(57)【要約】一種以上の治療剤（例えば、薬物または薬物結合体分子）に共有結合したポリマー足場を含有する、親水性ポリマー物品。この物品は、必要に応じて、特定の細胞または特定の組織において発現される生体分子構造体に結合して、標的化および／または送達を容易にするための、認識エレメント（ＲＥ）をさらに含有し、これに共有結合し得る。本発明は、治療実体の分野に関する。より特定すると、本発明は、生物活性成分を組み込むポリマー物品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロゲルナノ物品であって、以下：
ｉ）架橋した親水性構築ブロックを含むポリマー足場；
ｉｉ）該ポリマー足場に共有結合した治療剤；および
ｉｉｉ）該ポリマー足場に共有結合した、２種以上の認識エレメント、
を含む、ヒドロゲルナノ物品。
【請求項２】
前記認識エレメントが、前記足場のポリマー分子に直接共有結合している、請求項１に記載のポリヒドロゲルナノ物品。
【請求項３】
前記認識エレメントが、前記足場のポリマー分子に、リンカー分子によって共有結合している、請求項１に記載のポリヒドロゲルナノ物品。
【請求項４】
前記リンカー分子が、ポリエチレングリコール鎖である、請求項３に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項５】
前記認識エレメントの少なくとも１つが、アミノ酸配列ＲＧＤである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項６】
前記認識エレメントの少なくとも１つが、増殖因子ＥＧＦである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項７】
前記足場が、少なくともいくらかの分解可能な共有結合を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項８】
前記親水性構築ブロックが、低分子架橋剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項９】
前記親水性構築ブロックの少なくともいくつかが、炭水化物ベースのモノマーである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１０】
前記炭水化物ベースのモノマーの少なくともいくつかが、アクリレート、部分、メタクリレート部分、アクリルアミド部分、またはメタクリルアミド部分で官能基化されている、請求項９に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１１】
前記親水性構築ブロックの少なくともいくつかが、イヌリンまたはデキストランを含む、請求項９または１０に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１２】
前記親水性構築ブロックの少なくともいくつかが、イヌリンマルチメタクリレートである、請求項１１に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１３】
前記親水性構築ブロックの少なくともいくつかが、Ｎ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１４】
前記親水性構築ブロックの少なくともいくつかが、ジアセトンアクリルアミドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１５】
前記親水性構築ブロックの少なくともいくつかが、アミノプロピルメタクリルアミドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１６】
前記構築ブロックが、イヌリンマルチメタクリレート、Ｎ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミド、およびアクリル酸ナトリウムを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１７】
前記構築ブロックが、イヌリンマルチメタクリレート、Ｎ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミド、およびジアセトンアクリルアミドを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１８】
前記ポリマーマトリックスに共有結合した、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項１９】
前記治療剤が、化学療法剤である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項２０】
前記治療剤が、ドキソルビシンまたはドキソルビシンアナログである、請求項１９に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項２１】
前記治療剤が、加水分解可能な結合を介して前記足場に結合している、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のヒドロゲルナノ物品。
【請求項２２】
以下の式Ｉ：
【化１】
2005535604.tif 000011
の、化合物Ｎ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミド。
【請求項２３】
以下の式ＩＶ：
【化２】
2005535604.tif 000012
の、化合物イヌリンマルチメタクリレートであって、ここで、ｎが約５〜約５０である、化合物。
【請求項２４】
治療剤を哺乳動物身体内の環境に制御可能に放出するための方法であって、該方法は、該環境に、ヒドロゲルナノ物品を投与する工程を包含し、該ヒドロゲルナノ物品は、以下：
ｉ）架橋した親水性構築ブロックを含むポリマー足場；および
ｉｉ）該足場に共有結合した治療剤；
を含む、方法。
【請求項２５】
標的化された細胞または組織型の近隣への、治療剤の制御された送達のための方法であって、該方法は、該標的化された細胞または組織型を含む環境に、ヒドロゲルナノ物品を投与する工程を包含し、該ヒドロゲルナノ物品は、以下：
ｉ）架橋した親水性構築ブロックを含むポリマー足場；
ｉｉ）該足場に共有結合した治療剤；および
ｉｉｉ）該足場に共有結合した、２種以上の認識エレメントであって、該認識エレメントは、該標的化された細胞または組織型において発現される生体分子に対して結合親和性を有する、認識エレメント、
を含む、方法。
【請求項２６】
癌の処置のための、請求項２４または２５に記載の方法の使用。
【請求項２７】
ヒドロゲル認識エレメント官能基化ポリマーナノ物品を合成するための方法であって、該方法は、以下：
逆ミクロエマルジョンの不連続な水相において、親水性構築ブロックの架橋を介して、ナノ物品のポリマー足場を形成する工程であって、該構築ブロックの少なくともいくつかが、Ｎ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミドである、工程；
該ポリマー足場を還元して、該Ｎ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミドのジスルフィド結合から、遊離チオールを生成する工程；
リンカー分子を添加して、該リンカーを該ポリマー足場に結合させる工程であって、該リンカー分子は、チオールと反応性の基を含有する、工程；ならびに
認識エレメントを添加する工程であって、該認識エレメントは、該リンカー分子の遊離末端と反応性の基を含む、工程、
を包含し、これによって、認識エレメント官能基化ナノ物品を生じる、方法。
【請求項２８】
ヒドロゲル認識エレメント官能基化ポリマーナノ物品を合成するための方法であって、該方法は、以下：
逆ミクロエマルジョンの不連続な水相において、親水性構築ブロックの架橋を介して、ナノ物品のポリマー足場を形成する工程であって、該構築ブロックの少なくともいくつかが、Ｎ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミドである、工程；
該ポリマー足場を還元して、該Ｎ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミドのジスルフィド結合から遊離チオールを生成する工程；および
リンカー分子を添加して、該リンカー分子の一端に結合した認識エレメント官能基化リンカー分子を、該ポリマー足場に結合させる工程であって、該リンカー分子は、該認識エレメントを含み、該リンカー分子は、チオールと反応性の基を含む、工程、
を包含し、これによって、認識エレメント官能基化ナノ物品を生じる、方法。
【請求項２９】
前記親水性構築ブロックの少なくともいくつかが、炭水化物ベースのモノマーである、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリマー足場を還元する前に、前記ナノ物品に治療剤を添加する工程をさらに包含し、該治療剤が、該ポリマー足場と反応性であり、該治療剤を該足場に共有結合させる基を有する、請求項２７、２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
ヒドロゲルナノ物品であって、以下：
ｉ）架橋された親水性構築ブロックを含むポリマー足場；および
ｉｉ）該ポリマー足場に共有結合された治療剤、
を含む、ヒドロゲルナノ物品。
【請求項３２】
さらに、以下：
ｉｉｉ）前記ポリマー足場に共有結合した、２種以上の認識エレメントであって、該認識エレメントは、特定の細胞または特定の組織において発現される生体分子構造体に対して結合親和性を有する、認識エレメント、
を含む、請求項３１に記載のヒドロゲルナノ物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、治療実体の分野に関する。より特定すると、本発明は、生物活性成分を組み込むポリマー物品に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
低分子薬物は、しばしば、制限された水溶性および血液溶解度を有する、実質的に疎水性の構造を含む。これらの化合物は、生体膜と強く相互作用し、生体膜を通って迅速に拡散し、従って、血流を容易に出、そして非特異的に組織に侵入する。このような所望でない分布は、高い用量要求、迅速なクリアランス、および毒性の副作用をもたらし得る。実際に、低分子薬物は、疎水性の性質であるか親水性の性質であるかにかかわらず、毒性の問題を提示し得る。性能を改善するために、薬物は、例えば、生体分布を変化させるため、毒性を減少させるため、多重薬物耐性（ＭＤＲ）の流出を減少させるため、および活性を延長するために、水溶性の合成ポリマー（例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ））（Ｂｕｒｔｌｅｓら、Ｈｕｍ．Ｅｘｐ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９８８，１７，９３−１０４）；天然ポリマー（例えば、デキストラン；およびタンパク質（例えば、アルブミン）（Ｓｃｈｕｔｔｅ  Ｍ．Ｔ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１９９９，１６，２４５−２８８）に共有結合されてきた。大きさおよび溶解度は、薬物結合体と比較した薬物の間の差異を理解するための基礎を提供する。親水性ポリマーへの結合は、拡散性が低下し、そして水溶性および血液溶解度が増加した、より大きい分子を生じる。従って、非特異的な膜貫通は、かなり減少される。従って、このような薬物−ポリマー結合体は、薬物単独と比較して、血流中により長く存在し、従って、漏出性の脈管を有する組織を受動的に標的化し得る。
【０００３】
薬物の能動的な標的化は、生物活性薬剤を、所望の型の細胞または細胞成分、組織の型または組織成分、あるいは器官に局在させる目的で、特定の生体分子構造体（例えば、特定の癌細胞において過剰発現されるレセプター）に結合し得るリガンド構築物の使用を介して、達成されている。例えば、ＨＰＭＡ−薬物結合体は、特定の癌において過剰発現されるレセプターを標的とするモノクローナル抗体で、さらに官能基化されている。別の例において、薬物分子は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に直接結合体化されている。例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）は、化合物ＳＧＮ１５（これは、ドキソルビシン（ｄｏｘ）で官能基化されたｍＡｂである）を有し、そして特定の腫瘍において発現される表面Ｌｅｙ抗原に結合させる）。
【０００４】
現在の技術水準を越えて、性能を改善する他の材料および方法（例えば、改善された治療効果、より大きい治療指数、改善された溶解度、またはより低い投薬レジメンを介する）が、当該分野に対する重要な追加である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本明細書中において使用される場合、用語「物品」および「ナノ物品」は、交換可能に使用される。
【０００６】
本発明は、親水性ポリマーのナノ物品に関し、この物品は、以下を含む：ｉ）架橋した親水性構築ブロックを含む足場およびｉｉ）足場に共有結合した一種以上の治療剤（例えば、薬物または薬物結合体化分子）。このナノ物品は、さらに、必要に応じて、一種以上の認識エレメント（ＲＥ）を含み、標的化および／または送達を容易にし得る。このナノ物品はまた、必要に応じて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの分子からなり得る。このＰＥＧ鎖は、一端がナノ物品の表面に結合し、そして他端がＲＥで官能基化されて、リンカーまたはテザー（ｔｅｔｈｅｒ）として働き得、そして／またはこのＰＥＧ鎖は、他の有用もしくは所望の特徴を、この親水性ナノ物品に提供し得る。本発明は、さらに、これらのナノ物品を合成する方法、およびこれらのナノ物品が使用され得る種々の適用に関する。
【０００７】
本発明のナノ物品は、好ましくは、直径が約５ｎｍ〜約１００ｎｍであり、より好ましくは、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍである。ナノ物品の大きさは、哺乳動物における生物活性実体としてのそれらの使用を可能にする。細網内皮系による取り込みを回避するためには、ナノ物品は、好ましくは、１００ｎｍ未満である。腎臓クリアランスを回避するためには、ナノ物品は、好ましくは、５ｎｍより大きい。逆ミクロエマルジョン（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）重合は、本発明のナノ物品の足場を生じ得る。
【０００８】
治療剤が、ヒドロゲル足場への共有結合を介して、ナノ物品に組み込まれる。好ましい治療実体は、ドキソルビシンまたはドキソルビシン誘導体である。
【０００９】
ＲＥは、本発明のナノ物品を、特定の細胞表面もしくは特定の組織において過剰発現されるかまたは他に見出される、所望の生体分子に結合させる。１つのナノ物品あたりのＲＥの数は、２〜約１０００、好ましくは、２〜５００の範囲であり得る。ナノ物品は、必要に応じて、一種以上の型のＲＥからさらになり得る。本明細書中において使用される場合、ＲＥの「型」とは、特定の分子構造のＲＥとして定義される。本発明のさらなる利点は、相補的な特徴を有する多数のＲＥ系が、単一のナノ物品に組み込まれ得ることである。
【００１０】
ナノ物品の足場は、架橋された親水性構築ブロックを含む。この構築ブロックは、逆ミクロエマルジョンの分散した水相において架橋される。炭水化物および炭水化物誘導体が、好ましくは、構築ブロックとして使用される。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、用語「ａ」および「ａｎ」は、他に示されない限り、「１以上」を意味する。
【００１２】
「水溶性」とは、本明細書中および添付の特許請求の範囲において、１０ｍｇ／ｍＬより大きい、そして好ましくは、５０ｍｇ／ｍＬより大きい、水中への溶解度を有することを意味する。
【００１３】
