(57)【要約】本発明は、小規模ミルまたは微小流体工学を用いて、難溶性の候補化合物の粒子径を約1ミクロンまたはそれより小さい大きさまで減少させることを含む、高スループットスクリーニング（HTS）法に向けられる。このプロセスによって産生された産物は、化合物の表面に吸着した一つまたは複数の表面安定化剤を有するナノ粒子候補化合物の分散物である。粒子径の減少によって、化合物の溶解度および／または分散性の増加が起こり、したがって、粒子径減少プロセスと共に行われるHTSの有効性が増加する。粒子径の減少プロセスは、スクリーニング化合物を可溶性および／または分散性にするためにHTSの前に行うことができ、またはスクリーニングの後に活性であることが決定された不溶性または難溶性の化合物を有効にするためにHTSの後に行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、高スループットスクリーニング法：
（a）摩耗製粉媒体の存在下で小規模ミルにおいて一つまたは複数の候補化合物の粒子径を減少させる段階であって、
（1）候補化合物が難溶性である液体分散媒体において一つまたは複数の候補化合物が製粉される；
（2）製粉された一つまたは複数の候補化合物が約1ミクロン未満の有効平均粒子径を有する；且つ
（3）少なくとも一つの表面安定化剤が、粒子径減少の前後のいずれかに、一つまたは複数の候補化合物の有効平均粒子径を粒子径減少後に約1ミクロン未満に維持するために十分な量で液体分散媒体に加えられる、段階；および
（b）一つまたは複数の化合物が所望の活性を有するか否かを決定するために、通常の高スループットスクリーニングアッセイ法において一つまたは複数のナノ粒子候補化合物をスクリーニングする段階。
【請求項２】
摩耗製粉媒体がポリマーである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
摩耗製粉媒体が約500ミクロンまたはそれ未満、約200ミクロンまたはそれ未満、約50ミクロンまたはそれ未満、およびその混合物からなる群より選択される粒子径を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
高スループットスクリーニングアッセイ法が酵素または全細胞アッセイ法である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
段階（a）からのナノ粒子候補化合物の分散物が、段階（b）の高スループットスクリーニングアッセイ法において直接用いられる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
分散媒体が水、塩水溶液、ベニバナ油、エタノール、t-ブタノール、ヘキサン、およびグリコールからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
高スループットスクリーニングアッセイ法が手動または自動である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
二つまたはそれ以上の候補化合物の混合物の大きさが段階（a）において減少する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
二つまたはそれ以上の候補化合物の混合物が段階（b）においてスクリーニングされる、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
候補化合物の液体分散媒体における溶解度が約10 mg/ml未満である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
候補化合物の液体分散媒体における溶解度が約1 mg/ml未満である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
候補化合物を難溶性にするために、候補化合物が塩または他の物質に結合される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
候補化合物が、疎水性分子、両親媒特性を有する分子、脂質分子、燐脂質分子、脂肪、プレニル基、およびパルミトイル基からなる群より選択される物質に結合される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記結合が、化合物上の特定の部位に対する直接結合、中間的なスペーサー分子による化合物のN末端またはC末端残基に対する結合、および化合物上の内部側鎖を通しての結合からなる群より選択される方法によって行われる、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
候補化合物が、化合物の化学合成または生物学的発現のいずれかの際のアミノ酸残基の付加によって難溶性となる、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
分散媒体のpHを調整することによって、候補化合物が難溶性となる、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
候補化合物が、治療物質、化粧品、診断物質、バイオエンジニアリングにおいて有用な物質、および農業用物質からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
候補化合物が、農薬、肥料、殺虫剤、および除草剤からなる群より選択される農業用物質である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
段階（a）を行う時間と段階（b）を行うまでの時間が1年までに及ぶ、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
候補化合物が、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約25％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満、約0.5％未満、約0.1％未満、約0.01％未満、および約0.001％未満からなる群より選択される濃度で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
候補化合物が、候補化合物および表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、重量で約90％〜約0.001％、約90％〜約0.1％、および約60％〜約5％からなる群より選択される量で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
粒子径減少プロセスにとって必要な候補化合物の量が、約100 mg未満、約90 mg未満、約80 mg未満、約70 mg未満、約60 mg未満、約50 mg未満、約40 mg未満、約30 mg未満、約25 mg未満、約20 mg未満、約15 mg未満、約10 mg未満、約5 mg未満、約4 mg未満、約3 mg未満、約2 mg未満、および約1 mg未満からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
粒子径減少プロセスにとって必要な総分散容積が、約15 ml未満、約10 ml未満、約9 ml未満、約8 ml未満、約7 ml未満、約6 ml未満、約5 ml未満、約4 ml未満、約3 ml未満、および約2 ml未満からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
粒子径の減少プロセスのために必要な時間が、約1時間またはそれ未満、約45分またはそれ未満、約40分またはそれ未満、約35分またはそれ未満、約30分またはそれ未満、約25分またはそれ未満、約20分またはそれ未満、約15分またはそれ未満、約10分またはそれ未満、および約5分またはそれ未満からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも一つの表面安定化剤が、候補化合物と表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、重量で約0.01％〜約90％、約1％〜約90％、および約5％〜約90％からなる群より選択される量で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一つの表面安定化剤が、ゼラチン、カゼイン、レシチン、デキストラン、アカシアゴム、コレステロール、トラガカント、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセロール、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ロウ、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシエチレン、コロイド状二酸化珪素、燐酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、非結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、チロキサポル、ポロキサマー、ポロキサミン、テトロニック1508（登録商標）、スルホコハク酸ナトリウムのジアルキルエステル、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールポリエーテルスルホネート、ステアリン酸蔗糖とジステアリン酸蔗糖の混合物、p-イソノニルフェノキシポリ-(グリシドール)、クロデスタスSL-40（登録商標）、C18H37CH2C(O)N(CH3)-CH2(CHOH)4(CH2OH)2であるSA9OHCO、デカノイル-N-メチルグルカミド、n-デシルβ-D-グルコピラノシド、n-デシルβ-D-マルトピラノシド、n-ドデシルβ-D-グルコピラノシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、ヘプタノイル-N-メチルグルカミド、n-ヘプチル-β-D-グルコピラノシド、n-ヘプチル-β-D-チオグルコシド、n-ヘキシル-β-D-グルコピラノシド、ノナノイル-N-メチルグルカミド、n-ノイルβ-D-グルコピラノシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド、オクチル-β-D-チオグルコピラノシド、PEG-ホスホリピッド、PEG-コレステロール、PEG-コレステロール誘導体、PEG-ビタミンA、PEG-ビタミンE、ライソザイム、および酢酸ビニルとビニルピロリドンとのランダムコポリマーからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
候補化合物が、約900 nm未満、約800 nm未満、約700 nm未満、約600 nm未満、約500 nm未満、約400 nm未満、約300 nm未満、約250 nm未満、約200 nm未満、約150 nm未満、約100 nm未満、および約50 nm未満からなる群より選択される有効平均粒子径に減少される、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
候補化合物粒子の少なくとも60％、70％、80％、90％、または95％が有効平均粒子径未満に粒子径が減少される、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
以下の段階を含む、高スループットスクリーニング法：
（a）ホモジナイゼーションを用いて一つまたは複数の候補化合物の粒子径を減少させる段階であって、
（1）候補化合物が難溶性である液体分散媒体において一つまたは複数の候補化合物の大きさを減少させる；
（2）ホモジナイズされた一つまたは複数の候補化合物が約1ミクロン未満の有効平均粒子径を有する；且つ
（3）少なくとも一つの表面安定化剤が、粒子径減少の前後のいずれかに、一つまたは複数の候補化合物の有効平均粒子径を粒子径減少後に約1ミクロン未満に維持するために十分な量で液体分散媒体に加えられる、段階；および
（b）一つまたは複数の化合物が所望の活性を有するか否かを決定するために、通常の高スループットスクリーニングアッセイ法において一つまたは複数のナノ粒子候補化合物をスクリーニングする段階。
【請求項３０】
一つまたは複数の候補化合物が摩耗媒体の存在下でホモジナイズされる、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
摩耗媒体がポリマーである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
摩耗媒体が約500ミクロンまたはそれ未満、約200ミクロンまたはそれ未満、約50ミクロンまたはそれ未満、およびその混合物からなる群より選択される粒子径を有する、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
高スループットスクリーニングアッセイ法が酵素または全細胞アッセイ法である、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
