(57)【要約】感染動物における伝播性海綿状脳症（TSE）株の分類方法であって、以下のステップ：ａ）分子量及び／又は糖形態比率に基づいて異常なプリオンタンパク質のサンプルを分離し、上記分離された形態を検出するステップ；ｂ）上記サンプル中のペプチド配列の存在を検出するステップであって、異常なプリオンタンパク質内の上記ペプチド配列がTSEの特別な株を他の株から識別することができる、上記ステップ；及びｃ）ステップａ）及びｂ）の上記結果を上記サンプル中に存在するTSE株の上記類型を決定するために使用するステップを含む、上記方法。上記方法は、特別にはヒツジにおいてBSEをスクレイピーから識別するために使用されることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染動物における伝播性海綿状脳症（TSE）株の分類方法であって、以下のステップ：
（ａ）分子量及び／又は糖形態比率に基づいて異常なプリオンタンパク質のサンプルを分離し、その分離されたサンプルの形態を検出するステップ；
（ｂ）上記サンプルを抗体又はその結合フラグメントと接触させ、ここで当該抗体又はその結合フラグメントは、サンプル中に見出されるTSE株からのプリオンタンパク質に、少なくとも１の他のTSE株のプリオンタンパク質に対するのとは異なり且つ識別可能な結合親和性をもって結合する抗体又はその結合フラグメントであり、そして結合した抗体又は結合フラグメントを検出するステップ；及び
（ｃ）上記サンプル中に存在するTSE株の類型を決定するために、ステップ（ａ）及び（ｂ）の結果を使用するステップ；
を含む前記方法。
【請求項２】
上記ステップ（ｂ）において、特別な配列の存在が、異なる株においていくつかの相違を含むプリオンタンパク質の抗原決定領域から成るペプチド配列に対して異なる親和性を有する抗体又はその結合フラグメントを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
BSE及びスクレイピーの間の相違を検出するための請求項２に記載の方法であって、上記抗体がヒツジ海綿状脳症のプリオンタンパク質の８９〜１０４位のアミノ酸に対応するペプチドに対して作製された抗体又はその抗原決定領域である、前記方法。
【請求項４】
分子量に基づいて分離され、プリオンタンパク質中に現れる配列に特異的な抗体又はその結合フラグメントを用いて検出される脳組織の抽出物について実施される、請求項1〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
上記分離が電気泳動ゲル上で行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
異常なプリオンタンパク質のジグリコシル化、モノグリコシル化又は非グリコシル化形態の分子量における相違が検出され、株を差別化する方法としてさらに使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記非グリコシル化タンパク質の上記分子量が株の識別手段として使用される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
異常なプリオンタンパク質のジグリコシル化、モノグリコシル化、又は非グリコシル化形態の比率が検出され、そして株の識別方法としてさらに使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
分子量の差別化及び糖形態のプロファイリングがステップ（ｂ）の前に行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒツジにおけるBSEを検出するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
以下のステップ：
TSEを有する疑いのある動物からのホモジェナイズされた組織サンプルを遠心分離するステップ；
上記遠心分離された生成物を、正常タンパク質を消化する酵素であって、異常なタンパク質はこれに対して抵抗性である、前記酵素に加えるステップ；
上記のようにして形成された混合物をゲル上で分離するステップ；
上記分離された混合物を以下の：（ｉ）プリオンペプチドに結合する抗体、及び（ｉｉ）いくつかのプリオンペプチドに強い親和性を有するが、他のペプチドにはより弱い親和性を有する抗体、でプローブするステップ；及び
得られたシグナルの特徴に基づいて上記TSE株を分類するステップ；
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ｉ）で使用される上記抗体がウシPrPタンパク質に１４４〜１５２位のアミノ酸において結合し、ステップ（ｉｉ）で使用される上記抗体がヒツジPrPタンパク質の８９〜１０４位のアミノ酸中のアミノ酸配列を識別する抗体である、ヒツジにおけるBSEを検出するための、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を使用して伝播性海綿状脳症（TSE)株を分類するためのキットであって、以下の：
（ａ）プリオンタンパク質に結合する抗体又はその結合フラグメント；及び
（ｂ）特別なTSE株に対して、第２のTSE株と比較して異なり且つ識別可能な親和性を有する、抗体又はその結合フラグメント
を含む、前記キット。
【請求項１４】
前記（ａ）の抗体が、ウシPrPタンパク質を１４４〜１５２位のアミノ酸において認識する抗体である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記（ｂ）の抗体が、ヒツジPrPタンパク質中のアミノ酸配列を８９〜１０４位のアミノ酸において認識する、請求項１３又は１４に記載のキット。
【請求項１６】
本明細書中に実質的に記載された通りに、感染動物における伝播性の海綿状脳症（TSE）株を分類する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染動物において見出される伝播性海綿状脳症又はプリオン疾患の株又は形態の分類方法、並びに上記方法において使用される診断キット及び試薬に関する。特別には、出願人は、上記方法が実験的にヒツジに伝播されたBSEとヒツジにおける自然のスクレイピーとを識別する技術を提供することを見出した。