本発明のナノ物品は、２つの型の分子構造体を含む：足場および治療剤。現在好ましい実施形態において、このナノ物品はまた、第三の分子構造体を含む：ＲＥであり、これは、特定の細胞または特定の組織において発現される生体分子に結合する。ＲＥおよび治療剤は、ナノ物品足場に共有結合される。本明細書中において使用される場合、用語「ナノ物品の足場」、「ヒドロゲル足場」および「足場」は、交換可能に使用され、そしてナノ物品（ポリマーマトリックス構造体）の、生物活性薬剤および認識エレメントの結合より前に形成される部分をいう。本発明の足場は、化学的に架橋された、ナノ規模の（ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ）ヒドロゲル構造体である。
【００１４】
ナノ物品は、親水性であり、そして哺乳動物における使用が意図される。１つの実施形態において、各ナノ物品は、２つ以上の認識エレメントで官能基化され、これらの認識エレメントは、生体分子標的に対する高い親和性を保有し、これらの認識エレメントは、ナノ物品のポリマーマトリックス構造体に共有結合される。本発明は、さらに、これらのポリマーナノ物品を合成する方法に関する。
【００１５】
本発明のナノ物品は、大きさが、約５ｎｍ〜約１０００ｎｍ、より好ましくは、約５ｎｍ〜約１００ｎｍの直径、そして最も好ましくは、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍの範囲であり得る。１０〜７０ｎｍの大きさの範囲のナノ物品は、腎臓クリアランスおよび細網内皮細胞系による取り込みを、効果的に回避し得る。さらに、このようなナノ物品は、有利に血流を出て、所望の細胞、組織、または器官の標的に達し得る。
【００１６】
本発明のナノ物品は、特に、癌の処置において有利に使用され得る。腫瘍において見出される漏出性の脈管構造は、これらのナノ物品が血流を離れて腫瘍内で濃縮されることを可能にし得る。この効果（高分子薬剤について増強された浸透性および保持（ＥＰＲ）と記載される）が、固形腫瘍において普遍的であることが観察された（Ｍａｅｄａ  Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０００，６５，ｐ２７１−２８４）。高分子に対するＥＰＲ効果についての主要な機構は、保持であり、一方で、低分子量の物質は、保持されず、拡散によって循環血液に戻される。従って、５〜１００ｎｍの直径のナノ物品は、固形腫瘍において蓄積し得る。従って、本発明のナノ物品は、標的結合の前でさえも、自然に腫瘍中に濃縮され、より大きい効力およびより小さい全身毒性を提供する。
【００１７】
重合可能な基を有する親水性構築ブロックは、ヒドロゲル足場を形成するために使用される。この構築ブロックは、逆ミクロエマルジョンの分散した水相中で架橋される。単一の構築ブロックに結合する重合可能な基の数は、例えば、低分子量の構築ブロックについては約１〜３個の範囲、ポリマー構築ブロックについては１０以上であり得る。１つより多くの重合可能機を含む構築ブロックは、架橋剤として働き得、そしてヒドロゲル足場の形成が可能である。１つ、２つ、またはそれより多くの重合可能基を有する構築ブロックのセットとは異なる量および割合の構築ブロックを使用することによって、重合の際に、異なるコンプライアンシー（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｙ）のヒドロゲルの形成が可能になる。
【００１８】
例示的な重合可能基としては、アクリレート部分、アクリルアミド部分、メタクリレート部分、メタクリルアミド部分、ビニルエーテル部分、スチリル部分、エポキシド部分、マレイン酸誘導体部分、ジエン部分、置換ジエン部分、チオール部分、アルコール部分、アミン部分、ヒドロキシアミン部分、カルボン酸部分、カルボン酸無水物部分、カルボン酸ハロゲン化物部分、アルデヒド部分、ケトン部分、イソシアネート部分、スクシンイミド部分、カルボン酸ヒドラジド部分、グリシジルエーテル部分、シロキサン部分、アルコキシシラン部分、アルキン部分、アジド部分、２’−ピリジルジチオール部分、フェニルグリオキサール部分、ヨード部分、マレイミド部分、イミドエステル部分、ジブロモプロピオネート部分、およびヨードアセチル部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
フリーラジカル重合：好ましい重合可能官能基は、アクリレート部分、アクリルアミド部分、メタクリレート部分、およびメタクリルアミド部分である。このような部分は、フリーラジカル重合を受けやすい。フリーラジカル重合は、ＵＶ光と光重合開始剤、レドックス結合フリーラジカル重合開始剤、または熱と熱活性化開始剤の組み合わせを介して、容易に達成され得る。
【００２０】
物品の足場を形成するために使用され得る構築ブロックは、１つの重合可能基または複数の重合可能部分（これらは、低分子架橋剤として働き得る）を有する低分子を含む。例示的な構築ブロックとしては、アクリルアミド、アクリル酸ナトリウム（ＮａＡ）、ジアセトンアクリルアミド（ＤＡＡ）、マロネートアクリルアミド（ＭａｌＡｃ）、レブリン酸アクリルアミド、メチレンビスアクリルアミド、２，２−ビスアクリルアミド酢酸アンモニウム、２−アクリルアミドグリコール酸、２−アミノエチルメタクリレート、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド（ＡＰＭＡ）、オルニチンモノアクリルアミド、オルニチンジアクリルアミドナトリウム塩、Ｎ−アクリルオキシトリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミン、ヒドロキシエチルアクリレート、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）アクリルアミド、２−スルホエチルメタクリレート、２−メタクリルオキシエチルグルコシド、グルコースモノアクリレート、グルコース−１−（Ｎ−メチル）アクリルアミド、グルコース−２−アクリルアミド、グルコース−１，２−ジアクリルアミド、マルトース−１−アクリルアミド、ソルビトールモノアクリレート、ソルビトールジアクリレート、スクロースジアクリレート、スクロースモノ（エチレンジアミンアクリルアミド）、スクロースジ（エチレンジアミンアクリルアミド）、スクロースジ（ジエチレントリアミンアクリルアミド）、カナマイシンテトラアクリルアミド、カナマイシンジアクリルアミド、スクロースモノ（エチレンジアミンアクリルアミド）モノ（ジエチレントリアミンアクリルアミド）モノ（フェニルアラニン）ナトリウム塩、および他のアクリレート誘導体化糖またはアクリルアミド誘導体化糖が挙げられる。
【００２１】
構築ブロックは、物品の足場において特定の官能基の所望の含有量を達成するように選択される。このような官能基は、溶解度を改善し得、そしてまた、治療剤とＲＥとの結合点として使用され得る。例えば、ＡＰＭＡは、アミンを導入するために使用され得、アクリル酸ナトリウムは、カルボキシレートを導入するために使用され得、そしてＤＡＡは、ケトンを組み込むために使用され得る。好ましい実施形態において、構築ブロックの少なくともいくつかは、Ｎ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミド（ＣｉＢＡ）モノマーであり、これは、以下の式Ｉを有する：
【００２２】
【化３】
2005535604.tif 000002
ＣｉＢＡは、以下の反応スキームに従って、Ｌ−シスチン（ＩＩ）を２当量のアクリロイルクロリド（ＩＩＩ）と反応させることによって、調製され得る：
【００２３】
【化４】
2005535604.tif 000003
ＣｉＢＡは、水溶性であり、そして他の足場構築ブロック（例えば、アクリレート官能基化炭水化物）を重合させて、ヒドロゲル足場を形成し得る。さらに、そのジスルフィド結合は、還元後、リンカーの結合のための遊離チオールを提供する。
【００２４】
好ましい実施形態において、構築ブロックの少なくともいくつかは、炭水化物である。炭水化物構築ブロックの場合、この炭水化物領域は、複数のヒドロキシル基を含み、ここで、少なくとも１つのヒドロキシル基は、少なくとも１つの重合可能基を含むように修飾される。
【００２５】
炭水化物構築ブロックの炭水化物領域は、炭水化物または炭水化物誘導体を含み得る。例えば、炭水化物領域は、単純な糖（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ノイラミン酸、ガラクツロン酸、グルクロン酸、イズロン酸（ｉｏｄｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、グルコース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、アピオース（ａｐｉｏｓｅ）、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、フコース、フルクトース、フルクトフラノース、ラムノース、アラビノフラノース、およびタロース）；二糖類（例えば、マルトース、スクロース、ラクトース、またはトレハロース）；三糖類；多糖類（例えば、セルロース、デンプン、グリコゲン、アルギン酸、イヌリン、プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）、デキストラン、硫酸デキストラン、キトサン、グリコサミノグリカン、ヘパリン、硫酸ヘパリン、ヒアルロン酸、トラガカントガム、キサンタン、他のカルボン酸含有炭水化物、ウロン酸含有炭水化物、ラクツロース、アラビノガラクタン、およびこれらの誘導体、ならびにこれらの任意のものの混合物）；または修飾多糖類から誘導され得る。他の代表的な炭水化物としては、ソルビタン、ソルビトール、キトサン、およびグルコサミンが挙げられる。炭水化物は、ヒドロキシル基に加えてアミン基を含み得、そしてこのアミン基またはヒドロキシル基は、修飾（すなわち、置換）されて、架橋基、他の官能基、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【００２６】
炭水化物ベースの構築ブロックは、炭水化物前駆体（例えば、スクロース、イヌリン、デキストラン、プルランなど）から、生物有機化学の分野において公知のカップリング技術によって、調製され得る（例えば、Ｇ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９６、２７−４０頁、１５５頁、１８３−１８５頁、６１５−６１７頁；およびＳ．Ｈａｎｅｓｉａｎ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７を参照のこと）。例えば、架橋可能基は、塩化アクリロイルをアミン官能基化糖に滴下することによって、炭水化物に結合され得る。アミン官能基化糖は、エチレンジアミン（または他のアミン）と、１，１’−カルボニルジイミダゾール活性化糖との反応によって、調製され得る。エステル結合した反応性基は、アクリル酸無水物またはメタクリル酸無水物を、炭水化物（例えば、イヌリン）のヒドロキシル基と、ピリジン中で反応させることによって、合成され得る。
【００２７】
炭水化物ベースの構築ブロックはまた、フリーラジカル条件下で重合することが既知である部分での、炭水化物の部分的な（または完全な）官能基化によって、調製され得る。例えば、メタクリル酸エステルは、炭水化物と、メタクリル酸無水物またはメタクリル酸グリシジルとの反応によって、種々の置換レベルで、炭水化物上に配置され得る（Ｖｅｒｖｏｏｒｔ  Ｌ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１９９８，１７２，１２７−１３５）。
【００２８】
現在好ましい実施形態において、構築ブロックの少なくともいくつかは、イヌリンマルチメタクリレート（ＩＭＭＡ）モノマーであり、これは、以下の式ＩＶを有する：
【００２９】
【化５】
2005535604.tif 000004
式ＩＶにおけるｎの値は、約５〜約５０である。現在好ましい実施形態において、約１０〜約２０の平均重合度（ＤＯＰ）を有するイヌリンが使用される。従って、好ましい実施形態において、ｎは、約８〜約１８である。イヌリンがメタクリレート部分で官能基化される程度、すなわち、イヌリン上の、メタクリル酸エステルに変換されてＩＭＭＡを生成するヒドロキシル部分の数は、イヌリンおよびメタクリル酸無水物の出発物質の濃度および重量比によって支配される、統計学的プロセスである。官能基化の程度は、１〜１００の単糖類繰り返し単位ごとに１つのメタクリレート、より好ましくは、３〜２０の単糖類繰り返し単位ごとに１個のメタクリレートの範囲であり得る。イヌリンへのエステル結合は、インビボでの分解の部位として有利に機能し得、物品が分解して身体から除去されることを可能にする。デキストランマルチメタクリルアミドおよびプルランマルチメタクリルアミドは、類似の方法を使用して調製され得る、さらなる好ましい構築ブロックである。
【００３０】
炭水化物ベースの構築ブロックはまた、化学酵素的（ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ）方法（Ｍａｒｔｉｎ  Ｂ．Ｄ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９２，２５，７０８１）によって（例えば、ここで、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａが、ピリジン中での単糖類の酢酸ビニルでのエステル交換を触媒する）、またはアクリレートの直接的付加によって（Ｐｉｌｅｔｓｋｙ  Ｓ．ら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９９，３２，６３３−６３６）調製され得る。多数の誘導体化炭水化物が、炭水化物化学の分野の当業者に公知であるので、他の官能基が存在し得る。
【００３１】
炭水化物構造は、それらの親水性に関して一部選択される。実質的に疎水性の薬物を組み込むナノ物品は、薬物での官能化の後に高い水溶性が維持されるように、非常に親水性の足場を有さなければならない。ＩＭＭＡから構成される本発明のナノ物品は、高い水分含有量を有する。「高い水分含有量」とは、本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、約６５〜約９８ｗｔ％水、より好ましくは、約７５〜約９８ｗｔ％水、最も好ましくは、約８０〜９７ｗｔ％水から構成される物品を意味する。従って、分解生成物の量は、より高いポリマー濃度を有する物品より少ない。高い水含有量足場はまた、免疫系成分のための相互作用する表面がより少ないので、免疫原性を減少させ得る。
【００３２】
炭水化物ベースの構築ブロックの他に、アクリレート誘導体化ポリマー構築ブロックまたはアクリルアミド誘導体化ポリマー構築ブロックの他の例としては、２００〜４０，０００ダルトンの範囲の分子量を有するポリエチレングリコールベースの分子（例えば、ポリエチレングリコールジアクリレート）が挙げられる。
【００３３】
好ましい実施形態において、ヒドロゲル足場の代謝を容易にし、それによって所望の時間枠での薬物放出を容易にするために、分解性結合が架橋足場内に含められる。分解性結合は、とりわけ、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリホスファジン、ポリホスフェート、ポリカーボネート、ポリアミノ酸、ポリ無水物、およびポリオルトエステルベースの構築ブロックの使用を介して含められ得る。さらに、分解性結合は、重合可能部分を炭水化物に結合するために使用され得る。例えば、ＩＭＭＡは、エステル部分を含み、このエステル部分は、本発明の足場を生成するために使用されるフリーラジカル重合の際に形成されるイヌリン炭水化物骨格をアルキル鎖に接続する。さらに、ポリマー（例えば、カーボネート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、およびリン酸）として類似の加水分解可能部分を含む低分子架橋剤は、構築ブロックとして使用され得る。ヒドロゲル足場中の分解性成分として機能させるために、これらの構築ブロックは、２以上の重合可能部分で官能化されなければならない。例えば、ポリグリコリドジアクリレート、ポリオルトエステルジアクリレート、およびアクリレート置換ポリホスファゼン、アクリレート置換ポリアミノ酸、またはアクリレート置換ポリホスフェートポリマーが、分解性構築ブロックとして使用され得る。メタクリレートまたはアクリルアミド部分は、上記の例において、アクリレート部分の代わりに使用され得る。同様に、加水分解可能セグメント、および２以上のアクリレート、メタクリレート、またはアクリルアミドを含む低分子が使用され得る。このような分解性ポリマーおよび低分子構築ブロックは、当該分野で公知の方法によって、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミドまたは類似の部分で官能化され得る。