段階（a）からのナノ粒子候補化合物の分散物が、段階（b）の高スループットスクリーニングアッセイ法において直接用いられる、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
分散媒体が、水、塩水溶液、ベニバナ油、エタノール、t-ブタノール、ヘキサン、およびグリコールからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
高スループットスクリーニングアッセイ法が手動または自動である、請求項29記載の方法。
【請求項３７】
二つまたはそれ以上の候補化合物の混合物の大きさが段階（a）において減少する、請求項29記載の方法。
【請求項３８】
二つまたはそれ以上の候補化合物の混合物が段階（b）においてスクリーニングされる、請求項29記載の方法。
【請求項３９】
候補化合物の液体分散媒体における溶解度が約10 mg/ml未満である、請求項29記載の方法。
【請求項４０】
候補化合物の液体分散媒体における溶解度が約1 mg/ml未満である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
候補化合物を難溶性にするために、候補化合物が塩または他の物質に結合される、請求項29記載の方法。
【請求項４２】
候補化合物が、疎水性分子、両親媒特性を有する分子、脂質分子、燐脂質分子、脂肪、プレニル基、およびパルミトイル基からなる群より選択される物質に結合される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記結合が、化合物上の特定の部位に対する直接結合、中間的なスペーサー分子による化合物のN末端またはC末端残基に対する結合、および化合物上の内部側鎖を通しての結合からなる群より選択される方法によって行われる、請求項41または42に記載の方法。
【請求項４４】
候補化合物が、化合物の化学合成または生物学的発現のいずれかの際のアミノ酸残基の付加によって難溶性となる、請求項29記載の方法。
【請求項４５】
分散媒体のpHを調整することによって、候補化合物が難溶性となる、請求項29記載の方法。
【請求項４６】
候補化合物が、治療物質、化粧品、診断物質、バイオエンジニアリングにおいて有用な物質、および農業物用質からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項４７】
候補化合物が、農薬、肥料、殺虫剤、および除草剤からなる群より選択される農業用物質である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
段階（a）を行う時間と段階（b）を行うまでの時間が1年までに及ぶ、請求項29記載の方法。
【請求項４９】
候補化合物が、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約25％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満、約0.5％未満、約0.1％未満、約0.01％未満、および約0.001％未満からなる群より選択される濃度で存在する、請求項29記載の方法。
【請求項５０】
候補化合物が、候補化合物および表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、重量で約90％〜約0.001％、約90％〜約0.1％、および約60％〜約5％からなる群より選択される量で存在する、請求項29記載の方法。
【請求項５１】
粒子径減少プロセスにとって必要な候補化合物の量が、約100 mg未満、約90 mg未満、約80 mg未満、約70 mg未満、約60 mg未満、約50 mg未満、約40 mg未満、約30 mg未満、約25 mg未満、約20 mg未満、約15 mg未満、約10 mg未満、約5 mg未満、約4 mg未満、約3 mg未満、約2 mg未満、および約1 mg未満からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項５２】
粒子径減少プロセスにとって必要な総分散容積が、約15 ml未満、約10 ml未満、約9 ml未満、約8 ml未満、約7 ml未満、約6 ml未満、約5 ml未満、約4 ml未満、約3 ml未満、および約2 ml未満からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項５３】
粒子径の減少プロセスのために必要な時間が、約1時間またはそれ未満、約45分またはそれ未満、約40分またはそれ未満、約35分またはそれ未満、約30分またはそれ未満、約25分またはそれ未満、約20分またはそれ未満、約15分またはそれ未満、約10分またはそれ未満、および約5分またはそれ未満からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも一つの表面安定化剤が、候補化合物と表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、重量で約0.01％〜約90％、約1％〜約90％、および約5％〜約90％からなる群より選択される量で存在する、請求項29記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも一つの表面安定化剤が、ゼラチン、カゼイン、レシチン、デキストラン、アカシアゴム、コレステロール、トラガカント、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセロール、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ロウ、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシエチレン、コロイド状二酸化珪素、燐酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、非結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、チロキサポル、ポロキサマー、ポロキサミン、テトロニック1508（登録商標）、スルホコハク酸ナトリウムのジアルキルエステル、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールポリエーテルスルホネート、ステアリン酸蔗糖とジステアリン酸蔗糖の混合物、p-イソノニルフェノキシポリ-(グリシドール)、クロデスタスSL-40（登録商標）、C18H37CH2C(O)N(CH3)-CH2(CHOH)4(CH2OH)2であるSA9OHCO、デカノイル-N-メチルグルカミド、n-デシルβ-D-グルコピラノシド、n-デシルβ-D-マルトピラノシド、n-ドデシルβ-D-グルコピラノシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、ヘプタノイル-N-メチルグルカミド、n-ヘプチル-β-D-グルコピラノシド、n-ヘプチル-β-D-チオグルコシド、n-ヘキシル-β-D-グルコピラノシド、ノナノイル-N-メチルグルカミド、n-ノイルβ-D-グルコピラノシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド、オクチル-β-D-チオグルコピラノシド、PEG-ホスホリピッド、PEG-コレステロール、PEG-コレステロール誘導体、PEG-ビタミンA、PEG-ビタミンE、ライソザイム、および酢酸ビニルとビニルピロリドンのランダムコポリマーからなる群より選択される、請求項29記載の方法。
【請求項５６】
候補化合物が、約900 nm未満、約800 nm未満、約700 nm未満、約600 nm未満、約500 nm未満、約400 nm未満、約300 nm未満、約250 nm未満、約200 nm未満、約150 nm未満、約100 nm未満、および約50 nm未満からなる群より選択される有効平均粒子径に減少される、請求項29記載の方法。
【請求項５７】
候補化合物粒子の少なくとも60％、70％、80％、90％、または95％が、有効平均粒子径未満の粒子径に減少される、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
以下の段階を含む高スループットスクリーニング法：
（a）一つまたは複数の化合物が所望の活性を有するか否かを決定するために、通常の高スループットスクリーニングアッセイ法において一つまたは複数の候補化合物をスクリーニングする段階；および
（b）摩耗製粉媒体の存在下で小規模ミルにおいて一つまたは複数の候補化合物の粒子径を減少させる段階であって、
（1）候補化合物が難溶性である液体分散媒体において一つまたは複数の候補化合物が製粉される；
（2）製粉された一つまたは複数の候補化合物が約1ミクロン未満の有効平均粒子径を有する；且つ
（3）少なくとも一つの表面安定化剤が、粒子径減少の前後のいずれかに、一つまたは複数の候補化合物の有効平均粒子径を粒子径減少後に約1ミクロン未満に維持するために十分な量で液体分散媒体に加えられる、段階；ならびに
（c）一つまたは複数の化合物が、許容される溶解度および／または分散性を有するか否かを決定する段階。
【請求項５９】
摩耗製粉媒体がポリマーである、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
摩耗製粉媒体が約500ミクロンまたはそれ未満、約200ミクロンまたはそれ未満、約50ミクロンまたはそれ未満、およびその混合物からなる群より選択される粒子径を有する、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
高スループットスクリーニングアッセイ法が酵素または全細胞アッセイ法である、請求項58記載の方法。
【請求項６２】
分散媒体が水、塩水溶液、ベニバナ油、エタノール、t-ブタノール、ヘキサン、およびグリコールからなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項６３】
高スループットスクリーニングアッセイ法が手動または自動である、請求項58記載の方法。
【請求項６４】
二つまたはそれ以上の候補化合物の混合物の大きさが段階（b）において減少される、請求項58記載の方法。
【請求項６５】
二つまたはそれ以上の候補化合物の混合物が段階（a）においてスクリーニングされる、請求項58記載の方法。
【請求項６６】
候補化合物の液体分散媒体における溶解度が約10 mg/ml未満である、請求項58記載の方法。
【請求項６７】
候補化合物の液体分散媒体における溶解度が約1 mg/ml未満である、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
候補化合物を難溶性にするために、候補化合物が塩または他の物質に結合される、請求項58記載の方法。
【請求項６９】
候補化合物が、疎水性分子、両親媒特性を有する分子、脂質分子、燐脂質分子、脂肪、プレニル基、およびパルミトイル基からなる群より選択される物質に結合される、請求項68記載の方法。
【請求項７０】
前記結合が、化合物上の特定の部位に対する直接結合、中間的なスペーサー分子による化合物のN末端またはC末端残基に対する結合、および化合物上の内部側鎖を通しての結合からなる群より選択される方法によって行われる、請求項68または69に記載の方法。
【請求項７１】
候補化合物が、化合物の化学合成または生物学的発現のいずれかの際のアミノ酸残基の付加によって難溶性となる、請求項58記載の方法。
【請求項７２】
分散媒体のpHを調整することによって、候補化合物が難溶性となる、請求項58記載の方法。
【請求項７３】
候補化合物が、治療物質、化粧品、診断物質、バイオエンジニアリングにおいて有用な物質、および農業物質からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項７４】
候補化合物が、農薬、肥料、殺虫剤、および除草剤からなる群より選択される農業用物質である、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
段階（a）を行う時間と段階（b）を行うまでの時間が1年までに及ぶ、請求項58記載の方法。
【請求項７６】
候補化合物が、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約25％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満、約0.5％未満、約0.1％未満、約0.01％未満、および約0.001％未満からなる群より選択される濃度で存在する、請求項58記載の方法。
【請求項７７】
候補化合物が、候補化合物および表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、重量で約90％〜約0.001％、約90％〜約0.1％、および約60％〜約5％からなる群より選択される量で存在する、請求項58記載の方法。
【請求項７８】
