(57)【要約】陰イオン的性質を有するある種の混合モード樹脂に関して、メルカプト含有部分、エーテル含有部分、またはアミノ含有部分を含む結合を介して、リガンドが固体支持体と結合している。適切なリガンドは、場合により縮合しており、サルフェート、スルホネート、ホスホネート、またはホスフェートで置換されており、このような部分中に結合している、芳香族基、複素環式芳香族基、または複素環式基を含む。これらの樹脂は、それらの使用の場合に規定される条件下で陰イオン性を有する。ペプチドまたはタンパク質などの生物学的物質の分離は、この種類の樹脂を使用し、溶離液のｐＨを変化させることで吸着および脱着を行うことによって、実施することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）固体支持体と、
（ｂ）複素環式、複素環式芳香族、または芳香族であり、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基、またはホスホネート基で置換されている単環式基または多環式基と、
（ｃ）（ｂ）を前記固体支持体と結合させるメルカプト含有部分、エーテル含有部分、またはアミノ含有部分を含む結合基と、
を含む、固体基材。
【請求項２】
前記固体支持体が有機材料である、請求項１に記載の固体基材。
【請求項３】
前記固体支持体が無機材料である、請求項１に記載の固体基材。
【請求項４】
前記有機材料が、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンとのコポリマー、およびそれらの混合物からなる群より選択されるものである、請求項２に記載の固体基材。
【請求項５】
前記無機材料が、ヒドロゲル含有シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア、セラミックス、およびそれらの混合物からなる群より選択されるものである、請求項３に記載の固体基材。
【請求項６】
前記結合基がメルカプト含有部分を含む、請求項１に記載の固体基材。
【請求項７】
前記結合基がエーテル含有部分を含む、請求項１に記載の固体基材。
【請求項８】
前記結合基がアミノ含有部分を含む、請求項１に記載の固体基材。
【請求項９】
前記結合基の前記部分が、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、アルキルオキシ基、芳香族基、アルキル芳香族基、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される構成要素である、請求項１に記載の固体基材。
【請求項１０】
前記結合基がメルカプトアルキル基である、請求項９に記載の固体基材。
【請求項１１】
前記複素環式基または複素環式芳香族基が少なくとも１つのＳ原子を含む、請求項１に記載の固体基材。
【請求項１２】
前記複素環式基または複素環式芳香族基が少なくとも１つのＮ原子を含む、請求項１に記載の固体基材。
【請求項１３】
前記複素環式基または複素環式芳香族基が少なくとも１つのＳ原子および１つのＮ原子を含む、請求項１に記載の固体基材。
【請求項１４】
基（ｂ）が多環式基である、請求項１に記載の固体基材。
【請求項１５】
基（ｂ）が、芳香族基と縮合している複素環式基または複素環式芳香族基を含む、請求項１４に記載の固体基材。
【請求項１６】
前記芳香族基が、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、またはアセナフチレニルである、請求項１５に記載の固体基材。
【請求項１７】
前記複素環式基または複素環式芳香族基が少なくとも１つのＳ原子を含む、請求項１４に記載の固体基材。
【請求項１８】
前記複素環式基または複素環式芳香族基が少なくとも１つのＮ原子を更に含む、請求項１４に記載の固体基材。
【請求項１９】
前記複素環式基または複素環式芳香族基が少なくとも２つのＮ原子を含む、請求項１４に記載の固体基材。
【請求項２０】
前記複素環式基または複素環式芳香族基が芳香族基と縮合している、請求項１８に記載の固体基材。
【請求項２１】
前記複素環式基または複素環式芳香族基が５員環または６員環である、請求項２０に記載の固体基材。
【請求項２２】
基（ｃ）が式：
【化１】
2005539223.tif 000012
で表される、請求項２１に記載の固体基材。
【請求項２３】
前記結合基がアミノ含有部分である、請求項２２に記載の固体基材。
【請求項２４】
前記アミノ含有部分が式：
【化２】
2005539223.tif 000013
で表される、請求項２３に記載の固体基材。
【請求項２５】
前記結合基がメルカプト含有部分である、請求項２２に記載の固体基材。
【請求項２６】
前記メルカプト含有部分が式：
【化３】
2005539223.tif 000014
又は、
【化４】
2005539223.tif 000015
で表される、請求項２５に記載の固体基材。
【請求項２７】
基（ｂ）が、少なくとも２つのＮ原子を含み芳香族基と縮合している複素環式基または複素環式芳香族基を含む、請求項１４に記載の固体基材。
【請求項２８】
前記複素環式基または複素環式芳香族基が５員環または６員環である、請求項２７に記載の固体基材。
【請求項２９】
基（ｂ）が式：
【化５】
2005539223.tif 000016
で表される、請求項２８に記載の固体基材。
【請求項３０】
前記結合基がアミノ含有部分である、請求項２９に記載の固体基材。
【請求項３１】
前記アミノ含有部分が式：
【化６】
2005539223.tif 000017
で表される、請求項３０に記載の固体基材。
【請求項３２】
前記結合基がメルカプト含有部分である、請求項２９に記載の固体基材。
【請求項３３】
前記メルカプト含有部分が式：
【化７】
2005539223.tif 000018
又は、
【化８】
2005539223.tif 000019
で表される、請求項３２に記載の固体基材。
【請求項３４】
（ａ）請求項１記載の固体基材を、少なくとも１種類の生物学的物質を含有する液体試料と接触させるステップと、
（ｂ）（ｂ）で得られた前記固体基材を平衡緩衝液で洗浄するステップと、
（ｃ）前記生物学的物質が前記固体基材から脱着するように、ｐＨを調整するステップと、
を含む、生物学的物質を試料から分離する方法。
【請求項３５】
前記生物学的物質が前記固体基材上に吸着されるように、前記試料のｐＨを調整するステップを更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）におけるｐＨが約４〜約６の間の値に調整される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
（ｃ）におけるｐＨが約８〜約１１の間の値に調整される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）におけるｐＨが約４〜約６の間の値に調整され、（ｃ）におけるｐＨが約８〜約１１の間の値に調整される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記分離が、固定床、流動床、またはバッチ式のクロマトグラフィーによって実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的物質が、タンパク質、ウイルス、核酸、炭水化物、および脂質から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物学的物質がタンパク質である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質が、免疫グロブリン、ホルモン、凝固因子、サイトカイン、ペプチド、および酵素から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質が免疫グロブリンである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１に記載の固体基材の製造方法であって、
（ｉ）前記固体支持体を、前記結合基の一部またはすべてを含む二官能性試薬と反応させるステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた生成物を、スルホネート基、ホスフェート基、またはホスホネート基で置換されている複素環式基、複素環式芳香族基、または芳香族基を含む試薬と反応させることによって、前記複素環式基、複素環式芳香族基、または芳香族基と、前記結合基との間に結合を形成するステップと、
を含む、方法。
【請求項４５】
前記固体支持体が有機材料である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記固体支持体が無機材料である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記有機材料が、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンとのコポリマー、およびそれらの混合物からなる群より選択されるものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記無機材料が、ヒドロゲル含有シリカ、ジルコニア、チタニア、アルミナ、セラミックス、およびそれらの混合物からなる群より選択されるものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記固体支持体がバイオチップである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記二官能性試薬が、ブロミド、ヨージド、エポキシド、カルボキシル、エステル、アルデヒド、ケトン、アミド、アルケン、シアノ、およびイミノから独立に選択される少なくとも２つの官能基を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）入口端と出口端とを有する管状部材と、
