(57)【要約】粘膜の薬物吸収を強化するための修飾された放出性の医薬製剤と方法。該製剤は、消化管の第１位置で放出される薬物と浸透促進剤の両方を含む粒子の（１つまたは複数の）初期集団と、ポリマー被膜若しくはマトリックスによる遅延放出を有する、浸透促進剤（単数又は複数種類）を含む粒子のその後の集団（単数又は複数）を含む。この浸透促進剤は、第１位置から下流の、消化管の他の位置（単数又は複数）で放出されて、薬物が該他の位置に達したときに、薬物の吸収を強化する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物の消化管吸収を強化した遅延放出性経口製剤であって、
（ａ）上記薬物及び浸透促進剤を含み、該薬物と該浸透促進剤とを消化管における第１位置で放出する、第１粒子集団と；
（ｂ）浸透促進剤及び遅延放出用被膜又はマトリックスを含み、該浸透促進剤を、前記第１位置から下流の、該消化管の少なくとも１つの付加的位置で放出し、それによって、該薬物が該付加的位置に達したときに、該薬物の吸収が促進されるようにする、１つ以上の付加的粒子集団
とを含む上記製剤。
【請求項２】
薬物が、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチドホルモン、プロテアーゼ阻害剤、代謝制御剤、化学療法剤、ワクチン、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体から成る群から選択される、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス・オリゴヌクレオチドである、請求項２記載の製剤。
【請求項４】
（ａ）と（ｂ）における浸透促進剤が同じである、請求項２記載の製剤。
【請求項５】
（ａ）と（ｂ）における浸透促進剤が異なるものである、請求項２記載の製剤。
【請求項６】
浸透促進剤が、脂肪酸、脂肪酸塩、胆汁酸、胆汁酸塩、キレート化剤、界面活性剤及び非キレート化非界面活性剤から成る群から選択される、請求項２記載の製剤。
【請求項７】
前記脂肪酸又は脂肪酸塩が炭素原子８〜２０個を有し、前記炭素原子の間の結合が飽和であるか、又は前記結合の１つ以上が不飽和、分枝状若しくは環状である、請求項６記載の製剤。
【請求項８】
前記脂肪酸が、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、又はこれらの製薬的に受容される塩から成る群から選択される、請求項７記載の製剤。
【請求項９】
前記胆汁酸が、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、及びこれらの製薬的に受容される塩から成る群から選択される、請求項６記載の製剤。
【請求項１０】
前記キレート化剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、サリチレート、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、β−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体、及びこれらの混合物から成る群から選択される、請求項６記載の製剤。
【請求項１１】
前記非キレート化非界面活性剤が、不飽和環状尿素、１−アルキル−アルカノン、１−アルケニルアザシクロアルカノン、ステロイド抗炎症剤、及びこれらの混合物から成る群から選択される、請求項６記載の製剤。
【請求項１２】
前記製剤が、カプセル剤、錠剤、圧縮被覆錠剤、二層若しくは三層錠剤、サシェ剤、液体充填カプセル剤、又は液体成分と固体成分の両方を含むカプセル剤である、請求項１記載の製剤。
【請求項１３】
前記粒子が生体接着性である、請求項１記載の製剤。
【請求項１４】
前記粒子が、ポリアミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール、ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ポルラン及びセルロースから成る群から選択される物質を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項１５】
前記粒子が、キトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−エチルヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から成る群から選択される材料を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項１６】
前記粒子がカチオン成分を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項１７】
前記粒子が、ポリ−Ｌ−リシンとアルギネートとの複合体、プロタミンとアルギネートとの複合体、リシン、ジリシン、トリリシン、カルシウム、アルブミン、グルコサミン、アルギニン、ガラクトサミン、ニコチンアミド、クレアチン、リシン−エチルエステル及びアルギニン−エチルエステルを含む、請求項１６記載の製剤。
【請求項１８】
前記遅延放出用被膜又はマトリックスが、アセテート・フタレート、プロピレングリコール、ソルビタンモノオレエート、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸トリメリト酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、メタクリレート、キトサン、グアールガム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースから成る群から選択される、請求項１記載の製剤。
【請求項１９】
前記第１粒子集団が約５０％までの前記浸透促進剤を含み、前記付加的粒子集団（単数又は複数）が残りの前記浸透促進剤を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項２０】
前記第１粒子集団が少なくとも約５０％の前記浸透促進剤を含み、前記付加的粒子集団（単数又は複数）が残りの前記浸透促進剤を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項２１】
前記第１粒子集団が約５０％の前記浸透促進剤を含み、前記付加的粒子集団（単数又は複数）が約５０％の前記浸透促進剤を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項２２】
前記第１粒子集団が約７０％の前記浸透促進剤を含み、前記第２粒子集団が約３０％の前記浸透促進剤を含む、請求項２１記載の製剤。
【請求項２３】
哺乳動物における薬物吸収を強化する方法であって、請求項１記載の薬剤を該哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、薬物（特にオリゴヌクレオチド）の消化管吸収を強化する組成物及び方法に関する。より詳しくは、本発明は、浸透促進剤と組み合わせた薬物の第１パルスと、浸透促進剤の第１パルスによる放出によって吸収されない薬物の吸収を促進するための浸透促進剤の第２パルスとをデリバリーする経口薬剤に関する。
発明の背景
【０００２】
バイオテクノロジー分野における進歩は、以前は治療が困難であった疾患（例えば、癌、遺伝的疾患、関節炎及びＡＩＤＳなど）の治療に顕著な進歩を生じている。多くの、このような進歩は、対象（特にヒト対象）へのオリゴヌクレオチド及びその他の核酸の投与を伴う。このような分子の非経口的経路による投与は、疾患及び／又は障害の治療に有効であることが判明している。例えば、哺乳動物の眼の硝子体液へアンチセンス・オリゴヌクレオチドを直接デリバリーするための手段として、硝子体内注射を開示するDraper et al.,米国特許第５，５９５，９７８号（１９９７年１月２７日）を参照されたい。さらに、それぞれ、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの静脈内注入によるＣｒｏｈｎ病の治療を考察している、Robertson,Nature Biotechnology,1997,15,209,及びGenetic Engineering News,1997,15,1も参照されたい。
【０００３】
オリゴヌクレオチド及びその他の核酸を含めた薬物の経口投与は、無菌処置及び投与に伴う出費（例えば、入院及び／又は医師の費用）を必要としない、簡単で、容易な、有害でない投与の見込みをしばしば提供する。しかし、粘膜バリヤー（即ち、口腔、直腸、膣及び鼻腔）を横切っての、幾つかの種類の薬物の吸収は、しばしば、乏しい。
【０００４】
薬物は、それらの薬物の溶解性及び浸透性に基づいて、４カテゴリーのいずれかに分類することができる。薬物の吸収可能性に関する、薬物の関連する物理的及び生物物理的性質に基づいて薬物を分類するための、この生物薬剤学系について考察する、Amidon,et al.,Pharm.Res.12:413-420(1995)を参照されたい。主として、製薬業界及び規制団体は、この系の妥当性を認識し、多くの薬物開発の試みにおいて、この概念が考慮されると予想している。このことは、２０００年８月に発行された食品医薬品局のガイダンス：“Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate-Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System”によって例証される。簡単に説明すると、低い（用量関連）溶解性、又は低浸透性、又はこれらの両方を示す薬物は、経口投与される薬物の場合には、粘膜バリヤー（例えば、消化管上皮など）を横切る吸収が低い傾向を示す。低溶解性薬物の可溶化を促進するために、非常に多くの有効な方法が提案されているが、今のところ、低浸透性を示す薬物（特に、例えばオリゴヌクレオチド又はタンパク質のようなマクロ分子）の大部分をデリバリーするための有効で、実用的な（即ち、非侵襲的な）手段は現在存在しない。
【０００５】
経口投与される薬物の吸収を強化するアプローチの１つは、多数の用量(multiple doses)の薬物が、遅延放出用被膜を使用することによって、単一製剤から放出されるパルス放出性製剤である（米国特許第５，５０８，０４０号、第６，１１７，４５０号、第５，８４０，３２９号、第５，８１４，３３６号及び第５，６８６，１０５号、これらの全内容は本明細書に援用される）。経口投与される薬物（特に、オリゴヌクレオチド）の吸収及びバイオアベイラビリティを強化するための組成物及び方法を提供することが熱望されている。
［発明の概要］
【０００６】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを始めとする薬物の経口デリバリーに関する幾つかの利点のために、本発明の組成物及び方法は、本明細書でさらに詳細に説明するように、治療方法において用いることができる。本明細書で提供する組成物及び方法は、動物における種々のタンパク質及び遺伝子（動物の発達に必須であるものを含む）の機能を検査するためにも、使用可能である。本発明の方法は、薬剤的に活性な経口化合物によって治療可能なあらゆる疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、リウマチ様関節炎、Ｃｒｏｈｎ病、炎症性腸疾患又は過度の細胞増殖など）に罹患したと知られる又は疑われる動物の治療に用いることができる。
【０００７】
１つの実施態様において、本発明は、腸での薬物吸収を強化するための遅延放出性経口製剤であって、
（ａ）上記薬物及び浸透促進剤を含み、該薬物と該浸透促進剤とを消化管における第１位置で放出する、第１粒子集団と
（ｂ）浸透促進剤及び遅延放出用被膜又はマトリックスを含み、該浸透促進剤を、前記第１位置から下流の、該消化管の１つ以上の付加的位置で放出し、それによって、該薬物が該付加的位置に達したときに、該薬物の吸収が促進されるようにする、１つ以上の付加的粒子集団
とを含む上記製剤である。
【０００８】
好ましくは、薬物は、大きなマクロ分子であり、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、酵素、代謝制御剤、プロテアーゼ阻害剤、化学療法剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ワクチン、モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体などである。この好ましい実施態様の１つにおいて、オリゴヌクレオチドはアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。好ましくは、（ａ）と（ｂ）における浸透促進剤は同じものである。或いは、（ａ）と（ｂ）における浸透促進剤は異なるものである。この好ましい実施態様の１態様では、浸透促進剤は、脂肪酸、胆汁酸、キレート化剤、アニオン、カチオン若しくは非イオン界面活性剤又は非キレート化非界面活性剤、又はこれらの製薬的に受容される塩である。
【０００９】
該脂肪酸は、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノグリセリド、又はこれらの製薬的に受容される塩であることが有利である。脂肪酸には、飽和であるか又は１つ以上の不飽和結合を有する、炭素原子８〜２０個を有する脂肪酸、並びにそれらの塩及びグリセリドが含まれる。
【００１０】
好ましくは、該胆汁酸は、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、またはこれらの製薬的に受容される塩である。この好ましい実施態様の１態様では、該キレート化剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、サリチレート、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、β−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体、及びこれらの混合物である。
【００１１】
界面活性剤は、アニオン、カチオン若しくは非イオン界面活性剤、例えば、エチレン及び／又はプロピレンオキシド誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びエステル、ポリソルベート、ポロキサマー、アルキル硫酸ナトリウム、及びポリエチレングリコール誘導体を包含する。
【００１２】
該非キレート化非界面活性剤が、不飽和環状尿素、１−アルキル−アルカノン、１−アルケニルアザシクロアルカノン、ステロイド抗炎症剤、及びこれらの混合物であることが好ましい。好ましくは、該製剤は、カプセル剤、錠剤、圧縮被覆錠剤、二層錠剤、三層錠剤、サシェ剤、液体充填カプセル剤、又は液体成分と固体成分の両方を含むカプセル剤である。この好ましい実施態様の１態様では、生体接着性(bioadhesive)キャリヤー粒子が用いられる。該キャリヤー粒子は、ポリアミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール、ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ポルラン、セルロース、キトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチレン  Ｐ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−エチルヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことが有利である。この好ましい実施態様の１態様では、該キャリヤー粒子はカチオンである。有利には、該カチオン粒子は、ポリ−Ｌ−リシンとアルギネートとの複合体、プロタミンとアルギネートとの複合体、リシン、ジリシン、トリリシン、カルシウム、アルブミン、グルコサミン、アルギニン、ガラクトサミン、ニコチンアミド、クレアチン、リシン−エチルエステル又はアルギニン−エチルエステルを含む。好ましくは、遅延放出用被膜又はマトリックスは、アセテートフタレート、プロピレングリコール、ソルビタンモノオレエート、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸トリメリト酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、メタクリレート、キトサン、グアールガム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルセルロース、又は酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ−ＡＳ）である。
【００１３】
好ましくは、全ての粒子集団は、ほぼ等しい割合（即ち、約５０％）の浸透促進剤を含む。より好ましくは、各粒子集団は、異なる割合の浸透促進剤を含む。第１キャリヤー粒子集団は約５０％の前記浸透促進剤を含み、第２キャリヤー粒子集団は約５０％の浸透促進剤を含む。さらに好ましくは、第１キャリヤー粒子集団は約７０％の浸透促進剤を含み、前記第２キャリヤー粒子集団は約３０％の浸透促進剤を含む。
発明の詳細な説明
【００１４】
本発明は、生物学的に活性な物質の消化管吸収の強化を生じる経口薬剤組成物を提供する。特に、本発明は、薬物（好ましくは、アンチセンス・オリゴヌクレオチド及びその他の核酸）の消化管吸収を強化し、それによって、静脈内及び他の非経口投与経路での投薬に付随しうる併発症及び出費を回避するための組成物及び方法を提供する。この強化は、少なくとも２つの粒子集団をカプセル封入することによって得られる。第１粒子集団は、生物学的活性物質及び浸透促進剤を含み、第２（及び任意の付加的な）粒子集団は、浸透促進剤及び遅延放出用被膜又はマトリックスを含む。
【００１５】
これらの薬剤組成物を、直腸、膣、鼻腔又は肺経路によって投与した場合に、生物学的活性物質の吸収を強化することができると考えられる。また、生物学的活性物質の放出は、消化管の如何なる部分でも達成されうるとが考えられる。
【００１６】
