(57)【要約】ＤＵＢのヒトおよびマウス類似体、第７染色体に位置する造血細胞特異的なサイトカイン誘導性の脱ユビキチン化プロテアーゼであって、それぞれの調節領域が同定されている。それらによりコードされたヌクレオチドまたはタンパク質は、ｈＤＵＢ７またはｍＤＵＢ７の阻害剤を同定するための分析に用いることができる。本発明はまた、積荷（ｃａｒｇｏ）分子に結合したｈＤＵＢ７またはｍＤＵＢ７のＮＬＳまたは移行（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）配列を含む移行ペプチドを含み、さらに、生物学的に活性なタンパク質、治療上有効な化合物、アンチセンスヌクレオチド、または試験化合物を細胞に送達する方法（移行ペプチドは、外部から細胞に加えられる）を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７からなる群より選択されるヒト脱ユビキチン化プロテアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７からなる群より選択されるヒト脱ユビキチン化プロテアーゼであるポリペプチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドが、請求項１に記載のｈＤＵＢまたはｍＤＵＢ７の阻害剤を同定するための分析で用いられる、請求項１に記載のポリヌクレオチドの使用方法。
【請求項４】
ポリペプチドが、請求項２に記載のｈＤＵＢまたはｍＤＵＢ７の阻害剤を同定するための分析で用いられる、請求項２に記載のポリペプチドの使用方法。
【請求項５】
請求項２に記載のポリペプチドを阻害することができる化合物を投与して、炎症性サイトカインシグナル伝達を調節することにより炎症を減少させる方法。
【請求項６】
請求項２に記載のポリペプチドを阻害することができる化合物を投与して、リンパ球の増殖に関与するサイトカイン受容体シグナル伝達を変化させることにより自己免疫疾患を調節する方法。
【請求項７】
請求項２に記載のポリペプチドを阻害することができる化合物を投与して、感染の際の免疫反応を調節する方法。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの転写の調節を変化させることができる化合物を投与して、炎症性サイトカインシグナル伝達を調節することにより炎症を減少させる方法。
【請求項９】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの転写の調節を変化させることができる化合物を投与して、リンパ球の増殖に関与するサイトカイン受容体シグナル伝達を変化させることにより自己免疫疾患を調節する方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの転写の調節を変化させることができる化合物を投与して、感染の際の免疫反応を調節する方法。
【請求項１１】
レポーター遺伝子に操作可能に結合した、ｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７からなる群より選択されるヒト脱ユビキチン化プロテアーゼの５’側に隣接するポリヌクレオチドを含むレポーター分析において、化合物を加え、ついでその化合物の効果を測定する、ヒト脱ユビキチン化プロテアーゼの調節因子を同定する方法。
【請求項１２】
積荷分子に結合したＮＬＳまたはｈＤＵＢ７もしくはｍＤＵＢ７の移行配列を含む移行ペプチド。
【請求項１３】
ＮＬＳまたは移行配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選択される、請求項１２に記載の移行ペプチド。
【請求項１４】
積荷分子が、生物学的に活性なタンパク質、治療上有効な化合物、アンチセンスヌクレオチド、または試験化合物である、請求項１２に記載の移行ペプチド。
【請求項１５】
請求項１２に記載の移行ペプチドを外部から細胞に加える、生物学的に活性なタンパク質、治療上有効な化合物、アンチセンスヌクレオチド、または試験化合物を細胞に送達す
る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウスのＤＵＢのヒト相同体、第７染色体で見出された造血細胞特異的なサイトカイン誘導性の脱ユビキチン化プロテアーゼ、それぞれの調節領域およびそれぞれｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７と名付けられたそのマウスのオーソログの同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分解におけるユビキチンの役割が発見され、このシステムの主要な酵素反応が網状赤血球由来の無細胞系での生化学的な研究で明らかになった。このシステムにおいて、タンパク質がユビキチン（７６個のアミノ酸残基からなるタンパク質）に共有結合することにより、分解の標的となる。簡単に言えば、ユビキチン−タンパク質結合は、三つの酵素の連続した作用を必要とする。ユビキチンのＣ末端のＧｌｙ残基は、ＡＴＰを必要とする段階で特異的な活性化酵素Ｅ１により活性化される（第１段階）。この段階は、ＰＰiの放出を伴うユビキチンアデニレートの中間体形成、それに続き、ＡＭＰの放出を伴うユビキチンのＥ１のＣｙｓ残基へのチオールエステル結合での結合からなる。次に、活性化されたユビキチンは、ユビキチン−キャリアータンパク質Ｅ２の活性部位のＣｙｓ残基に転移される（第２段階）。第三の段階において、ユビキチン−タンパク質リガーゼまたはＥ３酵素で触媒され、ユビキチンは、そのＣ末端で、基質タンパク質のＬｙｓ残基のアミノ基にアミドイソペプチド結合で結合する（第３段階）。
【０００３】