（ｂ）前記管状部材の内部にある第１および第２の多孔質部材と、
（ｃ）前記管状部材の内部で前記第１の多孔質部材と前記第２の多孔質部材との間に充填される、請求項１に記載の固体基材と、
を含む、クロマトグラフィーカラム。
【請求項５２】
カラム体積が約１マイクロリットル〜約５０００リットルの間である、請求項５１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項５３】
前記カラム体積が約１リットル〜約１００リットルの間である、請求項５２に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項５４】
液体試料が前記固体基材を通って上方に流れるようにするための１つ以上の流体制御装置を更に含む、請求項５１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項５５】
前記入口端と前記出口端との間に一連のステージを含む、請求項５１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項５６】
バイオチップの形態である、請求項１に記載の固体基材。
【請求項５７】
前記固体支持体が、金属、ケイ素、ガラス、および有機ポリマーからなる群より選択されるものである、請求項５６に記載の固体基材。
【請求項５８】
前記バイオチップが質量分析計プローブである、請求項５６に記載の固体基材。
【請求項５９】
前記単環式基または多環式基が前記バイオチップと、複数のアドレス指定可能な位置で結合している、請求項５６に記載の固体基材。
【請求項６０】
前記結合基が多糖部分を更に含む、請求項５６に記載の固体基材。
【請求項６１】
（ａ）請求項５９に記載の固体基材のアドレス指定可能な位置を、検体を含む試料と接触させ、それによって前記検体を前記固体基材に固定するステップと、
（ｂ）前記固体基材をレーザー脱離質量分析計のプローブインターフェイス内に導入し、それによって前記アドレス指定可能な位置を、前記質量分析計中のレーザービームに近接させて配置するステップと、
（ｃ）前記アドレス指定可能な位置において前記固体基材に、前記検体を脱離させイオン化させるために十分な時間および出力においてレーザーを照射するステップと、
（ｄ）（ｃ）で得られた前記検体を前記質量分析計で検出するステップと、
を含む、検体の検出方法。
【請求項６２】
前記検体が、タンパク質、ウイルス、核酸、炭水化物、および脂質から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記検体がタンパク質である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記タンパク質が、免疫グロブリン、ホルモン、凝固因子、サイトカイン、ペプチド、および酵素から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記タンパク質が免疫グロブリンである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記固体支持体がチップである、請求項１に記載の固体基材。
【請求項６７】
前記固体支持体が、架橋した多糖を含む層と共有結合している共有結合的に取り付けられたシリル層を更に含む、請求項６６に記載の固体基材。
【請求項６８】
前記架橋した多糖が、第１の多糖と、１つ以上の架橋性基で置換されている第２の多糖とのコポリマーである、請求項６７に記載の固体基材。
【請求項６９】
前記第１および第２の多糖が、デキストラン、ヒドロキシ−エチル−セルロース、デンプン、アミラーゼ、およびアガロースからなる群より選択される、請求項６７に記載の固体基材。
【請求項７０】
前記多糖がデキストランである、請求項６９に記載の固体基材。
【請求項７１】
前記架橋性基がベンゾフェノン基である、請求項７０に記載の固体基材。
【請求項７２】
前記結合基が、単環式基または多環式基を、複数の異なるアドレス指定可能な位置において前記固体基材と結合させる、請求項６６に記載の固体基材。
【請求項７３】
少なくとも２つの異なるアドレス指定可能な位置が、同じ結合基と単環式基または多環式基とを含む、請求項７２に記載の固体基材。
【請求項７４】
前記固体支持体がアルミナまたはシリカである、請求項７３に記載の固体基材。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、固体基材、ならびに分離科学および分析的生化学におけるそれらの製造方法および使用方法に関する。
【０００２】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体などのタンパク質の急速な発展および増加する必要性によって、抗体を、それらを含有する溶液から分離する種々の技術が生まれている。沈殿方法、電気泳動分離、および膜濾過などの分離技術が、この必要性に適合するように進歩してきている。最も将来性のある技術は液体クロマトグラフィーである。
【０００３】
イオン交換体などの吸着剤、疎水性支持体、ハイドロキシアパタイト、およびゲル濾過媒体を使用する古典的な液体クロマトグラフィー技術は、実施するために長時間を消費することになる。また、これらの技術は、免疫グロブリンの不均一混合物を分離するために必要な特異性が不足している場合が多い。
【０００４】
したがって、免疫グロブリンなどのタンパク質を分離するための従来技術では、いわゆるアフィニティーまたは擬アフィニティークロマトグラフィー技術の利用が増加しており、これは、固定化されたリガンドとタンパク質などの特定の分子との間の特定の相互作用により精製を行うことに依拠している。例えばＳｃｈｗａｒｚらが国際公開公報第９５／３１２７９号において記載しているように、タンパク質親和性リガンドを含む吸着剤が一般に有効である。更にタンパク質系吸着剤にも、重大な欠点が存在することがある。特に、生物活性を有する溶離液との不都合な相互作用；固体支持体からのタンパク質の放出による所望の材料の汚染；化学的および物理的感受性（例えば過度のｐＨ、界面活性剤、カオトロピック剤、高温に対して）のために、選択性の低いカラムに必要となる頻繁な洗浄が困難であること；ならびに非常にコストが高いことが挙げられる。
【０００５】
公知の擬アフィニティー系分離方法は、分離するために、より低分子量の種々のリガンドを使用している。一般には、米国特許第５，６５２，３４８号明細書、第５，１８５，３１３号明細書、第５，１４１，９６６号明細書、第４，７０１，５００号明細書、および第４，３８１，２３９号明細書を参照されたい。これらの技術は、典型的には疎水性相互作用および静電的相互作用の一方または両方を利用して、標的分子の吸着および脱着を行う。
【０００６】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは一般に、リオトロピック塩の添加が必要であり、これは大規模な分離が望ましい場合に大きな欠点となる。標的分子と吸着剤との間の静電的相互作用に依拠する方法は、一般に供給材料のｐＨ調整が必要である。
【０００７】
供給材料のｐＨを低下させると、一部のリガンドがイオン化し、それによって標的分子が吸着する。低ｐＨにおけるその他の状況としては、他の標的分子の脱着が起こる。Ｅ．Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９（２００１）３６１を参照されたい。しかし酸性ｐＨは、凝集物の形成が誘導されたり、免疫グロブリンなどの一部の分子の生物活性が低下したりすることがあるため、これが常に望ましいわけではない。したがって、一部の擬アフィニティー系リガンドの有用性および低コストにもかかわらず、これらを使用するほとんどの方法は、低い処理能力、および供給材料のイオン強度、ｐＨ、またはその両方を変化させる必要性という欠点を有する。
【０００８】
基本的に、有力な分析方法は、前述のアフィニティーリガンド吸着剤を使用して実現することができる。例えば、検体／吸着剤相互作用による疾患マーカーの迅速な同定が、そのようなマーカーが特異的に結合する試薬を調製するための従来の臨床診断において必要であった単調で時間のかかる作業の代わりに使用されるであろう。更に、異なる発現をしたタンパク質の直接的で迅速な同定はこの分野において非常に有益であり、そのため例えばポリペプチドの単離および引き続く免疫化によって所望の免疫グロブリンを産生する長時間の過程が回避される。しかし、従来の吸着剤の前述の欠点のために、このような分析器具の感度および分解能が限定される。
【０００９】
したがって、当技術分野においては、高い結合能力および特異性を示し、生理化学的分解を起こさずに大規模に再生可能であり、生理学的ｐＨおよび／またはイオン強度下で機能することができる、改善された吸着剤が必要とされている。生物学的に重要な分子の迅速な同定のために有用となる、改善された生化学的分析器具も必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
これらおよびその他の必要性に対処するために、本発明は、固体支持体と；複素環式、複素環式芳香族、または芳香族であり、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基、またはホスホネート基で置換されている単環式基または多環式基と；メルカプト含有部分、エーテル含有部分、またはアミノ含有部分を含む結合基とで構成される固体基材を提供する。この結合基は、単環式基または多環式基を固体支持体と結合させる。
【００１１】
本発明の一態様によると、固体基材は有機材料である。好ましくは、有機材料は、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンとのコポリマー、またはそれらの混合物である。あるいは、固体支持体は無機材料であり、好ましくは、ヒドロゲル含有シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア、セラミックス、およびそれらの混合物から選択されるものである。