【０００２】
伝播性海綿状脳症（TSEｓ）は、神経柔組織の空胞化、及び疾患に特異的なプリオンタンパク質（PrP）と呼ばれる、宿主によりコードされた細胞表面シアロ糖タンパクのアイソフォームに特徴を有する進行性の神経学的障害の一群を含む。スクレイピー、ウシ海綿状脳症（BSE）及びクロイツフェルト−ヤコブ病の変種がこの群の疾患に属する。上記疾患は多様な形態又は株で現れる。
【０００３】
すでに、げっ歯類への一連の感染源の伝播に続いて、数多くの単離された（通常、株と呼ばれる）TSEが同定された。BSEはわずかに０．５gの脳物質による経口チャレンジによってヒツジに伝播された（Foster et al., Vet Rec (1993) 133:339-341）。あるヒツジが自然にBSE物質に感染したかも知れないという可能性は、ヒト及び動物の健康に関係する。
【０００４】
一般に、TSE株の唯一の信頼できる分類方法は、マウスにおける連続的な伝播に続いて単離されたTSEの生物学的性質に基づく（Bruce et al., 1994, Transmision of bovine spongiform encephalopathy and scrapie to mice: strain variation and the species barrier. Philosophical Transactions-Royal Society of London. Series B. 343, 405-411）。しかしながら、そのような方法は極端に時間がかかり、すべてのスクレイピー株が容易にマウスに伝播されるわけではない。いくつかの研究が、スクレイピーに罹ったマウスの脳内に沈着したPrPのパターンが株に特異的であることを示した（Bruce M E et al. 1989., Neuroscience Letters 102, 1-6; Bruce 1996, Prion Diseases Baker, H. F. and Ridleym R. M.編 pp. Totowa/NJ 07512: Humana Press Inc 中のBruce 1996, Strain typing studies of scrapie and BSE ）。
【０００５】
株の同定へのより迅速な解答を提供することを目的として、いくつかの他の方法が研究された。これらの全ては疾患に特異的なプロテアーゼ耐性のPrP (PrPres) フラグメントの性質、例えば、分子量（Parchi et al., 1996, Annals of Neurology 39, 767-778）、PrPresフラグメントの糖形態の比率（Collinge et al., 1996, Nature 383, 685-690; Kuczius et al., 1998, Journal of Infectious diseases 178, 693-669; Somerville et al., 1997a, Nature 386、564-564）又はPrPresの相対的なプロテアーゼ耐性(Kuczius and Groschup, 1999. Molecular Medicine 5, 406-４18)に基づく。
【０００６】
PrPscを検出する１の方法は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Laemmli U.K. (1970, Nature 277: 680-685)）とそれに続くウエスタン・イムノブロッティング（Towbin H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354）の適用による。
【０００７】
しかしながら、異なる株又は単離物が比較された場合に、PrPresのこれらの性質は重複し、したがってそれらはいまだ絶対的な株の分類に使用されることができない。PrPresのコンフォメーションアッセイが記載され、株の分類手段を提供することができるが、この技術の有用性は、いまだ確立されていない（Safar et al., 1998, Nature Medicine 4, 1157-1165）。
【０００８】
出願人は、特異的なPrPエピトープの検出が、特にヒツジにおいて見られるTSEの類型の場合に常に信頼できる区別を提供するとはいえない、分子量及び／又は糖形態比率に基づく現存の分類方法への有用な追加の方法を提供することができる。
【０００９】
本発明によれば、感染動物における伝播性の海綿状脳症（TSE）株の分類方法が提供され、該方法は、以下のステップ：
（ａ）分子量及び／又は糖形態比率に基づいて、異常なプリオンタンパク質のサンプルを分離し、その分離されたサンプルの形態を検出するステップ；
（ｂ）サンプルを抗体又は結合フラグメントと接触させ、ここで当該抗体又はその結合フラグメントは、サンプル中に見出されるTSE株からのプリオンタンパク質に、少なくとも１の他のTSE株のプリオンタンパク質に対するのとは異なり且つ識別可能な結合親和性をもって結合する抗体又はその結合フラグメントであり、そして結合した抗体又は結合したフラグメントを検出するステップ；及び
（ｃ）上記サンプル中に存在するTSE株の類型を決定するために、ステップ（ａ）及び（ｂ）の結果を使用するステップ；
を含む。
【００１０】
この組み合わせの技術又は”ハイブリッド”技術を用いて、出願人は、例えば複数のTSE株のプリオンタンパク質が類似の分子量及び／又は糖形態比率を有する場合にさえ、TSEの分類が促進されることができることを発見した。
【００１１】
抗体又はそのフラグメントは、特定の株のプリオンタンパク質の抗原決定領域を構築するペプチド配列に好適に結合するだろう。他のプリオンタンパク質中の類似の抗原決定領域はわずかに異なる配列を有することができ、これは抗体の結合、又は異常なプリオンタンパク質が生物学的材料から分離されるところのサンプル調製によりタンパク質が影響を受ける過程に対して効果を及ぼす。
【００１２】
本明細書中で使用されるように、”ペプチド配列”は配列であって、分泌ペプチド、又はタンパクの一部分または切断されたタンパクの形態で単離されるものを指す。
【００１３】