【００３４】
本発明のナノ物品足場および足場分解生成物は、非毒性であり、かつ身体から排除されるように設計される。これらは、分解性を有し得、好ましくは、炭水化物ベースの、ポリアミノ酸ベースの、ポリエステルベースの、またはＰＥＧベースのコアを有し、糖の正体、架橋密度、および他の特徴によって制御される分解速度を有する。従って、この物品は、身体中で代謝され得、身体中での所望されない蓄積を防止する。
【００３５】
（化学選択的重合）：化学選択的構築ブロックはまた、足場を形成するために使用され得る。このストラテジーの代表的な例は、逆ミクロエマルジョン内に多数のアルデヒドを含むように部分的に酸化されたポリサッカリドの使用であり得る。ジ（アミノ−オキシ）含有化合物（例えば、エチレンジアミンとＢｏｃ−アミノ−オキシ酢酸のＮＨＳエステルとを反応させる（以下の反応スキームを参照のこと）ことにより作製されるもの）は、次いで、アミノ−オキシ官能基と反応する、酸化された糖のアルデヒドの反応を介して架橋剤として使用され得る。
【００３６】
【化６】
2005535604.tif 000005
（逆ミクロエマルジョンにおける物品足場製作）：本発明の物品は、まず、逆ミクロエマルジョンの分散水相中に可溶化した親水性構築ブロックの架橋を介してナノ規模のヒドロゲル足場を形成することにより、製作される。有機溶媒および非反応性界面活性剤は、重合後に除去されて、架橋された水溶性ナノ範囲物品を生じる。
【００３７】
足場製作のための逆ミクロエマルジョンは、適切な比にて水性緩衝液または水、構築ブロック、有機溶媒、界面活性剤および開始剤を合わせて、連続油相に分散した界面活性剤安定化水性ナノ液滴の安定相を得ることによって形成される。安定な逆ミクロエマルジョン処方物は、当業者によって、既知の方法を用いて見出され得る。それらは、例えば、Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈ．Ｌ．ＲｏｓａｎｏおよびＭ．Ｃｌａｕｓｓｅ編），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，１９８７；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐ．ＫｕｍａｒおよびＫ．Ｌ．Ｍｉｔｔｅｌ編），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，１９９９において議論される。本発明において、可溶化親水性構築ブロックを有する水相は、１以上の可溶化界面活性剤を含む有機溶媒に添加されて、逆ミクロエマルジョンを形成する。
【００３８】
分散された水相は、約５〜約６５ｗｔ％、好ましくは、約５〜約２５ｗｔ％、最も好ましくは、１０〜２０ｗｔ％で可溶化された親水性構築ブロックを含む。理論に縛られることは望まないが、高い水含有量ヒドロゲル足場の使用はまた、エンドユーザーにおける免疫原性を減少させ得る。なぜなら、免疫系成分の認識する外来性表面が少ないからである。高い水含有量はまた、より可撓性の足場を介してコンプライアンシーを提供する。従って、細胞表面レセプターに結合する場合、この物品は、細胞表面に適合し得、より多くの表面レセプターを結合させ得る。より多くのレセプターが結合すると、その物品がアンタゴニストとしてよりよく機能することが可能になり得る。さらに、理論に縛られることは望まないが、物品細胞表面カバーは、他の細胞のシグナル伝達系路を阻害し得ると考えられる。
【００３９】
逆ミクロエマルジョンの分散水相のナノ液滴における構築ブロックの重合は、当業者に公知の手順に従う（例えば、Ｏｄｉａｎ  Ｇ．Ｇ．；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，第３版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；Ｌ．Ｈ．Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１章，１−２１頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６；ならびにＲ．Ｂ．ＳｅｙｍｏｕｒおよびＣ．Ｅ．Ｃａｒｒａｈｅｒ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第７〜１１章、１９３−３５６頁、Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１を参照のこと）。重合は、ミクロエマルジョンおよび逆ミクロエマルジョンの分散相中で行われる（総説については、Ａｎｔｏｎｉｅｔｔｉ，Ｍ．；およびＢａｓｔｅｎ，Ｒ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９５，１９６，４４１を参照のこと；逆ミクロエマルジョンの分散水相中の親水性モノマーの重合の研究については、Ｈｏｌｔｚｓｃｈｅｒｅｒ，Ｃ．；およびＣａｎｄａｕ，Ｆ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ，１９８８，２９，４１１を参照のこと）。このような重合は、５ｎｍ〜５０ｎｍサイズ範囲における物品を生じ得る。
【００４０】
分散水相のナノ液滴のサイズは、使用される水、界面活性剤および油相の相対量によって決定される。界面活性剤は、逆ミクロエマルジョンを安定化するために利用される。これらの界面活性剤は、架橋可能部分を含まない；それらは、構築ブロックではない。使用され得る界面活性剤としては、以下のような市販の界面活性剤が挙げられる：Ａｅｒｏｓｏｌ  ＯＴ（ＡＯＴ）、ポリエチレンオキシ（ｎ）ノニルフェノール（ＩｇｅｐａｌＴＭ，Ｒｈｏｄｉａ  Ｉｎｃ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｃｒａｎｂｒｏｏｋ，ＮＪ）、ソルビタンエステル（ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８０）、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ（登録商標）２０）、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ（登録商標）４０）、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標）６０）、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８５）、およびソルビタントリステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標）６５）（これらは、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である）が挙げられる）。ソルビタンセスキオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８３）は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手可能である。使用され得る他の界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））化合物が挙げられる。例示的な共界面活性剤（ｃｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）２１）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０Ｒ）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０およびＴｗｅｅｎ（登録商標）６１）、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５）、およびポリオキシエチレンソルビタントリステアレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５）（これらは、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である）が挙げられる。他の例示的な市販の界面活性剤としては、ポリエチレンオキシ（４０）−ソルビトールヘキサオレエートエステル（Ａｔｌａｓ  Ｇ−１０８６、ＩＣＩ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＤＥ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ、Ａｌｄｒｉｃｈ）、および直鎖状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ，Ａｓｈｌａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）が挙げられる。
【００４１】
他の例示的な界面活性剤としては、脂肪酸セッケン、アルキルホスフェートおよびジアルキルホスフェート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、１級アミン塩、２級アミン塩、３級アミン塩、４級アミン塩、ｎ−アルキルザンテート、ｎ−アルキルエトキシル化スルフェート、ジアルキルスルホスクシネート塩、ｎ−アルキルジメチルベタイン、ｎ−アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、ｎ−アルキルポリオキシエチレンエーテル、ソルビタンエステル、ポリエチレンオキシソルビタンエステル、ソルビトールエステルおよびポリエチレンオキシソルビトールエステルが挙げられる。
【００４２】
他の界面活性剤としては、脂質（例えば、リン脂質、糖脂質、コレステロールおよびコレステロール誘導体）が挙げられる。例示的な脂質としては、脂肪酸または脂肪酸を含む分子が挙げられる（ここでこの脂肪酸としては、例えば、パルミテート、オレエート、ラウレート、ミリステート、ステアレート、アラキデート、ベヘネート、リグノセレート、パルミトレート、リノリエート、リノレネート、およびアラキドネートが挙げられる）、およびそれらの塩（例えば、ナトリウム塩）が挙げられる。脂肪酸は、例えば、酸官能基を含む低分子へのカップリング反応により酸官能基をスルホネートに変換することによって、または当業者に公知の他の官能基変換によって改変され得る。
【００４３】
さらに、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デンプンおよびそれらの誘導体は、本発明において界面活性剤としての使用が見出され得る。
【００４４】
カチオン性脂質は、共界面活性剤として使用され得る（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド／クロリド（ＣＴＡＢ／ＣＴＡＣ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド／クロリド（ＤＯＤＡＢ／ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、［２，３−ビス（オレオイル）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、および［Ｎ−（Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール、ジオレオイル）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ））。アルコールもまた、共界面活性剤として使用され得る（例えば、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールおよびオクタノール）。より長い炭素鎖を有する他のアルコールもまた、使用され得る。
【００４５】
（物品への薬物分子の組み込み）：用語「薬物」、「薬物結合体」、「生体活性薬剤」および「治療剤」は、本明細書中で交換可能に使用される。好ましい実施形態において、薬物分子は、物品足場に共有結合される。例えば、化学療法剤ドキソルビシンは、例えば、構築ブロックとしてアクリル酸ナトリウム（ＮａＡ）、マロン酸アクリルアミド（ＭａｌＡｃ）またはＣｉＢＡを使用することによって、ドキソルビシン上のアミン部分とヒドロゲル足場に含まれるカルボン酸部分との間のＥＤＣカップリング反応を介して足場に結合され得る。別の実施形態にいおて、ドキソルビシンは、ドキソルビシンのアミン部分とヒドロゲル足場のアルデヒド部分とを反応させることによって、イミン結合を介して結合され得る。アルデヒドは、まず、炭水化物ベースの構築ブロックを使用して物品を形成し、次いで、その物品が形成された後にその炭水化物を酸化することによって作製され得る。別の実施形態において、ドキソルビシンは、そのケトン部分を介して物品マトリクスに結合され得る。カルボヒドラジドまたは他のジヒドラジドまたはジ−アミノ−オキシ官能化構造は、アルデヒドまたはケトンを含む足場に、ヒドラゾン結合の形成を介してドキソルビシンを結合するために使用され得る。アルデヒドまたはケトンは、ケトン含有アクリレート構築ブロック（例えば、ＤＡＡ）の使用を介して足場に組み込まれ得る。ヒドラゾン結合は、物品のエンドサイトーシスおよびリソソームへの進入に遭遇する温和な酸性の生理学的条件下で治療化合物を都合良く放出し得る。
【００４６】
別の実施形態において、ＡＰＭＡまたはメタクリレート官能化された短いペプチド（米国特許第５，０３７，８８３号に従って調製される）構築ブロックを含めることによって、例えば、アミノ基から構成されるナノ物品足場は、カルボキシレート結合を含むシクロスポリンを共有結合するために使用され得る。シクロスポリン薬物は、免疫抑制から利益を得る病理（例えば、炎症疾患）、および器官移植のための適用を見出し得る。
【００４７】
別の実施形態において、アルデヒドまたはケトン基（例えば、ＤＡＡ、レブリン酸アクリルアミドまたは酸化カルボキシレート（例えば、イヌリンまたはデキストラン構築ブロック）を含めることによって組み込まれる）から構成されるナノ物品足場は、ヒドラゾンカップリングスキームの使用を介して、ある部分を含む薬物または薬物誘導体（例えば、ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）を共有結合するために使用され得る。このカップリングスキームは、特にリソソームにおいて見出される低ｐＨで加水分解不安定性のヒドラゾン結合を生じる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｉ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２００２，１３，４０−４６）。
【００４８】
別の実施形態において、例えば、アクリル酸ナトリウムまたは無水物構築ブロックを含めることによって組み込まれる、酸または無水物基から構成されるナノ物品足場は、デキサメタゾンを、アミドカップリングスキームの使用を介して共有結合する貯めに使用され得る。
【００４９】
カルボキシレート基（例えば、アクリル酸ナトリウム（ＮａＡ）、ＣｉＢＡまたはＭＡＩＡｃ構築ブロックを含めることによって組み込まれる）から構成されるナノ物品足場は、アミン部分、薬物または薬物誘導体（例えば、ペプチド改変カンプトテシン（Ｆｒｉｇｅｒｉｏ  Ｅ．ら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０００，６５，１０５−１１９））を、ＥＤＣ−ＮＨＳカップリングスキームを介して共有結合するために使用され得る。
【００５０】
別の実施形態において、ナノ物品足場が、アルデヒドまたはケトン基（これらは、ＤＡＡ、レブリン酸アクリルアミドまたは酸化カルボキシレート（例えば、イヌリンまたはデキストラン）の使用を介して組み込まれ得る）から構成される場合、アミンを保有する薬物または薬物誘導体（例えば、ゲムシタビン）は、「シッフ塩基」カップリングスキームの使用を介して組み込まれ得る。ＤＡＡへのゲムシタビンの結合から形成されるイミド結合は、酸性媒体によって切断され得る。インターナリゼーションの間に、薬物は、リソソームの酸性環境に曝される細胞によって取り込まれ、それによって、その非改変形態でゲムシタビンを放出する。
【００５１】