粒子径減少プロセスにとって必要な候補化合物の量が、約100 mg未満、約90 mg未満、約80 mg未満、約70 mg未満、約60 mg未満、約50 mg未満、約40 mg未満、約30 mg未満、約25 mg未満、約20 mg未満、約15 mg未満、約10 mg未満、約5 mg未満、約4 mg未満、約3 mg未満、約2 mg未満、および約1 mg未満からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項７９】
粒子径減少プロセスにとって必要な総分散容積が、約15 ml未満、約10 ml未満、約9 ml未満、約8 ml未満、約7 ml未満、約6 ml未満、約5 ml未満、約4 ml未満、約3 ml未満、および約2 ml未満からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項８０】
粒子径の減少プロセスのために必要な時間が、約1時間またはそれ未満、約45分またはそれ未満、約40分またはそれ未満、約35分またはそれ未満、約30分またはそれ未満、約25分またはそれ未満、約20分またはそれ未満、約15分またはそれ未満、約10分またはそれ未満、および約5分またはそれ未満からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項８１】
少なくとも一つの表面安定化剤が、候補化合物と表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、重量で約0.01％〜約90％、約1％〜約90％、および約5％〜約90％からなる群より選択される量で存在する、請求項58記載の方法。
【請求項８２】
少なくとも一つの表面安定化剤が、ゼラチン、カゼイン、レシチン、デキストラン、アカシアゴム、コレステロール、トラガカント、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセロール、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ロウ、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシエチレン、コロイド状二酸化珪素、燐酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、非結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、チロキサポル、ポロキサマー、ポロキサミン、テトロニック1508（登録商標）、スルホコハク酸ナトリウムのジアルキルエステル、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールポリエーテルスルホネート、ステアリン酸蔗糖とジステアリン酸蔗糖の混合物、p-イソノニルフェノキシポリ-(グリシドール)、クロデスタスSL-40（登録商標）、C18H37CH2C(O)N(CH3)-CH2(CHOH)4(CH2OH)2であるSA9OHCO、デカノイル-N-メチルグルカミド、n-デシルβ-D-グルコピラノシド、n-デシルβ-D-マルトピラノシド、n-ドデシルβ-D-グルコピラノシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、ヘプタノイル-N-メチルグルカミド、n-ヘプチル-β-D-グルコピラノシド、n-ヘプチル-β-D-チオグルコシド、n-ヘキシル-β-D-グルコピラノシド、ノナノイル-N-メチルグルカミド、n-ノイルβ-D-グルコピラノシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド、オクチル-β-D-チオグルコピラノシド、PEG-ホスホリピッド、PEG-コレステロール、PEG-コレステロール誘導体、PEG-ビタミンA、PEG-ビタミンE、ライソザイム、および酢酸ビニルとビニルピロリドンのランダムコポリマーからなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項８３】
候補化合物が、約900 nm未満、約800 nm未満、約700 nm未満、約600 nm未満、約500 nm未満、約400 nm未満、約300 nm未満、約250 nm未満、約200 nm未満、約150 nm未満、約100 nm未満、および約50 nm未満からなる群より選択される有効平均粒子径に減少される、請求項58記載の方法。
【請求項８４】
候補化合物粒子の少なくとも60％、70％、80％、90％、または95％が、有効平均粒子径未満の粒子径に減少される、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
以下の段階を含む高スループットスクリーニング法：
（a）一つまたは複数の化合物が所望の活性を有するか否かを決定するために、通常の高スループットスクリーニングアッセイ法において一つまたは複数の候補化合物をスクリーニングする段階；および
（b）摩耗製粉媒体の存在下で小規模ミルにおいて一つまたは複数の候補化合物の粒子径を減少させる段階であって、
（1）候補化合物が難溶性である液体分散媒体において一つまたは複数の候補化合物が製粉される；
（2）製粉された一つまたは複数の候補化合物が約1ミクロン未満の有効平均粒子径を有する；且つ
（3）少なくとも一つの表面安定化剤が、粒子径減少の前後のいずれかに、一つまたは複数の候補化合物の有効平均粒子径を粒子径減少後に約1ミクロン未満に維持するために十分な量で液体分散媒体に加えられる、段階；ならびに
（c）一つまたは複数の化合物が、許容される溶解度および／または分散性を有するか否かを決定する段階。
【請求項８６】
一つまたは複数の候補化合物が摩耗媒体の存在下でホモジナイズされる、請求項85記載の方法。
【請求項８７】
摩耗媒体がポリマーである、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
摩耗媒体が約500ミクロンまたはそれ未満、約200ミクロンまたはそれ未満、約50ミクロンまたはそれ未満、およびその混合物からなる群より選択される粒子径を有する、請求項86記載の方法。
【請求項８９】
高スループットスクリーニングアッセイ法が酵素または全細胞アッセイ法である、請求項85記載の方法。
【請求項９０】
段階（a）からのナノ粒子候補化合物の分散物が、段階（b）の高スループットスクリーニングアッセイ法において直接用いられる、請求項85記載の方法。
【請求項９１】
分散媒体が水、塩水溶液、ベニバナ油、エタノール、t-ブタノール、ヘキサン、およびグリコールからなる群より選択される、請求項85記載の方法。
【請求項９２】
高スループットスクリーニングアッセイ法が手動または自動である、請求項85記載の方法。
【請求項９３】
二つまたはそれ以上の候補化合物の混合物の大きさが段階（b）において減少される、請求項85記載の方法。
【請求項９４】
二つまたはそれ以上の候補化合物の混合物が段階（a）においてスクリーニングされる、請求項85記載の方法。
【請求項９５】
候補化合物の液体分散媒体における溶解度が約10 mg/ml未満である、請求項85記載の方法。
【請求項９６】
候補化合物の液体分散媒体における溶解度が約1 mg/ml未満である、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
候補化合物を難溶性にするために、候補化合物が塩または他の物質に結合される、請求項85記載の方法。
【請求項９８】
候補化合物が、疎水性分子、両親媒特性を有する分子、脂質分子、燐脂質分子、脂肪、プレニル基、およびパルミトイル基からなる群より選択される物質に結合される、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
前記結合が、化合物上の特定の部位に対する直接結合、中間的なスペーサー分子による化合物のN末端またはC末端残基に対する結合、および化合物上の内部側鎖を通しての結合からなる群より選択される方法によって行われる、請求項97または98に記載の方法。
【請求項１００】
候補化合物が、化合物の化学合成または生物学的発現のいずれかの際のアミノ酸残基の付加によって難溶性となる、請求項85記載の方法。
【請求項１０１】
分散媒体のpHを調整することによって、候補化合物が難溶性となる、請求項85記載の方法。
【請求項１０２】
候補化合物が、治療物質、化粧品、診断物質、バイオエンジニアリングにおいて有用な物質、および農業用物質からなる群より選択される、請求項85記載の方法。
【請求項１０３】
候補化合物が、農薬、肥料、殺虫剤、および除草剤からなる群より選択される農業用物質である、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
段階（a）を行う時間と段階（b）を行うまでの時間が1年までに及ぶ、請求項85記載の方法。
【請求項１０５】
候補化合物が、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約25％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満、約0.5％未満、約0.1％未満、約0.01％未満、および約0.001％未満からなる群より選択される濃度で存在する、請求項85記載の方法。
【請求項１０６】
候補化合物が、候補化合物および表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、重量で約90％〜約0.001％、約90％〜約0.1％、および約60％〜約5％からなる群より選択される量で存在する、請求項85記載の方法。
【請求項１０７】
粒子径減少プロセスにとって必要な候補化合物の量が、約100 mg未満、約90 mg未満、約80 mg未満、約70 mg未満、約60 mg未満、約50 mg未満、約40 mg未満、約30 mg未満、約25 mg未満、約20 mg未満、約15 mg未満、約10 mg未満、約5 mg未満、約4 mg未満、約3 mg未満、約2 mg未満、および約1 mg未満からなる群より選択される、請求項85記載の方法。
【請求項１０８】
粒子径減少プロセスにとって必要な総分散容積が、約15 ml未満、約10 ml未満、約9 ml未満、約8 ml未満、約7 ml未満、約6 ml未満、約5 ml未満、約4 ml未満、約3 ml未満、および約2 ml未満からなる群より選択される、請求項85記載の方法。
【請求項１０９】
粒子径の減少プロセスに必要な時間が、約1時間またはそれ未満、約45分またはそれ未満、約40分またはそれ未満、約35分またはそれ未満、約30分またはそれ未満、約25分またはそれ未満、約20分またはそれ未満、約15分またはそれ未満、約10分またはそれ未満、および約5分またはそれ未満からなる群より選択される、請求項85記載の方法。
【請求項１１０】
少なくとも一つの表面安定化剤が、候補化合物と表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、重量で約0.01％〜約90％、約1％〜約90％、および約5％〜約90％からなる群より選択される量で存在する、請求項85記載の方法。
【請求項１１１】
少なくとも一つの表面安定化剤が、ゼラチン、カゼイン、レシチン、デキストラン、アカシアゴム、コレステロール、トラガカント、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセロール、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ロウ、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシエチレン、コロイド状二酸化珪素、燐酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、非結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、チロキサポル、ポロキサマー、ポロキサミン、テトロニック1508（登録商標）、スルホコハク酸ナトリウムのジアルキルエステル、ラウリル硫酸ナトリウム、アルキルアリールポリエーテルスルホネート、ステアリン酸蔗糖とジステアリン酸蔗糖の混合物、p-イソノニルフェノキシポリ-(グリシドール)、クロデスタスSL-40（登録商標）、C18H37CH2C(O)N(CH3)-CH2(CHOH)4(CH2OH)2であるSA9OHCO、デカノイル-N-メチルグルカミド、n-デシルβ-D-グルコピラノシド、n-デシルβ-D-マルトピラノシド、n-ドデシルβ-D-グルコピラノシド、n-ドデシルβ-D-マルトシド、ヘプタノイル-N-メチルグルカミド、n-ヘプチル-β-D-グルコピラノシド、n-ヘプチル-β-D-チオグルコシド、n-ヘキシル-β-D-グルコピラノシド、ノナノイル-N-メチルグルカミド、n-ノイルβ-D-グルコピラノシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド、オクチル-β-D-チオグルコピラノシド、PEG-ホスホリピッド、PEG-コレステロール、PEG-コレステロール誘導体、PEG-ビタミンA、PEG-ビタミンE、ライソザイム、および酢酸ビニルとビニルピロリドンのランダムコポリマーからなる群より選択される、請求項85記載の方法。
【請求項１１２】