生物学的活性物質のバイオアベイラビリティの強化も、本発明の組成物及び方法の経口投与によって達成される。“バイオアベイラビリティ”なる用語は、薬物を動物に導入するために非経口的でない投与形式を用いる場合に、投与された薬物のうち、どれほどの割合が循環系まで到達するかを測定したものである。この用語は、薬物の最終的作用部位が細胞内であるとしても、薬効が得られる血中濃度に関係するような薬物に対して用いられる（Van Berge-Henegouwen et al.,Gastroenterol.,1977,73,300)。伝統的に、バイオアベイラビリティ研究においては、経口投与後の薬物の末梢血レベルの変化を測定することによって、薬物の腸吸収度を決定する(DiSanto,Chapter76 In:Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990,pages1451-1458)。曲線下面積（ＡＵＣ０）を静脈内（ｉ．ｖ．）投与後の曲線下面積（ＡＵＣｉｖ）で除して、その商を用いて、吸収された薬物の割合(fraction)を算出する。しかし、大きな“初回通過クリアランス（first pass clearance）”を有する化合物（即ち、肝摂取が迅速なため、吸収された物質のごく一部のみが末梢血に入るような化合物）に関しては、この方法を用いることができない。このような化合物に対しては、他の方法を用いて、絶対バイオアベイラビリティを決定しなければならない(van Berge-Henegouwen et al.,Gastroenterol.,1977,73,300)。オリゴヌクレオチドに関しては、オリゴヌクレオチドがｉ．ｖ．投与後に血漿から迅速に排除されて、主として肝臓及び腎臓に蓄積されることが、研究により示している(Miyano et al.,Antisense Res.Dev.,1995,5,115;Takakura et al.,Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177)。
【００１７】
経口投与された薬物に該当する、他の“初回通過効果”は、胃酸及び種々の消化酵素の作用による分解である。その上、多くの高分子量活性剤（例えば、ペプチド、タンパク質及びオリゴヌクレオチド）及び一部の慣用的及び／又は低分子量薬物（例えば、インシュリン、バソプレッシン、ロイシン  エンケファリン等）の、粘膜経路（例えば、口腔、肺、頬側、直腸、経皮、膣及び眼）を介した血流への進入は、上皮細胞を横切る輸送が乏しいことと輸送中に同時に起こる代謝とによって、しばしば妨害される。オリゴヌクレオチド及び核酸に関して、このタイプの分解代謝が知られている。例えば、ホスホジエステラーゼは、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合と、合成オリゴヌクレオチド及び核酸中に存在する多くの他の修飾結合を切断することが知られている。
【００１８】
初回通過クリアランス効果を改善する１つの手段は、投与される薬物の投与量を増大して、それによって初回通過クリアランスで失われる薬物の割合を補填することである。このことは、例えば、単純に動物により多くの薬物を与えることによって、ｉ．ｖ．投与によって容易に達成されうるが、他の要因が、非経口的でない手段によって投与される薬物のバイオアベイラビリティに影響を及ぼす。例えば、薬物は、消化管若しくは血流中で酵素的若しくは化学的に分解される可能性があり、及び／又は、種々の粘膜に不浸透性若しくは半浸透性である可能性がある。
【００１９】
本発明の遅延放出性パルス薬剤は、少なくとも２つの粒子集団を含む。第１粒子集団は、対象の生物学的活性物質と浸透促進剤（吸収促進剤としても知られる）とを含む。これらは、生物学的活性物質の、粘膜表面及び他の上皮細胞膜（特に、腸粘膜）を横切っての輸送を促進する物質である。第１粒子集団は、消化管（即ち、腸）の第１位置で製剤から放出されて、迅速に生物学的活性物質及び浸透促進剤を放出する（第１パルス）。該浸透促進剤は該生物学的活性物質の吸収を促進する。しかし、該促進剤は迅速に吸収されるので、生物学的活性物質の全投与量の吸収を促進するためには、促進剤の量はしばしば不充分である。本発明は、浸透促進剤と遅延放出用被膜又はマトリックスとを含んでなる粒子の第２（及び任意の付加的）集団を設けることによって、この問題を解決する。該遅延放出用被膜又はマトリックスのために、第２粒子集団中の浸透促進剤は、該第１位置から下流の消化管内で放出され、そこで、該浸透促進剤は、生物学的活性物質がこの部位に達したときに、更なる吸収を促進する（第２パルス）。第１粒子集団中の浸透促進剤は、第２粒子セット中の浸透促進剤と同じものでも、また異なるものでもよい。第１粒子集団中の浸透促進剤の割合は、投与形（dosage form）中の浸透促進剤の総量の約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％のいずれかでありうる。第２粒子集団中の浸透促進剤の割合は、投与形中の浸透促進剤の総量の約９９％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％のいずれかでる。好ましい実施態様では、浸透促進剤は、投与形中の全ての粒子集団に均等に分配される。特に好ましい実施態様では、浸透促進剤は、種々な粒子集団に均等に分配されない。最も好ましくは、第１集団は、少なくとも５０％の浸透促進剤を含む。遅延時間は、第２粒子集団上の遅延放出用被膜の厚さを変えることによって調節することができ、このことは、より厚い被膜はより長い遅延時間を生じるように、当業者に知られている。或いは、遅延放出用マトリックスの量を変えることによって、遅延時間を調節することができる。
【００２０】
生物学的活性物質とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的効果を発揮する任意の分子、又は分子の混合物若しくは複合体を意味し、医薬品、薬物、タンパク質、ビタミン、ステロイド、ポリアニオン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、抗体、ポリヌクレオチド等を包含する。好ましくは、本発明の製剤には、低吸収マクロ分子(poorly absorbed macromolecules)が用いられる。
【００２１】
薬物は、動物（特にヒト）における疾患の、予防、診断、軽減、治療又は治癒に用いられる治療剤又は予防剤を意味する。治療的に有用なオリゴヌクレオチド及びポリペプチドは、この薬物の定義内に入る。
【００２２】
浸透促進剤は、非限定的に、例えば界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸、キレート化剤、非キレート化非界面活性剤分子、及びこれらの塩といった分子群の一員を包含する(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。キャリヤーは、バイオアベイラブルな薬物の量を低下させるようなプロセスを防ぐために、本発明の組成物中に含ませることができる、不活性な分子である。
【００２３】
本発明に関連して、界面活性剤（又は“表面−活性剤”）とは、水溶液中に溶解した場合に、溶液の表面張力、又は水溶液と他の液体との間の界面張力を減じて、その結果、消化管粘膜及び他の上皮膜を通してのオリゴヌクレオチドの吸収を促進させるという結果をもたらす化学的物質である。胆汁酸、脂肪酸及びそれらの塩の他に、界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；及びペルフルオロケミカル・エマルジョン、例えばＦＣ−４３(Takahashi et al.,J.Pharmacol.,1988,40,252)を包含する。
【００２４】
浸透促進剤として作用し、本発明の組成物中に使用可能な脂肪酸及びそれらの塩は、Ｃ８−Ｃ２０の飽和又は不飽和の、直鎖、分枝鎖又は環状化合物を包含し、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）（Ｃ１０）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、並びにこれらのモノ−及びジ−グリセリド及び／又はこれらの生理的に許容される塩（即ち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等）を包含する（Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1;EI-Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651)。
【００２５】
多様な胆汁酸及び塩も、浸透促進剤として作用して、薬物の摂取及びバイオアベイラビリティを促進する。胆汁の生理的役割は、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収を促進することである(Brunton,Chapter 38 In:Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.,McGraw-Hill,New York,NY,1996,pages934-935)。種々な天然胆汁酸塩及びそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、“胆汁酸塩”なる用語は、胆汁の如何なる自然生成成分をも、並びに如何なるそれらの合成誘導体をも包含する。本発明の胆汁酸塩は、例えば、コール酸（又はその製薬的に受容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ、ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムを包含する（Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Swinyard,Chapter 39 In:Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990,pages782-783; Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1;Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25;Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579)。
【００２６】
本明細書において用いられるキレート化剤は、これと錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去して、その結果、消化管粘膜及び他の上皮膜を通してのオリゴヌクレオチドの吸収を促進する化合物であると定義できる。本発明における浸透促進剤としてのキレート化剤の使用に関して、特性が明らかにされているＤＮＡヌクレアーゼの大部分は触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがって、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化剤はＤＮアーゼの阻害剤としても機能するという付加的利点を有する(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315)。本発明のキレート化剤は、非限定的に、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ＥＧＴＡ、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）を包含する(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1;Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43)。
【００２７】
本明細書で用いる限り、非キレート化非界面活性剤は、キレート化剤としても、また界面活性剤としても有意な活性を示さないが、それにも拘わらず、消化管及びその他の粘膜を通してのオリゴヌクレオチドの吸収を強化する化合物として定義することができる(Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1)。このクラスの浸透促進剤は、非限定的に、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；及び非ステロイド系抗炎症薬（例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、及びフェニルブタゾン(Yamashita et al.,J.Pharmacol.,1987,39,621)）を包含する。
【００２８】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの摂取を強化する作用剤も、本発明の薬剤組成物及びその他の組成物に加えることができる。例えば、カチオン性脂質（例えば、リポフェクチン(Junichi et al.,米国特許第５，７０５，１８８号））、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン(Lollo et al.,ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１））を用いることができる。
【００２９】
粒子集団を組み込むことができる医薬製剤は、例えば、カプセル剤、錠剤、圧縮被覆錠剤又は二層状錠剤であることができる。好ましい実施態様では、これらの製剤は、胃での分解に耐えて、腸管腔中で溶解する腸溶性外被を含む。好ましい実施態様では、該製剤は、胃の強烈なｐＨから核酸を保護するのに有効な，又は特定の粘膜部位への核酸のデリバリーを最適化するための長時間にわたる核酸の放出に有効な、腸溶性物質を含む。耐酸性の錠剤、カプセル剤及びキャプレット(caplet)のための腸溶性物質は、当該技術分野で知られており、典型的に、アセテートフタレート、プロピレングリコール、ソルビタンモノラウレート、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸トリメリト酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、メタクリレート、キトサン、グアールガム、ペクチン、ローカスビーンガム及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。メタクリレートの特に有用なタイプの１つは、ＥｕｄｒａｇｉｔｓＴＭである。これらは、低いｐＨでは水不浸透性であるが、腸管のｐＨではイオン化及び溶解する、アニオン性ポリマーである。ＥＵＤＲＡＧＩＴＳＴＭ  Ｌ１００及びＳ１００は、メタクリル酸とメチルメタクリレートとのコポリマーである。
【００３０】
腸溶性物質は、投与形に組み込むことができるか、又は錠剤、カプセル剤若しくはキャプレットの外表面を実質的に被覆する被膜であることができる。腸溶性物質に、例えば錠剤硬化又は熟成中の破損に耐えるために該物質にフレキシブルな弾力性を与える、可塑剤を加えることもできる。可塑剤は当該技術分野で知られており、典型的に、ジエチルフタレート（ＤＥＰ）、トリアセチン、ジブチルセバケート（ＤＢＳ）、ジブチルフタレート（ＤＢＰ）及びトリエチルシトレート（ＴＥＣ）を包含する。
【００３１】
本発明の製剤の“製薬的に受容される”成分は、賦形剤、希釈剤、安定剤、保存剤及び他の成分と共に用いられる場合に、製剤の性質、組成及び投与形式に適切である成分である。したがって、薬物（特にオリゴヌクレオチド）の摂取を、該薬物の活性を妨害することなく、さらに、該薬物を、許容されない副作用（例えば毒性、刺激又はアレルギー反応など）なしに動物体内に導入できる方法で、促進する浸透促進剤を選択することが望ましい。
【００３２】
“粒子”とは、本明細書では、顆粒、ビーズ、ミクロ粒子、ミニ粒子、ミニ錠剤、ナノ粒子、又は上記経口医薬製剤中に組み込まれうる、任意の他の投与形として定義される。
“キャリヤー粒子”とは、本明細書では、主として、生体活性(bioactive)物質又は浸透促進剤以外の機能を果たすものを含む粒子として定義される。
【００３３】
好ましいキャリヤー粒子形成物質は、ポリアミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、デンドリマー、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、ポルラン及びセルロースを包含する。
【００３４】
他の好ましい実施態様では、キャリヤー粒子形成物質は、ポリカチオン性ポリマーを包含し、例えば、キトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノ−メチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、パラ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン、及びＤＥＡＥ−デキストランを包含する。他の好ましい実施態様では、粒子形成物質は、アルギネートとのポリ−Ｌ−リシン複合体である。
【００３５】
他の実施態様では、キャリヤー粒子形成物質は、非ポリカチオン性である、即ち、ポリアクリレート、例えばポリアルキルアクリレート（例えば、メチル、ヘキシル）、ポリオキセタン、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びポリエチレングリコールなどのように、全体で中性又は負の電荷を有する。
【００３６】
他の実施態様では、本発明の医薬製剤は、粒子を粘膜に接着させるのに役立つ生体接着性物質をさらに含むことができる。ＰＬＬ−アルギネート・キャリヤー粒子の場合のように、キャリヤー粒子自体が生体接着性であることが可能である、又はキャリヤー粒子を生体接着性物質で被覆することができる。このような物質は、製剤技術分野で周知であり、その例はＰＣＴ  ＷＯ８５／０２０９２（これの内容は、本明細書に援用される）に記載されている。好ましい生体接着性物質は、ポリアクリルポリマー（例えば、カルボマー(carbomer)と、カルボマー誘導体）、トラガカント、ポリエチレンオキシド・セルロース誘導体（例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）、カラヤゴム、デンプン、ゼラチン並びにペクチンを包含する。
【００３７】
本発明の製剤はさらに、横切られる粘膜部位でムチンを部分的に又は完全に分解又は侵食するように機能する粘液溶解性(mucolytic)物質を含むことができる。粘液溶解性物質は製剤技術分野で周知であり、粘液溶解性物質には、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオトレイトール、ペプシン、ピロカルピン、グアイフェネシン、グリセロール・グアイアコレート、抱水テルピン、塩化アンモニウム、グアッテネシン(guattenesin)、アムブロキソール、ブロムヘキシン、カルボシステイン、ドミオドール、レトステイン、メシステイン、メスナ、ソブレロール、ステプロニン、チオプロニン及びチロキサポールが包含される。
【００３８】
薬物にキャリヤー粒子を、該薬物及びキャリヤー粒子並びにキャリヤー粒子の調製方法に応じて、静電的（イオン性、極性、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）、共有結合的又は機械的（非静電性、非共有結合）相互作用によって結合させることができる。例えば、オリゴヌクレオチドのようなアニオン性薬物には、イオン性相互作用によって、カチオン性キャリヤー粒子を結合させることができる。
【００３９】
