(57)【要約】本発明は、遺伝子発現の全体的な変化の解明と既知の毒に曝された肝臓組織又は細胞中の毒性マーカーの同定に基づいている。医薬スクリーニング及び毒性アッセイにおいて、遺伝子が毒性マーカーとして使われる。本発明は、マイクロアレイ及びその他の固相プローブと共に使用するように設計された、肝臓毒に誘導された差次的な発現によって特徴づけられる遺伝子のデータベースを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の少なくとも１つの毒作用を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞試料の遺伝子発現プロファイルを作成すること、及び
（ｂ）当該遺伝子発現プロファイルを表１〜５のデータ又は情報の少なくとも一部を含むデータベースと比較すること
を含む方法。
【請求項２】
前記組織又は細胞試料から作成された前記遺伝子発現プロファイルが少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子の発現レベルが表１〜５の毒性平均及び／又は非毒性平均の値と比較される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現レベルが比較の前に規格化される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記データベースが表１〜５のデータ又は情報の実質的にすべてを含む、請求項４に記載の方法
【請求項６】
前記組織又は細胞試料が肝臓組織又は肝臓細胞試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
化合物の少なくとも１つの毒作用を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞試料において、表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の遺伝子の差次的発現が少なくとも１つの毒作用を示唆している、方法。
【請求項８】
化合物の毒作用の進行を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞試料において、表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の遺伝子の差次的発現が毒性の進行を示唆している、方法。
【請求項９】
化合物の肝毒性を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞試料において、表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の遺伝子の差次的発現が肝毒性を示唆している、方法。
【請求項１０】
毒性反応の発症又は進行を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）細胞を当該薬剤及び既知の毒に曝すこと、及び
（ｂ）表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表１〜３の中の遺伝子の差次的発現が毒性を示唆している、方法。
【請求項１１】
細胞中で化合物が調節する細胞経路を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞において、表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、
ここで、表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の遺伝子の差次的発現が少なくとも１つの細胞経路の調節と関連している、方法。
【請求項１２】
少なくとも３個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも４個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも５個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも６個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも７個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも８個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも９個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１０個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記作用が、発癌、胆汁鬱帯、肝炎、肝肥大、炎症、肝壊死、脂肪肝及びペルオキシソーム増殖からなる群から選択される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項２１】
前記肝毒性が、発癌、胆汁鬱帯、肝炎、肝肥大、炎症、肝壊死、脂肪肝及びペルオキシソーム増殖からなる群から選択される少なくとも１つの肝臓疾患の病理と関連している、請求項９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞経路が、アセトアミノフェン、２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）、アシクロビル、ＡＮＩＴ、ＡＹ−２５３２９、ＢＩ肝毒素、クロロホルム、ビカルタミド、四塩化炭素、クロロホルム、ＣＩ−１０００、クロフィブラート、コルヒチン、ＣＰＡ、ジクロフェナク、ジフルニサル、ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）、ダイオキシン、１７α−エチニルエストラジオール、ゲムフィブロジル、ヒドラジン、インドメタシン、ＬＰＳ、メナジオン、フェノバルビタール、タクリン、チオアセタミド、バルプロ酸、Ｗｙ−１４６４３及びジロートンからなる群から選択される毒によって調節される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
各プローブが表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む、少なくとも２個のプローブのセット。
【請求項２４】
前記セットが少なくとも３個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項２３に記載のプローブのセット。
【請求項２５】
前記セットが少なくとも５個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項２３に記載のプローブのセット。
【請求項２６】
前記セットが少なくとも７個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項２３に記載のプローブのセット。
【請求項２７】
前記セットが少なくとも１０個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項２３に記載のプローブのセット。
【請求項２８】
前記プローブが固体支持体に取り付けられている、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載のプローブのセット。
【請求項２９】
前記固体支持体が、膜、ガラス支持体及びシリコン支持体からなる群から選択される、請求項２８に記載のプローブのセット。
【請求項３０】
各プローブが表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む、少なくとも２個のプローブを含む固体支持体。
【請求項３１】
前記固体支持体が、１平方センチメートル当たり、少なくとも１０個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項３０記載の固体支持体。
【請求項３２】
前記固体支持体が、１平方センチメートル当たり、少なくとも約１００個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項３１記載の固体支持体。
【請求項３３】
前記固体支持体が、１平方センチメートル当たり、少なくとも約１，０００個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項３１記載の固体支持体。
【請求項３４】
前記固体支持体が、１平方センチメートル当たり、少なくとも約１０，０００個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項３１記載の固体支持体。
【請求項３５】
（ａ）肝臓毒に曝された組織又は細胞試料において、表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の少なくとも２個の遺伝子を含む遺伝子セットの発現レベルを同定する情報を含むデータベース、及び
（ｂ）前記情報を見るためのユーザーインターフェース
を含むコンピューターシステム。
【請求項３６】
前記データベースが前記遺伝子の配列情報をさらに含む、請求項３５に記載のコンピューターシステム。
【請求項３７】
前記データベースが肝臓毒に曝される前の組織又は細胞試料における前記遺伝子セットの発現レベルを同定する情報をさらに含む、請求項３５に記載のコンピューターシステム。
【請求項３８】
前記データベースが少なくとも第二の肝臓毒に曝された組織又は細胞試料における前記遺伝子セットの発現レベルを同定する情報をさらに含む、請求項３５に記載のコンピューターシステム。
【請求項３９】
請求項３５〜３８のいずれか１項に記載のコンピューターシステムであって、外部データベースからの記述的な情報を含む記録をさらに含み、当該情報は前記遺伝子を当該外部データベースの記録に関連する、コンピューターシステム。
【請求項４０】
前記外部データベースがＧｅｎＢａｎｋである、請求項３９に記載のコンピューターシステム。
【請求項４１】
組織又は細胞試料における表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを同定する情報を提示するために、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載のコンピューターシステムを用いる方法であって、
（ａ）試験薬剤に曝された組織又は細胞試料における、表１〜３の中の少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを、データベース中の遺伝子の発現レベルと比較すること
を含む方法。
【請求項４２】
少なくとも２個の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも５個の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１０個の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
組織又は細胞試料における少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを、毒に曝されたときの発現レベルと比較して表示するステップを更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記既知の毒が肝臓毒である、請求項１０に記載の方法。
【請求項４７】
前記肝臓毒が、アセトアミノフェン、２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）、アシクロビル、ＡＮＩＴ、ＡＹ−２５３２９、ＢＩ肝毒素、クロロホルム、ビカルタミド、四塩化炭素、クロロホルム、ＣＩ−１０００、クロフィブラート、コルヒチン、ＣＰＡ、ジクロフェナク、ジフルニサル、ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）、ダイオキシン、１７α−エチニルエストラジオール、ゲムフィブロジル、ヒドラジン、インドメタシン、ＬＰＳ、メナジオン、フェノバルビタール、タクリン、チオアセタミド、バルプロ酸、Ｗｙ−１４６４３及びジロートンからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の遺伝子のほぼすべてが検出される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの少なくとも１つの表の中のすべての遺伝子が検出される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記遺伝子の遺伝子発現情報と共にパッケージされた、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の少なくとも１個の固体支持体を含むキット。
【請求項５１】
前記遺伝子発現情報が、肝臓毒に曝された組織又は細胞試料における遺伝子発現情報を含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記遺伝子発現情報が電子フォーマットである、請求項５１のキット。
【請求項５３】
化合物への曝露がインビボ又はインビトロである、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記発現レベルが増幅アッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイによって検出される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記増幅アッセイが定量的又は半定量的ＰＣＲである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ハイブリダイゼーションアッセイが、ノーザンブロット、ドットブロット、スロットブロット、ヌクレアーゼ保護及びマイクロアレイアッセイからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ及び５ＷＷＷの中の遺伝子によってコードされるタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）当該タンパク質を当該薬剤に曝すこと、及び
（ｂ）当該タンパク質の少なくとも１つの活性をアッセイすること
を含む方法。
【請求項５８】
前記薬剤が前記タンパク質を発現している細胞に曝される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞が既知の毒に曝される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記毒が前記タンパク質の発現を調節する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記遺伝子の発現レベルが表５Ａ〜５ＷＷＷの毒性平均及び／又は非毒性平均の値と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
前記発現レベルが比較の前に規格化される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記組織又は細胞試料が肝臓組織又は肝臓細胞試料である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
（ａ）肝臓毒に曝された組織又は細胞試料において、表５Ａ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ、５Ｇ、５Ｉ、５Ｋ、５Ｌ、５Ｍ、５Ｎ、５Ｏ、５Ｑ、５Ｓ、５Ｔ、５Ｕ、５Ｖ、５Ｗ、５Ｘ、５Ｚ、５ＢＢ、５ＤＤ、５ＦＦ、５ＧＧ、５ＨＨ、５ＩＩ、５ＪＪ、５ＬＬ、５ＭＭ、５ＮＮ、５ＰＰ、５ＲＲ、５ＳＳ、５ＴＴ、５ＵＵ、５ＶＶ、５ＷＷ、５ＸＸ、５ＺＺ、５ＢＢＢ、５ＤＤＤ、５ＥＥＥ、５ＦＦＦ、５ＧＧＧ、５ＨＨＨ、５ＩＩＩ、５ＫＫＫ、５ＬＬＬ、５ＭＭＭ、５ＮＮＮ、５ＯＯＯ、５ＰＰＰ、５ＲＲＲ、５ＳＳＳ、５ＴＴＴ、５ＵＵＵ及び５ＶＶＶの中の実質的にすべての遺伝子を含む遺伝子セットの発現レベルを同定する情報を含むデータベース、及び
（ｂ）前記情報を見るためのユーザーインターフェース
を含むコンピューターシステム。
【請求項６５】
表５Ａ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ、５Ｇ、５Ｉ、５Ｋ、５Ｌ、５Ｍ、５Ｎ、５Ｏ、５Ｑ、５Ｓ、５Ｔ、５Ｕ、５Ｖ、５Ｗ、５Ｘ、５Ｚ、５ＢＢ、５ＤＤ、５ＦＦ、５ＧＧ、５ＨＨ、５ＩＩ、５ＪＪ、５ＬＬ、５ＭＭ、５ＮＮ、５ＰＰ、５ＲＲ、５ＳＳ、５ＴＴ、５ＵＵ、５ＶＶ、５ＷＷ、５ＸＸ、５ＺＺ、５ＢＢＢ、５ＤＤＤ、５ＥＥＥ、５ＦＦＦ、５ＧＧＧ、５ＨＨＨ、５ＩＩＩ、５ＫＫＫ、５ＬＬＬ、５ＭＭＭ、５ＮＮＮ、５ＯＯＯ、５ＰＰＰ、５ＲＲＲ、５ＳＳＳ、５ＴＴＴ、５ＵＵＵ及び５ＶＶＶの中の実質的にすべての遺伝子に、個々に特異的にハイブリダイズするプローブを含むアレイ。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】  ［０００１］  本出願は、２００２年３月１５日に出願された６０／３６４，０４５、２００２年３月１５日に出願された６０／３６４，０５５及び２００２年１２月３０日に出願された６０／４３６，６４３の米国仮出願の優先権を主張するものであり、２００２年１月３１日に出願された係属中の米国出願１０／０６０，０８７の一部継続出願である。さらに、本出願は、米国仮出願６０／２２２，０４０、６０／２４４，８８０、６０／２９０，０２９、６０／２９０，６４５、６０／２９２，３３６、６０／２９５，７９８、６０／２９７，４５７、６０／２９８，８８４、６０／３０３，４５９及び６０／３３１，２７３、並びに、２００１年７月３１日に出願された係属中の米国出願０９／９１７，８００に関連し、これらすべては全体として関連付けにより本明細書に取り入れられる。
【０００２】  （コンパクトディスクによる配列表提出）
［０００２］  本明細書と同時に提出されるコンパクトディスクの配列表はその全体として関連付けにより本明細書中に取り入れられる。４部の配列表（４枚のコンパクトディスクのそれぞれに１部）が提供される。コピー１、コピー２及びコピー３は同一である。コピー１、コピー２及びコピー３はＣＲＦとも同一である。配列表の電子的複製物はそれぞれが２００３年１月３０日に作製され、ファイルサイズは５７９５ＫＢである。ファイル名は下記の通りである：コピー１−ｇｌ５０３８ｕｓ０１．ｔｘｔ；コピー２−ｇｌ５０３８ｕｓ０１．ｔｘｔ；コピー３−ｇｌ５０３８ｕｓ０１．ｔｘｔ；及びＣＲＦ−ｇｌ５０８９ｕｓ０１．ｔｘｔ。
【０００３】  （発明の背景）
［０００３］  細胞又は生物体に対する、化合物、薬剤又は環境汚染物質の有毒な影響力を評価する方法の必要性により、生物学的モニターとして生物体を利用する手法の開発につながってきた。これらの系統の最も単純であり、そして最も便利なものは、酵母やバクテリアのような単細胞の微生物を利用する、というのは、それらが最も簡単に維持され、そして操作されるからである。また、単細胞のスクリーニング系は、細胞に対する試験化合物の効果をモニターするために、たびたび表現型の簡単に検知できる変化を使用する。しかしながら、単細胞の生物は、それらがより高等な生物で見られる範囲、又はレベルで生体内変換を実行する能力を有しないので、複雑な多細胞の動物に対する多くの化合物の潜在的な効果を評価するための適当なモデルではない。
【０００４】  ［０００４］  多細胞生物による化合物の生体内変換は、それらが曝される薬剤の全体的な毒性を決定する上での重要なファクターである。したがって、多細胞のスクリーニング系が、化合物の毒作用を検知するのに、好まれるか、又は要求される。しかしながら、毒性学スクリーニングツールとして多細胞生物を使用することは、酵母又はバクテリアの系で利用できるような、便利なスクリーニングメカニズム又はエンドポイントの欠如によって、かなり阻害されてきた。さらに、毒性学的予測系を作成する以前からの試みによっては、必要なモデリング情報を提供することができなかった（例えば、ＷＯ００／１２７６０、ＷＯ００／４７７６１、ＷＯ００／６３４３５、ＷＯ０１／３２９２８及びＷＯ０１／３８５７９）。
【０００５】  （発明の概要）
［０００５］  本発明は、既知の毒（毒性物質）−特に、肝臓毒−に曝された組織若しくは細胞における、曝されない組織若しくは細胞と比較しての遺伝子発現の全体的な変化の解明、ならびに毒に曝すことにより、発現量に差のある個々の遺伝子の同定に基づく。
【０００６】  ［０００６］  様々な態様で、本発明は化合物の少なくとも１つの毒作用を予測し、化合物の毒作用の進行を予測し、そして化合物の肝臓毒性を予測する方法を含む。また、本発明は、毒性反応の発症又は進行を調節する薬剤を同定する方法をも含む。さらに、化合物が細胞で調節する細胞経路を予測する方法も、また提供される。本発明は、タンパク質活性を調節する薬剤を同定する方法を含む。
【０００７】  ［０００７］  さらなる態様で、本発明は表１〜５ＷＷＷの中の遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含むプローブを提供する。また、前に述べたプローブのうちの少なくとも２つを含む固体支持体も提供される。また、本発明は、肝臓毒に曝された組織又は細胞試料において表１〜５ＷＷＷの中の少なくとも２個の遺伝子を含む遺伝子セットの発現レベルを同定する情報を含んでいるデータベースをもつコンピューターシステムをも含む。
【０００８】  ［０００８］  本発明は、さらに、そこからプローブを作製し固体支持体に取り付けることが可能な、表５Ａ〜５ＷＷＷの中の遺伝子の基本セットを提供する。これらの基本遺伝子は肝毒性のマーカーの好ましいセットとして役立ち、化合物の毒作用を予測若しくはモニターする又は毒性反応の発症若しくは進行を調節する本発明の方法に用いることができる。
【０００９】  （詳細な説明）
［０００９］  多くの生物学的機能は、転写（例えば、開始の制御、ＲＮＡ前駆体の供給、ＲＮＡプロセッシング等を通して）及び／又は翻訳制御を通して、様々な遺伝子の発現を変化させることによって達成される。例えば、細胞周期、細胞分化及び細胞死のような基本的生物学的プロセスは、遺伝子群の発現レベルにおける変化によって、しばしば特徴づけられる。
【００１０】  ［００１０］  遺伝子発現の変化は、生物又は細胞に対する様々な化学物質、医薬、毒、薬剤及び汚染物質の影響とも関連する。例えば、薬剤に曝された後、機能的な腫瘍抑制遺伝子の十分な発現の欠如及び／又は癌遺伝子／癌原遺伝子の過剰発現によって、腫瘍形成又は細胞の過形成増殖がもたされるであろう（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｅｌｌ，６４：３１３−３２６（１９９１）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１１３８−１１４６（１９９１））。このように、特定の遺伝子（例えば、癌遺伝子又は腫瘍サプレッサー）の発現レベルの変化は、特定の化合物に曝されたときの毒性の存在及び進行又はその他の細胞の応答の指標として役に立つであろう。
【００１１】  ［００１１］  遺伝子発現の変化をモニターすることによって、医薬スクリーニング及び開発の間、ある種の利点が提供されるであろう。しばしば、医薬はそれが細胞に対して持つ他の作用を無視して、主要な標的と相互作用する能力についてスクリーンされる。これらの細胞への作用は、動物個体において毒性を引き起こすかもしれないし、そして、それは可能性のある医薬の開発と臨床への使用を妨げる。
【００１２】  ［００１２］  本発明者は、有害な肝臓への影響を誘導する既知の肝臓毒に曝された動物から、組織を調べて、これらの化合物によって誘導される遺伝子発現の全体的な変化を確認した。遺伝子発現の全体的な変化は、発現プロファイルの作成によって検出することができるが、試験化合物による毒性及び／又は毒性進行をモニターするのに用いることができる有用な毒性マーカーを提供する。また、これらのマーカーの一部は、様々な病気又は生理的状態、病気の進行、医薬の効能及び薬物代謝をモニター又は検出するのに用いることができる。
【００１３】  （毒性マーカーの識別）