ステップ（ｂ）は、例えば染料で結合抗体が可視化されるウエスタン・ブロッティングのような技術を用いてゲル上で物質が分離されることにより好適に実施される。使用される抗体又はそれらの結合フラグメントは、ゲル上で分離されたサンプルと接触させられ、その後、結合親和性に依存した異なる強度を有するシグナルを発生させるために可視化される。例えば、抗体又は結合フラグメントは、スクレイピーのような１の種のプリオンタンパク質中の特別な配列に対して、例えばプロテイナーゼ酵素で処理されたホモジェネートのようなサンプル中に存在する形態で見出される、ＢＳＥのような他の種のプリオンタンパク質中の類似の又は対応する配列に対するのと比較して異なるそして識別可能な親和性を有する。
【００１４】
結合し、可視化された抗体によって提供されたシグナルの強度の検出のために、必要であれば当分野において知られた光学機器が使用されることができるにもかかわらず、特異的親和性は結果の肉眼による比較によって好適に判定されることができる。特別には、本発明の方法のステップ（ａ）が、以下の：分子量に基づいて処理された脳組織を、例えばゲル上で、分離するステップ、そしてその後、プリオンタンパク質に結合する、例えば抗体又はそれらの結合フラグメントを用いて、またウエスタン・ブロッティング技術によって、タンパクを検出するステップ、を含むことが望ましい。この方法によって、類似のブロットがステップ（ａ）及び（ｂ）の両方に使用されることができ、ステップ（ｂ）の特異的結合が明らかになる。
【００１５】
分子量による測定及びPrPSc（の糖形態比率）を形成する３のタンパク質バンドのそれぞれのシグナル強度による測定が、コンピューター分析ソフトウエアを用いて行われる。前者については、該ソフトウエアは標準分子量マーカーを測定し、そして試験されている特別なサンプルについての分子量の計算が行われるように設定されている。糖形態比率については、３のバンド全体のシグナルの密度が１００％とみなされ、ジグリコシル化されたタンパク質のバンド（一番上のバンド）のシグナル百分率をモノグリコシル化されたタンパク質のバンド（真中のバンド）のシグナル百分率に対してプロットすることによって、何らかの差別化をすることができる。そして、グラフ上にプロットされた点の相対位置がPrPScの起源を示唆することができる。
【００１６】
糖形態比率及び分子量における相違を検出するために、ステップ（ａ）単独に類似した方法が先に試みられた。例えば、PrPscの成分形態が、タンパク質のジグリコシル化形態、モノグリコシル化形態、及び非グリコシル化形態の相対量及び分子量によって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離され得ることは知られている。これらはその後に、PrPに対して作製された抗血清を用いたウエスタン・イムノブロッティングによって検出される。糖形態比率及び分子量が、TSEの特別な株の特徴として示された。
【００１７】
例えば、これらの因子の類似性はヒトvCJD感染の感染源がウシである可能性を支持するものであり、なぜならそれは、CJDの散発性及び医原性の形態に由来する因子がvCJDおよびBSEのそれらと全く異なるためである（Collinge J et al. Nature (1996) 383:685-690; Hill A.F. et al., Nature (1997) 389, 448-450）。
【００１８】
分子的分析による、自然のヒツジスクレイピーを実験的にBSE株に感染させられたヒツジから識別するための試みもまた、先に報告されているが、矛盾する結果が得られた。１の文献（Hill AF, et al., (1998) Neuroscience Letters 255: 159-162）中では、自然のスクレイピーの場合に比較して、より低い非グリコシル化バンドがBSE感染ヒツジにおいて報告されたが、他の２の文献（Hope J, et al., (1999) Gen. Vir. 80:1-4, Hope J, et al., (2000) Corrigendum 81:1-4）中では、ヒツジにおけるBSEサンプルと比較した場合に、８の自然のスクレイピーのうちの７において、より低い非グリコシル化バンドが見出された。さらに、実験的なスクレイピー株であるCH1641に類似する分子的特徴をヒツジにおけるBSEが示すことを、後者の報告中で著者たちは記録した。この株はヒツジにおいて伝播し、最初はブリティッシュ・チェビオット（British Cheviot）ヒツジから1971年に単離された（Foster JD, et al., (1998) Vet. Rec. 123: 5-8）。
【００１９】
出願人らは、この方法を用いて、ヒツジにおける実験的BSEについての非グリコシル化タンパク質バンドの分子量及び糖形態比率が、自然のスクレイピー及びBSEのサンプルから識別可能であることを見出した（以後の実施例１を参照のこと）。しかしながら、この方法は、すべての株が並行して試験されることを必要とする。結果の複雑性及び重複性を考慮すると、信頼できる診断キットとしてこの方法のみを使用することは難しい。
【００２０】
しかしながら、上記の場合、スクレイピーPrPSc中に存在する配列に強い親和性を有し、ウシPrPScに対して大きく親和性の低下した抗体を使用して、より明確な株間の識別が可能であった。これを達成した特別な抗体は、プリオンタンパク質の８４−１０５アミノ酸に相当するペプチド又はその抗原決定領域（例えば、ヒツジの８９−１０４アミノ酸に相当するペプチド）に対して作製された抗体であった。
【００２１】
このことは、上記の２の株に対して異なる親和性を示す抗体またはその結合フラグメントの両方によって、そして好ましくは、全ての株に強力な親和性をもって結合する抗体及びその結合フラグメントで別々の形態をプローブし、結果を比較することによって最もよく説明された。
【００２２】