ポリユビキチン鎖に結合したタンパク質は、通常、２６Ｓプロテアソーム複合体により分解され、この作用はＡＴＰ加水分解を必要とする。２６Ｓプロテアソームは、プロテアーゼ触媒部位を含む複合体である２０Ｓプロテアソームと１９Ｓ「キャップ」または調節複合体とのＡＴＰ依存性の集合体により形成される。１９Ｓ複合体は、いくつかのＡＴＰアーゼサブユニットと、ユビキチン化タンパク質に対する２６Ｓプロテアソームの特異的な作用に関与すると思われるその他のサブユニットとを含む。２６Ｓプロテアソーム複合体の集合及びそのタンパク分解作用におけるＡＴＰの役割はわかっていない。２６Ｓプロテアソームの作用により、いくつかのタイプの生成物：遊離ペプチド、ユビキチンのＬｙｓ残基を介してユビキチンと結合したままの低分子ペプチド、および、ポリユビキチン鎖が生じるものと思われる（第４段階）。後者の２つの生成物は、ユビキチン−Ｃ末端加水分解酵素またはイソペプチダーゼの作用により遊離で再使用可能なユビキチンに変換される（第５段階および第６段階）。いくつかのイソペプチダーゼはまた、特定のユビキチン−タンパク質複合体を分解し（第７段階）、それにより２６Ｓプロテアソームによるそれらのタンパク質分解を防ぐと考えられる。後者のタイプのイソペプチダーゼ作用は、間違ってユビキチン化されたタンパク質を救い出す修正機能、または、調節的な役割を有する可能性がある。上記プロセスにより形成された低分子ペプチドはさらに、細胞質内のペプチダーゼにより遊離アミノ酸に分解され得る（第８段階）。
【０００４】
ユビキチンが介在するタンパク質分解は、様々な生物学的プロセスに関与する。細胞周期調節タンパク質、例えばサイクリン、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤、および分裂後期インヒビターの、選択的でプログラム化された分解は、細胞周期の進行において必須の現象である。細胞成長と増殖はさらに、腫瘍サプレッサー、癌原遺伝子、およびシグナル伝達システムの構成要素の、ユビキチンが介在する分解により制御される。多数の転写調節因子の迅速な分解は、多種多様なシグナル伝達プロセス、および、環境からの信号への応答に関与する。ユビキチンシステムは、エンドサイトーシス、および、受容体とトランスポーターのダウンレギュレーション、同様に、小胞体中の既存のタンパク質や異常なタンパク質の分解に関与することがはっきりしている。発生およびアポトーシスにおいて
ユビキチンシステムの役割が強く示唆されているが、このような場合に関与する標的タンパク質は同定されていない。いくつかのユビキチンが介在するプロセスにおける機能障害は、悪性の形質転換などの病的状態を引き起こす。
【０００５】
ユビキチン化のためにタンパク質を印付ける様々なシグナルに関する我々の知識も限定されている。近年の報告では、リン酸化により多くのタンパク質が分解の標的となることが示されている。これまでに、迅速に分解されるタンパク質の多くは、ＰＥＳＴ要素（Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒ残基が豊富な領域）を含むことが示されている。さらに近年、ＰＥＳＴ要素は、Ｓ／ＴＰ配列（Ｃｄｋやその他いくつかのタンパク質キナーゼの最小限のコンセンサスなリン酸化部位）が豊富であることが指摘された。実際には、目下、いくつかの（ただし、もちろん全部ではない）事例において、ＰＥＳＴ成分は、分解に必要なリン酸化部位を含むとみられている。従って、酵母Ｇ１サイクリンＣｌｎ３およびＣｌｎ２、同様に、Ｇｃｎ４転写アクチベーターのユビキチン化および分解には、ＰＥＳＴ成分における複数のリン酸エステル化が必要である。その他のタンパク質、例えば哺乳動物Ｇ１調節因子サイクリンＥおよびサイクリンＤ１は、特異的な単一の部位でのリン酸化により、ユビキチン化の標的となる。ＮＦ−ｋＢ転写レギュレーターのＩｋＢα阻害剤の場合では、２つの特異的部位（Ｓｅｒ−３２およびＳｅｒ−３６）におけるリン酸化はユビキチンの結合を必要とする。β−カテニンは、リン酸化によりユビキチンが介在する分解の標的となるが、これは、これらリン酸化部位周辺のＩｋＢαの配列モチーフと類似した配列モチーフを有する。しかしながら、これら２つのタンパク質のリン酸化パターンにおける相同性は完全ではなく、なぜならβ−カテニンのその他の部位のリン酸化もまたその分解に必要とされるためである。リン酸化により分解の標的となるその他のタンパク質としては、Ｃｄｋ阻害剤Ｓｉｃ１ｐ、および、ＳＴＡＴ１転写因子が挙げられる。異なるリン酸化パターンは異なるタンパク質を分解の標的とするが、共通の特徴は、最初の調節現象はタンパク質キナーゼにより行われること、一方、ユビキチンリガーゼの役割はタンパク質基質のリン酸化形態を認識すると考えられる。さらに、異なるユビキチンリガーゼは、様々なタンパク質基質において、異なるリン酸化パターンと同時に、それに加えてその他のモチーフをも認識するものと思われる。しかしながら、出芽酵母において数種のリン酸化した細胞周期の調節因子に作用する数種のＰＵＬＣ型ユビキチンリガーゼを除きこのようなＥ３の同一性はわかっていない。実際に、数種のタンパク質のリン酸化がそれらの分解を妨害するという観察により、タンパク質をユビキチンが介在する分解の標的とするシグナル（および、このようなシグナルを認識しなければならないリガーゼ）の多様性が明らかである。従って、ＭＡＰキナーゼによる、Ｓｅｒ３におけるｃ−Ｍｏｓ癌原遺伝子のリン酸化、および、ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎ癌原遺伝子の複数の部位での複数のリン酸エステル化により、それらのユビキチン化と分解が抑制される。
【０００６】
ユビキチンの結合に関与する酵素ファミリーの他にも、近年、極めて大規模な脱ユビキチン化酵素ファミリーが様々な生物から同定された。これら酵素は、数種の機能を有すると考えられている。第一に、これらは、ペプチダーゼ活性を有し、ユビキチン遺伝子産物を切断する可能性がある。ユビキチンは、２つの別個の遺伝子クラスでコードされている。一つはポリユビキチン遺伝子であり、これは、隣接するユビキチン分子のＣ末端ＧｌｙとＮ末端Ｍｅｔとがペプチド結合することにより連結した直鎖状のユビキチンポリマーをコードする。ユビキチンの各コピーは、連続するユビキチン部分のＧｌｙ−７６とＭｅｔ−１との間のペプチド結合を正確に切断することにより解離されなければならない。その他のユビキチン遺伝子クラスは、ユビキチンのＣ末端伸長タンパク質をコードしており、これは、ユビキチンのＣ末端のＧｌｙと、伸長タンパク質のＮ−末端のＭｅｔとの間でペプチド結合が融合したものである。現在までに、上述の伸長体としては、５２または７６〜８０個のアミノ酸からなるリボソームタンパク質がある。これらユビキチン融合タンパク質を処理すると、ユビキチンと対応するＣ末端伸長タンパク質とが得られる。第二に、脱ユビキチン化酵素は、イソペプチダーゼ活性を有する可能性がある。標的タンパク質が分解されると、脱ユビキチン化酵素は、標的タンパク質またはその残余物からポリユビキチン鎖を切り取ることができる。ポリユビキチン鎖はまた、２６Ｓプロテアソームによるタンパク質分解の最中またはその後に、脱ユビキチン化酵素により分解されなければならず、それにより遊離のユビキチン単量体が再生する。