(57)【要約】本発明は、乳腺炎の処置をする薬物の製造のためのＮＦ−ＫＢ（ＮＦ−カッパＢ）インヒビターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳腺炎の処置をする薬物の製造のためのＮＦ−κＢインヒビターの使用。
【請求項２】
乳腺炎が慢性乳腺炎である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
乳腺炎が急性乳腺炎である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
抗生物質との組み合わせにおける請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
ＮＦ−κＢインヒビターが特異的ＮＦ−κＢインヒビターである、先行請求項のいずれか１つに記載の使用。
【請求項６】
ＮＦ−κＢインヒビターが、１５ｄ−ＰＧＪ２、テポキサリン（ｔｅｐｏｘａｌｉｎ）、シクロエポキシドン（ｃｙｃｌｏｅｐｏｘｙｄｏｎ）、（＋）−シクロエポキシドン、（−）−シクロエポキシドン、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、グリオトキシン（ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ）、ＭＧ−１３２、ＢＡＹ  １１−７０８２、ＢＡＹ  １１−７０８５またはボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）から選ばれる、先行請求項のいずれか１つに記載の使用。
【請求項７】
ＮＦ−κＢインヒビターが乳房内に投与される、先行請求項のいずれか１つに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳腺炎の処置をする薬物の製造のためのＮＦ−κＢ（ＮＦ−カッパＢ）インヒビターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳腺炎は酪農場の群れ（ｄａｉｒｙ  ｈｅｒｄ）においてもっとも損失の大きい疾病の１つである。損害は主として、乳汁の生産と品質の低下、治療による介入、抗生物質で汚染された乳汁の損失および過剰な労働から生じる。乳腺の炎症症状として定義される乳腺炎は、通常、病原性細菌によって惹起される。乳腺炎を引き起こすもっとも共通する病原菌は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・アガラクチエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、スタフィロコッカス・ジスガラクチエ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、スタフィロコッカス・ウベリス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、アルカノバクテリウム・ピオゲネス（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびコリ型細菌（ｃｏｌｉｆｏｒｍｓ）を含む。これらの微生物は、乳頭管を通して乳房に侵入することができ、そして瘢痕組織の形成の原因となる乳汁産生組織の炎症を起すが、この瘢痕が一旦形成されると、雌牛の乳汁産生において永続的な減少を惹起するであろう。また、感染は乳汁の組成、分量、外観および品質を変化させる。
【０００３】
乳牛における乳腺炎は、通常、抗生物質によって処置される。しかしながら、細菌菌株の抵抗性の上昇を避けるために、そのような抗生物質による処置を非抗生物質系化学療法剤による処置で置き換えるのが望ましいことが見い出された。さらにまた、抗生物質処置の際に乳牛によって産生される乳汁は、それが残留抗生物質を含有するので廃棄されねばならない。
【０００４】
ＮＦ−κＢ（核内因子−カッパＢ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ  Ｂ））は、共通配列モチーフを認識するＤＮＡ結合タンパク質のＲｅｌファミリーのメンバーからなる誘導性二量体転写因子についての集団名である。ＮＦ−κＢは本質的にはすべての細胞型において見いだされ、そして感染、炎症、および遺伝子発現の急速なリプログラミングを要する他のストレス状況への応答において例外的に多数の遺伝子の活性化に関与している。
【０００５】
驚くべきことに、ＮＦ−κＢの活性化を抑制できる化合物、すなわちＮＦ−κＢインヒビターが、乳腺炎の処置において使用できることが見い出された。
【０００６】
既知のＮＦ−κＢインヒビターは、例えば：
−  １５ｄ−ＰＧＪ２（１５−デオキシ−△，１２，１４−プロスタグランジンＪ２）（参照、非特許文献１）；
−  テポキサリン（ｔｅｐｏｘａｌｉｎ）（参照、非特許文献２）；
−  シクロエポキシドン（ｃｙｃｌｏｅｐｏｘｙｄｏｎ）およびその（＋）−および（−）−立体異性体（参照、非特許文献３）；
−  ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（Ｎａ−ＤＤＴＣ）（参照、非特許文献４）；
−  グリオトキシン（ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ）、ＭＧ−１３２（Ｎ−［（フェニルメトキシ）カルボニル］−Ｌ−ロイシル−Ｎ−［（１Ｓ）−１−ホルミル−３−メチルブチル］−Ｌ−ロイシンアミド）、ＢＡＹ  １１−７０８２（３−［［４−（１，１−ジメチルエチル）フェニル］−スルホニル］−２−プロペンニトリル）、ＢＡＹ  １１−７０８５（（Ｅ）−３−［［４−（１，１−ジメチルエチル）フェニル］−スルホニル］−２−プロペンニトリル），（参照、非特許文献５）；