候補化合物が、約900 nm未満、約800 nm未満、約700 nm未満、約600 nm未満、約500 nm未満、約400 nm未満、約300 nm未満、約250 nm未満、約200 nm未満、約150 nm未満、約100 nm未満、および約50 nm未満からなる群より選択される有効平均粒子径に減少される、請求項85記載の方法。
【請求項１１３】
候補化合物粒子の少なくとも60％、70％、80％、90％、または95％が、有効平均粒子径未満の粒子径に減少される、請求項112記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物の溶解度および／または分散性を増加させるために、小規模ミルまたは微小流体工学を用いて難溶性の化合物の粒子径を減少させることを含む、高スループットスクリーニング法に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
A．高スループットスクリーニングに関連する背景
新薬の発見は、細胞、抗体、受容体、酵素、転写因子等のような選択された標的と相互作用する化合物を同定できるか否かに依存する。通常の新薬発見は、何年もかかって蓄積された化合物の固有のデータベース、天然物、発酵ブロス、および合理的ドラッグデザインから得られたコレクションまたは「ライブラリ」に依存した。分子生物学、化学、および自動化の最近の進歩によって、これらのコレクションをスクリーニングするための迅速なHTSプロトコールが開発された。HTSおよび試料の調製は、医薬品開発費用の約1％（約270万米ドル）となりうる。D. McName、「Robotised assays」、Lancet 346：114（1995）。
【０００３】
組み合わせ化学およびHTSの有益な作用は、医薬品の製造パイプラインの最終段階で初めて実感され始める。何らかの薬剤40個がHTSから得られ、臨床試験が行われている。試験「高スループットスクリーニング2000：新しい傾向と方向」に参加している50カ所のHTS研究所長によって、自身のHTS研究所に由来する薬物候補物質46個が同定され、それらは現在ヒトににおいて試験中である。スクリーニングすべき新しい化学実体の備蓄は途方もなく多く、ロボットは化合物をアッセイし続けるであろう。24/7。「Screening」、Drug Discovery／Technology News 4（2001）。
【０００４】
研究所長は、より高いスループットを促進し、不足する化合物、細胞、膜、および試薬の利用を減少させ、試薬のコストを低下させる技術を求めている。HTSにおける新しい技術は、スループットを有意に増加させて、アッセイの容量を減少させる。過去数年間の重要な進歩には、新しい蛍光方法、検出プラットフォーム、および液体取り扱い技術が含まれる。少ないアッセイ容積で1日あたり試料100,000個のスクリーニングがいずれ日常的となるであろう。Hertzbergら、「High throughput screening：new technology for the 21st century」、Curr. Opin. Chem. Biol. 4：445〜51（2000）。
【０００５】
B．薬物候補物質の溶解度
薬物の溶解挙動は、製剤を開発する上で依然として最も難しい局面の一つである。Leunerら、「Improving drug solubility for oral delivery using solid dispersions」、Eur. J. Pharm. Biopharm. 50：47〜60（2000）。組み合わせ化学およびHTSの出現により、難溶性の化合物の数は劇的に増加した。固体溶液は薬物溶解度の改善の可能性が非常に高いが、40年間研究を行っても、このアプローチを用いてごく少数の産物が販売されるに至ったに過ぎない。同書物。
【０００６】
HTSの環境における溶解度および分散性の決定は、最も有望な可能性がある薬物候補物質を選択する際に非常に貴重である。これは、経口吸収のために必要な透過性または溶解度レベルが効力に関連するためである。経口吸収が不良である問題に対して難溶性および透過性不良が相対的に重要であるか否かは、リード化合物を生成するために用いられる研究アプローチに依存する。現在の研究アプローチでは、多数の難溶性候補物質が得られる傾向がある。例えば、「合理的ドラッグデザイン」アプローチでは、時間依存的に、より高分子量、より高いH-結合特性、不変の親油性、そしてしたがってより不良な透過性となる。同様に、HTSに基づくアプローチでは、より高い分子量、不変のH-結合特性、より高い親油性、そしてしたがってより不良な水溶性となる。同書物。
【０００７】
HTSを行う前に可能性がある薬物候補物質（通常、組み合わせ化学から）の溶解度を決定するために用いられる一つの方法は、レーザー比濁分析に基づき、これは96ウェルプレートにおいてジメチルスルホキシド（DMSO）溶液として供給されうる。Bevanら、「A high-throughput screening method for the determination of aqueous drug solubility using laser nephelometry in microtiter plates」、Anal. Chem. 72：1781〜7（2000年4月15日）。しかし、この方法は、薬物がさらなる研究を行うために十分に溶解性であるか否かを単に決定するに過ぎず、薬物候補物質の溶解度を増加させるものではない。
【０００８】
HTSの前に化合物の溶解度を増加させるもう一つの方法は、化合物を溶媒に溶解することであるが、そのような溶媒は毒性となり得て、化合物の活性を妨害しうる。
【０００９】
化合物の溶解度を増加させるために用いることができるが、本発明の出願者の知る限り、これまでHTSに関連して用いられていないさらにもう一つの方法は、微小流体工学である。微小流体工学は小さい粒子を得るために用いてもよいが、大量の化合物にとっては現実的ではなく、多くの固有の複雑な状況を有する。HTSのために多くのスクリーニングトレイを準備する場合、または能動的スクリーニングの確認に用いられる大量の化合物を調製する場合には、微小流体工学は適当ではない。さらに、微小流体工学は小さい粒子を安定化させないため、微小流体工学によってナノ粒子の粒子径に減少させた粒子は、凝集および再結晶による粒子径の成長を防止するために直ちに使用しなければならない。さらに、微小流体工学を用いて調製された化合物は、後の研究のために規模を拡大することができない。
【００１０】
C．薬学的組成物の製粉
難溶性を示す薬剤はしばしば、製剤の有効性を減少させうる。溶解度の改善は、その表面積を増加させる薬物粒子径の減少によって得ることができる。より小さい粒子径を得るために薬物化合物を粉砕する微小化法が十分に確立されている。本発明の出願人が知る限り、薬剤の製粉はこれまでHTSに関連して用いられていない。
【００１１】
ジェットミルまたは回転子固定子コロイドミルのような通常の製粉技術は、薬物を、0.1 μm〜25 μmの範囲の粒子径を有する粉末に粉砕する。Woodalらに公布された米国特許第5,797,550号、およびStehrの米国特許第4,848,676号に記載されるような湿式媒体ミルは一般的に、比較的大量の材料を製粉または粉砕するために用いられる。これらのかなり大きい媒体ミルは、HTSにおいて用いる試料またはHTSから生成された試料の場合に必要な量のような、少量または微量を粉砕するためには一般的に適していない。Corbinに公布された米国特許第5,593,097号は、0.25 gもの少量を、約60分間で大きさ0.5ミクロン未満〜約0.05ミクロン（平均直径）へと粉砕することが必要であると認識している。
【００１２】
ミクロ、ミニ、およびナノミルを開発および製造する研究グループおよび企業がいくつか存在する。例えば、スイスのバコフェン（W.A. Bachofen）社は、DYNO（登録商標）-Millを製造し、これは水平な粉砕子容器を有する連続操作式のビーズミルである。バコフェン社は、不連続操作に関して0.15〜0.3 Lの粉砕容器および連続操作に関して0.3〜0.6 Lの粉砕容器に適応する小さい研究所モデル（DYNO（登録商標）Mill KDL A）のような、異なる仕様を有するDYNO（登録商標）-Millの変種を製造している。粉砕ビーズは球状で、直径が0.2〜1.5 mmである。ミルのモーターの出力は、1.5〜1.85 kWである。この特定のDYNO（登録商標）-Millの好ましい適応分野の一つは、微生物学および生化学における機械的細胞破壊である。大きさおよび容積範囲の最も大きいものは、容積600 Lの粉砕子を有するDYNO（登録商標）-Mill KD 600である。
【００１３】
分散および湿式粉砕応用のために特に開発された高い効率のビーズミルは、バコフェン社の「新しく開発されたDYNO（登録商標）加速器（DYNO（登録商標）-Mill ECM」を利用する。ECM-Pilotバージョンは容積1.5 Lで、モーターの出力は6.8〜7.5 kWである；ECM-Proモデルは容積18.2 Lであり、出力36〜45 kWである。さらに、同社はまた、比重と粒子径とが異なる粉末物質を混合する装置（TURBULA（登録商標））を有し、これは、製薬産業において用いるために都合がよい。
【００１４】
ネツシュ（Netzsch）社は、LMZ Zetaシステムを作製し、これは、非常に狭いミクロン下の大きさの粒子を得るために、高エネルギーで高流量の多数回通過粉砕メカニズムを有する。同社のDynamic Cartridge Media Separator（登録商標）（DCMS）は、大きさが100 μmもの小さい粉砕媒体を用いることができる。異なるモデルは、懸濁液1.6 L〜62 Lに適合しうる。一つのモデル、MiniZetaは、小さいバッチ分析のための高エネルギー粉砕システムである。この特定のモデルにおいて、バッチサイズは、チャンバー容積300 mlで250 mlに減少する。さらに、非常に少量の材料用として、粉砕容器が冷却または加熱のために被筒されている研究用摩耗ミル（Laboratory Attrition Mill）が設計されている。
【００１５】
マイクログラインディングシステムズインク（MicroGrinding Systems, Inc）は、湿式または乾式のいずれかで操作することができる「極めて迅速かつ非常にエネルギー効率のよい」製粉機械であるVibrokinetic Energy Grinding Millを製造した。この特定のミルは、粉砕室を懸垂するための独自の同調スプリング系とモーターエネルギー源とを利用する。これは、「リバウンド」エネルギーを節約して再利用して、特にモーターが唯一の可動部分であるために、エネルギー支出と動力メンテナンスがわずかであることから、ミルは費用効果が高くメンテナンス不要となる。調節可能な空気サイクロン分類器は、5〜10ミクロンの範囲で産物の流れを分離する。
【００１６】
ミルは、1/4"供給量から1時間あたり微粉産物50ポンドを産生することができる研究用ミル、および1/4"硬供給材料から1時間あたり微粉粉末250ポンドを製造するパイロットプラントミルを含むいくつかの基本的モデルが利用可能である。同社はこれらの装置を用いて薬剤を粉砕できることを提案している。
【００１７】
ナノスケールコンビナトリアルシンセシスインク（Nanoscale Combinatorial Synthesis, Inc、Nanosyn）は、その加速ナノスケール合成技術（ANST（登録商標））を公表し、これによって、小型化アッセイ法において化合物をスクリーニングすることができる。その固有の製品およびサービスは2001年に日本において公表され、このとき同社は、ベルギーに本社がある分子診断企業であるユーロスクリーン（Euroscreen）社に低分子ライブラリを提供するとの声明を発表した。
【００１８】
最後に、先行技術に対して改善を示す小規模ミルが、参照として本明細書に詳しく組み入れられる、1999年6月1日に提出された米国特許仮出願第60/137,142号、および2000年5月31日に提出された米国実用新案出願第09/583,893号に記述されている。
【００１９】