該粒子は、賦形剤を含むこともできる。典型的な製薬的賦形剤は、非限定的に、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）；充填剤（例えば、ラクトース及び他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウム等）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩(metallic stearates)、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、ＥＸＰＬＯＴＡＢ）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）を包含する。
【００４０】
好ましい実施態様では、第２又はそれ以後の粒子集団（浸透促進剤を含む）はさらに遅延放出用被膜若しくはマトリックスを含み、遅延放出用被膜若しくはマトリックスを含まない第１粒子集団から薬物と浸透促進剤が放出された部位よりも下流の消化管の位置に達するまで、溶解が遅延させられる。この遅延放出用被膜若しくはマトリックスは、上記医薬製剤（例えば、カプセル剤若しくは錠剤）上の遅延放出用被膜若しくはマトリックスに比べて、異なるものであるか、又は異なる厚さを有することができ、第１粒子集団から薬物と浸透促進剤との組み合わせが放出された後に、浸透促進剤を放出させる。好ましい実施態様では、第２粒子集団上の該被膜はｐＨ依存性ではない。ＨＰＭＣサブコートを、遅延放出用被膜の前に塗布し、遅延放出用被膜を接着させるための改良された表面を与えることができる。
【００４１】
医薬製剤に、経口投与後に腸（小腸又は結腸）をターゲットにさせるためには、実際に３つのメカニズムがある。つまり、結腸細菌酵素による又はミクロフローラが作る還元性環境による活性化、ｐＨ依存性被膜、及び時間依存性被膜（被膜厚さ）である。
【００４２】
遅延放出用被膜と、それらの溶解に影響を及ぼす性質とは、当該技術分野で周知であり、例えば、Bauer et al.,Coated Pharmaceutical Dosage Forms,Medpharm Scientific Publishers,CRC Press,New York,1998 及びWatts et al.,による,Grug Devel,Industr.Pharm.23:893-913,1997に記載されており、これらの文献の全内容は本明細書に援用される。
【００４３】
本発明の組成物はさらに、薬剤組成物中に伝統的に見出される他の添加成分を当該技術分野で確立されたそれらの使用量で含むことができる。したがって、該組成物は、付加的な、適合性の薬剤学的有効物質（例えば、痒み止め、収斂剤、局部麻酔薬又は抗炎症薬など）を含有することができ、また、本発明の組成物の種々な投与形を物理的に製剤化する上で有用な付加的物質（例えば、染料、フレーバー剤、保存剤、酸化防止剤、不透明化剤(opacifier)、増粘剤及び安定剤など）を含有することができる。しかし、このような物質は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性を不当に妨害しない。
【００４４】
本発明の薬剤組成物は、大きいマクロ分子薬物（即ち、約８００ダルトン以上の分子量を有するもの）並びに小さい分子をデリバリーするために用いられ、このような分子としては、ペプチド、タンパク質、モノクローナル抗体とそのフラグメント、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、オリゴヌクレオチドとアンチセンス・オリゴヌクレオチド、プロテアーゼ阻害剤、ワクチン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、代謝制御剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤が含まれる。
【００４５】
好ましい実施態様では、製薬的な製剤は、モジュレーションすることが望まれる、タンパク質をコードするＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の機能をアンチセンス・モジュレートするために用いられるオリゴヌクレオチドをデリバリーして、究極的には、このようなタンパク質の量を調節するために用いられる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとそのｍＲＮＡターゲットとのハイブリダイゼーションにより、ｍＲＮＡの正常な役割が干渉され、細胞におけるｍＲＮＡの機能がモジュレートされる。干渉されるｍＲＮＡの機能としては、生命維持に必要なあらゆる機能が含まれ、例えば、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転位、ＲＮＡからのタンパク質の実際の翻訳、１つ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、ｍＲＮＡのターンオーバー又は分解、及び恐らくは、ＲＮＡが関与しうる独立した触媒活性さえも含まれる。ｍＲＮＡ機能のこのような干渉の総合的効果は、タンパク質の発現のモジュレーションである、この場合、“モジュレーション”とは、タンパク質の発現における増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味する。本発明に関連して、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好ましい形式である。
【００４６】
本発明に関連して、“オリゴヌクレオチド”なる用語は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のオリゴマー又はポリマーを意味する。この用語は、天然で発生する核酸塩基、糖及び糖間（主鎖）共有結合からなるオリゴヌクレオチド、並びに機能は同じであるが非天然発生部分を有する修飾オリゴヌクレオチドを包含する。このような修飾された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、その望ましい性質（例えば、強化された細胞取り込み、ターゲットへの強化された結合、及びヌクレアーゼの存在下での増強された安定性など）のために、天然型よりもしばしば好まれる。
【００４７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、非限定的に、修飾された結合、修飾された核酸塩基、又は修飾された糖を有するような核酸、及びキメラ核酸でありうる。
オリゴヌクレオチドと他の核酸の多くの生物学的等価物(bioequivalents)も、本発明において使用することができる。それ故、本発明はさらに、例えば、非限定的に、オリゴヌクレオチドと核酸の同等物をも包含し、例えば、オリゴヌクレオチドと核酸のプロドラッグ、欠失誘導体、オリゴヌクレオチドのコンジュゲート、アプタマー及びリボザイムが包含される。
【００４８】
オリゴヌクレオチドは、一般に、ヌクレオチドとして知られる反復単位のポリマーである。非修飾（天然に生じる）ヌクレオチドは３つの成分を有する。つまり、（２）５−炭素環状糖及び（３）この糖の５位の炭素にエステル化したホスフェートに、（１）その窒素原子の１つによって連結した含窒素塩基を有する。第１ヌクレオチドのホスフェートは、オリゴヌクレオチド鎖中に組み入れられた場合に、隣接する第２ヌクレオチドの糖の３位の炭素にもエステル化する。非修飾オリゴヌクレオチドの“主鎖”は、（２）及び（３）、即ち、第１ヌクレオチドの糖の５位（５’）の炭素と、隣接する第２ヌクレオチドの３（３’）位の炭素との間のホスホジエステル結合によって一緒に連結された糖から成る。“ヌクレオシド”は、（１）核酸塩基と（２）糖との組み合わせであって、（３）ホスフェート部分が存在しない(Komberg,A.,DNA Replication,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1980,pages4-7)。オリゴヌクレオチドの主鎖は、一連の塩基が特定の順序で配置されている（慣例的に５’から３’という順序で書かれている）。このように記載された塩基列の表示は、ヌクレオチド配列として知られる。
【００４９】
オリゴヌクレオチドは、特定の核酸との特定のハイブリダイゼーションを達成するために、アイデンティティ(identity)と数において充分なヌクレオチド配列を含むことができる。遺伝子のセンス鎖の一部に特異的にハイブリダイズする、このようなオリゴヌクレオチドは、一般に、“アンチセンス”と表される。本発明に関連して、“ハイブリダイゼーション”は、相補的なヌクレオチド間の水素結合形成を意味し、この水素結合形成は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合形成でありうる。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合の形成によって対をなす相補的核酸塩基である。本明細書で用いる“相補的”とは、２つのヌクレオチド間の正確に対合する能力を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドのある一定の位置におけるヌクレオチドが、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の同じ位置におけるヌクレオチドと水素結合を形成することができる場合に、該オリゴヌクレオチドと該ＤＮＡ又はＲＮＡとはその位置において相互に相補的であると考えられる。該オリゴヌクレオチドと該ＤＮＡ又はＲＮＡとは、各分子中の充分な数の対応位置が、相互に水素結合を形成しうるヌクレオチドによって占有される場合に、相互に相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能な”及び“相補的な”とは、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡターゲットとの間に安定で、特異的な結合が生じるような、充分な相補性度又は正確な対合を表わすために用いられる用語である。オリゴヌクレオチドが、特異的にハイブリダイズ可能である、そのターゲットＤＮＡ配列に１００％相補性である必要がないことは、当該技術分野において理解される。ターゲットＤＮＡ又はＲＮＡ分子へのオリゴヌクレオチドの結合が該ターゲットＤＮＡ又はＲＮＡの正常な機能を妨害して、機能の低下又は欠損を生じさせる場合に、該オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望まれる状況下（即ち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ若しくは治療処置の場合の生理的状況下で、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合には、アッセイが行なわれる状況下）で非ターゲット配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるほどの充分な相補性度が存在する。
【００５０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、試験・研究用試薬、診断助剤及び治療剤として一般に用いられる。例えば、当業者は、特定の遺伝子の機能を解明するために、例えば、生物学的経路の種々なメンバーの機能を識別するために、鋭敏な特異性で遺伝子発現を阻害することができるアンチセンス・オリゴヌクレオチドをしばしば用いる。それ故、この特異的な阻害効果は、当業者によって、試験研究用途のために利用されている。アンチセンス・オリゴヌクレオチドはまた、ある種の疾患状態において存在するＤＮＡ又はｍＲＮＡに対するそれらの特異的結合又はハイブリダイゼーションに基づいて、並びにハイブリダイゼーションに基づくアッセイ及びポリメラーゼ連鎖反応の一部を利用する増幅アッセイが与える高度な感度のために、診断助剤としても用いられている。オリゴヌクレオチドの特異性及び感度はまた、当業者によって、治療用途にも利用されている。例えば、下記米国特許において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを利用する苦痛緩和方法、治療方法及び他の方法が実証されている。米国特許第５，１３５，９１７号は、ヒトインターロイキン−１受容体発現を阻害するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第５，０９８，８９０号は、ｃ−ｍｙｂ癌遺伝子に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドとある種の癌状態についての、アンチセンス・オリゴヌクレオチド療法に関する。米国特許第５，０８７，６１７号は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる癌患者の治療方法を提供する。米国特許第５，１６６，１９５号は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。米国特許第５，００４，８１０号は、単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５  ｍＲＮＡにハイブリダイズして、複製を阻害することができるオリゴマーを提供する。米国特許第５，１９４，４２８号は、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第４，８０６，４６３号は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ複製を阻害するためのアンチセンス・オリゴヌクレオチドと、それらの使用方法を提供する。米国特許第５，２８６，７１７号は、癌遺伝子の一部に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第５，２７６，０１９号と米国特許第５，２６４，４２３号は、細胞における異種核酸の複製を防止するために用いられるホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド類似体に関する。米国特許第４，６８９，３２０号は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に特異的な抗ウイルス剤としてのアンチセンス・オリゴヌクレオチドに関する。米国特許第５，０９８，８９０号は、ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子のｍＲＮＡ転写体の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第５，２４２，９０６号は、潜在性Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染症の治療に有用なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンス・オリゴヌクレオチドの他の例は、本明細書に記載する。
【００５１】
さらに、本発明の組成物に用いるオリゴヌクレオチドは、白血球及び他の細胞種の接着を調節するタンパク質の合成に関与するｍＲＮＡ又はＤＮＡの効果を修飾することに関連づけさせることもできる。血管内皮への白血球の付着は、５つの細胞接着分子ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１及びＧＭＰ−１４０によって、全体的にではないとしても、部分的に媒介されるように思われる（Dustin and Springer,J.Cell.Biol.1987,107,321）。このようなアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、米国特許５，５１４，７８８（Bennett et al.,May7,1996)と米国特許５，５９１，６２３(Bennett et al.,January7,1997)、及び係属中の米国特許出願第０８／４４０，７４０号（May12,1995出願）と第０９／０６２，４１６号(April17,1998出願）に開示されるように、ｍＲＮＡに直接又は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、内皮白血球接着分子−１（ＥＬＡＭ−１又はＥ−セレクチン）及び血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）をコードする、選択されたＤＮＡ部分にハイブリダイズするように設計される。これらのオリゴヌクレオチドは、ターゲットｍＲＮＡの活性をモジュレートして、特異的な細胞接着分子の合成と代謝のモジュレーションをもたらし、それによって、苦痛緩和及び治療効果を生じることが見出されている。ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１及び／又はＥＬＡＭ−１発現の阻害は、炎症性疾患、炎症性要素を有する疾患、同種移植片拒絶、乾癬と他の皮膚疾患、炎症性腸疾患、癌と癌転移、及びウイルス感染症の治療のために有用であると期待される。動物を本発明のオリゴヌクレオチド組成物に接触させることを含む、細胞接着をモジュレートする方法が提供される。
【００５２】
典型的なアンチセンス化合物は下記化合物を包含する。
ＩＳＩＳ２３０２は、ホスホロチオエート主鎖と、配列５’−ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ−ＡＴＣ−ＣＧＴ−ＣＡ−３’（配列番号１）を有する２’−デオキシオリゴヌクレオチドである。ＩＳＩＳ２３０２は、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子の３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）をターゲットとする。ＩＳＩＳ２３０２は米国特許５，５１４，７８８と５，５９１，６２３に記載されており、これらの特許は本明細書に援用される。
【００５３】
ＩＳＩＳ１５８３９は、構造５’−ＧＣＣ−ＣＡＡ−ＧＣＴ−ＧＧＣ−ＡＴＣ−ＣＧＴ−ＣＡ−３’（配列番号１）を有するＩＳＩＳ２３０２のホスホロチオエート相同配列(isosequence)“ヘミマー”誘導体であり、配列における太字の(emboldened)“Ｃ”残基は５−メチルシトシン（ｍ５ｃ）塩基を有し、太字の二重下線付き残基はさらに２’−メトキシエトキシ修飾を含む（他の残基は２’−デオキシである）。ＩＳＩＳ１５８３９は、同時係属中の米国特許出願第０９／０６２，４１６号（April 17,1998出願）に記載されており、この出願は本明細書に援用される。
【００５４】
ＩＳＩＳ１９３９は、ホスホロチオエート主鎖と、配列５’−ＣＣＣ−ＣＣＡ−ＣＣＡ−ＣＣＴ−ＣＣＣ−ＣＴＣ−ＴＣ−３’（配列番号２）を有する２’−オリゴデオキシヌクレオチドである。ＩＳＩＳ１９３９は、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子の３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）をターゲットとする。ＩＳＩＳ１９３９は米国特許５，５１４，７８８と５，５９１，６２３に記載されており、これらの特許は本明細書に援用される。