別の実施形態において、カルボニル基（例えば、ＣｉＢＡ、ＭａｌＡｃまたはＮａＡ構築ブロックの封入を介して取りこまれる）からなる、ナノ物品の足場は、ＥＤＣ−ＮＨＳカップリングスキームの使用を介して、部分（例えば、サリチル酸）を含む薬物および薬物誘導体に共有結合するために使用され得る。例えば、サリチル酸のヒドロキシル基は、ＣｉＢＡ、ＭａｌＡｃまたはＮａＡのカルボキシル基と反応して、エステル結合を形成する。加水分解またはエステラーゼ酵素は、サリチル酸とＣｉＢＡまたはＮａＡのカルボキシル基との間のエステル結合を切断し、未修飾の形態のサリチル酸を放出する。
【００５２】
別の実施形態において、薬物構造体は、ナノ物品の足場への結合を促進するように修飾され得る。例えば、パクリタキセルの２’ヒドロキシル基は、ナノ物品の足場とカップリング可能な複数のリンカーと反応され得る。例えば、樹脂固定化グリシンリンカーの酸性部分が、カルボジイミドを使用してパクリタキセルに結合され得る；生じた化合物は、１％  ＴＦＡを使用してアミン部位で切断され得、ＥＤＣカップリングスキームを使用してカルボン酸を有するナノ物品と結合体化し得る遊離アミンを生成し得る。
【００５３】
別の実施形態において、パクリタキセル−２’−スクシネート（Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．ら，Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，３２，７８８−７９２）のナノ物品への結合は、カルボジイミド媒介性アミドカップリングを使用することで可能である。このカップリングは、パクリタキセル−２’−スクシネート基とナノ物品のＡＰＭＡ成分のアミン基との間で生じ、不安定なエステルを形成する。
【００５４】
別の実施形態において、ナノ物品は、酸官能基化（ＮａＡ）ナノ物品をパクリタキセルの２’−ヒドロキシル基と反応させることによって、パクリタキセルに直接的に結合し得る。この化学経路は、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）−パクリタキセル結合体を用いて、以前に記載されている（Ｌｉ  Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９８，５８，２４０４−２４０９）。
【００５５】
別の実施形態において、カルボン酸（例えば、アクリル酸ナトリウム（ＮａＡ）構築ブロックの封入を介して取りこまれる）を含むナノ物品の足場は、アミン官能基化５ＦＵ誘導体とナノ物品上に位置するカルボン酸との間でのアミン形成カップリング反応の使用を介して、部分（例えば、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）（または、その誘導体））を含む薬物および薬物の誘導体に共有結合するために使用され得る。５ＦＵの１−アルキルカルボニルオキシメチル誘導体の合成は、以前に記載されており、これらの物質が未修飾形態の５ＦＵを放出することが実証されている（Ｔａｙｌｏｒ  Ｈ．Ｅ．；Ｓｌｏａｎ  Ｋ．Ｂ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９８，８７，１５）。この合成経路の適用は、同様の放出プロフィールを実現する一方で、必然的にアミン官能基化５ＦＵを生じる。
【００５６】
酸基（例えば、ＣｉＢＡ、ＭａｌＡｃまたはＮａＡ構築ブロックの封入を介して取りこまれる）から構成されるナノ物品の足場は、カルボン酸部分（例えば、メトトレキセート）を含む薬物または薬物の誘導体に共有結合するために使用され得る。この共有結合は、まず、薬物または薬物の誘導体をｂｏｃ保護されたエタノールアミンにカップリングさせてエステルを形成し、次いで、修飾された薬物を脱保護した後、ＥＤＣカップリングスキームを介してナノ物品にカップリングさせる。このエステル結合体は、低ｐＨで加水分解し、元々の形態の薬物を放出することが公知である（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｊ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９２，１８４，３００−３０５；Ｏｈｋｕｍａ  Ｓ．，Ｐｏｏｌｅ  Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７８，７５，３３２７−３３３１）。このような低ｐＨの条件は、細胞内のリソソーム中に見出される。これらのナノ物品は、複数の病理（癌および炎症状態（例えば、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患）が挙げられる）の処置における使用が見出され得る。
【００５７】
別の実施形態において、白金結合体が、ナノ物品の足場上に取りこまれる。白金は、第２段階または第４段階の酸化状態であり得る。現在承認されている白金キレートと比較して、治療指標においてさらに改良された新たな白金キレートの明確な必要性が残っている。このようなキレートは、水性環境において、高度に水溶性であり、かつ安定であるが、腫瘍細胞においては、ＤＮＡを架橋化し究極的には腫瘍細胞の死を引き起こし得る種を提供するために十分に不安定であるべきである。その化学的組成を微細に調節する能力を有するように組合わされた、本発明のナノ物品のヒドロゲルネットワークにより、キレートに接着するような、高度な水溶性および可撓性が可能となり、このことが、ＷＯ  ９８４７５３７よりも有意な改善を構成する。白金キレートの構造の変化によって、白金治療が有効である腫瘍型の種類を改変し得るか、および／またはそのキレートの毒性プロフィールを変化させ得ることが示されている。本発明の１つの重要な実施形態において、白金は、Ｏ，Ｎ−結合を介して、ヒドロゲルマトリクスと複合体を形成し、より安定な化合物を生じことが予測される。
【００５８】
これは、フリーラジカル重合によって得られるナノ物品、および酸官能基（例えば、ＮａＡに由来する）および、アミン部分（例えば、ＡＰＭＡに由来する）またはアミド部分（例えば、アクリルアミド）、ならびに両方の型の官能基を保持する構築ブロック（ＣＩＢＡ、ＭａｌＡｃまたは米国特許第５，０３７，８８３号に従って製造されるメタクリロレート官能基化短ペプチド）の組合せを含むナノ物品について、好ましく達成され得る。このような部分は、Ｏ，Ｎ−シス白金ナノ物品結合体を生成するための結合点を提供し、ナノ物品を標的化する可能性を開く。
【００５９】
最後に、白金誘導体の高い毒性により、ナノ物品の器官または腫瘍部位への特定の標的化が治療指標を増大させるために素晴らしく効果的となる。
【００６０】
本発明において使用が見出され得る薬物としては、末梢神経、アドレナリン作用性レセプター、コリン作用性レセプター、神経系、骨格筋、心臓血管系、平滑筋、血液循環系、シナプス部位、神経−効果器接合部位、内分泌系、ホルモン系、免疫系、生殖系、骨格系、オータコイド系、消化系および排出系、ヒスタミン系、呼吸器系、細網内皮系、骨格系、骨格筋、平滑筋、免疫系、生殖系、癌性組織などにおいて作用する薬物が挙げられる。これらのレシピエントにおいて作用するために送達され得る活性薬物としては、抗痙攣薬、鎮痛薬、抗パーキンソン病薬、抗炎症薬、カルシウムアンタゴニスト、麻酔薬、抗微生物薬、抗マラリア薬、抗寄生虫薬、抗高血圧症薬、抗ヒスタミン薬、抗発熱薬、α−アドレナリンアゴニスト、αブロッカー、殺生物薬、殺細菌薬、気管支拡張薬、β−アドレナリン遮断薬、避妊薬、化学療法薬、心臓血管系薬、カルシウムチャネル阻害剤、抑制薬、診断薬、利尿薬、電解質、酵素、催眠薬、ホルモン、低血糖薬、高血糖薬、筋収縮薬、筋弛緩薬、新生物薬、糖タンパク質、核タンパク質、リポタンパク質、眼用薬（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ）、医薬賦活剤（ｐｓｙｃｈｉｃ  ｅｎｅｒｇｉｚｅｒ）、鎮静薬、ステロイド、交感神経様作用薬、副交感神経様作用薬、鎮痛剤、尿路薬、ワクチン、窒用薬、ビタミン、非ステロイド性抗炎症薬、アンギオテンシン変換酵素、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカリドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
現在の好ましい実施形態において、本発明において好都合に使用され得る薬物としては、化学療法薬（例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ビンクリスチン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、メトトレキセート、これらの化合物の誘導体、および他のＦＤＡに承認された化学療法薬）、ならびにまだ市販されていないが化学療法薬として作用し得る分子、ならびに上記の全ての化学療法薬の誘導体およびアナログが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明の送達用の治療剤は、種々の薬学的に受容可能な形態（例えば、それは、プロドラッグ、非荷電分子、分子複合体、および薬学的に受容可能な塩）であり得る。医薬の誘導体（例えば、エステル、エーテルおよびアミド）が使用され得る。
【００６３】
（認識エレメントによる物品の官能基化）：アセンブリさせた構築ブロックを架橋化してヒドロゲルの足場を形成し、治療剤をその足場に共有結合させた後で、物品表面はＲＥで官能基化され得る。ＲＥは、直接的に、またはリンカー分子を介して、ナノ物品の表面に結合され得る。リンカー形状において、ＲＥの一部または全部が、このテザーの末端で「提示」される。そのために、本発明の１つの適用において、物品は、ヒドロゲル足場上に提示されるＲＥからなる。本特許の別の実施形態において、物品は、リンカー分子を介して物品の中核な足場の表面に結合されたＲＥ（例えば、高親和性ペプチド）からなり、このリンカーは、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【００６４】
これらの実施形態の各々について、物品をいくつかのカップリング戦略で官能基化することが可能であり、種々の成分およびカップリングに使用される反応性の化学的部分の付加の順序の両方が変動する。
【００６５】
構成成分は、以下の順序で互いに結合され得る。ヒドロゲルの足場は、まず２官能基性のＰＥＧを含有するテザーと反応させられ、続いて、ＰＥＧ鎖の一部の自由末端をＲＥによって官能基化する。あるいは、まずＲＥがＰＲＧ含有テザーに結合され、続いて、他のＰＥＧ末端を足場に結合させる。
【００６６】
反応性の部分のいくつかの組合せが、ＲＥをテザーに結合させるため、そしてテザーを足場と反応させるために選択され得る。一連のオルトロガルな反応セットの使用において、足場の構築ブロックのいくつかを変化させる場合、および／またはアームを係留する場合、ＲＥを、良く制御された比率で同じ物品の足場上に、異なるレセプターと結合する異なる分子構造体に結合させることもまた可能である。オルトゴナルな反応性の対を使用する反応は、同時にまたは連続的に行われ得る。
【００６７】
反応条件に関する限り、水系で物品を官能基化することが好ましい。界面活性剤およびオイルの相は、ヒドロゲルの足場の合成の残留物は、溶媒洗浄の使用（単独で、または組合せて）（例えば、物品が沈降している間に界面活性剤とオイルを可溶化するためのエタノールの使用；界面活性剤吸収ビーズの使用；透析の使用；または水系（例えば、４Ｍの尿素）の使用）を通じて除去され得る。界面活性剤を除去するための方法は、当該分野で公知である。
【００６８】
ＲＥは、物品への結合を可能にする官能基を含まなければならない。必ずしもそうではないが、好ましくは、この官能基は、カップリング反応を補助するために選択される１対の化学選択性の試薬の１つのメンバーである（Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｇ．，Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６，５０６−５１３）。例えば、物品表面（および／またはその表面にグラフトされたリンカー）がハロアセタールを提示する場合に、ペプチドＲＥが、スルフヒドリル部分を介して結合され得る。ＲＥ構造体中のスルフヒドリル部分は、システイン残基の封入を介して達成され得る。
【００６９】
カップリングはまた、物品またはリンカー末端上の１級アミンとＲＥ上のカルボン酸との間でも可能である。ペプチド構造体中のカルボン酸は、アミノ末端上（直鎖状ペプチドについて）、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基の封入のいずれかを介して見出され得る。カルボン酸が、物品およびペプチドに属する１級アミン上に存在する、反対の形状もまた、容易に接触可能である。多くの重合可能な構築ブロックが、重合の後でビーズの表面にて接触可能である、酸性部分を含む。ポリ（アミノ酸）ベースのＲＥのように、１級アミン官能基が、Ｎ末端のいずれか（直鎖状である場合）および／またはリジン残基の導入を介して、見出され得る。
【００７０】
反応性の化学対の別の例は、スルフヒドリルとハロアセタール部分またはマレイミド部分とのカップリングからなる。マレイミド官能基は、当業者に公知の方法（例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ編，１９９６）によって例示のために記載される）を介して、他の一般的な官能基（例えば、カルボン酸、アミン、チオールまたはアルコール）をリンカーと反応させることにより、ペプチド上、リンカー上、または物品の表面上のいずれかに容易に導入され得る。好ましい実施形態において、ＣｉＢＡ、または他のジスルフィド含有構築ブロックの足場への封入により、チオール反応性部分を介したＲＥの結合が容易になる。足場形成の後で、ＣｉＢＡのジスルフィド結合の還元により、遊離チオールが生じる。チオールと反応性の基（例えば、ブロモアセトアミドまたはマレイミド）を含有するリンカー分子が、還元された治療的薬剤を含有する物品に付加され、リンカーを物品の足場に結合させる。ついで、ＲＥが添加され、リンカー部分の自由末端と反応し、ＲＥ官能基化物品が得られる。あるいは、ＲＥは、リンカー分子を還元物品に結合する前に、リンカー分子の１つの末端に結合され得る。
【００７１】
ペプチドはまた、アミノオキシ官能基とアルデヒド部分またはケトン部分との間での反応によって、物品および／またはテザーに結合され得る。アミノオキシ部分（物品上またはペプチド上のいずれか）は、他の一般的な官能基（例えば、アミン）から始まり、当該分野で公知の一連の変形によって導入され得る。同様に、アルデヒドまたはケトンを含有する物品およびアルデヒド含有ペプチドが、公知の方法で容易に合成され得る。
【００７２】
生じたＲＥで官能基化した薬物含有物品は、すぐに使用され得るか、液体溶液として保存され得るか、または長期保存のために凍結乾燥され得る。
【００７３】
ＲＥは、標的分子の細胞表面レセプターと所望の結合性相互作用を提供する、低分子構造体または高分子構造体であり得る。１物品あたりの認識エレメント部分の数は、２〜１０００、好ましくは２〜５００、そして最も好ましくは２〜１００の範囲であり得る。物品は、必要に応じて、さらに１つよりも多くの型のＲＥから構成され得る。本明細書中で使用する場合、ＲＥの「型」は、特定の分子構造として規定される。
【００７４】
