(57)【要約】  本発明は、ペプチドおよびタンパク質の配座異性体のアンサンブルを作製および分析し、標的タンパク質に対するペプチドまたはタンパク質の所与の立体配座の親和性を予測する方法を提供する。
2005512161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i.タンパク質配列データセットから無作為な立体配座の角を作製する工程、
ii．前記立体配座の角を使用してタンパク質骨格を作製する工程、
iii．前記タンパク質骨格のファンデルワールス計算を実行する工程、
iv．工程i〜iiiで作製した配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程、
v．前記タンパク質骨格中にジスルフィド結合をモデリングする工程、
vi．前記ジスルフィド結合についてファンデルワールス計算を実行する工程、
vii．工程i〜viで作製した配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程、および
viii．上記工程で見出された構造の特徴を有する修飾タンパク質を作製する工程
を含む、タンパク質の修飾に使用するコンピュータ支援方法。
【請求項２】
前記修飾タンパク質が増加した安定性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジスルフィド結合の座標対を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記立体配座角がφ、Ψ、またはωである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ジスルフィド結合を形成することができる配座異性体数を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質骨格中の各残基に回転異性体を付加する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
テンプレート分子を使用して各配座異性体の結合試験を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ジスルフィド結合ループの閉鎖率を計算する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質のジスルフィド結合ループの閉鎖率の決定が、
i．前記タンパク質の配座異性体の多重度に基づいてファンデルワールス計算を実行し、分子内ジスルフィドを形成できない配座異性体を差し引いて立体的に許容される配座異性体N０のアンサンブルを得る工程、
ii．前記立体的に許容される配座異性体のアンサンブルを分析して分子内ジスルフィド結合を形成することができる配座異性体Ncのアンサンブル得る工程、および
iii．ペプチド中のジスルフィド結合ループの閉鎖率を示すNc/N０比を計算する工程
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質中のアミノ酸の総数を減少させながら、請求項１に記載の方法を使用して必要な活性部位の立体配座を有するタンパク質をモデリングする工程を含む、タンパク質最小化法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法を使用して立体配座空間中のタンパク質の不安定領域の少なくとも1つのループの制限を含むタンパク質による結合時の立体配座エントロピーの喪失を減少させることによって、タンパク質とテンプレート分子との間の結合親和性を増加させる方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の工程を実行するソフトウェアプログラムが格納された、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１３】
請求項９に記載の工程を実行するソフトウェアプログラムが格納された、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項１４】
i．請求項１に記載の方法の工程を実施する工程、
ii．各配座異性体とテンプレート分子との結合試験を実施する工程、および
iii．修飾タンパク質の結合親和性を増大させるために上記工程で見出された構造の特徴を使用して修飾タンパク質を作製する工程
を含む方法によって作製された結合親和性が増大した修飾タンパク質。
【請求項１５】
i．請求項１に記載の方法の工程を実施する工程、および
ii．修飾タンパク質の安定性を増大させるために上記工程で見出された構造の特徴を使用して修飾タンパク質を作製する工程
を含む方法によって作製される修飾タンパク質。
【請求項１６】
i．タンパク質配列データセットからラマチャンドランマップの許容領域に無作為な立体配座の角を作製する工程、
ii．前記立体配座の角を使用してタンパク質骨格を作製する工程、
iii．各骨格原子についてファンデルワールス計算を実行する工程、
iv．前記タンパク質骨格中のジスルフィド結合を決定する工程、
v．前記骨格中の残基に回転異性体を付加する工程、
vi．前記回転異性体についてファンデルワールス計算を実行する工程、
vii．テンプレートタンパク質を使用して結合試験を実行する工程、
viii．工程i〜viiで作製した全配座異性体の溶媒接触可能表面積を計算する工程、および
ix．上記工程で同定された構造の特徴を使用して修飾タンパク質を作製する工程
を含む、タンパク質の修飾に使用するコンピュータ支援方法。
【請求項１７】
前記タンパク質骨格の作製が、前記骨格の各残基に立体配座の角を割り当てる工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
原子間に距離対を作製する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ジスルフィド結合の座標対を決定する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨格原子がN、CA、またはCである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記立体配座角がφ、Ψ、またはωである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の工程を実行するソフトウェアプログラムが格納された、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項２３】
i．タンパク質配列データセットからラマチャンドランマップの許容領域に無作為な立体配座の角を作製する工程、
ii．前記立体配座の角を使用してタンパク質骨格を作製する工程、
iii．前記骨格中の残基に回転異性体を付加する工程、
iv．前記タンパク質骨格中のジスルフィド結合を決定する工程、
v．直鎖配座異性体を計算するコンピュータ支援プログラムに前記方法をリンクする工程、
v．工程i〜ivで作製した配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程、および
vi．上記工程で同定された構造の特徴を使用して修飾タンパク質を作製する工程
を含む、タンパク質の修飾に使用するコンピュータ支援方法。
【請求項２４】
直鎖配座異性体を計算する前記コンピュータ支援プログラムがCOREXである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記立体配座角がφ、Ψ、またはωである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の工程を実行するソフトウェアプログラムが格納された、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項２７】
i．タンパク質の配座異性体の多重度に関してファンデルワールス計算を実行し、分子内ジスルフィドを形成できない配座異性体を差し引いて立体的に許容される配座異性体N０のアンサンブルを得る工程、
ii．前記立体的に許容される配座異性体のアンサンブルを分析して分子内ジスルフィド結合を形成することができる配座異性体Ncのアンサンブル得る工程、および
iii．ペプチド中のジスルフィド結合ループの閉鎖率を示すNc/N０比を計算する工程
を含む、C-Xn-C(式中、nは整数である)によって示される少なくとも1つの２−システインモチーフを含むタンパク質中のジスルフィド結合ループの閉鎖率を決定する方法。
【請求項２８】
前記比率を少なくとも1つの異なる２−システインモチーフを含むタンパク質のジスルフィド結合ループの閉鎖率と比較する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
各残基についてのラマチャンドランマップの許容領域内に無作為に作製した標準的な結合角、結合長、および二面角由来のC-Xn-Cモチーフのペプチド骨格座標を作製してタンパク質の配座異性体の多重度を得る工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
側鎖回転異性体ライブラリーを使用してC-Xn-C側鎖座標を作製して前記ペプチドの配座異性体の多重度を得る工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記立体的に許容された配座異性体の分析が、溶媒接触可能表面積に基づいて配座異性体の自由エネルギーを計算する工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記立体的に許容された配座異性体の分析が、システイン側鎖を柔軟にモデリングする工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
C-Xn-Cモチーフのジチオール型とジスルフィド型との間の自由エネルギーの差(ΔG)によってNcおよびN０に重みを掛け、前記タンパク質中のジスルフィドループ閉鎖のエネルギー加重比を示す比:
【数１】
2005512161.tif 000015
を計算する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるタンパク質のNc配座異性体のアンサンブルを同定する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
テンプレート生体分子上の結合部位へのNc配座異性体のアンサンブルのドッキングが、
i．テンプレート生体分子上の結合部位にNc配座異性体のアンサンブルを整列させて整列させた配座異性体のアンサンブルを得る工程、および
ii．前記整列させた配座異性体のアンサンブルに対してファンデルワールス計算を実行してテンプレート生体分子に結合する立体的に許容される配座異性体Nbのアンサンブルを得る工程を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
テンプレート生体分子上の結合部位へのNc配座異性体のアンサンブルのドッキングが、
i．テンプレート生体分子上の結合部位にNc配座異性体のアンサンブルを整列させて整列させた配座異性体のアンサンブルを得る工程、および
ii．前記整列させた配座異性体のアンサンブルに対してファンデルワールス計算を実行してテンプレート生体分子に結合する立体的に許容される配座異性体Nbのアンサンブルを得る工程を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質が、C-Xn-C(式中、nは各２−システインモチーフについて独立して整数である)によって示される複数の２−システインモチーフをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２７に記載の工程を実行するソフトウェアプログラムが格納された、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体。
【請求項３９】
テンプレート分子に対するタンパク質の結合親和性を評価する方法であって、前記タンパク質がC-Xn-C(式中、nは整数である)によって示される少なくとも1つの２−システインモチーフを含み、
i．テンプレート生体分子上の結合部位にNc配座異性体のアンサンブルをドッキングさせて、テンプレート生体分子に結合するNb配座異性体のアンサンブルを得る工程、および
ii．テンプレート生体分子に対する前記タンパク質の結合親和性の指標であるNb/Nc比を計算する工程を含む方法。
【請求項４０】
テンプレート分子に対するタンパク質の結合親和性を評価する方法であって、前記タンパク質がC-Xn-C(式中、nは整数である)によって示される少なくとも1つの２−システインモチーフを含み、
i．C-Xn-C(式中、nは整数である)によって示される少なくとも1つの２−システインモチーフを含む候補ペプチド集団をスクリーニングして、分子内ジスルフィド結合を形成することができる複数の候補ペプチドを得る工程、および
ii．前記分子内ジスルフィド結合を形成することができる少なくとも1つの候補ペプチドに対して請求項３９に記載の方法を実施して前記候補ペプチドの結合親和性を評価する工程を含む方法。
【請求項４１】
前記各候補ペプチドが予め選択したアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記予め選択したアミノ酸配列が前記ペプチドを所望の二次構造を形成させやすくする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記所望の二次構造がβターンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
i．標的分子に結合した酸化基準ペプチドを含み、前記基準タンパク質が少なくとも1つの分子内ジスルフィド結合を含むX線結晶構造または核磁気共鳴溶液構造を評価して、分子内ジスルフィド結合形成に有利な位置で少なくとも2つのアミノ酸が同定される工程、
ii．前記基準タンパク質中の2つのアミノ酸をシステインに置換して、少なくとも4つのシステインを含む修飾タンパク質を得る工程、
iii．少なくとも2つの分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができる修飾タンパク質のNc配座異性体のアンサンブルを同定する工程、
iv．テンプレート生体分子上の結合部位にNc配座異性体のアンサンブルをドッキングさせて、前記テンプレート生体分子に結合するNb配座異性体のアンサンブルを得る工程、
v．前記テンプレート生体分子に対する前記修飾タンパク質の結合親和性の指標であるNb/Nc比を計算する工程、および
vi工程(i．)〜(v．)を繰り返して、異なる位置でシステインが置換された修飾タンパク質を得て、最も高いNb/Nc比を有する修飾ペプチドを同定する工程
を含む、タンパク質の修飾方法。
【請求項４５】
アンサンブルの同定工程が、
i．第1のジスルフィド結合ループを定義する第1の分子内ジスルフィド結合を形成することができるタンパク質の第1の配座異性体を同定する工程、
ii．前記第1のジスルフィド結合によってモデルを拘束する工程、および
iii．第2のより長いジスルフィド結合ループを定義する第2の分子内ジスルフィド結合を形成することができるタンパク質の第2の配座異性体を同定する工程
を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第2の配座異性体を約5回〜約10回試行後に同定しても前記配座異性体は同定されず、
i．モデルから第1のジスルフィド結合を排除する工程、
ii．異なる第1のジスルフィド結合ループを定義する第1の分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるペプチドの第1の配座異性体を同定する工程、