薬剤または診断薬をミクロン下の粒子径まで製粉することは、例えば、その全てが参照として本明細書に詳しく組み入れられる、「Surface Modified Drug Nanoparticles」に関する米国特許第第5,145,684号、「Use of Ionic Cloud Point Modifiers to Prevent Particle Aggregarion During Sterilization」に関する米国特許第5,298,262号、「Method to Reduce Particle Size Growth During Lyophilization」に関する米国特許第5,302,401号、「X-ray Contrast Compositions Useful in Medical Imaging」に関する米国特許第5,318,767号、「Novel Formulation For Nanoparticulate X-ray Blood Pool Contrast Agents Using High Molecular Weight Non-ionic Surfactants」に関する米国特許第5,326,552号、「Method of X-ray Imaging Using Iodinated Aromatic Propanedioates」に関する米国特許第5,328,404号、「Use of Charged Phospholipids to Reduce Nanoparticle Aggregation」に関する米国特許第5,336,507号、「Formulations Comprising Olin 10-G to Prevent Particle Aggregation and Increase Stability」に関する米国特許第5,340,564号、「Use of Non-Ionic Cloud Point Modifiers to Minimize Nanoparticulate Aggregation During Sterilization」に関する米国特許第5,346,702号、「Preparation and Magnetic Properties of Very Small Magnetic-Dextran Particles」に関する米国特許第5,349,957号、「Use of Purified Surface Modifiers to Prevent Aggregation During Sterilization」に関する米国特許第5,352,459号、「Surface Modified Anticancer Nanoparticles」に関する米国特許第5,399,363号、「Water Insoluble Non-Magnetic Manganese Particles as Magnetic Resonance Enhancement Agents」に関する米国特許第5,401,492号、「Use of Tyloxapol as a Nanoparticulate Stabilizer」に関する米国特許第5,429,824号、「Method for Making Nanoparticulate X-Ray Blood Pool Contrast Agents Using High Molecular Weight Non-ionic Surfactants」に関する米国特許第5,447,710号、「X-Ray Contrast Compositons Useful in Medical Imaging」に関する米国特許第5,451,393号、「Formulations of Oral Gastrointestinal Diagnostic X-Ray Contrast Agents in Combination wirh Pharmaceutically Acceptable Clays」に関する米国特許第5,466,440号、「Method of Preparing Nanoparticle Compositions Containing Charged Phospholipids to Reduce Aggregation」に関する米国特許第5,470,583号、「Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carbamic Anhydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging」に関する米国特許第5,472,683号、「Surface Modified Anticancer Nanoparticles」に関する米国特許第5,494,683号、「Nanoparticulate Diagnostic Dimers as X-Ray Contrast Agents for Blood Pool Lymphatic System Imaging」に関する米国特許第5,500,204号、「Method of Grinding Pharmaceutical Substances」に関する米国特許第5,518,187号、「Nanoparticulate NSAID Formulations」に関する米国特許第5,518,738号、「Nanoparticulate Iododipamide Derivatives for Use as X-Ray Contrast Agents」に関する米国特許第5,521,218号、「Nanoparticulate Diagnostic Diatrizoxy Ester X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging」に関する米国特許第5,525,328号、「Process of Preparing X-Ray Contrast Compositions Containing Nanoparticles」に関する米国特許第5,543,133号、「Surface Modified NSAID Nanoparticles」に関する米国特許第5,552,160号、「Formulations of Compounds as Nanoparticulate Dispersions in Digestible Oils or Fatty Acids」に関する米国特許第5,560,931号、「Polyalkylene Block Copolymers as Surface Modifiers for Nanoparticles」に関する米国特許第5,565,188号、「Sulfated Non-ionic Block Copolymer Surfactant as Stabilizer Coatings for Nanoparticle Compositions」に関する米国特許第5,569,448号、「Formularions of Compounds as Nanoparticulate Dispersions in Digestible Oils or Fatty Acids」に関する米国特許第5,571,536号、「Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carboxylic Anhydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging」に関する米国特許第5,573,749号、「Diagnostic Imaging X-Ray Contrast Agents」に関する米国特許第5,573,750号、「Redispersible Nanoparticulate Film Matrices With Protective Overcoats」に関する米国特許第5,573,783号、「Site-specific Adhesion, Within the GI Tract Using Nanoparticles Stabilized by High Molecular Weight, Linear Poly(ethylene Oxide)Polymers」に関する米国特許第5,580,579号、「Formulations of Oral Gastrointestinal Therapeutic Agents in Combination with Pharmaceutically Acceptable Clays」に関する米国特許第5,585,108号、「Butylene Oxide-Ethylene Oxide Block Copolymers Surfactants as Stabilizer Coatings for Nanoparticulate Compositions」に関する米国特許第5,587,143号、「Milled Naproxen with Hydropropyl Cellulose as Dispersion Stabilizer」に関する米国特許第5,591,456号、「Novel Barium Salt Formulations Stabilized by Non-ionic and Anionic Stabilizers」に関する米国特許第5,593,657号、「Sugar Based Surfactant for Nanocrystals」に関する米国特許第5,622,938号、「Improved Formulations of Oral Gastrointestinal Diagnostic X-Ray Contrast Agents and Oral Gastrointestinal Therapeutic Agents」に関する米国特許第5,628,981号、「Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carbonic Anhydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging」に関する米国特許第5,643,552号、「Continuous Method of Grinding Pharmaceutical Substances」に関する米国特許第5,718,388号、「Nanoparticles Containing the R(-)Enantiomer of Ibuprofen」に関する米国特許第5,718,919号、「Aerosols Containing Beclomethasone Nanoparticle Dispersions」に関する米国特許第5,747,001号、「Reduction of Intravenously Administered Nanoparticulate Formulation Induced Adverse Physiological Reactions」に関する米国特許第5,834,025号、「Nanocrystalline Formulation of Human Immunodeficiency Virus (HIV)Protease Inhibitors Using Cellulosic Surface Stabilizers」に関する米国特許第6,045,829号、「Methods of Making Nanocrystalline Formulations of Human Immunodeficiency Virus (HIV)Protease Inhibitors Using Cellulosic Surface Stabilizers」に関する米国特許第6,068,858号、「Injectable Formulations of Nanoparticulate Naproxen」に関する米国特許第6,153,225号。「New Solid Dose Form of Nanoparticulate Naproxen」に関する米国特許第6,165,506号、および「Methods  of Treating Mammals Using Nanocrystalline Formulations of Human Immunodeficiency Virus (HIV)Protease Inhibitors」に関する米国特許第6,221,400号、「Nebulized Aerosols Containing Nanoparticle Dispersions」に関する米国特許第6,264,922号、「Methods for Preventing Crystal Growth and Particle Aggregation in Nanoparticle Compositions」に関する米国特許第6,267,989号、「Use of PEG-Derivatized Lipids as Surface Stabilizers for Nanoparticulate Compositions」に関する米国特許第6,270,806号、および「Rapidly Disintegrating Solid Oral Dosage Form」に関する米国特許第6,316,029号に記述されている。さらに、2002年1月31日に公表された「Controlled Release Nanoparticulate Compositions」に関する米国特許第出願第20020012675 A1号は、ナノ粒子組成物について記述しており、これも参照として本明細書に詳しく組み入れられる。
【００２０】
合理的薬物デザイン、組換えバイオテクノロジー、組み合わせ化学、およびHTSの相乗的および乗法的相互作用によって、何百万という化合物が化学者によって合成されている。しかし、これらの候補化合物の開発は、終了しない場合、しばしば候補化合物の難溶性に関連した生物薬剤学および／または薬物動態学上の拘束のために妨害される。これによって、薬物研究プログラムにおける開発時間の遅延とコストの上昇が起こった。Panchagnulaら、「Biopharmaceutics and pharmacokinetics in drug research」、Int. J. Pharm. 201：131〜50（2000年5月25日）。
【００２１】
本発明は、薬学的に許容される生物学的利用率のような許容される生物学的利用率に関して化合物をスクリーニングするのみならず、候補化合物の溶解度および／または分散性を増加させる迅速な方法に関する当技術分野における要求を満足する。
【発明の開示】
【００２２】
概要
本発明は、小規模ミルまたは微小流体工学を用いて、難溶性の候補化合物の粒子径を約1ミクロンまたはそれ未満に減少させることを含む、HTSの有効性を増加させる方法に向けられる。
【００２３】