［００１３］  毒性を予測する遺伝子発現の変化を評価及び識別するために、本発明者らは、十分に特徴付けられた毒性を持つ選択された化合物を用いた研究を実施して、生体内での曝露中に変化した遺伝子発現を分類整理した。本研究では、アセトアミノフェン、２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）、アシクロビル、ＡＮＩＴ、ＡＹ−２５３２９、ＢＩ肝毒素、クロロホルム、ビカルタミド、四塩化炭素、クロロホルム、ＣＩ−１０００、クロフィブラート、コルヒチン、ＣＰＡ、ジクロフェナク、ジフルニサル、ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）、ダイオキシン、１７α−エチニルエストラジオール、ゲムフィブロジル、ヒドラジン、インドメタシン、ＬＰＳ、メナジオン、フェノバルビタール、タクリン、チオアセタミド、バルプロ酸、Ｗｙ−１４６４３、及びジロートンを既知の肝臓毒として選択した。
【００１４】  ［００１４］  芳香族及び脂肪族イソチオシアネートは、一般に使用される土壌燻蒸剤及び殺虫剤である（Ｓｈａａｙａ等（１９９５）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４４（３）：２４９−２５３；Ｃａｉｒｎｓ等（１９８８）  Ｊ  Ａｓｓｏｃ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  ７１（３）：５４７−５５０）。これらの化合物は、植物中に毒性残留物としてとどまるため（Ｃｅｒｎｙ等（１９９６）Ｊ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４（１２）：３８３５−３８３９）、そして土壌から周囲の空気に放出されるため（Ｇａｎ等（１９９８）Ｊ  Ａｇｒｉｃｕｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（３）：９８６−９９０）、環境有害物質でもある。
【００１５】  ［００１５］  α−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ）への曝露は、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ及び血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼの血清レベルを上昇させ、同時に総胆汁流量は減少することが示され、そのどちらも重篤な胆汁機能障害の徴候である。ＡＮＩＴは、黄疽及び胆汁鬱滞（胆汁を分泌できないことによって生じた症状、胆汁物質の血漿蓄積、肝細胞壊死及び胆管閉塞を引き起こす）も誘導する（Ｔａｎａｋａ等（１９９３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２０：５４３−５４７）。ＡＮＩＴは、広範囲の壊死を生成しないが、肝門路に炎症及び浮腫を生成することが見出された（Ｍａｚｉａｓａ等（１９９１）Ｔｏｘｉｃｏｌ  ＡｐｐｌＰｈａｒｍａｃｏｌ  １１０：３６５−３７３）。ＡＮＩＴ誘導肝毒性は、胆細管性肝炎及び胆管損傷によっても特徴付けられる。ＡＮＩＴによって引き起こされたラットの急性肝毒性は、胆管上皮細胞（ＢＤＥＣｓ）及び肝実質細胞の好中球依存性壊死として明らかにされる。これらの変化は、ヒトに見られる胆細管性肝炎を再現している（Ｈｉｌｌ（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ４７：１１８−１２５）。
【００１６】  ［００１６］  組織学的変化は、多形核好中球の浸潤及びアポトーシス性肝細胞数の増加を含む（Ｃａｌｖｏ等（２００１）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８０（４）：４６１−４７０）。ＡＮＩＴへの曝露の他の既知の肝毒性効果は、損傷した抗酸化防御系、スーパーオキシドジスムターゼ及びカタラーゼの活性低下（Ｏｈｔａ等（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １３９（３）：２６５−２７５）、及び肝細胞死滅を仲介する浸潤好中球、アラニンアミノトランスフェラーゼ、カテプシンＧ、エラスターゼからのプロテアーゼの放出を含む（Ｈｉｌｌ等（１９９８）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ１４８（１）：１６９−１７５）。
【００１７】  ［００１７］  強力な発癌物質及び肝腫瘍誘導物質であるモデル化合物、２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）の効果は、ラット肝臓において研究されてきた。２−ＡＡＦは、アポトーシス及び再生細胞増殖の誘引となるミトコンドリアの変化を引き起こすことが示されている。これらは次に、肝臓に肝硬変状の変化を引き起こす。２−ＡＡＦへの曝露は、ＡＬＴ及びＡＳＴのレベルの上昇、ヘモグロビン付加体ならびにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの胎盤形を含有する病巣も生じる。染色体異常、微小核及び姉妹染色分体交換も認められている（Ｂｉｔｓｃｈ等（２０００）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ５５（１）：４４−５１；Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ等（１９９６）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｉｓ  １７：１３２３−１３２９；Ｓａｗａｄａ等（１９９１）Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ２５１（１）：５９−６９）。
【００１８】  ［００１８］  抗ウィルス性グアノシンアナログである、アシクロビル（９−［（２−ヒドロキシエチル）メチル］グアニン、ゾビラックス（登録商標））は、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウィルス（ＶＺＶ）及びエプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）感染を治療するために使用される。アシクロビル治療の最も一般的な副作用は、腎臓の各部、特に尿細管への損傷であるが、該薬剤は肝臓及び神経系に損傷を引き起こすことがある。結晶尿、すなわち尿細管の管腔中でのアシクロビル結晶の沈殿が発生することがある（Ｆｏｇａｚｚｉ（１９９６）  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １１（２）：３７９−３８７）。該薬剤が腎集合管中で結晶化すると、閉塞性腎症及び尿細管壊死が起きることがある（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（２０００）Ｖｅｔ  Ｈｕｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４２（６）：３７０−３７１）。罹患患者からの生検組織の検査は、刷子縁の消失、裏打ち細胞の平坦化及び病巣核消失とともに、近位及び遠位尿細管の拡張を示した（Ｂｅｃｋｅｒ等（１９９３）Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２２（４）：６１１−６１５）。
【００１９】  ［００１９］  アシクロビルを摂取している患者の肝臓損傷は、異常肝臓機能試験によって臨床的に示されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｐｋｉｎｓ−ａｉｄｓ．ｅｄｕ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｂｏｏｋ／ｃｈ６＿ａｃｙｃｌｏｖｉｒ．ｈｔｍｌ）。肝臓での副作用は、肝炎、高ビリルビン血症及び黄疸を含むが（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ．第５６版，１７０７頁，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，２００２）、動物での肝毒性の研究成果はまだ公表されていない。本発明者らによるアシクロビルによって処置したラットに関する研究は、ＢＵＮ及びクレアチニンの血清レベルの上昇を見出している。ＡＬＴ、ＡＳＴ及びトリグリセリド（肝機能の指標）のレベルの低下も見出されているが、肝臓損傷と同様に、腎臓損傷のためである。アシクロビル投与によるラットにおける肝毒性の古典的な徴候は公表されていないが、遺伝子発現の変化は、該薬剤がヒトの肝毒素となることを予測するために使用される。
【００２０】  ［００２０］  アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）は広範に使用されている解熱鎮痛剤であり、アスピリンの効果的な代用品である。アセトアミノフェンは抗炎症特性を持たないが、好ましくは潰瘍を持つ患者、又は長い凝固時間が望ましくない患者に与えられる。アスピリンに対してあまり耐性のない人に摂取されることも好ましい。
【００２１】  ［００２１］  アセトアミノフェンは、シトクロムＰ４５０−仲介プロセスにおけるＮ−ヒドロキシル化によって、Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン（ＮＡＰＱＩ）に代謝される。高い反応性のこの中間体は、グルタチオン中の、及びグルタチオン枯渇後の他の肝臓タンパク質中のスルフヒドリル基と反応して、小葉中心性肝臓壊死（特にゾーン３において）、腎尿細管壊死、ならびに肝臓及び腎臓障害を引き起こすことがある（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．第９版，Ｈａｒｄｍａｎ等，ｅｄｓ．，６３１頁〜６３３頁，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；Ｃｈａｎｄａ等（１９９５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２１（２）：４７７−４８６）。より重篤でない副作用は、皮膚発疹（紅斑及び蕁麻疹）及びアレルギー反応を含む。
【００２２】  ［００２２］  ラットをアセトアミノフェンで処置すると、投与の２４時間後に肝毒性を観察することができ、それは、血清中のＡＬＴ及びＡＳＴの統計的に有意な上昇や光学顕微鏡レベルで見ることができる肝細胞壊死によって判定される（Ｈｅｓｓｅｌ等（１９９６）Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２９（６）：７９３−７９６；Ｂｒｕｃｋ等（１９９９）Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  ４４（６）：１２２８−１２３５）。ラットに投与されたアセトアミノフェンの、高いが致死的でない用量は、肝臓急性期反応ならびに肝細胞の維持及び修復に関与する遺伝子のレベルの上昇も生じさせた：アルギナーゼ、β−フィブリノゲン、α１−酸糖タンパク質、α−チューブリン、ヒストン３、ＴＧＦβ及びサイクリンｄ。細胞周期によって調節される遺伝子の発現レベルは低下した（Ｔｙｇｓｔｒｕｐ等（１９９６）Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２５（２）：１８３−１９０；Ｔｙｇｓｔｒｕｐ等（１９９７）Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２７（１）：１５６−１６２）。マウスにおいては、成長停止及び細胞周期調節タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルは、ストレス誘導遺伝子、転写因子ＬＲＧ−２１、ＳＯＣＳ−２（サイトカイン情報伝達リプレッサ）及びＰＡＩ−１（プラスミノゲン活性化因子阻害物質−１）の発現レベルとともに上昇した（Ｒｅｉｌｌｙ等（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２８２（１）：３２１−３２８）。
【００２３】  ［００２３］  独自の化合物であるＡＹ−２５３２９は、壊死を引き起こすことができる肝臓及び腎臓組織において毒性であることが示されているフェノチアジンである。フェノチアジンは、統合失調症、妄想症、躁病、小児の活動亢進、一部の種類の老衰、及び不安を治療するために使用される向精神薬のクラスである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓｎｅｗ／３６５９１．ｈｔｍｌ）。これらの薬剤の長期使用に関連する副作用は、血圧低下、パーキンソニズム、運動活性低下、視力障害である。
【００２４】  ［００２４］  本発明者らは、血清化学現象の変化によるＡＹ−２５３２９の肝臓及び腎臓効果の指標を認めている。最初の投与後から早くも６時間後に、クレアチニン、ＢＵＮ、ＡＬＴ、トリグリセリド及びコレステロールの血清レベルの統計的に有意な上昇が認められた。腎臓及び肝臓機能障害のこれらのマーカーの大半は、１４日間の研究期間中変化したままであった。光学顕微鏡分析により、肝細胞有糸分裂像数の増加及びグリコーゲン含有量の減少によって証明されるように、早くも６時間及び２４時間後に肝臓での効果が明らかになった。反復投与の１４日後、ネフローゼ及び肝臓の末梢葉（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｌｏｂｅｓ）及び肝細胞の細胞質における変化は、ＡＹ−２５３２９  ２５０ｍｇ／ｋｇ／日を投与したラットで明らかであった。
【００２５】  ［００２５］  モデル化合物であるＢＩ肝毒素は、イヌでの心臓の変化（ＱＴｃ延長）ならびにラットでの肝臓及び心臓の変化を生じる。４週間の期間にわたってラットから収集した肝臓サンプルは、本化合物が鎮静作用を誘導し、体重を減少させ、肝臓重量を増加させ、ＡＳＴ、ＡＬＰ及びＢＵＮの血清レベルをやや上昇させることを示した。３ヶ月の期間にわたって、心血管効果も認められる。
【００２６】  ［００２６］  前立腺癌治療のための薬剤であるビカルタミドの毒性特性は、薬剤の非ステロイド性抗アンドロゲン活性と密接に関連している。ビカルタミドは、テストステロンによる下垂体フィードバックの阻害より生じる前立腺、精巣及び精嚢の萎縮ならびにライディッヒ細胞過形成を含めた、抗アンドロゲンの典型的な効果を生じる。ラットでは、ヒトでは見られなかった良性ライディッヒ細胞腫瘍及びＣＹＰ３Ａ１レベルの上昇が見られたが、ヒトでの肝臓毒性は認められている。ビカルタミドは、肝臓拡大を引き起こし、げっ歯類及びイヌにおいては、混合機能オキシダーゼ誘導物質である。これらの効果は、ラットでの甲状腺肥大及び腺腫ならびに雄性マウスでの肝細胞癌につながる（Ｉｓｗａｒａｎ等（１９９７）Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２２（２）：７５−８８；Ｏｈ等（２００２）Ｕｒｏｌｏｇｙ  ６０（３  Ｓｕｐｐｌ  １）：８７−９３；ＭｃＫｉｌｌｏｐ等（１９９８）Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ２８（５）：４６５−４７８）。ビカルタミドで処置した前立腺癌患者において、肝臓酵素のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬ−Ｐ）及びガンマグアノシン５’−三リン酸（ガンマーＧＴＰ）のレベル上昇が、胸痛、女性化乳房及び顔面紅潮とともに認められた（Ｋｏｔａｋｅ等（１９９６）Ｈｉｎｙｏｋｉｋａ  Ｋｉｙｏ  ４２（２）：１４３−１５３）。
【００２７】  ［００２７］  急性四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘導肝毒性の発病は、ヒト及び実験動物において十分に特徴付けられた経路をたどり、小葉中心性壊死及び脂肪肝を生じ、肝再生及び組織修復が続く。肝細胞損傷の重症度も用量依存性であり、種、年齢、性別及び食餌に影響を受けることがある。
【００２８】  ［００２８］  ＣＣｌ４肝毒性への感受性の相違は主に、動物モデルがＣＣｌ４を反応性中間体に代謝する能力に関連する。ＣＣｌ４誘導肝毒性は、主として中心ゾーンの（ｃｅｎｔｒｉｚｏｎａｌ）肝細胞に局在するシトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ２Ｅ１）による、トリクロロメチルフリーラジカルへのＣＣｌ４生物活性化に依存する。フリーラジカルの形成は、肝細胞の損傷又は死を生じる、膜脂質過酸化及びタンパク質変性につながる。
【００２９】  ［００２９］  ＣＣｌ４の雄性ラットへの急性投与後に肝臓は迅速に損傷する。形態学的研究は、投与の１〜３時間以内に肝細胞中の脂質の細胞質蓄積が、そして５〜６時間までには肝細胞の局所壊死及び水症性膨潤が明らかであることを示している。小葉中心性壊死及び炎症性浸潤は、投与後２４〜４８時間で最高となる。ＤＮＡ合成の増加及び有糸分裂像の出現から、回復の開始もこの時間枠内で明らかである。壊死組織片の除去は４８時間までに始まり、通常は１週間で完了し、１４日までの肝臓の完全な回復を伴っている。
【００３０】  ［００３０］  血清トランスアミナーゼレベルの上昇も、ＣＣｌ４誘導肝臓組織病変と並行して起こる。雄性のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットにおいて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルは、ＣＣｌ４投与（０．１、１、２、３、４ｍＬ／ｋｇ、腹腔内投与；２．５ｍＬ／ｋｇ、経口投与）の３時間以内に上昇し、投与後４８時間以内にピークレベル（約５〜１０倍の上昇）に達する。血清α−グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ（α−ＧＳＴ）レベルの著しい上昇も、雄性ＳＤラットへのＣＣｌ４投与（２５μＬ／ｋｇ、経口投与）の早くも２時間後に検知されている。
【００３１】  ［００３１］  分子レベルでは、成長関連原癌遺伝子であるｃ−ｆｏｓ及びｃ−ｊｕｎの誘導は、伝えられるところによれば、ＣＣｌ４誘導肝毒性（Ｓｃｈｉａｆｆｏｎａｔｏ等（１９９７）Ｌｉｖｅｒ  １７：１８３−１９１）の急性モデルで検出される最初の事象である。これらの前初期反応遺伝子の発現は、ＣＣｌ４のマウスへの単回投与（０．０５〜１．５ｍＬ／ｋｇ、腹腔内投与）の３０分以内に、そしてラットへの投与後の１〜２時間までに（２ｍＬ／ｋｇ、腹腔内投与；５ｍＬ／ｋｇ、腹腔内投与）検出された（Ｓｃｈｉａｆｆｏｎａｔｏ等，ｓｕｐｒａ，及びＨｏｎｇ等（１９９７）Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊ３８：１６７−１７７）。同様に、肝臓ｃ−ｍｙｃ遺伝子発現は、雄性ＳＤラットへのＣＣｌ４急性投与後１時間までに増加する（５ｍＬ／ｋｇ、経口投与）（Ｈｏｎｇ等，ｓｕｐｒａ）。ＣＣｌ４への曝露後のこれらの遺伝子の発現は、迅速かつ一過的である。ＣＣｌ４の急性投与後のｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、及びｃ−ｍｙｃのピーク肝臓ｍＲＮＡレベルは、それぞれ、投与後１〜２時間、３時間、及び１時間に報告されている。
【００３２】  ［００３２］  腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現も、ＣＣｌ４に曝露されたげっ歯類の肝臓において上昇し、ＴＮＦ−αは肝臓修復プロセスの開始に関わっている。抗ＴＮＦ−α抗体による前処置は、ｃ−ｊｕｎ及びｃ−ｆｏｓ遺伝子発現のＣＣｌ４仲介による上昇を防止することが示されているが、これに対してＴＮＦ−αの投与は、これらの遺伝子の迅速な発現を誘導した（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ等（１９９７）Ｈｅｐａｔｏｌ  ２５：１３３−１４１）。修復プロセス（ＣＣｌ４投与の２４〜４８時間後）における後での形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）及び形質転換増殖因子受容体（ＴＢＲＩ−ＩＩＩ）のアップレギュレーションは、ＴＧＦ−βがアポトーシスの誘導による再生反応の制限で役割を果たすことを示唆する（Ｇｒａｓｌ−Ｋｒａｕｐｐ等（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌ  ２８：７１７−７１２６）。
【００３３】  ［００３３］  クロロホルム（ＣＨＣｌ３）は、その肝毒性によって使用中止にされた、もはや使用されていない麻酔剤である。急性ＣＨＣｌ３誘導肝毒性の発病は、ヒト及び実験動物において十分に特徴付けられた経路をたどり、小葉中心性壊死及び脂肪肝を生じ、肝再生及び組織修復が続く。肝細胞損傷の重症度も用量依存性であり、動物種、系統、年齢、性別、食餌、ビークル及び／又は投与経路に影響を受けることがある（Ｌｉｌｌｙ等（１９９７）Ｆｕｎｄ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ４０：１０１−１１０及びＲａｙｍｏｎｄ等（１９９７）Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ５２：４６３−４７６）。
【００３４】  ［００３４］  ＣＨＣｌ３毒性への感受性の相違は、差次的代謝に関連すると見なされる。ＣＨＣｌ３誘導肝毒性は主に、シトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ２Ｅ１）による、ホスゲン及びトリクロロメチルフリーラジカルなどの反応性種の形成によって仲介される。ＣＨＣｌ３肝毒性は、シトクロムＰ４５０を誘導し（すなわちエタノール、フェノバルビタール）、肝臓グルタチオン（ＧＳＨ）を枯渇させる薬剤への曝露によっても上昇する。フリーラジカルの形成は、肝細胞の損傷又は死を生じる、膜脂質過酸化及びタンパク質変性につながる。
【００３５】  ［００３５］  ＣＨＣｌ３のげっ歯類への慢性投与は、非遺伝毒性−細胞毒性の作用方式によって、肝臓及び腎臓癌の発生率の上昇を誘導する。ＣＨＣｌ３の発癌性は、ＤＮＡとＣＨＣｌ３又はその代謝産物との直接相互作用というよりも、続いての代償性細胞増殖を伴う化学誘導細胞毒性の次であると考えられる。
【００３６】  ［００３６］  ＣＨＣｌ３の雄性ラットへの急性投与後、迅速に肝臓毒性が発症する。形態学的研究は、投与の１〜３時間以内に肝細胞の細胞質への脂質の蓄積、そして５〜６時間までには肝細胞の局所壊死及び水症性膨潤が明らかであることを示している。小葉中心性壊死及び炎症性浸潤は、投与後２４〜４８時間で最高となる。ＤＮＡ合成の増加及び有糸分裂像の出現から、回復の開始もこの時間枠内で明らかである。壊死組織片の除去は４８時間までに始まり、通常は１週間で完了し、１４日までの肝臓の完全な回復を伴っている。
【００３７】  ［００３７］  ラット及びマウスの研究では、臨床パラメーターの著しい変化は、ＢＵＮ及び血清クレアチニンのレベルの上昇及びホスファチジルエタノールアミン及び組織グルタチオン（ＧＳＨ）レベルの低下を含んでいた。リン脂質付加体の形成、ＧＳＨの枯渇及び肝臓毒性の間には強力な相関がある（Ｄｉ  Ｃｏｎｓｉｇｌｉｏ等（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １５９（１−２）：４３−５３）。マウスの実験によれば、クロロホルムへの曝露は肝臓重量：体重比及び増殖細胞核抗原−標識指数も増加させる。５−メチルシトシン及びメチル化ｃ−ｍｙｃ遺伝子（発癌性活性の増加と関連している）のレベル低下も見出された（Ｃｏｆｆｉｎ等（２０００）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ５８（２）：２４３−２５２）。マウスに関する他の研究によれば、Ｐ４５０  ２Ｅ１及びＣＹＰ２Ａ５などのＰ４５０シトクロムのレベル上昇が細胞毒性代謝変換に関与することが指摘されている（Ｃｏｎｓｔａｎ等（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １６０（２）：１２０−１２６；Ｃａｍｕｓ−Ｒａｎｄｏｎ等（１９９６）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３８（１）：１４０−１４８）。
