したＡＰ２０５のＥＭ分析は、図４２Ｂに示す。ＥＭ手順は以下の通りであった：タンパク質の懸濁液を、カーボン−ホルムバール被覆型グリッドに吸収させ、２％リンタングステン酸（ｐＨ６，８）で染色した。グリッドは、ＪＥＭ  １００Ｃ（ＪＥＯＬ、Ｊａｐａｎ）電子顕微鏡を用いて８０ｋＶの加速電圧で調べた。写真による記録（ネガティブ）をＫｏｄａｋ電子画像フィルム上に行い、Ｋｏｄａｋ  Ｐｏｌｙｍａｘ紙上にネガをプリントすることによって、電子顕微鏡写真を得た。ＣｙＣｐＧの存在下で再構築したＶＬＰを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（１×５０ｃｍ）で精製し、ＮＥＴバッファーで溶出させた（１ｍｌ／ｈ）。画分をオクタロニー分析によって分析し、ＶＬＰを含む画分を集めた。これによって８ｍｌのサンプルを生成させ、このサンプルを透析により水で脱塩し、乾燥させた。キャプシドの収量は１０ｍｇであった。臭化エチジウムで染色した０．６％アガロース・ゲル中の、再溶解物質を分析することによって、キャプシドが核酸を含んでいなかったことが示された。再構築ステップ後およびさらなる透析前に採取した、ＣｙＣｐＧを含む再構築反応混合物のサンプルを、０．６％アガロース・ゲル上で分析し、これらを図４３ＡおよびＢに示す。完全なＡＰ２０５  ＶＬＰと同じ高さで移動し、かつ臭化エチジウムおよびクーマシーブルー染色用に染色されたバンドを得ることができ、オリゴデオキシヌクレオチドを含むＡＰ２０５  ＶＬＰが再構築したことが示された。再構築手順の後のさらなる透析ステップによって、ＶＬＰの外側へのオリゴデオキシヌクレオチドの拡散がもたらされた可能性がある。重要なことに、臭化エチジウム染色を使用したアガロース・ゲル電気泳動によって測定したように、ＡＰ２０５  ＶＬＰは、検出可能なオリゴデオキシヌクレオチドの不在下でも再構築することができた。したがってオリゴデオキシヌクレオチドは、ＶＬＰの最初の分解、核酸由来の分解したコート・タンパク質の精製、およびその後のオリゴデオキシヌクレオチドの存在下でのＶＬＰの再構築の後に、ＡＰ２０５  ＶＬＰと首尾良く結合することができた。
【０３７６】
図４２は、分解ステップ用に使用した完全な組み換えＡＰ２０５  ＶＬＰ（Ａ）、又は分解し、その後ＣｙＣｐＧの存在下において再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰ（Ｂ）の、電子顕微鏡写真を示す。
【０３７７】
図４３は、ＣｙＣｐＧの存在下において再構築し、透析前の再構築ステップ後に直接採取したＡＰ２０５  ＶＬＰサンプルの、アガロース・ゲルの電気泳動分析を示す図である。図４３Ａのゲルは、臭化エチジウムで染色した。ＣｙＣｐＧと再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰをレーン１に担持し、一方未処理の純粋なＡＰ２０５  ＶＬＰはレーン２に担持した。矢印は、再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰのバンドを示す。図４３Ｂのゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。未処理ＡＰ２０５  ＶＬＰをレーン１に担持し、一方ＣｙＣｐＧと再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰはレーン２に担持した。
【０３７８】
Ｂ．添加オリゴヌクレオチドの不在下では再構築することができない分解した物質を使用する、ＡＰ２０５  ＶＬＰの再構築
分解：１００ｍｇの精製し、乾燥した組み換えＡＰ２０５  ＶＬＰ（Ｃｙｔｏｓの特許）を、前に記載したように分解用に使用した。すべてのステップは、本質的にＡ項の分解で記載したのと同様に行った。ただし、８Ｍ尿素を使用して、硫酸アンモニウム沈殿ステップのペレットを可溶化させ、再構築前のＣＬ−４Ｂカラムを使用するゲル濾過ステップは省略した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５カラムの集めた画分は、Ａ項に記載した式を使用する分光測定法により測定して、２１ｍｇのタンパク質を含んでいた。サンプルの２８０ｎｍでの吸光度と２６０ｎｍでの吸光度の比は、０．１６〜０．１２５であった。このサンプルは、測定用に５０倍希釈した。
【０３７９】
再構築：Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５によるゲル濾過精製ステップから生じたタンパク質調製物を、６０％飽和の硫酸アンモニウムによって沈殿させ、生成したペレットを、２ｍｌの７Ｍ尿素、１０ｍＭのＤＴＴに可溶化させた。１０％  ２−メルカプトエタノールをＮＥＴバッファーに溶かしたもの８ｍｌで、サンプルを希釈し、１０％  ２−メルカプトエタノールをＮＥＴバッファーに溶かしたもの４０ｍｌで１時間透析した。透析バッグ中で、０．４ｍｌのＣｙＣｐＧ溶液（１０９ｎｍｏｌ／ｍｌ）をタンパク質サンプルに加えることによって、再構築を開始させた。連続形式の透析を設定し、ＮＥＴバッファーを溶出バッファーとして使用した。透析は２日間続け、この透析ステップの終了後に、サンプルをＥＭ分析用に採取した（図４４Ｂ）。透析した再構築溶液を、その後ＮＥＴバッファーに溶かした５０％ｖ／ｖグリセロールで透析し、濃度を得た。１回のバッファーの交換を、透析の１日後に行った。透析は合計３日間続けた。
【０３８０】
透析および濃縮した再構築溶液を、ＮＥＴバッファー中において、流速１ｍｌ／時間でのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４−Ｂカラム（１×６０ｃｍ）によるゲル濾過によって精製した。画分をオクタロニー分析において試験し、キャプシドを含む画分を乾燥させ、水に再懸濁させ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．６中で平衡化させた４−Ｂカラムにおいて、再びクロマトグラフィーにかけた。それぞれの以下の３つの式を使用した：
１．（１８３＊ＯＤ２３０ｎｍ−７５．８＊ＯＤ２６０ｎｍ）＊体積（ｍｌ）−２．（（ＯＤ２３５ｎｍ−ＯＤ２８０ｎｍ）／２．５１）×体積−３．（（ＯＤ２２８．５ｎｍ−ＯＤ２３４．５ｎｍ）＊０．３７）×体積
再構築したＶＬＰの６〜２６ｍｇのタンパク質量を測定した。
【０３８１】
再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰは、非還元条件下において、前に記載したのと同様のＥＭ、アガロース・ゲル電気泳動およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３８２】
分解した物質のＥＭ分析によって、ＡＰ２０５  ＶＬＰを塩酸グアニジンで処理することにより、ＶＬＰのキャプシド集合体が本質的に破壊されることが示される。この分解した物質とオリゴヌクレオチドの再構築よってキャプシドが生じ（図４４Ｂ）、これを精製し、ゲル濾過によってさらにブロモフェノールブルーさせた（図４４Ｃ）。２つの大きさの粒子を得た；直径約２５ｎｍの粒子、および小さな粒子は、図４４Ｃの電子顕微鏡写真において見ることができる。オリゴヌクレオチドの不在下では、再構築体は得られなかった。アガロース・ゲル電気泳動で、再構築した粒子を担持することによって、再構築した粒子が核酸を含んでいたことが示された。フェノール抽出による核酸含有物の抽出、およびその後臭化エチジウムで染色したアガロース・ゲルに担持することによって、これらの粒子が、再構築用に使用したオリゴヌクレオチドを含んでいたことが明らかになった（図４５Ａ）。パッケージ化されるオリゴヌクレオチドの同一性は、このオリゴヌクレオチドのサンプルを粒子から抽出した核酸物質の傍らにに担持することによって調節した。再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰを担持し、前に臭化エチジウムで染色したアガロース・ゲルを、次にクーマシーブルーで染色し、オリゴヌクレオチド含有物と粒子のタンパク質含有物が同時に移動したことが明らかになり（図４５Ｂ）、オリゴヌクレオチドが粒子にパッケージ化されたことが示された。
【０３８３】
再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに担持し、還元剤の不在下で作業することにより（図４６）、再構築した粒子が、未処理ＡＰ２０５  ＶＬＰの場合と同様に、ジスルフィド結合を形成したことが示された。さらに、そのジスルフィド結合型は、未処理粒子と同一である。
