(57)【要約】本発明は、バクテリオファージテールタンパク質を使用したエンドトキシンの同定方法および前記エンドトキシンのサンプルからの排除方法に関する。
2005530991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）サンプルをバクテリオファージテールタンパク質とインキュベートする工程と、
ｂ）前記バクテリオファージテールタンパク質に結合したエンドトキシンを検出する工程とを含む、エンドトキシンの検出方法。
【請求項２】
必要に応じて、工程ａ）の後且つ工程ｂ）の前に、
ａ’）前記サンプルから前記バクテリオファージテールタンパク質−エンドトキシン複合体を分離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出を分光学的方法によって実施する、請求項１〜３の１項に記載の方法。
【請求項４】
ａ）サンプルを恒久的キャリア（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）上に非特異的または直接固定されたバクテリオファージテールタンパク質とインキュベートするか接触させる工程と、
ｂ）前記サンプルから前記バクテリオファージテールタンパク質−エンドトキシン複合体を分離する工程を含む、サンプルからエンドトキシンを除去する方法。
【請求項５】
工程ａ）およびｂ）をクロマトグラフィカラムスルーフロー（ｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｗ）法において実施する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記恒久的キャリアが、濾過媒体、ガラス粒子、磁性粒子、遠心分離材料、沈殿材料、またはクロマトグラフィカラムのための充填材料である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記バクテリオファージテールタンパク質を結合基を介して前記恒久的キャリア上に固定する、請求項４〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記結合基がレクチン、受容体、またはアンチカリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記結合基がストレプトアビジンまたはアビジンであり、前記バクテリオファージテールタンパク質がビオチンまたはＳｔｒｅｐ−タグに結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記バクテリオファージテールタンパク質を化学結合を介して恒久的キャリア上に共有結合的に固定する、請求項４〜６に記載の方法。
【請求項１１】
前記バクテリオファージテールタンパク質がＳｔｒｅｐ−タグまたはＨｉｓ−タグを有する、請求項１〜１０の１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タグが、配列番号５、６、または７に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
バクテリオファージテールタンパク質としてＴ４ファージのｐ１２タンパク質を使用する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
インキュベーション中のＣａ2+濃度が０．１μＭ〜１０ｍＭであり、Ｍｇ2+濃度が０．１μＭ〜１０ｍＭである、請求項１〜１３の１項に記載の方法。
【請求項１５】
標識したエンドトキシンがバクテリオファージテールタンパク質との結合から離れ、その後標識されたエンドトキシンが検出される、請求項１〜３の１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプルからエンドトキシンを検出および枯渇させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシン（ＥＴ）は、タンパク質およびリン脂質と共にグラム陰性細菌の外部細胞壁を形成するリポ多糖のファミリーである。エンドトキシンはこの細菌群でのみ産生され、外膜の組織化、安定性、およびバリア機能で重要な役割を果たす。多数のバクテリオファージは、その宿主細菌の特異的検出のためにエンドトキシンまたは一般的なリポ多糖を使用する。
【０００３】
全てのエンドトキシン変異型は、脂質Ａに共有結合するヘテロ多糖を含む（Ｈｏｌｓｔ，Ｏ．，１９９９，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｉｎ：Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ（Ｂｒａｄｅ，Ｈ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｏｐａｌ，Ｓ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。脂質Ａは、細菌外膜中でエンドトキシンを固定する。コアオリゴ糖およびＯ抗原を含むヘテロ多糖は、周囲の溶液に出現し、細菌の血清学的同一性を決定する。Ｏ抗原は、反復オリゴ糖単位を含み、その組成は株特異的である（本段落の上記のＨｏｌｓｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）。コアオリゴ糖の特徴的な基礎単位は、２−ケト−３−デオキシオクタン（ＫＤＯ）およびＬ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース（Ｈｅｐ）である。
【０００４】
異なる型のエンドトキシンのほとんどで保存されている部分は脂質Ａである。内部コア領域は、脂質Ａと同様に保存されており、外部コア領域は既に高度に変異している。内部コア領域ＫＤＯおよび脂質Ａ自体は置換基として複数のリン酸基を保有し、それによりエンドトキシンの負電荷の原因となる。さらに、脂質Ａ上およびコア領域上のリン酸基を、アラビノース、エタノールアミン、およびリン酸塩で様々に置換することができる。Ｏ抗原の各糖基礎単位は、アセチル化、シアル化、またはグリコシル化される。Ｏ抗原は、さらに、反復単位数が様々であり、これは、各細菌のエンドトキシン集団が一定の不均一性を有するためである（Ｐａｌｖａ  Ｅ．Ｔ．，Ｍａｋｅｌａ  Ｐ．Ｈ．，Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ａｎａｌｙｓｅｄ  ｂｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０；１０７（１）：１３７−４３；Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｒ．Ｃ．，Ｌｅｉｖｅ  Ｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ−ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１１１  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＬＴ２．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０；１０７（１）：１４５−５３）。
【０００５】
エンドトキシンは、実際には対応する予防策を用いずに全ての水溶液で見出すことができる生体分子である。ヒトおよび動物中のエンドトキシンにより敗血症、免疫系の強力で不正確な応答を発症し得る。したがって、例えば、医薬品タンパク質（ｐｈａｒｍａｐｒｏｔｅｉｎ）を製造する場合、エンドトキシンによる汚染を正確に検出し、その後完全に除去しなければならない。エンドトキシンは、ヒトまたは動物（例えば、獣医学的治療または動物試験）に注射された遺伝子操作された医薬品、遺伝子治療薬、または物質に関する問題を示す。しかし、医学だけでなく哺乳動物細胞のトランスフェクション実験などの研究への適用において、エンドトキシンによるトランスフェクション効率の阻害または低下が認められる。
【０００６】
臨床研究の枠組み内でタンパク質を使用することができるように、欧州および米国薬局方は、タンパク質をエンドトキシンレベルについて特定の境界値未満とすることを要求している（例えば、免疫血清グロブリン０．９１ＥＵ／ｍｌ、これは５ＥＵ／ｋｇ体重および時間に相当する（投薬量＝ＥＵ／ｋｇ*ｈ）；ＥＵ＝エンドトキシン単位；ＦＤＡ（食品医薬品局）：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＡＬ  ａｓ  Ｅｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）。これらに含まれる薬物またはタンパク質のエンドトキシンレベルが非常に高い場合、これにより被実験者が死亡する可能性がある。誤った免疫防御は、過剰反応により患者に損傷を与える。これにより、組織炎症、血圧低下、脈拍の増加、血栓症、ショックなどを引き起こし得る。ｐｇ量の長期持続的エンドトキシン曝露でさえも慢性副作用（例えば、免疫不全、敗血症の症状など）を引き起こし得る。したがって、物質産生の枠組み内、特に「製造管理及び品質管理規則」（ＧＭＰ）を用いたプロセスで、できるだけ迅速なエンドトキシンの枯渇が試みられる。しかし、タンパク質、多糖、およびＤＮＡ中のエンドトキシンの除去には問題がある。タンパク質自体の場合、電荷状態または疎水性などの本来備わっている特性による大きな問題があり、それは事実上エンドトキシン除去を妨害するか除去手順において多くの産物を喪失し得る。
【０００７】