【００３８】  ［００３８］  ヒトでのクロロホルム中毒の研究によれば、血清生物マーカー（ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼ）のレベルの低下と肝細胞再生のマーカー（α−フェトタンパク質、レチノール結合タンパク質、γ−グルタミルトランスフェラーゼ及びデス−γ−カルボキシプロトロンビン）のレベルの上昇によって特徴付けられる肝細胞壊死が認められた（Ｈｏｒｎ等（１９９９）Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １１２（３）：３５１−３５７）。
【００３９】  ［００３９］  分子レベルでは、２つの既知の遺伝子、ＭＵＳＴＩ２１（増殖因子及び腫瘍プロモーターにより誘導されるマウス一次反応遺伝子）及びＭＵＳＭＲＮＡＨ（前立腺癌株化細胞から単離した遺伝子に高度に相同的な遺伝子）、ならびに２つの新規な遺伝子（ＭＵＳＦＲＡ及びＭＵＳＦＲＢ）のｍＲＮＡレベルの変化がＣＨＣｌ３で誘導されることが、再生マウス肝臓でのディファレンシャル・ディスプレイによって同定されている（Ｋｅｇｅｌｍｅｙｅｒ等（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌ  Ｃａｒｃｉｎ  ２０：２８８−２９７）。これらの遺伝子は、肝再生又はおそらくはＣＨＣｌ３誘導肝発癌性で役割を果たすと仮定されている。
【００４０】  ［００４０］  ＣＩ−１０００（４Ｈ−ピロロ：３，２−ｄ：ピリミジン−４−オン、２−アミノ−３，５−ジヒドロ−７−（３−チェニルメチル）一塩酸塩  一水和物）は、抗炎症特性を備えた化合物である。ＣＩ−１０００による処置後、肝臓毒性の標準マーカーである血清ＡＬＴレベルの上昇が、イヌにて認められた。
【００４１】  ［００４１］  ハロゲン化フェノキシプロパン酸誘導体（クロフィブリン酸のエチルエステル）であるクロフィブラートは、抗高脂血症剤である。クロフィブラートが、トリグリセリド及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの血清濃度を低下させ、また、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールを増加させる、正確なメカニズムは不明確である。該薬剤は、トリグリセリド及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールのクリアランスを増強するリポタンパク質リパーゼの活性化、コレステロール及びトリグリセリド生合成の阻害、組織からのコレステロールの流動、中性ステロイドの糞便排泄の増加、肝臓リポタンパク質の合成及び分泌の減少、ならびに遊離脂肪酸放出の減少を含む、いくつかの抗高脂血作用を持つ。
【００４２】  ［００４２］  クロフィブラートは、肝細胞肥大、細胞増殖、肝腫大、ＣＹＰ４５０アイソザイムの誘導、及びパルミトイルＣｏＡ酸化の誘導を含め、ラット肝臓に対する多くの効果を持つ。クロフィブラートの長期投与は、ラットにおいて肝細胞癌、良性精巣ライディッヒ細胞腫瘍及び膵腺房腫の発生率の向上を引き起こす。クロフィブラートは、げっ歯類におけるペルオキシソームの増殖を誘導し、遺伝毒性損傷というよりも本効果が、げっ歯類発癌の原因事象であると考えられている（ＡＨＦＳ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ２００１，ＭｃＥｖｏｙ，ｅｄ．，１７３５頁〜１７３８頁；Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−Ａｔｒｏｍｉｄ−Ｓ（Ｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ）ａｔ  ｗｗｗ．ｐｄｒ．ｎｅｔ；Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，“Ｄｒｕｇｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｌｉｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａｓ”ｉｎ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｅｉｇｈｔｈ  ｅｄ．，Ｇｏｏｄｍａｎ等，ｅｄｓ．，８７４頁〜８９６頁，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）。
【００４３】  ［００４３］  クロフィブラートは、肝臓脂質含有量を増加させ、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンのレベルを著しく上昇させることによって、その正常な組成を変化させる（Ａｄｉｎｅｈｚａｄｅｈ等（１９９８）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １１（５）：４２８−４４０）。ペルオキシソーム増殖因子によって誘導される肝臓過形成及び肝腫瘍のラットでの研究から、クロフィブラートの投与が、肝臓新生物組織中の銅のレベルを増加させ、銅関連遺伝子の発現を変化させることが明らかになっている。セルロプラスミン遺伝子及びウィルソン病遺伝子（Ｐ型ＡＴＰａｓｅをコードする）のダウンレギュレーションが、メタロチオネイン遺伝子のアップレギュレーションとともに、これらの組織で認められている（Ｅａｇｏｎ等（１９９９）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０（６）：１０９１−１０９６）。クロフィブラート誘導ペルオキシソーム増殖及び発癌性は、げっ歯類に特異的であると考えられており、ヒトでは示されていない。
【００４４】  ［００４４］  イヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ  ａｕｔｕｍａｌｅ）のアルカロイドであるコルヒチンは、通風性関節炎の治療に使用される抗炎症剤である（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ９ｔｈｅｄ．，６４７頁，Ｊ．Ｇ，Ｈａｒｄｍａｎ等，Ｅｄｓ，，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。抗有糸分裂剤であるコルヒチンはチューブリンに結合するが、それは顆粒球及び他の運動性細胞における原線維微小管の脱重合及び消失につながる。結果として、顆粒球の炎症区域への移入は阻害され、それによって炎症性反応を抑制する。
【００４５】  ［００４５］  コルヒチン処置に関連する一般的な弱い副作用は、胃腸障害、食欲減少、及び毛髪喪失である。より重篤な副作用は、肝毒性、悪心、嘔吐、及び重篤な下痢及び／又は腹痛を含む。コルヒチンの過量は、痙攣、昏睡、及び多臓器不全を高い死亡率で引き起こす可能性がある。腎不全は多因子性であり、長期の低血圧、低酸素血症、敗血症及び横紋筋融解症に関連している。ラットにおいては、より劇的でない用量がインスリン及び副甲状腺ホルモンなどの多くの内因性タンパク質の分泌を阻害することが示されている。肝臓損傷の徴候は、乳酸デヒドロゲナーゼ及びアルブミンなどのマーカー化合物の、血漿及び胆汁への漏出である（Ｄｖｏｒａｋ等（２００２）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １６（３）：２１９−２２７；Ｃｒｏｃｅｎｚｉ等（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １２１（２）：１２７−１４２）。
【００４６】  ［００４６］  酢酸シプロテロン（ＣＰＡ）は、強力なアンドロゲン拮抗物質であり、にきび（アクネ）、男性型脱毛症、性早熟症ならびに前立腺過形成及び前立腺癌の治療に使用されている（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ９ｔｈｅｄ．，１４５３頁，Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ等，Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。さらに、ＣＰＡは、子宮内膜を保護し、更年期症状及び骨粗鬆症骨折の危険性を減少させるために、ホルモン補充療法で臨床的に使用されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ  ３（Ｓｕｐｐｌ．２）：２１−２７（２０００））。
【００４７】  ［００４７］  ラットを用いた実験において、ＣＰＡはインビトロでの不定期ＤＮＡ合成を誘導することが示されている。単回経口投与の後、持続的なＤＮＡ修復活性が１６時間後に認められた。ＣＰＡはＳ期細胞の発生も増加させたが、それは、ラット肝臓におけるＣＰＡの分裂促進のポテンシャルを実証している（Ｋａｓｐｅｒ等（１９９６）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７（１０）：２２７１−２２７４）。ＣＰＡは、ヒトにおいて肝硬変を生じさせることも示されている（Ｇａｒｔｙ等（１９９９）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １５８（５）：３６７−３７０）。
【００４８】  ［００４８］  非ステロイド性抗炎症剤であるジクロフェナクは、リウマチ様関節炎、骨関節炎、及び強直性脊椎炎に罹患した患者に頻繁に投与されてきた。経口投与の後、ジクロフェナクは迅速に吸収され、次に肝臓でシトクロムＰ４５０アイソザイムであるＣＹＣ２Ｃサブファミリーによって代謝される（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ９ｔｈｅｄ．，６３７頁，Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ等，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。さらに、ジクロフェナクは、角膜損傷による痛みを治療するために局所塗布されている（Ｊａｙａｍａｎｎｅ等，（１９９７）Ｅｙｅ１１（Ｐｔ．１）：７９−８３；Ｄｏｒｎｉｃ等（１９９８）Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １２５（５）：７１９−７２１）。
【００４９】  ［００４９］  ジクロフェナクは多数の臨床用途があるが、角膜融解、潰瘍形成、及び重篤な角膜症を含む角膜合併症などの有害な副作用は、該薬剤と結び付られてきた（Ｇｕｉｄｅｒａ等（２００１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １０８（５）：９３６−９４４）。別の研究において、ジクロフェナクに対する拒絶反応が、食品医薬品局に報告された患者１８０症例が調査された（Ｂａｎｋｓ等（１９９５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２２（３）：８２０−８２７）。報告された１８０症例のうち、最も一般的な症状は黄疸（症候性患者の７５％）であった。肝臓切片を採取及び分析すると、肝臓損傷は薬剤処置の１ヵ月後に明らかであった。さらに別の報告では、骨関節炎のジクロフェナク治療の開始５週間後に、ある患者は重篤な肝炎を発症したことを示した（Ｂｈｏｇａｒａｊｕ等（１９９９）Ｓｏｕｔｈ  Ｍｅｄ  Ｊ９２（７）：７１１−７１３）。
【００５０】  ［００５０］  ジクロフェナク処置ウィスターラットに関するある研究では（Ｅｂｏｎｇ等（１９９８）Ａｆｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ２７（３−４）：２４３−２４６）、ジクロフェナク処置は、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、メトヘモグロビンならびに総ビリルビン及び抱合型ビリルビンの血清化学作用レベルの上昇を誘導した。さらに、ジクロフェナクは、アルカリホスファターゼ及び５’ヌクレオチダーゼの活性を向上させた。ヒトでの研究では、対照群と比較したときに肝臓トランスアミナーゼ及び血清クレアチンのレベルが上昇することが明らかになった（ＭｃＫｅｎｎａ等（２００１）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ３０（１）：１１−１８）。
【００５１】  ［００５１］  非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）であるジフルニサルは、サリチル酸のジフルオロフェニル誘導体である（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ９ｔｈｅｄ．，６３１頁，Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ等，Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。それは骨関節炎及び筋骨格緊張の治療に最も頻繁に使用される。ＮＳＡＩＤは鎮痛、解熱及び抗炎症作用を持つが、肝毒性がＮＳＡＩＤ処置の有害な副作用であることが既知である（Ｍａｓｕｂｕｃｈｉ等（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２８７：２０８−２１３）。ジフルニサルは他のＮＳＡＩＤよりも毒性が低いことが示されているが、最終的には血小板又は腎機能に対する悪影響を持つ可能性がある（Ｂｅｒｇａｍｏ等（１９８９）Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ９：４６０−４６３）。ジフルニサル処置に関連する他の副作用は、下痢、眩暈、傾眠、ガス又は胸やけ、頭痛、悪心、嘔吐、及び不眠症である（ｈｔｔｐ：／／ａｒｔｈｒｉｔｉｓｉｎｓｉｇｈｔ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉｃａｌ／ｍｅｄｓ／ｄｏｌｏｂｉｄ．ｈｔｍｌ）。
【００５２】  ［００５２］  １８の酸性ＮＳＡＩＤの肝毒性比較研究において、対照サンプルと比較した場合、ジフルニサルは、ラット肝細胞において、細胞損傷のマーカーであるＬＤＨ漏出を増加させることが示された。さらに、ジフルニサルによる処置は、細胞内ＡＴＰ濃度の低下を引き起こした。ジフルニサル及びイブプロフェンの効果を比較する研究において（Ｍｕｎｃｉｅ  ａｎｄ  Ｎａｓｒａｌｌａｈ（１９８９）Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ  １１：５３９−５４４）、両方の薬剤が、たとえ短期使用であっても、腹部痙攣を生じることが明らかになった。胃潰瘍形成が発生するレベルより低くなるように毒性用量が選択されたため、さらに重篤な胃腸効果は検知されなかった。しかし、腎臓損傷の徴候である、クレアチニンの血清レベル上昇も認められた（Ｍｕｎｃｉｅ等（１９８９）Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ  １１：５３９−５４４）。
【００５３】  ［００５３］  環境及び職場の毒素であるダイオキシンは、塩素化除草剤、殺虫剤及びプラスチックの製造での副生成物である化合物のクラスに与えられた名称である。これらのうち最も毒性及び発癌性であるのは、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）である。ダイオキシンへの曝露は、芳香族炭化水素（Ａｈ）受容体の発現を増加させ、ミトコンドリアにおいて活性酸素種の生成も増加させる。ダイオキシンはまた、ミトコンドリアにおけるＣＹＰｌＡ１、ＣＹＰ１Ａ２及びグルタチオンのレベルも増加させ、肝細胞におけるＳＯＤ及び酸化的ストレスに関与する酵素のレベルも向上させる（Ｓｅｎｆｔ等（２００２）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ３３：１２６８−１２７８；Ｋｅｒｎ等（２００２）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １７１：１１７−１１２５）。
【００５４】  ［００５４］  別のモデル化合物のジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）は、既知の発癌物質ならびに肝臓線維症及び脂質過酸化の誘導物質である。ＤＭＮは肝細胞において酸化的ストレスを引き起こし、それは慢性肝臓損傷と肝臓線維症との関連付けとなり得る。ＤＭＮ処置ラットは、散在性フィブロネクチン沈着、ヒドロキシプロリン（線維症の指標）のレベル上昇、コラーゲンのレベル上昇、線維性中隔、及び損なわれた酸化バランスを示した。ＡＬＴ及びマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の血清レベルは上昇したが、ＳＯＤの血清レベルは低下した（Ｖｅｎｄｅｍｉａｌｅ等（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １７５：１３０−１３９；Ｌｉｕ等（２００１）Ｚｈｏｎｇｈｕａ  ＧａｎＺａｎｇ  Ｂｉｎｇ  ＺａＺｈｉ  ９  Ｓｕｐｐｌ：１８−２０）。ラットでの他の研究では、３日間のＤＭＮ投与の数日後に、重篤な小葉中心性鬱帯及び出血性壊死が認められた。ＤＭＮ処置のさらなる期間の後、ラットは小葉中心性壊死及び極度の好中球性浸潤を発症し、重篤な小葉中心性壊死、線維沈着、局所脂肪沈着、胆管増殖、架橋壊死及び中心静脈周囲の線維症（肝硬変様症状）へと進行した。総タンパク質の減少及びＤＮＡの増加も認められた（Ｇｅｏｒｇｅ等（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １５６：１２９−１３８）。
【００５５】  ［００５５］  合成エストロゲンである１７α−エチニルエストラジオールは、経口避妊薬の成分であり、プロゲステロン化合物であるノルエチンドロンと併用されることが多い。閉経後のエストロゲン補充療法にも使用される（ＰＤＲ  ４７ｔｈＥｄ．，２４１５頁〜２４２０頁，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，１９９３；Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ９ｔｈＥｄ．，１４１９頁〜１４２２頁，Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ等Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。
【００５６】  ［００５６］  １７α−エチニルエストラジオール用法の最も頻繁な副作用は、心臓血管疾患（心筋梗塞、血栓塞栓症、血管疾患及び高血圧）のリスクの増加、及び炭水化物代謝の変化、特にグルコース不耐性及びインスリン分泌異常である。良性肝臓新形成の発症の危険増加もある。該薬剤が肝臓代謝の速度を低下させるため、それは肝臓からゆっくりと除去され、腫瘍増殖などの発癌性効果が生じることがある。
【００５７】  ［００５７］  １７α−エチニルエストラジオールは、主に胆汁流の胆汁酸塩非依存性画分（ＢＳＩＦ）を減少させることによって、雄性ラットにおける可逆性の肝臓内胆汁鬱帯を引き起こすことが示されている（Ｋｏｏｐｅｎ等（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：  ５３７−５４５）。この研究において、ビリルビン、胆汁酸塩、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血漿レベルは、変化しなかった。１７α−エチニルエストラジオールは血漿コレステロール及び血漿トリグリセリドのレベルを低下させたが、３日間の薬剤投与後に、胆汁流量を減少させるとともに肝臓重量を増加させたことも、この研究で示されている。この研究によるさらなる結果は、以下のとおりである。肝臓酵素のロイシンアミノペプチダーゼ及びアルカリホスファターゼの活性は、最初に著しい上昇を示したが、酵素レベルは３日後に低下した。ビリルビン産出量は増加したが、グルタチオン（ＧＳＨ）産出量は減少した。血漿レベルに影響しない、ビリルビンの胆汁中への分泌の増加は、ビリルビン生成の増加がヘム含有タンパク質からのヘムの分解の増加に関連しなければならないことを示唆している。同様の結果が別の実験でも得られており、肝臓を光学顕微鏡及び電子顕微鏡によっても検査している（Ｂｏｕｃｈａｒｄ等，（１９９３）Ｌｉｖｅｒ  １３：１９３−２０２）。１７α−エチニルエストラジオールの毎日投与は、胆汁鬱帯も同様に引き起こすことが示されているが、薬剤治療後に胆汁流速は徐々に正常に戻った（Ｈａｍａｄａ等（１９９５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２１：１４５５−１４６４）。おそらく腫瘍プロモーターの効果に応答している、肝臓過形成も認められている（Ｍａｙｏｌ（１９９２）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １３：２３８１−２３８８）。
【００５８】  ［００５８］  脂質低下剤のゲムフィブロジルは、肝臓組織における既知のペルオキシソーム増殖因子であり、肝臓細胞の過形成及び拡大の両方を引き起こす。ゲムフィブロジルに曝露すると、ラット及びマウスで肝発癌が認められ、ラットとハムスターでα−トコフェロールの減少及びＤＴ−ジアフォラーゼ活性の上昇が認められた（抗酸化能力の障害）。ペルオキシソーム増殖因子は、脂肪酸のペルオキシソームベータ酸化及びオメガ−ヒドロキシル化に関与する酵素の活性を向上させ、これは酸化的ストレスを生じる（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ等（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ６０：２７１−２７８；Ｃａｒｔｈｅｗ等（１９９７）Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １７：４７−５１）。
【００５９】  ［００５９］  ヒドラジン（ＮＨ２＝ＮＨ２）は、航空宇宙用及び航空機用燃料、腐食防止剤、染料及び写真用化学薬品などの、多くの産業用化学薬品の成分である。その誘導体は癌患者の悪液質の治療に使用されるヒドラジンサルフェート、抗結核薬であるイソニアジド、及び血圧降下薬であるヒドララジンなどの医薬品に使用される。これらの薬剤は、生体内で代謝されて、副生成物の中でもヒドラジンを生成する。その結果、ヒドラジンへの曝露は、たとえば軍隊及び航空関係者の間での直接的な接触によるか、たとえば癌又は高血圧を有する患者の体内での生成の結果である。
【００６０】  ［００６０］  ラット肝細胞に関する研究によれば、ヒドラジンは用量依存的に生存度喪失、ＬＤＨ漏出、ＧＳＨ及びＡＴＰの枯渇ならびにタンパク質合成速度の低下を引き起こすことが示されている（Ｄｅｌａｎｅｙ等（１９９５）Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ２５：１３９９−１４１０）。ラットに投与した場合、ＧＳＨ及びＡＴＰの枯渇ならびに脂肪肝の誘導（脂肪液滴の出現、ミトコンドリアの膨潤及び微小体の出現を伴う、肝臓重量及びトリグリセリドの増加）に特徴付けられる肝毒性の変化も、用量依存的であることが見出された（Ｊｅｎｎｅｒ等（１９９４）Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ６８：３４９−３５７；Ｓｃａｌｅｓ等（１９８２）Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  １０：９４１−９５３）。ヒドラジン曝露と関連した肝毒性は、腎毒性と同様に、フリーラジカルと還元グルタチオンとの抱合を触媒する、シトクロムＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）による酸化的代謝から生じるフリーラジカル損傷に関連付けられている。ヒドラジン及びいくつかのヒドラジン誘導体への曝露が腎臓組織での酵素レベルを向上させるが、酵素レベルの向上は肝臓組織では検出されなかった（Ｒｕｎｇｅ−Ｍｏｒｒｉｓ等（１９９６）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ２４：７３４−７３７）。