【００１２】
一実施形態においては、固体支持体が、共有結合的にコーティングされたシリル層によって改質され、これが次に架橋した多糖と共有結合する。この多糖は、好ましくは２つの多糖のコポリマーであり、その１つは１つ以上の架橋性基で置換されている。好ましくは、これと関連する多糖としては、デキストラン、ヒドロキシ−エチル−セルロース、デンプン、アミラーゼ、およびアガロースが挙げられ、最も好ましくはデキストランである。適切な架橋剤としては、ベンゾフェノン基が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１３】
本発明は、メルカプト含有部分、エーテル含有部分、またはアミノ含有部分を含む種々の結合基を使用して実施することができる。結合基中に使用すると適切な部分としては、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、アルキルオキシ基、芳香族基、アルキル芳香族基、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、結合基はメルカプトアルキル基である。
【００１４】
本発明の別の実施形態によると、固体基材が多環式基を含む。許容できる多環式基は、芳香族基と縮合している複素環式基または複素環式芳香族基である。好ましい芳香族基としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、またはアセナフチレニルが挙げられる。
【００１５】
ある実施形態においては、前述の複素環式基または複素環式芳香族基は、少なくとも１つの硫黄（Ｓ）原子を含むか、あるいは少なくとも１つの窒素（Ｎ）原子を含む。複素環式基または複素環式芳香族基は、少なくとも１つのＳ原子および１つのＮ原子を含むこともできる。本発明は、少なくとも２個、３個、または４個のＮ原子を含む複素環式基または複素環式芳香族基も更に考慮している。４個のＮ原子を有する好ましい複素環は式：
【化１】
2005539223.tif 000002
又は、
【化２】
2005539223.tif 000003
で表される。
【００１６】
ある実施形態においては、複素環式基または複素環式芳香族基は、芳香族基と縮合している５員環または６員環である。縮合環は、好ましくは式：
【化３】
2005539223.tif 000004
又は、
【化４】
2005539223.tif 000005
で表される。
【００１７】
これらの実施形態においては、結合基は、好ましくはアミノ含有部分またはメルカプト含有部分である。特に好ましいアミノ含有部分は式：
【化５】
2005539223.tif 000006
で表される。
【００１８】
特に好ましいメルカプト含有部分は式：
【化６】
2005539223.tif 000007
および
【化７】
2005539223.tif 000008
で表される。
【００１９】
本発明は、生物学的物質を試料から分離する方法を更に提供する。この方法は、前述の固体基材を、少なくとも１種類の生物学的物質を含有する液体試料と接触させるステップと、得られた上記固体基材を平衡緩衝液で洗浄するステップと、続いて生物学的物質が固体基材から脱着するように、ｐＨを調整するステップとを含む。好ましくは、この方法は、固定床、流動床、またはバッチ式のクロマトグラフィーと関連して実施される。本発明の一実施形態においては、この方法では、試料のｐＨが、生物学的物質が基材上に吸着される値まで調整される。好ましくは、このｐＨは約４〜約６である。更に別の実施形態においては、生物学的物質の脱着が起こるｐＨが約８〜約１１に調整される。好ましい実施形態では、試料のｐＨが約４〜約６に調整され、生物学的物質が脱着するｐＨは約８〜約１１である。
【００２０】
この方法は、タンパク質、ウイルス、核酸、炭水化物、および脂質を含む種々の生物学的物質に適用することができる。好ましくは、生物学的物質はタンパク質である。より好ましくは、タンパク質は、免疫グロブリン、ホルモン、凝固因子、サイトカイン、ペプチド、または酵素である。最も好ましいタンパク質は免疫グロブリンである。
【００２１】
本発明の更に別の態様は、固体基材の製造方法に関する。この方法は、固体支持体を、結合基の一部またはすべてを含む二官能性試薬と反応させるステップを含む。得られた生成物を次に、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基、またはホスホネート基で置換されている複素環式基、複素環式芳香族基、または芳香族基を含む試薬と反応させ、それによって、複素環式基、複素環式芳香族基、または芳香族基と結合基との間に結合を形成させる。二官能性試薬は、互いに独立に選択される少なくとも官能基を含み、これらとしては、ブロミド、ヨージド、エポキシド、カルボキシル、エステル、アルデヒド、ケトン、アミド、アルケン、シアノ、およびイミノが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明は更に、入口端および出口端を有する管状部材を含むクロマトグラフィーカラムを提供する。このカラムは、本発明の固体基材を更に含み、これは、管状部材内部にある第１の多孔質部材と第２の多孔質部材との間で管状内部に充填される。
【００２３】
一実施形態においては、カラムの体積が好ましくは約１マイクロリットルまたは１ミリリットル〜約５０００リットルの間である。より好ましくは、カラム体積は約１リットル〜１００リットルの間である。別の実施形態においては、このカラムは、液体試料が固体基材を通って上方に流れるようにするための１つ以上の流体制御装置を更に含む。更に別の実施形態においては、このカラムは、入口端と出口端との間に一連のステージを含む。
【００２４】
本発明の別の態様によると、本発明の固体基材がバイオチップの形態である。この場合、固体支持体は、金属、ケイ素、ガラス、または有機ポリマーであってよい。一実施形態においては、固体基材が質量分析計プローブである。別の実施形態においては、単環式基または多環式基がバイオチップと、複数のアドレス指定可能な位置で結合している。更に別の実施形態においては、固体基材の結合基が多糖を更に含む。
【００２５】
あるいは、本発明の固体支持体はチップである。この支持体は、架橋した多糖層と共有結合的に結合している、共有結合的に取り付けられた層を更に含むことができる。ある実施形態においては、この架橋した多糖は、第１の多糖と、１つ以上の架橋性基で置換されている第２の多糖とのコポリマーである。好ましい架橋性基はベンゾフェノン基である。多糖は、好ましくは、デキストラン、ヒドロキシ−エチル−セルロース、デンプン、アミラーゼ、およびアガロースから選択される。デキストランが最も好ましい多糖である。
【００２６】
別の実施形態においては、結合基が、単環式基または多環式基を固体基材と、チップ上の複数のアドレス指定可能な位置で結合させる。場合によっては、２つ以上の異なるアドレス指定可能な位置が、同じ結合基と単環式基または多環式基とを含む。この場合に好ましい固体支持体はアルミナまたはシリカである。
【００２７】
本発明は、前述の固体基材のアドレス指定可能な位置を、検体を含む試料と接触させ、それによって上記検体を上記固体基材に固定することによる、検体の検出方法も提供する。次に、固体基材を、レーザー脱離質量分析計のプローブインターフェイス内に導入して、アドレス指定可能な位置が質量分析計内のレーザービームと近接するようにする。固体基材のアドレス指定可能な位置に、検体を脱離させイオン化させるために十分な時間および出力においてレーザーを照射して、続いて質量分析計で検出する。検体は、前述のような生物学的物質である。
【好ましい実施形態の詳細な説明】
【００２８】
本発明は、種々の生物学的物質の分離および単離に使用するための効果的な吸着剤となる固体基材を提供する。本発明の固体基材は、例えば、カラムクロマトグラフィーなどの分取技術、およびバイオチップなどの分析装置に使用することができる。本明細書に記載される本発明の固体基材の利点の１つは、免疫グロブリンなどの生物学的物質に対する高い選択性および特異性であり、これに加えて、従来技術の基材では必要であった費用がかかり多くの場合有害である洗浄工程を回避できる。第２の利点は、本発明の固体基材が、生理学的なｐＨおよびイオン強度において生物学的試料を使用する場合に理想的であり、そのため従来技術において規定されるようなｐＨ調整およびリオトロピック塩の添加の必要性がないことである。第３の利点は、本発明の基材が高い処理能力を有することであり、製造に使用される試薬が低コストとなるという点で、特化された従来技術の吸着剤を使用するよりもはるかに経済的利益が得られる。
【００２９】
＜混合モードのリガンド＞
本発明の固体基材は、固体支持体と、その固体支持体に取り付けられたリガンドとを含む。このリガンドは、単環式基または多環式基であってよい環式基と、硫黄原子を場合により含む結合基とを含む。混合モード作用によって検体を引きつけるリガンドが、固体支持体に取り付けられる。
【００３０】
このリガンドは環式基を含み、この環式基は、固体支持体に結合し、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基、またはホスホネート基によって置換されている単環式基または多環式基であってよい。この単環式基または多環式基は、芳香族基であってよく、これは、本明細書による定義では、芳香族系となるために不飽和炭素−炭素結合のみを含有する環状炭化水素である。原則的にはあらゆる芳香族基を本発明に使用することができるが、適切な芳香族基は典型的には１、２、または３個の芳香環を含む。したがって、代表的な芳香族基は、フェニルおよびその誘導体、例えばトリルおよびキシリルである。二環式芳香族基は、縮合した個別の環を含み、例えばナフチルが挙げられるが、これに限定されるものではない。多環式芳香族基としては、アントラセニルおよびフェナントレニル、ならびに異なる大きさの縮合環を含有するアセナフチレニルなどの基が挙げられる。芳香族基が選択される場合、必ずしも必要であるわけではないが、その基が以下に述べるような複素環式基または複素環式芳香族基と縮合していることが好ましい。