現在、生体液中のエンドトキシンの検出方法が３つだけ説明されており、最初の２つの方法のみがＦＤＡによって承認されている。１．「ウサギ発熱物質試験」（生きたウサギにエンドトキシン溶液を注射し、それにより免疫応答を誘発する方法）。このエンドトキシン誘導免疫応答を、発熱によって検出する。２．「リムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）試験」−現在最も頻繁に使用されている試験（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ，Ｉｎｃ．，Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．，ａｌｌ  ＵＳＡ）を有意に改良した方法で標準化することができる。この方法を使用して、エンドトキシン接触後にカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血塊を測定する。３．さらなる可能性は、特定のサイトカインの出現によって単球の活性化を追跡する特定の細胞培養系（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）の使用である。
【０００８】
しかし、最初に記載した２つの方法は、非常に高価であり（競合性比較エンドトキシン検出を参照のこと）、非常に多数の試験動物または非常に貴重なカブトガニ血液が必要であるので動物保護の観点から特に適当でない。実際にＬＡＬ試験の規模を小さくして自動化することもできるが、成分の安定性が低いので、適用には非常に不利である。数時間で成分が凝固するので、一旦ＬＡＬ溶液を開栓すると、処理して直ちに使い切らなければならない。当業者は、全ての試験方法を必要とし、例えば、ウサギの免疫系は同量のエンドトキシンでも全く異なって反応する可能性があるのでこの方法は干渉に非常に敏感である。Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙなどの細胞培養法（全ての細胞培養法など）は、同様に非常に複雑であり、基準化に関して問題がある。
【０００９】
全体として、容易に取り扱える経済的なエンドトキシン検出方法は存在せず、現在使用されている方法は一連の不利益を有することが認められる。したがって、これらの不利益を回避する方法が必要である。
【００１０】
一般に、生体液からエンドトキシンを枯渇する一連の方法が存在する。しかし、特にタンパク質の場合、現在一般的に適用可能な標準的方法は存在しない。それぞれ使用されている方法を、各タンパク質の特定の性質に適合させ、対応するタンパク質の産生プロセスに適合させる。エンドトキシン枯渇について種々の可能性が存在し、これらの各方法は、特定の利点および欠点を有する。
【００１１】
塩、糖、抗生物質などの低分子成分を含む水および溶液からのエンドトキシンの枯渇に限外濾過（Ｐｅｔｓｃｈ，Ｄ．＆Ａｎｓｐａｃｈ，Ｆ．Ｂ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６，９７−１１９およびその参考文献）が使用されているが、高分子のタンパク質またはＤＮＡには適切ではない。
【００１２】
２相抽出（例えば、ＷＯ０１６６７１８号、Ｍｅｒｃｋ）は、エンドトキシンからの水溶性タンパク質およびＤＮＡの分離を試みるものであるが、精製物中に界面活性剤の残渣が生成される。さらにこの方法は、精製手順の複数の反復により時間がかかる。
【００１３】
同様にＤＮＡおよび塩基性タンパク質からのエンドトキシンの枯渇のために陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ）法が使用されているが（例えば、米国特許第５，９９０，３０１号、Ｑｉａｇｅｎ；ＷＯ９４１４８３７号、Ｅｎｚｏｎ）、低イオン強度を必要とし（５０ｍＭＮａＣｌ未満）、酸性タンパク質の場合、タンパク質が同時吸着する。
【００１４】
ＤＮＡおよびタンパク質（例えば、ＢＳＡ、ミオグロビン、γグロブリン、チトクロムＣ）からのエンドトキシンのさらなる枯渇方法は親和性吸着（例えば、ポリミキシンＢ、ヒスタミン、ヒスチジン、ポリリジン）であるが（例えば、英国特許第２１９２６３３号（Ｈａｍｍｅｒｓｍｉｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ））、ポリミキシンＢの場合有毒であり、低イオン強度の場合タンパク質が同時吸着し得る。
【００１５】
さらに、免疫親和性クロマトグラフィが使用されており、コアオリゴ糖に対する高価な抗体（米国特許第５１７９０１８号、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ；ＷＯ０００８４６３，Ｂｉｏｓｅｒｖ）のみによって特定のエンドトキシンに対する特異性を達成することができる。
【００１６】
さらに、因子Ｃ（ＬＡＬ試験の成分）のＳ３δペプチド（ＷＯ０１２７２８９）（ＷＯ９９１５６７６（両方）：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）がタンパク質（例えば、ＢＳＡ、キモトリプシノゲン）と共に使用されているが、この方法は高イオン強度の場合に効率が低く、産生費用も高い（昆虫細胞培養での産生）。
【００１７】
製薬産業での適用において、標的タンパク質の性質に適合したタンパク質溶液のために本質的に以下の３つの方法が見出されている。
・陰イオン交換クロマトグラフィ
・逆相クロマトグラフィ；これは、全てのタンパク質に同等に適応せず、特に疎水性タンパク質の場合に問題があるという欠点を有する。さらに、この方法は、非常に時間がかかる。
・Ｒｅｍ  Ｔｏｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）：この方法は非常に長いインキュベーション期間に加えて、非特異的結合成分が高く、タンパク質の回収率がしばしば適切でないという欠点を有する。
【００１８】
１０ＥＵ／ｍｌまでの値のタンパク質のエンドトキシンのおおまかな枯渇は、多くの場合既存の方法を使用すれば可能である。しかし、エンドトキシンの残存濃度は、常に依然として有毒である。したがって、さらなる枯渇（＝高度な精製）が提案されるか、医学への適用におけるタンパク質の投与量に依存して、欧州薬局方（例えば、静脈内適用において５ＥＵ／ｋｇ体重および時間）およびＦＤＡで義務的に規定されている。しかし、この高度な精製は、しばしば現在の発明の方法を用いて満足に保証されない。現行時価法（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｒｋｅｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ）は、非常に不利であり、特定のタンパク質の場合、適用できないこともあるか、もしくは標的タンパク質を多量に損失するだけである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、本発明の目的は、サンプル中のエンドトキシンを検出することができる方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、水溶液からエンドトキシンを除去することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本目的は、特許請求の範囲に定義の主題によって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以後の図面により本発明を説明する。
【００２２】
本明細書中で使用される、用語「エンドトキシン枯渇」は、サンプル材料からのエンドトキシンの完全または部分的除去を意味する。
【００２３】
本明細書中で使用される、用語「エンドトキシン」は、グラム陰性細菌の外膜成分である細菌リポ多糖を示す。
【００２４】
本明細書中で使用される、用語「バクテリオファージテールタンパク質」は、バクテリオファージ中で産生され、且つ細胞膜成分に結合することができるタンパク質を示す。通常、これらのタンパク質はバクテリオファージテール中に存在するが、テールを有さないバクテリオファージの場合、バクテリオファージの頭部または正常な細菌殻上に存在することもできる。バクテリオファージテールタンパク質によって結合した細胞成分により、特にエンドトキシンが検出される。
【００２５】
本明細書中で使用される、用語「非特異的固定」または「非有向固定」は、タンパク質表面全体に分布するタンパク質ラジカル（第１級アミン）を介してタンパク質が基質に結合することを意味する。各タンパク質分子の結合のために使用される基の選択は無作為である。
【００２６】
本明細書中で使用される、用語「有向固定」は、アミノ酸ラジカルまたは他のラジカルを介して結合する（例えば、タンパク質のグリコシル化）ことを意味し、タンパク質中のその位置（例えば、Ｎ末端またはＣ末端）が公知である。好ましくはこれらのラジカルと反応する適切な反応パートナー／リンカーの選択によって結合のためのこれらの基の選択を行う（例えば、スルフヒドリルラジカルのヨードアセテートラジカルへの結合；ヨードアセテートはアミノラジカルよりもスルフヒドリルラジカルと１０００倍以上迅速に反応する）。
【００２７】
本発明は、ａ）サンプルをバクテリオファージテールタンパク質とインキュベートする工程と、ｂ）前記バクテリオファージテールタンパク質に結合したエンドトキシンを検出する工程とを含むエンドトキシンの検出方法に関する。
【００２８】
本発明は、好ましくは、分光学的方法（例えば、蛍光発光、蛍光偏光、吸収、または円偏光二色性）、電気容量の測定（例えば、電気シグナル）、または競合検出によって間接的に検出を行う方法に関する。
【００２９】
必要に応じて、工程ａ）の後且つ工程ｂ）の前に、
ａ’）前記サンプルからバクテリオファージテールタンパク質−エンドトキシン複合体を分離する追加の工程を導入する。
【００３０】
本発明は、さらに、ａ）非特異的または有向様式でサンプルを固定キャリア上に固定されているバクテリオファージテールタンパク質とインキュベートするか接触させる工程と、ｂ）前記サンプルから前記バクテリオファージテールタンパク質−エンドトキシン複合体を分離する工程を含む、サンプルからエンドトキシンを除去する方法に関する。
【００３１】