このようにして、脱ユビキチン化酵素は、ユビキチン化タンパク質を分解する２６Ｓプロテアソームの能力を高めることができる。第三に、脱ユビキチン化酵素は、ユビキチンのＧｌｙ−７６のカルボキシル基へのエステル結合、チオールエステル結合、およびアミド結合を加水分解する可能性がある。このような非機能的な結合は、低分子の細胞内化合物（例えばグルタチオン）と、Ｅ１−、Ｅ２−、またはＥ３−ユビキチンチオールエステル中間体との反応から生じる可能性がある。第四に、脱ユビキチン化酵素は、タンパク質基質からユビキチンを除去することにより結合系と競合する可能性があり、それにより、ユビキチン化が介在する分解またはその他いずれかの機能からそれらを防御する。従って、直鎖状ポリユビキチンおよびユビキチン融合タンパク質、ならびに、タンパク質に結合した分岐状ポリユビキチンからの、脱ユビキチン化酵素によるユビキチンの生成は、遊離ユビキチンの十分なプールを維持するのに必須であるべきである。多くの脱ユビキチン化酵素が存在するということは、これら脱ユビキチン化酵素は別々の基質を認識し、それゆえに特異的な細胞のプロセスに関与するということを示唆する。これら脱ユビキチン化酵素の上記特異性を証明する最新の証拠があるにも関わらず、これら酵素の構造と機能との関連性に関する研究は未だに不十分である。
【０００７】
脱ユビキチン化酵素は、配列相同性に基づき大まかに２つのクラスに分類することができ、すなわち、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ（ＵＢＰまたはＵＳＰ、または２型ユビキチンＣ末端加水分解酵素（２型ＵＣＨ）としても知られている）と、ＵＣＨ（または１型ＵＣＨとしても知られている）である。ＵＣＨ（１型ＵＣＨ）酵素は、主としてユビキチンのＣ末端のエステルとアミドを加水分解するが、ユビキチンの遺伝子産物を切断し、ポリユビキチン鎖を分解する可能性もある。これら酵素は、共通して、これら酵素を同定する配列の高度に保存された４つのブロックを含む２１０個のアミノ酸からなる触媒ドメインを有する。これら酵素は、２つのよく保存されたモチーフである、ＣＹＳボックスとＨＩＳボックスを含む。変異誘発の研究により、２つのボックスは触媒作用において重要な役割を果たすことが明らかになった。いくつかのＵＣＨ酵素は、かなりのＣ末端伸長を有する。Ｃ末端伸長の機能はまだわかっていないが、酵素の適切な局在に関与するようである。これらＵＣＨ酵素の活性部位は、システイン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸で構成される触媒３残基を含み、パパインと類似した化学メカニズムを利用する。これら酵素の一種であるＵＣＨ−Ｌ３の結晶構造が解像度１.８Åで解明されている。この酵素は、ヘリックスの両側面に存在する中心部の逆平行βシートを含む。βシートと１つのヘリックスは、チオールプロテアーゼのカテプシンＢで観察されたものと類似している。その類似性としては、活性部位を含む３つのアミノ酸残基、Ｃｙｓ95、Ｈｉｓ169、およびＡｓｐ184が挙げられる。活性部位はユビキチンの結合に適合するようであり、その他の部位でも固定する可能性がある。遊離酵素における触媒部位は、非特異的な加水分解を制限する分子の２つの異なるセグメントによりマスキングされ、基質が結合した後、コンフォメーションの再編成を受けるに違いない。
【０００８】
ＵＢＰ（２型ＵＣＨ）酵素は、ユビキチン遺伝子産物を切断し、加水分解後にポリユビキチン鎖を解体することができる。ＣＹＳボックスとＨＩＳボックスで区切られた約４５０個のアミノ酸からなるコア領域が存在するようである。これらアイソフォームの多くはＮ末端伸長を有し、Ｃ末端伸長を有するものは少数である。加えて、多くのアイソフォームのコア領域において可変的な配列が存在する。これら多様な配列の機能は、未だよく特徴付けられていない。特異的なＵＢＰのその他の興味深い機能は、細胞増殖の調節である。サイトカインが、Ｔ細胞で特異的な脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）（ＤＵＢ−１およびＤＵＢ−２と称する）を誘導することが観察されている。ＤＵＢ−１は、ＩＬ−３、ＩＬ−５、およびＧＭ−ＣＳＦに対するサイトカイン受容体の刺激により誘導されるが、これは、インターロイキン受容体のβ−共通（ベータｃ）サブユニットに関するその誘導における役割を示唆する。ＪＡＫ２の優性の負の突然変異体の過剰発現は、ＤＵＢ−１のサイトカイン誘導を阻害するが、これは、酵素の調節がＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル変換経路に対する細胞反応の一部であることを示唆する。ＤＵＢ−１の持続した発現は、Ｇ1で細胞を停止させる；それゆえに、この酵素は、Ｇ0からＧ1への移行を制御することにより細胞成長を調節するようである。この酵素の触媒性の保存されたＣｙｓ残基は、その活性に必要である。ＤＵＢ−２は、ＩＬ−２により前初期（ＩＥ）遺伝子として誘導され、刺激の開始直後にダウンレギュレートされる。この酵素の機能もまた不明確である。この酵素は、重要な細胞周期レギュレーターの分解を促進または阻害する可能性がある。
【０００９】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）のようなサイトカインは、それらの受容体のチロシンを迅速にリン酸化することにより細胞内のシグナル伝達経路を活性化し、細胞成長や生存に関与する多くの遺伝子の活性化を起こす。脱ユビキチン化酵素ＤＵＢ−２は、ＩＬ−２に対する反応で誘導され、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）で形質転換されたＴ細胞で発現され、このＴ細胞はＩＬ−２のＪＡＫ／ＳＴＡＴ（シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子）経路の構成的な活性化を示し、Ｂａ／Ｆ３細胞で発現されれば、ＤＵＢ−２は、ＩＬ−２により誘導されたＳＴＡＴ５のリン酸化を著しく持続する。ＤＵＢ−２はＩＬ−２が介在する増殖を増強しないが、成長因子が取り除かれた場合、ＤＵＢ−２発現細胞は、ＳＴＡＴ５のリン酸化を継続し、ＩＬ−２により誘導された遺伝子であるｃｉｓおよびｃ−ｍｙｃの発現を増強した。ＤＵＢ−２発現は、サイトカインの除去により誘導されるアポトーシスを顕著に阻害し、細胞を生存させることができた。それゆえに、ＤＵＢ−２は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介するシグナル伝達を増強し、リンパ球の生存を延長させる役割を有し、ＤＵＢ−２が構成的に発現される場合は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化に寄与すると考えられ、これは、いくつかの形質転換細胞で観察されている。（Ｍｉｇｏｎｅ，Ｔ．−Ｓ．等，Ｂｌｏｏｄ．２００１年，９８：１９３５〜１９４１）。