【０３８４】
図４４Ａに示すのは、分解したＡＰ２０５  ＶＬＰタンパク質の電子顕微鏡写真であり、一方図４４Ｂは、精製前に再構築した粒子を示す。図３Ｃは、精製した再構築ＡＰ２０５  ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。図３Ａ〜Ｃの倍率は、２０００００倍である。
【０３８５】
図４５ＡおよびＢは、アガロース・ゲル電気泳動によって分析した、再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰを示す。両方の図のゲルに担持したサンプルは、左から右に：未処理ＡＰ２０５  ＶＬＰ、ＣｙＣｐＧと再構築し精製された異なる量のＡＰ２０５  ＶＬＰを含む３個のサンプル、および未処理Ｑβ  ＶＬＰであった。図４５Ａのゲルは臭化エチジウムで染色し、一方図４５Ｂでは、同じゲルをクーマシーブルーで染色した。
【０３８６】
図４６は、非還元条件下で担持した再構築ＡＰ２０５  ＶＬＰの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。５つのサンプルをゲルに担持した。ゲルに担持したサンプルは、左から右に：タンパク質マーカー、未処理ｗｔ  Ｑβ、再構築ｗｔ  Ｑβ、未処理ＡＰ２０５  ＶＬＰ、再構築ＡＰ２０５  ＶＬＰである。ＡＰ２０５  ＶＬＰサブユニットの分子量は１４．０ｋＤａであり、一方Ｑβサブユニットの分子量は１４．３ｋＤａである（いずれの分子量も、Ｎ末端メチオニンで計算した）。ジスルフィド結合したマルチマーは、図面において矢印でそれぞれ示す。
【０３８７】
Ｃ．ｐ３３エピトープ（配列：Ｈ２Ｎ−ＫＡＶＹＮＦＡＴＭＧＧＣ−ＣＯＯＨ、遊離ＮおよびＣ末端を有する）と、ＣｙＣｐＧと再構築したＡＰ２０５  ＶＬＰの結合
Ｂ項に記載したように、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で得た再構築ＡＰ２０５  ＶＬＰを、１．４ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＤＭＳＯに溶かした５０ｍＭストックから希釈した５倍過剰な架橋剤ＳＭＰＨと、１５℃において３０分間反応させた。得られたいわゆる誘導体化ＡＰ２０５  ＶＬＰを、少なくとも１０００倍体積の２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４バッファーで、２×２時間透析した。誘導体化ＡＰ２０５は、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＤＭＳＯに溶かした２０ｍＭストックから希釈した２．５倍又は５倍過剰なペプチドと、１５℃において２時間反応させた。サンプルはその後、保存用に液体窒素中で急速凍結させた。
【０３８８】
結合反応の結果は、図６に示す。結合反応において、２．５倍過剰なペプチドよりも５倍過剰なペプチドを使用することによって、より高度な結合を得ることができた。
【０３８９】
図４７に示すのは、結合反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。以下のサンプルを（左から右に）ゲルに担持した：タンパク質マーカー；誘導体化ＡＰ２０５  ＶＬＰ（ｄ）；２．５倍過剰なペプチド、上澄み（ｓ）と結合させたＡＰ２０５  ＶＬＰ；２．５倍過剰なペプチド、ペレット（ｐ）と結合させたＡＰ２０５  ＶＬＰ；５倍過剰なペプチド、上澄み（ｓ）と結合させたＡＰ２０５  ＶＬＰ；５倍過剰なペプチド、ペレット（ｐ）と結合させたＡＰ２０５  ＶＬＰ。
【実施例１８】
【０３９０】
ＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸ではなく、遊離免疫賦活性核酸が巨脾症を誘導する
マウスを未処理のままにしたか、あるいは１００μｇのＨＢｃ３３単独、２０ｎｍｏｌのＣｙＣｐＧｐｔ、２０ｎｍｏｌのＣｙＣｐＧｐｔと混合した１００μｇのＨＢｃ３３、又はＣｙＣｐＧｐｔがパッケージ化された１００μｇのＨＢｃ３３を皮下に免疫化した。２１日後、脾臓を単離し、脾臓重量および脾臓の細胞性を評価した。ＣｙＣｐＧｐｔは、単独で与えると、脾臓重量および細胞数の大幅な増大を誘導した（図４８）。ＨＢｃ３３にパッケージ化されたＣｙＣｐＧｐｔに関しては、このような効果は見たれなかったが、この組成物はウィルスの感染に対する保護を誘導することができた（実施例４を参照のこと）。
【実施例１９】
【０３９１】
インビボでのウィルス保護アッセイ
ワクシニア保護アッセイ
３匹のメスのＣ５７Ｂ１／６マウスの群に、ｐ３３と結合又は融合させた１００μｇのＶＬＰのみ、これを２０ｎｍｏｌの免疫賦活性核酸と混合したもの、あるいは免疫賦活性核酸をパッケージ化したものを皮下に免疫化した。末梢組織の抗ウィルス免疫性を評価するために、７〜９日後に、マウスの腹膜内に、ＬＣＭＶ−糖タンパク質（ｐ３３ペプチド含む）を発現する、１．５×１０６ｐｆｕの組み換えワクシニア・ウィルスを感染させた。５日後、卵巣を回収し、ウィルス力価を決定した。したがって卵巣は、５％ウシ胎児血清を含み、グルタミン、Ｅａｒｌｓの塩および抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を補った最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中において、ホモジナイザーで粉砕した。ＢＳＣ４０細胞の１０倍希釈ステップにおいて、懸濁液を滴定した。３７℃で一晩のインキュベーションの後、ウィルスのプラークを見るために、５０％エタノール、２％クリスタルバイオレット、および１５０ｍＭのＮａＣｌからなる溶液で、接着細胞層を染色した。免疫化をしていない未処置マウスを、コントロールとして使用した。
【０３９２】
ＬＣＭＶ保護アッセイ
３匹のメスのＣ５７Ｂ１／６マウスの群に、ｐ３３と結合又は融合させた１００μｇのＶＬＰのみ、あるいはこれをアジュバント／２０ｎｍｏｌのＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合したものを皮下に免疫化した。全身の抗ウィルス免疫性を評価するために、１１〜１３日後に、マウスの腹膜内に、２００ｐｆｕのＬＣＭＶ−ＷＥを感染させた。４日後、脾臓を単離し、ウィルス力価を決定した。脾臓は、２％ウシ胎児血清を含み、グルタミン、Ｅａｒｌｓの塩および抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を補った最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中において、ホモジナイザーで粉砕した。ＭＣ５７細胞の１０倍希釈ステップにおいて、懸濁液を滴定した。１時間のインキュベーションの後、５％ウシ胎児血清、１％メチルセルロース、および抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン）を含むＤＭＥＭで、細胞を覆った。３７℃で２日間のインキュベーションの後、細胞内染色手順（これによってウィルスの核タンパク質を染色する）により、ＬＣＭＶ感染に関して細胞を評価した。細胞を４％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、次に２０分間の溶解ステップを１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて行った。１０％ウシ胎児血清と共に、１時間のインキュベーションすることによって、非特異的な結合が阻害された。ラット抗ＬＣＭＶ抗体（ＶＬ−４）で１時間、細胞を染色した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を、二次抗体として使用し、次に標準的な手順に従って、ＯＤＰ基質を用いた呈色反応を行った。
【実施例２０】
【０３９３】
抗原と融合したＶＬＰ中にパッケージ化された異なる免疫賦活性核酸は、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答およびウィルス保護をもたらす
ＨＢｃＡｇとペプチドｐ３３（ＨＢｃ３３）の融合タンパク質を、実施例１に記載したように生成させ、実施例１１に記載したように異なるＣｐＧ核酸をパッケージ化した。