ＲＥは、好ましくは、ペプチドからなる。本発明に従って、ＲＥとして使用されるペプチドは、一般的に、１０−４と１０−９Ｍ以下との間の解離定数を有する。このようなＲＥは、公知のペプチドリガンドからなり得る。例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓのペプチドリガンド−レセプターライブラリー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｏｅｎｉｘｐｅｐｔｉｄｅ．ｃｏｍ／Ｐｅｐｔｉｄｅｌｉｂｒａｒｙｌｉｓｔ．ｈｔｍ）は、潜在的な治療的価値のあるレセプターに対する数千の公知のペプチドリガンドを含む。ペプチドは、天然のペプチド（例えば、ラクタム、ダラージン（Ｄａｌａｒｇｉｎ）および他のエンカファリン、エンドルフィン、アンジオテンシンＩＩ、ゴナドトロピン放出ホルモン、メラノサイト刺激ホルモン、トロンビンレセプターフラグメント、ミエリン、ならびに抗原性ペプチド）であり得る。本発明に有用なペプチド結合性ブロックは、目的のタンパク質に対するペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリーまたはビーズ上に提示される直鎖状配列のライブラリー）のハイスループットスクリーニングを介して、発見され得る。このようなスクリーニング方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ，Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ，Ｇ．Ｊ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。高親和性のペプチドは、天然に存在するアミノ酸、修飾アミノ酸または完全に合成のアミノ酸からなり得る。ペプチドの認識部分の長さは、約３〜約１００アミノ酸で変動し得る。好ましくは、ペプチドの認識部分は、約３〜約１５アミノ酸、およびより好ましくは、３〜１０アミノ酸の範囲である。より短い配列が好ましい。なぜなら、１５アミノ酸未満のペプチドは、より長いペプチド配列と比べてより免疫原性が小さくてもよいためである。小さなペプチドは、ライブラリーが容易にスクリーニングされ得る、さらなる利点を有する。または、それらは、固相技術を使用してより容易に合成され得る。
【００７５】
ＲＥは、抗体、抗体フラグメント、レクチン、核酸、および他のレセプターリガンドを含む、種々の他の分子構造を含み得る。ヒト化抗体または完全にヒトの抗体、ならびにヒト化抗体フラグメントまたは完全にヒトの抗体フラグメントは、本発明の使用のために好まれる。
【００７６】
さらに、薬剤設計の当業者に公知の技術を使用して、他の非タンパク質化合物を結合部分として使用されるように設計することは、可能となり得る。このような方法として、つじつまの合う場（ＳＣＦ）分析、配置間相互作用（ＣＩ）分析、および通常モード動力学コンピュータープログラムが挙げられるがこれらに限定されず、これらのすべては、科学文献に詳細に記載される。Ｒｅｉｎら，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照のこと。非タンパク質化合物および部分の調製は、これらの構造および他の特徴に依存し得、そして標準的な化学合成技術により通常達成され得る。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＶＩＩ；Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｇａｒｓ，Ｗｈｉｓｔｌｅｒら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ（１９６２）（これの開示は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００７７】
本物品を作り上げるために同じ分子構造の複数のＲＥ分子または異なる分子構造の複数のＲＥ分子を使用することにより、本物品の結合力は増加し得る。本発明で使用されるように、「高親和性（ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）」とは、単一のＲＥが単一の標的分子と１０−４Ｍより強い結合定数で結合することを意味し、一方で、「結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）」とは、２つ以上のこのようなＲＥユニットが２つ以上の標的分子と細胞上でまたは分子複合体上で結合することを意味する。
【００７８】
これらのＲＥは、複数の疾患関連の生物分子を標的とし得る。腫瘍関連の標的として、ｅｒｂＢ１（例えば増殖因子ＥＧＦを使用するか、またはアミノ酸配列ＹＣＰＩＷＫＦＰＤＥＥＣＹから構成されるペプチド、もしくはＧｒｅｅｎｅ，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７（３１），２８３３０−２８３３９中にＲＥとして見出される他の配列を使用する）、ｅｒｂＢ２（例えばアミノ酸配列ＣｄＦＣＤＧＦｄＹＡＣＹＭＤＶから構成されるペプチド（ここで、ｄＦおよびｄＹは、これらのアミノ酸残基のＤ異性体を表す）またはＭｕｒａｌｉ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００１，４４，２５６５−２５７４中にＲＥとして描写される他の配列を使用する）、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＣＭＥＴ、ＣＥＡ（例えばＰＣＴ  ＷＯ  ０１／７４８４９中にＲＥとして開示される他のペプチドを使用する）、ならびにＥｐｈＡ２が挙げられる。癌を含む、複数の病理に関連する血管の標的として、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２（例えば、Ｄｅｍａｎｇｅｌら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０００，１９（７），１５２５−１５３３に記載されるようなアミノ酸配列ＡＴＷＬＰＰＲから構成されるペプチドを使用する）、インテグリン（インテグリンαｖβ３、およびインテグリンαｖβ１が挙げられる）、ならびにフィブリンのような細胞外タンパク質（これは、ＰＣＴ公開物ＷＯ  ０２／０５５５４４に開示されるアミノ酸配列からなるペプチドを使用して標的化され得る）までが挙げられる。
【００７９】
（物品特性値：）
本発明で実施されるように、本物品は、これらを卓越した治療的候補とするいくつかの特性値を有する。
【００８０】
本物品は、注射（皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、または非経口的）により投与され得、静脈内注射が好ましい経路である。本物品は、経鼻送達、肺送達、膣送達、眼球送達および経口投与のために適し得る。本物品は、投与のために薬学的に受容可能なキャリアの中に懸濁され得る。
【００８１】
いくつかの実施形態における試薬および開始物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯおよびＭｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、Ｆｉｓｈｅｒ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｃａｒｂｏｍｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）、Ｒａｄｃｕｒｅ（Ｓｍｙｒｎａ，ＧＡ）、ならびにＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｉｌｅｓ，ＩＬ）のような化学の卸業者から商品として入手し得る。ＰＥＧ化合物は、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｈｉｔｅ  Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ）、およびＮｅｋｔａｒ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を通じて購入し得る。ＲＥとして使用されるペプチドは、多数の供給元（一つはＢａｃｈｅｍ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ））から購入し得る。タンパク質は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のような供給元から入手し得る。
【００８２】
以下の限定されない実施例は、本発明がいかに実施され得るかをさらに記載するために提供される。
【実施例】
【００８３】
（実施例１：ＩＭＭＡ（イヌリンマルチメタクリレート）の合成）
イヌリン（４ｇ）を、１本首型丸型フラスコの中に量り取った。テフロン（登録商標）コートされた撹拌棒を加えて、このフラスコを隔壁で密閉した。次いで、無水ピリジン（各５グラムのイヌリンに対して約２０ｍＬ）を、この系全体を窒素雰囲気下に保ちながら、このフラスコの中に移した。この混合物を、このイヌリンが溶解するまで撹拌し、次いで、１ｍＬの無水メタクリル酸を、シリンジを使用して滴下して加えた。この反応を１６時間継続させた。この期間の後、ピリジンを減圧下で十分に除去して粘性の液体を得た。次いで、トルエン（約４０ｍＬ）を激しく混合しながら加えて、この粗生成物を沈殿させた。次いで、この液体をこの沈殿からデカントした。この固体を水で溶解し、粘性があるが自由に流動するシロップが産生され、次いで、これを２−プロパノール（約２００ｍＬ）で沈殿させた。この水溶解および引き続いての沈殿のプロセスを、二回以上繰り返し、その後この産物を減圧下で乾燥させた。次いで、この産物を５０ｍＬの水に再溶解し、濾紙を通して濾過して蓄積したごみおよび他の不溶物を除去し、次いで、この生成物を凍結乾燥させてイヌリンマルチメタクリレート（ＩＭＭＡ）を得た。ＩＭＭＡの同一性（メタクリレートの官能化の程度）を、ＮＭＲ分析により確証した。
【００８４】
（実施例２：デキストラン複（メタクリレート）（ＤＭＭＡ）の調製）
デキストラン（分子量＝５０００）を、撹拌棒の補助により１００ｍＬの乾燥ＤＭＳＯに溶解した。完全な溶解時に、無水ピリジンを加えた（２０ｍＬ）。０．５時間のこの工程の間を通じて、無水メタクリル酸（３．２７ｍＬ）を滴下により加えて、この反応物を一晩撹拌させた。翌日、トルエン（１５０ｍＬ）の添加によりこの生成物を沈殿させて、この反応溶媒／トルエン混合物をこの固体からデカントした。この生成物を、シロップを得るために必要な最小量の水に溶解し、即座に撹拌したイソプロパノール（約１５０ｍＬ）に加えた。この溶液をこの固体からデカントし、この溶解／沈殿サイクルを二回以上繰り返した。この固体を減圧下で乾燥させて微量の有機溶媒を除去し、７５ｍＬの水に溶解し、得られた溶液を濾過した。この生成物を凍結乾燥により単離し、１Ｈ  ＮＭＲにより特徴付けた。
【００８５】
（実施例３：ＣｉＢＡの合成）
水酸化ナトリウム（２．０ｇ）を７０ｍＬの乾燥メタノールに溶解した。Ｌ−シスチン（２．７３ｇ）をこのメタノール性ＮａＯＨ溶液に加え、この混合物を含む丸底フラスコを氷水槽に浸してこの反応容器を０℃に維持した。次いで、アクリロイルクロライド（２．２２ｍＬ）をこのメタノール性シスチン溶液に滴下して加えた。
【００８６】
この反応物に蓋をして１時間室温で撹拌し、その後この反応溶液を遠心してこの液相を即座に撹拌した酢酸エチル（１２０ｍＬ）の中にデカントした。得られた懸濁固体を遠心により単離し、減圧下で乾燥させた。この単離された物質のＮ，Ｎ’−シスチンビスアクリルアミド（ＣｉＢＡ）としての同一性を１Ｈ  ＮＭＲにより確証した。
【００８７】
（実施例４：ＭａｌＡｃ（マロネート−アクリルアミド）の合成）
ジエチルアミノマロネート塩酸塩（５ｇ）を、１本首型丸型フラスコの中に量り取る。テフロン（登録商標）コートされた撹拌棒を加えて、このフラスコを隔壁で密閉する。次いで、無水ジクロロメタン（各１グラムのジエチルアミノマロネートに対して約１０ｍＬ）を、この系全体を窒素雰囲気下に保ちながら、このフラスコの中に移す。この混合物を撹拌し、３．６２ｍＬのトリエチルアミンをシリンジで加え（１．１当量）、引き続いて２．１２ｍＬのアクリロイルクロライド（１．１当量）をシリンジにより滴下して加える。この反応を２時間継続させた。この反応混合物を水で三回抽出して未反応性生物［トリエチルアミンおよびアクリル酸］を除去する。この有機相を減圧下で乾燥させ、強酸性残基を有する樹脂を含有する水の中で再懸濁する。この水性樹脂懸濁物を回転振盪機に乗せ、この脱保護反応を一晩進行させる。次いで、この反応混合物を濾過して凍結乾燥させてマロン酸アクリルアミドを得る。
【００８８】
（実施例５：ＰＥＧ−１５００  ｄＢＡの合成）
ポリ（エチレングリコール）（平均分子量＝１５００、１５．３６ｇ）を丸底フラスコの中に含まれる７５ｍＬの乾燥クロロホルムに溶解した。この溶解工程を補助し、かつ反応物の均質性を維持するために撹拌棒を加えた。ブロモアセチルクロライド（４．００ｍＬ）を加え、空気冷却還流冷却器を丸底フラスコに接させ、この反応混合物を大気へ通気される窒素パージ下の還流で加熱した（この反応の間に生じるＨＣｌ気体を除去するために）。４時間後、さらにブロモアセチルクロライド（１．０ｍＬ）を加え、この反応混合物をさらに５時間加熱した。この反応混合物を冷却し、一晩穏やかに撹拌した。翌日、この溶媒および過剰な試薬を減圧下で除去し、この残留物を飽和炭酸水素ナトリウムに溶解した。この水溶液をクロロホルム（４回、５０ｍＬ）で抽出した。この有機抽出物を組み合わせ、硫酸マグネシウム下で乾燥させ、濾過した。減圧下でのこの溶媒の除去によりＰＥＧ−１５００  ｄＢＡが灰色がかった白色の固体として残留する。この生成物の同一性を１Ｈ  ＮＭＲにより確証した。
【００８９】
（実施例６：ヘテロ二官能化ＰＥＧ−４００、ブロモアセテートおよびカルボン酸の調製）
ポリ（エチレングリコール）ジブロモアセテート（平均分子量４００、ＰＥＧ−４００  ｄＢＡ）（４．０ｇ）を、１００ｍＬのＴＨＦを含有するリン酸緩衝液（０．１５Ｍ）（１５０ｍＬ、ｐＨ＝８）に溶解した。この溶液に、水１０ｍＬ中の３−メルカプトプロピオン酸（０．１７ｇ）を撹拌棒により提供される急速な混合により加えた。このｐＨを１．０ＭのＮａＯＨ溶液の添加により再度８まで調整した。この添加の１６時間後、この反応物の体積を減圧下で５０ｍＬまで減少させた。この体積を１００ｍＬ、ｐＨ＝８．０のリン酸緩衝液（０．１０Ｍ）を加えることにより１５０ｍＬまで増加させ、この水溶液をクロロホルム（２回、５０ｍＬ）で抽出して未反応のＰＥＧ開始物質を除去した。この溶液のｐＨを１．０ＭのＨＣｌを加えることにより２まで調整し、この溶液をクロロホルム（３回、５０ｍＬ）で再度抽出した。このｐＨ＝２．０の溶液の組み合わされた抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。この溶媒の減圧下での除去によりこの標的化合物を得た。
【００９０】
（実施例７：ヘテロ二官能化ＰＥＧ−２００、チオールおよびカルボン酸の調製）
ポリ（エチレングリコール）ジチオール（平均分子量２００）（１．５３ｇ）を１００ｍＬのＴＨＦ含有リン酸緩衝液（０．１５Ｍ）（１５０ｍＬ、ｐＨ＝８）に溶解した。この溶液に、水１０ｍＬ中のブロモ酢酸（０．２７ｇ）を撹拌棒により提供される急速な混合により加えた。このｐＨを１．０ＭのＮａＯＨ溶液の添加により再度８まで調整した。この添加の１６時間後、この溶媒を減圧下で除去し、粘性の残留物を得、これに１００ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）を加えた（０．０５０Ｍ）。この水溶液をクロロホルム（２回、５０ｍＬ）で抽出して未反応のＰＥＧ開始物質を除去した。この溶液のｐＨを１．０ＭのＨＣｌを加えることにより２まで調整し、この溶液をクロロホルム（３回、５０ｍＬ）で再度抽出した。このｐＨ＝２．０の溶液の組み合わされた抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。この溶媒の減圧下での除去によりこの標的化合物を得た。
【００９１】
（実施例８：フリーラジカル重合化を通じたＩＭＭＡ−ＣｉＢＡ−ＮａＡ骨格の生成）
水相を８３重量％の緩衝液、１４重量％ＩＭＭＡ、２重量％のＣｉＢＡ、１重量％のアクリル酸ナトリウム、およびエオシンＹ（この光開始剤はモノマー質量の０．００１〜０．１重量％を呈する）を組み合わせることにより調製した。油＋界面活性剤相を７．３重量％のＩｇｅｐａｌ  ＣＯ−２１０、９．４重量％のＩｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０、および８３．３重量％のシクロヘキサンを混合することにより調製した。３グラム（３ｇ）のこの水相を３０ｇのこの油＋界面活性剤相に激しい撹拌により加え、逆ミクロエマルジョンの生成を引き起こした。この逆ミクロエマルジョンには、シクロヘキサンの連続相の中に分散された、界面活性剤により安定化された水相のナノ液滴が含まれる。この逆ミクロエマルジョンを１００ｍＬのＳｃｈｌｅｎｋ管へと移し、この冷却混合物の状態で短時間に減圧で吸引することにより脱気した。このＳｃｈｌｅｎｋ管の内容物を撹拌し、ＵＶ光源で１時間照射してこの基礎的エレメントを重合化した。一旦このポリマー化が完了したならば、このナノ物品を、純粋エタノールを直接この溶液に加えることにより沈殿させ、遠心によりこの反応混合物から単離した。このナノ物品含有ペレットを脱イオン水の中で再懸濁した。残存する界面活性剤および溶媒を標準的な技術（固相抽出）により除去した。この時点で、ナノ物品のこの水溶液を濾過し、この生成物を凍結乾燥後に固体生成物として単離した。