【００３１】
「複素環」は、少なくとも１つのヘテロ原子を含有する飽和から部分的飽和の環である。同様に、「複素環式芳香族基」は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子によって置換されている芳香族基である。本発明において、ヘテロ原子は好ましくはＮ、Ｓ、またはＯである。複素環式基または複素環式芳香族基は５員環または６員環であることも好ましいが、その理由は、これらの基を含む試薬は商業的供給元から容易にかつ安価で入手できるからである。
【００３２】
後述の定義の結合基が二価の硫黄原子を含まない場合は、好ましくは、複素環式基または複素環式芳香族基が、固体基材の「チオフィリックな」性質を確立するまたは付与する基であり、したがって少なくとも１つのＳ原子を含有する基である。二価の硫黄原子を含む他の結合基を使用する場合、好ましくは複素環式基または複素環式芳香族基が、少なくとも１つのＮ原子、またはＳ原子とＮ原子との組み合わせを含む。
【００３３】
したがって、代表的な複素環式基または複素環式芳香族基としては、チアゾリン、チアゾリドン、イミダゾール、イミダゾリン、チアゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、イミダゾール、ピリジン、およびモルホリンが挙げられる。特に好ましい実施形態においては、前述したように、適当な複素環式基または複素環式芳香族基が芳香族基に縮合している。この場合、ベンズイミダゾールおよびベンゾチアゾールが容易に入手可能な候補であり、優れた固体基材が得られる。
【００３４】
前述したように、単環式基または多環式基は、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基、またはホスホネート基で置換されている。これらの基は、広いｐＨ範囲内、例えば約２〜約１２の範囲内で荷電部分として存在するために十分酸性である。この場合、本発明の固体支持体は、生理的イオン強度およびｐＨにおいて免疫グロブリンなどの生物学的物質を吸着するために理想的となる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「置換された」とは、サルフェート基、スルホネート基、ホスフェート基、またはホスホネート基が単環式基または多環式基に、直接または間接的に結合していることを意味する。間接的な結合は、Ｃ１〜６直鎖または分岐のアルキレン基であるスペーサー基を介して行うことができる。場合によりこのアルキレン基は、限定するものではないが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、および−ＯＣ（Ｏ）−などの１つ以上の二価部分によって中断される。したがって、代表的なスペーサー基としては、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、および−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ２−が挙げられる。
【００３６】
単環式基または多環式基は、メルカプト含有部分、エーテル含有部分、またはアミノ含有部分を含む結合基によって本発明の固体支持体と結合する。後述の構造的考察を行うと、好ましくは結合基が疎水性であり、それによって、生物学的物質の結合が静電相互作用および疎水性相互作用の両方によって起こるｐＨにおいて、固体支持体が疎水性となる。疎水性部分としては、直鎖および分岐のＣ１〜６アルキレン基、Ｃ２〜６アルケニレン基、Ｃ２〜６アルキニレン基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に有用な部分はエチレンおよびプロピレンである。他の疎水性部分は、前述したようなフェナントレンなどを形成する芳香族基を含む。したがって、上記部分が、少なくとも１つのメルカプト部分、エーテル部分、またはアミノ部分で中断またはキャップされる。単環式基または多環式基が硫黄原子を含まない実施形態においては、結合基は、好ましくはメルカプト部分を含む。この点に関して、結合基によって、疎水性のおよびチオフィリックな性質が、固体基材に付与される。好ましいメルカプト含有結合基の１つは式：
【化８】
2005539223.tif 000009
で表される。
【００３７】
結合基の疎水性は、ヒドロキシル、ハライド、またはニトロなどの極性置換基の導入によって；公知の方法によりメルカプト部分を酸化することによって；エーテル部分またはアミノ部分の結合基への導入によって；またはそれらの組み合わせによって、容易に調整することができる。したがって、容易に利用できるこのようなメルカプト含有結合基の１つは式：
【化９】
2005539223.tif 000010
によって表される。
【００３８】
代表的なアミノ含有結合基は、式：
【化１０】
2005539223.tif 000011
によって表される。
【００３９】
好ましくは、アミノ含有結合基で構成される固体基材、または酸化されたメルカプト部分を含有する固体基材も、少なくとも１つのＳ原子を含む単環式基または多環式基を含む。この点に関して、固体基材は、ある程度チオフィリックな性質を有することができる。
【００４０】
別の好ましい実施形態においては、結合基自体が、ヒドロキシ−エチル−セルロース、デンプン、アミロース、またはアガロースなどの多糖を含む。この場合、好ましい多糖はデキストランである。したがって、本発明の固体支持体は多糖で改質され、これを後述の結合基で誘導体化することができる。
【００４１】
これらを特定の理論によって限定しようとするものではないが、本発明者らは、本発明の固体基材が、固体基材と生物学的物質との間の相互作用の「混合モード」によって機能すると考えている。前述の単環式基および多環式基は４未満のｐＫを有し、したがって、前述のような使用ｐＨ範囲内では負の電荷を有する。免疫グロブリンなどの生物学的物質を、固体基材と、約ｐＨ４〜ｐＨ６の間で接触させると、このｐＨ範囲では生物学的物質が正または中性の正味電荷を有する。このｐＨ範囲においては、単環式基または多環式基との１つ以上の種類の相互作用を介して、生物学的物質が固体基材と結合する。このような相互作用としては、クーロン引力および弱い疎水性会合が挙げられる。ｐＨが約８を超えるまで増加すると、生物学的物質は負の正味電荷を有するようになり、そのため負電荷を有する固体基材と負電荷を有する生物学的物質との間で静電反発力が生じる。その結果、生物学的物質は、静電反発力によって固体基材から離れ、続いてこれを単離することができる。これらのイオン反発力は、前述のより弱い引力よりも強いと考えられる。
【００４２】
＜固体基材＞
本発明は、混合モードリガンドが取り付けられている固体支持体を考慮している。２つの異なる形式が特に考慮される。１つの形式においては、固体支持体は、クロマトグラフィー媒体、すなわちビーズまたは粒子に典型的に使用される形態である。これらのビーズまたは粒子は、混合モードリガンドで誘導体化されている。これらのビーズまたは粒子は、カラムの充填に使用することができるクロマトグラフィー媒体を形成する。もう１つの形式においては、固体支持体はチップの形態をとり、すなわち、固体支持体はほぼ平面状の表面を有し、これに混合モードリガンドを共有結合的またはその他の方法で取り付けることができる。検出装置のプローブインターフェイスに係合するように適合させたチップも「プローブ」と呼ぶ。
【００４３】
＜ビーズおよび粒子＞
本発明の教示によると、本発明の固体基材は第１に、有機材料を含むことができる固体支持体を含む。代表的な有機材料は、セルロース、デンプン、寒天、アガロース、およびデキストランなどの多糖である。置換または未置換のポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレン、ポリスルホン、ならびにコポリマーまたはスチレンおよびジビニルベンゼンなどの親水性合成ポリマーが考慮される。あるいは、無機材料を固体支持体材料として使用することができる。そのような無機材料としては、シリカなどの多孔質無機材料；ヒドロゲル含有シリカ、ジルコニア、チタニア、アルミナ；およびその他のセラミック材料が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの材料の混合物を使用することもできるし、あるいは、米国特許第５，２６８，０９７号明細書、第５，２３４，９９１号明細書、および第５，０７５，３７１号明細書に開示されるような２つの材料の共重合または相互侵入網目によって形成される複合材料を使用することもできる。
【００４４】
本発明の固体支持体は、直径が約０．１ｍｍ〜約１０００ｍｍのビーズまたは不規則な粒子の形態であってよい。あるいは、本発明の固体支持体は、繊維、膜、またはミクロンから数ミリメートルの寸法の孔が全体に広がるスポンジ状材料にすることができる。
【００４５】
前述の単環式基または多環式基は、固体支持体と結合基との間、ならびに結合基と単環式基または多環式基との間に共有結合を形成することによって、固体支持体上に化学的に固定される。典型的なシナリオにおいては、先ず、固体支持体を、結合基の一部またはすべてを構成する反応性基を固体支持体上に導入する機能を果たす二官能性試薬で処理する。セルロース、ヒドロゲルを含有する複合材料、またはヒドロキシル基が存在する他の材料などの一部の固体支持体の場合、例えば二官能性試薬との反応の前に、ヒドロキシル基を水酸化物源で脱プロトン化すると好都合であることが多い。二官能性試薬は、固体支持体と、単環式基または多環式基を含む試薬との両方と反応することができる。同じまたは異なる官能基を含む代表的な二官能性試薬としては、エピクロルヒドリン（ｅｐｉｃｈｌｏｒｈｙｄｒｉｎ）、エピブロムヒドリン（ｅｐｉｂｒｏｍｈｙｄｒｉｎ）、ジブロモ−およびジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテル、および臭化アリルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