【０３９４】
１００μｇのワクチンをマウスに注射し、組み換えワクシニア感染の後の卵巣中のワクシニア力価を、実施例１９に記載したように検出した。二本鎖ＣｙＣｐＧｐｔ（ｄｓＣｙＣｐＧｐｔ）は、０．５ｍＭのＤＮＡオリゴヌクレオチドＣｙＣｐＧｐｔとＣｙＣｐＧ−ｒｅｖ−ｐｔ（表Ｉ）を、１５ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５中で、８０℃で１０分間の加熱ステップおよびその後の室温への冷却によって、アニールさせることにより生成させた。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、２０％  ＴＢＥポリアクリルアミド・ゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で調べた。
【０３９５】
ＣｙＣｐＧ、ＮＫＣｐＧ、Ｂ−ＣｐＧおよびｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＳを含むＨＢｃ３３キャプシドは、ウィルス感染を完全に阻害することができる、ＣＴＬ応答を誘導した（図４９、図５０）。リン酸ジエステル又はホスホロチオエート結合（ｐｔ又はＰＳ）を含む核酸に関して、保護を観察した。二本鎖オリゴヌクレオチドｄｓＣｙＣｐＧｐｔも、ワクシニア感染に対する保護を誘導していた（図４９）。
【実施例２１】
【０３９６】
ＨＢｃＡｇおよびＱβ  ＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸は、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答およびウィルス保護をもたらす
ＨＢｃＡｇとペプチドｐ３３（ＨＢｃ３３）の融合タンパク質を、実施例１に記載したように生成させ、実施例１１に記載したようにオリゴヌクレオチドＢＣｐＧｐｔをパッケージ化した。ペプチドｐ３３をＲＮＡファージＱβと結合させ、オリゴヌクレオチドＢ−ＣｐＧｐｔを実施例１３に記載したようにパッケージ化した。それぞれ１００μｇ、３０μｇ、１０μｇ、又は３μｇのワクチンをマウスに注射し、組み換えワクシニア感染の後の卵巣中のワクシニア力価を、実施例１９に記載したように検出した。Ｂ−ＣｐＧをパッケージ化した１００μｇおよび３０μｇのＨＢｃ３３およびＱｂｘ３３は、ウィルス感染に対する完全な保護を誘導したが、一方低濃度では、部分的な保護が観察されたか、あるいは保護は観察されなかった（図５１）。
【実施例２２】
【０３９７】
自己抗原と結合したＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸は、自己抗原に対する寛容性を克服することができる
膵臓β島細胞中でＬＣＭＶ糖タンパク質を発現する、トランスジェニック・マウス（Ｏｈａｓｉ他、Ｃｅｌｌ  ６５、３０５〜３１７（１９９１））を、２００ｐｆｕのＬＣＭＶ、２０ｎｍｏｌのＣｙＣｐＧｐｔと混合した１００μｇのＨＢｃ３３、又はＣｙＣｐＧｐｔがパッケージ化された１００μｇのＨＢｃ３３、あるいはコントロールとして２０ｎｍｏｌのＣｙＣｐＧｐｔと混合した１００μｇのｐ３３ペプチドで免疫化した。血中グルコースのレベルを、Ｇｌｕｃｏｔｒｅｎｄ  Ｐｌｕｓ  Ｇｌｕｃｏｓｅ試験用キット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて４日毎に測定した。血中グルコースのレベルが１２ｍＭを超えたマウスは、糖尿病であるとみなした。ＬＣＭＶによる免疫化によって、第１２日には４匹中４匹の動物で糖尿病が誘導された。ＨＢｃ３３と混合したＣｙＣｐＧｐｔは、３匹のマウス中１匹のマウスで糖尿病を引き起こしただけだった。ＣｙＣｐＧｐｔがパッケージ化されたＨＢｃ３３で免疫化した、３匹のマウス中２匹は、第１２日に糖尿病が進行し、第３のマウスは第１６日に糖尿病が進行する。ＣｙＣｐＧｐｔと混合したペプチドｐ３３による免疫化によって、３匹のマウスで糖尿病が誘導されることはなかった。これによって、抗原と融合したＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸は、強いＣＴＬ応答を誘導する際には、核酸と抗原の混合物より、はるかに効果的であることが明らかに示される。これらは、ＶＬＰと融合した抗原、および免疫賦活性核酸と混合した抗原より、強い応答も誘導した。
【実施例２３】
【０３９８】
抗原と結合したＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する際には、免疫賦活性核酸と混合したＶＬＰより、はるかに効果的である
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１００μｇのＨＢｃ３３のみ、これをＣｙＣｐＧｐｔと混合したもの、あるいはＣｙＣｐＧｐｔをパッケージ化したものを皮下に免疫化した。未処理のマウスをコントロールとした。
【０３９９】
免疫化の８日後に、ｐ３３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために、ＰＥ標識ｐ３３テトラマーおよびＦＩＴＣ−結合モノクローナル抗ＣＤ８抗体を用いて血中リンパ球を二重染色し、ＣＤ８＋Ｔ細胞群全体に対するｐ３３特異的細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析によって決定した。
【０４００】
表ＩＩ．ＣｐＧｓと混合したかあるいはこれをパッケージ化したｐ３３−ＶＬＰによるワクチン接種後の、ｐ３３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導。数字は、頻度の平均値（パーセント）および標準偏差に対応する。
【０４０１】
ＣｙＣｐＧｐｔをパッケージ化したＨＢｃ３３は、ＣｙＣｐＧｐｔと混合したＨＢｃ３３より、ｐ３３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の高い頻度を誘導した（表ＩＩ）。パッケージ化したオリゴヌクレオチドの量は、混合設定で使用したオリゴヌクレオチドの量よりはるかに少ないので（約１／２０）、これによって、免疫賦活性核酸がパッケージ化されたＶＬＰは、多数の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する際には一層効果的であることが明らかに示される。
【実施例２４】
【０４０２】
ＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸は、ＣＴＬ応答を誘導する際には、免疫賦活性核酸と混合したＶＬＰより、はるかに効果的である
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群に、１００μｇの所与のｐ３３−ＶＬＰのみ、これを２０ｎｍｏｌのＣｙＣｐＧｐｔと混合したもの、あるいはＣｙＣｐＧｐｔをパッケージ化したもので皮下を初回抗原刺激した。主なエキソビボでの細胞障害性を検出するために、エフェクター細胞の懸濁液を、初回抗原刺激後の第９日にワクチン接種したマウスの脾臓から調製した。ＥＬ−４細胞をｐ３３ペプチドで標識し（１０−６Ｍ、２時間３７℃、２％  ＦＣＳ  ＭＥＭ培地中）、５時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて使用した。
【０４０３】
2005517632.tif 000003
【０４０４】
図５２は、１００μｇの所与のｐ３３−ＶＬＰのみ（Ａ）、これを２０ｎｍｏｌのＣｙＣｐＧｐｔと混合したもの（Ｂ）、あるいはＣｙＣｐＧｐｔをパッケージ化したもの（Ｃ）で皮下を初回抗原刺激したＣ５７ＢＬ／６マウスの群の、主なエキソビボでの細胞障害性を示す。９日後、脾臓細胞を、示したエフェクターと標的細胞の比での、ｐ３３標識した（黒丸記号）又は非標識（白丸記号）ＥＬ−４標的細胞の５時間の５１Ｃｒ放出アッセイで、直接的なエキソビボでのＣＴＬ活性に関して試験した。細胞培養物の懸濁液の放射活性を、Ｃｏｂｒａ  ＩＩ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ、Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｗｅ、ＩＬ）中で測定した。自発的な放出は常に１０％未満であった。マウス当たりのエフェクター細胞の、２つの希釈系を行った。（Ａ）では、一群当たり２匹のマウスを使用し、一方（Ｂ）および（Ｃ）では、一群当たり４匹のマウスからのデータを示す。