iii．前記第1のジスルフィド結合によってモデルを拘束する工程、
iv．第2のより長いジスルフィド結合ループを定義する第2の分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるペプチドの第2の配座異性体を同定する工程をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
テンプレート分子に対するタンパク質の結合親和性を評価する方法であって、前記タンパク質が可撓性ループを含み、
i．開始残基Iから長さNのペプチド立体配座を作製し、ペプチドモデル上の標的残基I＋Nに適合させる工程、
ii．残基Nと標的残基との間の逸脱が小さい場合に前記ループ立体配座を許容する工程、
iii．幾何学的最小法を使用して前記ループを閉じる工程、
iv．請求項２９に記載の方法によって前記残基の立体配座を選択する工程、
v．表面ループのアンサンブルを作製する工程、および
vi．完全なミニタンパク質アンサンブルとループアンサンブルを含むペプチド標的とのドッキングを試験することによって結合親和性を評価する工程を含む方法。
【請求項４８】
請求項１に記載の方法を使用してタンパク質中のアミノ酸の総数を減少させながら必要な活性部位の立体配座を有するようにタンパク質をモデリングする工程を含む、タンパク質最小化によって生成されたタンパク質。
【請求項４９】
前記タンパク質の一部の立体配座が請求項１に記載の方法によるジスルフィド結合の導入によって制限される、結合部位にドッキング可能なタンパク質。
【請求項５０】
前記タンパク質が毒素の三次構造に基づき、ジスルフィドにより制限される少なくとも1つのループを含む、ウイルスの細胞への結合阻害を特徴とする、請求項１に記載の方法によって作製されたタンパク質。
【請求項５１】
請求項５０に記載のタンパク質由来のループの分子内ジスルフィド結合形成配座異性体のアンサンブル。
【請求項５２】
請求項１に記載の方法を使用した天然に存在するタンパク質で見出されるジスルフィド結合以外のジスルフィド結合の形成によって立体配座空間中のタンパク質の不安定領域の少なくとも1つのループの制限により天然に存在するタンパク質と比較してテンプレート分子への結合の際の立体配座エントロピーの損失が減少したタンパク質。
【請求項５３】
請求項５２に記載のタンパク質のループの分子内ジスルフィド結合形成配座異性体のアンサンブル。
【請求項５４】
請求項４４に記載の方法によって修飾されたタンパク質。
【請求項５５】
修飾タンパク質デザイン用のコンピュータシステムであって、前記システムは、
ix．タンパク質配列データセットを含むデータベースと、
x．前記データベースを組み込んだソフトウェアプログラムを含み、
前記ソフトウェアプログラムが、
(a)前記タンパク質配列データセットから無作為な立体配座の角を作製する工程、
(b)前記立体配座角を使用してタンパク質骨格を作製する工程、
(c)前記タンパク質骨格のファンデルワールス計算を実行する工程、
(d)工程(a)〜(c)で作製した配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程、
(e)前記タンパク質骨格中のジスルフィド結合をモデリングする工程、
(f)前記ジスルフィド結合のファンデルワールス計算を実行する工程、
(g)工程(a)〜(f)で作製した配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程、および
(h)上記工程で見出された構造の特徴を使用して修飾タンパク質を作製する工程
からなる工程の実行に適合されたものであるシステム。
【請求項５６】
修飾タンパク質デザイン用のコンピュータシステムであって、前記システムは、
i．タンパク質配列データセットを含むデータベースと、
ii．前記データベースを組み込んだソフトウェアプログラムを含み、前記ソフトウェアプログラムが、
(a)前記タンパク質配列データセットからラマチャンドランマップの許容領域中に無作為に立体配座の角を作製する工程、
(b)前記立体配座角を使用してタンパク質骨格を作製する工程、
(c)前記骨格中の残基に回転異性体を付加する工程、
(d)前記タンパク質骨格中のジスルフィド結合を決定する工程、
(e)直鎖配座異性体を計算する工程、
(f)工程(a)〜(d)で作製した配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程、および
(g)上記工程で同定された構造の特徴を使用して修飾タンパク質を作製する工程
からなる工程の実行に適合されたものであるシステム。
【請求項５７】
前記計算工程が配座異性体計算用の外部プログラムにリンクする工程を含む、請求項５６に記載のコンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、構造生物学分野に関する。本発明は、ペプチド構造をモデリングし、ペプチド中のその位置に天然に存在しないアミノ酸の挿入によってそのペプチド構造を安定化する方法に関する。本発明はまた、テンプレート分子に対するペプチドの結合親和性を評価し、ジスルフィド結合を介したペプチド中のループの閉鎖率を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、2001年3月12日提出の米国特許仮出願第60/275,144号の優先権を主張する。
【０００３】
合衆国政府は、DARPAからの助成金によって本発明に一定の権利を有し得る。
【０００４】
本発明のタンパク質モデリングアプローチは、ペプチド安定化のためにペプチド中のどこにシステインまたは他のアミノ酸を挿入するのかを予測する有効な方法を提供する。
【０００５】
タンパク質の三次元構造は、多数の方法で決定されている。タンパク質構造の最も周知の決定方法の1つは、X線結晶学の技術の使用を含む。この技術を使用して、良好に正確な三次元構造を解明することが可能である。さらに、タンパク質構造を、中性子回折技術の使用または核磁気共鳴(NMR)の使用によって決定することができる。
【０００６】
多数のタンパク質の三次元構造は、内表面(通常タンパク質が見出される水性環境から離れた方向を向いている)および外表面(水性環境に曝されている)を有するものとして特徴付けることができる。多数の天然タンパク質の研究により、研究者らは、タンパク質分子の内表面上に疎水性残基(トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはメチオニンなど)が最も頻繁に見出されることを発見した。対照的に、タンパク質外表面上に親水性残基(アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、セリン、およびトレオニンなど)が最も頻繁に見出される。アミノ酸アラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、プロリン、セリン、チロシン、およびトレオニンは、タンパク質内表面および外表面上でほぼ等しい頻度で出現する。
【０００７】
タンパク質の生物学的特性は、タンパク質の三次元(3D)立体配座に直接依存する。立体配座は、酵素活性、結合タンパク質の能力および特異性、ならびに受容体分子の構造的寄与を決定する。各タンパク質の可能な立体配座の数は天文学的であり(100残基の小タンパク質で約1016通り)、水溶液中で支配的な1つの立体配座を選択する信頼できる方法は存在しなかった。第2の困難は、タンパク質の一部と別の部分および水との相互作用についての正確且つ信頼できる力学的法則が存在しないことである。これらおよび他の要因は、公知のタンパク質配列中の各残基の最も可能性の高い相対的位置の決定を非常に複雑にしている。
【０００８】
タンパク質折りたたみ問題(そのタンパク質配列からのタンパク質三次元四次構造の決定における問題)は、半世紀以上前に最初に体系化された。初期の所見およびその後の実験により、タンパク質の立体配座をアミノ酸配列のみによって決定し、配列中では離れているが空間的に隣接した残基により疎水性残基中に豊富な密集コアが得られる固有の天然立体配座が存在するという当時の見解が導かれた。分子生物学における革命の結果として、公知のタンパク質配列数は、公知の三次元タンパク質構造の数の約50倍である。タンパク質配列が三次元構造の範囲外でほとんど意味を待たないので、この不釣合いは多くの生化学領域の進展を妨げている。
【０００９】
本発明のタンパク質モデリングアプローチは、ペプチド安定化のためにペプチド中のどこにシステインまたは他のアミノ酸を挿入するのかを予測する有効な方法を提供する。本発明は、より親和性の高い結合を得るためにタンパク質を安定化するためのアンサンブルベースの全原子方法(ミニタンパク質モデリングプログラム(MPMOD))を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、ペプチドおよびタンパク質の配座異性体のアンサンブルを作製および分析し、標的タンパク質に対するペプチドまたはタンパク質の所与の立体配座の親和性を予測する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態は、分析用のペプチド配列およびパラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、φ、Ψ、ωを無作為に作製する工程と、ペプチド骨格を作製する工程と、前記骨格のファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程と、ジスルフィドをモデリングする工程と、各回転異性体を付加した後にファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程とを含む、タンパク質の修飾に使用するコンピュータ支援方法である。さらなる実施形態では、タンパク質は、ペプチドを含み得る。なおさらなる実施形態では、本方法は、各配座異性体のテンプレート分子への結合試験を実施する工程を含み得る。さらなる実施形態では、本方法は、ジスルフィド結合ループの閉鎖率を計算する工程を含み得る。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、タンパク質中のアミノ酸の総数を減少させながら上記の方法を使用して必要な活性部位の立体配座を有するタンパク質をモデリングする工程を含むタンパク質最小化法である。
【００１３】
さらに別の実施形態は、上記の方法を使用して立体配座空間中のタンパク質の不安定領域の少なくとも1つのループの制限を含むタンパク質による結合時の立体配座エントロピーの喪失を減少させることによってタンパク質とテンプレート分子との間の結合親和性を増加させる方法である。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、ペプチド配列をコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、分析用パラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、ラマチャンドランマップの許容領域中にφ、Ψ、およびω角を作製する工程と、骨格の各残基に角を割り当てる工程と、N、CA、Cについての骨格原子を作製する工程と、残りの骨格原子を作製する工程と、各原子についてファンデルワールスチェックを実行する工程と、ジスルフィド結合をモデリングしてジスルフィド座標対を記録する工程と、残基に回転異性体を付加する工程と、各回転異性体についてファンデルワールスチェックを実行する工程と、テンプレートタンパク質との結合試験を実施する工程と、各配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程とを含むタンパク質の修飾に使用されるコンピュータ支援方法である。さらなる実施形態では、タンパク質は、1つのペプチドを含み得る。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、ペプチド配列をコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、分析用パラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、ラマチャンドランマップの許容領域中にφ、Ψ、およびω角を無作為に作製する工程と、骨格の各残基に角を割り当てる工程と、骨格原子N、CA、Cを作製する工程と、残りの骨格原子を作製する工程と、各原子を付加した後に他のすべての原子を用いてファンデルワールスチェックを実行する工程と、残基に回転異性体を付加する工程と、原子間の距離対をチェックする工程と、ジスルフィド結合をモデリングしてジスルフィド座標対を記録する工程と、完全な配座異性体を含むジスルフィド結合についてファンデルワールスチェックを実行する工程と、ジスルフィド結合を形成することができる配座異性体数を記録する工程と、各配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程とを含むタンパク質の修飾に使用されるコンピュータ支援方法である。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態は、分析用のペプチド配列およびパラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、ラマチャンドランプロットの許容領域中の配座異性体空間を検索する工程と、配座異性体のN末端およびC末端を高分解能構造と同一に最小化する工程と、前記配座異性体の左右像をチェックする工程と、高分解能構造に前記配座異性体を整列させる工程と、ファンデルワールス計算を実行する工程とを含むタンパク質の修飾に使用されるコンピュータ支援方法である。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態は、タンパク質の可撓性ループの残基数をコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、分析用パラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、ラマチャンドランマップの許容領域中にφ、Ψ、およびω角を無作為に作製する工程と、骨格原子を作製する工程と、N末端およびC末端についてCA-CA距離チェックを実行する工程と、配座異性体のN末端およびC末端を高分解能構造と同一になるように最小化する工程と、前記配座異性体の左右像をチェックする工程と、骨格原子についてファンデルワールスチェックを実行する工程と、高分解能構造に前記配座異性体を整列させる工程と、骨格およびテンプレートタンパク質原子に対してファンデルワールスチェックを実行する工程と、前記骨格原子に側鎖を付加する工程と、全原子についてファンデルワールスチェックを実行する工程とを含むタンパク質の修飾に使用されるコンピュータ支援方法である。
【００１８】