したがって、特別な実施態様において本発明の方法は、以下のステップ：TSEを有する疑いのある動物からのホモジェナイズされた組織サンプルを遠心分離するステップ；産物を、正常のタンパク質を消化するが異常なプリオンタンパク質はこれに対して耐性を有する（プロテイナーゼKのような）酵素に加えるステップ；このようにして形成された混合物をゲル上で分離するステップ、分離された混合物を（ｉ）プリオンペプチドに対して特異的な抗体またはその結合フラグメント、及び（ｉｉ）あるTSE株に由来するプリオンペプチドに対して強い親和性を有し、他のTSE株に由来するプリオンペプチドに対してはより弱い親和性を有する抗体又はその結合フラグメントでプローブするステップ、並びに発生したシグナルの特徴に基づいてTSE株を分類するステップを含む。
【００２３】
例えば、この方法は、実験的に感染させられたヒツジにおいてＢＳＥを検出するために使用されることができ、該方法中で、ステップ（ｉ）中で使用される抗体はウシPrPタンパク質とアミノ酸の１４４〜１５２位において結合し、ステップ（ｉｉ）中で使用される抗体はウシPrPタンパク質中の８９〜１０４位のアミノ酸のアミノ酸配列を認識する抗体である。
【００２４】
特別にこの場合において、（ｉ）の抗体が結合しなければ、分子量は測定できない。もし、それが（mAb 6H4のような）（ｉ）の抗体による強いシグナルに比べて（mAb P4のような）（ｉｉ）の抗体に弱く結合する場合、分子量の相違及びこのサンプルの糖形態比率もヒツジにおけるBSEが疑われる場合の可能性を診断するのに考慮されるだろう。したがって、最終的な判定をするのに使用される３の基準すべてについての全体的な結果と共に、異なる抗体親和性の視覚的な比較が可能である。
【００２５】
反芻動物の脳組織のパネルがウエスタン・イムノ・ブロッティング及びプリオンタンパク質を認識するモノクローナル抗体を使用してプローブされたゲルにかけられた。実験的にBSEに感染させられたARQ/ARQ遺伝子型を有するロムニー（Romney）ヒツジとAHQ/AHQ遺伝子型を有するチェビオット（Cheviot）ヒツジは、ヒツジのスクレイピーというよりもウシBSEにより近い分子量を示すことが発見された。主な違いは、一貫してヒツジスクレイピーよりもヒツジにおけるBSEサンプルにおいて低い、非グリコシル化タンパク質のバンドと関連している。これは、フランスにおけるヒツジの実験的BSEについての発見（Baron TGM, et al., (2000) Neuroscience letters 284: 175-1）に類似した発見である。結果は、CH1641が他のすべてのサンプルにおいて得られた数値に比べて、３のバンドすべてについての低い分子量を示すことも明らかにしている。CH1641株についてのこれらの数値は、自然のヒツジスクレイピー及びSSRB1株よりも、ヒツジにおけるBSEについて得られたものにより近く、ウシBSEについて得られた数値にもそれほどではないが、近かった。SSPB1についての分子量は、自然のスクレイピーについて得られたものとは区別できなかった。これらもまた、他の研究者によって出版されたもの（Hope J, et al., (1999) Gen. Vir. 80: 1-4, Baron TGM, et al., (2000) Neuroscience Letters 284: 175-178）と同様の発見である。２のウシBSEサンプルについての分子量は、実験的にBSEを接種されたチェビオット及びロムニー系ヒツジについて得られたものよりも自然のヒツジスクレイピー及びSSPR1の分子量により近いことが明らかとなった。
【００２６】
他の文献（Collinge J, et al., (1996) Nature 383: 685-690, Hill AF, et al., (1997) Nature 389, 448-450）中では、各糖形態についての異なるタンパク質量の比率もまた、株の類型又は種の相違を決定するために使用された。このハイブリッド技術を使用して自然のヒツジスクレイピーサンプルを自然のウシBSEサンプルから区別するために、糖形態比率が用いられた。しかしながら、ヒツジにおける実験的BSEサンプルについての糖形態比率は自然のスクレイピー及びBSEサンプルと明らかに離れて位置付けられるものではなかった（図３）。CH1641がチェビオットARQ/ARQの自然スクレイピーの場合に得られたのとよく似た糖形態プロフィールを提供するにもかかわらず、他のすべてとは、最も一貫して異なるプロフィールを提供した。これらの結果は、分子量の相違が差別化に使用される場合に得られる結果と明らかに矛盾する。実測に基づけば、２のウシBSEケースは、分子量の相違（図１）によってスクレイピーと識別されるが、糖形態比率の撒布図（図３）上のそれらの位置は平均からの標準偏差における重複によって特徴付けられる。
【００２７】
本発明によれば、この特別な方法論を用いて、例えば、スクレイピーPrPScに強い親和性を有しウシPrPScに対して大きく親和性の低いことが明らかなmAb P4を使用することによってさらなる差別化が可能である。
【００２８】
Prionicsテストキット中に提供される正常のウシ対照並びに陽性のサンプルBSE1及びBSE2からのシグナルは、この技術を用いてmAb P4抗血清によっては検出されなかった。これは、mAb P4のエピトープがヒツジPrPタンパク質のアミノ末端に近く、且つ、プロテイナーゼK開裂部位のごく近傍に位置されるということで説明がつくだろう。異なる技術を用いると、開裂部位は全く同じ場所でないかも知れず、且つBSE認識のためのエピトープの重要な部分がハイブリッド手順の間に部分的又は全体的に破壊され、したがって、この抗体のBSE PrPScへの結合能力を減少させるということがありそうである。ヒツジのBSEがウシのBSEと同じPrPSc立体配置を有する場合、ヒツジにおける実験的BSEサンプルに残った残留シグナルがエピトープに対してわずかに異なる効果を示すにもかかわらず、エピトープも同じように影響を受けるであろうことは理解できる。また、上記技術が実施される間のタンパク質の折りたたみが立体配置に相違をもたらし、これがBSE PrPScに対するエピトープを遮断し、ヒツジにおけるBSEのサンプルに対するエピトープを部分的に遮断するが、スクレイピーPrPScに対するエピトープには効果を有さない可能性もある。
【００２９】