【００１０】
タンパク質のユビキチン化は、サイトカイン活性化シグナル伝達経路と造血細胞の成長の重要なレギュレーターである。タンパク質のユビキチン化は、ユビキチン結合酵素と脱ユビキチン化酵素との協調作用により制御される。近年、成長を調節する脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ−１およびＤＵＢ−２）をコードする遺伝子の新規のファミリーが同定された。ＤＵＢは前初期遺伝子であり、サイトカイン刺激に反応して迅速かつ一時的に誘導される。ＤＵＢ−２に相補的なＤＮＡに対する縮重プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応による増幅により、３個のマウスのＤＵＢ遺伝子配列を含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを単離した。１つのＢＡＣは、ＤＵＢ−２に対して広範な相同性を有する新規のＤＵＢ遺伝子（ＤＵＢ−２Ａ）を含んでいた。ＤＵＢ−１およびＤＵＢ−２と同様に、ＤＵＢ−２Ａ遺伝子は、２つのエキソンを含む。予測されるＤＵＢ−２Ａタンパク質は、そのＣ末端における高度可変領域を含む一次アミノ酸配列ではその他のＤＵＢと高い関連を示す。インビトロで、ＤＵＢ−２Ａは、機能的な脱ユビキチン化活性を有していた；その保存されたアミノ酸残基の突然変異により、この活性が失われた。ＤＵＢ−２Ａ遺伝子の５’フランキング配列は、造血細胞特異的な機能的エンハンサー配列を有する。ＤＵＢサブファミリーの少なくとも３つのメンバー（ＤＵＢ−１、ＤＵＢ−２、およびＤＵＢ−２Ａ）があり、別々の造血サイトカインが特異的なＤＵＢ遺伝子を誘導し、それによりサイトカイン特異的な成長反応を開始させると考えられている。（Ｂａｅｋ，Ｋ．−Ｈ．等，Ｂｌｏｏｄ．２００１年：９８：６３６〜６４２）。
【００１１】
タンパク質のユビキチン化はまた、プロテアソームが介在する分解を伴わない細胞において調節機能を提供する。例えば、近年、ＨｉｃｋｅおよびＲｉｅｚｍａｎは、酵母におけるＳｔｅ２受容体のリガンド誘導性のユビキチン化を実証している。Ｓｔｅ２受容体の
ユビキチン化は、受容体のエンドサイトーシスと、プロテアソームではなく小胞への受容体の標的化を引き起こす。また、Ｃｈｅｎ等は、ＩＢキナーゼの活性化は、迅速な、誘導性のユビキチン化現象を必要とすることを実証している。このユビキチン化現象は、ＩＢの特異的リン酸化に必須であり、その後のキナーゼ複合体のタンパク質分解を起こさない。Ｓｔｅ２およびＩＢキナーゼのユビキチン化は可逆的であり、恐らく特異的な脱ユビキチン化酵素の作用により生じるものと考えられる。
【００１２】
脱ユビキチン化酵素、すなわちＵＢＰ、をコードする遺伝子の大規模なスーパーファミリーが近年同定された。ＵＢＰは、ユビキチン特異的なチオールプロテアーゼであり、直鎖状ユビキチン前駆体タンパク質、または、イソペプチドユビキチン結合体を含む翻訳後修飾されたタンパク質のいずれをも切断する。多数のＵＢＰでは、タンパク質のユビキチン化は、タンパク質のリン酸化のように、細胞内で調節される極めて可逆的なプロセスであることが示唆される。
【００１３】
興味深いことに、ＵＢＰの間では、長さと構造の複雑性が大きく相違していることから、その機能的な多様性が示唆される。それらのコーディング領域を通してアミノ酸配列類似性はわずかであるが、配列比較により２つの保存されたドメインが明らかになった。Ｃｙｓドメインは、活性な酵素の求核剤として役立つシステイン残基を含む。Ｈｉｓドメインは、酵素の活性部位に寄与するヒスチジン残基を含む。さらに最近の証拠によれば、ｕｂｐスーパーファミリーの全メンバーに含まれる６つの相同性ドメインが示されている。ＣｙｓドメインおよびＨｉｓドメインにおける保存された残基の変異誘発により、ＵＢＰ活性に必須な数種の残基が同定された。
【００１４】
近年、サイトカイン受容体の刺激に対する反応で迅速に誘導される、成長を調節する脱ユビキチン化酵素ＤＵＢ−１が同定されている。ＤＵＢ−１は、ＩＬ−３、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、およびＩＬ−５に対する受容体により特異的に誘導されるが、これは、これら受容体が共通して有するｃサブユニットに関する特異的な役割を示唆している。ＤＵＢ−１遺伝子のクローニングの過程において、クロスハイブリダイゼーションする関連のＤＵＢ遺伝子のファミリーが同定された。このことから、その他のＤＵＢ遺伝子も異なる成長因子により誘導可能と思われる。この方法を用いて、ＩＬ−２誘導性のＤＵＢ酵素、ＤＵＢ−２、および、強い関連性を示すＤＵＢ−２ａが同定された。ＤＵＢ−１およびＤＵＢ−２は、ｕｂｐスーパーファミリーの他のメンバーに比べて互いにより密接に関連しているため、新規の脱ユビキチン化酵素サブファミリーと定義される。
【００１５】
マウス系における造血細胞特異的なサイトカイン誘導性ＤＵＢが、サイトカイン受容体を持続させることが示されている（Ｍｉｇｏｎｅ，Ｔ．Ｓ．等（２００１年）を参照）。脱ユビキチン化酵素ＤＵＢ−２は、サイトカイン誘導性のシグナルトランスデューサーと転写活性アクチベーターを持続させ、サイトカインの除去の後のアポトーシスを抑制する（Ｂｌｏｏｄ，９８，１９３５〜４１；Ｚｈｕ，Ｙ．等（１９９７年））。ＤＵＢ−２は、新規のサイトカイン誘導性脱ユビキチン化酵素のファミリーのメンバーである（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２，５１〜７、および、Ｚｈｕ，Ｙ．等（１９９６年））。マウスのＤＵＢ−１遺伝子は、インターロイキン−３受容体のベータｃサブユニットにより特異的に誘導される（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１６，４８０８〜１７）。これらの効果は、ｈＤＵＢのマウス類似体であるＤＵＢ−１またはＤＵＢ−２による受容体またはその他のシグナル伝達中間体の脱ユビキチン化による可能性がある。ｈＤＵＢの阻害は、特異的サイトカイン受容体シグナル伝達のダウンレギュレートをもたらし、従って、特異的な免疫反応を調節することができるかもしれない。