官能化された後に、固体支持体を１種類以上の溶媒で広範囲にわたって洗浄することで、未反応の二官能性試薬、反応副生成物、または両方を除去する。この場合に使用される典型的な溶媒は水である。
【００４７】
続いて、単環式基または多環式基の導入を、メルカプト基、ヒドロキシル基、またはアミノ基で置換されたこのような基を含む試薬によって行う。このような試薬を、前述のように官能化された固体支持体に存在する官能基と反応させる。
【００４８】
二官能性試薬と、単環式または多環式の試薬との特定の組は、公知の化学的性質によって得られる。例えば、エポキシドで官能化させた固体支持体を、メルカプト含有、ヒドロキシ含有、またはアミノ含有試薬と反応させて、エチレン含有結合基を有する基材を得ることができる。例えば、臭化アリルで改質したその他の固体支持体は、メルカプト含有試薬と直接反応させることができるアルケン基を有する。あるいは、アルケン基を更に臭素化して、適切な反応性ブロモ誘導体を得ることができる。
【００４９】
固定化された単環式基または多環式基の濃度は、固体支持体の製造に使用される二官能性試薬の濃度に依存して、固体支持体１ミリリットル当たり数分の１マイクロモルから数百マイクロモルの間で変動させることができる。固定化された基が低濃度であると、典型的には固体基材の分離能力が低くなり、一方、高濃度であれば、一般に能力が向上する。
【００５０】
＜バイオチップ＞
好ましい実施形態は、前述したように「バイオチップ」またはマイクロアレイ形式で固体基材を有し、この基材はほぼ平面状の表面を有し、これに、この場合では結合基と単環式基または多環式基との組み合わせである捕捉試薬が取り付けられている。したがって、バイオチップには、画定された領域または部位、より典型的には画定された複数の領域または部位の集まりが存在し、この上で検体を選択的に捕捉することができる。捕捉後、検体は、より詳細に後述する種々の技術によって検出することができ、更に場合によっては特徴付けることができる。
【００５１】
例えば、固体支持体は、金属、例えば金、アルミニウム、鉄、チタン、クロム、白金、銅、およびそれらのそれぞれの合金を含むことができる。このような金属は、それらの表面上を、例えば二酸化ケイ素で誘導体化して、結合のための反応基を付与することができる。金属表面を誘導体化する方法の１つは、酸化ケイ素などの金属酸化物を金属表面上にスパッタすることである。あるいは、固体支持体は、ケイ素、ガラス、またはプラスチックなどの有機ポリマーを含むことができる。ある実施形態においては、固体支持体は透明であってよい。
【００５２】
本発明の基本的な固体基材は、固体支持体を含み、これに捕捉層が直接または間接のいずれかで結合される。捕捉層は、化学的部分を固体支持体に結合させる個々の結合基を含む。結合基および化学的部分の化学的性質を組み合わせることで、後で詳述するが、ある条件下で生物学的物質が選択的に引き寄せられる。本発明の基材は、固体支持体以外に、捕捉層を間接的に固体支持体と結合させる中間層を含むことができる。
【００５３】
本発明のある実施形態によると、固体支持体は、シリルコーティングおよび架橋した多糖コーティングで順次改質される。シリルコーティングは、固体支持体表面に共有結合的に取り付けられる。例えば、同時係属中の米国特許出願第１０／４１２，７６９号明細書に開示されている、このコーティングは、固体支持体上に、固体支持体表面と反応することができる１種類以上のシラン（通常は、メトキシまたはエトキシなどのポリアルキルオキシシラン）を付着させることで得られる。この場合、適切なシランとしては、（３−アクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、（３−アクリロキシプロピル）メチルジメトキシシラン、（３−アクリロキシプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３−アクリロキシプロピル）トリクロロシラン、（３−アクリロキシプロピル）メチルジクロロシラン、（３−アクリロキシプロピル）ジメチルクロロシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリクロロシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジクロロシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルクロロシラン、ビニルトリクロロシラン、ビニルトリメトキシシラン、アリルクロロメチルジメチルシラン、アリルクロロジメチルシラン、アリルブロモジメチルシラン、アリルジクロロメチルシラン、アリルジイソプロピルアミノジメチルシラン、アリルオキシ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラン、アリルトリメトキシシラン、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
したがって、この実施形態のシリル化された固体支持体は、次に、架橋した多糖を含む層を共有結合で取り付けることができる。架橋した多糖は、第１の多糖と、架橋性基で置換されている第２の多糖とのコポリマーとして見ることができる。したがって、活性化させると架橋性基によって、多糖自体が架橋するだけでなく、多糖をシリル化された固体支持体に共有結合的に取り付けられる。
【００５５】
この場合、適切な第２の多糖は、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−メタクリルアミド、ジアリル酒石酸ジアミド、または４−カルボキシル−ベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類で置換されている多糖である。架橋剤は、ビス−エポキシド架橋剤、例えばブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＧＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＤＧＥ）、またはポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＧＥ）であってよい。したがって、活性化は、化学的手段（例えば重合）、あるいはＵＶ光または近ＵＶ光の照射などの光化学的手段によって行うことができる。後者の活性化手段は、ベンゾフェノン類などの感光性架橋性基で置換されている多糖コーティングの場合に特に有用である。
【００５６】
特に、本発明のバイオチップの表面上の部位の配置は、好ましくは、より高い処理量および速度が得られるように、同時に複数の部位に呼び掛け（インタロゲイション）可能である。したがってバイオチップを使用することは、それぞれが異なるクロマトグラフィーカラムを使用する複数のクロマトグラフィー実験を同時に実施することと実質的に同等であるが、本発明のバイオチップは１つのシステムのみを必要とするという利点を有する。
【００５７】
したがって、好ましくは、本発明のバイオチップは複数のアドレス指定可能な位置を含み、そのような位置のそれぞれに結合基と単環式基または多環式基との独特の組み合わせが結合している。このバイオチップは、１つのアドレス指定可能な位置、または１０、１００、１０００、１０，０００またはそれを超える数のアドレス指定可能な位置を組み込むことができ、これらはレーザーなどの衝突させるエネルギー源と同じ大きさであることのみが必要となる。これに関して、「アドレス指定可能な」とは、例えばエネルギー源によって、適切なアドレス指定方式またはアルゴリズムを使用して位置を特定できる、固体基材上の位置を意味する。したがって、アドレス指定可能な位置または位置のサブセットのそれぞれは、生物学的物質と優先的に結合することができ、バイオチップ上の画定された位置において捕捉が行われるために、結合の位置を特定することができる。
【００５８】
アドレス指定可能な位置は、あらゆるパターンで配置することができるが、好ましくは線または直交する配列、更には円などの曲線などの規則的なパターンとなる。アドレス指定可能な位置の円形の配列は、ディスク型バイオチップにおいて特に有用となる。このように配列されると、アドレス指定可能な位置によって、固体基材上で結合能力に既知の勾配を生じさせることができる。特に好ましい実施形態においては、バイオチップの形態である本発明の固体基材は、質量分析計などの検出機器中に使用するためのプローブとなり、これによって、既知および未知の生物学的検体の捕捉および同定のための強力な分析器具が得られる。代表的なプローブは米国特許第６，２２５，０４７号明細書に記載されており、この記載内容を本明細書に引用して援用する。例えば、質量分析計プローブ（「ＭＳプローブ」）とは、イオン化源、例えばレーザー脱離／イオン化源と呼び掛け可能な関係の位置で係合し、大気圧または減圧下において好ましいレーザー脱離／イオン化飛行時間分光計の検出器と同時に連絡している場合に、検体から得られたイオンを分光計中に導入するために使用することができる装置を意味する。好ましいレーザー源としては、窒素レーザー、Ｎｄ−Ｙａｇレーザー、およびその他のパルスレーザー源が挙げられる。したがって、典型的には、ＭＳプローブには、イオン化源と連絡可能な関係となり検出器と連絡するようにＭＳプローブを配置するプローブインターフェイスを、可逆的に係合させることができる（例えば着脱自在に挿入できる）。
【００５９】