このプロセスによって産生された産物は、化合物表面上に吸着された一つまたは複数の表面安定化剤を有するナノ粒子候補化合物の分散物である。粒子径の減少によって、候補化合物の溶解度および／または分散性の増加が起こり、このように、製粉または微小流体工学プロセスと共に行ったHTSの有効性が増加する。製粉または微小流体工学によって行われる粒子径減少プロセスは、スクリーニング化合物をより溶解性にする、および／またはより分散性にするためにHTSの前に、またはスクリーニング後に活性であると決定された難溶性の化合物を有効にするためにHTSの後に行うことができる。製粉または微小流体工学から得られた液体分散物は、HTSにおいて直接用いることができる。
【００２４】
このように、本発明の一つの態様は、小規模ミルにおいて、スクリーニングすべき一つまたは複数の難溶性の候補化合物を約1ミクロンまたはそれ未満に製粉することを含む、HTSの方法に向けられる。製粉プロセスは、少なくとも一つの表面安定化剤の存在下で行うことができ、または少なくとも一つの表面安定化剤は、粒子径の減少後に化合物分散物に加えることができる。そのような表面安定化剤は、候補化合物の表面に吸着するが、化学的に相互作用しないまたは化合物の特性を変化させない。粒子径の減少後、候補化合物が所望の活性を有するか否かを決定するために、ナノ粒子化合物分散物を、酵素または全細胞アッセイのような標準的なHTSスクリーニングによって調べる。
【００２５】
同様に、本発明のもう一つの態様において、一つまたは複数の難溶性の化合物を、化合物の粒子径を約1ミクロンまたはそれ未満に減少させるために微小流動化を行う。微小流動化プロセスは、少なくとも一つの表面安定化剤の存在下で行うことができ、または少なくとも一つの表面安定化剤は、微小流動化の後に化合物分散物に加えることができる。そのような表面安定化剤は、候補化合物の表面に吸着して、化学的に相互作用しない、または化合物の特性を変化させない。粒子径の減少後、候補化合物が所望の活性を有するか否かを決定するために、ナノ粒子化合物分散物を、酵素または全細胞アッセイのような標準的なHTSスクリーニングによって調べる。
【００２６】
本発明のさらにもう一つの態様は、酵素または全細胞アッセイのような標準的なHTSスクリーニングによって、一つまたは複数の難溶性の候補化合物を試験することを含むHTSの方法に向けられる。この後に、薬学的に許容されるレベルのような許容されるレベルまで化合物の溶解度および／または分散性を増加させるために、所望の活性を有すると同定された化合物の粒子径を、小規模ミルにおいて個々にまたは混合物中で、約1ミクロンまたはそれ未満に減少させる。製粉プロセスは、少なくとも一つの表面安定化剤の存在下で行うことができ、または粒子径を減少させた後に少なくとも一つの表面安定化剤を化合物分散物に加えることができる。そのような表面安定化剤は、候補化合物の表面に吸着して、化学的に相互作用せず、または化合物の特性を変化させない。
【００２７】
最後に、本発明はまた、酵素または細胞全体のアッセイのような標準的なHTSスクリーニングによって一つまたは複数の難溶性の候補化合物を試験することを含むHTSの方法を含む。この後に、化合物の溶解度および／または分散性を、薬学的に許容されるレベルのような許容レベルまで増加するために、所望の活性を有すると同定された化合物の粒子径を、微小流動化によって個々にまたは混合物中で、約1ミクロンまたはそれ未満に減少させる。微小流動化は、少なくとも一つの表面安定化剤の存在下で行うことができ、または微小流動化の後に少なくとも一つの表面安定化剤を化合物分散物に加えることができる。そのような表面安定化剤は、候補化合物の表面に吸着して、化学的に相互作用せず、または化合物の特性を変化させない。
【００２８】
上記の一般的な説明と以下の詳細な説明はいずれも例として示して、説明するためであって、請求される本発明のさらなる説明を提供するためであると解釈される。他の目的、利点、および新規特性は、以下の本発明の詳細な説明から当業者には容易に明らかとなる。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明の前まで、HTSスクリーニングまたはさらなる新薬発見活性のために化合物を調製する場合に、粒子径は考慮されていない。それより、溶解度および／または分散性の不良な化合物は、毒性となりうるまたは化合物の活性を妨害しうる溶媒に溶解されている。
【００３０】
本発明に従うHTS法は、小規模ミルまたは微小流体工学を用いて、スクリーニングすべき一つまたは複数の難溶性の候補化合物の粒子径を、個々にまたは混合物中で、約1ミクロンまたはそれ未満に減少させることを含む。粒子径を減少させた後、所望の活性を有する化合物を同定するために、ナノ粒子化合物分散物を、酵素または全細胞アッセイ法のような標準的なHTSスクリーニングによって調べる。アッセイ法は如何なる既知のHTSアッセイ法となりえて、手動または自動となりうる。
【００３１】
または、本発明は、酵素的または全細胞アッセイ法のような標準的なHTSスクリーニングによって難溶性の候補化合物を調べることを含む方法を含む。アッセイ法は如何なる既知のHTSアッセイ法となり得て、手動または自動となりうる。この後に、小規模ミルまたは微小流体工学を用いて、所望の活性を有すると同定された化合物の粒子径を、個々にまたは混合物中で約1ミクロンまたはそれ未満に減少させる。この粒子径の減少によって、化合物の溶解度および／または分散性は、薬学的に許容されるレベルのような許容レベルまで増加する。
【００３２】
分散培地
候補化合物は少なくとも一つの液体培地において不溶性であるか、または難溶性でなければならなない。好ましい液体分散媒体は水である。しかし、本発明は、例えば、塩水溶液、ベニバナ油、ならびにエタノール、t-ブタノール、ヘキサン、およびグリコールのような溶媒を含む、候補化合物の溶解度および分散性が低い他の液体媒体によって実践することができる。分散媒体のpHは、当技術分野で既知の技術によって調節することができる。
【００３３】
「難溶性」
「難溶性」とは、候補化合物の液体分散媒体における溶解度が約10 mg/ml未満である、好ましくは約1 mg/ml未満であることを意味する。候補化合物が難溶性でなければ、化合物を難溶性にするために塩または他の物質に結合させることができる。このように、例えば治療、化粧品、診断、またはバイオエンジニアリングでの用途を有する全ての候補化合物は、本発明に適していると思われる。本発明は、如何なるそして全ての難溶性の化合物、または難溶性にすることができ、しかも所望の活性を有する化合物、例えば薬学、化粧品、診断薬、バイオエンジニアリング、ならびに農業において有用な、殺虫剤、肥料、殺虫剤、および除草剤のような化合物を含むと解釈されることから、「候補化合物」という用語は薬学的活性を有する物質に限定されない。
【００３４】
例えば、候補化合物が液体分散媒体において溶解性であれば、化合物を製粉の前に難溶性にするために、化合物を他の分子または部分に結合させることができる。化合物は、候補化合物を粉砕または微小流動化の前により不溶性または難溶性にするために、例えば、疎水性分子、両親媒特性を有する分子、脂質分子、燐脂質分子、脂肪、プレニル基、またはパルミトイル基に結合させることができる。そのような結合は、化合物上の特定の部位との直接結合、化合物上の一つまたは複数の部位に結合することができる中間的なスペーサー分子による化合物のN末端もしくはC末端残基との直接結合によって、および／または化合物上の内部側鎖を通して行うことができる。
【００３５】
さらに、化合物は、化合物の化学合成または生物学的発現のいずれかの際にアミノ酸残基、特に疎水性特性を有するアミノ酸残基または誘導体を付加することによってより難溶性にすることができる。そのような残基またはモチーフは、加水分解可能なリンカーまたはインビボで例えば特定の酵素もしくはエステラーゼによって切断することができるリンカーによって化合物から分離することができる。
【００３６】
さらに、候補化合物は、化合物を難溶性にするために薬学的に許容される塩に結合させることができる。さらに、化合物は分散媒体のpHを調整することによって、難溶性にすることができる。
【００３７】
例としての製粉法
本発明に係る一つの製粉法は、製粉すべき一つまたは複数の難溶性の候補化合物と摩耗製粉培地との分散物を提供することを含む。好ましい摩耗媒体の粒子径は500ミクロンまたはそれより小さい。
【００３８】
例としての製粉装置として、分散物を円柱形または他の形状の容器のような容器に入れて、攪拌子と容器を閉じる連結器とを提供する。連結器は、その中に攪拌子の一部が伸長する開口部を有し、攪拌子は円柱形のローターとそこから伸長するシャフトとを含み、円柱形のローターは、外部末端が最小である、例えば壁の内表面から3 mm離れるにすぎないような寸法であるが、他の大きさの範囲を本発明において用いることができ、例としての量は制限的に解釈してはならない。攪拌子を容器に入れて、連結器を密封または閉じ、容器に加える分散物の量は、攪拌子を容器に完全に入れた場合に容器の中で分散物中の空気の全てが実質的に消失する量である。次に、攪拌子を規定の期間攪拌する。候補化合物（複数）に関して一つまたは複数の表面安定化剤を、製粉の前後いずれかに分散物に加える。
【００３９】
本発明に従うもう一つの方法は、製粉すべき一つまたは複数の難溶性の候補化合物と摩耗製粉媒体とを含む分散物を提供することを含む。好ましい摩耗媒体の粒子径は500ミクロンまたはそれより小さい。円柱形のローターとそこから伸長するシャフトを有する攪拌子を提供し、攪拌子は水平方向に容器に挿入して、容器を密封する。ローターは、ローターの外表面と容器の内表面のあいだが例えば3 mmに過ぎない最小のギャップを提供する寸法であるが、他の大きさの範囲を本発明において用いることができ、例としての量は制限的に解釈してはならない。容器の中に少なくとも一つまたは複数の口を提供し、口は水平方向の容器の最高点で維持される。分散物が容器中の空気の全てを実質的に追い出すまで容器に化合物分散物を満たす。最後に、攪拌子を一定期間回転させる。候補化合物（複数）に関して一つまたは複数の表面安定化剤を製粉の前後いずれかに分散物に加える。
【００４０】
実質的に全ての空気が垂直および水平方向のミルにおいて置換されうるため、攪拌と汚染の問題は最小限であるかまたは回避される。このように、本発明に従う製粉プロセスは、分散製剤が泡立つのを防止することができる。
【００４１】
例としての微小流動化法
「Method for Preparing Therapeutic Compositions Containing Nanoparticles」に関する米国特許第5,510,118号は、微小流動化を用いて難溶性で大きさがミクロン下の化合物を作製する方法の例を記述する。本特許は参照として本明細書に組み入れられる。
【００４２】
本発明のHTS法の利点
本発明のHTS法の一つの利点は、分散媒体が水である場合、水が細胞に対して非毒性であることから、細胞全体のHTSスクリーニングに関して、製粉されたまたは微小流動化された本発明の化合物の水性懸濁液が非毒性であるという点である。これは、難溶性の化合物が溶媒中で可溶化される先行技術の方法と対照的である。その結果、細胞活性は、溶媒による細胞毒性がないため、本発明の分散物においてより明確に認められる。
【００４３】
本発明の方法のもう一つの利点は、標準的なHTSスクリーニングを行うために、製粉されたまたは微小流動化された分散物を正確な濃度でウェルに等分することによって、HTSにおいて直接用いることができる点である。さらに、濃度はHTSアッセイ法のウェルが異なれば変化させることができる。製粉されたおよび微小流動化された化合物の分散物はまた、活性および毒性に関する他の酵素または細胞試験において用いることができる。この場合も、本発明の長所は、製粉された分散物に毒性溶媒が存在しないことである。さらに、化合物は、臨床試験のために再度製剤化を行う必要がほとんどない。
【００４４】
本発明に従って調製されるナノ粒子分散物は、長期間にわたって、例えば1年またはそれより長いあいだ安定である。このように、本発明のHTS法は、製粉または微小流動化後、化合物を直ちにスクリーニングする必要はない。その上、本発明に従って調製した化合物は、製造のために容易に規模を拡大することができる。
【００４５】
一定量の開始材料から製粉されたミクロまたはナノ粒子懸濁液を調製するために必要な時間は、平均で約1時間またはそれ未満である。このように、試料3〜4個またはそれ以上を、一つの小規模ミルによって、調製時間、製粉、回収、および製粉した分散物の粒子ふるい分けを含めて1営業日内で容易に製粉することができる。律速因子は得られた試料の調製と分析であり、予め調製した試料であれば、それぞれの小規模ミルにおいて1日あたり化合物約6〜8個またはそれ以上を製粉することができる。
【００４６】
一般的に、粒子径減少プロセスのために必要な時間は、約1時間またはそれ未満、約45分またはそれ未満、約40分またはそれ未満、約35分またはそれ未満、約30分またはそれ未満、約25分またはそれ未満、約20分またはそれ未満、約15分またはそれ未満、約10分またはそれ未満、および約5分またはそれ未満からなる群より選択される。
【００４７】
摩耗媒体
小規模ミルにおいて用いられる摩耗媒体は、名目上の直径が500ミクロンに過ぎないポリスチレンまたはクロスリンクしたポリスチレンで形成されるもののようなポリマータイプとなりうる。有用な製粉媒体の他の粒子径には、200ミクロンおよび50ミクロンが含まれ、ならびに約50〜約500ミクロンの範囲の大きさの混合物が含まれる。