本発明の実施形態は、ペプチドの配座異性体の多重度に対してファンデルワールス計算を実行し、分子内ジスルフィドを形成することができない配座異性体を差し引いて立体的に許容される配座異性体N0のアンサンブルを得る工程と、立体的に許容される配座異性体のアンサンブルを分析して分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるNc配座異性体のアンサンブルを得る工程と、ペプチド中のジスルフィド結合ループの閉鎖率を示すNc/N０比を計算する工程とを含む、C-Xn-C(式中、nは整数である)によって示される少なくとも1つの２−システインモチーフを含むタンパク質中のジスルフィド結合ループの閉鎖率を決定する方法である。別の実施形態では、この閉鎖率を少なくとも1つの異なる２−システインモチーフを含むペプチドのジスルフィド結合ループの閉鎖率と比較することができる。さらなる実施形態では、本方法は、各残基についてのφ、Ψラマチャンドランマップの許容領域内に無作為に得た標準的な結合角、結合長、およびφ、Ψ、ω二面角由来のC-Xn-Cモチーフのペプチド骨格座標を作製してペプチドの配座異性体の多重度を得る工程を含み得る。さらなる実施形態では、本方法は、側鎖回転異性体ライブラリーを使用してC-Xn-C側鎖の座標を作製し、ペプチドの配座異性体の多重度を得る工程をさらに含み得る。本発明の別の実施形態では、立体的に許容される配座異性体の分析は、溶媒接触可能表面積に基づいて配座異性体の自由エネルギーを計算する工程をさらに含み得る。本発明のさらに別の実施形態では、立体的に許容される配座異性体の分析は、システイン側鎖を可動的にモデリングする工程をさらに含み得る。本発明のさらなる実施形態では、本方法は、C-Xn-Cモチーフのジチオール型とジスルフィド型との間の自由エネルギーの差（ΔG）によってNcおよびN０に重みを掛け、前記ペプチド中のジスルフィドループ閉鎖のエネルギー加重比を示す比:
【００１９】
【数１】
2005512161.tif 000003
を計算する工程を含み得る。本発明のさらなる実施形態では、本方法は、分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるタンパク質のNc配座異性体のアンサンブルを同定する工程を含み得る。本発明の別の実施形態では、テンプレート生体分子上の結合部位へのNc配座異性体のアンサンブルのドッキングにより整列した配座異性体のアンサンブルを得る工程と、整列させた配座異性体のアンサンブルに対してファンデルワールス計算を実行してテンプレート生体分子に結合する立体的に許容される配座異性体Nbのアンサンブルを得る工程とを含み得る。さらなる実施形態では、テンプレート生体分子上の結合部位へのNc配座異性体のアンサンブルのドッキングは、テンプレート生体分子上の結合部位にNc配座異性体のアンサンブルを整列させて整列させた配座異性体のアンサンブルを得る工程と、前記整列させた配座異性体のアンサンブルに対してファンデルワールス計算を実行してテンプレート生体分子に結合する立体的に許容される配座異性体Nbのアンサンブルを得る工程とを含み得る。本発明の別の実施形態では、ペプチドが、C-Xn-C(式中、nは各２−システインモチーフについて独立して整数である)によって示される複数の２−システインモチーフをさらに含み得る。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、タンパク質がC-Xn-C(式中、nは整数である)によって示される少なくとも1つの２−システインモチーフを含み、テンプレート生体分子上の結合部位にNc配座異性体のアンサンブルをドッキングさせてテンプレート生体分子に結合するNb配座異性体のアンサンブルを得る工程と、テンプレート生体分子に対する前記タンパク質の結合親和性の指標であるNb/Nc比を計算する工程とを含む、テンプレート分子に対するタンパク質の結合親和性を評価する方法である。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態は、タンパク質がC-Xn-C(式中、nは整数である)によって示される少なくとも1つの２−システインモチーフを含み、C-Xn-C(式中、nは整数である)によって示される少なくとも1つの２−システインモチーフを含む候補ペプチド集団をスクリーニングして潜在的に分子内ジスルフィド結合を形成することができる複数の候補ペプチドを得る工程と、テンプレート生体分子上の結合部位にNb配座異性体のアンサンブルをドッキングさせてテンプレート生体分子に結合するNb配座異性体のアンサンブルを得る工程と、細胞内ジスルフィドを潜在的に結合することができる少なくとも1つの候補ペプチド上のテンプレート生体分子に対するタンパク質の結合親和性の指標であるNb/Nc比を計算して候補ペプチドの結合親和性を評価する工程とを含む、テンプレート分子に対するタンパク質の結合親和性を評価する方法である。本発明の別の実施形態では、各候補ペプチドは、予め選択したアミノ酸配列を含み得る。本発明のさらに別の実施形態では、予め選択したアミノ酸配列に所望の二次構造を形成させやすくすることができる。本発明の別の実施形態では、所望の二次構造がβターンであり得る。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、標的分子に結合した酸化基準ペプチドを含み、前記基準タンパク質が少なくとも1つの分子内ジスルフィド結合を含むX線結晶構造または核磁気共鳴溶液構造を評価して、分子内ジスルフィド結合形成が好む位置で少なくとも2つのアミノ酸が同定される工程と、前記基準ペプチド中の2つのアミノ酸をシステインに置換して、少なくとも4つのシステインを含む修飾タンパク質を得る工程と、少なくとも2つの分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができる修飾タンパク質のNc配座異性体のアンサンブルを同定する工程と、テンプレート生体分子上の結合部位にNc配座異性体のアンサンブルをドッキングさせて、前記テンプレート生体分子に結合するNb配座異性体のアンサンブルを得る工程と、前記テンプレート生体分子に対する前記修飾タンパク質の結合親和性の指標であるNb/Nc比を計算する工程と、工程(i．)〜(v．)を繰り返して、異なる位置でシステインが置換された修飾タンパク質を得て、最も高いNb/Nc比を有する修飾ペプチドを同定する工程とを含む、タンパク質の修飾方法である。本発明の別の実施形態では、少なくとも2つの分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができる修飾ペプチドのNc配座異性体のアンサンブルの同定は、第1のジスルフィド結合ループを定義する第1の分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるタンパク質の第1の配座異性体を同定する工程と、前記第1のジスルフィド結合によってモデルを拘束する工程と、第2のより長いジスルフィド結合ループを定義する第2の分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるペプチドの第2の配座異性体を同定する工程とを含み得る。本発明の別の実施形態では、配座異性体を約5〜約10回試行後に同定しても第2の配座異性体が同定されない場合、モデルから第1のジスルフィド結合を排除する工程と、異なる第1のジスルフィド結合ループを定義する第1の分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるペプチドの第1の配座異性体を同定する工程と、前記第1のジスルフィド結合によってモデルを拘束する工程と、第2のより長いジスルフィド結合ループを定義する第2の分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるペプチドの第2の配座異性体を同定する工程とをさらに含み得る。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、タンパク質が可撓性ループを含み、開始残基Iから長さNのペプチド立体配座を作製し、ペプチドモデル上の標的残基I＋Nに適合させる工程と、残基Nと標的残基との間の逸脱が小さい場合に前記ループ立体配座を許容する工程と、幾何学的最小法を使用して前記ループを閉じる工程と、ペプチドの配座異性体の多重度に対してファンデルワールス計算を実行する方法によって残基の立体配座を選択し、分子内ジスルフィドを形成することができない配座異性体を差し引いて立体的に許容される配座異性体N0のアンサンブルを得る工程と、立体的に許容される配座異性体のアンサンブルを分析して分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができるNc配座異性体のアンサンブルを得る工程と、ペプチド中のジスルフィド結合ループの閉鎖率を示すNc/N０比を計算し、各残基についてのφ、Ψラマチャンドランマップの許容領域内に無作為に得た標準的な結合角、結合長、およびφ、Ψ、ω二面角由来のC-Xn-Cモチーフのペプチド骨格座標を作製してペプチドの配座異性体の多重度を得る工程と、表面ループのアンサンブルを作製する工程と、完全なミニタンパク質アンサンブルとループアンサンブルを含むペプチド標的とのドッキングを試験することによって結合親和性を評価する工程とを含む、テンプレート分子に対するタンパク質の結合親和性を評価する方法である。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、分析用のペプチド配列およびパラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、φ、Ψ、ωを無作為に作製する工程と、ペプチド骨格を作製する工程と、前記骨格のファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程と、ジスルフィドをモデリングする工程と、各回転異性体を付加した後にファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程とを含む、タンパク質の修飾に使用されるコンピュータ支援方法によって作製されたタンパク質である。
【００２５】
本発明の実施形態は、分析用のペプチド配列およびパラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する方法を使用して必要な活性部位の立体配座を有するようにタンパク質をモデリングする工程と、φ、Ψ、ωを無作為に作製する工程と、ペプチド骨格を作製する工程と、前記骨格のファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程と、ジスルフィドをモデリングする工程と、各回転異性体を付加した後にファンデルワールスチェックを実行する工程と、タンパク質中のアミノ酸の総数を減少させながら全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程とを含む、タンパク質最小化によって生成されたタンパク質である。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、分析用のペプチド配列およびパラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、φ、Ψ、ωを無作為に作製する工程と、ペプチド骨格を作製する工程と、前記骨格のファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程と、ジスルフィドをモデリングする工程と、各回転異性体を付加した後にファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程とを含む方法によるジスルフィド結合の導入によってタンパク質の一部の立体配座が制限される、結合部位にドッキング可能なタンパク質である。
【００２７】
本発明の実施形態は、分析用のペプチド配列およびパラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、φ、Ψ、ωを無作為に作製する工程と、ペプチド骨格を作製する工程と、前記骨格のファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程と、ジスルフィドをモデリングする工程と、各回転異性体を付加した後にファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程とを含む方法によって作製され、毒素の三次構造に基づき、ジスルフィド結合による少なくとも1つのループを含む、ウイルスの細胞への結合阻害を特徴とするタンパク質である。さらに別の実施形態では、タンパク質由来のループの分子内ジスルフィド結合形成配座異性体のアンサンブルを本方法によって作製することができる。
【００２８】
本発明のさらに別の実施形態は、分析用のペプチド配列およびパラメータをコンピュータ支援のモデリングプログラムに入力する工程と、φ、Ψ、ωを無作為に作製する工程と、ペプチド骨格を作製する工程と、前記骨格のファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程と、ジスルフィドをモデリングする工程と、各回転異性体を付加した後にファンデルワールスチェックを実行する工程と、全配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程とを含む方法を使用した天然に存在するタンパク質で見出されるジスルフィドおよびそれ以外のジスルフィド結合の形成によって立体配座空間中のタンパク質の不安定領域の少なくとも1つのループの制限により天然に存在するタンパク質と比較してテンプレート分子への結合の際の立体配座エントロピーの損失が減少したタンパク質である。さらに別の実施形態では、タンパク質のループの分子内ジスルフィド結合形成配座異性体のアンサンブルを本方法によって作製することができる。
【００２９】
本発明の実施形態は、分析用のペプチド配列およびパラメータを入力する工程と、ラマチャンドランプロットの許容領域中の配座異性体空間を検索する工程と、配座異性体のN末端およびC末端を高分解能構造と同一になるように最小化する工程と、前記配座異性体の左右像をチェックする工程と、高分解能構造に前記配座異性体を整列させる工程と、ファンデルワールス計算を実行する工程とを含む、タンパク質の修飾に使用するコンピュータ支援方法によって作製されたタンパク質である。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、標的分子に結合した酸化基準ペプチドを含み、前記基準タンパク質が少なくとも1つの分子内ジスルフィド結合を含むX線結晶構造または核磁気共鳴溶液構造を評価して、分子内ジスルフィド結合形成に有利な位置で少なくとも2つのアミノ酸を同定する工程と、前記基準タンパク質中の2つのアミノ酸をシステインに置換して、少なくとも4つのシステインを含む修飾タンパク質を得る工程と、少なくとも2つの分子内ジスルフィド結合を潜在的に形成することができる修飾タンパク質のNc配座異性体のアンサンブルを同定する工程と、テンプレート生体分子上の結合部位にNc配座異性体のアンサンブルをドッキングさせて、前記テンプレート生体分子に結合するNb配座異性体のアンサンブルを得る工程と、前記テンプレート生体分子に対する前記修飾ペプチドの結合親和性の指標であるNb/Nc比を計算する工程と、これらの工程を繰り返して、異なる位置でシステインが置換された修飾タンパク質を得て、最も高いNb/Nc比を有する修飾ペプチドを同定する工程とを含む方法によって修飾されたタンパク質である。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、記載の方法を実行することができるコンピュータシステムである。コンピュータシステムは、上記方法を実行するようにコード化されたソフトウェアプログラムを有する。好ましくは、ソフトウェアプログラムは、データベースまたは入力ファイルからタンパク質配列を読み取る。修飾タンパク質をデザインするためのこのようなコンピュータシステムの1つの実施形態には、タンパク質配列データセットを含むデータベースおよび前記データベースとの相互作用のために前記データベースを組み込んだソフトウェアプログラムが含まれる。ソフトウェアプログラムは、タンパク質配列データセットから無作為に立体配座の角を作製する工程と、前記立体配座角を使用してタンパク質骨格を作製する工程と、前記タンパク質骨格のファンデルワールス計算を実行する工程と、配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程と、前記タンパク質骨格中のジスルフィド結合をモデリングする工程と、前記ジスルフィド結合のファンデルワールス計算を実行する工程と、前記工程で作製した配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程と、上記工程で見出された構造の特徴を有する修飾タンパク質を作製する工程とを含む工程の実行に適合する。