【００１６】
サイトカインは、特異的な標的遺伝子の発現を誘導することにより細胞成長を調節する。近年同定されたサイトカイン誘導性の前初期遺伝子ＤＵＢ−１は、成長調節活性を有す
る脱ユビキチン化酵素をコードする。加えて、インターロイキン−２により誘導される高い関連性を示す遺伝子ＤＵＢ−２が同定された。ＤＵＢ−２のｍＲＮＡは、Ｔ細胞で前初期遺伝子として誘導され、迅速にダウンレギュレートされた。ＤＵＢ−１と同様に、ＤＵＢ−２タンパク質は、インビトロで脱ユビキチン化活性を有していた。ＤＵＢ−２のユビキチン特異的なチオールプロテアーゼ活性に必要とされる保存されているシステイン残基をセリンに変異させた場合（Ｃ６０Ｓ）、脱ユビキチン化活性が失われた。ＤＵＢ−１およびＤＵＢ−２タンパク質は、それらの一次アミノ酸配列においてそれらのＣＯＯＨ末端における高度可変領域を除き高い関連性を示す。その上、ＤＵＢ遺伝子はマウス第７染色体のある領域に一緒に局在しており、これは、それらが先祖からのＤＵＢ遺伝子のタンデム重複により生じたことを示唆している。さらなるＤＵＢ遺伝子がこの領域に一緒に局在しているが、これは、サイトカイン誘導性ＤＵＢ酵素のより大規模なファミリーを示唆している。我々は、様々なサイトカインが特異的なＤＵＢ遺伝子を誘導すると考えている。それにより、それぞれの誘導されたＤＵＢ酵素が、未知の成長調節因子の分解またはユビキチン化状態を調節し、サイトカイン特異的な成長反応を起こす。これら構造的な基準に基づき、ＤＵＢサブファミリーのさらなるメンバーをＧｅｎＢａｎｋTMで同定することができる。最も高い相同性は、ＣｙｓドメインとＨｉｓドメインでみられる。加えて、この予測されるヒトＤＵＢタンパク質は、Ｌｙｓドメイン（アミノ酸４００〜４１０個）と、高度可変領域（アミノ酸４１３〜４４２個）を含む。
【００１７】
マウスのＤＵＢ（ｍＤＵＢ）サブファミリーメンバーは、さらに機能的な基準において他のＵＢＰと異なる。ｍＤＵＢサブファミリーメンバーは、サイトカイン誘導性の前初期遺伝子であり、それゆえに細胞成長または分化において調節作用を有する可能性がある。また、ＤＵＢタンパク質は不安定であり、それらが誘導された直後にユビキチン介在タンパク質分解により迅速に分解される。
【００１８】
ｍＤＵＢに関する報告によれば、ＩＬ−２やＩＬ−３のような特異的なサイトカインは、特異的な脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）を誘導することを実証している。これらのＤＵＢタンパク質は、ユビキチン−タンパク分解経路を修飾し、それにより特異的な細胞成長または分化シグナルに介在する可能性がある。これら修飾は、時間的に調節されている。例えば、ＤＵＢ−２タンパク質は、ＩＬ−２により、迅速に、ただし、一過性に誘導される。ＤＵＢ酵素の特異的イソペプチダーゼ阻害剤による干渉は、特異的サイトカインシグナル伝達現象をブロックする可能性がある。
【００１９】
従来技術によれば、ＤＵＢとの相同性を示すいくつかの部分配列が示されている；特に、ＥＰ１０７４６１７Ａ２に記載の、ヒトｃＤＮＡ配列、配列番号１７１６８；ＷＯ２００１１０９０３Ａ２に記載の、ヒトプロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビターＰＰＩＭ−４をコードするｃＤＮＡ；および、ＷＯ２００１２３５８９Ａ２に記載の、ヒトユビキチンプロテアーゼ２３４３１をコードする配列。
【００２０】
参考文献
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【００２１】
Ｓｃｏｔｔ  Ｅｍｒは、後期エンドソームでの、タンパク質の選別におけるモノユビキチン化に関する役割を説明しており、この後期エンドソームは、どのタンパク質（新しく合成されたタンパク質とエンドサイトーシスされたタンパク質の両方）が、液胞内腔に送達されるか、そしてその境界膜のいずれに送達されるかを決定することにおいて役割を有する。内腔に方向づけられたタンパク質は、エンドソーム成熟の多胞体（ＭＶＢ）ステージで内部の小胞に選別され、その一方で、液胞の膜または細胞質膜へのリサイクルに方向づけられたタンパク質は、エンドソームの境界膜内に残留する。Ｅｍｒは、液胞の加水分解酵素のＭＶＢ小胞への選別は、この積荷（ｃａｒｇｏ）分子の特異的なリシン残基でのモノユビキチン化が必要であることを示した（Ｋａｔｚｍａｎｎ等，２００１年）。従って、モノユビキチン化は、この重要な細胞内の交差点で液胞内腔へ通行する際の青信号である。交通を指示する警察官は、エンドソームに局在するタンパク質複合体（ＥＳＣＲＴ−Ｉという）であり、その成分の一つであるＶｐｓ２３は、積荷のユビキチンシグナルの認識において重要な役割を果たす（Ｋａｔｚｍａｎｎ等，２００１年）。Ｖｐｓ２３は、ＵＥＶタンパク質（ユビキチンＥ２変異体）の小規模ファミリーの一つであり、Ｅ２と類似しているが、標準的なＥ２機能を行うことができない。ＥＳＣＲＴ−Ｉ複合体はユビキチンに結合するが、Ｖｐｓ２３を突然変異させることによりＭＶＢ経路でのユビキチン依存性の選別行われなくなり、ユビキチンのＥＳＣＲＴ−Ｉへの結合が不可能になる。Ｖｓｐ２３がユビキチンに直接結合するモデルは、未だ推論の域を出ないが、様々なＵＥＶタンパク質の構造の研究から支持を得ている。興味深いことに、Ｖｐｓ２３の哺乳動物の相同体（ｔｓｇ１０１として知られている）は、腫瘍サプレッサーである（ＬｉおよびＣｏｈｅｎ，１９９６年）。目下の研究結果によれば、ｔｓｇ１０１における突然変異により、受容体が不適切に細胞質膜へリサイクリングされるために、成長因子受容体による持続的なシグナル伝達を起こす可能性があり、そのため腫瘍形成を引き起こすことが示されている。
【００２２】