【００４８】
米国特許第5,518,187号、第5,718,388号、および第5,862,999号は、ポリマー製粉媒体を用いて薬剤を製粉することを開示する。これらの特許はさらに、湿式媒体製粉のための分散製剤を開示する。これらの特許の開示は特に参照として本明細書に組み入れられる。
【００４９】
表面安定化剤
一つまたは複数の表面安定化剤を、有効平均粒子径約1ミクロン未満または他の所望の粒子径で候補化合物を維持するために十分な量で化合物の表面に吸着させる。
【００５０】
候補化合物と表面安定化剤の相対量は広く異なり、表面安定化剤の最適な量は、例えば特定の候補化合物および選択される表面安定化剤、表面安定化剤がミセルを形成する場合にはその臨界ミセル濃度等に依存しうる。
【００５１】
少なくとも一つの表面安定化剤は、候補化合物と表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、約0.01％〜約90％、約1％〜約90％、および約5％〜約90％から選択される量で液体分散媒体中に存在する。一つまたは複数の候補化合物の大きさを減少させる前後いずれかに、一つまたは複数の表面安定化剤を液体分散媒体に加えることができる。
【００５２】
特に参照として本明細書に組み入れられる、当技術分野で既知であって米国特許第5,145,684号に記述される有用な表面安定化剤には、候補化合物の表面に物理的に接着するが、化合物と化学結合しないまたは相互作用しない化合物が含まれると考えられる。さらに、表面安定化剤の個々に吸着された分子は、本質的に分子間クロスリンクを含まない。本発明の方法において、二つまたはそれ以上の表面安定化剤を用いることができる。
【００５３】
適した表面安定化剤は、好ましくは既知の有機および無機薬学的賦形剤から選択することができる。そのような賦形剤には、様々なポリマー、低分子量オリゴマー、天然物、および界面活性剤が含まれる。好ましい表面安定化剤には、非イオン性およびイオン性界面活性剤が含まれる。
【００５４】
表面安定化剤の代表的な例には、ゼラチン、カゼイン、レシチン（ホスファチド）、デキストラン、アカシアゴム、コレステロール、トラガカント、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセロール、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ロウ、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、セトマクロゴール1000のようなマクロゴールエーテル）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、例えばツイーン20（登録商標）およびツイーン80（登録商標）（ICIスペシャルティケミカルズ（ICI Specialty Chemicals）社）のような市販のツイーン（登録商標））、ポリエチレングリコール（例えば、カルボワックス3550（登録商標）および934（登録商標））（ユニオンカーバイド（Union Carbide）社）、ステアリン酸ポリオキシエチレン、コロイド状二酸化珪素、燐酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、非結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン（PVP）、エチレンオキサイドおよびホルムアルデヒドを有する4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェノールポリマー（チロキサポル、スペリオン、およびトライトンとしても知られる）、ポロキサマー（例えば、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイドのブロックコポリマーであるプルロニクスF68（登録商標）およびF108（登録商標））、ポロキサミン（例えば、プロピレンオキサイドおよびエチレンオキサイドをエチレンジアミンに連続的に付加することに由来する四官能基ブロックコポリマー（BASFウィアンドット（BASF Wyandotte Corporation）社、パルシッパニー、ニュージャージー州）であるポロキサミン908（登録商標）としても知られるテトロニック908（登録商標））；テトロニック1508（登録商標）（T-1508）（BASFウィアンドット社）；スルホコハク酸ナトリウムのジアルキルエステル（例えば、スルホコハク酸ナトリウムのジオクチルエステル（アメリカンシアナミド（American Cyanamid）社）であるエアロゾルOT（登録商標））；ラウリル硫酸ナトリウム（デュポン（Du Pont）社）であるデュポノールP（登録商標）；アルキルアリールポリエーテルスルホネート（ローム＆ハース（Rohm and Haas）社）であるトライトンX-200（登録商標）；ステアリン酸蔗糖とジステアリン酸蔗糖（クロダインク（Croda Inc.））の混合物であるクロデスタスF-110（登録商標）；オーリン-IOG（登録商標）またはサーファクタント10-G（登録商標）（オーリンケミカルズ（Olin Chemicals）社、スタンフォード、コネチカット州）としても知られるp-イソノニルフェノキシポリ-(グリシドール)；クロデスタスSL-40（登録商標）（クロダインク）；およびC18H37CH2C(O)N(CH3)-CH2(CHOH)4(CH2OH)2であるSA9OHCO（イーストマンコダック社（Eastman Kodak Co.））；デカノイル-N-メチルグルカミド；n-デシルβ-D-グルコピラノシド；n-デシルβ-D-マルトピラノシド；n-ドデシルβ-D-グルコピラノシド；n-ドデシルβ-D-マルトシ��；ヘプタノイル-N-メチルグルカミド；n-ヘプチル-β-D-グルコピラノシド；n-ヘプチル-β-D-チオグルコシド；n-ヘキシル-β-D-グルコピラノシド；ノナノイル-N-メチルグルカミド；n-ノイルβ-D-グルコピラノシド；オクタノイル-N-メチルグルカミド；n-オクチル-β-D-グルコピラノシド；オクチル-β-D-チオグルコピラノシド；PEG-ホスホリピッド、PEG-コレステロール、PEG-コレステロール誘導体、PEG-ビタミンA、PEG-ビタミンE、ライソザイム、および酢酸ビニルとビニルピロリドンとのランダムコポリマー（すなわち、プラスドン（登録商標）S630）等が含まれる。
【００５５】
これらの表面安定化剤のほとんどが既知の薬学的賦形剤であり、参照として本明細書に組み入れられる、アメリカ製薬工業会とイギリス製薬境界の共同出版である「Handbook of Pharmaceutical Excipients」（The Pharmaceutical Press、1995）に詳細に記述されている。表面安定化剤は市販されている、および／または当技術分野で既知の技術によって調製することができる。
【００５６】
候補化合物／表面安定化剤の粒子径
本発明の化合物は、約1ミクロン未満の有効平均粒子径まで減少させる。化合物はまた、有効平均粒子径を約900 nm未満、約800 nm未満、約700 nm未満、約600 nm未満、約500 nm未満、約400 nm未満、約300 nm未満、約250 nm未満、約200 nm未満、約150 nm未満、約100 nm未満、および約50 nm未満まで減少させることができる。そのような小さい有効平均粒子径は一般的に、通常のミルを用いて得ることができない。
【００５７】
本明細書において用いられるように、粒子径は当業者に周知の通常の粒子径測定技術によって測定した重量平均粒子径に基づいて決定される。そのような技術には、例えば、沈降フィールドフロー（field flow）分画、光子相関分光光度法、光の散乱、およびディスク遠心が含まれる。
【００５８】
「約1ミクロン未満の有効平均粒子径」とは、候補化合物粒子の少なくとも50％が、上記の技術によって測定した場合に、約1ミクロン未満の平均粒子径を有することを意味する。好ましくは、候補化合物粒子の少なくとも60％、70％、80％、90％または95％が有効平均粒子径未満の粒子径、すなわち約1ミクロン未満、約900 nm未満、約800 nm未満に減少される。
【００５９】
候補化合物の濃度／量：必要な分散容積
少量の候補化合物を本発明の製粉および微小流動化を用いて処理することができる。例えば、候補化合物100 mg（2％分散物）を用いることができ、これより少ない量も同様に用いることができる。より高濃度の候補化合物、例えば5％〜約50％までも同様に製粉または微小流動化することができる。100 mg（2％分散物）は、一般的に総分散容積の4〜6 mlに対応する。候補化合物の量は薬物に依存しうる；製粉および微小流動化の場合、分散物は流動性で非粘性でなければならない。
【００６０】
本発明の方法において、候補化合物は、約50％未満、約40％未満、約30％未満、約25％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満、約1％未満、約0.5％未満、約0.1％未満、約0.01％未満、および約0.001％未満からなる群より選択される濃度中に存在する。
【００６１】
または、候補化合物は、候補化合物および表面安定化剤の総乾燥重量に基づいて、重量で約90％〜約0.001％、約90％〜約0.1％、および約60％〜約5％からなる群より選択される量で存在する。
【００６２】
粒子径減少プロセスにとって必要な候補化合物の量は、約100 mg未満、約90 mg未満、約80 mg未満、約70 mg未満、約60 mg未満、約50 mg未満、約40 mg未満、約30 mg未満、約25 mg未満、約20 mg未満、約15 mg未満、約10 mg未満、約5 mg未満、約4 mg未満、約3 mg未満、約2 mg未満、約1 mg未満、および約0.5 mg未満からなる群より選択される。
【００６３】
さらに、粒子径減少プロセスにとって必要な総分散容積は、約15 ml未満、約10 ml未満、約9 ml未満、約8 ml未満、約7 ml未満、約6 ml未満、約5 ml未満、約4 ml未満、約3 ml未満、および約2 ml未満からなる群より選択される。
【００６４】
小規模ミルの構造
本発明に係る小規模ミルは、粒子径が約500ミクロン（0.5 mm）もしくはそれ未満から約50ミクロンである、または500〜50ミクロンの範囲の大きさの混合物を有するポリマー媒体タイプ、例えばクロスリンクしたポリスチレン媒体のような摩耗製粉媒体を用いて、比較的短時間、すなわち1時間またはそれ以上または1時間未満で、比較的少量の分散物をミクロンからナノメートルの範囲の大きさに製粉するように設計されている。
【００６５】
本発明において有用な好ましい小規模ミルは、2000年12月7日に公表された「Small Scale High Energy Mill」に関する国際公開公報第00/72973号において記述されている。そのようなミルは可動部分がほとんどなく、迅速に取り外すことができることから組み立ておよび掃除が容易であり、フットプリントが小さく、これは臨床試験の状況において重要である。これは、例えば、多くの可動部分を有するDymomill（登録商標）ミルとは対照的である。
【００６６】
好ましい小規模ミルは、フットプリントが小さい卓上ユニットであり、化合物のスクリーニングを増加するためにいくつかの小規模ミルを同時に用いることができる。
【００６７】
さらに、好ましい小規模ミルは、製粉のあいだに生成した過剰な熱量を効率よく除去するために水冷システムを利用する。一つの態様において、水冷システムは、水の被包を含みうる；もう一つの態様において、ミルのチャンバーは冷却剤を循環させるために二重壁になっている。さらに、単一の冷却系について三つまたはそれ以上のミルを組み立てることができる。そのような冷却系の存在によって、より高速で製粉することができる。同様に、好ましくは小規模ミルの製粉速度は変化させることができる。冷却と製粉速度の変更の複合作用によって、小規模ミルは、温度および／または製粉エネルギー感受性化合物に関して有効なツールとなる。
【００６８】
好ましい小規模ミルのさらにもう一つの利点は、ローターを変更できることである。なめらかなシャフトは剪断製粉力を生じるが、木釘を打ったシャフトは、剪断力と衝突力とを生じる。木釘を打ったシャフトは、製粉が困難な化合物にとって有用である。その上、同じ製粉ヘッドを用いて、大きさが異なるチャンバー、すなわち大きさが10、18、および26 mlであるチャンバーを用いることができる（一般的に、分散物の大きさはチャンバーの大きさの約1/2である）。部品のこの互換性は、先行技術の製粉技術に対して有意な改善である。
【００６９】
ローターは、円柱形となりうる、そして先細りの末端表面を有しうる。一つの態様において、ローターは、特に分散物が粒子径500ミクロンまたはそれ未満の摩耗媒体を含む場合には、その外部末端が容器の内表面からわずか3 mm離れているに過ぎないような寸法を有する。空白またはギャップは、分散物が粒子径200ミクロンまたはそれ未満の摩耗媒体を含む場合には、好ましくは1 mmに過ぎない。
【００７０】
容器の大きさは、少量の分散物を製粉するために変更することができる。本発明は、特定の大きさに制限されないが、好ましい態様において、容器の内径は5/8インチから4インチである。例示目的に限り、製粉チャンバーと円柱形のローターは、表1および2に明記した寸法を有しうる。