【００３２】
修飾タンパク質デザイン用のコンピュータシステムの別の実施形態は、タンパク質配列データセットを含むデータベースおよび前記データベースを組み込んだソフトウェアを有する。ソフトウェアプログラムは、タンパク質配列データセットからラマチャンドランマップの許容領域中に無作為に立体配座の角を作製する工程と、前記立体配座角を使用してタンパク質骨格を作製する工程と、前記タンパク質骨格中のジスルフィド結合を決定する工程と、直鎖配座異性体を計算する工程と、前記工程で作製した配座異性体の溶媒接触可能表面積ベースのエネルギーを計算する工程と、上記工程で同定された構造の特徴を有する修飾タンパク質を作製する工程とを含む工程の実行に適合する。計算工程を前記ソフトウェアによって実行することができ、この工程は配座異性体計算用の外部プログラムにリンクすることができる。
【００３３】
本発明の別の態様は、本明細書中に記載の方法を実行することができるソフトウェアプログラムが格納されたコンピュータ読み取り可能な記憶媒体である。コンピュータ読み取り可能な記憶媒体は、コンピュータによって利用される任意の格納-読み取り可能な記憶媒体であり、例えば、フロッピーディスク、ハードドライブ、記憶装置、ディスクパック、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＰＣカード、光媒体、および磁気媒体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、この詳細な説明から本発明の精神および範囲内の種々の変更形態および修正形態が当業者に明らかであるので、これらは例示のみを目的とすると理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本出願は、テンプレート分子への結合の際の立体配座のエントロピー喪失によりペプチドの安定性を増加させることによってテンプレート分子の結合親和性を増加させるようにペプチドを修飾する方法を含む。
【００３６】
I．定義
本明細書中で使用される、「a」または「an」は、1つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲で使用されるように、用語「含有する」と共に使用される場合、用語「a」または「an」は、1つまたは1つを超えることを意味し得る。
【００３７】
本明細書中で使用される、「別の」は、少なくとも第2またはそれを超えることを意味し得る。
【００３８】
本明細書中で使用される、「三次構造に基づく」は、それに基づくために言及した元の構造の骨格構造に類似の骨格構造を保有する構造をいう。
【００３９】
本明細書中で使用される、「立体配座」は、共有結合を破壊することなく相互変換可能な原子の重ね合わせ不可能な三次元配列をいう。
【００４０】
本明細書中で使用される、「制限」は、ペプチドが選択することができる立体配座空間の制限をいう。
【００４１】
本明細書中で使用される、「ジスルフィド架橋またはジスルフィド結合」は、2つのシステインの硫黄原子間の共有結合をいう。
【００４２】
本明細書中で使用される、「作製」は、1つまたは複数の操作の使用によって定義または創作する行為をいう。本発明を使用する当業者は、事項もしくはデータ自体を作製するか、事項もしくはデータを別の場所に置いて本発明の実施の際に使用することができる。
【００４３】
本明細書中で使用される、「ループ」は、分子表面でポリペプチド鎖の方向が逆転するポリペプチド鎖中のターンをいう。
【００４４】
本明細書中で使用される、「回転異性体」は、低エネルギーアミノ酸側鎖立体配座をいう。
【００４５】
本明細書中で使用される、「ペプチド」は、物理的特性がそのアミノ酸残基の合計から予測される特性であり、固定した三次元構造が存在しない定義された配列を含むアミノ酸鎖をいう。
【００４６】
本明細書中で使用される、「タンパク質」は、通常定義された配列、長さ、および三次元構造のアミノ酸残基の鎖をいう。タンパク質を生成する重合反応により、各アミノ酸から1分子の水が喪失し、タンパク質は、アミノ酸残基から構成されるといわれる場合がある。天然タンパク質分子は、20種もの異なるアミノ酸残基を含むことができ、それぞれ個別の側鎖を含む。タンパク質は、多数のペプチドから構成され得る。
【００４７】
本明細書中で使用される、「構造の特徴」は、コンピュータ支援プログラムを使用して決定される特徴をいい、折りたたみの特徴、ジスルフィド結合、結合親和性、凝集、溶解性、免疫原性、安定性などであるが、これらに限定されない。したがって、当業者は、本発明を使用してタンパク質の任意の構造の特徴を決定し、この特徴を用途に依存して増減することができることを理解している。
【００４８】
本明細書中で使用される、「テンプレート分子」は、修飾タンパク質が結合しているタンパク質をいう。
【００４９】
II．MPMOD
立体化学的に許容可能な立体配座を作製するために単純な剛球モデルを使用して、ラマチャンドランプロットの許容される領域中の立体配座空間の無作為な検索と可撓性ジスルフィド結合モデリングとの組み合わせにより、環状ペプチドの挙動を研究するための簡単且つ有用なツールが得られる。Nc／Noによって定義したSS結合ループ閉鎖の「比率」または確率は、アンサンブルが1000個を超える配座異性体を有する場合に安定な値に収束する。ペプチドのCXCおよびCXXC系について、モデリングしたループ閉鎖の確率は、4つ全てのペプチド型の実験的に決定した平衡定数Kcと同様に挙動する。共通の倍率を適用後に両方を十分に比較する。幾何学またはファンデルワールス相互作用は、ループ閉鎖において小ペプチドCXCおよびCXXCに優勢な役割を果たす。当業者は、タンパク質デザインのMPMOD法はタンパク質医薬品に制限されないことを理解している。例えば、これは、診断試薬、研究試薬、農薬、または除草剤として有利であり得るタンパク質をデザインするためのMPMODの使用が含まれるが、これに限定されない。
【００５０】
プログラム(MPMOD)は、ジスルフィド結合配座異性体の有効な作製方法である。Pentium III 450MHzでLinuxシステムを使用して4000個のジスルフィド結合配座異性体CXXCを得るためにCPUは約10〜20分かかる。配座異性体CXCの衝突の確率がより高いので、CXXCを作製するよりもCPU時間は約3倍長い。しかし、消費したCPU時間は、配座異性体の作製のために使用した基準に強く依存した。
【００５１】
基本的なMPMODプログラムは以下のステップを含む。ペプチド配列およびジスルフィド結合の連結性などの入力パラメータをロードし、その後4つのマップに立体配座角(φ、Ψ、ω)を作製する。角度に基づいて主鎖および側鎖の原子を作製する。骨格原子および側鎖原子についてファンデルワールスチェックを個別に行う。ファンデルワールスの違背が認められた場合、配座異性体を拒否する。いかなる原子の接触もなくペプチドが終了するまで別の立体配座角のセットを得るために戻る。次いで、ペプチドの座標を記録し、溶媒接触可能表面(SAS)ベースのエネルギーを計算する。2つの残基対で可能なジスルフィド結合が存在するかどうかを調査するためにジスルフィド結合をモデリングする。ジスルフィド結合が可能な場合、この配座異性体のSASエネルギーを計算する。ジスルフィド結合が可能でない場合、別の立体配座角のセットを試験し、ジスルフィド結合を有する配座異性体が得られるまでこの手順を繰り返す。最後に、この配座異性体のSASエネルギーを再度計算する。
【００５２】
MPMODを使用して、ジスルフィド結合配座異性体および／または直鎖配座異性体を作製することができる。ジスルフィド結合配座異性体と組み合わせた直鎖配座異性体を作製するために、MPMODをCOREXアルゴリズムにリンクさせる（Hisler & Freire, 1996）。
【００５３】
III．原核生物のペプチドディスプレイ
天然に存在するタンパク質および人工タンパク質のライブラリーの分子分析は、種々の「ディスプレイ」法の開発によって非常に改良された。ディスプレイ技術の背景となる一般的スキームは、有利なペプチド発現およびいくつかの生体表面（ファージ、細胞など）上のペプチドの配置である。ディスプレイ生物の異なるバージョンの何百万もの異なる変異体の提示能力により、生体機能についての対応するライブラリーを迅速にスクリーニング可能である。
【００５４】
米国特許第5,821,047号では、1価のファージディスプレイが記載されている。この方法は、新規のタンパク質およびその変異型の選択を提供している。この方法は、目的のタンパク質をコードする遺伝子を繊維状ファージM13の第III遺伝子コートタンパク質のカルボキシ末端ドメインに融合する工程を含む。融合により、ファージミド候補の表面上で少量で発現する構造的に関連する融合タンパク質のライブラリーを形成するように変異する。
【００５５】
米国特許第5,571,698号は、M13ファージミド系を使用した進化を記載している。タンパク質は、M13遺伝子第IIIタンパク質との融合としての発現である。改良された生体機能（タンパク質の同族結合パートナーへの結合）が選択されるたびに、連続的な変異誘発が行われる。
【００５６】
ヘテロ二量体ファージライブラリーは、米国特許第5,759,817号に記載されている。抗体などの自己構築受容体の第1および第2のポリペプチドをコードするゲノムをカプセル化するcpVIIIタンパク質基質を含む繊維状ファージが得られる。受容体は、cpVIII膜アンカーを介してファージ外殻基質の表面に組み込まれて、生物学的評価のための受容体を提示する。
【００５７】
別の系（λファージ）もまた、ディスプレイ目的に使用することができる。米国特許第5,672,024号では、自己構築受容体の第1および第2のポリペプチドをコードするゲノムをカプセル化するタンパク質基質を含むλファージを調製している。表面組み込み受容体は、特徴付けのためにファージの表面上で利用可能である。
【００５８】
米国特許第5,824,520号に記載のように、免疫グロブリン重鎖ライブラリーをファージによってディスプレイする。一本鎖抗体ライブラリーを、高分岐した合成超可変領域の作製ならびにその後のファージディスプレイおよび選択によって作製する。得られた抗体を使用して、細胞内酵素活性を阻害した。抗体ディスプレイを記載している別の特許は、米国特許第5,922,545号である。
【００５９】
ファージディスプレイの別の例を、米国特許第5,780,279号に見出すことができる。この方法は、酵素の新規の基質の同定および選択を提供する。この方法は、基質ペプチドをコードするDNAに融合し、その後ファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードするDNAに融合したポリペプチドをコードするDNAを含む遺伝子融合物を構築する工程を含む。基質ペプチドをコードするDNAを、1つまたは複数のコドンで変異させ、それにより変異体のファミリーを作製する。融合タンパク質を、ファージミド粒子表面上で発現させ、基質ペプチドの化学的または酵素修飾に供する。次いで、修飾したファージミド粒子を、修飾されていないものと分離する。
【００６０】
細菌もまたタンパク質を首尾よくディスプレイしていた。米国特許第5,348,867号は、細菌表面上でのタンパク質発現を記載している。組成物および方法により、組換えグラム陰性細菌細胞宿主から安定な表面発現ポリペプチドが得られる。三成分からなるキメラ遺伝子およびその関連組換えベクターには、方向付けまたは標的化および細胞ペリプラズムから細胞外表面への所望の遺伝子産物の輸送のための個別のDNA配列が含まれる。広範なポリペプチドは、この系を使用して有効に発現した表面であり得る。米国特許第5,508,192号および同第5,866,344号もまた参照のこと、
米国特許第5,500,353号は、別の細菌ディスプレイ系を記載している。細菌Ｓ層タンパク質遺伝子が1つまたは複数の異種ペプチドまたはポリペプチドをコードする1つまたは複数のインフレーム融合物を含むように修飾されたＳ層を有する細菌（例えば、Caulobacter）を記載している。タンパク質は細菌表面上で発現され、これはフィルムとして有利に培養することができる。
【００６１】
IV．変異誘発
使用する場合、変異誘発を種々の標準的な変異誘発手順によって行う。変異は、生物の量または構造が変化するプロセスである。変異は1つの遺伝子、遺伝子ブロック、または染色体全体のヌクレオチド配列の修飾を含むことができる。1つの遺伝子の変化は、DNA配列内の1ヌクレオチド塩基の除去、付加、または置換を含む点変異の結果であるか、多数のヌクレオチドの挿入または欠失を含む変化の結果であり得る。
【００６２】
変異は、DNA複製の忠実度のエラーまたはゲノム内への輸送可能な遺伝要素（トランスポゾン）の移動などの結果として自発的に誘発することができる。変異はまた、化学的または物理的変異誘発原への曝露後に誘導される。このような変異誘導因子には、電離放電線、紫外線、ならびにアルキル化剤および多環式芳香族炭化水素（その全てが核酸と直接または間接的に相互作用することができる（一般にその後いくつかの代謝性生体内変換物質が得られる））などの種々の化学物質が含まれる。このような環境物質によって誘導されたDNA損傷は、影響を受けたDNAが複製されるか修復されることによって変異する場合に塩基配列が改変し得る。変異はまた、特定の標的方法の使用により部位特異的であり得る。
【００６３】
構造誘導部位特異的変異誘発は、タンパク質-リガンド相互作用の詳細な分析および操作のための強力なツールの代表である(Wells、1996)。この技術は、1つまたは複数のヌクレオチド配列変化の選択されたDNAへの移入によって配列変異型を調製および試験する。
【００６４】
部位特異的変異誘発は、所望の変異DNA配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列および十分な数の隣接する非修飾ヌクレオチドを使用する。この方法により、横断する欠失連結点の両側上に安定な二重鎖を形成させるための十分なサイズおよび複雑さのプライマー配列が得られる。配列の接合点の両側上の約5〜10残基が変化した約17〜25ヌクレオチド長のプライマーが好ましい。
【００６５】
この技術は、典型的には、一本鎖および二本鎖形態で存在するバクテリオファージベクターを使用する。部位特異的変異誘発に有用なベクターには、M13ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージベクターは市販されており、その使用は一般に当業者に周知である。二本鎖プラスミドはまた、部位特異的変異誘発で日常的に使用されており、ファージからプラスミドへの目的の遺伝子の導入工程が排除される。
【００６６】
一般に、最初に一本鎖ベクターを獲得するか、その配列内に所望のタンパク質または遺伝要素をコードするDNA配列を含む二本鎖ベクターの2つの鎖を融解する。次いで、合成した所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーを、ハイブリッド形成条件の選択の際のミスマッチ度を考慮して一本鎖DNA調製物にアニーリングする。ハイブリッド形成産物を、E.coliポリメラーゼI(Klenowフラグメント)などのDNAポリメラーゼ酵素に供して、変異を有する鎖の合成を完了する。したがって、ヘテロ二本鎖が形成され、第1の鎖は元の非変異配列をコードし、第2の鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二本鎖ベクターを使用して、E.coli細胞などの適切な宿主細胞を形質転換し、変異配列を保有する組換えベクターを含むクローンを選択する。