【０４０５】
図５２によって、１００μｇのＨＢｃ３３のみでは主なインビボでのＣＴＬ応答は誘導されず、一方２０ｎｍｏｌのＣｙＣｐＧｐｔと混合した同じ量のＨＢｃ３３が有意な細胞障害性を誘導したことが明らかに示される。しかしながら、パッケージ化したオリゴヌクレオチドの量は、混合設定で使用したオリゴヌクレオチドの量よりはるかに少なかったが（約１／２０）、ＣｙＣｐＧｐｔをパッケージ化した１００μｇのＨＢｃ３３を免疫化に使用すると、細胞障害性が高まった（図５２）。
【実施例２５】
【０４０６】
ＶＬＰのＲＮＡ含有物の非酵素的加水分解、および免疫賦活性核酸のパッケージ化
ＶＬＰの核酸含有物のＺｎＳＯ４依存性の分解
５ｍｇのＱβ  ＶＬＰ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析により測定）を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌに溶かしたものを、２０００ｍｌの５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、又は２０００ｍｌの４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３０ｍＭ  ＮａＣｌで、４℃において２時間、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ（商標）ひだ付き透析チューブ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６８０３５）中で透析した。それぞれの透析バッファーを１回交換し、透析は４℃においてさらに１６時間続けた。透析した溶液は、１０分間１４０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５４１７Ｒ、固定角ローターＦ４５−３０−１１中、以下のステップすべてで使用した）で浄化し、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって再び測定した。５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に溶かしたＱβ  ＶＬＰを、対応するバッファーで希釈して最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌにし、一方４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３０ｍＭ  ＮａＣｌに溶かしたＱβ  ＶＬＰは、対応するバッファーで希釈して最終タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌにした。このキャプシド含有溶液を、４℃において１４０００ｒｐｍで１０分間再度遠心分離にかけた。次いで上澄みを、ＺｎＳＯ４と共にインキュベートし、ＺｎＳＯ４は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ中において５５０ｒｐｍで、６０℃で２４時間、最終濃度２．５ｍＭまで加えた。２４時間後、溶液を１０分間１４０００ｒｐｍで浄化し、沈殿物を捨てた。核酸のＺｎＳＯ４依存性の分解の有効性を、アガロース・ゲルの電気泳動によって確認した（図５３）。上澄みは、５０００ｍｌの４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３０ｍＭ  ＮａＣｌで、４℃において２時間透析した。５０００ｍｌのバッファーを１回交換し、透析は４℃において一晩続けた。透析した溶液は、４℃において１０分間１４０００ｒｐｍで浄化し、無視できるほどの沈殿物を捨て、上澄みのタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定した。
【０４０７】
塩化銅／フェナントロリン／過酸化水素処理したキャプシドに関して、同様の結果を得た。当業者には、他の非酵素的なＲＮＡの加水分解手順は知られている。
【０４０８】
オリゴデオキシヌクレオチドのＺｎＳＯ４処理したＶＬＰへのパッケージ化：
（Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定した）タンパク質濃度が０．４ｍｇ／ｍｌと０．９ｍｇ／ｍｌの間である（これは、それぞれ１５９ｎＭおよび３５７．５ｎＭというキャプシド濃度に対応する）、ＺｎＳＯ４処理および透析したＱβキャプシドを、オリゴデオキシヌクレオチドのパッケージ化用に使用した。オリゴデオキシヌクレオチドは、３００倍モル過剰でＱβ−ＶＬＰキャプシドに加え、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  ｃｏｍｆｏｒｔ中において５５０ｒｐｍで、３７℃で３時間インキュベートした。３時間後、反応混合物を４℃において１０分間１４０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。上澄みを、ＭＷＣＯ  ３０００００（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１３５  ５２６）を有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）ＣＥ  ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒ中において、５０００ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで、４℃において８時間透析した。５０００ｍｌのバッファーを１回交換し、透析は４℃において一晩続けた。透析したサンプルのタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析によって決定した。Ｑβキャプシドおよびそれらの核酸含有量は、実施例１１および１３に記載したように分析した。
【０４０９】
図５３は、アガロース・ゲルの電気泳動による、ＺｎＳＯ４処理したＱβ  ＶＬＰの分析を示す：大腸菌から精製し、バッファー１（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、又はバッファー２（４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３０ｍＭ  ＮａＣｌ）で透析したＱβ  ＶＬＰを、２．５ｍＭの硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）の有無の下で、６０℃において２４時間インキュベートした。この処理後、等量の示したサンプル（５μｇのタンパク質）をローディング染料と混合し、０．８％アガロース・ゲルに担持した。作業終了後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。ＶＬＰをＺｎＳＯ４で処理することによって、核酸含有物の分解が起こり、一方非処理のコントロールには変化がなかったことに留意されたい。
【０４１０】
図５４は、オリゴデオキシヌクレオチドのＺｎＳＯ４処理したＶＬＰへのパッケージ化、およびアガロース・ゲルの電気泳動によるそれらの分析を示す。２．５ｍＭの硫酸亜鉛で処理した（ＺｎＳＯ４を加えた）Ｑβ  ＶＬＰを、４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３０ｍＭ  ＮａＣｌで透析し、３７℃において３時間、過剰のオリゴデオキシヌクレオチドと共にインキュベートした（この透析によって、ＺｎＳＯ４の濃度が約１０６に低下したので、これは括弧内でのみ示す）。オリゴデオキシヌクレオチドの存在下での、このインキュベーションの後、等量の示したサンプル（５μｇのタンパク質）をローディング染料と混合し、０．８％アガロース・ゲルに担持した。作業終了後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。オリゴデオキシヌクレオチドをＺｎＳＯ４処理したＱβ  ＶＬＰに加えることによって、大腸菌から精製した未処理Ｑβキャプシドと比較して、このように処理したキャプシドの電気泳動における挙動を元通りにすることができたことに留意されたい。
【０４１１】