−  シクロペンテノンプロスタグランジンＡ１（ＰＧＡ１）（参照、非特許文献６）；
−  特許文献１に記載のシクロペンタベンゾフラン；および
−  ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）のＩＮＮ名としてまた既知である［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−２−［（ピラジニルカルボニル）アミノ］プロピル］−アミノ］ブチル］−ボロン酸
である。
【０００７】
他のＮＦ−κＢインヒビターは文献から学習することができ、そして化合物は当該技術分野で既知のアッセイを用いてＮＦ−κＢ抑制活性について試験することができる。参照、例えば、非特許文献６。
【０００８】
乳腺炎の処置における使用のためのＮＦ−κＢインヒビターは、ＮＦ−κＢの特異的インヒビターであってもよく、また非特異的であってもよい。
【特許文献１】ＷＯ−００／０８００７；
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（９），４８４４−４８４９（２０００）；
【非特許文献２】Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５３（２，３），１０９−１１３（１９９６）；
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３（４５），１１３０８−１１３０９（２００１）；
【非特許文献４】Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，５５／３，３７５−３８６（２００１）；
【非特許文献５】Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３１（１２），１４８２−１４９０（２０００）；
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，７４６−７５０（１９９７）；
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、乳腺炎の処置をする薬物の製造のためのＮＦ−κＢインヒビターの使用を提供する。
【００１０】
結果として、本発明は、ＮＦ−κＢインヒビターの有効量を被験者に投与することを含んでなる乳腺炎を処置する方法を提供する。
【００１１】
本明細書で使用されるように、用語「被験者」は温血動物種、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファローなどのような反芻動物を包含する。
【００１２】
次に示す：
−  乳房の突然かつ短期の炎症である急性乳腺炎、
−  乳腺の中等度かつ持続性炎症である慢性乳腺炎
を含む、種々の重篤度および症候を有するウシ乳腺炎の多様な形態もしくは種類が存在する。
【００１３】
しばしば慢性乳腺炎が準臨床形態の疾病であるのに対して、急性乳腺炎は一般に臨床形態である。準臨床的乳腺炎は、乳汁における変化、例えば特別な試験によって検出できる体細胞カウント（ＳＣＣ）における増加があるけれども、乳腺の膨潤または乳汁の観察しうる異常がない乳腺炎の形態である。この種の乳腺炎は、断然、もっとも普及しており、そしてほとんどの群れ（ｈｅｒｄ）において最大の全体的損失を惹起する。それはしばしば「隠れた」乳腺炎と呼ばれる。臨床的乳腺炎は、乳房および泌乳の異常症状が観察できる乳腺炎の形態である。軽症の臨床的乳腺炎は、乳汁における変化、例えば、薄片物、凝固物、および水っぽいまたは異常な外観を伴う。乳房の熱および過敏性はわずかにあるかまたは全くないが、膨潤の兆候はあることがある。重症の臨床的乳腺炎は、熱く、堅い、かつ敏感である感染したクォーター（ｑｕａｒｔｅｒ）の膨潤を有する突然の開始期を伴う。乳汁は異常に見え、そして乳汁産生は低下する。乳房における局所的影響に加えて、時には雌牛自身が病気になる。発熱、急速な脈拍、気分低下、衰弱および食欲喪失の兆候がある。これらの症状の組み合わせは、しばしば、乳房のみならず動物全身が罹患するので急性の全身性乳腺炎と呼ばれる。
【００１４】
乳腺炎の処置のためのＮＦ−κＢインヒビターの有効量は、日常的な最適化技術を用いて決定でき、そして処置される特定の症状、被験者の症状、投与経路、調合物、および実施者の判断および当業者には明らかな他のファクターに応じて異なる。有効量は複数回の投薬によって達成されてもよい。
【００１５】
ＮＦ−κＢインヒビターを含有する組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、または製薬学的技術において既知の剤形を用いる乳房内注入によって投与されてもよい。静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内または乳房内投与では、活性薬物成分は、適当な担体、例えば水、生理食塩水、デキストローズ水溶液等と組み合わされてもよい。ＮＦ−κＢインヒビターを含有する獣医学的調合物は、通常、該ＮＦ−κＢインヒビターを添加物と混合するか、添加物により希釈するか、またはカプセル、サッシェもしくは他の容器の形態であってもよいキャリヤー内に封入することによって調製される。添加物が希釈剤として使われる場合、それはＮＦ−κＢインヒビターのための媒質、担体もしくは媒体として働く、固形、半固形もしくは液状物質であってもよい。適当な添加物の例は、ラクトース、デキストローズ、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップおよびメチルセルロースを含む。調合物は、さらに：滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油；湿潤剤；乳化および懸濁化剤；保存剤、例えばメチル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート；甘味剤；および着香剤を含んでもよい。本発明の組成物は、当該技術分野において既知の操作によって宿主に投与後、有効成分の即効性、持続性もしくは遅延性放出を与えるように製剤化されてもよい。