【００５５】
ＩＳＩＳ２３０２（配列番号１）は、ヒト臍静脈細胞、ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）、ヒト上皮癌細胞（Ａ４３１）及びヒトケラチノサイトにおけるＩＣＡＭ−１発現を阻害することが判明している。ＩＳＩＳ２３０２はまた、他の可能な核酸ターゲット（例えば、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ）よりも、そのターゲットＩＣＡＭ−１に対して特異性を示している。ＩＳＩＳ１９３９（配列番号２）及びＩＳＩＳ２３０２は、Ｃ８１６１ヒト黒色腫細胞中のｍＲＮＡレベルを測定するためのノーザンブロット分析によって測定されたように、ＩＣＡＭ−１発現を著しく抑制した。実験的な転移試験によると、ＩＳＩＳ２３０２は、Ｃ８１６１細胞の転移可能性を低下させ、ＴＮＦ−α治療に由来する、Ｃ８１６１細胞の強化された転移能力を低下させた。ＩＳＩＳ２３０２はまた、炎症性疾患の動物モデルにおいて顕著な生物学的活性も示している。動物試験のデータから、Ｃｒｏｈｎ病、リウマチ様関節炎、乾癬、潰瘍性大腸炎及び腎臓移植片拒絶を始めとする多くの炎症性疾患において、ＩＳＩＳ２３０２の強い抗炎症効果を明らかにされた。ヒトで試験した場合には、ＩＳＩＳ２３０２は、Ｃｒｏｈｎ病に対する良好な安定性と活性を示した。さらに、ＩＳＩＳ２３０２は、すでに治療された対象に対しても、統計的に有意なステロイド節約効果を示しており、治療後５か月後においても、治療された対象はステロイドを止め、疾患寛解状態に留まっているほどである。これは、ＩＳＩＳ２３０２の効果についての驚くべき、重要な所見である。
【００５６】
本発明の組成物に用いるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約８〜約３０ヌクレオチドを含む。より好ましくは、このようなオリゴヌクレオチドは、約１０〜約２５ヌクレオチドを含む。
【００５７】
本発明の組成物に用いるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いて、動物体の種々の遺伝子成分の性質、機能及び、動物の正常又は異常な身体状態に関する潜在的な可能性を知ることもできる。今までは、遺伝子の機能は、主として、動物（例えば、トランスジェニックマウス）の遺伝子における機能欠損(loss-of-function)突然変異（即ち、“ノックアウト”突然変異）の構築によって試験されている。このようなタスクは困難で時間がかかる上に、“ノックアウト”突然変異は致命的な表現型を生じると考えられるので、このようなタスクを、動物の発達のために重要な遺伝子に関して行うことはできない。さらに、機能欠損表現型を動物のライフサイクルの特定の部分又は疾患状態において一時的に導入することはできない。つまり、“ノックアウト”突然変異は常に存在することになる。“アンチセンス・ノックアウト”、即ち、直接の遺伝子操作によるのではなく、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の選択的モジュレーションを用いると、これらの限定を克服することができる（例えば、Albert et al.,Trends in Pharmacological Sciences,1994,15,250参照のこと）。さらに、一部の遺伝子は、例えば選択的スプライシングのようなプロセスの結果として多様なｍＲＮＡ転写体を産生するが、“ノックアウト”突然変異は、典型的に、このような遺伝子から産生された、あらゆる形のｍＲＮＡ転写体を除去するので、特定のｍＲＮＡ転写体の生物学的役割を検討するために用いることができない。薬物（オリゴヌクレオチド及び他の核酸を含む）の単純な経口デリバリーのための組成物と方法を提供することによって、本発明は、上記及びその他の欠点を克服する。
【００５８】
本発明の組成物として用いることが予想される、幾つかの好ましい修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾された主鎖又は非自然の糖間結合を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書で定義するように、修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドは、主鎖にリン原子を有するもの、及び主鎖にリン原子以外の原子（又は原子グループ）を有するものを包含する。本明細書のために、及び当該技術分野で時々参照されるように、糖間の主鎖にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドも、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を含めて、オリゴヌクレオチドであると見なされる。
【００５９】
以下の段落では、特定のオリゴヌクレオチド化学修飾を記載する。ある化合物における全ての位置が均一に修飾されることは必要ではなく、実際に、下記修飾の１つ以上を単独アンチセンス化合物中に又はその単一残基中のみ（例えば、オリゴヌクレオチド内の単一ヌクレオシド）において組み入れることができる。
【００６０】
Ａ．修飾結合：  好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、例えば、正常な３’−５’鎖を有する、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート及びキラル・ホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含む）、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び、通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連鎖類似体、並びにヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’が５’−３’に又は２’−５’が５’−２’のように結合している逆極性を有するものを包含する。種々な塩、混合塩及び遊離塩形も包含される。
【００６１】
上記リン原子含有鎖の調製について説明する代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，６２５，０５０号；及び第５，６９７，２４８号を包含し、これらの特許の一部は、本出願と共通に所有されている、また、これらの特許の各々は本明細書に援用される。
【００６２】
その中にリン原子を包含しない、好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖（即ち、オリゴヌクレオシド）は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合、混合ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキル糖間結合、又は１つ以上の短鎖へテロ原子若しくは複素環糖間結合によって形成される主鎖である。これらは、モルホリノ結合を有するもの（一部はヌクレオシドの糖部分から形成）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成部分を有する他の主鎖を包含する。
【００６３】
上記オリゴヌクレオシドの調製について説明する代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；及び第５，６７７，４３９号を包含し、これらの特許の一部は、本出願と共通に所有されている、また、これらの特許の各々は本明細書に援用される。
【００６４】
他の好ましいオリゴヌクレオチド類似体では、ヌクレオチド単位の糖と糖間結合の両方（即ち主鎖）が新規な基で置換される。塩基単位は、適当な核酸ターゲット化合物とのハイブリダイゼーションのために残される。このようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション能を有することが判明しているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は残され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製について教示する代表的な米国特許としては、非限定的に、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；及び第５，７１９，２６２号が挙げられ、これらの特許の各々は本明細書に援用される。他にも、ＰＮＡ化合物に関する記載は、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497に見い出すことができる。
【００６５】
本発明の幾つかの好ましい実施態様において、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドと、ヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオシドを用いることができ、特に、上記米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ主鎖として知られる］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［この場合、天然型のホスホシエステル主鎖は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、並びに上記米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖を用いることができる。さらに、上記米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００６６】
Ｂ．修飾核酸塩基：  本発明の組成物に用いるオリゴヌクレオチドは、付加的に又は代替的に、核酸塩基（当該技術分野では、しばしば単純に“塩基”と呼ばれる）修飾又は置換を含む。本明細書で用いる限り、“非修飾”又は“天然型”核酸塩基はプリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）と、ピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を包含する。修飾核酸塩基は、他の合成及び天然の核酸塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ（特に、５−ブロモ）、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを包含する。更なる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages858-859,Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley & Sons,1990に開示されるもの、English et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613によって開示されるもの、及びSanghvi,Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications,pages289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,ed.,CRC Press,1993によって開示されるものを包含する。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合アフィニティを高めるために特に有用である。これらとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む）を包含する。５−メチルシトシン置換が、核酸二本鎖の安定性を０．６−１．２℃高めることが判明しており（同上文献、pages289-278)、現在好ましい塩基置換である。特に、５−メチルシトシン置換は、２’−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合に、一層好ましい塩基置換である。
【００６７】
上記修飾核酸塩基の一部並びに他の修飾核酸塩基の調製について教示する代表的な米国特許は、非限定的に、上記米国特許第３，６８７，８０８号並びに米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；及び第５，６８１，９４１号を包含し、これらの特許の一部は共通に所有されており、また、これらの特許の各々は本明細書に援用される、さらに、共通に所有される米国特許出願０８／７６２，４８８（December10,1996出願）も、本明細書に援用される。
【００６８】
Ｃ．糖の修飾：  本発明の組成物に用いるオリゴヌクレオチドは、付加的に又は代替的に、１つ以上の置換糖部分を含むことができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位置に下記の１つを含む。つまり、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−若しくはＮ−アルケニル、又はＯ−、Ｓ−若しくはＮ−アルキニル、この場合、該アルキル、該アルケニル及び該アルキニルは、置換若しくは非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル又はＣ２−Ｃ１０アルキニルであることができる。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、この場合、ｎとｍは１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは２’位置に下記の１つを含む。つまり、Ｃ１−Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基(cleaving group)、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態的性質を改良するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改良するための基、及び同様な性質を有する他の置換基である。好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られる］（Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486)、即ち、アルコキシアルコキシ基を包含する。他の好ましい修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、共通に所有される米国特許出願第０９／０１６，５２０号（January30,1998に出願）（これの内容は、本明細書に援用される）に記載されるような、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基を包含する。
【００６９】
他の好ましい修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を包含する。同様な修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置においても、特に３’末端ヌクレオチド又は２’−５’連結オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位置及び５’末端ヌクレオチドの５’位置においても行なうことができる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、例えばシクロブチル部分のような糖部分を有することもできる。このような修飾糖構造の調製について教示する代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，４８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３１号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；及び第５，７００，９２０号（これらの一部は共通に所有され、これらの各々は本明細書に援用される）、並びに共通に所有される米国特許出願０８／４６８，０３７（１９９５年６月５日出願、これも本明細書に援用される）を包含する。
【００７０】
Ｄ．その他の修飾：  付加的な修飾を、オリゴヌクレオチドの他の位置においても、特に３’末端ヌクレオチドの３’位置及び５’末端ヌクレオチドの５’位置においても行なうことができる。例えば、本発明の組成物に用いるオリゴヌクレオチドの付加的な修飾の１つは、該オリゴヌクレオチドの活性を強化し、該オリゴヌクレオチドの細胞分配又は細胞取り込みを促進する１つ以上の部分又はコンジュゲートを該オリゴヌクレオチドに化学的に連結することを包含する。このような部分は、非限定的に、例えばコレステロール部分のような脂質部分（Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553)、コール酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053)、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306;Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765)、チオコレステロール(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20,533)、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBOJ.,1991,10,111;Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259,327;Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75,49)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651;Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777)、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14,969)、又はアダマンタン酢酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651）、パルミチル部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys Acta,1995,1264,229)、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923)を包含する。