好ましくは、最適なエンドトキシン−バクテリオファージテールタンパク質結合を得るために、インキュベーション前に２価のイオン（例えば、Ｃａ2+、Ｍｇ2+）のイオン組成および／またはｐＨ値を調整する。さらに、インキュベーション中またはインキュベーション後に、界面活性剤および／または塩（例えば、Ｔｗｅｅｎ、トリトンＮａＣｌ、硫酸アンモニウム）または例えばタンパク質または核酸からのエンドトキシンの分離を促進する他の物質（例えば、キトサン、糖、または脂質）の添加による結合エンドトキシンの「脱マスキング」が好ましい。
【００３２】
バクテリオファージテールタンパク質は天然に存在し得るか、分子生物学的または生化学的に修飾することができる。種々の理由のために遺伝子操作および／または生物学的操作によってバクテリオファージテールタンパク質を修飾することができる。本発明の方法のために、天然に存在するバクテリオファージテールタンパク質だけでなくその変異型も使用することができる。本発明の意味では、変異型は、バクテリオファージテールタンパク質のアミノ酸配列が変化していることを意味する。これらを、天然に存在する変異型のスクリーニングまたは無作為な変異誘発もしくはターゲティング変異誘発だけでなく化学修飾によっても得ることができる。本発明の方法のために使用したバクテリオファージテールタンパク質を、その特異性またはキャリア構造への結合特性におけるターゲティングまたは無作為な変異誘発によって適合することができる。キャリアへのこの結合を恒久的に行うことができるだけでなく（例えば、共有結合または特異的もしくは非特異的ビオチン化）、例えば、還元可能なジスルフィド架橋を介して可逆的に行うことができる。さらに、修飾によって安定性を増大させることができる。分子生物学的または化学的変異誘発により、アミノ酸の付加、欠失、置換、または化学修飾であり得る変異を導入する。要件（例えば、エンドトキシンのバクテリオファージテールタンパク質への結合の増大）を試験するために特異性および結合親和性の適合、または検出もしくは枯渇を改良するために不可逆的にする目的のために、これらの変異は、バクテリオファージテールタンパク質の結合領域中のアミノ酸配列の変化に影響を与え得る。結果的に結合を改良するか不可逆的にするために存在する可能性のある酵素活性を消滅させる目的のために、さらに、ファージタンパク質の遺伝子操作または生物学的修飾を行うことができる。さらに、本発明の方法という意味でタンパク質の存在する物理的性質（安定性、熱安定性など）を適合させるためにファージタンパク質の遺伝子操作または化学修飾を行うことができる。
【００３３】
Ｔ４  ｐ１２の三次元構造を説明するための研究により、高温で、３３ｋＤａおよび４５ｋＤａのタンパク質分解フラグメントを産生することができ、Ｎ末端およびＣ末端（３３ｋＤａ）またはＮ末端のみ（４５ｋＤａ）が短縮されることが示された。３３ｋＤａフラグメントと対照的に、４５ｋＤａフラグメントは依然として細菌に結合することができる。したがって、Ｃ末端は細胞結合に関与する。
【００３４】
さらに、修飾は、特に、例えばトリプトファン蛍光の測定によって直接検出することができることを目的とすることができる。例えば、ｐ１２は、５つのトリプトファンラジカルを有する。天然タンパク質の蛍光スペクトルは、これらのラジカルが広範に溶媒接近不可能であることを示す。複数の科学的研究から、エンドトキシンでも起こるように、芳香族アミノ酸はほとんどの場合糖ラジカルの結合に関与することが公知である。糖ラジカルのタンパク質への結合後にトリプトファン蛍光を消光することができるか、必要に応じてさらに蛍光極大を変更することができる。いくつかの研究から、天然のｐ１２の好ましくない蛍光分布により結合測定のためのｐ１２の蛍光特性の利用が妨害されることを推定することができる。ｐ１２の蛍光特性は、５つのトリプトファンラジカルに支配され、その蛍光は測定不可能な様式でのエンドトキシンの添加によって変化する。これらのデータから、チロシンラジカルはむしろ結合におけるトリプトファンラジカルとして関与し、そのシグナルの変化は高トリプトファンバックグランドによって視覚不可能になることが予想される。タンパク質分解の結果に基づいて、ｐ１２のＣ末端上の６つのチロシンにより同様に「視覚可能となる」ことができるエンドトキシン検出キットが可能である。５つのトリプトファンラジカルのチロシンへの選択的な分子生物学的交換により、１つのトリプロファンラジカルの蛍光シグナルの変化によるエンドトキシン結合が測定可能なように第１の工程で分光学的特性が特異的に変化する。その後、Ｃ末端領域中の６つのチロシンのうちの１つのトリプトファンラジカルへの特異的交換により、エンドトキシン検出キットの開発に魅力的なシグナルの相違を得るための測定可能なシグナルの強度が有意に増大する。
【００３５】
使用されるバクテリオファージテールタンパク質は、エンドトキシンの検出または排出（ｄｒａｗ  ｏｆｆ）のいずれを意図するかに依存する。今でさえ、前に記載の細菌の大部分に多数の公知のバクテリオファージが利用可能であり、本発明の方法で使用することができる。ファージおよび対応する宿主細菌は、特に以下の株寄託機関で得ることができる。ＡＴＣＣ（米国）、ＤＳＭＺ（ドイツ），ＵＫＮＣＣ（英国），ＮＣＣＢ（オランダ）、およびＭＡＦＦ（日本）。
【００３６】
好ましくは、本発明の方法のためのバクテリオファージテールタンパク質はバクテリオファージに由来し、その宿主細菌は、医薬品または生物工学に関して重要である（例えば、遺伝子治療用の組換えタンパク質または核酸の産生で使用されるＥ．ｃｏｌｉなど）。エンドトキシンの高度に保存された領域（例えば、コア領域または脂質Ａなど）に結合するバクテリオファージテールタンパク質が特に好ましい。特に、ｐ１２およびｐ１２に類似したバクテリオファージテールタンパク質が好ましい。種々の宿主細菌由来のエンドトキシン夾雑物の組み合わせでは、対応するエンドトキシン検出バクテリオファージテールタンパク質の組み合わせを使用することができる。
【００３７】
バクテリオファージテールタンパク質へのエンドトキシンの結合によってサンプル中またはサンプル由来のエンドトキシンを検出または枯渇させる。例えば、分光学的方法（例えば、蛍光発光、蛍光偏光、吸収、または円偏光二色性）による直接測定によってこの結合を検出することができる。さらに、電気シグナル（例えば、電気容量の測定）によって結合を視覚化することができる。さらに、バクテリオファージテールタンパク質へのエンドトキシンの結合を、置換実験によって間接的に検出することもできる。
【００３８】
本発明の検出のために、サンプル由来のバクテリオファージテールタンパク質−エンドトキシン複合体の分離が必要な場合、バクテリオファージテールタンパク質を適切なキャリア構造物（例えば、磁性粒子、アガロース粒子、マイクロタイタープレート、フィルター材料、またはスルーフロー細胞チャンバー（間接的検出））に結合することができる。キャリア構造は、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、セルロースアセテート、ニトロセルロース、ガラス、シリコン、またはアガロースを含んでもよい。例えば、吸着または共有結合によって結合することができる。
【００３９】
本発明の枯渇法のために、バクテリオファージテールタンパク質を恒久的キャリア（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ）に結合させる。恒久的キャリアは、クロマトグラフィカラムのための材料（例えば、セファロース材料、濾過媒体、ガラス粒子、磁性粒子、遠心分離材料、または沈殿材料（例えば、アガロース粒子））であってもよい。
【００４０】
本明細書では、機能的結合が重要である（すなわち、キャリア材料に結合するにもかかわらず、バクテリオファージテールタンパク質はエンドトキシンに接近可能な構造を有する）。例えば、選択的ビオチン化もしくは結合またはスペーサーもしくはリンカーによってバクテリオファージテールタンパク質を非特異的または好ましくは有向で結合することができる。
【００４１】
この目的のために、これらの低分子物質をポリペプチド（例えば、ストレプトアビジン）に結合させるために、バクテリオファージテールタンパク質をその一部がキャリア上に固定されている低分子物質（例えば、ビオチン）と架橋することができる。ビオチンの代わりに、短いアミノ酸配列であり、且つストレプトアビジンに結合するいわゆるＳｔｒｅｐ−タグ（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．＆Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１９９９），７９−８６）をさらに使用することができる。さらに、２価イオン（亜鉛またはニッケル）またはこれに特異的な抗体（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ）を介してキャリア物質に結合することができるＨｉｓ−タグを使用することができる。Ｓｔｒｅｐ−タグおよびＨｉｓ−タグを、ＤＮＡ組換え技術により組換えによって産生されたバクテリオファージタンパク質に結合させることが好ましい。例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端上に有向または非有向でこの結合を行うことができる。勿論ファージタンパク質中で頻繁に表面に曝露せず、適切な位置で特異的に移入されたシステインなどの適切な反応性アミノ酸を介して有向結合を行う。ファージテールタンパク質は細胞質中で合成されるので、ジスルフィド架橋に配慮する必要はない。好ましくは、他のアミノ酸を介するか、直接か、もしくは「スペーサー」または「架橋剤」（一官能性または二官能性）を介してシステインと間接的に結合させることもできる。
【００４２】
システイン結合の場合、介在スペーサー（例えば、１１−マレイミドウンデカン酸スルホＮＨＳまたはスクシニミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミノ］カプロン酸）を用いるか用いないで、ＮＨ反応基およびＳＨ反応基を有する全ての二官能性架橋剤が可能である。スペーサーが存在しない場合、末端ＮＨ基を含む８〜１２個のＣ原子スペーサーを挿入することができる。好ましくは、例えば、ＥＺ−リンク−ＰＥＯ−マレイミド活性化ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）によるシステインの特異的ビオチン化を介してシステインを結合させる。