エンドサイトーシスの第一段階（細胞質膜のタンパク質の内在化）を引き起こす際のモノユビキチン化の役割はよく確立されているが（Ｈｉｃｋｅ，２００１年）、どのようにこのシグナルが認識されるかは不明確である。Ｌｉｎｄａ  Ｈｉｃｋｅは、酵母Ｅｎｔ１が、酵母因子受容体のユビキチン依存性エンドサイトーシスに必要であることを報告している（またはＷｅｎｄｌａｎｄ等，１９９９年を参照）。Ｅｎｔ１は、ＵＩＭドメインという予測されるユビキチン結合モチーフを有し（ＨｏｆｍａｎｎおよびＦａｌｑｕｅｔ，２００１年）、Ｈｉｃｋｅは、実際にＥｎｔ１はユビキチンと直接結合していることを示した。Ｅｎｔ１はまた、クラスリンと結合し（Ｗｅｎｄｌａｎｄ等，１９９９年）、それによりモノユビキチン化積荷分子をエンドサイトーシス機構に連結させる準備ができる。ＨｉｃｋｅとＥｍｒの研究結果によれば、２つの異なる配送の結果をもたらすように指示するモノユビキチンの能力は、部分的に、関連シグナル認識成分が別個に局在することに
依存する（Ｅｎｔ１は細胞質膜に存在し、ＥＳＣＲＴ−Ｉは後期エンドソームに関連する）ということが示唆されている。
【００２３】
ファンコーニ貧血（ＦＡ）は、ＤＮＡ損傷に対する細胞の感受性に関連する珍しいガン感受性障害であり、少なくとも７つの遺伝子の突然変異により発症する可能性がある。Ａｌａｎ  Ｄ’Ａｎｄｒｅａは、ＦＡの分子機構に新たな光を当てた：１種のＦＡタンパク質（Ｄ２として知られる）における特異的なリシン残基のモノユビキチン化は、４つの上流のＦＡ遺伝子の活性を必要とし、核内でのＤ２の再局在化を引き起こす（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａ等，２００１年）。正常な細胞においては、ＤＮＡ損傷後に、Ｄ２のモノユビキチン化が著しく増強され、これはＤ２とＢＲＣＡ１を損傷に関連して核内中心に標的化させるために厳密に必要とされる。従って、Ｄ２のモノユビキチン化は、ＦＡタンパク質複合体をＢＲＣＡ１修復機構に連結させる。この経路における下流での現象は未だ不明確であるが、シグナル認識因子の局在が不可欠である可能性が高い。この新しいユビキチンの機能は、Ｓｕｍｏ−１、ＵｂＬの、タンパク質の特異的核内構造への標的化に関与すると考えられている特定の役割の強い特徴を有する（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，２０００年）。
【００２４】
ポリユビキチン鎖は、２６Ｓプロテアソームによる基質の破壊に関するシグナルとしてよく知られている。しかしながら、ユビキチンの様々なリシンに結合する数種の鎖が存在し、これは、様々な鎖が別個のシグナルである可能性を示唆する（Ｐｉｃｋａｒｔ，２０００年）。Ｊａｍｅｓ  Ｃｈｅｎは、多数の逆向の調節の実例とは異なり、標準的でないポリユビキチン化が、リン酸化を活性化し得ることを示すことによって、この仮説の正確な証明を提供している（ＨｅｒｓｈｋｏおよびＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，１９９８年）。複製後ＤＮＡ修復とＩｋＢαキナーゼ（ＩＫＫ）活性化は、通常、プロテアソームのタンパク質分解を指示するＬｙｓ４８−鎖よりむしろ、Ｌｙｓ６３を介して結合した鎖を必要とする。Ｃｈｅｎにより、Ｔａｋ１キナーゼは、ＩＫＫ活性化経路においてＬｙｓ６３−鎖が指示する下流の標的であることが発見された。これら鎖の集合は、異常なＵＥＶ／Ｅ２複合体と、ＲＩＮＧフィンガータンパク質、Ｔｒａｆ６に依存する（Ｄｅｎｇ等，２０００年）（ＲＩＮＧフィンガーは、大規模なＥ３ファミリーを定義する）。Ｔｒａｆ６のＬｙｓ６３−鎖での修飾によりＴａｋ１の活性化が起こり、順にＩＫＫをリン酸化する（Ｗａｎｇ等，２００１年）。次に、活性化ＩＫＫは、ＩｋＢαをリン酸化し、Ｌｙｓ４８−鎖でのタグ付けを開始させる。そうすることによって初めてプロテアソームが出現し、ＩｋＢαを分解し、それによりそのパートナーＮＦｋＢを遊離し核に転送し、炎症反応性遺伝子の発現を活性化する。Ｃｈｅｎの研究結果によれば、Ｔｒａｆ６は、Ｌｙｓ６３−鎖の標的であり、同様に、そのアセンブリの触媒であることが示唆されている。実際には、その他多くのＲＩＮＧ  Ｅ３も、自己修飾を行うが、結果としてＴｒａｆ６で観られるその種の特徴的な変化よりも自滅する可能性が高い（Ｌｙｓ４８−鎖でのタグ付けを参照）（ＪｏａｚｅｉｒｏおよびＷｅｉｓｓｍａｎ，２０００年）。異なるＲＩＮＧタンパク質であるＲａｄ５ヘリカーゼが、関連するＵＥＶ／Ｅ２複合体に結合するようなＤＮＡ修復に、類似のメカニズムが適用されるかどうかは未だ不明である（ＵｌｒｉｃｈおよびＪｅｎｔｓｃｈ，２０００年）。Ｈｅｌｌｅ  Ｕｌｒｉｃｈにより報告された新しい遺伝学的データは、ＤＮＡ修復におけるＬｙｓ−６３鎖シグナル伝達でのＲａｄ５の中核となる重要性を確認するものである（Ｕｌｒｉｃｈ，２００１年）。
【００２５】
これらの報告によれば、タンパク質のユビキチン化の多種多様な新しい機能と、その機能と核や細胞内の小胞内腔を含む細胞レベル下の配送との考えられる関連が示唆されている。従って、様々な細胞内局在における脱ユビキチン化プロテアーゼによるユビキチン化の調節は、非常に重要な問題になりつつある。
【００２６】
近年、移行可能な、すなわちエネルギーに依存しない方式で細胞膜や核膜を通過して移
動することができる多数のタンパク質が同定されている。移行配列が、ヒトピリオドタンパク質のような概日リズムに関与するタンパク質において同定されている。これらタンパク質は、細胞膜や核膜を通過してより自由に移動し、この動きは協調した制御を可能にすると考えられている。これまでに、移行できるか、ＮＬＳを保持することができる脱ユビキチン化活性に関与するその他の酵素は同定されていない。
【００２７】
Ｃ末端にＮＬＳが存在することにより、ｈＤＵＢ７およびそのマウスのオーソログ、ｍＤＵＢ７は、恐らくインポーチン依存性での核移行が可能であり、これらＤＵＢが、核に移行したユビキチン化核タンパク質および／またはユビキチン化タンパク質を脱ユビキチン化することにおいて役割を有することが示される。これまで、このことは確認されていなかった。タンパク質のユビキチン化は、プロテアソーム分解に選択的に標的化し、および／または、タンパク質の局在を促進させる。従って、核タンパク質の脱ユビキチン化は、核タンパク質の分解、同様に、核タンパク質局在の調節における独特な機能において、ある役割を有する可能性がある。同じ論理が、標的化配列によるＤＵＢ７の液胞の標的化、液胞のタンパク質分解の調節に適用させることができ、同様に、液胞タンパク質の配送に関連させることができる。
【００２８】
参考文献
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between ubiquitin-conjugating enzymes in DNA repair. EMBO J., 19:3388-3397. 