【００１６】
乳房内注入はオイル基剤、例えば、植物油、例えばピーナッツ油、または非植物油、例えば鉱油基剤であってもよく、そしてさらに増粘剤および場合によってはまた界面活性剤を含んでもよい。
【００１７】
組成物は、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、サッシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、浸剤、シロップ剤、エアゾル剤、軟膏剤、硬、軟ゼラチンカプセル剤、坐剤、無菌注射用液剤および無菌包装散剤の形態で存在してもよい。選ばれる投与経路に拘わらず、これらの組成物は当業者には既知の慣用の方法によって製薬学的に許容しうる用量形態に製剤化される。
【００１８】
またＮＦ−κＢインヒビターは抗生物質との併用療法において使用されてもよい。乳腺炎の処置において使用される抗生物質は、例えば、β−ラクタム抗生物質、例えばアンピシリン、クロキサシリン、ヘタシリン、ナフシリン、ペニシリンＧ、プロカインペニシリン；セファロスポリン、例えばセフォペラゾン、セフロキシン、サファロニウム、セファピリン、セフォキサゾール、セフラセトリル；アミノグリコシド抗生物質、例えばフラミセチン、ネオマイシン、ノボビオシン、ストレプトマイシン；マクロライド抗生物質、例えばエリスロマイシン；テトラサイクリン類、例えばクロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン；またはポリペプチド抗生物質、例えばポリミキシンＢである。
【実施例】
【００１９】
実験の詳細
健康な雌牛ならびに急性および慢性乳腺炎に罹患した雌牛からの乳汁細胞（ｍｉｌｋ  ｃｅｌｌ）におけるＮＦ−κＢ活性のレベルが測定された。
【００２０】
Ａ．乳腺炎に罹患した雌牛におけるＮＦ−κＢ活性の測定
１．動物
１２頭の健康な雌牛、６頭の急性および慢性乳腺炎に罹患したＨｏｌｓｔｅｉｎ−Ｆｒｉｅｓｉａｎ雌牛がこの研究では使用された。健康な雌牛は低い体細胞カウント（ＳＣＣ）（＜１０５細胞／ｍｌ）を有し、そして乳腺炎のいかなる臨床症候も有しない。急性乳腺炎に罹患した雌牛は高いＳＣＣ（＞４ｘ１０５細胞／ｍｌ）を有し、そして病気の臨床症候を示した。健康な雌牛でも急性乳腺炎に罹患した雌牛でも、臨床症候と毎月のＳＣＣ記録によって測定されるように、より早期の乳房疾患の記録を有しなかった。慢性乳腺炎に罹患した雌牛は、毎月のＳＣＣ測定によって決定されるように、持続的に増加したＳＣＣ（＞４ｘ１０５細胞／ｍｌ）を有したが、疾病のいかなる臨床症候もなかった。すべての雌牛は２〜７年齢であり、１〜５回の授乳数（ｌａｃｔａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）を有し、そして１〜６カ月間授乳し続けた。いずれの雌牛も実験前月にはいかなる処置も受けなかった。
【００２１】
２．無菌乳汁のサンプリング
乳汁は無菌の乳頭カニューレ注入装置を使用して回収された。この装置は、乳頭管中に挿入され、そして２０００ｍｌ容の無菌回収バッグに結合される注入セットの遊離末端に接続される無菌かつ発熱物質不含のカニューレからなった。乳汁サンプルは１つのクォーター（ｑｕａｒｔｅｒ）から採取された。サンプリング前に、そのクォーターは、７０％アルコールと３０％クロロヘキシジンを含有する溶液により徹底的に消毒された。乳汁のサンプリング直後、一定分量５０μｌが微生物学的分析にかけられた。細菌によって汚染されていることが分かったサンプルは研究から除外された。
【００２２】
３．体細胞カウント
乳汁回収直後に、各乳汁サンプルの５０ｍｌが専門研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｌｋ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｂａｔｔｉｃｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に送付され、ここで体細胞カウントが古典的手順にしたがって実施された。
【００２３】
４．乳汁細胞の単離
乳汁サンプルは最初に４℃で３０分間遠心（３００ｇ）分離された。次いで、ペレットがリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄され、そしてさらに４℃で３０分間遠心（３００ｇ）された。最後に沈降細胞はタンパク質抽出前にＰＢＳの１ｍｌ中に再懸濁された。細胞の分別はＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｄｕｄｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により染色されたサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）標本において実施された。