【００４３】
２価イオン（例えば、Ｃａ2+またはＭｇ2+など）は、ｐ１２などのファージタンパク質へのエンドトキシンの結合に重要である。しかし、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどの適切なキレート剤の添加により、この結合を破壊することができる。結合のために、約０．１μＭ〜約１００ｍＭの範囲、特に好ましくは約０．１μＭ〜約１０ｍＭの範囲、特に好ましくは約０．１μＭ〜約１ｍＭの範囲、さらに特に好ましくは約１０μＭ〜１ｍＭの範囲のＣａ2+濃度が好ましい。１００ｎＭ下で１ｍＭ  ＥＤＴＡの添加によって２価イオン濃度が減少する場合、ｐ１２へのエンドトキシンの結合が破壊される。１０ｍＭを超えるＭｇ2+濃度によりｐ１２へのエンドトキシンの結合が減少し、解離定数の増加が顕著になる。Ｍｇ2+を添加せずに、５０ｎＭのＫd値が得られ、１０ｍＭ  Ｍｇ2+を含む緩衝液中で、１μＭのＫd値が測定された。亜鉛によりさらにより高い阻害効果が明らかとなった。１ｍＭ  ＺｎによりＫd値が１０μＭに増加する。ＨＥＤＴＡ、ＮＴＡ、または一般的なキレート剤／緩衝液（ＡＤＡ：Ｎ−[２−アセトアミド]−２−イミノジ酢酸；５−ＡＭＰ：アデノシン−５’−一リン酸；ＡＤＰ：アデノシン−５’−二リン酸；ＡＴＰ：アデノシン−５’−三リン酸；Ｂａｐｔａ：１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−四酢酸；クエン酸塩：クエン酸；ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸；ＥＧＴＡ：エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸；ＨＥＤＴＡ：Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸；ＮＴＡ：ニトリロ三酢酸；ＳＯ4硫酸）（２価イオンの緩衝液として使用することができる）などの物質によって２価または他のイオン（例えば、Ｃｕ2+、Ａｌ3+、Ｚｎ2+、Ｆｅ2+、Ｃａ2+、Ｂａ2+、Ｍｇ2+、Ｃｄ2+）を結合に最適な範囲の濃度に調整することができる。
【００４４】
したがって、本発明の方法は、さらなる洗浄工程を含み得る。直接もしくは間接的検出または枯渇のいずれかにはサンプルおよびバクテリオファージテールタンパク質の分離が必要であるので、洗浄工程を組み込むことができる。Ｃａ2+または他の金属イオン（例えば、Ｍｇ2+）が結合に不可欠であるので、適切な洗浄工程によって例えばｐ１２へのエンドトキシンの結合を破壊することができる。エンドトキシンがバクテリオファージテールタンパク質（例えば、ｐ１２）上で結合したままであることを意図する目的のために、無ＥＤＴＡ緩衝液で洗浄し、結合を破壊することを意図する場合、ＥＤＴＡ含有緩衝液で洗浄し、ＥＤＴＡ濃度は、少なくとも０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ超の範囲、好ましくは２ｍＭ〜５ｍＭの範囲である。
【００４５】
約５〜６０分もしくは約３０〜１８０分または必要に応じて一晩バクテリオファージテールタンパク質に対応して結合するキャリア材料とのサンプルのインキュベーション後に分離する。この目的のために、例えば、クロマトグラフィカラムからサンプルを溶離するか、濾過するか、対応する粒子を遠心分離または沈殿によって除去するか、磁界の印加によって磁気的に分離する。本明細書中に記載のバッチ法（すなわち、サンプルと対応するバクテリオファージテールタンパク質と結合するキャリア材料とのプレインキュベーション）により、特に非常に低濃度のエンドトキシンを感知することができる。
【００４６】
しかし、純粋なスルーフロー法でクロマトグラフィカラムを介したエンドトキシンの枯渇を行うこともできる。サンプルをこの目的のためのカラムに適用することができ、このカラムはキャリア材料とこれと結合したバクテリオファージテールタンパク質とを含む。流速は、カラムの体積および幾何学的性質に依存する。さらに、カラムとエンドトキシンとの間の接触時間をできるだけ長くすることによって低エンドトキシン濃度の場合でさえも有効に枯渇させるために、流速はサンプルの体積およびエンドトキシン含有量に依存する。それにより、接触時間は、サンプルのカラムへの適用から流出までに必要な時間である。
【００４７】
恒久的キャリアに結合するバクテリオファージテールタンパク質を再生するために、例えば、枯渇方法で分離工程を使用することができる。結果として、恒久的キャリア（例えば、マトリクス）を、クロマトグラフィカラムで再利用することができる。ＥＤＴＡまたは対応するキレート剤を含む適切な再生緩衝液による結合したエンドトキシンの除去によって再生する。ＥＤＴＡの場合、２ｍＭを超えるＥＤＴＡ濃度、特に１０ｍＭを超えるＥＤＴＡ濃度が好ましい。
【００４８】
イオン相互作用は基本的に常にイオン強度の変化に影響を受け得るので、溶液中の他の塩（例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌなど）の増減もまたバクテリオファージテールタンパク質へのエンドトキシンの結合に影響を与える可能性がある。
【００４９】
検出法で直接または間接的に視覚可能な結合を得るために、測定または改良することができるようにタンパク質を分子生物学的または生化学的に変化させることもできる。エンドトキシンを例えばｐ１２に結合させるために、チロシンラジカルのトリプトファンへの直接視覚可能な分子生物学的交換を行うことができる。それにより、チロシンを最初から含まれるトリプトファンと交換するためにシグナルバックグラウンドを減少させる必要があり得る。タンパク質含有溶液中でも測定することができるように、ｐ１２をトリプトファン導入後にさらに化学修飾することができる。それにより、トリプトファンラジカルは、その分光学的性質に関してＫｏｓｈｌａｎｄ試薬（２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロマイド）によって変化する。置換試験の場合、標識した（例えば、蛍光標識した）エンドトキシン（例えば、Ｓｉｇｍａ）を、サンプル中に存在するエンドトキシン（例えば、ｐ１２）と置換することができ、無蛍光エンドトキシン濃度を決定することができる。
【００５０】
本発明の方法を使用して、全ての水溶液中のエンドトキシンを検出するか、これらから除去することができる。これらの溶液は、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質−核酸複合体（例えば、ファージもしくはウイルスなど）、糖、ワクチン、薬物、透析緩衝液（薬物）、塩、エンドトキシン結合によって汚染されている他の物質を含むことが可能である。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、いわゆるタグ（例えば、Ｓｔｒｅｐ−タグまたはＨｉｓ−タグ）が好ましくはタンパク質のＮ末端またはＣ末端、特に好ましくはＣ末端に結合しているバクテリオファージタンパク質である。ＤＮＡ組換え技術によるタグのバクテリオファージタンパク質との結合または架橋が好ましい。バクテリオファージタンパク質およびタグの配列を含む核酸の産生および発現産物の産生は、最先端技術であり、本明細書中で個別に説明する必要はない。本発明のさらなる態様は、Ｓｔｒｅｐ−タグまたはＨｉｓ−タグと共にバクテリオファージタンパク質をコードする核酸配列である。Ｔ４ファージのｐ１２タンパク質は、Ｓｔｒｅｐ−タグまたはＨｉｓ−タグで修飾された特に好ましいバクテリオファージタンパク質であるが、細菌の検出および結合に関与するかこれらを担う全ての他のバクテリオファージタンパク質が同様に好ましい。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、特異的有向ビオチン化のための表面曝露システインを有するタグ（例えば、配列番号５、６、および７のタグ）を含むバクテリオファージタンパク質である。タグを有するｐ１２の例は、配列番号８に記載のアミノ酸配列である。タグ（特に表面曝露システインを含むタグ）を有するｐ１２、特に配列番号６および７のタグを有するｐ１２が好ましい。適切なスペーサーまたはリンカーによってこの有向ビオチン化をさらに付与することができる。さらに、本発明は、配列番号５、６、および７の配列を有するアミノ酸に関する。さらに、本発明は、配列番号５、６、および７の配列のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。
【００５３】
本発明の方法は、エンドトキシンの検出および精製方法に関し、対応する適用のパフォーマンスに優れた効果を発揮する。さらに、ＬＰＳコアオリゴ糖に対する抗体の産生は非常に困難であり、抗体に基づいた対応する方法は非常に高価となる。
【００５４】
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明を制限すると理解すべきではない。他で示さない限り、分子生物学的に標準的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載の方法など）を使用した。
【実施例１】
【００５５】
ガラス容器、プラスチック容器、および緩衝液
エンドトキシン除去のために、全てのガラス容器を、２００℃（４時間）での加熱によって発熱物質を除去し、発熱物質を全く含まないプラスチック材料（例えば、ピペットチップ、マイクロタイタープレート）を使用した。他の非加熱耐性装置または容器を、３％過酸化水素で処理するか、１％デオキシコール酸ナトリウムで洗浄した。その後、これらをエンドトキシンフリーの水でリンスした。十分にエンドトキシンを含まない緩衝液物質（Ｓｉｇｍａ）から緩衝液を作製し、エンドトキシンフリーの水と混合した。２００℃で加熱することができる塩（例えば、ＮａＣｌ）を加熱した（２００℃、４時間）。クロマトグラフィ精製で使用する緩衝液を脱気および濾過した。