mAb P4のエピトープのためのアミノ酸配列はGGGGWGQGGSHSQWNKヒツジ８９〜１０４位であるとして報告された（Harmeyer S, et al., (1998) Gen, Virol. 79: 937-945）。ウシでの同等物はGGGGWGQGGTHGQWNKであり、ヒツジPrPの９８及び１００位の２の残基のみが異なる。イムノブロッティングに使用される強力な変性条件下では、mAbは主に線状の非立体特異的なエピトープに結合すると考えられる（Harmeyer S, et al., (1998) Gen. Virol. 79: 937-945）。したがって、ハイブリッド技術を用いて示された、ヒツジサンプルにおけるウシPrPScに対する親和性の完全な欠如及びヒツジにおけるBSEに対する低下した親和性は、BSE PrPSc及びスクレイピーPrPScに対するこのエピトープの構造の相違を示唆すると考えられる。ウシ及びヒツジ起源のPrPの認識における相違は、上記２のアミノ酸置換の効果によって単純に説明されることができる。しかしながら、BSE誘発試験を行ったヒツジから抽出されたPrPScは、その１次構造がヒツジのものであり、種特異性はもはや当てはまらない。しかしながら、異なる株の作用物質による異常なPrP中の主要なプロテイナーゼK開裂部位は、ここで適用されるタンパク質分解条件下において変化する可能性がある。したがって、スクレイピー由来のPrPScについては、エピトープ及び耐性コアの一部分はそのまま残るが、BSE由来のPrPScについては、主要な開裂点はmAb P4エピトープ内又はこれに接続するC末端内にある。
【００３０】
mAb P4と組み合わせた（遠心分離ステップなしの）プリオニクス・チェック（Prionics-Check）テストはウシBSE PrPScに対してあまり敏感でないことがわかった。mAb 6H4を使用した結果に比較して、免疫反応はmAb P4に対するジグリコシル化されたバンドの弱いシグナルに限定される（結果は示していない）。本発明のハイブリッド技術及びしたがって遠心分離ステップの付加は、BSE PrPScをより検出性の低いものとすることが明らかである。これはおそらく、遠心分離がP4エピトープまでC末端部分が切断されたPrPを優先的に濃縮し、又は反対にタンパク分解後にエピトープのみが比較的溶解性のPrP物質として少量残るためであろう。これは、プロテイナーゼK消化ステップ及びPrPScの異なる立体配置の遠心分離ステップの併用による効果が反芻動物のPrPScへのmAbsの親和性を決定するのに重要であるということであろう。
【００３１】
ハイブリッド技術を用いてここに提示された結果は、ウシBSE及びヒツジにおけるBSEの分子量及び糖形態比率における相違を表し、mAb P4が自然のウシの場合に全く検出しなかったのにもかかわらず、いくらかの残留シグナルがヒツジにおけるBSE及びCH1641株について発生した。これは、宿主の因子又はプロテアーゼ耐性において可能な相違によるものかも知れない。しかしながら、上記結果はまた、BSE PrPScがヒツジ宿主において何らかの変化を起こし、又はおそらく上記作用物質の異なる株を発生させたことを示唆しているかも知れず；しかし、後者はマウスにおけるウシBSE及び試験的にBSEを誘発したヒツジについて見出された類似のインキュベーション時間及び病変のプロフィールに関する我々の現在の知識（Bruce M, et al., (1994) Philos Trans R Soc Lond Ser B 343: 405-411）に反するものである。ハイブリッド技術のためのプロテイナーゼK濃度及びインキュベーション時間の増加又はmAb P4希釈度の減少は、この残留シグナルをさらに減少させることができる。
【００３２】
一般的に、ウエスタン・イムノブロッティングによる診断サンプルのルーチン試験は定量結果を得るためにのみ使用されるが、それはヒツジ及びウシのサンプル間の相違の正確な定量化を与えるものではない。各ゲル上に適当なヒツジ及びウシの陽性対照を含ませることは、ヒツジにおけるBSEのサンプルの差別化を促進するのに有用である。この方法によって処理した場合、ヒツジスクレイピー、ヒツジにおけるBSE及びウシBSE間の最大の相違は、非グリコシル化されたバンドの分子量であったが、電気泳動実施条件の多様な性質によって分子量の小さな相違が容易に歪められる可能性は問題であるかも知れない。これは、分子量の値が８の異なるゲル上の各個別のサンプルについて全く同じでないということによって示される。我々は、各ゲル上の適当な比較対照及び厳密な対照の使用並びに試験のすべての面のモニタリングが、分子量プロフィール及び糖形態比率における相違の再現性に不可欠であることを見出したために、組織のこの特別なパネルは非常に価値のあるものだと評価することができる。清澄化のための遠心分離ステップのプリオニクス技術への導入によって、タンパクバンドのより明らかな区分が行われ、分解度が改善され、分子量の相違を強めることが明らかである（プリオニクス法及びハイブリッド法の間の比較の結果は示さない）。
【００３３】
本発明の方法の結果の判定は慎重に行われる必要がある。データ分析において遭遇する困難性の一例は、CH1641及びヒツジにおけるBSE間の分子量プロフィールの類似性及びmAb P4が適用される場合にこの株において発生するシグナルの減少が、スクレイピー株の起源がウシにおけるBSEである可能性を示唆するかもしれないということである。しかしながら、分子量プロフィールは同一ではなく、糖形態比率はスクレイピーにより似ていた。
【００３４】
これらの結果は、分子量の差別化、糖形態のプロファイリング及び２の特異的抗体の組み合わせがUKヒツジ集団におけるBSEの良好な試験方法を提供するために使用され得ることを示唆する。
【００３５】
さらなる実施態様においては、本発明は伝播性の海綿状脳症（TSE)株の分類のためのキットを提供し、該キットはプリオンタンパク質に結合する抗体又はその結合フラグメント並びに特別なTSE株に対して、第２のTSE株に比較して異なる及び識別可能な親和性を有する抗体又はその結合フラグメントを含む。
【実施例】
【００３６】
実施例１
動物及び組織においてBSE及びヒツジスクレイピーを識別するためのハイブリッド法