ある実施形態では、バイオチップの固体支持体が最初にシリルおよび架橋した多糖層で改質される。これらの場合において、化学蒸着を使用してシラン層を付着させることなどによって、前述の１種類以上のシランを固体支持体と反応させることが好ましい。架橋した多糖層の取り付けは、２つの主要な方法のいずれかによって行うことができる。典型的な方法では、未改質固体支持体を有する固体基材の一般的製造方法において前述したように、第１の多糖を、複数のヒドロキシル基において、結合基とおよび単環式基または多環式基とで誘導体化する。続いて、従来の有機化学を利用して、第２の多糖を架橋性基で置換する。好ましい架橋性基は４−カルボキシル−ベンゾフェノンである。次に、第１および第２の多糖をシリル化された固体支持体と接触させ、多糖とシリル化された固体支持体との間の架橋を開始させる化学的または光化学的条件にさらす。
【００６０】
別の方法においては、架橋性基で置換されている多糖を、場合によっては未置換の多糖とともに、同様に、架橋させて、シリル化された固体支持体に取り付ける。得られる架橋した多糖層には、結合基と単環式基または多環式基とで誘導体化されているヒドロキシル基が形成される。
【００６１】
＜生物学的物質の分離方法＞
本発明の固体基材は、タンパク質、ウイルス、核酸、炭水化物、および脂質などの種々の生物学的物質の分離および単離に使用することができる。典型的には生物学的物質は、限定するものではないが、液体試料、例えば唾液、血液、尿、リンパ液、前立腺液、精液、乳、乳清、器官抽出物、植物抽出物、細胞抽出物、細胞培地、発酵ブロス、血清、腹水、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物の抽出物などの供給源から誘導されるか、それらの中に含まれるかである。
【００６２】
この場合、生物学的物質の特に好ましい種類は免疫グロブリンである。「免疫グロブリン」の分類は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む免疫グロブリン全体、ならびにそれらのＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、およびＦｖフラグメントを含んでいる。
【００６３】
１種類以上の生物学的物質を含有する液体試料を、本発明の固体基材と、少なくとも１種類の生物学的物質を固体基材と結合させるのに十分な時間接触させる。典型的には、接触時間は約３０秒〜約１２時間の間である。
【００６４】
本発明の利点の１つは、試料を固体基材と接触させる前に、液体試料のｐＨ、イオン強度、または両方を調整する必要がないことである。更に、試料を濃縮したり、希釈したり、または塩などの添加物と混合したりする必要がない。乳清などの多くの液体試料は、すでに弱酸性（例えばｐＨ５〜５．５）であり、この場合、本発明の固体基材のサルフェート基、スルホネート基、ホスホネート基、またはホスフェート基は電荷を有し、したがって、ある種のタンパク質の吸着が促進される状態となる。したがって、液体試料を本発明の固体基材上に直接投入することが可能である。しかし、他の液体試料のｐＨは、必要であれば約ｐＨ４〜約６の範囲に調整することができる。
【００６５】
液体試料を固体基材と接触させる温度は、試料と所定の固体基材との間で変動する。好ましくは、この温度は周囲温度であるが、変化させることができる。
【００６６】
試料を固体基材と接触させた後、固体基材を平衡緩衝液で洗浄する。本明細書で定義される限りでは、平衡緩衝液は、好ましくは、液体試料が固体支持体と接触したｐＨの緩衝液である。更に、平衡緩衝液は、基材に吸着しないあらゆる物質を固体支持体から洗い流す。適切な平衡緩衝液としては、酢酸緩衝液およびリン酸緩衝食塩水が挙げられる。洗浄は、固体基材と結合した生物学的物質とを平衡緩衝液中に入れる、浸す、または浸漬することによって行うことができる。あるいは、平衡緩衝液を固体基材上ですすぐ、噴霧する、または洗浄することができる。
【００６７】
望ましい生物学的物質は典型的には、固体基材に吸着する物質である。しかし、本発明は、対象となる生物学的物質が平衡緩衝液による洗浄で除去される場合も考慮している。この場合この物質は、通常の方法によって緩衝液から単離することができる。
【００６８】
固体基材に吸着している生物学的物質は、物質を脱着することができる値にｐＨを調整することによって脱着される。脱着が起こるｐＨは物質によって変動するが、このｐＨは好ましくは約８〜約１１の範囲である。この場合、本発明の脱着方法は、低従来技術の方法が実施される低いｐＨにおいて分解するタンパク質の場合に特に使用することができる。ｐＨは、あらゆる通常入手可能な試薬、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液または炭酸緩衝液によって調整することができる。続いて、脱着した生物学的物質が回収される。本発明の方法によって精製された抗体などの生物学的物質の典型的な純度は約７０％〜約９９％であり、好ましくは８５％〜約９９％であり、最も好ましくは約９０％〜約９９％である。
【００６９】
前述の分離方法は、固定床、流動床、およびバッチ式のクロマトグラフィーを使用する分取方法などの種々の技術で使用するために適合させることができる。あるいはこの方法は、装置体積が数マイクロリットルと少なくなりうるスピンカラムまたはマルチウェルプレート方式などの小型装置を使用する高処理量分離技術と関連させて実施することができる。
【００７０】
前述の技術は、生物学的物質を含有する溶液を本発明の固体基材と接触させるステップと、それによって溶液中の少なくとも１種類の生物学的物質を固体基材に選択的に吸着させるステップとを含む。所望の生物学的物質が樹脂に固定される場合は、後者の溶離によって、物質を分離し、精製および濃縮された形態で回収することができる。所望の生物学的物質が処理された溶液中に残留する場合は（他の生物学的物質が固体基材に固定される）、溶離液を回収することによって所望の分離が直接行われる。
【００７１】
バッチ式の吸着／分離を使用する場合、本発明の固体基材を生物学的物質の溶液に直接加え、この固体基材／生物学的物質の混合物を、生物学的物質が固体基材に結合するのに十分な時間のあいだ穏やかに撹拌する。次に、吸着した生物学的物質を有する固体基材を遠心分離または濾過によって取り出し、続いて分離ステップにおいて生物学的物質を固体基材から溶出させることができる。
【００７２】
あるいは、カラムクロマトグラフィーを使用することができる。固定床カラムクロマトグラフィーにおいては、本発明の固体基材をカラム内に充填し、分離すべき生物学的物質を含有する溶液を、生物学的物質が固体基材に結合する速度で吸着剤を介して注ぐことによって固体基材に加える。
【００７３】
固定床クロマトグラフィーの利点としては、カラム体積および水の消費が最小となることが挙げられる。カラムクロマトグラフィー方法の欠点は、カラムを通過する液体の流速が遅く、そのため時間を消費することである。この流速は、カラムに加えられる材料が粒子を含む場合更に遅くなることがあり、その理由はこのような粒子材料が固体基材をある程度「詰まらせる」ことがあるからである。
【００７４】
流動床カラムクロマトグラフィーにおいては、上昇する濾過流と、この上昇力に対して平衡を維持するために大型／高密度の粒子とが用いられる。別のカラムの上部に配置され１〜５の間のステージで構成される実質的に垂直のカラムが使用され、ステージに連続的に溶液が流され、上部ステージの上部のオーバーフローによって溶液が除去される。好ましくは、このカラムは３つのステージを有する。最上部のステージを除いた各ステージは、２つの分配システムによって分離され、その一方は、対象となるステージの底部に置いて溶液を分配し、他方はすぐ上にあるステージに向けて溶液を分配する。
【００７５】
流動床の利点は、固定床クロマトグラフィーと比較すると、より低い圧力で流速がより速いことである。より速い流速によってクロマトグラフィー分離におけるある種の利点が得られるが、この方法はいくつかの欠点を有する。この方法は、高い上昇液体速度においてのみ展開する大きな直径および／または高密度のいずれかの樹脂が必要である。大きな直径の樹脂は、使用される小さな樹脂よりも単位体積当たりの表面が小さく、これに対応して表面結合能力も低くなる。このため、ビーズ樹脂が高密度である必要がある場合には、小さなビーズの樹脂が好ましい。
【００７６】
一方、流動床クロマトグラフィーでは、詰まり、洗浄の必要性、圧縮および洗浄によって誘導される樹脂の劣化などの固定床の重大な欠点の多くが回避される。実際、流動床では、詰まりの危険性なしに溶液中の固体不純物が自由に通過することができ、あまり厳格な洗浄を必要としないため樹脂の寿命が大きく延長される。しかし、生物学的物質用のクロマトグラフィーの吸着剤は、一般に、水に非常に近い密度を有し、粒度分布においては小さすぎ、流動床クロマトグラフィーには適していない。このため、粒子を流束中に引き込まずに流動化することは不可能である。生物学的物質の流動床クロマトグラフィーの別の問題は、ビーズ間の大きな空間に関するものであり、これによって効率が低下する。
【００７７】
これらの要因を考慮すると、バッチ式および固定床のクロマトグラフィーは、生物学的物質の従来の分離技術において選択されている方法である。一方、本発明の固体基材は、バッチ式、固定床、または流動床のクロマトグラフィーにおいて使用することができる。
【００７８】
したがって、好ましい実施形態においては、本発明は、本明細書に記載の固体基材が充填された管状部材であるクロマトグラフィーカラムを提供する。この管状部材は、ガラス、プラスチック、または金属などのあらゆる適切な材料でできていてよい。充填された固体基材は、各端部において多孔質部材が接しており、これによって基材が管状部材内部に固定される。
【００７９】
ある実施形態においては、溶離液が重力流でカラムを通過すれば十分である。別の実施形態においては、カラムは、溶離液がカラムを通過して上方に流れるようにするための１つ以上の流体移動装置を含むことができる。このような装置としては、ポンプ、注射器、およびクロマトグラフィー装置と関連して典型的に使用されている他のあらゆる装置が挙げられる。