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、マウスのＤＵＢのヒト相同体、第７染色体で見出された造血細胞特異的なサイトカイン誘導性の脱ユビキチン化プロテアーゼ、それぞれの調節領域およびそれぞれｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７と名付けられたそのマウスのオーソログの同定に関する。ｈＤＵＢ７およびそのマウスのオーソログであるｍＤＵＢ７はいずれも、ヒトおよびマウスのゲノムデータベースをマウスのＤＵＢ−１およびＤＵＢ−２配列を用いて検索することにより同定された。これらの遺伝子（ｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７）は、欠失により生じるギャップをミスマッチとしてカウントしない場合、互いに６７％のアミノ酸の同一性を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を共有し、ヌクレオチド配列において７５％の同一性を示す。その上、ｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７はいずれも、２９７個のアミノ酸コアのＤＵＢ配列においてマウスのＤＵＢ、ＤＵＢ１およびＤＵＢ２と４８％の同一性を有する。加えて、ｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７遺伝子は、５４０個のアミノ酸からなるＮ末端のユビキチンプロテアーゼドメインにおいて、９２％超のアミノ酸が同一性なオープンリーディングフレームを有する（３１３個のアミノ酸からなるコアにおいては９８.４％の同一性を有する）。これら遺伝子はまた、数種の予測される核局在化配列（ＮＬＳ）と、移行能力を有することがわかっているアミノ酸配列のストレッチ（ＫＡＫＫＨＫＫＳＫＫＫＫＫＳＫＤＫＨＲ、および、ＨＲＨＫＫＫＫＫＫＫＫＲＨＳＲＫ）とを含む１３８個のアミノ酸からなるＣ末端の保存されたドメインにおいて、７４％の同一性を示す。それゆえに、本発明はまた、積荷分子に結合したｈＤＵＢ７またはｍＤＵＢ７のＮＬＳまたは移行配列を含む移行ペプチドに関する。本発明はまた、ＮＬＳを含む移行ペプチドを含み、また、移行配列は、ＫＡＫＫＨＫＫＳＫＫＫＫＫＳＫＤＫＨＲ、ＨＲＨＫＫＫＫＫＫＫＫＲＨＳＲＫ、ＫＫＨＫＫＳＫＫＫＫＫＳＫＤＫＨＲ、およびＨＲＨＲＫＫＫＫＫＫＫＲＨＳＲＫを含むペプチドの断片からなる群より選択される。本発明はまた、積荷分子が、生物学的に活性なタンパク質、治療上有効な化合物、アンチセンスヌクレオチド、または試験化合物である移行ペプチドを含む。本発明はまた、生物学的に活性なタンパク質、治療上有効な化合物、アンチセンスヌクレオチド、または試験化合物を細胞に送達する方法を含み、該方法において、移行ペプチドは、外部から細胞に加えられる。
【００３０】
低分子化合物によるこれら遺伝子産物の操作により、（１）炎症性サイトカインシグナル伝達を調節することにより炎症を低減させること、（２）リンパ球の増殖に重要なサイトカイン受容体シグナル伝達を調節することにより自己免疫疾患を調節すること、および（３）上記メカニズムを用いた感染の際の免疫過剰反応を調節することができる。
【実施例】
【００３１】
ｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７を同定するための検索方法：
ｍＤＵＢ１（Ｕ４１６３６）、ｍＤＵＢ２（Ｕ７０３６８）、およびｍＤＵＢ２Ａ（ＡＦ３９３６３７）のＤＮＡ配列を用いて、可能な相同体に関して、ＧｅｎＢａｎｋのｎｒ（全て重複のないＧｅｎＢａｎｋのＣＤＳ翻訳＋ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＰＲＦ）で検索した。Ｃ末端が不完全なｃＤＮＡ（ＡＫ０２２７５９）（１１９７個のアミノ酸をｒｕｎ−ｏｆｆ翻訳で発現することができる３６６０個のヌクレオチド）との相同性が見出された。インシリコでクローニングするために、ＥＳＴ伸長反応とゲノム配列アノテーションの両方の方法を用いた。ＡＫ０２２７５９の配列を用いて、ヒトＥＳＴとゲノム配列に対して検索した。ＡＫ０２２７５９をＥＳＴとのマッチングに基づき手動で伸長させ、第７染色体からのコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）ＮＴ＿００７８４４.８でゲノ
ム配列をマッピングした。これらから、ｈＤＵＢ７のオープンリーディングフレームに関する完全長配列が得られた（１３１６個のアミノ酸長を有するポリペプチドを生産することができる、３９５１個のヌクレオチド長を有するＤＮＡセグメント）。
【００３２】
予測される全長ｍＤＵＢ７をインシリコでクローニングするために、ｈＤＵＢ７アミノ酸配列を用いて、ｂｌａｓｔｐによりｎｒで検索した。マウスタンパク質に対して最も一致したのは、ｍＤＵＢ２に類似したタンパク質である。このタンパク質の登録番号はＢＡＢ２７１９０であり、ヌクレオチド配列の登録番号はＡＫ０１０８０１である（４８７個のアミノ酸をｒｕｎ−ｏｎ翻訳で翻訳することができる１４８５個のヌクレオチド長を有する）。Ｇｅｎｂａｎｋアノテーションに基づけば、その遺伝子は、Ｃ末端が不完全な部分配列を有する。全長ｍＤＵＢ７を得るために、ＡＫ０１０８０１のヌクレオチド配列を用いて、マウスゲノム配列で検索した。マウスの補正されたＮＴコンティグデータベースでは適合がなく、Ｇｅｎｂａｎｋで、マウスＡｒａｃｈｎｅ＿Ｎｏｖ３０データベースからのコンティグ＿７０７９５で適合が見出された（マウスＷＧＳの予備アセンブリは、１１月９日に凍結したＷＧＳデータに基づき読み出す）。ＧＥＮＳＣＡＮで予測することによりコンティグ＿７０７９５からの推定の遺伝子をアノテーションした。ＢＡＢ２７１９０と完全にアラインされた伸長／終止したＣ末端を有する１つの予測されるタンパク質が見出されたが、配列の中央部で３３個のアミノ酸を欠失していた。ＢＡＢ２７１９０からの３３個のアミノ酸セグメントのヌクレオチド配列をマウスゲノム配列に対して検索し、予測される全長ｍＤＵＢ７を生成し、可能性があるスプライシング部位を境界に有するゲノム配列領域に一致することがわかった。これは、ＧＥＮＳＣＡＮアノテーションによりエキソンが失われたことを意味する。ゲノム配列アライメントに従って、３３個のアミノ酸を推定のタンパク質に付加することにより全長マウスＤＵＢ７を構築した（１３２６個のアミノ酸長を有するポリペプチドを生産することができる、３９８１個のヌクレオチド長を有するオープンリーディングフレーム）。最終的なｍＤＵＢ７配列をｈＤＵＢ７と並べたところ、アミノ酸レベルで６７％の相同性を示し、ヌクレオチドレベルで７５％の相同性を示した。
【００３３】
ヒト免疫細胞での様々な刺激に対するｈＤＵＢ７発現のＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ分析
プライマーとしてランダムヘキサマーを用いたトータル細胞ＲＮＡからの逆転写（ＲＴ）プロトコール（ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）を使用）
トータルＲＮＡ１μｇを、１×ＴａｑＭａｎＲＴ緩衝液ミックス１００μｌ（５.５ｍＭのＭｇＣｌ2、０.５ｍＭのｄＮＴＰ、２.５μＭのランダムヘキサマー、４０Ｕのリボヌクレアーゼインヒビター、１２５ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素）中に調製。上下にピペッティングすることにより混合する。２５℃で１０分間（アニーリング工程）、４８℃で３０分間（逆転写）、および９５℃で５分間（酵素の加熱不活性化）インキュベートする。サンプルを機械装置に４℃で放置してもよいし、その代わりに、−２０℃で保存してもよい。少量の放射性ｄＡＴＰ（またはｄＣＴＰ）を取り込ませることによりｃＤＮＡ合成の収率を測定することができる。このプロトコールにおけるＲＮＡからｃＤＮＡへの変換の平均効率は、６０〜８０％である。
【００３４】
ＴａｑＭａｎリアルタイム定量ＰＣＲのプロトコール
ＴａｑＭａｎＲＴ産物１μｌを、１×マスターミックス１２.５μｌ（アプライドバイオシステムズ，カタログ番号４３０４４３７（プライマーとプローブ以外の全ての必要な反応成分を含む）、０.９μＭのフォワードプライマー、０.９μＭのリバースプライマー、０.２μＭのプローブ）に調製。上下にピペッティングすることにより混合する。コントロールとしてＧＡＤＰＨプライマー対とプローブを含むサンプルも調製した。サーマルサイクリングとリアルタイム増幅の検出をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ配列検出システムを用いて行った。ＰＣＲの対数期中に測定されたＣt値に基づき、ＧＡＤＰＨコントロールに対する相対値として標的遺伝子の量を得た。
【００３５】
用いられたプライマー−プローブセットは以下の通りである：