脳幹領域からの凍結され、記録された脳組織を、どちらも実験的にBSEに感染させたロムニー系ヒツジ（AA136RR154QQ171遺伝子型）及びチェビオット系ヒツジ（AA136HH154QQ171遺伝子型）から得た。両方のヒツジを５グラムのウシBSE陽性の脳物質の経口投与によって感染させた。（ヒツジPrP遺伝子は、それぞれが遺伝子内の３のDNA塩基（１のコドン）によってコードされる、アミノ酸２５６個からなるタンパク質を産生する。）スクレイピーに対する感受性が、１３６、１５４及び１７１のコドンにおいてコードされたアミノ酸中の変化によって定義され、多型と呼ばれるPrPタンパク質の遺伝子型に関連していることが示された。ARQ、ARR、VRQ、AHQ及びARHと呼ばれるスクレイピーに罹る危険性に関して、少なくとも５の対立遺伝子変異体が発見された。コードは各コドンにおけるアミノ酸の多型を表し、すなわち、A136R154Q171（ARQ）でA＝アラニン、R＝アルギニン、Q＝グルタミンである。他の２のアミノ酸は；H＝ヒスチジン及びV＝バリンである。したがって、雄羊及び雌羊から受け継いだ２の対立遺伝子のホモ接合性及びヘテロ接合性の組み合わせは、見出されたPrP遺伝子型の多数の異形をもたらす。この危険性のレベルは品種の型及び集団に見られる遺伝子型に依存して変化する（Hunter N(1997) Trends in Microbiology 5: 331-334, Dawson M, et al., (1998) Vet. Rec. 6: 623-625）。自然のスクレイピーの脳組織を日常の診断のための検体から得て、これらは以下の品種及び遺伝子型；ロムニーVRQ/VRQ、チェビオットVRQ/VRQ、及びチェビオットARQ/ARQを含んでいた。我々は実験的BSE接種のために使用されたものに類似した遺伝子型のヒツジから自然のスクレイピーサンプルを得ることができなかったが、品種を合わせることは可能であり、ヘテロ接合性の遺伝子型ARQ/VRQを有するスウェイルデール種のヒツジをさらなる比較のために追加した。
【００３７】
ウシサンプル中の２のBSEは正常の診断のための検体から得られた保管組織であった。SSBP1及びCH1641のスクレイピー株を継代したヒツジからの組織はほとんどチェビオットヒツジで継代され（Wilson DR, et al., (1950) J. Comp. Pathol. 60: 267-275）、今やA群株と呼ばれる混合のスクレイピー株として知られている（Dickinson AG, et al., (1979) Slow Transmissible Diseases of the Nervous System Vol. 1, Eds S.B. Prusiner, W.J. Hadlow. New York. Academic Press p367）。CH1641は本来チェビオット種のスクレイピーの自然のケースに由来し（Dickinson AG, et al., (1986) Unconventional Viruses and Central Nervous System Diseases, Part III chapter 9 446-460 Eds. L. Court.D. Dormont. D. Kingsbury. Moisdon la Riviere, Abbaye de Mellaray）、ヒツジにおいて単一株又は解析されていない株の混合物のいずれかとして継代培養されることによって特徴づけされた。A群株に比較して、第２及び第３継代においてはインキュベーション特性が異常な変化をし、C群株と分類された（Foster JD, et al., (1988) Vet. Rec. 123: 5-8, Dickinson AG, et al., (1988) Novel Infectious Agents and the Central Nervous System. Chiba Foundation Symposium No.135. Eds G. Bock, J. Marsh, Chichester, Wiley p63）。
【００３８】
ウエスタン・イムノブロッティング技術
遠心分離ステップ(Collinge J, et al., (1996) Nature 383: 685-690)を組み込んだ改変プリオニクスに基づく技術であるハイブリッド技術（Schaller O, et al., (1999) Acta. Neuropathol. 98: 437-443）をPrPScを検出するために使用した。基本的に、１．５μｌの１０％ホモジェネート（プリオニクス）を１１２７ｇで５分間遠心分離した（TLA 45 rotor-Beckman）。プロテイナーゼK（Roche）（最終濃度５０μg/mlとなるように、1mg/mlのストックを５μｌ）を１００ｍｌの上清に加え、これを３７℃で１時間インキュベートした。ペファブロック（Pefabloc）（Boehringer、１ｍMまで）を加え、100℃で１０分間インキュベートした。遠心分離をミクロ遠心分離機中で行い（14,000rpmで５分間）、１０μｌの上清を１２％Bis-Trisポリアクリルアミドゲル（Invitrogen）上に負荷した。電気泳動を２００ｖで３５分間行い、ポリビニリデンジフルオライドPVDF膜（Millipore）上へ１５０ｖで１時間、ウエスタンイムノブロッティングを行った。ブロットを５０ｍｌのブロッキング緩衝液（Prionics）で１時間ブロックし、１：５０００に希釈した第１抗体（ブロッキング緩衝液中6H4プリオニクス）中、４℃で１夜インキュベートした。膜を（0.05%Tween20を含む）TBS中で７分間×４回洗浄し、第２抗体（1:5000）（アルカリホスファターゼに結合した抗マウスヤギ抗体）（Prionics）と室温で１時間インキュベートした。そして、それらを再びTBST中で７分間×４回洗浄し、その後ルミネッセンス緩衝液（Prionics）中で5分間インキュベートした。標識化は増強されたケミルミネッセンス・システム（CPD-Star Tropix）によって可視化した。Fluor S Multimagerコンピュータ分析（Quality One software, Biorad UK Ltd）を用いてシグナルを定量した。このシステムを用いて、ゲル上のビオチン付加されたマーカーとの比較によって分子量を測定し、各サンプルバンドの中心位置を分子量として記録する。糖形態の分析のためには、中心位置を読み取り点として再び使用する。シグナルをあわせたものを１００％と定義し、各バンドの寄与を全体のパーセンテージとして計算した。