【００６７】
部位特異的変異誘発の他の方法は、米国特許第5,220,007号、同第5,284,760号、同第5,354,670号、同第5,366,878号、同第5,389,514号、同第5,635,377号、および同第5,789,166号に開示されている。
【００６８】
V．修飾ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性(例えば、疎水性、親水性、電荷、および／またはサイズなど)に基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状、および／または型の分析により、アルギニン、リジン、および／またはヒスチジンは全て正電荷の残基であり、アラニン、グリシン、および／またはセリンは全て類似のサイズであり、および／またはフェニルアラニン、トリプトファン、および／またはチロシンは全て一般に類似の形状であることが明らかとなる。したがって、これらの検討材料に基づいて、アルギニン、リジン、および／またはヒスチジン；アラニン、グリシン、および／またはセリン；および／またはフェニルアラニン、トリプトファン、および／またはチロシンは、本明細書中で生物学的に機能的な等価物と定義する。
【００６９】
より定量的に変化させるために、アミノ酸の親水性指数を考慮することができる。各アミノ酸は、その疎水性および／または電荷の特徴に基づいて親水性指数が割り当てられており、これを以下に示す:イソロイシン(＋4.5)；バリン(＋4.2)；ロイシン(＋3.8)；フェニルアラニン(＋2.8)；システイン／シスチン(＋2.5)；メチオニン(＋1.9)；アラニン(＋1.8)；グリシン(−0.4)；トレオニン(−0.7)；セリン(−0.8)；トリプトファン(−0.9)；チロシン(−1.3)；プロリン(−1.6)；ヒスチジン(−3.2)；グルタミン酸(−3.5)；グルタミン(−3.5)；アスパラギン酸(−3.5)；アスパラギン(−3.5)；リジン(−3.9)；および／またはアルギニン(−4.5)。
【００７０】
タンパク質への生物学的相互作用機能の付与における親水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で理解されている(Kyte ＆ Doolittle、1982(本明細書中で参考として援用される))。一定のアミノ酸を類似の親水性指数および／またはスコアを有する他のアミノ酸に置換し、および／または依然として類似の生物活性を保持することができることが公知である。親水性指数に基づいた変化において、親水性指数が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1以内での置換が特に好ましく、および／または±0.5以内がなおさらに特に好ましい。
【００７１】
親水性に基づいて類似のアミノ酸置換を有効に行うことができることも当該分野で理解されており、特にこれによって作製された生体機能が等価なタンパク質および／またはペプチドは本発明の一定の実施形態における免疫学的実施形態での使用が意図される。米国特許第4,554,101号(本明細書中で参考として援用される)は、隣接するアミノ酸の親水性に支配されているタンパク質の最も高い局所平均親水性は免疫原性および／または抗原性(すなわち、タンパク質の生物学的特性)に相関すると記述している。
【００７２】
米国特許第4,554,101号に詳述するように、アミノ酸残基に以下の親水性値が割り当てられている:アルギニン(＋3.0)；リジン(＋3.0)；アスパラギン酸(＋3.0±1)；グルタミン酸(＋3.0±1)；セリン(＋0.3)；アスパラギン(＋0.2)；グルタミン(＋0.2)；グリシン(0)；トレオニン(−0.4)；プロリン(−0.5±1)；アラニン(−0.5)；ヒスチジン(−0.5)；システイン(−1.0)；メチオニン(−1.3)；バリン(−1.5)；ロイシン(−1.8)；イソロイシン(−1.8)；チロシン(−2.3)；フェニルアラニン(−2.5)；トリプトファン(−3.4)。類似の親水性値に基づいた変化において、親水性値が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1以内での置換が特に好ましく、および／または±0.5以内がなおさらに特に好ましい。
【００７３】
VI．模倣物 
本発明は、構造的に類似の化合物をペプチドまたはポリペプチドの鍵となる部分を模倣するように構築することができることを意図する。このような化合物を、ペプチド模倣物と呼ぶことができる。
【００７４】
タンパク質の二次構造および三次構造のエレメントを模倣する一定の模倣物は、Johnsonら(1993)に記載されている。ペプチド模倣物の使用の背景となる基本的な論理的根拠は、分子の相互作用(抗体および／または抗限の相互作用など)を促進する方法などで主にアミノ酸側鎖を方向付けるためにタンパク質のペプチド骨格が存在することである。したがって、ペプチド模倣物を、天然の分子に類似の分子相互作用が得られるようにデザインする。
【００７５】
ペプチド模倣物概念のいくつかの首尾の良い適用は、抗原性が高いことが公知のタンパク質内のβターンの模倣物に注目している。本明細書中で考察されるように、ポリペプチド内の可能なβターン構造を、コンピュータベースのアルゴリズムによって予想することができる。一旦ターンの成分アミノ酸が決定されると、アミノ酸側鎖の不可欠なエレメントの類似の空間的方向が得られるように模倣物を構築することができる。
【００７６】
他のアプローチは、巨大タンパク質の結合部位を模倣する生物活性高次構造の産生のための魅力的な構造テンプレートとして小さな多ジスルフィド含有タンパク質の使用に注目している(Vitaら、1998)。一定の毒素で進化的に保存されているようである構造モチーフは、小さく(30〜40アミノ酸)、安定であり、変異モチーフに対する許容性が高い。このモチーフは、βシートおよび3つのジスルフィドによって内部コアで架橋したαヘリックスから構成される。
【００７７】
βIIターンは、環状L−ペンタペプチドおよびDアミノ酸を含むものを使用して首尾よく模倣されている。Weisshoffら(1999)。また、Johannessonら(1999)は、逆ターンを誘導する特性を有する二環式トリペプチドについて報告している。
【００７８】
特異的構造の作製方法は、当該分野で開示されている。例えば、αヘリックス模倣物は、米国特許第5,446,128号、同第5,710,245号、同第5,840,833号、および同第5,859,184号に開示されている。これらの構造はペプチドまたはタンパク質により高い熱安定性を付与し、タンパク質分解への耐性も増加する。6員環、7員環、11員環、12員環、13員環、および14員環の構造が開示されている。
【００７９】
高次構造が制限されたβターンおよびβバルジの作製方法は、例えば、米国特許第5,440,013号;同第5,618,914号、同第5,670,155号に記載されている。βターンにより、対応する高次構造の骨格を変化させることなく側鎖置換基を荷電可能であり、標準的な合成手順によってペプチドに組み込むための適切な末端を有する。他の模倣ターン型には、逆ターンおよびγターンが含まれる。逆ターン模倣物は、米国特許第5,475,085号および同第5,929,237号で開示されており、γターン模倣物は、米国特許第5,672,681号および同第5,674,976号に記載されている。
【００８０】
［実施例］
VII．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すことを含む。本発明の実施で十分に機能することが本発明者らによって発見された代表的技術に付随する実施例で技術が開示されているので、その実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができることを当業者は認識すべきである。しかし、当業者は、本発明の開示に照らして、開示された特定の実施形態で、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく依然として類似の結果が得られる多数の変更形態を得ることができることを認識する。より詳細には、化学的および生理学的に関連する一定の薬剤を類似の結果を達成しながら本明細書中に記載の薬剤に置換することができることが明白である。全てのこのような類似の構成要素および修飾が当業者に明白であり、添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。
【００８１】
［実施例１］
（ポリペプチドの構築）
方向コサインλ、μ、νを有する原点を通る軸を回転軸として角度θによる点座標に対する回転効果について回転行列[M]θλ,μ,ν（Jeffreys & Jeffreys, 1950）を使用して単位ペプチドを作製した。
【００８２】
【数２】
2005512161.tif 000004
これらの連続的な原子A、B、およびCの座標が与えられた場合、行列中の3つの成分λ、μ、νを決定した。第4の原子Xを、行列および二面角χ（A-B-C-X）、結合角α（B-C-X）、および結合長d(C-X)に基づいて作製することができる。図1は、第4の原子Xを構築するための図である。
【００８３】
図1で使用した座標について、3つの原子位置A、B、およびCのベクトルは、r1、r2、r3である。ベクトルp、q、およびvは、それぞれp=r2-r1、q=r3-r2、v=d*(q/|q|)（dはC-X結合長である）である。単位ベクトルn=(p×q)/|p×q|は、原子A、B、およびCによって形成される平面A-B-Cに対して正常である。X0は、方向qの一時的位置である。原子の位置は、最初に回転軸nおよび回転角π−α（αは原子B、C、およびXの結合角である）の位置Xに対して回転する。最終位置Xを、軸qおよび二面角χ（3つの二面角φ、Ψ、およびωの1つ）での回転によって得る。π−αおよびχの両回転は、関連ベクトルを見下ろして時計回りである。角度は時計回りである場合プラスであり、反時計回りである場合マイナスである。原子Xの最終的な位置は、式：
【００８４】
【数３】
2005512161.tif 000005
（式中、表記[M]θaは、方向λ、μ、νの単位ベクターとしてａとともに式(1)の行列[M]θλ,μ,νの代わりに使用されている）で示される。
【００８５】
単位ペプチドから始まって、ポリペプチドの全ての他の原子を、式(2)によって決定することができる。立体配座角（φ、Ψ、ω）を使用して骨格原子（N、Cα、N、O、HN、HCα）を作製し、標準的な結合角および結合長（Momanyら、1975）を表1に列挙する。残基i上の骨格原子を、中括弧中の以下のパラメータによって構築する：｛Ni-1, Cαi-1, Ci-1, φi-1, α（Cαi-1-Ci-1-Ni）,d(Ci-1-Ni)｝による原子Ni、｛Cαi-1, Ci-1, Ni, ωi-1, α（Ci-1-Ni-Cαi）,d(Ni-Cαi)｝による原子Cαi、｛Ci-1, Ni, Cαi,Ψi, α(Ni-Cαi-Ci), d(CαI-Ci)｝による原子Ci、｛Ci-1, Ni, Cαi, Ψi, α(Cαi-Ci-Oi), d(Ci-Oi)｝による原子Oi、および｛Cαi-1, Ci-1, Ni, α(Cαi-1-Vi-1-Ni), d(Ni-Hi)｝による原子HNi（式中、αは丸括弧中の3つの原子によって形成された結合角であり、dは2つの原子の結合長である）。NおよびC原子との四面体幾何学によりCβおよびHCαは空間的に処理される。両原子は、二面角（φ、Ψ、ω）に依存しない。Cβ原子の2つの可能な位置のうち、Lアミノ酸残基に対応する位置を、研究で使用した。したがって、残基iのCβi原子を、｛Ni, Cαi, Ci, 109.5°, d(Cαi-Cβi)｝によって構築し、HCαiを｛Ni, Cαi, Ci, -109.5°, d(Cαi-HCαi)｝によって構築した。図2は、2つの連続した単位ペプチドを示す。
【００８６】
ポリペプチドの側鎖原子を、骨格原子構築と同一の方法で構築した。結合長および結合角を、公開された値から得た（Momanyら、1975）。20個のアミノ酸について最高で4つの二面角型（χ1、χ2、χ3、χ4）が存在する。タンパク質および小ペプチドの結晶構造の調査により、χ角が非常に好ましいことが示されている（Janinら、1978、Benedettiら、1983）。PonderとRichards（1987）は、分解能1.8ÅおよびR因子が0.18未満で19個のタンパク質結晶構造から得た2273個の残基を使用してχ角集団を研究した。PonderとRichardsは、χ角集団がいくつかの好ましい値で非常に高く、標準偏差が以前に発表されている値よりも小さいことを見出した。これは、回転異性体ライブラリーが、側鎖の挙動をほぼ示し得ることを示す。PonderとRichards（1987）による回転異性体ライブラリーを、全二面角に使用した。回転異性体の付加での偏りをできるだけ小さくするために、各残基の骨格原子と衝突しない回転異性体を選択した。全残基から1組の回転異性体を無作為に選択した。しかし、この回転異性体組は、ファンデルワールスの衝突違背を有し得る。適切な回転異性体組を得る機会を増やすために、3回無作為試験を行った。3回の試験でファンデルワールスチェックを満たさなかった場合、骨格を拒絶し、手順を繰り返す。
【００８７】
［実施例２］
二面角（φ、Ψ、ω）の決定
「数的手段」（Pressら、1986）の部分的ルーチンran2.fを使用して、0.0〜1.0の範囲で均一に分布する乱数を作製した。これらの乱数は、連続的相関関係がなく、期間は事実上無限大である。立体配座角（φ、Ψ）を、ax+b（（xは乱数（0≦x≦1.0）であり、aおよびbは2つの角がラマチャンドランプロットの許容領域に制限されるように調整される2つの定数である）に割り当てる。
【００８８】
【表１】
2005512161.tif 000006
立体配座空間を効率的にサンプリングするために、タンパク質の骨格二面角（φ、Ψ）を、4つのカテゴリー（グリシンについて１、プロリンについて１、CB分岐アミノ酸（VAL、ILE、およびTHR）について１、および他の全アミノ酸について１）に分類する。側鎖に1つの水素原子を有するグリシンは、広範な立体配座に適合することができ、α炭素（Cα）上のR置換基が存在しないためにマップは対称的である。プロリンは、立体配座を非常に制限するNおよびCα原子に結合するピロリジン環のために唯一非常に狭い範囲の立体配座空間に適合する。アラニンは、Lアミノ酸の原型であり、その立体配座空間はプロリンおよびグリシンを除いた他のアミノ酸の立体配座空間をほぼ示し得る。しかし、CB原子上の2つの分岐により、アミノ酸（VAL、ILE、およびTHR）は、ALAよりも立体配座空間が制限される（Scheraga,1992; Chakabarti & Pal, 1998）。図3は、4つのマップ上の立体配座角の分布を示す。乱数の数が十分に多いので、点は許容領域に均一に分散する。
【００８９】