【００６１】  ［００６１］  ヒドラジンの変異原性及び肝臓発癌性効果は、ハムスターの肝臓で検査された。生体内では、ヒドラジンはホルムアルデヒドと反応して、ＤＮＡ中のグアニンをメチル化するアルキル化中間体である、ホルムアルデヒドヒドラゾン（ＣＨ２＝Ｎ−ＮＨ２）を形成する。ヒドラジンで処置すると、肝臓ＤＮＡは、メチル化グアニン、ＤＮＡ付加体の存在、及び維持メチル化の障害（デオキシシトシンのメチル化の障害）を示した。肝臓腺腫及び癌も用量依存的に発症し、維持メチル化と相関することが可能であった（ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ等（１９９６）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １７：２７０３−２７０９）。
【００６２】  ［００６２］  インドメタシンは、非ステロイド性抗炎症、解熱及び鎮痛薬であり、リウマチ様関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎、痛風、及び頻繁に日常的に発生し突くような痛みを特徴とする、重篤な慢性群発性頭痛を治療するために一般に使用される。本薬剤は、プロスタグランジン合成の強力な阻害剤として作用する。それは、アラキドン酸のプロスタグランジンへの変換に必要なシクロオキシゲナーゼ酵素を阻害する（ＰＤＲ  ４７ｔｈＥｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，１９９３；Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ９ｔｈＥｄ．，Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ等  ｅｄｓ，，１０７４頁〜１０７５頁，１０８９−１０９５，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；Ｃｅｃｉｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０ｔｈ  Ｅｄ．，ｐａｒｔ  ＸＩＩ，７７２頁〜７７３頁，８０５頁〜８０８頁，Ｊ．Ｃ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｆ．Ｐｌｕｍ  Ｅｄｓ．，Ｗ．Ｂ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ，，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。
【００６３】  ［００６３］  インドメタシン治療の最も頻繁な副作用は胃腸障害であり、通常は軽度の消化不良であるが、出血、潰瘍及び穿孔などのさらに重篤な症状が発生する可能性がある。肝臓の関与はまれであるが、肝炎及び黄疸のある致死的症例が報告されている。特に長期投与後の、腎臓毒性も発生することがある。腎乳頭壊死がラットで認められ、血尿、タンパク尿及びネフローゼ症候群を伴う間質性腎炎がヒトで報告されている。腎機能障害に罹患している患者は、腎臓プロスタグランジンが腎臓還流に重要な役割を果たしているため、腎血流減少を発症する危険にさらされている。
【００６４】  ［００６４］  ラットでは、インドメタシンは肝臓よりも消化管で副作用をさらに発生するが、肝細胞シトクロムＰ４５０における変化を誘導することが示されている。ある研究では、肝臓において広範囲での変化は認められなかったが、弱い局所的な小葉中心性反応が見られた。アルブミン及び総タンパク質の血清レベルは著しく低下したが、尿素の血清レベルは上昇した。クレアチニン又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルの変化は認められなかった（Ｆａｌｚｏｎ等（１９８５）ＢｒＪ  ｅｘｐ  Ｐａｔｈ  ６６：５２７−５３４）。別のラットの研究では、インドメタシンの単回投与は、ＣＹＰ４５０を含む肝臓及び腎臓ミクロソーム酵素を減少させ、消化管内に障害を生じることが示された（Ｆｒａｃａｓｓｏ等（１９９０）Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３１：３１３−３１６）。
【００６５】  ［００６５］  メナジオン（ビタミンＫ３）は、肝臓でメナキノンに変換される脂溶性ビタミン前駆物質である。ビタミンＫの主要な既知の機能は、正常な血液凝固を補助することであるが、骨石灰化でも重要な役割を果たす。メナジオンは、酸化的ストレスを誘導するキノン化合物である。抗癌剤及び放射線増感作用剤として使用されており、腎臓、肺、心臓、及び肝臓で毒性を生じ得る。腎臓において、毒性の徴候は用量依存的であり、低用量での尿細管細胞のわずかな脱顆粒から、尿細管拡張、尿細管中でのタンパク円柱（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｓｔ）の形成、カルシウム石灰化、近位及び遠位尿細管中での空胞形成、皮質での顆粒変性ならびに壊死及びアポトーシスにわたる（Ｃｈｉｏｕ等（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １２４：１９３−２０２）。肝臓での毒性効果には、グルタチオンの枯渇、Ｃａ２＋のレベルの上昇、脂質過酸化及びタンパク質チオール酸化の増加、ＤＮＡ鎖切断、及び原形質膜突出（小疱）が含まれ、これらは細胞変性につながる。メナジオンによって誘導される酸化的ストレスは、表面小疱に関連付けられる細胞骨格異常をも引き起こす（Ｃｈｉｏｕ等（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ｓｃｉ  Ｃｏｕｎｃ  Ｒｅｐｕｂ  Ｃｈｉｎａ  Ｂ  ２２：１３−２１；Ｍｉｒａｂｅｌｌｉ等（１９８８）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２６４：２６１−２６９）。
【００６６】  ［００６６］  フェノバルビタールは、抗癲癇、鎮静又は催眠薬として使用され、高血圧、冠動脈疾患、胃腸障害及び術前不安などの関連する緊張状態を伴う神経症を治療するためにも使用できる。フェノバルビタールは、不眠症及び頭痛を治療する薬物療法にも見出される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈＥｄ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．，１１６４頁〜１１６５頁，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９５）。肝臓毒性は一般的な副作用ではないが、該薬剤はＣＹＰ２Ｂレベルの上昇を引き起こし、胆汁鬱帯及び肝細胞損傷の発生が見出されている（Ｓｅｌｉｍ等（１９９９）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：１３４７−１３５１；Ｇｕｔ等（１９９６）Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  １０４：１２１１−１２１８）。
【００６７】  ［００６７］  強力なアセチルコリンステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤である、タクリン（１，２，３，４−テトラヒドロ−９−アミノアクリジン塩酸塩）は、軽度から中程度のアルツハイマー痴呆の治療に使用される。アルツハイマー患者は、シナプス喪失、ニューロン萎縮及び前脳のコリン作動性核の変性を有するが、これらはグルコースの酸化代謝の減少ならびにＡＴＰ及びアセチルＣｏＡレベルの低下に関連する。タクリンなどのＡＣｈＥ阻害剤の投与は、この損失に対抗するためにコリン作動性活性を上昇させるように設計されている（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ（１９９５）Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ４：３４９−３５６）。患者に見られる効果は、認知及び機能低下の回復であるが、該薬剤は神経変性プロセスを変化させないようである（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ９ｔｈＥｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ等ｅｄｓ．，１７４頁，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。
【００６８】  ［００６８］  タクリンに引き起こされる肝毒性は、通常、可逆的であるが、重篤な肝毒性の症例が見られている（Ｂｌａｃｋａｒｄ等（１９９８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２６：５７−５９）。毒性は、タンパク質合成のレベル低下及び乳酸デヒドロゲナーゼの放出によってはもちろんのこと、トランスアミナーゼのレベルの上昇ならびにＡＴＰ、グリコーゲン及びグルタチオンのレベルの低下によっても特徴付けられる。タンパク質合成の低下は、細胞死に至るシグナルとなることがある（Ｌａｇａｄｉｃ−Ｇｏｓｓｍａｎｎ等（１９９８）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １４：３６１−３７３）。
【００６９】  ［００６９］  前臨床研究は有害な肝臓事象を検知できなかったが、タクリンは、ヒト肝臓癌株化細胞及び初代ラット肝細胞に対して細胞毒性を示した（Ｖｉａｕ等（１９９３）Ｄｒｕｇ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １６：２２７−２３９）。肝毒性はヒトで見出されているが、インビボのラット研究は、タクリン曝露と肝毒性の間の相関を示しておらず、作用機序は完全に理解されていない。ヒト及びラットの肝臓ミクロソーム調製物のタクリンに対する反応を比較するインビトロ研究（Ｗｏｏｌｆ等（１９９３）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ２１：８７４−８８２）は、２つの種が該薬剤に対し、異なって反応することを示しており、そこから、ラットが、肝臓マーカー酵素のタクリン誘導上昇をモニターするための最良のモデルでないことが示唆された（Ｗｏｏｌｆ等（１９９３）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ２１：８７４−８８２）。
【００７０】  ［００７０］  タクリンは、ラットにおける肝毒性の古典的徴候を示さなかったが、タクリン投与による遺伝子発現の変化は、該薬剤がヒトでは肝毒素となることを予測するために使用できる。このことは、前臨床スクリーニングにおける古典的であるがさらに粗雑な方法が毒性を検知できない場合でさえ、臨床で毒性であることが判明する薬剤を、トキシコゲノミクスが検知できることを示唆している。
【００７１】  ［００７１］  チオアセタミドの唯一の重要な商業用途は、定性分析における硫化水素の代用物としてである（ＩＡＲＣ，７巻，１９７４）。それは、殺真菌剤として、皮革、織物及び製紙産業での有機溶媒として、ブナゴムの加硫促進剤として、そしてモーター燃料の安定剤としても使用されてきた。ヒト曝露の主な経路は、チオアセタミドが溶媒として使用された製品の吸入及び皮膚接触である（９ｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ｈｔｔｐ：／／ｅｈｐ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｏｃ／ｔｏｃ９．ｈｔｍｌ）。チオアセタミドは、非イオン性求電子物質に代謝されて、酸化的ストレス及び他の損傷性事象を引き起こす；シトクロムＰ４５０  ２Ｅ１及びフラビン含有モノオキシゲナーゼ系の両方が、この生物活性化に関わってきた（Ｒ．Ｓｎｙｄｅｒ  ＆  Ｌ．Ｓ．Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｔｏｘｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｖａｐｏｒｓ，ｉｎ  Ｃａｓａｒｅｔｔ  ＆  Ｄｏｕｌｌ’ｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｉｓｏｎｓ，Ｋｌａａｓｅｎ．ｅｄ．，７３７頁，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；Ｓｍｉｔｈ等（１９８３）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７０：４６７−４７９；Ｊｕｒｉｍａ−Ｒｏｍｅｔ等（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １４：４６（１２）：２１６３−２１７０）。
【００７２】  ［００７２］  曝露されたラットでは、チオアセタミドが肝臓及び腎臓に蓄積し、血清総ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＢＵＮ、クレアチニン及びＴＮＦαのレベルの上昇を生じることが示された。毒素のクリアランスの障害及びＴＮＦαの分泌増加は、肝臓及び腎臓における毒素効果の進行に関連付けられる（Ｎａｋａｔａｎｉ等（２００１）Ｌｉｖｅｒ  ２１（１）：６４−７０）。腎臓組織における別の組織学的変化は、糸球体係蹄崩壊及び間質性出血を含む（Ｃａｂａｌｌｅｒｏ等（２００１）Ｇｕｔ  ４８：３４−４０）。
【００７３】  ［００７３］  肝臓において、チオアセタミドの低急性用量はアポトーシスを誘導するが、高急性用量は壊死を誘導する（Ｃａｓａｒｅｔｔ  ＆  Ｄｏｕｌｌ’ｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｖ，ｓｕｐｒａ）。長期曝露は、肝硬変及び腫瘍を誘導する（Ｒｉｓｔｅｌｉ等（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １５８：３６１−３６７）。急性肝臓損傷は、重篤な静脈周囲壊死によって特徴付けられ、その直後に肝細胞再生及びこの壊死が引き起こされる。一酸化窒素合成酵素活性及び一酸化窒素放出は、チオアセタミド曝露後に肝臓再生を引き起こす病態生理機構において重要な役割を果たすと考えられている（Ａｌａ−Ｋｏｋｋｏ等（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２４４：７５−７９）。チオアセタミドへの曝露は、ＳＯＤ、グルタチオンペルオキシダーゼ及び尿酸などの抗酸化剤のレベルも低下させる。それはカスパーゼ−３活性とともに、アポトーシスも増加させ、肝臓の窒素代謝に影響を与えることが認められた。尿素の生成及び排泄の速度は、グルタメートデヒドロゲナーゼ活性及びグルタミン合成酵素活性と同様に低下した。しかしながら、有糸分裂促進活性及びＤＮＡ合成は増加することが認められた（Ａｂｕｌ等（２００２）Ａｎａｔ  Ｈｉｓｔｏ  Ｅｍｂｒｙｏｌ  ３１：６６−７１；Ｈａｙａｍｉ等（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５８：１９４１−１９４３；Ｍａｓｕｍｉ等（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １３５：２１−３１；Ｍａｉｅｒ等（１９９１）Ａｒｃｈ  Ｔｏｘｉｃ  ６５：４５４−４６４）。
【００７４】  ［００７４］  バルプロ酸（ｎ−ジプロピル酢酸、デパケン（登録商標））は、複数の種類の癲癇性発作−欠伸発作、ミオクローヌス発作及び強直間代性発作を治療するために日常的に使用される。大半の他の抗癲癇薬は、１種類のみに対して有効である。バルプロ酸はニューロンに作用して、皮質又は脊髄ニューロンの脱分極によって引き起こされる持続的反復発火を阻害し、不活性化された電位−活性化Ｎａ＋チャネルの長期回復が続く。該薬剤は、低閾値Ｃａ２＋電流を低下させることによっても作用し、その複数の機構は、複数の種類の発作でのその使用に寄与する。バルプロ酸はニューロンのＧＡＢＡに対する反応に影響を与えないが、ＧＡＢＡ合成酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼの活性を上昇させ、ＧＡＢＡを分解する酵素、ＧＡＢＡトランスアミナーゼ及びコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを阻害する（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．９ｔｈＥｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ等，ｅｄｓ．，４６２頁，４７６頁，４７７頁，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。
【００７５】  ［００７５］  最も一般的な副作用は、食欲不振、悪心及び嘔吐を含む胃腸障害である。ＣＮＳに対する効果は、鎮静、運動失調及び振戦を含む。発疹、毛髪喪失、食欲向上及び催奇形性効果も認められている（Ｂｒｉｇｇｓ等，Ａ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｒｉｓｋ，Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ａｎｄ  Ｌａｃｔａｔｉｏｎ，４ｔｈ  ｅｄ．，８６９頁，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９９４）。肝臓毒性については、バルプロ酸は、約４０％の患者で無症候症状であり得る肝臓酵素レベルの上昇が生じ、また、肝臓脂質レベルの上昇を生じる。劇症肝炎、微小空胞脂肪肝（脂肪変性）、肝細胞壊死及び肝不全も発生する可能性がある。肝毒性はバルプロ酸の不飽和代謝産物の蓄積によって引き起こすと考えられており、特に、２つの既知の肝臓毒である４−エン−ペンタノエート及びメチレンシクロプロピル酢酸に構造的に類似している、４−エン−バルプロ酸の蓄積によって引き起こされると考えられる（Ｅａｄｉｅ等（１９８８）ＭｅｄＴｏｘｉｃｏｌ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｅｘｐ  ３：８５−１０６）。
【００７６】  ［００７６］  ラットに対する研究では、バルプロ酸によって引き起こされた微小胞脂肪肝が、ミエロイド小体、脂質空胞及びミトコンドリアの異常を伴うことが見出された（Ｋｅｓｔｅｒｓｏｎ等（１９８４）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４：１１４３−１１５２）。培養ラット肝細胞に対する実験によれば、バルプロ酸が、用量依存的に、乳酸デヒドロゲナーゼを漏出させ、脂肪酸のベータ酸化を妨害する化合物であるアシル−ＣｏＡエステルを増加させることが示された（Ｖａｎｃｅ等（１９９４）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ３５：１０１６−１０２２）。バルプロ酸をラットへ投与すると、ミトコンドリアのベータ酸化異常の徴候である、ジカルボン酸の排泄増大を引き起こすことも示されている。他の代謝効果は、低血糖症、高アンモニア血症、ベータヒドロキシ酪酸及びカルニチンのレベル低下ならびに脂肪酸酸化に関与する酵素であるアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性の低下を含む。しかしながら、短鎖、中鎖及び長鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼなどの脂肪酸酸化に関与する遺伝子のｍＲＮＡレベルは、上昇することが見出された（Ｋｉｂａｙａｓｈｉ等（１９９９）Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｔ  ４１：５２−６０）。
【００７７】  ［００７７］  肝臓で作用する腫瘍誘導化合物であるＷｙ−１４６４３は、癌を検出、診断及び治療するための戦略を開発する目的で、発癌性発症の各種段階の間の細胞の遺伝的特性を研究するために使用されてきた（Ｒｏｃｋｅｔｔ等（２０００）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １４４（１−３）：１３−２９）。他の発癌物質とは対照的に、Ｗｙ−１４６４３はＤＮＡを直接突然変異させない。代わりに、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲα）や増殖を調節する他の情報伝達経路に作用する（Ｊｏｈｎｓｏｎ等（２００１）Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７７（１）：５９−７１）。効果は、アポトーシスの低下を伴う、上昇かつ持続された細胞複製である（Ｒｕｓｙｎ等（２０００）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２１（１２）：２１４１−２１４５）。これらの著者らは（Ｒｕｓｙｎら）、塩基除去によってＤＮＡを修復する酵素の発現の増加を認めたが、ＤＮＡに対する酸化的損傷を修復しない酵素の発現増加を認めなかった。げっ歯類に関する研究において、Ｊｏｈｎｓｏｎらは、Ｗｙ−１４６４３が肝臓−Ｘ−受容体仲介転写を、新規ステロール合成と同様に、用量依存的に阻害したことを認めた。
【００７８】  ［００７８］  マウス肝臓細胞を用いた実験において（Ｐｅｔｅｒｓ等（１９９８）  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９（１１）：１９８９−１９９４）、Ｗｙ−１４６４３への曝露は、アシルＣｏＡオキシダーゼ及び細胞増殖に関与するタンパク質：ＣＤＫ−１，２及び４、ＰＣＮＡならびにｃ−ｍｙｃのレベルの上昇を生じた。レベルの上昇は、ＰＰＡＲαによって直接的に又は間接的に仲介される、加速された転写によって引き起こされる。ペルオキシソーム増殖因子の発癌特性は、ＰＰＡＲα依存的な細胞周期調節タンパク質のレベル変化によるものであると思われる。
【００７９】  ［００７９］  げっ歯類に関する別の研究（Ｋｅｌｌｅｒ等（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ  ＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ  １１０２（２）：２３７−２４４）は、Ｗｙ−１４６４３がラット肝臓ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化を脱共役できることを示した。２つのエネルギー依存プロセスである、アンモニア及び胆汁流量からの尿素合成の速度は低下し、これらのプロセスへのエネルギー供給が、細胞を毒素に曝露する結果として妨害されたことが示されている。Ｗｙ−１４６４３が、クップフェル細胞における核因子κＢ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ及びスーパーオキシドの生成を活性化することも示されている（Ｒｕｓｙｎ等（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０（１７）：４７９８−４８０３）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、肝臓細胞の増殖を引き起こす有糸分裂促進剤を誘導することが知られている。