【００８０】
本発明のクロマトグラフィーカラムは、あらゆる体積にすることができる。例えば、実験室規模における分離では、約１ミリリットル、更には約１マイクロリットルの小さなカラム体積で品質を保証することができる。生物学的物質の大規模な精製および単離は、５０００リットルまでの大きさのカラムで実施することができる。より典型的な体積は１リットル〜１００リットルの間である。本発明のカラムは、概形が環状であるが、その他の長さまたは直径においては特に限定されない。カラムが使用される状況に依存するが、カラム直径は約０．５ｍｍ〜約１０００ｍｍの間で変動させることができる。更に、カラム長さは約５０ｍｍ〜約１０００ｍｍの間で変動させることができる。したがって、本発明は、種々の寸法および対応する体積のカラムを考慮している。
【００８１】
本発明のカラムは、異なる不純物を試料から除去するために有効となる他の固体基材を含むカラムと直列で使用することができる。したがって、本発明のカラムの利点は、他のカラムすなわち従来のカラムの性質と相補的であるとみなすことができる。この場合、このようなカラムの直列配列は、溶離液および平衡緩衝液が節約され、そのため追加の試料操作および調製が不要となる。
【００８２】
＜検体の検出方法＞
したがって、本発明は、検体の検出に好適な方法を提供する。前述の本発明のバイオチップのアドレス指定可能な位置を、少なくとも１種類の検体を含有する試料と接触させる。検体は、本明細書に記載されるような生物学的物質であり、アドレス指定可能な位置に吸着される（すなわちこの位置で捕捉される）。したがって本発明の方法は、１つの試料に含まれる複数の検体の検出に対応しており、各検体はバイオチップ上の固有の位置に結合する。
【００８３】
次に、バイオチップを、好ましくは、前述の溶離液で洗浄して未結合の材料を除去する。この場合、固体基材の小さな直径のスポットへの溶離液の導入は、マイクロフルーイディックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）法によって最も首尾良く実施される。
【００８４】
バイオチップに結合して残留する検体の検出は、種々の方法によって実施することができる。このようなものとしては、顕微鏡法およびその他の光学的技術、質量分析、ならびに電気的技術が挙げられる。光に基づく検出パラメーターとしては、例えば、吸光度、反射率、透過率、複屈折、屈折率、および回折測定技術が挙げられる。
【００８５】
標識された検体の蛍光検出が特に一般的である。蛍光が関与する方法としては、直接的および間接的な蛍光測定が挙げられる。具体的な方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチアッセイなどの免疫学的方法における蛍光標識付けが挙げられる。
【００８６】
その他の有用な技術としては、例えば、表面プラズモン共鳴、楕円偏光法、共振ミラー法、グレーティング結合導波路法、多極共鳴分光法、インピーダンス測定検出、化学発光検出、および導電率／還元−酸化方法が挙げられる。直接分析のための検体のバイオチップからの脱離および／またはイオン化方法は当技術分野においてよく知られており、例えば米国特許第６，２２５，０４７号明細書に記載されている。
【００８７】
特に好ましい分析方法は、表面増強レーザー脱着／イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）であり、これは例えば、米国特許第５，７１９，０６０号明細書および第６，２５５，０４７号明細書に記載されている。ＳＥＬＤＩにおいては、バイオチップ上のアドレス指定可能な位置をレーザーなどのエネルギー源に曝露することで、アドレス指定可能な位置において結合した検体の脱離およびイオン化が起こる。次に、イオン化した検体は飛行時間（「ＴＯＦ」）質量分析計で直接検出され、例えば、それによって脱離下検体の質量電荷比が求められる。レーザーと位置合わせするために、プローブインターフェイス内部のバイオチップを繰り返し移動および配置することによって、バイオチップ上の各アドレス指定可能な位置を同様に分析することができる。
【００８８】
更に、イオン移動度分光計を使用して試料を分析することができる。イオン移動度分光法の原理は、イオンの異なる移動度に基づいている。特にイオン化によって生成した試料のイオンは、例えば質量、電荷、または形状が異なるため、電界の影響下にある管を異なる速度で通過する。典型的には電流の形態であるイオンが検出器において記録され、次にこれを使用して試料が同定される。イオン移動度分光法の利点の１つは、大気圧で操作が可能なことである。
【００８９】
更に、全イオン電流測定装置を使用して試料を分析することができる。この装置は、１種類のみの検体を結合させることができる表面化学的性質をプローブが有する場合に使用することができる。１種類の検体がプローブ上に結合すると、イオン化した検体から発生する全電流が検体の性質を反映する。次に、検体からの全イオン電流を、蓄積されている既知化合物の全イオン電流と比較することができる。したがって、プローブ上に結合した検体の同一性を決定することができる。
【００９０】
本発明のバイオチップおよび分析方法の利点の１つは、検体の結合および検出が、ピコモル量更にはアトモル量の検体において有効となることである。本発明の教示によると、例えばバイオマーカーと呼ばれるあるサブクラスの生物学的物質を発見することも可能である。この場合、バイオマーカーは、有機の生物学的物質であり、特にポリペプチドまたはタンパク質であり、これは、健康な被験者から採取した試料と比較して、罹患した被験者から採取した試料中に差別的に存在する。バイオマーカーが、健康な被験者から採取した試料中に存在する量と比較して増加した量または減少した量で存在する場合に、バイオマーカーが、罹患した被験者から採取した試料中に差別的に存在することになる。特にバイオチップの形態である本発明の固体基材によって、バイオマーカーの迅速な発見および同定が可能となる。
【００９１】
以下の実施例は本発明を説明するために提供される。しかし、本発明は、これらの実施例に記載される特定の条件または詳細に限定されない。特許を含めた公的に入手可能な文書に対するすべての言及は、それらの記載内容全体を本願に引用して援用する。
【００９２】
（実施例１）：メルカプト−ベンズイミダゾールスルホン酸（「ＭＢＩＳＡ」）のセルロースビーズ上への固定
この実施例の目的は、メルカプト−アルキル結合基で構成される固体基材の作製を説明することである。
【００９３】
ウェットセルロースビーズ（１００ｇ）を、塩および保存剤の除去のために広範囲にわたって水で洗浄した。これらのビーズを、１００ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液、および激しく振盪しながら１０ｇの臭化アリルで連続して処理した。確実に反応を完了させるため、この混合物を室温で終夜撹拌した。次に、この誘導体化されたビーズを広範囲にわたって水で洗浄して、余分の試薬および副生成物を除去した。
【００９４】
このアリル−セルロース誘導体を、１００ｍｌの脱イオン水、５ｇのＮ−ブロモスクシンイミド、および８．３ｇの臭化カリウムで処理した。これによって得られた懸濁液を撹拌し、続いてリン酸で処理してｐＨを３．８〜４．０に調整した。この混合物を室温で１時間更に撹拌し、続いて水で洗浄した。
【００９５】
結果として得られたセルロースビーズの臭素化誘導体に、ｐＨ１０（水酸化ナトリウムの添加によって）の８０ｍｌの水中に溶解した２．７ｇのＭＢＩＳＡを加えた。この懸濁液を室温で１６時間撹拌した後、過剰の試薬および副生成物がなくなるまで広範囲にわたって水で洗浄して、所望の固体基材を得た。
【００９６】
（実施例２）：混合メルカプトおよびエーテル含有リンカーを介したセルロースビーズ上へのＭＢＩＳＡの固定
この実施例の目的は、メルカプトおよびエーテルを含有する結合基で構成される固体基材の作製を説明することである。
【００９７】
セルロースビーズ（１００ｇ）を実施例１と同様に洗浄した。このビーズを、振盪しながら、４０ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、２５ｍｌのエタノール、および２０ｇのアリルグリシジル−エーテルで連続して処理した。確実に反応を完了させるため、この混合物を室温で終夜撹拌した。次に、この誘導体化されたビーズを広範囲にわたって水で洗浄して、余分の試薬および副生成物を除去した。
【００９８】
実施例１の手順に従って、臭素化し、その後ＭＢＩＳＡで処理することによって、所望の生成物を得た。
【００９９】
（実施例３）：酸化ジルコニウム複合ビーズ上へのメルカプト−ベンズイミダゾールスルホン酸（ＭＢＩＳＡ）の固定
この実施例は、複合固体支持体材料で構成される固体基材の作製を説明する。
【０１００】
孔隙内部に５％アガロースのヒドロゲルを含有するウェット多孔質酸化ジルコニウムビーズの複合樹脂（１００ｇ）を、広範囲にわたって水で洗浄した。次に、これらのビーズを５０ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液、および激しく振盪しながら５ｇの臭化アリルで連続して処理した。確実に反応を完了させるため、この混合物を室温で終夜撹拌した。次に、この誘導体化されたビーズを広範囲にわたって水で洗浄して、余分の試薬および副生成物を除去した。
【０１０１】
次にこのアリル−セルロース誘導体を、２ｇのＮ−ブロモスクシンイミドおよび４ｇの臭化カリウムの５０ｍｌの脱塩水溶液で処理した。撹拌しながら、この懸濁液を０．５ｇの８５％リン酸で更に処理した。この混合物を室温で１時間撹拌した後、水で洗浄した。
【０１０２】
この結果得られた臭素化誘導体を、４ｇのＭＢＩＳＡのｐＨ１０（水酸化ナトリウムの添加によって）の水溶液８０ｍｌで処理した。
【０１０３】