フォワードプライマー：５’−ＣＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＴＡＧ−３’
リバースプライマー：５’−ＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＧ−３’
プローブ配列：５’−ＣＡＡＣＴＧＴＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＴＣＧＧＴＴＴＣＡＣＧＡＡ−３’。
【００３６】
【表１】
2005520567.tif 000002
【００３７】
【表２】
2005520567.tif 000003
【００３８】
【表３】
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【００３９】
【表４】
2005520567.tif 000005
【００４０】
【表５】
2005520567.tif 000006
【００４１】
【表６】
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【００４２】
【表７】
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【００４３】
【表８】
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【００４４】
【表９】
2005520567.tif 000010
【００４５】
脱ユビキチン化分析
ＤＵＢが脱ユビキチン化酵素であるという確認は、これまでに同定されたユビキチン−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の脱ユビキチン化分析を用いて示すことができ、この分析は以前に文献で説明されている。簡単に言えば、野生型ＤＵＢのｃＤＮＡ（アミノ酸１〜約５００に相当する）とミスセンス突然変異を含むｃＤＮＡに基づく、約１,５００個のヌクレオチドのＤＵＢ断片をＰＣＲにより生産し、これを、ｐＧＥＸ（ファルマシア）のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コーディング要素の下流にフレームを合わせて挿入する。ｐＡＣＹＣ１８４を基礎とするプラスミドからＵｂ−Ｍｅｔ−ｇａｌを発現させる。プラスミドをＭＣ１０６１Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに指示通りに共形質転換させる。プラスミドを含むＥ，ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１細胞を溶菌させ、ウサギ  抗ｇａｌ抗血清（Ｃａｐｐｅｌ）、ウサギ抗ＧＳＴ抗血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、およびＥＣＬシステム（アマシャム社）を用いて免疫ブロット法で分析する。インビトロでの脱ユビキチン化酵素の活性は、基質として市販のポリユビキチン化タンパク質を用いて精製ｈＤＵＢ融合タンパク質により示すことができる。
【００４６】
ｈＤＵＢ７およびｍＤＵＢ７は、炎症性サイトカイン特異的な前初期遺伝子の可能性がある
ｍＤＵＢ−１は、初めはＩＬ−３誘導性の前初期遺伝子としてクローニングされた。同様に、ｍＤＵＢ−２は、ＩＬ−２誘導性の前初期遺伝子としてクローニングされた。我々は、アフィメトリックスチップ分析と様々なＴａｑＭａｎ分析により、ヒト臓器のＲＮＡサンプルと、ヒト免疫細胞のＲＮＡサンプルを用いて、これら遺伝子の誘導性と細胞型特異的な発現を試験した。我々のデータによれば、ｈＤＵＢ７発現は、単球およびその他の骨髄細胞型では明らかではなかったが、数人のドナーから得られた新鮮なヒトＰＢＭＣでは強く発現されることが示される。その上、数種のリンパ球の濃縮細胞集団（Ｂ細胞、Ｔｈ−１およびＴｈ−２が分化した状態のＣＤ４＋Ｔ細胞、同様に、バルクのＣＤ４＋Ｔ細胞を含む）は、適切な刺激により顕著なアップレギュレーションを示した。現在、我々は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、場合によってはＮＫ／ＮＫ−Ｔ細胞における、刺激によるアップレギュレーションの可能性を除外することはできない。
【００４７】
ｕｂｐスーパーファミリーのＤＵＢサブファミリー
これらのデータから、我々は、ｈＤＵＢ４とｈＤＵＢ８は、ｍＤＵＢサブファミリー（ｍＤＵＢ１、ｍＤＵＢ２、およびｍＤＵＢ２Ａを含む）に最も高い類似性を示す、ＤＵＢサブファミリーという脱ユビキチン化酵素の別個のサブファミリーのメンバーであることを提唱する。ＤＵＢサブファミリーメンバーは、その他のｕｂｐとは区別される別個の構造的特徴を有する。
【００４８】
第一に、ＤＵＢサブファミリーメンバーは、約５００〜５５０個のアミノ酸からなる比較的小さい酵素である。第二に、ＤＵＢサブファミリーメンバーは、ＣｙｓドメインおよびＨｉｓドメインだけでなく、それらの一次アミノ酸配列にわたってアミノ酸の類似性を有する。例えば、ＤＵＢタンパク質は、リシンが豊富な領域（Ｌｙｓドメイン）と、それらのカルボキシル末端の近辺にＨＶドメインを含む。
【００４９】
各ｈＤＵＢ７の調節領域またはプロモーター領域を予測される転写因子結合モチーフに関してＴＲＡＮＳＦＡＣＦｉｎｄ、ダイナミックプログラミング法、を用いて分析した（Ｈｅｉｎｅｍｅｙｅｒ，Ｔ．等の「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ＴＲＡＮＳＦＡＣ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｔｏｗａｒｄｓ  ａｎ  ｅｘｐｅｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７，３１８〜３２２（１９９９年）を参照）。Ｔｒａｎｓｆａｃデータベースより、真核性のシス−およびトランス作用性の調節要素が得られる。データは表Ｘとして示される。
【００５０】
【表１０】
2005520567.tif 000011
【００５１】
【表１１】
2005520567.tif 000012
【００５２】
【表１２】
2005520567.tif 000013
【００５３】
【表１３】
2005520567.tif 000014
【００５４】
【表１４】
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【００５５】
【表１５】
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【００５６】
【表１６】
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【００５７】
【表１７】
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【００５８】
【表１８】
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【００５９】
【表１９】
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【００６０】
【表２０】
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【００６１】
【表２１】
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【００６２】
【表２２】
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【００６３】
【表２３】
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【００６４】
【表２４】
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【００６５】
【表２５】
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【００６６】
【表２６】
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【００６７】
【表２７】
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【００６８】
【表２８】
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【００６９】
【表２９】
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【００７０】
【表３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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