【００８０】  ［００８０］  抗喘息薬ジロートンは、５−リポキシゲナーゼ阻害剤及びロイコトリエン合成阻害剤であり、ロイコトリエンの負の効果−炎症性プロセス及び気管支収縮の有害な効果の増悪を阻止するために、喘息患者に与えられる。しかしながらジロートンは、肝腫ならびに肝臓ペルオキシソームパルミトイルＣｏＡオキシダーゼならびにミクロソームシトクロムＰ４５０  ２Ｂ及びＰ４５０  ４Ａのレベルの上昇を引き起こすことが報告されている。これらのシトクロムのモノオキシゲナーゼ活性も向上することが認められた（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ等（１９９６）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３７（２）：１９３−２０１；Ｓｏｒｋｎｅｓｓ（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  １７（１Ｐｔ  ２）：５０Ｓ−５４Ｓ）。
【００８１】  ［００８１］  ＬＰＳ（リポ多糖）は、哺乳動物における急性炎症性反応を誘導し、敗血症性ショックを引き起こす可能性がある、細胞の破壊又は破裂時にグラム陰性細菌によって放出されるエンドトキシンである。ＬＰＳは、炎症性機構を通じてラットにおける肝臓損傷を開始させるために使用される研究ツールでもある。通常、ＬＰＳの膜成分は、リピドＡ、ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシ−オクツロソン酸）、コア多糖及びＯ−抗原多糖であり、細菌によって多糖ユニットは異なる（Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ｊｏｋｌｉｋ等，ｅｄｓ．，８２頁〜８７頁，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９２）。
【００８２】  ［００８２］  ＬＰＳにインビボで曝露されたラットの肝臓実質細胞及び類洞細胞に由来する初代ラット肝細胞は、細胞培養物中のＬＰＳに直接反応することができる。一酸化窒素及び亜硝酸塩生成の増加を伴う、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）のレベル上昇、細胞肥大、空胞形成、染色体切痕、細胞質ＤＮＡ断片化及び壊死を含む、ＬＰＳによって誘導される内毒血症の多くの効果を検知することができる（Ｐｉｔｔｎｅｒ等（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １８５（１）：４３０−４３５；Ｌａｓｋｉｎ等，（１９９５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２２（１）：２２３−２３４；Ｗａｎｇ等（１９９５）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６９（２  Ｐｔ  １）：Ｇ２９７−３０４）。他の研究は、初代ラット肝細胞と一緒にクップフェル細胞が存在することが、ＬＰＳによる肝細胞のアポトーシス誘導に必須であることを示した（Ｈａｍａｄａ等（１９９９）Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ３０（５）：８０７−８１８）。
【００８３】  ［００８３］  ラット又は初代肝細胞のＬＰＳへの曝露は、肝臓における多くの急性期タンパク質の発現を誘導する。最近の証拠は、ラット肝細胞が可溶性ＣＤ１４タンパク質を発現し、ＬＰＳが遺伝子発現及びタンパク質発現レベルの両方において、ＣＤ１４のレベルを著しく上昇させることができることを示している（Ｌｉｕ等（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６６（１１）：５０８９−５０９８）。可溶性ＣＤ１４は、内皮及び上皮細胞においても、ＬＰＳの毒性レベルまでの各種の細胞の活性化に必要とされる、重要なＬＰＳ認識タンパク質であると考えられる（Ｐｕｇｉｎ等（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０（７）：２７４４−２７４８）。ＬＰＳ認識系の別の主要な成分は、ＬＰＳに結合するリポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）である。ＬＰＳ−ＬＢＰ複合体は、ＣＤ１４受容体と相互作用して、ＬＰＳ感受性遺伝子を誘導する。ＬＢＰは、ＬＰＳによって初回刺激を受けていないラットから単離された肝細胞において誘導することが可能であり、この主要な調節経路が初代ラット肝細胞においてインタクトであることが示されている（Ｗａｎ等（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３  （７）：２４３５−２４４２）。
【００８４】  （毒性予測とモデリング）
［００８４］  表１〜５ＷＷＷで提供される遺伝子のポートフォリオ及びサブセットと同様に、遺伝子及び遺伝子発現情報を用いて、試験化合物又は未知化合物の肝毒性を含む、少なくとも１つの毒作用を予測する。本明細書で使用する場合、少なくとも１つの毒作用には、細胞又は生物の生理的状態の有害な変化が含まれるが、これに限定はされない。その応答は、特定の病理学的状態（例えば、組織壊死）と関連するかもしれないが、そうあることを要求されない。したがって、毒作用は、分子及び細胞レベルでの作用を含む。本明細書で使用される、肝毒性とは作用であり、そして、肝壊死、肝炎、脂肪肝（肝臓の脂肪変性）、発癌、胆汁鬱帯、肝肥大、炎症及びペルオキシソーム増殖の病理学的状態を含むが、これらには限られない。
【００８５】  ［００８５］  一般に、試験薬剤（又は化合物又は多重成分組成物）の毒性又は肝毒性を予測するアッセイは、細胞集団を試験化合物に曝す工程と、表１〜５ＷＷＷの遺伝子の１個又はそれ以上の相対的又は絶対的な遺伝子発現レベルをアッセイし又は測定する工程と、同定した発現レベルを前記表及びそこに開示されたデータベースに開示された発現レベルと比較する工程と、を含む。アッセイは、表１〜５ＷＷＷから約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルの測定を含むかもしれない。ある場合には、発現レベルはアッセイされ、すべて又は実質的にすべての表の遺伝子と比較される。
【００８６】  ［００８６］  本発明の方法では、試験薬剤、化合物又は組成物によって誘導される、１又は複数の遺伝子の発現レベルが約２倍、約１．５倍又は約１．０倍の係数の範囲内で変化するならば、本明細書に開示される表又はデータベースに見出されるレベルに匹敵する。いくつかのケースでは、薬剤が参照毒と同じ方向（例えば、アップ又はダウン）に、遺伝子の発現変化を誘導するならば、それらの発現レベルは匹敵する。
【００８７】  ［００８７］  試験薬剤、化合物又は組成物に曝される細胞集団は、インビトロ又はインビボで曝されてもよい。例えば、培養又は新たに単離された肝細胞（特に、ラット肝細胞）は、標準的な実験室及び細胞培養条件の下でその薬剤に曝される。別のアッセイ様式では、インビボの曝露は、生きている動物（例えば、研究室ラット）に、その薬剤を投与することによって達成できる。
【００８８】  ［００８８］  インビトロ及びインビボ系で毒性試験を設計及び実施するための手順は、周知であり、その主題に関しては多くの教科書に記載されている。例えば、Ｌｏｏｍｉｓら、Ｌｏｏｍｉｓ’ｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，４版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６）、Ｅｃｈｏｂｉｃｈｏｎ，Ｔｈｅ  ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９２）、Ｆｒａｚｉｅｒ編、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）などである。
【００８９】  ［００８９］  インビトロ毒性試験では、２つのグループの試験生物が通常使用される。１つのグループは対照であり、他のグループは単一用量で（急性毒性試験用）、又は１つの投薬計画の用量で（遷延性又は慢性毒性試験用）、試験化合物を受ける。いくつかのケースでは、本発明の方法で要求される組織の抽出が、試験動物を犠牲にする必要があるので、実験の継続期間を通して遺伝子発現のダイナミックスを観察することが望ましいならば対照グループ及び化合物を受けているグループの両方とも、組織サンプリングのために動物を取り除くことができるように十分大きくなければならない。
【００９０】  ［００９０］  毒性研究を計画するに際して、試験される化合物のために適切な試験生物を選ぶこと、投与経路、用量の範囲などについて広範囲な指針が文献で提供されている。水又は生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）が、試験化合物のために選択される溶質である。というのは、これらの溶剤が様々な経路による投与を許容するからである。溶解性の限界のために、これが可能でないとき、コーン油のような植物油、又はプロピレングリコールのような有機溶媒が使用できる。
【００９１】  ［００９１］  投与経路に関係なく、所与の用量を投与するのに要する容積は、使われる動物の大きさによって制限される。動物のグループ内又はグループ間で各用量の容積を均一に保つことが望ましい。ラット又はマウスを使用するとき、一般に経口経路で投与される容積は、動物のグラム当たり０．００５ｍＬを超えてはならない。水溶液又は生理的食塩水溶液が非経口的注入のために使われるときでも、そのような溶液は通常無害であると考えられているが、許容される容積は制限される。マウスでの蒸留水の静脈ＬＤ５０は、マウスグラム当たり約０．０４４ｍＬであり、等張性生理食塩水のそれはマウスグラム当たり０．０６８ｍＬである。ある場合には、試験動物への投与経路は、治療目的のためのヒトへの該化合物の投与経路と同一、又はできるだけ似通っているべきである。
【００９２】  ［００９２］  化合物が吸入によって投与されることになっているとき、試験空気を発生する特殊な手法が必要である。その方法は、通常、化合物を含む液のエーロゾル化又は噴霧化を含む。試験される薬剤が感知できる蒸気圧を持つ液であるならば、それは制御された温度条件下で空気を溶液に通すことによって投与できる。これらの条件下で、用量は単位時間当たりに吸入される空気の容積、溶液の温度及び関与する薬剤の蒸気圧から見積もられる。ガスは、ガス溜めからメーターで測られる。溶液の粒子が投与されることになっているとき、粒径が約２μｍより小さくなければ、粒子は肺で末端の肺胞嚢に達しない。吸入によって投与されるとき、様々な装置やチャンバーが、刺激物質又はその他の有毒なエンドポイントの効果を検出するための研究を実行するために利用できる。動物に薬剤を投与する好ましい方法は、挿管によるか又は飼料に薬剤を取り入れることによる、経口経路を通してある。
【００９３】  ［００９３］  薬剤がインビトロで、細胞又は細胞培養物に曝されるとき、薬剤に曝される細胞集団は、例えば、その集団を２つ以上の同一のアリコートに分割することによって、２つ以上の副集団に分割されるかもしれない。本発明の方法の好適ないくつかの実施の形態で、薬剤に曝される細胞は、肝臓組織に由来する。例えば、培養されたか、又は新たに単離されたラット肝細胞が使われる。
【００９４】  ［００９４］  本発明の方法は、一般に少なくとも１つの毒性反応を予測するのに使用でき、そして、実施例に記載されているように、化合物又は試験薬剤が、肝壊死、脂肪肝、タンパク質付加体形成、肝炎又はその他の本明細書に記載された少なくとも１つの毒に関連する症状などの様々な特定の肝臓症状を誘導するという見込みを予測するのに使用できる。また、本発明の方法を用いて、１つ又はそれ以上の個々の化合物に対する、毒性反応の類似性を決定できる。それに加えて、本発明の方法を用いて、既知の毒（表５Ａ〜５ＷＷＷを参照）によって誘導されるプロファイルと比較しての、発現プロファイルの類似性のために、前記化合物又は試験薬剤によって影響、誘導又は調節される可能性のある細胞経路を予測するか、又は解明できる。
【００９５】  （毒性マーカーの診断用途）
［００９５］  上述のように、化合物に曝された組織若しくは細胞試料の生理的状態の予測又は同定のための診断マーカーとして、或いは化合物又は薬剤の毒作用を同定するか、予測するのに表１〜５ＷＷＷに提供されたような遺伝子や遺伝子発現情報、又はそれらの発現情報を備える遺伝子のポートフォリオを使用することができる。例えば、末梢血液細胞の試料のような組織試料又は他の簡単に得ることができる若干の組織試料を上記の方法のいずれかによってアッセイでき、そして、表１〜５ＷＷＷからの１又は複数の遺伝子の発現レベルが本明細書に記載される毒に曝された組織若しくは細胞で見出される発現レベルと比較できる。これらの方法は、細胞での生理的状態の診断をもたらし、ある化合物（例えば、新しいか未知の化合物又は薬剤）の潜在的な毒性を確認するために使用することができる。利用できる配列又は他の情報と同様に、発現データの比較は、研究者又は診断者が行ってもよいし、下記のようにコンピュータやデータベースの助けを借りてもなし得る。
【００９６】  ［００９６］  別の様式では、試料（例えば、身体の組織若しくは体液試料）中、表１〜５ＷＷＷの１又は複数の遺伝子のレベル、それがコードする１又は複数のタンパク質、又は該コードされたタンパク質によって生産されるいかなる代謝産物でも、モニター又は検出して、生物体の生理的状態を確認するか、診断することができる。そのような試料としては、尿、血液及び簡単に取得できる細胞（例えば、末梢リンパ球）を含む、いかなる組織又は液試料でも挙げられる。
【００９７】  （毒性進行をモニターするためのマーカーの使用）
［００９７］  上述のように、医薬、候補薬、毒、汚染物質などに最初に曝された後に見出されるような毒性進行をモニターするためのマーカーとして、表１〜５ＷＷＷに提供される遺伝子や遺伝子発現情報を使用することもできる。例えば、組織試料又は細胞試料を上記の方法のいずれによってアッセイでき、そして、表１〜５ＷＷＷの１又は複数の遺伝子の発現レベルが本明細書に記載される肝臓毒に曝された組織若しくは細胞で見出される発現レベルと比較できる。利用できる配列又は他の情報と同様に、発現データの比較は、研究者又は診断者が行ってもよいし、下記のようにコンピュータやデータベースの助けを借りてもなし得る。
【００９８】  （医薬スクリーニングのための毒性マーカーの使用）
［００９８］  本発明によれば、表１〜５ＷＷＷで同定された遺伝子を、マーカー又は薬標的として使用して、細胞又は組織試料に対する、候補薬、化学物質又は他の薬剤の効果を評価することができる。遺伝子をその発現や活性を調節する薬剤をスクリーニングするための薬標的として使用することもできる。様々な様式で、候補薬又は薬剤は、所定の１又は複数のマーカーの転写・発現を刺激する能力、或いは１又は複数のマーカーの転写・発現をダウンレギュレート又は妨げる能力をスクリーニングできる。本発明によれば、薬が誘導するマーカーの数を見て、そしてそれらを比較することによって、薬の効果の特異性を比較することもできる。より特異的な薬は、より少ない転写標的を持つ。２つの薬のために同定されたマーカーの類似したセットは、効果の類似性を示すかもしれない。
【００９９】  ［００９９］  表１〜５ＷＷＷに定義するような１又は複数のマーカーの発現をモニターするためのアッセイは、本発明の核酸の発現レベル変化をモニターするのに利用可能ないかなる手段を利用してもよい。本明細書で使用する場合、それが細胞で核酸の発現をアップ又はダウンレギュレーションできるならば、薬剤は本発明の核酸の発現を調節するという。
【０１００】  ［０１００］  １つのアッセイ様式で、表１〜５ＷＷＷからの１個、２個若しくはそれ以上の遺伝子に対するプローブを含む遺伝子チップを使用して、処理又は曝露された細胞で、遺伝子発現の変化を直接モニター又は検出することができる。株化細胞、組織又は他の試料を最初に試験薬剤にさらし、そしてある場合には既知の毒にさらして、表１〜５ＷＷＷの遺伝子のうちの１個若しくはそれ以上、又は好ましくは２個若しくはそれ以上の検出した発現レベルを、既知の毒単独で曝されたそれらと同じ遺伝子の発現レベルと比較する。既知の１又は複数の毒の発現パターンを調節する化合物は、インビボで潜在的に有毒な生理作用を調節することが期待されるだろう。表１〜５ＷＷＷ中の遺伝子は、既知の肝臓毒に曝されたとき、細胞で差次的に発現されるので、これらのアッセイにおいて特に適切な指標である。
【０１０１】  ［０１０１］  別の様式では、表１〜５ＷＷＷの遺伝子のオープンリーディングフレーム及び／又は転写調節領域間のリポーター遺伝子融合を含む株化細胞及びアッセイ可能な融合パートナーを調製する。多数のアッセイ可能な融合パートナーが知られており、容易に入手可能であるが、ホタルルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む（Ａｌａｍら、（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：２４５−２５４）。リポーター遺伝子融合を含む株化細胞を、適切な条件と時間で試験される薬剤に曝す。薬剤に曝された試料と対照試料との間のリポーター遺伝子の示差発現は、核酸の発現を調節する薬剤を同定する。
【０１０２】  ［０１０２］  追加のアッセイ様式を用いて、表１〜５ＷＷＷ中で同定された遺伝子の発現を調節する薬剤の能力をモニターできる。上述のように、例えば、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションによって直接モニターできる。株化細胞を適切な条件と時間で、試験される薬剤にさらして、トータルＲＮＡ又はｍＲＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に開示されているような標準的な手順によって単離する。
【０１０３】  ［０１０３］  もう一つのアッセイ様式では、本発明の遺伝子産物を生理的に発現する細胞又は株化細胞をまず同定する。そのように同定された細胞及び／又は株化細胞は、転写装置の調節の忠実度が、適当な表面伝達機構及び／又は細胞質カスケードと薬剤の外因性接触に関して、維持されるように必要な細胞機構を含むと期待されるだろう。さらに、そのような細胞又は株化細胞は、表１〜５ＷＷＷの遺伝子産物をコードする構造遺伝子の端を含んでいる操作可能な非翻訳性の５’−プロモーターが１つ以上の抗原性フラグメント又は他の検出可能なマーカーに融合したものを含む発現媒体（例えば、プラスミド又はウィルスベクター）構築体で形質導入又は形質転換できるが、これらは本発明の遺伝子産物に特有であり、前記フラグメントはプロモーターの転写調節下にあり、分子量が天然に存在するポリペプチドから区別できるか、又はさらに免疫学的に識別される若しくは他の検出可能なタグを含むポリペプチドとして発現される。そのようなプロセスは、当該技術において周知である（上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）。
【０１０４】  ［０１０４］  上記で概説したような細胞又は株化細胞を、それから、適切な条件下で薬剤と接触させる。例えば、その薬剤は薬学的に許容される賦形剤を含み、そして、生理的ｐＨでのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理的ｐＨでのイーグル緩衝塩類溶液（ＢＳＳ）、血清を含むＰＢＳ又はＢＳＳ、若しくはＰＢＳ又はＢＳＳ及び／又は血清を含む条件培地などの水性の生理的緩衝液に含まれる細胞と接触され、３７℃でインキュベートされる。前記条件は、当業者が必要と思えば調節されるかもしれない。細胞を前記薬剤に接触させるのに続いて、該細胞を粉砕して、細胞溶解液のポリペプチドを、ポリペプチド画分がプールされ、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降又はウエスタンプロット）によってさらに処理されることになっている抗体と接触させられるように分画する。薬剤と接触された試料から単離したタンパク質のプールを次いで対照試料（非曝露又は既知の毒への曝露）と比較するが−そこでは賦形剤のみが細胞と接触される−、そして、その対照と比較して薬剤と接触された試料からの免疫学的に発生されたシグナルにおける増加又は減少を用いて、前記薬剤の有効性及び／又は毒作用を識別する。
【０１０５】  ［０１０５］  本発明の別の実施の形態は、表１〜５ＷＷＷの遺伝子によってコードされる１又は複数のタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定するための方法を提供する。そのような方法又はアッセイは、所望の活性をモニター又は検出するいかなる手段をも利用できる。
【０１０６】  ［０１０６］  １つの様式では、曝されていない対照細胞集団と比較しての試験される薬剤に曝された細胞集団と既知の毒に曝された細胞集団との間のタンパク質の相対量（表１〜５ＷＷＷ）をアッセイする。この様式の中で、特異的抗体のようなプローブを用いて、異なる細胞集団でのタンパク質の差次的な発現をモニターする。株化細胞又は細胞集団を、適切な条件と時間の下で試験される薬剤に曝す。曝された株化細胞又は細胞集団、及び対照の曝されていない株化細胞又は細胞集団から細胞溶解液を調製する。この細胞溶解液は、それから、プローブ（例えば、特異的抗体）で分析される。
【０１０７】  ［０１０７］  上記の方法でアッセイした薬剤を無作為に選ぶことができるか、又は合理的に選ぶか若しくは設計することができる。本明細書で使用する場合、薬剤が本発明のタンパク質単独で、又はその関連する基質、結合パートナーなどとの会合に関与する特異的配列を考慮することなく無作為に選ばれるとき、その薬剤は無作為に選ばれるという。無作為に選ばれた薬剤の例は、化学的なライブラリ若しくはペプチドのコンビナトリアルライブラリ、又は生物の成長ブロスの使用である。
【０１０８】  ［０１０８］  本明細書で使用する場合、薬剤がその作用と関連して、標的部位の配列及び／又はその立体配座を考慮する、無作為な基準ではなく選ばれるとき、その薬剤は合理的に選ばれる又は設計されるという。薬剤は、これらの部位を構成するペプチド配列を利用することによって合理的に選ぶか、設計することができる。例えば、合理的に選ばれたペプチド薬剤は、そのアミノ酸配列が機能コンセンサス部位と同一であるか、又はその誘導体でありえる。
【０１０９】  ［０１０９］  本発明の薬剤は、例えば、ペプチド、小分子、ビタミン誘導体、同様に炭水化物でありえる。ドミナントネガティブなタンパク質、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ、これらのタンパク質に対する抗体、これらのタンパク質のペプチドフラグメント、又はこれらのタンパク質の模擬体（ミミック）は、機能に影響を及ぼすために細胞に導入される。本明細書で使用する「模擬体（ミミック）」とは、親ペプチドと化学的に構造は異なるが、組織分布的に、そして、機能的に親ペプチドと類似な構造を提供するためのペプチド分子の１つの領域又はいくつかの領域の改変を指す（Ｍｅｙｅｒｓ（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）中，６５９−６６４頁、Ｇｒａｎｔ  ＧＡ．の項を参照）。当業者は、本発明の薬剤の構造上の性質に関して、制限がないと容易に認識できる。
【０１１０】  （核酸アッセイ様式）
［０１１０］  既知の肝臓毒（表１〜５ＷＷＷ）に曝されると、差次的に発現されると同定した遺伝子を様々な核酸検出アッセイで使用して、与えられた試料中、１又は複数の遺伝子の発現レベルを検出又は定量できる。表１〜５ＷＷＷに記載した遺伝子は、その差次的な発現が細胞又は組織での毒性に関連する、１つ以上の追加の遺伝子と組合せても使用されるかもしれない。好ましい実施の形態では、表１〜５ＷＷＷ中の遺伝子は、先願の関連出願である６０／２２２，０４０、６０／２４４，８８０、６０／２９０，０２９、６０／２９０，６４５、６０／２９２，３３６、６０／２９５，７９８、６０／２９７，４５７、６０／２９８，８８４、６０／３０３，４５９、６０／３３１，２７３、６０／３６４，０４５、６０／３６４，０５５、６０／４３６，６４３、０９／９１７，８００及び１０／０６０，０８７に記載される遺伝子の１つ以上と組合せられるかもしれない。これらすべては、関連付けによって本明細書に取り入れられる。