【００２４】
５．タンパク質抽出
単離した乳汁細胞は３００ｇで１０分間遠心され、そしてペレットが６００μｌの溶解バッファー（０．１％ノニデットＰ−４０；１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．４；１０ｍＭＮａＣｌ；３ｍＭＭｇＣｌ２；１ｍＭＥＤＴＡ；２ｍＭオルトバナデート；１ｍＭフルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ）；１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン；１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン）中に再懸濁された。細胞は１５秒間撹拌され、５分間氷上に維持され、そして３００ｇで１０分間遠心された。得られるペレットはＫＣｌバッファー（１０ｍＭＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４；４００ｍＭＫＣｌ；１０％グリセロール；２ｍＭＥＤＴＡ；１ｍＭエチレングリコール−ビス［β−アミノエチルエーテル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）；１％ノニデットＰ−４０；１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）；２ｍＭオルトバナデート；１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン；１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン；１ｍＭＤＦＰ）中に再懸濁され、そして１０分間４℃に維持された後１２，０００ｇで１５分間遠心された。上澄液は３倍希釈され、そして使用まで−８０℃に保存された。
【００２５】
６．ＮＦ−κＢの電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
結合反応は、２０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９），１０ｍＭＫＣｌ，０．２ｍＭＥＤＴＡ，２０％（ｖ／ｖ）グリセロール，１％（ｗ／ｖ）アセチル化ウシ血清アルブミン，ポリ（ｄＩ−ｄＣ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｙｌｅｓｂｕｒｇ，Ｕ．Ｋ．）３μｇ，１ｍＭＤＴＴ（ジチオトレイトール），１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルおよび３２Ｐ−標識二本鎖オリゴヌクレオチドプローブ１００，０００ｃｐｍ中で、総タンパク質抽出液５μｇを用いて室温で３０分間実施された。プローブは、１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍＭＮａＣｌ中で、適当な一本鎖オリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈ，Ｌｉｅｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を６５℃で１０分間アニーリングし、続いて室温まで徐々に冷却することによって調製された。プローブは、［３２Ｐ］ｄＡＴＰと［３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のクレノウフラグメントによる末端フィリングによって標識された。標識したプローブはＳｅｐｈｄｅｘＧ−２５カラム（Ｒｏｃｈｅ）におけるスピンクロマトグラフィーによって精製された。ＤＮＡ−タンパク質複合体は、０．２５ＭＴｒｉｓ，０．２５Ｍホウ酸ナトリウムおよび０．５ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０中で１５０Ｖにおいて４％ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）ポリアクリルアミドゲルにおいて未結合プローブから分離された。ゲルを真空乾燥し、そして−８０℃で１２時間、Ｘ線フィルムに露出された。特異的複合体の量はオートラジオグラフィーのフォトデンシトメトリーによって決定された。特異性を確認するために、競合アッセイが未結合の野生型と変異型のプローブの５０倍過剰量を用いて実施された。スーパーシフト実験では、各抗体１．５μｌが抽出液とインキュベートされ、３０分後放射能標識したプローブを添加した。この作業で使用されたオリゴヌクレオチドの配列は次のとおりである：野生型パリンドロームκＢプローブ、５’−ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＴＡＧ  ＧＴＴ−３’；変異型パリンドロームκＢプローブ、５’−ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＴＴＣ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＴＡＧ  ＧＴＴ−３’。
【００２６】
ＮＦ−κＢ活性は、特異バンドのフォトデンシトメトリーによってアッセイされた。
【００２７】
７．結果