【００９２】
（実施例９：フリーラジカル重合化を通じたＩＭＭＡ−ＣｉＢＡ−ＤＡＡ骨格の生成）
水相を８３重量％の水、１４重量％のＩＭＭＡ、２重量％のＣｉＢＡおよび１重量％のジアセトンアクリルアミド（ＤＡＡ）を組み合わせることにより調製した。油＋界面活性剤相をＩｇｅｐａｌ  ＣＯ−２１０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０およびシクロヘキサンを１．０：１．３：９．０の重量比で混合することにより調製した。３グラム（３ｇ）のこの水相を３０ｇのこの油＋界面活性剤相と混合し、逆ミクロエマルジョンの生成を引き起こした。この逆ミクロエマルジョンには、シクロヘキサンの連続相の中に分散された、界面活性剤により安定化された水相のナノ液滴が含まれた。この逆ミクロエマルジョンに、エオシンＹ含有水溶液（この光開始剤はモノマー質量の０．００１〜０．１重量％を呈する）を加えた。このミクロエマルジョンを減圧下での凍結融解サイクル（サイクル間のＮ２気体の埋め戻しを伴う）により脱気した。この内容物を撹拌し、少なくとも１００ＷのＵＶ光源または可視光源で２０分間〜２時間照射してこの基礎的エレメントをポリマー化した。一旦このポリマー化が完了したならば、このナノ物品を、９ｍＬの純粋エタノールを直接この溶液に加えることにより沈殿させた。このナノ物品含有ペレットを水の中で再懸濁した。残存する界面活性剤および溶媒を標準的な技術（透析、クロマトグラフィーなど）により除去した。この時点で、ナノ物品のこの水溶液を、望まれる場合に凍結乾燥し得る。
【００９３】
（実施例１０：フリーラジカル重合によるＩＭＭＡ−ＣｉＢＡ−ＡＰＭＡ足場形成）
水相を、８３重量％緩衝液、１４重量％ＩＭＭＡ、２重量％ＣｉＢＡ、１重量％Ｎ−（３−アミノプロピル）メタアクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）、およびエオシンＹ（光開始剤は、０．００１〜０．１重量％のモノマー質量を表す）を組み合わせることによって調製した。オイル＋界面活性剤相を、７．３重量％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−２１０、９．４重量％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０、および８３．３重量％シクロヘキサンを混合することによって調製した。３グラム（３ｇ）の水相を、激しく攪拌しながら、３０ｇのオイル＋界面活性剤相に加え、逆ミクロエマルジョンの形成を得た。逆ミクロエマルジョンは、シクロヘキサンの連続相中に分散した水相の界面活性剤安定化ナノ液滴を含む。逆ミクロエマルジョンを、１００ｍＬ  Ｓｃｈｌｅｎｋ管に移し、そして冷やした混合物で手短に減圧に引っ張ることによって脱気した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管の内容物を攪拌し、そしてＵＶ光源で、１時間照射して、構築ブロックを重合した。一旦、重合が完了すると、ナノ物品を、純粋なエタノールを直接溶液に添加することによって沈殿させ、そして遠心分離によって反応混合物から単離した。ナノ物品を含むペレットを、脱イオン水で再懸濁した。残りの界面活性剤および溶媒を、標準的な技術（固相抽出）によって除去した。この時点で、ナノ物品の水溶液を濾過し、そして生成物を凍結乾燥後、固体生成物として単離した。
【００９４】
（実施例１１：フリーラジカル重合によるＩＭＭＡ−ＭａｌＡｃ足場形成）
水相を、８０重量％緩衝液、１４重量％ＩＭＭＡ、６重量％マロン酸アクリルアミド（ＭａｌＡｃ）、およびエオシンＹ（光開始剤は、０．００１〜０．１重量％のモノマー質量を表す）を組み合わせることによって調製した。オイル＋界面活性剤相を、７．３重量％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−２１０、９．４重量％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０、および８３．３重量％シクロヘキサンを混合することによって調製した。３グラム（３ｇ）の水相を、激しく攪拌しながら、３０ｇのオイル＋界面活性剤相に加え、逆ミクロエマルジョンの形成を得た。逆ミクロエマルジョンは、シクロヘキサンの連続相中に分散した水相の界面活性剤安定化ナノ液滴を含む。逆ミクロエマルジョンを、１００ｍＬ  Ｓｃｈｌｅｎｋ管に移し、そして冷やした混合物で手短に減圧に引っ張ることによって脱気した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管の内容物を攪拌し、そしてＵＶ光源で、１時間照射して、構築ブロックを重合した。一旦、重合が完了すると、ナノ物品を、純粋なエタノールを直接溶液に添加することによって沈殿させ、そして遠心分離によって反応混合物から単離した。ナノ物品を含むペレットを、脱イオン水で再懸濁した。残りの界面活性剤および溶媒を、標準的な技術（固相抽出）によって除去した。この時点で、ナノ物品の水溶液を濾過し、そして生成物を凍結乾燥粉末として単離した。
【００９５】
（実施例１２：短Ｎ−メタクリロイル化ペプチドを含む足場）
水相を、８２重量％緩衝液、１４重量％ＩＭＭＡ、２重量％ＣＩＢＡおよび２重量％Ｎ−メタクリロイル化Ｇｌｙ−Ｇｌｙペプチド（米国特許第５，０３７，８８３号に従って作製される）とエオシンＹ（光開始剤は、０．００１〜０．１重量％のモノマー質量を表す）を組み合わせることによって調製した。オイル＋界面活性剤相を、７．３重量％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−２１０、９．４重量％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０、および８３．３重量％シクロヘキサンを混合することによって調製した。３グラム（３ｇ）の水相を、激しく攪拌しながら、３０ｇのオイル＋界面活性剤相に加え、逆ミクロエマルジョンの形成を得た。逆ミクロエマルジョンは、シクロヘキサンの連続相中に分散した水相の界面活性剤安定化ナノ液滴を含む。逆ミクロエマルジョンを、１００ｍＬ  Ｓｃｈｌｅｎｋ管に移し、そして冷やした混合物で手短に減圧に引っ張ることによって脱気した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管の内容物を攪拌し、そしてＵＶ光源で、１時間照射して、構築ブロックを重合した。一旦、重合が完了すると、ナノ物品を、純粋なエタノールを直接溶液に添加することによって沈殿させ、そして遠心分離によって反応混合物から単離した。ナノ物品を含むペレットを、脱イオン水で再懸濁した。残りの界面活性剤および溶媒を、標準的な技術（固相抽出）によって除去した。この時点で、ナノ物品の水溶液を濾過し、そして生成物を凍結乾燥粉末として単離した。
【００９６】
（実施例１３：酸化イヌリンとビスアミノオキシ化合物との反応による足場形成）
水相を、８５重量％水および１５重量％イヌリンと一緒に混合することによって、調製した。オイル＋界面活性剤相を、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−２１０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０およびシクロヘキサンを１．０：１．３：９．０の重量比で混合することによって調製した。３グラム（３ｇ）の水相を、４０ｇのオイル＋界面活性剤相と混合し、逆ミクロエマルジョンの形成を得た。１ｇの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を混合物に添加した。インサイチュ酸化を、約１０分間進行させた。次いで、ビス［（２−アミノ−オキシ）エチルアミド］−（１，３−）プロパンの水性メタノール混合物（５０／５０容積）中の濃縮溶液（少なくとも１ｇ／ｍｌ）を、ミクロエマルジョンに添加し、一晩反応させた。酸化イヌリンのアルデヒド官能基を用いる、ビス［（２−アミノ−オキシ）エチルアミド］−（１，３）プロパンの架橋によって得られた生じたナノ物品を、エタノールの存在下での沈殿および遠心分離によって単離し、そして透析によって過剰の未反応試薬から精製した。
【００９７】
（実施例１４：酸化デキストランとカルボヒドラジドとの反応による足場形成）
水相を、９０重量％水および１０重量％デキストランと混合することによって、調製した。オイル＋界面活性剤相を、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−２１０、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−７２０およびシクロヘキサンを１．０：１．３：９．０の重量比で混合することによって調製した。３グラム（３ｇ）の水相を、４０ｇのオイル＋界面活性剤相と混合し、逆ミクロエマルジョンの形成を得た。グルコースモノマー単位（デキストラン由来）当たり最大１当量の過ヨウ素酸塩であるように、１ｇの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を混合物に添加した。インサイチュ酸化を、５〜２０分間進行させた。次いで、緩衝溶液中のカルボヒドラジド（５０〜２５０ｍＭ、ｐＨ８〜９）の濃縮溶液（少なくとも１ｇ／ｍｌ）を、ミクロエマルジョンに添加し、一晩４℃で反応させた。酸化デキストランのアルデヒド官能基を用いる、カルボヒドラジドの架橋によって得られた生じたナノ物品を、エタノールの存在下での沈殿および遠心分離によって単離し、そして透析によって過剰の未反応試薬から精製した。
【００９８】
（実施例１５：酸化イヌリンとビスヒドラジンオキシ化合物との反応による足場形成）
水相を、８５重量％水および１５重量％イヌリンと一緒に混合することによって、調製した。２グラム（２ｇ）のこの水相を、シクロヘキサン中の８．５重量％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−５２０から構成される３０ｇのオイル＋界面活性剤相と混合した。グルコースモノマー単位（イヌリン由来）当たり最大１当量の過ヨウ素酸塩であるように、１ｇの水中の過ヨウ素酸溶液を混合物に添加した。インサイチュ酸化を、約１０分間進行させた。コハク酸ジヒドラジンの水性メタノール混合物（５０／５０容積）中の濃縮溶液を、ミクロエマルジョンに添加し、３時間反応させ、アルデヒド官能基を用いてアミノオキシ部分を架橋させた。得られたナノ物品を沈殿によって精製し、そして過剰のコハク酸ジヒドラジンの存在下で水溶液中に再懸濁させた。コハク酸ジヒドラジンの（ナノ物品上の残りのアルデヒドとの）反応を１２時間進行させた。
【００９９】
（実施例１６：アミド連結を介するドキソルビシン（Ｄｏｘ）結合）
ドキソルビシン（１２０ｍｇ）を、１５．０ｍＬ水中に完全に溶解し、そして１５．０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５（０．２０Ｍ））を添加した。１０．０ｍＬ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５（０．２０Ｍ））中に溶解させた実施例８（１．０ｇ）のナノ物品の溶液に、１０．０ｍＬの水を添加した。この溶液に、１６０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および５０ｍｇ  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を連続して添加した。ＥＤＣ添加の２０分後、７．５ｍＬのドキソルビシン溶液を添加した。第２の５０ｍｇのアリコートＥＤＣを添加し、続いて、２０分遅らせて、第２の量のドキソルビシンを添加した。さらに０．５時間の反応間隔の後に、添加／遅延サイクルを、ドキソルビシン溶液全体が添加されるように、さらに２回繰り返した。次いで、この反応混合物を２４時間攪拌した。未反応の出発物質および副生成物を、ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラムを通過させることによってＤｏｘ−ナノ物品生成物から分離し、そのナノ物品を凍結乾燥によって乾燥固体として単離した。得られた物品のＤｏｘ装填は、約６〜８重量％であった。ナノ物品のドキソルビシン含有量を、添加の間、少量のこの物質を使用することによって、または反応サイクルの合計数を減少させることによって、変更され得る。
【０１００】
（実施例１７：ヒドラゾン連結によるドキソルビシン結合（高充填））
実施例９由来の１．０ｇの物質を、４０ｍＬの０．１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ８．５）中に溶解し、そして過剰のカルボヒドラジド（開始物質における各ジアセトンアクリルアミドに対して１００当量のカルボヒドラジド）の濃縮溶液に添加した。反応を１２時間４℃で進行させた。このようにして、ヒドラゾン結合を、カルボヒドラジドとナノ物品のケトン部分との間に形成した。反応混合物を、透析またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して過剰のカルボヒドラジドから精製した。
【０１０１】
２００ｍｇのドキソルビシン（１００ｍＬ水中に希釈された）を、ギ酸アンモニウムによって緩衝化された水中のカルボヒドラジド官能基化足場に添加した。反応を１８〜２４時間４℃で進行させた。このようにして、ヒドラゾン結合を、ドキソルビシンのケトン部分とナノ物品に連結されたカルボヒドラジドとの間に形成した。次いで、共有結合されたドキソルビシンを有する生じたナノ物品を、透析またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、未反応ドキソルビシンおよび副生成物から精製した。
【０１０２】
（実施例１８：ヒドラゾン連結によるドキソルビシン結合（低充填））
実施例９由来の１．０ｇの物質を、４０ｍＬの０．１Ｍホウ酸カリウム（ｐＨ８）中に溶解し、そして過剰のカルボヒドラジド（開始物質における各ジアセトンアクリルアミドに対して１０当量のカルボヒドラジド）の濃縮溶液に添加した。反応を１時間進行させた。反応混合物を、透析またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して過剰のカルボヒドラジドから精製した。このようにしてヒドラゾン結合を、カルボヒドラジドとナノ物品のケトン部分との間に形成した。
【０１０３】
５０ｍｇのドキソルビシン（２０ｍＬ水中に希釈された）を、ギ酸アンモニウムによって緩衝化された水中のカルボヒドラジド官能基化ナノ物品に添加した。反応を１〜６時間進行させた。このようにして、ヒドラゾン結合を、ドキソルビシンのケトン部分とナノ物品に連結されたカルボヒドラジドとの間に形成した。次いで、共有結合されたドキソルビシンを有する生じたナノ物品を、透析またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、未反応ドキソルビシンおよび副生成物から精製した。
【０１０４】
（実施例１９：アミド結合によるシクロスポリン結合）
シクロスポリンを、ベンゼン中で、１〜２のモル比で４−ベンゾイル安息香酸（ＢＢａ）と混合した。この溶液を、窒素ガスでパージし、そして室温で、３２０ｎｍの波長で光分解した（米国特許第５，４０５，７８５号）。光分解後、ベンゼンを減圧下でロータリーエバポレーターでエバポレートし、そして乾燥生成物をメタノール中で溶解した。生成物を分取用ＨＰＬＣによって単離した。次いで、シクロスポリン−ＢＢａを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（約１〜１．２対１のモル比）のメタノール溶液に添加した。反応を室温で一晩進行させた。活性化エステルの形成を、中性Ｆｅ−ヒドロキサメート試験を用いて検出し得る。シクロスポリン−ＢＢａ−ＮＨＳを、ＥＤＣカップリングを用いて、アミン部分（その製造は、実施例１３に記載される）から構成されるナノ物品足場に結合させ得る。
【０１０５】
（実施例２０：デキサメタゾン結合）
ヒドラゾン結合を介するカリチアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）結合）