【０１１１】  ［０１１１］  遺伝子発現を検出するいかなるアッセイ様式を使用してもよい。例えば、伝統的なノーザンブロッティング、ドットブロット又はスロットブロット、ヌクレアーゼ保護、プライマー指示された増幅、ＲＴ−ＰＣＲ、半定量的若しくは定量的ＰＣＲ、分枝鎖ＤＮＡ及びディファレンシャル・ディスプレイ法が、遺伝子発現レベルを検出するために使われるかもしれない。それらの方法は、本発明のいくつかの実施の形態に有用である。より少ない数の遺伝子が検出される場合には、ハイスループットな増幅に基づくアッセイが最も効率的であるかもしれない。しかしながら、本発明の方法及びアッセイは、多数の遺伝子の発現を検出するハイブリダイゼーションに基づく方法で、最も能率的に設計される。
【０１１２】  ［０１１２］  いかなるハイブリダイゼーションアッセイ様式を用いてもよいが、これには溶液に基づくアッセイ様式及び固体支持体に基づくアッセイ様式が含まれる。本発明の差次的に発現された遺伝子用オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体は、フィルター、ポリ塩化ビニルディシュ、粒子、ビーズ、微粒子又はシリコン若しくはガラス基盤チップ等であり得る。そのようなチップ、ウエハー及びハイブリダイゼーション法は広く利用でき、例えばＢｅａｔｔｉｅ（ＷＯ９５／１１７５５）によって開示されたものがある。
【０１１３】  ［０１１３］  オリゴヌクレオチドが、直接的に又は間接的に、共有結合的に又は非共有結合的に、結合され得るいかなる固体の表面でも、使用することができる。好ましい固体支持体は、高密度アレイ又はＤＮＡチップである。これらは、アレイ上で予め決められた位置に特定のオリゴヌクレオチドプローブを含んでいる。予め決められた位置は、１分子以上のプローブを含むかもしれないが、その予め決められた位置内の各分子は同一の配列を持つ。そのようなあらかじめ決められた位置は、特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）と呼ばれる。例えば、単一の固体支持体上に２、１０、１００、１，０００から１０，０００、１００，０００個まで、又は４００，０００個以上のこのような特徴があるかもしれない。固体支持体又はプローブが取り付けられる範囲は、約１平方センチメートル程度である。表１〜５ＷＷＷの遺伝子に対応するプローブ、又は上記の関連出願からのプローブは、単一の又は複数の固体支持体に取り付けることができる。例えば、それらのプローブは、単一のチップ又は１つのチップセットを構成する複数のチップに取り付けることができる。
【０１１４】  ［０１１４］  発現モニター用のオリゴヌクレオチドプローブアレイは、当該技術で知られているいかなる手法によっても作製し、使用することができる（例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）１４，１６７５−１６８０；ＭｃＧａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３，１３５５５−１３４６０）。そのようなプローブアレイは、表１〜５ＷＷＷに記載した２個若しくはそれ以上の遺伝子に相補的であるか、又はハイブリダイズする少なくとも２個以上のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、そのようなアレイは、本明細書に記載される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、７０、１００個若しくはそれ以上の遺伝子に相補的であるか、又はハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含んでよい。好ましいアレイは、表１〜５ＷＷＷに挙げられた遺伝子のすべて、実質的にすべて、又はほぼすべてを含んでおり、或いは個別的には、表５Ａ〜５ＷＷＷの遺伝子セットを含む。好ましい実施の形態では、単一の固体支持体基質（例えば、チップ）上に表１〜５ＷＷＷのいずれか１個又はすべて遺伝子のうち、すべて又はほぼすべての遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドを含むように、アレイが構築される。
【０１１５】  ［０１１５］  表１〜５ＷＷＷの発現マーカー遺伝子の配列は、公共のデータベースにある。表１は、配列の各々についてＧｅｎＢａｎｋ受入番号を提供する（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照）。本出願の出願日現在でのＧｅｎＢａｎｋ中の遺伝子の配列は、明示により本明細書にそれらの全体が関連付けにより組み入れられ、さらに関連する配列、例えば、異なる長さの同一遺伝子からの配列、該遺伝子の変異体配列、多型配列、ゲノム配列及び異なる種（適当な場合、ヒトの対応物を含む、表３を参照）からの関連配列も同様である。これらの配列は、本発明の方法に用いることができるか、或いは本発明のプローブ又はアレイを作製するのに用いることができる。ある実施の形態では、以前から毒性反応に関連する遺伝子又はフラグメントに一致する表１〜５ＷＷＷ中の遺伝子は、その表から除外してよい。
【０１１６】  ［０１１６］  上述のように、表１〜５ＷＷＷに開示されたＧｅｎＢａｎｋ受入番号の配列に加えて、天然に起こっている変異体又は多型の配列のような配列を本発明の方法及び組成で使用してもよい。例えば、表１〜５ＷＷＷに開示された遺伝子の様々な対立形質（ａｌｌｅｌｉｃ）体又は相同体の発現レベルをアッセイできる。表１〜５ＷＷＷに挙げられた遺伝子の機能活性を変えない、いかなるそしてすべてのヌクレオチド変異−本明細書に開示された遺伝子の天然に起こっている対立形質変異体を含むが−を本発明の方法に用いて、本発明の組成（例えば、アレイ）を作ることができる。
【０１１７】  ［０１１７］  上記の遺伝子の配列に基づくプローブは、一般に利用できるいかなる方法によっても調製できる。組織若しくは細胞試料をスクリーニング又はアッセイするためのオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、適当な、相補的遺伝子又は転写物のみに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さである。典型的には、オリゴヌクレオチドプローブが、長さで少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２５個のヌクレオチドである。ある場合には、少なくとも３０、４０又は５０個のヌクレオチドのより長いプローブが望ましいこともある。
【０１１８】  ［０１１８］  本明細書で使用する場合、表１〜５ＷＷＷに記載された遺伝子の１個若しくはそれ以上に相補的であるオリゴヌクレオチド配列とは、ストリンジェントな条件下、該遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。そのようなハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは典型的には、該遺伝子にヌクレオチドレベルで、少なくとも約７５％の配列同一性、好ましくは約８０％又は８５％の配列同一性、さらに好ましくは該遺伝子に約９０％又は９５％以上の配列同一性を示すことになる。
【０１１９】  ［０１１９］  「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸間の相補的なハイブリダイゼーションを指し、標的ポリヌクレオチド配列の望ましい検出を達成するためにハイブリダイゼーション培地の厳密性を減らすことによって適応することができる、少数のミスマッチを包含する。
【０１２０】  ［０１２０］  「バックグランド」又は「バックグランドシグナル強度」という用語は、ラベルされた標的核酸とオリゴヌクレオチドアレイの成分（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、対照プローブ、アレイ基質等）との間の非特異的な結合又はその他の相互作用から生じるハイブリダイゼーションシグナルを指す。バックグランドシグナルは、また、アレイ成分自身の内部蛍光によって生じるかもしれない。単一のバックグランドシグナルは、全アレイのために計算することができ、或いは、異なるバックグランドシグナルを各標的核酸のために計算してもよい。好ましい実施の形態では、バックグランドはアレイ中のプローブの最も低い５％〜１０％に対する平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算されるか、或いは、異なるバックグランドシグナルを各標的遺伝子のため計算する場合、各遺伝子のプローブの最も低い５％〜１０％に対する平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算される。当然ながら、当業者は、特定の遺伝子へのプローブがよくハイブリダイズして、標的配列に特異的に結合しているようにみえる場合は、それらをバックグランドシグナル計算に使用してはならないと理解するであろう。別法として、試料中に見出されるいかなる配列にも相補的でないプローブ（例えば、反対のセンスの核酸に指向されているプローブ、又は、試料が哺乳類の核酸であるとき、バクテリア遺伝子のような試料中に見出されない遺伝子に指向されているプローブ）へのハイブリダイゼーションによって生成されるハイブリダイゼーションシグナル強度として計算してもよい。また、バックグランドは、全くプローブを欠くアレイの領域によって生じる平均シグナル強度として計算されることもできる。
【０１２１】  ［０１２１］  「特異的にハイブリダイズしている」という表現は、配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡ又はＲＮＡに存在するとき、ストリンジェントな条件下、特定の１又は複数の核酸配列に実質的に又はそれらだけに、ある分子が結合、二本鎖形成（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）又はハイブリダイズすることを指す。
【０１２２】  ［０１２２］  本発明のアッセイ及び方法は、入手可能な形態を利用して、同時に少なくとも約１００個、好ましくは約１，０００個、より好ましくは約１０，０００個、最も好ましくは約１０万又は１００万個の異なる核酸ハイブリダイゼーションを選別できる。
【０１２３】  ［０１２３］  本明細書で使用する場合、「プローブ」は、１種類以上の化学結合を通して、通常は相補的な塩基対形成を通して、通常は水素結合形成を通して、相補配列の標的核酸に結合することができる核酸として定義される。本明細書で使用する場合、プローブは天然型の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ又はＴ）又は修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシン等）を含む。加えて、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、プロープ中の塩基は、ホスホジエステル結合以外の結合でつながれていてもよい。したがって、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合でつながれているペプチド核酸であってもよい。
【０１２４】  ［０１２４］  「完全なマッチプローブ」という用語は、特定の標的配列に、完全に相補的である配列を持つプローブを指す。試験プローブは、典型的には、標的配列の部分（部分配列）に対して完全に相補的である。完全なマッチ（ＰＭ）プローブは、「試験プローブ」、「規格化対照」プローブ、発現レベル対照プローブなどであり得る。しかしながら、完全なマッチ対照又は完全なマッチプローブは、「ミスマッチ対照」又は「ミスマッチプローブ」から区別される。
【０１２５】  ［０１２５］  「ミスマッチ対照」又は「ミスマッチプローブ」という用語は、その配列が特定の標的配列に完全には相補的でないように故意に選ばれるプローブを指す。高密度アレイ中の各ミスマッチ（ＭＭ）対照に対して、同じ特定の標的配列に、完全に相補的である対応する完全なマッチ（ＰＭ）プローブが典型的には存在する。そのミスマッチは、１つ以上の塩基を含むかもしれない。
【０１２６】  ［０１２６］  ミスマッチは、ミスマッチプローブでどこにでも存在していてもよいが、末端ミスマッチはより望ましくない。なぜなら、末端ミスマッチは標的配列のハイブリダイゼーションを防ぎそうにないからである。特に好ましい実施の形態では、試験ハイブリダイゼーション条件下、そのミスマッチが標的配列との二本鎖を最も不安定にしそうな、プローブの中央又はその近くにミスマッチは位置する。
【０１２７】  ［０１２７］  「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列へは実体のないハイブリダイゼーションだけか、又は違いが確認される程度に他の配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列に依存しており、異なる状況において異なることになる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般的には、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度とｐＨにおける特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選ばれる。
【０１２８】  ［０１２８］  典型的には、ストリンジェントな条件は、その塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において少なくとも０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（又は他の塩）であり、そして、温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）用には少なくとも約３０℃であるものであろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成することもできる。
【０１２９】  ［０１２９］  「配列同一性のパーセント」又は「配列同一性」は、比較ウィンドウ又はスパンにわたって、２つの最適に整列した配列又は部分配列を比較することによって決定されるが、ここで比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分が、該２つの配列の最適な整列のための基準配列（それは、付加又は欠失を含まない）と比較して、随意に付加若しくは欠失（すなわち、ギャプ）を含むかもしれない。同一のサブユニット（例えば、核酸塩基又はアミノ酸残基）が両方の配列で起こる位置の数を決定しマッチした位置の数をだし、マッチした位置の数を比較ウィンドウ中にある位置の全数で割り、そしてその結果に１００を乗じて配列同一性のパーセントを出すことにより、前記パーセントを計算する。ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラム（下記参照）を使用して計算するとき、配列同一性パーセントは、デフォルトギップの加重値を用いて計算する。
【０１３０】  （プローブ設計）
［０１３０］  配列設計の莫大な数が本発明の実施に適切であることを当業者は理解するであろう。高密度アレイは、興味ある配列に特異的にハイブリダイズする数多くの試験プローブを典型的に含む。プローブは、表及び付随する代表的な配列表において同定されている遺伝子のいかなる領域から作製してもよい。表中の遺伝子参照がＥＳＴである例では、その配列から、又は配列データベース（例えば、本明細書に記載されたもの）のどれかで入手可能であろう対応する全長転写物の他の領域から、プローブは設計されてもよい。与えられた１又は複数の遺伝子のためのプローブを作製する方法については、ＷＯ９９／３２６６０を参照。それに加えて、利用できるソフトウェアならなんでも用いて特定のプローブ配列を作成することができるが、これは例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、オリンパス光学工業（株）及びＢｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能なソフトウェアを含む。好ましい実施の形態では、そのアレイはまた、１個若しくはそれ以上の対照プローブを含む。
【０１３１】  ［０１３１］  本発明の高密度アレイチップは、「試験プローブ」を含む。その試験プローブは、長さで約５個〜約５００個、又は約７個〜約５０個のヌクレオチド、より好ましくは約１０個〜約４０個のヌクレオチド、そして、最も好ましくは約１５個〜約３５個のヌクレオチドの範囲にあるオリゴヌクレオチドであってもよい。他の特に好ましい実施の形態では、プローブが長さで２０個又は２５個のヌクレオチドである。好ましい別の実施の形態では、試験プローブは、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列は、自然源から単離されるかクローンされるか、或いは天然の核酸を鋳型に使用して増幅される。これらのプローブは、その発現を検出するように設計した遺伝子の特定の部分配列に相補的な配列を有する。このように、前記試験プローブは、それが検出するはずである標的核酸に、特異的にハイブリダイズすることができる。
【０１３２】  ［０１３２］  興味ある標的核酸と結合する試験プローブに加えて、高密度アレイは、数多くの対照プローブを含むことができる。その対照プローブは、本明細書において、１）規格化対照、２）発現レベル対照、そして３）ミスマッチ対照と呼ばれる３つのカテゴリーに分類されるかもしれない。
【０１３３】  ［０１３３］  規格化対照は、ラベルされた参照オリゴヌクレオチドに、又はスクリーンされる核酸試料に加えられた他の核酸配列に相補的であるオリゴヌクレオチド、又は他の核酸プローブである。ハイブリダイゼーション後、規格化対照から得られるシグナルは、ハイブリダイゼーション条件の変化、ラベル強度、「読み」効率及び完全ハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変化させる他の因子、のための対照を提供する。好ましい実施の形態において、アレイ中すべての他のプローブから読まれるシグナル（例えば、蛍光強度）は、対照プローブからのシグナル（例えば蛍光強度）によって割られ、かくして、測定を規格化している。
【０１３４】  ［０１３４］  実質的に、いかなるプローブでも、標準対照として役に立つかもしれない。しかしながら、ハイブリダイゼーション効率は、塩基組成及びプローブ長さとともに変化すると認識されている。好ましい規格化プローブは、アレイに存在する他のプローブの平均長を反映するように選ばれるが、それらはある範囲の長さをカバーするように選ばれることができる。規格化対照も、また、アレイ中の他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選ばれ得るが、好ましい実施の形態では、１個か、数個のみのプローブを使用し、それらはよくハイブリダイズし（すなわち、二次構造をとらない）、そしていかなる標的特異的プローブにもマッチしないように選択される。
【０１３５】  ［０１３５］  発現レベル対照は、生物学的試料中の恒常的に発現した遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブである。実質的に、恒常的に発現した遺伝子はどれも、発現レベル対照に対して適当な標的を提供する。典型的には、発現レベル対照プローブは、アクチン遺伝子、トランスフェリンレセプター遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子などを含むがこれらに限らない、恒常的に発現した「ハウスキーピング遺伝子」の部分配列に相補的な配列を有する。
【０１３６】  ［０１３６］  標的遺伝子に対するプローブ、発現レベル対照、又は規格化対照に対して、ミスマッチ対照が提供される。ミスマッチ対照は、１個以上のミスマッチ塩基の存在を除いて、対応する試験プローブ又は対照プローブと同一なオリゴヌクレオチドプローブ又は他の核酸プローブである。ミスマッチ塩基とは、そのプローブがそうでなければ特異的にハイブリダイズするだろう標的配列中の対応する塩基に相補的でないように、選ばれる塩基である。適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、ストリンジェントな条件）、試験プローブ又は対照プローブがその標的配列にハイブリダイズすると期待されるが、ミスマッチプローブはハイブリダイズしないであろう（又は、かなり少ない程度でしかハイブリダイズしないであろう）ように、１個以上のミスマッチが選択される。好ましいミスマッチプローブは、中央ミスマッチを含む。このように、例えばプローブが２０ｍｅｒである場合、対応するミスマッチプローブは、６位から１４位（中央ミスマッチ）のどの位置でも単一の塩基ミスマッチ（例えば、Ｇ、Ｃ又はＴをＡのかわりとする）を除いて、同一の配列を持つことになる。
【０１３７】  ［０１３７］  かくして、ミスマッチプローブは、試料中でそのプローブが指示する標的以外の核酸に非特異的に結合するか、又はクロスハイブリダイゼーションするための対照を提供する。例えば、標的が存在するならば、完全なマッチプローブはミスマッチプローブより絶えず明るいはずである。それに加えて、すべての中央ミスマッチが存在するならば、ミスマッチプローブを使用して、変異（例えば、添付の表１〜５ＷＷＷの遺伝子の変異）を検出することができる。完全なマッチプローブとミスマッチプローブとの間の強度の違いは、ハイブリダイズした材料の濃度の良い尺度を提供する。
【０１３８】  （核酸試料）
［０１３８］  細胞又は組織試料は、インビトロ又はインビボで試験薬剤に曝される。培養細胞又は組織が使用されるとき、適当な哺乳動物の細胞抽出物（例えば、肝臓抽出物）を、試験薬剤と共に加え、毒性を示すのに生体内変換を要するかもしれない薬剤を評価してもよい。好ましい様式では、すでに薬物代謝酵素の適切な補体を発現している動物又はヒト肝細胞の初代単離株（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅ）が、哺乳類の肝臓抽出物の添加なしで、試験薬剤に曝される。
【０１３９】  ［０１３９］  本発明によってアッセイされる遺伝子は、典型的にはｍＲＮＡ又は逆転写されたｍＲＮＡの形態である。その遺伝子は、クローン化されてもよいし、されなくてもよい。その遺伝子は、増幅されてもよいし、されなくてもよい。クローニング及び／又は増幅は、集団内での遺伝子の表現にバイアスをかけるようには見えない。しかし、いくつかのアッセイでは、より少ないプロセッシングステップで使用できるので、材料としてｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを用いることが好ましいかもしれない。
【０１４０】  ［０１４０］  当業者にとって明らかであるように、本発明の方法及びアッセイにおいて使われる核酸試料は、いかなる利用可能な方法又はプロセスによって調製されてもよい。トータルｍＲＮＡを単離する方法は、当業者に周知である。例えば、核酸の単離と精製の方法は、「生化学と分子生物学における研究室手法（第２４巻）  核酸プローブとのハイブリダイゼーション：理論と核酸プローブ、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ、編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）」の第３章に詳しく記載されている。そのような試料は、ＲＮＡ試料を含むが、興味ある細胞若しくは組織から単離されるｍＲＮＡ試料から合成されるｃＤＮＡをも含む。また、そのような試料は、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、及びその増幅されたＤＮＡから転写されるＲＮＡをも含む。当業者は、ホモジネートが使われる前に、ホモジネートに存在するＲＮＡ分解酵素を阻害又は破壊することが、望ましいと認めるだろう。
【０１４１】  ［０１４１］  生物学的試料は、どんな生物並びにインビトロで育てられた細胞（例えば、株化細胞及び組織培養細胞）からのいかなる生体組織、液体又は細胞のものでもよい。しばしば、その試料は、化合物、薬剤、医薬、医薬組成物、潜在的な環境汚染物質又は他の組成物に曝された組織又は細胞試料である。ある様式では、試料は、患者に由来する試料である「臨床試料」であるだろう。典型的な臨床試料には、痰、血液、血液細胞（例えば、白血球）、組織若しくは細針バイオプシーの試料、尿、腹膜液や胸水、或いはそれらからの細胞が含まれるが、これらには限定されない。