【００７１】
このようなオリゴヌクレオチド・コンジュゲートの調製について教示する代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号；及び第５，６８８，９４１号を包含し、これらの一部は共通に所有され、これらの各々は本明細書に援用される。
【００７２】
腸におけるオリゴヌクレオチドの良好な吸収をもたらす、好ましいコンジュゲートは、葉酸である。したがって、オリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドを葉酸にコンジュゲートさせるキャリヤーとを含む、経口投与用組成物を提供する。葉酸（フォレート）をオリゴヌクレオチドの３’若しくは５’末端に、核酸塩基に、又は鎖中の糖残基のいずれかの２’位置にコンジュゲートさせることができる。コンジュゲーションは、オリゴヌクレオチド及びフォレートの官能基を用いて、任意の適当な化学的リンカーを介して行なうことができる。オリゴヌクレオチド−フォレート・コンジュゲートと、その調製方法は、同時係属中の米国特許出願０９／０９８，１６６（１９９８年６月１６日出願）及び０９／２７５，５０５（１９９９年３月２４日出願）（両方とも本明細書に援用される）に記載される。
【００７３】
Ｅ．キメラ・オリゴヌクレオチド：  本発明はさらに、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を用いる組成物をも包含する。本発明に関連した“キメラ”アンチセンス化合物又は“キメラ”は、アンチセンス化合物（特に、オリゴヌクレオチド）であって、それぞれが少なくとも１つのモノマー単位（即ち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチド）から成る、２つ以上の化学的に異なる領域を有する。これらのオリゴヌクレオチドは典型的に、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する耐性を増強するため、細胞取り込みを増強するため、及び／又は、ターゲット核酸への結合アフィニティを増強するため、修飾される、少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドの他の領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断する酵素の基質として役立つことができる。１例として、ＲＮアーゼ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。それ故、ＲＮアーゼの活性化により、ＲＮＡターゲットの切断が生じ、それによって、遺伝子発現を阻害するオリゴヌクレオチドの効率が大きく強化される。その結果、キメラ・オリゴヌクレオチドを用いると、同じターゲット領域にハイブリダイズするホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドに比べて、より短いオリゴヌクレオチドによって、匹敵する結果を得ることがしばしば可能である。ＲＮＡターゲットの切断は、ゲル電気泳動と、必要な場合には、当該技術分野で知られた会合核酸ハイブリダイゼーション法とによって、ルーチンに検出することができる。ＲＮアーゼＨ−媒介ターゲット切断は、核酸を切断するリボザイムの使用とは異なる。
【００７４】
例えば、このような“キメラ”は“ギャップマー”、即ち、オリゴヌクレオチドの中央部分（“ギャップ”）が例えばＲＮアーゼＨの基質となり、５’部分及び３’部分（“ウィング”）が、ターゲットＲＮＡ分子に対する大きなアフィニティ、又はターゲットＲＮＡ分子と二本鎖を形成したときの大きい安定性を有するように修飾されているが、ヌクレアーゼ活性を支持することはできない（例えば、２’−フルオロ−又は２’−メトキシエトキシ−置換）オリゴヌクレオチドであってもよい。他のキメラは、“ヘミマー”（即ち、オリゴヌクレオチドの５’部分が例えばＲＮアーゼＨの基質となるのに反して、３’部分は、ターゲットＲＮＡ分子に対する大きなアフィニティ、又はターゲットＲＮＡ分子と二本鎖を形成したときの大きい安定性を有するように修飾されているが、ヌクレアーゼ活性を支持することはできない（例えば、２’−フルオロ−又は２’−メトキシエトキシ−置換）オリゴヌクレオチド）を包含する。
【００７５】
オリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二本鎖を大きく安定にする、オリゴヌクレオチドの化学修飾の多くが、Ｆｒｅｉｅｒ等(Nucl.Acids Res.,1997,25,4429)によって記載されている。このような修飾は、キメラ・オリゴヌクレオチドのＲＮアーゼ耐性部分に対して好ましく、一般に、このような修飾を用いて、ターゲットＲＮＡに対するアンチセンス化合物のアフィニティを強化することができる。
【００７６】
本発明のキメラ・アンチセンス化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又は上述したようなオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造体として形成させることができる。このような化合物は、当該技術分野では、ハイブリッド又はギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造体の調製について教示する代表的な米国特許は、非限定的に、米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；及び第５，７００，９２２号（これらの一部は共通に所有され、これらの各々は本明細書に援用される）並びに共通に所有され、許可された米国特許出願第０８／４６５，８８０号（１９９５年６月６日出願、これも本明細書に援用される）を包含する。
【００７７】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチド内の特定の位置に関して実質的に不斉化学的に純粋なオリゴヌクレオチドを用いる組成物をも包含する。実質的に不斉化学的に純粋なオリゴヌクレオチドの例は、非限定的に、少なくとも７５％Ｓｐ若しくはＲｐであるホスホロチオエート結合を有するもの(Cook et al.,米国特許第５，５８７，３６１号）及び実質的に不斉化学的に純粋な（Ｓｐ又はＲｐ）アルキルホスホネート、ホスホルアミデート又はホスホトリエステル結合を有するもの（Cook,米国特許第５，２１２，２９５号及び第５，５２１，３０２号）を包含する。
【００７８】
本発明はさらに、リボザイムを用いる組成物を包含する。高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を触媒する、合成ＲＮＡ分子とその誘導体は、リボザイムとして知られる（一般的には、米国特許第５，５４３，５０８号と第５，５４５，７２９号を参照のこと）。切断反応は、ＲＮＡ分子自体によって触媒される。天然型（天然に生じる）ＲＮＡ分子では、自己触媒作用による切断(self-catalyzed cleavage)部位は、ＲＮＡ二次構造の高度保存領域内に位置する（Buzayan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1986,83,8859;Forster et al.,Cell,1987,50,9)。特定細胞のＲＮＡ分子又は病原性のＲＮＡ分子を、極めて特異的にターゲットとすることができるリボザイムを形成するように、天然に生じる自己触媒性ＲＮＡ分子が修飾されている。したがって、リボザイムは、アンチセンス・オリゴヌクレオチドと同じ一般的目的を果たし（即ち、特定遺伝子発現のモジュレーション）、オリゴヌクレオチドと同様に、一本鎖のかなりの部分を有する核酸である。即ち、リボザイムは、化学的及び機能的に、オリゴヌクレオチドとの実質的に同一であり、したがって、本発明の目的に対して同等物であると見なされる。
【００７９】
生物学的に活性な他のオリゴヌクレオチドも、本発明の組成物として製剤化して、本発明の方法によって、治療、緩和又は予防の目的に用いることができる。このような、生物学的に活性な他のオリゴヌクレオチドは、非限定的に、特にアンチセンス・オリゴヌクレオチド、アンチセンスＰＮＡ及びリボザイム（上記）及びＥＧＳを含めたアンチセンス化合物、並びにアプタマー及び分子デコイ（下記）を包含する。
【００８０】
ＲＮアーゼＰを補強する(recruit)配列は、Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（したがって、略号“ＥＧＳ”）として知られる。ＥＧＳは、内因性ヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＰ）をターゲット核酸に導くアンチセンス化合物である(Forster et al.,Science,1990,249,783;Guerrier-Takada et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997,94,8468)。
【００８１】
アンチセンス化合物は、内因性ヌクレアーゼの補強に依存する代わりに、アンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドに共有結合したヌクレアーゼ活性を有する合成部分を代替的に又は付加的に含んでもよい。ヌクレアーゼ活性を有する合成部分は、非限定的に、酵素ＲＮＡ（リボザイムにおけるように）、ランタニドイオン錯体等を包含する(Haseloff et al.,Nature,1988,334,585;Baker et al.,J.Am.Chem.Soc.,1997,119,8749)。
【００８２】
アプタマーは、特異的リガンドをＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合以外の機構によって結合する一本鎖オリゴヌクレオチドである。アプタマーは、典型的に、例えばタンパク質をターゲットとし、核酸に結合するようには設計されない(Ellington et al.,Nature,1990,346,818)。
【００８３】
分子デコイは、例えばタンパク質のような、ファクターが結合する核酸上の部位を模倣する、短い二本鎖核酸（それ自体の上に“フォールドバック”するように設計された一本鎖核酸を包含する）である。このようなデコイは、該ファクターを競合的に阻害すると予想される。即ち、該ファクター分子が過剰なデコイと結合するので、該デコイに対応する細胞部位に結合するファクターの濃度が低下し、その結果として、治療的、緩和的又は予防的効果が生じる。核酸デコイ分子を同定し、構築する方法は、例えば米国特許第５，７１６，７８０号に記載されている。
生体活性オリゴヌクレオチドの他の種類は、内因性核酸の遺伝子変換を導くことができるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子である(Cole-Strauss et al.,Science,1996,273,1386)。
【００８４】
本発明の製剤に使用可能である、特異的オリゴヌクレオチドと、それらが阻害するターゲット遺伝子は、下記を包含する：
ＩＳＩＳ−２３０２    GCCCA AGCTG GCATC CGTCA（配列番号１）ＩＣＡＭ−１
ＩＳＩＳ−１５８３９  GCCCA AGCTG GCATC CGTCA（配列番号１）ＩＣＡＭ−１
ＩＳＩＳ−１９３９    CCCCC ACCAC TTCCC CTCTC（配列番号２）ＩＣＡＭ−１
ＩＳＩＳ−２９２２    GCGTT TGCTC TTCTT CTTGC G（配列番号３）ＨＣＭＶ
ＩＳＩＳ−１３３１２  GCGTT TGCTC TTCTT CTTGC G（配列番号３）ＨＣＭＶ
ＩＳＩＳ−３５２１    GTTCT CGCTG GTGAG TTTCA（配列番号４）ＰＫＣα
ＩＳＩＳ−９６０５    GTTCT CGCTG GTGAG TTTCA（配列番号４）ＰＫＣα
ＩＳＩＳ−９６０６    GTTCT CGCTG GTGAG TTTCA（配列番号４）ＰＫＣα
ＩＳＩＳ−１４８５９  AACTT GTGCT TGCTC（配列番号５）ＰＫＣα
ＩＳＩＳ−２５０３    TCCGT CATCG CTCCT CAGGG（配列番号６）Ｈａ−ｒａｓ
ＩＳＩＳ−５１３２    TCCCG CCTGT GACAT GCATT（配列番号７）ｃ−ｒａｆ
ＩＳＩＳ−１４８０３  GTGCT CATGG TGCAC GGTCT（配列番号８）ＨＣＶ
ＩＳＩＳ−２８０８９  GTGTG CCAGA CACCC TATCT（配列番号９）ＴＮＦα
ＩＳＩＳ−１０４３８  GCTGA TTAGA GAGAG GTCCC（配列番号１０）ＴＮＦα
ＩＳＩＳ−２１０５    TTGCT TCCAT CTTCC TCGTC（配列番号１１）ＨＰＶ
これらにおいて（ｉ）各オリゴ主鎖結合はホスホロチオエート結合（ＩＳＩＳ−９６０５を除く）である、及び（ｉｉ）各糖は肉太フォントで表示されない限り２’−デオキシであり、肉太フォントで表示される場合には２’−Ｏ−メトキシエチル基を組み入れるものである、及び（ｉｉｉ）下線が引かれているシトシン・ヌクレオシドはそれらの核酸塩基上に５−メチル置換基を組み入れる。ＩＳＩＳ−９６０５は最初の５つの結合と最後の５つの結合に天然のホスホジエステル結合を組み入れ、残りはホスホロチオエート結合である。
【００８５】
Ｆ．合成：  本発明の組成物に用いるオリゴヌクレオチドは、周知の固相合成法によって、簡便かつルーチンに製造することができる。このような合成装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Foster,CA)を始めとする幾つかの供給メーカーによって販売されている。当該技術分野で知られた、このような合成のための任意の他の手段を付加的に又は代替的に用いることができる。同様な方法を用いて、例えばホスホロチオエートとアルキル誘導体のような、他のオリゴヌクレオチドを調製することも知られている。
【００８６】
１．オリゴヌクレオチドの合成：  特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する記載を、それぞれ本出願と共に譲渡される、下記の米国特許又は係属中の特許出願に見出すことができる。つまり、ポリアミンとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，１３８，０４５号と第５，２１８，１０５号；キラルなリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのモノマーに関する米国特許第５，２１２，２９５号；修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，３７８，８２５号と第５，５４１，３０７号；主鎖が修飾されたオリゴヌクレオチドと、還元的カップリングによるその製造法に関する米国特許第５，３８６，０２３号；３−デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基と、その合成方法に関する米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ−２置換プリンに基づく修飾核酸塩基に関する米国特許第５，４５９，２５５号；キラルなリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製方法に関する米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸に関する米国特許第５，５３９，０８２号；β−ラクタム主鎖を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドの合成のための方法及び物質に関する米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基を有するヌクレオシドであって、このような基が、該ヌクレオシドの多様な位置のいずれかに結合する他の部分へのリンカーとして用いられうるヌクレオシドに関する米国特許第５，５７８，７１８号；高度に不斉化学的に純粋なホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに関する、米国特許第５，５８７，３６１号と第５，５９９，７９７号；２’−Ｏ−アルキルグアノシンと、２，６−ジアミノプリン化合物を始めとする関連化合物の調製方法に関する米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，４６９号；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，４７０号；両方ともが共役４’−デスメチルヌクレオシド類似体に関する、米国特許第５，２２３，１６８号（１９９３年６月２９日出願）と第５，６０８，０４６号；主鎖修飾されたオリゴヌクレオチド類似体に関する、米国特許第５，６０２，２４０号と第５，６１０，２８９号；並びに特に、２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドの合成方法に関する、米国特許出願第０８／３８３，６６６号（１９９５年２月３日出願）と米国特許第５，４５９，２５５号である。
【００８７】
２．生物学的同等物：  本発明の組成物には、ヒトを含めた動物に投与したときに、その生物学的に活性な代謝産物又は残渣を（直接又は間接的に）生じることができる、いずれかの、製薬的に受容される化合物が含まれる。したがって、例えば、この開示は、本発明のアンチセンス化合物の“プロドラック”及び“製薬的に受容される塩”にも関する。
【００８８】
Ａ．オリゴヌクレオチド・プロドラック：  本発明の組成物に用いる、オリゴヌクレオチド及び核酸化合物は、付加的に又は代替的に、“プロドラック”形でデリバリーされるように調製することができる。“プロドラック”なる用語は、不活性形で調製され、この不活性形が身体内又は身体の細胞内で、内因性酵素又は他の化学物質及び／又は条件の作用で活性形（即ち、薬物）に転化する治療剤を意味する。特に、アンチセンス化合物のプロドラック形は、ＷＯ９３／２４５１０(Gosselin et al.,１９９３年１２月９日公開）に開示された方法によってＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製することができる。
【００８９】
Ｂ．製薬的に受容される塩：  “製薬的に受容される塩”なる用語は、本発明の組成物に用いる浸透促進剤、オリゴヌクレオチド及び核酸化合物の生理的及び製薬的に受容される塩（即ち、親化合物の望ましい生物学的活性を保有し、その活性に好ましくない有害な効果を与えない塩）並びに浸透促進剤の製薬的に受容される塩を意味する。