【実施例２】
【００５６】
ＬＡＬ試験によるエンドトキシンの検出
製造者の説明書にしたがって呈色ＬＡＬ試験（リムルス変形細胞溶解物試験、Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ，チャールストン，アメリカ合衆国）を使用してエンドトキシン対照試験を行った。濃度を決定するために、０．００５〜５０または０．０２〜５０ＥＵ／ｍｌの範囲のエンドトキシン標準（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ，チャールストン，アメリカ合衆国）を使用した。温度制御マイクロタイタープレートリーダー（Ｇｅｎｉｏｓ，Ｔｅｃａｎ  ＧｍｂＨ）で４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【実施例３】
【００５７】
ｐ１２検出のためのウェスタンブロット
ウェスタンブロットによってビーズで処理したサンプルの残渣中またはアフィニティクロマトグラフィの画分中のｐ１２の検出を行った。ＮａＤＯＣ／ＴＣＡ沈殿（デオキシコール酸ナトリウム／テトラクロロアセテート）によって事前にある程度タンパク質を濃縮した。この目的のために１２％ＳＤＳゲルでの電気泳動によってサンプルを分離し、ＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。メンブレンをＰＢＳで３０分間洗浄し、５％粉乳でブロッキングし（１時間）、その後ポリクローナル抗ｐ１２抗体（１時間、１０００倍希釈）とインキュベートした。二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ）とのインキュベーション後、アルカリフォスファターゼに抱合されてＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム塩）でサンプルを発色させた。
【実施例４】
【００５８】
エンドトキシンの精製
Ｇａｌａｎｏｓ，Ｃ．，Ｌｕｅｄｅｒｉｔｚ，Ｏ．＆  Ｗｅｓｔｐｈａｌ，Ｏ．１９６９，Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９，２４５−２４９の詳説にしたがって、エンドトキシンを精製した。
【実施例５】
【００５９】
固定化ヨードアセチルラジカルへのｐ１２の特異的結合
表面へのｐ１２の有向結合を達成するために、実施例１２に記載のように配列番号５のＳｔｒｅｐ−タグの３位のアミノ酸セリンをシステインに置換し、好ましくはスルフヒドリルフリーラジカルに結合するヨードアセチルラジカルを介してタンパク質を固定した。得られたｐ１２をｐ１２Ｓ３Ｃと呼んだ。
【００６０】
１ｍｌ  Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｇｅｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を注ぎだし、６ｍｌの１％デオキシコール酸ナトリウムで洗浄し、６ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５））で平衡化した。その後、１ｍｌ  ｐ１２Ｓ３Ｃ（＝Ｎ−ｓｔｒｅｐＳ３Ｃｐ１２）を注入し（１〜１．５ｍｇ／ｍｌを含む結合緩衝液）、カラムを１５分間穏やかに撹拌し、さらに、撹拌なしで室温で３０分間インキュベートし、１ｍｌのｐ１２Ｓ３Ｃを再度注入し、インキュベーション工程を繰り返した。このｐ１２Ｓ３Ｃ結合を全部で４回繰り返し、その後カラムを６ｍｌ結合緩衝液で洗浄した。スルーフローを回収し、２８０ｎｍでの吸光度の測定によって各ｐ１２Ｓ３Ｃ濃度を決定した。１ｍｌのゲルあたり２．２〜２．８ｍｇのｐ１２Ｓ３Ｃを結合させた。その後、１ｍｌシステイン（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）中に５０ｍＭ）とのインキュベーション（４５分）によって過剰なヨードアセチルラジカルをブロッキングした。１６ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌおよび１６ｍｌの２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）でのカラムの洗浄後、カラムは使用状態にあった。
【００６１】
このゲルのタンパク質溶液からエンドトキシンを除去する能力を、ＢＳＡ（２〜４ｍｇ／ｍｌ）、炭酸脱水酵素（１〜２ｍｇ／ｍｌ）、およびリゾチーム（３〜４ｍｇ／ｍｌ）を用いて試験した。ＢＳＡおよびリゾチーム溶液に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ，チャールストン，アメリカ合衆国）またはＥ．ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（１００〜１０００ＥＵ／ｍｌ）由来のエンドトキシンを添加する一方で、炭酸脱水酵素には追加のエンドトキシンと混合しなかった。それぞれ０．５ｍｌのタンパク質溶液をカラムに導入し、室温で１時間インキュベートし、その後カラムを緩衝液で洗浄した。画分中にタンパク質を回収し、カラム前後のエンドトキシン含有量を呈色ＬＡＬ試験（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ，チャールストン，アメリカ合衆国）によって決定した。さらに、２８０ｎｍでの吸光度の測定によってタンパク質回収率を決定した。図２Ａに示すように、３つ全てのタンパク質溶液からほとんど全てのエンドトキシン（９３〜９９％）を除去することができた。さらに、タンパク質をカラムから十分に溶離することができた（８０〜９９％、図２Ｂ）。最後に、カラムを５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて再生した。ｐ１２の分離に起因するカラム通過後のタンパク質画分の夾雑物を除去するために、ウェスタンブロット技術によって画分をｐ１２について試験した。画分中にｐ１２を検出することができなかった。
【実施例６】
【００６２】
ＮＨＳ活性化キャリア材料へのｐ１２の非特異的結合
化合物由来のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を第１級アミノラジカルと置換し、これを使用して表面にタンパク質を結合させる。ＮＨＳ活性化セファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−活性化ＨＰ、１ｍｌ、アマシャム−ファルマシア−バイオテック）を最初に６ｍｌの氷冷１ｍＭ塩酸で洗浄した。その後、ｐ１２Ｓ３Ｃ（１．０〜３．５ｍｇ／ｍｌ）を含む１０〜１５ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）を、室温でカラム上に円形にポンピングした（流速０．８ｍｌ／分）。６０分後、スルーフローを画分中に回収し、カラムを６ｍｌ緩衝液で洗浄した。これらの画分から、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（５ｍｌ、アマシャム−ファルマシア−バイオテック）による溶液の脱塩によってＮＨＳを分離し、その後２８０ｎｍでの吸光度の測定によってｐ１２量を決定した。２０〜２５ｍｇのｐ１２Ｓ３Ｃがカラムに結合した。結合後に製造者の説明書に従って６ｍｌブロッキング緩衝液（０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３））および洗浄緩衝液（０．１Ｍ酢酸塩、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．０））でそれぞれ繰り返しカラムをリンスした。その後、カラムを、６ｍｌの使用可能な（ｕｓａｂｌｅ）緩衝液（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）または２０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５））で平衡化した。
【００６３】
リゾチーム溶液（３〜４ｍｇ／ｍｌを含む２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）または２０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５））を使用して、このカラムによるエンドトキシンの除去を試験した。リゾチーム溶液にＥ．ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（約５００ＥＵ／ｍｌ）由来のエンドトキシンを添加した。０．５ｍｌタンパク質溶液をカラムに導入し、室温で１時間インキュベートし、その後カラムを緩衝液で洗浄した。画分中にリゾチームを回収し、カラム前後のエンドトキシン含有量を呈色ＬＡＬ試験（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ，チャールストン，アメリカ合衆国）によって決定した。さらに、２８０ｎｍでの吸光度の測定によってタンパク質回収率を決定した。図３Ａに示すように、溶液から８５〜９０％のエンドトキシンが除去され、使用可能な緩衝液での洗浄によってカラムから８５〜９０％のリゾチームを再度溶離することができた（図３Ｂ）。その後、カラムを、６ｍｌの５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）および６ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。ｐ１２の分離に起因するカラム通過後のタンパク質画分の夾雑物を除去するために、ウェスタンブロット技術によって画分をｐ１２について試験した。画分中にｐ１２を検出することができなかった。