カリチアマイシン誘導体（Ｎ−アセチル−γカリチアマイシンジメチルヒドラジド）の合成は、以前に報告されている（Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９３，５３，３３３６−３３４２）。１．０ｇのＩＭＭＡ−ＣｉＢＡ−ＤＡＡ足場ナノ物品を、４０ｍＬの０．１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ８．５）中に溶解し、そして過剰のＮ−アセチル−γカリチアマイシンジメチルヒドラジド（開始物質における各ジアセトンアクリルアミドに対して１００当量のＮ−アセチル−γカリチアマイシンジメチルヒドラジド）の濃縮溶液に添加した。反応を１２時間４℃で進行させた。このようにして、ヒドラゾン結合を、Ｎ−アセチル−γカリチアマイシンジメチルヒドラジドとナノ物品のケトン部分との間に形成した。反応混合物を、２６／１０脱塩カラムを使用して過剰のＮ−アセチル−γカリチアマイシンジメチルヒドラジドから精製した。
【０１０６】
（実施例２１：デキサメタゾン結合）
ナノ物品に対するデキサメタゾン結合は、グリシン官能基化リンカーによって可能である。リンカー化合物を、グリシン官能基化２−ＣＩＴｒｉｔｙｌ樹脂（２００２／２００３  ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔａｌｏｇ，ｐａｇｅ２．１６−２．１７，ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ−ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳＡ）によって、固相合成技術の使用によって調製する。グリシンリンカーの酸部分を、カルボジイミドを使用して、デキサメタゾンの２１炭素ヒドロキシ基と反応させる。過剰のデキサメタゾンを使用して、グリシンリンカーの全ての酸基と反応させる。得られる化合物を１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してアミンの部位で切断する。これは、酸（ＮａＡ）官能基化ナノ物品と結合体化され得る遊離アミンを生成する。この生成物は、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム／サイズ排除クロマトグラフィーの使用によって精製される。次いで、エステル結合を、インビボで切断し、デキサメタゾンを放出する。
【０１０７】
（実施例２２：ゲムシタビンの組込み）
実施例９のナノ物品（１．０ｇ）（好ましくはＤＡＡまたは酸化糖を含む）を、１０．０ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２、０．２Ｍ）に溶解する。１５．５ｍｇのゲムシタビンをこのナノ物品溶液に加える（３５℃）。１時間反応させ、その後、サイズ排除クロマトグラフィーによってナノ物品を単離する。このナノ物品水溶液を、この時点で凍結乾燥し得る。
【０１０８】
（実施例２３：メトトレキサートの結合）
メトトレキサート（１００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、ｂｏｃ保護エタノールアミン（１００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（９１ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（３６ｍｇ、０．２９３ｍｍｏｌ）を加えたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１０ｍＬ）に、０℃で溶解する。この反応混合物を、室温で一晩静置する。このＮ保護アミノエステルメトトレキサートを、０．１ＮのＨＣｌで洗浄し、乾燥し、そして減圧下でエバポレートして、固体生成物を得る。この生成物を塩化メチレンとＴＦＡとの５０：５０の混合物中に溶解して、室温で３時間攪拌することによって、ｂｏｃ保護基を除去する。溶媒をエバポレートすると、脱保護アミノエステル誘導体が得られる（Ｍｉｎｋｏ  Ｔ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００２，５０，１４３−１５０）。
【０１０９】
このアミノエステル誘導体の乾燥粉末（１００ｍｇ）を、２ｍＬのＤＭＳＯに完全に溶解する。１０．０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した実施例８のナノ物品（１．０ｇ）の溶液（０．２０Ｍ）を、１０．０ｍＬの水に添加する。この溶液に、メトトレキサート溶液を添加し、次いで、１６０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および５０ｍｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を連続的に添加する。３０分後、ＥＤＣの第２の５０ｍｇアリコートを添加する。さらに０．５時間の反応間隔の後、この添加／遅延サイクルを、さらに２回繰り返す。次いで、この反応混合物を２４時間攪拌する。未反応の出発物質および副生成物を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムに通すことによって、メトトレキサート−ナノ物品生成物から単離し、このナノ物品を、凍結乾燥によって乾燥固体として単離する。
【０１１０】
（実施例２４：サリチル酸の結合）
４００ｍｇの無水コハク酸を、２．０ｇのＩＭＭＡ（実施例１に従って調製した）と、ピリジン中で反応させて、インシュリンの糖繰り返し基３つあたり約１つのカルボン酸部分のレベルにし、そして実施例１に記載される方法に従って単離する。次いで、１．０ｇのこの酸修飾ＩＭＭＡ（ＡＭ−ＩＭＭＡ）を、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、５００ｍｇ）を使用して、ＤＭＦ中のサリチル酸（３００ｍｇ）と結合させる。この手順において、このＡＭ−ＩＭＭＡを、無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、そしてＤＣＣを添加する。４時間後、サリチル酸を添加し、そしてこの反応物を一晩攪拌する。翌日、この反応物を濾過し、そしてＤＭＦを減圧下で除去する。粗物質を、水（５０ｍＬ）に溶解し、再び濾過し、そして凍結乾燥の後、この生成物を単離する。次いで、このサリチル酸修飾ＳＡＭ−ＩＭＭＡを、未修飾のＩＭＭＡの代わりに、実施例８に記載の処方手順で使用して（合成手順および単離手順は変えない）、ＳＡＭ−ＩＭＭＡ／ＣｉＢＡ／アクリル酸ナトリウムナノ物品骨格を生成する。
【０１１１】
（実施例２５：カンプトセシンの結合）
２０−Ｏ−ペプチジル−カンプトセシン（１２０ｍｇ）（Ｆａｒａｏ  Ｍ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００３，２，２９−４０）の手順に従って調製した）を、１５ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、そして１５．０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５、０．２０Ｍ）を添加した。１０．０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した実施例８に従って作製されたナノ物品（１．０ｇ）（酸含有ナノ物品）の溶液（０．２０Ｍ）に、１０．０ｍＬの水を添加した。この溶液に、１６０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および５０ｍｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を、連続して添加した。ＥＤＣの添加の２０分後、７．５ｍＬの２０−Ｏ−ペプチジル−カンプトセシン溶液を添加した。ＥＤＣの第２の５０ｍｇアリコートを添加し、次いで、２０分遅延させた後に、第２の量の２０−Ｏ−ペプチジル−カンプトセシンを添加した。さらに０．５時間の反応間隔の後、添加／遅延サイクルをさらに２回繰り返し、その結果、２０−Ｏ−ペプチジル−カンプトセシン溶液全ての添加を確実にした。次いで、この反応混合物を２４時間攪拌した。未反応の出発物質および副生成物を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムに通すことによって、２０−Ｏ−ペプチジル−カンプトセシンナノ物品生成物から分離し、そして凍結乾燥によって、このナノ物品を乾燥固体として単離した。
【０１１２】
（実施例２６：マロネート含有ナノ物品とＮ，Ｏ錯化したｃｉｓ−ジアミノ白金）
０．１Ｍの硝酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中の実施例１１に記載のナノ物品（１．０ｇ）（８０ｗｔ％  緩衝液、１４ｗｔ％  ＩＭＭＡ、６ｗｔ％  ＭａｌＡｃおよびエオシンＹから構成される）の溶液に、硝酸ナトリウム中のｃｉｓ−ジアミンジアクア白金ジニトラートの５０ｍＭの溶液（２６ｍＬ）を添加した。この反応を、室温で１２時間進行させる。ニトラートの使用は、リガンド交換に有利である。最初に形成されるＯ，Ｏ−白金−マロネート錯体は、それ自体再配置して、より安定なＯ，Ｎ−マロネート錯体になり得る（この変換はＰｔ  ＮＭＲによって追跡され得る）。次いで、未反応の白金誘導体を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムに通すことによって、白金錯化ナノ物品生成物から分離する。凍結乾燥によって、このナノ物品を乾燥固体として単離する。
【０１１３】
（実施例２７：ＣＩＢＡのアミド部分および酸部分とＮ，Ｏ錯化したｃｉｓ−ジアミノ−白金）
０．１Ｍの硝酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中の１．０ｇのナノ物品（８０ｗｔ％  緩衝液、１４ｗｔ％  ＩＭＭＡ、６ｗｔ％  ＣｉＢＡおよびエオシンＹから構成される）の溶液に、硝酸ナトリウム中のｃｉｓ−ジアミノジアクア白金ジニトラートの１００ｍＭ溶液（１８ｍＬ）を添加した。この反応を、室温で一晩進行させた。未反応の白金誘導体および錯化がゆるすぎる白金誘導体を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムに通すことによって、白金錯化ナノ物品生成物から分離した。凍結乾燥によって、このナノ物品を乾燥固体として単離した。
【０１１４】
（実施例２８：標的化ｃｉｓ−プラチンナノ物品（標的化後の負荷）
実施例１２に従って作製したナノ物品（８２ｗｔ％  緩衝液、１４ｗｔ％  ＩＭＭＡ、２ｗｔ％  ＣＩＢＡおよび２ｗｔ％  Ｎ−メタクリロイル化Ｇｌｙ−Ｇｌｙペプチド（米国特許第５，０３７，８８３号に従って作製した）、ならびにエオシンＹから構成される）を、実施例３０に記載の手順に従って還元し（ＤＴＴ還元）、ＰＥＧ  ｄＢＡで官能化し（実施例３０）、そして実施例３７に記載されるようにしてＥｒｂＢ−２リガンド（ブロモアセトアミド官能化環状Ｆ［ＣＤＧＦＹＡＣ］ＹＭＤＶ）で標的化した。
【０１１５】
０．１Ｍの硝酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中のこれらのナノ物品（１．０ｇ）の溶液に、硝酸ナトリウム中のｃｉｓ−ジアミンジアクア白金ジニトラートの１００ｍＭ溶液（１８ｍＬ）を添加した。この反応を、室温で一晩進行させた。未反応の白金誘導体および錯化がゆるすぎる白金誘導体を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムに通すことによって、白金錯化ナノ物品生成物から分離した。凍結乾燥によって、このナノ物品を単離した。
【０１１６】
（実施例２９：５−フルオロウラシル（５ＦＵ）の結合）
Ｂｏｃ−保護グリシンのクロロメチルエステルを、Ｔａｙｌｏｒら（Ｔａｙｌｏｒ  Ｈ．Ｅ．，Ｓｌｏａｎ  Ｋ．Ｂ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９８，８７，１５）の方法に従って、５ＦＵに結合する。トリフルオロ酢酸（ＡＴＦ）で脱保護し、過剰なＴＦＡを減圧下で除去した後、アミン官能化５ＦＵ（Ｂｏｃ保護出発物質１９８ｍｇから作製した）を、カルボン酸含有ナノ物品への結合のために直ちに使用する。この物質を、１５．０ｍＬの水に完全に溶解し、そして１５．０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５、０．２０Ｍ、１５．０ｍＬ）を添加する。１０．０ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した実施例８のナノ物品の溶液（０．２０Ｍ）に、１０．０ｍＬの水を添加する。この溶液に、１６０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および５０ｍｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を連続的に添加する。ＥＤＣの添加の２０分後、７．５ｍＬのアミン官能化５ＦＵ溶液を添加した。得られた溶液を、０．５時間穏やかに攪拌する。ＥＤＣの第２の５０ｍｇアリコートを添加し、次いで、２０分遅延させた後に、第２の量の誘導体化５ＦＵを添加する。さらに０．５時間の反応間隔の後、この添加／遅延サイクルを、さらに２回繰り返し、その結果、誘導体化５ＦＵ溶液全ての添加を確実にする。次いで、この反応混合物を、２４時間攪拌する。未反応の出発物質および副生成物を、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムに通すことによって、ナノ物品生成物から分離し、そして凍結乾燥によってこのナノ物品を乾燥固体として単離する。
【０１１７】
（実施例３０：リンカーの結合）
実施例１６に記載のドキソルビシン負荷物品（４００ｍｇ）を、０．５ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２，０．１０Ｍ、０．１５ＭのＮａＣｌを含む、この緩衝液はしばしば、ＰＢＳと称される）に溶解した。この溶液に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、１９８ｍｇ）を添加し、そしてその還元反応物を、２．０時間穏やかに攪拌した。得られた物品を、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）を溶離溶媒として使用するＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムを取り付けた高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システムを使用することによって、他の物質から分離した。ＰＥＧ−１５００  ｄＢＡ（２．５９ｇ）を５０ｍＬバイアルに測り取った。新たに精製したナノ物品溶液を、このＰＥＧ−１５００  ｄＢＡに添加し、そしてこのＰＥＧ結合反応物を室温で２時間、アルミニウム箔下で穏やかに攪拌した。次いで、このナノ物品を、先に記載された同じＦＰＬＣ配置を使用して、反応混合物の他の成分から分離した。ナノ物品を含むプールした画分を、以下の実施例に記載される次の手順（ここで、特異的標的化エレメントが結合する）に使用した。
【０１１８】
（実施例３１：ＢＭＰＥＯ４の結合）
実施例１６に記載のドキソルビシン負荷物品（４００ｍｇ）を、ＰＢＳに溶解した。この溶液に、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、１９８ｍｇ）を添加し、そしてこの還元反応物を、２．０時間穏やかに攪拌した。この物品を、溶離溶媒としてＰＢＳを使用するＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムを取り付けたＦＰＬＣを使用することによって、他の物質から分離した。ホモ二官能性架橋剤１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ４、３７９ｍｇ）を、ナノ物品を含むプールしたＦＰＬＣ画分に添加した。この反応を、攪拌しながら、室温で２時間進行させた。次いで、未反応のリンカーを、先に記載された同じＦＰＬＣを使用して、ナノ物品から除去した。これらの物質を、ＰＥＧ−ｄＢＡ官能化物品と類似の様式で使用する。
【０１１９】
（実施例３２：Ｄｏｘ負荷物品へのｅｒｂＢ１リガンドの結合）