MacArthur & Thornton（1993）は、2.5Åまたはそれ以上の分解能で決定した非相同X線結晶構造由来のプロリン残基の立体配座角を分析した。彼らは、立体配座角の大部分は、α領域についてはφ,ω=-61°,-35°、β領域についてはφ,ω=-65°,150°の平均値に集まることを示した。剛球体ポテンシャルを使用した初期の計算（例えば、Ramachandranら、1963; NemethyとScheraga, 1965）（良好な一次概算）は、Ψ=0°周囲の領域は許容されないことを示した。現実的なポテンシャルを使用した場合、この領域は部分的に許容されるようになった。この考慮に基づいて、本発明者らは、マップを実線によって囲まれた好ましい領域と破線で囲まれたあまり好ましくない領域に分類した。好ましい領域よりも発生機会が60〜80％のあまり好ましくない領域を決定した。グリシンおよびプロリン以外の全アミノ酸について、φプラス領域に5％だけ乱数を割り当てた。この立体配座の割り当ては、以下の2つの局面の相違を有するSowdhaminiら、（1993）によって提案された割り当てに類似している：1)本発明者らはラマチャンドランプロット付近に立体配座空間をサンプリングし、プラスのφ領域に2つの小さな領域を付加したことと、2)各マップの角分布は「均一ではない」こと。これらの局面により、ペプチドのモデリングが有意に迅速になる。
【００９０】
ペプチドのトランス型およびシス型の二面角はω=180°および0℃である。非Proアミノ酸は、約1000:1の比でトランス型を好む。プロリンについては、トランス型は4:1しか好まれない。したがって、非Proアミノ酸を100％トランス型と設定し、プロリンは、5％（または任意選択）シス型および95％トランス型と設定した。二面角ωもまた180°または0°で約5°のばらつきを有することが許容される。
【００９１】
［実施例３］
（ファンデルワールス立体衝突）
巨視的にありそうにない立体配座を排除するための採点関数として剛球体原子モデルを想定した。Ramachandran（1963）はX線データを使用してタンパク質で生じる各種原子対の接触距離（表2の「通常」および「極端」距離を参照のこと）のリストを決定した。これらの距離は、2つの原子のファンデルワールス半径の総和よりも約0.3〜0.5Å小さい（Gavezzotti, 1983）。Gavezzotiは、構造は、「通常の限度」の距離よりも「極端な限度」の距離のほうが安定性が低いと結論付けた。しかし、水素結合または他の魅力的な効果が存在する場合、短い接触距離は、通常、極端な限度である。Iijimaら（1987）は、逆ラマチャンドランプロットを使用して原子のファンデルワールス半径を較正した。較正は、公開された標準的結合角および結合長から構築したジペプチド分子モデルの許容される立体配座空間とのタンパク質およびペプチドの高分解能X線データから得たラマチャンドランプロットの比較に基づいた。各原子対の較正された接触距離は、「極端な限度」よりも約0.1〜0.2Å短い（表2）。
【００９２】
3つの短い接触距離のうち、特記しない限り「極端な」および「較正した」距離をファンデルワールスチェックで使用した。「極端な」距離を、骨格原子対のチェックのみに使用した。「較正した」距離を、側鎖−側鎖または側鎖−骨格原子対のチェックに使用した。2つの接触距離を使用した理由は以下であった：(1)骨格で幾らか可撓性が得られ、側鎖でわずかにより可撓性が得られることと、(2)ポリペプチドの構築に使用した固定された幾何学的パラメータに起因する不正確さを補うことと、(3)配座異性体中に水素結合またはいくつかの魅力的な特徴を含むことと、(4)特に側鎖原子対がファンデルワールスチェックに関連する場合に計算時間を節約すること。各原子について、可能な全ての非結合原子対をチェックすることに留意すべきである。同一残基中の原子対はチェックしない。
【００９３】
【表２】
2005512161.tif 000007
［実施例４］
本発明は、構造中に存在する可能性のあるジスルフィド結合の柔軟な検索方法を含む。特定のシステインiについて、硫黄原子Siの座標を、ねじれ角χ1（N-Cα-Cβ-S）および原子Ni、Cαi、およびCβiの座標を使用して作製する。Si原子の位置は、回転角χ1でCαi-Cβi結合に関する回転によって形成された円上に存在しなければならない。統計により、好ましい二面角χ1は約-60、60、および180°であることが示される。本発明では、各角周囲のより広い領域（すなわち、χ1は-20〜-100、20〜100、および140〜220である）をスキャンした。Cαi-Cβi結合に関して回転する場合、4つそれぞれの値のSi座標を記録する。同一の手順を、特定の残基jに適用する。両方の円上に作製された全ての原子対SiおよびSjの距離をチェックする。図4は、作製した硫黄対の1つを示す。SiとSjとの間の距離が2.04±0.4Å内であり、結合角Cβi-Si-SjおよびCβj-Sj-Siが104±5°以内であり、二面角χS-S(Cβi-Si-Sj-Cβj)が|90|±40°以内である場合、これら2つのシステインはジスルフィド結合を形成することができるとみなした。作製されたS原子の位置が配座異性体の他の全原子と幾何学的に良好に存在することを確認するために、ファンデルワールスチェックも行った。特に第1のCysのCαi-Cβi結合が第2のCys残基のCαj-Cβjとほぼ直線で存在する場合、これにより多数の対の位置が拒否される。次いで、最良の対の位置を選択した。
【００９４】
ジスルフィド結合を予想する手段を試験するために、Sowdhaminiら（1989）によって首尾よくモデリングされなかった19個のジスルフィド結合を試験した。表3に、モデリングして結晶学的に認められたジスルフィド結合由来のデータを列挙する。全ジスルフィド結合を、首尾よく予測した（表3）。しかし、2つのジスルフィド結合は、ねじれ角χS-Sの基準を|90|±40°を超えるように調整することによってモデリングしなければならない。
【００９５】
【表３】
2005512161.tif 000008
［実施例５］
MPMODプログラム
本発明は、立体配座空間のモンテカルロ検索を実行するためのミニタンパク質モデリング（MPMOD）プログラムを含む。ラマチャンドランマップをサンプリングする発想は、プログラムRANMOD（Sowdhaminiら、1993）に基づいた。本発明者らは、側鎖を作製する部分的ルーチンと共にPonderとRichardの回転異性体ライブラリー（1989）を使用した。プログラムの一部を、標準的なFortran-77および溶媒接触可能表面積（SAS）エネルギーを計算するプログラムの一部で書き、熱力学的分析を、Cで書いた（Hilser & Freire, 1996）。図5は、ジスルフィド結合のモデリングに使用したプログラムの流れ図を示す。ステップ100では、配列、ジスルフィド結合連結性、および他のパラメータを入力する。開始データを手動で入力するか、当業者に周知で使用されているデータベースから検索してもよい。ステップ101で入力データから二面角(φ、Ψ、ω)を無作為に作製する。ステップ102で、作製した二面角を使用してポリペプチドを作製する。一旦ポリペプチドが作製されると、ステップ103でファンデルワールスチェックを実行する。ファンデルワールスチェックが許容可能な場合、ステップ104でポリペプチドのSASベースのエネルギーを計算する。ファンデルワールスチェックが許容可能でない場合、そのときは二面角を再度作製する。次に、ステップ105は、作製したポリペプチド中のジスルフィド結合の存在を検索する。ジスルフィド結合をモデリングした後、ファンデルワールスチェックを行って硫黄原子(S)が他の全原子と幾何学的に良好であることを確認する。ステップ106で、最良の位置対を選択し、SASベースのエネルギーを計算する。
【００９６】
MPMODプログラムは、ジスルフィド結合配座異性体を作製またはジスルフィド結合配座異性体および直鎖配座異性体を作製するようにデザインされている。このプログラムがジスルフィド結合配座異性体のみを作製するように作動する場合、「ファーストモード」と考えられ、図13Aおよび図13Bに示す。ステップ200では、配列、ジスルフィド結合の結合性および他のパラメータを入力する。開始データを手動で入力するか、当業者に周知で使用されているデータベースから検索してもよい。ステップ201で、入力データから二面角(φ、Ψ、ω)を無作為に作製し、角度を骨格の各残基に割り当てる。ステップ202で、作製した二面角を使用して所与の３原子から開始して骨格原子を作製する。ステップ203で距離対をチェックする。2つのCα原子間の距離および2つのCβ原子間の距離を決定することが重要である。距離が許容されない場合、そのときは二面角を再度作製する。システイン(C)の間の距離は、ループ封鎖の比において役割を果たす。距離が許容可能な場合、そのときはステップ204でファンデルワールスチェックを行う。ファンデルワールスチェックが許容可能な場合、次いでステップ205で残りの骨格を作製する。ファンデルワールスチェックが許容不可能な場合、そのときは二面角を再度作製する。骨格を作製している間ファンデルワールスチェックが許容可能なままである場合、次いでステップ206でジスルフィド結合のモデリングを行う。ファンデルワールスチェックが許容可能なままではない場合、そのときは二面角を再度作製する。次に、ステップ207で回転異性体または側鎖を骨格に付加する。システイン以外の各残基に回転異性体を付加する。ステップ208で、ステップ207からの1つを全ての非ファンデルワールス違背を照合して二面角を再度作製し、ステップ209で骨格および全回転異性体の組み合わせをファイルに書き込む。ステップ210で各回転異性体のファンデルワールスチェックが許容可能である場合、次いでステップ211で硫黄原子(S)が他の全ての原子と幾何学的に良好であることを確認するためにジスルフィド結合対をチェックする。全チェックが許容可能である場合、次いでステップ212で骨格の角度および他の情報をファイルに書き込む。次に、ステップ213で配座異性体がより高い結合親和性を有するかどうかを決定するために受容体を含む各配座異性体について結合試験を行う。最後に、ステップ214でSASベースのエネルギーを計算する。
【００９７】
記載のように、MPMODプログラムはまた、ジスルフィド結合配座異性体および直鎖配座異性体をも作製することができる。このプログラム型を「スローモード」とみなし、図14Aおよび図14Bに示す。ステップ300では、配列、ジスルフィド結合連結性、および他のパラメータを入力する。開始データを手動で入力するか、当業者に周知で使用されているデータベースから検索してもよい。ステップ301で、入力データから二面角(φ、Ψ、ω)を無作為に作製し、角度を骨格の各残基に割り当てる。ステップ302で、作製した二面角使用して所与の３原子から開始して骨格原子を作製する。次に、ステップ303で残りの骨格を作製する。ファンデルワールスチェックが許容可能な場合、ステップ304で骨格に回転異性体または側鎖を付加する。各残基に回転異性体を付加する。回転異性体の付加後、ステップ305で距離対をチェックし、ジスルフィド結合をモデリングし、完全な配座異性体を有するSS対についてファンデルワールスチェックを行う。ステップ305での任意のステップが許容不可能である場合、ステップ308でSS結合を形成することができない配座異性体数を記録し、プログラムをCOREXプログラムにリンクさせて各配座異性体のSASベースのエネルギーΔGを計算する。ステップ305の全ステップが許容可能である場合、次いでステップ306で配座異性体のSS結合数を記録し、各配座異性体のSASベースのエネルギーΔGを計算する。計算後、ステップ307で各配座異性体をファイルに書き込む。
【００９８】
なおさらに、MPMODプログラムは、図15に記載のようにループ作製を行うことができる。ステップ400では、タンパク質の可撓性ループの2つの残基数および精度を入力する。開始データを手動で入力するか、当業者に周知で使用されるデータベースから検索することができる。ステップ401で、入力データから二面角(φ、Ψ、ω)を無作為に作製し、角度を骨格の各残基に割り当てる。作製した二面角を使用して、骨格原子または主鎖原子を作製する。ステップ403で、距離対をチェックする。配座異性体のCα原子およびN末端およびC末端の２つの間の距離を決定することが重要である。ステップ404では、配座異性体のN末端とC末端との間の距離を、二面角の変更または改変によって最小化する。ステップ405は、配座異性体の左右像が標的タンパク質の切断部分と同一であることが必要である。ステップ406で、主鎖原子対のファンデルワールスチェックを行う。ファンデルワールスチェックが許容可能である場合、次いでステップ407で、標的タンパク質に対して配座異性体を整列させる。ステップ408で主鎖および標的タンパク質原子対のファンデルワールスチェックを行う。許容可能な場合、次いでステップ409で主鎖に回転異性体または側鎖を付加する。ステップ409で各回転異性体のファンデルワールスチェックが許容可能である場合、次いでステップ410で情報をファイルに書き込む。
【００９９】
ジスルフィド結合のためのMPMODのモデリングモジュールを図16に示す。ステップ500では、2つのシステインのN、Cα、およびCβの座標が得られる。次に、ステップ501では、Ca−CaおよびCb−Cbの距離チェックを行う。距離が許容されない場合、ステップ500で他の座標を得なければならない。距離が許容される場合、ステップ502でCα−Cβ結合に沿った回転によって形成される円上にSGを作製する。次に、ステップ503で結合長、結合角、および二面角を決定する。ステップ503での測定が許容可能である場合、ステップ504でジスルフィド結合を形成し、座標をファイルに書き込む。
【０１００】
MPMODプログラムの結合試験モジュールを、図17に示す。ステップ600では、作製した配座異性体およびその結晶構造のpdb座標、両アラインメント配列のセグメント、最良のアラインメントの基準、および「結合」試験のための3つのオプションが必要である。一旦全部の情報が収集されると、ステップ601で対応するペプチドの結晶構造に対して配座異性体を整列させる。次に、モデリングした各配座異性体と標的ペプチドとの間の二乗平均平方根偏差を決定し、2つの配座異性体の各残基の間の高次構造角の差の平均を決定する。値が許容可能である場合、次いでステップ603で各配座異性体とタンパク質とのファンデルワールスチェックを行う。ファンデルワールスチェックが許容可能である場合、次いでステップ604で各配座異性体のSASベースのエネルギーを計算し、ステップ605で統計処理を行う。
【０１０１】
［実施例６］
（環状ペプチドCXCおよびCXXCのループ閉鎖率）
一連のCXCおよびCXXC（式中、Xは、アミノ酸Ala、Val、Pro、およびGlyのうちの1つである）の立体配座アンサンブルを作製した。各アンサンブルは、ジスルフィド結合を形成することができる4000個の配座異性体からなる。各配座異性体の骨格に側鎖を付加した。骨格水素原子（HNおよびHCA）のみが、各配座異性体中で作製された。
【０１０２】
ジスルフィド結合ループ閉鎖「率」または確率を、Nc/N0(Ncはジスルフィド結合を潜在的に形成することができる配座異性体数であり、N0はジスルフィド結合を形成することができないが、ファンデルワールスチェックをパスした配座異性体数である)として定義することができる。この定義は平衡定数Kcと同様である。表4は、各ペプチド型のモデリングおよび実験データ由来のループ閉鎖率を列挙した。モデリング由来の相対値は、実験データと同一のパターンを示す。CPC率は、CXC系で最も高く、CPPCはCXXC系中で比率が最も低い。両方の値を直接比較するために、これらの値を同一のレベルになるように倍率をかけた。CXCおよびCXXCの一般的な係数を、K=Σ(Exp)/Σ(Mod)（式中、Σ(Exp)は全実験値の総和であり、Σ(Mod)はモデリング値の総和である）によって定義することができる。モデリング配座異性体の各値にスケール係数Kを掛ける。図6にモデリングと実験データの倍率をかけた値の比較を示す。値は、CXXC系で一致している。
【０１０３】