【実施例７】
【００６４】
スペーサーとしてジアミノエタンおよびＮ−スクシンイミジル−ヨードアセテート（ＳＩＡ）を介したＮＨＳ活性化キャリア材料カラムへのｐ１２の有向結合
クロマトグラフィキャリア材料への有向結合を達成するために、二官能性リンカーをＮＨＳ活性化表面に結合させ、リンカーによりｐ１２Ｓ３Ｃのその遊離システインおよび二官能性リンカーのヨードアセチルラジカルを介した結合が可能になる。
【００６５】
ＮＨＳ活性化セファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−活性化ＨＰ、１ｍｌ、アマシャム−ファルマシア−バイオテック）を最初に６ｍｌの氷冷１ｍＭ塩酸で洗浄し、その後１ｍｌエチレンジアミン（１０ｍｇ／ｍｌを含むＮａＨＣＯ3、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３））を注入し、カラムを室温で３０分間インキュベートした。エタノールアミン（０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３））での過剰なＮＨＳ基のブロッキングおよびカラムの洗浄（０．１Ｍ酢酸塩、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４．０））後、カラムを６ｍｌホウ酸緩衝液（５０ｍＭホウ酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．３））で平衡化した。その後、１０ｍｌのＮ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ、Ｐｉｅｒｃｅ、２００μｌのＳＩＡ親溶液を含む１０ｍｌホウ酸緩衝液；ＳＩＡ親緩衝液：１．４ｍｇのＳＩＡを含む１ｍｌのＤＭＳＯ）で、３０分間カラムを円状にリンスした。その後、カラムを６ｍｌホウ酸緩衝液で洗浄し、ｐ１２Ｓ３Ｃ（１ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｌを含むホウ酸緩衝液）でカラムを１時間リンスした。過剰なヨードアセチルラジカルを１ｍｌシステイン溶液（５ｍＭシステインを含むホウ酸緩衝液での室温で１５分間のインキュベーション）で中和し、使用可能な緩衝液（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）または５０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５））でカラムを平衡化した。ＳＩＡでの結合反応を暗所で行った。
【００６６】
リゾチーム溶液（３〜４ｍｇ／ｍｌを含む２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）または２０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．５））を使用して、このカラムによるエンドトキシンの除去を試験した。リゾチーム溶液にＥ．ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（約５００ＥＵ／ｍｌ）由来のエンドトキシンを添加した。０．５ｍｌタンパク質溶液をカラムに導入し、室温で１時間インキュベートし、その後カラムを緩衝液で洗浄した。画分中にリゾチームを回収し、カラム前後のエンドトキシン含有量を呈色ＬＡＬ試験（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ，チャールストン，アメリカ合衆国）によって決定した。さらに、２８０ｎｍでの吸光度の測定によってタンパク質回収率を決定した。図３Ａに示すように、溶液から９０％のエンドトキシンが除去され、使用可能な緩衝液での洗浄によってカラムから７５〜８５％のリゾチームを再度溶離することができた（図３Ｂ）。その後、カラムを、６ｍｌの５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）および６ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。ｐ１２の分離に起因するカラム通過後のタンパク質画分の夾雑物を除去するために、ウェスタンブロット技術によって画分をｐ１２について試験した。画分中にｐ１２を検出することができなかった。
【実施例８】
【００６７】
スルーフロー法におけるＢＳＡ溶液からのエンドトキシンの除去
製造者の説明書に従って、ＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳ活性化セファロース（アマシャムバイオサイエンス，ウプサラ  スウェーデン）を第１級アミノ基を介して非特異的にｐ１２と結合させた。それにより、８ｍｇのｐ１２／ｍｌゲル材料が共有結合的に固定された。したがって、得られた１ｍｌのクロマトグラフィカラムを、１ｍｌ／分の流速で１０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2）で平衡化した。次に、４ｍｌのＢＳＡ溶液（１１．５ｍｇ  ＢＳＡ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ，ドイツ）／ｍｌ緩衝液Ａ）を適用し（注入：Ｉ）、スルーフロー（Ｅ）を２．５ｍｌ画分に回収した。次いで、カラムを１５ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、カラムに結合したエンドトキシンを７ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で溶離した。洗浄および溶離時に、それぞれ２ｍｌの画分を回収した。各試験後、カラムを、２０ｍｌの緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）で再生した。製造者の説明書にしたがって、呈色リムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ，チャールストン，アメリカ合衆国）によってエンドトキシン濃度を決定した。ＵＶ吸収の測定によってタンパク質濃度を決定した。エンドトキシンの除去率は９５〜９９％であり、タンパク質の喪失は約６〜１０％であった。
【実施例９】
【００６８】
非特異的に結合したｐ１２による緩衝液からの小量のエンドトキシンの除去
２０ｍｌのＮＨＳ活性化セファロース４ＦａｓｔＦｌｏｗ（アマシャム  バイオサイエンス）を最初に氷冷塩酸で洗浄し、その後２９２ｍｇのｐ１２（７ｍｇ／ｍｌを含む２５ｍＭクエン酸（ｐＨ７．０））と撹拌しながら室温で４時間インキュベートした。その後、７×８０ｍｌの５ｍＭクエン酸（ｐＨ２．０）でセファロースを洗浄し、それぞれ１ｍｌの洗浄画分を５ｍＭクエン酸（ｐＨ２．０）に対して透析した。これらの透析物を使用して、２８０ｎｍでの吸光度の測定による洗浄画分中の過剰なｐ１２を定量した。１ｍｌセファロースあたりの８．７ｍｇのｐ１２の電荷密度を決定した。セファロースの１Ｍ  ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）との１２時間のインキュベーションによって非反応ＮＨＳラジカルを中和した。体積２ｍｌのカラムにこのカラム材料を充填し、これを使用するまで２０％４℃のエタノール中で保存した。
【００６９】
３つの並行試験では、それぞれ４ｍｌのエンドトキシン溶液（Ｓ）をカラムにアプライした（図９を参照のこと）。エンドトキシン溶液は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ，チャールストン，アメリカ合衆国）由来のエンドトキシンを含む平衡緩衝液（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2（ｐＨ７．５））を含んでいた。この溶液のエンドトキシン濃度は、４．６ＥＵ／ｍｌであった。
【００７０】
カラムを最初に１２ｍｌの再生緩衝液（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））でリンスし、その後１２ｍｌの平衡化緩衝液でリンスした。その後、平衡化緩衝液をカラムに再度導入し、１ｍｌを分画した。
【００７１】
エンドトキシン溶液をカラム（Ｉ）上にアプライし、５ｍｌおよび２ｍｌの画分を回収した。その後、カラムを４ｍｌ再生緩衝液（Ｂ）で再生した。スルーフロー画分では、エンドトキシンを検出することができなかった（すなわち、３つ全ての試験においてエンドトキシン夾雑物を完全に除去することができた）。
【実施例１０】
【００７２】
ビオチン化ｐ１２の磁性ストレプトアビジンビーズへの非特異的結合
ｐ１２（３ｍｇ／ｍｌを含むＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）と１：１０〜１：２０の比にて室温で１時間インキュベートし、その後緩衝液（例えば、ＰＢＳまたは２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））に対して透析した。それによりＮＨＳ活性化ビオチンはｐ１２の第１級アミノラジカルに結合する。その後、５０μｌのビオチン化ｐ１２（１ｍｇ／ｍｌ）を、１ｍｌストレプトアビジンビーズ（ＭａｇＰｒｅｐストレプトアビジンビーズ、Ｍｅｒｃｋ）に添加し、室温で２時間撹拌し、１．５ｍｌの２０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）での４回の洗浄によって過剰のｐ１２を除去した。
【００７３】