図５５は、ベンゾナーゼおよびプロテイナーゼＫによる消化、およびポリアクリルアミドＴＢＥ／尿素ゲルの電気泳動による、ＺｎＳＯ４およびオリゴデオキシヌクレオチド処理したＱβ  ＶＬＰの核酸含有量の分析を示す：オリゴデオキシヌクレオチドを、前に記載したように、ＺｎＳＯ４処理したＱβ  ＶＬＰ中にパッケージ化した。２５μｇのこれらのＶＬＰを、製造者の指示に従って、２５μｌのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１．０１６９４．０００１）で消化した。ヌクレアーゼを熱により失活させた後（８０℃で３０分）、ＶＬＰを、製造者の指示に従って、プロテイナーゼＫ（最終酵素濃度は０．５ｍｇ／ｍｌであった）で処理した。３時間後、ベンゾナーゼおよびプロテイナーゼＫによって消化した、等量の２ｕｇのＱβ  ＶＬＰを、ＴＢＥ−尿素のサンプル・バッファーと混合し、１５％ポリアクリルアミドＴＢＥ／尿素ゲル（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ６８８５）に担持した。レーン２に担持したキャプシドを、バッファー１（前を参照）の存在下において２．５ｍＭのＺｎＳＯ４で処理し、一方レーン３に担持したキャプシドは、バッファー２（前を参照）の存在下において２．５ｍＭのＺｎＳＯ４で処理した。定性および定量標準として、１ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌおよび１０ｐｍｏｌの、再構築反応用に使用したオリゴデオキシヌクレオチドを、同じゲルに担持した（レーン４〜６）。コントロールとして、大腸菌から精製したＱβキャプシドを全く同様に処理し、同じポリアクリルアミドＴＢＥ／尿素ゲル上で分析した（レーン１）。展開を終えた後、ゲルを固定し、中性ｐＨに平衡化し、ＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ−１１４９４）で染色した。（大腸菌から精製した）完全なＱβ  ＶＬＰは、ＺｎＳＯ４およびオリゴデオキシヌクレオチド処理したＱβキャプシドから抽出されたＶＬＰと、同じ大きさの核酸を含んでいなかったことに留意されたい。さらに、後者のＶＬＰから単離した核酸は、再構築反応で使用したオリゴデオキシヌクレオチドと同時に移動した。この結果によって、使用したオリゴデオキシヌクレオチドが、ＺｎＳＯ４処理したＱβキャプシド中にパッケージ化されたことが確認された。
【実施例２６】
【０４１２】
免疫賦活性核酸を含むＶＬＰは、ウィルス・ベクター：ＬＣＭＶによって追加抗原刺激することができる、Ｔ細胞の応答を誘導する
マウスを、免疫賦活性核酸を含む２０μｇのｐ３３−ＶＬＰで皮下を初回抗原刺激した。免疫化の前に、ｐ３３−ＶＬＰの調製物を、透析によって非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドから十分に精製した（実施例２および図５を参照のこと）。１２日後、血液を採取し、ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度をテトラマー染色によって決定した。マウスを、２００ｐｆｕの生きたＬＣＭＶ菌株ＷＥで追加抗原刺激し、特異的Ｔ細胞の頻度を５日後に決定した。追加抗原刺激前の頻度は３．５％＋／−１．８％であり、追加抗原刺激後は１５．５％＋／−１．９％であった。
【実施例２７】
【０４１３】
免疫賦活性核酸を含むＶＬＰは、ウィルス・ベクター：組み換えワクシニア・ウィルスによって追加抗原刺激することができる、Ｔ細胞の応答を誘導する
マウスを、免疫賦活性核酸を含む２０μｇのｐ３３−ＶＬＰで皮下を初回抗原刺激する。免疫化の前に、ｐ３３−ＶＬＰの調製物を、透析によって非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドから十分に精製する（実施例２および図５を参照のこと）。１２日後、血液を採取し、ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度をテトラマー染色によって決定する。マウスを、ＬＣＭＶ−ＧＰを発現する組み換えワクシニア・ウィルス１０６ｐｆｕで追加抗原刺激し、特異的Ｔ細胞の頻度を５日後に決定する。
【実施例２８】
【０４１４】
免疫賦活性核酸を含むＶＬＰは、ウィルス・ベクター：組み換えカネリー痘瘡ウィルスによって追加抗原刺激することができる、Ｔ細胞の応答を誘導する
マウスを、免疫賦活性核酸を含む２０μｇのｐ３３−ＶＬＰで皮下を初回抗原刺激する。免疫化の前に、ｐ３３−ＶＬＰの調製物を、透析によって非結合ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドから十分に精製する（実施例２および図５を参照のこと）。１２日後、血液を採取し、ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度をテトラマー染色によって決定する。マウスを、ＬＣＭＶ−ＧＰを発現する組み換えカネリー痘瘡ウィルス１０７ｐｆｕで追加抗原刺激し、特異的Ｔ細胞の頻度を５日後に決定する。
【実施例２９】
【０４１５】
免疫賦活性核酸を含むＶＬＰは、Ｔ細胞の応答を追加抗原刺激することができる
マウスを、腹膜内にＬＣＭＶ−ＧＰを発現する組み換えワクシニア・ウィルスを感染させる。２０日後、血液を採取し、ｐ３３特異的Ｔ細胞の頻度をテトラマー染色によって決定する。マウスは同じ日に、免疫賦活性核酸を含むｐ３３−ＶＬＰの調製物（実施例２および図５を参照のこと）で追加抗原刺激し、特異的Ｔ細胞の頻度を５日後に決定する。
【実施例３０】
【０４１６】
免疫賦活リボ核酸のＶＬＰへのパッケージ化
免疫賦活リボ核酸として、リン酸ジエステル又はホスホロチオエート骨格を有するポリイノシン酸およびポリシチジル酸の、ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ）又は合成二本鎖３０ｍｅｒなどを、水に溶かす。あるいは、ポリデオキシイノシン酸およびポリデオキシイノシン酸を使用して、二本鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）類似体を調製する。ＨＢｃ３３  ＶＬＰおよびＱβ  ＶＬＰを、実施例１１、１３又は２５に記載したようにＲＮＡｓｅで処理し、０．２×ＨＢＳ中に１、１０および１００ｎｍｏｌ／ｍｌで核酸を加え、サーモ・ミキサー中において３７℃で３時間インキュベートする。過剰な核酸は、実施例１１、１３および２５に記載したように、酵素による加水分解又は透析によって除去し、分析する。
【０４１７】
あるいは、免疫賦活リボ核酸およびそれらの類似体を、実施例１４、１５、１６に記載したように、Ｑβコート・タンパク質の再構築中にパッケージ化する。再構築は、β−メルカプトエタノールを１０ｍｌの二量体画分に最終濃度１０％まで加えることによって行い、キャプシド濃度より１、１０および１００モル過剰をもたらす、３００μｌの核酸溶液を加える。再構築混合物は、１０％β−メルカプトエタノールを含む３０ｍｌのＮＥＴバッファーで、４℃において２時間かけて最初に透析し、次いで８ｍｌ／ｈというＮＥＴバッファーの流速で、４℃で４日間かけて連続方式で透析する。次いで再構築混合物を、透析により水で脱塩し、６回バッファーを交換する（４回は１００ｍｌ、２回は１リットル）。次いで再構築したＱβ  ＶＬＰを、実施例１４に記載したようにスクロース勾配遠心分離によって、あるいは実施例１６に記載したようにゲル濾過によって単離する。
【図面の簡単な説明】
【０４１８】
【図１】ＣｐＧオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列（Ａ）、およびＢ型肝炎コア由来のペプチドｐ３３含有ＶＬＰのＤＮＡ配列（Ｂ）を示す。九量体ｐ３３エピトープを、位置１８５で３個のロイシン連結配列を介して、Ｂ型肝炎コア・タンパク質のＣ末端と遺伝子工学により融合させる。
【図２】電子顕微鏡法（Ａ）およびＳＤＳ  ＰＡＧＥ（Ｂ）によって評価した、ｐ３３−ＶＬＰの構造を示す。組み換えによって生成させた野生型ＶＬＰ（ＨＢｃＡｇ［ａａ  １−１８５］モノマーから構成される）およびｐ３３−ＶＬＰを、精製するためにＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ゲル濾過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテクノロジーＡＧ）に担持した。集めた画分を、ヒドロキシアパタイト・カラムに担持した。流動物（精製したＨＢｃキャプシドを含む）を回収し、モノマー分子量を分析するために還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに担持した（Ｂ）。