ジスルフィド架橋環状ペプチド：
【０１２０】
【化７】
2005535604.tif 000006
（１７４ｍｇ）を、実施例１６に記載されるナノ物品を含むＦＰＬＣから溶離されたプールされた画分に添加した。この反応物を、アルミニウム箔下で、２時間、穏やかに攪拌した。この反応混合物中の他の成分からのナノ物品の分離を、溶媒として脱イオン水を使用するＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムを取り付けたＦＰＬＣを使用することによって達成した。凍結乾燥によって、ナノ物品生成物を単離し得る。
【０１２１】
（実施例３３：Ｄｏｘ−負荷物品へのｅｒｂＢ２リガンドの結合）
ジスルフィド架橋環状ペプチド：
【０１２２】
【化８】
2005535604.tif 000007
（記号ｄＦは、フェニルアラニンのＤ異性体を表わし、そしてｄＹはチロシンのＤ異性体を表わす、１６２ｍｇ）を、実施例１６に記載されるナノ物品を含むＦＰＬＣから溶離されたプールされた画分に添加した。この反応物を、アルミニウム箔下で、２時間穏やかに攪拌した。この反応混合物中の他の成分からのナノ物品の分離を、溶媒として脱イオン水を使用するＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムと取り付けたＦＰＬＣを使用することによって達成した。凍結乾燥によって、このナノ物品生成物を単離し得る。
【０１２３】
（実施例３４：Ｃｏｘ負荷物品へのＶＥＧＦＲ２リガンドの結合）
ペプチドＡＴＷＬＰＰＲＣ（１２０ｍｇ）を、実施例１６で記載されるナノ物品を含むＦＰＬＣから溶離したプールされた画分に添加した。この反応物を、アルミニウム箔下で、２時間穏やかに攪拌した。この反応混合物中の他の成分からのナノ物品の分離を、溶媒として脱イオン水を使用するＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムと取り付けたＦＰＬＣを使用することによって達成した。凍結乾燥によって、このナノ物品生成物を単離し得る。
【０１２４】
（実施例３５：ＰＥＧ  ｄＢＡ官能化物品へのＲＧＤの結合）
環状ＲＧＤペプチド（ＨＡＰ３Ｃ、ＲＧＤｄＦＣ、またはＦＷ  ５７６）（６２ｍｇ）を、結合ＰＥＧ４００ｄＢＡリンカーテザーを有するドキソルビシン含有ナノ物品（３５５ｍｇ）（実施例３０の手順に従って、ＰＥＧ４００ｄＢＡを用いて実施例１７のＤｏｘ物品を官能化することによって調製した）を含む溶液に、ＰＢＳ（ｐＨ８）中１０ｍｇ／ｍＬで添加した。この反応を２時間進行させ、その後、１３ｍｇのシステインを添加した。システインとの反応を１時間進行させ、その後、このナノ物品を、溶離液として揮発性緩衝液（ｐＨ７〜９）を用いるＦＰＬＣによって精製して、ＰＥＧ４００ｄＢＡ鎖を介して結合したＰＧＤを有するドキソルビシン含有ナノ物品を得た。このナノ物品を凍結乾燥した。
【０１２５】
（実施例３６：ＰＥＧ  ｄＢＡ官能化物質へのｅｒｂＢ１リガンドの結合）
Ｎ末端にシステインを有する１００ｍｇの環状ＥｒＢ１ペプチド（ＣＹＣＰＩＷＫＦＰＤＥＥＣＹ）を、ＰＥＧ４００ｄＢＡリンカーテザー（ｔｅｔｈｅｒ）が結合した３００ｍｇのドキソルビシン含有ナノ物品（ｎａｎｏａｒｔｉｃｌｅ）（実施例３０の手順に従って、実施例１７のＤｏｘ−物質をＰＥＧ４００ｄＢＡで官能化することによって調製した）を５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（ｐＨ８）中に含有する溶液に加えた。反応を４時間行い、その後、１１ｍｇのシステインを添加した。システインとの反応を１時間行い、その後、ナノ物品をＦＰＬＣで精製し、ＰＥＧ４００ｄＢＡ鎖を介してＥｒｂ１が結合したドキソルビシン含有ナノ物品を得た。
【０１２６】
（実施例３７：ＰＥＧ  ｄＢＡ官能化物質へのｅｒｂＢ２リガンドの結合）
Ｎ末端にシステインを有する５０ｍｇの環状ＥｒＢ１ペプチド（ＣｄＦＣＤＧＦｄＹＡＣＹＭＤＶ）を、水中に事前に溶解し、そしてＰＥＧ４００ｄＢＡリンカーテザーが結合した３００ｍｇのドキソルビシン含有ナノ物品（実施例３０の手順に従って、実施例１７のＤｏｘ−物質をＰＥＧ４００ｄＢＡで官能化することによって調製した）を終濃度２．５ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（ｐＨ８）中に含有する溶液に加えた。反応を４時間行い、その後、１１ｍｇのシステインを添加した。反応を２時間行い、その後、ナノ物品をＦＰＬＣで精製し、ＰＥＧ４００ｄＢＡ  鎖を介してＥｒｂ２が結合したドキソルビシン含有ナノ物品を得た。
【０１２７】
（実施例３８：ＰＥＧ  ｄＢＡ官能化物質へのＶＥＧＦＲ−２リガンドの結合）
システイン末端終末化ＶＥＧＦＲ−２ペプチド（ＡＴＷＬＰＰＲＣ）（１００  ｍｇ）を、３５５ｍｇの、ＰＥＧ４００ｄＢＡリンカーテザーが結合したドキソルビシン含有ナノ物品（実施例３０の手順に従って、実施例１７のＤｏｘ−物質をＰＥＧ４００ｄＢＡをで官能化することによって調製した）を１０ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ（ｐＨ８）中に含有する溶液に加えた。反応を２時間行い、その後、１３ｍｇのシステインを添加した。反応を１時間行い、その後、ナノ物品をＦＰＬＣで精製し、ＰＥＧ４００ｄＢＡ鎖を介してＶＥＧＦＲ−２が結合したドキソルビシン含有ナノ物品を得た。
【０１２８】
（実施例３９：マウスにおけるヒドロゲル骨格の耐容性）
１４％  ＩＭＭＡおよび１重量％  ＤＡＡの骨格ナノ物品を、ＣｉＢＡの付加を省いて実施例９の手順に従って調製した。
【０１２９】
実験開始の前に、９匹の雌ＳＣＩＤ／Ｒａｇ  ２Ｍマウス（９週齢、体重１８〜２２ｇ）を、無作為に３匹ずつ３つの群に分配した。物質を、生理食塩水中で可溶化し、そしてマウスの尾静脈内に静脈内注射した。１００  ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇおよび４００ｍｇ／ｋｇでのナノ物品の静脈内投与は、毒性の急性の兆候も遅効性の兆候もなく、耐容性を示した。体重を、１６日間に渡ってモニターした。この期間の間、体重減少は見られなかった。結果を、表１に示す：
（表１：ナノ物品の単回静脈内注射後のマウス（ｎ＝３）における平均体重変化  （％））
【０１３０】
【表１】
2005535604.tif 000008
（実施例４０：ＦＩＴＣ標識化ＮＰマトリックスのＰＫ）
ＦＩＴＣ標識化ナノ粒子（ＮＰ）またはＰＥＧ−４００と結合したＦＩＴＣ標識化ナノ粒子（ＮＰ−ＰＥＧ）を、実施例８に記載の逆ミクロエマルジョンポリマー化法を用いて作製し、ここで、水相は、８３重量％の水、１４重量％  ＩＭＭＡ、１重量％  ＡＰＭＡ、および１重量％  ＮＯＢＡから構成されていた。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を、フルオレセインのイソチオシアネートとナノ粒子上のアミン含有部分のアミノプロピルメタクリレート（ＡＰＭＡ）との間の結合を介して結合した。
【０１３１】
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、５０ｍｇ／ｋｇ  ＦＩＴＣ標識化ナノ粒子（ＮＰ）またはＰＥＧ−４００と結合したＦＩＴＣ標識化ナノ粒子を静脈内に注射した。処置群を、１５分、２時間、６時間、および２４時間後に評価した。血液サンプルおよび組織サンプルを、上記の時点で採取した。組織サンプルを、さらなる分析の前に素早く冷凍した。血液サンプルから、１５００ｇで１０分間の遠心分離を通して、血漿を調製した。血漿および組織を、ＮＰまたはＮＰ−ＰＥＧの存在について、マイクロプレート蛍光リーダーを使用して４８５ｎｍの励起波長および発光波長５３５ｎｍで蛍光アッセイを通してアッセイした。血漿サンプルを、ＰＢＳで１０倍希釈した。最終アッセイ容量は、黒色底９６ウェルプレートの１ウェルにつき１００ｐｓｉであった。組織を、０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有のＰＢＳ  ２ｍｌ中に、組織ホモジナイザーを使用して抽出した。次いで、組織サンプルを、ＰＢＳ中で５倍希釈し、黒色底９６ウェルプレート中で１００ｐｓｉの収容量とした。
【０１３２】
粒子のμｇで表したＦＩＴＣ−ＮＰの血漿除去は、裸の（官能化していない）ナノ粒子およびＰＥＧ−４００と結合したナノ粒子の両方について、血液中の長い半減期（６．６時間）を示した。体内分布を、肝臓、脾臓、腎臓、心臓および肺における蛍光の測定によって分析した。肝臓および脾臓における低い蓄積が、２４時間にわたって４つの時点で採取した組織抽出物からの両方の型のナノ粒子について検出された。ナノ粒子は、肺、心臓および腎臓において見出された。
【０１３３】
（表２：２４時間の間の、ＦＩＴＣ標識化ＮＰの全血区画からのクリアランス。注射したナノ粒子のマウスあたりの全量は、１０００μｇであった（２０ｇの体重に対して正規化）。表中の値はμｇ／組織である。）
【０１３４】
【表２】
2005535604.tif 000009
（実施例４１：ＲＧＤ−Ｄｏｘ−ＮＰのＣＡＭ結果）
７日齢のニワトリ胚の絨毛尿膜（ＣＡＭ）を、マウス乳癌ＣＩ−６６を各１０５細胞と共に、２４時間インキュベートし、その後、５μｇのドキソルビシン、５μｇのナノ粒子中のＤｏｘ等価物（１４／１／１  ＩＭＭＡ／ＮＯＢＡ／ＮａＡ、ＰＥＧ３４００）、５μｇの環状ＲＧＤで官能化したナノ粒子中のＤｏｘ等価物（１４／１／１  ＩＭＭＡ／ＮＯＢＡ／ＮａＡ、ＰＥＧ３４００−ｃＲＧＤ）、またはＰＢＳコントロールのいずれかを含むディスク（ｄｉｓｋ）と共にインキュベートした。ナノ粒子に結合したリンカーを、実施例３１で記載のように作製した。
【０１３５】
３日後、ＣＡＭを切除し、そして分析のために写真撮影した。ドキソルビシン単独が、血管の数の減少に最も効果的であった。しかし、その適用はまた、最も毒性が強かったため、この群の胚１０匹中６匹のＣＡＭが壊死し、そして群の胚１０匹中３匹が処置中に死んだ。Ｄｏｘ−ＮＰは、ディスク周囲の血管分布の変化においてよく機能した。Ｄｏｘ−ＮＰ−ｃＲＧＤは、Ｄｏｘ−ＮＰと比較して、ディスク周囲の血管の数の減少により効果的であった。
【０１３６】
（実施例４２：ＲＧＤ−Ｄｏｘ  ＮＰおよびＤｏｘ  ＮＰについてのインビボ毒性／効力データ）
ナノ物品結合ドキソルビシン（Ｄｏｘ−ＮＰ）の効力および毒性を、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）および生理食塩水コントロールと比較した。組成物１４／１／１  ＩＭＭＡ／ＣｉＢＡ／ＮａＡのＤｏｘ−ＮＰ、５．６％のＤｏｘを、実施例１６における以下の手順に従って作製した。
【０１３７】
ＣＬ６６乳癌細胞を、富化培地中で８０〜９０％コンフルーエンスまで増殖させ、３７℃で２分間、１×トリプシンでトリプシン処理し、ハンクス平衡化塩溶液（カルシウムおよびマグネシウム非含有）でリンスし、そして１×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌで再懸濁し、０．１  ｍｌを、雌Ｂａｌｂ／マウスの乳房の脂肪パッド内に注射した。
【０１３８】
凍結乾燥したＤｏｘ−ＮＰを、無菌ＰＢＳ中で適切な濃度で再構築し、そして２〜８℃で、少なくとも１時間または一晩保存した。賦形剤Ｄｏｘを、ＰＢＳ中に、適切な濃度で溶解した。２００μＬをマウスの尾静脈を介して、腫瘍誘発の１３日、１５日および１８日後に、静脈内注射した。Ｄｏｘを、２２５μｇ／動物で注射し、一方、Ｄｏｘ−ＮＰを、２５０μｇ／動物、４２０μｇ／動物および５６０μｇ／動物でのＤｏｘ送達に十分なナノ粒子レベルで注射した。
【０１３９】
腫瘍体積を、表面的に二次元で測定した。体重減少（または増加）および生存率を記録した。腫瘍サイズの有意な減少が、２５０μｇ／動物群で観察された。より高い用量（例えば、Ｄｏｘ  ２２５μｇ／動物用量）のＤｏｘを含有するナノ粒子は毒性が強いが、Ｄｏｘを注射したマウスは、僅かに長い生存時間を有した。最も低い用量のＤｏｘ−ＮＰは、治療活性を有し、腫瘍増殖速度を遅くし、従って、腫瘍を小さくした。死の時、腫瘍は、２５０μｇ／動物Ｄｏｘ−ＮＰ群でＤｏｘ群よりも小さく、そしてその体重は、Ｄｏｘ群よりも低かった。しかし、腫瘍が小さくなるほど、２５０μｇ／動物Ｄｏｘ−ＮＰマウスとコントロールマウスとの間の生存率の差異（腫瘍注射後）は最小であった。これは、Ｄｏｘ−ＮＰは活性を有し、これはさらなる治療の非存在下で、連続性の腫瘍増殖により打ち消されることを示唆する。
【０１４０】
（実施例４３：ＲＧＤ−Ｄｏｘ  ＮＰおよびＤｏｘ  ＮＰについてのインビボ毒性／効力データ）
ナノ物品結合ドキソルビシン（Ｄｏｘ−ＮＰおよびＤｏｘ−  ＮＰ−ｃＲＧＤ）の効力および毒性を、研究した。組成物１４／１／１  ＩＭＭＡ／ＣｉＢＡ／ＮａＡのＤｏｘ−ＮＰ、５．６重量％  Ｄｏｘ、ＰＥＧ４００（ｃＲＧＤ含有および非含有）を、実施例１６の手順に従って作製した。ＰＥＧ４００ｄＢＡを、実施例３０の手順に従って結合した。腫瘍保有マウスを、実施例４２（上記）に記載のように接種し、処置し、そして観察した。静脈内注射を、最初の週に、１２００μｇのＤｏｘ等価物（Ｄｏｘ−ＮＰおよびＤｏｘ−ＮＰ−ｃＲＧＤ）の蓄積用量で週に３回行った。Ｄｏｘ−ＮＰ群のマウスの１匹だけが死に、そしてＤｏｘ−ＮＰ−ｃＲＧＤ群の全てのマウスが生き残った。平均腫瘍体積は、生理食塩水中のコントロール群において、３０倍以上増加した。対して、Ｄｏｘ−ＮＰ群は１２倍、Ｄｏｘ−ＮＰ−ｃＲＧＤ群は６倍に増加した。Ｄｏｘ−ＮＰ−ｃＲＧＤ群における大型の腫瘍は、有意な壊死を示した。
【０１４１】
（表３：処置後（処置開始後の日数（ｔｉｗ））の体積における平均ｘ倍の増加で表した、腫瘍サイズ（ｎ＝５）における変化）
【０１４２】
【表３】
2005535604.tif 000010
（ＮＡ＝適用不能）
（実施例４４：Ｄｏｘ−アミド結合ナノ粒子のインビトロ細胞毒性）
ドキソルビシンは、共有結合（細胞内環境において非常にゆっくり分解されるかまたはそれより迅速に分解される）からなる結合を介してナノ物品骨格に結合し得る。例えば、アミド結合はよりゆっくりと分解されるが、他の結合（例えば、ヒドラゾン結合からなる結合）は、加水分解を介してより迅速に分解される。アミド結合を介してナノ粒子に結合するＤｏｘの毒性を、インビトロ毒性アッセイにおいて、Ｃ−３２細胞（ヒト黒色腫）に対して試験した。組成物１４／２／１ＩＭＭＡ／ＣｉＢＡ／ＮａＡ  のＤｏｘ−ナノ−物質を、実施例８に記載の手順に従って作製した。
【０１４３】
９６ウェル組織培養マイクロタイタープレートにおいて、培養培地中で１ウェルにつき１０，０００個のＣ−３２細胞を、２時間結合させ、その後、Ｄｏｘ−アミドナノ−物質および遊離のＤｏｘの濃度を変えてインキュベートした。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で、湿潤チャンバー内で４８時間インキュベートした。細胞増殖を、比色分析ＭＴＴキット（ＣＴ０１，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｔ．）を使用してアッセイした。５０％増殖阻害を、Ｄｏｘ等価物の０．３μｇ／ｍＬに対して、０．８μｇ／ｍＬの遊離Ｄｏｘと比較して、決定した。
【０１４４】
（実施例４５：Ｄｏｘ−ヒドラゾン結合ナノ粒子のインビトロ毒性）
ヒドラゾン結合を介してナノ物品に結合するＤｏｘの毒性を、Ｃ−３２細胞（ヒト黒色腫）に対するインビトロ毒性アッセイにおいて試験した。組成物１４／２／１  ＩＭＭＡ／ＣｉＢＡ／ＤＡＡのＤｏｘ−ナノ−物質を、実施例９に記載の手順に従って作製した。
【０１４５】
９６ウェル組織培養マイクロタイタープレートにおいて、培養培地中で１ウェルにつき１０，０００個のＣ−３２細胞を、２時間結合させ、その後、Ｄｏｘ−ヒドラゾンナノ−物質および遊離のＤｏｘの濃度を変えてインキュベートした。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で、湿潤チャンバー内で４８時間インキュベートした。細胞増殖を、比色分析ＭＴＴキット（ＣＴ０１，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｔ．）を使用してアッセイした。５０％増殖阻害を、Ｄｏｘ等価物の０．０７μｇ／ｍＬに対して、０．８μｇ／ｍＬの遊離のＤｏｘと比較して、決定した。
【国際調査報告】
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