緩衝液（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））およびタンパク質溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム、０．１ｍｇ／ｍｌ  炭酸脱水酵素を含む２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））を使用して、エンドトキシン除去を試験した。緩衝液およびＢＳＡおよびリゾチーム溶液に５ＥＵ／ｍｌ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５由来のエンドトキシン、Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ，チャールストン，アメリカ合衆国）を添加した。炭酸脱水酵素溶液は、約１ＥＵ／ｍｌを含んでいた。固定化ｐ１２を含む２５μｌの磁性ビーズを、２００μｌ緩衝液またはタンパク質溶液に添加し、上下にピペッティングすることによって混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁石によって溶液からビーズを取り出し、残渣をピペットで除去した。その後、未処理サンプルおよびビーズとインキュベートしたサンプルのエンドトキシン含有量を、ＬＡＬ試験を使用して決定し、タンパク質回収率を２８０ｎｍでの吸光度の測定によって決定した。緩衝液からエンドトキシンを実質的に完全に除去することができ（９９．９％エンドトキシン除去、図４Ａ）、エンドトキシンはまたタンパク質溶液から７０〜９２％枯渇した（図４Ｂ）。タンパク質回収率は、５７％と９９％との間であった（ＢＳＡ：８７％、炭酸脱水酵素：９９％、リゾチーム５７％；図４Ｂ）。
【実施例１１】
【００７４】
固定化ストレプトアビジンへのビオチン化ｐ１２の非特異的結合
ｐ１２（３ｍｇ／ｍｌを含むＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）と１：１０〜１：２０の比にて室温で１時間インキュベートし、その後緩衝液（例えば、ＰＢＳまたは２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））に対して透析した。それにより、ＮＨＳ活性化ビオチンは、ｐ１２の第１級アミノラジカルに結合する。その後、ビオチン化ｐ１２を、ストレプトアビジンを負荷したクロマトグラフィ材料（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ固定化ストレプトアビジン、６％架橋アガロースビーズ）と室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳでの洗浄によって過剰なｐ１２を除去する。
【００７５】
緩衝液（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））およびＢＳＡ（０．５ｍｇ／ｍｌを含む２０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を使用してエンドトキシン除去を試験した。１ｍｌ緩衝液またはＢＳＡ溶液それぞれに１０ＥＵ／ｍｌを添加し、５０μｌのｐ１２アガロースを添加し、室温で１時間撹拌した。その後、ｐ１２アガロースを遠心分離よって除去し、残渣中のエンドトキシンおよびタンパク質の濃度を測定した。緩衝液から９９％のエンドトキシンを除去することができ、ＢＳＡ溶液から８６％を除去することができた（図５）。ＢＳＡの回収率は９０％までであった。
【実施例１２】
【００７６】
表面プラズモン共鳴測定によるｐ１２エンドトキシン結合による試験
細胞外膜中のリポ多糖を介したエンドトキシンまたは細菌へのｐ１２の結合を、表面プラズモン共鳴測定（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｊ）によって試験した。解離定数（Ｋd）を決定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５（Ｓｉｇｍａ）由来のエンドトキシンを製造者の説明書にしたがって疎水性ＨＰＡチップ上に固定し、種々の濃度でｐ１２を注射した（図６Ａ）。相対「応答単位」（ＲＵ）において結合を測定し、結合したｐ１２の濃度に対して平衡値をプロットした（図６Ｂ）。これらのデータへのラングミュア吸着等温式（ＲＵ＝（ＲＵmax*［ｐ１２］）／（［ｐ１２］＋Ｋd））の適合により、Ｋd値を決定した（表１）。測定のためにエンドトキシンフリーの緩衝液を使用した。６と１０との間のｐＨ値について１０-7〜１０-9Ｍの範囲のＫd値を決定した（表１）。１ｍＭまたは５ｍＭのＥＤＴＡの注入によって再度結合を破壊し、チップを再生させた。
【００７７】
【表１】
2005530991.tif 000003
【００７８】
細菌のｐ１２への結合を試験するために、ストレプトアビジンチップ上にビオチン化ｐ１２を固定し、種々のＥ．ｃｏｌｉ株に注射した。測定のために細菌をＰＢＳ中に取り込んだ。異なる多糖組成のリポ多糖を有するＥ．ｃｏｌｉ株を使用した。多糖部分は、脂質ＡおよびいわゆるＯ抗原に架橋した「コア」領域を含む。Ｏ抗原は、細菌型および細菌株の相違により非常に異なるが、「コア」領域は高度に保存されている。「コア」領域およびＯ抗原を有する株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）および完全な「コア」領域を有する株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｄ２１）はｐ１２に結合するが、非常に短い「コア」領域を有する株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｄ２１ｆ２）はもはやｐ１２によって検出されなかった（図６Ｃ）。ＥＤＴＡ（５ｍＭ）によって結合を破壊し、チップを再生することができた。
【実施例１３】
【００７９】
組換えｐ１２構築物
１．Ｎ末端Ｓｔｒｅｐ−タグを含むｐ１２（Ｎ−ｓｔｒｅｐ−ｐ１２）の構築：ＰＣＲによって、Ｓｔｒｅｐ−タグのヌクレオチド配列（米国特許第５，５０６，１２１号）を、Ｔ４ｐ１２遺伝子の５’末端に導入した。この目的のために、その５’末端にＳｔｒｅｐ−タグのヌクレオチド配列（配列中の斜体）を含み、右側のリーディンググリッド中の遺伝子を発現プラスミドに挿入することができるように接着末端（ＮｄｅＩ、配列中の下線部）を有するｐ１２遺伝子の５’末端のプライマー（５’−ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＧＴＴ−３’（配列番号１））を構築した。ｐ１２遺伝子の３’末端について、ｐ１２遺伝子の後ろにＢａｍＨＩ接着末端（配列中の斜体）を移入したプライマー（５’−ＡＣＧ  ＣＧＣ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＡＴ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＧＴＴ−３’），（配列番号２））を構築した。ＰＣＲを４０サイクル行った（９５℃で１分、４５℃で１分、７２℃で１分）。ＰＣＲバッチを制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲルでのサイズ分画およびゲルからの溶離後、所望のフラグメントと発現プラスミドｐＥＴ２１ａのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。Ｎ−ｓｔｒｅｐ−ｐ１２遺伝子配列を、ＤＮＡ配列決定によってその精度についてチェックした。Ｔ４ｐ１２ｐ５７についてＢｕｒｄａ，Ｍ．Ｒ．＆Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９  ２６５（２），７７１−７７８）に記載のように、プラスミドｐＮＳ−Ｔ４ｐ１２ｐ５７のためのさらなる工程を行った。次いで、プラスミドｐＮＳ−Ｔ４ｐ１２ｐ５７を、発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【００８０】
２．Ｎ−ｓｔｒｅｐ−ｐ１２中のＮ末端システインラジカルの挿入（Ｎ−ｓｔｒｅｐ−Ｓ３Ｃ−ｐ１２およびＮ−ｓｔｒｅｐ−Ｓ１４Ｃ−ｐ１２）：１に記載のようにＮ末端システインラジカルの挿入を行い、この目的のために５’末端の２つの新規のプライマーを構築した。Ｎ−ｓｔｒｅｐ−Ｓ３Ｃ−ｐ１２のためにプライマー５’−ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＧＴＴ−３’（配列番号３）を使用し、Ｎ−ｓｔｒｅｐ−Ｓ１４Ｃ−ｐ１２のためにプライマー５’−ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＧＴＴ−３’（配列番号４）を使用した。
【００８１】
３．Ｎ−ｓｔｒｅｐ−ｐ１２タンパク質の精製：プラスミドｐＮＳ−Ｔ４ｐ１２ｐ５７を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株（ＤＥ３）を、３７℃の２Ｌの撹拌培養物（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地）から取り出し（０．５〜０．７のＯＤ６００まで）、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオ−ガラクトピラノシド）の添加によってＮ−ｓｔｒｅｐ−ｐ１２−タンパク質の発現を誘導した。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞を回収した。回収した１０Ｌの培養物由来の細胞を、５０ｍｌのリン酸ナトリウム、２０ｍＭ（ｐＨ７．２）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に取り出し、フレンチプレス処理（２０，０００ｐｓｉ）によって３回破壊し、その後、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離により除去した（ＳＳ３４）。同一の緩衝液での２回の洗浄後、Ｎ−ｓｔｒｅｐ−ｐ１２タンパク質をペレットから抽出し、４０ｍＭ  ｔｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中での３０分の撹拌によってペレットを３回抽出し、バッチを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し（ＳＳ３４）、溶解したＮＳ−ｐ１２を残渣中４℃で保存した。抽出を２回繰り返し、合わせた残渣を、緩衝液「Ｗ」（１００ｍＭ  ｔｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化したＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎアフィニティカラム（１５ｍｌ）にアプライした（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）。５カラム体積の緩衝液「Ｗ」での洗浄後、２．５ｍＭデチオビオチンを含む緩衝液「Ｗ」を含む３体積の緩衝液「Ｗ」で溶離した。緩衝液「Ｗ」に対する複数回の透析および濃縮後、Ｎ−ｓｔｒｅｐ−Ｔ４ｐ１２の濃度および純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＵＶ分光法によって決定した（Ｂｕｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。したがって、１０リットルの培養物から約１００ｍｇのＮ−ｓｔｒｅｐ−Ｔ４ｐ１２が精製された。