【００９０】
製薬的に受容される塩基付加塩は、例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属又は有機アミンのような、金属又はアミンによって形成される。カチオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、例えばスペルミン及びスペルミジンのようなポリアミン等である。適当なアミンの例は、クロロプロカイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカインである（例えば、Berge et al.,“Pharmaceutical Salts”,J.of Pharma Sci.,1977,66:1参照のこと）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形を充分な量の望ましい塩基を接触させて、慣用的な方法で塩を製造することによって調製される。この塩を酸と接触させ、遊離酸を慣用的な方法で単離することによって、遊離酸を再生することができる。遊離酸形は、それらの各々の塩形とは、例えば極性溶媒中の溶解性のような、ある種の物理的性質において幾らか異なるが、他の点では、本発明の目的のために、塩はそれらの各々の遊離酸と等価である。
【００９１】
オリゴヌクレオチド合成のプロセス中に、ヌクレオシドモノマーは、例えばヌクレオシドモノマーのカップリング、酸化、キャッピング及び脱トリチル化のような化学反応の繰り返すことにより一度に１つずつ鎖に結合する。各ヌクレオシド付加の段階的収率は約９９％である。このことは、不完全なカップリング、続いての不完全なキャッピング、脱トリチル化及び酸化の総合的な結果として、各段階でのヌクレオシドモノマー付加から配列鎖の１％未満が形成されることができなかったことを意味する(Smith,Anal.Chem.,1988,60,381A)。（ｎ−１）、（ｎ−２）等から１マー（ヌクレオチド）までの範囲の短いオリゴヌクレオチドは全て、ｎマーオリゴヌクレオチド生成物中の不純物として存在する。不純物のなかで、（ｎ−２）マー以下の短いオリゴヌクレオチド不純物は非常に少ない量で存在し、クロマトグラフィー精製法によって容易に除去することができる(Warren et al.,Chapter 9 In:Methods in Molecular Biology,Vol.26:Protocols for Oligonucleotide Conjugates,Agrawal,S.,Ed.,1994,Humana Press Inc.,Totowa,NJ,pages233-264)。しかし、精製プロセス後にも、クロマトグラフィーによる選択性及び生成物収率のために、幾らかの（ｎ−１）マー不純物が全長（即ち、ｎマー）オリゴヌクレオチド生成物中にまだ存在する。（ｎ−１）部分は、ｎマーの親オリゴヌクレオチドに比べて全ての可能な単一塩基欠損配列の混合物から成る。このような（ｎ−１）不純物は、欠失塩基の位置（即ち、５’若しくは３’末端又は内部）に応じて、末端欠失配列又は内部欠失配列として分類される。単一塩基欠失配列不純物を含有するオリゴヌクレオチドを薬物として用いる場合には(Crooke,Hematologic Pathology,1995,9,59)、末端欠失配列不純物は全長配列と同じターゲットｍＲＮＡに結合するが、その結合のアフィニティはやや低い。したがって、このような不純物は、ある程度まで、活性薬物成分の一部と見なすことができ、したがって、本発明の目的のために生物学的同等物であると考えられる。
【００９２】
核酸と不利に反応しない、経口投与に適した、製薬的に受容される有機又は無機キャリヤー物質を用いて、本発明の組成物を製剤化することもできる。適当な、製薬的に受容されるキャリヤーは、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、マンニトール、ラクトース及び他の糖と糖誘導体、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、コロイダル二酸化ケイ素、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を包含する。該製剤は滅菌することができ、必要な場合には、該製剤の核酸（単数又は複数）と不利に相互作用しない補助剤（例えば、滑沢剤、保存剤、フレーバー剤(flavorant)、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、増量剤(bulking agent)、着色剤、香味料(flavoring)及び／又は芳香剤(aromatic substance)等）と混合することができる。
【００９３】
本発明は、動物に薬物を経口デリバリーするための組成物及び方法を提供する。本発明の目的のために、“動物”なる用語は、ヒト並びに他の哺乳動物、並びに爬虫類、魚類、両生類及び鳥類を包含する意味である。
【００９４】
界面活性剤は、例えばエマルジョン（ミクロエマルジョンを包含する）及びリポソームのような製剤に広範囲に用いられている。天然及び合成の両方の、多様な種類の界面活性剤の性質を分類し、ランク付ける最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（“ヘッド”としても知られる）の性質は、製剤に用いられる種々の界面活性剤を類別するための最も有用な手段となる(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,vol.1,Lieberman,Rieger and Banker,Eds.,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,1988,p.285)。
【００９５】
界面活性剤分子がイオン化しない場合には、これは非イオン界面活性剤として分類される。非イオン界面活性剤は、薬剤製品及びコスメティック製品に広範囲に用いられており、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、該界面活性剤のＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲にある。非イオン界面活性剤は、非イオン性エーテル及びエステルを包含し、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエーテルとエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエーテルとエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル及びエトキシル化エステルを包含する。非イオン性アルカノールアミドとエーテル（例えば、脂肪アルコール・エトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマー）も、このクラスに包含される。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン界面活性剤という分類において、最も多く出回っているものである。
【００９６】
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散したときに、負の電荷を有する場合には、該界面活性剤はアニオン系として分類される。アニオン界面活性剤は、カルボキシレート（例えば、セッケン、アシルラクチレートなど）、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル（例えば、アルキルスルフェート及びエトキシル化アルキルスルフェートなど）、スルホネート（例えば、アルキルベンゼンスルホネートなど）、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、並びにホスフェートを包含する。アニオン界面活性剤という分類において、最も重要なものは、アルキルスルフェート及びセッケンである。
【００９７】
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散したときに、正の電荷を有する場合には、該界面活性剤はカチオン系として分類される。カチオン界面活性剤は、第４級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンを包含する。第４級アンモニウム塩は、このクラスにおいて最も用いられるものである。
【００９８】
界面活性剤分子が正電荷又は負電荷のいずれかを帯びる能力を有する場合には、該界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、及びホスファチドを包含する。
【００９９】
薬物製品、製剤及びエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、概説されている(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,vol.1,Lieberman,Rieger and Banker,Eds.,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,1988,p.285)。
本発明の好ましい実施態様では、１種類以上の核酸が、粘膜デリバリーを介して投与される。
【０１００】
粘膜投与用組成物は、散剤又は顆粒、ビーズ、水中若しくは非水性媒質中の懸濁液若しくは溶液、カプセル剤、サシェ剤、トローチ、錠剤又はＳＥＣ（軟弾性カプセル剤又は“キャプレット”）を包含する。増粘剤、香味料、着色剤、乳化剤、分散助剤、キャリヤー物質又は結合剤が、このような製剤に望ましく加えられうる。錠剤は、任意に補助成分を用いて圧縮成形又は成形することによって製造することができる。
【０１０１】
圧縮錠剤は、適当な装置において、自由流動形（例えば、粉末又は顆粒など）の有効成分を、任意にバインダー（ＰＶＰ又はガム（例えば、トラガカント、アラビアゴム、カラゲナンなど））、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸塩）、グライダント（タルク、コロイダル二酸化ケイ素）、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤又は分散剤と任意に混合して、圧縮成形することによって調製することができる。好ましい結合剤／崩壊剤は、ＥＭＤＥＸ（デキストレート(dextrate))、ＰＲＥＣＩＲＯＬ（トリグリセリド）、ＰＥＧ及びＡＶＩＣＥＬ（セルロース）を包含する。成形錠剤は、適当な装置において、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を成形することによって製造することができる。錠剤は任意に被覆する又は折り線を入れて、その中の有効成分を緩慢放出する又は制御放出するように製剤化することができる。
【０１０２】
消化管デリバリー用製剤を製造するための種々の方法が、当該技術分野で周知である。一般的には、Nairn,Chapter 83;Block,Chapter 87;Rudnic et al.,Chapter 89;Porter,Chapter 90;and Longer et al.,Chapter 91 In:Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990を参照されたい。本発明の組成物は、公知の方法で、不活性で、非毒性の、製薬的に適切な賦形剤又は溶媒を用いて、一般的な製剤（例えば、錠剤、ピル、顆粒、カプセル剤、エーロゾル、シロップ、エマルジョン、懸濁液及び溶液など）にすることができる。治療的に活性な化合物は、総混合物の約０．５〜約９５重量％の濃度（即ち、上記投与量範囲に達するために充分な量）で存在する。本発明の組成物は、慣用的な方法で、付加的な製薬的に受容されるキャリヤー又は賦形剤を必要に応じて用いることにより、製剤化することができる。このようにして、組成物を慣用的な方法で、キャリヤー又は賦形剤（例えば、結合剤（例えば、プレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム））を用いて調製することができる。錠剤は当該技術分野で周知の方法で被覆することができる。製剤はさらに、香味料、着色剤及び／又は甘味剤を必要に応じて含有することができる。
【０１０３】
経口デリバリーに用いられるカプセルは、当該技術分野で周知である製剤を包含しうる。さらに、Digenis et al.,米国特許第５，６７２，３５９号に記載されている、制御放出性を有するマルチコンパートメント硬質カプセル、Amidon et al.,米国特許第５，６７４，５３０号に記載記載されている、多段階薬物デリバリーシステムを有する透水性カプセルを用いても、本発明の組成物を製剤化することができる。カプセルに、散剤、顆粒、ビーズ若しくは他の多重粒子、半固体、液体、錠剤、固体コンパクト、エマルジョン又はこれら若しくは同等の組成物の任意の組み合わせを充填することができる。
【０１０４】
薬剤組成物の製剤化と、その後のそれらの投与は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。本発明に関する具体的なコメントは以下に示す。
【０１０５】
一般に、治療用途のために、疾患若しくは障害を有する又は疾患若しくは障害に罹りやすい患者（即ち、ヒトを含めた動物）に、本発明に従って、１種類以上の薬物（好ましくは核酸（オリゴヌクレオチドを包含する））が、患者の年齢及び治療すべき疾患若しくは障害の重症度に応じて０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲内の投与量で、製薬的に受容されるキャリヤー中で投与される。さらに、治療計画は、特定の疾患若しくは障害の性質、その重症度及び患者の総合的状態に依存して、変更する時間にわたって継続させることができ、１日１回から２０年毎に１回までに及ぶことができる。本発明に関して、“治療計画”なる用語は治療的、緩和的及び予防的モダリティ(modality)を包含する意味である。治療後に、患者はその状態の変化に関して、及び障害又は疾患状態の症状の軽減に関して、観察される。薬物の投与量は、患者が現状の投与量レベルに有意に反応しない場合には増加することができる。また、障害若しくは疾患状態の症状の軽減が観察される場合、又は障害若しくは疾患が抑制された場合、投与量を減ずることができる。
【０１０６】
投薬は、治療すべき疾患状態の重症度及び反応に依存し、治療過程は数日から数か月まで、又は治癒が惹起されるまで若しくは該疾患状態の軽減が達成されるまで継続する。最適の投薬スケジュールは患者の体内の薬物蓄積の測定から算出することができる。当業者は最適投与量、投薬方法論及び反復速度を容易に決定することができる。最適投与量は、個々の薬物の相対的効力に依存して変化する可能性があり、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であると見出されたＥＣ５０値に基づいて算出することができる。一般に、投与量は０．０１μｇから１００ｇ／ｋｇ体重までであり、１日に、１週間に、１か月に若しくは１年間に１回以上、又は２〜２０年間毎に１回さえも投与することができる。最適な投薬スケジュールを用いて、特定の投与形式によって投与された薬物の治療有効量をデリバリーする。
【０１０７】
本発明の目的のために、“治療有効量”なる用語は、不快な副作用（例えば、毒性、刺激又はアレルギー反応）なく所定の目的を達成するために有効である、薬物含有組成物の量を意味する。個々の必要性は変化しうるが、製剤の有効量の最適範囲は、当業者によって容易に決定することができる。動物研究からヒトの場合を推定することができる(Katocs et al.,Chapter 27 In:Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990)。一般に、当業者が調節することができる、製剤の有効量を提供するために必要である投与量は、レシピエントの年齢、健康、身体的条件、疾患若しくは障害の種類と程度、治療の頻度、同時療法（存在するならば）の性質、並びに所望の効果（単数又は複数）の性質と範囲に依存して変化する（Nies et al.,Chapter 3 In:Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.,eds.,McGraw-Hill,New York,NY,1996)。
【０１０８】
良好な治療後に、患者に療法を継続させ、疾患状態の再発を阻止することが望ましいと考えられ、この継続的療法では、核酸が０．０１μｇから１００ｇ／ｋｇ体重の継続的用量で１日に１回以上から２０年間毎に１回まで投与される。例えば、自己免疫又は炎症状態になり易いと知られた又は疑われる個体の場合には、０．０１μｇから１００ｇ／ｋｇ体重までの範囲の予防量を１日に１回以上から２０年間毎に１回まで投与することによって、予防効果を得ることができる。同様な方法で、個体を、何らかの医学的処置の結果として生じると予想される炎症状態（例えば、個体への細胞、組織又は器官の移植から生じる移植片対宿主反応疾患など）に罹患し難くさせることができる。
【０１０９】
粘膜投与用製剤は、滅菌及び非滅菌水性溶液又は懸濁液、一般的溶媒（例えばアルコールなど）中の非水性溶液、或いは液体又は固体のオイルベース中の溶液又は懸濁液を包含することができる。これらの溶液はさらに、緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤を含有することができる。懸濁液には、この懸濁液の粘性を高めるような物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランが含まれる）を含有することができる。懸濁液は、安定剤を含有することもできる。
【０１１０】
単位投与形として便利に提供することのできる医薬製剤は、製薬業界で周知の慣用的手法によって調製することができる。このような手法は、有効成分を製薬的キャリヤー（単数又は複数）又は賦形剤（単数又は複数）と一緒にする工程を包含する。一般に、有効成分を、液体キャリヤー又は微粉状固体キャリヤー又は両方と均一かつ密接に一緒にして、次に、必要に応じて生成物を成形することによって、製剤が調製される。
【０１１１】
好ましい実施態様では、本発明は、生物学的活性を有する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を動物に経口投与することに関する。“生物学的活性を有する”とは、核酸が動物における１つ以上の遺伝子の発現をモジュレートするように機能することを意味し、これは、該遺伝子の絶対的機能（例えば、リボザイム活性）又はこのような遺伝子によってコードされるタンパク質の産生によって示される。本発明に関して、“モジュレートする”とは、遺伝子の発現を増加させる（刺激する）か、減少させる（抑制する）かのいずれかを意味する。このようなモジュレーションは、例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによって、非限定的に、転写停止；ＲＮＡプロセシング（キャッピング、ポリアデニル化及びスプライシング）及び輸送に対する効果；ターゲット核酸の細胞分解の強化若しくは減退；並びに翻訳停止を始めとする当該技術分野で知られた多様な機構により達成することができる(Crooke et al.,Exp.Opin.Ther.Patents,1996,6,1)。