【００７１】
（表１）  直線ローター
2005504266.tif 000002
【００７２】
（表２）  先細りローター
2005504266.tif 000003
【００７３】
以下の実施例は、本発明を説明するために示される。しかし、本発明はこれらの実施例に記述した特定の条件または詳細に限定されないと理解すべきである。明細書を通して、公表された文書に対する任意のおよび全ての参照は、本特許出願において特に参照として組み入れられる。
【００７４】
実施例1
本実施例の目的は、前臨床インビボ試験のために、水に難溶性の化合物のミリグラム量を製粉する場合に、高エネルギー製粉技術を用いる有効性を証明することであった。
【００７５】
方法  薬物＜100 mgを処理することができる低容量高エネルギー媒体ミルを、水に難溶性の薬物候補物質としてナプロキセンを用いてその効率および性能に関して試験した。プロセスの強健性を調べるため、および平均粒子径が200 nmまたはそれ未満であるナノ粒子懸濁液を生成するために必要な製剤パラメータを同定するために、統計学的デザイン試験を実施した。
【００７６】
プロセシングのために、ナプロキセンを様々な濃度で水性基剤の安定化剤溶液において10℃で15分〜60分間製粉した。分散物の品質を、顕微鏡およびレーザー光回折を用いて評価した。
【００７７】
ナプロキセンは分子量が230.3 gであり、水中での溶解度はpH 2で16 μg/mLおよびpH 7.5では3.2 mg/mLである。この薬物を低いpHで製粉した。製粉条件は以下の通りであった：3000〜6000 rpm；0.5％〜2％薬物ローディング量；15〜60分の製粉時間；60％〜90％媒体のローディング；および異なるミル4個を用いた（全て、エランドラッグデリバリーインク（Elan Drug Delivery Inc.）が製造したNanoMills（登録商標）であった）。
【００７８】
グレコ-ラテン方格フォーマットを用いて、実験順序を無作為化した。下記の表は、行った実験を示している：
【００７９】
（表３）
2005504266.tif 000004
【００８０】
小規模ミルにおいて製粉するために重要なパラメータは、ミルの速度（rpm）、媒体のローディング率、薬物濃度、ミル速度と媒体のローディングの相互作用、製粉時間と薬物濃度との相互作用、ならびにミル速度、媒体ローディング率、および薬物濃度間の相互作用である。
【００８１】
結果  粒子径が約200 nm未満の組成物を得るために、以下の好ましい製剤および製粉パラメータを同定した。
【００８２】
ミル速度＝4300 rpm；最小製粉時間＝15分；最大製粉時間＝60分；最小薬物濃度＝0.5％；最大薬物濃度＝20％；および最終収率は約75％であった。
【００８３】
本研究は、低容量高エネルギーミルを用いて15分で薬物50 mg未満によって、ナプロキセンの安定なナノ粒子製剤を生成できることを示している。ナノ粒子懸濁液は、光学顕微鏡によってモニターすると均一であり、平均直径が200 nm未満である単モード粒子径分布プロフィールを示した。薬物の約90％が処理後回収された。回収された製剤の物理的安定性は、冷蔵庫で少なくとも2週間保存後も許容された。
【００８４】
結論  小規模高エネルギー湿式製粉技術は、25 mgもの少量の薬物によって15分未満で水に難溶性の薬物の安定な製剤を生成するために首尾よく用いることができる。このアプローチは、溶媒の使用を含まず、前臨床生物学的利用率および毒性学試験にとって理想的である、水に難溶性の薬物を有効に製剤化する代替法を提供する。
【００８５】
実施例2
本実施例の目的は、ナプロキセンといくつかの異なる新規化学実体を用いて、実施例1において記述した小規模製粉プロセスの再現性を証明することであった。
【００８６】
ナプロキセンと、様々な化学構造、様々な作用機序を有し、および異なる医学適応を目標とする、異なる5個の水に難溶性の新規化学物質とを実施例1のように製粉した。試験結果を下記に示す。
【００８７】
（表４）
2005504266.tif 000005
【００８８】
この結果は、製粉方法が、広く多様な化合物に適用できること、そして製粉される化学物質によって制限されないことを証明している。
【００８９】
実施例3
本実施例の目的は、小規模ミルにおいて行われた製粉実験を大きいバッチサイズの製粉プロセスに規模拡大する有効性を示すことであった。
【００９０】
ナプロキセンを大きさが異なる5個の媒体ミルにおいて製粉した：（1）25 mg〜1 g；（2）4 g〜2 kg；（3）1〜10 kg；（4）10〜100 kg；および（5）100〜1000 kg。実験の結果を下記に示す。D50の値は、その下にナプロキセン粒子の50％が入る粒子径である。同様にD90は、その下にナプロキセン粒子の90％が入る粒子径である。
【００９１】
2005504266.tif 000006
【００９２】
上記の結果は、特にD90（すなわち、その下に組成物粒子の90％が入る粒子径）に関して、少量からより大きい製造規模の量までの製粉による粒子径が一貫していることを示している。これは、用いるスクリーニング法が製造のために容易に規模拡大できれば、前臨床生物学的利用率および毒性試験のために適した候補物質を同定するための高スループットスクリーニング法が有意により有用であることから、重要である。
【００９３】
実施例4
本実施例の目的は、小規模ミルにおいて極めて少量の活性物質を製粉する有効性を証明することであった。
【００９４】
化合物X（0.5％薬物）の約15 mgを、NanoMill（登録商標）（エランドラッグデリバリーインク）において、0.25％プルロニック（登録商標）F108および0.25％デオキシコール酸ナトリウムと60分間混合した。0.8 mm YTZ粉砕媒体（イットリア処置ジルコニア；トーソー社（Tosoh Corporation））6 mlを製粉プロセスにおいて用いた。
【００９５】
得られた製剤は良好に分散して、光学顕微鏡分析に基づくと約300 nmの平均粒子径を有した。
【００９６】
実施例5
本実施例の目的は、非常に少量の薬物の小規模製粉に成功したことを証明することであった。
【００９７】
ナプロキセン、ポリビニルピロリドン（PVP）K29/32、ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）を5：2：0.05の比で混合すると、ナプロキセンは0.0625％で存在した。混合物をNanoMill（登録商標）（エランドラッグデリバリーインク）において製粉した。最大速度6000 rpmで100％の媒体ローディングを用いて、エネルギー入力を最大とした。
【００９８】
さらに、PolyMill（登録商標）500 μ媒体（ダウケミカル（Dow Chemical）社）に関するバルク密度0.61 g/mlおよび空隙容量40％に基づいて計算を行った。量が少なく混合が難しいため、PVPおよびSLSはそれぞれ、20％および5％保存溶液として調製した。10 ml、18 ml、および26 ml製粉チャンバーにおける製粉に関する計算を、以下の図表に要約する：
【００９９】
（表５）
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【０１００】
10 mlチャンバー：
ホリバLA-910レーザー散乱粒子径分布アナライザ（ホリバインストルメンツ（Horiba Instruments）、アーバイン、カリフォルニア州）を用いてナプロキセン分散物について得られた粒子径の分析を行ったところ、安定な分散物が形成されたものの、製粉は完全ではないことが示された。粒子をふるい分けした結果、より大きい材料の大きい凝集ピークは存在した。このピークは、時間と共にわずかに減少したが1時間後でなおも存在した。二相性の粒子径ピークは、平均値が1496 nmおよび中央値が354 nmであった。したがって、中央値は主たるピークを表しており；平均値は、試料中になおも存在する非製粉材料の大きい凝集物のためにより高くなる。
【０１０１】
18 mlチャンバー：
ナプロキセン分散物の完全な製粉を認めた。ホリバLA-910レーザー散乱粒子径分布アナライザを用いた粒子径分析から、本質的に単一のピークの粒子径が示された。単一のピーク平均粒子径は314 nmであった。
【０１０２】
26 mlチャンバー：
ナプロキセン分散物の完全な製粉を認めた。ホリバLA-910レーザー散乱粒子径分布アナライザを用いた粒子径分析は、本質的に単一のピークの粒子径を示したが、ピークは18 ml試料よりかなり広かった。より狭いピークは、より狭い粒子径分布に対応する。単一のピーク平均粒子径は630 nmであった。
【０１０３】
実施例6
本実施例の目的は、得られた活性物質の粒子径に及ぼす影響を決定するために、大きさが異なる製粉チャンバーにおいて活性物質の一定量を製粉することであった。製粉チャンバーの大きさのみを変更する効果は、存在する薬物の割合を減少させるためであった。
【０１０４】
ナプロキセン試料25 mgを、NanoMill（登録商標）の10 ml、18 ml、および26 mlチャンバーにおいて製粉した。ナプロキセン、ポリビニルピロリドン（PVP）K29/32、およびラウリル硫酸ナトリウム（SLS）を5：2：0.05の比で混合した。得られた粒子径の分析を写真顕微鏡によって行った。
【０１０５】
10 mlチャンバー：
妥当なナプロキセン分散物が15分後に形成された。より大きく製粉されていない粒子の大きい集団が明らかに存在したが、これはチャンバーとローターの形状によるためであり、製剤によるものではなかった。後の30分および60分の試料は、改善を示さず、おそらくより不均一であった。
【０１０６】
18 mlチャンバー：
妥当なナプロキセン分散物が15分で形成されたが、分散物は10 mlチャンバーの場合より不均一であった。30分の試料は明らかに製粉過剰であり、凝集した。
【０１０７】
26 mlチャンバー：
高エネルギーおよび／またはより長い時間は、試料の製粉過剰を引き起こすように思われることから、この試料を5分後に観察したところ、優れた均一性を有する分散物を示したが、より大きい粒子も存在した。15分後、試料は完全に変質した。
【０１０８】
実施例5および6は、スクリーニングされた製剤が実行可能な候補物質であるか否かを示す「妥当な」分散物を得るために必要な活性物質は極めて低レベルでよく、必要なエネルギーは非常に小さいことを証明している。要約すると、有用であるか否かを決定するために活性物質をスクリーニングする場合、10 mlチャンバーを用いて5分の時点で採取することが十分となるはずである。そのような方法は、分散物を連続製粉後の後の時点でチェックすれば、試料の製粉過剰を回避する利点を有する。
【０１０９】
実施例7
本実施例の目的は、極めて少量の活性物質の製粉に成功したことを示すことである。
【０１１０】
ナプロキセン、PVP、およびSLS 5 mgをNanoMill（登録商標）の10 mlチャンバーにおいて製粉した。ナプロキセン、PVP K29/32、およびSLSは5：2：0.05の比率で混合した。
【０１１１】
光学顕微鏡下で良好に分散したナノ懸濁液であると示されうる分散物を形成するために、10 mlチャンバーにおいてナプロキセンのような活性物質は5 mgで十分であることが判明した。より大きい粒子も同様に存在したが、これは用いたパラメータならびにチャンバーとローターの形状に起因し、製剤が原因ではなかった。
【０１１２】
このように、活性物質の生物学的利用率を増加させるためにナノ粒子組成物を製剤化する場合、組成物が適しているか否かを決定するために、活性物質の5 mgのような少量を製粉することができる。
【０１１３】
実施例8
本実施例の目的は、極めて少量の活性物質の製粉に成功したことを証明することである。化合物フォトゲン（WIN 67722：6-エトキシ-6-オキソヘキシル-3,5-ビス(アセトアミド)-2,4,6-トリヨードベンゾエート）を、実施例7に記載の技術を用いてスクリーニングした。フォトゲンはヨウ素添加造影剤である。
【０１１４】
15％フォトゲンと3％プルロニック（登録商標）F-108の混合物を5：2の比率に調節して、活性物質を10 mgに減少した。次に、組成物をNanoMill（登録商標）の10 mlチャンバーにおいて製粉した。得られた粒子径はナプロキセンより大きかったが、5分で良好に分散した粒子を認め、より小さい粒子が15分および30分で形成された。得られた粒子径は主にミクロン下であった。
【０１１５】
本実施例は、ナノ粒子分散物を生成するために必要な活性物質が少量または微量でよい小規模ミルまたは微小流動化を用いて、活性物質の量が限定されている可能性がある薬物開発段階で活性物質をスクリーニングする有用性をさらに証明する。
【０１１６】
本発明の方法には様々な改変および変更を行うことができ、それらも本発明の趣旨または範囲に含まれることは、当業者に明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内に入る限り、本発明は、本発明の改変および変更も含むと解釈される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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