【００８２】
【表２】
2005530991.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１：Ｂ４由来のエンドトキシンの化学構造の概観を示す図である。Ｈｅｐ＝Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース；Ｇａｌ＝ガラクトース；Ｇｌｃ＝グルコース、ＫＤＯ＝２−ケト−３−デオキシオクタナート；ＮＧａ＝Ｎ−アセチル−ガラクトサミン；ＮＧｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン。
【図２】スルフヒドリルラジカルを介して固定されたＮＳｔｒｅｐＳ３Ｃｐ１２を有するクロマトグラフィカラムを使用した試験結果を示す図である。（Ａ）タンパク質溶液からのエンドトキシン除去：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）、およびリゾチーム（Ｌｙｓ）をカラム上で１時間インキュベートし、その後緩衝液で溶離した。ＬＡＬ試験を使用してカラム前後のエンドトキシン濃度を測定し、それらから除去率を計算した。（Ｂ）タンパク質回収率：出発溶液およびカラム後の画分のタンパク質濃度を、２８０ｎｍの吸光度の測定によって決定し、それらからタンパク質回収率を決定した。
【図３】「非有向」（１）および「有向」（２）固定ｐ１２を含むクロマトグラフィカラムを介したリゾチーム溶液からのエンドトキシン除去を示す図である。両方の場合、ｐ１２Ｓ３ＣをＮＨＳ活性化カラムに結合させた。ＮＨＳ基との反応によってキャリア物質と共有結合化合物を生成するｐ１２Ｓ３Ｃの第１級アミノラジカルを介して「非有向」固定を行った。ジアミノエタンおよびＳＩＡ（Ｎ−スクシニミジル−ヨードアセテート）によってＮ末端システインを介したｐ１２Ｓ３Ｃの「有向」架橋を行った。（Ａ）エンドトキシン除去率。（Ｂ）タンパク質回収率。
【図４】ストレプトアビジンを介して磁性ビーズに結合したビオチン化ｐ１２を使用した試験の結果を示す図である。（Ａ）緩衝液（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））およびタンパク質溶液からのエンドトキシンの枯渇を、ＬＡＬ試験によって決定した。（Ｂ）吸収測定によってタンパク質溶液についてタンパク質回収率を決定した。磁石分離装置によって溶液からビーズを分離した。ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン。ＣＡ：炭酸脱水酵素。Ｌｙｓ：リゾチーム。
【図５】ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介したアガロースビーズ上に固定したｐ１２でのエンドトキシン除去の結果を示す図である。遠心分離によって固定化ｐ１２を分離した。緩衝液（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））およびＢＳＡ溶液からのエンドトキシンの除去を、出発溶液および残渣のエンドトキシン濃度によって決定した。
【図６】表面プラズモン共鳴測定の結果を示す図である。（Ａ）種々のｐ１２濃度（ ）（それぞれμｇ／ｍｌ：１００；２５；６．２５；４；１．５６；０．４）の注射の応答として測定した共鳴曲線。疎水性ＨＰＡチップ上に固定したＥ．ｃｏｌｉ  Ｄ２１ｆｌ由来のエンドトキシン上に結合させる。ｐ１２およびＥＤＴＡ（５ｍＭ）の注射を、曲線状のバーによって印をつける。緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）。（Ｂ）固定化エンドトキシンへのｐ１２の結合についての平衡共鳴値を、ｐ１２の注射開始から約６００秒後に測定し、ｐ１２結合濃度に対してプロットした。連続的ラインは、データへのラングミュア吸着等温式（ＲＵ＝ＲＵmax*［ｐ１２］／［ｐ１２］＋Ｋd）の適合を示す。（Ｃ）ストレプトアビジンチップ上に固定したビオチン化ｐ１２へのＥ．ｃｏｌｉの結合。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｄ２１ｅ８（ ）（完全な内部コア領域）はｐ１２に結合する。対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｄ２１ｆ２（−−−）（非常に短くしたコア領域）はｐ１２に結合しない。ＰＢＳ中で測定した。
【図７】種々のＥ．ｃｏｌｉ変異体のエンドトキシンコア領域構造の略図である。
【図８】クロマトグラフィカラムスルーフロー法によるエンドトキシン枯渇の結果の略図である。Ｅは平衡化緩衝液（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2（ｐＨ７．５））を意味し、Ａは洗浄緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2（ｐＨ７．５））を意味し、Ｂは溶離緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５））を意味し、Ｃは再生緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  ＮａＤＯＣ（ｐＨ７．５））を意味し、Ｓは出発溶液中のタンパク質およびエンドトキシンの濃度を意味する。ＢＳＡはウシ血清アルブミンを意味する。ＥＵはエンドトキシン単位を意味する。４ｍｌの出発溶液（Ｓ）の注射（Ｉ）後、１５ｍｌの洗浄緩衝液で再度リンスし、スルーフローを分画した（適用中それぞれ２．５ｍｌおよび洗浄中それぞれ２ｍｌ）。その後、カラムを緩衝液ＢおよびＣで再生し、同様に画分中に流出物を回収した（それぞれ２ｍｌ）。図で明らかなように、注射後最初の３〜５画分中にＢＳＡが認められた。これらの画分中のエンドトキシンの含有量は、出発溶液の１／１００であった。次いで、カラムに結合したエンドトキシンを緩衝液ＢおよびＣを使用してカラムから洗い流した。
【図９】スルーフロー法における僅かに汚染した緩衝液（５ＥＵ／ｍｌ）からのエンドトキシン除去の結果の略図である。ＮＨＳ活性化セファロース４  ＦａｓｔＦｌｏｗ（アマシャム  バイオサイエンス，ウプサラ，スウェーデン）に非有向でｐ１２を固定し（８ｍｇ  ｐ１２／１ｍｌセファロース）、３つのカラムをそれぞれ２ｍｌカラム体積で満たした。３つのカラムで平衡して試験を行った。サンプルの適用前に、それぞれ１ｍｌの平衡化緩衝液（２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2（ｐＨ７．５））を回収し、その後サンプル（Ｓ：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｂ５由来のエンドトキシンを含む平衡化緩衝液、４．６ＥＵ／ｍｌ）を注射し（Ｉ）、５ｍｌおよび２ｍｌの画分を回収した。４ｍｌ再生緩衝液（Ｂ：２０ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  ＮａＤＯＣ（ｐＨ７．５））の添加によってカラムの再生を行った。ＬＡＬ試験（速度発色ＬＡＬ試験、Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃ．）によってエンドトキシン濃度を決定した。３つ全ての試験でエンドトキシン夾雑物を完全に除去することができた（すなわち、スルーフロー中のエンドトキシン濃度は検出限度未満（＜０．００５ＥＵ／ｍｌ）であった）。
【配列表】
2005530991.tif 000005
2005530991.tif 000006
2005530991.tif 000007
2005530991.tif 000008
【図１】
2005530991.tif 000009
【図２】
2005530991.tif 000010
【図３】
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【図４】
2005530991.tif 000012
【図５】
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【図６】
2005530991.tif 000014
【図７】
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【図８】
2005530991.tif 000016
【図９】
2005530991.tif 000017
【国際調査報告】
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2005530991.tif 000022
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