【０１１２】
ヒト以外の動物において、本発明の組成物及び方法を用いて、動物における１つ以上の遺伝子の機能を研究することができる。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ニューロン死におけるＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体の役割を調べるため、プロテインキナーゼＣ−ａの生物学的役割を調べるため、及び不安におけるノイロペプチドＹ１受容体の役割を調べるために、ラットに全身投与されている(それぞれ、Wahlestedt et al.,Nature,1993,363,260;Dean et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1994,91,11762;及びWahlestedt et al.,Nature,1993,259,528）。関連タンパク質の複雑なファミリーが研究されている場合には、“アンチセンス・ノックアウト”（即ち、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの全身投与による遺伝子の阻害）が、該ファミリーの特定のメンバーを調べるための最も正確な手段であると考えられる（一般的には、Albert et al.,Trends Pharmacol.Sci.1994,15,250を参照のこと）。
【０１１３】
上述したように、本発明の組成物と方法は、治療的に有用である、即ち、１種類以上の核酸によって全体的に若しくは部分的に治療可能である疾患若しくは障害を有するか又はこのような疾患若しくは障害を有すると疑われる若しくはこのような疾患若しくは障害に罹りやすいと疑われる、ヒトを含めた動物に治療的、緩和的又は予防的リリーフ(relief)を与えるために有用である。“疾患又は障害”なる用語は、（１）特に、正常な生理的機能を損なう、感染、生来の虚弱、環境的ストレスの結果として生物又は器官(part)の何らかの異常な状態を包含し；（２）妊娠自体は除外するが、妊娠に関連した自己免疫及び他の疾患は除外せず；（３）癌及び腫瘍を包含する。“〜を有する、又は〜を有する若しくは〜に罹りやすいと疑われる”とは、対象動物が本明細書で定義された特定の疾患若しくは障害を発生させる危険性が大きい状態にあると決定されていること、又はこのような危険性の大きい状態にあると疑われることを意味する。例えば、対象動物は、特定の疾患又は障害が頻繁に発生することを含む、個人的及び／又は家族病歴を有していてもよい。他の例として、対象動物は、当該技術分野で知られた手法による遺伝子スクリーニングによって決定される、このような罹患し易さを有している可能性がある(例えば、U.S.Congress,Office of Technology Assessment,Chapter 5 In:Genetic Monitoring and Screening in the Workplace,OTA-BA-455,U.S.Government Printing Office,Washington,D.C.,1990,pages 75-99参照のこと）。“１つ以上の核酸によって全体的又は部分的に治療可能である疾患又は障害”なる用語は、本明細書で定義するような疾患又は障害を意味し、（１）それらの管理、モジュレーション若しくは治療、及び／又は（２）それらからの治療的、緩和的及び／若しくは予防的レリーフが、より多くの核酸を投与することによって達成されうる。好ましい実施態様では、このような疾患又は障害はアンチセンス・オリゴヌクレオチドによって全体的又は部分的に治療可能である。
［実施例］
【０１１４】
下記実施例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定することを意図しない。当業者は、本明細書に記載する特定の物質及び方法の数多くの均等物を認識するか、又は通常の実験によって確認することができるであろう。このような均等物は、本発明の範囲内であると見なされる。
［実施例１：オリゴヌクレオチドの調製］
【０１１５】
一般的合成方法：  ＤＮＡ自動合成装置によって、ヨウ素による酸化と共に標準ホスホロアミダイト試薬を用いてオリゴヌクレオチドを合成した。β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Foster City,CA)から購入した。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドに関しては、ホスファィト結合の段階的なチア化(thiation)のために、標準酸化ボトルをアセトニトリル中３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液と取り替えた。
【０１１６】
２’−Ｏ−メチル−（２’−メトキシ−）ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの合成は、上記方法によって、標準ホスホロアミダイトの代わりに２’−Ｏ−メチル  ｂ−シアノエチルジイソプロピル・ホスホロアミダイト(Chemgenes,Needham,MA)を用いて、かつテトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待機サイクルを３６０秒間に延長して行なう。
【０１１７】
同様に、このアプローチを若干修飾して、本質的には米国特許出願第０８／３８３，６６６号（１９９５年２月３日出願）に開示された方法に従って、２’−Ｏ−プロピル−（別名２’−プロポキシ−）ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを調製する、該特許出願は本出願と同じ譲受人に譲渡され、本明細書に援用される。
【０１１８】
本発明の２’−フルオロ−ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドは、５’−ジメトキシトリチル−３’−ホスホロアミダイトを用いて合成され、米国特許出願第０８／３８３，６６６号（１９９５年２月３日出願）及び米国特許第５，４５９，２５５号（１９９６年１０月８日公開）に開示されたように調製される。該特許出願と特許の両方は本出願と同じ譲受人に譲渡され、本明細書に援用される。２’−フルオロ−オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト試薬を用い、標準ＤＮＡ合成プロトコールを若干変更（即ち、脱保護は、室温におけるメタノール性アンモニアを用いて行われた）して調製される。
【０１１９】
ＲＮＡアンチセンス類似体は、本質的に米国特許第５，５３９，０８２号及び第５，５３９，０８３号に記載されたように調製される、該米国特許の両方は（１）１９９６年７月２３日に公開され、（２）本出願と同じ譲受人に譲渡され、（３）本明細書に援用される。
【０１２０】
２，６−ジアミノプリンを含むオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，５０６，３５１号（１９９６年４月９日に公開され、本出願と同じ譲受人に譲渡され、本明細書に援用される）に記載される化合物と、Gaffney et al.(Tetrahedron,1984,40,3)、Chollet et al.(Nucl.Acids Res.,1988,16,305)及びProsnyak et al.(Genomics,1994,21,490)によって記載される物質及び方法を用いて調製される。２，６−ジアミノプリンを含むオリゴヌクレオチドは、酵素による方法(Bailly et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1996,93,13623)によって調製することもできる。
本発明の２’−メトキシエトキシ・オリゴヌクレオチドは、本質的にMartin et al.の方法(Helv.Chim.Acta,1995,78,486)に従って合成される。
【０１２１】
Ｂ．オリゴヌクレオチド精製：  制御多孔性ガラス(controlled pore glass)（ＣＰＧ）カラム(Applied Biosystems)から切断し、濃水酸化アンモニウム中、５５℃で１８時間脱ブロックした後に、オリゴヌクレオチドを０．５Ｍ  ＮａＣｌから２．５倍量のエタノールによる２回の沈殿と、その後の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製した。２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素及び４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ボレート緩衝剤（ｐＨ７）中で分析ゲル電気泳動を行った。
【０１２２】
Ｃ．オリゴヌクレオチド標識：  本明細書に記載したｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態研究の過程で採取したサンプル中のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの存在を検出し、及び／又はその量を測定するために、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを標識した。トリチウム交換による放射能標識は、このようなｉｎ  ｖｉｖｏ研究においてアンチセンス・オリゴヌクレオチドを標識する好ましい方法の１つであるが、オリゴヌクレオチド及び他の核酸に放射能ラベル、化学ラベル又は酵素ラベルを組み入れるために、多様な他の手段が利用可能である。
【０１２３】
１．トリチウム交換：  本質的に、Graham et al.(Nucleic Acids Research,1993,21,3737)の方法を用いて、オリゴヌクレオチドをトリチウム交換によって標識した。具体的には、オリゴヌクレオチド約２４ｍｇを、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）２００μｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）４００μｌ及び脱イオン水２００μｌの混合物中に溶解した。得られた混合物のｐＨを測定し、０．０９５Ｎ  ＮａＯＨを用いて、ｐＨ７．８に調節した。この混合物を１．２５ｍｌガスケット付きポリプロピレン・バイアル中で一晩凍結乾燥した。このオリゴヌクレオチドを、フリーラジカル・スキャベンジャーとして作用するβ−メルカプトエタノール８．２５μｌ（Graham et al.,Nucleic Acids Research,1993,21,3737)及びトリチウム化Ｈ２Ｏ（５Ｃｉ／ｇ）４００μｌ中に溶解させた。この管にキャップを施し、９０℃オイル浴中に撹拌せずに９時間入れ、その後、短時間、遠心分離して、凝縮物を管の内蓋から除去した。（任意の分析工程として、２つの１０μｌアリコート（１つはＨＰＬＣ分析用、また１つはＰＡＧＥ分析用）を反応管から取り出し、各アリコートを、５０μＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）４９０μｌを含有する、別々の１．５ｍｌマイクロチューブ(microfuge tube)に加えた）。次に、オリゴヌクレオチド混合物を液体窒素中で凍結させ、凍結乾燥装置に移して、そこで高真空下で凍結乾燥を通常３時間行なった。次いで、この物質を２回蒸留した水  ｍｌ中に再懸濁させ、室温において１時間交換させた。インキュベーション後に、混合物を再び急速凍結させ、一晩凍結乾燥させた。（任意の分析工程として、オリゴヌクレオチド物質約１ｍｇをＨＰＬＣ分析のために取り出す）。さらに３回の凍結乾燥を、それぞれ２回蒸留した水約１ｍｌで行なって、組み込まれなかった残留トリチウムを確実に除去した。最終的な再懸濁オリゴヌクレオチド溶液を清潔なポリプロピレン・バイアルに移して、分析した。トリチウム標識オリゴヌクレオチドを約−７０℃で貯蔵する。
【０１２４】
２．核酸を標識するための他の手段：  当該技術分野で周知のように、オリゴヌクレオチド及び他の核酸を標識して、組み込まれなかったラベルを標識済み核酸から分離するには、多様な手段が利用可能である。例えば、二本鎖核酸をニックトランスレーション及びプライマー伸長法によって放射能標識することができ、オリゴヌクレオチドを始めとする多様な核酸を、酵素（例えばＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ又は末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼなど）を用いて末端放射能標識することができる（一般的に、Chapter 3 In:Short Protocols in Molecular Biology,2d Ed.,Ausubel ed al.,eds.,John Wiley & Sons,New York,NY,pages3-11 to 3-38;and Chapter 10 In:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d Ed.,Sambrook et al.,eds.,pages10.1 to 10.70を参照のこと）。オリゴヌクレオチド及び他の核酸を、非放射性ラベル（例えば、酵素、蛍光部分等など）で標識することも、当該技術分野で周知である（例えば、Beck,Methods in Enzymology,1992,216,143;and Ruth,Chapter 6 In:Protocols for Oligonucleotide Conjugates(Methods in Molecular Biology,Volume26) Agrawal,S.,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,1994,pages167-185を参照のこと)。
［実施例２：オリゴヌクレオチドのターゲット］
【０１２５】
本発明は、オリゴヌクレオチド又は核酸と１種類以上の粘膜浸透促進剤とを含む組成物及び製剤と、このような製剤を用いる方法に関する。１つの実施態様では、このような製剤を用いて、ヒト以外の動物における１つ以上の遺伝子の機能を研究する。好ましい実施態様では、ヒトを含めた動物に治療的にデリバリーするように意図された薬剤組成物に、オリゴヌクレオチドを製剤化する。局所又は全身に治療的にデリバリーするように意図されたオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、本発明の組成物及び方法によって経口投与することができる。このような望ましいオリゴヌクレオチドは、非限定的に、細胞接着タンパク質（例えば、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１）の発現、細胞増殖の速度（例えば、ｃ−ｍｙｂ、ｖＥＧＦ、ｃ−ｒａｆキナーゼ）をモジュレートする、又は種々な障害（例えば、アルツハイマー病、β−サラセミア病）及び真核性病原体（例えば、マラリア）、ＨＩＶを包含するレトロウイルス及び非レトロウイルス科ウイルス（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ、ＣＭＶ）に起因する疾患に対して生物学的若しくは治療的活性を有するオリゴヌクレオチドを包含する。
【０１２６】
本発明の組成物に製剤化することができる、その他のオリゴヌクレオチドは、例えば、リボザイム、アプタマー、分子デコイ、Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＥＧＳｓ）及びペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を包含する。
【０１２７】
種々な脂肪酸、それらの塩及びそれらの誘導体は、浸透促進剤として作用する。これらは、例えば、オレイン酸、別名シス−９−オクタデセン酸（又は、それらの製薬的に受容される塩、例えば、オレイン酸ナトリウム又はオレイン酸カルシウム）；カプリル酸、別名ｎ−オクタン酸（カプリレート）；カプリン酸、別名ｎ−デカン酸（カプレート）；ラウリン酸（ラウレート）；アシルカルニチン；アシルコリン；並びにモノ−及びジ−グリセリドを包含する(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page92)。種々な天然の胆汁酸塩と、それらの合成誘導体は浸透促進剤として作用する。胆汁の生理的役割は、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進を包含する(Brunton,Chapter 38 In:Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Goodman et al.,McGraw-Hill,New York,NY,1996,pages934-935)。胆汁酸塩に由来する浸透促進剤は、例えば、コール酸、コーラル酸(cholalic acid)又は３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸(3a,5a,12a-trihydroxy-5b-cholan-24-oic acid)（又はその製薬的に受容されるナトリウム塩）；デオキシコール酸、デスオキシコール酸、５ｂ−コラン−２４−酸−３ａ，１２ａ−ジオール、７−デオキシコール酸又は３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸（デオキシコール酸ナトリウム）；グリココール酸、（Ｎ−［３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル］グリシン又は３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸Ｎ−［カルボキシメチル］アミド又はグリココール酸ナトリウム）；グリコデオキシコール酸、（５ｂ−コラン−２４−酸Ｎ−［カルボキシメチル］アミド−３ａ，１２ａ−ジオール）、３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸Ｎ−［カルボキシメチル］アミド、Ｎ−［３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル］グリシン又はグリコデスオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）；タウロコール酸、（５ｂ−コラン−２４−酸Ｎ−［２−スルホエチル］アミド−３ａ，７ａ，１２ａ−トリオール）、３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸Ｎ−［スルホエチル］アミド又は２−［（３ａ，７ａ，１２ａ−トリヒドロキシ−２４−オキソ−５ｂ−コラン−２４−イル）アミノ］エタンスルホン酸（タウロコール酸ナトリウム）；タウロデオキシコール酸、（３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン−２−酸Ｎ［２−スルホエチル］アミド又は２−［（３ａ，１２ａ−ジヒドロキシ−２４−オキソ−５ｂ−コラン−２４−イル）−アミノ］エタンスルホン酸、又はタウロデオキシコール酸ナトリウム、又はタウロデスオキシコール酸ナトリウム）；ケノデオキシコール酸（ケノジオール、ケノデスオキシコール酸、５ｂ−コラン酸−３ａ，７ａ−ジオール、３ａ，７ａ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン酸、又はケノデオキシコール酸ナトリウム、又はＣＤＣＡ）；ウルソデオキシコール酸、（５ｂ−コラン−２４−酸−３ａ，７ｂ−ジオール、７ｂ−ヒドロキシリトコール酸又は３ａ，７ｂ−ジヒドロキシ−５ｂ−コラン−２４−酸、又はＵＤＣＡ）；タウロジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）；及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムを包含する(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page92;Swinyard,Chapter 39 In:Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack publishing Co.,Easton,PA,1990,pages782-783)。