【０１４２】  ［０１４２］  生物学的試料は、組織学的目的で取られた凍結切片又はホルマリン固定切片のような、組織の切片をも含むかもしれない。
【０１４３】  （高密度アレイの作成）
［０１４３］  合成のステップの最小数で、オリゴヌクレオチドの高密度アレイを作成する方法は、知られている。オリゴヌクレオチド類似体のアレイは、様々な方法で単一又は複数の固体基質上に合成することができ、これらは限定されないが、光指向された化学的カップリング及び機械的に指向されたカップリングを含む（Ｐｉｒｒｕｎｇ（米国特許第５，１４３，８５４号）を参照）。
【０１４４】  ［０１４４］  手短に言えば、ガラス表面上でのオリゴヌクレオチドアレイの光指向されたコンビナトリアル合成は、自動化されたホスホラミダイト化学とチップマスキング手法を用いて進む。１つの特定的実施において、ガラス表面を、官能基（例えば、光反応性保護基によってブロックされている水酸基又はアミン基）を有するシラン試薬で誘導体化する。光リソグラフ性マスクを通しての光分解を使用して、導入する５’光保護されたヌクレオシドホスホラミダイトと化学反応する準備ができている官能基を選択的に露出する。そのホスホラミダイトは、照射された（かくして、光反応性ブロック基の除去によって曝される）部位のみと反応する。このように、ホスホラミダイトは前のステップで選択的に曝されるそれらの領域にのみ付加する。所望の配列アレイが固体表面上に合成されるまで、これらのステップが繰り返される。アレイ上の異なる位置での異なるオリゴヌクレオチド類似体のコンビナトリアル合成は、合成の間の照射パターンとカップリング試薬の添加の順序によって決定される。
【０１４５】  ［０１４５］  前述のことに加えて、単一基質上でオリゴヌクレオチドのアレイを生成するために使用できる追加の方法は、ＰＣＴ公報ＷＯ９３／０９６６８号及びＷＯ０１／２３６１４号に記載されている。高密度核酸アレイは、予め調製した、又は天然の核酸を予め決められた位置に置くことによって組み立てることもできる。合成又は天然の核酸は、光指向ターゲティング及びオリゴヌクレオチド指向ターゲティングによって、基質の特定位置に置かれる。別の実施の形態は、区域から区域に移動し、核酸を特定スポットに置くディスペンサーを使用する。
【０１４６】  （ハイブリダイゼーション）
［０１４６］  核酸ハイブリダイゼーションは、相補的な塩基対形成を通してプローブとその相補的な標的とが安定した混成二本鎖を形成することができる条件下、プローブと標的核酸とを接触させることを単に含む。ＷＯ９９／３２６６０を参照。混成二本鎖を形成しない核酸は、その後、洗い流されて、ハイブリダイズした核酸が検出されるのにまかせる（典型的には、付着した検出可能なラベルの検出を通して）。核酸を含んだ緩衝液の温度を上昇させるか、又はその塩濃度を減少させることによって、核酸が変性すると一般に認められている。低いストリンジェンシー条件下では（例えば、低温及び／又は高塩濃度）、アニールした配列が完全に相補的でない場合でも、混成二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成される。このように、ハイブリダイゼーションの特異性は、低いストリンジェンシーで減少する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高温及び／又は低塩濃度）では、うまくゆくハイブリダイゼーションは、より少ないミスマッチしか許容しない。ハイブリダイゼーション条件を選択して、いかなる程度のストリンジェンシーをも提供できると当業者は認識するであろう。
【０１４７】  ［０１４７］  好ましい実施の形態では、ハイブリダイゼーションを確実にするために低いストリンジェンシー（この場合、３７℃で６×ＳＳＰＥＴ（０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００））でハイブリダイゼーションを実行し、それから、ミスマッチした混成二本鎖を除去するためにより高いストリンジェンシー（例えば、３７℃で１×ＳＳＰＥＴ）で、続く洗浄を実行する。続く洗浄はハイブリダイゼーション特異性の要求されるレベルが得られるまで、ストリンジェンシーをより高くしながら（例えば、３７℃から５０℃で０．２５×ＳＳＰＥＴまで低く落として）実行されるかもしれない。ストリンジェンシーは、ホルムアミドのような薬剤の添加によっても増加することができる。存在することがありえる様々な対照（例えば、発現レベル対照、規格化対照、ミスマッチ対照など）へのハイブリダイゼーションと試験プローブへのハイブリダイゼーションを比較することによって、ハイブリダイゼーション特異性を評価できる。
【０１４８】  ［０１４８］  一般に、ハイブリダイゼーション特異性（ストリンジェンシー）とシグナル強度の間にはトレードオフがある。このように、好ましい実施の形態では、一貫した結果を生む、そして、バックグランド強度のおよそ１０％を超えるシグナル強度を与える最も高いストリンジェンシーで、洗浄を実行する。このように、好ましい実施の形態では、ハイブリダイズしたアレイは、継続してより高いストリンジェンシー溶液で洗浄され、各洗浄の間に読み取られる。このようにでてきたデータセットの解析により、それ以上ではハイブリダイゼーションパターンが認めうるほどに変化せず、適切なシグナルを興味ある特定のオリゴヌクレオチドプローブのために適切なシグナルを提供する洗浄ストリンジェンシーが明らかとなる。
【０１４９】  （シグナル検出）
［０１４９］  ハイブリダイズした核酸は、試料核酸に付けられた１つ以上のラベルを検出することによって典型的に検出される。ラベルは、当業者に周知である数多い手段のいずれによって取り込まれてもよい。ＷＯ９９／３２６６０を参照。
【０１５０】  （データベース）
［０１５０］  本発明には、配列情報（例えば、表１〜５ＷＷＷの遺伝子の配列情報）と同様に、様々な標準的毒に曝された組織又は細胞からの遺伝子発現情報（例えば、本明細書に記載のもの、表５Ａ〜５ＷＷＷを参照）を含んでいる関連あるデータベースが含まれる。データベースは、与えられた配列又は組織試料に関連する情報をも含むかもしれないが、これは例えば、配列情報と関連する遺伝子についての記載的な情報（表１を参照）や組織試料の臨床状態又はその試料が由来する動物に関する記載的な情報である。データベースは、例えば配列データベースと遺伝子発現データベースというような異なる部分を含むようになっているかもしれない。そのようなデータベースの配置と構築のための方法及びそのようなデータベースがセーブされるコンピュータ読み取り可能な媒体は、広く利用できる。例えば、その全体が関連付けにより本明細書に取り入れられている、米国特許５，９５３，７２７号を参照されたい。
【０１５１】  ［０１５１］  本発明のデータベースは、外部のデータベースとリンクされていてもよいが、これらは例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ．ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＫＥＧＧ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｋｅｇｇ）、ＳＰＡＤ（ｗｗｗ．ｇｒｔ．ｋｙｕｓｈｕ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｐａｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＨＵＧＯ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｈｕｇｏ）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ．ｓｐｒｏｔ）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃｎｐｓｉｔｌ．ｈｔｍｌ）、ＯＭＩＭ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ）及びＧＤＢ（ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ）である。好ましい実施の形態では、表１〜３に記載されているように、外部データベースはＧｅｎＢａｎｋ及び国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によって維持されているそれに関連するデータベースである。
【０１５２】  ［０１５２］  配列情報、遺伝子発現情報及びデータベース中のその他の情報又は入力として提供された他の情報の間の必要な比較を実行するためには、適当なコンピュータープラットフォーム、ユーザーインターフェースなどを用いてもよい。例えば、多数のコンピューターワークステーションが様々な製造業者から入手可能であり、そのようなものは、シリコングラフィックス（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ）から入手可能ものを有する。クライアント／サーバー環境、データベースサーバー及びネットワークも、本発明のデータベースのために広く利用できて、適当なプラットフォームである。
【０１５３】  ［０１５３］  本発明のデータベースを用いて、とりわけ、与えられた遺伝子が発現する細胞の型又は組織をユーザーが決定することが可能な電子ノーザンを生成し、そして特定の組織又は細胞中の与えられた遺伝子の存在量及び発現レベルを決定することが可能となる。
【０１５４】  ［０１５４］  組織又は細胞において表１〜５ＷＷＷの遺伝子の１個若しくはそれ以上からなる遺伝子セットの発現レベルを同定する情報であって、試験薬剤に曝された細胞又は組織中で表１〜５ＷＷＷ中の少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを、データベース中のその遺伝子の発現レベルと比較するステップを含むものを提供するために、本発明のデータベースを用いることができる。前記試験薬剤に曝された組織又は細胞試料から、表１〜５ＷＷＷの１又は複数の遺伝子の発現レベルを、標準毒又は肝臓毒（例えば、本明細書に記載されたもの）に曝された対照組織試料又は細胞試料で見出される発現レベルと比較することによって、与えられた化合物の毒性ポテンシャルを予測するために、そのような方法を用いることができる。そのような方法は、また、本明細書に記載するように薬又は薬剤スクリーニングアッセイでも使われるかもしれない。
【０１５５】  （キット）
［０１５５］  本発明は、異なる組合せで、高密度のオリゴヌクレオチドアレイ、アレイと使用する試薬、表の遺伝子によってコードされるタンパク質試薬、シグナル検出とアレイ−プロセッシング機器、遺伝子発現データベース及び上記の解析・データベース管理ソフトウェアを組合せたキットをさらに含む。例えば、前記キットを用いて、試験化合物の毒性反応を予測し、モデリングし、肝臓疾患の状態の進行をモニターし、新しい薬標的としての見込みを示す遺伝子を同定し、そして上記で議論したように既知及び新しく設計された薬をスクリーニングすることができる。
【０１５６】  ［０１５６］  キットとパッケージされるデータベースは、ヒト又は実験動物の遺伝子及び遺伝子断片（表１〜５ＷＷＷの遺伝子に対応する）からの発現パターンの編集体である。特に、データベースソフトウェア及びパッケージされた情報−コンピュータ読み取り可能な媒体にセーブされたデータベースも含む−には、試験薬剤によって誘導される表１〜５ＷＷＷの遺伝子の発現レベルを表１〜５ＷＷＷに提示される発現レベルと比較することによって、試験薬剤の毒性を予測するために使用することができる、表１〜５ＷＷＷの発現結果が含まれる。別の様式では、データベース及びソフトウェア情報は、例えば、ウェブサイトのようにアドレスがキットとパッケージされた、遠隔電子フォーマットで提供されるかもしれない。
【０１５７】  ［０１５７］  キットは、製薬業界で使用されるが、そこでは医薬開発に関連する高いコストのために早期の医薬試験への要求が強いが、バイオインフォマティクス、特に遺伝子発現情報がまだ欠落している。これらのキットは、細胞培養や実験動物を使用する伝統的な新薬スクリーニングに伴うコスト、時間及びリスクを低減するであろう。予めグループ分けされた患者集団、薬理ゲノミクス試験の大規模な医薬スクリーニングの結果も、またより大きい効能とより少ない副作用を備える薬を選ぶために応用できる。そのような大規模試験を実施するための施設を持たない規模の小さいバイオテクノロジー会社及び研究機関によっても前記キットは、使用されるであろう。
【０１５８】  ［０１５８］  マイクロアレイと使用するように設計されたデータベースとソフトウェアは、Ｂａｌａｂａｎらの米国特許第６，２２９，９１１号（少数又は多数のマイクロアレイから収集され、インデックス化された表として保存されている情報を管理するためのコンピュータで実行される方法）及び第６，１８５，５６１号（遺伝子発現レベルデータを集め、追加の特性を加え、そしてそのデータをフォーマットし直して様々な質問に対する答えを出すデータマイニング能力を有する、コンピュータベースの方法）で議論されている。Ｃｈｅｅらの米国特許第５，９７４，１６４号には、参照配列にハイブリダイズする野生型及び変異型配列間のプローブ蛍光強度の差異に基づいて、核酸配列中の変異を同定するためのソフトウェアベースの方法が開示されている。
【０１５９】  ［０１５９］  さらに説明することなく、当業者は以上の記載と以下の例示的な実施例を使って、本発明の化合物を作りそして利用することができ、請求項に記載の方法を実施できると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好適な実施の形態を特定的に指摘するものであり、開示の残りをいかようにも制限するもとは解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６０】  （実施例１：毒性マーカーの同定）
［０１６０］  肝臓毒である２−アセチルアミノフルオレン（２−ＡＡＦ）、ＢＩ肝毒素、クロロホルム、ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ）、ゲムフィブロジル、メナジオン、チオアセタミド、アシクロビル、ＡＹ−２５３２９、ビカルタミド、クロフィブラート、コルヒチン、ジフルニサル、ダイオキシン、ヒドラジン、フェノバルビタール、バルプロ酸、ジロートン及びＬＰＳを、表６に示した投与希釈剤、プロトコルや投与計画を用いて、様々な時間点において、雄性ＳＤ系ラットに投与した。肝臓毒であるＡＮＩＴ、アセトアミノフェン、四塩化炭素、クロロホルム、ＣＰＡ、ジクロフェナク、１７α−エチニルエストラジオール、インドメタシン、タクリン及びＷｙ−１４６４３を、当該技術分野で既に記載され、そして上で議論した関連出願に記載されているような投与希釈剤、プロトコルや投与計画を用いて、様々な時間点において、雄性ＳＤ系ラットに投与した。【０１６１】  ［０１６１］  投与後、投与された動物を観察し、そして、組織を以下に記載したように収集した。【０１６２】  （動物の観察）
［０１６２］  １．臨床観察  毎日２回、死亡率と瀕死性をチェックする。【０１６３】  ［０１６３］  ケージ側面観察  皮膚と毛、目と粘膜、呼吸系、循環器系、自律神経系及び中心神経系、体性運動パターン及び行動パターン。【０１６４】  ［０１６４］  震え、痙攣、唾液分泌、下痢、傾眠、昏睡又は異常な行動や外見を含む、毒性の可能性のある兆候が起こったときに、発症の時間、程度及び持続時間も含めて記録した。【０１６５】  ［０１６５］  ２．身体検査  ランダム化の前、最初の処置前に、そして犠牲の前に。【０１６６】  ［０１６６］  ３．体重  ランダム化の前、最初の処置前に、そして犠牲の前に。【０１６７】  （臨床病理）
［０１６７］  １．頻度  死体解剖の前に。【０１６８】  ［０１６８］  ２．動物の数  すべての生き残っている動物。【０１６９】  ［０１６９］  ３．出血手順  ７０％ＣＯ２／３０％Ｏ２麻酔下にあるあいだに、眼窩洞に穴を開けて血液を得た。【０１７０】  ［０１７０］  ４．血液試料の採取  血液学パラメーターの評価のために、約０．５ｍＬの血液をＥＤＴＡチューブに集めた。臨床化学分析のために、約１ｍＬの血液を血清セパレーターチューブに集めた。試験化合物／代謝産物の推定のために、約２００μＬの血漿を取得して、−８０℃で凍結した。追加の２ｍＬの血液を１５ｍＬ円錐状ポリプロピレン・バイアルに収集して、直ちに３ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加えた。内容物を直ぐにボルテックス及び繰り返し逆さまにして混合した。それらチューブを液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。【０１７１】  （終結手順）
（終結犠牲）
［０１７１］  各肝臓毒に対して表６に示したサンプリング時間において、上記の関連出願で既に記載したように、ラットを計量し、身体検査して、断頭によって犠牲にし、失血させた。犠牲の約５分以内に動物を死体解剖した。頭蓋帽を開くのに使用した骨切断機を除いては、別々の滅菌した、使い捨ての機器を各々の動物のために使用した。その骨切断機は、動物と動物の間に殺菌剤溶液に浸した。【０１７２】  ［０１７２］  委員会に認証された病理学者に承認された手順に従って、各動物の死体解剖を実施した。【０１７３】  ［０１７３］  終結犠牲まで生き残っていない動物は、死体解剖（もし瀕死であるなら、二酸化炭素仮死状態による安楽死に続いて）することなく捨てられた。瀕死又は死んでいるのが見つかった動物の死のおおよその時間を記録した。【０１７４】  （死後手順）
［０１７４］  新しくかつ滅菌した使い捨て機器を使用して組織を収集した。組織又はバイアルを取り扱うときは、手袋をいつでも着用した。すべての組織は、動物の死のおよそ７分以内に回収して、凍結した。肝臓切片は、動物の死のおよそ２分以内に凍結した。安楽死の時間、肝臓切片及び腎臓の凍結の暫定的な時間点、及び死体解剖完了の時を記録した。組織を約−８０℃で保存するか、又は１０％中性緩衝ホルマリンに保存した。【０１７５】  （組織収集及びプロセッシング）
（肝臓）
［０１７５］  １．内側右葉  液体窒素で瞬時に凍結し、そして−８０℃で保存した。【０１７６】  ［０１７６］  ２．内側左葉  １０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）に保存し、全体の及び顕微鏡での病理検査のために評価した。【０１７７】  ［０１７７］  ３．外側左葉  液体窒素で瞬時に凍結し、そして−８０℃で保存した。【０１７８】  （心臓）
［０１７８］  ２つの心房の部分及び２つの心室の部分を含んでいる矢状横断面を１０％ＮＢＦに保存した。残っている心臓を液体窒素で凍結して、−８０℃で保存した。【０１７９】  （腎臓（両方））
［０１７９］  １．左：  半分に切開した。半分を１０％ＮＢＦに保存して、そして残っている半分を液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。【０１８０】  ［０１８０］  ２．右：  半分に切開した。半分を１０％ＮＢＦに保存して、そして残っている半分を液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。【０１８１】  （精巣（両方））
［０１８１］  各精巣の矢状横断面を１０％ＮＢＦに保存した。残っている精巣を液体窒素中、一緒に凍結して、−８０℃で保存した。【０１８２】  （脳（全部））
［０１８２］  大脳半球及び間脳の横断面を１０％ＮＢＦに保存し、そして脳の残りを液体窒素中で凍結して−８０℃で保存した。【０１８３】  （骨髄）
［０１８３］  シリンジ及び新しい冷やしたＲＰＭＩ（大腿当り１ｍＬのＲＰＭＩ×３回洗浄）を用いて各大腿から骨髄を２つの別々の１５ｍＬのコニカルバイアルに流した。バイアルは、右大腿及び左大腿の試料を区別できるように標識してあった。回収後、バイアルをゆっくりと数回ひっくり返し、塗れた氷の上に保持した。【０１８４】  ［０１８４］  マイクロアレイ試料の調製は、アフイメトリックス  ジーンチップ発現解析マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍａｎｕａｌ）に記載されているプロトコルに従って、若干修正した上で実施した。凍結した組織は、Ｓｐｅｘ  Ｃｅｒｔｉｐｒｅｐ  ６８００  Ｆｒｅｅｚｅｒ  Ｍｉｌｌを使用して、粉末へすりつぶした。トータルＲＮＡは、製造業者のプロトコルを利用してＴｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で抽出した。各試料用のトータルＲＮＡ収率は、３００ｍｇの組織重量あたり２００〜５００μｇであった。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡを単離し、エタノール沈殿を行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成させた。第１鎖ｃＤＮＡ合成をＴ７−（ｄＴ２４）オリゴヌクレオチドでプライムした。ｃＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出して、終濃度１μｇ／ｍＬにエタノール沈殿した。２μｇのｃＤＮＡからＡｍｂｉｏｎ’ｓ  Ｔ７  ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ  ｉｎｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してｃＲＮＡを合成した。【０１８５】  ［０１８５］  ｃＲＮＡをビオチンラベルするために、ヌクレオチドＢｉｏ−１１−ＣＴＰとＢｉｏ１６−ＵＴＰ（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を反応液に加えた。６時間、３７℃のインキュベーションに続いて、不純物をＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、ラベルされたｃＲＮＡから取り除いた。ｃＲＮＡを９４℃で３５分間、断片化した（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．１、５００ｍＭ  酢酸カリウム、１５０ｍＭ  酢酸マグネシウムからなるフラグメンテーション緩衝液）。アフィメトリックスプロトコルに従って、５５μｇの断片化したｃＲＮＡを４５℃のハイブリダイゼーション・オーブンの中で、６０ｒｐｍで２４時間、アフィメトリックスラットアレイセットでハイブリダイズした。チップを洗浄して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎ中、ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で染色した。染色を増幅するために、抗ストレプトアビジン  ビオチン化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）染色ステップを間に挟んで、ＳＡＰＥ溶液を２回加えた。プローブアレイへのハイブリダイゼーションは、蛍光測定スキャンニング（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ）によって検出した。データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐバージョン３．０及びＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ（ＥＤＭＴ）ソフトウェア（バージョン１．０）、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ２０００及びＳ−Ｐｌｕｓを使��して解析した。【０１８６】  ［０１８６］  表１には、示された毒に曝されたときに差次的に発現する遺伝子及びそれらの対応するＧｅｎＢａｎｋ受入番号及び配列識別番号、知られている場合には遺伝子名、並びに配列クラスタータイトル（コアセット及び代替セット遺伝子断片）のセットが開示される。表１のラット遺伝子のヒトのホモログは表３に示される。表１の遺伝子が機能する代謝経路の同定は表２に示される。表１−３のモデルコードは、各遺伝子が識別することができる様々な毒性状態又は肝臓病理を表し、また、各遺伝子の差次的な発現に関連する個々の毒又は毒のタイプも表す。モデルコードは表４で定義される。ＧＬＧＣ  ＩＤはジーン・ロジック内部の識別番号である。【０１８７】  ［０１８７］  表５Ａ〜表５ＷＷＷには、コア遺伝子セット又は代替遺伝子セットが、これらの表に示したように行われた各々の比較に対する統計概要とともに開示される。すなわち、特定の毒に曝されるのに応じて又は特定の疾病の状態において測定されて、非毒性群の試料と比較された毒性群の試料における特定の遺伝子の発現レベル。これらの表はそれぞれが、予測遺伝子のセットを含み、未知の化合物、すなわち、試験されていない化合物の肝臓毒性を予測するためのモデルを作り出す。それぞれの遺伝子は、そのジーン・ロジック識別番号によって識別され、表１中の又は１頁で述べたように１以上の関連出願中の遺伝子名及び代表的な配列番号に対して相互参照することができる。毒性群における試料（ある毒に曝されて影響を受けた試料）と非毒性群における試料（ある毒に曝されて影響を受けなかった試料）との間における遺伝子発現レベルのそれぞれの比較のために、毒性平均（毒性群試料について）は、アッセイされている様々なチップパラメーターについて規格化されたときの平均シグナル強度である。非毒性平均は、非毒性群試料における、アッセイされている様々なチップパラメーターについて規格化されたときの平均シグナル強度を表す。個々の遺伝子について、非毒性平均と比較した場合の毒性平均の増大は、トキシンに曝されたときのアップレギュレーションを示している。逆に、非毒性平均と比較した場合の毒性平均の低下はダウンレギュレーションを示している。【０１８８】  ［０１８８］  平均値は、対応する試料全体で平均化された特定の遺伝子に対する平均差（ＡｖｅＤｉｆｆ）値から導かれる。個々の平均差値はそれぞれが、特定のフラグメントについて覆われる多数のプローブ対から得られる強度情報を積分することによって計算される。規格化により、所与の実験（チップ）に対するそれぞれの発現強度が全体的な調整係数（ｓｃａｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）で乗ぜられる。この規格化の意図は、チップ間の個々の遺伝子の比較を可能にすることである。調整係数は下記のように計算される：