【図３】コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲルの電気泳動（１％アガロース）におけるｐ３３−ＶＬＰを示す。臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＲＮＡ又はタンパク質の存在を評価した。組み換えによって生成させたｐ３３−ＶＬＰを、ＰＢＳバッファー中０．５μｇ／μｌタンパク質の最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２）において、３７℃で２時間インキュベートした。その後これらのサンプルに、６倍濃縮したＤＮＡローディング・バッファー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補い、１％の純粋なアガロース・ゲル中に１００ボルトで３０分間展開した。Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒマーカー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。矢印は、ｐ３３−ＶＬＰにパッケージ化されたＲＮＡ（Ａ）又はｐ３３−ＶＬＰキャプシド自体（Ｂ）の存在を示している。３個の独立した実験において、同一の結果を得た。
【図４】バッファーのみ又はＣｐＧ含有ＤＮＡオリゴマーの存在下での、コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲルの電気泳動（１％アガロース）におけるｐ３３−ＶＬＰを示す。臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価した。組み換えｐ３３−ＶＬＰを、ＰＢＳバッファー中０．５μｇ／μｌタンパク質の最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２および３）において、３７℃で２時間インキュベートした。５ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（骨格のホスホロチオエート修飾体を含む）を、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化の前にサンプル３に加えた。Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒマーカー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。矢印は、ｐ３３−ＶＬＰ中のＲＮＡ又はＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（Ａ）又はｐ３３−ＶＬＰキャプシド自体（Ｂ）の存在を示している。リン酸ジエステル結合を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを、ＶＬＰとＲＮａｓｅ  Ａの同時インキュベーション用に使用すると、同一の結果を得た。
【図５】ＣｐＧ含有ＤＮＡオリゴマーの存在下でのＲＮａｓｅ  Ａによる消化、およびその後の透析（ＶＬＰ非結合ＣｐＧ  ＤＮＡを排除するため）前後の、純粋なアガロース・ゲルの電気泳動（１％アガロース）におけるｐ３３−ＶＬＰを示す。臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価した。組み換えｐ３３−ＶＬＰを、ＰＢＳバッファー中０．５μｇ／μｌタンパク質の最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２〜５）において、３７℃で２時間インキュベートした。５０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体を含む：レーン２および３、リン酸ジエステル結合を含む：レーン４および５）を、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化の前にＶＬＰに加えた。処理したサンプルを、３００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を用いてＰＢＳ（４５００倍希釈）で２４時間かけて十分に透析して、過剰なＤＮＡを排除した（レーン３および５）。Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒマーカー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。矢印は、ｐ３３−ＶＬＰ中のＲＮＡ又はＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（Ａ）又はｐ３３−ＶＬＰキャプシド自体（Ｂ）の存在を示している。
【図６】コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲルの電気泳動（１％アガロース）におけるｐ３３−ＶＬＰを示す。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ消化が終了した後でのみ加え、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価した。組み換えｐ３３−ＶＬＰを、ＰＢＳバッファー中０．５μｇ／μｌタンパク質の最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２および３）において、３７℃で２時間インキュベートした。５ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体を含む）を、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化の後でのみサンプル３に加えた。Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒマーカー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。矢印は、ｐ３３−ＶＬＰ中のＲＮＡ又はＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（Ａ）又はｐ３３−ＶＬＰキャプシド自体（Ｂ）の存在を示している。リン酸ジエステル結合を有するＣｐＧオリゴヌクレオチドを、ＶＬＰを再構築するために使用すると、同一の結果を得た。
【図７】ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格のホスホロチオエート修飾体を含む）をパッケージ化したｐ３３−ＶＬＰは、ウィルス保護の誘導において有効であることを示す。マウスは、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰ単独で、これを２０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと混合したもの（ｐ３３−ＶＬＰ＋ＣｐＧ）で、あるいはＣｐＧを含まないオリゴヌクレオチドを透析した後にＣｐＧ−オリゴヌクレオチドをパッケージ化したｐ３３−ＶＬＰ（ｐ３３−ＶＬＰ／ＣｐＧ）で、皮下を初回抗原刺激した。未処理の未処置マウスを、ネガティブコントロールとした。Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ，Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｉ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中に記載されたように、２１日後、マウスをＬＣＭＶで感染させ（２００ｐｆｕ、静脈内）、脾臓中のウィルス力価を５日後に評価した。