【００３９】
抗血清
P4モノクローナル抗体(mAb)実験のために、この抗血清を６H4mAbに代え、１：２５００に希釈して使用した。mAb６H4は、アミノ酸位置１４４〜１５２においてウシPrPタンパク質中の配列を認識するマウスIgG1抗体である（Korth C, et al., (1997) Nature 390: 74-77）。mAbP4はマウス内で作製し、これはヒツジPrPタンパク質中のアミノ酸配列をアミノ酸位置８９〜１０４において認識する（Harmeyer S, et al., (1998) Gen. Virol. 79: 937-945）。
【００４０】
ゲル設計
各ゲル上に１７のウエルを準備し、レーン１は分子量マーカー及び正常のウシ脳組織から成るプリオニクス対照サンプル、そして分子量測定の正確性のために３のウエル（レーン２，９及び１４）はビオチン付加した分子量マーカーを含んだ。ゲルの残りの部分には、左から右に向かって以下の：ロムニーVRQ/VRQの自然のスクレイピー、チェビオットARQ/ARQの自然のスクレイピー、CH1641、ヒツジにおけるチェビオットBSE、ヒツジにおけるロムニーBSE、ウシBSE１、ヒツジにおけるチェビオットBSEの２重のサンプル、ヒツジにおけるロムニーBSEの２重のサンプル、チェビオットVRQ/VRQの自然のスクレイピー、スウェイルデールARQ/ARQの自然のスクレイピー、SSBP1、ウシBSE2及び陰性の正常なウシを準備した。各抗血清について、同じホモジェネートを用いてゲルの処理を８回繰り返し、計１６枚のゲルを処理した。ゲル設計は使用する抗血清がmAb６H４又はmAbP４であるかにかかわらず同じであった。
【００４１】
結果
分子量の分析
すべてのサンプルは、PrPScの３の糖形態に対応する特徴的なタンパクバンドのパターンを示した。ここで、ジグリコシル化されたもの（一番上のバンド）が最強のシグナルを示し、モノ−グリコシル化されたもの（中間のバンド）は次に強いシグナル、グリコシル化されないもの（一番下のバンド）は最も弱いシグナルを示した。mAb６H４抗血清を用いた８回の反復からのサンプルのパネルについて得られた３のバンドすべての分子量の平均及び標準偏差を図１にヒストグラムとして示す。モノ−グリコシル化されたもののバンド及びグリコシル化されないもののバンドでは、CH1641が最も低い分子量の平均値を示し、次いでヒツジにおけるBSE、そしてウシBSE、最後に最も高い分子量値を示したのは、自然のヒツジスクレイピーサンプル及びSSBP1というパターンが生じたことが明らかとなった。サンプルのパネルについての結果のパターン全体は、モノ−グリコシル化されたタンパク質及びグリコシル化されないタンパク質のバンドでは類似しており、グリコシル化されないものについての方がより差が大きかった。ジ−グリコシル化されたもののバンドは分子量によってサンプルのパネルを差別化するのには用いることができなかった。
【００４２】
CH1641スクレイピー株について得られた分子量は他のすべてのサンプルよりも３のバンドすべてについて一貫して低い分子量を示したが、値はスクレイピー及びSSBP1サンプルについて得られたよりもヒツジにおけるBSE及びウシBSEの分子量に近かった。SSBP1の分子量は自然のスクレイピーサンプルについて得られたものと識別不可能であると考えられた。
【００４３】
mAbP４抗血清（自然のヒツジスクレイピーサンプル及びSSBP1）を使用して検出可能なシグナルを生じた各サンプルについての、８回の試行からのタンパク質バンドに対して得られた分子量の平均及び標準偏差を図２に示す。分子量プロフィールは、これらのスクレイピーサンプルすべてについて類似していたが、３のバンドすべての分子量はmAb６H４で得られたものよりも高かった。
【００４４】
糖形態の比率
mAb６H４抗血清で得られた糖形態の比率に関しては、高分子量の糖形態（ジーグリコシル化されたもののバンド）及び低分子量の糖形態（モノ−グリコシル化されたもののバンド）の平均値の比率を撒布図としてプロットした（図３）。SSBP1は他から離れて現れた比率を有した（45：32）。CH1641の比率（53：29）はチェビオットARQ/ARQ（52：30）自然のスクレイピーサンプルについて得られたものに非常に類似していた。チェビオットVRQ/VRQ（57：27）、ロムニーVRQ/VRQ（57：25）及びスウェイルデールARQ/ARQ（58：25）は、ウシBSEサンプルの１について得られたもの（60：26）に類似した比率を示した。他のウシBSEサンプルは、低分子量のものに関してヒツジにおけるBSEサンプルに近い比率を有した（59：22）。実験的にBSE接種されたチェビオットからの２連のサンプルについての比率は65：23及び66：23であった。実験的にBSE接種されたロムニーからの２連のサンプルについての比率は、65：22及び66：21であった。糖形態比率の標準偏差は、チェビオットVRQ/VRQ、ロムニーVRQ/VRQ及びスウェイルデールARQ/ARQのスクレイピーサンプルと重複する傾向のあるウシにおけるBSEでは８回の試行で変化があった。しかしながら、CH1641及びチェビオットARQ/ARQの比率はわずかに重複し、ヒツジにおけるBSE及びSSBP1の比率は他の糖形態比率のいずれとも重複しなかった。
【００４５】
一般的に、mAbP4を用いて得られた平均の糖形態比率は、以下のmAb６H４抗血清；SSBP1（46：31）、チェビオットARQ/ARQ（57：27）、チェビオットVRQ/VRQ（62：23）、ロムニーVRQ/VRQ（59：25）及びスウェイルデールARQ/VRQ（62：24）を使用して自然のヒツジサンプルについて得られた比率よりも高かった。これらのどれもmAb６H４を用いて見出されたヒツジにおけるBSEの糖形態比率に類似しなかった。
【００４６】
mAb６H4及びmAbP4を使用する差別化