表4は、CXC系のループ閉鎖率はCXXC系のそれよりも非常に低いことを示す。これを、２つの因子（2システイン間の距離および骨格の可撓性）によって決定する。統計により、ジスルフィド結合を形成するためには、システインiおよびjの2つのCα原子間の距離Cαi-Cαjが4.0〜7.0Å、および2つのCβ原子間の距離Cβi-Cβjが3.3〜4.7Åでなければならないことが示される。本発明者らは、ファンデルワールスチェックをパスした全配座異性体を調査し、CXC系については、2つのCαの平均距離は約6.2〜6.5Åであり、2つのCβの平均距離は約7.1〜7.9Åであることを見出した。CPCの距離が最も短かった。無作為に作製した配座異性体の平均Cβ距離は、適切な距離に程遠かった。CXCのみが3つの残基を有するので、標準結合角および結合長が変化しない場合でも骨格の可動度はCβ距離をより短くさせるにはあまり十分ではない。Ncacb/NvdW比（Ncacbは適切なCαおよびCβ距離を有する配座異性体数であり、NvdWはファンデルワールスチェックをパスした全配座異性体数である）は、CAC、CVC、CPC、およびCGCでそれぞれ0.72％、0.63％、1.45％、および0.23％である。CXXC系について、２つのCαおよびCβの平均距離は、それぞれ8.4〜8.7Åおよび9.1〜9.6Åであり、CPPCが最も短い。これらの距離は、ジスルフィド結合形成の標準的な距離とさらにかけ離れているが、残基の骨格に対する可動度はさらにより高い。より高い比率の配座異性体は、適切なCαおよびCβ距離を有する。CAAC、CVVC、CPPC、およびCGGCのNcacb/NvdW比は、それぞれ2.19％、2.61％、0.53％、および1.26％である。
【０１０４】
ジスルフィド結合を形成させるために、適切なCαおよびCβ距離だけでなく、良好な立体上の位置を有する2つの硫黄も重要である。本発明者らは、CαおよびCβ距離を満たす配座異性体数およびジスルフィド結合を形成する配座異性体数をチェックした。CACの配座異性体は適切なCαおよびCβ距離を有するけれども、CACが結合長S-S、結合角Cβ-S-Sおよびねじれ角Cβ-S-S-Cβなどの適切な幾何学的パラメータセットを欠くので、ジスルフィド結合の形成率はCAACよりもさらに低い。CAC、CVC、CPC、およびCGCのNc/Ncacb比（Ncは、ジスルフィド結合を形成することができる配座異性体数である）は5.7％、4.6％、6.0％、および8.4％であり、CAAC、CVVC、CPPC、およびCGGCのNc/Ncacb比は、36.0％、35.1％、34.3％、および33.0％である。したがって、CXC系は、適切なCαおよびCβ距離を有する配座異性体の比率が低いだけでなく2つの硫黄がジスルフィド結合を形成するための良好な幾何学的位置を有する配座異性体の比率が低い。
【０１０５】
【表４】
2005512161.tif 000009
同一の残基数を有するペプチドのループ閉鎖率を比較すると、CXC系ではCPCの確率が最も高く、CVCの確率が最も低い。それに対して、CXXC系ではCPPCの確率が最も低く、CVVCの確率が最も高い。これは、ProおよびValの空間の性質に起因していた。2つの系についてのNc/Ncacb比はほぼ同一であるが、Ncacb/NvdW比のみが有意に異なる。ピロリジン環のためにプロリンが2つのシステインを互いに引き合うようにするので、CPCの2つのシステインがより良好なCβi-Cβj距離を有するようにする。これにより、他のCXC系よりもジスルフィド結合を形成する機会が増える。実際、XPX（Xは非プロリンアミノ酸である）の組み合わせは、容易にβターンを形成することができる。それに対して、Valは、3つの回転異性体（χ1=180°、-60°、および60°）を有する。CVCペプチドでは、χ1=180°の回転異性体は2つのシステインを互いに押し合うようにするが、χ1=-60°および60°の回転異性体は、2つのCB分岐鎖が骨格に対してほぼ垂直に位置するので、互いに離れるように2つのシステインを押し合う。CB分岐鎖は2つのシステインを離すように押し合う可能性がより高い。これがCVCのループ閉鎖率が最も低い理由である。CXXCの配座異性体については、骨格の可撓性がループ閉鎖に対して支配的な役割を果たす。CPPC骨格の可撓性は、CXXC系の他のペプチドよりはるかに低く、CPPCのループ閉鎖の機会もまた、CXXC系の他のメンバーよりも低い。
【０１０６】
本発明者らは、有意なNc/N0比を得るためにはいくつの配座異性体数が必要であるかを決定した。この比は、アンサンブル中の配座数が増加するにつれて安定な値に収束する。図7は、この比が各系の配座異性体数の増加と共に変化することを示す。アンサンブル中に十分な配座異性体が存在しない場合、値のばらつきは大きい。配座異性体数が増加するにつれて、Nc/N0比は安定な値に収束する。したがって、収束した比を、実験で測定した結果と比較することができる。図7は、配座異性体数が過剰に作製された可能性があることを示す。収束した比を得るためには、各アンサンブル中に1000個の配座異性体が十分な配座異性体である。1000個でのばらつきは、CXC系で0.003％以下であり、CXXC系で0.05％以下である。
【０１０７】
［実施例７］
（より長いCXnCポリペプチド）
ZhangとSnyder（1989）はまた、CAnC系（nは1〜5である）の平衡定数Kcを測定した。定数Kcは、CA2C、CA4C、CA3C、CA5C、CA1Cの順序で減少し、Anのnが偶数の方が高く、奇数は低いことが見出された（図8のライン3を参照のこと）。ファンデルワールス近似のみを使用した本発明者らのモデリングの結果は、ZhangとSnyder（1989）の実験結果と一致しない。2システイン間のアラニン数を増加した場合、Nc/N0によって定義した確率は、n>2からは単調に減少する（図8のライン4を参照のこと）。CA4Cのピークは、モデリングによって得られなかった。本発明者らの計算は幾何学的因子のみを考慮しているので、これは驚くべきことではないが、本実験では分子内相互作用はより複雑である。本発明者らは、骨格のみに制限されるN-H...O水素結合を調査した。H結合形成の基準は、N-H...O結合角については120°≦θ≦180°であり、NとOの原子間距離についてはd≦3.3Åである。ジスルフィド結合が閉じた配座異性体中の水素結合数をCA2C、CA4C、CA5C、CA3C、CA1Cの順序で減少する全配座異性体数で割った比は、定数Kcの比と類似している（H結合の比については。図8のライン1を参照のこと）。これは、偶数番号のCAnCは、構造を安定化するH結合を有することを好むことを示す。
【０１０８】
溶媒接触可能表面積（SAS）エネルギーΔGを計算した。ΔG計算で水素結合を考慮しないので、エネルギーを比較した。各H結合について、エネルギーは0.5単位増加する。エネルギーに重みを掛けた確率を、閉じたペプチドの分配関数を閉じていないペプチドすべての分配関数で割った比である、式：
【０１０９】
【数４】
2005512161.tif 000010
として定義する。この比は、実験結果に従う傾向がある（図8のライン2を参照のこと）。SS結合を形成することができるアンサンブル中のいくつかの配座異性体の確率が高く、これにより比が高くなる。CA4Cのピークは、CA3CおよびCA5Cよりもわずかに高い。
【０１１０】
［実施例８］
(ペプチド−ストレプトアビジン複合体のモデリングのためのペプチドの構築)
ペプチド骨格の二平面角(φ、Ψ)を、4つのラマチャンドランマップ(グリシンについて１、プロリンについて１、CB分岐アミノ酸(VAL、ILE、およびTHR)について１、および全ての他のアミノ酸について１)に無作為に作製した。ペプチドのトランスおよびシス形態の二平面角は、無作為偏差を少し含む(通常、±5°)ω＝180°および0°である。二面角(φ、Ψ、ω)ならびに標準的な結合の長さおよび結合角に基づいて、ペプチド骨格を作製した。PonderとRichardの回転異性体ライブラリー(1989)を使用して、骨格に側鎖を付加した。簡単な剛体球接近を使用して、ありそうにない配座異性体を排除した。各原子を、適切なファンデルワールス半径を有する剛体球とみなした。2原子間の最小距離(Iijimaら、1987)を、各原子対のファンデルワールスチェックで使用した。これらの距離は、Ramachandranら(1963)の「正常な」距離よりも約0.2〜0.4Å短い。骨格水素原子(HNおよびHCA)が作製された場合、H原子の他の原子との重複は正常よりもさらに長い(約0.5Å)。さもなければ、ファンデルワールス違背によって配座異性体が十分に作製されないであろう。
【０１１１】
［実施例９］
(ペプチド−ストレプトアビジン複合体のジスルフィド結合のモデリング)
1つのジスルフィド結合を、本発明の方法を使用してモデリングすることができる。配座異性体中の2つのジスルフィド結合をモデリングする場合、計算効率に注意すべきである。ポリペプチドの2つのジスルフィド結合が同時に形成される確率は、形成される各ジスルフィド結合の確率の産物である。現在、2つのジスルフィド結合を含む1つのペプチドの作製には長時間かかる。本発明者らは、2つのジスルフィド結合を含む配座異性体の有効なモデリング法を得た。2つのジスルフィドが結合したループを使用して、短い構造異性体を最初にモデリングする。短い鏡像異性体がジスルフィド結合を形成した場合、このループの高次構造を固定する。最初のループを固定した時に第1のループは適切な幾何学を含まない場合、第2のループを見出すのに長時間かかる。したがって、第1のループの高次構造を固定しながら第2のループを検索するために数回試行しなければならない。試行回数は通常約5回と10回との間である。第1のループのための1つの固定された高次構造および第2のループのための種々の高次構造を含むいくつかのポリペプチドを得ることができる。
【０１１２】
ポリペプチドがペプチド共有結合(すなわち、第1の残基の窒素(N)は最後の残基の炭素(C)と共有結合を形成する)によって環状化される場合、ジスルフィド結合のモデリング法は、もはや妥当ではない。このような環状ペプチドを形成するための基準は、N−C結合長については1.35±0.6Å、結合角(CA−N−CまたはCA−C−N)については120±35°である。このような環状ペプチドの作製は1つのジスルフィド結合ペプチドの作製よりも効率が悪く、これは、前者は原子NまたはCの1つの位置のみによって検索され、後者は硫黄の多数の位置から検索するからである。
【０１１３】
［実施例１０］
(ストレプトアビジン結合部位への配座異性体の整列)
配座異性体のアンサンブルを作製した後、「結合」試験を行った。第1の工程は、テンプレートに配座異性体を整列させることである。テンプレートは、同時結晶構造複合体中のペプチドである。第2の工程は、剛体球のポテンシャルモデルの使用によって配座異性体をスクリーニングすることである。ペプチド−ストレプトアビジン複合体のために、ペプチドのHPQ配列で支配的結合力が生じ、モデリングした配座異性体を、複合体結晶構造の対応するHPQ配列に整列させた。任意の高分解能X線結晶構造をテンプレートに使用することができる。2つの基準を使用して、アラインメントが成功するかどうかを決定する。1つの基準は、以下の各モデリングした配座異性体kと標的ペプチドtとの間の平方根平均二乗偏差(rmsd)である:
【０１１４】
【数５】
2005512161.tif 000011
(式中、nはアラインメントで分配された原子数である(HPQ配列についてn＝9))。
【０１１５】
別の基準は、以下の2つの配座異性体の各残基間の高次構造の角度の相違の平均である:
【０１１６】
【数６】
2005512161.tif 000012
(式中、mは比較した配列の残基数である(HPQ配列についてm＝3))。
【０１１７】
アラインメントが許容されるかどうかを決定するために、2つの共通の基準値(rmsd(k，t)およびΔA(k，t)についてそれぞれrmsdrefおよびΔAref)を得る。アンサンブル中のk番目の配座異性体のために、rmsd(k，t)≦rmsdrefおよびΔA(k，t)≦ΔArefを満足する場合、このアラインメントは、許容可能である。基準の任意の1つを満足しない場合、アラインメントは許容不可能であり、配座異性体は拒絶される。HPQ配列について、基準値は、rmsdref＝0．50Å(各残基のアラインメントのために3つの原子Cα、C、およびNを使用した)およびΔAref=50°である。
【０１１８】
アラインメントが許容可能である場合、第2の工程としてストレプトアビジンでファンデルワールスチェックを行って、最終のドッキングが成功するかどうかを決定する。配座異性体および標的タンパク質の原子対に任意の衝突が存在する場合、ドッキングは成功せず、配座異性体は拒絶される。ファンデルワールスチェックのための原子半径は、先に記載の半径と同一である。任意の原子対にファンデルワールス違背が存在しない場合、配座異性体はタンパク質に首尾よくドッキングしたとみなされる。「結合比」を、Nb／Nt比(NbはHPQ結合ポケットに首尾よくドッキングすることができる配座異性体数であり、Ntはアンサンブル中の配座異性体の総数である)と定義することができる。この比は、複合体の実験で測定した結合親和性と十分に相関した。
【０１１９】
［実施例１１］
(HPQ配列のクラスター分析)
本発明者らは、ペプチド−ストレプトアビジン複合体を調査した。表5は、ペプチドおよびストレプトアビジンを使用して実験的に測定した結合親和性を列挙している。これら全てのペプチドの配座異性体のアンサンブルを、上記の手順に従って作製した。図10は、CCHPQCGMVEECのペプチドアンサンブルの例を示す。ペプチドのHPQ配列は結合に極めて重要であるので、モデリングした配座異性体のどのフラクションがHPQ配列中のI型βターンに適合することができるのかを知る必要がある。分解能1.46Åで決定したCCHPQCGMVEECの結晶構造(図9)を、そのフラクションを計算するためのテンプレートとして使用した。すべてのモデリングした配座異性体を、基準値rmsdref＝0.5ÅおよびΔAref＝50°を使用して結晶構造CCHPQCGMVEECのHPQ配列に整列させる。各配座異性体について、計算したrmsd(k，t)およびΔA(k，t)の両方が所与の基準値未満である場合、配座異性体は「HPQ様」であるか、HPQ配列中の結晶構造に類似する。言い換えれば、モデリングしたHPQ配列を、I型βターンに適用することができる。基準を満たすことができる配座異性体の割合を、表5に列挙する。
【０１２０】
直鎖ペプチドのHPQ様配座異性体(約6％)は、ジスルフィド結合を含むペプチド(12％〜42％)の約1／2〜1／7である（表5）。その理由は、直鎖ペプチドは高次構造空間を抑制せず、種々の高次構造を許容可能であることである。それに対して、ジスルフィド結合を有するペプチドについて、配座異性は制限される。直鎖ペプチドについてのHPQ様比はあまり変化しない。環状ペプチドの比は、2システイン間のアミノ酸の型および数によって変化する。配座異性体AECHPQFNCIEGRKとAECHPQFPCIEGRKとの間の相違は、残基8のみである。しかし、両異性体の比は有意に異なり、前者が22.4％であり、後者が41.9％である。残基8のプロリンを有することにより、HPQモチーフのI型βターンを形成する機会が非常に増える。
【０１２１】
【表５】
2005512161.tif 000013
ペプチドCCHPQCGMVEECおよびCCHPQCGMAEECでは、最初の2つのシステインが互いに近すぎてジスルフィド結合を形成できない。形成することができるジスルフィド結合の組み合わせは、架橋形態C1−C6、C2−C12、およびネスト化形態C2−C6、C1−C12である。架橋形態は、ネスト化形態よりもHPQ様配座異性体の比率が高い。これは、ループが小さいことに起因していた。ZhangとSnyder、1989は、CXXXC形成のための平衡定数KcはCXXXXC形成のための平衡定数より小さいことを示した。架橋形態についてのCCHPQC中の第1のループは、HPQ配列中のI型βターンよりも高い比を採る。2つのループを含むペプチドのAlaをValに置換した場合、HPQ様配座異性体フラクションが増えた。CB分岐アミノ酸は、HPQ配列の高次構造をさらに制限し、HPQ様配座異性体の比が上昇した。