所望の固体基材の懸濁液を室温で５時間撹拌した後、余分の試薬および副生成物がなくなるまで広範囲にわたって１Ｍ水酸化ナトリウムおよび水で洗浄した。
【０１０４】
（実施例４）：セルロースビーズ上へのアミノ−ベンズイミダゾールスルホン酸（ＡＢＩＳＡ）の固定
この実施例の目的は、アミノ含有結合基で構成される固体基材の作製を説明することである。
【０１０５】
ウェットセルロースビーズ（１００ｇ）を、塩および保存剤の除去のために広範囲にわたって水で洗浄した。これらのビーズを、１００ｍｌの０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液、および激しく振盪しながら１０ｇのジビニルスルホンで連続して処理した。確実に反応を完了させるため、この混合物を室温で終夜撹拌した。次に、この誘導体化されたビーズを広範囲にわたって水で洗浄して、余分の試薬および副生成物を除去した。
【０１０６】
このビニルスルホン−セルロース誘導体を次に、３ｇのＡＢＩＳＡを含有する１００ｍｌの０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（水酸化ナトリウムの添加によってｐＨを少なくとも１０に維持した）で処理した。この懸濁液を室温で１６時間撹拌した後、広範囲にわたって水で洗浄して、余分の試薬および副生成物を除去し、それによって所望の固体基材を得た。
【０１０７】
（実施例５）：セルロースビーズ上へのアミノ−ベンゾチアゾールスルホン酸（ＡＢＴＳＡ）の固定
この実施例の目的は、アミノ含有結合基および硫黄含有多環式複素環で構成される固体基材の作製を説明することである。
【０１０８】
実施例４に記載の手順に従ってビニルスルホン−セルロースビーズを調製することができ、次にこれを１００ｍｌの０．１Ｍ水酸化ナトリウム中の３ｇのＡＢＴＳＡで処理することができる。実施例４と同じ後処理を行うことによって、所望の固体支持体が得られる。
【０１０９】
（実施例６）：セルロースビーズ上へのリン酸モノ−｛２−［２−（５−メルカプト−テトラゾール−１−イル）−アセチルアミノ］−エチル｝エステルの固定
この実施例の目的は、４個のＮ原子を含有し、更に間接的に結合したホスフェート基を有する複素環で構成される固体基材の作製を説明することである。
【０１１０】
リン酸モノ−｛２−［２−（５−メルカプト−テトラゾール−１−イル）−アセチルアミノ］−エチル｝エステルは、５−メルカプト−１−テトラゾール酢酸とＯ−ホスホ−エタノールアミンとの間の反応から得ることができる。この生成物は、臭化アリルを使用する実施例１、またはアリルグリシジル−エーテルを使用する実施例２と類似の方法で、セルロースビーズに結合させることができる。
【０１１１】
（実施例７）：セルロースビーズ上への２−［２−（５−メルカプト−テトラゾール−１−イル）−アセチルアミノ］−エタンスルホン酸の固定
この実施例の目的は、４個のＮ原子を含有し、更に間接的に結合したスルホン酸基を有する複素環で構成される固体基材の作製を説明することである。
【０１１２】
２−［２−（５−メルカプト−テトラゾール−１−イル）−アセチルアミノ］−エタンスルホン酸は、５−メルカプト−１−テトラゾール酢酸と２−アミノエタンスルホン酸との間の反応から得ることができる。この生成物は、臭化アリルを使用する実施例１、またはアリルグリシジル−エーテルを使用する実施例２と類似の方法で、セルロースビーズに結合させることができる。
【０１１３】
代替の手順においては、５−メルカプト−１−テトラゾール酢酸を、実施例１と類似の方法で臭化アリルを使用して最初にビーズと結合させる。続いて、２−アミノエタンスルホン酸をこの生成物との縮合を、２−アミノ基をテトラゾールのカルボキシル基と縮合させることによって行う。
【０１１４】
（実施例８）：ウシ血清からの抗体の分離
この実施例の目的は、本発明の固体基材を使用した血清から誘導される抗体の単離および精製を説明することである。
【０１１５】
直径１．６ｃｍのカラムに、実施例１により作製した固体基材１０ｍｌを充填した。この固体基材を、ｐＨ５．５の５０ｍＭ酢酸緩衝液および０．１４Ｍ塩化ナトリウムで平衡化させた。
【０１１６】
次に、ウシ血清試料のｐＨをｐＨ５．５に調整し、その２ｍｌを直接カラム上に投入した。吸着していないタンパク質を確実に除去するために、このカラムを、範囲にわたって酢酸緩衝液で洗浄した。結合した不純物は、カラムをリン酸緩衝食塩水で洗浄することによって除去した。
【０１１７】
カラムをｐＨ９．５の１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でフラッシングすることによって、所望の抗体を溶出させた。捕集した分画はＩｇＧクラスの抗体の大部分を含有しており、その純度を評価すると約７０〜９０％であった。この抗体分画は、別の適切なカラムで分別することによって更に精製することができる。
【０１１８】
（実施例９）：乳清からの抗体の分離
この実施例の目的は、本発明の固体基材を使用した乳清から誘導される抗体の単離および精製を説明することである。
【０１１９】
実施例８に記載のものと同じカラムに５０ｍｌの乳清を投入した。乳清のｐＨはすでに５．５近くであるため、ｐＨ調整は不要である。
【０１２０】
実施例８と同じ方法において、カラムを洗浄し、平衡化し、フラッシングして所望の抗体を捕集し、その純度を評価すると約８０〜９５％であった。この抗体分画は、別の適切なカラムで分別することによって更に精製することができる。
【０１２１】
（実施例１０）：ＭＢＩＳＡバイオチップアレイの作製
＜基材の作製＞
平坦なアルミニウム基材（「チップ」）に二酸化ケイ素をスパッタすることによりコーティングした。疎水性ポリマー（メリーランド州ベルツビルのサイトニクス（Ｃｙｔｏｎｉｘ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を適用して、チップ上にアドレス指定可能な位置を形成した。この方法で作製したチップをプラズマクリーナーで洗浄し、化学蒸着（ＣＶＤ）オーブンに入れた。ＣＶＤによりメタクリロキシプロピル−トリメトキシシランをチップ上に付着させ、減圧し、続いてコーティングされたチップを６０℃で硬化させた。
【０１２２】
＜デキストランの改質＞
アリル化
１０ｇのデキストラン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ＭＷ約７５，０００）を５０ｍｌの脱イオン水中に溶解し、１００ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムも加えることで酸化を防止した。水酸化ナトリウム溶液（１２．５ｍｌ）をこのデキストラン混合物に加え、５分後に臭化アリル（３ｍｌ）を加えた。１６時間撹拌した後、１００ｍｌのアセトンを加えることによって生成物（アリル−デキストラン）を沈殿させた。このアリル化デキストロースを、アセトン（１００ｍｌ）を加えることによって水溶液（５０ｍｌ）から粗生成物を２回沈殿させることによって精製した。最後に、精製された生成物を２００ｍｌのＤＩ水中に溶解した後、凍結乾燥した。
【０１２３】
臭素化およびメルカプトベンズイミダゾールスルホン酸改質
アリル化されたデキストラン（５ｇ）の水溶液（１００ｍｌ）を、１．５ｇのＮ−ブロモスクシンイミド（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））、および２．５ｇの臭化カリウムで連続して処理した。続いて、リン酸（ＤＩ水で１／３に希釈した）でｐＨを３．７〜３．９の間に調整した。得られた溶液を室温で１時間撹拌した（臭素が発生するため換気フード下で行った）。
【０１２４】
２．７のメルカプトベンズイミダゾールスルホン酸（アルドリッチ）をこの溶液に加えた。１０ＭのＮａＯＨ（ａｑ）でｐＨを１１〜１１．５の間に調整し、１時間にわたって確認を行い、必要に応じて調整した。１６時間後、２００ｍｌのアセトンを溶液に加えて粗生成物を沈殿させ、続いてこれを１００ｍｌの水中に再溶解させた後、ＭＷＣＯ５，０００セルロース透析バッグ（ＭＷＣＯ  ５，０００  ＣｅｌｌｕｌｏｓｅＤｉａｌｙｓｉｓ  ｂａｇ）で透析した。この結果得られた生成物（ＭＢＩ−デキストラン）は、凍結乾燥後に白色粉末として得られた。
【０１２５】
ベンゾフェノンデキストラン
２５０ｍｌ丸底フラスコ中に、２．２６ｇの４−ベンゾイル安息香酸（アルドリッチ、ベンゾフェノン４−カルボン酸）、２．２６ｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（アルドリッチ、ＤＣＣ）、および５０ｍｌの乾燥ＤＭＳＯを加えた。
【０１２６】
８．１ｇのデキストラン（シグマ、ＭＷ約７５，０００）および０．１２ｇのジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の１００ｍｌのＤＭＳＯ溶液を、添加漏斗を介して、撹拌しながらベンゾフェノン溶液に滴下した。１６時間撹拌の後、得られた沈殿物を濾過し、続いてロータリーエバポレーターで溶媒を濾液から除去した。場合によっては、粗生成物を再結晶によって更に精製することができる。
【０１２７】
＜ＭＢＩポリマーの基材上へのコーティング＞
前述のように調整した１．３５ｇのＭＢＩデキストランと０．１５ｇのベンゾフェノンデキストランとを１００ｍｌのＤＩ水中に溶解した。１μｌのこのデキストラン溶液と１μｌのエタノールとを、シラン化されたチップ上に順次付着させた。このコーティングされたチップをオーブンで乾燥させ、（近ＵＶ）を２０分間照射して硬化させた。放射線照射後、チップをＤＩ水で洗浄し、乾燥させた。
【０１２８】
好ましい実施形態およびそれらの好ましい使用法に関して本発明を説明し例証してきたが、これらに限定されるものではなく、添付の請求項に記載される本発明の全体の範囲内にあるそれらの修正および変更が可能である。
【国際調査報告】
2005539223.tif 000020
2005539223.tif 000021
2005539223.tif 000022