１．実験における規格化されていない発現値のすべてから、最大値側の２％及び最小値側の２％の値を除く。すなわち、実験により、１０，０００個の実験値が得られた場合、それらの値を順に並べ、最小値側の２００個及び最大値側の２００個を除く。
２．残った値の平均値に等しい調整平均を計算する。
３．調整係数ＳＦ＝１００／（調整平均）を計算する。【０１８９】  ［０１８９］  ここで使用される１００の値は、使用された基準標的の値である。【０１９０】  ［０１９０］  ２．０＊ＳＤノイズよりも大きな値は、エクスプレッサー（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒｓ）に由来している推定される。これらの値について、標準偏差ＳＤｌｏｇ（シグナル）の対数を計算する。対数に１／ＳＤｌｏｇ（シグナル）に比例する調整係数を乗じ、指数にする。得られた値に別の調整係数を乗じるが、ここで調整係数は両側の２．０＊ＳＤノイズの非調整の数値から規格化した値に不連続が生じないように選ばれる。ＡｖｅＤｉｆｆ値のいくつかは、核酸ハイブリダイゼーション実験に含まれる一般的なノイズのために負になることがある。多くの結論を、ＧｅｎｅＣｈｉｐプラットフォームでの負の値に対応して下すことができるが、個々のフラグメントについて負の値の背後にある意味を評価することは困難である。本発明者らの観測結果は、負の値が予測遺伝子セット内において何度も観測されるが、これらの値は測定が行われたすべての試料にわたって非常に再現的である実際の生物学的現象を反映することを示している。この理由のために、負の値を示すそのような遺伝子が予測セットに含められる。遺伝子発現測定の他のプラットフォームにより、対応する遺伝子について負の数字が解消され得ることに留意しなければならない。しかし、そのような遺伝子のそれぞれの予測能はプラットフォーム中に広がるはずである。それぞれの平均値には、平均値に対する標準偏差が伴う。表に開示されるような線形判別分析スコア（判別スコア、又はＬＤＡ）により、サンプルが毒性であるか否かを予測する各遺伝子の能力が評価される。判別スコアは、下記の工程によって計算される：【０１９１】  （判別スコアの計算）
［０１９１］  Ｘｉがグループ１の試料、ｉ＝１・・・ｎにわたる、与えられた遺伝子のＡｖｅＤｉｆｆ値を表わすとする。【０１９２】  ［０１９２］  Ｙｉがグループ２の試料、ｉ＝１・・・ｔにわたる、与えられた遺伝子のＡｖｅＤｉｆｆ値を表わすとする。【０１９３】  ［０１９３］  計算を次のように進める。【０１９４】  ［０１９４］  ＸｉとＹｉに対する平均値と標準偏差を計算して、そして、これらをｍＸ、ｍＹ、ｓＸ、ｓＹと表示する。【０１９５】  ［０１９５］  ＸｉとＹｉに対して、関数
ｆ（ｚ）  ＝  （（１／ｓＹ＊ｅｘｐ（−．５＊（（ｚ−ｍＹ）／ｓＹ）２））  ／  （（（１／ｓＹ）＊ｅｘｐ（−．５＊（（ｚ−ｍＹ）／ｓＹ）２））＋（（１／ｓＸ）＊ｅｘｐ（−．５＊（（ｚ−ｍＸ）／ｓＸ）２）））の数値を求める。【０１９６】  ［０１９６］  正しい予測（例えば、Ｐ）の数は、ｆ（Ｙｉ）＞．５であるＹｉの数にｆ（Ｘｉ）＜．５であるＸｉの数を足した数である。【０１９７】  ［０１９７］  判別式スコアは、それからＰ／（ｎ＋ｔ）である。【０１９８】  ［０１９８］  線形判別分析（ＬＤＡ）は、試料を分類するのに、各遺伝子の個々の測定値と遺伝子のすべての組合せの計算された測定値の両方を使用する。各遺伝子については、加重値は毒性グループと非毒性グループの平均と標準偏差から導かれる。あらゆる遺伝子に加重値が乗ぜられ、そして、これらの値の合計が集合的な判別スコアをもたらす。この判別スコアは、それから毒性グループと非毒性グループの集合的な中心（重心）に対して比較される。これらの中心は、それぞれ毒性と非毒性すべての試料の平均値である。したがって、各遺伝子は、全体的な予測に貢献する。この貢献は、その遺伝子に対する。毒性と非毒性試料の間の相対的な間隔が大きいならば大きい正値又は負値であり、相対的な間隔が小さいならば小さい数値である、加重値に依存している。各未知試料の判別スコアと中心値を使用して、その未知試料がどのグループに属しているかについて、０と１の間の確率を計算することができる。【０１９９】  （実施例２：一般的な毒性モデル）
［０１９９］  試料が、主成分分析（ＰＣＡ）を用いてそれぞれの実験を個々に調べて、どの処置が観測可能な応答を有するかを明らかにすることによって毒性応答群及び毒性非応答群へのグループ分けのために選択された。それらの毒性応答状態及び毒性非応答状態の信頼度が明らかにされた群のみが、一般的な毒性モデルを組み立てる際に含められた。【０２００】  ［０２００］  線形判別モデルが、毒性試料及び非毒性試料を記述するために作製された。最高の判別遺伝子及び／又はＥＳＴが、分散の等分散的処理及び異分散的処理ならびに遺伝子間の相互情報の包含又は排除とともにそれぞれの遺伝子寄与を計算することによって毒性を明らかにするために使用された。データベース内の試料の予測は、真の陽性が８０％を越え、偽陽性率は５％未満であった。遺伝子及び／又はＥＳＴの組み合わせは、個々の遺伝子よりも良好な予測能を一般にもたらすこと、そして使用される遺伝子及び／又はＥＳＴが多いほど、予測能が良好であることが明らかにされた。好ましい実施形態には、５０個以上の遺伝子が含まれるが、遺伝子及び／又はＥＳＴの多くの対形成又はより多くの組み合わせが個々の遺伝子よりも良好に機能し得る。選択されたリスト（表５）からの２つ以上の遺伝子の組み合わせはすべてが、毒性を予測するために使用され得る。これらの組み合わせは、集団として、区別的に、又は無作為なアプローチでの対形成によって選択することができる。さらに、今までのところ明らかにされていない遺伝子及び／又はＥＳＴを、予測能を増大させるために、本明細書に記載される遺伝子及び／又はＥＳＴの１つ１つと組み合わせることができ、あるいは本明細書に記載される遺伝子及び／又はＥＳＴの組み合わせと組み合わせることができる。しかし、本明細書に記載される遺伝子及び／又はＥＳＴは、任意のそのような明らかにされていない組み合わせの予測能の大部分に寄与していると考えられる。【０２０１】  ［０２０１］  上記方法に対する他の様々な変化により、十分な予測能が提供され得る。これらには、集団として、区別的に、又は無作為なアプローチによる構成成分の選択的包含、あるいは集団として、区別的に、又は無作為なアプローチで構成成分を負荷し、組み合わせることの抜き出しが含まれる。また、サンプルの分類を決定するためのロジスティック回帰における複合変数の使用もまた、線形判別分析、ニューラルネットワークもしくはベイジアンネットワーク、又は類別的もしくは連続的な従属変数及び独立変数に基づく回帰及び分類の他の形態を用いて達成することができる。【０２０２】  （実施例３：コア遺伝子セットによるモデリング）
［０２０２］  上記実施例１及び２で述べたように、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション実験から収集したデータをＬＤＡ及びＰＣＡによって解析した。表５Ａ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ、５Ｇ、５Ｉ、５Ｋ、５Ｌ、５Ｍ、５Ｎ、５Ｏ、５Ｑ、５Ｓ、５Ｔ、５Ｕ、５Ｖ、５Ｗ、５Ｘ、５Ｚ、５ＢＢ、５ＤＤ、５ＦＦ、５ＧＧ、５ＨＨ、５ＩＩ、５ＪＪ、５ＬＬ、５ＭＭ、５ＮＮ、５ＰＰ、５ＲＲ、５ＳＳ、５ＴＴ、５ＵＵ、５ＶＶ、５ＷＷ、５ＸＸ、５ＺＺ、５ＢＢＢ、５ＤＤＤ、５ＥＥＥ、５ＦＦＦ、５ＧＧＧ、５ＨＨＨ、５ＩＩＩ、５ＫＫＫ、５ＬＬＬ、５ＭＭＭ、５ＮＮＮ、５ＯＯＯ、５ＰＰＰ、５ＲＲＲ、５ＳＳＳ、５ＴＴＴ、５ＵＵＵ及び５ＶＶＶ中の遺伝子は、化合物の肝毒性を予測するためのマーカーのコアセットを構成する。表５Ｂ、５Ｈ、５Ｊ、５Ｐ、５Ｒ、５Ｙ、５ＡＡ、５ＣＣ、５ＥＥ、５ＫＫ、５ＯＯ、５ＱＱ、５ＹＹ、５ＡＡＡ、５ＣＣＣ、５ＪＪＪ、５ＱＱＱ、及び５ＷＷＷの遺伝子は、本発明の方法でまた使用されるマーカーの代替セットを構成するが、表５Ａ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ、５Ｇ、５Ｉ、５Ｋ、５Ｌ、５Ｍ、５Ｎ、５Ｏ、５Ｑ、５Ｓ、５Ｔ、５Ｕ、５Ｖ、５Ｗ、５Ｘ、５Ｚ、５ＢＢ、５ＤＤ、５ＦＦ、５ＧＧ、５ＨＨ、５ＩＩ、５ＪＪ、５ＬＬ、５ＭＭ、５ＮＮ、５ＰＰ、５ＲＲ、５ＳＳ、５ＴＴ、５ＵＵ、５ＶＶ、５ＷＷ、５ＸＸ、５ＺＺ、５ＢＢＢ、５ＤＤＤ、５ＥＥＥ、５ＦＦＦ、５ＧＧＧ、５ＨＨＨ、５ＩＩＩ、５ＫＫＫ、５ＬＬＬ、５ＭＭＭ、５ＮＮＮ、５ＯＯＯ、５ＰＰＰ、５ＲＲＲ、５ＳＳＳ、５ＴＴＴ、５ＵＵＵ及び５ＶＶＶのコアマーカーセットは、該マーカーセットが追加の予測遺伝子を含有するために、本発明のある実施形態で望ましいことがある。表１−５ＷＷＷの各遺伝子断片は、ＬＤＡスコアを割当てられ、コアセット中のこれらの遺伝子断片は、最高のＬＤＡスコアを持つ遺伝子断片である。表５Ａ−５ＷＷＷの遺伝子断片は、８０％を超える真陽性結果及び５％未満の偽陽性結果を与えることが判定された。毒素処置を伴う、及び伴わない、これらの遺伝子の発現データから作成された遺伝子発現プロファイルは、その毒素特性が調査されていない化合物のアッセイにおいて、対照として使用できる。試験化合物曝露及び試験化合物非曝露動物によるデータと、表５Ａ−５ＷＷＷのデータとの、又はコア遺伝子セット対照からのデータとの比較は、試験化合物への曝露時の毒性効果又は非毒性効果の予測を可能にする。それゆえ表１の、実施例１で述べたよりも小さい遺伝子セットによって、コア遺伝子セットを用いて曝露後の毒性特性が未知である化合物の生物学的効果を調査し、本化合物の肝臓組織における毒性を予測することができる。【０２０３】  （実施例４：モデリング方法）
［０２０３］  上記のモデリング方法は、遺伝子の発現を組合せて試料毒性を予測する、広いアプローチを提供する。１つの方法は、各変数を個々に使用しそれらを重み付けするが、その他の方法は、変数を複合性の測定として組み合わせ、組み合わせ後にそれらに加重を加えて新しい変数にする。１つの方法は、単純な投票方法（ｖｏｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）で加重値を提供しないか、集団として、区別的に、又は無作為なアプローチを用いる、監督された或いは監督されなかった方法で加重値を決定する。遺伝子のすべて又は選ばれた組み合わせを、分類のための未知試料と、順序づけた、集団として、又は区別的に、監督されているか、監督されていないクラスタリングアルゴリズムと組み合わせることができる。未知試料を分類するために相関行列のどんな形でも用いることができる。グループ分布と判別スコアの広がり単独で、当業者に個別遺伝子の判別能力を超えうる正確さをもって上記のモデルタイプのすべてを作成することを可能にする十分な情報を提供できる。個別に又はデータタイプを変換した後に組み合わせて用いることができる方法のいくつかの例には、以下のものが含まれるが、これらには限定されない。すなわち、判別分析、多重判別分析、ロジスティック回帰、多重回帰分析、線形回帰分析、共同解析、正準相関、階層的なクラスタ解析、ｋ−ｍｅａｎクラスタ解析、自己編成マップ、多次元尺度解析、構造方程式モデリング、サポートベクトルマシン決定境界、ファクター解析、ニューラルネットワーク、ベイシアン分類及びリサンプリング方法である。【０２０４】  （実施例５：個々の化合物と病理学的クラスのグループ化）
［０２０４］  既知の毒性学的反応、観察された臨床化学及び病理学測定に基づく、個々の病理学的クラスへ、或いはある化合物（表１〜５ＷＷＷ）の範囲内で観察される毒性の早期又は後期に、試料を分類した。１つのモデルにおいて個々の判別スコアに基づく上位１０、２５、５０、１００個の遺伝子を使用して、遺伝子の組み合わせが個々の遺伝子に比べてより良い予測を提供することを確実にした。上記で説明したように、どのような順序で、或いは順序づけて、集団として、区別的に、又は無作為なアプローチによって、選択されるとき、このリストからの２個若しくはそれ以上の遺伝子のすべての組み合わせは、潜在的に個々の遺伝子に比べてより良い予測を提供することができた。それに加えて、これらの遺伝子を他の遺伝子と組み合わせることは、より良い予測能力を提供することができたが、この予測能力の大部分は、本明細書にリストされた遺伝子から来るだろう。【０２０５】  ［０２０５］  それらがここで表示された、病理学的な又は個々の化合物クラスで、或いはデータから獲得できる個々の毒性化合物の投与量グループ分けと個々の時間との組み合わせに基づく、一般的な毒性学モデルの項で言及されるいかなるモデリング方法において、正を記録する場合、試料は毒性があるとみなされる。病理学的なグループ化及び早期や後期モデルは、試料時間と用量時間点とのすべての得られうる組み合わせの好ましい例である。１個若しくはそれ以上の遺伝子及び１つ若しくはそれ以上の試料用量と時間点を備えるほとんどの論理的なグループ化は、個々の遺伝子と比べて、一般的な毒性、病理的な特異的毒性又は既知の毒への類似性のより良い予測を出すはずである。【０２０６】  ［０２０６］  本発明は、上記の実施例に関連して詳述されてきたが、本発明の精神から逸脱することなく、様々な改変をなし得ることが理解される。したがって、本発明は特許請求の範囲のみによって限定される。本出願で言及されたすべての引用特許、特許出願及び刊行物は、それらの全体が関連付けによって本明細書に取り入れられる。【０２０７】
【表１−１】
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【０２０８】
【表１−２】
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【０２０９】
【表１−３】
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【０２１０】
【表１−４】
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【０２１１】
【表１−５】
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【０２１２】
【表１−６】
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【０２１３】
【表１−７】
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【０２１４】
【表１−８】
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【０２１５】
【表１−９】
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【０２１６】
【表１−１０】
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【０２１７】
【表１−１１】
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【０２１８】
【表１−１２】
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【０２１９】
【表１−１３】
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【０２２０】
【表１−１４】
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【０２２１】
【表１−１５】
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【０２２２】
【表１−１６】
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【０２２３】
【表１−１７】
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【０２２４】
【表１−１８】
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【０２２５】
【表１−１９】
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【０２２６】
【表１−２０】
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【０２２７】
【表１−２１】
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【０２２８】
【表１−２２】
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【０２２９】
【表１−２３】
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【０２３０】
【表１−２４】
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【０２３１】
【表１−２５】
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【０２３２】
【表１−２６】
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【０２３３】
【表１−２７】
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【０２３４】
【表１−２８】
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【０２３５】
【表１−２９】
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【０２３６】
【表１−３０】
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【０２３７】
【表１−３１】
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【０２３８】
【表１−３２】
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【０２３９】
【表１−３３】
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【０２４０】
【表１−３４】
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【０２４１】
【表１−３５】
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【０２４２】
【表１−３６】
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【０２４３】
【表１−３７】
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【０２４４】
【表１−３８】
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【０２４５】
【表１−３９】
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【０２４６】
【表１−４０】
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【０２４７】
【表１−４１】
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【０２４８】
【表１−４２】
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【０２４９】
【表１−４３】
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【０２５０】
【表１−４４】
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【０２５１】
【表１−４５】
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【０２５２】
【表１−４６】
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【０２５３】
【表１−４７】
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【０２５４】
【表１−４８】
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【０２５５】
【表１−４９】
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【０２５６】
【表１−５０】
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【０２５７】
【表１−５１】
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【０２５８】
【表１−５２】
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【０２５９】
【表１−５３】
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【０２６０】
【表１−５４】
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【０２６１】
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【国際調査報告】
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