【図８】ＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸ジエステル結合を含む）をパッケージ化したｐ３３−ＶＬＰは、ウィルス保護の誘導において有効であることを示す。マウスは、１００μｇのｐ３３−ＶＬＰ単独で、これを２０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドと混合したもの（ｐ３３ＶＬＰ＋ＣｐＧ）で、あるいはＣｐＧを含まないオリゴヌクレオチドを透析した後にＣｐＧ−オリゴヌクレオチドをパッケージ化したｐ３３−ＶＬＰ（ｐ３３−ＶＬＰ／ＣｐＧ）で、皮下を初回抗原刺激した。未処理の未処置マウスを、ネガティブコントロールとした。Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｉ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中に記載されたように、２１日後、マウスをＬＣＭＶで感染させ（２００ｐｆｕ、静脈内）、脾臓中のウィルス力価を５日後に評価した。
【図９】ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドのみで治療したマウスは、ウィルス感染から保護されないことを示す。マウスは２０ｎｍｏｌのＣｐＧ−オリゴヌクレオチドで皮下を初回抗原刺激したか（ＣｐＧ）、あるいはネガティブコントロールとして未処理のままにした（未処置）。Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｉ，ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９７）ｐ．１９２１中に記載されたように、２１日後、マウスをＬＣＭＶで感染させ（２００ｐｆｕ、静脈内）、脾臓中のウィルス力価を５日後に評価した。
【図１０】ＢＫＶ（ＡＳ）ＶＰ１タンパク質（ＧＩ：３３２７７９）のアミノ酸配列を示す。この配列が酵母菌中で発現して、ＢＫＶキャプシドが生成された（Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ  Ｋ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３８０（３）：３８１（１９９９）；Ｋ．他、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．３ｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  「Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｂｅｒｌｉｎ、（２００１））。
【図１１】ＢＫＶ  ＶＬＰのパッケージ化および安定化用に使用した、２４６ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を示す。
【図１２】コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化、およびその後の蛍光ホスホロチオエート（ｐｔ）ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドとのインキュベーション後の、純粋な０．８％アガロース・ゲルの電気泳動におけるＢＫＶ  ＶＬＰ（１５μｇ）を示す。ＵＶ励起によって、臭化エチジウム染色ゲル中のＤＮＡの検出（Ａ）、および臭化エチジウムの不在下でのＣｐＧ−ＦＡＭオリゴマーの蛍光がもたらされる（Ｂ）。レーン１：未処理のＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン２：ＲＮａｓｅ  Ａで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン３：ＲＮａｓｅ  ＡおよびＣｐＧ（ｐｔ）−ＦＡＭで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン４：ＲＮａｓｅ  ＡおよびＣｐＧ（ｐｔ）−ＦＡＭおよびＤＮａｓｅＩ処理剤で処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーンＭ：Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒ、１ｋｂのＤＮＡラダー（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。矢印は、ＢＫＶ  ＶＬＰ中のＲＮＡ又はＣｐＧ−ＦＡＭオリゴマーの存在を示している。
【図１３】コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化、および臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色した二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ（２４６ｂｐ）との、その後のインキュベーション後の、純粋な０．８％アガロース・ゲルの電気泳動におけるＢＫＶ  ＶＬＰ（１５μｇ）を示す。レーン１：未処理のＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン２：ＲＮａｓｅ  Ａで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン３：ＲＮａｓｅ  Ａで処理し、ｄｓ  ＤＮＡとインキュベートしたＢＫＶ  ＶＬＰ；レーンＭ：Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒ、１ｋｂのＤＮＡラダー（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。矢印は、ＢＫＶ  ＶＬＰ中のＲＮＡ又はｄｓ  ＤＮＡの存在を示している。
【図１４】コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化、および臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色したＣｐＧ−オリゴヌクレオチド（リン酸骨格を有するか、あるいはホスホロチオエート（ｐｔ）骨格を有する）との、その後のインキュベーション後の、純粋な０．８％アガロース・ゲルの電気泳動におけるＢＫＶ  ＶＬＰ（１５μｇ）を示す。レーン１：ＢＫＶ  ＶＬＰストック（ＰＢＳ／５０％グリセロール）；レーン２：未処理（ＰＢＳバッファー）のＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン３：ＲＮａｓｅ  Ａで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン４：透析後にＲＮａｓｅ  Ａで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン５：ＲＮａｓｅ  ＡおよびＣｐＧ−オリゴヌクレオチドで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン６：ＲＮａｓｅ  ＡおよびＣｐＧ（ｐｔ）−オリゴマーで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン７：透析後にＲＮａｓｅ  ＡおよびＣｐＧ（ｐｔ）−オリゴマーで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーンＭ：Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒ、１ｋｂのＤＮＡラダー（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。矢印は、ＢＫＶ  ＶＬＰ中のＲＮＡ又はＣｐＧ−オリゴヌクレオチドの存在を示している。
【図１５】ＢＫＶ  ＶＬＰおよびホスホロチオエート（ｐｔ）ＣｐＧ−オリゴヌクレオチドによる免疫化１４日後の、ＢＫＶ  ＶＬＰに対するマウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのＯＤ５０％での抗体力価を示す。レーン１：ＲＮａｓｅで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン２：０．３ｎｍｏｌのＣｐＧ（ｐｔ）−オリゴマーと組み合わせてＲＮａｓｅで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン３：２０ｎｍｏｌのＣｐＧ（ｐｔ）−オリゴマーと組み合わせてＲＮａｓｅで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ；レーン４：０．３ｎｍｏｌのＣｐＧ（ｐｔ）−オリゴマーを含むＲＮａｓｅで処理したＢＫＶ  ＶＬＰ。