サンプルのパネルについての２の代表的なゲルの結果を図４に示す。イムノブロットの一番上の列は、本発明のハイブリッド技術及びmAb６H4抗血清を使用した結果並びに一番下の列はmAbP4抗血清を使用した結果を示す。mAbP4を使用した場合には、すべてのヒツジスクレイピーサンプル及びSSBP1が強く染まったバンドを示したことを観察した。CH1641及びヒツジにおけるBSEサンプルは３のバンドすべてにおいて大きくシグナルが減少し、ウシBSEサンプルについてはシグナルは検出されなかった。また、プリオニクス対照として提供された正常のウシ脳サンプルのシグナルも検出されなかった。全く同じ結果が８回反復されたゲルにおいて見出された。
【００４７】
本発明は、付随する以下の図面に関連する実施例によって、ここに特別に記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、ハイブリッド技術及びmAb 6H4抗血清を使用するサンプルパネルのバンドの分子量の平均を示す。ジグリコシル化されたもののバンドは、自然のスクレイピーサンプル（ロムニーVRQ/VRQ、チェビオットARQ/ARQ、チェビオットVRQ/VRQ、スェイルデールARQ/VRQ）及びヒツジで継代されたスクレイピー株SSBP1と重複する、ヒツジにおけるBSE（ロムニーBSE及びチェビオットBSE）及びウシBSEサンプル（BSE1及びBSE"）のサンプルのパネルについてはより少ない分子量の相違を示す。サンプル間の相違が非グリコシル化されたもののバンドについてはより大きいにもかかわらず、モノグリコシル化されたもののバンド及び非グリコシル化されたもののバンドは、サンプルのパネルについてほとんど同一の特異的プロフィールを示す。CH1641が最低の平均値を示し、次いでヒツジにおけるBSE、ウシBSEの順により高い値、そして最後に自然のヒツジスクレイピーサンプル及びSSBP1が最高の分子量値を示すパターンが得られる。
【図２】図２は、ハイブリッド技術及びmAb P4を使用した、自然のヒツジスクレイピー及びスクレイピーを継代したSSBP/１ヒツジサンプルについての平均バンドの分子量を示す。これらのスクレイピー由来サンプルの３のタンパクバンドすべては、ヒツジスクレイピーサンプル（ロムニーVRQ/VRQ, チェビオットARQ/ARQ, チェビオットVRQ/VRQ, スウェイルデールARQ/VRQ）及びヒツジで継代されたSSBP1株のパネルにおいてごく僅かな相違を示し、ほとんど同一の分子量プロフィールを示す。
【図３】図３は、自然のウシBSE（BSE1及びBSE２）、自然のスクレイピー（ロムニーVRQ/VRQ, チェビオットARQ/ARQ, チェビオットVRQ/VRQ, スウェイルデールARQ/VRQ）、ヒツジで継代された２のスクレイピー株（SSBP1及びCH1641）及び実験的にBSEに感染させられたヒツジ（ロムニーARQ/ARQ及びチェビオットAHQ/AHQ）についてのジグリコシル化バンド及びモノグリコシル化バンド中の異常タンパク部分の糖形態比率の撒布図である。ヒツジにおけるBSEサンプルは、独特の糖形態比率を示すが、ウシBSEの自然のケース並びにロムニーVRQ/VRQ及びスウェイルデールヒツジスクレイピーの結果の間にはかなりの重複がある。CH1641株は、チェビオットARQ/ARQスクレイピーヒツジについて見出されたものにより近い比率を示す。
【図４】図４は、脳のサンプルのパネルについてハイブリッド法を使用して得られたイムノブロットを表す。メンブレンａ）をウシPrPタンパク質のアミノ酸を１４４位〜１５２位の配列において認識するマウスIgG1抗体、mAb 6H4でプローブする。メンブレンｂ）をマウス中で産生され、８９位〜１０４位のアミノ酸においてヒツジPrPタンパク中のアミノ酸配列を認識するp4でプローブした。
mAb 6H4でプローブされたメンブレンａ）は、両方のBSEスクレイピーサンプルで強いシグナルを示し、分子量の相違が明らかに観察されることができる。
mAb P4でプローブされたメンブレンｂ）は、スクレイピーサンプル（レーン２，３，１０及び１１）及びSSBP1（レーン１２）で強いシグナルを示すが、実験的にBSE（レーン５，６，８及び９）及びCH1641株（レーン４）に感染させられたヒツジでは減少したシグナルを示す。自然のBSEの場合（レーン１及び１３）、及びプリオニクス正常ウシ脳対照（レーン１）は、可視的なシグナルを示さない。mAb P4を使用して、ごく僅かな分子量の差が見られる。
【図１】
2005506551.tif 000002
【図２】
2005506551.tif 000003
【図３】
2005506551.tif 000004
【図４】
2005506551.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2005506551.tif 000006
2005506551.tif 000007
2005506551.tif 000008
2005506551.tif 000009
2005506551.tif 000010
2005506551.tif 000011
2005506551.tif 000012
2005506551.tif 000013
2005506551.tif 000014
2005506551.tif 000015
2005506551.tif 000016
2005506551.tif 000017
2005506551.tif 000018
2005506551.tif 000019
2005506551.tif 000020
2005506551.tif 000021
2005506551.tif 000022
2005506551.tif 000023
2005506551.tif 000024
2005506551.tif 000025
2005506551.tif 000026
2005506551.tif 000027
2005506551.tif 000028
2005506551.tif 000029
2005506551.tif 000030
2005506551.tif 000031
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506551.tif 000032
【国際調査報告】
2005506551.tif 000033
2005506551.tif 000034
2005506551.tif 000035
2005506551.tif 000036