【０１２８】
或いは、非置換及び置換ホスホジエステル・オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成装置(Applied Biosystems model 380B)によって、標準ホスホロアミダイト試薬とヨウ素による酸化とを用いて合成される。
【０１２９】
ホスホロチオエートは、ホスファィト結合を段階的にチア化するために、標準酸化ボトルをアセトニトリル中３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液と取り替えることを除いて、ホスホジエステル・オリゴヌクレオチドと同様に合成する。チア化待機工程は６８秒間に延長し、続いて、キャッピング工程を行なった。ＣＰＧカラムから切断し、濃水酸化アンモニウム中、５５℃で脱ブロックした（１８時間）後に、オリゴヌクレオチドを０．５Ｍ  ＮａＣｌから２．５倍量のエタノールによって２回沈殿させて精製した。
【０１３０】
ホスフィネート・オリゴヌクレオチドは、米国特許５，５０８，２７０（本明細書に援用される）に記載されるように調製する。
アルキルホスホネート・オリゴヌクレオチドは、米国特許４，４６９，８６３（本明細書に援用される）に記載されているように調製する。
【０１３１】
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネート・オリゴヌクレオチドは、米国特許５，６１０，２８９又は５，６２５，０５０（本明細書に援用される）に記載されるように調製する。
ホスホロアミダイト・オリゴヌクレオチドは、米国特許５，２５６，７７５又は米国特許５，３６６，８７８（本明細書に援用される）に記載されるように調製する。
【０１３２】
アルキルホスホノチオエート・オリゴヌクレオチドは、公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれ、ＷＯ９４／１７０９３及びＷＯ９４／０２４９９として公開）に記載されるように調製する。
３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート・オリゴヌクレオチドは、米国特許５，４７６，９２５（本明細書に援用される）に記載されるように調製する。
【０１３３】
ホスホトリエステル・オリゴヌクレオチドは、米国特許５，０２３，２４３（本明細書に援用される）に記載されるように調製する。
ボラノホスフェート・オリゴヌクレオチドは、米国特許５，１３０，３０２又は５，１７７，１９８（両方とも、本明細書に援用される）に記載されるように調製する。
メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）、及びメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）、及びメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）、並びに例えば交互にＭＭＩとＰＯ又はＰＳ結合を有する混合主鎖化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号；第５，３８６，０２３号；第５，４８６，６７７号；第５，６０２，２４０号及び第５，６１０，２８９号（これらは全て、本明細書に援用される）に記載されるように調製する。
【０１３４】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許５，２６４，５６２及び５，２６４，５６４（本明細書に援用される）に記載されるように調製する。
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許５，２２３，６１８（本明細書に援用される）に記載されるように調製する。
ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）は、Peptide Nucleic Acids(PNA):Synthesis,Properties and Potential Applications,Bioorganic & Medicinal Chemistry,1996,4,5に挙げられた種々な方法のいずれかによって調製する。ペプチド核酸は、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７００，９２２号、及び第５，７１９，２６２号（これらは、本明細書に援用される）に従って調製することもできる。
【０１３５】
オリゴヌクレオチドの吸収動態(absorption kinetics)に関して、オリゴヌクレオチドの吸収速度関数が拡散法則に従って挙動するかどうか、又はゼロ次（即ち、飽和し得る）プロセスが支配的であるかどうかを知ることが重要である。この情報は、ゼロ次のプロセスにより、一定時間に吸収されるオリゴヌクレオチドの絶対量が制限されると考えられるので、製剤設計のために重要である。このことが、取り込みを最大にするために、Ｋ０（単位時間当りの吸収量）以下の速度で、腸の浸透可能な領域より上流でオリゴヌクレオチドを放出させること対して、製剤化の努力を向けていると考えられる。しかし、吸収プロセスは濃度と無関係である筈であり、一次吸収プロセスが一貫した取り込み率をもたらすと考えられるので、上記製剤化アプローチは用いられないと思われる。
［実施例３：薬物動態試験］
【０１３６】
この問題に対処するために、２つの試験を計画した。第１の試験は、浸透促進剤（ＰＥ）カプリン酸ナトリウム（Ｃ１０）の用量を一定（５０ｍｇ／ｋｇ）に維持し、ＩＳＩＳ１０４３８の投与量を高めて空腸内（ＩＪ）投与した。オリゴヌクレオチドの投与量は、ヒトへの投与形開発のために実現可能と考えられるオリゴヌクレオチド投与量の範囲を確定するように選択した（２．５、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ）。飽和が生じる場合、オリゴヌクレオチドの投与量が多いと絶対バイオアベイラビリティ（ＢＡＶ）が低下することが示されると考えられる。第２の試験は、腸の活性化区分（ボラス浸透促進剤投与によって活性化）に高投与量のオリゴヌクレオチドを低濃度で徐々に与えることによって、該仮説をやや異なる方法で検証した。飽和し得るプロセスが存在するならば、オリゴヌクレオチドの緩慢な投与が、ボラス同時投与に比較して、高いＢＡＶをもたらす筈である。
【０１３７】
表１及び図１から分かるように、オリゴヌクレオチド取り込み経路の飽和は、試験した投与量では生じなかった。ＢＡＶ算出のために低投与量のＩＶ  ＡＵＣを不適当に用いたために、初期の反応において高いＢＡＶとなった。ＢＡＶを再計算した後では、ＢＡＶは均等であり、それ故、吸収プロセスは直線的であり、試験した投与量では飽和可能にならないと思われる。
【０１３８】
【表１】
2005505533.tif 000002
【０１３９】
第２の試験では、オリゴヌクレオチドをｔ＝５分間に、Ｃ１０の５ｍｇ／ｋｇボラスによって浸透性にした腸の領域に３０分間注入の手段で、徐々に与えた（１５ｍｇ／ｍｌ＠３０ｍｇ／ｋｇ投与量）。上記で仮定したように、吸収プロセスがゼロ次（即ち、飽和し得る）であるならば、この試験の計画は、上述の対応する（３０ｋｇ／ｋｇ）オリゴヌクレオチド・ボラスの試験に比べて、増加したオリゴヌクレオチド取り込みを生じると考えられる。得られた比較バイオアベイラビリティを表２に示し、血漿濃度を図２に示す。オリゴヌクレオチドＢＡＶに統計的有意差は存在しなかった。このことから、さらに、オリゴヌクレオチド吸収プロセスが、少なくとも、試験したオリゴヌクレオチド用量−濃度の範囲内で一次であるという結論が支持される。
【０１４０】
【表２】
2005505533.tif 000003
【０１４１】
上記データは、ＢＡＶを改善するための製剤設計変更のアプローチが、オリゴヌクレオチドではなく、カプリン酸ナトリウム浸透促進剤（Ｃ１０）投与に重点を置くべきであることを強く示唆する。このことは、オリゴヌクレオチドが劇的に異なる投与（即ち、ボラス対均等なＣ１０投与に反する緩慢注入）によっても均等に吸収されるという事実によって支持される。腸からの浸透促進剤（ＰＥ）の迅速な吸収及び消失は、単一ボラスＰＥ投与後の浸透面積を制限する可能性がある。
【０１４２】
この仮説の中心的な考えは図３Ａ−Ｂに示される、この図は、現在の溶液状投与形が腸腔中に過剰なＰＥを与えると考えられる方法を示す（図３Ａ）。過剰なＰＥは、最大の粘膜浸透性強化のために必要な、いわゆる最大効果レベルを超えるＰＥ曲線の面積によって表される量である。これの例は、ヒトの挿管実験中に生じ、この実験では、ＰＥレベルの倍加（３．３ｇまで）が反応の増強を生じることができなかった。
［実施例４：  臨床評価のための固体投与製剤］
【０１４３】
この研究の目的は、ＰＥＧに基づく即時放出性製剤及びパルス放出性製剤を、初期量後にカプリン酸ナトリウム（Ｃ１０）の追加量を放出することによって、Ｃ１０のダイナミックな作用を迅速に生じ、その作用をより延長するような方法で、経口からのオリゴヌクレオチド吸収を強化することに関して臨床的に評価することである（図３Ｂ）。４種類の製剤を表す、３タイプの投与形をヒトにおいて評価した：
オリゴヌクレオチド及びＣ１０の総量を有する、即時放出性（ＩＲ）２ｍｍミニ錠剤の単一集団を含む腸溶性被覆（ＥＣ）カプセル剤；
オリゴヌクレオチド及びＣ１０の総量を含むＥＣモノリシス錠剤；
オリゴヌクレオチドの総量及びＣ１０の部分量を有するＩＲ２ｍｍミニ錠剤と、Ｃ１０用量の残部を含むがオリゴヌクレオチドを含まない遅延放出性２ｍｍミニ錠剤との両方の混合物を含むＥＣパルス化放出性カプセル。
【０１４４】
上記２種類のカプセル投与形（４製剤化バッチ）の即時放出性成分は、例えば、高剪断ミキサーにおいて好ましくは約７０℃の制御温度でＰＥＧ−３３５０、ＩＳＩＳ１０４８３８及びカプリン酸ナトリウムをホットメルト造粒することにより製造される。顆粒を錠剤又はミニ錠剤に、付加的な賦形剤を用いずに、圧縮成形することができる。
【０１４５】
該遅延放出性（第２パルスＣ１０）ミニ錠剤のために、２つのアプローチが予定される。マトリックス形成ポリマーがＣ１０の典型的なバースト放出を生じ、その後に設定された時間にわたる持続放出を生じると考えられる。被覆ポリマーによるアプローチでは、持続放出から予想されるプロフィルではなく、より長期の遅延（ボラス放出）プロフィルを伴う遅延時間(lag time)を特徴とする（図１）。上記投与形（ｉｉｉ）で挙げた２パラメータ（即ち、放出されるべきＣ１０の遅延時間と部分量(fractional amount)）を有効に確定するために、遅延放出性被覆アプローチが推進される。したがって、ミニ錠剤の適当な集団をＳｉｚｅ０００カプセル中に充填し、次に、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ−５５による腸溶性被覆の前に、バンドをした(banded)。
【０１４６】
上記医薬製剤は、オリゴヌクレオチド約５ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくはオリゴヌクレオチド約１００ｍｇ〜５００ｍｇ、より好ましくはオリゴヌクレオチド約１００ｍｇ〜２００ｍｇを含む量で１日１回単一経口量（例えば、単一錠剤中に２００ｍｇオリゴヌクレオチド）又は分割経口量（例えば、２ｘ１００ｍｇオリゴヌクレオチド錠剤を同時に摂取）として投与することができる。或いは、総投与量を分割して、別々の投与量として、１日に２回、３回又はそれ以上の回数（即ち、１００ｍｇ錠剤１個を１日２回）で投与することができる。
［実施例５：ｉｎ  ｖｉｖｏパルス性研究］
【０１４７】
健康な被験者(volunteer)に、即時放出性（ＩＲ）ミニ錠剤製剤又はパルス性ミニ錠剤製剤を含む腸溶性被覆サイズ０００カプセル５個を投与した。
オリゴヌクレオチド、カプリン酸ナトリウム及びＰＥＧ３３５０を含む顆粒を２ｍｍ錠剤に圧縮成形した。同様に、カプリン酸ナトリウム及びＰＥＧ３３５０から成る顆粒を２ｍｍ錠剤に圧縮成形してから、遅延放出性被膜で被覆した。適当なミニ錠剤をサイズ０００ゼラチンカプセル中に手で充填し、ゼラチンバンドを用いて、カプセルを密封して、密封されたカプセルを腸溶性被覆した。
【０１４８】
パルス性組成物は、カプリン酸ナトリウム、アンチセンス・オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１０４８３及びポリエチレングリコール３３５０から成る即時放出性２ｍｍ錠剤（第１パルス）を、カプリン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール３３５０及び遅延放出性被膜から成る同様な２ｍｍ錠剤の第２集団（第２パルス）と共に含む、バンド付き腸溶性被覆サイズ０００ゼラチンカプセル５個含むものであった。パルス間の遅延は、第２集団のミニ錠剤上の遅延放出性被膜の量によって制御される。被膜量が多ければ多いほど、パルス間の遅延は長くなる。総量は、ＩＳＩＳ１０４８３８  ５００ｍｇとカプリン酸ナトリウム３．３ｇ（ＢとＣ）、又はＩＳＩＳ１０４８３８  ７００ｍｇとカプリン酸ナトリウム３．３ｇ（Ｄ）であった。表３を参照されたい。
【０１４９】
即時放出性（ＩＲ）ミニ錠剤組成物（Ａ）は、カプリン酸ナトリウム、ＩＳＩＳ１０４８３８及びポリエチレングリコール３３５０から成る２ｍｍ錠剤の単一集団を含有するバンド付き腸溶性被覆サイズ０００ゼラチンカプセル５個から成るものであった。総量は、ＩＳＩＳ１０４８３８  ５００ｍｇ及びカプリン酸ナトリウム３．３ｇであった。
【０１５０】
【表３】
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【０１５１】
薬物動態パラメータを、ＩＳＩＳ１０４８３８  ４５０ｍｇ、カプリン酸ナトリウム３．３ｇ、及びポリビニルピロリドン、ポリプラスドン、ステアリン酸マグネシウム、Ａｅｒｏｓｉｌ及びマンニトールを含めた、付加的な賦形剤の総量を有する腸溶性被覆錠剤１０個を含む初期組成物からの薬物動態パラメータと比較した。
【０１５２】
健康な男性被験者に、一晩絶食させた後に各製剤を投与した。選択した時点で瀉血を行なった。ＩＳＩＳ１０４８３８のＩＶ投与による曲線（血漿濃度対時間）下面積の比較によって、バイオアベイラビリティを評価した（表４）。結果を、図４にグラフで示す。カプセル製剤中のＩＲ及びパルス化放出性ミニ錠剤は、大きい錠剤よりも有意に高いバイオアベイラビリティを生じた。パルス化放出性組成物のなかでは、短パルス製剤Ｄが、最も良いバイオアベイラビリティを生じた。
【０１５３】
【表４】
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【０１５４】
当業者は、本発明の好ましい実施態様に多くの変化及び修飾を加えることができること、並びにこのような変化及び修飾が本発明の要旨から逸脱せずになされうることを理解するであろう。それ故、特許請求の範囲が、このような同等の変形の全てを、本発明の実際の要旨及び範囲内に入る限りカバーするように意図される。
【０１５５】
本明細書に挙げた又は引用した特許、出願、印刷された出版物及び他の公開資料の各々について、それら全体が本明細書に援用されるように意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、サルに空腸内投与した後の一定時間にわたるオリゴヌクレオチドの血漿濃度を示すグラフである。オリゴヌクレオチド取り込み経路の飽和は、試験した投与量では生じなかった。
【図２】図２は、ｔ＝５分間にカプリン酸ナトリウムの５０ｍｇ／ｋｇボラスによって浸透性にした、腸の領域への３０分間注入後の、サルにおけるオリゴヌクレオチドの血漿濃度を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、即時放出性製剤の投与後の腸腔における浸透促進剤の濃度を示す概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のパルス放出性製剤の投与後の腸腔における浸透促進剤の濃度を示す概略図である。
【図４】図４は、健康なヒト被験者に経口投与した後のアンチセンス・オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１０４８３８の血漿バイオアベイラビリティを示すグラフである。ＩＲ＝即時放出；５０／５０は、カプリン酸ナトリウムの５０％がオリゴヌクレオチド１００％と共に被覆されないＩＲミニ錠剤中に含まれ、残りの５０％が被覆された遅延放出性ミニ錠剤中に存在することを意味する；７０／３０は、カプリン酸ナトリウムの７０％がオリゴヌクレオチド１００％と共に被覆されないＩＲミニ錠剤中に含まれ、残りの３０％が被覆された遅延放出性ミニ錠剤中に存在することを意味する。迅速（fast)は、緩慢(slow)のための第２パルス上の被膜量よりも少量の遅延放出性被膜を、第２パルスミニ錠剤上に含む。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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