活性のあるＮＦ−κＢ複合体は、ＥＭＳＡによって測定されるように健康な雌牛からの乳汁細胞では検出することができなかった。これに対して、急性乳腺炎に罹患した雌牛の乳汁サンプルから調製されたタンパク質抽出液は高いＮＦ−κＢ活性を例証した。慢性乳腺炎に罹患した雌牛からの乳汁細胞では、ＮＦ−κＢ活性は低活性から高活性まで変化した。
【００２８】
直線回帰が、フォトデンシトメトリーによって調査されるような乳汁細胞におけるＮＦ−κＢ活性のレベルと、乳腺における炎症の程度との間の関係を検査するために実施された。この回帰分析はＮＦ−κＢ活性と乳房炎症の２つのマーカー、すなわちＳＣＣ（図１Ａ）および乳汁サンプル中の好中球のパーセンテージ（図１Ｂ）との間に高度に有意な（Ｐ＜０．０１）相関関係を例証した。
【００２９】
この研究は、ＮＦ−κＢ活性が乳腺炎に罹患した雌牛からの乳汁細胞において増加し、したがってＮＦ−κＢインヒビターが乳腺炎の処置における潜在的用途を有すると考えられることを例証した。
【００３０】
Ｂ．慢性乳腺炎に罹患した雌牛から得られた乳汁細胞に及ぼすＮＦ−κＢインヒビターの投与の効果
１．動物
４頭の慢性乳腺炎に罹患したＨｏｌｓｔｅｉｎ−Ｆｒｉｅｓｉａｎ雌牛がこの研究では使用された。これらの雌牛は、毎月のＳＣＣ測定によって決定されるように、持続的に増加したＳＣＣ（＞４ｘ１０５細胞／ｍｌ）を有したが、疾病のいかなる臨床症候もなかった。いずれの雌牛も実験前月の間いかなる処置も受けなかった。
【００３１】
２．無菌乳汁のサンプリング
乳汁は先に記述したように回収された。
【００３２】
３．体細胞カウント
乳汁回収直後に、各乳汁サンプルの５０ｍｌが専門研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｌｋ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｂａｔｔｉｃｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に送付され、ここで体細胞カウントが古典的操作にしたがって実施された。
【００３３】
４．乳汁細胞の単離
乳汁サンプルは最初に４℃で３０分間遠心（３００ｇ）分離された。次いで、ペレットがリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄され、そしてさらに４℃で３０分間遠心（３００ｇ）された。最後に沈降細胞はタンパク質抽出前にＰＢＳの１ｍｌ中に再懸濁された。細胞の分別はＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｄｕｄｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により染色されたサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）標本において実施された。
【００３４】
５．乳汁細胞の培養および処置
乳汁細胞は、１％グルタミン、１０％胎児ウシ血清、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌおよびペニシリン５０ＵＩ／ｍｌを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｅｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で４ｘ１０６／ｍｌにおいて培養された。細胞は最初に、５％ＣＯ２−９５％空気混合物中で３７℃９０分間インキュベートされ、次いで、種々の用量のＮＦ−κＢインヒビター（４０μＭ，５０μＭ，６０μＭおよび８０μＭの濃度における１５−ｄＰＧＪ２；または１μｌ／ｍｌの濃度におけるグリオトキシン（ｇｌｉｏｔｏｘｉｎｅ））により処置された。処置された細胞はタンパク質の抽出前に３時間インキュベートされた。
【００３５】
６．タンパク質抽出
先に記述された操作を参照。
【００３６】
７．ＮＦ−κＢ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
フォトデンシトメトリーによるＮＦ−κＢ活性の調査については、先に記述された操作を参照。
【００３７】
８．結果
慢性乳腺炎に罹患した雌牛からの未処置の乳汁細胞では、ＥＭＳＡによって測定されるように、上昇したレベルのＮＦ−κＢ活性が検出された。これに対して、１５−ｄＰＧＪ２またはグリオトキシンで処置された乳汁細胞から調製したタンパク質抽出液は低下したＮＦ−κＢ活性を例証した。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、フォトデンシトメトリーによって測定されるような乳汁細胞によって示される比ＮＦ−κＢ活性と、健康な雌牛（■，ｎ＝６）ならびに急性（●，ｎ＝６）および慢性（▲，ｎ＝２０）乳腺炎に罹患したＨｏｌｓｔｅｉｎ−Ｆｒｉｅｓｉａｎ雌牛におけるＳＣＣ（Ａ）および好中球のパーセンテージ（Ｂ）との間の関係を示す。ｒ，相関係数。
【図２】図２：１５−ｄＰＧＪ２およびグリオトキシンは、慢性乳腺炎に罹患した雌牛からの乳汁細胞においてＮＦ−κＢ活性化を抑制する。単離後、乳汁細胞は９０分間インキュベートされ、次いで、指示した濃度の１５−ｄＰＧＪ２およびグリオトキシンにより処置された。タンパク質抽出液は処置３時間後に、ＥＭＳＡによってＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合活性について調査された。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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