【図１６】コントロールのインキュベーション後、又はＲＮａｓｅ  Ａによる消化後の、純粋なアガロース・ゲルの電気泳動（１％アガロース）におけるｐ３３−ＶＬＰを示す。線状二本鎖ＤＮＡ（３５０塩基対の長さ）は、ＲＮＡ消化が終了した後でのみ加え、臭化エチジウム（Ａ）又はクーマシーブルー（Ｂ）で染色して、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の存在を評価した。組み換えｐ３３−ＶＬＰを、ＰＢＳバッファー中０．５μｇ／μｌタンパク質の最終濃度に希釈し、ＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｕｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２、３および４）において、３７℃で２時間インキュベートした。３５０ｂｐの長さの線状二本鎖ＤＮＡを、ＲＮａｓｅ  Ａによる消化の後でのみサンプル３および４に加えて、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度にし、３７℃で３時間インキュベートした。サンプル４は、３７℃においてさらに３時間、ＤＮａｓｅ  Ｉ（５０ＩＵ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌｕｋａ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてさらに消化した。Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒマーカー（ＭＢＳ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ｐ３３−ＶＬＰの移動速度に関する参照として使用した（レーンＭ）。矢印は、ｐ３３−ＶＬＰ中の遊離又は封入ＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ（Ａ）およびｐ３３−ＶＬＰ（Ｂ）の存在を示している。
【図１７】Ｂ−ＣｐＧのＨＢｃ３３  ＶＬＰへのパッケージ化を示す。
【図１８】ＮＫＣｐＧのＨＢｃ３３  ＶＬＰへのパッケージ化を示す。
【図１９】ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯのＨＢｃ３３  ＶＬＰへのパッケージ化を示す。
【図２０】ＣｙＣｐＧ−１５０のＨＢｃ３３  ＶＬＰへのパッケージ化を示す。
【図２１】ＮＫＣｐＧｐｔのＨＢｃＰ１Ａ  ＶＬＰへのパッケージ化を示す。
【図２２】ｐ３３とＨＢｃＡｇ  ＶＬＰの連結を示す。
【図２３】Ｂ−ＣｐＧｐｔのＨＢｘ３３  ＶＬＰへのパッケージ化を示す。
【図２４】ｐ３３とＱβ  ＶＬＰの連結を示す。
【図２５】イオン強度および低いタンパク質濃度が、Ｑβ  ＶＬＰ中でのＲＮａｓｅ  ＡによるＲＮＡ加水分解を可能にすることを示す。
【図２６】イオン強度によって、免疫賦活性核酸のＱβ  ＶＬＰへのパッケージ化が増大することを示す。
【図２７】Ｂ−ＣｐＧｐｔ、ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＯおよびｄｓＣｙＣｐＧの、Ｑｂｘ３３  ＶＬＰへのパッケージ化を示す。
【図２８】免疫賦活性核酸の存在下におけるＱβ  ＶＬＰ分解および再構築の後の、スクロース勾配遠心分離からの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２９】オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）２０ＯｐＡの存在下における分解および再構築の後の、Ｑβ  ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。
【図３０】分解および再構築したＱβ  ＶＬＰのオクタロニー分析（免疫拡散）を示す。
【図３１】分解および再構築したＱβ  ＶＬＰのゲルの電気泳動分析を示す。
【図３２】オリゴヌクレオチドＣｙＯｐＡを有する分解および再構築したＱβ  ＶＬＰの、電子顕微鏡写真を示す。
【図３３】異なる免疫賦活性核酸を有する、精製した分解および再構築したＱβ  ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。
【図３４】オリゴデオキシヌクレオチドＣｙＯｐＡと再構築したＱβ  ＶＬＰとｐ３３ＧＧＣペプチドの連結の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３５】Ｑβ  ＶＬＰの分解および再構築、およびその後のｐ３３ＧＧＣペプチドとの連結の後に、パッケージ化されたオリゴデオキシヌクレオチドを示す。
【図３６】サイズ排除クロマトグラフィーによる、分解されたＱβコート・タンパク質の精製を示す。
【図３７】サイズ排除クロマトグラフィーによる、再構築したＱβ  ＶＬＰの精製を示す。
【図３８】異なるオリゴデオキシヌクレオチドの存在下において、再構築したＱβ  ＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す。
【図３９】再構築および精製したＱβキャプシド中の、ジスルフィド結合型の分析を示す。
【図４０】ヌクレアーゼ処理およびアガロース・ゲルの電気泳動による、再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析を示す。
【図４１】プロテアーゼＫ処理およびポリアクリルアミドＴＢＥ／尿素ゲルの電気泳動による、再構築したＱβ  ＶＬＰの核酸含量の分析を示す。
【図４２】ＡＰ２０５  ＶＬＰが分解し、その後ＣｙＣｐＧの存在下において再構築した、電子顕微鏡写真を示す。
【図４３】ＡＰ２０５  ＶＬＰが分解し、ＣｙＣｐＧの存在下において再構築した、アガロース・ゲルの電気泳動分析を示す。
【図４４】分解および再構築したＡＰ２０５の、電子顕微鏡写真を示す。
【図４５】ＡＰ２０５  ＶＬＰが分解し、ＣｙＣｐＧの存在下において再構築した、アガロース・ゲルの電気泳動分析を示す。
【図４６】分解および再構築したＡＰ２０５の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４７】分解および再構築したＡＰ２０５へのペプチド結合の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４８】ＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸ではなく、遊離免疫賦活性核酸が巨脾症を誘導することを示す。
【図４９】抗原と融合しＶＬＰ中にパッケージ化された異なる免疫賦活性核酸が、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答およびウィルス保護をもたらすことを示す。
【図５０】抗原と融合したＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸ｇ１０ｇａｃｇａ−ＰＳが、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答およびウィルス保護をもたらすことを示す。
【図５１】ＨＢｃＡｇおよびＱβ  ＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸が、強力な抗原特異的ＣＴＬ応答およびウィルス保護をもたらすことを示す。
【図５２】ＶＬＰ中にパッケージ化された免疫賦活性核酸が、免疫賦活性核酸と混合したＶＬＰよりも、ＣＴＬ応答を誘導する際により一層有効であることを示す。
【図５３】Ｑβ  ＶＬＰ中のＲＮＡの、非酵素的ＲＮＡ加水分解の分析を示す。
【図５４】非酵素的ＲＮＡ加水分解の後の、オリゴデオキシヌクレオチドのＱβ  ＶＬＰへのパッケージ化を示す。
【図５５】非酵素的ＲＮＡ加水分解の後の、オリゴデオキシヌクレオチドのＱβ  ＶＬＰへのパッケージ化の分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４ＡＢ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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