【０１２２】
［実施例１２］
(ペプチド−ストレプトアビジン複合体の「結合比」)
X線同時結晶構造は、全ペプチドが同一の部位でストレプトアビジンに結合することを示す。HPQ配列は、複合体の結合に極めて重要である。モデリングした配座異性体のHPQモチーフが対応する結晶構造のそれに類似する場合、モデリングした配座異性体は、ストレプトアビジンと結合するポテンシャルを有する。各HPQ様配座異性体を、同時結晶構造のHPQ配列に整列させる。配座異性体が標的タンパク質とファンデルワールス衝突を有しない場合、「結合物」と定義する。アンサンブル中の「結合物」フラクションが大きいほど、複合体の結合親和性は高くなる。表5の最後の列にアンサンブル中の「結合物」の比率を示す。「結合物」フラクションは、一連のペプチドに対する実験的に測定した結合親和性と相関する。直鎖ペプチドは、環状またはジスルフィド結合ペプチド(7％〜28.7％)と比較して非常に低い割合でストレプトアビジンを採る(0.85％〜1.1％)。直鎖ペプチドに対する測定した結合親和性もまた、他のペプチドよりも非常に低い。これは、エントロピー効果に起因する。直鎖ペプチドは高次構造空間を制限せず、標的タンパク質に結合した場合、エントロピーがさらに減少する。したがって、直鎖ペプチドの測定した結合親和性および計算した「結合物」フラクションは非常に低い。
【０１２３】
表5に列挙した最後の2つのペプチドを、ファージディスプレイライブラリから選択した。高次構造は、1つのジスルフィドを有するペプチドよりも制限される。2つのジスルフィド結合によって高次構造がより制限されるので、環状ペプチドよりもさらに高い親和性を期待することが妥当であり得る。実際、測定した結合親和性は、いくつかの環状ペプチドの結合親和性よりも低い。モデリングした「結合物」フラクションの一部もまた、測定した親和性と同様に振る舞う。これは、この系の結合部位の幾何学に起因し得る。ペプチドがより強固であり、HPQ様配座異性体フラクションがより多いにもかかわらず、ミニタンパク質が大きすぎて結合部位の環境に適切に適合しないので、ストレプトアビジンと衝突する機会はより高い。衝突由来のペナルティは、ペプチドの剛性由来の利点よりもさらに高い。各残基がストレプトアビジンに衝突する回数を計数し、ペプチド上の各原子はストレプトアビジンと1回だけ衝突すると仮定した。図11は、2つのジスルフィド結合ペプチドの各残基の衝突数を示す。残基7〜11(GMVEE)を含む第2のループは、他の残基よりもストレプトアビジンと衝突する回数が多い。
【０１２４】
［実施例１３］
（測定した結合親和性とモデル化した「結合比」との相関関係）
リガンドがタンパク質と結合するギブス自由エネルギーの差を、ΔGm=-RT*Ln(Ka)（Kaは測定した会合定数である）で記載することができる。Rは定数であり、Tは温度である。測定した自由エネルギーは、モデリング「自由エネルギー」と直線的な相関関係にあるとみなされる。ΔGf=m*ΔGc+b（ΔGc=-RT*Ln[fb/(1-fb)]）でfbはモデリング「結合」比である。傾きmおよび切片bを、差の総和Res=Σi=1N(ΔGf-ΔGm)2（Nは表5に列挙した全ペプチド数）の最小化によって決定することができる。図12は、「結合比」と認められた結合定数Kaとの相関関係を示す。直線は、総和Res=Σi=1N(ΔGf-ΔGm)2の最小化によって適合させている。
【０１２５】
［実施例１４］
（ウイルス侵入の毒素ベースの阻害剤を開発するためのMPMODの使用）
アルファウイルス、フラビウイルス、およびアレナウイルスの付着および／または複製を阻害する化合物を開発中である。これらの病原性RNAウイルスは、潜在的な生物兵器であり、一般的に医学で関心がもたれている。マウス脳膜受容体標品を使用して、結合しないLangatウイルス変異型を選択する。これらの変異型のEタンパク質遺伝子を配列決定して、結合を担うヌクレオチドを同定する変異領域を見出す。組換えタンパク質を発現させ、X線結晶学構造決定に供する。免疫反応性によって検出される結合を有するLangat Eタンパク質への結合についてのcDNAライブラリーのスクリーニングによってこの時点で細胞受容体も同定する。候補cDNAをスクリーニングして、読み取り枠をさらに同定する。Sf9細胞中に推定受容体を発現させる。Langatのトランスフェクト細胞に感染する能力によって細胞受容体の同一性を確認する。受容体相互作用部位を含むLangat Eタンパク質のドメインを過剰発現させて、ファージディスプレイスクリーニング用の材料を得る。ファージディスプレイテクノロジーを使用してドメインIIIおよび／またはEタンパク質に強固に結合し、細胞へのウイルスの付着およびその後の侵入を妨害する毒素ベースの化合物を同定する。細胞受容体構造の決定により、ファージディスプレイ用のさらなるテンプレートを構築可能である。同定された化合物を、Vero細胞における抗Langat活性について試験し、その後腹腔内およびエアロゾル投与によってマウスモデルで試験する。
【０１２６】
本発明者らは、スピペロン（ドーパミンD2サブタイプ受容体アンタゴニスト）がマウス脳MRP（膜受容体調製物）への結合について日本脳炎ウイルスと競合することを確証した。アパミン、テルチアピン、セラフォトキシン、およびコノトキシン、ならびにヒトホルモンエンドセリンを含む10〜45残基のジスルフィド豊富な高次構造制限毒素ファミリーに基づいて、毒素ベースの抗ウイルス化合物をデザイン中である。構造の拘束により結合時の高次構造エントロピー喪失が減少し、それにより結合親和性が増加し、血清中でのプロテアーゼに対するその感度の減少により化合物の生物学的利用能が拡大し、ヒトタンパク質に結合し得る立体配座の排除により１つの標的の相互作用の特異性が増加するので、制限されたペプチドループおよびより強固な毒素ベースの分子を使用中である。NMR溶液構造決定によって毒素アナログ配列の至適化を合理的に誘導して高次構造および力学の変化を同定することができる。ファージディスプレイテクノロジーを使用するので、一旦配列が抗ウイルス化合物と同程度の有効性で同定されると、類似のウイルスの関連Langat Eタンパク質および外殻タンパク質に対して変異体を迅速に至適化することができる。毒素の強固な足場をインヒビターによって適合しながら、同定された配列は、野生型の毒素と著しく異なり、いかなる内因性の毒性も排除されている。ジスルフィド架橋ループペプチドおよび構築された毒素ベースのライブラリーの使用により、各配列によってサンプリングされた立体配座空間が制限される。
【０１２７】
厳格な盲検組み合わせ方法と並行して合理的な構造ベースの付加的アプローチを行う。末端がジスルフィドで制限された無作為な八量体配列を含むファージディスプレイライブラリーを調製する。強固に結合したループペプチドを合成し、ウイルス侵入阻害について試験する。Eタンパク質との複合体中の阻害ループペプチドの結晶構造を決定する。MPMODを使用して、認められたループ高次構造が安定化するようにコンパクトに折りたたまれた構造をデザインする。このペプチドを合成し、ウイルス感染に対する結合および阻害効果について試験する。関連配列のファージディスプレイライブラリーの使用によって結合相互作用を至適化する。
【０１２８】
in vitro細胞培養アッセイにおいて抗ウイルス薬をスクリーニングする。サル腎臓Vero細胞培養物を、異なる濃度の試験薬で予備処理し、Langatウイルスの種々の希釈物に感染させる。培養物をLangatウイルスに感染させた後、細胞に同一濃度の試験薬を含む寒天を重層する。培養物をインキュベートし、その後染色して薬剤処理対偽処理培養物におけるウイルスプラーク形成を定量する。90％またはそれ以上のウイルスプラーク形成を減少させる任意の薬剤を、さらに研究する。
【０１２９】
in vivoモデル研究は、Langatウイルス攻撃の1日前、攻撃時、および攻撃後のそれぞれに4日試験薬で処理した4週齢の異系交配NIH Swissマウスを使用する。異なる薬物の濃度および投与経路（腹腔内および鼻腔内）を、腹腔内ウイルス攻撃で試験する。マウスの平均死亡日数を、偽処置マウスと比較し、試験薬の有効性を決定する。エアロゾル攻撃に対する保護能力によって任意のポテンシャル薬剤をさらに試験する。
【０１３０】
明細書中に記載の全ての特許および刊行物は、本発明に属する当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、各刊行物が具体的且つ個別に参考として援用されることを示す場合と同一の範囲で本明細書中で参考として援用される。
（引例）
米国特許第4,554,101号
米国特許第5,284,760号
米国特許第5,348,867号
米国特許第5,354,670号
米国特許第5,366,878号
米国特許第5,389,514号
米国特許第5,446,128号
米国特許第5,475,085号
米国特許第5,500,353号
米国特許第5,508,192号
米国特許第5,571,698号
米国特許第5,618,914号
米国特許第5,635,377号
米国特許第5,672,681号
米国特許第5,674,976号
米国特許第5,759,817号
米国特許第5,780,279号
米国特許第5,789,166号
米国特許第5,821,047号
米国特許第5,824,520号
米国特許第5,866,344号
米国特許第5,922,545号
米国特許第5,929,237号
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当業者は、本発明は目的を実行し、上記および本明細書中に記載の目的および利点を得るために十分に適用していることを容易に認識する。本明細書中に記載の方法、手順、および技術は、現在好ましい実施形態の代表であるが、例示を意図するものであり、本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者は変更形態および他の用途を得ることができ、これらは本発明の精神の範囲内であり、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【０１３１】
以下の図面は、本発明の一部を構成し、本発明の一定の態様をさらに証明する。本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて1つまたは複数のこれらの図面を参照することによってより理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】この図では、文字A、B、およびCは、3つの原子の出発位置である。文字p、q、およびvは、その長さが標準的な結合長であるベクトルである。X0（Xの一時的な位置）は、qの方向である。CとX0との間の距離は、C-X結合距離と同一である。
【図２】2つの連続した（残基i-1およびi）ペプチド単位は、ポリペプチド骨格から選択される。N-Cα結合についての回転をφとし、Cα-C結合についての回転をΨとし、C-N結合についての回転をωとする。
【図３】Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ、  φおよびΨ角の配置。破線で囲まれたあまり望ましくない領域は、実線で囲まれた好ましい領域よりも30％点の対が少ない。図は、それぞれ図3AがALA、図3BがVAL、図3CがGLY、図3DがPROである。
【図４】ジスルフィドモデリングのために配置された2つのシステイン（iおよびj）を示す図である。硫黄SGの位置は、Cα-Cβ結合に沿った回転によって得られる円上に制限される。
【図５】MPMOD流れ図である。ペプチド配列とジスルフィド結合の連結性などの入力パラメータ（ステップ101）をロードし、次いで立体配座角（φ、Ψ、ω）を4つのマップに作製する（ステップ102）。主鎖および側鎖の原子を、角に基づいて作製する。骨格原子および側鎖原子についてファンデルワールスチェックを個別に行う（ステップ103）。ファンデルワールスの違背が認められた場合、配座異性体を拒否する。いかなる原子の衝突もなくペプチドが終了するまで別の立体配座角のセットを得るために戻る。次いで、ペプチドの座標を記録し、溶媒接触可能表面積(SAS)ベースのエネルギーを計算する(ステップ104)。2つの残基対で可能なジスルフィド結合が存在するかどうかを調査するためにジスルフィド結合をモデリングする(ステップ105)。ジスルフィド結合が可能な場合、この配座異性体のSASエネルギーを計算する。ジスルフィド結合が可能でない場合、別の立体配座角のセットを試験し、ジスルフィド結合を有する配座異性体が得られるまでこの手順を繰り返す。最後に、この配座異性体のSASエネルギーを再度計算する(ステップ106)。
【図６】ＡおよびＢ、  実験から得た平衡定数Kdを使用したモデリングから得た確率の比較を示す図である（Zhang & Snyder, 1989）。確率は、実験値を掛けている。CXCおよびCXXCの倍率を、K=Σ（Exp）/Σ（Mod）（式中、Σ（Exp）は、全実験値の合計であり、Σ（Mod）は、全モデリング値の合計である）と定義した。モデリング配座異性体の各確率に倍率Kを掛けて倍率を掛けた値を得る。黒いバーは実験に由来し、白いバーは計算に由来する。図6Aは、CXCの値を示す。図6Bは、CXXCの値を示す。
【図７】アンサンブル中の配座異性体の増加数としてのNc/N0比の変動性を示す図である。ここでは、CXXC系のみを示す。CXC系もまた同様である。
【図８】実験から得た平衡定数Kcを使用したモデリングから得た確率の比較を示す図である（Zhang & Snyder, 1989）。系1は、SS結合で閉じた配座異性体中の水素結合数を全配座異性体数で割った比である。系2は、状態確率：
【０１３３】
【数７】
2005512161.tif 000014
によって重みが掛けられた比である。系3は、実験由来のKcに由来する。系4は、剛体球原子モデル由来のNc/N0比である。これらを1つの図に収めるために、全系に以下の係数を掛けた：系1（*1000）、系1（*10000）、系2（*100）、系3（*0.1）、系4（*1000）。
【図９】ペプチド−ストレプトアビジン複合体の相互作用を示す図である。ここでは、ペプチドは、架橋した2つのジスルフィド結合を有する。HPQモチーフが結合ポケットに存在し、複合体の相互作用に関与する3つの水素結合が存在する。
【図１０】アンサンブルCCHPQCGMVEECのジスルフィド結合無作為立体配座を示す図である。各立体配座は、2つの架橋ジスルフィド結合を有する。無作為に作製した配座異性体は、種々の立体配座を有する。
【図１１】標的ストレプトアビジンに衝突するペプチドCCHPQCGMVEECの各残基の変更数を示す図である。
【図１２】「結合比」と観察された結合定数Kaとの相関関係を示す図である。直線は、総和Res＝Σi=1N(ΔGf-ΔGm)2の最小化によって適合される。
【図１３】ＡおよびＢ、  MPMODプログラム(ファーストモード)の流れ図である。
【図１４】ＡおよびＢ、  MPMODプログラム(スローモード)の流れ図である。
【図１５】MPMODプログラム(ループ作製)の流れ図である。
【図１６】ジスルフィド結合のMPMODプログラムのモデリングの流れ図である。
【図１７】MPMODプログラムの結合試験の流れ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2005512161.tif 000027
【図１１】
2005512161.tif 000028
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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